(57)【要約】  有効量のＦＴＳ（Ｓ−トランス，トランス−ファルネシルチオサリチル酸もしくはサリラシブ）またはＦＴＳアナログと、ヒストンデアセチラーゼ酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤と、薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物が開示される。ＦＴＳまたはそのアナログを含む有効量のＲａｓアンタゴニストとＨＤＡＣ阻害剤とをがん患者に共投与することによるがんの治療方法も開示される。
2013508458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2013508458.tif 000008
［式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはアルケニルであり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキルを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す］により表されるＲａｓアンタゴニストと、
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤と、
薬学的に許容可能な担体とを含み、
前記Ｒａｓアンタゴニストおよび前記ＨＤＡＣ阻害剤は組成物中に治療有効量で存在する、がん患者を治療するための組成物。
【請求項２】
前記ＲａｓアンタゴニストがＦＴＳである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、５−クロロ−ＦＴＳ、５−フルオロ−ＦＴＳ、ＦＴＳ−メチルエステル、ＦＴＳ−アミド、ＦＴＳ−メチルアミド、ＦＴＳ−ジメチルアミド、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるＦＴＳアナログである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がボリノスタットである、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＳＮＤＸ−２７５である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記薬学的に許容可能な担体が液体である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記薬学的に許容可能な担体が固体である、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
錠剤またはカプセル剤の形態である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
がん患者を治療するための方法であって、前記患者に、治療有効量の、式
【化２】
2013508458.tif 000009
［式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはアルケニルであり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキルを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す］により表されるＲａｓアンタゴニストと、
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤とを共投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
前記Ｒａｓアンタゴニストと前記ＨＤＡＣ阻害剤とを同一剤形で投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記共投与が経口送達によるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが、腎癌、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ、卵巣がん、肝がん、甲状腺がん、精上皮腫、皮膚がん、子宮内膜がん、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、前立腺がん、膀胱および泌尿器のがん、乳がん、ならびに前記がんおよび癌腫の脳転移、原発性脳がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんが甲状腺がんである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんが結腸がんである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんが肺がんである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲａｓアンタゴニストがＦＴＳである、請求項１０から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、５−クロロ−ＦＴＳ、５−フルオロ−ＦＴＳ、ＦＴＳ−メチルエステル、ＦＴＳ−アミド、ＦＴＳ−メチルアミド、ＦＴＳ−ジメチルアミド、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるＦＴＳアナログである、請求項１０から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸である、請求項１０から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がボリノスタットである、請求項１０から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＳＮＤＸ−２７５である、請求項１０から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
治療有効量の、本明細書の式により規定されるＲａｓアンタゴニストおよびＨＤＡＣ阻害剤を含有する第一の剤形、または、ＲａｓアンタゴニストおよびＨＤＡＣ阻害剤をそれぞれ含有する別々の剤形と、任意選択的に、１つまたは複数の剤形を使用してがん患者を治療するための取扱説明書とを含む、がん治療において使用するためのキット。
【請求項２３】
有効量の、式
【化３】
2013508458.tif 000010
［式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはアルケニルであり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキルを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す］により表されるＲａｓアンタゴニストと、
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤との、
がん患者におけるがんの治療において使用するための活性薬剤の組合せ。
【請求項２４】
前記Ｒａｓアンタゴニストおよび前記ＨＤＡＣ阻害剤が、同一剤形で共投与されるためのものである、請求項２３に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項２５】
前記Ｒａｓアンタゴニストおよび前記ＨＤＡＣ阻害剤が経口共投与のためのものである、請求項２３に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項２６】
前記がんが、腎癌、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ、卵巣がん、肝がん、甲状腺がん、精上皮腫、皮膚がん、子宮内膜がん、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、前立腺がん、膀胱および泌尿器のがん、乳がん、ならびに前記がんおよび癌腫の脳転移、原発性脳がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項２７】
前記がんが甲状腺がんである、請求項２３に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項２８】
前記がんが結腸がんである、請求項２３に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項２９】
前記がんが肺がんである、請求項２３に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項３０】
前記ＲａｓアンタゴニストがＦＴＳである、請求項２３から２９のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項３１】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、５−クロロ−ＦＴＳ、５−フルオロ−ＦＴＳ、ＦＴＳ−メチルエステル、ＦＴＳ−アミド、ＦＴＳ−メチルアミド、ＦＴＳ−ジメチルアミド、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるＦＴＳアナログである、請求項２３から２９のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項３２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸である、請求項２３から３１のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項３３】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がボリノスタットである、請求項２３から３１のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【請求項３４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＳＮＤＸ−２７５である、請求項２３から３１のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その開示を引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００９年１０月２６日出願の米国仮特許出願第６１／２５４，８７２号の出願日の権益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒａｓタンパク質は、正常細胞およびがん性または悪性細胞の両方において、同様に成長を制御する要である。このタンパク質は、ヒトがんの全体の約３０％において突然変異していることがわかっている。正常なＲａｓタンパク質は、その活性を発揮するために、少なくとも３回の変化を経なければならず、その最初の変化が、プレニル基の結合を伴う化学修飾である。そのプレニル基がトリテルペノイドファルネシル基である場合、結合ステップは、ファルネシル化として知られている。この反応は、ファルネシルトランスフェラーゼとして知られる酵素を触媒とする。次いで、ファルネシル化された正常なＲａｓは、成長因子受容体との相互作用により促進されるステップである、酵素触媒によるいくつかのアミノ酸残基の追加の切断を受ける。次いで、Ｒａｓタンパク質が活性化されなければならないが、これには、細胞膜の内部表面に位置するタンパク質であるガレクチンへのドッキングまたはアンカリングが必要となる。
【０００３】
正常な、病的でない状態では、細胞膜に結合した活性化型ファルネシル化Ｒａｓの量が、細胞質ゾル中の不活性なファルネシル化Ｒａｓとバランスが取れていることにより、細胞分裂がある程度制御される。がん細胞では、そのバランスが異常であり、膜に結合したＲａｓ、特に突然変異したＲａｓの量がより多くなる方へとシフトし、Ｒａｓは、細胞膜にアンカリングされたままとなる。このアンバランスの結果、この疾患の特徴である、制御されない細胞分裂が起こる。
【０００４】
Ｒａｓタンパク質の活性化、および続いて起こる下流の諸事象は、特にがんに関連して広く研究されている。その結果、Ｒａｓ活性の抑制を目標として、Ｒａｓタンパク質の阻害剤が開発されている。たとえば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシル化Ｒａｓの成熟を妨げる成長因子受容体阻害剤、およびファルネシル化ＲａｓのガレクチンへのアンカリングをターゲットとするＲａｓアンタゴニストは、すべてヒト臨床試験の対象になっている。特に、ＲａｓアンタゴニストであるＳ−トランス，トランス−ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）が、いくつかのがんに関して、現在までに臨床試験で有効であるとわかっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多くの有効ながん治療は、２種の異なる抗がん剤の組合せに関する。治療の構想および設計の要となるのは、付加的、好ましくは相乗的な治療効果を実現する組合せを選ぶことである。しかし、所与の任意の組合せの治療有効性、特にそれが相乗的となるかどうかを前もって予測することは、依然として実現が難しい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の態様は、本明細書に記載される式によって共に規定されるＳ−トランス，トランス−ファルネシルチオサリチル酸（本明細書においてＦＴＳまたはサリラシブとも称される）またはＦＴＳアナログと、ヒストンデアセチラーゼ酵素の阻害剤（本明細書においてＨＤＡＣ阻害剤とも称される）と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物に関する。ＦＴＳおよびＨＤＡＣ阻害剤は、組成物中に有効量で存在する。
【０００７】
本発明の第二の態様は、ＦＴＳまたはＦＴＳアナログとＨＤＡＣ阻害剤の共投与を含む、がん患者の治療方法に関する。一部の実施形態では、これらの抗がん剤を単一組成物で投与することにより治療を実施する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】０．１％のＭｅ２ＳＯ４（対照）、示した濃度のＦＴＳ、ＨＤＡＣ阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）、または２種の阻害剤の組合せの存在下での、３種の異なるがん細胞系、すなわち、ヒトＡ５４９細胞（非小細胞肺がん細胞）、ＤＬＤ１細胞（ヒト結腸腺癌細胞）、およびＡＲＯ細胞（甲状腺癌細胞）の成長抑制を示す棒グラフである。処理した培養物中の生細胞数を、対照においてカウントされた総生細胞数に対する百分率として示す。
【図２Ａ．２Ｂ】ＦＴＳおよびＶＰＡと共に１６日間インキュベートしたＡ５４９細胞およびＤＬＤ１細胞でのＶＰＡプラスＦＴＳの相乗的な成長抑制効果を示すグラフである。細胞は７、１２および１６日にカウントしており、処理した培養物中の有糸分裂のＳ期にある細胞数をＦＡＣＳ分析によって決定したものを、対照のＳ期細胞数に対する百分率として示す。
【図２Ｃ】ＶＰＡプラスＦＴＳによってＳ期のＡ５４９細胞、ＤＬＤ１細胞、およびＡＲＯ細胞（７２時間後）の相乗的な成長抑制が実現されたことをＦＡＣＳ分析を介して示す棒グラフである。
【図３Ａ．３Ｂ】示した濃度のＦＴＳおよびＶＰＡで７２時間処理した後に、ＦＴＳおよびＶＰＡの併用処理によってＡ５４９細胞およびＤＬＤ１細胞のシグナル伝達が阻害されることを示す図である。図３Ａは、細胞を溶解させ、次いで免疫ブロットにかけた後の、サイクリンＤ１、Ｒａｓ、サバイビン、およびβ−チューブリンの総レベルを示す電気泳動ゲルの写真である。図３Ｂは、対照Ａ５４９細胞、ならびにＦＴＳ、ＶＰＡ、およびＶＰＡプラスＦＴＳで処理したＡ５４９細胞におけるサバイビン転写物のリアルタイムＰＣＲ分析を示す棒グラフである。データは、正規化した対照レベルに対する、薬物処理した細胞中の正規化したサバイビン転写物量として、百分率で示す。
【図４】ＶＰＡとＦＴＳとの組合せが、オーロラキナーゼＡ転写を相乗的に阻害し、Ａ５４９細胞の有糸分裂を妨害することを、対照、ＦＴＳ、ＶＰＡ、およびＶＰＡプラスＦＴＳで処理したＡ５４９細胞（７２時間）におけるオーロラＡ（Ａｕｒｋ−Ａ）転写物のリアルタイムＰＣＲ分析によって示す棒グラフである。データは、正規化した対照レベルに対する薬物処理した細胞中の正規化したオーロラＡ転写物量の百分率として示す。
【図５】対照、ＦＴＳ、ＶＰＡ、およびＶＰＡプラスＦＴＳで処理したＡ５４９細胞（７２時間）におけるＮｕＳＡＰ転写物のリアルタイムＰＣＲ分析を示す棒グラフである。ＮｕＳＡＰ転写物のレベルは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現に対して正規化したものであり、データは、正規化した対照レベルに対する、薬物処理した細胞中の正規化したＡｕｒＫ−Ａ転写物量として、百分率で示す。
【図６Ａ．６Ｂ】Ａ５４９細胞およびＳＷ−４８０細胞それぞれに対する、示した濃度で１８日間での、ＳＡＨＡプラスＦＴＳの相乗的な成長抑制効果を示すグラフである。すべての細胞は、７、１４、および１８日にカウントしている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［Ｒａｓアンタゴニスト］
Ｒａｓタンパク質、たとえば、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓは、細胞成長、分化、および生存を制御するシグナル伝達経路を調節する入切スイッチとして働く［Ｒｅｕｔｈｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：１５７〜６５（２０００）］。Ｒａｓタンパク質は、形質膜の内側小葉状部分にアンカリングされ、そこで、受容体チロシンキナーゼなどの細胞表面受容体が活性化されて、Ｒａｓ上でのグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）との交換、および不活性Ｒａｓ−ＧＤＰの活性Ｒａｓ−ＧＴＰへの変換が誘発される［Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３３３〜７（１９９７）］。これらのシグナルの停止には、Ｒａｓ−ＧＴＰをＲａｓ−ＧＤＰにする加水分解が必要となる［Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３３３〜３３８（１９９７）］。Ｒａｓのいくつかの変異型は、そのＧＴＰ加水分解の受けやすさに欠陥があり、したがって構成的活性型である［Ｂａｒｂａｃｉｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７７９〜８２７（１９８７）、Ｂｏｘ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３１：１０５１〜１０５４（１９９５）］。多くのがんタイプで見られるこうした発がん性Ｒａｓタンパク質は、悪性腫瘍の一因となり、したがって指向型治療の好適なターゲットとみなされる［Ｂｏｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：４６８２〜４６８９（１９８９）］。活性Ｒａｓタンパク質は、細胞成長、分化の調節解除、ならびに生存、遊走、および浸潤の増進に寄与する複数のＲａｓエフェクターの活性化を通して発がんを促進する［たとえば、Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３：１１〜２２（２００３）、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：１４７〜５４１（２０００）、およびＭｉｔｉｎ，Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１５：Ｒ５６３〜７４（２００５）］を参照のこと］。
【００１０】
形質膜との連係は、野生型および変異した構成的活性型の両方において同様に、Ｒａｓ活性にとって非常に重要であることが示されている［Ｂｏｇｕｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３６６：６４３〜６５４（１９９３）、Ｃｏｘら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：１００８〜１０１６（１９９２）、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：１９７〜２０４（１９９６）］。少なくとも２種の構造的要素がこの連係に必要であり、第一は、Ｒａｓのカルボキシ末端にあるファルネシルシステインカルボキシメチルエステルであり、第二の要素は、近傍の上流配列に存在し、異なるＲａｓアイソフォームによって様々である［Ｈａｎｃｏｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：４０３３〜４０３９（１９９１）、Ｈａｎｃｏｃｋら、Ｃｅｌｌ  ５７：１１６７〜１１７７（１９８９）］。正常なＲａｓ活性には、特にファルネシルイソプレノイド部分が必要であり［Ｃｏｘら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：１００８〜１０１６（１９９２）、Ｃｏｘら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６０６〜２６１５（１９９２）］、この部分が特異的な認識単位として働いて、Ｈ−Ｒａｓをガレクチン−１と［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３７１６９〜３７１７５（２００２）、Ｒｏｔｂｌａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６４：３１１２〜３１１８（２００４）］、Ｋ−Ｒａｓをガレクチン−３と結合させ［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３４９２２〜３４９３０（２００４）］、強力な膜連係および強固なシグナル伝達を促進する。
【００１１】
ＦＴＳは、活性のあるＧＴＰ結合型のＨ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびＫ−Ｒａｓタンパク質に、どちらかと言えば特異的に作用するＲａｓ阻害剤として知られている［Ｗｅｉｓｚ，Ｂ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２５７９〜２５８８（１９９９）、Ｇａｎａ−Ｗｅｉｓｚ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：５５５〜６５（２００２）］。より詳細には、ＦＴＳは、形質膜において、特異的な飽和性結合部位への結合を巡ってＲａｓ−ＧＴＰと競合し、その結果、活性Ｒａｓの誤った局在化が生じ、Ｒａｓ分解が促進される［Ｈａｋｌａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（５）：１３０６〜１４（１９９８）］。この競合的阻害により、活性Ｒａｓがその主立った下流エフェクターと相互作用することが妨げられ、活性化型Ｒａｓを収容する形質転換細胞の形質転換された表現型が逆転する。その結果として、Ｒａｓ依存的な細胞成長および形質転換活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、ＦＴＳによって強力に阻害される［Ｗｅｉｓｚ，Ｂ．ら、上記を参照、Ｇａｎａ−Ｗｅｉｓｚ，Ｍ．ら、上記を参照］。
【００１２】
本発明における有用なＲａｓアンタゴニストとして、以下に述べるＦＴＳおよびその構造アナログが挙げられる。
【００１３】
Ｒａｓアンタゴニストは、次式により表される。
【化１】
2013508458.tif 000003
式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはアルケニル（線状および分枝状のアルキルまたはアルケニルを含み、一部の実施形態では、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアルケニルを含む）であり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキル（線状および分枝状のアルキルを含み、一部の実施形態では、Ｃ１〜Ｃ４アルキルを表す）を表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ（線状および分枝状のアルキル、アルケニル、またはアルコキシを含み、一部の実施形態では、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アルケニル、またはアルコキシである）、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す。Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９および／またはＲ１０のいずれかがアルキルを表す実施形態では、アルキルは、メチル基またはエチル基であることが好ましい。Ｒａｓアンタゴニストは、薬学的に許容可能な塩の形、または治療上有効である他の任意の形態で存在してもよい。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストは、Ｓ−トランス，トランス−ファルネシルチオサリチル酸またはＦＴＳ（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ２はＣＯＯＲ７であり、Ｒ７は水素である）である。
【００１５】
一部の実施形態では、ＦＴＳアナログは、ハロゲン化されており、たとえば、５−クロロ−ＦＴＳ（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ２はＣＯＯＲ７であり、Ｒ４はクロロであり、Ｒ７は水素である）および５−フルオロ−ＦＴＳ（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ２はＣＯＯＲ７であり、Ｒ４はフルオロであり、Ｒ７は水素である）である。
【００１６】
他の実施形態では、ＦＴＳアナログは、ＦＴＳ−メチルエステル（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＯＲ７を表し、Ｒ７はメチルを表す）、ＦＴＳ−アミド（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＮＲ７Ｒ８を表し、Ｒ７およびＲ８は、両方とも水素を表す）、ＦＴＳ−メチルアミド（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＮＲ７Ｒ８を表し、Ｒ７は水素を表し、Ｒ８はメチルを表す）、およびＦＴＳ−ジメチルアミド（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＮＲ７Ｒ８を表し、Ｒ７およびＲ８は、それぞれメチルを表す）である。
【００１７】
さらに他の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストは、Ｓ−プレニルチオサリチル酸アルコキシアルキルまたはＦＴＳ−アルコキシアルキルエステル（Ｒ２はＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０を表す）である。代表例としては、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ９はＨであり、Ｒ１０はメチルである）、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル（Ｒ１はゲラニルゲラニルであり、Ｒ９はＨであり、Ｒ１０はメチルである）、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ５はフルオロであり、Ｒ９はＨであり、Ｒ１０はメチルである）、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチル（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ９はメチルであり、Ｒ１０はエチルである）が挙げられる。上述の実施形態のそれぞれにおいて、別段詳細に指摘しない限り、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素を表す。
【００１８】
［ＨＤＡＣ阻害剤］
真核細胞中のＤＮＡは、タンパク質と密な複合体をなして、クロマチンを形成する。ヒストンは、ＤＮＡと複合体をなす小さなタンパク質である。Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４として知られるヒストンそれぞれ２分子ずつが、通常は約１５０塩基対の量のＤＮＡと密な複合体をなして、ヌクレオソームを形成する。この構造は、リンカーＤＮＡによってさらに連結されて、ソレノイドとなる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヌクレオソームコアヒストンのリシン残基のアセチル基をそれぞれ付加および除去することによりヒストン尾部のアセチル化レベルを制御する、２種の酵素ファミリーである。ヌクレオソームコアから伸びるヒストンが、こうして酵素的な修飾を受け、クロマチン構造および遺伝子発現に影響を及ぼす。アセチル化されたヒストンは、転写因子および他のコアクチベータータンパク質を補充することができるので、ＨＡＴは、ヒストンのアセチル化によって、転写および遺伝子発現を可能にする。ＨＤＡＣは通常、ＤＮＡの過剰メチル化および遺伝子サイレンシングと関連付けられる。
【００１９】
ＨＤＡＣは、細胞増殖および分化において重要な役割を果たす。アセチル化ヒストンは、ＤＮＡ転写の促進において効力が比較的弱いのに対し、脱アセチル化ヒストンは、この過程の促進において効力が比較的強い。アセチル化と脱アセチル化は、正常細胞においてはバランスが取れている。しかし、悪性細胞では、ＨＤＡＣ活性がＨＡＴ活性に比べて過剰になっており、脱アセチル化ヒストンのアセチル化ヒストンに対するバランスが悪くなる。このアンバランスの結果、ＤＮＡ転写が度を超え、細胞増殖が制御されなくなる。細胞増殖および分化の制御にＨＤＡＣが関与することは、異常なＨＤＡＣ活性ががんにおいて役割を果たし得ることを示唆している。
【００２０】
ＨＤＡＣ酵素ファミリーには、４クラス（クラスＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩ、およびＩＶ）に分類される少なくとも１８種の酵素が含まれる。クラスＩ  ＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ１、２、３および８が含まれる。クラスＩ  ＨＤＡＣは、核において見ることができ、転写制御リプレッサーおよび補助因子と関わり合いがあると考えられている。クラスＩＩａ  ＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ４、５、７および９が含まれ、クラスＩＩｂ  ＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ６および１０が含まれる。これらの酵素は、細胞質ならびに核の両方において見ることができる。特定のクラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＤＡＣは、正常組織に比べて腫瘍で過剰発現される。Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｏｖｅｒｙ  １：２８７〜９９（２００２）を参照のこと。クラスＩＩＩ  ＨＤＡＣは、ＮＡＤ依存性タンパク質であると考えられており、サーチュインファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。サーチュインタンパク質の非限定的な例として、ＳＩＲＴ１−７が挙げられる。クラスＩＶ  ＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ１１が含まれる。
【００２１】
広範には、用語「ＨＤＡＣ阻害剤」とは、本明細書では、ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害する能力を有する化合物を指す。この治療クラスは、血管新生および細胞周期をブロックし、アポトーシスおよび分化を促進し得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、標的抗がん活性を示し、本明細書で開示するように、がん治療においてＦＴＳおよびそのアナログと相乗的に作用する。
【００２２】
選択的ＨＤＡＣ阻害剤および非選択的ＨＤＡＣ阻害剤は、同様に本発明において有用となり得る。用語「選択的ＨＤＡＣ阻害剤」とは、３種すべてのＨＤＡＣクラスと実質的に相互作用しないＨＤＡＣ阻害剤を指す。本明細書では、「クラスＩ選択的ＨＤＡＣ」とは、ＨＤＡＣ１、２、３または８の１種または複数と相互作用するが、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ（すなわち、ＨＤＡＣ４〜７、９および１０）とは実質的に相互作用しないＨＤＡＣ阻害剤を指す。
【００２３】
本発明の一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤などの選択的ＨＤＡＣ阻害剤である。本発明において有用となり得るこのような阻害剤の代表例として、モセチノスタット（Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ）としても知られているＭＧＣＤ−０１０３（Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−メチル］−ベンズアミド）などのベンズアミド、および米国特許第６，８９７，２２０号で開示されているような関連化合物、エンチノスタット（ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）または「ＳＮＤＸ−２７５」としても知られているＭＳ−２７５（（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−（Ｎ−（ピリジン−３−イルメトキシカルボニル）アミノメチル）ベンズアミド）などのベンズアミド、およびたとえば米国特許第６，１７４，９０５号で開示されているような関連化合物、スピルコスタチンＡ、ＳＫ７０４１およびＳＫ７０６８（クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、Ｐａｒｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５２７１（２００４））、ならびに６−アミノニコチンアミドが挙げられる。
【００２４】
一部の実施形態では、ＨＤＡＣは、非選択的ＨＤＡＣ阻害剤である。本発明において有用となり得るこのような阻害剤の代表例として、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）やトリコスタチンＣ（ＴＳＣ）などのトリコスタチンアナログ（Ｋｏｇｈｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３５９〜６４（１９９８））、サリチリヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）（米国特許第５，６０８，１０８号）、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）、アゼライン酸−１−ヒドロキサメート−９−アナリド（ＡＡＨＡ）、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロン酸ヒドロキサム酸（３Ｃ１−ＵＣＨＡ）、およびＮ’−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−オクタンジアミド（「ＳＡＨＡ」またはボリノスタットとしても知られるスベロイルアニリドヒドロキサム酸ならびに米国特許第５，３６９，１０８号、第６，０８７，３６７号、第７，３９９，７８７号、第７，４５６，２１９号、および第ＲＥ３８，５０６号で開示されているような関連ヒドロキサム酸化合物）を含むヒドロキサム酸、トラポキシン（ＴＰＸ、非競合的ＨＤＡＣ阻害剤である）などのエポキシケトン、ピロキサミド、ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサミド（ＣＢＨＡ；Ｒｉｃｈｏｎら、ＰＮＡＳ  ９５：３００３〜７（１９９８））、オキサムフラチン（ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）、Ａ−１６１９０６、ＧＣＫ１０２６（スクリプタイド；Ｌｅｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．３３（４）：７６７〜７６（２００８））、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１、クラスＩおよびＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤）、ＬＡＱ−８２４（Ｒｅｍｉｓｚｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６（２１）：４６０９〜２３（２００３））、環状含ヒドロキサム酸ペプチド（ＣＨＡＰ；Ｆｕｒｕｍａｉら、ＰＮＡＳ  ９８（１）：８７〜９２（２００１））、ＭＷ２７９６およびＭＷ２９９６（Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３０：７６１〜８（２０００））、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）（Ｔａｎら、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．３：５（２０１０））、タセジナリン（ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅ）、ＣＩ−９９４、アセチルジナリン、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド（Ｌｏｐｒｅｖｉｔｅら、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．１５（１）：３９〜４８（２００５））、ＢＭＬ−２１０、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド（Ｓａｖｉｃｋｉｅｎｅら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４９（１〜３）：９〜１８（２００６））  Ｍ３４４、Ｄ２３７、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド（Ｔａｋａｉら、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １０１：１０８〜１１３（２００６））が挙げられる。
【００２５】
こうした実施形態のいくつかでは、非選択的ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸（２−ｎ−プロピルペンタン酸、ＶＰＡ）またはその誘導体などの低分子量カルボキシレートである。ＶＰＡは、ＨＤＡＣ１〜３（クラスＩ）およびＨＤＡＣ４〜８（クラスＩＩ）を阻害することが報告されている。バルプロ酸は、次式により表される。
【化２】
2013508458.tif 000004
【００２６】
本発明での使用に適するＶＰＡ誘導体は、次式により表される。
【化３】
2013508458.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、１個または数個のヘテロ原子を任意選択的に含み、置換されていてもよい、線状または分枝状、飽和または不飽和の脂肪族Ｃ２〜２５、好ましくはＣ３〜２５炭化水素鎖を表し、Ｒ３は、ヒドロキシル、アルコキシ、または任意選択的にアルキル化されたアミノ基である。炭化水素鎖Ｒ１およびＲ２は、炭化水素鎖中に、炭素原子に代わる１個または数個のヘテロ原子（たとえば、Ｏ、Ｎ、Ｓ）を含んでいてもよい。Ｒ１およびＲ２は、たとえば、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、およびアルコキシ基、ならびにアリール基およびヘテロ環基で置換されていてもよい。Ｒ１およびＲ２は、別個に、２〜１０個の炭素原子を含んでいることが好ましく、３〜１０個または５〜１０個の炭素原子を含んでいることがより好ましい。また、Ｒ１およびＲ２は、別個に、飽和であるか、または１個の二重結合もしくは１個の三重結合を含んでいることが好ましい。特に好適であり得るＶＰＡ誘導体として、Ｓ−４−ｙｎ  ＶＰＡおよび２−ＥＨＸＡ（２−エチル−ヘキサン酸）が挙げられる。
【００２７】
ＨＤＡＣ阻害剤は、薬学的に許容可能な塩の形、または治療上有効である他の任意の形態で存在してもよい。
【００２８】
一般に、ＨＤＡＣ阻害によって引き起こされるヒストンの過剰アセチル化によって、リシン側鎖の正電荷が中和され、クロマチン構造が変化し、結果としていくつかの遺伝子の転写活性化が起こって、最終的な成果が細胞周期の阻止になると考えられている。すなわち、細胞は分裂を止める。数多くのＨＤＡＣ阻害剤が、現在がん臨床試験で使用されている。それらには、上記した種々のＨＤＡＣ阻害剤の他に、パノビノスタット、ベリノスタット、ＩＴＦ−２３５７、ＰＣ−２４７８１、フェニルブチレート、ＳＢ−９３９、およびＪＨＪ−２６４８１５８５が含まれる。
【００２９】
［組成物および方法］
ＲａｓアンタゴニストとＨＤＡＣ阻害剤は共投与されるが、共投与は、本明細書では、これらの抗がん剤が、その複合治療効果の恩恵を得るために、両方の薬剤および／またはその代謝産物が患者において同時に存在するように、同じまたは異なる時間に（すなわち、事実上同時にまたは逐次に）、同じまたは異なる投与経路で、がん患者に投与される治療計画を包含する。すなわち、共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時間での投与、および／または両方の薬剤を含有する組成物での投与が含まれる。したがって、一部の実施形態では、ＲａｓアンタゴニストとＨＤＡＣ阻害剤は、単一組成物において投与される。
【００３０】
用語「治療有効量」とは、本明細書では、がんおよびその関連する徴候の少なくとも１つの症状を回復させ、疾患の程度または重症度を軽減し、疾患の進行を遅らせまたは阻止し、部分的または完全な寛解を実現し、生存を引き延ばすのに十分な、ＲａｓアンタゴニストおよびＨＤＡＣ阻害剤それぞれの量およびその組合せを指す。実施例に示すように、ＲａｓアンタゴニストとＨＤＡＣ阻害剤を組み合わせることにより、少なくとも、がん細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長抑制に関して、相乗的、すなわち付加的より大きい効果が実現される。出願人らは、こうした結果は、腫瘍／がん細胞成長のｉｎ  ｖｉｖｏでの抑制活性を反映しており、最終的により効果的ながん治療、および疾患の臨床徴候の１つまたは複数の相応の改善につながると考えている。任意のがん患者のための適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定することができる。任意の特定の患者の特別な用量レベルは、ＲａｓアンタゴニストおよびＨＤＡＣ阻害剤の効力、患者の年齢、体重、および全般的な健康状態、がんの重症度などのいくつかの要素に応じて決まる。
【００３１】
本発明のＲａｓアンタゴニストの平均日用量は、一般には約２００ｍｇ〜約２０００ｍｇ（たとえば、２００ｍｇ、４００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、１０００ｍｇ、１２００ｍｇ、１４００ｍｇ、１６００ｍｇ、１８００ｍｇ、および２０００ｍｇ）、一部の実施形態では約４００〜約１６００ｍｇ、他の一部の実施形態では約６００〜約１２００ｍｇ、さらに他の実施形態では約８００ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲である。ＨＤＡＣ阻害剤の平均日用量は、具体的な薬剤に応じて様々となる。バルプロ酸（およびその誘導体）の平均日用量は、たとえば、一般には約５００ｍｇ〜約３５００ｍｇ、一部の実施形態では約７５０〜３０００ｍｇ、他の一部の実施形態では約７５０ｍｇ〜約１５００ｍｇの範囲である。ボリノスタット（およびその誘導体）の平均日用量は、たとえば、一般には約１００ｍｇ〜約６００ｍｇ、他の一部の実施形態では約２００〜約５００ｍｇ、他の一部の実施形態では約３００ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲である。ＳＮＤＸ−２７５（およびその誘導体）の平均週用量は、たとえば、２週間に１回、一般には約２．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、一部の実施形態では約５ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。
【００３２】
用語「投与する」、「投与すること」、「投与」などは、本明細書では、化合物または組成物の所望の生物学的作用部位への送達を可能にするために使用することのできる方法を指す。本発明での使用に適する医学的に許容可能な投与技術は、当業界で知られている。たとえば、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、現行版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（現行版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルヴェニア州イーストンを参照のこと。一部の実施形態では、少なくとも一方または両方の活性薬剤を経口投与する。他の実施形態では、少なくとも一方または両方の活性薬剤を非経口投与する（本発明の意図では、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、および注入がこれに含まれる）。局所投与や直腸投与などの他の投与経路が適する場合もある。
【００３３】
用語「薬学的に許容可能な」とは、本明細書では、（１種または複数の）活性薬剤の生物学的活性または特性を損なわず、比較的非毒性である、担体や他の不活性賦形剤などの材料を指す。
【００３４】
用語「医薬組成物」とは、本明細書では、任意選択的に薬学的に許容可能な担体と組み合わされた（たとえば、混合された）Ｒａｓアンタゴニストおよび／またはＨＤＡＣ阻害剤を指す。こうした成分は、非毒性であり、生理学的に不活性であり、組成物中に存在する（１種または複数の）活性薬剤と不利に相互作用しない。担体は、活性薬剤の製剤および／または投与を円滑にする。本発明の医薬組成物は、１種または複数の賦形剤をさらに含有してもよい。
【００３５】
Ｒａｓアンタゴニストおよび／またはＨＤＡＣ阻害剤の経口組成物は、（１種または複数）の薬剤を、担体と関連させる（たとえば、混合する）ことにより調製でき、ここで担体の選択は投与方式に基づく。担体は一般に、固体または液体である。場合によっては、組成物は、固体担体と液体担体を含有してもよい。活性物を含有する、経口投与に適する組成物は、錠剤（たとえば、フィルムコート、糖衣、制御放出、または持続放出を含む）、カプセル剤、たとえば、硬ゼラチンカプセル剤（制御放出または持続放出を含む）および軟ゼラチンカプセル剤、粉末および顆粒などの固体剤形にすることが好ましい。しかしながら、組成物は、他の経口形態、たとえば液体またはゲルでの患者への投与を可能にする、他の担体中に含まれていてもよい。形態にかかわらず、組成物は、所定の量の１種または複数の活性成分を含む個別または組合せの用量に分けられる。
【００３６】
経口剤形は、１種または複数の活性医薬成分を１種または複数の適切な担体と（任意選択的に１種または複数の他の薬学的に許容可能な賦形剤と共に）混合し、次いで組成物を所望の剤形に製剤することにより、たとえば、組成物を錠剤に圧縮する、または組成物をカプセルもしくは小袋に充填することにより調製できる。典型的な担体および賦形剤として、ラクトース、デンプン、マンニトール、微結晶性セルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、第二リン酸カルシウム、アカシア、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、トウコロコシ油、植物油、およびポリエチレングリコールを含む、増量剤もしくは希釈剤、結合剤、緩衝剤もしくはｐＨ調整剤、崩壊剤（架橋およびスーパー崩壊剤、たとえばクロスカルメロースを含む）、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、および／または滑沢剤が挙げられる。糖、セラック、合成ポリマーなどのコーティング剤、ならびに着色剤および保存剤を用いることもできる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（２０００）を参照のこと。
【００３７】
液体形態の組成物としては、たとえば、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル、および加圧組成物が挙げられる。たとえば、（１種または複数の）活性薬剤を、水、有機溶媒（およびその混合物）、および／または薬学的に許容可能な油脂などの薬学的に許容可能な液体担体に溶解または懸濁させることができる。経口投与用の液体担体の例として、水（特に、前述のような添加剤、たとえば、セルロース誘導体を好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液中の懸濁液にしたものを含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、たとえばグリセリンおよび非毒性グリコールを含む）およびその誘導体、ならびに油（たとえば、ヤシ油およびラッカセイ油）が挙げられる。液体組成物は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、着香剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、浸透圧調節剤などの適切な他の医薬添加剤を含有していてもよい。
【００３８】
非経口投与用組成物の調製に適する担体としては、注射用滅菌水、注射用静菌水、塩化ナトリウム注射液（０．４５％、０．９％）、デキストロース注射液（２．５％、５％、１０％）、乳酸化リンゲル注射液などが挙げられる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物、および油中に分散液を調製することもできる。組成物は、等張化剤（たとえば、塩化ナトリウムおよびマンニトール）、抗酸化剤（たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸）、および保存剤（たとえば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびメチルパラベンとプロピルパラベンの組合せ）も含有し得る。
【００３９】
ＲａｓアンタゴニストおよびＨＤＡＣ阻害剤を含有する医薬組成物、またはＲａｓアンタゴニストおよびＨＤＡＣ阻害剤をそれぞれ含有する第一および第二の組成物は、キットの形で包装および販売することができる。たとえば、組成物は、活性薬剤の一方または両方を含有する錠剤やカプセル剤（たとえば、硬ゼラチンカプセル剤または軟ゼラチンカプセル剤）などの１種または複数の経口剤形の形にすることができる。キットには、本明細書に記載の本発明の方法を実施するための取扱説明書を含めてもよい。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストは、（単一または分割用量で）毎日経口的に３週間服用させ、続いて１週間の「休止期間」を置き、寛解に到達するまで繰り返すことにより投与される。こうした実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤が同じ組成物中に存在していてもよい。他の一部の実施形態では、たとえばＶＰＡを、単一または分割投与量で毎日（たとえば、１日２回または３回）投与する。ボリノスタットは、たとえば、約４００ｍｇの初期用量で１日１回服用させることができ、次いでこれを３００ｍｇの日用量に減らし、次いで３００ｍｇで５日間毎日連続して続けることができる。ＳＮＤＸは、約５ｍｇまたは１０ｍｇの量で２週間毎に投与することができる。
【００４１】
がんとは一般に、身体の隣接した組織または他の部分に広がり得る、細胞の制御されない異常な成長によって引き起こされる疾患を指す。がん細胞は、がん細胞が一まとまりになっている固形腫瘍を形成する場合もあり、またはがん細胞は、白血病でのように分散した細胞として存在する場合もある。正常細胞は、成熟に至るまで、また損傷または死滅した細胞の補充に必要な場合に限り分裂（複製）する。がん細胞は、永久に分裂し、最終的に近傍の細胞を締め出し、身体の他の部分に広がるので、しばしば「悪性」と呼ばれる。悪性のがん細胞は、結局は血流またはリンパ系を介して身体の他の部分に転移および拡散し、そこで増殖し、新たな腫瘍を形成し得る。悪性腫瘍は、癌腫（上皮性前駆細胞から生じる）、肉腫（主として間葉組織から生じる）、およびリンパ腫（赤血球および白血球の前駆体から生じる）に類別される。
【００４２】
増大した野生型Ｒａｓの存在または変異したＲａｓタンパク質の存在を特徴とするがんは、本発明による治療の影響を受けやすい。そうしたがんには、ヒトリンパ腫、肉腫、および癌腫、たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、リンパ管内皮肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸直腸（たとえば、結腸）癌、胃腸（たとえば、胃）がん、膵臓がん、甲状腺がん（たとえば、濾胞性、乳頭状、および未分化甲状腺癌）、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、精巣腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、たとえば、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病）を包含する白血病、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ球性白血病）（ＣＬＬ）、真性多血症、リンパ腫（たとえば、ホジキン病、非ホジキン病、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫を包含する）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに重鎖病が含まれる。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明は、腎癌、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸（たとえば、結腸）がん、ＮＳＣＬＣ、卵巣がん、肝細胞（肝）がん、甲状腺がん、精上皮腫、皮膚がん、子宮内膜がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、前立腺がん、膀胱および泌尿器のがん、乳がん、ならびにこれら原発腫瘍の脳転移、原発性脳がん（神経膠腫や神経芽細胞腫など）、および頭頸部がんに罹患している患者の治療に使用する。たとえば、Ｂｏｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：４６８２〜８９（１９８９）を参照のこと。
【００４４】
ＲａｓアンタゴニストとＨＤＡＣ阻害剤との組合せは、単独で使用しても、または他の治療剤、たとえば、生物学的抗がん剤（たとえば、抗体）、化学療法、および放射線と共に使用してもよい。この組合せは、一次治療戦略として、たとえば、がんが転移しているかいないかにかかわらず、新たに診断されたがん患者における初回の治療として、使用することができる。この組合せはまた、二次治療戦略として、たとえば、少なくとも１種の他の薬剤を使用して以前に治療を受けたことがあるが、以前の（１種または複数の）薬剤に反応しなかった、またはそれに対して抵抗性が出てしまい、そのため、はっきりとわかる治療有効性が実現できる前に治療を終了する結果となってしまった可能性もあるがん患者の治療において使用することもできる。
【００４５】
ここで、本発明の実施形態について、以下の非限定的な実施例によって説明する。
【００４６】
［実施例１：異なる３種類のがん細胞においてＦＴＳとＶＰＡの相乗効果を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験］
−細胞系−
発がん性Ｋ−Ｒａｓを発現するヒトＡ５４９非小細胞肺癌細胞（ＣＣＬ−１８５、ＡＴＣＣ）は、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充したＫａｉｇｈｎ変法ハムＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ）で維持した。
【００４７】
同じく発がん性Ｋ−Ｒａｓを発現する、ヒト結腸腺癌細胞であるＤＬＤ１およびＳＷ−４８０は、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭで培養した。
【００４８】
野生型Ｋ−Ｒａｓが慢性的に活性であり、Ｂ−Ｒａｆが構成的に活性である、甲状腺癌細胞ＡＲＯは、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【００４９】
細胞はすべて、９５％の空気および５％のＣＯ２の加湿雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。
【００５０】
−薬物の調製−
ＦＴＳは、Ｒｏｔｂａｌｔ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４３９：４６７〜８９（２００８）に従前から記載されているとおりに調製した。
【００５１】
ＶＰＡは、４℃で粉末として貯蔵し、各実験の前に秤量し、細胞培地で希釈して所望の濃度とした。
【００５２】
ＳＡＨＡは、ＤＭＳＯで５ｍＭの濃度に再構成し、１０μｌの保存液に分け、４℃で貯蔵した。各実験では、１つの保存液を、細胞培地を使用して所望の濃度に希釈した。
【００５３】
増殖アッセイ
細胞の生存を判定するために、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ１細胞、ＳＷ−４８０細胞、およびＡＲＯ細胞を、２４ウェルプレートに１ウェルあたり８×１０３細胞の密度で播いた。２４時間後、０．１％Ｍｅ２ＳＯ４（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、フロリダ州フォートローダーデール）に溶解させたＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ）、ＳＡＨＡ（Ａｌｅｘｉｓ）、もしくはＦＴＳ、またはＦＴＳとＶＰＡの組合せ、またはＦＴＳとＳＡＨＡの組合せで、細胞を指定の時間処理した。対照細胞は、０．１％Ｍｅ２ＳＯ４で処理した。３日より長いインキュベート時間の場合、細胞を分離し、カウントし、１０ｃｍプレートあたり３×１０５細胞の密度で播き直した。以下は、異なる細胞系で使用したＶＰＡ、ＳＡＨＡ、およびＦＴＳの濃度である。
【表１】
2013508458.tif 000006
【００５４】
トリパンブルーを使用して生細胞を直接カウントすることにより、細胞成長を推定した。実験は、４通りに２回実施した。
【００５５】
−蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）分析−
Ａ５４９細胞、ＤＬＤ１細胞、およびＡＲＯ細胞（１０ｃｍプレートあたり４×１０５細胞）を２４時間播いておき、次いで、１０％のＦＣＳを含有する培地においてＶＰＡおよびＦＴＳと共にさらに７２時間インキュベートした。次いで細胞を収集し、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、０．１％のクエン酸ナトリウム、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（ＢＤＨ、英国プール）を含有するＰＢＳに再懸濁し、暗所にて４℃で一晩インキュベートした。
【００５６】
次いで細胞を蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州ロサンゼルス）による分析にかけた。実験は２通りに２回実施した。
【００５７】
−ウエスタンブロット解析−
ＦＴＳが培養細胞のタンパク質レベルに与える効果を調べるために、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ１細胞、およびＡＲＯ細胞を１０ｃｍプレートあたり４×１０５細胞の密度で播き、２４時間成長させた。次いで、０．１％Ｍｅ２ＳＯ４（対照）、ＦＴＳ、ＶＰＡ、ＳＡＨＡ、ＶＰＡとＦＴＳの組合せ処理、またはＦＴＳとＳＡＨＡの組合せ処理により、細胞を７２時間処理した。次に、３００μｌのホモジナイズ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ４０、１ｍＭのＤＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤）に細胞を溶解させ、４℃で１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を集めた。等しい量のタンパク質（１レーンあたり５０〜１００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ウサギ抗サイクリンＤ１（１：１，０００）、マウス抗ｐａｎ−Ｒａｓ抗体Ａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ウサギ抗サバイビンＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）、およびウサギ抗β−チューブリンＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫ブロットにかけた。次いでブロットを適切なペルオキシダーゼ結合二次ＩｇＧ（１：５，０００）に暴露し、強化化学発光にかけた。Ｚｕｎｄｅｌｅｖｉｃｈら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３１：３１（２００７）。ＴＩＮＡ２．０ソフトウェア（Ｒａｙ  Ｔｅｓｔｓ）を使用する濃度測定によって、タンパク質バンドを定量化した。
【００５８】
−免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察−
１０ｃｍプレートに配置されたガラスカバースリップ上にＡ５４９細胞を４×１０５細胞／プレートの密度で２４時間播いておいた後に、０．１％のＭｅ２ＳＯ４、７５μＭのＦＴＳもしくはＶＰＡを０．８ｍＭ、またはＶＰＡ＋ＦＴＳを加えてさらに２４時間または７２時間おいた。その後、細胞を室温で３０分間ホルムアルデヒド固定し、次いで０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、スライドを、２００μｇ／ｍＬの無処置ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有する１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に３０分間浸漬し、次いで、ウサギ抗オーロラＡ（１：５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンヴァーズ）、抗オーロラＢ（１：５０、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ、テキサス州Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、またはマウス抗ホスホ−Ｈ３（１：５０、Ｕｐｓｔａｔｅ、バージニア州シャーロッツヴィル）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、細胞をヤギ抗マウスＣｙ３結合Ａｂまたはロバ抗ウサギＣｙ２結合Ａｂ（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、抗α−チューブリンＦＩＴＣ  Ａｂ（１：５０、ｓｉｇｍａ、Ｆ２１６８）と共に室温で１時間さらにインキュベートした。最後に、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、ＣＨ９４７０）で対比染色し、ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ顕微鏡を用いた拡大率６０倍での蛍光顕微鏡観察によって調べた。
【００５９】
−全ＲＮＡ精製−
Ａ５４９細胞を７５μＭのＦＴＳ、０．８ｍＭのＶＰＡ、０．１％のビヒクル（対照）、または７５μＭのＦＴＳプラス０．８ｍＭのＶＰＡのいずれかで７２時間処理した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）に収められているプロトコールおよび試薬を使用して、培養細胞から全ＲＮＡを単離した。分光光度計において２６０ｎｍ（Ａ２６０）で吸光度を測定することにより、ＲＮＡサンプルの濃度を決定した。精製したＲＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水中にて−７０℃で貯蔵した。この精製ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲに使用した。
【００６０】
−リアルタイムＰＣＲ分析−
Ｖｅｒｓｏ（商標）ＲＴ−ＰＣＲキット（ＡＢｇｅｎｅ）を使用して、全ＲＮＡ（１μｇ）の抽出物を総体積２０μＬで逆転写した。次いで、１μＬのｃＤＮＡサンプルをリアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ  Ｐｌｕｓ  ＲＯＸ  Ｖｉａｌ、ＡＢｇｅｎｅ）に使用した。使用したプライマーは、サバイビン、ＡｕｒＫ−Ａ、およびＮｕＳａｐ遺伝子、ならびにハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨをターゲットとするものとした。これら実験に使用するプライマー配列を以下の表に示す。
【表２】
2013508458.tif 000007
【００６１】
−統計解析−
データは、平均±ＳＤとして表示する。平均値の差の統計的有意性を、一方向ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙ事後検定で評価した。Ｐ値≦０．０５を有意であるとみなした。
【００６２】
−結果−
ＶＰＡおよびＦＴＳは、Ｒａｓ経路が活発な細胞の成長を相乗的に抑制する。
【００６３】
ＶＰＡとＦＴＳの併用処理が細胞の成長および死滅に及ぼす効果を調べるために、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ１細胞、およびＡＲＯ細胞を、２種の阻害剤のそれぞれ、およびその組合せと共に、またはこれらなしでインキュベートした。細胞を阻害剤と共に７２時間インキュベートし、次いで画像処理し、直接カウントした。阻害剤のそれぞれにより、細胞数が有意に減少し、組合せでは、ＶＰＡまたはＦＴＳ単独よりもはるかに大きく細胞数が減少した（図１）。詳細には、Ａ５４９細胞において、細胞数は、阻害剤それぞれ単独で５０％の減少となり、組合せにより９０％の減少となった。ＤＬＤ１細胞およびＡＲＯ細胞でも同様の結果が得られた（図１）。これらの結果は、ＨＤＡＣ阻害剤およびＲａｓ阻害剤が、Ｒａｓ経路が活発な細胞において細胞成長の協調的な阻害を発揮したことを示唆した。
【００６４】
予想外に、このような細胞、たとえば、Ａ５４９（図２Ａ）およびＤＬＤ１（図２Ｂ）を７２時間（５日）より長い期間阻害剤と共にインキュベートしたとき、顕著な成長抑制効果が観察された。ＶＰＡまたはＦＴＳで処理した細胞は、対照と比べて相対的にゆっくりとしたペースで成長し続けたが、２種の阻害剤で一緒に処理した細胞は、驚くべきことに成長が止まり、完全に成長が停止した（図２Ａおよび２Ｂ）。さらに、ＶＰＡプラスＦＴＳで処理した細胞（７２時間の処理）のＦＡＣＳ解析では、Ｓ期の細胞の相乗的な減少が示された（図２Ｃ）。
【００６５】
したがって、本発明者らは、Ｒａｓ経路が活発なＮＳＣＬＣ細胞の成長を抑制するのに、ＶＰＡとＦＴＳが相乗的に働くと結論付けた。
【００６６】
ＶＰＡおよびＦＴＳは、Ａ５４９細胞およびＤＬＤ１細胞においてサバイビンを相乗的に下方制御する
次に、本発明者らは、ＲａｓおよびＲａｓの既知の下流ターゲットに対するＶＰＡとＦＴＳの併用効果について調べた。Ａ５４９細胞およびＤＬＤ１細胞を、ＶＰＡまたはＦＴＳ単独で、または両方の薬物で７２時間処理した。次いで、Ｒａｓ、サイクリンＤ１、およびサバイビンタンパク質のレベルにこの処理が与える影響を、特異的Ａｂを用いるウエスタン免疫ブロット法によって明らかにした。サバイビンは、いくつかのカスパーゼに対する阻害作用を通して抗アポトーシス性の因子として、ならびに紡錘体との関連を通して細胞周期の進行に重要な因子として作用することがわかっている。Ｂｌｕｍら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５：２３３７〜４７（２００６）、Ｄｅｌａｃｏｕｒ−Ｌａｒｏｓｅら、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ（Ｐａｒｉｓ）２４：８２８〜３２（２００８）。サバイビンは、オーロラＢ、ＩＮＣＥＮＰ、およびボレアリンも含んでいる染色体パッセンジャー複合体（ＣＰＣ）の重要なサブユニットであるとみなされる。Ｒｕｃｈａｕｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：７９８〜８１２（２００７）。ＣＰＣ複合体は、有糸分裂における重要な側面を制御する。Ｖａｇｎａｒｅｌｌｉ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １１３：２１１〜２２（２００４）。サイクリンＤ１は、細胞が細胞周期のＳ期に入るのに不可欠である。サイクリンＤ１は、活発に増殖する細胞において細胞周期の調節スイッチとして働く。Ｓｔａｃｅｙ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（２）：１５８〜６３（２００３）。
【００６７】
これらの実験の典型的な結果（図３Ａ）では、Ａ５４９細胞およびＤＬＤ１細胞において、ＲａｓおよびサイクリンＤ１のレベルが、ＦＴＳによって有意に低下したが、ＶＰＡでは低下しなかったことが示された。これらの結果は、ＦＴＳの既知の抗Ｒａｓ活性と矛盾していない。Ｅｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２：４２７〜３６（２００６）、Ｂｌｕｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１９：５２７〜３８（２００６）。ＶＰＡは、それ自体ではＲａｓおよびサイクリンＤ１のレベルに影響を及ぼさない（図３Ａ）。しかしながら、Ｒａｓ、サイクリンＤ１、およびサバイビンに対する併用処理の効果は、いずれかの薬物単独の効果より明らかに強かった（図３Ａ）。従前の研究では、ＦＴＳによってＲａｓが阻害されると、Ｒａｓ依存的なＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路が阻害されて、活性Ｒａｓを示す細胞においてサイクリンＤ１のプロテアソーム分解が増強されるために、サイクリンＤ１タンパク質が下方制御されたことが示されている。Ｅｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２：４２７〜３６（２００６）、Ｂｌｕｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１９：５２７〜３８（２００６）。これにより、Ａ５４９およびＤＬＤ１細胞においてＲａｓおよびサイクリンＤ１の減少が認められたことの説明がつく。同様に、本発明者らは、Ｒａｓが、神経膠芽腫においてサバイビンの転写をプラス方向に調節することも示していた。Ｂｌｕｍら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５：２３３７〜４７（２００６）。Ｒａｓによるサバイビン発現のプラス方向への制御は、ＦＴＳで処理した細胞においてサバイビンｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルが低下することに現れるように、ＦＴＳによって（またはドミナントネガティブＲａｓによって）緩められる場合がある。Ｂｌｕｍら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５：２３３７〜４７（２００６）。この結果は、Ａ５４９およびＤＬＤ１において、サバイビンタンパク質レベルがＦＴＳによって同様に激しく低下することを示している（図３Ａ）。この結果は、少なくとも、２種の薬物が、細胞成長サイクルに加えて、関連のない細胞経路にも影響を及ぼすという観点から、予想外であった。
【００６８】
ＶＰＡおよびＦＴＳは、Ａ５４９細胞においてオーロラキナーゼＡ転写を相乗的に阻害し、有糸分裂をブロックする
サバイビンのレベルにおいてＶＰＡとＦＴＳの非常に強力な相乗効果が検出された。２種の薬物の存在下では、細胞系のいずれにおいてもサバイビンタンパク質を検出することができなかった（図３Ａ）。実際に、サバイビンｍＲＮＡを測定するＲＴ−ＰＣＲでは、サバイビン転写物のレベルの低減においてＶＰＡとＦＴＳの強力な相乗作用が示された（図３Ｂ）。これは、サバイビン転写の阻害、または小分子ＲＮＡにより媒介されるｍＲＮＡ安定性の低下の結果であるとすることができるであろう。
【００６９】
これらのデータは、観察された、サバイビンを完全に消失させるＦＴＳとＶＰＡの相乗効果が、２種の薬物の存在下で認められた細胞周期停止（図２Ａ）と関連付けられることを示唆している。本発明者らは、サバイビンの消失は、主として有糸分裂に欠陥を生じさせると仮定した。したがって、本発明者らは、阻害剤と共に７２時間インキュベートしたＡ５４９細胞において、ＶＰＡ、ＦＴＳ、およびこれら組合せがオーロラＡ発現に与える影響を調べた（図４）。ＶＰＡ単独では、オーロラＡ発現に対する阻害効果は非常に小さく（１０％±１０）、ＦＴＳは、５７％±７の阻害というより強い効果を示し、ＶＰＡとＦＴＳの組合せは、オーロラＡ発現を相乗的に完全にブロックした（９６％±１．５の阻害、図４）。
【００７０】
これらの結果に照らして、本発明者らは次いで、薬物の分裂中期細胞に対する影響を、三重蛍光共焦点顕微鏡法を使用し、染色体（Ｈｏｅｃｈｓｔで標識、青色蛍光）、オーロラＡ（抗オーロラＡ  ＡｂおよびＣｙ３−Ａｂ、赤色蛍光）、およびこれらの細胞において紡錘極の強力な標識となるα−チューブリン（ＦＩＴＣ標識抗α−微小管Ａｂ、緑色蛍光）を検出して調べた。これらの実験および後続の実験では、細胞を薬物と共に２４時間インキュベートして、Ｍ期細胞の検出が可能になるようにした。対照細胞について本発明者らが得た画像（図示せず）は、先の報告（Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：１３８８〜９７（２００８））と合致する。すなわち、画像は、紡錘体赤道面上に整列した典型的な中期染色体（青色）を示し、オーロラＡが紡錘極に局在化していることがわかる。ＶＰＡのみでの処理では、紡錘極におけるオーロラＡのレベルに対する効果が相対的に存在せず（１５％±１０の低下、ｎ＝３０、ｐ＞０．０５）、ＦＴＳ処理ではより強い効果が示され（６０％±１２の低下、ｎ＝３０、ｐ＜０．００１）、併用処理では、紡錘極においてオーロラＡがほぼ完全に消失する結果となった（９５％±６の低下、ｎ＝３０、ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＲＴ−ＰＣＲデータ（図４）と一致している。さらに、以前の研究であるＶａｄｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７８６：６０〜７２（２００８）とも合致して、画像は、分裂中期の対照細胞の染色体が紡錘極の中間に局在化し、紡錘極は、オーロラＡと共局在することを実証している。薬物処理により、こうした構造は破壊されなかったが、オーロラＡのレベルが低下し、またはオーロラＡが完全に消失した。オーロラＡは、正確な二極の紡錘構築に不可欠であるので、これらの結果は、ＶＰＡおよびＦＴＳの存在下で認められた完全な成長停止（図２Ａ）と整合性がある。
【００７１】
ＶＰＡおよびＦＴＳは、オーロラキナーゼＢ発現およびヒストン−Ｈ３リン酸化を相乗的にブロックする
オーロラＢは、分裂中期の間、動原体に局在化し、異常なオーロラＢ発現は、有糸分裂に不可欠であるホスホヒストン−Ｈ３（ｓｅｒ１０）レベルの低下と同時に起こる。Ｖａｄｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７８６：６０〜７２（２００８）。ＦＴＳ処理したＡ５４９細胞（７５μＭのＦＴＳで７２時間）における本発明者らの以前の遺伝子プロファイリング分析（Ｂｌｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：３３２０〜８（２００７））では、オーロラＢ発現の減少が示されている。他の研究では、ＨＤＡＣ阻害剤が、オーロラＢのレベルを低下させたことが示されている。Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：１３８８〜９７（２００８）。したがって、本発明者らは次に、Ａ５４９細胞においてＶＰＡおよびＦＴＳがオーロラＢおよびホスホヒストンＨ３（ｓｅｒ１０）レベルに与える合算した影響について調べた。三重蛍光共焦点顕微鏡法を使用して、染色体（Ｈｏｅｃｈｓｔで標識、青色蛍光）、オーロラＢ（抗オーロラＢ  ＡｂおよびＣｙ３標識Ａｂ、赤色蛍光）、およびホスホヒストンＨ３（ｓｅｒ  １０）（抗ホスホヒストンＨ３（ｓｅｒ  １０）ＡｂおよびＣｙ２標識Ａｂで標識、緑色蛍光）を検出した（写真は示さず）。本発明者らは、２４時間の処理の後、ＶＰＡによってオーロラＢ（３０％±８の阻害）およびホスホヒストンＨ３が減少し、ＦＴＳによってオーロラＢが３０％±７阻害されたことを見出した。予想外に、併用処理によって、オーロラＢが完全に消失した（９０％±５の阻害）。先の研究と合致して、オーロラＢレベルの低下には、染色体濃度の低下が伴った。Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：Ｒ４５８〜６０（２００２）、Ｖａｓら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ７：２９３〜６（２００８）。
【００７２】
ＦＴＳ処理したＡ５４９細胞における有糸分裂の欠陥
次に、本発明者らは、薬物により長い時間（７２時間）暴露したＡ５４９細胞において、ＦＴＳがオーロラＢに与える影響を調べた。細胞を上記に詳述したように標識し、次いで三重蛍光共焦点顕微鏡法を使用して画像処理した。上記で指摘したように、Ｍ期細胞で検出したとき、薬物で２４時間処理した細胞において、ＦＴＳは、オーロラＢに対して３０％の効果を示した（写真は示さず）。本発明者らは、ＦＴＳ  ７２時間後のＭ期細胞を調べた際、以前の遺伝子プロファイリング分析と一致する、オーロラＢの激しい減少（６０％±７、示さない）を見出した。Ｂｌｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：３３２０〜８（２００７）。さらに、本発明者らは、細胞質分裂の間のオーロラＢの局在化に対するＦＴＳの強力な効果を検出した。従前の実験（Ｔｅｒａｄａ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２６：６５３〜７（２００１））と一致して、分裂終期の対照細胞は、α−チューブリンを標識とする紡錘中央体を示し、そこにオーロラＢも局在化していた。それに著しく反して、ＦＴＳ処理した細胞では、オーロラＢが中央体からは完全に誤った場所に局在化した（写真は示さず）。これらの結果から、ＦＴＳの長期間の効果は、オーロラＢが誤った場所に局在化して正しく完了し得ない、細胞質分裂の欠陥としても現れることがまた示された。Ｋｏｌｌａｒｅｄｄｙら、Ｂｏｍｅｄ．Ｐａｐ．Ｍｅｄ．Ｆａｃ．Ｕｎｉｖ．Ｐａｌａｃｋｙ  Ｏｌｏｍｏｕｃ  Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂ．１５２：２７〜３３（２００８）。対照Ｍ期細胞の正常な紡錘構造とは異なり、ＦＴＳ処理したＭ期細胞の紡錘体は、不完全であった（図示せず）。さらに、Ｇ２期のＦＴＳ処理細胞では、ビヒクル処理した対照の正常な二極紡錘構造とは対照的に、三極の紡錘体が検出された（図示せず）。こうした条件下（ＦＴＳで７２時間）では、細胞が完全に成長を阻止されたので、本発明者らは、ＶＰＡとＦＴＳの複合効果を検出することができなかった。
【００７３】
最近の実験では、核小体および紡錘体関連タンパク質（ＮｕＳＡＰ）が、有糸分裂の紡錘体編成に関与する新規の微小管関連タンパク質であることが示されている。Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１３５：５８３〜９０（２００６）、Ｒｉｂｂｅｃｋら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１７：２３０〜６（２００７）。実際に、ＮｕＳａｐに対するｓｉＲＮＡは、正常な紡錘体の形成を妨害している。Ｒａｅｍａｅｋｅｒｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６２：１０１７〜２９（２００３）。したがって、本発明者らは、Ａ５４９細胞においてＶＰＡとＦＴＳの組合せがＮｕＳＡＰ転写のレベルに与える影響を調べた。図５に示すように、ＶＰＡ単独では弱い効果しか示されず（１０％±１０の阻害）、ＦＴＳ単独は効果が強く（６６％±８阻害）、併用処理によりＮｕＳＡＰ発現がほぼ完全に阻害された（９５％±１の阻害）。これらの結果は、ＶＰＡとＦＴＳの組合せがサバイビンおよびオーロラキナーゼの減少において相乗作用を示したという所見に加えて、併用処理によって、観察された細胞成長停止を説明付ける分裂期細胞死が導かれることを示唆している（図２Ａ）。
【００７４】
ＳＡＨＡおよびＦＴＳは、Ａ５４９およびＳＷ−４８０細胞系の成長を相乗的に抑制する
本発明者らは、Ａ５４９およびＳＷ−４８０細胞でＳＡＨＡプラスＦＴＳ処理の組合せについて調べた。細胞を、これらの薬剤それぞれと共に、または薬剤なしで、またこれらの組合せと共に７２時間インキュベートし、次いで画像処理し、直接カウントした（写真は示さず）。阻害剤それぞれにより、細胞数が有意に減少した。組合せにより、ＳＡＨＡまたはＦＴＳ単独よりも、細胞数がはるかに大きく減少した。これらの結果は、ＦＴＳの相乗効果が、他の異なるＨＤＡＣ阻害剤とでも実現できることを示唆している。
【００７５】
細胞を阻害剤と共に７２時間より長時間インキュベートしたとき、ＳＡＨＡ単独での処理により、著しい成長抑制効果がもたらされたが、細胞は非常にゆっくりとしたペースで成長し続けた。併用処理した細胞は、成長が止まり、完全に成長が停止した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＳＡＨＡでの処理はアポトーシスを高めたので、ＳＡＨＡプラスＦＴＳ処理の機序は、ＶＰＡプラスＦＴＳの機序とはやや異なるように思われる。併用処理した細胞では、２種の集団、すなわち、アポトーシス細胞からなる第一の集団、およびアポトーシスを免れ、完全に成長が停止した細胞からなる第二の集団が観察された。
【００７６】
次に、本発明者らは、Ａ５４９細胞系において、ＳＡＨＡとＦＴＳの併用処理がサバイビンおよびオーロラＡタンパク質レベルに与える効果を調べた。ＳＡＨＡ処理により、オーロラＡおよびサバイビンが減少した（データは示さない）。ＳＡＨＡプラスＦＴＳの併用処理により、オーロラＡタンパク質レベルはより大きく減少し、サバイビンタンパク質レベルはＳＡＨＡ単独での処理と同様に減少した。
【００７７】
［実施例２：ＦＴＳ（２００ｍｇ）およびバルプロ酸ナトリウム（２３０ｍｇ、ＶＰＡ  ２００ｍｇに相当）を含有する錠剤］
ＦＴＳ活性医薬成分（２．０ｋｇ）、バルプロ酸ナトリウム活性医薬成分（２．３ｋｇ）、微結晶性セルロース（２．０ｋｇ）、クロスカルメロースナトリウム（０．２ｋｇ）、およびステアリン酸マグネシウム（０．１ｋｇ）を均質に混和し、打錠機で錠剤に圧縮する。材料の移動、ならびに打錠機の始動、調整、および停止での５％の損失を想定し、ＦＴＳ（２００ｍｇ）およびバルプロ酸ナトリウム（２３０ｍｇ）を含有する、およそ９，５００錠が得られる。
【００７８】
［実施例３：ＦＴＳ（１００ｍｇ）およびバルプロ酸ナトリウム（２３０ｍｇ、ＶＰＡ  ２００ｍｇに相当）を含有する硬ゼラチンカプセル剤］
ＦＴＳ活性医薬成分（１．０ｋｇ）、バルプロ酸ナトリウム（２．３ｋｇ）、微結晶性セルロース（２．０ｋｇ）、クロスカルメロースナトリウム（０．２ｋｇ）、およびステアリン酸マグネシウム（０．１ｋｇ）を均質に混和し、カプセル化装置で硬ゼラチンカプセルに充填する。材料の移動、ならびにカプセル化装置の始動、調整、および停止での５％の損失を想定し、およそ９，５００カプセルが得られる。
【００７９】
［実施例４：ＦＴＳ（１００ｍｇ）およびボリノスタット（１００ｍｇ）を含有する硬ゼラチンカプセル］
ＦＴＳ活性医薬成分（２．０ｋｇ）、ボリノスタット活性医薬成分（２．０ｋｇ）、微結晶性セルロース（２．０ｋｇ）、クロスカルメロースナトリウム（０．２ｋｇ）、およびステアリン酸マグネシウム（０．１ｋｇ）を均質に混和し、カプセル化装置で硬ゼラチンカプセルに充填する。材料の移動、ならびにカプセル化装置の始動、調整、および停止での５％の損失を想定し、およそ１９，０００カプセルが得られる。
【００８０】
［実施例５：ＦＴＳ（１００ｍｇ）およびＶＰＡ（１００ｍｇ）を含有する軟ゼラチンカプセル］
ＦＴＳ活性医薬成分（２．０ｋｇ）およびＶＰＡ活性医薬成分（２．０ｋｇ）をトウモロコシ油（４．０ｋｇ）に溶解させ、撹拌して均質な溶液とした。製袋−充填−シールカプセル化機で軟ゼラチンカプセルに溶液を充填する。材料の移動、ならびに軟ゼラチンカプセル化装置の始動、調整、および停止での５％の損失を想定し、ＦＴＳ（１００ｍｇ）およびＶＰＡ（１００ｍｇ）を含有する、およそ１９，０００カプセルが得られる。
【００８１】
すべての特許刊行物および非特許刊行物は、本発明が属する分野の技術者の技量のレベルを示唆する。これらの刊行物はすべて、個々のそれぞれの刊行物について引用することにより本明細書の一部をなすものとすると明確かつ個別に指摘した場合と同じく、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００８２】
本明細書では本発明について特定の実施形態に関して述べてきたが、それらの実施形態は、単に本発明の原理および応用の具体例に過ぎないことを理解されたい。したがって、その具体例となる実施形態に数多くの変更を加えてもよいこと、ならびに添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、他の計画を考案してもよいことを理解されたい。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【国際調査報告】
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