(57)【要約】本発明は、メチレン−イソロイシンを含有する新規のバシトラシン化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
2013509367.tif 000029
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つは−ＣＨ＝ＣＨ２であり、かつ
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して−Ｈ、−ＣＨ３、又は−ＣＨ＝ＣＨ２である）
により表される化合物、その塩及び水和物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの１つが−ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの２つが−ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２及びＲ３が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１及びＲ３が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
治療効果を有する請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細菌感染症治療用の薬剤を調製するための、請求項１に記載の化合物の使用方法。
【請求項１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏバシトラシン合成中に、イソロイシン又はバリンを５−メチレン−イソロイシンに置換することにより請求項１に記載の化合物を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質活性を有する新規の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）により天然で産生される、密接に関連するペプチド抗生物質の一群は、バシトラシンと呼ばれる。バシトラシンは一般に、多数のグラム陽性細菌種及び少数のグラム陰性細菌種に対して活性である。
【０００３】
幾つかのバシトラシンが特定されており、それらの中でもバシトラシンＡが最も重要であり、高い活性を有する（非特許文献１）。バシトラシンＡは、非リボソームペプチド合成のチオテンプレート機序により合成される、分岐環状ドデカペプチドラクタム抗生物質である（非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００４】
バシトラシンＡの一次構造は、ＮＨ２−Ｌ−Ｉｌｅ１−Ｌ−チアゾリン２−Ｌ−Ｌｅｕ３−Ｄ−Ｇｌｕ４−Ｌ−Ｉｌｅ５−Ｌ−Ｌｙｓ６−Ｄ−Ｏｒｎ７−Ｌ−Ｉｌｅ８−Ｄ−Ｐｈｅ９−Ｌ−Ｈｉｓ１０−Ｄ−Ａｓｐ１１−Ｌ−Ａｓｎ１２−ＣＯＯＨであり、Ｌ−Ｌｙｓ６のε−アミノ基とＬ−Ａｓｎ１２のＲ−カルボキシル基との間で環化されている（非特許文献４）。
【０００５】
非特許文献５では、バシトラシンは、以下の式を有するペプチド化合物として記述された。
【０００６】
【化１】
2013509367.tif 000002
式中、
Ｘは、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
かつ
Ｙは、Ｉｌｅ又はＶａｌである。
【０００７】
特に、Ｒ１及びＲ３は、活性バシトラシンのＮ末端部分であり、Ｒ４及びＲ５は、より低活性のバシトラシンの酸化Ｎ末端部分である。しかしながら、Ｒ２は、不活性立体異性体である。
【０００８】
従来技術
Ｉｋａｉらは、バシトラシンの活性が、疎水性に依存する可能性があることを示唆した：
「ＭＩＣ及び微量成分の提唱構造を比較すると、バリンの位置が、Ｎ末端、７員ペプチド環、及び側鎖ペプチド部分の順で、各成分の活性に影響を与える（減少させる）ことが示唆される。この順序は、ＨＰＬＣでの微量成分の溶出順序と関連しているため、活性は、それぞれの成分の疎水性に依存する可能性がある」（非特許文献６を参照）。
【０００９】
Ｗａｇｎｅｒらは、バシトラシンの応用における既存の制限を克服するために、バシトラシンＡに新規のヘテロ環を組み込むことを示唆した（非特許文献４）。
幾つかの非リボソーム的に合成されたペプチドは、異常アミノ酸を含む。例えば、サイクロスポリンＡは、２（Ｓ）−アミノ−３（Ｒ）−ヒドロキシ−４（Ｒ）−メチル−６（Ｅ）−オクテン酸を含み、これは、サイクロフィリンの細胞内受容体に結合するために重要であり、したがってその免疫抑制活性にとって重要である（非特許文献７）。
【００１０】
幾つかの非通常アミノ酸は、イソロイシンの構造に似ている：
・新規のメチオニン類似体である２−アミノ−５−メチル−５−ヘキセン酸は、ストレプトミセスの発酵ブロスから単離された（非特許文献８）。
【００１１】
・４メチレン−ノルロイシン及び２−アミノヘプタ−６−エン酸は、式：Ｃ７Ｈ１３ＮＯ２を有する化合物である。
・４−メチル−ノルロイシンは、組換えタンパク質に組み込むことができるイソロイシン誘導体である(非特許文献９）。
【００１２】
・２−アミノ−３−メチル−４−ペンテン酸は、タンパク質に組み込むことができる不飽和イソロイシン類似体である（非特許文献１０）。
・アマニタ・ソリタリア（Ａｍａｎｉｔａ  ｓｏｌｉｔａｒｉａ）の不飽和ノルロイシン。化学的及び薬理学的研究により、２−アミノ−ヘキサ−５−エン酸が開示されている（非特許文献１１）。
【００１３】
・セラチア・マルセセンス(Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）により産生される抗代謝剤であるベータ−メチルノルロイシン（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｅｐｐｅｒｓｏｎ及びＭｉｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻１４号、２０００年、４０３７〜４５頁
【非特許文献２】Ｗａｇｎｅｒら、Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２８巻、２００６年、１０５１３〜１０５２０頁
【非特許文献３】Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ及びｖｏｎ  Ｄｏｈｒｅｎ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９２巻、１号、１９９０年、１〜１５頁
【非特許文献４】Ｗａｇｎｅｒら、Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２８巻、１０５１３〜１０５２０頁、２００６年
【非特許文献５】Ｍｉｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９１巻、２００２年
【非特許文献６】Ｉｋａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、４８巻、３号、１９９５年、２３３〜２４２頁
【非特許文献７】Ｏｆｆｅｎｚｅｌｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８巻、３５号  １９９３年
【非特許文献８】Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３２巻  １１号  １１１８〜１１２４頁、１９７９年
【非特許文献９】Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ、３１巻、５号、２００３年、９７９〜９８７頁
【非特許文献１０】Ｍｏｃｋら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ７巻  １号、２００６年、８３〜８７頁
【非特許文献１１】Ｃｈｉｌｔｏｎら、Ｌｌｏｙｄｉａ  ３６巻  ２号、１９７３年、６９〜７３頁
【非特許文献１２】Ｓｕｇｉｕｒａら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ、３４巻  １０号、１９８１年  １２７８〜８２頁
【発明の概要】
【００１５】
１つの態様では、本発明は、新規のバシトラシン化合物に関する。より詳しくは、本発明は、これまでに知られていないアミノ酸側鎖を含む新規のバシトラシン化合物に関する。
【００１６】
理論により束縛されないが、本発明者らは、バチルス・スブチリス及びバチルス・リケニフォルミスでは、この側鎖が、バシトラシンの化学的修飾又はこれまでに知られていない天然アミノ酸の取りこみから生じると推測する。
【００１７】
新規の側鎖を含むα−アミノ酸化合物の系統名は、２−アミノ−３−メチル−５−ヘキセン酸であり、その分子式は、Ｃ７Ｈ１３ＮＯ２である。
本発明者らは、２−アミノ−３−メチル−５−ヘキセン酸について、５−メチレン−イソロイシンという名称を提案し使用する。したがって、５−メチレン−イソロイシン側鎖は、構造−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２を有する。
【００１８】
したがって、本発明は、少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。そのようなバシトラシンは、少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシンの側鎖を含む。５−メチレン−イソロイシンの側鎖は、以下のように表すことができる：
【００１９】
【化２】
2013509367.tif 000003
本発明は、１つ又は複数の５−メチレン−イソロイシンの側鎖を含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
【００２０】
本発明によるバシトラシンは、少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を、１位及び／又は５及び／又は８位に含む。そのような化合物は、以下の構造を有する。
【００２１】
【化３】
2013509367.tif 000004
式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の少なくとも１つは、−ＣＨ＝ＣＨ２であり、
かつ
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して−Ｈ、−ＣＨ３、又は−ＣＨ＝ＣＨ２である。
【００２２】
上記の構造は、仮にＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全て−ＣＨ３であった場合、バシトラシンＡを包含すると解釈されるべきである。
したがって、バシトラシンＡは、以下のように表されることになる。
【００２３】
【化４】
2013509367.tif 000005
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を５位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＪ１という名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの溶出順序に基づいている。
【００２４】
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を８位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＪ２という名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの溶出順序に基づいている。
【００２５】
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を１位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＪ３という名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの溶出順序に基づいている。
【００２６】
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を５位及び８位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＫ１という名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの予測される溶出順序に基づいている。
【００２７】
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び５位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＫ２という名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの予測される溶出順序に基づいている。
【００２８】
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び８位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＫ３という名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの予測される溶出順序に基づいている。
【００２９】
本発明者らは、５−メチレン−イソロイシン残基を１位、５位、及び８位に含む本発明によるバシトラシンについて、バシトラシンＬという名称を提案し使用する。この命名法は、Ｃ１８カラムからの予測される溶出順序に基づいている。
【００３０】
本発明の態様は、下記の本発明の説明及び／又は添付の特許請求の範囲に示されている特徴により得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２．０ｍｍ）を３０℃で使用して得られた、Ａｘｅｌｌｉａ社製の市販ロット（ＢＡＮＮ２１１４１２）の２５４ｎｍにおけるＵＶクロマトグラムを示す図である。移動相は、メタノール／アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ６．０／水  ５８：５：１０：２７、ｖ／ｖ／ｖ／ｖで構成されていた。０．２ｍｌ／分の流速で、定組成条件を使用した。注入容積は、１０μｌであった。バシトラシンＡを除いて、バシトラシンＪ１、バシトラシンＪ２、及びバシトラシンＪ３と表示されている３つの微量成分は全て、バシトラシンＡよりも１２Ｄａ大きい分子量を有しており、目印が付けてある。
【図１Ｂ】対応するＭＳ  ＴＩＣクロマトグラムを示す図であり、表示は、図１Ａと同じである。
【図２Ａ】バシトラシンＡの構造を示す図であり、断片イオンの帰属は、下記のプロダクトイオンスペクトルの特徴的イオンについて実施されている。
【図２Ｂ】バシトラシンＡのプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを示す図であり、ｍ／ｚ  ７１２．０（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）の前駆イオンが単離及び断片化された。
【図３Ａ】バシトラシンＡの環状部分の構造を示す図であり、断片イオンの帰属は、下記の二次生成プロダクトイオンスペクトルの特徴的イオンについて実施されている。
【図３Ｂ】バシトラシンＡの二次生成プロダクトイオン（ＭＳ３）スペクトルを示す図であり、連続する前駆イオンは、ｍ／ｚ  ７１２．０（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及びｍ／ｚ  ８６９．６（［Ｍ＋Ｈ］＋）であった。
【図４Ａ】バシトラシンＪ１の構造を示す図であり、断片イオンの帰属は、下記のプロダクトイオンスペクトルの特徴的イオンについて実施されている。
【図４Ｂ】バシトラシンＪ１のプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを示す図であり、ｍ／ｚ  ７１８．０（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）の前駆イオンが単離及び断片化された。
【図５Ａ】バシトラシンＪ２の構造を示す図であり、断片イオンの帰属は、下記のプロダクトイオンスペクトルの特徴的イオンについて実施されている。
【図５Ｂ】バシトラシンＪ２のプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを示す図であり、ｍ／ｚ  ７１８．０（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）の前駆イオンが単離及び断片化された。
【図６Ａ】バシトラシンＪ２の環状部分の構造を示す図であり、断片イオンの帰属は、下記の二次生成プロダクトイオンスペクトルの特徴的イオンについて実施されている。
【図６Ｂ】バシトラシンＪ２の二次生成プロダクトイオン（ＭＳ３）スペクトルを示す図であり、連続する前駆イオンは、ｍ／ｚ  ７１８．０（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及びｍ／ｚ  ８８１．６（［Ｍ＋Ｈ］＋）であった。
【図７Ａ】バシトラシンＪ３の構造を示す図であり、断片イオンの帰属は、下記のプロダクトイオンスペクトルの特徴的イオンについて実施されている。
【図７Ｂ】バシトラシンＪ３のプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを示す図であり、ｍ／ｚ  ７１８．０（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）の前駆イオンが単離及び断片化された。
【図８Ａ】５−メチレン−イソロイシン残基を５位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＪ１）の構造を示す図である。
【図８Ｂ】５−メチレン−イソロイシン残基を８位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＪ２）の構造を示す図である。
【図８Ｃ】５−メチレン−イソロイシン残基を１位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＪ３）の構造を示す図である。
【図８Ｄ】５−メチレン−イソロイシン残基を５位及び８位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＫ１）の構造を示す図である。
【図８Ｅ】５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び５位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＫ２）の構造を示す図である。
【図８Ｆ】５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び８位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＫ３）の構造を示す図である。
【図８Ｇ】５−メチレン−イソロイシン残基を１位、５位、及び８位に有するバシトラシン（＝バシトラシンＬ）の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義：
「バシトラシン」は、以下の構造（アミノ酸残基は上付きで付番されている）を含むペプチド化合物である。
【００３３】
【化５】
2013509367.tif 000006
式中、Ｘは以下の式であり、
【００３４】
【化６】
2013509367.tif 000007
Ｒは、イソロイシン、バリン、又は５−メチレン−イソロイシンのアミノ酸残基の側鎖であり、
Ｙ及びＺは、独立して、イソロイシン、バリン、又は５−メチレン−イソロイシンのアミノ酸残基であり、
式中、Ｔｈｚは、以下のチアゾリン環であり、
【００３５】
【化７】
2013509367.tif 000008
２’は、Ｘに結合されており、４’は、Ｌｅｕのα炭素に結合されており、
Ｌｅｕは、ロイシンアミノ酸残基であり、
Ｇｌｕは、グルタミンアミノ酸残基であり、
Ｌｙｓは、Ｙ及びＯｒｎとペプチド結合を形成するリジンアミノ酸残基であり、そのε−アミンは、ペプチド結合によりアスパラギンのα−カルボキシル基に結合されており、
Ｏｒｎは、オルニチンアミノ酸残基であり、
Ｐｈｅは、フェニルアラニンアミノ酸残基であり、
Ｈｉｓは、ヒスチジンアミノ酸残基であり、
Ａｓｐは、アスパラギン酸アミノ酸残基であり、
Ａｓｎは、Ａｓｐとペプチド結合を形成するアスパラギンアミノ酸残基であり、そのα−カルボキシル基は、ペプチド結合によりリジンのε−アミンに結合されている。
【００３６】
本出願で使用される場合、「バシトラシン」は、生成方法に関わらず、上記の構造を有するあらゆる化合物を包含することが意図されている。したがって、用語「バシトラシン」には、バチルス・リケニフォルミスにより天然で産生される抗生物質化合物が含まれるが、上記の一次構造を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成化合物（合成物）及び半合成化合物も含まれる。また、「バシトラシン」は、ｐＨに応じて変化する電荷に関わらず、上記の構造を有するあらゆる化合物を包含することが意図されている。また、「バシトラシン」は、立体化学に関わらず、上記の一次構造を有するあらゆる化合物を包含することが意図されている。また、「バシトラシン」は、上記の一次構造を有する化合物の塩及び水和物を包含することが意図されている。
【００３７】
「少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を含むバシトラシン」は、イソロイシン又はバリン残基（複数可）が、１位及び／又は５位及び／又は８位で５−メチレン−イソロイシン残基と置換された場合に生成されることになる構造を含むあらゆるバシトラシンを包含することが意図されている。
【００３８】
「１つの５−メチレン−イソロイシン残基を含むバシトラシン」は、イソロイシン又はバリン残基が、１位又は５位又は８位で５−メチレン−イソロイシン残基と置換された場合に生成されることになる構造を示すあらゆるバシトラシンを包含することが意図されている。
【００３９】
「少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシンの側鎖を含むバシトラシン」は、「少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を含むバシトラシン」を包含することが意図されている。
【００４０】
バシトラシンのＮ末端アミノ基及び／又はチアゾリン環が酸化されると、相当量の抗菌活性が失われる。例えば、低活性化合物バシトラシンＦは、アミノ−チアゾリン部分の代りにケト−チアゾール部分を含む（Ｃｒａｉｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、２２巻、１９５７年、１３４５〜１３５３頁）。
【００４１】
Ｄ配置のアミノ酸は、非リボソーム的に合成された細菌ペプチドで一般的であり、リボソーム的に合成されたタンパク質ではあまり一般的でない。例えば、バシトラシンでは、４位、７位、９位、及び１１位のアミノ酸残基は、通常Ｄ配置である（Ｇｌｕ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、及びＡｓｐ）。
【００４２】
５−メチレン−イソロイシンは、独立してＲ又はＳ配置であってもよい２つのキラル炭素原子を含む。
「アミノ酸残基」は、以下のものを含むペプチドの単位であり、
−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ末端残基）
又は
ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯ−（Ｎ末端残基）
又は
ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−（内部残基）
式中、Ｒは、
グリシンの場合は、−Ｈであり、
アラニンの場合は、−ＣＨ３であり、
セリンの場合は、−ＯＨであり、
システインの場合は、−ＣＨ２ＳＨであり、
イソロイシンの場合は、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、
ロイシンの場合は、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であり、
バリンの場合は、−ＣＨ（ＣＨ３）２、などである。
【００４３】
「アミノ酸側鎖」は、「アミノ酸残基」のＲ基である。例えば、Ｒ基は、
５−メチレン−イソロイシンの場合は、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり、
イソロイシンの場合は、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、
ロイシンの場合は、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であり、
バリンの場合は、−ＣＨ（ＣＨ３）２である。
【００４４】
「抗菌活性」は、
・細菌の増殖、代謝、若しくは生殖を阻害するか、又は
・細菌の死滅を増加させるか、又は
・細菌の病原性を低減するあらゆる活性である。
【００４５】
効力とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性である。それは、ＩＵ／ｍｇとして測定及び表すことができる。
バシトラシンのアミノ酸残基の「位置」は、イソロイシン、バリン、又は５−メチレン−イソロイシンであってもよい１位のＮ末端（本出願では、バシトラシンを示す図の全てにおいて左端にある）から付番されている。したがって、Ｌｙｓは位置番号６であり、Ａｓｎは位置番号１２である。
【００４６】
バシトラシンでは、「１位」は、このアミノ酸残基が部分的にチアゾリン環に組み込まれているため、特別である。したがって、バシトラシンの１位のアミノ酸残基は、以下の通常Ｎ末端単位：
【００４７】
【化８】
2013509367.tif 000009
を含んでいないが、その代りに、チアゾリン又はその酸化誘導体に結合された
【００４８】
【化９】
2013509367.tif 000010
を含む。
【００４９】
「組成物」は、２つ以上の異なる化合物を含む任意の混合物である。例えば、２つの活性医薬成分の混合物、又は１つの活性医薬成分及び１つ若しくは複数の医薬賦形剤の混合物である。
【００５０】
本出願で使用される「成分」又は「成分（複数）」という用語は、組成物中の特定の化合物を指す。したがって、「微量成分」とは、組成物中に比較的少量で見出される化合物である。
【００５１】
「医薬組成物」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に好適な任意の組成物である。したがって、そのような組成物は、皮膚、皮下、静脈内、非経口的、経口的等に投与することができる。
【００５２】
本発明は、少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基の側鎖を含む、新規のバシトラシン化合物に関する。
より詳しくは、本発明は、少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
【００５３】
更により詳しくは、本発明は、少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を１位又は５位又は８位に含む、抗菌活性が向上された新規のバシトラシン化合物に関する。
更により詳しくは、本発明は、１つの５−メチレン−イソロイシン残基を１位又は５位又は８位に含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
【００５４】
また、本発明は、２つの５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び５位に含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
また、本発明は、２つの５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び８位に含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
【００５５】
また、本発明は、２つの５−メチレン−イソロイシン残基を５位及び８位に含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
また、本発明は、３つの５−メチレン−イソロイシン残基を１位及び５位及び８位に含む、抗菌活性を有する新規のバシトラシン化合物に関する。
【００５６】
少なくとも１つの５−メチレン−イソロイシン残基を１位、５位、又は８位に含むバシトラシンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、望ましくない細菌増殖を阻害するために使用することができる。したがって、これら化合物は、細菌感染症を有する動物又はヒトに投与すると、治療効果を示すことができる。
【００５７】
５−メチレン−イソロイシンが、バシトラシンの１位、５位、又は８位に組み込まれると、その結果生じたアミノ酸側鎖は不飽和であり、５個の炭素原子を含む。イソロイシン及びバリン残基の側鎖は、それぞれ４個又は３個の炭素原子を含む。Ｃ１８カラムからの溶出順序は、バシトラシンＡ、バシトラシンＪ１、バシトラシンＪ２、そしてバシトラシンＪ３である（図１のクロマトグラムを参照）。したがって、イソロイシン側鎖を５−メチレン−イソロイシン側鎖と置換することにより、より疎水性のバシトラシンがもたらされるということは妥当である。
【００５８】
【表１】
2013509367.tif 000011
本発明の好ましい化合物は、バチルス・リケニフォルミスにより天然で産生されるバシトラシンＪ１〜３、例えば、図８Ａ〜８Ｃで視覚化されているバシトラシンＪ１、バシトラシンＪ２、及びバシトラシンＪ３である。
【００５９】
本発明の好ましい化合物は、天然発酵産物バシトラシンＡと同じ立体化学を有するバシトラシンＪ１〜３である。
本発明の好ましい化合物は、４位、７位、９位、及び１１位のアミノ酸残基がＤ配置（Ｇｌｕ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、及びＡｓｐ）であるバシトラシンＪ１〜３、バシトラシンＫ１〜３、又はバシトラシンＬである。
【００６０】
略語：
Ｍｉｌ＝５−メチレン−イソロイシン
Ｔｈｚ＝チアゾリン
Ａｌａ＝アラニン
Ａｒｇ＝アルギニン
Ａｓｎ＝アスパラギン
Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｃｙｓ＝システイン
Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｇｌｙ＝グリシン
Ｈｉｓ＝ヒスチジン
Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｌｙｓ＝リジン
Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｍｅｔ＝メチオニン
Ｐｒｏ＝プロリン
Ｓｅｒ＝セリン
Ｔｈｒ＝トレオニン
Ｔｒｐ＝トリプトファン
Ｔｙｒ＝チロシン
Ｖａｌ＝バリン
ＬＣ−ＭＳ＝液体クロマトグラフィー質量分析
ＮＭＲ＝核磁気共鳴
Ｖ＝容積
Ｍ＝モル濃度
本出願で開示されたバシトラシンの生成は、ＬｅｅらによるＪ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ、６１巻  １２号、１９９６年、３９８３〜３９８６頁に記載のように固相合成により実施することができる。
【００６１】
国際公開第１９９７４７３１３号には、本発明の新規バシトラシンを生成するために使用することができるバシトラシンペプチドの合成が記載されている。
或いは、新規のバシトラシンは、バチルス・リケニフォルミスのバシトラシン産生株で産生し、精製することにより得ることができる。
【００６２】
本発明は、以下の例示的な例によってではなく、特許請求の範囲により規定される。
（実施例）
実験１：ＬＣ−ＭＳｎ
試料は、Ａｘｅｌｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製の市販ロットを使用した。試料を水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度にし、ＬＣ−ＭＳｎ分析前に０．４５μｍフィルター（ＶＷＲ）でろ過した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）は、４連液送ポンプ、脱気装置、サーモスタット付オートサンプラー（５℃に設定）、サーモスタット付カラム区画（３０℃に設定）、及びダイオードアレイ検出器（２５４ｎｍに設定）で構成されていた。ＨＰＬＣ条件は、Ｇｏｖａｅｒｔｓら（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、１７巻、１２号、１３６６〜１３７９頁）に記載の条件と同じであった。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２．０ｍｍ）を使用した。移動相は、メタノール／アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ６．０／水  ５８：５：１０：２７、ｖ／ｖ／ｖ／ｖで構成されていた。０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液は、０．１Ｍ酢酸を添加することによりｐＨ６．０に調整した。０．２ｍｌ／分の流速で、定組成条件を使用した。注入容積は、１０μｌであった。ＥＳＩインターフェースを備えたＬＸＱ線形イオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を、ＨＰＬＣシステムに接続した。調整は、バシトラシンＡの２重プロトン化分子イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）で実施した。ＥＳＩパラメータを、以下の通りに設定した：シースガス  ３５（任意単位）、補助ガス  １０（任意単位）、スプレー電圧  ５．０ｋＶ、キャピラリー温度  ３２０℃、キャピラリー電圧  ９．０Ｖ、チューブレンズ電圧  ９５Ｖ。ＭＳパラメータを以下の通りに設定した：ＲＦレンズオフセット  −４．２５Ｖ、レンズ０電圧  −３．０Ｖ、多重極０オフセット  −４．５Ｖ、レンズ１電圧  −８．０Ｖ、ゲートレンズ電圧  −５６Ｖ、多重極１オフセット  −９．５Ｖ、多重極ＲＦ振幅  ４００Ｖ、正面レンズ電圧  −６．５Ｖ。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ−ＭＳ３分析は、単離幅３及び衝突エネルギー１６％で実施した。
【００６３】
結果
Ａｘｅｌｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製の典型的なロット（ＢＡＮＮ２１１４１２）のＵＶクロマトグラム及びＭＳクロマトグラムは、図１Ａ〜Ｂに示されている。ＵＶクロマトグラムは、ＬＣ−ＭＳと適合しないＰｈ．Ｅｕｒ．ＨＰＬＣ法を使用したこのロットの対応するクロマトグラムと非常に類似している。バシトラシンＡを除き、バシトラシンＪ１、バシトラシンＪ２、及びバシトラシンＪ３と表示されている３つの微量成分は全て、バシトラシンＡよりも１２Ｄａ大きい分子量を有しており、図１において目印が付けてある。これら３つの成分の構造解明を本出願で記述するものとし、それらの構造から、それらの表示の根拠がわかるであろう。
【００６４】
バシトラシンＡ
２重プロトン化分子イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋、ｍ／ｚ  ７１２．０）が、単離及び断片化され、その結果生じたプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルは、図２Ｂに示されている。スペクトルは、ｍ／ｚ  １３３７．７／６６９．８２＋（Ｉｌｅの喪失）、ｍ／ｚ  １２２４．７／６１３．１２＋（ＩｌｅＴｈｚの喪失）、ｍ／ｚ  １１１１．７（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕの喪失）、ｍ／ｚ  ９８２．６／４９２．２２＋（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕの喪失）、及びｍ／ｚ  ８６９．６（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅの喪失）を有する、完全なひと揃いのｙ’’イオンを含んでいる。これら断片の帰属は、図２Ａに視覚化されている。ｍ／ｚ  ５５４．５（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅ）及びｍ／ｚ  ４４１．３（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）を有するｂイオンに加えて、対の結合切断に起因する断片イオンを、ｍ／ｚ  ２２７．１（ＴｈｚＬｅｕ）、ｍ／ｚ  ３５６．１（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）、及びｍ／ｚ  ４６９．２（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅ）で見ることができる。
【００６５】
バシトラシンＡの環状部分の配列決定は、ＭＳ３実験（７１２．０→８６９．６）において、ｍ／ｚ  ８６９．６の環状部分断片イオンを更に単離及び断片化することにより実施した。図３Ｂを参照されたい。ＯｒｎとＩｌｅとの間の優先的開環により、図３Ａに示されている２つの系列の断片イオンがもたらされる。１つの系列は、ｍ／ｚ  ７５６．５（Ｉｌｅの喪失）、ｍ／ｚ  ６０９．４（ＩｌｅＰｈｅの喪失）、ｍ／ｚ  ４７２．４（ＩｌｅＰｈｅＨｉｓの喪失）、及びｍ／ｚ  ３５７．４（ＩｌｅＰｈｅＨｉｓＡｓｐの喪失）のプロダクトイオンを含む。もう一方の系列では、ｍ／ｚ  ７５５．６（Ｏｒｎの喪失）、ｍ／ｚ  ６２７．４（ＯｒｎＬｙｓの喪失）、ｍ／ｚ  ５１３．４（ＯｒｎＬｙｓＡｓｎの喪失）、及びｍ／ｚ  ３９８．４（ＯｒｎＬｙｓＡｓｎＡｓｐの喪失）のプロダクトイオンが見出される。したがって、これら断片イオンは全て、バシトラシンＡの十分に確立されている配列を確認し、切断化パターンを比較することにより、未知のバシトラシン類似体の配列を解明する可能性があることを示している。
【００６６】
バシトラシンＪ１
バシトラシンＡの場合と同じ方法を使用して、バシトラシンＡと＋１２Ｄａ差をもたらす修飾の位置を決定することができた。２重プロトン化分子イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋、ｍ／ｚ  ７１８．０）が、単離及び断片化され、その結果生じたプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルは、図４Ｂに示されている。スペクトルは、ｍ／ｚ  １３４９．７／６７５．８２＋（Ｉｌｅの喪失）、ｍ／ｚ  １２３６．７／６１９．１２＋（ＩｌｅＴｈｚの喪失）、ｍ／ｚ  １１２３．７（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕの喪失）、ｍ／ｚ  ９９４．６／４９８．１２＋（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕの喪失）、及びｍ／ｚ  ８６９．６（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕＭｉｌの喪失）を有する、完全なひと揃いのｙ’’イオンを含んでいる。これら断片の帰属は、図４Ａに視覚化されている。ｍ／ｚ  ５６６．４（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕＭｉｌ）及びｍ／ｚ  ４４１．３（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）を有するｂイオンに加えて、対の結合切断に起因する断片イオンを、ｍ／ｚ  ２２７．１（ＴｈｚＬｅｕ）、ｍ／ｚ  ３５６．１（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）、及びｍ／ｚ  ４８１．２（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕＭｉｌ）で見ることができる。
【００６７】
ＬＣ−ＭＳ３実験（７１８．０→８６９．６）により、バシトラシンＡの環状部分に対する対応する実験の場合と同じ特徴的な断片イオンがもたらされた。したがって、これら断片イオンは全て、この成分の５位が、Ｉｌｅよりも１２Ｄａ重い残基であることと一致しており、残りの配列は、バシトラシンＡと同じであると考えられる。
【００６８】
バシトラシンＪ２
バシトラシンＡの場合と同じ方法を使用して、バシトラシンＡと＋１２Ｄａ差をもたらす修飾の位置を決定することができた。２重プロトン化分子イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋、ｍ／ｚ  ７１８．０）が、単離及び断片化され、その結果生じたプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルは、図５Ｂに示されている。スペクトルは、ｍ／ｚ  １３４９．７／６７５．８２＋（Ｉｌｅの喪失）、ｍ／ｚ  １２３６．７／６１９．２２＋（ＩｌｅＴｈｚの喪失）、ｍ／ｚ  １１２３．７（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕの喪失）、ｍ／ｚ  ９９４．６／４９８．１２＋（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕの喪失）、及びｍ／ｚ  ８８１．６（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅの喪失）を有する、完全なひと揃いのｙ’’イオンを含んでいる。これら断片の帰属は、図５Ａに視覚化されている。ｍ／ｚ  ５５４．５（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅ）及びｍ／ｚ  ４４１．３（ＩｌｅＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）を有するｂイオンに加えて、対の結合切断に起因する断片イオンを、ｍ／ｚ  ２２７．１（ＴｈｚＬｅｕ）、ｍ／ｚ  ３５６．１（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）、及びｍ／ｚ  ４６９．２（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅ）で見ることができる。これら断片から、バシトラシンＡと異なる＋１２Ｄａ修飾が、分子の環状部分に位置することは明白である。
【００６９】
バシトラシンＪ２の環状部分の配列決定は、ＭＳ３実験（７１８．０→８８１．６）において、ｍ／ｚ  ８８１．６の環状部分断片イオンを更に単離及び断片化することにより実施した。図６Ｂを参照されたい。ＯｒｎとＩｌｅのと間の優先的開環により、図６Ａに示されている２つの系列の断片イオンがもたらされる。１つの系列は、ｍ／ｚ  ７５６．４（Ｍｉｌの喪失）、ｍ／ｚ  ６０９．５（ＭｉｌＰｈｅの喪失）、ｍ／ｚ  ４７２．４（ＭｉｌＰｈｅＨｉｓの喪失）、及びｍ／ｚ  ３５７．４（ＭｉｌＰｈｅＨｉｓＡｓｐの喪失）のプロダクトイオンを含む。もう一方の系列では、ｍ／ｚ  ７６７．４（Ｏｒｎの喪失）、ｍ／ｚ  ６３９．４（ＯｒｎＬｙｓの喪失）、ｍ／ｚ  ５２５．４（ＯｒｎＬｙｓＡｓｎの喪失）、及びｍ／ｚ  ４１０．４（ＯｒｎＬｙｓＡｓｎＡｓｐの喪失）のプロダクトイオンが見出される。したがって、これら断片イオンは全て、この成分の８位が、Ｉｌｅよりも１２Ｄａ重い残基であることと一致しており、残りの配列は、バシトラシンＡと同じであると考えられる。
【００７０】
バシトラシンＪ３
バシトラシンＡの場合と同じ方法を使用して、バシトラシンＡと＋１２Ｄａ差をもたらす修飾の位置を決定することができた。２重プロトン化分子イオン（［Ｍ＋２Ｈ］２＋、ｍ／ｚ  ７１８．０）が、単離及び断片化され、その結果生じたプロダクトイオン（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルは、図７Ｂに示されている。スペクトルは、ｍ／ｚ  １３３７．８／６６９．８２＋（Ｍｉｌの喪失）、ｍ／ｚ  １２２４．８／６１３．２２＋（ＭｉｌＴｈｚの喪失）、ｍ／ｚ  １１１１．７（ＭｉｌＴｈｚＬｅｕの喪失）、ｍ／ｚ  ９８２．６／４９２．２２＋（ＭｉｌＴｈｚＬｅｕＧｌｕの喪失）、及びｍ／ｚ  ８６９．６（ＭｉｌＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅの喪失）を有する完全なひと揃いのｙ’’イオンを含んでいる。これら断片の帰属は、図７Ａに視覚化されている。ｍ／ｚ  ５６６．４（ＭｉｌＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅ）及びｍ／ｚ  ４５３．４（ＭｉｌＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）を有するｂイオンに加えて、対の結合切断に起因する断片イオンを、ｍ／ｚ  ２２７．１（ＴｈｚＬｅｕ）、ｍ／ｚ  ３５６．１（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕ）、及びｍ／ｚ  ４６９．２（ＴｈｚＬｅｕＧｌｕＩｌｅ）で見ることができる。
【００７１】
ＬＣ−ＭＳ３実験（７１８．０→８６９．６）により、バシトラシンＡの環状部分に対する対応する実験の場合と同じ特徴的な断片イオンがもたらされた。したがって、これら断片イオンは全て、この成分の１位が、Ｉｌｅよりも１２Ｄａ重い残基であることと一致しており、残りの配列は、バシトラシンＡと同じであると考えられる。
【００７２】
実験２：成分の単離
ＮＭＲ分光法を用いて３つの成分の構造を解明するために、濃縮試料を調製しなければならなかった。理想的には、３つの成分の各々は、他の成分からの干渉シグナルがない「クリーンな」ＮＭＲスペクトルを得るために、約９０％の純度に単離されているべきである。単離は、２段階で実施した。第１段階では、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８−カラム（２５〜４０μｍ、３５×５ｃｍ）を使用して、３つの成分の前後に溶出する成分を除去した。移動相は、メタノール／アセトニトリル／０．０３Ｍギ酸アンモニウムｐＨ６．０  ３．５：３１．５：６５、ｖ／ｖ／ｖで構成されていた。このようにして、３つの成分の総純度が約２５％である精製物質を得た。第２段階では、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ−カラム（５μｍ、２５０×１０ｍｍ）を使用して、３つの成分を互いから分離した。移動相は、メタノール／アセトニトリル／０．０２５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ６．０  ５８：５：３７、ｖ／ｖ／ｖで構成されていた。この２段階精製の最終的な結果は、４つの試料（試料Ｂ、Ｂ’、Ｃ、及びＣ’と表示されている）であり、試料Ｂ及びＢ’は類似しており、主としてバシトラシンＪ１及びバシトラシンＡを含有し、試料Ｃ及びＣ’は類似しており、主としてバシトラシンＪ２及びバシトラシンＪ３を含有していた（表１）。正しい成分が単離されたことを確認するために、ＬＣ−ＭＳｎを全ての試料で実施した。試料Ｂ及びＣの純度は、十分なＮＭＲ解明に必要であると通常考えられている純度よりもはるかに低かった。しかしながら、試料Ｂの他の主成分がバシトラシンＡであったため、更なる精製をせずにＮＭＲ研究を試みることにした。バシトラシンＡの含有量が豊富な試料（試料Ａと表示されており、以前に調製されていた）に対するＮＭＲ研究を最初に実施することにより、基準化合物としての役割を果たすことに加えて、バシトラシンＡに由来するシグナルを試料Ｂのスペクトルから取り除くことができることが期待された。試料Ｃは、バシトラシンＪ２及びバシトラシンＪ３の混合物を含有していたため、シグナルの重なり度合いが高いことが予測され、十分な構造解明は期待できない可能性かあった。しかしながら、これらの成分における修飾は、バシトラシンＪ１と同じであると予想されるため（ＬＣ−ＭＳｎ試行から、実験１を参照）、ＬＣ−ＭＳｎの結果と組み合わせたＮＭＲ実験により、十分な構造的根拠がもたらされる可能性があることが、依然として期待された。
【００７３】
【表２】
2013509367.tif 000012
実験３：精密質量測定
試料Ａ、Ｂ’及びＣを、精密質量決定により分析した（表２を参照）。バシトラシンＪ１／バシトラシンＡ間の分子量差は、１１．９９９８であった。バシトラシンＪ２／バシトラシンＡ間の分子量差及びバシトラシンＪ３／バシトラシンＡ間の分子量差は両方とも、それぞれ１２．００００であった。これにより、成分バシトラシンＪ１、バシトラシンＪ２、及びバシトラシンＪ３が、バシトラシンＡよりも、１個多い炭素原子（精密質量１２．００００）で構成される元素組成を有していたという更なる根拠がもたらされた。
【００７４】
【表３】
2013509367.tif 000013
実験４：ＮＭＲ
ＮＭＲスペクトルは、３０３Ｋにて、９５％リン酸緩衝液ｐＨ６．５／５％Ｄ２Ｏ中の試料Ａ、Ｂ、及びＣの１０ｍＭ溶液で記録した。実験は、Ｂｒｕｋｅｒ社製６００ＭＨｚ分光計を用いて、２次元同核種プロトン化学シフト相関（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ）、ヘテロ核１Ｈ−１３Ｃ相関（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ）、及びヘテロ核１Ｈ−１５Ｎ相関（ＨＳＱＣ）実験の標準的パルスシーケンスを使用して得られた。ＴＯＣＳＹ実験の場合、２０ｍｓ及び６０ｍｓの混合時間を使用し、ＮＯＥＳＹ実験では、１００ｍｓ、２００ｍｓ、４００ｍｓ、及び６００ｍｓの混合時間を使用した。試料Ｃの場合は、ＤＥＰＴ（１３５）実験を得た。化学シフトは、内部的な２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−スルホン酸（０．５ｍＭ）を基準として使用して、ｐ．ｐ．ｍ．で報告されている。
【００７５】
結果
試料Ａ（バシトラシンＡ）
アミノ酸スピン系の特定は、１Ｈ検出モードの２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ化学シフト相関実験（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ及びＴＯＣＳＹ）及びヘテロ核１Ｈ−１３Ｃ及び１Ｈ−１５Ｎ化学シフト相関（ＨＳＱＣ）により実施した。データは表３に要約されている。化学シフトデータは、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９９２年）の１Ｈ化学シフトデータ（表３を参照）及びＢＭＲＢデータベースに見出される化学シフト統計（表３を参照）の両方と比較して、残基Ｉｌｅ、Ｔｈｚ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、及びＡｓｎの存在と一致する。
【００７６】
アミノ酸残基の配列は、２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ（ＮＯＥＳＹ、表４）及び１Ｈ−１３Ｃ（ＨＭＢＣ、表５）相関実験で確立した。双極子カップリング（空間経由、ＮＯＥＳＹ）及び遠隔スカラーカップリング（ＨＭＢＣ）は、バシトラシンＡの確立されている配列と合致した。
【００７７】
【化１０】
2013509367.tif 000014
【００７８】
【表４】
2013509367.tif 000015
2013509367.tif 000016
2013509367.tif 000017
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2013509367.tif 000019
2013509367.tif 000020
【００７９】
【表５】
2013509367.tif 000021
【００８０】
【表６】
2013509367.tif 000022
試料Ｂ（バシトラシンＪ１）
アミノ酸スピン系の特定を、１Ｈ検出モードの２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ化学シフト相関実験（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ及びＴＯＣＳＹ）及びヘテロ核１Ｈ−１３Ｃ及び１Ｈ−１５Ｎ化学シフト相関（ＨＳＱＣ）により実施した。データは表３に要約されている。残基Ｉｌｅ、Ｔｈｚ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、及びＡｓｎの化学シフトデータは、バシトラシンＡの対応するデータとほぼ同一であり、同じ残基が、試料Ｂの主成分では未修飾であると判明したことを示す。注目すべきは、バシトラシンＡのＩｌｅ５に対応するスピン系が、試料Ａと比較して、この試料では著しく弱かったことである（試料Ｂが約２０％のバシトラシンＡを含有していたことに留意されたい）。
【００８１】
これらのシグナルに加えて、３ＪＨ、Ｈ結合スピン系は、δ８．１９（骨格アミドプロトン）、５．７２、５．０６、４．１１、２．１０、１．９８、１．９０、及び０．８２との共鳴が見出された。δ５．７２／１３８．２、δ５．０６／１２０．１、δ４．１１／６０．８、δ２．１０／３８．８、δ１．９０／３８．８、δ１．９８／３６．７、及びδ０．８２／１７．９のＨＳＱＣクロスピークは、少なくとも６つのＣＨＸ−基を示した。δ８．１９／４．１１、δ４．１１／１．９８、δ１．９８／０．８２のＣＯＳＹクロスピーク、及びδ８．１９／６０．８、δ４．１１／１７５．７、δ４．１１／３６．７、δ４．１１／１７．９、δ０．８２／６０．８、及びδ０．８２／３６．７のＨＭＢＣクロスピークは、以下のエレメント−ＮＨＣＨ（ＣＯ）ＣＨＣＨ３を明らかにした。これは、予想通りのＮＯＥ相関でも支持された。
【００８２】
δ２．１０／１．９０のＣＯＳＹクロスピーク、及びδ４．１１／３８．８、δ０．８２／３８．８、δ１．９０／３６．７、及びδ１．９０／１７．９のＨＭＢＣクロスピークは、以下のエレメント−ＮＨＣＨ（ＣＯ）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２を明らかにした。これは、予想通りのＮＯＥ相関でも支持された。
【００８３】
δ５．７２／２．１０、δ５．７２／１．９０、δ５．７２／５．０６のＣＯＳＹクロスピーク、及びδ５．７２／３８．８、δ１．９０／１３８．２、δ５．０６／３８．８、及びδ１．９０／１２０．１のＨＭＢＣクロスピークは、以下のエレメント−ＮＨＣＨ（ＣＯ）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２を明らかにした。これは、予想通りのＮＯＥ相関でも支持された。この異常Ｉｌｅアミノ酸類似体の化学シフトデータは全て、ＣｈｅｍＤｒａｗで生成された予測データと類似している（データ非表示）。
【００８４】
アミノ酸残基の配列は、２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ（ＮＯＥＳＹ、表４）及び１Ｈ−１３Ｃ（ＨＭＢＣ、表５）相関実験で確立した。アミノ酸配列は、バシトラシンＡと同じであることが見出された。そこでは、５位のＩｌｅが、異常Ｉｌｅ類似体（５−メチレン−イソロイシンと呼ぶ）により置換されている。このように、ＮＭＲデータは、ＬＣ−ＭＳｎの結果及び精密質量決定と合致し、データは全て、以下のバシトラシンＡ類似体が試料Ａに存在することを示している。
【００８５】
【化１１】
2013509367.tif 000023
試料Ｃ（バシトラシンＪ２及びバシトラシンＪ３）
ＮＭＲデータは、試料Ｂに存在していた同じ異常Ｉｌｅ類似体の２つの残基が存在することを明らかにした（表６を参照）。試料Ａ及びＢについて取得した２Ｄ実験に加えて、試料Ｃに対してはＤＥＰＴ（１３５）実験も実施した（表６）。この実験により、試料Ｃ中の２つの同じ異常Ｉｌｅアミノ酸類似体の構造が、更に確認された。これらＩｌｅ類似体のうちの一方は、Ｎ末端に位置しており（可視骨格アミドプロトンが欠如することにより示された）、したがって５−メチレン−イソロイシン１と表示した。他方のＩｌｅ類似体は、ＮＯＥＳＹ及びＨＭＢＣ相関により明らかにされたように、８位に位置しており、したがって、５−メチレン−イソロイシン８と表示した。このように、ＮＭＲデータは、ＬＣ−ＭＳｎ及び精密質量決定の結果と合致している。データは全て、試料Ｃに２つのバシトラシンＡ類似体が存在し、一方のバシトラシンＡ類似体の８位のＩｌｅが、異常Ｉｌｅ類似体で置換されており、第２のバシトラシンＡ類似体中の１位のＩｌｅが、異常Ｉｌｅ類似体で置換されていることを示している。
【００８６】
【化１２】
2013509367.tif 000024
【００８７】
【化１３】
2013509367.tif 000025
【００８８】
【表７】
2013509367.tif 000026
2013509367.tif 000027
実験５：効力
試料Ａ、Ｂ’及びＣ’の抗菌活性（表１を参照）を測定した。未知試料の抗菌活性を既知（標準）試料と比較することにより、効力と呼ばれることが多い比抗菌活性（本明細書ではＩＵ／ｍｇとして列挙されている）を測定した。具体的には、亜鉛バシトラシン標準物質を、０．０７Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解し、２．０、１．０、及び０．５ＩＵバシトラシン／ｍｌに希釈した。これら３つの標準溶液を、試験生物、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）を播種した寒天プレートに添加した。未知試料を溶解し、希釈し、標準物質同じプレートに添加した。３２〜３７Ｃで１６〜２４時間後、阻止領域を測定し、未知試料を標準物質と比較した。各試料の結果（ＩＵ／ｍｇとして報告）は、表７に列挙されている。
【００８９】
【表８】
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試料Ａは、表１に列挙されているように、９３％（ＨＰＬＣを用いて２５４ｎｍで測定）バシトラシンＡを含有していた（バシトラシンＪ１、Ｊ２、又はＪ３は含有していなかった）。したがって、バシトラシンＡの比抗菌活性を７７．４ＩＵ／ｍｇと計算することができる。これは、以前の報告よりも低い。考え得る説明は、水又は塩の含有量、並びに微量成分の拮抗効果の可能性である。試料Ｂ’及びＣ’は、幾つかのバシトラシンの混合物を含有しているため、バシトラシンＪ１、Ｊ２、又はＪ３の正確な比抗菌活性（ＩＵ／ｍｇ）を報告することは可能ではない。しかしながら、利用可能なデータは、バシトラシンＪ１、Ｊ２、及びＪ３の効力は、バシトラシンＡの効力と類似しているか、又はそれを超えていることを強く示している。また、試料Ｂ’及びＣ’は、水、塩、及び／又は相乗効果若しくは拮抗効果を有する成分を含有している可能性がある。
【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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