(57)【要約】本発明の主題は、標的核酸配列とハイブリダイズできる核酸分子の組み合わせである。ＦＩＳＨアッセイの再現性の問題を克服し、アッセイ時間を減少させるために、ヘアピンプローブを、ヘアピンプローブの標的部位に隣接してアニールするヘルパープローブと組み合わせて用いる。【選択図】図３
2013520980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列とハイブリダイズできる核酸分子の組み合わせであって、組み合わせが、
（ａ）
（ｉ）標的配列とハイブリダイズできる配列と、
（ｉｉ）ステムを形成できる２つの相補配列と、
（ｉｉｉ）発光基及び消光基と
を含む少なくとも１つの第１核酸分子であり、核酸がステム−ループ構造を形成すると消光基が蛍光基を消光し、オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズすると蛍光基が励起により発光シグナルを発することができる、少なくとも１つの第１核酸分子と、
（ｂ）第２核酸分子、第３核酸分子及び場合によって少なくとも１つのさらなる核酸分子と
を含み、第２核酸分子、第３核酸分子及び場合による少なくとも１つのさらなる核酸分子が、第１核酸がハイブリダイズする配列の５’側又は／及び３’側に位置する配列にて標的配列とハイブリダイズする組み合わせ。
【請求項２】
核酸が、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、特にＦＩＳＨに適切である、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項３】
標的核酸配列が、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列から選択され、標的核酸配列が、好ましくはｒＲＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列である、請求項１又は２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
核酸分子が、互いに直接隣接する場所にて標的配列とハイブリダイズするか、又は少なくとも２つの核酸分子が、少なくとも１つのヌクレオチドのギャップにより互いに分離された場所にて標的配列とハイブリダイズする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項５】
標的配列とハイブリダイズする核酸分子の少なくとも１つの配列が、１６〜２６ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６】
組み合わせの核酸分子が、
（ｉ）−１５〜−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のΔＧで、
（ｉｉ）−６０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ若しくは−１００〜−１２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲の組み合わせたΔＧで、又は／及び
（ｉｉｉ）標的配列の天然のリフォールディングにより生じるΔＧよりも負が大きいΔＧで
標的配列と独立してハイブリダイズする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項７】
診断用の、特に細胞の存在の診断のための請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項８】
抗生物質耐性、毒素生成又は／及び癌遺伝子発現の決定のための請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み合わせを含むキット又はチップ。
【請求項１０】
試料中の細胞を同定する方法であって、
（ａ）試料を用意するステップと、
（ｂ）（ａ）の試料を、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子の組み合わせと、細胞におけるオリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させるステップと、
（ｃ）第１核酸分子の発光基の発光を決定するステップと
を含み、
第１オリゴヌクレオチドの蛍光が、標的配列の存在を示す、方法。
【請求項１１】
試料が、生体試料、特に臨床試料から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、特にＦＩＳＨにより行われる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）で使用するハイブリダイゼーション緩衝液が、２価カチオンを含有しない、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の同定のための請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み合わせ又は請求項９に記載のキット若しくはチップの使用。
【請求項１５】
細胞の存在の診断用の医薬組成物の製造のための請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み合わせ又は請求項９に記載のキット若しくはチップの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための多重ヘアピンループの使用と、アッセイの再現性、特異性及び速度の増強とに関する。本発明の第１の態様は、標的核酸配列とハイブリダイズできる核酸分子の組み合わせであって、（ａ）ヘアピンループを形成できる配列（例えば分子ビーコン）を含む少なくとも１つの核酸と、（ｂ）ヘルパー核酸である第２核酸分子、第３核酸分子及び場合によって少なくとも１つのさらなる核酸分子とを含む組み合わせである。
【背景技術】
【０００２】
臨床試料中の病原性生物の迅速な同定は、死亡率、罹患率及び感染性疾患の治療の費用を低減するために、ますます重要性が増している。ＤＮＡ−ビーコン技術をｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの用途に用いること（１）における進展により、ＦＩＳＨ技術は、ＰＣＲ系及びマイクロアレイ技術と速度の点で競争すること及び費用効率の点で勝ることが可能である。本発明の目的は、ＦＩＳＨが経験している再現性の問題を解決し、さらにアッセイ時間の速度をさらに増加することであった。
【０００３】
アッセイの速度を増加するために、アッセイの動力学を分析する必要がある（２）。ＰＣＲアッセイにおいて、ハイブリダイゼーションに関与する全ての成分は、均質な溶液中にあり、２次速度論に従う。マイクロアレイは、捕捉オリゴヌクレオチドが固相に固定され、分析物が溶液中にあるので擬１次速度に従う（３）。ＦＩＳＨでは、それぞれの役割が交換されているが（すなわち、分析物が固相に固定され、オリゴヌクレオチドが溶液中にある）、構成は速度論の観点から類似している。プローブが固相に結合している場合に測定される速度定数は、溶液中で測定されるものよりも３桁ほど大きさが低かった（３）。よって、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション速度論を均質な溶液中のものと同じ次数の大きさにできるとは期待できない。
【０００４】
先行技術（ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ）のハイブリダイゼーションアッセイの速度論的特性は、次のようにまとめることができる。
【０００５】
2013520980.tif 000003
【０００６】
ＰＣＲの固有の問題は、それが阻害剤に感受性であり、影響を受けやすいことである。臨床試料についてのＰＣＲでは、ＤＮＡ／ＲＮＡは、ポリメラーゼ阻害成分を頻繁に有する非常に粗製で過剰に変動性のマトリクスから抽出される。そのような阻害剤は、望ましくない偽陰性の結果を生じることがある。ＦＩＳＨは、シグナルを発するために酵素を必要とせず、よってそのような限定の下にない。
【０００７】
マイクロアレイ技術は、既知の配列を固相支持体に固定することを含む。リボソームＲＮＡに対するハイブリダイゼーションのために用いる場合、マイクロアレイ技術は、２次及び３次構造を示す大きいＲＮＡ分子内の標的配列への近づきやすさの問題に取り組まなければならない。Ｆｕｃｈｓらは、１６Ｓ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡの両方における領域が、様々な程度の近づきやすさを有することを丹念に示した（４、５）。これは、容易に近づくことができる部位（ＦｕｃｈｓスコアＩ）から全く近づくことができない部位（ＦｕｃｈｓスコアＶＩ）にまで及び得る。領域に近づくことができないことは、種特異性のために選択できる部位を限定する。同じく、近づくことができない領域は、最大の変異性を示し、種特異的プローブのために最も望ましい標的である。さらに、それが部分的であっても近づくことができない配列を用いようとする試みは、アッセイにおける非常に望ましくない変動要因としてハイブリダイゼーション結果に揺らぎを導入する。
【０００８】
ＦＩＳＨプローブもインタクトなリボソームの複雑な構造に対してハイブリダイズしなければならないので、同じ困難を有する。さらに、直鎖状プローブを、近づくことができる部位とハイブリダイズさせることも、蛍光体とタンパク質／ＲＮＡ複合体との相互作用により消光を引き起こすことがある。このような場合、生物の総数の１％〜２０％の間の様々な量だけが蛍光を示す。この変動要因を有する結果の解釈は、広範な知見及び読み取りの経験を必要とする。試料調製及び温度の揺らぎのようなその他の実験的変動要因により、ＦＩＳＨは、偽陰性の結果を生じる傾向を有する。信頼できる結果を得るために、丹念な制御を組み込まなければならない。プローブが特異的配列に近づくことを２次構造が阻害しないように、プローブ設計において注意しなければならない。ほとんどの種特異的配列は、近づきやすさが乏しい変動性の領域にあるので、このことは難題である（６）。さらに、ハイブリダイゼーション及び洗浄中の温度が精密に制御されないならば、ハイブリダイゼーションは起こらず、偽陰性が生じることがある。ＦＩＳＨアッセイの使用における初期の情熱は、不安定な性能によりすぐに失望に置き換わった。
【０００９】
ＦＩＳＨは、
（ａ）自己蛍光の不適当な読み取りにより、
（ｂ）試料を起源とする粒子状物質の不適当な読み取りにより、
偽陽性の結果を生じることがあり、
（ｃ）直鎖状プローブを用いる場合、不適当な洗浄が偽陽性の最も頻度が高い源であり、
（ｄ）不適当なプローブ設計により、密接に関連する生物との交差反応性が生じることがある（７）。
【００１０】
増幅アッセイの絶対的分析感度により、アッセイは、試料採取中又は実験室においてＤＮＡ／ＲＮＡ混入の影響を受けやすくなる（これは次いで、偽陽性の結果を生じる）。偽陽性は、複雑な閉鎖系を用いることにより低減されることがある。
【００１１】
ＦＩＳＨ技術が競合するために、ＦＩＳＨ技術の手順及びハイブリダイゼーション条件は、アッセイの取り扱い、速度論及びハイブリダイゼーション手順に関して能率化される必要がある。感度及び特異性、並びにエネルギー転移の速度及びハイブリダイゼーション速度論を確実にし、よってＦＩＳＨにおける問題を排除し、性能を著しく増強するための解決策を見つけなければならない。
【００１２】
Ｆｕｃｈｓらは、懸濁大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の１６Ｓ  ＲＮＡにおいて、少なくとも９０分間の標準的ハイブリダイゼーション時間を用いて、弱い４〜７％から最適シグナルである７５％までのシグナルの増加としてヘルパーオリゴヌクレオチドの使用を示した（６）。蛍光を発する大腸菌細胞は、フローサイトメトリーにより検出された。Ｆｕｃｈｓらの教示は、ヘルパーオリゴヌクレオチドが、２次及び３次構造の付近におかれた場合にシグナルを増加できることであり、多重隣接ヘルパーオリゴヌクレオチドの協同の作用により、ｒＲＮＡ上の全ての部位がＦＩＳＨのために開放されることを示唆する。しかし、これらの教示は、変動する結果を生じる使用と一致しない。いくつかの場合では、４つの隣接ヘルパーが、２つのヘルパーのシグナルに関してシグナルを低減した。
【００１３】
Ｆｕｃｈｓ（６）は、様々なヘルパーの異なる効率について記載し、プローブに隣接するヘルパーがこの領域において最も効率が高かったことを見出した。これらのデータに基づくと、ヘルパーについての最適な位置が、ｒＲＮＡ内の標的の配列及び位置におけるそれぞれの違いによって生物ごとに変動することが期待される。
【００１４】
シグナル限定因子は、生物に存在するリボソームの数である。シグナル限定因子は、次いで、生物がストレス条件に対してどのように反応するかに依存する。ストレス条件下では、リボソームの数が下方制御され、完全な４＋から非常に弱いシグナルにＦＩＳＨのシグナル強度を変化させることが当該技術において公知である（７）。
【００１５】
米国特許第５，０３０，５５７号は、単離リボソームＲＮＡを標的として使用する、溶液中で行われたハイブリダイゼーション実験について記載している（８）。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、リボソームＲＮＡへの標識オリゴヌクレオチドの結合を増強するために用いられる。しかし、このことは、増強シグナルを達成するために１晩のインキュベーションを必要とした。さらに、米国特許第５，０３０，５５７号は、改善を達成するために５０〜２００倍高い各ヘルパーの濃度を要求する（８）。さらなるヘルパーを加えることにより、シグナルが２０％増加し、第３のヘルパーをさらに加えることにより、シグナルはさらに７％だけ増加した。米国特許第５，０３０，５５７号のデータを図１にまとめる。
【００１６】
まとめとして、ハイブリダイゼーションによる病原性微生物の迅速同定は、以下の短所により妨げられる。
マイクロアレイ法は、長いインキュベーション時間を必要とすることがわかっている。
ＰＣＲ法は、マイクロアレイ法より速い。ＰＣＲは、粗製試料に曝露された場合に阻害されることがあるポリメラーゼを必要とする。よって、臨床試料はＰＣＲの前に精製されるべきである。
ＦＩＳＨのようなｉｎ−ｓｉｔｕ法は、同定しようとする細胞における標的配列への近づきやすさにより妨げられることがある。一様なハイブリダイゼーション条件は存在しない。むしろ、ｉｎ−ｓｉｔｕ法は、それぞれの新しい標的配列又は／及び生物におけるハイブリダイゼーション条件の適合を必要とする。ｉｎ−ｓｉｔｕ法の実験条件は、偽陰性又は偽陽性の結果を回避するために非常に注意深く制御されなければならない。さらに、ｉｎ−ｓｉｔｕ法は、長いインキュベーション時間を必要とする。
【発明の概要】
【００１７】
本発明では、１００％の完全シグナルが、ｒＲＮＡ内の位置及び選択した生物に関係なく、表面に固定された細胞に対するＦＩＳＨアッセイにおいて、分子ビーコンと少なくとも２つのヘルパーオリゴヌクレオチドとの組み合わせにより８分間で達成できることが驚くべきことに見出された。本発明で計画されるようにヘルパーをビーコンと一緒に用いることが、全ての生物の再現可能で均質な染色を完全シグナル強度とともに生じることは、さらに驚くべきことであった。
【００１８】
ビーコン−ヘルパーアレイの上記の厳密な設計及びアッセイ条件が、ＦＩＳＨ手順が遭遇していた問題点を除去したことは、驚くべきことであった。
【００１９】
本発明の目的は、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのヘルパー配列と分子ビーコンとの組み合わせについての普遍的な規則を見出し、ＦＩＳＨにおけるハイブリダイゼーション速度論を今まで制限してきた熱力学的制限及び熱移動を克服することである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】米国特許第５，０３０，５５７号（「従来のプローブ」）に由来するハイブリダイゼーションデータと本発明のハイブリダイゼーションデータとの比較。米国特許第５，０３０，５５７号の表Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂ及びＩＩｃのデータを平均化している。（１）米国特許第５，０３０，５５７号によるプローブ単独。（２）米国特許第５，０３０，５５７号によるプローブと１つのヘルパー。（３）米国特許第５，０３０，５５７号によるプローブと２つのヘルパー。（４）米国特許第５，０３０，５５７号によるプローブと３つのヘルパー。（５）本発明によるプローブ（分子ビーコン）と４つのヘルパー核酸。「１２分」及び「１晩」は、ハイブリダイゼーション期間を示す。「１晩の％改善」は、１２分間のハイブリダイゼーションと比較した、１晩インキュベーションのハイブリダイゼーションによる％改善を示す。「％ハイブリダイゼーション」は、ハイブリダイゼーションプローブが占める試料中のハイブリダイゼーション部位のパーセンテージを示す。
【図２】ハイブリダイゼーションの速度論。（１）ヘルパーを有する大腸菌分子ビーコン、（２）ヘルパーを有さない大腸菌、（３）ヘルパーを有するＢ−Ｓｔｒａｇａ−３分子ビーコン（表４を参照されたい）、（４）ヘルパーを有さないＢ−Ｓｔｒａｇａ−３。蛍光は、相対的単位で示す。
【図３】分子ビーコン及び４つのヘルパーオリゴヌクレオチドとｒＲＮＡ配列とのアラインメントを示すスキーム。
【図４】表１は、本発明のビーコン配列を示す。略語：Ｒ＆Ｇ：Ｃｙ３若しくはＦＩＴＣ又はそれらの誘導体のような赤色又は／及び緑色蛍光色素をビーコンに結合させてもよい。
【図５】表２は、ＰＮＡビーコンが、本発明において適切でないことを示す。計算は、ビーコンがＰＮＡビーコンであると仮定して、表１の配列を用いて行った。ＤＮＡビーコンとは対象的に、以下の５つの基準の全てが充足されなければならない：ＧＣ含量＜６０％、＜３塩基の自己相補性、連続で４つのプリン、最大で１８の長さ、逆配列回文又は反復又はヘアピン。表２における「有」（「無」）は、基準が充足される（充足されない）ことを示す。「最終」の列は、ＰＮＡビーコンが本発明に適切である（「有」）か又はそうでない（「無」）ことを示す。最終における「いいえ」は、５つの基準のうちの１つが満たされないことを示す。「有」は、全ての基準が満たされることを示す。表２の全ての配列は、「無」と判断される。よって、表１の配列はいずれも、ＰＮＡビーコンにおいて適切でない。
【図６】表３：表１と同一の条件下で働き、非常に類似した物理化学的条件を有するビーコンプローブのリスト。
【図７】表４：ヘアピンループとヘルパー核酸との個別の組み合わせであって、ビーコン及びヘルパー配列の同族配列が、微生物（「標的生物」）の標的配列上に局在している組み合わせ。ヘアピンループ配列において、同族配列に相補的な配列に下線を付す。「ｒＲＮＡ」は、当てはまるならば、１６Ｓ又は２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける標的配列の局在のことをいう。「大腸菌とのアラインメント」は、それぞれ大腸菌１６Ｓ又は２３Ｓ  ＲＮＡにおける対応する配列の位置のことをいう。「Ｆｕｃｈｓスコア」は、Ｆｕｃｈｓら（４）において定義されるスコア（明度のクラス）のことをいう。「キットにおける活性ビーコン」の列は、組み合わせの好ましい群を示す。組み合わせの好ましい群は、グラム陰性生物の血液培養（ＢＣ）中の生物、グラム陽性生物の血液培養中の生物、肺炎を引き起こす生物、嚢胞性線維症と関連する生物、及び糞便で見出される生物を同定するために適切な組み合わせの群のことをいう。これらの「診断群」のメンバーは、各列において「１」で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の第１の態様は、標的核酸配列とハイブリダイズできる核酸分子の組み合わせであって、組み合わせが、
（ａ）
（ｉ）標的配列とハイブリダイズできる配列と、
（ｉｉ）ステムを形成できる２つの相補配列と、
（ｉｉｉ）発光基及び消光基と
を含む少なくとも１つの第１核酸分子であり、核酸がステム−ループ構造を形成すると消光基が蛍光基を消光し、オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズすると蛍光基が励起により発光シグナルを発することができる、少なくとも１つの第１核酸分子と、
（ｂ）第２核酸分子、第３核酸分子及び場合によって少なくとも１つのさらなる核酸分子と
を含み、第２核酸分子、第３核酸分子及び場合による少なくとも１つのさらなる核酸分子が、少なくとも１つの第１核酸がハイブリダイズする配列の５’側又は／及び３’側に位置する配列にて標的配列とハイブリダイズする組み合わせである。
【００２２】
標的核酸配列とハイブリッドを形成でき、標的配列とハイブリッドが形成されないときはステム−ループ構造を形成できる本発明の少なくとも１つの第１核酸は、本明細書において、「ビーコン」、「分子ビーコン」、「ヘアピン」又は「ヘアピンループ」ともいい、「開放」形（ステムが形成されない）及び「閉鎖」形（ステムが形成される）が含まれる。開放形は、標的配列とハイブリッドを形成しないビーコン及び標的配列とハイブリッドを形成するビーコンを含む。
【００２３】
特に、第１核酸分子は、ヘアピンループ、例えば分子ビーコンを形成できる配列を含む。
【００２４】
第１核酸分子の配列（ｉ）は、本明細書において、「プローブ配列」又は「分子ビーコンのプローブ配列」とも称する。
【００２５】
１つより多い第１核酸が存在するならば、２つ以上の第１核酸がハイブリダイズする配列は、互いに直接隣接して独立して位置するか、又は１、２、３、４、５若しくはそれより多いヌクレオチドのような少なくとも１つのヌクレオチドのギャップにより独立して分離されてもよい。２つ以上の第１核酸がハイブリダイズする配列は、１又は複数のヘルパーがギャップ内の配列とハイブリダイズできるように十分に大きいギャップにより分離されてもよい。
【００２６】
１つより多い第１核酸が存在するならば、これらは、同じ遺伝子を指向してもよい。言い換えると、１つより多い第１核酸が存在するならば、１つより多い第１核酸の標的配列は、同じ遺伝子から得られる配列から選択できる。好ましくは、これらの配列はオーバーラップしない。このことにより、増幅することなく個別の遺伝子の検出が可能になる。
【００２７】
１つより多い第１核酸が存在するならば、これらは、同じ遺伝子の発現生成物ｍＲＮＡを指向してもよい。言い換えると、１つより多い第１核酸が存在するならば、１つより多い第１核酸の標的配列は、同じ遺伝子により発現されたｍＲＮＡから得られる配列から選択できる。好ましくは、これらの配列は、オーバーラップしない。このことにより、増幅することなく個別の遺伝子の検出が可能になる。
【００２８】
本発明では、「互いに直接隣接して位置する」とは、核酸分子が標的配列上の隣接する位置にてハイブリダイズするならば、ギャップが残されないことを意味する。
【００２９】
第２核酸、第３核酸及び少なくとも１つのさらなる核酸は、本明細書において、「ヘルパー」又は「ヘルパー核酸」又は「ヘルパーオリゴヌクレオチド」と命名する。
【００３０】
本発明において設計されるヘルパーの同族配列は、ビーコンの同族配列の５’又は／及び３’端上に近接して配置してもよい。多重のヘルパーを用いてもよいが、完全シグナル強度は、２、３又は４つのヘルパーのいずれかを用いて達成できる。本発明の組み合わせは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８又は１０のヘルパー核酸を含む。好ましくは、本発明の組み合わせは、２、３、４のヘルパー核酸を含む。
【００３１】
本発明の組み合わせの核酸は、互いに直接隣接する場所にて標的配列とハイブリダイズするか、又は１、２、３、４、５若しくはそれより多いヌクレオチドのような少なくとも１つのヌクレオチドのギャップにより独立して分離されていてもよい。例えば、少なくとも２つの核酸分子は、１、２、３、４、５又はそれより多いヌクレオチドのような少なくとも１つのヌクレオチドのギャップにより互いに分離された場所にて標的配列とハイブリダイズしてもよい。
【００３２】
より好ましくは、本発明の組み合わせは、４つのヘルパー核酸を含む。最も好ましい構成では、４つのヘルパーの同族配列は、直接隣接して、ビーコンの同族配列の隣にギャップなく互いに直接隣接して、ビーコンの同族配列の５’側方に２つ及び３’端に２つ位置する。一例を図３に示す。この設計では、標的配列位置及びＦｕｃｈｓによる近づきやすさは無視できる。
【００３３】
標的配列は、少なくとも１つの第１核酸分子、第２核酸分子、第３核酸分子及び場合による少なくとも１つのさらなる核酸分子がハイブリダイズする配列が、標的配列の非オーバーラップ配列であるように選択してもよい。
【００３４】
例示的構成を図３に示す。「１」及び「２」と称するヘルパーは、ビーコンのステム部分をリボソームから遠ざけ、スペーサーとして機能するビーコンのプローブ配列の５’端から延び、「３」及び「４」と命名するヘルパーは、３’端から延びる。ヘルパー２及び４は、等しくギャップなくそれぞれ５’及び３’端上でヘルパー１及び３の隣に配置される。ハイブリダイゼーションにおける最大限の相乗作用を達成するために、全てのプローブ及びヘルパー配列は、同族配列との結合に関して同じ熱力学的特性を有していてもよい。オリゴヌクレオチドのこの厳密な選択により、リボソームＲＮＡの再現可能な開放のための１００塩基（例えば８９〜１２０の間）の長さのリボソームＲＮＡをカバーする大量ハイブリダイゼーション動作と、小さい２０マー（１６〜２６マー）オリゴヌクレオチドの迅速な速度論及び高い特異性との巧みな編成（全て上記の同じストリンジェントな条件に働く）が可能になる。
【００３５】
本発明の核酸がハイブリダイズする標的配列の配列は、本明細書においてそれぞれの核酸の「同族配列」と称する。例えば、第１核酸（すなわち分子ビーコン）の同族配列は、本明細書で示すように、配列（ｉ）がハイブリダイズする標的配列の配列である。本発明の組み合わせの核酸分子と標的配列とのハイブリッドは、本明細書において、「同族配列とのハイブリッド」又は「同族ハイブリッド」ともいう。
【００３６】
本発明の様々な実施形態で使用される標的核酸配列は、細胞の核酸配列であってもよい。細胞は、真核細胞又は原核細胞であってもよい。細胞は、生体試料又は臨床試料に存在できる任意の細胞であってもよい。特に、標的核酸配列は、細菌、酵母及びカビから、特にグラム陽性又は／及びグラム陰性細菌から選択される微生物のような微生物の核酸配列であってもよい。疾患状態に依存して、あるいくつかの病原体は最も頻繁に原因因子であり、よって、診断群にまとめることができる。あるいくつかの病原体の追加又は省略が、９５百分位数に到達するために地域疫学に依存して要求されることがある。表１の列挙は、欧州及び北米のほとんどでの要件をカバーする。微生物は、好ましくは、表１及び表４に列挙する微生物から選択される。
【００３７】
本発明で使用される細胞は、懸濁又は／及び懸濁培養に維持されてもよい。
【００３８】
標的核酸配列は、ＤＮＡ配列又は／及びＲＮＡ配列、特に細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ又は／及び細菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列のようなｒＲＮＡ配列であってもよい。標的核酸配列は、ｍＲＮＡ配列であってもよい。
【００３９】
特に、第１核酸分子の２つの相補配列（ｉｉ）は、配列（ｉ）を挟み、すなわち（ｉｉ）の第１配列が配列（ｉｉ）の３’端に位置し、（ｉｉ）の第２配列が配列（ｉ）の５’端に位置する。
【００４０】
（ｉｉ）の２つの相補配列は、４〜１０ヌクレオチド、特に４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多いヌクレオチドの長さを独立して有してもよい。好ましくは、（ｉｉ）の２つの配列は、同じ長さを有する。
【００４１】
第１核酸分子において、発光基は、ステムを形成できる２つの相補配列の一方に結合してもよく、消光剤は、２つの相補配列の他方に結合してもよく、よって消光剤が、ステムが形成される場合に発光を本質的に消光し、発光は、ヘアピンが開放される場合に発光シグナルを発することができる。
【００４２】
好ましくは、発光基は、少なくとも１つの第１核酸分子の５’端にて、又は５’端から１、２、３、４、５若しくは６ヌクレオチド離れた位置にて独立して結合する。この場合、消光剤は、発光基により覆われていない他方の端、すなわち３’端にて、又は３’端から１、２、３、４、５若しくは６ヌクレオチド離れた位置にて独立して結合する。
【００４３】
発光基が、少なくとも１つの第１核酸分子の３’端にて、又は３’端から１、２、３、４、５若しくは６ヌクレオチド離れた位置にて独立して結合することも好ましい。この場合、消光剤は、発光基により覆われていない他方の端、すなわち５’端にて、又は５’端から１、２、３、４、５若しくは６ヌクレオチド離れた位置にて独立して結合する。
【００４４】
発光基は、少なくとも１つの第１核酸分子とリンカーにより独立して連結してもよい。消光基は、少なくとも１つの第１核酸分子とリンカーにより独立して連結してもよい。当業者は、適切なリンカーを熟知している。リンカーは、少なくとも１つのヌクレオチドを独立して含んでもよい。
【００４５】
当業者は、適切な発光基及び消光剤を熟知している。発光基は、好ましくは、蛍光基である。適切な蛍光基は、ＵＶから可視まで、ＩＲ光範囲までを吸収し、励起及び発光により光を物理的に分離することを可能にするストークスシフトで発光する、商業的に容易に入手可能なものから独立して選択できる。蛍光基において、自己蛍光は、増強されたストークスシフトにより低減され得る。適切な蛍光基は、ＦＡＭ、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ及びそれらの誘導体から独立して選択してもよい。
【００４６】
発光、特に蛍光は、顕微鏡観察、フローサイトメトリー又は当該技術において既知の任意のその他の適切な方法により決定してもよい。懸濁又は懸濁培養に維持している細胞において、発光、特に蛍光は、フローサイトメトリーにより決定してもよい。
【００４７】
本発明のビーコンと標的配列とのハイブリダイゼーションは、同族配列の存在下でループが折り畳まれない条件下で起こることができる。閉じたステムを有するビーコンは、より高い特異性を示し、配列の長さの増加による減少を補償する。
【００４８】
この目標は、ハイブリダイゼーション条件下でさえ負であるがループ配列（同族ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）よりも実質的に高い（あまり負でない）ΔＧを有するステム配列を、好ましくはＭｇ２＋の非存在下で選択することにより達成される。よって、標的配列とのハイブリダイゼーションは、Ｍｇ２＋を本質的に含まない条件によりステムが不安定化される場合に起こることができる。
【００４９】
「実質的により高いΔＧ」とは、約−１５〜約−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間、好ましくは約−１７〜約−２３ｋｃａｌ／ｍｏｌの間、さらにより好ましくは約−１９〜約−２１ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の各ΔＧの差を意味する。
【００５０】
ともにビーコンの一部分を形成する発光基の消光を達成するために、標的配列とハイブリダイズしないビーコン分子において、ハイブリダイゼーション反応の後にステム形成が誘導されなければならない。このことは、例えば、ΔＧ＜０を有するビーコンにより達成でき、よって、ヘアピンが自発的に形成される。さらに、ステム形成は、本明細書で記載するようにＭｇ２＋含有緩衝液で洗浄することにより導入してもよい。
【００５１】
特に、ヘアピンループは、標準化されたハイブリダイゼーション条件下（例えばＭｇ２＋を本質的に含まない条件下）で、可能性のある立体制限がハイブリダイゼーションプロセスを妨げないようにステムが開放されるような方法で構築される。例えば、立体制限は、標的配列がｒＲＮＡ配列である場合に存在し得る。エフェクターが蛍光体であるならば、蛍光体は、リボソームタンパク質の近接により消光されない。
【００５２】
ハイブリダイゼーション後のステム形成の誘導のために適切な条件は、例えば約０．１〜約２０ｍＭ  Ｍｇ２＋、約１〜約２０ｍＭ  Ｍｇ２＋、５〜約１５ｍＭ  Ｍｇ２＋、約８〜約１２ｍＭ  Ｍｇ２＋、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、約２．５ｍＭ〜約７．５ｍＭ  Ｍｇ２＋を含有するＭｇ２＋含有緩衝液を含む。好ましくは、約５ｍＭ  Ｍｇ２＋又は約１０ｍＭ  Ｍｇ２＋の濃度である。緩衝液は、ｐＨ＞８、好ましくは約８．３を有してもよい。ｐＨは、約７．５〜約９又は約８〜約８．５に調整してもよい。
【００５３】
さらに、ヘアピンループはそれらの全体で機能し、切開できない。最近傍のステムとループ及びスタッキング効果は、それらの熱力学的特性にとって重大な影響を有する。本発明の好ましい核酸を、表１、表３及び表４に記載する。これらは、好ましいステム配列が、種を同定するために選択された配列のΔＧ、Ｔｍ、ＧＣ含量又は長さから独立していることを明確に示す。
【００５４】
本発明では、標準化された条件に適切な本発明の組み合わせにおいて使用される核酸の個別の構築についての熱力学的仕様は、次のように設定される。核酸の形成のためのギブズエネルギー（ΔＧ）は、以下のような様式で設計できる。
ハイブリダイゼーション条件下で同族標的配列の非存在下においてヘアピンステムが自発的に形成される（ΔＧ＜０）。
同族ハイブリッドのΔＧが、ヘアピンステムのΔＧよりも著しく低い（すなわち、より負である）。
同族配列の各ΔＧが、ミスマッチ又は非同族配列よりも低い。
ヘアピンループの形成についてのＴｍが、ヘアピンループのＴｍがハイブリッドのＴｍよりも低いか又は本質的にハイブリッドのＴｍであるような様式で設計されなければならない。
【００５５】
特に、本発明の組み合わせの核酸は、標的配列（これは、好ましくは標的ｍＲＮＡ又は標的ＤＮＡ配列である）の天然のリフォールディングにより生じるΔＧよりも負が大きいΔＧで標的配列と独立してハイブリダイズする。
【００５６】
同族ハイブリッド（すなわち、本発明のヘルパー又は／及び分子ビーコンと標的配列とのハイブリッド）のΔＧは、ハイブリダイゼーション条件下で約−１５〜約−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間、好ましくは約−１７〜約−２３ｋｃａｌ／ｍｏｌの間、さらにより好ましくは約−１９〜約２１ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の範囲であることが好ましい。同族ハイブリッドのΔＧは、本明細書で記載する組み合わせの核酸分子について独立して調整してもよい。
【００５７】
ハイブリダイゼーション条件下での少なくとも２つの同族ハイブリッドのΔＧが、５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えて変動せず、好ましくは３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは２ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、最も好ましくは１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。特に、ハイブリダイゼーション条件下での同族ハイブリッドのΔＧは、５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えて変動せず、好ましくは３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは２ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、最も好ましくは１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。
【００５８】
組み合わせの核酸分子は、−６０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又は−１００〜−１２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲の組み合わせたΔＧで標的配列、好ましくは標的ｒＲＮＡ配列と独立してハイブリダイズしてもよい。驚くべきことに、５つの核酸（１つの分子ビーコンを含む）の厳密にギャップを含まない構成を用いて、普遍的に強いシグナルまでのシグナル強度の増加が、大腸菌の１つの領域について達成されただけでなく、強いシグナル増強が、同じ速度論で広範囲の生物における１６Ｓ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡの両方の多数の領域についても達成できたことが見出された。全ての生物について同一条件下で、組み合わせて標準化されたΔＧ＝−６０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌで、単一塩基識別能力を失うことなくハイブリダイズできるような様式で同じ熱力学的特徴を全てが有する標識及び未標識オリゴヌクレオチドを組み合わせることが好ましい。
【００５９】
プローブ集合体の選択についての基準は、よって、当該技術において用いられる今までの駆動熱力学的パラメータとしてのＴｍを無視して、第１に配列特異性により、第２にハイブリダイゼーションの際に生じる自由エネルギー（ΔＧ）により駆動されるように決定できる。全てのヘルパー及びビーコンを、非常によく似た特徴を有するように設計できるので、一致したヘルパーをビーコンと一緒に有することが可能なだけでなく、上記のグループ分けの多重の例を作製することもでき、全て同一条件下で働き、密接に類似した速度論で１６Ｓ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡの両方と結合する。効率的には、例えば短い１８〜２６マーのオリゴヌクレオチドの識別特異性を維持し、よって天然のリボソーム構造の再形成の間の強いシグナルでのハイブリッド結合に好ましいようにしながら、作製した１００マーの自由ハイブリダイゼーションエネルギーを用いてもよい。表４は、それぞれのヘルパーと一緒に設計されたビーコンを、熱力学的特性及びＦｕｃｈｓらによる評点（６）と一緒にまとめる。
【００６０】
時に、同族配列は、ビーコン形成を達成するために１つの腕だけが補充されることを必要とする自発的ヘアピンループを形成してもよい。標的配列がｒＲＮＡ配列であるならば、これは、しかし、エフェクター、例えば蛍光体をリボソームの潜在的に消光性のタンパク質の非常に近傍にする。好ましい構成では、ステムは伸長される。伸長ステムを用いてさえ本明細書で記載する上記の熱力学的仕様に一致するために、方法を工夫して、Ｔｍ及びΔＧの両方を仕様の範囲内に維持するようにした。本発明によると、このことは、少なくとも１つの非一致ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を導入することにより達成できる。本発明では、少なくとも１つの非一致ヌクレオチドの導入は、追加ヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体の導入により増進でき、よって、２つの相補配列は異なる長さを有し、ステムが「曲がる」ようになる（例えば配列番号１の３６位を参照されたい）か、又は／及び一致ヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体を非一致ヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体で置き換えることにより達成できる（例えば配列番号７の５位を参照されたい）。よって、本発明では、「ステムを形成できる相補配列」は、少なくとも１つの非一致ヌクレオチド、好ましくは１、２、３、４又は５の非一致ヌクレオチドも含んでもよい。
【００６１】
表２からわかるように、ＰＮＡ−オリゴヌクレオチドの構築における上記の制限のために、本明細書で開示する配列はいずれもＰＮＡ−ビーコンとして考案できなかった。オリゴヌクレオチドの長さにおける主な制限は、十分な特異性とハイブリダイズしていない場合にループのリフォールディングを確実にするのに十分なステム長さとの両方を必要とした。よって、微生物のｉｎ−ｓｉｔｕ同定を可能にするために十分な親和性及び速度でハイブリダイズできるＤＮＡ−ビーコンを考案することが必要である。
【００６２】
本発明のビーコンは、好ましくは、ＰＮＡビーコンでない。ビーコンの主鎖は、好ましくは、核酸主鎖、特にＤＮＡである。ビーコンは、核酸部分又は／及びリンカーが存在するならばリンカー中にデオキシリボヌクレオチド類似体又はリボヌクレオチド類似体のような核酸類似体を含んでもよい。この類似体は、好ましくは、糖部分、塩基又は／及びホスフェート基にて改変されたヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド類似体は、好ましくは、ＰＮＡ基礎単位でない。
【００６３】
臨床試料における上記の９５百分位数に従って、病原体を疾患関連群にグループ分けできる。これらの生物に対するプローブは、特に全てのプローブを１つのチップ上で利用するならば、上記の条件下で同時に働かなければならない。チップの用途は、同族及びステムの両方の特徴の厳密な標準化を要求する。１つより多いプローブ、すなわち少なくとも２つのプローブの組み合わせを使用するならば、全てのプローブは、同じスライド／チップ上で同時に働くように設計されなければならない。
【００６４】
本発明の組み合わせの分子ビーコンは、表１、表３及び表４のビーコンから選択してもよい。本発明の組み合わせは、本明細書で記載する１、２、３又はそれより多くのビーコンさえ含んでもよく、これらは、表１、表３及び表４のビーコンから選択してもよい。１つより多いビーコンが本発明の組み合わせに存在するならば、ビーコンは、同じ又は異なる同族配列を有してもよい。個別のビーコンの同族配列は、異なることが好ましい。
【００６５】
１つより多いビーコンが本発明の組み合わせに存在するならば、標的配列と（ｉｉ）の配列のハイブリッド又は／及び（ｉ）の配列のハイブリッドの個別のビーコンとのΔＧの差は、同族配列に関して最大で約４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、好ましくは最大で約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より好ましくは最大で約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、最も好ましくは最大で約１ｋｃａｌ／ｍｏｌであってもよい。
【００６６】
第２核酸、第３核酸及び少なくとも１つのさらなる核酸は、少なくとも１つの第１核酸の発光基から区別できる標識を独立して含有してもよい。第２核酸、第３核酸及び少なくとも１つのさらなる核酸は、好ましくは、発光基を含有しない。第２核酸、第３核酸及び少なくとも１つのさらなる核酸は、好ましくは、消光剤を含有しない。
【００６７】
ヘルパー核酸分子の設計は、ＥＰ０７８１８８８３．６（１）（これは、本明細書に参照により含まれている）で計画されるような厳密な熱力学的設計に従って行ってもよい。標識ビーコン及びヘルパーの同族配列は全て、同じ熱力学的特徴を有し、よって相乗的に作用してもよい。正確な設計による作用の相乗作用は、ハイブリダイゼーション速度論における差を生じる。
【００６８】
標的配列とハイブリダイズできるヘルパー核酸の配列は、その相補標的配列（同族配列）に基づいて設計してもよく、ここで、ヘルパーの配列は、好ましくは、標的配列に関してミスマッチを有さない。分子ビーコンを設計するならば、当業者は、分子ビーコンの同族配列に隣接する配列からヘルパー核酸のための同族配列を選択できる。適切な配列は、公共データベースから得てもよい。本明細書で記載するように、好ましい分子ビーコンは、表１、表３及び表４から選択してもよい。この場合、ヘルパー核酸の同族配列は、表１、表３及び表４に記載するビーコンの同族配列に隣接するそれぞれの生物のデータベース配列から選択してもよい。ヘルパー核酸の同族配列は、表１、表３及び表４に記載する配列から選択してもよい。
【００６９】
表１、表３及び表４において「ヘルパー配列」又は「ヘルパー」として示す配列も、分子ビーコンの設計のために使用してもよい。この場合、ステムを形成できるＮ末端及びＣ末端相補配列（ｉｉ）又は／並びに本明細書で記載するその他の成分が加えられなければならない。表１、表３及び表４に「ビーコン配列」として示す配列も、ヘルパー核酸の設計のために使用してもよい。この場合、ステム配列を排除しなければならない。例えば、表４は、本発明の５つの核酸の組み合わせを示し、ここで、１つの特定の核酸の配列を「ビーコン配列」と称する。表４の組み合わせの１又は複数の配列が分子ビーコンの設計のために選択され、残りの配列がヘルパー配列として使用される表４の任意の組み合わせが本発明の範囲内であることが構想される。当てはまるならば、ステム配列又は／及び本明細書で記載するその他の成分を排除するか又は加える。
【００７０】
表４に記載するヘアピンループ及びヘルパー核酸の組み合わせが好ましい。表４は、ヘアピンループ及びヘルパー核酸の個別の組み合わせを記載し、ここで、ヘアピンループ及びヘルパー配列の同族配列は、微生物の標的配列上に局在する。本発明の具体的な実施形態は、ヘアピンループと１、２、３又は４つのヘルパー核酸とを含む表４に記載する組み合わせのことをいう。表４に記載する組み合わせは、ヘアピンループの名称で呼ぶことができる。好ましい組み合わせは、Ｂ−Ａｃｈｘｙｌ、Ｂ−Ａｃｉｎｂａｕｍ−ＩＶ、Ｂ−Ａｃｉｂａｃｔ−２、Ｂ−Ｂａｃｃｅｒ−ＩＩ、Ｂ−ＢａｃＰｒｅｖ、Ｂ−Ｂｃｃ、Ｂ−Ｃｔｈｅｒｍ、Ｃｉｔｆｒｅｕ−ＷＩＩＩ、Ｂ−Ｃｌｏｄｉｆｆ、Ｂ−Ｃｌｏｐｅｒ−ＩＩ、Ｂ−Ｃｌｏｓｐｐ、Ｃｏｒｓｐｐ、ＳＢ−Ｃｏｒｓｐｐ、ＥｃｏＳｈｉ、Ｂ−ＥＨＥＣ−ＩＩ、Ｂ−Ｅｎｔｂａｃ−ＩＩ、ＳＢ−ＥｎｔＳａｋ−Ｉ、ＳＢ−ＥｎｔＳａｋ−ＩＩ、Ｅｕｂｉａｅ、Ｅｎｔｃｏｃ  ＩＩＩ、Ｂ−Ｅｎｔｃｏｃ−ＩＩ、Ｂ−Ｅｎｔａｌｉｓ−２、Ｂ−Ｅｎｔｉｕｍ−ＩＩ、Ｂ−Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＩＩ、Ｂ−Ｈａｅｉｎｆ、ＳＢ−ＩｎｑＬｕｍ、Ｋｌｅｐｎｅ−５、Ｂ−Ｋｌｅｂｏｘｙ−ＩＩ、ＳＢ−Ｋｌｅｐｎｅ−６、Ｂ−Ｋｌｅｐｎｅ−４、Ｂ−Ｌｉｍｏ−ＩＩ、ＳＢ−Ｍｙｃａｖｉ−Ａ、ＳＢ−Ｍｙｃａｖｉ−Ｂ、Ｂ−Ｎｅｉｇｏｎ、Ｂ−Ｎｅｉｍｅｎｇ、ＳＢ−Ｐａｎａｐｉ、ＳＢ−ＰａｎｓｐｐＡ、ＳＢ−ＰａｎｓｐｐＢ、Ｂ−ｐｒｏｐａｃｎ、Ｂ−ｐｒｏｐａｃｎ、Ｂ−Ｐｒｏｔｍｉｒ、Ｂ−Ｐｒｏｔｖｕｌ、ＳＢ−Ｐｓａｅｒ−Ｅ、Ｂ−Ｐｓａｅｒ  Ｄ、ＳＢ−ＲａｌｓｐｐＡ、ＳＢ−ＲａｌｓｐｐＢ、ＳＢ−ＲａｌｓｐｐＣ、Ｓｔａｌｕｇ、Ｂ−Ｓａｌ  １６８６、Ｂ−Ｓｅｒｍａｒｃ−ＩＩ、Ｂ−Ｓｈｉｇ−ＩＩ、Ｂ−Ｓｈｉｇ−ＩＩＩ、Ｓｂ−Ｓｈｉｓｐｐ−４、Ｂ−Ｓｔａｐｈｓｐｐ−２、Ｂ−Ｓｔａｕｒ−３、Ｓｔａｌｕｇ、Ｂ−Ｓｔｅｍａｌ−２、Ｂ−Ｓｔｒａｇａ−３、Ｂ−Ｓｔｒｅｐｎｅ−２、Ｂ−Ｓｔｒｅｐｎｅ−３、Ｂ−Ｓｔｒｐｙｏ−Ｄ、Ｂ−Ｓｔｒｅｐｔ−ＩＩＩ、Ｂ−Ｙｅｒｓ−ＩＩＩ及びＢ−Ｙｅｒｓ−ＩＩで表される組み合わせから選択してもよい。Ｂ−Ａｃｈｘｙｌ、Ｂ−Ａｃｉｎｂａｕｍ−ＩＶ、Ｂ−Ａｃｉｂａｃｔ−２、Ｂ−Ｂａｃｃｅｒ−ＩＩ、Ｂ−ＢａｃＰｒｅｖ、Ｂ−Ｂｃｃ、Ｂ−Ｃｔｈｅｒｍ、Ｃｉｔｆｒｅｕ−ＷＩＩＩ、Ｂ−Ｃｌｏｄｉｆｆ、Ｂ−Ｃｌｏｐｅｒ−ＩＩ、Ｂ−Ｃｌｏｓｐｐ、Ｃｏｒｓｐｐ、ＳＢ−Ｃｏｒｓｐｐ、ＥｃｏＳｈｉ、Ｂ−ＥＨＥＣ−ＩＩ、Ｂ−Ｅｎｔｂａｃ−ＩＩ、ＳＢ−ＥｎｔＳａｋ−Ｉ、ＳＢ−ＥｎｔＳａｋ−ＩＩ、Ｅｕｂｉａｅ、Ｅｎｔｃｏｃ  ＩＩＩ、Ｂ−Ｅｎｔｃｏｃ−ＩＩ、Ｂ−Ｅｎｔａｌｉｓ−２、Ｂ−Ｅｎｔｉｕｍ−ＩＩ、Ｂ−Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＩＩ、Ｂ−Ｈａｅｉｎｆ、ＳＢ−ＩｎｑＬｕｍ、Ｋｌｅｐｎｅ−５、Ｂ−Ｋｌｅｂｏｘｙ−ＩＩ、ＳＢ−Ｋｌｅｐｎｅ−６、Ｂ−Ｋｌｅｐｎｅ−４、Ｂ−Ｌｉｍｏ−ＩＩ、ＳＢ−Ｍｙｃａｖｉ−Ａ、ＳＢ−Ｍｙｃａｖｉ−Ｂ、Ｂ−Ｎｅｉｇｏｎ、Ｂ−Ｎｅｉｍｅｎｇ、ＳＢ−Ｐａｎａｐｉ、ＳＢ−ＰａｎｓｐｐＡ、ＳＢ−ＰａｎｓｐｐＢ、Ｂ−ｐｒｏｐａｃｎ、Ｂ−ｐｒｏｐａｃｎ、Ｂ−Ｐｒｏｔｍｉｒ、Ｂ−Ｐｒｏｔｖｕｌ、ＳＢ−Ｐｓａｅｒ−Ｅ、Ｂ−Ｐｓａｅｒ  Ｄ、ＳＢ−ＲａｌｓｐｐＡ、ＳＢ−ＲａｌｓｐｐＢ、ＳＢ−ＲａｌｓｐｐＣ、Ｓｔａｌｕｇ、Ｂ−Ｓａｌ  １６８６、Ｂ−Ｓｅｒｍａｒｃ−ＩＩ、Ｂ−Ｓｈｉｇ−ＩＩ、Ｂ−Ｓｈｉｇ−ＩＩＩ、Ｓｂ−Ｓｈｉｓｐｐ−４、Ｂ−Ｓｔａｐｈｓｐｐ−２、Ｂ−Ｓｔａｕｒ−３、Ｓｔａｌｕｇ、Ｂ−Ｓｔｅｍａｌ−２、Ｂ−Ｓｔｒａｇａ−３、Ｂ−Ｓｔｒｅｐｎｅ−２、Ｂ−Ｓｔｒｅｐｎｅ−３、Ｂ−Ｓｔｒｐｙｏ−Ｄ、Ｂ−Ｓｔｒｅｐｔ−ＩＩＩ、Ｂ−Ｙｅｒｓ−ＩＩＩ及びＢ−Ｙｅｒｓ−ＩＩで表される組み合わせから組み合わせの群を選択することがより好ましい。群は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、又は表４に記載する組み合わせの全てさえ含んでもよい。群は、表４に記載する組み合わせの最大で６０、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１０又は最大で５を含んでもよい。本発明の具体的な実施形態は、本明細書で記載する組み合わせの最小の数又は／及び最大の数を有する群に言及し、任意の組み合わせを表４から選択してもよいことが構想される。例えば、本発明の具体的な実施形態は、表４から選択される２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の組み合わせを含む群のことをいう。
【００７１】
本発明の組み合わせの好ましい群は、診断群のことをいう。組み合わせの好ましい群は、例えば表４に示すようなグラム陰性生物の血液培養（ＢＣ）中の生物を同定するために適切な組み合わせから選択される。組み合わせのその他の好ましい群は、例えば表４に示すようなグラム陽性生物の血液培養中の生物を同定するために適切な組み合わせから選択される。組み合わせのその他の好ましい群は、例えば表４に示すような肺炎を引き起こすことができる生物を同定するために適切な組み合わせから選択される。組み合わせのその他の好ましい群は、例えば表４に示すような嚢胞性線維症と関連する生物を同定するために適切な組み合わせから選択される。組み合わせのその他の好ましい群は、例えば表４に示すような糞便中で見出される生物を同定するために適切な組み合わせから選択される。
【００７２】
表４から選択される組み合わせは、本明細書で記載するように、組み合わせの１又は複数の配列がヘアピンループの設計のために選択され、残りの配列がヘルパー配列として使用される組み合わせであってもよい。言い換えると、表４にプローブ配列（標的配列に対して相補的）として示す配列だけでなく、表４にヘルパー配列として示す配列も、ヘアピンループの設計のために使用してもよい。
【００７３】
本発明のヘルパー核酸は、好ましくは、ＰＮＡでない。ヘルパーの主鎖は、好ましくは、核酸主鎖、特にＤＮＡである。ヘルパー核酸は、核酸部分又は／及びリンカーが存在するならばリンカー中にデオキシリボヌクレオチド類似体又はリボヌクレオチド類似体のような核酸類似体を含んでもよい。この類似体は、好ましくは、糖部分、塩基又は／及びホスフェート基にて改変されたヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド類似体は、好ましくは、ＰＮＡ基礎単位でない。
【００７４】
第２核酸、第３核酸及び少なくとも１つのさらなる核酸は、好ましくは、標的配列とハイブリダイズできる配列中にミスマッチを含有しない。第２核酸、第３核酸及び少なくとも１つのさらなる核酸は、好ましくは核酸分子の３’又は／及び５’末端に独立して位置する標的配列とハイブリダイズしない少なくとも１つのヌクレオチドを独立して含んでもよい。
【００７５】
本発明による組み合わせの核酸は、特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのため、より特にはＦＩＳＨのために適切である。ハイブリダイゼーションは、本明細書で記載するように細胞内、特に本明細書で記載する微生物内で起こることがある。組み合わせの核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションのために設計できる。
【００７６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書で用いる場合、好ましくは、５２℃（±０．２℃）にて３０分まで、２０分まで、１５分まで又は１０分まで、好ましくは約１０分間、高い塩の下で、好ましくは二価のカチオンを本質的に含まない条件下、特にＭｇ２＋を本質的に含まない条件下（例えば９００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．３、０．０１％ｗ／ｗ  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％ｖ／ｖホルムアミド）でのハイブリダイゼーションと、本質的にエタノール性、低い塩及び室温において約３０〜約９０秒又は約４５〜約７５秒間、好ましくは約６０秒間の洗浄とを含む。好ましくは、洗浄は、高いＭｇ２＋条件下で、例えば５０％エタノール、２１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．３中で行う。
【００７７】
本発明では、ハイブリダイゼーションは、ＳＤＳ、例えば約０．００５％ｗ／ｗ〜０．０１５％ｗ／ｗ又は約０．０１％ｗ／ｗのＳＤＳの存在下で行ってもよい。ハイブリダイゼーションは、ホルムアミド、例えば約１５％ｖ／ｖ〜約２５％ｖ／ｖのホルムアミド、好ましくは約２０％ｖ／ｖのホルムアミドの存在下で行ってもよい。ハイブリダイゼーション中に、ＥＤＴＡのような２価カチオンと錯体形成できる物質が、約０．２ｍＭ〜約２ｍＭ又は約０．５ｍＭ又は約１．５ｍＭの濃度で存在してもよい。好ましくは、約１ｍＭのＥＤＴＡ濃度である。
【００７８】
室温は、本明細書で用いる場合、好ましくは、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃若しくは約２４℃のような約１８℃〜約２４℃又は約１９℃〜約２２℃の範囲の温度のことをいう。
【００７９】
「本質的にエタノール性の条件」とは、本明細書で用いる場合、好ましくは、０〜９０％ｖ／ｖ、４０〜９０％ｖ／ｖ、５０〜９０％ｖ／ｖ、６０〜９０％ｖ／ｖ、例えば４０〜６０％ｖ／ｖの範囲、好ましくは約５０％ｖ／ｖのエタノール濃度のことをいう。
【００８０】
ハイブリダイゼーション又は／及び洗浄中に、ｐＨは、＞８、約７．５〜約９又は約８〜約８．５、好ましくは約８．３に独立して調整してもよい。
【００８１】
本明細書で用いる場合、低い塩条件は、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ又は約１５０〜約２５０ｍＭの全塩濃度を含む。好ましくは、２１５ｍＭのような約２００ｍＭの濃度である。高い塩は、本明細書で用いる場合、約７００ｍＭ〜約１１００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約１０００ｍＭ又は約８５０ｍＭ〜９５０ｍＭの全塩濃度を含む。好ましくは、９１５ｍＭのような約９００ｍＭの濃度である。「全塩濃度」とは、本明細書で用いる場合、１価カチオンの塩の濃度を意味する。
【００８２】
本発明の組み合わせにおいて、個別の核酸が一様に機能することが好ましい。「一様に機能する」とは、本発明の異なる核酸プローブを用いて同じハイブリダイゼーション条件下で、例えば標準化されたハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションの成功が達成できることを意味する。言い換えると、本発明の一様に機能する核酸は、ハイブリダイゼーション条件を個別に最適化することを要求しない。
【００８３】
本明細書で記載する核酸分子の組み合わせは、１又は複数の組成物において、場合によって、要求されるハイブリダイゼーション試薬と一緒に提供できる。組み合わせは、１つの組成物で提供することが好ましい。
【００８４】
本発明の組み合わせの核酸において、そのそれぞれの同族配列に関する個別の核酸のΔＧ値は、最大で約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、好ましくは最大で約６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より好ましくは最大で約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ異なっていてもよい。特に、１つより多いビーコンが本発明の組み合わせに存在するならば、そのそれぞれの同族配列に関する個別のビーコンステムのΔＧ値は、約８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、好ましくは最大で約５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より好ましくは最大で約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ異なっていてもよい。
【００８５】
本発明の組み合わせの核酸分子は、独立してオリゴヌクレオチドであってもよい。標的配列とハイブリダイズできる核酸分子の配列は、独立して１６〜２６ヌクレオチドの範囲、特に約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、標的配列とハイブリダイズする核酸分子の少なくとも１つの配列は、１６〜２６ヌクレオチドの範囲、特に約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。
【００８６】
ヘルパー配列が、大過剰濃度で用いられるべきであることを当該技術は教示している。驚くべきことに、上記の構成において要求されるヘルパー及びビーコンの作業濃度は、本質的に等モル濃度であってもよい。さらに、この設計は、ｒＲＮＡ領域への近づきにくさによる制限を除去し、ユニーク配列の自由な選択を可能にした。驚くべきことに、ビーコンがハイブリダイズしている位置にかかわらず、一様な１００％のシグナルが８分だけの後に生じることができた。組み合わせの核酸分子は、本質的に等モル濃度の組成物で提供してもよい。本発明において、「本質的に等モル濃度」とは、組成物中の少なくとも２つの核酸分子の濃度が、最大で１５重量パーセント、最大で１０重量パーセント又は最大で５重量パーセント異なってもよいことを意味する。
【００８７】
本発明のさらに別の態様は、本明細書で記載する核酸分子の組み合わせを、要求されるハイブリダイゼーション試薬と場合によって一緒に含むキット又はチップである。好ましくは、チップ又はキットは、別々の組成物中に本明細書で記載する核酸分子の１又は複数の組み合わせ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多くの組み合わせさえ含有する。キット中又はチップ上の８つの別々の組み合わせが好ましい。グループ分けのリスト、並びにそれにより得られる列挙される生物の検出、列挙及び同定用のキットを表１にまとめる。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う組み合わせを利用して、遺伝子の活性な発現生成物を、ｍＲＮＡレベルで、例えば１つより多いヘアピンループ対を予め増幅することなく特定の配列に沿ってアラインメントすることにより検出できることである。抗生物質耐性、毒素生成又はまさに癌遺伝子をコードする遺伝子の高度に発現された配列を、微生物の同定におけるのと同じ速度及び特異性で検出できる。
【００８９】
本発明の組み合わせ、キット又は／及びチップは、本明細書で記載する細胞、特に本明細書で記載する微生物の同定のために用いてもよい。本発明の組み合わせ又は／及びキットは、好ましくは、診断用である。より好ましくは、本発明の組み合わせは、本明細書で記載する細胞、特に本明細書で記載する微生物の存在の診断用である。
【００９０】
本発明の組み合わせ又は／及びキットは、抗生物質耐性の決定のために用いてもよい。
【００９１】
本発明の組み合わせ又は／及びキットは、毒素生成物、例えば本明細書で記載する細胞又は／及び微生物の決定のために用いてもよい。
【００９２】
本発明の組み合わせ又は／及びキットは、例えば本明細書で記載する細胞又は／及び微生物における癌遺伝子発現の決定のために用いてもよい。
【００９３】
本発明の組み合わせ、キット又は／及びチップは、本明細書で記載する細胞、特に本明細書で記載する微生物の存在の診断の医薬組成物の製造のために用いてもよい。
【００９４】
本発明の組み合わせ、キット又は／及びチップは、本明細書で記載する細胞内の病原性の特徴の診断用の医薬組成物の製造のために用いてもよい。
【００９５】
組み合わせは、試験管、マイクロタイタープレート、ろ過マイクロタイターウェル、スライド及びチップで行われるように設計されたアッセイに用いることができる。検出は、蛍光、時間分解蛍光を用いて、複数の蛍光体を用いて行うことができる。
【００９６】
ＦＩＳＨについての好ましい実施形態では、アッセイは、いくつかの試料を保持して分離するように設計されたガラススライド上で行われる。
【００９７】
本発明のさらに別の態様は、試料中の細胞を同定する方法であって、
（ａ）試料を用意するステップと、
（ｂ）（ａ）の試料を、本発明に従う核酸分子の組み合わせと、細胞におけるオリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させるステップと、
（ｃ）第１核酸分子の発光基の発光を決定するステップと
を含み、
第１オリゴヌクレオチドの発光が、標的配列の存在を示す、方法である。
【００９８】
標的配列の存在は、特に標的配列が細胞又は／及び細胞の群に特異的ならば、細胞又は／及び細胞の群の存在を示す。
【００９９】
細胞は、本明細書で記載する細胞、例えば原核又は真核細胞であってもよい。特に、細胞は、本明細書で記載する微生物であってもよい。
【０１００】
試料は、ヘアピンループにより検出される核酸を含むことが疑われる臨床又は食物試料のような生体起源の任意の試料であってもよい。試料は、細胞、特に細菌、酵母又は／及びカビ、特にグラム陽性又は／及びグラム陰性細菌のような微生物を含む試料であってもよい。アッセイの一般的な手順は、グラム陰性及びグラム陽性生物の前処理においてわずかな逸脱を有して同一である（例えば実施例３を参照されたい）。
【０１０１】
本発明の方法では、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、特にＦＩＳＨにより行ってもよい。
【０１０２】
ステップ（ｂ）において、試料を表面上に固定してもよい。ステップ（ｂ）は、本明細書で記載するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含んでもよい。
【０１０３】
ステップ（ｂ）では、（ａ）の試料と核酸分子の組み合わせとを接触させるステップは、約３０分間まで、約２０分間まで、約１５分間まで又は約１０分間まで行ってもよい。
【０１０４】
ステップ（ｂ）で使用するハイブリダイゼーション緩衝液は、好ましくは、２価カチオンを本質的に含有せず、特に、ステップ（ｂ）で使用するハイブリダイゼーション緩衝液は、好ましくは、マグネシウムを本質的に含まない。
【０１０５】
ステップ（ｂ）では、組み合わせの核酸は、本質的に等モル濃度で用いてもよい。
【０１０６】
本発明の方法のステップ（ｂ）は、
（１）本発明のいずれかの少なくとも１つの核酸又は本発明の核酸の組み合わせを生体試料と接触させるサブステップと、
（２）（１）の核酸又は核酸の組み合わせを、試料と、同族配列の存在下でステムが開放される条件下でハイブリダイズさせるサブステップ、例えば２価カチオンを本質的に含まない、特にＭｇ２＋を本質的に含まない緩衝液を用いてハイブリダイズさせるサブステップと、
（３）（１）の核酸又は核酸の組み合わせを、試料と、核酸のステムが開放される条件下でハイブリダイズさせるサブステップ、例えば２価カチオンを本質的に含まない、特にＭｇ２＋を本質的に含まない緩衝液を用いてハイブリダイズさせるサブステップと、
（４）試料とハイブリッドを形成しない（１）の核酸分子においてステム形成を可能にする条件を誘導するサブステップ、例えばマグネシウム含有緩衝液を用いて、例えばｐＨ＞８又は／及び室温にて洗浄するサブステップと
を含んでもよい。
【０１０７】
上記のようにＭｇ２＋を本質的に含まない溶液及びＭｇ２＋含有溶液を用いることを含むいずれのハイブリダイゼーションプロトコールも用いることができる。「２価カチオンを本質的に含まない」とは、１ｍＭ未満、好ましくは０．１ｍＭ未満、より好ましくは０．０５ｍＭ未満、最も好ましくは０．０１ｍＭ未満の濃度の２価カチオンのことをいう。「Ｍｇ２＋を本質的に含まない」とは、１ｍＭ未満、好ましくは０．１ｍＭ未満、より好ましくは０．０５ｍＭ未満、最も好ましくは０．０１ｍＭ未満のＭｇ２＋濃度のことをいう。さらに、２価イオンの除去は、約０．２ｍＭ〜２ｍＭ又は０．５ｍＭ〜１．５ｍＭの濃度で存在するＥＤＴＡのような錯体形成剤の添加により確実にすることができる。好ましくは、約１ｍＭのＥＤＴＡ濃度である。
【０１０８】
ステップ（ｂ）で使用されるマグネシウム含有緩衝液は、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ  Ｍｇ２＋、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ  Ｍｇ２＋、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、約２．５ｍＭ〜約７．５ｍＭ  Ｍｇ２＋を含有してもよい。好ましくは、約５ｍＭ  Ｍｇ２＋の濃度である。
【０１０９】
ハイブリダイゼーションの最後に、全ての非結合ビーコンは、ヘアピンループ形成に戻って確保される必要がある。熱力学的パラメータに従って、リフォールディングは、室温にて自発的に生じるはずである。このことは、２価金属イオンの存在下でのみ確実にできることが見出された。さらに、アッセイの特異性は、停止緩衝液中の１価の塩の濃度に依存した。
【０１１０】
よって、リフォールディングは、スライドを、まずエタノール浴に、次いで、弱く結合したビーコンとヘアピンループ形成を支持する２価の塩の解離を支持するための１価の塩を含有する停止緩衝液浴に、ヘアピンループ形成に好ましい温度にて短時間浸すことにより達成できる。好ましい構成では、エタノール浴及び塩浴は組み合わされ、０〜９０％ｖ／ｖエタノール、１０ｍＭ〜１Ｍの１価の塩、０．１〜２０ｍＭの２価の塩を含有し、ｐＨ７〜ｐＨ９の間に緩衝されることができる。最も好ましい構成では、停止緩衝液は、５０％  ｖ／ｖエタノール、２１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．３を含有する。
【０１１１】
例えば、以下のプロトコールを用いてもよい。分割量の臨床試料を、スライド上の規定された区域に塗布する。好ましくは、１０μｌの規定された量を塗布して乾燥させる。
１．試料をスライドに熱固定する。
２．グラム陽性生物は、十分に発表された仕様に従ってリゾチーム／リゾスタフィン消化に供する。好ましい実施形態では、消化は、２〜７分間、２８〜６０℃の間にて、加湿チャンバ中で行う。最も好ましい消化は、（５２℃）のホットプレート上にある間に直接、スライドのそれぞれの要求される区域に消化酵素を加えることにより行われ、乾燥まで放置される。
３．次いで、例えばスライドを純粋メタノール又は純粋（少なくとも９６％）エタノールに数分間浸漬することにより、孔を形成する。好ましい実施形態では、メタノール又はエタノールは氷のように冷たく、浸漬時間は２〜１０分の間である。より好ましい実施形態では、スライドをエタノールに４〜６分間浸漬する。最も好ましい実施形態では、スライドを９６％工業用メタノール変性（ＩＭＳ）エタノール（又は変性エタノールと等価）に５分間、室温にて浸漬する。
４．スライドを、例えば５２℃にてホットプレート上で乾燥させる。
５．核酸（１又は複数のビーコン、少なくとも２つのヘルパー）をハイブリダイゼーション緩衝液（これは、Ｍｇ２＋を本質的に含まないことがある）に溶解し、次いで、スライド加温器上にある間にスライドのそれぞれの区域に塗布する。
６．スライドをハイブリダイゼーション緩衝液で加湿したハイブリダイゼーションチャンバ中に入れる。好ましい実施形態では、スライドを疎水性カバーガラスで覆い、５２℃の覆われたスライド加温器上に約１０分間置く。
７．スライドを、次いで、マグネシウム含有緩衝液で、例えばｐＨ＞８又は／及び室温にて洗浄する。緩衝液は、主に、約０．１〜約２０ｍＭ  Ｍｇ２＋、特に約１〜約１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、より特には約２．５〜７．５ｍＭ  Ｍｇ２＋、さらにより特には約５ｍＭ  Ｍｇ２＋を含有する。
８．スライドを、次いで、乾燥させ、封入液で封入してもよく、落射蛍光顕微鏡の下で、例えば４００×、６００×又は１０００×の合計倍率で読み取ることができる。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションのために他の容器を用いるならば、検出は、当該技術において公知のフローサイトメトリー又は自動化蛍光リーダーによることができる。
【０１１３】
本発明の方法では、本明細書で記載するキット又はチップを用いることもできる。
【０１１４】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明のビーコンのチップへの応用である。チップへの応用のために、ビーコンを、担体表面上に共有結合させる必要がある。このことを容易にするために、設計されたビーコンの３’末端塩基を、ビオチン化するか又はタンパク質及び核酸化学の当該技術において公知の方法を用いてヘテロ２官能性試薬により酵素に連結してもよい。ビオチン化ビーコンは、次いで、商業的な供給源から自由に得ることができるストレプトアビジン被覆チップに加えることができる（１９）。この応用では、それぞれのビオチン化ヘアピンループを、１つのチップの複数の別個の区域、例えば少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００若しくは少なくとも５００の区域、又は最大で５００、最大で４００若しくは最大で３００の区域に結合させることができる。トータルＲＮＡを、商業的に入手可能なキット（２０）を用いて試料から抽出でき、チップに、本明細書で記載するハイブリダイズ条件下で塗布できる。ハイブリダイゼーションの後に、チップを、本明細書で記載するようなマグネシウム含有緩衝液で、例えばｐＨ＞８にて短時間洗浄できる。区域上の蛍光は、特異的標的配列、例えば試料中のそれぞれの生物の存在を示す特異的ＲＮＡの存在を示す。
【０１１５】
ハイブリダイゼーションアッセイを大規模な日常的用途のために切り開くために、１つの再利用可能なチップ上で複数の試料を逐次的に分析する必要がある。チップの設計は、大規模製造、効率的な品質管理及び長い貯蔵寿命を可能にしなければならない。
【０１１６】
このようなアッセイを行うために、それぞれ検出デバイス（チップ）上の規定された位置に塗布できる同一の特徴を有する多数の配列（例えば表１、表３又は／及び表４）を開発した。
【０１１７】
典型的なアッセイでは、トータルＲＮＡを、市場で容易に入手可能な抽出手順及びキットを利用して試料から抽出し、上記のハイブリダイゼーション条件下でチップ上に置く。ハイブリダイゼーションの後に、チップを上記の停止緩衝液を用いて室温にて洗浄し、当該技術において公知であるように読み取る。サイクルの最後に、全てのハイブリダイズしたＲＮＡを、ＤＮＡ及びＲＮＡを含まないハイブリダイゼーション緩衝液で約６２℃にて洗い流す。温度を、次いで、約５２℃に落として、次のハイブリダイゼーションサイクルのために平衡化する。
【実施例】
【０１１８】
本発明を、以下の実施例及び図面によりさらに説明する。
【０１１９】
実施例１．ヘルパーの効果
【０１２０】
最先端の効果の比較。図１は、米国特許第５，０３０，５５７号に記載される、プローブハイブリダイゼーションの際のヘルパーオリゴヌクレオチドの効果をまとめる（図１のバー（１）〜（４）を参照されたい）。データは、米国特許第５，０３０，５５７号の表Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂ及びＩＩｃから得た。平均値を計算した。
【０１２１】
米国特許第５，０３０，５５７号は、単離リボソームＲＮＡに対する標識オリゴヌクレオチドの結合を増強するためのヘルパーオリゴヌクレオチドの使用を教示する。１８〜２４ヌクレオチドの長さの直鎖状プローブを使用している。ヘルパーは、２３〜５８ヌクレオチドの長さを有した。しかし、これは、増強されたシグナルを達成するために１晩のインキュベーションを要求した。さらに、米国特許第５，０３０，５５７号は、改善を達成するために５０〜２００倍高い濃度の各ヘルパーを要求する。第２ヘルパーを加えることにより、シグナルが２０％増加し、第３ヘルパーをさらに加えることにより、シグナルがさらに７％だけ増加した（図１において「１晩」のバーを参照されたい）。
【０１２２】
本発明による分子ビーコンと４つのヘルパー核酸の組み合わせを用いる微生物におけるｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションは、１２分後に約１００％に到達する（図１のバー（５）を参照されたい）。ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、溶液中で起こるハイブリダイゼーションよりも長いハイブリダイゼーション期間を一般的に必要とすることに鑑みて、米国特許第５，０３０，５５７号に記載される１晩ハイブリダイゼーションと比較して本発明の組み合わせを用いての１２分だけのハイブリダイゼーション期間は、プローブとヘルパーとの最先端の組み合わせに対して強力な改善である。
【０１２３】
実施例２．ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの速度論
【０１２４】
本発明の分子ビーコン（大腸菌分子ビーコン、Ｂ−Ｓｔｒａｇａ−３、表４を参照されたい）を、スライド上に固定されたそれぞれ大腸菌及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）とのｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて４つのヘルパー核酸の非存在下及び存在下で試験する。ビーコンＢ−Ｓｔｒａｇａ−３は、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の１６Ｓ  ｒＲＮＡに位置する標的配列とハイブリダイズする配列を含む。
【０１２５】
１０μｌの分割量のそれぞれの細菌懸濁物を、スライドの各区域に置き、乾燥して区域あたり１０５細胞にした。さらなるｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを、１つの例外以外は本発明で記載するようにして行った。区域１は、時間＝０にて、区域２は２分後、区域３は４分後、区域４は６分後、区域５は８分後、区域６は１０分後、区域７は１１．５分後、及び区域８は停止溶液に浸す前にハイブリダイゼーションミックスを受けた。
【０１２６】
図２においてわかるように、支援されていない大腸菌ビーコンのハイブリダイゼーションは弱く、よって可逆性であり、ｒＲＮＡの再アニーリングが、ビーコンとのハイブリダイゼーションよりも好ましい。図２に示すハイブリダイゼーションの速度は、それぞれのヘルパーと一緒にビーコンの厳密な設計による。
【０１２７】
実施例３
【０１２８】
アッセイの典型的なハイブリダイゼーション手順は、以下の表に示すようにグラム陰性及びグラム陽性生物の前処理におけるわずかな逸脱を有して、全てのビーコンについて同一である。
【０１２９】
2013520980.tif 000004
【０１３０】
読み取りは、視覚的に又は蛍光顕微鏡を用いて自動化読み取りデバイスの支援により行うことができる。当該技術において公知であるように、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、上記のステップをマイクロタイタープレートで行い、フローサイトメータにより読み取ることによりフローサイトメトリーに容易に適合できる。明白な利点は、自動化が容易なことにある。
【０１３１】
参考文献
(1) EP 07 818 883.6 
(2) M. S. Shchepinov, S. C. Case-Greenand E. M. Southern, Appl Environ Microbiol. 2007 January; 73(1 ): 73-82. Stericfactors influencing hybridisation of nucleic acids to oligonucleotide arrays 
(3) Michael M. A. Sekar, Will Bloch andPamela M. St John, Nucleic Acids Research 2005 33(1):366-375; Comparative studyof sequence- dependent hybridization kinetics in solution and on microspheres 
(4) BERNHARD M. FUCHS, KAZUAKI SYUTSUBO,WOLFGANG LUDWIG, AND RUDOLF AMANN, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,AEM.67.2.961-968.2001 , In Situ Accessibility of Escherichia coli 23S rRNA toFluorescently Labeled Oligonucleotide Probes 
(5) BERNHARD MAXIMILIAN FUCHS, GUNTERWALLNER, WOLFGANG BEISKER, INES SCHWIPPL, WOLFGANG LUDWIG, AND RUDOLF AMANN1 ,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 1998, p. 4973-4982 Flow CytometricAnalysis of the In Situ Accessibility of Escherichia coli 16S rRNA forFluorescently Labeled Oligonucleotide Probes 
(6) BERNHARD M. FUCHS, FRANK OLIVERGLOCKNER, JORG WULF, AND RUDOLF AMANN, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Aug. 2000, p. 3603-3607, Unlabeled Helper Oligonucleotides Increase the In SituAccessibility to 16S rRNA of Fluorescently Labeled Oligonucleotide Probes 
(7) RUDOLF I. AMANN, WOLFGANG LUDWIG,AND KARL-HEINZ SCHLEIFER, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, Mar. 1995, p. 143-169,Phylogenetic Identification and In Situ Detection of Individual, MicrobialCells without Cultivation 
(8) U.S. Pat. No. 5,030,557: Means andMethods for enhancing nucleic acid hybridisation. Inventors: Hogan JJ andMilliman CL.
(9) WO 1992014841 19920903, NOVELLANTHANIDE CHELATE- CONJUGATED OLIGONUCLEOTIDES. 
【０１３２】
本発明の主題は、以下の実施形態でもある。
【０１３３】
項目１．標的核酸配列とハイブリダイズできる核酸分子の組み合わせであって、組み合わせが、
（ａ）
（ｉ）標的配列とハイブリダイズできる配列と、
（ｉｉ）ステムを形成できる２つの相補配列と、
（ｉｉｉ）発光基及び消光基と
を含む少なくとも１つの第１核酸分子であり、核酸がステム−ループ構造を形成すると消光基が蛍光基を消光し、オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズすると蛍光基が励起により発光シグナルを発することができる、少なくとも１つの第１核酸分子と、
（ｂ）第２核酸分子、第３核酸分子及び場合によって少なくとも１つのさらなる核酸分子と
を含み、第２核酸分子、第３核酸分子及び場合による少なくとも１つのさらなる核酸分子が、第１核酸がハイブリダイズする配列の５’側又は／及び３’側に位置する配列にて標的配列とハイブリダイズする組み合わせ。
【０１３４】
項目２．少なくとも１つの第１、第２、第３及び場合による少なくとも１つのさらなる核酸分子がハイブリダイズする配列が、標的配列の非オーバーラップ配列である、項目１に記載の組み合わせ。
【０１３５】
項目３．核酸が、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、特にＦＩＳＨに適切である、項目１又は２に記載の組み合わせ。
【０１３６】
項目４．ハイブリダイゼーションが、細胞内で起こる、項目１〜３のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１３７】
項目５．標的核酸配列が、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列から選択される、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１３８】
項目６．標的核酸配列が、ｒＲＮＡ配列である、項目５に記載の組み合わせ。
【０１３９】
項目７．標的核酸配列が、ｍＲＮＡ配列である、項目５に記載の組み合わせ。
【０１４０】
項目８．発光基が、第１核酸の５’端又は３’端に独立して結合し、消光剤が、発光基により覆われていない他方の端に結合する、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４１】
項目９．第１核酸分子が、ヘアピンループを形成できる配列、例えば分子ビーコンを含む、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４２】
項目１０．核酸分子が、互いに直接隣接する場所にて標的配列とハイブリダイズする、項目１〜８のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４３】
項目１１．少なくとも２つの核酸分子が、少なくとも１つのヌクレオチドのギャップにより互いに分離された場所にて標的配列とハイブリダイズする、項目１〜８のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４４】
項目１２．標的配列とハイブリダイズする核酸分子の少なくとも１つの配列が、１６〜２６ヌクレオチドの範囲の長さを有する、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４５】
項目１３．組み合わせの核酸分子が、本質的に等モル濃度の組成物で提供される、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４６】
項目１４．組み合わせの核酸分子が、−１５〜−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のΔＧで標的配列と独立してハイブリダイズする、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４７】
項目１５．組み合わせの核酸が、−６０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０〜−１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又は−１００〜−１２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲の組み合わせたΔＧで標的配列と独立してハイブリダイズする、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４８】
項目１６．組み合わせの核酸が、標的配列の天然のリフォールディングにより生じるΔＧよりも負が大きいΔＧで標的配列と独立してハイブリダイズする、前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１４９】
項目１７．診断用の前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１５０】
項目１８．細胞の存在の診断のための前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１５１】
項目１９．抗生物質耐性の決定のための前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１５２】
項目２０．毒素生成の決定のための前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１５３】
項目２１．癌遺伝子発現の決定のための前記項目のいずれかに記載の組み合わせ。
【０１５４】
項目２２．前記項目のいずれかに記載の組み合わせを含むキット又はチップ。
【０１５５】
項目２３．試料中の細胞を同定する方法であって、
（ａ）試料を用意するステップと、
（ｂ）（ａ）の試料を、項目１〜１６のいずれかに記載の核酸分子の組み合わせと、細胞におけるオリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させるステップと、
（ｃ）第１核酸分子の発光基の発光を決定するステップと
を含み、
第１オリゴヌクレオチドの蛍光が、標的配列の存在を示す、方法。
【０１５６】
項目２４．試料が、生体試料、特に臨床試料から選択される、項目２３に記載の方法。
【０１５７】
項目２５．ステップ（ｂ）及び（ｃ）が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、特にＦＩＳＨにより行われる、項目２３又は２４に記載の方法。
【０１５８】
項目２６．ステップ（ｂ）において、試料が表面上に固定されている、項目２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【０１５９】
項目２７．ステップ（ｂ）が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含む、項目２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【０１６０】
項目２８．（ａ）の試料と核酸分子の組み合わせとを接触させるステップが、約３０分間まで行われる、項目２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【０１６１】
項目２９．ステップ（ｂ）で使用するハイブリダイゼーション緩衝液が、２価カチオンを含有しない、項目２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【０１６２】
項目３０．細胞の同定のための項目１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ又は項目２２に記載のキット若しくはチップの使用。
【０１６３】
項目３１．細胞の存在の診断用の医薬組成物の製造のための項目１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ又は項目２２に記載のキット若しくはチップの使用。
【図４−０１】
2013520980.tif 000005
【図４−０２】
2013520980.tif 000006
【図４−０３】
2013520980.tif 000007
【図４−０４】
2013520980.tif 000008
【図４−０５】
2013520980.tif 000009
【図４−０６】
2013520980.tif 000010
【図４−０７】
2013520980.tif 000011
【図４−０８】
2013520980.tif 000012
【図４−０９】
2013520980.tif 000013
【図４−１０】
2013520980.tif 000014
【図４−１１】
2013520980.tif 000015
【図４−１２】
2013520980.tif 000016
【図４−１３】
2013520980.tif 000017
【図４−１４】
2013520980.tif 000018
【図４−１５】
2013520980.tif 000019
【図４−１６】
2013520980.tif 000020
【図４−１７】
2013520980.tif 000021
【図４−１８】
2013520980.tif 000022
【図４−１９】
2013520980.tif 000023
【図４−２０】
2013520980.tif 000024
【図４−２１】
2013520980.tif 000025
【図４−２２】
2013520980.tif 000026
【図４−２３】
2013520980.tif 000027
【図４−２４】
2013520980.tif 000028
【図４−２５】
2013520980.tif 000029
【図４−２６】
2013520980.tif 000030
【図４−２７】
2013520980.tif 000031
【図４−２８】
2013520980.tif 000032
【図４−２９】
2013520980.tif 000033
【図４−３０】
2013520980.tif 000034
【図４−３１】
2013520980.tif 000035
【図４−３２】
2013520980.tif 000036
【図４−３３】
2013520980.tif 000037
【図４−３４】
2013520980.tif 000038
【図４−３５】
2013520980.tif 000039
【図４−３６】
2013520980.tif 000040
【図４−３７】
2013520980.tif 000041
【図４−３８】
2013520980.tif 000042
【図４−３９】
2013520980.tif 000043
【図４−４０】
2013520980.tif 000044
【図４−４１】
2013520980.tif 000045
【図４−４２】
2013520980.tif 000046
【図４−４３】
2013520980.tif 000047
【図４−４４】
2013520980.tif 000048
【図４−４５】
2013520980.tif 000049
【図４−４６】
2013520980.tif 000050
【図４−４７】
2013520980.tif 000051
【図４−４８】
2013520980.tif 000052
【図４−４９】
2013520980.tif 000053
【図４−５０】
2013520980.tif 000054
【図４−５１】
2013520980.tif 000055
【図４−５２】
2013520980.tif 000056
【図４−５３】
2013520980.tif 000057
【図４−５４】
2013520980.tif 000058
【図４−５５】
2013520980.tif 000059
【図４−５６】
2013520980.tif 000060
【図４−５７】
2013520980.tif 000061
【図４−５８】
2013520980.tif 000062
【図４−５９】
2013520980.tif 000063
【図４−６０】
2013520980.tif 000064
【図４−６１】
2013520980.tif 000065
【図４−６２】
2013520980.tif 000066
【図４−６３】
2013520980.tif 000067
【図４−６４】
2013520980.tif 000068
【図５−０１】
2013520980.tif 000069
【図５−０２】
2013520980.tif 000070
【図５−０３】
2013520980.tif 000071
【図５−０４】
2013520980.tif 000072
【図５−０５】
2013520980.tif 000073
【図５−０６】
2013520980.tif 000074
【図５−０７】
2013520980.tif 000075
【図５−０８】
2013520980.tif 000076
【図５−０９】
2013520980.tif 000077
【図５−１０】
2013520980.tif 000078
【図５−１１】
2013520980.tif 000079
【図５−１２】
2013520980.tif 000080
【図５−１３】
2013520980.tif 000081
【図５−１４】
2013520980.tif 000082
【図５−１５】
2013520980.tif 000083
【図５−１６】
2013520980.tif 000084
【図５−１７】
2013520980.tif 000085
【図６−０１】
2013520980.tif 000086
【図６−０２】
2013520980.tif 000087
【図６−０３】
2013520980.tif 000088
【図６−０４】
2013520980.tif 000089
【図６−０５】
2013520980.tif 000090
【図６−０６】
2013520980.tif 000091
【図６−０７】
2013520980.tif 000092
【図７−０１】
2013520980.tif 000093
【図７−０２】
2013520980.tif 000094
【図７−０３】
2013520980.tif 000095
【図７−０４】
2013520980.tif 000096
【図７−０５】
2013520980.tif 000097
【図７−０６】
2013520980.tif 000098
【図７−０７】
2013520980.tif 000099
【図７−０８】
2013520980.tif 000100
【図７−０９】
2013520980.tif 000101
【図７−１０】
2013520980.tif 000102
【図７−１１】
2013520980.tif 000103
【図７−１２】
2013520980.tif 000104
【図７−１３】
2013520980.tif 000105
【図７−１４】
2013520980.tif 000106
【図７−１５】
2013520980.tif 000107
【図７−１６】
2013520980.tif 000108
【図７−１７】
2013520980.tif 000109
【図７−１８】
2013520980.tif 000110
【図７−１９】
2013520980.tif 000111
【図７−２０】
2013520980.tif 000112
2013520980.tif 000113
2013520980.tif 000114
2013520980.tif 000115
2013520980.tif 000116
2013520980.tif 000117
2013520980.tif 000118
2013520980.tif 000119
2013520980.tif 000120
2013520980.tif 000121
2013520980.tif 000122
2013520980.tif 000123
2013520980.tif 000124
2013520980.tif 000125
2013520980.tif 000126
2013520980.tif 000127
2013520980.tif 000128
2013520980.tif 000129
2013520980.tif 000130
2013520980.tif 000131
2013520980.tif 000132
2013520980.tif 000133
2013520980.tif 000134
2013520980.tif 000135
2013520980.tif 000136
2013520980.tif 000137
2013520980.tif 000138
2013520980.tif 000139
2013520980.tif 000140
2013520980.tif 000141
2013520980.tif 000142
2013520980.tif 000143
2013520980.tif 000144
2013520980.tif 000145
2013520980.tif 000146
2013520980.tif 000147
2013520980.tif 000148
2013520980.tif 000149
2013520980.tif 000150
2013520980.tif 000151
2013520980.tif 000152
2013520980.tif 000153
2013520980.tif 000154
2013520980.tif 000155
2013520980.tif 000156
2013520980.tif 000157
2013520980.tif 000158
2013520980.tif 000159
2013520980.tif 000160
2013520980.tif 000161
2013520980.tif 000162
2013520980.tif 000163
2013520980.tif 000164
2013520980.tif 000165
2013520980.tif 000166
2013520980.tif 000167
2013520980.tif 000168
2013520980.tif 000169
2013520980.tif 000170
2013520980.tif 000171
2013520980.tif 000172
2013520980.tif 000173
2013520980.tif 000174
2013520980.tif 000175
2013520980.tif 000176
2013520980.tif 000177
2013520980.tif 000178
2013520980.tif 000179
2013520980.tif 000180
2013520980.tif 000181
2013520980.tif 000182
2013520980.tif 000183
2013520980.tif 000184
2013520980.tif 000185
2013520980.tif 000186
2013520980.tif 000187
2013520980.tif 000188
2013520980.tif 000189
2013520980.tif 000190
2013520980.tif 000191
2013520980.tif 000192
2013520980.tif 000193
2013520980.tif 000194
2013520980.tif 000195
2013520980.tif 000196
2013520980.tif 000197
2013520980.tif 000198
2013520980.tif 000199
2013520980.tif 000200
2013520980.tif 000201
2013520980.tif 000202
2013520980.tif 000203
2013520980.tif 000204
2013520980.tif 000205
2013520980.tif 000206
2013520980.tif 000207
2013520980.tif 000208
2013520980.tif 000209
2013520980.tif 000210
2013520980.tif 000211
2013520980.tif 000212
2013520980.tif 000213
2013520980.tif 000214
2013520980.tif 000215
2013520980.tif 000216
2013520980.tif 000217
2013520980.tif 000218
2013520980.tif 000219
2013520980.tif 000220
2013520980.tif 000221
2013520980.tif 000222
【図１】
2013520980.tif 000223
【図２】
2013520980.tif 000224
【図３】
2013520980.tif 000225
【配列表】
2013520980000001.app
【国際調査報告】
2013520980.tif 000226
2013520980.tif 000227
2013520980.tif 000228