(57)【要約】  本発明は、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有し、二置換β−アミノ酸を組み込んだ、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体であって、β−アミノ酸中の各置換基が、同一または異なっていてよく、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、少なくとも１個の環式基を有し、一方の置換基内の１個または複数の環式基は、他方の置換基内の１個または複数の環式基に連結または縮合されていてもよく、また、環式基がこのように縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総計数が少なくとも１２である、細胞溶解治療剤としての使用のための、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体、ならびに、これらの分子、および特定の定義されたこの定義内の新規化合物の非治療的使用を提供する。【選択図】図２
2013509389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも＋２の正味の陽電荷を有し、二置換β−アミノ酸を組み込んだ、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体であって、β−アミノ酸中の各置換基が、同一または異なっていてよく、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、少なくとも１個の環式基を有し、一方の置換基内の１個または複数の環式基は、他方の置換基内の１個または複数の環式基に連結または縮合されていてもよく、また、環式基がこのように縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総計数が少なくとも１２である、細胞溶解治療剤としての使用のための、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体。
【請求項２】
２個の置換基が同一である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
β−アミノ酸がβ2,2またはβ3,3−二置換アミノ酸である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
各親油性置換基が場合によって置換されたフェニルまたはシクロヘキシル基を含む、請求項１から３に記載の使用。
【請求項５】
前記フェニルまたはシクロヘキシル基がβ−アミノ酸のαまたはβ炭素原子から１から４個の連結原子によって分離されている、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
各親油性置換基が８から１２の非水素原子を含む、請求項１から５に記載の使用。
【請求項７】
ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体が、長さで１から１２のアミノ酸、または等価なサブユニットである、請求項１から６に記載の使用。
【請求項８】
ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体のＣ末端がアミド化され、場合によって置換されている、請求項１から７に記載の使用。
【請求項９】
ペプチドまたはペプチド模倣体が、陽イオン性アミノ酸、好ましくはアルギニンまたはリシンを組み込んでいる、請求項１から８に記載の使用。
【請求項１０】
抗生物質としての使用のための、請求項１から９に定義されるペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体。
【請求項１１】
抗腫瘍剤としての使用のための、請求項１から９のいずれか一項に定義されるペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体。
【請求項１２】
細胞溶解剤としての使用のための、請求項１から９のいずれか一項に定義されるペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体の生体外の使用。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか一項に定義されるペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体の対象への投与を含む、菌感染を治療する方法。
【請求項１４】
腫瘍細胞を処置する、あるいは腫瘍の成長、定着の伝播、または転移を阻止するもしくは減少させる方法であって、請求項１から９のいずれか一項に定義されるペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体の対象への投与を含む、方法。
【請求項１５】
下記式Ｉの基を組み込んだ、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有するペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体。
【化１】
2013509389.tif 000029
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4からの任意の２つは水素原子であり、２つは、同一または異なっていてもよい置換基であり、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、αまたはβ炭素原子のどちらにも直接結合されていないが、他方の置換基中の環式基に場合によって連結されまたは縮合されている環式基を含み、環式基が縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総数は、少なくとも１２であり、また、ここで、ＸはＯ、Ｃ、ＮまたはＳを表すが、化合物Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリル−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル−Ｄ−アルギニンおよびＮ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｄ−シクロヘキシルアラニル−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル−Ｄ−アルギニンを除外する。］
【請求項１６】
請求項１５に記載の分子および希釈剤、担体または賦形剤を含む配合物。
【請求項１７】
治療での使用のための、請求項１５に記載のペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体。
【請求項１８】
（ａ）請求項１から９のいずれか一項に定義される、または請求項１５に記載の、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体、および（ｂ）抗菌性感染症の治療における別々の、同時のまたは連続する使用のための組み合わせた調製としてのさらなる抗生物質を含む生成物。
【請求項１９】
（ａ）請求項１から９のいずれか一項に定義される、または請求項１５に記載の、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体、および（ｂ）腫瘍細胞の処置における別々の、同時のまたは連続する使用のための組み合わせた調製としてのさらなる抗腫瘍剤を含む生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞溶解剤としての修飾アミノ酸、ペプチドおよびペプチド模倣体、ならびにそれらの使用に関する。これらの細胞溶解剤は、抗菌剤および抗腫瘍剤として特に有用である。
【０００２】
多耐性細菌によって引き起こされる感染は、過去２０〜２５年にわたって社会の主要な関心事となっている。これは特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、およびメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）によって引き起こされる感染が、特に免疫力が低下した患者の間で、重症障害、長期間の入院および死亡をもたらし得る病院内の問題である。バンコマイシンは一時期最後の手段とも言われる薬物であったが、世界中の病院からの報告によると、バンコマイシンはもはや稀にしか使用されていない。
【０００３】
上記のグラム陽性種だけでなく、臨床医はまた、緑膿菌（プセウドモナス・アエルギノサ）および大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）を包含する多耐性グラム陰性種に関する問題を報告している。もし、グラム陽性およびグラム陰性種を含む広範囲の細菌に対して単一の抗生物質分子が活性を示すなら、それは大いに望ましい。
【０００４】
見たところでは、開発の膨大な費用のため、および成人病の治療と比較して患者の治療の継続時間が比較的限られているために、最大手の医薬品会社の間では新規のクラスの抗菌性化合物を開発する筋書きがあった。しかし、新規の抗菌剤の必要性は緊急であり、米国内の院内感染によって引き起こされる死亡は、現在、ＨＩＶ関連の死亡率に取って代わっている。
【０００５】
有望なクラスの抗菌剤は、宿主側防御ペプチドとしても知られる陽イオン性抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。ＡＭＰは、細菌の内膜および／または外膜を、受容体非特異的な方式で標的にすることによる独特の作用様式を有している。ＡＭＰによる膜破壊の詳細なメカニズムは、今なお十分に理解されていず、様々なモデルが、観察された作用を説明するために提案されている。
【０００６】
前核生物と真核生物の腫瘍細胞の脂質細胞膜成分間に比較的類似性があるので、腫瘍細胞に対する選択的な膜不安定化および結果としての溶解作用もまた、これらの抗菌ペプチドに観察された。標的細胞タイプの両方について、正味の陽電荷および親油性基（複数可）を有する効果的なクラスの両親媒性ペプチドおよびペプチド状分子が同定された。これらの分子の第１世代に対して、細孔形成様式の作用が仮定され、典型的には１０以上のアミノ酸が組み込まれたが、はるかに小さい分子が治療上適切なレベルの活性および選択性を保持することができることがより最近示された（ＳｔｒｏｍＭ．Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３，４６，１５６７〜１５７０）。
【０００７】
治療活性、選択性、毒性、インビボおよびインビトロの安定性、製造費および送達手段の容易さの、時には相容れない目的にもかかわらず、この全体的なクラスの分子内で新薬候補を開発する、一定の必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、二置換β−アミノ酸を利用することにより、広範囲の抗細菌活性、例えばグラム陽性およびグラム陰性種に対する活性を含む、大いに有望な活性および他の望ましい特性を有する、新規のクラスの細胞溶解性分子を生み出すことができることを見出した。好ましくは、分子は経口送達に適切である。
【００１０】
したがって、一態様において、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有し、二置換β−アミノ酸を組み込んだ、ペプチド、ペプチド模倣体または（修飾）アミノ酸であって、β−アミノ酸中の各置換基が、同一または異なっていてよく、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、少なくとも１個の環式基を有し、一方の置換基内の１個または複数の環式基は、他方の置換基内の１個または複数の環式基に連結または縮合されていてもよく、また、環式基がこのように縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総計数が少なくとも１２である、細胞溶解治療剤としての使用のための、ペプチド、ペプチド模倣体またはアミノ酸誘導体を提供する。β−アミノ酸の２個の置換基は、同一であるのが好ましい。
【００１１】
理論によって束縛されることは欲しないが、二置換β−アミノ酸を包含することによって、分子の安定性を高め、しかし、配座として強いられた電荷は分子の両親媒性を改善し、しかも、二置換残基の２つの親油性部分の反発的相互作用により、膜への強力な崩壊効果を引き起こすように見える。これにより、細胞毒素になり得る細胞溶解作用が得られる。
【００１２】
細胞溶解活性は、抗菌性、好ましくは抗菌活性および／または抗腫瘍活性であり、そのような医療での使用は、本発明の好ましい実施形態を構成する。したがって、本発明は、細胞溶解性抗菌剤または抗腫瘍剤として使用するための上に定義された（およびより詳細には以下に記載される）ような、ペプチド、ペプチド模倣体および修飾アミノ酸を提供する。代替として見れば、本発明は、菌による（特に細菌性）感染症を治療するのに使用する、または腫瘍細胞（特に固形腫瘍）の処置のための、上に定義された（およびより詳細には以下に記載される）ようなペプチド、ペプチド模倣体および修飾アミノ酸を提供する。
【００１３】
標的にするまたは処置することができる菌は、細菌（グラム陽性およびグラム陰性）、菌類、古細菌および原生生物を含む。細菌は、ヒトおよび他の動物を感染させ健康および生命を脅かすそれらの能力により特に関心がある。
【００１４】
好ましい細菌の標的は、グラム陽性の細菌、特にブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）およびメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）を含む。緑膿菌および大腸菌などのグラム陰性種もまた、処置することができる。慢性傷は、しばしばグラム陽性およびグラム陰性種の両方によって感染し、複数の病原体による感染症（例えば、慢性傷の部位での）を有するまたは発症していると疑われる患者の治療は、本発明による好ましい使用である。
【００１５】
抗菌活性または、例えば、消毒剤のような非治療薬の使用を提供する。またさらなる態様において、本発明は、細胞溶解剤として本明細書に定義され記載されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の生体外の使用を提供する。
【００１６】
親油性は、二相系、例えば、１−オクタノール／水などの液中の分子の分布によって測定することができる。ヒドロキシ、カルボキシ、カルボニル、アミノおよびエーテルなどの極性置換基が、親油性を減少させるので、１−オクタノール／水などの二相系での分配係数を減少させることは当業界で周知であり、したがって、親油性置換基は、そのような極性基の、好ましくは２個以下を含み、より好ましくは、１個を含みまたはまったく含まない。
【００１７】
β−アミノ酸は、β炭素原子に結合したアミノ基を有し、遺伝子コード化アミノ酸は、アミノ基がα炭素原子に結合したα−アミノ酸である。この配置は、β−アミノ酸当たり１個の原子だけ、１個または複数のβ−アミノ酸を組み込むペプチドの骨格を延長する。この配置において、αおよび／またはβ炭素原子は置換されていてもよい。αまたはβ炭素原子は二置換であってもよく、炭素原子が二置換である場合、β2,2−アミノ酸が結果としてでき、また、β炭素原子が二置換である場合、β3,3−アミノ酸が生じる。各αまたはβ炭素原子の１個の置換基は、β2,3−アミノ酸をもたらす。本発明による使用には、β2,2およびβ3,3−二置換アミノ酸が好ましく、β2,2−二置換アミノ酸が特に好ましい。
【００１８】
β−アミノ酸は少なくとも７個の非水素原子を組み込んだ２個の基によって置換されている。好ましくは１個、より好ましくは置換基の両方は、少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個の非水素原子を含んでいる。これらの基は親油性の性質であり、これらは異なっていてもよいが、好ましくは同一である。それぞれは、少なくとも１個の環式基、通常、脂肪族または芳香族、好ましくは芳香族であってもよく、置換されていてもよい六員環を含み、置換基は、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン、特にフッ素または塩素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。好ましい置換基は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル（特にｔ−ブチル）、メトキシ、フルオロおよびフルオロメチル基を含む。環式基は、同素環または複素環であってもよく、好ましくは、炭素原子の同素環である。好ましい親油性置換基は、連結または縮合、好ましくは縮合されてもよい２または３個の環式基、好ましくは２個の環式基を組み込んでいる。特に好ましい置換基は、ナフタレン基を含む。
【００１９】
親油性置換基のさらなる好ましい基は、単置換または非置換の環式基、好ましくはフェニルまたはシクロヘキシル基を有する。
【００２０】
環式基（複数可）は、通常、１から４、好ましくは１から３の原子鎖によってペプチド骨格（すなわちβ−アミノ酸のαまたはβ炭素原子からの）から離れて間隔をおいて配置され、連結原子は、窒素および／または酸素を含んでもよいが、通常炭素原子であり、好ましくは連結原子は非置換である。これらのスペーサーは、もちろん本明細書において定義されるように置換基の一部である。
【００２１】
二置換β−アミノ酸の各置換部分は、通常７から２０の非水素原子、好ましくは７から１３、より好ましくは８から１２、最も好ましくは９〜１１の非水素原子を含む。
【００２２】
本発明による使用のための分子は、１または２から１２のアミノ酸または等価な長さのサブユニットのペプチドまたはペプチド模倣体であることが好ましい。文脈から明白でない限り、本明細書における「アミノ酸」に対する言及は、ペプチド模倣体の等価なサブユニットを含む。抗菌の目的には、好ましい分子は、１から３または４個のアミノ酸を有し、抗腫瘍の目的には、好ましい分子は、より長く、例えば、長さが３から１２のアミノ酸、より好ましくは、５から１２のアミノ酸である。実施例において示されるように、本発明に従って使用する分子は、単一アミノ酸を含むだけでもよいが、電荷の要件を満たすためには、これは「修飾」アミノ酸とする。
【００２３】
単一アミノ酸ならびにペプチドおよびペプチド模倣体は、好ましくは修飾Ｃ末端を、通常、結果として電荷反転を起こす、すなわち、カルボキシル基の負電荷を除去し、例えば、アミノ基を存在させることによって陽電荷を加えるＣ末端修飾基を、組み込んでいる。Ｎ末端基が修飾されないと仮定すると、この修飾単独で、全体として＋２の実効電荷を分子は得る。Ｃ末端が、電荷反転を得るために修飾されようと、または単純にカルボキシル基の負電荷を除去するために修飾されようと、分子は、好ましくはまた、１個または複数の陽イオン性アミノ酸を含んでいる。したがって、分子の全体的な電荷は、より大きい分子に対して＋３、または＋４以上でもよい。
【００２４】
好ましくは陽イオン性の性質の、好適なＣ末端基は、通常、最大サイズ１５個の非水素原子を有する。Ｃ末端は好ましくはアミド化され、アミド基はさらに置換されて、Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアミドを形成することができる。第一級および第二級アミド基が好ましい。アミド基を置換する好適な基は、アミノアルキル、例えば、アミノエチルまたはジメチルアミノエチルを含み、アミド基の窒素原子は、環式基、例えば、ピラゾリジン、ピペリジン、イミダゾリジンおよびピペラジン、好ましくはピペラジンの一部を形成してもよく、これらの環式基は、これら自身、例えばアルキルまたはアミノアルキル基によって置換されていてもよい。
【００２５】
本発明による使用のためのペプチドは、好ましくは１種または複数の陽イオン性アミノ酸を組み込み、リシン、アルギニン、オルニチンおよびヒスチジンが好ましいが、しかし、ｐＨ７．０で陽電荷を持つ任意の非遺伝子コード化または修飾アミノ酸が組み込まれていてもよい。
【００２６】
好適な非遺伝子コード化陽イオン性アミノ酸および修飾陽イオン性アミノ酸は、ホモリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸およびホモアルギニンなどのリシン、アルギニンおよびヒスチジンの類似体、ならびにトリメチルリシンｔｒｉｍｅｔｈｙｌｙｓｉｎｅおよびトリメチルオルニチン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、４−アミノ−１−カルバミミドイルピペリジン−４−カルボン酸および４−グアニジノフェニルアラニンを含む。
【００２７】
ジペプチドは、通常１個の陽イオン性アミノ酸を組み込み、より長いペプチドは、通常追加の陽イオン性アミノ酸を組み込み、したがって、４または５個のアミノ酸のペプチドは、２または３個の陽イオン性アミノ酸を有していてもよく、６から９個のアミノ酸のペプチドは３から６個の陽イオン性アミノ酸を有していてもよい。
【００２８】
分子の好ましい基は、Ｃ末端Ｌ−アルギニンアミド残基に結合したβ2,2−二置換アミノ酸を含み、この配置を有するジペプチドは特に好ましい。
【００２９】
３以上のアミノ酸を含むペプチドは、通常１個または複数の追加の親油性アミノ酸、すなわち、親油性Ｒ基を含むアミノ酸を有する。通常、親油性Ｒ基は、縮合または結合していてよい少なくとも１個、好ましくは２個の環式基を有する。親油性Ｒ基は、Ｏ、ＮまたはＳなどのヘテロ原子を含んでいてもよいが、通常、１個までのヘテロ原子、好ましくは窒素である。このＲ基は、好ましくは２個未満の、より好ましくは１個以下の極性基を含み、最も好ましくは極性基を含まない。
【００３０】
トリプトファンは好ましい親油性アミノ酸であり、ペプチドは好ましくは１から３個のトリプトファン残基を含む。組み込まれてもよいさらなる遺伝子コード化親油性アミノ酸は、フェニルアラニンおよびチロシンである。
【００３１】
親油性ｌｉｐｈｏｐｈｉｌｉｃアミノ酸は、修飾Ｒ基を含む遺伝子コード化アミノ酸を包含し、遺伝子コード化されていなくてもよい。
【００３２】
ペプチド模倣体は、そのペプチド相当物の極性、３次元寸法および機能性（対生物作用）の保持により通常特徴づけられるが、この場合、ペプチド結合はしばしばより安定した結合によって置き換えられている。「安定な」によって、加水分解酵素による酵素分解に、より抵抗することを意味する。一般にアミド結合に代わる結合（アミド結合代用）は、多くのアミド結合の特性、例えば、配座、立体的大きさ、静電気的特徴、水素結合の可能性など、を保存する。“Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｌａｒｓｅｎ，Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍａｄｓｅｎ（Ｅｄｓ）１９９６，Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄ．Ｐｕｂの１４章は、ペプチド模倣体の設計および合成の技法の全般的な考察を提供している。本事例において、分子は、酵素の特異的活性点ではなく膜と反応する場合、親和性および有効性または基質機能を正確に模倣することについて記載された問題のいくつかは重要ではなく、ペプチド模倣体は、所与のペプチド構造または必要とされる官能基のモチーフに基づいて容易に調製することができる。好適なアミド結合の代用は以下の基を含む。Ｎ−アルキル化（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９５，４６，４７）、逆‐反転アミド（Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ，１９９３，２６，２６６）、チオアミド（Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｄ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，４３３）、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｖ．  ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｈ．Ｏ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，５１０７），ヒドロキシメチルエン、フルオロビニル（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ，Ｔ．ら，Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，３１，７２９７）、ビニル、メチレンアミノ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ  ａｎｄ  Ａｂｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９７  ４５，１３）、メチレンチオ（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９３，１３，１９）、アルカン（Ｌａｖｉｅｌｌｅ，Ｓ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９３，４２，２７０）およびスルホンアミド（Ｌｕｉｓｉ，Ｇ．ら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，２３９１）。
【００３３】
本発明の分子は、二置換β−アミノ酸を含み、ただ１個の追加のアミノ酸、すなわち、アミド結合によって結合した２個のアミノ酸を有する分子を含む様々な分子が実施例に記載されている。そのような分子は、アミド結合のためにジペプチドと考えることができるかもしれない。しかしながら、これらの分子中のアミド結合は、β−アミノ酸の二置換性により切れにくいという事実があり、それゆえ、これらの分子をペプチド模倣体と考えることができよう。本発明の目的に関して、そのような分子（およびより多くのアミノ酸を含むより大きい分子）は、アミド結合の存在によってペプチド（ペプチド模倣体ではなく）であると考えられる。これにより、所与のアミド結合が切れやすいかまたはどの程度かの試験を必要とせずに、明白な命名法が可能になる。言いかえれば分子中のアミノ酸がすべてアミド結合によって連結されている場合、１個または複数のアミド結合が容易に切れやすくなくても、分子はペプチドと考えられる。
【００３４】
本発明のペプチド模倣化合物は、通常アミノ酸と寸法および機能においてほぼ等しい識別可能なサブユニットを有する。ペプチド模倣体は、一般にアミノ酸のＲ基と等価な基を有し、適切なＲ基、ならびにＮおよびＣ末端修飾基の本明細書における考察は、必要な変更を加えて、ペプチド模倣化合物に当てはまる。
【００３５】
上記の参考文献に論じられるように、アミド結合の代替と同様に、ペプチド模倣体は、ジまたはトリペプチド模倣構造を有するより大きい構造部分の代替品を含むことができ、またこの場合、アゾール由来模倣体などのペプチド結合を含む模倣部分が、ジペプチド代替品として使用されてもよい。しかし、ペプチド模倣体、およびしたがって、上に論じられたように、単なるアミド結合が代わっただけのペプチド模倣骨格が、好ましい。
【００３６】
好適なペプチド模倣体は、アミド結合が、還元剤、例えば、ボランまたは水素化リチウムアルミニウムなどの水素化物試薬で処理することによってメチレンアミンに還元された還元ペプチドを含む。そのような還元は、分子の全体的な陽イオン性を高めるという追加の利点を有する。
【００３７】
他のペプチド模倣体は、例えば、アミド官能化ポリグリシンの段階的合成によって形成されるペプトイドを含む。いくつかのペプチド模倣骨格は、過メチル化された〈ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ〉ペプチドなどのそれらのペプチド前駆体から容易に入手できるものである。適切な方法はＯｓｔｒｅｓｈ，Ｊ．Ｍ．らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１，１１１３８−１１１４２に記載されている。強塩基性条件は、Ｏ−メチル化よりもＮ−メチル化を促進することになり、ペプチド結合中の窒素原子およびＮ末端窒素の一部または全部がメチル化される結果になる。
【００３８】
好ましいペプチド結合代替物は、エステル、ポリアミンおよびその誘導体ならびに置換アルカンおよびアルケン、特にアミノメチルおよびケトメチレンを含む。ペプチド模倣体は、本明細書において論じられるように修飾されていてもよいＮおよびＣの末端を好ましくは有する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、菌感染、好ましくは細菌感染を治療または予防する方法を提供し、その方法は上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の対象への投与を含む。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞を処置する、または腫瘍の成長、定着の伝播、または転移を予防するまたは減少させる方法を提供し、その方法は、上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の、対象への投与を含む。
【００４１】
本明細書において使用される場合、菌／細菌感染の治療は、好ましくは生存可能な菌／細菌細胞の数の減少を意味するが、しかし、また感染症を抑制せずに進行させた場合よりも、細胞の数が、対象にはそれほど有害でない数で含まれている、静菌作用のタイプの働きを含んでもいてもよい。「予防」は、測定可能なおよび／または有害な集団が治療される対象において確立されないように菌／細菌細胞成長を阻止することを含む。
【００４２】
処置される腫瘍細胞は、血中にあってもよいが、菌細胞でのように、通常固形腫瘍の一部になる。治療は、好ましくは細胞溶解を経て細胞死滅を含む。細胞溶解は、腫瘍細胞抗原の提示、および二次的腫瘍の発生を予防するまたは阻止することができる後天性免疫の生成をもたらし得る。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸、および（ｂ）抗菌性感染症の治療または予防における別々の、同時のまたは連続する使用のための組み合わせた調製としてのさらなる抗生物質を含む生成物を提供する。
【００４４】
なおさらなる態様において、本発明は、（ａ）上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸、および（ｂ）腫瘍細胞の治療における別々の、同時のまたは連続する使用のための組み合わせた調製としてのさらなる抗腫瘍剤を含む生成物を提供する。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、菌感染、好ましくは細菌感染を治療するための医薬の製造において上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の使用を提供する。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞を処置する、あるいは腫瘍の成長、定着の伝播、または転移を予防するもしくは減少させるための医薬の製造において上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の使用を提供する。
【００４７】
上記クラスの分子の間に、非常に効果的な分子の新規の群が存在する。これらの分子は本明細書において記載される様々な使用および方法に適切である。したがって、さらなる態様において、本発明は、下記式Ｉの基を組み込む、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有するペプチド、ペプチド模倣体または（修飾）アミノ酸を提供する。
【００４８】
【化１】
2013509389.tif 000003
【００４９】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4からの任意の２つは水素原子であり、２つは、同一または異なっていてもよい置換基であり、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、αまたはβ炭素原子のどちらにも直接結合されていないが、他方の置換基中の環式基に場合によって連結されまたは縮合されている環式基を含み、環式基が縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総数は、少なくとも１２であり、また、
ここで、ＸはＯ、Ｃ、ＮまたはＳを表すが、化合物Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリル−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル−Ｄ−アルギニンおよびＮ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｄ−シクロヘキシルアラニル−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル−Ｄ−アルギニンを除外する。］
ＩＵＰＡＣ系ではなくケミカルアブストラクト型命名法を使用すると、上記の２つの分子は、Ｄ−アルギニン、Ｎ２−［Ｎ−［１−［Ｎ２−（Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル）−Ｌ−リシル］−Ｌ−プロリル］−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル］およびＤ−アルギニン、Ｎ２−［Ｎ−［３−シクロヘキシル−Ｎ−［１−［Ｎ２−（Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル）−Ｌ−リシル］−Ｌ−プロリル］−Ｄ−アラニル］−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル］と呼ばれ、これらのＣＡＳ番号はそれぞれ１４５１４９−４２−４および１４５１４９−４３−５である。
【００５０】
炎症性疾患状態の治療に有用なアナフィラトキシン受容体配位子として、国際公開第９２／１２１６８号に拒絶された化合物が開示され、それゆえこの文書は、本発明によって解決された問題に取り組まない。
【００５１】
Ｒ1〜4の２個の基において非水素原子の総計の１２の最小数は、非水素原子のうちの２個が各基において環形成に効果的に関与するので、各部分の環式基が縮合されている場合、縮合されていない基の最少数を加え（７＋７＝１４）、２を減じることにより、達せられることは理解されよう。好ましくは、各部分の環式基が縮合されている場合、Ｒ1〜4の２個の基において、非水素原子の総計は１４である。置換基間の追加の連結結合を含み、または含まないで、ＣαまたはＣβに結合された２個の基が１対を超える縮合環式基を含み得る場合、複雑な縮合および連結基を目論むことができる。それにもかかわらず、これらの基が運動の最も大きい可撓性を有する分子が好ましいので、２個の置換基は、好ましくは縮合されずまたは連結されていない。
【００５２】
式（Ｉ）の基の窒素原子は、好ましくは、Ｒ1〜4基のいずれの原子にも結合されていない（当然、ＣβまたはＣαを間接的に経由する以外は）。好ましくは、上記骨格（Ｎ−Ｃβ−Ｃα−Ｃ−Ｘ）の５個の原子は、環状でなく直鎖状においてのみ互いに連結されている。式（Ｉ）のＸおよびＮが通常の価数を有し、それにより、化合物の他の部分、例えば、さらなるアミノ酸またはＮ−またはＣ−末端キャッピング基に結合されるように、通常、さらに置換されることが理解される。
【００５３】
Ｒ1〜4の置換基は、一般に親油性の性質であり、好ましくは電荷を持たず、また、好ましくは２以下、より好ましくは１以下の極性基を有する。Ｒ1〜4の置換基の１個または両方は、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも９または１０の非水素原子、例えば、７〜１３、７〜１２、８〜１２または９〜１１の非水素原子を含む。これらの２個の置換基は、合成のしやすさのためのみであれば、同一であることが好ましい。好ましくは、この２個の置換基は、Ｒ1とＲ2またはＲ3とＲ4であり、Ｒ3とＲ4が最も好ましい。
【００５４】
上記のように、Ｒ1〜4の環式基は、これらが１から４個の鎖、好ましくは１から３個の原子によってそこから間隔を置かれているのでαまたはβ炭素原子のどちらにも直接結合されていない。これらの連結原子は、窒素および／または酸素を含んでもよいが、通常、炭素原子であり、好ましくは、連結原子は非置換である。好ましい間隔部分は、実施例において示され、本明細書において定義されるようなＲ1〜4の置換基の一部を形成する。
【００５５】
Ｘは、置換または非置換であってよく、好ましくは、Ｎ原子であり、また、好ましくは置換されている。ＸがＮである場合、Ｘは、実施例１の分子において示されるように、さらなるアミノ酸とのアミド結合の一部を形成してもよい。代替として、Ｎ原子は、例えば、アミノアルキル基、例えばアミノエチルまたはアミノプロピルまたはジメチルアミノエチルによって置換されていてもよい。そのような分子は実施例２において示される。さらなる代替において、Ｎ原子は、実施例２においてまた示されるように、それ自体アルキルまたはアミノアルキル基によって置換されていてもよいピペラジンなどの環式基の一部を形成してもよい。
【００５６】
式Ｉの基を組み込んだペプチドまたはペプチド模倣体ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｎｉｍｅｔｉｃｓは、好ましくは修飾Ｃ末端を有し、これは好ましくはアミド化され、細胞溶解剤として使用する分子に関して上に記載されている。
【００５７】
β−アミノ酸の好ましい置換基を定義する上記の語句は、必要な変更を加えて、Ｒ1〜4の２個の置換基に当てはまる。式Ｉの基を組み込んだペプチドおよびペプチド模倣体は、細胞溶解剤として使用するためのこの用途に、先に記載された分子の好ましい部分集合である。したがって、分子の好ましい特性、例えば、それらの長さ、およびそれらが含んでいる他のアミノ酸、を定義するすべての上記の語句はまた、式Ｉの基のそれらの組み込みによって定義された分子にも、またその逆にも当てはまる。特に好ましい分子は、１から７または８（例えば、１から５）、より好ましくは１、２、３または４の長さのアミノ酸である。ペプチド模倣分子は同数のサブユニットを含むが、これらのサブユニットはアミド結合模倣体によって通常連結されている。好ましい結合は、上に論じられ、エステルおよびアミノメチルおよびケトメチレンを含む。
【００５８】
本明細書における実施例は、ジペプチド（実施例１）および単一の修飾アミノ酸およびヘプタペプチド（実施例２および４）の形態の本発明の構造モチーフを示す。実施例の分子は、本発明の好ましい分子、および本発明における使用の好ましい分子を代表する。
【００５９】
本発明のペプチド、ペプチド模倣体およびアミノ酸は、塩、環状またはエステル化、ならびに上記に論じられた、好ましいアミド化された誘導体の形態であってもよい。
【００６０】
本発明の好ましい分子、および本発明における使用の好ましいクラスの分子は、上に定義されるような２個の親油性側鎖を組み込んだ単一のβ2,2−アミノ酸、２個の陽イオン性基によって挟まれた二置換β−アミノ酸を有するβ、好ましくはβ2,2−アミノ酸誘導体である。先に記載されたように、２個の置換基は、好ましくは同一であり、六員環式基および少なくとも８、好ましくは少なくとも１０の非水素原子を含む。これらの分子は、抗菌剤として特に適切であり、経口投与に適切である。
【００６１】
本明細書において記載される分子は、任意の都合のよい方法で合成することができる。存在する反応基（例えばアミノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は、全体の合成の間、保護される。したがって、合成の最終ステップは、本発明の保護された誘導体の脱保護である。化合物合成の方法は、本発明のさらなる態様を構成する。例えば、一実施形態において、本明細書に定義されるような式Ｉの基を組み込んだ、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有するペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の合成方法が提供され、この方法は、前記ペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸からの保護基の除去を含む。
【００６２】
ペプチドを構築する際、原則としてＣ末端またはＮ末端基のいずれからも出発することができるが、Ｃ末端から出発する手順が好ましい。
【００６３】
ペプチド合成の方法は、当業界で周知であるが、本発明に関しては、固相支持体、当業界で周知のそのような支持体で合成を行うのが特に好都合であり得る。
【００６４】
アミノ酸の保護基の広い選択肢は公知であり、適切なアミン保護基は、カルボベンジルオキシ（Ｚとも示される）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃとも示される）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）および９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃとも示される）を含んでもよい。ペプチドがＣ末端部から構築される場合、アミン保護基は添加される新規の各残基のアミノ基に存在し、次のカップリングステップ以前に選択的に除去する必要があることは理解されよう。
【００６５】
例えば、使用することができるカルボキシル保護基は、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｐ−ニトロベンジル（ＯＮｂ）、またはｔ−ブチル（ＯｔＢｕ）基などの容易に切断されるエステル基、ならびに固体支持体、例えば、ポリスチレンに連結されたＲｉｎｋアミド）のカップリング基を含む。
【００６６】
チオール保護基は、ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、トリチル（Ｔｒｔ）およびアセトアミドメチル（Ａｃｍ）を含む。
【００６７】
本発明の好ましいペプチドは、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基をＬｙｓ，Ｏｒｎ、ＤａｂおよびＤａｐのアミン側鎖に、ならびにトリプトファン残基のインドール窒素の保護に使用して、好都合に調製されていてもよい。Ｆｍｏｃは、アルファアミノ基の保護に使用することができる。Ａｒｇ含有ペプチドのためには、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルを、グアニジン側鎖の保護に使用することができる。
【００６８】
アミンおよびカルボキシル保護基を除去するための広範囲の手順が存在する。しかし、これらは使用する合成戦略と矛盾してはならない。側鎖保護基は、次のカップリングステップ以前の、一時的なアミノ保護基を除去するために使用される条件に安定でなければならない。
【００６９】
Ｂｏｃなどのアミン保護基およびｔＢｕなどのカルボキシル保護基は、例えばトリフルオロ酢酸で酸処理によって、同時に除去されてもよい。Ｔｒｔなどのチオール保護基は、ヨウ素などの酸化剤を使用して選択的に除去することができる。
【００７０】
ペプチド模倣化合物を合成するための参考文献および技法は上記に提供され、当業者に公知である。
【００７１】
適切な希釈剤、担体または賦形剤と混合された、本発明の１種または複数の化合物を含む配合物は、本発明のさらなる態様を構成する。そのような配合物は、とりわけ医薬品（畜産を含む）目的のためであってもよく、したがって、適切な希釈剤、担体または賦形剤は薬学的に許容されることが好ましい。好適な希釈剤、賦形剤および担体は、当業者に公知である。
本明細書において記載される分子は、本来細胞溶解性であり、抗菌性剤ａｎｔｉｍｃｒｏｂｉａｌ、例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗菌の好ましい使用として特に有益である。分子の特異性はまた、分子を抗腫瘍剤として適切にする。したがって、さらなる態様において、本発明は、下記式Ｉの基を組み込んだ、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有する、治療に使用するためのペプチド、ペプチド模倣体または（修飾）アミノ酸を提供する。
【００７２】
【化２】
2013509389.tif 000004
【００７３】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4からの任意の２つは水素原子であり、２つは、同一または異なっていてもよい置換基であり、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、αまたはβ炭素原子のどちらにも直接結合されていないが、他方の置換基中の環式基に場合によって連結されまたは縮合されている環式基を含み、環式基が縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総数は、少なくとも１２であり、また、ここで、ＸはＯ、Ｃ、ＮまたはＳを表すが、化合物Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリル−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル−Ｄ−アルギニンおよびＮ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｄ−シクロヘキシルアラニル−２，２−ビ（フェニルメチル）−β−アラニル−Ｄ−アルギニンを除外する。］
本発明は、下記式Ｉの基を組み込んだ、少なくとも＋２の正味の陽電荷を有する、細胞溶解剤として使用するためのペプチド、ペプチド模倣体または（修飾）アミノ酸をさらに提供する。
【００７４】
【化３】
2013509389.tif 000005
【００７５】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4からの任意の２つは水素原子であり、２つは、同一または異なっていてもよい置換基であり、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、αまたはβ炭素原子のどちらにも直接結合されていないが、他方の置換基中の環式基に場合によって連結されまたは縮合されている環式基を含み、環式基が縮合されている場合、２個の置換基の非水素原子の総数は、少なくとも１２であり、また、ここで、ＸはＯ、Ｃ、ＮまたはＳを表す。］好ましくは、その使用は、抗菌剤ａｎｔｉｍｃｒｏｂｉａｌ、特に抗細菌剤、または抗腫瘍剤としてである。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、菌感染、好ましくは細菌感染を治療または防止する方法を提供し、その方法は、上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の対象への投与を含む。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞を処置する、あるいは腫瘍の成長、定着の伝播、または転移を阻止するもしくは減少させる方法を提供し、その方法は、上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の対象への投与を含む。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、菌感染、好ましくは細菌感染を治療するための医薬の製造において、上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の使用を提供する。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞を処置する、あるいは腫瘍の成長、定着の伝播、または転移を阻止するもしくは減少させる医薬の製造における、上に定義されるようなペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸の使用を提供する。
【００８０】
菌感染は、複数の病原体による感染症であり得、またはそうと疑われてもよく、そのような感染（例えば、慢性傷の部位での）の、例えば、グラム陽性およびグラム陰性細菌種の両方を含む感染の治療は、本発明による使用および方法の好ましい標的を代表する。
【００８１】
投与される量は、標的細胞のすべてまたは一部を死滅させるために、または増殖を予防するまたは増殖のそれらの割合を減少させるために、または転移を阻止するために、またはさもなければ患者への腫瘍の悪影響を減少させるために効果的であるべきである。臨床医または患者は、腫瘍に関連する１つまたは複数のパラメーターまたは症候の改善を観察しなければならない。投与はまた予防的でもよい。患者は、通常ヒト患者であるが、家畜または家畜動物などの人類以外の動物も治療することができる。
【００８２】
タンパク質標的を有する大多数の薬剤と異なり、本発明の分子は種々様々の癌を標的にすることができる。好ましい癌の標的は、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫（例えば、脳からの）、癌腫および腺癌（特に乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺および皮膚からの）および黒色腫を含む。
【００８３】
本発明による組成物は、例えば、経口、局所、鼻、非経口、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）、腫瘍内、直腸または局所（例えば、分離式肢灌流）の投与に適切な形態で提示されてもよい。投与は、通常、非経口経路により、好ましくは、皮下、筋肉内、嚢内、髄腔内ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌｙ、腫瘍内または静脈内の注射による。
【００８４】
本明細書に定義される活性化合物は、錠剤、コーティング錠、鼻内噴霧、溶液、乳剤、リポソーム、粉末、カプセル剤または徐放性製剤などの従来の薬理学的な投与形態で提示することができる。製造の通常の方法だけでなく従来の医薬品賦形剤も、これらの形態の調製のために使用することができる。
【００８５】
器官特異的な担体システムも使用されてもよい。
【００８６】
注射溶液は、例えば、ｐ−オキシ安息香酸エステルなどの保存剤、または、ＥＤＴＡなどの安定剤の添加によるような従来の方式で製造することができる。次いで、溶液は注射バイアルまたはアンプルに充填される。
【００８７】
好ましい配合物は、ペプチドが食塩水に溶解されているものである。そのような配合物は、特に局所投与、すなわち、腫瘍内、例えば、好ましくは分離式（部分的な分離を包含する）肢、身体部位または臓器の注射によるまたは灌流／浸剤による、投与の好ましい方法に使用するのに適切である。
【００８８】
活性分子を含む用量単位は、好ましくは０．１〜１０ｍｇ、例えば、１〜５ｍｇの抗腫瘍剤を含む。医薬組成物は、他の抗腫瘍ペプチドなどの他の細胞毒性薬を包含するさらなる活性成分をさらに含んでもよい。他の活性成分は異なるタイプのサイトカイン、例えば、ＩＦＮｇ、ＴＮＦ、ＣＳＦ、成長因子、免疫調節薬、化学療法薬、例えば、シスプラチン、または抗体、もしくは癌ワクチンを含んでもよい。
【００８９】
そのような組成物を全身で使用する際、活性分子は、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌの生理活性分子の血中濃度を達成する量が存在する。一般に、血中濃度は５００ｍｇ／ｍｌを上回る必要はない。好ましい血中濃度は約１００ｍｇ／ｍｌである。そのような血中濃度は、１から約１０ｍｇ／ｋｇの用量で全身に投与される組成物に、生理活性分子を組み込むことにより達成することができる。一般に、１００ｍｇ／ｋｇを上回る用量で分子（複数可）を投与する必要はない。
【００９０】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）少なくとも＋２の正味の陽電荷を有し、本明細書において定義された式（Ｉ）の基を組み込んだペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸、および（ｂ）抗菌性感染症の治療または予防における別々の、同時のまたは連続する使用のための組み合わせた調製としてのさらなる抗生物質を含む生成物を提供する。
【００９１】
なおさらなる態様において、本発明は、（ａ）少なくとも＋２の正味の陽電荷を有し、本明細書において定義された式（Ｉ）の基を組み込んだペプチド、ペプチド模倣体または修飾アミノ酸、および（ｂ）腫瘍細胞の処置における別々の、同時のまたは連続する使用のための組み合わせた調製としてのさらなる抗腫瘍剤を含む生成物を提供する。
【００９２】
本発明の化合物、および本発明の方法および使用に適切な化合物は、塩の形態を含み、ペプチドおよび同様の分子に適切な薬学的に許容される塩は、当業者に周知である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
本発明は、本発明の範囲外のいくつかの基準の分子を含む、以下の実施例、および以下の図を参照して、さらに説明される。
【図１】実施例１の化合物４ａ〜ｎを示す図である。
【図２】実施例１に記載されているような化合物４ａ〜ｎの合成の概略の概観を示すである。
【図３】実施例４の化合物４ａ〜ｄ、５ａ〜ｄ、６ａ〜ｄおよび７ａ〜ｄを示すである。
【図４】実施例４の化合物の合成の概略の全体図を示すである。実施例４  ａ）ＮａＯＭｅ（１当量）、Ｒ−Ｂｒ（１当量）、２度実施、７８℃、ｓ：ＭｅＯＨ。ｂ）Ｒａ／Ｎｉ、Ｈ２（ｇ）、４５℃、５日、ｓ：２％ＭｅＯＨ含有酢酸。ｃ）ＴＥＡ、ｐＨ８、Ｂｏｃ2Ｏ（１．２当量）、室温、１８時間、ｓ：Ｈ２Ｏ：ジオキサン（１：５）。ｄ）ＬｉＯＨ（６当量）、１８時間、１００℃、ｓ：Ｈ2Ｏ：ジオキサン（１：３）。ｅ）ＤＩＰＥＡ（３当量）、ＴＦＦＨ（１．５当量）、室温、２時間、次いで所望のアミン（２当量）の添加、最大７日間、ｓ：ＤＭＦ．ｆ）ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ2Ｏ（９５：２．５：２．５）、室温、２時間  ｓ：ＤＣＭ。すべてのβ2,2−アミノ酸誘導体はそれらの二−トリフルオロ酢酸塩として単離した。実施例実施例１  Ｃ末端Ｌ−アルギニンアミド残基にカップリングされたアキラルの親油性３−アミノ−２，２−二置換プロピオン酸(β2,2−アミノ酸)の骨格に基づいた一連の分子を作製し、それらの抗菌活性に関して試験した。これらのジペプチドは、β2,2−アミノ酸誘導体によるトリペプチドの側鎖の官能基を有する。β2,2−アミノ酸誘導体の広範囲の親油性置換基を図１に示すように調査した。化合物４ａ〜ｎの合成の全体図は図２に提示される。試薬および分析法 1Ｈおよび13ＣＮＭＲスペクトルは、４００または６００ＭＨｚＶａｒｉａｎスペクトロメーターで記録した。質量スペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＬＣ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で得られた。高分解能質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で得られた。市販の化合物および溶媒はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらなる精製をすることなく使用した。分取ＲＰ−ＨＰＬＣは、ＲＰ  ＢｏｎｄａＰａｋ  Ｃ１８  １２５、１０μｍ、２５×１００ｍｍを装備したＷａｔｅｒｓシステムで行い、アセトニトリルおよび水（どちらも０．１％ＴＦＡを含有する）で溶出した。分析ＨＰＬＣは、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ１８，１００Ａ，５μｍ，３．９ｘ１５０ｍｍ  Ｗａｔｅｒｓカラムを装備をしたＷａｔｅｒｓ２６９５ＨＰＬＣで行い、波長２１０から３１０ｎｍにわたるＰＤＡ検出器で波長２１４ｎｍで分析した。化合物はすべてＲａｄｌｅｙｓ（登録商標）からの並発反応回転荷台の使用により調製した。シアノ酢酸メチル（ＧＰ１）１ａ〜ｎのジアルキル化の一般手順  ナトリウムメトキシド（２０ｍｍｏｌ）をメタノール（０．２Ｍ）に溶解し、シアノ酢酸メチル（２０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で５分撹拌した後、所望の臭化ベンジル（２０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液は加熱し還流した。１５分後、溶液を室温に冷却した。ナトリウムメトキシド（２０ｍｍｏｌ）の第２の部分を添加し、室温で５分撹拌した後、所望の臭化ベンジル（２０ｍｍｏｌ）の第２の部分をもう一度添加し、続いて１５分還流した。反応混合物の体積を、真空下で約１／３に減少させ、水／酢酸エチルで抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し蒸発乾固させた。生成物は、さらなる精製をすることなく以下の合成に使用した。Ｒａ／Ｎｉおよび以下のＢｏｃ−保護（ＧＰ２）２ａ��ｎを用いるアミンへのニトリルの還元の一般手順  Ｒａ／Ｎｉ（およそ２ｍｌ／ｇのニトリル）を、アルゴン下でメタノールで３回洗浄した。次に、メタノール（０．１Ｍ）に溶解した所望のニトリル（３．５ｍｍｏｌ）を、酢酸（およそ１ｍｌ／ｇのニトリル）と共に添加した。反応混合物を１バールのＨ２圧力下で４５℃で５日間水素化した。その後、反応混合物をセライトに通して濾過し、Ｒａ／Ｎｉを除去して、蒸発乾固させた。粗のβ2,2−アミノ酸メチルエステル（０．３５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンと水５：１（〜０．３５Ｍ）の混合物に溶解し、ｐＨはＴＥＡで８に調節し、可能な限り少量の１，４−ジオキサンに溶解したＢｏｃ２Ｏ（０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は室温で約１８時間撹拌し、１０％クエン酸でｐＨ２〜３に酸性化し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し蒸発乾固させた。生成物はさらなる精製をすることなく以下の合成に使用した。エステル加水分解（ＧＰ３）３ａ〜ｎの一般手順  Ｂｏｃ保護β2,2−アミノ酸メチルエステル（０．３５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンと水の３：１（１．１７ｍＭ）混合物に溶解し、可能な限り少ない水に溶解した水酸化リチウム（２．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をＮ２下で１８時間撹拌しながら還流し、体積を真空下でおよそ１／５に減少させた。水（１０ｍｌ）を反応混合物に添加し、ｐＨは１〜２に０．１ＭＨＣｌで滴下して調節した。この水溶液は、等しい体積の酢酸エチルで３回抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固させた。生成物はさらなる精製をすることなく以下の合成に使用した。Ｂｏｃ保護β2,2−アミノ酸（ＧＰ４）４ａ〜ｎのＬ−アルギニンカップリングの一般手順  Ｂｏｃ保護β2,2−アミノ酸（０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．０２Ｍ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（０．６ｍｍｏｌ）をＴＦＦＨ（０．２ｍｍｏｌ）と共に添加した。アミノ酸を２時間前もって活性化し、Ｈ−Ａｒｇ−ＮＨ２ｘ２ＨＣｌ（０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は７日間室温で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機相はＭｇＳＯ４で乾燥し蒸発乾固させた。粗のＢｏｃ保護生成物は、ＤＣＭ（〜０．４Ｍ）に溶解し等しい体積のＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）を添加することにより脱保護した。混合物を２時間室温で撹拌し蒸発乾固させた。粗生成物は分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの純度は分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって点検し、溶液を蒸発乾固させ、残基は水に再溶解し凍結乾燥した。すべての化合物は、９５％を超える純度を有していた。細胞試験  抗菌性試験はＴｏｓＬａｂ  Ａ／Ｓ（Ｔｒｏｍｓｏ、Ｎｏｒｗａｙ）によって行われた。各化合物は、水に希釈して１ｍｇ／ｍｌにし、溶解性の問題により５０、３５、１５、１０、５、２．５、１、０．５μｇ／ｍｌで試験した４ｎ以外は、２００、１００、５０、３５、１５、１０、５、２．５、１、０．５μｇ／ｍｌで二重反復試験した。試験した化合物はすべて二ＴＦＡ塩であった。
【００９４】
指数関数的成長が達成されるまで、細菌の株は２％のＢａｃｔｏペプトン水培地で育てた。ＭＩＣは、３７℃で１％Ｂａｃｔｏペプトン水培地中の終夜培養によって求めた。２ｘ１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌濃度を使用した。負の対照（ペプチドはない）および正の対照（ゲンタマイシン）の両方を、すべての細菌株に使用した。成長または成長はウェルの濁り度で判断しなかった。ＭＢＣは、ＭＩＣ値以上の濃度をすべて、寒天プレートで平板培養し、３７℃で終夜インキュベートし、成長の有無を判断することにより求めた。
【００９５】
５０μｇ／ｍｌ未満のＭＩＣ値を示すすべての化合物は、同一の手順を使用して再試験した。
【００９６】
ＭＩＣおよびＭＢＣの値は表１ＡおよびＢに示される。
【００９７】
ヒト赤血球に対する溶血性試験はＬｙｔｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ（Ｔｒｏｍｓｏ、Ｎｏｒｗａｙ）によって行われた。溶解性問題により０．５ｍｇ／ｍｌまでのみ試験した４ｋおよび４ｎ以外は、各化合物を１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度から試験した。健康な成人男子提供者から血液８ｍＬを収集した。血液は均等に分割し、市販のＥＤＴＡ含有試験管（ＢＤバキュテーナー、７．２ｍｇ、Ｋ２ＥＤＴＡ）、およびヘパリン溶液（０．９％塩化ナトリウム中の１０００Ｕ／ｍＬ）４０μＬを含む、１０ｍＬ反応バイアルに分配した。３０分後、ＥＤＴＡ処理した血液のヘマトクリットを求めた。ヘパリン添加血液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけ、上澄みは除去した。続いて、ＲＢＣを、前もって暖めたＰＢＳで３回洗浄し、１０％ヘマトクリットに希釈した。ＰＢＳ（濃度１μｇ／ｍＬから１０００μｇ／ｍＬ）に溶解した化合物、および赤血球を、３７℃で１時間揺動しながらインキュベートした。０．１％のトリトンＸ−１００の最終濃度を含む正の対照、および純粋なＰＢＳ緩衝剤を含有する負の対照が包含されていた。試料は５分間遠心分離機にかけ（４０００ｒｐｍ）、上澄みの吸収を４０５ｎｍで測定した。表１Ａに示す値は、５０％溶血に対応する。
α−キモトリプシンに対する安定性
α−キモトリプシンに対する安定性試験を、所望の化合物を水に溶解して１ｍｇ／ｍｌにすることにより行った。α−キモトリプシンは、２ｍＭＣａＣｌ２を含有する１ｍＭＨＣｌに溶解して０．１ｍｇ／ｍｌにした。酵素消化は、１０ｍＭＣａＣｌ２を含有する１００ｍＭトリスＨＣｌ中で行った。最終酵素濃度は２μｇ／ｍｌであり、最終ペプチド濃度は１００μｇ／ｍｌであった。合計体積は０．５ｍｌであった。
【００９８】
１５μｌ試料を、２４および４８時間の試料に加えて０、１５、３０、６０、１２０および２４０分で収集した。消化を終結させるために、試料に、外部標準（アテノロール塩酸塩）および１０％酢酸１００μｌを添加し、水で希釈して１ｍｌにした。
【００９９】
すべての試験に、分解が他の因子ではなく酵素活性によることを保証するために、酵素を含まない負の対照を用いた。スクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐａｒａ  ｎｉｔｒｏａｎｈｉｉｎｅを正の対照として使用した。すべての試験は３回繰り返して実施した。
結果
【０１００】
【表１】
2013509389.tif 000006
【０１０１】
【表２】
2013509389.tif 000007
【０１０２】
６種の化合物（４ｃ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｋおよび４ｍ）の選別を、α−キモトリプシンに対するタンパク質分解安定性について検討した。その結果、４８時間にわたってどの化合物も分解を検出することができなかった。本発明者らはまた、試験化合物がすべて、ｐＨ７．４の水溶液中で少なくとも４８時間、化学的に安定であることを見出した。
【０１０３】
その結果、調製した化合物の抗菌効力と全体的な親油性との間に強い相関性を示した。これは、黄色ブドウ球菌に対する化合物の効力と、カラムの疎水性固定相に対する化合物の親和性を示す（結果は示さず）、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラムでの保持時間（Ｒｔ）との比較によって説明することができる。
【０１０４】
調製した化合物の溶血作用は、毒性の測定として使用し、化合物４ｇ、４ｊおよび４ｎを例外として、化合物は試験濃度範囲内（＜１０００μｇ／ｍｌ）で非溶血性であった。最高の溶血作用は、化合物４ｎによって示された。しかし、ＥＣ50濃度は、それにもかかわらずグラム陽性およびグラム陰性菌の両方に対するＭＩＣ値より１０からほとんど５０倍高かった。同様の抗菌効力を示した化合物４ｊおよび４ｋが、溶血作用に関して極めて異なったことは注目すべきである。このことは、溶血作用および抗菌効力が、正確に同一の構造特性によって決定されなかったことを示す。
実施例２
本発明のさらなる分子を製造し、抗菌および抗癌活性の両方を試験した。
材料および方法
細菌株
黄色ブドウ球菌（ＡＴＴＣ２５９２３）
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）
メチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２７６２６）
大腸菌（ＡＴＴＣ２５９２２）
癌細胞系統
Ａ２０またはＭｅｔｈＡ
使用する毒性試験の細胞
ＭＲＣ−５およびヒトＲＢＣ
様々なアッセイで試験した最高濃度は、
抗菌性アッセイ：２００μｇ／ｍｌ
抗癌性アッセイ：５００μｇ／ｍｌ
ＭＲＣ−５アッセイ：５００μｇ／ｍｌ
ＲＢＣアッセイ：１０００μｇ／ｍｌ
ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ版１１．０を、生理化学的特性ＬｏｇＰ、ｔＰＳＡおよびＣＬｏｇＰを算定するために使用した。
分子の合成
樹脂の膨潤：ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ装填）を７ｍｌＤＭＦに１時間膨潤させ、ＤＭＦ７ｍｌで５回洗浄した。
Ｆｍｏｃ−除去：ＤＭＦ中の２０％ピペリジン７ｍｌを反応管に添加し、懸濁液を１０分間撹拌し、溶液を除去した。この手順は、１分間撹拌しながら２回反復し、樹脂をＤＭＦ７ｍｌで５回洗浄した。
脱保護樹脂へのアミノ酸のカップリング：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨまたはＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４当量）、ＨＯＢｔ水和物（４当量）およびＨＢＴＵ（３．９２当量）を５ｍｌＤＭＦに溶解し、ＤＩＰＥＡ（８当量）を添加し、混合物は１５分間前もって活性化しておき、樹脂に添加した。１時間撹拌した後、カップリング混合物を除去し、樹脂は７ｍｌのＤＭＦで５回洗浄した。
β−アミノ酸の脱保護樹脂へのカップリング：Ｆｍｏｃ−β−ａａ−ＯＨ（２当量）およびＴＦＦＨ（１．９６当量）をＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＤＩＰＥＡ（８当量）を添加し、混合物は１５分間前もって活性化し、樹脂に添加した。４８時間撹拌した後に、カップリング混合物を除去し、樹脂はＤＭＦ７ｍｌで５回洗浄した。
β−アミノ酸後のアミノ酸の脱保護樹脂へのカップリング：Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４当量）およびＴＦＦＨ（３．９２当量）をＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＤＩＰＥＡ（８当量）を添加し、混合物を１５分間前もって活性化させ、樹脂に添加した。２４時間撹拌した後、カップリング混合物を除去し、樹脂はＤＭＦ７ｍｌで５回洗浄した。最後のカップリングの後、樹脂はＤＣＭで５回洗浄し、終夜風乾した。
樹脂からの開裂およびＢｏｃ除去：ＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）１０ｍｌを反応管に添加し、懸濁液は２時間撹拌し、ペプチド溶液を収集した。この手順は、１０分間撹拌しながら２度反復した。収集したペプチド溶液を減圧下で蒸発乾固させ、ジエチルエーテルで沈澱させ、ジエチルエーテルで洗浄した。ペプチドはＨＰＬＣによって精製し凍結乾燥した。
細胞試験
好適な方法論は実施例１に記載されている。
結果
【０１０５】
【表３】
2013509389.tif 000008
【０１０６】
【表４】
2013509389.tif 000009
【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
【表７】
2013509389.tif 000012
【０１１０】
【表８】
2013509389.tif 000013
【０１１１】
【表９】
2013509389.tif 000014
【０１１２】
【表１０】
2013509389.tif 000015
【０１１３】
【表１１】
2013509389.tif 000016
【０１１４】
【表１２】
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【０１１５】
【表１３】
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【０１１６】
【表１４】
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【０１１７】
【表１５】
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【０１１８】
【表１６】
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【０１１９】
【表１７】
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【０１２０】
実施例３
実施例２に記載された化合物７は、２つの正常細胞系統および９つの癌細胞系統からふるい分けした。
【０１２１】
すべての細胞系統はヒト起源であった。化合物７の原料溶液を１０％ＤＭＳＯ含有アッセイ培地に溶かした。３つの並行実験を各細胞系統に対して行った。
【０１２２】
化合物７の先の結果は、Ａ２０癌細胞に対してＩＣ50０．７μｇ／ｍｌおよびＲＢＣに対してＥＣ50２９２μｇ／ｍｌを与えた（表２）。ＭＲＣ−５細胞に対する化合物７の先の試験は、ＩＣ50１３．５および１４μｇ／ｍｌを与えたが、パネルスクリーニングはＩＣ50８．２１μｇ／ｍｌを与えた。
【０１２３】
【表１８】
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【０１２４】
実施例４
本発明のβ2,2−アミノ酸誘導体を製造し、抗菌活性について試験し、経口投与に対するそれらの適合性を調べた。
合成
β2,2−アミノ酸誘導体（図３）は、図４に示す方式によって合成した。β−アミノを調製する方法の広範囲を覆う総説の間としてＡｂｅｌｅ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．［２０００］２０００，１−１５．を参照のこと。Ｂｏｃ保護β2,2−アミノ酸３ａ−ｄを４つの異なるＣ末端陽イオン基（図４）にカップリングさせた。収率を改善するために、カップリング試薬ＴＦＦＨの１．５当量は、最終のカップリングステップにおいて使用された。β2,2−アミノ酸も、標準１０分の代わりにＴＦＦＨで２時間前もって活性化した。カップリング反応の後、質量分光分析を行い、Ｎａ2ＣＯ3水溶液の添加によって終了させた。しかし、立体障害によって、Ｃ末端陽イオン基の結合にカップリング時間は、７日まで延長しなければならなかった。
１ａ〜ｄの合成の一般手順
合成は、以前に報告されたＣｒｏｎｉｎら  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．［１９８２］１２４，１３９−１４９による合成に基づいていた。手短には、ナトリウムメトキシド（２０ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解して０．２Ｍのおよその濃度を達成し、シアノ酢酸メチル（２０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。所望の臭化ベンジル（２０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液は加熱して１５分間還流し、溶液を室温に冷却し、ナトリウムメトキシド（２０ｍｍｏｌ）の第２の部分を添加した。室温で５分撹拌後、所望の臭化ベンジル（２０ｍｍｏｌ）の別の部分を添加し、さらに１５分還流した。メタノールのおよそ２／３を真空内で除去し、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機相はＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。生成物１ａ−ｄは、さらなる精製をすることなく以下の合成に使用した。
２ａ〜ｄの合成の一般手順
合成は上記ＣｒｏｎｉｎらおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙら“Ｔｈｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  
ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｓｐｒｉｎｇｅ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４
．によって以前報告された合成に基づいた。手短には、Ｒａ／Ｎｉ（通常２ｍＬ）を、メタノールで洗浄して水分を除去し、所望のシアノ酢酸メチル誘導体（１ａ〜ｄ）（３．５ｍｍｏｌ）を酢酸（通常１ｍｌ）およびメタノールと共に添加し、およそ０．１ｍの１ａ〜ｄの最終濃度を得た。反応物混合物は、搭載した還流凝縮器で１バールのＨ２で４５℃で５日間水素化し、Ｒａ／Ｎｉを濾過し、反応混合物は蒸発乾固させた。粗のβ2,2−アミノ酸メチルエステルを１，４−ジオキサンと水の５：１混合物（０．３５Ｍ）に溶解し、ｐＨをＴＥＡで８に調節し、可能な限り少量の１，４−ジオキサンに溶解したＢｏｃ２Ｏ（１．５当量）を添加し、溶液は１８時間室温で撹拌した。反応混合物は０．１ｍＨＣｌでｐＨ４〜５に酸性化し、酢酸エチルで３回抽出し有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。粗生成物２ａ〜ｄは、さらなる精製をすることなく以下の合成に使用した。
３ａ〜ｄの合成の一般手順。
【０１２５】
合成は、ＳｅｅｂａｃｈらＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ［１９９８］８１，２２１８−２２４３による刊行物に基づいた。手短には、粗のＢｏｃ保護β2,2−アミノ酸メチルエステル２ａ〜ｄ（０．３５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンと水の３：１の混合物に溶解し、およそ１．２ｍＭの最終濃度を達成し、可能な限り少ない水に溶解した水酸化リチウム（２．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を加熱して還流し、１８時間放置し体積を真空内でおよそ１／５に減少させ、０．１ｍＨＣｌをゆっくり添加することによってｐＨを１〜２に調節した。水溶液は酢酸エチルで３回抽出し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。粗生成物３ａ〜ｄは、さらなる精製をすることなく以下の合成に使用した。
４ａ〜ｄ、５ａ〜ｄ、６ａ〜ｄ、および７ａ〜ｄの合成の一般手順
この合成は、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ、「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成：実際的な手法」Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００；ｐ３４６の文献に基づいた。手短には、Ｂｏｃ保護β2,2−アミノ酸（３ａ〜ｄ）（通常０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．０２Ｍ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３当量）はＴＦＦＨ（１当量）と共に添加した。β2,2−アミノ酸を２時間活性化させ、所望のアミンを添加した（２当量）。反応物は続いてＭＳを行い、最大７日間反応させ、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機相はＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。Ｂｏｃ保護β2,2−アミノ酸誘導体をＤＣＭにそれらを溶解することにより脱保護し、等しい体積のＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）を添加し２時間室温で撹拌し、蒸発乾固させた。粗生成物を分取ＲＰＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。化合物の純度は、分析ＨＰＬＣによって２１０ｎｍから３１０ｎｍにわたるＰＤＡ検出器で点検した。すべての化合物は９５％を超える純度を有していた。
抗菌活性
各化合物は、２００、１００、５０、３５、１５、１０、５、２．５、１、０．５ｍｇ／ｍｌで二重反復試験した。試験した化合物はすべて、二−トリフルオロ酢酸塩であった。
溶血作用
ヘパリン処理したヒト血液の血漿分画を、遠心分離、および前もって３７℃に暖めたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での３つの追加の洗浄ステップによって最初に除去した。続いて、ヒトＲＢＣを１０％ヘマトクリットに希釈し、β2,2−アミノ酸誘導体をＰＢＳに溶解して１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲の濃度を提供した。希釈したＲＢＣを化合物の溶液に添加し、１％ｖ／ｖの最終赤血球濃度にした。０．１％ｖ／ｖの最終濃度のＰＢＳおよびトリトンＸ−１００は、負および正の対照として包含されていた。揺動しながら３７℃で１時間のインキュベーションの後、試料を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離機にかけた。ヘモグロビンの放出は、４０５ｎｍで上澄みの吸光度を測定することにより求めた。溶血作用は、β2,2−アミノ酸誘導体で処理した試料と、界面活性剤で処理した試料の比率として、下記式によって算定した。
【０１２６】
【数１】
2013509389.tif 000024
【０１２７】
【表１９】
2013509389.tif 000025
【０１２８】
薬らしさおよび経口吸収
2013509389.tif 000026
Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアｖ９．１に包含されている
2013509389.tif 000027
ＱｉｋＰｒｏｐ適用の使用によってリピンスキーのルール
オブファイブに関するβ2,2−アミノ酸誘導体の薬らしさの評価を、ヒトのパーセント経口吸収の評価と一緒に見積もった。ルールは、経口活性薬物が以下の４つの基準の２つ以上を破るべきでないと述べる。１）オクタノール−水分配係数ｌｏｇＰが５未満であるべきである。２）分子量（Ｍｗ）は５００ダルトンを上回るべきでない。３）最大５個の水素結合供与体（ＨＢＤ）基は許容される。および、４）１０以下の水素結合受容体（ＨＢＡ）基があること。結果は、下記表１０に提示される。
【０１２９】
【表２０】
2013509389.tif 000028
【０１３０】
計算からの結果それを明らかにする。化合物のどれも４つのルールのうち２つ以上を破らなかったので、すべてのβ2,2−アミノ酸誘導体はリピンスキーのルールオブファイブを満たした。調製した１６種のβ2,2−アミノ酸誘導体のうち５種は１つのルールを破ったが、これらの逸脱のうちの３種は、５００（４ｂ、４ｃおよび４ｄ）を超える分子量により、他の２つは５（５ｄおよび６ｄ）の限界を超えるｌｏｇＰ値による。
ソフトウェアによるヒトにおいてパーセント経口吸収の計算は、すべてのβ2,2−アミノ酸誘導体が、８９％から６２％の範囲に算定された経口吸収を有することによりかなりよく吸収されるであろうという結論を下した。最も高いパーセント経口吸収は、β2,2−アミノ酸誘導体５ａ、５ｂ、５ｃ、６ｂおよび６ｃに算定した８６％〜８９％の経口吸収の範囲にすべてあった。
浸透性
理論計算に励まされて、β2,2−アミノ酸誘導体の浸透性を、最近確立されたリン脂質小胞系のバリアモデルを使用してさらに調べた（Ｆｌａｔｅｎら  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．［２００６］２７，８０−９０）。ＭＲＳＡおよび大腸菌に対する同様の効力を示す、４種のβ2,2−アミノ酸誘導体（４ｃ、５ｃ、６ｃおよび７ｃ）を調べた。モデルの吸収の分類に基づいて、４種の化合物すべてがヒトに中程度に吸収されることと等価な浸透性を示した。実験的な浸透性値のために、化合物５ｃは、最も高い浸透性を示し、化合物６ｃ、４ｃ、および７ｃが続いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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