(57)【要約】  スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記濾過する工程が、１以上のフィルタ膜を用いて実施され、少なくとも１枚のフィルタ膜が、無菌グレード（例えば、０．２μｍ又は０．２２μｍ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が、濾過されたスプリットウイルス調製物中のＨＡ収量を高めるのに十分な量で存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が、０．０２５％ｗ／ｖ超の量で存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が、０．１〜１．５％ｗ／ｖの量で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記スプリットインフルエンザウイルス調製物を不活化する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記不活化する工程が、工程（ｉｉｉ）の後且つ工程（ｉｖ）の前に実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記不活化する工程が、工程（ｉｉｉ）の後且つ工程（ｉｖ）の後に実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
任意で無菌グレードのフィルタ（例えば、０．２μｍ又は０．２２μｍのフィルタ）を用いて、工程（ｉｖ）の濾過工程に加えて、前記スプリットインフルエンザウイルス調製物を濾過する工程を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）、ラウリル硫酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、及びデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スプリットインフルエンザウイルス調製物を超遠心する工程を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記全ウイルス調製物を清澄化する工程を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記全ウイルス調製物を超遠心する工程を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記スプリットインフルエンザウイルス調製物が、汎発流行性株に由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記スプリットインフルエンザウイルス調製物が、汎発流行間株に由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１が、デオキシコール酸ナトリウムである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第１の界面活性剤が、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）が同時に実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
濾過前にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））をスプリットウイルス調製物に添加しない方法と比べたＨＡより、濾過したスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニット調製物中のＨＡ濃度が５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％超高い、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））を工程（ｉｉ）に添加し、且つ濾過前にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））をスプリットウイルス調製物に添加しない方法と比べたＨＡより、濾過したスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニット調製物中のＨＡ濃度が５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％超高い、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法により得られるか又は得ることができるスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物。
【請求項２２】
医薬組成物及び／又は免疫原性組成物を調製する方法であって、（ｉ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によりスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）前記スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物と薬学的に許容し得る担体とを混合して、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物を調製する工程とを含む方法。
【請求項２３】
工程（ｉｉ）の前に、工程（ｉ）のスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を望ましいＨＡ濃度（例えば、１５μｇ、９μｇ、７．５μｇ、５．０μｇ、３．８μｇ、又は２．５μｇ）になるように希釈する工程を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の方法により得られるか又は得ることができる医薬組成物及び／又は免疫原性組成物。
【請求項２５】
アジュバントを更に含む、請求項２４に記載の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記アジュバントが、水中油型エマルション（例えば、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、及び任意でトコール（例えば、α−トコフェロール）を含む水中油型エマルション）である、請求項２５に記載の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物。
【請求項２７】
ヒト被験体において免疫反応を誘導する方法であって、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
薬剤に使用するための請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物。
【請求項２９】
インフルエンザによって引き起こされる疾患の治療及び／又は予防において使用するための請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物。
【請求項３０】
インフルエンザによって引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物の使用。
【請求項３１】
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と界面活性剤とを含む抗原調製物であって、前記界面活性剤のヘマグルチニンに対する重量／体積比が１．５〜１５：１である、抗原調製物。
【請求項３２】
スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニット調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）一旦分割されたウイルス粒子の凝集を防ぐのに好適な量で添加されたｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の存在下で、前記全ウイルス調製物を分割する工程とを含む方法。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って調製される１以上のスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年１０月２７日出願の英国特許出願第０９１８８３０．１号及び２０１０年４月２９日出願の米国特許出願第６１／３２９２３０号の利益を主張する。
【０００２】
米国特許規則１．７１（Ｅ）に関する著作権表示
本特許明細書の開示の一部は、著作権保護に従う内容を含む。著作権者は、本特許文献又は本特許開示が米国特許商標局の特許ファイル又は記録に見られる場合、如何なるものによる本特許文献又は本特許開示の複製にも異議を申し立てないが、その他の場合の全ての著作権は如何なる場合にも保護される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ワクチンにおいて使用するのに好適なインフルエンザ抗原を調製する方法、及び前記抗原を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルスは、世界中で最も広範に存在するウイルスのうちの１つであり、ヒト及び家畜の両方に感染する。インフルエンザは、経済的負担、病的状態、及び更には死を引き起すので、重大である。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、直径約１２５ｎｍの粒径を備えるＲＮＡエンベロープウイルスである。インフルエンザウイルスは、脂質二分子膜構造を有するウイルスエンベロープに囲まれている、核タンパク質に結合しているリボ核酸（ＲＮＡ）の内部ヌクレオカプシド、すなわちコアと、外部糖タンパク質とから基本的になる。ウイルスエンベロープの内層は、マトリクスタンパク質から主になり、外層は、大部分が宿主由来の脂質物質からなる。インフルエンザウイルスは、２つの表面抗原である糖タンパク質であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）及びヘマグルチニン（ＨＡ）を含み、これらは、粒子の表面に長さ１０〜１２ｎｍのスパイクとして現れる。インフルエンザ亜型の抗原特異性を決定するのは、これら表面タンパク質、特にヘマグルチニンである。ウイルス株の分類は、起源である宿主動物種、地理的な位置、単離された年、通し番号に従って、そしてインフルエンザＡ型についてはＨＡ及びＮＡ亜型の血清学的性質により行われる。インフルエンザＡ型ウイルスについては、１６種のＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１６）及び９種のＮＡ亜型（Ｎ１〜Ｎ９）が同定されている（Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＲＧら．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２年；５６：１５２−１７９；Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ＲＡら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｓｕｂｔｙｐｅ（Ｈ１６）Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｌａｃｋ−Ｈｅａｄｅｄ  Ｇｕｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５年；７９：２８１４−２８２２）。ＨＡ及びＮＡの全ての亜型のウイルスが水鳥から検出されているが、１９１８年以降ヒト集団において安定した系統が確立されているのは３種のＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３）と２種のＮＡ亜型（Ｎ１及びＮ２）のみである。インフルエンザＢ型ウイルスについては、１種のＨＡ亜型及び１種のＮＡ亜型のみが認められている。
【０００６】
予測不能の間隔で、前の季節に流行した株とは全く異なる亜型のヘマグルチニン抗原を有する新しいインフルエンザウイルスが出現する。ここで、生じる抗原は、以前ヒトにおいて流行した株の対応するタンパク質と２０％〜５０％異なる場合がある。「抗原シフト」と呼ばれるこの現象から、「集団免疫」を回避し且つ汎発流行病を確立するウイルスが生じ得る。言いかえれば、ヒト集団が免疫を有しない新しいインフルエンザウイルスが現れた場合、インフルエンザの汎発流行（パンデミック）が生じる。
【０００７】
汎発流行中、抗ウイルス薬は、ニーズを満たすのに十分ではない又は有効ではない場合もあり、汎発流行間期にはインフルエンザのリスクのある個体数がより多くなるので、大量に産生でき且つ効率的に分配及び投与することができる好適なワクチンの開発が必須である。また、一般的に集団の年齢が上がるにつれて、インフルエンザワクチンの必要性も増加するので、季節性（汎発流行間）インフルエンザワクチン用抗原の製造を最大化するための改善されたプロセスも重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含む方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記方法によって得られる又は得ることができるスプリットインフルエンザウイルス調製物及び／又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物に関する。
【００１１】
また、本発明は、医薬組成物又は免疫原性組成物を調製する方法であって、（ｉ）本明細書に記載する本発明の方法によって製造されるスプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットインフルエンザ調製物を提供する工程と、（ｉｉ）前記スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットインフルエンザ調製物と薬学的に許容し得る担体とを混合して、医薬組成物又は免疫原性組成物を調製する工程とを含む方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、本発明の方法によって得られる又は得ることができる医薬組成物又は免疫原性組成物に関する。
【００１３】
また、本発明は、ヒト被験体において免疫反応を誘導する方法であって、本明細書に記載する前記医薬組成物又は免疫原性組成物を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明は、更に、インフルエンザ疾患又は感染の治療又は予防において使用するための、本明細書に定義される医薬組成物及び／又は免疫原性組成物に関する。
【００１５】
また、本発明は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び界面活性剤を含む抗原調製物であって、前記界面活性剤（μｇ／ｍＬ）の前記ヘマグルチニン（μｇ／ｍＬ）に対する重量比が１．５〜１５である抗原調製物に関する。
【００１６】
また、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物を製造する方法であって、（ｉ）全インフルエンザウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）一度分割されたウイルス粒子の凝集を防ぐのに好適な量で添加された界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程とを含む方法に関する。
【００１７】
また、本発明は、本明細書に記載するプロセスのうちのいずれかに従って調製される１以上のスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を含むワクチンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】様々なインフルエンザワクチンの製造プロセスを開示する。
【図２】ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加しないいくつかの製造工程後のＨＡの減少について開示する：８／１：精製された一価スプリットウイルスバルク；８／２及び８／３：段階的濾過；８／４：不活化。
【図３】ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加して／添加せずに製造されたＨ１Ｎ１ｖ一価バルクのＳＤＳ−ＰＡＧＥを開示する。
【図４】ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加せずに調製されたアジュバント無添加の（ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）Ａ／カリフォルニア／７／２００９スプリットワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＩ後１４日目のＨＩ力価（ＧＭＴ＋／−ＣＩ９５）を開示する。
【図５】ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加して調製されたアジュバント無添加のＡ／カリフォルニア／７／２００９スプリットワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＩ後１４日目のＨＩ力価（ＧＭＴ＋／−ＣＩ９５）を開示する。
【図６】更なるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加していない、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンＡ／カリフォルニア／７／２００９  ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａについて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩ力価（ＧＭＴ＋／−ＣＩ９５）−１４ＰＩを開示する。
【図７】更なるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンＡ／カリフォルニア／７／２００９  ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａについて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける赤血球凝集阻止力価（ＧＭＴ＋／−ＣＩ９５）−１４ＰＩを開示する。
【図８】更なるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加していない、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンＡ／カリフォルニア／７／２００９  ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａについて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける赤血球凝集阻止力価（ＧＭＴ＋／−ＣＩ９５）−１４ＰＩＩを開示する。
【図９】更なるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンＡ／カリフォルニア／７／２００９  ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａについて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける赤血球凝集阻止力価（ＧＭＴ＋／−ＣＩ９５）−１４ＰＩＩを開示する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、スプリットウイルス調製物と組合せてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を使用すると、前記ウイルス調製物の抗原成分の収量が増加することを見出した。このプロセスは、汎発流行株及び季節性（汎発流行間）株からの抗原の収量を増加させる。例えば、このようなワクチン用量が現在不十分である場合、一度により多くのワクチン用量を製造することが可能になるので、  収量の増加は望ましい。
【００２０】
また、スプリットウイルス調製物又はサブユニット調製物と組合せてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を使用すると、インフルエンザ抗原、例えばＨＡ又はＮＡの純度が向上する。
【００２１】
理論に縛られるものではないが、スプリットインフルエンザウイルス調製物と組合せてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を使用すると、スプリットウイルス粒子の凝集を防ぐのに役立ち、且つインフルエンザワクチンをより容易に濾過することが可能になる。これは、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を使用するときにみられる収量の増加の理由の全て又は一因である。
【００２２】
本発明は、一般的に、スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットのインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と；（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含む方法に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含み、第２の界面活性剤が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）の濃度で工程（ｉｉｉ）において用いられる方法を提供する。
【００２４】
前記方法は、好適には工程（ｉｉｉ）の後に、前記スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を不活化させる更なる工程を含んでもよい。
【００２５】
したがって、第３の態様では、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を不活化する工程と、（ｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含む方法を提供する。
【００２６】
界面活性剤
スプリットインフルエンザウイルス調製物は、これまで、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））と組合せて、トリ−ｎ−ブチルリン酸塩又はジエチルエーテル等の溶媒／界面活性剤処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割として知られている）を用いて製造されており、一部の生産設備では未だにこのプロセスが用いられている。現在使用されている他の分割剤としては、参照することにより本明細書に組み込まれる東独国特許第１５５  ８７５号明細書又は国際公開第０２／０９７０７２号パンフレット（米国特許第７３１６８１３Ｂ２号明細書）に記載されている通り、界面活性剤又はタンパク質分解酵素又は胆汁酸塩、例えばデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。分割剤として用いることができる界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸塩、タウロデオキシコール酸塩、又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））（例えば、Ｌｉｎａら，２０００年，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２８，９５−１０３に記載のプロセスにおいて）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１を含む上記界面活性剤等の非イオン性界面活性剤、あるいは任意の２以上の界面活性剤の組合せが挙げられる。
【００２７】
１つの態様では、第１の界面活性剤は、アニオン性若しくはカチオン性界面活性剤等のイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、又はこれらの組合せからなる群より選択される。好適な界面活性剤の例は、デオキシコール酸ナトリウム、ＣＴＡＢ、及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））である。
【００２８】
また、第１の界面活性剤は、上に列記した界面活性剤等の他の界面活性剤と組合せて使用してもよく、非イオン性界面活性剤との組合せ、例えば、デオキシコール酸ナトリウムとポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））との組合せ、又はデオキシコール酸ナトリウムとｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））との組合せであってもよい。
【００２９】
１つの態様では、第１の界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））ではない。特定の実施形態では、残留量の第１の界面活性剤及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が、最終のスプリットインフルエンザ又はサブユニット抗原調製物中に存在する。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、第１の界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））である。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、第１の界面活性剤はデオキシコール酸ナトリウムである。
【００３２】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の別名としては、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、４−オクチルフェノールポリエトキシレート、Ｍｏｎｏ３０、ＴＸ−１００、オクトキシノール−９、オクトキシノール１０、Ｘ−１００、及びオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
１つの態様では、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、上に列記した界面活性剤等の他の界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、例えば、アニオン性又はカチオン性界面活性剤等のイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、あるいはこれらの組合せと組合せて使用される。
【００３４】
濾過を改善するために、スプリットインフルエンザ調製物の濾過前又は濾過中に、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加してもよい。したがって、本発明の１つの実施形態では、スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記スプリットウイルス調製物を濾過する工程とを含み、前記工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）が同時に実施される方法を提供する。
【００３５】
スプリットインフルエンザウイルス調製物に添加されるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、分割後に界面活性剤処理を行わない方法と比べてＨＡ収量を改善するのに好適な量である。例えば、０．２μｍの膜を通して濾過した後の［ＨＡ］においてＳＲＤアッセイによって測定したとき、分割後に界面活性剤処理を行わずに得られた結果と比べて、ＨＡの改善が評価されることが好ましい（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７年）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１年）３１７−３３０）。
【００３６】
したがって、１つの実施形態では、濾過されたスプリットウイルス調製物中のＨＡ収量を高めるのに十分な量、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が存在する本発明の方法を提供する。
【００３７】
特定の実施形態では、濾過前にスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加しない方法と比べたＨＡより、濾過したスプリットウイルス調製物又はサブユニット調製物中のＨＡ濃度が５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％超高い本発明の方法を提供する。
【００３８】
特定の実施形態では、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、０．０２５％（ｗ／ｖ）超の量で存在する。特定の実施形態では、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、０．１〜１．５％の量で存在する。更なる実施形態では、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、０．１〜０．８％の量で存在する。更なる実施形態では、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、０．１〜０．４％、例えば、０．２５％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【００３９】
１つの態様では、本発明の方法は、不活化工程前、好適には実質的に不活化の直前に濾過工程を含み、前記濾過工程前又は濾過工程中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する。
【００４０】
したがって、本発明は、１つの態様では、スプリット又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記調製物を濾過する工程と、（ｖ）前記濾過されたスプリットウイルス調製物を不活化する工程とを含む方法に関する。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、スプリット又はサブユニットインフルエンザウイルス調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）第１の界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程と、（ｉｉｉ）得られたスプリットウイルス調製物にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する工程と、（ｉｖ）前記不活化されたスプリットウイルス調製物を濾過する工程と、更に、工程（ｉｉｉ）後且つ工程（ｉｖ）前に前記スプリットウイルス調製物を不活化する工程とを含む方法を提供する。
【００４２】
好適には、濾過は、０．４５μｍ以下、例えば、０．２μｍ又は０．２２μｍのフィルタを通して行われる。１つの態様では、濾過の前に前濾過工程が行われる。１つの態様では、濾過工程を促進するために、予め濾過した生成物を超音波で処理する。
【００４３】
１つの態様では、分割プロセス中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが存在する、すなわち、第１の界面活性剤に加えて、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が存在する。
【００４４】
１つの態様では、好適にはスプリットウイルス調製物の濾過の有効性によって決定するとき、例えば、濾過後のＨＡ濃度によって決定するとき、一度分割されたウイルス粒子の凝集を防ぐのに十分な量のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが分割中に存在する。
【００４５】
本発明の別の態様は、スプリットインフルエンザウイルス又はサブユニットインフルエンザ調製物を製造する方法であって、（ｉ）全ウイルス調製物を提供する工程と、（ｉｉ）ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が存在しないプロセスと比較して収量の減少を決定した場合、濾過後のＨＡ収量の減少を防ぐのに好適な量で添加されるこのような界面活性剤の存在下で前記全ウイルス調製物を分割する工程とを含む方法を含む。
【００４６】
この態様では、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、ＨＡ収量を改善するために分割中に存在する。分割後のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の使用が必要ない場合もある。ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、分割プロセスにおいて役立つ場合もあるが、必須ではない。好適には、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、調製物を濾過する場合に生じるＨＡの減少を低減するのに役立ち得る。
【００４７】
したがって、１つの実施形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が同時に実施される本発明の方法を提供する。
【００４８】
インフルエンザ株
本明細書に記載する全インフルエンザウイルス、サブユニットインフルエンザウイルス、又はスプリットインフルエンザウイルス調製物は、任意のインフルエンザ菌株に由来してよい。
【００４９】
本発明の１つの実施形態では、本明細書に記載する全、サブユニット又はスプリットインフルエンザウイルス調製物は、Ａ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザの株に由来する。１つの態様では、Ａ型インフルエンザウイルス株は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ７、Ｈ９又はＨ５ヘマグルチニン亜型である。１つの態様では、ウイルスは、汎発流行性若しくは潜在的に汎発流行性の株（例えば、Ｈ１Ｎ１ｖ又はＨ５Ｎ１）、又は非汎発流行性（汎発流行間）株（例えば、Ｈ３Ｎ２）である。汎発流行性株（Ａ／カリフォルニア／７／２００９  Ｘ−１７９Ａ等のＨ１Ｎ１ｖ）及び汎発流行間株Ｈ３Ｎ２の両方に対する本発明の利点を示すデータを本明細書に提供する。
【００５０】
本発明の全、サブユニット又はスプリットインフルエンザウイルス調製物が由来する好適な株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
Ｈ１Ｎ１株
Ａ／ニューカレドニア／２０／９９−類似株、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（ＩＶＲ−１１６）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６−類似ウイルス、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（ＩＶＲ−１４５）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７−類似ウイルス、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７  ＩＶＲ−１４８、Ａ／シンガポール／６／８６−類似、Ａ／シンガポール／６／８６、Ａ／テキサス／３６／９１、Ａ／バイエルン／７／９５−類似、Ａ／ヨハネスブルグ／８２／９６（ＮＩＢ−３９）、Ａ／北京／２６２／９５−類似、Ａ／北京／２６２／９５（Ｘ−１２７）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９−類似、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（ＩＶＲ−１１６）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６−類似、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（ＩＶＲ−１４５）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７−類似ウイルス、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７  ＩＶＲ−１４８
Ｈ３Ｎ２株
Ａ／シドニー／５／９７−類似株、Ａ／シドニー／５／９７（ＩＶＲ−１０８）、Ａ／モスクワ／１０／９９−類似株、Ａ／パナマ／２００７／９９（ＲＥＳＶＩＲ−１７）、Ａ／フーチェン／４１１／２００２−類似株、Ａ／ワイオミング／３／２００３（Ｘ−１４７）、Ａ／ウェリントン／１／２００４−類似株、Ａ／ウェリントン／１／２００４（ＩＶＲ−１３９）、Ａ／カリフォルニア／７／２００４−類似株、Ａ／ニューヨーク／５５／２００（ＮＹＭＣ  Ｘ−１５７）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５−類似株、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（ＮＹＭＣ  Ｘ−１６１−Ｂ）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７−類似ウイルス、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（ＩＶＲ−１４７）、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７  ＮＹＭＣ  Ｘ−１７５Ｃ、Ａ／北京／３５３／８９−類似、Ａ／コイチョウ／５４／８９、Ａ／北京／３５３／８９、Ａ／北京／３２／９２、Ａ／山東／９／９３、Ａ／ヨハネスブルグ／３３／９４、Ａ／ウハン／３５９／９５−類似、Ａ／南昌／９３３／９５（ＲＥＳＶＩＲ−９）、Ａ／シドニー／５／９７−類似、Ａ／シドニー／５／９７（ＩＶＲ−１０８）、Ａ／モスクワ／１０／９９−類似、Ａ／パナマ／２００７／９９（ＲＥＳＶＩＲ−１７）、Ａ／フーチェン／４１１／２００２−類似、Ａ／ワイオミング／３／２００３（Ｘ−１４７）、Ａ／カリフォルニア／７／２００４−類似、Ａ／ニューヨーク／５５／２００４  ＮＹＭＣ（Ｘ−１５７、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（ＮＹＭＣ  Ｘ−１６１）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５−類似、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（ＮＹＭＣ  Ｘ−１６１−Ｂ）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７−類似ウイルス、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７  ＮＹＭＣ  Ｘ−１７５Ｃ
Ｂ型株
Ｂ／北京／１８４／９３−類似株、Ｂ／山梨／１６６／９８、Ｂ／四川／３７９／９９−類似株、
Ｂ／ヨハネスブルグ／５／９９、Ｂ／四川／３７９／９９−類似株、Ｂ／ヨハネスブルグ／５／９９
Ｂ／香港／３３０／２００１−類似株、Ｂ／山東／７／９７、Ｂ／香港／３３０／２００１−類似株、Ｂ／ブリズベーン／３２／２００２、Ｂ／上海／３６１／２００２−類似株、Ｂ／江蘇省／１０／２００３、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４−類似株、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６−類似株、
Ｂ／ブリズベーン／３／２００７、Ｂ／山形／１６／８８、Ｂ／パナマ／４５／９０、Ｂ／ハルビン／７／９４、Ｂ／北京／１８４／９３−類似、Ｂ／北京／１８４／９３−類似、Ｂ／山梨／１６６／９８、Ｂ／四川／３７９／９９−類似、Ｂ／ヨハネスブルグ／５／９９、Ｂ／香港／３３０／２００１−類似、Ｂ／山東／７／９７、Ｂ／上海／３６１／２００２−類似、Ｂ／江蘇省／１０／２００３、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４−類似、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６−類似ウイルス、Ｂ／ブリズベーン／３／２００７、Ｂ／ブリズベーン／６０／２００８−類似ウイルス、Ｂ／ブリズベーン／６０／２００８
好適には、全、サブユニット、又はスプリットインフルエンザウイルス調製物が由来するインフルエンザウイルス株は、汎発流行間（季節性）株であるか、あるいは汎発流行病のアウトブレイクに関連しているか又は汎発流行病のアウトブレイクに関連している可能性を有する株である。
【００５２】
汎発流行間株は、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２又はＢ等であるがこれらに限定されない汎発流行間期中に世界中に蔓延する株である。市販されているインフルエンザワクチンは、１種のＢ型インフルエンザ株及び２種のＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）を含む三価の組合せである。
【００５３】
汎発流行性インフルエンザ株に関連してインフルエンザ疾患の汎発流行又はアウトブレイクを引き起こす可能性のあるインフルエンザウイルス株の特徴は、以下の通りである：現在流行している株におけるヘマグルチニンと比べて新規のヘマグルチニンを含有するので、ほとんど全てのヒトが免疫学的にナイーブである；ヒト集団において水平に伝搬することができる；及び、ヒトにとって病原性である。新規のヘマグルチニンは、Ｈ２等の、長時間、恐らく数十年間、ヒト集団において明らかになっていなかったものであってもよい。あるいは、例えば、鳥類の種（鳥）でみられるＨ５、Ｈ９、Ｈ７又はＨ６等の、それまでヒト集団において世界中で流行したことのないヘマグルチニンであってもよい。いずれの場合も、集団の大多数、又は少なくとも大きな比率、又は更には集団全体が、その抗原に遭遇したことがない及び／又はその抗原に対して免疫学的にナイーブである。現在、ヒトにおいて汎発流行病を引き起こす可能性があるとＷＨＯによって確認されているＡ型インフルエンザウイルスは、非常に病原性の高いＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスである。したがって、本明細書に開示する汎発流行病用ワクチンは、好適には、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２又はＨ７Ｎ１を含む。
【００５４】
インフルエンザウイルス株は、汎発流行性株であってもよい。好適な汎発流行性株は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２及びＨ７Ｎ１である。ヒトにおける他の汎発流行性株：Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ５Ｎ２及びＨ７Ｎ２であるが、これらに限定されない。本文書では、汎発流行性株又は汎発流行病に関連している疑いのある株であるインフルエンザ株を略して「汎発流行性株」と呼ぶ。
【００５５】
本明細書に記載する全、サブユニット、又はスプリットインフルエンザウイルス調製物は、卵由来であっても、細胞培養物由来であってもよい。例えば、本発明に係る全、サブユニット又はスプリットインフルエンザウイルス調製物は、卵においてインフルエンザウイルスを増殖させ、採取した尿膜腔液を精製することによる従来の発育鶏卵方法に由来してもよい。卵は、短期間に多数を蓄積することができる。あるいは、ウイルスを増殖させるか、又は組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させるために細胞又は細胞培養物を使用する新規産生方法のいずれかに由来してもよい。ウイルスを増殖させるのに好適な細胞基質としては、例えば、ＭＤＣＫ等のイヌ腎臓細胞、又はＭＤＣＫのクローンに由来する細胞、ＭＤＣＫ類似細胞、ベロ細胞を含むＡＧＭＫ細胞等のサル腎臓細胞、好適なブタ細胞株、又はワクチン目的のためのインフルエンザウイルスの産生に好適な任意の他の哺乳類細胞種が挙げられる。また、好適な細胞基質としては、ヒト細胞、例えば、ＭＲＣ−５細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株が挙げられる。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明の全、サブユニット又はスプリットインフルエンザウイルス調製物は、ニワトリ胚線維芽細胞等の一次細胞に由来し、また、ニワトリ又はアヒル細胞株等の鳥類細胞株（例えば、国際公開第０３／０７６６０１号パンフレット（米国特許出願公開第２００４０５８４４１Ａ１号明細書）及び国際公開第０８／１２９０５８号パンフレット（米国特許出願公開第２０１００６２４８９Ａ１号明細書）に開示されている、ニワトリに由来するＥＢ１４等のＥＢｘ細胞株又はアヒル胚幹細胞に由来するＥＢ２４若しくはＥＢ６６）も含まれる。好適な昆虫細胞は、Ｓｆ９又はＨｉ５である。特定の実施形態では、本発明の全、サブユニット又はスプリットインフルエンザウイルス調製物は、ＥＢ６６細胞に由来する。
【００５７】
１つの態様では、本発明は、本発明の方法で得られるか又は得ることができるスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物に関する。
【００５８】
１つの態様では、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、（ｉ）本明細書に開示する方法のいずれかにより、スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を提供する工程と、（ｉｉ）前記スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を薬学的に許容し得る担体と混合してワクチンを調製する工程とを含む方法に関する。
【００５９】
１つの態様では、本発明は、本発明の方法のいずれかにより得られる又は得ることができる医薬組成物及び／又は免疫原性組成物に関する。
【００６０】
スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を含有する本発明の医薬組成物は、本明細書で免疫原性組成物又はワクチンと称する場合もある。
【００６１】
医学的処置
１つの態様では、本発明は、ヒト被験体において免疫反応を誘導する方法であって、本明細書に記載する本発明の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物、すなわちワクチンを前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【００６２】
本発明の更なる実施形態では、薬剤において使用するための、本明細書に記載する医薬組成物／免疫原性組成物、すなわちワクチンを提供する。
【００６３】
本発明の更なる実施形態では、被験体においてインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び／又は予防において使用するための、本明細書に記載する医薬組成物／免疫原性組成物、すなわちワクチンを提供する。
【００６４】
本発明の更なる実施形態では、被験体においてインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における、本明細書に記載する医薬組成物／免疫原性組成物、すなわちワクチンの使用を提供する。
【００６５】
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載する医薬組成物／免疫原性組成物、すなわちワクチンを投与する被験体は、免疫力が低下している。特定の実施形態では、被験体は、６０歳超、特に６５歳以上である。更なる実施形態では、被験体は、特に６ヶ月齢未満、更により具体的には６〜２３ヶ月齢の乳児／小児である。
【００６６】
アジュバント
１つの態様では、本発明の医薬組成物又は免疫原性組成物にアジュバントを添加しない。別の態様では、本発明の医薬組成物又は免疫原性組成物は、アジュバント、例えば、水中油型エマルションを含む。
【００６７】
１つの態様では、本発明に係るアジュバントは、エマルション、特に、水中油型エマルションであり、任意で他の免疫賦活剤を含んでもよい。
【００６８】
特定の実施形態では、水中油型エマルションは、スクアラン又はスクアレン等の代謝可能で無毒な油と、任意でトコール、特にαトコフェロール等のトコフェロールと、（任意で、スクアレン及びαトコフェロールの両方と）、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））等の乳化剤（すなわち、界面活性剤）とを含む。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））／ソルビタントリオレアート（ＳＰＡＮ  ８５（商標））混合物、又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））／ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））混合物等の界面活性剤の混合物を用いてもよい。
【００６９】
油エマルションアジュバント（欧州特許第０３８２２７１Ｂ１号明細書；米国特許第５６６７７８４号明細書；国際公開第９５／１７２１０号パンフレット）においては、トコール（例えばビタミンＥ）も使用される。油エマルション（任意で、水中油型エマルション）において用いられるトコールは、米国特許出願公開第５６５０１５５Ａ号明細書；米国特許出願公開第５６６７７８４Ａ号明細書；欧州特許第０３８２２７１Ｂ１号明細書に記載の通り製剤化することができ、ここで、トコールは、任意で乳化剤を含み、任意で直径１ミクロン未満であるトコール液滴の分散物であってもよい。あるいは、油エマルションの油相を形成するために、トコールを別の油と組み合わせて使用してもよい。トコールと組み合わせて使用することができる油エマルションの例は、本明細書に記載されており、上記代謝可能な油等である。
【００７０】
水中油型エマルションでは、油及び乳化剤は水性担体中に存在すべきである。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又はクエン酸緩衝液であってもよい。
【００７１】
１つの態様では、水中油型エマルジョンは、以下の組成のうちの１つを有する：
−  ０．５〜１１ｍｇのスクアレン、０．０５〜５％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））及び、任意で２〜１２％のαトコフェロール；あるいは
−  約５％のスクアレン、約０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、及び約０．５％のソルビタントリオレアート（ＳＰＡＮ  ８５（商標））。このアジュバントは、ＭＦ５９と呼ばれる。
【００７２】
医薬組成物及び／又は免疫原性組成物
１つの実施形態では、本発明の医薬組成物及び／又は免疫原性組成物は、約１５μｇ／株、約７．５μｇ／株、約３．８μｇ／株、約１．９μｇ／株、又は５μｇ／株の量、１以上の株のヘマグルチニンを含む。
【００７３】
いくつかの現在存在するワクチンは、分割プロセスにおいて界面活性剤を使用する結果、残留界面活性剤が存在する。他の場合では、ワクチン抗原に界面活性剤を添加する場合もある。本発明では、ウイルスの分割後（及び好適には濾過前、及び好適には不活化前）に添加されるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））等の非イオンの界面活性剤等の界面活性剤を使用することにより、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））及びＨＡの重量／体積比により評価される、製造方法後に産生される最終一価バルク中のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））：ＨＡの比を１．５〜１５、好適には２．５〜１５、好適には３〜１５、好適には３．３〜１５、又はより高い比にする。
【００７４】
１つの態様では、本発明は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び非イオン性界面活性剤を含む医薬組成物又は免疫原性組成物であって、非イオン性界面活性剤のヘマグルチニンに対する重量／体積比が１〜１５である組成物に関する。界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））であってよい。ＨＡ濃度は、２〜２００μｇ／株／ｍＬであってよい。ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の濃度は、１０〜５００μｇ／ｍＬであってよい。
【００７５】
１つの態様では、本発明は、複数のインフルエンザ株から作製されるワクチンであって、少なくとも１成分が、本発明の方法に従って製造されるワクチンに関する。好適には、２又は３種の株を含むワクチンが、本発明の方法を使用して作製される。
【００７６】
１つの態様では、多価株を含む本発明の医薬組成物又は免疫原性組成物は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））及びＨＡの重量／体積比により評価される、最終ワクチン中のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））：ＨＡの比が１〜１５、好適には１．５〜１５、例えば、２〜１５、例えば、２．５〜１５、好適には３〜１５、好適には３．５〜１５、又はより高い比である。
【００７７】
スプリットインフルエンザ調製物
医薬組成物又は免疫原性組成物で使用されるスプリットインフルエンザウイルス調製物の調製プロセスは、多くの異なる濾過工程及び／又は様々な組合せの超遠心、限外濾過、ゾーン遠心及びクロマトグラフィー（例えば、イオン交換）等の他の分割工程と、任意で、分割前に実施しても分割後に実施してもよい、例えば、熱、ホルムアルデヒド、又はβ−プロピオラクトン、又はＵＶによる不活化工程を含んでもよい。分割プロセスは、バッチプロセス、連続プロセス、又は半連続プロセスとして実施してもよい。スプリット免疫原性組成物において好ましい分割及び精製プロセスは、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる国際公開第０２／０９７０７２号（米国特許第７３１６８１３Ｂ２号）に記載されている。
【００７８】
このようなプロセスは、好適には、初期濾過、ウイルス分割、濾過、不活化、濾過の工程を含み、前記濾過は、限外濾過工程であってもよい。
【００７９】
したがって、１つの実施形態では、スプリットインフルエンザウイルス調製物を不活化する工程を更に含む本発明の方法を提供する。不活化は、ホルムアルデヒドの使用が挙げられるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法により実施することができる。不活化は、工程（ｉｉ）後の方法の任意の段階で実施してよい。本発明の特定の実施形態では、不活化は、工程（ｉｉｉ）の後に行われる。
【００８０】
本発明の方法は、少なくとも１つの濾過工程（工程ｉｖ）を含むが、工程（ｉｖ）に加えて１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の濾過工程を含んでもよい。例えば、スプリットインフルエンザウイルス調製物は、様々なサイズの一連のフィルタ、例えば、０．５μｍ、０．４５μｍ及び／又は０．２／０．２２μｍのフィルタを用いて濾過してもよい。特定の実施形態では、濾過工程（工程ｉｖ）は、１以上のフィルタ膜を用いて実施され、少なくとも１枚のフィルタ膜は、無菌グレード（例えば、０．２μｍ又は０．２２μｍ）である。更なる実施形態では、工程（ｉｖ）の濾過工程に加えて、スプリットインフルエンザウイルス調製物を濾過する工程を含む本発明の方法を提供する。特定の実施形態では、工程（ｉｖ）に加えて、無菌グレードのフィルタ（例えば、０．２μｍ又は０．２２μｍのフィルタ）を使用して濾過工程を実施する。
【００８１】
更なる実施形態では、スプリットインフルエンザウイルス調製物を超遠心する工程を更に含む本発明の方法を提供する。好適には、約２０ｋＤａのＭＷでカットオフするセルロースアセテート膜を使用して限外濾過を行う。
【００８２】
更なる実施形態では、全ウイルス調製物を清澄化する工程を更に含む本発明の方法を提供する。
【００８３】
更なる実施形態では、全ウイルス調製物を超遠心する工程を含む本発明の方法を提供する。
【００８４】
本発明に係る好ましいスプリットインフルエンザウイルス調製物は、製造方法から残る残留量のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））及び／又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を含むが、これらは、スプリット抗原の調製後に添加されてもよく、その濃度が調整されてもよい。１つの実施形態では、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の両方が存在する。ワクチン用量中のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））の最終濃度の好ましい範囲は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））：０．０１〜１％、又は約０．１％（ｖ／ｖ）である。
【００８５】
特定の実施形態では、スプリットインフルエンザウイルス調製物から生じるポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））の最終濃度は、０．０２５％〜０．０９％  ｗ／ｖである。別の特定の実施形態では、スプリットインフルエンザウイルス調製物は、２倍の濃度の混合物として提供され、これは、０．０２５％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））濃度を有し、アジュバント（又は対照製剤の場合バッファ）を添加する最終製剤化時に２倍に希釈しなければならない。
【００８６】
１つの実施形態では、スプリットインフルエンザウイルス調製物は、低濃度のチオメルサールの存在下で、又はチオメルサールの非存在下で調製される。別の実施形態では、得られるスプリットインフルエンザウイルス調製物は、有機水銀化合物である保存剤の非存在下で安定であり、特に、前記調製物は、残留チオメルサールを含有しない。具体的には、スプリットインフルエンザウイルス調製物は、チオメルサールの非存在下で、又は低濃度のチオメルサール（一般的に、５μｇ／ｍＬ以下）の存在下で安定化されているヘマグルチニン抗原を含む。具体的には、αトコフェロールコハク酸塩（ビタミンＥコハク酸塩、すなわちＶＥＳとしても知られている）等のαトコフェロールの誘導体によって、Ｂ型インフルエンザ株の安定化が行われる。このような調製物及び前記調製物を調製する方法は、参照することにより全体が組み込まれる国際公開第０２／０９７０７２号パンフレット（米国特許第７３１６８１３Ｂ２号明細書）に開示されている。
【００８７】
好ましい組成物は、ＷＨＯによって推奨されている適切なインフルエンザの季節性株から調製される３つの不活化スプリットインフルエンザウイルス調製物を含有する。
【００８８】
１つの実施形態では、本発明に係るスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物と、アジュバントとが同じ容器に収容されている。これは、「１バイアルアプローチ」と呼ばれる。別の実施形態では、バイアルはプレフィルドシリンジである。別の実施形態では、本発明に係るスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物と、アジュバントとは別々の容器又はバイアルに収容されており、被験体に投与する直前又は投与時に混合される。これは、「２バイアルアプローチ」と呼ばれる。好適には、２バイアルアプローチは、Ｉ型ガラスバイアル（抗原容器）で提示される本明細書に記載の濃縮スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物０．５ｍＬと、０．５ｍＬのアジュバントを収容しているプレフィルドＩ型ガラスシリンジ（アジュバント容器）とからなる。あるいは、２バイアルアプローチは、室温で最初の患者に投与する２４時間以内前に、混合するための２つのバイアル（１つは抗原用、１つはアジュバント用、各１０用量）で提示され、次いで、後で投与するために短期間（例えば、１週間以内）４℃で保存される。注射する際に、濃縮スプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物を収容しているバイアルに、アジュバントを収容している複数用量バイアル又はシリンジの内容物を注入する。混合後、内容物をシリンジに吸い出し、針を筋肉内用針に取り替える。アジュバント添加したスプリットインフルエンザウイルス調製物又はサブユニットインフルエンザ調製物（医薬組成物又は免疫原性組成物）の１用量は、０．５ｍＬに相当する。
【００８９】
１つの実施形態では、ＳＲＩＤによって決定されるとき、医薬組成物又は免疫原性組成物の各ヒト用量は、１用量当たり、１インフルエンザ株当たり、１５μｇのＨＡを含有する。これは、高齢者集団に特に有用である。
【００９０】
本発明の重要な態様は、これまで有用であると考えられていた量よりも少量で、好適には１ヒト用量の免疫原性組成物当たり、１ウイルス株当たり１５μｇ未満のＨＡ、例えば、１株当たり１〜１０μｇのＨＡの濃度で、インフルエンザ抗原を使用することができるという事実である。
【００９１】
したがって、１つの実施形態では、医薬組成物又は免疫原性組成物の各ヒト用量は、単純放射免疫拡散法（ＳＲＤ）により測定されるとき、１用量当たり１５μｇ未満、好適には１０μｇ未満の量のＨＡと定義される低用量のヘマグルチニン（ＨＡ）を含有する（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７年）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１年）３１７−３３０）。特定の実施形態では、ヒト用量の免疫原性組成物は、１株当たり、約１０μｇ、例えば、５〜１５μｇ、好適には６〜１４μｇ、例えば、７〜１３μｇ、又は８〜１２μｇ、又は９〜１１μｇ、又は１０μｇの量の用量のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む。更なる実施形態では、ヒト用量の免疫原性組成物は、１株当たり、約５μｇ、例えば、１〜９μｇ、又は２〜８μｇ、又は好適には３〜７μｇ、又は４〜６μｇ、又は５μｇの量の用量のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む。好適な量は、１．９μｇ、２．５μｇ、３．８μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、又は１０μｇのＨＡであるか、又は１５μｇ未満の任意の好適な量のＨＡであり、これらは、ワクチン組成物が本明細書に定義する有効性基準を満たすように決定されなければならない。有利なことに、表Ｃ及び／又はＤに定義される規制基準を満たすことができる１μｇのＨＡ、又は０．５μｇのＨＡ等の更に少ないＨＡ用量を用いてもよい。好適な量のＨＡは、例えば、１インフルエンザ株あたり、１ヒト用量の免疫原性組成物当たり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４μｇ（ｗ／ｖ）のいずれかである。前記少量のＨＡは、以下に詳述する国際的な、例えば、ＥＵ又はＦＤＡの有効性基準を満たすワクチンを製剤化できる限り、実際に実現可能な最も少ない量であってよい（表３及び４、並びに記載する特定のパラメータを参照されたい）。
【００９２】
０．５ｍＬの医薬組成物又は免疫原性組成物の用量が好適に用いられる。また、１ｍＬの医薬組成物又は免疫原性組成物の用量（０．５ｍＬのアジュバント及び０．５ｍＬの抗原調製物）も好適である。有利なことに、本発明に係る医薬組成物又は免疫原性組成物の用量、具体的には低ＨＡ量ワクチンは、一般的に１用量当たり約０．５、０．７、又は１ｍＬである、従来注射されるスプリット流感ワクチンよりも低体積で提供することができる。本発明に係る低体積用量は、１用量当たり、好適には５００μＬ未満、典型的には３００μＬ未満、及び好適には約２００μＬ以下である。用量体積の僅かな調整は、慣例的に、オリジナルのバルクサンプル中のＨＡ濃度に依存するか、送達経路に依存するか（少用量は、鼻腔内又は皮内経路により投与される）、又は標的集団（例えば、乳児には成人用量の半分を投与してもよい）に依存して行われる。
【００９３】
本発明のインフルエンザ用医薬組成物又は免疫原性組成物は、好適には、ワクチンに関する特定の国際的基準を満たす。インフルエンザワクチンの有効性を測定するための基準が国際的に適用される。インフルエンザワクチンの毎年許可される手順に関連する臨床試験については、ヒト使用に関する欧州医薬品審査庁の基準（ＣＨＭＰ／ＢＷＰ／２１４／９６、医薬品委員会（ＣＰＭＰ）、Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９７．ＣＨＭＰ／ＢＷＰ／２１４／９６  ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｎ°９６−０６６６：１−２２）に従って血清学的変数を評価する（表３又は４）。この要件は、成人集団（１８〜６０歳）及び高齢者集団（６０歳超）で異なる（表Ｃ）。汎発流行間インフルエンザワクチンについては、評価（セロコンバージョン係数、セロコンバージョン率、セロプロテクション率）のうちの少なくとも１つが、ワクチンに含まれるインフルエンザのすべての株についての欧州要件を満たさなければならない。１：４０以上の力価比率が最も関連していると考えられるが、その理由は、これら力価が防御と最もよく相関すると予測されるためである［Ｂｅｙｅｒ  Ｗら．１９９８年．Ｃｌｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｖｅｓｔ．；１５：１−１２］。
【００９４】
「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｄｏｓｓｉｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．（ＣＨＭＰ／ＶＥＧ／４７１７／０３，２００４年４月５日、又はより最近ではｗｗｗ．ｅｍｅａ．ｅｕ．ｉｎｔから入手可能な「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｆｌｕ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｃａｕｓｅ  ａ  ｐａｎｄｅｍｉｃ」と題されている２００７年１月２４日付けのＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＶＷＰ／２６３４９９／２００６）に記載されている通り、非循環株に由来するインフルエンザワクチンに関する特定の基準が存在しない場合、汎発流行性の候補ワクチンは、２用量のワクチン後、非感作成人又は高齢被験体における既存のワクチンについて設定された現在の基準のうちの好適には３つ全てを満たすように、十分な免疫反応を（少なくとも）誘発することができなければならないと予測される。ＥＭＥＡのガイドラインには、汎発流行性の場合、集団が免疫学的にナイーブである状況について記載されているので、汎発流行性の候補ワクチンは、季節性ワクチンについての３つのＣＨＭＰ基準全てを満たすと推測される。ワクチン接種前の血清反応が陰性である被験体においてそれを証明する明示的な要件は必要ではない。
【００９５】
本発明の組成物は、好適には、表３に記載の通り、組成物に含まれる株について少なくとも１つのこのような基準（承認を得るには１つの基準で十分である）、好適には少なくとも２つ、又は典型的には少なくとも３つ全ての防御基準を満たす。
【表１】
2013508437.tif 000002
【００９６】
＊  セロコンバージョン率は、防御的ワクチン接種後の力価が１：４０以上である各群における被験体の比率として定義される。セロコンバージョン率は、単に、ワクチン接種前のＨＩ力価が１：１０未満であり、ワクチン接種後のＨＩ力価が１：４０以上である被験体の百分率である。しかし、初期力価が１：１０以上である場合、ワクチン接種後の抗体の量が少なくとも４倍増加する必要がある。  
＊＊  コンバージョン係数は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ＨＩ幾何学平均力価（ＧＭＴ）の４倍増加として定義される。  
＊＊＊  防御率は、ワクチン接種前に血清反応陰性であり且つ（防御的）ワクチン接種後のＨＩ力価が１：４０以上であるか、又はワクチン接種前に血清反応陰性であり且つワクチン接種後の力価が有意に４倍増加した被験体の比率として定義される；通常、防御を示すと認められる。
【００９７】
ＦＤＡは、わずかに異なる年齢カットオフ点を使用しているが、これら基準はＣＨＭＰ基準に基づいている。適切なエンドポイントは、同様に、以下を含む：１）ＨＩ抗体力価が１：４０以上になる被験体の百分率、及び２）ワクチン接種後にＨＩ抗体価が４倍上昇すると定義されるセロコンバージョン率。幾何平均力価（ＧＭＴ）が結果に含まれているべきであるが、データは、点推定値だけでなくセロコンバージョンの発生率の９５％信頼区間の下限も含むべきであり、４２日目におけるＨＩ力価１：４０以上の発生率が標的値を超えなければならない。したがって、これらのデータ、及びこれらの評価の点推定値の９５％信頼区間（ＣＩ）を提供するべきである。ＦＤＡ指針草案では、両方の標的を満たすことを必要としている。表４にこれを要約する。
【表２】
2013508437.tif 000003
【００９８】
＊  セロコンバージョン率は、ａ）ベースライン力価が１：１０以上である被験体については、４倍以上の増加；又はｂ）ベースライン力価が１：１０未満である被験体については、１：４０以上への上昇として定義される。真の値について９５％ＣＩの下限においてこれら基準が満たされなければならない。
【００９９】
別の実施形態では、本発明の組成物は、好適には、前記組成物に含まれる株について少なくとも１つのこのような基準を満たし、好適には、表４に記載の通り防御基準を両方満たす。
【０１００】
好適には、この効果は、７．５μｇのＨＡ等の低用量の抗原、又は更には３．８μｇ若しくは１．９μｇのＨＡ等の更に低用量の抗原で得られる。
【０１０１】
好適には、このような基準のいずれか又は全ては、小児及び任意の免疫力が低い集団等の他の集団についても満たされる。
【０１０２】
本発明の１つの態様では、ヒト用量の医薬組成物又は免疫原性組成物は、単一のインフルエンザ株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含有しており、「一価」インフルエンザ組成物と呼ばれる。本発明の別の態様では、ヒト用量の医薬組成物又は免疫原性組成物は、２以上のインフルエンザ株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含み、「多価」インフルエンザ組成物と呼ばれる。本発明に係る好適な多価組成物は、二価組成物（汎発流行病に関連しているか又は汎発流行病に関連している疑いのある２種の株等であるがこれに限定されない２種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む、例えば、Ｈ５＝Ｈ２）、三価組成物（任意で２種のＡ型株と、Ｂ／山形又はＢ／ビクトリアが挙げられるがこれらに限定されない１種のＢ型株とに由来する３種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む）、四価組成物（４種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む）、又は五価組成物（５種のインフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む）である。好適な四価組成物は、２種のＡ型株と、異なる系統（Ｂ／山形又はＢ／ビクトリア等）に由来する２種のＢ型株とに由来するヘマグルチニンを含む。第２のＢ型株を含むこのような組成物は、事前曝露又は初回抗原刺激が重要である非常に幼い小児に特に好適である。あるいは、四価組成物は、３種のＡ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及び汎発流行病に関連しているか又は汎発流行病に関連している疑いのある１種のＡ型株）と、１種のＢ型株（Ｂ／山形又はＢ／ビクトリア等）とに由来するヘマグルチニンを含む。別の代替の四価組成物は、例えば、Ｈ５＋Ｈ２＋Ｈ７＋Ｈ９等、鳥類株等の汎発流行病に関連しているか又は汎発流行病に関連している疑いのある株に由来する４種のＡ型株に由来するヘマグルチニンを含む。具体的には、多価のアジュバント添加した汎発流行病用組成物、例えば、汎発流行病用の二価（例えば、Ｈ５＋Ｈ２）又は三価又は四価（例えば、Ｈ５＋Ｈ２＋Ｈ７＋Ｈ９）の組成物等は、汎発流行性Ａ型インフルエンザ脅威亜型に対する先制免疫、及び脅威亜型に対する耐久性初回抗原刺激という利点を提供する。典型的には、従来のスケジュール（例えば、６〜１２ヶ月間隔）、任意で定期的なブースター予測（例えば、１０年間）を用いて６週齢から２用量が投与される。任意で、このような汎発流行病用ワクチンを季節性ワクチンと組合せてもよい。
【０１０３】
多価組成物は、５種超のインフルエンザ株、例えば、６、７、８、９、又は１０種のインフルエンザ株を含んでもよい。
【０１０４】
多価季節性組成物で２種のＢ型株が用いられるとき、前記Ｂ型株は、２つの異なる系統（任意で、Ｂ／ビクトリア及びＢ／山形）に由来してもよい。前記Ｂ型株のうちの少なくとも１つ、好適には両方のＢ型株は、流行している系統に由来する。このような組成物は、特に、小児に好適である。好適には、小児で使用される多価組成物が２種のＢ型株を含む場合、通常、Ｂ型株に割り当てられる抗原の量は、２種のＢ型株に分割される。具体的には、アジュバント添加した四価（Ｈ１＋Ｈ３＋両Ｂ型系統）インフルエンザワクチンは、アジュバント無添加のワクチンと比べて（同種及びドリフト防御、並びに２種の流行しているＢ型系統に対する有効性の観点で）有効性が優れているので、ナイーブな小児に対する予防が強化され、且つ年齢に基づいて通年免疫可能であるという利点を提供する。１用量又は２用量が、早くも６週齢、又は６〜３５月齢で好適に投与される。
【０１０５】
特定の実施形態では、ヒト用量の医薬組成物又は免疫原性組成物は、２種のＡ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）及び１種のＢ型株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む三価の免疫原性組成物又はワクチン組成物である。好適には、１株当たりのＨＡは、少量のＨＡ（任意で、１株当たり１０μｇ以下のＨＡ）であり、上に定義された通りである。好適には、１株当たりのＨＡは、約５μｇ又は５μｇ未満、約２．５μｇ又は２．５μｇ未満である。本明細書に定義するアジュバントを含んでもよく、具体的には、表１に定義する通りである。好適には、アジュバント組成物は、それぞれ、１用量当たり５〜６ｍｇ、５〜６ｍｇ、及び２〜３ｍｇの量でスクアレン、αトコフェロール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））を含む水中油型エマルションである。あるいは、アジュバント組成物は、それぞれ、１用量当たり２．５〜３．５ｍｇ、２〜３ｍｇ、及び１〜２ｍｇの量でスクアレン、αトコフェロール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））を含む水中油型エマルションである。これらアジュバント添加した免疫原性組成物、すなわちワクチンは、成人（１８〜６０歳）又は年長小児（３〜１７歳）の集団に特に好適であり、Ｈ３Ｎ２ドリフト変異体、及び異なる系統に由来するＢ型株に対する交差防御能を提供することができる。
【０１０６】
別の特定の実施形態では、ヒト用量の免疫原性組成物は、２種のＡ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）及び２種のＢ型株（任意で、Ｂ／ビクトリア及びＢ／山形等の異なる系統に由来する）に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む四価免疫原性組成物又はワクチン組成物である。別の特定の実施形態では、ヒト用量の免疫原性組成物は、２種の汎発流行間Ａ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、１種のＢ型株、及び汎発流行病に関連しているか又は汎発流行病に関連している疑いのある１種のＡ型株（任意で、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、及びＨ７Ｎ１）に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む四価の免疫原性組成物又はワクチン組成物である。別の特定の実施形態では、ヒト用量の免疫原性組成物は、３種の流行間Ａ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、及び２種のＨ３Ｎ２株）及び１種のＢ型株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む四価の免疫原性組成物又はワクチン組成物である。好適には、ＨＡ／株／用量は、約１５μｇである。好適には、１株当たりのＨＡは、少量のＨＡ（任意で、１用量の四価組成物当たりＨＡが最大４０〜４５μｇになるように、約１０μｇ／株／用量以下のＨＡ）であり、上に定義される通りである。好適には、１株当たりのＨＡは、約５μｇ又は５μｇ未満、約２．５μｇ又は２．５μｇ未満である。アジュバントが存在する場合、前記アジュバントは、本明細書に記載する任意のアジュバントであってよい。
【０１０７】
別の特定の実施形態では、ヒト用量の医薬組成物又は免疫原性組成物は、２つの汎発流行間Ａ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、２種のＢ型株（任意で、Ｂ／ビクトリア及びＢ／山形等の異なる系統に由来する）、及び汎発流行病に関連しているか又は汎発流行病に関連している疑いのある１種のＡ型株（任意で、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ５Ｎ２、及びＨ７Ｎ１）に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む五価の免疫原性組成物又はワクチン組成物である。別の特定の実施形態では、ヒト用量の医薬組成物又は免疫原性組成物は、３種の汎発流行間Ａ型株（任意で、Ｈ１Ｎ１、及び２種のＨ３Ｎ２株）及び２種のＢ型株（任意で、Ｂ／ビクトリア及びＢ／山形等の異なる系統に由来する）に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）を含む五価の免疫原性組成物又はワクチン組成物である。好適には、１株当たりのＨＡは、少量のＨＡ（任意で、１株当たり１０μｇ以下のＨＡ）であり、上に定義された通りである。
【０１０８】
１つの実施形態では、多価組成物は、好適には、スクアレンに基づく水中油型エマルションアジュバントを用いてアジュバント添加する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、スクアレン及びＨＡを含むインフルエンザ免疫原性組成物であって、スクアレン：合計ＨＡ量（全てのインフルエンザ株に含まれる）の重量比が、約５０〜１５０又は約１５０〜４００（例えば、約２００〜３００）の範囲である組成物を提供する。このような組成物は、高齢者集団において使用するのに適切であるが、これに限定されず、反応原性及び免疫原性のバランスが最良である。別の実施形態では、本発明は、スクアレン及びＨＡを含むインフルエンザ免疫原性組成物であって、スクアレン：合計ＨＡ量（全てのインフルエンザ株に含まれる）の重量比が、約５０〜４００、例えば、約５０〜１００、７５〜１５０、７５〜２００、７５〜４００、１００〜２００又は２００〜４００である組成物を提供する。前記比は、好適には、特定の集団について、少なくとも２つ、好適には３つ全ての防御基準（表Ｃ又はＤ）を満たすような比である。好適には、ＨＡは、少なくとも３、少なくとも４種のインフルエンザ株に由来する。好適には、３種の季節性（例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ）株が存在する。好適には、４種の株が存在する場合、それらは４種の季節性株（例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、２種のＢ型株；又はＨ１Ｎ１、Ｂ、２種のＨ３Ｎ２株）、又は１種の汎発流行性株（例えば鳥類）と３種の季節性株（例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ）との群から選択される。
【０１０９】
一般的用語
特許出願及び特許を含む本願における全ての参照文献の教示は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。本願が優先権を主張する任意の特許出願は、公開及び参照のために本明細書に記載される方式で、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
疑念を回避するために、本発明者らは、本発明における用語「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）」が、いかなる場合においても、用語「からなる（「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」、「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ」、及び「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ」）」と任意で置換可能であることを意図する。本発明の「ワクチン組成物」に関する本発明の実施形態は、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、逆も同様である。全ての数値における用語「約」（又は「およそ」）は、５％の偏差を許容する、すなわち、約１．２５％という値は、１．１９％〜１．３１％を意味する。
【０１１１】
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」と併用される場合、用語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味する場合もあるが、「１以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１又は１超の」の意味にも一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、いずれか一方のみであるか又は選択肢が相互に排他的であることを明示的に示していない限り、「及び／又は」を意味するが、本開示は、いずれか一方のみ及び「及び／又は」であることを指す定義を支持する。本願全体を通して、用語「約」は、ある値が、測定、前記値を決定するために使用される方法、又は研究対象の中に存在する変動について誤差の固有の変動を含むことを示すために用いられる。
【０１１２】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられるとき、用語「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」（並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等を含む任意の形態）、「有する（「ｈａｖｉｎｇ」）」（並びに「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」等を含む任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」等を含む任意の形態）、又は「含有する（「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」）」（並びに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」等を含む任意の形態）は、包括的又はオープンエンドであり、更なる列記されていない要素又は方法工程を除外するものではない。
【０１１３】
以下の非限定的な実施例を参照して本発明を更に説明する。
【実施例】
【０１１４】
実施例１：
国際公開第０２／０９７０７２号パンフレット（米国特許第７３１６８１３Ｂ２号明細書）に記載のプロセスに基づくインフルエンザウイルス株の代表的な産生プロセス、及び図１に要約する工程を、図１に概説する他の２つのプロセスと比較した。
【０１１５】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の存在下又は非存在下で実施されるプロセスＡに従って汎発流行性Ｈ１Ｎ１ｖ株（Ａ／カリフォルニア／７／２００９  Ｘ−１７９Ａ）を製造した（図１）。製造プロセスＡを適用したとき、ＨＰＬＣによって測定されたヘマグルチニン（ＨＡ）の約５０％が、２回の０．２μｍ濾過工程で失われたことが観察された（図２）。
【０１１６】
ホルムアルデヒドによる不活化直前に、段階的分割（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）後に添加される希釈バッファにｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加することにより変更された製造プロセスＡ（本明細書では、「プロセスＡ＋ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））」と称する）を用いて、Ａ／カリフォルニア／７／２００９  Ｘ−１７９Ａ  Ｈ１Ｎ１ｖ一価バルクの３つの試験ロットを製造した。
【０１１７】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の添加の上流のプロセス工程は、変更しなかった。
【０１１８】
図５に示す通り、分割後且つ濾過前にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加すると、この段階でｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加しなかったプロセスに比べてＨＡの収量が向上した。
【０１１９】
濾過前の粒径は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の添加を含まないプロセスＡでみられる粒径と比べて小さいことが見出された。
【０１２０】
一価バルク工程におけるＨＡ収量は、プロセスＡ＋ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が１５μｇ／卵であるのに比べて３９μｇ／卵であり、これは、２．６倍の増加に対応する。
【０１２１】
Ｈ１Ｎ１ｖ最終バルク中のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））含量／ＨＡ含量の比は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加しないプロセスＡ単独と比べて、プロセスＡ＋ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を用いたときの方が高い。
【０１２２】
変更された精製プロセス（プロセスＡ＋ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）））をＨ３Ｎ２株に対しても実施し、プロセス中のＨ１Ｎ１ｖ株に用いたのと同じ時点で、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した。ホルムアルデヒドによる不活化直前に、段階的分割後に希釈バッファにｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加すると、Ａ／Ｈ２Ｎ２／南昌／９３３／９５  ＲＥＳＶＩＲ−９株において２〜３倍増加した。
【表３】
2013508437.tif 000004
【０１２３】
実施例２：抗原の品質に対する影響
製品の品質に対するｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の潜在的な影響を、粒径測定、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度及びタンパク質パターン解析により評価した。
【０１２４】
ゲル及びウエスタンブロットによるプロファイル解析
合計タンパク質／ＨＡ含量の比が２．５から１．７に低下したことが示されたので、プロセスにおけるｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））の添加が純度を向上させることが示された。
【０１２５】
図３に示す通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるペプチドバンドのパターンは、製造プロセスにおいてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を用いようと用いまいと変化しなかった。ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を用いて製造したロットでは、ＨＡの部分の増加（濃度測定により約３倍であると示された）が観察された。この知見は、タンパク質／ＨＡ比の改善と一致する。
【０１２６】
実施例３：ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を用いて製造された第１の汎発流行性一価バルクロットに対する予備的な品質データ
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））プロセスを用いて産生された３つの一価バルクについて得られた予備的な品質データを表６に示す。
【０１２７】
得られたデータは、プロセスの第１の評価のために産生された試験ロットに対してみられたものと一致しており、ＨＡ収量が多いほど、純度プロファイルも上昇する。
【表４】
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【０１２８】
比較として、上記の通りｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を用いて作製されるＨ３Ｎ２  Ｆｌｕａｒｉｘワクチンのために製造されたＨ３Ｎ２一価バルクに対して得られたデータを表７に示す。
【表５】
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【０１２９】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を含有する、改変季節性Ｆｌｕａｒｉｘプロセスを用いて製造された代表的なＨ３Ｎ２一価バルクに対して得られた安定性データを表９及び表１０に示す。２〜８℃で最長１２ヶ月間の間追跡したロットに関するｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））／ＨＡ含量の比は、全て３に近く（表８を参照されたい）、ＨＡ含量は経時的に安定であることが示され、生じた各時点及び試験された各ロットについて同程度の値を有していた。
【０１３０】
必要に応じて、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））−アンモニウム−コバルト−チオシアネート複合体の濃度の分光光度測定により百万分率の範囲で検出することができる。例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））製品に関する情報は、Ｓｉｇｍａ及びＣｒａｂｂ，Ｎ．Ｔ．Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，４１，７５２−７５５（１９６４年）及びＧｒｅｆｆ，Ｒ．Ａ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，４２，１８０−１８５（１９６５年）を参照されたい。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１３１】
実施例４：マウスにおける前臨床試験
インビボにおける効力についてのマウスを用いる方法
赤血球凝集の阻害アッセイ
赤血球凝集阻止試験（ＨＩ）を使用して、Ａ／カリフォルニア／７／２００９−Ｘ１７９Ａインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を決定した。ＨＩ試験の原理は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）によってニワトリ赤血球（ＲＢＣ）の赤血球凝集を阻害する特異的な抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。熱で不活化した血清をカオリン及びニワトリＲＢＣで予め処理して、非特異的なウイルス阻害剤を除去した。前処理の後、各インフルエンザ株の４つの赤血球凝集ユニットと共に２倍希釈した血清をインキュベートした。次いで、ニワトリの赤血球細胞を添加し、凝集の阻害を採点した。完全に赤血球凝集を阻害した血清の最大希釈の逆数として力価を表した。血清の最初の希釈は１：２０であったので、検出不可能なレベルは、１０に等しい力価として採点した。
【０１３２】
アジュバント無添加のＡ／カリフォルニア／７／２００９−Ｘ１７９Ａスプリットワクチンで免疫されたマウスにおけるインビボ効力試験
実験設計及び目的
処理／群（表１１）
１０匹の成体雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、合計体積１ｍＬのＡ／カリフォルニア／７／２００９−ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａスプリットワクチン２用量を用いて腹腔内にワクチンを接種した。バルク中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加しない（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））／ＨＡ比は１）又はバルク中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））／ＨＡ比は２．８３）Ａ／カリフォルニア／７／２００９の全ヒト用量（１５μｇのＨＡ）又はヒト用量の一部（３．７５、１．９、０．４６及び０．１１５μｇのＨＡ）を含有する製剤でマウスを免疫した。
【０１３３】
即席で調製した（Ｔ０）製剤又は３０℃で３０日間保存した同様の製剤（４℃における長期間保存を模倣するために仮定された加速安定性）でマウスを免疫した。
【０１３４】
オクトキシノール１０を添加しないＡ／カリフォルニア／７／０９スプリットワクチン：５３μｇのＨＡ／ｍＬのロットＡＦＬＳＦＤＡ０４８。
【０１３５】
オクトキシノール１０を添加したＡ／カリフォルニア／７／０９スプリットワクチン：１８０μｇのＨＡ／ｍＬのロットＡＦＬＳＦＤＡ１０７。
【表９】
2013508437.tif 000010
【０１３６】
ワクチン製剤の調製
ワクチンの最終濃度を１１５．４μｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、１５μｇ／ｍＬのｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、及び１０μｇ／ｍＬのチオメルサールにするために、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、及びチオメルサールを、バッファＡ（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７．２６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．７４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）に添加した。既に株中に存在する量を考慮して、使用する量を計算する。室温で軌道振動型テーブルにて１５〜４５分間プレミックスを混合した後、１５μｇのＡ／カリフォルニアスプリットワクチンを添加した。スプリットワクチンを添加した後、室温で軌道振動型テーブルにて１５〜４５分間製剤を混合した。
【０１３７】
全用量の製剤の一部を、段階希釈により、同じバッファＡ（上記を参照されたい）で１／４、１／８、１／３２、及び１／１２８倍に即席で希釈した。調製完了後１時間以内に全用量及び希釈物を注入した。
【０１３８】
全用量製剤の別の一部を３０℃で３０日間インキュベートし、即席で希釈し、注入した。
【０１３９】
読み出し
１０匹のマウス／群において、二次免疫（２８日目）の１４日後に、ワクチン接種に対する体液性免疫反応を測定した。赤血球凝集阻止アッセイ（ＨＩ）により血清サンプルを試験した。
【０１４０】
結果
体液性免疫反応
結果を図４及び図５に示す。
【０１４１】
ＨＩ力価を４０超に誘導するためには、アジュバント無添加のワクチンで免疫されたマウスにおいて２回の免疫が必要である。
【０１４２】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加しないプロセスでは（図４）、即席で調製されたアジュバント無添加のワクチンで免疫されたマウスと比べて、唯一３０℃で３０日間保存したアジュバント無添加のワクチンの全ヒト用量（１５μｇのＨＡ）で免疫されたマウスのみが同様の免疫反応を示した。
【０１４３】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した場合（図５）、３０℃で３０日間保存したアジュバント無添加のワクチンの全ヒト用量（１５μｇのＨＡ）及び１／４ヒト用量で免疫されたマウスと、即席で調製されたアジュバント無添加のワクチンで免疫されたマウスとの間に同様の免疫反応が観察された。
【０１４４】
結論
即席で調製されたアジュバント無添加のワクチンで免疫されたマウスにおいて誘導された免疫反応と比べたとき、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した３０℃で３０日間保存したアジュバント無添加のワクチンは、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加せずに製剤化したアジュバント無添加のワクチンと比べて、高い安定性を示した。
【０１４５】
ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したＡ／カリフォルニア／７／２００９−Ｘ１７９Ａスプリットワクチンで免疫されたマウスにおけるインビボ効力試験
実験設計及び目的
処理／群（表１２）
１０匹の成体雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、合計体積１ｍＬのＡＳ０３Ａアジュバントを添加したＡ／カリフォルニア／７／２００９−ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａスプリットワクチン２用量を用いて腹腔内免疫した。ヒト用量（ＨＤ）は、１５μｇのＨＡであるとみなし、１１．８ｍｇのαトコフェロール（ビタミンＥ）を含有していた。
【０１４６】
バルク中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加していない（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））／ＨＡの比は１）又はバルク中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））／ＨＡ比は２．８３）、ヒト用量の半分のアジュバント添加したワクチンと、ワクチンの２倍又は４倍段階希釈物（７．５、３．７５、１．９、０．４６、及び０．１１５μｇのＨＡ）でマウスを免疫した。
【０１４７】
即席で調製された（Ｔ０）製剤又は３０℃で３０日間保存した同様の製剤でマウスを免疫した。
【０１４８】
更なるオクトキシノールを添加しないスプリットＡ／カリフォルニアウイルス抗原：ロットＡＦＬＳＦＤＡ０４８−５３μｇＨＡ／ｍＬ
更なるオクトキシノール１０を含有するスプリットＡ／カリフォルニアウイルス抗原：ロットＡＦＬＳＦＤＡ１０７−１８０μｇＨＡ／ｍＬ
【表１０】
2013508437.tif 000011
【０１４９】
全ヒト用量及びヒト用量の１／２のＡＳ０３Ａアジュバントを添加したＡ／カリフォルニア／７／０９ワクチンを用いて得られたデータは、腹腔内経路により免疫されたマウスにおける死亡率が高かったので（＞５０％）含めなかった。
【０１５０】
ワクチン製剤の調製
ワクチンの最終濃度を１１５．４μｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、１５μｇ／ｍＬのｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、及び１０μｇ／ｍＬのチオメルサールにするために、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、及びチオメルサールを、バッファＡ（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７．２６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．７４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）に添加する。既に株中に存在する量を考慮して、使用する量を計算する。室温で軌道振動型テーブルにて１５〜４５分間プレミックスを混合した後、１５μｇのＡ／カリフォルニアスプリットワクチンを添加する。スプリットワクチンを添加した後、室温で軌道振動型テーブルにて１５〜４５分間製剤を混合する。次いで、１ｍＬ当たり１０．６９ｍｇのスクアレン、１１．８６ｍｇのαトコフェロール及び４．８６ｍｇのポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））の最終濃度にするために、水中油型エマルションを添加する。室温で軌道振動型テーブルにて１５〜４５分間ワクチンを混合する。
【０１５１】
全用量の製剤の一部を、段階希釈により、同じバッファＡ（上記を参照されたい）で１／２、１／４、１／８、１／３２、及び１／１２８倍に即席で希釈する。調製完了後１時間以内に全用量及び希釈物を注入した。
【０１５２】
全用量製剤の別の一部を３０℃で３０日間インキュベートし、即席で希釈し、注入した。
【０１５３】
読み出し
１０匹のマウス／群において、一次免疫（１４日目）及び二次免疫（２８日目）の１４日後に、ワクチン接種に対する体液性免疫反応を測定した。赤血球凝集阻止アッセイ（ＨＩ）により血清サンプルを試験した。
【０１５４】
結果
体液性免疫反応
図６及び７に最初の投与の１４日後の結果を示し、図８及び９に２回目の投与の１４日後の結果を示す。
【０１５５】
１用量のＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンを即席で調製した後、４０超のＨＩ力価が観察された。１用量のＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチン接種後、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））が存在していようと（図７）いまいと（図６）、即席で調製したＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンで免疫されたマウスにおいて誘導された免疫反応と比べて、３０℃で３０日間保存した後、有意に低いＨＩ力価が観察された。
【０１５６】
ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチン単回用量で免疫されたマウスにおいて誘導された免疫反応と比べて、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチン２用量で免疫されたマウスでは、より高いＨＩ力価が観察された（図８および図９）。
【０１５７】
ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加せずに調製されたＡＳ０３Ａアジュバントを添加したワクチンを２用量投与した後（図８）、即席で調製されたワクチンで免疫されたマウスと比べて、３０℃で３０日間保存したワクチンで免疫されたマウスではより低いＨＩ力価が観察された。
【０１５８】
プロセスにおいてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した場合（図９）、３０℃で３０日間保存したワクチンで免疫されたマウスと、即席で調製されたアジュバント添加したワクチンで免疫されたマウスとにおいて同様の免疫反応が観察された。
【０１５９】
結論
即席で調製されたアジュバント添加したワクチンで免疫されたマウスにおいて誘導された免疫反応と比べたとき、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加せずに調製されたアジュバント添加したワクチンと比べて、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加した、３０℃で３０日間保存したアジュバント添加したワクチンは高い安定性を示した。
【０１６０】
一般的結論
より高濃度のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を含有するプロセスで製造されたアジュバント無添加の又はＡＳ０３Ａアジュバントを添加したＡ／カリフォルニア／７／０９スプリットワクチンをマウスにワクチン接種したところ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加せずに調製したワクチンと比べて、より高い体液性免疫反応（ＨＩ力価）が生じた。これらデータは、このワクチンがプロセス中にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加して調製された場合、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加した又はされていないスプリットワクチンの安定性の向上を示した。
【０１６１】
実施例５：１８〜６０歳の成人における第ＩＩＩ相、二重盲検、無作為化研究
序論及び研究設計
１８〜６０歳の成人において第ＩＩＩ相、二重盲検、無作為化研究を実施して、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原の２つの製造プロセスの免疫学的非劣性を評価した。
【０１６２】
約３００被験体の４つの並行群（１：１：１：１）に、合計で以下のワクチンをＩＭ投与した：
−  Ｄ−ＩＮＩ−１Ｄ群：７５名の被験体に、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加した初期プロセスで製造されたＦｌｕ  Ｄ−ＰＡＮ  Ｈ１Ｎ１候補ワクチン１用量を投与した
−  Ｄ−ＩＮＩ−２Ｄ群：７５名の被験体に、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加した初期プロセスで製造されたＦｌｕ  Ｄ−ＰＡＮ  Ｈ１Ｎ１候補ワクチン２用量を投与した
−  Ｄ−ＮＥＷ−１Ｄ群：７５名の被験体に、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加した新規プロセスで製造されたＦｌｕ  Ｄ−ＰＡＮ  Ｈ１Ｎ１候補ワクチン１用量を投与した
−  Ｄ−ＮＥＷ−２Ｄ群：７５名の被験体に、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加した新規プロセスで製造されたＦｌｕ  Ｄ−ＰＡＮ  Ｈ１Ｎ１候補ワクチン２用量を投与した
スケジュール：１回又は２回の筋肉内（ＩＭ）注射、２つの群１には１回だけ（０日目）又は２つの群２には２回（０日目及び２１日目）、ワクチン接種後０日目、２１日目、４２日目、１８２日目、及び３６４日目に血液サンプルを採取した。
【０１６３】
研究目的
１８〜６０歳の健常被験体において最初にワクチン接種した２１日後に、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加して新規プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原の（ワクチン−相同ウイルスＨ１Ｎ１  ＨＩ抗体  ＧＭＴ−赤血球凝集阻止（ＨＩ）抗体の観点における）免疫学的非劣性を、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加して初期プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原と比較した。Ａ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似に対するＨＩ抗体力価の観点で、初期プロセスで製造されたワクチンと新規プロセスで製造されたワクチンとの間のＧＭＴの比について両側９５％ＣＩの上限が２以下である場合、非劣性に達したとみなす。一次ワクチン投与の２１日後（２１日目）及び二次ワクチン接種の２１日後のＨＩ抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）も測定した。セロコンバージョン率（ＳＣＲ−ワクチン接種前の力価が１：１０未満であり、且つワクチン接種後の力価が１：４０以上であるか、又はワクチン接種前の力価が１：１０以上であり、且つワクチン接種後の力価が少なくとも４倍上昇するワクチン被接種者の百分率として定義される）、セロコンバージョン係数（ＳＣＦ−ワクチン接種前と比較してワクチン接種後の血清ＨＩ  ＧＭＴが何倍増加したかとして定義される）、セロプロテクション率（ＳＰＲ−通常防御を示すと認められる、血清ＨＩ力価が１：４０以上のワクチン被接種者の百分率として定義される）、及び中和抗体等の更なるパラメータも以下に報告する。
【０１６４】
抗原調製
２つのプロセスＤ−ＩＮＩとＤ−ＮＥＷとの間の唯一の差は、ウイルスの分割直後にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加することである。これは、最終滅菌濾過工程中の抗原の凝集及び抗原の減少を防ぐのに役立つ。図１は、Ｄ−ＩＮＩ（左のカラム）及びＤ−ＮＥＷ（中央のカラム）についてスプリット不活化Ｈ１Ｎ１ｖバルク調製物の調製方法の概略を示す。
【０１６５】
基本的に、バルクの製造プロセスは、４つの主な部分に分けることができ、αトコフェロールクエン酸塩安定剤を添加しなかったこと以外、大部分は国際公開第０２／０９７０７２号パンフレット（米国特許第７３１６８１３Ｂ２号明細書）の実施例５ａに記載のプロセスに基づく。
【０１６６】
１．「粗全ウイルスバルク」を得るために、受精鶏卵において実施種（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｅｅｄ）を増殖させ、感染した尿膜腔液を回収し、プールする（工程１）。  
２．「精製全ウイルスバルク」を得るために各ウイルス株を精製する（工程２〜６）。  
３．デオキシコール酸ナトリウムを用いて、精製された一価の全ウイルスバルクを分割して、「精製スプリットウイルスバルク」を得る（工程７〜８／１）。  
４．「精製不活化スプリットウイルスバルク」、すなわち「バルク」を得るために、デオキシコール酸ナトリウム及びホルムアルデヒドと共にインキュベートし、次いで、限外濾過及び滅菌濾過することにより、２段階で精製一価スプリットウイルスバルクを不活化する（工程８／２〜９）。
【０１６７】
次いで、Ｄ−ＮＥＷプロセスの精製スプリットウイルスバルク（図１における画分７／２）を以下の処理に供する。濾過前に、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））を添加する（濾液中の最終濃度を０．２５％にするために）。バイオバーデンを除去するために、画分７／２を０．４５μｍ以上の濾過膜で段階的に濾取し、次いで、０．４５μｍ以下の孔径の第２の膜濾過工程を行う。次いで、濾液を短時間超音波処理し、０．４５μｍ以下の孔径の膜を通して濾過する。濾過の最後に、０．０２５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有するリン酸バッファでフィルタをすすぐ。濾過及びすすぎの結果、濾液の最終体積は元の画分７／２の体積の５倍になる。
【０１６８】
チオメルサールを（両プロセスにおいて）製剤に添加する、これは、１用量当たり５μｇの濃度で、１０用量の提示中に存在する。
【０１６９】
ワクチン組成物
ワクチン１用量当たりのＨＡ含量を０．５ｍＬ用量当たり３／７５μｇに固定すると、再構成後のワクチンは、それぞれ、０．５ｍＬの用量当たり２８．７５μｇ以上及び２２．５μｇ以上の量になるポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））等の幾つかの賦形剤を含有する。ＡＳ０３Ａアジュバントは、０．５ｍＬのワクチン用量当たり１１．８６ｍｇのトコフェロール、１０．６９ｍｇのスクアレン及び４．８６ｍｇのポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）又はＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０（商標））を含有している水中油型エマルションアジュバント系である（国際公開第２００６／１００１０９号パンフレット）。アジュバントＯ／Ｗエマルションを抗原懸濁液と混合することにより、再構成されたワクチンを作製する。また、再構成されたワクチンの組成物は、０．５ｍＬの用量当たり５μｇのチオメルサールを含有する。
【０１７０】
研究において使用した抗原ロットは、以下の通りであった：
・Ｈ１Ｎ１（新規プロセスＤ−ＮＥＷ）のロット番号＝ＤＦＬＳＡ０１４Ａ；アジュバントＡＡ０３Ａ２０９Ｃのロット番号；ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））含有量は、２２．５μｇ／０．２５ｍＬの抗原懸濁液である。  
・Ｈ１Ｎ１（初期プロセスＤ−ＩＮＩ）のロット番号＝ＤＦＬＳＡ０１３Ａ；アジュバントＡＡ０３Ａ２０９Ｃのロット番号；ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））含有量は、３．７５μｇ／０．２５ｍＬの抗原懸濁液（ＨＡ含有量に対して１：１の比率）である。
【０１７１】
Ｈ１Ｎ１抗原懸濁液のＴｗｅｅｎ８０の含有量は、両方の抗原懸濁液について、２８．７５μｇ／０．２５ｍＬ抗原懸濁液（１１５μｇ／ｍＬの標的製剤）以上であるが、５５μｇ／０．２５ｍＬ（２２０μｇ／ｍＬ）を超えない。抗原懸濁液の組成を表１３に示す。
【表１１】
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【０１７２】
免疫原性結果−体液性免疫反応
アジュバントＡＳ０３Ａを添加して初期プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原ワクチンと比べた、アジュバントＡＳ０３Ａを添加して新規プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原ワクチンの非劣性（ＧＭＴ）
アジュバントＡＳ０３Ａを添加して新規プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原ワクチンは、２１日目におけるＧＭＴ比（表１４）及び２１日目におけるセロコンバージョン率の差（表１５）の両方の観点で、アジュバントＡＳ０３Ａを添加した初期プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原ワクチンに対して非劣性であることが示された。
【表１２】
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【表１３】
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【０１７３】
ＨＩ  幾何平均力価（ＧＭＴ）
９５％ＣＩを有するＨＩ抗体のＧＭＴを表１６に示す。０日目に血清反応陽性である割合は、４３．２％〜４７．２％であった。ワクチン接種前、ＧＭＴ値は低く、９．６〜１０．２であった。２１日目、血清反応陽性である割合は、両群（Ｄ−ＩＮＩ及びＤ−ＮＥＷ）で１００％に増加した。観察されたＨＩ反応の規模は、両群で類似していた（Ｄ−ＮＥＷ群のＧＭＴは３８８．８であるのに対して、Ｄ−ＩＮＩ群は４４１．８）。
【表１４】
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【０１７４】
抗ＨＩ  Ａｂ力価のセロプロテクション率、セロコンバージョン率及びセロコンバージョン係数
セロプロテクション率（ＳＰＲ）については表１７、セロコンバージョン率（ＳＣＲ）については表１８、セロコンバージョン係数（ＳＣＦ）については表１９に結果を示す。
【０１７５】
ＳＰＲは、両群において同じ範囲内であり、且つＣＨＭＰを満たす（平均が７０超）ことが示された。新規プロセスで製造されたＦｌｕ  Ｄ−ＰＡＮ  Ｈ１Ｎ１ワクチン、及び初期プロセスで製造されたＦｌｕ  Ｄ−ＰＡＮ  Ｈ１Ｎ１ワクチンにより誘導されるＳＣＲは、同じ範囲内であり、且つ両方共ＣＨＭＰを満たしていた（平均が４０超）。両群において、ＳＣＦは、同じ範囲内であり、且つＣＨＭＰ基準を超えていた（２．５超）。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１７６】
年齢層毎の免疫学的応答
全年齢に対して及び年齢層毎に（１８〜４０歳及び４１〜６０歳）、血清反応陽性、ＧＭＴ、セロプロテクション率、セロコンバージョン率、及びセロコンバージョン係数の結果を表２０に示す。
【０１７７】
全年齢に対して及び年齢層毎に、２１日目、Ｄ−ＩＮＩ及びＤ−ＮＥＷ群の被験体における免疫反応は、両方共、成人におけるインフルエンザワクチン関するＣＨＭＰ規制で認められる基準の全てを超えていた。試験した全てのパラメータは、両群間で類似しているとみなすことができる。
【表１８】
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【０１７８】
反応原性結果
Ｄ−ＮＥＷ及びＤ−ＩＮＩ群において同様の頻度で生じた局所症状を報告した。注射部位の疼痛が最も高い頻度で報告された症状であり、一方、両方の群においてより低い頻度で腫脹及び発赤が観察された。グレード３の生じた局所症状は、それほど頻度が高くなく、両群で同程度であった。
【０１７９】
Ｄ−ＮＥＷ群（１８．８％）に比べてＤ−ＩＮＩ（２７．５％）において高い頻度で報告された振戦を除いて、生じた局所症状は、両群で等しい頻度で報告された。グレード３の生じた全身症状は、それほど頻度が高くなく、両群で同程度であった（０％〜２．０％）。
【０１８０】
結論
免疫原性結論
１８〜６０歳の健常被験体において最初にワクチン接種した２１日後に、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加して初期プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原と比べて、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加して新規プロセスで製造されたＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似抗原は、（ＧＭＴ及びＳＣＲの観点において）両方で免疫学的非劣性に達した。
【０１８１】
３．７５μｇのＨＡ抗原でインフルエンザ汎発流行病用ワクチンの最初の投与後２１日目に観察されたＨＩ体液性免疫反応は、初期又は新規プロセスのいずれかで製造されたワクチン１用量を投与した全ての年齢層及び両群において、ＳＣＲ、ＳＰＲ、及びＳＣＦの観点でＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ規制の判定基準すべてを満たし、且つ超えていた。
【０１８２】
更に、両方のワクチンについて二次ワクチン接種の２１日後にも、ＳＣＲ、ＳＰＲ及びＳＣＦの観点でＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ判定基準を満たし、且つ超えていた。
【０１８３】
安全性結論
反応原性プロファイルは両方の群において同等であった。最も高い頻度で生じたＡＥは、注射部位における疼痛、疲労、筋肉痛、及び頭痛であった。すべての反応原性パラメータの個々の値は、Ｄ−Ｎｅｗ及びＤ−Ｉｎｉワクチンについて類似している。
【０１８４】
総体的結論
新規プロセスで製造され、ＡＳ０３Ａアジュバントを添加したＨ１Ｎ１候補ワクチンは、成人において、初期プロセスに従って製造されたワクチン抗原により誘導される免疫反応に劣らないＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｖ−類似株に対する免疫反応を誘発する。両方のワクチンは、許容し得る反応原性プロファイルを示し、安全性の問題はみられなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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