(57)【要約】本発明は、人工的スキャフォールドを含まない人工組織スキャフォールドフリーの３次元肺モデル組織培養物を提供する。健康肺組織及び疾患組織の３次元モデルが利用可能である。本発明による製品は、例えば、組織培養物、そのような培養物を含むプレートもしくはアレイ、またはキットの形態で市販することができる。本発明は、肺組織に対する化合物の効果について試験するためや、薬物をスクリーニング、試験及び／または評価するための医学的及び科学的研究において、また、肺疾患の診断において適用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工３次元肺モデル組織培養物であって、
ａ）多孔質３次元マトリックス、３次元ゲルマトリックスまたは多孔質膜支持体である人工的組織スキャフォールドを含まず、
ｂ）培養細胞から構成され、
ｃ）少なくとも肺上皮細胞及び間質細胞、好ましくは、線維芽細胞を含み、
ｄ）肺上皮細胞が多く存在する表面を有する細胞凝集塊を１以上含み、
ｅ）その上皮細胞が上皮分化マーカーを発現する
ことを特徴とする人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項２】
細胞凝集塊のサイズまたは平均サイズが、少なくとも８０μｍ及び最大でも６００μｍであり、好ましくは、１００〜３００μｍであり、
かつ／または、その細胞の量が、
少なくとも２×１０４細胞、好ましくは、少なくとも４×１０４細胞、
最大でも５×１０５細胞、好ましくは、最大でも２×１０５または最大でも１０５細胞である
請求項１に記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項３】
モデル組織培養物が、人工的組織スキャフォールドを含まず、かつ／または、
モデル組織培養物が、細胞外マトリックスを含み、その細胞外マトリックスタンパク質が、組織培養物に含まれる細胞型のうちの少なくとも１つによって、好ましくは、線維芽細胞によって分泌され、かつ／または、
上皮細胞が、細胞凝集塊の表面の少なくとも一部に肺上皮細胞内層を形成し、好ましくは、肺上皮細胞内層が、少なくとも部分的に、細胞凝集塊の表面を被覆する
請求項１または２に記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項４】
モデル組織培養物が、対象から得られた培養初代細胞を含み、かつ／または、
モデル組織培養物が、培養前に脱分化した細胞及び培養後によって再分化した細胞を含み、かつ／または、
モデル組織培養物が、樹立細胞株の細胞を含む
請求項１ないし３のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項５】
内皮細胞を含む
請求項１ないし４のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項６】
肺上皮細胞が、細胞型：Ｉ型肺細胞（ＡＴＩ細胞）、ＩＩ型肺細胞（ＡＴＩＩ細胞）のうちの少なくとも１つを含み、
人工３次元肺モデル組織の組織細胞によって発現される上皮分化マーカーが、好ましくは、ＡＴＩＩ型分化マーカー、ＡＴＩ型分化マーカーのいずれかである
請求項１ないし５のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項７】
マーカー：ＴＴＦ１、ＡＱＰ３、ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＣ、ＫＲＴ７のレベルが、非培養細胞、好ましくは、純化された初代細胞を含む対照と比べて増加していて、
マーカー：ＣＸＣＬ８、ＩＬ１ｂ、Ｓ１００Ａ４のレベルが、非培養細胞を含む対照と比べて減少していて、
マーカー：ＡＱＰ３、ＳＦＴＰＡのレベルが、対照の２次元培養物と比べて増加していて、
マーカー：ＣＸＣＬ８、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、Ｓ１００Ａ４、Ｎ−カドヘリンのレベルが、対照の２次元培養物と比べて減少している
請求項１ないし６のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項８】
培養細胞、好ましくは、肺上皮細胞及び／または間質細胞が、モデル組織培養物が肺疾患モデル組織培養物となる罹患肺組織の病理学的特徴を有する病的細胞を含み、好ましくは、
その疾患が炎症を伴い、かつ、病的細胞が正常レベルを上回る炎症性サイトカインを発現し、かつ、モデルが炎症モデルであり、
疾患が腫瘍であり、かつ、細胞が、悪性形質転換細胞または不死細胞を含む群から選択される形質転換細胞であり、かつ、モデルが腫瘍モデルであり、
疾患が線維症を伴い、かつ、モデルが線維症モデルであり、
疾患が組織の損傷を伴い、かつ、モデルが再生モデルである
請求項１ないし７のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項９】
人工３次元肺モデル組織培養物の調製方法であって、
少なくとも肺上皮細胞及び間質細胞、好ましくは、線維芽細胞、より好ましくは、初代線維芽細胞の混合懸濁物を調製する工程、
その懸濁物の細胞をペレット化する工程、
細胞をペレット化する工程、
ペレット化した懸濁物を、ＣＯ２の存在下で、細胞が１以上の細胞凝集塊を含む３次元肺モデル組織を形成するのに十分な時間、インキュベートする工程、
必要に応じ、モデル組織を、
ａ）参照培養物と比較したときの発現レベルの増加を、３次元肺モデル組織培養物の形成を示すとみなし、モデル組織培養物に特徴的な１以上の上皮分化マーカーの発現、ならびに／または、
ｂ）好適な参照培養物と比較したときの発現レベルの減少を、３次元肺モデル組織培養物の形成を示すとみなし、１以上の炎症促進性サイトカインの発現、
ｃ）１以上の凝集塊のサイズ及び形態
についてアッセイする工程、を有する
ことを特徴とする人工３次元肺モデル組織培養物の調製方法。
【請求項１０】
細胞凝集塊の平均サイズが、少なくとも、８０μｍ及び最大でも６００μｍであり、好ましくは、１００〜３００μｍであり、かつ／または、
１以上の細胞凝集塊の細胞の量が、
少なくとも２×１０４細胞、好ましくは、少なくとも４×１０４細胞、及び、
最大でも５×１０５細胞、好ましくは、最大でも２×１０５または最大でも１０５細胞である
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペレット化した懸濁物を、
ＣＯ２の存在下で、
２週間以下の期間、好ましくは、１２、１０、８、７、６または５日以下の期間、及び、
１０時間以上の期間、好ましくは、１２または１４時間以上の期間、インキュベートする
請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
混合懸濁物を調製する際に、１種類以上の細胞を、１８時間以内に、好ましくは、１２時間以内に、より好ましくは、４時間以内に、特に好ましくは、１時間以内にまたは同時に容器に添加し、特に好ましくは、使用される各種類の細胞をその期間内に添加する
請求項９ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
容器が組織培養用の処理を行なっていないＶ底の容器であり、かつ／または、
ペレット化を２００〜６００ｇで１〜２０分間、好ましくは、２〜１０分間行ない、かつ／または、
細胞を、以下の細胞特徴：細胞の細胞状態、例えば、細胞相、細胞生存性、アポトーシスもしくは瀕死状態；細胞型；細胞位置；悪性形質転換；炎症のうちの１つまたは複数について知らせるのに好適な生体適合性色素で染色する
請求項９ないし１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも肺上皮細胞及び肺間質細胞の混合懸濁物が、対象から得られた培養初代細胞を含み、かつ／または、
少なくとも肺上皮細胞及び肺間質細胞の混合懸濁物が、培養前に脱分化した細胞を含み、かつ、細胞が培養によって再分化し、かつ／または、
少なくとも肺上皮細胞及び肺間質細胞の混合懸濁物が、樹立細胞株の細胞を含む
請求項９ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
培養細胞、好ましくは、肺上皮細胞及び／または間質細胞が、モデル組織培養物が肺疾患モデル組織培養物となる罹患肺組織の病理学的特徴を有する病的細胞を含む
請求項９ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項９ないし１５のいずれかに記載の方法によって得られ、好ましくは、請求項１ないし７のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物となり得る
人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項１７】
肺組織に対する薬物の効果についてスクリーニングする方法であって、
請求項１ないし８、１６のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物を準備する工程、
モデル組織培養物の少なくとも試験サンプル及び参照サンプルを採取する工程、
試験サンプルを薬物と接触させる一方で、試験サンプル及び参照サンプルを同じ条件下に維持する工程、
参照サンプルと比較して試験サンプルの何らかの変化または変更を検出し、試験サンプルの何らかの変化または変更が検出された場合、薬物の効果を示すものと評価する工程、を有する
ことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１８】
モデル組織培養物が健康肺組織のモデルであり、かつ、薬物の有害効果を試験し、試験サンプルの細胞を害する変化または変更を、薬物の毒性効果または有害効果と評価する
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
モデル組織培養物が、病理学的特徴を有する病的細胞を含む肺疾患モデル組織培養物であり、かつ、薬物の有益な効果が試験され、
疾患の程度を得るために、病理学的特徴を測定または評価するアッセイをモデル組織培養物について準備し、
健康肺組織の参照サンプル（健康参照サンプル）及び／または罹患肺組織の参照サンプル（罹患参照サンプル）を準備し、
それを薬物と接触させる前及び接触させた後に、病理学的特徴を健康参照サンプル及び／または罹患参照サンプルならびに少なくとも１つの試験サンプルにおいて測定または評価し、
試験サンプルにおける疾患の程度を、健康参照サンプルにおける疾患の程度へと変化させる及び／または罹患参照サンプルにおける疾患の程度から変化させる、試験サンプルにおける何らかの変化または変更を、薬物の有益な効果と評価する
請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１ないし８、１６のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物の各サンプルが、プレートの別々の容器中に入れられている少なくとも２つの容器と、
モデル組織培養物の細胞を培養するための適切な培地と、
多数並んだ容器を有する試験プレートとを備える
ことを特徴とする人工３次元肺モデル組織キット。
【請求項２１】
プレートが９６ウェルプレートであるか、
プレートがＶ底プレートであるか、
容器中の培養物サンプルが、
少なくとも１０３、好ましくは、少なくとも１０４、より好ましくは、少なくとも２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４細胞、及び、
最大でも１０７、好ましくは、最大でも１０６、より好ましくは、最大でも５×１０５、４×１０５、３×１０５、２×１０５までの細胞、または最大でも１０５、の量の細胞を含むか、
容器が個別にまたは１つにまとめて密封されていて、かつ、肺組織培養に好適なＣＯ２が豊富な環境または雰囲気を含むか、
ＣＯ２が豊富な環境または雰囲気が、
少なくとも２％、３％、４％のＣＯ２環境、最大でも１０％、９％、８％または７％のＣＯ２環境、特に好ましくは、約５％のＣＯ２を含むか、
のいずれかの特徴を１つまたは複数を有する
請求項２０に記載の人工３次元肺モデル組織キット。
【請求項２２】
毒性試験、候補化合物の探索を含む群から選択される肺組織に対する化合物の効果についての並行スクリーニング、
モデル組織培養物が初代患者肺細胞から得られるという条件での、化合物のその治療能力についての患者特異的な試験、
肺組織における細胞相互作用の研究、
肺疾患を含む群から選択される疾患の期間中における遺伝子変化の研究、
のいずれかのための、請求項１ないし７のいずれかに記載の３次元肺モデル組織培養物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工的スキャフォールドを含まない人工３次元肺モデル組織培養物に関する。健康肺組織及び疾患組織の３次元モデルを含む。本発明による製品は、例えば、組織培養物、そのような培養物を含むプレートもしくはアレイ、またはキットの形態で市販することができる。本発明は、肺組織に対する化合物の効果について試験するため、また、薬物をスクリーニング、試験及び／または評価するための医学的及び科学的研究、また、ある場合には肺疾患の診断において適用できる。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は、損傷した組織を修復するか、置換するかまたは再生させることを目指す、急速に発展している生物医学研究の分野である。最近の失敗に終わっている第ＩＩ相の臨床薬試験（例えば、ＴＧＮ１４１２）の事象のために、組織工学のさらなる目的には、薬学的化合物の安全性試験と効力試験のためのヒト組織モデルの作製が含まれる。一般的な及び本発明者らのモデルにおける組織工学は特に、自己集合の一例である生物学的形態形成を利用している。
【０００３】
細胞工学及び組織工学は、今日、いくつかの観点から追求されている。一態様では、それは、細胞生物学及び生理学に対するさらに深い洞察を得るために使用される。
【０００４】
組織工学研究では、２つの主な方向：組織スキャフォールドベースのシステム及び組織スキャフォールドフリーのシステムが開発されている。スキャフォールドベースのシステムが、ほとんどの場合、生分解性スキャフォールド材料を用いて人工的な３Ｄ構造を提供して、細胞相互作用を容易にするのに対し、スキャフォールドフリーのシステムは、直接的な細胞と細胞の相互作用を可能にし、かつ細胞が、そのモデルにおいて細胞が分泌したスキャフォールド材料の上で増殖することを可能にする。
【０００５】
特許文献１「Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ」では、薬をスクリーニングするための前癌性乳房疾患のモデルとして有用な３次元インビトロ細胞培養システムが開示されている。そのモデルは、増殖因子、エストロゲンなどのようなさらなる添加剤を含む培地中の再構成された基底膜上で乳房起源の前癌性上皮細胞、内皮細胞及び乳房線維芽細胞を共培養することによって調製される。したがって、この溶液中では、基底膜、好ましくはマトリゲル（登録商標）が組織スキャフォールドとして使用される。その説明によれば、このシステムでは、分岐した管胞単位血管系のネットワークは、約３〜７日以内に形成される。
【０００６】
このシステムは、乳房に関するものであって、肺に関するものではなく、その方法で肺培養物を作製するための示唆はない。
【０００７】
特許文献２「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ」の開示では、微小血管内皮細胞が成人の肺から得られ、３次元コラーゲンゲル中に存在するヒト真皮線維芽細胞の２つの層の間に置かれた。その結果、サンドイッチ構造が形成された。
【０００８】
血管内皮細胞はヒトの肺から得られたが、この方法で調製された人工的な組織は、ヒトの皮膚に類似していた。そのため、実際には、それを肺組織モデルとみなすことはできない。
【０００９】
特許文献３「Ｆｅｔａｌ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」では、胎仔マウスの上皮細胞、内皮細胞及び間質細胞に基づく３Ｄ組織様調製物が教示されている。著者らは、人工肺を得るためにマウス胚性肺細胞を調製に使用し、３Ｄ組織様調製物に対するスクリーニングを行なった。マトリックスとして、ハイドロゲルのマトリゲル（商標）を用いて、適切な細胞−細胞相互作用を樹立させた。その記載から、上皮細胞と線維芽細胞を共培養したときに、線維芽細胞の異常増殖が起こったように思われる。
【００１０】
特許文献４「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」は、胎仔肺細胞と、生体適合性材料でできた組織スキャフォールドと、好ましくは線維芽細胞増殖因子とを含む肺組織モデル調製物に関する。胎仔肺細胞は、上皮細胞、内皮細胞及び間質細胞を含む。いくつかの適用可能な生体適合性材料が列挙されている。
【００１１】
特許文献５「Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ」では、微小重力環境下での人工的な３Ｄ組織の調製が提案されている。組織はヒト乳癌細胞をベースにしていて、乳癌モデルとして有用である。回転するバイオリアクターチャンバーの中で、３Ｄの回転楕円構造が形成されるまで結合組織細胞をまず培養し、次に、この培養物に順次、内皮細胞と上皮細胞を添加する。この教示は理論上のものであり、細胞を培養するためのプロトコル及び培養物を処理するためのプロトコルは提供されているが、実際の実験結果は開示されていないことに留意すべきである。
【００１２】
非特許文献１は、文書で十分に立証されている正常な不死化肺細胞株を用いて、培養フラスコ中の従来の単層（ＭＬ）として及び回転壁容器中の３Ｄ培養物として増殖させた。これらの培養物と手術患者検体から採取した対照組織の間の分化及びマーカー発現の存在についての比較が研究された。著者らの目的は、既知の細胞株の従来の単層細胞培養物と３Ｄ細胞培養物の両方を開発することであった。
【００１３】
最近、Ｋｅｌｌｙ  ＢｅｒｕＢｅとその共同研究者らは、安全性試験のためのヒト肺上皮の３Ｄ組織工学モデルを開発した。彼女らは、正常なヒト気管支上皮細胞［ＮＨＢＥ］を使用した。ヒトから得られた初代細胞を微多孔膜上で増殖させて、３次元（３Ｄ）細胞培養物を形成させた。３Ｄ培養物は、細胞間に、すなわち、活発な繊毛を有する細胞と粘液を産生及び分泌する細胞との間に、密着結合を形成した。これらの特徴は、ネイティブなヒト呼吸上皮組織で見られるものとよく似ていて、組織損傷に対するヒトの応答を正確に模倣すると考えられた。この培養物は、粘膜表面を形作る厚い細胞層を実際に形成する（非特許文献２）。
【００１４】
肺モデルに関する文献がたくさんあるにもかかわらず、先行技術では、組織スキャフォールドベースの３次元モデルしか開示されておらず、少なくとも上皮細胞及び線維芽細胞を含む、簡単な組織スキャフォールドフリーの肺組織モデルは先行技術では開示されていないように思われる。
【００１５】
驚くべきことに、本発明者らは、簡単な生化学的方法により、いくつかの側面で２次元システムまたはマトリックスをベースにしたシステムよりも好都合な組織スキャフォールドフリーの肺組織モデルシステムを迅速に作り出すことができることを見出した。本発明は、様々な試験ですぐに使えるモデル組織を提供する。このモデルは、正常な機能や疾患の進行を模倣するために様々な肺組織における細胞−細胞相互作用を研究するのに好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＵＳ２００１／００５５８０４Ａ１号
【特許文献２】ＵＳ２００３／０１０９９２０号
【特許文献３】ＵＳ２００８／０１１２８９０号
【特許文献４】ＷＯ２００８／１００５５５号
【特許文献５】ＷＯ２００４／０４６３２２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｖｅｒｔｒｅｅｓ，ＲＡ，Ｚｗｉｓｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．２００８
【非特許文献２】Ｈｕｇｈｅｓ  Ｔｒａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．２００７
【非特許文献３】Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｃｏｒｔｉｅｌｌａ  Ｊ．２００８
【非特許文献４】Ｌｏｎｚａ  Ｖｅｎｄｅｒｓ，Ｓ．ｐ．ｒ．ｌ．Ｐａｒｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌ  ｄｅ  Ｐｅｔｉｔ−Ｒｅｃｈａｉｎ  Ｂ−４８００  Ｖｅｎｄｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ  Ｌｔｄ．，Ｔｅｍｅｓｖａｒｉ  ｋｒｔ．６２  Ｈ−６７２６  Ｓｚｅｇｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ５７９１  Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ  Ｗａｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２００８  ＵＳＡの１部門）
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ，Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５
【非特許文献６】Ｈａｒｅ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献７】Ｎｅａｇｕ  ２００６
【非特許文献８】Ｄｅ  Ｍｏｅｒｌｏｏｚｅ，Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｄｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献９】Ｃｒａｐｏ  ｅｔ  ａｌ，１９８２
【非特許文献１０】Ｎａｋａｈａｔａ  ａｎｄ  Ｔｏｒｕ  ２００２；Ａｕｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｃｅ，２００１
【非特許文献１１】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ，ＸＱ，Ｌｉ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００９
【非特許文献１３】Ｈｏｎｉｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｒ．Ｉ．Ｈｕｍｅ  １９８９
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｑ．，Ｘ．Ｍ．Ｄｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．２００５
【非特許文献１５】Ｄ．Ｊ．Ｇｉａｒｄら  １９７３
【非特許文献１６】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＡＴＣＣＡｄｖａｎｃｅｄＣａｔａｌｏｇＳｅａｒｃｈ／ｔａｂｉｄ／１１２／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
【非特許文献１７】Ｗａｒｄｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．２００２
【非特許文献１８】Ｈｏｎｉｇ  ａｎｄ  Ｈｕｍｅ  １９８９
【非特許文献１９】ＣＦＳＥ  Ｗａｎｇ，Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５
【非特許文献２０】「カドヘリン−スイッチ」Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  Ｍ  ａｎｄ  Ｅ．Ｇ．Ｎｅｉｌｓｏｎ  ２００９
【非特許文献２１】Ｄｏｂｂｓ，Ｌ．Ｇ．  １９８９
【非特許文献２２】Ａｌｃｏｒｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．  １９９７
【非特許文献２３】Ｓｈｅｒｂｅｔ，Ｇ．Ｖ  ｅｔ  ａｌ．２００９
【非特許文献２４】Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００９
【非特許文献２５】Ｚｅｉｓｂｅｒｇ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅ．Ｇ．Ｎｅｉｌｓｏｎ，２００９
【非特許文献２６】Ｓｅｉｋｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００９
【非特許文献２７】Ｂｅｌｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９２
【非特許文献２８】Ｗａｒｄｌａｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６２，３２６−３３３  ２００２
【非特許文献２９】Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００７
【非特許文献３０】Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｇｅｎｄａ．２００８，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ
【非特許文献３１】Ａｌｃｏｒｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｙｔｅｓ：Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１７（６）：ｐ．６７２−６８２
【非特許文献３２】Ｂｅｌｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ４−（ｍｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｏ）−１−（３  −ｐｙｒｉｄｙｌ）−１−ｂｕｔａｎｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａ／Ｊ  ｍｏｕｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２  ３１６４−３１７３
【非特許文献３３】Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．，Ｊ．Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．“Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０（ＦＧＦ１０）  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ．”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２４（２３）：４８６７−４８７８
【非特許文献３４】Ｂｒｕｎｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｒ．Ｊ．Ｂｏｈｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．“Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＳＰ−Ａ）  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＳＰ−Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−  １．”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６５３１−６５３６
【非特許文献３５】Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｗ．Ｖ．（２００１）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６３：４７１−４９４
【非特許文献３６】Ｃｏｌｖｉｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａ．Ｃ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ｌｕｎｇ  ｈｙｐｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｆｇｆ９−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｈｉｓ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ．”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８（１１）：２０９５−２１０６
【非特許文献３７】Ｃｏｌｖｉｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｂ．Ｆｅｌｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．“Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ９  ｇｅｎｅ．”  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２１６（１）：７２−８８
【非特許文献３８】Ｄｅ  Ｍｏｅｒｌｏｏｚｅ，Ｌ．，Ｂ．Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｄｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．“Ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＩＩＩｂ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＦＧＦＲ２）  ｉｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７（３）：４８３−４９２
【非特許文献３９】Ｄｏｂｂｓ，Ｌ．Ｇ．，（１９８９）．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４０（１）：ｐ．４３１−４４６
【非特許文献４０】Ｇｉａｒｄ  Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９７３）．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ：ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．［Ｂｅｔｈｅｓｄａ］  ５１：１４１７−１４２３
【非特許文献４１】Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｍ．，Ａ．Ｔｏｓｏｎｉ，ａｎｄ  Ｍ．Ｎｅｂｕｌｏｎｉ，（２００９）．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｔｏ  ｏｒｇａｎ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，４０（１０）：ｐ．１３６５−１３７６
【非特許文献４２】Ｈａｒｅ，ＫＪ．，Ｅ．Ｊ．Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，（１９９９）．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１（１）：ｐ．３−１２
【非特許文献４３】Ｈａｒｅ，ＫＪ．，Ｅ．Ｊ．Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，（１９９９）．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１（１）：ｐ．３−１２
【非特許文献４４】Ｈｏｎｉｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｒ．Ｉ．Ｈｕｍｅ（１９８９）．“ＤｉＩ  ａｎｄ  ｄｉＯ：ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｒａｃｉｎｇ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（９）：３３３−３３５
【非特許文献４５】Ｈｏｎｉｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｒ．Ｉ．Ｈｕｍｅ（１９８９）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（９）：３３３−３３５
【非特許文献４６】Ｈｕｇｈｅｓ  Ｔｒａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，ａ  ｐｏｓｔｅｒ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｈｏｗｃａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ３Ｒｓ  Ｐｏｒｔｃｕｌｌｉｓ  Ｈｏｕｓｅ，２８  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００７
【非特許文献４７】Ｉｋｅｄａ，Ａ．，Ｊ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．“Ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８１０８−８１１４
【非特許文献４８】Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｇｅｎｄａ．２００８，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ
【非特許文献４９】Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｆ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，３（５）：ｐ．ｅ２１４２
【非特許文献５０】Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｅ．Ｓａｇａｒｔｚ，ａｎｄ  Ｄ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ，（２００７）．Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓａｆｅｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｌｅａｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，６（８）：ｐ．６３６−６４９
【非特許文献５１】Ｋｒｅｄａ，Ｓ．Ｍ．，Ｍ．Ｃ．Ｇｙｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ．”  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏl．Ｂｉｏｌ．２４：２２４−２３４
【非特許文献５２】Ｌａｚｚａｒｏ，Ｄ．，Ｍ．Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．“Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ＴＴＦ−Ｉ，ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ．”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１０９３−１１０４
【非特許文献５３】Ｍｉｎ，Ｈ．，Ｄ．Ｍ．Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．“Ｆｇｆ−１０  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｌｉｍｂ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｓｔｒｉｋｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｂｒａｎｃｈｌｅｓｓ．”  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２（２０）：３１５６−３１６１
【非特許文献５４】Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ，ＡＰ，Ｃｈａｉ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．“Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｍｏｌｄｅｄ  ｎｏｎａｄｈｅｓｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．”  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．１３（８）：２０８７−９４
【非特許文献５５】Ｎｅａｇｕ，Ａ．（２００６）．“ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＯＦ  ＴＩＳＳＵＥ  ＳＥＬＦ−ＡＳＳＥＭＢＬＹ．”  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｂ  ２０：１２０７−１２３１
【非特許文献５６】Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｊ．Ｃｏｒｔｉｅｌｌａ，（２００８）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｏｒｇａｎ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｌｕｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ，．５（６）：ｐ．７２３−７３０
【非特許文献５７】Ｏｒｎｉｔｚ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｎ．Ｉｔｏｈ（２００１）．“Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．”  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２（３）：３００５
【非特許文献５８】Ｓｅｉｋｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｏｏｌ，７６（４）：ｐ．１８１−１８１
【非特許文献５９】Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，Ｈ．Ｏｈｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．“Ｆｇｆ１０  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｍｂ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．”  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２１（１）：１３８−１４１
【非特許文献６０】Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｈｙａｔｔ（２００４）．“Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｌｕｎｇ．”  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ６６：６２５−６４５
【非特許文献６１】Ｓｈｅｒｂｅｔ，Ｇ．Ｖ．，（２００９）．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｓ１００Ａ４  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８０（１）：ｐ．１５−３０
【非特許文献６２】Ｖｅｒｔｒｅｅｓ，ＲＡ，Ｚｗｉｓｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  “Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．Ｍａｒ；７（３）：４０４−１２
【非特許文献６３】Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｑ．，Ｈ．Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  “Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｋ−Ｒａｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ２０，７９１−８００
【非特許文献６４】Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｑ．，Ｘ．Ｍ．Ｄｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．“Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ．”  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ３７（６）：３７９−３８５
【非特許文献６５】Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｑ．，Ｘ．Ｍ．Ｄｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ３７（６）：３７９−３８５
【非特許文献６６】Ｗａｒｄｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｓａｌ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６２，３２６−３３３
【非特許文献６７】Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｃ，Ｙ．Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．“Ｔｈｅ  ＴＴＦ−１／ＴＡＰ２６  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ（ＳＰ−Ｂ）  ａｎｄ  −Ｃ（ＳＰ−Ｃ）  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３４４（２）：４８４−４９０
【非特許文献６８】Ｚｅｉｓｂｅｒｇ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅ．Ｇ．Ｎｅｉｌｓｏｎ，（２００９）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１９（６）：ｐ．１４２９−１４３７
【非特許文献６９】Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｔ．Ｓ．Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．“Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３３：１７３−１８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、人工３次元肺モデル組織培養物を提供し、そのモデル組織培養物は、
ａ）人工的組織スキャフォールドを含まず、
ｂ）培養細胞から構成されるかまたは培養細胞材料を有し、ここで、これらの細胞は、この組織材料からなる１以上の他の細胞型の細胞と直接的に細胞−細胞相互作用していて、
ｃ）少なくとも肺上皮細胞と、間質細胞、好ましくは肺間質細胞、好ましくは線維芽細胞とを含み、ここで、好ましくは、モデル組織中の肺上皮細胞と間質細胞の比は、少なくとも１：６、好ましくは少なくとも１：３、及び最大でも６：１、好ましくは、最大でも３：１であり、
ｄ）１以上の細胞凝集塊の形態を有し、ここで、この凝集塊の表面には肺上皮細胞が多く存在するか、または肺上皮細胞と、間質細胞、好ましくは線維芽細胞とは、その凝集塊において少なくとも部分的に分離していて、
ｅ）上皮細胞が上皮分化マーカーを発現する。
【００１９】
ａ）好ましい一実施形態では、そのモデル組織培養物は、細胞に３次元環境を提供するための人工的なマトリックス材料を含まない。一実施形態では、そのモデル組織培養物は、人工的組織スキャフォールド材料、生分解性または非生分解性のいずれかの組織スキャフォールド材料（例えば、多孔質３次元マトリックス）、３次元ゲルマトリックスを含まない。一実施形態では、そのモデル組織培養物は、微小多孔質膜支持体を含まないかまたは含まない。
【００２０】
ｂ）好ましい一実施形態では、そのモデル組織培養物は、細胞外マトリックスも含み、その細胞外マトリックスタンパク質は、組織を含む細胞型のうちの少なくとも１つ、好ましくは線維芽細胞によって分泌される。
【００２１】
ｃ）さらなる好ましい実施形態では、肺上皮細胞は、以下の細胞型：
−Ｉ型肺細胞［肺胞Ｉ型細胞（ＡＴＩ）］
−ＩＩ型肺細胞［肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴＩＩ）］
のうちの少なくとも１つを含む。
【００２２】
好ましくは、そのＩＩ型肺細胞（ＡＴＩＩ特徴を有する肺胞上皮細胞）は、以下のマーカー：ＴＴＦ１転写因子、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＦＰＡ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＦＰＣ）及びアクアポリン３（ＡＱＰ３）のうちの１つまたは複数を発現する。
【００２３】
好ましくは、そのＩ型肺細胞（ＡＴＩ特徴を有する肺胞上皮細胞）は、以下のマーカー：ＴＴＦ１転写因子、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、アクアポリン４（ＡＱＰ４）及びアクアポリン５（ＡＱＰ５）のうちの１つまたは複数を発現する。
【００２４】
様々なさらなる実施形態では、肺上皮細胞及び肺間質細胞のうちの少なくとも１つがモデル中に存在する。
【００２５】
好ましくは、細胞は、両生類、爬虫類、鳥類またはより好ましくは、哺乳動物の細胞である。
【００２６】
好ましい鳥類細胞は、家禽の肺細胞である。
【００２７】
好ましい哺乳動物細胞は、例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシの細胞のような、草食動物、好ましくは家畜動物の細胞、または齧歯類細胞（例えば、ウサギもしくはネズミの細胞）である。さらに好ましい哺乳動物細胞は、ブタ細胞のような雑食動物の細胞である。極めて好ましい細胞は、ヒト細胞である。
【００２８】
さらなる実施形態では、肺上皮細胞及び／または間質細胞は、
−好ましくは市販供給源からの樹立細胞株
−健康ドナー
−患者ドナー
から得られる。
【００２９】
好ましい一実施形態では、細胞は初代細胞である。好ましい一実施形態では、細胞は、脱分化していない細胞または一部しか脱分化していない細胞である。
【００３０】
さらに好ましい一実施形態では、細胞は脱分化した細胞であるか、または細胞を培養して３Ｄモデル組織培養物にする前に脱分化させる。
【００３１】
好ましい一実施形態では、肺上皮細胞は、小気道上皮細胞、好ましくはＡＴＩＩ特徴を有する小気道上皮細胞を含む。
【００３２】
さらに好ましい一実施形態では、本発明のモデル組織培養物は内皮細胞も含む。好ましい一実施形態では、内皮細胞は、ＨＭＶＥＣ細胞またはＨＵＶＥＣ細胞である。
【００３３】
場合によって、本発明のモデル組織培養物は、マクロファージ、肥満細胞、平滑筋細胞から選択されるさらなる種類の細胞をさらに含み得る。
【００３４】
ｄ）好ましい一実施形態では、凝集塊の平均直径または典型的直径は、少なくとも１０μｍ、４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍまたは１２０μｍであり、凝集塊の平均直径または典型的直径は、最大でも１０００μｍ、８００μｍ、６００μｍ、５００μｍ、４００μｍまたは３００μｍである。
【００３５】
凝集塊の平均直径または典型的直径は１００〜３００μｍであることが極めて有利であり、好ましい実施形態では、それは約２００μｍである。
【００３６】
凝集塊の平均サイズは、任意の実験的及び数学的に正しい手段で評価及び計算または推定することができる。凝集塊は本質的には球形をしているが、正確な球体からのずれのために、また、測定時の凝集塊の位置に応じて及び測定法に応じて、各凝集塊の複数直径の直径を決定することができることが明白である。例えば、いくつかの凝集塊のサイズを測定する顕微鏡で最小直径と最大直径を直接測定し、平均化することができる。この目的で顕微鏡を使用するのは好都合である。
【００３７】
好ましい一実施形態では、大部分の凝集塊、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の凝集塊は、少なくとも１０μｍ、４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍまたは１２０μｍの直径、及び最大でも１０００μｍ、８００μｍ、６００μｍ、５００μｍ、４００μｍまたは３００μｍの直径を有し、上記の比の凝集塊の直径は１００〜３００μｍであることが極めて有利であり、好ましい実施形態では、それは約２００μｍである。
【００３８】
好ましい一実施形態では、キットの各凝集塊または各容器の培養物サンプルは、少なくとも１０３、好ましくは少なくとも１０４、より好ましくは少なくとも２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４細胞、及び、最大でも１０６、より好ましくは、最大でも５×１０５、４×１０５、３×１０５、２×１０５または最大でも１０５細胞という量の細胞を含む。
【００３９】
好ましい一実施形態では、肺上皮細胞及び線維芽細胞は、その表面張力の差に基づいて分離される。好ましくは、大部分の肺上皮細胞は、凝集塊の表面に位置している。
【００４０】
好ましくは、大部分の肺上皮細胞は、凝集塊の表面に肺上皮細胞内層を形成し、好ましくはその肺上皮細胞内層は、少なくとも部分的には、凝集塊の表面を被覆している。
【００４１】
さらに好ましい一実施形態では、凝集塊は内皮細胞も含む。
【００４２】
好ましい一実施形態では、内皮細胞の比は、上皮細胞及び線維芽細胞と比較して、凝集塊の表面でよりも凝集塊の中心または中心領域でより高いか、または内皮細胞の比は、凝集塊の表面から凝集塊の中心に向かって増加する。
【００４３】
好ましい一実施形態では、凝集塊は層状構造を有し、ここで、凝集塊のコアまたは中心領域は、最大比の内皮細胞を含み、凝集塊の中間層または中間領域は、最大比の線維芽細胞を含み、かつ凝集塊の外層または表面層は、最大層の上皮細胞を含む。
【００４４】
ｅ）好ましい一実施形態では、人工３次元肺モデル組織の組織細胞によって発現される上皮分化マーカーは、以下の群：
−ＡＴＩＩ型分化マーカー、好ましくはＴＴＦ１転写因子、サイトケラチン７（ＫＲＴ７）、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＦＰＡ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＦＰＣ）及びアクアポリン３（ＡＱＰ３）ならびに／またはマーカー
−ＡＴＩ型分化マーカー、好ましくはアクアポリン４（ＡＱＰ４）及びアクアポリン５（ＡＱＰ５）
から選択される少なくとも１つ以上のマーカーである。
【００４５】
発現されるマーカーは、組織培養で使用される細胞型によっても決まる。
【００４６】
これらのマーカーのうちのいずれかのレベルを、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで検出することができる。したがって、マーカーのレベルは、ｍＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルであり得る。
【００４７】
好ましくは、本発明のモデル組織培養物において、ＡＱＰ３及びＳＦＴＰＡのレベルうちの少なくとも１つが増大する、すなわち、それらは、対照の２Ｄ培養物と比較して、上方調節される。
【００４８】
好ましくは、本発明のモデル組織培養物において、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６及びＣＸＣＬ８から選択される少なくとも１つの炎症マーカーが下方調節される、すなわち、それらのレベルは、対照の２Ｄ培養物と比較して、３Ｄ培養条件下で減少する。
【００４９】
好ましくは、本発明のモデル組織培養物において、脱分化マーカーのＳ１００Ａ４及びＮ−カドヘリンのうちの少なくとも１つのレベルが、２Ｄ培養条件下または対照の２Ｄ組織培養物中の純化された初代細胞と比較して減少する。
【００５０】
様々なさらなる実施形態では、肺上皮細胞及び肺間質細胞のうちの少なくとも１つがモデル中に存在し、かつ胚性期の肺発生と同様に、
−肺上皮細胞は、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子を分泌し、
−肺上皮細胞は、細胞表面ＦＧＦＲ２ｂ受容体を発現し、
−肺間質細胞、好ましくは線維芽細胞は、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０を分泌し、かつＦＧＦＲ１ｃ及びＦＧＦＲ２ｃ受容体を発現する。
【００５１】
本発明の組織培養物の好ましい一実施形態では、ＡＴＩＩ型分化マーカー及び／またはＡＴＩ型分化マーカーは、参照として用いられる２次元組織培養物で測定されるレベルよりも高いレベルで、より好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％高いレベルで発現される。
【００５２】
好ましくは、モデル組織におけるその上皮マーカーのｍＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルは、以下の参照培養物
−同じ細胞型の２次元培養物、
−肺上皮細胞のみの培養物、
−初代線維芽細胞、好ましくはヒト線維芽細胞のみの培養物
のうちの１つもしくは複数またはそのような培養物の各々よりも高い。
【００５３】
好ましくは、そのマーカーのうちの少なくとも２つのレベルが上昇する。
【００５４】
好ましい一実施形態では、小気道上皮細胞を適用する。
【００５５】
さらに好ましい一実施形態では、少なくともいくつかのＡＴＩＩ型特徴を示す小気道上皮細胞を適用する。この場合、モデル組織は、以下の群のＡＴＩＩ型分化マーカー、例えば、上で列挙したものから選択される少なくとも１つ以上のマーカーのｍＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルの増大を示す。
【００５６】
本発明の人工３次元肺モデル組織は、好ましくは、１以上の炎症促進性サイトカイン及び／または１以上のＥＭＴマーカーの発現の低下を示す。
【００５７】
好ましくは、モデル組織におけるその１以上の炎症促進性サイトカインのｍＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルは、以下の参照培養物
−同じ細胞組成の２次元培養物、
−肺上皮細胞のみの培養物、ここで、その肺上皮細胞は、モデル組織培養物と同様に処理される
のうちの１つもしくは複数またはそのような培養物の各々よりも低い。
【００５８】
好ましくは、炎症促進性サイトカインは、以下の群：ＣＸＣＬ−８炎症促進性サイトカイン、ＩＬ６、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦαから選択される。
【００５９】
極めて好ましい実施形態では、炎症促進性ケモカインは、ＣＸＣＬ−８走化性因子である。
【００６０】
好ましい一実施形態では、モデル組織培養物は、肺上皮細胞及び肺間質細胞を含み、かつ内皮細胞を含まず、ここで、
−以下のマーカー：Ｅ−ｃａｄ、ＩＬ−１ｂ及び／またはＩＬ６のうちの１つまたは複数のレベルは、非培養細胞を含む対照と比べて増大し、
−Ｅ−ｃａｄのレベルは、対照の２次元培養物と比べて増大し、
−以下のマーカー：ＩＬ−１ｂ、ＣＸＣＬ８、ＩＬ６のうちの１つまたは複数のレベルは、対照の２次元培養物と比べて減少する。
【００６１】
好ましい一実施形態では、モデル組織培養物は、肺上皮細胞、肺間質細胞及び内皮細胞を含み、ここで、
以下のマーカー：Ｅ−ｃａｄ、Ｎ−ｃａｄのうちの１つまたは複数のレベルは、非培養細胞を含む対照と比べて減少し、
−Ｅ−ｃａｄのレベルは、対照の２次元培養物と比べて増大し、
−以下のマーカー：Ｎ−ｃａｄ、Ｓ１００Ａ４のうちの１つまたは複数のレベルは、対照の２次元培養物と比べて減少する。
【００６２】
好ましい一実施形態では、３次元肺モデル組織培養物は、以下の群：
−例えば、血管系を模倣する内皮細胞、
−マクロファージ、
−肥満細胞
から選択される細胞をさらに含む。
【００６３】
より後の段階では、このモデルを、細胞型：
−平滑筋細胞、
−神経細胞
を用いて拡大適用することができる。
【００６４】
疾患モデル：
本発明はまた、上で規定されたような人工３次元肺モデル組織培養物に関するものであり、ここで、その上皮細胞及び／または線維芽細胞は、そのモデル組織培養物が肺疾患モデル組織培養物となるような罹患肺組織の病理学的特徴を有する病的細胞を含む。
【００６５】
好ましい実施形態では、疾患は、炎症、腫瘍、線維症、組織の損傷から選択される状態を伴い、モデル組織培養物は、それぞれ、炎症モデル、腫瘍モデル、線維症モデルまたは再生モデルとみなされることになる。
【００６６】
疾患モデルの病的細胞は、患者（患者細胞）から得られた細胞、疾患特徴を有する細胞株（例えば、腫瘍細胞株）；環境影響（例えば、疾患特徴を生じさせる炎症促進性物質）に曝された細胞；突然変異原の影響に曝され、疾患特徴について選択された細胞；またはタンパク質を発現するように形質転換されたかもしくは疾患特徴を有するように遺伝子がサイレンシングされた遺伝子改変細胞であることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
好ましい一実施形態では、細胞は健康対象から得られ、疾患状態がその中で誘発される。この実施形態では、例えば、腫瘍誘発または潜在的薬物標的のシグナル伝達を明らかにすることができる。
【００６８】
他の一実施形態では、腫瘍モデル組織は、不死細胞から、例えば、悪性形質転換したまたは腫瘍性の細胞または細胞株から調製される。この実施形態では、「健康」対照は存在しないが、プラセボ薬と接触したサンプルが薬物治療サンプルの対照を提供するので、このシステムは薬物試験において有用である。
【００６９】
一実施形態では、腫瘍性細胞を患者から得て、計画された治療法の効率を試験することができる。したがって、モデル組織培養物を、個別療法を確立するために使用することができる。
【００７０】
調製方法：
本発明はまた、本明細書に規定されたような人工３次元肺モデル組織培養物の調製方法であって、
−少なくとも初代線維芽細胞及び肺上皮細胞の混合懸濁物を調製する工程、
−この混合懸濁物またはそのアリコートを懸濁物の細胞のペレット化に好適な容器に入れる工程、
−細胞をペレット化する工程、
−ペレット化された懸濁物を、ＣＯ２の存在下で、細胞が細胞凝集塊を含む３次元肺モデル組織を形成するのに十分な時間、インキュベートする工程、
−場合によって、モデル組織を、
ａ）肺組織に特徴的な１以上の上皮分化マーカーの発現、ここで、例えば、本明細書に開示したような好適な参照培養物と比較したときの発現レベルの増加は、３次元肺モデル組織培養物の形成を示すと考えられる；及び／または、
ｂ）１以上の炎症促進性サイトカインの発現、ここで、例えば、本明細書に開示したような任意の好適な参照培養物と比較したときの発現レベルの減少は、３次元肺モデル組織培養物の形成を示すと考えられる
についてアッセイする工程、
を含む方法を提供する。
【００７１】
好ましくは、容器は、組織培養用の処理を行なっていない容器である。
【００７２】
好ましくは、複数のアリコートを複数の容器に入れる。
【００７３】
好ましくは、容器は、プレート、例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのウェルである。
【００７４】
好ましくは、ペレット化は、２００ｇ〜６００ｇで、１〜２０分間、好ましくは２〜１０分間行なわれる。
【００７５】
好ましくは、細胞にレポーター分子を供給する、例えば、細胞を、本明細書に開示したような細胞特徴を知らせる生体適合性色素で染色する。
【００７６】
容器は、それを使用する目的に応じて、Ｖ底、平底またはＵ底容器であることができる。
【００７７】
混合懸濁物を調製するとき、１８時間以内に、好ましくは１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間以内に、より好ましくは４時間、３時間、２時間以内に、極めて好ましくは１時間または０．５時間以内に、１種類以上の細胞を容器に添加する。好ましくは、使用される各種類の細胞を上で規定した期間内に添加する。
【００７８】
好ましい一実施形態では、ペレット化された懸濁物を、ＣＯ２の存在下で、５０時間、４０時間、３０時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間または１０時間を超えない期間、インキュベートする。好ましい一実施形態では、ペレット化された懸濁物を、ＣＯ２の存在下で、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間以上の期間、インキュベートする。
【００７９】
本発明の一実施形態では、さらなる種類の細胞を細胞の混合懸濁物に添加する。本発明の一実施形態では、さらなる種類の細胞は、少なくとも内皮細胞である。本発明の一実施形態では、さらなる種類の細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞、顆粒球、樹状細胞、肥満細胞、Ｔ／Ｂリンパ球、マクロファージから選択される。顆粒球、樹状細胞、肥満細胞、Ｔ／Ｂリンパ球及びマクロファージを、不活性な状態または免疫学的に活性のある状態のいずれかで培養物に添加することができる。
【００８０】
場合によって、本発明による方法は、混合懸濁物を調製する前に１種類以上の細胞を脱分化させることを含む。
【００８１】
場合によって、本発明による方法は、混合懸濁物を調製する前に１種類以上の細胞を繁殖させることを含む。この工程は、多数のサンプルの並行試験が、例えば、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）による解決法で必要となる場合に、特に必要である。
【００８２】
スクリーニング方法：
本発明はまた、薬物を肺組織に対するその効果についてスクリーニングする方法であって、
−本明細書に規定したような人工３次元肺モデル組織培養物を準備する工程、
−そのモデル組織培養物の少なくとも試験サンプル及び参照サンプルを採取する工程、
−試験サンプルを薬物と接触させる一方で、試験サンプル及び参照サンプルを同じ条件下に維持する工程、
−参照サンプルと比較して試験サンプルの何らかの変化または変更を検出する工程、ここで、試験サンプルの何らかの変化または変更が検出された場合、それは、薬物の効果を示すものと考えられる、
を含む方法に関する。
【００８３】
本方法の特定の変形では、変化または変更の方向のみを観察し、生理学的な数値を計算しない。特定の変形では、所定の閾値を較正曲線に基づいて規定し、この値と比較する。
【００８４】
好ましい一実施形態では、モデル組織培養物は健康肺組織のモデルであり、薬物の有害効果が試験され、ここで、試験サンプルの細胞にとって害のある変化または変更は、その薬物の毒性効果または有害効果と考えられる。
【００８５】
好ましい一実施形態では、モデル組織培養物は、病理学的特徴を有する病的細胞を含む肺疾患モデル組織培養物であり、薬物の有益な効果が試験され、ここで、
−疾患の程度を得るために、その病理学的特徴を測定または評価するアッセイをそのモデル組織培養物について準備し、
−健康肺組織の参照サンプル（健康参照サンプル）及び／または罹患肺組織の参照サンプル（罹患参照サンプル）を準備し、
−それを薬物に接触させる前及び接触させた後に、健康参照サンプル及び／または罹患参照サンプルならびにその少なくとも１つの試験サンプルにおいて病理学的特徴を測定または評価し、ここで、試験サンプルにおける疾患の程度を、健康参照サンプルにおける疾患の程度へと変化させる及び／または罹患参照サンプルにおける疾患の程度から変化させる、試験サンプルにおける何らかの変化または変更は、その薬物の有益な効果と考えられる。すなわち、それは、罹患参照サンプルよりも健康参照サンプルの状態と類似している。
【００８６】
好ましい一実施形態では、患者から得られる初代細胞を適用する。好ましい一実施形態では、所与の患者由来の初代細胞は、脱分化していないかまたは一部しか脱分化しておらず、細胞の混合懸濁物を調製するために、それらをその患者から入手した後、５、４、３、２もしくは１日以内にまたは１２、１０、８、６、４、３、２、１時間以内に使用される。初代細胞でできたモデル組織培養物では、所与の患者の疾患状態の特徴を研究することができ、治療的薬物及び／またはレジメンを試験することができる。
【００８７】
キット：
本発明は、多数並んだ容器を有する試験プレートを含む人工３次元肺モデル組織キットに関し、ここで、少なくとも２つの容器は、
−各サンプルがそのプレートの別々の容器中に入れられている、前述の請求項のいずれかにおいて規定されたような１種類以上の人工３次元肺モデル組織培養物のサンプル、
−モデル組織培養物の細胞を培養するための適切な培地、
を含む。
【００８８】
好ましくは、容器のサブセットは、１以上の対照サンプルを含む。対照サンプルは、特定の細胞型の純粋な培養物、例えば、上皮細胞及び線維芽細胞のみの培養物、ならびに／または２次元（２Ｄ）培養物であることができる。疾患モデルでは、対照は、健康細胞の培養物であることができる。
【００８９】
好ましくは、人工３次元肺モデル組織キットは、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：
−プレートは９６ウェルプレートである、
−プレートはＶ底プレートまたは平底プレートまたはＶ底ウェルと平底ウェルの両方を含むプレートであり、Ｕ底プレートを適用することもできる、
−各容器中の培養サンプルは、
少なくとも１０３、好ましくは少なくとも１０４、より好ましくは少なくとも２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４細胞、及び
最大でも１０６、好ましくは最大でも５×１０５、４×１０５、３×１０５、２×１０５細胞、または最大でも１０５細胞
という量の細胞を含む、
−容器は個別にまたは１つにまとめて密封されていて、かつ肺組織培養に好適なＣＯ２が豊富な環境または雰囲気を含む、
−ＣＯ２が豊富な環境または雰囲気は、
少なくとも２％、３％、４％のＣＯ２環境、
最大でも１０％、９％、８％または７％のＣＯ２環境、
極めて好ましくは約５％のＣＯ２
を含む。
【００９０】
好ましい実施形態では、サンプルは、試験サンプル及び対応する対照サンプルを含む。
【００９１】
好ましい実施形態では、試験サンプルは、Ｖ底プレートの上またはプレートのＶ底ウェルの中に存在し、対照サンプルは、平底プレートの上またはプレートの平底ウェルの中に存在する。
【００９２】
定義：
本説明の文脈における「人工的組織スキャフォールド」の意味は、細胞を付着させるために及び／または組織もしくは細胞培養中の細胞の構造的な３次元配置を助けるために特別に設計され、かつ細胞を付着させるために及び／または組織もしくは細胞培養中の細胞の構造的な３次元配置を助けるために有用な構造を有する固体支持体材料である。好ましくは、その人工的組織スキャフォールドを、組織または細胞を培養する前に作製し、その組織もしくは細胞を培養する前またはその組織もしくは細胞を培養している間に、組織または細胞と接触させる。したがって、人工的組織スキャフォールドは、通常、細胞相互作用（例えば、細胞−細胞相互作用）の少なくとも一部または細胞環境それ自体に影響を及ぼすことによって、構造（例えば、組織または細胞培養物の３次元構造）に寄与する細胞増殖支持構造または細胞増殖支持材料である。結果として、組織スキャフォールドを組織または細胞培養物から取り除いた場合、組織または細胞培養物は、崩壊するかまたは無秩序状態になる。
しかしながら、当業者であれば、人工的組織スキャフォールドが生分解性材料でできていて、それが徐々に分解されて、細胞−細胞相互作用の形成を可能にする場合、これは、組織スキャフォールドの除去と考えられるべきではなく、また、この過程では、組織または細胞培養物は、崩壊状態または無秩序状態とはならないことを理解する。
【００９３】
あるバージョンでは、人工的組織スキャフォールドは、３次元マトリックス、好ましくは３次元ゲルマトリックスまたは多孔質３次元マトリックスであり、そのマトリックスは、細胞が存在する微小空間または孔を有することが好ましい。
【００９４】
あるバージョンでは、人工的組織スキャフォールドそれ自体が、細胞が付着する表面にある支持体、好ましくは多孔質膜支持体である。このスキャフォールドのバージョンでは、スキャフォールドは、これによって３次元構造の形成が促進されるように、細胞を付着させるために特別に設計され、かつ細胞を付着させるために有用な構造、例えば、細胞が付着する、多孔性であるか、湾曲しているか、縁取りがあるか、または溝がある表面を有する。
【００９５】
好ましくは、人工的組織スキャフォールドは、
−明確な３次元構造を有し、
−多孔性、好ましくは高度に多孔性の材料またはマトリックスであり、
−多孔性膜であり、
−多孔質３次元マトリックスであり、
−生体適合性材料でできていて、かつ／または、
−ポリマーでできている。
【００９６】
場合によって、「人工的組織スキャフォールド」は、多糖ベースのマトリックスであり、例えば、それは、セルロースベースのマトリックス、例えば、メチルセルロースマトリックスである。
【００９７】
場合によって、「人工的組織スキャフォールド」は、ビーズ構造を有し、例えば、それは、サイトデックスビーズである。
【００９８】
「人工的組織スキャフォールドを含まない３次元組織培養物」は、本明細書では、３次元構造を有する組織培養物として理解され、ここで、その組織培養物の３次元構造は、本来備わっている細胞−細胞相互作用によって形成または寄与されるのであって、人工的組織スキャフォールドによって助長されるのではない。
【００９９】
したがって、人工的組織スキャフォールドを含まない３次元組織培養物は、人工的組織スキャフォールドがないときに崩壊するかまたは無秩序状態になるのではなく、その３次元構造を維持する。その人工的組織スキャフォールドを含まない３次元組織培養物が、固体支持体材料の上で培養され、形成されるとしても、３次元構造の形成は、細胞がこの固体支持体に付着することによって助長されるものではなく、また、それによって生じるものでもなく、それは、３次元構造を破壊せずに分離することができる。
【０１００】
本明細書で使用される「細胞の分離」は、組織または細胞培養物のうちの少なくとも２種類の細胞の空間的隔離に関するものであり、この空間的隔離（すなわち、分離）の後、２種類の細胞の比が分離前の培養物の同じ領域の同じ種類の細胞の比と培養物の他の領域中の同じ種類の細胞の比の両方と異なる、培養物の領域、例えば、（部分的）体積または表面を規定するかまたは見出すことができる。好ましくは、少なくとも２種類の細胞の表面張力の差は、インビトロでのそれらの分離に大いに寄与する。
【０１０１】
領域、例えば、特定の細胞型の培養物の体積または部分的体積または表面または部分的表面の「濃縮」は、特定の細胞型の比が、参照領域（例えば、その培養物の他の領域）でよりもその領域で高いときの現象として理解されるべきである。通常、培養物の領域の「濃縮」は、細胞の分離の結果である。
【０１０２】
「炎症」は、感染及び組織損傷などの有害な刺激及び条件によって誘発される適応応答である。
【０１０３】
いくつかのサイトカインは、炎症を加速するので、まとめて「炎症促進性サイトカイン」として知られるが、これらはまた、直接的にまたは特定の細胞型において細胞接着分子もしくは他のサイトカインの合成を誘導する能力によって炎症反応を調節する。初期応答に関与する主な炎症促進性サイトカインは、ＩＬ１−α、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びＴＮＦ−αである。他の炎症促進性調節因子としては、ＩＦＮ−γ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）ならびに炎症性細胞を化学的に誘引する種々の他のケモカイン、及び様々な神経調節因子が挙げられる。炎症応答の正味の効果は、炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ４、ＩＬ１０、及びＩＬ１３、ＩＬ１６、ＩＦＮ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ１ｒａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦまたはＩＬ６の可溶性受容体）のバランスによって決定される。様々なカスケードによるＩＬ１−βの活性化は、インフラマソームと名付けられた巨大な多タンパク質複合体で起こる。
【０１０４】
ＬＩＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１１及びＯＳＭは、炎症過程に影響を及ぼし、かつ本発明の疾患モデルの調製において有用である可能性があるさらなるサイトカインである。
【０１０５】
対照的に、ＩＬ１０のような「抗炎症性サイトカイン」は、炎症過程を調節し、その結果、炎症過程は抑制または緩和される。
【０１０６】
３次元組織の「平均直径」は、上記の方法で生成された３次元組織直径のいくつかの測定値の算術平均と解釈される。
【０１０７】
「典型的直径」（中央直径）は、所与の沈渣サンプルを重量によって２つの等しい部分に分けることを示す直径であり、一方の部分にはその直径よりも大きい凝集塊が全て含まれ、もう一方の部分にはより小さい凝集塊が全て含まれる。
【０１０８】
容器の「並び」は、同じ大きさ、形状及び材料の複数の容器の配置と理解される。配置は、例えば、容器の配列、または容器の２次元マトリックスであることができる。
【０１０９】
ウイルスは、多くの場合、特定の細胞型に強い特異性を持って細胞に感染する偏性細胞内病原体である。「組換えウイルスベクター」では、ウイルス生活環の複製期に必要な遺伝子が除去され、対象となる遺伝子がウイルスゲノムに付加されている。組換えウイルスベクターは、それが通常感染する細胞型に形質を導入することができる。そのような組換えウイルスベクターを作製するために、非必須遺伝子を、パッケージング細胞株のゲノムに組み込んでまたはプラスミド上で、トランスに提供する。いくつかのウイルスが開発されていて、関心は、４種類；レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単純ヘルペスウイルス１型に集中している。
【０１１０】
「癌」は、一群の細胞が制御されない増殖、浸潤（隣接組織への侵入及び隣接組織の破壊）、ならびに時には転移（リンパまたは血液を経由した身体の他の場所への拡大）を示す疾患群である。癌のこれら３つの悪性特性によって、癌と、自己限定的で、浸潤または転移しない良性腫瘍とが区別される。肺腫瘍の９５％は、気管支癌、また、気管支カルチノイド、間質性新生物、混合性新生物である。
【０１１１】
「線維症」は、器官または組織の通常の構成要素としての線維性組織の形成とは対照的な、修復過程または反応過程としての器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成または発生である。肺線維症は、肺構造の再構築をもたらす、弾性の喪失と、間質性筋線維芽細胞に置換される肺上皮細胞と、肺間質における細胞外マトリックスタンパク質の堆積とを特徴とする重症慢性疾患である。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】３Ｄの２細胞型微小培養物の構造を示す写真。ＳＡＥＣ及びＮＨＬＦ細胞を、それぞれ、ＣＦＳＥまたはＤｉＩという生体染色色素で染色した。純粋なまたは様々な比で混合された細胞集団をペレット化し、２４時間のインキュベーションの後、凝集塊を形成させ、その後、画像撮影のために２４ウェル細胞培養プレートに移した。上の列：位相差顕微鏡画像；中央の列：蛍光顕微鏡画像；下の列：共焦点画像。ＳＡＥＣ：緑色のチャンネル；ＮＨＬＦ：赤色のチャンネル。
【図２】５０％ＳＡＥＣと５０％ＮＨＬＦの混合物のマトリゲルに基づく培養物を示す写真。
【図３】異なる比のＳＡＥＣ及びＮＨＬＦを含有するペレット化された微小組織培養物を示す写真。生理的蛍光マーカーのために、ＳＡＥＣ細胞が緑色または黒白コピーで薄い灰色となるのに対し、ＮＨＬＦ細胞は赤色または濃い灰色となる。
【図４ａ】３Ｄヒト肺微小組織におけるＴＴＦ−１のｍＲＮＡレベルを示すグラフ。ＴＴＦ１転写因子は、肺胞上皮細胞の特徴的マーカーである。３Ｄ線維芽細胞培養物はＴＴＦ１発現を示さないが、ＴＴＦ１は、３Ｄ  ＳＡＥＣ単独培養物に存在し、また、２Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ共培養物で増加していて、線維芽細胞の有益な効果を示している。最大レベルのＴＴＦ１発現は、３Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ組織で達せられた。
【図４ｂ】３Ｄヒト肺微小組織におけるＡＱＰ−３水輸送体のｍＲＮＡレベルを示すグラフ。ＡＱ３は、肺におけるＡＴＩＩ上皮型マーカーである。３Ｄ線維芽細胞培養物はＡＱ３発現を示さないが、ＡＱ３は、３Ｄ  ＳＡＥＣ単独培養物に存在し、また、２Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ共培養物で増加していて、線維芽細胞の有益な効果を示しているが、それにもかかわらず、ＡＱ３の最大レベルは３Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ組織培養物で観察された。
【図５】ＳＡＥＣ分化マーカーにおける遺伝子発現変化を示すグラフ及び写真。  Ａ：２Ｄ及び３Ｄヒト肺微小組織におけるＡＱＰ３水輸送体の相対ｍＲＮＡレベル。相対ＡＱＰ３発現レベルは、ＳＡＥＣのみの培養物の相対ＡＱＰ３発現レベルと比べて混合細胞培養物で増加していたが、２Ｄ培養条件と３Ｄ培養条件の間に差は検出されなかった。  Ｂ：ＫＲＴ７  ｍＲＮＡ発現の相対レベルは、ＳＡＥＣのみの培養物と比較して混合細胞培養物で増加していた（独立した実験：ｎ＝３）。  Ｃ：２Ｄ及び３Ｄ培養物におけるＳＦＴＰＡ１及びβ−アクチン発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＳＦＴＰＡ１発現は、ＳＡＥＣ＋ＮＨＬＦ共培養物でしか検出されなかった。ＳＦＴＰＡ１の発現は、２Ｄ培養物よりも３Ｄ培養物で常に高かった。３回の独立した実験の代表的な画像を示す。  Ｄ：ＮＨＬＦ細胞と２Ｄまたは３Ｄ共培養した７２時間後、ＦＡＣＳで選別したＳＡＥＣにおける遺伝子発現変化を調べた。再純化されたＳＡＥＣにおける分化マーカーＡＱＰ３及びＴＴＦ−１のレベルは、２Ｄ共培養物と比較して３Ｄ共培養物で著しく上方調節された。示したデータは、２回の独立した実験の平均である（本発明者らの全ての実験で使用された純化された初代肺細胞は、無作為に選んだ宿主からのものであった）。
【図６】３Ｄ肺組織モデルにおけるＥＭＴマーカーを示すグラフ。  Ａ：２Ｄ及び３Ｄ共培養物におけるＳ１００Ａ４の相対ｍＲＮＡレベル。線維芽細胞の存在は、ＳＡＥＣのみの培養物と比較してＳＡＥＣ−ＮＨＬＦ共培養物におけるＳ１００Ａ４のレベルを著しく減少させたが、２Ｄまたは３Ｄ培養条件は、Ｓ１００Ａ４発現をそれほど変化させなかった。  Ｂ：Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）の相対ｍＲＮＡレベルは、ＮＨＬＦの存在下では３Ｄ培養物で増加している。  Ｃ：２Ｄ及び３Ｄヒト肺微小組織におけるＮ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄ）の相対ｍＲＮＡレベル。  Ｄ：ＮＨＬＦ細胞と２Ｄまたは３Ｄ共培養した７２時間後、ＦＡＣＳで選別したＳＡＥＣにおける遺伝子発現変化を調べた。選別された肺上皮細胞におけるＥＭＴマーカーＳ１００Ａ４及びＥ−ｃａｄのレベルは、２Ｄ共培養物と比較して３Ｄの２細胞共培養物で増加していたが、Ｎ−ｃａｄは、３Ｄ混合培養物では遙かに低いレベルで発現していた。本発明者らの実験で使用された純化された初代肺細胞は、無作為に選んだ宿主からのものであった。示したデータは、３回（パネルＡ〜Ｃ）または２回（パネルＤ）の独立した実験の平均である。本発明者らの全ての実験で使用された純化された初代肺細胞は、無作為に選んだ宿主からのものであった。
【図７】ヒト初代肺細胞培養物における炎症性サイトカイン及びケモカイン分泌を示すグラフ。  Ａ：２Ｄ及び３Ｄ  ＮＨＬＦ単独培養物のＣＸＣＬ−８分泌は、細胞培養上清ではほとんど検出されなかった。２Ｄ  ＳＡＥＣ培養物よりも低い程度ではあるが、３Ｄ  ＳＡＥＣ培養物は依然としてＣＸＣＬ８を産生した。２Ｄ共培養物では、ＣＸＣＬ−８発現がそれほど変化せず、線維芽細胞の存在が、サイトカイン発現に影響を与えることができないことを示した。ＣＸＣＬ−８発現レベルは、純粋なＳＡＥＣとＳＡＥＣ−ＮＨＬＦ共培養物の両方において３Ｄ組織システムで著しく低下した。  Ａ及びＢ：それぞれ、ヒト初代肺細胞培養物におけるＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベル。２Ｄ培養物と比較して、炎症性サイトカインＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６の炎症性のｍＲＮＡレベルは、３Ｄ培養物で常により低い。純粋な線維芽細胞培養物では、ＩＬ−１ｂ  ｍＲＮＡ発現は検出されなかったのに対し、ＩＬ−６レベルは遙かに低く、発現変化もあまり目立たなかった（表２も参照）。  Ｄ：混合細胞培養サンプルと同様に、炎症性サイトカインＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６のレベルもまた、２Ｄ培養物のＳＡＥＣよりも３Ｄ培養物から純化されたＳＡＥＣで顕著に減少していた。示したデータは、３回（パネルＡ〜Ｃ）または２回（パネルＤ）の独立した実験の平均である。本発明者らの全ての実験で使用された純化された初代肺細胞は、無作為に選んだ宿主からのものであった。
【図８】ＳＡＥＣ、ＮＨＬＦ、及びＨＭＶＥＣからなる３Ｄの３細胞型微小培養物の構造を示す写真。ＳＡＥＣ、ＮＨＬＦ及びＨＭＶＥＣを、それぞれ、生体染色色素ＣＦＳＥ、ＤｉＩ、またはＤｉＤで染色し、その後、凝集させた。２４時間のインキュベーションの後、自発的に再配置した２細胞または３細胞型微小培養物を画像撮影のために２４ウェル細胞培養プレートに慎重に移した。  Ａ：２細胞型培養物、Ｂ：３細胞型培養物。上の列：位相差顕微鏡画像；中央の列：蛍光顕微鏡画像；下の列：共焦点画像。ＳＡＥＣ：緑色のチャンネル；ＮＨＬＦ：赤色のチャンネル；ＨＭＶＥＣ：青色のチャンネル。
【図９】３細胞型培養物における遺伝子発現変化を示すグラフ。  Ａ：２Ｄ培養物と比較して、３Ｄ培養物において、ＡＱＰ３及びＫＲＴ７の発現レベルは増加し、Ｓ１００Ａ４及びＮ−ｃａｄは減少していた。  Ｂ：３Ｄ  ＳＡＥＣ−ＮＨＬＦの２細胞型培養物及びＳＡＥＣ−ＮＨＬＦ−ＨＭＶＥＣの３細胞型培養物における分子マーカーの発現変化の比較。ＡＱＰ３及びＥ−ｃａｄのｍＲＮＡレベルは増加し、Ｓ１００Ａ４及びＮ−ｃａｄは減少し、組織の分化が３細胞型モデルで維持されたことを示している。本発明者らの全ての実験で使用された純化された初代肺細胞は、無作為に選んだ宿主からのものであった。
【図１０】９６ウェルプレート中で供給され、すぐに試験できる肺組織キットの調製のフローチャート。
【図１１ａ】２細胞型モデルにおけるＳＡＥＣへのアデノウイルス遺伝子送達を示す写真。ＧＦＰ発現のために、ＳＡＥＣは３Ｄ組織モデルの表面で緑色に見える。凝集の前に、線維芽細胞を生理的色素で予め赤色に染色した。
【図１１ｂ】同じく、ＲＴ−ＰＣＲ反応により、このモデルへの効果的なＧＦＰ遺伝子送達が示されている。アデノウイルスによって形質導入されたモデル培養物でＧＦＰを検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
本発明者らは、肺組織モデルとして有用で、かつ、様々な試験方法ですぐに使える簡単な人工３次元肺モデル組織培養物を作り出した。
【０１１４】
モデルの作製において、肺の組織型の主な特徴を含む組織特徴、胚性期の肺発生における細胞型の相互作用及び組織工学における技術的進歩のいくつかの側面を考慮した。
【０１１５】
スキャフォールドベースのシステムとスキャフォールドフリーのシステムの両方を、本明細書に記載の通りに試験した。驚くべきことに、肺組織特異的マーカーの解析から、３次元のスキャフォールドフリーのシステムがネイティブな肺組織との顕著な類似を示すことが示された。
【０１１６】
従来技術では、線維芽細胞の異常増殖は、これらの種類の細胞をモデル組織で利用しようと試みるときによく起こることであった（特許文献３）。本明細書に提示された結果を踏まえると、そのような異常増殖の原因は、凝集塊の形成の欠如であった可能性があると推測することができる。凝集塊から離れた細胞であれば、容器の表面に付着した可能性があるし、それらによって接触阻害が達成されるまで繁殖し始める可能性がある。
【０１１７】
これまでに開発された肺組織モデルは、特殊なスキャフォールド材料を用いて、長々と培養状態で維持された（非特許文献３）。対照的に、本明細書に提示されたモデルは、容易な操作を可能にし、簡単な実験設定と比較的短い培養時間を使用する。さらに、特別な実験機器は必要とされない。本システムは、ヒト初代細胞及び非形質転換ヒト細胞を含むヒト細胞とともに使用するのに適している。
【０１１８】
特定のシステムでは、スキャフォールド（例えば、マトリックス）が生分解性であることが理解されるべきである。しかしながら、スキャフォールドが、組織培養物の構造もしくは形状に影響を及ぼすかまたはそれらを規定するので、そのような場合は、これらのシステムは、スキャフォールドが分解された後でもスキャフォールドフリーのシステムと考えられるべきではない。加えて、本発明でのようなインビトロシステムでは、通常、分解性の膜が溶解するとは考えられない。
【０１１９】
さらに、生分解性スキャフォールドの溶解には長い時間がかかり、本発明の組織培養物の調製及び使用にかかる時間よりも遙かに長い。
【０１２０】
脱分化した細胞でない細胞を本発明で適用することもできるが、細胞の数は少なくなるであろう。そのため、この実施形態は、主に、計画された試験において、細胞の数が少数で十分な場合、例えば、試験の感度が十分に高い場合に有用である。迅速試験では、本発明のモデル組織培養物の調製を純化された分化細胞から開始することが可能である。そのような細胞は、対象から新鮮に調製することができる。このバージョンの方法は、例えば、薬物もしくは化合物の患者特異的試験においてまたは活性剤の効果を（例えば、潜在的な製造業者のための）特定の疾患状況で試験しようとする場合に特に有用である。
【０１２１】
初代細胞は、商業的供給源、例えば、非特許文献４から入手することもできる。
【０１２２】
多数のサンプルが必要な場合、モデル組織培養物サンプルを調製する前に、細胞を繁殖させるべきである。この過程の間に、脱分化が起こり得る。これは、スクリーニング（例えば、ＨＴＳ）用途に当てはまる。患者特異的な試験では、より少ない数のサンプルで十分である。
【０１２３】
細胞が凝集塊の中で分化する場合、繁殖は減速または停止し、その後、凝集塊はそれほど増加しない。
【０１２４】
少数のサンプルで十分な場合、予備的な繁殖は必要ない。通常、こうしたことは、２、３の薬物についての患者サンプル試験においてまたは特定の現象（例えば、シグナル伝達過程）を観察しようとする場合に生じ得る。しかしながら、スクリーニング過程では、多数のサンプルが必要であり、モデル組織培養物を調製する前に細胞の繁殖が行なわれるべきである。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態では、成体の脱分化した上皮細胞を使用する。成体の脱分化した上皮細胞では、線維芽細胞の存在下で単に共培養されることで、分化がもたらされることがあり、これはさらに、３Ｄ条件、特に、３Ｄ凝集塊の形成に適した条件で増大することが当技術分野で知られていなかった。したがって、好ましい実施形態では、モデル組織培養物調製を脱分化した細胞から開始する。
【０１２６】
培養下で、例えば、２Ｄ組織培養下で維持された初代細胞は、特定の脱分化マーカーを示す。したがって、そのような細胞を本発明で適用することもできる。脱分化マーカーとしては、Ｓ１００Ａ４、Ｎ−カドヘリン及び炎症マーカーが挙げられる。したがって、より多くの細胞を適用することができる。
【０１２７】
多能性細胞または未分化細胞は、組織成分及び／または因子を添加した後に、分化できるようにすることができる。
【０１２８】
肺組織内での細胞相互作用：
細胞の脱分化及び再分化：
幹細胞と組織特異的前駆細胞は両方とも、方向性のある組織特異的分化段階を経ることができ、そのため、器官特異的組織培養材料を作製するための理想的な供給源である。残念なことに、両方の細胞型は、分化した組織において限られた数でしか入手できない。
【０１２９】
組織モデルが、実験及び／または試験要件に従って定期的に構築される必要があるとき、単にそれがたくさんあるという理由で、組織特異的分化細胞は、一次材料のより優れた供給源となる。本モデルシステムは、少なくとも一部は、２次元培養条件下の分化細胞は脱分化することができ、かつ適切な培養条件を用いて再分化させることができるという現象を利用している。
【０１３０】
細胞相互作用：
肺発生、及び上皮損傷修復は、肺の幹細胞及び成体前駆細胞の機能を共調節するように思われる刺激性遺伝子と抑制性遺伝子の微妙なバランスによって厳重に調整されている。例えば、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼシグナル伝達は、呼吸器の器官形成に必須であり、誘導性ＦＧＦ経路阻害因子のファミリーによって負に調節されている（非特許文献５）。さらに、ＦＧＦシグナル伝達は、新しい肺胞の形成、損傷からの肺胞上皮細胞の保護、ならびに肺修復時の推定上の肺胞幹細胞／前駆細胞の移動及び増殖に必要である。逆に、Ｓｍａｄ２、３及び４を介するＴＧＦβ受容体セリン−トレオニンキナーゼシグナル伝達は、肺の形態形成を阻害し、かつ出生後の肺胞発生を阻害することができるが、Ｓｍａｄ３を介する過剰なＴＧＦβシグナル伝達は、間質性線維症を引き起こす。
【０１３１】
したがって、やや複雑ではあるが、相互に関連する、間質と上皮の間の相互作用のシステムが必要である。本発明者らは、純化された肺胞上皮と線維芽細胞の混合物を用いて、基本的な肺モデルを作り出すことができるという仮説を立てた。
【０１３２】
そのため、当初は、２つの細胞型、すなわち、両方とも市販されている（Ｌｏｎｚａ）、初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＬＦ）及び小気道上皮細胞（ＡＴＩＩ特徴を有するＳＡＥＣ）のみを使用した。驚くべきことに、この２つの細胞型は、３次元肺組織モデルを形成するための必要な因子を十分に提供することが分かった。当業者であれば、さらなる細胞型、例えば、本明細書に列挙された細胞型を追加することで、このモデルをさらに発展させることができる。
【０１３３】
混合培養物中の細胞型の分離（選別）：
本発明者らの顕微鏡検査によって、自発的な組織再組織化−「選別」−が、３Ｄ肺初代細胞培養物で起こることが実証されている。本発明者らは、胎仔胸腺器官培養物の調製の方法（非特許文献６）と類似した、細胞を凝集させるための簡単な遠心分離法を本明細書において使用した。本明細書では、初代肺上皮細胞と線維芽細胞との３Ｄ共培養は、２Ｄまたは３Ｄのいずれかのインビトロ単独培養よりもＳＡＥＣがより分化した状態を維持するのに有利であるという証拠が示されている。ＮＨＬＦを含めることによって、上皮分化が容易になっただけでなく、３Ｄ微小組織の凝集及び構造が、ＳＡＥＣのみの培養物（図３）またはＳＡＥＣ−ＨＭＶＥＣ（図８ａ）培養物と比較して、遙かに堅くかつコンパクトにもなった。
【０１３４】
ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）と正常なヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）とからなる本２細胞型共培養システムは、３Ｄ構造を形成及び維持するための外から加えられるＥＣＭの存在を必要としなかった（図３）。１細胞型のＳＡＥＣ及びＮＨＬＦの細胞懸濁物ならびに様々な比の細胞混合物をペレット化することにより、肺微小組織の生成には、コンパクトでかつ安定な３Ｄ構造を維持するための線維芽細胞の存在が必要となることが明らかになった（図３）。３Ｄ微小組織の形態学的検査によって、混合培養物における２つの細胞型の分離は、３Ｄ微小組織、内側のコア部分を形成する線維芽細胞の特徴である一方、上皮細胞が外層を被覆していることが明らかになった（図３）。
分離または「選別」という現象は、細胞型の異なる接着エネルギー特性に基づくものであり、これまで初代ヒト肺組織については記載されていなかった。自発的な細胞「選別」は、異なる細胞型間の凝集力の違いに基づく。肺微小組織の最も凝集性のあるコアまたは中心領域は、凝集性の低いＳＡＥＣに囲まれているＮＨＬＦ集団によって形成される。分化したヒト成体細胞でさえも、それ自身の微小環境を積極的に探求する能力を維持しているという考えの基礎となるので、初代分化ヒト肺組織における分離の過程は特に興味深い。３Ｄ共培養物中の細胞は、隣接する細胞と位置を交換することができ、したがって、組織を構造的に再編成することができる。この過程には、細胞外マトリックスの再編成も必要になる。３Ｄ微小組織モデルにおける様々なＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ比のモデルの研究により、上皮細胞が線維芽細胞の内部コアを被覆するのに１：１の比で十分であることが明らかになり、したがって、１：１の設定を用いて、このモデルのさらなる解析が行なわれた。しかしながら、このモデルは、他の上皮−間質細胞比で有用である可能性がある。完全な被覆に十分な比は、細胞型によって様々な程度に異なり得る。
【０１３５】
理論に束縛されるわけではないが、本発明者らは、本モデルにおける細胞の分離は、その表面張力の違いが大きな役割を果たす細胞型の異なる凝集性によるものであると考えている。
【０１３６】
いかなる細胞もそれ自身の微小環境を積極的に探求し、隣接する細胞と位置を交換するかまたはその近くの細胞外マトリックスを再編成することができる。後者の過程は、機械的牽引力とマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）による酵素活性の両方を必要とすることが知られている。異なる接着エネルギー特性に基づき、特定の細胞組成の混合細胞型が凝集塊中で分離することができるということは、公知の実験的事実である。
【０１３７】
懸滴培養物の分離した細胞凝集塊では、最も凝集性の高い集団が中心領域を占め、それが凝集性の低い集団に囲まれている。組織凝集性の尺度は、細胞の表面張力である。したがって、実験的に検出可能な量である表面張力により、選別階層を予測することができる。そのため、それに関して、初期の試みが当技術分野で行なわれていて、この選別階層によって、新しい細胞型を含めることができるかどうかをある程度予測することができる（非特許文献７）。
【０１３８】
しかしながら、ヒト肺の特定の細胞型については、表面張力係数が知られていない。先行技術では、組織選別という現象が他の培養物で起こるのか、または懸滴培養物でのみ起こるのかということに関して全く何も言われていない。本発明者らは、驚くべきことに、上皮細胞と線維芽細胞の分離が、ペレット化された肺胞上皮と線維芽細胞の混合培養物中で起こることを本明細書で初めて実験的に明らかにした。
【０１３９】
微小凝集塊のサイズ及び構造：
極めて小さいが構造化された凝集塊でさえも組織特徴を示し、したがって、相互作用の研究、及び化合物または環境影響の試験に適していることが本発明者らによって予想外に見出された。
【０１４０】
小さい凝集塊にはいくつかの利点があり、例えば、特別な反応容器が必要なく、そのサイズ及び様々な細胞型の比が再現可能であり、そのため、相互作用がより容易に制御される。小さい凝集塊では、組織凝集塊の内部の壊死化は実質的にないと考えることができる。さらに、驚くほどに均一なサイズ分布を達成することができ、このサイズ分布のおかげで、小さい凝集塊は、並行試験に非常に適したものになる。
【０１４１】
したがって、組織特徴が現われ、それにより相互作用を調べることができるならば、好ましくは、本発明に従って、凝集塊のサイズを小さく維持すべきである。
【０１４２】
凝集塊が小さすぎる場合、本明細書に開示したような正確な形態は、形を成さない可能性があり、凝集塊には組織様の特徴がない可能性がある。凝集塊が大きすぎる場合、そのサイズは、ほとんどが平均から逸脱する可能性がある。
【０１４３】
さらに、培養時間が長く、凝集塊の灌流が少ないという理由で、壊死化が凝集塊の内部で起こる可能性もある。
【０１４４】
特別な添加剤がないとき、例えば、細胞培養培地のみを受容するとき、凝集塊の増殖は細胞の接触阻害によって制御される。
【０１４５】
しかしながら、サイズは、凝集塊中の細胞の数によって決まる。当業者は、上記の要件が満たされるならば、凝集塊のサイズ及び細胞数が、本明細書に示される限度内で変わり得ることを理解する。
【０１４６】
内皮細胞を加えても、凝集塊のサイズはそれほど変化しないことが分かっている。
【０１４７】
本発明において有用な細胞型：
線維芽細胞：
線維芽細胞は、最も用途が広い結合組織細胞ファミリーであり、また、実際のところ、最もありふれた細胞型である。線維芽細胞は、組織完全性の重要な構造エレメントである。線維芽細胞は、ほとんど全てのヒト組織及び器官（肺を含む）における修復及び再生過程に関与する。その主要な機能は、上皮細胞移動などの通常の修復事象のための組織スキャフォールドを提供する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を分泌することである。
【０１４８】
線維芽細胞、または明確なその亜集団は、免疫調節細胞が、炎症細胞及び免疫細胞を誘引することによって免疫応答を誘発することができるケモカイン及びサイトカインを分泌するときに、組織特異的な機能を果たす。異なる解剖学的部位に由来する線維芽細胞は、数多くの共通の表現型特性を示す。しかしながら、線維芽細胞は、異なる解剖学的部位において明確な表現型を示す。線維芽細胞増殖因子及び受容体の特徴的発現も肺線維芽細胞の特徴である（非特許文献８）。
【０１４９】
本発明者らは、線維芽細胞生理機能に基づいて、遠位肺組織のいくつかの側面を模倣する人工的組織スキャフォールドフリーの組織システムを作り出すことが可能であり、人工的なマトリックスベースのモデルが、３次元肺培養物を作り出すための必ずしも唯一の方法ではないということを見出した。理論に束縛されるわけではないが、本発明者らは、肺の線維芽細胞がＥＣＭを分泌するという事実が、この結果に大きく寄与すると考えている。
【０１５０】
肺上皮細胞（肺細胞）：
肺細胞（肺上皮細胞または肺胞上皮細胞またはＡＥＣ）は、正常な肺胞基底膜（すなわち、肺の遠位気道内の末梢ガス交換領域）を裏打ちする上皮細胞である。肺細胞またはＡＥＣは、Ｉ型肺細胞とＩＩ型肺細胞に細分することができる。
【０１５１】
この２つの肺胞上皮細胞型の特徴的マーカーは、容易に追跡可能であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応または免疫組織化学を用いる実験の間にモニタリングすることができる。
【０１５２】
１型肺細胞：
１型肺細胞［肺胞１型肺細胞、１型肺胞細胞、肺胞１型細胞（ＡＴＩ細胞と略す）、またの名を、小肺胞細胞、扁平肺胞細胞、膜性肺細胞、または１型肺胞上皮細胞ともいう］は、肺胞内のガス交換表面である多数の細胞質板を有する複雑に分岐した細胞である。これらの細胞は代謝的に活発であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、増殖因子、及びサイトカインをはじめとする種々の物質に対する細胞表面受容体を有している。肺胞表面の約９５％は、Ｉ型肺細胞で覆われている。
【０１５３】
２型肺細胞：
２型肺細胞（肺胞２型肺細胞、肺胞２型細胞；ＡＴＩＩ細胞、Ｔ２Ｐと略す）は、２型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ、ＥＰＩＩ細胞とも略す）、２型顆粒状肺細胞、２型細胞、２型肺胞細胞、中隔細胞、または大肺胞細胞、大肺胞細胞、もしくは顆粒状肺細胞とも呼ばれている立方上皮細胞である。これらの細胞は、未成熟上皮細胞前駆体から生じる。肺胞２型肺細胞は、肺胞上皮の前駆細胞と考えられている。肺胞２型肺細胞は、自己再生と扁平上皮１型肺細胞への分化が可能である。ＩＩ型細胞は、肺胞表面積の４％しか構成しないが、肺胞上皮細胞の６０％及び全肺細胞の１０〜１５％を占める立方細胞である（非特許文献９）。
【０１５４】
３型肺胞上皮細胞：
３型肺胞上皮細胞は、頂端微繊毛房の存在及びラメラ型分泌顆粒の不在によって、扁平な１型細胞及び立方形の２型細胞とは異なる。これらの細胞は、肺胞刷子細胞とも呼ばれている。
【０１５５】
内皮細胞：
内皮細胞は、単一の扁平上皮細胞層として全ての血管の内腔を裏打ちする楕円形の細胞である。内皮細胞は、血管芽細胞及び血管芽細胞に由来する。
【０１５６】
マクロファージ：
マクロファージは、組織にホーミングした骨髄由来単球（骨髄由来マクロファージ）に由来する細胞である。骨髄中での単能性及び両能性前駆細胞からのマクロファージの分化は、種々のサイトカインによって制御される。さらなる分化は組織中で起こり、その結果として得られるマクロファージ集団は、在住マクロファージと呼ばれている。
【０１５７】
肥満細胞：
肥満細胞は、骨髄中の多能性ＣＤ３４（＋）前駆体から生じる（非特許文献１０）。未成熟肥満細胞は、組織中に移動したときに、その典型的な顆粒状の形態をとる。
【０１５８】
これらの細胞はまた、Ｆｃ−ε  Ｒ１を発現し、かつＣＤ３４及びＦｃ−γ  Ｒ２の発現を停止させる。肺及び腸粘膜におけるほとんどの肥満細胞は、トリプターゼ（ＭＣＴと表す）しか産生しないかまたはキマーゼしか産生しない。肥満細胞は、潜在的メディエーターを放出することによって、即時型アレルギー反応において中心的な役割を果たしている。
【０１５９】
平滑筋細胞：
平滑筋細胞は、一過性に（可逆的収縮）、または（線維症及び筋肉肥大のために）慢性的に、中空器官の内腔を調節する高度に特殊化した多機能の収縮性細胞である。平滑筋細胞は、脈管形成において重要な役割を果たし、血管壁を形作り、かつ血管緊張を維持する。
【０１６０】
さらなる細胞の観察：
内皮細胞を添加することにより、分化した細胞を含む安定な凝集塊が生じた。発現したマーカーに基づいて分かるように、内皮細胞をモデル組織培養物に含めても、分化の程度は減少しない。これらの凝集塊は、内皮細胞が内部に位置する層状構造を維持するように見える。
【０１６１】
実施形態：
３次元モデル組織培養物の調製：
本発明の方法では、少なくとも肺上皮細胞と、間質細胞、好ましくは線維芽細胞とを使用する。生きた培養物を得るために、細胞を別々に培養し、その後、適当な比で混合し、本開示及び当技術分野の方法に基づいて理解されるような適当な条件下においてＣＯ２の存在下で共培養する。細胞の比を定め、条件を選択することにより、１つの細胞型の別の細胞型による異常増殖を避けることができる。
【０１６２】
好ましい一実施形態では、その細胞をヒト対象から初代細胞として得て、脱分化させるかまたはすぐに使用する。例えば、既知の方法（継代、他の細胞型の除去、増殖因子の添加）によって、脱分化を行なうことができる。コンフルエントになることができる場合、細胞は脱分化したとみなされる。
【０１６３】
共培養細胞混合物のペレット化は、細胞−細胞接触を確立させるための及び細胞間の適切な距離を生じさせるための重要な工程である。細胞をペレット化するための最も好都合な方法は、遠心分離を適用することである。ペレット化のための好適な手段を選択することは、本明細書に提供された教示に基づいて、当業者の能力の範囲内で十分に可能である。
【０１６４】
本モデルでは、原理上、上に列挙した細胞のいずれかを用いて、ネイティブな肺組織に近い肺モデル組織を得ることができる。適用される各細胞型は、本明細書に開示したような３次元モデル組織を得るのに有用な条件下で増殖することができ、かつ本モデルの他の細胞型と関連することができなければならない。これらの要素は、予備的な実験で試験されるべきである。便宜上、最初は、比較的小さい比率のさらなる細胞を適用すべきであり、その後、通常、インビボの比率と同様の比率が達成されるまで、さらなる細胞型の比率を増加させることができる。
【０１６５】
好ましい実施形態では、本モデルに含めることができる追加の細胞型は、例えば、内皮細胞及び平滑筋細胞である。
【０１６６】
疾患モデル：
上記のモデルに基づき、かつ様々な遺伝子送達方法及び多様な標的遺伝子を用いて、上記のシステムは、新規の薬物標的の同定及び新規治療法の開発をもたらすことができる肺疾患期の遺伝子変化を研究するために容易に適合され、ここで、
疾患は炎症を含み、罹患細胞、好ましくは上皮細胞は、（正常レベルを上回る）炎症性サイトカインを発現し、モデルは炎症モデルであり、
疾患は腫瘍であり、細胞は、形質転換細胞、例えば、悪性形質転換細胞または不死細胞であり、モデルは腫瘍モデルであり、
疾患は線維症を含み、モデルは線維症モデルであり、
疾患は組織の損傷を含み、モデルは再生モデルである。
【０１６７】
疾患モデルを薬物試験で利用することができる。
【０１６８】
患者から得られる細胞：
一実施形態では、肺細胞を患者から得て、本発明に従って培養する。この実施形態では、脱分化が全く許されないかまたは一部しか許されないことが好ましい。その後、迅速調製法において、３Ｄモデル組織培養物を形成させ、その患者の治療用に提案されている薬物を試験するかまたは計画された治療レジメンを試験することができる。中でも、この実施形態の利点は、均一な組成及びサイズを有する純粋でかつ並行したサンプル培養物を調製することができることである。そのサンプルはまた、いかなる病原体も含まず、また、必要に応じて精製し得る。
【０１６９】
健康細胞から調製されるモデル：
好ましい一実施形態では、健康細胞から始めて疾患モデルを調製し、細胞の疾患特徴（症状）に影響を与える因子を後で添加する。
【０１７０】
例えば、腫瘍モデルを健康細胞から調製し、悪性形質転換に影響を与える因子を添加し、かつ／または悪性形質転換を引き起こす遺伝子をその中で発現させる。Ｗｎｔタンパク質（例えば、Ｗｎｔ５）のレベルが肺腫瘍組織で増大していることが観察されている。したがって、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＩＧＦ（インスリン様増殖因子）、インスリン、Ｗｎｔ因子（例えば、Ｗｎｔ５）またはそれらのカクテルのような、発癌性因子を、本発明の細胞混合物または培養物に添加することにより、腫瘍モデルを調製することができると想定される。
【０１７１】
本方法の代替法では、腫瘍性細胞を、本発明によるモデル培養物が存在するが、半透膜で隔てられている培地に添加する。それにより、腫瘍性細胞によって産生される因子が、本発明の培養細胞の腫瘍性（悪性）転換を誘導する。
【０１７２】
肺腫瘍細胞株でできた肺腫瘍モデル：
肺腫瘍モデルを肺腫瘍細胞株から調製することができる。そのような細胞株は、腫瘍細胞株を検索することにより、非特許文献１１においてすぐに入手可能である。
【０１７３】
賢明には、細胞を培養し、細胞混合物で用いる細胞型の比率を最適化するための適切な条件を見出すための実験を行なうべきである。
【０１７４】
炎症モデル：
炎症モデルについては、単球及び／またはマクロファージを、好ましくは調製過程において本発明のモデル培養物に添加することができる。
【０１７５】
このモデルでは、ＬＰＳまたはＷＮＴ５Ａによる前処理が賢明である。
【０１７６】
活性化マクロファージのサイトカイン産生及びＷｎｔ５のような他の因子の産生は、組織培養物に影響を及ぼし、炎症モデルを可能にする。
【０１７７】
炎症モデルシステムを調べたい場合、適当なチャンバーにて膜で肺凝集塊から隔てて好中球細胞を提供することができる。この場合、好中球移動及びＭＭＰ産生を測定することもできる。
【０１７８】
代わりの実施形態では、疾患モデル肺細胞株を本発明に従って培養する。この実施形態では、薬物をその疾患に対する効力について試験することができる。
【０１７９】
この疾患モデルでは、過剰発現する遺伝子の使用は避けるべきであり、むしろ、誘導性プロモーターを適用すべきである。
【０１８０】
ネイティブな３次元肺細胞凝集塊による炎症モデル：
炎症状態を模倣するために、炎症反応を誘発する様々な材料でネイティブな３次元肺細胞凝集塊を処理することができる。
【０１８１】
そのような材料は、例えば、
急性炎症を引き起こす化学物質、例えば、血管作用性アミン、エイコサノイドなど、
炎症促進性ポリペプチド、例えば、増殖因子、加水分解酵素など、
活性酸素種、
炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ及び他のサイトカイン、
細菌細胞壁抽出物
である。
【０１８２】
例えば、生化学的アッセイ、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ＰＣＲベースの方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）、または例えば、遺伝子チップの適用による発現解析によって、サイトカイン発現を検出することにより、炎症状態を検査する。
【０１８３】
初代細胞の遺伝子改変：
組換えウイルス送達ベクター（ｒアデノウイルス及びｒレンチウイルスベクター）を用いて上皮細胞と間質細胞の両方を遺伝子改変することができ、これらの遺伝子送達方法は、細胞が凝集する能力を損なわない。炎症、腫瘍、線維症及び再生についての特徴的な遺伝子を構成的にまたは誘導性に過剰発現させるかまたはサイレンシングすることができ、組織形態、細胞応答、遺伝子及びタンパク質の発現変化を３次元微小環境で研究することができる。
【０１８４】
例えば、腫瘍形成を促進することが知られている１以上の遺伝子を、肺細胞株、例えば、肺胞Ｉ型もしくはＩＩ型細胞株、好ましくはＩＩ型細胞株に、または線維芽細胞細胞株に導入することができる。そのような遺伝子は、例えば、オンコジーン（例えば、ｒａｓ遺伝子）または腫瘍の発現パターンに特有の遺伝子もしくは遺伝子セット（例えば、ＣＯＸ−２遺伝子）であることができる。ｒａｓ遺伝子の発現だけでは、細胞、好ましくは不死細胞を形質転換するのに不十分であるかも知れないが、増殖は増大する可能性が高く（非特許文献１２）、これにより、本モデルの疾患特徴が提供され得る。
【０１８５】
遺伝子改変した及び致死量以下で放射線を照射した細胞株を用いた初代細胞凝集塊における分泌因子組成の改変：
この実施例では、全ての細胞型は非感染状態のままであり、そのため、遺伝子発現は、任意の所与の３次元肺組織モデルと同じく正常である。しかしながら、凝集塊の細胞組成は、遺伝子改変され、凝集塊内部の細胞微小環境を改変する分泌因子（Ｗｎｔ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、炎症性及び炎症促進性サイトカイン、増殖因子など）を産生する線維芽細胞株（ＷＩ−３８）もしくは肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）のいずれかまたは両方の致死量以下で放射線を照射した細胞（凝集塊の全細胞数の５〜１０％）を含有する。致死量以下での放射線照射は、細胞の繁殖を減少させ、１つの細胞型の他の細型胞による異常増殖を抑制することができる。
【０１８６】
製品：
本発明はまた、３Ｄモデル組織培養物の複数のサンプルを含むキットを提供する。
【０１８７】
好ましくは、容器は、プレート（例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート）のウェルである。
【０１８８】
３Ｄモデル組織は、健康組織のモデルまたは疾患モデル（疾患モデルキット）であることができる。
【０１８９】
プレートは、便宜上、多数並んだ容器またはウェルを含み、その場合、多数の容器は、適切な培地中に１種類以上の人工３次元肺モデル組織培養物のサンプルを含有する。
【０１９０】
容器は、例えば、複数のサンプルの並行試験を可能にするプレート上の平底、Ｕ底または好ましくは、Ｖ底容器であることができる。
【０１９１】
細胞が容器の壁に付着するのを避けるために、容器は、組織培養用の処理を行なっていない容器であることが好ましい。
【０１９２】
好ましい一実施形態では、各容器は単一の凝集塊を含む。好ましい一実施形態では、各容器中の培養物サンプルは、本発明の簡単な説明で規定したような量の細胞含む。
【０１９３】
容器は、個別にまたは１つにまとめて、密封され、かつ本発明の簡単な説明で規定されたような肺組織培養に好適なＣＯ２が豊富な環境または雰囲気を含有することが好ましい。
【０１９４】
通常、本疾患モデルでは同じ環境が必要とされる。
【０１９５】
以下の細胞特徴：細胞の細胞状態、例えば、細胞相、細胞生存性、アポトーシスまたは瀕死状態；細胞型；細胞位置；悪性形質転換；炎症のうちの１つまたは複数について知らせるのに好適な生体適合性色素で細胞を染色することが好ましい。
【０１９６】
対照：
対照サンプルとして、キットは、上皮細胞及び線維芽細胞のみの培養物を含む。プレート上に、少なくとも３−３ウェルの対照（それぞれ、上皮細胞及び線維芽細胞）が存在することが好ましい。
【０１９７】
２Ｄ肺組織であるさらなる対照を用いて、３Ｄ組織に特異的な特徴を同定または評価することが好ましい。
【０１９８】
したがって、要求に応じて、２Ｄ対照プレート（好ましくは、平底の付着組織培養プレート）を３Ｄ組織とともに含めることができる。あるいは、プレートはまた、好ましくは平底ウェル中の２Ｄ肺組織のウェルを対照として含み得る。
【０１９９】
したがって、本発明の一実施形態では、３Ｄ組織用のＶ底ウェルと２Ｄ組織用の平底またはＵ底ウェルの両方を含むプレートを使用する。
【実施例】
【０２００】
実施例１−材料及び方法：
初代ＳＡＥＣ、ＮＨＬＦ及び肺ＨＭＶＥＣ細胞は、Ｌｏｎｚａから購入した。細胞型は全て、異なる性別及び年齢の複数の無作為に選ばれた宿主の肺から単離された。本発明者らは、製造元によって推奨されている通りに、ＳＡＥＣ、ＮＨＬＦまたは肺ＨＭＶＥＣの初期の拡大のために、それぞれ、ＳＡＧＭ、ＦＧＭまたはＥＧＭ−２培地を使用した。全種類の細胞培養物を５％ＣＯ２を含む雰囲気にて３７℃でインキュベートした。２Ｄ及び３Ｄ培養のために、純粋なまたは混合された細胞集団をＳＡＧＭ（小気道増殖培地、Ｌｏｎｚａ）と完全ＤＭＥＭの５０−５０％混合物中で培養した。ＨＭＶＥＣ細胞を含有する２及び３細胞培養物については、ＨＭＶＥＣ細胞用の適切な増殖因子補給剤をＳＡＧＭとＤＭＥＭの５０−５０％混合物に添加した。細胞培養培地の組成物は、製造元の指示に従って調製された。２Ｄ及び３Ｄ培養のために、細胞を示された比率で混合し、それぞれ、平底６ウェルプレートまたは９６ウェルＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に分配した。Ｖ底プレートは、細胞を播種した後すぐに、６００×ｇにて室温で１０分間遠心分離した。
【０２０１】
培養物中での細胞の移動を追跡することができるように、ＳＡＥＣ及びＮＨＬＦを以下の生理的蛍光色素：ＤｉＩ（非特許文献１３及び１４）で染色した。マトリゲルを含むまたは含まない細胞をピペッティングして、組織培養用の処理を行なっていないＶ底９６ウェルプレートに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍにて室温で５分間ペレット化し、その後、得られた細胞ペレットを一晩インキュベートした（５％ＣＯ２、３７℃）。
【０２０２】
Ａ５４９株は、５８歳の男性由来の肺の癌性組織の外植片培養によって非特許文献１５により１９７２年に樹立された。Ａ５４９細胞は、腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞である。Ａ５４９細胞は、上皮細胞の扁平上皮の区分に分類される。上記の培養培地中に２×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種された細胞は、５日で１００％コンフルエントになる。
【０２０３】
Ａ５４９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）においてＣＣＬ−１８５として入手可能であり、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含むＨａｍのＦ−１２培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中でまたは供給元の推奨に従って増殖させることができる。
【０２０４】
ＷＩ−３８細胞株は、約３カ月の在胎月齢の治療的に中絶された胎児から採取された肺組織から１９６２年に開発された。肺組織のトリプシン消化によって放出された細胞が初代培養に使用された。細胞形態は線維芽細胞様である。核型は、４６、ＸＸ；正常２倍体女性である。この培養物の５０回の集団倍加という最長寿命はリポジトリで得られた。８６％というチミジン標識指数は復帰後に得られた。Ｇ６ＰＤはアイソザイムＢ型である。このＷＩ−３８の培養物は、提出者から得られた継代数９回の凍結細胞から拡大したものである。
【０２０５】
非特許文献１６においてＣＣＬ−７５として入手可能なＷＩ−３８細胞を供給元の推奨に従って増殖させる。ＣＬ１３またはＣＬ３０細胞（非特許文献１７）は、５％胎仔ウシ血清及び２５％μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル／Ｆ１２培地中で培養した。
【０２０６】
ヒト細胞は、必要に応じて、ＣＯ２を含む湿気のある雰囲気にて３７℃で維持することが好ましい。
【０２０７】
蛍光及び共焦点顕微鏡検査：
２Ｄ及び３Ｄ培養の前に、ＳＡＥＣ、ＮＨＬＦ及びＨＭＶＥＣを、それぞれ、生理的蛍光色素のＣＦＳＥ、ＤｉＩ及びＤｉＤ（全てＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）で染色した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌの濃度のＣＦＳＥ、ＤｉＩまたはＤｉＤとともに３７℃で１０分間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで洗浄して余分な色素を除去した。先に示したような蛍光標識細胞を用いて、２Ｄ及び３Ｄ培養物を調製した。一晩のインキュベーションの後、３Ｄ細胞培養物をＶ底プレートから注意深く取り出し、カバースリップボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に移した。肺組織微小培養物を蛍光顕微鏡検査（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−８１顕微鏡）または共焦点顕微鏡検査（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００共焦点画像撮影システム）で調べた。
【０２０８】
細胞選別：
ＳＡＥＣ及びＮＨＬＦを製造元の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）に従ってＣＦＳＥ及びＤｉＩで染色した。細胞を混合し、２Ｄ及び３Ｄシステムで７２時間培養した。染色された細胞を、穏やかなトリプシン処理、次いでＰＢＳ＋ＥＤＴ処理で解離させた。ＢＤ  ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅセルソーターを用いて解離した細胞を選別し、ｍＲＮＡ調製用の溶解バッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むチューブに入れた。
【０２０９】
ｃＤＮＡ合成及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
カラム上でのＤＮアーゼ消化とともにＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて、２Ｄ及び３Ｄ細胞培養物からトータルＲＮＡを調製した。μＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ単離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、選別されたＳＡＥＣサンプルからメッセンジャーＲＮＡを調製した。ＭＭｕＬＶ逆転写酵素キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを調製した。ＡＢｓｏｌｕｔｅ  ＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌｏｗ  ＲＯＸマスターミックス（ＡＢＧｅｎｅ）及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００サーマルサイクラーシステムを用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲ実験を行なった。プライマーを表１に記載する。
【０２１０】
組換えアデノウイルスベクター：
対象となる完全遺伝子またはＧＦＰのみの配列を、フォワード（５’）：５’−−３’、リバース（３’）：５’−−３’プライマー配列を用いたＰＣＲ反応で増幅し、シャトルベクターにクローニングした後、相同組換えでアデノウイルスベクターにクローニングした。線状化したプラスミドＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２９３パッケージング細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）にトランスフェクトすることにより、アデノウイルスを産生した。得られたプラークを増幅し、アデノウイルス精製キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、アデノウイルスを精製及び濃縮した。
【０２１１】
上皮細胞のアデノウイルス感染：
ＧＦＰまたは対象となる遺伝子−ＧＦＰを含有するアデノウイルスを２Ｄまたは３ＤのＳＡＥＣに添加した。１×１０６細胞を細胞培養培地２５０μｌ及びウイルス５０μｌに３７℃で９０分間再懸濁した。
【０２１２】
【表１】
2013504303.tif 000002
【０２１３】
ＣＸＣＬ−８アッセイ：
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＣＸＣＬ−８／ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２Ｄ及び３Ｄ細胞培養上清のＣＸＣＬ−８（ＩＬ−８）含量を測定した。製造元の指示に従って、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行なった。簡潔に述べると、同じ様に希釈した細胞培養上清サンプル及びＣＸＣＬ−８標準を、抗ＣＸＣＬ−８モノクローナル抗体で事前にコーティングしたウェルに分配した。室温で２時間のインキュベーションの後、提供された洗浄バッファーでプレートを４回洗浄した。その後、ＨＲＰＯがコンジュゲートされたポリクローナル抗ＣＸＣＬ−８抗体を１時間添加した。最後の洗浄工程の後、ＴＭＢ基質溶液をウェルに添加した。４５０及び５７０ｎｍでｉＥＭＳリーダーＭＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて光学密度を決定し、Ａｓｃｅｎｔソフトウェアを用いてデータを解析した。
【０２１４】
データの定量：
７５００システムＳＤＳソフトウェアを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提案されているようなΔＣｔ（ｄＣｔ）及び相対量（ＲＱ）法により、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータを解析した。サンプルは全て２つの複製を作って準備した。簡潔に述べると、７５００システムＳＤＳソフトウェアによって決定される自動閾値レベルを用いて、各サンプルについてＣｔ値を決定した。以下の式：ｄＣｔ（標的遺伝子）＝Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）に従って、ΔＣｔ（ｄＣｔ）値を決定した。遺伝子発現の変化を、次の式：
ＲＱ＝２−ｄｄＣｔ（式中、ｄｄＣｔ値は、ｄｄＣｔ＝ｄＣｔ（サンプル）−ｄＣｔ（参照サンプル）として計算された）
を用いて計算されたＲＱ値として示す。
【０２１５】
ＯＤを３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌの範囲のＣＸＣＬ−８の７つの異なる濃度から計算された標準曲線と比較して、細胞培養上清のＣＸＣＬ−８含量を決定した。２つの複製を作ってサンプルを分配し、その平均をさらなるデータ解析に使用した。
【０２１６】
実施例２−３次元肺組織モデルを開発するための実験：
懸滴モデル：
ヒト肺構造をシミュレーションするために、本発明者らは、無作為に混合された、ほぼ等量の明確な線維芽細胞集団（ＮＨＬＦ）及び小気道上皮細胞集団（ＳＡＥＣ）中の１０００００細胞の３Ｄ細胞凝集塊から始めた。懸滴アッセイでインキュベートして１日以内に、細胞は、ゆるい組織構造を生成させた。図１に、５０％ＳＡＥＣと５０％ＮＨＬＦの混合物の懸滴培養物を示す。
【０２１７】
しかしながら、形成は安定ではなく、組織構造の回復不可能な損傷なしでは、生成された微小組織を初期の培養条件から別の試験プレートに移すことは不可能であった。
【０２１８】
ペレット化された、マトリゲル含有モデル：
混合された肺微小組織の安定性を改善するために、１：１の比のＳＡＥＣ及びＮＨＬＦをペレット化し、マトリゲルの存在下で増殖させた。多くの３Ｄ肺組織モデル及び他の組織モデルは、マトリゲルを用いて３次元構造を作り出し、この構造の中で、様々な細胞型が増殖して、互いに相互作用することができる。培養物における細胞の移動を追跡することができるように、ＳＡＥＣ及びＮＨＬＦを生理的蛍光色素のＤｉＩ（非特許文献１８及び１９）で染色した。細胞及びマトリゲルをピペッティングして、組織培養用の処理を行なっていないＶ底９６ウェルプレートに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１時間放置した。インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍにて室温で５分間ペレット化し、その後、得られた細胞ペレットを一晩インキュベートした（５％  ＣＯ２、３７℃）。
【０２１９】
図２に、５０％ＳＡＥＣと５０％ＮＨＬＦの混合物のマトリゲルに基づく培養物を示す。マトリゲルが存在するにもかかわらず、ＳＡＥＣ及びＮＨＬＦは安定な３Ｄ構造を形成することができなかったことが明白である。さらに、主に上皮細胞を含有する小さい球形の組織構造は、組織／マトリゲル塊から離れているように見えた。
【０２２０】
実施例３−ペレット化された、人工的組織スキャフォールドフリーのモデル：
ヒト肺の３Ｄ培養条件をシミュレーションする際の次の工程として、同じ数の上皮細胞（ＳＡＥＣ）と線維芽細胞（ＮＨＬＦ）のランダムな混合物をマトリゲルなしで２段階でペレット化した。細胞をピペッティングして、組織培養用の処理を行なっていないＶ底９６ウェルプレートに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１時間放置した。インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍにて室温で５分間ペレット化し、その後、得られた細胞ペレットを一晩インキュベートした（５％ＣＯ２、３７℃）。混合培養する前の細胞を、ＰＢＳ（リン酸バッファー生理食塩水ｐＨ７．２）中１：１０００希釈の生理的蛍光色素のＤｉＩ（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌストック）及びＣＦＳＥ（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌストック）を用いて染色した。これらの培養条件では、細胞は安定な凝集塊を形成し、この凝集塊では、最も付着性の高い線維芽細胞（赤または濃い灰色）が付着性の低い上皮細胞型の細胞（緑色または薄い灰色）に囲まれていた（図３）。凝集塊直径は約２００μｍである。
【０２２１】
さらなる実験では、ＳＡＥＣ細胞とＮＨＬＦ細胞の比を系統的に変化させ、それぞれ、以下のＳＡＥＣ：ＮＨＬＦ比、すなわち、０／１００％、２５／７５％、５０／５０％、７５／２５％、１００／０％、さもなければ上で記載したような比を用いて、培養物を調製した。図３に、異なる比のＳＡＥＣ及びＮＨＬＦを含有するペレット化された微小組織培養物を示す。図から明らかなように、表面の上皮細胞内層を有する最も顕著な３Ｄ構造凝集塊は、同じ量の上皮細胞と線維芽細胞を適用したときに形成され、凝集塊は、２５／７５％の比で、やや小さく、形態はあまり明確でないが、規則正しい上皮細胞内層を有するのに対し、過剰なＳＡＥＣ細胞のとき、すなわち、上皮細胞と線維芽細胞の比が７５／２５％であるときに、遙かに均一な上皮内層が形成される。純粋な培養物は、３Ｄ構造の凝集塊を形成しないか（上皮細胞）、または凝集塊のサイズが遙かに小さい（線維芽細胞）。
【０２２２】
実施例４−２細胞型組織スキャフォールドフリーの３Ｄ肺組織モデルの特徴解析：
分化マーカー：
本モデルの分子特徴解析は、リアルタイムＰＣＲ解析を用いて上皮分化マーカーを基にした。ｍＲＮＡを細胞凝集塊から精製し、ｃＤＮＡを作製した。ＴＴＦ１（図４ａ）、ＡＱ３（図４ｂ）及びＡＱ５特異的プライマーを用いて、内部対照としてのβ−アクチンと比べて結果を解析した。
【０２２３】
図４ａに、３Ｄヒト肺微小組織におけるＴＴＦ−１のｍＲＮＡレベルを示す。ＴＴＦ１転写因子は、肺胞上皮細胞の特徴的マーカーである。３Ｄ線維芽細胞培養物はＴＴＦ１発現を示さないが、ＴＴＦ１は３Ｄ  ＳＡＥＣ単独培養物中に存在し、２Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ共培養物中で増加し、線維芽細胞の有益な効果を示している。最大レベルのＴＴ１発現は、３Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ組織で達せられた。
【０２２４】
図４ｂは、３Ｄヒト肺微小組織におけるＡＱＰ−３水輸送体のｍＲＮＡレベルを示す。ＡＱ３は、肺におけるＡＴＩＩ上皮型マーカーである。３Ｄ線維芽細胞培養物はＡＱ３発現を示さないが、ＡＱ３は３Ｄ  ＳＡＥＣ単独培養物中に存在し、２Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ共培養物中で増加し、線維芽細胞の有益な効果を示しているが、それにもかかわらず、ＡＱ３の最大レベルは３Ｄ  ＳＡＥＣ／ＮＨＬＦ組織培養物で観察された。
【０２２５】
したがって、上記のマーカーは、ＡＴＩＩ型分化の誘導性増加を示し、これは、ＡＴＩ型マーカー発現の増加がないことによってさらに裏付けられた。
【０２２６】
本発明者らが実験で使用した純化された分化細胞型は、市販供給源から得たものであった。これらの細胞型は分化した組織が基になっていたが、ひとたび純化され、２Ｄ培養条件下で維持されると、これらの細胞は、Ｓ１００Ａ４のレベルの増加によって示される脱分化の兆候をほぼすぐに示した（図６及び表２）。ＳＡＥＣをＮＨＬＦと共培養するとすぐに、Ｓ１００Ａ４及びＮ−カドヘリンレベルが著しく減少したが、Ｅ−カドヘリンレベルは増加した。非特許文献２０は、２Ｄ培養条件よりも３Ｄ培養条件で顕著であり（図６）、ＮＨＬＦの存在とは別に、３Ｄ構造もＳＡＥＣの脱分化を減少させるのに必要であることが示された。
【０２２７】
これらの変化もまた、上皮脱分化過程に特徴的な上皮−間質移行（ＥＭＴ）の特徴である。
【０２２８】
炎症促進性サイトカイン発現：
肺感染または肺胞上皮損傷（連続的な上皮細胞層の破壊）によって誘発されると、炎症促進性サイトカインが肺胞上皮によって産生され、好中球をはじめとする炎症性細胞を引き付ける。炎症促進性サイトカインのＣＸＣＬ−８の発現を検討するために、図３に見られるように準備された、２Ｄ単独及び共培養物ならびに３Ｄ組織共培養物の細胞上清からのＣＸＣＬ−８のタンパク質レベルを検討した。市販のＥＬＩＳＡ試験キット（Ｒ＆Ｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＣＸＣＬ−８発現レベルが、従来の２Ｄ組織培養物と比較して３Ｄ組織システムで著しく低下すること（図７ａ）及び上皮細胞比が最大の場合に最小のレベルが検出されることが明らかとなり、ＣＸＣＬ−８発現が上皮細胞層の中断によって誘発されることが示唆された。
【０２２９】
図７の図では、ＣＸＣＬ−８分泌がヒトのインビトロ３Ｄ肺モデルで示されている。線維芽細胞の３Ｄ単独培養物はＣＸＣＬ−８を分泌しないが、３Ｄ  ＳＡＥＣは（２Ｄ  ＳＡＥＣ培養物よりも少ない程度ではあるが−データは示さない）依然としてサイトカインを産生することが分かった。２Ｄ共培養物はＣＸＣＬ−８発現をそれほど変化させず、線維芽細胞の存在がサイトカイン発現に影響を及ぼすことができないことが示された。ＣＸＣＬ−８発現レベルは、上皮−線維芽細胞比が７５／２５％で、上皮細胞が線維芽細胞球を本質的に完全に被覆している場合に、３Ｄ組織システムで著しく低下し、ＣＸＣＬ−８発現は、肺胞上皮細胞層の中断によって誘発され得ることが示唆された。このＣＸＣＬ−８発現の低下は、５０／５０％及び２５／７５％の比ではやや目立たなかった。
【０２３０】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６のｍＲＮＡレベルも調べた。ＳＡＥＣ−ＮＨＬＦ  ｍＲＮＡの混合物からＰＣＲを行なった場合、それぞれの２Ｄ培養物と比較した３Ｄ培養物において、ＩＬ−１βとＩＬ−６の両方のｍＲＮＡレベルは、著しく下方調節された（それぞれ、図７Ｂ及び７Ｃ）。ひとたびＳＡＥＣ細胞が２Ｄ及び３Ｄ  ＮＨＬＦ共培養物から選別されれば、３Ｄ条件で培養されたＳＡＥＣにおけるＩＬ−１β及びＩＬ−６の発現の減少はさらにより顕著であった（図７Ｄ）。
【０２３１】
実施例５−上皮細胞、内皮細胞及び線維芽細胞成分を含む３細胞型モデル：
本発明者らの肺組織培養モデルの複雑さをさらに改善するために、本発明者らは、初代ヒト肺由来微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）をＳＡＥＣ及びＮＨＬＦ細胞に添加し、ＳＡＥＣ及びＮＨＬＦ共培養物と類似した２Ｄ及び３Ｄ組織微小培養物を準備した。
【０２３２】
蛍光及び共焦点顕微鏡検査による微小組織の形態検査により、ＨＭＶＥＣは、３Ｄ条件でＳＡＥＣ細胞とＮＨＬＦ細胞の両方とうまく共培養することができることが明らかになった（図８ａ）。興味深いことに、ＳＡＥＣまたはＮＨＬＦのいずれかとの共培養物中で、ＨＭＶＥＣは、微小培養物の内側のコンパクトなコアを形成した。３つの細胞型（１：１：１）を３Ｄ条件で一緒に培養したとき、それらは接着して１つにまとまり、著しくコンパクトでかつ安定な３Ｄ構造を形成した（図８ｂ）。
【０２３３】
３細胞培養物の分子特徴解析により、ＡＱＰ３及びＫＲＴ７発現のレベルが、２Ｄ培養条件で測定されるレベルと比較して３Ｄ培養物で顕著に増加することが明らかになった（図９ａ及び表２）。ＥＭＴマーカーのＳ１００Ａ４及びＮ−ｃａｄのレベルは、細胞を２Ｄ培養下で維持したときに増加したが、３Ｄ培養下で安定化された。３Ｄ培養物におけるＥ−ｃａｄのわずかな減少は、２Ｄ培養条件では検出されなかった（図９ａ及び表２）。３つの細胞型の混合ｍＲＮＡから定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なったが、純化された組織要素からの組織構築を助ける３つの細胞型の最適な割合を見出すためには、３つの細胞型の３Ｄ培養物のさらなる解析が必要である。
【０２３４】
表２は、ヒト初代肺細胞培養物における遺伝子発現変化を示している。数字は、式ＲＱ＝２−ｄｄＣｔ（式中、ｄｄＣｔ値は、ｄｄＣｔ＝ｄＣｔ（サンプル）−ｄＣｔ（参照サンプル）として計算される）に従って計算されたＲＱ値である。選別されたＳＡＥＣ＊＊を除き、データをｄＣｔ値として提示する場合、以下のように計算した：ｄＣｔ＝Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）。様々な培養物を準備する前に回収された細胞の一部を常に参照サンプルとして使用した。ΔＣｔ（ｄＣｔ）値は以下のように計算された：ｄＣｔ（標的遺伝子）＝Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）。選別されたＳＡＥＣ＊＊サンプルの場合（この場合はアクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した）を除き、１８ＳリボソームＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として使用した。
【０２３５】
【表２】
2013504303.tif 000003
【０２３６】
略語：
Ｎ．Ａ．：データが利用できず、発現レベルが決定されなかった。Ｎ．Ｄ．：特異的なＰＣＲ産物がリアルタイムＱＰＣＲによって検出されなかった。Ｎ．Ｄ．＊：特異的なＰＣＲ産物が従来のＰＣＲによって検出されなかった。Ｎ．Ｃ：特異的な発現レベルが、リアルタイムＱＰＣＲによって並列ウェルまたはサンプルで得られなかった。低い＊：相対的に低い発現レベルが従来のＰＣＲによって検出された。高い＊：相対的に高い発現レベルが従来のＰＣＲによって検出された。
【０２３７】
細胞によって分泌された細胞マーカー及び因子に関する結果のまとめ：
本発明者らは、初代肺上皮細胞と線維芽細胞との３Ｄ共培養は、２Ｄまたは３Ｄのいずれかのインビトロ単独培養よりもＳＡＥＣがより分化した状態を維持するのに有利であるという証拠をここで提供している。ＮＨＬＦを含めることによって、上皮分化が容易になっただけでなく、３Ｄ微小組織の凝集及び構造が、ＳＡＥＣのみの培養物（図３）またはＳＡＥＣ−ＨＭＶＥＣ培養物（図８ａ）と比較して、遙かに堅くかつコンパクトにもなった。
【０２３８】
ＴＴＦ１転写因子は、ＡＴＩＩ細胞における胚発生期及び出生後の肺胞上皮細胞の特徴的な一般的マーカーである。サイトケラチンは、細胞骨格の中間径フィラメントの構成要素であり、その発現パターンは、細胞系譜の同定に重要である。本発明者らの実験において、肺上皮マーカーのＴＴＦ−１及びサイトケラチン７（ＫＲＴ７）は、３Ｄ共培養物における発現レベル上昇を示した。
【０２３９】
ＩＩ型肺細胞は、（アクアポリンタンパク質（ＡＱＰ）ファミリーのメンバーを介した）水の経上皮移動を容易にする。ＡＴＩＩマーカーアクアポリン３は、線維芽細胞の存在下でレベル上昇を示す（図５）。サーファクタントタンパク質の分泌は、ＡＴＩＩ肺上皮細胞の独特の特徴である（非特許文献２１及び２２）。
本発明者らの実験では、単独培養物中のＳＡＥＣ細胞は、サーファクタントタンパク質を発現することができなかったが、サーファクタントタンパク質Ａ１のｍＲＮＡは、結局、３Ｄにおいて及びより少ない量で２Ｄ共培養物において発現された（図５ｃ）。しかしながら、サーファクタントタンパク質Ｂ及びＣは、結局、本発明者らの３Ｄ共培養システムで検出されなかった（データは示さない）。本発明者らは、２細胞培養物と３細胞培養物の両方におけるＡＴＩマーカーのアクアポリン４及び５の発現も調べたが、これらの分子の発現も、結局、検出されなかった。これは、おそらく、本明細書で使用した細胞（ＳＡＥＣ）がどちらかと言えばＡＴＩＩ型であることが理由である。さらに、ＡＴＩ分化にはかなりの量の時間が必要である（データは示さない）。やや長い培養時間で、ＡＴＩ型特徴を有する細胞を使用した場合、ＡＴＩマーカーが現われる。
【０２４０】
したがって、ＳＦＰＣを除き、分化マーカーのＡＱＰ３、ＫＲＴ７、ＴＴＦ１及びＳＦＰＡが線維芽細胞の存在下で上方調節された。ＡＱＰ３及びＳＦＴＰＡのレベルは、３Ｄ培養条件下でさらに増加したが、ＫＲＴ７またはＴＴＦ１分化マーカーは増加しなかった。
【０２４１】
Ｓ１００Ａ４は、よく知られた上皮−間質移行の分子マーカーであり、その発現レベルは、転移性癌腫（非特許文献２３）及び肺線維症（非特許文献２４）で高いことが多い。Ｓ１００Ａ４及びＮ−カドヘリンの上方調節ならびに同時に起こるＥ−カドヘリンの下方調節（非特許文献２５及び２６）もまた、上皮脱分化過程に特徴的で、かつ細胞接着の喪失、Ｅ−カドヘリン発現の抑制、及び細胞移動の増大を特徴とする上皮−間質移行（ＥＭＴ）の特徴である。
【０２４２】
脱分化マーカーのＳ１００Ａ４及びＮ−カドヘリンは、２Ｄ培養条件下の純化された初代細胞で現われた。
【０２４３】
上記の脱分化マーカーは、線維芽細胞の存在下で減少し、３Ｄ条件でさらに減少した。
【０２４４】
ＩＬ１ｂ、ＩＬ６及びＣＸＣＬ８をはじめとする炎症マーカーの減少は、２Ｄ培養物と比較して３Ｄ培養物で観察することができた。そのマーカーは、３Ｄ培養条件下で著しく下方調節され、例えば、線維芽細胞が２Ｄ培養物中に単に存在するだけでは、そのレベルを減少させるのに十分ではなかった。
【０２４５】
ＳＦＴＰＡ１発現は、２細胞培養物では観察されたが、３細胞培養物では観察されなかった（図５ｃ及びデータは示さない）。
【０２４６】
実施例６−疾患モデル：
肺腫瘍細胞株由来の肺腫瘍モデル：
人工的な３次元肺組織培養物を以下の変更とともに実施例３に記載の通りに調製する。
【０２４７】
上皮細胞（ＳＡＥＣ）の代わりに、ＩＩ型肺胞上皮細胞（Ａ５４９）と、肺腺癌のモデルであるＮＮＫ［４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン］処理したＡ／Ｊマウス（非特許文献２７）に由来する５〜２０％のＣＬ１３またはＣＬ３０細胞（非特許文献２８）の組合せを使用する。ＣＬ１３またはＣＬ３０細胞は、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の突然変異を担持している。
【０２４８】
Ａ５４９細胞とＣＬ１３またはＣＬ３０細胞の適切な比を見出すために一連の実験を行なう。腫瘍が自然に形成されるときの比を用いて３Ｄ肺モデル組織を調製し、これを肺腫瘍疾患モデルとして使用する。
【０２４９】
上記の方法の代替法では、患者腫瘍細胞を使用する。
【０２５０】
遺伝子改変した及び致死量以下で放射線を照射した細胞株を用いた初代細胞凝集塊における分泌因子組成の改変：
全ての細胞型は非感染状態のままであり、そのため、遺伝子発現は、任意の所与の３次元肺組織モデルと同じく正常である。しかしながら、凝集塊の細胞組成は、遺伝子改変され、凝集塊内部の細胞微小環境を改変する分泌因子（Ｗｎｔ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、炎症性及び炎症促進性サイトカイン、増殖因子など）を産生する線維芽細胞細胞株（ＷＩ−３８）または肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）のいずれかの致死量以下で放射線を照射した細胞（凝集塊の全細胞数の５〜１０％）を含有する。
【０２５１】
ネイティブな３次元肺細胞凝集塊：
炎症状態を模倣するために、ネイティブな３次元肺細胞凝集塊を様々な濃度の細菌細胞壁抽出物で処理する。サイトカイン産生は、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡ技術を用いて組織培養培地から決定し、上皮細胞と線維芽細胞の両方における遺伝子発現変化は、リアルタイムＰＣＲ反応で定量することができる。
【０２５２】
実施例７−３Ｄ肺組織キット：
この実施例では、以下の特徴のすぐに試験できる３Ｃ肺組織キットを調製する。
１．すぐに試験できる肺組織は、９６ウェルプレートに供給される。
２．すぐに実験または試験できる少量の（８００００細胞／ウェル）肺モデル組織のサンプルがウェル中に存在する。
３．各組織は、ヒト初代肺胞上皮と線維芽細胞（それぞれ、２５、５０及び７５％上皮）の混合培養物からなる。
４．プレートは、３−３ウェルの対照（上皮及び線維芽細胞のみ）を含む。
５．プレートは、透明な、好ましくは付着力のある、プラスチックホイルで（例えば、サランラップ（登録商標）で）密封される。
【０２５３】
組織の品質は、配送を含めて、３日間保証される。
【０２５４】
プレート自体は、Ｖ底９６ウェルの非付着性組織培養用プレートである。
【０２５５】
モデル組織を実施例３に記載の通りに調製する。各組織を、５％ＣＯ２環境での肺培養に最適な２００ｌの組織培養培地中に浸し、密封し、室温または氷上に置く。
【０２５６】
品質管理：１つの組織を各ウェルから採取し、生存率を検査する。分化マーカーをリアルタイムＰＣＲで検査する。
【０２５７】
要求に応じて、２Ｄ対照プレート（平底９６ウェルの付着性組織培養用プレートで増殖させた組織）を３Ｄ組織とともに含めることができる。
【０２５８】
参考文献：
非特許文献３１〜６９
【産業上の利用可能性】
【０２５９】
上記の基本的なパラメータ及び培養条件は、ＡＴＩＩ型の組織スキャフォールドフリーの肺モデルについて確立されたものであり、このモデルで、細胞の自発的な自己集合と細胞相互作用とを研究することができる。このモデルにより、理論的研究及び応用研究と医薬品検査の両方における複雑な組織システムの容易な取扱いと遺伝子操作が可能になる。このモデルはまた、脈管化のための内皮細胞、さらには平滑筋細胞を含むよう、さらなる細胞型によって容易に拡大され、その場合には、相互関係を示す組織と細胞相互作用をさらに研究することができる。
【０２６０】
スキャフォールドフリーの３Ｄ培養により、理論的研究及び応用研究と医薬品検査の両方における単純なまたはより複雑な組織システムの円滑な遺伝子操作が可能になる。この肺組織モデルは、細胞の自発的な自己集合と細胞相互作用とを研究するのに特に好適である。生物医学研究と医薬品会社の両方が、前臨床段階における薬物候補分子の毒性または効力の予測の有効性を高めるインビトロモデルを必要としている（非特許文献２９）。新たに設けられた指針も、動物モデルを取り換えることに重点を置いていて、新しい前臨床試験方法の開発を促している（非特許文献３０）。
【０２６１】
上記のモデルに基づき、かつ様々な遺伝子送達方法及び多様な標的遺伝子を用いて、本発明者らの３Ｄヒト肺微小組織モデルシステムは、新規の薬物標的の同定及び新規治療法の開発をもたらすことができる肺疾患期の遺伝的変化を研究するために容易に適合される。これらの疾患モデルは、炎症モデル、腫瘍モデル、肺線維症モデル、または再生モデルを含み得る。
【０２６２】
健康肺組織及び疾患組織の３次元モデルが利用可能である。本発明による製品は、例えば、組織培養物、そのような培養物を含むプレートもしくはアレイ、またはキットの形態で市販することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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