(57)【要約】TAM受容体、またはTAM受容体リガンドもしくはアゴニストに基づく方法、組成物およびキットが、神経病理学的疾患の検出またはその進行の判定のために提供される。神経疾患は、具体的には、多発性硬化症または脱髄、乏突起膠細胞毒性および小膠細胞活性化によって特徴付けられる他の炎症性神経障害を含む。これらの方法は対象の細胞をスクリーニングする段階を含み、ここでTAM受容体の発現の上昇またはTAM受容体リガンドの発現の変化の特定が疾患の存在または進行の診断となる。TAM受容体リガンド(GAS6もしくはプロテインSのような)の投与によるか、またはTAM受容体に特異的な抗体のようなアゴニストの投与による、そのような神経病理学的疾患を有する対象の処置に加えて、Axl、MerまたはTyro3が記述される。2013535694.tif 000006
2013535694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における炎症性神経病理学的疾患または疾患状態の存在を検出するための方法であって、前記対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、前記受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはその発病の可能性を示す、前記方法。
【請求項２】
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症(metabolic leukodystrophy)、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症、および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項2または3記載の方法。
【請求項６】
前記対象がヒトである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、それをコードするmRNAのレベルによって判定される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、タンパク質のレベルによって判定される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が初回脱髄事象を呈する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
病変部についてスクリーニングするためにMRIを行う段階をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
対象における炎症性神経病理学的疾患または状態を検出するアッセイの作製におけるTAM受容体またはそのリガンドの使用。
【請求項１４】
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、請求項13記載の使用。
【請求項１５】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項14記載の使用。
【請求項１６】
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症、および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項14または15記載の使用。
【請求項１８】
前記対象がヒトである、請求項13〜17のいずれか一項記載の使用。
【請求項１９】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項18記載の使用。
【請求項２１】
前記リガンドがTAM受容体鎖に特異的な抗体である、請求項13記載の使用。
【請求項２２】
対象における炎症性神経病理学的疾患または状態の処置または予防のための方法であって、前記炎症性神経病理学的疾患または状態を寛解させるのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストまたはTAM受容体リガンド調節因子の有効量を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項23または24記載の方法。
【請求項２７】
前記対象がヒトである、請求項22〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記調節因子がAxl、MerまたはTyro3単量体に特異的な抗体である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
炎症性神経病理学的疾患または状態の処置のための医用薬剤の製造におけるTAM受容体のアゴニストまたはそのリガンドの調節因子の使用。
【請求項３２】
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、請求項31記載の使用。
【請求項３３】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、請求項33記載の使用。
【請求項３５】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項32または33記載の使用。
【請求項３６】
前記対象がヒトである、請求項31〜35のいずれか一項記載の使用。
【請求項３７】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、請求項36記載の使用。
【請求項３８】
前記調節因子がAxl、MerまたはTyro3単量体に特異的な抗体である、請求項37記載の使用。
【請求項３９】
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項36記載の使用。
【請求項４０】
対象における炎症性神経病理学的状態の進行をモニタリングするための方法であって、前記対象由来の細胞をTAM受容体の発現またはそれに対するリガンドの発現の調節について経時的にスクリーニングする段階を含み、時間内の前記受容体またはそのリガンドの発現の変化が疾患進行を示す、前記方法。
【請求項４１】
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症、および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項41または42記載の方法。
【請求項４５】
前記対象がヒトである、請求項40〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、それをコードするmRNAのレベルによって判定される、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、タンパク質のレベルによって判定される、請求項40記載の方法。
【請求項５０】
前記対象が初回脱髄事象を呈するか、またはそれを発病するリスクがある、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願データ
本出願は「A method of diagnosis and treatment」という名称の、2010年8月19日付で出願された、豪州仮特許出願第2010903728号と関連しており、その優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本開示は、広くは、炎症性神経病理の分野に関する。本開示は、炎症性神経病理、例えば脱髄疾患、乏突起膠細胞毒性および小膠細胞活性化ならびに他の神経変性状態の診断およびモニタリング、かつそのような状態の処置および予防における医用薬剤のスクリーニングを可能にする。炎症性神経病理に対しての診断キット、ハイスループットスクリーニングおよび治療用組成物も、本明細書において教示される。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書において著者により言及される刊行物の書誌の詳細は、説明の最後にアルファベット順にまとめられている。
【０００４】
本明細書におけるいずれかの先行技術についての言及は、この先行技術が、いずれかの国における一般的な一般知識の一部を形成することの認識または何らかの形態の暗示ではなく、そのように理解されるべきではない。
【０００５】
受容体タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)は、細胞外リガンドの結合により、受容体二量体化およびキナーゼ活性を誘発する細胞表面膜貫通受容体である。PTK活性化から始まるシグナル伝達カスケードは、細胞分化およびアポトーシスを含むさまざまな範囲の細胞過程を制御する。PTK受容体の1つの特定の群は、TAM受容体ファミリーである(Lai and Lemke, Neuron 6:691-704, 1991 (非特許文献1))。このファミリーの3つの成員がこれまでに特定されており、Axl、MerおよびTyro3と名付けられている(Lemke and Rothlin, Nature Reviews (Immunology) 8:327-336, 2008 (非特許文献2)により概説されている)。TAM受容体を介したシグナル伝達は、神経系、生殖器系および脈管系における組織恒常性と関連している。TAMシグナル伝達はまた、樹状細胞およびマクロファージによる病原体およびアポトーシス細胞に対する炎症反応ならびにナチュラルキラー細胞の成熟の阻害を含む先天性免疫反応の調節において重要である。
【０００６】
TAM受容体およびそのリガンドは、ホモ二量体およびヘテロ二量体として結晶化する。この受容体の各単量体型はN末端領域、Gla-ドメイン、EGF-様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通ドメインおよびPTKドメインを含む(Lemke and Rothlin, 2008 前記(非特許文献2))。
【０００７】
脱髄疾患は、ニューロンの髄鞘が損傷を受ける神経系障害である。これは罹患神経でのシグナル伝達を低減し、とりわけ、感覚、運動および認知の損傷を引き起こす。脱髄疾患は多発性硬化症(MS)および他の炎症性特発性脱髄疾患を包含する。臨床分離症候群(clinically isolated syndrome; CIS)としても公知の、初回脱髄事象(FDE)を呈するある割合の患者は、MSへと進み、MSを発病する。最初の2年における再発数を含むMSの早期経過は、永続的疾患の早期発病の予測となる。疾患活動性およびFDEからMSへの進行の可能性の予測因子の1つの形態がMRIによるものである(Brex el al., N. Engl. J. Med 346(3): 158-164, 2002 (非特許文献3))。MRIは病変部を検出する。病変部のない患者はMSの可能性が11%あり、2つまたはそれ以上の病変部のある患者はMSの可能性が83〜88%あり、全ての者が10年の期間内にその可能性がある(Barkinof et al., Brain 120:2059-2069, 1997; O'Riorden el al., Brain 121:495-503, 1998 (非特許文献4〜5))。MRIは有用な手段であるが、MRIは高価であり、特別な設備および訓練を要する。
【０００８】
乏突起膠細胞は、これらのMSおよび他の炎症性特発性脱髄疾患において損傷を受ける主要な細胞種である。ゆえに、「乏突起膠細胞疾患」という用語は、乏突起膠細胞に影響を与える脱髄疾患および脱髄域におけるさまざまな細胞種と関係を持つその能力を定義するために用いられる。TAM受容体ファミリーは、乏突起膠細胞を含む神経系において発現されることが分かっている(Binder et al., The Journal of Neuroscience 28(2):5195-5206, 2008 (非特許文献6))。乏突起膠細胞死は脱髄疾患における早期の事象である(Barnett and Prineas, Ann. Neurol 55:459-468, 2004 (非特許文献7))。
【０００９】
本開示によれば、TAM受容体は脱髄の、ならびに乏突起膠細胞生存および小膠細胞調節の有用な生物指標であることが分かった。MSおよび他の炎症性特発性脱髄疾患の分子決定因子の開発は、早期の診断および介入を可能にし、患者の臨床転帰を改善する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Lai and Lemke, Neuron 6:691-704, 1991
【非特許文献２】Lemke and Rothlin, Nature Reviews (Immunology) 8:327-336, 2008
【非特許文献３】Brex el al., N. Engl. J. Med 346(3): 158-164, 2002
【非特許文献４】Barkinof et al., Brain 120:2059-2069, 1997
【非特許文献５】O'Riorden el al., Brain 121:495-503, 1998
【非特許文献６】Binder et al., The Journal of Neuroscience 28(2):5195-5206, 2008
【非特許文献７】Barnett and Prineas, Ann. Neurol 55:459-468, 2004
【発明の概要】
【００１１】
概要
本明細書を通じて、文脈により別の意味が必要とされない限り、「含む(comprise)」という単語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」のような変化形は、述べられた要素もしくは整数もしくは方法段階または要素もしくは整数もしくは方法段階の群を含むことを意味するが、他のいかなる要素もしくは整数もしくは方法段階または要素もしくは整数もしくは方法段階の群を排除することを意味するものではないと理解されよう。
【００１２】
本開示は、多種多様の神経変性疾患および状態を包含する炎症性神経病理学的状態の生物指標について教示する。生物指標はTAM受容体およびそのリガンドである。TAM受容体のレベルの上方制御および/またはTAM受容体リガンドのレベルの変化は、炎症性神経病理学的状態の存在またはその発病の素因に対応することが本明細書において分かる。
【００１３】
本開示によって教示される生物指標は、疾患進行の予測、診断、予後判定およびモニタリングのための指示であり、炎症性神経病理の処置または予防のための医用薬剤に有用な治療標的である。生物指標はまた、生体指標および診断標的と考えられる。生体指標は単独でまたはMRIを含む他の診断プロトコルとの組み合わせで用いられてもよい。
【００１４】
したがって、本明細書において可能とされる局面は、対象における炎症性神経病理学的状態または疾患の存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、受容体の発現の上昇またはリガンドの発現の変化が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性を示す、方法である。「発現」とは、タンパク質(すなわちTAM受容体もしくはTAM受容体リガンド)のレベルについてアッセイすること、あるいはTAM受容体(もしくはその単量体型)またはそのリガンドをコードする遺伝子の発現の変化についてアッセイすることを意味する。TAM受容体タンパク質もしくはそれをコードするmRNAの上昇または正常対照もしくはそのリガンドの既知の疾患状態を有する対象由来の対照と比較して(タンパク質もしくはmRNAレベルで)の変化は、炎症性神経病理を示す。
【００１５】
本明細書において教示される別の局面は、対象における炎症性神経病理学的状態または疾患の存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体もしくはリガンドまたは該受容体もしくはリガンドをコードする遺伝子の発現についてスクリーニングする段階を含み、受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現の変化が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはその発病の可能性を示す、方法を提供する。簡潔にするために、「発現」という用語は、遺伝子発現およびタンパク質レベルについて用いられる。
【００１６】
1つの態様において、炎症性神経病理学的疾患または状態は、炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態のような脱髄事象である。そのような疾患または状態は、多発性硬化症(MS)または急性播種性脳脊髄炎のような関連状態、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症(metabolic leukodystrophy)、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および脱髄に関連する疾患または外傷の修復におけるものを含む。全てのそのような炎症性神経病理はまた、「神経変性疾患または状態」という用語によって包含される。対象はまた、無症状であるにも関わらず、状態の発病を阻止または遅延するために処置されうる。
【００１７】
炎症性神経病理は炎症性神経変性疾患または状態を含み、具体的には、乏突起膠細胞毒性もしくは細胞周期停止、脱髄および/または小膠細胞活性化を伴う神経変性状態を含む。
【００１８】
本開示によって同様に教示されるのは、炎症性神経病理のモニタリングのためのアッセイ法である。そのようなモニタリングは、治療的介入の後にまたは治療を開始するための決定過程の一部として有用である。「治療」とは、医用薬剤の投与および行動介入を含む。この局面は、初回脱髄事象(FDE)を呈している患者およびFDEを発病するリスクのある患者のモニタリングを含む。
【００１９】
ゆえに、本開示は、対象における炎症性神経病理学的状態の進行をモニタリングするための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現について経時的にスクリーニングする段階を含み、時間内の受容体またはそのリガンドの発現の変化が疾患進行を示す、方法をさらに対象にする。検出はタンパク質レベルまたは遺伝子発現レベルであってよい。
【００２０】
「疾患進行」とは、炎症性神経病理の症状の寛解または症状の悪化のモニタリングを意味する。1つの態様において、治療中などの、TAM受容体の発現レベルの減少またはリガンドレベルの変化は疾患の転帰または状態の改善の指標となる。
【００２１】
疾患状態においてTAM受容体発現が上方制御されるにもかかわらず、TAM受容体を介したシグナル伝達の促進は、炎症性神経病理学的状態または疾患の症状を寛解するものと本明細書において提唱される。ゆえに、本明細書において教示される別の局面は、対象における炎症性神経病理学的状態または疾患の存在を検出するための方法であって、対象の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドによって媒介されるシグナル伝達の程度についてスクリーニングする段階を含み、TAM受容体を介したシグナル伝達の減少が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性を示す、方法である。
【００２２】
「TAM受容体」への言及は、Axl、MerおよびTyro3またはそれらの機能的等価体を含む。TAM受容体はホモ多量体型もしくはヘテロ多量体型であってもよく、またはそれは単量体のプレ受容体型であってもよい。1つの態様において、「多量体」は二量体、ゆえにホモ二量体またはヘテロ二量体である。「TAM受容体リガンド」への言及は、Gas6 (増殖停止遺伝子6)およびプロテインSまたはそれらの機能的等価体を含む。TAM受容体リガンドは同様に、TAM受容体複合体に対する抗体あるいは該受容体の単量体型またはヘテロ多量体型もしくはホモ多量体型に対する抗体を含む。
【００２３】
本明細書において教示される別の局面は、TAM受容体リガンドのアゴニスト、例えばGas6またはプロテインSのアゴニストおよびTAM受容体それ自体のアゴニストであり、これらのアゴニストはTAM受容体を介したシグナル伝達を容易にする。
【００２４】
本開示は対象における炎症性神経病理学的疾患または状態の処置または予防のための方法であって、炎症性神経病理学的疾患または状態の症状を寛解するのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストまたはTAM受容体リガンド調節因子の有効量を対象に投与する段階を含む、方法について教示する。リガンド調節因子はアゴニストまたはアンタゴニストであってよい。
【００２５】
「TAM受容体アゴニスト」および「TAM受容体リガンドアゴニスト」は、「TAM受容体を介したシグナル伝達のアゴニスト」を含む。そのようなアゴニストの一例は、Gas6またはプロテインSの模倣体である。アゴニストの別の例は、二量体化または多量体化を容易にし、かつシグナル伝達を促進するTAM受容体の単量体型に対する抗体である。
【００２６】
それゆえ、アゴニストは、TAM受容体リガンドのアゴニストもしくはTAM受容体のアゴニストであってよく、またはTAM受容体を介したシグナル伝達をそれ以外の方法で容易にしうる。上記のように、炎症性神経病理学的疾患または状態は、脱髄疾患を含む。
【００２７】
TAM受容体を介したシグナル伝達のアゴニストについてのハイスループットスクリーニングも、本明細書において企図される。受容体リガンドのアンタゴニストも本明細書において企図される。
【００２８】
本開示はさらに、炎症性神経病理を検出するアッセイの作製におけるTAM受容体を介したシグナル伝達の使用を可能にする。本開示は同様に、炎症性神経病理学的疾患または状態の処置における医用薬剤の製造におけるTAM受容体を介したシグナル伝達のアゴニストの使用について教示する。
【００２９】
本明細書において用いられる略語を表1にまとめる。
【００３０】
（表１）略語
2013535694.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３１】
図のなかには色彩表現または実体を含むものもある。カラー写真は依頼に応じて特許権者から、または適切な特許庁から利用可能である。特許庁から入手するなら、特許料が課されうる。
【００３２】
【図１】MS病変部におけるAxl、Gas6、Mer、プロテインSおよびTyro3の発現のグラフ表示である。
【図２】血球におけるAxl、Mer、Gas6およびプロテインS遺伝子発現のグラフ表示である。
【図３】脱髄に及ぼす効果を示す、クプリゾン 対 非曝露Gas6ノックアウト(Gas6-/-)マウスの写真表示である。
【図４】小膠細胞の活性化および浸潤に及ぼす効果を示す、クプリゾン 対 非曝露Gas6ノックアウト(Gas6-/-)マウスの写真表示である。
【図５】図5A〜Cは、外因性Gas6がインビトロで髄鞘形成を増大することを示す写真表示およびグラフ表示である。
【図６】図6A〜Cは、TAM受容体およびリガンドがEAEの間に調節されること、ならびに発現またはレベルが細胞変化の指標と相関することを示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本明細書において用いられる場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単数形は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の局面を含む。したがって、例えば、「1つのTAM受容体」への言及は、単一のTAM受容体、および2種またはそれ以上のTAM受容体を含み; 「1つのアゴニスト」または「1つの炎症性神経病理」への言及は、単一のアゴニストまたは単一の炎症性神経病理、および2種またはそれ以上のアゴニストまたは炎症性神経病理を含み; 「その開示」への言及は、開示によって教示される単一または複数の局面を含む; など。本明細書において記述される全ての局面および態様は、「発明」という用語によって包含される。
【００３４】
本開示は、炎症性神経病理学的疾患または状態の発病の間または前に、例えば、炎症性脱髄疾患を含む乏突起膠細胞疾患の間または前にTAM受容体が上方制御され、TAM受容体リガンドのレベルが変化することを教示する。「上方制御」は、TAM受容体またはリガンドのmRNAまたはタンパク質の正常(非疾患状態)細胞と比べてレベルの増強または上昇が存在することを意味する。それはTAM受容体を介したシグナル伝達の増強を意味しない。「変化した」とは、正常対照と比べて上方制御または下方制御を意味する。本明細書において企図される疾患状態は、MS、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復を含む。これらの疾患状態の全てが神経変性疾患または状態という用語によって包含される。これらの状態は、状態の発症前の形態、ならびに状態を無症候的に呈するが、状態を発病するリスクのある対象を含む。
【００３５】
本明細書において企図される炎症性神経病理は、乏突起膠細胞疾患、例えば、乏突起膠細胞のアポトーシスもしくは死または乏突起膠細胞を伴う他の細胞傷害性事象、および乏突起膠細胞の細胞周期停止または脱髄を含む。炎症性神経病理は、小膠細胞活性化を伴ってもよい。
【００３６】
したがって、本明細書において可能とされる局面は、対象における炎症性神経病理学的状態または疾患の存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性を示す、方法である。
【００３７】
本明細書において教示される別の局面は、対象における炎症性神経病理学的状態または疾患の存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体もしくはリガンドまたは該受容体もしくはリガンドをコードする遺伝子の発現についてスクリーニングする段階を含み、受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現の変化が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはその発病の可能性を示す、方法を提供する。簡潔にするために、「発現」という用語は、遺伝子発現およびタンパク質レベルについて用いられる。
【００３８】
1つの態様において、TAM受容体リガンドが上昇する。別の態様において、TAM受容体リガンドが低減する。これらのレベルは正常対照または既知の疾患状態を有する対象由来のサンプルに対してである。リガンドの「レベルの調節」という用語は、そのレベルの変化を記述するために用いられる。そのレベルは正常対照と比較され、または既知の疾患状態を有する対象由来の対照と比較される。
【００３９】
本明細書において教示される別の局面は、対象における脱髄疾患または状態の存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそのリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、TAM受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、脱髄疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性を示す、方法である。1つの態様において、レベルの変化はリガンドのレベルの上昇である。
【００４０】
本開示は同様に、対象における神経変性疾患または状態の存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそのリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、TAM受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、神経変性疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性を示す、方法のための指示である。
【００４１】
脱髄疾患の一例はMSのような炎症性特発性脱髄疾患である。
【００４２】
1つの局面において、対象において企図されるMSの存在を検出するための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、TAM受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、MSの存在またはそれを発病するリスクを示す、方法が可能とされる。
【００４３】
ゆえに、本開示は、以下のことを教示する:
(i) TAM受容体タンパク質(単量体型、ホモ二量体型もしくはヘテロ二量体型を含む)の増加; および/または
(ii) 1種もしくは複数のTAM受容体リガンドの増加もしくは減少; および/または
(iii) 該受容体もしくはリガンドをコードする遺伝子の発現レベルの変化
が炎症性神経病理学的状態または疾患に関連する。これらのレベルは、正常対照または既知の疾患状態を有する対象由来の対照と比較される。
【００４４】
本明細書において記述されるアッセイ法は、単独でまたはMRIのような他の診断プロトコルと併せて用いられてもよい。さらに、MSの分子決定因子または他の炎症性神経病理学の使用は、FDEを呈している患者または疾患の症状の早期発症の後にモニタリングされている患者またはFDEを発病するリスクがある患者において有用である。対象は無症状でありうるがFDEまたは他の状態を発病するリスクがある。それゆえ、本開示は、FDEを有する患者をスクリーニングするための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそのリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、TAM受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、神経変性疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性を示す、方法について教示する。
【００４５】
「TAM受容体」は、Axl、MerおよびTyro3の単量体型または多量体(ホモメリックもしくはヘテロメリック)型を含む。TAM受容体リガンドはGas6およびプロテインSを含む。受容体またはリガンドへの言及は、その誘導体、相同体および機能的等価体を含む。「機能的等価体」という用語はTAM受容体リガンドの模倣体も包含し、これは、この活性の能力がある生物学的または化学的分子を含むアゴニストとして作用する。
【００４６】
本明細書において教示される方法は、とりわけ、アッセイ法、スクリーニング、予測因子、方法、試験、システム、診断、予後判定、バイオアッセイ法、判定または報告といわれてもよい。この方法は、医用薬剤介入または行動修正の後などの、疾患の進行をモニタリングするのに有用である。ゆえに「治療」とは、医用薬剤および行動介入の使用を意味する。
【００４７】
ゆえに、本開示は、状態の発症前相にある対象などまたは状態を発病するリスクのある無症状の対象における、対象における炎症性神経病理学的状態の進行をモニタリングするための方法であって、対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現について経時的にスクリーニングする段階を含み、時間内の受容体またはそのリガンドの発現の変化が疾患進行を示す、方法について教示する。この変化は正常対照または既知の疾患状態の対象由来の対照に対してである。
【００４８】
本明細書において可能とされるさらに別の局面は、対象における炎症性神経病理学的状態もしくは疾患の存在を検出するための、またはその進行をモニタリングするための方法であって、対象の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、TAM受容体を介したシグナル伝達の減少が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはそれを発病する可能性、または疾患もしくは状態の継続的進行を示す、方法である。
【００４９】
TAM受容体のレベルの上方制御またはリガンド発現の変化のスクリーニングは、mRNAレベル、タンパク質レベルおよびTAM受容体を介したシグナル伝達レベルの変化の判定などの任意の手段によるものであってよい。細胞選別およびFACSが利用されてもよい。本開示のアッセイ法は、炎症性神経病理学的状態における微小残存病変(MRD)を判定するために利用されてもよい。タンパク質または核酸発現の使用は、より高感度のアッセイ法を可能にする。
【００５０】
好都合には、血球を単離し、アッセイ法に供して、TAM受容体レベルおよび/またはTAM受容体リガンドレベルの任意の増加を判定する。これは、単独で、または対象の状態を発病するリスクもしくは予測を含む炎症性神経病理学的状態の他の症状との組み合わせで情報を臨床医に提供する。対象はFDEを有しうるか、または炎症性神経病理を有するものと症候的に考えられるか、または無症状であるにも関わらず、FDEもしくは他の状態を発病するリスクがある。
【００５１】
TAM受容体またはそのリガンドのレベルは、神経系におけるストレスのレベルの指標を提供する。それはシグナル伝達のレベルと同じではない。
【００５２】
任意の細胞種またはさまざまな範囲の細胞種もしくは細胞種の混合物がアッセイされてもよい。ゆえに、血球(CD3+リンパ球のような)が集団で回収されるかもしくは分離され、かつ/または選別され、その後、TAM受容体もしくはTAM受容体リガンドのmRNAもしくはタンパク質またはTAM受容体を介したシグナル伝達についてアッセイされてもよい。
【００５３】
本開示はさらに、炎症性神経病理のアッセイの作製におけるTAM受容体またはTAM受容体リガンドのmRNAまたはタンパク質の使用について教示する。炎症性神経病理は炎症性特発性脱髄疾患、例えばMSまたは乏突起膠細胞を伴う他の障害を含む。アッセイ成分は、TAM受容体またはリガンドのレベルを定量化または半定量化するために、さまざまな試薬、プライマーおよび/または抗体を含有するよう適合された区画を有するキットの形態で包装されてもよい。キットは使用説明書を含んでもよい。キットまたはアッセイ法はポイント・オブ・ケアでまたは診断プロトコルの一部として用いられてもよい。
【００５４】
アッセイ法は、TAM受容体を介したシグナル伝達を刺激する作用物質についてのハイスループットスクリーニングに適合されてもよい。アッセイ法は、TAM受容体リガンドまたは模倣体またはアゴニストとの相互作用によって識別可能なシグナルを提供するレポーター分子に融合されたTAM受容体を含むように遺伝子操作されている細胞を含む、あらゆる方法で適合されうる。ハイスループットスクリーニングシステムは、多数の化合物をスクリーニングする能力、および/または稀有な化合物を検出する能力を増すように半自動化されてもよい。
【００５５】
以下のように、対象はヒトもしくは試験動物であってもよく、または胚もしくは胎児であってもよい。
【００５６】
本開示はさらに、炎症性神経病理学的疾患および状態の処置または予防で用いるためのTAM受容体のアゴニストおよびTAM受容体リガンドの調節因子またはTAM受容体シグナル伝達のアゴニストについて教示する。
【００５７】
それゆえ、本開示は対象における炎症性神経病理学的疾患または状態の処置または予防のための方法であって、炎症性神経病理学的疾患または状態を改善するのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストまたはTAM受容体リガンド調節因子の有効量を対象に投与する段階を含む、方法を可能にする。リガンド調節因子は、リガンド遺伝子発現またはリガンド活性のアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。「リガンド活性」とは、リガンドがTAM受容体と相互作用する能力を含む。1つの態様において、リガンド調節因子はアゴニストである。別の態様において、それはアンタゴニストである。
【００５８】
「化合物」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」および「薬物」という用語は、所望の薬理的および/または生理的効果を誘導するアゴニストを指すように本明細書において互換的に用いられる。所望の効果は、TAM受容体を介したシグナル伝達の促進またはリガンドレベルもしくは活性の調節を含む。これは乏突起膠細胞の生存および維持の誘導もしくは促進、髄鞘形成の促進もしくは保護ならびに/または軸索および/もしくはニューロンの保護をもたらす。これらの用語はまた、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、類似体、模倣体、機能的等価体などを含むがこれらに限定されない、本明細書において具体的に言及した活性薬剤の、薬学的に許容され薬理活性のある成分も包含する。「化合物」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」および「薬物」という用語が用いられる場合、これには、活性薬剤それ自体のほかに、薬学的に許容される薬理活性のある塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などが含まれることが理解されるべきである。
【００５９】
「化合物」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」および「薬物」への言及は、2種またはそれ以上のGas6および/またはプロテインSアゴニストもしくはアンタゴニストまたはそれらの模倣体またはそれらの機能的等価体のような2種またはそれ以上の活性物の組み合わせを含む。「組み合わせ」は、2つの部分の組成物のような、複数の部分の組成物も含み、ここで薬剤は個別に提供され、かつ個別に供与されるか、もしくは分配されて投薬されるか、または投薬前に混和される。
【００６０】
TAM受容体シグナル伝達アゴニストは、別の態様において、髄鞘形成および乏突起膠細胞の生存を促進する。
【００６１】
乏突起膠細胞の生存への言及は、乏突起膠細胞毒性または細胞周期停止の低減および乏突起膠細胞の維持の促進を含み; 髄鞘形成の促進または保護は脱髄の阻害、阻止またはそれ以外の方法での低減を含み; 軸索およびニューロンの保護は軸索およびニューロンの修復、機能および維持の促進、ならびに免疫系が損傷を誘導するその能力を低減するかまたはそれ以外の方法で修復を促進する活性の調節を含む。「細胞周期停止」という用語は、細胞性塞栓または他の細胞増殖停止(細胞毒性であろうとなかろうと)および細胞老化を含む。
【００６２】
アゴニストの1つの形態はTAM受容体またはそのリガンドの模倣体である。
【００６３】
TAM受容体またはそのリガンドの模倣体は、神経保護能を有するものと提唱される。この用語は、模倣する分子に対しいくらかの化学的類似性を有し、かつアゴニストとして作用する物質を指すように意図される。ペプチド模倣体は、例えば、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であってよい(Johnson et al., Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al. (Eds), Chapman and Hall, New York, 1993)。ペプチド模倣体の使用の背後にある基礎となる論理的根拠は、プロテインSのペプチド骨格が、受容体またはリガンドとのような分子相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向させるよう主として存在するというものである。ペプチド模倣体は、それゆえ、天然分子と類似した分子相互作用を可能にするようにデザインされる。
【００６４】
薬学的活性化合物に対する模倣体のデザインは、「リード」化合物に基づいた医薬開発の既知のアプローチである。これは、活性化合物の合成が困難であるかもしくは費用がかかる場合、またはそれが特定の投与方法には不適切である場合、例えばペブチドが消化管内のプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるためにそれが経口組成物の活性薬剤として適さない場合、望ましいと考えられる。模倣体のデザイン、合成および試験は、一般に、標的特性について多数の分子を無作為にスクリーニングする必要を避けるために用いられる。
【００６５】
所与の標的特性を有する化合物からの模倣体のデザインには、通例行われるいくつかの段階が存在する。最初に、標的特性を決定するうえで不可欠および/または重要である化合物の特定部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチド内のアミノ酸残基を体系的に変更することにより、例えば各残基を順番に置換することにより行われうる。そのようなペプチドモチーフを絞り込むために、例えば、ペプチドのアラニンスキャンが通常用いられる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られている。
【００６６】
ファルマコフォアが見出されたならば、その物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズおよび/または電荷にしたがい、一連の情報源、例えば分光学的技法、X線回析データおよびNMRからのデータを用いてその構造をモデル化する。コンピュータ解析、類似度マッピング(原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷および/または容積をモデル化する)、および他の技法をこのモデル化過程で用いることができる。
【００６７】
このアプローチの1つの変形では、受容体およびリガンドの三次元構造をモデル化する。これは、受容体および/またはリガンドが結合によって高次構造を変える場合に特に有用であり、これによりモデルが模倣体のデザインにおいてこれを考慮に入れることが可能になる。モデリングを用いて、直鎖状の配列または三次元立体配置と相互作用する薬剤を作出することができる。
【００６８】
次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基を接ぎ合わすことができる鋳型分子を選択する。鋳型分子およびその上に接ぎ合わす化学基は、リード化合物の生物活性を保持しつつ、模倣体の合成が容易であり、模倣体が薬理学的に許容される可能性が高く、かつインビボで分解されないように都合よく選択することができる。あるいは、模倣体がペプチドに基づく場合、ペプチドを環化して、その強剛性を増すことによってさらなる安定性を達成することができる。次いで、このアプローチによって見出された模倣体を、それらが標的特性を有するかどうか、またはそれらが標的特性をどの程度示すかを調べるためにスクリーニングすることができる。次に、さらなる最適化または修飾を行って、インビボ試験または臨床試験用の1つまたは複数の最終模倣体に達することができる。
【００６９】
アゴニストの別の形態は、Axl、MerもしくはTyro3の単鎖に対するまたはそのホモ多量体型もしくはヘテロ多量体型に対するようなTAM受容体の単量体型に特異的な抗体である。1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、キメラもしくは脱免疫化型である。TAM受容体の単量体型または多量体型に対する抗体は、多量体化および、ゆえに、TAM受容体を介したシグナル伝達を促進するものと提唱される。抗体はリガンド非依存的なTAM受容体シグナル伝達を促進するうえで特に有用である。「抗体」への言及は、異なる2つのTAM受容体単量体またはヘテロ多量体もしくはホモ多量体のような異なる2つの標的に対する特異性を有する多価のキメラ抗体のような抗体の組み合わせを含む。
【００７０】
本開示はさらに、1つの動物または鳥類生物に由来する抗体を、同じまたは異なる種の別の動物または鳥類生物において実質的に非免疫原性とするための生化学技術の適用について教示する。この生化学処理は本明細書において「脱免疫化」といわれる。具体的には、ヒトにおいて非ヒト抗体を用いることに関連して、脱免疫化は「ヒト化」といわれうる。本明細書において「脱免疫化」またはその特定の形態「ヒト化」への言及は、相補性決定領域(CDR)移植、免疫相互作用分子のフレームワーク領域に対する「再形成」および可変(v)領域突然変異などの処理を含み、これらは全て特定の宿主(例えばヒト)での免疫相互作用分子(例えば抗体)の免疫原性の低減を目的としている。本発明の場合には、好ましい免疫相互作用分子は、Axl、MerまたはTyro3単量体のようなTAM受容体単量体に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの抗体である。1つの態様において、免疫相互作用分子は、1つの動物または鳥類生物に由来するかつ限定されるものではないが、ヒトのような同じまたは異なる種由来の別の動物もしくは鳥類生物において免疫原性の低減を示す、モノクローナル抗体または抗体のキメラ誘導体である。1つの態様において、抗体は、ヘテロ二量体の作出を容易とするように異なる2種のTAM受容体単量体に対する特異性を有する。
【００７１】
「実質的に非免疫原性」への言及は、親抗体、すなわち脱免疫化処理への曝露前の抗体と比較して免疫原性の低減を含む。「免疫原性」という用語は、宿主動物において液性反応および/またはT細胞媒介性反応を誘発し、誘導しまたはそれ以外の方法で促進する能力を含む。特に好都合な免疫原性の基準には、抗体の可変(v)領域に由来するアミノ酸配列がMHCクラスII分子と相互作用し、それによってT細胞により支援される液性反応を含むT細胞媒介性反応を刺激または促進する能力が含まれる。脱免疫化処理は、特定の宿主において用いられる場合に抗体の免疫原性を低減する。
【００７２】
「抗体」とは、抗原または異なる2種の抗原、および具体的にはTAM受容体単量体、例えばAxl、MerもしくはTyro3またはそれらのホモ多量体型もしくはヘテロ多量体型と結合、相互作用またはそれ以外の方法で結び付くことができる免疫グロブリンファミリーのタンパク質を意味する。それゆえ、抗体は抗原結合分子である。「抗体」は免疫相互作用分子の一例であり、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。本明細書において教示される特定の免疫相互作用分子は、モノクローナル抗体である。1つの態様において、抗体は、ヘテロ二量体の作出を促進するように異なる2種の単量体に対して特異性を有するキメラである。
【００７３】
「抗原」という用語は、免疫反応において反応でき、および/または免疫反応を誘導できる物質をいうように本明細書においてその最も広い意味で用いられる。「抗原」への言及は、Axl、MerまたはTyro3と結び付くペプチド鎖を含む。広く、Axl、MerおよびTyro3の二量体または多量体に対して作製された抗体以外の単量体中のペプチド鎖も本明細書において企図される。
【００７４】
「抗原結合分子」とは、標的のTAM受容体に対する結合親和性を有する任意の分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン(例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体)、免疫グロブリン断片および抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークにまで及ぶことが理解されよう。「抗体」および「抗原結合分子」という用語は、これらの分子の脱免疫化型を含む。
【００７５】
「抗原決定基」または「エピトープ」とは、特定の免疫反応が向けられ、ハプテンを含むTAM受容体の部分を意味する。抗体は2つのヘテロ単量体上の異なる2種のエピトープを標的化しうる。典型的には、動物において、抗原は、同時にいくつかのまたはさらに多数の抗原決定基を提示する。「ハプテン」は、抗体と特異的に結合できるが、担体に結合されていなければ免疫反応を誘導できないか、またはわずかにしか誘導しない物質である。ハプテンは、典型的には、Axl、MerまたはTyro3単量体の一部分に存在する単一の抗原決定基またはエピトープを含む。
【００７６】
本明細書において教示される特定の抗体は、ヒトで用いるためのネズミモノクローナル抗体の脱免疫化型である。しかしながら、本開示は、任意の供給源由来の、および任意の宿主で用いるために脱免疫化された抗体を企図する。動物および鳥類の供給源ならびに宿主の例としては、ヒト、霊長類、家畜動物(例えばヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ロバ)、実験動物(例えばマウス、ウサギ、モルモット、ハムスター)、愛玩動物(例えばイヌ、ネコ)、家禽鳥類(例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ)および狩猟鳥(例えばキジ)が挙げられる。
【００７７】
所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞株にクローニングされ、それぞれの細胞株が2つの標準的な方法のいずれかで増殖されうる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性の動物に注射することができる。注射された動物には、その後、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的なモノクローナル抗体を分泌する腫瘍ができる。血清または腹水のような、動物の体液は、穿刺して高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。あるいは、個々の細胞株は実験培養容器中にてインビトロで増殖されてもよい。高濃度の単一の特異的モノクローナル抗体を含有する培地は、デカンテーション、ろ過または遠心分離によって収集することができ、その後、精製することができる。
【００７８】
細胞株を、任意の適当な免疫検出手段によって関心対象のTAM受容体を検出するためにその特異性について試験する。例えば、細胞株をいくつかのウェルに分注し、インキュベートしてもよく、各ウェルの上清を酵素免疫測定法(ELISA)、間接的蛍光抗体技法などによって分析する。標的のTAM受容体を認識できるが標的でないエピトープを認識しないモノクローナル抗体を産生する細胞株を特定し、その後、インビトロで直接培養しまたは組織適合性の動物に注射して腫瘍を形成させ、必要な抗体を産生、回収かつ精製する。
【００７９】
したがって、本開示は、Axl、MerもしくはTyro3由来のペプチド鎖またはその断片と、あるいは1つがそれぞれAxl、Merおよび/またはTyro3由来の、2つのペプチド鎖と特異的に相互作用するモノクローナル抗体を提供する。
【００８０】
モノクローナル抗体は次いで、通常、脱免疫化手段に供される。そのような処理は、本開示によって調製されたモノクローナル抗体と同じまたは類似の特異性を有するキメラ抗体の調製を含むいくつかの形態のどれをとってもよい。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的には、遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域および定常領域の遺伝子から構築された抗体である。したがって、本開示によれば、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られたら、1つの種の結合領域が別の種の抗体の非結合領域と結合されている種間のモノクローナル抗体を産生する技法が用いられる(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443, 1987)。例えば、非ヒト(例えばネズミ)モノクローナル抗体由来のCDRをヒト抗体に移植し、それによってネズミ抗体を「ヒト化する」ことができる(欧州特許公開公報第0 239 400号、Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986、Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988およびRichmann et al., Nature 332:323-327, 1988)。この場合、脱免疫化処理はヒトに特異的なものである。より具体的には、CDRは、ヒト定常領域を持つまたは持たないヒト抗体可変領域に移植できる。CDRを提供する非ヒト抗体は、典型的には「ドナー」といわれ、フレームワークを提供するヒト抗体は、典型的には「アクセプター」といわれる。定常領域は存在する必要はないが、もし存在するのであれば、これらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならない、すなわち少なくとも約85〜90%、好ましくは約95%またはそれ以上同一でなければならない。ゆえに、おそらくCDRを除き、ヒト化抗体の全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。したがって、「ヒト化抗体」はヒト化軽鎖およびヒト化重鎖の免疫グロブリンを含む抗体である。ドナー抗体は「ヒト化」処理により「ヒト化される」といわれる。これは、結果として得られるヒト化抗体が、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合することが予測されるためである。本明細書において「ヒト化される」への言及は、特定の宿主、この場合、ヒト宿主に対して脱免疫化された抗体への言及を含む。
【００８１】
脱免疫化抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に何の影響も与えない、さらなる保存的アミノ酸置換を有しうることが理解されよう。
【００８２】
本開示による脱免疫化抗体を産生するために利用されうる例示的な方法は、例えば、Richmann et al., 前記, 1988、Chou et al., (米国特許第6,056,957号)、Queen et al., (米国特許第6,180,377号)、Morgan et al., (米国特許第6,180,377号)およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987に記述されている。
【００８３】
抗体はTAM受容体単量体の単量体型、ホモ二量体型またはヘテロ二量体型に対して作出されてもよい。
【００８４】
本開示は、TAM受容体に結合できる他の分子を企図する。理論的薬物デザインの目標は、例えば、ポリペプチドのより活性のあるもしくは安定な形態である薬物、または、例えば、インビボでポリペプチドの機能を増強もしくは妨害する薬物を作製するために、関心対象の生物活性ポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤もしくは賦活剤)の構造類似体を作出することにある(例えばHodgson, Bio Technology 9:19-21, 1991を参照のこと)。1つのアプローチでは、最初に、x線結晶学により、コンピュータモデリングによりまたは最も典型的にはアプローチの組み合わせにより、関心対象のタンパク質の三次元構造を決定する。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同なプロテインSの構造に基づいたモデリングによって得られる場合もある。
【００８５】
本明細書において用いられる薬剤の「有効量」および「治療的有効量」という用語は、上記のように所望の治療的または生理的効果または結果を提供するのに十分な薬剤(すなわちTAM受容体アゴニスト)の量を意味する。望ましくない効果、例えば副作用が所望の治療効果とともに現れる場合があり; ゆえに、実行者は適切な「有効量」の判定において潜在的利益と潜在的リスクの均衡を保たせる。必要とされる的確な量は、対象の種、年齢および一般的健康状態、投与方法などに応じて、対象により異なるであろう。したがって、的確な「有効量」を特定するのが可能ではないこともある。しかし、任意の個々の場合における適切な「有効量」は、日常的な実験のみを用いて当業者により判定されうる。
【００８６】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤または希釈剤とは、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない物質から構成される薬学的媒体を意味し、すなわち、その物質は、いかなる有害反応も起こさずにまたは実質的な有害反応を起こさずに選択された活性薬剤とともに対象に投与されうる。担体には賦形剤、および希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、保存剤などのような他の添加剤が含まれうる。
【００８７】
同様に、本明細書において提供される化合物の「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体は、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体である。
【００８８】
本明細書において用いられる「処置する」および「処置」という用語は、処置されている状態の症状の重症度および/または頻度の低減、症状および/または根底にある原因の排除、状態の症状および/またはその根底にある原因の発生の予防、ならびに神経変性状態後の損傷の改善または修復または寛解をいう。一般用語では、処置は、疾患を能動的に反転させること、あるいは、例えば乏突起膠細胞死、老化もしくは細胞増殖の停止、脱髄および/または軸索もしくはニューロンの変性の、症状を寛解させることを伴いうる。下流の生理的、心理的または精神的状態の寛解も、処置の有用な指標である。処置はTAM受容体シグナル伝達の増強のような即時の効果をもたらしうる。処置は、無症状であるが疾患を発病するリスクがある対象のものであってもよい。
【００８９】
それゆえ、対象を「処置する」ことは、感受性の高い個体における状態または他の有害な生理的もしくは心理的事象の予防、および状態の症状を寛解させることによる臨床的に症候性の個体の処置または臨床的に無症状の対象を処置して状態の発病のリスクを低減させることを含みうる。
【００９０】
本明細書において用いられる「対象」は、本開示の薬学的な作用物質および製剤ならびに方法から恩恵を受けうる動物、好ましくは哺乳動物およびより好ましくはヒトをいう。本記述の薬学的製剤および方法から恩恵を受けうる動物の種類に制限はない。ヒトか非ヒト動物かにかかわらず対象は、個体、患者、動物、宿主またはレシピエントといわれうる。本開示によって教示される化合物および方法は、ヒト医学において特定の用途を有する。
【００９１】
上記のように、好ましい動物はヒトであるが、しかし他の霊長類、例えばオランウータン、ゴリラおよびマーモセット、マカク、家畜動物、実験動物、愛玩動物または捕獲野生動物、ならびに鳥類種は有用な動物モデルでありうる。
【００９２】
実験動物の例としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターが挙げられる。ウサギならびにラットおよびマウスなどの齧歯類動物は、簡便な試験系または動物モデルを提供する。家畜動物にはヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマおよびロバが含まれる。鳥類種、ゼブラフィッシュ、およびアフリカツメガエル種(Xenopus spp)を含む両生類のような非哺乳類動物。
【００９３】
ヒトは最も重要な対象であるが、非ヒト動物は有用な動物モデルである。1つの態様において、潜在的な神経保護剤を試験するためにモデルとして非ヒト動物においてEAEが誘導されうる。
【００９４】
「乏突起膠細胞(oligodendrocyte)」またはその複数形「乏突起膠細胞(oligodendrocytes)」という用語は、軸索を支えかつ髄鞘を生み出す神経細胞を意味する。乏突起膠細胞は多数のニューロンの髄鞘のセグメントを形成する。乏突起膠細胞は膠細胞の類である。対象薬剤の効果は、乏突起膠細胞それ自体に対して、および関連する細胞(例えば他の膠細胞)、前駆体細胞もしくは子孫またはより成熟な細胞に対して顕在化しうる。
【００９５】
本開示によれば、免疫変性過程のような変性炎症過程または細胞周期停止を誘導する状態に起因した乏突起膠細胞毒性もしくは細胞周期停止を低減するためにまたは乏突起膠細胞維持を促進するために神経保護剤を利用することが提唱される。
【００９６】
さらに、神経保護剤は脱髄を低減し、または髄鞘形成過程を促進もしくは維持し、および/あるいは軸索変性もしくはニューロン変性を阻止し、または軸索修復もしくはニューロン修復を促進しうる。
【００９７】
別の神経保護剤は、TAM受容体の活性を上方制御する薬剤であるものと提唱される。そのような薬剤は、本明細書においてTAM受容体アゴニストといわれる。「TAM受容体」への言及は、TAM受容体の単量体型、ホモ二量体型およびヘテロ二量体型を含む。
【００９８】
ゆえに、本開示は、対象における神経変性疾患または状態の処置または予防のための方法であって、乏突起膠細胞の生存を促進するのに、脱髄を阻害するのに、ならびに/または軸索およびニューロンの修復および機能を促進するのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストの有効量を対象に投与する段階を含む、方法について教示する。
【００９９】
別の局面において、本開示は、対象における神経変性疾患の処置のための、またはその症状の発症を少なくとも遅延させるための方法であって、乏突起膠細胞の生存を促進するのに、脱髄を阻害するのに、または軸索およびニューロンの修復および機能を促進するのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストの有効量を対象に投与する段階を含む、方法を可能にする。
【０１００】
本開示は、対象における乏突起膠細胞毒性もしくは細胞周期停止、脱髄および/または軸索もしくはニューロンの破壊の1つまたは複数から生じる神経変性疾患または状態の処置または予防のためであって、乏突起膠細胞の生存および/または維持を促進するのに十分な時間または条件の下でTAM受容体アゴニストを含む神経保護剤の有効量を対象に投与する段階を含む、方法のためのさらなる指示である。
【０１０１】
上記のように、神経変性疾患または状態を処置するのに十分な量または時間は、神経変性障害の1つまたは複数の症状を寛解するのに必要とされる量または時間でありうる。症状は心理的または精神的症状を含む。TAM受容体アゴニストはTAM受容体リガンドのアゴニストを含む。
【０１０２】
本明細書において企図される神経変性疾患および状態は、MS、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復を含む。
【０１０３】
MSは、本開示によって可能とされる特定の態様である。
【０１０４】
ゆえに、本開示は、対象におけるMSを処置するための方法であって、MSの症状を寛解するのに、ならびに/または乏突起膠細胞の生存および/もしくは維持を促進するのに、脱髄を阻害するのに、ならびに/あるいは軸索またはニューロンの修復または機能を促進するのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストの有効量を対象に投与する段階を含む、方法を可能にする。TAM受容体調節因子(アゴニストまたはアンタゴニスト)があるいは、投与されてもよい。
【０１０５】
「対象におけるMS」への言及は、MSを有する対象、MSを潜在的に有する対象、MSを発病するリスクのある対象またはMSの症状を有する対象を処置することを含む。対象はまた、無症状であるにも関わらずMSを発病するリスクがありうる。
【０１０６】
本開示によって教示される別の局面では、対象におけるMSの処置のための方法であって、乏突起膠細胞の生存を促進するのに、脱髄を阻害するのに、または軸索およびニューロンの修復および機能を促進するのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストを含む神経保護製剤の有効量を対象に投与する段階を含む、方法を企図する。
【０１０７】
TAM受容体アゴニストは白血病抑制因子(LIF)または毛様体神経栄養因子(CNTF)のような、神経保護剤とともに提供されてもよい。
【０１０８】
化学薬剤またはタンパク質性薬剤は本開示に従って有用であるが、本方法は遺伝的アプローチを用いて実践されてもよい。
【０１０９】
したがって、本開示は、対象における神経変性疾患または状態の処置または予防のための方法であって、TAM受容体シグナル伝達のレベルを増大する遺伝的薬剤の有効量を対象に投与する段階を含む、方法について教示する。
【０１１０】
遺伝的薬剤は、例えば、TAM受容体リガンドまたはそのアゴニストをコードするcDNAまたはmRNAを導入するウイルス構築体; TAM受容体リガンドまたはそのアゴニストをコードする裸のcDNAまたはmRNA; およびTAM受容体リガンドまたはそのアゴニストをコードする遺伝子の阻害因子を下方制御するRNAiまたはアンチセンス構築体を含む。
【０１１１】
上記のように、対象は、通常、ヒトであり、神経変性疾患または状態の一例はMSである。
【０１１２】
ゆえに、本開示は、本明細書において開示される薬剤の1つまたは複数を含む薬学的組成物および製剤について教示する。本開示によって可能とされる薬学的組成物は、局所処置または全身処置が望まれるかに依りおよび処置される領域に依り、いくつかの方法で投与されうる。投与は局所(眼ならびに膣送達および直腸送達を含む粘膜への送達を含む)、肺、例えば、噴霧器を含む粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入; 気管内、鼻腔内、上皮および経皮)、経口または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入; または頭蓋内、例えば、くも膜下もしくは脳室内投与; または経口投与; または経脊椎穿刺を含む。局所投与のための薬学的組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ剤、坐剤、スプレイ、液体および粉末が含まれてもよい。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤なども必要または所望でありうる。コーティングされたコンドーム、手袋なども同様に有用でありうる。明らかに、製剤は薬剤が血液脳関門を横断することを可能にする必要がある。ゆえに、薬剤それ自体が改変されることが必要でありうる。あるいは、製剤は逆行性輸送を可能にしうる。
【０１１３】
単位投与剤形として好都合に提示されうる、本明細書において可能とされる薬学的製剤は、製薬業界において周知の従来の技法によって調製されうる。そのような技法は、活性成分を薬学的担体または賦形剤と合わせる段階を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細固体担体またはその両方と均一かつ密接に合わせ、その後、必要であれば、製品に成形することによって調製される。
【０１１４】
本開示によって教示される組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐剤、および浣腸のような、多くの可能な投与剤形のいずれに製剤化されてもよい。本開示の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁液として製剤化されてもよい。水性懸濁液はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。
【０１１５】
本明細書において記述される薬学的組成物は、溶液、乳濁液、泡状物質、およびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されることはない。本開示によって教示される薬学的組成物および製剤は、1つまたは複数の浸透増強剤、担体、賦形剤または他の活性もしくは不活性成分を含んでもよい。
【０１１６】
乳濁液は、典型的には、1つの液体が直径0.1 μmを通常は超える小滴の形態で別の液体に分散されている不均一な系である。乳濁液は分散相の他にさらなる成分、および水相、油相、または分離相そのものに溶液として存在してもよい活性薬を含有してもよい。微小乳濁液は、本開示の態様として含まれる。乳濁液およびその使用は、当技術分野において周知であり、米国特許第6,287,860号にさらに記述されており、これはその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１７】
本開示によって記述される製剤は、リポソーム製剤を含む。本明細書において用いられる場合、「リポソーム」という用語は、球状の二重層に整列された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料から形成された膜と、送達される組成物を含有する水性の内層とを有する単層または多層の小胞である。陽イオン性リポソームは、陰性荷電DNA分子と相互作用して、安定な複合体を形成すると考えられる陽性荷電リポソームである。pH感受性または陰性荷電であるリポソームは、複合体を形成するよりむしろDNAを捕獲すると考えられている。陽イオン性リポソームも非陽イオン性リポソームもともに、DNAを細胞に送達するために用いられている。
【０１１８】
リポソームはまた、本明細書において用いられる場合、リポソームに組み入れられると、そのような特殊な脂質を欠損するリポソームと比べて循環中の寿命が増強される、1つまたは複数の特殊な脂質を含むリポソームをいう用語である「立体的に安定化された」リポソームを含む。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部の部分が1つまたは複数の糖脂質を含む、またはポリエチレングリコール(PEG)部分のような、1つまたは複数の親水性重合体によって誘導体化されたリポソームである。リポソームおよびその使用は米国特許第6,287,860号にさらに記述されており、これはその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
1つの態様において、本開示は、さまざまな浸透増強剤を利用して核酸の効率的な送達をもたらす。細胞膜を越えた非親油性薬物の拡散の補助に加えて、浸透増強剤はまた、親油性薬物の浸透性を増強する。浸透増強剤は5つの広義の部類、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤および非キレート性の非界面活性剤のうちの1つに属すると分類されうる。浸透増強剤およびその使用は米国特許第6,287,860号にさらに記述されており、これはその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
当業者は、製剤がその意図した使用、すなわち、投与経路にしたがってルーチンにデザインされることを認識するであろう。
【０１２１】
非経口、くも膜下または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤ならびに、限定されるものではないが、浸透増強剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤のような、他の適当な添加剤を含有してもよい滅菌水溶液を含んでもよい。
【０１２２】
治療用組成物の製剤化およびその後の投与(投薬)は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投薬は処置すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、処置過程は数日から数ヶ月間、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは患者の体内での薬物蓄積の測定から計算することができる。当業者は、最適な投与量、投薬の方法論および繰り返し数を容易に判定することができる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的強度に依存して変化してもよく、一般的にインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが判明したEC50に基づいて推定することができる。一般的に、投与量は、0.01 μg〜100 g/kg体重であり、毎日、毎週、毎月もしくは毎年1回もしくはそれ以上、または2〜20年毎に1回与えられてもよい。当業者は、体液または組織中の薬物に関して測定された残留時間および濃度に基づき、投薬の繰り返し数を容易に推定することができる。処置の成功後、疾患状態の再発を予防するために、患者に、オリゴヌクレオチドを0.01 μg〜100 g/kg体重の範囲の維持用量で、毎日、毎週、毎月または毎年1回またはそれ以上投与する、維持治療を受けさせることが望ましいかもしれない。
【０１２３】
本開示はTAM受容体アゴニストまたはTAM受容体リガンド調節因子ならびに1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む神経保護製剤について教示する。
【０１２４】
別の態様において、本開示は、TAM受容体アゴニストならびにLIFおよび/またはCNTFの一方または両方ならびに1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む神経保護製剤を可能にし、それに向けられる。
【０１２５】
本明細書において教示される局面を、これから、以下の非限定的な実施例によって記述する。
【実施例】
【０１２６】
実施例1 脱髄におけるTAM受容体シグナル伝達の役割
TAM受容体シグナル伝達の役割をインビトロでの乏突起膠細胞生存および小膠細胞活性化に関して脱髄にて調べた。さらに、Gas6およびTAM受容体の調節をマウスでのクプリゾン媒介性の脱髄の間に調べた(クプリゾン媒介性の脱髄は、Binder et al., 2008 前記に記述されている)。最後に、Gas6ノックアウトマウスを用いて脱髄の経過に及ぼすGas6の喪失の影響について調べた。クプリゾン誘導性の脱髄では、Axl、MerおよびGas6 mRNAの発現が脳梁において時間的プロファイルで増大し、このモデルでの小膠細胞/マクロファージの浸潤および増殖の増加と相関していた。その一方で、Tyro3の発現は減少し、乏突起膠細胞の損傷および喪失と相関していた。組み換えヒトGas6は、乏突起膠細胞のインビトロでの生存も促進し、小膠細胞の精製培養物において活性化のマーカーも低減したことが分かった。クプリゾンに供されたGas6ノックアウトマウスでは、ルクソールファストブルー染色および微細構造的解析によって評価した場合に、脱髄が対照マウスでよりも、顕著にはより大きな脳梁吻側部で大きかった。髄鞘の喪失はGas6ノックアウトマウスにおいて乏突起膠細胞の喪失の増大と一致していた。さらに、小膠細胞マーカーの発現(IBA1)はクプリゾンによる脱髄に供されたGas6ノックアウトマウスにおいて増大した。総合して、これらの結果は、TAM受容体の活性化および調節が乏突起膠細胞の生存と小膠細胞の活性化の両方を制御することによって脱髄に影響を与えることを示している。
【０１２７】
実施例2 MS病変部における発現プロファイル
定量的PCRを用いてAxl、MerおよびTyro3ならびにリガンドGas6およびプロテインSに対する遺伝子をコードする転写産物の発現を調べた。これは、ヒトMS病変部(18病変部)、ならびにMS患者(30サンプル)および正常対照(15サンプル)の両方由来の正常に見える白質に由来するRNAを用いることによって達成された。非MS対照患者由来の正常に見える白質と比べて、Mer発現の増加の傾向が強く(p=0.08)、Axl発現の増加の傾向が弱く(p=0.25)、およびTyro3、Gas6またはプロテインS発現の有意な変化がなかった。
【０１２８】
実施例3 MSにおけるT細胞でのTAM受容体およびリガンドの発現
初回脱髄事象を呈している患者11名(女性9名および男性2名)から血液を回収した。また、年齢および性別を適合させた健常対照から血液を回収した。磁気カラムを用いて、CD3+ T細胞を血液から、およびこの細胞集団から回収し、RNAを抽出し、その後、マイクロアレイ分析において用いた。
【０１２９】
マイクロアレイ分析からAxl、Mer、Gas6およびプロテインSが健常対照と比べMS患者においてどれも顕著に上方制御されることが示された。
【０１３０】
マイクロアレイに用いられたサンプルの一部に対する定量的PCRを用い、Gas6は顕著に上方制御され、他の遺伝子は、マイクロアレイにおいて認められた同じ傾向に沿っていることが示された。
【０１３１】
実施例4 Gas6ノックアウトマウスでの脱髄
図3は、脱髄がGas6の非存在下でいっそう大きく、Gst-pi陽性の乏突起膠細胞がいっそう少ないことを示す。図4は、小膠細胞の活性化および浸潤がクプリゾン誘導性の脱髄の間にGas6の非存在下でいっそう大きいことを示す。
【０１３２】
実施例5 Gas6ノックアウトマウスでの再髄鞘形成
ルクソールファストブルー(LFB)平均密度はGas6の非存在下、回復4週後に低かった。
【０１３３】
G比はこの間に影響を受けなかった。
【０１３４】
さらに、Gas6の非存在下で、回復4週後にいっそう少ない有髄軸索が認められた。
【０１３５】
実施例6 Gas6によるインビトロでの髄鞘形成
図5A〜Cは、外因性Gas6がインビトロで髄鞘形成を増大したことを示す。
【０１３６】
実施例7 EAE誘導性の脱髄におけるTAM受容体シグナル伝達
図6A〜Cは、TAM受容体およびリガンドがEAEの間に調節され、発現レベルが細胞変化の尺度と相関していたことを示す。
【０１３７】
実施例8 Gas6を欠くマウスではクプリゾン誘導性の脱髄の間に乏突起膠細胞の喪失および炎症が増大され、回復が阻害される
脱髄の経過に及ぼすGas6の喪失の影響について調べるために、野生型およびGas6ノックアウトマウスを3週間クプリゾン(0.2% w/v)に曝露した。髄鞘形成を組織学的に(ルクソールファストブルー; LFB)および微細構造的レベルで測定した。免疫組織化学を用いて乏突起膠細胞数(Gst-pi)および小膠細胞活性化(IBA1)を評価した。これらの試験を拡張して、クプリゾン除去後の回復相に及ぼすGas6欠如の影響について調べた。回復試験の場合、マウスを5週間クプリゾン曝露に供した。1つの群をこの時点で分析して、最低レベルの髄鞘形成および乏突起膠細胞数をもたらした。残りのマウスをクプリゾン除去後2週、4週または10週の時点で分析した。脱髄試験に関しては髄鞘形成および細胞反応を評価した。定量的PCRを用いて初代小膠細胞の生存および活性化に及ぼすGas6の影響を評価した。インビトロでの髄鞘形成アッセイ法を用いて外因性Gas6に対するラット乏突起膠細胞の反応を評価した。
【０１３８】
Gas6遺伝子ならびにその受容体Tyro3、AxlおよびMerに対する遺伝子の発現は、クプリゾン誘導性の脱髄の経過中に調節されることが分かった。Axl、MerおよびGas6 mRNAの発現プロファイルは、脳梁において時間的プロファイルで増大し、このモデルでの小膠細胞/マクロファージの浸潤および増殖の増加と相関していた。その一方で、Tyro3の発現は減少し、乏突起膠細胞の損傷および喪失と相関していた。3週間クプリゾン誘導性の脱髄に供されたGas6ノックアウトマウスでは、脱髄が、ルクソールファストブルー染色とクプリゾンによる脱髄に供されたGas6ノックアウトマウスでの増大(およそ3倍の増大; p<0.05)の両方によって評価した場合に、対照マウスでよりも、顕著にはより大きな脳梁吻側部で大きかった(髄鞘形成は野生型マウスと比べて3週のクプリゾン曝露Gas6ノックアウトマウスにおいて36%低減した; p=0.027)。インビトロで、組み換えヒトGas6 (100 ng/ml)は乏突起膠細胞の生存を促進もし(39.3±3.1% vs 11.8±2.4%; p=4.6×10-5)、小膠細胞の精製培養物において活性化のマーカーも低減した(TNFα発現はおよそ48%低減した; p<0.05)ことが分かった。
【０１３９】
回復試験において、クプリゾン曝露5週後に、脱髄は、ルクソールファストブルー染色と微細構造の両方によって評価した場合に、対照マウスよりもGas6ノックアウトマウスにおいて大きかった。しかしながら、クプリゾン除去後2週までに、遺伝子型間に有意な差異はなかった(p<0.05)。しかしながら、クプリゾンの非存在下での回復4週後に、WTマウスはGas6 KOマウスよりも顕著に高い程度まで再髄鞘形成されていた(p=0.04)。認められた効果を推進する分子機構を理解するために、インビトロでの髄鞘形成アッセイ法での外因性Gas6の効果も調べた。Gas6は用量依存的に髄鞘形成を顕著に増大した(p=0.02)ことが分かり、TAM受容体シグナル伝達が、乏突起膠細胞による髄鞘形成に直接関与しうることが示唆された。
【０１４０】
Gas6ノックアウトマウスの脳梁において特定されたGst-pi (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-pi)陽性乏突起膠細胞の喪失の増大は、IBA1陽性小膠細胞の増大とともに、TAM受容体の調節および活性化がCNS脱髄の間に乏突起膠細胞の生存にも小膠細胞の活性化にも影響を及ぼしうることを示唆している。この結論は、外因性Gas6が初代乏突起膠細胞の生存も増加させ、小膠細胞の活性化も減少させうることを示すインビトロでのデータによって支持される。
【０１４１】
さらに、Gas6の非存在下で、クプリゾン除去後の初期の再髄鞘形成は、野生型マウスで認められたものに匹敵することが示されたが、しかし持続的回復は弱まっているように思われることが示された。TAM受容体シグナル伝達は、乏突起膠細胞による髄鞘形成に直接関与しうることもインビトロで示された。Gas6 KOマウスが十分に再髄鞘形成できないことは、したがって、損傷後の髄鞘生成中の重要な時点でのGas6の欠如から生じうる。これらの問題にさらに取り組むため、乏突起膠細胞の前駆細胞の動員レベル、小膠細胞の活性化を評価しているところであり、髄鞘完全性の詳細な微細構造的解析を仕上げているところであり、およびGas6 KOマウスでのクプリゾン曝露後の、再髄鞘形成の後期を評価しているところである。
【０１４２】
実施例9 TAM受容体抗体の作出
Axl、Merおよび/またはTyro3の単量体型に対する、あるいはそれらのヘテロ二量体型もしくはホモ二量体型または誘導体に対するモノクローナル抗体を用いて、二量体化のような多量体化、それゆえ、シグナル伝達を促進することが本明細書において提唱される。組み換えTyro3、Axlおよび/またはMer鎖を作出および使用して、本明細書において記述されるようにマウスまたはウサギにおいてモノクローナル抗体を作出する。これらの抗体をその後、ヒト対象での試験のために脱免疫化またはヒト化に供する。
【０１４３】
免疫およびその後のモノクローナル抗体の産生は、例えば、KohlerおよびMilstein (Kohler et al., Nature 256:495-499, 1975およびKohler et al., Eur. J. Immunol 6(7):511-519, 1976、Coligan el al., Current Protocols in Immunology, 1991-1997またはToyama et al., Monoclonal Antibody, Experiment Manual, Kodansha Scientific, 1987から刊行されている)によって記述されているように標準的なプロトコルを用いて行われる。本質的には、動物を抗原含有物(例えばTAM受容体を含有するサンプル)またはその画分で標準的な方法により免疫して、抗体産生細胞、特に抗体産生体細胞(例えばBリンパ球)を産生させる。次いで、免疫した動物から不死化のためにこれらの細胞を採取する。抗原をまず初めに担体と会合させることが必要な場合もある。
【０１４４】
抗体産生細胞の不死化は、当技術分野において周知の方法を用いて行われる。例えば、不死化は、エプスタイン・バーウイルス（EBV）を用いる形質転換法[Kozbor et al., Methods in Enzymology 121:140, 1986]によって達成されうる。1つの態様において、抗体産生細胞は細胞融合法([Coligan et al., supra, 1991-1997]に記述されている)を用いて不死化されるが、これはモノクローナル抗体の産生のために広く利用されている。この方法では、抗体産生能を有する抗体産生体細胞、特にB細胞を骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、感作動物、好ましくはマウスおよびラットなどの齧歯類動物のリンパ節、脾臓および末梢血に由来してもよい。1つの態様において、マウス脾細胞が用いられる。しかし、ラット、ウサギ、ヒツジもしくはヤギの細胞、または他の動物種由来の細胞を代わりに用いることも可能であると考えられる。
【０１４５】
ハイブリドーマを産生する融合手順で用いるために特化した骨髄腫細胞株がリンパ球性腫瘍から開発されている(Kohler et al., 前記, 1976, Kozbor et al., 前記, 1986およびVolk et al., J. Virol. 42 (1):220-227, 1982)。これらの細胞株は少なくとも3つの理由から開発された。第1の理由は、融合しておらず同様に無限に自己増殖する骨髄腫細胞からの、融合したハイブリドーマの選択を容易にするためである。これは通常、ハイブリドーマの増殖を支持するある種の選択培地における増殖を不可能にする酵素欠損を有する骨髄腫を用いることによって達成される。第2の理由は、リンパ球性腫瘍細胞が自らの抗体を産生する固有の能力に起因する。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生が起こらないように、内因性免疫グロブリン軽鎖または重鎖を産生することができない骨髄腫細胞株を用いる。これらの細胞株の選択に関する第3の理由は、それらに融合に対する適性があり、効率が高いことによる。
【０１４６】
融合細胞雑種の作出には、例えば、P3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1 (NS-1)、Sp2/0-Ag14およびS194/5.XXO.Bu.1を含む、多くの骨髄腫細胞株が用いられうる(Trowbridge, J. Exp. Med. 148(1):220-227, 1982)。P3X63-Ag8およびNS-1細胞株は、KohlerおよびMilstein (Kohler et al., 前記, 1976)によって記述されている。Shulman et al., Nature 276:269-270, 1978は、Sp2/0-Ag14骨髄腫株を開発した。
【０１４７】
融合方法は記述されている(Kohler et al., 前記, 1975、Kohler et al., 前記, 1976、Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3:231-236, 1977およびVolk et al., 前記, 1982)。このような研究者らによって用いられた融合促進性の作用因子は、センダイウイルスおよびポリエチレングリコール(PEG)であった。
【０１４８】
当業者は、本明細書において記述された局面が具体的に記述されたもの以外の変更および改変を受けることを理解するであろう。これらの局面はそのような変更および改変の全てを含むものと理解されるべきである。本開示は、本明細書において言及されるまたは示される段階、特徴、組成物および化合物の全てを個別にまたはまとめて可能にし、ならびにこれらの段階または特徴の任意の2つまたはそれ以上の任意のおよび全ての組み合わせを可能にする。
【０１４９】
参考文献
2013535694.tif 000004
2013535694.tif 000005
【図１】
2013535694.tif 000007
【図２】
2013535694.tif 000008
【図３】
2013535694.tif 000009
【図４】
2013535694.tif 000010
【図５Ａ】
2013535694.tif 000011
【図５Ｂ】
2013535694.tif 000012
【図５Ｃ】
2013535694.tif 000013
【図６Ａ】
2013535694.tif 000014
【図６Ｂ】
2013535694.tif 000015
【図６Ｃ】
2013535694.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月27日(2013.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性特発性の神経病理学的疾患を検出するアッセイの作製におけるTAM受容体またはそのリガンドの使用。
【請求項２】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記疾患または状態が多発性硬化症である、請求項2記載の使用。
【請求項４】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項1記載の使用。
【請求項５】
対象がヒトである、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択され、かつ、前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項5記載の使用。
【請求項７】
前記リガンドがTAM受容体鎖に特異的な抗体であり、かつ前記TAM受容体はAxl、MerおよびTyro3から選択される、請求項1記載の使用。
【請求項８】
炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態の処置のための医用薬剤の製造におけるTAM受容体のアゴニストまたはそのリガンドの調節因子の使用。
【請求項９】
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、請求項8記載の使用。
【請求項１０】
前記疾患または状態が多発性硬化症である、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、請求項8記載の使用。
【請求項１２】
対象がヒトである、請求項8〜11のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択され、かつ前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、請求項11記載の使用。
【請求項１４】
前記調節因子がAxl、MerまたはTyro3単量体に特異的な抗体である、請求項11記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
[本発明1001]
対象における炎症性神経病理学的疾患または疾患状態の存在を検出するための方法であって、前記対象由来の細胞をTAM受容体またはそれに対するリガンドの発現についてスクリーニングする段階を含み、前記受容体の発現の上昇またはそのリガンドの発現レベルの変化が、炎症性神経病理学的疾患もしくは状態の存在またはその発病の可能性を示す、前記方法。
[本発明1002]
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症(metabolic leukodystrophy)、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症、および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、本発明1002または1003の方法。
[本発明1006]
前記対象がヒトである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、それをコードするmRNAのレベルによって判定される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、タンパク質のレベルによって判定される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記対象が初回脱髄事象を呈する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
病変部についてスクリーニングするためにMRIを行う段階をさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
対象における炎症性神経病理学的疾患または状態を検出するアッセイの作製におけるTAM受容体またはそのリガンドの使用。
[本発明1014]
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、本発明1013の使用。
[本発明1015]
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、本発明1014の使用。
[本発明1016]
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、本発明1015の使用。
[本発明1017]
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症、および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、本発明1014または1015の使用。
[本発明1018]
前記対象がヒトである、本発明1013〜1017のいずれかの使用。
[本発明1019]
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、本発明1018の使用。
[本発明1020]
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、本発明1018の使用。
[本発明1021]
前記リガンドがTAM受容体鎖に特異的な抗体である、本発明1013の使用。
[本発明1022]
対象における炎症性神経病理学的疾患または状態の処置または予防のための方法であって、前記炎症性神経病理学的疾患または状態を寛解させるのに十分な時間および条件の下でTAM受容体アゴニストまたはTAM受容体リガンド調節因子の有効量を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1023]
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、本発明1023または1024の方法。
[本発明1027]
前記対象がヒトである、本発明1022〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前記調節因子がAxl、MerまたはTyro3単量体に特異的な抗体である、本発明1028の方法。
[本発明1031]
炎症性神経病理学的疾患または状態の処置のための医用薬剤の製造におけるTAM受容体のアゴニストまたはそのリガンドの調節因子の使用。
[本発明1032]
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、本発明1031の使用。
[本発明1033]
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、本発明1032の使用。
[本発明1034]
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、本発明1033の使用。
[本発明1035]
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、本発明1032または1033の使用。
[本発明1036]
前記対象がヒトである、本発明1031〜1035のいずれかの使用。
[本発明1037]
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、本発明1036の使用。
[本発明1038]
前記調節因子がAxl、MerまたはTyro3単量体に特異的な抗体である、本発明1037の使用。
[本発明1039]
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、本発明1036の使用。
[本発明1040]
対象における炎症性神経病理学的状態の進行をモニタリングするための方法であって、前記対象由来の細胞をTAM受容体の発現またはそれに対するリガンドの発現の調節について経時的にスクリーニングする段階を含み、時間内の前記受容体またはそのリガンドの発現の変化が疾患進行を示す、前記方法。
[本発明1041]
前記炎症性神経病理が炎症性特発性の神経病理学的疾患である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記炎症性特発性の神経病理学的疾患または状態が脱髄事象を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記疾患または状態が多発性硬化症または関連状態である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記疾患または状態が、急性播種性脳脊髄炎、視神経症(一過性の自律神経障害を伴う視神経脊髄炎を含む)、Devic視神経脊髄炎、熱帯性痙性不全対まひ、非圧迫性脊髄症、同心性硬化症、広汎性硬化症 急性出血性白質脳症、代謝性大脳白質萎縮症、白質病変、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、多系統萎縮症、および疾患または外傷に関連する脱髄の修復より選択される、本発明1041または1042の方法。
[本発明1045]
前記対象がヒトである、本発明1040〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記TAM受容体がAxl、MerおよびTyro3より選択される、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記TAM受容体リガンドがGas6およびプロテインSより選択される、本発明1045の方法。
[本発明1048]
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、それをコードするmRNAのレベルによって判定される、本発明1040の方法。
[本発明1049]
前記TAM受容体またはそのリガンドの発現レベルが、タンパク質のレベルによって判定される、本発明1040の方法。
[本発明1050]
前記対象が初回脱髄事象を呈するか、またはそれを発病するリスクがある、本発明1040の方法。
本明細書において用いられる略語を表1にまとめる。
【国際調査報告】
2013535694.tif 000017
2013535694.tif 000018
2013535694.tif 000019