(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞の標的抗原を同定する方法に関し、該方法は（ａ）以下の細胞（ａａ）および（ａｂ）を接触させ：  （ａａ）以下を発現する細胞：    （ｉ）所定の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を含有する機能性Ｔ細胞受容体複合体；および    （ｉｉ）Ｔ細胞活性化のリードアウト系  （ａｂ）以下を保有する抗原提示細胞：    （ｉｉｉ）ランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー；および    （ｉｖ）（ｉ）のＴ細胞受容体によって認識されるＭＨＣ分子（ｂ）該リードアウト系を用いてＴ細胞の活性化を評価し；（ｃ）リードアウト系がＴ細胞活性化を示している細胞と接触している抗原提示細胞を単離し；（ｄ）標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定することを含む。本発明は更に、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定する方法、並びに、該本発明の方法に、対合するＴ細胞受容体α鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定することを更に包含させた方法に関する。本発明の方法は、患者に特異的なＴ細胞抗原を同定する方法に関し、該方法は、（ａ）該患者から得たサンプルからＴ細胞を単離し；（ｂ）（ａ）で単離したＴ細胞から、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定し；そして、（ｃ）本発明の方法に従ってＴ細胞抗原を同定し、ここで、機能性Ｔ細胞受容体およびＴ細胞活性化のリードアウト系を含有する細胞は、（ｂ）で同定された、Ｔ細胞由来の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現する、ことを含む。本発明は更に、本発明の方法によって同定されたＴ細胞抗原を含有する組成物、ペプチドライブラリー、並びに、抗原提示細胞およびプライマーまたはプライマー・セットの調製法に関する。
2013535209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞の標的抗原を同定する方法であって、
（ａ）以下の細胞（ａａ）および（ａｂ）を接触させ：
（ａａ）以下を発現する細胞：
（ｉ）所定の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を含有する機能性Ｔ細胞受容体複合体；および
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化のリードアウト系
（ａｂ）以下を保有する抗原提示細胞：
（ｉｉｉ）ランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー；および
（ｉｖ）（ｉ）のＴ細胞受容体によって認識されるＭＨＣ分子
（ｂ）該リードアウト系を用いてＴ細胞の活性化を評価し；
（ｃ）リードアウト系がＴ細胞活性化を示している細胞と接触している抗原提示細胞を単離し；
（ｄ）標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定する
ことを含む上記方法。
【請求項２】
（ｄ）の標的抗原の同定が該標的抗原をコードする核酸分子のシーケンシングを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）の標的抗原の同定が、抗原の少なくとも１つのミモトープの同定を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
抗原提示細胞がペプチドライブラリーを増幅する能力がある細胞である、請求項１から３のいずれかに記載される方法。
【請求項５】
リードアウト系がレポータータンパク質の活性化を含む、請求項１から４のいずれかに記載される方法。
【請求項６】
レポータータンパク質が蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物から成る群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−９のプライマーから選択されるプライマーまたはプライマー・セットを用いてαβ  Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞から得た該核酸分子を増幅することを含む、上記方法。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５−３８のプライマーから選択されるプライマーまたはプライマー・セットを用いて該核酸分子を増幅させることによって、対合するＴ細胞受容体α鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定することを更に含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該方法が以下の段階：
（ｉ）以下を含むプライマー・セットを用いて核酸分子を増幅し：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−９のプライマー；および／または
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５−３８のプライマー；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９−４７のプライマーを含むプライマー・セットを用いて（ｉ）（ａ）の反応産物を増幅し；そして／または
（ｉｉｉ−ａ）以下を用いて（ｉｉ）の反応産物を増幅し：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のプライマー；および
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のプライマー；そして／または
（ｉｉｉ-ｂ）以下を用いて（ｉ）（ｂ）の反応産物を増幅する：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−８３のプライマー・セット；および
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のプライマー；
ことを含む、請求項７または８に記載される方法。
【請求項１０】
患者特異的Ｔ細胞抗原を同定する方法であって、
（Ａ）該患者から得たサンプルからＴ細胞を単離し；
（Ｂ）（Ａ）で単離したＴ細胞から、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定し；そして
（Ｃ）請求項１から６のいずれかに記載される方法に従ってＴ細胞抗原を同定し、ここで、機能性Ｔ細胞受容体およびＴ細胞活性化のリードアウト系を含有する細胞は、（Ｂ）で同定された、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現する、
ことを含む、上記方法。
【請求項１１】
段階（Ｂ）において、請求項７から９のいずれかに記載される方法に従って該Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定することによって、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載される方法によって同定されたＴ細胞抗原および／または請求項１０もしくは１１記載の方法によって同定された患者特異的Ｔ細胞抗原を含有する組成物。
【請求項１３】
該組成物が医薬組成物である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病の治療に使用するための、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該組成物が診断用組成物である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１６】
ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病の診断に使用するための、請求項１５記載の診断用組成物。
【請求項１７】
ペプチドをコードする核酸配列を含有する複数のベクターを含有するペプチドライブラリーであって、該ペプチドはＴ細胞の標的抗原である可能性があるペプチドであり、該核酸配列はランダムな核酸配列である、上記ペプチドライブラリー。
【請求項１８】
請求項１７記載のペプチドライブラリーで細胞をトランスフェクトまたは形質転換することを含む、抗原提示細胞の作製法。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−９および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９−４７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１４から成る群から選択されるプライマーまたはプライマー・セット。
【請求項２０】
請求項１７記載のペプチドライブラリーおよび／または請求項１９記載のプライマーもしくはプライマー・セットおよび／または請求項１８記載の抗原提示細胞を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞の標的抗原を同定する方法に関し、該方法は
（ａ）以下の細胞（ａａ）および（ａｂ）を接触させ：
（ａａ）以下を発現する細胞：
（ｉ）所定の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を含有する機能性Ｔ細胞受容体複合体；および
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化のリードアウト系
（ａｂ）以下を保有する抗原提示細胞：
（ｉｉｉ）ランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー；および
（ｉｖ）（ｉ）のＴ細胞受容体によって認識されるＭＨＣ分子
（ｂ）該リードアウト系を用いてＴ細胞の活性化を評価し；
（ｃ）リードアウト系がＴ細胞活性化を示している細胞と接触している抗原提示細胞を単離し；
（ｄ）標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定する
ことを含む。本発明は更に、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定する方法、並びに、該本発明の方法に、対合するＴ細胞受容体α鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定することを更に包含させた方法に関する。本発明の方法は、患者に特異的なＴ細胞抗原を同定する方法に関し、該方法は、（Ａ）該患者から得たサンプルからＴ細胞を単離し；（Ｂ）（Ａ）で単離したＴ細胞から、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定し；そして、（Ｃ）本発明の方法に従ってＴ細胞抗原を同定し、ここで、機能性Ｔ細胞受容体およびＴ細胞活性化のリードアウト系を含有する細胞は、（Ｂ）で同定された、Ｔ細胞由来の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現する、ことを含む。本発明は更に、本発明の方法によって同定されたＴ細胞抗原を含有する組成物、ペプチドライブラリー、並びに、抗原提示細胞およびプライマーまたはプライマー・セットの調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書では、特許出願および製造者の取扱説明書を含む多くの文献を引用する。それらの文献の開示は、本発明の特許性に関連性があると見なされるものではなく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参考文献は、個々の文献が参照によって具体的かつ個別に組み込まれることが示されるのと同じ程度まで、参照によって組み込まれる。
【０００３】
Ｔ細胞は、多くの感染性疾患、腫瘍性疾患、および自己免疫疾患において重要な役割を果たすが、ごくわずかの例外を除いて、ヒト病原性Ｔ細胞の標的抗原は解明されていない。それらの標的抗原に対するＴ細胞の特異性は、そのヘテロ２量体超可変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子によって決定され、それらの分子は、ＭＨＣ分子によって提示される抗原性ペプチドを認識する。免疫防御においては、ＭＨＣ分子は「自己」に由来するが、抗原性ペプチドは「非自己」、すなわち、ウイルスまたは微生物ペプチドに由来する。一般に、ＭＨＣクラスＩ分子は細胞内（ウイルス）起源のペプチドをＣＤ８＋  Ｔ細胞に提示し、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子は食作用を受けた（微生物）ペプチドをＣＤ４＋  Ｔ細胞に提示する。更に、「自己」ＭＨＣ分子は「自己」ペプチドも提示するが、これらは通常、Ｔ細胞寛容のために無視される。自己免疫疾患においては、寛容が破綻し、「自己」ペプチドの認識によって慢性炎症、臓器機能の撹乱、または組織破壊が起こると推測される。Ｔ細胞の更なる重要な役割は腫瘍防御の際に起こるもので、Ｔ細胞は抗腫瘍反応を起こしうる。しかしながらこの場合、それらは腫瘍関連抗原を認識する。
【０００４】
多くの研究グループによる様々な技術を適用した膨大な努力にもかかわらず、これまでのところ、Ｔ細胞抗原を決定するための簡便で信頼性があり、偏りのない方法は存在しない。一つの理由は、ストレートな生化学技術（例えば免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィー）を使用できないことであり、これは、ＴＣＲのＭＨＣ／ペプチド複合体への親和性が桁違いに低いことによる。それらの技術は一般に、抗体または慣例的な受容体-リガンド相互作用のためのものであるため、解離定数がナノモルまたはそれ未満の範囲であれば有効に機能するが、解離定数が通常１０-6Ｍより高いＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用では機能しない（Rudolphら（2006）；J.D.Stoneら（2009））。
【０００５】
これまでに、インビトロにおいて、自己免疫抗原または腫瘍抗原に対する既知の、または正当な候補Ｔ細胞株を作製することによって、いくつかの抗原が同定され、その後、合成ペプチドを用いて正確なエピトープがマッピングされた。
【０００６】
他のアプローチでは、腫瘍組織または自己免疫組織のＭＨＣ分子からの抗原ペプチドの溶出、および質量分析による解析が行われた（Coxら, 1994；Fissoloら, 2009）。
【０００７】
第３の方法は、ランダム合成ペプチドライブラリーを用いるものである（Nino-Vasquezら, 2005）。このアプローチは、ＴＣＲ分子が確定された配列または構造ではなく、パターンを認識するという考えに基づく。すなわち、標的構造の認識は多特異性である（「無差別（promiscuous）」または「縮重（degenerate）」ともいう）（Wucherpfennigら, 2007）。それらのライブラリーは、１つの位置を除いて全ての位置に無作為のアミノ酸を含有し、それによって、「認識パターン」、すなわち野生型ペプチドのミモトープを同定することができ、その後、データベース検索によってそれらを同定できる。それらのアプローチは、特異性および多特異性間で好適なバランスを示すＴＣＲに限定される。特異性が高すぎる場合は、少数の活性化ペプチドはライブラリー中で希薄であり過ぎ、特異性が低すぎる場合は、もはやパターンを認識することができない。これらのアプローチは、ＴＣＲの多特異性の程度を判定するのに好適であるが、これまでのところ、ほとんどの場合で、新規の未知抗原の同定はできていない。
【０００８】
第４に、ｃＤＮＡライブラリーが、特に腫瘍Ｔ細胞抗原の研究に用いられてきた。それらは、ＳＶ４０起点を有するプラスミドを介してＣＯＳ細胞にトランスフェクトするか（Van der Bruggenら, 1991；Wongら, 1999；Boonら, 2006）、またはレトロウイルスコンストラクトを介して好適な宿主細胞にトランスフェクトされた（Smithら, 2001）。いずれの場合でも、トランスフェクトした細胞からプラスミドまたはウイルス粒子を回収し、細菌内で増幅することができる。通常、多くのプラスミドプールを用い、陽性プールについて更なるラウンドのトランスフェクションを行い、単一の抗原を有するプラスミドが単離および特性決定されるまでこれを行う。それらの増幅法は、当然、生化学またはコンビナトリアル合成ペプチドライブラリーに比較して有利である。いくつかの腫瘍抗原が検出されたが、それらの方法は、一般的な適用には到っていない。理由は様々である：ライブラリーは通常、罹患組織（多くの場合、入手不能である）に由来し、膨大な数のクローンを、困難かつ高価な細胞毒性アッセイまたはサイトカインアッセイ（これは、多量のＴ細胞を必要とするため、更なる制約となる）によってスクリーニングしなければならない。しかし、最も重要なのは、ｃＤＮＡライブラリーから発現されるタンパク質が、広範かつ正確なプロセシングを必要とすることである。従って、インビトロで使用されるＡＰＣのプロセシング・パターンは、元のＡＰＣのプロセシング・パターンと同一でなければならない。しかし多くの場合、そうはならない。
【０００９】
第５の戦略は、ファージディスプレイ・ライブラリーに関連する。ここでは、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞が、組換えＭＨＣ分子の結合溝にランダムペプチドライブラリーを提示する（Crawfordら, 2004；Wangら, 2005；Crawfordら, 2006）。これらのライブラリーを、蛍光オリゴマー化可溶性ＴＣＲ分子でスクリーニングする。この技術では、クラスＩおよびクラスＩＩ制限的ＴＣＲを活性化することが知られているペプチドのミモトープは明らかになるが、幾分複雑である。最も重大な欠点は、上記のように、ＴＣＲのＭＨＣ／ペプチドリガンドへの親和性が、周知の通り低いことである。これは、陽性昆虫細胞クローンの検出の妨げとなる。ＴＣＲのオリゴマー化により、親和性の上昇によって認識は促進されるが、この制限を完全に克服するものではないと推測される。更に、ライブラリークローニングは、相同組換え（構築されるライブラリーのサイズは限定されている）またはバキュロウイルスＤＮＡへの直接クローニング（サイズが大きいために、困難である）によってのみ可能である。
【００１０】
国際特許WO2003068800号は、ＨＬＡ分子に結合し、ペプチドとＨＬＡ分子の複合体に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する、単離されたペプチドについて記載している。国際特許WO2003068800号では、抗原提示細胞の組換えコンビナトリアル・ペプチドライブラリーでのトランスフェクションは企図されていない。
【００１１】
米国特許第6,037,135号は、ＨＬＡ結合ペプチドの作製法を開示しているが、それらのＭＨＣ分子への負荷、および、それらのペプチドをコードするペプチドライブラリーを介した抗原提示細胞による抗原の提示については、開示していない。
【００１２】
要約すると、過去に使用された種々の技術の中には、場合によって、既知の抗原のミモトープの検出を可能とするものもあったが、これまでに知られていない抗原が発見されたのは、稀なケースだけであった。従って、Ｔ細胞抗原同定の分野における上記の進歩にも関わらず、新規のＴ細胞抗原を偏りなく同定するための、改善された方法を提供する必要性が未だ残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO2003/068800
【特許文献２】WO2003/068800
【特許文献３】US 6,037,135
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この必要性は、特許請求の範囲に記載する態様の規定によって対処される。
【００１５】
従って、本発明は、Ｔ細胞の標的抗原を同定する方法に関し、該方法は
（ａ）以下の細胞（ａａ）および（ａｂ）を接触させ：
（ａａ）以下を発現する細胞：
（ｉ）所定の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を含有する機能性Ｔ細胞受容体複合体；および
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化のリードアウト系
（ａｂ）以下を保有する抗原提示細胞：
（ｉｉｉ）ランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー；および
（ｉｖ）（ｉ）のＴ細胞受容体によって認識されるＭＨＣ分子
（ｂ）該リードアウト系を用いてＴ細胞の活性化を評価し；
（ｃ）リードアウト系がＴ細胞活性化を示している細胞と接触している抗原提示細胞を単離し；
（ｄ）標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定する
ことを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】使用したトランスフェクタントに関する概略図。５８α-β-Ｔ細胞ハイブリドーマを、以下でトランスフェクトすることに成功した：TCR JM22のＴＣＲα鎖およびβ鎖（それぞれ、プラスミドpRSVneoおよびpRSVhygroに挿入されたもの）（58-JM22細胞と称する）、ヒトＣＤ８αおよびβ鎖（ＩＲＥＳ−２配列で連結され、プラスミドpLPC-CD8αIRESβによって作製したレトロウイルスに挿入されたもの）（58-JM22-CD8細胞と称する）、および、パッケージング細胞株ＧＰ＋ＥおよびｓＧＦＰ（pcDNA6に挿入され、ＮＦＡＴの制御下にあるもの）（58-JM22-CD8-sGFP細胞と称する）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてＣＯＳ−７細胞を使用し、これを、プラスミドｐＲＳＶ中のHLA-A2*0201をコードするプラスミドpRSV-A2、および、pcDNArc-library（これは、コントロールペプチドｆｌｕ（５８−６６）をコードするか、または、コンビナトリアル・ランダムペプチドライブラリーの場合は、HLA-A2アンカー位置である２、６、および９位を一定にしたもの）で一過性共トランスフェクトした（それぞれ、pcDNArc-flu(58-66)およびpcDNArc-A2-269と称する）。
【図２】58-JM22-CD8-sGFP細胞とHLA-A*0201でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞との共培養の蛍光顕微鏡分析。58-JM22-CD8-sGFP細胞は活性化すると緑色蛍光を発する。ＣＯＳ−７細胞は、未トランスフェクト細胞（COS-7empty）として使用するか、または、HLA-A*0201での安定的（COS-7-A2stable）もしくは一過性（COS-7-A2trans）トランスフェクションを行った。ペプチドｆｌｕ（５８−６６）を、化学的に合成されたペプチド（flu(58-66)-peptide）として添加するか、または、該ペプチドをコードするプラスミド（pcDNArc- flu(58-66)）としてトランスフェクトした。合成ペプチドhCMV(184-192)（HLA-A*0201に結合するが、TCR JM22によって認識されない）および空プラスミドpcDNA-emptyを陰性コントロールとして使用した。更に、完全長インフルエンザ基質タンパク質（pcDNA-flu(1-252)）でのトランスフェクションも行った。以下のトランスフェクタントを示す：ａ：COS-7-A2stable + flu(58-66)-peptide；ｂ：COS-7empty + flu(58-66)-peptide；ｃ：COS-7-A2stable + pcDNA-flu(58-66)；ｄ：COS-7empty + pcDNA-flu(58-66)；ｅ：COS-7-A2trans + pcDNA-flu(58-66)；ｆ：COS-7-A2trans + pcDNA-empty；ｇ：COS-7-A2trans + pcDNA-flu(1-252)；ｈ：COS-7-A2stable + hCMV-peptide。
【図３】ＨＬＡおよびペプチドでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞との共培養後の58-JM22-CD8-sGFP細胞のＦＡＣＳスキャン。図２と同じ組み合わせである。
【図４】pcDNA-sGFPおよびpRSV-HLA-A2でのＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション。トランスフェクション効率は、内因性ｓＧＦＰ蛍光、および抗体ＢＢ７．２（Proimmune社）でのＨＬＡ−Ａ２の染色によって測定した（黒線、黒塗り部分）。トランスフェクションは全て一過性とした。ｓＧＦＰ分析の場合は、トランスフェクトしていない細胞を陰性コントロールとした。ＨＬＡ−Ａ２分析の場合は、アイソタイプ・コントロール抗体BD-555743を使用した（コントロール：灰色の線、白塗り部分）。ａ：pcDNA-sGFPでの単独トランスフェクション；ｂ：pRSV-HLA-A2での単独トランスフェクション；ｃ：pcDNA-sGFPおよびpRSV-HLA-A2での共トランスフェクション；ｓＧＦＰ分析；ｄ：pcDNA-sGFPおよびpRSV-HLA-A2での共トランスフェクション；ＨＬＡ−Ａ２分析；ｅ：pcDNA-sGFPおよびpRSV-HLA-A2での共トランスフェクション；二重陽性細胞の分析。
【図５】58-JM22-CD8-sGFP細胞と、HLA-A*0201およびプラスミドpcDNArc-A2-269にコードされたライブラリーで共トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞との共培養の蛍光顕微鏡分析。陽性58-JM22-CD8-sGFP細胞は、活性化すると緑色蛍光を発する。陽性細胞の頻度は、非活性化細胞１０6当たり約３個であった。陽性細胞を矢印で示す。ａ：透過光。ＣＯＳ−７細胞（不規則な形状）およびＴＣＲトランスフェクトＴ細胞ハイブリドーマ（円形）を示す；ｂ：ｓＧＦＰ蛍光（４７２ｎｍ−５２０ｎｍ）は活性化ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞ハイブリドーマを示す；ｃ：ＰＥチャネル（５４５ｎｍ−６０５ｎｍ）、蛍光は検出されていない。これは、検出されたｓＧＦＰ蛍光が自己蛍光によるものでないことの証拠である。
【図６】抗原ミモトープの同定につながるプロトコルの概要。まず、活性化された緑色蛍光ＴＣＲトランスフェクタントを、下部の、活性化プラスミドを保有する抗原提示細胞と共に選別採取する。プラスミドの挿入断片をクローニングし、細菌にトランスフェクトする。細菌クローンを計数するために、細菌クローンの画分を寒天プレート上に播種する。その後、５００個の独立した細菌クローンを含有する細菌のサブプールを、３０またはそれ以上作製する。それらをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、再び試験する。陽性サブプールから更なるサブプールを作製する。それらの各サブプールには、より少ないクローンが含有される。最後に、単一細菌クローンを解析する。陽性クローンのシーケンシングを行い、抗原性ミモトープを解明する。
【図７】親ペプチドｆｌｕ（５８−６６）、および、コンビナトリアル・ランダムペプチドライブラリーpcDNArc-A2-269によって発見されたミモトープ＃１−＃４のアミノ酸配列。ミモトープ＃２は２回観察された。このライブラリーでは、２位、６位、および９位のＨＬＡ−Ａ２アンカーをコードするアミノ酸を固定した（灰色のハイライト部分）。ＴＣＲ  ＪＭ２２と接触することが知られている４位、５位、および８位のアミノ酸（Stewart-Jonesら 2003）を、点線の囲み部分で示す。模倣ペプチド中の、親ペプチドと異なるアミノ酸を丸印で示す。
【図８】縮重ＶプライマーによるＶα−／β−鎖の増幅。Ｖαプライマー・セットおよびＶβプライマー・セットを合一した場合の、単一反応で完全長ＴＣＲ  ＶβおよびＶα遺伝子レパートリーを増幅する能力を、多重ＲＴ−ＰＣＲにより、末梢血Ｔ細胞由来のｍＲＮＡを用いて試験した。５００細胞のＲＮＡの転写および増幅を、ワンステップＲＴ−ＰＣＲにより、単一細胞ＰＣＲと同じプロトコルで、９個のＶβプライマーおよび２４個のＶαプライマーのセットを用いて行った。次いで、個別のＶβプライマーまたはＶαプライマーを用い、個別のＰＣＲ反応で、ＰＣＲ産物を増幅した。（Ａ）同じ９個のＶβプライマー（Ｖｐ１−９）およびネステッドＣβプライマーを用い、多重ＰＣＲ産物の０．５μｌ画分をＰＣＲ（９４℃で３０秒／５３℃で３０秒／６８℃で３０秒を３５サイクル、そして、最終伸長を６８℃で１５分）で増幅した。全てのＶｐ１−９プライマー（レーン１−９）で、期待されたサイズのＰＣＲシグナルを得た。（Ｂ）これと同時に、個別の反応で２４個の異なるＶαプライマーを使用して、多重ＰＣＲ産物からＴＣＲ  Ｖαレパートリーを増幅した。Ｖαセミ・ネステッド増幅を、Ｖβ増幅と同様に行った。全てのＶαプライマー（上段および下段のレーン１−１２）で、期待されたサイズのＰＣＲシグナルを得た。（Ｃ）第２のセミ・ネステッドＰＣＲを、ＦＡＭ標識したＣβプライマーおよび個別のＶβ遺伝子ファミリーのプライマーを用いて、第１の多重ＰＣＲから実施した。ＰＣＲ産物をＰＯＰ６ゲルに供し、遺伝子シーケンサーで解析した。全てのＶβファミリーがポリクローナルな分布を示し、これは、多重Ｖβプライマー・セットによっていずれの機能性Ｖβファミリーも増幅できることを示している。
【図９】単一Ｔ細胞からの３段階ＴＣＲ  Ｖβ鎖増幅。第１の前増幅の後、第２のラン・オフＰＣＲ段階を実施してユニバーサル・プライマー部位を導入した。その後、第３のセミ・ネステッドＰＣＲを行い、ユニバーサル・プライマーおよびＣβ（２）ネステッドプライマーを用いてそれぞれの再構成ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子を増幅した。
【図１０】単一Ｔ細胞の単離。単一細胞でのＴＣＲ解析のために、モノクローナル抗体でコーティングした磁気ビーズでＴ細胞を標識し、倒立顕微鏡下で吸引採取し、ＰＣＲバイアルに移してＲＴ−ＰＣＲを行った。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に従って使用する「Ｔ細胞の標的抗原」という用語は、Ｔ細胞によって認識され、これと結合する抗原に関連する。Ｔ細胞への抗原の結合により、該Ｔ細胞の活性化が起こる。Ｔ細胞標的抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ３複合体から成る機能性Ｔ細胞受容体複合体によって認識される。Ｔ細胞標的抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在する主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される。本発明によれば、「Ｔ細胞の標的抗原」はペプチドエピトープをいう。ペプチドエピトープがＭＨＣ分子と複合体を形成している場合は、本明細書では「抗原−ＭＨＣ複合体」と記載する。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される標的抗原は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識され、一般的に、細胞内に由来する（例えばウイルス標的抗原）。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される標的抗原は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞によって認識される。それらは一般的に、食作用を受けた、細胞外に由来するペプチド（例えば、微生物由来のペプチド）である。Ｔ細胞の標的抗原は、ホスト生物にとって外因性のものに由来してもよい（例えばウイルスまたは微生物ペプチド）。標的抗原は、自己由来、例えば腫瘍関連抗原、または、ホスト生物において自己免疫応答を引き起こす自己抗原であってもよい。
【００１８】
好ましい態様では、Ｔ細胞の標的抗原は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の標的抗原である。
【００１９】
本明細書で使用する「機能性Ｔ細胞受容体複合体」という用語は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす能力を有する複合体をいう。Ｔ細胞受容体複合体は、６つのサブユニットから成る。Ｔ細胞受容体は、２つのサブユニット（本明細書では、「鎖」とも記載する）、すなわちＴＣＲαおよびβから成り、これらはジスルフィド結合によってヘテロダイマーを形成しており、ＴＣＲ受容体複合体の可変領域、超可変領域、および結合領域を含有し、これが抗原／ＭＨＣ複合体と相互作用し、それによって単一の抗原結合部位が形成される。Ｔ細胞の亜群では、Ｔ細胞受容体はＴＣＲγおよびδサブユニットから成る。更に、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は保存（定常）領域を有し、それらの領域はＣＤ３複合体タンパク質と相互作用してＴＣＲを膜に固定する。Ｔ細胞受容体複合体は、４つのＣＤ３サブユニットを更に含有する。各ＣＤ３複合体は、１つのＣＤ３γサブユニット、１つのＣＤ３δサブユニット、および２つのＣＤ３εサブユニットを含有する。ＣＤ３εサブユニットの一方はＣＤ３γサブユニットとヘテロダイマーを形成し、他方のＣＤ３εサブユニットはＣＤ３δサブユニットとヘテロダイマーを形成する。抗原の結合によって、それらのＴＣＲヘキサマーが架橋され、活性化される。その後、(鎖によって、更に下流の細胞内化合物にシグナルが伝達される。Ｔ細胞受容体複合体の機能性は当該分野で公知の方法を用いて分析することができ、それらには例えば以下の測定がある：タンパク質および他の細胞内分子（例えばＩＰ３）のリン酸化および脱リン酸化、Ｔ細胞へのCa2+流入、サイトカイン（例えばインターフェロン−γ、インターロイキン（ＩＬ−２  、−４、−６、−１７など）、ＴＮＦ−α）の生成、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の分泌、または標的細胞の細胞死（Smith-Garvinら (2009)；Murphyら"Janeway's Immunobiology" 2008, 第7版）。
【００２０】
本発明によれば、「所定の対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖」という用語は、単一分子タイプのＴ細胞受容体に由来するα鎖およびβ鎖、すなわち、対を成すα鎖およびβ鎖をいう。言い換えると、それらの鎖は、対合して、機能性Ｔ細胞受容体のヘテロダイマーを成す。これに関して使用する「所定の」という用語は、目的のＴ細胞受容体を示すＴ細胞受容体鎖の意図的な選択をいい、本発明の方法によってこれに対して該当する抗原が同定される。好ましくはＴ細胞受容体は脊椎動物Ｔ細胞受容体であり、より好ましくは哺乳動物Ｔ細胞受容体である。更に好ましくは、Ｔ細胞受容体はウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、または霊長類動物由来のＴ細胞受容体である。最も好ましくは、Ｔ細胞受容体はヒトＴ細胞受容体である。
【００２１】
Ｔ細胞受容体鎖は、当該分野で公知の任意の方法によって得ることができる。それらには、例えばSeitzら（2006）に報告されている方法があり、該方法では、形態学的に特性決定されている単一細胞からＴＣＲ鎖をクローニングする。それらの細胞は、例えば生検組織のレーザー・マイクロダイセクションによって、患者から採取したサンプルから得てもよい。更に、配列が既知であるＴ細胞受容体を使用してもよく、その場合は、細胞（ａａ）を、該Ｔ細胞受容体鎖をコードする核酸分子でトランスフェクトすることによって鎖を得てもよい。
【００２２】
本発明によれば、「Ｔ細胞活性化のリードアウト系」という用語は、Ｔ細胞受容体の活性化の際に測定可能なシグナルを生ずる系をいう。通常、Ｔ細胞受容体の活性化により、該Ｔ細胞受容体を発現する個別のＴ細胞の活性化が起こる。従って、リードアウト系によってシグナルが得られれば、これは、抗原提示細胞によって提示された抗原とＴ細胞受容体との結合を介してＴ細胞の活性化が起こったことを示す。細胞（ａａ）において発現されたＴ細胞受容体の該活性化により、シグナル（例えばレポータータンパク質の発現）が生じる。Ｔ細胞の活性化に際して測定可能なシグナルを得るのに好適なレポーター遺伝子の非制限的な例として、酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ（ＸｙｌＥ）、トレハラーゼ（ＴｒｅＡ）、アルカリホスファターゼ、または分泌型アルカリホスファターゼ、並びに、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物がある。それらのリードアウト系は当該分野で公知であり、例えばSuter-Crazzolaraら（1995）またはShanerら（2005）に報告されている。
【００２３】
このように、細胞（ａａ）は、機能性Ｔ細胞受容体複合体、および、Ｔ細胞の活性化を示すリードアウト系の発現を特徴とする。それらの細胞は、Ｔ細胞受容体複合体を含有する任意の細胞（例えば、Ｔ細胞受容体複合体を天然に発現する細胞、または、Ｔ細胞受容体もしくはＴ細胞受容体複合体で形質転換もしくはトランスフェクトした細胞）であることができる。それらの細胞も、Ｔ細胞受容体トランスフェクタントと称する。それらの細胞の非制限的な例として、Ｔ細胞、Ｔ細胞ハイブリドーマ、リンパ腫、および人工的に不死化したＴ細胞がある（Katakuraら（1998））。好ましくは、細胞（ａａ）はＴ細胞ハイブリドーマである。Ｔ細胞ハイブリドーマは当該分野で公知であり、Ozakiら（1988）；Shirahataら（1998）；Chenら（2007）に報告されている方法、または以下の実施例に記載する方法によって得てもよい。
【００２４】
好ましくは、細胞（ａａ）は、単一分子タイプのＴ細胞受容体のみを発現する。それらの細胞は、例えば野生型Ｔ細胞であるか、または、内因性Ｔ細胞受容体を有さず、目的のＴ細胞受容体でトランスフェクトもしくは形質転換されたＴ細胞ハイブリドーマであってもよい。
【００２５】
別の態様では、既に内因性Ｔ細胞受容体を発現している細胞を、目的の、更なるＴ細胞受容体でトランスフェクトまたは形質転換することができる。その場合、目的のＴ細胞受容体を改変して、内因性Ｔ細胞受容体の鎖と目的のＴ細胞受容体の鎖との間でヘテロ２量体化が起こらないようにする。それらの改変は当該分野で公知であり、それらに限定される訳ではないが、目的のＴ細胞受容体鎖の定常領域の接合部分への変異型アミノ酸の導入、または、不均一性が非常に低いＴ細胞（例えばオリゴクローナルまたはモノクローナルＴ細胞集団）をレシピエントとして選択する（Vossら（2008）；Cohenら（2007）；Kuballら（2007）；Weinholdら（2007）；van Loenen ら（2010）；Bendleら（2010））。好ましくは、種々の分子タイプのＴ細胞受容体を発現する細胞を本発明の方法に使用する場合、種々の細胞（例えば、目的のＴ細胞受容体を単一の内因性Ｔ細胞受容体と共に発現する細胞で、該内因性Ｔ細胞受容体が第１のラウンドの、または先のラウンドのスクリーニングで細胞中に含有されていたＴ細胞受容体と異なるもの）を用いて、更なるラウンドのスクリーニングを行う。好ましくは、それらの更なるラウンドのスクリーニングで使用する細胞は、同定される抗原が目的のＴ細胞受容体の抗原であって内因性Ｔ細胞受容体の抗原ではないことを確かにするために、目的のＴ細胞受容体のみを発現するものとする。
【００２６】
本明細書で使用する「抗原提示細胞」という用語は、抗原を、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）との複合体としてその表面上に提示する細胞をいう。ＭＨＣを発現し、抗原を提示するものであれば、いずれの細胞も、本発明にかかる抗原提示細胞として好適である。インビボにおいて抗原提示細胞として作用する可能性のある細胞としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、または活性化された上皮細胞が挙げられるが、線維芽細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、または血管内皮細胞も挙げられる。それらの細胞は、以下に記載するペプチドライブラリーでトランスフェクトまたは形質転換した後、本発明に従って使用することができる。また、ＭＨＣを内因的に発現しない細胞を使用してもよく、その場合、好適なＭＨＣを該細胞に形質転換またはトランスフェクトする。
【００２７】
本発明にかかる「ランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー」という用語は、ペプチドの集合体、すなわちライブラリーをいい、ここで、ペプチドは無作為な配列を有する核酸配列にコードされている。言い換えれば、それらの核酸配列は、ランダムに選択された、可能性のある様々な配列バリエーションを示す。すなわち、ペプチドライブラリーが、例えば９アミノ酸長のペプチドを表す場合、コードする核酸配列は２７ヌクレオチド長であり、つまり、それぞれの可能性のあるヌクレオチドの組み合わせは合計427 = 1.8 x 1016の異なる核酸配列に相当する。好ましくは、ペプチドライブラリーは、少なくとも103個の異なる核酸配列、例えば少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、少なくとも1014個、少なくとも1015個、または少なくとも1016個の異なる核酸配列を有する核酸配列群にコードされる。最も好ましくは、ペプチドライブラリーは、所定のペプチド長についての、全ての可能な順列に相当する核酸配列群にコードされるものである。更に、種々の長さのペプチドを含むペプチドライブラリーも本明細書で企図され、該ライブラリー中にも上記の数の核酸配列群が準用される。
【００２８】
更に、ＭＨＣ複合体の標的抗原の多くで、いわゆるアンカー部位が抗原およびＭＨＣ間の結合に必要であることが知られている。これらのアンカー部位が知られている場合は、それらの位置に一定のアミノ酸を導入し、それ以外の位置だけをランダム化することによって、ランダム核酸配列を作製することができる。種々のＭＨＣのアンカー部位が知られている。その中には、例えば実施例に記載するＨＬＡ−Ａ２があり、アンカー部位は２位のイソロイシン、６位のバリン、および９位のロイシンである（Rammenseeら（1999））。更なるアンカーも当該分野で公知であり、例えばRammenseeら（1999）に報告されている。
【００２９】
本明細書に使用する「ペプチド」という用語は、最大５０個のアミノ酸から成る一群の分子を指す。ペプチドは、２量体、３量体、およびそれ以上のオリゴマーを形成していてもよい、すなわち、１つより多い分子から成ってもよく、それらの分子は同一であっても、同一でなくてもよい。それに伴い、対応するより高次の構造は、ホモ２量体またはヘテロ２量体、ホモ３量体またはヘテロ３量体等と称する。「ペプチド」という用語は（「ペプチド」が「タンパク質」と同義に使用される場合）、天然に修飾されたペプチドを意味し、修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などによってなされる。それらの修飾は当該分野で公知である。好ましくは、ペプチドは最短で少なくとも４アミノ酸長、例えば、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７８アミノ酸長、少なくともアミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、または、少なくとも１０アミノ酸長である。また、好ましくは、ペプチドは最大５０アミノ酸長、例えば最大４５アミノ酸長、最大４０アミノ酸長、最大３５アミノ酸長、最大３０アミノ酸長、最大２５最大アミノ酸長、最大２０アミノ酸長である。明記していないそれらの中間の数も、本明細書で企図される。より好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドは、４から２０アミノ酸長である。従って、該ペプチドは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長であってもよい。また、好ましくは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドは、４から５０アミノ酸長である。クラスＩＩペプチドは、両端がＭＨＣ結合溝の外側に伸長しうるため、原理上は、どれだけ長くてもよい。エピトープ自体は、通常、８から１０アミノ酸長である。従って、該ペプチドは4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸長であってもよい。更に好ましくは、本発明のペプチドは８から１０アミノ酸長である。最も好ましくは、ペプチドは９アミノ酸長である。
【００３０】
本発明にかかる「核酸配列」には、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡが含まれる。理解されるように、本明細書で使用する「ＲＮＡ」という用語は、全ての形態のＲＮＡを含み、好ましくはｍＲＮＡをいう。更に、当該分野で公知の核酸様配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成誘導体、および混合ポリマーは、センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれも含まれる。本発明にかかるそれらの核酸様分子または核酸誘導体には、ホスホロチオエート核酸、ホスホルアミダイト核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、およびロックト核酸（ＬＮＡ）がある（BraaschおよびCorey (2001) Chem Biol. 8, 1参照）。ＬＮＡはＲＮＡ誘導体であり、リボース環が、２’−酸素および４’−炭素間のメチレン結合によって拘束されている。それらが更なる非天然型または誘導型ヌクレオチド塩基を含有してもよいことは、当業者に容易に認識されるところである。
【００３１】
核酸配列のランダム性により、既知の標的配列に基づく考慮は必要とされない。従って、本発明に使用するペプチドライブラリーは、従前技術とは異なる。従前技術では、遺伝子の既知の配列に従って核酸配列を設計しなければならなかったが、本発明のライブラリーでは、完全にランダムな異なるペプチドの集団（それらの配列を事前に知る必要はない）によるスクリーニングによってＴ細胞の標的抗原を探索する。好ましい態様では、ペプチドライブラリー（単数または複数）をコードするランダム核酸配列は、野生型遺伝子をコードしない。つまり、「ランダム核酸配列」という用語は、特定のタンパク質またはｃＤＮＡ（例えばｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）をコードする完全長遺伝子を含まない。
【００３２】
好ましくは、ペプチドライブラリーのペプチドをコードする核酸配列をベクターに導入する。
【００３３】
好ましくは、ベクターはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または、それ以外の（例えば遺伝子操作で慣例的に使用される）ベクターである。本発明の核酸配列を市販のベクターに挿入してもよい。非制限的な例として、以下のような、哺乳動物細胞での発現に適合するベクターが挙げられる：pREP（Invitrogen社）、pcDNA3（Invitrogen社）、pCEP4（Invitrogen社）、pMC1neo（Stratagene社）、pXT1（Stratagene社）、pSG5（Stratagene社）、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR（Clontech社）、pIRES-EGFP（Clontech社）、pEAK-10（Edge Biosystems社）、pTriEx-Hygro（Novagen社）、およびpCINeo（Promega社）。
【００３４】
ベクターの改変法は、SambrookおよびRussel（2001）を参照されたい。一般にベクターは、クローニングまたは発現のための１つまたはそれ以上の複製起点（ｏｒｉ）および遺伝システム、ホストにおける選択のための1つまたはそれ以上のマーカー（例えば抗生物質耐性）、および1つまたはそれ以上の発現カセットを含有することができる。好適な複製起点（ｏｒｉ）には、例えばＣｏｌ  Ｅ１複製起点、ＳＶ４０ウイルス複製起点、およびＭ１３複製起点がある。
【００３５】
ベクターに挿入されるコード核酸配列は、例えば標準的な方法によって合成するか、または天然の供与源から単離することができる。コード配列の転写調節要素および／または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションは、確立された方法を用いて実施することができる。真核細胞において確実に発現させるための転写調節要素（発現カセットの一部）は、当業者に公知である。これらの要素は、転写を開始させる調節配列（例えば翻訳開始コドン、プロモーター、エンハンサー、および／またはインスレーター）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476）、および、必要により、転写の停止および転写物の安定化のためのポリＡシグナルを含有する。更なる調節要素には、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、および／または、天然で結合している、もしくは非相同のプロモーター領域を含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸配列は、それらの発現制御配列に機能的に結合し、それによって真核細胞における発現が可能となる。ベクターは、更なる調節要素として、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を更に含んでもよい。それらの配列は当業者に公知である。更に、使用する発現系によって、発現されたポリペプチドを細胞内コンパートメントに誘導する能力を有するリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加してもよい。それらのリーダー配列は当業者に公知である。
【００３６】
転写開始を確実にするための調節要素の例として考えられるものには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＬａｃＺプロモーター、Ｇａｌ１０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭキナーゼプロモーター、オートグラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus）（AcMNPV）多角体プロモーター、またはＳＶ４０エンハンサーがある。真核細胞における更なる調節要素の例として、核酸配列の下流に位置する転写終了シグナル（例えばＳＶ４０-ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位）またはＳＶ４０、ｌａｃＺ、およびＡｃＭＮＰＶの核多角体病ウイルス（polyhedral）ポリアデニル化シグナルがある。
【００３７】
更に、好ましくは、本発明のベクターは選択マーカーを含有する。選択マーカーの例として、ネオマイシン、アンピシリン、およびハイグロマイシン耐性などがある。特異的に設計したベクターにより、異なるホスト（例えば細菌−真菌細胞または細菌−動物細胞）間でＤＮＡをシャトルすることが可能となる。
【００３８】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸配列およびコードされるペプチドの複製および発現を引き起こす能力を有する。記載した調節要素を含有する好適な発現ベクターは当該分野で公知であり、例えばOkayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia社）、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogene社。別記の実施例で使用したもの）、pSPORT1（GIBCO BRL社）、Gatewayプラスミド（Invitrogen社）、またはpGEMHE（Promega社）がある。
【００３９】
上記の本発明の核酸配列は、直接、または、以下を介して細胞内に導入されるように設計することができる：エレクトロポレーション（例えばMultiporator（Eppendorf社）またはGenepulser（BioRad）を使用）、ＰＥＩ（Polysciences社（米国ウォリントン、ドイツ  エッペルハイム））、Ｃａ2+によるトランスフェクション、または、リポソーム（例えば「リポフェクタミン」（Invitrogen社））、非リポソーム化合物（例えば「Fugene」（Roche社））、リポソーム、ファージベクター、またはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）。更に、バキュロウイルス系、または、ワクシニアウイルスもしくはセムリキ森林熱ウイルスに基づく系を、本発明の核酸配列の真核生物発現系として使用してもよい。
【００４０】
本明細書では、「ＭＨＣ」という用語はＨＬＡと同義に使用する。本発明にしたがえば、「Ｔ細胞受容体によって認識されるＭＨＣ分子」を使用することが必要条件である。従って、ＣＤ８＋  Ｔ細胞標的抗原のスクリーニングを行う場合、細胞（ａｂ）によって発現されるＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩでなければならず、また、ＣＤ４＋  Ｔ細胞標的抗原のスクリーニングでは、ＭＨＣはＭＨＣクラスＩＩでなければならない。更に、細胞（ａａ）によって発現されるＴ細胞受容体によって認識される、特定のＭＨＣを使用する必要がある。検討を行っているＴ細胞受容体によって認識されるＭＨＣをコードする特定のＨＬＡ遺伝子が未知の場合、予備実験を実施し、被験体（例えば患者）の全対立遺伝子から発現させた一連のＭＨＣ（ＨＬＡ）分子全てを、当該分野で十分確立されている方法を用いてスクリーニングしてもよい。それらの方法は、例えば以下に報告されている：Robinson Jら（2003）（ http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/citations.html参照）；Bettinottiら（2003）；Marshら（2010）。
【００４１】
従って、目的のＴ細胞受容体を発現する細胞（ａａ）は、該Ｔ細胞受容体の抗原を提示する細胞（ａｂ）と接触すると、活性化される。Ｔ細胞の活性化はリードアウト系によって観察することができ、これによって、（ａｂ）と（ａａ）との細胞複合体の単離、または、活性化細胞（ａｂ）のみの単離を便宜に行うことができる。細胞の単離方法は、当該分野で公知であり、それらには、限定される訳ではないが、手作業による細胞の選別採取、または、ロボット、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション、またはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）の使用による自動化選別採取がある。それらの方法は、例えば Murray（2007）またはTungら（2007）、並びに、以下の実施例に報告されている。
【００４２】
抗原提示細胞（ａｂ）の単離後、該個別細胞に含有されるペプチドライブラリーのペプチド（単数または複数）をコードする核酸分子を単離する。核酸分子の単離法は当該分野で公知であり、また、代表的な方法を以下の実施例に記載する。標的抗原またはそれをコードする核酸分子を同定する前に、該核酸分子を増幅してもよい。増幅には、例えばＰＣＲ法（更なる詳細は後述する）、および／または、細菌細胞への核酸分子のトランスフェクションおよびその後の細菌培養による核酸分子の増幅がある。
【００４３】
その後、増幅された核酸分子またはそれらの核酸分子にコードされるペプチドを同定する。本発明に関して使用する「同定」という用語は、標的抗原（単数または複数）のアミノ酸配列または核酸配列を決定することをいう。核酸分子の同定法には、それに限定される訳ではないが、核酸シーケンシングがある。
【００４４】
その後、標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定する。
【００４５】
本発明によれば、Ｔ細胞の標的抗原を決定するための、偏りがなく、直接的な方法が提供される。以下の実施例に示すように、短鎖ペプチドをコードする組換えコンビナトリアルライブラリーおよび好適なＭＨＣ-Ｉ分子を細胞（例えばＣＯＳ細胞）に共トランスフェクトすることにより、複雑なタンパク質プロセシングを回避することができる。ライブラリーは、短鎖ペプチドをコードするランダムヌクレオチド配列を含有するプラスミドを含有する。それらのプラスミドは容易に回収できる。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、例えば以下の実施例に示すように、細胞を用いてスクリーニングする。それらの細胞は、機能性ＣＤ３および下流シグナリング分子を保有し、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）を保有する細胞中、ＮＦＡＴの応答要素の制御下で、ＴＣＲα鎖およびβ鎖（Ｔ細胞受容体トランスフェクタント）、ヒトＣＤ８α鎖およびβ鎖、そしてｓＧＦＰで共トランスフェクトしたものである（Fieringra, 1990；KarttunenおよびShastri, 1991）。好ましくは、これらの細胞はＴＣＲでトランスフェクトしたＴ細胞ハイブリドーマである。これは、それらの細胞では無限数の「再生（revived）」Ｔ細胞を得ることができ、より問題の多い「本物の」Ｔ細胞クローンを構築する必要がないためである。
【００４６】
ライブラリーを提示するＣＯＳ細胞の集密単層に、ＴＣＲトランスフェクタントを積層する。特定の単一ＴＣＲトランスフェクタントがライブラリーからのペプチドによって活性化されると緑色が発生し、蛍光顕微鏡下、マイクロマニピュレーターを用いて、下部の該ＣＯＳ細胞を選択採取することができる。この高スループット法によれば、数百万のライブラリーペプチドを数時間以内で試験することができる。この方法は、これまでに報告されている方法、すなわち、プラスミドをトランスフェクトしたＡＰＣのプールで細胞毒性または分泌されたサイトカインを測定する、または、数ラウンドのＦＡＣＳソーティングによって行うものより、効率的である（Van der Bruggenら, 1991；Smithら, 2001；Nino-Vasquezら, 2005；Crawford ら, 2006）。
【００４７】
その後、回収されたＣＯＳ細胞からのライブラリー・プラスミドを単離し、新たなラウンドのスクリーニングを行い、最後にシーケンシングを行うことができる。その後、Ｔ細胞受容体活性化モチーフを解析し、データベース内の既存のタンパク質と比較することができる。この方法の実行可能性は別記の実施例に記載しているが、ここでは、十分研究が行われているＴＣＲ  ＪＭ２２（Gotchら, 1987；Stewart-Jonesら, 2003；Ishizukaら, 2008）を使用しており、このＴＣＲはＨＬＡ−Ａ２およびインフルエンザ基質タンパク質ペプチドｆｌｕ（５８−６６）に特異的である。
【００４８】
本発明の方法の主な利点は、短鎖ペプチドをコードするプラスミドベクターを提供することによって、抗原提示細胞の抗原プロセシング機構に依存しないことである。実施例に示すように、多数の抗原提示細胞がプラスミドｐｃＤＮＡでのトランスフェクション後、コードされたペプチド（例えばｆｌｕ（５８−６６））を効率的に提示する（図２ｃ、ｅ）。また、実施例で実証するように、ペプチド（例えばｆｌｕ（５８−６６））は発現後、それらのＨＬＡ−Ａ＊０２０１への負荷が起こる場所である小胞体内腔に、効率的に輸送される。特筆すべきことに、完全長タンパク質ｆｌｕ（１−２５２）は認識されなかった（図２ｇ）。これは、完全長タンパク質がＣＯＳ７細胞によって正確にプロセシングされないことを示唆しており、ｃＤＮＡライブラリーの一般的な問題、すなわち、それらが選択したＡＰＣのプロセシング機構に依存することを示している。患者病変中の抗原提示に全く類似した状態をインビトロで得ることは不可能であると考えられ、それにはいくつかの理由がある：第１に、多くの場合、いずれの細胞がインサイチューで（自己）抗原を提示するかということさえ知られていない。第２に、例え知られたとしても、元のＡＰＣを回収および増殖することは、ほとんど不可能であるか、少なくとも非常に困難である。第３に、炎症組織における抗原のプロセシングは、健常組織に比較して、変更されている可能性がある（Martinonら, 2009）。このため、同一の親タンパク質から、全く異なるペプチド・スペクトラムが得られうる。第４に、抗原、すなわちｃＤＮＡライブラリーを初代細胞に導入しなければならないが、そのトランスフェクション効率および形質転換効率は非常に低いことが知られている。本明細書に開示する方法は抗原のプロセシングに全く依存しないため、これらの問題は全て解決される。更に、ＣＯＳ細胞は高い有効性でトランスフェクトすることができ、そのサイトゾル中でプラスミドベクターを増幅し、それによって回収および分析が可能となる。
【００４９】
本明細書に開示する結果は、ミモトープを同定し、それによって、天然に存在する親ペプチドを簡単なデータベース検索によって明確に同定できることを実証している。本発明の方法によって得られる、同定済みミモトープのリストは不完全でありうる。その理由は、一部のペプチドはＣＯＳ細胞のサイトゾル中でエンドペプチダーゼもしくはエキソペプチダーゼによって更に消化されるかもしれず、あるいは、他のペプチドは、その化学的特性のゆえに消失するかもしれない、すなわち、疎水性であって膜内に挿入されるか、または、タンパク質もしくは他の細胞成分に結合するかもしれないためである。実際に、化学的に合成したペプチドライブラリーに基づく方法が存在し、これによって、特定のＴＣＲの多特異性について包括的な概要が得られている（Nino-Vasquezら, 2005）。しかしながら、未知の抗原の同定に関する報告は稀である。これはおそらく、化学的に合成されたペプチドを、膨大な数の他のペプチドのプール中でしか分析できないためである。従って、「正しい」ペプチドはライブラリー中に存在するかもしれないが、その濃度が低すぎて検出できない。これに対して、本発明の高スループット法では、数百万個の陰性細胞から単一の活性化細胞を選別採取し、その後、陽性プラスミドを増幅することができる。従って、本発明の方法は実際的である：たとえミモトープのリストが不完全な可能性があっても、データベースで親ペプチドを発見するのに十分なミモトープを得ることができる。
【００５０】
本発明の方法は、ファージライブラリーのスクリーニング法、または、検出手段としてオリゴマー化した可溶性Ｔ細胞受容体を使用する方法（Crawfordら, 2006）を連想させるが、根本的な違いがある。それは、本発明はＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用の親和性の高さに依存しないことである。ファージライブラリーのスクリーニングはいくつかの選別段階を伴うため、相応の親和性が必要とされる。ファージライブラリーの一般的な適用、すなわち、抗体または受容体とリガンドの相互作用の検討では、確かに親和性の高さは十分である。これに対して、Ｔ細胞受容体は、周知の通り親和性が低い。それらは一般に、抗体で観察されるものより数桁低い。ＴＣＲのオリゴマー化によってもこの欠点は解決できず、それは、そのようなアッセイのリードアウトも、感度が中度である結合アッセイであるためである。おそらくこれが、上記のように、未知のＴ細胞抗原がこの方法によって未だ発見されていない理由である。これに対し、本発明は非常に高感度のバイオアッセイを使用する：細胞（例えばＴ細胞ハイブリドーマ）の活性化を測定するが、該細胞は、その抗原提示細胞に弱く結合するだけでよい。このアッセイの驚異的な感度によって、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対するＴ細胞受容体の結合親和性の低さは相殺される。
【００５１】
本発明の方法は、科学的目的のみならず、医学的適用にも関連する。第１に、これは、一般的に適用できる方法である、すなわち、興味の対象であるあらゆるＴ細胞に適用しうる。これはヒトＴ細胞に限定されず、任意の種由来の任意のＴＣＲの抗原認識特性を研究できる。これはもちろん、Ｔ細胞が関与する多くの科学的疑問に関して非常に興味深いものである。技術的には、唯一の条件は、特定のＭＨＣクラスＩ分子が知られているか、または特定のＭＨＣクラスＩＩ分子が知られていることである。そうでない場合は、当該分野で確立された方法（Robinson Jら（2003）；http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/citations.html；Bettinottiら（2003）；Marshら（2010））を用いて、候補となる対立遺伝子の全てから成る完全なセットを予備実験で同定しなければならない。その後、全ての候補ＨＬＡ対立遺伝子を、本明細書に開示する方法で試験することができる。更に、多くの場合に（特にヒト由来サンプルを研究する場合に）大きな問題となる初代細胞の作製は、Ｔ細胞についても抗原提示細胞についても、必要としない。
【００５２】
しかしながら、最も重要な観点は医学分野である。Ｔ細胞は多くの疾病に関与している。それらは感染および腫瘍を撃退し、自己免疫疾患では「自己」組織を攻撃する。ほとんどの場合、その正確な抗原は知られていない。これらのエピトープを知ることにより、科学者はその知識を診断および治療に利用することができる。このように、抗原は、感染および腫瘍を検出し、多くの自己免疫疾患の診断を改善するためのバイオマーカーとなりうる。更に、それらのバイオマーカーは、疾病の進行の予測に大きな価値を有するものでありうる。また、抗原を知ることは、治療的アプローチにも有益である。それらを感染または腫瘍に対するワクチン接種に用いることができる可能性がある（Boonら（2006））。また、それらによって、多くの自己免疫疾患（例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞が重要な役割を果たすことが知られている疾患、すなわち、多発性硬化症、乾癬、炎症性筋疾患、および他の多くの疾患）において、自己攻撃性Ｔ細胞クローンを選択的に除去または調節することが可能となりうる（FrieseおよびFugger, 2009；Dalakas, 2006；WalterおよびSantamaria, 2005）。
【００５３】
更に、抗原についての知見を得ることにより、その標的抗原への親和性を向上させるように操作した、新規の改善型Ｔ細胞受容体の合理的設計および開発が可能となる。それらの改善型Ｔ細胞受容体は、部位特異的変異導入による相補性決定領域中のアミノ酸の置換または導入によって作製することができる。改善型Ｔ細胞受容体を、科学的、診断的、および治療的目的で、インビトロおよびインビボにおけるその抗原の検出に使用することができる。それらを使用して、ある種の抗原を提示する細胞を検出、阻害、または除去（毒性物質をカップリングさせることによって）してもよい。必要により、Ｔ細胞受容体をオリゴマー化して親和性を向上させてもよい。従って、別の態様では、本発明は遺伝子操作したＴ細胞受容体に関し、ここで、アミノ酸は野生型Ｔ細胞受容体と比較して改変されており、該改変によって、改変されていないＴ細胞受容体に比較して標的抗原への親和性が増加している。
【００５４】
更に、特定の抗原の知見を得ることにより、目的とする特定のＴ細胞受容体の改変型ペプチドリガンドの設計が可能になりうる。それらの改変型抗原は、Ｔ細胞寛容を誘導し、特定の抗原ワクチンの免疫原性を向上するのに重要でありうる。改変型および／または改善型Ｔ細胞抗原を合理的に設計する方法は、当該分野で公知である（Fontouraら(2005)；BielekovaおよびMartin (2001)）。
【００５５】
好ましい態様では、本発明の方法は、上記方法の段階（ａ）から（ｃ）を、単一タイプの抗原をコードする単一分子タイプの核酸分子が単離されるまで反復することを含む。従って、段階（ａ）から（ｃ）を、少なくとも更に１回、例えば更に２回、更に３回、更に４回、更に５回、更に６回、更に７回、更に８回、更に９回、または更に１０回反復してもよい。更に多くの回数での段階（ａ）から（ｃ）の反復も、本明細書で企図される。
【００５６】
標準的な方法を用いてペプチドライブラリーを抗原提示細胞（ａｂ）に導入することによって、該細胞内に、コード核酸分子が1コピーより多く存在することになる。更に、培養液中に存在する核酸分子は、段階（ｃ）における該細胞の単離の際、抗原提示細胞と共に移動される。従って、本発明の方法の段階（ａ）から（ｃ）までを1ラウンドだけ実施すると、種々の抗原ペプチドをコードする核酸分子の多種多様なコピーを保有する抗原提示細胞、または、種々の抗原ペプチドをコードする核酸分子の多種多様なコピーが結合する対象となる抗原提示細胞が単離される。段階（ａ）から（ｃ）を反復することにより、正確な標的抗原をその後の段階（ｄ）で同定してもよい。理解されるように、段階（ａ）を反復する際、抗原提示細胞は、前ラウンドのスクリーニングの段階（ｃ）で単離された抗原提示細胞から単離された核酸分子を保有する細胞である。
【００５７】
以下の図６に、単一タイプの抗原をコードする単一分子タイプの核酸分子を得るための、これらの反復法の好ましい実施方法についての概略を示す。簡潔に記載すると、第１の段階で、活性化された緑色蛍光ＴＣＲトランスフェクタントを、その下部にある、活性化プラスミドを保有する抗原提示細胞と共に選別採取する。プラスミドの挿入断片をクローニングし、細菌にトランスフェクトする。細菌クローンを計数するために、細菌クローンの画分を寒天プレート上に播種する。その後、５００個の独立した細菌クローンを含有する細菌のサブプールを、３０またはそれ以上作製する。それらをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、再び試験する。陽性サブプールから更なるサブプールを作製する。それらの各サブプールには、より少ないクローンが含有される。最後に、単一細菌クローンを解析する。陽性クローンのシーケンシングを行い、抗原性ミモトープを解明する。
【００５８】
別の好ましい態様では、細胞（ａａ）は、ＣＤ８鎖、より好ましくはＣＤ８  α鎖およびβ鎖を更に発現する。
【００５９】
細胞（ａａ）上でのＣＤ８の更なる発現は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての役割を果たす。ＣＤ８−αの細胞外ＩｇＶ様ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子のα3部分と相互作用する。この相互作用により、抗原特異的活性化の際、Ｔ細胞受容体発現細胞は、結合する標的細胞と近接した状態に保たれる。従って、本発明によれば、細胞（ａａ）上にＣＤ８を更に発現させることにより、２つの細胞間の相互作用が更に向上する。
【００６０】
本発明の方法の別の好ましい態様では、（ｄ）における標的抗原の同定は、該標的抗原をコードする核酸分子のシーケンシングを含む。
【００６１】
シーケンシング法には、限定される訳ではないが、直接シーケンシング、自動ＤＮＡシーケンサーでの蛍光ＳＳＣＰ、およびパイロシーケンシングによる配列解析法がある。これらの方法は当該分野で公知である。例えば以下参照：Adamsら（編）“Automated DNA Sequencing and Analysis”, Academic Press, 1994；Alphey, “DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics”, Springer Verlag Publishing, 1997；Ramonら, J. Transl. Med. 1 (2003) 9；Mengら, J. Clin. Endocrinol. Metab. 90 (2005) 3419-3422。
【００６２】
より好ましい態様では、該標的抗原をコードする核酸分子を、シーケンシングの前に増幅する。
【００６３】
核酸分子の増幅法には、限定される訳ではないが、ＰＣＲおよびその変法、例えばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲとも呼ばれる）がある。ＰＣＲは当該分野で公知であり、標的配列の多数のコピーを作製するのに使用される。これは、自動サイクラー装置によって行われ、この装置は、非常に短時間で反応液を含有する容器を加熱および冷却できる。ＰＣＲは一般的に、以下から構成されるサイクルを多数回反復することから成る：（ａ）変性段階（ＤＮＡ分子の両鎖を融解させ、前段階の全ての酵素反応を停止させる）；（ｂ）アニーリング段階（融解したＤＮＡ分子鎖にプライマーを特異的にアニーリングさせる）；および（ｃ）伸長段階（テンプレート鎖からの情報を用いて、アニールしたプライマーを伸長させる）。一般的に、ＰＣＲは、例えば以下を含有する５０μｌの反応液中で行うことができる：５μｌの１０ｘ  ＰＣＲバッファー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸、０．５μｌの各プライマー（１０μＭ）、約１０−１００ｎｇのテンプレートＤＮＡ、および１−２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ。増幅のためのプライマーは、標識されていても、未標識であってもよい。ＤＮＡの増幅は、例えばモデル２４００サーマルサイクラー（Applied Biosystems社、カリフォルニア州フォスター）を用い、以下の条件で行うことができる：９４℃で２分間、次いで、アニーリング（例えば５０℃、３０秒間）／伸長（使用するＤＮＡテンプレートの長さおよび酵素により、例えば７２℃、１分間）／変性（例えば９４℃、１０秒間）から成るサイクルを３０−４０サイクル、そして、最終アニーリング段階（５５℃、１分間）並びに最終伸長段階（７２℃、５分間）。ＤＮＡテンプレート共に使用するのに好適なポリメラーゼには、例えばE. coli DNA ポリメラーゼIまたはそのクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、好熱菌から単離された熱安定性DNAポリメラーゼ であるVent、Amplitaq、iProof、Pfu、およびKODがあり、これらの一部は、校正（proof-reading）機能および／または異なる至適温度を有する。しかしながら、特定の核酸分子を増幅するために異なる長さおよび／もしくは組成のプライマーを使用してＰＣＲ条件を最適化する方法、または、反応混液の容量をスケールダウンもしくはスケールアップするための方法は、当業者に公知である。増幅すべき核酸がＲＮＡから成る場合は、「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する。「逆転写酵素」という用語は、デオキシリボヌクレオシド３リン酸の重合化を触媒し、リボ核酸テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を生成する酵素を意味する。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡウイルスを用いて本発明の方法に使用するためのライブラリープラスミドをコードさせる場合に、特に適している。酵素により、プライマーの３’末端で合成が開始され、テンプレートの５’末端に向かって、合成が停止するまで進行する。ＲＮＡ標的配列を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する好適な重合化剤の例として、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素および高度好熱菌（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から販売されている、逆転写酵素活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメ���ーゼ）がある。一般に、最初の逆転写段階の後、第１の変性段階でゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡデュプレックステンプレートを熱変性させ、ＤＮＡ鎖を増幅テンプレートとして使用できる状態にする。高温ＲＴにより、プライマーの特異性が高くなり、効率が向上される。米国特許出願第07/746,121号（１９９１年８月１５日出願）は、「ホモジニアスＲＴ−ＰＣＲ」について開示しており、このＰＣＲでは、逆転写およびＰＣＲ増幅段階の両方を同じプライマーおよびポリメラーゼで行うことができ、反応条件は、試薬を変更せずに両反応が起こるように最適化する。高度好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としても機能する熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ）は、テンプレートにかかわらず、全てのプライマー伸長段階に使用することができる。両過程を、試薬を変更または添加するためにチューブを開けることなく、行うことができる；ただし、温度プロファイルは、第１のサイクル（ＲＮＡテンプレート）と残りの増幅サイクル（ＤＮＡテンプレート）間で調整する。ＲＴ反応は、例えば以下を含有する２０μｌの反応液中で行うことができる：４μｌの５ｘ  ＡＭＶ−ＲＴバッファー、２μｌのオリゴｄＴ（１００μｇ／ｍｌ）、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの総ＲＮＡ、１０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素、およびＨ2Ｏ（最終容量を２０μｌに調整）。反応は、例えば以下の条件を用いて行うことができる：反応液を７０℃で１５分間保持し、逆転写を行わせる。次いで、反応温度を上昇させ、９５℃で１分間、ＲＮＡ−ｃＤＮＡデュプレックスを変性させる。その後、９５℃で１５秒間／６０℃で２０秒間から成るサイクルを２サイクル行った後、９０℃で１５秒間／６０℃で２０秒間から成るサイクルを３８サイクル行う。最後に、反応温度を６０℃４分間保持して最終の伸長段階を行い、１５℃に冷却して、増幅したサンプルを更に処理するまでこの温度を維持する。上記の反応条件はいずれも、特定の状況の必要に応じてスケールアップしてもよい。
【００６４】
当業者は、十分確立された方法を用いて、核酸分子のシーケンシングおよび増幅の両方に好適なプライマーを構築することができる。例えば、プライマーの配列は、ペプチドライブラリーをコードするランダム核酸配列の上流および下流隣接領域、例えば、該核酸配列を挿入したプラスミドバックボーン、ペプチドの発現に使用されるプロモーター配列、または他の調節配列（エンハンサー配列など）に関する知見に基づいて構築してもよい。
【００６５】
本発明の方法の更なる好ましい態様では、（ｄ）の標的抗原の同定は、抗原の少なくとも１つのミモトープを同定することを含む。
【００６６】
本発明によれば、「ミモトープ」という用語は、抗原エピトープの構造を模倣した分子を指す。該分子は、例えばペプチドであってもよい。その模倣性により、ミモトープは、野生型抗原エピトープによって引き起こされるのと同じＴ細胞受容体応答を誘導する。従って、特定の抗原エピトープを認識するＴ細胞受容体は、その抗原エピトープを模倣するミモトープも認識する。好ましくは、ミモトープは、特定のＴ細胞受容体の天然の標的抗原エピトープと、そのアミノ酸構造（例えばアミノ酸配列および組成）において、例えばアミノ酸構造中の４０個未満のアミノ酸、例えば３０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、１５個未満のアミノ酸、１０個未満のアミノ酸、５個未満のアミノ酸、４個未満のアミノ酸、３個未満のアミノ酸、そして最も好ましくは１個のアミノ酸が異なっている。
【００６７】
本明細書で使用する「少なくとも1つのミモトープ」とは、所定の抗原に関する任意数の可能なミモトープをいう。これには、例えば少なくとも２個のミモトープ、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のミモトープが含まれる。また、少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、または少なくとも５００個のミモトープも含まれる。
【００６８】
この態様は、本発明の方法によってミモトープを同定できるという知見に基づき、その後、それをデータベース検索に使用して野生型抗原を同定することができる。このように、本発明の方法によって実際の抗原が直接同定されなくても、後述する実施例のように、該ミモトープを介して間接的に同定できる。
【００６９】
本発明の方法の別の好ましい態様では、抗原提示細胞は、ペプチドライブラリーを増幅する能力を有する細胞である。
【００７０】
本明細書で使用する「ペプチドライブラリーを増幅する能力を有する細胞」という用語は、核酸配列またはベクターを複製する能力のある細胞を指す。それらの細胞は当該分野で公知である。非制限的な例として以下がある：上記のＳＶ４０起点を有するプラスミドを使用する場合、大型Ｔ抗原を含有する細胞；Durocherら（2002）に報告されるＥＢＮＡ系を含む細胞、またはウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス）で形質転換するのに好適な細胞で、それらのレトロウイルスベクターのホストとなり、それらを増幅しうるもの（Smithら（2001））。また、該系を内因的に発現しない細胞を使用してもよく、この場合、細胞は、単に、それぞれの系に必要とされる成分、例えば大型Ｔ抗原でトランスフェクトまたは形質転換してもよい。
【００７１】
本発明によれば、好適な程度の増幅は、最初に該細胞内にトランスフェクトまたは形質転換されたものより、多くのコピーの核酸配列が存在する場合に、達成される。従って増幅が達成されるのは、核酸配列コピーの量が少なくとも２倍、例えば、１つの分子種の核酸配列のコピーが少なくとも５％多く、例えば少なくとも１０％多く、例えば少なくとも２０％多く、例えば少なくとも３０％多く、例えば少なくとも５０％多く、例えば少なくとも１００％多く、例えば少なくとも２００％多く、例えば少なくとも５００％多く、例えば少なくとも１，０００％多く、例えば少なくとも２，０００％多く、例えば少なくとも３，０００％多く、例えば少なくとも４，０００％多く、例えば少なくとも５，０００％多く、例えば少なくとも１０，０００％多く、例えば少なくとも１５，０００％多く、例えば少なくとも５０，０００％多く、例えば少なくとも１００，０００％多く、例えば少なくとも２５０，０００％多く、例えば少なくとも５００，０００％多く、細胞に存在する場合である。
【００７２】
特定の細胞がペプチドライブラリーを増幅する能力を有するか否かを確認するために、該細胞の一部を用いて、トランスフェクション／形質転換の直後に、１つの分子タイプの核酸配列のコピー数について分析することができる。更に、同じ分析を、後の時点（単数または複数）に回収した細胞で反復し、測定されたコピー数を比較してもよい。所定の核酸配列のコピー数の定量または半定量の方法は当該分野で公知であり、それらには、限定される訳ではないが、本明細書に別途記載するＰＣＲ法がある。
【００７３】
より好ましい態様では、抗原提示細胞は以下から成る群から選択される：ＣＯＳ−７、ＨＥＫ、Ｈｅｌａ、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｃ１２７、ＣＯＳ−１、ＣＶ１、ＱＣ１−３、マウスＬ細胞、マウスＣ２Ｃ１２細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｗｉ−３８、ＭＲＣ−５、昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞、Ｈｉ−５細胞）。
【００７４】
別の好ましい態様では、リードアウト系はレポータータンパク質の活性化を含む。
【００７５】
本明細書で使用する「レポータータンパク質」という用語は、研究対象であるある種の刺激に応答して発現され、容易に検出されるタンパク質をいう。従って、本発明によれば、レポータータンパク質がＴ細胞活性化の際に発現されるのが好ましい。好ましくは、レポータータンパク質は、容易に検出されるタンパク質であり、より好ましくは、研究を行う細胞中に通常存在しないタンパク質である。レポータータンパク質の非制限的な例として、以下がある：β−ガラクトシダーゼ（細菌遺伝子、ｌａｃＺにコードされる）、ルシフェラーゼ（例えば細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、ホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケルシフェラーゼ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；細菌由来）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ；通常、植物で使用される）、並びに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；クラゲ由来）およびその改変体、例えばＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ＋。更なる非制限的例として、以下がある：アルカリホスファターゼまたは分泌型アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−キシロシダーゼ、ＸｙｌＥ（カテコールジオキシゲナーゼ）、ＴｒｅＡ（トレハラーゼ）、並びに、サンゴ由来発光タンパク質、例えばＤＳＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ。
【００７６】
更に、レポータータンパク質は、抗生物質耐性を与えるタンパク質であってもよい。この場合、好ましくは、細胞を抗生物質の存在下で培養し、レポータータンパク質を発現するクローンだけが増殖できるようにする。一般に、タンパク質は以下のような抗生物質に対する耐性に関与する：ハイグロマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ブラスチサイジン、ゼオシン、ヒスチジノール、メトトレキサート、キサンチン／ヒポキサンチン−アミノプテリン−ミコフェノール酸含有培地（Ｇｐｔ選択）、ＨＡＴ選択、トリプトファン未含有インドール培地、またはフレオマイシン（R.Vile (1991) Meth Mol.Biol. 8:49-60）。
【００７７】
より好ましい態様では、レポータータンパク質は、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物から成る群から選択される。
【００７８】
より好ましくは、レポータータンパク質は、以下から成る群から選択される：ＧＦＰおよびＧＦＰの改変体、例えばＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ＋、ｓＧＦＰ、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、ホタル・ルシフェラーゼ、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、およびサンゴ由来発光タンパク質、例えばＤＳＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ。
【００７９】
本発明は更に、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および／または、結合領域をコードする核酸分子を同定する方法に関し、該方法は、αβT細胞受容体を発現するＴ細胞から得た該核酸分子を、SEQ ID NO:1-9に示すプライマーから選択されるプライマーまたはプライマー・セットを用いて増幅することを含む。
【００８０】
本発明の他の方法に関する上記の定義および好ましい態様は、このＴ細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法、並びに、以下に記載するそれらの好ましい態様にも準用される。
【００８１】
好ましくは、Ｔ細胞は単一のＴ細胞、すなわち、個別のＴ細胞または個別のＴ細胞をクローン増殖したものである。すなわち、Ｔ細胞は単一の分子タイプの細胞のみを示す。
【００８２】
本発明の方法によれば、当該分野で公知の方法（例えば、本明細書に記載する方法）を用いて、Ｔ細胞から核酸分子を得る。
【００８３】
本明細書で使用する「セット」という用語は、プライマーを組み合わせたものをいう。本発明のプライマー・セットは、１つより多い分子種のプライマーが存在することを必要とする。従って、SEQ ID NO:1-9のプライマーから選択される、少なくとも２つの異なるプライマー、例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つの異なるプライマーが、プライマー・セットに含まれる。
【００８４】
本発明によれば、Ｔ細胞受容体のＶβ-プライマーを、種々の機能性Ｖβ遺伝子ファミリーの配列相同性に基づいて同定した。プライマー位置は、直接シーケンシングによってそれぞれのＴＣＲ  Ｖβ遺伝子を同定できるようなものである。更に、ＰＣＲ増幅の際に起こりうる相互作用を最小限にするように、Ｖβレパートリーのプライマー間での調整および２４個のＶαプライマーとの調整を行った。９個のＶβ-プライマーのセット（Ｖｐ１-９。表１）は、全ての機能性Ｖβ遺伝子を網羅する。リーダーセグメントに位置するＶｐ１以外は、全てのプライマーがＶβ遺伝子セグメントに位置する。Cβ（ｏｕｔ）-プライマー（SEQ ID NO:11）と組み合わせ、これらのプライマーのそれぞれから、対応する再構成Ｖβ遺伝子が効率的に増幅されたことが、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって明らかとなった（図８Ａ）。
【００８５】
【表１】
2013535209.tif 000003
【００８６】
Ｔ細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法の好ましい態様では、増幅は、Ｃβ（ｏｕｔ）-プライマー（SEQ ID NO:11）の使用を更に含む。
【００８７】
【表２】
2013535209.tif 000004
【００８８】
Ｔ細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法の更なる好ましい態様では、この方法は、対合するＴ細胞受容体α鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定することを更に含み、同定は、SEQ ID NO:15-38のプライマーから選択されるプライマーまたはプライマー・セットを用いて該核酸分子を増幅することによって行う。
【００８９】
SEQ ID NO:15-38に示す２４個のＴ細胞受容体Ｖα-プライマーは、最近、ＴＣＲ  Ｖαレパートリーの増幅に関して報告されたものであるが（Seitz, Schneiderら,2006）、それらを表３に示す。
【００９０】
【表３】
2013535209.tif 000005
【００９１】
好ましい態様では、増幅はＣα  ｏｕｔ-プライマー（SEQ ID NO:10）の使用を更に含む。
【００９２】
Ｔ細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法のより好ましい態様では、この方法は以下の段階：
（ｉ）
（ａ）SEQ ID NO:1-9のプライマー；および／もしくは
（ｂ）SEQ ID NO:15-38のプライマー
を含有するプライマー・セットを用いて核酸分子を増幅し；
（ｉｉ）SEQ ID NO:39-47のプライマーを含有するプライマー・セットを用いて、（ｉ）（ａ）の反応産物を増幅し；そして／または、
（ｉｉｉ-ａ）
（ａ）SEQ ID NO:13のプライマー；および
（ｂ）SEQ ID NO:14のプライマー
を用いて（ｉｉ）の反応産物を増幅し；そして／または、
（ｉｉｉ-ｂ）
（ａ）SEQ ID NO:48-83のプライマー・セット；および
（ｂ）SEQ ID NO:12のプライマー
を用いて（ｉ）（ｂ）の反応産物を増幅する
ことを含む。
【００９３】
【表４】
2013535209.tif 000006
【００９４】
【表５】
2013535209.tif 000007
【００９５】
上記の方法により、第1段階（段階（ｉ））において、２４個のＶα特異的プライマーおよび９個のＶβ特異的プライマー（Ｖｐ１-Ｖｐ９）（これらは、機能性αおよびβ  ＴＣＲ可変領域遺伝子の全てを網羅する）を含有するプライマーのプールを用いて、目的の細胞から単離したｃＤＮＡから、全てのＶα鎖および／またはβ鎖を同時に増幅することが可能となる。第２の段階、すなわち段階（ｉｉ）では、前増幅産物から、個別の再構成ＴＣＲ  Ｖβ鎖を増幅する。２３個という多数の異なるＶβ遺伝子サブファミリーを使用して１つのサンプル中でＶβ特異的ネステッドＰＣＲを行うことはできないため、段階（ｉｉ）では、ユニバーサル・プライマー配列をＴＣＲ  β鎖  ＰＣＲ産物の５’末端に導入する。これを行うために、ユニークな２１ヌクレオチド長配列を、プライマー相互作用またはヒト遺伝子との相同性を有さないように設計し、９個の異なるＶｐ（Ｖｐ１−９）プライマーの５’末端に付加した（本明細書ではＶｐ＋プライマーと称する）。前増幅産物の一部を用い、それらの伸長型プライマーを使用してラン・オフ（run-off）ＰＣＲを行った後、第３のセミ・ネステッドＰＣＲを行う。これは、ユニバーサル・プライマーをネステッドＣβ（２）プライマー（SEQ ID NO:14）と共に使用し、ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーから独立した、個別の単一細胞再構成ＴＣＲ  Ｖβを増幅する（段階（ｉｉｉ-ａ））。このＰＣＲ法を、図９に示す。これと同時に、またはこれに続いて、対応する再構成ＴＣＲ  Ｖαを、異なるネステッドＰＣＲ（すなわち、段階（ｉｉｉ-ｂ））において多重ＰＣＲで前増幅（すなわち、段階（ｉ））から増幅する。好ましくは、Seitzらが報告する個別反応ではなく、表５に示す５つのＶαプライマー・プールを用いて、５つだけの異なるネステッドＰＣＲを行う。その後、増幅された再構成ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖を直接シーケンシングによって特性決定する。
【００９６】
好ましい態様では、上記の方法を行う前に、細胞（好ましくは単一細胞またはクローン増幅した単一タイプの細胞）のｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写段階を行う。それらの逆転写法は公知であり、例えば、ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（例えばＱＩＡＧＥＮ社製）および遺伝子特異的Ｃαおよびβプライマーを用いて行ってもよい。
【００９７】
単一Ｔ細胞の再構成αβ−ＴＣＲペアの分子解析は、約７０個のＴＣＲ  Ｖα領域遺伝子および約５０個のＴＣＲ  Ｖβ領域遺伝子の完全なスペクトラムを包含しなければならない。本発明では、最近ＴＣＲ  Ｖαレパートリーの同時増幅に関して報告された２４個のＴＣＲ  Ｖαプライマーのセット（Seitz, Schneiderら, 2006）と共に、ＴＣＲ  β鎖レパートリーの種々のＶβ遺伝子ファミリーの全てを増幅できるＰＣＲ法を構築した。この方法の複雑さは、特異的増幅に干渉しうる、多数のプライマー間で起こりうる相互作用に起因する。本発明では、１つの反応で全てのＴＣＲ  Ｖα遺伝子およびＶβ遺伝子を前増幅することが可能な多重ＲＴ−ＰＣＲから開始する、ＰＣＲプロトコルを確立した。その後、ＴＣＲ  Ｖα−およびＶβ−ＰＣＲ産物を別々に処理する。
【００９８】
更に本発明は、患者特異的Ｔ細胞抗原の同定法に関し、この方法は、
（Ａ）該患者から得たサンプルからＴ細胞を単離し；
（Ｂ）（Ａ）で単離したＴ細胞から対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定し；そして、
（Ｃ）本発明の方法に従って、Ｔ細胞抗原を同定し、ここで、機能性Ｔ細胞受容体およびＴ細胞活性化のリードアウト系を含有する細胞は、（Ｂ）で同定された、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現する、
ことを含む。
【００９９】
本発明の方法に関連する上記の定義および好ましい態様は、この患者特異的Ｔ細胞抗原同定法にも準用される。
【０１００】
この患者特異的Ｔ細胞抗原同定法では、Ｔ細胞を患者から単離する。患者からＴ細胞を単離する方法は当該分野で公知であり、それらに限定される訳ではないが、以下によるＴ細胞の単離がある：凍結組織生検サンプルからのレーザー・マイクロダイセクション；手作業またはマイクロマニピュレーターによる、生細胞を有する新鮮な生検標本からの生細胞または死細胞の選択採取；ＦＡＣＳソーティング装置を用いる細胞の単離；限界希釈によるエクスビボ・クローニング（細胞は、あらかじめ好適な腫瘍細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞とするか、または、融合を行わない）（Burgemeister R. (2005) J Histochem Cytochem. 53:409-12；Erickson HSら (2008) Methods Mol Biol. 424:433-48；Dainiak MBら(2007) Adv Biochem Eng Biotechnol. 106:1-18；Tung JWら (2007) Clin Lab Med. 27:453-68）。
【０１０１】
次の段階では、該細胞内で発現したヘテロ２量体Ｔ細胞受容体を同定する。Ｔ細胞からのＴ細胞受容体の同定法は当該分野で公知であり、それらに限定される訳ではないが、以下がある：クローン特異的プライマーを使用するＰＣＲによるＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖の増幅（例えば鎖の一方の配列が知られている場合。例えばＣＤＲ３スペクトラタイピング（Pannetierら（1995））またはＴＣＲの可変領域上のエピトープを認識する抗体を使用する免疫組織化学による）、または、多数の異なる（例えば未知の）ＴＣＲ鎖を増幅させることができる１つもしくはそれ以上のＰＣＲプライマー・セットを用いるＰＣＲによるＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖の増幅。それらの方法には、それに限定される訳ではないが、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域をコードする核酸分子を同定する上記の本発明の方法があり、例えば、α鎖にはSeitzら（2006）が開示するプライマー、β鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域には本明細書に開示するＶβプライマーを使用する。これ以外に、Ｔ細胞からのＴ細胞受容体の同定法に好適なプライマー・セットには、限定される訳ではないがGenevee（1992）；Monteiroら（1996）；Roersら（2000）；Gagneら（2000）、またはZhouら（2006）に開示されるものがある。その後、このようにして同定されたＴ細胞受容体を、本発明にかかるＴ細胞標的抗原の同定法の細胞（ａａ）に使用し、本発明の方法を上記のように実施する。
【０１０２】
好ましい態様では、患者から単離したＴ細胞は、単一の分子タイプのＴ細胞を示す。更に、好ましくは、それらの細胞から単離したＴ細胞受容体は、単一の分子タイプのＴ細胞受容体を示す。更に好ましくは、態様は、単一細胞中で発現される２つの異なるＴ細胞受容体、すなわち、２つの異なるＶα鎖と１つのＶβ鎖、およびその逆を有するＴ細胞受容体に関連してもよい。
【０１０３】
本発明の患者特異的抗原探索法の主な利点は、非常に複雑なインビボの状態を、インビトロ条件に直接移行できることである。これは非常に興味深いことであり、なぜなら、多くの異なる細胞タイプおよび多くの異なるＴ細胞が炎症性病変に存在するが、それらのごく一部しか、疾病の発症または進行に関係しないからである。炎症性自己免疫病変において特定の目的の個別Ｔ細胞を分析する方法が近年報告された（Seitzら, 2006）。これによって、種々のインビボ条件において、関連Ｔ細胞と非関連Ｔ細胞を識別することが可能となる：例えば、関連Ｔ細胞は、自己免疫疾患における自己攻撃性Ｔ細胞、腫瘍性疾患における腫瘍浸潤性Ｔ細胞、または感染性疾患における抗ウイルスＴ細胞であってもよい。非関連細胞は、非特異的に炎症環境に誘引されるバイスタンダー細胞、血管中の細胞、または免疫サーベイランスの際のパトローリングＴ細胞であってもよい。選択した個別のＴ細胞を、例えば凍結組織生検サンプルからのレーザー・マイクロダイセクション、または他の上記の単一細胞単離法によって単離し、その対合するＴＣＲα鎖およびβ鎖をクローニングし、５８α-β-Ｔ細胞ハイブリドーマ株で発現させることができる。この検出法を本明細書に記載する抗原探索法と併用し、推定される病原性Ｔ細胞または有益Ｔ細胞の抗原を、直接的で、迅速かつ安価な高スループットアッセイで特性決定することができる。それらのＴ細胞受容体をトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞には、「本物の」Ｔ細胞またはＴ細胞株を使用する他の方法とは異なり、実質的に細胞数の制限がないという利点があり、これは、ハイブリドーマ細胞が迅速かつ確実に増殖するためである。
【０１０４】
患者特異的Ｔ細胞抗原同定法の好ましい態様では、対合するＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を段階（Ｂ）で同定し、これは、該Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域を上記の本発明の方法に従って同定することによって行う。
【０１０５】
以下の実施例４に詳述するように、本明細書に開示するプライマーまたはプライマー・セットを使用する本発明の方法により、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および／または結合領域を、対合するα鎖と併せて同定することが可能となる。
【０１０６】
本発明はまた、本発明の方法によって同定されるＴ細胞抗原、そして／または、本発明の患者特異的Ｔ細胞抗原同定法によって同定されるＴ細胞抗原を含有する組成物にも関する。
【０１０７】
本発明に関連して使用する「組成物」という用語は、本発明に従って同定されたＴ細胞抗原を少なくとも１つ含有する組成物を指す。必要により、本発明のＴ細胞抗原の特性を改変する（例えばＴ細胞抗原を安定化する）能力を有する分子を更に含有してもよい。組成物は固体、液体、または気体であってもよく、特に、粉末（単数または複数）、錠剤（単数または複数）、溶液（単数または複数）、またはエアロゾル（単数または複数）であってもよい。
【０１０８】
上記のように、本発明の方法によって同定されるＴ細胞抗原は、感染および腫瘍の検出、および自己免疫疾患の診断向上のためのバイオマーカーとしての役割を果たし、疾病進行の予測に非常に有用である。更に、該Ｔ細胞抗原は治療的アプローチに有用である：それらを感染または腫瘍に対するワクチン投与に使用することができ、それによって、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症、乾癬、炎症性筋疾患、および他の多くの疾患）において、自己攻撃性Ｔ細胞クローンを選択的に除去または調節することが可能となりうる。従って、本発明の組成物は、（例えばワクチンに使用するための）Ｔ細胞活性化能を有してもよく、または、（例えばＴ細胞クローンの除去に使用するための）Ｔ細胞中和能を有してもよい。
【０１０９】
好ましい態様では、組成物は医薬組成物である。
【０１１０】
本発明によれば、「医薬組成物」という用語は、患者（好ましくはヒト患者）に投与するための組成物をいう。本発明の医薬組成物は、上記の化合物、すなわちＴ細胞抗原を含有する。本発明の医薬組成物は、必要により、また、付加的に、医薬的に許容されるキャリアおよび／または賦形剤を含有してもよい。「医薬的に許容されるキャリアおよび／または賦形剤」とは、非毒性の固体、半固体、または液体である充填剤、希釈剤、カプセル化のための物質、または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。好適な医薬キャリアおよび／または賦形剤の例は当該分野で公知であり、それらには塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液、有機溶媒、例えばＤＭＳＯなどがある。好ましくは、キャリア／賦形剤は非経口キャリア／賦形剤であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張の溶液である。キャリア／賦形剤は、少量の添加剤（例えば等張性および化学安定性を向上する物質）を必要に応じて含有する。それらの物質は、使用する用量および濃度でレシピエントに毒性を示さないものであり、以下がある：バッファー（例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはその塩）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満）の（ポリ）ペプチド（例えばポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖類、二糖類、および他の糖質（例えばセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えばマンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えばナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧ）。慣例的な賦形剤には、結合剤、充填剤、潤滑剤、および湿潤剤がある。また、保存剤および他の添加剤を含有してもよく、それらには、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどがある。更に、医薬組成物は、企図される医薬組成物の使用法によって、更なる物質を含有してもよい。特に好ましくは、該医薬組成物は、当該分野で公知の、（ワクチンに使用する場合はＴ細胞活性の活性化によって、または、Ｔ細胞の中和／除去に使用する場合はＴ細胞活性の中和によって）Ｔ細胞活性に作用する物質を更に含有する。本発明の医薬組成物は上記のＴ細胞抗原に基づくものであるため、上記の更なる物質は、単に補助的に、例えば単剤として使用される場合に推奨される用量より低い用量で使用するか、または必要とされるＴ細胞の量を低減させるために使用され、それによって、更なる物質またはＴ細胞抗原にいずれかによってもたらされる副作用を低減するのが好ましい。
【０１１１】
本明細書で使用する「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および輸液を含む投与方式を指す 。
【０１１２】
それらのキャリアおよび／または賦形剤を含む組成物は、公知の慣例的な方法によって調製できる。一般に、製剤は、医薬組成物の成分を液体キャリア／賦形剤もしくは微粉化した固体キャリア／賦形剤、またはその両方と、均質かつ十分に接触させることによって調製する。その後、必要により、生成物を所望の製剤に成形する。
【０１１３】
それらの医薬組成物は、好適な用量で被験体に投与できる。投与計画は、担当医および臨床学的因子によって決定される。医学分野で公知のように、各患者への投与量は多くの因子、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、および、同時に投与する他の薬剤などに依存する。所定の状況での治療的有効量は、慣例的な試験によって容易に決定され、通常の臨床従事者または医師の技術および判断の範囲内である。一般に、医薬組成物の定期的投与としての治療計画は、１μｇから２０ｇユニット／日の範囲である。しかしながら、より好ましい投与量は、 0.01mg−100mg／日、より好ましくは 0.01mg−50mg／日、そして最も好ましくは0.01mg−10mg／日の範囲である。本発明の医薬組成物の投与は種々の方法によって行うことができ、それらには例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内、または気管支内投与がある。
【０１１４】
治療のための投与に使用する医薬組成物の成分は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌ろ過メンブレン（例えば０．２ミクロンのメンブレン）を通してろ過することによって、容易に行うことができる。
【０１１５】
医薬組成物の成分は、通常、単回または多回投与容器（例えば密封アンプルまたは密封バイアル）中に、水溶液として、または再溶解して使用するための凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルに５ｍｌの滅菌ろ過済み１％（ｗ／ｖ）水溶液を充填し、得られた混合液を凍結乾燥する。凍結乾燥された化合物（単数または複数）を、注射用静菌水を用いて再溶解し、注射液を調製する。
【０１１６】
より好ましい態様では、本発明の医薬組成物を使用して、ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病を治療する。
【０１１７】
本発明にかかる「ガン」とは、細胞の無制御な分裂、および、浸潤を介する隣接組織への直接増殖、または、転移による遠位への移植（ガン細胞が血流またはリンパ系を通して輸送される）による拡散能を特徴とする、一群の疾病または疾患をいう。ガンの非制限的な例として、リンパ腫、黒色腫、肺ガン、および他の腫瘍浸潤リンパ球を伴う腫瘍がある。
【０１１８】
本明細書で使用する「感染」という用語は、外来種によるホスト生物への有害な定着をいう。感染において、感染生物はホストの供給源を利用し、通常はホストを犠牲にして、増殖しようとする。感染に対するホストの応答が炎症である。
【０１１９】
本発明によれば、細菌感染には、それらに限定される訳ではないが、以下がある：細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳、肺炎球菌性肺炎、サルモネラ症、破傷風、発疹チフス、結核、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、または、種々の微生物病原体による尿路感染。
【０１２０】
本発明によれば、ウイルス感染には、それらに限定される訳ではないが、以下がある：単核症、ヒト免疫不全ウイルス感染症（ＨＩＶ）、水痘、風邪、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、ポリオウイルス感染症、狂犬病、天然痘、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、または黄熱病。
【０１２１】
本発明によれば、真菌感染には、それらに限定される訳ではないが、以下がある：アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、または足白癬。
【０１２２】
本発明によれば、「自己免疫疾患」という用語は、通常身体内に存在する物質および組織に対する、身体の過剰なＴ細胞介在性免疫応答によって起こる疾病を指す。自己免疫疾患は当業者に公知であり、それらに限定される訳ではないが、以下がある：リウマチ性関節炎、多発性硬化症、炎症性大腸炎、I型糖尿病、乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性（ハシモト）甲状腺炎、およびベーチェット症候群。
【０１２３】
別の好ましい態様では、本発明の組成物は診断用組成物である。
【０１２４】
本発明によれば、「診断用組成物」という用語は、各患者の本発明の医薬組成物への応答可能性、または本発明の医薬組成物による治療可能性を診断するための組成物をいう。本発明の診断用組成物は、上記のＴ細胞抗原を含有する。診断用組成物は、上記のように好適なキャリアおよび／または賦形剤を更に含有してもよい。診断用組成物は、１つまたは複数の容器に入れられてもよい。
【０１２５】
上記のように、Ｔ細胞抗原は、感染および腫瘍の検出、および自己免疫疾患の診断向上のためのバイオマーカーとして、診断用組成物に有用である。更に、それらの疾病の進行をモニタリングするための予後診断としても有用である。
【０１２６】
このように、更なる好ましい態様では、本発明の診断組成物は、ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病の診断に使用するためのものである。
【０１２７】
更に本発明はペプチドライブラリーに関し、該ペプチドライブラリーはペプチドをコードする核酸配列を含有する複数のベクターを含み、該ペプチドはＴ細胞の標的抗原の可能性があるものであり、該核酸配列はランダム核酸配列である。
【０１２８】
本発明の方法に関する上記の定義および好ましい態様は、このペプチドライブラリーにも準用される。
【０１２９】
「複数のベクター」という用語は、１より多い任意数のベクターをいう。従って、複数のベクターは、例えば少なくとも２個のベクター、例えば５個のベクター、少なくとも１０個のベクター、少なくとも１５個のベクター、少なくとも２０個のベクター、少なくとも３０個のベクター、少なくとも４０個のベクター、少なくとも５０個のベクター、少なくとも１００個のベクター、少なくとも２００個のベクター、少なくとも３００個のベクター、少なくとも５００個のベクター、少なくとも１，０００個のベクター、少なくとも５，０００個のベクター、少なくとも１０4個のベクター、少なくとも１０5個のベクター、少なくとも１０6個のベクター、少なくとも１０7個のベクター、少なくとも１０8個のベクター、少なくとも１０9個のベクター、少なくとも１０10個のベクター、または少なくとも１０11個のベクターであってもよい。
【０１３０】
本発明はまた、抗原提示細胞の作製法にも関し、この方法は、細胞を本発明のペプチドライブラリーでトランスフェクトまたは形質転換することを含む。
【０１３１】
この場合も、本発明の方法およびペプチドライブラリーに関する上記の定義および好ましい態様は全て、この抗原提示細胞調製法にも準用される。
【０１３２】
細胞をトランスフェクトまたは形質転換する方法は当該分野で公知であり、限定される訳ではないが以下がある：エレクトロポレーション（例えばMultiporator（Eppendorf社）、Genepulser（BioRad社）を使用）、ウイルス転移（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターを使用）、カルシウムによるトランスフェクション（例えばリン酸カルシウム沈殿）、陽イオン性脂質、ＰＥＩ（Polysciences社、米国ウォリントン、ドイツ  エッペルハイム）、リポソーム（例えば「Ｆｕｇｅｎｅ」（Ｒｏｃｈｅ社）または「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、またはファージベクター。それらの方法は当業界で報告されており、また、以下の実施例にも記載する。
【０１３３】
従って、この抗原提示細胞の作製法により、それらの抗原提示細胞のライブラリーが得られる。そのようなライブラリーを、例えば本発明の方法に使用してもよい。
【０１３４】
本発明は更に、本発明の方法によって得られる抗原提示細胞に関する。
【０１３５】
更に、本発明は、SEQ ID NO:1−9、および／またはSEQ ID NO:39−47、および／またはSEQ ID NO:11および14から成る群から選択されるプライマーまたはプライマー・セットにも関する。
【０１３６】
本発明によれば、個別の細胞または細胞クローンからＴ細胞受容体β鎖をコードする核酸分子を増幅および同定するのに好適な多くのプライマーが同定されている。上に詳述したように、これらのプライマーは、ＰＣＲ反応の際に、互いの、またはα鎖のプライマーとの相互作用の可能性が最小限になるように最適化されている。
【０１３７】
上記の「セット」という用語は、プライマーの組み合わせをいう。本発明のプライマー・セットは、１個より多い分子種のプライマーが存在することを必要とする。従って、少なくとも２個の異なるプライマー、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の、SEQ ID NO:1-9および／またはSEQ ID NO:39-47および／またはSEQ ID NO:11および14のプライマーから選択される種々のプライマーが、プライマー・セットに含有される。
【０１３８】
本発明は更に、本発明のペプチドライブラリーおよび／または本発明のプライマーもしくはプライマー・セットおよび／または本発明の抗原提示細胞（単数または複数）を含むキットにも関する。
【０１３９】
キットの種々の内容物は、１つまたはそれ以上の容器（例えば１つまたはそれ以上のバイアル）に充填することができる。容器またはバイアルは、内容物の他に、保存のための保存剤またはバッファーを含んでもよい。
【０１４０】
好ましくは、本発明のキットは本発明のペプチドライブラリーおよび本発明のプライマーもしくはプライマー・セットを含有する。
【０１４１】
特に記載しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。相反する場合は、定義を含め、本明細書が優先する。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：試料および方法
１．１  プラスミドおよびトランスフェクション
表６に、プラスミド構築に使用したプライマー配列を示す。全ての構築物は、挿入断片全長のシーケンシングを行って確認した。
【０１４３】
【表６−１】
2013535209.tif 000008
【０１４４】
【表６−２】
2013535209.tif 000009
【０１４５】
１．１．１  発現プラスミドpRSVhygro-JM22αおよびpRSVneo-JM22βの構築およびＴＣＲトランスフェクト・ハイブリドーマ細胞（58-JM22細胞）の作製
TRIzol-RS試薬（Gibco/Invitrogen社）を用いて、ボランティアの末梢血からＲＮＡを調製し、Superscript III逆転写酵素（Gibco/Invitrogen社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてＤＮＡを調製した。TCR JM22（Lehnerら, 1995）のα鎖およびβ鎖のＶ領域をＰＣＲで増幅した。変異誘発によってＮ（Ｄ）Ｎ領域を挿入した。クローニングカセットとしてＣ領域を含有するpRSVneoおよびpRSVhygroプラスミドを使用した（Seitz, 2006）。具体的には、以下の２つのα鎖ＰＣＲフラグメントを作製した：第１のフラグメントはＶα１０のリーダー領域からＪ領域までであり（プライマー：JM22-Valpha-forおよびJM22-VJalpha-rev）、第２のフラグメントはＪ領域からＣ領域中のPvuII部位までである（プライマー：JM22-Jalpha-forおよびCalpha-PvuII-rev）。JM22-VJalpha-revおよびJM22-Jalpha-for中のＧｌｙおよびＳｅｒをコードするヌクレオチドをサイレント変異で置換し、ＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ライゲーションを行い、JM22-Valpha-forおよびCalpha PvuII-revを用いる第２のＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩ消化した産物を、クローニングカセットとしてＴＣＲのＣ領域を既に含有させてあるpRSVhygroに挿入した。
【０１４６】
JM22β鎖のクローニングでは、Ｖβ17-Ｊβ2.7陽性クローンをテンプレートとして使用した。これは、既にpRSVneoにクローニングしてあったものである。プライマーJM22-Vbeta-Kpn-forおよびJM22-VJbeta-Sca-revを用いて、Ｖβ１７のＫｐｎＩ部位およびＪβ２．７中のＳｃａＩ部位間の領域を増幅させ、ＰＣＲ産物を上記のプラスミドに導入した。
【０１４７】
両プラスミドをＴ細胞ハイブリドーマ株５８α-β-（Blankら, 1993）にトランスフェクトし、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ社）による選択を行い、Seitzら（2006）が他のＴＣＲ鎖に関して報告しているように、個々のクローンを単離した。得られたＴＣＲトランスフェクト細胞株を58-JM22と称する。
【０１４８】
１．１．２  pLPC-hCD8α-IRES2-hCD8βプラスミドの構築および58-JM22-CD8細胞の作製
プライマー：hCD8a-Not-for、hCD8a-EcoRI-rev、hCD8b-MluI for、およびhCD8b-Xho-revを用いて、ヒトＣＤ８分子のα鎖およびβ鎖をｃＤＮＡから増幅した。α鎖をpQCXIX（Clontech社）のＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、β鎖をＭｌｕＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。pQCXIX（Clontech社）中のpIRES配列を、pIRES2-DsRed2（BD Biosciences社）から切り出したpIRES2で置換した。hCD8α-IRES2-hCD8βを含有するフラグメントをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで切り出し、pLPCX（Clontech社）のＮｏｔＩ／平滑ＣｌａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドpLPC-hCD8α-IRES2-hCD8βをGP+E86パッケージング細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。ヒスチジノール選択下においてＣＤ３  ξ鎖でトランスフェクトした58-JM22ハイブリドーマ細胞を（Blankら, 1993）、レトロウイルス発現GP+E86-CD8αβ細胞と、２日間、共培養した。形質導入した細胞を、１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ社）で選択した。ＣＤ８αβ発現を、ＦＡＣＳにより、抗ＣＤ８α抗体および抗ＣＤ８β抗体、すなわちＢ９．１１および２ＳＴ８−５Ｈ７（Beckman Coulter社）を用いて解析した。得られた、ＴＣＲおよびＣＤ８でトランスフェクトされた細胞株を58-JM22-CD8と称する。
【０１４９】
１．１．３  プラスミドpcDNA6-NFAT-sGFPの構築および58-JM22-CD8-sGFP細胞の作製
ＮＦＡＴ応答要素hrGFP-SV40splice/pA配列を、pNFAT-hrGFP（Stratagene社）から単離した。まず、ＡｃｃＩ消化によって平滑末端を生成し、その後、ＡａｔＩＩで消化した。フラグメントを、ＰｍｅＩおよびＡａｔＩＩで消化したpcDNATM6/V5-His Cにライゲートし、プラスミドpcDNA-NFAT-hrGFPを得た。プライマーsGFP-Eco-forおよびsGFP-Xho-revを用いてsGFP(S65T)（Heimら, 1995）を増幅し、pcDNA-NFAT-hrGFPのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にライゲートして、プラスミドpcDNA-NFAT-sGFPを得た。58-JM22-CD8細胞をトランスフェクトし、３μｇ／ｍｌのブラスチサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で選択し、個々のクローンを選別採取し、抗ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１（ＢＤ社））および HLA-A2-flu(58-66)で刺激した後、ＧＦＰ発現を分析した。得られた、ＴＣＲ、ＣＤ８、およびＮＦＡＴ-ｓＧＦＰでトランスフェクトした細胞株を58-JM22-CD8-sGFPと称する。
【０１５０】
１．１．４  プラスミドpRSV-A2およびpHSE3'-A2の構築
ＨＬＡ−Ａ２重鎖のｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、プライマー5'EX1-A-6および3'A-ex8-1 （M.P. Bettinottiら (2003) J.Immunol.Meth. 279:143-148）、および患者ＰＭ１６４８８由来のｃＤＮＡ（Seitz 2006）を用いて増幅した。ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を伸長するためのプライマー（HLA-A0101-leadおよびHLA-A0101-end）を用いて再増幅した後、ＰＣＲ産物を pRSVneoおよびpHSE3'のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した（Pircherら, 1989）。これらのプラスミドを用いて、後述のようにＣＯＳ-７細胞をトランスフェクトした。
【０１５１】
１．１．５  プラスミドpcDNA6-flu(1-252)の構築
基質タンパク質の完全長配列ｆｌｕ（１−２５２）を、開始コドン直前のコザック配列ＣＣＡＣＣ、停止シグナル、およびＮｈｅＩおよびＸｂａＩオーバーハングを有するように合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。フラグメントをpcDNATM6/V5-His A（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した。
【０１５２】
１．１．６  プラスミドpcDNA6-flu(58-66)の構築
粘着オーバーハング、開始コドン直前のコザック配列ＣＣＡＣＣ、および停止シグナルを含有する２本鎖合成リンカーによって、ｆｌｕ（５８−６６）をコードするヌクレオチド配列をpcDNATM3.1zeo(+)（Invitrogen社）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。フォワード鎖flu(58-66)-COS-forおよびリバース鎖flu(58-66)-COS-revを、９５℃で５分間インキュベートしてハイブリダイズさせ、徐々に冷却して、pcDNATM3.1zeo(+)のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位にライゲートさせた。このプラスミドから、ＮｈｅＩ-ＸｂａＩフラグメントをpcDNATM6/V5-His AのＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位にライゲートさせた。
【０１５３】
１．１．７  プラスミドpcDNA6rc-spacerの構築
プラスミドpcDNArc-spacerを、複雑なライブラリーのためのレシピエント・プラスミドとして設計した。まず、レア切断酵素、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩの制限部位をpcDNATM 6/V5-His A （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニング部位に導入した。これを行うために、pcDNATM/V5-His AをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、リンカーオリゴヌクレオチドpcDNArc-MCS-forおよびpcDNArc-MCS-revをpcDNATM6/V5-His AのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にライゲートしてプラスミドpcDNArcを得た（「ｒｃ」は「レアカッター（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｅｒ）」を意味する）。
【０１５４】
２つの制限部位、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩは非常に接近しているため、その後のＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ消化を容易にするために、無関係なＤＮＡフラグメントを挿入した。そのため、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩでの消化によって、プラスミドpLNCX2（Clontech社）から２５１４ｂｐのフラグメントを切り出し、ＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ消化したプラスミドpcDNArcにこれを挿入した。その後、得られたプラスミド「pcDNArc-spacer」を、ライブラリーおよびｆｌｕ（５８−６６）のレシピレント・プラスミドとして使用した。
【０１５５】
１．１．８  プラスミドpcDNA6rc-flu(58-66)の構築
ｆｌｕ（５８−６６）をコードするヌクレオチド配列を、pcDNA6rcのＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入した。ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩの粘着オーバーハング、開始コドン直前のコザック配列ＣＣＡＣＣ、および停止シグナルを有する２本鎖合成リンカーを生成した。フォーワード鎖N27-flu-Asc-forおよびリバース鎖N27-flu-Not-revを９５℃で５分間インキュベートしてハイブリダイズさせ、徐々に冷却し、消化したpcDNA6rc-spacerにライゲートさせた。pcDNA6rc-flu(58-66)は、全ての試験において、pcDNA6-flu(58-66)と全く同じ挙動を示した。
【０１５６】
１．１．９  プラスミドpcDNArc -N27-allおよびpcDNArc -N27-A2-269の構築
ランダムペプチドライブラリーを作製するために、以下の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した：N27-all-lib-Asc-for（完全にランダムな９アミノ酸のライブラリー用）；およびN27-A2-269-lib-Asc-for（ｆｌｕ（５８−６６）の３つの固定アンカー位置、すなわち２位のイソロイシン、６位のバリン、および９位のロイシンを有する９アミノ酸ライブラリー用）。オリゴヌクレオチドは全て、制限部位ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ、開始コドン直前のコザック配列ＣＣＡＣＣ、および停止配列を含有する。
【０１５７】
短鎖プラスミドN27-Not-revのアニーリングおよびその後のフィルイン反応によって、これらのプラスミドから２本鎖を作製した。ライブラリーをコードしているプラスミドおよびN27-Not-revをアニールさせるため、それぞれを５μＭの濃度で含有する溶液（10mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl（pH=8.2）中）を１００℃で５分間インキュベートし、１時間以内に室温まで徐々に冷却した。その後、等量の上記バッファー（ｄＮＴＰおよびＴａｑ−ポリメラーゼ（共にＲｏｃｈｅ社）を、それぞれ最終濃度２００μＭおよび５Ｕ／１００μｌとなるように調整して含有させたもの）を添加し、混合液を徐々に加熱し、６０℃で５分間、次いで６３℃で４分間、その後６５℃で４分間、最後に６８℃で１時間加熱した。その後、２本鎖をＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、pcDNArc-spacerのＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入した。
【０１５８】
１．１．１０  プラスミドpcDNA-sGFPの構築
トランスフェクション法の効率を測定するために、ＮＦＡＴ応答要素を含有しないｓＧＦＰのクローニングを行った。pcDNA-NFAT-sGFPをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｓＧＦＰ配列を単離し、pcDNATM6/V5-HisA（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲートした。
【０１５９】
１．１．１１  合成ペプチド
インフルエンザ基質タンパク質アミノ酸５８−６６（ｆｌｕ（５８−６６）：GILGFVFTL）およびヒト・サイトメガロウイルス・フラグメントｐｐ６５アミノ酸１８４−１９２（hCMV-pp65(184-192): NLVPMVATV）に相当するペプチドを、Ｆｍｏｃ化学によって合成し、Ｃ８逆相ＨＰＬＣで精製した。それらの配列が正確であることを、質量分析で確認した。
【０１６０】
１．２  抗原検出アッセイ
１．２．１  細胞のトランスフェクション
58α-β-を、JM-22α鎖およびβ鎖、そして、CD8(-IRES2-βで、トランスフェクトおよび選択した。これは他のＴＣＲ鎖に関する報告に従って行った（Seitzら, 2006）。その後、これらの細胞をプラスミドpcDNA- NFAT-sGFPでトランスフェクトし、３μｇ／ｍｌのブラスチサイジンで安定的トランスフェクタントを選択した。
【０１６１】
２つの異なる方法、すなわち「Ｆｕｇｅｎｅ」によるトランスフェクションおよびエレクトロポレーションを用いて、ライブラリーを含有するプラスミドでＣＯＳ−７細胞を一過性にトランスフェクトした。「Ｆｕｇｅｎｅ」法は非常に効率的であり、平均２００個のプラスミドが１つのＣＯＳ−７細胞に送達される。この方法は、プラスミド・プールのトランスフェクト、または、個別の細菌クローン由来の単一プラスミドの（すなわち抗原探索後期の）トランスフェクトに適している。他方、エレクトロポレーションは、１つのＣＯＳ−７細胞に約３−５個のプラスミドを送達する。従って、エレクトロポレーションを用いる場合、１つの細胞におけるライブラリー・プラスミドの多様性は低い。このため、この方法は、高度に複雑なライブラリーを使用する、抗原探索の初期に適している。留意すべきことに、各ＣＯＳ−７細胞はトランスフェクトされたプラスミドを、２−３日以内に合計約５，０００コピーまで増幅する。結果として、エレクトロポレーション後、それぞれのプラスミド種はかなりの程度まで増幅され、例えば、エレクトロポレーションによって４つの異なるプラスミドがトランスフェクトされると、４つの異なるプラスミド種が１，２５０コピーずつ得られる。これに対してＦｕｇｅｎｅ法では、例えば２００個の異なるプラスミドをトランスフェクトした場合、２００個の異なるプラスミド種が、わずか２５コピーずつ生成する。
【０１６２】
エレクトロポレーション法のプロトコル：エレクトロポレーションによってＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションを行うため、４ｘ１０6細胞をＲＰＭＩで２回洗浄し、０．８ｍｌのハイポオスモラーバッファー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）に再懸濁した。次いで、１６μｇのＤＮＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中）を添加した。共トランスフェクションには、プラスミドpRSV-A2およびpcDNA-flu(58-66)またはpcDNA-flu(1-152)またはpcDNA-A2-269またはpcDNArcを等モル量で使用した。室温において、０．４ｃｍのエレクトロポレーション・キュベット（Eppendorf社）中、「マルチポレーター」トランスフェクション装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を使用して、１２００Ｖ、４０ｍｓで電気パルスを適用した。電気パルスの直後に、加温済みの完全培地に細胞を再懸濁した。いくつかの実験では、細胞を２０ｍＭ  Ｎａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2で２回洗浄した。その後、それらを培養プレートに播種し（０．５−１ｘ１０6細胞／３．５ｃｍ培養プレート）、通常の細胞培養条件下でインキュベートした。
【０１６３】
Ｆｕｇｅｎｅ法のプロトコル：ＦｕｇｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社）によるＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションを、２μｇ  ＤＮＡ：７μｌ  Ｆｕｇｅｎｅの比率で行った。プラスミドpRSV-A2およびpcDNA-flu(58-66)またはpcDNA-A2-269を等モル量で使用した。残留するトランスフェクション複合体を除去するために、トランスフェクションの２４時間後、ＣＯＳ−７細胞をＰＢＳで４回洗浄し、５０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡと共に１時間インキュベートしてトランスフェクション複合体中のプラスミドを置換した後、０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ2と共に２時間インキュベートして残存ＤＮＡを消化した。
【０１６４】
ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクション効率の測定を、for-sGFPまたはpRSV-A2をコードするpcDNA6を用いるＦＡＣＳ解析によって行った。陽性細胞を内因性ｓＧＦＰ蛍光、または抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＢＢ７．２（Proimmune社）での染色によって分析した。最大の発現はトランスフェクション後４８時間から７２時間の間で観察された。
【０１６５】
１．２．２  Ｔ細胞によって認識される抗原を提示する細胞の検出
ＴＣＲをトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞によって認識されるペプチドをコードするライブラリープラスミドを含有するＣＯＳ−７細胞を検出するために、ライブラリーをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を組織培養プレートに約４０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。３７℃で２−３日間インキュベートした後、ほぼ集密となった細胞層をＲＰＭＩ培地で２回洗浄して58-JM22-CD8-sGFP Ｔ細胞ハイブリドーマを積層し、更に１２−１８時間インキュベートした。その後、培養プレートを倒立蛍光顕微鏡（AxioVert200M、Zeiss社。CCD-カメラ（CoolSNAP-HQ、Roper Scientific社）、蛍光ランプ（HXP 120、Visitron社）、および対物レンズ: 5x, NA 0.15; ∞/0, Epiplan-NEOFLUAR; 10x, NA0.45 Plan Apochromat; 20x, NA 0.4; ∞/0-1.5 Achroplan, Korr Ph2を搭載）下で観察した。Ｃｙ３フィルター（励起／発光：545(25)/605(70) nm、Zeiss社）を用いて自発蛍光を確認し、ＧＦＰフィルター（励起／発光：472(30)/520(35) nm、Semrock社  BrightLine）を用いてｓＧＦＰ発現を検出した。手動で検査する代わりに、電動式ｘｙ−ステージ（BioPresision2、Visitron社、ドイツ  プッフハイム）による自動スキャンシステム、および自動画像取得および解析（MetaMorph-Software, V7.7）を用いる。その後、活性化緑色58-JM22-CD8-sGFPハイブリドーマ細胞と接触したＣＯＳ−７細胞を、毛細管（Eppendorf社、customTips Type I。内径１５μｍ）およびマイクロマニピュレーター（Mini 25、Luigs & Neumann社）を用いて選別採取した。採取した細胞を７μｌの２５％アンモニア溶液に添加し、プラスミドを保持しＤＮａｓｅを阻害するために、氷上で最大４時間まで保存した。ＰＣＲ反応の前に、チューブを開けて室温で３０分間放置し、アンモニアを揮発させた。
【０１６６】
１．２．３  抗原をコードするプラスミドの増幅
ｐｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ増幅するために、２ラウンドのネステッドＰＣＲを行った。第１のＰＣＲ反応は、５０−１００μｌで、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）（０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマー）を用いて行った。いくつかの実験では、インナープライマーまたはアウタープライマーを用いる単回ＰＣＲで十分であった。次いで、第１の反応産物の０．０１μｌ相当をテンプレートとし、ｉＰｒｏｏｆポリメラーゼ（Ｂｉｏｒａｄ社）およびインナープライマーを用いてネステッドＰＣＲ反応を行った。MinElute  ＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いてＰＣＲ産物を精製し、プラスミドpcDNA3.1D/V5-His-TOPO（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。ライゲーション産物を、エレクトロポレーションによってDH10B ElectroMax（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフェクトした。
【０１６７】
１．２．４  更なるスクリーニングおよびミモトープの同定
濃縮したミモトープを、更なるラウンドの抗原スクリーニングに供した。ここでは、個別の細菌クローンのプールを使用した（図６）。トランスフェクトした細菌の小画分を寒天培地上で培養し、含まれる細菌数を確認した。画分の大部分をバルク培養した。これから、＞３０のプール（それぞれ約５００個の個別細菌クローンを含有）を懸濁培養液中で培養し、プラスミドを調製した後、フレッシュのＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。これらを再び58-JM22-CD8-sGFP細胞の活性について試験した。陽性プールから、＞３０のサブプール（それぞれ１００個の細菌クローンを含有）を作製し、上記のように試験した。その後、＞３０のサブプール（２０個の個別細菌クローンを含有）でこの操作を反復し、更に、寒天培地上で培養した。これらから、個々の細菌コロニーを選別採取し、試験した。この最終ラウンドの分析で陽性であったプラスミドについて、シーケンシングを行った。
【０１６８】
１．３  ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる単一細胞からのＴＣＲα鎖およびβ鎖ｃＤＮＡの増幅
プロトコル  段階１．１、１．２  （ＲＴ−ＰＣＲ）
単一細胞のｍＲＮＡをＲＴ反応によってｃＤＮＡに転写した。反応は５０℃で３５分間、ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社）および遺伝子特異的ＣαプライマーおよびＣβプライマー（各０．６μＭ）を使用して行った（Ｃプライマー＝Ｃαｏｕｔプライマー＋Ｃβｏｕｔプライマー。表２）。
【０１６９】
プロトコル段階１．３  （第１の多重ＰＣＲ）
Ｖα鎖およびＶβ鎖の同時増幅のためのプライマー・プール（Ｖプライマー）を反応溶液に添加した。プールは２４個のＶα特異的プライマーおよび９個のＶβ特異的プライマー（Ｖｐ１−Ｖｐ９）（各０．０７５μＭ）を含有し（表１および３）、これらは機能性αおよびβＴＣＲ可変領域遺伝子の全てを網羅している。９５℃で１５分間、ホットスタオートポリメラーゼを活性化させた後、ＰＣＲサイクル：９４℃で３０秒間／６０℃で９０秒間／６８℃で６０秒間を、１０サイクル行った。次いで、ＰＣＲサイクル：９４℃で３０秒間／５３℃で９０秒間／６８℃で６０秒間を３０サイクル行い、その後、６８℃で１５分間の最終伸長段階を行った。
【０１７０】
プロトコル段階２．１  （ラン・オフＰＣＲ）
Ｖβ鎖を増幅するために、前増幅産物の１μｌ画分のラン・オフＰＣＲ（９４℃で５分間／５３℃で１５０秒間／６８℃で１５分間）を１サイクル行った。このＰＣＲには、Ｖｐプライマーをベースとし、５’末端にユニバーサルプライマーを含有させたプライマー（Ｖｐ＋プライマー）を使用した。１０μＬの反応溶液には、１ｘＰＣＲバッファー、０．２５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、およびプライマー・プール（各プライマーが０．１μＭ）が含有される。
【０１７１】
プロトコル段階２．２  （第２のセミ・ネステッドＰＣＲ）
Ｃβ特異的ネステッドプライマー（Ｃβ−ｉｎ）およびユニバーサルプライマー（ＵＰ）を用いて「セミ・ネステッド」ＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下から成る：９４℃で２分間の変性段階、９４℃（３０秒間）／５８℃（６０秒間）／６８℃（６０秒間）を５０サイクル、および、６８℃で１５分間の最終伸長段階。
【０１７２】
プロトコル段階３（Ｖａ増幅）
第２のＶα鎖のネステッド増幅を、既に報告されている方法をわずかに改変して行った（Seitzら(2006)）。簡潔に記載すると、１μｌの前増幅プローブを、Ｃαネステッドプライマー（Ｃα−ｉｎ）およびＶαネステッドプライマー・プール（各プライマーが０．１μＭ）を含有するＰＣＲ溶液に添加した。変性（９４℃で２分間）後、タッチダウンＰＣＲを、６１℃、５８℃、および５６℃でのアニーリングを各４サイクル、次いで５３℃でのアニーリングを４０サイクルで行った。アニーリングおよび伸長（６８℃）の時間はそれぞれ１分間、変性時間は３０秒間とし、その後、６８℃で１５分間の最終伸長を行った。Ｃβ／Ｃαネステッドプライマー、および０．５μｌのネステッドＰＣＲ産物を用いて、ＴＣＲβ鎖およびα鎖を直接シーケンシングした。
【０１７３】
実施例２：リードアウト系の特性
ＴＣＲ  ＪＭ２２のα鎖およびβ鎖、ヒトCD8α鎖およびβ鎖、およびｓGFPがNFATによって制御されるレポーターコンストラクトで、Ｔ細胞ハイブリドーマ株５８α-β-の安定的トランスフェクションを行った（58-JM22-CD8-sGFP細胞と称する）（図１）。これらのトランスフェクタントにおいて、抗原刺激後に緑色蛍光が検出されるか否かを試験するために、ＣＯＳ−７細胞をＡＰＣとして使用した。この細胞は、プラスミドｐＨＳＥ３’中のＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ｐＨＳＥ３’−Ａ２）で安定的トランスフェクションを行い、合成ペプチドｆｌｕ（５８−６６）を添加したものである。ＣＯＳ−７接着細胞は、ほぼ集密な単層を形成した。58-JM22-CD8-sGFP細胞を添加し、１６時間後に蛍光顕微鏡（図２ａ）およびＦＡＣＳ（図３ａ）でｓＧＦＰ蛍光を観察した。ｓＧＦＰの明るい蛍光により、58-JM22-CD8-sGFP細胞の５０％以上が活性化されたことが確認された。ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクトしていない空のＣＯＳ−７細胞を使用した場合（図２ｂおよび図３ｂ）、またはｆｌｕ（５８−６６）の代わりに無関係なペプチドｈＣＭＶ（１８４−１９２）を使用した場合（図２ｈおよび図３ｈ）、２５０，０００細胞のうち、陽性58-JM22-CD8-sGFP細胞は１つも観察されなかった。これらの試験は、58-JM22-CD8-sGFP細胞がＨＬＡ−ペプチド複合体の特異的検出のための好適なリードアウト細胞となりうることを示している。
【０１７４】
ＨＬＡで安定的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を、検討対象となるＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれについて作製する必要を回避するために、ＣＯＳ細胞への全てのトランスフェクションを一過性とするようにプロトコルを改変した。第１段階で、ｆｌｕ（５８−６６）が合成ペプチドとして添加される必要があるか否か、または、これがＨＬＡ−Ａ＊０２０１を安定的に発現するＣＯＳ細胞にトランスフェクトするプラスミドにコードされていてもよいか否かを試験した。このため、エレクトロポレーションにより、pHSE3'-A2で安定的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、ｆｌｕ（５８−６６）の発現をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ（pcDNA-flu(58-66)）で一過性スーパートランスフェクションした（図２ｃおよび図３ｃ；プラスミド挿入断片の配列は表６参照）。ｐｃＤＮＡはＳＶ４０複製起点を保有し、これによってＣＯＳ−７細胞において、プラスミドの細胞内増幅が起こる（Gluzman, 1981）。蛍光58-JM22-CD8-sGFPの収量は３１％であり、合成ペプチドを直接添加した試験と比較して、わずかに低かった（図２ａおよび図３ａ）。注目すべきことに、この試験は、ｐｃＤＮＡにコードされるペプチドをＣＯＳ−７細胞の細胞質中で発現することができ、それらは小胞体内腔に効率的に輸送され、そこでＭＨＣクラスＩ分子に負荷されることを直接的に示している。
【０１７５】
次に、pRSV-A2およびpcDNA-flu(58-66)を１：１の比率でＣＯＳ細胞に一過性共トランスフェクトした。５６時間後に58-JM22-CD8-sGFP細胞を添加し、更に１６時間後にその蛍光を観察した（図２ｅおよび図３ｅ）。活性化58-JM22-CD8-sGFPの収量は１３％であり、安定的トランスフェクタントの場合よりわずかに低かった（図２ａおよび２ｄ）。これは、ｐｃＤＮＡ中のpRSV-A2およびGFPを共トランスフェクトしたモデル系でのトランスフェクション効率（１４％）と同程度であり、いずれもＦＡＣＳによって容易に定量を行うことができた（図４）。58-JM22-CD8-sGFP細胞におけるｓＧＦＰの発現を、ライブラリーをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞との共培養を開始してから８時間後に観察したが、発現は１６時間以上の間、安定であった。この間、58-JM22-CD8-sGFP細胞は、その抗原を提示するＣＯＳ−７細胞と密着したままであった。陰性コントロール試験、すなわち、pRSV-A2および挿入断片を有さないpcDNA（pcDNA-empty）を共トランスフェクトした場合（図２ｆおよび図３ｆ）、または、pRSV-A2無しでpcDNA-flu(58-66)だけをトランスフェクトした場合（図２ｄおよび３ｄ）では、58-JM22-CD8-sGFP細胞の活性化は観察されなかった。pcDNA-flu(58-66)の代わりにpcDNA-flu(1-252)、すなわちインフルエンザ基質タンパク質配列の全長をコードするコンストラクトを使用した場合は、陽性細胞は全く同定されなかった（図２ｇおよび図３ｇ）。このことは、ＣＯＳ−７細胞が完全長ｆｌｕ（１−２５２）タンパク質を正確にプロセシングできないことを示している。注目すべきことに、本発明の方法は短鎖ペプチドを用いて試験を行うため、抗原に必要とされる全ての細胞内プロテアーゼ開裂を回避できる。
【０１７６】
実施例３：ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングおよびｆｌｕ（５８−６６）ミモトープの同定
ｆｌｕ（５８−６６）のミモトープを同定するために、ランダムライブラリーを作製した。これらのライブラリーは、５’末端にＫｏｚａｋ配列および開始コドン、そして３’末端に停止コドンが隣接した一連のＮ−ヌクレオチドから成る（表６）。ライブラリーをプラスミドｐｃＤＮＡｒｃに挿入し、pRSV-A2と共にＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクトした。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示される抗原は既に研究が行われているため、３つの固定アミノ酸を導入し、２位、６位、および９位にある３個のＨＬＡ−Ａ２結合アンカーとした（pcDNA-A2-269）（Rammenseeら, 1999）。ｆｌｕ（５８−６６）のＨＬＡ−Ａ２＊０２０１アンカー位、すなわち２位のイソロイシン、６位のバリン、および９位のロイシン（これが主要アンカーである）を固定した。他の全ての位置をランダムとした。ライブラリーをpRSV-A2と共にＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクトし、少数の58-JM22-CD8-sGFP細胞の活性化を観察した（図５ｂ）。蛍光活性化58-JM22-CD8-sGFP細胞と下部にあるＣＯＳ−７細胞が直接接触していることが確認できる（図５ａ）。活性化58-JM22-CD8-sGFP細胞の頻度は、ＣＯＳ−７細胞１００万個当たり、約３個の蛍光細胞であった。
【０１７７】
活性化ペプチドミモトープをコードするｐｃＤＮＡプラスミドを回収するために、蛍光顕微鏡下で毛細管を用い、活性化58-JM22-CD8-sGFP細胞を下部のＣＯＳ−７細胞と共に選別採取した。ＣＯＳ−７細胞は接着細胞であるが、組織培養プレートの底面から回収することができる。58-JM22-CD8-sGFPと、HLA-A2およびpcDNA-A2-2,6,9で共トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞との共培養条件下で、蛍光58-JM22-CD8-sGFP細胞および下部のＣＯＳ細胞の両方を共に選別採取できる。これを蛍光下、またはより好ましくは透過光下で観察することができる。
【０１７８】
選別採取した細胞から、ミモトープをコードする配列をＰＣＲで増幅し、クローニングを行い、pRSV-A2と共にフレッシュのＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクトするか、または、予めHLA-A2での安定的トランスフェクションを行ったＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。その後、58-JM22-CD8-sGFP活性化について試験した。ほとんどの場合、単一のＣＯＳ−７細胞を選別採取することができたが、最初は、多くの異なる挿入断片が回収された。おそらくこれは、トランスフェクション複合体中のプラスミドが培地中で細胞外部に残存し、細胞と共に吸引されるために、一般的に単一のＣＯＳ細胞が１つより多いライブラリープラスミドを含有するためであると考えられる。そのため、細菌クローンの個別のプールを、集団が均一になり、プラスミドの挿入断片のシーケンシングができるようになるまで分析した（図６）。４つのペプチドによって提示される４つの異なるミモトープが同定された（「ｍｉｍｏ−１」から「ｍｉｍｏ−４」；図７）。ｍｉｍｏ−２は独立して２回同定された。このようにして推定されたアミノ酸配列は、１位、３位、および５位のいくつかのアミノ酸がｆｌｕ（５８−６６）と異なっていることが明らかになった。１位および３位のアミノ酸は、HLA-A*0201およびJM22のいずれとも強い相互作用を示さないことが知られている（Stewart-Jonesら, 2003）。５位のアミノ酸置換（ｍｉｍｏ−２：フェニルアラニンからトリプトファンへの置換）は保存的である。しかしながら、興味深いことに、このアミノ酸はＴＣＲ相補性決定領域中のいくつかのループと相互作用する。ミモトープ配列を用い、標準的な条件でＢｌａｓｔ検索を行い、親ｆｌｕ（５８−６６）配列を明確に同定することができた。
【０１７９】
実施例４：単一Ｔ細胞における再構成αβ−Ｔ細胞受容体の解析
４．１  プライマーの設計およびＰＣＲ法
単一Ｔ細胞の再構成αβ−ＴＣＲペアの分子解析は、約７０個のＴＣＲ  Ｖα領域遺伝子および約５０個のＴＣＲ  Ｖβ領域遺伝子の完全なスペクトラムを包含しなければならない。出願人は、近年、ＴＣＲ  Ｖαレパートリーの同時増幅に関して報告された２４個のＴＣＲ  Ｖαプライマー・セットと共に、ＴＣＲ  β鎖レパートリーの全ての異なるＶβ遺伝子ファミリーを同時に増幅できるＰＣＲ法の開発に取り組んだ（Seitz, Schneiderら, 2006）。この方法の複雑さは、特異的増幅に干渉しうる、多数のプライマー間の相互作用の可能性に起因する。出願人は、１つの反応で全てのＴＣＲ  Ｖα遺伝子およびＶβ遺伝子を前増幅することが可能な多重ＲＴ−ＰＣＲから開始する、ＰＣＲプロトコルを確立した。その後、ＴＣＲ  Ｖα−およびＶβ−ＰＣＲ産物を別々に処理する。
【０１８０】
４．２  再構成αβ  ＴＣＲの前増幅
数量を増やさないために、配列アラインメントによって同定された種々のＶβ遺伝子ファミリーの配列相同性を利用してＴＣＲ  Ｖβプライマーを設計した。主要なヌクレオチド配列との１個のミスマッチは許容した。プライマー位置は、それぞれのＴＣＲ  Ｖβ遺伝子がなおも直接シーケンシングによって同定できるように考慮されなければならない。オリゴ解析ソフトウェアプログラムによって、起こりうる相互作用が最小限となるよう、Ｖβレパートリーの全てのプライマー間で、また、２４個のＶαプライマーとの間で調整を行った。
【０１８１】
３０個の異なるVβ遺伝子プライマーを、２４個のVαプライマーと種々に組み合わせて試験した。これによって、最終的に９個のVβプライマーから成るセット（Ｖｐ１−９、表１）が得られ、これは全ての機能性Ｖβ遺伝子を網羅する。リーダーセグメント上に位置するＶｐ１以外は、全てのプライマーがＶβ遺伝子セグメント上に位置する。Ｃβ（１）プライマーと組み合わせ、これらのプライマーのそれぞれから、対応する再構成Ｖβ遺伝子が効率的に増幅されたことが、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって明らかとなった（図８Ａ）。
【０１８２】
Ｖαプライマー・セットおよびＶβプライマー・セットを合一した場合の、単一反応で完全長ＴＣＲ  ＶβおよびＶα遺伝子レパートリーを増幅する能力を、多重ＲＴ−ＰＣＲにより、末梢血Ｔ細胞由来のｍＲＮＡを用いて試験した。前増幅の後、種々の再構成ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーを、２３の異なるネステッドＰＣＲ反応で多重ＰＣＲ産物から増幅した。ＰＣＲには、種々のＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーに特異的な２３個の異なるプライマーおよびＦＡＭ標識したＣβ（２）プライマーを使用し、本質的に報告されている通りに行った。ＰＣＲ産物のフラグメント長を、遺伝子シーケンサーによるスペクトラタイピングによって解析した。各ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーの増幅により、期待されたサイズ範囲のＰＣＲ産物を得た。それらは、ポリクローナルなＴ細胞集団に典型的な再構成ＴＣＲで、ガウス様のフラグメント長分布を示すものであった（図８Ｃ）。
【０１８３】
これと同時に、別々の反応で２４個の異なるＶαプライマーを使用して、多重ＰＣＲ産物からＴＣＲ  Ｖαレパートリーを増幅した。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色から明らかなように、そのそれぞれから、増幅された再構成ＴＣＲ  Ｖαを示す独自のＰＣＲ産物を得た（図８Ｂ）。このように、出願人がαβＴＣＲレパートリーの前増幅のために構築した多重ＲＴ−ＰＣＲの条件により、実際に単一反応で完全長ＴＣＲ  ＶβレパートリーおよびＶαレパートリーの両方を増幅することが可能であった。
【０１８４】
４．３  単一細胞の解析
次の段階では、単一Ｔ細胞の前増幅産物からそれぞれの再構成ＴＣＲ  Ｖβ鎖を増幅することが必要となる。２３個という多数の異なるＶβ遺伝子サブファミリーを使用して１つのサンプル中でＶβ特異的ネステッドＰＣＲを行うことはできないため、ユニバーサル・プライマー配列をＴＣＲ  β鎖  ＰＣＲ産物の５’末端に導入した。これを行うために、ユニークな２１ヌクレオチド長配列を、プライマー相互作用またはヒト遺伝子との相同性を有さないように設計し、９個の異なるＶｐ（Ｖｐ１−９）プライマーの５’末端に付加した。１μｌの前増幅産物を用い、これらの伸長型プライマーを使用してラン・オフＰＣＲを行った（ＰＣＲ容量は１０μｌ）。次いで、第３のセミ・ネステッドＰＣＲを行った。これは、ユニバーサル・プライマーをネステッドＣβ（２）プライマーと共に使用し、ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーから独立した、個別の単一細胞再構成ＴＣＲ  Ｖβを増幅する。ＰＣＲ法を図９に示す。これと同時に、対応する再構成ＴＣＲ  Ｖαを、Seitzらの報告による５つのＶαプライマー・プールを用いる５つの異なるネステッドＰＣＲで、多重ＰＣＲ前増幅産物から増幅した。その後、増幅された再構成ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖を直接シーケンシングによって特性決定した。
【０１８５】
単一Ｔ細胞レベルでのこの方法の効率を試験するために、末梢血Ｔ細胞を、ＣＤ４モノクローナル抗体またはＣＤ８モノクローナル抗体でコーティングした磁気ビーズで標識し、単一のＴ細胞を倒立顕微鏡下で２μｌピペットを用いて吸引採取し、前増幅バイアルに移した。好適な細胞密度に調整すれば、この方法によって、種々の起源の細胞懸濁液から単一のロゼット形成Ｔ細胞を同定および単離することができる（図１０）。
【０１８６】
この方法で、合計９６個のＣＤ４＋末梢血Ｔ細胞および９６個の末梢血Ｔ細胞を回収し、解析した。８２個のＣＤ４＋Ｔ細胞（８５．４％）および７６個（７９．２％）のＣＤ８＋Ｔ細胞で再構成ＴＣＲ  Ｖβが増幅され、ＰＣＲ産物の直接ＤＮＡシーケンシングによって特性決定された。ＴＣＲ  β鎖増幅の効率は８０％以上であった。解析した再構成のうち、Ｖβ１６（これは、一般的に、まれにしか再構成されない）以外の全ての機能性ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーが提示された。他のＴＣＲ  Ｖβ遺伝子ファミリーの発生率はＴＣＲ  Ｖβ遺伝子の平均的な使用量を反映しており、それらのＴＣＲＢＶ遺伝子ファミリーは、一般に単一細胞の解析でもしばしば観察される優位性を示した。再構成β鎖を保有するＴ細胞のそれぞれから、対応するＴＣＲ  α鎖を得、直接シーケンシングによって確認することができた。手作業による単一細胞の吸引採取のあらゆる試みが成功していないことから、出願人は、出願人の方法によって実質的に全ての単一αβＴ細胞から再構成αβＴＣＲペアの分子の特性決定を行うことが可能であると結論づける。
【０１８７】
４．４  乾癬における単一Ｔ細胞の再構成αβＴＣＲの解析
現在の概念によれば、Ｔ細胞が介在する自己免疫疾患は、自己抗原特異的活性化および自己反応性Ｔ細胞のクローン性増殖に起因する。出願人は、開示する試験法によって、炎症組織病変からそれらの病原性クローンＴ細胞を同定し、推定される自己抗原に対する特異性をコードする再構成αβＴＣＲペアを特性決定することができるかどうかを試験した。出願人は、Ｔ細胞が介在する皮膚の自己免疫疾患である尋常性乾癬に着目した。従前の、病変生検由来ＴＣＲ  ｃＤＮＡのランダム増幅、クローニング、およびシーケンシングによる乾癬病変部Ｔ細胞浸潤のＴＣＲ  β鎖レパートリーの解析によって、優占なオリゴクローナルなＴ細胞の増殖は示唆されていたが、個々のＴ細胞の推定されるクローン性およびサブタイプは未だ不明確である。
【０１８８】
病原性自己免疫Ｔ細胞クローンは、ｅｘ  ｖｉｖｏで、病原性Ｔ細胞浸潤中で同一の再構成αβ−ＴＣＲを有する複数のＴ細胞として認識できるものでなければならない。この前提に基づき、単一細胞レベルで、乾癬病変Ｔ細胞クローンを同定し、組織病変内でのその存在を確認するための、段階的なプロトコルを構築した。
【０１８９】
慢性乾癬斑から生検を採取し、２つの切片に分割した。一方はＴＣＲ  β鎖ｃＤＮＡの作製に使用し、他方は培養して、炎症性浸潤からＴ細胞を遊出させた。遊出は２４から４８時間以内に観察された。Ｔ細胞を回収し、ＣＤ４特異的磁気ビーズまたはＣＤ８特異的磁気ビーズで標識し、個別のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＴＣＲ  β鎖解析を行った。単一Ｔ細胞の再構成ＴＣＲα鎖は、Ｔ細胞クローン中でのみ、すなわち、特定の再構成ＴＣＲ  Ｖβ鎖が、複数のＴ細胞の両方で同定されるか、および、他方の生検標本内で同定されるかについて解析した。
【０１９０】
４名の患者からの病変生検をこのようにして試験した。患者＃１ではＣＤ４＋Ｔ細胞を、患者＃２ではＣＤ８＋Ｔ細胞を解析した。４０個のＣＤ４＋のうちの２個（＃１）、または３７個のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの２個（＃２）は、それぞれ、同一の再構成ＴＣＲ  Ｖβおよび再構成ＴＣＲ  Ｖαを有した（表７）。再構成特異的プライマーを、対応するＶβリーダープライマーと共に使用し、ＰＣＲ産物を直接シーケンシングして、再構成ＴＣＲ  Ｖβのそれぞれを、対応する生検サンプルから増幅することができ、これによって、組織病変内で対応するＴ細胞のクローナルな増殖が起きていることが裏付けられた。
【０１９１】
【表７】
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【０１９２】
患者＃３では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を解析した。この患者は、反復性連鎖球菌性アンギーナ（感染性乾癬を引き起こす主な要因である）に伴う乾癬炎症が持続していたため、扁桃摘出を受けていた。血中リンパ球および扁桃腺断片も、同様に解析を行うことができた。１つの特定の再構成αβ−ＴＣＲが、８２個のＣＤ４＋  Ｔ細胞のうち２個で確認され（表７）、３個の再構成αβＴＣＲが、４１個のＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちそれぞれ２個または３個で反復して確認された。これらの再構成ＴＣＲは全て、対応する生検サンプル（他方の切片）中でも同定された。最も興味深いことは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞で繰り返し観察された再構成ＴＣＲ  Ｖβはいずれも、患者のＰＢＬおよび／または扁桃腺組織からも増幅され、このことは、対応するＴ細胞クローンが全身に分布することを示している。
【０１９３】
４．５  表皮および真皮におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンの示差的分布
Ｔ細胞浸潤物の多くは乾癬皮膚病変の真皮コンパートメントに局在するが、乾癬の発症は表皮内のＴ細胞の蓄積に強く依存し、それらの多くはＣＤ８＋である。従って、実際に病原性を示すＴ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞であると言うことができ、これが表皮に侵入して乾癬皮膚病変を促進する必要がある。次の２人の患者では、表皮および真皮内のＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンの示差的クローン分布を解析した。このため、真皮と表皮を剥離し、個別に培地中に播種した。
【０１９４】
単一ＣＤ８＋  Ｔ細胞のコンパートメントに関する解析で、どちらの患者でも、ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンは真皮コンパートメントより表皮コンパートメントで強く示されることが実証された（表８）。患者＃４では、８個の異なる再構成αβ−ＴＣＲが５２個の表皮ＣＤ８＋  Ｔ細胞のうち２個または３個で確認され、４個の再構成αβ−ＴＣＲが、表皮および真皮Ｔ細胞の両方で反復して観察された。患者＃５では、３個の異なる再構成αβ−ＴＣＲが３３個の表皮ＣＤ８＋  Ｔ細胞のうち３、４、または７個で選択的に提示され、２つの表皮再構成αβ−ＴＣＲが真皮Ｔ細胞でも同様に観察された。真皮では、同一の再構成αβ−ＴＣＲを示すＴ細胞クローンは１個（患者＃４）または２個（患者＃５）のみであった。従って、表皮Ｔ細胞は、真皮Ｔ細胞に対してクローン優位性を示した。
【０１９５】
【表８】
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【０１９６】
４．６  ＴＣＲハイブリドーマの作製
クローン増殖したＣＤ８＋  Ｔ細胞の再構成αβＴＣＲペアは、乾癬病変部Ｔ細胞応答の抗原特異性を有すると考えられる。それらを、可能性のある乾癬抗原の同定に使用するために、いくつかの病変ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンの再構成ＴＣＲで、組換えＴＣＲハイブリドーマを作製した。これを行うために、３個の異なるＣＤ８＋クローンの再構成α鎖およびβ鎖をクローニングし、組換えαβ−ＴＣＲクローンとして、マウス５８−／−  Ｔ細胞ハイブリドーマ株において、ヒトＣＤ８分子および緑色蛍光タンパク質と共に、ＮＦＡＴの制御下で安定発現させた。ＣＤ３モノクローナル抗体によって活性化すると、これらのハイブリドーマは十分な量のインターロイキン２（ＩＬ−２）を生成し（ＩＬ−２  Ｅｌｉｓａで測定）、ＵＶ顕微鏡下で緑色蛍光を示した。更に、それらのハイブリドーマは、ケラチノサイト細胞株の細胞、ＨａＣａＴをＨＬＡ−Ｃｗ６（乾癬への罹病性を与える主なリスク対立遺伝子）でトランスフェクトすると、これらの細胞株の細胞によって活性化された。
【０１９７】
参考文献
Bendle,G.M., et al. (2010). Nature Med 16:565-570
Bettinotti, M.P. et al. (2003) J. Immunol. Meth. 279:143-148.
Bielekova and Martin, J Mol Med. 2001 Oct;79(10):552-65: Antigen-specific immunomodulation via altered peptide ligands
Blank,U., Boitel,B., Mege,D., Ermonval,M., and Acuto,O. (1993). Analysis of tetanus toxin peptide/DR recognition by human T cell receptors reconstituted into a murine T cell hybridoma. Eur. J. Immunol. 23, 3057-3065.
Boon,T., Coulie,P.G., Van den Eynde,B.J., and Van der Bruggen,P. (2006). Human T cell responses against melanoma. Annu. Rev. Immunol. 24, 175-208.
Chen, E.H.  et al. (2007) FEBS Letters 581:2181-2193.
Cohen, C.J. et al. (2007) Cancer Res. 67:3898-3903.
Cox,A.L., Skipper,J., Chen,Y., Henderson,R.A., Darrow,T.L., Shabanowitz,J., Engelhard,V.H., Hunt,D.F., and Singluff,C.L. (1994). Identification of a peptide recognized by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines. Science 264, 716-719.
Crawford,F., Huseby,E., White,J., Marrack,P., and Kappler,J.W. (2004). Mimotopes for alloreactive and conventional T cells in a peptide-MHC display library. PLoS Biology 2, 523-533.
Crawford,F., Jordan,K.R., Stadinski,B., Wang,Y.B., Huseby,E., Marrack,P., Slansky,J.E., and Kappler,J.W. (2006). Use of baculovirus MHC/peptide display libraries to characterize T-cell receptor ligands. Immunol. Rev. 210, 156-170.
Dalakas,M.C. (2006). Sporadic inclusion body myositis - diagnosis, pathogenesis and therapeutic strategies. Nature Clinical Practice Neurology 2, 437-447.
Durocher, Y.et al. (2002) Nucl. Acid Res. 30:e9.
Fiering,S., Northrop,J.P., Nolan,G.P., Mattila,P.S., Crabtree,G.R., and Herzenberg,L.A. (1990). Single cell assay of a transcription factor reveals a threshold in transcription activated by signals emanating from the T-cell antigen receptor. Genes Dev. 4, 1823-1834.
Fissolo,N., Haag,S., De Graaf,K.L., Drews,O., Stevanovic,S., Rammensee,H.G., and Weissert,R. (2009). Naturally presented peptides on major histocompatibility complex I and II molecules eluted from central nervous system of multiple sclerosis patients. Mol. Cell. Proteomics 8, 2090-2101.
Fontoura et al. Int Rev Immunol. 2005 Sep-Dec;24(5-6):415-46: Antigen-specific therapies in multiple sclerosis: going beyond proteins and peptides.
Friese,M.A. and Fugger,L. (2009). Pathogenic CD8+ T cells in multiple sclerosis. Ann. Neurol. 66, 132-141.
Gluzman,Y. (1981). SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell 23, 175-182.
Gotch,F., Rothbard,J., Howland,K., Townsend,A., and McMichael,A. (1987). Cytotoxic lymphocytes-T recognize a fragment of influenza-virus matrix protein in association with HLA-A2. Nature 326, 881.
Heim,R., Cubitt,A.B., and Tsien,R.Y. (1995). Improved green fluorescence. Nature 373, 663-664.
Ishizuka,J., Stewart-Jones,G.B.E., Van der Merwe,A., Bell,J.I., McMichael,A.J., and Jones,E.Y. (2008). The structural dynamics and energetics of an immunodominant T cell receptor are programmed by its Vb domain. Immunity 28, 171-182.
Karttunen,J. and Shastri,N. (1991). Measurements of ligand induced activation in single viable T cells using lacZ reporter gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3972-3976.
Katakura, Y. et al. (1998) Meth. Cell Biol. 57:69-91.
Kuball, J. et al. (2007) Blood 109:2331-2338. 
Lehner,P.J., Wang,E.C.Y., Moss,P.A.H., Williams,S., Platt,K., Friedman,S.M., Bell,J.I., and Borysiewicz,L.K. (1995). Human HLA-A0201-restricted cytotoxic T lymphocyte recognition of influenza A is dominated by T cells bearing the Vb17 gene segment. J. Exp. Med. 181, 79-91.
Marsh, S.G. et al. (2010) Tissue Antigens 75:291-455
Martinon,F., Mayor,A., and Tschopp,J. (2009). The inflammasomes: Guardians of the body. Annu. Rev. Immunol. 27, 229-265.
Murphy, K.et al. " Janeway's Immunobiology" 2008, 7th Edition, Garland Science, New York, ISBN 978-0-8153-4123-9
Murray, G.I. (2007) Acta Histochemica  109:171-176. 
Nino-Vasquez,J.J., Allicotti,G., Borras,E., Wilson,D.B., Valmori,D., Simon,R., Martin,R., and Pinilla,C. (2005). A powerful combination: the use of positional scanning libraries and biometrical analysis to identify cross-reactive T cell epitopes. Mol. Immunol. 40, 1063-1074.
Ozaki, S.et al. (1988) J.Immunol. 141:71-78.
Pannetier, C.et al. 1995 Immunol.Today 16:176-181.
Pircher,H, Mak,T.W., Ballhausen,W., Ruedi,E., Hengartner,H., Zinkernagel,R.M., Burki,K. (1989). T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor Vb8.1 chain transgenic mice.  EMBO J. 8, 719-727.
Rammensee,H.-G., Bachmann,J., Emmerich,N.P.N., Bachor,O.A., and Stevanovic,S. (1999). SYFPEITHI: Database for MHC ligands and peptide motifs. IG 50, 213-219.
Robinson J, et al. (2003) Nucleic Acids Research, 31:311-314. 
Rudolph,M.G., Stanfield,R.L., and Wilson,I.A. (2006). How TCRs bind MHC, and coreceptotrs. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466.
Seitz,S., Schneider,C.K., Malotka,J., Nong,X., Engel,A.G., Wekerle,H., Hohlfeld,R., and Dornmair,K. (2006). Reconstitution of paired T cell receptor a- and b-chains from microdissected single cells of human inflammatory tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 12057-12062.
Shaner, N.C. et al. Nat Methods. (2005) 2:905-909.
Shirahata, S. et al. (1998) Meth Cell Biol. 52:111-145. 
Smith,E.S., Mandokhot,A., Evans,E.E., Mueller,L., Borrello,M.A., Sahasrabudhe,D.M., and Zauderer,M. (2001). Lethality-based selection of recombinant genes in mammalian cells: Application to identifying tumor antigens. Nature Med. 7, 967-972.
Smith-Garvin,J.E., Koretzky,G.A., and Jordan,M.S. (2009). T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619.
Stewart-Jones,G.B.E., McMichael,A.J., Bell,J.I., Stuart,D.I., and Jones,E.Y. (2003). A structural basis for immunodominant human T cell receptor recognition. Nature Immunol. 4, 657-663.
Stone, J.D. et al. (2009) Immunology 126:165-176
Suter-Crazzolara, C. et al. Meth. Cell Biol. (1995) 50:425-438. 
Tung, JW et al (2007) Clin Lab Med. 27:453-468
Van der Bruggen,P., Traversari,C., Chomez,P., Lurquin,C., De Plaen,E., Van den Eynde,B., Knuth,A., and Boon,T. (1991). A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254, 1643-1647.
van Loenen,M.M., et al. (2010). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 107, 10972-10977.
Voss, R.H. et al. (2008) J. Immunol. 180:391-401. 
Walter,U. and Santamaria,P. (2005). CD8+ T cells in autoimmunity. Curr. Opin. Immunol. 17, 624-631.
Wang,Y.B., Rubtsov,A., Heiser,R., White,J., Crawford,F., Marrack,P., and Kappler,J.W. (2005). Using a baculovirus display library to identify MHC class I mimotopes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2476-2481.
Weinhold, M. et al. (2007) J. Immunol. 179:5534-5542. 
Wong,F.S., Karttunen,J., Dumont,C., Wen,L., Visintin,I., Pilip,I.M., Shastri,N., Pamer,E.G., and Janeway,C.A. (1999). Identification of an MHC class I-restricted autoantigen in type I diabetes by screening an organ-specific cDNA library. Nature Med. 5, 1026-1031.
Wucherpfennig,K.W., Allen,P.M., Celada,F., Cohen,I.R., De Boer,R., Garcia,K.C., Goldstein,B., Greenspan,R., Hafler,D., Hodgkin,P., Huseby,E.S., Krakauer,D.C., Nemazee,D., Perelson,A.S., Pinilla,C., Strong,R.K., and Sercarz,E.E. (2007). Polyspecificity of T cell and B cell receptor recognition. Semin. Immunol. 19, 216-224.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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