(57)【要約】本明細書において、増強量のメトホルミンおよび低減された量の1つまたは複数の化学療法剤を投与する段階を含む、それを必要としている対象において腫瘍を処置するための方法が開示される。増強量のメトホルミンの一つの例は、約250 mg/日である。対象に有効量のメトホルミンを投与する段階を含む、該対象においてがんを予防するためまたはがんの再発を遅延させるための方法もまた、開示される。そのような方法の一つの例において、メトホルミンの量は約75 mg/日である。また、増強量のメトホルミン、ならびに低減された量の1つまたは複数の化学療法剤および薬学的に許容される担体を含む、組成物も開示される。メトホルミンおよび1つまたは複数の化学療法剤を含むキットも開示される。2013503171.tif 000005
2013503171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増強量のメトホルミンおよび低減された量の1つまたは複数の化学療法剤を投与する段階を含む、それを必要としている対象において腫瘍を処置するための方法。
【請求項２】
メトホルミンの前記増強量が250 mg/日である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
増強量のメトホルミン、ならびに低減された量の1つまたは複数の化学療法剤および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項４】
メトホルミンの前記増強量が約25 mgである、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
メトホルミンの前記増強量が約75 mgである、請求項3記載の組成物。
【請求項６】
メトホルミンの前記増強量が約250 mgである、請求項3記載の組成物。
【請求項７】
メトホルミンのバイアル、1つまたは複数の化学療法剤のバイアル、該メトホルミンと該化学療法剤の併用のための使用説明書を含む、キット。
【請求項８】
対象に有効量のメトホルミンを投与する段階を含む、該対象においてがんを予防するためまたはがんの再発を遅延させるための方法。
【請求項９】
メトホルミンの前記量が約75 mg/日である、請求項8記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は2009年8月25日付で出願された米国特許仮出願第61/236,778号に対する米国特許法119条(e)の下での優先権の恩典を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所が与えるCA 57436およびCA 107486の下で政府支援によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は腫瘍治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
がんの化学療法処置は腫瘍塊を効果的に低減できるが、しかし疾患は再発することが多い。この現象を説明するために、がん幹細胞仮説では、腫瘍が非腫瘍形成性がん細胞の集団のなかに少数の腫瘍形成性で自己再生性のがん幹細胞を含むことを提唱している(1, 2)。腫瘍内の大多数の細胞とは異なり、がん幹細胞は明確に定義された化学療法に対して抵抗性を有し、処置後、それらの幹細胞様の挙動を通じて該腫瘍中の全細胞種を再生することができる。このため、がん幹細胞を選択的に標的化する薬物はがん処置のために非常に有望であるが、現在知られているものはない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一つの局面は、増強量のメトホルミンおよび低減された量の1つまたは複数の化学療法剤を投与する段階を含む、それを必要としている対象においてがん/腫瘍を処置するための方法に関する。一つの態様において、メトホルミンの増強量は250 mg/日である。
【０００６】
本発明の別の局面は、増強量のメトホルミン、ならびに低減された量の1つまたは複数の化学療法剤および薬学的に許容される担体を含む、組成物に関する。一つの態様において、メトホルミンの増強量は約25 mg、75 mgまたは250 mgである。
【０００７】
本発明の別の局面は、対象に有効量のメトホルミンを投与する段階を含む、該対象においてがんを予防するためまたはがんの再発を遅延させるための方法に関する。一つの態様において、メトホルミンの量は約75 mg/日である。
【０００８】
本発明の別の局面は、メトホルミンのバイアル、1つまたは複数の化学療法剤のバイアル、該メトホルミンと該化学療法剤の併用のための使用説明書を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1A〜図1Bは、実験データのグラフ図を含み、その結果から、メトホルミンはMCF10A-ER-Src細胞の形質転換を阻止することが示唆される。図1A: 24時間、表示濃度のメトホルミンとともに1 μMの4-ヒドロキシタモキシフェン(TAM)の存在下または非存在下で増殖した細胞の数。図1B: 表示濃度のメトホルミンの存在下でのTAM処理細胞または非処理細胞における増殖巣、軟寒天中のコロニーおよびマンモスフィアの相対数。
【図２】実験データの棒グラフであり、その結果から、メトホルミンはマンモスフィアの増殖を阻害することが示唆される。表示した細胞株由来の6日目（6-days old）のマンモスフィアを0.1 mMメトホルミンで48時間処置するかまたは処置せず、マンモスフィアの数をカウントした。
【図３】図3A〜図3Cは、実験データのグラフ図を含み、その結果から、メトホルミンががん幹細胞を選択的に死滅させ、ドキソルビシンと相乗的に機能することが示唆される。図3A: ドキソルビシン、0.1 mMメトホルミンまたはその両方で処理された形質転換(36時間のTAM処理) MCF-10A集団(n = 3)におけるがん幹細胞(CD44高/CD24低; 黒色)およびがん細胞(CD44低/CD24高; 灰色)の数。図3B: 選別によって得られたがん幹細胞(SC)および非幹がん細胞(NSC)を0、24および48時間0.1 mMメトホルミンで処理した。図3C: 注射前に0.1 mMメトホルミンで1時間処理するか、または処理しなかったMCF10A-ER-Srcがん幹細胞の注射後の表示日数の時点でのヌードマウスにおける腫瘍容積。
【図４】図4A〜図4Bは、実験データのグラフ図を含み、その結果から、メトホルミンおよびドキソルビシンが一緒に作用し、ヌードマウスにおいて腫瘍塊を低減させ、かつ寛解を延長させることが示唆される。図4A: 4 mg/kgのドキソルビシン(Dox)、100 μg/mlのメトホルミン(Met)もしくはその両方の腹腔内注射により5日ごと(3サイクル; 矢印は注射当日を示す)に処理するかまたはしなかった、形質転換MCF10A-ER-Src細胞を注射した(0時間は注射時点を示す)マウスの腫瘍容積(平均値および95%信頼区間)。図4B: 3サイクルの処理(25日目)後にDoxまたはDox + Metの組み合わせで処理した腫瘍から得られた細胞におけるがん幹細胞(CD44高/CD24低)の数。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
がん幹細胞仮説では、腫瘍内の大多数のがん細胞とは異なり、がん幹細胞は化学療法薬に対して抵抗性を有し、腫瘍中のさまざまな細胞種を再生し、それによって疾患の再発を引き起こしうることを提唱している。したがって、がん幹細胞を選択的に標的化する薬物は、特に化学療法と組み合わせて、がん処置のために非常に有望となる。本明細書において、本発明者らは、糖尿病の標準薬であるメトホルミンの低用量が細胞形質転換を阻害し、4種の遺伝学的に異なるタイプの乳がんにおいてがん幹細胞を選択的に死滅させることを示す。メトホルミンおよび明確に定義された化学療法剤ドキソルビシンの組み合わせにより、培養下のがん幹細胞も非幹がん細胞も死滅される。さらに、この組み合わせ療法は異種移植マウスモデルにおいていずれかの薬物だけよりもずっと効果的に腫瘍塊を低減し、再発を阻止する。マウスは、メトホルミンおよびドキソルビシンによる組み合わせ療法を終えた後に少なくとも2ヶ月間、腫瘍のない状態を維持する。これらの結果は、がん幹細胞仮説を支持するさらなる証拠を提供し、かつそれらは、乳がんおよび他のがんを有する患者の処置を改善するためにメトホルミンおよび化学療法薬の組み合わせを用いることの論理的根拠および実験的基礎を提供する。
【００１１】
本発明の局面は、メトホルミンが、治療的処置(例えば、がん療法)において用いられる化学療法剤の抗腫瘍効果を増強するという知見に基づく。したがって、治療的抗腫瘍効果を生み出すのに必要な化学療法剤の量が低減される。化学療法剤の量の低減は、化学療法剤からのレシピエントに対する副作用の減少をもたらす。したがって、本発明の一つの局面は、増強量のメトホルミンおよび低減された量の化学療法剤を、それを必要としている患者に投与する段階を含む、該化学療法剤の抗腫瘍効果を増加させる方法に向けられる。
【００１２】
定義
本明細書において用いられる場合、「細胞毒性剤」という語句は、異常かつ無秩序な進行性の細胞増殖を処置するために用いられる剤を意味する。好ましい細胞毒性剤には、例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、シタラビン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびダウノルビシン、クロラムブシル、カルムスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、ならびにパクリタキセルが含まれる。
【００１３】
メトホルミンの「増強量」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、化学療法剤(例えば、細胞毒性剤)または療法(例えば、放射線療法)の抗腫瘍効果を、統計学的に有意かつ再現可能に増強するのに十分な量である。抗腫瘍効果の増強は、当技術分野において公知の種々の手段を通じて判定することができる。例えば、抗腫瘍効果の増強は、抗腫瘍効果をもたらすのに必要な剤または療法の投与量の統計学的に有意な減少を通じて判定することができる。これは例えば、メトホルミンの非存在下で標準的な量の療法を受けた適切な対照群との比較によって判定される。
【００１４】
「化学療法剤」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、腫瘍の処置において用いられる化学物質または薬物をいう。そのような剤は、細胞毒性剤であることが多い。
【００１５】
「放射線療法」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、がん細胞を死滅させ、腫瘍を縮小させるための電離放射線の使用をいう。
【００１６】
化学療法剤(例えば、細胞毒性剤)または療法の「低減された量」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、腫瘍の処置のために該腫瘍を患う対象に投与される標準的な量を下回り、かつ同じまたはさらに良好な治療結果をもたらす量である。低減された量の化学療法剤または腫瘍療法を用いることの一つの利点とは、治療結果が同じまたはさらに高いままで、レシピエントが受ける副作用が減少することである。量の低減は、1回もしくは複数回の個々の投与で与えられる量(投与量)の低減、投与の頻度の低減、またはその組み合わせでありうる。標準的な投与量および投与スケジュールのレジメンについての案内は、当業者に対し当技術分野において(例えば、the Physicians' Desk Reference, 56th Ed. (2002) Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey (「PDR」)において)）提供されている。低減された量は、治療的投与において一般に用いられる標準的な用量よりも著しく少ない(例えば、標準的な投与量の約90%、80%または70%まで低減される)。場合によっては、治療上の恩恵は、標準的投与量を75%未満まで低減した投与量の投与から得られよう(例えば、投与は標準的投与量の約75%〜25%以内である)。治療上の恩恵は、標準的投与量の約60%、50%または40%まで標準的投与量を低減した投与量の投与から得られると予想される。場合によっては、治療上の恩恵は、標準的投与量を40%未満まで低減した投与量の投与から得られよう(例えば、投与は標準的投与量の約40%〜10%以内である)。一つの態様において、投与量は標準的投与量の約30%である。一つの態様において、投与量は標準的投与量の約20%である。一つの態様において、投与量は標準的投与量の約10%である。
【００１７】
「抗腫瘍効果」または「抗がん効果」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、腫瘍増殖、増殖速度、サイズ、広がり、転移の低減、ならびに個体における腫瘍の発生および/または再発の阻止をいう。
【００１８】
「対象を処置する」などの「処置する」という用語は、ヒトまたは動物のいずれかであるそのような対象に、特に、生理的もしくは医学的に望ましくない状態の発生を予防する目的でまたはその悪化を予防する目的で、あるいは、そのような対象においてそのような状態を改善する目的で、医学的補助を与えることを意味する。特に指定のない限り、「処置する」という用語は、いかなる特定の期間にも、いかなる特定の用量レベルにも限定されない。
【００１９】
「組成物」または「薬学的組成物」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、当技術分野において慣用的でありかつ対象への投与に適した薬学的に許容される担体のような、賦形剤を通常含む、組成物または製剤をいう。そのような組成物は、経口投与、眼投与および鼻投与などを含むがこれらに限定されない、いくつかの経路の1つまたは複数による投与のために特に製剤化されてもよい。
【００２０】
「薬学的に許容される担体」とは、標的化した送達組成物を混合するためおよび/または標的化した送達組成物を対象に送達するための任意の薬学的に許容される手段を意味する。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、体内のある臓器または部分から体内の別の臓器または部分に対象である剤を運ぶまたは輸送する際に関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分に適合するという意味で「許容され」なければならず、対象、例えばヒトへの投与に適合する。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、「対象」とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類または魚類のような動物をいう。「哺乳類」という用語は、単数の「哺乳類」および複数の「哺乳類」を包含するように意図され、ヒト、霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなど; イヌ科、例えばイヌおよびオオカミなど; ネコ科、例えばネコ、ライオンおよびトラなど; ウマ科、例えばウマ、ウシ、ロバおよびシマウマなど、食用動物、例えばウシ、ブタおよびヒツジなど; 有蹄動物、例えばシカおよびキリンなど; げっ歯類、例えばマウス、ウサギ、ラット、ハムスターおよびモルモットなどを含むが、これらに限定されることはない。
【００２２】
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、動物、例えば哺乳類、例えばヒトをいう。
【００２３】
本明細書において利用される「メトホルミン」という用語は、メトホルミンまたは薬学的に許容されるその塩、例えば、1999年3月4日付で出願された米国特許出願第09/262,526号に開示された、塩酸塩、メトホルミン(2:1)フマル酸塩およびメトホルミン(2:1)コハク酸塩、塩化臭素酸塩、p-クロロフェノキシ酢酸塩またはエンボン酸塩、ならびに、米国特許第3,174,901号に開示されたものを含む他の公知の一塩基カルボン酸および二塩基カルボン酸のメトホルミン塩などをいい、これらの塩全てをメトホルミンと総称する。本明細書において利用されるメトホルミンはメトホルミン塩酸塩、すなわち、Glucophage(登録商標) (Bristol-Myers Squibb Companyの商標)として上市されているものでありうる。
【００２４】
本明細書において用いられる「誘導体」という用語は、類似の化学構造および類似の機能を有する化合物をいう。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」とは、文脈上明らかでない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「1つの薬物」を送達するための組成物への言及は、2つまたはそれ以上の薬物への言及を含む。本発明について記述および主張する際に、以下の専門用語は以下に記載の定義にしたがって用いられる。
【００２６】
本発明の別の局面は、腫瘍に対する対象の処置中の化学療法剤の副作用を低減する方法に関し、該方法は、増強量のメトホルミンおよび低減された量の化学療法剤を対象に投与する段階を含み、投与される化学療法剤の量がもたらす副作用は、化学療法剤の通常の量と比べて少ない、該方法に関する。本発明はさらに、増強量のメトホルミンおよび低減された量の1つまたは複数の化学療法剤を含む、腫瘍を阻害する薬学的組成物に向けられ、該化学療法剤の腫瘍を阻害する量とは、副作用の減少をもたらす量である。
【００２７】
本明細書において記述される方法の一つの態様において、化学療法剤はがん幹細胞に対して阻害的ではない。本明細書において記述される方法の別の態様において、化学療法剤はがん幹細胞に対して阻害的である。がん幹細胞阻害的および非阻害的な化学療法薬の併用療法も想定される。
【００２８】
一つの態様において、増強量のメトホルミンは腫瘍(例えば、がん)の切除手術後の患者に、(例えば、低減された量の)標準的な化学療法剤のカクテルとともに投与される。
【００２９】
本明細書において論じられるように、メトホルミンの同時投与の効果はまた、他の形式の抗腫瘍療法(例えば、インターフェロン療法のようなホルモン療法、または放射線療法)を増強することも予想される。したがって、化学療法剤の使用に関して本明細書において記述される治療方法は代替的に、増強量のメトホルミンを用いかつ同様に投与量および/または頻度を低減したこれらの他の形式の腫瘍療法およびその対応する治療剤を用いて、行うことができる。増強量のメトホルミンを、1つもしくは複数の治療法と組み合わせて、かつ/または本明細書において記述される1つもしくは複数の他の治療薬と組み合わせて用いることも想定される。
【００３０】
本明細書において論じられるように、メトホルミンの同時投与の効果はさらに、腫瘍/がん細胞を死滅させる他の剤の効果を増強すると予想される。これには、細胞の形質転換に影響を与える薬物(例えば、エキセンジン4、アスピリン、メロキシカム、インドメタシン、セレコキシブ、ピロキシカム(piroxican)、ニメスルフィド、スリンダク、トシリズマブ、シンバスタチン、セルレニン、メバスタチン)のような、伝統的に化学療法の一部ではない他の剤(例えば、薬物)が含まれる。そのような剤を、メトホルミン同時投与による相乗効果/増強についてアッセイ法(例えば、本明細書において記述される細胞アッセイ法)で試験することができる。したがって、化学療法剤の使用に関して本明細書において記述される治療方法は代替的に、増強量のメトホルミンを用いかつ同様に投与量および/または頻度を低減したこれらの他の腫瘍/がん殺傷剤を用いて、行うことができる。腫瘍/がん細胞を死滅させると考えられるそのような剤は、非限定的に、抗体(例えば、抗HER2)、タモキシフェンおよび形質転換を阻害する他の化合物を含む。増強量のメトホルミンを、1つもしくは複数の治療法および/もしくは剤と組み合わせて、かつ/または本明細書において記述される1つもしくは複数の他の治療薬および/もしくは剤と組み合わせて用いることも想定される。
【００３１】
所与の化学療法剤または処置を増強できそれによって対象に与えられる量の低減を可能にできるメトホルミンの能力は、当業者の能力の範囲内である。例えば、化学療法剤または腫瘍処置の増強は、メトホルミン投与なしの1つまたは複数の適切な対照と比べて、メトホルミン投与と組み合わせた場合の該剤または処置の効力の増加によって証明される。当業者は処置の効力を判定することができる。効力は、がんおよび腫瘍の動物モデルにおいて、例えばがんを有するげっ歯類の処置において、評価することができ、腫瘍の少なくとも1つの症状の減少、例えば腫瘍サイズの低減または腫瘍の増殖速度の緩徐化もしくは停止をもたらす全ての組成物または製剤の投与または処置は、有効な処置であることを示す。
【００３２】
任意の所与の製剤の効力もまた、がんの実験動物モデル、例えば、野生型マウスもしくはラット、または好ましくは、以下の本明細書における実施例に記述されているものに類似の腫瘍細胞の移植を用いて、判断することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の効力は、腫瘍の症状の低減、例えば腫瘍サイズの低減または腫瘍の増殖速度の緩徐化もしくは停止が未処置動物と比べて処置動物でより早く起こる場合に証明される。「より早く」とは、例えば腫瘍サイズの減少が、少なくとも5%早く、しかし好ましくはそれより早く、例えば、1日早く、2日早く、3日早く、またはそれ以上早く生じることを意味する。
【００３３】
以下の実施例の項に詳述される実験から、メトホルミンはがん幹細胞を選択的に死滅させること、およびこの死滅は、がん幹細胞が比較的低い濃度のメトホルミンに曝露される場合に生じることが示唆される。したがって、本発明の別の局面は、メトホルミンを対象に投与する段階を含む、該対象において腫瘍/がんの発生を予防するためまたは遅延させるための方法に関する。そのような対象は、例えば、(例えば、遺伝的にまたは発がん物質への曝露により)腫瘍発生の素因を有しうる。非限定的に、そのような遺伝的素因の例としては、brca1、brcaII、rbまたはp53遺伝子における突然変異を起こしやすいことが挙げられる。一つの態様において、対象は化学療法または放射線療法を過去に受けており、続発性がんを発生するリスクが高い。一つのそのような例は、小児白血病またはリンパ腫の処置を受けた対象である。一つの態様において、本明細書において記述される方法によりメトホルミンを投与し、前がん病変(例えば、皮膚病変)と接触させて、それにより該病変ががんに発展することを阻止する。別の態様において、メトホルミンは(例えば、除去部位と接触させるために)そのような病変の除去後に投与される。
【００３４】
本発明の別の局面は、血液がんの処置における自家移植の前の、メトホルミンによる骨髄または末梢血骨髄幹細胞サンプルの処置に関し、それによってがん幹細胞を低減させる。そのような処置は幹細胞が再播種される可能性を減少させるであろう。一つの態様において、メトホルミンは、移植が行われた後に(例えば、移植後の数日間、数週間、数ヶ月間または1年間)、移植を受けた対象に投与することができる。
【００３５】
本発明の別の局面は、対象における長期がん予防のための低用量のメトホルミンの投与に関する。一つの態様において、そのような投与は、メトホルミンを補充した栄養補助食品または普通食(例えば、イヌ飼料、ネコ飼料、または家畜に日常的に与えられる飼料のような配合動物飼料)の形態である。飼料および栄養補助食品のそのような製剤も本発明によって包含される。
【００３６】
本発明の別の局面は、がん細胞の死滅において化学療法剤、殺腫瘍剤および他の治療法を増強する能力に関して、メトホルミンの誘導体を試験するためのアッセイ法に関する。当業者は、以下の実施例の項に記述される細胞アッセイ法をそのようなアッセイ法に適合させることができる。
【００３７】
投与量および投与
治療用途において、用いられる化学療法剤または療法の標準的な投与量および投与スケジュールは、投与される細胞毒性剤または療法の組み合わせ、腫瘍タイプ、レシピエント患者の年齢、体重および臨床状態、投与の経路、ならびに治療法の投与を行う臨床医または実施者の経験および判断のような、いくつかの変数に依って変化しうる。しかしながら、本発明は、そのような投与量および/または投与スケジュールを顕著に低減させることができ、それにより処置からの副作用の減少をもたらす。
【００３８】
一つの態様において、投与されるメトホルミンの量は、2型糖尿病の処置のための治療的投与において一般に用いられる標準的な用量(約1500 mg/日〜約2550 mg/日)でありうる。別の態様において、メトホルミンの(例えば、化学療法剤による腫瘍処置を増強する際に用いられる、または腫瘍発生の予防の際に用いられる)治療量は、2型糖尿病の処置のための治療的投与において一般に用いられる標準的な用量よりも著しく少ない(例えば、標準的な投与量の約90%すなわち約1350 mg/日、80%すなわち約1200 mg/日、または70%すなわち約1050 mg/日まで低減される)。場合によっては、治療上の恩恵は、標準的な投与量を75%未満まで低減した投与量の投与から得られるであろう(例えば、投与は標準的な投与量の約75%すなわち約1125 mg/日〜25%すなわち約375 mg/日の範囲内である)。治療上の恩恵は、標準的な投与量の約60%すなわち約900 mg/日まで、50%すなわち約750 mg/日まで、または40%すなわち約600 mg/日まで標準的な投与量を低減した投与量の投与から得られると予想される。場合によっては、治療上の恩恵は、標準的な投与量を40%未満まで低減した投与量の投与から得られるであろう(例えば、投与は標準的な投与量の約40%〜10%、すなわち約600 mg/日〜約150 mg/日の範囲内である)。一つの態様において、投与量は標準的な投与量の約30%すなわち約450 mg/日である。一つの態様において、投与量は標準的な投与量の約20%すなわち約300 mg/日である。一つの態様において、投与量は標準的な投与量の約10%すなわち約150 mg/日である。
【００３９】
投与は、投与剤(例えば、メトホルミンおよび化学療法剤)が腫瘍または腫瘍部位と接触するように(例えば、腫瘍の除去後に)行われる。適当な投与経路は当技術分野において公知である。本明細書において記述される剤は、Physicians' Desk Reference, 56th Ed. (2002) Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey (「PDR」)に記述されているものなどの、臨床医が適切と認めた全ての様式で投与することができる。例えば、非経口、経腸、局所投与である。混合した剤を、または各剤を個別に、当技術分野において公知の任意の手段によって投与することができる。そのような様式には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与(口腔投与および舌下投与を含む)、または非経口投与(皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与および皮内投与を含む)が含まれる。メトホルミンおよび増強される剤は全身的に投与されてもよく、あるいは腫瘍部位にまたは腫瘍部位の近傍に局部的に(例えば、腫瘍、または腫瘍を含んだ臓器もしくは体内部分への注射により)投与されてもよい。一つの態様において、メトホルミンおよび増強される治療剤(例えば、化学療法剤)は中枢神経系に投与される。
【００４０】
投与は術前、術後またはその両方であってよい。一つの態様において、メトホルミンは手術および腫瘍除去の前1ヶ月にわたり1日3回(例えば25 mg/用量)投与される。
【００４１】
本明細書において記述される方法におけるメトホルミンの投与(化学療法剤と共に適用できる場合)は、長期間(例えば、6〜12ヶ月、または1、2、3年、または無期限)であってよい。一つの態様において、メトホルミンは化学療法剤よりも頻繁に投与される。例えば、対象に、メトホルミン(例えば、250 mg/日)を毎日投与しながら化学療法剤(例えば、ドキソルビシン)を、他の場合に処方されるよりも有意に少ない頻度、例えば3日/月で投与することができる。
【００４２】
一般に、用量および投与スケジュールは、腫瘍の増殖の緩徐化および好ましくは停止、かつ好ましくは腫瘍の完全な退縮の惹起をもたらすのに十分でなければならない。場合によっては、退縮は腫瘍特異的なマーカーの血中レベルの減少によってモニタリングすることができる。薬剤の有効量とは、臨床医または他の有資格観察者が気付くような客観的に識別可能な改善をもたらすものである。患者における腫瘍の退縮は、典型的には、腫瘍の直径を基準にして測定される。腫瘍の直径の減少は退縮を示す。退縮はまた、処置を停止した後に腫瘍が再発しないことによって示される。
【００４３】
メトホルミンおよび化学療法剤は、組み合わされてまたは別々に、1日数回から1ヶ月1回までに及びうる定期的な間隔で送達される。上記のように、該剤は、所望の治療結果が得られるまで投与される。さらに、副作用を回避するため、該組み合わせの全ての成分を各投与で送達する必要が無くてもよい。
【００４４】
治療剤
現在利用できる細胞毒性薬はその作用機序によって4つの群に大別することができる: アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、およびその他の活性。がんを有する個体を処置するための特定の細胞毒性剤の選択は、がんのタイプ、患者の年齢および全身状態、ならびに多剤耐性の問題を含む多くの要因によって影響を受ける。
【００４５】
本発明の組成物では、以下の剤(可能な供給元を含む)がこれらに限定されない、種々の細胞毒性剤を利用することができる: アルキル化剤であるシクロホスファミド(Bristol-Meyers Squibb)、イホスファミド(Bristol-Meyers Squibb)、クロラムブシル(Glaxo Wellcome)、およびカルムスチン(Bristol-Meyers Squibb); 代謝拮抗薬であるシタラビン(Pharmacia & Upjohn)、6-メルカプトプリン(Glaxo Wellcome)、6-チオグアニン(Glaxo Wellcome)、およびメトトレキサート(Immunex); 抗生物質であるドキソルビシン(Pharmacia & Upjohn)、ダウノルビシン(NeXstar)、およびミトキサントロン(Immunex); ならびにビンクリスチン(Lilly)、ビンブラスチン(Lilly)、およびパクリタキセル(Bristol-Meyers Squibb)のようなその他の剤を含む。好ましい細胞毒性剤には、シクロホスファミド、イホスファミド、シタラビン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、およびビンクリスチンが含まれる。最も好ましい細胞毒性剤は、シクロホスファミドおよびイホスファミドである。
【００４６】
化学療法剤は、当技術分野において公知であり、少なくともタキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン; 葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、抗生物質、酵素、白金配位複合体、置換された尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑止剤、またはアンタゴニストを含む。より具体的には、化学療法剤は、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、またはアンドロゲンの非限定的な群より選択される1つまたは複数の剤であってもよい。さらに具体的には、化学療法剤は、アザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン-1、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、カルボプラチン、シスプラチン、CPT-11、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、L-アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、パクリタキセル、酪酸フェニル、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスチンストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、テストステロンプロピオン酸、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、またはビンクリスチンであってもよい。化学療法剤の任意の組み合わせの使用も企図される。
【００４７】
その他の適当な治療剤は、放射性同位元素、ホウ素付加物、免疫調節物質および化学増感剤からなる群より選択される(米国特許第4,925,648号および同第4932,412号を参照のこと)。適当な化学療法剤は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)に、およびGoodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman et al., Eds. Macmillan Publishing Co., New York, 1980 and 2001 editions)に記述されている。実験薬などの、その他の適当な化学療法剤が当業者に公知である。例えば、Harbert, 「Nuclear Medicine Therapy」, New York, Thieme Medical Publishers, 1087, pp. 1-340に記述されているように、がんおよび他の病的状態の処置のために放射性核種療法のさまざまな方法を使用できることが当技術分野において周知である。さらに、適当な治療用放射性同位元素は、α-放射体、β-放射体、γ-放射体、オージェ電子放射体、α粒子を放射する中性子捕獲薬、および電子捕獲によって壊変する放射性同位元素からなる群より選択される。好ましくは、放射性同位元素は、225Ac、198Au、32P、125I、131I、90Y、186Re、188Re、67Cu、177Lu、213Bi、10Bおよび211Atからなる群より選択される。
【００４８】
別の態様において、同位元素の個々のエネルギー発光の結果として種々の距離にわたって有効である種々の同位元素が、第1および第2の治療剤として用いられる。このような剤は、通常の臨床環境と同様に、より有効な腫瘍の処置を達成するために用いることができ、サイズが異なる複数の腫瘍を呈する患者において有用である。
【００４９】
利用できる同位元素のいくつかは、非常に小さな腫瘍沈着および単細胞を処置するために有用である。これらの状況では、薬物または毒素が、より有用な治療剤となりうる。したがって、本発明の好ましい態様において、同位元素は薬物、毒素および中性子捕獲剤などの非同位元素種と組み合わせて用いられる。細胞に対して細胞毒性を有する多くの薬物および毒素が公知であり、本発明に関連して用いられうる。これらは、Merck Index, Goodman and Gilmanなどのような、薬物および毒素の概論において、ならびに上記の参考文献において見出される。
【００５０】
また、細胞内タンパク質合成を妨害する薬物を本発明の方法において用いることができ; このような薬物は当業者に公知であり、ピューロマイシン、シクロヘキシミドおよびリボヌクレアーゼを含む。
【００５１】
放射線療法
腫瘍治療において種々の放射線療法が用いられる。出願人らは腫瘍処置におけるそのような放射線療法のいずれか1つまたは組み合わせの量の低減を可能にするために増強量のメトホルミンを用いることを想定する。
【００５２】
ある種の腫瘍の場合、腫瘍のエビデンスがない領域に放射線を適用してもよい。これは、放射線を受ける該領域において腫瘍細胞が増殖することを防ぐために行われる。この技法は予防的放射線療法と呼ばれる。また、骨または体内の他の部分に広がったがんに起因する疼痛などの症状を低減する助けとするために、放射線療法を施すことができる。これは緩和的放射線療法と呼ばれる。
【００５３】
放射線は体外の機械から出たものでもよく(外部放射線)、体内に配置されてもよく(内部放射線)、または全身に行き渡る非密封放射性物質を用いてもよい(全身放射線療法)。適用される放射線のタイプは、がんのタイプ、その位置、体内のどの程度深くまで放射線が進む必要があるか、患者の全身的健康および病歴、患者が他のタイプのがん処置を受けるかどうか、ならびに他の要因に依る。がんの放射線療法を受ける大多数の人は、外部放射線を照射される。患者のなかには、交互にまたは同時に、外部放射線と内部放射線または全身放射線療法とを受ける者がいる。外部放射線療法は、通常、外来で施され; 大多数の患者は入院する必要がない。外部放射線療法は、膀胱、脳、乳房、頸部、喉頭、肺、前立腺および膣のがんを含めて、大多数のタイプのがんを処置するために用いられる。さらに、外部放射線は、疼痛を軽減するために、またはがんが原発部位から身体の他の部分に広がる際の他の問題を緩和するために用いることができる。
【００５４】
術中照射治療(IORT)は、手術中に施される外部放射線の一形態である。IORTは、完全に除去できないかまたは隣接組織における再発(再起)のリスクが高い限局性がんを処置するために用いられる。全てのまたは大部分のがんを除去した後、手術中に、大量かつ高エネルギー線量の放射線を直接腫瘍部位に照射する(近傍の健常組織は専用の遮蔽で保護する)。患者は手術からの回復のために入院する。IORTは、甲状腺および結腸直腸がん、婦人科がん、小腸のがん、ならびに膵臓のがんの処置において用いることができる。これはまた、成人におけるある種の脳腫瘍および骨盤肉腫を処置するための臨床試験(調査研究)において研究されている。
【００５５】
予防的頭蓋照射(PCI)は、原発がん(例えば、小細胞肺がん)が脳に広がるリスクが高い場合に脳に照射される外部放射線である。
【００５６】
内部放射線療法(小線源療法とも呼ばれる)では、腫瘍のすぐ近くまたは内部に配置される放射線を用いる。放射線源は、通常、インプラントと呼ばれる小容器の中に密封される。インプラントは細い針金、カテーテルと呼ばれるプラスチック管、リボン、カプセルまたはシードの形態であってよい。インプラントは体内に直接配置される。内部放射線療法では入院が必要になることがある。内部放射線は、通常、二つのうちどちらかの方法で送達され、このいずれでも密封されたインプラントを用いる。組織内放射線療法では腫瘍部位のまたはその近傍の組織へ挿入が行われる。これは、頭頸部、前立腺、子宮頸部、卵巣、乳房ならびに肛門周囲および骨盤の領域の腫瘍を処置するために用いられる。乳がんのために外部放射線で処置された女性の一部は「追加線量」の放射線を受け、これは、組織内放射線または外部放射線を用いることができる。腔内または管腔内放射線療法ではアプリケータを用いて体内へ挿入される。これは子宮がんの処置においてよく用いられる。また、研究者らは、乳がん、気管支がん、子宮頸がん、胆嚢がん、口腔がん、直腸がん、気管がん、子宮がんおよび膣がんを含む、他のがんに対するこれらのタイプの内部放射線療法を研究している。全身放射線療法ではヨウ素131およびストロンチウム89のような放射性物質を用いる。これらの物質は口から服用されてもよく、または体内へ注射されてもよい。全身放射線療法は、甲状腺のがんおよび成人非ホジキンリンパ腫を処置するために使われることもある。
【００５７】
腫瘍
本発明の方法および組成物によって処置される腫瘍は、悪性(例えば、発がん性もしくは「がん」)でも良性でもよい。処置に向けた良性腫瘍の例としては甲状腺腫、副腎皮質腺腫、および下垂体腺腫、良性脳腫瘍(例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫)が挙げられる。「がん」とは、通常、症状として腫瘍の出現を有する疾患の群を意味する。これらの腫瘍は異型細胞から構成され、自律的増殖能、不明確な境界決定、隣接組織および血管に浸潤する能力、ならびに転移の発生によって拡散する傾向を有する。非限定的に、本明細書において記述される方法および組成物によって処置できるがんの例としては、膀胱がん、黒色腫、乳がん、非ホジキンリンパ腫、結腸および直腸がん、膵臓がん、子宮内膜がん、前立腺がん、腎臓(腎細胞)がん、皮膚がん(非黒色腫)、白血病、甲状腺がん、肺がん、子宮頸がん、卵巣がん、精巣がんが挙げられる。以下の腫瘍の原発性および転移性増殖を上記の方法によって阻害することができる: 外陰部表皮がん、子宮頸がん、子宮内膜腺がん、卵巣腺がんおよび眼黒色腫。
【００５８】
メトホルミンは血液脳関門を通過することができるので、本明細書において記述される方法によるその投与は、中枢神経系腫瘍の処置もしくは予防、または中枢神経系へのがんの広がりの予防において有用でありうる。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、例えば懸濁液、エアロゾルなどのような、固体、半固体または液体の剤形であってよい。好ましくは、組成物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形で投与される。組成物は、所望の製剤化に依存して、薬学的に許容される、無毒の担体または希釈剤を含んでもよく、それらは、動物またはヒトへの投与用の薬学的組成物を製剤化するためによく用いられるビヒクルと定義される。組成物は持続放出製剤または徐放性製剤として提供されてもよい。担体または希釈剤は、単独のまたはロウと混合された、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような、当技術分野において公知の任意の持続放出材料を含んでもよい。制御放出調製物は、メトホルミンおよび/または化学療法剤を複合体化または吸着するための重合体の使用によって達成することができる。制御送達は、放出を制御するために導入法に加えて、適切な巨大分子(例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよび硫酸プロタミン)ならびに巨大分子の濃度の選択によって行うことができる。マイクロカプセル化が用いられてもよい。徐放性製剤により、一日を通して即時放出とパルス放出の組み合わせを提供することができる。希釈剤は、該組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらに、製剤の薬学的組成物は、他の担体、アジュバント、ポロキサマーのような乳化剤、または無毒で非治療的かつ非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。そのような希釈剤または担体の有効量は、成分の可溶性または生物学的活性などの点で薬学的に許容される製剤を得るために有効な量であろう。
【００６０】
本発明の別の局面は、上記の薬物の組み合わせを用いてがんを処置するための製剤に関する。一つの態様において、製剤は、薬物の1つまたはいくつかを遅延様式で放出させる制御放出装置を含む。そのような製剤は、経口的に服用された後に異なる時間間隔で異なる用量の薬物を放出する錠剤(または丸剤)の形態であってよい。
【００６１】
本発明の別の局面は、本明細書において開示される方法(例えば、腫瘍治療)による対象の処置のためのキットに関する。キットは上記に示された用量で、メトホルミンの1つまたは複数のバイアルおよび化学療法剤の1つまたは複数のバイアルを(一緒にまたは別々のバイアル中に)含む。キットはさらに、それらの組み合わせ使用について記述した使用説明書を含んでもよい。キットは1つまたは複数の化学療法剤と一緒にメトホルミンの製剤を両方含んでよい。
【００６２】
化学療法剤を調節する剤またはメトホルミンによって調節される剤をスクリーニングするための方法
本発明は、本発明の方法によって化学療法剤を調節する剤(例えば、メトホルミン誘導体)をスクリーニングするための方法を提供する。腫瘍、がんおよび/またはがん幹細胞を用いて、細胞の死滅に対する効力について試験化合物(例えば、メトホルミン誘導体)をアッセイすることができる。この方法では、メトホルミン誘導体を既知の化学療法剤とともに細胞に投与し、細胞の所与のパラメータ(例えば、細胞生存性)を測定することによって、細胞を死滅させる能力を判定する。細胞生存性を、メトホルミン誘導体を投与されていない適切な対照と比較し、死滅の増強(例えば、相乗効果)によって、該メトホルミン誘導体が化学療法剤を調節する剤であることが示唆される。
【００６３】
本発明はまた、腫瘍、がんおよび/またはがん幹細胞を死滅させるその能力がメトホルミンにより増強される剤をスクリーニングするための方法を提供する。この方法では、試験化合物をメトホルミン(または同定されたメトホルミン誘導体)とともに細胞に投与し、細胞の所与のパラメータ(例えば、細胞生存性)を測定することによって、細胞を死滅させる能力を判定する。細胞生存性を、試験化合物を投与されていない適切な対照と比較し、死滅の増強(例えば、相乗効果)によって該試験化合物がメトホルミンによって増強される剤であることが示唆される。
【００６４】
試験化合物は好都合には、培養中の細胞の培地に、溶液状態でまたは易溶性の形態で添加される。剤は、間欠的または連続的な流れとして貫流系に添加してもよく、あるいは代替的に、化合物のボーラスを一度にまたは徐々に増やして、他の点では静的な溶液に添加してもよい。貫流系では、二つの液体が用いられ、一方は生理学的に中性の溶液であり、他方は同一の溶液に試験化合物を添加したものである。第1の液体が細胞上を通過し、次に第2の液体が通過する。単一溶液の方法では、細胞を取り囲む培地の液量に、試験化合物のボーラスを添加する。培地の成分の全体的な濃度は、ボーラスの添加によっても、または貫流法における二つの溶液の間でも、有意に変化してはならない。いくつかの態様において、剤の製剤は、製剤全体に有意な効果を及ぼしうる、保存料などのさらなる成分を含まない。したがって一つの態様において、製剤は試験剤および生理学的に許容される担体、例えば水、エタノール、DMSOなどから本質的になる。しかしながら、化合物が溶媒なしの液体であれば、製剤は化合物それ自体から本質的になりうる。
【００６５】
さまざまな濃度に対して異なる応答を得るために、複数のアッセイを異なる剤濃度で並行して行ってもよい。当技術分野において公知のように、剤の有効濃度の判定には、通常、1:10または他の対数スケールの希釈から得られる濃度範囲が用いられる。濃度は、必要なら、第2の連続希釈でさらに適応範囲を縮めてもよい。通常、これらの濃度の1つは、陰性対照となり、すなわちゼロ濃度または剤の検出レベル未満であるか、あるいは表現型における検出可能な変化を与えない濃度もしくはそれ未満の剤である。
【００６６】
試験化合物
本明細書においておよび本明細書の全体にわたって用いられる「試験化合物」または「試験剤」という用語は、スクリーニングアッセイ法に関連して用いられる場合、修飾および非修飾核酸、例えばアンチセンス核酸、RNAi、例えばsiRNAまたはshRNA、ペプチド、ペプチド模倣体、受容体、リガンド、ならびに抗体を含む、任意の有機または無機分子を意味する。
【００６７】
試験化合物は、試験動物に投与できる、任意の分子、化合物、または他の物質でありうる。場合によっては、試験剤は、動物の生存性に実質的に干渉しない。適当な試験化合物は、小分子、生体高分子、例えばポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチドなどであってよい。試験化合物は、典型的には、1 ng/kg〜10 mg/kg、通常、10 μg/kg〜1 mg/kgの投与量で動物に投与される。試験化合物を、治療的に有効な、例えば抗増殖剤であると同定することもでき、または創薬のためのリード化合物として同定することもできる。
【００６８】
いくつかの態様において、試験化合物はペプチドまたは非ペプチドの無作為またはコンビナトリアルライブラリなどの、多様なライブラリに由来しうる。例えば、化学的に合成されたライブラリ、組み換えファージディスプレイライブラリ、およびインビボ翻訳に基づくライブラリなどの、多くのライブラリが当技術分野において公知である。
【００６９】
化学的に合成されたライブラリの例は、Fodor et al. (Science 251:767-73 (1991))、Houghten et al. (Nature 354:84-86 (1991))、Lam et al. (Nature 354:82-84 (1991))、Medynski (Bio/Technology 12:709-10 (1994))、Gallop et al. (J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994))、Ohlmeyer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-26 (1993))、Erb et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-26 (1994))、Houghten et al. (Biotechniques 13:412-21 (1992))、Jayawickreme et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-18 (1994))、Salmon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-12 (1993))、国際特許公開WO 93/20242およびBrenner and Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-83 (1992))に記述されている。
【００７０】
ファージディスプレイライブラリの例は、Scott and Smith (Science 249:386-90 (1990))、Devlin et al. (Science 249:404-06 (1990))、Christian et al. (J. Mol. Biol. 227:711-18 (1992))、Lenstra (J. Immunol. Meth. 152:149-57 (1992))、Kay et al. (Gene 128:59-65 (1993))および国際特許公開WO 94/18318に記述されている。
【００７１】
インビボ翻訳に基づくライブラリは、限定されるものではないが、国際特許公開WO 91/05058およびMattheakis et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-26 (1994))に記述されているものを含む。非ペプチドライブラリの例として、ベンゾジアゼピンライブラリ(例えば、Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-12 (1994)を参照のこと)を使用のために適応させることができる。ペプチドライブラリ(例えば、Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71 (1992)を参照のこと)を用いることもできる。化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリを作出するためにペプチド中のアミド官能基が過メチル化された、使用できるライブラリの別の例は、Ostreshら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-42 (1994))によって記述されている。
【００７２】
スクリーニング方法において用いられる試験剤は、化学物質、小分子、化学的実体、核酸配列、作用; 核酸類似体またはタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片の類似体の群から選択することができる。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNAであり、核酸類似体は、例えばPNA、pcPNAおよびLNAであってよい。核酸は一本鎖または二本鎖であってよく、関心対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNAなどを含む群から選択することができる。このような核酸配列は、例えば、転写レプレッサーとして作用するタンパク質をコードする配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害核酸配列、例えば限定されるものではないが、RNAi、shRNAi、siRNA、micro RNAi (mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどを含むが、これらに限定されることはない。タンパク質および/またはペプチド剤もしくはその断片は、関心対象の任意のタンパク質、例えば、限定されるものではないが、変異タンパク質、治療用タンパク質、短縮タンパク質であってよく、このタンパク質は、通常、細胞において存在せず、またはより低いレベルで発現される。関心対象のタンパク質は、変異タンパク質、遺伝子組み換えタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組み換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびその断片を含む群から選択することができる。剤は媒質に適用されてもよく、これが細胞(例えば内胚葉由来の細胞)と接触し、その効果を誘導する。あるいは、剤は、核酸配列の細胞内への導入ならびに細胞内での核酸および/またはタンパク質剤の産生をもたらすその転写の結果として、細胞(例えば、内胚葉由来の細胞)内にあってもよい。剤はまた、細胞(例えば、内胚葉由来の細胞)が供されるいかなる措置および/または事象をも包含する。非限定的な例として、作用は、細胞中において生理学的変化を誘発する任意の作用、例えば、限定されるものではないが、熱ショック、イオン化照射、低温ショック、電気的刺激、光および/または波長曝露、UV曝露、圧力、ストレッチング作用、酸素曝露の増加および/または減少、活性酸素種(ROS)への曝露、虚血状態、蛍光曝露などを含みうる。環境刺激はまた、以下で定義される固有の環境刺激を含む。剤への曝露は連続的または非連続的であってよい。
【００７３】
いくつかの態様において、剤は、数多くの化学的クラスを包含する既知および未知の化合物、主に有機分子を含む関心対象の剤であり、これには有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などを含めることができる。本発明の重要な局面は、毒性試験などを含む、候補薬物の評価である。候補剤にはまた、構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含む有機分子も含まれ、かつ典型的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基が含まれ、しばしば少なくとも2つの化学官能基が含まれる。候補剤は、多くの場合、上記の官能基の1つまたは複数で置換された、環状炭素もしくは複素環式の構造および/または芳香族もしくは多環芳香族の構造を含む。候補剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを含む生物学的分子中にも見出される。
【００７４】
試験剤として同様に含まれるのは、薬理学的に活性な薬物、遺伝的に活性な分子などである。関心対象の化合物には、例えば、化学療法剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、増殖因子または組み換え増殖因子ならびにそれらの断片および変種が含まれる。本発明に適した薬剤の例には、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth editionに、Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; およびToxicologyの節の下で記述されたものがあり、全てが参照により本明細書に組み入れられる。同様に含まれるのは、毒素、ならびに生物兵器および化学兵器であり、例えば、Somani, S. M. (編), 「Chemical Warfare Agents」, Academic Press, New York, 1992)を参照されたい。
【００７５】
剤には上記の分子クラスの全てが含まれ、さらに、内容物が不明なサンプルも含まれうる。植物などの天然源に由来する天然化合物の複雑な混合物が関心対象である。多くのサンプルが化合物を溶液状態で含むと考えられるが、適当な溶媒に溶解しうる固体サンプルをアッセイすることもできる。関心対象のサンプルには、環境サンプル、例えば地下水、海水、採鉱廃棄物など; 生物学的サンプル、例えば、穀物から調製された溶解物、組織サンプルなど; 製造サンプル、例えば、医薬の調製中の経時変化; および分析のために調製された化合物のライブラリなどが含まれる。関心対象のサンプルには、潜在的治療価値についてアッセイされる化合物、すなわち薬物候補が含まれる。
【００７６】
スクリーニングのための化合物には、メトホルミン誘導体および候補剤(本明細書において試験剤または試験化合物ともいわれる)が含まれる。候補剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含む、多種多様の供給源から得られる。例えば、生物学的分子を含む多種多様な有機化合物の無作為合成および指向的な合成のために、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、数多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態にある天然化合物のライブラリが利用可能であり、または容易に作出される。さらに、天然のライブラリおよび合成により作出されたライブラリならびに化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的な手段によって容易に修飾され、これを用いてコンビナトリアルライブラリを作出することができる。構造類似体を作出するために、既知の薬理作用物質をアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような、指向的なまたは無作為の化学修飾に供することができる。
【００７７】
剤を、細胞、通常は、複数の腫瘍/がん/がん幹細胞に及ぼす効果について、通常は該剤なしの同種の細胞とともに、スクリーニングする。剤に応じたパラメータの変化を測定し、その結果を、例えば該剤の存在下および非存在下での、他の剤で得られた等の参照培養物との比較によって、評価する。
【００７８】
パラメータは、望ましくは高速大量処理系で正確に測定できる、細胞生存性、増殖および/または腫瘍発生といった定量化可能な要素である。大多数のパラメータは、定量的な読み取り値を提供するが、半定量的または定性的な結果が許容される場合もある。読み取り値には単一の測定値が含まれてもよく、または平均、中央値もしくは分散などが含まれてもよい。特徴的に、広範なパラメータ読み出し値が、各パラメータについて複数回の同一アッセイ法から得られよう。バラツキが予想され、試験パラメータのセットの各々に対する値の範囲は、標準的な統計学的方法と、単一値を与えるために使われる一般的な統計学的方法とを用いて得られよう。いくつかの態様において、アッセイ法は、コンピュータ化されたアッセイ法またはコンピュータインターフェースを通じて操作されるロボットによる高速大量処理系である。
【００７９】
スクリーニングされる化合物は、天然に存在する分子または合成分子でありうる。スクリーニングされる化合物はまた、天然の供給源、例えば、海洋微生物、藻類、植物および菌類などから得ることができる。試験化合物は鉱物またはオリゴ剤であってもよい。あるいは、試験化合物は、ペプチドもしくは小分子を含む剤のコンビナトリアルライブラリから得られてもよく、または産業界で、例えば、化学産業、薬学産業、環境産業、農産業、水産業、化粧品産業、製薬産業およびバイオテクノロジー産業によって合成された化合物の既存のレパートリーから得られてもよい。試験化合物には、例えば、医薬(pharmaceuticals)、治療用物質、農業または工業用の剤、環境汚染物質、化粧品、薬物、有機および無機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、キメラ分子、ならびにそれらの組み合わせを含めることができる。
【００８０】
コンビナトリアルライブラリを、段階的様式で合成できる多くのタイプの化合物について作出することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、β-ターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、N-置換グリシンオリゴマーおよびオリゴカルバメートが含まれる。本発明の方法において、好ましい試験化合物は小分子、核酸および修飾核酸、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、脂質または糖脂質である。好ましくは、核酸はDNAまたはRNAである。
【００８１】
化合物の大きなコンビナトリアルライブラリをAffymax, WO 95/12608、Affymax WO 93/06121、Columbia University, WO 94/08051、Pharmacopeia, WO 95/35503およびScripps, WO 95/30642(これらはそれぞれ、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記述されているコード化合成ライブラリ(ESL)法によって構築することができる。ファージディスプレイ法によってペプチドライブラリを作出することもできる。例えば、Devlin, WO 91/18980を参照されたい。スクリーニングされる化合物は、例えばChemBridge Corporation (San Diego, CA)のDIVERSet Eライブラリ(16,320種の化合物)、米国立がん研究所(NCI)のNatural Product Repository, Bethesda, MD、NCI Open Synthetic Compound Collection, Bethesda, MD、NCIのDevelopmental Therapeutics Programなどを含めて、公的または私的な供給元から得ることもできる。
【００８２】
さらに、天然のライブラリおよび合成により作出されたライブラリならびに化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的な手段によって容易に修飾される。さらに、既知の薬理作用物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような、指向的なまたは無作為の化学修飾に供することができる。
【００８３】
筋成長に関連する因子の転写および/または発現を調節する能力について上記の化合物をスクリーニングするためには、試験化合物は試験対象に投与されねばならない。一つの態様において、試験対象は、腫瘍、がんおよび/またはがん幹細胞から構成される細胞の培養物である。細胞は初代細胞培養物または腫瘍由来の不死化細胞株であってよい。
【００８４】
試験化合物は、例えば、細胞が維持されている培地中で化合物を希釈することにより、試験化合物と、筋肉を有する動物の飲食物とを混合することにより、筋肉を有する動物に対して薬学的に許容される担体中での化合物を局所的に投与することにより、徐放ビーズなどのような、試験化合物を染みこませた三次元基材を使用してこのような基材を動物に埋め込むことにより、化合物を筋肉内投与することにより、化合物を非経口投与することにより、投与することができる。
【００８５】
種々の他の試薬を混合物中に含めてもよい。これらには、最適なタンパク質-タンパク質の結合および/もしくはタンパク質-核酸の結合を促進するため、ならびに/または、非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を低減するために用いられ得る、塩、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのような、アッセイ法の効率を他の点で改善する試薬を用いることもできる。
【００８６】
保存料および他の添加物が存在してもよい。例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤および不活性ガスを添加することができる(一般的には、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Mack, 1980を参照のこと)。上記のように、スクリーニングアッセイ法は一般に、インビボで、例えば、培養細胞内で行われる。
【００８７】
本明細書において他に定義されない限り、本出願に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上そうでないよう要求されない限り、単数形の用語は複数形を含みかつ複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００８８】
本発明は、本明細書において記述される特定の方法論、プロトコルおよび試薬などに限定されず、したがって変動しうることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を記述する目的のためにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を制限することは意図されない。
【００８９】
実施例以外において、または他に指定のない場合、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表現する全ての数値は、いずれの場合にも「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。割合に関連して、本発明について記述するために用いられる場合、「約」という用語は、±1%を意味する。
【００９０】
一つの点で、本発明は、本発明に不可欠なものとして、本明細書において記述される組成物、方法およびその個別の構成要素に関するが、不可欠であるか否かに関わらず、特定されない要素を包含することを制限しない(「含む」)。いくつかの態様において、組成物、方法またはその個別の構成要素の記述に含まれる他の要素は、本発明の基本的特徴および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定される(「から本質的になる」)。これは、記述される方法内の段階ならびにその中の組成物および構成要素に同様に当てはまる。他の態様において、本明細書において記述される本発明、組成物、方法およびその個別の構成要素は、構成要素、組成物または方法に対して不可欠な要素とみなされない任意の要素を除外すると意図される(「からなる」)。
【００９１】
特定される全ての特許、特許出願および刊行物は、例えば、本発明に関連して使用されうるそのような刊行物において記述されている方法論を記述および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。この点に関して、本発明者らが、以前の発明のせいでまたは他の何らかの理由のためにそのような開示に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されるべきではない。日付に関する記載またはこれらの文献の内容に関する表現は全て、出願人が入手可能な情報に基づいており、かつ、これらの文献の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
【００９２】
本発明は、以下の番号が付けられた段落のいずれか一つに定義の通りでありうる。
1. 増強量のメトホルミンおよび低減された量の1つまたは複数の化学療法剤を投与する段階を含む、それを必要としている対象において腫瘍を処置するための方法。
2. メトホルミンの前記増強量が250 mg/日である、段落1記載の方法。
3. 増強量のメトホルミン、ならびに低減された量の1つまたは複数の化学療法剤および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
4. メトホルミンの前記増強量が約25 mgである、段落3記載の組成物。
5. メトホルミンの前記増強量が約75 mgである、段落3記載の組成物。
6. メトホルミンの前記増強量が約250 mgである、段落3記載の組成物。
7. メトホルミンのバイアル、1つまたは複数の化学療法剤のバイアル、該メトホルミンと該化学療法剤の併用のための使用説明書を含む、キット。
8. 対象に有効量のメトホルミンを投与する段階を含む、該対象においてがんを予防するためまたはがんの再発を遅延させるための方法。
9. メトホルミンの前記量が約75 mg/日である、段落8記載の方法。
【００９３】
本発明は以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９４】
実施例1
ここでは、メトホルミンが4種の遺伝学的に異なるタイプの乳がんにおいてがん幹細胞を選択的に死滅させることが示される。メトホルミンと明確に定義された化学療法剤ドキソルビシンとの組み合わせにより、培養中のがん幹細胞および非幹がん細胞が死滅され、かつ、異種移植マウスモデルにおいていずれかの薬物だけよりもずっと効果的に腫瘍塊が減少され寛解が延長される。これらの所見は、がん幹細胞仮説の別個の支持を構成するものであり、かつ、メトホルミンおよび化学療法薬の組み合わせによって乳がん(および場合により他のがん)を有する患者の処置が改善されうる理由の論理的根拠を提供する。
【００９５】
メトホルミンの抗がん特性を調べるために、本発明者らは最初に、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインとv-Srcがんタンパク質との融合体ER-Srcを含んだ非形質転換ヒト乳房上皮細胞(MCF-10A)からなる誘導性形質転換モデルを利用した。これらの細胞をタモキシフェンで処理すると、24〜36時間以内に形質転換されるようになる。形質転換された細胞集団は、CD44マーカーの発現、およびマンモスフィア、つまり非接着性かつ非分化性の条件において生成される多細胞性の「微小腫瘍」を形成する能力によって定義されるがん幹細胞を10%含む(18)。さらに本発明者らは、異なる薬物で処理される遺伝学的かつ表現型的に異なる腫瘍に由来する、3種の他の乳腺がん細胞株: ER陽性MCF7 (13); HER陽性SKBR3 (14); 三重陰性MDA-MB-468 (15)について分析した。これらの細胞株には、マンモスフィアの形成が可能ながん幹細胞の少数集団も含まれる。どの実験においても、非形質転換細胞の増殖に影響を与えない濃度(0.1または0.3 mM; 図1A)でメトホルミンを用いた。がん細胞株に対する以前の実験(7〜9)では、ずっと高い濃度のメトホルミン(典型的には10〜30 mM)、つまり非形質転換細胞に対しても毒性のある条件が使われた。
【００９６】
誘導性MCF-10Aモデルにおいて、メトホルミンは、0.1 mMメトホルミンおよび/またはTAMの存在下または非存在下で36時間増殖させた細胞の位相差画像(データは示されていない)で見られるように形態変換を強力に阻害し、0.1 mMメトホルミンおよび/またはTAMの存在下または非存在下で増殖させた細胞の創傷治癒/浸潤応答アッセイ法(データは示されていない)で見られるように創傷治癒アッセイ法において浸潤性増殖を強力に阻害し、増殖巣形成、軟寒天中でのコロニーの形成、およびマンモスフィアの作出を強力に阻害した(図1B)。さらに、4種全ての乳がん細胞株に由来するマンモスフィアのメトホルミン処理は、細胞死の結果としてのマンモスフィアの数の劇的な低減を48時間以内に引き起こした(図2)。マンモスフィアはがん幹細胞から主に構成される(18)ので、この後者の所見から、メトホルミンが、がん幹細胞を死滅させうることが示唆される。
【００９７】
興味深いことに、メトホルミンは形質転換されたMCF-10A細胞またはMCF-7細胞の集団内のがん幹細胞(CD44高/CD24低)を選択的に死滅させた(図3A)。同様に、4種全てのがん細胞株を選別した場合に、がん幹細胞はメトホルミンに対してかなり感受性が高かったが、標準的ながん細胞集団は本質的に影響を受けないままである(図3B)。さらに、わずか1時間のメトホルミンによるMCF-10Aがん幹細胞の処理により、たとえこの薬物が注射後一ヶ月間存在していなくても、これらの細胞がヌードマウスにおいて腫瘍を形成する能力が遮断された(図3C)。がん幹細胞を選択的に死滅させるメトホルミンの能力は、がん細胞を死滅させるががん幹細胞を死滅させない化学療法剤ドキソルビシンとは、大いに異なっていた。これらの異なる特性から予想される通り、メトホルミンはドキソルビシンと一緒に働き、混合した形質転換集団中の非幹がん細胞とがん幹細胞の両方を低減した(図3A)。
【００９８】
細胞株での上記の結果と一致して、メトホルミンとドキソルビシンの間の相乗効果が、ヌードマウスへのMCF-10A-ER-Src細胞の注射から10日後に行われる腫瘍の処置によって認められた。処置(5日ごとに3サイクル)の15日後に、この薬物の組み合わせで腫瘍が実質的に除去されたが、ドキソルビシンだけでは腫瘍容積が1/2しか低減できず、かつメトホルミンだけではほとんど効果がない(図4A)。ドキソルビシン処置マウスはさらに10日後(35日目)に腫瘍容積のさらなる低減を示した。メトホルミンだけによる最小限の効果は、第三者による報告(8)において見られた、より顕著な効果とは対照的であったが、これらの研究の間で実験プロトコルが大きく異なっていた。
【００９９】
メトホルミンとドキソルビシンの組み合わせがドキソルビシンだけよりも効果的である理由についての原理を確認するため、本発明者らは、3サイクルの処置の後(25日目)に腫瘍から回収された細胞の集団を調べた。細胞株での本発明者らの結果と一致して、がん幹細胞はその薬物の組み合わせで処置されたマウスには実質的に存在していなかったのに対し、ドキソルビシンだけで処置されたマウス由来の腫瘍においては容易に検出された(図4B)。このように、従来の化学療法の文脈におけるメトホルミンの治療的利点は、がん幹細胞を死滅させるその能力と関係している。
【０１００】
ヒト疾患の進行に関するがん幹細胞仮説は、がん幹細胞と非幹がん細胞との、差次的な腫瘍形成特性および明確に定義された化学療法に対する応答に基づく。これまで試験されていないこのモデルの予測は、がん幹細胞を選択的に阻害する薬物が化学療法薬と共に相乗的に再発を遅延させるように機能するはずであるということである。顕著には、メトホルミンおよびドキソルビシンの組み合わせで処置されたマウスは、処置が終わってから少なくとも60日間は寛解期のままであった(図4A)。対照的に、ドキソルビシンだけでマウスを処置してから20日後には腫瘍増殖が再開し、再発後の腫瘍増殖の速度は初期疾患で(すなわち処置なしで)認められたものに匹敵していた。このように、組み合わせ療法は寛解の延長に劇的な効果があり、そして実際に、これらの異種移植で作出された腫瘍の治癒とさえなりうる。その潜在的な医学的意義に加えて、これらの所見は、がん幹細胞仮説の別個かつ追加の支持となる。
【０１０１】
本発明者らの知る限り、がん幹細胞を選択的に死滅させることができ、かつドキソルビシンと相乗的に機能してがん幹細胞と形質転換非幹細胞の両方を遮断することができるメトホルミンの能力は、独特である。乳がんの場合、ハーセプチンおよびタモキシフェンは、それぞれ、HER2およびエストロゲン受容体を発現するがん種に有用な薬物であるが、しかしある形態の乳がんはこれらの受容体を欠いており、これらの処置に対して抵抗性を示す。これらのタイプの乳がんの全てで、メトホルミンはがん幹細胞増殖を選択的に阻害し、したがって、化学療法薬と相乗的に機能する可能性が高い。さらに、メトホルミンはMCF10A-ER-Src細胞の形質転換を阻害したので、既に行われているがんの処置とは対照的に、がんの発生を予防する能力を有することが示唆された。実際、メトホルミンが細胞の形質転換を阻害できることが、メトホルミンで処置された糖尿病ではがんの発生率が低いという疫学的観察の根底にあるのかもしれない(5, 6)。がん予防薬としては、メトホルミンを長期的に投与されることが好ましく、この点で、本明細書で観察された抗がん効果に必要なメトホルミンの濃度は、糖尿病の処置に使われる濃度よりもかなり低い。最後に、腫瘍中の異なるタイプの細胞に対するメトホルミンおよびドキソルビシンの選択性によって、ヌードマウスにおける腫瘍塊の低減および寛解の延長に及ぼす顕著な組み合わせ効果を説明することができ、これが、乳がんまたは他のがんの新たな処置としてメトホルミンを化学療法と組み合わせることの論理的根拠となる。
【０１０２】
本発明の方法
細胞株
MCF10A細胞は、乳がんの家族歴も疾患のエビデンスもない36歳女性の乳房切除術から得られた線維嚢胞乳房組織に由来する乳房上皮細胞である(12)。遺伝子解析ではHER2/neuがん遺伝子のいかなる増幅もH-Rasがん遺伝子における突然変異も現れておらず、これらの細胞はエストロゲン受容体を発現しない。本明細書における実験では、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインによるv-Srcがんタンパク質の組み込み融合体を含んだMCF10Aの誘導体を用いる。MCF7細胞は乳腺がん細胞であり、これは非常に高いレベルのエストロゲン受容体を発現し、HER2/neu陰性であり、かつ足場非依存特性が強くない(13)。SKBR3細胞は乳腺がん細胞であり、これはHER2/neu受容体を過剰発現し、足場非依存特性を持ち、かつ異種移植において腫瘍を形成する(14)。MDA-MB-468細胞は三重陰性乳がんに由来し、これは、ER-PR-HER2陰性状態、p53欠損、EGFR過剰発現、PTEN喪失およびMEK/ERK経路の構成的活性化などの、再発性の基底様分子異常の多くを示す(15)。MDA-MB-468細胞は極めて侵襲性であり、異種移植実験において大きな腫瘍を形成し、これらはタモキシフェンまたはハーセプチンによる処置に対して抵抗性を示す。
【０１０３】
細胞培養
MCF-7、SKBR3およびMDA-MB-486細胞はDMEM培地(Invitrogen)、10%ウシ胎仔血清(Atlanta Biologicals)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)中、37℃にて5% CO2で増殖させた。MCF10A ER-Src細胞は既述(16)のように培養し、EtOHに溶解された1 μM 4OH-タモキシフェン(TAM) (Sigma)で形質転換するように誘導した。形態変化、表現型形質転換および増殖巣形成はTAM添加から24〜36時間後に起こり、これらを位相差顕微鏡法によってモニタリングした。他に指定のない限り、水に溶解されたメトホルミン(Sigma)を典型的には0.1 mMまで添加した。
【０１０４】
創傷治癒運動性アッセイ法
細胞を1×105個/ウェルで6ウェルディッシュ上に播種した。p10マイクロピペットチップを用いて集密細胞中へ単一のかき傷を付けた。細胞をPBSで3回洗浄して細胞残屑を除去し、アッセイ培地を補充し、モニタリングした。創傷後0および12時間の時点で位相差顕微鏡法により画像をキャプチャした。
【０１０５】
コロニー形成アッセイ法
MCF10A ER-Src由来の細胞5×104個の三つ組のサンプルを、0.4%アガロースの終濃度とするためのMCF-10A増殖培地中2.0%のアガロースと、4:1 (v/v)混合した。細胞混合物を増殖培地中0.5%のアガロースの固化層上にプレーティングした。6〜7日ごとに0.4%アガロースを含有する増殖培地を細胞に供給した。15日後にコロニーの数をカウントした。
【０１０６】
マンモスフィア培養
既述(17)の通りB27 (1:50, Invitrogen)、0.4% BSA、20 ng/ml EGF (Preprotech)および4 μg/mlインスリン(Sigma)を補充した、無血清DMEM/F12培地中でマンモスフィアを懸濁状態(細胞1000個/ml)で培養した。形質転換細胞集団をメトホルミンの存在下または非存在下でこれらの条件下に置くことによってマンモスフィアの形成について試験し、一方、メトホルミンを6日目のマンモスフィアに加え、処理から2日および4日後にマンモスフィアの数をカウントすることによってマンモスフィアの増殖について調べた。
【０１０７】
がん幹細胞の特定および分析
形質転換細胞集団のフローサイトメトリー細胞選別を単細胞懸濁液に対して行った。細胞をCD44抗体(FITC結合) (555478, BD Biosciences)で染色し、CD24抗体(PE結合) (555428, BD Biosciences)で染色した。MCF10A ER-Src (TAM処理)由来のがん幹細胞(CD44高/CD24低)および非幹形質転換細胞(CD44低/CD24高)ならびにMCF7細胞、SKBR3細胞およびMDA-MD-486細胞を0.1 mMメトホルミンで処理し、細胞増殖を異なる時点(12時間、24時間、48時間)で評価した。実験は三つ組で行っており、データは平均±SDを表す。
【０１０８】
異種移植における腫瘍増殖および再発
MCF10A ER-Src細胞5×106個を16匹の雌性nu/nuマウス(Charles River Laboratories)の右脇腹に注射したが、これらの全てが10日間でサイズおよそ50 mm3の腫瘍を発現した。マウスを4群に無作為に分け、これらを処置なしか、または5日ごと(3サイクル)に4 mg/kgドキソルビシン、100 μg/mlメトホルミンもしくはその組み合わせの腹腔内注射によって処置した。腫瘍容積(平均値および95%信頼区間)を初回注射後のさまざまな時点で測定した。全てのマウス実験は動物実験委員会の手順およびガイドラインにしたがって行われた。
【０１０９】
本明細書において引用される参考文献は、参照により組み入れられる。
【０１１０】
参考文献
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2013503171.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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