(57)【要約】  本発明は、Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質における変異を検出することによって、又はＲＴＫ及び／又はそれらのリガンドの過剰発現を検出することによって、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に感受性でない腫瘍を識別する予後予測的方法に関する。該方法を実行するためのキットもまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法であって、Ｋ-ｒａｓ変異の有無を決定することを含んでなり、これによりＫ-ｒａｓ変異の存在は患者が前記Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に応答しないことを示す方法。
【請求項２】
腫瘍がＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に応答するか決定する方法であって、前記腫瘍の試料において変異体Ｋ-ｒａｓタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含んでなり、変異体Ｋ-ｒａｓタンパク質又は遺伝子の存在は腫瘍がＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に応答しないことを示す方法。
【請求項３】
前記Ｋ-ｒａｓ変異が活性化変異である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｋ-ｒａｓ変異が、Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；及びＧ１３Ｄの少なくとも一つである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂ-Ｒａｆ阻害剤が特異的Ｂ-Ｒａｆキナーゼ阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｋ-ｒａｓ変異の存在が、変異を有すると疑われる前記腫瘍からのＫ-ｒａｓ核酸、又はそれらの断片を増幅し、前記増幅された核酸の配列を決定することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｋ-ｒａｓ変異の存在が、変異を有すると疑われる前記腫瘍からのＫ-ｒａｓ核酸、又はそれらの断片を増幅し、増幅された核酸の電気泳動移動度を対応する野生型のＫ-ｒａｓ核酸又は断片の電気泳動移動度と比較することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
患者が特異的Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答であるか予測する方法であって、患者の腫瘍におけるＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することを含んでなり、Ｋ-ｒａｓ変異がコドン１２又はコドン１３にあり；またＫ-ｒａｓ変異が存在する場合、患者は特異的Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答であると予測される方法。
【請求項９】
腫瘍におけるＫ-ｒａｓ変異の有無の決定が、腫瘍からのＫ-ｒａｓ核酸の増幅及び増幅された核酸の配列の決定を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍におけるＫ-ｒａｓ変異の有無の決定が、変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドに特異的に結合する薬剤を用いて腫瘍の試料における変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドを検出することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｋ-ｒａｓ変異が、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ及びＧ１３Ｄから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｋ-ｒａｓ変異体遺伝子又はタンパク質を検出することに特異的である材料、及びＢ-Ｒａｆ変異体遺伝子又はタンパク質を検出することに特異的である材料を含んでなる請求項１に記載の方法に使用可能なキット。
【請求項１３】
Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別することに用いる指示を更に含んでなる請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記患者が肺又は結腸直腸癌を有する請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
乳房、肺、結腸、卵巣、甲状腺、黒色腫又は膵臓腫瘍を分類する方法において、腫瘍試料を得る工程；試料における（ｉ）Ｂ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ変異体をコードする遺伝子及び（ｉｉ）ｋ-Ｒａｓ変異体をコードする遺伝子の発現又は活性を検出する工程を含んでなる方法。
【請求項１６】
検出工程の結果に基づいて腫瘍を腫瘍サブクラスに属するとして分類する工程；及び分類工程に基づいて治療を選択する工程を更に含んでなり、前記ｋ-ＲＡＳ変異体が前記腫瘍試料において過剰発現されている場合、前記治療はＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤以外である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である腫瘍を識別する方法であって、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の発現レベルを決定することを含んでなり、前記ＲＴＫの異常発現又は誘発は前記患者が前記Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に応答しないことを示し、前記腫瘍はＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅを発現している方法。
【請求項１８】
前記ＲＴＫがＥＧＦＲ又はｃＭＥＴである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＧＦＲ又はｃＭＥＴの阻害剤の有効量をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組合わせて投与することによって前記腫瘍を治療することを更に含んでなる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＧＦＲ阻害剤がエルロチニブである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組合せが相乗的な量で投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍タイプが結腸又は黒色腫である請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年８月２４日に出願された米国仮出願第６１／２３６４６６号、及び２０１０年２月３日に出願された米国仮出願第６１／３０１１４９号の優先権を米国特許法第１１９（ｅ）条に基づき主張するものであり、全ての目的に対し出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、癌の診断及び／又は治療、特に、診断的及び／又は予後予測的である変異又はＲＴＫ過剰発現の検出及び検出と癌治療との関連付けに関する。
【背景技術】
【０００３】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）及びそれらのリガンドは、腫瘍細胞増殖、血管新生及び転移の重要な調節因子である。例えば、ＲＴＫのＥｒｂＢファミリーは、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１及びＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｎｅｕ又はＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含み、異なるリガンド結合及びシグナリル活性を有する。ＥｒｂＢ受容体に結合するリガンドは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ａ（ＴＧＦａ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様リガンド（ＨＢＥ-ＧＦ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、エピジェン（ＥＰＧ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）及びニューレグリン（ＮＲＧ）を含む。これらのリガンドは直接ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４に結合し、ＲＡＳ-ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ-Ａｋｔ経路を含む多数の下流のシグナルカスケードの引き金を引く。ＥＧＦ及び他の増殖因子及びサイトカイン、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等は、Ｒａｓを介して信シグナルを送る。Ｒａｓ変異は、Ｒａｓを永久にその活性状態、ＧＴＰ結合状態に固定する（Wislez, M,等, Cancer Drug Discovery and Development: EGFR Signaling Networks in Cancer Therapy, Eds: J. D. Haley and W. J. Gullick, Humana Press, pp. 89-95, 2008）。
【０００４】
ＭＥＴは別のＲＴＫであり、そのリガンド肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）による活性化はＭＥＴキナーゼ触媒活性を誘発し、チロシンＴｙｒ１２３４及びＴｙｒ１２３５のトランスリン酸化の誘因となる。これらの２つのチロシンは様々なシグナル伝達に関与し、従ってＭＥＴによって作動される全範囲の生物学的活性を開始する。ＨＧＦはＲＡＳ活性を持続させ、従ってＭＡＰＫ活性を延長する。
【０００５】
Ｋ-ｒａｓは、様々な癌において変異するｒａｓ遺伝子のうちの1つである。コドン１２及び１３のＫ-ｒａｓ遺伝子の変異は腫瘍形成に関与し、Ｋ-ｒａｓ遺伝子産物であるｐ２１-ｒａｓタンパク質の機能的変更を導き、結果として細胞増殖及び分裂を刺激する細胞核への過剰な増殖シグナルの伝達となる。従って、Ｋ-ｒａｓ遺伝子の変異の同定は、例えば膵臓、結腸直腸、及び非小細胞肺癌等の癌の診断における有用なツールとして広く用いられており、また研究はそれが何らかの腫瘍表現型に関連しうることを示唆してきた（Samowitz W S,等, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9: 1193-1197, 2000; Andreyev H J,等, Br. J. Cancer 85: 692-696, 2001;及びBrink M,等, Carcinogenesis 24: 703-710, 2003）。
【０００６】
Ｒａｓは、発癌性形質転換及び発生において基本的役割を果たす。発癌性Ｈ-、Ｋ-、及びＮ-Ｒａｓは少数の部位に限られる点変異から生じる（アミノ酸１２、１３、５９及び６１）。正常のＲａｓと異なり、発癌性ｒａｓタンパク質は固有のＧＴＰアーゼ活性を欠き、従って恒常的に活性化されている（Trahey, M., and McCormick, F. (1987) Science 238: 542-5; Tabin, C. J.等 (1982) Nature. 300: 143-9; Taparowsky, E.等 (1982) Nature. 300: 762-5）。ヒト癌における発癌性ｒａｓの関与は３０％であると推定される（Almoguera, C.等(1988) Cell. 53:549-54）。
【０００７】
変異はしばしばｒａｓ遺伝子の内の１つのみに限られ、頻度は組織及び腫瘍のタイプに特異的である。Ｋ-ｒａｓは、ヒト癌において最も一般的に変異される癌遺伝子であり、特にコドン-１２変異である。一塩基置換から生じるＨ-、Ｋ-、及びＮ-Ｒａｓの発癌性活性はヒト癌の３０％において観察され（Bos, J. L. (1989) Cancer Res 49, 4682-9）、９０％以上のヒト膵臓癌はコドン１２Ｋ-ｒａｓ変異を示す（Almoguera, C.等 (1988) Cell 53, 549-54; Smit, V. T.等 (1988) Nucleic Acids Res 16, 7773-82; Bos, J. L. (1989) Cancer Res 49, 4682-9）。膵臓で最も一般的な癌である膵管腺癌は、その急速な発症及び治療に対する耐性で悪名が高い。ヒト膵腫瘍における高頻度のＫ-ｒａｓ変異は、恒常的なＲａｓ活性が膵臓腫瘍形成の間、重要な役割を果たすことを示唆する。膵外分泌部の腺癌は、西洋諸国における癌関連の死亡原因の第４位である。治療は、限られた成功となり、５年生存率は依然５％未満であり、外科的に切除不可能な腫瘍を有する患者の平均生存期間は４ヵ月である（Jemal, A等(2002) CA Cancer J Clin 52, 23-47; Burris, H. A., 3rd等 (1997) J Clin Oncol 15, 2403-13）。この点変異は、正常の立方膵臓管上皮が扁平過形成性病変へ進行した場合、疾患の経過における早い段階で同定されることが可能であり、膵臓癌の病変形成における原因と考えられる（Hruban, R. H.等(2000) Clin Cancer Res 6, 2969-72; Tada, M.等 (1996) Gastroenterology 110, 227-31）。しかしながら、ヒト膵臓癌におけるＫ-ｒａｓ発癌性シグナル伝達の調節は大部分が未知のままである。
【０００８】
Ｋ-ｒａｓ変異は結腸及び肺の癌の５０％に存在する（Bos, J. L.等 (1987) Nature. 327: 293-7; Rodenhuis, S.等 (1988) Cancer Res. 48: 5738-41）。尿路及び膀胱の癌において、変異は主にH-ｒａｓ遺伝子にある（Fujita, J.等 (1984) Nature. 309: 464-6; Visvanathan, K. V.等 (1988) Oncogene Res. 3: 77-86）。Ｎ-ｒａｓ遺伝子変異は３０％の白血病及び肝癌に存在する。ヒトの皮膚病変のおよそ２５％は、Ｈａ-Ｒａｓの変異を含む（扁平上皮癌２５％及び黒色腫２８％）(Bos, J. L. (1989) Cancer Res. 49:4683-9; Migley, R. S, and Kerr, D. J. (2002) Crit Rev Oncol Hematol. 44:109-20)。甲状腺癌の５０−６０％は全３遺伝子に変異を持つことで特有である（Adjei, A. A. (2001) J Natl Cancer Inst. 93: 1062-74）。
【０００９】
Ｒａｓの恒常的な活性化は、発癌性変異を通して又は過剰活性化されたＥＧＦＲ等の増殖因子受容体を介して達成される。ＥＧＦＲファミリーのメンバー、特にＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の上昇した発現及び／又は増幅は、様々な形態のヒト悪性腫瘍に関連する（Prenzel, N.等 (2001) Endocr Relat Cancer. 8: 11-31に総説される）。これらの癌（膵臓、結腸、膀胱、肺を含む）の幾つかにおいて、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２の過剰発現は、発癌性Ｒａｓへにの存在によって悪化される。腫瘍におけるこれらの受容体の異常な活性化は、過剰発現、遺伝子増幅、恒常的な活性化変異、又は自己分泌増殖因子ループに起因することができる（Voldborg, B. R.等 (1997) Ann Oncol. 8: 1197-206）。増殖因子受容体、特にＥＧＦＲに関して、これらの受容体の増幅及び／又は過剰発現は、胸部、卵巣、胃、食道、膵臓、肺、結腸及び神経芽細胞腫の癌でしばしば生じる。
【００１０】
ＲＡＳ-ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、細胞増殖、分化及び生存を制御する。このシグナル伝達経路は、広範なヒト腫瘍からの細胞の増殖及び生存を調整する中心的役割に基づき、抗癌治療の魅力的な経路として見られており、またこのシグナル伝達経路の要素における変異は哺乳動物細胞における腫瘍開始の基礎を成す(Sebolt-Leopold等(2004) Nat Rev Cancer 4, pp 937-47)。
【００１１】
ＲＡＳ-ＭＡＰＫシグナル経路は、様々な細胞外シグナル（ホルモン及び増殖因子）によって活性化され、それはＧＤＰのＧＴＰとの交換によってＲＡＳを活性化する。次にＲａｓはＲＡＦをその活性化が起こる形質膜に動員する。上記の如く、シグナル経路の構成要素における変異は、結果として恒常的な活性化となり、哺乳動物細胞における腫瘍開始の基礎をなす。例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）等の増殖因子受容体は、多くの癌において増幅及び変異を受け、最高で２５％の肺非小細胞癌及び６０％の神経膠芽腫を占める。Ｂｒａｆもしばしば変異され、特に黒色腫（症例のおよそ７０％）及び結腸癌（症例のおよそ１５％）で生じる。更に、ｒａｓは最も頻繁に変異する癌遺伝子であり、全ヒト癌のおよそ３０％で生じる。変異ｒａｓ遺伝子の頻度及びタイプ（Ｈ-ｒａｓ、Ｋ-ｒａｓ又はＮ-ｒａｓ）は腫瘍のタイプに依存して広く異なる。しかしながら、Ｋ-ｒａｓが最も頻繁に変異される遺伝子であり、膵臓癌（およそ９０％）及び結直腸癌（およそ４５％）において最も高い頻度で検出される。これは、シグナル経路の他の構成要素と同様に、それを抗癌治療の適切な標的にする。実際、この経路の様々な工程を標的とする設計された小分子量阻害剤が臨床試験に入っている。更には、ソラフェニブ(Nexavar.RTM., Bayer HealthCare Pharmaceuticals)、ＲＡＳシグナル伝達阻害となるＲＡＦ-キナーゼ阻害剤が、腎細胞癌に対して最近承認された。これらのデータを受け、改善された癌治療の発展に対し、ＲＡＳ-ＭＡＰＫ経路を標的とすることへの高い関心があり続ける。
【００１２】
ＲＡＳ-ＭＡＰＫシグナル経路は、様々な細胞外シグナル（ホルモン及び増殖因子）によって活性化され、それはＧＤＰのＧＴＰとの交換によってＲＡＳを活性化する。次にＲａｓはＲＡＦをその活性化が起こる形質膜に動員する。上記の如く、シグナル経路の構成要素における変異は、結果として恒常的な活性化となり、哺乳動物細胞における腫瘍開始の基礎をなす。例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）等の増殖因子受容体は、多くの癌において増幅及び変異を受け、最高で２５％の肺非小細胞癌及び６０％の神経膠芽腫を占める。Ｂｒａｆもしばしば変異され、特に黒色腫（症例のおよそ７０％）及び結腸癌（症例のおよそ１５％）で生じる。更に、ｒａｓは最も頻繁に変異する癌遺伝子であり、全ヒト癌のおよそ３０％で生じる。変異ｒａｓ遺伝子の頻度及びタイプ（Ｈ-ｒａｓ、Ｋ-ｒａｓ又はＮ-ｒａｓ）は腫瘍のタイプに依存して広く異なる。しかしながら、Ｋ-ｒａｓが最も頻繁に変異される遺伝子であり、膵臓癌（およそ９０％）及び結直腸癌（およそ４５％）において最も高い頻度で検出される。これは、シグナル経路の他の構成要素と同様に、それを抗癌治療の適切な標的にする。実際、この経路の様々な工程を標的とする設計された小分子量阻害剤が臨床試験に入っている。更には、ソラフェニブ(Nexavar.RTM., Bayer HealthCare Pharmaceuticals)、ＲＡＳシグナル伝達阻害となるＲＡＦ-キナーゼ阻害剤が、腎細胞癌に対して最近承認された。これらのデータを受け、改善された癌治療の発展に対しＲＡＳ-ＭＡＰＫ経路を標的とすることへの高い関心があり続ける。
【００１３】
Downward, J. (2002) Nature Reviews Cancer, volume 3, 11-22頁に記載されるように、ＲＡＳタンパク質は低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の大きなスーパーファミリーのメンバーであり、配列保存の度合いに従い幾つかのファミリーに分けられる。異なるファミリーは、異なる細胞過程にとって重要である。例えば、ＲＡＳファミリーは細胞増殖を制御し、ＲＨＯファミリーはアクチン細胞骨格を制御する。一般的に、ＲＡＳファミリーは３つのメンバーＨ-、Ｎ-及びＫ-ＲＡＳから成りとされ、Ｋ-ＲＡＳがメジャー（４Ｂ）及びマイナー（４Ａ）スプライスバリアントを生成する（Ellis, C. A and Clark, G. (2000) Cellular Signalling, 12:425-434）。ＲＡＳファミリーのメンバーが、ヒト腫瘍における変異により活性化され、強力な形質転換能を有すると分かった。
【００１４】
ＲＡＳメンバーは非常に密接に関連し、８５％のアミノ酸配列同一性を有する。ＲＡＳタンパク質は非常に類似した方法で機能するが、それらの間の微妙な違いの幾つかの兆候が最近明るみに出た。Ｈ-ｒａｓ、Ｋ-ｒａｓ及びＮ-ｒａｓタンパク質は広く発現され、Ｋ-ｒａｓはほとんど全ての細胞タイプにおいて発現される。ノックアウト研究は、Ｈ-ｒａｓ及びＮ-ｒａｓはマウスにおける正常発生に単独でも又は組合わせでも必要でないが、Ｋ-ｒａｓが重要であることを示した（Downward, J. (2002) 12頁）。
【００１５】
更に、Downward, J. (2002)に記載されるように、ＲＡＳ経路の異常なシグナル伝達は、腫瘍細胞における幾つかの異なる種類の変異性損傷の結果として生じる。これらの変異の最も明らかなものは、ｒａｓ遺伝子それ自身にある。ヒト腫瘍の約２０％がｒａｓに活性化点変異を有し、Ｋ-ｒａｓに最も高い頻度（全体の約８５％）、次にＮ-ｒａｓ（約１５％）、次にＨ-ｒａｓ（１％未満）となる。これらの変異は全てＲＡＳのＧＴＰアーゼ活性を損なわせ、ＧＡＰがＲＡＳ上のＧＴＰの加水分解を促進するのを妨げ、これによりＲＡＳを活性形態であるＧＴＰ結合の状態で蓄積させる。腫瘍におけるほとんど全てのＲＡＳ活性化は、コドン１２、１３及び６１における変異で説明される(Downward, J. (2002) 15頁)。
【００１６】
癌治療が特定の癌に合わせて調整されると有益である。特に、本発明は、特定の承認された利用可能である治療法が、それでも、特定のタイプの癌に有益でないかどうか決定する手段を提供する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質における変異を検出することによって、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に感受性でない腫瘍を識別する予後予測方法に関する。方法は、試料における変異Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質の有無を決定し、これによりＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に非応答性である腫瘍を識別することを含む。該方法を実行するためのキットもまた開示される。
【００１８】
別の態様では、本発明は、Ｋ-ｒａｓの異常発現レベルを決定することにより、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に感受性でない腫瘍を識別する予後予測的方法に関する。方法は、試料における特定のＲＴＫの発現レベルを決定することを含み、ここではＲＴＫの過剰発現はＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に対する非応答性と相関する。Ｂ-Ｒａｆ治療の応答に相関するＲＴＫの例は、限定するものではないが、ＥＧＦＲ及びｃＭｅｔを含む。方法はまた、試料におけるＲＴＫの特定のリガンドの誘導レベルを決定することを含み、ここではリガンド誘導の異常に高いレベルはＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に対する非応答と相関する。Ｂ-Ｒａｆ治療に対する非応答性に相関するリガンドの例は、限定するものではないが、ＥＧＦ及びＨＧＦを含む。方法はまた試料におけるＲａｓ-ＧＴＰのレベルを決定することを含み、Ｒａｓ-ＧＴＰの異常に高いレベルはＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に対する非応答と相関する。該方法を実行するためのキットもまた開示される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に非応答性である腫瘍を治療する方法に関する。方法は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤をＥＧＦＲ阻害剤と組合せて投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は生化学的酵素アッセイデータを示す。データは、生理的［ＡＴＰ］ではＧＤＣ-０８７９のみがＢ-ＲａｆＶ６００Ｅ及びＷＴ Ｒａｆアイソフォーム双方に対して効果的効力を維持することを示す。
【図２】図２は異なるＲａｆ／Ｒａｓ変異状態の腫瘍株における生存率アッセイを示す。
【図３】図３は非Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅ株おいてのみＲａｆ阻害剤による持続されたｐＭＥＫ誘導を示す。ｐＭＥＫレベルはＷＴ Ｒａｆに対する阻害剤のＩＣ５０に相対的にプラトーに達する。
【図４】図４はｃ-Ｒａｆが非Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅ株におけるＲａｆ阻害剤によるｐＭＥＫ誘導に対する主要な原因であるＲａｆアイソフォームであることを示す。
【図５】図５は非Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅ株においてのみ、両阻害剤によって誘導されるｃ-Ｒａｆ特異的活性を示す。Ｒａｆ誘導の条件下でSproutyレベルの減少はなかった。
【図６】図６はｐＥＲＫレベルの非誘導を示す。阻害剤の相対的効力はそれらの生化学的ＩＣ５０と相関する。
【図７】図７は基本条件下でのｐＭＥＫレベルへの釣鐘型効果を示す。ＧＤＣ-０８７９の阻害効果は血清刺激後に優勢である。
【図８Ａ】図８Ａは原発ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、ＢＲＡＦ経路阻害の期間及び程度のＢ-Ｒａｆ阻害剤、ＧＤＣ-０８７９有効性の決定を示す。 Kaplan-Meierプロットは、毎日１００ｍｇ／ｋｇＧＤＣ-０８７９又はビヒクルで処置された患者由来黒色腫及び非小細胞性肺癌腫瘍モデルの腫瘍倍増速度を示す。ＢＲＡＦ、Ｎ-ｒａｓ及びＫ-ｒａｓの遺伝子型を示す。腫瘍進行における統計学的に有意の（Ｐ＜０．０５）の遅延がＭＥＸＦ９８９、ＭＥＸＦ２７６及びＭＥＸＦ３５５腫瘍が認識される。ＧＤＣ-０８７９の投与は、例えばＬＸＦＡ１０４１及びＬＸＦＡ９８３等の幾つかのＫ-ｒａｓ変異体非小細胞性肺癌腫瘍の増殖を著しく加速した。
【図８Ｂ】図８ＢはＧＤＣ-０８７９処置がＢＲＡＦＶ６００Ｅ原発ヒト異種移植片腫瘍におけるＥＲＫ１／２リン酸化を下方制御したことを示す。経時的薬力学研究では、マウスを１００ｍｇ／ｋｇＧＤＣ-０８７９で処置し、最終投与（２１−２４日）後１又は８時間で殺した。リン酸化及び全ＥＲＫ１／の免疫ブロットを示す。８時間持続の強力なリン酸化ＥＲＫ１／２の阻害はＢＲＡＦＶ６００Ｅ状態及びＧＤＣ-０８７９抗腫瘍効果と強く相関した。全ＥＲＫ１／２発現をローディング・コントロールとして全サンプルにおいて調査した。
【図９】図９Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはＫ-ｒａｓ変異腫瘍細胞株を示し、インビボ及びインビトロでのＧＤＣ-０８７９ ＲＡＦ及びＭＥＫ阻害剤に対する異なる感受性を示す。Ａ及びＢ、ＲＡＦでなく、ＭＥＫの阻害はＫ-ＲＡＳ変異ＨＣＴ１１６腫瘍のインビボでの増殖を妨げた。マウスを腫瘍が〜２００ｍｍ３に達した時ランダム化し、治療を１００ｍｇ／ｋｇＧＤＣ-０８７９（Ａ）又は２５ｍｇ／ｋｇＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫＩｎｈ；Ｂ）でデイリースケジュールにおいて開始した。点、平均；バー、ＳＥ。Ｃ、１３０細胞株に対するＧＤＣ-０８７９ＥＣ５０値をＢＲＡＦ及びＫ-ＲＡＳ変異状態に応じて示す。細胞増殖のＧＤＣ-０８７９媒介阻害はＢＲＡＦ変異と強く相関した。Ｄ、ＭＥＫ阻害ＥＣ５０値のドットプロットを遺伝子型に従い整理する。ＭＥＫ阻害はまた野生型ＢＲＡＦを発現している細胞株のかなりの割合において強力であった。データは４重測定の平均を示す。
【図１０】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１１】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１２】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１３】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１４】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１５】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１６】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１７】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１８】図１０−１８はＧＤＣ-０８７９の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖を示す。
【図１９ＡＢ】図１９Ａ及びＢは非Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞における形質膜への野生型ＲＡＦのＲＡＳ依存トランスロケーションを誘導するＲａｆ阻害剤を示す。(Ａ)ＭｅＷｏ(ＲＡＳ／ＲＡＦＷＴ)細胞を、ＧＤＣ-０８７９(２-｛４-［(１Ｅ)-１-(ヒドロキシイミノ)-２,３-ジヒドロ-１Ｈ-インデン-５-イル］-３-(ピリジン-４-イル)-１Ｈ-ピラゾール-１-イル｝エタン-１-オル)、ＰＬＸ４７２０(Ｎ-［３-［(５-クロロ-１Ｈ-ピロロ［２,３-ｂ］ピリジン-３-イル)カルボニル］-２,４-ジフルオロフェニル］-１-プロパンスルホンアミド)又はＡＺ-６２８(３-(２-シアノプロパ-２-イル)-Ｎ-(４-メチル-３-(３-メチル-４-オキソ-３,４-ジヒドロキナゾリン-６-イルアミノ)フェニル)ベンズアミド)（全て０．１、１、１０ｍＭ）で１時間処理し、膜（Ｐ１００）及び細胞質（Ｓ１００）画分に分画した。一定分量の膜及び細胞質画分を表示抗体で免疫ブロットした。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＶｅｎｕｓ-Ｃ-ＲＡＦ（緑）、ＣＦＰ-Ｋ-ＲＡＳ（赤）及びｍＣｈｅｒｒｙ-Ｈ２Ｂ（青）で一過性に形質移入した。１０ｍＭのＧＤＣ-０８７９又はＡＺ-６２８で４時間処理され、その後共焦点蛍光顕微鏡を使用したライブ細胞イメージングを行った細胞において、ＶｅｎｕｓタグＣ-ＲＡＦは形質膜にＣＦＰ-ＫＲＡＳと共局在する。ＫＲＡＳＷＴの代わりにドミナントネガティブＣＦＰタグＫＲＡＳＳ１７Ｎが形質移入された時、膜移行が遮断された（右パネル）。
【図２０ＡＢ】図２０Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ＲＡＦ阻害剤によるＣ-ＲＡＦ活性化及びリン酸ＭＥＫ誘発において活性Ｒａｓが果たす役割の重要性を示す。（Ａ）Ａ３７５（Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ）細胞をＧＤＣ-０８７９又はＰＬＸ４７２０で１時間処理し、膜分画のために低張緩衝液において溶解した。膜（Ｐ１００）及び細胞質（Ｓ１００）画分を表示抗体で免疫ブロットした。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞をＫＲＡＳＷＴ又はＫＲＡＳＳ１７Ｎで一過性に形質移入し、ＧＤＣ-０８７９又はＰＬＸ４７２０（０．１、１、１０ｍＭで）で１時間処理し、膜（Ｐ１００）及び細胞質（Ｓ１００）画分に分画した。一定分量の膜及び細胞質画分を、抗リン酸化及び抗全ＭＥＫ抗体で免疫ブロットした。（Ｃ）ＲＡＳ-ＧＴＰレベルを、ＲＡＳ-ＧＴＰ捕獲のベイトとして固定化されたＣ-ＲＡＦ-ＲＢＤを使用し、Ｒａｓ-ＧＴＰ ＥＬＩＳＡプロトコルにより、ＭｅＷｏ（ＲＡＳ／ＲＡＦＷＴ）、Ａ３７５（Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ）及びＨ２１２２（ＫＲＡＳＭＴ）細胞の溶解物から測定した。相対蛍光単位は、ＲＢＤに結合した抗ＲＡＳ抗体のＲＡＳ検出を表す。ＲＡＳ-ＧＴＰ Ｈ２１２２＞＞Ｍｅｗｏ＞Ａ３７５。（Ｄ）Ａ３７５（Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ）細胞における変異体ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（ＫＲＡＳＷＴではない）の形質移入は、細胞が、ＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ-０８７９（０．１、１、１０ｍＭで投与）の存在下で、Ｂ-ＲＡＦ：Ｃ-ＲＡＦヘテロ二量体及びＣ-ＲＡＦキナーゼ活性化を誘導することを可能にする。Ｃ-ＲＡＦを、コントロール及び阻害剤処理細胞から免疫沈降し、タンパク質活性及びＢ-ＲＡＦヘテロ二量体化について検定した。免疫沈降においてＷＢにより示される全Ｃ-ＲＡＦレベルは各通路に対するローディングを示す。
【図２０ＣＤ】図２０Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ＲＡＦ阻害剤によるＣ-ＲＡＦ活性化及びリン酸ＭＥＫ誘発において活性Ｒａｓが果たす役割の重要性を示す。（Ａ）Ａ３７５（Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ）細胞をＧＤＣ-０８７９又はＰＬＸ４７２０で１時間処理し、膜分画のために低張緩衝液において溶解した。膜（Ｐ１００）及び細胞質（Ｓ１００）画分を表示抗体で免疫ブロットした。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞をＫＲＡＳＷＴ又はＫＲＡＳＳ１７Ｎで一過性に形質移入し、ＧＤＣ-０８７９又はＰＬＸ４７２０（０．１、１、１０ｍＭで）で１時間処理し、膜（Ｐ１００）及び細胞質（Ｓ１００）画分に分画した。一定分量の膜及び細胞質画分を、抗リン酸化及び抗全ＭＥＫ抗体で免疫ブロットした。（Ｃ）ＲＡＳ-ＧＴＰレベルを、ＲＡＳ-ＧＴＰ捕獲のベイトとして固定化されたＣ-ＲＡＦ-ＲＢＤを使用し、Ｒａｓ-ＧＴＰ ＥＬＩＳＡプロトコルにより、ＭｅＷｏ（ＲＡＳ／ＲＡＦＷＴ）、Ａ３７５（Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ）及びＨ２１２２（ＫＲＡＳＭＴ）細胞の溶解物から測定した。相対蛍光単位は、ＲＢＤに結合した抗ＲＡＳ抗体のＲＡＳ検出を表す。ＲＡＳ-ＧＴＰ Ｈ２１２２＞＞Ｍｅｗｏ＞Ａ３７５。（Ｄ）Ａ３７５（Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ）細胞における変異体ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（ＫＲＡＳＷＴではない）の形質移入は、細胞が、ＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ-０８７９（０．１、１、１０ｍＭで投与）の存在下で、Ｂ-ＲＡＦ：Ｃ-ＲＡＦヘテロ二量体及びＣ-ＲＡＦキナーゼ活性化を誘導することを可能にする。Ｃ-ＲＡＦを、コントロール及び阻害剤処理細胞から免疫沈降し、タンパク質活性及びＢ-ＲＡＦヘテロ二量体化について検定した。免疫沈降においてＷＢにより示される全Ｃ-ＲＡＦレベルは各通路に対するローディングを示す。
【図２１ＡＢ】図２１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅ及びＷＴ Ｂ-Ｒａｆ細胞株におけるＲａｆ阻害剤による基本及びＥＧＦ刺激ｐＥＲＫノックダウンの測定を示す。（Ａ）試験された株間の遺伝子型及びＥＧＦＲレベルの表。（Ｂ）基本及び刺激ｐＥＲＫレベルの測定：細胞を無血清媒体において１時間、０．０００４−１０ｍＭの化合物で処理した。刺激のために２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを細胞を溶解する前５分間加えた。溶解物をＭＤプレートに移動し、そこでリン酸化及び全ＥＲＫレベルを測定した。（Ｃ）ｐＥＲＫ ＩＣ５０データを、基本及びＥＧＦ刺激条件下での２つのＲａｆ阻害剤（ＣＨＲ−２６５、１-メチル-５-[[２-[５-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-イミダゾール-２-イル]-４-ピリジニル]オキシ]-Ｎ-[４-(トリフルオロメチル)フェニル]-１Ｈ-ベンズイミダゾール-２-アミン及びＧＤＣ-０８７９）に対してプロットした。（Ｄ）表示ＷＴ Ｂ-Ｒａｆ株のＲａｆ阻害剤による１時間の処理におけるｐＥＲＫ誘導の用量反応曲線。
【図２１ＣＤ】図２１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅ及びＷＴ Ｂ-Ｒａｆ細胞株におけるＲａｆ阻害剤による基本及びＥＧＦ刺激ｐＥＲＫノックダウンの測定を示す。（Ａ）試験された株間の遺伝子型及びＥＧＦＲレベルの表。（Ｂ）基本及び刺激ｐＥＲＫレベルの測定：細胞を無血清媒体において１時間、０．０００４−１０ｍＭの化合物で処理した。刺激のために２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを細胞を溶解する前５分間加えた。溶解物をＭＤプレートに移動し、そこでリン酸化及び全ＥＲＫレベルを測定した。（Ｃ）ｐＥＲＫ ＩＣ５０データを、基本及びＥＧＦ刺激条件下での２つのＲａｆ阻害剤（ＣＨＲ−２６５、１-メチル-５-[[２-[５-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-イミダゾール-２-イル]-４-ピリジニル]オキシ]-Ｎ-[４-(トリフルオロメチル)フェニル]-１Ｈ-ベンズイミダゾール-２-アミン及びＧＤＣ-０８７９）に対してプロットした。（Ｄ）表示ＷＴ Ｂ-Ｒａｆ株のＲａｆ阻害剤による１時間の処理におけるｐＥＲＫ誘導の用量反応曲線。
【図２２ＡＢ】図２２Ａ及びＢはＥＧＦはＥＧＦ刺激を示し、リン酸化ＭＥＫレベル及びＲＡＦ阻害剤に耐性のＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異細胞株の細胞増殖を表示する。（Ａ）細胞を無血清培地において１時間、０．０００４−１０ｍＭの化合物で処理した。刺激のために、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを細胞を溶解する前の５分間添加した。溶解物をＭＳＤプレートに移し、リン酸化及び全ＭＥＫレベルを測定した。リン酸化ＭＥＫ（ｐＭＥＫ）ＩＣ５０データを、基本及びＥＧＦ刺激条件下で表示される２つのＲａｆ阻害剤に対してプロットした。ＧＤＣ-０８７９はノックダウンリン酸化ＭＥＫレベルにおいてより効果的であり、なぜならＰＬＸ４７２０より野生型Ｃ-ＲＡＦ及びＢ-ＲＡＦアイソフォームに対してより低い調整ＩＣ５０を有するためである。（Ｂ）ＥＧＦ処理はＢ-ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞をＲＡＦ阻害剤耐性にするが、タルセバ（又はＭＥＫ阻害剤、例えばＰＤ-０３２５９０１）との組み合わせはこの耐性を克服する。細胞に表示阻害剤を、培地の２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦの存在下で単独で又は組合わせで投与した。
【図２３】図２３は、Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ変異体株（ＬＯＸ、８８８が黒色腫でありＨＴ２９が結腸である）におけるＢ-ＲＡＦ及びＣ-ＲＡＦ活性を誘導するＥＧＦ刺激を示す。全細胞株は表面ＥＧＦＲレベルを発現する。８８８はＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ対立遺伝子についてホモ接合型であり、全ての他の株はヘテロ接合型であり従って野生型Ｂ-ＲＡＦ対立遺伝子も同様に保有する。ヘテロ接合型細胞株はＢ-ＲＡＦ及びＣ-ＲＡＦ活性双方を誘導するが、ホモ接合型株はＣ-ＲＡＦ活性のみを誘発する。この野生型ＲＡＦ活性は、Ｂ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ選択性ＲＡＦ阻害剤によって阻害されることができず、よって、ＥＧＦによるリン酸化ＭＥＫ誘導レベルはこれらの株においてＲＡＦ阻害剤に耐性であるが、Ｂ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅにより作動される内因性リン酸化ＭＥＫレベルはＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ選択的ＲＡＦ阻害剤に感受性である。
【図２４】図２４は、高ＥＧＦｍＲＮＡレベル（ｘ軸）及びＲＡＦ阻害剤ＩＣ５０（ｕＭ、ｙ軸）間の逆相関の傾向を示す。細胞有効性データをＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞株について示し、Ｂ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅアイソフォームに対して生化学的に選択的であり、野生型ＲＡＦアイソフォームに対してより低い各生化学的及び細胞効力を有するＲＡＦ阻害剤を示す。
【図２５】図２５は様々な腫瘍タイプにおけるＲＡＳ-ＧＴＰレベルを示す。ＲＡＳ-ＧＴＰレベルはＫ-ＲＡＳＷＴ腫瘍において低く、変異Ｋ-ＲＡＳを有する腫瘍、例えばＨ２１２２腫瘍、において高い。Ｒａｓ-ＧＴＰレベルはＲＢＤ-Ｅｌｉｓａアッセイによって決定した。
【図２６】図２６は、ＥＧＦの導入の有（＋ＥＧＦ）無（ＮＩ）でのＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞におけるＲａｓ-ＧＴＰレベルを示す。ＥＧＦ刺激はＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞におけるＲａｓ-ＧＴＰレベルを増加する。
【図２７】図２７は、ＥＧＦの導入の有（刺激）無（非刺激）でのＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞におけるｐＥＲＫレベルを示す。ＥＧＦ刺激は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞におけるＲａｓ-ＧＴＰレベルを増加し、Ｃ-Ｒａｆの活性化を介したＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞株におけるｐＥＲＫレベルの増加を導く（図２３に示すＣ-Ｒａｆ活性化を参照）。全４つの細胞株はＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ変異体であるが、この中でもＡ３７５は最も低いＲａｓ-ＧＴＰレベル（最低レベルの活性Ｒａｓ）を有し、ＥＧＦに応答したｐＭＥＫ及びｐＥＲＫレベルの頑強な誘導を示さない。Ａ３７５細胞はＲａｆ阻害剤に感受性であることが知られている。
【図２８】図２８は、ＥＧＦの導入の有（刺激）無（非刺激）でのＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞におけるｐＭＥＫレベルを示す。ＥＧＦ刺激は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞におけるＲａｓ-ＧＴＰレベルを増加し、Ｃ-Ｒａｆの活性化を介したＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞株におけるｐＭＥＫレベルの増加を導く（図２３に示すＣ-Ｒａｆ活性化を参照）。
【図２９】図２９は、特定のＲＡＦ阻害剤（ＧＤＣ-０８７９、ＰＬＸ-４７２０、及び２,６-ジフルオロ-Ｎ-(３-メトキシ-１Ｈ-ピラゾロ[３,４-ｂ]ピリジン-５-イル)-３-(プロピルスルホンアミ)ベンズアミド)である「Ｒａｆ 阻害剤 ａ」）ＥＧＦ刺激に応答して細胞性ｐＥＲＫ誘導を遮断する効力をまとめる。ＥＧＦＲを発現するＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞を血清飢餓にし、次に異なる用量での表示ＲＡＦ阻害剤の存在下で非刺激（−ＥＧＦ）のままか又はＥＧＦ（＋ＥＧＦ）で刺激した。ｐＥＲＫ阻害曲線を作成し、ＩＣ５０値をグラフ化した。ＧＤＣ-０８７９は、図１に示すように、野生型ＲＡＦシグナル伝達をより効果的に遮断し、残りの２つの阻害剤はＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ選択的である。
【図３０】図３０は、ｃ-ＭＥＴを過剰発現している細胞において、ＨＧＦ刺激（＋ＨＧＦ）がどのようにｐＥＲＫ誘導を導くか示す。この誘導はＲＡＦ阻害剤によって阻害されない。しかしながら、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅによって作動される基本ｐＥＲＫレベルはＲＡＦ阻害剤によって効果的に遮断される。これはｃ-ＭＥＴシグナル伝達がまた野生型ＲＡＦアイソフォームを介することを実証する。  このように、ＥＧＦＲを含む受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の異常発現、又は対応のリガンドによる異常誘導は細胞をＲＡＦ阻害剤に耐性にすることができる。
【図３１】図３１は、Ｂ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ細胞の間でＥＧＦＲ発現がどのようにＲＡＦ阻害剤に対する耐性と関連するか示す。このグラフは、細胞生存率決定の前の４日間ＲＡＦ阻害剤で処理したＢ-ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異体黒色腫及び結腸細胞株の細胞生存率ＥＣ５０値（ｕＭ）を示す。ＥＧＦＲレベルをウエスタンブロットにより決定し、細胞溶解物の抗ＥＧＦＲ抗体を用いたウエスタンブロットによりバンドが検出されない場合に陰性として分類した。ＥＧＦＲ陽性細胞株の間で、低から中及び高の発現の範囲がある。耐性である（＞２０ｕＭ ＥＣ５０）唯一のＥＧＦＲ陰性細胞株はＰＴＥＮ欠損である。
【図３２ＡＢＣ】図３２Ａ−Ｃは、異なるレベルのＥＧＦＲ発現を有する結腸腫瘍株におけるＲＡＦ阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤（タルセバ）の組み合わせ研究を示す。図３２Ａでは、２つのＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ結腸株からの溶解物のウエスタンブロットが異なるレベルの全ＥＧＦＲを示す：ＣＯＬＯ２０１は低いＥＧＦＲレベルを有しＣＸ-１は比較的高いＥＧＦＲレベルを有する。図３２Ｂでは、ＲＡＦ阻害剤単独、タルセバ単独又はＲＡＦ阻害剤及びタルセバの組合せでのＣＯＬＯ２０１細胞の組合せ治療の効果を示す。図３２Ｃでは、ＲＡＦ阻害剤単独、タルセバ単独又はＲＡＦ阻害剤及びタルセバの組合せでのＣＯＬＯ２０１細胞の併用治療の効果を示す。ＲＡＦ阻害剤単独、又はタルセバ単独のどちらも併用ほど効果的には増殖を抑制しない。両阻害剤とも、ＣＸ-１細胞に共に投与された場合に良い相乗効果を示す。従って、ＥＧＦＲ発現ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞の中で、高レベルのＥＧＦＲはＲＡＦ阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤間の強い相乗効果を予測する。特に、高いＥＧＦＲ発現がＢＲＡＦＶ６００Ｅ腫瘍間で一般的である結腸癌において、これらのＲＡＦ阻害剤及びタルセバの併用は腫瘍細胞の増殖の阻害において相乗効果を示す。
【図３３】図３３は、高ＥＧＦＲレベルを発現するＢＲＡＦＶ６００Ｅ腫瘍細胞におけるＲＡＦ阻害剤及びタルセバ間の相乗作用の基本メカニズムを示す。細胞ＥＣ５０値に等しい濃度で、阻害剤無し（通路１、５、９、１３）又はＲＡＦ阻害剤単独（通路２、６、１０、１４）、タルセバ単独（通路３、７、１１、１５）又はＲＡＦ阻害剤及びタルセバの組み合わせ（通路４、８、１２、１６）により１時間又は２４時間処理された細胞のウエスタンブロットを調整した。２４時間の時間点は、高いＥＧＦＲ発現を有するＢ-ＲＡＦＶ６００Ｅ変異細胞（ＣＸ-１）におけるＥＲＫリン酸化はＲＡＦ阻害剤による阻害に対し低減された感受性を持ち、最大効率のためにＲＡＦ阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤の組合せを必要とすることを示す。ＥＲＫに対する一部の活性化シグナルは野生型ＲＡＦから来、ＥＧＦＲの下流で活性化されＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ選択的ＲＡＦ阻害剤によって遮断されない。
【図３４Ａ】図３４Ａ−Ｃは、皮下ＨＴ-２９ ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅヒト結腸直腸癌異種移植片を有するＮＣＲヌード（Taconic）マウスに組合わせで与えられるＲＡＦ阻害剤ａ及びエルロチニブ（タルセバ）の相互作用及び有効性からの結果を示す。図３４Ａでは、ＲＡＦ阻害剤は漸増用量のタルセバと共に１００ｍｇ／ｋｇで与えられた。図３４Ｂでは、Ｔａｒｃｅｖａは漸増濃度のＲＡＦ阻害剤ａと共に全ての動物に与えられた。両化合物を組合わせで投与した場合、増加した有効性が観察された。図３４Ｃでは、３４Ａ図及びＢにおける表示した用量の阻害剤で処理した腫瘍からの溶解物を、ウェスタンブロットによってリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）レベルについて分析した。ＲＡＦ阻害剤ａ及びタルセバは、マウスに共投与された場合、腫瘍における減少リン酸化ＥＲＫレベルにおいて相乗された。
【図３４Ｂ】図３４Ａ−Ｃは、皮下ＨＴ-２９ ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅヒト結腸直腸癌異種移植片を有するＮＣＲヌード（Taconic）マウスに組合わせで与えられるＲＡＦ阻害剤ａ及びエルロチニブ（タルセバ）の相互作用及び有効性からの結果を示す。図３４Ａでは、ＲＡＦ阻害剤は漸増用量のタルセバと共に１００ｍｇ／ｋｇで与えられた。図３４Ｂでは、Ｔａｒｃｅｖａは漸増濃度のＲＡＦ阻害剤ａと共に全ての動物に与えられた。両化合物を組合わせで投与した場合、増加した有効性が観察された。図３４Ｃでは、３４Ａ図及びＢにおける表示した用量の阻害剤で処理した腫瘍からの溶解物を、ウェスタンブロットによってリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）レベルについて分析した。ＲＡＦ阻害剤ａ及びタルセバは、マウスに共投与された場合、腫瘍における減少リン酸化ＥＲＫレベルにおいて相乗された。
【図３４Ｃ】図３４Ａ−Ｃは、皮下ＨＴ-２９ ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅヒト結腸直腸癌異種移植片を有するＮＣＲヌード（Taconic）マウスに組合わせで与えられるＲＡＦ阻害剤ａ及びエルロチニブ（タルセバ）の相互作用及び有効性からの結果を示す。図３４Ａでは、ＲＡＦ阻害剤は漸増用量のタルセバと共に１００ｍｇ／ｋｇで与えられた。図３４Ｂでは、Ｔａｒｃｅｖａは漸増濃度のＲＡＦ阻害剤ａと共に全ての動物に与えられた。両化合物を組合わせで投与した場合、増加した有効性が観察された。図３４Ｃでは、３４Ａ図及びＢにおける表示した用量の阻害剤で処理した腫瘍からの溶解物を、ウェスタンブロットによってリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）レベルについて分析した。ＲＡＦ阻害剤ａ及びタルセバは、マウスに共投与された場合、腫瘍における減少リン酸化ＥＲＫレベルにおいて相乗された。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
一実施態様では、ここに開示される主題は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法であって、ＲＴＫ及び／又はそれらのリガンドの発現又は誘導の量を決定することを含んでなる。方法は、試料における特定のＲＴＫ及び／又はそれらのリガンドの発現又は誘導レベルを決定することを含み、ここではＲＴＫ及び／又はそれらのリガンドの過剰発現はＢ-Ｒａｆ阻害剤治療への非応答性と相関する。一実施態様では、試料はＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ変異体を発現する。Ｂ-Ｒａｆ治療の応答性に相関するＲＴＫの例は、限定するものではないがＥＧＦＲ又はｃＭＥＴを含む。方法はまた、試料におけるＲＴＫの特定のリガンドの発現のレベルを決定することを含み、異常に高レベルのリガンド発現はＢ-Ｒａｆ阻害剤治療への非応答性と相関する。Ｂ-Ｒａｆ治療の応答性に相関するリガンドの例は、限定するものではないがＥＧＦ及びＨＧＦを含む。
【００２２】
一実施態様では、ここに開示される主題は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法に関し、試料におけるＲａｓ-ＧＴＰの量を決定することを含んでなり、上昇した量は患者が前記Ｂ-Ｒａｆ阻害剤治療に応答しないことを示す。一実施例では、上昇した量は、正常の非刺激試料に見られる量より大きい。試料におけるＲａｓ-ＧＴＰのレベルを測定する方法は公知であり、例えばＥＬＩＳＡアッセイが使用される（例えばUpstate, Inc.のRas-GTPase ELISAアッセイ）。一実施例では、方法は、前記非応答性患者に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００２３】
一実施態様では、ここに開示される主題は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法に関し、試料におけるＥＧＦ又はＥＧＦＲ発現のレベルを決定することを含んでなり、ＥＧＦ又はＥＧＦＲの過剰発現レベルは、患者がＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に応用しないことを示す。一実施例では、ＥＧＦｍＲＮＡの量が決定される。試料におけるＥＧＦ及びＥＧＦＲのレベルを測定する方法は公知であり、例えばＥＬＩＳＡイムノアッセイが使用される（例えばR&D Systems, Inc.のQUANTIKINE（登録商標）イムノアッセイ）。一実施例では、方法は、前記非応答性患者に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００２４】
一実施態様では、ここに開示される主題は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法に関し、試料におけるＨＧＦ又はｃＭＥＴ発現のレベルを決定することを含んでなり、ＨＧＦ又はｃＭＥＴの過剰発現レベルは、患者がＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に応用しないことを示す。一実施例では、患者はＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅを発現する。一実施例では、ＨＧＦ ｍＲＮＡの量が決定される。試料におけるＨＧＦ又はｃＭＥＴのレベルを測定する方法は公知であり、例えば定量的ＲＴ-リアルタイムＰＣＲアッセイが使用される。別の実施態様では、ＥＬＩＳＡイムノアッセイが使用される（例えばEMD Chemicals, IncのPhosphoDetect（登録商標）cMET ELISAキット、又はInvitrogen, Inc.のcMET Human ELISAキット）。一実施例では、方法は、前記非応答性患者に有効量のＨＧＦ又はｃＭＥＴ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＨＧＦ又はｃＭＥＴ阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００２５】
一実施態様では、ここに開示される主題は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法に関し、Ｋ-ｒａｓ変異の有無を決定することを含んでなり、Ｋ-ｒａｓ変異の存在は患者がＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に応用しないことを示す。一実施例では、前記非応答性患者に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００２６】
一実施態様では、ここに開示される主題は、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性である患者を識別する方法に関し、前記腫瘍の試料における変異体Ｋ-ｒａｓタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含んでなり、変異体Ｋ-ｒａｓタンパク質又は遺伝子の存在は腫瘍がＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に応用しないことを示す。一実施例では、前記非応答性患者に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００２７】
ある実施態様では、患者がＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性か予測する方法が提供される。ある実施態様では、患者の腫瘍における腫瘍のＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することを含み、Ｋ-ｒａｓ変異がコドン１２又はコドン１３にある。ある実施態様では、Ｋ-ｒａｓ変異が存在する場合、患者は特定のＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答であると予測される方法。
【００２８】
ある実施態様では、腫瘍がＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答性か予測する方法が提供される。ある実施態様では、前記腫瘍の試料におけるＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することを含み、Ｋ-ｒａｓ変異はコドン１２又はコドン１３にある。ある実施態様では、Ｋ-ｒａｓ変異の存在は、腫瘍がＢ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療に非応答であることを示す。
【００２９】
ある実施態様では、治療プロトコルにおいてヒト被験体を層別化する方法を提供する。方法は、被験体からの試料における変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はそれらのタンパク質の存在を決定することを含み、変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質の存在は、被験体がＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に応答しないことを示し、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤を用いた治療からの被験体は除く。この方法は、例えば臨床試験等の特定のサブグループに被験体を層別化することを含むことができる。別の実施態様では、方法は、前記変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質を有する前記被験体に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００３０】
一実施態様では、乳房、肺、結腸、卵巣、甲状腺、黒色腫又は膵臓腫瘍を分類する方法を提供する。方法は、腫瘍試料を得る又は提供する工程；試料における（ｉ）Ｂ-Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異体をコードする遺伝子及び（ｉｉ）ｋ-Ｒａｓ変異体をコードする遺伝子の発現又は活性を検出する工程を含んでなる。方法は、検出工程の結果に基づいて腫瘍を腫瘍サブクラスに属するとして分類する工程；及び分類工程に基づいて治療を選択する工程を更に含んでなり、前記ｋ-ＲＡＳ変異体が前記腫瘍試料において過剰発現されている場合、前記治療はＢ-Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤以外である。別の実施態様では、方法は、前記変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質を有する前記非応答性の被験体に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００３１】
別の実施態様では、結腸直腸又は肺癌を治療する方法を提供する。方法は、癌がＫ-ｒａｓ又はＢ-Ｒａｆ作動性であるか決定することを含み、Ｋ-ｒａｓ作動性であると決定されたこのような癌の治療において治療はＢ-Ｒａｆ阻害剤を含まない。一実施例では、治療は、Ｋ-ｒａｓ作動性の癌に有効量のＭＥＫ又はＥＲＫ阻害剤を投与することを含む。また、癌がＫ-ｒａｓ作動性又はＢ-Ｒａｆ作動性であるか決定するための特定の材料を含んでなるキット、及びＢ-Ｒａｆ阻害剤治療に非応答性である患者又は腫瘍を識別する指示を提供する。
【００３２】
ある実施態様では、被験体における一又は複数のＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することは、被験体からの試料における変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの発現の存在又は量を決定することを含む。ある実施態様では、被験体における一又は複数のＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することは、被験体からの試料における変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量を決定することを含む。
【００３３】
ある実施態様では、被験体における一又は複数のＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することは、以下からなる群、US2009/0075267に挙げられる配列番号：配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６から選択される少なくとも一アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの発現の存在又は量を決定することを含む。ある実施態様では、被験体における一又は複数のＫ-ｒａｓ変異の有無を決定することは、被験体からの試料における、以下からなる群、US2009/0075267に挙げられる配列番号：配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６から選択される少なくとも一アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を決定することを含む。
【００３４】
ある実施態様では、変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は量を決定することが提供される。ある実施態様では、試料における変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有無を決定する方法は、（ａ）変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブに試料を曝す工程であって、領域はＧ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ、及びＧ１３Ｄから選択される少なくとも一つのＫ-ｒａｓ変異を含む工程、及び（ｂ）試料において変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有無を決定する工程を含む。ある実施態様では、試料において変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの有無を決定する方法は、（ａ）変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブに試料を曝す工程であって、領域はＧ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ及びＧ１３Ｄから選択される少なくとも一つのＫ-ｒａｓ変異を含む工程、及び（ｂ）試料における変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの有無を決定する工程を含む。
【００３５】
ある実施態様では、変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有無を決定することが提供される。ある実施態様では、試料における変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有無を決定する方法は、（ａ）変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブに試料を曝す工程であって、領域はＶ６００Ｅ変異を有する工程、及び（ｂ）試料において変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有無を決定する工程を含む。ある実施態様では、試料において変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの有無を決定する方法は、（ａ）変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブに試料を曝す工程であって、領域はＶ６００Ｅ変異を有する工程、及び（ｂ）試料における変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの有無を決定する工程を含む。
【００３６】
ある実施態様では、被験体における変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するためのキットを提供する。特定のこのような実施態様では、キットは、変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを含み、領域はＧ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ、及びＧ１３Ｄから選択される少なくとも一つのＫ-ｒａｓ変異を含む。ある実施態様では、キットは２つ異常の増幅プライマを更に含む。ある実施態様では、キットは検出要素を更に含む。ある実施態様では、核酸サンプリング要素を更に含む。キットは、Ｂ-Ｒａｆ変異を検出する材料を任意で含むことができる。これらの材料は当技術分野で公知である。Ｋ-ｒａｓ及びＢ-Ｒａｆ変異体遺伝子又はタンパク質を検出可能なキットの組合せが、結腸及び肺癌の治療において特に有用である。キットに含まれるものは、癌がＫ-ｒａｓ作動性である場合、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤に非応答性である患者又は腫瘍を識別するための指示である。ＲＡＳ作動性の癌は当技術分野において公知である。ＲＡＳ作動性の癌は、ＲＡＳタンパク質の異常活性が形質転換細胞の生成又は癌又は腫瘍の形成となる何れかの癌又は腫瘍である。
【００３７】
ある実施態様では、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤に非応答性であると決定されたそれらの試料、腫瘍、癌、被験体又は患者に対して、方法は、前記非応答性の試料、腫瘍、癌、被験体又は患者に有効量のＭＥＫ阻害剤を投与することを更に含む。
ある実施態様では、Ｂ-Ｒａｆ阻害剤に非応答性であると決定されたそれらの試料、腫瘍、癌、被験体又は患者に対して、方法は、前記非応答性の試料、腫瘍、癌、被験体又は患者に有効量のＥＲＫ阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与することを更に含む。別の実施例では、方法は、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤をＢ-Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与することを更に含む。
【００３８】
ＥＧＦＲシグナル伝達は様々な方法によって阻害されることが可能であり、ＥＧＦＲキナーゼ活性の阻害、活性を阻害するためにＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合又はＥＧＦリガンドの活性及びシグナル伝達の阻害によることを含む。
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は当技術分野で知られており、例えば、エルロチニブ（TARCEVA（登録商標））、ゲフィチニブ（IRESSA（登録商標））、ラパチニブ、ペリチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ及びマツズマブ、及び米国特許第5,747,498号に記載のものを含む。
【００３９】
Ｂ-Ｒａｆ阻害剤は当技術分野で公知であり、例えば、ソラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ-３６０３、ＧＳＫ２１１８４３６、ＧＤＣ-０８７９、Ｎ-(３-(５-(４-クロロフェニル)-１Ｈ-ピロロ［２,３-ｂ］ピリジン-３-カルボニル)-２,４-ジフルオロフェニル)プロパン-１-スルホンアミド、及びWO2007/002325、WO2007/002433、WO2009111278、WO2009111279、WO2009111277、WO2009111280及び米国特許第7,491,829号に記載に記載のものを含む。
【００４０】
ｃＭＥＴ阻害剤は当技術分野で知られており、限定するものではないがＡＭＧ２０８、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ２０９、ＰＨＡ６６５７５２（３Ｚ)-５-[(２,６-ジクロロベンジル)スルホニル]-３-[(３,５-ジメチル-４-{[(２Ｒ)-２-(ピロリジン-１-イルメチル)ピロリジン-１-イル]カルボニル}-１Ｈ-ピロール-２-イル)メチレン]-１,３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-オン、Ｎ-(４-(３-((３Ｓ,４Ｒ)-１-エチル-３-フルオロピペリジン-４-イルアミノ)-１Ｈ-ピラゾロ[３,４-ｂ]ピリジン-４-イルオキシ)-３-フルオロフェニル)-２-(４-フルオロフェニル)-３-オキソ-２,３-ジヒドロピリダジン-４-カルボキサミド及びＳＵ１１２７４、及び米国特許第7,723,330号に記載のものを含む。
【００４１】
ＭＥＫ阻害剤は当技術分野において知られており、限定するものではないがＡＲＲＹ-１６２、ＡＺＤ８３３０、ＡＺＤ６２４４、Ｕ０１２６、ＧＤＣ-０９７３、ＰＤ１８４１６１及びＰＤ９８０５９、及びWO2003047582、WO2003047583、WO2003047585、WO2003053960、WO2007071951、WO2003077855、WO2003077914、WO2005023251、WO2005051300、WO2005051302、WO2007022529、WO2006061712、WO2005028426、WO2006018188、US20070197617、WO2008101840、WO2009021887、WO2009153554、US20090275606、WO2009129938、WO2009093008、WO2009018233、WO2009013462、WO2008125820、WO2008124085、WO2007044515、WO2008021389、WO2008076415及びWO2008124085に記載のものを含む。
ＥＲＫ阻害剤は当技術分野において知られており、限定するものではないが、ＦＲ１８０２０４及び３-(２-アミノエチル)-５-((４-エトキシフェニル)メチレン)-２,４-チアゾリジンジオン、及びWO2006071644、WO2007070398、WO2007097937、WO2008153858、WO2008153858、WO2009105500及びWO2010000978に記載のものを含む。
【００４２】
変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質を検出する何れの既知の方法がここに開示される方法に適する。エクソン１における特定の変異は：Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄである。Ｋ-ｒａｓへにの存在を決定する方法はまたＫ-ｒａｓ及びＥＧＦＲ変異を同定するために使用されるものと類似であり、例えば、米国特許出願公開US2009/0202989A1号に記載される配列番号５５、５６、５７及び５８として挙げられるＰＣＲのＫ-ｒａｓオリゴ（oligos）があり、出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。例として、Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質を検出する他の方法、及びプライマー、オリゴ及び配列番号は、米国特許出願公開第US2009/0202989A1、同第US2009/0075267A1号、同第US20090143320号、同第US20040063120号及び同第US2007/0003936号に開示される。技術及び手順は一般的に当技術分野で周知である従来的な方法により実施され、本明細書を通して引用及び検討される様々な一般的な及びより具体的な引例に記載される。出典明記により本明細書に援用される、例えばSambrook等. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。
【００４３】
ポリヌクレオチドにおける変異を検出する特定の方法は当技術分野で公知である。特定の例示的な方法は、限定するものではないが、配列決定、プライマー伸長反応、電気泳動、ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＳＮＰｌｅｘアッセイ、及び例えば米国特許第5,470,705号、同第5,514,543号、同第5,580,732号、同第5,624,800号、同第5,807,682号、同第6,759,202号、同第6,756,204号、同第6,734,296号、同第6,395,486及び米国特許出願公開第US 2003-0190646 A1号に記載のアッセイを含む。
【００４４】
ある実施態様では、ポリヌクレオチドにおける変異を検出する方法は、始めに変異を有しうるポリヌクレオチドを増幅することを含む。ポリヌクレオチドを増幅する特定の方法が当技術分野で公知である。かかる増幅産物は、ポリヌクレオチドにおける変異を検出するために、ここに記載の又は当技術分野で公知の何れかの方法で用いられることができる。
ポリペプチドにおける変異を検出する特定の方法は当技術分野で公知である。特定の例示的なそのような方法は、限定するものではないが、変異体ポリペプチドに特異的な特異的結合剤を使用して検出することを含む。変異体ポリペプチドを検出する他の方法は、限定するものではないが、電気泳動及びペプチド配列決定を含む。
【００４５】
ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドにおける変異を検出するある例示的な方法は、例えばSchimanski等 (1999) Cancer Res., 59: 5169-5175; Nagasaka等 (2004) J. Clin. Oncol., 22: 4584-4596; PCT Publication No. WO 2007/001868 A1; 米国特許出願公開第2005/0272083 A1号;及びLievre等 (2006) Cancer Res. 66: 3992-3994に記載される。
【００４６】
ある実施態様では、一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイを提供する。ある実施態様では、一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチドに相補的な一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイを提供する。ある実施態様では、一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイを提供する。ある実施態様では、一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチドに相補的な一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイを提供する。
【００４７】
ある実施態様では、一又は複数の細胞又は組織試料における一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの有無がマイクロアッセイ技術を使用して評価される。ある実施態様では、二以上の細胞又は組織試料における一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの量がマイクロアッセイ技術を使用して評価される。
ある実施態様では、一又は複数の細胞又は組織試料における一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの有無がマイクロアッセイ技術を使用して評価される。ある実施態様では、二以上の細胞又は組織試料における一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの量がマイクロアッセイ技術を使用して評価される。
【００４８】
ある実施態様では、二以上の細胞又は組織試料における一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの有無がマイクロアッセイ技術を使用して評価される。ある実施態様では、ｍＲＮＡがまず細胞又は組織試料から抽出され、次いでｃＤＮＡに変換されこれがマイクロアレイにハイブリダイズされる。特定のかかる実施態様では、マイクロアレイに特異的に結合されるｃＤＮＡの有無が変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの有無を示す。特定のかかる実施態様では、一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの発現レベルが、マイクロアレイに特異的に結合されるｃＤＮＡの量を定量化することによって評価される。
【００４９】
ある実施態様では、二以上の細胞又は組織試料における一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの有無がマイクロアッセイ技術を使用して評価される。ある実施態様では、ｍＲＮＡがまず細胞又は組織試料から抽出され、次いでｃＤＮＡに変換されこれがマイクロアレイにハイブリダイズされる。特定のかかる実施態様では、マイクロアレイに特異的に結合されるｃＤＮＡの有無が変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの有無を示す。特定のかかる実施態様では、一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの発現レベルが、マイクロアレイに特異的に結合されるｃＤＮＡの量を定量化することによって評価される。
【００５０】
ある実施態様では、一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合剤を含んでなるマイクロアレイが提供される。特定のかかる実施態様では、細胞又は組織における一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの有無が検定される。特定のかかる実施態様では、細胞又は組織における一又は複数の変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの量が検定される。
【００５１】
ある実施態様では、一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合剤を含んでなるマイクロアレイが提供される。特定のかかる実施態様では、細胞又は組織における一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの有無が検定される。特定のかかる実施態様では、細胞又は組織における一又は複数の変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドの量が検定される。
【００５２】
特許、特許出願、論文、教科書等、及びそこに引用される引例を含むここに引用される全ての引例は、既にでない範囲で、出典明記によりその全体を本明細書中に援用に援用する。出典明記により援用する一又は複数の資料が、本出願における用語の定義に矛盾して用語を定義する場合本出願が支配する。ここで使用されるセクションの表題は編成目的のみのためであり、記載の主題を制限するとして解釈されるものではない。
【００５３】
定義
特に明記しない限り、本発明に関連して使用される化学的及び技術的用語は、当技術分野の通常の技術者により一般的に理解される意味を持つ。更には、文脈により別に定められない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
【００５４】
用語「Ｂ-Ｒａｆ阻害剤」は、Ｂ-Ｒａｆキナーゼの活性を阻害する何れかの化合物又は薬剤を意味する。かかる阻害剤は、他のｒａｆキナーゼを含む他のキナーゼを阻害しうる。「特異的Ｂ-Ｒａｆキナーゼ阻害剤」は、野生型Ｂ-Ｒａｆと比較して変異体Ｂ-Ｒａｆに対する選択性を持つ阻害剤を意味し、アミノ酸位置６００のバリン残基の変異等であり、例えばＶ６００Ｅ変異である。かかる阻害剤は、少なくとも２倍、より多くの場合少なくとも３倍以上、野生型Ｂ-Ｒａｆと比較して強力である。効力はまた増殖阻害を測る細胞アッセイのＩＣ５０値において比較されることができる。
用語「治療プロトコルは、障害又は疾患を治療するための、一又は複数の薬剤を投与する治療レジメン又は課程を意味する。これは臨床試験を含む。
【００５５】
ポリペプチド配列における変異に関連する用語「Ｘ＃Ｙ」は、当該技術分野において承認され、「＃」はポリペプチドのアミノ酸番号による変異の位置を表し、「Ｘ」は野生型アミノ酸配列のその位置にあるアミノ酸を表し、また「Ｙ」はその位置での変異体アミノ酸を表す。例えば、Ｋ-ｒａｓポリペプチドへの言及での表記「Ｇ１２Ｓ」は、野生型Ｋ-ｒａｓ配列のアミノ酸番号１２にグリシンがあり、グリシンは変異体Ｋ-ｒａｓ配列のセリンと置換されることを表す。
【００５６】
用語「変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチド」及び「変異体Ｋ-ｒａｓタンパク質」は互換的に用いられ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ及びＧ１３Ｄから選択される少なくとも一つのＫ-ｒａｓ変異を含んでなるＫ-ｒａｓポリペプチドを意味する。特定の例示的変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドは、限定するものではないが、対立遺伝子多様体、スプライス多様体、派生多様体、置換多様体、欠失多様体、及び／又は挿入多様体、融合ポリペプチド、オルソログ、及び種間相同体を含む。ある実施態様では、変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドは、Ｃ-又はＮ-末端に更なる残基を含み、例えば、限定するものではないが、リーダー配列残基、標的残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基等である。
【００５７】
用語「変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチド」及び「変異体Ｂ-Ｒａｆタンパク質」は互換的に用いられ、Ｖ６００Ｅ変異を含んでなるＢ-Ｒａｆポリペプチドを意味する。特定の例示的変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドは、限定するものではないが、対立遺伝子多様体、スプライス多様体、派生多様体、置換多様体、欠失多様体、及び／又は挿入多様体、融合ポリペプチド、オルソログ、及び種間相同体を含む。ある実施態様では、変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチドは、Ｃ-又はＮ-末端に更なる残基を含み、例えば、限定するものではないが、リーダー配列残基、標的残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基等である。
【００５８】
用語「変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチド」、「変異体Ｋ-ｒａｓオリゴヌクレオチド」及び「変異体Ｋ-ｒａｓ核酸」は互換的に用いられ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ及びＧ１３Ｄから選択される少なくとも一つのＫ-ｒａｓ変異を含んでなるＫ-ｒａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
用語「変異体Ｂ-Ｒａｆポリペプチド」、「変異体Ｂ-Ｒａｆオリゴヌクレオチド」及び「変異体Ｂ-Ｒａｆ核酸」は互換的に用いられ、Ｖ６００Ｅ変異を含んでなるＢ-Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５９】
用語「薬剤」はここで使用される場合、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子、又は生物学的物質から得られた抽出物を示す。
用語「医薬品又は薬」はここで使用される場合、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導可能である化学物質又は組成物を意味する。ここでの他の化学用語は当技術分野における一般的な使用に準拠して使用され、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))に例示されており、出典明記により本明細書中に援用する。
用語患者はヒト及び動物被験体を含む。
【００６０】
治療の目的のための「哺乳動物」及び「動物」なる用語は、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む。好ましくは哺乳動物はヒトである。
用語「疾患状態」は、細胞又は身体機能、系、又は器官の妨害、休止、又は障害が生じている細胞又は哺乳動物全体の生理学的状態を指す。
【００６１】
用語「治療する」又は「治療」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、望まれない生理学的変化又は疾患、癌の形成又は広がり等を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。本発明の目的に対し、有益な又は望ましい臨床結果は、検出の可、不可に関わらず、症状の軽減、疾患程度の減少、安定化された疾患状態（すなわち悪化していない）、疾患進行の遅延又は緩徐化、病状の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体の）を含むがこれに限定するものではない。「治療」はまた、治療を受けなかった場合の予想される生存期間と比較した延長生存期間を意味する。治療を必要とするものは、既に状態又は疾患を有するもの、並びに状態又は疾患を有する傾向にあるもの、又は状態又は疾患が予防されるべきものを含む。
【００６２】
用語「応答性」は、ここで使用される場合、薬剤を投与した後、患者又は腫瘍がＲＥＣＩＳＴ(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)により完全奏効又は部分奏効を示すことを意味する。用語「非反応性」は、ここで使用される場合、薬剤を投与した後、患者又は腫瘍がＲＥＣＩＳＴ(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)により安定疾患又は進行性疾患を示すことを意味する。ＲＥＣＩＳＴは、例えばTherasse等, February 2000, "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors," J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-216に記載され、出典明記によりその全体を本発明書中に援用する。
【００６３】
「障害」は、一又は複数の治療から益を受けうる何れかの状態である。これは慢性及び急性障害を含み、哺乳類の問題の障害の素因になる病的状態を含む。ここにおいて治療される障害の非制限的な例は、良性及び悪性腫瘍、白血病、及びリンパ系腫瘍を含む。「腫瘍」は、一又は複数の癌細胞を有する。癌の例は、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性腫瘍を含む。このような癌の更なる具体的な例は、扁平上皮癌（例えば上皮性扁平上皮癌）、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌「ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃（gastric又はstomach）癌、胃腸癌を含む、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵嚢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の癌、陰茎癌、並びに  頭頸部癌を含む。特に、本方法は、胸部、結腸直腸、卵巣、膵臓又は肺癌に適している。より具体的には、癌は結腸、肺又は卵巣のものである。癌は、Ｒａｓ促進性の癌でありうる。
【００６４】
変異体Ｋ-ｒａｓに関連した疾患又は状態は、以下の一又は複数を含む：変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質によって引き起こされる疾患又は状態；変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質により貢献される疾患又は状態;及び変異体Ｋ-ｒａｓ遺伝子又はタンパク質の存在と関連している疾患又は状態。ある実施態様では、変異体Ｋ-ｒａｓに関連した疾患又は状態は癌である。
【００６５】
「変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドに関連した疾患又は状態」は、以下の一又は複数を含む：変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドによって引き起こされる疾患又は状態；変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドにより貢献される疾患又は状態；変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドを引き起こす疾患又は状態；及び変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの存在と関連している疾患又は状態。ある実施態様では、変異体Ｋ-ｒａｓに関連した疾患又は、変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドの非存在下で存在しうる。ある実施態様では、変異体Ｋ-ｒａｓに関連した疾患又は状態は、変異体Ｋ-ｒａｓポリペチドの存在により悪化される。ある実施態様では、変異体Ｋ-ｒａｓポリペプチドに関連した疾患又は状態は癌である。
【００６６】
以下の実験は、実施された実験及び得られた結果を含め、例証目的のみのために提供され、請求の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。
【００６７】
実施例
実施例１
Ｂ-ＲＡＦ欠損及び薬理学的阻害はＫ-ｒａｓ作動性腫瘍形成を増強する
Ｒａｓ ＧＴＰアーゼファミリーは、増殖及び生存を含む細胞過程を調節するシグナルに応答して、多くの下流シグナル伝達カスケードを制御する。Ｒａｓがヒト腫瘍における機能獲得型変異に対する最も一般的な標的の一つであるが、Ｒａｓエフェクター経路が変異体Ｋ-ｒａｓ作動性腫瘍形成においてどのように機能するかに関しての疑問が残る。Ｋ-ｒａｓの重要な機能は標準的ＭＡＰＫシグナル伝達経路内でのＢ-ＲＡＦ活性化を含むため、我々は、変異体Ｋ-ｒａｓ作動性の腫瘍促進及び維持に関係してＢ-ＲＡＦの役割を決定する研究を開始した。幾つかのＫ-ｒａｓ変異体腫瘍において、Ｂ-ＲＡＦ阻害は、何れかの腫瘍利点を示さないだけでなく、更には腫瘍増殖を加速した。腫瘍倍増時間を示す図８を参照のこと。
【００６８】
Ｃｒｅレコンビナーゼを発現するアデノウィルスを、条件Ｋ-ｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子（Ｋ-ｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ）及びＬｏｘＰ部位に隣接されたＢ-ｒａｆ遺伝子（Ｂ-ｒａｆＣＫＯ）の０、１又は両コピーを有する遺伝子操作されたマウスの肺に送達した。この手順は結果として、マウスの肺内で欠失された一又は両Ｂ-ｒａｆ対立遺伝子の有無における変異体Ｋ-ｒａｓＧ１２Ｄの発現となる。驚くことに、Ｂ-ｒａｆ欠失は著しく肺腫瘍数及び組織量を増強し、全生存率を低下した。Ｋ-ｒａｓG12D 変異を持つマウス非小細胞肺癌株におけるＢ-Ｒａｆを標的とする高特異的な小分子阻害剤を使用した場合に、我々は細胞増殖及び軟寒天コロニー形成を観察した。更なる調査は、Ｋ-ｒａｓＧ１２Ｄ発現細胞をＢ-ｒａｆ阻害剤で処理することはＭＥＫ及びＥｒｋリン酸化を強化することを示した。従って、これらのデータは、Ｂ-ｒａｆ欠失はＫ-ｒａｓ作動性腫瘍発生を阻害しないが、その存在は恒常的な変異体Ｋ-ｒａｓ活性の負のフィードバック調節の構築において極めて重要な役割を果たしうることを示唆する。
【００６９】
実施例２
Ｂ-ＲＡＦＶ６００Ｅ変異体対野生型腫瘍のＲＡＦシグナル伝達の理解
Ｒａｓ及びＲａｆ遺伝子に異なる変異を有するＲａｆ経路の役割を理解するために、我々は、野生型（ＷＴ）Ｂ-Ｒａｆ及びｃ-Ｒａｆ対変異体（ＭＴ）Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅに対して異なる効力プロファイルを有する２つの選択的小分子Ｒａｆ阻害剤を特徴づけた。それらの生化学差異にも関わらず、それらは同一の細胞性プロファイルを有し、Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅに対して有効性でありＷＴ又はＲａｓ ＭＴ腫瘍には異なる。両阻害剤は、主にｃ-Ｒａｆアイソフォームを介して非ＢＲＡＦＶ６００Ｅ株におけるＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性化を誘導した。一方、それらは、それらの予測される生化学能力により、ホルボールエステル及び増殖因子刺激Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性を阻害した。このように、Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅ株に対する選択的Ｒａｆ阻害剤の細胞特異性は、Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅアイソフォームに対するそれらの選択性の単なる反映ではなく、むしろ異なる細胞状況におけるＲａｆ活性の複雑な調節を反映する。Ｂ-ＲａｆＶ６００Ｅに対する生化学的選択性は、Ｒａｆ阻害剤の細胞有効性プロファイルの唯一の推進力ではない。阻害剤は、ｃ-Ｒａｆを介し非Ｖ６００Ｅ変異体株において選択的にｐＭＥＫレベルを誘導する。阻害剤は、急速に、またそれらの効力に従い用量依存的に、ｃ-Ｒａｆ特異的活性及びｐＭＥＫレベルを誘導する。基本条件下で、ＧＤＣ-０８７９に関する釣鐘状曲線はｃ-Ｒａｆへの二重刺激対阻害効果を示唆する。異なる条件でのＢ-及びｃ-Ｒａｆ経路状態はＲａｆ阻害薬力学を決定する。特徴付けの結果は図１−７に示される。
【００７０】
実施例３
Ｂ-ＲＡＦ阻害剤の投与後の肺腫瘍異種移植片における増殖
データを以下に示し、実験Ｈ３３１については図１０−１４、実験Ｈ３２７については図１５−１８に示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ＡＢ】
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【図２０ＡＢ】
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【図２０ＣＤ】
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【図２１ＡＢ】
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【図２１ＣＤ】
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【図２２ＡＢ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２ＡＢＣ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【国際調査報告】
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