(57)【要約】本発明は、患者において皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を診断し、悪性Ｔ細胞でのＮＫｐ４６受容体の異常発現を検出するための方法、及び、患者においてＣＴＣＬを診断するためのキットに関し、前記キットは、ＮＫｐ４６受容体を検出することが可能な抗体及びＴ細胞を検出することが可能な抗体を含む。さらに、本発明は、ＣＴＣＬの処置における使用のための抗ＮＫｐ４６抗体及び前記抗ＮＫｐ４６抗体を含むＣＴＣＬの処置のための医薬的組成物を指す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、該方法が、該患者から得られた生物学的サンプル中のＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現を評価する工程を含み、それにおいてＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現がＣＴＣＬを示している方法。
【請求項２】
以下の工程：
（ｉ）前記生物学的サンプルにおいてＴ細胞を検出すること、
（ｉｉ）これらのＴ細胞においてＮＫｐ４６の発現を検出すること、
（ｉｉｉ）それにおいて、これらのＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現はＣＴＣＬを示していること
を含む、請求項１記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法。
【請求項３】
以下の工程：
（ｉ）前記生物学的サンプルにおいて細胞中のＣＤ４の発現を検出すること、
（ｉｉ）前記生物学的サンプルにおいて細胞中のＮＫｐ４６の発現を検出すること、
（ｉｉｉ）それにおいて、これらの細胞中のＮＫｐ４６及びＣＤ４の発現はＣＴＣＬを示していること
を含む、請求項２記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法。
【請求項４】
前記ＣＴＣＬが、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法。
【請求項５】
前記生物学的が全血サンプルである、請求項１〜４のいずれか一項記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法。
【請求項６】
キットがＮＫｐ４６受容体を検出することが可能な結合パートナー及びＴ細胞を検出することが可能な結合パートナーを含む、患者において皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を診断するためのキット。
【請求項７】
前記結合パートナーが、ＮＫｐ４６受容体を検出することが可能な抗体及びＴ細胞を検出することが可能な抗体である、請求項６記載のキット。
【請求項８】
前記Ｔ細胞を検出することが可能な抗体が、ＣＤ４を検出することが可能な抗体である、請求項６又は７記載のキット。
【請求項９】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の処置における使用のための抗ＮＫｐ４６抗体。
【請求項１０】
前記ＣＴＣＬが、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される、請求項９記載の使用のための抗ＮＫｐ４６抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、キメラ又はヒト化抗ＮＫｐ４６抗体である、請求項９又は１０記載の使用のための抗ＮＫｐ４６抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、細胞傷害薬剤又は増殖阻害薬剤にコンジュゲートした抗体である、請求項９〜１２のいずれか一項記載の使用のための抗ＮＫｐ４６抗体。
【請求項１３】
組成物が、請求項９〜１２のいずれか一項記載の抗ＮＫｐ４６抗体を含む、ＣＴＣＬの処置における使用のための医薬的組成物。
【請求項１４】
前記ＣＴＣＬが、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される、請求項１１記載の使用のための医薬的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の診断及び処置に関する。
【０００２】
発明の背景
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、主に皮膚を含むＴリンパ腫の群を構成する。ＣＴＣＬ群は、即ち、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、セザリー症候群、リンパ腫様丘疹症、及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫を含む。セザリー症候群は、血液中でのＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のクローン拡大及びこれらの悪性Ｔ細胞の出現により特徴づけられるＣＴＣＬの攻撃的な形態である。
【０００３】
ＣＴＣＬ疾患及び特にセザリー症候群の生物学は、あまり理解されていないままである。ＣＴＣＬ及び特にセザリー症候群の現在の診断は、疑われる身体部位から採取したサンプル中での腫瘍細胞の存在又は非存在の細胞学的及び組織学的観察（皮膚生検での病理組織学的外観及び／又は脳状核を示す細胞の検出を介した血液中でのセザリー症候群細胞の存在の観察）に基づく。そのような診断方法は、著しくは、皮膚リンパ球の悪性リンパ球への形質転換の初期段階では、完全には信頼できない。
【０００４】
今日、ＣＴＣＬ治療は、非特異的な化学療法を介した腫瘍細胞アポトーシスの誘導により一時的に達成される。
【０００５】
循環悪性セザリー細胞（及び他のＣＴＣＬ細胞）の新たなマーカーが近年記載されている（特にＣＤ１５８ｋ／ＫＩＲ３ＤＬ２及びＳＣ５）（ＷＯ  ２００２  ５０１２２特許出願；Bagot M et al, 2001；Ortonne N et al, 2006；Poszepczynska-Guigne E et al, 2004；Bouaziz JD et al, 2009；Huet D et al, 2006）。しかし、ＣＤ１５８ｋ／ＫＩＲ３ＤＬ２発現は、一部の患者において、腫瘍中に異質であるように見え、患者の約１０%がそれを欠く；同様に、ＳＣ５は、また、正常な活性化リンパ球で発現しているように見える（Ortonne N et al, 2006）。このように、悪性Ｔ細胞の増殖を含む疾患例えばＣＴＣＬなど及び特にセザリー症候群の診断及び治療のためのより正確で適当な解決策についての必要性が依然としてある。
【０００６】
発明の概要
本発明は、患者においてＣＴＣＬを診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関し、前記方法が、前記患者から得られた生物学的サンプル中のＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現を評価する工程を含み、それにおいてＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現はＣＴＣＬを示している。
【０００７】
本発明は、また、患者においてＣＴＣＬを診断するためのキットを提供し、前記キットは、ＮＫｐ４６受容体を検出することが可能な抗体及びＴ細胞を検出することが可能な抗体を含む。
【０００８】
さらに、本発明は、ＣＴＣＬの処置のための抗ＮＫｐ４６抗体及び本発明の抗ＮＫｐ４６抗体を含むＣＴＣＬの処置のための医薬組成物を指す。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ＮＫｐ４６（特異的なＮＫ細胞受容体である）が、驚くべきことに、セザリー症候群（皮膚Ｔ細胞リンパ腫の攻撃的な形態）を伴う患者からの末梢血悪性ＣＤ４＋Ｔリンパ球上に発現されることを示した。このように、ＮＫｐ４６受容体は、診断のためのバイオマーカーとして及びＣＴＣＬ治療のための標的として使用してもよい。
【００１０】
定義
本明細書を通して、いくつかの用語を用いており、以下の段落において定義する。
【００１１】
用語「ＮＫｐ４６」（また、ＣＤ３３５、Ｌｙ９４、ＭＡＲ−１、ＮＣＲ１、又はＲＡＲ−１と呼ばれる）は、当技術分野においてその一般的な意味を有しており、Sivori S et al (1997)により同定されたＮＫ細胞の細胞表面受容体を指す。この用語は、自然発生ＮＫｐ４６ならびにその変異体及び修飾形態を含みうる。ＮＫｐ４６は、任意の供給源からでありうるが、しかし、典型的には、哺乳動物（例、ヒト及び非ヒト霊長類）ＮＫｐ４６、特にヒトＮＫｐ４６である。例示的なヒト天然ＮＫｐ４６アミノ酸配列がＮＰ＿００４８２０．１（ＧｅｎＰｅｐｔデータベース）に提供されており、例示的なヒト天然核酸配列がＮＭ＿００４８２９．５（ＧｅｎＢａｎｋデータベース）に提供されている。
【００１２】
本発明によれば、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。用語「抗体」は、本明細書に使用する通り、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。そのようなものとして、抗体という用語は、全抗体分子だけでなく、しかし、また、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体において、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。軽鎖の２つの型、ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、集合的にＣＨと呼ぶ）を含む。軽（ＶＬ）及び重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域が、抗原への結合認識及び特異性を決定する。軽（ＣＬ）及び重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性（例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合など）を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間での構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成される。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、全ドメイン構造及び、故に、結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、各々が、３つのＣＤＲを有する（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名される）。抗原結合部位は、従って、６つのＣＤＲ（重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む）を含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。
【００１３】
用語「キメラ抗体」は、本発明の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含む抗体を指す。
【００１４】
本発明によれば、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からの可変領域フレームワーク及び定常領域を有する抗体を指すが、しかし、本発明の抗体のＣＤＲを保持する。
【００１５】
用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示し、それにおいて、プロテアーゼパパインを用いてＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの内、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及び全Ｌ鎖が、ジスルフィド結合を通じて一緒に結合されている。
【００１６】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、プロテアーゼペプシンを用いてＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの内、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されるＦａｂよりもわずかに大きい。
【００１７】
用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。
【００１８】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマー（通常は、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される）である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成することができる、又は、ペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを結合させることにより生成することができる（例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２など）。
【００１９】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を伴う小さな抗体フラグメントを指し、フラグメントは同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を許すには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作るように強制される。
【００２０】
用語「バイオマーカー」及び「マーカー」を、本明細書において互換的に使用する。それらは、生物学的プロセス、生物学的事象、及び／又は病理学的状態の特有の指標である物質を指す。本発明によれば、生物学的マーカーは、免疫系からの細胞（特にＴリンパ球を含む）により特異的に発現される表面抗原を含む。
【００２１】
本明細書に使用する通り、用語「患者」は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）に罹患していることが疑われる被験者、好ましくはヒトを指す。
【００２２】
用語「生物学的サンプル」を、その最も広い意味において本明細書に使用する。生物学的サンプルは、一般的に、患者から得られる。サンプルは、任意の生物学的組織又は体液でありうるが、それを用いて本発明のバイオマーカーをアッセイしてもよい。しばしば、サンプルは、「臨床サンプル」、即ち、患者由来のサンプルでありうる。そのようなサンプルは、しかし、限定しないが、細胞を含みうるか又は含まないであろう体液、例えば、血液（例、全血、血清、又は血漿）を含む。用語「生物学的サンプル」は、また、生物学的サンプルをプロセシングすることにより由来する任意の材料を包含する。由来する材料は、しかし、限定しないが、サンプルから単離した細胞（又はそれらの子孫）又はサンプルから抽出したタンパク質を含む。生物学的サンプルのプロセシングは、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活化、試薬の添加などの１つ又は複数を含みうる。
【００２３】
その最も広い意味において、用語「処置する」又は「処置」は、そのような用語が適用される障害又は状態、あるいはそのような障害又は状態の１つ又は複数の症状の進行を逆転、緩和、阻害することを指す。
【００２４】
本発明の診断方法
本発明の第１の目的は、患者においてＣＴＣＬを診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関し、前記方法が、前記患者から得られた生物学的サンプルのＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現を評価する工程を含み、それにおいてＴ細胞におけるＮＫｐ４６受容体の発現はＣＴＣＬを示している。
【００２５】
本発明の一実施態様において、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は以下の工程：
（ｉ）前記生物学的サンプルにおいてＴ細胞を検出すること、
（ｉｉ）これらのＴ細胞においてＮＫｐ４６の発現を検出すること、
（ｉｉｉ）それにおいて、これらのＴ細胞におけるＮＫｐ４６の発現はＣＴＣＬを示していること
を含む。
【００２６】
Ｔ細胞の検出は、特異的Ｔ細胞マーカーの検出により実施することができる。特に、ＣＤ４を使用するが、しかし、他のマーカー（例えばＣＤ３など）を使用することができる。
【００２７】
このように、一つの特定の実施態様において、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は以下の工程：
（ｉ）前記生物学的サンプルにおいて細胞中のＣＤ４の発現を検出すること、
（ｉｉ）前記生物学的サンプルにおいて細胞中のＮＫｐ４６の発現を検出すること、
（ｉｉｉ）それにおいて、これらの細胞中のＮＫｐ４６及びＣＤ４の発現はＣＴＣＬを示していること
を含む。
【００２８】
本発明の特定の実施態様において、前記ＣＴＣＬは、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される。
【００２９】
本発明によれば、使用する生物学的サンプルはＴ細胞を含む。本発明の一実施態様において、前記生物学的サンプルは全血サンプルである。
【００３０】
細胞での特定の表面マーカー（例えばＮＫｐ−４６、ＣＤ３、又はＣＤ４など）の発現を検出するための標準的な方法が、当技術分野において周知である。例えば、方法は、患者から細胞集団を採取すること、及び、特定の表面マーカー（例、ＮＫｐ−４６、ＣＤ３、又はＣＤ４）に対して向けられた判別結合パートナーを使用することにあり、それにおいて、前記細胞は、前記表面マーカーへの前記結合パートナーにより結合される。
【００３１】
Ｔ細胞マーカー、例えばＣＤ４など（又はＣＤ３）との結合は、Ｔ細胞を選択することを許す。ＮＫｐ４６とのさらなる結合は、ＮＫｐ４６を発現するＴ細胞の特定の集団を選択することを許す。
【００３２】
特定の実施態様において、本発明の方法は、生物学的サンプルを、特定の表面マーカー（例えばＮＫＰ−４６、ＣＤ３、又はＣＤ４など）と選択的に相互作用することが可能な結合パートナーのセットと接触させることを含む。結合パートナーは、特定の表面マーカーに対して向けられた、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルでありうる抗体でよい。別の実施態様において、結合パートナーはアプタマーのセットでありうる。
【００３３】
本発明のポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスより選択される宿主動物へ適当な抗原又はエピトープを投与することにより、公知の方法に従って産生することができる。当技術分野において公知の種々のアジュバントを使用して、抗体産生を増強することができる。本発明を実行する際に有用な抗体は、ポリクローナルでありうるが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、培養中での連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、調製及び単離することができる。産生及び単離のための技術は、しかし、限定しないが、ハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む。
【００３５】
別の実施態様において、結合パートナーはアプタマーでありうる。アプタマーは、分子認識に関して、抗体の代替物を示す分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を伴う標的分子の実質的に任意のクラスを認識するための能力を伴うオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を通じて単離されうる（Tuerk C. 1997に記載する通り）。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により入手可能である。このライブラリーにおいて、各々のメンバーは、固有配列の線形オリゴマー（最終的には化学的に修飾される）である。このクラスの分子の可能な修飾、使用、及び利点が、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド方法によるコンビナトリアルライブラリーより選択される、プラットフォームタンパク質（例えば大腸菌チオレドキシンＡなど）により表示される立体構造的に制約された抗体可変領域からなる（Colas et al., 1996）。
【００３６】
本発明の結合パートナー（例えば抗体又はアプタマーなど）は、検出可能な分子又は物質（例えば蛍光分子、放射性分子、又は当技術分野において公知の任意の他の標識など）を用いて標識してもよい。一般的に（直接的又は間接的のいずれかで）シグナルを提供する標識が、当技術分野において公知である。
【００３７】
本明細書において使用する通り、用語「標識した」は、抗体又はアプタマーに関して、検出可能な物質、例えば放射性薬剤又はフルオロフォア（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体又はアプタマーに結合させる（即ち、物理的に連結させる）ことによる抗体又はアプタマーの直接的標識、ならびに、検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識を包含することを意図する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法により放射性分子を用いて標識してもよい。例えば、放射性分子は、しかし、限定しないが、シンチグラフィー試験用の放射性原子（例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８など）を含む。
【００３８】
好ましくは、表面マーカーに対する抗体は、フルオロフォアに既に共役されている（例、ＦＩＴＣ共役及び／又はＰＥ共役）。例は、Ancell Co.（Bayport, Minn.）を通じて利用可能なモノクローナル抗ヒトＣＤ６２Ｅ−ＦＩＴＣ、ＣＤＣ１０５−ＦＩＴＣ、ＣＤ５１−ＦＩＴＣ、ＣＤ１０６−ＰＥ、ＣＤ３１−ＰＥ、及びＣＤ５４−ＰＥを含む。
【００３９】
前述のアッセイは、固体支持体への結合パートナー（例、抗体又はアプタマー）の結合を含みうる。本発明の実行において使用することができる固体支持体は、基質、例えばニトロセルロース（例、メンブレン又はマイクロタイターウェル形態で）；ポリ塩化ビニル（例、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリビニリデンフルオライド；ジアゾ化ペーパー；ナイロンメンブレン；活性炭ビーズ；磁気応答性ビーズなどを含む。固体表面は、好ましくは、ビーズである。ビーズは、様々な材料（しかし、限定しないが、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、及びアクリルを含む）で作製されうる。また、ビーズは、好ましくは、蛍光標識される。好ましい実施態様において、蛍光ビーズは、Becton Dickinson Biosciences（San Jose, California）から入手可能なTruCount（商標）チューブに含まれるものである。
【００４０】
本発明によれば、フローサイトメトリーの方法は、患者から得られた生物学的サンプル中での特定の表面マーカー（例えばＮＫＰ−４６、ＣＤ３、又はＣＤ４など）を発現する細胞の存在を検出する又はレベルを決定するための好ましい方法である。
【００４１】
前記方法は当技術分野において周知である（例、(1976) Herzenber et al.(1976) Sci. Amer., 234: 108を参照のこと）。例えば、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）は、従って、生物学的サンプルにおいて所望のＴ細胞（例、ＮＫｐ４６を発現するＴ細胞）を分離するために使用してもよい。別の実施態様において、磁気ビーズを使用して、内皮微粒子を単離してもよい（ＭＡＣＳ）。
【００４２】
例えば、モノクローナル特異的抗体を用いて標識したビーズは、ＮＫｐ４６を発現するＴ細胞のポジティブセレクションのために使用してもよい。例えば、細胞は４８８nmの光を用いて励起されうる。ＦＩＴＣ及びＰＥの対数緑色及び赤色蛍光を、それぞれ５３０／３０nm及び５８５／４２nmのバンドパスフィルターを通じて測定してもよい。ＮＫｐ４６を発現するＴ細胞の絶対数を、次に、本発明の方法を実行する際に有用な特定のソフトウェアを通じて算出してもよい。
【００４３】
典型的には、以下の本明細書の実施例に記載するような蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）方法を使用して、患者から得られた生物学的サンプル中での所望のＴ細胞レベルを決定してもよい。
【００４４】
したがって、特定の実施態様において、本発明の方法は、上に記載するような生物学的サンプルを得る工程を含む；所望のＴ細胞に特異的である表面マーカーに対する両方の標識抗体を加えること、及び、既知数の固体表面を有する容器中に前記調製サンプルを入れること、それにおいて固体表面が蛍光色素を用いて標識される；それにおいて所望のＴ細胞の絶対数を算出するために、調製サンプルでＦＡＣＳフローサイトメトリーを実施すること。
【００４５】
あるいは、Ｔ細胞の特定の表面マーカーを、そのようなマーカーをコードする遺伝子の発現を測定することにより間接的に検出してもよい。
【００４６】
特定の実施態様において、細胞表面マーカーのｍＲＮＡの存在は、当技術分野において公知の方法を使用して、生物学的サンプルにおいてインサイチュ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方のフォーマットにより決定することができる。多くの発現検出方法で単離ＲＮＡを使用する。
【００４７】
単離ｍＲＮＡを、しかし、限定しないが、サザン又はノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析、及びプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、単離ｍＲＮＡを、検出中の遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ又はその部分（例えば少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、又は５００ヌクレオチド長の、本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドなど）でありうる。本発明の予後アッセイにおける使用のための他の適したプローブを、本明細書において記載する。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、問題のマーカーが発現されていることを示す。
【００４８】
１つのフォーマットにおいて、ｍＲＮＡを固体表面上に固定し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲルに流し、ゲルからメンブレン（例えばニトロセルロースなど）にｍＲＮＡをトランスファーすることによりプローブと接触させる。代替フォーマットにおいて、プローブを固体表面上に固定し、ｍＲＮＡを、例えばAffymetrix遺伝子チップアレイにおいてプローブと接触させる。当業者は、本発明のマーカーによりコードされるｍＲＮＡのレベルを検出する際での使用のための公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応することができる。
【００４９】
サンプル中のｍＲＮＡマーカーの存在を決定するための代替方法は、核酸増幅のプロセス（例、ｒｔＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、自己持続的な配列複製、転写増幅システム、Ｑ−ベータレプリカーゼ、ローリングサークル複製、又は任意の他の核酸増幅方法による）を含み、当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出が続く。
【００５０】
本発明のキット
本発明のさらなる局面は、本発明の診断方法を行うための有用な材料を含むキットを提供する。本明細書において提供する診断手順は、診断研究室、実験研究室、及び開業医により実施されうる。本発明は、これらの異なる設定において使用することができるキットを提供する。
【００５１】
被験者においてＣＴＣＬを検出するために生物学的サンプル中の本発明の特定のバイオマーカーを検出するための材料及び試薬を、キットと一緒に組み立ててもよい。
【００５２】
特に、本発明の各々のキットは、少なくともＮＫｐ４６の結合パートナーと少なくとも１つのＴ細胞マーカーの結合パートナー（例えばＣＤ４（又はＣＤ３）など）を含む。そのような結合パートナーを上に記載する。特に、前記結合パートナーは、目的のマーカーを検出することが可能な抗体である。
【００５３】
このように、本発明のさらなる目的は、患者においてＣＴＣＬを診断するためのキットに関し、前記キットは、ＮＫｐ４６を検出することが可能な抗体及びＴ細胞マーカーを検出することが可能な少なくとも別の抗体を含む。
【００５４】
特に、前記Ｔ細胞マーカーはＣＤ４である。このように、特定の実施態様において、本発明のキットにおいて、Ｔ細胞マーカーを検出することが可能な前記抗体は、ＣＤ４を検出することが可能な抗体である。
【００５５】
本発明の一実施態様において、前記キットを、患者において、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択されるＣＴＣＬを診断するために使用する。
【００５６】
結合パートナーは、より容易な検出のためにタグ付けすることができる。それは、基質表面（例、ビーズ、アレイなど）上に固定されうる又はされないであろう。例えば、本発明のキットは、本明細書に提供する、心不全リスクを予測するためのアレイを含みうる。あるいは、基質表面（例、メンブレン）が、結合パートナーの（例、ゲル電気泳動及びメンブレンへのトランスファーを介した）固定のための本発明のキット中に含まれうる。
【００５７】
また、本発明のキットは、一般的に、キットに含まれる結合パートナーと本発明のバイオマーカーの間での複合体の検出のための少なくとも１つの試薬も含む。
【００５８】
手順に依存して、キットは、さらに、抽出緩衝液及び／又は試薬、ウェスタンブロッティング緩衝液及び／又は試薬、ならびに検出手段の１つ又は複数を含みうる。手順の様々な工程を実施するためにこれらの緩衝液及び試薬を使用するためのプロトコールが、キットに含まれうる。
【００５９】
本発明のキットに含まれる様々な試薬が、固体（例、凍結乾燥）又は液体の形態で供給されうる。本発明のキットは、場合により、各々の個々の緩衝液及び／又は試薬のための様々な容器（例、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、又はボトル）を含みうる。各々の成分は、一般的に、そのそれぞれの容器に分注する、又は、濃縮形態で提供するのに適しうる。開示する方法の特定の工程を行うために適した他の容器も提供されうる。キットの個々の容器は、好ましくは、商業販売用の密閉中で維持される。
【００６０】
特定の実施態様において、キットは、本発明の方法に従って被験者におけるＣＴＣＬ診断のためにその成分を使用するための指示を含む。本発明の方法に従ってキットを使用するための指示は、被験者から得られた生物学的サンプルをプロセシングするため及び／又はテストを実施するための指示、あるいは、結果を解釈するための指示を含みうる。キットは、また、医薬品又は生物学的産物の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定されるフォームの通知を含みうる。
【００６１】
本発明の処置の方法
本発明のさらなる目的は、ＣＴＣＬの処置における使用のための抗ＮＫｐ４６抗体に関する。
【００６２】
特定の実施態様において、前記ＣＴＣＬは、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される。
【００６３】
一実施態様において、本発明は、患者において、抗ＮＫｐ４６抗体を用いて前記患者に投与する工程を含む、ＣＴＣＬを処置するための方法に関する。特定の実施態様において、前記ＣＴＣＬは、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される。
【００６４】
本発明によれば、抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫｐ４６受容体に結合し、患者において、その表面でＮＫｐ４６を発現する細胞を枯渇又は破壊することができる抗体である。
【００６５】
このように、本発明の抗ＮＫｐ４６抗体は、それを用いて処置される患者においてＮＫｐ４６を発現する悪性Ｔ細胞を枯渇する（即ち、循環悪性Ｔ細胞レベルを低下させる）ことができる。そのような枯渇は、種々の機構、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、悪性Ｔ細胞増殖の阻害及び／又は悪性Ｔ細胞死の誘導（例、アポトーシスを介して）などを介して達成されうる。
【００６６】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、同族抗原に結合した抗体への補体系の第１成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例、Gazzano-Santoro et al. (1997)に記載される通り）を実施してもよい。
【００６７】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、細胞傷害性の形態を指し、それにおいて、特定の細胞傷害性細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌抗体によって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を持つ標的細胞に特異的に結合し、その後に標的細胞を殺すことが可能になる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイ（例えば米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されるものなど）を実施してもよい。
【００６８】
本発明の抗ＮＫｐ４６抗体は、従来の方法（例えば上に記載するハイブリドーマ方法など）に従って得ることができる。当技術分野において公知の種々のアジュバントを使用して、抗体産生を増強することができる。本発明を実行する際に有用な抗体は、ポリクローナルでありうるが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００６９】
次に、上に記載する通りに抗体を産生した後、当業者は、ＮＫｐ４６を発現する細胞を枯渇させるもの、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、細胞増殖の阻害、又は細胞死の誘導（例、アポトーシスを介して）を介して細胞を枯渇させるものを容易に選択することができる。
【００７０】
ヒト化抗体及びそれらからの抗体フラグメントは、また、公知の技術に従って調製することができる。
【００７１】
特定の実施態様において、抗ＮＫｐ４６抗体は、キメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗ＮＫｐ４６抗体である。
【００７２】
別の特定の実施態様において、抗ＮＫｐ４６抗体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び最小認識単位の群より選択される抗体フラグメントである。
【００７３】
本発明は、また、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、及びＶＨ抗体を包含する。
【００７４】
抗ＮＫｐ４６抗体は、また、他の機構を介して悪性Ｔ細胞を破壊する抗体を含む。例えば、これらは、悪性Ｔ細胞表面に結合し、致死量の放射線を送達することにより、悪性Ｔ細胞の破壊を促進する標識抗体を含む。
【００７５】
特定の実施態様において、抗ＮＫｐ４６抗体は、細胞傷害薬剤又は増殖阻害薬剤に共役した抗体にありうる。
【００７６】
したがって、本発明は、細胞傷害薬剤又は増殖阻害薬剤に共役した抗ＮＫｐ４６抗体を含む免疫複合体の使用を熟慮する。
【００７７】
「増殖阻害薬剤」は、本明細書において使用する場合、細胞、特にＢ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はインビボのいずれかで阻害する化合物又は組成物を指す。増殖阻害薬剤の例は、細胞周期の進行を遮断する薬剤（例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤など）を含む。古典的なＭ期遮断剤は、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなど）を含む。Ｇ１停止させるそれらの薬剤は、また、Ｓ期停止に波及する。例えば、ＤＮＡアルキル化薬剤（例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、及び５−フルオロウラシルなど）である。
【００７８】
用語「細胞傷害薬剤」は、本明細書において使用する通り、細胞の機能を阻害もしくは防止する及び／又は細胞の破壊を起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法薬剤、例、メトトレキサート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入薬剤、酵素及びそのフラグメント（例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物、又は動物由来の小分子毒素又は酵素活性毒素など（そのフラグメント及び／又は変異体、例、ゲロニン、リシン、サポリンを含む）、ならびに以下に開示する種々の抗腫瘍薬剤又は抗癌薬剤を含むことを意図する。他の細胞傷害薬剤を以下に記載する。殺腫瘍薬剤は、腫瘍細胞の破壊を起こす。
【００７９】
本発明の抗体と細胞傷害薬剤又は増殖阻害薬剤との共役は、種々の二官能性タンパク質結合薬剤（しかし、限定しないが、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を含む）を使用して作製してもよい。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al. (1987)において記載される通りに調製することができる。炭素標識１−イソチオシアネートベンジルメチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、抗体への放射性ヌクレオチドの共役のための例示的なキレート薬剤である（ＷＯ  ９４／１１０２６）。
【００８０】
あるいは、抗体及び細胞傷害薬剤又は増殖阻害薬剤を含む融合タンパク質は、組換え技術又はペプチド合成により作製してもよい。ＤＮＡの長さは、互いに隣接する又はコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離された、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含みうる。
【００８１】
本発明の抗ＮＫｐ４６抗体は、医薬的組成物の形態で投与してもよい（以下に定義する通り）。
【００８２】
好ましくは、前記抗ＮＫｐ４６抗体は、治療的に効果的な量で投与する。
【００８３】
「治療的に効果的な量」により、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比でアテローム性動脈硬化症を処置又は防止するための十分な量の抗ＮＫｐ４６抗体を意味する。
【００８４】
本発明の化合物及び組成物の定期的な総使用量が、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められうることが理解されるであろう。任意の特定の患者についての特定の治療的に効果的な用量レベルは、以下を含む種々の因子に依存する：治療されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般健康、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置の持続時間；用いられる特定のポリペプチドとの組み合わせで又は同時に使用される薬物；及び医学的技術において周知の同類の因子。例えば、所望の治療的効果を達成するために、及び、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために要求されるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始することは、当業者の技術内で周知である。しかし、産物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される患者への投与量の症候性調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分を、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含む。効果的な量の薬物は、普通は、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００８５】
医薬的組成物
本発明のさらなる目的は、ＣＴＣＬの処置における使用のための医薬的組成物に関し、前記組成物は本発明の抗ＮＫｐ４６抗体を含む。
【００８６】
本発明の特定の実施態様において、前記ＣＴＣＬは、菌状息肉腫、形質転換した菌状息肉腫、リンパ腫様丘疹症及びＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及びセザリー症候群からなる群より選択される。
【００８７】
本発明の抗ＮＫｐ４６抗体は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により、徐放性マトリックス（例えば生物分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成しうる。
【００８８】
本発明の医薬的組成物において、活性成分は、単独で又は別の活性成分との組み合わせで、動物及びヒトに、従来の医薬的支持体との混合物としての単位投与形態で投与することができる。適した単位投与形態は、経口経路形態（例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤及び経口懸濁剤又は溶液など）、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、髄腔内及び鼻腔内投与形態及び直腸投与形態などを含む。
【００８９】
好ましくは、医薬的組成物は、注入することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、滅菌水又は生理学的食塩水の添加時に、場合に依存して、注射用溶液の構成を許す。
【００９０】
注射用の使用のために適した医薬的形態は、無菌水溶液又は分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射用溶液又は分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の混入作用に対して保護されなければならない。
【００９１】
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての本発明の化合物を含む溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物ならびに油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含む。
【００９２】
本発明の抗ＮＫｐ４６抗体は、中性又は塩の形態で組成物に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸、例えば、塩酸又はリン酸など、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、また、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。
【００９３】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適した混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散媒質でありうる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒子サイズの維持により（分散剤の場合において）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）中での使用によりもたらすことができる。
【００９４】
無菌注射用溶液は、上に列挙する種々の他の成分を伴う適当な溶媒中に、要求される量で活性ポリペプチドを取り込ませることにより調製し、必要に応じて、ろ過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基礎分散媒質及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に取り込ませることにより調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分＋先に無菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
【００９５】
製剤化時に、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的な量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態（例えば上に記載する注射用溶液の型など）で容易に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
【００９６】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適切である。これに関連して、用いることができる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に添加する又は提案された注入部位に注射しうる。投与量におけるいくらかの変動が、処置されている患者の状態に依存して必ず生じる。投与に責任のある人は、任意の事象において、個々の被験者のために適当な用量を決定する。
【００９７】
本発明の抗ＮＫｐ４６抗体を、治療用混合物内で製剤化し、約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０、又はさらには約１０ミリグラム／用量かそこらを含みうる。複数用量を投与することもできる。
【００９８】
非経口投与（例えば静脈内又は筋肉内注射など）のために製剤化される本発明の化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体；リポソーム製剤；徐放カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態を含む。
【００９９】
本発明は、さらに、以下の図面及び実施例により例証される。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして如何なる方法でも解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１．ＲＴ−ＰＣＲを、患者３、６、１２、及び１３（表１を参照のこと）（左パネル）又は健康な血液ドナー（右パネル）からの選別ＣＤ４＋Ｔ細胞上で、ＮＫｐ４６又はβアクチン特異的プライマーを使用して実施した。健康な個人の精製した末梢血ＮＫ細胞から抽出した全ＲＮＡをポジティブコントロールとして使用した。
【図２】図２．免疫沈降物を、Ｐｎｏセザリー細胞株、ＳＳ患者の選別ＣＤ４＋Ｔリンパ球、又はＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞株ＳＮＫ６の細胞溶解物で、抗ＣＤ８又はＮＫｐ４６  ｍＡｂを使用して調製した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びニトロセルロース上へのトランスファーによる分離後、沈降タンパク質が、抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂそれに続くＨＲＰ結合二次抗体、及びＥＣＬ検出システムを使用して明らかになった。矢印はＮＫｐ４６受容体の位置を示す。
【０１０１】
実施例１：セザリー症候群患者の循環悪性ＣＤ４  Ｔリンパ球での天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４６の発現及び機能。
【０１０２】
材料＆方法：
患者及び細胞
１４人の患者が本試験に含まれた。全ての患者について、セザリー症候群（ＳＳ）の診断は、臨床的、組織学的、及び生物学的基準に基づいて確立された。コントロールとして、健康なボランティアからの血液も採取した。本試験は、施設の倫理委員会（CCPPRB, Hopital Henri Mondor, Creteil, France）により承認された。ＰＢＭＣを密度勾配により単離し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を、さらに、製造者の指示（Miltenyi Biotec）に従って抗ＣＤ４結合ビーズを使用した磁気抗体細胞選別（ＭＡＣＳ）により得た。ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を使用したネガティブ選択によりＰＢＭＣから抽出した。セザリー細胞株Ｐｎｏを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し（Poszepczynska-Guigne E et al, 2004に先に記載された通り）、１０%ヒト血清（Institute of Biotechnologies, Lyon, France）、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＩＬ２（２００U/ml；Sanofi-Avantis, Labege, Franceからの寄贈）、及びＩＬ７（５ng/ml；Peprotech）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。示される場合、ＳＳ患者のＰＢＭＣを同じ条件において一晩培養した。ＮＫ細胞株ＳＮＫ６を、ＲＰＭＩ  １６４０培地＋１０%  ＳＶＦ及びＩＬ２中で増殖させた。
【０１０３】
ＦＡＣＳ分析
三重免疫標識を、抗ＫＩＲ３ＤＬ２／ＣＤ１５８ｋ  ｍＡｂ（ＡＺ１５８，  ＩｇＧ２ａ；Innate-Pharma, Marseille, Franceによりご厚意で提供された）＋ＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体、ＰＥ結合抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂ（Beckman Coulter, Villepinte, France）、及びＰＣｙ５共役抗ＣＤ３  ｍＡｂ（Beckman Coulter）を使用して実施した。対応するコントロールアイソタイプｍＡｂを、ネガティブコントロールとして使用した。分析を、ＦＣ５００サイトメーター（Beckman Coulter）を使用して実現した。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Trizol（Invitrogen）を使用して抽出し、先に記載された通りに（Namekawa T et al, 200）逆転写に供した。ｃＤＮＡ増幅は、ＮＫｐ４６について特異的なプライマーを用いた標準的な手順に従って行い、５２２bpの産物に導いた。βアクチンの増幅を内部コントロールとして実施した。ＰＣＲ産物を１%アガロースゲルで分離した。
【０１０５】
細胞の活性化、免疫沈降、及び免疫ブロット
細胞を、１μg/mlの抗ＣＤ３（ＣＤ３ｘ３，  ＩｇＧ１；局所的に産生される）又はＮＫｐ４６  ｍＡｂ（R&D Systems）単独又は組み合わせで５分間にわたり室温でインキュベートした。必要な場合、抗ＣＤ１６  ｍＡｂを使用して、細胞に加えられた抗体の量を標準化した。細胞の活性化を、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（３μg/ml；Jackson ImmunoResearch）の添加及びその後の３７℃で５分間にわたるインキュベーションにより実施した。洗浄及び溶解後、プロテインＧセファロースビーズを、活性化工程の間に標的となる受容体を沈殿させるために、後核上清に直接的に加えた。
【０１０６】
ＮＫｐ４６の免疫沈降のために、抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂを細胞溶解物に加えて、インキュベーションを４℃で１時間にわたり実施した。抗ＣＤ８  ｍＡｂ（Beckman Coulter）をアイソタイプコントロールｍＡｂとして使用した。免疫沈降物を、その後、プロテインＧセファロースビーズを用いて回収した。
【０１０７】
免疫複合体を、示す通り、還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−８%  ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をニトロセルロースメンブレン上にエレクトロトランスファーし、抗ホスホ−ＣＤ３ζ（Tebu-Bio）、−ＣＤ３ζ（Tebu-Bio）、又は−ＮＫｐ４６（Tebu-Bio）ｍＡｂを用いた免疫ブロットに供した。顕色は、製造者の推奨に従って、充当するＨＲＰ共役二次抗体及びＥＣＬ検出システムを用いて実現した。
【０１０８】
結果
ＳＳを伴う患者のＰＢＭＣでのＫＩＲの発現に関する本発明者らの以前の研究は、大半の場合において、信頼できるセザリー細胞マーカーとしてのＫＩＲ３ＤＬ２／ＣＤ１５８ｋの特徴付け、及び、稀な場合において、悪性細胞表面での追加のＨＬＡ−Ｃ特異的ＫＩＲの検出に導いた。これらの観察によって、本発明者らは、ＮＣＲファミリーに属するＭＨＣクラスＩ非特異的ＮＫ細胞表面受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６の可能な発現をさらに研究することが促された（Pessino A et al, 1998）。本発明者らの予備データはＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４発現プロファイルに関する明かな解釈を与えないため、本発明者らはＮＫｐ４６に注目の焦点を合わせた。フローサイトメトリー分析では、ＳＳを伴う全１４人の患者においてＣＤ１５８ｋ＋集団の検出を許し、ゲートＣＤ３＋Ｔリンパ球の７．６〜１００%（平均：５１．１%）を占めた（表１）。これらの細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞として同定されたことに注目すること（悪性細胞が、疾患の時間経過の間にＣＤ４の発現を失った患者８を除く）。著しくは、ＣＤ３＋ＮＫｐ４６＋細胞の明かなサブセットが、１人（患者９）を除く、全てのＳＳ患者から得られたＰＢＭＣにおいて証明された（平均：４３．７%）。ＣＤ１５８ｋ＋ＮＫｐ４６＋細胞の平均%の分析によって、この細胞集団が、ＣＤ３＋表現型を表示し、従って、ＮＫ細胞ではなく、しかし、悪性セザリー細胞に対応しうることが明らかになった（表１）。最後に、ＣＤ３＋ＣＤ１５８ｋ＋又はＣＤ３＋ＮＫｐ４６＋Ｔリンパ球の非有意なパーセンテージが、健康な個人から単離したＰＢＭＣの間で検出され（ｎ＝４、表１）、発現のこのパターンがセザリー患者の腫瘍細胞に特異的であることが確認された。
【０１０９】
ＮＣＲの発現が、サイトカインの添加時にＮＫ細胞において影響を受けないことが示されたが、多数のＴリンパ球受容体の発現が、刺激条件下で誘導又は増加されることが報告された。フローサイトメトリー分析は、従って、ＩＬ２及びＩＬ７の混合物に暴露された細胞で実施した。これらの培養条件下で、全ＣＤ３＋ＣＤ１５８ｋ＋ＮＫｐ４６＋Ｔリンパ球のパーセンテージにおける主要な改変は、全てのセザリー患者（患者９の例外を伴う）について観察されなかった（表１）。実際に、この場合において、ＣＤ３＋ＣＤ１５８ｋ＋Ｔ細胞の増加パーセンテージが、ＩＬ２＋ＩＬ７処理時に得られた。また、ＮＫｐ４６発現は、新しく単離された細胞では見られず、インターロイキンの添加に続いて、ＣＤ３＋ＣＤ１５８ｋ＋Ｔ細胞で検出可能となり、ＣＤ３＋ＣＤ１５８ｋ＋ＮＫｐ４６＋表現型を示す悪性細胞の検出をもたらした。また、セザリー細胞が大半の患者においてＣＤ１５８ｋを発現することが見出されたが、ＣＤ１５８ｋ−腫瘍細胞のサブセットの検出に導く悪性Ｔ細胞クローンによるＣＤ１５８ｋの異種発現も証明された（Ortonne N et al, 2006）。この後の場合において、ＣＤ３＋ＣＤ１５８ｋ−亜集団がＮＫｐ４６＋細胞として同定され、ＣＤ１５８ｋ発現を欠く悪性リンパ球のサブセットが、インターロイキンへの暴露時にＮＫｐ４６免疫標識を通じて効率的に検出されうることを示唆する。ＮＫｐ４６のインターロイキン誘導性発現は、健康なドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞では見られず（表１）、患者６及び９について観察された固有の発現プロファイルを推測する。
【０１１０】
セザリー細胞によるＮＫｐ４６の発現を確かめるために、全ＲＮＡをＳＳ患者又は健康な個人の選別ＣＤ４＋Ｔリンパ球から調製し、ＲＴ−ＰＣＲ実験において使用した。図１に示す通り、ＮＫｐ４６  ｍＲＮＡの存在が、ＳＳ患者３、６、１２、及び１３から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞において証明されたが、しかし、健康な血液ドナーから得られたものではされなかった。二本鎖シークエンシングによって、さらに、増幅産物がＮＫｐ４６  ｃＤＮＡに対応することが確認された。検出されたＮＫｐ４６  ｍＲＮＡのレベルは、ＣＤ３＋ＮＫｐ４６＋循環細胞のパーセンテージと比例し、弱い悪性集団が患者１３についてのほとんど検出可能ではないＮＫｐ４６転写物に導き、上昇した腫瘍含量がＮＫｐ４６  ｍＲＮＡの強い検出に対応した（患者３、６、及び１２）ことに注目すること。ＮＣＲの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたセザリー細胞株又は患者の選別ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞溶解物から調製されたＮＫｐ４６免疫沈降物で実施した抗ＮＫｐ４６免疫ブロットによりさらに確認された（図２）。このように、セザリー細胞株及び代表的な患者３からの循環悪性細胞の両方におけるＮＫｐ４６の特異的で効果的な検出が、コントロールＮＫ細胞株において得られたものと等しい量で観察された（図２Ｂ）。全体では、これらのデータによって、ＮＫｐ４６がセザリー細胞において効率的に発現され、循環悪性細胞の新たな信頼できるマーカーを示しうることが確立された。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
実施例２：ＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及び菌状息肉腫の生検から単離された皮膚リンパ球によるＮＫｐ４６の発現。
【０１１３】
ＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及び菌状息肉腫を伴う患者からの皮膚生検を得た。ＣＴＣＬの他の型がＮＫｐ４６を発現するか否かを決定するために、本発明者らは、ＣＤ３０＋皮膚リンパ腫又は菌状息肉腫を伴う患者から得た皮膚生検からリンパ球を単離した（Oshtory S, Apisarnthanarax N, Gilliam AC, Cooper KD, Meyerson HJ. Usefulness of flow cytometry in the diagnosis of mycosis fungoides. J Am Acad Dermatol. 2007; 57: 454-62.）。フローサイトメトリー分析では、ゲートリンパ球におけるＣＤ３＋ＮＫｐ４６＋細胞の有意なサブセットの存在が明らかになる。これらの結果によって、ＮＫｐ４６が、ＣＤ３０＋皮膚リンパ腫及び菌状息肉腫を含むＣＴＣＬｓの全ての型についての特異的マーカーであることが明らかに確立された。重要なことに、非形質転換の菌状息肉腫がＮＫｐ４６を発現するという事実は、それがＣＴＣＬ診断のための初期マーカーに対応しうることを示す。セザリー症候群について図１に示す通り、ＮＫｐ４６  ｍＲＮＡの同様の検出が、菌状息肉腫の生検から単離された皮膚リンパ球を用いて得られた。
【０１１４】
参考文献
本願を通して、種々の参考文献が、本発明が関係する技術分野の状態を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。
【０１１５】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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