(57)【要約】  本発明は、例えば、患者における主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）の発生に関連するリスクの決定に用いられ得るバイオマーカーの組み合わせおよびそのレベルに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）患者から試験試料を得る工程、
ｂ）前記試験試料における、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（プロＢＮＰ）またはその切断産物、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、コリン、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）およびリポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬｐＰＬＡ２）からなる群から選択される少なくとも３種類のバイオマーカーの量を決定する工程、ならびに
ｃ）前記少なくとも３種類のバイオマーカーの量をバイオマーカー標準試料と比較する工程
を含み、リスクは前記比較の結果によって決定される、
患者における、急性冠症候群（ＡＣＳ）の少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を経験するリスクを決定する方法。
【請求項２】
前記少なくとも３種類のバイオマーカーが、プロＢＮＰまたはその切断産物、ＰｌＧＦ、ｅＧＲＦおよびホモシステインからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記少なくとも３種類のバイオマーカーが、プロＢＮＰまたはその切断産物、ＰｌＧＦおよびｅＧＦＲからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記少なくとも３種類のバイオマーカーが、ｃＴｎＩ、プロＢＮＰまたはその切断産物およびＰｌＧＦからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記少なくとも３種類のバイオマーカーが、ｃＴｎＩ、プロＢＮＰまたはその切断産物、コリンおよびｅＧＦＲからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記試験試料が、血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
前記切断産物がＢＮＰまたはＮＴ−プロＢＮＰである、請求項１の方法。
【請求項８】
前記患者がストレス試験を受けた後に、急性冠症候群の少なくとも１症状を呈して１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクの決定に前記結果が用いられる、請求項１の方法。
【請求項９】
前記主要有害心イベントが、心筋梗塞、死亡、血行再建、血行再建反復、脳卒中、心不全およびリズム障害からなる群から選択される少なくとも１状態を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
患者から得られた試験試料におけるＢＮＰレベルを評価する工程を含み、
約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記試験試料におけるＰｌＧＦレベルが評価される必要があることを示し、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者のｅＧＲＦが評価される必要があることを示し、前記ＰｌＧＦレベルが評価される必要がある場合、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルは、前記試験試料におけるＢＮＰレベルが再評価される必要があることを示し、前記ＢＮＰレベルが再評価される必要がある場合、約６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが低いことを示し、約６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、ｅＧＦＲが評価される必要がある場合、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＲＦレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが高いことを示す、
患者における、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクを決定する方法。
【請求項１１】
約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約６．４％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２７．６％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１３】
約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２．４％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１４】
約１９．５ｐｇ／ｍＬを超えるＰｌＧＦ値を有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．５％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１５】
約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．３％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１６】
６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＦＲを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１７】
約６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１％未満の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１８】
約６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１２．１％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１０の方法。
【請求項１９】
患者から得られた試験試料におけるＢＮＰレベルを評価する工程を含み、
約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記試験試料におけるＰｌＧＦレベルが評価される必要があることを示し、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者のｅＧＲＦが評価される必要があることを示し、前記ＰｌＧＦレベルが評価される必要がある場合、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルは、前記試験試料におけるＨＣＹレベルが評価される必要があることを示し、１９．５を超えるＰｌＧＦレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、前記ｅＧＦＲが評価される必要がある場合、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＲＦレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが高いことを示し、前記ＨＣＹレベルが評価される必要がある場合、約１２．５μｍｏｌ／Ｌ以下のＨＣＹレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが低いことを示し、約１２．５μｍｏｌ／Ｌを超えるＨＣＹレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示す、
患者における、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験する発生率を決定する方法。
【請求項２０】
約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２７．６％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約６．４％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２２】
約１９．５ｐｇ／ｍＬを超えるＰｌＧＦ値を有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．５％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２３】
約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２．４％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２４】
約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．３％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２５】
約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＦＲレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２６】
１２．５μｍｏｌ／Ｌ以下のＨＣＹレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１％未満の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２７】
約１２．５μｍｏｌ／Ｌを超えるＨＣＹレベルを有する患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１０％の主要有害心イベント発生率を有する、請求項１９の方法。
【請求項２８】
患者が約０．０１５ｎｇ／ｍＬ以下の心筋トロポニンＩレベルを有するかどうか決定する工程、および前記患者が約０．０１５ｎｇ／ｍＬ以下の心筋トロポニンＩレベルを有する場合、前記患者から得られた試験試料におけるＢＮＰレベルを評価する工程を含み、
約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記試験試料におけるＰｌＧＦレベルが評価される必要があることを示し、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者のｅＧＲＦが評価される必要があることを示し、前記ＰｌＧＦレベルが評価される必要がある場合、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルは、前記試験試料におけるＢＮＰレベルが再評価される必要があることを示し、前記ＢＮＰレベルが再評価される必要がある場合、約６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが低いことを示し、約６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、ｅＧＦＲが評価される必要がある場合、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＲＦレベルは、前記患者が、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが高いことを示す、
慢性腎疾患であると診断された患者における、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクを決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、特定の期間にわたり患者における主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）の発生に関連する予後または将来的なリスク決定に用いられ得るバイオマーカーの組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
急性冠症候群（ＡＣＳ）の徴候および症状を呈する患者における将来的な主要有害心イベントのリスクを予測する能力は、重要な研究成果である。主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）は、一般に、死亡（あらゆる原因または心臓関連のいずれか）、心筋梗塞（ＭＩ）および血行再建（経皮的冠動脈血行再建術または冠動脈バイパス術のいずれか）のエンドポイントを意味する。二次的なエンドポイントは、多くの場合、うっ血性／慢性心不全（ＣＨＦ）、脳卒中、再血行再建、およびＡＣＳまたは生命に関わるリズム障害による入院を含む。特に、リスク水準の早期決定により、外科手術、薬物投与、食事や運動の変化および／または定期的な心モニタリングによるかにかかわらず適切な治療介入を受けることによって、このようなイベントの重大なリスクを有する患者がこのリスクを低下させることができる。
【０００３】
急性冠症候群は、心臓への不十分な血液供給による胸痛である急性心筋虚血と適合する臨床症状の一群を包含する。特にこれは、不安定狭心症から非ＳＴ上昇型心筋梗塞およびＳＴ上昇型心筋梗塞にわたる臨床状態の範囲を包含する。２０００年における心筋梗塞の再定義（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００；３６：９５９−９６９）および２００７年における心筋梗塞の新しい普遍的な定義（Ｔｈｙｇｅｓｅｎら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７；５０：２１７３−９５）は、臨床症状と併せた心筋梗塞の診断のための確実なバイオマーカーとしてトロポニンを確立した。トロポニンは、ＣＫ−ＭＢに代わる好ましいマーカーとして同定された。トロポニンＩおよびＴは、先ず１９７０年代後半に心筋損傷の血清マーカーとして同定され（Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．１９７９；５６：３０）、１９８０年代後半にその測定法が記載された（Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１９８７；１１３：１３３３−４４およびＪ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９８９；２１：１３４９−１３５３）。
【０００４】
トロポニンは、３種のトロポニン分子（すなわち、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣ）の複合体である。トロポニンＴは、トロポニン複合体とトロポミオシンを結合し、トロポニンＩは、アクトミオシンアデノシントリホスファターゼ活性の阻害剤としてアクチンとミオシンの相互作用を調節し、トロポニンＣは、カルシウム結合ユニットである。トロポニン複合体は、骨格筋および心筋の両方を含むあらゆる横紋筋組織において見出される。トロポニンＣは、あらゆる種類の横紋筋に単一の型しか存在せず、一方、トロポニンＩおよびトロポニンＴは、心筋、速筋および遅筋に対して特異的な３種のアイソフォームが発見されている。トロポニンＩおよびトロポニンＴの心筋特異型は、心筋梗塞の診断に用いられる型である。（心筋型は、名称の前に付けられた小文字のｃ、すなわち、ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴで表されている。）ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴは、心臓の細胞壊死により心臓から放出される。Ｔｎの小型の細胞質プールが存在することが知られており、これは筋細胞のさらなる崩壊に先立ち放出される。原文献は、トロポニンの放出が傷害後約４−６時間に始まり（Ｗｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：１１０４−２１）、１２−１６時間でピークに達すると説明するが、より新しくさらに高感度の測定法によると、トロポニンはさらに早く、恐らくはミオグロビンと同程度の早さで放出されると考えられる。
【０００５】
トロポニンは、数種類の異なる型で血液中を循環する。正確な循環型は完全には特徴付けられていないが、循環型ｃＴｎＩの大部分はＴｎＣと二重複合体を形成し（Ｋａｔｒｕｋｈａら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９７；４３：１３７９−８５）、その後、ｃＴｎＩ−ＴｎＣ−ｃＴｎＴ三重複合体を形成し、遊離型ｃＴｎＩは殆ど循環していないと考えられる。さらに、ｃＴｎＩは、リン酸化されていても、還元／酸化されていても、ヘパリンと結合していてもよい。
【０００６】
以前の研究から、初診後短期（すなわち、３０から４２日）または中期（すなわち、６ヶ月）の患者をリスク層別化するための単一マーカーの有用性が証明された。ＯｈｍａｎらおよびＡｎｔｍａｎら（ＮＥＪＭ  １９９６；３２５：１３３１−４１および１３４２−９）は、短期リスク層別化に対するトロポニンの有用性を証明した。急性冠症候群における閉塞冠動脈の再疎通治療戦略の国際的使用（Ｇｌｏｂａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  Ｏｐｅｎ  Ｏｃｃｌｕｄｅｄ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ＧＵＳＴＯ−ＩＩａ）のサブ研究は、急性心筋虚血患者のリスク層別化における心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の可能性を調査した。３０日以内の死亡率は、ｃＴｎＴレベルが上昇した患者において有意に高かった。ＴＩＭＩ（心筋梗塞における血栓溶解）ＩＩＩＢ試験において、急性冠症候群の患者から得られた試料が心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に関して解析され、ｃＴｎＩレベルと４２日目の死亡率との間の関連性が決定された。ｃＴｎＩのレベル上昇に伴い統計的に有意な死亡率増加が見られた。
【０００７】
別の研究において、不安定狭心症および非ＳＴ上昇型心筋梗塞の患者におけるリスクを予測するＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の能力が評価された（Ｍｏｒｒｏｗら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３；４１：１２６４−７２）。ＴＡＣＴＩＣＳ−ＴＩＭＩ（アグラスタットによる狭心症の治療と侵襲的または保存的治療の経費の決定−心筋梗塞における血栓溶解（Ｔｒｅａｔ  Ａｎｇｉｎａ  ｗｉｔｈ  Ａｇｇｒａｓｔａｔ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｃｏｓｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｏｒ  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ−Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ））１８試験に登録された患者から得られた試料が評価された。非ＳＴ上昇型急性冠症候群（ＡＣＳ）患者において、単独およびｃＴｎＩと併せて、様々な切点にわたってリスク評価および臨床判断するためにＢＮＰを用いる能力が評価された。７日目および６ヶ月目にイベントが評価された。ＢＮＰが上昇（＞８０ｐｇ／ｍＬ）した患者は７日目および６ヶ月目の死亡リスクがより高く、この関連はｃＴｎＩとは独立的であった。ＢＮＰが上昇した患者は、３０日目のうっ血性心不全（ＣＨＦ）発症リスクもより高かった。著者らは、受診時のＢＮＰ上昇は、より高い死亡およびＣＨＦリスクを有する非ＳＴ上昇型ＡＣＳ患者を同定し、ｃＴｎＩに追加的な情報を付け加えると結論した。
【０００８】
単一のマーカーに加えて、バイオマーカーパネルの急性冠症候群患者をリスク層別化する能力が評価された。上述の個々のマーカーが有害心イベントを予測することを示した。有害心イベントの予測における組み合わせマーカーの有用性は、ＯＰＵＳ−ＴＩＭＩ（不安定冠症候群の患者を対象としたオルボフィバン−心筋梗塞における血栓溶解（Ｏｒｂｏｆｉｂａｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ−Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ））試験に登録された患者から得られた試料を用いて評価された（Ｓａｂａｔｉｎｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２；１０５：１７６０−３）。ｃＴｎＩ、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）およびＢＮＰのベースライン測定値が測定された。それぞれｃＴｎＩ、ＣＲＰおよびＢＮＰの上昇は、死亡、心筋梗塞またはうっ血性心不全の独立的予測因子であった。上昇マーカーの数に基づく患者の分類は、各追加的な陽性マーカーに対しほぼ２倍の死亡リスクと関連した。ＭＩ、ＣＨＦおよび複合型のエンドポイントに対して３０日目と１０ヶ月間の両方でも同様の関係性が示された。
【０００９】
ＴＡＣＴＩＣＳ−ＴＩＭＩの患者から得られた試料を利用する同様の研究は、異なるマーカーパネルを調査した（Ｍｏｒｒｏｗら、Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２００８；２９：１０９６−１１０２）。非ＳＴ上昇型ＡＣＳにおける非致死的虚血性イベント再発に対するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、ＢＮＰ、高感度ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）およびｃＴｎＩの予後上の有用性が調査された。ベースラインＭＰＯの上昇は、３０日目における非致死的心筋梗塞またはＡＣＳによる再入院のより高いリスクを示す。ベースラインＭＰＯ、ＢＮＰおよびｃＴｎＩを用いた層別化は、３０日目における虚血性イベント再発の＞３倍のリスクを同定した。ｓＣＤ４０Ｌは、この集団におけるリスク増加と関連しなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００；３６：９５９−９６９
【非特許文献２】Ｔｈｙｇｅｓｅｎら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７；５０：２１７３−９５
【非特許文献３】Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．１９７９；５６：３０
【非特許文献４】Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１９８７；１１３：１３３３−４４
【非特許文献５】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９８９；２１：１３４９−１３５３
【非特許文献６】Ｗｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：１１０４−２１
【非特許文献７】Ｋａｔｒｕｋｈａら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９７；４３：１３７９−８５
【非特許文献８】Ｏｈｍａｎら（ＮＥＪＭ  １９９６；３２５：１３３１−４１）
【非特許文献９】Ａｎｔｍａｎら（ＮＥＪＭ  １９９６；３２５：１３４２−９）
【非特許文献１０】Ｍｏｒｒｏｗら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３；４１：１２６４−７２
【非特許文献１１】Ｓａｂａｔｉｎｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２；１０５：１７６０−３
【非特許文献１２】Ｍｏｒｒｏｗら、Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２００８；２９：１０９６−１１０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述に鑑み、心臓の傷害、不可逆的またはさらには致死的となり得る傷害のイベントに先立って治療介入を行うことができるような、主要有害心イベントの有意で正確な予測をするものが極めて必要である。より具体的には、本明細書に記載されているバイオマーカーおよびその使用により、このようなイベントを予測する能力を提供し、医師と患者に、このような予後情報なくしては失われていた筈の命を救うための適切な工程を実施する機会を与えることができる。
【００１２】
本明細書に参照されているあらゆる特許および刊行物は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、患者における、急性冠症候群（ＡＣＳ）の少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を経験するリスクを決定する方法を包含する。この方法は、ａ）患者から試験試料を得る工程、ｂ）試験試料におけるトロポニンＩ（ＴｎＩ）、プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（プロＢＮＰ）またはその切断産物、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、コリン、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）およびリポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬｐＰＬＡ２）からなる群から選択される少なくとも３種類のバイオマーカーの量を決定する工程、ならびにｃ）少なくとも３種類のバイオマーカーの量をバイオマーカー標準試料と比較する工程を含み、リスクは比較の結果によって決定される。特に、これら少なくとも３種類のバイオマーカーは、例えば、プロＢＮＰまたはその切断産物、ＰｌＧＦ、ｅＧＲＦおよびホモシステインからなる群から選択されてよい。あるいは、少なくとも３種類のバイオマーカーは、例えば、プロＢＮＰまたはその切断産物（例えば、ＢＮＰまたはＮＴ−プロＢＮＰ）、ＰｌＧＦおよびｅＧＦＲからなる群から選択される。さらに、少なくとも３種類のバイオマーカーは、例えば、ｃＴｎＩ、プロＢＮＰまたはその切断産物およびＰｌＧＦからなる群から選択される。あるいは、少なくとも３種類のバイオマーカーは、例えば、ｃＴｎＩ、プロＢＮＰまたはその切断産物、コリンおよびｅＧＦＲからなる群から選択される。試験試料は、血液、血清および血漿からなる群から選択されてよい。この結果は、患者がストレス試験を受けた後に、急性冠症候群の少なくとも１症状を呈して１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクの決定に用いられてよい。主要有害心イベントは、例えば、心筋梗塞、死亡および血行再建、血行再建反復、脳卒中、心不全およびリズム障害からなる群から選択される少なくとも１状態を含む。さらに、本発明は、患者から得られた試験試料におけるＢＮＰレベルを評価する工程を含む、患者における、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクを決定する方法を含み、約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記試験試料におけるＰｌＧＦレベルが評価される必要があることを示し、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、患者のｅＧＲＦが評価される必要があることを示し、ＰｌＧＦレベルが評価される必要がある場合、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルは、試験試料におけるＢＮＰレベルが再評価される必要があることを示し、ＢＮＰレベルが再評価される必要がある場合、約６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが低いことを示し、約６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、ｅＧＦＲが評価される必要がある場合、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＲＦレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが高いことを示す。特に、約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約６．４％の主要有害心イベント発生率を有する。また、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２７．６％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２．４％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約１９．５ｐｇ／ｍＬを超えるＰｌＧＦ値を有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．５％の主要有害心イベント発生率を有する。また、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．３％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＦＲを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する。また、約６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１％未満の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１２．１％の主要有害心イベント発生率を有する。
【００１４】
さらに、本発明は、患者から得られた試験試料におけるＢＮＰレベルを評価する工程を含む、患者における、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験する発生率を決定する方法を含み、約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記試験試料におけるＰｌＧＦレベルが評価される必要があることを示し、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者のｅＧＲＦが評価される必要があることを示し、ＰｌＧＦレベルが評価される必要がある場合、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルは、試験試料におけるＨＣＹレベルが評価される必要があることを示し、約１９．５を超えるＰｌＧＦレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、ｅＧＦＲが評価される必要がある場合、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＲＦレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが高いことを示し、前記ＨＣＹレベルが評価される必要がある場合、約１２．５μｍｏｌ／Ｌ以下のＨＣＹレベルは、前記患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが低いことを示し、約１２．５μｍｏｌ／Ｌを超えるＨＣＹレベルは、患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示す。約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２７．６％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約６．４％の主要有害心イベント発生率を有する。また、約１９．５ｐｇ／ｍＬを超えるＰｌＧＦ値を有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．５％の主要有害心イベント発生率を有する。
【００１５】
さらに、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約２．４％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１４．３％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＦＲレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、１２．５μｍｏｌ／Ｌ以下のＨＣＹレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１％未満の主要有害心イベント発生率を有する。さらに、約１２．５μｍｏｌ／Ｌを超えるＨＣＹレベルを有する患者は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に約１０％の主要有害心イベント発生率を有する。
【００１６】
また、本発明は、確立された標準試料（例えば、ｃＴｎＩ≦約０．０１５ｎｇ／ｍＬ）と比較することによって、患者が心筋トロポニンＩ陰性であるか決定する工程および前記患者が心筋トロポニンＩ陰性である場合、患者から得られた試験試料におけるＢＮＰレベルを評価する工程を含む、慢性腎疾患であると以前に確立または診断された患者における、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクを決定する方法を包含し、約１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記試験試料におけるＰｌＧＦレベルが評価される必要があることを示し、約１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者のｅＧＲＦが評価される必要があることを示し、前記ＰｌＧＦレベルが評価される必要がある場合、約１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦレベルは、前記試験試料におけるＢＮＰレベルが再評価される必要があることを示し、前記ＢＮＰレベルが再評価される必要がある場合、約６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰレベルは、前記患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが低いことを示し、約６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰレベルは、前記患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、ｅＧＦＲが評価される必要がある場合、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲレベルは、前記患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが中程度であることを示し、約６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＲＦレベルは、前記患者がＡＣＳの少なくとも１症状を呈してから１年以内に主要有害心イベントを経験するリスクが高いことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＢＮＰ、ＰｌＧＦおよびｅＧＦＲレベルを利用することによってどのようにリスク決定が行われるかを示す図である。カテゴリー毎に患者数（Ｎ）が示されており、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を生じた患者のパーセンテージは括弧内に示されている。各分割に利用したバイオマーカーおよびカットオフが示されている。ｃＴｎＩは解析に含まれているが、リスク決定に関して上述のバイオマーカーほど重要ではない。
【図２】ＢＮＰ、ＰｌＧＦ、ＨＣＹおよびｅＧＦＲレベルの使用に基づいてどのようにリスク決定が行われるかを示す図である。カテゴリー毎に患者数（Ｎ）が示されており、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を生じた患者のパーセンテージは括弧内に示されている。各分割に利用したバイオマーカーおよびカットオフが示されている。上と同様に、ｃＴｎＩは解析に含まれているが、リスク決定に関して上述のバイオマーカーほど重要ではない。
【図３】ｃＴｎＩ、ＢＮＰおよびＰｌＧＦレベルの使用に基づいてどのようにリスク決定が行われるかを示す図である。カテゴリー毎に患者数（Ｎ）が示されており、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を生じた患者のパーセンテージは括弧内に示されている。各分割に利用したバイオマーカーおよびカットオフが示されている。
【図４】ｃＴｎＩ、ＢＮＰ、コリン（血漿）およびｅＧＦＲレベルの使用に基づいてどのようにリスク決定が行われるかを示す図である。カテゴリー毎に患者数（Ｎ）が示されており、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を生じた患者のパーセンテージは括弧内に示されている。各分割に利用したバイオマーカーおよびカットオフが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、例えば、心筋梗塞、死亡および／または心臓の血行再建等、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）発生の可能性に関連するリスク決定のための、バイオマーカーの組み合わせの検出およびレベル（またはその不在）（すなわち、予後およびリスク層別化の式）に関する。より具体的には、本発明は、患者から得られた試験試料中に存在する少なくとも３種類のバイオマーカーの存在（または不在）およびレベルの使用を包含する。これらのマーカーは、例えば、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（プロＢＮＰ）、ＮＴ−プロＢＮＰ（Ｎ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、コリン、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬｐＰＬＡ２）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）および高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）からなる群から選択され、リスクがある患者もしくは急性冠症候群の臨床症状を呈する患者における、または完全な心臓評価がなされているそれ以外は健常な患者における、上述のこのような心イベントの将来的な発生の予測において、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と共に用いられ得る。これらバイオマーカーの存在およびレベルに関する情報は、医師がその後、リスクがある患者のために適切な介入療法および／または薬剤を処方できるように、患者のＭＡＣＥリスクの決定において医師を支援する。
【００１９】
このようなマーカーの存在または不在の検出およびそのレベルは、当業者によく知られた様々な測定法形式（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｌｏｎｄｏｎ  ２００１を参照）により得ることができる。例えば、試験試料における本明細書に記載のバイオマーカー（またはその断片）の存在、量または濃度は、１）サンドイッチ免疫測定法（例えば、化学発光検出、放射性同位元素検出（例えば、ラジオ免疫測定法（ＲＩＡ））および酵素検出（例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ測定法、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）））等、モノクローナル、ポリクローナルおよび／またはＤＶＤ−Ｉｇサンドイッチ免疫測定法、またはそれらの任意の変種（例えば、モノクローナル／ＤＶＤ−ＩｇもしくはＤＶＤ−Ｉｇ／ポリクローナル））、２）競合阻害免疫測定法（例えば、フォワードおよびリバース）、３）蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、４）酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、５）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、６）均一化学発光測定法、７）ＳＥＬＤＩに基づく免疫測定法、８）化学発光微粒子免疫測定法（ＣＭＩＡ）および９）臨床化学比色測定法（例えば、ＩＭＡ、ｅＧＦＲ決定のためのクレアチニンおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等、免疫測定法を用いて得ることができる。（例えば、Ｔｉｅｔｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．第４版、ＣＡ  Ｂｕｒｔｉｓ、ＥＲ  ＡｓｈｗｏｏｄおよびＤＥ  Ｂｒｕｎｓ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、ミズーリ州セントルイス、２００６を参照。）利用可能な方法（単数または複数）は、検出したいバイオマーカーの種類に依存し、このような方法は、上述の通り当業者によく知られている。
【００２０】
さらに、尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を採取、取り扱いおよび処理するための本技術分野でよく知られた方法が、本発明の実施に用いられる。試験試料は、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬剤、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド等、対象分析物に加えてさらに別の成分を含んでよい。例えば、試料は、対象から得られた全血試料となることができる。本明細書に記載されている免疫測定法または他の測定法に付される前に、試験試料、特に全血が、例えば前処理試薬を用いて処理されることが必要または望ましくなる可能性がある。前処理が必要とされない場合（例えば、大部分の尿試料）であっても、場合によって前処理が行われてよい（例えば、市販のプラットフォームにおける処方計画の一部として）。
【００２１】
本明細書に記載の測定法において利用できる固体担体または固相は、本技術分野でよく知られており、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
さらに、免疫測定法が利用されている場合、本技術分野で公知のような任意の適切で検出可能な標識が用いられてよい。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ等）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸脱水素酵素その他等）、化学発光標識（アクリジニウムエステル、チオエステルまたはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステル（その他等）、蛍光標識（フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートその他）等）、ローダミン、フィコビリンタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛キャッピングセレン化カドミウム）、温度測定標識または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識となることができる。標識、標識手順および標識検出の入門書として、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーンから刊行されたハンドブックとカタログの組み合わせであるＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）が挙げられる。蛍光標識は、ＦＰＩＡ（例えば、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５９３，８９６号、第５，５７３，９０４号、第５，４９６，９２５号、第５，３５９，０９３号および第５，３５２，８０３号明細書を参照）で用いられてよい。アクリジニウム化合物は、均一または不均一化学発光測定法において検出可能な標識として用いられてよい（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１（２００４）およびＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）を参照）。
【００２３】
好ましいアクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム９−カルボキサミドを調製するための方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９（１９９８）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４（１９９９）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１（１９９９）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４（２０００）、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ、Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、７７−１０５頁（２００２）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）ならびに米国特許第５，４６８，６４６号、第５，５４３，５２４号および第５，７８３，６９９号明細書（これらのそれぞれは、これに関するその教示のためその全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。別の好ましいアクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの一例として、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホン酸（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州アナーバーから入手可能）が挙げられる。アクリジニウム９−カルボン酸アリールエステルを調製するための方法は、ＭｃＣａｐｒａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１（１９６５）、Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９（２０００）、Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４（２０００）および米国特許第５，２４１，０７０号明細書（これらのそれぞれは、これに関するその教示のためその全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルおよびその使用に関するさらなる詳細は、米国特許出願公開第２００８−０２４８４９３号明細書に説明されている。化学発光測定法（例えば、上述のアクリジニウムまたは他の化学発光剤を用いた）は、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５７９（１）：６１−６７（２００６）に記載されている方法に従って行われてよい。どの適切な測定法形式が用いられてもよいが、マイクロプレート化学発光計（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、ＬＬＣ、テネシー州オークリッジ）は、小容量の複数試料の迅速な測定法を可能にする。それと同時またはその後に少なくとも１種類の塩基性溶液を試料に添加すると、分析物の存在を示唆する検出可能なシグナル、すなわち化学発光シグナルが生じる。塩基性溶液は、少なくとも１種類の塩基物質を含有し、１０以上、好ましくは１２以上のｐＨを有する。塩基性溶液の例として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸水素カルシウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料に添加される塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度に依存する。用いた塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者であれば、試料に添加する塩基性溶液の量を容易に決定することができる。
【００２４】
生じた化学発光シグナルは、当業者にとって公知のルーチンの技法を用いて検出されてよい。生じたシグナルの強度に基づいて、試料における分析物の量が定量化され得る。具体的には、試料における分析物の量は、生じたシグナルの強度に比例する。存在する分析物の量は、生じた光の量を分析物の検量線と比較することによって、または標準試料と比較することによって、定量化され得る。検量線は、段階希釈または公知の分析物濃度の溶液を用いて、質量分析、重量測定法および本技術分野で公知の他の技法により作成され得る。上の記述は、化学発光剤としてアクリジニウム化合物の使用に重点を置いて説明してきたが、当業者であれば、この記述を他の化学発光剤の使用に容易に適応させることができる。
【００２５】
上述の通り、分析物の免疫測定法は一般に、サンドイッチ形式等、本技術分野で公知のどの形式を用いて行われてよいが、これに限定されるものではない。具体的には、免疫測定法の一形式において、試料におけるヒト分析物またはその断片等、分析物の分離および定量化のために少なくとも２種類の抗体が用いられる。より具体的には、少なくとも２種類の抗体は、分析物（またはその断片）上の異なるエピトープと結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。一般に、免疫測定法において、試験試料における分析物（またはその断片）を捕捉するために、１つ以上の抗体が用いられてよく（すなわち、これらの抗体は、多くの場合「捕捉」抗体と言う。）、検出可能（すなわち、定量化可能）な標識をサンドイッチに結合するために、１つ以上の抗体が用いられてよい（すなわち、これらの抗体は、多くの場合「検出抗体」または「コンジュゲート」と言う）。したがって、サンドイッチ免疫測定法形式に関連して、抗体（またはその断片、変種もしくは変種の断片）は、捕捉抗体、検出抗体またはその両方として用いられてよい。例えば、分析物（またはその断片）上の第一のエピトープと結合できるドメインを有するあるＤＶＤ−Ｉｇは、捕捉抗体として用いることができ、および／または分析物（またはその断片）上の第二のエピトープと結合できるドメインを有する別のＤＶＤ−Ｉｇは、検出抗体として用いることができる。この点において、分析物（またはその断片）上の第一のエピトープと結合できる第一のドメインおよび分析物（またはその断片）上の第二のエピトープと結合できる第二のドメインを有するＤＶＤ−Ｉｇは、捕捉抗体および／または検出抗体として用いることができる。あるいは、第一の分析物（またはその断片）上のエピトープと結合できる第一のドメインおよび第二の分析物（またはその断片）上のエピトープと結合できる第二のドメインを有する１種類のＤＶＤ−Ｉｇは、２種類以上の分析物を検出、場合によって定量化するための捕捉抗体および／または検出抗体として用いることができる。
【００２６】
一般的に言えば、免疫測定法において、バイオマーカー（またはその断片）に関して検査されている（例えば、それを含有している疑いのある）試料は、同時または連続的のいずれかにおいて任意の順序で少なくとも１種類の捕捉抗体および少なくとも１種類の検出抗体（例えば、捕捉および／または検出抗体が複数の抗体を含む場合、これは、第二の検出抗体もしくは第三の検出抗体またはさらに続く数の抗体となることができる。）と接触されてよい。例えば、試験試料は、先ず少なくとも１種類の捕捉抗体と、次に（連続的に）少なくとも１種類の検出抗体と接触されてよい。あるいは、試験試料は、先ず少なくとも１種類の検出抗体と、次に（連続的に）少なくとも１種類の捕捉抗体と接触されてよい。さらに別の代替法において、試験試料は、捕捉抗体および検出抗体と同時に接触されてよい。
【００２７】
上述のサンドイッチ測定法形式において、分析物（またはその断片）を含有している疑いのある試料は、先ず、第一の抗体／分析物複合体が形成できる条件下で、少なくとも１種類の第一の捕捉抗体と接触させる。２種類以上の捕捉抗体が用いられる場合、２種類以上の捕捉抗体を含む第一の捕捉抗体／分析物複合体が形成される。サンドイッチ測定法において、抗体、すなわち好ましくは少なくとも１種類の捕捉抗体は、試験試料において予想される最大量の分析物（またはその断片）のモル過剰量で用いられる。例えば、バッファー（例えば、微粒子コーティングバッファー）１ｍＬ当たり約５μｇから約１ｍｇの抗体が用いられてよい。
【００２８】
対照的に、単一の抗体による結合が必要とされることから多くの場合小分子分析物の測定に用いられる競合阻害免疫測定法は、連続的形式および古典的形式を含む。連続的競合阻害免疫測定法において、対象分析物に対する捕捉抗体は、マイクロタイタープレートウエルまたは他の固体担体上にコーティングされる。対象分析物を含有する試料がウエルに添加されると、対象分析物は捕捉抗体と結合する。洗浄後、公知の量の標識された分析物（例えば、アクリジニウム、ビオチンまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））がウエルに添加される。シグナル発生のため、酵素標識に対する基質が必要とされる。ＨＲＰに対する適切な基質の一例として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が挙げられる。洗浄後、標識された分析物によって生じたシグナルが測定され、これは試料における分析物の量に反比例する。古典的競合阻害免疫測定法において、対象分析物に対する抗体が固体担体（例えば、マイクロタイタープレートのウエル）上にコーティングされる。しかし、連続的競合阻害免疫測定法とは異なり、試料および標識された分析物が同時にウエルに添加される。試料中の任意の分析物は、捕捉抗体との結合において標識された分析物と競合する。洗浄後、標識された分析物によって生じたシグナルが測定され、これは試料における分析物の量に反比例する。
【００２９】
試験試料における分析物（例えば、バイオマーカー）またはその断片の濃度は、公知の濃度の分析物またはその断片の段階希釈を用いて作成された検量線の使用等、適切な手段により決定される。分析物またはその断片の段階希釈を用いる以外には、検量線は、重量測定により、質量分析により、および本技術分野で公知の他の技法により作成できる。
【００３０】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）分析装置を用いた化学発光微粒子測定法において、コンジュゲート希釈液のｐＨは、約６．０＋／−０．２となることができ、微粒子コーティングバッファーは、ほぼ室温（すなわち、約１７から約２７℃）で維持されてよく、微粒子コーティングバッファーのｐＨは、約６．５＋／−０．２となることができ、微粒子希釈液のｐＨは、約７．８＋／−０．２となることができる。固形物は、好ましくは約０．２％未満であり、例えば約０．１５％未満、約０．１４％未満、約０．１３％未満、約０．１２％未満または約０．１１％未満等であり、例えば約０．１０％等である。当然ながら、これらの範囲または数値は、例えば、バックグラウンド干渉の低下、感度の上昇、特異性の上昇等を含む、測定法のこのような性質を増強するために変更され得る。
【００３１】
ＦＰＩＡは、競合的結合免疫測定法の原理に基づく。蛍光標識した化合物は、直線偏光により励起されると、その回転速度に反比例する偏光度の蛍光を発する。蛍光標識したトレーサー−抗体複合体が直線偏光により励起されると、フルオロフォアは吸光時から発光時の間における回転が制約されるため、放射光は高度に偏光し続ける。「遊離」トレーサー化合物（すなわち、抗体と結合していない化合物）が直線偏光により励起されると、その回転は、競合的結合免疫測定法において生成された対応するトレーサー−抗体コンジュゲートよりも速くなる。ＦＰＩＡは、特別な取り扱いおよび廃棄処理を必要とする放射性物質がないため、ＲＩＡよりも有利である。加えて、ＦＰＩＡは、容易で迅速に行うことのできる均一測定法である。
【００３２】
測定法の方法（およびそのキット）に関し、市販の抗分析物抗体または文献に記載されている抗分析物を作製するための方法を用いることが可能となり得る。種々の抗体の商業的サプライヤーとして、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンタクルーズ）、ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＲＤＳ；ミネソタ州ミネアポリス）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
一般に、所定のレベルは、例えば疾病を検出または疾病リスクを決定するため、分析物またはその断片に関して試験試料を測定法することにより得られた結果を評価するためのベンチマークとして用いられ得る。一般にこのような比較において、所定のレベルは、分析物の存在、量または濃度と、疾病、障害または状態の特定のステージもしくはエンドポイントとのまたは特定の臨床兆候との連関もしくは関連付けがなされるように、特定の測定法を適切な条件下で十分な回数行うことにより得られる。通常、所定のレベルは、基準対象（または対象の集団）の測定法により得られる。測定される分析物は、その断片、その分解産物および／またはその酵素切断産物を含み得る。
【００３４】
特に、疾病進行および／または治療のモニタリングに用いられる所定のレベルに関し、分析物またはその断片の量または濃度は、「変化しない」、「好ましい」（もしくは「好ましく変更」）または「好ましくない」（もしくは「好ましくなく変更」）となり得る。「上昇」または「増加」は、試験試料における、通常もしくは正常レベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）よりも高い、または別の基準レベルもしくは範囲（例えば、より初期の試料もしくはベースライン試料）よりも高い量もしくは濃度を意味する。用語「低下」または「減少」は、試験試料における、通常もしくは正常レベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より低い、または別の基準レベルもしくは範囲（例えば、より初期の試料もしくはベースライン試料）より低い量もしくは濃度を意味する。用語「変更」は、試料における、通常もしくは正常レベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）と比べて、または別の基準レベルもしくは範囲（例えば、より初期の試料もしくはベースライン試料）と比べて、変更した（増加または減少した）量もしくは濃度を意味する。
【００３５】
分析物の通常または正常レベルまたは範囲は、標準的技法に従って規定される。分析物のレベルは一部の事例では非常に低いため、実験誤差または試料変動では説明できない、通常もしくは正常レベルもしくは範囲または基準レベルもしくは範囲と比べて何らかの純変化があれば、いわゆる変更レベルまたは変更が生じたと考えてよい。したがって、特定の試料において測定されたレベルは、いわゆる正常な対象から得られた同様の試料において決定されたレベルまたはレベル範囲と比較される。これに関連して、「正常な対象」は、例えば検出可能な疾病のない個体であり、「正常」（「対照」と呼ばれることもある）患者または集団は、例えばそれぞれが検出可能な疾病を示さない患者または集団である。さらに、分析物がヒト集団の大多数でルーチンに高レベルで見出されなければ、「正常な対象」は、実質的に検出可能に増加または上昇した分析物の量または濃度を持たない個体であると考えてよく、「正常」（「対照」と呼ばれることもある）患者または集団は、実質的に検出可能に増加または上昇した分析物の量または濃度を示さない患者または集団である。「見かけ上正常な対象」は、分析物が現在まで評価されていないまたは現在評価されている対象である。分析物が正常では検出不能（例えば、正常レベルがゼロ、または正常集団の約２５から約７５パーセンタイルの範囲内）であるが、試験試料において検出される場合、また、分析物が正常レベルより高いレベルで試験試料中に存在する場合、分析物のレベルは「上昇した」と言われる。したがって、とりわけ本開示は、特定の疾病、障害または状態を発症するまたは発症リスクがある対象を選別する方法を提供する。測定法法は、他のマーカー等の測定法にも関与し得る。
【００３６】
したがって、本明細書に記載されている方法は、対象が所定の疾病、障害または状態を発症しているまたは発症リスクがあるか否かの決定に用いてもよい。具体的には、このような方法は、（ａ）本明細書に記載されている方法または本技術分野で公知の方法を用いて、対象から得られた試験試料における分析物（またはその断片）の濃度または量を決定する工程、および（ｂ）工程（ａ）において決定された分析物（またはその断片）の濃度または量を所定のレベルと比較する工程を含むことができ、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量が所定のレベルに関して好ましい場合、その後対象は所定の疾病、障害または状態を発症していないまたはリスクがないと決定される。しかし、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量が所定のレベルに関して好ましくない場合、その後対象は所定の疾病、障害または状態を発症しているまたはリスクがあると決定される。
【００３７】
さらに、対象における疾病進行をモニタリングする方法が本明細書に提供されている。最も有利には、（ａ）対象から得られた試験試料における分析物（例えば、バイオマーカー）の濃度または量を決定する工程、（ｂ）対象から得られたより後期の試験試料における分析物の濃度または量を決定する工程、および（ｃ）工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量を工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量と比較する工程を含み、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量と比較して工程（ｂ）において決定された濃度または量が変化しないまたは好ましくない場合、その後対象における疾病が持続、進行または悪化したことが決定される方法。比較することにより、工程（ａ）において決定された分析物の濃度または量と比較して工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量が好ましい場合、その後対象における疾病が休止、消退または改善されたと決定される。
【００３８】
場合によって、方法は、工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量を、例えば所定のレベルと比較する工程をさらに含む。さらに場合によって、比較が、工程（ｂ）において決定された分析物の濃度または量が例えば所定のレベルに関して好ましくなく変更したことを示す場合、方法は、ある期間１つ以上の医薬組成物で対象を治療する工程を含む。
【００３９】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、所定の疾病、障害または状態を発症しているまたはリスクがある対象が治療候補であるか決定する方法も提供する。一般に、対象は、所定の疾病、障害もしくは状態の一部症状を経験した、または所定の疾病、障害もしくは状態を発症しているもしくはリスクがあると実際に診断された、および／または本明細書に記載されている分析物もしくはその断片の好ましくない濃度もしくは量を示した対象である。
【００４０】
当然ながら、本明細書における特定の実施形態は、本明細書に記載されている所定の疾病、障害または状態の評価に用いられた場合に有利であるが、測定法およびキットは、他の疾病、障害および状態における分析物の評価に用いられてよい。測定法法は、他のマーカー等の測定法にも関与し得る。
【００４１】
キット
分析物（またはその断片）の存在、量または濃度に関して試験試料を測定法するためのキットもまた、本発明の範囲内に包含される。キットは、分析物（またはその断片）に関して試験試料を測定法するための少なくとも１種類の構成要素および分析物（またはその断片）に関して試験試料を測定法するための取扱説明書を含む。分析物（またはその断片）に関して試験試料を測定法するための少なくとも１種類の構成要素は、例えば、場合によって固相上に固定化された、バイオマーカー（またはその断片、変種もしくは変種の断片）に対する抗体を含む組成物を含むことができる。
【００４２】
キットは、測定法、例えば化学発光微粒子免疫測定法により分析物に関して試験試料を測定法するための少なくとも１種類の構成要素および免疫測定法、例えば化学発光微粒子免疫測定法により分析物に関して試験試料を測定法するための取扱説明書を含むことができる。例えば、キットは、そのいずれかが検出可能に標識されていてよい、抗分析物モノクローナル／ポリクローナル抗体（または分析物と結合できるその断片、分析物と結合できるその変種もしくは分析物と結合できる変種断片）等、分析物に対する少なくとも１種類の特異的結合パートナーを含むことができる。あるいは、またはさらに、キットは、そのいずれかが固体担体上に固定化されてよい、抗分析物モノクローナル／ポリクローナル抗体（または分析物と結合できるその断片、分析物と結合できるその変種もしくは分析物と結合できる変種断片）または抗分析物ＤＶＤ−Ｉｇ（またはその断片、変種もしくは変種の断片）との結合において試験試料中の任意の分析物と競合できる、検出可能に標識された分析物（または抗分析物モノクローナル／ポリクローナル抗体もしくは抗分析物ＤＶＤ−Ｉｇ（もしくはその断片、変種もしくは変種断片）と結合できるその断片）を含むことができる。キットは、１つ以上の検量物質または対照、例えば、単離または精製された分析物を含むことができる。キットは、測定法を行うための少なくとも１種類の容器（例えば、例えば第一の特異的結合パートナーで予めコーティングされていてよいチューブ、マイクロタイタープレートまたは条片）および／またはその内いずれか一方が濃縮液、検出可能な標識（例えば、酵素標識）のための基質溶液もしくは停止液として提供されてよい測定法バッファーもしくは洗浄バッファー等のバッファーを含むことができる。好ましくは、キットは、測定法の実施に必要とされるあらゆる構成要素、すなわち試薬、標準物質、バッファー、希釈液等を含む。取扱説明書は、書面形式であっても、ディスク、ＣＤ、ＤＶＤその他等、コンピューターで読み込み可能な形式であってもよい。
【００４３】
抗バイオマーカー抗体もしくは抗分析物ＤＶＤ−Ｉｇ等、任意の抗体またはトレーサーは、フルオロフォア、放射性成分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識その他等、本明細書に記載されている検出可能な標識を取り込むことができる、またはキットは、検出可能な標識を行うための試薬を含むことができる。抗体、検量物質および／または対照は、別個の容器に提供されてよい、または適切な測定法形式、例えばマイクロタイタープレートに予め分注されてよい。
【００４４】
場合によって、キットは、品質管理用構成要素（例えば、感受性パネル、検量物質および陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、本技術分野でよく知られており、様々な免疫診断用製品の添付文書に記載されている。感受性パネル要素は、場合によって測定法の性能特性を確立するために用いられ、さらに場合によって測定法キット試薬の完全性および測定法の標準化の有用な指標である。
【００４５】
キットは、場合によって、バッファー、塩、酵素、酵素補助因子、酵素基質、検出試薬その他等、診断測定法の実施に必要とされる、または品質管理評価を容易にする他の試薬を含むこともできる。試験試料の単離および／または処理のためのバッファーおよび溶液（例えば、前処理試薬）等、他の構成要素もキットに含まれてもよい。キットは、１つ以上の他の対照を追加的に含むことができる。キット構成要素の内１つ以上は凍結乾燥されてよく、その場合、キットは、凍結乾燥した構成要素の再構成に適した試薬をさらに含むことができる。
【００４６】
様々なキット構成要素は、場合によって、必要に応じて適切な容器、例えばマイクロタイタープレートに提供される。キットは、試料を保持または保存するための容器（例えば、尿試料のための容器またはカートリッジ）をさらに含むことができる。適切であれば、キットは、場合によって反応槽、混合槽および試薬または試験試料の調製を容易にする他の構成要素を含むこともできる。キットは、注射器、ピペット、ピンセット、計量スプーンその他等、試験試料の採取を補助するための１つ以上の器具を含むこともできる。
【００４７】
検出可能な標識が少なくとも１種類のアクリジニウム化合物である場合、キットは、少なくとも１種類のアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１種類のアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。さらに、検出可能な標識が少なくとも１種類のアクリジニウム化合物である場合、キットは、バッファー、溶液等の過酸化水素源および／または少なくとも１種類の塩基性溶液を含むこともできる。必要に応じて、キットは、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップ等、固相を含むことができる。
【００４８】
キットおよび方法の適応
本明細書に記載されている測定法等、測定法により試験試料における分析物の存在、量または濃度を決定するキット（またはその構成要素）および方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号明細書に記載され、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イリノイ州アボットパーク）により市販されている、様々な自動および半自動システム（固相が微粒子を含むシステム等）における使用に適応され得る。
【００４９】
非自動システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した際の自動または半自動システムとの差異の一部として、第一の特異的結合パートナー（例えば、抗分析物モノクローナル／ポリクローナル抗体（またはその断片、その変種もしくはその変種の断片）または抗分析物ＤＶＤ−Ｉｇ（またはその断片、その変種、もしくはその変種の断片）が結合し、いずれの場合であれサンドイッチの形成および分析物の反応性が影響され得る）基質、ならびに捕捉、検出および／または場合による任意の洗浄工程の長さおよびタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡ等、非自動形式は、試料および捕捉試薬との相対的により長いインキュベーション時間を必要とし得る（例えば、約２時間）のに対し、自動または半自動形式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、相対的により短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約１８分間）でよい。同様に、ＥＬＩＳＡ等、非自動形式は、コンジュゲート試薬等、検出抗体を相対的により長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）インキュベートし得るのに対し、自動または半自動形式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標））は、相対的により短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約４分間）でよい。
【００５０】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる他のプラットフォームとして、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，２９４，４０４号明細書を参照）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩならびに他のプラットフォームが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、測定法、キットおよびキット構成要素は、他の形式、例えば、電気化学的手法によるまたは他のコンパクトなもしくはポイントオブケア測定法系において用いられ得る。本開示は、例えば、サンドイッチ免疫測定法を行う市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的免疫測定法系に適用できる。免疫センサーならびにその製造および使い捨て検査装置における操作の方法は、例えば、これに関するそれらの教示のためそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，０６３，０８１号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号明細書、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号明細書に記載されている。
【００５１】
具体的には、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）システムに対する分析物測定法の適応に関し、次の構成が好ましい。一対の金電流測定作用電極および銀塩化銀参照電極を備える微細加工シリコンチップが製造される。作用電極の一方において、抗分析物モノクローナル／ポリクローナル抗体（またはその断片、その変種もしくはその変種の断片）または抗分析物ＤＶＤ−Ｉｇ（またはその断片、その変種もしくはその変種の断片）が固定化されたポリスチレンビーズ（０．２ｍｍ直径）は、電極上にパターン形成したポリビニルアルコールのポリマーコーティングに付着する。このチップは、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジ内に免疫測定法に適した流体工学形式で組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部において、そのいずれかが検出可能に標識されてよい、抗分析物モノクローナル／ポリクローナル抗体（または分析物と結合できるその断片、その変種もしくはその変種の断片）または抗分析物ＤＶＤ−Ｉｇ（または分析物と結合できるその断片、その変種もしくはその変種の断片）等、分析物に対する特異的結合パートナーを含む層が存在する。カートリッジの液体パウチ内には、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水溶性の試薬が存在する。
【００５２】
操作において、分析物を含有している疑いのある試料が検査カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジがＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）読取装置内に挿入される。分析物に対する特異的結合パートナーが試料中に溶解した後、カートリッジ内のポンプ要素が、チップを含む導管内に試料を押し込む。そこで、それが振動されてサンドイッチの形成を促進する。測定法の最後から２番目の工程において、液体がパウチから押し出されて導管に押し込まれ、チップから試料を洗い流し、廃液チャンバーに入れる。測定法の最後の工程において、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールホスフェートと反応してそのリン酸基を切断し、作用電極において遊離ｐ−アミノフェノールを電気化学的に酸化させる。読取装置は、測定電流に基づいて、内蔵アルゴリズムおよび工場で決定された検量線により試料における分析物の量を計算することができる。
【００５３】
さらに当然ながら、本明細書に記載されている方法およびキットは、測定法を行うための他の試薬および方法を必然的に包含する。例えば、本技術分野で公知および／または容易に調製もしくは例えば洗浄用に最適化され得るような様々なバッファーが、コンジュゲート希釈液、微粒子希釈液および／または検量物質希釈液として包含される。例示的なコンジュゲート希釈液は、特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州アボットパーク）において用いられるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）コンジュゲート希釈液であり、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗菌剤および界面活性剤を含有する。例示的な検量物質希釈液は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカーおよび抗菌剤を含有するバッファーを含む、特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州アボットパーク）に用いられるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ヒト検量物質希釈液である。さらに、２００８年１２月３１日に出願された米国特許出願第６１／１４２，０４８号明細書に記載されている通り、例えば、シグナル増幅因子としてのシグナル抗体と結合した核酸配列を用いたＩ−Ｓｔａｔカートリッジ形式において、改善されたシグナル発生が得られる可能性がある。
【００５４】
他の定義
本明細書における「バイオマーカー」は、正常な生物学的過程、発病過程または治療介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定および評価される特性または実体である。これは、血圧または心拍数等、生理学的指標を含むことができ、身体によって産生され、血流中に放出される、測定可能で定量化可能なタンパク質、ペプチドまたは小分子等、化合物または生体物質も意味し得る。この定義には、クレアチニン、アルブミン、血中尿素窒素、年齢、性別、民族および体重に基づいてよい、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）等のバイオマーカーに基づくパラメータも含まれる。
【００５５】
本明細書における「プロＢＮＰ」、「プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド」または「プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド」は、プレプロＢＮＰ分子に由来する１０８アミノ酸の配列を意味する。プロＢＮＰは、酵素によりプロセシングされてＮＴ−プロＢＮＰ（アミノ酸１−７６）およびＢＮＰ（アミノ酸７７−１０８）を生成する。プロＢＮＰは、血液中における循環を示し（Ｓｅｆｅｒｉａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００７；５３：８６６−８７３）、心不全患者における内因性ナトリウム利尿ペプチド活性の決定において機能し得る（Ｌａｍら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２００７；４９：１１９３−１２０２）。
【００５６】
本明細書における「ＢＮＰ」は、３２アミノ酸を含有する４ｋＤａのＢ型ナトリウム利尿ペプチドを意味する。これは、血圧調節および体液バランスのためのナトリウム利尿系に関与する（Ｂｏｎｏｗ、Ｒ．Ｏ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：１９４６−１９５０、１９９６）。これは、前駆プロＢＮＰ分子に由来するカルボキシル末端（Ｃ末端）の３２アミノ酸（アミノ酸番号７７から１０８）である。ＢＮＰレベル上昇は、心房および肺動脈楔入圧上昇と共に心室収縮および拡張機能低下、左心室肥大ならびに心筋梗塞を伴う（Ｓａｇｎｅｌｌａ、Ｇ．Ａ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９５：５１９−５２１９、１９９８）。ＢＮＰは、臨床的に用いられ、「呼吸が正しく行われない（Ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  Ｎｏｔ  Ｐｒｏｐｅｒｌｙ）」試験（Ｍａｉｓｅｌら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００３；３４７：１６１−７）から得られたデータに基づいた、呼吸困難（すなわち、息切れ）のために救急医療部に来院した患者における心不全の診断、およびＡＣＳ患者におけるリスク層別化（Ｍｏｒｒｏｗら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３；４１：１２６４−７２）を支援する。
【００５７】
本明細書における「Ｎ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド」または「ＮＴ−プロＢＮＰ」は、プロＢＮＰから切断された不活性アミノ末端（Ｎ末端）ポリペプチドを意味する。これは、プロＢＮＰのアミノ酸番号１−７６を含む。その利用を、呼吸困難を呈する患者における心不全の診断に有用なものとして支持する研究によると、ＮＴ−プロＢＮＰの臨床上の有用性は、ＢＮＰの臨床上の有用性と非常に類似している（Ｊａｎｕｚｚｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ２００５；９５：９４８−９５４）。
【００５８】
「トロポニンＩ」または「ＴｎＩ」（上に簡潔に記載されている）は、あらゆる横紋筋組織に存在する、トロポニン複合体の２５ｋＤａの阻害要素である。このタンパク質は、Ｃａ２＋の不在下でアクチンと結合し、これによりアクトミオシンのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する。このタンパク質には数種類のアイソフォームが存在する。心臓組織に見られるアイソフォーム（すなわち、ｃＴｎＩ）は、急性心筋梗塞または他の有害心イベントを経験している患者に高レベルで存在し得る（Ｋｈａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．１７：２２５−２２９、１９９９）。遊離および複合体心筋トロポニンＩも存在する。
【００５９】
本明細書における「ホモシステイン」は、２−アミノ−４−メルカプトブタン酸とも呼ばれるアミノ酸である。これはアミノ酸システインのホモログである。高レベルの血清ホモシステインは、心血管系疾患および脳卒中の重要なリスク因子であることが決定された（Ｂｏｕｓｈｅｙ  ＣＪら、ＪＡＭＡ．１９９５；２７４：１０４９−５７）。しかし、ホモシステイン低下療法は、再発予防における心血管イベントの発生頻度を低下させることができなかった（Ｌｏｓｃａｌｚｏ、Ｊ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４（１５）：１６２９−１６３２、２００６）。ホモシステインレベルの上昇は、ＡＣＳ患者における虚血性傷害の増加とも関連している（Ａｌ−Ｏｂａｉｄｉ  ＭＫら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００；３６：１２１７−２２）。
【００６０】
本明細書における「コリン」は、水溶性の必須栄養素であり、ビタミンＢ複合体内にグループ化される有機化合物である。これは、細胞膜を構成する脂質に存在する天然の四級飽和アミンであり、神経伝達物質アセチルコリンにも存在する。具体的には、コリンおよびその代謝産物は、細胞膜の構造的統合性およびシグナル伝達の役割、コリン作動性神経伝達（すなわち、アセチルコリン合成）ならびにＳ−アデノシルメチオニン合成経路に関与するメチル基の主要なソース（その代謝産物であるトリメチルグリシンを経由）に必要とされる。コリンは、ホスホリパーゼＤの刺激およびプラーク不安定化に関する様々な細胞型由来の細胞表面受容体の活性化の後に放出されると仮定された。入院時のコリン濃度の増加は、ＡＣＳが疑われる患者、特にトロポニン陰性患者における有害心イベントの予測因子である（Ｄａｎｎｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３；９１：１０６０−６７）。
【００６１】
「ｅＧＦＲ」または「推算糸球体濾過量」は、クレアチニン濃度に基づき、また多数の式、通常は「腎臓病に対する食事制限（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」式（ＭＤＲＤ）（Ｌｅｖｅｙら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５３（４）：７６６、２００７）またはコッククロフト・ゴールト式に基づいて計算される。
【００６２】
本明細書における「虚血修飾アルブミン」または「ＩＭＡ（登録商標）」は、虚血状態において生じるアルブミンの修飾を意味する。これは、Ｉｎｖｅｒｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ（マサチューセッツ州ウォルサム）によって製造されたアルブミンコバルト結合検査（ＡＣＢ（登録商標））を用いて評価される。これは、多数の臨床化学分析装置において行われ得る臨床化学比色測定法である。現在、このマーカーは心筋梗塞の「除外」のために用いられている。
【００６３】
本明細書における「Ｃ反応性タンパク質」、「ＣＲＰ」、「高感度ＣＲＰ」または「ｈｓＣＲＰ」は、多くの場合炎症に応答した、生体防御に関与するホモ５量体Ｃａ２＋結合急性期タンパク質である。１９９０年代後半に始まった研究は、健康な男性における将来的な心疾患のリスクを示唆する高い正常レベルのＣＲＰを同定し（Ｒｉｄｋｅｒ、ＮＥＪＭ．１９９７；３３６：９７３−９７９）、女性における将来的な疾病の予測にまで拡大適用した（Ｒｉｄｋｅｒ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８；９８：７３１−３３）。従来のＣＲＰ測定法は感度が低く、正常で健康な個体における値を定量化できなかった。したがって、高感度測定法が利用できるようになったとき、正常範囲内で上昇した値が測定できるようになり、これらの研究が行われた。同時に、予後およびリスク評価のためにより急性の心疾患においてＣＲＰレベルが調査された。Ｌｉｕｚｚｏら（ＮＥＪＭ．１９９４：３３１：４１７−２４）は、不安定狭心症患者におけるＣＲＰの予後有用性を証明した。
【００６４】
本明細書における「ＰｌＧＦ」もしくは「胎盤増殖因子」または「血管内皮増殖因子関連タンパク質」は、ヒト動脈硬化病変内におけるその発現がプラーク炎症および新生血管成長に関連するタンパク質である。（急性心臓病患者におけるＰｌＧＦの有用性は、ＣＡＰＴＵＲＥ（治療抵抗性不安定狭心症を対象としたｃ７Ｅ３  Ｆａｂの抗血小板療法（ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ  Ａｎｔｉ−Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｕｎｓｔａｂｌｅ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ａｎｇｉｎａ））治験から得られた患者においてＨｅｅｓｃｈｅｎら（ＪＡＭＡ．２００４；２９１：４３４−４４１）によって最初に説明された。治験に参加すると、ベースライン試料が採取され、ＰｌＧＦに関して評価され、３０日後の死亡または非致死的心筋梗塞のリスクが決定された。血漿ＰｌＧＦレベルは、ＡＣＳの疑いがある患者における有害事象から独立したバイオマーカーとなることができ、単一の初期測定値が、従来の炎症マーカーから得られた予測および予後情報を拡大すると考えられる。４年後のさらなる解析（Ｌｅｎｄｅｒｉｎｋら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００６；４７：３０７−１１）は、ＡＣＳ患者における予後有用性を支持し続けた。）
本明細書における「ミエロペルオキシダーゼ」または「ＭＰＯ」は、白血球に貯蔵された血液タンパク質であり、広範囲の生物に対する生体防御機構において機能する。白血球の活性化は、過酸化水素の介在によるハロゲン化物イオンの過酸化を触媒するＭＰＯの分泌をもたらす。これらの産物は、炎症部位における酸化ダメージを促進する。ＭＰＯは、炎症ならびに初期内皮細胞機能不全、プラーク惹起および進行、不安定プラークの発達およびそれに続く動脈硬化性プラークの合併症に関与するイベントと関連付けられてきた。ＭＰＯは、心イベントのリスクがあるトロポニン陰性患者を同定し（Ｂａｌｄｕｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００３；１０８：１４４０−１４４５）、他の従来マーカーよりも的中率を増す（Ｂｒｅｎｎａｎら、ＮＥＪＭ．２００３；３４９：１５９５−６０４）ことを示した。
【００６５】
本明細書における「ＬｐＰＬＡ２」または「リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２」は、破裂し易いプラークの形成に関係付けられた血管特異的な炎症性酵素である。ＬｐＰＬＡ２は、リン脂質を２種の炎症性分子、リゾホスファチジルコリンおよび酸化脂肪酸に切断し、動脈硬化性プラーク形成へと至るイベントカスケードをもたらす。ＰＬＡＣ（商標）測定法（ＤｉａＤｅｘｕｓ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）により測定されたＬｐＰＬＡ２は、冠動脈心疾患および粥状動脈硬化に伴う虚血性脳卒中のリスク予測の補助として臨床評価および患者リスク評価と併せて用いられる。
【００６６】
本明細書における「ｓＣＤ４０Ｌ」または「可溶性ＣＤ４０リガンド」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであり、多機能リガンドである。ＣＤ４０Ｌは、タンパク質切断を経て可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（１５−１８ｋＤａ）を生成することのできる３９ｋＤＡ糖タンパク質である。ｓＣＤ４０Ｌは、膜貫通領域および一部細胞外ドメインを欠くが、ＴＮＦ−α相同領域全体を含有する。
【００６７】
本明細書における「予後」は、特定の経過または治療成績が起こる可能性が高いことを意味する。言い換えると、それは、特定の疾病または状態ではない患者と比較した場合、その疾病または状態であると思われる患者において起こる可能性がより高い経過または治療成績である。当業者であれば、予後バイオマーカーと有害事象を生じるリスクまたは治療成績との相関は、標準試料として機能するバイオマーカーの所定のカットオフまたは範囲を用いた統計解析に基づくことを理解する。
【００６８】
本明細書における「生物活性」は、本明細書に記載されているマーカー（例えば、トロポニンＩ、ＰＩＧＦおよびＢＮＰ）のあらゆる固有の生物学的性質を意味する。このような性質は、例えば、本明細書に記載されている抗体と結合する能力を含む。
【００６９】
本明細書における「ＭＡＣＥ」は、患者に対する有効性および安全性転帰の重要な複合臨床基準である主要有害心イベントとして定義される。ＭＡＣＥは、例えば、心臓死、心臓発作（ＭＩ）または虚血が引き起こす標的病変血行再建を含む。
【００７０】
本明細書における「低リスク」は、急性心臓症候群（ＡＣＳ）の少なくとも１症状を呈して１年以内に患者がＭＡＣＥを発生する確率が１０パーセント以下、好ましくは確率が５パーセント未満、より好ましくは確率が２パーセント未満と定義される。
【００７１】
本明細書における「中程度のリスク」は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈して１年以内に患者がＭＡＣＥを発生するリスクが１０パーセントを超え３０パーセント未満であると定義される。
【００７２】
本明細書における「高リスク」は、ＡＣＳの少なくとも１症状を呈して１年以内に患者がＭＡＣＥを発生するリスクが２５パーセントを超え、好ましくは３０パーセント以上、より好ましくは３５パーセントを超えると定義される。（用語「低リスク」、「中程度のリスク」および「高リスク」に関連して本明細書に列挙されている範囲およびカットオフポイントは、リスク評価に関する関連データを集めるために利用された特定の試験に応じて変化し得ることに留意するべきである。さらに、これらカットオフポイントは、相対リスクではなくイベントリスクに関与することに留意するべきである。）
用語「多価結合タンパク質」は、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を表すよう本明細書において用いられている。多価結合タンパク質は、好ましくは３以上の抗原結合部位を有するよう操作され、一般に自然発生的な抗体ではない。
【００７３】
用語「多重特異的結合タンパク質」は、２以上の関連のあるまたは関連のない標的と結合できる結合タンパク質を意味する。本明細書における二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、四価または多価結合タンパク質である。このようなＤＶＤは、単一特異的であっても（すなわち１種類の抗原と結合でき）、多重特異的であってもよい（すなわち２種類以上の抗原と結合できる）。２個の重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２個の軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ  Ｉｇと言う。ＤＶＤ  Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチドならびに２個の抗原結合部位を含む。各結合部位は、抗原結合部位につき抗原結合に関与する合計６個のＣＤＲを備える重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。ＤＶＤ結合タンパク質およびＤＶＤ結合タンパク質の作製方法は、米国特許出願第１１／５０７，０５０号明細書に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれている。
【００７４】
本明細書における「機能的に均等」は、本明細書に記載されているバイオマーカーに対する抗体と同じ特性（例えば、結合親和性）を有するタンパク質（例えば、抗体）を意味する。
【００７５】
本明細書における用語「ポリペプチド」は、任意のアミノ酸ポリマー鎖を意味する。用語「ペプチド」および「タンパク質」は、用語ポリペプチドと互換的に用いられ、同様にアミノ酸ポリマー鎖を意味する。用語「ポリペプチド」は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。
【００７６】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導ソースのため、その天然状態ではそれに付随する天然関連の構成要素と関連しない；同じ種由来の他のタンパク質が実質的に含まれない；異なる種由来の細胞によって発現される；または自然に発生しない；タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学合成またはそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然関連の構成要素から「単離」される。タンパク質は、本技術分野でよく知られているタンパク質精製技法を用いた単離により天然関連の構成要素を実質的に含まないようにされてよい。
【００７７】
本明細書における用語「回収」は、例えば本技術分野でよく知られているタンパク質精製技法を用いた単離により、ポリペプチド等の化学種が天然関連の構成要素を実質的に含まなくさせるプロセスを意味する。
【００７８】
抗体、タンパク質またはペプチドと第二の化学種との相互作用に関連して、本明細書における用語「特異的結合」または「特異的に結合」は、相互作用が、化学種における特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば抗体は、タンパク質一般よりむしろ特異的タンパク質構造を認識し結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対し特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含む反応におけるエピトープＡ（または遊離型非標識のＡ）を含む分子の存在は、抗体と結合している標識されたＡの量を減少させる。
【００７９】
本明細書における用語「抗体」は、Ｉｇ分子の重要なエピトープ結合特性を保有する、４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはその任意の機能断片、変異体、変種もしくは誘導体を広く意味する。このような変異体、変種または誘導体抗体の形式は、本技術分野で公知のものである。その非限定的な実施形態を下に記す。
【００８０】
完全長の抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するさらに保存された領域が散りばめられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲを含む。免疫グロブリン分子は、どの型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
【００８１】
本明細書における用語、抗体の「抗原結合部分」（または、単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、対象バイオマーカーの１つ以上のエピトープ）と特異的に結合する能力を有する１つ以上の抗体断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の１つ以上の断片によって達成され得ることが示された。このような抗体の実施形態は、２種以上の異なる抗原と特異的に結合する、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃもしくはｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）または多重特異的であってもよい。用語、抗体の「抗原結合部分」の内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結した２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込まれているＷａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒら、国際出願公開第９０／０５１４４（Ａ１）号）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子にコードされているが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成した単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）として作製することが可能な合成リンカーにより、組換え法を用いて連結され得る。このような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」の内に包含されている。二特異性抗体等、単鎖抗体の他の形態もまた包含されている。二特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖において発現しているが、同一鎖上の２個のドメイン間で対形成を行うには短すぎるリンカーを用いており、このためドメインを別の鎖の相補ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を作製させる、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。このような抗体結合部分は、本技術分野で公知のものである（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７９０頁（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。本明細書における用語「抗体構築物」は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインと連結した本発明の１つ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により連結した２個以上のアミノ酸残基を含み、１つ以上の抗原結合部分の連結に用いられる。このようなリンカーポリペプチドは、本技術分野でよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖定常ドメインを意味する。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、本技術分野で公知のものである。
【００８２】
本明細書における「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味するよう企図されている（例えば、対象バイオマーカーの少なくとも１個のエピトープと特異的に結合し、バイオマーカー内に存在する抗原またはエピトープ以外の抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体を実質的に含まない単離された抗体）。
【００８３】
本明細書において、用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれに３個のＣＤＲが存在し、これらは各可変領域につきＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名された。本明細書における用語「ＣＤＲセット」は、抗原と結合できる単一の可変領域に生じる３個のＣＤＲ群を意味する。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従い異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔにより記載されたシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベテスダ（１９８７）および（１９９１））は、抗体のどの可変領域にも適用できる明確な残基番号付与方式を提供するだけではなく、３個のＣＤＲを画定する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと言ってもよい。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内の特定のサブ部分が、アミノ酸配列のレベルでは大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２およびＨ３（「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖および重鎖領域を示す）と命名された。これらの領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと言ってもよい。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを画定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））によって記載されている。特定の残基もしくは残基群、またはいっそＣＤＲ全体であっても抗原結合に有意な影響を与えないという予測または実験上の知見を考慮すると、これらは短縮されても延長されてもよいが、さらに別のＣＤＲ境界の定義は、上述のシステムの１つに厳密に従わない可能性があるが、そうであってもＫａｂａｔ  ＣＤＲと重複する。好ましい実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲを用いるが、本明細書に用いた方法は、これらのシステムのいずれかに従って画定されたＣＤＲを利用することができる。
【００８４】
本明細書において、用語「重要」残基は、抗体、特にヒト化抗体の結合特異性および／または親和性に与える影響がより大きい可変領域内の特定の残基を意味する。重要残基は次の内１つ以上を含むが、これらに限定されるものではない。ＣＤＲに隣接する残基、潜在的糖鎖付加部位（Ｎ−またはＯ−糖鎖付加部位のいずれであってもよい）、希少残基、抗原と相互作用できる残基、ＣＤＲと相互作用できる残基、標準残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、Ｖｅｒｎｉｅｒ帯内の残基、Ｃｈｏｔｈｉａ定義の可変重鎖ＣＤＲ１およびＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域内の残基。
【００８５】
用語「活性」は、抗体の、抗原、例えば抗体が反応する抗原に対する結合特異性／親和性等の活性を含む。
【００８６】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合できる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル等、化学的な活性を有する分子表面配置を含み、特定の実施形態において、特異的な三次元構造特性および／または特異的な電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体に結合される抗原の領域である。特定の実施形態において、抗体は、タンパク質および／または高分子の複合体混合物におけるその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原と特異的に結合すると言われる。
【００８７】
本明細書における用語「標識された結合タンパク質」は、結合タンパク質の同定をもたらす標識を取り込んだタンパク質を意味する。好ましくは、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射標識されたアミノ酸の取り込み、または標識されたアビジン（例えば、光学的または比色方法により検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出され得るビオチン化成分とポリペプチドとの結合である。上述の通り、ポリペプチドの標識の例として次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレート等の磁性薬剤。
【００８８】
用語「抗体コンジュゲート」は、治療薬または細胞毒等の第二の化学成分と化学的に連結した抗体等の結合タンパク質を意味する。
【００８９】
本明細書における用語「結晶」および「結晶化」は、結晶の形態で存在する抗体またはその抗原結合部分を意味する。結晶は、アモルファス固体状または液晶状等、他の形態とは異なる物質の固体状の一形態である。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体等のタンパク質）または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的に反復する三次元配列で構成されている。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特定の数理的関連性に従って配置される。結晶において反復する基本単位または構成要素は、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に定義された結晶学的対称性に適合する配置における非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を提供する。全三次元における規則的な平行移動による単位格子の反復は、結晶を提供する。Ｇｉｅｇｅ、Ｒ．  ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ、Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、２０１−１６頁、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、（１９９９）を参照されたし。
【００９０】
本明細書に記述されている用語「ポリヌクレオチド」は、ポリマー型の２以上のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型）である。この用語は、一本鎖および二本鎖型のＤＮＡを含むが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００９１】
本明細書における用語「単離されたポリヌクレオチド」は、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」と共に天然において見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と関連しない；天然においては連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した；またはより長い配列の一部として自然発生しない；ポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源の、またはそれらの特定の組み合わせ）を意味する。
【００９２】
本明細書における用語「ベクター」は、それと連結した別の核酸を運搬することが可能な核酸分子を意味するよう企図されている。ベクターの一型は、そこに付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされてよい環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別の種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律増殖できる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞へと導入すると宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、そこに作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と言う。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態をしている。プラスミドは最も一般に用いられているベクター形態であるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられてよい。しかし、本発明は、均等な機能を果すウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等、その他の形態の発現ベクターを含むことを企図する。
【００９３】
用語「作動可能に連結」は、記載されている構成要素類が、それらに企図された仕方で機能できる関係性にある並列を意味する。コード配列に「作動可能に連結した」調節配列は、調節配列に適合する条件下でコード配列の発現が行われる仕方でライゲーションされている。「作動可能に連結」した配列は、対象遺伝子と近接した発現調節配列と、トランスでまたは距離をおいて作用して対象遺伝子を調節する発現調節配列の両方を含む。本明細書における用語「発現調節配列」は、それがライゲーションされたコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに必要に応じてタンパク質の分泌を増強する配列を含む。このような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物において、このような調節配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む。真核生物において一般に、このような調節配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「調節配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必要不可欠な構成要素を含むよう企図され、その存在が有利となる追加的な構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。
【００９４】
本明細書に定義されている「形質転換」は、外来ＤＮＡが宿主細胞に進入する任意の過程を意味する。形質転換は、天然条件下または本技術分野でよく知られている様々な方法を用いた人工条件下で起こり得る。形質転換は、外来核酸配列を原核生物または真核生物の宿主細胞へと挿入するための任意の公知の方法に依存し得る。方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクションおよび微粒子銃を含んでよいが、これらに限定されるものではない。このような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自己複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部として複製できる安定的に形質転換された細胞を含む。これは、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを限られた期間一過的に発現する細胞も含む。
【００９５】
本明細書における用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、そこに外来ＤＮＡが導入された細胞を意味するよう企図されている。このような用語が、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の後代も意味するよう企図されていることを理解するべきである。突然変異または環境影響のいずれかにより後の世代においてある程度の改変が生じ得るため、このような後代は実際に親細胞と同一のものとなることはできないが、依然として本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。好ましくは、宿主細胞は、生物界のいずれかから選択される原核生物および真核生物の細胞を含む。好ましい真核生物細胞は、原生生物、真菌、植物および動物の細胞を含む。最も好ましくは、宿主細胞は、原核生物細胞株Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）；哺乳類細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９；ならびに真菌細胞サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のため、標準技法が用いられてよい。酵素反応および精製技法は、メーカーの仕様書に従って、または本技術分野において一般に達成される通りもしくは本明細書に記載されている通りに行われてよい。前述の技法および手順は一般に、本技術分野でよく知られている従来の方法に従って、または本明細書を通じて引用および記述されている様々な一般的およびより特定の参考文献に記載されている通りに行われてよい。例えば、いかなる目的に対しても参照により本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたし。
【００９７】
用語「制御する」および「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は互換的に用いられ、本明細書において、対象分子の活性の変化または変更を意味する。調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、対象分子の特定の活性または機能の規模の増加であっても減少であってもよい。分子の例示的な活性および機能は、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化およびシグナル伝達を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
同様に、本明細書における用語「調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、対象分子の活性または機能を変化または変更することのできる化合物である。例えば、調節因子は、調節因子の不在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子の特定の活性または機能の規模の増加または減少をもたらし得る。特定の実施形態において、調節因子は、分子の少なくとも１種類の活性または機能の規模を減少させる阻害剤である。例示的な阻害剤は、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、炭水化物または有機小分子を含むが、これらに限定されるものではない。ペプチボディーは、例えば、国際出願公開第０１／８３５２５号に記載されている。
【００９９】
本明細書において、用語「有効量」は、障害またはその１つ以上の症状の重症度および／または持続時間の低減もしくは寛解、障害進行の予防、障害の消退の原因、障害を伴う１つ以上の症状の再発、発症、発生もしくは進行の予防、障害の検出、または別の治療（例えば、予防薬もしくは治療薬）の予防効果もしくは治療効果の増強もしくは改善に十分な治療の量を意味する。
【０１００】
本明細書における用語「試料」は、その最も広い意味で用いられる。本明細書における「生物試料」は、生物またはかつて生物だったものに由来する任意の量の物質を含むが、これらに限定されるものではない。このような生物は、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよび他の哺乳類または非哺乳類動物を含むが、これらに限定されるものではない。上述のこのような物質は、血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織（例えば、脳）、骨髄、リンパ節、脳脊髄液および脾臓を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
本明細書において他に規定がなければ、本発明に関連して用いられる科学および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を持つ。用語の意味および範囲は明確でなければならないが、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に提供されている定義は、任意の辞書または外部定義における慣例に従う。さらに、文脈においてそれ以外が必要とされなければ、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含む。本願において、「または」の使用は、他に記述がなければ「および／または」を意味する。さらに、用語「含む」ならびに「含んでいる」および「含まれる」等の他の活用形の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「構成要素」等の用語は、他に特に記されていなければ１ユニットを含む要素および構成要素の両方ならびに２以上のサブユニットを含む要素および構成要素を包含する。
【０１０２】
一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法およびそれらの技法は、本技術分野においてよく知られており、また一般に用いられている。本発明の方法および技法は一般に、他に断りがなければ、本技術分野でよく知られている従来の方法に従って、本明細書を通じて引用および記述されている様々な一般的およびより特定の参考文献に記載されている通りに行われる。酵素反応および精製技法は、メーカーの仕様書に従って、本技術分野において一般に行われる通りまたは本明細書に記載されている通りに行われる。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学ならびに医薬品および製薬化学に関連して用いられる命名法ならびにそれらの実験手順および技法は、本技術分野においてよく知られており、また一般に用いられている。標準技法は、化学合成、化学解析、医薬品の調製、製剤および送達ならびに患者治療に用いられる。
【０１０３】
本発明において、また、特に抗体の結合親和性を評価するため、参照により本明細書に組み込まれている国際出願公開第２００４／０６７５６１号に記載されているプロセスが用いられてよい。前記プロセスは、天然、組換えもしくは合成ペプチドまたはそれらの誘導体をアンフォールディングする工程；少なくとも部分的にアンフォールディングしたペプチドまたはその誘導体を界面活性剤に曝露し、洗浄作用を低下させ、インキュベーションを継続する工程を含む。
【０１０４】
当業者であれば、本明細書に記載されている本発明の方法の他の適切な修正および適応が明らかであり、本発明の範囲または本明細書に開示されている実施形態から逸脱することなく適切な均等物を用いて行われてよいことを容易に理解できる。本発明を詳細に説明してきたが、これは説明目的のためだけに含まれ、本発明の範囲の限定を企図しない次の実施例を参照することによりさらに明確に理解される。
【実施例】
【０１０５】
前向き多施設治験
前向き、盲検、多施設コホート治験を行った。この試験の目的は、バイオマーカーの濃度が単独または様々な組み合わせのいずれかにより予後値を提供するか決定して、ＡＣＳを示唆する虚血性症状を呈する患者における死亡、非致死的ＭＩまたは血行再建の必要性を予測（陽性的中率）または除外（陰性的中率）することである。加えて、試験は、非心臓性原因による心虚血のために胸痛を呈した患者の識別にバイオマーカーを用いることができるか決定するよう調査した。試験は、心不全、血行再建反復の必要性、ＡＣＳによる再入院または生命に関わるリズム障害等、二次イベントの予測における、これらのバイオマーカーの有用性の決定も調査した。
【０１０６】
患者
５９８名の患者を試験に登録した。新規のＮＳＴＥＭＩ／ＡＣＳを示唆する虚血性症状を発症した適格患者が救急医療部に来院した際に補充した。入院中の臨床特性、心臓手術および心イベントに関するデータを収集した。登録後３０日および約１年目に電話による追跡調査を行い、一次および二次エンドポイントを評価した。欧州心臓病学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）／米国心臓病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）合同委員会の心筋梗塞の定義（Ａｌｐｅｒｔ  ＪＳ、Ｔｈｙｇｅｓｅｎ  Ｋら、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ、２０００；２１：１５０２−１３）を利用した地域委員会によりＭＩを判定した。したがって、次の判断基準の内いずれか１項は、急性、発展中または最新のＭＩの診断を満たす。
１）次の内少なくとも１項を伴う、心筋壊死の生化学マーカーの典型的な上昇およびゆるやかな低下（トロポニン）またはより急速な上昇および低下（ＣＫ−ＭＢ）
ａ）虚血性症状
ｂ）ＥＣＧにおける病的Ｑ波の発生
ｃ）虚血を示唆するＥＣＧ変化（ＳＴ上昇または下降）
ｄ）冠動脈インターベンション（例えば、冠動脈形成術）
２）急性ＭＩの病理的所見
【０１０７】
組み入れ基準
試験に登録されるには、患者は次の要件を満たさなければならない。
１．試験に向けた活動の開始前に署名した同意書
２．妊娠が判明していない出産可能年齢の女性
３．年齢：最低でも１８歳
４．それに先立つ１２時間以内に最新の胸痛を伴う虚血の少なくとも１種類の徴候および／または症状の呈示。虚血の徴候および／または症状を次に挙げる。
【０１０８】
・胸の痛み、圧力、圧迫感もしくは重苦しさ、痙攣、灼熱感または疼痛感；加速的パターンの胸痛または安静時または最小限の労作による遷延［＞２０分間］もしくは再発エピソード。
・首、顎、肩、背中または片方もしくは両方の腕に放散する痛み；または胸部不快感を伴う可能性のある原因不明の消化不良もしくは「胸焼け」、げっぷ、心窩部痛、吐き気および／または嘔吐；および／または付随する呼吸困難、および／または付随する発汗。
・カテーテル処置、血行再建または心筋梗塞の病歴に記録された冠疾患。
・虚血と一致したＥＣＧ所見；例として、次のものが挙げられる。
○少なくとも０．０５ｍＶのＳＴ下降の新規所見、または
○少なくとも０．１ｍＶの一過的（＜２０分間）ＳＴ上昇、または
○少なくとも２導出におけるＴ波逆転
【０１０９】
除外基準
次の要件を満たす場合、患者は試験に登録しなかった。
１．少なくとも０．１ｍＶの持続的（＞２０分間）ＳＴ上昇
２．試験の目的を理解できない
３．患者が１８歳未満である
４．患者が囚人である
【０１１０】
試料採取
登録時、４から８時間後、その時点で入院していれば登録１２−１６時間後に患者の血液試料を得た。血液を採取および処理して、５種類の異なる検体型（ヘパリンリチウム血漿、ヘパリンリチウム全血、ＥＤＴＡ血漿、ＥＤＴＡ全血および血清）を得た。解析前に試料を主に−７０℃で保存した。
【０１１１】
バイオマーカー測定法
患者の病歴または指示された治療に関する知識を持たず、心臓バイオマーカーを決定した。表１に示す臨床試料により評価したバイオマーカーは、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｎ末端プロＢＮＰ（ＮＴ−プロＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、コリン、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬｐＰＬＡ２）、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）およびホモシステイン（ＨＣＹ）を含む。これらのバイオマーカーを検査して、濃度増加が、患者集団における死亡、非致死的ＭＩまたは血行再建の必要性を予測する（陽性的中率）か決定した。これらのバイオマーカーの、将来的な死亡、非致死的ＭＩまたは血行再建の必要性を除外する（陰性的中率）能力も決定した。
【０１１２】
市販のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）測定法を用いて心筋ＴｎＩ、ＢＮＰ、ＨＣＹ、ｈｓＣＲＰおよびクレアチニンを検査した。プロトタイプのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ測定法を用いてＭＰＯおよびＰｌＧＦを検査した。クレアチニン値に基づきＭＤＲＤ（腎臓病に対する食事制限）式（Ｌｅｖｅｙ  ＡＳら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００７；５３：７６６−７２）により推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を計算した。記載（Ｙｕｅ  Ｂら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００８：５４：５９０−５９３）されている通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を用いて、ヘパリンリチウム全血、ヘパリンリチウム血漿およびＥＤＴＡ全血におけるコリンを測定した。Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡにより可溶性ＣＤ４０Ｌを測定した。Ｈｉｔａｃｈｉ装置におけるアルブミンコバルト結合測定法（ＡＣＢ、Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によりＩＭＡを測定した。ＥＬＩＳＡ（ＤｉａＤｅｘｕｓ）によりＬｐＰＬＡ２を測定した。Ｏｒｔｈｏ  Ｖｉｔｒｏｓ装置においてＮＴプロＢＮＰを決定した。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
結果および主要有害心イベントの概要
合計５９８名の患者を試験に登録したが、５５名の患者は追跡調査の情報を利用できなかった。バイオマーカーの予後有用性にさらに焦点を合わせるため、発症後最初の２４時間に主要有害心イベントを患う別の４０名の患者は解析セットから除外した。全患者における各バイオマーカーの有用性を評価するため、実験室からバイオマーカー値が失われたため別の５３名の患者を除外した。これにより、評価のために合計４４９名の患者が残った。表２は、この患者集団のベースライン特性を示す。この患者群において４７例（１０．５％発生率）の複合型主要有害心イベントが存在した。主要有害心イベントは、１９例の死亡（４．２％発生率）、７例の心筋梗塞（１．６％発生率）および２１例の血行再建（４．７％発生率）からなる。
【０１１５】
【表２】
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ＭＡＣＥ＝主要有害心イベント；ＴＩＭＩ＝心筋梗塞における血栓溶解；ＥＤ＝救急医療部；ｅＧＦＲ＝推算糸球体濾過量
【０１１６】
ａ）検査値、性別および年齢の識別力
利用できる全時点の最大バイオマーカー値をその後の解析に用いた。各バイオマーカーおよび検査値をいくつかの二値変数（１０％区間により規定）に独立的に分類して、１年目における主要有害心イベントの発生率との最も強い関連を明らかにする二分法を同定した。カイ二乗検定を用いて最適カットオフを決定した。次に、最適カットオフにおける各バイオマーカーに対する相対リスクを決定した。最適カットオフ、カイ二乗値および相対リスクを有する各バイオマーカーの二分法を表３に示す。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
ＮＴプロＢＮＰ、ＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ＨＣＹ、ＰｌＧＦ、血漿コリン、ＩＭＡ、ｈｓＣＲＰ等、数種類のバイオマーカーは、主要有害心イベントに対し有意な的中率を示した。年齢および推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）も有意であった。ＮＴプロＢＮＰ（６．１）、ＢＮＰ（４．３）、年齢（４．２）およびｃＴｎＩ（４．０）に関し、最も高い相対リスクが観察された。
【０１１９】
１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰカットオフおよび０．０１５ｎｇ／ｍＬ以下のｃＴｎＩカットオフを用いると、ＢＮＰとｃＴｎＩとの間に共線性が観察された。３７５名の患者は同一の結果であり、その内３２５名は両方の測定法におけるカットオフを下回り、５０名は両方の測定法におけるカットオフを超える。両方の測定法は１８例の主要有害心イベントを同定し、両者ともに１８例の主要有害心イベントを見落とす。ＢＮＰは、ｃＴｎＩにより見落とされる６例の主要有害心イベントを同定し、一方ｃＴｎＩは、ＢＮＰにより見落とされる５例の主要有害心イベントを同定する。
【０１２０】
ｂ）ＣＡＲＴ解析
ＣＡＲＴ（分類と回帰木（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ））解析（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．２００８；３９４：１−６を参照）を複数マーカーの解析に利用した。ＢＮＰは、最高のカイ二乗値を有し、したがって患者の予後またはリスク層別化に最も有意に関連する。図１に示す通り、第一の分割に１５０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰカットオフを用いた。１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰ値を有する６．４％の主要有害心イベント発生率の３６２名の患者および１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰ値を有する２７．６％の主要有害心イベント発生率の８７名の患者が存在する。次に、推算ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）を用いて、１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰ値により８７名の患者をさらに区別化する。６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２のｅＧＦＲカットオフを用いると、５２名の患者は３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する高リスクカテゴリーに入り、３５名の患者は、６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲを有し１４．３％の主要有害心イベント発生率を有する。
【０１２１】
ＰｌＧＦを用いて、１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰ値を有する３６２名の患者を区別化した（図１を参照）。１９．５ｐｇ／ｍＬのＰｌＧＦカットオフを用いると、１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦを有する２．４％の主要有害心イベント発生率の２４５名の患者および１９．５ｐｇ／ｍＬを超えるＰｌＧＦを有する１４．５％の主要有害心イベント発生率の１１７名の患者が存在する。１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦを有する２４５名の患者は、６５ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ値に基づいてさらに分割させることができる。０．９％の主要有害心イベント発生率（９９．１％陰性的中率）の低リスクカテゴリーにおいて６５ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰを有する２１２名の患者が存在し、６５ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰを有する１２．１％の主要有害心イベント発生率の３３名の患者が存在する。
【０１２２】
ＢＮＰ、ＰｌＧＦおよびｅＧＦＲの組み合わせは、患者集団を低、中程度および高リスク群に層別化することができる。低リスク群は、１％未満の主要有害心イベント発生率を有する２１２名の患者を含み、一方、高リスク群は、３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する５２名の患者を含む。１２．１％から１４．５％の主要有害心イベント発生率を有する１８５名の患者が中程度リスク群に存在する（図１を参照）。
【０１２３】
感度解析を行って、様々なカットオフでＢＮＰおよびＮＴプロＢＮＰを評価した。ＢＮＰとＮＴプロＢＮＰの両方は、広範囲のカットオフ値にわたって統計的に有意な相対リスクを提供する。表４に示す通り４０から１８０ｐｇ／ｍＬにおいてＢＮＰを評価し、表５に示す通り１２５から１，２００ｐｇ／ｍＬにおいてＮＴプロＢＮＰを評価した。
【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
１５０ｐｇ／ｍＬ以下または６０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰ値を有する患者サブセットにおいて、ＰｌＧＦを用いた相対リスクは、１８から２２ｐｇ／ｍＬでカットオフを評価する場合、依然として統計的に有意である（表６）。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
図１に記載されている解析と同様に、ＨＣＹがＢＮＰの代わりとなり、１９．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦを有する患者をさらに区別化することができる。図２に示す通り、１２．５μｍｏｌ／Ｌ以下のＨＣＹを有し１．０％の主要有害心イベント発生率を有する２０５名の患者および１２．５μｍｏｌ／Ｌを超えるＨＣＹを有し１０．０％の主要有害心イベント発生率を有する４０名の患者が存在する。
【０１２９】
図２に示す通り、ＢＮＰ、ＰｌＧＦ、ＨＣＹおよびｅＧＦＲの組み合わせも、患者集団を低、中程度および高リスク群に層別化することができる。低リスク群は、１％の主要有害心イベント発生率（９９％陰性的中率）を有する２０５名の患者を含み、一方、高リスク群は、３６．５％の主要有害心イベント発生率を有する５２名の患者を含む。１０．０％から１４．５％の主要有害心イベント発生率を有する１９２名の患者が、中程度リスク群に存在する。
【０１３０】
ＢＮＰとｃＴｎＩとの間に観察される共線性のため、図３および４に示す通り、第一の分割においてＢＮＰの代わりにｃＴｎＩを用いた追加的なＣＡＲＴ解析を行った。図３において、第一の分割において０．０１５ｎｇ／ｍＬ以下のｃＴｎＩカットオフを用いた。０．０１５ｎｇ／ｍＬ以下のｃＴｎＩを有する６．６％の主要有害心イベント発生率の３６２名の患者および０．０１５ｎｇ／ｍＬを超えるｃＴｎＩを有する２６．４％の主要有害心イベント発生率の８７名の患者が存在する。次に、ＢＮＰを用いて０．０１５ｎｇ／ｍＬを超えるｃＴｎＩ値を有する８７名の患者をさらに区別化した。１５０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰを有する３６．０％の主要有害心イベント発生率の５０名の患者および１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰを有する１３．５％の主要有害心イベント発生率の３７名の患者が存在する。
【０１３１】
ＰｌＧＦを用いて０．０１５ｎｇ／ｍＬ以下のｃＴｎＩ値を有する３６２名の患者を区別化した（図３を参照）。この場合、２１．５ｐｇ／ｍＬのＰｌＧＦカットオフを用いた。２１．５ｐｇ／ｍＬ以下のＰｌＧＦを有し３．６％の主要有害心イベント発生率を有する２７５名の患者および２１．５ｐｇ／ｍＬを超えるＰｌＧＦを有し１６．１％の主要有害心イベント発生率を有する８７名の患者が存在する。２７５名の患者は、９０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ値に基づいてさらに分割させることができる。９０ｐｇ／ｍＬ以下のＢＮＰを有する１．７％の主要有害心イベント発生率の２３７名の患者および９０ｐｇ／ｍＬを超えるＢＮＰを有する１５．８％の主要有害心イベント発生率の３８名の患者が存在した。
【０１３２】
図３に示す通り、ｃＴｎＩ、ＢＮＰおよびＰｌＧＦの組み合わせも、患者集団を低、中程度および高リスク群に層別化することができる。低リスク群は、２％未満の主要有害心イベント発生率を有する２３７名の患者を含み、一方、高リスク群は、３６％の主要有害心イベント発生率を有する５０名の患者を含む。１３．５％から１６．１％の主要有害心イベント発生率を有する１６２名の患者が、中程度リスク群に存在する。
【０１３３】
図３に記載されている解析に代わる解析を図４に示すが、ここでは血漿コリンの結果がＰｌＧＦに代わる。この場合、コリンに１５．３μｍｏｌ／Ｌのカットオフを用いると、１５．３μｍｏｌ／Ｌ以下のコリンを有し４．２％の主要有害心イベント発生率を有する２８３名の患者が存在する。１５．３μｍｏｌ／Ｌを超えるコリンを有し１５．１％の主要有害心イベント発生率を有する７９名の患者が存在する。次に、６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２のｅＧＦＲカットオフを用いて、１５．３μｍｏｌ／Ｌ以下のコリンを有する２８３名の患者を区別化した。６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超えるｅＧＦＲを有し２．２％の主要有害心イベント発生率を有する２２５名の患者および６８ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下のｅＧＦＲを有し１２．１％の主要有害心イベント発生率を有する５８名の患者が存在する。
【０１３４】
図４に示す通り、ｃＴｎＩ、血漿コリン、ＢＮＰおよびｅＧＦＲの組み合わせも、患者集団を低、中程度および高リスク群に層別化することができる。低リスク群は、２．２％の主要有害心イベント発生率を有する２２５名の患者を含み、一方、高リスク群は、３６％の主要有害心イベント発生率を有する５０名の患者を含む。１２．１％から１５．１％の主要有害心イベント発生率を有する１７４名の患者が、中程度リスク群に存在する。
【０１３５】
本試験において統計的に有意なバイオマーカーは、ＮＴプロＢＮＰ、ＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ＨＣＹ、ｅＧＦＲ、ＰｌＧＦ、コリン、ＩＭＡおよびｈｓＣＲＰである。バイオマーカー類（表３に列挙）は、異なる病態生理学的経路下にある（Ｖａｓａｎ  ＲＳ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６；１１３：２３３５−２３６２およびＡｐｐｌｅ  ＦＳ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００５；５１：８１０−８２４）。バイオマーカーの異なる病態生理に基づいて、バイオマーカーの組み合わせは、患者のリスク層別化の補助に有益となる。バイオマーカーの組み合わせは、上述のマーカー由来の少なくとも３種類のバイオマーカーを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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