(57)【要約】  人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質としてのジントニンを製造する方法、前記方法で人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質ジントニン、及び前記新規な糖脂質タンパク質ジントニンの用途を提供する。  本発明の新規な糖リポタンパク質ジントニンは、一時的に細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発し、細胞内カルシウム濃度の一時的な増加によりアフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus  oocytes)で内因性に存在するカルシウム依存性塩素イオンチャネル（ＣａＣＣ）を活性化して細胞内カルシウム濃度を増加させるので、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療に有用に使用できるうえ、強壮作用、免疫力増加、性機能強化、神経系保護及び活性、血管新生、抗糖尿作用などの細胞内カルシウム依存性の様々な生理活性などにおいても優れた効果を示す。
2013502409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）人参からメタノール抽出物を製造する段階と、
（２）前記メタノール抽出物を水とｎ−ブタノールの混合溶媒で分画する段階と、
（３）前記水分画物とｎ−ブタノール分画物のうち、ｎ−ブタノール分画物に対して、溶出溶媒としてクロロメタン：メタノール：水の混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、８個の分画に分離する段階と、
（４）前記８個の分画物のうち、ＣａＣＣ(Ca2+activated  Chloride  Channel)に対する活性が最も高い第７の分画物に対して、溶出溶媒としてエタノール：酢酸エチル：水の混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、２つの分画に分離する段階と、
（５）前記２つの分画物のうち、ＣａＣＣ活性が高い分画物IIを透析して最終生成物を得る段階とを含んでなる、新規な糖リポタンパク質ジントニンの製造方法。
【請求項２】
前記（５）段階の後、
（６）最終分画物をＮａＣｌが含有されたｐＨ７．２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを行い、２つの分画に分離する段階と、
（７）前記２つの分画物に対して、それぞれ、ＮａＣｌが含有されたｐＨ８．２のＴｒｉｓ−ＨＣｌとＮａＣｌが含有されたｐＨ７．２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、個別糖リポタンパク質を分離する段階とをさらに含む、請求項１に記載の個別ジントニンＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の製造方法。
【請求項３】
前記人参は紅参、水参、白参、栽培参、長脳参及び山参よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の新規な糖リポタンパク質ジントニンの製造方法。
【請求項４】
請求項２の方法で製造され、分子量６７ｋＤａ及び見掛け分子量１３ｋＤａの五量体であることを特徴とする、人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質ジントニンＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３。
【請求項５】
前記糖リポタンパク質は、アミノ酸組成成分として、システインとシスチン(cysteine  and  cystine)、アスパラギンとアスパラギン酸(asparagine  and  aspartic  acid)、グルタミンとグルタミン酸(glutamine  and  glutamic  acid)、セリン(serine)、グリシン(glycine)、アルギニン(arginine)、トレオニン(threonine)、アラニン(alanine)、プロリン(proline)、バリン(valine)、イソロイシン(isoleucine)、ロイシン(leucine)、フェニルアラニン(phenylalanine)、トリプトファン(tryptophan)及びリシン(lysine)を含むことを特徴とする、請求項４に記載の人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質ジントニン。
【請求項６】
前記糖リポタンパク質は、炭水化物組成成分として、ラムノース(rhamnose)、アラビノース(arabinose)、グルコース(glucose)、マンノース(mannose)、キシロース(xylose)及びグルコサミン(glucosamine)を含むことを特徴とする、請求項４に記載の人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質ジントニン。
【請求項７】
前記糖リポタンパク質は、脂質組成成分として、リノール酸(linoleic  acid)、パルミチン酸(palmitic  acid)、オレイン酸(oleic  acid)及びステアリン酸(stearic  acid)を含むことを特徴とする、請求項４に記載の人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質。
【請求項８】
請求項４の糖リポタンパク質を有効成分として含む、精神分裂(Schizophrenia)、アルツハイマー病(Alzheimer’s  disease)、ハンチントン病(Huntington’s  disease)、家族性片麻痺性片頭痛(Familial  hemiplegic  migraine)、癲癇(epilepsy)、一過性運動失調症(episodic  ataxia)、脊髄小脳失調症(spinocerebellar  ataxias)及びカルシウム不足による成長阻害の中から選ばれる、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療のための薬学組成物。
【請求項９】
請求項４の糖リポタンパク質及び食品学的に許容される食品補助添加剤を含む、健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人参に存在する新規な糖リポタンパク質(glycolipoprotein)に係り、さらに詳しくは、人参から分離同定して新規な糖リポタンパク質を製造する方法、前記方法で人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質、および前記新規な糖リポタンパク質の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
人参は、一般に、適応促進薬(adaptogen)又は生命延長のための強壮剤として用いられており、ストレス、疲労、疾病、癌及び糖尿病に対抗して生体機能を向上させる。このような人参は、韓国だけでなく、中国及び日本でも数百年前から使われてきた。最近、人参は世界で薬草として最も有名なものの一つである（非特許文献１）。
【０００３】
ジンセノサイド(Ginsenoside)は、１９６０年代初めに分離されて特性化されたから、生理学的、薬理学的研究で代表的な成分として多用されるものである（非特許文献２、非特許文献３）。この他にも、最近の研究では、人参にはよく知られていない他の成分、例えば多糖類(polysaccharides)、ポリアセチレン類(polyaccetylenes)、タンパク質(protein)などが含有されていることが明らかになった（非特許文献４）。
【０００４】
人参のジンセノサイド成分は、量が少なく、分離過程が複雑であり、純粋なジンセノサイドの場合には価格が高いため、人参の根からブタノール抽出方法で得た粗総サポニン分画（crude ginseng  total  saponin  fraction、ＣＧＳＦ）を使用してきた（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３及び非特許文献１４）。
【０００５】
粗総サポニン分画（ＣＧＳＦ）は細胞膜シグナル経路(signal  pathway)を介してその活性が現れるものと知られているが、例えば、Ｃｈｏｉ等は、アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus  oocytes)に粗総サポニン分画を処理したとき、ＰＬＣβ−ＩＰ３に連結されているＰＴＸ−ｉｎｓｅｎｔｉｖｅ  Ｇαｑ／11タンパク質を介してカルシウム依存性塩素イオンチャネル（Ca2+activated  Chloride  Channel、ＣａＣＣ）が活性化されることを解明した（非特許文献７）。また、Ｌｅｅ等は、アフリカツメガエル卵母細胞に粗総サポニン分画を持続的に処理したとき、粗総サポニン分画によって活性化されたカルシウム依存性塩素イオンチャネル電流(CaCC  currents)が自発的に減少することを報告した（非特許文献９）。
【０００６】
カルモジュリン(Calmodulin)をアフリカツメガエル卵母細胞に直接注入したとき、或いは細胞内のカルシウム貯蔵庫を枯渇させたときに、粗総サポニン分画によるカルシウム依存性塩素イオンチャネルの活性がなくなる（非特許文献１２）。しかも、アフリカツメガエル卵母細胞に粗総サポニンを処理したときにＳＯＣＥ(stored-operated  Ca2+  entry)が誘発され（非特許文献１０）、これにより細胞外或いは細胞内のカルシウム貯蔵庫でカルシウム濃度の増加が引き起こされてアフリカツメガエル卵母細胞内のＣａＣＣが活性化されるものと知られている（非特許文献１５）。
【０００７】
本発明者らは、ジンセノサイドがＣａＣＣを活性化させることを確認するために、粗総サポニン分画物（ＣＧＳＦ）から純粋なジンセノサイドを分離する過程中に、ＣＧＳＦよりジンセノサイドに富む分画物の場合、ＣａＣＣの活性に対するその効果が急激に消えるか無くなることを見出した。すなわち、ＣＧＳＦから純粋に分離されたジンセノサイドの場合、アフリカツメガエル卵母細胞内におけるＣａＣＣ活性効果がないことを確認した。これはジンセノサイドだけでなく、未知のある物質がＣＧＳＦに存在し、この物質がアフリカツメガエル卵母細胞内のＣａＣＣの活性に影響を及ぼすことが分かった。
【０００８】
そこで、ＣＧＳＦ内に内因性ＣａＣＣの活性を起こすある成分の分離のために鋭意努力した結果、新規な生理活性成分を分離同定し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tyler,J.Pharm.Technol.11,214-220,1995
【非特許文献２】Shibata,et  al.Tetraheadron  Letters  1962,1239-1245,1963
【非特許文献３】Wagner-Jauregg  and  Roth,Pharm  Acta  Helv  37,352-357,1962
【非特許文献４】Nah,Kor.J.Ginseng  Sci.21,1-12,1997
【非特許文献５】Kanzaki,et  al.Br  J  Pharmacol.125(2),255-262,1998
【非特許文献６】Choi,et  al.Br J.Pharmacol.132,641-648,2001
【非特許文献７】Choi,et  al.,J.Biol.Chem.276,48797-48802,2001
【非特許文献８】Choi,et  al.Eur  J  Pharmacol  468,83-92,2003
【非特許文献９】Lee,et  al,J  Biol  Chem.279,9912-9921,2004
【非特許文献１０】Jeong,et  al,Br  J  Pharmacol.142,585-593,2004
【非特許文献１１】Reay,et  al,J  Psychopharmacol.19,357-365,2005
【非特許文献１２】Lee,et  al,Arch  Pharm  Res  28,413-420,2005
【非特許文献１３】Wei,et  al  J  Ethnopharmacol.111,613-618,2007
【非特許文献１４】Eriksson,et  al  J  Ethnopharmacol.119,17-23,2008
【非特許文献１５】Dascal,CRC  Crit  Rev  Biochem  22,317-387,1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の主な目的は、人参から強壮活性の役目を果たす新規な生理活性物質を分離同定する方法、前記方法で分離同定された生理活性物質、及び前記生理活性物質の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、人参に存在する新規な糖リポタンパク質(glycolipoprotein)を人参から分離同定して製造する方法を提供する。
【００１２】
具体的に、本発明に係る人参から新規な糖リポタンパク質としてのジントニン（以下「ジントニン(gintonin)という」を製造する方法は、（１）人参からメタノール抽出物を製造する段階と、（２）前記メタノール抽出物を水とｎ−ブタノールの混合溶媒に分画する段階と、（３）前記水分画物とｎ−ブタノール分画物のうち、ｎ−ブタノール分画物に対して、溶出溶媒としてクロロメタン：メタノール：水の混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、８個の分画に分離する段階と、（４）前記８個の分画物のうち、ＣａＣＣ(Ca2+activated  Chloride  Channel)に対する活性が最も高い第７の分画物に対して、溶出溶媒としてエタノール：酢酸エチル：水の混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、２つの分画に分離する段階と、（５）前記２つの分画物のうち、ＣａＣＣ活性が高い分画物IIを透析し、最終生成物を得る段階とを含んでなる。
【００１３】
また、本発明は、これに加えて、（６）最終分画物をＮａＣｌが含有されたｐＨ７．２のリン酸塩緩衝食塩水（phosphate  buffer  saline、ＰＢＳ）溶液に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを行い、２つの分画に分離する段階と、（７）前記２つの分画物に対してそれぞれ、ＮａＣｌが含有されたｐＨ８．２のＴｒｉｓ−ＨＣｌ及びＮａＣｌが含有されたｐＨ７．２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、個別ジントニンを分離する段階とを含んでもよい。
【００１４】
また、本発明は、前述したような方法で人参から分離同定した新規な糖リポタンパク質（ジントニン）を提供する。
【００１５】
本発明において、前記糖リポタンパク質（ジントニン）の分子量が約６７ｋＤａであり、見掛け分子量は約１３ｋＤａの五量体であることを特徴とし、アミノ酸組成成分として、システインとシスチン(cysteine  and  cystine)、アスパラギンとアスパラギン酸(asparagine  and  aspartic  acid)、グルタミンとグルタミン酸(glutamine  and  glutamic  acid)、セリン(serine)、グリシン(glycine)、アルギニン(arginine)、トレオニン(threonine)、アラニン(alanine)、プロリン(proline)、バリン(valine)、イソロイシン(isoleucine)、ロイシン(leucine)、フェニルアラニン(phenylalanine)、トリプトファン(tryptophan)及びリシン(lysine)を含み、炭水化物組成成分として、ラムノース(rhamnose)、アラビノース(arabinose)、グルコース(glucose)、マンノース(mannose)、キシロース(xylose)及びグルコサミン(glucosamine)を含み、脂質組成成分としては、リノール酸(linoleic  acid)、パルミチン酸(palmitic  acid)、オレイン酸(oleic  acid)及びステアリン酸(stearic  acid)などを含む。
【００１６】
人参は、ウコキ科薬用植物であって、例えば、加工方法に従って加工していない水参（生参）、水参を乾燥させた白参、水参を蒸して乾燥させた紅参などがあり、栽培方法によっては人参の畑で人為的に栽培した栽培参、人参の種を山中に播いて自然状態で栽培した長脳参、自然状態で自生した山参などがあり、本発明において、用語「人参」は前記全ての人参の種類を含む意味で使用される。また、本発明における人参は高麗人参（オタネニンジン、Panax  ginseng  C.A.Meyer)、西洋参（アメリカニンジン）及び中国人参（田七人参）などを含む。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の人参に存在する新規な糖リポタンパク質としてのジントニンは、下記のとおり収得できる。
【００１９】
まず、乾燥した人参粉末を、試料重量の約１〜２０倍、好ましくは約１〜１０倍に達する体積の水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコールの極性溶媒又はこれらの約１：０．１〜１：１０の混合比を有する混合溶媒で、好ましくは１：０．２〜１：５の混合比（ｖ／ｖ）を有する水とメタノールとの混合溶媒で、７０〜１２０℃で約０．１〜４８時間、好ましくは５〜１２時間攪拌抽出、熱水抽出、冷浸抽出、加温抽出、還流冷却抽出又は超音波抽出などの抽出方法、好ましくは還流冷却抽出によって行った後、濾過して上層液を回収し、前述の過程を数回、好ましくは２〜５回繰り返し行った後、上層液を集めて減圧濃縮したものを、水とｎ−ブタノールが同量で混合された混合溶媒で溶媒分画し、水とｎ−ブタノールの分画物を得る。
【００２０】
前記分画物のうち、粗総サポニン分画（ＣＧＳＦ）に該当するｎ−ブタノール分画物に対して、溶出溶媒としてクロロメタノール：メタノール：水（ＣＨＣｌ３Ｌ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）の混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、８個の分画に分離した後、分離された分画物に対してアフリカツメガエル卵母細胞におけるカルシウム依存性塩素イオンチャネル（ＣａＣＣ）の活性確認実験を行って分画物の活性を検索した後、最も活性の高い分画に対してさらにエタノール：酢酸エタノール：水（ＥｔＯＨ：ＥｔＯＡｃ：Ｈ２Ｏ）の混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って２個の分画に分画し、二重活性の高い分画を過量の蒸留水と透析膜(dialysis  membrane)を用いて透析し、本発明の粗ジントニンを得ることができる。
【００２１】
こうして得られた粗ジントニンは、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量分析、タンパク質及びアミノ酸組成分析、炭水化物組成分析、ＧＣ−ＭＳによる脂質組成分析などを介して確認することができる。
【００２２】
また、本発明の個別ジントニンは、上述したような工程で得られた粗ジントニンをＮａＣｌの含有されたリン酸塩緩衝食塩水（phosphate  buffer  saline、ＰＢＳ）に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを行って２個のジントニン分画物を収得する。それぞれのジントニン分画物は、ＮａＣｌが含有されたＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）及びＮａＣｌが含有されたＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行って得ることができる。
【００２３】
本発明において、ジントニンの製造のために、山参、長脳参、栽培参、西洋参及び中国人参などの人参を使用することができる。前記人参は、水参、白参、紅参などの形として利用でき、好ましくは４〜６年根の高麗人参(Panax  ginseng  C.A.Meyer)から製造した紅参を使用することが良いが、これに限定されるものではない。
【００２４】
また、本発明は、糖リポタンパク質（ジントニン）をカルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防または治療剤としての用途で提供する。
【００２５】
具体的に、本発明は、前述の方法で製造された糖リポタンパク質としてのジントニンを有効成分として含む、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療のための薬学組成物を提供する。
【００２６】
本発明において、前記ジントニンは、一時的に細胞質内遊離Ｃａ２＋(Free  Ca2+)の増加を誘発し、細胞内カルシウム濃度の一時的な増加により、アフリカツメガエル卵母細胞で内因性に存在するカルシウム依存性塩素イオンチャネル（ＣａＣＣ）を活性化して細胞内カルシウム濃度を増加させ、その結果、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療に優れた効果を示し、特にカルシウム濃度の低下により引き起こされる神経系疾患の異常を改善することにより、治療及び予防が可能である。
【００２７】
カルシウム濃度の低下による神経系疾患は、精神分裂(Schizophrenia)、アルツハイマー病(Alzheimer’s  disease)、ハンチントン病(Huntington’s  disease)、家族性片麻痺性片頭痛(Familial  hemiplegic  migraine)、癲癇(epilepsy)、一過性運動失調症(episodic  ataxia)、脊髄小脳失調症(spinocerebellar  ataxias)などを含むが、これらの疾患に限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明の組成物は、カルシウム不足による成長阻害などにも効果があり、細胞内カルシウム依存性の様々な生理活性、例えば強壮作用、免疫力増加、性機能強化、神経系保護及び活性、血管新生、抗糖尿作用などにおいても効果を示す。
【００２９】
また、人参は長時間生薬として使用されてきたものであり、このような人参から分離した本発明のジントニンも毒性及び副作用などの問題が全くない。
【００３０】
本発明のカルシウム濃度の低下による疾患の予防及び治療用薬学組成物は、組成物の全体重量に対し、前記ジントニンは０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％で含む。
【００３１】
また、本発明のジントニンを含む組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよく、本発明のジントニンの薬学的投与形態は単独で或いは他の薬理的活性化合物との結合又は適当な集合として使用できる。
【００３２】
本発明に係るジントニンを含む組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形に剤形化して使用できる。前記組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラル類を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、前記ジントニン又は分画物に少なくとも一つの賦形剤、例えば澱粉、カルボン酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口のための液相製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤としての水、流動パラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用でき、坐剤の基剤としてはウイテプソル(witepsol)、マクロゴール(macrogol)、ツイン(tween)６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用できる。
【００３３】
本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、病気の重症程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。ところが、望ましい効果のために、本発明の組成物は１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与することがよい。投与は１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいずれの面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００３４】
本発明の薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内膜または脳室内(intracerebroventricular)注射によって投与できる。
【００３５】
本発明のジントニンを含む組成物は、前述したような剤形で、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療のための薬剤、食品及び飲料などに様々に利用できる。前記ジントニンを添加することが可能な食品としては、例えば、各種食品類、飲料、チューインガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【００３６】
本発明のジントニンは、毒性及び副作用が殆どないので、予防の目的で長期間服用する場合にも安心して使用することができる。
【００３７】
本発明のジントニンは、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防を目的として食品又は飲料に添加できるが、この際、食品又は飲料中に前記ジントニンは全体重量に対して０．０１〜１５重量％で加えることができ、健康飲料組成物は１００ｍＬを基準として０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇの割合で加えることができる。
【００３８】
本発明の健康機能性飲料組成物は、指示された比率で必須成分として前記ジントニンを含有する以外は他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料と同様に、様々な香味剤又は天然炭水化物などをさらに含んでもよい。この際、前記天然炭水化物としては、例えば、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、及びデキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類のような通常の糖、並びにキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールなどが挙げられる。また、香味剤としては天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物、例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は本発明の組成物１００ｍＬあたり一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００３９】
この他に、本発明の抽出物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成矯味剤、及び天然矯味剤などの矯味剤、着色剤及び増音剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の抽出物は天然果物ジュース飲料、果物ジュース飲料及び野菜医療の製造のための果肉を含有することができ、このような成分を独立に或いは組み合わせて使用することができる。また、前記添加剤の比率は、あまり重要ではないが、本発明の抽出物１００重量部当たり０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、人参に存在する新規な糖リポタンパク質としてのジントニンを分離同定して製造する方法、前記方法で製造された新規な糖リポタンパク質ジントニン、及び前記新規な糖リポタンパク質ジントニンのカルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療剤としての用途を提供するという効果がある。
【００４１】
本発明のジントニンは、一時的に細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発し、細胞内カルシウム濃度の一時的な増加により、アフリカツメガエル卵母細胞で内因性に存在するカルシウム依存性塩素イオンチャネル（ＣａＣＣ）を活性化して細胞内カルシウム濃度を増加させるので、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防及び治療に有用に使用できる。
【００４２】
また、本発明のジントニンは、細胞内カルシウム依存性の様々な生理活性、例えば強壮作用、免疫力増加、性機能強化、神経系保護及び活性、血管新生、抗糖尿作用などにおいても優れた効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Ａは人参から新規な糖リポタンパク質としてのジントニンを分離同定する方法を図式化した図であり、Ｂはジントニン分画物のアフリカツメガエル卵母細胞におけるＣａＣＣの活性を確認したクロマトグラムであり、Ｃは粗ジントニンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図２】粗ジントニンから個別ジントニンを分離同定する方法を図式化した図である。
【図３】個別ジントニンの陰イオン交換及びゲルクロマトグラムであって、Ａは粗ジントニンから分離したジントニンＥ分画とジントニンＬ分画の陰イオン交換クロマトグラムであり、Ｂは前記Ａから得たジントニンＬ分画のゲル濾過クロマトグラムであり、ＣはジントニンＥ分画の陰イオン交換クロマトグラムであり、ＤはジントニンＬ分画の陰イオン交換クロマトグラムである。
【図４】ゲル又は連続陰イオン交換クロマトグラフィーによる個別ジントニンの溶出パターンを示すもので、ＡとＣは精製されたジントニンＥ１〜Ｅ３及びジントニンＬ１〜Ｌ３のゲル濾過クロマトグラムであり、ＢとＤは精製されたジントニンＥ１〜Ｅ３及びジントニンＬ１〜Ｌ３の陰イオン交換クロマトグラムである。
【図５】ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたジントニンの分子量決定較正曲線であって、各点は使用された標準タンパク質であり（ＩｇＧ：１６０ｋＤ、ＢＳＡ：６７ｋＤａ、β−ラクトグロブリン：３５ｋＤａ、シトクロムＣ：１２ｋＤａ、アプロチニン：６．５ｋＤａ）、矢印はジントニンである。
【図６】Ａは個別ジントニンのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、Ｂは前記個別ジントニンの炭水化物成分のゲル染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図７】ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤクロマトグラムによる個別ジントニンの炭水化物成分分析結果を示すもので、Ａは中性糖(Neutral  sugar)の成分分析であり（標準物質：１．Ｌ−果糖、２．Ｌ−ラムノース、３．Ｄ−アラビアノース、４．Ｄ−ガラクトース、５．Ｄ−グルコース、６．Ｄ−マンノース、７．Ｄ−キシロース）、Ｂはアミノ糖の成分分析である（標準物質：１．Ｄ−ガラクトサミン、２．Ｄ−グルコサミン）。
【図８】個別ジントニンＥ１〜Ｅ３及びＬ１〜Ｌ３の脂質成分をＧＣ−ＭＳスペクトル分析結果である。
【図９】ジントニン処理の際にマウスＥＡＴ細胞における内因性、内向性ＣａＣＣの電流流れを示すもので、Ａは−８０ｍＶの保持電位におけるジントニンとジンセノサイドの電流流れを示すグラフ、ＢとＣはそれぞれ粗ジントニンと個別ジントニンの濃度別電流流れを示すグラフである。
【図１０】ジントニン処理の際にマウスＥＡＴ細胞における細胞内カルシウムの増加を確認したグラフであって、ＡはＣａ２＋緩衝液に培養したＦｕｒａ−２に混ぜたＥＡＴ細胞における時間による細胞内カルシウムの増加を確認したものであり、ＢはＣａ２＋遊離緩衝液に培養したＦｕｒａ−２に混ぜたＥＡＴ細胞におけるジントニン濃度による細胞内カルシウムの増加を確認したものである。
【図１１】ジントニンによるＣａＣＣの活性及びマウスＥＡＴ細胞における細胞内カルシウムの増加に対するＰＬＣ抑制剤、ＩＰ３受容体拮抗剤及びＣａ２＋キレート剤の効果を示すもので、ＡはＰＬＣ抑制剤（Ｕ−７３３４３／Ｕ−７３１２２）によって、ＢとＣはそれぞれＩＰ３受容体拮抗剤（２−ＡＰＢ）及びＣａ２＋キレート剤（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）によってＣａＣＣの活性化が減少することを確認した電流流れの棒グラフである。
【図１２】マウスＥＡＴ細胞でジントニンによって増加する細胞内カルシウム濃度に対する活性型又は非活性型ＰＬＣ抑制剤の効果を示すもので、ＡはＣａ２＋緩衝液に培養したＦｕｒａ−２に混ぜたＥＡＴ細胞における細胞内カルシウム増加の抑制を確認したものであり、ＢはＣａ２＋遊離緩衝液に培養したＦｕｒａ−２に混ぜたＥＡＴ細胞におけるジントニン濃度による細胞内カルシウム増加の抑制を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例が本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないのは、当業者にとっては自明なことであろう。
【００４５】
実施例１：人参からの粗ジントニン(crude  gintonin)の分離
韓国人参公社（大田、韓国）から購入した６年根紅参(Panax  ginseng  C.A.Meyer)２０ｋｇを細かく粉砕（＞３ｍｍ）し、８０％メタノールを３０Ｌ加えて８０℃で８時間還流冷却抽出した後、真空濾過して上層液を回収した。この過程を３回繰り返し行って上層液を集めた後、減圧濃縮し（メタノール抽出物の総６．２ｋｇを収得）、水とｎ−ブタノールの混合溶媒（１：１）で溶媒分画して水とｎ−ブタノールの分画物を収得した（ｎ−ブタノール分画物を総９０８ｇ収得）。
【００４６】
前記ｎ−ブタノール分画物（粗総サポニン分画、ＣＧＳＦ）は濃縮してクロロホルム：メタノール：水（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝１３：７：２）の混合溶媒で溶離してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、８個の分画に分離した。その後、それぞれの分画物に対して、アフリカツメガエル卵母細胞で内因性に存在するカルシウム依存性塩素イオンチャネル（ＣａＣＣ）に対する活性を実験し、ＣａＣＣの活性が最も高く示された第７の分画（図１のＢ参照）に対して、さらに酢酸エチル：エタノール：水（ＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ＝１：３：０．５）の混合溶媒で溶離してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、２個の分画物を得た。
【００４７】
前記２個の分画物のうち、ＥＡＴ(Ehrlich  Ascites  Tumor)細胞における細胞内カルシウム放出実験の評価とアフリカツメガエル卵母細胞で強いＣａＣＣ活性を示した分画物IIを４℃で８時間過量の蒸留水（distilled  water、ＤＷ）とＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ  ｏｆ  ６，０００〜８，０００）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｉｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて透析し、ジンセノサド及び他の低分子物質を除去した後、最終的に分画物を得た。
【００４８】
前記得た分画物に対して電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った結果、クマシーブリリアントブルー(Coomassie  Brilliant  Blue)で染色され、見掛け分子量が約１３ｋＤａであることを確認した。これは、ＥＡＴ細胞における細胞内カルシウム放出実験の評価とアフリカツメガエル卵母細胞でＣａＣＣ活性を起こす新規物質が、ジンセノサイドではなく、タンパク質の１種類であることを示唆する。前記タンパク質をジントニンと命名し、これから得た最終分画物は粗ジントニン(crude  gintonin)と命名した。
【００４９】
ところが、人参のタンパク質または多糖類を含んでいる水分画物、および脂質(lipid)成分を含有している石油エーテル分画物は、ＥＡＴ細胞の細胞内カルシウム放出実験とアフリカツメガエル卵母細胞におけるＣａＣＣ活性効果が全くなかった（図式しない）。
【００５０】
実施例２：個別ジントニンの分離
粗ジントニン(crude  gintonin)から個別ジントニン(gintonins)を分離するために、前記実施例１で得た粗ジントニンをリン酸塩緩衝食塩水（phosphate  buffer  saline、ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）に溶解し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムが装着された陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ)を行い、２個の主なピーク(major  peak)を得た。この際、溶媒は、０〜２Ｍ  ＮａＣｌがＰＢＳに溶けているものを使用した。１ｍＬ／分の流速にて２８０ｎｍでモニタリングしながら線形勾配(linear  gradient)方式で分離して得た２個の主なピークはそれぞれジントニンＥ(early  eluted  gintonin)、ジントニンＬ(late  eluted  gintonin)と命名した。
【００５１】
前記ジントニンＥの分画物と前記ジントニンＬの分画物はＣｅｎｔｒｉＶａｐ
ＤＮＡ真空濃縮器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）で濃縮した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を溶離液とし、スーパーデキス(Superdex)７５ゲル濾過カラムを用いて０．５ｍＬ／分の流速にて２８０ｎｍでモニタリングしながらクロマトグラフィーを行い、分子量の大きい主ピークと副ピークを得た（図３のＢ参照）。
【００５２】
こうして得たジントニンＥとジントニンＬは、アフリカツメガエル卵母細胞でＣａＣＣ活性を示すことを確認した後、ジントニンＥ分画物は再び１００、１５０、２００、２５０ｍＭ  ＮａＣｌが含有された２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を用いて段階勾配(step  gradient)ＤＥＡＥ陰イオン交換カラム(anion  exchange  column：ＨｉＴｒａｐＴＭＤＥＡＥ  ＦＦ、１ｍＬ)に１ｍＬ／分の流速にてロードして４個のピークを得た（図３のＣ参照）。これらのうち、１００、１５０及び２００ｍＭ  ＮａＣｌ溶離液の分画物を大量透析(extensive  dialysis)及び濃縮した後、さらに０〜１Ｍ  ＮａＣｌが含有された２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を用いて段階勾配ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムを行い、しかる後に、最終的にスーパーデキス７５ゲル濾過クロマトグラフィーを行って最終分画物をそれぞれ３．７、２６．７及び１３．５ｍｇずつ得た。これらはそれぞれジントニンＥ１、Ｅ２及びＥ３と命名した。
【００５３】
一方、ジントニンＬ分画物は１５０、２００、２５０、３００、４００ｍＭ  ＮａＣｌが含有されたＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて前記と同様の方法で得た５個のピーク（図３のＤ参照）のうち、１５０、２００及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶離液の分画物に対して最終分画物を７．４、１７．６及び６．６ｍｇずつ得た。これらはそれぞれジントニンＬ１、Ｌ２及びＬ３と命名した。
【００５４】
また、粗総サポニン分画（ＣＧＳＦ）９０８ｇからそれぞれ、ジントニンＥ１の場合は０．０００４％（３．７ｍｇ）、ジントニンＥ２の場合は０．００２９％（２６．７ｍｇ）、ジントニンＥ３の場合は０．００１５％（１３．５ｍｇ）、ジントニンＬ１の場合は０．０００８％（７．４ｍｇ）、ジントニンＬ２の場合は０．００１９％（１７．６ｍｇ）、ジントニンＬ３の場合は０．００７％（６．６ｍｇ）の収率で得られた。
【００５５】
実施例３：ジントニンの分子量決定
前述したように得た６個のそれぞれ異なるジントニンは、ヤマモト等の方法(Yamamoto,Y.,Nunome,T.,Yamauchi,R.,Kato,K.,and  Sone,Y.(1995)  Carbohydr  Res.275,319-332)に準じてゲル濾過クロマトグラフィーを行って分子量を決定するが、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡を維持したスーパーデキス７５カラム（１０×３００ｍｍ）を装着したバイオロジックデュオフロークロマトグラフィーシステム（BioLogic  DuoFlowTMChromatograpgy、ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて２８０ｎｍでモニタリングしながら流速０．５ｍＬ／分で分画物を集めた後、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；１６０，０００Ｄａ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ；６７，０００Ｄａ）、β−ラクトグロブリン（３５，０００Ｄａ）、シトクロムＣ（１２，３２７Ｄａ）、及びアプロチニン（６，５１２Ｄａ）などの標準タンパク質からなる較正曲線(calibration  curve)を用いて分子量を決定した。
【００５６】
その結果、ジントニンの帯びる電荷が異なってＮａＣｌ勾配溶出によって溶出(elution)パターンが異なったが、ゲル濾過クロマトグラフィーではほぼ同時に溶出して分子量がほぼ同一であった（図４のＢ及びＤ参照）。
【００５７】
また、標準タンパク質を用いて決定したジントニンＬ２のネイティブ(native)分子量も約６７ｋＤａであった（図５参照）。他のジントニンの分子量も約６７ｋＤａであると確認された（図式せず）。
【００５８】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、６個のジントニンがブロード(broad)であるが、単一な主バンド(single  major  band)を示し、その見掛け分子量(apparent  molecular  weight)は約１３ｋＤａであると確認された。
【００５９】
前述したような結果は、本発明のジントニンが五量体(pentamer)であることを示唆する（図６のＡ参照）。
【００６０】
実施例４：ジントニンの純度決定
前記粗ジントニン及び個別ジントニンの純度を決定するために、１２．０％分離ゲル(separating gel)を用いて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った(Laemmli,U.K.(1970)  Nature  227,680-685)。
【００６１】
具体的に、粗ジントニンと個別ジントニンＥ１〜Ｅ３、Ｌ１〜Ｌ３を１００μｇずつ取って各レイン(lane)にロードして電気泳動した後、ジントニンバンドをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色で視覚化した。また、糖タンパク質(glycoprotein)検出のために、ゲルはＰＡＳ染色(periodic  acid-schiff  based  staining)技法を用いて染色し、４０％エタノール−７％酢酸水溶液で３０分間培養した後、１％過ヨウ素酸−３％酢酸で１時間培養し、しかる後に、過ヨウ素酸溶液を除去し、Ｓｃｈｉｆｆ試薬を添加して１時間培養した。染色された糖タンパク質のバンドは桃色を呈し、ＰＡＳ染色されたゲルは７．５％酢酸で浸漬(soaking)した後、保管した。
【００６２】
実施例５：ジントニンのアミノ酸組成分析
一般アミノ酸(general  amino  acid)分析のために、ジントニン３０μｇを真空内(in  vacuo)で６Ｎ  ＨＣｌを用いて１１０℃で２４時間加水分解した。また、システインの分析のためには、ジントニンを過酸化(peroxidation)させた後、６Ｎ  ＨＣｌを用いて１１０℃で２４時間加水分解し、蟻酸：過酸化水素（１０：１）溶液で処理した。トリプトファンの分析のためには、試料を４Ｍメタンスルホン酸(methanesulfonic  acid)で加水分解し、４Ｍ  ＫＯＨを加えた。
【００６３】
また、フェニルイソチオシアネート（Phenylisothiocyanate、ＰＩＴＯＣ）誘導体に隠されたアミノ酸は、大田所在の韓国基礎科学支援研究所に依頼し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（３．９×３００ｍｍ）を装着したＨＰＬＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ）で分析した。
【００６４】
タンパク質成分は、標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法(Bradford,M.M.(1976).Anal.Biochem.72,248-254)で決定した。
【００６５】
実施例６：ジントニンの部分アミノ酸配列
ジントニンのＮ末端アミノ酸配列は、自動エドマン分解アプライドバイオシステムモデル４７７Ａガス相タンパク質配列(automated  Edman  degration  on  an  Applied  Biosystem  model  477A  gas-phase  protein  sequence)及びミリゲン６６００固体相配列(MilliGen  6600  solid-phase  sequence)によって行われた。
【００６６】
ジントニン１００μｇに対して１２％分離ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質バンドはクマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色で視覚化した。前記バンドを切断してトリプシンで消化(digesting)し、前記消化産物(digestion  product)は脱塩及び濃縮した。
【００６７】
こうして誘導された全てのペプチドのＭＳ／ＭＳは、韓国基礎科学支援研究所で、ナノ−ＥＳＩを装着した質量分析計(Mass  spectrometer)（ＱＴＯＦ  II、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）を用いて行った。この際、生成されたイオン(product  ion)は、反射体(reflector)、マイクロチャネル検出器(microchannel  plate  detector)及び時間対デジタル変換器(time-to-digital  converter)が固定された直角ＴＯＦ分析器(orthogonal  TOF  analyzer)を用いて分析した。データはウィンドウＮＴ環境でＭａｓｓ  Ｌｙｎｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅが駆動されるＰＣを用いて処理した。配列同族体はＢＬＡＳＴ(www.ncbi.nln.nih.gov/BLAST.cgi)を用いて検索した。
【００６８】
表１はジントニンのｄｅ  ｎｏｖｏアミノ酸配列と組成を示すものであり、純粋分離されたジントニンは自動エドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列からなるものと確認された。ところが、ジントニンのＮ末端がブロッキング(blocking)されて全体配列を得ることができなかったため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳを用いてトリプシン処理したジントニンから１８個の内部ペプチド配列(internal  peptide  sequence)を推定した結果、６個の個別ジントニンは一般に幾つかのペプチドを含有し、アミノ酸配列はヒトグルコキナーゼ(human  glucokinase)及びグルコキナーゼイソ型２(glucokinase  isoform  2)と部分的相同性を示した（図式せず）。
【００６９】
また、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法によるジントニンの総タンパク質の含量は、ジントニンＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３でそれぞれ９．４、２４．１、２０．５、３５．８、３７．１及び３９．６％であった。ジントニンＬ１〜Ｌ３のタンパク質含量はジントニンＥ１のそれより約３倍高い含量である。
【００７０】
また、ジントニンにおける疎水性アミノ酸(hydrophobic  amino  acid)は、親水性アミノ酸(hydrophilic  amino  acid)よりさらに多かったが、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、チロシン（ｔｙｒ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）は検出されなかった。これらの中でも、メチオニンはジントニンのＮ末端がブロッキングされて検出されなかったものと思われる。
【００７１】
一方、ジントニンＥ１〜Ｅ３及びＬ１〜Ｌ３では、共通にフェニルアラニン（Ｐｈｅ）が最も高く含有されるものと確認された。また、ジントニンＬ１〜Ｌ３におけるリシン（Ｌｙｓ）はＥ１〜Ｅ３のそれより高く示された（表１参照）。
【００７２】
【表１】
2013502409.tif 000003
実施例７：ジントニンの炭水化物組成分析
図６のＡに示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるジントニンのバンドは単一(single)であるがブロード(broad)であり、クマシーブリリアントブルー染色で強く染色されなかったため、炭水化物を含んでいる可能性がある。
【００７３】
したがって、ジントニンの炭水化物組成を確認するために、ジントニンを２Ｍトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic  acid)を用いて１００℃で４時間加水分解した後、中性糖(neutral  sugar)を得た。また、ジントニンをガラスアンプルで６Ｎ  ＨＣｌを用いて１００℃で４時間加水分解によってアミノ糖(amino  sugar)と酸性糖(acid  sugar)を得た。
【００７４】
ジントニンの炭水化物組成は、ソウル所在の世宗大学校炭水化物素材研究所に依頼し、ＰＡＳ染色(periodic  acid-schiff  based  staining)技法を用いて染色した後、ＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰＡｌカラムを装着したＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステム（high  performance  anion  exchange  chromatography-plused  amphermetric  dectection  system、Ｄｉｏｎｅｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて分析した。単糖類のモル重量(molar  weight)はピーク面積(peak  area)から計算した。炭水化物の含量は、中性糖の場合にはフェノール−スルホン酸方法(Hounsell,E.F.,Davies,M.J.,and  Smith,K.D.(1997)  Protein  protocol  handbood,Humanna  press,Totawa,803-804)で決定し、酸性糖の場合にはＡｎｔｈｒｏｎｅ方法で決定した(Scott,T.A.,and  Melvin,E.H.(1953)Anal.Biochem.25,1656-1660)。
【００７５】
その結果、ジントニンは、ラムノース(rhamnose)、アラビノース(arabinose)、グルコース(glucose)、マンノース(mannose)、キシロース(xylose)などの５個の異なる種類の中性糖、及びグルコサミンなどの１個のアミノ糖から構成されるものと確認された。６個のジントニンは互いにほぼ類似した炭水化物構成を有することが分かった（表２及び図７参照）。ところが、ジントニンＥ１〜Ｅ３からマンノースは検出されなかった。
【００７６】
一方、１−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸(1-N-acetyl-neuraminic  acid)、２−ガラクツロン酸(2-galacturonic  acid)、３−グルクロン酸(3-glucuronic  acid)などの酸性糖は検出されなかった（図式せず）。
【００７７】
最後に、ジントニンの総炭水化物含量は、ジントニンＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３でそれぞれ約３４．３、４５．３、３８．１、３６．０、２９．８及び４５．２％であった。その結果より、本発明のジントニンは糖タンパク質であることを再確認することができた。
【００７８】
【表２】
2013502409.tif 000004
実施例８：ジントニンの脂質成分分析
本発明のジントニンは、ｎ−ブタノール抽出によってジンセノサイドと同様の分画にあったため、ジントニンも脂質部分(lipid  moiety)を含有するものと予想することができる。
【００７９】
これを確認するために、ジントニンを６Ｎ  ＨＣｌを用いて４時間１００℃で加水分解し或いはリポタンパク質リパーゼ(lipoprotein  lipase)に消化させて脂質(lipid)及び疎水性部分(hydrophobic  moiety)を確認した。
【００８０】
具体的に、粗総サポニン分画（ＣＧＦＳ）を酸加水分解又は消化させたものを濃縮し、さらに水とｎ−ヘキサンにさらに分画した後、ｎ−ヘキサン分画物に対して、ＤＢ５−ＭＳ毛細管カラム(capillary  column)（３０ｃｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ）を装着したＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ  ＧＣ−ＭＳシステム（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、韓国基礎科学支援研究所で脂質(lipid)及び疎水性部分を分析した。この際、ＧＣ（６８９０Ｎ）は、火イオン化検出器(flame  ionization  detector)と分離注入システム(split  injection  system)が装着されており、ｓｕｐｅｌｃｏ  ＳＰＢ−１毛細管カラム（内径：１５ｍ×０．３２ｍｍ、厚さ：０．２５ｍ）を固定した。
【００８１】
その結果、表３及び図８に示すように、ジントニンは、エステル型(ester  form)又は自由型(free  form)のパルミチン酸(plamitic  acid)、ステアリン酸(stearic  acid)、オレイン酸(oleic  acid)、リノール酸(linoleic  acid)などを含有するものと確認された。
【００８２】
また、ジントニンＥ１又はＬ１における多価不飽和脂肪酸としてのリノール酸の比率は飽和脂肪酸としてのパルミチン酸とステアリン酸又はオレイン酸より高かった。パルミチン酸はジントニンＥ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２で多量含有されていた。
【００８３】
また、ＧＣによって測定したジントニンに含有された総脂質含量は、ジントニンＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３がそれぞれ３４．３、４５．３、３８．１、３６．０、２９．８及び４５．２％であった。これらの中でも、ジントニンＥ１の脂質含量が最も高かった。
【００８４】
前述したような結果は、本発明のジントニンが新規な糖リポタンパク質であることを示唆する。
【００８５】
【表３】
2013502409.tif 000005
測定例１：アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus  laevis  oocytes)からのＣａＣＣ活性の測定
１−（１）．卵母細胞(Oocyte)の準備
Ｘｅｎｏｐｕｓ  I（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）から得たアフリカツメガエル(Xenopus  laevis)は、最上の規格指針に従って保管及び処理し、卵子(oocytes)を分離するために、カエルを３−アミノ安息香酸エチルエステル(3-amino  benzoic  acid  ethyl  ester)の通気溶液(aerated  solution)で麻酔させて手術した後、コラゲナーゼで処理し、しかる後に、８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭピルビン酸ナトリウム(sodium  pyruvate)、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬフェニリシン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが含有されたＣａ２＋遊離培地で２時間攪拌して分離した。
【００８６】
V−VI段階の卵子を収集し、ゲンタマイシン(gentamicin)５０μｇ／ｍＬを追加したＮＤ９６（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で保管した。前記卵子を含む溶液は、連続的に軽く振とうしながら１８℃に維持し、毎日交換した。
【００８７】
１−（２）．ＣａＣＣの測定
２−電極電圧固定(two-electrode  voltage  clamp)記録は、小型プレキシガラス(plexiglass)ネットチャンバー（０．５ｍＬ）に置かれた個別的な卵子から得た。電気生理学実験(electrophysiological  experiments)は、３Ｍ  ＫＣｌで充填したマイクロ電極（抵抗：０．２〜０．７ＭΩ）と卵子固定増幅器（Oocyte  Clamp  amplifier、ＯＣ−７２５Ｃ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて室温で行った後、ＣａＣＣを−８０ｍＶ保持電位(holding  potential)で記録した。
【００８８】
ジントニンは、バス灌流(bath  perfusion)によって卵子に適用した(Lee,J.H.,Jeong,S.M.,Lee,B.H.,Noh,H.S.,Kim,B.K.,Kim,J.I.,Rhim,H.,Kim,H.C.,Kim,K.M.,and  Nah,S.Y.(2004)J  Biol  Chem  279,9912-9921)。
【００８９】
測定例２：マウスＥＡＴ細胞からの細胞内遊離カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）の測定
２−（１）．ＥＡＴ(Ehrlich Ascites Tumor)細胞の準備
ＥＡＴ細胞は、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法(Jorgensen,N.K.,Pedersen,S.F.,Hoffmann,E.K.(1999)Am  J  Physiol  276.C26-C37)によってＩＣＲマウスの腹腔内移植(interaperitoneal  transplantation)から毎週収集した。
【００９０】
具体的に、腹水(ascites  fluid)は、マウス腹膜腔(peritoneal  cavity)から２．５Ｕ／ｍＬのヘパリンが含有されたＨａｎｋ’ｓ溶液に収集した。ＲＢＣからＥＡＴ細胞を分離するためには、ＥＡＴ細胞を１０及び２０％フィコール溶液(Ficoll  solution)の２層を含む遠心分離管にロードして１，８００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、ＥＡＴ細胞のみを得た。前記細胞は、所望の細胞数となるように浮遊させた後、実験を開始する前に約３０分間培養した。
【００９１】
２−（２）．Ｆｕｒａ  ２とＥＡＴ細胞との混合
Ｆｕｒａ  ２−負荷マウスＥＡＴ細胞におけるＧ−タンパク質結合受容体作用剤(G-protein  coupled  receptor  agonist)の処理は、細胞内遊離カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）の一時的な増加を誘導することが明らかになった(Scott  and  Melvin.Anal.Biochem.,25,1656-1660,1953)。
【００９２】
本発明では、ジントニン又はジンセノサイドＲａ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｇ１がＦｕｒａ２−負荷マウスＥＡＴ細胞における［Ｃａ２＋］ｉの一時的増加に効果を示すかを確認するために、Ｆｕｒａ−２に混ぜたＥＡＴ細胞（２〜４×１０６／ｍＬ）は１．５ｍＭ  Ｃａ２＋緩衝液またはＣａ２＋遊離緩衝液で１０分間培養した後、ジントニンとジンセノサイドを添加し、ＥＡＴ細胞における細胞内カルシウム濃度に及ぼす効果を確認した。但し、利用可能な純粋分離された個別ジントニンの量の限界のために、代表的なジントニンとしてジントニンＥ２を用いてマウスＥＡＴ細胞（Ｒｉｋｅｎ  ＢＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、Ｔｓｕｋｕｂａ、Ｊａｐａｎ）における［Ｃａ２＋］ｉの増加について実験した。
【００９３】
具体的に、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法によって、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、ＣａＣｌ２１．５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭからなるＣａ２＋緩衝液（ｐＨ７．２）と、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、ＥＧＴＡ  ０．２ｍＭ、グルコース１０ｍＭ及びＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭよりなるＣａ２＋遊離緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、３７℃の水浴で３０分間振とうしながら２μＮ  Ｆｕｒａ  ２−ＡＭにＥＡＴ細胞（２〜４×１０６／ｍＬ）を混合し、過量のｆｕｒａ−２は細胞をＣａ２＋緩衝液又はＣａ２＋遊離緩衝液で３回洗浄して除去した。
【００９４】
２−（３）．細胞浮遊物内［Ｃａ２＋］ｉの蛍光測定
［Ｃａ２＋］ｉは、ＲＦ−５３００ＰＣ細胞内イオン測定システム(Intracellular  Ion  Measurement  System)（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いてＦｕｒａ  ２−負荷セルから推定した。具体的に、Ｆｕｒａ  ２−負荷セルは、最終的に２〜４×１０６／ｍＬまで実験培地で希釈した後、ポリスチレンキュベット（Ｅｌｋａｙ  Ｕｌｔｒａ−ＵＶ）に移した。細胞はテフロン（登録商標）でコートされた磁石を用いて攪拌した。キュベットハウジングは３７℃に調節した。励起波長(excitation  wavelengths)は、コンピュータ制御の下で３４０ｎｍと３８０ｎｍを交互にし、放出(emission)は５１０ｎｍで検出した。この際、励起及び放出の隙間幅は５ｎｍとし、背景補正はＪｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法に準じて行うが、ジギトニン(digitonin)及びＥＧＴＡはｆｕｒａ−２が完全にＣａ２＋と化合し、Ｃａ２＋から解離される状態を作るための濃縮反応試薬(concentration  adjustment  reagent)として使用した。
【００９５】
２−（４）．Ｆｕｒａ  ２測定値からの［Ｃａ２＋］ｉの推定
測定された３４０ｎｍ対３８０ｎｍの比率値は、Ｈｏｕｎｓｅｌｌ等の式(Hounsell,E.F.,Davies,M.J.,and  Smith,K.D.(1997)Protein  protocol  handbood,Humanna  press,Totawa,803-804)を用いて［Ｃａ２＋］ｉの値に変換した。
【００９６】
［Ｃａ２＋］＝Ｋｄ［（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）］（Ｓｆ３８０／Ｓｂ３８０）
但し、Ｋｄは解離定数（２２４ｎＭ）であり、Ｒは測定された３４０ｎｍ対３８０ｎｍの蛍光比(fluorescence  ratio)であり、Ｒｍａｘ及びＲｍｉｎは５０μｇ／ｍＬのジギトニンを添加した飽和濃度でのＲ値及び２０ｍＭ  ＥＧＴＡを添加した遊離培地でのＲ値である。また、Ｓｆ３８０とＳｂ３８０はジギトニンとＥＧＴＡを添加したときの３８０ｎｍでの蛍光強度であり、比率はこれらの値が表示されるときの最大及び最小値である(Grynkiewicz,G.,M.Poenie,and  R.Y.Tsien.(1985)  J  Biol  Chem  260:3440-3450)。
【００９７】
２−（５）．データ分析
ＩｎｓＰ６を含む濃度反応曲線を得るために、観察されたピークの振幅を標準化及び図表化した後、Ｏｒｉｇｉｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を用いて下記のＨｉｌｌ式に対応させた。
【００９８】
ｙ／ｙｍａｘ＝［Ａ］ｎ／（［Ａ］ｎ＋［ＥＣ５０］ｎ）
式中、ｙはジントニンの与えられた濃度における％活性であり、ｙｍａｘは最大ピーク電流(maximum  peak  current)であり、［ＥＣ５０］は最大反応の５０％を示すことが可能なジントニンの濃度であり、［Ａ］はジントニンの濃度である。また、ｎは相互作用係数(interaction  coefficient)であり、全ての値は平均±標準誤差で示し、対照群のデータとジントニン処理群のデータ間の平均値はｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’s  ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析した。統計学的有意性はＰ＜０．０５で検定した。
【００９９】
実験例１．アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus  laevis  oocytes)で内因性に存在するＣａＣＣの活性に対する粗ジントニン及び個別ジントニンの効果確認
アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus  laevis  oocytes)で内因性に存在するＣａＣＣの活性に対する粗ジントニン及び個別ジントニンの効果を確認するために、前記測定例１の夫々の方法を用いて、ＣａＣＣの活性増加として記録される保持電位を測定した。
【０１００】
その結果、粗ジントニンを処理した群では−８０ｍＶ保持電位で内向性(inward)のＣｌ−電流を誘導したが、ジンセノサイドは誘導効果が全く確認されなかった。ＥＤ５０は４．４±０．５μｇ／ｍＬであった（図９のＡ及びＢ参照）。
【０１０１】
また、個別ジントニンに対しても、アフリカツメガエル卵母細胞におけるＣａＣＣ活性効果を実験した結果、ジントニンＥ１〜Ｅ３及びＬ１はほぼ同一程度のＣａＣＣ活性を示したが、ジントニンＬ２とＬ３は相対的に弱いＣａＣＣ活性を示した（図９のＣ参照）。この際、ＥＤ５０は、それぞれジントニンＥ１〜Ｅ３が１．５±０．１、２．３±０．１、１．５±０．１であり、ジントニンＬ１〜Ｌ３が１．０±０．１、３．２±０．２及び４．３±０．２μｇ／ｍＬであった。
【０１０２】
実験例２：マウスＥＡＴ細胞における細胞内遊離カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）に対する効果の確認
前記測定例２のそれぞれの方法に従い、マウスＥＡＴ細胞における細胞内［Ｃａ２＋］ｉを測定した結果、浮遊させたＥＡＴ細胞にジンセノサイドを単独でそれぞれ１００μＭずつ処理したとき、実験したあるジンセノサイドもＥＡＴ細胞に反応を起こさなかった反面、これと対照的に、１００ｎｇ／ｍＬのジントニンＥ２で処理した実験群では［Ｃａ２＋］ｉを一時的に増加させることが確認された（図１０のＡ参照）。
【０１０３】
図１０のＢはジントニンＥ２によって誘導された［Ｃａ２＋］iの増加が処理濃度依存的であることを示す。興味深く、ジントニンＥ２によって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加は外部のＣａ２＋（０．２ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＣａ２＋遊離緩衝液）を除去することにより大きく減少した（Ｐ＜０．００１、細胞外Ｃａ２＋の存在対比）。これは細胞外Ｃａ２＋もジントニン処理の際に細胞内に入ることを意味する。ところが、ジントニンＥ２の処理は依然として濃度依存的に［Ｃａ２＋］ｉを増加させた。これより、ジントニンＥ２によって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの増加は細胞内貯蔵Ｃａ２＋の放出と細胞外におけるＣａ２＋の流入によるものであることが分かった。
【０１０４】
この際、ＥＣ５０値は、細胞外Ｃａ２＋の存在と不在によってそれぞれ３３．６±８．２ｎｇ／ｍＬと４３．６±１４．２ｎｇ／ｍＬ（平均±標準誤差、ｎ＝５〜６）であった。このような結果は、哺乳動物細胞における［Ｃａ２＋］ｉの増加を起こすものがジンセノサイドではなくジントニンであることを示す。
【０１０５】
実験例３：粗ジントニンによるＣａＣＣ活性とＥＡＴ細胞における［Ｃａ２＋］ｉ上昇効果に対するＰＬＣ抑制剤、ＩＰ３受容体拮抗剤又はＣａ２＋キレート剤効果の確認
細胞質の［Ｃａ２＋］ｉとＣａＣＣ活性化を増加させるジントニン誘導シグナル伝達経路におけるリン脂質分解酵素Ｃ（phospholipase  C、ＰＬＣ）の可能な役目を説明するために、まず、活性ＰＬＣ抑制剤としてのＵ−７３１２２と非活性類似体としてのＵ−７３３４３の効果を、アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus  oocytes)とマウスＥＡＴ細胞を用いて確認した。
【０１０６】
アフリカツメガエル卵母細胞において、粗ジントニン誘導ＣａＣＣ電流はＵ−７３１２２で対照群が３．９±０．３であったが、Ｕ−７３３４３では対照群の９７．２±０．２％であった（図１１のＡ参照）。このような結果は、ジントニンによって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの上昇とジントニンによって媒介されたＣａＣＣ活性化がＰＬＣ活性化を介して媒介されることを意味する。
【０１０７】
次の段階として、ＩＰ３受容体を介しての細胞内Ｃａ２＋放出がジントニン誘導ＣａＣＣ活性化を起こすか否かを検査した(Grynkiewicz,et  al.,J.Biol.Chem.260:3440-3450,1985;Parekh,A.B.Pflugers  Arch.-Eur.J.Physiol.,430,954-963,1995;Broad,et  al.,J.Biol.Chem.276,15945-15952,2001)。
【０１０８】
このために、ＩＰ３受容体拮抗剤としての膜透過性２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenylborate)のジントニン誘導ＣａＣＣ活性に対する効果を検査した。
【０１０９】
図１１のＢに示すように、２−ＡＰＢの添加はジントニンによって誘導された内向性Ｃ１−電流（１．３±０．２〜０．０３±０．０１μＡの対照電流、Ｐ＜０．０１）をほぼ完全に消滅させた。また、膜透過性ＢＡＰＴＡ(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic  acid)−ＡＭ（１０μＭ最終）処理で細胞内遊離Ｃａ２＋を除去することもジントニン媒介ＣａＣＣ活性化を殆ど消滅させた（図１１のＣ参照）。
【０１１０】
マウスＥＡＴ細胞の場合でも、Ｕ−７３１２２の処理は細胞外Ｃａ２＋の存否を問わずジントニンの作用を殆ど消滅させるものと確認されたが、Ｕ−７３３４３はそうではなかった（図１２参照）。
【０１１１】
このような結果より、アフリカツメガエル卵母細胞とマウスＥＡＴ細胞でＰＬＣ−ＩＰ３−Ｃａ２＋経路を介して起るＣａＣＣ活性を起こす粗総サポニン分画（ＣＧＳＦ）の主要活性物質がジントニンであることを再び確認することができた。
【０１１２】
結論的に、本発明のジントニンは、細胞内カルシウム濃度を増加させる作用だけでなく、細胞外からカルシウムの流入増加を誘発して細胞内カルシウム濃度を増加させるシグナル伝達経路を介してその効能を示すことが分かった。
【０１１３】
本発明のジントニンを含む薬学組成物の製剤例を下記のとおり例示する。ところが、これらの例は本発明を限定するためのものではなく、具体的に説明するためのものである。
【０１１４】
製剤例１：錠剤の製造
ジントニン    １００ｍｇ
乳糖    １００ｍｇ
澱粉    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ２ｍｇ
これらの成分を混合し、通常の錠剤の製造方法に従って打錠して錠剤を製造した。
【０１１５】
製剤例２：散剤の製造
ジントニン    １００ｍｇ
乳糖    １００ｍｇ
タルク    １０ｍｇ
これらの成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造する。
【０１１６】
製剤例３：カプセル剤の製造
ジントニン    １００ｍｇ
結晶性セルロース    ３ｍｇ
ラクトース    １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法に従って、これらの成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
【０１１７】
製剤例４：注射剤の製造
ジントニン    ２０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水    適量
ｐＨ調節剤    適量
通常の注射剤の製造方法に従って、１アンプル当たり（２ｍＬ）前記の成分含量で注射剤を製造する。
【０１１８】
製剤例５：液剤の製造
ジントニン    １０００ｍｇ
異性化糖    １０ｇ
マンニトール    ５ｇ
精製水    適量
通常の液剤の製造方法に従って、精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前述の成分を混合し、しかる後に、精製水を加えて全体１００ｍＬに調節した後、褐色瓶に充填して滅菌させて液剤を製造する。
【０１１９】
製剤例６：健康食品の製造
ジントニン    １００ｍｇ
ビタミン混合物    適量
ビタミンＡアセテート    ７０μＬ
ビタミンＥ  １．０ｍｇ
ビタミンＢ１    ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２    ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６    ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２    ０．２μｇ
ビタミンＣ    １０ｍｇ
ビオチン    １０μｇ
ニコチン酸アミド  １．７ｍｇ
葉酸    ５０μｇ
パントテン酸カルシウム  ０．５ｍｇ
無機質混合物    適量
硫酸第１鉄    １．７５ｍｇ
酸化亜鉛    ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム    ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム    １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム    ５５ｍｇ
クエン酸カリウム    ９０ｍｇ
炭酸カルシウム    １００ｍｇ
塩化マグネシウム    ２４．８ｍｇ
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適した成分を好適な実施例で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても構わず、通常の健康食品製造方法に従って前述の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品組成物の製造に使用することができる。
【０１２０】
製剤例７：健康飲料の製造
ジントニン    １００ｇ
ビタミンＣ  １５ｇ
ビタミンＥ（粉末）    １００ｇ
乳酸鉄    １９．７５ｇ
酸化亜鉛    ３．５ｇ
ニコチン酸アミド    ３．５ｇ
ビタミンＡ  １．０ｇ
ビタミンＢ１    ０．１３ｇ
ビタミンＢ２    ０．１５ｇ
通常の健康飲料の製造方法に従って前述の成分を混合した後、約１時間８５℃で攪拌加熱し、しかる後に、作られた溶液を濾過し、滅菌した２Ｌの容器に取得し、密封滅菌させた後、冷蔵保管して本発明の健康飲料組成物の製造に使用する。
【０１２１】
前記組成比は、比較的嗜好飲料に適した成分を好適な実施例として混合組成したが、需要階層や需要国家、使用用途などの地域的、民族的嗜好度に応じてその配合比を任意に変形して実施しても構わない。
以上、本発明の内容の特定部分について詳細に記述したが、このような具体的記述は好適な実施様態に過ぎないものであり、これらの実施様態に本発明の範囲が限定されないのは当該分野における通常の知識を有する者には明白なことであろう。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求の範囲とそれらの等価物によって定められるべきであるといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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