(57)【要約】  本発明は、T細胞集団を検出、弁別及び定量する方法とともに本方法を実施するためのキットに関し、本方法は以下の工程を含む：a）個体の体液の第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる工程（前記体液は抗原提示細胞（APC）及びT細胞を含む）；b）前記第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と一定時間インキュベートする工程；c）第一のアリコート及び前記少なくとも1つの抗原とインキュベートされていない前記個体の体液の第二のアリコートで、特異的T細胞集団のT細胞によって誘導されたAPCの少なくとも1つの第一のマーカーを、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）を用いて検出及び弁別する工程；及びd）APCの検出マーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによって、T細胞集団を検出及び定量する工程。
2013539652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、T細胞集団を検出、弁別及び定量する方法：
a）個体の体液の第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる工程であって、前記体液が抗原提示細胞（APC）及びT細胞を含む、前記工程；
b）前記第一のアリコートを前記少なくとも1つの抗原と一定の時間インキュベートする工程；
c）前記個体の体液の第一のアリコート及び前記少なくとも1つの抗原とインキュベートされていない第二のアリコートにおいて、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）を用いて、特異的T細胞集団のT細胞によって誘導されたAPCの少なくとも1つの第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程；及び
d）検出されたAPCのマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによってT細胞集団を検出及び定量する工程。
【請求項２】
工程c）でさらに別に、少なくとも1つの第二のマーカーが前記第一及び第二のアリコートで検出され、ここで前記第二のマーカーはT細胞自体の誘導マーカーであり、さらに工程d）が、APCの第一の検出マーカー及びT細胞の第二のマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによって、T細胞集団を検出及び定量する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
第二のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる、さらに別の工程a’）を工程a）に含み、さらに前記第二のアリコートを一定の時間インキュベートする、さらに別の工程b’）を工程b）に含み、ここで工程b’）の一定の時間は工程b）の時間とは異なり、さらにRT-qPCRによって第一及び第二のアリコートで第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程c’）を工程c）の代わりに含み、工程d）を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
工程c’）が第一及び第二のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程を含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
体液のアリコートが、APCのみを含むアリコートA及びT細胞を含むアリコートBに分けられ、さらに工程a）が、アリコートAを少なくとも1つの抗原と接触させる工程a1）及び、少なくとも1つの抗原と接触させたアリコートAをアリコートBと接触させる、後続工程a2）を含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
T細胞集団がナイーブT細胞、活性化T細胞又はメモリーT細胞を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
T細胞集団のT細胞が、CD4+T細胞、Th-1細胞、Th-2細胞、Th-17細胞、CD4+CD25+調節性T細胞、Th-3細胞、CD8+T細胞、CD4-CD8+細胞傷害性T細胞、CD4+CD8+T細胞、CD161+NKT細胞及び／又は多様なT細胞の混合物である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
体液が、血液、脳脊髄液、リンパ、心膜液、気管支洗浄液、骨髄吸引物、リンパ組織懸濁物又は精製PBMC集団である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗原がペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、RNA又はDNAである、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗原が、細菌、ウイルス、植物、動物、真菌又は寄生虫の抗原である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗原が、PSA、HER-2/neu、ムチン-1、MAGE、CEA、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（PLP）、ミエリン、インスリンB、プレプロインスリン、IA-2、GAD65、Hsp60、ESAT-6、CFP-10、TB7.7、TB37.6、MPT63、ツベルクリンPPD、VlsE、p58（BBQ03）、p14、p21-24（OspC）、 p37-38（FlaA）、p41、p19（OspE）、p18、Crasp3、BB0323、p26（OspF）、p28（OspD）、p30、p39（BmpA）、p60-65（共通抗原、Hsp60）、p83-100、p17（Osp17）、p31-32（OspA）、p34（Osp B）、ボレリア脂質、ボレリア株の溶解物、Pr55gag、p24、p17、POL、RT、nef、pp65、IE1、IE2、BZLF1、EBNA3、EBNA2、EBNA6、BMLF1、EBNA1、ORF1、ORF4、PRF62、ORF68、HBsAg、HBcAg及びAdV5から成る群から選択される、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程a）の接触及び工程b）のインキュベーションの時間が0から72時間、好ましくは4、6又は8時間である、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
APCの第一のマーカー及びT細胞の第二のマーカーが、それぞれ核酸又はタンパク質、特にRNA、DNA、核酸フラグメント、ペプチド又はペプチドフラグメントであり、さらに少なくとも1つの抗原との前記接触及びインキュベーションによって誘導される、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
APCのマーカーが、4-1BBリガンド（4-1BBL）、OX40リガンド（OX40L）、TNFSF（CD70）、B7.1（CD80）、B7.2（CD86）、FcγRIII（CD16）、FcγRII（CD32）、FcγRI（CD64）又はTNF/TNFレセプター若しくは免疫グロブリンスーパーファミリーのさらに別の代表例である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
T細胞のマーカーが、INF-β、INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、GM-CSF、TGF-β、MIP1a、MIP1b、4-1BB、CD25、パーフォリン及び／又はグランザイムである、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程c）及びd）の検出及び定量が、さらにPCR、定量PCR（qPCR）、マイクロアレイ、FACS、ELISpot又はELISAを用いることによって実施される、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
抗原及びマーカー増幅用プライマー対を含む、請求項1から16のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞集団を検出、弁別及び定量する方法とともに本方法を実施するためのキットに関し、本方法は以下の工程を含む：a）個体の体液の第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる工程であって、前記体液が抗原提示細胞（APC）及びT細胞を含む、前記工程；b）前記第一のアリコートを前記少なくとも1つの抗原と一定の時間インキュベートする工程；c）第一のアリコート及び前記少なくとも1つの抗原とインキュベートされていない前記個体の体液の第二のアリコート中の特異的T細胞集団のT細胞によって誘導されたAPCの少なくとも1つの第一のマーカーを、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）によって検出及び弁別する工程；及びd）検出されたAPCのマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによって、T細胞集団を検出及び定量する工程。
【背景技術】
【０００２】
T細胞は、微生物感染及び腫瘍疾患に対する免疫防御の複雑なネットワークにおいて、免疫応答を統合することによって、さらに多種多様な直接的及び間接的エフェクター機能を介して病原体及び腫瘍細胞を制御し排除することによって主要な役割を果たす。複雑なT細胞機能の妨害は自己攻撃性T細胞の誤った活性化をもたらし、同時に重篤な自己免疫疾患（例えば多発性硬化症（MS）、慢性関節リウマチ（RA）及び若年性糖尿病（I型糖尿病））を引き起こし得る。
原則として、T細胞は、大きな不均質性とともに広域のエフェクター機能を示す。したがって、T細胞は、表面タンパク質CD4及びCD8の発現を基準にCD4陽性T細胞（Tヘルパー細胞（Th））及びCD8陽性細胞傷害性T細胞（CTL）として大雑把に分類され得る。
CD4+T細胞は、免疫防御の活性化、分極化及び統合において主要な役割を果たす。CD4+T細胞は、それらのT細胞レセプターと抗原提示細胞（APC）表面に位置するペプチド装荷MHCクラスII分子との特異的相互作用により活性化され、続いて細胞-細胞接触及び／又は多様なメッセンジャー分子（例えばサイトカイン、ケモカイン）の分泌を介して、B細胞による抗体産生（免疫応答の液性部門）及びCTLの活性化（免疫応答の細胞部門）を管理する。
【０００３】
CD4+T細胞は、特徴的な表面タンパク質の発現及びマーカーサイトカインの生成を基準にしてTヘルパー1（Th-1）、Tヘルパー2（Th-2）及びTヘルパー17（Th-17）細胞に細分類される。Th-1細胞は、サイトカインIFN-γ及びTNF-αの生成とともに転写因子T-betの発現を特徴とする。Th-1細胞は、マクロファージ、CD4-CD8+細胞傷害性T細胞、CD4+CD8+細胞傷害性T細胞とともにナチュラルキラー細胞（NK細胞）及びNKT細胞の活性化及び分化を刺激することによって、効率的な細胞媒介免疫応答の上昇を支援する。Th-2細胞は、サイトカインIL-4、IL-5、IL-6、IL-10及びIL-13の分泌とともに転写因子GATA-3の生成を特徴とし、さらにB細胞における抗体の生成とともに抗体のクラス切り替え（免疫系の液性部門）を支援する。Th-17細胞は、サイトカインIL-17、TNF-α、GM-CSF及びIL-6の生成と特徴とし、さらにリウマチ学性自己免疫疾患で役割を果たすように思われる。調節性T細胞に関しては、Th-1、Th-2及びTh-17細胞の他にさらに別の、免疫応答の減弱、経口性寛容とともに自己免疫疾患の予防に重要な役割を果たすCD4+T細胞集団が規定された。調節性T細胞はCD4+CD25+CTLA4+天然系（ナチュラル）調節性T細胞（Treg）とともにTh-3及びTr-1に細分類される。これらはサイトカインTGF-β（Th-3細胞）又はIL-10（Tr-1細胞）の生成を特徴とする。
【０００４】
CTLは、直接的エフェクターメカニズム、例えば細胞傷害性物質（例えばパーフォリン、グランザイム）の放出及びアポトーシスの引き金を介して、微生物及び寄生虫に感染した細胞及び組織とともに腫瘍細胞を破壊することによって、前記細胞との戦いで中心的な役割を果たす。さらにまた、免疫刺激サイトカイン（IFN-γ、TNF-α、IL-15）及びケモカイン（MIP1α、MIP1β、Rantes）とともに多様な可溶性抗ウイルス因子（IFN-α、IFN-β、IFN-δ、CAF）を分泌することによって、CTLはさらに相当な範囲で非常に特異的なエフェクター機能を示し、これは病原体の複製及び拡散の制限に非常に効率的に寄与する。さらにまた、CD4+CD8+表現型（CD4+CD8dim、CD4dimCD8bright又はCD4hiCD8hi）を示すまた別の細胞傷害性T細胞が報告されている。
したがって、T細胞は、微生物（特にウイルス）誘発疾患の予防及び制御とともに腫瘍細胞の認識及び破壊のための後天的免疫系の重要な防御メカニズムである。
特異的T細胞の活性化、分極化及び調節はAPCを介する厳密な制御によって管理され、本質的には、APCのサブタイプ及び成熟レベルによって、抗原取り込み及び提示のメカニズムによって、それとともに対応する免疫原の固有の特性によって規定される。この結果、免疫原の用量及び局在化とともに免疫調整物質の濃度が、Th-1、Th-2又はTh-17媒介免疫応答が発達するか否か、又は寛容が誘発されるか否かを決定する。
【０００５】
専門的APC（例えば樹状細胞（DC）、単球及びマクロファージ）、またB細胞も、病原体及び腫瘍細胞を特異的に認識し、これらを取り込み、さらにそのフラグメントをMHCクラスI及びクラスII分子と一緒にT細胞に提示することによって、先天的免疫系と後天的免疫系との接合点において主要な位置を占める。加えて皮膚の線維芽細胞、胸腺及び甲状腺の上皮細胞、グリア細胞、膵臓のベータ細胞とともに血管内皮細胞は、非専門的APCとして機能できる。さらにまた、これまでの研究は、T細胞はまたAPCとして機能できることを示している。これらのAPC T細胞は、MHCクラスI及びクラスII分子とともに共刺激分子（例えばCD80、CD40リガンド（CD40L）、OX40リガンド（OX40L）及び4-1BBリガンド（4-1BBL、TNFSF9）の細胞間移転（APC（特にDC）との接触による）によって作出される（Sokke Umeshappa et al. (2009), J. Virol. 182:193-206）。
APCによるT細胞の刺激が成功するためには、以下の3つの独立したシグナルが要求される：T細胞レセプター（TCR）を介するペプチド装荷MHC分子の特異的認識（シグナル1）、APC及びT細胞系共刺激分子とそれらのリガンドとの相互作用（シグナル2）、およびT細胞を分極化させるサイトカイン（例えばIFN-γ、IL-12、IL-4、IL-6及びTGF-β）の存在（シグナル3）。
細胞外可溶性タンパク質は、通常外因性抗原プロセッシング経路を介して分解され、生じたペプチドは、APCの表面で提示されMHC-II分子と複合体を形成する。MHCクラスII分子と複合体を形成したペプチドはCD4+T細胞（Tヘルパー細胞）によって認識される。
【０００６】
対照的に、サイトゾルタンパク質の分解は内因性プロセッシング経路を介して生じ、発生したエピトープのMHCクラスI上での提示に至る。これらのペプチド/MHC-I複合体はAPCの表面に輸送され、ここでそれらは細胞傷害性T細胞（CTL）に提示される。MHCクラスI分子上で提示されるエピトープの大半は内因性タンパク質に由来し、MHC-II分子と複合体を形成するペプチドの大半は外因性タンパク質に由来するが、この区別は絶対的なものではない。例えば、多様な外因的に存在する免疫原（例えば粒状構造物、多様なウイルス粒子、免疫複合体及びリポタンパク質）は、MHC-I分子上での抗原提示のための内因性プロセッシング経路で交差提示と称されるメカニズムを介して終わりを迎える。
ナイーブT細胞の特異的活性化のためには、ペプチド装荷MHC分子の認識（シグナル1）は別として、第二の共刺激シグナル（シグナル2）が要求される。これは、多様なAPC及びT細胞系共刺激リガンドとそれらのレセプターとの相互作用が引き金となって生じる。TNF/TNF-レセプタースーパーファミリーのメンバーは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとともに、共刺激分子のもっとも重要な代表分子に属する。共刺激シグナルが存在しないとき、T細胞はアネルギー状態になる。アネルギーは、T細胞が増殖せず抗原と反応しない状態である。
【０００７】
APC上での共刺激シグナルの発現は、本質的には外因性刺激（例えば病原体又は外傷を受けた組織の成分）とともにサイトカインによって管理される。APCの活性化及び成熟は、前炎症性及びT細胞分極化サイトカインの発現増加とともに共刺激分子（CD80、CD86及びCD40）の発現増加をもたらし、それによってAPCの細胞媒介免疫反応活性化能力が劇的に高められる。TCRによる特異的抗原認識及び共刺激分子との相互作用は、病原体及び疾患特異的ナイーブT細胞の標的照準活性化及び増殖を誘導する。これはIL-2分泌及びCD40リガンド発現の増加によって達成される（その後の他の特異的T細胞亜集団の活性化及び増殖で重要な役割を果たす）。Th-1又はTh-2エフェクター細胞における活性化T細胞の分極化は、APCの成熟レベル、広範なサイトカイン環境とともに対応する抗原の固有の特性及び用量に依存して生じる。
急性微生物感染の過程における特異的T細胞応答の上昇は通常以下の3工程で生じる：エフェクター期の間、抗原特異的ナイーブT細胞は抗原を装荷したAPCとの接触によって活性化され、これは、特異的T細胞の劇的なエクスパンション、エフェクター機能の発達、及び感染部位における活性化エフェクターT細胞の浸潤をもたらす。このエフェクター期は通常、病原体の除去まで1から2週間に及ぶ。その後の縮小期（数週間続く）には、90％を超える産生エフェクターT細胞が死滅する。ほんのわずかの抗原特異的T細胞が生存し、長期持続メモリーT細胞に分化する。このメモリー期に、これらのメモリーT細胞は体内で何年にもわたって比較的安定な細胞数で持続する。これらのメモリーT細胞は、それらの抗原との新規な接触後に迅速に再活性化され、それらのエフェクター機能を発揮ができる。
【０００８】
身体自身のタンパク質及び組織に対する望ましくない免疫反応を回避するために、自己反応性T細胞は早期からクローン欠失によって除去又は不活化される（アネルギー）。その結果は、身体自身の構造物（例えばタンパク質、細胞、組織及び器官）に対する抗原特異的寛容である。自己免疫疾患では、これらの防御的メカニズムが阻害されているか、又は単に発達が不十分なだけである。自己免疫疾患は、環境的影響（例えば微生物感染、妊娠）と組み合わさって、又は身体自身の構造物と病原体及び外来組織特異的ポリペプチドとの類似性（いわゆる分子模倣）のために生来の“感受性”（遺伝的気質）によりもたらされることを示唆する多くの手がかりが存在する。
その他に、活性化T細胞はまた、慢性ウイルス感染の成立及び移植組織及び器官の拒絶に中心的役割を果たす。
T細胞の表現型、頻度、特異性、機能性、活性化の状態を決定することは、疾患の現在の進行過程又は既に克服された疾患についての情報を得るための有効な方法である。さらにまた、そのような方法は、治療用及び予防用ワクチン接種において、さらにまた慢性炎症、自己免疫疾患及び移植拒絶時のT細胞の数及び機能性の診断用検出において特異的T細胞の応答のモニタリングのために非常に重要である。
【０００９】
過去数十年間で、T細胞検出のために種々の技術が開発され、それらは大雑把に2つのカテゴリーに分類できる。これら方法の第一のグループは、ペプチド-MHCマルチマー（例えばテトラマー（Beckmann Coulter）、ペンタマー（Proimmune）及びストレプタマー（IBA）を用いることによるポリペプチド特異的T細胞の直接同定及び定量に信を置く。この方法は、公知のMHC拘束によるエピトープ特異的T細胞の決定を可能にする。この方法ではT細胞の機能性の分析は可能ではない。疾患又は病原体特異的T細胞の日常的モニタリングのためにペプチドMHCマルチマーを使用することでもっとも重要な制限は、MHC/ペプチドマルチマーがHLA特異的であると同様にエピトープであることから生じる。したがって、種々のHLA群をもつ対象者で病原体とともに疾患特異的T細胞の徹底的なモニタリングは、広いスペクトルをもつ種々のペプチド/MHCマルチマーの使用（これは高コストもたらす）を必要とする。加えるに、これらのペプチド/MHCマルチマーはこれまでのところ、MHC分子の限定的スペクトルについてのみ利用可能である。
【００１０】
特異的T細胞を決定するさらに別の方法は、ペプチド装荷HLA分子の使用に信を置く（前記ペプチドは緑色蛍光タンパク質（GFP）と結合されている）。エピトープ特異的認識及びこれら複合体のT細胞レセプターによる結合はGFP標識ペプチドの内在化をもたらし、それによって対応するCTLが可視化される（Tomaru et al. (2003), Nat Med. 9:469）。
対照的に、特異的T細胞をモニタリングする“機能的な”方法は、T細胞及びAPC含有患者材料の刺激物質抗原によるex vivo刺激、及びその後の特異的再活性化T細胞における成熟プロセス（例えば増殖、マーカーサイトカイン生成）の種々の検出系の手段による検出に信を置く。特異的なCD4+T細胞の検出はここでは、通常APC及びT細胞含有患者サンプル（例えばヘパリン処理全血又は単離末梢血単核球（PBMC））のタンパク質、ポリペプチド又は長さが15から25アミノ酸のペプチドによる刺激及び特徴的マーカーサイトカインの生成又はT細胞増殖を決定することによる特異的T細胞活性化の検出によって達成される。サイトカイン検出は、例えばフローサイトメトリー方法（例えば細胞内サイトカイン染色）及びサイトカイン分泌アッセイとともにELISpot又はELISA技術を用いて実施される。T細胞増殖の決定は、例えばブロモデオキシウリジン（BrdU）増殖アッセイ又はカルボキシルフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CSFE）増殖アッセイによって実施できる。
【００１１】
対照的に、特異的CD8+T細胞（TCL）の検出は、APC及びT細胞含有患者サンプルを長さが8から16アミノ酸の短いペプチドで刺激することによって通常実施される。さらにまた、CTLは、組換えウイルス又は細菌（これらはAPCの細胞内でT細胞の標的構造物を発現する）による感染及びその後の抗原特異的T細胞により生成されるマーカーサイトカイン（通常IFN-γ）の決定によって特異的に検出できる。前記マーカーサイトカインの決定は、フローサイトメトリー方法、例えば細胞内サイトカイン染色、又はそれぞれELISpot又はELISAを用いることによって実施される。別の選択肢では、CTLの特異的検出は、51クロム放出アッセイの手段によって又は適切な非放射性方法（例えばラクテートデヒドロゲナーゼ細胞傷害性アッセイ（例えばClontech））を用いることによって実施できる。
これら利用可能な技術は、疾患及び病原体特異的CD4+又はCD8+メモリーT細胞の決定を可能にするが、活性化Tヘルパー細胞（疾患の活動期に単に一過性に出現する）の検出には不適切であるか、適切性は非常に限定的である。
CD4+T細胞は、活動性微生物感染及び疾患の進行時に一過性に活性化される。一過性活性化は、T細胞が一定の期間、かなり短時間しか存在しないことを暗示する。したがって、活性化Tヘルパー細胞は、活動性疾患現出を検出するための重要な対象物である。検出アッセイ（可能な限り顕著なものである）が、活動性感染症及び自己免疫疾患の診断の関係で活性化T細胞を正確に決定するために要求される。
【００１２】
しかしながら、活性化及び非活性化T細胞間の区別が要求されるある種の適用（例えば急性微生物感染時の活性化T細胞の検出及び多発性硬化症又は1型糖尿病が疑われる事例での自己攻撃性T細胞の再活性化又は検出における適用）のためには、メモリーT細胞のin vitro再活性化に基づく方法は利用できないか、又は非常に限定的にしか利用できない。
活性化CD4+T細胞の検出にこれまで利用し得た方法はこれまでのところ低い感度しか示さず、したがって不利である。この感度の低さの理由は、とりわけ病原体又は疾患特異的活性化CD4+T細胞が直接検出されること、及び典型的には患者材料中に少量しか存在しないことによる。しかしながら、利用可能な特異的活性化T細胞の数が少ないことは信頼に足る一目瞭然の検出（これはまた診断要件も満たす）を妨げる。なぜならば、これまでに利用可能なこれらの方法の検出限界はしばしばアンダーカットされるからである。
【００１３】
したがって、抗原特異的活性化Tヘルパー細胞の検出にこれまで利用可能な方法は、通常、例えば活性化T細胞の表面で一過性に発現されるタンパク質のフローサイトメトリー検出に信を置く。特にCD40リガンド及びCD25タンパク質が前記に属する。しかしながら、CD40リガンドは、抗体の結合がCD40リガンドの内在化をもたらすためにフローサイトメトリーではほとんど検出できない。対照的に、CD25タンパク質は活性化Tヘルパー細胞だけでなく調節性T細胞でも見出され、したがってこれら2つのTヘルパー細胞亜集団間の信頼に足る区別のためには適切ではない。加えるに、HLA-DR及びCD69の発現強化とともにCD27の発現低下は活性化T細胞のさらに別のマーカーである。活性化抗原特異的T細胞の検出は、特異性の検出のために（例えば特異的テトラマー、ペンタマー又はストレプタマーによって）、表現型の検出のために（例えば特徴的表面マーカーの決定によって）、及び／又は特異的再刺激後のT細胞活性化の検出のために（例えばマーカーサイトカインの生成を介して）パラレルマーカーの検出を要求する。これまでに公知の方法のさらに別の欠点は、ELISA、ELISpot又はFACS技術によるいくつかのマーカータンパク質の信頼に足る検出は、マーカータンパク質が膜に局在するため、前形成マーカータンパク質が細胞内小胞に存在するため、及び利用可能な抗体が細胞性タンパク質と高い非特異的反応性を有するために不可能であるということである。
したがって、細菌性、ウイルス性、寄生虫性抗原又は自己抗原によって活性化される、特異的T細胞集団の検出、弁別及び定量を可能にし、それによってこれらT細胞集団を固有の疾患及び病期に割り当てることを可能にする方法が希求されている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明によって解決されるべき問題はしたがって、特異的T細胞集団において病原体又は疾患特異的T細胞の定性的で鋭敏であるとともに定量的な検出を可能にする方法を提供することであった。
本発明によって解決されるべきさらに別の問題は、特異的T細胞間の識別、例えば抗原特異的ナイーブT細胞、活性化T細胞及びメモリーT細胞の別個の特異的T細胞集団としての識別を可能にする方法を提供することであって。
さらにまた、本発明によって解決されるべきさらに別の問題は、活動性病原体特異的感染及び疾患現出の検出方法を実施するためのキットを提供することであった。前記方法は、活性化された病原体又は疾患特異的T細胞の間接的検出に信を置く。
本発明によって解決されるべきさらに別の問題は、活動性及び潜伏性感染並びに疾患現出の弁別的診断のための方法を実施するキットを提供することであった。前記方法は、活性化された病原体又は疾患特異的T細胞の間接的検出並びに前記特異的T細胞とナイーブT細胞及びメモリーT細胞との識別に信を置く。
本発明の根幹にあった問題は特許請求の範囲で規定した内容によって解決される。
以下の図面は本発明を例示するために供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】公知の従来技術にしたがってこれまで用いられてきた技術（A）の原理の模式図を示す。
【図１Ｂ】特異的T細胞を検出する本発明の方法の技術（B）の原理の模式図を示す。
【図２】ex vivoで予め活性化させたESAT-6/CFP-10特異的T細胞と潜伏性結核症ドナーの血液のPBMCとの共培養（前記共培養はESAT-6/CFP-10融合タンパク質で刺激され又は刺激されなかった）において、細胞内で検出される4-1BBLタンパク質をもつB細胞の数をドットブロットグラフで示す。in vitroでエクスパンドさせた前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞を、自家PBMCと1：1で混合し、18時間10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下又は非存在下で共培養した。最後の16時間にタンパク質の分泌をブレフェルジンAで阻害した。B細胞の細胞内4-1BBLの検出はフローサイトメトリーで実施した。
【図３】自己のin vitroエクスパンド前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞と共培養した後の、ESAT-6/CFP-10を装荷されたPBMCの4-1BBL mRNA合成の相対的増加をESAT-6/CFP-10非装荷PBMCと比較した図を示す（RT-qPCRによって決定）。ヒト型結核菌（M.ツベルクローシス（M. tuberculosis））に潜伏感染したドナーから新しく単離したPBMCを10μg/mLのESAT-6/CFP-10と12時間インキュベートし、その後、ex vivoでエクスパンドさせた自己のESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞と1：1の比で共培養した。ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と非装荷PBMCの共培養を陰性コントロールとして供した。表示の時点で刺激サンプルを採集し、4-1BBL mRNAの相対的増加を、特異的刺激細胞培養対非刺激細胞培養としてRT-qPCRによって決定した。RT-qPCRのデータは、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した（前記方法では、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として供した）。
【図４】非装荷PBMCに対するESAT-6/CFP-10装荷PBMCにおける4-1BBL mRNAの相対的増加と抗原特異的活性化ESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞数との相関性を示す図である（RT-qPCRによって決定）。ヒト型結核菌に潜伏感染したドナーから新しく単離した1ｘ106のPBMCを、ex vivoでエクスパンドさせたESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞の数を増加させながら10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下で共培養した。自家PBMC及び予め活性化させたESAT-6/CFP-10特異的T細胞の非刺激共培養をコントロールとして供した。表示の時点で、2ｘ105の細胞を採集し、非刺激細胞と比較して特異的刺激細胞の4-1BBL mRNAの相対的増加をRT-qPCRによって決定した。RT-qPCRのデータは、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した（前記方法では、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として供した）。
【図５Ａ】図Aは、ex vivoで予め活性化させた自己のESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞との共培養によりESAT-6/CFP-10装荷又は非装荷PBMCで4-1BBL mRNA生成が相対的に増加することを示す（RT-qPCRによって決定）。潜伏性結核症のドナーから新しく単離した1ｘ106のPBMCを50,000のex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞と10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下及び非存在下で共培養した。表示の時点で、2ｘ105の細胞を取り出し、ペレットにして液体窒素中で凍結させた。非刺激細胞と比較した、特異的刺激細胞培養の4-1BBL mRNAの相対的増加をRT-qPCRで決定した。RT-qPCRのデータは、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した（前記方法では、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールをカリブレーターとして供した）。
【図５Ｂ】図Bは、ESAT-6/CFP-10装荷又は非装荷PBMCと自己のex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞との共培養進行中のIFN-γmRNA生成の相対的増加を示す（RT-qPCRによって決定）。潜伏性結核症のドナーから新しく単離した1ｘ106のPBMCを50,000のex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Tヘルパー細胞と10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下及び非存在下で共培養した。表示の時点で、2ｘ105の細胞を取り出してペレットにし、非刺激細胞培養と比較して、特異的刺激細胞培養のIFN-γ mRNAの相対的増加をRT-qPCRで決定した。RT-qPCRのデータは、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した（前記方法では、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として供した）。
【図６】RT-qPCR技術によって決定した、活性化Th細胞による4-1BBL mRNAの抗原特異的誘導を示す図である。予め活性化させたESAT-6/CFP-10特異的T細胞は、エクスパンダービーズで前活性化したESAT-6/CFP-10非特異的T細胞と比較して、ESAT-6/CFP-10刺激対非刺激において4-1BBL mRNA生成の誘導能力の顕著な改善を示す。 エクスパンダービーズによる非特異的活性化及び特異的に活性化させたESAT-6/CFP-10特異的Th細胞を10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下及び非存在下で自家PBMCと共培養し、ここで種々の数のT細胞を新しく単離した1ｘ106のPBMCとともに用いた。表示の時点で、2ｘ105の細胞を各々の事例で取り出してペレットにし、4-1BBL mRNAの相対量をRT-qPCRで定量した。RT-qPCRのデータは、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した（前記方法では、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として供した）。
【図７】RT-qPCR技術によって決定した、活性化Th細胞による4-1BBL mRNA合成の誘導における抗原特異性を示すさらに別の図である。予め活性化させたESAT-6/CFP-10特異的T細胞は、ESAT-6/CFP-10刺激細胞培養でのみ4-1BBL mRNA生成の誘導増加を誘導し、EBV BZLF1又はCMV pp65タンパク質刺激細胞培養では誘導しない。ヒト型結核菌持続感染ドナーの1ｘ106のPBMCを、約70,000の前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と10μg/mLのESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1又はCMV pp65の存在下で共培養した。さらに別のコントロールとして、前活性化T細胞及びPBMCの非刺激培養を供した。表示の時点で、2ｘ105の細胞を各々の事例でサンプルから取り出し、4-1BBL mRNAの相対的含有量をRT-qPCRで定量した。RT-qPCRのデータは、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した（前記方法では、GAPDHを参照遺伝子として用い、非刺激コントロールを較正用として用いた）。
【図８Ａ】RT-qPCR技術によって決定した、活性化Th細胞の4-1BBL mRNA合成の誘導における抗原特異性を示すさらに別の図である。前活性化ESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1及びCMV pp65特異的Th細胞は、それぞれの対応する標的抗原で刺激された共培養でのみ4-1BBL mRNA生成の誘導増加を示す。ヒト型結核菌ESAT-6/CFP-10装荷PBMC（A）存在下でのCMV pp65、EBV BZLF1及びヒト型結核菌ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞による4-1BBL mRNA合成の誘導を示す図である（RT-qPCRによって決定）。各事例で、1ｘ106のPBMCを、約70,000のex vivoエクスパンドpp65、BZLF1及びESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と、各事例で10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下で（コントロールとして各事例で前記の非存在下で）共培養した。表示の時点で、2ｘ105の細胞をサンプルから取り出し、全RNAを単離し、cDNAに転写し、4-1BBL mRNAの相対的含有量をRT-qPCRの手段により定量した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用い、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した。
【図８Ｂ】RT-qPCR技術によって決定した、活性化Th細胞の4-1BBL mRNA合成の誘導における抗原特異性を示すさらに別の図である。前活性化ESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1及びCMV pp65特異的Th細胞は、それぞれの対応する標的抗原で刺激された共培養でのみ4-1BBL mRNA生成の誘導増加を示す。CMV pp65装荷PBMC存在下でのCMV pp65、EBV BZLF1及びヒト型結核菌ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞による4-1BBL mRNA合成の誘導を示す図である（RT-qPCRによって決定）。各事例で、1ｘ106のPBMCを、約70,000のex vivoエクスパンドpp65、BZLF1及びESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と、各事例で10μg/mLのpp65存在下で（コントロールとして各事例で前記の非存在下で）共培養した。表示の時点で、2ｘ105の細胞をサンプルから取り出し、全RNAを単離し、cDNAに転写し、4-1BBL mRNAの相対的含有量をRT-qPCRの手段により定量した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用い、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した。
【図８Ｃ】RT-qPCR技術によって決定した、活性化Th細胞の4-1BBL mRNA合成の誘導における抗原特異性を示すさらに別の図である。前活性化ESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1及びCMV pp65特異的Th細胞は、それぞれの対応する標的抗原で刺激された共培養でのみ4-1BBL mRNA生成の誘導増加を示す。EBV BZLF1装荷PBMC存在下でのCMV pp65、EBV BZLF1及びヒト型結核菌ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞による4-1BBL mRNA合成の誘導を示す図である（RT-qPCRによって決定）。各事例で、1ｘ106のPBMCを、約70,000のex vivoエクスパンドpp65、BZLF1及びESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と、各事例で10μg/mLのBZLF1の存在下で（コントロールとして各事例で前記の非存在下で）共培養した。表示の時点で、2ｘ105の細胞をサンプルから取り出し、全RNAを単離し、cDNAに転写し、4-1BBL mRNAの相対的含有量をRT-qPCRの手段により定量した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用い、2-ΔΔCq方法にしたがって解析した。
【図９】RT-qPCRによって決定した、MHC-Iブロッキング抗体を用いることによる本発明のRTT方法の感度の上昇を示す図である。10μg/mLのEBV BZLF1装荷又は非装荷PBMCを、in vitro前活性化BZLF1特異的Th細胞と10μg/mLのMHC-Iブロッキング抗体W6/32の存在下及び非存在下で共培養した。表示の時点で、2ｘ105の細胞を取り出し、RNAを精製しRT-qPCR技術で解析した。RT-qPCRのデータは2-ΔΔCq方法にしたがって解析し、GAPDHを参照遺伝子として用いた。
【図１０Ａ】（A）から（E）の図は、活動性結核症のドナー（D）は、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナー（B）、治療されたTB感染のドナー（C）、及び健常ドナー（A）と比較して、特異的に刺激したPBMCでは非刺激PBMCと比較して4-1BBL mRNA生成の相対的誘導の測定可能な増加を示すことを示す。3人の、（A）ヒト型結核菌非感染健常ドナー（p012、p010、p008）；（B）潜伏性結核症感染健常ドナー（p009、p006、p005）；（C）試験前の最後の6ヶ月間に活動性結核症のために治療薬で処置されたドナー（p013、p014、P003）；及び（D）原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナーの新しく単離したヘパリン処理全血からPBMCを単離し、10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下又は非存在下でインキュベートした。選択したドナーのコントロールPBMC（E）として、HIV血清陰性ドナーを10μg/mLのHIV p24キャプシドタンパク質（p005、p008、p007、p006、p003）又はウシ血清アルブミン（p001）で刺激した。表示の時点で、細胞を採取し、刺激及び非刺激細胞の4-1BBLの発現をRT-qPCRによって決定した。結果は2-ΔΔCq方法で解析した。GAPDHを参照遺伝子として供した。
【図１０Ｂ】（A）から（E）の図は、活動性結核症のドナー（D）は、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナー（B）、治療されたTB感染のドナー（C）、及び健常ドナー（A）と比較して、特異的に刺激したPBMCでは非刺激PBMCと比較して4-1BBL mRNA生成の相対的誘導の測定可能な増加を示すことを示す。3人の、（A）ヒト型結核菌非感染健常ドナー（p012、p010、p008）；（B）潜伏性結核症感染健常ドナー（p009、p006、p005）；（C）試験前の最後の6ヶ月間に活動性結核症のために治療薬で処置されたドナー（p013、p014、P003）；及び（D）原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナーの新しく単離したヘパリン処理全血からPBMCを単離し、10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下又は非存在下でインキュベートした。選択したドナーのコントロールPBMC（E）として、HIV血清陰性ドナーを10μg/mLのHIV p24キャプシドタンパク質（p005、p008、p007、p006、p003）又はウシ血清アルブミン（p001）で刺激した。表示の時点で、細胞を採取し、刺激及び非刺激細胞の4-1BBLの発現をRT-qPCRによって決定した。結果は2-ΔΔCq方法で解析した。GAPDHを参照遺伝子として供した。
【図１０Ｃ】（A）から（E）の図は、活動性結核症のドナー（D）は、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナー（B）、治療されたTB感染のドナー（C）、及び健常ドナー（A）と比較して、特異的に刺激したPBMCでは非刺激PBMCと比較して4-1BBL mRNA生成の相対的誘導の測定可能な増加を示すことを示す。3人の、（A）ヒト型結核菌非感染健常ドナー（p012、p010、p008）；（B）潜伏性結核症感染健常ドナー（p009、p006、p005）；（C）試験前の最後の6ヶ月間に活動性結核症のために治療薬で処置されたドナー（p013、p014、P003）；及び（D）原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナーの新しく単離したヘパリン処理全血からPBMCを単離し、10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下又は非存在下でインキュベートした。選択したドナーのコントロールPBMC（E）として、HIV血清陰性ドナーを10μg/mLのHIV p24キャプシドタンパク質（p005、p008、p007、p006、p003）又はウシ血清アルブミン（p001）で刺激した。表示の時点で、細胞を採取し、刺激及び非刺激細胞の4-1BBLの発現をRT-qPCRによって決定した。結果は2-ΔΔCq方法で解析した。GAPDHを参照遺伝子として供した。
【図１０Ｄ】（A）から（E）の図は、活動性結核症のドナー（D）は、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナー（B）、治療されたTB感染のドナー（C）、及び健常ドナー（A）と比較して、特異的に刺激したPBMCでは非刺激PBMCと比較して4-1BBL mRNA生成の相対的誘導の測定可能な増加を示すことを示す。3人の、（A）ヒト型結核菌非感染健常ドナー（p012、p010、p008）；（B）潜伏性結核症感染健常ドナー（p009、p006、p005）；（C）試験前の最後の6ヶ月間に活動性結核症のために治療薬で処置されたドナー（p013、p014、P003）；及び（D）原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナーの新しく単離したヘパリン処理全血からPBMCを単離し、10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下又は非存在下でインキュベートした。選択したドナーのコントロールPBMC（E）として、HIV血清陰性ドナーを10μg/mLのHIV p24キャプシドタンパク質（p005、p008、p007、p006、p003）又はウシ血清アルブミン（p001）で刺激した。表示の時点で、細胞を採取し、刺激及び非刺激細胞の4-1BBLの発現をRT-qPCRによって決定した。結果は2-ΔΔCq方法で解析した。GAPDHを参照遺伝子として供した。
【図１０Ｅ】（A）から（E）の図は、活動性結核症のドナー（D）は、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナー（B）、治療されたTB感染のドナー（C）、及び健常ドナー（A）と比較して、特異的に刺激したPBMCでは非刺激PBMCと比較して4-1BBL mRNA生成の相対的誘導の測定可能な増加を示すことを示す。3人の、（A）ヒト型結核菌非感染健常ドナー（p012、p010、p008）；（B）潜伏性結核症感染健常ドナー（p009、p006、p005）；（C）試験前の最後の6ヶ月間に活動性結核症のために治療薬で処置されたドナー（p013、p014、P003）；及び（D）原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナーの新しく単離したヘパリン処理全血からPBMCを単離し、10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下又は非存在下でインキュベートした。選択したドナーのコントロールPBMC（E）として、HIV血清陰性ドナーを10μg/mLのHIV p24キャプシドタンパク質（p005、p008、p007、p006、p003）又はウシ血清アルブミン（p001）で刺激した。表示の時点で、細胞を採取し、刺激及び非刺激細胞の4-1BBLの発現をRT-qPCRによって決定した。結果は2-ΔΔCq方法で解析した。GAPDHを参照遺伝子として供した。
【図１１Ａ】（A）から（C）の図は、活動性結核症（A）のドナーのツベルクリンPPD刺激PBMCは、潜伏性ヒト型結核菌感染（B）ドナー又は健常（C）ドナーのPBMCと比較して、4-1BB mRNA生成の相対的誘導の増加を、非刺激PBMCと比較して特異的に刺激したPBMCで示すことを示す。活動性TBドナー（A）、潜伏性TBドナー（B）及びヒト型結核菌非感染ドナーから新しく単離した1ｘ106PBMC/mLを各事例でそれぞれ10μg/mLのESAT-6/CFP-10又はツベルクリンPPDで、又は陽性コントロールとして1μg/mLのPMA/イオノマイシンで刺激した。表示の時点で、0.5ｘ106の細胞を取り出して-80℃で保存した。全RNAを細胞から単離し、cDNAに転写し、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで定量した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用いることによって、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
【図１１Ｂ】（A）から（C）の図は、活動性結核症（A）のドナーのツベルクリンPPD刺激PBMCは、潜伏性ヒト型結核菌感染（B）ドナー又は健常（C）ドナーのPBMCと比較して、4-1BB mRNA生成の相対的誘導の増加を、非刺激PBMCと比較して特異的に刺激したPBMCで示すことを示す。活動性TBドナー（A）、潜伏性TBドナー（B）及びヒト型結核菌非感染ドナーから新しく単離した1ｘ106PBMC/mLを各事例でそれぞれ10μg/mLのESAT-6/CFP-10又はツベルクリンPPDで、又は陽性コントロールとして1μg/mLのPMA/イオノマイシンで刺激した。表示の時点で、0.5ｘ106の細胞を取り出して-80℃で保存した。全RNAを細胞から単離し、cDNAに転写し、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで定量した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用いることによって、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
【図１１Ｃ】（A）から（C）の図は、活動性結核症（A）のドナーのツベルクリンPPD刺激PBMCは、潜伏性ヒト型結核菌感染（B）ドナー又は健常（C）ドナーのPBMCと比較して、4-1BB mRNA生成の相対的誘導の増加を、非刺激PBMCと比較して特異的に刺激したPBMCで示すことを示す。活動性TBドナー（A）、潜伏性TBドナー（B）及びヒト型結核菌非感染ドナーから新しく単離した1ｘ106PBMC/mLを各事例でそれぞれ10μg/mLのESAT-6/CFP-10又はツベルクリンPPDで、又は陽性コントロールとして1μg/mLのPMA/イオノマイシンで刺激した。表示の時点で、0.5ｘ106の細胞を取り出して-80℃で保存した。全RNAを細胞から単離し、cDNAに転写し、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで定量した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用いることによって、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
【図１２Ａ】（A）及び（B）の図では、RT-qPCRで決定した、1μg/mLのPMA/イオノマイシン（A）又はPGE2/α-CD40（B）による刺激後の健常ボランティアのPBMCにおける4-1BBL mRNAの非特異的誘導が非刺激コントロールと比較して示される。健常ボランティアの新しく単離したPBMCを、各事例で1μg/mLのPMA/イオノマイシン（A）又は5μg/mLのPGE2及び2μg/mLのα-CD40（B）とともにインキュベートした。表示の時点で、0.5ｘ106の細胞を取り出し、更なる使用まで-80℃で保存した。全RNAを細胞から単離し、cDNAに転写した。続いて4-1BBL cDNAの量をRT-qPCRで決定した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用いることによって、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
【図１２Ｂ】（A）及び（B）の図では、RT-qPCRで決定した、1μg/mLのPMA/イオノマイシン（A）又はPGE2/α-CD40（B）による刺激後の健常ボランティアのPBMCにおける4-1BBL mRNAの非特異的誘導が非刺激コントロールと比較して示される。健常ボランティアの新しく単離したPBMCを、各事例で1μg/mLのPMA/イオノマイシン（A）又は5μg/mLのPGE2及び2μg/mLのα-CD40（B）とともにインキュベートした。表示の時点で、0.5ｘ106の細胞を取り出し、更なる使用まで-80℃で保存した。全RNAを細胞から単離し、cDNAに転写した。続いて4-1BBL cDNAの量をRT-qPCRで決定した。解析は、GAPDHを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用いることによって、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
【図１３】ESAT-6/CFP-10特異的活性化T細胞及び持続性結核症ドナーの自家PBMCの非刺激共培養に対するESAT-6/CFP-10刺激共培養における4-1BBL mRNAの測定された相対的増加に対する多様な参照遺伝子の影響を示す図である（RT-qPCRによって決定）。持続性結核症のドナーから新しく単離したPBMCを予め活性化させたESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と10μg/mLのESAT-6/CFP-10タンパク質の存在下及び非存在下で共培養した。表示の時点で、0.5ｘ106の細胞を取り出し、ペレットにして更なる使用まで-80℃で保存した。全RNAを細胞から単離し、cDNAに転写した。続いて4-1BBL cDNAの含有量をRT-qPCRで決定した。解析は、GAPDH、huP0及びPBGDを参照遺伝子として、非刺激コントロールを較正用として用いることによって、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
【図１４】RTT方法に適切な参照遺伝子を同定するためのリアルタイムPCRの増幅プロットを示す。ｙ軸には、4つ刺激条件（非刺激、ツベルクリン（PPD）、ESAT6/CFP10、PMA/イオノマイシン）下における7つの潜在的参照遺伝子のための定量サイクル（Cq）が、1つのサンプルについて3組ずつ例示的に示される。拡大部分は、12のデータ点の各々に対する刺激条件の連続性を示す。ｘ軸には、96ウェルプレートのプレートの位置が示される。18S：真核細胞18SリボソームRNA；ALAS：アミノレブリネート、デルタ-、シンターゼ1；GAPDH：グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ；GUSB：グルクロニダーゼ、ベータ；HMBS：ヒドロキシメチルビレンシンターゼ；HPRT1：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1；Iono：イオノマイシン；PMA：ホルボル-12-ミリステート-13-アセテート；PPD：ツベルクリンPPD；RPLP0：リボソームタンパク質、大型、P0；TAF1A：TATAボックス結合タンパク質（TBP）関連因子、RNAポリメラーゼI、A、48kDa；unstim：非刺激。
【図１５】活動性又は潜伏性感染TB患者とともに健常BCGワクチン接種ボランティア又は健常ワクチン非接種ボランティアのサンプルにおいて、対応する非刺激サンプルと比較してツベルクリンPPD刺激後のRTTマーカー遺伝子4-1BBL（TNFSF9とも称される）の相対的発現増加を示す。値は参照遺伝子TAF1Aに対して正規化した（2-ΔΔCq）。サンプル当たり、5ｘ106のPBMCを10μg/mLのPPDによりB細胞培養液中で刺激した。活動性：活動性結核症患者；潜伏性：潜伏性結核症患者；BCG：バチルス・カルメット-ゲリン（Bacillus Calmette-Guerin）、結核症に対する弱毒生ワクチン。
【図１６】潜伏性TB患者及び健常ボランティアのPBMCにおけるツベルクリンPPD刺激後のIFN-γ（IFNGとも称される）の発現シグナルの、非刺激サンプルと比較した相対的増加に対する種々の細胞培養液の影響をTAF1Aに対して正規化して示す。B細胞培養液（BZM+）、IL-4を含まないB細胞培養液（BZM-）、LONZAの無血清UltraCULTURETM培養液（Ultra）及びInvitrogenのAIM V培養液（AIMV）を用いた。
【図１７】潜伏性TB患者及び健常ボランティアのPBMCにおけるツベルクリンPPD刺激後の4-1BBL（TNFSF9とも称される）の発現シグナルの、非刺激サンプルと比較した相対的増加に対する種々の細胞培養液の影響をTAF1Aに対して正規化して示す。B細胞培養液（BZM+）、IL-4を含まないB細胞培養液（BZM-）、LONZAの無血清UltraCULTURETM培養液（Ultra）及びInvitrogenのAIM V培養液（AIMV）を用いた。
【図１８】三重qPCRサンプル（左）における、対応する二重反応（右）と比較したTNFSF9及びIFNGの相対的発現増加の同時検出の結果を示す（参照遺伝子としてのTAF1Aに対して正規化）。Unst：非刺激；PPD：ツベルクリンPPD；PMA：ホルボル-12-ミリステート-13-アセテート/イオノマイシン。
【図１９】健常ボランティア及び潜伏性TB患者のサンプルのツベルクリンPPD刺激後における遺伝子FCGR1ABC、CXCL9、CXCL10、CXCL11の発現の、対応する非刺激サンプルと比較した相対的増加を示す。リアルタイムqPCRは、SYBRグリーンシステムを用いて実施した。ｘ軸に遺伝子及び個体がそれぞれプロットされる。ｙ軸は発現の相対的増加（2ΔCq）を示す。BCG：バチルス・カルメット-ゲリン、結核症に対する弱毒生ワクチン；CXCL9から11：ケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガンド9から11；FCGR1ABC：Fcガンマレセプター1A、B、C。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の関係では、“T細胞集団”は特定の表現型を有する一定のT細胞グループであると理解される。
本発明のT細胞集団は、特にナイーブT細胞、活性化T細胞及びメモリーT細胞である。
本発明の関係では、“T細胞”という用語は、Tリンパ球、例えばCD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はCD4+T細胞及びCD8+T細胞のようなそれぞれのT細胞を指すと理解される。本明細書では、CD4+T細胞のグループは、Tヘルパー細胞、例えばTヘルパー1（Th-1）細胞、Tヘルパー2（Th-2）細胞、Tヘルパー17（Th-17）細胞、CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）、Tr1細胞及びTヘルパー3（Th-3）細胞を包含する。CD8+T細胞のグループは、CD4-CD8+細胞傷害性T細胞、及びCD4+CD8+表現型（CD4+CD8dim、CD4dimCD8bright又はCD4hiCD8hi）を示すT細胞を含む。
本発明の関係では、ナイーブ“T細胞”は、一定の抗原特異性を示すが、未だその抗原と最初の接触をもたないT細胞であると理解される。ナイーブT細胞、例えばナイーブCD4+T細胞はそれらの表面のマーカーとして例えばCD45RAを示す。
【００１７】
本発明の関係では、“活性化T細胞”は、T細胞レセプターの最初の抗原接触によって刺激される最初の抗原チャレンジの前のナイーブ状態と共通基盤上にあるT細胞であると理解される。MHC分子上で提示されるペプチドのT細胞レセプターによる認識は、いわゆるT細胞レセプターの架橋を生じる。T細胞活性化のためのさらに別の前提条件は第二のシグナルである。このシグナルは、T細胞と同様にAPCにもある共刺激分子及びそれらのリガンドの相互作用によって媒介される。この活性化は、T細胞内におけるシグナルカスケード及び最終的には増殖及び多様なエフェクター機能の発達を生じる。加えて、活性化T細胞は、特徴的な表面分子（例えばCD40リガンド、4-1BB、CD69及び／又はCD25）の一過性発現を特徴とする。専門的抗原提示細胞の表面における最初の抗原接触の後にナイーブT細胞から活性化T細胞へと向かう活性化はまた“プライミング”と称される。“活性化T細胞”という用語は“エフェクターT細胞”という用語と同義であり、その抗原との復活接触によって特異的に再活性化されたメモリーT細胞もまた含む。
本発明の関係では、“メモリーT細胞”は、既に特異的抗原と接触したT細胞であると理解される。メモリーT細胞は特別な表面マーカー（例えばCD45RO、CD44及びL-セレクチン）を特徴とする。
【００１８】
本発明の関係では、“抗原提示細胞”（APC）は、ポリペプチドを取り込み、それらをプロセッシングし、さらに前記ポリペプチドのフラグメント（いわゆるエピトープ）をMHCI及びMHCIIと一緒に免疫系に提示することができる細胞を指すと理解される。“抗原提示細胞”という用語は、特にいわゆる専門的抗原提示細胞（例えば樹状細胞（DC）、単球及びマクロファージ）、非専門的APC（例えばB細胞）以外にもまた、血管内皮細胞、皮膚の線維芽細胞、胸腺又は甲状腺の上皮細胞、脳のグリア細胞、膵臓のベータ細胞とともに血管の内皮の細胞も含む。非専門的APCは、T細胞との相互作用のために必要とされるクラスI及びIIのMHC分子を、サイトカイン（例えばIFN-γ）による活性化の後でのみ発現する。加えるに、T細胞はまたAPCとして機能できる。これらのAPC T細胞は、APC（特に樹状細胞（DC））と接触することによって、共刺激分子（例えばCD80、CD40リガンド（CD40L）、OX40リガンド（OX40L）及び4-1BBリガンド（4-1BBL、TNFSF9））と同様にMHCクラスI及びクラスII分子の細胞内移転によって作出される。
【００１９】
本発明の関係では、“APCのマーカー”及び“T細胞のマーカー”は、それぞれ核酸（特にRNA又はDNA）又は核酸フラグメントであると理解される。さらにまた、“APCのマーカー”及び“T細胞のマーカー”はまた、それぞれペプチド、オリゴペプチド又はタンパク質でもあると理解される。本発明によれば、APC上でMHC分子と複合体を形成した抗原の活性化T細胞による特異的認識の後で、マーカーの発現の増加又は低下が検出できることが予想される。本発明によれば、したがって、APCのマーカーは活性化T細胞とAPCとの抗原特異的相互作用によって誘導され、それによって検出及び定量できるようになると予想される。
本発明の関係では、マーカーが“誘導される”又はマーカーの“誘導”は、それぞれマーカーの発現の変化であると理解される。マーカーが核酸である事例では、本発明によれば、“誘導”は例えば遺伝子のmRNAの生成の増加又は低下であると理解される。さらにまた本発明によれば、“誘導”は、遺伝子の、例えばメチル化の手段による調節であると理解される。さらにまた本発明の関係では、“誘導される”は、タンパク質の発現が増加又は低下することを指すと理解される。この結果として、タンパク質の発現は細胞上及び細胞において（すなわち細胞内で）生じ得る。
【００２０】
本発明の関係では、“抗原”は特にタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであると理解される。抗原は特にポリペプチド配列であり、APCによって取り込まれ、プロセッシングされ、さらにそのフラグメント（いわゆるエピトープ）はMHC分子上でT細胞に提示される。抗原はまた特にペプチドであり、MHC分子と一緒にT細胞に提示される。加えるに、抗原は、ポリペプチドをコードするRNA、DNA又は発現プラスミドであると理解される。
本明細書で用いられる“発現プラスミド”又は“発現ベクター”という用語は、細胞に核酸を導入し発現させるために人工的に作出された構築物を指す。発現ベクターは、例えば細菌プラスミド及びMIDGES、ウイルス誘導プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、又は人工的に作製された核酸、例えば人工染色体である。ベクターはさらにまた1つ以上の選別マーカーを含むことができる。
【００２１】
本発明の関係では、“ポリペプチド”という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーであると理解される。“ポリペプチド”という語はまた、標的エピトープ、エピトープ、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、ポリプロテイン及びポリペプチドの凝集物という用語を含む。さらにまた、“ポリペプチド”という表現はまた、翻訳後改変（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、カルバモイル化及び類似の改変）を示すポリペプチドを包含する。加えるに、“ポリペプチド”という表現はまた、1つ以上のアミノ酸アナローグ、例えば非天然アミノ酸を示すポリペプチド、置換結合とともに従来技術で公知の他の改変（それらが天然に存在するか又は非天然起源であるかにかかわらず）を有するポリペプチドを指すと理解される。
本明細書で用いられる“エピトープ”という用語はポリペプチドの部分であって、抗原特性を示し、例えばT細胞又は免疫グロブリンの認識部位として機能するものをいう。本発明によれば、エピトープは例えば、免疫細胞（例えばCD4+Tヘルパー細胞、CD8+細胞傷害性T細胞、CD4+CD8dim細胞傷害性T細胞、CD56+CD8+とともにCD56-CD57+CD8NKT細胞又はCD4+CD25+調節性T細胞）によって認識されるポリペプチドの部分である。エピトープは3つ以上のアミノ酸を含むことができる。通常は、エピトープは少なくとも5から7アミノ酸から成り、より頻繁には8から11アミノ酸、又は11を超えるアミノ酸、又は20を超えるアミノ酸、より稀には30すら超えるアミノ酸から成る。
【００２２】
本発明の関係では、“逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、RT-qPCR”は、通常のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法であると理解される。加えるに、RT-qPCRは、増幅に加えてさらにまた標的mRNAの定量を可能にする。この目的のために、全RNAを試験のために材料から単離して抗原とインキュベートし、さらに比較として非刺激材料又は無関係の抗原とインキュベートした材料から全RNAを単離し、続いてその後の逆転写反応でcDNAに転写する。特異的プライマーを用いることによって、続いてqPCRで標的配列を増幅させる。標的配列の定量のためには、いくつかの方法を利用することができる。
定量のもっとも簡単な方法は、インターカレート蛍光色素（例えばSYBRグリーン又はEVAグリーン）を用いることである。これらの色素はそれら自身を二本鎖DNA分子に適合させ、前記適合は特異的生成物の伸長時に生じる。検出は、常に伸長の終わりに蛍光色素の励起後の発光を検出することによって実施される。PCR生成物の量の増加とともに、より多くの色素が取り込まれ、したがって蛍光シグナルが増加する。
定量のさらに別の可能性は配列特異的プローブの使用である。加水分解（Taqman）又はハイブリダイゼーション（Light-Cycler）プローブが存在する。加水分解プローブは蛍光色素で5’末端を、さらにいわゆるクェンチャーで3’末端を標識される。レポーター色素と空間的に近接するために、クェンチャーは蛍光シグナルの消光に応答でき、伸長期の相補性DNAの合成中に切断される。蛍光色素が伸長終了時に光源で励起されると直ちに特異的な波長の光が放出され、前記発光が検出される。
【００２３】
ハイブリダイゼーションプローブ系は2つのプローブから成り、これらのプローブは互いに隣り合って標的配列と結合する。両プローブは蛍光色素で標識される。第一のプローブの5'末端の第一の蛍光色素が光源で励起される。前記発光は続いて蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）により第二のプローブの3’末端の蛍光色素に移される。したがって前記色素は励起され、それによって特異的波長の光が放出され、前記が検出される。標的配列の相補鎖の伸長過程で、第一のプローブがポリメラーゼによって分解されるならば、FRETはもはや発生せず、その後蛍光シグナルは減少する。前述の方法とは対照的に、ここでは定量は常に伸長プロセスの開始時に生じる。
しばしば用いられる蛍光色素は、例えばフルオロフォア1、フルオロフォア2、アミノクマリン、フルオレセイン、Cy3、Cy5、ユーロピウム、テルビウム、ボディピー、ダンシル、ナフタレン、ルテニウム、テトラメチルローダミン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、VIC、YAK、ローダミン及びテキサスレッドである。しばしば用いられるクェンチャーは、例えばTAMRATM、6-カルボキシテトラメチルローダミン、メチルレッド又はダーククェンチャーである。
【００２４】
“リアルタイム”という用語は、PCRの各サイクル内のそれぞれ別個の（すなわち“リアルタイム（即時）”の）測定を指す。いわゆる標的配列の増加はサイクルからサイクルへと蛍光の増加と相関する。作業が終了したとき（通常数サイクルから成る）、続いて得られた蛍光シグナルを基準にしてPCRの指数期に定量を実施する。したがって、増幅の測定は通常Cq（定量サイクル）の値（サイクルを説明する）により実施され、定量サイクルで蛍光が初めてバックグラウンドの蛍光を超えて顕著に上昇する。Cqの値が、一方で標的核酸について、他方で参照核酸について決定される。このようにして、標的配列の絶対的又は相対的コピー数を決定できる。
本発明の関係では、発現参照遺伝子は、ゲノムDNAレベル上およびmRNAレベル上の配列であると理解できる。これらはまた本発明の刺激条件下で転写的に活性でなくてもよく、またそれらはゲノムの非コードDNA領域に一致してもよい。本発明によれば、参照遺伝子はまた標的遺伝子サンプルに添加されたDNA又はRNAでもよい。参照遺伝子のもっとも厳しい基準は、参照遺伝子は刺激進行中に及び本発明の方法の条件によって変化しないということである。実験結果はしたがって、種々のサンプルで用いられる鋳型の量に関して正規化することができる。したがって、参照遺伝子は標的遺伝子の相対的発現の決定を可能にする。参照遺伝子の例は、グリセロアルデヒド-3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、hu0（ヒト酸性タンパク質0）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（PBGD）、β-アクチン又はチューブリンである。
【００２５】
本発明の第一の目的では、T細胞集団の検出、弁別及び定量のための方法を提供することが意図される。前記方法は以下の工程を含む：a）個体の体液の第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる工程（ここで、前記体液は抗原提示細胞（APC）及びT細胞を含む）；b）前記第一のアリコートを前記少なくとも1つの抗原と一定の時間インキュベートする工程；c）前記個体の体液の第一のアリコート及び前記少なくとも1つの抗原とインキュベートされていない第二のアリコートで、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）によって、特異的T細胞集団のT細胞によって誘導されたAPCの少なくとも1つの第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程；及びd）APCの検出マーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによってT細胞集団を検出及び定量する工程。
【００２６】
本発明によれば、したがって、特異的T細胞集団のT細胞の検出、弁別及び定量は、非刺激及び／又は非特異的及び特異的刺激細胞の培養サンプルで、APCの少なくとも1つのマーカーをRT-qPCRを用いて検出及び相対的に定量することによって実施されることが意図される。本発明は、特に活性化されたT細胞はフィードバックメカニズムにより抗原提示細胞（APC）の成熟に寄与するという事実を根拠にして検出及び定量が可能であると考える。本発明の関係では、このフィードバックメカニズムはまた逆T細胞技術（RTT）と称される。したがって、抗原特異的活性化T細胞（特にTヘルパー細胞）は、TCRを介する抗原装荷MHC分子の認識及び同時に発生するT細胞とAPCとの更なる相互作用によって媒介されて、とりわけ例えばAPCのマーカーとしての多様な遺伝子のプロモーターの活性化、mRNA分子の生成の増加、及びこれらマーカータンパク質の発現の増加を誘導する。これらの成熟プロセスにより、APCは、病原体又は疾患特異的細胞傷害性T細胞及び低親和性Tヘルパー細胞を刺激する能力の増加を獲得する。
本発明によれば、したがって、特異的T細胞集団のT細胞、例えば活性化T細胞の検出は、APCのマーカーを介する間接検出によって達成できると考えられる。いかなる理論にも拘束されないが、本発明によれば、抗原フラグメントとのインキュベーションにより、APCはそれらの表面でMHCクラスII又はI分子と協力して活性化T細胞にこの抗原を提示すると考えられる。それによって、活性化T細胞と抗原提示細胞との特異的結合が生じる。この特異的なT細胞-APC相互作用により、APCは特異的に刺激される。この特異的刺激の結果として、APCにおけるマーカー誘導が生じる。逆転写定量PCR（RT-qPCR）による特異的刺激APC及び非刺激APCにおけるマーカーの決定は、特異的T細胞集団の形式の活性化T細胞の検出、弁別及び定量を可能にする。
【００２７】
本方法は、特異的T細胞集団のT細胞（例えばナイーブ、活性化又はメモリーT細胞）の鋭敏で信頼できる検出を可能にする。本方法の鋭敏性は、特にT細胞がAPCでマーカーの（とりわけ多数のmRNAコピーの形式の）刺激を誘引するという事実による。さらにまた、おそらく多数のAPCが1つのT細胞（いわば1つのAPCから別のAPCに“ジャンプする”T細胞）によって刺激されると考えられ、全般的にシグナルの強化に、したがって本発明の鋭敏性の増加につながる。
本方法は、したがってT細胞集団の検出及び弁別を可能にし、それによって特に活性化T細胞をメモリー細胞から区別することを可能にする。
本発明の好ましい実施態様では、正確な遺伝子発現の定量を達成するために、集めたリアルタイムPCRデータ（リアルタイムPCRデータ）の正規化が、固定参照値（実験の条件によって影響を受けない）を用いることによって実施される。この目的のために、参照遺伝子の発現もまた量の相対的比較を実施するために測定される。
【００２８】
本発明によれば、APCのマーカーの決定のために、個体の体液の第一及び第二のアリコートが提供される。本発明の関係では、“提供する”は、体液のアリコートが既に容器に存在することを示唆すると理解される。本発明によれば、“提供する”はまた、体液のアリコートが、例えば血液サンプルを採取することによって患者から直接提供されることを意味することができる。本発明は、第一のアリコートは少なくとも１つの抗原で刺激され、一方、第二のアリコートは刺激されないままであることを意図する。全般的に、第一のアリコートと第二のアリコートは抗原と接触するという点を除いて同一であることがしたがって意図される。したがって、第二の非刺激アリコートは一種のカリブレーターとして機能する。定量はしたがってカリブレーターに対応して実施される。マーカーの決定又は定量のために、第一の刺激アリコート中のマーカーの量を第二の非刺激アリコート中のマーカーの量で割ることが意図される。したがって、カリブレーター（すなわち第二の非刺激アリコート）に対して第一の刺激アリコートのマーカーの量にｎ倍の相違が検出される。本方法はもっぱらex vivoで実施される方法である。
本方法は、公知の利用可能な方法よりも有利な態様で、実験プロセスの鋭敏性、速度及び信頼性が高められてある活性化Tヘルパー細胞の検出を可能にする。加えるに、本方法は特にメモリーT細胞に対する活性化T細胞の区別とともに弁別的決定を可能にする。
【００２９】
活動性微生物感染時並びに特に自己免疫疾患及び腫瘍疾患における活性化T細胞の確定的検出が顕著に困難であるのは、循環中に存在する疾患及び病原体特異的活性化T細胞の数が非常に少ないことに起因する。T細胞はリンパ系器官で抗原装荷APCとの接触によって活性化され、増殖し、続いて血液及びリンパを介して感染部位又は疾患部位（前記部位にそれらはしばしば留まりそれらのエフェクター機能を発揮する）に遊走する。
本方法は、APCにおける生成が活性化T細胞との抗原特異的接触後に測定可能な程度で調節される（すなわち増加、低下又は改変される）T細胞誘導性成分、例えばRNA分子又はタンパク質の検出を根幹とする。
APC又はAPC含有培養物のT細胞に誘導される成熟プロセスの決定は、タンパク質の形式のマーカーを発現ベクターで特異的に刺激した細胞培養で、多様なタンパク質検出方法（例えばFACS、EliSpot又はELISA）を用いて検出することによって以前から公知の方法で実施される。しかしながらこれらの方法は、診断的応用における活性化T細胞の信頼に値する検出では適切性が限定的であるか、又は不適切であることが判明した。
【００３０】
T細胞誘導性マーカー分子は、多数の種々の疾患及び微生物感染において試験されるべき種々の細胞集団、対象者又は患者で生成され、したがって各個体でこれらのマーカータンパク質は時に強く変動し、部分的には既に非常に高い基礎的発現レベルを示すことが知られている。さらにまた、APCは、しばしばすでに大量の前形成マーカー分子（すなわち既に発現されたマーカー分子）を含み、それらは活性化Tヘルパー細胞による抗原特異的刺激とは別個に存在する。さらにまた、活性化Tヘルパー細胞は通常ただ1つ又はほんのいくつかのAPCのみをそれぞれ刺激し、ほんの限定的な感度の増加が細胞レベルで達成され得るだけである。これら公知の状況のために、前記活性化T細胞によって刺激されたAPCのタンパク質レベルで特異的マーカーを検出することにより信頼できる活性化T細胞を決定することは、診断として信頼可能な基準としては不可能であろうとこれまでのところ考えられてきた。
【００３１】
驚くべきことには、本方法は、APCのマーカーとして例えばmRNAのT細胞誘導生成を決定することによって実施できることを示すことができた。ある種のマーカー分子の変動的発現に関する上述の問題のために、本発明のRNAレベルにおけるAPCのマーカー検出は、抗原特異的活性化T細胞の信頼できる鋭敏な決定を可能にするということは予想に反すると考えられるはずである。例えば、活性化T細胞とAPCとの接触は、非常に大量のmRNA分子の生成を誘導し、前記分子はマーカーの強力な増幅をもたらし、したがって本発明の方法の感度を顕著に高める。
しかしながら、活動性疾患の存在のマーカーとして、活性化された抗原特異的T細胞を検出するためにAPCのT細胞誘導性マーカー（例えばmRNA分子の生成）を使用することに対してはこれまで基本的な技術的不利益があった。これらの技術的不利益は、特にAPCの特異的マーカーは個々に非常に不規則に変動する基礎発現を示すという事実に基づく。しかしながら、有意義な試験結果のために信頼できる閾値レベルの規定のために、これらの変動性の補整が必然的に要求される。
これらの技術的不利益は、本発明の方法では特に、少なくとも1つの抗原で刺激した個体体液の第一のアリコート及び刺激しなかった第二のアリコートのAPCのマーカーを検出して第一のアリコート対第二のアリコートの比を決定することによって、マーカー発現の相対的増加を決定することによって克服された。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、工程c）でさらに別に少なくとも1つの第二のマーカーが第一のアリコート及び第二のアリコートで検出され、前記第二のマーカーはT細胞自体の誘導マーカーであり、さらに工程d）が、検出されたAPCの第一の検出マーカー及びT細胞の第二のマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによって、T細胞集団を検出及び定量する工程を含む方法が意図される。
本発明によれば、個体のT細胞集団としてナイーブT細胞、活性化T細胞及びメモリーT細胞の弁別が可能になるということが本方法のために意図される。本発明の方法は、一定の疾患で弁別的診断の可能性を提供する。例えば、とりわけ結核症についてそのような弁別的診断の手段によって、活動性疾患を有し同時治療を必要とする患者を、潜伏性感染を有し具体的治療を必要としない患者及び健常な個体と区別することを可能にする。この弁別的診断は、第一及び第二のマーカーの検出によって可能になる。第一のマーカーはこれによってAPCのT細胞誘導マーカーを表す。このマーカーは活動性疾患現出時にのみ誘導される。第二のマーカーはT細胞自体のマーカーである。この第二のマーカーは、本方法のサンプルで活性化T細胞及びメモリーT細胞の存在下で形成される。
【００３３】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、第二のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる、さらに別の工程a’）を工程a）に含み、さらに前記第二のアリコートを前記抗原と一定の時間インキュベートする、さらに別の工程b’）を工程b）に含み、ここで工程b’）の時間は工程b）の時間とは異なり、さらにRT-qPCRによって第一及び第二のアリコートで第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程c’）を工程c）の代わりに含み、さらに工程d）を含む方法が意図される。
本発明の特に好ましい実施態様では、工程b’）のインキュベーションの時間が0分であることが意図される。さらに別の特に好ましい本発明の実施態様では、当該時間は0から60分、より好ましくは0から45分、より好ましくは0から30分、より好ましくは0から20分、より好ましくは0から15分、より好ましくは0から10分、特に好ましくは0から5分である。本発明によれば、第二のアリコートは、第一のアリコートのインキュベーションの時間と比較して顕著に短いいわゆる“ゼロサンプル”（すなわち0分の間）までの時間抗原と接触させることが意図される。したがって、第二のアリコートのインキュベーション時間内にはマーカーは未だ形成されていないか又は非常に低量のマーカーがその時までに存在しているだけである。本発明によれば特に、工程b’）の時間は工程b）の時間より顕著に短いことが意図される。本発明によれば、工程b’）における第二のアリコートの抗原とのインキュベーションは、したがって数秒から0分のままである範囲でのみ生じるか、または少なくとも継続的時間で生じることはない。
【００３４】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、第二のアリコートは、無関係の抗原と工程a’）で接触され、さらに工程b’）でインキュベートされる。本発明によれば、無関係の抗原は、それに対して当該個体又はメモリー細胞が活性化しなかった抗原であると理解される。そのような無関係の抗原は例えばアルブミン又はHIV血清陰性者におけるHIVタンパク質であり得る。
本発明の好ましい実施態様では、工程c’）が、第一及び第二のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程を含む方法が意図される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、体液のアリコートがAPCのみを含むアリコートA及びT細胞を含むアリコートBに分けられ、さらに工程a）が、アリコートAを少なくとも1つの抗原と接触させる工程a1）及び、少なくとも1つの抗原と接触させたアリコートAをアリコートBと接触させる後続工程a2）を含む方法が意図される。
本発明によれば、T細胞を添加する前に、APCは最初に抗原を装荷される。本発明によればより好ましくは、T細胞含有アリコートBはまた非装荷APC（すなわちその前に抗原と接触させられていないAPC）を含むことが意図される。
本発明によれば、T細胞集団はナイーブT細胞、活性化T細胞又はメモリーT細胞を含むことが意図される。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様では、T細胞集団のT細胞は、CD4+T細胞、特にTh-1細胞、Th-2細胞、Th-17細胞、CD4+CD25+調節性T細胞、Th-3細胞、CD8+T細胞、特にCD4-CD8+細胞傷害性T細胞、CD4+CD8+T細胞、CD161+NKT細胞及び／又は多様なT細胞の混合物であることが意図される。
本発明にしたがえば、さらに好ましくは、体液は、血液、脳脊髄液、リンパ、心膜液、気管支洗浄液、骨髄吸引物、リンパ組織懸濁物又は精製PBMC集団であることが意図される。
本発明の関係では、“リンパ組織”は、リンパ節、脾臓、扁桃腺とともに胃腸管粘膜のリンパ組織（例えばペイヤープラーク）、呼吸器のリンパ組織及び尿道のリンパ組織であると理解される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、体液はさらに別に分離されたAPC集団を含むことが意図される。さらにまた本発明によれば、いわゆるバッフィーコートが体液として好ましい。
【００３６】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原はペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、RNA又はDNAであることが意図される。
さらに別の好ましい実施態様では、抗原は発現プラスミドである。
本発明にしたがえば、さらに好ましくは、抗原は、オリゴペプチドの、ポリペプチドの、タンパク質の、RNAの、又はDNAのフラグメント、切断成分又は断片である。
本発明にしたがえば、好ましくは、抗原は、細菌、ウイルス、植物、動物、真菌又は寄生虫に由来する抗原であることが意図される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン-バールウイルス（EBV）、肝炎Bウイルス（HBV）、肝炎Cウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、パルボウイルスB19、水痘-帯状疱疹ウイルス（VZV）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、JC-及びBK-ウイルス、A、B、C型インフルエンザウイルス、ヒト型結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis））、ボレリア、トキソプラズマ・ゴンディー（Toxoplasma gondii）若しくはアスペルギルスのポリペプチド、又は腫瘍若しくは自己抗原であることが意図される。
【００３７】
本発明によれば、抗原は好ましくはヒトに病原性を有するウイルスの抗原である。以下の例では本発明にしたがってそのようなウイルスが提示される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、オルトミクソウイルス（特にインフルエンザウイルスA、B、C型）、パラミクソウイルス（特にパラインフルエンザウイルス）、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体形成ウイルス（RS-ウイルス）、コロナウイルス、フラビウイルス（特に黄熱-、デング-、日本脳炎B-、ダニ媒介脳炎（TBE）ウイルス、肝炎Cウイルス（HCV））、トガウイルス（特にアルファ-及びルビウイルス）、ブンヤウイルス（特にブンヤ-、ハンタ-、ナイロ-、フレボ-、及びトスポウイルス）、ジェネラウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス（特にリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）及びラッサ熱ウイルス）、胃腸炎ウイルス（特にロタウイルス）、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス（特にレトロウイルスA、B、C及びD型）、レンチウイルス（特にヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）及び2型（HIV-2）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV））、スプマウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）及び2型（HTLV-2）、パルボウイルス（特にパルボウイルスB19及びアデノ関連ウイルス（AAV））、パポーバウイルス（特にパピローマウイルス）、進行性多病巣性白質脳障害（PML）のウイルス、BK-ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（特に単純疱疹ウイルス1型（HSV-1）及び2型（HSV-2）、水痘-帯状疱疹ウイルス（VZV）、サイトメガロウイルス（CMV）及びエプスタイン-バールウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス6、7及び8（HIV6、7及び8））、肝炎ウイルス（特に肝炎Aウイルス（HAV）、肝炎Bウイルス（HBV）、肝炎Cウイルス（HCV）、肝炎Dウイルス（HDV）、肝炎Eウイルス（HEV）及び肝炎Gウイルス（HGV）とともに輸血伝播ウイルス（TTV））、並びにポックスウイルス（特にオルトポックスウイルス、例えばヒトポックスウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及びパラポックスウイルス）。さらにまた、ポリペプチドは、稀な亜急性又は慢性疾患のウイルス病原体（特にマールブルグ及びエボラウイルスとともにボルナウイルス）から誘導できる。
【００３８】
本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはヒト免疫不全ウイルス（HIV）、例えばgp120、gp160、p17、p24、Pr55gag、ポリメラーゼ（Pol）、逆転写酵素（RT）及びnefである。
さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはエプスタイン-バールウイルス（EBV）のポリペプチド、例えばEVNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B（EBNA4）、EBNA3C（EBNA-6）BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1、BARF0、BRLF1、BI’LF4、gp85、gp110、gp220/350、VCA p150、EBNA-LB、LMP1及びLMP2である（例えば以下にまとめられている：Khanna et al. (2000), Annu. Rev, Microbiol. 54:19-48）。
さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはサイトメガロウイルス（CMV）のポリペプチド、例えばUL123（IE1）、UL122（IE-2）、UL83（pp65）、UL82、HL99、UL28、UL33、UL37、US3、UL94、UL16、UL55（gB）、UL85、UL25、US18、UL45及びUL32（pp150）である（例えば以下にまとめられている：Crough et al. (2009) Clin Microbiol Rev. 22:76-98）。
さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくは水痘-帯状疱疹ウイルス（VZV）のポリペプチド、例えばORF1、ORF4、ORF10、ORF14、ORF29、ORF62及びORF68（gE）である。
さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくは肝炎Bウイルスのポリペプチド、例えばHBsAg及びHBcAgである。
さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはアデノウイルスのポリペプチド、例えばAdV5である。
【００３９】
さらにまた本発明にしたがえば、抗原は好ましくは動物に病原性のウイルスの抗原であり、以下に列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、むしろ単なる代表例である。ウマモルビリウイルス（EMP）、ピコルナウイルス、特にエンテロウイルス、口蹄疫（FMD）の病原体を含むアフトウイルス、水疱性口内炎ウイルス、パラミクソウイルス、特にモルビリウイルス、トリパラミクソウイルス、ポックスウイルス、特にカプリポックスウイルス、ブンヤウイルス、レオウイルス、特にオルビウイルス、フラビウイルス、特にペスチウイルス、オルトミクソウイルス、特にインフルエンザAウイルス、ヘルペスウイルス、特にアルファヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、レトロウイルス、特にレンチウイルス及びC型レトロウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、ビルナウイルス、コロナウイルス及びカリシウイルス。
これまで記載したウイルスの包括的リストは例えば以下にまとめられてあり（International Committee on Taxonomy of Viruses (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV))、インターネットを介してアクセスできる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&name=Viruses&lfl=3&srchmode=1&keep =1&unlock）。
【００４０】
さらにまた本発明によれば、抗原は好ましくは細菌の抗原である。本発明によればヒトの病原性細菌の抗原が特に好ましい。以下の例でそのような細菌が列挙される。このリストは本発明の関係で限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、エンテロコッカス、ナイセリア、腸内細菌科、特に大腸菌（Escherichia coli（E. coli））（乳児に病原性を有する大腸菌（EPEC）、腸内凝集性大腸菌株（EAggEC）を含む）、クレブシーラ、エンテロバクター、セラチア、プロテウス、シトロバクター及びチフス様サルモネラ、腸炎サルモネラ、シゲラ、エルシニア、ビブリオ、特にコレラ菌（ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae））及びビブリオ・エル-トール（Vibrio El Tor）、シュードモナス、ブルクホルデリア、ステノトロホマス。
アシネトバクター、カンピロバクター、ヘリコバクター、特にピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））、ヘモフィルス、ボルデテーラ、レジオネラ、リステリア、ブルセラ、フランシセラ、エリシペロトリクス、コリネバクテリア、バチルス、クロストリジア、バクテロイデス、プレボテラ、ポリフィロモナス、フゾバクテリア、アネロビオスピリルム、アネロビブリオ、ブチビブリオ、セントリペジア、デスルフォモナス、ジケロバクター、フィブロバクター、レプロトリキア、メガモナス、ミツオケラ、リケネラ、セバルデラ、セレモナス、スクシノビブリオ、スクシノモナス、チセレラ、マイコバクテリア、特にヒト型結核菌（M.ツベルクローシス（M. tuberculosis））、非定形マイコバクテリア（MOTT）、らい菌（M.レプラエ（M. leprae））、ノカルジア、トレポネーマ、特にT.パリダム（T. pallidum）及びT.カラテウム（T. carateum）、ボレリア、特にB.ブルグドルフェリ-センス-ラト（B. burgdorferi sensu lato）、B.ガリニー（B. garinii）、B.アフゼリー（B. afzelii）、B.バレイシアナ（B. valaisiana）、B.ルシタニアエ（B. lusitaniae）及びB.スピエルマニ（B. spielmani）/A14S及びB.レクレンチス（B. recurrentis）、レプトスピラ、リケッチア、コクシエラ、エルリキア、バルトネラ、マイコプラズマ、特に肺炎マイコプラズマ（M.プニューモニアエ（M. pneumoniae））及びM.ホミニス（M. hominis）、ウレアプラズマ、アクチノミセタ、クラミジア。さらにまた本発明によれば、抗原は好ましくはさらに別の医学的に関連する細菌、例えばトレフェリマ、パスツレラ、ブランハメラ、ストレプトバチルス、スピリルム及びガルドネレラから誘導できる。
【００４１】
さらにまた本発明によれば、抗原は、より好ましくはヒト型結核菌のポリペプチド、例えばCFP-10、ESAT-6、TB7.7、TB37.6及びMPT63、又はポリペプチド混合物、例えばツベルクリンPPDである。
さらにまた本発明によれば、抗原は、特に好ましくはボレリア・スペク（Borrelia spec）のポリペプチド、例えばVlsE、p58（OppA-2）、BBK32、p14、p20（BBQ03）、p21-24（OspC）、p37-38（FlaA）、p41（フラゲリン、FlaB）、p19（OspE）、p18、Crasp3、BBA36、BB0323、p26（OspF）、p28（OspD）、p30、p39、（BmpA）、p60-65（共通抗原、Hsp60）、p83-100、p17（Osp17）、 p31-32（OspA）及びp34（Osp B）、又はボレリア脂質又はボレリア株の溶解物である。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は動物に病原性の細菌の抗原である。本発明にしたがえば以下の例でそのような細菌が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。マイコプラズマ、バチルス、特に炭疽菌（バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis））、ブルセラ、マイコバクテリア、特にヒト型結核菌及びウシ型結核菌（M.ボビス（M. bovis））、カンピロバクター、トリトリコモナス、レプトスピラ、リケッチア、サルモネラ、クロストリジア、アクチノバチルス、クラミジア、エキノコッカス、リステリア、エルシニア、コリネバクテリア及びフランシセラ。これまで記載した細菌の包括的リストはインターネットによりアクセスできる：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/ wwwtax.cgi?mode=Root。
【００４２】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は真菌の抗原である。本発明の特に好ましい実施態様では、抗原はヒトに病原性の真菌から誘導される。本発明にしたがえば以下の例でそのような真菌が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。酵母、特にカンジダ、クリプトコッカス、マラセチア、糸状不完全菌類、特にアスペルギルス、トリコフィトン、ミクロスポルム及びエピデルモフィトン、二形性菌類、特にヒストプラズマ、ブラストミセス、コクシジオイデス、パラコクシジオイデス、シポロトリクス、及びニューモシスチス。
本発明のさらに別の実施態様では、抗原は寄生虫の抗原である。本発明の好ましい実施態様では、抗原はヒトに病原性の寄生虫から誘導される。本発明にしたがえば以下の例でそのような寄生虫が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。原生動物、例えばトリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ジアルジア、アメーバ、プラスモジア、トキソプラズマ、クリプトスポリジア、ミクロスポリジア、吸虫類、例えばシストソーマとともに多節条虫、例えばサナダムシ及びエキノコッカスとともに線虫類、例えばトリクリス、トリキネラ、ストロンギロイデス、鉤虫属、アメリカ鉤虫属、エンテロビウス、回虫属及びフィラリア上科。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は動物に病原性の寄生虫のポリペプチドである。本発明の好ましい実施態様では、抗原はヒトに病原性の寄生虫から誘導される。本発明にしたがえば以下の例でそのような動物に病原性の寄生虫が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。原生動物、特にプロトモナス、ジプロモナス、ポリマスチギジア、アメーバ、トキソプラズマ及びコクシシジア、ミクロスポラ、ヘルミンテス、トレマトーラ、多節条虫及び線虫。
【００４３】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は腫瘍抗原又は自己抗原であることが意図される。本発明の関係では、“自己抗原”は、ペプチドフラグメントの形態の構造を示し、身体自身の構造物である抗原と理解される。T細胞（そのような自己抗原に対して反応性を示す）が存在する事例では、自己免疫疾患の出現があり得る。自己抗原はまたセルフ抗原又は自己免疫抗原とも称される。
本発明の関係では、活性化T細胞（それぞれ腫瘍疾患又は自己免疫疾患を示す）は、腫瘍関連抗原又は自己免疫抗原とのインキュベーションによって検出され得る。
本発明の好ましい実施態様では、抗原はヒト腫瘍抗原である。本発明にしたがえば、特に好ましいものは、前立腺特異的抗原（PSA）、HER-2/neu、ムチン-1、過剰発現野生型p53とともに点変異を示すp53、MAGE抗原及びCEA（癌胎児抗原、Carcino-Embryonic-Antigen）である。
【００４４】
さらに別の好ましい実施態様では、抗原は自己抗原である。本発明にしたがえば、好ましくは多発性硬化症（MS）に対する自己免疫抗原、例えば以下である：ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（PLP）、ミエリン、MBP/PLP融合タンパク質（MP4）、オリゴデンドロサイトのミエリン関連塩基性タンパク質（MOBP）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（OSP）、ミエリン関連糖タンパク質（MAG）、とともに糖タンパク質P0、末梢ミエリンタンパク質22（PMP-22/PAS-II）、p170k/SAG（シュワン細胞膜糖タンパク質）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（OMgp）、シュワン細胞ミエリンタンパク質（SMP）、トランスアルドラーゼ、S100β、アルファBクリスタリン、2’,3’-サイクリックヌクレオチド3’ホスホジエステラーゼ（CNP）、線毛神経栄養因子（CNF）及びグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）。
さらにまた本発明にしたがえば、1型糖尿病（若年性真性糖尿病）に対する自己免疫抗原、例えばインスリンB、プレプロインスリン（PPI）、チロシンホスファターゼIA-2、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（GAD65）、熱ショックタンパク質Hsp60、島細胞タンパク質ICA69、IGRP、cd4、クロモグラニンA（ChgA）（以下をまた参照されたい：Velthuis et al. (2010) Diabetes）が好ましい。
【００４５】
本発明の特に好ましい実施態様では、抗原は以下から成る群から選択される：PSA、HER-2/neu、ムチン-1、MAGE、CEA、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MGO）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（PLP）、ミエリン、インスリンB、プレ-プロ-インスリン、IA-2、GAD65、Hsp60、ESAT-6、CFP-10、TB7.7、TB37.6、MPT63、ツベルクリンPPD、p14、OspC、p37-38（FlaA）、p41、OspE、OspF、OspD、p39、Osp17、OspA、OSP B、Pr55gag、p24、p17、POL、RT、nef、pp65、IE1、IE2、BZLF1、EBNA3、EBNA2、EBNA6、BMLF1、EBNA1、ORF1、ORF4、PRF62、ORF68、HBsAg、HBcAg及びAdV5。
本発明のさらに好ましい実施態様では、抗原はTヘルパー細胞のエピトープを含むポリペプチドから選択される。
【００４６】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、工程a）の接触及び工程b）のインキュベーションの時間は0から72時間、好ましくは4、6又は8時間であることが意図される。さらにまた、好ましいこととして、工程a）及び／又は工程b）の時間は0から72時間、好ましくは4、6又は8時間であることが意図される。さらにまた本発明にしたがえば、好ましくは、工程a）及び／又は工程b）の時間は、0から48時間、より好ましくは0から36時間、より好ましくは0から34時間、より好ましくは0から32時間、より好ましくは0から30時間、より好ましくは0から28時間、より好ましくは0から26時間、より好ましくは0から24時間、より好ましくは0から22時間、より好ましくは0から20時間、より好ましくは0から18時間、より好ましくは0から16時間、より好ましくは0から15時間、より好ましくは0から14時間、より好ましくは0から12時間、より好ましくは0から10時間、より好ましくは0から9時間、より好ましくは0から8時間、より好ましくは0から7時間、より好ましくは0から6時間、より好ましくは0から5時間、より好ましくは0から4時間、より好ましくは0から3時間、より好ましくは0から2時間、より好ましくは0から1時間である。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、工程a）及び／又は工程b）の時間は0から60分、より好ましくは0から50分、より好ましくは0から40分、より好ましくは0から30分、より好ましくは0から20分、より好ましくは0から15分、より好ましくは0から10分及びより好ましくは0から5分である。
【００４７】
本発明にしたがえば好ましくは、APCの第一のマーカー及びT細胞の第二のマーカーは核酸又はタンパク質、特にRNA、DNA、核酸フラグメント、ペプチド又はペプチドフラグメントであること、及びこれらは少なくとも1つの抗原との接触及びインキュベーションによって誘導されることがさらにまた意図される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、APCのマーカーは、4-1BBリガンド（4-1BBL）、OX40リガンド（OX40L）、TNFSF（CD70）、B7.1（CD80）、B7.2（CD86）、FcγRIII（CD16）、FcγRII（CD32）、FcγRI（CD64）、又はTNF/TNF-レセプター及び／又は免疫グロブリンスーパーファミリーのさらに別の代表例、又はCXCLファミリーのメンバー、例えばCXCL9、CXCL10、CXCL11、又はケモカイン（C-Cモチーフ）リガンドファミリーのメンバー、例えばCCL2、CCL 7、CCL8、CCL10又はIL1RNであることが意図される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、T細胞のマーカーは、IFN-β、INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、GM-CSF、TGF-β、MIP1a、MIP1b、4-1BB、CD25、パーフォリン及び／又はグランザイムであることが意図される。さらにまた本発明にしたがえば、T細胞のマーカーは、活性化T細胞又は活性化メモリーT細胞によって生成されるさらに別のサイトカイン又はケモカインである。
【００４８】
本発明の好ましいマーカーは特に核酸であり、T細胞によるAPCのエピトープ特異的認識の後で、APCでの生成が通常的に検出できるほどに増加する。APCの本発明のマーカーであるそのような核酸の例は、4-1BBリガンド（4-1BBL）及びOX40リガンド（OX40L）のmRNA分子である（Oshima et al. 1997, J. Immunol. 159, 3838-3848；den Haan and Bevan; 2000, PNAS 97, 12950-12952）。さらにまた本発明にしたがえば、共刺激タンパク質B7.1（CD80）、B7.2（CD86）及びFasリガンド（FasL）のmRNA分子とともにTNF/TNFリセプタータンパク質ファミリー及び免疫グロブリンスーパーファミリーの他のタンパク質のmRNA及び多様なFc-レセプターのmRNA、並びにサイトカイン及びケモカインのmRNA分子が好ましい。加えるに、本発明にしたがえば、任意のポリペプチドの核酸であって、その生成が、APCの表面のMHCタンパク質と一緒に存在するポリペプチドの、活性化T細胞による特異的認識のために同じAPCでのその生成が検出できるほどに増加又は低下する前記核酸が好ましい。
【００４９】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、工程c）及びd）の検出及び定量は、また別にPCR定量PCR（qPCR）マイクロアレイ、FACS、ELISpot及び／又はELISAによって実施されることが意図される。
本発明のさらに別の主題は、少なくとも1つの抗原及び第一のマーカーの増幅用プライマー対を含む、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、キットはさらにまた第二のマーカーの増幅のための1対のプライマーを含む。さらに別の好ましい実施態様では、キットはさらにまた参照遺伝子の増幅のための1対のプライマーを含む。さらにまた本発明にしたがえば、好ましくは、キットはまた別にプローブとともに細胞培養液を含む。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、キットはさらに別にRNA安定化試薬、RT-マスターミックス、qPCR-マスターミックス、陽性コントロール、及び陽性試薬を含む。本発明にしたがえば、“陽性コントロール”は、増幅されるべきマーカーDNAの規定量であると理解される。本発明にしたがえば、“陽性試薬”は、非特異的に（たとえ活性化T細胞が存在しなくても）APCのマーカーを刺激する試薬であると理解される。“陽性試薬”の本発明の例は、PMA/イオノマイシン又はプロスタグランジンE2（PGE2）と協力して活性を示す抗CD40抗体である。
本発明の好ましい実施態様では、キットはさらにまた、PCR、qPCR又はマイクロアレイによるAPCのマーカーの検出を可能にするプライマーを含むことが意図される。
以下で本発明を後続の実施例により例示する。これらの実施例は本発明の具体的な実施態様と考えられるべきであり、限定的であると考えてはならない。
【実施例１】
【００５０】
特異的T細胞集団、例えば活性化T細胞を検出、弁別及び定量するために、抗原提示細胞（APC）のT細胞誘導成熟プロセスを分析した。この目的のために、細胞培養モデルを開発した。前記培養モデルは、抗原装荷APCとex vivoでエクスパンドさせた活性化抗原特異的Tヘルパー細胞との共培養を基準にしている。このモデル系では、（i）非装荷APC又は無関係の抗原を装荷したAPCと前活性化抗原特異的Tヘルパー細胞との共培養、及び（ii）抗原装荷APCと非特異的活性化T細胞又は無関係抗原特異性を有する活性化Tヘルパー細胞の共培養（陰性コントロール）が提供される。この系では抗原特異的Tヘルパー細胞（Th細胞）の検出は、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）によって、特異的刺激及び非刺激培養サンプルでマーカーmRNAの比較定量により実施される。
【００５１】
a）抗原特異的T細胞のex vivoエクスパンション
ESAT-6/CFP-10-特異的活性化Th細胞を作製するために、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナーのCD4+T細胞を3−4週間in vitroでエクスパンドさせた。この目的のために、ドナーの血液をヘパリン化注射筒に抜き取り、PBSwithout（二価イオンを含まないリン酸緩衝食塩水：Lonza）で希釈し、続いてパンコール（Pancoll：Pan Biotech）を用いて密度勾配遠心分離（800ｘg、30分、20℃）により、 血球をそれらの密度にしたがって分離した。その後、PBMCを前記勾配から単離し、PBSwithoutで2回（300ｘg、10分）洗浄した。続いて、MACS技術（CD4+T細胞単離キットII、Miltenyi）を用いてCD4+T細胞を単離し、ESAT-6/CFP-10融合タンパク質（AG Lindner, Institute for medical Microbiology and Hygiene, University Hospital Regensburg）を装荷した自己APC（成熟樹状細胞、PBMC）により、完全R5培養液中にて1：3の割合（Th細胞：APC）で毎週刺激することによって培養した（完全R5培養液：RPMI1640（Pan Biotech）、5％ヒトAB血清（血液型ABのドナーの血液から調製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（PAN Biotech））。この目的のために、完全R5培養液中の1ｘ107細胞/mLの濃度のAPCに10μg/mLのESAT-6/CFP-10融合タンパク質を3時間、37℃で、5％CO2含有湿潤雰囲気で装荷し、さらに単離Th細胞と培養する前に30Gyのγ照射に付した。Th細胞の最適増殖のために、50U/mLの組換えIL-2（Proleukin S, Novartis）を培養に添加した。Th細胞の増殖は、血球計算版を用いて生細胞の全細胞数を検出することによって毎週決定した。同様に培養の特異性は、ESAT-6/CFP-10を装荷した照射PBMCで刺激した後でIFN-γ及びCD40L陽性細胞の数を検出することによって毎週決定した。この目的のために、エクスパンション培養のTh細胞を10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下で新しく単離した自家PBMCと1：1の割合で6時間、5％CO2、37℃でインキュベートした。2時間のインキュベーション後に、ブレフェルジンAを添加して細胞のサイトカインの放出を停止させた。各事例で1μg/mLのPMA/イオノマイシンで刺激したサンプル及び非刺激サンプルをそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして供した。1μg/mLの共刺激用モノクローナル抗CD49d及び抗CD28抗体を各刺激サンプルに添加した。インキュベーションの後で、1回の洗浄工程が続いた。この目的のために、9mLのPBSwithoutを細胞に添加し、この細胞を300ｘgにて8分間4℃で遠心分離した。上清を廃棄し、リフラックスして細胞を再懸濁させた。続いて表面分子を各事例で5μLの以下の発蛍光団結合抗体で標識した：抗CD3アロフィコシアニン-H7（BD）、抗CD4アロフィコシアニン（BD）、抗CD8ペリジニンクロロフィルタンパク質（BD）。表面染色は室温で暗所にて20分実施した。続いて、細胞を洗浄し、500μLのPBSwithout中の2％パラホルムアルデヒド（PFA）（Sigma Aldrich）で室温にて暗所で10分固定した。更なる洗浄工程の後、細胞の透過性のために10μLのPBSwithout中の2％サポニン（Carl Roth）の存在下で、1μLの抗IFN-γ-フルオレセインイソチオシアネート（BD）及び10μLの抗CD40L R-フィコエリトリン（BD）を用いて細胞内IFN-γとともに細胞内CD40Lの染色を室温にて暗所で30分実施した。続いて細胞を0.1％のPBSwithout中のサポニンで2回洗浄し、300μLのPBSwithout中の1％PFAに再懸濁させた。染色細胞は、FACS CANTOIIフローサイトメーター（BD）で分析した。この目的のために、まず初めに細胞集団をフォワードスキャター光及びサイドスキャター光にしたがって分離させた。続いてリンパ球集団をそれらのCD3の発現に関して分析した。続いて全てのCD3+細胞をCD4及びCD8タンパク質の発現に関して分析した。続いてCD4+T細胞をIFN-γ及びCD40Lの発現に関して分析した。
この目的のために、特異的Tヘルパー細胞として活性化ESAT-6/CFP-10のパーセンテージをIFN-γ及びCD40Lの発現を基準にして決定した（データは示されていない）。発現培養では、Tヘルパー細胞の持続的増殖が観察され、ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞の増加を伴った。このようにして、3−4週間後に5から18％の特異的Th細胞がエクスパンション培養で作出できた。EBV-（BZLF1）及びCMV-（pp65）特異的Th細胞の作製及び性状の決定は、それぞれEBV-及びCMV血清陽性ドナーの血液サンプルを用いることによって前述の実験手順と同様に実施した。
【００５２】
b）ex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞とESAT-6/CFP-10融合タンパク質を装荷した新鮮調製自家PBMCとの共培養
潜伏性結核症のドナーの新しく調製したPBMCを、ex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞のエクスパンジョン培養と1：1の割合で1ｘ106細胞/mLの全細胞数を用い、10μg/mLのESAT-6/CFP-10融合タンパク質の存在下及び非存在下でB細胞培養液にて共培養した（B細胞培養液：イスコフ（Iscove）の改変ダルベッコー培養液（IMDM：Lonza）、10％ヒトAB血清、6ng/mLのIL-4（Miltenyi Biotech）、50ng/mLトランスフェリン（Roche）、5μg/mLインスリン（Roche））。細胞を37℃、5％CO2下で10時間インキュベートし、各事例で2ｘ105細胞のサンプルを種々の時点（例えば0、0.5、1、2、3、4、6、8及び10時間後）で取り出した。これらのサンプルを迅速に遠心分離し、上清を廃棄して直ちにペレットを液体窒素で凍結した。更なるプロセッシングまでサンプルは-80℃で保存した。新しく調製したPBMCと自己ex vivo前活性化Th細胞との共培養におけるTh細胞の表面の活性化マーカーCD40Lの存在は、ESAT-6/CFP-10による刺激後の時間経過にしたがって予め分析した。これらの分析で、in vitroで特異的に再刺激したTh細胞はそれらの表面に一過性のCD40Lの発現を提示することが示され、CD40L発現細胞の最高数は抗原装荷APCとの共培養の6時間後に観察された（データは示されていない）。
【００５３】
c）抗原特異的活性化Th細胞の間接検出としてのRT-qPCRによるPBMCの4-1BBL mRNAの定量
peqLab peqGOLD全RNAキット（peqLab）を用いて、全RNAを細胞サンプルから単離した。DNAの夾雑は、peqGOLD DNaseIダイジェストキット（peqLab）を用いて除去した。全RNAは60μLのDEPC水で溶出させた（DEPC水：1Lの蒸留水＋1mLのジエチルピロカーボネート（Sigma）；1時間37℃でインキュベーション、続いて121℃で15分のオートクレーブ）。
cDNAへの逆転写（RT-PCR）のために、10μLの溶出RNAを10μLのRT-PCRマスターミックスと混合した。RT-PCRマスターミックスは、DEPC水に50mMの緩衝液A（緩衝液A中のTaqMan 1000 RXN Gold（Applied Biosystems））、5mM MgCl2（緩衝液A中のTaqMan 1000 RXN Gold（Applied Biosystems））、2.5 mMランダム化ヘキサマー（MWG Operons/Eurofins）、5 mM dNTP、2.5U/μLのMuLV逆転写酵素（Applied Biosystems）、1U/μLのRNase阻害剤（Applied Biosystems）を含んでいる。逆転写は、23℃で15分、95℃で5分及び42℃で30分実施し、PTC-200ペルティヤー（Peltier）サーモサイクラー（MJ Research）を用いた。続いて以下を含む24μLのqPCRマスターミックスを6μLの前記作製cDNAと混合した：DEPC水中の50mM緩衝液A、6.875mM MgCl2、0.308μM 4-1BBLフォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCG（biomers）（配列番号：1で示す）、0.308μM 4-1BBLリバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAAC（biomers）（配列番号：2で示す）、0.2525μM 4-1BBLプローブFAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR、TIB Molbiol(配列番号:3で示す)、0.308μM GAPDHフォワードプライマーGAAGGTGAAGGTCGGAGTC（biomers）（配列番号：4で示す）、0.308μM GAPDHリバースプライマーGTAAACCATGTAGTTGAGGTC（biomers）（配列番号：5で示す）、0.2525μM GAPDHプローブYAK-TCATTGATGGCAACAATATCCACT-TMR（TIB Molbiol）（配列番号：6に示す）、0.003125U/μLのTaqGoldポリメラーゼ。qPCRの温度プロフィールは、95℃で10分の工程とその後に続く95℃で15秒及び60℃で1分から成る50サイクルを含み、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて実施した。
THP-1細胞（構成的に4-1BBL mRNAを発現する）を陽性コントロール及び参照として供した。前記をこの試験でサンプルと同じ態様で処理した。その後、以前に増幅させた同様なグリセロアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）を参照遺伝子として用い、4-1BBL mRNAの相対的定量を以下の式にしたがって実施した：
R＝2-ΔΔCq
ΔΔCq＝[(Cq4-1BBL(S)−CqGAPDH(S))]−[(Cq4-1BBL(NK)−CqGAPDH(NK))]
結果は、マーカーmRNA生成の刺激サンプル対対応する陰性コントロールの比として提供され、既にGAPDHで正規化されている。分析は各サンプルについてトリプリケートで実施した。
これらの分析により、ESAT-6/CFP-10タンパク質装荷自家PBMCと共培養したESAT-6/CFP-10-特異的前活性化Th細胞は、非装荷PBMCと共培養したものと比較して、測定可能な4-1BBL mRNA生成の増加を誘導することが示された（図3）。
【実施例２】
【００５４】
ESAT-6/CFP-10タンパク質装荷PBMCの共培養における4-1BBリガンドmRNA生成誘導とex vivoエクスパンドESAT-6/CFP-10タンパク質特異的Th細胞数との相関性
ヒト型結核菌潜伏感染対象者のESAT-6/CFP-10特異的Th細胞を、実施例1の項a）に記載したようにex vivoでエクスパンドし、続いて新しく調製した自家PBMCと実施例1の項b）に記載したように共培養した。このプロセスで、1ｘ106のPBMCと共培養したESAT-6/CFP-10特異的Th細胞の数は、一続きの半対数的濃度で定量された（濃度段階：1ｘ106のPBMCにつき0、117、370、1170、3700、11700、37000、117000の前活性化Th細胞）。インキュベーションから0、0.5、1、2、3、4、6、8及び10時間後に2ｘ105の細胞を取り出し、5分間300gでペレットにし、前記ペレットを直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。全RNAを実施例1のc）のプロトコルにしたがって単離し、4-1BBL mRNAの生成に関してRT-qPCRで分析した。
これらの分析では、前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞の数とマーカーのシグナル強度（4-1BBL mRNAの生成の増加）との間に明瞭な相関性が観察された（図4）。
【実施例３】
【００５５】
非刺激及びESAT-6/CFP-10刺激PBMCと自己のex vivo前活性化ヒト型結核菌ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞との共培養における4-1BBL及びIFN-γ mRNA生成の誘導
ヒト型結核菌潜伏感染患者のESAT-6/CFP-10特異的Th細胞を、実施例1のa）に記載したようにex vivoでエクスパンドし、続いて新しく調製した自家PBMCと実施例1のb）に記載したように共培養した。このプロセスで、50,000のex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞を1ｘ106のPBMCと共培養した。0から32時間にわたって2時間の間隔で、各事例において2ｘ105の細胞を培養サンプルから取り出し、5分間300gでペレットにし、前記ペレットを直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。全RNAを実施例1のc）のプロトコルにしたがって単離し、4-1BBL mRNAの生成に関してRT-qPCRで分析した。加えて、サイトカインIFN-γのmRNAも実施例1のc）に記載したように分析した（IFN-γはAPCの特異的T細胞との抗原特異的接触後にT細胞によって放出される）。この目的のために、以下のプライマープローブ系を用い、ここでも同様にGAPDHを参照遺伝子として用いた：IFN-γフォワードプライマーGTGGAGACCATCAAGGAAGACAT（biomers）（配列番号：7で示す）；IFN-γリバースプライマーGGCGACAGTTCAGCCATCA（biomers）（配列番号：8で示す）；IFN-γプローブFAM-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-TMR（配列番号：9で示す）。
ヒト型結核菌潜伏感染者では、ヒト型結核菌特異的Th細胞がPBMC混合物に存在し、この細胞はまた部分的にESAT-6/CFP-10に対して特異性を示す。対照的に、活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞は、急性病期に一過性に出現し、そのときだけPBMC混合物で見出される。力価測定によれば、PBMCへのex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10-特異的Th細胞の添加は急性結核症感染を模倣する。これらの分析は、4-1BBL mRNAの生成増加とは別に、IFN-γmRNAの相対的増加が、ex vivo前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞と潜伏性結核症のドナーの自家PBMCとの共培養で検出できることを示している（図5A及び5B）。
【実施例４】
【００５６】
ESAT-6/CFP-10装荷PBMCとESAT-6/CFP-10特異的活性化Th細胞又は非特異的前活性化Th細胞との共培養における4-1BBL mRNA生成の誘導
RTT方法の抗原特異性を証明するために、ESAT-6/CFP-10タンパク質の存在下及び非存在下で潜伏性結核症ドナーのPBMCを、前活性化ESAT-6/CFP-10特異的活性化Th細胞又はESAT-6/CFP-10非特異的活性化Th細胞で刺激し、ESAT-6/CFP-10刺激培養の4-1BBL生成の相対的増加を、RT-qPCR技術を用いて種々の時点で非刺激細胞培養と比較して決定した。この目的のために、Th細胞を実施例1のa）に記載したように単離し、そのようにして入手したTh細胞を市場で入手できるT細胞エクスパンダービーズ（Dynabeads, Invitrogen）と2：1の割合で14日間R5培養液にて37℃及び5％CO2下の湿潤雰囲気で培養した。T細胞の活性化は、CD40Lの発現をモニターすることによってフローサイトメトリーで決定した。この分析で、エクスパンダービーズによる刺激から14日後に40％を超えるTh細胞がCD40をそれらの表面に提示することが証明された（データは示されていない）。
続いて、10μg/mLのESAT-6/CFP-10の存在下及び非存在下で、1ｘ106/mLの新しく調製した自家PBMCを、各事例で0、210、6636又は66360のex vivo前刺激ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞（実施例1のa）の記載にしたがって作製）又は非特異的活性化Th細胞（実施例1のb）にしたがって作製）と共培養した。0、0.5、1、2、3、4、6及び8時間後に、各事例で2ｘ105の細胞を共培養から取り出し、実施例1のc）に記載したようにRT-qPCRで4-1BBL mRNAの生成に関して分析した。
これらの実験で、特異的刺激共培養サンプルと非刺激共培養サンプルと比較したとき、前活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞の数と4-1BBL発現の相対的増加との間で正の相関性が示された。対照的に、非特異的前活性化Th細胞との共培養サンプルでは、4-1BBLのmRNA生成の相対的増加の顕著な低下が観察された（図6）。
【実施例５】
【００５７】
ESAT-6/CFP-10、BZLF1又はpp65の存在下及び非存在下の、ヒト型結核、EBV及びCMV陽性ドナーから選択したPBMCとex vivo前活性化ヒト型結核菌- ESAT-6/CFP-10-、EBV BZLF1-又はCMV-pp65-特異的Th細胞との共培養における4-1BBL mRNA生成誘導の特異性
さらに別の実験で、（i）ヒト型結核菌ESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1及びCMV pp65タンパク質のPBMCへの装荷自体が4-1BBL mRNAの非特異的活性化を誘導するか否か、及び（ii）RTTマーカーの誘導は、APCと活性化Th細胞との抗原特異的態様における相互作用により生じるか否か、が分析された。この目的のために、ヒト型結核菌に潜伏感染したEBV-及びCMV-血清陽性ドナーのTh細胞を単離し、実施例１のa）に記載されたようにex vivoでエクスパンドし前活性化させた。続いて、Ex vivoでエクスパンドした70000のTヘルパー細胞を10μg/mLのESAT-6/CFP-10、BZLF-1又はpp65の存在下及び非存在下で、各事例で1ｘ106 PBM/mlの実施例１のｂ）に記載されたように新たに調製した自家PBMCと共培養した。0、0.5、1、2、3、4、6 、8及び10時間後に、各事例で2ｘ105の細胞を共培養から取り出し、5分間300gでペレットにし、前記ペレットを直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。全RNAを実施例1のc）のプロトコルにしたがって単離し、4-1BBL mRNAの生成についてRT-qPCRで分析した。
これらの分析によって、APC含有PBMCの多様な刺激抗原による刺激は、4-1BBL mRNAの非特異的活性化を誘引しないことが証明された。加えて、これらの分析は、APCの4-1BBL mRNAの生成増加はもっぱら活性化Th細胞とAPCとの抗原特異的接触の後で生じることを立証した。ヒト型結核菌特異的Th細胞を自家PBMCと共培養した場合、それらは、ESAT-6/CFP-10の存在下でのみ4-1BBL mRNAの生成を誘引したが、BZLF1若しくはpp65の存在下又は抗原の非存在下では誘引しなかった（図7及び8a）。加えて、in vitro前活性化BZLF1-及びpp65-特異的Th細胞は、それぞれ自家PBMC（対応する活性化T細胞の対応する標的抗原構造物を既に装荷されていた）の培養においてのみ4-1BBL mRNA生成の増加を誘導した（図8b及び8c）。
さらにまた、実行した分析は、4-1BBL mRNAの誘導効率とPBMCに存在する抗原特異的CTLの数は逆比例することを示している。TB患者の血中には、ESAT-6/CFP-10特異的CTLは通常非常にわずかしか見出すことができないが、CMV-及び特にEBV-血清陽性対象者では、それぞれ既存のメモリーT細胞の顕著な割合又は支配的割合が細胞傷害性T細胞（CTL）の亜集団に帰属する。ESAT-6/CFP-10特異的前活性化Th細胞とESAT-6/CFP-10装荷PBMCとの共培養では、最強の4-1BBL活性化が観察され、BZLF1特異的前活性化Th細胞とBZLF1装荷PBMCとの共培養ではもっとも低い4-1BBLの活性化が観察された。この発見は、シグナル提供APCの特異的CTLによる溶解と説明できよう。
【実施例６】
【００５８】
BZLF1装荷PBMCとex vivo活性化BZLF1-特異的Th細胞との共培養における4-1BBリガンドmRNA生成誘導のブロッキング抗MHCクラス1抗体の添加による調節
ヒト型結核菌感染はもっぱらTh細胞によって制御される。加えて、細胞傷害性T細胞（CTL）もまた、病原体感染細胞の認識及び破壊によってこの病原体との戦いに役割を果たす。ある種の感染（すなわちエプスタイン-バールウイルス（EBV）感染）では、CTLは支配的なTリンパ球集団である。本発明の方法の場合、いわゆる逆T細胞技術（RTT）により、CTLもまた病原体特異的標的構造物を装荷されたAPCを（これらがAPCのマーカー（RTTマーカー）を発現する前であっても）認識しこれを破壊することが可能である。それによって可能なシグナル提供APCの数、したがって試験の感度が低下する。RTT方法の感度に対する細胞傷害性T細胞の影響を精査するために、in vitro前活性化BZLF1特異的Th細胞（実施例1のa）にしたがって作製）とBZLF1装荷自家PBMCとの共培養を用いた実験を、MHC-1ブロッキング抗体（10μg/mL）（HLA ABC antibody, Cat. No. MCA81EL；クローンW6/32 AbD Serotec）の存在下及び非存在下で実施例1のb）に記載したように実施した。抗原提示細胞上のMHC-1分子と抗体との結合のために、CTLによるそれらの認識は妨げられ、結果としてタンパク質装荷APCの殺滅は発生しない。1ｘ106細胞/mLをBZMで共培養した（1ｘ106のPBMCにつき70000のBZLF1-特異的前活性化Th細胞を用いた）。0、1、2、3、4、6 、8及び10時間の時点で、各事例で2ｘ105/サンプルの細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。続いて、実施例1のc）に記載したように、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで分析した。
MHCクラス1ブロッキング抗体を用いることによって、これらの実験で、BZLF1-特異的Th細胞とBZLF1-装荷PBMCとの共培養で4-1BBL mRNAの生成を顕著に増加させることができた（図9）。
【実施例７】
【００５９】
活性化Th細胞の間接的検出のための、活動性及び潜伏性結核症患者並びに健常ドナーのPBMCにおける4-1BBリガンドmRNA生成の特異的誘導の分析
本方法（RTT方法）が、活動性結核症の患者の同定並びに潜伏性結核症の患者及び健常ドナーとの区別のために有用であるか否かを究明するために、ヘパリン化注射筒で以下の各事例において3人から血液を取り出して（（i）ヒト型結核菌に感染していない健常ドナー（p012、p010、p008）、（ii）潜伏性結核症の健常ドナー（p009、p006、p005）、（iii）活動性結核症のために本分析前の6カ月間に医薬で治療されたドナー（p013、p014、p003）、及び（iv）原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナー（p001、p004、p007））、それらからPBMCを新しく単離した。続いて各事例で、1ｘ106細胞/mLを10μg/mLのESAT-6/CFP-10と37℃及び5％CO2下の湿潤雰囲気でインキュベートした。加えて、選択したドナーのPBMCをコントロール抗原、HIV p24（キャプシド抗原）（健常：p008、潜伏性：p005及びp006、治療：p003、活動性：p007及びp001）と一緒に又はウシ血清アルブミン（p001）と一緒に、又はさらに別の陰性コントロールとして一切の抗原の非存在下でインキュベートした。インキュベーションから0.5、1、2、3、4、6 、8及び10時間後に、各事例で2ｘ105の細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。続いて、実施例1のc）に記載したように、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで分析した。
健常ドナーのPBMCではESAT-6/CFP-10による刺激は4-1BBL mRNAの誘導を生じないことが示された（図10a）。同様に、ヒト型結核菌潜伏感染対象者（図10b）又は活動性結核症のために分析前の6カ月間に治療を受けた対象者（図10c）のPBMCでも、4-1BBL mRNAの誘導は測定できなかった。原因療法の開始前又は開始後間もない急性期症状を有する対象者のPBMCの場合だけ、ESAT-6/CFP-10による刺激後に、非刺激細胞培養と比較して特異的に刺激した細胞培養で4-1BBL mRNAの顕著な誘導を観察することができた（図10d）。無関係の抗原BSA及びp24によるPBMCの刺激は4-1BBL mRNAの誘導増加をもたらさなかった（図10e）。
【実施例８】
【００６０】
ツベルクリンPPDによる、急性及び潜伏性結核症ドナー並びに健常対象者のPBMCにおける4-1BBL mRNA生成の誘導
急性結核症患者のPBMCの4-1BBL mRNA誘導がより広い抗原域を用いることによって増加し得るか否かを究明するために、活動性及び潜伏性結核症患者並びに健常ドナーの各事例においてヘパリン化注射筒で血液を取り出し、それらからPBMCを新しく単離した。続いて、1ｘ106細胞/mLを10μg/mLのESAT-6/CFP-10又はツベルクリンPPD（Statens Serum Institut, Denmark）と37℃及び5％CO2下の湿潤雰囲気でインキュベートした。加えて、PBMCのアリコートを、陰性コントロールとして抗原の非存在下で、さらに4-1BBL mRNA生成の誘導能力についての陽性コントロールとして各々の事例で1μg/mLのホルボル-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）（Sigma Aldrich）及びイオノマイシン（Sigma Aldrich）と一緒にインキュベートした。インキュベーションから0、2、4、6 、8及び10時間後に、2ｘ105の細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。続いて、実施例1のc）に記載したように、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで分析した。
ツベルクリンPPDによる刺激は、ESAT-6/CFP-10よりも何倍も高い4-1BBL mRNAの誘導を急性結核症の患者のPBMCで誘引することを示すことができた（図11a、上図）。対比して、潜伏感染及び健常対象者のPBMCでは、ツベルクリンPPDとともにESAT-6/CFP-10による刺激後に4-1BBL mRNA生成誘導の顕著な増加は観察されなかった（図11b及び11c上図）。加えて、3通りのドナーの全てのPMA/イオノマイシン刺激PBMCアリコートで、非刺激PBMCアリコートと比較して、4-1BBL mRNA生成の顕著な増加が観察され、したがって、このRTTマーカーの生成についてPBMCの機能性が立証された（図11a−c、下図）。
【実施例９】
【００６１】
PMA/イオノマイシン又はPGE2/抗CD40の組合せによる刺激後の健常ドナーのPBMCにおける4-1BBリガンド発現誘導のタイムコース
活性化T細胞を検出する本発明のRTT方法のための陽性コントトールを同定するために、PMA/イオノマイシン又はPEG2/抗CD40の組合せが、4-1BBL mRNA発現の非特異的誘導を誘引するか否か又はどの程度誘引するかを究明した。この目的のために、健常ドナーの1ｘ106PBMC/mLを、各事例で1μg/mLのPMA及びイオノマイシン又は5μg/mLのPEG2（Alexis Biochemicals）及び2μg/mLのCD40抗体（LEAF-抗CD40; Biozol）の組合せとともにインキュベートした。陰性コントロールとして非刺激PBMCを供した。インキュベーションから0、2、4、6及び8時間後に、5ｘ105の細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を-80℃で保存した。続いて、実施例1のc）に記載したように、4-1BBL mRNAの含有量をRT-qPCRで分析した。
これらの分析で、PMA及びイオノマイシン（図12a）は、PGE2及びCD40抗体の組合せ（図12b）よりも顕著に強い非特異的誘導物質であることが示された。
【実施例１０】
【００６２】
in vitro前活性化ヒト型結核菌特異的Th細胞と自家PBMCとの、非刺激及びESAT-6/CFP-10刺激共培養における、4-1BBL mRNA生成の相対的誘導の種々の参照遺伝子を用いた比較測定
本発明のRTT方法に適切な参照遺伝子を同定するために、参照遺伝子GAPDH、huP0及びPGBDを4-1BBL mRNA量の正規化のために実施例3に記載したcDNAサンプルで対応するプライマー/プローブ系を用いて増幅させた。この目的のために、遺伝子増幅のためのプライマー/プローブ系を実施例1のc）に記載のRT-qPCR条件にしたがって用いた。
この目的のために以下のプライマー/プローブ系を用いた：huP0フォワードプライマーGTGGTGCTGATGGGCAAGA（biomers）（配列番号：10で示す）；huP0リバースプライマーGCAGCAGTTTCTCCAGAGCTG（biomers）（配列番号：11で示す）；huP0プローブFAM-ACCATGATGCGCAAGGCCATCC-TMR（TIB Molbiol）、（配列番号：12で示す）；PBGDフォワードプライマーCCAGCTCCCTGCGAAGAG（配列番号：13で示す）；PBGDリバースプライマーCACTGAACTCCTGCTGCTCG（biomers）（配列番号：14で示す）；PBGDプローブFAM-CCCAGCTGCAGAGAAAGTTCCCGC-TMR（TIB Molbiol）（配列番号：15で示す）；分析は、GAPDH、huP0及びPBGDを参照遺伝子として、さらに非刺激コントロールをカリブレーターとして用い、2-ΔΔCq方法にしたがって実施した。
これらの分析は、4-1BBL mRNAの含有量は、3つの参照遺伝子のいずれを用いても最終結果に顕著な影響を与えることなく正規化できることを示した（図13）。3つの参照遺伝子で正規化すると4-1BBL mRNAの誘導の強さの違いが観察されたが、傾向は比較可能であった。
【実施例１１】
【００６３】
ESAT-6/CFP-10-装荷PBMCとex vivoエクスパンドESAT6/CFP-10-特異的Th細胞の共培養における4-1BBリガンド発現のフローサイトメトリーによる決定
in vitroエクスパンド活性化ESAT-6/CFP-10特異的Th細胞（実施例1のa）にしたがって作製）を自家PBMCと1：1で混合し、組換えESAT-6/CFP-10の存在下及び非存在下でR5中の1ｘ106細胞/mLの濃度で28時間共培養した。最後の26時間に、タンパク質分泌をブレフェルジンAによって阻害した。続いて、B細胞の4-1BBLのタンパク質発現を実施例1のa）のプロトコルにしたがって細胞内標識し、続いてフローサイトメトリーによって決定した。表面染色のためには抗CD19 R-ピコエリトリンシアニン7（PerCy7）（BD）の5μLを、4-1BBLの細胞内染色のためには20μLの抗4-1BBL PE (BD)を用いた。
これらの分析によって、非刺激B細胞は非常に高い含有量の細胞内既存4-1BBLを既に示し、したがってESAT-6/CFP-10による刺激後のタンパク質レベルでの4-1BBL発現の更なる誘導が検出できないことが示された（図2）。これらの分析により、タンパク質レベルでのT細胞誘導成熟プロセスの検出は、変動性で部分的に非常に高い含有量のRTTマーカーのせいで、制限付きではあるがフローサイトメトリー又はELISA及びELISpot技術を用いることによってのみ可能であることが明らかにされた。
【実施例１２】
【００６４】
RTT方法のためのRT-qPCR正規化用参照遺伝子の同定。細胞内発現が生物学的変化によって引き起こされない、多様な反応混合物における発現レベルの変動はしたがって修正されるであろう。
臨床サンプル分析のためにRTT方法において適切な参照遺伝子を同定するために、多様な対象者のグループ由来のPBMCサンプルを異なる3つの条件下で刺激し、参照遺伝子に対するRT-qPCRの結果を対応する非刺激サンプルの結果と比較した。2人の活動性TB感染患者、1人の潜伏性TB感染者並びに1人の健常対象者及び1人の健常BCGワクチン接種対象者のヘパリンナトリウム血液サンプルを処理した。この目的のために、PBMCを実施例1のa）に記載したように単離した。続いて6mLにつき1ｘ106のPBMCをB細胞培養液中で刺激した。刺激は、ESAT6/CFP10（10μg/mL）、ツベルクリンPPD（10μg/mL）、非特異的にPMA/イオノマイシン（各事例1μg/mL）により、37℃及び5％CO2下の湿潤雰囲気で6時間にわたって実施した。インキュベーション後、細胞を10分間300gでペレットにし、上清を廃棄し、ペレットを1％のβ-メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液（QIAGEN）に溶解し、直ちに液体窒素で凍結させた。RNAは、DNase消化を含むRNeasyミニキット（QIAGEN）を製造業者の指示にしたがって用いてカラムで単離した。cDNA合成は、QuantiTect 逆転写キット（QIAGEN）を用いて実施した。qPCRは、Custom TaqMan(商標)遺伝子発現アレイ96ウェルファストプレート（Applied Biosystems）及びTaqManファストユニバーサルマスターミックス（Applied Biosystems）を用いABI StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で製造業者の指示にしたがって実施した。
RT-qPCR用に良好に適合させた参照遺伝子の遺伝子発現は、全ての適用実験条件下及びそこで意図される刺激下で一定に維持されるべきである。加えて、参照遺伝子の発現レベルは標的遺伝子の発現レベルと対応するべきである。同様に、qPCR効率は標的遺伝子の1つと同様であるべきである。5つのサンプル全てについて、結果を比較し分析した。結果を図14に示す。種々の刺激条件に対するRTTマーカー遺伝子TNFSF9及びIFNGの発現はCq23からCq30の間で検出された(データは示していない)。遺伝子TAF1A及びHMBSは、4-1BBL（TNFSF9とも称される）及びIFN-γ（IFNGとも称される）のRTTマーカーRNAのための参照遺伝子として適切であり、それは、全ての刺激条件についての定常的発現のため並びにCq28−Cq29における発現レベルのため及び標的遺伝子の1つと比較して同様なRT-qPCR効率のためである（データは示されていない）。より高い発現レベルを有するまた別のマーカーとしては、HPRT1又はRPLP0が適切な参照遺伝子と考えることができる。
総合すればこのようにして、発現レベルが全実験条件下で一定に維持されるいくつかの適切な参照遺伝子がこれらの分析で同定できた。RTTマーカー遺伝子の発現レベルに応じて、TAF1A、HMBSは低発現のために、HPRT1は中間的発現のために、またRPLP0は高い発現のために参照遺伝子として用いることができる。マーカーTNFSF9及びIFNGのためには、 TAF1Aが参照遺伝子として適切である。
【実施例１３】
【００６５】
RTTマーカーのバックグラウンド発現並びに活動性TB感染者及び健常者間の識別のための閾値の決定のための、非刺激サンプルと比較した、種々の患者に由来するツベルクリンPPD刺激PBMCにおける4-1BBL（TNFSF9とも称される）発現の測定
健常対象者及び潜伏性TB患者におけるRTTマーカー4-1BBL（TNFSF9とも称される）の平均的バックグラウンド発現についての情報を得るために、21人の対象者の血液で本発明のRTT方法を実施した。この目的のために、PBMCを実施例1のa）に記載したように単離した。サンプルにつき、5ｘ106のPBMCをB細胞培養液中で、10μg/mLのツベルクリンPPDの存在下及び非存在下で37℃及び5％CO2下の湿潤雰囲気で6時間インキュベートした。刺激はデュープリケートで実施し、それぞれ別個に処理した。インキュベーション後に、細胞をペレットにし、40mMのDTTを含むRLT緩衝液（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）中で溶解させ、溶解物を直ちに液体窒素で凍結した。RNAは、DNase消化を含むRNeasyミニキット（QIAGEN）を製造業者の指示にしたがって用いてカラムで単離した。cDNA合成は、製造業者の指示にしたがいQuantiTect 逆転写キット（QIAGEN）により各事例で1μgのRNAを用いて実施した。qPCRは、10μLの全反応体積中に1μLのcDNAを用い、TaqMan(商標)ファストユニバーサルマスターミックス（Applied Biosystems）を用いることによって実施した。マスターミックスは以下の組成を有していた：300nMのNFSF9フォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCG（配列番号：1で示す）；300nMのTNFSF9リバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAAC（配列番号：2で示す）；200nMのTNFSF9プローブFAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR（配列番号：3で示す）；1ｘTaqMan(商標)ファストユニバーサルPCRマスターミックス、1ｘTaqMan(商標)遺伝子発現アッセイTAF1A VIC色素標識MGBプローブ（プライマー限定）（Applied Biosystems）。qPCRの温度プロフィールは、95℃で20秒の変性、続いて95℃で3秒及び60℃で30秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて実施した。21サンプルについて比較Cq分析（2-ΔΔCq）の各事例で2つの別個の刺激から得られた結果の平均値は図15に示されている。
これらの分析は、刺激後のRTTマーカーTNFSF9発現の相対的増加は、潜伏性TB対象者、健常個体及びBCGワクチン接種健常個体では2倍未満又はせいぜい2倍として認められたが、一方、活動性TB感染患者は2倍を超える発現増加を有することを示した。したがって、2-ΔΔCq＝2.0の予備的閾値を決定することができた。それぞれ活動性感染TB患者と健常個体又は潜伏性TB対象者との間の弁別はしたがってRTT方法を用いれば可能である。
【実施例１４】
【００６６】
代替の部分合成無血清培養液によるIFN-γ（IFNGとも称される）発現の改善
IFN-γ（IFNGとも称される）シグナルが、代替細胞培養液を用いることによって増加させ得るか否かを調査するために、いくつかの部分合成培養液を試験した。通常的に用いられるB細胞培養液はIL-4を含む（IL-4はIFGNシグナルの阻害をもたらし得る）。加えて、前記培養液は自家製AB血清を含み、それは標準的条件（すなわち品質が変動しない一定の条件）が場合によって伴われ得ないことを意味する。潜伏性TBの3人の対象者及び3人の健常個体の血液サンブルを用いて、本発明のRTT方法を実施した。この目的のために、PBMCを実施例1のa）に記載したように単離した。サンプルにつき、5ｘ106のPBMCを2．5mLの種々の細胞培養液で、それぞれ10μg/mLのツベルクリンPPDの存在下及び非存在下で37℃及び5％CO2下の湿潤雰囲気で6時間インキュベートした。以下の培養液を試験した：B細胞培養液（BZM+）、IL-4を含まないB細胞培養液（BZM-）、LONZAの無血清UltraCULTURETM培養液（Ultra）及びInvitrogenのAIM V培養液（AIMV）。細胞溶解、RNA抽出、cDNA合成及びqPCRは実施例13に記載したように実施した。発現の増加はIFGN及び4-1BBL（TNFSF9とも称される）について判定した（図16及び図17を参照されたい）。IFNGのマスターミックスは以下の組成を有していた：300nMのIFNGフォワードプライマーGTGGAGACCATCAAGGAAGACAT（biomers）（配列番号：7で示す）；300nMのIFNGリバースプライマーGGCGACAGTTCAGCCATCA（biomers）（配列番号：8で示す）；200nMのIFNGプローブFAM-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-TMR（TIB MOLBIOL）（配列番号：でに示す）；1ｘTaqMan(商標) ファストユニバーサルPCRマスターミックス、1ｘTaqMan(商標)遺伝子発現アッセイTAF1A VIC色素標識MGBプローブ（プライマー限定）（Applied Biosystems）。TNFSF9のためのマスターミックスは以下の組成を有していた：300nMのTNFSF9フォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCG（biomers）（配列番号：1で示す）；300nMのTNFSF9リバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAAC（biomers）（配列番号：2で示す）；200nMのTNFSF9プローブFAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR（TIB MOLBIOL）（配列番号：3で示す）；1ｘTaqMan(商標) ファストユニバーサルPCRマスターミックス、1ｘTaqMan(商標)遺伝子発現アッセイTAF1A VIC色素標識MGBプローブ（プライマー限定）（Applied Biosystems）。qPCRの温度プロフィールは、95℃で20秒の変性、続いて95℃で3秒及び60℃で30秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で実施した。
IFNG発現の相対的増加（2-ΔΔCq）は、刺激後に通常のBZM+よりもUltraCULTURETM及びAIM V培養液で顕著に強くなった。B細胞培養液からIL-4を除去（BZM-）してもシグナル増強は生じなかった（図16）。UltraCULTURETMでの刺激では、TNFSF9発現の相対的増加は、潜伏性TB患者及び健常対象者のサンプルでは検出できなかった。対照的に、AIM V培養液の刺激は、B細胞培養液及びUltraCULTURETM培養液と比較したとき、TNFSF9 RNA発現の強い非特異的誘導をそれぞれもたらした（図17）。
これらの分析は、培養液の選択が、RTTマーカー遺伝子の相対的発現に対して強い影響を有し得ることを示している。LONZAの無血清UltraCULTURETM培養液の使用は、潜伏性TB対象者のサンプルでIFNGシグナルの顕著な強化をもたらし、RTTマーカー遺伝子TNFSF9のバックグラウンド発現は一定であった。
【実施例１５】
【００６７】
三重qPCRを用い参照遺伝子に対し同時正規化することによる2つのRTTマーカー遺伝子の同時検出
本発明のRTT方法の簡易化及び実用性の改善とともに適用範囲の拡大のために、三重RT-qPCRを開発した。三重RT-qPCRは、1つの反応サンプルで、RTTマーカー4-1BBL（TNFSF9とも称される）及び潜伏性TB感染検出のためのマーカーIFN-γ（IFNGとも称される）の同時検出を可能にし、さらにまた別に参照遺伝子を用いることによりシグナルの正規化を可能にする。潜伏性TB対象者のサンプルを実施例12に記載したように本発明の方法にしたがって処理した、qPCRは、10μLの全反応体積中に1μLのcDNAによりTaqMan(商標)ファストユニバーサルPCRマスターミックス（Applied Biosystems）を用いて実施した。前記マスターミックスは以下の組成を有していた：150nMのTNFSF9フォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCG（biomers）（配列番号：1で示す）；150nMのTNFSF9リバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAAC（biomers）（配列番号：2で示す）；200nMのTNFSF9プローブFAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-BBQ（TIB MOLBIOL）（配列番号：3で示す）；300nMのIFNGフォワードプライマーGTGGAGACCATCAAGGAAGACAT（biomers）（配列番号：7で示す）；300nMのIFNGリバースプライマーGGCGACAGTTCAGCCATCA（biomers）（配列番号：8で示す）；200nMのIFNG Sonde BoTMR-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-BBQ（TIB MOLBIOL）（配列番号：9で示す）；1ｘTaqMan(商標)ファストユニバーサルPCRマスターミックス、1ｘTaqMan(商標)遺伝子発現アッセイTAF1A VIC色素標識MGBプローブ（プライマー限定）（Applied Biosystems）。qPCRの温度プロフィールは、95℃で20秒の変性、続いて95℃で3秒及び60℃で30秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で実施した。図18は、潜伏性TB対象者の1つのサンプルの比較Cq分析（2-ΔΔCq）の結果を示す。三重qPCRの結果（左）及び比較として対応する二重qPCRの結果（右）が提供される。二重qPCRのサンプルは実施例14に記載したように調製した。
これらの比較分析は、RTTマーカーの検出は原理的に参照遺伝子による複数の値の同時正規化により多重反応が可能であることを示している。
【実施例１６】
【００６８】
非刺激サンプルと比較した2人の対象者のツベルクリンPPD刺激PBMCにおける本発明のRTTのためのさらに別のマーカー遺伝子の発現決定
本発明のRTT方法のより高い感度を達成するために、SYBRグリーンシステムを用いさらに別のマーカーをRT-qPCRで試験した。この目的のために、各事例で1人の潜伏性TB患者及び1人の健常対象者のサンプルを実施例12に記載したように本発明の方法にしたがって処理した、qPCRは、20μLの全反応体積中に1μLのcDNAを用いブリリアントIIIウルトラ-ファストSYBRグリーンQPCRマスターミックス（Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix）（Applied Biosystems）で実施した。前記マスターミックスは以下の組成を有していた：300nMのフォワードプライマー、300nMのリバースプライマー、1ｘのブリリアントIIIウルトラ-ファストSYBRグリーンQPCRマスターミックス、300 nMの参照色素。以下のプライマーを用いた：FCGR1A/B/CフォワードプライマーGAAGGGGTGCACCGGAA（TIB MOLBIOL）（配列番号:16で示す）；FCGR1A/B/CリバースプライマーCTCACGGGGAGCAAGTGG（TIB MOLBIOL）（配列番号:17で示す）；CXCL9フォワードプライマーGAGTGCAAGGAACCCCAGTAGT（配列番号:18で示す）；CXCL9リバースプライマーGGTGGATAGTCCCTTGGTTGGT（配列番号:19で示す）；CXCL10フォワードプライマーTCCACGTGTTGAGATCATTGC（配列番号:20で示す）；CXCL10リバースプライマーTCTTGATGGCCTTCGATTCTG（配列番号:21で示す）；CXCL11フォワードプライマーCAAGGCTTCCCCATGTTCA（配列番号:22に示す）；CXCL11リバースプライマーCCCAGGGCGTATGCAAAGA（配列番号:23で示す）（全てのCXCLプライマーは以下の学位論文に由来する：Theresa Knoblach, 2010, Das Cytomegalievirus IE1-Protein als Regulator des humanen Transkriptoms und Zielstruktur RNAi-basierter Therapiestrategien, University of Regensburg）。qPCRの温度プロフィールは、95℃で3分の変性、続いて95℃で5秒及び60℃で10秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で実施した。比較Cq分析（2ΔCq）の結果は図19において両サンプルについて提供される。
潜伏感染TB患者及び健常個体の刺激及び非刺激サンプルにおけるこの比較分析はそれぞれ、これらの遺伝子が潜伏性TBの検出のためのマーカーとして適切であり得ることを示している。
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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