(57)【要約】  最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする方法が、一般に、撮像装置の暗画素強度を決定し；最適露光時間で第１の画像を取得し；最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第１の画像における１つ以上の画素の画素強度を調整することを含む。【選択図】  図１
2013546083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された露光時間に対して、最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする方法であって、
撮像装置の暗画素強度を決定する段階と、
最適露光時間で第１の画像を取得する段階と、
前記最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、前記暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、前記第１の画像における１つ以上の画素の画素強度を調整する段階と
を含む方法。
【請求項２】
前記暗画素強度を決定する段階が、
露光時間をゼロに設定する段階と、
強度画像を取得する段階と、
前記強度画像全体の平均強度を計算する段階
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記最適露光時間が、前記撮像装置の１つ以上の設定に少なくとも部分的に基づく、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記第１の画像が生体物質の蛍光顕微鏡画像を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生体物質が第１のバイオマーカを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカが蛍光バイオマーカである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記生体物質の前記第１の画像が、蛍光チャネルに信号を示す、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記生体物質が第２のバイオマーカを含んでいて、当該方法が、第２の画像を同時に又は異なる最適露光時間で撮影する段階をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記第２の画像における１つ以上の画素の画素強度を、前記最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、前記暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて調整する段階をさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の画像及び前記第２の画像を位置合わせして、複合画像を形成する段階をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記生体物質の自己蛍光画像を取得する段階をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の画像から前記生体物質の前記自己蛍光画像をサブトラクションする段階をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記生体物質にバイオマーカを適用する段階をさらに含み、前記第１の画像は、前記バイオマーカが前記生体物質に適用された後に取得される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記自己蛍光画像及び前記第１の画像を位置合わせする段階をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記生体物質に別のバイオマーカを適用し、前記生体物質の第２の画像を取得する段階をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の画像及び前記第２の画像を位置合わせする段階をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
各々がチャネルに対応する１つ以上の追加バイオマーカを前記生体物質に適用し、前記バイオマーカチャネルの各々について１つ以上の追加画像を取得する段階をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の画像、前記第２の画像、及び前記追加画像を位置合わせして、前記チャネルの複合画像を形成する段階をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記画素強度を調整する段階が、以下の式を少なくとも部分的に用いる、請求項１記載の方法。
【数１】
2013546083.tif 000015
式中、ｔ１は、前記最適露光時間であり、ｔ２は、前記第２の露光時間であり、Ｉｔ１は、前記露光時間ｔ１の間の所与の画素の信号強度であり、Ｉｔ２は、前記露光時間ｔ２の間の推定信号強度であり、ＤａｒｋＰｉｘｅｌＩｎｔｅｎｓｉｔｙは前記撮像装置の前記暗画素強度である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、選択された露光時間又は異なる露光時間に対して、所与の露光時間で撮影された画像をスケーリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光マーカで染色された生物試料のデジタル撮像の分野では、異なる露光時間で撮影された同一視野の画像を比較する必要が生じている。一例では、生体物質の試料から自己蛍光を除去する必要がある。生体物質の試料は、ある生物学的特徴に関して組織試料を調査するのに使用される一般的な蛍光マーカの周波数範囲と重なる周波数範囲で蛍光を発する物質を含む。例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５などの安定した蛍光染料に結合する関心タンパク質に対する抗体を用いて試料を染色することが、かなり一般的である。例えば、ヒトの乳癌組織が、Ｃｙ３に結合したｐ５３腫瘍抑制タンパク質に対する抗体で染色されるであろう。
【０００３】
そのような蛍光マーカで染色された組織の顕微鏡画像から自己蛍光を除去する１つの技法が、蛍光マーカで染色する前に同一視野の画像を撮影し、次いで、画素毎に、無染色画像において観察された信号強度を染色画像から除去することである。所望の結果は、蛍光マーカのチャネルに記録されている蛍光信号がまさに蛍光マーカの結合による補正画像である。しかし、高精度画像をもたらすそのようなサブトラクションでは、２つの画像の露光時間は実質的に同じであるべきである。
【０００４】
同じ露光時間で蛍光画像及び蛍光マーカ染色画像を撮影することが都合が悪いか又は不可能である例がある。一般に、各種の画像には、最大数の画素から信号を得ることとその記録チャネルを飽和状態にする任意の画素からの信号を避けることとの間の最良のバランス、及びまた、真の信号とバックグラウンド信号との間の最良のバランスをもたらす、それ自体の最適露光時間がある。いくつかの場合には、許容不可能なほど多数の画素が飽和状態になるような長い露光時間では、画素は更なる信号が検出できないほど多数の信号を受信していることを意味するため、自己蛍光を測定するのに望ましいものである限り、ある露光時間をいくつかの蛍光マーカで用いることは不可能であるか又は実践的でない可能性がある。
【０００５】
したがって、露光時間が異なっていた場合、蛍光画像の画素の信号が何であったかを推定する必要がある。式Ｉｔ２＝Ｉｔ１×（ｔ２／ｔ１）を用いることでそうすることが試みられてきており、Ｉｔ１は、露光時間ｔ１の強度であり、ｔ２は、露光時間ｔ２の推定強度である。しかし、そのような推定の結果は十分満足できるものではなかった。この推定時に、式Ｉｔ２＝｛（Ｉｔ１−ｔ１でのバックグラウンド）×（ｔ２／ｔ１）｝−（ｔ２でのバックグラウンド）に従って、各露光時間についてバックグラウンドをサブトラクションすることにより改善が試みられてきたが、推定は、依然として所望されるほど正確ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／１４１９５９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の方法及びシステムは、実際の画像を撮影するのに使用されるデジタルカメラの暗画素強度を用いて、異なる露光時間での実際の信号強度で始まる、所与の露光時間での顕微鏡試料の蛍光画像の画素からの信号強度の高精度の推定を実現する。
【０００８】
選択された露光時間に対して、最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする本方法の例が、一般に、撮像装置の暗画素強度を決定し；最適露光時間で第１の画像を取得し；最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第１の画像における１つ以上の画素の画素強度を調整することを含む。暗画素強度を決定する段階が、露光時間をゼロに設定し；強度画像を取得し；強度画像全体の平均強度を計算することを含んでいてもよい。最適露光時間は、通常、撮像装置の１つ以上の設定に少なくとも部分的に基づく。
【０００９】
一例では、第１の画像は生体物質のものであり、生体物質は、染色されているか又は第１のバイオマーカを含んでいてもよい。バイオマーカは、蛍光バイオマーカを含んでいてもよく、それにより、生体物質の第１の画像は、バイオマーカに対応する蛍光チャネルの信号を示す。生体物質は、第２のバイオマーカで染色されてもよく、それにより、本方法は、同じ又は異なる最適露光時間で第２の画像を撮影することをさらに含む。本方法は、最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第２の画像における１つ以上の画素の画素強度を調整することをさらに含んでいてもよい。第１の画像及び第２の画像は、合成画像を形成するために位置合わせされてもよい。画像は、例えば１つ以上の形態学的特徴を特定し且つ特定された形態学的特徴を用いて画像を揃えるか又は共に位置合わせすることにより、位置合わせされてもよい。また、画像は、限定されないが画像の画素を揃えるなどの他の方法を用いて位置合わせされてもよい。
【００１０】
本方法は、第１の画像から生体物質の自己蛍光画像を取得すること、及びいくつかの例では、第１の画像から生体物質の自己蛍光画像をサブトラクションすることをさらに含んでいてもよい。また、該自己蛍光画像は、第１の画像及び／又は第２の画像と共に位置合わせされてもよい。本方法は、第１の画像及び第２の画像を取得することに限定されない。所与の用途に関する必要又は所望に応じて、物質に関して任意の数の画像が撮影され、スケーリングされ、且つ／又は位置合わせされてもよい。画像の任意の２つの以上が、複合画像を形成するために位置合わせされてもよい。
【００１１】
また、本方法は、生体物質を染色するか又はそれに１つ以上のバイオマーカを適用する段階を含んでいてもよく、第１の画像は、生体物質にバイオマーカが適用された後に取得される。該バイオマーカは１つ以上のチャネルに適合されていてもよい。バイオマーカは、同時に又は順次、物質に適用されてもよい。画像が、バイオマーカチャネルに対応するフィルタを使用して撮影されてもよい。
【００１２】
本発明のこれらの且つ他の特徴、態様、及び利点は、図面を通じて同様の文字が同様の部分を示す添付図面を参照して以下の詳細な説明を読むと、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ダークフレームの平均画素強度とデジタル撮像装置に関連する露光時間との間の相関の例のグラフである。
【図２Ａ】露光時間が２００ミリ秒である画像の図である。
【図２Ｂ】露光時間が５００ミリ秒である図２Ａの画像の図である。
【図２Ｃ】図２Ａ及び図２Ｂの画素強度の散布図である。
【図３】所与の関心領域での画素強度に関する露光時間の影響の例のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法及びシステムの例の１つ以上が、実際の画像を撮影するのに使用されるデジタルカメラの暗画素強度を用いて、異なる露光時間での実際の信号強度で始まる、所与の露光時間での顕微鏡試料の蛍光画像の画素からの信号の強度の高精度の推定を実現する。
【００１５】
自己蛍光画像及び染色画像が異なる露光時間でキャプチャされることが多いが、画像サブトラクションが、同じ露光時間を用いて２つの画像が得られることを必要とする。画素強度は、一般に、画像がカメラの線形範囲で取得される限り露光時間に対して線形であるが、通常はカメラにより設定される切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）が存在する。この説明のために、この切片は暗画素強度と呼ばれる。暗画素強度は、無光及びゼロ露光時間という条件下の画素強度である。暗画素強度は、カメラの読出しノイズ（電子／画素）、利得、及びＤＣオフセットにより決定される。画素取得設定の暗画素強度を知ることにより、又はそれを決定することにより、１つの露光時間で取得される画像が、異なる露光時間での画像へ線形スケーリングされてもよい。暗画素強度は、例えば無光及び最少露光時間で画像を得ることにより、又は一連の露光時間で画像をキャプチャすることで強度を間接的に計算することにより、測定されてもよい。
【００１６】
露光時間が蛍光顕微鏡画像取得中のパラメータであり、一般に、数ミリ秒から２秒に及ぶが、必ずしもこの範囲に限定されない。正確な露光時間は、蛍光信号の線形表示を維持するために重要である。しかし、やはり、アナログ利得、デジタル利得、オフセット及びビニングを含むがそれらに限定されないデジタル画像に影響を及ぼす、取得中の他のパラメータがある。
【００１７】
選択された露光時間に対して、最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする本方法の例が、一般に、撮像装置の暗画素強度を決定し；最適露光時間で第１の画像を取得し；最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第１の画像における１つ以上の画素の画素強度を調整することを含む。暗画素強度を決定することは、露光時間をゼロに設定し；強度画像を取得し；強度画像全体の平均強度を計算することを含んでいてもよい。最適露光時間は、通常、撮像装置の１つ以上の設定に少なくとも部分的に基づく。例では、例えば所与の撮像装置がゼロ露光時間で設定できない場合、露光時間からゼロの場合が推定されるか、又は所与の撮像装置が許容可能な、可能な限り低い設定に設定されてもよい。
【００１８】
平均強度が計算された場合、暗画素強度の信号値が一次元で適用されてもよい。例えば、画像がゼロ露光時間で取得された場合、それは２次元マトリクスに拡張されてもよい。また、画像は平均化されてもよい。例えば、補償フィルタはスカラ値又は配列値のどちらかであってもよい。
【００１９】
一例では、第１の画像は生体物質のものであり、生体物質は、染色されているか、又は第１のバイオマーカを含んでいてもよい。バイオマーカには蛍光バイオマーカが含まれている可能性があり、それにより生体物質の第１の画像は、バイオマーカに対応する蛍光チャネルに信号を示す。生体物質は、第２のバイオマーカで染色されてもよく、それにより、本方法は、同じ又は異なる最適露光時間で第２の画像を撮影することをさらに含んでいてもよい。本方法は、最適露光時間とは異なる第２の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第２の画像における１つ以上の画素の画素強度を調整することをさらに含んでいてもよい。第１の画像及び第２の画像は、合成画像を形成するために位置合わせされてもよい。また、最終画像が２つ以上の画像から計算されてもよく、例えば、１つの画像が別の画像からサブトラクションされてもよい。画像は、例えば１つ以上の形態学的特徴を特定し且つ特定された形態学的特徴を用いて画像を揃えるか又は共に位置合わせすることにより、位置合わせされてもよい。また、画像は、限定されないが画像の画素を揃えるなどの他の方法を用いて位置合わせされてもよい。
【００２０】
本方法は、生体物質の自己蛍光画像を取得すること、いくつかの例では、第１の画像から生体物質の自己蛍光画像をサブトラクションすることをさらに含んでいてもよい。また、自己蛍光画像は、第１の画像及び／又は第２の画像と共に位置合わせさてもよい。本方法は、第１の画像及び第２の画像を取得することに限定されない。所与の用途に関する必要又は所望に応じて、物質に関して任意の数の画像が撮影され、スケーリングされ、且つ／又は位置合わせされてもよい。画像の任意の２つの以上が、複合画像を形成するために位置合わせされてもよい。
【００２１】
また、本方法は、生体物質に対して染色するか又は１つ以上のバイオマーカを使用する段階を含んでいてもよく、第１の画像は、生体物質にバイオマーカが適用された後に取得される。バイオマーカは、１つ以上のチャネルに適合されていてもよい。バイオマーカは、同時に又は順次、物質に適用されてもよい。画像が、バイオマーカチャネルに対応するフィルタを使用して撮影されてもよい。
【００２２】
本方法及び本システムに顕微鏡が使用されて、蛍光物質から発せられる光子を収集し、それらを、電荷結合素子（ＣＣＤ：ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラ又は電荷結合素子検出器などの撮像装置へ中継してもよい。ＣＣＤアレイ検出器は光子を光電流に変換し、光電流は電圧に変換される。アレイ内の各検出器電圧は、最終的に、光子強度を示す画素値にデジタル化される（Ａ／Ｄ変換、例えば、アナログ利得及びデジタル利得）。最高科学グレードのＣＣＤカメラが、０から４０９５に及ぶ画素値を有する１２ビットの出力を有する。量子効率（Ｑｅ）及びノイズの両方が、ＣＣＤ検出器の感度をもたらす。ＣＣＤによりキャプチャされていない光子が、一般に損失として見なされ、感度の低下をもたらす。ノイズが、３つの成分：１）光検出器に固有であり、入射光子なしで作り出される（主として熱的に生成される）スプリアス信号を指す、暗ノイズと；２）光子のランダム到着に起因する光電流における統計変動を指す、光子ノイズと；３）光電流をデジタルワードに変換する成分により生じる合成ノイズを指す、（読出しノイズ（ｒｅａｄ  ｎｏｉｓｅ）としても既知の）読出しノイズ（ｒｅａｄｏｕｔ  ｎｏｉｓｅ）と、に集約されることが多い。集合的に、これらのノイズ成分はカメラノイズと呼ばれてもよく、ＣＣＤ上の電子信号を定量化する工程中に導入される可能性がある誤差を表す可能性がある。信号対ノイズ比（ＳＮＲ）は次の式で決定される。
【００２３】
【数１】
2013546083.tif 000003
式中、ＰはＣＣＤ上の光子束（信号）入射（光子／画素／秒）であり、ＢはＣＣＤ上のバックグラウンド光子束入射（光子／画素／画素）であり、ｔは積分時間又は露光時間（秒）であり、Ｄは電子／画素／秒の暗電流であり、Ｎｒは読出しノイズ（二乗平均平方根電子／画素）である。ＳＮＲは、時間／速度依存的であり、積分時間が長いほど高いＳＮＲを生じる。したがって、比率（フレーム／秒）と検出限界との間にトレードオフがある。ＳＮＲは、積分時間の平方根に比例する。例えば、蛍光顕微鏡を使用して異なるタンパク質発現レベルを関連付ける工程では、各タンパク質に異なる積分時間を用いることが望ましい可能性がある。デジタル画像の画素強度（例えば、タンパク質の染色強度）への暗電流、読出しノイズ、及び露光時間の影響は、定量化の精度に影響を及ぼす。
【００２４】
ＣＣＤカメラの出力は、最終的に、光電子から電圧への変換により作り出されるデジタルワードであり、該デジタルワードは必要に応じて増幅され、アナログデジタル変換器（ＡＣＤ）により処理される。その処理に関連するノイズ項に関する短い考察が続く。電圧信号は、以下の式に従ってＣＣＤを含む個々の光検出器により生成される。
【００２５】
【数２】
2013546083.tif 000004
本方法の１つ以上の例では、所与の露光時間で測定される信号強度から暗画素値をサブトラクションし、この差に、実際の画像の露光時間による推定が所望される露光時間の比率を掛け、この結果から暗画素強度をサブトラクションすることにより推定が得られる。本方法の一例が、アルゴリズムＩｔ２−ＤａｒｋＰｉｘｅｌＩｎｔｅｎｓｉｔｙ＝（ｔ２／ｔ１）×（Ｉｔ２−ＤａｒｋＰｉｘｅｌＩｎｔｅｎｓｉｔｙ）を用いることを含む。
【００２６】
暗画素強度は、ゼロ露光時間での単一の測定を用い、各々が異なる露光時間でいくつかの測定を行い、ゼロ露光時間の場合を推定することなどの種々の方法で決定されてもよい。蛍光顕微鏡で使用されるようになされたほとんどのデジタルカメラにより、画像がゼロ露光時間で撮影されることが可能になる。１つ以上の例では、これには、照明源から隔絶されているカメラで画像を撮影することが含まれ、その設定に依存することは試料なしで画像を撮影することを含んでもよい。ソフトウェアを使用して、視野内の全画素に亘る平均強度値を得ることができる。一例では、この値は単に暗画素強度として用いることができるだけであるが、別の例では、各露光時間の平均値を用いて、ゼロ露光時間の場合に戻って推定してもよい。そのような推定を実施する際に、平均強度は露光時間の一次関数であると考えられる可能性がある。
【００２７】
暗画素強度は、共通の測定チャネルに亘って同一である可能性がある。したがって、その値は、一般に、その値を決定するのに使用される測定チャネルとは無関係である。
【００２８】
また、本発明の方法の１つ以上の例が、暗画素強度を用いて自己蛍光補正の精度を向上させることを含んでいてもよい。そのような補正は、第２の画像において行われる測定を用いて第１の画像を補正することを含んでいてもよい。この第２の画像は、第１の画像とは異なる露光時間で撮影されてもよく、したがって、２つの画像のうちの一方が、他方の画像の露光時間で撮影されていたらそうであったであろうものに調整されてもよい。
【００２９】
本方法の１つ以上の例が、所与のカメラ設定の暗画素強度を決定して、蛍光顕微鏡で画像を撮影する際に所与の画素における強度への露光時間の影響の予測を可能にすることを含む。顕微鏡を通して蛍光画像を撮影するようになされたデジタルカメラ装置の暗画素強度に関して、最初の決定がなされる。暗画素強度は、所与の装置設定に少なくとも部分的に依存している可能性があり、その設定の全蛍光チャネルに関して同一である可能性がある。そのような値は、次いで、異なる露光時間での画素における強度の測定値からもたらされる、所与の露光時間の所与の画素における強度の予測又は推定に用いられてもよい。この予測を用いて、生体試料の画像から自己蛍光の影響を除去してもよい。所与のカメラ設定の暗画素強度は、例えばゼロ露光時間での測定、又はいくつかの露光時間で行われた測定からのゼロ露光時間の場合の推定から決定されてもよい。いずれかの例では、適切なソフトウェアが使用されて、デジタルカメラが読み出し且つ平均値を提示する全画素からの信号の強度を合計してもよい。
【００３０】
第１の例では、照明なしで読出しがカメラから行われる。これは、閉じられたカメラへの光の入力を調節するシャッタが閉じた状態で、カメラ出力からの読出しを行うことにより達成されてもよい。暗画素の読出しは、所与の露光時間、例えば画素信号がカメラから読み出される時間間隔、に依存している。読出しは複数の露光時間で行われてもよい。例えば、複数の読出しが、１ミリ秒と５００ミリ秒との間に行われてもよく、線形回帰式を使用してゼロ露光時間での値を予測してもよい。また、読出しは、例えば１ミリ秒などの非常に短い時間間隔で行われてもよい。
【００３１】
後者の例では、暗画素強度は、様々な露光時間で所与の蛍光チャネルで撮影される、同一視野の一連の画像から決定されてもよい。画素信号強度平均が、例えばカメラにより読み出される全画素からの信号を集約することにより、各露光時間について生成されてもよく、この値を関連する画素数で割って平均値をもたらしてもよい。次いで、線形回帰分析を用いて、露光時間と平均画素信号強度との間の関係を決定してもよい。そのような関係は、暗画素強度である、ゼロ露光時間での信号強度を予測するのに用いられてもよい。露光時間と平均画素信号強度との間の関係は、画素が入射光で飽和状態にならなかった露光時間の範囲に亘ってほぼ線形であり、それにより、画素の信号出力は、もはや、画素が暴露される入射光に比例していない。
【００３２】
特定の露光時間での画素信号強度の向上した予測は、自己蛍光の影響に関して所与の画像を調節又は補正するのに用いられてもよい。所与の蛍光画像から自己蛍光の影響を決定し除去する際に、関心特徴を表示する画像にとって最適でないか又はさらには実践的でない露光時間が用いられてもよい。例えば、試料物質の自己蛍光を測定する場合、望ましい信号対ノイズ比を得るための所与の蛍光チャネルの露光時間は、そのチャネルにおいて有効な蛍光マーカで染色された後、試料の画像に通常は最適である時間より長い必要がある可能性がある。染色剤が向けられる特徴の多数を含むために試料が染色剤のかなりの量を吸収した場合、自己蛍光を決定するための最適露光時間より、染色画像の最適露光時間が大幅に短い可能性がある。また、画素が暴露される入射光量が飽和レベルをさらに超えて増大した場合、より長い露光時間で、試料画像の画素は、それ以上の信号を供給することができないように飽和状態になるであろう。
【実施例】
【００３３】
カメラには、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ−ＥＲ−１２ＡＧ深冷デジタルカメラ（型：Ｃ４７４２−８０−１２ＡＧ、浜松市、日本）を使用した。その暗電流は０．０３電子／画素／秒であった。読出しノイズは６ＲＭＳ電子／画素である。撮像装置は、２０×Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ（ＮＡ＝０．８）を備えたＺ１正立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．  Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＪ）であった。ＤＡＰＩフィルタセット（励起＠３６５／４０ｎｍ及び発光＠４４５／５０ｎｍ）、Ｃｙ３フィルタキューブ（励起＠５５０／２５ｎｍ及び発光＠６０５／７０ｎｍ）、及びＣｙ５フィルタキューブ（励起＠６４０／３０ｎｍ及び発光＠６９０／５０ｎｍ）を使用してグレースケール画像を取得した。アナログ利得、デジタル利得、アナログオフセット、及びデジタルオフセットを全てゼロに設定した。
【００３４】
試料を用意するために、パラフィン包埋ＬＮＣａＰ細胞ＩＨＣ制御ＳｉｇｎａｌＳｌｉｄｅ（商標）（＃８１０１）をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手した。乳癌スライドをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から入手した。正常皮膚スライドをＢｉｏｃｈａｉｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）から入手した。標準的な脱ろう及び抗原回復処理の後に、ＬＮＣａＰ細胞をウサギモノクローナルグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）抗体（１：５０、Ｃａｔ＃ＣＳ９３１５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰA）と共役するロバ抗ウサギ二次抗体を、室温で１時間インキュベートした（１：２５０）。乳癌スライド及び皮膚組織スライドをＡＬＣＡＭ抗体で染色した（１：４０、製品番号：ＮＣＬ−ＣＤ１１６、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ、Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ、ＩＬ）。Ｃｙ３及びＣｙ５二次抗体と共役するロバ抗マウス抗体を乳癌スライド及び皮膚組織スライドそれぞれに使用した。全スライドを、最終的にＤＡＰＩで対比染色し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ（Ｈ１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を取り付けた。
【００３５】
暗画素強度を決定するために、反射体を閉じたままにして、カメラに進入する光を遮断した。異なる露光時間（１、５０、１００、２５０、５００ミリ秒）を用いて、３つ組の画像（サンプルなし）を取得した。画像をＺＶＩフォーマットで保存して、取得設定及びＴＩＦ強度生値を維持した。その後、各画像をＩｍａｇｅＪ  ＢｉｏＦｏｒｍａｔ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒで読み出し、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、バージョン１．４２ｄ）を使用して各画像の平均強度を測定した。
【００３６】
各画素において異なる露光時間で得られた２つの画像の画素強度を相関させるために、ＳｉｇｎａｌＳｌｉｄｅを使用して、２００ミリ秒及び５００ミリ秒で２つの画像をキャプチャした。該画像をＴＩＦＦフォーマットにエクスポートし、その後、ＭＡＴＬＡＢ画像処理ツールボックス（ＭａｔｈＷｏｒｋ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）により読み出した。画素強度を、１３４４×１０２４の寸法を有する２つのマトリクスに格納した。対応する位置の画素強度を比較するために、２Ｄマトリクスを１Ｄマトリクス（１３７５６２５６×１）に「再形成」した。ＭＡＴＬＡＢ統計ツールボックスを使用して、２つの１Ｄマトリクス間で線形回帰を実施した。
【００３７】
関心領域（ＲＯＩ）レベルでの画素強度と露光時間との間の関係を調査するために、膜タンパク質であるＡＬＣＡＭで染色された正常皮膚スライド及び乳癌スライドを使用した。これらのスライドを、光を用いず、光を用い且つ１、２、４、８、１６、３２、６４、９６、１２８、１６０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００ミリ秒の露光時間で撮像した。各露光時間につき２つの画像を得た。バックグラウンド領域（組織なし）を、ＩｍａｇｅＪの描画機能を使用して手動で選択した。ＤＡＰＩバックグラウンド及びＣｙ３バックグラウンドを、ＲＯＩマネージャ機能を使用し且つバックグラウンド領域のみを選択して定量化した。１６ミリ秒（最適露光時間）で露光されたＤＡＰＩチャネル画像に閾値処理してＤＡＰＩ陽性領域を識別し、核マスクを画定するのに使用した。このマスクを全画像に適用し、ＤＡＰＩ信号をマスク領域の範囲内のみで定量化した。Ｃｙ３信号及びＣｙ５信号を、同様の技法を用いて膜領域上で定量化した。
【００３８】
蛍光強度を較正するために、標準的な蛍光ビーズ（Ｆ３６９０９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を蛍光強度基準として使用した。ビーズの強度を０．００６６７、０．０３、０．１、０．３３、及び１としている。ビーズを、最初に、７５ミリ秒の一定露光時間で撮像した。次に、これらのビーズに異なる露光時間を用いた。具体的には、強度０．００６６７のビーズに３００ミリ秒及び１５０ミリ秒を、０．０３及び０．１のビーズに１５０ミリ秒及び７５ミリ秒を、０．３３のビーズに７５ミリ秒及び３０ミリ秒を、１のビーズに３０ミリ秒を用いた。
【００３９】
表１は、カメラへの発光なしで露光時間に応答した、平均画素強度の変化を示す。露光時間での平均強度に若干の上昇がある。平均は約２００であり、それは、１２ビットカメラのダイナミックレンジの５％を消費する。（露光時間に比例する）暗ノイズの寄与を（一定の）読出しノイズの寄与と分離するために、線形回帰を得た。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
【数３】
2013546083.tif 000006
ノイズは計測システムにおいてポアソン分布を示すので、標準偏差が平均の平方根である場合、ＣＣＤカメラ上で観察された信号は次の式で与えられる。
【００４２】
【数４】
2013546083.tif 000007
無光条件下で、ＤａｒｋＳｉｇｎａｌは次の式で与えられる。
【００４３】
【数５】
2013546083.tif 000008
ＤａｒｋＳｉｇｎａｌは、電子／画素の単位で得られる。この信号は、Ａ／Ｄ変換され、最終的にＰｉｘｅｌＩｎｔｅｎｓｉｔｙにデジタル化される。
【００４４】
【数６】
2013546083.tif 000009
図１は、Ｈａｍａｍａｔｓｕのカメラを使用する、暗画素強度とノイズＲＭＳとの間の相関の例を示す。
【００４５】
個々の画素レベルでの画素強度への露光時間の影響を決定するために、この例では、ＳｉｇｎａｌＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、式６と同様の式に従う。
【００４６】
【数７】
2013546083.tif 000010
式７を並べ替えると、以下の式が得られる。
【００４７】
【数８】
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この式は、単一画素レベル、ＲＯＩレベル、及びその画像レベルで使用することができる。図２は、２００ミリ秒（Ａ）及び５００ミリ秒（Ｂ）で暴露された２つの画像からの対応する位置の画素強度を示す。回帰分析は、以下の線形関係を示唆する。
【００４８】
【数９】
2013546083.tif 000012
回帰線からの誤差分散が１７２であり、それは画素強度のダイナミックレンジに亘って一様である。勾配２．５は露光時間の比率（この場合は２．５）であった。Ｒ２＝０．９７６である。この回帰の切片（３０１）は、１９９の切片とは異なると思われる。しかし、式１０の単純な変換により、暗画素強度が前に得られたものと全く同じであることが明らかになる。
【００４９】
【数１０】
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重要なことに、無光条件下で決定される通り、回帰切片２００．９は１９９．１２の暗画素強度に非常に近い。
【００５０】
定量的蛍光顕微鏡における一般的な役割の１つが、核領域又は細胞質領域などの異なるＲＯＩでの染色強度を測定することである。ＩｍａｇｅＪを使用して、全体画像をバックグラウンド（組織／セルなし）、核領域、及び膜領域にセグメント化し、露光時間に対する各信号をプロットした（図３）。露光時間と異なるＲＯＩにおける且つ異なるチャネル（ＤＡＰＩ，Ｃｙ３，及びＣｙ５）を使用する強度との間に、明らかな線形関係がある。これら全ての線に関する切片／暗画素強度が、前に測定した１９９と実質的に同じで、１９９．９から２０２．６までの間で変化する。また、図の底部に、０露光時間での暗画像の平均画素強度が示されている。各線の勾配は、Ｇ［（Ｐ＋Ｂ）・Ｑｅ＋Ｄ］であり、正規化信号強度を示す。バックグラウンド領域において、勾配は、Ｇ［（Ｂ）・Ｑｅ＋Ｄ］になる。
【００５１】
染色強度がＧＰＱｅｔである。それは、信号とバックグラウンド（暗画素強度なし）との間の差により計算されるべきである。信号強度及びバックグラウンド強度の両方が同じ暗画素強度を含むので、それらは相殺される。正規化染色強度を簡単にと定義することができる。
【００５２】
【数１１】
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式１２を立証するために、異なる露光時間を用いて、基準蛍光強度ビーズの画像をキャプチャした。単一の露光時間が最適条件でこれらビーズの全てをキャプチャすることができない結果として、これらビーズの強度はほとんど１５０倍変化する。
【００５３】
本方法の例の１つ以上では、暗画素強度が、カメラオフセット、及び画像における信号強度への付加である。それは、読出しノイズ、アナログ利得、デジタル利得、アナログオフセット、デジタルオフセット、及び他の設定の１つ以上により決定されてもよい。エンドユーザの観点から、カメラ取得設定が露光時間を除いて定められている限り、暗画素強度は一定である。暗画素強度は、無光及びゼロ（最少）露光時間の条件下で画像を取得することにより、続いて画像の平均強度を計算することにより、決定されてもよい。非限定的例として、２００の暗画素強度が、２０００の平均強度を有する正常蛍光画像の１０％以上寄与する可能性がある。設定の暗画素強度を予め定めることにより、１つの露光時間で取得される画像が、例えば式９を用いて、別のものにスケーリングされてもよい。
【００５４】
暗画素強度及びバックグラウンド強度（又は最低画素強度）は区別できる。例えば、バックグラウンド強度は、Ｇ［（Ｂ）・Ｑｅ＋Ｄ］・ｔ＋ＤａｒｋＰｉｘｅｌＩｎｔｅｎｓｉｔｙにより決定されてもよい。結果として、バックグラウンド強度は、通常、暗画素強度より高く、露光時間で上昇する。バイオマーカの染色が弱く且つより長い露光時間が必要である場合、バックグラウンド強度は、例えば１０００〜３０００の高さである可能性がある。対照的に、暗画素強度は、カメラ取得設定が露光時間を除いて定められている限り、一定（例えば、２００）である。
【００５５】
バイオマーカの染色強度が、（画像の範囲内の）信号強度とバックグラウンド強度との間の差である。バックグラウンド強度のサブトラクションにより、ガラススライドからの散乱光、暗電流、及び暗画素強度による寄与が除去される。しかし、バイオマーカの染色強度は、依然として自己蛍光で汚染されている可能性がある。式１２を用いて、所与のバイオマーカの染色強度を比較してもよい。
【００５６】
また、温度が暗画素強度に影響を及ぼす。温度が上昇すると電子がずっと移動しやすくなり、したがって、暗電流及び読出しノイズはどちらも温度の関数である。実施例では、環境温度が−５℃から４０℃の範囲内である限り、カメラの温度を−３０℃に調節した。この冷却温度は、一般にデジタルカメラに関連している。低温が低暗電流及び低読出しノイズに寄与する。
【００５７】
暗画素強度に対するオフセットを設定することが有益である。したがって、この値は、最終画素強度からサブトラクションされ、画素強度は露光時間に比例する。オフセットを用いる１つの利点は、画素強度のダイナミックレンジを増大させることである。しかし、最大の利益を達成するために、オフセットは暗画素強度と同一であるべきである。
【００５８】
本発明のある特徴のみを本明細書に例示し記載したが、多くの修正及び変更が当業者に思い付くであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内に入るそのような修正及び変更全てを包含することを意図としていることは言うまでもない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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