(57)【要約】  本発明は、藻類での導入遺伝子の発現を増強する系を提供する。導入遺伝子を、それらのプロモーターの近傍に、特定のタンパク質の結合部位、例えばＬｅｘＡ結合部位を含むように改変する。藻類をまた、協調して作用するＤＮＡ結合部位への親和性をもつタンパク質に融合させた、ヌクレオソームを変化させるタンパク質を発現するように改変する。一例としてはＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質があり、ここでｐ３００はコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である。ＬｅｘＡ結合ドメインはｐ３００を結合部位に誘導し、ｐ３００は導入遺伝子の近傍にあるヒストンをアセチル化することによりヌクレオソームの構造を緩ませ、その結果、その部位のクロマチン構造が再構築されて高レベルの発現が生じる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類での遺伝子発現を増強する系であって、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、
藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及び
ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した、少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、
藻類での遺伝子発現を高めるための、藻類中にある、前記系。
【請求項２】
ＤＮＡ結合タンパク質がＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインである、請求項１に記載の系。
【請求項３】
ＧＥＥ融合タンパク質のｐ３００部分がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である、請求項１に記載の系。
【請求項４】
ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインのみがＧＥＥ融合タンパク質の一部分である、請求項１に記載の系。
【請求項５】
導入遺伝子の藻類での発現が改善されるようにコドンを変化させた、請求項１に記載の系。
【請求項６】
導入遺伝子が、蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子である、請求項５に記載の系。
【請求項７】
蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子がＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合体である、請求項６に記載の系。
【請求項８】
蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子がＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合体である、請求項６に記載の系。
【請求項９】
少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１０】
ＧＥＥ融合タンパク質と少なくとも１つの導入遺伝子を、２つのプロモーターの近傍に配置したＤＮＡ結合部位を含む１つの両方向性プロモーター領域から発現されるような構造で配置した１つのベクターを用いて導入する、請求項９に記載の系。
【請求項１１】
ＧＥＥ融合タンパク質と導入遺伝子を、それぞれが選択マーカーを含み、それぞれの選択マーカーが同じではない別個のベクターを用いて導入する、請求項９に記載の系。
【請求項１２】
藻類に適した転写プロモーターがｈｓｐ７０、ｒｂｃＳ、ｎｉｔＡ、ｔｕｂＡ２又はその組み合わせである、請求項１に記載の系。
【請求項１３】
ＧＥＥ融合タンパク質が、ＨＡＴ領域がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のｐ３００のＨＡＴ領域と少なくとも８０％の同一性を有する藻類由来ｐ３００ホモログに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１に記載の系。
【請求項１４】
ＧＥＥ融合タンパク質が、ＨＡＴ領域がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のｐ３００のＨＡＴ領域と少なくとも８０％の同一性を有する藻類由来のｐ３００ホモログのＨＡＴドメインに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１３に記載の系。
【請求項１５】
藻類において高レベルで遺伝子を発現させる方法であって、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及びＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、少なくとも１つのベクターで藻類を形質転換する工程、形質転換された藻類細胞を選抜する工程、及び
前記ＧＥＥ遺伝子又は前記導入遺伝子の藻類での発現を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ結合タンパク質がＬｅｘＡ結合ドメインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｐ３００がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＥＥ融合タンパク質が、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインに機能的に融合させたＬｅｘＡ結合ドメインを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記導入遺伝子がＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質又はＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質である、請求項に１７記載の方法。
【請求項２０】
まずＧＥＥ融合タンパク質を安定して発現しているベクターを選抜し、次に導入遺伝子を含むベクターを用いて選抜した藻類を形質転換する、別個のベクターにのせた前記ＧＥＥ融合タンパク質及び前記導入遺伝子を用いて藻類を形質転換する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６１／２５６，９２１号、名称「藻類での遺伝子発現の増強（ENHANCED GENE EXPRESSION IN ALGAE）」の優先権を主張し、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は分子生物学の分野、具体的には藻類での導入遺伝子の発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
導入遺伝子は、ゲノム、真核細胞の場合には染色体、に導入された外生のＤＮＡ配列である。これらの遺伝子は通常、宿主のその他の遺伝子と同様に転写される。転写は通常、染色体のＤＮＡを真核生物ではヌクレオソームと呼ばれている緊密な束にまとめる、クロマチン構造によって制御されている。特定の遺伝子の周囲にあるクロマチン構造がゆるむと、細胞の転写機構が、特定の遺伝子のＤＮＡに接近できるようになる。染色実験から、真核生物で活発に転写された遺伝子はヌクレオソーム内でよりルーズになっており、真性染色体となることが分かっている。いくつかの例では、導入遺伝子は宿主の染色体に組み込まれているが、クロマチン構造が適切でないために発現しない。この現象は「遺伝子サイレンシング」と呼ばれている。ヌクレオソームをどの程度密に束ねるかを制御する能力は、宿主細胞での導入遺伝子の発現を補助することができる。哺乳類の細胞では、ヒストン「尾部」に対する高い修飾能力をもつ遺伝子であるｐ３００（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ又は「ＨＡＴ」；ＣＲＥＢ結合タンパク質ファミリーの場合は「ＣＢＰ」としても知られる）を一緒に導入して発現させると、そのアセチルトランスフェラーゼ活性によってヒストンとＤＮＡの関係がよりルーズになり、転写因子が遺伝子に接近することができるようになることから、発現レベルが上昇すると提唱されてきた。T.H.J. Kwaks et al., J. Biotechnology, 115:35-46 (2005)。
【０００４】
微小藻類には広い範囲の生物、主に単細胞の水生生物が含まれる。単細胞の真核微小藻類（緑藻類、珪藻、及び褐藻類など）は光合成を行い、かつ、核、ミトコンドリア、及び葉緑体をもつ。藻類のクロマチン構造はその他の真核生物のものとは異なる。藻類のクロマチンが濃く染色されることは、これらのヌクレオソーム構造がより圧縮されていること、及びＤＮＡとヒストンの関係がより緊密であることを示している。特に緑藻類のクロマチン構造におけるこれらの違いは、遺伝子発現のヒストンクロマチン制御機構が異なることを示唆するものである。
【０００５】
真核微小藻類のクロマチン構造に見られるこれらの違いは、クロマチン介在性遺伝子サイレンシングにより、微小藻類の核に導入した遺伝子を安定に及び一過的に発現させることが難しいことの原因であると考えられる。H. Cerutti, A.M.J., N.W. Gillham, J.E. Boynton, Epigenetic silencing of a foreign gene in nuclear transformants of Chlamydomonas, The Plant Cell 9:925-945 (1997)。本発明者らが、哺乳類由来の抗アポトーシス遺伝子と蛍光レポーター遺伝子を藻類に導入した予備実験では、蛍光遺伝子の発現レベルが低いか、その発現は検出されなかった。このことにより、藻類で導入遺伝子を発現させることが難しいことを確認した。
【０００６】
藻類は健康のためにヒトが摂取する栄養源として、かつ、バイオ燃料のバイオマスとしても重要だと考えられている。遺伝子工学によって藻類に導入した遺伝子の発現を（複数世代にわたって）安定させることは有用な培養藻類の新しい展望を切り開き、価値と評価を強く高めるだろう。しかしながら上述したように、安定で十分に高いレベルで遺伝子を発現させることは難しかった。藻類での導入遺伝子の発現を改善させるための方法、及び発現を安定させる方法は非常に有用であると考えられる。そのような方法のためには、緑藻類を含む微小藻類の独特で強固なヒストン介在性遺伝子サイレンシングを明らかにすることが必要であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T.H.J. Kwaks et al., J. Biotechnology, 115:35-46 (2005)
【非特許文献２】H. Cerutti, A.M.J., N.W. Gillham, J.E. Boynton, Epigenetic silencing of a foreign gene in nuclear transformants of Chlamydomonas, The Plant Cell 9:925-945 (1997)
【発明の概要】
【０００８】
一実施形態において本発明は、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分が藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、
藻類に適した転写プロモーターの機能的下流にに配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及び
ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した、少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、
藻類での遺伝子発現を高めるための、藻類中にある系を提供する。
【０００９】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質はＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質のｐ３００部分はコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である。より好ましい実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質の一部分は、ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインのみから成る。ｐ３００又はｐ３００のＨＡＴドメインのみは、コナミドリムシに加え、緑藻類を含むその他の微小藻類のホモログ由来であってもよい。
【００１０】
別の実施形態では、藻類での発現を改善するために、導入遺伝子のコドンを変化させる。好ましい実施形態では、導入遺伝子又は目的の遺伝子（ＧＯＩ）は蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子である。融合タンパク質は蛍光−Ｂｃｌ−ｘL構築物（例えばＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合体又はＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合体）を含んでもよい。別の好ましい実施形態では、導入遺伝子がＹＦＰ／Ｖｅｎｕｓ遺伝子であり、融合タンパク質の一部分である必要はない。Ｖｅｎｕｓは広範囲のｐＨで安定で、素早く折りたたまれ、かつ、標準的なＹＦＰの３０倍の強度をもつ、改良された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K. and Miyawaki A. (2002).  A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnol, 20, 87-90.
【００１１】
別の実施形態においてこの系は、抗生物質耐性マーカーのような、少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む。好ましい実施形態では１つのベクター中に、ＧＥＥ融合タンパク質、少なくとも１つの導入遺伝子、及び２つのプロモーターを含む両方向性プロモーター領域を配置する。両方のプロモーターの近くにはＤＮＡ結合部位を配置し、ＧＥＥ融合タンパク質と少なくとも１つの導入遺伝子をどちらか一方のプロモーターから発現させるように構成して、このベクターを系に導入する。より好ましい実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質及び導入遺伝子を別個のベクターに入れて系に導入する。各ベクターは選択マーカーを含み、かつ、選択マーカーはそれぞれ異なる。別個のベクターにする場合、ＧＥＥベクターと目的遺伝子（ＧＯＩ）のベクターは選択マーカーを含む。ＧＥＥをＧＯＩのベクターとは別のベクターとして導入する場合、ＧＥＥベクターを、ＧＯＩを発現している２番目のベクターの受容株として役立つ、安定な藻類細胞株を生成するために使用してもよい。この安定なＧＥＥ藻類細胞株は、ＧＯＩを含む２番目のベクターの発現を高める機能をもつと考えられる。
【００１２】
一層さらに別の実施形態では、藻類に適した転写プロモーターはｈｓｐ７０、ｒｂｃＳ、ｎｉｔＡ、ａｃｔｉｎ、ｔｕｂＡ２又はその組み合わせである。
【００１３】
別のさらなる実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質は、そのＨＡＴ領域がコナミドリムシのｐ３００のＨＡＴ領域と少なくとも８０％の同一性をもつ、藻類由来ｐ３００ホモログに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましくはＧＥＥ融合タンパク質は、コナミドリムシ由来のｐ３００のＨＡＴ領域のＨＡＴドメインに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む。哺乳動物種由来のｐ３００は、コナミドリムシのｐ３００よりもかなりサイズが大きく、かつ、同一性が５０％未満であることに注意する。
【００１４】
本発明はまた、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及びＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、少なくとも１つのベクターで藻類を形質転換する工程、
形質転換された藻類細胞を選抜する工程、及び
前記ＧＥＥ遺伝子及び／又は前記導入遺伝子の藻類での発現を検出する工程を含む、藻類において高レベルで遺伝子を発現させる方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質はＬｅｘＡ結合ドメインであり、より好ましくは、ｐ３００はコナミドリムシ由来である。より一層好ましくはＧＥＥ融合タンパク質は、コナミドリムシ由来ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインに機能的に融合させたＬｅｘＡ結合ドメインを含む。
【００１６】
別の実施形態では、導入遺伝子はＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質又はＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質である。
【００１７】
一層さらに別の実施形態では、まずＧＥＥ融合タンパク質を安定して発現しているベクターを選抜し、次に導入遺伝子を含むベクターを用いて選抜した藻類を形質転換することにより、別個のベクターに入れたＧＥＥ融合タンパク質及び前記導入遺伝子で藻類を形質転換する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の一実施形態におけるベクターの特徴を示している。転写される方向を矢印で示す。この図は、本明細書の別の部分で議論した、特定の構造要素を示している。線状の図は、ベクターの対応する領域、すなわち、融合させたＬｅｘＡ−ｐ３００タンパク質のコード領域及びＧＯＩのコード領域の詳細を表している。この実施形態では、これら２つのコード領域はそれぞれ反対の方向に転写される（従って、「両方向性」と命名した）。これら２つのコード領域はＬｅｘＡ結合部位を含む遺伝子座によって分けられている。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の別の実施形態を示す。図２ＡはＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質を発現しているベクターである。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の別の実施形態を示す。図２Ｂは、藻類に導入することが望まれる別の遺伝子（「目的の遺伝子」又は「ＧＯＩ」）を発現しているベクターを示している。この実施形態では、ＬｅｘＡ−ｐ３００融合体及びＧＯＩはそれぞれ、その５’末端に又は５’末端付近にＬｅｘＡ結合部位を含む。
【図３】図３は、藻類（コナミドリムシ、Chlamydomonas reinhardtii）由来の推定ｐ３００タンパク質と、図に示した系統発生学的に代表的な種由来の既知のｐ３００タンパク質との比較を示す。それぞれの線の灰色に塗った部分は、ヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを表す。見やすくするためにＨＡＴドメインを整列させた。これらの灰色の部分に書いてある数字は、各タンパク質のＨＡＴドメインとの同一性パーセントを示している。各図のタンパク質中に記載されているパーセンテージは、コナミドリムシ由来のｐ３００タンパク質の、ｐ３００  ＨＡＴドメインと比較した場合の同一性を示す。この図は、ｐ３００タンパク質全体のサイズと、このタンパク質中に含まれるＨＡＴドメインの位置に基づいて書かれている。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
藻類で導入遺伝子を発現させることは困難である。H. Cerutti, A.M.J. et al., The Plant Cell 9:925-945 (1997)。同様に、本発明者らが癌抑制Ｂｃｌ−ｘL遺伝子に融合させた黄色蛍光タンパク質（「ＹＦＰ」）（この転写は、熱ショック転写エンハンサー（ＨＳＰ７０）に依存したｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（ｒｃｂＳ２）によって操作した）を用いて微小藻類を形質転換したところ、形質転換した微小藻類は蛍光を生産できなかった。しかしながら、わずかに長く生存した形質転換体は、（Ｂｃｌ−ｘL遺伝子が僅かに発現した結果）形態に影響を受けていたことが観察された。このことにより、藻類での導入遺伝子の発現が低いことは遺伝子サイレンシングによると推測された。
【００２０】
本発明は、藻類、好ましくは緑藻類、より好ましくは微小藻類、での導入遺伝子の発現を高めるために有効な方法を提供する。本発明の好ましい藻類は、単細胞の光合成藻類である。一層さらに好ましい藻類は微小藻類である。本発明を用いて藻類で発現させたＧＯＩ導入遺伝子の発現レベルはより高くなる。発現は、本発明の恩恵を受けることなく改変した、同じ導入遺伝子の藻類での発現と比較して、少なくとも５０％、好ましくは約２から５倍に上昇する。蛍光導入遺伝子に関しては、発現は蛍光シグナルを観察するのに十分な程度上昇する。より好ましくは、クラミドモナス中の蛍光シグナルを観察する。
【００２１】
導入遺伝子を藻類に導入する。本発明のある実施形態に従って、導入遺伝子をベクター上に配置する。ベクターは、ＤＮＡ配列を含むカセットを藻類の染色体に導入するために用いられる核酸構造である。ベクターは宿主藻類細胞の核に導入され、そして導入遺伝子は藻類の中で転写／翻訳される。藻類の形質転換方法は当業者に周知である。例えば、ベクター構築物をエレクトロポレーションを用いて、プラスミド接合により、及びパーティクルボンバードメントによって導入してもよい。形質転換した藻類を固形の栄養培地又は液体培地中で回復させる。Elizabeth H Harris, Chlamydomonas As A Model Organism, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52:363-406 (2001)及びEMBO Practical Course: Molecular Genetics of Chlamydomonas, Laboratory protocols. Geneva, September 18-28, 2006。
【００２２】
本発明の好ましいベクターは、目的のＤＮＡ配列を藻類の染色体に統合することができるプラスミドである。数多くのベクターが知られており、かつ、特徴付けられている。本発明の好ましいベクターはｐＳＰ１２４である。Lumbreras et al., Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous introns, The Plant Journal 14(4):441-447 (1998)。
【００２３】
ベクターの改変方法は当該分野において周知である。ベクター骨格は、宿主細胞がベクターによって形質転換されたことを示す、形質転換マーカーをコードしている遺伝子を含んでいてもよい。形質転換マーカーは、ベクターを含まない細胞と、ベクターを含む細胞を選択するために用いる選択マーカー遺伝子であってもよい。選択マーカーは当業者に周知である。一般的に用いられる選択マーカーには、ブレオマイシンのような、特定の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。ベクターを含む細胞だけが、抗生物質を含む培地上で生育できる。その他のベクター骨格はまた、単にどの細胞が形質転換されたかを示すマーカー遺伝子を含んでいてもよい。そのようなマーカーを用いる場合には、ベクターを含む細胞もベクターを含まない細胞も成長するが、ベクターを含む細胞はベクターによって付与される特定の特徴、例えば色を呈することにより、ベクターを含まない細胞から区別することができる。一般的に用いられる形質転換マーカー遺伝子は黄色又は緑色蛍光遺伝子である。そのような遺伝子を有するベクターを含む細胞は黄色又は緑色の蛍光を発する。その他の一般的な形質転換マーカーには、様々なルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子を含む細胞は発光する。
【００２４】
藻類の核で遺伝子を発現させるために有効な遺伝子発現制御機構の任意の組み合わせをベクター中に組み込むことができる。プラスミドは、異なる型のプロモーター、例えば構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含んでいてもよい。本発明に好ましい転写プロモーターには、ｈｓｐ７０（「熱ショックタンパク質」プロモーター）、ｒｂｃＳ（「ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット」プロモーター）及びｔｕｂＡ２（「アクチン」プロモーター）が挙げられる。ベクターは、通常は５’非翻訳領域又は「５’ＵＴＲ」と呼ばれる、好適な翻訳エンハンサーエレメントを含む。本発明の好ましいエンハンサーはｔｕｂＡ２イントロン１、ＨＳＰ７０エンハンサー、及びｒｃｂＳ２イントロン１である。本発明のベクターはまた、有効な翻訳終結因子である、３’ＵＴＲを含む。好ましい３’ＵＴＲ配列の例としては、ｔｕｂＡ２、ＨＳＰ７０、及びｒｃｂＳ２の３’ＵＴＲが挙げられる。その他の有効なプロモーター、転写エンハンサー及び終結因子は具体的には、十分に高く、かつ、安定は発現を生じる組み合わせであってもよい。
【００２５】
図１及び２に、これらの選択肢のいくつかを示す。例とした図１及び２で選択した特徴としては、コナミドリムシ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ領域、アクチン（チューブリン）をコードしているｔｕｂＡ２、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットをコードしているｒｂｃＳ２、又は硝酸塩レダクターゼをコードしているｎｉｔＡが挙げられる。さらに、ｈｓｐ７０Ａ／ｒｂｃＳ２のタンデムプロモーターが導入遺伝子の発現を誘導するために好ましい。Schroda M., Beck C.F. and Vallon A., Sequence elements within an hsp70 promoter counteract transcriptional transgene silencing in Chlamydomonas. Plant J. 31:445-455 (2002)。このキメラプロモーターは、核と細胞質に局在する７０ｋＤの熱ショックタンパク質遺伝子のエンハンサー領域（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：Ｍ７６７２５；５７２−８３３ｂｐ）及び、核ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット遺伝子のプロモーター（ＮＢＣＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：Ｘ０４４７２；９３４−１１４２ｂｐ）を含む。加えて、導入遺伝子の発現をより安定にするために、ｒｂｃＳ２遺伝子の１番目のイントロン（１３０７−１４５１ｂｐ）及び３’非翻訳領域（２４０１−２６３２ｂｐ）を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明のある実施形態では、目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）及び遺伝子サイレンシング阻害剤を含むカセットを、藻類、例えばコナミドリムシの核ＤＮＡに導入するために、１つ以上のベクターを用いる。ＧＯＩは藻類で発現することが望まれる任意の遺伝子であってよい。生存可能な目的の遺伝子には、藻類の代謝経路の制御に関与する遺伝子が含まれる。例えば、本発明の一実施形態では、Ｂｃｌ−ｘL遺伝子を挿入し、藻類の核で発現させることができる。Ｂｃｌ−ｘLはＢ細胞リンパ腫エクストラ−ラージの略語であり、アポトーシス（プログラム細胞死）の阻害剤として知られている。Boise L.H. et al., Bcl-x, a bcl-2-related Gene that Functions as a Dominant Regulator of Apoptotic Cell Death, Cell 74:597-608 (1993)。別の実施形態では、脂質又はイソプレノイドの生産経路に影響を及ぼす遺伝子を導入することが望まれる。アポトーシスを阻害するＢｃｌ−ｘLの能力により、その発現は藻類細胞をより長く生存させることを可能にする。微小藻類の寿命が長くなると、光バイオリアクターのような様々な産業的な応用に微小藻類を利用することが可能になる。
【００２７】
遺伝子サイレンシング阻害剤をもまた藻類に導入する。遺伝子サイレンシング阻害剤は、藻類の核の中にあるヌクレオソームの緩みを誘導するペプチドである。遺伝子サイレンシング阻害剤には、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）及び、ヌクレオソーム上のエレメントを修飾してクロマチン構造を緩ませ、転写因子が目的の遺伝子に近づくことを可能にするその他のペプチドが含まれる。ＨＡＴタンパク質並びにｐ３００及びその他のＨＡＴタンパク質のＨＡＴドメインはヒストンのアセチル化を引き起こすことが知られており、本発明に用いることができる。本発明では、アセチル化活性に関与するドメイン又はタンパク質全体を使用する。Fukuda H, et al., Brief Funct. Genomic Proteomic, 5(3):190-208 (2006); Renthal W. and Nestler E.J., Semin Cell Dev Biol. 20(4):387-94 (Epub 2009); 及びLin Y.Y. et al., Genes Dev., 22(15):2062-74 (2008)を参照のこと。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態では、遺伝子サイレンシング阻害剤として、ｐ３００タンパク質を使用する。より好ましくは、コナミドリムシ由来ｐ３００タンパク質を使用する。一層さらに好ましい実施形態では、コナミドリムシのｐ３００タンパク質は、図３で詳細を示したホモログである。さらにより好ましい実施形態では、コナミドリムシｐ３００遺伝子のＨＡＴドメインのみを用いる。図３及び配列番号４の対応する部分を参照のこと。
【００２９】
図３では、コナミドリムシのｐ３００と、系統発生学的に異なるその他のｐ３００ホモログのアライメントの比較を示す。それぞれの線の灰色の部分はヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを表す。見やすくするためにＨＡＴドメインを整列させた。これらの灰色の部分に含まれる数字は、それぞれのタンパク質のＨＡＴドメインの同一性パーセントを示している。各図のタンパク質中に記載されているパーセンテージは、コナミドリムシ由来のｐ３００タンパク質の、ｐ３００  ＨＡＴドメインと比較した場合の同一性を示す。図３は、ｐ３００タンパク質全体のサイズと、このタンパク質中に含まれるＨＡＴドメインの位置に基づいて書かれている。
【００３０】
表１に、ｐ３００タンパク質、特にＨＡＴドメインを高度に保存している生物の例を挙げる。
【表１】
2013509199.tif 000003
各カラムの一番上の欄に記載した生物種をそのクレードの代表とし、それを基準としてその他の生物における同一性パーセントを算出した。
【００３１】
実際、植物及び哺乳類のｐ３００ホモログ間の同一性パーセントもまた非常に高く、具体的には少なくとも約８０％である。米国特許公開第２００３／０１４５３４９号を参照のこと。しかしながら、コナミドリムシｐ３００ホモログとその他の生物との相同性はより低い。同様に、コナミドリムシｐ３００の完全長タンパク質はマウスｐ３００タンパク質と１１．５％が同一で、さらに９．９％が類似しており；ショウジョウバエｐ３００タンパク質とは９．１％が同一で、さらに４．７％が類似しており；及びシロイヌナズナｐ３００タンパク質とは２３．６％が同一で、さらに９．９％が類似している。コナミドリムシ由来のタンパク質はより短いＮ末端又はＣ末端領域をもち、かつ、ＨＡＴドメインの位置が、哺乳類又は植物のｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインとは異なっている。図３を参照のこと。このことは、タンパク質全体の異なる機能及び系統発生を示唆している。
【００３２】
図１及び本明細書の他の部分で記載した様々なｐ３００ホモログタンパク質は以下の通りである。
コナミドリムシ（C. reinhardtii）ｐ３００／ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１５９４６７７０３。
ボルボックス（V. carteri）ｐ３００／ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：３００２５６２６６。
ソルガム（S. bicolor）推定ｐ３００タンパク質、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＩＤ：Ｃ５ＸＴＺ４。
ポプラ（P. trichocarpa）Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースからのＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＰＯＰＴＲ＿００７ｓ１５０９０。
ダイズ（G. max）タンパク質、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースＩＤ：ＰＦ０２１３５。
シロイヌナズナ（A. thaliana）、ＨＡＣ１／ｐ３００／ＣＢＰ  ＮＣＢＩデータベースによるＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＭ＿１０６５５０．３。
イネ（O. sativa）ｐ３００／ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１０８７９２６５７。
ショウジョウバエ（D. melanogaster）ＣＢＰ／ＨＡＴ、ＮＣＢＩデータベースによるＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＭ＿０７９９０３．２。
ガンビエハマダラカ（A. gambiae）ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１５８２８９３９１。
フロリダマミズヨコエビ（C. floridanus）ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：３０７１７２９９０。
アカゲザル（M. musculus）Ｅ１Ａ／ＢＰ／ｐ３００、ＮＣＢＩデータベースよるＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＭ＿１７７８２１．６。
アナウサギ（O. cuniculus）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：２９１４１０３３４。
ラット（R. norvegicus）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＸＰ＿５７６３１２．３。
マウス（M. mulatta）ｐ３００ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＸＰ＿００１１０２８４４．１。
ヒト（H. sapiens）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＮＰ＿００１４２０．２。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態では、遺伝子サイレンシング阻害剤をＤＮＡ結合タンパク質又はそのドメインに機能的に連結させ、又は好ましくは融合させた（連結した／融合させたタンパク質又はその／それらの遺伝子をこれ以降遺伝子発現増強ユニット、又は「ＧＥＥ」と呼ぶ）。ＤＮＡ結合タンパク質又はドメインは特定のＤＮＡ配列（結合部位又は「ＢＳ」）に結合して遺伝子サイレンシング阻害剤を、ＢＳの近くの標的ヒストンに近づけ、それにより、その遺伝子の位置のヌクレオソームの緩みを誘導する。ヌクレオソームが緩むと、近くにあるＤＮＡ配列が転写因子に曝されてより活性に転写される。
【００３４】
好ましい実施形態では本発明は、特定のＤＮＡ配列に結合する藻類タンパク質の発現を必要とする。この配列は、藻類で発現させるために、任意のＧＯＩの上流を改変したものであってもよい。既知のＤＮＡ結合部位を含むタンパク質である可能性のある、ＤＮＡ結合タンパク質／ドメインを用いることができる。本発明で使用できる、タンパク質を標的とする特定のＤＮＡモチーフの例としては、Ｇａｌ４タンパク質及び初期増殖応答タンパク質１が挙げられる。これらタンパク質のＤＮＡ結合部位モチーフは既知である。同様に、これらの並びにＬｅｘＡタンパク質の結合ドメインが既知であり、かつ、完全長タンパク質の代わりに主に使用される。例えばYoung, K., Biol. Reprod., 58:302-311 (1998) 及び Joung, J. et al., Proc. Natnl. Acad. Sci., 97:7382-7 (2000)を参照のこと。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位（ＢＳ）は、５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’である。
【００３５】
ＬｅｘＡは好ましいＤＮＡ結合タンパク質の例である。ＬｅｘＡは細菌由来の遺伝子である。ＬｅｘＡタンパク質又は遺伝子は藻類では見つかっていない。従って、コナミドリムシのゲノムにはＬｅｘＡのＤＮＡ結合配列は含まれていないと考えられる。本発明におけるＬｅｘＡの機能は、特定のＤＮＡ配列（結合部位、「ＢＳ」）に結合することである。ＬｅｘＡ結合部位は多数の部生物の上流プロモーターに見られる。ＬｅｘＡのＢＳに共通の配列はＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧ、配列番号９である。ＬｅｘＡタンパク質の結合ドメインは既知であり、本発明の目的では、結合ドメインのみを用いることが好ましい。ＮＣＢＩデータベースでのタンパク質ＩＤは２２９３１１８、配列は、ＭＫＡＬＴＡＲＱＱＥＶＦＤＬＩＲＤＨＩＳＱＴＧＭＰＰＴＲＡＥＩＡＱＲＬＧＦＲＳＰＮＡＡＥＥＨＬＫＡＬＡＲＫＧＶＩＥＩＶＳＧＡＳＲＧＩＲＬＬＱＥＥＥＥＧＬＰＬＶＧＲＶＡＡＧＥＰＬＬＡＱＱＨＩＥＧＨＹＱＶＤＰＳＬＦＫＰＮＡＤＦＬＬＲＶＳＧＭＳＭＫＤＩＧＩＭＤＧＤＬＬＡＶＨＫＴＱＤＶＲＮＧＱＶＶＶＡＲＩＤＤＥＶＴＶＫＲＬＫＫＱＧＮＫＶＥＬＬＰＥＮＳＥＦＫＰＩＶＶＤＬＲＱＱＳＦＴＩＥＧＬＡＶＧＶＩＲＮＧＤＷＬＥＦＰＧＩＲＲＰＷＲＰＬＥＳＴＣＳＱＡＮＳＧＲＩＳＹＤＬ、である。
【００３６】
上述したように、ＤＮＡ結合タンパク質又はそのドメイン、好ましくはＬｅｘＡドメインを、ＤＮＡ結合ドメインを構成し、協調してヌクレオソームを緩ませることが可能なタンパク質に翻訳されるように構築する。任意のヌクレオソームを緩ませることができるタンパク質を用いることができる。好ましくは、上述したように、コナミドリムシｐ３００ドメインを用いる。
【００３７】
１つの作用機序に制限されないが、１つのパートナーがＤＮＡに結合し、その他が近傍のヒストンをアセチル化し、それにより、その場にあるＤＮＡとヒストンの結合が緩むと考えられている。そのため、ＤＮＡ結合ドメインとアセチル化ドメインが、互いに空間的に近くなるようにする任意の方法が好ましい。融合タンパク質がより好ましい。融合タンパク質中の２つのユニットの順番（Ｎ末端からの）は重要ではない。しかしながら、ｐ３００−ＬｅｘＡ結合ドメインの例では、ＬｅｘＡ結合ドメインが融合タンパク質のＮ末端になることが好ましい。「機能性」融合タンパク質を設計する。例としては、可撓性や方向性をもつようにする特定のリンカー領域、又はプライマー及び制限酵素部位のような遺伝子工学的特徴に対応する、単に「機能しない」タンパク質配列を戦略的に導入する。
【００３８】
好ましくは、ｐ３００−ＬｅｘＡ結合ドメイン融合タンパク質及びその遺伝子構築物を生成するように、ＧＥＥはｐ３００ペプチドホモログであってもよく、かつ、ＤＮＡ結合ドメインはＬｅｘＡ結合ドメインであってもよい。好ましくは、この融合タンパク質は藻類のｐ３００−ＬｅｘＡ結合ドメイン融合タンパク質である。より好ましくは、融合タンパク質はコナミドリムシのｐ３００−ＬｅｘＡ融合タンパク質である。あるいは、融合タンパク質は、コナミドリムシのｐ３００−ＬｅｘＡタンパク質から選択したドメインを含む。配列番号４を参照のこと。一層さらに好ましくは、融合タンパク質は、藻類で発現させた場合の発現量がより高くなるように、そのコドン使用頻度を核酸レベルで修飾したＬｅｘＡ配列を含む。好ましくは、遺伝子（ｐ３００）の一部分が、配列番号１及び配列番号３に示したように藻類由来の遺伝子である場合でも、ＧＥＥ融合タンパク質遺伝子全体を、藻類での好ましいコドン使用頻度に基づいて設計する。実際に、この系中の導入遺伝子（ＧＯＩ）及びその他の遺伝子は好ましくは、藻類でのコドン使用頻度に基づいて最適化する。
【００３９】
本発明では主に、その他の藻類ｐ３００ホモログ又はそれらのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを用いてもよいこと注意すべきである。しかしながら、これらの好ましいホモログは、コナミドリムシのｐ３００と少なくとも約６０％同一、好ましくは少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％又はそれ以上同一でなければならない。ボルボックス（V. carteri、藻類）由来のｐ３００ホモログが近年同定され、このＨＡＴドメインは、コナミドリムシのｐ３００と約８５％同一である。
【００４０】
ＬｅｘＡ−ｐ３００融合ＤＮＡ（配列番号１）は、ＬｅｘＡ結合ドメインと完全長コナミドリムシｐ３００配列を含む融合タンパク質（典型的なＧＥＥ）をコードしているヌクレオチド配列であり、全ての融合体を藻類で好ましいコドン使用頻度を反映して設計した。Ｋａｚｕｓａコドン使用頻度データベース（種ＩＤ：３０５５）から提供されたコナミドリムシの核でのコドン使用頻度の表に基づき、ＤＮＡ２０の遺伝子設計ソフトウェアを使用して変化させた。６９０番目のヌクレオチドまでの配列がＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインであり、７００番目のヌクレオチドから、コナミドリムシｐ３００の完全長配列が始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結され、この配列はＰｐｕＭＩ（９ｂｐ）のＤＮＡ制限部位を表す。ＮＣＢＩデータベースのタンパク質ＩＤ：２２９３１１８からのアミノ酸配列を使用して、ＬｅｘＡ遺伝子配列をコナミドリムシの核で発現させるためにコドン最適化する。
1 ATGAAGGCTCTGACCGCTCGCCAGCAGGAGGTGTTTGATCTGATTCGGGA 
51 CCATATCAGCCAAACGGGCATGCCCCCTACGCGCGCGGAGATCGCGCAAC 
101 GGCTGGGCTTCCGCTCCCCGAACGCGGCTGAGGAGCACCTGAAGGCGCTG 
151 GCGCGCAAGGGTGTGATTGAGATCGTCTCCGGCGCGTCGCGGGGCATTCG 
201 GCTGCTGCAGGAGGAGGAGGAGGGTCTGCCTCTGGTGGGGCGGGTGGCTG 
251 CGGGCGAGCCCCTGCTGGCCCAGCAGCACATTGAGGGCCACTACCAAGTG 
301 GACCCGTCCCTCTTCAAGCCGAACGCCGATTTCCTGCTGCGCGTCAGCGG 
351 TATGAGCATGAAGGACATCGGCATCATGGACGGTGACCTGCTGGCCGTGC 
401 ATAAGACGCAGGACGTGCGCAACGGCCAAGTGGTCGTCGCCCGCATCGAT 
451 GACGAGGTGACCGTGAAGCGCCTGAAGAAGCAGGGGAACAAGGTCGAGCT 
501 GCTGCCCGAGAACAGCGAGTTCAAGCCCATCGTGGTGGATCTGCGCCAGC 
551 AATCCTTCACCATCGAGGGCCTGGCGGTGGGCGTGATCCGCAACGGCGAC 
601 TGGCTGGAGTTCCCGGGCATCCGCCGCCCGTGGCGCCCTCTGGAGTCCAC 
651 GTGCTCGCAGGCCAACTCCGGCCGCATTAGCTACGACCTGGGGGTCCTTA 
701 TGGTGCCGATGGGCGCGCCCGCTATGCCCATGGGCAACAACGGCTCGCCC 
751 ATGCTGAACGGCATGGGTATGTTCAACGCCCCGCAGCAGACCGTGCCCAA 
801 CGGCGGGCCGGGTGGCGTGAACCCCATGGGCCAGGTGCCGGCGATGCCTG 
851 CGCCGATCCCCAACGGCGGTCTGCCCGGTATGAACGCTGCCGGCGGTGCC 
901 GACGATCCTGCGAAGCAGCGGGAGCAATCGATCCAGAAGCAGCAGCGCTG 
951 GCTGCTGTTCCTGCGGCACTGCGCGAAGTGCCGGGCTCCCGGCGAGGACT 
1001 GCCAGCTGAAGTCCCAGTGCAAGTTCGGCAAGCAGCTGTGGCAGCACATC 
1051 CTGTCGTGCCAAAACCCGGCCTGCGAGTACCCGCGCTGCACCAACTCCAA 
1101 GGATCTGCTCAAGCACCACCAGAAGTGCCAGGAGCAGACCTGCCCCGTGT 
1151 GCATGCCGGTGAAGGACTACGTGAAGAAGACGCGCCAGGCGACCCAACAG 
1201 CAGCAACAAATGCAGCAACAACAGCAAATCCAGCAACAGCAACAACAACA 
1251 AATGCAACAGCAACAGATGCAACAGCAGCAGCTCCAGCAGCAGCAGATGC 
1301 AACAACAACAGCAGATGCAGCAGCAGCAACAGCCCGGCGTGGGCGCCAAC 
1351 TTCATGCCCACCCCGCCCATGATGCCGAACGGCATGTTCCCTCAACAGCA 
1401 GCCCCAGCAGGCGATGCGCCTGAACGCCAACGGCCTCGGCGGCCAGAAGC 
1451 GCCCCCACGAGATGATGGGTATGTCCAGCGGCGGCATGGACGGTATGAAC 
1501 CAGATGGTGCCCGTCGGCGGCGGCGGCATGGGCATGTCGATGCCGATGGG 
1551 TATGAACAACCCCATGCAGGGCGGTATGCCCCTGCAGCCTCCGCCCCAGG 
1601 TGCAGGCTCCCGGTCAGGGCCCCATGATGAGCGCCCCTCAGCAGCAACAG 
1651 CAGCAACCGGCCCCTAAGCGGGCGAAGACCGACGATGTGCTGCGCCAGAA 
1701 CACGGGCACCAGCCTCCTGGAGACGTTCGACGCCAAGCAGATCCGCGTGC 
1751 ACGTGGACCTGATCCGCGCTGCCGCGGTGACCCAGAAGGCCCAGCAGCCT 
1801 CCCCCGGCTAACCCCGACGACGCGTGCAAGGTCTGCGCGCTGACGAAGCT 
1851 GTCGTTCGAGCCCCCGGTGATTTACTGCTCGAGCTGCGGCCTGCGCATCA 
1901 AGCGCGGCCAGATCTTCTACAGCACGCCTCCGGACCACGGCAACGACCTG 
1951 AAGGGTTACTTCTGCCACCAGTGCTTCACCGACCAGAAGGGCGAGCGCAT 
2001 CCTGGTGGAGGGCGTCTCGATCAAGAAGAGCGACCTGGTGAAGCGCAAGA 
2051 ACGATGAGGAGATCGAGGAGGGGTGGGTGCAGTGCGACCACTGCGAGGGC 
2101 TGGGTGCACCAGATTTGCGGCATGTTCAACAAGGGCCGGAACAACACGGA 
2151 CGTCCACTACCTGTGCCCTGACTGCCTGGCCGTGGGCTACGAGCGCGGCC 
2201 AGCGCCAGAAGACGGAGGTCCGCCCCCAGGCGATGCTCGAGGCGAAGGAT 
2251 CTGCCCACGTCCCGGCTGTCCGAGTTTATTACGGAGCGCCTGAACCGCGA 
2301 GCTGGAGAAGGAGCACCACAAGCGGGCTGAGCAGCAGGGCAAGCCGCTGC 
2351 ACGAGGTGGCGAAGCCCGAGCCCCTGACCGTGCGGATGATCAACTCCGTG 
2401 ATGAAGAAGTGCGAGGTCAAGCCGCGCTTCCACGAGACGTTCGGCCCCAC 
2451 CGACGGCTACCCCGGGGAGTTCGGCTACCGGCAGAAGGTGCTGCTGCTGT 
2501 TCCAAAGCCTGGACGGTGTCGACGTGTGCCTGTTCTGCATGTACGTGCAG 
2551 GAGTACGGCAAGGACTGCCCTGCGCCCAACACCAACGTGGTGTACCTGTC 
2601 GTATCTGGACTCCGTCAAGTACTTCCGCCCTGAGATTCCCTCGGCCCTGG 
2651 GCCCTGCCGTGTCGCTGCGCACCTTCGTGTACCACCAACTCCTGATCGCC 
2701 TACGTGGAGTTTACCCGCAACATGGGTTTTGAGCAGATGTACATTTGGGC 
2751 GTGCCCGCCGATGCAAGGCGACGACTACATCCTGTACTGCCACCCGACCA 
2801 AGCAGAAGACGCCGCGCTCGGACCGCCTGCGCATGTGGTACATTGAGATG 
2851 CTGAAGCTGGCGAAGGAGGAGGGTATCGTGAAGCACCTGAGCACGCTGTG 
2901 GGATACGTACTTCGAGGGCGGTCGCGACCACCGGATGGAGCGCTGCTCGG 
2951 TCACGTACATTCCGTACATGGAGGGCGACTACTGGCCCGGCGAGGCTGAG 
3001 AACCAGCTCATGGCCATTAACGACGCGGCCAAGGGCAAGCCTGGGACCAA 
3051 GGGTGCGGGCAGCGCCCCGAGCCGCAAGGCCGGTGCCAAGGGCAAGCGCT 
3101 ACGGCGGTGGCCCCGCCACGGCTGATGAGCAGCTGATGGCCCGCCTCGGT 
3151 GAGATCCTGGGCGGGAACATGCGGGAGGACTTCATTGTGGTCCACATGCA 
3201 GGTGCCCTGCACGTTCTGCCGCGCTCACATTCGGGGTCCGAACGTGGTGT 
3251 ACCGCTATCGGACGCCGCCTGGCGCGACCCCTCCCAAGGCTGCCCCCGAG 
3301 CGCAAGTTCGAGGGCATCAAGCTGGAGGGCGGTGGCCCCAGCGTGCCCGT 
3351 GGGCACCGTCTCGAGCCTGACGATCTGCGAGGCGTGCTTTCGCGACGAGG 
3401 AGACGCGCACGCTGACCGGCCAACAGCTGCGCCTGCCCGCTGGCGTGTCG 
3451 ACCGCTGAGCTCGCGATGGAGAAGCTGGAGGAGATGATCCAGTGGGACCG 
3501 CGACCCTGACGGCGACATGGAGAGCGAGTTCTTCGAGACGCGGCAGACCT 
3551 TCCTGTCGCTGTGCCAGGGCAACCACTACCAGTTCGACACCCTCCGCCGC 
3601 GCTAAGCACTCGTCGATGATGGTGCTCTACCACCTGCACAACCCCCACTC 
3651 GCCGGCGTTCGCGTCCTCGTGCAACCAGTGCAACGCCGAGATCGAGCCGG 
3701 GCAGCGGCTTTCGCTGCACCGTGTGCCCCGACTTCGACATGTGCGCCAGC 
3751 TGCAAGGTCAACCCTCATAAGCGCGCCCTGGACGAGACGCGCCAGCGGCT 
3801 GACCGAGGCCGAGCGCCGGGAGCGCAACGAGCAGCTGCAGAAGACCCTCG 
3851 CCCTGCTGGTGCACGCCTGCGGCTGCCACAACAGCGCGTGCGGCTCCAAC 
3901 AGCTGCCGCAAGGTGAAGCAGCTGTTCCAGCACGCGGTCCACTGCCAGAG 
3951 CAAGGTGACCGGGGGCTGCCAGCTGTGCAAGAAGATGTGGTGCCTGCTGA 
4001 ACCTGCACGCCAAGTCCTGCACCCGCGCGGACTGCCCGGTGCCGCGCTGC 
4051 AAGGAGCTGAAGGAGCTGCGCCGGCGCCAAACGAACCGGCAGGAGGAGAA 
4101 GCGCCGGGCGGCCTACGCCGCTATGCTGCGCAACCAGATGGCCGGCAGCC 
4151 AGGCTCCGCGCCCCATGTAA  SEQ ID NO 1.
【００４１】
ＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質（配列番号２）は、配列番号１によってコードされる核酸配列に対応するタンパク質の配列である。２３０個のアミノ酸を含み、２３０番目のアミノ酸までの配列がＬｅｘＡ結合ドメインである。完全長ｐ３００ＨＡＴドメイン配列は２３４番目のアミノ酸から始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結され、この配列はＰｐｕＭＩ（９ｂｐ）のＤＮＡ制限部位を表す。
1 MKALTARQQEVFDLIRDHISQTGMPPTRAEIAQRLGFRSPNAAEEHLKAL
51 ARKGVIEIVSGASRGIRLLQEEEEGLPLVGRVAAGEPLLAQQHIEGHYQV
101 DPSLFKPNADFLLRVSGMSMKDIGIMDGDLLAVHKTQDVRNGQVVVARID
151 DEVTVKRLKKQGNKVELLPENSEFKPIVVDLRQQSFTIEGLAVGVIRNGD
201 WLEFPGIRRPWRPLESTCSQANSGRISYDLGVLMVPMGAPAMPMGNNGSP
251 MLNGMGMFNAPQQTVPNGGPGGVNPMGQVPAMPAPIPNGGLPGMNAAGGA
301 DDPAKQREQSIQKQQRWLLFLRHCAKCRAPGEDCQLKSQCKFGKQLWQHI
351 LSCQNPACEYPRCTNSKDLLKHHQKCQEQTCPVCMPVKDYVKKTRQATQQ
401 QQQMQQQQQIQQQQQQQMQQQQMQQQQLQQQQMQQQQQMQQQQQPGVGAN
451 FMPTPPMMPNGMFPQQQPQQAMRLNANGLGGQKRPHEMMGMSSGGMDGMN
501 QMVPVGGGGMGMSMPMGMNNPMQGGMPLQPPPQVQAPGQGPMMSAPQQQQ
551 QQPAPKRAKTDDVLRQNTGTSLLETFDAKQIRVHVDLIRAAAVTQKAQQP
601 PPANPDDACKVCALTKLSFEPPVIYCSSCGLRIKRGQIFYSTPPDHGNDL
651 KGYFCHQCFTDQKGERILVEGVSIKKSDLVKRKNDEEIEEGWVQCDHCEG
701 WVHQICGMFNKGRNNTDVHYLCPDCLAVGYERGQRQKTEVRPQAMLEAKD
751 LPTSRLSEFITERLNRELEKEHHKRAEQQGKPLHEVAKPEPLTVRMINSV
801 MKKCEVKPRFHETFGPTDGYPGEFGYRQKVLLLFQSLDGVDVCLFCMYVQ
851 EYGKDCPAPNTNVVYLSYLDSVKYFRPEIPSALGPAVSLRTFVYHQLLIA
901 YVEFTRNMGFEQMYIWACPPMQGDDYILYCHPTKQKTPRSDRLRMWYIEM
951 LKLAKEEGIVKHLSTLWDTYFEGGRDHRMERCSVTYIPYMEGDYWPGEAE
1001 NQLMAINDAAKGKPGTKGAGSAPSRKAGAKGKRYGGGPATADEQLMARLG
1051 EILGGNMREDFIVVHMQVPCTFCRAHIRGPNVVYRYRTPPGATPPKAAPE
1101 RKFEGIKLEGGGPSVPVGTVSSLTICEACFRDEETRTLTGQQLRLPAGVS
1151 TAELAMEKLEEMIQWDRDPDGDMESEFFETRQTFLSLCQGNHYQFDTLRR
1201 AKHSSMMVLYHLHNPHSPAFASSCNQCNAEIEPGSGFRCTVCPDFDMCAS
1251 CKVNPHKRALDETRQRLTEAERRERNEQLQKTLALLVHACGCHNSACGSN
1301 SCRKVKQLFQHAVHCQSKVTGGCQLCKKMWCLLNLHAKSCTRADCPVPRC
1351 KELKELRRRQTNRQEEKRRAAYAAMLRNQMAGSQAPRPM* SEQ ID NO 2.
【００４２】
ＬｅｘＡ−ｐ３００ＨＡＴドメインＤＮＡ（配列番号３）は、コナミドリムシｐ３００タンパク質のＬｅｘＡ結合ドメイン−アセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインをコードしている遺伝子に対応する核酸配列である。同様に、ＬｅｘＡ結合ドメインは６９０個のヌクレオチドを含む６９０番目のヌクレオチドまでの配列であり、ｐ３００ＨＡＴドメイン配列は７００番目のヌクレオチドから始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結され、この配列はＰｐｕＭＩ（９ｂｐ）のＤＮＡ制限部位を表す。
1 ATGAAGGCTCTCACCGCTCGCCAACAGGAGGTCTTTGATCTGATTCGCGA 
51 CCACATCTCGCAGACCGGCATGCCGCCGACCCGGGCGGAGATTGCTCAGC 
101 GGCTGGGCTTCCGGAGCCCCAACGCGGCCGAGGAGCACCTGAAGGCCCTC 
151 GCGCGCAAGGGGGTGATCGAGATTGTCTCCGGCGCTAGCCGCGGCATCCG 
201 CCTGCTGCAGGAGGAGGAGGAGGGCCTGCCGCTGGTCGGGCGGGTCGCGG 
251 CCGGGGAGCCTCTGCTGGCCCAGCAGCACATCGAGGGCCACTACCAAGTG 
301 GACCCCTCGCTGTTTAAGCCCAACGCGGACTTCCTGCTCCGGGTGTCGGG 
351 CATGAGCATGAAGGACATCGGCATCATGGACGGCGACCTCCTGGCGGTGC 
401 ACAAGACCCAGGACGTGCGCAACGGCCAGGTGGTCGTCGCGCGGATTGAC 
451 GACGAGGTGACCGTGAAGCGGCTGAAGAAGCAGGGCAACAAGGTCGAGCT 
501 GCTGCCCGAGAACTCGGAGTTCAAGCCTATCGTGGTCGACCTGCGCCAGC 
551 AGTCCTTCACCATCGAGGGCCTGGCCGTGGGGGTCATCCGCAACGGTGAC 
601 TGGCTGGAGTTCCCCGGCATCCGGCGCCCGTGGCGGCCGCTGGAGTCCAC 
651 CTGCAGCCAGGCGAACTCCGGCCGCATCTCCTACGATCTGGGGGTCCTTG 
701 AGGTGGCCAAGCCGGAGCCGCTGACCGTGCGGATGATCAACAGCGTGATG 
751 AAGAAGTGCGAGGTCAAGCCCCGCTTCCACGAGACGTTCGGTCCGACCGA 
801 CGGTTACCCCGGGGAGTTCGGCTACCGGCAGAAGGTGCTCCTCCTGTTCC 
851 AGTCCCTCGACGGCGTCGACGTGTGCCTGTTCTGCATGTACGTGCAGGAG 
901 TACGGGAAGGACTGCCCGGCGCCCAACACGAACGTGGTGTACCTGAGCTA 
951 CCTGGACTCCGTCAAGTATTTCCGCCCCGAGATTCCCAGCGCCCTGGGCC 
1001 CTGCGGTGAGCCTGCGGACCTTCGTGTACCACCAGCTCCTGATTGCGTAC 
1051 GTGGAGTTCACGCGCAACATGGGCTTCGAGCAGATGTACATTTGGGCGTG 
1101 CCCCCCCATGCAGGGGGACGACTATATCCTGTATTGCCATCCCACGAAGC 
1151 AGAAGACCCCGCGCTCGGACCGCCTGCGCATGTGGTACATCGAGATGCTG 
1201 AAGCTGGCTAAGGAGGAGGGCATCGTGAAGCACCTGTCGACGCTGTGGGA 
1251 CACCTACTTCGAGGGCGGTCGCGACCACCGGATGGAGCGCTGCAGCGTGA 
1301 CCTACATCCCCTACATGGAGGGCGACTACTGGCCTGGCGAGGCCGAGTAA SEQ ID NO 3.
【００４３】
ＬｅｘＡ−ｐ３００ＨＡＴドメインＡＡ（配列番号４）は、ＬｅｘＡ結合ドメイン−コナミドリムシｐ３００タンパク質の典型的なＧＥＥタンパク質配列であり、ここでは、コナミドリムシｐ３００はコナミドリムシｐ３００酵素のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインに限定されている。２３０個のアミノ酸を含む２３０番目のアミノ酸までの配列がＬｅｘＡ結合ドメインである。ｐ３００ＨＡＴドメイン配列は２３４番目のアミノ酸から始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結している。
1 MKALTARQQEVFDLIRDHISQTGMPPTRAEIAQRLGFRSPNAAEEHLKAL
51 ARKGVIEIVSGASRGIRLLQEEEEGLPLVGRVAAGEPLLAQQHIEGHYQV
101 DPSLFKPNADFLLRVSGMSMKDIGIMDGDLLAVHKTQDVRNGQVVVARID
151 DEVTVKRLKKQGNKVELLPENSEFKPIVVDLRQQSFTIEGLAVGVIRNGD
201 WLEFPGIRRPWRPLESTCSQANSGRISYDLGVLEVAKPEPLTVRMINSVM
251 KKCEVKPRFHETFGPTDGYPGEFGYRQKVLLLFQSLDGVDVCLFCMYVQE
301 YGKDCPAPNTNVVYLSYLDSVKYFRPEIPSALGPAVSLRTFVYHQLLIAY
351 VEFTRNMGFEQMYIWACPPMQGDDYILYCHPTKQKTPRSDRLRMWYIEML
401 KLAKEEGIVKHLSTLWDTYFEGGRDHRMERCSVTYIPYMEGDYWPGEAE* SEQ ID NO 4.
【００４４】
コドン最適化したＶｅｎｕｓ遺伝子配列が好ましい実施形態である。
1  ATGGTGTCGAAGGGTGAGGAGCTGTTTACCGGTGTCGTGCCTATTCTGGT 
51 GGAGCTCGACGGCGACGTCAACGGGCACAAGTTTTCGGTGTCCGGCGAGG 
101 GTGAGGGGGACGCGACGTACGGCAAGCTCACGCTGAAGCTGATCTGCACC 
151 ACCGGCAAGCTGCCCGTCCCCTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGGGCTA 
201 CGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCGGACCACATGAAGCAGCACGACT 
251 TCTTCAAGTCGGCCATGCCCGAGGGGTACGTGCAGGAGCGCACGATCTTC 
301 TTTAAGGACGATGGCAACTACAAGACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGG 
351 CGATACGCTGGTGAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG 
401 ACGGCAACATCCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAAC 
451 GTGTACATCACGGCGGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTTAA 
501 GATTCGCCATAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC 
551 AGCAGAACACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGATAACCAC 
601 TACCTCAGCTACCAGTCGGCCCTGTCCAAGGATCCCAACGAGAAGCGCGA 
651 TCACATGGTCCTCCTGGAGTTCGTGACCGCCGCTGGCATCACCCTGGGCA 
701 TGGACGAGCTGTACAAGTAA SEQ ID NO 5.
【００４５】
配列番号６は、配列番号５の核酸によってコードされているタンパク質である。Ｖｅｎｕｓのアミノ酸配列。
1 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICT
51 TGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIF
101 FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHN
151 VYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
201 YLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*  SEQ ID NO 6.
【００４６】
配列番号７は、本発明のＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合体をコードしている核酸である。これは藻類での好ましいコドン使用頻度に基づいて設計した。７１７番目のヌクレオチド配列がＶｅｎｕｓを表す。ＶｅｎｕｓとＢｃｌ−ｘLは３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結し、この配列はＰｐｕＭＩのＤＮＡ制限部位（９ｂｐ）を表す。Ｂｃｌ−ｘLは７２６番目のヌクレオチドから始まる。
1 ATGGTGTCGAAGGGTGAGGAGCTGTTTACCGGTGTCGTGCCTATTCTGGT 
51 GGAGCTCGACGGCGACGTCAACGGGCACAAGTTTTCGGTGTCCGGCGAGG 
101 GTGAGGGGGACGCGACGTACGGCAAGCTCACGCTGAAGCTGATCTGCACC 
151 ACCGGCAAGCTGCCCGTCCCCTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGGGCTA 
201 CGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCGGACCACATGAAGCAGCACGACT 
251 TCTTCAAGTCGGCCATGCCCGAGGGGTACGTGCAGGAGCGCACGATCTTC 
301 TTTAAGGACGATGGCAACTACAAGACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGG 
351 CGATACGCTGGTGAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG 
401 ACGGCAACATCCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAAC 
451 GTGTACATCACGGCGGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTTAA 
501 GATTCGCCATAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC 
551 AGCAGAACACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGATAACCAC 
601 TACCTCAGCTACCAGTCGGCCCTGTCCAAGGATCCCAACGAGAAGCGCGA 
651 TCACATGGTCCTCCTGGAGTTCGTGACCGCCGCTGGCATCACCCTGGGCA 
701 TGGACGAGCTGTACAAGGGGGTCCTTATGAGCCAGAGCAACCGGGAGCTG 
751 GTGGTGGACTTCCTGAGCTACAAGCTGAGCCAAAAGGGCTATAGCTGGTC 
801 GCAGTTCTCCGACGTCGAGGAGAACCGGACCGAGGCCCCCGAGGGGACCG 
851 AGTCCGAGATGGAGACGCCGAGCGCGATTAACGGCAACCCGAGCTGGCAC 
901 CTGGCGGACTCCCCTGCCGTGAACGGCGCGACCGGCCACAGCTCCAGCCT 
951 GGACGCGCGCGAGGTCATCCCGATGGCGGCCGTGAAGCAGGCCCTCCGCG 
1001 AGGCCGGCGACGAGTTCGAGCTGCGCTATCGCCGCGCTTTCTCGGACCTG 
1051 ACCAGCCAGCTGCACATCACCCCCGGCACGGCTTACCAAAGCTTCGAGCA 
1101 GGTGGTGAACGAGCTGTTCCGCGACGGCGTGAACTGGGGTCGCATCGTGG 
1151 CGTTCTTCAGCTTCGGCGGTGCGCTGTGCGTGGAGAGCGTCGACAAGGAG 
1201 ATGCAGGTGCTGGTGTCGCGCATTGCGGCTTGGATGGCCACCTACCTGAA 
1251 CGACCACCTGGAGCCCTGGATTCAGGAGAACGGCGGCTGGGACACCTTCG 
1301 TCGAGCTGTACGGCAACAACGCTGCGGCGGAGAGCCGCAAGGGCCAAGAG 
1351 CGGTTCAACCGCTGGTTCCTCACGGGGATGACCGTGGCGGGCGTCGTCCT 
1401 GCTGGGCAGCCTGTTCTCGCGGAAGTAA   SEQ ID NO 7.
【００４７】
Ｖｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘLタンパク質（配列番号８）は、配列番号７の核酸によってコードされされている融合タンパク質である。後半のＢｃｌ−ｘLタンパク質配列（２３３ＡＡ）は、ＮＣＢＩデータベースからのＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：２０３３６３３４のＤＮＡ配列によってコードされている。
1 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICT
51 TGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIF
101 FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHN
151 VYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
201 YLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGVLMSQSNREL
251 VVDFLSYKLSQKGYSWSQFSDVEENRTEAPEGTESEMETPSAINGNPSWH
301 LADSPAVNGATGHSSSLDAREVIPMAAVKQALREAGDEFELRYRRAFSDL
351 TSQLHITPGTAYQSFEQVVNELFRDGVNWGRIVAFFSFGGALCVESVDKE
401 MQVLVSRIAAWMATYLNDHLEPWIQENGGWDTFVELYGNNAAAESRKGQE
451 RFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK*  SEQ ID NO 8.
【実施例】
【００４８】
実施例１
本発明の代表的なベクター
【００４９】
本発明の構築物を図１に示す。基にしたベクターはｐＳＰ１２４である。V. Lumbreras, D.R.S. and S. Purton, Plant J., 14(4):441-447 (1998)を参照のこと。ベクターの特徴を図１にあげた。すなわち、図１に示した２つの領域は、ｐＳＰ１２４のベクター骨格の一部である。
【００５０】
周知の技術により、それぞれの合成ＤＮＡ断片を制限酵素部位を介して連結し、非ｐＳＰ１２４配列を好ましく改変する。別の方法、及び方法を組み合わせて用いることも可能である。例えば、いくつかの特徴をＰＣＲ産物として、又はその他に使用可能な構築物からの「切り貼り」で導入してもよい。通常、得られたベクターを確認するために、配列決定及び／又はその他のアッセイ（例えばサイズ解析、ハイブリダイゼーション）を行う。
【００５１】
一例として、ＢａｍＨＩを含み、ＥｃｏＲＩで終わる領域を合成することより、挿入断片の一部分を作出する（「合成＿１」）。この領域には、転写エンハンサー領域、２つのＬｅｘＡ結合モチーフ、ｒｕｂｉｓｃｏ転写プロモーター（ｒｂｃＳ２の最初のイントロンを含む）、ＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質、及びｒｕｂｉｓｃｏの３’ＵＴＲが含まれる。この例では、ＹＦＰ及びＢｃｌ−ｘLのコード領域を藻類で好ましいコドン使用頻度に基づいて設計した。
【００５２】
組み込む別の領域を高忠実度ＰＣＲで準備し、ｐ３００（ＨＡＴ）遺伝子（「ゲノムＰＣＲ」）を効果的に提供する。ゲノムＰＣＲ断片に隣接した２ｔの領域を、合成ＤＮＡによりさらに準備する（「合成＿２」）。ｐ３００遺伝子の上流の転写領域には、転写プロモーターとその下流にＬｅｘＡ結合ドメインコード配列、及び２つのＬｅｘＡ結合部位が含まれる。合成＿２領域には３’ＵＴＲが含まれる。合成＿２とゲノム領域は合わせて、ＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質（ＧＥＥ）をコードしている転写ユニットの全長を生成する。
【００５３】
図１及びこれらの説明は効果的に、本発明の構築物の特徴の例を提供し、かつ、藻類に適したプラスミド中に特徴を加える方法を説明する。２つの転写単位は反対の方向に転写されるように配置され、それぞれは２つのＬｅｘＡ結合部位を有し、これによってＬｅｘＡ−ｐ３００が４つの部位のいずれかに結合する機会を作り出し、転写ユニットのいずれかの転写レベルに影響を及ぼす。３番目の転写ユニットは選択マーカーであるブレオマイシン耐性を提供する。
【００５４】
このベクターの作出の根底にある概念、すなわち、ＤＮＡ−ＢＳの近傍に配置した遺伝子の発現レベルをＢＳを認識／結合するＧＥＥの存在下で効果的に上昇させること、を変化させることなく、ベクター中に発現のためのさらなる又は異なる遺伝子、遺伝子発現を制御するための異なる特徴、及びその他の制限部位を組み込むこと、並びにＬｅｘＡ−ＢＳの数を変えることなどの、その他の設計法が利用可能であることが当業者には明かだろう。
【００５５】
実施例２
別の代表的なベクター
【００５６】
大部分は同一だが、ＧＥＥユニットの有無が異なる２つのベクターを構築する。これらのベクターは互いに他の点では同じであり、かつ、図２Ａのベクターと同様である。これらのベクターを同時に使用することにより、他の点は同一の遺伝的バックグラウンドでの、ｐ３００の活性及びＬｅｘＡの役割を試験することができる。２つのベクターを使用することで、例えばその他の遺伝子の付加、さらに複数コピーのＧＥＥの付加などのさらなる改変によるＧＥＥ活性の変化を試験することもまた可能である。
【００５７】
特に、「ＬｅｘＡ  ＢＳ」には結合部位の数になんの制限もない。１つのＢＳから多くのＢＳにしても指定した位置に配置することができる。経験的には、過剰な部位による効果は期待できないことから、約８ＢＳより多いＢＳの使用は好ましくない。好ましくは、約２−６のＢＳを領域に又は発現することが期待される遺伝子の５’末端に配置し、より好ましくは２−４ＢＳである。
【００５８】
実施例３
両方向性プロモーターを用いたＧＥＥの効果の特徴付け
【００５９】
実験１。ＧＯＩの位置にＹＦＰレポーターをもつ両方向性構築物、及び２つの内の１つのＧＥＥ構築物の変異体（１）ＬｅｘＡ−ｐ３００キメラ遺伝子は反対の方向に転写される（図１）又は（２）ＬｅｘＡのみが反対の方向に転写され対照となる、を使用する。
【００６０】
２つの構築物で藻類を形質転換し、適切な抗生物質を含む選択培地（例えばブレオマイシンを含む培地）上で選抜した。選抜した後、各構築物による形質転換体から１００個のコロニーを選択し、ｒｔＰＣＲによるｍＲＮＡ発現、ウェスタンブロットによるタンパク質の発現、並びにフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡による単一の細胞での蛍光を試験することにより、ＹＦＰ導入遺伝子の発現を解析する。クローン集団を２、４、６及び１０世代継代する。高レベルでＹＦＰを発現しているクローンの頻度を、ＬｅｘＡ−ｐ３００及びＬｅｘＡのみで比較する。ＬｅｘＡ−ｐ３００ＧＥＥでは、核に導入した遺伝子の発現が上昇し、時間が経過しても高レベルの発現が維持される。
【００６１】
実施例４
別個のプラスミドを用いたＧＥＥの効果の特徴付け
【００６２】
２セットの安定なクローンを作出する。１セット目は、ＬｅｘＡ−ｐ３００融合体（図２Ａ）をコードしている導入遺伝子を組み込んだ安定な細胞株で、これを次にＹＦＰベクター（図２Ｂ）を発現しているプラスミドで形質転換する。２セット目はＬｅｘＡのみ（ｐ３００融合パートナー以外は図２Ａと同様）をコードしている導入遺伝子を組み込んだ安定な細胞株で、これを次にＹＦＰベクター（図２Ｂ）を発現しているプラスミドで形質転換する。
【００６３】
安定な細胞株を選択し、時間経過に伴うＹＦＰの発現を、ｒｔＰＣＲによるｍＲＮＡの発現試験、ウェスタンブロットによるタンパク質発現の決定、並びにフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡による単一の細胞内の蛍光を試験することによって特徴付ける。クローン集団を２、４、６及び１０世代継代する。同様に、高レベルでＹＦＰを発現しているクローンの頻度をＬｅｘＡ−ｐ３００及びＬｅｘＡのみで比較する。ＬｅｘＡ−ｐ３００ＧＥＥでは、核に導入した遺伝子の発現が上昇し、時間が経過しても高レベルの発現が維持される。
【００６４】
上に記載した本発明は、添付の請求項及び図面と合わせて読まれるべきである。実施形態及び実施例の詳細により、本発明の様々な実施を行うことができる。実施形態及び実施例は本発明を好ましい実施形態に制限することを意図しないが、本発明の特定の例として役立つ。開示した概念及び特定の実施形態を、変更を行うための、又は本発明と同じ目的をもつその他の方法及び系を設計するための基礎として容易に用いることができることを当業者は理解するだろう。
【００６５】
本明細書で引用した、出版物、特許出願、特許及びウェブサイトに含まれる内容を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照により組み込まれること個別に及び特定して示すものと同様に、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００６６】
本明細書において言及したウェブサイトは、２０１０年１０月３０日時点のものである。
【００６７】
本明細書においては、別段の指定のない限り又はその文脈で明かに矛盾がない限り、本明細書で記載した文脈で使用される「１つ（ａ）」及び「１種（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び同様の用語は、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。
【００６８】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書では単に、その範囲に中にある個々の値をそれぞれ個別に記載することの簡略法として役立ち、そして別段の指定のない限り本明細書においては、それぞれ個別の値は、本明細書で個々に記載されたかのうように、明細書中に組み込まれる。数値に伴って使用される場合、用語「約」は、述べられた数値の１０％の偏差を含み、１０％の偏差までの数値を示していると解釈される。任意の及び全ての実施例、又は例を示す言葉（「例えば」又は「など」）の使用は本明細書では、単に本発明の理解をより容易にするためだけに用いられ、請求項に記載の内限り、本発明の範囲を制限するものではない。明細書中のいずれの言葉も、請求項に記載されていない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているとは解釈されない。
【図１】
2013509199.tif 000004
【図２Ａ】
2013509199.tif 000005
【図２Ｂ】
2013509199.tif 000006
【図３】
2013509199.tif 000007
【配列表】
2013509199000001.app
【国際調査報告】
2013509199.tif 000008
2013509199.tif 000009