(57)【要約】  哺乳類においてライム病の状態を診断するための方法を提供する。前記方法は、哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌(B.burgdorferi)細胞表層タンパク質(Osp) OspA、OspCおよびOspFに対する抗体を測定することを伴う。前記OspA、OspCおよびOspF抗体の測定に基づいて、前記哺乳類が、ワクチン接種を受けているか、ワクチン接種を受けていないか、ライム病菌に感染しているかあるいは感染していないか診断できる。初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患している哺乳類を特定することも可能である。前記方法は、特に馬および犬での使用に適している。単離されたあるいは組換えライム病菌抗原およびそれらを含む組成物も提供される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法であって、
哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌(B.burgdorferi)細胞表層タンパク質(Osp) OspA、OspCおよびOspFに対する抗体の有無を決定し、前記抗体の有無に基づいて、前記哺乳類がライム病菌に感染しているか感染していないかを特定することを含む方法。
【請求項２】
前記哺乳類が馬または犬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法において測定されるライム病菌抗原に対する抗体が、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体だけである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の非存在の決定によって、前記哺乳類がライム病菌に感染していないことを特定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体の有無の決定に基づいて、前記動物が初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患していることを判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体の有無の決定に基づいて、前記哺乳類がライム病に対するワクチン接種を受けているかどうかを判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体の有無の決定が、側方流装置を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体の有無の決定が、蛍光ビーズ-ベースのマルチプレックス解析を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法であって、哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌(B.burgdorferi)細胞表層タンパク質(Osp) OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のテストレベルを測定し、前記OspA、OspCおよびOspF抗体のテストレベルと基準の比較に基づいて、前記哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けているか及び／又は初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患しているかを特定することを含む方法。
【請求項１０】
前記方法において測定されるライム病菌タンパク質に対する抗体が、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体だけである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
OspA、OspCおよびOspFタンパク質に対する抗体の非存在の決定によって、前記哺乳類がライム病菌に感染していないことを特定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体の有無の決定が、蛍光ビーズ-ベースのマルチプレックス解析を使用して決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記基準が、蛍光強度中央値の値域である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法であって、哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌(B.burgdorferi)細胞表層タンパク質(Osp) OspA、OspCおよびOspFに特異的な抗体の有無を決定すること、および：
i) OspAに対する抗体の存在、および、OspCあるいはOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ワクチン接種を受けているが、ライム病菌に感染していないことを特定する；
ii) OspCに対する抗体の存在、および、OspAおよびOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、初期のライム病を有することを特定する；
iii) OspFに対する抗体の存在、および、OspAおよびOspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、慢性のライム病を有することを特定する；
iv) OspAおよびOspCに対する抗体の存在、および、OspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有することを特定する；
v) OspAおよびOspFに対する抗体の存在、および、OspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有することを特定する；
vi) OspCおよびOspFに対する抗体の存在、および、OspAに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、中期のライム病を有することを特定する；または
vii) OspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有することを特定する；
ことを含む方法。
【請求項１５】
配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９の配列を含む単離されたタンパク質、あるいは前記タンパク質の組み合わせを含む組成物。
【請求項１６】
配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７を含むタンパク質の組み合わせを含む、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ライム病の診断に関し、より具体的には、ウマ科の動物やイヌ科の動物等の哺乳類におけるライム病の様々な段階の判定に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライム病は、広義のライム病菌(Borrelia burgdorferi)グループのスピロヘータによる感染によって起こる。それは、ヒト、犬、馬および他の哺乳類種を侵す人獣共通感染症である。前記バクテリアは、感染したマダニ(Ixodes spp.)によって哺乳類宿主に伝染する。ライム病は、米国、欧州およびアジアにおける最も一般的なベクター媒介疾患である。米国では、B.burgdorferi狭義株が存在するが、欧州およびアジアでは、前記疾患はボレリア・ガリニ(B. garinii)およびボレリア・アフゼリ(B. afzelii)によって一般に起こる。ライム病診断のための現在の方法では、一般に、前記病原体に接触して発症のリスクのある犬および馬を確認するために、全ライム病菌溶解物に対するあるいはスピロヘータの個々の抗原に対する血清抗体が分析される。犬および馬において、ライム病菌に対する血清抗体の検出は、不十分な手段であるが、それにもかかわらず今なおヒトのライム病診断法のゴールド・スタンダードと考えられているELISAおよびそれに続くウエスタンブロット法(WB)によって行われる。いくつかのテストが利用できるが(犬および馬のライム病菌の可変表面抗原VlsEの不変ドメインIR6を検出するスナップテスト等)、それらは望ましいレベルの感度を有さず、疾患の様々な段階を見分けることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、哺乳類（馬および犬を含むが必ずしもそれらに限定されない）におけるライム病診断の改善された方法に対する継続した且つ満たされていないニーズが存在する。本発明は、これらおよび他のニーズを満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、哺乳類においてライム病の状態を診断する方法を提供する。前記方法は、哺乳類から得られたまたは哺乳類から派生した(哺乳類に由来する)生体サンプルにおいて、ライム病菌(B.burgdorferi)細胞表層タンパク質(outer surface protein：Osp) OspA、OspC、およびOspFに対する抗体の有無を決定(測定)し、前記抗体の有無に基づいて、前記哺乳類がライム病菌に感染しているか否かを特定(同定)することを含む。前記方法は、前記動物がライム病菌に対するワクチン接種を受けたかどうかを判定することを含む。前記方法は、前記抗体の有無の決定に基づいて、ライム病の様々な段階、すなわち初期、中期あるいは慢性のライム病(ボレリア・ブルグドルフェリ感染症)を判別することを可能にする。一実施形態において、前記哺乳類は、OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の非存在の決定によって、ライム病菌に感染していないことが確認される。一実施形態において、前記方法において測定されるライム病菌抗原に対する抗体は、ライム病菌 OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のみである。
【０００５】
前記方法は、適切なシステムまたは装置を使用して、前記抗体の有無を決定するのに適している。様々な実施形態において、前記抗体は、側方流装置(lateral flow device)または蛍光ビーズ-ベースのマルチプレックス解析(fluorescent bead-based multiplex assay)を使用して測定される。
【０００６】
本発明は、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のテストレベルを測定(決定)すること、および前記OspA、OspCおよびOspF抗体のテストレベルと基準との比較に基づき、前記哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種(予防接種)を受けたか及び／又は初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患しているかを特定することを含む。一実施形態において、前記基準は、蛍光強度中央値の値域である。
【０００７】
本発明の特定の態様において、前記方法は以下の工程を含む：
i) OspAに対する抗体の存在の決定、および、OspCあるいはOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ワクチン接種を受けているが、ライム病菌に感染していないことを確認する
ii) OspCに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、初期のライム病を有することを確認する
iii) OspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、慢性のライム病を有することを確認する
iv) OspAおよびOspCに対する抗体の存在の決定、および、OspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有することを確認する
v) OspAおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有することを確認する
vi) OspCおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、中期のライム病を有することを確認する、または、
vii) OspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有することを確認する
【０００８】
ライム病タンパク質を含む新規の単離されたタンパク質およびそれらをコードする単離された核酸を含む組成物およびキットも含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】精製組換えライム病菌OspA(A)、OspC(B)およびOspF(C)タンパク質および免疫ブロット法によるワクチン接種したあるいは感染した犬の血清を使用した検出を示す。左パネル：組換えタンパク質は、還元条件下15% SDS-PAGEによって分離され、クーマシーブリリアントブルー(Coomassie Brilliant Blue)で染色された(1＝分子量マーカー；2＝精製組換えライム病菌タンパク質)。右パネル：前記タンパク質はその後WBによってフッ化ポリビニリデン (PVDF)膜に転写され、従来の全ライム病菌細胞溶解物WBにてプレテストされたイヌ血清とともにインキュベートされた(3＝陽性血清；4＝陰性血清)。
【図２】ライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原に対する血清抗体の分析のためのシングルプレックス(single bead analysis)およびマルチプレックス解析結果の相関関係。計79のイヌ血清が比較のために使用された。データは、表３で決定された陰性(白丸)、曖昧(灰色の丸)および陽性(黒丸)の解釈範囲に従って、色分けされた。スピアマンの順位相関が、抗原のそれぞれに対し計算された。MFI＝蛍光強度中央値
【図３】イヌ血清中のライム病菌に対する抗体検出のための従来のWBを示す。全ライム病菌細胞溶解物は、還元条件下12% SDSゲル上で分離された。前記タンパク質はWBによって転写された。ブロット膜は5%のミルクでブロックされ、その後異なるイヌ血清とともにインキュベートされた。ペルオキシダーゼ抱合-抗イヌ免疫グロブリン抗体(二次抗体)が検出のために使用され、その後発色基質が続いた。レーン1＝分子量マーカー；レーン2＝感染した犬の血清；レーン3＝ワクチン接種された犬の血清；レーン4＝陰性のイヌ血清。細い矢印は、22, 28, 29, 30および39 kDaの感染の指標となるタンパク質をそれぞれ指し示す。太い矢印は、犬のワクチン接種を確認する31 kDaのタンパク質を示す。
【図４】ライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原のWB結果(全細菌溶解物)およびマルチプレックス解析の比較を示す。計188のイヌ血清が、WBによってテストされ、各抗原に対しWB陰性(neg)あるいはWB陽性(pos)として分類された。WBnegおよびWBpos群のマルチプレックス解析結果は、マンホイットニー検定を使用して比較された。MFI＝蛍光強度中央値
【図５】マルチプレックス解析によるライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原に対する血清抗体の検出用受信者動作曲線(ROC)を示す。マルチプレックス解析結果は、各抗原について、WBによって検出された対応するライム病菌タンパク質に対する血清抗体の有無と比較された。188のイヌ血清サンプルから得られた結果は、各ROC曲線と比較された。曲線(bold line)の下のエリアは、OspAでは0.93、OspCでは0.82、OspFでは0.89である。点による曲線は、95%信頼区間を示す(→は太い線[bold line]を示す：太い線を囲む2つの線＝点線)。
【図６】ウエスタンブロット法によるライム病菌タンパク質の検出のためのウマ血清中の抗体分析を示す。ライム病菌の全細胞溶解物は、SDS-PAGEによって分離され、タンパク質はウエスタンブロット法によってニトロセルロース膜に転写された。レーン(1)は分子量マーカーを示す。残りのレーンは、ライム病菌に感染した馬の血清(2)、非感染馬の血清(3)、あるいはライム病に対するワクチン接種を受けた馬の血清(4)で染色された。感染およびワクチン接種馬から得られた血清は、特徴的な検出パターンを示す。OspAはワクチン接種された馬のためのマーカーと見なされるが、OspC、OspF、並びに28、30および39 kDaの抗原に対する抗体は、感染の指標である。
【図７】81のウマ血清サンプル中で検出されたライム病菌のOspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体のためのシングルプレックスおよびマルチプレックス結果の比較を示す。マルチプレックス解析結果は、蛍光強度中央値(MFI)として表される。スピアマンの順位相関(rsp)は各比較のために計算された。
【図８】ライム病菌のOspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体のためのウエスタンブロット(WB)およびマルチプレックス結果(MFI)が562のウマ血清サンプルにおいて比較された。WB陰性サンプルと比べてWB陽性血清の使用により、MFI値の明確な増加が、全３つのビーズ-ベース解析(bead-based assay)で観察された(P値は＜0.0001)。
【図９】ライム病菌に対する抗体の検出のためのマルチプレックス解析の一実施形態の図解である。(1)組換えライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原は蛍光ビーズに結合される。(2)サンプル(例えば、血清、CSFあるいは他の体液)が3つの蛍光ビーズ全てと同時にインキュベートされる。(3)ビオチン化抗-種特異的免疫グロブリン抗体が解析に加えられる。(4)ストレプトアビジン-フィコエリトリンがレポーター色素として添加される。前記解析はその後、蛍光ビーズコードおよび個々のビーズ解析それぞれのレポーター色素を検出するマルチプレックス分析器において測定される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法を提供する。
一般に、前記方法は、哺乳類から得られたまたは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌(B.burgdorferi)細胞表層タンパク質(Osp) OspA、OspC、およびOspFに対する抗体を測定することを含む。OspA、OspCおよびOspF抗体の測定に基づき、前記哺乳類はライム病菌に感染しているか感染していないかを診断されることができる。様々な実施形態において、前記方法は、哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けたか及び／又は初期、中期あるいは慢性のライム病を有するかを同定することを提供する。本発明は、新規な単離されたライム病菌タンパク質およびそのフラグメントを含む組成物も提供する。
【００１１】
本明細書で使用されるライム病の「状態(status)」は、ライム病菌 OspA、OspCおよびOspFを特異的に認識する抗体に関する哺乳類の抗体プロファイルに言及する。ライム病の状態を判定(決定)することは、前記哺乳類が以下のカテゴリーの一つに該当することの判定を含み得る；i) ライム病菌に対するワクチン接種を受けており、ライム病菌に感染していない；ii) 初期のライム病を有している；iii) 慢性のライム病を有している；iv) ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有している；v) ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有している；vi) 中期のライム病を有している；vii) ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有している；またはviii) ライム病菌に対するワクチン接種を受けておらず、ライム病を有していない。本明細書中で使用される「初期」感染は、２〜６週間の感染を意味する。「慢性」あるいは「後期」感染は、５か月以上の感染を意味する。中期の感染は、６週〜５か月の感染を意味する。
【００１２】
本発明の方法は、哺乳類におけるライム病の状態の決定に有用である。ある特定の実施形態において、前記哺乳類はウマ科の動物、イヌ科の動物あるいはヒトである。ウマ科には、分類学的な科によるウマ科のメンバーが含まれる。ある実施形態において、本発明によって診断されるウマ科の動物は馬である。イヌ科には、分類学的な科によるイヌ科のメンバーが含まれる。ある実施形態によって、本発明によって診断されるイヌ科の動物は飼い犬等の犬である。
【００１３】
前記方法においてテストされる生体サンプルは、抗体を含むことが予期される生体サンプルのいずれであってもよい。前記生体サンプルは好ましくは生体液体である。様々な実施形態において、前記生体サンプルは、血液、血清あるいは脳脊髄液(CSF)を含む。前記生体サンプルは、いずれかの適切な技術を用いて哺乳類から得ることができ、前記抗体の有無の決定に直接使用することができる。あるいは、前記サンプルは、生体サンプルを加工工程(血液、血清、CSFあるいはそのような生体液体の成分を単離あるいは精製するために行われる加工工程等)にかけることによって生体サンプルから得られた(生体サンプルから派生した)ものであってもよい。
【００１４】
一般に、ライム病の状態は、表１に示すマトリクスを使用して本発明に従って確認することができる。表中において、「＋」は、表示されたOsp抗原を特異的に認識する抗体の存在を意味し、「−」はそのような抗体の非存在を意味する。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
以下の記述および実施例からより完全に理解されるように、表１に示されたマトリクスは、多数の馬および犬から得られた非常に多くの生体サンプルをテストし、検証して作成された。
【００１７】
表１は、本発明のいくつかの限定されない有用な態様を強調したデータの要約を説明する。例えば、OspA、OspCおよびOspFのそれぞれに対する抗体の有無が、ライム病の状態の最終的な評価を提供するのに重要であることが表１から明確である。特に、OspAのみに対する抗体の存在の決定(測定)は、ライム病菌感染に対する偽陽性を提供でき、また、初期および慢性の感染に対する偽陰性の結果も提供できることは明確である。同様に、OspAに対する抗体の非存在およびOspCに対する抗体の非存在のみの決定は、慢性の感染に対する偽陰性の結果をもたらす。さらに、感染していないことおよびワクチン接種されていないことの確定診断は、OspA、OspCおよびOspFのそれぞれに対する抗体の非存在を決定することによって、ライム病の他の抗体または指標を測定しなくても、行うことができる。このように、全３つのOspA、OspCおよびOspF抗原を対象とする抗体の状態を決定するという認識は、本発明の重要な特徴であり、従来の利用可能なテストを超える予期できない利益を提供する。これに関連し、本発明は、OspA、OspCおよびOspFのみに対する抗体を測定することによって、それゆえ他のライム病菌抗原に対する抗体を測定することなく、実施することができる。本発明の一実施形態において、BBK32タンパク質に対する抗体は測定されない。BBK32タンパク質は、米国特許公開公報20060034862号に記述されており、そのBBK32タンパク質の記述およびそのようなタンパク質を対象とする抗体の記述は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
一実施形態において、前記方法は、OspA、OspCおよびOspFに特異的な抗体の有無(存在または非存在)を決定(測定)することによって、哺乳類におけるライム病の状態の診断を提供し、以下を含む：i) OspAに対する抗体の存在の決定、および、OspCあるいはOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病菌に対するワクチン接種を受けているが、ライム病菌に感染していないことを確認する；ii) OspCに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、初期のライム病を有することを確認する；iii) OspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、慢性のライム病を有することを確認する；iv) OspAおよびOspCに対する抗体の存在の決定、および、OspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有することを確認する；v) OspAおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有することを確認する；vi) OspCおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、中期のライム病を有することを確認する；vii) OspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有することを確認する；またはviii) OspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の非存在に基づき、前記哺乳類が、ライム病菌に対するワクチン接種を受けておらず、ライム病を有していないことを確認する。
【００１９】
本発明の様々な態様において、OspA、OspCおよびOspF抗体は、テスト抗体と考えることができる。ライム病の状態の判定のために、哺乳類から得られたまたは派生した生体サンプルから測定されたテスト抗体のレベルは、基準と比較されることができる。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、哺乳類から得られたまたは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌 OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のテストレベルを測定(決定)すること、および前記OspA、OspCおよびOspF抗体のテストレベルと基準との比較に基づき、前記哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けたか及び／又は初期、中期あるいは慢性のライム病を有しているかを同定することを含む、哺乳類のライム病の状態を診断するための方法を提供する。
【００２１】
一実施形態において、前記基準は、前記テストサンプルにおける抗体の有無を決定(判定)するために使用される。基準は、テスト抗体のレベルを推定するために使用することもできる。前記基準は、テストサンプルと同時に確立されてもよく、あらかじめ確立されても、後で確立されてもよい。
【００２２】
一般に、基準値は、関心のあるもの(すなわち、場合によっては、抗体及び／又は抗原)の、異なるが既知の量の変数を使用することによって得られ、および当業者に既知の方法によって得ることができる。前記基準は、単一の値または範囲のある値であってもよい。例えば、基準はグラフ上の標準化曲線あるいはエリアであってもよい。ある特定の実施形態において、基準は、サンプル中の抗体が認識すると予期される既知の抗原を使用して得ることができる。前記抗原は好ましくは、テストサンプル中の抗体を測定するために使用される抗原である。一以上のレベルの前記抗原を、一以上のレベルのサンプル中に存在すると予想される抗体に暴露することによって、基準の単一値、値域、グラフ等を確立することができる。
【００２３】
一実施形態において、前記基準は、ポジティブコントロールを含むことができる。一実施形態において、前記ポジティブコントロールは、前記テストサンプルのために使用されるのと同じプラットホームの上または中に位置する。例えば、前記ポジティブコントロールは側方流装置上にあってもよく、その上に、異なる位置及び／又はレベルの一以上の異なる抗原も配置される。この配置は、分析されるサンプル中にテスト抗体が存在するかしないかに関係なく、テスト条件下のコントロール基準からのシグナルをもたらし、テストが正しく機能していることの確認を提供できる。前記ポジティブコントロールは、例えばヒトあるいは機械によって知覚できるシグナルを産出できる。
【００２４】
本発明の様々な態様において、前記ライム病菌抗原に対するテスト抗体レベルの定性的または定量的な測定を提供するために、前記テスト抗体を基準と比較することができる。いずれにしても、前記基準との比較によって、テスト抗体のレベルは、本発明の方法において分析されるサンプル中に存在している、あるいは存在していないと見なされることができる。
【００２５】
基準は、それがシグナルを生成しないように、あるいはそれから生成した何らかのシグナルがバックグラウンド・シグナルと見なされるように、構成されてもよい。典型的に、これはネガティブコントロールと見なされ、前記テスト抗体が結合することが予期される特定の抗原を除くすべての反応成分を含む。あるいは、前記ネガティブコントロールは、非特異的タンパク質あるいは抗原(ウシ血清アルブミンまたは同様のもの)も含むことができる。
【００２６】
ある実施形態では、前記抗体のレベルは、一以上の値域を含む基準と比較される。非限定的なある実施形態では、第一の基準値範囲に分類されるテスト抗体のレベルは、前記哺乳類のライム病の状態に関し有益な(情報価値のある)テスト抗体の高いレベルを示す。第二の基準値範囲に分類されるテスト抗体のレベルは、哺乳類のライム病状態に関し同様に有益なテスト抗体の低レベル(検出不能なレベルあるいは完全な非存在を含む)を示す。第三の基準値範囲に分類されるテスト抗体のレベルは、追加テストを行う必要があることを示してもよい。
【００２７】
値域からなる基準は、例えば、初期、慢性あるいは中期のライム病と確認された、あるいはライム病に罹患していないと確認された、及び／又はライム病に対するワクチン接種を受けていないと確認された哺乳類の各グループから得られる抗体の平均レベルを測定することによって、作成できる。
【００２８】
何らかの適切な技術、装置、システム及び／又は試薬が、OspA、OspCおよびOspF ライム病菌抗体、及び／又はその組み合わせを検出するために使用できる。一般に、抗体を検出する方法は、固体マトリクスと物理的に結合した、OspA、OspCおよびOspFタンパク質またはそのフラグメントを使用することを含む。前記タンパク質のフラグメントは、ライム病菌に対するワクチン接種によってまたはライム病菌の感染によって哺乳類中で製造される抗体によって認識されると予期されるフラグメントである。そのようなフラグメントのアミノ酸組成は、当該技術分野の通常の技術を使用して同定することができる。前記タンパク質及び／又はフラグメントは、ライム病菌から得られ、単離されあるいは誘導されてもよく、またそれらは多種多様の従来法のいずれかを使用して組換え技術によって製造されてもよい。OspA、OspCおよびOspF ライム病菌タンパク質あるいはそれらのフラグメントが物理的に結合する前記固体マトリクスは、何らかの適切な固体マトリクスであればよい。前記固体マトリクスは、マルチウェルアッセイ・プレート、ビーズ(蛍光標識ビーズ等)、ミクロスフェア、フィルター材、側方流装置あるいはストリップ、あるいは前記タンパク質をある位置に保つのに好適で、それにより哺乳類から得られた生体サンプル中に存在するあるいは由来する抗体を捕獲し検出できる他の何らかのフォームもしくはフォーマット中に存在してもよく及び／又はその一部であってもよい。前記タンパク質は前記固体マトリクスと共有結合または非共有結合してもよい。
【００２９】
一実施形態において、前記OspAタンパク質は、以下の配列番号１の配列あるいはそのフラグメントを有する：
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVLVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
【００３０】
一実施形態において、前記OspCタンパク質は、以下の配列番号２の配列あるいはそのフラグメントを有する：
MKKNTLSAILMTLFLFISCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITDSNAVLLAVKEVEALLSSIDELAKAIGKKIKNDGSLDNEANRNESLLAGAYTISTLITQKLSKLNGSEGLKEKIAAAKKCSEEFSTKLKDNHAQLGIQGVTDENAKKAILKANAAGKDKGVEELEKLSGSLESLSKAAKEMLANSVKELTSPVVAESPKKP
【００３１】
一実施形態において、前記OspFタンパク質は、以下の配列番号３の配列あるいはそのフラグメントを有する：
MNKKMFIICAVFALIISCKNYATSKDLEGAVQDLESSEQNVKKTEQEIKKQVEGFLEILETKDLNKLDTKEIEKRIQELKEKIEKLDSKKTSIETYSEYEEKLKQIKEKLKGKADLEDKLKGLEDSLKKKKEERKKALEDAKKKFEEFKGQVGSATGVTTGHRAGNQGSIGAQAWQCANSLGLGVSYSSSTGTDSNELANKVIDDSIKKIDEELKNTIENNGEVKKE
【００３２】
本明細書中に示された実施例に記述された分析で使用されたOspタンパク質のアミノ酸配列は新規である。特に、表２Ａは、既刊のライム病菌Genbank配列との違いを示す。
【００３３】
【表２】
2013539032.tif 000004
【００３４】
【表３】
2013539032.tif 000005
【００３５】
【表４】
2013539032.tif 000006
【００３６】
Genbank受入番号 HM756743、HM756744およびHM756745と関連する前記ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本発明の遂行において決定され、2011年1月1日まで公的にアクセス可能にされなかった。このように、様々な実施形態においておよび表２Ｂで示すように、それらを対象とする抗体を捕獲するために本発明の方法で使用される前記Osp抗原は、本明細書中に記述されるOspAヌクレオチド配列の1〜666ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列(配列番号15)、及び／又はOspCヌクレオチド配列の52〜636ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列(配列番号17)、及び／又は本明細書に開示されたOspFヌクレオチド配列の178〜684ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列(配列番号19)を含む。
【００３７】
様々な実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号2または配列番号3の配列を含む(または前記配列からなる)単離されたあるいは組換えタンパク質を含む組成物を提供する。これらのタンパク質のフラグメントも提供され、含む(またはからなる)フラグメントを含むが、それらに限定されない。前記タンパク質またはそのフラグメントは、本明細書中でさらに記述される組成物及び／又はキットの構成成分として提供されることができる。例えば、それらは、それらを特異的に認識できるライム病菌抗体の有無の決定のために使用できるシステム、装置あるいは組成物の一部として提供されることができる。一実施形態において、前記タンパク質は固体マトリクスと物理的に結合して提供されることができる。一実施形態では、前記固体マトリクスはビーズ(ミクロスフェア)である。
【００３８】
限定されない例において、ライム病菌に対する抗体は、何らかの免疫検出技術(ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、スナップテスト、様々な種類のマルチプレックス抗体検出技術、あるいは関心のある抗体を検出するために適した分析の何らかの変更を含むが、必ずしもそれらに限定されない)を使用して検出でき、互いから識別できる。
【００３９】
一実施形態において、OspA、OspCおよびOspF抗原は、側方流動ストリップの上にあるいは側方流動ストリップ(lateral flow strip)として構成された固体マトリクスと物理的に結合して別々の位置で提供される。哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルは、ストリップ(OspA、OspCおよびOspF抗原を特異的に認識する別個の抗体の存在が、各抗原に対する抗体の有無を示す別々のシグナルを生成する)を使用して分析できる。前記抗原の全てに対する抗体の非存在は、その哺乳類がワクチン接種を受けておらず、ライム病菌に感染していないことを示す。抗体の有無は、一般に表１に示されたマトリクスとの関連で解釈される。
【００４０】
一実施形態において、OspA、OspCおよびOspFに対する抗体またはそれらの組み合わせは、蛍光ビーズに結合したOspA、OspCおよびOspF抗原を使用して検出される。前記蛍光ビーズは、適切な蛍光ビーズのいずれであってもよく、その例として、例えばルミネックス社から市販されているものが挙げられる。前記ビーズはそれぞれ、異なったあるいは同じ蛍光検出可能成分で標識されることができる。前記ビーズは、別個の抗原それぞれに結合したビーズが、互いに区別できるようにコード化されることができる。哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプル中に存在する抗体は、各ビーズタイプが結合する抗原によって、抗原-結合蛍光ビーズに結合する。検出可能標識に結合された抗-種特異的抗体は、OspA、OspCおよびOspF、あるいはそれらの組み合わせに対する抗体の有無を検出するために使用でき、その後、例えば、表１に記述したマトリクスに従ってライム病の状態を診断するために使用できる。
【００４１】
本発明にかかる抗体を測定するためのマルチプレックス蛍光ビーズ解析のための説明に役立つ一例を図９に示す。図９から分かるように、(1) 組換えライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原が蛍光ビーズに結合され；(2) サンプル(例えば、血清、CSF、もしくは他の体液)が同時に全３つの蛍光ビーズとともにインキュベートされ；(3) ビオチン化抗-種特異的免疫グロブリン抗体が前記解析に添加され；(4) ストレプトアビジン-フィコエリトリンがレポーター色素として添加される。前記解析は、その後、個々のビーズ解析用の蛍光ビーズコードとレポーター色素を検出するマルチプレックスアナライザーにて測定される。ストレプトアビジンやビオチンやそれらの誘導体等の成分および他のレポーター色素は、マルチプレックス解析において同一または類似する機能を実行できる様々な市販の置換剤(substitute agents)のいずれかで置換されることができる。
【００４２】
蛍光ベースの抗体検出法から得られた出力データは、当業者に周知の様々な方法で表現されることができる。一実施形態において、蛍光ベースの抗体検出は、蛍光強度中央値(MFI)として提示されることができる。本発明において、我々はあるMFI値の範囲が、ライム病の状態(特にウマ科およびイヌ科の)を決定するために使用できることを特定した。本発明での使用に好適なMFI値は、表３に記述されたものを含む。
【００４３】
【表５】
2013539032.tif 000007
【００４４】
表３に記述される曖昧という結果は、前記サンプルを陰性または陽性に分類することができるように追加のテストを行うべきことを示している。
【００４５】
一実施形態において、前記方法はウマのライム病の状態を判定するために実施される。この実施形態は、ウマから得られたあるいは派生した生体サンプル中で、OspA、OspCおよびOspF抗体の有無を決定(測定)することを含む。前記抗体の有無は、なんらかの適切な技術(一実施形態では、蛍光ビーズと物理的に結合されたOspA、OspCおよびOspF抗原を含むマルチプレックス解析)を使用して決定することができる。前記OspA、OspCおよびOspF抗原は、ウマから得られたあるいは派生した生体サンプルと接触させられる。前記抗原に対する抗体が存在すれば、前記抗原に結合し、それによって、抗原/蛍光ビーズ複合体に固定化される。検出可能に標識化された抗-ウマ特異的抗体が添加され、OspA、OspCおよびOspF抗体それぞれのMFI値を作成するために、蛍光ビーズおよび前記抗-ウマ特異的抗体からの検出可能標識を検出するために、マルチプレックスアナライザーが使用される。前記抗体の有無が、表３に示されたウマの値に従って決定され、ライム病の状態が、表１に記述されたマトリクスによって決定される。同じ原理が、イヌから得られたあるいは派生した生体サンプルの分析に適用され、その際、表３に示されたイヌのサンプル用のMFI値が、抗体の有無を決定するために使用され、抗-ウマ特異的抗体の代わりに抗-イヌ特異的抗体が使用される。このようにして、OspA、OspCおよびOspF抗体のMFI値の測定に基づき、ウマあるいはイヌが、ライム病菌に感染しているか感染していないかが診断でき、さらに、ライム病菌に対するワクチン接種を受けているか、及び／又は初期、中期あるいは慢性のライム病を有しているかが確認できる。
【００４６】
様々な実施形態において、本発明は、有形的表現媒体(tangible medium)に前記抗体に関する決定を固定(保存)することをさらに含む。当該有形的表現媒体は、いかなるタイプの有形的表現媒体(例えば、DVD、CD-ROM、携帯用フラッシュメモリーデバイスなどを含むがこれらに限定されないあらゆる種類のデジタルメディア等)であってもよい。本発明は、動物の飼い主、ブリーダー、及び／又は動物のヘルスケア提供者に、ライム病感染を有すると判定された哺乳類の治療のための勧告を展開するために、前記有形的表現媒体を提供することを含む。
【００４７】
本発明ではまた、前記抗体を測定するための装置も提供される。一実施形態において、前記装置は、固体マトリクスに物理的に結合したOspA、OspCおよびOspF抗原を含む側方流装置である。一実施形態において、前記OspA、OspCおよびOspFは、前記固体マトリクスに結合して提供される唯一のライム病菌抗原である。一実施形態において、前記装置に備えられた前記OspA、OspCおよびOspF抗原は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【００４８】
前記抗体の有無を検出するためのキットも提供される。一実施形態において、前記キットは、固体マトリクスに物理的に結合したOspA、OspCおよびOspF抗原を含む。一実施形態において、前記OspA、OspCおよびOspFは、前記キットに備えられる唯一のライム病菌抗原である。前記キットは、前記固体マトリクスとして蛍光ビーズを含んでも良い。前記キットはさらに、前記抗原及び／又は前記ビーズを一以上の別個のバイアル中に含んでも良い。前記キットは、任意で、前記キットの使用説明書を含んでも良い。
【００４９】
以下の実施例は、本発明を具体的に説明することを目的とするものであり、限定を目的としない。
【実施例１】
【００５０】
本実施例は、イヌにおけるライム病の状態の判定に関し高い有用性を示す方法の一実施形態の説明を提供する。特に、本実施例において、我々はイヌ血清中のライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原に特異的な抗体の同時検出用の蛍光ビーズ-ベースのマルチプレックス解析の開発と検証を記述する。前記検証は、マルチプレックス解析結果を、ライム病診断の推奨確認テストであるウエスタンブロット法(WB)(例えば、www.cdc.gov/ncidod/dvbid/lyme/ld_humandisease_diagnosis.htm参照)と比較することによって行われた。本発明の他の利点の中で、本発明は、OspCが適切な診断マーカーではなかったと教示したイヌの過去の研究に反して、別のことをはっきり示す。特に、本実施例で示したテスト結果は、現在利用できるライム病テスト方法と比べて、イヌのライム病の状態の改良された判定を提供し、OspA、OspCおよびOspFに対する抗体を測定することによって、イヌの現在のワクチン接種および感染の状態のより良い決定を提供することができる。
【００５１】
以下の材料および方法が、本実施例で示される結果を得るために使用された。
ライム病菌遺伝子のクローニング
ライム病菌 OspA、OspCおよびOspFタンパク質が、E.coli中で発現され、マルチプレックス解析における抗原として使用された。DNAは、ニューヨークのウエストチェスター郡の森林地帯で採取された感染したシカダニ(Ixodes dammini ticks)由来のライム病菌から単離された(1993年、Appel他)。 完全なOspCおよびOspF遺伝子は、Pfu DNAポリメラーゼ(米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ、Stratagene社)を使用したPCRによって増幅された。OspCおよびOspFプライマーはそれぞれ、Genbank受入番号 NC_001903およびL13925からデザインされた。増幅のために使用されたプライマーのポジションが、括弧内に示される:OspC forward (1-23) 5’ atgaaaaagaatacattaagtgc 3’ 配列番号10；OspC reverse (633-607) 5’ ttaaggtttttttggactttctgccac 3’ 配列番号11；OspF forward (16-44) 5’ atgaataaaaaaatgtttattatttgtgc 3’ 配列番号12；およびOspF reverse (708-688) 5’ ttattcttttttgacttctcc 3’ 配列番号13。PCRは、前述の通り実施された(2001年、Wagner他)。PCR産物は、pCR4 TopoBluntベクター(米国、カリフォルニア州、カールズバッド、Invitrogen社)中でクローン化され、コーネル大学のバイオリソースセンター(BioResource Center)にてABI自動配列決定装置を使用して配列決定された。OspA遺伝子は、プラスミドOspA/pRSETから増幅された。前記クローン化した遺伝子の完全な翻訳領域のヌクレオチド配列は、Genbankに提出され、受入番号 HM756743(OspA)、HM756744(OspC)およびHM756745(OspF)にて受理された。
【００５２】
ライム病菌遺伝子の発現と精製
発現クローニングは、表２でも言及した以下のDNA配列に基づいて実施された。
OspA(822bp)、Genbank受入番号 HM756743
atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatgttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaaagttcttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaagcttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaagctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaagttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtcatcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagcagacggaaccagacttgaatacacaggaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagaggttttaaaaggctatgttcttgaaggaactctaactgctgaaaaaacaacattggtggttaaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagttttagttgaacttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcgggcacttcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaaaacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagttgaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa  配列番号14
【００５３】
M K K Y L L G I G L I L A L I A C K Q N V S S L D E K N S V S V D L P G E M K V L V S K E K N K D G K Y D L I A T V D K L E L K G T S D K N N G S G V L E G V K A D K S K V K L T I S D D L G Q T T L E V F K E D G K T L V S K K V T S K D K S S T E E K F N E K G E V S E K I I T R A D G T R L E Y T G I K S D G S G K A K E V L K G Y V L E G T L T A E K T T L V V K E G T V T L S K N I S K S G E V L V E L N D T D S S A A T K K T A A W N S G T S T  配列番号15
【００５４】
OspC(636bp)、Genbank受入番号 HM756744
atgaaaaagaatacattaagtgcaatattaatgactttatttttatttatatcttgtaataattcagggaaagatgggaatacatctgcaaattctgctgatgagtctgttaaagggcctaatcttacagaaataagtaaaaaaattacggattctaatgcggttttacttgctgtgaaagaggttgaagcgttgctgtcatctatagatgagcttgctaaagctattggtaaaaaaataaaaaacgatggtagtttagataatgaagcaaatcgcaacgagtcattgttagcaggagcttatacaatatcaaccttaataacacaaaaattaagtaaattaaacggatcagaaggtttaaaggaaaagattgccgcagctaagaaatgctctgaagagtttagtactaaactaaaagataatcatgcacagcttggtatacagggcgttactgatgaaaatgcaaaaaaagctattttaaaagcaaatgcagcgggtaaagataagggcgttgaagaacttgaaaagttgtccggatcattagaaagcttatcaaaagcagctaaagagatgcttgctaattcagttaaagagcttacaagccctgttgtggcagaaagtccaaaaaaaccttaa  配列番号16
【００５５】
S C N N S G K D G N T S A N S A D E S V K G P N L T E I S K K I T D S N A V L L A V K E V E A L L S S I D E L A K A I G K K I K N D G S L D N E A N R N E S L L A G A Y T I S T L I T Q K L S K L N G S E G L K E K I A A A K K C S E E F S T K L K D N H A Q L G I Q G V T D E N A K K A I L K A N A A G K D K G V E E L E K L S G S L E S L S K A A K E M L A N S V K E L T S P V V A E S P K K P  配列番号17
【００５６】
OspF(684bp)、Genbank受入番号 HM756745
atgaataaaaaaatgtttattatttgtgctgtttttgcgttgataatttcttgcaagaattatgcaactagtaaagatttagaaggggcagtgcaagatttagaaagttcagaacaaaatgtaaaaaaaacagaacaagagataaaaaaacaagttgaaggatttttagaaattctagagacgaaagatttgaataaattggatacaaaagagattgaaaaacgaattcaagaattaaaggaaaaaatagaaaaattagattctaaaaaaacttctattgaaacatattctgagtatgaagaaaaactaaaacaaataaaagaaaaattgaaaggaaaggcagatcttgaagataaattaaagggacttgaagatagcttaaaaaagaaaaaagaggaaagaaaaaaagctttagaagatgctaagaagaaatttgaagagtttaaaggacaagttggatccgcgactggagtaactaccgggcatagagctggaaatcaaggtagtattggggcacaagcttggcagtgtgctaatagtttggggttgggtgtaagttattctagtagtactggtactgatagcaatgaattggcaaacaaagttatagatgattcaattaaaaagattgatgaagagcttaaaaatactatagaaaataatggagaagtcaaaaaagaataa  配列番号18
【００５７】
E T K D L N K L D T K E I E K R I Q E L K E K I E K L D S K K T S I E T Y S E Y E E K L K Q I K E K L K G K A D L E D K L K G L E D S L K K K K E E R K K A L E D A K K K F E E F K G Q V G S A T G V T T G H R A G N Q G S I G A Q A W Q C A N S L G L G V S Y S S S T G T D S N E L A N K V I D D S I K K I D E E L K N T I E N N G E V K K E  配列番号19
【００５８】
発現クローニングのために、OspA(塩基1-666)、OspC(塩基52-636)およびOspF(上述のDNA配列の塩基178-684)は、まずBamHI(5’)およびKpnI(3’)制限酵素部位を有するプライマーを使用したPCRによって増幅された。前記遺伝子は、pQE-30 Xa発現ベクター(カリフォルニア州、バレンシア、Qiagen社)内でクローン化され、1mMのIPTGの導入後、 E.coli SG13009細胞(カリフォルニア州、バレンシア、Qiagen社)内でHisタグタンパク質として発現された。前記バクテリアは、100mMのリン酸ナトリウム、10mMのトリスおよび8Mの尿素を含む、pH8の緩衝液中で溶解された。溶解物は、40mMのイミダゾール緩衝液で1:5に希釈され、前記Hisタグタンパク質は、AKTA-FPLC機器を使用するHisTrapFFカラム(両方とも、ニュージャージー州、ピスカタウェイ、GE Healthcare社)を使用して精製された。タンパク質濃度は、BCA assay(イリノイ州、ロックフォード、Pierce社)によって測定された。
【００５９】
SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法 
SDS-PAGE、ウエスタンブロット法および免疫ブロット法(後者２つを本明細書中でWBと称する)は、記述されているように行われた(2005年、Wagner他)。手短に説明すれば、2〜4μg/レーンの組換えライム病菌タンパク質は、還元条件下で15%のmini-gels(米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ、BioRad Laboratories社)中で分離された。ゲルが、クーマシーブリリアントブルーで染色されるか、タンパク質が免疫ブロット法用の膜(PVDF：米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ、BioRad Laboratories社)に転写された。転写後、トリス緩衝液(0.1M Tris、pH 7.6、0.05%(v/v)Tween 20を含む)中の5%(w/v)ノンファット・ドライミルクを使用して、ブロッキングステップが実施された。前記膜は、その後、5%のノンファット・ドライミルクを含むトリス緩衝液で1:10に希釈されたイヌ血清とともにインキュベートされた。二次ペルオキシダーゼ結合ラビット抗-ドッグIgG(H＋L)抗体(ペンシルベニア州、ウエストグローブ、Jackson ImmunoResearch Lab社)が検出のために使用された。各抗体のインキュベーション後、膜はトリス緩衝液で三回洗浄され、抗体結合が、ECL化学発光法(米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ、Amersham Bioscience社)によって可視化された。さらに、マルチプレックス解析の検証のために使用された血清は全て、前述の通り、全細菌溶解物を使用した従来のライム病菌WB(1993年、Appel他)で試験された。
【００６０】
蛍光ビーズと組換えライム病菌抗原のカップリング
精製された組換えライム病菌タンパク質それぞれ計100μgが、蛍光ビーズ(Luminex社)にカップリング(結合)された。OspAはビーズ33に、OspCがビーズ34に、OspFはビーズ37にカップリングされた。前記カップリングは、前記ビーズ供給者であるルミネックス社(www.luminexcorp.com/uploads/data/Protein%20Protocols%20FAQs/Protein%20Coupling%20Protocol%200407%2010207.pdf参照)の推奨プロトコルに従って行われた。手短に説明すると、全手順は室温で行われた。全遠心分離ステップは、4分間14,000xgで行われた。その後、前記ビーズは20秒間、ボルテックスおよび超音波処理によって再懸濁された。活性化のために、5×106ビーズはH2O中で一度洗浄された。ビーズは、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.2)80μl中で再懸濁された。その後、10μlのSulfo-NHS(50 mg/ml)および10μ1の1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC、50 mg/ml、いずれもイリノイ州、ロックフォード、Pierce Biotechnology社より)が添加され、20分間インキュベートされた。前記ビーズは、50mMのpH5.0の2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)で二回洗浄され、MES溶液中に再懸濁された。これらの活性化ビーズは、組換えライム病菌抗原のカップリングのために使用された。前記カップリングは、回転しながら3時間行われた。カップリング後、前記ビーズはブロッキング緩衝液[1%(w/v)のBSAと0.05%(w/v)のアジ化ナトリウムを含むPBS]中で再懸濁され、30分間インキュベートされた。前記ビーズは、0.1%(w/v)のBSA、0.02%(v/v)のTween 20および0.05%(w/v)のアジ化ナトリウムを含むPBS(PBS-T)中で3回洗浄され、カウントされ、2〜8℃の暗所で保管された。
【００６１】
ルミネックス解析
OspA、OspCおよびOspFと結合したビーズは、それぞれ、超音波処理され、混合され、およびブロッキング緩衝液で1×105ビーズ/mlの最終濃度に希釈された。前記解析のために、マイクロタイター・ウェルあたり5×103ビーズ／各々が使用された。全イヌ血清サンプルはブロッキング緩衝液で1:600に希釈された。あらかじめテストされた、陰性、低陽性および高陽性のイヌ血清と、ブロッキング緩衝液のみでインキュベートされたビーズが、陽性および陰性コントロールとして各解析プレート上で用いられた。ミリポアマルチスクリーンHTSプレート(マサチューセッツ州、ダンバーズ、Millipore社)が、ELx50プレート・ウォッシャー(バーモント州、ウィヌースキ、Biotek Instruments社)を使用するPBS-Tに2分間浸漬された。前記溶液は、前記プレートから吸引され、50μlの各コントロール血清あるいはサンプルが前記プレートに塗布された。その後、50μlのビーズ溶液が各ウェルに添加され、室温にて振盪機上で30分間インキュベートされた。前記プレートはPBS-Tで洗浄され、ブロッキング緩衝液で1:5000に希釈された50μlのビオチン化ラビット抗-ドッグIgG(H＋L)(ペンシルベニア州、ウエストグローブ、Jackson ImmunoResearch Lab社)が各ウェルに添加され、上記のように30分間インキュベートされた。洗浄後、ブロッキング緩衝液で1:100に希釈された50μlのストレプトアビジン-フィコエリトリン(カリフォルニア州、カールズバッド、Invitrogen社)が添加された。プレートは上記のように30分間インキュベートされ、洗浄された。前記ビーズは100μlのブロッキング緩衝液中で再懸濁され、各プレートは、ビーズを再懸濁するために15分間振盪機上に置かれた。前記解析は、Luminex IS 100 instrument (Luminex社)で解析された。データは、蛍光強度中央値(MFI)として報告された。
【００６２】
血清サンプル
全てのイヌ血清サンプルが、コーネル大学の動物健康診断センター(Animal Health Diagnostic Center)に、ライム病菌に対する抗体の血清学的テストのために提出され、ライム病菌に対する抗体を検出するためにキネティックELISAでおよびWBによってテストされた。両方の解析は、ライム病菌の全細胞溶解物を使用しており、前述されている(1993年、Appel他；1996年、Jacobson他)。二セットのイヌ血清サンプルが、この研究のために使用された。
まず、ライム病菌に対する抗体のための利用可能なELISAおよびWB結果を有する79の血清サンプルが、各抗原に関するおよびシングルプレックスとマルチプレックス解析の結果の比較に関するビーズ-ベース解析のコンディションを確立するために使用された。これら79のサンプルは、ELISAとWBにより陰性の結果から高陽性の結果にわたる同様の数のサンプルを提供するために選択され、これらの結果によれば、ワクチン接種及び／又は自然感染した犬からの血清を含んだ。第二に、あらかじめテストされなかった計188のイヌ血清サンプルが、さらなるマルチプレックス解析の検証のために使用された。全サンプルは、WBによって、ライム病菌抗原に対する抗体について平行して分析された。ブロット上の31kDa (OspA)、22kDa (OspC)および29kDa (OspF)に対する血清抗体の存在(陽性)あるいは非存在(陰性)が、マルチプレックス解析結果を知らないオブザーバーによって盲検的に決定された。前記WB結果は、各抗原に対し「相対的ゴールド・スタンダード」を提供し、受信者動作曲線(ROC)分析のためにおよびマルチプレックス解析におけるライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の解釈範囲を決定するために使用された。
【００６３】
統計解析
シングルプレックスおよびマルチプレックス解析フォーマットによって得られた結果の比較のために、全サンプルの対応するMFI値が、スピアマンの順位相関を算出することによって各ライム病菌抗原について比較された。マンホイットニー検定が、WBによってテストされた際それぞれの抗原に対し陰性あるいは陽性のいずれかであったサンプルに対するマルチプレックス解析のMFI値の違いを比較するために実施された。マンホイットニー検定は、ガウス近似、両側、95%信頼区間および有意性カットオフとしてp＜0.05を使用して実行された。マルチプレックス解析フォーマットにおける各ビーズ解析の感度(敏感度)および特異度を判定するために、各血清サンプルのWB結果(陽性/陰性)および「相対的ゴールド・スタンダード」としての対応するタンパク質を使用して、マルチプレックス解析の使用によりそのサンプルおよび組換え抗原について得られたMFI値と比べることによって、ROC曲線が作成された。解釈範囲と、マルチプレックス解析における診断の感度(sensitivity)および特異度(specificity)を規定するために、尤度比解析が行われた。ROC曲線および尤度解析は、各抗原に対し別々に行われた。スピアマンの順位相関およびマンホイットニー検定は、GraphPad Prism program, version 5.01を使用して行われた。ROC曲線は、MedCalc program, version 11.2.0.0;2010F.(Schoonjans, Mariakerke, Belgium)を使用して作成された。尤度解析は、Statistix 9.0, 2008 (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA)を使用して行われた。
【００６４】
結果
ライム病菌抗原の発現
ライム病菌OspA、OspCおよびOspFタンパク質の細胞外部分が、E. coliで発現され(図１)、それぞれ333、194および169のアミノ酸サイズであった。結果として生じたrOspAタンパク質は、30 kDaの計算分子量を有していた。30kDaでの対応する主タンパク質に加えて、22と42kDaの２つのより弱いタンパク質が、精製後に観察され、これはrOspAのアフィニティー精製の間に他のタンパク質が微量に混入したことを示唆する。計算分子量は、rOspCが17.5kDa、rOspFが15.2kDaであった。SDS-PAGEによって見つけられたタンパク質は、rOspCが29kDa、rOspFが27kDaであり、両方のタンパク質の二量体形成を示唆する。
【００６５】
蛍光ビーズ-ベース解析の開発
組換えライム病菌 OspA、OspCおよびOspFタンパク質が蛍光ビーズにカップリングされた。プレテストされたイヌの血清サンプル(ライム病菌に対する抗体のための既知のWBテスト結果を有する)が、各ビーズ-ベース解析のコンディションを確立するために使用された。陽性と陰性コントロールが同定され、各解析プレートに含まれた(表３)。計79の血清は、その後個々の抗原を有するシングルプレックス解析と３つ全ての抗原を同時に使用するマルチプレックス解析で測定された(図２)。シングルプレックスとマルチプレックス解析の間のスピアマン順位相関は、0.93 (OspA)、0.88 (OspC)および0.96 (OspF)であった。マルチプレックス解析の平均バックグラウンド値は、血清無しの40ランで決定され、OspAとOspCの解析について10 MFI未満、OspFについて80 MFIであった。
【００６６】
【表６】
2013539032.tif 000008
【００６７】
OspA、OspCおよびOspFのWBおよびマルチプレックス解析結果の比較
188のイヌ血清から得られたWBおよびマルチプレックス解析結果が各タンパク質のために比較された。図３は、感染(レーン2)、ワクチン接種(レーン3)および非感染/非ワクチン接種(レーン4)の犬血清から得られた従来法のWB結果を示す。OspAのマルチプレックスの結果が、WBの31kDaタンパク質の発生と比較され、OspCが22kDaタンパク質と、OspFが29kDaタンパク質と比較された。WB結果は、３つの抗原それぞれについて別々に陰性または陽性として分類された(図４)。WBによって、188の血清のうち、107が31kDa OspA抗原を検出し、39が22kDa OspCを検出し、82が29kDa OspFタンパク質を確認した。有意に高い(p＜0.0001)MFI値が、陰性WB結果のものと比べてWB陽性血清を使用した３つ全てのライム病菌タンパク質のマルチプレックス解析において得られた。さらに、ライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原のためのROC曲線が、「相対的ゴールド・スタンダード」として188の血清のWB結果を使用して作成された(図５)。前記ROC曲線は、OspA、OspCおよびOspFについてマルチプレックス解析とWB結果の間の高い一致を示した。
【００６８】
マルチプレックス解析結果の解釈
マルチプレックス解析におけるライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原の解釈範囲を決定するために、尤度解析が実施された。前記解析は、血清学的解析は大抵、ゴールド・スタンダードと比較した際、いくらの偽陽性および偽陰性の結果をもたらすということを考慮した(1996年、Jacobson他)。これは、高い非特異的結合を示すある種の血清の性質によって、準最適なゴールド・スタンダードによって、あるいは比較される解析の分析感度の違いによって、引き起こされる可能性がある。このようにして、陰性、曖昧および陽性の解釈範囲が各抗原について決定された。表５は、解釈範囲、陽性テストの尤度比(LR＋)およびイヌ血清におけるライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原のそれぞれに対する抗体のマルチプレックス解析の診断感度と特異度を示す。マルチプレックスフォーマットにおけるOspA、OspCおよびOspF解析の診断特異度は、それぞれ90%、89%および86%であった。診断感度は、83% (OspA)、62% (OspC)および82% (OspF)であった。
【００６９】
【表７】
2013539032.tif 000009
【００７０】
前述したことから明らかなように、本実施例において、我々はライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原に対する血清抗体を同時に検出するため、新しいマルチプレックス解析の開発と検証を実証する。前記マルチプレックス解析は、ELISAとWBの現在のテスト手順を一つのテストにまとめ、且つ、ワクチン接種または感染のためのマーカーとして個々のライム病菌抗原を区別する。ELISAとその後に続くWBは、今なお、ライム病菌に対する抗体を検出するためのゴールド・スタンダードであると考えられている。ライム病菌の全細胞溶解物について行われるELISAは、高い診断感度を有するが、かなり低い診断特異度を有していた(1996年、Jacobson他)。全細胞溶解物を使用する偽陽性のELISA結果は、血清抗体と、他のバクテリアの対応するタンパク質と高い相同性を共有するスピロヘータタンパク質(例えば、ライム病菌の鞭毛タンパク質)との反応によって引き起こされた(1990年、Lindenmayer他；1993年、Shin他)。本願で開発されたマルチプレックス解析が、ライム病菌の新規の組換えタンパク質を使用したことは、新しい解析における交差反応の可能性を減少させた。
【００７１】
ここで、我々は、特異的ライム病菌抗原に対するWB結果と、対応するOspA、OspCおよびOspF抗原に対するマルチプレックス結果を比較した。前記ROC曲線解析は、２つのテストの間の非常に良好な関連性を示した。しかしながら、WBとマルチプレックス解析の間の不一致が観察された。この不一致について考えられる説明として、WBは一般的に、特異的なバンドが存在するか否かの観察者の主観的な解釈に依存するということが挙げられる。WBの解釈は、ブロット展開における日差変動によっても影響され得る。WBの分析感度(低μg/ml範囲)は、ELISAのそれ(低ng/ml範囲)より低く、マルチプレックス解析の分析感度(低pg/ml範囲)よりはるかに低い。したがって、低濃度のライム病菌に対する抗体を含む様々な血清は、WBによって検出されなかったが、マルチプレックス解析によって識別されたと考えられる。
【００７２】
WBと比較したマルチプレックス解析の分析感度の増加に加えて、ブロット上のいくつかのバンドも誤解釈される可能性がある。例えば、ライム病菌は、WB上で22kDa付近に現れる２つのタンパク質である、OspCと22kDaのさらなるタンパク質を発現する(2001年、Magnarelli他)。一般に、ライム病菌の粗製調製物がWBのために使用されるため、OspCに対する抗体の分析は、サンプル中の22kDaタンパク質に対する抗体の存在によって複雑になり得る。結果的に、WBによって同定される22kDaのバンドは、OspCに対する抗体と常に対応しているわけではない可能性がある。これは、我々がビーズ-ベースOspC解析とWB結果の間で観察した低い一致を説明できる。したがって、OspCマルチプレックス解析の真の診断特異度と感度は、WBによって検出される22kDaのタンパク質との比較によって計算されるものより高いと思われる。全体的に見て、我々は、WBはライム病菌に対する抗体を検出する他の解析を検証するための「相対的ゴールド・スタンダード」であり得るだけであると結論を出した。
【００７３】
188のイヌ血清サンプルからなるセットを使用して、我々は、OspC (n=39)およびOspF (n=82)に関するWB陽性サンプルの総数について、高い相違を観察した。これは、ライム病菌抗原の差次的発現および結果として生じる上述のホスト抗体応答に一致している。前記サンプルは、診断分野の提出に由来するものであり、したがって、これらの犬の感染及び／又はワクチン接種の時期は知られていなかった。我々は、前記血清サンプルに応じて、OspCもしくはOspFのいずれか又は両方に対する抗体がマルチプレックス解析によって検出できることを観察し、このことは、これらの細胞表層タンパク質検出パターンがライム病菌による感染の異なる段階の指標となることを示唆する。このように、OspCとOspF抗原に対する異なった抗体パターンは、前記犬においてライム病菌への暴露が生じた時期の指標となる。このような改良された感染段階の判定は、治療法の決定および治療成功の予測に役立つと思われる。
【００７４】
このように、ライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の検出のために本実施例において記述されたマルチプレックス解析は、ライム病菌への感染及び／又はワクチン接種の結果生じた抗体の指標となるイヌ血清中の抗体を測定するための、定量的、経済的および鋭敏な代替手段を提供する。
【実施例２】
【００７５】
本実施例は、ウマにおいてライム病の状態を判定するための高い有用性を実証する方法の一実施形態に関する説明を提供する。馬のためのマルチプレックス解析は、実施例１のイヌのライム解析について前述したように、ワクチン接種及び／又は初期もしくは慢性の感染のマーカーとして、OspA、OspCおよびOspFを使用する。一般に、マルチプレックス解析は、生体サンプルにおける可溶性分析物の同時検出の原理を使用する(2004年、Morgan他；2005年、 Prabhakar他)。それらは、前記解析のマトリクスを提供する個々の抗原と結合した蛍光ビーズをベースとする。ELISAはng/ml濃度、WBはμg/ml濃度を検出するのに対し、マルチプレックス解析は、典型的にはpg/ml範囲の抗体を検出する(2003年、KellarおよびDouglas；2004年、Morgan他；2009年、WagnerおよびFreer)。このように、馬のための新しいライム・マルチプレックス解析は、ライム病菌による感染あるいはライム病菌に対するワクチン接種に関する特異的マーカータンパク質に基づいており、また、抗体の濃度が低い状況(感染初期あるいは神経学的兆候を有する馬の脳脊髄液サンプル中など)において有利であると思われる。
【００７６】
以下の材料および方法が、本実施例に示す結果を得るために使用された。
【００７７】
組換えライム病菌タンパク質および蛍光ビーズへのカップリング
ライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原は、E.coli中で発現され、実施例１で説明したように、蛍光ビーズにカップリング(結合)された。OspAはビーズ33に、OspCはビーズ34に、OspFはビーズ37にカップリングされた。前記カップリングは、ビーズ提供者の推奨プロトコルに従って実施された。
【００７８】
マルチプレックス解析
マルチプレックス解析は、以下の変更を伴い、実施例１のイヌ血清サンプルについて前述した通りに行われた：ウマ血清サンプルは、1:400に希釈された。血清抗体の検出のために、ビオチン化ヤギ抗-ウマIgH(H+L)抗体(ペンシルベニア州、ウエストグローブ、Jackson Immunoresearch Laboratories社)が1:3000の希釈にて使用された。全ての他の試薬、緩衝液およびインキュベーション工程は、先に述べた手順と同一である。当該解析は、Luminex IS 100 instrument (Luminex社)で分析された。データは蛍光強度中央値(MFI)として報告された。
【００７９】
馬の血清
全てのウマ血清サンプルは、コーネル大学の動物健康診断センターに、血清学的なライムテストのために提出され、ライム病菌に対する抗体を検出するためにキネティックELISAそしてそれに続くWBによってテストされた。両方の解析は、ライム病菌の全細胞溶解物を使用し、前述したように行われた(2000年、Chang他)。二セットのウマ血清サンプルがこのアプローチのために分析された：
まず、ライム病菌に対する抗体のための利用可能なELISAおよびWB結果を有する81のウマ血清サンプルが、各抗原のためのおよびシングルプレックスとマルチプレックス解析を比較するための、ビーズ-ベース解析のコンディションを確立するために使用された。これら81のサンプルは、ELISAとWBによって同定される陰性から高陽性の解釈範囲内の同様の数のサンプルを提供するために選択され、ワクチン接種及び／又は自然感染した馬の血清を含んだ。第二に、前もってテストされなかった計562のウマ血清サンプルが、さらなるマルチプレックス解析の検証のために評価された。これらのサンプルは、2008年７月と2009年６月の間にコーネル大学の動物健康診断センターに提出された。全てのサンプルは、ライム病菌抗原に対する抗体についてもWBによって分析された。ブロット上の31kDa (OspA)、22kDa (OspC)および29kDa (OspF)に対する血清抗体の存在(陽性)あるいは非存在(陰性)が、マルチプレックス解析結果を知らないオブザーバーによって盲検的に判定された(図６)。
【００８０】
統計解析
第一セットの血清サンプル(n=81)から得られたMFI値が、シングルプレックスとマルチプレックス解析フォーマットによって分析され、スピアマンの順位相関を算出することによって各ライム病菌抗原について比較された。マンホイットニー検定が、WBによってテストされた際それぞれの抗原に対し陰性あるいは陽性のいずれかであったサンプルに関するマルチプレックス解析のMFI値における違いを比較するために実施された。マンホイットニー検定は、ガウス近似、両側、95%信頼区間および有意性カットオフとしてp＜0.05を使用して実行された。スピアマンの順位相関およびマンホイットニー検定は、GraphPad Prism program, version 5.01を使用して行われた。
【００８１】
第二の血清サンプルセット(n＝562)のために、前記WB結果が、受信者動作特性(ROC)曲線解析における「相対的ゴールド・スタンダード」(陽性／陰性)として使用され、マルチプレックスMFI値と比較された。この解析は、WBが本当に真のゴールド・スタンダード(すなわち、100%の診断感度と特異度)であると想定した。尤度比解析は、ライム病菌 OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の解釈範囲およびマルチプレックス解析の診断感度と特異度を規定するために行われた。ROC曲線と尤度解析は、各抗原について別々に行われた。ROC曲線は、MedCalc program, version 11.2.0.0 2010(MedCalc Software, Broekstraat 52, 9030 Mariakerke)を使用して作成された。尤度解析は、Statistix 9.0, 2008 (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA)を使用して行われた。
【００８２】
第二の血清サンプルセットは、真のゴールド・スタンダードが利用できない場合に分析性能の解析のために使用できるベイズ統計アプローチのためにも使用された(2007年、Wang他)。その乏しい分析感度および特異的なバンドが存在するか否かの分析におけるその主観的な構成要素のため、ライム抗体検査において、WBは「相対的ゴールド・スタンダード」として考慮されることができるのみである(2011年、Wagner他)。前記データは、新しいライム・マルチプレックス解析およびWBの両方のテストに対する診断特異度、感度および陽性カットオフ値を特定するためにベイズモデルを使用して分析された。
【００８３】
ベイズ的アプローチは、異なる有病率の疾患指標を有する２つのグループを必要とした。さもないとパラメーターを推定するために使用されたベイズモデルは同定不可能になる(2006年、Wang他；2007年、Wang他)。したがって、血清サンプルは、人為的に２つのグループに分けられた。2008年７月と１２月の間に収集された全サンプル(n＝408)は、グループ１に割り当てられ、2009年１月と６月の間に収集された全サンプル(n＝156)は、グループ２とされた。この分類は、ライム病の指標としてのライム病菌に対する抗体の保有率が、年の最初の６か月の期間より７月から１２月により高いという前提に基づいた。前記解析は、この前提が、OspCとOspFに対する抗体について真実であることを示したため、前記解析が行われた。OspAについては、前記２グループ間の保有率は同様に低く、ベイズ的アプローチはOspA解析のために使用できなかった。
【００８４】
結果
ライム病菌に対する抗体を検出するためのウマのマルチプレックス解析の開発
ライム病菌に対する抗体を含むあるいは含まない計81のプレテストされたウマ血清が、蛍光ビーズ-ベース解析のコンディションを確立するために使用された。ビーズは、ライム病菌の組換えOspA、OspCあるいはOspF抗原と結合された。これらの抗原に対する血清抗体の測定値は、個々のビーズについての解析(シングルプレックス)を行うことによっておよびマルチプレックス解析によっても比較された(図７)。ライム病菌に対する抗体のマルチプレックスおよびシングルプレックス解析結果は、高度に相関した。個々の抗原比較用のスピアマンランク値は、OspA、OspCおよびOspFについて、それぞれ0.77、0.83および0.96であった。マルチプレックス解析のためのバックグラウンド値は、OspAとOspCについて10MFI未満であり、OspFについて100MFI未満であった(表６)。前記81の血清サンプルは、OspAについて347〜21650、OspCについて75〜3842、およびOspFについて192〜23209の間のMFI値をもたらし、ライム・マルチプレックス解析の広いダイナミックレンジが確認された。
【００８５】
【表８】
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【００８６】
ウマのライム・マルチプレックス解析の検証
OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のマルチプレックス解析の検証が、計562の馬の血清に対する、マルチプレックスの結果と、WBによって得られた対応する結果を比較することによって行われた。WBによって、OspCとOspFに対する抗体が、ダニ咬傷後ライム病菌に感染した馬において検出できる。OspAに対する抗体は、ライム病に対するワクチン接種後に発生すると考えられる(図６)。マルチプレックス解析によって得られたMFI値は、WB陰性および陽性の血清サンプルと比較された。これは、個々の抗体それぞれについて、WB陰性サンプルよりもWB陽性サンプルにおいて明確に高いMFI値を示した(図８)。全MFI値におけるこれらの明確な差にもかかわらず、前記解析は、WB陰性および陽性サンプルのMFI値間の重複も示し(表６)、これは様々な統計アプローチによるマルチプレックス解析のカットオフ値のさらなる評価を要求した。
【００８７】
「相対的ゴールド・スタンダード」としてWBを使用する解析
WBは、その相対的に乏しい分析感度およびWB評価に含まれる主観的な構成要素のため、「相対的ゴールド・スタンダード」として考慮されることができるのみである。それにもかかわらず、ROC曲線が、個々のOspA、OspCあるいはOspF解析に対するマルチプレックス解析結果を、WB上の対応するバンドの存在または非存在と比較することによって作成された。ROC曲線下のエリアは、OspAで0.765、OspCで0.773およびOspFで0.738であった。WB陰性およびWB陽性サンプルの量複するMFI値のために(図８)、我々は各ビーズ-ベース解析について、３つの解釈範囲(陰性、曖昧、陽性)を確立するために尤度比解析も実施した。診断感度と特異度の値は、尤度解析の陽性カットオフ値に基づいても計算された(表７)。
【００８８】
【表９】
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【００８９】
ベイズモデルを使用する真のゴールド・スタンダードが無い場合の解析の妥当性
WBは、複数の解釈の間違いをもたらす可能性も非常に高いということを考慮し、我々は、比較される両方のテストについて診断感度と特異度を推定するベイズ的アプローチを使用してもう一つの解析を行った。前記解析は、異なる罹患率を有する二つの実験群を必要とした。前記データは、１年の間に提出されたサンプルから得られ、それらは人為的に７月〜１２月の間に提出された血清(グループ１)および１月〜６月の間に提出されたサンプル(グループ２)に分類された(グループ１のライム病罹患率がより高いと想定される)。前記解析は、グループ１で、ライム病菌に対する抗体の保有率が、２つの感染マーカーOspCとOspFについてはより高いが、ワクチン接種マーカーOspAについてはそうではないことを確認した。したがって、前記モデルは、OspCとOspFに対する抗体のための結果について実行されることができただけであり、２つの独立したテストとしてビーズ-ベース解析とWBを比較した(それらのいずれもゴールド・スタンダードでは無い)(表８)。OspCに対する抗体について、ビーズ-ベース解析は80%の診断感度と79%の診断特異度をもたらした。OspC WBは、わずか72%の感度と92%の特異度を有した。OspFに対する抗体については、ビーズ-ベース解析の感度は86%であり、特異度は69%であった。OspF WBは、80%の感度と77%の特異度を有した。前記ベイズ解析は、より多数の偽陰性が、マルチプレックス解析よりもWBによって得られることを示した。WBのより高い特異度の値は、このテストによって検出された偽陽性の数の低さを示していた。OspCとOspFのビーズ-ベース解析のためのカットオフ値は、それぞれ、813と1270 MFIであり、これは尤度解析によって規定される曖昧(OspC)あるいは非常に低い陽性(OspF)解釈範囲に該当する(表７および８)。
【００９０】
【表１０】
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【００９１】
前述したことから明らかなように、本実施例において、我々は、ライム病の指標となる抗体を検出するための新しいマルチプレックス解析を開発するために、E.coliによって発現されたライム病菌のOspA、OspCおよびOspF抗原を使用した。新マルチプレックス解析の検証における大きな課題は、カットオフ値、解釈範囲、および診断の感度と特異度の値を確立するための真のゴールド・スタンダードが存在しないことであった。ライム病菌に対する抗体の検出について、WBは、確認テストおよび、血清学的ライム病診断のための最も優れた利用可能なスタンダードと考えられる。テスト検証のためのゴールド・スタンダードとしてWBを使用することは、この方法についての100%の診断感度と特異度を前提とする。この事実に基づけば、新しいテストが、従来のゴールド・スタンダード法を使用する既存のテストより優れていることはありえない。しかしながら、WBは定性的なテストであり、分析感度、ブロット展開における日差変動、および、経験豊かな評価者によってさえバンドの誤解をもたらし得るその主観的な評価に関し、限界を有する(実施例１参照)。WB結果の解釈は、非常に高い抗体価を有するサンプルについては、あるいは、実験的に感染させた隔離されたウマでは単純であるが、感染歴が不明な臨床的状況では及び／又はライム病菌に対する抗体レベルの低い血清については、より困難である。WBとマルチプレックス・テクノロジー間の分析感度の予想される違いとともに、WB評価のこれらの特徴は、新ライム・マルチプレックス解析を検証するための異なる統計アプローチを我々に探索させた。従来のROC曲線と尤度比解析は、WBが真のゴールド・スタンダード、すなわち100%正確であるという前提の下で行われた。ベイズモデル・アプローチは、ゴールド・スタンダード不在の中で診断解析を分析でき（2006年、Wang他；2007年、Wang他）且つWBとマルチプレックス解析を同等のテストとして比較できる。それゆえ、前記分析は、両方の解析に対し診断の感度と特異度のデータをもたらした。２つのテストがそれらの分析感度の点で明らかに広範囲において異なるので、これら全ての前提は必ずしも正しくないかもしれないが、ベイズ解析は、WBが真のゴールド・スタンダードではない、すなわち100%正確ではないということを考慮することによって、より正確に新マルチプレックス解析の診断感度と特異度を推定することを可能にした。その結果として、前記ライム・マルチプレックス解析の診断感度および特異度の値は、「相対的ゴールド・スタンダード」アプローチよりも、前記ベイズ法においてより高かった。従来のゴールド・スタンダード分析は、OspCおよびOspFビーズ-ベース解析の感度として56%と72%、特異度として86%と67%の値をそれぞれ示した。上記のWBに関する議論に基づいて、これらの値は前記マルチプレックス解析の真の特異度および感度を過小評価した可能性がある。前記ベイズモデルは、WBに関する後者の記載を確認し、OspCおよびOspFビーズ-ベース解析と比較べてWBのより低い診断感度とより高い診断特異度を算出した。前記ベイズ解析は、マルチプレックス解析においてOspCについて80%、OspFについて86%の診断感度をもたらした(WBでは、それぞれ72%と80%)。前記マルチプレックス解析の診断感度の値は、従来のゴールド・スタンダードアプローチと比べて明らかに改善され、且つ、WB(μg/ml)と比べたマルチプレックス解析(pg/ml)による抗体検出の改善した分析感度のため、実際の診断感度の値をより反映する。ベイズ解析を使用するマルチプレックス解析の診断特異度は、OspCについて79%(WB 92%)、OspFについて69%(WB 77%)であったが、これは計算に基づくゴールド・スタンダードと比べてOspFについて改善され、OspCについてはわずかに低い。OspC解析の特異度の値が違う理由は、ベイズ的アプローチの計算におけるOspCに対するより低いカットオフ値 (ゴールド・スタンダード解析に対するより)を適用する２つの統計的手法によるOspCのカットオフ値がより大きく違うためである。
【００９２】
ゴールド・スタンダードおよびベイズ解析は、OspCおよびOspFに対する抗体のカットオフ値を確立するためにも使用された。OspCに関し、尤度比解析は、＞1000 MFIの陽性カットオフ値を示し、ベイズ的アプローチは、813 MFIといったさらに低いカットオフ値さえ確認した。OspFに関し、尤度解析は、ベイズ的アプローチでの1270 MFIカットオフとほぼ同一の最適陽性カットオフとして＞1250 MFIを見出した。我々のサンプルセットに関し、OspCについて約10.000およびOspFについて＞25.000のMFI値をもたらしたマルチプレックス解析の広いダイナミックレンジを考慮すると、示されたカットオフ値はウマ血清におけるライム病菌に対する抗体の詳細な定量分析を可能にするこのテストの広いダイナミックレンジを裏付けた。広い動的定量範囲は、かなり狭い線形の定量範囲を有するELISA等の現存する定量テストに比べて、前記マルチプレックスアプローチの重要な利点である(2009年、WagnerおよびFreer)。我々の経験では、増加した線形のダイナミックレンジの最も重要な利点は、血清が、マルチプレックス解析において単一の希釈で使用でき、および結果がほとんどの場合、前記解析の線形の定量範囲に属することである(前記解析の上部プラトーに分類されるごくわずかな結果は除く。すなわち、これらの血清はそれぞれのライム病菌Osp抗原に対する非常に高濃度の抗体を含む)。
【００９３】
現在の従来型ライムELISAは、ほぼ全ライム病菌溶解物に基づいており、感染とワクチン接種とを区別しない。これらの解析は、溶解混合物中の共通の細菌成分に対する非特異的交差反応性のリスクを負った(1990年、Lindenmayer他；1993年、Shin他；1996年、Jacobson他)。したがって陽性の場合、これらの解析は、定性的WB等の第二の確認テストを必要とする。抗体の定量が要求される状況(例えば、ライム病の馬における抗生物質による治療の成功を判定するため)では、テストは通常２つのテスト；第一に、抗体の減少を確認するための定量的ELISA、および、第二に、その現象がライム病の指標となる抗体に特異的であることを確認するためのWBテストを要求する。他のオンサイド(stick-based tests)またはELISAに基づくテスト(C6に対する抗体の定量等)は、ライム病原体を有する馬の感染とよく相関することが発見された(2008年、Johnson他；2010年、 Hansen他；2010年、Maurizi他)。しかしながら、C6に対する抗体が早期に検出される、または、従来のライム病菌ELISAによって検出される抗体と比べてより急速に低下するようには見えなかった(2008年、Johnson他)。
【００９４】
WBと新マルチプレックス・ライム解析の両方が、ライム病菌による自然感染から生じた抗体と、ワクチン接種後に発生した抗体とを区別できる。後者の応答は、ヒト、実験齧歯動物、イヌ(1990年、Fikrig等；1990年、Schaible他；1996年、Jacobson等；1996年、Wittenbrink等；2000年、Wieneke他；2007年、ToepferおよびStraubinger)についておよび馬(2000年、Chang他)についても頻繁に記述されているように、ライム病菌のOspA抗原に対する抗体の高い値を特徴とする。馬に使用するための認可されたライムワクチンは現在存在していない。それゆえ、イヌ用のワクチンが時々、ライム病が風土病の地域において小屋で飼われている馬のために使用されている(2009年、Divers)。認可ワクチンが存在しないことは、我々のサンプルセットにおけるOspA陽性のウマ血清が全体的に低い数(562中43)であることを説明する。２つのグループ間でOspAに対する抗体の保有率が同様であったため、ベイズモデルは、OspAに対する抗体のためのこのデータセットについて実行できなかった。ワクチン接種がいつでも実施でき、環境中の感染ダニの発生に依存するライム病菌感染のように必ずしも季節的なピークに追随しないので、これは当然のことである。風土病地域の小屋で飼われたワクチン接種済みの馬に対し、ワクチン接種力価の定量的な評価は、これらの馬についてライム病を防止するためにワクチンを再接種するか否かの決定を方向付けることができる重要な情報である。新マルチプレックス解析は、ワクチン接種マーカーOspAに対する抗体反応を定量化する初めての利用可能なテストであり、ワクチン接種に対する宿主応答と感染に対する宿主応答を区別することもできる。ワクチン応答は、使用したワクチンによって、OspAのみに対する、あるいはOspAとOspCに対する抗体によって特徴づけられることができる。OspFは、現在利用できるワクチンには含まれておらず、それゆえ、たとえその馬がワクチン接種を受けていたとしても感染用マーカーのままである。
【００９５】
要約すれば、ウマのための新ライム・マルチプレックス解析を検証するための２つの統計アプローチの使用は、感染マーカーOspCおよびOspFに対して、よく似たカットオフおよび診断感度と特異度の値をもたらした。前記分析は、WBの最初の診断感度と特異度の評価、ライム病菌に対する抗体分析用の伝統的なゴールド・スタンダードももたらした。マルチプレックス解析の総合的性能は、それがWBに比べて、期待できる向上した分析および診断に関する感度を有する有益なテストであることを示した。馬のための新ライム・マルチプレックス解析は、ウマにおけるライム病感染及び／又はライム病に対するワクチン接種の指標となる抗体を検出するための、有益で、素早く、鋭敏でかつ定量的なツールを提供する。
【００９６】
本発明は、実例となる実施例を通して説明されてきたが、当業者に明らかな通常の変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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