(57)【要約】  本発明は自己完結的生物学的アッセイ装置に関し、前記装置は：ハウジング；前記ハウジング内に設けられる、制御可能−移動可能な試薬分配システムを含む分配プラットフォーム；前記ハウジング内に設けられる試薬供給コンポーネント；前記ハウジング内に前記分配プラットフォームと空間を共有して設けられ、流体輸送層と複数の貯槽と移動可能に接続される、ニューマチックマニホールドを含み、前記流体輸送層、前記貯槽及びそこに導入される試験サンプルが前記ハウジング内に、前記分配プラットフォームから空間的に分離されて設けられ；前記ハウジング内に前記分配プラットフォームから空間的に離れて、前記ニューマチックマニホールドに移動可能に接続されるニューマチック供給システム、；及び前記分配プラットフォーム及び前記ニューマチック供給システムの少なくとも１つに接続され、前記ハウジング内に設けられる制御システムを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己完結的生物学的アッセイ装置であり、前記装置は：
ハウジング；
前記ハウジング内に設けられる、制御可能で、移動可能な試薬分配システムを含む分配プラットフォーム；
前記ハウジング内に設けられる試薬供給コンポーネント；
前記ハウジング内に前記分配プラットフォームと空間を共有して設けられ、流体輸送層と複数の貯槽と移動可能に接続される、ニューマチックマニホールドを含み、
前記流体輸送層、前記貯槽及びそこに導入される試験サンプルは、前記ハウジング内に、前記分配プラットフォームから空間的に分離されて設けられ；
前記ハウジング内に前記分配プラットフォームから空間的に離れて、前記ニューマチックマニホールドに移動可能に接続されるニューマチック供給システム；及び
前記分配プラットフォーム及び前記ニューマチック供給システムの少なくとも１つに接続され、前記ハウジング内に設けられる制御システムを含み、
前記装置が、自己完結的、完全自動化、生物学的アッセイ−実施装置である、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であり、前記分配プラットフォームがさらに：
前記試薬分配システムと操作的に接続される動作制御システムを含み、前記試薬分配システムが、遠位分配端部を持つ試薬分配コンポーネントを含み；及び
前記試薬分配システムに接続されるカメラを含み、前記カメラは前記貯槽の対象となる選択された領域を少なくとも含む視野を持つ、装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置であり、前記試薬分配コンポーネントが、長さＬ及び選択された孔サイズを持つ細長いニードル構造である、装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置であり、前記試薬分配システムはさらに、前記試薬分配コンポーネントと流体的に接続される試薬貯蔵構造を含み、前記試薬貯蔵構造が、前記選択された孔サイズと操作的に一致する選択された寸法を持つ、装置。
【請求項５】
請求項４に記載の装置であり、前記試薬貯蔵構造がチューブの長さである、装置。
【請求項６】
請求項２に記載の装置であり、前記試薬分配コンポーネントが、複数の、異なるそれぞれ選択された孔サイズを持つ、長さＬの細長いニードル構造である、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置であり、前記試薬分配システムがさらに、
複数の試薬貯蔵構造を含み、これらはそれぞれ前記複数の試薬分配コンポーネントへ流体的に接続され、それぞれの試薬貯槽構造が選択された寸法を持ち、前記それぞれ選択された孔サイズと操作的に一致する、装置。
【請求項８】
請求項７に記載の装置であり、前記試薬貯蔵構造のそれぞれがチューブの長さである、装置。
【請求項９】
請求項７に記載の装置であり、２つの試薬貯蔵構造を含み、これらはそれぞれ２つの試薬分配コンポーネントと流体的に接続され、前記試薬分配コンポーネントの１つが、孔直径ｂ１が、０．００３＜ｂ１＜０．０１８インチであり、他の試薬分配コンポーネントが、孔直径ｂ２が、０．０１５＜ｂ２＜０．０３０インチである、装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の装置であり、前記ニューマチックマニホールドが、少なくとも１つのアッセイ容量を持つミクロ流体システムと相互作用する、装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の装置であり、前記ミクロ流体システムがさらに、多層、モノリシック、ポリマー性、非弾性的ミクロ流体コンポーネントを含み、これは複数のニューマチック的に駆動されるダイヤフラムを含むミクロ構造の所定の構成を持つ、装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置であり、
前記ニューマチックマニホールドはその下側に複数のニューマチックのみポート、及び前記流体輸送層中の複数のバルブと前記複数のニューマチックのみポートとを流体接続するように設けられる複数のニューマチックのみチャンネルを含み、
前記複数のニューマチックポートが固定構造を持ち、かつ前記複数のニューマチックのみチャンネルが所定の構成を持ち、特に前記流体輸送層内の前記複数のニューマチック的に駆動されるダイヤフラムの所定の構造に対応する、装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の装置であり、前記ニューマチック供給システムがさらに、
前記複数のニューマチックのみポートと流体接続して、前記ニューマチックシグナルが通過する通路を与える複数の開口チューブを含み、
前記複数の開口チューブが、特に、前記ニューマチックマニホールドの複数のニューマチックのみポートの前記構造に対応する、前記ニューマチックマニホールドと移動可能に接続された固定構造を持つ、装置。
【請求項１４】
請求項１１に記載の装置であり、それぞれの多層、モノリシックミクロ流体コンポーネントがさらに：
ポリマー性、非弾性的基板を含み、前記基板はそこに設けられる複数の流体チャンネルを持ち、前記流体チャンネルのそれぞれは入口端部及び出口端部を持ち；
試薬材料を保持し得るタイプの少なくとも１つの試薬貯槽；
少なくとも３つの非弾性膜に基づくダイヤフラムバルブ構造を含む少なくとも１つの双方向ダイヤフラムポンプ；及び
前記少なくとも１つの試薬貯槽と前記少なくとも１つの入口端部と流体的に接続して設けられるバルブを含み、
前記バルブが、前記少なくとも１つの試薬貯槽から前記バルブと接続される前記少なくとも１つのチャンネルを介して複数の貯槽へ前記材料のフローの方向を制御可能に適合され、さらに、多層の、モノリシックのミクロ流体コンポーネントのそれぞれが非弾性的、ポリマー性材料から形成される、装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の装置であり、それぞれの基板がさらに、複数の分析貯槽を含み、それぞれの分析貯槽がそこに設けられる分析システムを含む、装置。
【請求項１６】
請求項１４に記載の装置であり、前記分析システムが、比色、蛍光発光、化学発光、電気化学、電気泳動、ラテラルフロー、タンパク質ミクロアッセイ、核酸ミクロアッセイ、蛍光を含む群から選択される１つである、装置。
【請求項１７】
請求項１４に記載の装置であり、さらに、複数の周縁段差を持つ保護リング構造を含み、前記分析膜が前記保護リング構造と操作的に協働する、装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の装置であり、前記貯槽が、前記分析膜が設けられる少なくとも部分的に内側周辺に棚部を持つ、装置。
【請求項１９】
請求項１７に記載の装置であり、前記保護リング構造は２つの対抗するリング構造を持ち、それぞれは複数の周縁段差を持ち、さらに前記分析膜が前記２つの対抗する保護リング構造の中間に設けられる、装置。
【請求項２０】
請求項１５に記載の装置であり、さらにヒーターを含む、装置。
【請求項２１】
請求項２０に記載の装置であり、前記ヒーターは、加熱可能な、磁気的係合可能な貯槽に近接して設けられる、装置。
【請求項２２】
請求項１４に記載の装置であり、さらに：
前記基板の底部表面へ付される空洞配置層を含み、前記空洞配置層は、複数の駆動を含み、それぞれが流体チャンネルに流体的に接続される近位端、及び前記基板から下向き垂直に突出した遠位端を持ち；及び
それぞれ複数の増幅／反応チャンバを含み、前記チューブ配置層への上部領域に付され、それぞれのチューブの前記遠位端部で実質的にその底部領域の近くに設けられる、装置。
【請求項２３】
請求項２２に記載の装置であり、さらに前記増幅／反応チャンバのそれぞれに温度上昇のためのヒーターを含む、装置。
【請求項２４】
請求項１１に記載の装置であり、さらに、貯槽又はチャンネルの下に操作的に設けられる磁気アセンブリを含み、前記磁気アセンブリがさらに、磁石、磁石保持装置、ピストンロッド、及びニューマチックピストンアセンブリ（又は、前記ピストンアセンブリは、モーター又は電磁的駆動され得る）を含む、装置。
【請求項２５】
請求項２４に記載の装置であり、さらに前記磁気アセンブリと操作的に接続されるヒーターアセンブリを含む、装置。
【請求項２６】
流体試験サンプル中に存在するターゲット核酸配列を単離し、増幅し及び分析するための自動化プロセスであり、前記プロセスは：
流体輸送層とそこに設けられる流体チャンネルを含むミクロ流体システムを操作するニューマチックマニホールド、及びそれに付される貯槽を提供し；
前記流体チャンネル内に前記流体試験サンプルを導入し；
少なくとも１つの試薬を、前記流体輸送層と流体的に接続される少なくとも１つの貯槽から前記チャンネルへ提供し；
前記流体試験サンプルと前記流体輸送層の領域内で前記少なくとも１つの試薬とを組合せ；
前記流体試験サンプルを、前記流体輸送層と操作的に流通する温度制御された増幅／反応リアクタへ輸送し；
前記流体試験サンプルを、前記増幅／反応リアクタ中で、増幅される前記ターゲット核酸配列を可能にするために十分な条件下でインキュベートし；
前記流体試験サンプルを分析貯槽へ輸送し；及び
前記試験サンプルから前記増幅されたターゲット核酸配列を分析し、前記試験サンプルは前記流体輸送層中の開始位置から、他の全てのサンプルから分離され、かつ前記ニューマチックマニホールド及び前記分配システムから分離された前記分離貯槽へ輸送される、自動化プロセス。
【請求項２７】
請求項２６に記載の自動化プロセスであり、前記輸送及び組合せステップが、前記流体試験サンプル、及び前記ニューマチックマニホールドにより操作される少なくとも１つのマルチバルブダイヤフラムポンプを介して前記流体輸送層を通じて前記容量をポンプすることで達成される、自動化プロセス。
【請求項２８】
請求項２６に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップがさらに、前記ミクロ流体システム中のミクロアレイ分析貯槽においてミクロアレイ分析を実施することを含む、自動化プロセス。
【請求項２９】
請求項２８に記載の自動化プロセスであり、さらに、前記ミクロアレイ分析貯槽内のミクロアレイ分析膜を提供し；前記ミクロアレイ分析膜の上部表面に流体を流し；及び前記ミクロアレイ分析膜の周縁に沿って流体出口経路を実質的に通じて前記流体を除去することを含む、自動化プロセス。
【請求項３０】
請求項２８に記載の自動化プロセスであり、さらに、前記ミクロアレイ分析貯槽内のミクロ分析膜を提供し；及び前記ミクロ分析膜の上部表面を交互に前後に流体を流すことを含む、自動化プロセス。
【請求項３１】
請求項２８に記載の自動化プロセスであり、さらに、前記ミクロアレイ分析膜に熱を与えることを含む、自動化プロセス。
【請求項３２】
請求項２６に記載の自動化プロセスであり、前記ターゲット核酸配列が、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因又は薬品、医薬組成物、化学物質又は化合物感受性の素因に関連する、自動化プロセス。
【請求項３３】
請求項２６に記載の自動化プロセスであり、前記ターゲット核酸配列がＳＮＰを含む、自動化プロセス。
【請求項３４】
請求項３２の記載の自動化プロセスであり、前記疾患又は障害がＨＰＶ又は敗血症である、自動化プロセス。
【請求項３５】
請求項３２に記載の自動化プロセスであり、前記ターゲット核酸配列が、ワルファリン感受性の素因又はワルファリン処置に応じた抗凝固の素因に関連する、自動化プロセス。
【請求項３６】
請求項２６に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップが、前記増幅ターゲット核酸配列と前記ターゲット核酸配列の間の相互作用を検出することを含む、自動化プロセス。
【請求項３７】
請求項３６に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップが、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因又は薬品、医薬組成物、化学物質又は化合物感受性の存在を決定する、自動化プロセス。
【請求項３８】
請求項２６に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップが、前記増幅ターゲット核酸配列の量及びレベルの決定を含み、及び前記方法がさらに前記量及びレベルを前記ターゲット核酸配列の既定の量及びレベルと比較することを含む、自動化プロセス。
【請求項３９】
請求項３８に記載の自動化プロセスであり、前記量又はレベル及び前記既定の量又はレベルの間の差が、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因又は薬品、医薬組成物、化学物質又は化合物感受性の存在を示す、自動化プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、次の米国仮特許出願：２０１１年２月２日出願米国仮特許出願第６１／４４４９５２；２０１１年２月２２日出願米国仮特許出願第６１／４４５１２５；２０１１年２月２３日出願米国仮特許出願第６１／４４５１３０；２０１０年５月１９日出願米国仮特許出願第６１／３４６２０２；２０１０年６月１７日出願米国仮特許出願第６１／３５５７７３；２０１０年１０月２１日出願米国仮特許出願第６１／４０５３３９；２０１０年２月２３日出願米国仮特許出願第６１／３０７１８６、２０１０年２月２３日出願米国仮特許出願第６１／３０７１２１、２０１０年１０月１４日出願米国仮特許出願第６１／３９３２３７；２０１０年８月１７日出願米国仮特許出願第６１／３７４３０２について優先権を主張するものであり、これらの内容は参照されて本明細書に援用される。
【０００２】
本発明の開示は、一般的にはミクロ流体及び、より具体的には自己完結型、ミクロ流体に基づく生物学的アッセイ装置、関連する方法及び応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生化学的アッセイは、一般的には、研究、医療、環境及び工業環境で、特定の遺伝子配列、抗原、疾患及び病原体の存在や量を検出又は定量するために使用される。前記アッセイは、宿主生物又はサンプル内に存在する寄生生物、真菌、細菌及びウイルスを含む生物体を識別するために、しばしば使用される。ある条件下で、アッセイは、感染や疾患の程度を計算し、疾患の時間経過をモニタするために使用され得る定量化の尺度を提供することができる。一般に、生化学的アッセイは、研究、医療、環境又は工業的原料から由来のサンプルから抽出された抗原（免疫アッセイ）や核酸（核酸系アッセイ又は分子アッセイ）のいずれかを検出する。
【０００４】
分子生物学は、核酸に基づくアッセイを含み、生物学の一分野として広く定義され得るものであり、核酸及びタンパク質などのマクロ分子の形成、構造と機能、及び核酸の操作同様に細胞増殖及び遺伝子情報の伝達におけるそれらの役割などを取り扱い、それらは配列解析され、変位され及びさらに操作されて有機体のゲノムへ導入され、前記変位有機体の生物学的効果を研究される。
【０００５】
生化学及び分子生物学の従来方法では、研究対象物のサイズにしばしば反比例する規模の物理的なプロセスリソースを必要とすることがある。例えば、予定される分析のために核酸断片などの生物学的サンプルの調製及び精製に伴う装置及びプロセス化学は、通常は殺菌設備を持つ完全な規模の生物学実験室を必要とする。さらに、類似の規模の環境的に隔離された施設が、前記核酸断片を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの知られた核酸増幅手順を実施するために必要とされ得る。
【０００６】
「ミクロフルイディクス」とは一般に、流体の少量容量をプロセスするためのシステム、装置及び方法を意味する。ミクロフルイディクスシステムは、流体を操作するための広い種々の操作を集積することができる。かかる流体は化学的又は生物学的サンプルを含む。これらのシステムはまた、生物学的アッセイ（例えば医学診断、創薬及び医薬輸送のため）、生化学的センサ又は環境分析同様に一般的な生命科学研究、工業的プロセスモニタ及び食品安全性試験など、多くの応用分野を含む。
【０００７】
１つのタイプのミクロ流体装置は、ミクロ流体チップである。ミクロ流体チップは、流体を貯蔵し、チップ上の種々の位置へ及びから流体を経路付け及び／又は反応試薬のためのチャンネル、バルブ、ポンプ、リアクタ及び／又は貯槽などのミクロスケールの構造（又は「ミクロ構造」）を含む。しかし、既存のミクロ流体システムは、既設のフローパターンを通る以外の複数の流体の制御された操作を可能とするための適切な機構を欠失しており、システムを種々の化学又は生物学的アッセイで利用され得る実用性を限定する。この理由は、実際のアッセイでは、種々の分析目的のために異なる試薬の繰り返し操作がしばしば必要とされるからである。
【０００８】
さらに多くの既存のミクロ流体装置は１つの特定の使用に限定され、完全に再設計しない限り、他の応用に容易に適合化することはできない。これらの装置はモジュール性を欠失しており、従って、１つの設計が複数の機能を実施できる共通の装置コンポーネントを共有することができない。このフレキシビリティを欠くということは、それぞれの使用が異なるシステムを製造する必要があるということにより製造コストを増加させることとなる。
【０００９】
さらに、多くの既存のミクロ流体システムは、容易に相互作用又は前記アッセイから得られる検体の存在を検出することができる簡単なエンドポイントアッセイのための手段を欠く。例として、アッセイ後のサンプルの色変化を視覚的に検出することが前記アッセイ結果を評価するためにしばしば使用される。
【００１０】
従って、生物学的又は化学的サンプルの分析及び特に、ＤＮＡ、ＲＮＡアミノ酸及びタンパク質などのサンプルなどから由来する生物学的活性なマクロ分子の検出及び分析のために流体をプロセスするための改良されたミクロ流体システムの必要性が存在する。望ましいことは、前記システムが大量生産でき、安価で、かつ好ましくは使い捨てである、ということである。望ましいことは、前記システムが操作が容易で、前記流体プロセスステップの多く又は実質的に全てが自動化される、ということである。望ましいことは、前記システムがカスタマイズでき、モジュール化されることであり、それにより前記システムが、マクロ分子の検出が望まれる種々の応用に適するように容易にかつ迅速に再構成され得る、ということである。また望ましいことは、前記システムが簡単な意味のあるアッセイ結果を提供することができる、ということである。
【００１１】
核酸系アッセイを実施する場合、サンプルの調製は、前記サンプル中に存在し得る目標核酸を放出させかつ安定化させる第１の最も重要なステップである。サンプル調製はまた、ヌクレアーゼ活性を除去し、かつ前記目標核酸の核酸増幅又は検出の潜在的インヒビタを除去又は不活性化するために供される。前記サンプル調製の方法は変更され得るものであり、プロセスされるサンプルの特質に部分的に依存するものである。種々の溶解手順は当技術分野で知られており、当初のサンプル内に懸濁された細胞やウイルスから核酸を具体的に単離するように設計される。
【００１２】
溶解に続いて、前記サンプル中に放出された核酸は精製され、増幅反応を抑制する可能性があるインヒビタを核酸から除去され得る。一般には、精製は手間のかかる、大量の試薬、高価な設備及び労力を要する一連のくり返し作業であり、かつこのステップがその後の増幅反応の失敗に最も関係するステップである。
【００１３】
精製に続いて、当技術分野で知られるいくつかの核酸増幅手順を用いて特定の核酸配列を増幅することが一般に望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅される核酸配列に相同性の配列を含む核酸アンプリコン（コピー）の酵素合成である。当技術分野で実施される核酸増幅手順の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写関連増幅（ＴＡＡ）、コールドＰＣＲ、及び非酵素増幅技術（ＮＥＡＴ）が含まれる。核酸増幅は、サンプル中の目標配列の量が非常に低い場合に特に有益である。目標配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することで、アッセイの感度が飛躍的に改善される。というのは前記アッセイの最初にはほんの僅かな目標配列が、前記対象となる生物体又はウイルスに属するサンプル中の核酸の検出をより確実にするために必要とされるからである。
【００１４】
目標核酸配列の検出は、前記目標配列又はその代わりのアンプリコンに相補的であるヌクレオチド塩基配列を持つ核酸プローブの使用を必要とする。選択的なアッセイ条件下で、前記プローブが前記目標配列又はそのアンプリコンにハイブリダイズさせることで、実施者がサンプル中に前記目標配列の存在を検出することができる。効果的なプローブは、目標配列の存在の検出を妨害する核酸配列と非特異的にハイブリダイズすることを防止するように設計される。プローブ及び／又はアンプリコンは検出可能なラベルを含み、前記ラベルは、例えば放射性ラベル、蛍光色素、ビオチン、酵素、電気化学的又は化学発光化合物が挙げられる。
【００１５】
手動で実施する場合には、核酸系アッセイに伴うプロセスステップの複雑性と多数回のために、実施者誤差、病原体曝露及びアッセイ間のクロスコンタミネーションなどの機会を生じる。手動方式に従い、実施者は安全かつ簡便に、試験サンプル、試薬、廃棄容器、アッセイ容器、ピペットチップ、アスピレータ装置、ディスペンサ装置を配置整列させる必要があり、一方で、ラック、試験サンプル、アッセイ容器及び関連するチップを特に注意して区別し、又はチューブ、チップ、容器又は器具をひっくり返さないように特に注意する必要がある。さらに、実施者は、注意深く、手持ちの非固定器具を吸引し分配するステップを実施しなければならない。これらは、アッセイ容器間の望ましくない、接触、エアロゾル形成又は磁気粒子又は目標捕捉アッセイで使用される他の物質の吸引を避けるために正確な実施が要求される。
【００１６】
核酸系アッセイを実施する手動方法に伴う多くの問題に対処する自動分析装置への要求が存在する。特に、核酸系アッセイの種々のプロセスステップを自動化することで、ユーザ誤差、病原体曝露、コンタミネーション及び漏流の危険を大きく防止することを含む重要な利点が実現され得る。核酸系アッセイのステップを自動化することはまた、実施者に要求される訓練の量を低減し、高体積の手動適用による物理的傷害の原因を実質的に除去するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の実施態様及び側面は、前記説明された要求に対処するものであり、自己完結的ミクロ流体に基づく生物学的アッセイ装置、関連する方法及びその応用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
非限定的、例示的実施態様によれば、自己完結的、完全自動化、生物学的アッセイ−実施装置であり、前記装置は：自己完結的生物学的アッセイ装置であり、前記装置は：ハウジング；前記ハウジング内に設けられる、制御可能で、移動可能な試薬分配システムを含む分配プラットフォーム；前記ハウジング内に設けられる試薬供給コンポーネント；前記ハウジング内に前記分配プラットフォームと空間を共有して設けられ、流体輸送層と複数の貯槽と移動可能に接続される、ニューマチックマニホールドを含み、前記流体輸送層、前記貯槽及びそこに導入される試験サンプルが前記ハウジング内に、前記分配プラットフォームから空間的に分離されて設けられ；前記ハウジング内に前記分配プラットフォームから空間的に離れて、前記ニューマチックマニホールドに移動可能に接続されるニューマチック供給システム；及び前記分配プラットフォーム及び前記ニューマチック供給システムの少なくとも１つに接続され、前記ハウジング内に設けられる制御システムを含む。
【００１９】
非限定的側面によれば、前記分配プラットフォームはさらに、前記試薬分配システムと操作的に接続される動作制御システムを含み、前記試薬分配システムが、遠位分配端部を持つ試薬分配コンポーネントを含み；及び前記試薬分配システムに接続されるカメラを含み、前記カメラは前記貯槽の対象となる選択された領域を少なくとも含む視野を含む。
【００２０】
非限定的側面によると、前記ニューマチックマニホールドは、少なくとも１つのアッセイ容量を持つミクロ流体システムと相互作用する。前記ミクロ流体システムはさらに、多層、モノリシック、ポリマー性、非弾性的ミクロ流体コンポーネントを含み、これは複数のニューマチック的に駆動されるダイヤフラムを含むミクロ構造の所定の構成を持つ。前記ニューマチックマニホールドは、その下に１以上のニューマチックのみ（即ち、「流体」のない）ポート、及びそこに前記流体輸送層と１以上のニューマチックのみポートとを流体接続して設けられる１以上のニューマチックのみチャンネルを含み、前記１以上のニューマチックのみポートが固定構造を持ち、及び前記１以上のニューマチックのみチャンネルが所定の構造を持ち、これは特に前記流体輸送層内の前記１以上のニューマチック的に駆動されるダイヤフラムの所定の構造に対応する。前記ニューマチック供給システムはさらに、１以上の開口チューブを含み、これは、前記１以上のニューマチックのみポートと流体接続でそこを通る前記ニューマチックシグナルの通路を提供し、前記１以上の開口チューブは固定構造を持ち、特に、前記ニューマチックマニホールドの１以上のニューマチックポートの固定構造に対応し、前記ニューマチックマニホールドと移動可能に接続される。それぞれの多層、モノリシックミクロ流体コンポーネントがさらに：ポリマー性、非弾性的基板を含み、前記基板はそこに設けられる複数の流体チャンネルを持ち、前記流体チャンネルのそれぞれは入口端部及び出口端部を持ち；試薬材料を保持し得るタイプの少なくとも１つの試薬貯槽；少なくとも３つの非弾性膜に基づくダイヤフラムバルブ構造を含む少なくとも１つの双方向ダイヤフラムポンプ；及び前記少なくとも１つの試薬貯槽と前記少なくとも１つの入口端部と流体的に接続して設けられるバルブを含み前記バルブが、前記少なくとも１つの試薬貯槽から前記バルブと接続される前記少なくとも１つのチャンネルを介して複数の貯槽へ前記材料のフローの方向を制御可能に適合され、さらに、多層の、モノリシックのミクロ流体コンポーネントのそれぞれが非弾性的、ポリマー性材料から形成される。それぞれの基板はさらに、複数の分析貯槽を含み、それぞれの分析貯槽がそこに設けられる分析システムを含む。前記分析システムが、比色、蛍光発光、化学発光、電気化学、電気泳動、ラテラルフロー、タンパク質ミクロアッセイ、核酸ミクロアッセイ、蛍光を含む群から選択される１つである。前記装置はさらに、複数の周縁段差を持つ保護リング構造を含み、前記分析膜が前記保護リング構造と操作的に協働する。前記保護リング構造は２つの対抗するリング構造を持ち、それぞれは複数の周縁段差を持ち、さらに前記分析膜が前記２つの対抗する保護リング構造の中間に設けられる。前記装置はさらに、前記分析プロセスで試験サンプル又はその部分を加熱するために異なる位置に設けられる１以上のヒーターを含む。ヒーターは、磁気的係合可能な貯槽に近接して設けられる。前記装置はまた、前記基板の底部表面に付された１以上のチューブを含むチューブ層を含み、それぞれは、それぞれの流体チャンネルへ流体的に接続される近位端部と、前記基板から垂直下部に突出する遠位端部を含み；及び前記チューブ配置層に￥の上部領域で付される１以上のそれぞれの増幅／反応チャンバを含み、それぞれのチューブの遠位端部が実質的に前記底部領域の近くに設けられる。前記装置はさらに磁気アセンブリを含み、これは貯槽又はチャンネルの下に操作的に設けられ、前記磁気アセンブリがさらに磁石、磁石保持装置、ピストンロッド及びニューマチックピストンアセンブリ（又は前記ピストンアセンブリはモーター又は電磁的に駆動され得る）を含む。ヒーターアセンブリが前記磁気アセンブリの操作的に接続され得る。
【００２１】
本発明の他の非限定的例示的実施態様は、流体試験サンプル中に存在し得るターゲット核酸を単離、増幅及び分析するための自動化プロセスに関する。前記プロセスは：流体輸送層とそこに設けられる流体チャンネルを含むミクロ流体システムを操作するニューマチックマニホールド、及びそれに付される貯槽を提供し；前記流体チャンネル内に前記流体試験サンプルを導入し；少なくとも１つの試薬を、前記流体輸送層と流体的に接続される少なくとも１つの貯槽から前記チャンネルへ提供し；前記流体試験サンプルと前記流体輸送層の領域内で前記少なくとも１つの試薬とを組合せ；前記流体試験サンプルを、前記流体輸送層と操作的に流通する温度制御された増幅／反応リアクタへ輸送し；前記流体試験サンプルを、前記増幅／反応リアクタ中で、増幅される前記ターゲット核酸配列を可能にするために十分な条件下でインキュベートし；前記流体試験サンプルを分析貯槽へ輸送し；及び前記試験サンプルから前記増幅されたターゲット核酸配列を分析し、前記試験サンプルは前記流体輸送層中の開始位置から、他の全てのサンプルから分離され、かつ前記ニューマチックマニホールド及び前記分配システムから分離された前記分離貯槽へ輸送される、自動化プロセスである。
【００２２】
１つの側面では、前記輸送及び結合ｓｕテップハ、前記流体試験サンプル、及び前記ニューマチックマニホールドにより操作される少なくとも１つのマルチバルブダイヤフラムポンプを介して前記流体輸送層を通じて前記容量をポンプすることで達成される。１つの側面では、前記分析ステップはさらに、前記ミクロ流体システム中のミクロアレイ分析貯槽においてミクロアレイ分析を実施することを含む。前記自動化プロセスは、さらに、前記ミクロアレイ分析貯槽内のミクロアレイ分析膜を提供し；前記ミクロアレイ分析膜の上部表面に流体を流し；及び前記ミクロアレイ分析膜の周縁に沿って流体出口経路を実質的に通じて前記流体を除去することを含む。前記自動化プロセスはさらに、前記ミクロアレイ分析貯槽内のミクロ分析膜を提供し；及び前記ミクロ分析膜の上部表面を交互に前後に流体を流すことを含む。前記自動化プロセスは、さらに、前記ミクロアレイ分析膜に熱を与えることを含む。
【００２３】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記ターゲット核酸配列が、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因又は薬品、医薬組成物、化学物質又は化合物感受性の素因に関連する。
【００２４】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記ターゲット核酸はＳＮＰを含む。
【００２５】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記疾患又は障害がＨＰＶ又は敗血症を含む。
【００２６】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記ターゲット核酸配列が、ワルファリン感受性の素因又はワルファリン処置に応じた抗凝固の素因に関連する。
【００２７】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記分析ステップが、前記増幅ターゲット核酸配列と前記ターゲット核酸配列の間の相互作用を検出することを含む。
【００２８】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記分析ステップが、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因又は薬品、医薬組成物、化学物質又は化合物感受性の存在を決定することを含む。
【００２９】
流体試験サンプルに存在し得るターゲット核酸配列を単離し、増幅しかつ分析するためのその他の非限定的実施態様では、前記分析ステップが、前記増幅ターゲット核酸配列の量及びレベルの決定を含み、及び前記方法がさらに前記量及びレベルを前記ターゲット核酸配列の既定の量及びレベルと比較することを含む。
【００３０】
さらに前記量又はレベル及び前記既定の量又はレベルの間の差が、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因又は薬品、医薬組成物、化学物質又は化合物感受性の存在を示す。
【００３１】
ここまで説明され、以下同様に発明の詳細な説明で示される本発明の構成及び効果については、当業者であれば、詳細な説明、図面及び特許請求の範囲に基づき、容易に明らかとなるであろう。
【００３２】
理解されるべきことは、前記一般的説明及び以下の詳細な説明は、本発明を説明するためのものであり、特許請求される本発明の本質及び特徴の概略を与えることを意図するものである、ということである。
【００３３】
以下の添付図面は、本発明の種々の請求される実施態様及び側面の理解を提供するものであり、これらは本明細書の一部を構成するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明の例示的実施態様による、自己完結生物学的アッセイの斜視図である。
【図２】図２は、図１に示される自己完結的生物学的アッセイ装置の正面図である。
【図３】図３は、図１に示される自己完結的生物学的アッセイ装置の平面図である。
【図４】図４は、図１に示される自己完結的生物学的アッセイ装置の斜視図である。
【図５】図５は、本発明の例示的側面による、貯槽の「６ｘ４」の平面図である。
【図６】図６は本発明の例示的側面による、流体輸送層に付設され、ニューマチックマニホールド上に設けられた「６ｘ４」の貯槽の配置を示す斜視図である。
【図７】図７は、本発明の例示的側面による、増幅反応に関与するニューマチックマニホールドとヒータの上部ガスケット層の「６ｘ４」配置の断面正面図を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の例示的側面による、自己完結的生物学的アッセイ装置のニューマチックマニホールドの底部の「６ｘ４」配置の正面斜視図を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の例示的側面による、自己完結的生物学的アッセイ装置のニューマチックマニホールドの底部の「６ｘ４」配置の平面図を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、本発明の例示的側面による、自己完結的生物学的アッセイ装置のニューマチックマニホールドの底部の「６ｘ４」配置の底部斜視図を示す。
【図９】図９は、本発明の例示的側面により、流体輸送及び貯槽層の組合せである、貯槽、流体チャンネル及び増幅リアクタの「４アッセイユニット」の多層化、断面平面図を示す。
【図１０Ａ】図Ａは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｂ】図Ｂは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｃ】図Ｃは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｄ】図Ｄは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｅ】図Ｅは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｆ】図Ｆは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｇ】図Ｇは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｈ】図Ｈは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｉ】図Ｉは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｊ】図Ｊは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１０Ｋ】図Ｋは、本発明の例示側面による、ニューマチックマニホールドにより操作される場合に、組み合わされた流体輸送層と貯槽層内のチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図を示す。
【図１１】図１１は、本発明の例示的側面による、貯槽層、膜層を含む流体輸送層及び増幅リアクタを含む「４アッセイユニット」コンポーネントの斜視図を示す。
【図１２】図１２は、本発明の例示的側面による、図１１で示される「４アッセイユニット」の断面側面図を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の例示的側面による、「４アッセイユニット」コンポーネントの一例の分解図を示す、貯槽層、流体層、膜層、増幅リアクタを充填及び空にするために使用される空洞（ルーメン）を含む増幅リアクタ、孔付きリングと分析貯槽のための膜システム、シリカフィルタ及び孔付き保持リングを含む。
【図１３Ｂ】図１３Ｂをは、本発明の例示的側面による、孔付きリングの一例を示し、フローチャンネル、分析膜及び膜支持構造を持つ。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本発明の例示的側面による、「４アッセイユニット」コンポーネントの分析領域のための貯槽層の他の実施態様を示し、前記分析膜を保持するために穴付きリングアセンブリを適用しない分析貯槽のためのカバーされ、かつ曲げられたコンポーネントを含む。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本発明の例示的側面による、前記カバーされたかつ曲げられた分析貯槽の構造の拡大斜視図を示し、分析膜のモデル及び分析膜を保持するために使用される段差構造を含む。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、本発明の例示的側面による、４アッセイユニット構成の正面断面図を示し、前記構成は、ニューマチックマニホールドの上部ガスケット層、増幅リアクタに係合するヒーター及び分析貯槽の表面の下に係合するヒーターを含む。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ニューマチックマニホールドの上部層の内部ニューマチックチャンネルを示し、これは、どのようにして前記ニューマチック供給システムから前記ニューマチックマニホールドの底部層内に導入されるニューマチックシグナルがさらに分けられて、ニューマチックマニホールドの表面上の特定のガスケット層ボイドにアドレスされるかを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明の例示的側面による、ニューマチックマニホールドの単一アッセイユニットの分解図であり、ニューマチック起動磁石と多目的ヒーターを含み、同様に前記流体層とニューマチックマニホールドの境界に選択的にダイヤフラム層を含む。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明の例示的側面による、図１５Ａに示される単一ユニットアッセイの分解図であり、流体輸送層の薄膜層及びニューマチックマニホールド上のガスケット層を含む。
【図１６】図１６は、本発明の例示的側面による、貯槽、流体チャンネル及び増幅リアクタの「単一アッセイユニット」層状化された構成の断面正面図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｇ】図１７Ｇは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｈ】図１７Ｈは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｉ】図１７Ｉは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｊ】図１７Ｊは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｋ】図１７Ｋは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｌ】図１７Ｌは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｍ】図１７Ｍは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｎ】図１７Ｎは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１７Ｏ】図１７Ｏは、本発明の説明的側面による、ニューマチックマニホールドで操作される際の、流体輸送層と貯槽層とを組み合わせてチャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の層状化正面図を示す。
【図１８】図１８は、本発明の例示的側面による、単一アッセイユニットのニューマチックマニホールドとミクロ流体システムの断面側面図を示し、非加熱磁気アセンブリと多重化熱反応サイトを含むニューマチック起動磁石を含むマニホールドの機能的構成を示す。
【図１９】図１９は、本発明の例示的側面による、単一アッセイユニットのニューマチックマニホールドとミクロ流体システムの断面側面図であり、ニューマチック起動、加熱磁石アセンブリ及び多重化熱反応サイトを含む。
【図２０】図２０は、本発明の例示的側面による、貯槽、流体チャンネル及び増幅リアクタの「２アッセイユニット」構成の断面正面図であり、流体輸送層と貯槽層の組合せである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｆ】図２１Ｆは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｇ】図２１Ｇは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｈ】図２１Ｈは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｉ】図２１Ｉは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２１Ｋ】図２１Ｋは、本発明の説明的側面であり、ニューマチックマニホールドにより操作される際に、流体輸送層と貯槽層との組合せで、チャンネル、リアクタ及び貯槽を用いる例示的プロセス段階の正面図である。
【図２２】図２２は、本発明の例示的側面による、２アッセイユニットの分解図を示し、貯槽層、流体操、膜層及び増幅リアクタを満たしかつ空にするために使用される空洞を含む増幅リアクタを示す。
【図２３】図２３は、本発明の非限定的説明的側面による、多目的ヒーターの分解図である。
【図２４】図２４は、本発明の非限定的な説明的側面による、ＣＡＲＤでのプロセスのための組織サンプルの固定プロセスを模式的に示す図である。
【図２５】図２５は、本発明の非限定的説明的側面による、ＣＡＲＤでのサンプル溶解プロセスを模式的に示す図である。
【図２６Ａ】図２６Ａは、プライマ伸長プロトコルを示す。３’被分析ヌクレオチドを含むアミノ酸末端キャプチャプローブが膜フィルタへ共有結合される。増幅に続いて、アンプリコン生成物は変性され前記相補鎖が前記プローブとアニールされる。ここで前記プローブの３’ヌクレオチドと前記アンプリコン（Ａ）とが完全にマッチする場合には、ＤＮＡ合成が生じてビオチン化（ｂｉｏ）ヌクレオチドが取り込まれる。さらなる詳細は実施例２を参照すること。
【図２６Ｂ】図２６Ａは、プライマ伸長プロトコルを示す。３’被分析ヌクレオチドを含むアミノ酸末端キャプチャプローブが膜フィルタへ共有結合される。増幅に続いて、アンプリコン生成物は変性され前記相補鎖が前記プローブとアニールされる。ここで前記プローブの３’ヌクレオチドと前記アンプリコン（Ｂ）とがミスマッチである場合には、ＤＮＡ合成は起こらずビオチン化（ｂｉｏ）ヌクレオチドが取り込まれない。さらなる詳細は実施例２を参照すること。
【図２７】図２７は、前記カードの実施態様でのワルファリンＳＮＰアッセイのプライマ伸長コンポーネントから得られた代表的画像を示す。着色沈着物は、変性させたアンプリコンの固相キャプチャプローブとハイブリダイズさせ、ビオチン化ｄＵＴＰ及び非ラベル化ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰをＤＮＡポリメラーゼ存在下で取り込ませ、最後にストレプトアビジン化ＨＲＰと基質とをインキュベートすることで検出される。前記キーは前記キャプチャプローブで目標とされた対立遺伝子を示す。画像化に続いて、ＷＴスポット上で検出された画素数が前記変異スポット上で検出された画素数で割算される。ＷＴ画素数／変異画素数＞１はホモ接合性ＷＴを示し；ＷＴ画素数／変異画素数＝１はヘテロ接合性を示し；かつＷＴ画素数／変異画素数＜１はホモ接合変異体を示す。フィルタ上で示された得られた遺伝子型は：ＶＫＯＲＣ１−ヘテロ接合体；ＣＹＰ２Ｃ９＊２−ホモ接合型ＷＴ；及びＣＹＰ２Ｃ９＊３−ホモ接合型ＷＴを示す。
【図２８】図２８は、カードの実施態様でのプライマ伸長と共にワルファリンＳＮＰアッセイを用いて得られた７つの個人の遺伝子型の結果を示す。７つの個人の口腔スワブからのフィルタ結果は図の上に示される。図の下には、これらのフィルタから読まれた遺伝子型が示される。さらに、全ての遺伝子型が双方向配列決定により検証された。これらの遺伝子型は試験された２０の個人で代表された。遺伝子型のより稀な組合せはこの小さいサンプルセットでは予想されなかった。
【図２９】図２９は、カードの実施態様でＲＤＢと共にワルファリンＳＮＰアッセイを用いて得られた個人の遺伝子型の結果を示す。４の個人からの口腔スワブからのフィルタ結果は図の上に示される。フィルタの下の表はフィルタから読まれた遺伝子型を示す。図の下に示されるフィルタキーは、４つのミクロアッセイのそれぞれのスポットシステムを示す。
【図３０】図３０（表１）は、キャプチャプローブの配列を、配列番号ＮＯ：１から２０で表１にしたものを示す。詳細は実施例４を参照すること。
【図３１】図３１（表２）は、特定のＬ１配列、配列番号ＮＯ：２３から４６を持つ前方及び後方プライマキャプチャプローブの配列を表２に示す。詳細は実施例４を参照すること。
【図３２】図３２（表３Ａ）は、ＨＰＶＬ１遺伝子増幅するための前方プライマの配列、配列番号ＮＯ：５０から７７を配列を表３Ａに示す。詳細は実施例４を参照すること。
【図３３】図３３（表３Ｂ）は、ＨＰＶＬ１遺伝子を増幅するためのビオチン化後方プライマの配列、配列番号ＮＯ：７８から１０５を表３Ｂに示す。詳細は実施例４を参照すること。
【図３４】図３４は、Ｌ１プライマ混合物でＨＰＶ蔵づくの検証結果を示す。Ｌ１プライマ混合物の増幅対象物は、完全長ＨＰＶＬ１含有プラスミド、６、１１、１６、１８及び５２型、及び部分的ＨＰＶＬ１３５型含有プラスミドであった。ＰＣＲは、１６ｎｇＣ３３Ａ核酸のバックグラウンドでプラスミドＤＮＡの４０サイクル１０００コピーで実施された。Ｍ＝１００ｂｐＤＮＡ。詳細は実施例４を参照すること。
【図３５Ａ】図３５Ａは、連続的に希釈したＨＰＶクローンのＰＣＲを増幅の結果であって、完全長ＨＰＶ−６及びＨＰＶ−１８含有プラスミドの２倍増加量の増幅から得られた生成物を分離するために使用されたゲルの画像例を示したものであり；各レーンは、マーカー（１００ｂｐＤＮＡラダー）、ＨＰＶプラスミドの０．１２２、２４４、９７７、１９５３、３９０６、７８１３、１５６２５、３１２５０、６２５００、１２５０００コピーを示す。Ａの下の画像は、上の画像で示された当量サンプルでのグロブリンの増幅から得られた生成物の分離を示す代表的ゲルを示す。特にこれは上で示されるＨＰＶ−１６へのコンパニオンゲルである。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、完全長（６、１１、１６、１８、５２）又は部分長（３５）ＨＰＶ含有プラスミドのＰＣＲの生成物を分離するゲルの画像分析を示す。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、臨床サンプルから生成されたＨＰＶＬ１クローンのＰＣＲ生成物を分離するゲルの画像分析を示す。
【図３５Ｄ】図３５Ｄは、図３５Ａで示された曲線のそれぞれについてコンパニオングロブリンゲルの画像分析を示す。バーは、異なる数のＨＰＶ分子の存在下でグロブリン増幅の平均値と標準偏差を表す。
【図３６】図３６は、連続的希釈されたＣ３３Ａ精製核酸中でのベータグロブリンのＰＣＲの増幅の結果を示す。上部：Ｃ３３Ａ精製核酸の２倍量増加でのベータグロブリンの増幅から得られた生成物の分離に使用されたゲルの画像例を示す。Ｍ＝マーカー（１００ｂｐＤＮＡラダー）、ｎｇでの全導入核酸に対応して０、０．０２５、０．５、１、２、４、８及び１６を示す。下部：ＰＣＲの、３０（Ｎ＝４）、３５（Ｎ＝３）又は４０（Ｎ＝２）サイクルでの増幅に続いて生成物を分離するゲルの画像分析を示す。データポイントは、平均値±標準偏差である。詳細は実施例４を参照すること。
【図３７Ａ】図３７Ａは、１．６ｎｇ／μｌゲノム核酸のバックグラウンドでＨＰＶの１０コピー／μｌの増幅結果を示す。上部画像は、ＨＰＶアンプリコンのゲル画像を示し、下部画像は、対応するグロブリンアンプリコン示す。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、Ｂは、ＨＰＶの及びグロブリンアンプリコンのそれぞれの組合せのＲＤＢの結果を示す。詳細は実施例４を参照のこと。
【図３８】図３８は、臨床サンプルから精製された核酸の結果を示す。赤色バーは、２６０ｎｍ（左Ｙ軸）での吸収に基づくＤＮＡのｎｇ／μｌでの収率を示す。青色曲線は、ベータグロブリン（右Ｙ軸）のＰＣＲの増幅の生成物を分離するゲルの画像分析から得られた画素強度を示す。増幅は、精製核酸の１μｌを用いて濃度に寄らず３０サイクルで行った。両方のデータについて直線傾向ラインが示される。詳細は実施例４を参照のこと。
【図３９Ａ】図３９Ａは、診療サンプル中のゲノム等価物の推定結果を示す。ベータグロブリンの増幅が、選ばれた臨床サンプルからの希釈精製核酸を用いて実施された。標準曲線がＲＮＡのないＣ３３Ａ  ＤＮＡ  ＲＮＡ−ＤＮＡを用いて生成された。
【図３９Ｂ】図３９Ｂは、診療サンプル中のゲノム等価物の推定結果を示す。ベータグロブリンの増幅が、選ばれた診療サンプルからの希釈精製核酸を用いて実施された。図３９Ａに挿入された（後ろバー）線の式に基づいて等価「ゲノム」を計算するために画像分析が使用された。２６０ｎｍ（前バー）での吸収に基づく実際の導入核酸もまた示される。詳細は実施例４を参照のこと。
【図３９Ｃ】図３９Ｃは、診療サンプル中のゲノム等価物の推定結果を示す。ベータグロブリンの増幅が、選ばれた診療サンプルからの希釈精製核酸を用いて実施された。図３９Ａに挿入された（後ろバー）線の式に基づいて等価「ゲノム」を計算するために画像分析が使用された。２６０ｎｍ（前バー）での吸収に基づく実際の導入核酸もまた示される。詳細は実施例４を参照のこと。
【図４０】図４０（表４）は、臨床サンプルのＰＣＲ及びＲＤＢの結果をまとめたものを示す。表で示されるように、サンプルの７５％（８８／１１７）がＰＣＲ後ＨＰＶ増幅バンドを示し、ＨＰＶアンプリコンポジティブの４５％（４０／８８）がＲＤＢ上ＨＰＶ−特異的プローブでキャプチャされた。詳細は実施例４を参照のこと。
【図４１Ａ】図４１Ａは、Ｄｉｇｅｎｅシステムと実施例４で記載される実施態様を用いた、ＨＰＶ高リスクについてポジティブサンプルを比較した結果を示す。
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、Ｄｉｇｅｎｅシステムではネガティブとして読まれた６つの高リスクサンプルが、実施例４の記載された実施態様により検出されたことを示し、このことはアッセイに感度及び特異性において非常に優れていることを示す。
【図４２】図４２は、増幅の種々の目標領域に対応する強調された配列（配列番号ＮＯ：１０７から１１２）を含むＨＰＶ−１６のＬ１遺伝子の配列（配列番号ＮＯ：１０６）を示す。
【図４３Ａ】図４３Ａは、対応するグロブリン画素強度と共にＨＰＶ画素強度の増加をプロットした結果を示す。
【図４３Ｂ】図４３Ｂは、プロットされたグロブリン画素対低高リスクＨＰＶのタイプとの比を示す。
【図４３Ｃ】図４３Ｃは、プロットされたグロブリン画素対低高リスクＨＰＶのタイプとの比を示す。一連の「Ｄｉｇｅｎｅ」は、本アッセイと比較した市販Ｄｉｇｅｎｅアッセイの結果を数字で与えられる。挿入された図はＤｉｇｅｎｅアッセイ結果を示し（異なる尺度のＹを軸）、これをその後尺度を変えて主グラフに挿入されている。
【図４４】図４４は、実施例５で記載されるラテラルフローでの希薄目標のＣＡＲＤ検出から得られた結果を示す。クリプトスポリジウムパルバムからヒートショックｍＲＮＡが検出された。ＩＭＳ＝免疫磁気分離。
【図４５】図４５は、図２０で示されるかつ図２１、２２で示されるプロセスによるＣＡＲＤを用いることで、ＤＮＡが精製され、溶出され及び増幅され得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の例示的実施態様について以下詳細に記載される。以下記載の実施例はさらに添付図面において図示、説明される。ここで可能な限り同じ参照符号が図面を通じて同じ又は類似の部品について付される。
【００３６】
図１から４には、本発明による自己完結型の完全自動化、生物学的アッセイ装置１０が示される。前記装置は、ハウジングと；前記ハウジングに設けられた、制御可能な可動試薬分配システム１３を含む分配プラットフォーム１２と；前記ハウジング内に設けられた、前記分配システムと操作的に接続され、１以上の試薬の供給を保持することができる試薬供給コンポーネント１４と；ニューマチックマニホールド１５を含み、これは、流体輸送層１６と前記流体輸送層１６に付された複数の貯槽１７内の流体の輸送に作用するために操作し、前記ニューマチックマニホールド１５は前記分配プラットフォーム１２と共有される空間で前記ハウジング１１内に除去可能に設けられ、そこで、前記流体輸送層１６、貯槽１７及びそこへ導入される試験サンプルが前記分配プラットフォーム１２から空間的に離れて設けられており；ニューマチック供給システム１８を含み、ニューマチックシグナル（正圧及び負圧（真空））をニューマチックマニホールド１５を通る経路を通じて提供して、前記ニューマチックマニホールド１５上に設けられ、かつ前記分配システム１２から空間的に離れたハウジング１１内の前記ニューマチック供給システム１８と操作的に接続されて、前記流体輸送層１６及び複数の貯槽１７内の前記試験サンプルと前記試薬の輸送に作用し；及び前記ハウジング内に設けられた制御システム１９を含み、これは前記分配プラットフォーム１２、加熱システム（２９、４８及び４８ａ）、冷却システム（冷却は積極冷却でもそうでなくてもよく、前記加熱装置で前記ニューマチック供給システム１８、又はファンからの空気フローの供給により圧縮空気のジェットを向けることで達成される）及びニューマチック供給システム１８を制御するために使用される。
【００３７】
図１から４、５、６、９、１０から１３、１６及び２０を参照して、自己完結型生物学的アッセイ装置１０は前記アッセイ装置のオペレータに対して要求することは、対象となる生物学的サンプルを前記貯槽層１７上の３３ｎなどの複数のサンプル入力ポート３３（これは流体輸送層１６（膜層３０を伴い）をカバーし、かつこれらは一緒になって前記ニューマチックマニホールド１５により管理されている）に導入し、その後前記制御システム１９のスタート手順を開始させるだけでよく、これにより前記サンプルは完全にかつ自動的に前記アッセイのエンドポイントに向かってアッセイがプロセスされることとなる。図に示されるように、「６ｘ４」パターンに配置される２４の別々の例示的サンプルアッセイがあり、それぞれのサンプルはそのアッセイユニット内で他の全てのサンプルと分離され、かつプロセス手順を通じて生物学的アッセイ装置から分離されている。２４アッセイユニットが例示的実施態様には示されているが、下限は１つのアッセイであり、上限はない。
【００３８】
操作では、分析されるサンプルが貯槽層１７のサンプルインプット貯槽３３内に導入されると、サンプルは自動的にサンプルインプット貯槽から前記流体輸送層１６内へ引かれるか、試薬が流体輸送層１６により別の貯槽からサンプルインプット貯槽３３へ輸送される。サンプルを分析するために必要なプロセスステップの全てがその後、前記貯槽層１７及び／又は流体輸送層１６のいずれかの内部で実行される。これらにはオペレータの関与なしで、前記流体層１６内に設けられる適切なリアクタ（例えば図１１、１２の３１）を介する増幅、又は前記システムの空洞４４を介する流体層１６との流通が含まれる。自動的にサンプルを分析するために必要な一連のプロセスステップの全てが完了した際、前記システムは、前記試薬分配システム１３、ニューマチックマニホールド１５及びニューマチック供給システム１８から前記サンプルを分離維持する。この分離特性はクロスコンタミネーションの問題を排除する。この問題とは、プロセスの間に装置内でサンプルをステーションからステーションへ動かす必要があるか、又はミクロ流体システム内で流体の移動を伝達する分配システムを必要とする類似の作業を実施する現在のシステムのコストを必然的に上げ、かつ信頼性を下げる、というものである。
【００３９】
装置１０はハウジング１１を含み、これは操作の間システム内部を閉じるように設計されており、それにより全自動プロセスがオペレータに干渉されずに完了することを可能とする。ハウジング１１はまた、制御システム１９、分配プラットフォーム１２、試薬供給コンポーネント１４及び前記ニューマチックマニホールド１５を操作するニューマチック供給システム１８を閉じ込める。
【００４０】
図１から４はまた、試薬分配システム１３を示す。試薬分配システムは、Ｘ−Ｙ−Ｚ移動制御システムへ接続され、かつ共に分配プラットフォーム１２である。前記分配システム１３は、分配ニードル２３、大貯槽ループ２５、小貯槽ループ２６、それぞれの貯槽ループ２５、２６のためのソレノイドバルブ及びカメラ２７を含む。前記分配ニードル２３は、異なるそれぞれ選択された孔サイズを持つ長さＬの二重バレルチューブから構成されるか細長いニードル構造から構成される。前記小バレル（孔、ボア）が専用ソレノイドバルブ２４を通じて前記小貯槽ループ２６に付設され、前記大バレルが専用ソレノイドバルブ２４を通じて前記大貯槽ループ２５に付設される。異なるサイズの目的は、前記試薬分配システム１３により輸送される試薬の正確な秤量を実行するためである。前記ニードルのバレルの孔が小さいほど、試薬の少量の秤量が容易になる。図示された側面では、試薬分配ニードルの１つはボア直径がｂ１（ここで０．００３＜ｂ１＜０．０１８インチ（ｉｎ））を持ち、他の試薬分配ニードルはボア直径ｂ２（ここで０．０１５＜ｂ２＜０．０３０インチ）を持つ。
【００４１】
カメラ２７は、自己完結的生物学的アッセイ装置１０のために種々の機能を持ち得る。１つの機能は、前記分配システム１３の分配ニードル２３の位置を前記試薬供給コンポーネント１４及び前記流体輸送層１６の付設される前記貯槽層１７とに整合させ、試薬供給コンポーネント１４内の試薬が前記貯槽層１７上の適切な貯槽内に分配され得る、ことである。他の機能は、サンプル及び／又は分析情報を制御システム９に与えることである。オペレータが、特定のアッセイユニットの貯槽１７のサンプルインプットポート３３へサンプルを導入すると、前記カメラ２７は、バーコードやその他の知られた光学的マーキングなどの光学ソースから前記サンプル情報を記録することができる。サンプルから得られた情報はその後制御システム１９に適切なサンプル導入について知らせることができ、かつその後その情報は得られた結果と組み合わされることができる。識別され適切に導入されたサンプルはその後自己完結的生物学的アッセイ装置１０によりプロセスされ、最終結果が同じカメラ２７で記録される。前記情報はその後、制御システムを通じてオペレータに交信され得る。
【００４２】
前記小及び大サイズの制御ループ２５、２６は、コイル状のチューブであり、前記ソレノイドバルブ２４を介して前記二重バレル分配ニードル２３のそれらの特定のバレルに付設される。特定の試薬がアッセイによる要求されると、前記分配ニードル２３は前記Ｘ−Ｙ−Ｚ移動制御システムにより、前記試薬供給コンポーネント１４にある特定に試薬へ動かされる。前記ニードルが前記試薬容器内に挿入され、前記小又は大貯槽ループ２５、２６及び開ソレノイドバルブ２４を通じて負圧が供給される。前記特定の試薬の望ましい量が、前記試薬容器から引き出される。前記Ｘ−Ｙ−Ｚ移動制御システムはその後、前記分配システムを前記試薬が必要とされる貯槽の位置へ移送する。その後正圧を前記大又は小貯槽ループに供給し、適切なソレノイドバルブが開いて秤量された量の試薬を前記貯槽内に分配する。前記分配システム１３はその後、同じ試薬を要求する他の貯槽へ再位置され、特定の試薬を要求する貯槽の全てが供給されるまでこのプロセスが繰り返される。用いられる分配ニードル２３及び貯槽ループ２５又は２６はその後、前記分配ニードル２３と貯槽ループ２５、２６を適切な洗浄流体で繰り返しフラッシュさせることで洗浄される。前記分配システム１３はその後、前記アッセイが要求する場合、他の試薬の輸送及び供給の準備をする。
【００４３】
試薬の適切な秤量は、制御システム１９の積極的制御により達成され、試薬を引き上げるか分配するかの際に、前記貯槽ループ２５、２６への正又は負圧の供給と分配システム１３のセレニドバルブ２４の開閉のタイミングを制御システム１９による積極的制御により達成される。
【００４４】
自動的に洗浄される単一の分配ニードル２３の配置が好ましい。というのは試薬分配の他の方法では、一般的にピペッタと多数の使い捨てピペットチップが必要とされるからである。前記自己完結的生物学的アッセイ装置１０は、流体輸送層１６を用い、これはサンプルを前記貯槽層１７の前記試薬インプット貯槽から分離しており、これにより他の方法では起こり得るクロスコンタミネーションの可能性を防止する。従って、単一分配ニードルシステム２３が適用され、ピペッタシステムは必要とされない。又は、前記分配システムは、ピペッタとして構成され同様に操作されることも可能であるが、この場合は試薬供給間に分配ニードルを洗浄する代わりに使い捨てピペットが用いられる。ピペットシステムが適用される場合には、前記サンプルはまた自動的に前記ピペットによりサンプルインプットポート３３へ分配され、前記ピペットチップはクロスコンタミネーションを避けるために使い捨てられる。
【００４５】
図５から１４に種々図示されているように、前記ニューマチックマニホールド１５は、２つのサブユニット１５ａと１５ｂを含み、サブユニット１５ａは前記ニューマチック供給システム１８からニューマチック供給を受けてそのシグナルをその組み込まれたニューマチックチャンネル３２を通じて分けて前記ニューマチックシグナルをサブユニット１５ｂのニューマチックチャンネルに輸送し、それにより前記ニューマチックシグナルを前記流体輸送層の下にあるダイヤフラムへ供給し、かつ前記ニューマチックマニホールド１５は、複数のミクロ流体システム（１６、１６ａ及び１７を組合せてここではアッセイユニット、又は市販されているＣＡＲＤ（Ｒ）（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｖｉｃｅ）と参照される）と相互作用し、それぞれのＣＡＲＤが単一又は複数のアッセイ能力を有する。それぞれのＣＡＲＤはさらに、多層、モノリシック、ポリマー性、非弾性的ミクロ流体チップ（ミクロ流体輸送層）１６を含み、これは、複数のニューマチックシグナル起動ダイヤフラムバルブを含むミクロ構造の所定に構成を持つ。前記システムはさらに、分離された交換可能なニューマチックマニホールドを含み、これはそこを通じる複数のニューマチックポートと、そこに設けられるニューマチックチャンネルを含み、前記ニューマチックチャンネルは前記複数のダイヤフラムバルブと前記複数のニューマチックポートと流通接続されている。前記複数のニューマチックポートとニューマチックチャンネルは、前記流体輸送層１６上の複数のダイヤフラムバルブの前記所定の構成に特定対応して所定の構成を持つ。前記流体輸送層１６は、前記ニューマチックマニホールド１５に除去可能に接続される。前記ニューマチック供給システム１８はさらに、複数のニューマチック接続を含み、これはニューマチックシグナルを、前記複数のニューマチックポートと流通接続されるニューマチックマニホールド１５へ与える。前記複数のニューマチック接続は、前記ニューマチックマニホールド１５の前記複数のニューマチックポートの構成に対応する構成を持つ。前記ニューマチックマニホールド１５は前記ニューマチック供給システム１８に除去可能に接続される。
【００４６】
それぞれの多層、モノリシック流体輸送層１６はさらに、ポリマー性、非エラストマー基板１６ａを含み、これはそこに設けられた複数の流体チャンネル３９を持ち、それぞれの流体チャンネル３９は入口端部と出口端部を持ち、かつ少なくとも１つの双方向ダイヤフラムポンプを持ち、これは少なくとも３つの非エラストマー膜系バルブ構造を含み、これらは単一の非エラストマー、ポリマー性膜層３０から構成される。種々の側面で、それぞれの流体輸送層１６は、組み込まれたまたはコンポーネントである貯槽層１７を含み、これはサンプルを保持することができる少なくとも１つのサンプルインプット貯槽３３を含み、かつ試薬物質を保持することができる少なくとも１つの試薬貯槽（３４）を含み得る。
【００４７】
貯槽層１７及びそれが付された流体輸送層１６（輸送層基板１６ａを含む）は、前記ニューマチックマニホールド１５上に除去可能に設けられており、分析が終了した際に、前記貯槽層１７と流体輸送層１６の組み合わせは除去され、貯槽層１７と流体輸送層１６の異なる組み合わせ（未使用又は洗浄されて再使用されるかいずれかの）と交換され得る。前記ニューマチックマニホールド１５はまた、前記ハウジング内のニューマチック供給システム１８上に除去可能に設けられる。前記ニューマチックマニホールド１５はまた、その後、他のニューマチックマニホールド１５と交換され得る。他のニューマチックマニホールド１５は、他のアッセイのため、又は特定のアッセイの多いか少ないアッセイユニット数のために設計された他の貯槽層１７と流体輸送層１６の組合せに相補的なものである。
【００４８】
図７、１４Ｃ、１５Ａ、１５Ｂ、１８及び１９に示されるように、ニューマチックマニホールド１５は、例えば前記増幅／反応リアクタ３１及び／又は他の貯槽やチャンネルを加熱するために使用される多目的及び／又は特定目的ヒータ（２９、４８及び４８ａ）を含み得る。図２３での分解図で示されるように非限定的側面において、多目的ヒータ２３０１はラミネート化銅／アルミニウム構造２３０３の形であってよく、これはバネ負荷電気接触ピン２３０５上に設けられ、これは抵抗２３０７へ電気的接触を提供し、熱を生成しこの熱が前記ラミネートされたヒータ本体を通じて伝動される。前記接触ピンはまた、前記ヒータを変調するために使用される温度検出装置２３０９に接続を提供する。前記バネ負荷電気接触はまた、前記ヒータ表面と加熱される対象物との間に均一な接触を提供する。前記ラミネートされたヒーター装置は、市販品を利用できる金属コア（ラミネートされる銅／アルミニウム；例えば熱伝導性ＰＣＢ基板、Ｌａｉｒｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｈｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、ＭＯ）ボードであり得る。前記金属コアボードは、優れた熱伝導性を与え、さらに前記回路レイアウトに組み込まれている温度センサコンポーネントを用いて優れた温度均一性を与える。ミクロ流体システムの１つの大きな問題は、加熱領域における温度を正確に測定することができる、ということである。ポゴ接触ピン（例えばＳｐｒｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＫＳ）は、電気的及び機械的インタフェースを提供する。前記流体輸送相１６は、前記ニューマチックポート及び前記ヒータ２９、４８及び４８ａと相互操作する。前記流体相１６上に設けられる前記ダイヤフラムポンプは前記ニューマチック供給システム１８からニューマチック又へ供給される正又は負のニューマチック圧力により操作され、前記サンプル及び／又は試薬は流体輸送相１６に引かれそこへ移送されて種々のプロセスステップ及び分析ステップを実行する。これらのステップには、貯槽相１７、増幅リアクタ３１及びその他のヒータ２９、４８及び４８ａ、及び前記ニューマチックマニホールド１５上に設けられる磁石４９などのコンポーネントが関与する。前記プロセスを通じて、前記サンプル及び前記流体輸送層１６、貯槽層１７又は増幅リアクタ３１で実施される全ての中間的な反応が、それらの特定のアッセイユニットにおいてその他のアッセイユニットから分離されている。かかる分離は、前記サンプルと他の全てのアッセイユニット、試薬分配システム１３、ニューマチックマニホールド１５又はニューマチック供給システム１８の又はからのクロスコンタミネーションを防止し、それにより優れた分析信頼性を与え、かつ操作費用を抑えることができる。というのはシステムの洗浄の必要性が大きく低減されるからである。前記ニューマチック供給システム１８はニューマチックシグナル（正又は負圧）を与える機能を有し、このシグナルは前記ニューマチックマニホールド１５を通じて前記流体輸送層１６内の試験サンプル及び試薬の輸送に影響を与える。その操作は前記分配プラットフォーム１２で調整され、試薬が特定の又は共通の貯槽層１７へ、前記分配システム１３による試薬供給コンポーネント１４から輸送されて、適切なプロセス手順が起こることとなる。前記ニューマチックマニホールド１５は、加熱、冷却（ヒーターでニューマチック供給システム１８から、積極的冷却されたものか又はそうでない圧縮空気のジェットを直接向けること、又はファンからの空気フローを供給することで達成される）又は磁気を適用して反応を行わせる領域を含み得る。前記ニューマチック供給システム１８は、前記ハウジング１１内に前記ニューマチックマニホールド１５と操作的に接続されて設けられ、前記分配プラットフォーム１２及び前記分配プラットフォーム１２を制御するために使用される制御装置１９、前記ニューマチック供給システム１８、及び全ての加熱、冷却（ヒーターでニューマチック供給システム１８から、積極的冷却されたものか又はそうでない圧縮空気のジェットを直接向けること、又はファンからの空気フローを供給することで達成される）又は前記流体輸送層１６、貯槽層１７又は増幅リアクタ３１で起こる前記ニューマチックマニホールド１５反応により実施される磁気から空間的に分離される。
【００４９】
図４は自己完結的生物学的アッセイ装置１０の斜視図であり、前記ニューマチックマニホールドシステム１５の下にあるニューマチック供給システム１８の位置をより明瞭に示す。前記ニューマチックシグナルを８は前記ハウジング１１の下部分内に位置される。前記ニューマチックマニホールド１５は前記ニューマチック供給システム１８に除去可能に付設され、前記流体輸送層１６の異なる設計が必要なアッセイについて前記自己完結的生物学的アッセイ装置１０を容易に再構成することを可能とする。前記ニューマチックシステム１８はいくつかのサブコンポーネントを含み、前記制御システム１９からの指示で、ニューマチックマニホールド１５を通じてアッセユニットの前記流体輸送層１６に位置するダイヤフラムを操作するために、ニューマチック圧を貯蔵、秤量及び配送するように設計されている。正圧及び負圧が、正圧及び負圧圧力制御装置２０を通じて前記正圧及び負圧貯蔵貯槽２１に供給される。正圧及び負圧は次に秤量され、ニューマチックマニホールド１５のチャンネルへ、前記正圧及び負圧貯蔵貯槽２１からニューマチック供給ソレノイド２２（前記ニューマチック供給ソレノイド２２からニューマチックマニホールド１５の下部へ導くチューブは明瞭には示されていない（前記構成はまた、前記ニューマチック供給システム及びニューマチックマニホールド１５の間にチューブレス半導体インタフェースを含ませることでチューブを用いない構成が可能である））を通じて供給される。前記圧力測定及びソレノイドの開閉は制御装置１９で制御され、前記測定・秤量されたニューマチック力をニューマチックマニホールド１５へ供給し、それにより前記流体輸送層１６に設けられたダイヤフラムポンプを操作する。
【００５０】
図５は、貯槽の「６ｘ４」配置を示す６つのＣＡＲＤアレイを示し、４つのアッセイユニットＣＡＲＤは前記ニューマチックマニホールド１５上に除去可能に設けられる。操作では、前記貯槽層１７は膜（図示されていない）でカバーされて隣接するアッセイユニットでプロセスされるサンプルによるクロスコンタミネーションの可能性から内容物を保護し、前記貯槽１７の内容物が分配プラットフォーム１２、ニューマチックマニホールド１５、ニューマチック供給システム１８、制御装置１９又はハウジング１１を汚染することを防止する。
【００５１】
図６はさらに、「６ｘ４」ＣＡＲＤ配置を示し、これはニューマチックマニホールド１５の流体輸送層１６へ除去可能に付設されている。
【００５２】
図７は、前記流体輸送層１６及びニューマチックマニホールド１５の間の境界の正面図である。ガスケット２８が、ニューマチックマニホールド１５の上部に付設され、流体輸送層１６の前記膜層（図１５Ｂ）に供給されるニューマチック力を分離するように設計される。それぞれのガスケットボイド内の端部は、ニューマチック供給システム１８からニューマチックマニホールド１５を通じて経路付けされるチャンネルである。流体輸送層１６が前記ガスケット２８の上部に設けられると、流体輸送層１６の前記膜層３０の結合されていない部分は、従って、ニューマチックマニホールド１５を通じてニューマチック供給システム１８から及び制御システム１９による制御されて供給される正圧及び／又は負圧によって、前記ガスケットボイドの内へ又は外へ自由に曲げられることとなる。制御システム１９は、正圧又は負圧を順に選択された位置へ供給することができ、これによりダイヤフラムポンプシステムを形成する。これについては米国特許番号第７、８３２、４２９に記載されている。このような適切なシステムを用いることで、前記ニューマチックマニホールド供給システム１８及びニューマチックマニホールド１５は、流体輸送層１６を通じて輸送される流体から分離維持され、このことはアッセイユニット間及びニューマチック供給システム１８とニューマチックマニホールド１５間のクロスコンタミネーションを防止するものである。
【００５３】
前記の通り、ヒーター２９はニューマチックマニホールド１５内に位置され、増幅リアクタ３１が、前記ＣＡＲＤがニューマチックマニホールド１５上に位置されると適合されることとなる。サンプルのプロセスの間の適切な時間に、増幅リアクタ３１は適切な試薬と、貯槽層１７の種々の貯槽から流体輸送層１６を通じて輸送されたプロセスされたサンプルで満たされる。増幅反応の内容物はその後、制御装置１９からの指示を通じて制御された方法で加熱されかつ冷却される（ヒーターでニューマチック供給システム１８から、積極的冷却されたものか又はそうでない圧縮空気のジェットを直接向けること、又はファンからの空気フローを供給することで達成される）。
【００５４】
図８Ａは、自己完結的生物学的アッセイ装置１０のニューマチックマニホールド１５の「６ｘ４」配置の前記層１５ａの斜視図である。前記オリフィスを通じて、前記ニューマチックシグナルがニューマチックマニホールド１５のより高い層１５ｂ及び前記ヒーターが設けられるベイへ経路付される。
【００５５】
図８Ｂは、自己完結的生物学的アッセイ装置１０のニューマチックマニホールド１５ａの「６ｘ４」配置の層状化された正面図である。ニューマチックシグナルが通じるニューマチックマニホールド１５の底部のオリフィスから経路付けされたチャンネル３２は、ニューマチック供給システム１８及び図８Ａで示される前記層のオリフィスを形成する。
【００５６】
図８Ｃは、自己完結的生物学的アッセイ装置１０のニューマチックマニホールド１５の「６ｘ４」配置の斜視底面図である。図４で示されるニューマチックソレノイド２２及び圧貯蔵貯槽２１はニューマチック圧又は真空を前記ニューマチックマニホールド１５の底部に位置されるオリフィスへ供給する。前記圧貯蔵貯槽２１は、ニューマチックマニホールド１５に形成された図８Ｂに示されるニューマチックチャンネル３２へ秤量された正及び負圧を供給する。前記制御装置１９がニューマチック供給ソレノイド２２を開くと、ニューマチックチャンネル３２は、圧貯蔵貯槽２１が特定のニューマチック供給ソレノイド２２に接続され前記制御装置１９により開かれているか閉じられているかに依存して、秤量された負圧か秤量された正圧が供給される。前記圧の秤量は、貯蔵貯槽２１の圧力調節、ニューマチック供給ソレノイド２２の開閉調節又は制御装置１９の管理の下でこれらの両方を組み合わせる方法で達成される。前記チャンネルへ供給された圧はその後流体輸送層１６を、ニューマチックマニホールド１５の前記ガスケットインタフェース２８を通じて操作する。
【００５７】
図９は、流体輸送層１６の流体チャンネル３９及び増幅リアクタ３１を含む「４アッセイ」ＣＡＲＤの層状化された正面図である。図はサンプルインプット貯槽３３、共通の調製および精製試薬貯槽３４、廃棄貯槽３５、及びシリカフィルタ保持リング３６ａを含むシリカフィルタ貯槽３６を示し、前記シリカフィルタ保持リング３６ａは、シリカフィルタ３６ｂ（明瞭に図示されていない）をＣＡＲＤの単一アッセイ部分の調製及び精製領域に保持する。また、溶出貯槽３７（左及び右）、増幅マスタ混合物貯槽３８（左及び右）及び前記流体輸送層１６の下部に付設され空洞４４を通じてアクセスされる増幅リアクタ３１（左及び右）が示される。また、共通の試薬インプット貯槽４０、分析貯槽４１、及び廃棄貯槽４２と穴付きリングシステム４３が示されており、前記穴付きリングシステム４３は、４アッセイユニットＣＡＲＤの単一アッセイユニットの分析部の分析膜４３（明瞭には図示されていない）を保持するために使用される。
【００５８】
図１０Ａから１０Ｋは、前記装置をサンプルをプロセスし分析するために使用する方法の、１つの非限定的な例示を一般的に示す。ここでは、単一アッセイユニットの説明がなされるが、サンプルが前記自己完結的生物学的アッセイ装置１０に与えられる際には並行的に又は順序的にサンプルをプロセスすることができるアッセユニット数に特に上限はない。ここのサンプルがプロセスされる順は、前記制御装置１９がニューマチック供給システム１８及びニューマチックマニホールド１５の特定に構成を管理する能力、及び試薬供給コンポーネント１４により供給され、分配システム１３により輸送される特定の試薬に基づく。特に、特定のアッセイは、前記ニューマチックマニホールド１５と作用する貯槽層１７及びそれに適合する流体輸送層１６の設計を必要とする。適合する全ての要素が組み合わされると、前記プロセスは一般には次のように進行する。
【００５９】
図１０Ａで、サンプルはサンプルインプット貯槽３３内に導入され、分配システム１３が共通貯槽３４内に細胞溶解試薬を導入する。細胞溶解試薬はその後サンプルインプット貯槽３３へポンプされ、前記アッセイによる必要な場合には緩やかな撹拌を伴うか、又は伴わずにインキュベートされる。この撹拌は共継続中の出願Ｓ／Ｎ  １２／２４９、８７２で「フラフィング」（即ち、貯槽層に流体をダイヤフラムにより引いたり出したり交互にアクセスさせて乱流を生じさせて混合する）として記載されている。前記サンプルがサンプルインプット貯槽３３内でインキュベートされる間、有機アルコール（例えばエタノール）が分配システム１３により共有貯槽３４に分配されサンプルインプット貯槽３３へポンプされさらにサンプルインプット貯槽３３の容量を増加させ；より多い混合物のインキュベートを続ける。インキュベーション期間の終了で、サンプルインプット貯槽３３の内容物がシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプされ、シリカフィルタ３６ｂを通じて吸引され、前記内容物は廃棄貯槽３５へポンプされる。
【００６０】
図１０Ｂで、有機アルコール（例えばエタノール）が共通貯槽３４内に分配され、シリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上位にポンプされ、シリカフィルタを通じて吸引され、廃棄貯槽３５へポンプされる。洗浄緩衝液を共通貯槽３４に分配し、シリカフィルタ貯槽３６のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプし、シリカフィルタ３６ｂを通じて吸引して廃棄貯槽３５へポンプする。同じ又は異なる洗浄緩衝液を共通貯槽３４へ分配し、シリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプし、シリカフィルタ３６ｂを通じて吸引し、廃棄貯槽へポンプする。
【００６１】
図１０Ｃで、溶出緩衝液がその後共通貯槽３４へポンプされ、廃棄貯槽３５へ直接ポンプされ、残留溶出物、有機アルコール及び洗浄緩衝液を洗浄する。新たな溶出緩衝液を共通貯槽３４に分配しシリカフィルタ貯槽３６のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプし、前記貯槽を洗浄し、その後前記シリカフィルタ３６ｂの上部から廃棄貯槽３５へポンプされる。
【００６２】
図１０Ｄでは、溶出緩衝液がその後溶出貯槽３７（右）へ分配され、シリカフィルタ３６ｂの底部を通じて貯槽３６へポンプアップされる。
【００６３】
図１０Ｅでは、増幅マスタ混合物がその後増幅マスタ混合物貯槽３８（左及び右）に分配される。シリカフィルタ貯槽３６の最初の容量が溶出貯槽３７（右）内にポンプされ、その後一回ポンプの材料がシリカフィルタ貯槽３６から増幅マスタ混合物貯槽３８（右）へポンプされる。増幅マスタ混合物貯槽３８（右）の内容物はその後増幅リアクタ３１（右）に入れて空にされる。同じプロセスが左側で繰り返される。その後増幅リアクタ３１（左及び右）の内容物は、特定のアッセイプロセスのプロトコルにより、制御装置１９の制御の下で熱サイクルされる。
【００６４】
次の図１０Ｆでは、熱サイクルに続いて、前ハイブリダイズ緩衝液が共通試薬貯槽４０に分配され、増幅リアクタ３１（右）へポンプされ、その後前ハイブリダイズ緩衝液を増幅リアクタ（左）へ繰り返しポンプされる。増幅リアクタの温度はその後上げられて初めの熱サイクルで生成されたアンプリコンを変性させる。
【００６５】
図１０Ｇでは、前記アンプリコンを変性する間、前記初めの熱サイクルから生成されたアンプリコンと適切にハイブリダイズさせるために分析膜上にミクロアレイを調製するために、同じ又はその他の前ハイブリダイズ緩衝液を共通し約貯槽４０に分配し、それを分析貯槽４１内に保持された分析膜４７（明瞭には図示されていない）上にポンプし、その後それを廃棄貯槽４２へポンプし；洗浄緩衝液を共通試薬貯槽４０へ分配し、それを分析貯槽４１内の分析膜４７上にポンプし、かつ廃棄貯槽４２へポンプする（数回これを繰り返す）。
【００６６】
図１０Ｈでは、同じか、又は他の前ハイブリダイズ緩衝液が共通貯槽４０に分配され、そこから増幅リアクタ３１（左及び右）及び分析貯槽４１内の分析膜４７の上部へ分配される。
【００６７】
図１０Ｉでは、増幅リアクタ３１（左及び右）の内容物は分析貯槽４７内に分析膜４７の上部にポンプされ、数回循環させて、前記アンプリコンと分析膜４７に付けられたターゲットとの十分な接触を与える。望ましいハイブリダイズが生じたなら、前記内容物を廃棄貯槽４２へポンプする。洗浄緩衝液を共通試薬貯槽４０へ分配し、分析貯槽４１内に保持された分析膜上部にポンプされ、その後廃棄貯槽４２へポンプされる（数回繰り返される）。
【００６８】
次に図１０Ｊので、適切なアンプリコン可視化試薬（例えばホースラディッシュパーオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）を共通試薬貯槽４０内に分配し、これを分析貯槽４１内に保持された分析膜４７の上部にポンプし、反応が十分完了するまで循環させ；その後内容物を廃棄貯槽４２へポンプする。洗浄緩衝液を共通貯槽４０へ分配し、それを分析貯槽４１内に保持される分析膜４７の上部にポンプし、廃棄貯槽４２へポンプする（数回繰り返す）。
【００６９】
図１０Ｋでは、可視化試薬（例えばテトラメチルベンジジン「ＴＭＢ」）を共通試薬貯槽４０に分配し、それを分析貯槽４１内に保持される分析膜４７の上部にポンプし；前記のように試薬との反応を完了するように循環させ、その後内容物廃棄貯槽４２へポンプする。洗浄緩衝液を共通試薬貯槽４０へ分配し、これを分析貯槽４１内に保持される分析膜４７の上部へポンプし、廃棄貯槽４２へポンプする（数回繰り返す）。最後に、分析貯槽４１内に保持される分析膜４７の上で分配システム１３にカメラ２７を配置して前記画像を記録する。画像データはその後制御装置１９で処理され、その結果はオペレータに交信される。
【００７０】
図１１は、貯槽層１７を含むＣＡＲＤの「４アッセイ」構成の斜視図であり、前記流体輸送層１６は前記膜層（非エラストマー膜又はダイヤフラム）３０を含み、かつ前記増幅リアクタ３１の１つをその付設システム４５、４６とともに持ち、分析貯槽４１中の分析膜４７を保持するために使用される孔付き保持リング４３とを含む。より具体的には、それぞれの例示「４」ＣＡＲＤは４つのミクロアレイ分析貯槽４１（図９、１１）を持ち、これはそこに除去可能に設けられるミクロ分析膜４７を含む。例示的分析膜４７は、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又は知られている全ての他の適切な材料からなる。分析貯槽４１は前記貯槽の底部に支持プラットフォーム又は前記底部回りにその内側境界回りに伸びる棚部又は肩部を持つ。孔付きの、区分け又はインデントされた保護リングは、前記膜を分析チャンバ内に確保するために使用され得る。図１３はＢは、例示的穴付き保護リング４３を示し、流体を前記膜の境界にわたる分析貯槽内から前記貯槽の底部へ及びその外へ輸送するチャンネル１７０８を含む。１つの側面で、２つの保護リング４３は膜４７をその間にサンドイッチするために使用され得る。又は図示されるように前記膜よりもやや小さいが前記穴付きリング４３の内部直径よりは小さくない支持プラットフォームが前記膜を保持するために使用される。
【００７１】
図１２は貯槽層１７、チャンネル３９の結合する膜層３０を含む流体輸送層１６、及び増幅リアクタを満たしかつ空にするために用いられる空洞４４を持つ１つの増幅リアクタ３１を含む、「アッセイユニット」の斜視図である。
【００７２】
ＰＣＲ反応の間、例えば水溶液が約３０℃の低温から約５０℃の高温へ繰り返し（２０から５０回）サイクルされる。例えば前記バルク溶液上にチューブ側での、水溶液が蒸発又は濃縮による容量の損失を避けるために、溶液の曝露表面をシールすることが有利であり、それによりシールされていない環境からの反応濃縮で十分な容量の不足や変化により反応を失敗することはない。
【００７３】
制御できない蒸発や濃縮を避けるために、ワックス、シリコーン、ミネラルオイル、又はその他の材料が通常は溶液の表面に導入され蒸発を防止するが、これらの材料の使用は次の欠点を持つ。例えばミネラルオイルが室温では液体であり、それによりいくつかの自動システムにとっては取り扱い上の問題を生じる。ワックスは室温では固体であり、自動システムにとってはその融点が非常に制御可能であるが、ワックスはより望ましい複雑なＰＣＲ反応を阻害する。シリコーンは、ミネラルイオル同様に室温では液体であり、同様の取扱い上の問題を持つが、ＰＣＲ反応を阻害はしない。
【００７４】
自動ＰＣＲ反応をシステムのために、特に有利なことは、ＰＣＲ反応チューブ（例えば図１１、１２の３１）が満たされると自動的に溶液をカバーすることができる材料を含むことである。例えば高純度シリコーンオイルで添加物として少量のワックス（数％）を含む制御可能な混合物が使用され得る。１つの例示的側面で、前記混合物はワックス＝１％から２０％及びシリコーンオイル＝９９％から８０％である。１つの側面により、前記混合物は約５％ワックスと９５％シリコーンオイルである。前記ワックスは標準ＰＣＲワックスであり得る（例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  パラフィンワックス、融点５８−６２℃）。前記混合物は室温及び予想貯蔵温度では固体である。前記混合物は、前記ＰＣＲチューブ（３１）の上部内側表面、前記チューブの開口部の直下及び前記空洞４４の底部開口部の上に、材料の層として設けられる。検体がチューブに導入された後最初の熱サイクルで温度上昇が実行されると、前記混合物は融解して溶液の表面をカバーして蒸発を防止し、同時に前記反応を阻害もしない。反応が完了した際、反応物が前記シールの下から前記空洞（４４、図１２）を通じて、前記増幅リアクタでの温度を前記混合物の融点以下に低減させる前又は後のいずれかで、除去され得る。１つの側面で、前記混合物は、冷却されて前記溶液及び空洞４４の上をカバーする固体キャップの形成させ、溶液を前記固化された層の下から引き出すことを可能とする。
【００７５】
図１３Ａは「４アッセイユニット」ＣＡＲＤの分解図であり、貯槽層１７、膜層３０を含む流体輸送層１６及び増幅リアクタ３１を含み、前記増幅リアクタは増幅リアクタを満たしかつ空にするために使用される空洞４４を含む。図はまた、シリカフィルタ保持具３６ａ、シリカフィルタ貯槽３６のためのシリカフィルタ３６ｂ及び前記分析チャンバ内の分析膜４７を保持するために使用される穴付き保護リング４３を含む。
【００７６】
図１４ＡからＤは、貯槽層１７及びそこに付設される流体輸送層１６の分析領域の１部分の他の変更配置を示す。前記変更配置は、分析貯槽４１内の分析膜４７上で循環しているアンプリコンと前記ターゲット分子との接触を改善するために、前記分析膜４７をカバーするために使用される。前記カバーは、分析貯槽４１から逃げる空気の泡を逃げすように通気される。前記配置はまた、上で説明された穴付きリング構成で使用されるステップ又はプラットフォームを省くことで分析貯槽４１の効果的な加熱を可能とする。前記変更配置では、分析膜は直接膜層３０上に位置され、これは加熱素子４８ａ上に直接曝露される。分析反応の間に適用される熱はしばしば、アッセイで重要なステップであり得る。前記カバーされたシステムはまた、前記分析貯槽に供給しかつ空にするチャンネルにつき異なる配置を可能とする。前記変更配置において、前記膜は前記貯槽のまさに底部上にあることから、前記流体は交代パターンで前記膜４７の上部が洗われ得る。前記貯槽の底部を構成する前記膜層上に前記膜を保持維持するために、図１４Ｂで示されるように分析貯槽４部分の基板層１６ａでオーバーハングが形成され、チャンネル開口部が前記分析貯槽４１のそれぞれの端部でのオーバーハングの下に形成される。前記分析貯槽４１はまた、前記チャンネル開口部をそれぞれに組み合わせる幅よりも長く形成され、前記分析膜の長さにわたり効果的なフローを可能とし、かつさらに前記カバーと組み合わせて前記流体と前記分析膜の表面との接触を改善し、それにより前記流体中のアンプリコンが前記分析膜へ付されているそれらのターゲットとより効果的にハイブリダイズすることを可能とする。前記配置はさらに、前記流体が前記膜上を通過する方向を、前記流体輸送層１６のポンプ及びチャンネルを用いて時計回りその後反時計回りに循環させることで、交互に変化させることができることで改善される。図１４Ｃは、図１４Ａ及び１４Ｂに記載される分析ユニットの前記変更配置に対応する他のニューマチックマニホールド１５及びガスケット層２８を示す。分析貯槽４１の下のニューマチックマニホールド１５に位置される第２のヒーター４８ａに留意すべきである。図１４Ｄは、はニューマチックマニホールド１５ｂの前記内部ニューマチックチャンネル３２を示し、どのようにして前記ニューマチック供給システム１８から前記底部層内に導入されたニューマチックシグナルがさらに分割されて前記１５ｂの表面上のガスケット層２８ボイドに到達するかを示す。
【００７７】
図１５Ａからは、ニューマチックマニホールド１５の例示的単一アッセイユニットの分解斜視図であり、ニューマチック的に起動される磁石アセンブリ５１及びそれに接続される調製、増幅及び分析反応に必要な多目的ヒーター４８を含む。前記図はまた、選択的なダイヤフラム層５３を、前記流体輸送層１６及びニューマチックマニホールド１５との間のインタフェースのために含む。図示されたシステムは、「数上げ」（例えば「４ＣＡＲＤ（Ｒ）」）され、制御装置１９による指示として平行又はランダム順序で多重アッセイユニットを操作するためにニューマチック供給システム１８へ付設される。図示されたシステムは、特定のアッセイにより、アッセイの際に必要とされる鉄、磁石又は常磁性粒子を操作するために必要とされる磁場の使用を提供する。実際に、必要とされる粒子は貯槽層１７の特定の貯槽内に、分配システム１３により導入され、かつ前記アッセイにあるステップでサンプルと混合される。又は、前記粒子は、サンプルインプット貯槽３３内に負荷する前のサンプルに含まれ得る。又は前記粒子は、前記流体輸送層１６又は貯槽層１７を製造する際に貯槽又はチャンネル内に前負荷され得る。
【００７８】
混合物中で前記粒子を含むサンプルは、ニューマチックピストンアセンブリ（又はピストンアセンブリはモーター又は電磁石駆動であり得る）５１にわたり位置される貯槽又はチャンネルに前負荷され得る。又はサンプル／粒子混合物はニューマチックピストンアセンブリ（又はピストンアセンブリはモーター又は電磁石駆動であり得る）５１にわたる貯槽又はチャンネルへポンプされ得る。いずれの場合でも、前記ニューマチックピストンアセンブリ（又はピストンアセンブリはモーター又は電磁石駆動であり得る）５１にわたる前記貯槽又はチャンネルは磁石４９の対象とされ、前記磁石は前記ニューマチックピストンアセンブリ（又はピストンアセンブリはモーター又は電磁石駆動であり得る）５１のピストンロッド５２の端部に固定された磁石ホルダ（保持装置）５０に、前記ニューマチックピストンアセンブリ（又はピストンアセンブリはモーター又は電磁石駆動であり得る）５１へ正圧を与えることで位置され、その後前記磁石を加熱された貯槽５５又は非加熱貯槽５６又はサンプル／粒子混合物をふくむチャンネルの直下に方向づける。磁気を前記サンプル／粒子混合物の場所に作用させて、前記アッセイは、粒子アッセイの要求を実行するために前記粒子の磁性を利用する。例えば前記粒子を特定の生物学的材料の濃縮ステップのために使用する、又は本技術分野で知られた他の共通粒子依存アッセイステップのために使用する。
【００７９】
それに代えて又はそれと組み合わせて、ニューマチック的に起動される磁石システム５１は、ニューマチックマニホールド１５の領域内に導入され、進行中の粒子及びサンプルが磁気作用と関連付けて加熱作用を受け得る。かかる場合の例は、前記粒子を大量のサンプル容量から有機体を濃縮するための使用である。有機体が捕捉される際に生きている場合にはその後、それが死んでいる場合には発現されないか、され得ないＲＮＡを加熱事象の対象として有機体にＲＮＡを発現させる。加熱の後、磁場を前記ニューマチックピストンアセンブリ（又はピストンアセンブリはモーター又は電磁石駆動であり得る）５１を負圧の対象とすることで除去し、それにより磁石４９を加熱磁石貯槽５５の下の位置から引き出し、前記有機体からＲＮＡを抽出するために前記粒子と濃縮サンプルをふくむ溶液を前記有機体と共に他の位置へポンプし、及びさらに前記抽出されたＲＮＡを増幅し得られるアンプリコンを上で説明されたプロセスに従う方法で分析する。
【００８０】
図１５Ａはまた、分析前にアンプリコンを変性するため、ラベル化反応インキュベーションするため、又はその他の特定の反応のプロセスを改善するために、前記増幅リアクタ３１から分離された貯槽５４での加熱を提供する機会を示す。図はまた、増幅リアクタを配置する他の方法を示す。この図は前記のチューブ内の増幅リアクタ及び空洞４４は設けられていないが、かかるチューブと空洞４４配置が前記のニューマチックピストンアセンブリ５１と共に使用できないという理由はない。図示されるように、ニューマチックマニホールド１５と流体輸送層１６の間のインタフェースは、場合により前記ガスケット層２８でのダイヤフラム層５３を含む。前記ダイヤフラム層は、前記膜層３０に分離された空間を設けることで、負圧が前記膜層３０の非結合領域に、制御装置１９の指示下でニューマチック供給システム１８へ付設されたニューマチックマニホールド１５のニューマチックチャンネル３２を通じて経路付けられたニューマチックシグナルからニューマチックマニホールド１５により適用される場合に偏向させる機能と同じ機能を奏する。
【００８１】
図１５Ｂは、ダイヤフラム層がないが図１５Ａと同じ要素が図示されている。従って、ガスケット層２８は、図７で記載のような機能を奏し、かつ流体輸送層１６は前記ニューマチックマニホールド１５と直接相互作用（インタフェース）する。ダイヤフラムのない配置は、ダイヤフラムのない場合には製造及び材料のコストが節約できかつシステムのアッセイ機能の点では大きな違いがない、という利点を持つ。
【００８２】
図１６は、希薄なターゲットであり、非生育又は生育可能な水性有機体の改善された迅速検出のための単一アッセイを示す斜視図であり、ニューマチック的に起動される磁石５１と多重加熱反応サイトを、前記システムにより適用される貯槽及びチャンネルとともに含む機能的構成を示す。特に、前記システムは、ニューマチックマニホールド１５がどのように、前記流体輸送相１６とそれが付される貯槽相１７との組合せで構成され、加熱がアッセイの異なるステップで提供され得ることを示す。具体的な場合において、加熱は、加熱磁石分離／濃縮／反応貯槽５５（磁気はまた、貯槽５５内の加熱と関連させて望ましいように選択的に適用され得る）での調製ステップで適用され得る。選択的な加熱に続いて、前記サンプルは前記流体輸送層１６を通じてアッセイにさらなる調製ステップに輸送される。アッセにより要求されるようにＤＮＡ又はＲＮＡの抽出に続いて、前記抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡはその後前記増幅マスタ混合物と混合され、前記流体輸送層１６を通じて前記増幅リアクタ３１へ輸送される。図１６に示されるように、前記リアクタは前記流体輸送層１６の面内に置かれる。しかしながらこれはまた、前記流体輸送層１６の面から出た図１１、１２及び１３のように構成されたリアクタを用いることも可能である。前記アンプリコンが増幅リアクタ３１内で生成された後、それらは前記加熱分析リアクタ５４に輸送され、そこでそれらは変性及び／又はラベル化、又は加熱を必要とされる組合せのために加熱される。前記アンプリコンはその後前記アッセイを完了するために前記分析貯槽４１（これもまた加熱のための構成がされ得る）へ輸送される。
【００８３】
図１７ＡからＯはさらに、以下説明する例示的分析プロセスを示す。
【００８４】
図１７Ａに示されるように、サンプルを貯槽３３／５５内に入れ、緩衝液とビーズを貯槽３３／５５内に分配し、貯槽３３／５５に隣接する大型ダイヤフラムを用いてフラフィングによりゆっくりと撹拌しながらインキュベートされる。前記アッセイのために温度及びインキュベーション時間が選択される。磁石４９を貯槽３３／５５の下に上げ、その後内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。
【００８５】
図１７Ｂに示されるように、磁石４９を貯槽３３／５５の下の位置から下げて外し、洗浄緩衝液を共通貯槽３４内に分配し（洗浄緩衝液１）、かつ共通貯槽３４からの洗浄緩衝液（洗浄緩衝液１）を貯槽３３／５５へビーズを再懸濁させるためにポンプする。上のようにゆっくりとフラフィングにより撹拌し、その後磁石を貯槽の下に上げて位置させ、内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。
【００８６】
図１７Ｃに示されるように、多重目的ヒーター４８を適切なインキュベーション温度（特定のアッセイで要求される場合に）を設定し、適切なインキュベーションの後、磁石４９を貯槽３３／５５の下の位置から下げて外し；先行緩衝液を貯槽３７／５６内に分配しかつそれを前記ビーズを再懸濁させるために貯槽３３／５５へポンプし、ゆっくりと撹拌し、かつ多目的ヒーターを適切なインキュベーション温度と時間（具体的なアッセイで必要とされるように）に設定し；溶解緩衝液を共通貯槽３４（溶解緩衝液）へ分配し、それを貯槽３３／５５へポンプし、上のようにフラフィングにより撹拌し、前記具体的なアッセイで要求されるように加熱し；有機アルコール（例えばエタノール）を共通試薬貯槽３４（エタノール）へ分配し、それを貯槽３３／５５へポンプして上のようにフラフィングにより撹拌し、前記具体的なアッセイで必要とされる加熱をする。
【００８７】
図１７Ｄで示されるように、貯槽３３／５５の内容物をシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプする。
【００８８】
図１７Ｅで示されるように、前記シリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂを通じてシリカフィルタ３６の内容物を吸引し、それを廃棄貯槽３５にポンプし、続いて（場合により）真空ポート５９を開く事で前記フィルタを通って空気を吸引する。
【００８９】
図１７Ｆに示されるように、有機アルコール（例えばエタノール）を共通貯槽３４（エタノール）に分配し、それをシリカフィルタ貯槽３６にポンプしてシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部に置き；その後図１７Ｅに記載されるステップを繰り返す。
【００９０】
図１７Ｇに示されるように、同じか又は別の洗浄緩衝液を共有貯槽３４内に分配し（洗浄緩衝液２）、それをシリカフィルタ貯槽３６にポンプしてシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部に置き；その後図１７Ｅに示されるステップを繰り返す。
【００９１】
図１７Ｈに示されるように、同じか又は別の洗浄緩衝液を共有貯槽３４内に分配し（洗浄緩衝液３）、それをシリカフィルタ貯槽３６にポンプしてシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部に置き；その後図１７Ｅに示されるステップを繰り返す。
【００９２】
図１７Ｈ及び１７Ｅに示されるステップを繰り返し；その後図１７Ｆ及び１７Ｅで示されるステップを繰り返す。
【００９３】
図１７Ｉに示されるように、洗浄緩衝液を貯槽３７／５６に分配し、それをシリカフィルタ貯槽３６へポンプしてシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部に置く。適切にインキュベートし、それを前記貯槽３７／５６へポンプして戻す。
【００９４】
図１７Ｊに示されるように、結合緩衝液を貯槽３７へ分配し（結合緩衝液）、それを貯槽３７／５６へポンプする；その後ビーズを貯槽３７／５６内に分配する；適切にインキュベートし撹拌する。磁石４９を貯槽３７／５６の下に上げて位置させ、貯槽３７／５６の内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。
【００９５】
図１７Ｋに示されるように、磁石４９を下げて貯槽３７／５６の下から外す。同じか異なる洗浄緩衝液を貯槽３７へ分配し（洗浄緩衝液Ａ）、貯槽３７（洗浄緩衝液Ａ）の内容をビーズを再懸濁させるための貯槽３７／５６へポンプする。ゆっくりと撹拌し適切にインキュベートする。磁石を貯槽３７／５６の下に上げて位置させ、貯槽３７／５６の内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。数回繰り返す。
【００９６】
図１７Ｌに示されるように、磁石４９を下げて貯槽３７／５６の下から外す。同じか異なる洗浄緩衝液を貯槽３７（洗浄緩衝液Ｂ）に分布して、貯槽３７（洗浄緩衝液Ｂ）の内容物をビーズを再懸濁させるためにポンプする。ゆっくりと撹拌して適切にインキュベートする。磁石４９を上げて貯槽３７／５６の下に位置させ、貯槽３７／５６の内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。磁石４９を下げて貯槽３７／５６の下から外す。同じか異なる洗浄緩衝液を貯槽３７（洗浄緩衝液Ｂ）へ分配し、貯槽３７（洗浄緩衝液Ｂ）の内容物をビーズを再懸濁させるために貯槽３７／５６へポンプする。ゆっくりと撹拌して適切にインキュベートする。上部に４９を貯槽３７／５６の下に位置させ、貯槽３７／５６の内容物を貯槽３７（洗浄緩衝液Ｂ）へポンプして貯槽３７／５６及び増幅マスタ混合物貯槽３８の間のチャンネル及びダイヤフラムを洗浄する。
【００９７】
図１７Ｍに示されるように、磁石４９を下げて貯槽３７／５６のしたから外す。増幅マスタ混合物を増幅マスタ混合物貯槽３８に分配し、増幅マスタ混合物貯槽３８の内容物を貯槽３７／５６へポンプしてビーズを再懸濁させる。ゆっくり撹拌して適切にインキュベートする。貯槽３７／５６の内容物を増幅マスタ混合物貯槽３８へポンプして戻す。増幅マスタ混合物の内容を増幅リアクタへポンプするか吸引して廃棄へ通じさせて増幅リアクタを満たす。増幅のための適切な温度と時間でインキュベートする。
【００９８】
図１７Ｎで示されるように、ハイブリダイゼーション緩衝液を分析貯槽４１（ハイブリダイゼーション緩衝液）へ分配し、一部分を廃棄貯槽４２へポンプする。貯槽４１（ハイブリダイゼーション緩衝液）の内容物を貯槽５４（加熱分析貯槽）へポンプする。前記増幅リアクタの内容物の一部を廃棄貯槽４２へポンプする。増幅リアクタの内容物の一部分及び貯槽４１（ハイブリダイゼーション緩衝液）の内容物の他の一部を貯槽５４（加熱分析貯槽）へポンプする
図１７Ｏで示されるように、全ての必要な試薬を貯槽５４（加熱分析貯槽）へ要求に従い分配する。貯槽５４（加熱分析貯槽）の内容物を要求に従い、撹拌、加熱及びインキュベートする。貯槽５４（加熱分析貯槽）の全て又は一部の内容物を貯槽４１（分析貯槽）にポンプして、貯槽５４（加熱分析貯槽）の内容物の分析を続いて進行する。ゆすぎ緩衝液を貯槽４１（ゆすぎ緩衝液）に分配し、貯槽４１に前にポンプされた内容物の全てが消費される場合に、貯槽４１（ゆすぎ緩衝液）の内容物を貯槽４１（分析貯槽）にポンプしてアッセイを完了する。最後に、貯槽４１（分析貯槽）内のフィルタ上に表示される結果を光学的に分析する。
【００９９】
図１８は、組み込まれたニューマチックピストンアセンブリ５１を持つニューマチックマニホールド１５の断面側面図を示し、その１つは多目的ヒーターアセンブリ４８に位置され、１つは前記システムの調製の領域に位置される。図は具体的に、前記システムの調製領域のための前記ニューマチックピストンアセンブリ（又は前記ピストンアセンブリはモーター又は電磁気駆動であってよい）５１の内部コンポーネントを示す。
【０１００】
図１９は、多目的ヒーターアセンブリ４８に位置され、組み込まれたニューマチックピストンアセンブリ（又は前記ピストンアセンブリはモーター又は電磁気駆動であってよい）５１を持つニューマチックマニホールド１５の断面側面図及びその内部コンポーネントを示す。
【０１０１】
図２０は、二重アッセイユニット配置の層状化正面図を示し、これはニューマチックマニホールド１５の例示的に他の機能を示し、これは図１７ＡからＯに記載された貯槽の代わりに磁気分離／濃縮を目標とするニューマチック的起動磁石アセンブリ５１を含み、かる前記システムに適用される貯槽及びチャンネルの構成を含む。
【０１０２】
図２１Ａ）からＫはさらに、以下の例示的分析プロセスを示す。
【０１０３】
図２１Ａに示されるように、サンプルをサンプルインプット貯槽３３に入れ、酵素を共通試薬貯槽３４に分配し、それをサンプルインプット貯槽３３にポンプする。ゆっくりとインキュベートする。溶解緩衝液を共通試薬貯槽３４に分配し、それをサンプルインプット貯槽３３にポンプする。ゆっくりと撹拌してインキュベートする。ビーズを共通試薬貯槽３４に分配し、それをサンプルインプット貯槽へポンプする。ゆっくりと撹拌してインキュベートする。有機アルコール（例えばイソプロパノール）を共通試薬貯槽３４に分配し、それをサンプルインプット貯槽３３へポンプし、それをゆっくりと撹拌してインキュベートする。
【０１０４】
図２１Ｂに示されるように、磁石４９を上げて分離／濃縮チャンネル５７の下に位置し、内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。磁石４９を下げて分離／濃縮チャンネル５７の下から外す。洗浄緩衝液を共通試薬貯槽３４（調製）へ分配し、分離／濃縮チャンネル５７へポンプし、分離／濃縮チャンネル５７を通じて時計方向及び反時計方向に交互に数回循環させ前記ビーズを再懸濁させ、洗浄する。磁気４９を上げて分離／濃縮チャンネル５７の下に位置させ、内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。磁石４９を下げて分離／濃縮チャンネル５７の下から外す。同じか又か他の洗浄緩衝液を共通試薬貯槽３４（調製）に分配し、分離／濃縮チャンネル５７にポンプし、分離／濃縮貯槽３４７を通じて時計回り及び反時計回りに数回循環させてビーズを再懸濁させ洗浄する。磁石４９を上げて分離／濃縮貯槽７の下に位置させ、内容物を廃棄貯槽３５へポンプする。前記洗浄ステップをアッセイの要求に従い続ける。洗浄緩衝液を共通試薬貯槽３４（調製）に分配し、それを廃棄貯槽３５にポンプして、前記貯槽、チャンネル及び前記調製領域のダイヤフラムからの全ての残留試薬を洗浄する。
【０１０５】
図２１Ｃに示されるように、分離／濃縮チャンネル５７からの溶液を共通試薬貯槽３４（調製）へポンプする。高濃度塩緩衝液を共通試薬貯槽３４（調製）に分配する。有機アルコールを共通試薬貯槽３４（調製）に分配する。共通試薬貯槽３４（調製）の内容物を、シリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプし、廃棄貯槽３５へポンプする。
【０１０６】
図２１Ｄに示されるように、同じか他の洗浄緩衝液を共通試薬貯槽３４（溶出）に分配し、これをシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの上部にポンプし、シリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂを通じて内容物を吸引し、廃棄貯槽３５にポンプする。同じ又は他の洗浄緩衝液を用いてアッセイの要求に従い繰り返す。
【０１０７】
図２１Ｅに示されるように、溶出緩衝液を貯槽３７（溶出）へ分配し、それをシリカフィルタ貯槽３６内のシリカフィルタ３６ｂの底部から上部までポンプする。
【０１０８】
図２１Ｆに示されるように、シリカフィルタ貯槽３６の内容物をシリカフィルタを通じて吸引し、それを溶出貯槽３７（中心）へポンプし、その後溶出貯槽３７Ｌ及び３７Ｒに等しくポンプするか又は、それを溶出貯槽３７（中心）をバイパスして直接等しい量で貯槽３７Ｌ及び３７Ｒへポンプする。
【０１０９】
図２１Ｇで示されるように、増幅マスタ混合物を貯槽３８Ｌ及び３８Ｒへ分配する。前記分離貯槽へ分配された前記マスタ混合物は、前記アッセイにより同じプライマを含むか、又は含まない。図では、最初のサンプルは２つの部分に分けられている。前記サンプルは単一の部分として残るか、又は２つ以上の部分に分けられ、これは具体的なアッセイ及び利用可能な貯槽、チャンネルにレイアウトに依存し、さらに前記サンプルを分ける増幅リアクタに依存する。貯槽３７Ｌ及び増幅マスタ混合物貯槽３８Ｌ内の溶液を増幅リアクタ３１Ｌと３１Ｒ（２つはアッセイユニットの左側に示されるが、単一の増幅リアクタのみが必要であるが、２以上も利用可能である）にポンプする。前記アッセイユニットの右についても繰り返される。増幅のために適切な温度及び時間でインキュベートされる。
【０１１０】
図２１Ｈに示されるように、前ハイブリダイズ緩衝液を共通試薬貯槽４０（右及び左）に分配し、そこから増幅リアクタ３１（左及び右）に分配し、分析貯槽４１（左及び右）の分析膜４７（左及び右）の上部に分配される。
【０１１１】
図２１Ｉで示されるように、増幅リアクタ３１（左及び右）の内容物を分析貯槽４１（左及び右）内の分析膜（左及び右）上にポンプされ、それを複数回循環して前記アンプリコンと分析膜４７（左及び右）に付されたターゲットとの十分な接触を与える。十分なハイブリダイゼーションが生じたなら、内容物を廃棄貯槽４２にポンプする。洗浄緩衝液を共通貯槽４０（左及び右）に分配し、分析貯槽４１（左及び右）に保持された分析膜４７（左及び右）の上部にポンプされ、その後廃棄貯槽４２へポンプされる（数回繰り返される。
【０１１２】
図２１Ｊに示されるように、適切なアンプリコン可視化試薬（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）を共通試薬貯槽４９（左及び右）に分配し、それを分析貯槽４１（左及び右）内に保持される分析膜４７（左及び右）の上部にポンプされ、反応が十分進行するまで循環され、その後内容物は廃棄貯槽４２へポンプされる。洗浄緩衝液を共通試薬貯槽４０（左及び右）に分配し、それを分析貯槽４１（左及び右）に保持される分析膜４７（左及び右）の上部にポンプし、その後内容物を廃棄貯槽４２へポンプする。数回繰り返される。
【０１１３】
図２１Ｋに示されるように、可視化試薬反応物（例えばテトラメチルベンジジン「ＴＭＢ」）を共通試薬貯槽４０（左及び右）に分配し、それを分析貯槽４１（左及び右）内に保持される分析膜４７（左及び右）の上部に分配され、上で記載のように反応試薬（例えばＨＲＰとＴＭＢ）を完全に反応させるために循環し、内容物を廃棄貯槽４２へポンプする。洗浄緩衝液を共通試薬貯槽４０（左及び右）に分配し、それを分析貯槽４１（左及び右）に保持される分析膜４７（左及び右）の上部に分配し、廃棄貯槽４２へポンプする（数回繰り返す）。最後に、カメラ２７を分配システム１３上で、前記分析貯槽４１（左及び右）に保持される分析膜４７（左及び右）上に位置させ画像を記録する。画像データはその後制御システム１９で処理され、結果がオペレーターに送信される。図２４、２５は非限定的、例示的な、ＣＡＲＤ装置をここで説明するように使用する自動組織断片分析のためのプロセスを示す。図４５は、図２０に示されるＣＡＲＤ構成を用いて、図２１、２２で示されるプロセスにより、ＤＮＡが精製され溶出されかる増幅されることができることを示す。前記ゲル上に示されるバンドは、カンジダ（敗血症を起こす菌）から増幅された１５ＳｒＲＮＡである。カラム見出しは、−Ｃｔｌｓであり、これはベンチトップネガティブコントロールを示す。＋Ｃｔｌはベンチトップポジティブコントロールを示す。Ｓ１−Ｓ４は４つのＣＡＲＤ実施例である。それぞれのＳ１−Ｓ４について白抜き四角はＣＡＲＤから除去され前記精製の第２のステップに先立つ増幅された部分からのものである。この実施態様では、核酸は最初に精製され、その後溶出され（精製に２段階及び溶出に２段階あった：第１の段階から第２の段階への１つ、その後前記第２の段階から溶出）、その後増幅されて、ゲル上で操作される。結果は、前記精製の第２の段階はターゲットの増幅の非常に顕著な改善を与える、ということを確認する。この場合には、前記プライマは、全血液サンプルにスパイクされたカンジダからの２５ＳｒＲＮＡを増幅した。
【０１１４】
図２４を参照して、通常行われるように試験片をブレンドするよりはむしろ、組織サンプルは３ｍｍ直径カッターで切り取られる。カッターは、その後サンプル貯槽内に挿入され、ここでカッタープランジャを操作して前記切り取られたサンプルを分析チャンバに移動する。より具体的には、図２５を参照して、サンプルを直上に説明されるように負荷し；制御装置が溶解緩衝液／プロテイナーゼＫを前記試薬貯槽に分配し；前記溶解緩衝液／プロテイナーゼＫをサンプル貯槽内にポンプし；前記混合物を循環させ；前記制御装置がエタノールを前記試薬貯槽に分配し；エタノールが前記反応溶液と混合され；前記反応溶液はシリカフィルタ上の精製装置内にポンプされ；及び前記反応溶液はシリカフィルタを通じてシリカ膜を介して廃棄貯槽内へポンプされる。さらに、スクリーンが前記貯槽内に、前記サンプルが挿入される前に挿入されてもよい。それにより、前記試薬と前記断片がより効果的に反応するために表面領域を増加させるために前記組織は前記スクリーンを通る。
【０１１５】
図２２は、チャンネルスタイル磁気分離を／濃縮システムの二重アッセイユニット構成の拡大図であり、貯槽１７、流体輸送層１６、膜層３０を示し、及びそれらのコンポーネントを示す面外増幅リアクタ３１を示す。
【０１１６】
核酸
実施態様では、本発明は対象核酸分子（これはまた「対象核酸」、「ターゲット核酸」、「ターゲットポリヌクレオチド」とも参照される）の増幅及び／又は単離の方法を提供する。単離された核酸分子（又は「単離核酸」）は、前記核酸分子の天然原料中に存在する他の核酸から分離された核酸分子（又は「核酸」）である。好ましくは、「単離」核酸は、前記核酸が由来する有機体のゲノムＤＮＡ中の核酸（即ち前記核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を自然に切り出した遊離の核酸配列（例えばタンパク質をコードする配列）である。他の実施態様では、前記単離された核酸はイントロンのない配列である。
【０１１７】
「対象核酸」、「ターゲット核酸」又は「ターゲットポリヌクレオチド」とは対象となる特定のポリヌクレオチドを意味する。本発明の方法で分析されるかかる対象核酸には、限定されるものではないが、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子及びそれらの断片を含み、前記断片にはオリゴヌクレオチド、発現配列タグ（「ＥＳＴ」）、配列タグサイト（「ＳＴＳ」）などが含まれる。本発明の方法で分析され得る対象核酸にはまた、限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子、ｃＲＮＡ（即ち、インビボで転写されるｃＤＮＡから調製されるＲＮＡ）分子およびそれらの断片が含まれる。種々の実施態様で、単離された核酸分子は、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂの核酸配列を含むことができ、これらは前記核酸が誘導されるゲノムＤＮＡ中の核酸分子が自然に切り出されたものである。さらに、ｃＤＮＡ分子などの単離核酸は、遺伝子組換技術で製造される際の他の細胞性物質や培地を含まず、また、化学的に合成される化学的前駆体又は化学物質を含まない。
【０１１８】
対象核酸はＤＮＡやＲＮＡ又はキメラ混合物やその誘導体や変性物であり得る。前記核酸は、塩基基、糖基又はリン酸エステル主鎖で修飾されることができ、及び他の追加の基やラベル基を含むことができる。
【０１１９】
例えば、いくつかの実施態様では、前記核酸は少なくとも１つの変性塩基を含み、これは、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、５−ぶろもウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンオシルクエオシン、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２、６−ジアミノプリンを含む群から選択される。
【０１２０】
他の実施態様では、核酸は少なくとも１つの変性糖基を含むことができ、これは限定されるものではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースが含まれる群から選択される。
【０１２１】
他の実施態様では、核酸は少なくとも１つの変性されたリン酸エステル主鎖を含むことができ、これには限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体を含む群から選択される。
【０１２２】
プライマ、プローブ又はテンプレートとして使用される核酸は、市販品又は当技術分野で知られている標準方法により得られる。前記標準方法としては、例えば自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡなどから市販されている）及び標準のホスホロアミデート化学を用いること；又は非特異的核酸開裂化合物や酵素又はサイト特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて大きい核酸断片の開裂により得られる。
【０１２３】
１つの種から対象核酸の配列が知られており、他の種の相補遺伝子が望まれる場合には、その知られた配列の基づいてプローブを設計することは日常の操作である。前記プローブは、配列が望まれる種からの核酸とハイブリダイズ、例えば対象種からのゲノム又はＤＮＡライブラリからの核酸とのハイブリダイズする。
【０１２４】
１つの実施態様では、増幅されるべき対象単離核酸に相補的であり、又は温和なストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸をプローブとして使用される。
【０１２５】
他の実施態様では、温和なストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、かつ対象増幅される核酸と少なくとも９５％相補的である核酸が、プローブとして使用される。
【０１２６】
他の実施態様では、少なくとも４５％（又は５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９８％、又は９９％）の対象ヌクレオチド配列との同一性である核酸をプローブとして使用される。
【０１２７】
他の実施態様では、対象核酸又はそれと相補的な核酸の少なくとも２５（５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、又は４０００）のヌクレオチド断片を含む核酸分子がプローブとして使用される。
【０１２８】
他の実施態様では、対象ヌクレオチド配列又はそれと相補的ヌクレオチド配列を持つ増幅される核酸へ温和なストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子がプローブとして使用される。他の実施態様では、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００又は４０００の長さのヌクレオチドを持ち、対象ヌクレオチド配列又はそれと相補的ヌクレオチド配列を持つ増幅される核酸へ温和なストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子がプローブとして使用される。
【０１２９】
対象増幅される核酸の検出のためにプローブ（又はテンプレート）として使用され得る核酸は、全ての知られた方法で得ることができる。例えば、プラスミドから、対象ヌクレオチド配列の３’及び５’末端へハイブリダイズ可能な合成プライマを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により及び／又はｃＤＮＡやゲノムライブラリから前記ヌクレオチド配列のための特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、得ることができる。ゲノムクローンは、適切なハイブリダイズ条件下ゲノムＤＮＡライブラリからプロービングすることで識別され得る。例えば高ストリンジェント条件、低ストリンジェント条件又は温和なストリンジェント条件など、プロービングされるゲノムＤＮＡと前記プローブとの関連性の高さに依存する。例えば、対象となるヌクレオチド配列のプローブとゲノムＤＮＡが同じ種からのものである場合、高ストリンジェントハイブリダイズ条件が使用され；一方前記プローブとゲノムＤＮＡが異なる種からのものである場合には、低ストリンジェントハイブリダイズ条件が使用され得る。高、低及び温和なストリンジェント条件は、全てこの技術分野でよく知られている。
【０１３０】
対象増幅核酸は、この技術分野で知られている方法により検出可能にラベル化され得る。
【０１３１】
検出可能なラベルが蛍光ラベルであり、例えばヌクレオチド類似体に組み込まれている。本発明の使用のために適した他のラベルには、限定されるものではないが、ビオチン、イムノビオチン、抗原、コファクタ、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン性化合物、検出可能なポリペプチド、電子豊富分子、基質との反応により検出可能なシグナルを生成する酵素及び放射性同位体が挙げられる。好ましくは３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、１５Ｎ及び１２５Ｉなどの放射性同位体である。本発明に適切な蛍光分子には、限定されるものではないが、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、テキサスレッド、５’−カルボキシ−フルオレセイン（「ＦＭＡ」）、２’、７’−ジメトキシ−４’、５’−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（「ＪＯＥ」）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン（「ＴＡＭＲＡ」）、６’−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＩＲＤ４０及びＩＲＤ４１が挙げられる。本発明に適する蛍光分子はさらに：限定されるものではないがＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７及びＦｌｕｏｒＸを含むシアニン色素；限定されるものではないがＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０及びＢＯＤＩＰＹ−６５０／６７０を含むＢＯＤＩＰＹ色素；及び、限定されるものではないがＡＬＥＸＡ−４８８、ＡＬＥＸＡ−５３２、ＡＬＥＸＡ−５４６、ＡＬＥＸＡ−５６８、及びＡＬＥＸＡ−５９４を含むＡＬＥＸＡ色素；また同様にこの技術分野で知られたその他の蛍光色素が挙げられる。本発明に適する電子豊富インジケータ分子には、限定されるものではないが、アフェリチン、ヘモシアニン及び金コロイドが挙げられる。又は、対象増幅核酸（ターゲットポリヌクレオチド）はそれへの第１の基と特異的に複合体化によりラベル化され得る。インジケータ分子と共有結合され、かつ前記第１の基と親和性を有する第２の基は前記ターゲットポリヌクレオチドを検出するために使用され得る。かかる１つの実施態様では、第１の基としての使用に適した化合物は、限定されるものではないがビオチン及びイムノビオチンが含まれる。
【０１３２】
本発明の方法により増幅され分析される（例えば検出される）対象核酸は、単一また複数のプローブと、相補的配列を持つポリヌクレオチド分子がハイブリダイズするような条件下で接触され得る。ここで使用される「プローブ」とは、特定の配列（一般的に前記プローブと相補的配列）を持つ対象核酸分子がハイブリダイズでき、前記ターゲットポリヌクレオチド分子の前記プローブとのハイブリダイゼーションが検出され得る特定の配列のポリヌクレオチド分子を意味する。前記プローブのポリヌクレオチド配列は、例えばＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡとＲＮＡのコポリマー配列であり得る。例えば、前記プローブのポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は細胞から抽出されたｃＲＮＡ配列の全配列又は部分配列である。前記プローブのポリヌクレオチド配列はまた、例えばこの技術分野で知られるオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成され得る。前記プローブ配列はまた、インビボで酵素的に、インビトロで酵素的に（例えばＰＣＲで）又はインビトロで非酵素的に合成され得る。
【０１３３】
好ましくは、本発明で使用される前記プローブは固体支持体又は表面に固定されたものであり、それにより前記プローブへハイブリダイズ又は結合しないポリヌクレオチドを、前記プローブ及びそれに結合又はハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を除去することなく、洗浄除去することができる。固定支持体又は表面へのプローブの固定化の方法はこの技術分野でよく知られている。１つの実施態様では、前記プローブは、ガラス表面又はナイロン表面又はニトロセルロース膜などの固体（又は半固体）支持体又は表面へ結合された別々のポリヌクレオチドのアレイを含む。最も好ましくは、前記アレイがアドレス可能なアレイであり、それぞれの異なるプローブが前記支持体又は表面の特定の知られた位置に位置され、特定のプローブの識別が前記支持体又は表面のその位置から識別され得る、ものである。具体的な実施態様では、国際公開第２００９／０４９２６８Ａ１（Ｚｈｏｕ等（２００９年４月１６日公開）に記載された方法が、固体支持体又は表面へ核酸プローブを固定化するために使用される。
【０１３４】
本発明で使用されるプローブは全てのタイプのポリヌクレオチドを含むことができ、好ましい実施態様では、プローブはオリゴヌクレオチド配列（即ち、約４と約２００塩基長さ、より好ましくは約１５と約１５０塩基長さの間）を含む。１つの実施態様では、約４と約４０塩基長さのより短いオリゴヌクレオチドが使用され、かつより好ましくは約１５と約３０塩基長さのオリゴヌクレオチドが使用される。しかし本発明のより好ましい実施態様は、より長いオリゴヌクレオチドプローブを使用するものであり、約４０と約８０塩基長さ、さらに約５０と約７０塩基長さ（例えば約６０塩基長さのオリゴヌクレオチド配列）を使用する。
【０１３５】
ＣＡＲＤの使用
当業者に明らかなことは、前記ＣＡＲＤに基づく診断アッセイが、ベンチトップアッセイが現在使用されている多くの異なる応用のために使用されてきている、ということである。プラスチックＣＡＲＤの設計が、全ての必要なミクロ流体ネットワーク、バルブ、ポンプ及び貯槽を、簡単な安価な使い捨てのミクロ流体装置を可能にする。全てのアッセイ機能（即ち、フロー及び混合速度、熱サイクルを含む温度制御、レジデンスタイムなど）がソフトウェアで容易に制御されることから、複雑な多重ＰＣＲアッセイが熟練度の異なる個々人により容易に実施され得る。さらに、ＣＡＲＤは、ポータブルな電池駆動ＰＯＣ制御装置に挿入され得るか、又は高スループットＥｎｃｏｍｐａｓｓＭＤｘ（ＴＭ）ワークステーションに挿入され得る。しかし形式の選択に拘わらず容易に実施が達成される。
【０１３６】
前記ＣＡＲＤは、増幅のためのプライマの選択及び検出されるべきプローブの選択を通じて全ての対象核酸配列のアッセイを行う当業者に採用され得る。
【０１３７】
１つの実施態様では、前記ＣＡＲＤは分子診断を実施するために使用され得る。これは個々人のバックグラウンドに基づく潜在的な疾患の管理のための基礎を提供することができる。
【０１３８】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは薬ゲノム感受性、例えば対象となる医薬、医薬組成物、化学物質又は化合物への感受性の遺伝子的素因をスクリーンするために使用され得る。
【０１３９】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは、癌スクリーンアッセイ、即ち癌素因に関連する対象となる核酸のスクリーニングを実施するために使用され得る。
【０１４０】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは、感染症剤、病原体又は敗血症のためのスクリーニングアッセイのための使用され得る。
【０１４１】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは、腫瘍の目的、医薬ゲノムの目的、コンパニオン診断（特定の医薬組成物に特異的な投与又はその他の必要性）又は伝染性又は非伝染性感染症を検出するために、単一塩基多型（ＳＮＰ）の分析のために使用され得る。
【０１４２】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは対象となる有機体の工業的又は環境学的アッセイのために使用され得る。これら有機体には人、動物又は植物への感染性の有機体、又はプロセスされた食品又は非プロセス食品での腐敗有機体が含まれる。
【０１４３】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは、娯楽用水（ビーチ、プールなど）又は飲用水のための水処理システムの監視、バラスト水又は処理排水の監視のためのアッセイを実施するために工業的に使用され得る。
【０１４４】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは、大量の液体中に分布された希薄なターゲット核酸をスクリーンアッセイを実施するために使用され得る。
【０１４５】
他の実施態様では、前記ＣＡＲＤは、希薄な核酸のスクリーニングアッセイを実施するために使用され得る。ここで前記希薄な核酸はサンプル中の非ターゲット核酸の高いバックグラウンドから区別されるべきものである。
【０１４６】
いくつかの実施態様では、前記ＣＡＲＤは、競合するプライマを隔離し、単一の分析貯槽４１へフィードする多重増幅リアクタ（例えば図１１、１２の３１）へ適合されることが容易であり、これにより多重増幅リアクタが連続的に単一サンプルから核酸について実行され得る。
【０１４７】
前記ＣＡＲＤは当業者により、知られた熱介在核酸増幅を実行するために適合され得るものであり、これには、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転者（ＲＴ）ＰＣＲ、ｃＤＮＡエンドの迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサークル増幅、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応、転写物関与増幅（ＴＡＡ）、冷ＰＣＲ及び非酵素的増幅技術（ＮＥＡＴ）などが挙げられる。
【０１４８】
核酸増幅のためのＣＡＲＤを加熱することに加えて、前記ＣＡＲＤは、検出有機体（例えば前記有機体で発現される熱ショック関連ＲＮＡの存在など）の実行可能性について試験するために加熱され得る。加熱はまた、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）などの分析でハイブリダイゼーションのストリンジェント性を制御するために使用され得る。
【０１４９】
前記ＣＡＲＤは当業者により、この技術分野で知られるアンプリコンについての全ての分析又は検出方法を実施するように適合され得る。例えば、限定されるものではないが、比色測定、蛍光比色測定、化学発光、電気化学、電気泳動、ラテラルフロー、タンパク質ミクロアッセイ、核酸ミクロアッセイ、蛍光検出方法又はこれらの検出方法の種々の組合せなどが挙げられる。
【０１５０】
以下の実施例は説明的、例示的目的でなされるものであり、なんら限定することを意図するものではない。
【０１５１】
実施例
実施例１：  ワルファリン感受性のためのゲノム薬理学的アッセイ
この例はワルファリン感受性のゲノム薬理学的アッセイの具体的な実施例を示す、前記ＣＡＲＤに完全に組み込まれ自動化されている。逆ドットブロット（ＲＤＢ）は結果を分析するために実施された。しかし以下示されるように前記プライマ伸長方法もまた使用され得る。以下記載されるプロトコルは当業者に容易に、プライマ及びプローブの選択により対象の単一塩基多型（ＳＮＰ）のためのアッセイに適合され得る。
【０１５２】
一般的に、前記ＣＡＲＤで実行されるアッセイは次のステップを含む：
１．  前記ＣＡＲＤ（オペレーターが行う唯一のステップ）へ原料試験片を適用するステップ、
２．  化学的細胞溶解ステップ、
３．  核酸抽出及び前記ＣＡＲＤに含まれるシリカカラムへ結合させることによる精製ステップ、
４．  前記シリカカラムから精製核酸溶出ステップ、
５．  前記精製核酸の一部を、緩衝液、プライマ、ヌクレオチドトリリン酸、塩化マグネシウム、ＴａｑＤＮＡ、ポリメラーゼ及びウラシル−ＤＮＡグルコシラーゼ（これは起こり得ないアプリコンのクロスオーバーコンタミネーションを保証するために使用される）を含むＰＣＲを増幅を実行するために必要な全ての試薬を含むＰＣＲマスタ混合物と混合するステップ、
６．  前記完全な混合物を、前記マニホールドに埋め込まれた抵抗ヒーター上に直接位置されるＰＣＲ熱サイクルチャンバ内に導入するステップ、
７．  前記熱サイクルプログラムを完了させた後、前記アンプリコンを前記検出モジュール内に導入し、そこでアッセイ、例えばプライマ伸長反応（図２６Ａ、Ｂ）又は逆ドットブロット（ＲＤＢ）アッセイ「図２９）などのアッセイを実施するステップ、
８．  例えばプライマ伸長方法又はＲＢＤ膜を介して分析膜上に検出されたスポットの画像化及び分析するステップ、
９．  結果をユーザに提供するステップ。
【０１５３】
ＰＣＲ増幅はこの実施態様で実施されるが、当技術分野で知られる全ての熱介在核酸増幅反応が上の方法を用いて実施され得る、これには限定されるものではないが：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサークル増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応、転写関与増幅（ＴＡＡ）、コールドＰＣＲ及び非酵素的増幅技術（ＮＥＡＴ）が挙げられる。
【０１５４】
図１４Ａから１４Ｌ及び図１８の貯槽の変更例を参照して、以下の操作及び試薬はワルファリン感受性のインジケータとして知られてる３つの個々のＳＮＰ：ＣＹＰ２Ｃ９＊２、ＣＹＰ２Ｃ９＊３及びＶＫＯＲＣｌ＊２の単一塩基多型（「ＳＮＰ」）に関連するゲノム薬理学研究を実施するために使用された。
【０１５５】
プローブセット
次のプローブセットが、ＣＹＰ２Ｃ９＊２、ＣＹＰ２Ｃ９＊３及びＶＫＯＲＣｌ＊２を検出するために使用された。
【０１５６】
ＣＹＰ２Ｃ９＊２＿ＷＴ／５ＡｍＭＣ６／ＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＴＴＣＡ（配列番号ＮＯ：１１３）。
【０１５７】
ＣＹＰ２Ｃ９＊２＿ＭＵＴ／５ＡｍＭＣ６／ＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡ（配列番号ＮＯ：１１４）。
【０１５８】
ＣＹＰ２Ｃ９＊３＿ＷＴ／５ＡｍＭＣ６／ＡＡＧＧＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＣＴ（配列番号ＮＯ：１１５）。
【０１５９】
ＣＹＰ２Ｃ９＊３＿ＭＵＴ／５ＡｍＭＣ６／ＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＣ（配列番号ＮＯ：１１６）。
【０１６０】
ＶＫＯＲＣｌ＿ＷＴ／５ＡｍＭＣ６／ＣＡＴＣＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣ（配列番号ＮＯ：１１７）。
【０１６１】
ＶＫＯＲＣｌ＿ＭＵＴ／５ＡｍＭＣ６／ＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＴＧＡ（配列番号ＮＯ：１１８）。
【０１６２】
サンプル添加及び細胞溶解
（ａ）  オペレーターが、前記サンプルインプット貯槽内に、血液又は口腔スワブ懸濁物のサンプルを５μｌ添加する。
（ｂ）  細胞貯蔵緩衝液３０μｌを前記試薬インプット貯蔵へ分配し、それを前記サンプルインプット貯槽内へポンプする。
（ｃ）  ３０μｌのプロテイナーゼＫ及び溶解緩衝液の混合物を前記試薬貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽内にポンプし、５分間インキュベートする。
（ｄ）  ３０μｌのエタノールを前記試薬貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプする。
（ｅ）  前記サンプルインプット貯槽の内容物全てを前記精製貯槽内の前記フィルタの上部にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。
（ｆ）  ４０μｌのエタノールを前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。
（ｇ）  ７０μｌの洗浄緩衝液１を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引し、廃棄へポンプする。
（ｈ）  ７０μｌの洗浄緩衝液２を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引し、廃棄へポンプする。
（ｉ）  ９０μｌの水を前記試薬インプット貯槽へ分配し、それを廃棄へポンプする。
（ｊ）  ７０μｌの溶出緩衝液を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後それをそれが通ってきたチャンネルを通って廃棄へポンプして戻される。その後全ての残流体を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。
【０１６３】
溶出
（ａ）  ５０μｌの溶出緩衝液を１つの溶出貯槽へ分配し、その一部分を他の溶出貯槽へポンプし、その後残りを前記精製貯槽内の前記フィルタの底部を通じてポンプして上げ、その後それを少なくとも２回前記精製貯槽を交互に満たしたり空にしてそれをフラフィングする。
【０１６４】
ＰＣＲ負荷
（ａ）  １２μｌのＰＣＲのマスタ混合物１を１つの前記マスタ混合物貯槽に分配し、その後１２μｌのＰＣＲマスタ混合物２で他のマスタ混合貯槽へ分配を繰り返す。
（ｂ）  前記精製貯槽の内容物の小部分（ダイヤフラム３フレックス分）を、溶出緩衝液がポンプされた前記第２の溶出貯槽へポンプする。
（ｃ）  前記精製貯槽から少量の材料を移動するためにダイヤフラム１回フレックス分を増幅貯槽の１つにポンプし、その後同じ増幅貯槽を、前記増幅貯槽と同じ側の前記マスタ混合物貯槽からの前記マスタ混合物で満たす。これを繰り返して前記第２の増幅貯槽を満たす。
【０１６５】
ＰＣＲ条件
（ａ）  １０分間、３７℃、
（ｂ）  ２分間、９５℃、
（ｃ）次を４０サイクル：
（ｉ）  ３０秒間、９５℃、
（ｉｉ）  ３０秒間、４５℃、
（ｉｉｉ）  ３０秒間、７２℃、
（ｉｖ）  ３分間、７２℃。
【０１６６】
逆ドットブロット（ＲＤＢ）フィルタブロック
ＲＤＢフィルタブロックは熱サイクルの間に実施され、２つのステップが増幅を完全に行わせるために連携させる。
（ａ）  ８０μｌの水を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを分析フィルタへポンプし、その後時計回り及び反時計回りに交互に廃棄へ１５回循環させる。
（ｂ）  ８０μｌの０．１ＮのＮａＯＨを前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、それをその後時計回り及び反時計回りに交互に廃棄へ１５回循環させる。
（ｃ）  ８０μｌの水を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、それをその後時計回り及び反時計回りに交互に廃棄へ循環させる。このステップを２回以上繰り返す。
【０１６７】
前ハイブリダイゼーション
（ａ）  ８０μｌのＳＳ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１Ｍのリン酸ナトリウム＋０．００１ＭのＥＤＴＡ＋０．１％のＳＤＳ；最終ｐＨ７．２５−７．５０）を前記分析貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、それを循環させる。８０μｌの水を前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後時計回り及び反時計回りに交互に５回循環させ、その後１０分間循環させずにインキュベートする。
【０１６８】
アンプリコン取り出し
１０分間の前ハイブリダイゼーションの間にこれらのプロセスが開始され得る。
（ａ）  前記増幅反応での温度を、前記ＳＳ緩衝液を添加する直前の３０秒間９５℃に上げる。
（ｂ）  同時に８０μｌのＳＳ緩衝液を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記増幅リアクタの１つにポンプする。他の増幅リアクタでも繰り返す。
（ｃ）  増幅反応ヒーターを切り、前記増幅リアクタを冷却して、前記ワックス／シリコーンのシーリング層を固化させ、アンプリコンを取り出す際に液状相ワックス／シリコーン層がアンプリコンと共に取り出されないようにする。
【０１６９】
ハイブリダイゼーション
（ａ）  アンプリコン取り出しステップ（ａ）−（ｃ）と同時に、前記分析貯槽を空にし、前記分析貯槽の下のヒーターの温度を５０℃にあげて前記膜を加熱する。
（ｂ）  それぞれの増幅リアクタについて３回分ポンプしてそれぞれのリアクタの内容物をいくらかを前記分析膜へポンプする。
（ｃ）  前記分析貯槽の内容物を、時計回り及び反時計回りに１５分間循環させてインキュベートする。前記反応を改善するためにカバーされた分析貯槽を用いることが最も好ましい。その後前記内容物を廃棄へ空にする。
（ｄ）  ８０μｌのＳＳ緩衝液を前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後１５分間時計回り及び反時計回りに循環させてその後廃棄へポンプする。これを２回繰り返す。
（ｅ）  前記分析貯槽の温度を下げて３０℃未満とする。
（ｆ）  ８０μｌのＳＳ緩衝液を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後１回循環し、その後それを、１分間に１回循環させて５分間インキュベートし、その後それを廃棄へポンプする。
【０１７０】
共役（コンジュゲート）
（ａ）  ８０μｌのＨＲＰを前記分析試薬貯槽へ分配し、それを分析膜へポンプし、１０分間、時計回り及び反時計回りに循環させ、その後廃棄へポンプする。
（ｂ）  ８０μｌのＳＳ緩衝液を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後時計回り及び反時計回りに１５回循環させその後廃棄へポンプする。
【０１７１】
基質の添加
（ａ）  ８０μｌのＴＭＢを前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析膜へポンプし、時計回り及び反時計回りに５分間循環し、その後廃棄へポンプする。
（ｂ）  ８０μｌの水を前記分析試薬貯槽へ分配し、それを分析膜にポンプし、時計回り及び反時計回りに１５回循環させて、廃棄へポンプする。これを２回繰り返す。
【０１７２】
画像分析
（ａ）  カメラを前記分析膜の上に位置させ、画像を記録する。
（ｂ）  画像を制御システムへ処理のために送る。
（ｃ）  結果を記録する。
【０１７３】
実施例２：  単一塩基多型（ＳＮＰ）の迅速かつ自動的検出のためのＣＡＲＤに基づく方法
イントロダクション
この実施例は、臨床生サンプルを分析するための低コストのＣＡＲＤ技術を組み込んだ先進分子診断業界のための前記ＣＡＲＤの使用を示すものである。生の試験片が前記ＣＡＲＤに導入されると、細胞溶解、核酸精製、多重ＰＣＲ及びエンドポイント分析の全てのアッセイ機能が自動的に実行される。
【０１７４】
前記ＣＡＲＤは、ワルファリン感受性に関連する単一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するためのゲノム薬学的アッセイで使用された。２０人の個人ボランティアの生口腔スワブサンプルが分析され、前記ＣＡＲＤで実施されたワルファリン感受性アッセイにより識別されたそのＳＮＰプロフィルが、双方向ＤＮＡ配列解析を介して確認された。以下記載するゲノム薬学的プロトコルは、しかし、当業者には、プライマ及びプローブを選択することで対象となる全ての核酸配列又はＳＮＰのためのアッセイを行うように容易に適合され得る。かかるアッセイは、例えば、ウイルス性病原体、腫瘍又は他の遺伝子変異、変異体又は対象物のマーカーをスクリーニングするために使用され得るものであり、さらに実質的に全ての細胞又は組織をアッセイすることができるものである。
【０１７５】
背景
分子診断の使用は、１９８０年代に、特に成長の遅い又は感染性疾患の原因となる選好性細菌の検出を可能とする手段として認められて依頼、大きく拡張されてきた。ウイルス性病原体の検出はまた、ウイルス負荷試験を含み、分子診断により大きく改善されてきた。ヒトゲノムについてのデータがより利用可能になるにつれて、ゲノム薬理学、コンパニオン診断及びその他の個人化された医薬の応用での分子診断の使用はますます大きくなってきている。その潜在能力と有用性にも拘わらず、しかしながら、高度に訓練された人員と高価な装置が必要なために、分子診断は、適切な装置と人員を持つ専門研究室又は中央実験室での使用に制限されている。
【０１７６】
多くの有効な「ポイントオブケア（ＰＯＣ）」診断が開発されており、これはラテラルフローアッセイ方式（例えば妊娠試験）で免疫アッセイによるものである一方で、容易に使用できかつ安価なＰＯＣ方式ではより複雑な分子アッセイを実施する能力はいまだに十分に達成されていない。分子診断が種々のＰＯＣ設定で広く使用されるようになるには、前記アッセイを簡略化し、必要な装置を減らさなければならない。現在「ベンチトップ」分子アッセイは、分析するためのサンプルを生の臨床試験片から調製するための高度に訓練された人員による大きな労力を必要とする。従って、遺伝子増幅及び検出ステップはまた、高度なスキルと高価な装置を必要とする。さらに、ラテラルフローＰＯＣアッセイはしばしば試験片上の色強度の主観的な解釈に頼るところがあり、より高度な分子アッセイからの結果は、曖昧でないかつ客観的なデジタル化された結果が提供されるならばより意味のあるものとなろう。これらのプロセスの全てが１つのシームレスな、完全に自動化された方法で組み込まれるならば、種々のスキルを持つ個人が広い範囲のＰＯＣ分子アッセイを実施でき、経済的なアッセイ方式で結果を客観的にかつ明瞭に解釈することを達成できることとなる。
【０１７７】
分子ＰＯＣ市場での課題は、いくつかの「サンプルから結果」プラットフォームの導入をもたらしたが、しかしそのほとんどが「サンプル調製」ステップ及び／又は装置の分離を必要とするか、遺伝子増幅及び検出を達成するために前記システムへ導入する前の相当なサンプル「前調製」を必要とするものである。真の「サンプルから結果」を達成するために、プラットフォームの簡単化が開発された。このプラットフォームは、全ての必要なサンプル調製、アッセイ及び検出ステップを単一の、安価な使い捨てプラスチック装置に組み込み、完全に自動化された分子診断試験を達成することができる。この実施例で示される前記ＣＡＲＤは、生試験片を導入するだけで、全てのステップが自動化されている。資本設備及び使い捨てという両方の前記装置の低コストは、また全ての「手作業」が必要ないことと共に、分子診断を臨床及びポイントオブケアテストの全ての面で実用的なものとする。
【０１７８】
材料及び方法
アッセイ
「ベチトップ」アッセイは種々のパラメータを確立するために最適化され、それらは前記ＣＡＲＤの自動化プラットフォームに変換された。例えば増幅及びキャプチャのためのプライマ及びプローブは、本技術分野で知られる方法を用いて設計された。これにはまた、分析される有機体が強すぎて溶解されない場合に標準化学溶解及び核酸精製プロトコルの最適化が含まれ得る。
【０１７９】
全ての配列は、国立バイオテクノロジセンタ（ＮＣＢＩ）情報（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得た。プライマ及びプローブは、ＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ｗｗｗ．ｃｌｃｂｉｏ．ｃｏｍ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳｃｉＴｏｏｌｓ（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｃｉｔｏｏｌｓ／）及びＮＣＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ）を用いて本技術分野で知られた方法で設計された。全てのプライマ及びプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を用いて合成された。全ての微生物及びウイルスＤＮＡ、はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入された。
【０１８０】
ワルファリン感受性アッセイ
口腔スワブを内容説明の上でボランティアから得た。それを溶解しＤＮＡを中有出した。ＤＮＡは前記ＣＡＲＤで増幅の対象とした。使用プライマは、ワルファリン感受性について知られる３つの個々のＳＮＰの回りの領域ＣＹＰ２Ｃ９＊２、ＣＹＰ２Ｃ９＊３及びＶＫＯＲＣｌ＊２（２７−３２）を増幅するように設計された。ＣＹＰ２Ｃ９＊２及びＣＹＰ２Ｃ９＊３ＳＮＰはチトクロームＰ４５０遺伝子の変異に対応し、ＶＫＯＲＣｌ＊２はビタミンＫエポキシドリダクターゼ複合体サブユニット１遺伝子の変異に対応する。
【０１８１】
精製に続き、ＤＮＡを２つの識別ＰＣＲ反応へ分け；１つはＣＹＰ２Ｃ９変異の両方の周りの領域を増幅するためのプライマを含む混合物であり、他方には、ＶＫＯＲＣｌ＊２変異の回りの領域を増幅するためのプライマを含む混合物である。ＰＣＲに続いて、両方の反応混合物からのアンプリコンを混合し、変性させ、その後前記膜フィルタに共有結合されたプローブを含むチャンバへ移送した。変性されたアンプリコンは、緩衝液、ビオチン化ｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ、マグネシウムイオン及び３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング機能が欠失したＤＮＡポリメラーゼ（例えばＶｅｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の存在下で前記キャプチャプローブとアニーリングさせた。
【０１８２】
前記プライマ伸長アッセイのために、前記固定化プローブは、約２０塩基長さであり、その３’末端に情報提供ヌクレオチドが含まれる。この条件下で、前記変性されアニーリングされたアンプリコン鎖はテンプレートとして挙動し、固体相プローブが伸長される「プライマ」を表す。前記テンプレートとプライマとの完全な一致がある場合に、ＤＮＡ合成が起こりビオチン化ｄＵＴＰを含むｄＮＴＰが取り込まれる。しかし、前記固定化「プライマ」の末端塩基とテンプレートの間に単一のミスマッチが存在する場合、伸長は起こらず従って、ビオチン取り込みは起こらない（図２６Ａ及び、Ｂ）。
【０１８３】
前記ＣＡＲＤで実施するように、プライマ伸長アッセイの熱サイクルは前記分析貯槽４１内で実施される（図１４ＡからＣ参照）。
【０１８４】
一回の伸長反応に続いて、伸長された生成物はその後、ストレプトアビジン共役ＨＲＰ及びＴＭＢ基質とインキュベートされて検出される。
【０１８５】
デジタル化取り込み画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）での分析対象となる。スポットの平均強度が測定され、野生型のスポットの平均が変異プローブの平均で割り算された。１以上、１又は１未満の比率は、ホモ接合野生型、ヘテロ接合型、又はホモ接合変異体遺伝子タイプのそれぞれ対応する。
【０１８６】
プライマ伸長遺伝子タイプの確認は、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  （Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ３７３０ＤＮＡ  ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ、ＢＢ、Ｌｅｅ、ＬＧ、Ｓｐｕｒｇｅｏｎ、ＳＬ等、Ｎｅｗ  ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９７；２５：４５００−４５０４；Ｈｅｉｎｅｒ、ＣＲ．、Ｋｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、ＫＬ、Ｃｈｅｎ、Ｓ−Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｍｅｇａｂａｓｅ−Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８；８：５５７−５６１）及びＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ−ＦＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて双方向配列決定により達成された。
【０１８７】
結果
前記ＣＡＲＤで実施されたこのアッセイは、ワルファリンの代謝に影響することが知られている３つの別のＳＮＰを識別することで遺伝子タイプ分析（ワルファリン感受性アッセイ）を実行するように設計された。この単一（ＶＫＯＲＣｌ＊２）及び多重（ＣＹＰ２Ｃ９＊２及びＣＹＰ２Ｃ９＊３）ＰＣＲアッセイは、それぞれのＳＮＰ周りの領域を増幅し、その後変性されたアンプリコンをプライマ伸長反応の対象としてそれぞれのアレル体遺伝子タイプをアッセイするものである。
【０１８８】
前記ＣＡＲＤでのＳＮＰアセイの評価のために、２０人のボランティアからの口腔スワブが分析された。それぞれのサンプルは、（１）前記ＣＡＲＤで実施されるワルファリンＳＮＰアッセイ及び（２）双方向ＤＮＡ塩基配列決定を用いて評価された。プライマ伸長アッセイを使用することで、ワルファリン感受性アッセイは前記３つの別々のワルファリン関連ＳＮＰにわたり見出された種々のアレル体間を識別する。図２６Ａ、Ｂで示されるように、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡ配列は変性され、膜フィルタ上に固定化された特異的キャプチャプローブとハイブリダイズさせることができる。このアッセイでは、前記キャプチャプローブは最終的にはテンプレートとして前記アンプリコンを用いて伸長されるプライマとして作用する。前記プライマ伸長された配列に沿ってビオチン化ｄＵＴＰの挿入は、ストレプトアビジン化ＨＲＰと結合させてその結果、上の材料及び方法で説明したように色が検出される。
【０１８９】
図２７は、どのようにして遺伝子タイプがプライマ伸長フィルタから読み出せるかを表す代表的画像であり、及び図２８は前記２０人の個人から得られた異なる遺伝子タイプを示す。識別された３つのＳＮＰにつき存在する３つの可能な遺伝子タイプが目視で検出され及び／又は個々のスポットのシグナル強度の比が決定されることで確立され得る。２０人のボランティからの口腔スワブサンプルのそれぞれがワルファリン感受性アッセイで評価され、最初前記遺伝子タイプは少なくとも２つの異なる個人により読まれた。これらの結果は、上の材料及び方法で記載されたように画像分析同様、双方向塩基配列決定により確認された。
【０１９０】
この実施例での前記ワルファリン感受性アッセイは前記ＣＡＲＤの有用性を示す。前記アッセイは一度だけ「手動」（ユーザ実施）ステップが必要であるにも拘わらず、全ての続くステップはコンピュータ自動化されている。この実施に容易性及び結果の解釈の容易性のために、医者がワルファリンの適切な初期投与量の確立の助けるために他の臨床情報と共にゲノムデータの使用を望む場合にこのアッセイはＰＯＣ設定で有用となる。従って、ワルファリンの適切な治療投与量を達成するために繰り返しＰＴ／ＩＮＲ試験に頼る時間のかかるしかも潜在的に危険性を伴う「試行錯誤」投与に頼る代わりに、医者はいくつかの従来知られたワルファリン投与アルゴリズムを用いて最初からワルファリンのより適切な投与量で開始するころができる（Ｄａｌｙ、ＡＫ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ、ＢＰ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３；１３：２４７−２５２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｈ．ａｎｄ  Ｅｓｃｈｉｚｅｎ、Ｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ２００１；４０：５８７−６０３；Ｓｃｈｗａｒｚ、ＵＩ、Ｒｉｔｃｈｉｅ、ＭＤ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｙ、  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｉｔｉａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ  ２００８；３５８：９９９−１００８；Ｏｓｉｎｂｏｗａｌｅ、Ｏ．、Ａｌ  Ｍａｌｋｉ、Ｍ．、Ｓｃｈａｄｅ、Ａ．、ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｉｎｇ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃｌｅｖ．Ｃｌｉｎｉｃ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．２００９；７６：７２４−７３０）。
【０１９１】
前記ＣＡＲＤで実施されるアッセイは、完全に「手作業なし」で高度な分子アッセイを実施するための簡便な、費用対効果の優れた手段を提供する。さらに、前記アッセイを実施するために必要な装置の低資本コスト及び低い使い捨てコストのために、このプラットフォームを、真の「サンプルから結果」分子試験ポイントオブケア設定を可能とする。
【０１９２】
実施例３：  ＣＡＲＤに基づく自動化ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）アッセイ
この実施例は、ヒトパリローマウイルス（ＨＰＶ）アッセイの具体的な実施態様を示し、前記ＣＡＲＤに完全に組み込まれている。以下説明するプロトコルが当業者により、増幅のためのプライマ選択及びアレイのためのプローブの選択により、対象となる他の核酸配列のアッセイに容易に適合させることができる。
【０１９３】
膣スワブは、必要な場合には長期室温貯蔵が可能ある移動媒体中に収集される。移動媒体は、例えば、ＰＢＳ緩衝液であり、ここで前記サンプルは分析のために前記ＣＡＲＤ内にすぐに導入され得る。前記移動媒体はまた、この技術分野で知られるＤＮＡを分解しない全てのタイプの溶液であり、前記サンプルを後の使用のために保持され得る。
【０１９４】
一部を前記ＣＡＲＤに供給し、以下のプロトコルで説明されるように開始される。オペレーターのさらなる干渉なく、全ての以下のステップは自動的に実施される：即ち細胞溶解、核酸精製、ＰＣＲ増幅及び低密度ミクロアレイ上で複合エンドポイント検出である。以下の走査及び試薬は、前記ＣＡＲＤでＨＰＶアッセイを実施するために使用された。図１４Ａから１４Ｌを参照すること。
【０１９５】
サンプル添加及び細胞溶解
（ａ）  オペレーターがサンプル（例えば膣スワブ）をサンプルインプット貯槽に挿入する。
（ｂ）  ３０μｌのプロテインキナーゼＫ及び溶解緩衝液の混合物を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプし、５分間インキュベートする。
（ｃ）  ３０μｌのエタノールを前記試薬インプット貯槽へ分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプする。
（ｄ）  前記サンプルインプット貯槽の全内容物を前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容部をフィルタを通じて吸引しそれを廃棄へポンプする。
（ｅ）  ４０μｌのエタノールを前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容物を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
（ｆ）  ７０μｌの洗浄緩衝液１を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容物を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
（ｇ）  ７０μｌの洗浄緩衝液２を前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容物を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
（ｈ）  ９０μｌの水を前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを廃棄へポンプする。
（ｉ）  ７０μｌの溶出緩衝液を前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後それを通ってきたチャンネルを通して廃棄へポンプして戻す。その後全ての残留流体を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
【０１９６】
溶出
（ａ）  ５０μｌの溶出緩衝液を前記溶出貯槽内に分配し、それを他の溶出貯槽へポンプし、その後残りを前記精製貯槽内の前記フィルタの底部を通してポンプして上げ、その後前記精製貯槽を少なくとも２回交互に満たしたり空にしたりしてフラフィングさせる。
【０１９７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）負荷
（ａ）  １２μｌのＰＣＲマスタ混合物１を前記マスタ混合物貯槽の１つに分配し、その後繰り返して１２μｌのＰＣＲマスタ混合物２を他のマスタ混合物貯槽に分配する。
（ｂ）  前記精製貯槽の内容物の少量（ダイヤフラムの３回分）を溶出緩衝液がポンプされる前記第２の溶出貯槽へポンプする。
（ｃ）  前記ダイヤフラムの１回フレックス分を、前記精製貯槽から前記材料の少量を増幅貯槽の１つに移動させるためにポンプし、その後その同じ増幅貯槽を前記増幅貯槽と同じ側のマスタ混合貯槽からの前記マスタ混合物で満たす。前記第２の増幅貯槽も繰り返し満たす。
【０１９８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
（ａ）  １０分間、３７℃、
（ｂ）  ２分間、９５℃、
（ｃ）  次のサイクル１０回
（ｉ）      ３０秒、９５℃、
（ｉｉ）    ３０秒、４６℃
（ｉｉｉ）  ３０秒、７２℃、
（ｄ）  次のサイクル３０回
（ｉ）        １５秒、９５℃、
（ｉｉ）      ３０秒、４９℃、
（ｉｉｉ）    ３０秒、７２℃
（ｉｖ）      ３分間、７２℃。
【０１９９】
逆ドットブロット（ＲＤＢ）フィルタブロック
（ａ）  前記ＰＣＲ熱サイクルの間に逆ドットブロット（ＲＤＢ）フィルタブロックを開始し、２つのステップが前記増幅反応の完了に調整される。
（ｂ）  １５０μｌの０．１ＮのＮａＯＨを前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタの上部にポンプしそれを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて膜の上部へ戻る循環を５回させ、その後廃棄へポンプされる。
（ｃ）９０μｌの水を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプし、その後それを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて膜の上部へ戻る循環を３回させ、その後廃棄へポンプされる。このステップを１回以上繰り返す。
【０２００】
前ハイブリダイゼーション
（ａ）  ７０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１Ｍのリン酸ナトリウム＋０．００１ＭのＥＤＴＡ＋０．１％のＳＤＳ＋１５％のホルムアルデヒド、最終ｐＨ７．２５−７．５０）を前記分析貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプし、それを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて前記膜の上部へ戻る循環を５回行い、その後廃棄へポンプする。
【０２０１】
アンプリコン取り出し
（ａ）  ７０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプする。
（ｂ）  ７０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を前記分析貯槽に分配し、それを増幅リアクタの１つのポンプする。他の増幅リアクタについて繰り返す。
（ｃ）  増幅反応ヒーターを切り、増幅リアクタを冷却し、シーリング層のワックス／シリコーンを硬化させ、アンプリコンを移動させる際に液状層ワックス／シリコーン層が前記アンプリコンと共に動かされないようにする。
【０２０２】
ハイブリダイゼーション
（ａ）  それぞれの増幅リアクタの内容物を前記分析膜上にポンプする。
（ｂ）  前記分析貯槽内の内容物を、１２．５分間、循環（前記分析膜の上部から穴付きリングを通じて前記分析膜の上部へ戻る循環）させてインキュベートする。
（ｃ）９０μｌの洗浄緩衝液を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上部にポンプしその後前記分析膜の上部から前記穴付きリングを通じて前記分析膜の上部へ戻る循環を３回させてその後廃棄へポンプする。これを２回繰り返す。
【０２０３】
共役（コンジュゲート）
（ａ）  １２０μｌのＨＲＰを前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析膜の上部にポンプする。それを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて前記分析膜に上部へ戻る循環を４分間行い、その後廃棄へポンプする。
（ｂ）  ９０μｌの洗浄緩衝液を前記分試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプする。その後前記分析膜上部から前記穴付きリングを通じて前記分析膜の上部へ戻る循環を３回行い、それぞれ廃棄へポンプする。これを３回繰り返す。
【０２０４】
基質添加
（ａ）  １２０μｌのＴＭＢを前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析膜上にポンプし、前記膜上から前記穴付きリングを通じて前記分析膜上に戻る循環を１０分間行い、その後廃棄へポンプする。
（ｂ）  ９０μｌの水を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記膜上にポンプする。その後前記分析膜上から前記穴付きリングを通じて前記分析膜上に戻る循環を１５分間行いその後廃棄へポンプする。これを３回繰り返す。
【０２０５】
画像分析
（ａ）  カメラを前記分析膜上に配置し、画像を記録する。
（ｂ）  前記画像を前記制御装置へ処理のために送る。
（ｃ）  結果を報告する。
【０２０６】
実施例４：  ２０の臨床的に関連するＨＴＰタイプのＣＡＲＤに基づく迅速分子検出及び識別
この実施例は、実施例３で説明されたプロトコルを用いて、前記ＣＡＲＤで臨床サンプルから直接ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に臨床的に関連する少なくとも２０のタイプを、迅速に、容易に、自動的に検出し識別するための方法を示す。
【０２０７】
イントロダクション
子宮頸癌は低所得国の女性の間で癌に関連する死亡の主な原因であり、世界的な規模では女性の癌に関する死亡の第２の原因である。現在ＦＤＡ承認分子診断においては、種々のＨＰＶの識別を、「高リスク」又は「低リスク」と分類する以上にはできない。
【０２０８】
現在、２つのＦＤＡ承認分子診断試験が、ＨＰＶＤＮＡの直接検出のために合衆国内で利用可能である。ハイブリッドキャプチャテスト（Ｄｉｇｅｎｅ  ＨＣ２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）及びセルビスタＨＰＶテスト（Ｈｏｌｏｇｉｃ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）である。両方のテストとも、ターゲット増幅よりはむしろシグナル増幅に依存する。しかし、両方のＦＤＡ認証キットは、個々のＨＲＨＰＶを識別はせず、むしろ単一の又は多重のＨＲＨＰＶの存在を同じポジティブ結果として読まれる。さらに、ＬＲＨＰＶをグループとして検出するハイブリッドキャプチャキットがあり、セルビスタキットは特にＨＰＶ１６及び１８のみを検出ためのものである。
【０２０９】
子宮頸癌の可能性を決定するための２つの高度な予期テストが利用可能であるにも拘わらず、低所得領域と産業化領域との間の子宮頸癌死亡率の乖離はなお大きく。文化的、社会経済的及び物流的障壁が、貧困領域の女性がこれらのテストの予期値から得られる利益を妨害している。ＨＰＶの分子テストのための安価なポイントオブケア装置の設計は、世界規模で子宮頸癌検出についての改善をもたらすであろう。かかるテストは、ＨＰＶ状態に関して迅速明確な結果を与え、さらなる処置の必要性又は次のチェックアップの期限についていずれかの情報を与えるであろう。この実施例で示されるＨＰＶ核酸テストは、これらの前記バリアにも拘わらず異なる集団にアクセス可能なものである。
【０２１０】
材料及び方法
ゲノムＤＮＡの調製、希釈及び貯蔵
Ｃ−３３ヒト子宮頸癌細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清を含むイーグルスの最小必須媒体で３７℃でＣＯ２水ジャケット培養装置で増幅させ、保持された。細胞はコンフルエンスになるまで成長させ、直接ＰＢＳに掻き取るか、又はトリプシン処理して細胞を計数した。約５百万細胞（１０百万ゲノムに等しい）を集めて溶解し、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。核酸濃度は２６０ｎｍでの吸収により決定された。精製核酸は−２０℃で保存された。
【０２１１】
ＨＰＶ核酸プラスミドＤＮＡの調製、希釈及び貯蔵
ＨＰＶゲノムを含むキメラプラスミドＤＮＡはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、ＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ大腸菌を形質転換させた。培地を拡大し、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。ＤＮＡの濃度は２６０ｎｍの吸収により決定され、かつＤＮＡを１μｌ当たり１Ｅ６コピーに希釈した。プラスミドＤＮＡを−２０度で保存した。
【０２１２】
臨床サンプルからＤＮＡの調製
全てのサンプルは、最初膣スワブとしてＤｉｇｅｎｅ  貯蔵媒体中に収集した。サンプルの一部をまた、Ｄｉｇｅｎｅ変性溶液で前処理した。サンプルの２００μｌをＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙでの核酸精製の対象とし又は他で説明されるインハウス精製試薬で精製した。精製された核酸は−２０℃で保存した。
【０２１３】
ＨＰＶプライマ及びプローブの設計
ＨＰＶＬ１遺伝子プライマセットは、Ｌ２遺伝子の３’末端及びＬ１遺伝子の５’末端に対応する前記ＨＰＶ領域にもとづいて設計された。これは最初Ｙｏｓｈｉｋａｗａにより記載されその後他者により精緻化された方法である（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｈ、Ｋａｗａｎａ  Ｔ、Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｋ、Ｍｉｚｕｎｏ  Ｍ、Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ  Ｈ、Ｉｗａｍｏｔｏ  Ａ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９１、８２（５）：５２４−５３１；Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、１４０（ｌ−２）：３２−４２；Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｋｏｖａｃｓ  Ｌ、Ｍｏｚｅｓ  Ｊ、Ｂｅｎｃｚｉｋ  Ｍ、Ｓｅｂｅ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ５  ｌｏｗ−ｒｉｓｋ  ＨＰＶ  ｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８、１４９（１）：１５３−１６２）。それぞれの特定のＨＰＶタイプの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得られた。前記ＨＰＶタイプ及び対応する受け入れ番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）は次のとおりである：６：ＮＣ＿０００９０４；１１：Ｍ１４１１９；１６：ＮＣ＿００１５２６；１８：ＮＣ＿００１３５７；３１：Ｊ０４３５３；３３：Ｍ１２７３２；３５：Ｍ７４１１７；３９：Ｍ６２８４９  Ｍ３８１８５；４２：Ｍ７３２３６；４３：ＡＪ６２０２０５；４４：Ｕ３１７８８；４５：Ｘ７４４７９；５ＬＭ６２８７７；５２：Ｘ７４４８１；５３：ＮＣ＿００１５９３；５６：ＥＦ１７７１７７；５８：Ｄ９０４００；５９：Ｘ７７８５８；６６：Ｕ３１７９４；６８：ＤＱ０８００７９。
【０２１４】
Ｊｅｎｅｙ等（Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、１４０（１−２）：３２−４２）に記載されるプライマに基づいて、前記対象となるＨＰＶゲノムの前方及び逆方向プライマ領域をＣＬＣＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ｗｗｗ．ｃｌｃｂｉｏ．ｃｏｍ）を用いて整列させた。プライマは、最も類似する配列にグループ化された。ミスマッチは、前記ポリメラーゼがヌクレオチドの挿入を触媒する上流で、直接最善の塩基対を持つように最大１０の３’ヌクレオチド内では許されなかった。前記配列が整列されると、これらは２以上の縮重ヌクレオチドが単一のプライマには含まれないようにグループ化された。
【０２１５】
前記キャプチャプローブのための配列は、ＨＰＶ６、１１、１６及び１８の僅かな変更以外はＪｅｎｅｙ等の論文に記載されている。前記キャプチャプローブ配列は図３０に示される（表１、配列番号ＮＯ：１−２０）。プローブは、６炭素スペーサを介してリンクされた一級アミンで５’修飾された。
【０２１６】
全てのプライマ及びプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）で合成された。
【０２１７】
グロビンプライマ及びプローブの設計
ヒトベータグロビン遺伝子は、内部ポジティブコントロールとして選択され、これは臨床サンプルからの核酸増幅が成功したかどうかを確認するために必要である。前方及び後方プライマは次のように設計された：即ちそれぞれ、５’−ＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧ−３’及び５’−ＧＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡ−３’  （配列番号ＮＯ：２１）である。アミノ末端ベータグロビンキャプチャプローブは、５’−ＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡ−３’（配列番号ＮＯ：２２）であった。
【０２１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
拡張ＰＣＲ最適化プロトコルが、高リスクサブタイプとしての顕著性に基づくＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８について完全長ウイルスＤＮＡを含むプラスミドを用いて実施された。予備実施例は、ＨＰＶ１６は１８よりも増幅することが難しいことを示し、従って最適化はＨＰＶ１６増幅に焦点を合わせた。Ｊｅｎｅｙら（Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、１４０（１−２）：３２−４２）に記載された条件と類似の熱サイクル条件が実施され、ＰＣＲは低温で１０サイクルアニーリングし、及び残り２５から３５サイクルをより高温でアニーリングして実施された。ＰＣＲは、３２ｎｇのＣ３３精製核酸と最適化ＭｇＣｌ２濃度、プライマ濃度、緩衝液構成物のバックグラウンドに重ねてプラスミドを含むＨＰＶ１６の１０００コピーを用いて、前記２つのアニーリング温度のそれぞれのアニーリング温度で実施された。ＰＣＲは最終的に次の条件で最適化された：１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９、５０ｍＭのＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．０７５ｍＭのｄＴＴＰ、０．１２５ｍＭのｄＵＴＰ、０．２μＭのそれぞれのプライマ、０．００２ユニット／μｌ熱安定ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＵＤＧ、（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）及び０．０５ユニット／μｌＧｏＴａｑホットスタートポリメラーゼ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。熱サイクル条件は次のとおりであった：３７℃で１０分（ＵＤＧ活性化）、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で３０秒、４６℃で３０秒、７２℃で３０秒、２５−３５サイクルの９５℃で３０秒、４９℃で３０秒、７２℃で３０秒及び最後に７２℃で３分で拡張。この同じ条件が、ベータグロビン増幅について有効であることが検証された。ＰＣＲ最適化は、ＭＪ  Ｍｉｎｉ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で行い、さらにＭｕｌｔｉｇｅｎｅ  ＩＩ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｌａｂｎｅｔ、Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＮＪ）で確認された。
【０２１９】
電気泳動及び画像分析
増幅に続いて、２μｌの６ｘ色素を１０μｌに加えて最終容積１２μｌとする。サンプルは、１／１０００００容積のＧｅｌＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）が添加された０．５ＸＴＡＥ（５０ＸＴＡＥは２ＭのＴｒｉｓアセテート、１００ｍＭのＥＤＴＡ；０．５ＸＴＡＥは２０ｍＭのＴｒｉｓアセテート、１ｍＭのＥＤＴＡである）緩衝液中に溶解させた３％アガロースゲルで分析された。サンプルは、ＶＷＲ  ｍｉｎｉ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を用いて１００ボルトで３０−６０分間電気泳動された。ウェルは、１７レーン（４ｍｍ幅）又は２４レーン（３ｍｍ幅）コムで生成され、そこへ色素を含む５μｌ又は３μｌそれぞれのサンプルが負荷された。
【０２２０】
ゲルバンドはＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｅｌｏｒｅｓ、ＣＯ）を用いて照明され、画像を、Ｓｏｎｙ  Ｃｙｂｅｒ−ｓｈｏｔ  ＤＳＣＨ２  Ｄｉｇｉｔａｌ  ｃａｍｅｒａ、ＩＳＯ設定８０、Ｆ＝３．５、シャッタ速度＝３秒及びタイマ＝２秒を用いてキャプチャした。バックグラウンドは、ローリングボール半径セットを用いて５０画素に差し引かれ、前記バンドを測定するピーク下の領域が収集された。
【０２２１】
臨床サンプルからＬ１断片のクローニング
ＨＰＶＬ１増幅領域が臨床サンプルから精製されたＤＮＡからの特定のタイプにつきクローンされた。これを行うために、ＨＰＶタイプは、増幅及び逆ドッロブロっとハイブリダイゼーションを介して識別された。ＨＰＶＬ１領域が単一感染を含むサンプルからクローン化された。前方及び後方プライマは、ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１制限サイトそれぞれが隣接するタイプ特異的Ｌ１配列（図３１参照、表２（配列番号ＮＯ：２３から４６）を用いて設計された。消化断片は、その後ゲル精製され、消化ＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１とゲル精製されたｐＢＳ  ＩＩＫＳ＋（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）クローニングベクターへ連結された。ＨＰＶ挿入物の増幅の達成は、ＨＰＶプライマ混合物を用いて確認され、特異的タイプは、ＲＤＢ及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ３７３０  ＤＮＡ  ＡｎａｌｙｚｅｒをＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ−ＦＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）とともに用いて確認された。
【０２２２】
スポッティング制御とポジティブコントロールの設計
ＲＤＢフィルタのスポッティング制御は次のように設計された：／５ＡｍＭＣ６／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／３Ｂｉｏ／（配列番号ＮＯ：４７）。
【０２２３】
ポジティブコントロールは、ＨＰＶ６／１１への前方プライマ配列、及びＨＰＶ４２への後方プライマを含むように設計され、グリーン蛍光タンパク質、プラスミド、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２から誘導される非ＨＰＶ関連配列を隣接させる。これを行うために、プライマは、前方及び後方プライマ配列にＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１制限サイトを隣接させるように設計され、それによりＧＦＰ特異的配列が隣接されて２５８ｂｐＧＦＰインサートの増幅を可能とする。得られる前方及び後方プライマ配列は、それぞれ５’−ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号ＮＯ：４８）及び５’−ＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号ＮＯ：４９）である。増幅の後、ＰＣＲ産物を生成しＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１で切り出した。消化させた断片を続いてゲル精製し、ＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１消化しゲル精製したｐＢＳ  ＩＩＫＳ＋（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）クローニングベクタに連結した。ＧＦＰ断片の増幅の達成はＨＰＶプライマ混合物を用いて確認された。
【０２２４】
逆ドットブロット（ＲＤＢ）
膜フィルタは、Ｚｈａｎｇ等（Ｚｈａｎｇ  Ｙ、Ｃｏｙｎｅ  ＭＹ、Ｗｉｌｌ  ＳＧ、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ＣＨ、Ｋａｗａｓａｋｉ  ＥＳ：Ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９１、１９（１４）：３９２９−３９３３）の記載する方法に従い調製された。即ち、負に荷電されたナイロン、０．４５μｍ、Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を０．１ＮのＨＣｌで前湿潤化させ、続いて１０％のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩化水素（ＥＤＣ）で１５分間活性化させた。膜を水ですすぎ、空気乾燥させた。アミノ末端核酸プローブは、０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム中に再分散され、かつＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ  Ｂｉｏｇｒｉｄ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて前記膜上にスポットされた。膜を空気乾燥し、使用するまでデシケータ中に保存した。使用直前に、膜は０．１ＮのＮａＯＨでインキュベートして全ての残留非結合活性化サイトをクエンチされた。
【０２２５】
アンプリコン５μｌを５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルムアミド）と混合し、５分間９５℃で加熱し、その後直ぐに氷に載せて再アニーリングを防止した。全ての膜操作は、ゆっくりと撹拌しながら室温で実施された。膜は２５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に１５分間前ハイブリッドさせ、続いて変性アンプリコンを添加して１−３時間ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルタを１．５ｍｌの０．１％のＳＤＳ中で１０−１５分間洗浄された。膜は、１：５００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と１ＸＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ中で３０分間インキュベートし、続いて３回、それぞれ１０分間０．５ＸＳＳＰＥ／０．３％ＳＤＳ中ですすがれた。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）の７５０μｌを前記膜に添加し、色現像を１０分間実施した。膜を１０分間５ｍｌの水で洗浄された。現像されたフィルタをＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓｃａｎｊｅｔ４８５０でスキャンするか及び／又は写真を取って資料とした。
【０２２６】
結果
ＰＣＲプライマの設計
図３２（表３Ａ、配列番号ＮＯ：５０−７７）及び図３３（表３Ｂ、配列番号ＮＯ：７８−１０５）はＨＰＶＬ１遺伝子増幅のためのプライマを示し、材料及び方法に記載したルールに沿って設計された。３’末端で開始する整列に続いて、最大１０の３’ヌクレオチド内にミスマッチがなく、プライマにつき最大２つの縮重を用いることで合計８前方及び８後方プライマ配列が設計された。これにより、Ｊｅｎｅｙ等（Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、１４０（１−２）：３２−４２）により合成された個々のプライマの半数に低減され、従って、ＰＣＲアッセイに合計コストを節約できた。合計で、これらの縮重配列から１３の前方及び２１の後方プライマとなった。この戦略に続いて、その中に含まれるプライマ混合物は、高リスクタイプの１つ以外の術店を含む２０のＨＰＶターゲットの１６と正確に一致する。さらに、できるだけ多くのプライマ配列をカバーするように試みられたが、ミスマッチは低リスクタイプで懸念されるほど多くはなかった。その理由は、全ての関連するタイプがこれらのプライマで増幅され得ることは予想されるが、低リスクが増幅されないという可能性の低い場合に、これらの条件下で偽陰性は高リスクの偽陽性ほど重要ではない、とされるからである。前方プライマセットでのミスマッチは、低リスク４２、４３については単一のミスマッチであり、低リスク４４については３ミスマッチである。後方プライマセットでのミスマッチは低リスク１１と４４及び高リスク６６では単一ミスマッチである。ＨＰＶ４４前方配列での１つ以外の全てのミスマッチは、プライマの５’末端内であった。
【０２２７】
ＨＰＶプライマ増幅の検証
前記ＨＰＶＬ１プライマセットは、最初に完全又は部分長ＨＰＶ配列を含むキメラプラスミドで試験された。図３４は、種々のＨＰＶタイプについてプラスミドＤＮＡの増幅の結果を示す。ＨＰＶ６、１１、１６、１８、５２について完全長のＤＮＡ配列を含むプラスミド又はＨＰＶ３５について部分配列のいずれかを１００コピー／μｌ含む反応混合物を４０サイクルの増幅の対象とされた。全ての場合において、ＨＰＶは、１．６ｎｇ／μｌＣ３３Ａ核酸の存在で増幅された。全てのプラスミドが前記プライマセットで増幅された。前記プラスミドには、テンプレートとしてどの程度好ましく作用するかに関して違いがあり、ＨＰＶ１８が他の比較して非常に好ましいテンプレートであった。
【０２２８】
それぞれのプラスミドの間のＬ１プライマセットについてテンプレートとしての作用の違いを明確に示すために、増幅反応が２倍連続希釈プラスミドで実施された。図３５Ａ−Ｄは、代表的な実施例の結果を示し、反応当たり１．６ｎｇ／μｌのゲノム核酸のバックグラウンドに重ねてＤＮＡの１２から１２５００コピー／μｌでＨＰＶプラスミドＤＮＡが増幅された。上画像は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ含有プラスミドの増幅産物を分離するために使用されるゲルの画像であり、これは図３４で示される画像と類似するものである。ＨＰＶ１８はＨＰＶ１６よりも低コピー数でより優れた増幅を示す。これらのゲルの画像分析結果と同様に、その他のプラスミドについても増幅産物の類似のゲル分析の結果も図３５Ｂに示される。これらのグラフからのデータは、ＨＰＶ１８の増幅は他のプラスミドに比較して非常に優れた増幅をすることを確認するものであり、同様にＨＰＶ１６はこれらの条件下では増幅に対しより低い感受性を有することを確認するものである。ＨＰＶ１８の増幅は、約２００コピー／μｌでプラトーとなり、ＨＰＶ１１、３５及び５２の増幅は約８００コピー／μｌでプラトーとなり、ＨＰＶ１６の増幅は、最も弱いものであり、約１５００コピー／μｌでプラトーとなった。
【０２２９】
完全長及び部分長ＨＰＶクローンに加えて、臨床サンプルから直接クローン化されたＬ１ターゲット領域はまた、Ｌ１プライマとの増幅反応が実施された。図３５Ｄでグラフは、１２のタイプ特異的ＨＰＶクローンの１０から１００００コピー／μｌのＰＣＲ、の画像分析の結果を示す。前記完全長プラスミドで見られたものと同様にいくつかのテンプレートは他のものよりもより感受性であった。最も感受性であるテンプレート、ＨＰＶ１８、３１、３３、５１、５６及び６６の増幅は、  １５０コピー／μｌ未満でプラトーとなった。より難しいテンプレートの増幅は  ３００コピー／μｌを超えるとでプラトーとなり、１６で最も難しいものは１５００コピー／μｌであった。残るテンプレートは、これらの低及び高い範囲の間でプラトーとなった。まとめると、これらのデータは、試験されたＨＰＶの全てのターゲットはＬ１プライマセットで増幅するための適切なテンプレートであることを示した。
【０２３０】
予備実施例（データは示されていない）は、ＨＰＶの及びベータグロビンは、お互いに強く影響与えることなく、同じ反応混合物内で同時に増幅されないことを示した。通常、１つのテンプレートが他のテンプレートの比べて有意に過剰である場合にはＰＣＲ反応物の競争が生じ、最終産物のためによくないアッセイ設計とする恐れがある。従って、アッセイは、ベータブロビンとＨＰＶが別々のチャンバ内で増幅され得るが、同じ熱サイクル条件に従うことができるように設計された。図３５Ａの下の画像は、グロブリン増幅産物の代表的ゲルを示す。これらの実験のサンプルは、前記ＨＰＶ増幅曲線と同じインプットＨＰＶゲノムＤＮＡを含んでいた。ＨＰＶインプットは増加される一方で、前記ゲノムインプット核酸は１．６ｎｇ／μｌを維持していた。前記画像で見られるように、インプットＨＰＶのレベルはほとんど又は全くグロビン増幅に影響を与えなかった。図３５Ｄは、図３５Ｂに示されるプラスミドＨＰＶのそれぞれについての実施のコンパニオングロビンゲルの画像分析の結果を示す。これらのデータは、ＨＰＶのインプットに拘わらず、ベータグロビン増幅は比較的一定を維持することを、示す。従って、ＨＰＶ及びグロビンの共増幅が競争となる一方で、特異的プライマがないといずれかのテンプレートが存在しても前記特異的ターゲットの増幅に悪影響を与えることはない。
【０２３１】
グロビン曲線
内部コントロールベータグロビンがＨＰＶとは別のチャンバで増幅されたが、ＨＰＶと同じ温度及びサイクル条件で実施された。従って、どのようにしてベータブロビン増幅がこれらの条件下で作用するかを確立することが重要であった。この質問に答えるために、Ｃ３３Ａ及び細胞から精製された連続的希釈核酸がベータブロビンプライマで増幅の対象とされた。増幅は、精製核酸の０．０２４−１．６ｎｇ／μｌを、３０、３５又は４０サイクルで実施された。これらの実験からの結果は図３６に示される。ＰＣＲを４０サイクルで実施された場合、アンプリコン産物はインプット核酸０．２ｎｇ／μｌで完全に飽和した。対照的に、３０又は３５サイクルで実施された場合には、グロビンの増加はそれぞれ０．４又は０．１ｎｇ／μｌでプラトーとなり、それぞれ１．６又は０．８ｎｇ／μｌまでは飽和しなかった。これらのデータは異なる時間で精製されたＣ３３Ａ核酸を用いて種々の日で生成され、このアッセイの高い再現性が示された。
【０２３２】
図３６での実施例では、テンプレートは、精製ＤＮＡよりもＣ３３Ａ細胞から精製された全核酸の内容物中に提示された。この実施例の最終目的が、ＨＰＶ検出のためのポイントオブケアミクロ流体分子診断ツールを設計することであることから、前記アッセイのそれぞれのステップは前記エンドポイントを考えて設計された。従って、ＲＮＡフリー（存在しない）精製ＤＮＡを与えるリボヌクレアーゼ処理核酸の使用が考慮された。実施例では、前記精製モジュール中のリボヌクレアーゼは不必要であることが決定され、低細胞濃度から核酸を実際に回収することに有害であり得ることが決定された。即ち、ＤＮＡを制限する条件下では、ＲＮＡは精製を補助するキャリアとして作用し得る。いくつかの精製実施例を行い、収率プラス／マイナスリボヌクレアーゼ処置を比較した。Ｃ３３Ａ細胞の場合には、核酸の収率は一般的にリボヌクレアーゼ処理をしない場合に比べて４倍高かった。このことは、ゲノムＤＮＡの実際の量は、２６０ｎｍでの吸収を介して決定され収率は実際の約１／４であることを示唆する。
【０２３３】
ＲＤＢＨＰＶ／グロビン
別の容器でゲノム及びＨＰＶＤＮＡのＰＣＲの増幅に続いて、アンプリコンを一緒にして、単一膜フィルタ上でＲＤＢの対象とした。図３７Ａには、１．６ｎｇ／μｌのゲノム核酸のバックグラウンドに重ねてＨＰＶの１０コピー／μｌの増幅の結果を示す。上の画像は、ＨＰＶアンプリコンのゲル画像を示し、下画像は対応するグロビンアンプリコンのゲル画像を示す。それぞれのクローンのテンプレートとしての作用を示す相対的強度は、これまでの１０コピー／μｌで見られたものと整合した（図３７Ｂ及びデータは示されていない）。図３７Ｂは、ＨＰＶのとグロビンのアンプリコンの組合せのＲＤＢの結果を示す。それぞれのクローンがその特異的膜結合性プローブによりキャプチャされ、明確なスポットを生成した。一例以外の全てで、前記ＥＤＢスポットは前記アンプリコン画像の強度に拘わらず強かった。一方でＨＰＶ５３キャプチャの強度は低強度増幅を真似るものではあるが、なお識別され得る。
【０２３４】
臨床サンプル−細胞数の決定
ＨＰＶ及びグロビン増幅、続いてＲＤＢ上での特異的検出の堅牢性と再現性の条件を確立したので、前記アッセイを標準的生物学的試験種を用いて検証した。１１７の臨床サンプルを入手し、ＨＰＶ及びグロビンの核酸増幅の対象とし、ＲＤＢを介して最終的検出の対象とした。全ての１１７のサンプルが貯蔵移動媒体（ＳＴＭ、Ｑｉａｇｅｎ）中に集められ保存された。前記サンプルの一部分がまた、貯蔵に先立ってアルカリ変性試薬（Ｑｉａｇｅｎ）で処理された。サンプルを凍結して核酸増幅に先立って数週間貯蔵された。前記追加の変性試薬とともに貯蔵されたサンプルから精製された核酸は、ＳＴＭのみで貯蔵されたサンプルに比較してやや高い収率と純度を与えた。ＳＭＴのみの溶液に対して、前記変性／ＳＴＭ含有溶液からの平均収率は、それぞれ１１および４．６ｎｇ／μｌであり、２６０／２８０ｎｍでの吸収の比率はそれぞれ１．８と１．６であった。最初、これらのサンプルのそれぞれの０．５μｌを３０サイクルのＰＣＲを介してグロビンの存在が分析され、かつ、それぞれのサンプルが、生成された核酸の濃度にかかわらず、画素強度により測定可能な検出可能なアンプリコンにつき分析され、ＥＤＢ検出を介して確認された。図３８に見られるように、これらの条件下で直接関連はないが、画素強度の増加の傾向はｎｇ／μｌ収率の増加の傾向を伴った。そこで、検出可能な核酸の不存在下（吸収による、内部スペースのドロップ制限は約１ｎｇ／μｌ）でも、前記アッセイは３０サイクルのＰＣＲで検出可能なグロビンアンプリコンを生成し、それにより臨床開発のためのアッセイの感度及び有用性を検証した。
【０２３５】
グロビンの半定量的ＰＣ増幅は前記臨床サンプル中のゲノムの数を計算するために使用された。報告により、膣スワブは約１から５百万細胞を含み（Ｄｅｐｕｙｄｔ  ＣＥ、Ｂｅｎｏｙ  ＩＨ、Ｂａｉｌｌｅｕｌ  ＥＪ、Ｖａｎｄｅｐｉｔｔｅ  Ｊ、Ｖｅｒｅｅｃｋｅｎ  ＡＪ、Ｂｏｇｅｒｓ  ＪＪ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｅｒｖｅｘ−Ｂｒｕｓｈ  Ｃｏｍｂｉ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００６、１７（６）：３７４−３８１；Ｑｕｉｎｔ  ＷＧ、Ｐａｇｌｉｕｓｉ  ＳＲ、Ｌｅｌｉｅ  Ｎ、ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ  ＥＭ、Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＣＭ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００６、４４（２）：５７１−５７９；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｊ、Ｂｌａｋｅ  Ｂａｌｌ  Ｔ、Ｌａｎｅ  Ｍ、Ｃｈｅａｎｇ  Ｍ、Ｐｌｕｍｍｅｒ  Ｆ：Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｖａｇｉｎａｌ  ｓｗａｂ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｓｅｌｆ−ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ  ａｔｔｅｎｄｉｎｇ  ａ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ｃｌｉｎｉｃ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８、７３（３）：２１６−２２６）、これは６．４ｘ１０−６から３．２ｘ１０−５ｇの純粋なＤＮＡに相当する。Ｃ３３Ａ細胞からのＲＮＡフリーＤＮＡを用いて、かつ３０サイクルのＰＣＲを実施して、画素強度対ｎｇインプットの曲線を生成した（図３９Ａ）。これは図３６で生成された曲線と類似するが、しかしこの場合の全インプット核酸はゲノムＤＮＡであり、従ってゲノム数と直接関連する。
【０２３６】
ｎｇ／μｌからゲノム数への変換のために、次の式が使用された：（（ｎｇ／μｌ／１Ｅ９）／３．２Ｅ−１２ｇ／ゲノム。
【０２３７】
ゲノムを細胞に変換するためには、上の式から得られた結果を２で割ればよい。
【０２３８】
臨床サンプル内にあるゲノムの数を決定するために、アンプリコンの得られた強度は前記アッセイの直線範囲内に含まれるように、種々の低、中間的及び高収率のサンプル（図３８）を希釈法で分析された。図３９Ｂの結果は、ＳＴＭのみ中で保存されたサンプルについて計算された範囲は、１から４０ｎｇ／μｌの範囲であった。これらの数は、２６０ｎｍでの吸収から得られたｎｇ／μｌ値より約２から７倍高い値であった。このことは驚きではない。というのは上で説明したように、リボヌクレアーゼの不存在で精製された全核酸は、リボヌクレアーゼ処理に続いて精製されたＤＮＡよりも平均して４倍高かったからである。上の式を用いると、この範囲は、３１２．５から１２５００ゲノム／μｌ又は１５６．２５から６２５０細胞／μｌに相当する。これらのサンプルの初期容量は１ｍｌであった。そこでこれらのサンプル中で見出された細胞の数は、１５６２５０から６２５００００の範囲であった。
【０２３９】
図３９Ｃは、ＳＴＭ及び変性剤中で貯蔵されたサンプルにつき計算されらｎｇ／μｌ値を示す。この条件下では、計算ｎｇ／μｌ値と２６０ｎｍでの吸収から得られたｎｇ／μｌ値の相違は、アルカリ存在下でＲＮＡの加水分解と大きな一貫性はなかった。これらの条件下で計算されたＤＮＡの範囲は、０．６から２０ｎｇ／μｌであった。これは、１８７．５から６２５０ゲノム／μｌ又は９３．７５から３１２５細胞／μｌに相当する。これらのサンプルの最初の容量は１．５ｍｌであった。そこで、これらのサンプル中で見出された細胞数は、１４０６２５から４６８７５００の波にであった。
【０２４０】
まとまると、これらのデータは、半定量的システムを用いると、異なる条件下で保存されていたサンプルからの細胞数が評価されること、及び貯蔵に拘わらず、計算された細胞数はこれまでの報告値と整合することを示した。これらのデータは、膣スワブサンプルで予期される下限（約１５００００細胞）及び上限（約５００００００細胞）値を与えるものであり、前記アッセイが前記サンプルで予期される全範囲と整合するものである、ことを示した。
【０２４１】
臨床サンプル及びＨＰＶの証明
本発明のシステムがＨＰＶを、現在認められているＨＰＶ検出の方法に比較してよりよく検出することができることを示すために、全ての１１７臨床サンプルから精製された核酸に基づきＬ１プライマセットを用いたＰＣＲ、さらに得られたアンプリコンのＲＤＢにより実施された。
【０２４２】
図４０（表４）は、臨床サンプルのＰＣＲ及びＥＤＢの結果を示す。表で示されるように、７５％（８８／１１７）のサンプルがＰＣＲによりＨＰＶ増幅バンドを示し、さらにＨＰＶアンプリコンポジティブの４５％（４０／８８）がＲＤＢ上のＨＰＶ特異的プローブによりキャプチャされた。残る非検出物に対する最もあり得る説明は、前記ＨＰＶタイプの特異的キャプチャプローブが存在しないことである。ＨＰＶ・ＲＤＢポジティブスポットのうち、３１／４０は高リスクＨＰＶタイプを含み、単一感染（２１）、複数感染（５）又は低及び高リスク感染の組合せ（５）として存在した。残る９ＲＤＢポジティブサンプルは低リスク（７）又は複数（２）感染であった。
【０２４３】
前記アッセイが、高リスクＨＰＶ検出でのＤｉｇｅｎｅＨＣ２（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によるデータと比較された。図４１Ａのデータは、Ｄｉｇｅｎｅシステムを用いるＨＰＶの高リスクのポジティブサンプルと、この実施例に記載されたシステムで得られたＨＰＶ結果との比較を示す。前記アッセイは、Ｄｉｇｅｎｅの高リスクサンプルの１つ以外につき全てが高リスク感染であることを確認した。Ｄｉｇｅｎｅで１．０１のポジティブ結果であるこのサンプル（データは示されていない）は、ほとんど高リスクＤｉｇｅｎｅポジティブとは考えられなかった。しかし、このサンプルの繰り返しでは、ＨＰＶアンプリコンは検出されなかった。このことは、このサンプルは偽陽性とされたものか、又は非常に低いポジティブ性であるとされたものであろう。一方で、この実施例で示されたアッセイシステムは、Ｄｉｇｅｎｅ  ＨＣ２キットでは検出されなかったいくつかの他の高リスクサンプルを見出した。図４１Ｂに示されるように、本発明のアッセイシステムは、６つの高リスクサンプルを見出したが、これらはＤｉｇｅｎｅシステムでは見出されなかったものであり、このことはこの実施例で示されたアッセイの顕著な感度及び特異性を示すものである。
【０２４４】
議論
この実施例は、個々の低及び高リスクＨＰＶサブタイプを検出し識別するＨＰＶ分子診断試験の開発を示す。前記方法は、完全に自動化されたミクロ流体（ＣＡＲＤ）プラットフォーム上で使用するように開発され、ユーザは生物学的試験片をインプットするだけが必要とされる。前記自動化プロトコルは、サンプルから核酸を遊離させ、それをグロビン及びＨＰＶ特異的プライマを用いて増幅し、及び逆ドットブロットハイブリダイゼーション及び検出を介してＨＰＶのサブタイプを識別する。実施例は、ＨＰＶアッセイが２０の異なる感染ＨＰＶタイプを、ヒト上皮細胞からのベータグロビン同様に識別することができることを示す。さらに、このアッセイの感度が、再現性とともに示された。
【０２４５】
予備実験（示されていない）が、既に知られた生物学的サンプル中でのＨＰＶ特異的サブタイプの識別のためのＰＣＲに基づく方法で、これらの方法のいずれがＨＰＶアッセイへの使用に適するか及び／又は改善できるか、について決定するためになされた。
ＣＡＲＤでの使用に選択された好ましいターゲットとしての基準は：
（１）  ＰＣＲの際に相当な伸長時間を必要とせず、ＰＣＲの全所要時間を低減する、短いアンプリコンの増幅、
（２）  新たなＨＰＶサブタイプが関連ありとされる場合に新たなＨＰＶサブタイプを含む全ての対象となるターゲットのためのキャプチャプローブの設計をするための超可変領域をターゲットとすること、
（３）  対象とする全てのＨＰＶターゲットを増幅するために必要なプライマの数を最小化するためにターゲットサイトの隣接領域での有意な相同性、である。
【０２４６】
この技術分野で多くのＰＣＲに基づく方法が、Ｌ１遺伝子内の区別された核酸配列の増幅に依存するけれども、ＨＰＶゲノム内の他の遺伝子に依存する方法も存在する（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ  Ａ、Ｌｉｖａｋ  Ｋ、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  Ｕ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９９、３７（３）：４９０−４９６）。図４２（配列番号ＮＯ：１０６）は、強調された配列（配列番号ＮＯ：１０７から１１２）を含むＨＰＶ１６のＬ１遺伝子の配列を示し、これは増幅のターゲット領域に対応する。即ち、配列番号ＮＯ：１０７と配列番号ＮＯ：１０８はＬ１の前方及び後方プライマであり、配列番号ＮＯ：１０９及び配列番号ＮＯ：１１０はＳＰＦプライマであり、配列番号ＮＯ：１１０及び配列番号ＮＯ：１１１はＧＰ５／ＧＰ６であり、配列番号ＮＯ：１０９及び配列番号ＮＯ：１１２はＰＧＭＹ１１／０９に対応する。
【０２４７】
確立された３つのシステムは、Ｌ１遺伝子の中間にある４５０ｂｐ領域の全て又は一部を増幅した。前記ＭＹ０９／ＭＹ１１システムは最初、縮重プライマセットとして１９９０年の初めに記載され（Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ  Ａ、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ  ＭＨ、Ｇｒａｖｉｔｔ  ＰＥ、Ｇｌａｓｓ  ＡＧ、Ｇｒｅｅｒ  ＣＥ、Ｚｈａｎｇ  Ｔ、Ｓｃｏｔｔ  ＤＲ、Ｒｕｓｈ  ＢＢ、Ｌａｗｌｅｒ  Ｐ、Ｓｈｅｒｍａｎ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ：Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｗｏｍｅｎ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９４、１６９（２）：２３５−２４０）、複数のＨＰＶタイプを検出でき、約４５０ｂｐのアンプリコンが得られた。縮重プライマの使用による生じる問題を避けるために、Ｇｒａｖｉｔｔ等（Ｇｒａｖｉｔｔ  ＰＥ、Ｐｅｙｔｏｎ  ＣＬ、Ａｌｅｓｓｉ  ＴＱ、Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＣＭ、Ｃｏｕｔｌｅｅ  Ｆ、Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ  Ａ、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ  ＭＨ、Ｓｃｏｔｔ  ＤＲ、Ａｐｐｌｅ  ＲＪ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０００、３８（１）：３５７−３６１）は前記ＭＹ０９／ＭＹ１１システムを変更し、５つの前方及び１３の後方プライマの集合を設計した。これらのプライマの個々の組合せが前記ターゲットＨＰＶのタイプの全てを増幅することを可能にする。前記同じ領域を増幅するためにＳｎｉｊｄｅｒｓ等は（Ｓｎｉｊｄｅｒｓ  ＰＪ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｌｅ  ＡＪ、Ｓｃｈｒｉｊｎｅｍａｋｅｒｓ  ＨＦ、Ｓｎｏｗ  Ｇ、Ｍｅｉｊｅｒ  ＣＪ、Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ  ＪＭ：Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９０、７１（Ｐｔ１）：１７３−１８１）、単一のプライマ配列を識別し、これらはさらに３’末端での伸長により改変され（ｄｅ  Ｒｏｄａ  Ｈｕｓｍａｎ  ＡＭ、Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ  ＪＭ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｌｅ  ＡＪ、Ｍｅｉｊｅｒ  ＣＪ、Ｓｎｉｊｄｅｒｓ  ＰＪ：Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ＧＰ５  ａｎｄ  ＧＰ６  ｅｌｏｎｇａｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅｉｒ  ３’ｅｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＣＲ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９５、７６（Ｐｔ４）：１０５７−１０６２）、及びＨＰＶタイプの広い範囲をカバーするように拡張された（Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｍ、Ｄｏｎｄｏｇ  Ｂ、Ｗａｔｅｒｂｏｅｒ  Ｔ、Ｐａｗｌｉｔａ  Ｍ：Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｂｒｏａｄ−ｓｐ���ｃｔｒｕｍ  ＧＰ５＋  ａｎｄ  ＧＰ６＋  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００８、４６（３）：１０５０−１０５９）。この「一般的プライマ」システムにより生成されるアンプリコンのサイズは１５０ｂｐであった。
【０２４８】
Ｌ１遺伝子の前記同じ領域をターゲットとするために、Ｋｌｅｔｅｒ等（Ｋｌｅｔｅｒ  Ｂ、ｖａｎ  Ｄｏｏｍ  ＬＪ、Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ  Ｌ、Ｍｏｌｉｊｎ  Ａ、Ｓａｓｔｒｏｗｉｊｏｔｏ  Ｓ、ｔｅｒ  Ｓｃｈｅｇｇｅｔ  Ｊ、Ｌｉｎｄｅｍａｎ  Ｊ、ｔｅｒ  Ｈａｒｍｓｅｌ  Ｂ、Ｂｕｒｇｅｒ  Ｍ、Ｑｕｉｎｔ  Ｗ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９９、３７（８）：２５０８−２５１７；Ｋｌｅｔｅｒ  Ｂ、ｖａｎ  Ｄｏｏｍ  ＬＪ、ｔｅｒ  Ｓｃｈｅｇｇｅｔ  Ｊ、Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ  Ｌ、ｖａｎ  Ｋｒｉｍｐｅｎ  Ｋ、  Ｂｕｒｇｅｒ  Ｍ、ｔｅｒ  Ｈａｒｍｓｅｌ  Ｂ、Ｑｕｉｎｔ  Ｗ：Ｎｏｖｅｌ  ｓｈｏｒｔ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８、１５３（６）：１７３１−１７３９）は、「汎用塩基」イノシンの導入により全てのＨＰＶタイプを認識することができる４つの前方及び２つの後方プライマのシステムを設計した。これらのプライマは６５ｂｐ領域を増幅し、これは前記アンプリコン内にタイプ特異的キャプチャのために直接ターゲットとされ得る、超可変領域を含むものであった。Ｌ１配列に焦点を合わせるために、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ等は（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｈ、Ｋａｗａｎａ  Ｔ、Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｋ、Ｍｉｚｕｎｏ  Ｍ、Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ  Ｈ、Ｉｗａｍｏｔｏ  Ａ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９１、８２（５）：５２４−５３１）、Ｌ１Ｃ１／Ｌ１Ｃ２プライマについて記載し、これらは後に改変されてＨＰＶの４６の区別されるタイプまで含まれるようにされた（Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、１４０（ｌ−２）：３２−４２；Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｋｏｖａｃｓ  Ｌ、Ｍｏｚｅｓ  Ｊ、Ｂｅｎｃｚｉｋ  Ｍ、Ｓｅｂｅ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ５  ｌｏｗ−ｒｉｓｋ  ＨＰＶ  ｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８、１４９（１）：１５３−��６２）。Ｊｅｎｅｙ等の研究（Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、  Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、  １４０（ｌ−２）：３２−４２；Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｋｏｖａｃｓ  Ｌ、Ｍｏｚｅｓ  Ｊ、Ｂｅｎｃｚｉｋ  Ｍ、Ｓｅｂｅ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ５  ｌｏｗ−ｒｉｓｋ  ＨＰＶ  ｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８、１４９（１）：１５３−１６２）は、より多くのタイプをより感度良く検出することができる新規な領域を識別することを目的としてなされ、ＨＰＶＬ１配列内に１つの領域を見い出し、この領域はＸ線結晶構造解析により識別された前記タンパク質の超可変領域の１つの整合し（Ｃｈｅｎ  ＸＳ、Ｇａｒｃｅａ  ＲＬ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  Ｉ、Ｃａｓｉｎｉ  Ｇ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＬＩ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０００、５（３）：５５７−５６７）、及びさらにドメイン交換実験により確認した（Ｏｌｃｅｓｅ  ＶＡ、Ｃｈｅｎ  Ｙ、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  Ｒ、Ｙｕａｎ  Ｈ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ１６  ＬＩ  ｌｏｏｐ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ、  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ．  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００４、４：２９）。Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｔａｋａｃｓ  Ｔ、Ｓｅｂｅ  Ａ、Ｓｃｈａｆｆ  Ｚ（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ４６  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌ１Ｆ／Ｌ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、１４０（ｌ−２）：３２−４２）、及びＴａｋａｃｓ  Ｔ、Ｊｅｎｅｙ  Ｃ、Ｋｏｖａｃｓ  Ｌ、Ｍｏｚｅｓ  Ｊ、Ｂｅｎｃｚｉｋ  Ｍ、Ｓｅｂｅ  Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ５  ｌｏｗ−ｒｉｓｋ  ＨＰＶ  ｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２００８、１４９（１）：１５３−１６２）により記載されたプライマの使用は２５０ｂｐのアンプリコンを生じる。
【０２４９】
これらのＬ１増幅方法のそれぞれの試験が実施された。それぞれにつき成功した。上流Ｌ１２５０ｂｐの試験が、そのアンプリコンのサイズ及び前記キャプチャプローブ領域内の超可変性によりさらなる研究のために選択され、これにより、さらに好ましい室温でもハイブリダイゼーションし得るキャプチャプローブの設計を可能とした。
【０２５０】
ＨＰＶ感染及び子宮頸癌の潜在的進展に関してより知られるようになるにつれて、高リスクＨＰＶタイプの存在を示すことに加えて、細胞当たりのウイルス保持量又はＨＰＶ粒子数を理解することがまた診断に寄与するようになってくる。前記アッセイを用いてこのことを試験するために、同じサンプルからのＨＰＶ及びグロビンの画素強度が評価された。図４３Ａは、ＨＰＶ画素強度の増加を対応するグロビン画素強度に対してプロットした結果を示す。図４３Ａに示されるように、グロビン画素強度とＨＰＶ画素強度の増加には関連性はない。
【０２５１】
ＨＰＶとグロビン画素の比率をその後高リスクＨＰＶタイプの存在と比較された。図４３Ｂは、ＨＰＶとグロビン画素の比率を示し、低リスクＨＰＶタイプに対してプロットされた。これらの比率は１未満から６を超える値まで変化したが、ＨＰＶタイプの存在とは明瞭な関連性はないように見えた。図４３Ｃは、ＨＰＶとグロビン画素の比率を低リスクＨＰＶタイプに対してプロットしたものを示す。「Ｄｉｇｅｎｅ」は、本発明のアッセイと比較するために市販のＤｉｇｅｎｅアッセイの結果を示す数字である。挿入された図面は、Ｄｉｇｅｎｅアッセイ結果（異なる寸法Ｙ軸で）を示し、これは寸法を合して主図面に組み込まれている。
【０２５２】
まとめると、ＣＡＲＤで実施されたＨＰＶアッセは、臨床的に関連するＨＰＶタイプにつき、完全に自動化された、迅速かつ信頼性のある分子検出システムを提供するものである。さらに、前記ＣＡＲＤの簡便性（持ち運び可能）により、この実施例で示された方法は、工業化された国及び発展途上の国の両方において広く応用分野を持つものである。
【０２５３】
実施例５：  ＣＡＲＤに基づく希釈ターゲットの検出
この実施例は希釈ターゲットの検出を示す。この例では、希釈ターゲット核酸は水系病原体に関連する。前記希釈ターゲットの検出は給水系でのターゲットの存在を示す。かかるアッセイは、大量の液状サンプル容積中の希釈ターゲット（少数の有機体又は細胞核）を検出するために使用され得る。
【０２５４】
図２０Ａから２０Ｐを参照して、以下の操作及び試薬が、生きている水系病原体であるクリプトスポリジウム・パルバムの検出を実施するために使用された。
【０２５５】
サンプル添加及び磁気免疫分離
クリプトスポリジウム・パルバムの磁気免疫キャプチャのための全ての試薬はＤｙｎａｌから入手される。容量をＣＡＲＤでの自動操作のために調節された。
（ａ）  オペレーターが１ｍｌの前濃縮水サンプルをサンプルインプットへ導入。
（ｂ）  １００μｌの緩衝液１、１００μｌの緩衝液２、及び１０μｌのビーズを前記サンプルと同じチューブに入れる。ゆっくりと撹拌又はフラフィングして３０分インキュベートする。
（ｃ）  前記サンプルインプットの下へ磁石を持ち上げ、貯槽の内容物を廃棄へポンプする。
（ｄ）  ２００μｌの緩衝液１を緩衝液１貯槽へ分配し、前記磁石を下げてから、サンプルインプットへポンプし、ビーズを再懸濁させる。
（ｅ）  前記サンプルインプット貯槽の下に磁石を再度持ち上げ、内容物を廃棄へポンプする。
【０２５６】
ヒートショック
場合によりヒートショックを前記磁気免疫分離ステップでキャプチャされた生きている有機体の試験のために実施する（でない場合は、以下説明する標準ＰＣＲ方法によりＤＮＡ増幅へ進む）。
【０２５７】
増幅はＲＮＡ（増幅試薬及びＲＮＡ増幅技術（例えば、ＴＲ−ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡ又はこれらと知られた同等の方法）を用いて実施される。
（ａ）  磁石を下げる。
（ｂ）  ４０μｌのヌクレアーゼフリー水を前記非加熱されていない磁気分離ユニット貯槽内に分配し、全内容物を加熱された磁気分離貯槽へポンプし、ゆっくりとフラフィングしてビーズを再懸濁させる。
（ｃ）  ヒーターを入れて、５分間４２℃とする。生きているクリプトはヒートショックタンパク質をコードするＲＮＡを発現し始める。
【０２５８】
溶解及び精製
全ての試薬はＱｉａｇｅｎから入手可能である。容量をＣＡＲＤの自動操作のために調節する。
（ａ）  １００μｌのＱｉａｇｅｎ溶解緩衝液ＲＬＴを前記溶解緩衝液貯蔵へ分配、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプし、６回フラフィングして撹拌する。その後前記ヒーターの温度を６０℃へ上げて１０分間インキュベートする。１０分間で２回フラフィングし、５分間で１回フラフィングし、その後丁度１０分直前フラフィングする。
（ｂ）  １００μｌのエタノールを前記エタノール貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプし、６回フラフィングする。
（ｃ）  前記サンプルインプット貯槽の全内容物を前記シリカフィルタの上部にポンプし、その後前記内容を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を３０秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
（ｄ）  １００μｌのエタノールをエタノール貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタの上部へポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を３０秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
（ｅ）  １００μｌの緩衝液２を緩衝液２貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタの上部にポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を３０秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
（ｆ）  １００μｌの緩衝液３を緩衝液２貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタ上部へポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を３０秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
（ｇ）  １００μｌのエタノールをエタノール貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタ上にポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を３０秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
（ｈ）  ４０μｌのヌクレアーゼフリーの水を、前記非加熱磁気分離貯槽へ分配し、全内容を前記シリカフィルタを通してポンプして満たし、２分間インキュベートし、その後全内容をポンプして前記加熱磁気分離貯槽へ戻す。
【０２５９】
ｍＲＮＡ分離
全ての試薬はＤｙｎａｌから入手される。容量はＣＡＲＤで自動操作されるように調節される。
（ａ）  １００μｌの結合緩衝液及びその後２０μｌのビーズを前記非加熱磁気分離貯槽へ分配し、その後前記結合緩衝液を前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。ゆっくりと撹拌して５分間インキュベートする。
（ｂ）  前記非加熱磁気分離貯槽の下に磁石を上げ、内容物を廃棄へポンプする。
（ｃ）１００μｌの洗浄緩衝液Ａを洗浄緩衝液Ａ貯槽に分配し、それを前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。磁石を下げてゆっくりとフラフィングしてビーズを再懸濁させる。
（ｄ）  磁石を前記非加熱磁気分離貯槽の下に持ち上げ、内容物を廃棄へポンプする。
（ｅ）  ステップ（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す。
（ｆ）  １００μｌの洗浄緩衝液Ｂを洗浄緩衝液Ｂ貯槽に分配し、それを前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。磁石を下げてゆっくりとフラフィングしてビーズを再懸濁される。
（ｇ）  磁石を前記非加熱磁気分離貯槽の下に持ち上げ、内容物を廃棄へポンプする。
（ｈ）  ステップ（ｆ）と（ｇ）を繰り返す。
（ｉ）  前記非加熱磁気分離貯槽が空の際に（ビーズ以外）、前記洗浄緩衝液Ｂ貯槽空気を逆ポンプして前記チャンネル及びダイヤフラムから全ての残留流体を除いてきれいにする。
【０２６０】
ＮＡＳＢＡ増幅
（ａ）  磁石を前記非加熱磁気分離貯槽の下から下げる。
（ｂ）  ３０μｌのＮＡＳＢＡマスタ混合物を、増幅マスタ混合物貯槽へ分配し、それを前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。前記非加熱磁気分離貯槽の内容物をフラフィングしてビーズを再懸濁させる。
（ｃ）  前記非加熱磁気貯槽の内容物を前記増幅マスタ混合物貯槽へポンプして戻す。
（ｄ）  前記多目的ヒーターの温度を４１℃へ上げる。
（ｅ）  前記増幅マスタ混合物貯槽の内容物を前記増幅リアクタを通して吸引し、少量を廃棄へポンプする。このプロセスは前記増幅リアクタを完全に流体で満たす（空気の泡がない）。
（ｆ）  前記増幅クリアクタの内容物を、４１℃で９０分間インキュベートする。
【０２６１】
ラテラルフロー分析
（ａ）  ２０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を前記ハイブリダイゼーション緩衝液貯槽に分配し、その最初の４μｌ部分を廃棄へポンプして前記チャンネル及びダイヤフラムをきれいにする。
（ｂ）  前記ハイブリダイゼーション緩衝液の４μｌを前記加熱分析貯槽へポンプする。
（ｃ）  前記増幅リアクタから最初の１４μｌの容量を廃棄へポンプして前記チャンネルとダイヤフラムをきれいにする。
（ｄ）  その後前記増幅リアクタから２μｌを前記加熱分析貯槽へ、その後前記ハイブリダイゼーション緩衝液から６μｌを前記加熱分析貯槽へポンプする。
（ｅ）  マーカー（この場合、前記アンプリコンと相同性のオリゴヌクレオチドでタグ化され、前記ラテラルフロー分析のエンドポイントで可視化され得るマーカーで満たされたリポソーム）の４μｌを前記加熱分析貯槽へ分配する。ゆっくりと撹拌しながら４１℃で５分間インキュベートする。
（ｆ）  前記加熱分析貯槽の内容物の８μｌを前記分析貯槽内のラテラルフローストリップへポンプする。
（ｇ）  同時にランニング緩衝液の３５μｌをランニング緩衝液貯槽に分配し、それを、最初の８μｌ又は前記加熱分析貯槽からの溶液が前記ラテラルフローストリップにポンプされる後に、前記ラテラルフローストリップにポンプする。
（ｈ）  タグ化されたリポソームが、前記アンプリコンとハイブリダイゼーションすると、前記ラテラルフローストリップに結合された他の相補的オリゴヌクレオチドによりキャプチャされ、前記リポソームに含まれる内部色素が同じ点で可視化され得る。
【０２６２】
画像分析
（ａ）  カメラを前記分析膜上に配置し、画像を記録する。
（ｂ）  前記画像を制御システムへ処理のために送る。
（ｃ）  結果を報告する。
【０２６３】
図４４は、ＣＡＲＤに基づく検出から得られた結果を示す。クリプトスポリジウムからのヒートショックｍＲＮＡが検出される。ＩＭＳ＝磁気免疫分離、ＨＳ＝ヒートショックを示す。
【０２６４】
ここで引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参照文献は、参照されて本明細書に援用される。即ち個々の文献の全内容が個別にかつ具体的に参照されて本明細書の援用される。
【０２６５】
ここで本発明を記載する内容において、用語「１つの」、「及び」、「前記」及び類似の参照用語は、特に断りがなされない限り、単数及び複数の両方含む。用語「含む」、「持つ」は、特に断りがなされない限り、制限的に使用されるものではない（即ち、「含む、しかし限定されるものではない」という意味である）。用語「接続され」は、部分的又は中に完全に含まれる、付されているか又は一緒に連結されている、と解釈されるべきである。
【０２６６】
ここで使用される数値範囲とは、特に断りがなされない限り、前記数値範囲に入るそれぞれの値を個別に参照する簡便な方法としてのみ使用されているものである。さらにそれぞれの別々の値は、ここであたかも個別に引用されているように、明細書内に取り込まれる。
ここで記載される全ての方法は、特に断りがなされない限り、全ての適切な順序で実施され得るものである。ここで全ての例又は例示的用語（例えば「など」、「例えば」など）は、本発明の実施態様をよりよく理解するために意図的に使用されるものであり、特に断りがなされない限り、特許請求の範囲の本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２６７】
明細書では、いかなる用語も、請求されていないエレメントを本発明の実施に本質的なものとして示すように解釈されてはならない。
【０２６８】
当業者には明確なことであるが、本発明の本質及び範囲から離れることなく種々の変更・変法が本発明でなされ得る。本発明を開示された具体的な形状に限定する意図はなく、逆に、本発明の本質及び範囲に含まれる全ての修正、変更構成及びそれに均等な構成が全て本発明に含まれる、ということを意図するものである。従って、本発明は、特許請求の範囲の範囲に含まれるものである限り、本発明の修正。変更。変法などを全て含むことを意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2013520658.tif 000036
【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2013520658.tif 000052
【図２１Ａ】
2013520658.tif 000053
【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
2013520658.tif 000056
【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
2013520658.tif 000058
【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
2013520658.tif 000060
【図２１Ｉ】
2013520658.tif 000061
【図２１Ｊ】
2013520658.tif 000062
【図２１Ｋ】
2013520658.tif 000063
【図２２】
2013520658.tif 000064
【図２３】
2013520658.tif 000065
【図２４】
2013520658.tif 000066
【図２５】
2013520658.tif 000067
【図２６Ａ】
2013520658.tif 000068
【図２６Ｂ】
2013520658.tif 000069
【図２７】
2013520658.tif 000070
【図２８】
2013520658.tif 000071
【図２９】
2013520658.tif 000072
【図３０】
2013520658.tif 000073
【図３１】
2013520658.tif 000074
【図３２】
2013520658.tif 000075
【図３３】
2013520658.tif 000076
【図３４】
2013520658.tif 000077
【図３５Ａ】
2013520658.tif 000078
【図３５Ｂ】
2013520658.tif 000079
【図３５Ｃ】
2013520658.tif 000080
【図３５Ｄ】
2013520658.tif 000081
【図３６】
2013520658.tif 000082
【図３７Ａ】
2013520658.tif 000083
【図３７Ｂ】
2013520658.tif 000084
【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013520658.tif 000099
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