(57)【要約】本発明は、ＰＰＡＲガンマリン酸化（例えば、ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体（ヒトを含む）中の対応するセリン残基）の調整により、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するための方法および組成物を提供する。このようなＰＰＡＲガンマリン酸化の選択的抑制による被験体における代謝障害のための治療の応答性を防止し、処置し、または予測するための方法も提供される。さらに、このようなＰＰＡＲガンマリン酸化を調整し得る化合物を同定するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）前記ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡガンマ２相同体中の対応するセリン残基を含む試料を試験化合物と接触させること；そして
ｂ）ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅ−２７３リン酸化を抑制する試験化合物の能力を確定すること、それにより、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化を選択的に抑制する化合物を同定すること
を包含する方法。
【請求項２】
試料がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析し、そして対照に対する比率を比較することにより確定される請求項１記載の方法。
【請求項４】
対照が標準条件下でのロシグリタゾンによる処置からの比率である請求項３記載の方法。
【請求項５】
試験化合物が、前記ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基と直接的に結合するか否かを確定するステップをさらに包含する請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＰＰＡＲガンマを結合し、そして一細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）化合物がＰＰＡＲガンマを結合するか否かを確定すること；そして
ｂ）試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること
（ここで、
第二試料に比して、第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または
第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す）
を包含する方法。
【請求項７】
細胞型が、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
第一および／または第二試料が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
第一および／または第二試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項６記載の方法。
【請求項１０】
第一および／または第二試料が、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項１１】
第一および第二試料が一被験体から得られる単一試料の部分である請求項６記載の方法。
【請求項１２】
第一および第二試料が一被験体から得られるプール試料の部分である請求項６記載の方法。
【請求項１３】
第二試料が、試験化合物の非存在下で保持される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む請求項６記載の方法。
【請求項１４】
第二試料が、ロシグリタゾンで処置される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む請求項６記載の方法。
【請求項１５】
有意に高い量および／または活性が、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％上方調節することを包含する請求項６記載の方法。
【請求項１６】
有意に低い量および／または発現が、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％下方調節することを包含する請求項６記載の方法。
【請求項１７】
マーカーの量が比較される請求項６記載の方法。
【請求項１８】
マーカーの量がマーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
試薬が、ＰＰＡＲガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスｃｄｋ５リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を含む請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
検出のステップが、転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
試料中のマーカーの発現のレベルが、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
マーカーがネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ｓｅｒ−２７３である請求項６記載の方法。
【請求項２７】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項２８】
ＰＰＡＲガンマが配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む請求項６記載の方法。
【請求項２９】
被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害を選択的に促進するためのＰＰＡＲガンマを結合する化合物の効力の査定方法であって、以下の：
ａ）マーカー（ここで、マーカーは表１または２に列挙されたマーカーである）の量および／または活性を、第一の時点で被験体において検出すること；
ｂ）化合物の投与後の少なくとも１つのその後の時点の間、ステップａ）を反復すること；そして
ｃ）ステップａ）およびｂ）で検出された量および／または活性を比較すること
（ここで、
少なくとも１つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性は、試験化合物がその被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または
少なくとも１つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性は、試験化合物がその被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す）
を包含する方法。
【請求項３０】
被験体が代謝障害のための処置を受け、代謝障害のための処置を完了し、および／または第一時点とその後の時点との間で代謝障害から寛解している請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
細胞型が、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料が、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料が、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料がその被験体から得られる単一試料の一部分である請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料がその被験体から得られるプール試料の一部分である請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
ロシグリタゾンを用いるステップａ）およびｂ）をさらに包含する請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
ロシグリタゾンによる処置の結果が試験化合物からの結果と比較される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
有意に高い量および／または活性が、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％上方調節することを包含する請求項２９記載の方法。
【請求項４０】
有意に低い量および／または発現が、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％下方調節することを包含する請求項２９記載の方法。
【請求項４１】
マーカーの量が比較される請求項２９記載の方法。
【請求項４２】
マーカーの量がマーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
試薬が、ＰＰＡＲガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスｃｄｋ５リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
検出のステップが、転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
試料中のマーカーの発現のレベルが、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
マーカーがネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ｓｅｒ−２７３である請求項２９記載の方法。
【請求項５１】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項５２】
ＰＰＡＲガンマが配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む請求項２９記載の方法。
【請求項５３】
代謝性疾患に苦しむ被験体の治療方法であって、ＰＰＡＲガンマを結合し、抗糖尿病活性を選択的に促進する化合物を被験体に投与し、それにより代謝性疾患に苦しむ被験体を治療することを包含する方法。
【請求項５４】
前記化合物が、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
化合物が製薬上許容可能な処方物中で投与される請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
製薬上許容可能な処方物が経口処方物である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
化合物が小分子である請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
ＰＰＡＲガンマを結合し、そして一細胞型における抗代謝障害活性を選択的に促進することによる代謝障害の処置するための化合物であって、化合物がＰＰＡＲガンマ上のＳｅｒ−２７３のリン酸化を抑制する化合物。
【請求項５９】
ロシグリタゾンのＰＰＡＲガンマアゴニスト機能の３０％未満を有する請求項５８記載の化合物。
【請求項６０】
１〜２００ｎＭ未満のＰＰＡＲガンマに関するＥＣ５０結合親和性を有する請求項５８記載の化合物。
【請求項６１】
同一条件下でロシグリタゾンに比して表１に列挙されたマーカーの発現を少なくとも３０％上方調節するか、および／または同一条件下でのロシグリタゾンに比して表２に列挙されたマーカーの発現を少なくとも３０％下方調節する請求項５８記載の化合物。
【請求項６２】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項５８記載の化合物。
【請求項６３】
ｍ−ベンジルインドール、ＭＲＬ−２０、ＭＲＬ−２４、ｎＴＺＤｐａ、ＳＲ１４５、ＳＲ１４７、Ｍｂｘ−１０２、ＭＫ−０５３３およびＢＶＴ．１３からなる群から選択される請求項５８記載の化合物。
【請求項６４】
位置Ｓｅｒ−２７３に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ２ポリペプチド、あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体をコードする単離核酸分子、またはその相補体。
【請求項６５】
配列番号２または３で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ｓｅｒ−２７３の非リン酸化可能アミノ酸をコードする請求項６４記載の単離核酸分子、またはその相補体。
【請求項６６】
非相同ポリペプチドをさらにコードする請求項６４または６５記載の単離核酸分子。
【請求項６７】
請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６８】
発現ベクターである請求項６７記載のベクター。
【請求項６９】
請求項６８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７０】
タンパク質の産生方法であって、タンパク質が産生されるまで適切な培地中で請求項６９記載の宿主細胞を培養することを包含する方法。
【請求項７１】
培地または宿主細胞からタンパク質を単離することをさらに包含する請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
位置Ｓｅｒ−２７３に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ２ポリペプチドまたはネズミＰＰＡＲガンマ２ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体を含む単離タンパク質。
【請求項７３】
配列番号２または３で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ｓｅｒ−２７３の非リン酸化可能アミノ酸をコードする請求項７２記載の単離タンパク質。
【請求項７４】
非相同ポリペプチドと操作可能的に連結される請求項７２または７３記載の単離タンパク質。
【請求項７５】
Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基と特異的に結合される抗体またはその断片を産生する単離ハイブリドーマの製造方法であって、以下の：
ａ）Ｓｅｒ−２７３でリン酸化される前記ネズミＰＰＡＲガンマ２あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含む組成物を用いて哺乳動物を免疫化すること、；
ｂ）免疫化哺乳動物から脾細胞を単離すること；
ｃ）単離脾細胞を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成すること；そして
ｄ）その前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体の産生のために個々のハイブリドーマをスクリーニングして、ハイブリドーマを単離すること
を包含する方法。
【請求項７６】
請求項７５記載の方法に従ったハイブリドーマにより産生される抗体。
【請求項７７】
Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２のアミノ酸配列あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含むポリペプチドと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７８】
アミノ酸配列：ＫＴＴＤＫ（ｐＳ）ＰＦＶＩＹＤＣを有するエピトープを特異的に結合する請求項７７記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７９】
モノクローナル抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８０】
ポリクローナル抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８１】
キメラまたはヒト化抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８２】
検出可能的に標識される請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８３】
エフェクタードメインを含む請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８４】
Ｆｃドメインを含む請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８５】
一本鎖抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８６】
Ｆａｂ断片である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８７】
Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基を特異的に検出するための１つ以上の試薬を含むＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制する化合物の能力を査定するためのキット。
【請求項８８】
セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ２遺伝子を含む非ヒト動物モデル。
【請求項８９】
突然変異が非リン酸化可能アミノ酸への前記セリンの突然変異を含む請求項８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９０】
前記動物が、セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ２遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である特許請求の範囲８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９１】
動物がノックインまたはトランスジェニック動物である請求項８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９２】
動物が齧歯類および／またはマウスである請求項８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９３】
被験体において調節される遺伝子の同定方法であって、以下の：
（ａ）セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子を発現すること；
（ｂ）前記突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子の１つ以上の候補標的遺伝子の発現および／または活性のレベルを確定すること；そして
（ｃ）対照に比して有意に変更された発現および／または活性を示す遺伝子を同定すること
を包含する方法。
【請求項９４】
予測処置結果に従った試料の分類方法であって、以下の：
ａ）生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル；ならびに
ｂ）対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル
を比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表１および２に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が予測処置結果に従った生物学的試料を分類する方法。
【請求項９５】
予測処置結果を有すると思われる被験体の同定方法であって、以下の：
ａ）生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル；ならびに
ｂ）対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル
を比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表１および２に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして被験体からの生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が被験体における予測処置結果の見込みを予測する方法。
【請求項９６】
予測処置結果が表１および２に列挙された処置結果から選択される請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９７】
予測処置結果がグルコース感受性増大の見込みである請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９８】
組織試料が、ＰＰＡＲガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる請求項９４記載の方法。
【請求項９９】
生物学的試料が、ＰＰＡＲガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる請求項９５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互引照
本出願は、米国特許仮出願第６１／３３６，４８３号（２０１０年１月２２日出願）、米国特許仮出願第６１／３４１，４５５号（２０１０年３月３１日出願）および米国特許仮出願第６１／３９９，９７５号（２０１０年７月２１日出願）（これらの記載内容は、各々参照により本明細書中で援用される）の利益を請求する。
【０００２】
政府後援
本明細書中の研究は、国立衛生研究所により与えられた認可番号ＤＫ３１４０５下で支援された。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
代謝障害は、罹患率の危険および生活の質の損失を増大する健康障害または危険の集合物を含む。例えば、糖尿病、肥満症、例えば中心性肥満（腹部およびその周囲の不均衡脂肪組織）、アテローム性異常脂質血症（これらは、血中脂肪障害の一ファミリー、例えば高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロールおよび高ＬＤＬコレステロール（血管系、例えば動脈壁におけるプラーク形成を促し得る）を包含する）、高血圧（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、インスリン抵抗性または糖不耐性（インスリンまたは血糖を適正に使用できないこと）、慢性プロトロンビン状態（例えば、血液中の高フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン活性因子阻害剤−１レベルにより特性化）、ならびに慢性前炎症状態（例えば、血液中の高感受性Ｃ反応性タンパク質の正常より高いレベルにより特性化）はすべて、米国において５０００万人を超える人々を全体として苦しめている代謝障害である。さらに、代謝障害に苦しめられる人々の数は、年齢の上昇と相関しており、６０代および７０代の人々の４０％以上に影響を及ぼしている。
【背景技術】
【０００４】
このような代謝障害のための治療は存在するが、しかしそれらは一般的に、重症副作用を欠点として有する。例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）核内受容体転写因子のアゴニスト、例えばロシグリタゾンおよびピオグリタゾンは、米国および欧州における２型糖尿病の治療のために定期的認可を受けている。しかしながら、このようなチアゾリジンジオンおよび非チアゾリジンジオンＰＰＡＲガンマアゴニストにより引き起こされるかまたは悪化され得る副作用または症状、例えば体重増加、体液貯留、末梢性浮腫および肺浮腫は、このような化合物の臨床的有用性および安全性を制限する。したがって、代謝障害、例えば肥満素質、インスリン抵抗性、高血圧、異常脂肪血症等を治療するためのいくつかの戦略があるが、しかし、副作用を引き起こすかまたは悪化することなくこのような障害を制御するための分子的基礎は不明であり、これらの代謝障害の診断または予後に問題を生じさせ、そしてそれらを治療するための治療薬の設計を難しくする。したがって、経口的活性小分子のような診断、予後および治療用の作用物質の生成を含めた代謝障害の分子的調節因子を同定し、次いで、被験体における代謝障害を有効に治療するために、このような分子調節因子を調節することが、当該技術分野で大いに必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、少なくとも一部は、脂肪組織における脂質代謝の主要な調節因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）は、サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）（例えば、ＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化）により直接的にリン酸化されるという、ならびにこの共有的修飾が、本明細書中に記載されるような体重増加、肥満症、インスリン抵抗性およびその他の代謝障害と関連した遺伝子発現の病理学的パターンを引き起こすという発見を基礎にしている。さらに、本明細書中に記載されるように、ＰＰＡＲガンマのＳｅｒ−２７３リン酸化を直接的に抑制するＰＰＡＲガンマリガンドは、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト活性化とは無関係に、このような代謝障害を逆転し得る。したがって、ＰＰＡＲガンマ上のホスホ−Ｓｅｒ−２７３の特異的抑制は、代謝障害の診断、予後および治療の状況で、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストを用いて観察される望ましくない副作用、例えば糖尿病および肥満症を排除し得る。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する化合物の同定方法であって、前記ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡガンマ２相同体中の対応するセリン残基を含む試料を試験化合物と接触させること；そしてネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅ−２７３リン酸化を抑制する試験化合物の能力を確定すること、それにより、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化を選択的に抑制する化合物を同定することを包含する方法を提供する。一実施形態では、試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される。別の実施形態では、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化の抑制は、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析し、そして対照に対する比率（例えば、標準条件下でのロシグリタゾンによる処置からの比率）を比較することにより確定される。さらに別の実施形態では、当該方法は、試験化合物が、前記ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基と直接的に結合するか否かを確定するステップをさらに包含する。
【０００７】
別の態様では、ＰＰＡＲガンマを結合し、そして一細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する化合物の同定方法であって、化合物がＰＰＡＲガンマを結合するか否かを確定すること；そして試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること（ここで、第二試料に比して、第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するということを示し；および／または第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するということを示す）を包含する方法が提供される。一実施形態では、細胞型は、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される。別の実施形態では、第一および／または第二試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、第一および／または第二試料は代謝障害の動物モデルから得られる。さらに別の実施形態では、第一および／または第二試料は、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される。別の実施形態では、第一および第二試料は一被験体から得られる単一試料の部分である。さらに別の実施形態では、第二試料は、試験化合物の非存在下で保持される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む。さらに別の実施形態では、第二試料は、ロシグリタゾンで処置される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む。別の実施形態では、有意に高い量および／または活性は、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％上方調節することを包含する。さらに別の実施形態では、有意に低い量および／または発現は、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％下方調節することを包含する。さらに別の実施形態では、マーカーの量は比較され、例えば、この場合、マーカーの量は、（例えば、タンパク質と特異的に結合する試薬、例えば抗体、抗体誘導体および抗体断片、例えば、ＰＰＡＲガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスｃｄｋ５リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を用いて）マーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される。さらに別の実施形態では、試料中のマーカーの発現のレベルは、転写ポリヌクレオチドまたはその部分（例えばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の試料中の存在を検出すること（および／または転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する）により査定されるか、あるいは緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される。別の実施形態では、マーカーは、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ｓｅｒ−２７３である。さらに別の実施形態では、代謝障害は、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、ＰＰＡＲガンマは配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
さらに別の実施形態では、被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害を選択的に促進するためのＰＰＡＲガンマを結合する化合物の効力の査定方法であって、（ａ）マーカー（ここで、マーカーは表１または２に列挙されたマーカーである）の量および／または活性を、第一の時点で被験体において検出すること；（ｂ）化合物の投与後の少なくとも１つのその後の時点の間、ステップ（ａ）を反復すること；そして（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で検出された量および／または活性を比較すること（ここで、少なくとも１つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性は、試験化合物がその被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または少なくとも１つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性は、試験化合物がその被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す）を包含する方法が提供される。一実施形態では、被験体は、代謝障害のための処置を受け、代謝障害のための処置を完了し、および／または第一時点とその後の時点との間で代謝障害から寛解している。別の実施形態では、細胞型は、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、第一および／または少なくとも１つのその後の試料は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、第一および／または少なくとも１つのその後の試料は、代謝障害の動物モデルから得られる。別の実施形態では、第一および／または少なくとも１つのその後の試料は、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、第一および／または少なくとも１つのその後の試料は、その被験体から得られる単一試料の一部分である。さらに別の実施形態では、第一および／または少なくとも１つのその後の試料は、その被験体から得られるプール試料の一部分である。別の実施形態では、当該方法はさらに、例えば、試験化合物からの結果と比較するためにロシグリタゾンによる処置を用いるために、ロシグリタゾンを用いてステップａ）およびｂ）を実施することを包含する。さらに別の実施形態では、有意に高い量および／または活性は、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％上方調節することを包含する。さらに別の実施形態では、有意に低い量および／または発現は、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％下方調節することを包含する。さらに別の実施形態では、マーカーの量が比較され、この場合、マーカーの量は、（例えば、タンパク質と特異的に結合する試薬、例えば抗体、抗体誘導体および抗体断片、例えば、ＰＰＡＲガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスｃｄｋ５リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を用いて）マーカーのタンパク��発現のレベルを確定することにより確定される。さらに別の実施形態では、試料中のマーカーの発現のレベルは、転写ポリヌクレオチドまたはその部分（例えばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の試料中の存在を検出すること（および／または転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する）により査定されるか、あるいは緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される。別の実施形態では、マーカーは、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ｓｅｒ−２７３である。さらに別の実施形態では、代謝障害は、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、ＰＰＡＲガンマは、配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害を選択的に促進するためのＰＰＡＲガンマを結合する化合物の効力の査定方法は、対照を上回る抗代謝障害を促進するためのＰＰＡＲガンマを結合する化合物の効力を査定するためにも用いられ得る。したがって、このような対照は、例えば、異なる用量、時間間隔および類似の変数で、対照に曝露されない、および／または化合物に曝露されない試料を包含し得る。このような方法により、薬剤療法を用いた、または他の療法を用いたモニタリングおよび／または治療介入のために、臨床医は所定の被験体を良好に層化することが可能になる。
【０００９】
さらに別の実施形態では、代謝性疾患に苦しむ被験体の治療方法であって、ＰＰＡＲガンマを結合し、抗糖尿病活性を選択的に促進する化合物を被験体に投与し、それにより代謝性疾患に苦しむ被験体を治療することを包含する方法が提供される。一実施形態では、化合物は、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する。別の実施形態では、化合物は製薬上許容可能な処方物中で投与される。さらに別の実施形態では、製薬上許容可能な処方物は経口処方物である。さらに別の実施形態では、化合物は小分子である。
【００１０】
別の態様では、一細胞型における抗代謝障害活性を選択的に促進することにより代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）を処置するための化合物であって、ＰＰＡＲガンマ上のＳｅｒ−２７３のリン酸化を抑制する化合物が提供される。一実施形態では、化合物は、ロシグリタゾンのＰＰＡＲガンマアゴニスト機能の３０％未満を有する。別の実施形態では、化合物は、１〜２００ｎＭ未満のＰＰＡＲガンマに関するＥＣ５０結合親和性を有する。さらに別の実施形態では、化合物は、同一条件下でロシグリタゾンに比して表１に列挙されたマーカーの発現を少なくとも３０％上方調節するか、および／または同一条件下でのロシグリタゾンに比して表２に列挙されたマーカーの発現を少なくとも３０％下方調節する。さらに別の実施形態では、代謝障害は、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される。
【００１１】
さらに別の態様では、位置Ｓｅｒ−２７３に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ２ポリペプチド、あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体をコードする単離核酸分子、またはその相補体が提供される。一実施形態では、単離核酸分子、またはその相補体は、配列番号２または３で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、さらに位置Ｓｅｒ−２７３の非リン酸化可能アミノ酸をコードする。別の実施形態では、別の実施形態では、単離核酸分子は非相同ポリペプチドをさらにコードする。
【００１２】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸分子を含むベクター（例えば発現ベクター）が提供され、そして本発明のベクターを含む宿主細胞も提供される。
【００１３】
別の態様では、タンパク質の産生方法であって、タンパク質が産生されるまで適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養することを包含する方法が提供される。一実施形態では、産生タンパク質はさらに、培地または宿主細胞から単離される。
【００１４】
さらに別の実施形態では、位置Ｓｅｒ−２７３に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ２ポリペプチドまたはネズミＰＰＡＲガンマ２ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体を含む単離タンパク質が提供される。一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２または３で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ｓｅｒ−２７３の非リン酸化可能アミノ酸をコードする。別の実施形態では、単離タンパク質は、非相同ポリペプチドと操作可能的に連結される。
【００１５】
さらに別の態様では、Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基と特異的に結合される抗体またはその断片を産生する単離ハイブリドーマの製造方法であって、Ｓｅｒ−２７３でリン酸化される前記ネズミＰＰＡＲガンマ２あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含む組成物を用いて哺乳動物を免疫化すること；免疫化哺乳動物から脾細胞を単離すること；単離脾細胞を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成すること；そしてその前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体の産生のために個々のハイブリドーマをスクリーニングして、ハイブリドーマを単離することを包含する方法が提供される。
【００１６】
別の態様では、本発明のハイブリドーマにより産生される抗体が提供される。
【００１７】
さらに別の態様では、Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２のアミノ酸配列あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含むポリペプチドと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分が提供される。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、アミノ酸配列：ＫＴＴＤＫ（ｐＳ）ＰＦＶＩＹＤＣを有するエピトープを特異的に結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラまたはヒト化抗体である。さらに別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、検出可能的に標識される。さらに別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、エフェクタードメイン、Ｆｃドメインを含み、一本鎖抗体であるかまたはＦａｂ断片である。
【００１８】
さらに別の態様では、Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基を特異的に検出するための１つ以上の試薬を含むＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制する化合物の能力を査定するためのキットが提供される。
【００１９】
別の態様では、セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ２遺伝子を含む非ヒト動物モデルが提供される。一実施形態では、突然変異は、非リン酸化可能アミノ酸、例えばアラニンへの前記セリンの突然変異を含む。別の実施形態では、非ヒト動物モデルは、セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ２遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である。別の実施形態では、非ヒト動物モデルは、ノックインまたはトランスジェニック動物である。さらに別の実施形態では、非ヒト動物モデルは齧歯類および／またはマウスである。
【００２０】
さらに別の態様では、被験体において調節される遺伝子の同定方法であって、セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子を発現すること；前記突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子の１つ以上の候補標的遺伝子の発現および／または活性のレベルを確定すること；そして対照に比して有意に変更された発現および／または活性を示す遺伝子を同定することを包含する方法が提供される。
【００２１】
さらに別の態様では、予測処置結果に従った試料の分類方法であって、生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル；ならびに対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベルを比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表１および２に列挙されたマーカーからなる群から選択され（例えば、リン酸化Ｓｅｒ−２７３−ＰＰＡＲガンマまたはその相同体）、そして生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が予測処置結果に従った生物学的試料を分類する方法が提供される。一実施形態では、予測処置結果は、表１および２に列挙された処置結果、例えばインスリン感受性増大から選択される。別の実施形態では、生物学的試料は、生物学的試料が得られた被験体にＰＰＡＲガンマリガンドが投与された後に得られる。
【００２２】
別の態様では、予測処置結果を有すると思われる被験体の同定方法であって、生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル；ならびに対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベルを比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表１および２に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして被験体からの生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が被験体における予測処置結果の見込みを予測する方法が提供される。一実施形態では、予測処置結果は、表１および２に列挙された処置結果、例えばインスリン感受性増大から選択される。別の実施形態では、生物学的試料は、ＰＰＡＲガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる。
【００２３】
本発明のある種の実施形態が、当業者に利用可能な知識に従って、本明細書中に記載される１つ以上の方法、組成物、キット等とともに用いられ得るということも、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ネズミＰＰＡＲガンマ２上のセリン２７３のｃｄｋ−５リン酸化の結果を表す。図１Ａは、多数の種を通してのＰＰＡＲガンマポリペプチドのリン酸化セリン残基の保存を示す。図１Ｂは、野生型（ＷＴ）またはＳ２７３Ａ突然変異化ＰＰＡＲでのｃｄｋ５／ｐ３５または指示ｃｄｋｓ／サイクリンＣＤＫ５／ｐ３５を用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫキナーゼ検定の結果を示す。ヒストンＨ１またはＲｂを陽性対照として用いた。図１Ｃは、ＣＤＫ５の野生型またはキナーゼ不活性突然変異（ＫＤ）によるＰＰＡＲガンマの同時発現後のＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５倍改正リン酸化を示す；ＩＰ、免疫沈降物；ＩＢ、免疫ブロット。図１Ｄは、ＣＤＫ５はＰＰＡＲガンマをリン酸化したが、しかしＰＰＡＲアルファまたはＰＰＡＲデルタアイソフォームをリン酸化しなかった、ということを示す。
【図１Ｂ】ネズミＰＰＡＲガンマ２上のセリン２７３のｃｄｋ−５リン酸化の結果を表す。図１Ａは、多数の種を通してのＰＰＡＲガンマポリペプチドのリン酸化セリン残基の保存を示す。図１Ｂは、野生型（ＷＴ）またはＳ２７３Ａ突然変異化ＰＰＡＲでのｃｄｋ５／ｐ３５または指示ｃｄｋｓ／サイクリンＣＤＫ５／ｐ３５を用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫキナーゼ検定の結果を示す。ヒストンＨ１またはＲｂを陽性対照として用いた。図１Ｃは、ＣＤＫ５の野生型またはキナーゼ不活性突然変異（ＫＤ）によるＰＰＡＲガンマの同時発現後のＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５倍改正リン酸化を示す；ＩＰ、免疫沈降物；ＩＢ、免疫ブロット。図１Ｄは、ＣＤＫ５はＰＰＡＲガンマをリン酸化したが、しかしＰＰＡＲアルファまたはＰＰＡＲデルタアイソフォームをリン酸化しなかった、ということを示す。
【図１Ｃ】ネズミＰＰＡＲガンマ２上のセリン２７３のｃｄｋ−５リン酸化の結果を表す。図１Ａは、多数の種を通してのＰＰＡＲガンマポリペプチドのリン酸化セリン残基の保存を示す。図１Ｂは、野生型（ＷＴ）またはＳ２７３Ａ突然変異化ＰＰＡＲでのｃｄｋ５／ｐ３５または指示ｃｄｋｓ／サイクリンＣＤＫ５／ｐ３５を用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫキナーゼ検定の結果を示す。ヒストンＨ１またはＲｂを陽性対照として用いた。図１Ｃは、ＣＤＫ５の野生型またはキナーゼ不活性突然変異（ＫＤ）によるＰＰＡＲガンマの同時発現後のＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５倍改正リン酸化を示す；ＩＰ、免疫沈降物；ＩＢ、免疫ブロット。図１Ｄは、ＣＤＫ５はＰＰＡＲガンマをリン酸化したが、しかしＰＰＡＲアルファまたはＰＰＡＲデルタアイソフォームをリン酸化しなかった、ということを示す。
【図１Ｄ】ネズミＰＰＡＲガンマ２上のセリン２７３のｃｄｋ−５リン酸化の結果を表す。図１Ａは、多数の種を通してのＰＰＡＲガンマポリペプチドのリン酸化セリン残基の保存を示す。図１Ｂは、野生型（ＷＴ）またはＳ２７３Ａ突然変異化ＰＰＡＲでのｃｄｋ５／ｐ３５または指示ｃｄｋｓ／サイクリンＣＤＫ５／ｐ３５を用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫキナーゼ検定の結果を示す。ヒストンＨ１またはＲｂを陽性対照として用いた。図１Ｃは、ＣＤＫ５の野生型またはキナーゼ不活性突然変異（ＫＤ）によるＰＰＡＲガンマの同時発現後のＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５倍改正リン酸化を示す；ＩＰ、免疫沈降物；ＩＢ、免疫ブロット。図１Ｄは、ＣＤＫ５はＰＰＡＲガンマをリン酸化したが、しかしＰＰＡＲアルファまたはＰＰＡＲデルタアイソフォームをリン酸化しなかった、ということを示す。
【図２Ａ】前炎症性サイトカインまたは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への細胞の曝露時のＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５特異的リン酸化の結果を表す。図２Ａは、指示時間の間、ＴＮＦ−α、ＩＬ‐６またはＦＦＡで分化３Ｔ３−Ｌ１細胞を処置した結果を示す。ホスホ−Ｓ２７３ＰＰＡＲガンマ抗体を用いて、ＰＰＡＲガンマのリン酸化を検出した。図２Ｂは、スクランブル化またはＣＤＫ５  ｓｈＲＮＡを発現する分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマリン酸化のウエスタンブロット分析の結果を示す。図２Ｃは、指示サイトカインで刺激し、ホスホ−Ｓ２７３  ＰＰＡＲガンマ抗体で分析したスクランブル化またはＣＤＫ５  ｓｈＲＮＡを発現する細胞の結果を示す。ＮＴ：処置せず。
【図２Ｂ】前炎症性サイトカインまたは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への細胞の曝露時のＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５特異的リン酸化の結果を表す。図２Ａは、指示時間の間、ＴＮＦ−α、ＩＬ‐６またはＦＦＡで分化３Ｔ３−Ｌ１細胞を処置した結果を示す。ホスホ−Ｓ２７３ＰＰＡＲガンマ抗体を用いて、ＰＰＡＲガンマのリン酸化を検出した。図２Ｂは、スクランブル化またはＣＤＫ５  ｓｈＲＮＡを発現する分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマリン酸化のウエスタンブロット分析の結果を示す。図２Ｃは、指示サイトカインで刺激し、ホスホ−Ｓ２７３  ＰＰＡＲガンマ抗体で分析したスクランブル化またはＣＤＫ５  ｓｈＲＮＡを発現する細胞の結果を示す。ＮＴ：処置せず。
【図２Ｃ】前炎症性サイトカインまたは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への細胞の曝露時のＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５特異的リン酸化の結果を表す。図２Ａは、指示時間の間、ＴＮＦ−α、ＩＬ‐６またはＦＦＡで分化３Ｔ３−Ｌ１細胞を処置した結果を示す。ホスホ−Ｓ２７３ＰＰＡＲガンマ抗体を用いて、ＰＰＡＲガンマのリン酸化を検出した。図２Ｂは、スクランブル化またはＣＤＫ５  ｓｈＲＮＡを発現する分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマリン酸化のウエスタンブロット分析の結果を示す。図２Ｃは、指示サイトカインで刺激し、ホスホ−Ｓ２７３  ＰＰＡＲガンマ抗体で分析したスクランブル化またはＣＤＫ５  ｓｈＲＮＡを発現する細胞の結果を示す。ＮＴ：処置せず。
【図３ａ】ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ−５媒介性Ｓ２７３リン酸化による特異的脂肪細胞遺伝子調節不全の結果を表す。図３ａは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマ／ＲＸＲαの野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体に応答するＰＰＡＲ誘導性レポーター遺伝子の転写活性を示す（±１０μＭロシグリタゾン）（ｎ＝３）。図３ｂは、脂肪細胞分化後７日目にオイルレッド−Ｏで染色したレトロウイルス野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞の結果を示す。ＰＰＡＲガンマの発現を、抗ＰＰＡＲガンマ抗体で分析した。図３ｃは、種々の遺伝子の発現に関する実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるこれらの細胞における遺伝子発現の結果を示す（ｎ＝３）。図３ｄは、培地中の分泌アディポネクチンレベルを示す（ｎ＝３）。図３ｅは、実時間ｑＰＣＲにより分析した場合の移植脂肪パッドにおけるｍＲＮＡ発現を示す（ｎ＝５）。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図３ｂ】ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ−５媒介性Ｓ２７３リン酸化による特異的脂肪細胞遺伝子調節不全の結果を表す。図３ａは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマ／ＲＸＲαの野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体に応答するＰＰＡＲ誘導性レポーター遺伝子の転写活性を示す（±１０μＭロシグリタゾン）（ｎ＝３）。図３ｂは、脂肪細胞分化後７日目にオイルレッド−Ｏで染色したレトロウイルス野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞の結果を示す。ＰＰＡＲガンマの発現を、抗ＰＰＡＲガンマ抗体で分析した。図３ｃは、種々の遺伝子の発現に関する実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるこれらの細胞における遺伝子発現の結果を示す（ｎ＝３）。図３ｄは、培地中の分泌アディポネクチンレベルを示す（ｎ＝３）。図３ｅは、実時間ｑＰＣＲにより分析した場合の移植脂肪パッドにおけるｍＲＮＡ発現を示す（ｎ＝５）。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図３ｃ】ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ−５媒介性Ｓ２７３リン酸化による特異的脂肪細胞遺伝子調節不全の結果を表す。図３ａは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマ／ＲＸＲαの野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体に応答するＰＰＡＲ誘導性レポーター遺伝子の転写活性を示す（±１０μＭロシグリタゾン）（ｎ＝３）。図３ｂは、脂肪細胞分化後７日目にオイルレッド−Ｏで染色したレトロウイルス野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞の結果を示す。ＰＰＡＲガンマの発現を、抗ＰＰＡＲガンマ抗体で分析した。図３ｃは、種々の遺伝子の発現に関する実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるこれらの細胞における遺伝子発現の結果を示す（ｎ＝３）。図３ｄは、培地中の分泌アディポネクチンレベルを示す（ｎ＝３）。図３ｅは、実時間ｑＰＣＲにより分析した場合の移植脂肪パッドにおけるｍＲＮＡ発現を示す（ｎ＝５）。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図３ｄ】ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ−５媒介性Ｓ２７３リン酸化による特異的脂肪細胞遺伝子調節不全の結果を表す。図３ａは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマ／ＲＸＲαの野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体に応答するＰＰＡＲ誘導性レポーター遺伝子の転写活性を示す（±１０μＭロシグリタゾン）（ｎ＝３）。図３ｂは、脂肪細胞分化後７日目にオイルレッド−Ｏで染色したレトロウイルス野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞の結果を示す。ＰＰＡＲガンマの発現を、抗ＰＰＡＲガンマ抗体で分析した。図３ｃは、種々の遺伝子の発現に関する実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるこれらの細胞における遺伝子発現の結果を示す（ｎ＝３）。図３ｄは、培地中の分泌アディポネクチンレベルを示す（ｎ＝３）。図３ｅは、実時間ｑＰＣＲにより分析した場合の移植脂肪パッドにおけるｍＲＮＡ発現を示す（ｎ＝５）。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図３ｅ】ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ−５媒介性Ｓ２７３リン酸化による特異的脂肪細胞遺伝子調節不全の結果を表す。図３ａは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマ／ＲＸＲαの野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体に応答するＰＰＡＲ誘導性レポーター遺伝子の転写活性を示す（±１０μＭロシグリタゾン）（ｎ＝３）。図３ｂは、脂肪細胞分化後７日目にオイルレッド−Ｏで染色したレトロウイルス野生型またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞の結果を示す。ＰＰＡＲガンマの発現を、抗ＰＰＡＲガンマ抗体で分析した。図３ｃは、種々の遺伝子の発現に関する実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるこれらの細胞における遺伝子発現の結果を示す（ｎ＝３）。図３ｄは、培地中の分泌アディポネクチンレベルを示す（ｎ＝３）。図３ｅは、実時間ｑＰＣＲにより分析した場合の移植脂肪パッドにおけるｍＲＮＡ発現を示す（ｎ＝５）。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ａ】高脂肪餌摂取マウス（ＨＦＤ）の脂肪組織においてＰＰＡＲガンマのＣＤＫ５媒介性リン酸化が増大するという結果を表す。図４Ａは、ホスホ−Ｓ２７３ＰＰＡＲガンマ、ＰＰＡＲガンマ、ホスホ−Ｙ１５ＣＤＫ５、ＣＤＫ５およびｐ３５抗体を用いて分析した指示時間の間のＨＦＤでのマウスからの白色脂肪組織（精巣上体）の結果を示す。図４Ｂは、固形飼料およびＨＦＤを摂食したマウスにおける選択代謝パラメーターの結果を示す。一晩絶食後７または１３週間の固形飼料またはＨＦＤでのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６）における体重、グルコースおよびインスリンレベルの結果を示す（誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４Ｃは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析した１３週ＨＦＤマウスからの精巣上体（Ｅｐｉ．）または鼠径部（Ｉｎｇ．）脂肪組織の結果を示す。
【図４Ｂ】高脂肪餌摂取マウス（ＨＦＤ）の脂肪組織においてＰＰＡＲガンマのＣＤＫ５媒介性リン酸化が増大するという結果を表す。図４Ａは、ホスホ−Ｓ２７３ＰＰＡＲガンマ、ＰＰＡＲガンマ、ホスホ−Ｙ１５ＣＤＫ５、ＣＤＫ５およびｐ３５抗体を用いて分析した指示時間の間のＨＦＤでのマウスからの白色脂肪組織（精巣上体）の結果を示す。図４Ｂは、固形飼料およびＨＦＤを摂食したマウスにおける選択代謝パラメーターの結果を示す。一晩絶食後７または１３週間の固形飼料またはＨＦＤでのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６）における体重、グルコースおよびインスリンレベルの結果を示す（誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４Ｃは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析した１３週ＨＦＤマウスからの精巣上体（Ｅｐｉ．）または鼠径部（Ｉｎｇ．）脂肪組織の結果を示す。
【図４Ｃ】高脂肪餌摂取マウス（ＨＦＤ）の脂肪組織においてＰＰＡＲガンマのＣＤＫ５媒介性リン酸化が増大するという結果を表す。図４Ａは、ホスホ−Ｓ２７３ＰＰＡＲガンマ、ＰＰＡＲガンマ、ホスホ−Ｙ１５ＣＤＫ５、ＣＤＫ５およびｐ３５抗体を用いて分析した指示時間の間のＨＦＤでのマウスからの白色脂肪組織（精巣上体）の結果を示す。図４Ｂは、固形飼料およびＨＦＤを摂食したマウスにおける選択代謝パラメーターの結果を示す。一晩絶食後７または１３週間の固形飼料またはＨＦＤでのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６）における体重、グルコースおよびインスリンレベルの結果を示す（誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４Ｃは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析した１３週ＨＦＤマウスからの精巣上体（Ｅｐｉ．）または鼠径部（Ｉｎｇ．）脂肪組織の結果を示す。
【図５Ａ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制するＰＰＡＲガンマリガンドの結果を表す。図５Ａは、ロシグリタゾンおよび／またはＧＷ９６６２で指示されたように処置したＰＰＡＲガンマの野生型またはＱ２８６Ｐ突然変異体を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化の結果を示す。図５Ｂは、指示濃度のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４とともにインキュベートしたＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に応答するＰＰＡＲ由来レポーター遺伝子の転写活性を示す（ｎ＝３；誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である）。図５Ｄは、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＣＤＫ５／ｐ３５およびＲｂまたはＰＰＡｒガンマを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定の結果を示す。図５Ｅは、指示濃度でのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化を示す。図５Ｆは、野生型（ＮＴ、無処置；ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４処置）またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する分化ＰＰＡｒガンマ−ヌル繊維芽細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｂ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制するＰＰＡＲガンマリガンドの結果を表す。図５Ａは、ロシグリタゾンおよび／またはＧＷ９６６２で指示されたように処置したＰＰＡＲガンマの野生型またはＱ２８６Ｐ突然変異体を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化の結果を示す。図５Ｂは、指示濃度のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４とともにインキュベートしたＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に応答するＰＰＡＲ由来レポーター遺伝子の転写活性を示す（ｎ＝３；誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である）。図５Ｄは、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＣＤＫ５／ｐ３５およびＲｂまたはＰＰＡｒガンマを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定の結果を示す。図５Ｅは、指示濃度でのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化を示す。図５Ｆは、野生型（ＮＴ、無処置；ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４処置）またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する分化ＰＰＡｒガンマ−ヌル繊維芽細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｃ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制するＰＰＡＲガンマリガンドの結果を表す。図５Ａは、ロシグリタゾンおよび／またはＧＷ９６６２で指示されたように処置したＰＰＡＲガンマの野生型またはＱ２８６Ｐ突然変異体を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化の結果を示す。図５Ｂは、指示濃度のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４とともにインキュベートしたＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に応答するＰＰＡＲ由来レポーター遺伝子の転写活性を示す（ｎ＝３；誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である）。図５Ｄは、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＣＤＫ５／ｐ３５およびＲｂまたはＰＰＡｒガンマを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定の結果を示す。図５Ｅは、指示濃度でのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化を示す。図５Ｆは、野生型（ＮＴ、無処置；ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４処置）またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する分化ＰＰＡｒガンマ−ヌル繊維芽細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｄ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制するＰＰＡＲガンマリガンドの結果を表す。図５Ａは、ロシグリタゾンおよび／またはＧＷ９６６２で指示されたように処置したＰＰＡＲガンマの野生型またはＱ２８６Ｐ突然変異体を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化の結果を示す。図５Ｂは、指示濃度のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４とともにインキュベートしたＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に応答するＰＰＡＲ由来レポーター遺伝子の転写活性を示す（ｎ＝３；誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である）。図５Ｄは、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＣＤＫ５／ｐ３５およびＲｂまたはＰＰＡｒガンマを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定の結果を示す。図５Ｅは、指示濃度でのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化を示す。図５Ｆは、野生型（ＮＴ、無処置；ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４処置）またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する分化ＰＰＡｒガンマ−ヌル繊維芽細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｅ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制するＰＰＡＲガンマリガンドの結果を表す。図５Ａは、ロシグリタゾンおよび／またはＧＷ９６６２で指示されたように処置したＰＰＡＲガンマの野生型またはＱ２８６Ｐ突然変異体を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化の結果を示す。図５Ｂは、指示濃度のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４とともにインキュベートしたＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に応答するＰＰＡＲ由来レポーター遺伝子の転写活性を示す（ｎ＝３；誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である）。図５Ｄは、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＣＤＫ５／ｐ３５およびＲｂまたはＰＰＡｒガンマを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定の結果を示す。図５Ｅは、指示濃度でのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化を示す。図５Ｆは、野生型（ＮＴ、無処置；ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４処置）またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する分化ＰＰＡｒガンマ−ヌル繊維芽細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｆ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制するＰＰＡＲガンマリガンドの結果を表す。図５Ａは、ロシグリタゾンおよび／またはＧＷ９６６２で指示されたように処置したＰＰＡＲガンマの野生型またはＱ２８６Ｐ突然変異体を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化の結果を示す。図５Ｂは、指示濃度のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４とともにインキュベートしたＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に応答するＰＰＡＲ由来レポーター遺伝子の転写活性を示す（ｎ＝３；誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．である）。図５Ｄは、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＣＤＫ５／ｐ３５およびＲｂまたはＰＰＡｒガンマを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定の結果を示す。図５Ｅは、指示濃度でのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４に関するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α誘導性リン酸化を示す。図５Ｆは、野生型（ＮＴ、無処置；ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４処置）またはＳ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する分化ＰＰＡｒガンマ−ヌル繊維芽細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す（ｎ＝３）。
【図６Ａ】ＰＰＡＲガンマのＣＤＫ５媒介性リン酸化を抑制する非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドの結果を示す。図６Ａは、指示濃度での異なるＰＰＡＲガンマリガンド（ロシグリタゾン、Ｍｂｘ−１０２、ＢＶＴ．１３、ｎＴＺＤｐａまたはＭＲＬ２４）に関して精製ＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマを用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。ＰＰＡＲガンマ、総ＰＰＡＲガンマおよびＣＤＫ５のリン酸化を、ウエスタンブロットで検出した。図６Ｂは、多数の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの構造的多様性を示す。図６Ｃは、多数の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストがＰＰＡＲ転写応答素子に関して非常に弱いアゴニスト活性を有する、ということを示す。
【図６Ｂ】ＰＰＡＲガンマのＣＤＫ５媒介性リン酸化を抑制する非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドの結果を示す。図６Ａは、指示濃度での異なるＰＰＡＲガンマリガンド（ロシグリタゾン、Ｍｂｘ−１０２、ＢＶＴ．１３、ｎＴＺＤｐａまたはＭＲＬ２４）に関して精製ＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマを用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。ＰＰＡＲガンマ、総ＰＰＡＲガンマおよびＣＤＫ５のリン酸化を、ウエスタンブロットで検出した。図６Ｂは、多数の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの構造的多様性を示す。図６Ｃは、多数の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストがＰＰＡＲ転写応答素子に関して非常に弱いアゴニスト活性を有する、ということを示す。
【図６Ｃ】ＰＰＡＲガンマのＣＤＫ５媒介性リン酸化を抑制する非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドの結果を示す。図６Ａは、指示濃度での異なるＰＰＡＲガンマリガンド（ロシグリタゾン、Ｍｂｘ−１０２、ＢＶＴ．１３、ｎＴＺＤｐａまたはＭＲＬ２４）に関して精製ＣＤＫ５／ｐ３５およびＰＰＡＲガンマを用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫ５キナーゼ検定の結果を示す。ＰＰＡＲガンマ、総ＰＰＡＲガンマおよびＣＤＫ５のリン酸化を、ウエスタンブロットで検出した。図６Ｂは、多数の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの構造的多様性を示す。図６Ｃは、多数の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストがＰＰＡＲ転写応答素子に関して非常に弱いアゴニスト活性を有する、ということを示す。
【図７】肥満マウスにおけるＰＰＡＲガンマリン酸化により調節される遺伝子組の調節不全を表す。１３週間固形飼料またはＨＦＤでのマウスのＷＡＴにおける細胞および移植脂肪パッド中のＰＰＡｒガンマのリン酸化により調節される遺伝子のｍＲＮＡ発現（ｎ＝５；誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図８Ａ】ＰＰＡＲガンマ−ＬＢＤ±ロシグリタゾンおよびＭＲＬ２４に関する分化ＨＤＸ  ＭＳデータを表す。示されたＨＤＸデータは、４つの当該領域に対応する：らせん３（ＩＲＩＦＱＧＣＱＦ）、βシート領域（ＩＳＥＧＱＧＦＭＴＲＥ）、らせん１２（ＱＥＩＹＫＤＬＹ）、およびＣＤＫ５リン酸化の部位を含有するらせん２−２’連結領域（ＫＴＴＤＫＳＰＦＶＩＹＤＭ）。図８Ａは、各ペプチド領域に関するＨＤＸの低減％を示すヒストグラムを図示する。値は、アポＰＰＡＲガンマ−ＬＢＤに関する測定％Ｄ値に比して算定される（ｎ＝４；誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である）。図８Ｂは、ロシグリタゾン（左、ＰＤＢ：２ＰＲＧ）およびＭＲＬ２４（右、ＰＤＢ：２Ｑ５Ｐ）と結合されるＰＰＡＲガンマ−ＬＢＤの構造上にプロットされた４つの当該ペプチドに関するＨＤＸデータを示す。アポ受容体と比較した場合のＨＤＸの低減％を、基調に従って色づけする。
【図８Ｂ】ＰＰＡＲガンマ−ＬＢＤ±ロシグリタゾンおよびＭＲＬ２４に関する分化ＨＤＸ  ＭＳデータを表す。示されたＨＤＸデータは、４つの当該領域に対応する：らせん３（ＩＲＩＦＱＧＣＱＦ）、βシート領域（ＩＳＥＧＱＧＦＭＴＲＥ）、らせん１２（ＱＥＩＹＫＤＬＹ）、およびＣＤＫ５リン酸化の部位を含有するらせん２−２’連結領域（ＫＴＴＤＫＳＰＦＶＩＹＤＭ）。図８Ａは、各ペプチド領域に関するＨＤＸの低減％を示すヒストグラムを図示する。値は、アポＰＰＡＲガンマ−ＬＢＤに関する測定％Ｄ値に比して算定される（ｎ＝４；誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である）。図８Ｂは、ロシグリタゾン（左、ＰＤＢ：２ＰＲＧ）およびＭＲＬ２４（右、ＰＤＢ：２Ｑ５Ｐ）と結合されるＰＰＡＲガンマ−ＬＢＤの構造上にプロットされた４つの当該ペプチドに関するＨＤＸデータを示す。アポ受容体と比較した場合のＨＤＸの低減％を、基調に従って色づけする。
【図９Ａ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を選択的に抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の変化を逆転する抗糖尿病性非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの結果を表す。図９Ａは、ビヒクル、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で処置した１６週ＨＦＤマウスにおけるグルコース耐容性試験の結果を示す（ｎ＝１０）。これらのマウスの絶食時インスリンレベル（図９Ｂ）および体重（図９Ｃ）を示す。図９Ｄは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析したこれらのマウスからのＷＡＴにおけるＰＰＡＲガンマのリン酸化の結果を示す。図９Ｅは、ＰＰＡＲガンマリン酸化により調節される遺伝子組の発現に関して分析したこれらのマウスからのＷＡＴの実時間ｑＰＣＲ結果を示す（誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９Ｂ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を選択的に抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の変化を逆転する抗糖尿病性非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの結果を表す。図９Ａは、ビヒクル、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で処置した１６週ＨＦＤマウスにおけるグルコース耐容性試験の結果を示す（ｎ＝１０）。これらのマウスの絶食時インスリンレベル（図９Ｂ）および体重（図９Ｃ）を示す。図９Ｄは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析したこれらのマウスからのＷＡＴにおけるＰＰＡＲガンマのリン酸化の結果を示す。図９Ｅは、ＰＰＡＲガンマリン酸化により調節される遺伝子組の発現に関して分析したこれらのマウスからのＷＡＴの実時間ｑＰＣＲ結果を示す（誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９Ｃ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を選択的に抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の変化を逆転する抗糖尿病性非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの結果を表す。図９Ａは、ビヒクル、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で処置した１６週ＨＦＤマウスにおけるグルコース耐容性試験の結果を示す（ｎ＝１０）。これらのマウスの絶食時インスリンレベル（図９Ｂ）および体重（図９Ｃ）を示す。図９Ｄは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析したこれらのマウスからのＷＡＴにおけるＰＰＡＲガンマのリン酸化の結果を示す。図９Ｅは、ＰＰＡＲガンマリン酸化により調節される遺伝子組の発現に関して分析したこれらのマウスからのＷＡＴの実時間ｑＰＣＲ結果を示す（誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９Ｄ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を選択的に抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の変化を逆転する抗糖尿病性非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの結果を表す。図９Ａは、ビヒクル、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で処置した１６週ＨＦＤマウスにおけるグルコース耐容性試験の結果を示す（ｎ＝１０）。これらのマウスの絶食時インスリンレベル（図９Ｂ）および体重（図９Ｃ）を示す。図９Ｄは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析したこれらのマウスからのＷＡＴにおけるＰＰＡＲガンマのリン酸化の結果を示す。図９Ｅは、ＰＰＡＲガンマリン酸化により調節される遺伝子組の発現に関して分析したこれらのマウスからのＷＡＴの実時間ｑＰＣＲ結果を示す（誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９Ｅ】ＰＰＡＲガンマのリン酸化を選択的に抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の変化を逆転する抗糖尿病性非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの結果を表す。図９Ａは、ビヒクル、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で処置した１６週ＨＦＤマウスにおけるグルコース耐容性試験の結果を示す（ｎ＝１０）。これらのマウスの絶食時インスリンレベル（図９Ｂ）および体重（図９Ｃ）を示す。図９Ｄは、ホスホ−Ｓ２７３抗体を用いて分析したこれらのマウスからのＷＡＴにおけるＰＰＡＲガンマのリン酸化の結果を示す。図９Ｅは、ＰＰＡＲガンマリン酸化により調節される遺伝子組の発現に関して分析したこれらのマウスからのＷＡＴの実時間ｑＰＣＲ結果を示す（誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】動物における無アゴニスト、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストまたは非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストの投与時の白色脂肪組織における選択的遺伝子発現増大の結果を表す。
【図１１】非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニスト処置または非処置動物で実施した呼吸実験の結果を表す。
【図１２Ａ】標的化ノックイン動物構築物生成（図１１Ａ）および育種（図１１Ｂ）戦略を表す。
【図１２Ｂ】標的化ノックイン動物構築物生成（図１１Ａ）および育種（図１１Ｂ）戦略を表す。
【図１３】ＣＤＫ５によるＰＰＡＲガンマの肥満連関リン酸化のモデルを表す。
【図１４Ａ】４ｍｇ／日の用量で６ヶ月間、ロシグリタゾンで処置した２型糖尿病を有するヒト被験者のＰＰＡＲガンマリン酸化レベルの結果を表す。図１４Ａは、ロシグリタゾン処置レジメンの前および後の、パーセンテージに換算したｐＰＰＡＲガンマ／ＰＰＡＲガンマの結果を示す。図１４Ｂは、ロシグリタゾン処置による被験者におけるインスリン感受性とｐＰＰＡＲガンマ／ＰＰＡＲガンマ比との相関を示す。図１４Ｃは、定量的データを提供する。
【図１４Ｂ】４ｍｇ／日の用量で６ヶ月間、ロシグリタゾンで処置した２型糖尿病を有するヒト被験者のＰＰＡＲガンマリン酸化レベルの結果を表す。図１４Ａは、ロシグリタゾン処置レジメンの前および後の、パーセンテージに換算したｐＰＰＡＲガンマ／ＰＰＡＲガンマの結果を示す。図１４Ｂは、ロシグリタゾン処置による被験者におけるインスリン感受性とｐＰＰＡＲガンマ／ＰＰＡＲガンマ比との相関を示す。図１４Ｃは、定量的データを提供する。
【図１４Ｃ】４ｍｇ／日の用量で６ヶ月間、ロシグリタゾンで処置した２型糖尿病を有するヒト被験者のＰＰＡＲガンマリン酸化レベルの結果を表す。図１４Ａは、ロシグリタゾン処置レジメンの前および後の、パーセンテージに換算したｐＰＰＡＲガンマ／ＰＰＡＲガンマの結果を示す。図１４Ｂは、ロシグリタゾン処置による被験者におけるインスリン感受性とｐＰＰＡＲガンマ／ＰＰＡＲガンマ比との相関を示す。図１４Ｃは、定量的データを提供する。  表の簡単な説明
【００２５】
表１は、その発現および／または活性が対照に比して増大される例示的遺伝子、活性および検定の一覧である。
【００２６】
表２は、その発現および／または活性が対照に比して低減される例示的遺伝子、活性および検定の一覧である。
【００２７】
表３は、本発明のマーカーの発現レベルを定量するために有用な例示的プライマー配列の一覧である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明をより容易に理解し得るために、一定の用８Ａ９Ｅを先ず定義する。詳細な説明全体を通して、付加的な定義が記述される。
【００２９】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書中で用いる場合、冠詞の文法的対象のうちの１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「１つの（ａｎ）素子」は、１つの素子または１つより多くの素子を意味する。
【００３０】
「変更された量」のバイオマーカーまたは「変更されたレベル」のバイオマーカーという用語は、対照試料におけるものと比較した場合、ある試料中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したマーカー）における本発明のバイオマーカーの、増大または低減された発現および／または活性を指す。「変更された量」のバイオマーカーという用語は、正常、対照試料中のバイオマーカーのタンパク質レベルと比較した場合、ある試料中のバイオマーカーの、増大または低減されたタンパク質レベルも包含する。
【００３１】
少なくとも一部の（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）本発明のバイオマーカーの「変更されたレベルの発現」という用語は、試験試料、例えば代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）に罹患している被験体由来の試料中のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数を指し、これは、発現またはコピー数を査定するために用いられる検定の標準誤差より大きいかまたは小さく、そして、対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常被験体からの試料）中の、少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数の、あるいはいくつかの対照試料中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、少なくとも２倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍またはそれ以上である。発現の変更されたレベルは、発現またはコピー数を査定するために用いられる検定の標準誤差より大きいかまたは小さく、そして対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常被験体からの試料）中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数、あるいはいくつかの対照試料中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上である。
【００３２】
バイオマーカーの「変更された活性」という用語は、正常、対照試料中のバイオマーカーの活性と比較して、疾患状態で、例えば代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）試料中で、増大されるかまたは低減されるバイオマーカーの活性を指す。バイオマーカーの変更された活性は、例えばバイオマーカーの変更された発現、バイオマーカーの変更されたタンパク質レベル、バイオマーカーの変更された構造、あるいは、例えばバイオマーカーと同一のまたは異なる経路に関与する他のタンパク質との変更された相互作用の結果であり得る。生物学的活性は、本明細書中で記載される場合、遺伝子発現変化および／または表１および２に列挙された検定により測定した場合、本出願中で記述されるような被験体応答を包含し得る。
【００３３】
バイオマーカーの「変更された構造」という用語は、バイオマーカー遺伝子またはマーカータンパク質内の突然変異の存在または突然変異、例えば正常または野生型の遺伝子またはタンパク質と比較した場合に、バイオマーカーの発現または活性に影響を及ぼす突然変異を指す。例えば突然変異としては、染色体間および染色体内転位、置換、欠失および挿入突然変異が挙げられるが、これらに限定されない。突然変異は、バイオマーカーのコードまたは非コード領域に存在し得る。
【００３４】
「結合化合物」は、結合組成物、例えば小分子、抗体、ペプチド、ペプチドまたは非ペプチドリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、例えばペプチド核酸、レクチン、あるいは標的タンパク質または分子と特異的に結合し得る任意のその他の分子存在物、あるいはタンパク質の複合体のような当該分析物との安定複合体形成を指す。
【００３５】
「結合部分」は、分子タグが直接または間接的に結合され得る任意の分子であって、分析物と特異的に結合し得る分子を意味する。結合部分としては、抗体、抗体結合組成物、ペプチド、タンパク質、核酸、ならびに約１０００ダルトンまでの分子量を有し、そして水素、炭素、酸素、窒素、イオウおよびリンからなる群から選択される原子を含有する有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「バイオマーカー」または「マーカー」は、変更され得る遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質であって、この場合、上記変更は代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）に関連する。変更は、正常または健常組織または細胞（例えば、対照）におけるその量、構造および／または活性と比較した場合に、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）組織または代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）細胞における量、構造および／または活性に認められ、疾患状態、例えば代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）と関連し得る。例えば、少なくとも一部が、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）と関連するかまたは抗代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）療法に対する応答を予測する本発明のバイオマーカーは、正常、健常組織または細胞と比較して、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）組織または代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）細胞における、変更されたヌクレオチド配列、アミノ酸配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性またはメチル化状態を有し得る。さらに、「バイオマーカー」は、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）のような疾患状態に関連した組織または細胞中に存在する場合、その構造が変更され、例えば突然変異化され（突然変異を含有し）、例えば、置換、欠失または挿入により、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで野生型配列と異なる分子を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のバイオマーカーは、少なくとも一部は、表１および２に列挙したバイオマーカーの群から選択される。
【００３７】
「相補的な」は、２つの核酸鎖の領域間、または同一核酸鎖の２つの領域間の配列相補性という広範な概念を指す。第一核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第一領域と逆平行である第二核酸の残基と特定の水素結合を形成し得る（「塩基対合」）、ということが知られている。同様に、第一核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第一領域と逆平行である第二核酸の残基と塩基対合し得る、ということが知られている。２つの領域が逆平行に整列される場合、第一領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第二領域の残基と塩基対合し得るならば、核酸の第一領域は、同一のまたは異なる核酸の第二領域と相補的である。ある実施形態では、第一領域は第一部分を含み、そして第二領域は第二部分を含んで、それにより、第一および第二部分が逆平行に整列される場合、第一部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合し得る。他の実施形態では、第一部分のヌクレオチド残基はすべて、第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合し得る。
【００３８】
「遺伝子のコピー数」または「バイオマーカーのコピー数」は、特定遺伝子産物をコードする細胞中のＤＮＡ配列の数を指す。一般的に、所定の遺伝子に関して、哺乳動物は各遺伝子の２つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は、遺伝子増幅または重複により増大され、あるいは欠失により低減され得る。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「糖尿病」という用語は、多数の周知の症状を指す。インスリン抵抗性は、グルコース負荷に対する正常応答を上回る循環インスリンレベルが、正常血糖状態を維持するために必要とされる状態と定義される（Ｆｏｒｄ  Ｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ＪＡＭＡ．  （２００２）  ２８７：  ３５６−９）。インスリン抵抗性、ならびに療法に対するインスリン抵抗性を有する被験体の応答は、インスリン抵抗性に対する恒常性モデル査定（ＨＯＭＡ−ＩＲ）スコア（インスリン抵抗性の信頼できる指標である）を査定することにより定量され得る（（Ｋａｔｓｕｋｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００１；  ２４：３６２−５）。恒常性査定モデル（ＨＯＭＡ）−ＩＲスコアによるインスリン抵抗性の概算は、式（Ｇａｌｖｉｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ  １９９２；９：９２１−８）：ＨＯＭＡ−ＩＲ＝［絶食時血清インスリン（μＵ／ｍＬ）］×［絶食時血漿グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５］により算定される。グルコース許容値低下（ＩＧＴ）または２型糖尿病の発症の素質を有する被験体は、正常血糖を有するものであり、高インスリン血症は、定義により、インスリン抵抗性である。インスリン抵抗性を有する典型的被験体は、通常は体重超過または肥満である。「前糖尿病」という用語は、個体が２型糖尿病を発症し易い状態である。前糖尿病は、グルコース許容値低下症の定義を拡大して、高い正常範囲１００ｍｇ／ｄＬ以内の絶食時血糖値（Ｊ．  Ｂ．  Ｍｅｉｇｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００３；  ５２：１４７５−１４８４）および絶食時高インスリン血症（血漿インスリン濃度上昇）を有する個体を包含する。重篤な健康への脅威として前糖尿病を同定するための科学的および医学的基礎は、米国糖尿病学会と国立糖尿病、消化器および腎疾患研究所により共同で発行された「２型糖尿病の防止または遅延」（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００２；  ２５：７４２−７４９）という表題の立場声明に割付されている。インスリン抵抗性を有すると思われる個体は、２つ以上の以下の属性を有する者である：１）体重超過または肥満；２）高血圧；３）高脂血症；４）ＩＧＴまたは２型糖尿病の診断に関する１以上の１．ｓｕｐ．ｓｔ度。インスリン抵抗性は、ＨＯＭＡ−ＩＲスコアを算定することにより、これらの個体で確証され得る。本発明の目的のために、インスリン抵抗性は、＞４．０のＨＯＭＡ−ＩＲスコア、あるいはグルコースおよびインスリン検定を実施する研究室に関して定義される場合の正常の上限を上回るＨＯＭＡ−ＩＲスコアを個体が有する臨床症状と定義される。２型糖尿病は、１２５ｍｇ／ｄｌ（６．９４ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい絶食時血糖または血清グルコース濃度を被験者が有する症状と定義される。
【００４０】
基質から解離するバイオマーカーの実質的画分を伴わずに、基質が流体（例えば、標準生理食塩水クエン酸塩、ｐＨ７．４）ですすがれ得るよう、バイオマーカーは、基質と共有的にまたは非共有的に会合される場合、基質に「固定」される。
【００４１】
「ハザード比」は、本明細書中で用いる場合、相対的危険に関する概算を得るために用いられる統計学的方法を指す。「ハザード比」は、ある群対別の群の予測される危険の間の比である。例えば、特にセリン２７３でのＰＰＡＲガンマリン酸化状態に関しては、ＰＰＡＲガンマリガンドが代謝障害を処置するのに有効であるか否かに関して、ＰＰＡＲガンマリガンドで処置される被験体集団対ＰＰＡＲガンマリガンドなしで処置される被験体集団が査定され得る。
【００４２】
「相同性」または「同一性」という用語は、本明細書中で互換的に用いる場合、２つのポリヌクレオチド配列間の、または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指し、同一性がより厳密な比較である。「同一性または相同性パーセント」および「同一性または相同性％」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の比較で見出される配列類似性のパーセンテージを指す。「配列類似性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の塩基対配列（任意の適切な方法により確定した場合）における類似性パーセントを指す。２つ以上の配列は、０〜１００％類似の間のどこか、またはその間の任意の整数値であり得る。同一性または類似性は、比較の目的のために一列に並べられ得る各配列中の一位置を比較することにより確定され得る。比較される配列中の一位置が同一ヌクレオチド塩基またはアミノ酸により占有される場合には、分子はその位置で同一である。ポリヌクレオチド配列間の類似性または同一性の程度は、ポリヌクレオチド配列により共有される位置での同一または整合ヌクレオチドの数の一関数である。ポリペプチド配列の同一性の程度は、ポリペプチド配列により共有される位置での同一アミノ酸の数の一関数である。ポリペプチド配列の相同性または類似性の程度は、ポリペプチド配列により共有される位置でのアミノ酸の数の一関数である。「実質的相同性」という用語は、本明細書中で用いる場合、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の相同性を指す。
【００４３】
「ありそうに思われる」は、本明細書中で用いる場合、事項、対象、事物または人が生じる確率増大、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％またはそれ以上（あるいは任意の範囲を含めて）を生じることを指す。したがって、一実施形態では、本発明のＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に応答すると思われる被験体は、少なくとも一部は、抗代謝障害活性が、参照被験体または被験体の群に比して、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回って選択的に抗代謝障害活性が選択的に促進されるよう、ＰＰＡＲガンマによる処置に対して応答する確率増大を示す。
【００４４】
「代謝障害」および「肥満関連障害」という用語は、本明細書中では互換的に用いられ、被験体における異常代謝（すなわち、それにより生命過程および活性のためにエネルギーが提供される生細胞中での化学変化）により引き起こされるかまたは特性化される障害、疾患または症状を包含する。代謝障害は、異所性熱産生または異所性脂肪細胞（例えば、褐色または白色脂肪細胞）含量または機能に関連した疾患、障害または症状を包含する。代謝障害は、１つ以上のバイオマーカー（その断片を含む）の発現、構造および／または発現の誤調節（例えば、下方調節または上方調節）、および／または表１および２に列挙した検定により特性化され得る。代謝障害は、細胞機能、例えば細胞増殖、成長、分化または移動、恒常性の細胞性調節、細胞間または細胞内情報伝達；組織機能、例えば肝機能、筋肉機能または脂肪細胞機能；生物体における全身性応答、例えばホルモン性応答（例えば、インスリン応答）に有害に作用し得る。
【００４５】
代謝障害の例としては、肥満症、例えばインスリン抵抗性肥満症、糖尿病、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＨ型糖尿病）、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、例えばグルコース許容値低下、糖不耐性、アテローム硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、卒中、Ｘ症候群、過食症、内分泌異常、トリグリセリド貯蔵病、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、パラデー・ラブハート・ウィリ症候群、ウェルナー症候群、脂質生合成、脂質運搬、トリグリセリドレベル、血漿レベルおよび血漿コレステロールに関連した機能不全、高脂血症、遊離脂肪酸上昇、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低密度リポタンパク質−（ＬＤＬ）−コレステロール上昇、極低密度リポタンパク質−（ＶＬＤＬ）−コレステロール上昇、中密度リポタンパク質−（ＩＤＬ）−コレステロール上昇、または高密度リポタンパク質−（ＨＤＬ）−コレステロール低減に関連した異脂肪血症が挙げられる。代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）は、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）の少なくとも１つの症候が軽減され、終結され、遅くされ、または防止されると、「抑制される」。本明細書中で用いる場合、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）は、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）の再発または転移が低減され、遅くされ、遅延され、または防止されても、「抑制される」。
【００４６】
さらに、代謝障害は、１つ以上の別個の表現型と関連する。例えば、被験体の体格指数（ＢＭＩ）は、体重（ｋｇ）÷身長（ｍ）の二乗と定義され、したがって、ＢＭＩはｋｇ／ｍ２の単位を有する。体重超過は、個体が２５ｋｇ／ｍ２以上および３０ｋｇ／ｍ２未満のＢＭＩを有する症状、と定義される。いくつかの実施形態では、肥満症は、個体が３０ｋｇ／ｍ２またはそれ以上のＢＭＩを有する症状、と定義される。別の態様では、肥満症という用語は、いくつかの実施形態で、胴囲対腰囲比が男性１．０および女性０．８であると定義され、別の態様では、インスリン抵抗性および前糖尿病の発症の危険を定義する内臓型肥満を意味するために用いられる。正常血糖は、７０ｍｇ／ｄｌ（３．８９ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きく、１１０ｍｇ／ｄｌ（６．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の正常範囲内の絶食時血糖濃度を被験体が有する状態と定義される。絶食時という語は、医学用語としての通常の意味を有する。グルコース許容値低下（ＩＧＴ）は、１１０ｍｇ／ｄｌより大きく、１２６ｍｇ／ｄｌ（７．００ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の絶食時血糖濃度または絶食時血清グルコース濃度、あるいは１４０ｍｇ／ｄｌ（７．７８ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きく、２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の食後２時間血糖または血清グルコース濃度を被験体が有する症状と定義される。グルコース許容値低下という用語は、絶食時グルコース減損の症状に適用することも意図される。高インスリン血症は、被験体がインスリン抵抗性を有し、正常血糖を有する場合も有さない場合もあり、絶食時または食後血清または血漿インスリン濃度が、インスリン抵抗性を示さず、＜１．０（男性）または＜０．８（女性）の胴囲対腰囲比を有する正常のやせた個体の値より上昇される症状と定義される。「糖尿病」、「前糖尿病」および「インスリン感作」、「インスリン抵抗性改善」または「インスリン抵抗性低下」（本明細書中では互換的に用いられる）という用語が、本明細書中で記載されている。
【００４７】
本明細書中で用いる場合、「代謝症候群」は、これらの因子のうちの１つより多くが単一個体中に存在する場合に存在する症状を指す。因子としては、以下のものが挙げられる：中心性肥満（腹部およびその周囲の不均衡脂肪組織）、アテローム性異常脂質血症（これらは、血中脂肪障害の一ファミリー、例えば高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロールおよび高ＬＤＬコレステロール（血管系、例えば動脈壁におけるプラーク形成を促し得る）を包含する）、高血圧（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、インスリン抵抗性または糖不耐性（インスリンまたは血糖を適正に使用できないこと）、慢性プロトロンビン状態（例えば、血液中の高フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン活性因子阻害剤［−１］レベルにより特性化）、ならびに慢性前炎症状態（例えば、血液中の高感受性Ｃ反応性タンパク質の正常より高いレベルにより特性化）。いくつかの実施形態では、「成人高コレステロール血症の検出、評価および治療に関する米国コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）専門委員会の第三次報告（成人治療パネルＩＩＩ）」は、代謝障害の診断に用いられ得る。ＮＣＥＰ判定基準下で、代謝症候群は、単一被験体における以下の構成成分のうちの３つ以上の存在により臨床的に同定され得る：（１）中心性肥満（胴囲で測定）（女性：３５インチより大きい胴囲；男性：４０インチより大きい胴囲）；（２）１５０ｍｇ／ｄＬ以上の絶食時血中トリグリセリド；（３）血中ＨＤＬコレステロール（女性：５０ｍｇ／ｄＬ未満；男性４０ｍｇ／ｄＬ未満）；（４）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；ならびに（５）１１０ｍｇ／ｄＬ以上の絶食時グルコース。他の特徴、例えばインスリン抵抗性（例えば絶食時血中インシュリン増大）、プロトロンビン状態または前炎症状態は、一般に臨床的診断のためには必要とされないが、しかしそれらは確実に代謝症候群も示し、これらの属性に関する追跡試験を用いて、代謝症候群の診断をさらに確証し得る。例えば、インスリン抵抗性は、ＮＣＥＰ判定基準の非存在下でさえ、しばしば代謝症候群を示す。
【００４８】
バイオマーカー「核酸」は、少なくとも一部は、本発明のバイオマーカーによりコードされるかまたは対応する核酸（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。例えば、このようなバイオマーカー核酸分子としては、表１および２で記述される核酸配列のいずれかの全体または一部配列、あるいはこのような配列の相補体またはハイブリダイズ断片を含むＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）が挙げられる。バイオマーカー核酸分子は、表１および２で記述される核酸配列のいずれかの全体または一部配列、あるいはこのような配列の相補体を含むＤＮＡも包含するが、この場合、チミジン残基はすべて、ウリジン残基と置換される。「バイオマーカータンパク質」は、少なくとも一部は、本発明のバイオマーカーによりコードされるかまたはそれに対応するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、表１および２で記述される配列またはその断片のいずれかによりコードされるタンパク質の全体または一部配列を含む。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる。
【００４９】
特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝暗号（以下に示す）により定義されるようなタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間には、既知の且つ明確な対応が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝暗号により定義されるようなその核酸によりコードされるアミノ酸配列との間には、既知の且つ明確な対応が存在する。
【表１】
2013520162.tif 000002
【００５０】
遺伝暗号の重要な且つ周知の特徴はその冗長性であり、それにより、タンパク質を作製するために用いられるアミノ酸のほとんどに関して、１つより多くのコード化ヌクレオチド三つ組が用いられ得る（例えば、上記例証）。したがって、多数の異なるヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列をコードし得る。このようなヌクレオチド配列は、すべての生物体における同一アミノ酸配列の産生を引き起こすため、機能的に等価であるとみなされる（しかし、ある種の生物体は、それらが別の方法で行なうより効率的にいくつかの配列を翻訳し得る）。さらに、時として、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体が所定のヌクレオチド配列中に見出され得る。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード化関係に影響を及ぼさない。さらに、関連コドン表に基づいてコード化アミノ酸を具体的に変更するために、特定コドンのヌクレオチドを如何に突然変異化するかを、当業者は理解している。
【００５１】
バイオマーカーの「正常」コピー数、あるいはバイオマーカーの発現の「正常」レベルは、生物学的試料、例えば代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）に罹患していない被験体からの、例えばヒトからの組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄を含有する試料中のバイオマーカーの発現レベル、コピー数である。
【００５２】
本明細書中で用いる場合、「肥満症」は、３０ｋｇ／ｍ２以上の体格指数（ＢＭＩ）を指す（米国国立衛生研究所；成人における体重超過および肥満の同定、評価および治療に関する臨床ガイドライン（１９９８））。しかしながら、本発明は、少なくとも一部は、２５ｋｇ／ｍ２以上、２６ｋｇ／ｍ２以上、２７ｋｇ／ｍ２以上、２８ｋｇ／ｍ２以上、２９ｋｇ／ｍ２以上、２９．５ｋｇ／ｍ２以上、または２９．９ｋｇ／ｍ２以上（これらはすべて、典型的には、体重超過として言及される）の体格指数（ＢＭＩ）により特性化される疾患、障害または症状を包含するようにも意図される（米国国立衛生研究所；成人における体重超過および肥満の同定、評価および治療に関する臨床ガイドライン（１９９８））。本明細書中で記載される肥満は、遺伝的であれ、環境的であれ、任意の原因によるものであり得る。肥満を引き起こすかまたは肥満の原因であり得る障害の例としては、過食および過食症、多嚢胞性卵巣疾患、頭蓋咽頭腫、パラデー・ウィリ症候群、フローリッヒ症候群、ＩＩ型糖尿病、ＧＨ欠損被験体、正常変異体低身長、ターナー症候群、ならびに代謝活性低減または総除脂肪体重のパーセンテージとしての安静時エネルギー消費の低減を示す他の病理学的状態、例えば急性リンパ芽球性白血病を有する小児が挙げられる。「肥満の防止」は、肥満症状の開始前に処置が施される場合に、肥満症または肥満関連障害が起きないようにすることを指す。さらに、肥満症または肥満関連障害にすでに罹患しているかまたはその症候を有する被験体で処置が開始される場合、このような処置は、肥満症または肥満関連障害、ならびに肥満の医学的続発症、例えばアテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、多嚢胞性卵巣疾患、心臓血管性疾患、骨関節炎、皮膚科学的障害、高血圧症、インスリン抵抗性、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症および胆石症を防止するかまたはその進行を防止すると予測される。「肥満症の治療」は、哺乳動物のＢＭＩを約２５．９未満に低減すること、そしてある期間の間、例えば少なくとも約６ヶ月間、その体重を維持することを指す。治療は、代謝活性の増大を適切に生じる。
【００５３】
本発明のバイオマーカーの「過剰発現」または「有意に高レベルの発現、コピー数および／または活性」は、少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）は、発現またはコピー数を査定するために用いられる検定の標準誤差より大きい、そして対照試料（例えば、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）に罹患していない健常被験体からの試料）中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数、あるいはいくつかの対照試料中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上である試験試料中の発現レベル、コピー数および／または活性を指す。
【００５４】
「プローブ」という用語は、具体的に意図された標的分子、例えば少なくとも一部は本発明のバイオマーカーと選択的に結合し得る任意の分子を指す。プローブは、当業者により合成され得るし、あるいは適切な生物学的調製物から得られる。標的分子の検出の目的のために、プローブは、本明細書中に記載されるように標識されるよう具体的に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機単量体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、「ＰＰＡＲガンマ」は、核内受容体の周知のファミリーの一成員を指す。さらにＰＰＡＲガンマの「Ｓｅｒ−２７３」または「リン酸化Ｓｅｒ−２７３」は、Ｎ末端からのマウスＰＰＡＲガンマポリペプチドのアミノ酸番号付けを指す。したがって、マウスＰＡＲガンマポリペプチドのセリン２７３は多数の種を通して保存され、そして本発明の組成物および方法が、上記セリン２７３に対応する他の種、例えばヒトにおけるアイソフォーム、相同体、オルソログのセリン残基に等しく良好に当てはまる、と当業者は容易に理解する。例えば代表的ＰＰＡＲガンマ種は、ＰＰＡＲ核内受容体スーパーファミリーの他の成員（例えば、ＰＰＡＲアルファおよびＰＰＡＲデルタ）と対照して、本明細書中で以下のように提示される：
【００５６】
【数１】
2013520162.tif 000003
【００５７】
【数２】
2013520162.tif 000004
【００５８】
【数３】
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【００５９】
【数４】
2013520162.tif 000006
【００６０】
【数５】
2013520162.tif 000007
【００６１】
【数６】
2013520162.tif 000008
【００６２】
【数７】
2013520162.tif 000009
【００６３】
【数８】
2013520162.tif 000010
【００６４】
「ＰＰＡＲガンマアゴニスト」は、本明細書中で用いる場合、任意の機序により、ＰＰＡＲガンマまたはＲＸＲとの直接結合により、または遺伝子発現に影響を及ぼすＰＰＡＲガンマまたはＰＰＡＲガンマ−ＲＸＲへテロ二量体の能力に作用する任意の他の機序を介して間接的に、ＰＰＡＲガンマの、またはＰＰＡＲガンマとレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とのヘテロ二量体の活性を増大するかまたは増大を引き起こす任意の化合物を指す。
【００６５】
「古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト」は、本明細書中で用いる場合、代謝障害を助長することと関連づけられるＰＰＡＲガンマ媒介性遺伝子発現を促すＰＰＡＲガンマリガンドを指す。古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストは、「脂肪生成」遺伝子の発現を促進する（例えば、以下の表２に記述した遺伝子、活性および検定を参照）。ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ロシグリタゾンにより調節される遺伝子は、一例である。古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストに関連した副作用としては、例えば体重増加、白色脂肪細胞増加、体液停留、末梢性浮腫および肺浮腫が挙げられる。
【００６６】
「非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニスト」または「選択的ＰＰＡＲガンマアゴニスト」は、本明細書中で用いる場合、主におよび／または専ら、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により調節される遺伝子の発現を調節するＰＰＡＲガンマリガンドを指す。例としては、「抗糖尿病」、「褐色脂肪」および／または「呼吸／酸素消費増大」遺伝子が挙げられる（例えば、表１参照）。非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドの一例は、例えばＭＲＬ２４である。ある実施形態では、非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストは、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストに関連した副作用、例えば体重増加、白色脂肪細胞増加、体液停留、末梢性浮腫および肺浮腫のうちの１つ以上を伴うことなく、抗代謝障害活性を促進し得る。したがって、本発明の例示的非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドは、少なくとも一部は、例えば、血糖低減作用、血中脂質低減作用、血中インスリン低減作用、インスリン感受性増強作用、インスリン抵抗性改善作用、体重低減作用、身体中心部周囲（胴囲：腰囲比として測定）低減作用、および／または体脂肪量低減作用を有する化合物または薬学的組成物を含む。
【００６７】
ＰＰＡＲガンマリガンドとしては、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、ＭＫ−０５３３、ＭＫ  ７６７（ＫＲＰ−２９７）、ＭＣＣ−５５５、ネトグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン）、非−チアゾリジネジオン（例えば、ＪＴＴ−５０１、ＬＳＮ８６２、ＤＲＦ  ４８３２、ＬＭ  ４１５６、ＬＹ  ５１０９２９、ＬＹ  ５１９８１８、ＴＹ  ５１５０１、Ｘ  ３３４）、ある種のチロシンベースの誘導体（例えば、ＧＷ１９２９、ＧＷ７８４５）、フェニル酢酸ベースの誘導体、フェノキサジンフェニルプロパン酸誘導体（例えば、ＤＲＦ  ２７２５、ＤＲＦ  ２１８９）、桂皮酸およびジヒドロ桂皮酸ベースの誘導体（例えば、テサグリタザール（ＡＺ  ２４２））、ならびに３−フェニル−７−プロピルベンズイソキサゾール（Ａｄａｍｓ  Ａ  Ｄ、ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  （２００３）  １３：９３１−５）、ＭＲＬ−２０、ＭＲＬ−２４、ｎＴＺＤｐａ、ＳＲ１４５、ＳＲ１４７、Ｍｂｘ−１０２およびＢＶＴ．１３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
処置に対して「応答する」ための「応答性」ならびにこの動詞の他の形態は、本明細書中で用いる場合、ＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に対する被験体の反応を指す。一例として、被験体における抗代謝活性が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上、遅延される場合、被験体はＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に応答する。別の例では、処置が施されない場合に予測される平均余命より約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上延長された平均余命を被験体が経験する場合、被験体は非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に応答する。別の例では、代謝障害なしの生存増大、総体的生存または代謝障害の進行までの時間増大を被験体が示す場合、被験体はＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に応答する。
【００６９】
「試料」、「組織試料」、「被験体試料」、「被験体細胞または組織試料」あるいは「検体」は、各々、被験体の組織または被験体から得られる類似の細胞の収集物を指す。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結された、および／または保存された器官、組織試料、生検または吸引物からのような固形組織；血液または任意の血液成分；体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹水または間質液；あるいは被験体の妊娠または発生の任意の時期からの細胞であり得る。組織試料は、天然では実際に組織と混ぜ合わせられない化合物、例えば防腐剤、凝固防止剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等を含有し得る。
【００７０】
被験体におけるバイオマーカーの量、例えば本発明のバイオマーカーの、少なくとも一部の（例えば表１および２に記述したバイオマーカー）発現またはコピー数は、量を査定するために用いられる検定の標準誤差より大きい量だけ、あるいはその量の少なくとも２、３、４、５、１０倍またはそれ以上、正常レベルよりバイオマーカーの量がそれぞれ大きいかまたは低い場合、バイオマーカーの正常量より「有意に」高いかまたは低い。代替的には、その量がバイオマーカーの正常量より、素それぞれ、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍または少なくとも約５倍高いかまたは低い場合、被験体におけるバイオマーカーの量は、正常量より「有意に」高いかまたは低いと考えられ得る。
【００７１】
本明細書中で用いる場合、「被験体」および「患者」という用語は互換的に用いられる。本明細書中で用いる場合、「被験体」およｂ「被験体（複数）」という用語は、動物、例えば哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）ならびに霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザル、ゴリラ、チンパンジーおよびヒト）を指す。
【００７２】
本明細書中で用いる場合、「時間経過」は、初期事象とその後の事象との間の時間の量を指す。例えば、被験体の代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）に関しては、時間経過は被験体の疾患に関連し得るし、疾患の経過における有意の事象を評価することにより測定され得るが、この場合、第一事象は診断であり、その後の事象は有意の体重損失、インスリン感受性等であり得る。
【００７３】
「進行までの時間」または「ＴＴＰ」は、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）の進行に対する処置あるいは検閲の開始から測定されるような時間を指す。検閲は、試験終了から、あるいは処置の変化から得られる。進行までの時間は、例えばカプリン・メーヤープロット（進行までの時間は特定時間に亘って進行していない確率を表し、その時間は処置の開始と進行またな検閲までの間の時間である）の場合と同じ確率を表し得る。
【００７４】
「転写ポリヌクレオチド」は、少なくとも一部は本発明のバイオマーカーの転写、ならびに、もしあれば、転写物の正常転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、および転写物の逆転写により作られる成熟ＲＮＡの全部または一部と相補的であるかまたは相同であるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいはＲＮＡまたはｃＤＮＡのうちの一方の類似体）である。
【００７５】
「処置する」、「処置」ならびにこの語の別の形態は、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）の増大を遅らせ、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）を改善させ、被験体の予測生存時間および／または代謝障害の進行までの時間を延長する等のためのＰＰＡＲガンマリガンドの投与を指す。
【００７６】
少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）は本発明のバイオマーカーの「低発現」または「有意に低レベルの発現、コピー数および／または活性」は、発現またはコピー数を査定するために用いられる検定の標準誤差より大きい、例えば対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常被験体からの試料）中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数、あるいはいくつかの対照試料中の少なくとも一部（例えば、表１および２に記述したバイオマーカー）の本発明のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１または少なくとも１０文の１またはそれ以下である試験試料における発現レベルまたはコピー数を指す。
【００７７】
「〜がありそうにない」は、事象、事項、対象、事物または人がある言及に関連して起こる確率低減を指す。したがって、ＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に応答しそうにない被験体は、参照被験体または被験体の群に比して、ＰＰＡＲガンマリガンドによる処置に応答する確率の低減を示す（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％またはそれ以上（あるいは任意の範囲を含めて）の低減）。
Ｉ．本発明の核酸
【００７８】
本発明の一態様は、マウスのセリン２７３でリン酸化され得ないＰＰＡＲガンマポリペプチドまたはその生物学的活性部分をコードする単離核酸分子を利用する組成物および方法に、ならびに対応するセリン残基でリン酸化され得ない例えばヒトを含めた上記セリン２７３に対応する他の種における対応するアイソフォーム、相同体およびオルソログ（すなわち、本明細書中では以後、非リン酸化可能なＰＰＡＲガンマと呼ぶ）、ならびに非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドまたはその生物学的活性部分をコードする核酸（すなわちｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるために十分な核酸断片に関する。本明細書中で用いる場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（すなわち、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（すなわちｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を包含するよう意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離されるものである。「単離」核酸は、その核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で核酸と天然に側面を接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を有さない。例えば、種々の実施形態では、単離非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ核酸分子は、核酸が由来する細胞（すなわち、褐色脂肪細胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子と天然に側面を接するヌクレオチド配列  約５ｋｂ、４ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含有し得る。さらに、「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、他の細胞性物質を、または組換え技法により産生される場合は培地を、あるいは化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有し得ない。
【００７９】
本発明の核酸分子、少なくとも一部（すなわち、表１および２に列挙した核酸分子）、あるいは表１および２に示したヌクレオチド配列またはその一部分（すなわち、４００、４５０、５００またはそれ以上のヌクレオチド）と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％またはそれ以上（例えば、約９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上）相同であるヌクレオチド配列が、標準分子生物学的技法ならびに本明細書中で提供される配列情報を用いて単離され得る。例えば、ヒト非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして表１および２に示したヌクレオチド配列の全部または一部を、ならびに標準ハイブリダイゼーション技法（すなわち、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９に記載）を用いて、（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  ＬａＪｏｌｌａ，  ＣＡ，  ｏｒ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡからの）ヒトの肝臓、心臓、腎臓または脳細胞株から単離され得る。さらに、表１および２に示したヌクレオチド配列、あるいは表１および２に示したヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列の全部または一部を包含する核酸分子は、表１および２に示したヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列の配列を基礎にして設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応および／または部位特異的突然変異誘発により単離され得る。例えばｍＲＮＡは、肝臓細胞、心臓細胞、腎臓細胞、脳細胞または褐色脂肪細胞から単離され（すなわち、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：  ５２９４−５２９９のグアニジニウム−チオシアネート抽出手法により）、そしてｃＤＮＡは、逆転写酵素（すなわち、モロニーＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤから入手可能）；またはＡＭＶ逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，  ＦＬから入手可能）を用いて調製され得る。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、表１および２に示したヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列を基礎にして設計され得る。本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技法に従って、鋳型としてｃＤＮＡまたは代替的にはゲノムＤＮＡ（生殖系列および体細胞ゲノムＤＮＡの両方を含めて）を、ならびに適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。そのようにして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化されて、ＤＮＡ配列解析により特性化され得る。さらに、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準合成技法により、すなわち自動ＤＮＡ合成機を用いて調製され得る。
【００８０】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマヌクレオチド配列を基礎にしたプローブを用いて、同一または相同のタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出し得る。ある実施形態では、プローブはさらに、それに結合される標識基を含み、すなわち、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば、被験体からの細胞の試料中のセリン２７３コード核酸でリン酸化され得ないＰＰＡＲガンマポリペプチドまたはその生物学的活性部分のレベルを測定することにより、すなわち、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡレベルを検出することにより、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質を発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る。
【００８１】
他の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマファミリー成員をコードし、したがって表１および２に列挙した配列の野生型ＰＰＡＲガンマ配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の一部であるよう意図される。さらに、異なる種からの非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質をコードし、したがって表１および２に列挙した非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であるよう意図される。例えば、ラットまたはサルの非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｃＤＮＡは、ヒトおよび／またはマウス非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ核酸配列の既知のヌクレオチド配列および工学処理突然変異に基づいて同定されおよび／または合成され得る。
【００８２】
一実施形態では、アラニンへのセリン２７３の突然変異（例えば２７３番目のアミノ酸はリン酸化されるようにできない）を有するマウスＰＰＡＲガンマポリペプチドに関して本明細書中に記載される以下の生物学的活性のうちの１つ以上をタンパク質またはその部分が保持するよう、表１および２に列挙したアミノ酸配列と十分に相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分を、本発明の核酸分子はコードする。セリンまたはリン酸化可能アミノ酸残基、例えば、トレオニンまたはチロシンのコード化を防止する任意の核酸突然変異が意図される。当該種における遺伝暗号の縮重およびコドンアルゴリズムに基づいて、任意のおよびすべてのこのような突然変異は、当業者に容易に理解される。
【００８３】
別の実施形態では、タンパク質は、表１および２に列挙した全アミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％またはそれ以上相同である。
【００８４】
本発明の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ核酸分子によりコードされるタンパク質の部分は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の生物学的活性部分である。本明細書中で用いる場合、「非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの生物学的活性部分」という用語は、本明細書中に記載されるような１つ以上の判定基準（例えば、Ｓｅｒ−２７３で非リン酸化可能なコンセンサスｃｄｋ５リン酸化モチーフおよび／または突然変異化ＰＰＡＲガンマ）に従って、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの一部分、例えばドメイン／モチーフを包含するよう意図される。
【００８５】
本明細書中に記載されるような標準結合検定、例えば免疫沈降および酵母２−ハイブリッド検定を実施して、ＰＰＡＲガンマリガンド依存性または非依存性であり得る検定において当該標的と相互作用する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質またはその生物学的活性部分の能力を確定し得る。本発明の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマファミリー成員が、少なくとも一部が、表１および２に列挙したバイオマーカーを調整するか否かを確定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写検定が実施され得る。このような検定を実施するために、当該遺伝子の全長プロモーター／エンハンサー領域が、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼと連結されて、宿主細胞（例えば、肝臓細胞、例えばＦａｏ肝癌細胞またはＣＯＳ細胞）中に導入され得る。次いで、同一宿主細胞は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ分子をコードする核酸分子をトランスフェクトされ得る。ＣＡＴまたはルシフェラーゼ活性を試験し、それを、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ分子をコードする核酸を含有しない細胞中のＣＡＴまたはルシフェラーゼ活性と比較することにより、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ分子の作用が測定され得る。ＣＡＴまたはルシフェラーゼ活性の増大または低減は、当該遺伝子の発現の調整を示す。別の実施形態では、表１および２に列挙したバイオマーカーの発現が別個の生物学的経路に導く事象のカスケードにおける重要な構成成分であることが規定であるため、この検定は、このような経路、例えば脂肪酸取込み、組織学、遺伝子発現、非結合酸素消費、ミトコンドリア生合成等による褐色脂肪の誘導、酸素消費増大によるｉｎ  ｖｉｖｏでのエネルギー消耗、発熱、食物摂取等の変化なし、血清脂肪酸レベル、血清アディポカイン（例えばアディポネクチン）レベル、白色脂肪貯留物、体脂肪量、除脂肪体重、絶食時グルコース、グルコース耐容性、インスリン耐容性、インスリン感受性、インスリン依存性グルコース摂取、ＴＮＦ−アルファ分泌による肥満誘導性炎症の抑制、ＭＣＰ１炎症遺伝子発現等を調整する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ分子の能力も測定し得る。このような分析は、当該技術分野で周知である。
【００８６】
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重のために表１および２に示したヌクレオチド配列（およびその部分）と異なり、したがって当業者に容易に理解される多数の方法で非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質をコードする核酸分子を包含する。例えば、変化は、表１および２のヌクレオチド配列中への突然変異により導入され、それによりコード化非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすが、実施例に記載されるＳ２７３Ａ突然変異を有する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の機能的能力を変更することはない、ということを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列中に作られ得る。「非必須」アミノ酸残基は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの活性を変更することなく、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの野生型配列（例えば、表１および２に列挙した配列）から変更され得る残基であるが、一方、「必須」アミノ酸残基は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ活性に必要とされる。しかしながら、他のアミノ酸残基（例えば、マウスおよびヒト間で保存されないかまたは半保存されるだけであるもの）は、活性に不可欠であるというわけではなく、したがって、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ活性を変更することなく変更が容易であると思われる。さらに、発熱および／または脂肪生成に関連した非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ機能に不可欠であるが、しかし糖新生に関連した非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ機能に不可欠でないアミノ酸残基は、変更が容易であると思われる。
【００８７】
したがって、本発明の別の態様は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ活性に不可欠でないアミノ酸残基における変化を含有する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質をコードする核酸分子に関する。このような非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、本明細書中に記載される非利が活性のうちの少なくとも１つを未だ保持する表１および２と、アミノ酸配列が異なる。
【００８８】
「配列同一性または相同性」は、本明細書中で用いる場合、２つのポリペプチド分子間の、あるいは２つの核酸分子間の配列類似性を指す。２つの比較配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより占められる場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々における一位置がアデニンにより占有される場合には、分子はその位置で相同であるかまたは配列同一性である。２つの配列間の相同性または配列同一性のパーセントは、２つの配列により共有される整合または相同同一位置の数を比較される位置の数で割って１００をかけた一関数である。例えば、２つの配列における１０の位置のうちの６つが同一である場合には、２つの配列は６０％相同であるかまたは６０％の配列同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性または配列同一性を共有する。一般的に、２つの配列が最大相同性を生じるよう一列に並べられる場合に、比較がなされる。別記しない限り、「ループアウト領域」、例えば配列のうちの１つにおける欠失または挿入から生じるものは、不整合とみなされる。
【００８９】
２つの配列間の配列の比較ならびに相同性％の確定は、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げられ得る。アラインメントは、クラスタル法を用いて実施され得る。多重アラインメントパラメーターとしては、ＧＡＰペナルティー＝１０、ギャップ長ペナルティー＝１０が挙げられる。ＤＮＡアラインメントに関しては、ペアワイズ・アラインメント・パラメーターは、Ｈｔｕｐｌｅ＝２、ギャップペナルティー＝５、ウィンドウ＝４および保存される対角線＝４であり得る。タンパク質アラインメントに関しては、ペアワイズ・アラインメント・パラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５および保存される対角線＝５であり得る。
【００９０】
ある実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ニードルマン・ブンシュ・アルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３  （１９７０））を用いて決定されるが、これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）のＧＡＰプログラム中に組入れられており、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびにギャップ重量：１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さ重量：１、２、３、４、５または６を用いる。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）中のＧＡＰプログラムを用いて決定され、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびにギャップ重量：４０、５０、６０、７０または８０、および長さ重量：１、２、３、４、５または６を用いる。別の実施形態では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性％は、Ｅ．マイヤーズ・Ｗ．ミラー・アルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７  （１９８９））を用いて決定されるが、これは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（オンラインで入手可能）中に組入れられており、ＰＡＭ１２０  重量残基表、ギャップ長ペナルティー：１２およびギャップペナルティー：４を用いる。
【００９１】
表１および２に列挙したタンパク質と相同である非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質をコードする単離核酸分子は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコード化タンパク質中に導入されるよう、表１および２のヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列中に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作製され得る。突然変異は、標準技法、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発により、表１および２または相同ヌクレオチド配列中に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と取り替えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で限定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝鎖側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ中の予測非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と置き換えられる。代替的には、別の実施形態では、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発により、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード配列の全部または一部に沿って無作為に導入され、その結果生じる突然変異体は、本明細書中に記載される非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ活性に関してスクリーニングされて、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ活性を保有する突然変異体を同定し得る。表１および２から選択される配列の突然変異誘発後、コード化タンパク質が組換え的に発現され（本明細書中にきさいされるように）、そして例えば本明細書中に記載の検定を用いて、タンパク質の活性が確定され得る。
【００９２】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマレベルは、転写分子またはタンパク質の発現を検出するための広範な種々の周知の方法のいずれかにより査定され得る。このような方法の非限定例としては、タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製方法、タンパク質機能または活性検定、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸逆転写方法および核酸増幅方法が挙げられる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマレベルは、遺伝子転写物（例えばｍＲＮＡ）を測定することにより、翻訳化タンパク質の量の測定により、または遺伝子産物活性の測定により確証される。発現レベルは、種々の方法で、例えば、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を検出することによりモニタリングされ、そのいずれかは、標準技法を用いて測定され得る。検出は、遺伝子発現（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または酵素活性）のレベルの定量を包含し得るし、代替的には、特に対照レベルと比較した場合の遺伝子発現のレベルの定性的査定であり得る。検出されているレベルの種類は、ブンミャクから明らかになる。
【００９４】
特定の実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡ発現レベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて、生物学的試料で、ｉｎ  ｓｉｔｕによりならびにｉｎ  ｖｉｖｏフォーマットにより、確定され得る。「生物学的試料」という用語は、被験体から単離された組織、細胞、生物学的流体およびその単離物、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および流体を包含するよう意図される。多数の発現検出方法が、単離ＲＮＡを用いる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関しては、ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技法が、細胞からのＲＮＡの精製のために利用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９参照）。さらに、当業者に周知の技法、例えば単一段階ＲＮＡ単離工程（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）を用いて、多数の組織試料が容易に加工処理され得る。
【００９５】
単離ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは増幅検定で、例えばサザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイ（これらに限定されない）で用いられ得る。ｍＲＮＡレベルの検出のための一診断方法は、単離ｍＲＮＡを、検出されている遺伝子によりコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させることを包含する。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡまたはその一部分、例えば少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと、緊縮条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分である。本発明の診断検定に用いるための他の適切なプローブは、本明細書中に記載されている。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマが発現されつつあることを示す。
【００９６】
一フォーマットでは、ｍＲＮＡは固体表面に固定され、そして例えば単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上で移動させて、ｍＲＮＡをゲルから膜、例えばニトロセルロースに移すことにより、プローブと接触される。代替的フォーマットでは、プローブ（単数または複数）は、固体表面に固定され、そして例えば遺伝子チップアレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）遺伝子チップアレイで、ｍＲＮＡがプローブ（単数または複数）と接触される。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡ発現レベルのレベルを検出するのに用いるために、既知のｍＲＮＡ検出方法を、当業者は容易に適合し得る。
【００９７】
試料中の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡ発現レベルを確定するための代替的方法は、例えばｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，  １９８７，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，６８３，２０２に記述された実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：１８９−１９３）、自己持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル型複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，８５４，０３３）または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅と、その後の、当業者に周知の技法を用いた増幅分子の検出の工程を包含する。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合、核酸分子の検出のために特に有用である。本明細書中で用いる場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれ、＋および−鎖、またはその逆）とアニーリングし得る、そして間に短い領域を含有する一対の核酸分子であると定義される。概して、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域の側面に位置する。適切な条件下で、適切な試薬を用いて、このようなプライマーは、プライマーが側面に位置するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【００９８】
ｉｎ  ｓｉｔｕ方法に関しては、ｍＲＮＡは検出前に細胞から単離される必要がない。このような方法では、細胞または組織試料は、既知の組織学的方法を用いて調製／加工処理される。次いで試料は、支持体、典型的にはガラススライド上に固定され、次に、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブと接触される。
【００９９】
絶対非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現レベルに基づいた決定の実行に代わるものとして、正規化非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現レベルに基づいて決定がなされ得る。非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と、その発現を比較することにより、絶対非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現レベルを補正することにより、発現レベルが正規化される。正規化のための適切な遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子が挙げられる。この正規化は、ある試料、例えば一被験体試料中の発現レベルと、別の試料、例えば正常試料との比較、あるいは異なる供給源からの試料間の比較を可能にする。
【０１００】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質のレベルまたは活性は、発現ポリペプチドを検出するかまたは定量することによっても検出および／または定量され得る。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドは、当業者に周知の多数の手段のいずれかにより検出され、定量され得る。これらの例としては、分析的生化学的方法、例えば電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー等、あるいは種々の免疫学的方法、例えば流体またはゲル沈降反応、免疫拡散法（単一または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光検定、ウエスタンブロッティング等が挙げられる。細胞が非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを発現するか否かを確定するのに用いるために既知のタンパク質／抗体検出方法を、当業者は容易に適合し得る。
【０１０１】
上記の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質をコードする核酸分子のほかに、本発明の別の態様は、それに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸と相補的である、すなわち二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合し得る。アンチセンス核酸は、全非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード鎖と、またはその一部分のみと相補的であり得る。一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域の側面に位置する５’および３’配列を指す（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
ＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
【０１０２】
本発明の別の態様は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ（またはその一部分）をコードする核酸を含有するベクターおよび発現ベクターの使用に関する。本明細書中で用いる場合、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を運搬し得る核酸分子を指す。ベクターの一型は「プラスミド」であって、これは、付加的ＤＮＡセグメントが結紮され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのほかの型はウイルスベクターであって、この場合、付加的ＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに結紮され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム型哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム型哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能的に連結される遺伝子の発現を指図し得る。このようなベクターは、本明細書中では、「発現ベクター」と呼ばれる。概して、組換えＤＮＡ技術において有用性を有する発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられ得る。しかしながら、本発明は、等価の機能を供するこのような他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含するよう意図される。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ核酸分子を含むアデノウイルスベクターは、ある実施形態において用いられる。
【０１０３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むが、これは、発現されるべき核酸配列と操作可能的に連結される、発現のために用いられるべき宿主細胞を基礎にして選択される１つ以上の調節配列を、組換え発現ベクターが包含する、ということを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能的に連結される」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、あるいはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞中で）、当該ヌクレオチド配列が調節配列（単数または複数）と連結される、ということを意味するものである。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御素子（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するよう意図される。このような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）に記載されている。調節配列としては、多数の型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、ならびにある種の宿主細胞だけのヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベル等といったような因子によって決まる、と当業者は理解する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより、本明細書中で記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド、例えば融合タンパク質またはペプチド（例えば、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質、突然変異体型の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ、融合タンパク質等）を産生し得る。
【０１０４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞における非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの発現のために設計され得る。例えば、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマは、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）でさらに考察されている。代替的には、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、翻訳され得る。
【０１０５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指図する構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌で、非常にしばしば実行される。融合ベクターは、多数のアミノ酸をその中でコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的に役立つ：１）組換えタンパク質の発現を増大するため；２）組換えタンパク質の溶解性を増大するため；ならびに３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を手助けするため。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解的切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されて、融合部分からの組換えタンパク質の分離とその後の融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素、ならびにそれらのコグネイト認識配列は、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．Ｓ．  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が挙げられるが、これらは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質と融合する。一実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマのコード配列は、ｐＧＥＸ発現ベクター中でクローン化されて、Ｎ末端からＣ末端に、ＧＳＴ−トロンビン結合部位−非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを含む融合タンパク質をコードするベクターを作製する。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。ＧＳＴと融合されない組換え非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマは、タンパク質とトロンビンとの融合の切断により回収され得る。
【０１０６】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９０）  ６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に頼る。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）により媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に頼る。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７  ｇｎ１遺伝子を保有する常在性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１０７】
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大にするための一戦略は、タンパク質分解的に組換えタンパク質を切断する能力を減損した宿主細菌中でタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｓ．，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９０）  １１９−１２８）。別の戦略は、各アミノ酸に関する個々のコドンが大腸菌で利用されるものであるよう、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準ＤＮＡ合成技術により実行され得る。
【０１０８】
別の実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。出芽酵母における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  ＥＭＢＯＪ．  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，  （１９８２）  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）が挙げられる。
【０１０９】
代替的には、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ  （１９８９）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１１０】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，  Ｂ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  ＥＭＢＯＪ．  ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節因子により提供される。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物および真核生物細胞の両方に関する他の適切な発現系に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９の第１６および１７章を参照されたい。
【０１１１】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定細胞型における核酸の発現を指図し得る（例えば、組織特異的調節因子は、核酸を発現するために用いられる）。組織特異的調節因子は、当該技術分野で既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ  （１９８８）  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  （１９８９）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；  Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  （１９８３）  Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経細繊維プロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開番号２６４，１６６）が挙げられる。発生段階調節型プロモーター、例えばネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ  （１９８９）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：５３７−５４６）も、包含される。
【０１１２】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクター中でクローン化される本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にする方式で、調節配列と操作可能的に連結される。アンチセンス配向でクローン化される核酸と操作可能的に連結される調節配列が選択され得るが、これは、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指図し、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指図するウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得るが、その中で、高効率性調節領域の制御下でアンチセンス核酸が産生され、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。
【０１１３】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中では互換的に用いられる。このような用語は、特定の被験体だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫も指す、と理解される。突然変異または環境的影響により、ある種の修飾が後の世代に起こり得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一であるわけではないが、しかし本明細書中で用いられるような用語の範囲内に包含される。
【０１１４】
宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物細胞であり得る。例えば、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、Ｆａｏ肝臓癌細胞、始原肝細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）中で発現され得る。他の適切な宿主細胞が当業者に既知である。
【０１１５】
ベクターＤＮＡは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技法により原核生物または真核生物細胞中に導入され得る。本明細書中で用いる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞中に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための種々の当該技術分野で認知された技法、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を指すよう意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）ならびに他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１１６】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションに関しては、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技法によって、細胞の小分画のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込み得る、ということが知られている。これらの組込み物を同定し、選択するために、選択可能なバイオマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に、当該遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。選択可能マーカーとしては、薬剤、例えばＧ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートに対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマをコードするものと同じベクター上で宿主細胞中に導入され得るし、あるいは別個のベクター上で導入され得る。導入核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定され得る（例えば、選択可能バイオマーカー遺伝子を組入れた細胞は生き残るが、一方、他の細胞は死亡する）。
【０１１７】
本発明の宿主細胞、例えば培養中の原核生物または真核生物宿主細胞は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質を産生する（すなわち、発現する）ために用いられ得る。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質を賛成するための方法を提供する。一実施形態では、当該方法は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマが産生されるまで、適切な培地中で本発明の宿主細胞（その中に非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養することを包含する。別の実施形態では、当該方法はさらに、宿主細胞の培地から非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを単離することを包含する。
【０１１８】
本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物（例えば、ノックイン動物）を産生するためにも用いられ得る。非ヒトトランスジェニック動物は、選定される障害、例えばグルコース恒常性障害、体重障害または不十分なインスリン活性に関連した障害の有害な症候を改善し得る作用物質または化合物、例えば薬剤、調合薬等を同定するために設計される検定をスクリーニングするのに用いられ得る。例えば、一実施形態では、本発明の宿主細胞は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード配列（例えば、ネズミＰＰＡＲガンマコードアラニンまたはセリンというよりむしろ位置２７３での他の非リン酸化可能アミノ酸）が導入された受精卵または胚性幹細胞である。次に、このような宿主細胞を用いて、外因性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列がそれらのゲノム中に導入された非ヒトトランスジェニック動物、あるいは内因性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列が変更された相同組換え動物を作製し得る。このような動物は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの機能および／または活性を試験するために、ならびに本明細書中に記載される方法および判定基準を用いて非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ活性の調節因子を同定しおよび／または評価するために、有用である。本明細書中で用いる場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、哺乳動物、決死類、例えばラットまたはマウスであり、この場合、動物の細胞の１つ以上が導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれる、そして成熟動物のゲノム中に保持され、それによりトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織中でのコード遺伝子産物の発現を指図する外因性ＤＮＡである。本明細書中で用いる場合、「相同組換え動物」は、内因性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子が、内因性遺伝子と、動物の細胞中に、例えば動物の胚細胞中に、動物の発生前に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えにより変更された非ヒト動物、哺乳動物、マウスである。
【０１１９】
本発明のトランスジェニック動物は、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、受精卵の雄性前核中に非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード核酸を導入し、そして偽妊娠養母動物中で卵を発生させることにより、作製され得る。ヒト非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム中に導入され得る。代替的には、ヒト非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウス非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子が、導入遺伝子として用いられ得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、導入遺伝子の発現の効率を増大するために、導入遺伝子中に含まれ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ導入遺伝子と操作可能的に連結されて、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の発現を特定細胞に向け得る。胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を生成するための方法は、当該技術分野では慣用的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号（ともにＬｅｄｅｒ等）、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒ等）に、ならびにＨｏｇａｎ，  Ｂ．，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８６）に記載されている。他のトランスジェニック動物の産生のために、同様の方法が用いられる。初代遺伝子導入動物は、そのゲノム中の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ導入遺伝子の存在、および／または動物の組織または細胞中の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、初代遺伝子導入動物は、導入遺伝子を保有する付加的動物を育種するために用いられ得る。さらに、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマをコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物と交配され得る。
【０１２０】
相同組換え動物を作製するために、それにより野生型のリン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子を変更する、例えば置き換えるために欠失、付加または置換が導入された、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターが調製される。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、表１および２に列挙した配列のｃＤＮＡでスクリーニングされたヒトゲノムライブラリーから単離されたヒトゲノムクローンから）であり得るし、ヒト非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子の非ヒト相同体でもあり得る。例えば、マウス非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子を用いて、マウスゲノム中の内因性リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子を変更するのに適した相同組換えベクターを構築し得る。ある実施形態では、相同組換え時に、内因性リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子が機能的に崩壊されるように、ベクターは設計される（すなわち、リン酸化可能タンパク質をもはやコードしない；「ノックイン」ベクターとも呼ばれる）。相同組換えベクターにおいて、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子の変更部分は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子の付加的核酸がその５’および３’末端で側面に位置して、ベクターにより保有される外因性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子との間に相同組換えを起こさせる。付加的フランキング非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ核酸は、内因性遺伝子との上首尾の相同組換えのために十分な長さを有する。典型的には、数キロ塩基のフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方に）が、ベクター中に含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明に関しては、Ｔｈｏｍａｓ，  Ｋ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．  Ｒ．  （１９８７）  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３参照）。ベクターは、胚性幹細胞株中に導入され（例えば、電気穿孔により）、そして導入非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子が内因性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ遺伝子と相同的に組み替えられた細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６９：９１５参照）。次いで、選択細胞は、動物（例えばマウス）の胚盤胞中に注入されて、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ａ．  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  ｅｄ．  （ＩＲＬ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８７）  ｐｐ．  １１３−１５２参照）。次に、キメラ胚が適切な偽妊娠義母動物中に移植されて、胚が分娩される。その生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を用いて、づ物の全細胞が、導入遺伝子の生殖系列伝搬により相同組換えＤＮＡを含有する動物を育種し得る。相同組換えベクターおよび相同組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ａ．  （１９９１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９  に、ならびにＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９０／１１３５４（Ｌｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃ等）；ＷＯ  ９１／０１１４０（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ等）；ＷＯ  ９２／０９６８（Ｚｉｊｌｓｔｒａ等）；ならびにＷＯ  ９３／０４１６９（Ｂｅｒｎｓ等）にさらに記載されている。
【０１２１】
別の実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含有するトランスジェニック非ヒト動物が産生され得る。このような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明に関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６参照。リコンビナーゼ系の別の例は、出芽酵母のＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を用いて、導入遺伝子の発現を調節する場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要とされる。このような動物は、例えば一方が選択タンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する２つのトランスジェニック動物を交配することによる「二重」トランスジェニック動物の構築により提供され得る。
【０１２２】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開  ＷＯ  ９７／０７６６８およびＷＯ  ９７／０７６６９に記載された方法によっても産生され得る。要するに、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞は、単離され、成長周期を出て、Ｇ０期に入るよう誘導される。次に、静止細胞は、例えば電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同一種の動物からの除核卵細胞と融合される。次に、再構築卵細胞は、桑実胚または芽細胞に発生した後、偽妊娠養母動物に移されるよう、培養される。この養母動物から産まれる子孫は、細胞、例えば体細胞が単離される動物のクローンである。
【０１２３】
トランスジェニック動物、例えばＳ２７３Ａ  ＰＰＡＲガンマ突然変異体ノックイン動物は、本明細書中にさらに記載されるように、多数の用途を有する。
【０１２４】
一実施形態では、例えばＰＰＡＲガンマのＳ２７３Ａ突然変異に関してホモ接合性であるノックイン動物を用いて、潜在的抗代謝障害治療薬の効力を試験し得る。ｃｄｋ５によりセリン２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化を遮断するＭＲＬ−２４および類似の化合物（ホスホ−ブロッカー）は、ＴＺＤのような古典的アゴニストの副作用を有することなく、代謝障害を改善すると考えられる。例えば、ＰＰＡＲガンマは、痩身および肥満個体の両方で活性である；しかしながら、これらの状態では、ＰＰＡＲガンマは、標的遺伝子のわずかに異なる転写を示す。転写活性におけるこの差は、Ｓｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマの抑制的リン酸化のためであると考えられる。アラニンまたは他の非リン酸化可能アミノ酸残基にＳｅｒ−２７３で突然変異化されるＰＰＡＲガンマの両コピーを有するマウスは、高脂肪餌の挑戦に直面した場合、正常グルコース耐性を保持するはずである。ＭＲＬ−２４のグルコース低下作用はＰＰＡＲガンマアゴニストを必要とせず、その作用は、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストの投与時に観察される体重増加および体液停留に関与すると思われる。概して、このような古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えばロシグリタゾン）は、ＷＴマウスにおいてのみ陽性グルコース低下を示すが、Ｓ２７３Ａマウスでは示さない、と考えられる。しかしながら、体重増加および体液停留のような副作用は、両方の系統において依然として起きると考えられる。それゆえ、理想的化合物はノックインマウスに全く影響を及ぼさず、これにより、薬剤のオフ・ターゲット効果を試験するための良好なモデルになる。
【０１２５】
別の実施形態では、これらのノックインマウスから得られる細胞株は、考え得る化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に用いられ得る。特定の化学的存在物は、野生型細胞中の標的遺伝子を変更するだけで、ノックイン細胞では変更しないと考えられる。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、野生型動物からＳ２７３Ａノックイン動物への（その逆も）骨髄移植を用いて、野生型宿主バックグラウンドにおける免疫系細胞（例えばマクロファージおよび単球）中のこのような突然変異体ポリペプチドの活性を分析し得る（この逆も）。この使用の一例は、ＣＤ３６依存性低減型脂質取込みによるアテローム硬化症の危険が免疫系細胞により媒介されるか否かを確定することである。
ＩＩＩ．単離非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質および抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体
【０１２７】
本発明の別の態様は、抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体を産生するための免疫原として用いるのに適した単離非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質およびその生物学的活性部分、ならびにペプチド断片の使用に関する。「単離」または「精製」タンパク質あるいはその生物学的活性部分は、組換えＤＮＡ技法により産生される場合、細胞性物質を実質的に含有せず、あるいは化学合成される場合には、化学的前駆体または他の化学物質を含有しない。「細胞性物質を実質的に含有しない」という語は、タンパク質が、天然にまたは組換え的に産生される細胞の細胞性構成成分から分離される非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の調製を包含する。一実施形態では、「細胞性物質を実質的に含有しない」という語は、約３０％（乾燥重量）未満の非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質（本明細書中では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）、約２０％未満の非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質、約１０％未満の非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質、および約５％未満の非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質を有する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の調製を包含する。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質またはその生物学的活性部分が組換え的に産生される場合、それは、培地も実質的に含有せず、すなわち、培地は、約２０％未満、約１０％未満および約５％未満の容積のタンパク質調製物を表す。「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない」という語は、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離される非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の調製を包含する。一実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない」という語は、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ化学物質、約２０％未満の化学的前駆体または非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ化学物質、約１０％未満の化学的前駆体または非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ化学物質、および約５％未満の化学的前駆体または非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ化学物質を有する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の調製を包含する。ある実施形態では、単離タンパク質またはその生物学的活性部分は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質が由来する同一動物からの夾雑タンパク質を欠く。典型的には、このようなタンパク質は、例えば非ヒト細胞におけるヒト非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の組換え発現により産生される。
【０１２８】
本発明の例示的単離非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質またはその一部分は、本明細書中に記載されるような１つ以上の判定基準に従って、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する。
【０１２９】
タンパク質の部分は、本明細書中に記載されるような生物学的活性部分であり得る。別の実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、それぞれ表１および２に示したアミノ酸配列を、あるいは表１および２に示したアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、例えば緊縮条件下で、表１および２に列挙したヌクレオチド配列、あるいは表１および２に示したヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する。本発明の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、少なくとも一部は、本明細書中に記載される非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ生物学的活性のうちの少なくとも１つも保有する。例えば、本発明の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、少なくとも一部は、緊縮条件下で、表１および２に列挙したヌクレオチド配列とハイブリダイズし、本明細書中に記載されるような１つ以上の判定基準に従って古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を包含する。
【０１３０】
本明細書中で用いる場合、２０の慣用的アミノ酸およびそれらの略号は、慣用的用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅ．  Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｇｒｅｎ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  Ｍａｓｓ．  （１９９１））（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、本明細書中で用いる場合、天然Ｌアミノ酸またはＤアミノ酸を指す。アミノ酸に関して一般に用いられる一文字および三文字略号が、本明細書中で用いられる（Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （４ｔｈ  ｅｄ．  ２００２））。２０の慣用的アミノ酸、非天然アミノ酸、例えばアルファ、アルファ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非慣用的アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、少なくとも一部は、本発明のポリペプチドに関する適切な構成成分であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、イプシロン−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、シグマ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびにその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチド表記法では、標準用法および慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０１３１】
他の実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、表１および２に列挙したアミノ酸配列と実質的に相同であり、表１および２に列挙したタンパク質の機能的活性を保持し、さらに、上記の小区分Ｉに詳述したように、天然対立遺伝子変異または突然変異誘発のために、アミノ酸配列が異なる。したがって、別の実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、表１および２に列挙したアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１３２】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の生物学的活性部分は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列、例えば表１または２に示したアミノ酸配列、あるいは非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質と相同なタンパク質のアミノ酸配列を包含し、これらは、全長非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質または非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質と相同である全長タンパク質より少ないアミノ酸を含み、そして非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的活性部分（ペプチド、例えば５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長であるペプチド）は、ドメインまたはモチーフ、例えばコンセンサスｃｄｋ５リン酸化モチーフおよび／またはＳｅｒ−２７３で非リン酸化可能な突然変異化ＰＰＡＲガンマを含む。さらに、タンパク質の他の領域が欠失される他の生物学的活性部分は、組換え技法により調製され、本明細書中に記載される活性のうちの１つ以上に関して評価され得る。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の生物学的活性部分としては、１つ以上の選択ドメイン／モチーフ、または生物学的活性を有するその部分が挙げられる。
【０１３３】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、組換えＤＮＡ技法により産生される。例えば、タンパク質をコードする核酸は、発現ベクター中でクローン化され（上記）、発現ベクターは宿主細胞中に導入され（上記）、そして非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質が宿主細胞中で発現される。次に、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、標準タンパク質精製技法を用いて、適切な精製スキームにより細胞から単離され得る。組換え発現に代わるものとして、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、標準ペプチド合成技法を用いて化学的に合成され得る。さらに、ネイティブ非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質は、例えば抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体（以下にさらに記載）を用いて、細胞（例えば褐色脂肪細胞）から単離され得る。
【０１３４】
本発明は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書中で用いる場合、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドと操作可能的に連結される非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドを含む。「非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチド」は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、一方、「非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチド」は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質と実質的に相同でないタンパク質、例えば非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質と異なる、そして同一のまたは異なる生物体に由来するタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内では、「操作可能的に連結される」は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドおよび非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドが互いにインフレームで融合されることを示すよう意図される。非非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドは、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマのＮ末端またはＣ末端と融合され得る。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列がＧＳＴ配列のＣ末端と融合されるＧＳＴ−非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換え非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの精製を促し得る。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に非相同シグナル配列を含有する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質である。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの発現および／または分泌は、非相同シグナル配列の使用により増大され得る。
【０１３５】
本発明の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマキメラまたは融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技法により産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、慣用的技法に従って、例えば結紮のための平滑末端化または付着末端化終端、適切な終端を提供するための制限酵素消化、適切な場合は粘着末端の充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、ならびに酵素的結紮を用いることにより、インフレームで一緒に結紮される。別の実施形態では、融合遺伝子は、慣用的技法、例えば自動ＤＮＡ合成機により合成され得る。代替的には、２つの連続遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅が実行され得るが、これはその後、アニーリングされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成する（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９９２参照）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードしている多数の発現ベクターが市販されている。融合部分が非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質とインフレームで連結されるよう、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード核酸はこのような発現ベクター中でクローン化され得る。
【０１３６】
本発明は、少なくとも一部は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマアゴニスト（模倣）または非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマアンタゴニストとして機能する非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の相同体にも関する。ある実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマアゴニストおよびアンタゴニストは、それぞれ、天然型の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の生物学的活性のサブセットを刺激するかまたは抑制する。したがって、特異的生物学的作用は、限定機能を有する相同体で処置することにより引き出され得る。一実施形態では、天然型のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する相同体を用いた被験体の処置は、天然型の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質による処置に比して、被験体におけるより少ない副作用を示す。
【０１３７】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の相同体は、突然変異誘発、例えば非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の離散的点突然変異または切頭化により生成され得る。本明細書中で用いる場合、「相同体」という用語は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する変異体型の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質を指す。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質のアゴニストは、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の実質的に同一のまたはサブセットの生物学的活性を保持し得る。
【０１３８】
代替的実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の相同体は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の変異体、例えば切頭化変異体の組合せライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。一実施形態では、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルの組合せ突然変異誘発により生成され、そして多様化遺伝子ライブラリーによりコードされる。潜在的非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列が個々のポリペプチドとして発現可能であるか、代替的には、その中に非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列の組を含有する一組のより大きな融合タンパク質（例えばファージ表示のために）として発現可能であるよう、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ変異体の多様化ライブラリーは、例えば構成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列と酵素的に結紮することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ相同体のライブラリーを産生するために用いられる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で実施され、次いで、合成遺伝子が適切な発現ベクターと結紮され得る。縮重組の遺伝子の使用により、所望組の潜在的非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ配列をコードする配列のすべてが、一混合物中に提供される。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，  Ｓ．Ａ．  （１９８３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１：４７７参照）。
【０１３９】
さらに、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質コード化の断片のライブラリーを用いて、スクリーニングのための非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ断片の多様化集団を生成し、その後、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の相同体を選択し得る。一実施形態では、コード配列断片のライブラリーは、ニッキングが分子当たり約１回だけ起こる条件下で、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して、異なるニック化産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを生成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して再生成二重鎖から１本鎖部分を除去し、そしてその結果生じた断片ライブラリーを発現ベクターに結紮することにより生成され得る。この方法により、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質のＮ待たん、Ｃ末端および種々のサイズの内部断片をコードする発現ライブラリーが得られる。
【０１４０】
点突然変異または切頭化により作製される組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびに選択特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技法が当該技術分野で既知である。このような技法は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ相同体の組合せ突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広範に用いられる技法（これは、高処理量分析が容易である）としては、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクター中でクローニングすること、その結果生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして所望の活性の検出が、その生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を促すことが挙げられる。ライブラリー中の機能性突然変異体の頻度を増強する新規の技法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）は、スクリーニング検定と組合せて用いられて、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ相同体を同定し得る（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌａｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１４１】
一実施形態では、単離非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質あるいはその一部分または断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技法を用いて非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。例えば、配列ＫＴＴＤＫ（ｐＳ）ＰＦＶＩＹＤＣを有するペプチドは、セリンリン酸化を伴うかまたは伴わずに、この目的のために用いられ得る。代替的には、全長非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質が用いられ得るし、代替的には、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの抗原性ペプチド断片が免疫原として用いられ得る。非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ免疫原は、典型的には、免疫原で適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫化することにより抗体を調製するために用いられる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質または化学合成非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマペプチドを含有し得る。調製物は、アジュバント、例えばフロイントの完全または不完全アジュバント、あるいは類似の免疫刺激剤も含み得る。免疫原性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ調製物による適切な被験体の免疫化としては、ポリクローナル抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体応答が挙げられる。
【０１４２】
したがって、本発明の別の態様は、抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体の使用に関する。「抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、免疫グロブリン分子、ならびに免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマのような抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例としては、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。本発明は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で用いる場合、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１つの種のみを含有する抗体分子の一集団を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質に関する単一結合親和性を表示する。
【０１４３】
ポリクローナル抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ免疫原で適切な被験体を免疫化することにより、上記と同様に調製され得る。免疫化被験体における抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体力価は、例えば免疫化非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを用いて、標準技法により、例えば酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）で長時間モニタリングされ得る。所望により、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマに対して向けられる抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、さらに、周知の技法、例えばプロテインＡクロマトグラフィーにより精製して、ＩｇＧ分画を得る。免疫化後の適切な時間に、すなわち、抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体力価が最高になったら、抗体産生細胞が被験体から得られ、これを用いて、標準技法により、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により最初に記載されたハイブリドーマ技法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ）  ２９：２６９−７５も参照）、さらに近年のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法  （Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５），  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）またはトリオーマ技法により、モノクローナル抗体を調製し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技法は、よく知られている（一般的に、Ｒ．  Ｈ．  Ｋｅｎｎｅｔｈ，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；Ｅ．  Ａ．  Ｌｅｒｎｅｒ  （１９８１）  Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ５４：３８７４０２；Ｍ．  Ｌ．  Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２３１３６参照）。要するに、不死細胞株（典型的には骨髄腫）は、上記のような非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ免疫原で免疫化された哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）と融合され、その結果生じたハイブリドーマ細胞の培養上清は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【０１４４】
リンパ球および不死化細胞株を融合するために用いられる多数の周知のプロトコールのうちのいずれかが、抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマモノクローナル抗体を生成するという目的のために適用され得る（すなわち、Ｇ．  Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．（上記）；Ｌｅｒｎｅｒ，  Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．（上記）；Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（上記）参照）。さらに、このような方法の多数の変法があり、それらも有用である、と当業者は理解する。典型的には、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同一の哺乳動物種から得られる。例えば、ネズミハイブリドーマは、少なくとも一部は本発明の免疫原性調製物で免疫化されたマウスからのリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合することにより作製され得る。いくつかの実施形態では、不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株のうちのいずれか、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株が、標準技法による融合相手として用いられ得る。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞と融合される。次いで、融合に起因するハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地（これは、非融合および非産生的融合骨髄腫細胞を殺害する）を用いて選択される（非融合脾細胞は、形質転換されないため、数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、すなわち、標準ＥＬＩＳＡ検定を用いて、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【０１４５】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代わりに、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマで組換え組合せ免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージ表示ライブラリー）をスクリーニングし、それにより、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを結合する免疫グロブリンライブラリー成員を単離することにより、モノクローナル抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体が同定され、単離され得る。ファージ表示ライブラリーを生成し、スクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）  ファージ表示キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体表示ライブラリーを生成し、スクリーニングするのに特に容易に用い得る方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９２／１８６１９（Ｋａｎｇ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９１／１７２７１（Ｄｏｗｅｒ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９２／２０７９１（Ｗｉｎｔｅｒ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９２／１５６７９（Ｍａｒｋｌａｎｄ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９３／０１２８８（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９２／０１０４７（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９２／０９６９０（Ｇａｒｒａｒｄ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９０／０２８０９（Ｌａｄｎｅｒ等）；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３６９−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：５５２−５５４に見出され得る。
【０１４６】
さらに、組換え抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体、例えば、標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等）；欧州特許出願第１８４，１８７号（Ａｋｉｒａ等）；欧州特許出願第１７１，４９６号（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．）；欧州特許出願第１７３，４９４号（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ８６／０１５３３（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等）；米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ等）；欧州特許出願第１２５，０２３号（Ｃａｂｉｌｌｙ等）；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１：４０５３−４０６０に記載された方法を用いて産生され得る。
【０１４７】
抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体（例えばモノクローナル抗体）は、標準技法、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降により、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマを単離するために用いられ得る。抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体は、細胞からの天然非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの、ならびに宿主細胞中で発現される組換え的産生性非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの精製を促し得る。さらに、抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の発現の発生量およびパターンを評価するために、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質（例えば、細胞性溶解物または細胞懸濁液中）を検出するために用いられ得る。抗非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ抗体は、例えば、非カップリング剤の安全投与量をモニタリングするために、臨床試験手順の一部として、細胞または組織、例えば脂肪細胞または組織中のタンパク質レベルをモニタリングするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質とカップリングする（例えば、物理的に連結する）ことにより促され得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジンビオチンが挙げられる；適切な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光性物質の一例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１４８】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマタンパク質の検出のためのｉｎ  ｖｉｖｏ技法は、タンパク質に対して向けられる標識化抗体を被験体中に導入することを包含する。例えば、抗体は、被験体におけるその存在および位置が標準画像処理技法により検出され得る放射性バイオマーカーで標識され得る。
ＩＶ．本発明の方法および化合物
【０１４９】
本発明の方法は、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するＰＰＡＲガンマリガンドの同定および使用に関する。このようなリガンドは、本明細書中では「非典型的」として言及される。
【０１５０】
「選択的に促進する」という用語は、「脂肪生成」遺伝子（例えば、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ロシグリタゾンにより調節されるもの）のような代謝障害を促進することに対比して、主におよび／または専ら、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により調節される遺伝子、例えば「抗糖尿病」および／または「褐色脂肪」および／または「呼吸／酸素消費増大」遺伝子（例えば、非典型的ＰＰＡＲガンマリガンド、ＭＲＬ２４により選択的に促進されるもの）を促進し、活性化し、刺激し、増強し、または促進を生じるＰＰＡＲガンマ活性の任意の示差的調節を包含するよう意図される。別の態様では、本発明は、主におよび／または専ら、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により調節されるこのような遺伝子、例えば、「抗糖尿病」および／または「褐色脂肪」および／または「呼吸／酸素消費増大」遺伝子（例えば、非典型的ＰＰＡＲガンマリガンド、ＭＲＬ２４により選択的に促進されるもの）を、例えば、ＰＰＡＲガンマリン酸化を選択的に抑制する試験化合物の存在下または非存在下で、あるいは非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの存在下または非存在下（野生型ＰＰＲガンマ）で、試料の遺伝子発現プロフィールを検定することにより同定するための方法に関する。別の態様では、本発明は、被験体における代謝障害、例えば糖尿病および／または肥満症を治療するための方法であって、主におよび／または専ら、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により、遺伝子、例えば「抗糖尿病」および／または「褐色脂肪」および／または「呼吸／酸素消費増大」遺伝子（例えば、非典型的ＰＰＡＲガンマリガンド、ＭＲＬ２４により選択的に促進されるもの）を選択的に調節する作用物質を被験体に投与することを包含する方法に関する。
【０１５１】
本明細書中で用いる場合、「作用物質」および「治療薬」という用語は、肥満症または肥満症関連障害を有する被験体からの細胞が治療プロトコールに曝露され得るあらゆるものと広範に定義される。
Ａ．  ＰＰＡＲガンマリガンドスクリーニング検定
【０１５２】
本発明は、非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドのような、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進し得る化合物または作用物質を同定するための方法を提供する。これらの方法は、本明細書中では、薬剤スクリーニング検定としても言及され、典型的には、ＰＰＡＲガンマタンパク質と相互作用し（結合し）、ＰＰＡＲガンマタンパク質および標的分子の相互作用を調整し、および／またはＰＰＡＲガンマ核酸発現および／またはＰＰＡＲガンマタンパク質活性を調整する能力に関して、候補／試験化合物または作用物質をスクリーニングするステップを包含する。これらの能力のうちの１つ以上を有する候補／試験化合物または作用物質は、異所性、異常および／または望ましくないＰＰＡＲガンマ核酸発現および／またはＰＰＡＲガンマタンパク質活性により特性化される障害を治療するための薬剤として用いられ得る。候補／試験化合物としては、例えば、小有機および無機分子（例えば、組合せおよび天然生成物ライブラリーから得られる分子）が挙げられる。
【０１５３】
本発明の試験化合物は、少なくとも一部は、当該技術分野で既知の組合せライブラリー方法、例えば生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；ならびにアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法；における多数のアプローチのうちのいずれかを用いて得られる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、一方、他の４つのアプローチが、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，  Ｋ．Ｓ．  （１９９７）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２：１４５）。
【０１５４】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該技術分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：２０６１に、ならびにＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：１２３３に見出され得る。
【０１５５】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  （１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、あるいはビーズ（Ｌａｍ  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）上に、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ  （１９９１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ、上記）上に提示され得る。
【０１５６】
一実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲガンマタンパク質と相互作用する（例えば、結合する）候補／試験化合物を巣にするための検定を提供する。典型的には、検定は細胞ベースの検定である。細胞は、例えば、哺乳動物起源のもの、例えば肝細胞、骨格筋細胞、免疫細胞、例えば単球またはマクロファージ、あるいは脂肪細胞、例えば前脂肪細胞、白色脂肪細胞および／または褐色脂肪細胞であり得る。他の実施形態では、細胞は、本明細書中に記載されるノックイン動物の場合のように、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマコード核酸配列を内因的に保有し得る。
【０１５７】
他の実施形態では、検定は、候補／試験化合物とＰＰＡＲガンマタンパク質またはその部分の相互作用（例えば結合）を可能にして、複合体を形成する条件下で、ＰＰＡＲガンマタンパク質またはその生物学的活性部分および候補／試験化合物を組合せること、そして複合体の形成を検出すること（この場合、ＰＰＡＲガンマポリペプチドまたはその断片と相互作用する（例えば、結合する）候補化合物の能力は、複合体中の候補化合物の存在により示される）、といったステップを包含する無細胞検定である。ＰＰＡＲガンマタンパク質と候補化合物との間の複合体の形成は、例えば、標準イムノアッセイを用いて定量され得る。このような分析は、試験化合物をＰＰＡＲガンマリガンドと同定する。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲガンマタンパク質と、ＰＰＡＲガンマタンパク質が常態では相互作用する分子（標的分子）との間の相互作用（そして同様にほぼＰＰＡＲガンマ活性）を調整する（例えば、刺激するかまたは抑制する）候補／試験化合物を同定するためのスクリーニング検定を提供する。このような標的分子の例としては、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回るＰＰＡＲガンマによる抗代謝障害活性を促進するシグナル伝達経路におけるタンパク質が挙げられる。典型的には、検定は、候補化合物の存在を別にして、既知の調節因子および／または補因子、例えばｃｄｋ５および／またはｐ３５／ｐ２５と一緒に、標的分子を結合するかまたは調整する条件下で、ＰＰＡＲガンマタンパク質またはその生物学的活性部分、ＰＰＡＲガンマ標的分子および候補／試験化合物を組合せること、そしてＰＰＡＲガンマタンパク質および標的分子を含む複合体の形成を検出すること、またはＰＰＡＲガンマタンパク質および標的分子の相互作用／反応を検出すること、といったステップを包含する無細胞検定である。複合体形成の検出は、例えば、ＰＰＡＲガンマタンパク質の誘導性作用を測定することによる、複合体の直接的定量を包含し得る。（候補化合物の非存在下で検出されるものと比較した場合の）候補化合物の存在下での、ＰＰＡＲガンマおよび標的分子の相互作用における（例えば、ＰＰＡＲガンマおよび標的分子間の複合体の形成における）統計学的有意の変化、例えば低減は、ＰＰＡＲガンマタンパク質と標的分子との間の相互作用の調整（例えば、刺激または抑制）を示す。ＰＰＡＲガンマタンパク質および標的分子間の複合体の形成の調整は、例えば、イムノアッセイにより定量され得る。
【０１５９】
上記の薬剤スクリーニング検定を実施するためには、ＰＰＡＲガンマまたはその標的分子を固定して、タンパク質の一方または両方の非複合化形態からの複合体の分離を促し、同様に、検定の自動化に対応するのが望ましい。候補化合物の存在下および非存在下での、ＰＰＡＲガンマと標的分子との相互作用（例えば、結合）は、反応体を含有するのに適した任意の容器中で成し遂げられ得る。このような容器の例としては、微量滴定プレート、試験管および微量遠心分離管が挙げられる。一実施形態では、ポリペプチドをマトリックスと結合させるドメインを付加する融合ポリペプチドが提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＰＡＲガンマ融合ポリペプチドは、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化微量滴定プレート上に吸着され、これは次に、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識化）および候補化合物と併合されて、混合物が、複合体形成を促す条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件で）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズは任意の非結合標識を除去するために洗浄され、そして複合体が解離された後、上清中で、マトリックスが固定され、放射性標識が直接的に確定される。代替的には、複合体はマトリックスから解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、そしてビーズ分画中に見出されるＰＰＡＲガンマ結合ポリペプチドのレベルが、標準電気泳動技法を用いてゲルから定量される。
【０１６０】
マトリックス上にポリペプチドを固定化するための他の技法も、本発明の例示的薬剤スクリーニング検定で用いられ得る。例えば、ＰＰＡＲガンマまたはその標的分子は、ビオチンおよびストレプトアビジンの共役を利用して固定化され得る。ビオチニル化ＰＰＡＲガンマ分子は、当該技術分野で周知の技法（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化され得る。代替的には、ＰＰＡＲガンマと反応性の抗体、例えばｐｈｏｓｐｈｅｒ−Ｓｅｒ−２７３−特異的抗ＰＰＡＲガンマ抗体（しかし、その標的分子とのポリペプチドの結合を妨げない）は、プレートのウェルに誘導体化され、そしてＰＰＡＲガンマが抗体共役によりウェル中に閉じ込められる。上記のように、ＰＰＡＲガンマ結合ポリペプチドおよび候補化合物の調製物は、プレートのＰＰＡＲガンマ提示ウェル中でインキュベートされ、ウェル中に閉じ込められた複合体の量が定量され得る。このような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体に関して上記した方法のほかに、ＰＰＡＲガンマ標的分子と反応性である、あるいはＰＰＡＲガンマポリペプチドと反応性で、標的分子堵競合する抗体を用いる複合体の免疫検出；ならびに標的分子に関連した酵素活性の検出に頼る酵素結合検定を包含する。
【０１６１】
さらに別の実施形態では、本発明は、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進し得る化合物または作用物質を同定するための方法（例えば、スクリーニング検定）を提供する。このような化合物は、本明細書中でさらに記載されるように、代謝障害の治療のためにも有用である。ＰＰＡＲガンマ核酸の発現またはＰＰＡＲガンマタンパク質の活性を調整する化合物または作用物質の能力を検定するための方法は、無細胞または細胞ベースの検定であり得る。
【０１６２】
したがって、試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ試料を含み得る。このような試料は、代謝障害分析に関連した任意数の細胞型、例えば前脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、単球およびマクロファージからも選択され得る。
【０１６３】
さらに、本明細書中に記載される無細胞および／または細胞ベースの検定は、主におよび／または専ら、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により調節される遺伝子、例えば「抗糖尿病」および／または「褐色脂肪」および／または「呼吸／酸素消費増大」遺伝子（例えば、非典型的ＰＰＡＲガンマリガンド、ＭＲＬ２４により選択的に促進されるもの）を促進し、活性化し、刺激し、増強し、または促進を生じるＰＰＡＲガンマ活性を示差的に調節する化合物または作用物質の作用を、「脂肪生成」遺伝子のような代謝障害を促進するもの、特に、古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ロシグリタゾンにより調節されるものと対比して確定するための、当業者に周知の方法に従って用いられ得る。これは、当該技術分野で周知の方法に従って、主におよび／または専ら、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により調節される遺伝子、例えば、「抗糖尿病」および／または「褐色脂肪」および／または「呼吸／酸素消費増大」遺伝子を同定することを包含し得る。このような遺伝子は、内因性細胞性状況で分析され得るし、あるいは、多数の周知の遺伝子レポーター系のいずれかに従って、例えば、ＰＰＡＲガンマ応答性プロモーターと操作可能的に連結される転写検定、ＰＰＡＲガンマトランス活性化検定（例えば、上流活性化部位（ＵＡＳ）プロモーター上のＧＡＬ４−ＰＰＡＲガンマ）等を用いて、検定され得る。
【０１６４】
ＰＰＡＲガンマ依存性応答（刺激または抑制）における統計学的有意の変化を生じる候補化合物が、同定され得る。このような統計学的有意の変化は、多数の判定基準に従って、および／または多数の対照と比較して、測定され得る。例えば、遺伝子発現、検定変化等の有意の調整は、分析中の出力が、対照に比して、１．１−、１．２−、１．３−、１．４−、１．５−、１．６−、１．７−、１．８−、１．９−、２．０−、２．１−、２．２−、２．３−、２．４−、２．５−、２．６−、２．７−、２．８−、２．９−、３．０−、３．１−、３．２−、３．３−、３．４−、３．５−、３．６−、３．７−、３．８−、３．９−、４．０−、４．１−、４．２−、４．３−、４．４−、４．５−、４．６−、４．７−、４．８−、４．９−、５．０−、５．５−、６．０、６．５−、７．０−、７．５−、８．０−、８．５−、９．０−、９．５−、１０−、１１−、１２−、１３−、１４−、１５−、１６−、１７−、１８−、１９−、２０倍またはそれ以上異なって（任意の範囲を含めて）大きいかまたは小さいかを査定され得る。
【０１６５】
一般的に、発現プロフィールの決定は、以下のステップを包含するアレイを用いて実施され得る：（ａ）被験体からＲＮＡ試料を得て、それから標識化核酸を調製すること（「標的核酸」または「標的」）；（ｂ）標的核酸がアレイ上の対応するプローブと結合するのに十分な条件下で、例えば、ハイブリダイゼーションまたは特異的結合により、標的核酸をアレイと接触させること；（ｃ）任意に、アレイから非結合標的を除去すること；（ｄ）結合標的を検出すること；ならびに（ｅ）結果を分析すること。本明細書中で用いる場合、「核酸プローブ」または「プローブ」はアレイと結合される核酸であり、一方、「標的核酸」は、アレイとハイブリダイズされる核酸である。これらのステップならびにそれらを実行するための方法および変法の各々は、当業者に周知である。
【０１６６】
ある実施形態では、数百または数千の遺伝子とは対照的に、相対的に少数の遺伝子（例えば、１つまたは２〜３つのみの遺伝子）の発現を確定することで足りる。マイクロアレイがこれらの実施形態でもちられ得るが、しかし遺伝子発現の検出の種々の他の方法が利用可能である。アレイベースの検出、例えばＲＮＡ単離、標識化等とのある種の類似性は共通であり得るが、しかし以下の方法は、用い易さおよび時間制約に関して、利点を提供し得る。
【０１６７】
一実施形態では、試料から得られるＲＮＡは、一次ｃＤＮＡ鎖に転写され、そしてＰＣＲ、例えばＲＴ−ＰＣＲに付される。ハウスキーピング遺伝子、またはその発現が変わらない他の遺伝子は、内部対照および実験中の対照として用いられ得る。ＰＣＲ反応後、増幅産物は電気泳動により分離され、検出され得る。定量的ＰＣＲを用いることにより、増幅産物のレベルは、試料中に存在したＲＮＡのレベルと相関する。増幅試料は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上でも分離され、フィルターに移されて、フィルターは、当該遺伝子に特異的なプローブとハイブリダイズされる。平行ＰＣＲ増幅により、例えば多重ＰＣＲにより、多数の試料が同時に分析され得る。
【０１６８】
定量的ＰＣＲ技法も、多数の技法、例えばそれぞれレポーターおよび消光剤蛍光染料を用いて５’および３’末端で標識されるＴａｑＭａｎまたはプローブ（ＦＱプローブ）（これは、２つのＰＣＲプライマー間をアニーリングする）を基礎にして用いられ得る。プローブがプライマー間で結合されると、特定生成物のみが検出される。ＰＣＲ増幅が進行すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、最初に、プローブからのレポーター染料を切断する。レポーター染料が消光剤染料から物理的に分離される場合に生成されるシグナルは、取り付けられたＣＣＤカメラでシグナルを測定することにより検出される。生成される各シグナルは、切断される一プローブと等しく、これは、一標的鎖の増幅に対応する。ＰＣＲ反応は、供給される使用説明書に従って、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲコア試薬キットを用いて設定され得る。この技法はさらに、例えば米国特許第６，３２６，４６２号に記載されている。
【０１６９】
他の実施形態では、ドットブロット、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション、大量シーケンシング、ＳＡＧＥ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびその他の同様の方法が、特に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ’’  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９）にさらに記載されているように、用いられ得る。
【０１７０】
他の方法では、遺伝子の発現のレベルは、遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを測定することにより検出され得る。これは、遺伝子によりコードされるタンパク質を特定基に検出する作用物質、例えば抗体を用いて、例えば免疫沈降、ＥＬＩＳＡまたは免疫組織化学により実行され得る。他の技法としては、ウエスタンブロット分析が挙げられる。イムノアッセイは、普通は、細胞試料中のタンパク質のレベルを定量するために用いられ、多数の他のイムノアッセイ技法が当該技術分野で既知である。本発明は、特定の検定手法に限定されず、したがって、相同的および非相同的手法の両方を包含するよう意図される。本発明に従って実行され得る例示的イムノアッセイとしては、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられ、ＥＬＩＳＡ等は、単独で、またはＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと組合せて、あるいはそれらの代わりに用いられ得る。指示薬部分または標識基は、被験体抗体と結合され、検定設備および適合性イムノアッセイ手法の利用可能性によりしばしば指図される方法の種々の使用の要求を満たすよう、選択される。上記の種々のイムノアッセイを実施するのに用いられるべき一般的技法は、当業者に既知である。
【０１７１】
細胞から分泌されるポリペプチド、例えばアディポカイン、例えばアディポネクチン、または肥満症誘導性炎症タンパク質、例えばＴＮＦ−アルファの場合、これらのペプチドの発現のレベルは、生物学的流体中で測定され得る。
【０１７２】
このような遺伝子発現分析を補足して、代謝障害活性のマーカーを表現型で報告する検定も実施され得る。例えば、抗代謝障害活性の誘導、例えば抗肥満症、抗糖尿病、褐色脂肪誘導（例えば、白色脂肪細胞におけるおよび／または前脂肪細胞からｄｅ  ｎｏｖｏで）等を報告する検定は、褐色脂肪特異的遺伝子、例えばＵＣＰ−１、ｃｉｄｅａおよびＰＧＣ−１ａ、ならびにミトコンドリア生合成および非結合酸素消費に関与する遺伝子の発現によって査定され得る。他の実施形態では、褐色脂肪誘導に関する表現型検定は、例えば組織学、非結合酸素消費、ミトコンドリアによる非結合呼吸、脂肪酸ベータ酸化、発熱（熱生成）、呼吸測定、体重変化、流体停留、ミトコンドリア生合成、エネルギー消費、脂肪生成、血清脂肪酸レベル、血清アディポカインレベル、白色および／または褐色脂肪沈着物、脂肪量および／または除脂肪量（例えば、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）スキャンにより査定される場合）、グルコース耐性試験、インスリン耐容性試験、ならびに肥満誘導性炎症の調整を分析することによっても査定され得る。
【０１７３】
本発明のさらに別の態様では、ＰＰＡＲガンマタンパク質は、２−ハイブリッド、３−ハイブリッド等の検定における「バイト・タンパク質」として用いて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＷＯ  ９４／１０３００（Ｂｒｅｎｔ）参照）、ＰＰＡＲガンマと結合するかまたは相互作用する他のタンパク質（「ＰＰＡＲガンマ結合タンパク質」または「ＰＰＡＲガンマ−ｂｐ」）を同定し、そして古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害を促進するＰＰＡＲガンマ活性を選択的に調整し得る。
【０１７４】
これらの方法のすべてにおいて、適正な対象の使用が重要であり得る。一実施形態では、本発明の非典型的ＰＰＡＲガンマ調節因子は、少なくとも一部は、検定出力（例えば、表１および２に列挙した遺伝子および検定）が候補化合物の非存在下での細胞と比較されるよう、本明細書中に記載されるような方法で同定され得る。一実施形態では、比較は、既知のＰＰＡＲガンマアゴニスト、例えば頑強な古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ロシグリタゾンと接触された細胞に対してなされ得る。別の実施形態では、比較は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマポリペプチドをコードすることおよび／または発現することを包含する細胞に対してなされ得る（例えば、Ｓ２７３Ａ突然変異体）。さらに別の実施形態では、比較は、遺伝子発現分析の比率、例えば表２に列挙した遺伝子に対する表１に列挙した遺伝子の発現の比率に対してなされ得る。
Ｂ．  化合物
【０１７５】
当該技術分野で既知であり、および／または本明細書中に記載される方法を用いて同定されるＰＰＡＲガンマリガンド、ならびに本明細書中に記載される方法を用いて分析される終点は、多数の判定基準に従って記載され得る。例えば、化合物または作用物質は、別のＰＰＡＲガンマアゴニスト、例えば頑強な古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ロシグリタゾンに比して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％未満またはそれ以下（または任意の範囲を含む）の古典的ＰＰＡＲアゴニスト活性を有し得る。ロシグリタゾンのほかに、他の古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト、例えばピオグリタゾンが用いられ得る。いくつかの実施形態では、古典的ＰＰＡＲアゴニスト活性は、本明細書中に記載される方法（例えば、表１および２に列挙したバイオマーカーの遺伝子発現を分析することを包含する）に従って測定され得る。例えば、遺伝子発現、検定変化等の有意の調整は、分析中の出力が、対照に比して、１．１−、１．２−、１．３−、１．４−、１．５−、１．６−、１．７−、１．８−、１．９−、２．０−、２．１−、２．２−、２．３−、２．４−、２．５−、２．６−、２．７−、２．８−、２．９−、３．０−、３．１−、３．２−、３．３−、３．４−、３．５−、３．６−、３．７−、３．８−、３．９−、４．０−、４．１−、４．２−、４．３−、４．４−、４．５−、４．６−、４．７−、４．８−、４．９−、５．０−、５．５−、６．０、６．５−、７．０−、７．５−、８．０−、８．５−、９．０−、９．５−、１０−、１１−、１２−、１３−、１４−、１５−、１６−、１７−、１８−、１９−、２０倍またはそれ以上異なって（任意の範囲を含めて）大きいかまたは小さいかを査定され得る。
【０１７６】
別の実施形態では、化合物または作用物質は、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、９μＭ、８μＭ、７μＭ、６μＭ、５μＭ、４．５μＭ、４μＭ、３．５μＭ、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８５０ｎＭ、８００ｎＭ、７５０ｎＭ、７００ｎＭ、６５０ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭまたはそれ以下（あるいは任意範囲を含む）の用量で、ＰＰＡＲガンマに対するＥＣ５０結合親和性を有し得る。ＥＣ５０値は、比較目的のために確定され、用いられ得る。この値は、対照に比して、関連ＰＰＡＲガンマ機能を５０％抑制するのに必要とされる薬剤の濃度である。
【０１７７】
さらに別の実施形態では、化合物または作用物質は、例えば、ＨＤＸ技法を用いて測定した場合、ＰＰＡＲガンマポリペプチドのある種のドメインを安定化し得る。理論に縛られずに考えると、らせん１２は古典的ＰＰＡＲアゴニストにより安定化されるだけであるが（強／全）、一方、非典型的ＰＰＡＲアゴニスト（すなわち、部分／中等度）、例えば、本明細書中に記載されるスクリーニング方法を用いて得られる化合物および作用物質は、らせん１２の統計学的有意の安定化パターンを示さない。それに反して、一実施形態では、非典型的アゴニストは、ベータシートを安定化する。別の実施形態では、非典型的アゴニストはらせん３を安定化する。タンパク質ドメイン安定化を確定するための検定は、当該技術分野で周知であり、例えばＢｒｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５：１２５８−１２７１（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。いくつかの実施形態では、化合物または作用物質は、対照（例えば、既知の非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニスト、例えばＭＲＬ２４および／またはＭＲＬ−２０）に比して、少なくとも１００％、９５％、９０％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％（または任意範囲を含む）、ベータシートおよび／またはらせん３を安定化し得る。
【０１７８】
さらに別の実施形態では、化合物または作用物質は、化合物の構造クラスに、例えば小分子の一ファミリーに属する。強力なアゴニストとして作用する古典的ＰＰＡＲガンマリガンドの例としては、チゾリジンジオン（ＴＺＤ）およびチアゾリジン誘導体（チアゾリジンジオンとして既知）、例えばプログリタゾン（ＡＤ−４８３３およびＵ−７２１０７Ｅとしても既知）、トログリタゾン（ＣＳ−０４５としても既知）（Ｓａｎｋｙｏ）およびＣ１−９９１（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ＢＲＬ  ４９６５３、シグリタゾン、エングリタゾンならびにその化学的誘導体が挙げられる。これらの化合物は、糖尿病の治療に関して慣用的に知られている。このような化合物の例示的供給源に関しては、例えば、米国特許第４，８１２，５７０号；第４，７７５，６８７号；第４，７２５，６１０号；第４，５８２，８３９号；および第４，５７２，９１２号参照。米国特許第５，５２１，２０１号および欧州特許出願第０００８２０３号、第０１３９４２１号、第０１５５８４５号、第０１７７３５３号、第０１９３２５６号、第０２０７５８１号および第０２０８４２０号、ならびにＣｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ  ３０  （１０）  ３５８０−３６００は、チアゾリジンジオン誘導体に関し、そして種々のＴＺＤおよびＴＺＤ様類似体（少なくとも一部は、本発明の方法を実行するのに有用であり得る）に関する商業的供給元／合成スキームを記載する。これに対して、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する非典型的ＰＰＡＲガンマリガンドの例としては、例えばＢｒｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５：１２５８−１２７１（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されるようなＭＲＬ−２０、ＭＲＬ−２４、ｎＴＺＤｐａ、ＳＲ１４５、ＳＲ１４７、Ｍｂｘ−１０２およびＢＶＴ．１３が挙げられる。
Ｃ．  治療方法
【０１７９】
本発明の非典型的ＰＰＡＲガンマ調節因子は、少なくとも一部は、例えば本明細書中に記載される代謝障害、例えば体重障害、例えば、肥満症、ならびに不十分なインスリン活性に関連した障害、例えば糖尿病を治療するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、このようなＰＰＡＲガンマ調節因子は、このような作用物質による治療の効力、毒性または副作用を確定するためにも用いられ得る。これらの治療方法は、一般的に、以下の小区分Ｖで記載されるような薬学的組成物中の非典型的ＰＰＡＲガンマ調節因子を、このような治療を必要とする被験体、例えば本明細書中に記載される障害を有する被験体に投与するステップを包含する。
【０１８０】
「投与すること」という用語は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を増大するというその意図された機能を作用物質に実施させる投与の経路を包含するよう意図される。用いられ得る投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、腸管外、腹腔内、くも膜下腔内等）、経口的、吸入および経皮的投与が挙げられる。注射は、大量瞬時注射であり得るし、あるいは連続注入であり得る。投与経路によって、作用物質は選択材料で被覆されるかまたはその中に配置されて、その意図された機能を実施するその能力に有害に作用し得る天然条件からそれを保護し得る。作用物質は、単独で、あるいは製薬上許容可能な担体と一緒に投与され得る。さらに、作用物質は、製薬上許容可能な担体と同時投与され得る。作用物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでその活性形態に転換されるプロドラッグとしても投与され得る。
【０１８１】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質の「有効量」という用語は、被験体または被験体の集団における非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を促進するのに必要なまたは十分な量である。有効量は、用いられる治療薬（単数または複数）の種類、被験体のサイズまたは障害の重症度によって変わり得る。
【０１８２】
個々の投与量は、担当医の判断での被験体の用件、処置されている症状の重症度、および用いられている特定化合物によって変えられ得る、と理解される。治療的有効量または用量を決定するに際しては、多数の付加的因子が担当医により考察され、例としては、特定作用物質の薬力学的特質およびその投与方式および経路；治療の望ましい時間経過；哺乳動物の種；そのサイズ、年齢および全身健康状態；関与する具体的疾患；疾患の関連度または重症度；個々の被験体の応答；投与される特定化合物；投与方式；投与される調製物の生物学的利用能特質；選択される用量投与レジメン；併用治療の種類；ならびにその他の関連環境が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
治療は、化合物の有効用量より少ない小投与量で開始され得る。その後、一実施形態では、投与量は、その環境下で最適効果が達成されるまで、小増分ずつ増大されるのが望ましい。便宜上、総１日投与量は分割されて、所望により、１日の間に分けて投与され得る。
【０１８４】
代謝障害を治療するための任意の特定作用物質の有効性は、抗代謝障害治療を受けている被験体から得られる１つ以上の試料を比較することにより、モニタリングされ得る。概して、第一試料は、療法開始前に被験体から得られ、治療中に１つ以上の試料が得られる。このような使用において、療法前に代謝障害を有する被験体からの細胞の発現の基線が確定され、次いで、代謝障害を有する被験体からの細胞の発現の基線状態における変化が、治療の経過の間、モニタリングされる。代替的には、治療中に得られる２つ以上の連続試料が用いられるが、治療前基線試料を必要としない。このような使用では、被験体から得られる第一試料は、代謝障害を有する被験体からの細胞の発現が増大しつつあるか低減しつつあるかを確定するための基線として用いられる。
【０１８５】
本発明の別の態様は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマの発現および／または活性を誘導し得る化合物または作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の薬剤）を同定するための方法に関する。
Ｖ．薬学的組成物
【０１８６】
別の態様では、本発明は、少なくとも一部は、１つ以上の製薬上許容可能な担体（添加物）および／または希釈剤と一緒に処方される治療的有効量の作用物質（これは、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する）を含む製薬上許容可能な組成物を提供する。以下で詳細に記載されるように、本発明の薬学的組成物は、少なくとも一部は、固体または液体形態で、例えば、以下の：（１）経口投与、例えば飲薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス剤、粉末、顆粒、ペースト；（２）非経口投与（例えば滅菌溶液または懸濁液として、皮下、筋肉内または静脈内注射により）；（３）局所的適用（例えば皮膚に塗布されるクリーム、軟膏またはスプレーとして）；（４）膣内または直腸内（例えばペッサリー、クリームまたは発泡体として）；あるいは（５）エーロゾル（例えば水性エーロゾル、リポソーム調製物または化合物を含有する固体粒子として）のために適合される形態で、投与のために具体的に処方され得る。
【０１８７】
「治療的有効量」という語句は、本明細書中で用いる場合、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する作用物質の量を意味し、これは、合理的利益／危険比率での何らかの所望の治療効果、例えば体重減少を生じるために有効である。
【０１８８】
「製薬上許容可能な」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激アレルギー反応、あるいはその他の問題または合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触するのに用いるために適している（合理的利益／危険比率と同等）作用物質、材料、組成物および／または剤形に言及するために本明細書中で用いられる。
【０１８９】
「製薬上許容可能な担体」という語句は、本明細書中で用いる場合、一器官または身体の部分から、別の器官または身体の部分に対象化学物質を運搬するかまたは輸送するのに関与する製薬上許容可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を意味する。各担体は、処方物の他の成分と相溶性であるという意味で「許容可能」でなければならない。製薬上許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、以下のものが挙げられる：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび坐薬用蝋；（９）油、例えば落花生油、綿実油、紅花油，ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばエチルオレエートおよびエチルラウレート；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去蒸留水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸塩緩衝溶液；ならびに（２１）薬学的処方物中に用いられるその他の非毒性相溶性物質。
【０１９０】
「製薬上許容可能な塩」という用語は、本発明に包含される非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質の相対的に非毒性の無機および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、作用物質の最終的単離および精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで、あるいはその遊離塩基形態の精製作用物質を適切な有機または無機酸と別個に反応させ、そしてこのように生成された塩を単離することにより、調製され得る。代表的塩としては、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシラート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩等が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  ’’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ’’，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９参照）。
【０１９１】
他の場合には、本発明の方法に有用な作用物質は、少なくとも一部は、１つ以上の酸性官能基を含有し、したがって、製薬上許容可能な塩基と製薬上許容可能な塩を形成し得る。これらの場合における「製薬上許容可能な塩」という用語は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質の相対的に非毒性の無機および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、同様に、作用物質の最終的単離および精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで、あるいはその遊離酸形態の精製作用物質を適切な塩基、例えば製薬上許容可能な金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩と、アンモニアと、あるいは製薬上許容可能な有機第一、第二または第三級アミンと別個に反応させることにより、調製され得る。代表的アルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩等が挙げられる。塩基付加塩の生成に有用な代表的有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記）参照）。
【０１９２】
湿潤剤、乳化剤および滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤も、組成物中に存在し得る。
【０１９３】
製薬上許容可能な酸か防止剤の例としては、以下のものが挙げられる：（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等；ならびに（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等。
【０１９４】
本発明の方法に有用な処方物は、少なくとも一部は、経口、鼻、局所（例えば頬および舌下）、直腸、膣、エーロゾルおよび／または非経口投与に適したものを包含する。処方物は、単位剤形で提示されるのが便利であり、そして製薬業界で周知の任意の方法により調製され得る。単一剤形を生じるために担体材料と組合せられ得る活性成分の量は、治療されている宿主、特定の投与方式によって変わる。単一剤形を生じるために担体材料と組合せられ得る活性成分の量は、一般的に、治療効果を生じる化合物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は、約１％〜約９９％の活性成分、例えば約５％〜約７０％、約１０％〜約３０％の範囲である。
【０１９５】
処方物または組成物の調製方法は、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質と担体との、ならびに任意に１つ以上の補助成分との会合をもたらすステップを包含する。概して、処方物は、作用物質と液体担体、または微粉砕担体、またはその両方とを均一且つ密に会合指せて、次に、必要な場合は、生成物を造形することにより調製される。
【０１９６】
本発明の化合物および組成物のために意図される特に有益な処方物は、少なくとも一部は、経口処方物を包含する。経口投与に適した処方物は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味付け下、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを用いる）、粉末、顆粒の形態であり得るし、あるいは水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型または油中水型液体エマルションとして、あるいはエリキシルまたはシロップとして、あるいは香錠（不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムを用いる）として、および／または口腔洗浄液等として存在し、各々が予定量の作用物質を活性成分として含有する。化合物は、ボーラス剤、舐剤またはペーストとしても投与され得る。
【０１９７】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒等）では、活性成分は、１つ以上の製薬上許容可能な担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムと、および／または以下のうちのいずれかと混合される：（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴム；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばアセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合は、薬学的組成物は緩衝剤も含み得る。同様の型の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等を用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても用いられ得る。
【０１９８】
錠剤は、任意に１つ以上の補助成分を用いて、圧縮または成型により製造され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製され得る。成型錠剤は、粉末ペプチドまたは不活性液体希釈剤で湿らせたペプチド模倣物の混合物を、適切な機械で成型することにより製造され得る。
【０１９９】
錠剤、ならびにその他の固体剤形、例えば糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒は、任意に、刻み目を付けられるか、あるいはコーティングおよび外皮、例えば腸溶コーティング、および製薬業界で周知のその他のコーティングを用いて調製され得る。それらは、さらにまた、例えば所望の放出プロフィールを提供するための種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／または微小球を用いて、その中の活性成分の遅いまたは制御された放出を提供するように処方され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、または滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組入れられて、使用直前に滅菌水または何らかの他の滅菌注射可能媒質中で溶解されることにより、滅菌され得る。これらの組成物は、任意に不透明化剤も含有し得るし、そしてそれらが活性成分（単数または複数）のみを、または消化管のある部分で、任意に遅延方式で、放出する組成物を有し得る。用いられ得る包埋組成物の例としては、重合物質および蝋が挙げられる。活性成分は、マイクロカプセル封入形態でもあり得るし、適切な場合には、上記賦形剤の１つ以上を伴う。
【０２００】
経口投与のための液体剤形としては、製薬上許容可能な乳濁液、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分のほかに、液体剤形は、当該技術分野で一般に用いられる不活性希釈剤、例えば水またはその他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール，油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物を含有し得る。
【０２０１】
不活性希釈剤のほかに、経口組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、風味剤、着色剤、芳香剤および防腐剤も含み得る。
【０２０２】
懸濁液は、活性成分のほかに、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物を含有し得る。
【０２０３】
直腸または膣投与のための処方物は坐薬として提示され、これは、１つ以上の作用物質を、１つ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬用蝋またはサリチル酸塩）と混合することにより調製され、室温では固体であるが、体温では液体で、したがって、直腸または膣腔中で融解して、活性物質を放出する。
【０２０４】
膣投与に適している処方物は、当該技術分野で適切であることが既知であるような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体またはスプレー処方物も包含する。
【０２０５】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質の局所または経皮投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性構成成分は、滅菌条件下で製薬上許容可能な担体と、任意に、必要とされ得る防腐剤、緩衝剤または噴射剤と混合され得る。
【０２０６】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、作用物質のほかに、賦形剤、例えば動物および植物脂肪、油、蝋、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはその混合物を含有し得る。
【０２０７】
粉末およびスプレーは、非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質のほかに、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、さらに、通例の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含有し得る。
【０２０８】
非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質は、臍帯的には、エーロゾルにより投与され得る。これは、水性エーロゾル、化合物を含有するリポソーム調製物または固体粒子を調整することにより成し遂げられる。非水性（例えばフルオロカーボン噴射剤）懸濁液が用いられ得る。超音波ネブライザーは、作用物質が剪断されるのを最小限にし、これが、化合物の分解を生じ得る。
【０２０９】
普通は、水性エーロゾルは、作用物質の水性溶液または懸濁液を、慣用的な製薬上許容可能な担体および安定化剤と一緒に処方することにより作製される。担体および安定化剤は、特定化合物の要件に伴って変わるが、しかし典型的には、非イオン性界面活性剤（トゥイーン、プルロニック、またはポリエチレングリコール）、無害タンパク質、例えば血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、アミノ酸、例えばグリシン、緩衝剤、塩、糖または糖アルコールを包含する。エーロゾルは、一般的に、等張溶液から調製される。
【０２１０】
経皮パッチは、身体への作用物質の制御送達を提供するという付加的利点を有する。このような剤形は、適正な媒質中に作用物質を溶解するかまたは分散することにより作製され得る。吸収増強剤も、皮膚を通したペプチド模倣物の流動を増大するために用いられ得る。このような流動の速度は、速度制御膜を提供することにより、またはポリマーマトリックスまたはゲル中にペプチド模倣物を分散することにより、制御され得る。
【０２１１】
眼用処方物、眼用軟膏、粉末、溶液等も、本発明の範囲内であるよう意図される。
【０２１２】
非蛍光投与に適した本発明の薬学的組成物は、１つ以上の作用物質を、１つ以上の製薬上許容可能な滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液と、あるいは使用直前に滅菌注射用溶液または分散液中で再構成され得る滅菌粉末と組合せて含み、これらは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、処方物を意図されたレシピエントの血液と等張にさせる溶質、あるいは懸濁化剤または濃化剤を含有し得る。
【０２１３】
本発明の薬学的組成物中に用いられ得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により保持され得る。
【０２１４】
これらの組成物は、アジュバント、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含有し得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の含入により保証され得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含入することも望ましい。さらに、注射用製剤形態の長期吸収は、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンのような吸収を遅延する作用物質の含入によりもたらされ得る。
【０２１５】
いくつかの場合には、薬剤の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収をおそくすることが望ましい。これは、貧水溶性を有する結晶または非晶質材料の液体懸濁液を用いることにより成し遂げられ得る。その場合、薬剤の吸収速度は、その溶解速度によって決まり、順次、結晶サイズおよび結晶形態によって左右され得る。代替的には、非蛍光投与剤形の吸収遅延は、油ビヒクル中に薬剤を溶解するかまたは懸濁することにより成し遂げられる。
【０２１６】
注射用デポ剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマーにおける非リン酸化可能ＰＰＡＲガンマ発現および／または活性を誘導する作用物質のマイクロカプセルマトリックスを生成することにより、作製される。薬剤対ポリマーの比率、ならびに用いられる特定のポリマーの性質によって、薬剤放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ剤注射用処方物は、身体組織と相溶性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬剤を閉じ込めることによっても調製される。
【０２１７】
本発明の作用物質が、少なくとも一部が、ヒトおよび動物に調合薬として投与される場合、それらは、それ自体、または例えば０．１〜９９．５％（例えば０．５〜９０％）の活性成分を製薬上許容可能な担体と組合せて含有する薬学的組成物として投与され得る。
【０２１８】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実投与量レベルは、被験体に対する毒性を伴わずに、得照りの被験体、組成物および投与様式に対する所望の治療的応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るよう、少なくとも一部は本発明の方法により確定され得る。
【０２１９】
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入され、遺伝子療法ベクターとして用いられ得る。遺伝子療法ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与により（米国特許第５，３２８，４７０号参照）、または定位的注射により（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：３０５４  ３０５７参照）、被験体に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子療法ベクターを包含し得るし、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋される緩徐放出マトリックスを含み得る。代替的には、完全遺伝子送達ベクターが組換え細胞から無傷で酸性され得る場合（例えばレトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じる１つ以上の細胞を包含し得る。
【０２２０】
【表２−１】
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【０２２１】
【表２−２】
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【０２２２】
【表２−３】
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【０２２３】
【表２−４】
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【０２２４】
【表２−５】
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【０２２５】
【表３】
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【０２２６】
【表４−１】
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【０２２７】
【表４−２】
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【０２２８】
【表５】
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【０２２９】
【表６】
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【実施例】
【０２３０】
以下の実施例により本発明をさらに例証するが、それらは本発明を限定するものではない。
実施例１：実施例１〜１０に関する材料および方法
ａ．  細胞培養
【０２３１】
３Ｔ３−Ｌ１およびＨＥＫ−２９３細胞は、ＡＴＣＣから入手した。ＰＰＡＲガンマ−ヌルマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）（Ｒｅａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：  １０２０−１０２４  （１９８８））を、ダルベッコ変法イーグル培地および１０％ウシ胎仔血清中で培養した。ＦＬＡＧ−ＰＰＡＲガンマおよびＦＬＡＧ−ＰＰＡＲガンマＳ２７３Ａを、ｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でサブクローニングした。レトロウイルス産生のために、Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞を１０μｇのレトロウイルスベクターでトランスフェクトした（Ｋｉｎｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：  １４０５−１４１３  （１９９６））。４８時間後、ウイルス上清を収集し、濾過した。細胞をレトロウイルスに感染させた後、２μｇ／ｍｌのプロマイシンとともにインキュベートすることにより、異所性タンパク質を発現する細胞を選択した。１μＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチンおよび８５０ｍＭのインスリンで４８時間、細胞を処理することにより、３Ｔ３−Ｌ１またはＭＥＦでの脂肪細胞分化を誘導し、細胞を、８５０ｎＭのインスリンを含有する維持培地に切り替えた。細胞中の脂質蓄積を、オイルレッドＯ染色により検出した。細胞培地中への分泌アディポネクチンの量を、ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により分析した。細胞培養に関する化学物質はすべて、別記しない限り、Ｓｉｇｍａから入手した。
ｂ．  ＤＮＡ構築物およびＣＤＫ５のｓｈＲＮＡ
【０２３２】
ＨＡ−ＷＴ  ＣＤＫ５、ＨＡ−ＫＤ  ＣＤＫ５およびＭｙｃ−ｐ３５を、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。ネズミＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲδを、ＦＬＡＧ−ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でサブクローニングした。ＣＤＫ５を標的にするレンチウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｐＬＫＯ．１；Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に関して用いた配列は、５’−ＴＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＡＡ−３’であった。レンチウイルス産生のために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０μｇのレンチウイルスベクターでトランスフェクトした  （Ｋｉｎｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：  １４０５−１４１３  （１９９６））。細胞をレンチウイルスに感染させた後、２μｇ／ｍｌのプロマイシンとともにインキュベートすることにより、細胞を選択した。
ｃ．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定
【０２３３】
ＡＴＰの存在下で、キナーゼ緩衝液中の基質として活性ｃｄｋ５／ｐ３５タンパク質および組換えＰＰＡＲガンマタンパク質を用いて、キナーゼ検定を実施した。試料緩衝液を付加することにより、反応を停止した。次に、脂漏をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、ＣＤＫ基質抗体により検出した。特に、活性ｃｄｋ５／ｐ３５、ｃｄｋ１／ｃｄｃ２、ｃｄｋ２／サイクリンＡ、ｃｄｋ２／サイクリンＥまたはｃｄｋ４／サイクリンＤ１  キナーゼを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。メーカーの使用説明書（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤＫキナーゼ検定を実施した。要するに、ＰＰＡＲガンマの免疫精製ＷＴまたはＳ２７３Ａ突然変異体  １μｇを、２０μＭのＡＴＰを含有するキナーゼ検定緩衝液（２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ベータ−グリセロホスフェート、２ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中の活性ＣＤＫキナーゼとともに、３０℃で１５分間、インキュベートした。検定のための要請対照、精製ヒストンＨ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＲｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。いくつかのＰＰＡＲガンマリガンドを、基質とともに３０分間予備インキュベートし、検定を実施した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ後の基質のリン酸化を、抗ＣＤＫ基質抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて分析した。
ｄ．  細胞または組織溶解物の調製、免疫沈降および免疫ブロット法
【０２３４】
ＣＤＫ５またはＰＰＡＲガンマを発現するＨＥＫ−２９３細胞を、トランスフェクション後に収集した。総細胞溶解物を、ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃でインキュベートした。免疫沈降物または総細胞溶解物を、抗ＣＤＫ基質、ＦＬＡＧまたはＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）抗体を用いて分析した。分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＦＦＡｓ（４００μＭパルミチン酸およびオレイン酸混合物）で、指示時間の間処理し、細胞溶解物をリン酸化特異的またはＰＰＡＲガンマ抗体を用いて分析した。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、種々のＰＰＡＲガンマリガンドで前処理し、ＴＮＦ−αとともにインキュベートした。組織溶解物に関しては、マウスからのＷＡＴを、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有する））中でホモジナイズした。ウエスタンブロッティングのために、ＰＰＡＲガンマのＳｅｒ−２７３周囲の残基に対応する合成ホスホペプチド（Ａｃ−ＫＴＴＤＫｐＳＰＦＶＩＹＤＣ−アミド）を用いて、ＰＰＡＲガンマＳｅｒ−２７３に対するウサギポリクローナルリン酸化特異的抗体をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓが産生した。抗ＰＰＡＲガンマ、ホスホ−ＣＤＫ５（Ｙ１５）、ＣＤＫ５およびｐ３５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて、総組織溶解物を分析した。  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｏｎ  Ｓｅｒ１１２またはＳｅｒ２７３におけるＰＰＡＲガンマのリン酸化を、リン酸化特異的抗体（Ｓｅｒ１１２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＭＡＢ３６３２）により検出した。
ｅ．  レポーター遺伝子検定
【０２３５】
いくつかの実施例において、ＨＥＫ−２９３細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルで１２−ウェルプレート中に播種した。ＨＥＫ−２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＤＲ−１（３Ｘ、ＵＣＰ１  ＰＰＡＲガンマ認識部位を基礎にして）−ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＰＰＡＲガンマ、ＲＸＲａおよびｐＲＬ−レニリンでトランスフェクトした。一晩トランスフェクション後、細胞を、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で、２４時間処理した。細胞を収穫し、二重ルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてレポーター遺伝子検定を実行した。ルシフェラーゼ活性を、レニリン活性に対して正規化した。
ｆ．  遺伝子発現分析
【０２３６】
トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞または組織から総ＲＮＡを単離した。ＡＢＩ逆転写キットを用いて、ＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ９３００  ＰＣＲ機を用いて、緑色蛍光染料により、定量的ＰＣＲ反応を実施した。ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）レベルに正規化されるΔΔ−Ｃｔ法により、相対的ｍＲＮＡ発現を確定した。この試験で用いられるプライマーの配列は、表３に見出される。
ｇ．  ヌードマウスにおける脂肪パッドの生成
【０２３７】
ＰＰＡＲガンマのＷＴまたはＳ２７３Ａ突然変異体を安定的に発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞（１×１０７）を、従来の方法に従って、７〜８週齢雄ＮＣＲヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に皮下移植した（ｎ＝５匹／群）（Ｗａｌｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３：  ２４２９０−２４２９４  （２００８））。注射の６週間後に、遺伝子発現の分析のために脂肪パッドを単離した。
ｈ．  マイクロアレイ解析
【０２３８】
１μＭのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で２４時間処置したＰＰＡＲガンマまたはＷＴ細胞のＷＴまたはＳ２７３Ａ突然変異体を発現するＰＰＡＲガンマ−ヌル繊維芽細胞から、総ＲＮＡを単離した。アレイハイブリダイゼーションおよびスキャンは、確立された方法に従って（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：  １６７５−１６８０  （１９９６））、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０  ２．０アレイを用いて、ダナ・ファーバー癌研究所マイクロアレイ中心機関（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）が実施した。ＤＮＡチップ解析機（ｄＣｈｉｐ）ソフトウェアを用いて、アレイデータを解析した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：  ３１−３６  （２００１））。非対合ｔ検定により、遺伝子発現における差の統計学的有意を査定した（ｐ＜０．０５）。ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５リン酸化により調節される厳密な遺伝子組を作製するために、ｐ値ならびにＷＴ対Ｓ２７３Ａ突然変異体細胞における遺伝子発現の倍変化を先ず算定し、そしてｌｏｇｐ値対ｌｏｇ２倍変化をプロットした。遺伝子のこの一覧から、大きさ（４倍差）および統計学的有意（ｐ＜０．０５）に変化を示した５３個の遺伝子を選択した。ｑＰＣＲにより、細胞または移植脂肪パッドにおいて選択遺伝子を実証し、その結果生じた遺伝子組（１７の遺伝子からなる）を、ｑＰＣＲを用いてマウスのＷＡＴで解析した。
ｉ．  動物
【０２３９】
べス・イスラエル・ディーコネス・メディカルセンターの動物実験委員会（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可された手法に従って、すべての動物実験を実施した。４〜５週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスに、通常餌（１０％  ｋｃａｌ脂肪、Ｄ１２４５０Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．）または高脂肪餌（６０％  ｋｃａｌ脂肪、Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．）を指示時間に与えた。耐糖試験のために、１日１０ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４を６日間、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、一晩絶食させた後、２ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射した。Ｔｒｕｅｔｒａｃｋ糖測定器を用いて、グルコース注射後、間隔を置いて、尾静脈血中でグルコースを測定した。ＥＬＩＳＡ（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ）を用いて、血清インスリン濃度を確定した。
実施例２：ｃｄｋ５はマウスＰＰＡＲガンマのセリン２７３を特異的にリン酸化する
【０２４０】
前炎症性サイトカインは、特に動物またはヒトが肥満になると、脂肪組織中に存在する脂肪細胞および免疫細胞の両方から分泌される（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：  ８７−９１  （１９９３））。ＰＰＡＲガンマは脂肪細胞における脂肪生成および遺伝子発現の主要調節因子であるため、分子の構造を解析し、ＰＰＡＲガンマの主なアミノ酸配列が、ＰＰＡＲγ２のセリン２７３でのプロテインキナーゼｃｄｋ５によるリン酸化のためのコンセンサス部位を含有する、ということが確定された（図１Ａ）。このプロテインキナーゼは、ｃｄｋ遺伝子ファミリーの一成員であるにもかかわらず、サイクリンにより調節されず、代わりに、多数のサイトカインおよび前炎症性シグナルの標的であるｐ３５／２５により活性化される（Ｄｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ７４９−７５９  （２００１））。このｃｄｋ５部位は、すべてのシーケンシング化哺乳動物ＰＰＡＲガンマ中に保存されるが、しかしＰＰＡＲ遺伝子ファミリーの他の成員には見出されない。ネズミＰＰＡＲガンマにおけるｃｄｋ５部位は、ｃｄｋ５およびその活性化補因子ｐ３５とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした場合にリン酸化され得る。実際、ＰＰＡＲガンマは、ｃｄｋ５／ｐ３５複合体の既知の基質であるヒストンＨ１と同様に効率的に、これらの条件下でリン酸化される（図１Ｂ）。アラニンへのセリン２７３の突然変異は、ＰＰＡＲガンマのリン酸化を完全に遮断し、これは、ＰＰＡＲガンマ上にはこのプロテインキナーゼに関する他の潜在性部位は存在しなかった、ということを示す（図１Ｂ）。ｃｄｋタンパク質ファミリーの他の成員は、ＰＰＡＲガンマをリン酸化しなかった。このキナーゼと野生型（ＷＴ）および突然変異体ＰＰＡＲガンマとの同時トランスフェクションにより示されるように、ｃｄｋ５は細胞中のＰＰＡＲガンマもリン酸化した（図１Ｃ）。細胞におけるこのリン酸化を、コンセンサスｃｄｋ５部位でリン酸化されるペプチドに対する抗体を用いて検出した。キナーゼ活性を不活性化する突然変異（ＫＤ）を有するｃｄｋ５のバージョンは、ＰＰＡＲガンマを修飾しなかった。さらに、これらの結果は、セリン１１２のリン酸化とは無関係であった。最後に、ｃｄｋ５は細胞中のネズミＰＰＡＲアルファまたはＰＰＡＲデルタを修飾しなかった（図１Ｄ）。
実施例３：Ｓｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化は脂肪生成を調節する
【０２４１】
肥満症は、前炎症性サイトカインおよび遊離脂肪酸の循環レベル上昇により特性化される。上記のように、ｃｄｋ５は、サイトカイン（例えばＴＮＦ−アルファ）により活性化されることが既知である（Ｄｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ７４９−７５９  （２００１）；Ｕｔｒｅｒａｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４：  ２２７５−２２８４  （２００９））。図２Ａは、セリン２７３でｃｄｋ５部位に由来するホスホペプチドに対して作製される特異的抗体により示されるように、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−６による３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の処置がｃｄｋ５部位でのＰＰＡＲガンマのリン酸化を引き起こす、ということを示す。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）によるｃｄｋ５の活性化についての報告はないが、一方、これらは肥満症において増大されることが知られている（Ｒｅａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：  １０２０−１０２４  （１９８８））。図２Ａは、抗レベルのＦＦＡによる脂肪細胞の処置時に、セリン２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化が起きる、ということも示す。サイトカインおよびＦＦＡ誘導性リン酸化は、実際、ｃｄｋ５により起きているが、図２Ｂおよび２Ｃで示されるように、異なるキナーゼでは起きず、この場合、これらの修飾は、ネズミｃｄｋ５に対して指図されるｓｈＲＮＡで細胞を処理することにより除去される。
【０２４２】
ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５修飾が、脂肪生成、ならびに分化脂肪細胞内での遺伝子発現に影響を及ぼすこの受容体の能力を変更する方法を確定するために、試験を実施した。ＰＰＡＲガンマの野生型およびＳ２７３Ａ突然変異体対立遺伝子は、ＰＰＡＲガンマを完全に欠く繊維芽細胞中で等しいＲＮＡおよびタンパク質レベルで発現された（図３ａおよび３Ｂ；Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６：  ２２−２６  （２００２））。これらの初期実験は、任意の他のリガンドを付加することなく、培養細胞中での考えられる基本レベルのｃｄｋ５媒介性リン酸化を利用した（図２Ｂに示した曝露で目に見える）。血清は、培養細胞中のｃｄｋ５を活性化することが示されている（Ｍｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｄｒｏｌ．  ２１：  ３９２−４０２  （２０００））。ｃｄｋ５のより頑強な活性化を誘導するサイトカインおよびＦＦＡによる細胞の処理は、以前に示されているように（Ｔｏｒｔｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：  ８６７−８６９  （１９８５））、脂肪細胞の分化をもたらし、したがって、これらの実験においては用いられ得なかった。突然変異体および野生型ＰＰＡＲガンマ対立遺伝子はともに、ＰＰＡＲガンマ転写活性および脂肪生成を等効率で駆動した（図３ａおよび３Ｂ）。ほとんどの古典的脂肪細胞遺伝子、例えばａＰ２およびＣ／ＥＢＰαは正確に等しいレベルに発現されたが、一方、ある種の遺伝子はＰＰＡＲガンマｃｄｋ５部位における突然変異に感受性であった（図３ｃ）。これらは、重要な脂肪酸運搬体、ｃｄ３６、ならびにアディポカイン、アディポネクチン、アディプシンおよびレプチンを包含する。ｃｄｋ５部位の突然変異は、培地中へのアディポネクチンの分泌の増大も引き起こした（図３ｄ）。
【０２４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ状況での脂肪細胞遺伝子発現を変更するこのｃｄｋ５媒介性リン酸化の能力を調べるために、野生型および突然変異体細胞を、ヌードマウスの皮膚下に移植した（図８Ａ；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０１：  １６９−１７１  （１９７９））。６週間後、両細胞型が脂肪パッドを生成し、これは、単離され、遺伝子発現に関して解析され得る。さらにまた、アディポネクチンおよびアディプシンはともに、顕著に調節不全化され、突然変異体対ｗｔＰＰＡＲガンマを発現する細胞中で増大される（図１０Ｂ）。これは、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化がこれらのアディポネクチンの両方の発現を低減した、ということを意味する。ｃｄ３６およびレプチンはともに、突然変異体対ｗｔ細胞においてわずかに高いレベルで発現されたが、これは、これらの移植実験において統計学的有意に達しなかった。
実施例４：Ｓｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化は肥満症において生じる
【０２４４】
ＰＰＡＲガンマにおけるｃｄｋ５突然変異によりその発現が調節不全にされるいくつかの遺伝子、例えばアディポネクチン、アディプシンおよびレプチンは、多数の型の動物およびヒト肥満症において不適切に調節されることが知られている、ということは注目に値する。実際、肥満症におけるアディポネクチンのレベル低減は、通常は肥満を伴うインスリン抵抗性に少なくとも部分的に関与することが示されている（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：  １０６９７−１０７０３  （１９９６））。この事実は、サイトカインによるｃｄｋ５の活性化および高脂肪酸レベルとともに、ｃｄｋ５が肥満マウスの脂肪組織中で活性化されるか、ならびにＰＰＡＲガンマが肥満症の状況で特異的にｃｄｋ５によりリン酸化されるか否かを試験するための実験を方向付けた。マウスを標準固形飼料または脂肪から６０％ｋｃａｌを含有する高脂肪、高糖餌に配置して、このプロトコールの開始後いくつかの時点で脂肪組織を採取した。マウスは７週間でインスリン上昇傾向を発症したが、これはインスリン抵抗性を示す。明白な高インスリン血症が、この餌の開始後１３週間で現れた（図４Ｂ）。図４Ａに示したように、この高脂肪餌の３週間後に、ｃｄｋ５の活性化（ネズミｃｄｋ５のチロシン１５での特異的リン酸化により検出可能）は認められなかった。しかしながら、活性化ｃｄｋ５は、高脂肪餌の７週間後に容易に観察された。この時点は、ｃｄｋ４に関するこの活性化サブユニットのより安定な形態である切断ｐ２５タンパク質の出現増大も示した（図４Ａ；Ｄｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ７４９−７５９  （２００１））。固形飼料餌動物におけるセリン２７３に関する検出可能な基本レベルのリン酸化が認められ、そして高脂肪餌に関する３週間後のこの修飾の増大は認められなかった。しかしながら、この餌での７週間までに、精巣上体脂肪組織は、固形飼料餌対照と比較して、ＰＰＡＲガンマのこのリン酸化の明らかな増大を示した。固形飼料餌動物と高脂肪餌動物との間のリン酸化のこの差は、この餌での１３週間後に明白であった。ｃｄｋ５媒介性修飾は、２つの異なる白色脂肪沈着物：鼠径部脂肪（皮下脂肪の一型）および精巣上体脂肪（内臓沈着物と考えられる）でも観察された（Ｃｉｎｔｉ，  Ｓ．，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ７３：  ９−１５  （２００５））。図４Ｃは、ｃｄｋ５によるリン酸化のこの増大が両白色脂肪沈着物において起こり、精巣上体脂肪におけるＳ２７３でのリン酸化のほうが強度が大きい、ということを例証する。
実施例５：ＰＰＡＲガンマリガンドはＳｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制し得る
【０２４５】
チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）クラスの抗糖尿病薬、例えばロシグリタゾンは、ＰＰＡＲガンマと結合し、活性化して、マウスおよびヒトにおけるインスリン感受性を改善することが知られている（Ｗｉｌｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：  ３４１−３６７  （２００１））。ＴＺＤおよび他の抗糖尿病ＰＰＡＲガンマリガンドがこの受容体のｃｄｋ５媒介性リン酸化を変更するか否かを問うために、野生型ＰＰＡＲガンマを発現する脂肪細胞を、ＴＮＦアルファ、ロシグリタゾンまたは２つの作用物質の組合せで処置した。図５Ａは、ロシグリタゾンが、脂肪細胞における他のＰＰＡＲガンマ媒介性活性に必要とされる用量と同様に、約１μＭでこの修飾を抑制する、ということを示す（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：  １２９５３−１２９５６  （１９９５））。ＧＷ９６６２、ＰＰＡＲガンマアンタゴニスト（Ｌｅｅｓｎｉｔｚｅｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：  ６６４０−６６５０  （２００２））は、ロシグリタゾンのこの作用を完全に遮断する。任意の既知のリガンドをもはや直接的に結合し得ない受容体の天然突然変異体である、
突然変異体形態のＰＰＡＲガンマ（Ｑ２８６Ｐ；Ｓａｒｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ３：７９９−８０４  （１９９９））のｃｄｋ５媒介性リン酸化に及ぼすこれらの化合物の作用も検査した。ロシグリタゾンは、この場合のｃｄｋ５リン酸化を妨げず、これは、リガンドの直接結合がこの抑制に必要とされることを意味する。
【０２４６】
このデータの最も分かり易い解釈は、ＰＰＡＲガンマアゴニストがプロテインキナーゼの発現を止めたか、あるいは受容体上で働く関連タンパク質ホスファターゼの発現を始めた、というものである。しかしながら、ロシグリタゾンおよび他のＰＰＡＲガンマリガンドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃｄｋ５リン酸化を直接的に抑制するよう働くか否かを確定するために、試験を実施した。これに取り組むために、精製ＰＰＡＲガンマおよびｃｄｋ５／ｐ３５を、適切な条件下でロシグリタゾンと混合するかまたは混合せずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾を達成した。意外にも、図５Ｂは、ロシグリタゾンが、ＰＰＡＲガンマ結合に関するこの化合物のＫｄに近い約３０ｎＭの半最大有効用量で、このｃｄｋ５媒介性リン酸化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで遮断した、ということを示す（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：１２９５３−１２９５６  （１９９５））。ロシグリタゾンを伴うインキュベーションはＲｂタンパク質をリン酸化するｃｄｋ５の能力を抑制しないため、この抑制がｃｄｋ５活性の全体的抑制により引き起こされるわけではない、ということは重要である（図５Ｄ）。
実施例６：非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストはＰＰＡＲガンマ活性の古典的活性化を上回るＳｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化を選択的に抑制する
【０２４７】
ＰＰＡＲガンマリガンドロシグリタゾンがＤＮＡ結合および直接転写受容体活性化作用の両方と関係なくＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化を遮断する能力を有する、という事実は、不十分なアゴニスト特性を有するＰＰＡＲガンマリガンドのいくつかが実質的抗糖尿病活性を有し得る方法に関する興味をそそる説明を示した。ＭＲＬ２４は、ＰＰＡＲガンマと強く結合し、マウスにおいて優れた抗糖尿病活性を有することが報告されている非ＴＺＤ化合物である（Ａｃｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １５：  ３５７−３６２  （２００５））。しかしながら、この化合物は、転写検定においてＰＰＡＲガンマに対する不十分なアゴニストであり、その結果、ＰＰＡＲガンマアゴニストの古典的作用である脂肪生成を促進する能力を実際には有さない。前に報告されたように（Ａｃｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １５：  ３５７−３６２  （２００５））、そして図５Ｄに示したように、ＭＲＬ２４は、ロシグリタゾンと比較して、ＰＰＡＲ転写応答素子に及ぼすアゴニスト活性が非常に弱い。他方で、ＭＲＬ２４は、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化を遮断するのに非常に有効であった（図５Ｂ）。例えば、３０ｎＭのＭＲＬ２４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞中の両方で、３００ｎＭのロシグリタゾンと同様にＰＰＡＲガンマの修飾を抑制した（図５Ｂおよび５Ｅ）。さらにまた、このキナーゼはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＲＬ２４の存在下でＲｂをリン酸化する完全な能力を保持したため、この作用はｃｄｋ５それ自体の全体的抑制の結果ではなかった。ＭＲＬ２４は、試験したすべての用量で、ロシグリタゾンのアゴニスト活性の小画分のみを有した（図５Ｄ）。実際、ＰＰＡＲガンマのＴＮＦ−α−媒介性リン酸化を本質的に完全に遮断した３０ｎＭのＭＲＬ２４（図５Ｅ）は、同一細胞中のＰＰＡＲガンマに及ぼす本質的に非検出可能なアゴニスト活性を有した（図５Ｄ）。さらに、ｃｄｋ５媒介性リン酸化を抑制する不十分なアゴニスト特性を有する多数の付加的抗糖尿病ＰＰＡＲガンマリガンドの能力を、査定した（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２３：  ９７５−９８８  （２００９）；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １７：  ６６２−６７６  （２００３）；Ｏｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：  ４１１２４−４１１３０  （２００４））。図６に示したように、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化を抑制するのに、すべて有効であった。
実施例７：非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストはＰＰＡＲガンマ活性の古典的活性化を上回るインスリン感受性を選択的に改善する
【０２４８】
ＰＰＡＲガンマにおけるｃｄｋ５突然変異およびこれらのＰＰＡＲガンマリガンドの両方により同一細胞中で引き起こされる遺伝子発現の変化の系統的見方をするために、野生型および突然変異体ＰＰＡＲガンマを発現する細胞、さらに、ロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で処理した野生型細胞からのＲＮＡを用いた遺伝子発現のＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ解析を試験した。図５Ｆに示したように、これらのデータすべての非監視群化は、遺伝子発現のいくつかの顕著な群を生じた。ＰＰＡＲガンマにおけるｃｄｋ５突然変異（Ｍｕｔ）を含有する細胞から得られるデータを野生型対照からのデータと比較した場合、示差的発現を有する遺伝子を４つの主な群に分ける。一群（「ａ」と標識）は、その発現がこの突然変異により低減される遺伝子であって、したがって、これらの遺伝子がＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５リン酸化により活性化されることを意味する。この同一遺伝子群は、ロシグリタゾンおよびＭＲＬ２４の両方により抑圧されたが、しかしＰＰＡＲガンマの非リン酸化可能突然変異体と同様のこの抑圧において劇的であるようにはリガンドは機能しなかった。これは、これらのリガンドによる処理が突然変異体タンパク質に匹敵するＰＰＡＲガンマの脱リン酸化を駆動し得るとは思われないという点で理解可能である。「ｂ」と標識された非常に小さい群は、Ａｈｎａｋ核タンパク質およびプロテオリピドタンパク質（ｐｌｐ）１（ともに髄鞘形成のために重要である）（Ｈａｋａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：  ４７４６−４７５１  （２００１）；Ｓａｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｉａ  ５７：  ５３５−５４９  （２００９））、ならびにソーティングネキシン５（Ｓｎｘ５）（これは、小胞輸送のために重要である）（Ｍｅｒｉｎｏ−Ｔｒｉｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１７：  ６４１３−６４２４  （２００４））を含有した。「ｃ」と標識されたより大きな群は、突然変異体細胞中で増大された遺伝子を表し、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化により低減されたものを表わす。肥満症において調節不全にされることが既知である遺伝子のいくつか、例えばアディポネクチンおよびアディプシンは、この群中に存在する。ロシグリタゾンは、さらにまた、これらの遺伝子の本質的にすべてを増大したが、しかし図５Ｆは、ロシグリタゾン作用により増大された非常に大きい遺伝子組の一部としてこれが起きた、ということを示す。実際、ロシグリタゾンによりほとんど劇的に誘導される遺伝子（「ｄ」と標識される）はｃｄｋ５突然変異誘導性遺伝子組に対応せず、大部分が、ａＰ２およびリポタンパク質リパーゼ（ＬＰｌ）のように脂肪生成の古典的遺伝子であった。著しく異なって、ＭＲＬ２４により強力に増大される遺伝子群は、ロシグリタゾンにより誘導されるものより非常に小さく、そしてＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５部位における突然変異により誘導される遺伝子組と顕著に良好に対応した。これらのデータは、ロシグリタゾンおよびＭＲＬ２４の両方が、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５リン酸化による影響を受けるが、しかしＭＲＬ２４により誘導される遺伝子とｃｄｋ５媒介性ＰＰＡＲガンマリン酸化の遺伝子的抑制に��り誘導されるものとの間の非常に密接な対応が認められる同一遺伝子のほとんどを制御する、ということを示す。合わせて考えると、図３〜６に提示したデータは、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５修飾が肥満症における遺伝子調節不全と脂肪組織の病変の大きな供給源である、ということを示す。
【０２４９】
連結をさらに分析するために、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５修飾により調節される精製遺伝子組を、遺伝子発現データの主要構成成分解析の概念を用いて作製した。このために、細胞培養からの、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの細胞の移植からのデータを利用した。次に、これらの遺伝子の発現を、１３週間固形飼料または高脂肪餌のマウスの脂肪組織で検査した。図７は、これらの遺伝子の大多数が、肥満症依存的に発現調節不全を有した。全体として、ＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５リン酸化により最も有意に低減されることが判明した１７の遺伝子のうち、少なくとも１３のこれらの遺伝子が予測芳香で肥満症において定量的に変更された。肥満症において定量的に不全調節されることが周知の遺伝子、例えばアディポネクチンおよびアディプシンは、この群に入る。肥満症と関連することが知られていないいくつかの遺伝子、例えばレチノイン酸受容体応答物２（Ｒａｒｒｅｓ２）、瀬レニウム結合タンパク質１（Ｓｌｅｌｎｂｐ１）およびカルボン酸アンヒドラーゼ３（Ｃａｒ３）もこの群に入る。
【０２５０】
ＰＰＡＲガンマリガンドがＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化に如何に影響を及ぼすかについての構造的理解を明らかにするために、質量分光分析と結びつけた水素／重水素交換（ＨＤＸ）技法を用いた（Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４０２：  ３１２−３６０  （２００５））。
【０２５１】
図８ａに示したように、ロシグリタゾンは、古典的アゴニズムに関与する受容体のＡＦ−２表面の一部を含むリガンド結合ドメイン中のらせんであるらせん１２（Ｈ１２）におけるＨ／Ｄ交換を劇的に低減した（Ｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：  １３７−１４３  （１９９８）；  Ｂｒｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５：  １２５８−１２７１  （２００７））。これに対して、ＭＲＬ２４はこのらせんの動力学に及ぼす統計学的に有意の作用を有さなかった（Ｂｒｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５：  １２５８−１２７１  （２００７））。他方で、ＭＲＬ２４は、Ｈ３（アミノ酸３０９〜３１５）、アミノ酸３６９〜３７９でのβ−シートおよびＰＰＡＲガンマにおけるセリン２７３でのｃｄｋ５部位それ自体を通してＨ／Ｄ交換動態により顕著な影響を及ぼした。ロシグリタゾンは、Ｈ３、βシート領域を通しての好感にも影響したが、しかしセリン２７３を通したＨ／Ｄ交換を如何なる有意程度にも変更しなかった。これらのＨＤＸデータが、結合されたこれらのリガンドの各々とのＰＰＡＲガンマの既知の共結晶構造上にマッピングされる場合、両ＰＰＡＲガンマリガンドがｃｄｋ５部位近くの領域におけるこの受容体の動力学的性質を低減したことは明白である。しかしながら、ＭＲＬ２４は、ロシグリタゾンより大きい程度に、これらの領域の動力学的性質を低減した（図８ｂ）。したがって、これは、ＰＰＡＲガンマリガンド（特にＭＲＬ２４）により誘導されたＨ３、βシートおよびｃｄｋ５部位それ自体における動力学的性質を低減し、ｃｄｋ５リン酸化に余り好ましくはしくない、あるいは不適合でさえある立体配置にこの領域を「凍結する」、と考えられる。
【０２５２】
さらに、ＰＰＡＲガンマリガンドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起きるｃｄｋ５媒介性リン酸化を変更し得るか、そしてこれらの作用物質がＰＰＡＲガンマに及ぼすｃｄｋ５作用により制御される遺伝子を調節するか否かをさらに調べた。図９Ａ〜９Ｃに示したように、１０ｍｇ／ｋｇで７日間のロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４による処置は、高脂肪餌マウスの糖耐性を劇的に改善し、そして体重の変化を伴わずに絶食時インスリンレベルを低減した。重要なことは、これらの高糖尿病用量のこれらの化合物がともに、これらの作用物質で処置したすべてのマウスの脂肪組織におけるＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５媒介性リン酸化を低減したことである（図９Ｄ）。さらに、（上記のように）ＰＰＡＲガンマに及ぼすｃｄｋ５作用により最も有意に制御される１７の遺伝子のうち１２が、一方または両方の作用物質の作用により変更された（図９Ｅ）。これらのデータは、これらの抗糖尿病性ＰＰＡＲガンマリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＰＡＲガンマのｃｄｋ５リン酸化を抑制し、その就職による遺伝子発現の変化を逆転した、ということを示す。
実施例８：非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストは白色脂肪を選択的に褐色にし、全身エネルギー消費を増大する
【０２５３】
図１０は、非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストが、典型的アゴニストであるロシグリタゾンと同様の作用強度で、マウスから単離された白色脂肪における褐色脂肪選択性遺伝子、ＵＣＰ１およびＰＧＣ−１アルファの発現を選択的に誘導する、ということを示す。鼠径部脂肪沈着物を、生理食塩水（対照）、１０ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンまたは３ｍｇ／ｋｇのＭＲＬ２４で１０日間処置したマウスから単離した。総ＲＮＡを、これらの試料から単離した。その後、ＵＣＰ１およびＰＧＣ−１アルファの発現を、実時間ＰＣＲにより定量した。ＵＣＰ１およびＰＧＣ−１アルファのｍＲＮＡレベルを、１８Ｓのもので正規化した。
【０２５４】
図１１は、非典型的ＰＰＡＲガンマアゴニストが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全身酸素消費も選択的に増大する、ということを示す。包括的実験動物監視システム（ＣＬＡＭＳ）を用いて、生理食塩水（対照）、１０ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンまたはＭＲＬ２４で１０日間処置したマウスで、酸素消費を測定した。
実施例９：セリン２７３での非リン酸化可能なＰＰＡＲガンマをコードするノックインマウス系統の生成および特性化
【０２５５】
ＰＰＡＲガンマセリン２７３は、ＰＰＡＲガンマの第５エキソン内に存在する（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＰＰＡＲガンマ  ＥＮＳＭＵＳＧ００００００００４４０から得た参照配列）。ＢＡＣ（細菌人工染色体）クローン  ＲＰ２３−２３２Ｈ１５（ＰＰＡＲガンマゲノム遺伝子座を含有）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＰＰＡＲガンマの第５エキソン周囲を中心に置かれた１１ｋｂ  ＤＮＡ断片を、ＢＡＣから、クローニングプラスミド（ジフテリア毒素陰性選択マーカーを含有）中に回収した。Ｓ２７３Ａ突然変異および制限エンドヌクレアーゼ切断のための新規部位を含有する断片を、この親プラスミド中に導入した。最後に、ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ｌｏｘＰ陽性選択カセットをコードするＤＮＡ配列を、標的プラスミド中に導入した（図１２Ａ）。このプラスミドを線状化して、ＥＳ細胞中に電気穿孔した。ＥＳ細胞を培養し、正しいターゲッティングに関してスクリーニングし、そしてマウスに移植した。子孫をＺｐ３−Ｃｒｅ発現マウスに育種して、ＰＰＡＲガンマ遺伝子内からネオマイシンカセットを欠失させた。次に、これらのマウスを、Ｃｒｅ遺伝子の非存在下でホモ接合性に育種した（図１２Ｂ）。
【０２５６】
ホモ接合性Ｓ２７３Ａ突然変異体ＰＰＡＲガンマノックインマウスは、少なくとも一部は、潜在的治療薬の効力を試験するために用いられ得る。ｃｄｋ５によりセリン２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化を遮断するＭＲＬ２４および類似の化合物（リン酸化遮断剤）は、ＴＺＤのような古典的アゴニストの副作用を有さずに、代謝症候群を改善すると考えられる。
【０２５７】
例えば、ＰＰＡＲガンマは、痩身および肥満個体の両方で活性である；しかしながら、これらの状態では、ＰＰＡＲガンマは、標的遺伝子の有意に異なる転写を示す。理論に縛られずに考えると、転写活性におけるこの差は、Ｓｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマの抑制的リン酸化によるものである。アラニンまたは他の非リン酸化可能アミノ酸残基にＳｅｒ−２７３で突然変異化されたＰＰＡＲガンマの両コピーを有するマウスは、高脂肪餌という難題に直面した場合、正常糖耐性を保持する、と考えられる。
【０２５８】
古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストの投与時に観察される体重増加および流体停留に関与すると思われる作用である、ＭＲＬ２４のグルコース低下作用は、ＰＰＡＲガンマアゴニズムを必要としない。理論に縛られずに考えると、このような古典的ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えばロシグリタゾン）は、ＷＴマウスにおいてのみ陽性グルコース低下を示すが、Ｓ２７３Ａマウスでは示さない。しかしながら、副作用、例えば体重増加および流体停留は、両方の系統で依然として起きる。それゆえ、理想的化合物は、ノックインマウスにおける作用を有さず、それを薬剤のオフ・ターゲット効果を試験するための良好なモデルにする。
【０２５９】
これらのノックインマウスから採取した細胞株は、潜在的化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために用いられ得る。特定の化学物質は、野生型細胞における標的遺伝子を変更するだけで、ノックイン細胞においては変更しないと考えられる。
【０２６０】
Ｓ２７３Ａ  ＰＰＡＲガンマ突然変異体ノックイン動物は、骨髄移植検定にも用いられ得る。野生型動物からＳ２７３Ａ  ＰＰＡＲガンマ突然変異体ノックイン動物への（その逆も）骨髄移植を用いて、例えば野生型宿主バックグラウンド（その逆も）における免疫系細胞（例えばマクロファージおよび単球）中のこのような突然変異体ＰＰＡＲガンマポリペプチドの活性を分析して、ＣＤ３６依存性低減脂質取込みのためのアテローム硬化症の危険が免疫系細胞により媒介されるか否かを確定し得る。
【０２６１】
本明細書中で提供されるデータのすべてに基づいて、図１３は、理論に縛られずに考えると、Ｓｅｒ−２７３でのＰＰＡＲガンマのリン酸化が抗代謝活性を如何に選択的に媒介するかについてのモデルを提供する。
実施例１０：ＰＰＡＲガンマのＳｅｒ−２７３リン酸化状態はグルコース感受性増大を予測する
【０２６２】
２型糖尿病を有するヒト被験者９名を、４ｍｇ／日の用量で６ヶ月間、ロシグリタゾンで処置した。ロシグリタゾン処置レジメンの前および後に、ＣＬＡＭＰ分析を実施した。図１４は、ロシグリタゾン投与レジメンにより産生されるリン酸化Ｓｅｒ−２７３のレベル低減とインスリン感受性改善との間の高い相関を示すデータを提供する。リン酸化Ｓｅｒ−２７３レベルの有意の低減を示さなかった被験者は、ロシグリタゾンに対して代謝的に非応答性であった（すなわち、インスリン感受性改善を示さなかった）。
参照による援用
【０２６３】
本出願全体を通して引用されたすべての参考文献、特許出願、特許および公開特許出願の記載内容、ならびに図面および配列表は、参照により本明細書中で援用される。
等価物
【０２６４】
本明細書中に記載した本発明の具体的実施形態に対する多数の等価物を、わずかな実験を用いて、当業者は理解するであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
【図１】
2013520162.tif 000021
【図２】
2013520162.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2013520162.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
2013520162.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
2013520162.tif 000033
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
2013520162.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月18日(2012.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013520162000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月3日(2012.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＰＡＲガンマのＳｅｒ−２７３リン酸化（ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）２番号付け）を抑制する化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）以下の：
ｉ）配列ＫＴＴＤＫＳＰＦＶＩＹＤＭを含むポリペプチド；および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるＰＰＡＲガンマポリペプチドを含む試料を、試験化合物と接触させること；そして
ｂ）ＰＰＡＲガンマポリペプチドのＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する試験化合物の能力を確定すること、それにより、ＰＰＡＲガンマの前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化を選択的に抑制する化合物を同定すること
を包含する方法。
【請求項２】
試料がin vitro、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＰＰＡＲガンマの前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析することにより確定される請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析し、そして対照との比を比較することにより確定される請求項３記載の方法。
【請求項５】
対照が古典的ＰＰＡＲガンマアゴニストによる処置からの比率である請求項４記載の方法。
【請求項６】
対照が標準条件下でのロシグリタゾンによる処置からの比率である請求項４記載の方法。
【請求項７】
試験化合物が、ＰＰＡＲガンマまたはＰＰＡＲガンマ相同体中の対応するセリン残基と直接的に結合するか否かを確定する工程をさらに包含する請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下の：
試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること
という工程をさらに包含する請求項１または５記載の方法。
【請求項９】
量／活性が、ＰＰＡＲガンマ応答性プロモーターと操作可能的に連結されるプロモーター遺伝子の使用により確定される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
第二試料に比して第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＰＡＲガンマポリペプチドが配列ＫＴＴＤＫＳＰＦＶＩＹＤＭを含む請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＰＡＲガンマポリペプチドが配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドを含む請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＰＡＲガンマポリペプチドが配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む請求項８記載の方法。
【請求項１４】
試料が前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、単球またはマクロファージから得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項１５】
試料が代謝障害の動物モデルから得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＰＡＲガンマがヒトＰＰＡＲガンマである請求項１記載の方法。
【請求項１７】
試料が、in vitro、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＰＰＡＲガンマの前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、Ｓｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析することにより確定される請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析し、そして対照との比を比較することにより確定される請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
試験化合物がヒトＰＰＡＲガンマと直接結合するか否かを確定する工程をさらに包含する請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
以下の：
試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること
という工程をさらに包含する請求項１６または２０記載の方法。
【請求項２２】
量／活性が、ＰＰＡＲガンマ応答性プロモーターと操作可能的に連結されるプロモーター遺伝子の使用により確定される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
第二試料に比して第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＰＡＲガンマがネズミＰＰＡＲガンマ２である請求項１記載の方法。
【請求項２５】
試料が、in vitro、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＰＰＡＲガンマの前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、Ｓｅｒ−２７３リン酸化ネズミＰＰＡＲガンマの量を分析することにより確定される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ネズミＰＰＡＲガンマの量を分析し、そして対照との比を比較することにより確定される請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物がネズミＰＰＡＲガンマ２と直接結合するか否かを確定する工程をさらに包含する請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
以下の：
試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること
という工程をさらに包含する請求項２４または２８記載の方法。
【請求項３０】
量／活性が、ＰＰＡＲガンマ応答性プロモーターと操作可能的に連結されるプロモーター遺伝子の使用により確定される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
第二試料に比して第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
ＰＰＡＲガンマを結合し、ある細胞型の古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）以下の：
ｉ）配列ＫＴＴＤＫＳＰＦＶＩＹＤＭを含むポリペプチド；および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるＰＰＡＲガンマポリペプチドと、化合物が結合するか否かを確定すること；そして
ｂ）試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること
を包含する方法であって、
第二試料に比して第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または
第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性が、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す方法。
【請求項３３】
量／活性が、ＰＰＡＲガンマ応答性プロモーターと操作可能的に連結されるプロモーター遺伝子の使用により確定される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
細胞型が前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
第一および／または第二試料がin vitro、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
第一および／または第二試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
有意に高い量および／または活性が、第二試料に比して少なくとも２５％、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を上方調節することを包含する請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
有意に低い量および／または発現が、第二試料に比して少なくとも２５％、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を下方調節することを包含する請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
マーカーの量が、マーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより決定される請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
試料中のマーカーの量が、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４１】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＰＡＲガンマがヒトＰＰＡＲガンマである請求項３２記載の方法。
【請求項４３】
前記ＰＰＡＲガンマがネズミＰＰＡＲガンマ２である請求項３２記載の方法。
【請求項４４】
前記ＰＰＡＲガンマポリペプチドが配列ＫＴＴＤＫＳＰＦＶＩＹＤＭを含む請求項３２記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＰＡＲガンマポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドを含む請求項３２記載の方法。
【請求項４６】
ＰＰＡＲガンマが配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む請求項３２記載の方法。
【請求項４７】
ＰＰＡＲガンマの前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化を抑制する試験化合物の能力を確定することをさらに包含する請求項３２または４２記載の方法。
【請求項４８】
位置Ｓｅｒ−２７３（ネズミＰＰＡＲガンマ２番号付け）に非リン酸化可能アミノ酸を有するペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項４９】
位置Ｓｅｒ−２７３（ネズミＰＰＡＲガンマ２番号付け）に非リン酸化可能アミノ酸を有するペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【請求項５０】
位置Ｓｅｒ−２７３（ネズミＰＰＡＲガンマ２番号付け）でリン酸化されるＰＰＡＲガンマポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５１】
位置Ｓｅｒ−２７３（ネズミＰＰＡＲガンマ２番号付け）でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子を含む非ヒト動物モデル。
【請求項５２】
被験体において調節される遺伝子の同定方法であって、以下の：
（ａ）位置Ｓｅｒ−２７３（ネズミＰＰＡＲガンマ２番号付け）でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子を発現すること；
（ｂ）前記突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子の１つ以上の候補標的遺伝子の発現および／または活性のレベルを確定すること；そして
（ｃ）対照に比して有意に変更された発現および／または活性を示す遺伝子を同定すること
を包含する方法。
【国際調査報告】
2013520162.tif 000037
2013520162.tif 000038
2013520162.tif 000039
2013520162.tif 000040
2013520162.tif 000041
2013520162.tif 000042
2013520162.tif 000043
2013520162.tif 000044
2013520162.tif 000045