(57)【要約】【解決手段】  本発明は、式(I)を有する化合物に関する。2013502450.tif 0000292013502450.tif 000030  式中、Ａは式(ａ)又は式(ｂ)であり、Ｘは酸素又はメチレンであり、ＹはＣ3-6アルキル又はアリールであり、Ｚは酸素又はＣ1-3アルキルであり、Ｒ1は水素又はＣ1-3アルキルであり、Ｒ2は水素又はＣ1-3アルキルであり、Ｒ3は各々が独立してＣ1-3アルキル又はハロであり、Ｒ4は各々が独立してＣ1-3アルキル又はハロであり、ｐは０〜４、ｑは０〜４、ｍは０又は１、そしてｎは１〜３である。これらの化合物は、癌や他の病気を治療するためのキナーゼ阻害剤として有用である。【選択図】  なし
2013502450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)を有する化合物であって、
【化１８】
2013502450.tif 000020
式中、
【化１９】
2013502450.tif 000021
Ｘは酸素又はメチレン；ＹはＣ3-6アルキル又はアリール；Ｚは酸素又はＣ1-3アルキル；Ｒ1は水素又はＣ1-3アルキル；Ｒ2は水素又はＣ1-3アルキル；Ｒ3は各々が独立してＣ1-3アルキル又はハロ；Ｒ4は各々が独立してＣ1-3アルキル又はハロ；ｐは０〜４；ｑは０〜４；ｍは０又は１；そしてｎは１〜３である、化合物。
【請求項２】
Ａは次の式を有する、請求項１に記載の化合物。
【化２０】
2013502450.tif 000022
【請求項３】
ｐ及び／又はｑは０である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
ｐは１〜４であり、Ｒ3は、各々がメチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルからなる群より選択され、それらのうちいずれもが置換されているか又は置換されておらず、及び／又は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードからなる群より選択される、請求項１又は２の何れかに記載の化合物。
【請求項５】
ｑは１〜４であって、Ｒ4は、各々がメチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルからなる群より選択され、それらのうちいずれもが置換されているか又は置換されておらず、及び／又は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードからなる群より選択される、請求項１、２又は４の何れかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2は水素である、請求項１乃至５の何れかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ2はメチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルからなる群より選択され、それらのうちいずれもが置換されているか又は置換されていない、請求項１乃至５の何れかに記載の化合物。
【請求項８】
ｍは０である、請求項１乃至７の何れかに記載の化合物。
【請求項９】
ｍは１であり、Ｚは酸素であるか又はメチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルのいずれかであり、それらのうちいずれもが置換されているか又は置換されていない、請求項１乃至７の何れかに記載の化合物。
【請求項１０】
ｎは１である、請求項１乃至９の何れかに記載の化合物。
【請求項１１】
ｎは２又は３である、請求項１乃至９の何れかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｙは、置換されているか又は置換されておらず、線形、分岐型又は環状であり、必要に応じて、不飽和のＣ3-6アルキル基であり、該アルキル基は、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルからなる群より選択される、請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物。
【請求項１３】
Ｙはt-ブチル−Ｃ(ＣＦ3)3からなる群より選択される、請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物。
【請求項１４】
Ｙは置換又は非置換のアリール基である、請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘは酸素である、請求項１乃至１４の何れかに記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ1は水素及びメチル基からなる群より選択される、請求項１乃至１５の何れかに記載の化合物。
【請求項１７】
化合物は式(II)を有する、請求項１に記載の化合物。
【化２１】
2013502450.tif 000023
【請求項１８】
化合物は式(III)を有する、請求項１に記載の化合物。
【化２２】
2013502450.tif 000024
【請求項１９】
化合物は式(IV)を有する、請求項１に記載の化合物。
【化２３】
2013502450.tif 000025
【請求項２０】
式(V)を有する、化合物。
【化２４】
2013502450.tif 000026
【請求項２１】
式(VI)を有する、化合物。
【化２５】
2013502450.tif 000027
【請求項２２】
式(VII)を有する、化合物。
【化２６】
2013502450.tif 000028
【請求項２３】
薬剤として用いられる、式(I)を有する化合物。
【請求項２４】
化学療法に用いられる、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
痛み若しくは炎症の予防及び／又は治療、又は痛み若しくは炎症に関連する状態の予防及び／又は治療に用いられる、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】
癌の予防及び／又は治療用の薬剤として用いられる、式(I)を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択されたキナーゼの活性調節能力をもたらすことができる生物学的活性を有する新規な化合物、及び該化合物のキナーゼ阻害剤としての使用に関する。本発明はまた、薬剤として用いられるこれら化合物に関する。そのような薬剤は、癌の予防及び／又は治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
癌はヒトの死の主要原因の一つで、ヒトの全ての死因中およそ８分の１を占めており、この割合は先進国において上昇している。癌による死亡の広がりからみても、癌の予防及び／又は治療に用いられる処方や薬剤に対する要請は、依然として満たされないままである。
【０００３】
癌の発生と進行が細胞キナーゼの過剰活性に関連することは、知られている。例えば、RhoAキナーゼ(ROCK)の活性化が、腫瘍細胞浸潤(tumour cell invasion)のプロセスに関係していることは広く知られている。また、ROCKのようなキナーゼが、癌の発生に関連する悪性形質転換の一因となることも示唆されてきた。
【０００４】
上記から、キナーゼ阻害剤は、癌の予防及び／又は治療において有望な分類としての化合物であることは理解されるだろう。従って、キナーゼ活性の阻害能力を有する新規な化合物に対する要請がある。キナーゼ阻害剤は癌の予防及び／又は治療において特に有効であるが、多発性嚢胞腎及び痛みや炎症を伴う様々な状態を含む他の様々な疾患や病気に対しても有用である。
【０００５】
本発明の目的は、上記課題のうち１又は複数の課題を解消するか又は軽減することである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様において提供される化合物は、次の式(Ｉ)を有する。
【化１】
2013502450.tif 000003
式中、
【化２】
2013502450.tif 000004
Ｘは酸素又はメチレン、
ＹはＣ3-6アルキル又はアリール、
Ｚは酸素又はＣ1-3アルキル、
Ｒ1は水素又はＣ1-3アルキル、
Ｒ2は水素又はＣ1-3アルキル、
Ｒ3は各々が独立してＣ1-3アルキル又はハロ(即ち、ｐが２、３又は４のとき、各Ｒ3置換基は同じでも異なっていてもよく、例えばｐが２のとき、一方のＲ3基はＣ1-3アルキルで、他方のＲ3基はハロ基でもよい)であり、
Ｒ4は各々が独立してＣ1-3アルキル又はハロ(即ち、ｑが２、３又は４のとき、各Ｒ4置換基は同じでも異なっていてもよい)であり、
ｐは０〜４の整数、
ｑは０〜４の整数、
ｍは０又は１、そして
ｎは１〜３の整数である。
【０００７】
式(I)に基づく化合物は、形質転換細胞の成長を阻害する能力を示した。形質転換細胞系(transformed cell lines)は癌細胞のインビトロ(in vitro)モデルであって、形質転換細胞をインビトロで阻害するという化合物の能力により、該化合物を、インビボ(in vivo)で癌の予防及び／又は治療に用いることができることを示している。
【０００８】
本発明の化合物は数多くのキナーゼの活性を阻害し、そのキナーゼには、限定するものでないが、RhoA依存性RhoAキナーゼ("ROCKs"とも呼ばれる)ROCK１及びROCK２、ｐ３８(MAP4K4とも呼ばれる)、HgK(MAPK14とも呼ばれる)、オーロラＡ(AURKAとも呼ばれる)が含まれる。如何なる仮説に制約されるものではないが、発明者らは、キナーゼ活性を阻害する本発明の化合物の能力が、形質転換細胞に対する該化合物の阻害活性に寄与すると考える。
【０００９】
本明細書において、“アルキル”又は“アルキル基”という用語が更なる限定を加えることなく用いられる場合は、置換アルキル基及び非置換アルキル基の両方を含むものと解釈されるべきである。更に、“アルキル”又は“アルキル基”という用語が更なる限定を加えることなく用いられる場合は、線形、分岐型及び環状のアルキル基を含むものと理解される。
【００１０】
本文中、“アリール”又は“アリール基”という用語が更なる限定を加えることなく用いられる場合は、置換アリール基及び非置換アリール基の両方を含むものと解釈されるべきである。炭素環構造の付加物として、及び／又は炭素環構造内にて、あらゆる置換が行われることができ、アリール環構造の少なくとも一つの炭素原子生成部は、非炭素原子と置換されて、例えばピリジニル基などのヘテロアリール環構造が形成される。
【００１１】
本発明の第１の態様の第１の好適な実施例では、Ａが−Ｃ(Ｏ)−Ｘ−Ｙである式(I)の化合物のサブクラスを提供するもので、該サブクラスは式(II)を有する。
【化３】
2013502450.tif 000005
【００１２】
式(I)及び(II)において、Ｒ3は各々が独立してＣ1-3アルキルであることが好ましく、各アルキル基は、必要に応じて置換又は非置換、線形又は分岐型、飽和又は不飽和であってよい。好適なＲ3基は、メチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルである。一又は複数のＲ3基はハロ基であってよく、最も好ましくはフルオロであるが、クロロ、ブロモ又はヨードも含む。
【００１３】
ｐは０〜４の整数であり、０であるときＲ3基は存在せず、ピリジンのオルト−及びメタ−炭素原子の対は両方とも‘非置換’であり、水素原子に結合される。この構造は、以下に述べる本発明の第１の態様の第２及び第３の好適な実施例において示される。
【００１４】
或いは、ｐは１であってもよく、その場合、オルト−又はメタ−ピリジン環炭素原子のうち一つは、水素原子ではなくＲ3基を担持する。
【００１５】
更なる他の実施例として、ｐは２であってもよく、その場合二つのＲ3基は同じでもよいし、異なってもよい。例えば、二つのＲ3基のうち一方がＣ1-3アルキル基(例えばメチル)、他方がハロ基(例えばＦ)であってよい。二つのＲ3基はいずれもピリジン環のオルト位に配置されてもよいし、一方のＲ3基がオルト位に、他方のＲ3基がメタ位に配置されてもよい。
【００１６】
更なる他の実施例においてｐは３であり、その場合三つのＲ3基は各々が同じでもよいし、異なってもよい。また、Ｒ3基のうち二つが同じで残りのＲ3基が異なってもよい。三つのＲ3基のうち二つがオルト位に配置され、残りのＲ3基がメタ位に配置されてもよい。また、三つのＲ3基のうち二つがメタ位に配置され、残りのＲ3基がオルト位に配置されてもよい。
【００１７】
更なる好適な他の実施例においてｐは４であり、ピリジン環のオルト−及びメタ−炭素原子は両方ともＲ3基と置換される。Ｒ3基は四つ全てが同じでもよいし、四つ全てが異なってもよい。Ｒ3基のうち三つが同じで一つが異なってもよい。Ｒ3基のうち二つが同じで他の二つが異なってもよい。また、Ｒ3基のうち二つが同じで、他の二つのＲ3基は、他のＲ3基とは異なり、かつ互いに同じでもよい。
【００１８】
式(I)及び(II)中のＲ4基に関しては、Ｒ4基は各々が独立してＣ1-3アルキルであることが好ましく、各アルキル基は、置換又は非置換、線形又は分岐型であってよい。好適なＲ4基は、メチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルである。一又は複数のＲ4基はハロ基であってよく、最も好ましくはフルオロであるが、クロロ、ブロモ又はヨードも含む。
【００１９】
ｑが０である好適な実施例において、Ｒ4基は存在せず、フェニル環のオルト−及びメタ−炭素原子の対は両方とも‘非置換’、即ち、水素原子に結合される。これは、以下に述べる本発明の第１の態様の第２及び第３の好適な実施例のとおりである。
【００２０】
或いは、ｑは１であり、オルト−又はメタ−フェニル環炭素原子のうち一つは、水素原子ではなくＲ4基を担持する。
【００２１】
更なる他の実施例として、ｑは２であり、その場合二つのＲ4基は同じでもよいし、異なってもよい。例えば、二つのＲ4基のうち一方がＣ1-3アルキル基(例えばメチル)、他方がハロ基(例えばＦ)であってよい。二つのＲ4基はいずれもフェニル環のオルト位に配置されてもよいし、一方のＲ4基がオルト位に、他方のＲ4基がメタ位に配置されてもよい。
【００２２】
更なる他の実施例においてｑは３であり、その場合三つのＲ4基は各々が同じでもよいし、異なってもよい。また、Ｒ4基のうち二つが同じで残りのＲ4基が異なってもよい。三つのＲ4基のうち二つがオルト位に配置され、残りのＲ4基がメタ位に配置されてもよい。また、三つのＲ4基のうち二つがメタ位に配置され、残りのＲ4基がオルト位に配置されてもよい。
【００２３】
ｑが４である更なる好適な他の実施例において、フェニル環のオルト−炭素及びメタ−炭素原子は両方ともＲ4基と置換される。Ｒ4基は四つ全てが同じでもよいし、四つ全てが異なってもよい。Ｒ4基のうち三つが同じで一つが異なってもよい。Ｒ4基のうち二つが同じで他の二つが異なってもよい。また、Ｒ4基のうち二つが同じで、他の二つのＲ4基は、他のＲ4基とは異なり、かつ互いに同じでもよい。
【００２４】
本発明の第１の態様の第２の好適な実施例において、式(II)の化合物のサブクラスを提供するもので、該サブクラスは式(III)を有する。
【化４】
2013502450.tif 000006
【００２５】
式(I)、(II)及び(III)において、Ｒ2は好ましくは水素である。又は、Ｒ2はＣ1-3アルキル基であり、該アルキル基は、必要に応じて置換又は非置換、線形又は分岐型、飽和又は不飽和であってよい。Ｒ2は、好ましくは非置換のＣ1-3アルキル基である。好適なＲ2基は、メチル、エチル、n-プロピル及びi-プロピルであり、置換であっても非置換であってもよいが、最も好ましくは非置換である。
【００２６】
ｍは０であってもよく、その場合、ピリジン窒素元素は孤立電子対を保持する。ｍは１であってもよく、その場合、窒素の孤立電子対は酸素原子に配位結合(dative bond)されて、Ｎ−酸化物誘導体(Ｚが酸素である好適な実施例において)が生成されるか、又はＣ1-3アルキル基、好ましくはメチル基に配位結合されて、Ｎ−メチル荷電塩が生成される。
【００２７】
本発明の第１の態様で述べたように、ｎは１〜３の整数であり、その場合フェニル基と高(upper)アミド基の窒素原子とは、１、２又は３のメチレンリンカー基によって離間する。式(I)、(II)及び／又は(III)において、以下に示す本発明の第１の態様の第３の好適な実施例のとおり、ｎは好ましくは１である。
【００２８】
本発明の第１の態様の第３の好適な実施例において、式(III)の化合物のサブクラスを提供するもので、該サブクラスは式(IV)を有する。
【化５】
2013502450.tif 000007
【００２９】
式(I)〜(IV)中、Ｙは好ましくはＣ3-6アルキルであり、該アルキルは、置換又は非置換であってよく、また、線形、分岐型又は環状であってよく、一又は複数の不飽和基を選択的に含むことができる。選択的な置換基として、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードなどのハロ基が含まれる。
【００３０】
Ｙは線形のＣ3-6アルキル基(例えば、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、又はn-ヘキシル基)であってもよい。
【００３１】
好ましくは、Ｙは比較的かさ高い(bulky)基であり、従って、より好ましくは分岐型のＣ3-6アルキル基(例えば、i-プロピル、i-ブチル、t-ブチル、i-ペンチル、t-ペンチル、i-ヘキシル又はt-ヘキシル基)である。特に好ましいＹ基は、以下に述べる化合物(V)、(VI)及び(VII)に用いられるt-ブチルであり、後で詳しく説明するが、極めて有望な生物学的活性を示した。t-ブチルの好ましい誘導体によって、３つのメチル基は、１、２、或いは最も好ましくは３つのトリフルオロメチル基と置換され、その結果、Ｙは−Ｃ(ＣＦ3)3となる。
【００３２】
比較的大きなＹ基の更なる他の実施例として、Ｙは置換又は非置換の環状Ｃ5-6アルキル基であってもよい。環状基は、例えばシクロペンタンやシクロヘキサンなどのような飽和基であってもよいし、不飽和基でもよい。不飽和基は、例えばシクロペンテンやシクロヘキセンなどのように、任意位置に一つの不飽和基を有するもの、或いは、例えば1,2−シクロヘキサジエン、1,3−シクロヘキサジエン又は1,4−シクロヘキサジエンなどのように、任意位置に二つの不飽和基を有するものがある。
【００３３】
或いは、Ｙは置換又は非置換のアリール基であってもよい。好ましいアリール基として、フェニル、ベンジル、トリル又はキシリル基が含まれる。適当な置換基であればどんな置換基でもよいが、一又は複数のアリール基の置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードなどのハロ基であることが好ましい。
【００３４】
Ｘは好ましくは酸素であり、ピリジン環にリンクされたアミド基に対してフェニル基のパラ位に結合される置換基は、カルバメート基である。
【００３５】
或いは、Ｘはメチレンリンカー基であり、置換されたものでも非置換のものでもよい。置換されたものである場合、前記メチレンリンカーは、更なるアルキル基やハロ基などの、一つ又は二つの置換基を担持することができる。
【００３６】
Ｒ1は、好ましくは水素である。又は、Ｒ1はＣ1-3アルキル基でもよく、該アルキル基は、必要に応じて置換又は非置換、線形又は分岐型、飽和又は不飽和であってよい。好適なＲ1アルキル基はメチルであり、他の選択肢として、エチル、n-プロピル及びi-プロピルが含まれる。
【００３７】
本発明の第２の態様では、式(V)の化合物を提供する。
【化６】
2013502450.tif 000008
【００３８】
本発明の第３の態様に基づき、式(VI)の化合物を提供する。
【化７】
2013502450.tif 000009
【００３９】
本発明の第４の態様では、式(VII)の化合物を提供する。
【化８】
2013502450.tif 000010
【００４０】
上述のように、本発明の化合物(本発明の第１、第２、第３又は第４の態様に基づく化合物を含むものとする)は、生物学的活性を有する。これらの活性には、キナーゼ活性を阻害する能力、及び形質転換細胞の挙動を変化させる能力が含まれる。特に、本発明の化合物は、形質転換細胞の成長を阻害する能力と、形質転換細胞コロニーの生成を阻害する能力とを有する。本発明に基づく(特に、式(V)に基づく)化合物は、形質転換細胞コロニーが既に生成された後に、多くのコロニーを減少させることさえ可能である。驚くべきことに、本発明の化合物は、そのようなキナーゼ又は細胞に対してほんの過渡的に供給された場合でも、これらの活性を発揮することができる。つまり、本発明の化合物の生物学的効果は、化合物が取り出された(withdrawn)後も持続することができる。
【００４１】
本発明の化合物のこれらの生物学的活性は、医療用途に非常に適しており、そのような使用は本発明の更なる態様をもたらすことは理解されるだろう。
【００４２】
本発明の第５の態様において、薬剤として用いられる本発明の化合物を提供する。本発明の化合物は、本発明の第１、第２、第３又は第４の態様に基づく化合物であってよい。本発明のこの態様に基づいて使用される化合物は、化学療法に用いる化合物として使用されることができる。また、本発明の化合物は、多発性嚢胞腎の予防及び／又は治療の他、痛みや炎症、又は痛みや炎症を伴う様々な状態の予防及び／又は治療に用いられることができる。
【００４３】
本発明の第６の態様において提供される化合物は、癌の予防及び／又は治療用薬剤として用いられる。前述と同様に、この化合物は本発明の第１、第２、第３又は第４の態様に基づく化合物であってよい。本発明のこの態様に基づく化合物は、転移癌の生成及び／又は成長を阻害するために用いられることができる。
【００４４】
如何なる仮説にも制約されるものではないが、発明者らは、本発明の化合物が、形質転換細胞と近接する非形質転換細胞との間でギャップ結合(gap junction)の発生を増加させることができ、その結果、非形質転換細胞が形質転換細胞の活性を阻害することができると考える。この作用形態は今までどの文献にも記載されておらず、癌細胞が非形質転換細胞との混合種固体群であるとき、本発明の化合物が癌細胞活性の最大の阻害をもたらすという発明者らの知見と一致する。
【００４５】
本発明の化合物が、本発明の第５又は第６の態様に基づいて用いられるとき、前記化合物は治療上有効な量で与えられるべきであることは理解されるだろう。本発明の治療上有効な適量は、特定の化合物の固有性、該化合物が適用される医療の性質(例えば、治療すべき状態の性質や、患者体内での進行状態など)、及び該化合物の投与経路などの検討事項を考慮して実験的に決定されることができる。
【００４６】
本発明の第５又は第６の態様に基づいて用いられる化合物は、適当な医薬用賦形剤(pharmaceutial excipient)を用いて調製されることができる。適当な医薬用賦形剤として求められる特性は、当業者であれば、本発明の化合物を含む製剤配合物(pharmaceutical formulation)の使用方法を参照することにより明らかだろう。
【００４７】
本発明の化合物は、全身投与用薬剤の製造に用いられることができる。或いは、本発明の化合物は、好ましくは局所投与用薬剤の製造に用いられる。このような薬剤は、本発明の化合物が生物学的活性を発揮することを所望される組織や臓器に供給するために適切な要領で調製されることができる。一例として、本発明の化合物は、皮膚又は頸部への局所投与用薬剤の製造に用いられることができる。
【００４８】
本発明の化合物について、形質転換細胞への直接の曝露が終わった後でも、形質転換細胞に対する阻害効果を持続して発揮できるという知見は、本発明の化合物を、非連続的な治療計画に使用する薬剤の製造に用いることができることを意味する。このように、本発明の第５又は第６の態様の好適な実施例は、少なくとも一つの治療事象の後に治療事象を施さない治療計画における薬剤として、本発明の化合物の使用を提供するものである。
【００４９】
本発明の化合物を非連続的な治療計画に用いることは、そのような治療計画に伴う副作用の軽減に有効であることが期待される。例えば、本発明の化合物は非連続的な化学予防計画又は化学療法計画に用いられることができる。これら化学予防計画又は化学療法計画は、癌の予防又は治療に有用である。
【００５０】
本発明の化合物が適する他の医療用途は、創傷治療の処置である。創傷治療と癌とは、細胞増殖、細胞外マトリックス沈着(deposition)及び組織リモデリングを含む多くの共通した機構を有することは、知られている。本発明の第７の態様は、創傷治療における本発明の化合物の使用を提供するもので、この使用により、前記化合物を創傷治療に用いなかったときに起こり得る線維症や瘢痕形成を防止することができる。本発明の化合物は、ケロイドの生成防止に用いられることができる。ケロイドとは、形成された瘢痕組織が初期損傷の境界を越えて増殖する病理学上の瘢痕の一種である。
【００５１】
本発明の態様について、例示を目的としてのみ、以下の非限定的な実施例及び添付の図を参照して、さらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１Ａは、GEF16形質転換されたNIH3T3コロニーとベクター制御コロニー(G418の存在下にて１２日間の成長後)の画像であり、形質転換された病巣(foci)はトルイジン青染色により可視化されている。この図はまた、GEF16 mRNAの発現がRT-PCRによって確認されたことを示す。
【００５３】
図１Ｂは、ベクターとGEF16多クローン性トランスフェクト細胞(transfected cells)について、Cell AQ96成長の比較結果を示す図である。
【００５４】
図１Ｃは、多クローン性GEF16トランスフェクトNIH3T3細胞の培養写真であり、培養物は、１０μＭのＹ27632又はＤＭＳＯ対照のいずれかで１０日間培養され、トルイジン青で染色されている。
【００５５】
図１Ｄは、GEF16及びベクタートランスフェクト細胞について、１ウェル当たり１×１０3個の細胞を９６ウェルプレートの中で播種し、その成長結果をCell AQ96評価(assessment)で示す棒グラフ図である。これら細胞は、３日間培養した後で試薬(reagent)を添加し、アッセイの開始点を決定した。その後、１０μＭのＹ27632又はＤＭＳＯのいずれかを、両方の細胞種が入れられたウェルに添加し、Cell AQ96の吸収度を６日目、８日目、及び１０日目に測定した。３日目で細胞の１００％コンフルエント(confluent)が、培養物の２０倍位相コントラスト目視検査で確認された。
【００５６】
【図２Ａ】図２Ａは、対照又はＹ27632又は本発明の化合物で処理した形質転換コロニーのトルイジン青染色結果を示す図である。２．０×１０5の多クローン性GEF16トランスフェクト細胞のアリコートを、３０ｍｍディッシュの中に播種して一晩中培養し、その後、Ｙ27632を異なる６４のＹ27632構造類似体１０μＭで処理した。この構造類似体には、ＹＡ１、ＹＡ２、ＹＡ３及びＹＡ４で表される本発明の４種類の化合物が含まれている。コロニー生成のアッセイを１０日後に行った。本発明の化合物のROCK阻害活性についてもＹ27632と比較し、この結果は棒グラフに示されている。
【００５７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、選択された40の代表的ヒトキナーゼに対するＹＡ１(式(V)に基づく本発明の化合物)のキナーゼ阻害活性について、SelectScreen(商標)評価の結果を表す図である。
【００５８】
【図２Ｃ】図２Ｃは、HGK、p38、ROCK１、ROCK２及びAuroraＡのキナーゼに対する本発明の化合物ＹＡ１〜ＹＡ４のキナーゼ阻害活性について、一点分析(single point analysis)結果を示す図である。
【００５９】
【図３】図３は、ＹＡ１がGEF16形質転換NIH3T3コロニーの生成を不可逆的に抑制することを示す図である。  図３Ａは、多クローン性GEF16トランスフェクト細胞(３０ｍｍディッシュにつき２．０×１０5の細胞を培養)の画像を示す図であり、前記細胞に１０μＭのＹＡ１を、２日間、４日間、６日間、８日間、又は１０日間添加した。この培養期間の後で化合物を培地から取り除き、図に示した写真を撮影する前に、細胞を標準的な生長媒体の中で更に１０日間維持した。  図３Ｂは、ＤＭＳＯ又は阻害剤で同じ時間間隔にて処理したサブコンフルエントについて、Cell AQ96増殖の評価結果を示す図である。  図３Ｃは、ＹＡ１又はＹ27632(１０μＭ)のいずれかで処理されたGEF16細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【００６０】
【図４Ａ】図４は、Ｙ27632とＹＡ１(式(V)に基づく本発明の化合物)とが、GEF16形質転換NIH3T3コロニーの生成を不可逆的に抑制することを示す図である。Ｙ27632とは異なり、ＹＡ１は予め存在する形質転換コロニーを除去することもできる。  図４Ａは、３０ｍｍディッシュにつき２．０×１０5個播種して一晩中培養した多クローン性GEF16トランスフェクト細胞を示す図である。その後、夫々のディッシュに１０μＭのＹＡ１又はＹ27632を、２日間、４日間、６日間、８日間、及び１０日間添加した。その後、細胞をトリプシンで分離し、２．０×１０5の細胞密度で再培養した。阻害剤が無い状態で更に１０日間経過した後、前記細胞をトルイジン青で染色し、これを撮影して図示の画像を作成した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、３０ｍｍディッシュにつき２．０×１０5個播種して１０日間培養し、その後、ＹＡ１、Ｙ27632又はＤＭＳＯ対照のいずれかを１０μＭ又は２０μＭ添加した多クローン性GEF16トランスフェクト細胞及びベクタートランスフェクト細胞を示す。これらは３日間又は６日間培養し、トルイジン青で染色した後、写真撮影したものである。
【００６１】
【図５Ａ】図５は、ＹＡ１の単一形質転換コロニー由来のGEF16 NIH3T3細胞及び多クローン性Ras形質転換NIH3T3細胞に対する成長抑制効果は、これらの細胞が非形質転換細胞と共培養された場合により著しいことを示す図である。  図５Ａは、GEF16多クローン性NIH3T3細胞の１０日間培養物から採取し増殖させた(expanded)単一の形質転換コロニーを示す図である。次に、これらの細胞を３０ｍｍディッシュにつき２．０×１０5個播種し、その直後か又は１０日培養後、１０μＭのＹＡ１又はＤＭＳＯ対照で処理した。重複(duplicate)ウェルを、フローサイトメトリー用に調製(harvested)した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、各々に２．０×１０5の細胞が培養されたウェルを示しており、非形質転換ベクター細胞が単一形質転換コロニーと共培養され、非形質転換ベクター細胞が増加し、GEF16細胞が減少している。これらは、１０μＭのＹＡ１又はＤＭＳＯのいずれかで１０日間処理された。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ｂに関して記載したのと同じ共培養実験であって、GEF16形質転換細胞の代わりに多クローン性Ras形質転換NIH3T3細胞を用いて行った実験結果を示す図である。
【００６２】
【図６Ａ】図６は、ＹＡ１(式(V)に基づく本発明の化合物)が、形質転換細胞と非形質転換細胞との間のギャップ結合の形成を刺激することを示す図である。  図６Ａは、考察３(後でより詳しく説明する)の結果を示す図である。考察３は単一のGEF16形質転換コロニーから生成された細胞をＬＹで電気穿孔し、PKH67で以前にラベリングされた非形質転換細胞と共培養したものである。ＹＡ１(１０μＭ)又はＤＭＳＯ対照のいずれかを重複培養物に添加し、これらの培養物を、フローサイトメトリー分析用にＴ＝０、１.５、４.５及び７.５時間で調製した。各種の蛍光を表す多くの細胞が示されている(“ＬＹのみ”、“PHK67のみ”、又は“両方”)。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＬＹ／PKH67で二重ラベリングされた細胞の比率を、ＬＹ群全体のパーセンテージとして表す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６３】
［考察１：本発明の化合物によるキナーゼ活性の阻害］
本発明の化合物について、キナーゼ活性阻害剤として作用する能力を調べた。本発明の化合物の構造類似体であるＹ27632は、RhoA依存性RhoAキナーゼ(ROCK)を阻害することが知られているため、とりわけ、このキナーゼに対する本発明の化合物の阻害能力を調べた。用いた材料及び方法の詳細、並びに得られた結果を以下に記載する。
【００６４】
＜1.1  材料及び方法＞
＜＜1.1.1  本発明の化合物＞＞
本発明の４種類の化合物を、明細書中の他の箇所で記載した要領にて製造した。４種類の化合物(ＹＡ１、ＹＡ２、ＹＡ３及びＹＡ４と表す)の構造は、図２に示される。これら化合物のうち、ＹＡ１は式(V)に基づく本発明の化合物、ＹＡ３は式(VII)に基づく本発明の化合物、そしてＹＡ４は式(VI)に基づく本発明の化合物である。
【００６５】
＜＜1.1.1  インビトロでのROCK活性測定＞＞
特定のアッセイを用いて本発明の化合物のROCK阻害能力を評価した。Rho−キナーゼ活性は、製造者(日本、長野のCycLex Co., Ltd.)が推薦する免疫学的検定を用いて決定した。簡単に説明すると、１０ｍユニット(１ユニットは、３０℃で毎分１ｎｍｏｌのリン酸塩をGST-MBS/MYPT１に取り込む)の組換え型ROCKが含まれる１００μｌの試料を、本発明の化合物と共に又は無しで、スレオニンRho−キナーゼリン酸化基質でプレコートされた９６ウェルプレート(１００μｌ／ウェル)の中に分配(aliquoted)した。３０℃で３０分間培養した後、プレートをPBSで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのHRP共役(conjugated)抗リン特異抗体を用いて、室温で１時間培養した。リン酸化基質の量は、１００μｌ／ウェルの基質反応剤を１０分間添加することによって求めた。反応は、１００μｌ／ウェルの停止溶液を添加することにより終了させた。吸収率の測定は、９６ウェルプレートリーダ(イギリス国、ウェストサセックスのDynex Technologies)で、４５０ｎｍにて行った。各データポイントの測定は３回行い、アッセイは２回繰り返した。
【００６６】
＜＜1.1.2  インビトロでのSelectScreen(商標)によるキナーゼプロファイリング＞＞
本発明の化合物の、多くの異なるキナーゼを阻害する能力について、SelectScreen(商標)キナーゼ阻害剤のアッセイサービス(イギリス国、ペースリーのInvitrogen Ltd.)を用いて調べた。商業的に提供されているこの手法により、本願化合物の広範なヒトキナーゼ群を阻害する能力を評価することができる。この手法に関する詳細は、次のInvitrogenウェブサイトにて入手できる。
www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Services/Screening- and-Profiling-Services/SelectScreen-Profiling-Service/SelectScreen-Kinase-Profiling- Service.html
【００６７】
今回の調査では、ＹＡ１(式(V)に基づく化合物)について、図２のパネルＢに示される４０のキナーゼの活性を阻害する能力を調べた。本発明の化合物を、ＤＭＳＯ中で１０ｍＭの濃度に希釈し、一点キナーゼ阻害活性のＡＴＰ濃度を１０μＭ及びＫｍ値で測定した。
【００６８】
＜1.2  結果＞
＜＜1.2.1  本発明の化合物におけるROCK阻害＞＞
このアッセイの結果を、図２Ａに示す。これらの結果から、ＹＡ１、ＹＡ３及びＹＡ４は、それらの構造類似体であるＹ27632よりも、ROCKに対する活性が有意に少なかったことが分かる。これに対し、ＹＡ２はＹ27632に匹敵するROCK阻害活性を示した(但し、以下に報告する更なる調査により、この化合物は、GEF16コロニー生成の抑制に殆ど効果がないことを示した)。
【００６９】
＜＜1.2.2  本発明の化合物における様々なキナーゼ阻害＞＞
ＹＡ１、ＹＡ３及びＹＡ４は、本発明の好適な化合物であり、夫々、式(V)、(VII)及び(VI)に示される化合物を表す。これら化合物のうち、ＹＡ１はＧＥＦ１６形質転換コロニーの阻害能力が最も高かった(以下の記載及び、図２Ａに示す結果を参照)ため、本発明に係る好適な化合物であると考えることができる。選択された40の代表的ヒトキナーゼの活性を阻害するこの化合物の能力を評価するため、インビトロでのキナーゼ阻害アッセイ(SelectScreen(商標))を行い、このアッセイの結果を図２Ｂに示す。
【００７０】
実験データは、ｐ３８アルファ(ＭＡＰＫ１４)(７２％)、ＨＧＫ(ＭＡＰ４Ｋ４)(６３％)及びＡｕｒｏｒａ  Ａ(４４％)に対するＹＡ１の阻害活性は１０μＭで最大であることを示しており、図２Ａに示されるように、ＹＡ１のＲＯＣＫ阻害活性は減少することが確認された(約４０％)。
【００７１】
これらの結果を踏まえ、追加の一点分析を行うことにより、本発明の化合物(ＹＡ１、ＹＡ２、ＹＡ３及びＹＡ４)の各々について、ＹＡ１による阻害が特に効果的であると思われるキナーゼ(例えば、ｐ３８、ＨＧＫ、Ａｕｒｏｒａ  Ａ)、並びにＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対する阻害活性を調べた。各化合物の阻害活性を、１０μＭの濃度にて検査した。
【００７２】
得られた結果は図２Ｂに示されており、ＹＡ２が、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対して最も大きな活性を有することが確認された。ＹＡ１、ＹＡ３及びＹＡ４はいずれもｐ３８、ＨＧＫ及びＡｕｒｏｒａ  Ａに対する活性は大きかったが、ＲＯＣＫｓに対する活性はＹＡ２よりも小さかった。
【００７３】
［考察２：本発明の化合物による形質転換細胞の成長阻害］
Ｙ２７６３２は、本発明の化合物の構造類似体であり、本発明の化合物と同様のキナーゼ活性阻害能力を有し、インビトロで形質転換細胞の成長を阻害できることは知られている。本発明の化合物について、形質転換細胞の成長阻害能力を調べるために次の考察を行った。
【００７４】
＜2.1  材料及び方法＞
＜＜2.1.1  細胞培養及び安定した遺伝子導入(transfection)＞＞
ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株を、１０％ウシ血清(ＢＳ)が入れられ、２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭ中で培養し、ＣＯ2が５％含まれる加湿空気中で３７℃にて成長させた。
【００７５】
以下のようにＧＥＦ１６又はＲａｓの細胞発現を生じさせる構造体(constructs)を形質移入することにより、形質転換細胞群を生成した。全長ＧＥＦ１６の読取り枠(open reading frame)(Accession NM#014448)をＰＣＲ増幅させ、配列検証し、ほ乳類発現ベクターｐＣＭＶＴａｇ(イギリス国、ペースリーのInvitrogen Ltd.)へのサブクローニングを行って、ｐＣＭＶＴａｇ−ＧＥＦ１６  ｃＤＮＡの構造体を生成した。次に、このｐＣＭＶＴａｇ−ＧＥＦ１６  ｃＤＮＡ構造体、又はＲａｓ発現を生じさせる構造体(ＬＺＲ−ＭＳ−ＩＲＥＳ−ＺＥＯ／ｐＢＲ−Ｒａｓの構造体)を使用し、製造者の推奨(イギリス国、ペースリーのInvitrogen Ltd.)に基づく、Lipofectamineを用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクトした。
【００７６】
ＧＥＦ１６、Ｒａｓ及びベクター対照トランスフェクト細胞を、Ｇ４１８又はZeocinの存在下で１０日間維持した。多クローン性ＧＥＦ１６、Ｒａｓ及びベクター形質転換体(transfectants)を、サブコンフルエント培養物中で成長させ、−８０℃の冷凍庫で保存した(freezer stock)。クローニングリングを用いて個々のＧＥＦ１６形質転換コロニーを単離し、培養物中で成長させ、−８０℃の冷凍庫で保存した。
【００７７】
形質転換された対照細胞群におけるＧＥＦ１６について、ベータアクチンを対照として使用し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて発現を調べた。全細胞ＲＮＡｓを、製造者(イギリス国、ケンブリッジシャーのAmbion)の推奨に基づいて、SuperScript(商標) III Cells Direct cDNA Synthesis Kitを用いて調製し、Trizol Reagent(イギリス国、ペースリーのInvitrogen Ltd.)を用いて全ＲＮＡｓを試料から単離した。次に、ＤＮＡａｓｅ Ｉ処理ＲＮＡｓの全てを、ランダムデカマー(random decamers)で逆転写した。逆転写生成物２μｌ、２×Bio-Red１０μｌ、及び各プリマー０.１μＭが入っている２０μｌの反応混合物中にて、ＰＣＲを実施した。ＧＥＦ１６及びベータアクチンに対する特異的プリマーは、以下の通りである。
- GEF16 forward [delta]-ACCACCACCTCTTCTCCAAC-S', (Sequence ID No. 1 )
- GEF16 reverse [delta]'-TCGTTGGAGCAGTAGGCGAT-S' (Sequence ID No. 2)
- Beta-actin forward: 5'-TCC ATC ATG AAG TGT GAC GT-3' (Sequence ID No. 3)
- Beta-actin reverse: 5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TT-3' (Sequence ID No. 4)
【００７８】
反応混合物を９４℃で４分間変性させ、更に、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃にて３０秒間延長(extension)のサイクルを３２回繰り返した後、７２℃で５分間の延長を１回行った。
【００７９】
＜＜2.1.2  形質転換コロニー生成の評価＞＞
多クローン性ベクター又はＧＥＦ１６がトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を上述のとおり生成して、１ウェルにつき２.０×１０5細胞密度で３０ｍｍディッシュに別々に播種し、１０μＭのＹ２７６３２(ドイツ、DarmstadtのCalbiochem)又はＹ２７６３２の構造類似体である本発明の化合物(ＹＡ１、ＹＡ２、ＹＡ３及びＹＡ４)又はＤＭＳＯ対照のいずれかの存在下で完全なコンフルエンスまで成長させた。媒体(Ｙ２７６３２又は本発明の選択された化合物、又はＤＭＳＯ対照が入っている)は、２日毎に取り替えた。コンフルエンス後１０日間成長させてから、トルイジン青(イギリス国、プールのSigma-Aldrich)染色により病巣の生成を分析した。トルイジン青染色により、コロニーは“黒い(dark)”斑点(patches)として顕在化し、コロニーが存在しない他の領域よりも強く染色された。各アッセイは３回行い、示した結果は少なくとも３回の個別実験の代表例である。
【００８０】
＜＜2.1.3  細胞成長のアッセイ＞＞
製造者のプロトコルに基づき、Celltiter Aq96試薬(イギリス国、サウサンプトンのPromega)を用いて細胞成長を調べた。１×１０3個／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートへ細胞を播種し、１データポイントにつき３ウェルとして、設定時間の細胞付着を行った。引き続いて、各ウェルに２０μｌのAq96試薬を添加し、５％ＣＯ2中で３７℃にて４時間培養して、初期開始点４９０ｎｍの吸収度を決定した(イギリス国、ウェストサセックスのDynex Technologiesの９６ウェルプレートリーダ)。次に、種々の化合物(Ｙ２７６３２又は本発明の化合物)又はＤＭＳＯ対照を重複ウェルに添加し、指示された時点での吸収度を同様に決定した。示した各データセットは、３つの別々の実験の代表例である。
【００８１】
＜＜2.1.4  フローサイトメトリー＞＞
薬物治療(Ｙ２７６３２又は本発明の化合物による)と共に又は薬物治療はせずに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を種々の時点で調製し、細胞数を計測して、各サイトメトリック分析に１×１０6の細胞が存在することを確認した。細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％の氷冷されたエタノールで固定し(fixed)、ペレット化して、細胞を４℃にて４５分間、ヨウ化プロピジウム(１０ｍｇ／ｍＬ)(イギリス国、プールのSigma-Aldrich)で培養することによりＤＮＡ染色した。次に、細胞を氷冷されたＰＢＳで２回洗浄し、４００μｌのＰＢＳの中で再懸濁した。次に、細胞サイクルの様々な段階でのＤＮＡ含有量をフローサイトメトリー(イギリス国、オックスフォードのBD Biosciences)により決定した。示した各プロファイルは、３つの別々の実験の代表例である。
【００８２】
＜2.2  結果＞
＜＜2.2.1  ＧＥＦ１６の構成的発現によるＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換＞＞
ＲＴ−ＰＣＲの結果は図１Ａに示されており、ＧＥＦ１６ベクタートランスフェクト細胞におけるＧＥＦ１６ ｍＲＮＡの存在量は、対照ベクターを含む細胞の場合よりも遙かに多いことを明確に示している。
【００８３】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞が、構成的に活性化されたＲｈｏＡの異所性発現又は、様々な他のグアニジン交換因子のいずれかにより形質転換され得ることは、知られている。本願の考察で得られた結果はこれら先行技術のデータと一致し、Ｇ４１８の存在下で１２日間成長させたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＧＥＦ１６ ｍＲＮＡの構成的発現により複数の病巣が形質転換されたことを示している(図１Ａ)。形質転換された多層Ｇ４１８耐性コロニーを採取し、更なる分析を行ったが、Ｇ４１８が選択されたベクタートランスフェクト対照細胞には、形質転換病巣は見られなかった。ベクタートランスフェクト細胞とＧＥＦ１６トランスフェクト細胞との成長を比較すると、これら２種類の細胞型における成長速度に大きな差はないことを示している(図１Ｂ、ｐ＞０.０５)。
【００８４】
＜＜2.2.2  Ｙ２７６３２によるＧＥＦ１６形質転換コロニーの生成阻害＞＞
形質転換細胞コロニーを１０μＭのＹ２７６３２(既知のＲＯＣＫ阻害剤)で１０日間処理すると、ＧＥＦ１６形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞コロニーの生成が抑制された(図１Ｃ)。これは先行技術において以前に報告されたデータと一致する。図１Ｄはまた、Ｙ２７６３２がコンフルエントＧＥＦ１６形質転換細胞の成長を阻害することを示しており、これらの細胞は処理されていない同じ培養物中で成長し続ける。
【００８５】
＜＜2.2.3  本発明の化合物によるＧＥＦ１６形質転換コロニーの生成阻害＞＞
Ｙ２７６３２はＡＴＰの構造類似体であり、この阻害剤の異なる６４の類似体を合成し、ＧＥＦ１６形質転換ＮＩＨ３Ｔ３病巣の生成阻害能力を評価した。これら６４の類似体のうち４つは、本発明化合物のＹＡ１、ＹＡ２、ＹＡ３及びＹＡ４である。
【００８６】
１０μＭでは、合成された６４の化合物のどれも有意な成長阻害活性を示さなかった(データは図示せず)が、本発明の４種類の化合物は、コンフルエント後の培養物にて成長するＧＥＦ１６形質転換コロニー生成を抑制する能力を示した(図２Ａ)。このアッセイを用いて得られたデータは、本発明の化合物(ＹＡ１など)による形質転換ＧＥＦ１６コロニー生成阻止能力が、Ｙ２７６３２による阻害能力と同程度であることを示す。
【００８７】
2.2.4  ＧＥＦ１６細胞がＹＡ１又はＹ２７６３２に過渡的曝露されることによる、多クローン性ＧＥＦ１６細胞から細胞を生成する形質転換コロニーの排除
新たにプレートに入れたＧＥＦ１６多クローン性細胞を、１０μＭのＹＡ１で夫々２日間、４日間、６日間、８日間、及び１０日間処理した。その後、化合物を培地から取り除き、前記細胞を標準媒体の中で更に１０日間維持した。この結果は、化合物への曝露時間が増加するにつれて形質転換病巣の数が段階的に減少することを示しており(図３Ａ)、また、式(V)に基づく本発明の化合物ＹＡ１は、形質転換病巣の生成を阻害するだけでなく、取出し後も、形質転換病巣の再生成を阻止できることを示している。なお、阻害剤ＹＡ１又はＤＭＳＯ対照のどちらで処理されたサブコンフルエントＧＥＦ１６多クローン性細胞についても、成長速度の差は検出されず(図３Ｂ)(Ｐ＞０.０５)、フローサイトメトリーでは、細胞サイクルの変化又はアポトーシスサブＧ１群の蓄積が全く認められなかった(図３Ｃ)ことは意義深いことである。これは、本発明の化合物には、直接的な細胞毒性(cytotoxic)はないこと、そして形質転換細胞に対する効果がこれら細胞の致死によって達成されるものではないことを示している。
【００８８】
図３Ａは、化合物を取り出す前の細胞数を示しており、ディッシュ当たりの細胞数は、阻害剤の処理時間と共に増加することを示している。この変数(variable)を取り除き、各１０日の追跡期間を同数の阻害剤処理済細胞で開始できるように、ＧＥＦ１６多クローン性細胞は、Ｙ２７６３２又は本発明の好適な化合物(ＹＡ１)で、２日間、４日間、６日間、８日間、及び１０日間処理した。この処理の後、細胞を分離し、１ウェル当たり２．０×１０5の細胞密度で６ウェルプレートの中で再培養し、続いてＹ２７６３１又はＹＡ１が存在しない状態で、１０日間維持した。この方法では、細胞群の細胞数を、追跡期間の開始時点のものと直接比較することができる。
【００８９】
得られたデータを、図４Ａに示す。このデータは、Ｙ２７６３２及び本発明の化合物(ＹＡ１)は両方とも、形質転換されたフォーカス生成を抑制できること、そしてその抑制程度は、形質転換細胞の前記化合物への曝露時間とは相関関係があることを示している。これらのデータは、Ｙ２７６３２又は本発明の化合物で形質転換された細胞を一過性処理することにより、形質転換コロニーの生成を永久的に抑制することができ、その効果は細胞を殺すことなく達成できることを初めて実証するものである。
【００９０】
＜＜2.2.5  本発明の化合物による、ＧＥＦ１６多クローン性細胞から予め生成された形質転換コロニーの除去＞＞
上記の報告結果は、Ｙ２７６３２及び本発明の化合物(特に、ＹＡ１)は両方とも、形質転換コロニーの生成を阻止できること、そしてこの効果は前記化合物による処理を中止した後も持続することを示した。予め生成されたコロニーに対するこれら化合物の効果を評価するために、多クローン性ＧＥＦ１６ＮＩＨ３Ｔ３形質転換コロニーを１０日間かけて生成させた後、Ｙ２７６３２又は本発明の化合物(ＹＡ１)に３日間及び６日間曝露した。Ｙ２７６３２については、予め生成された形質転換コロニーに対する効果はほとんど見られないが、ＹＡ１は前記コロニーの数を著しく減少させることが分かる(図４Ｂ)。ベクターが導入された多クローン性ＮＩＨ３Ｔ３細胞が対照として含まれており、阻害剤処理されたものとＤＭＳＯ対照との間で差異は見られなかった。
【００９１】
＜＜2.2.6  単一ＧＥＦ１６形質転換コロニー由来の細胞群に対する本発明の化合物の効果は最小＞＞
ＧＥＦ１６多クローン性ＮＩＨ３Ｔ３細胞から単一形質転換コロニーを採取し、上述の方法に基づいて増殖させた。増殖した細胞群をプレートに入れて、その直後、又は細胞をコンフルエントした時から１０日経過後、本発明の化合物(ＹＡ１)を添加した。
【００９２】
この考察結果は図５Ａに示されており、図５Ａを参照すると、ＹＡ１(式(V)に基づく本発明の化合物)を低密度の培養物に添加したとき、効果はわずかであり、対照で処理した細胞群と同じ飽和密度に達しないことを示している。しかしながら、本発明のこの化合物をコンフルエント後の培養物に添加しても、対照との違いを認識できる効果は認められない。フローサイトメトリーでは、本発明の化合物(ＹＡ１)が細胞サイクルに何の効果も及ぼさないこと、また、コンフルエンスの前後いずれかに処理された培養物中にアポトーシスサブＧ１群は認められないことを示している(本発明の化合物の効果は細胞の致死によって発揮されるものでないことをさらに示している)。
【００９３】
＜＜2.2.7  形質転換細胞を非形質転換細胞と共培養した場合における、本発明の化合物による単クローン性ＧＥＦ１６形質転換細胞及び多クローン性Ｒａｓ形質転換細胞の成長抑制＞＞
非形質転換ベクター細胞を、単一ＧＥＦ１６形質転換コロニーから増殖して数が減少した細胞と混合し、該混合物を本発明の化合物ＹＡ１又はＤＭＳＯで処理し、１０日間培養した。この結果、ＹＡ１による処理は培養物の最終飽和密度を著しく低減させ、この低減度はプレートに入れた形質転換細胞の数に依存することを示している(図５Ｂ)。
【００９４】
図５Ｂに示す結果を図５Ａに示す結果と比較すると、形質転換細胞が非形質転換細胞と接触しているとき、ＹＡ１は形質転換細胞の成長をより効果的に抑制できることを示している。図５Ｃを参照すると、ＹＡ１はＧＥＦ１６形質転換細胞と同様にＲａｓ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞コロニーに対して成長抑制効果を有し、これらの効果もまた、形質転換細胞と非形質転換細胞との接触に依存することを示している。位相コントラスト画像では、ＹＡ１処理Ｒａｓ形質転換細胞は、接触阻止と極性の両方を取り戻すことを示している。
【００９５】
［考察３：本発明の化合物による処理に反応して形成されるギャップ結合の調査］
本発明の化合物について、形質転換細胞の成長抑制能力は、形質転換細胞と非形質転換細胞との接触に影響されるという観察結果に関して、発明者らは、ギャップ結合形成に対する本発明の化合物の効果を調査した。
【００９６】
＜3.1  材料及び方法＞
＜＜3.1.1  ギャップ結合形成の定量分析＞＞
ギャップ結合細胞間伝達(ＧＪＩＣ)の程度を測定するために、異なる染色が施された２種類の細胞群を用いた新規なフローサイトメトリーアッセイが開発された。非形質転換受容ＮＩＨ３Ｔ３−ベクター細胞をＰＫＨ６７(イギリス国、プールのExcitation 490, Emission 502, Sigma-Aldrich)により、またＧＥＦ１６形質転換ドナー細胞をLuciferイエロー(ＬＹ)(イギリス国、ペースリーのInvitrogen Ltd.のExcitation 427nm, Emission 517nm)により。以下の通り染色した。
【００９７】
１×１０7の受容細胞の懸濁液１ｍｌを無血清のＤＭＥＭ中で、等体積の４μＭのＰＫＨ６７溶液と混合し、室温にて５分間培養した。反応は、２ｍｌの血清を添加して１分間培養することにより終了させた。その後、細胞を培地で３回洗浄し、Ｔ２５フラスコにつき１.５×１０6の細胞を播種した。
【００９８】
形質転換ドナー細胞のＬＹ染色は、７００μｌの５×１０6の細胞を、４ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベット(イギリス国、ミドルセックスのEquiBIO)中で、８ｍｇ／ｍｌＬＹ溶液１００μｌと混合し、氷の上で５分間保持した後、４００Ｖ(１０００Ｖ／ｃｍ)でエレクトロポレーション(米国、ニューヨークのSavant Instruments Inc.のGene Transformer(商標))を施した。新たな媒体を追加し、細胞をＴ２５フラスコに播種し、３７℃にて一晩かけて再生させた。
【００９９】
次に、ＬＹでラベリングされたドナー細胞を調製し、１×１０5個をＰＫＨ６７でラベリングされた受容細胞と１０μＭのＹＡ１又はＤＭＳＯ対照が入れられたＴ２５フラスコに添加した。様々な時間間隔で培養した後、共培養されたドナー細胞と受容細胞を収集し、BD FACS Aria(登録商標)(イギリス国、オックスフォードのBD Biosciences)を用いて分析した。ＬＹ励起には４０５ｎｍレーザーが用いられ、５１５ｎｍ乃至５４５ｎｍのバンドパスフィルターを用いて発光を測定した。共培養されたドナー細胞と受容細胞との間のＧＪＩＣを、ＬＹとＰＫＨ６７で二重ラベリングされた細胞のパーセンテージとして定量化した。
【０１００】
＜3.2  結果＞
＜＜3.2.1  ＹＡ１による、形質転換細胞と非形質転換細胞との細胞間ＧＪＩＣの増加＞＞
図６Ａは、共培養されたドナーＬＹでラベリングされたＧＥＦ１６単一コロニー形質転換細胞から、ＰＫＨ６７染色された非形質転換受容細胞への転染(dye transfer)の程度について、ＹＡ１又はＤＭＳＯ対照どちらかの効果を示している。図６Ｂを参照すると、ＹＡ１で処理した培養物は、ＬＹ／ＰＫＨ６７で二重ラベリングされた細胞の数は、ＤＭＳＯ対照の場合と比較すると約３倍であることを示している(ｐ＜０.０５)。これは、ＬＹからＰＫＨ６７染色細胞への転染が増大したことを示しており、阻害剤がＧＪＩＣの増大をもたらすことと一致する。
【０１０１】
＜4.  統計的分析＞
上述の様々な考察で言及したデータは全て、１又は対の実験を３回行行ない、或いは２−３の別個の実験を２回行なって得たものである。グループ間の比較は、対応のあるか又は対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて実施した。統計学的有意性は、ｐ値＜０.０５である。
【０１０２】
＜結果の考察＞
上記の結果は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２又は本発明の化合物(この化合物の構造類似体)のどちらかによる一過性処理は、形質転換ＮＩＨ３Ｔ３コロニーの生成を阻止するだけでなく、この効果が持続して、化合物を取り出してもコロニーが生成されないことを初めて示すものである。Ｙ２７６３２と異なり、式(V)、式(VI)又は式(VII)に係る本発明化合物の効果は、ＲＯＣＫ阻害活性とは無関係であり、細胞致死を伴わないことは、非常に驚くべきことである。更に、ＹＡ１(式(V)に基づく化合物)は、予め存在する形質転換コロニーを排除するという追加の特性を有しており、この効果もまた、細胞致死によって生じるものではない。
【０１０３】
本発明の３種類の合成化合物(ＹＡ１、ＹＡ３及びＹＡ４)は、最初は、形質転換コロニー生成に対する効果がＹ２７６３２と同等であることを示したが、ＲＯＣＫ阻害活性はＹ２７６３２より低かった。逆説的であるが、ＹＡ２はＹ２７６３２と同等のＲＯＣＫ阻害活性を示したが、形質転換コロニー生成の阻止には殆ど効果がなかった。
【０１０４】
形質転換細胞に対するＹ２７６３２の効果は、ＲＯＣＫ阻害があるために完全には現れない。例えば、ＲＯＣＫの１及び２に加えて、Ｙ２７６３２が１０μＭのとき、１６種類の他のキナーゼに対しても有意な阻害活性を示すことが知られている。このキナーゼには、タンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)のアイソフォーム(ベータ、イプシロン及びエータ)、そして、筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連Ｃｄｃ４２結合キナーゼＣｄｃ４２ＢＰＡ(ＭＲＣＫＡ)及びＣｄｃ４２ＢＰＢ(ＭＲＣＫＢ)が含まれる。Ｃｄｃ４２活性化ＭＲＣＫキナーゼは、ＲＯＣＫと同様、ミオシン依存細胞運動を促進し、ＲｈｏＡとＣｄｃ４２のシグナル伝達の合流点(a point of convergence)を示すので、特に関連性がある。このように、化合物ＹＡ２による形質転換コロニー生成の阻止能力が観察されなかったのは、これら代替の標的キナーゼのうち１種又は複数種に対する阻害活性の不足によるものであろう。実際、ＰＫＣイプシロンは、１０μＭのＹ２７６３２により９４％阻害され、このキナーゼの活性が増すと、カルパイン阻害剤由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換が結果的に関係することがはされている。更に、ＧＥＦ１６はＣｄｃ４２結合モチーフを潜在的に有しており、発明者らは、ＧＥＦ１６がインビトロ及び細胞内で、Ｃｄｃ４２を特異的に活性化することを明らかにした。興味深いことに、活性化されたＣｄｃ４２はｐ３８の活性化を促進することでも知られており、これは、化合物ＹＡ１、ＹＡ３及びＹＡ４におけるｐ３８阻害活性と完全に一致する。
【０１０５】
図２に示すデータを参照すると、ＹＡ１の生物学的活性は、単一のキナーゼターゲットの阻害を通じてではなく、ターゲットの組合せを阻害することにより起こることを示唆しており、その組合せには、現在未だ確認されていないキナーゼも含まれる。
【０１０６】
最少の毒性と共に、形質転換コロニー生成に対する抑制効果の持続が観察されたことで、この効果の背景にある論理的根拠を調査する必要がある。非形質転換細胞が形質転換細胞とＧＪＩＣを行なうことができる能力は、細の致死なしで細胞の形質転換特性を抑制する役割を果たすことはこれまでにも示唆されていた。
【０１０７】
発明者らは、形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞と形質転換されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞との間でのＧＪＩＣが阻害剤に誘起されて増加することは、本発明化合物の極めて妥当な作用態様であるとの仮説を立てた。この課題に取り組むために、発明者らは上述のＬＹ／ＰＫＨ６７生体染色法を開発した。ＬＹは細胞膜に浸透することができず、ＰＫＨ６７はラベリングされた細胞と共に非常に安定しているため、ＬＹとＰＫＨ６７の両方に二重ラベリングされた細胞が存在すると、これら細胞同士が相互に連結されることを示す。上述の報告結果を参照すると、ＹＡ１(式(V)に基づく本発明の化合物)は、ＤＭＳＯ処理された対照と比較して、ＬＹ／ＰＫＨ６７で二重ラベリングされた細胞の蓄積の増加を誘起することを示している。このことは、ＹＡ１の媒介が、形質転換細胞と非形質転換細胞との間のＧＪＩＣを増加させることを強く裏付けるものである。
【０１０８】
この示唆は、単一コロニー由来のＧＥＦ１６形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＹＡ１又はＹ２７６３２のどちらかで処理しても、該細胞が非形質転換細胞が存在しない状態で成長する場合、効果は殆どないか又は全くないという知見によって裏付けられる(結果を図５Ａに示す)。しかし、ＹＡ１による単一コロニー由来形質転換細胞に対する成長阻害効果は、これら細胞が非形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞と共培養されるとき明らかに復活する(図５Ｂ)。本発明の化合物が、予め生成された形質転換コロニーをＧＥＦ１６多クローン性細胞から除去する能力は、驚くべきことであり予期し得ぬ結果であった(図５)。Ｙ２７６３２も、試験された本発明の他の化合物(データは図示せず)も、この特性を発揮しなかった。このことは、ＹＡ１が、アッセイされた他の化合物とは異なる更なる作用形態を有することを示す。
【０１０９】
先行技術には、記載した種々のキナーゼターゲットが、形質転換誘起キャップ結合の破壊(disruption)に関わることを示唆するものがある。例えば、Ｙ２７６３２によるＲＯＣＫ活性化の阻害は、角膜上皮におけるギャップ結合の形成を促進することが示されており、また、ラット肝臓上皮細胞におけるＨ−Ｒａｓ誘起ギャップ結合の破壊は、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０による処理で停止させる(reversed)ことができる。発明者らは更なる考察により、ＳＢ２０３５８０は、ＧＥＦ１６形質転換コロニに抗して多少の活性を有することを見い出したが、この活性は本発明化合物ＹＡ１と比べて遙かに低かった。１０μＭのＳＢ２０３５８０が、同濃度のＹＡ１(Tocris Biosciences, Data Sheet)の２０倍より大きいｐ３８阻害活性を有することを鑑みると、ｐ３８の阻害のみでは、ＹＡ１の形質転換細胞に対する阻害活性を説明することができない。
【０１１０】
発明者らは、ＹＡ１が、Ｒａｓ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３コロニーの生成阻止に高い効果を有することは非常に重要であると考えており、このことは、これら化合物の活性が特定のＧＥＦに限定されるものでなく、一般的には、Ｒｈｏ／Ｒａｓ媒介形質転換がターゲットであることを示す。
【０１１１】
要するに、本文で開示したデータは、選択されたキナーゼの活性を調節できる能力を有する特定の阻害剤が、癌の化学予防における新規な戦略の基礎をなすという仮説を裏付けるものである。その効果は、形質転換細胞とのＧＪＩＣを構築する非形質転換細胞の能力を増強することによって得られると考えられ、その効果は阻害剤を取り出した後も確実に持続することができる。この知見は、本発明の化合物を活性剤として用いる処理は継続的に行われなくてもよいことを示す。更に、本発明の化合物は、転移癌(metastases)の生成と成長の両方を抑制するのに適当な試薬を表すものである。Ｙ２７６３２(本発明化合物の構造類似体)は、転移癌の発生をインビボで抑制することが示されており、この活性は、腫瘍細胞の転移(migration)を抑制するＲＯＣＫの阻害によって生じることが示唆されている。この明細書に開示したデータは、転移細胞と癌細胞の湿潤部位から遠位部位の正常細胞との細胞間伝達(intercellular communication)を促進することにより、Ｙ２７６３２又は本発明化合物の作用の更なる態様又は代替となる態様を示唆するものである。このことにより、転移プロセス中の成長制御レベルが高められるので、これらの特性を用いて新たな治療を開発することができる。
【０１１２】
［合成方法］
＜化合物(V)の調製＞
【化９】
2013502450.tif 000011
＜＜４−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル]安息香酸の調製＞＞
【化１０】
2013502450.tif 000012
市販の４−アミノメチル安息香酸(１０.０７８ｇ、６６.７ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)を、ＮａＯＨ水溶液(５.８６６ｇ、１４６.６ｍｍｏｌ、２.２ｅｑ.)、水(２５ｍｌ)及びＴＨＦ(テトラヒドロフラン；５０ｍｌ)に溶解した該溶液に、ジ−tert−ブチルジカーボネート(１６ｇ、７３.３ｍｍｏｌ、１.１ｅｑ.)を加えた。１２時間撹拌した後、混合物をヘキサン(２×５０ｍｌ)で洗浄し、水相を５℃まで冷却し、水性飽和クエン酸で調節してｐＨ３とした。得られた白色析出物を酢酸エチル(３×５０ｍｌ)で抽出し、有機抽出液と混合して乾燥させた(ＭｇＳＯ4)。真空内での(in vacuo)濃縮により、ＥｔＯＡｃから白色針状の表題カルバメート(１４.４３ｇ、８６％)が生成した。
【０１１３】
Rf = 0.43 (SiO2 petrol: EtOAc; 1 :3); υmax (neat)/cm-1 3357 (m), 2968 (w), 2930 (w), 2884 (w), 2488 (m), 1682 (s), 1510 (m), 1409 (m), 1291 (m), 1244 (m), 1 172 (m), 944 (m), 879 (m), 783 (m); δH (DMSO-d6) 1 .39 (9 H, s, 3 x CH3), 4.18 (2 H, d, J = 6.3, CH2), 7.34 (2 H, d, J = 8.1 , H-3, 5), 7.48 (1 H, t, J = 6.1 , NH), 7.89 (2 H, d, J = 8.2, H-2, 6), 12.87 (1 H, s, br, COOH); δc (DMSO-d6) 28.2 (3 x CH3), 43.2 (CH2), 77.9 (C(CH3)3), 126.9 (CH), 129.2 (C-1 ), 129.3 (CH), 145.3 (C-4), 155.8 (C=O), carbamate), 167.2 (C=O, acid).
【０１１４】
＜＜４−(ピリジン−４−イルカルバモイル)ベンジルカルバミン酸tert−ブチルエステル(化合物(V))の調製＞＞
【化１１】
2013502450.tif 000013
４−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル]安息香酸(５００ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)、ＥＤＣ(１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；ＨＣｌ塩、４２２ｍｇ、２.２ｍｍｏｌ、１.１ｅｑ.)、ＤＭＡＰ(４−ジメチルアミノピリジン；２４ｍｇ、０.２ｍｍｏｌ、０.１ｅｑ.)及び４−アミノピリジン(１８８ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)を無水ジクロロメタン(２００ｍｌ)に溶解した溶液を、室温にて一晩中撹拌した。混合物を水(３００ｍｌ)、飽和含水重炭酸ナトリウム(３００ｍｌ)、水(３００ｍｌ)、飽和塩水(３００ｍｌ)で洗浄して、乾燥させた(ＭｇＳＯ4)。真空中で濃縮した後、カラム・クロマトグラフィー(ＥｔＯＡｃ)により、ＥｔＯＡｃから白色固形物の表題アミド化合物(V)(４１３ｍｇ、１.２６ｍｍｏｌ、６３％)が生じた。
【０１１５】
Rf = 0.15 (SiO2 EtOAc); υmax (neat)/cm-1 3311 (w, br), 2977 (w), 2933 (w), 1684 (s), 1593 (s), 1521 (s), 1508 (s), 1331 (m), 1289 (m), 1 167 (m), 828 (w); δH (DMSO-d6) 1.40 (9 H, s, 3 x CH3), 4.21 (2 H, d, J = 6.2, CH2), 7.40 (2 H, d, J = 8.2, H-2, 6), 7.51 (1 H, t, J = 6.0, NH, carbamate), 7.78 (2 H, dd, J = 1.4, 4.9, H-3', 5'), 7.92 (2 H, d, J = 8.2, H-3, 5), 8.47 (2 H, d, J = 5.9, H-2', 6'), 10.54 (1 H, s, NH, amide); δc (DMSO-d6) 28.2 (3 x CH3), 43.2 (CH2), 78.0 (C(CH3)3), 1 14.0 (C-3', 5'), 126.8 (2 x CH), 127.9 (2 x CH), 132.6 (C-4), 144.6 (C), 146.0 (C), 150.3 (C-2', 6'), 155.8 (C=O, carbamate), 166.3 (C=O, amide).
【０１１６】
＜化合物(VI)の調製＞
【化１２】
2013502450.tif 000014
＜＜４−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル]安息香酸の調製＞＞
【化１３】
2013502450.tif 000015
市販の４−アミノメチル安息香酸(１０.０７８ｇ、６６.７ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)を、ＮａＯＨ水溶液(５.８６６ｇ、１４６.６ｍｍｏｌ、２.２ｅｑ.)、水(２５ｍｌ)及びＴＨＦ(テトラヒドロフラン；５０ｍｌ)に溶解した溶液に、ジ−tert−ブチルジカーボネート(１６ｇ、７３.３ｍｍｏｌ、１.１ｅｑ.)を添加した。１２時間撹拌した後、混合物をヘキサン(２×５０ｍｌ)で洗浄し、水相を５℃まで冷却し、水性飽和クエン酸で調節してｐＨ３とした。得られた白色析出物を酢酸エチル(３×５０ｍｌ)で抽出し、有機抽出液と混合して乾燥させた(ＭｇＳＯ4)。真空中で濃縮して、ＥｔＯＡｃから白色針状の表題カルバメート(１４.４３ｇ、８６％)が生じた。
【０１１７】
Rf = 0.43 (SiO2 petrol: EtOAc; 1 :3); υmax (neat)/cm-1 3357 (m), 2968 (w), 2930 (w), 2884 (w), 2488 (m), 1682 (s), 1510 (m), 1409 (m), 1291 (m), 1244 (m), 1 172 (m), 944 (m), 879 (m), 783 (m); δH (DMSO-d6) 1 .39 (9 H, s, 3 x CH3), 4.18 (2 H, d, J = 6.3, CH2), 7.34 (2 H, d, J = 8.1 , H-3, 5), 7.48 (1 H, t, J = 6.1 , NH), 7.89 (2 H, d, J = 8.2, H-2, 6), 12.87 (1 H, s, br, COOH); δc (DMSO-d6) 28.2 (3 x CH3), 43.2 (CH2), 77.9 (C(CH3)3), 126.9 (CH), 129.2 (C-1 ), 129.3 (CH), 145.3 (C-4), 155.8 (C=O), carbamate), 167.2 (C=O, acid).
【０１１８】
＜＜４−(Ｎ−メチル−Ｎ−ピリジン−４−イルカルバモイル)ベンジルカルバミン酸tert−ブチルエステル(化合物(VI))の調製＞＞
【化１４】
2013502450.tif 000016
化合物(V)に係る上記手順に基づいて、４−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル]安息香酸(５００ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)、ＥＤＣ(１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；ＨＣｌ塩、４２２ｍｇ、２.２ｍｍｏｌ、１.１ｅｑ.)、ＤＭＡＰ(４−ジメチルアミノピリジン；２４ｍｇ、０.２ｍｍｏｌ、０.１ｅｑ.)及び４−(メチルアミノ)ピリジン(２１５ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)から、表題のアミノ化合物(VI)を調製した。カラム・クロマトグラフィーでの精製(ｐｅｔｒｏｌ：ＥｔＯＡｃ；１：９)により、ＥｔＯＡｃから白色結晶の表題アミド化合物(VI)(４９５ｍｇ、１.４５ｍｍｏｌ、７３％)が生じた。
【０１１９】
Rf = 0.1 1 (SiO2 petrol: EtOAc; 1 :9); υmax (neat)/cm-1 3342 (m, br), 3033 (w), 2978 (m), 2931 (w), 2247 (w), 1707 (s), 1653 (s), 1589 (s), 1500 (m), 1365 (s), 1 169 (s), 731 (m); δH (CDCl3):1.43 (9 H, s, 3 x CH3), 3.50 (3 H, s, CH3), 4.26 (2 H, d, J = 5.6, CH2), 4.82 (1 H, s, NH, carbamate), 6.91 (2 H, dd, J = 1.6, 4.6, H-3', 5'), 7.14 (2 H, d, J = 8.2, H-2, 6), 7.26-7.32 (2 H, m, H-3, 5), 8.42 (2 H, dd, J= 1 .6, 4.6, H-2', 6'); δc (CDCl3): 28.6 (3 x CH3), 37.6 (CH3), 44.4 (CH2), 80.0 (C(CH3)3), 120.4 (C-3', 5'), 127.3 (C-3, 5), 129.3 (C-2, 6), 134.1 (C-4), 142.1 (C-1 ), 150.9 (C-2', 6'), 152.2 (C-4'), 156.0 (C=O, carbamate), 170.6 (C=O, amide).
【０１２０】
＜化合物(VII)の調製＞
【化１５】
2013502450.tif 000017
化合物(V)を、上述した２つの方法において調製した。
＜＜４−(アミノメチル)−Ｎ−ピリジン−４−イルベンズアミドの調製＞＞
【化１６】
2013502450.tif 000018
４−(ピリジン−４−イルカルバモイル)ベンジルカルバミン酸tert−ブチルエステル(３.６２ｇ、１１.０６ｍｍｏｌ、１ｅｑ.)を、酢酸(２０ｍｌ、２０ｍｍｏｌ)内に１ＭＨＣｌ溶解した溶液を、１時間撹拌した。エーテル(２００ｍｌ)を添加した後、得られた白色析出物をろ過し、水から再結晶させて白色粉末(１.６８ｇ、７.８ｍｍｏｌ、７１％)とした。
【０１２１】
Rf = 0.00 (SiO2 EtOAc); υmax (neat)/cm-1 3352 (w), 1664 (s), 1591 (s), 1506 (m), 1417 (m), 1332 (m), 1289 (w), 121 1 (w), 823 (m), 532 (w); δH (DMSO-d6) 2.16 (2 H, s, NH2), 3.80 (2 H, s, CH2), 7.50 (2 H, d, J = 8.5, H-2, 6), 7.79 (2 H, dd, J = 1 .6, 4.8, H- 3', 5'), 7.92 (2 H, d, J = 8.4, H-3, 5), 8.47 (2 H, dd, J = 1.6, 4.8, H-2', 6'), 10.52 (1 H, s, NH); δc (DMSO-d6) 45.3 (CH2), 1 14.0 (C-3', 5'), 126.9 (2 x CH), 127.8 (2 x CH), 132.0 (C-1 ), 146.0 (C), 148.8 (C), 150.3 (C-2', 6'), 166.3 (C=O).
【０１２２】
＜＜４−[(３，３−ジメチルブチルカルボニル)アミノメチル]−Ｎ−ピリジン−４−イルベンズアミド(化合物(VII))の調製＞＞
【化１７】
2013502450.tif 000019
４−(アミノメチル)−Ｎ−ピリジン−４−イルベンズアミド(２２７ｍｇ、１.０ｍｏｌ、１ｅｑ.)、tert−ブチル塩化アセチル(１５３μｌ、１.１ｍｍｏｌ、１.１ｅｑ.)及びピリジン(１６０μｌ、２ｍｍｏｌ、２ｅｑ.)をＤＣＭ(ジクロロメタン；５ｍｌ)に溶解した溶液を、常温で一晩中撹拌した。混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ3(１０ｍｌ)、塩水(１０ｍｌ)で洗浄し、乾燥させて(ＭｇＳＯ4)、真空中で濃縮した。カラム・クロマトグラフィー(ＥｔＯＡｃ)で精製し、ＥｔＯＡｃから白色固形物の表題アミド化合物(VII)(２１６ｍｇ、０.６６ｍｍｏｌ、６６％)が生じた。
【０１２３】
Rf = 0.08 (SiO2 EtOAc); m.p. 187.5℃; υmax (neat)/cm-1 3296 (w), 3034 (w), 2979 (w), 2927 (w), 1685 (s), 1655 (s), 1590 (s), 1519 (s), 1270 (m), 1 145 (w), 1 108 (w), 817 (w), 529 (w); δH (DMSO-d6) 0.97 (9 H, s, 3 x CH3), 2.05 (2 H, s, CH2CO), 4.34 (2 H, d, J = 6.0, CH2N), 7.42 (2 H, d, J = 8.3, H-3, 5), 7.78 (2 H, dd, J = 1.6, 4.8, H-3', 5'), 7.93 (2 H, d, J = 8.3, H-2, 6), 8.37 (1 H, t, J = 6.1 , NH-bn), 8.47 (2 H, dd, J = 1.4, 4.9, H-2', 6'), 10.54 (1 H, s, NH-py); δc (DMSO-d6) 29.7 (3 x CH3), 30.5 (C(CH3)3), 41.7 (CH2N), 48.7 (CH2CO), 1 14.0 (C-3', 5'), 127.2 (2 x CH), 127.9 (2 x CH), 132.5 (C-1), 144.4 (C), 145.9 (C), 150.3 (C-2', 6'), 166.2 (C=O), 170.9 (C=O).
【図１】
2013502450.tif 000031
【図２Ａ】
2013502450.tif 000032
【図２Ｂ】
2013502450.tif 000033
【図２Ｃ】
2013502450.tif 000034
【図３】
2013502450.tif 000035
【図４Ａ】
2013502450.tif 000036
【図４Ｂ】
2013502450.tif 000037
【図５Ａ】
2013502450.tif 000038
【図５Ｂ】
2013502450.tif 000039
【図５Ｃ】
2013502450.tif 000040
【図６Ａ】
2013502450.tif 000041
【図６Ｂ】
2013502450.tif 000042
【国際調査報告】
2013502450.tif 000043
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