(57)【要約】免疫原性組成物は、（ｉ）理想的には、互いに会合して複合体を形成する、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーと、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原とを含む。ほとんどの実施形態において、免疫原性組成物は、アルミニウム塩を含まず、水中油型エマルジョンを含まない。一局面において、（ｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む、免疫原性組成物が提供され、ここで、（ｉ）該免疫原性組成物はアルミニウム塩を含まず；（ｉｉ）該免疫原性組成物は水中油型エマルジョンを含まず；（ｉｉｉ）該髄膜炎菌血清群Ｂ抗原は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含まず；（ｉｖ）該免疫原性組成物はｆＨＢＰ抗原を含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む、免疫原性組成物であって、ここで、（ｉ）該免疫原性組成物はアルミニウム塩を含まず；（ｉｉ）該免疫原性組成物は水中油型エマルジョンを含まず；（ｉｉｉ）該髄膜炎菌血清群Ｂ抗原は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含まず；（ｉｖ）該免疫原性組成物はｆＨＢＰ抗原を含まない、免疫原性組成物。
【請求項２】
（ｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントと、（ｉｉｉ）肺炎球菌抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＡＶ抗原、Ｈｉｂ抗原および／もしくはＩＰＶから選択される１または複数のさらなる抗原とを含む、免疫原性組成物。
【請求項３】
（ｉ）精製髄膜炎菌リポオリゴ糖と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む、免疫原性組成物。
【請求項４】
（ｉ）アルミニウム塩および（ｉｉ）水中油型エマルジョンの１または複数をさらに含む、請求項２または請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記ポリマーが、互いに会合して複合体を形成している、前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドが１本鎖であり、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドを有する、前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが５’−（ＩＣ）１３−３’である、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ポリカチオン性ポリマーがペプチドである、前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが、１もしくは複数のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１もしくは複数のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列および／または１もしくは複数のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列を含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、１もしくは複数のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列および／または１もしくは複数のＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含む、請求項８または請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが５〜５０アミノ酸を有する、請求項８〜１０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドがアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫを有する、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記ポリマーが１：２５のモル比で存在する、前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーと、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原とを混合するステップを含む、プロセス。
【請求項１５】
（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含有する第１容器と、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原を含有する第２容器とを含むキットであって、ここで、免疫原性組成物はアルミニウム塩を含まず、（ｉｉ）該免疫原性組成物は水中油型エマルジョンを含まず、（ｉｉｉ）該髄膜炎菌血清群Ｂ抗原は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２を有するペプチドを含まず、（ｉｖ）該免疫原性組成物はｆＨＢＰ抗原を含まない、キット。
【請求項１６】
（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含有する第１容器と、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原を含有する第２容器とを含むキットであって、ここで、該髄膜炎菌血清群Ｂ抗原は精製髄膜炎菌リポオリゴ糖である、キット。
【請求項１７】
（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含有する容器と、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原を含有する容器と、（ｉｉｉ）肺炎球菌糖抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＡＶ抗原、Ｈｉｂ抗原および／もしくはＩＰＶから選択される１または複数のさらなる抗原を含有する容器とを含む、キット。
【請求項１８】
（ｉ）ＭｅｎＢ抗原、血清群Ａ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖、血清群Ｃ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖、血清群Ｗ１３５  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖、血清群Ｙ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖からなる５価抗原成分と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む、免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物は、アルミニウム塩を含まず、かつ水中油型エマルジョンを含まないことを条件とする、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３１５，３３６号および２０１０年３月２５日に出願された同第６１／３１７，５７２号（これらの両方の完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、髄膜炎菌ワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ（「ＭｅｎＢ」）に対する様々なワクチンが、現在、調べられている。Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＶａｃｃｉｎｅｓのＭＥＮＺＢ（商標）製品、Ｆｉｎｌａｙ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＶＡ−ＭＥＮＧＯＣ−ＢＣ（商標）製品およびＮｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  ＨｅａｌｔｈのＭＥＮＢＶＡＣ（商標）製品のような外膜小胞（ＯＭＶ）に基づくワクチンがある。非特許文献１（参考文献１）においてＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓにより報告される「血清群Ｂ髄膜炎菌のためのユニバーサルワクチン」のような組換えタンパク質に基づくワクチンもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｉｕｌｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２００６）１０３（２９）：１０８３４〜９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＭｅｎＢに対する改変および改善されたワクチン、特にアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、（ｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、（ｉ）前記免疫原性組成物がアルミニウム塩を含まず；（ｉｉ）前記免疫原性組成物が水中油型エマルジョンを含まず；（ｉｉｉ）前記髄膜炎菌血清群Ｂ抗原が、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含まず；（ｉｖ）前記免疫原性組成物がｆＨＢＰ抗原を含まない。
【０００７】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーは、好ましくは、互いに会合している。これらは、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体を形成できる。
【０００８】
本発明は、（ｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントと、（ｉｉｉ）肺炎球菌抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＡＶ抗原、Ｈｉｂ抗原および／もしくはＩＰＶから選択される１または複数のさらなる抗原とを含む免疫原性組成物も提供する。免疫原性組成物は、アルミニウム塩および／または水中油型エマルジョンをさらに含むことができる。
【０００９】
本発明は、（ｉ）精製髄膜炎菌リポオリゴ糖と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む免疫原性組成物も提供する。免疫原性組成物は、アルミニウム塩および／または水中油型エマルジョンをさらに含むことができる。
【００１０】
本発明はさらに、（ｉ）ＭｅｎＢ抗原、血清群Ａ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖、血清群Ｃ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖、血清群Ｗ１３５  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖、血清群Ｙ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの結合体化莢膜糖からなる５価抗原成分と、（ｉｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、この免疫原性組成物は、アルミニウム塩を含まず、かつ水中油型エマルジョンを含まないことを条件とする。
【００１１】
本発明のある実施形態において、ＭｅｎＢ抗原は、アジュバント中のオリゴヌクレオチドおよびポリマーにより形成された複合体に吸着できる。代わりに、ＭｅｎＢ抗原は、アジュバント中のオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体に吸着されない。
【００１２】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスも提供し、このプロセスは、（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体を含むアジュバントと、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ（「ＭｅｎＢ」）抗原とを混合するステップを含み、ここで、前記ＭｅｎＢ抗原が、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含まず、ｆＨＢＰ抗原を含まないことを条件とする。代替の方法において、ＭｅｎＢ抗原と、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントは、複合体が形成される前に混合される。例えば、ＭｅｎＢ抗原をオリゴヌクレオチドと混合し、次いでポリマーを加えることができるか、またはＭｅｎＢ抗原をポリマーと混合し、次いでオリゴヌクレオチドを加えることができる。複合体は、オリゴヌクレオチドとポリマーとが遭遇した後で形成されてよい。
【００１３】
ＭｅｎＢ抗原、オリゴヌクレオチドおよびポリマーは、いずれの順序で混合してもよい。
【００１４】
本発明は、（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含有する第１容器と、（ｉｉ）ＭｅｎＢ抗原を含有する第２容器とを含むキットも提供し、ここで、前記ＭｅｎＢ抗原が、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含まず、かつｆＨＢＰ抗原を含まないことを条件とする。キット中の第１容器または第２容器のいずれも、アルミニウム塩も水中油型エマルジョンも含まない。
【００１５】
本発明は、（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含有する第１容器と、（ｉｉ）精製髄膜炎菌リポオリゴ糖を含有する第２容器とを含むキットも提供する。
【００１６】
本発明は、（ｉ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含有する第１容器と、（ｉｉ）髄膜炎菌血清群Ｂ抗原を含有する第２容器と、（ｉｉｉ）肺炎球菌抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＡＶ抗原、Ｈｉｂ抗原および／もしくはＩＰＶから選択される１または複数のさらなる抗原を含有する容器とを含むキットも提供する。第（ｉｉｉ）部で言及する容器は、第１容器、第２容器または第３容器であり得る。
【００１７】
これらのキット中の容器の内容物を組み合わせて（例えば使用時に）、本発明の免疫原性組成物を形成できる。これらのキットは、免疫原および／またはさらなるアジュバントを含有するさらなる容器を含むこともできる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、組成物またはキット中の唯一のアジュバントは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むアジュバントである。
【００１９】
血清群Ｂ髄膜炎菌免疫原
本発明の免疫原性組成物は、血清群Ｂ髄膜炎菌（「ＭｅｎＢ」）に対する免疫応答を惹起するために有用である。抗ＭｅｎＢ応答を惹起するために適切な免疫原は、ポリペプチド抗原、リポオリゴ糖および／または膜小胞を含む。有用な血清群Ｂ抗原のさらなる詳細を以下に示す。
【００２０】
髄膜炎菌ポリペプチド抗原
本発明の免疫原性組成物は、１または複数の髄膜炎菌ポリペプチド抗原（複数可）を含んでよい。例えば、組成物は、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐおよび／またはＯｍｐ８５からなる群より選択されるポリペプチド抗原を含んでよい。これらの抗原は、精製ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドとして有用に存在する。抗原は、好ましくは、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起する。
【００２１】
本発明の組成物は、２８７抗原を含んでよい。２８７抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２７３８８；本明細書において配列番号３）として含まれた。多くの株からの２８７抗原の配列が、それ以降公開されている。例えば、２８７の対立遺伝子型は、参考文献３の図５および１５、参考文献４の実施例１３および図２１（その中の配列番号３１７９〜３１８４）で見ることができる。２８７抗原の種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましい２８７抗原は、（ａ）配列番号３と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号３からのエピトープを含む。本発明の最も有用な２８７抗原は、被験体に投与した後に、配列番号３のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利な２８７抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２２】
本発明の組成物の免疫原性組成物は、ＮａｄＡ抗原を含んでよい。ＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書において配列番号４）として含まれた。多くの株からのＮａｄＡ抗原の配列がそれ以降公開され、ナイセリアの付着因子としてのタンパク質活性は、詳細に文書化されている。ＮａｄＡの種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号４と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号４からのエピトープを含む。配列番号６は、１つのそのようなフラグメントである。本発明の最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号４のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＮａｄＡ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２３】
本発明の免疫原性組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含んでよい。ＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２５８８８；本明細書において配列番号５）として含まれた。抗原は、参考文献５および６から、以前に公知であった。多くの株からのＮｓｐＡ抗原の配列が、それ以降公開されている。ＮｓｐＡの種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号５と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号５の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号５からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号５のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＮｓｐＡ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２４】
本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含んでよい。全長ＨｍｂＲ配列は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書において配列番号１２）として含まれた。本発明は、全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを用いることができるが、部分的なＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを頻繁に用いる。よって、いくつかの実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、配列番号１２と少なくともｉ％（ここで、ｉの値は、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９またはそれより多い）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。別の実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、配列番号１２からの少なくともｊ連続アミノ酸（ここで、ｊの値は、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）のフラグメントを含んでよい。別の実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号１２と少なくともｉ％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号１２からの少なくともｊ連続アミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含んでよい。ｊアミノ酸の好ましいフラグメントは、配列番号１２からのエピトープを含む。このようなエピトープは、通常、ＨｍｂＲの表面上にあるアミノ酸を含む。有用なエピトープは、ヘモグロビンとのＨｍｂＲの結合に関与するアミノ酸を有するものを含む。なぜなら、これらのエピトープと結合する抗体は、宿主のヘモグロビンと結合する細菌の能力を遮断できるからである。ＨｍｂＲの位相幾何学およびその重要な機能的残基は、参考文献７において調べられた。本発明の最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号１２のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＨｍｂＲ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２５】
本発明の免疫原性組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含んでよい。ＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書において配列番号６）として含まれた。多くの株からのＮｈｈＡ抗原の配列がそれ以降公開され（例えば参考文献３および８）、ＮｈｈＡの種々の免疫原性フラグメントが報告されている。これは、Ｈｓｆとしても公知である。本発明で用いるために好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号６と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号６の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号６からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号６のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＮｈｈＡ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２６】
本発明の免疫原性組成物は、Ａｐｐ抗原を含んでよい。Ａｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書において配列番号７）として含まれた。多くの株からのＡｐｐ抗原の配列がそれ以降公開されている。Ａｐｐの種々の免疫原性フラグメントが報告されている。本発明で用いるために好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号７と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号７の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号７からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号７のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＡｐｐ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２７】
本発明の免疫原性組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含んでよい。Ｏｍｐ８５抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［２］中に、遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書において配列番号８）として含まれた。多くの株からのＯｍｐ８５抗原の配列がそれ以降公開されている。Ｏｍｐ８５についてのさらなる情報は、参考文献９および１０で見出すことができる。Ｏｍｐ８５の種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号８と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体に投与した後に、配列番号８のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＯｍｐ８５抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００２８】
本発明の組成物は、髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）抗原を含まない。ｆＨＢＰ抗原は、（ｉ）配列番号９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号９、１０もしくは１１からの少なくとも７隣接アミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、組成物は、参考文献１１および１２に記載されるアッセイにおいてＨ因子（例えばヒトＨ因子）と結合できるタンパク質を含まない。
【００２９】
フラグメントは、好ましくはそれぞれの配列番号の配列からのエピトープを含む。その他の有用なフラグメントは、それぞれの配列番号のＣ末端からの１もしくは複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端からの１もしくは複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、その少なくとも１つのエピトープを保持している。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド（複数可）は、例えばＮ末端システインにて脂質付加される。脂質付加ポリペプチド（複数可）について、システインに付加される脂質は、通常、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）、Ｎ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）などのようなパルミトイル残基を含む。
【００３１】
髄膜炎菌リポオリゴ糖
免疫原性組成物は、１または複数の髄膜炎菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）抗原（複数可）を含んでよい。髄膜炎菌ＬＯＳは、細菌の外膜の外側の単層で見出されるグルコサミンベースのリン脂質である。これは、リピドＡ部分とコアオリゴ糖領域とを含み、リピドＡ部分は、膜において疎水性アンカーとして作用する。オリゴ糖コア中の不均質性が、異なる髄膜炎菌株の間での構造的および抗原的多様性を生じ、これは、株を１２のイムノタイプ（Ｌ１〜Ｌ１２）に細分するために用いられている。本発明は、任意のイムノタイプ、例えばＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７および／またはＬ８からのＬＯＳを用いてよい。
【００３２】
Ｌ２およびＬ３のα鎖は、天然に、ラクトＮ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む。本発明がＬ２またはＬ３イムノタイプからのＬＯＳを用いる場合、このＬＮｎＴは存在しないことがある。この非存在は、α鎖内でＬＮｎＴ四糖を合成する能力が破壊されるように操作された変異体株を用いることにより、簡便に達成できる。関連する生合成付加を担う酵素のノックアウトによりこの目的が達成されることが公知である［１３、４３］。例えば、ＬｇｔＢ酵素のノックアウトは、ＬＮｎＴの末端ガラクトースの付加を妨げるとともに、α鎖の末端シアル酸の下流の付加も妨げる。ＬｇｔＡ酵素のノックアウトは、ＬＮｎＴのＮ−アセチル−グルコサミンの付加と、同様に下流の付加とを妨げる。ＬｇｔＡノックアウトは、ＬｇｔＣノックアウトを伴い得る。同様に、ＬｇｔＥおよび／またはＧａｌＥ酵素のノックアウトは、内部ガラクトースの付加を妨げ、ＬｇｔＦのノックアウトは、ＨｅｐＩ残基へのグルコースの付加を妨げる。これらのノックアウトのいずれも、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ７またはＬ９イムノタイプ株におけるＬＮｎＴ四糖の破壊のために、単独または組み合わせて用いることができる。有用な免疫原性を保持しながらＬＮｎＴエピトープが除去されたＬＯＳを提供するので、少なくともＬｇｔＢのノックアウトが好ましい。
【００３３】
ＬＮｎＴエピトープを破壊する変異に加えて、またはその代わりに、ｇａｌＥ遺伝子のノックアウトも、有用な改変ＬＯＳを提供し、リピドＡ脂肪トランスフェラーゼ（ｆａｔｔｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子も同様にノックアウトされ得る［１４］。少なくとも１つの第一級Ｏ結合脂肪酸を、ＬＯＳから除去してよい［１５］。１ＬＯＳ分子あたりの第二級アシル鎖の数が低減されたＬＯＳを用いることもできる［１６］。ＬＯＳは、典型的に、少なくともＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ２−リピドＡ構造を有する［１７］。ＬＯＳは、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ三糖を含むが、ＬＮｎＴ四糖を欠くことがある。
【００３４】
ＬＯＳは、種々の形態で含まれ得る。これは、精製された形態にてそれ自体で用いてよい。これは、担体タンパク質と結合体化してよい。ＬＯＳが結合体化されている場合、結合体化は、ＬＯＳ中のリピドＡ部分を介するか、または任意のその他の適切な部分、例えばそのＫＤＯ残基によるものであってよい。ＬＯＳのリピドＡ部分が存在しない場合、このような代替の連結が必要となる。ＬＯＳについての結合体化技術は、参考文献１５、１７、１８、１９などから公知である。これらの結合体に有用な担体タンパク質は、例えば、ジフテリアもしくは破傷風毒素またはそのトキソイドもしくは変異体のような細菌毒素を含む。
【００３５】
ＬＯＳは、参考文献２０に記載されるような固定（すなわち相変動性（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）でない）ＬＯＳイムノタイプを有する株（例えば遺伝子操作された髄膜炎菌株）からであってよい。例えば、Ｌ２およびＬ３  ＬＯＳイムノタイプを固定してよい。このような株は、イムノタイプ間のスイッチング率が、元の野生型株に対して１／２未満（＞１／５０にさえ）に低減されてよい。参考文献２０は、ｌｇｔＡおよび／またはｌｇｔＧ遺伝子生成物の改変によりこの結果をどのようにして達成できるかについて開示している。
【００３６】
ＬＯＳは、例えばＬ３について、そのヘプトースＩＩ残基に付加されたＧｌｃＮａｃ残基上でＯ−アセチル化されてよい［２１］。
【００３７】
本発明の免疫原性組成物は、１より多い型のＬＯＳ、例えば髄膜炎菌イムノタイプＬ２およびＬ３からのＬＯＳを含むことができる。例えば、参考文献２２に開示されるＬＯＳの組み合わせを用いてよい。
【００３８】
ＬＯＳ抗原は、好ましくは、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００３９】
膜小胞
本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌外膜小胞を含み得る。これらは、髄膜炎菌外膜の破壊または髄膜炎菌外膜からのブレブ形成（ｂｌｅｂｂｌｉｎｇ）により、外膜のタンパク質成分を含む小胞が形成されることにより得られる任意のプロテオリポソーム性小胞を含む。よって、この用語は、ＯＭＶ（「ブレブ」ということがある）、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＶ［２３］）および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［２４］）を含む。
【００４０】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌の成長中に自発的に形成されて培養培地中に放出される、天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａをブロス培養培地中で培養し、全細胞を、ブロス培養培地中のより小さいＭＶから分離し（例えばろ過、または細胞だけをペレットにし、より小さい小胞はペレットにしない低速遠心分離により）、次いで細胞を除いた培地からＭＶを回収する（例えばろ過、ＭＶの分画沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）もしくは凝集、ＭＶをペレットにするための高速遠心分離により）ことにより得ることができる。ＭＶの生成において用いるための株は、一般的に、培養で生成するＭＶの量に基づいて選択でき、例えば参考文献２５および２６は、ＭＶ生成量が高いＮｅｉｓｓｅｒｉａについて記載している。
【００４１】
ＯＭＶは、細菌から人工的に調製され、洗浄剤処理（例えばデオキシコール酸塩を用いる）または非洗浄剤手段（例えば参考文献２７を参照されたい）を用いて調製できる。ＯＭＶを形成するための技術は、胆汁酸塩洗浄剤（例えばリトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを処理するためにデオキシコール酸ナトリウム［２８および２９］が好ましい）を用いて、洗浄剤を沈殿させないために十分に高いｐＨにて［３０］細菌を処理することを含む。その他の技術は、洗浄剤の実質的に非存在下で［２７］、音波処理、ホモジナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、キャビテーション、浸透圧性ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンディングのような技術を用いて行ってよい。洗浄剤を全くまたはほとんど用いない方法は、ＮｓｐＡのような有用な抗原を保持できる［２７］。よって、方法は、約０．５％以下、例えば約０．２％、約０．１％、＜０．０５％またはゼロのデオキシコール酸塩を含むＯＭＶ抽出緩衝液を用いてよい。
【００４２】
ＯＭＶ調製のために有用なプロセスは、参考文献３１に記載され、高速遠心分離の代わりよりもむしろ粗製ＯＭＶに対する限外ろ過を含む。このプロセスは、限外ろ過を行った後に超遠心分離を行うステップを含むこともできる。
【００４３】
本発明で用いるための小胞は、任意の髄膜炎菌株から調製できる。小胞は、通常、血清群Ｂ株からであるが、これらをＡ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹのようなＢ以外の血清群から調製することが可能である（例えば参考文献３０は、血清群Ａについてのプロセスを開示する）。株は、任意の血清型（例えば１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清サブタイプおよび任意のイムノタイプ（例えばＬ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０など）であってよい。髄膜炎菌は、高度侵襲性（ｈｙｐｅｒｉｎｖａｓｉｖｅ）および高度病原性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）の系統、例えば以下の７つの高度病原性系統のいずれか：サブグループＩ；サブグループＩＩＩ；サブグループＩＶ−１；ＥＴ−５群；ＥＴ−３７群；Ａ４クラスタ；系統３を含む任意の適切な系統からであってよい。これらの系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）により定義されているが、髄膜炎菌［参考文献３２］を分類するために多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）も用いられており、例えばＥＴ−３７群は、ＭＬＳＴによりＳＴ−１１群であり、ＥＴ−５群は、ＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３は、ＳＴ−４１／４４である、などである。小胞は、以下のサブタイプの１つを有する株から調製できる：Ｐ１．２；Ｐ１．２，５；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．５，ｃ；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．７ｈ，４；Ｐ１．９；Ｐ１．１５；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４。
【００４４】
本発明で用いる小胞は、野生型髄膜炎菌株または変異体髄膜炎菌株から調製することもできる。例えば、参考文献３３は、改変ｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得られた小胞の調製物を開示している。参考文献４１は、付随するｐｏｒＡおよびｃｐｓノックアウトによりｎｓｐＡ発現が上方制御されることを教示している。ＯＭＶ生成のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのさらなるノックアウト変異体は、参考文献４１〜４３に開示されている。参考文献３４は、ｆＨＢＰが上方制御されている小胞を開示している。参考文献３５は、６つの異なるＰｏｒＡサブタイプを発現するように改変された株からの小胞の構築を開示している。ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトにより達成される内毒素レベルが低い変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを用いてもよい［３６、３７］。これらまたはその他の変異体は全て、本発明で用いることができる。
【００４５】
よって、本発明で用いる株は、いくつかの実施形態において、１より多いＰｏｒＡサブタイプを発現してもよい。６価および９価のＰｏｒＡ株が、以前に構築されている。株は、２、３、４、５、６、７、８または９のＰｏｒＡサブタイプ：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１および／またはＰ１．１８−１，３，６を発現してもよい。他の実施形態において、株は、ＰｏｒＡ発現について下方制御されてよく、ここで、例えば、ＰｏｒＡの量は、野生型レベルに対して（例えば参考文献４４に開示される株Ｈ４４／７６に対して）少なくとも２０％（例えば≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％など）低減されているかまたはノックアウトさえされている。
【００４６】
いくつかの実施形態において、株は、あるタンパク質を過剰に発現してもよい（対応する野生型株に対して）。例えば、株は、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７［３８］、ｆＨＢＰ［３４］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［３９］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ［３９］、ＨｍｂＲなどを過剰に発現してもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、株は、参考文献４０〜４３に開示されるノックアウトおよび／もしくは過剰発現変異の１または複数を含むこともできる。下方制御および／またはノックアウトのための好ましい遺伝子は：（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［４０］；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［４１］；（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［４２］；ならびに（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢおよび／またはＳｙｎＣ［４３］を含む。
【００４８】
変異体株を用いる場合、いくつかの実施形態において、これは、以下の特徴の１もしくは複数または全部を有してもよい：（ｉ）髄膜炎菌ＬＯＳを切断するように下方制御またはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／もしくはＧａｌＥ；（ｉｉ）上方制御されたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）上方制御されたＮｈｈＡ；（ｉｖ）上方制御されたＯｍｐ８５；（ｖ）上方制御されたＬｂｐＡ；（ｖｉ）上方制御されたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）下方制御またはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）下方制御またはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）下方制御またはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）ｃｐｓ遺伝子複合体の欠失。切断型ＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないものであり得、例えばこれは、ガラクトース欠損ＬＯＳである。ＬＯＳは、α鎖を有さないことがある。
【００４９】
ＬＯＳが小胞内に存在するならば、そのＬＯＳとタンパク質成分とを連結するように小胞を処理することが可能である（「ブレブ内」結合体化［４３］）。
【００５０】
本発明は、異なる株からの小胞の混合物とともに用いてよい。例えば、参考文献４４は、使用する国で流行している血清サブタイプを有する髄膜炎菌株に由来する第１小胞と、使用する国に存在する血清サブタイプを有する必要がない株に由来する第２小胞とを含む、多価髄膜炎菌小胞組成物を含むワクチンを開示している。参考文献４５も、異なる小胞の有用な組み合わせを開示している。Ｌ２およびＬ３イムノタイプのそれぞれの株からの小胞の組み合わせは、いくつかの実施形態において用いてよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、ＭｅｎＢ  ＯＭＶを含有しない。
【００５２】
本発明の免疫原性組成物は、動物に投与して免疫応答を誘導できる。本発明は、広範囲の疾患に対して処置または防御するために用いることができる。
【００５３】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー
本発明は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを用いる。これらは、理想的には互いに会合して、粒子状複合体（これは、通常、ＴＬＲ９アゴニストである）を形成する。
【００５４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、有用なアジュバントとして公知である。これらは、ＣｐＧモチーフ（グアノシンに連結した非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を頻繁に含有し、それらのアジュバント効果は、参考文献４６〜５１で論じられている。ＴｐＧモチーフ、パリンドローム配列、多重連続チミジンヌクレオチド（例えばＴＴＴＴ）、多重連続シトシンヌクレオチド（例えばＣＣＣＣ）またはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドも、２本鎖ＲＮＡと同様に、公知の免疫賦活剤である。これらの様々な免疫賦活性オリゴヌクレオチドのいずれも本発明で用いることができるが、デオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド［５２］、理想的にはデオキシイノシンおよびデオキシシトシンを含有するオリゴデオキシヌクレオチドを用いることが好ましい。イノシン含有オリゴデオキシヌクレオチドは、ＣｐＩモチーフ（イノシンに連結したシトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含み得る。オリゴデオキシヌクレオチドは、１より多い（例えば２、３、４、５、６またはそれより多い）ＣｐＩモチーフを含むこともでき、これらは、直接反復してもよいか（例えば配列（ＣＩ）ｘ（式中、ｘは、２、３、４、５、６またはそれより多い）を含む）、または互いに離れていてよい（例えば配列（ＣＩＮ）ｘ（式中、ｘは、２、３、４、５、６またはそれより多く、各Ｎは独立して１または複数のヌクレオチドを表す）を含む）。シトシン残基は、理想的にはメチル化されていない。
【００５５】
オリゴヌクレオチドは、典型的に１０〜１００のヌクレオチド、例えば１５〜５０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチドまたは２５〜２８ヌクレオチドを有する。これは、典型的に１本鎖である。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチドのみ、非天然ヌクレオチドのみまたは両方の混合物を含むことができる。例えば、これは、１もしくは複数のホスホロチオエート連結を含むこともでき、かつ／または１もしくは複数のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変を有してもよい。
【００５７】
本発明で用いるための好ましいオリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含む１本鎖デオキシヌクレオチドである。このオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリカチオン性ポリマーと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントが得られる。
【００５８】
ポリカチオン性ポリマーは、理想的には、カチオン性抗菌ペプチドのようなポリカチオン性ペプチドである。ポリマーは、１もしくは複数のロイシンアミノ酸残基および／または１もしくは複数のリジンアミノ酸残基を含むこともできる。ポリマーは、１もしくは複数のアルギニンアミノ酸残基を含むこともできる。これは、これらのアミノ酸のうちの１つの少なくとも１つの直接反復、例えば１もしくは複数のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１もしくは複数のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列または１もしくは複数のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列を含むこともできる。これは、少なくとも１つ（好ましくは複数、例えば２または３）のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列および／または少なくとも１つ（好ましくは複数、例えば２または３）のＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むこともできる。
【００５９】
ペプチドは、配列Ｒｌ−ＸＺＸＺｘＸＺＸ−Ｒ２（式中、ｘは、３、４、５、６または７であり、各Ｘは、独立して、正に荷電した天然アミノ酸残基および／または非天然アミノ酸残基であり、各Ｚは、独立して、アミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、ＦまたはＷであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３または−ＣＯＨからなる群から選択される）を含むこともできる。いくつかの実施形態において、Ｘ−Ｒ２は、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステル、またはチオエステルであってよい。参考文献５３も参照されたい。
【００６０】
ポリカチオン性ペプチドは、典型的に、５〜５０アミノ酸、例えば６〜２０アミノ酸、７〜１５アミノ酸または９〜１２アミノ酸を有する。
【００６１】
ペプチドは、天然アミノ酸のみ、非天然アミノ酸のみまたは両方の混合物を含むことができる。これは、Ｌアミノ酸および／またはＤアミノ酸を含むこともできる。Ｌアミノ酸が典型的である。
【００６２】
ペプチドは、天然のＮ末端（ＮＨ２−）または改変Ｎ末端、例えばヒドロキシル、アセチルなどを有することができる。ペプチドは、天然のＣ末端（−ＣＯＯＨ）または改変Ｃ末端、例えばヒドロキシル、アセチルなどを有することができる。このような改変は、ペプチドの安定性を改善できる。
【００６３】
本発明で用いるために好ましいペプチドは、１１ｍｅｒのＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２；参考文献５４）（全てＬアミノ酸）である。Ｎ末端は、脱アミノ化されてよく、Ｃ末端はヒドロキシル化されてよい。好ましいペプチドは、Ｈ−ＫＬＫＬ５ＫＬＫ−ＯＨ（全てＬアミノ酸）である。このオリゴペプチドは、公知の抗菌剤［５５］、好中球活性化剤［５６］およびアジュバント［５７］であり、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントが得られる。
【００６４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの最も好ましい混合物は、ＩＣ３１（商標）として公知のＴＬＲ９アゴニストであり［５８〜６０］、これは、配列番号１のオリゴデオキシヌクレオチドと配列番号２のポリカチオン性オリゴペプチドとの吸着性複合体である。
【００６５】
オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとは、様々な比で一緒に混合できるが、これらは、一般的にモル過剰の上記ペプチドと混合される。モル過剰は、少なくとも５：１、例えば１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０；１、３５：１、４０：１などであってよい。約２５：１のモル比が理想的である［６１、６２］。この過剰の比での混合は、オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとの間の不溶性粒子状複合体の形成をもたらすことができる。ＭｅｎＢ抗原が精製ＬＯＳである場合、複合体は、本明細書で記載するようにアルミニウム塩と組み合わせることができる。
【００６６】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、典型的に水性条件下で混合され、例えばオリゴヌクレオチドの溶液を、オリゴペプチドの溶液と所望の比で混合できる。２つの溶液は、水または緩衝液中に乾燥（例えば凍結乾燥）した材料を溶解してストック溶液を形成する（これらは次いで混合できる）ことにより調製することもできる。
【００６７】
複合体は、参考文献６３に開示される方法を用いて分析できる。１μｍ〜２０μｍの範囲の平均直径を有する複合体が、典型的である。
【００６８】
ポリアルギニンおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、同様に複合体を形成する［６４］。
【００６９】
複合体は、例えば水または緩衝液中の水性懸濁物で維持できる。複合体とともに用いるための典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ソルビトール緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液などである。代替として、複合体を、時折、凍結乾燥することもできる。
【００７０】
水性懸濁物中の複合体を遠心分離して、それらをバルクの媒体から分離できる（例えば吸引、デカンテーションなどにより）。これらの複合体は、次いで、所望により、代替の媒体に再懸濁できる。
【００７１】
アルミニウム塩
本発明のほとんどの実施形態は、アルミニウム塩を含まない。いくつかの実施形態では、しかし、アルミニウム塩の使用が許容される。例えば、免疫原性組成物が精製ＭｅｎＢ  ＬＯＳを含む場合または組成物が肺炎球菌糖抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＡＶ抗原、Ｈｉｂ抗原およびＩＰＶから選択される１もしくは複数のさらなる抗原を含む場合である。アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして個別に公知のアジュバントを含む。これらの名称は慣習的であるが、いずれも存在する実際の化学化合物の正確な記載ではないので、簡便のためだけに用いられている［例えば参考文献６５の第９章を参照されたい］。用語「アルミニウム塩」は、アジュバントとして一般的に用いられる「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントのいずれかをいう。アルミニウム塩が許容されるいくつかの実施形態において、水酸化アルミニウムアジュバントの使用が好ましい。
【００７２】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）で表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物から、赤外（ＩＲ）分光法により、特に１０７０ｃｍ−１での吸収バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いショルダーの存在により区別できる［参考文献６５の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さでの回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）により反映され、結晶化度が乏しい粒子は、より小さい晶子サイズのために、より大きな線の広がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増加するにつれて増加し、より高いＷＨＨの値を有するアジュバントは、抗原吸着のための能力がより大きいことが観察されている。繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。１〜１０μｍの範囲の平均粒子径が、参考文献６６に報告されている。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわちアジュバント自体は生理的ｐＨにて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００７３】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、少量の硫酸塩も頻繁に含有しているヒドロキシリン酸アルミニウムである（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、通常、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．３〜１．２である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在により厳密なＡｌＰＯ４から区別できる。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば２００℃に加熱時）でのＩＲスペクトルのバンドは、構造上のヒドロキシルの存在を示す［参考文献６５の第９章］。リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、通常、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩について、一般的に、非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に、粒子状である（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような板状の形態）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原を吸着した後に０．５〜２０μｍ（例えば約５〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７〜１．５ｍｇタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動できる。ＰＺＣは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、通常、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【００７４】
水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を用いることもできる。この状況では、水酸化物よりも多くのリン酸アルミニウムが存在し、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比であってよい。
【００７５】
（例えば免疫原性組成物が精製ＭｅｎＢ  ＬＯＳを含む）本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウム、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー、（ｉｉ）リン酸アルミニウム、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー、または（ｉｉｉ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含むこともできる。
【００７６】
本発明の薬学的組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、通常、＜１０ｍｇ／ｍｌ、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。
【００７７】
吸着
免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの好ましい複合体は、吸着性であり、すなわち、免疫原は、様々な機構により複合体に吸着できる。いくつかの状況において、しかし、免疫原と複合体はともに、免疫原の固有の特性によってまたは処方の間に行われるステップのため（例えば吸着が生じることを妨げるために処方の間に適当なｐＨを用いること）のいずれかにより、吸着せずに組成物中に存在する。
【００７８】
アルミニウム塩アジュバントも吸着性である。複合体とアルミニウム塩とがともに存在する実施形態において、よって、免疫原にとって複数の吸着の機会が存在できる。免疫原は、アルミニウム塩、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体、それらの両方（様々な割合で）に吸着できるか、またはいずれにも吸着しない。本発明は、このような構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の全てを網羅する。例えば、一実施形態において、免疫原は、アルミニウム塩に吸着でき、吸着された免疫原／塩を、次いで、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体と混合できる。別の実施形態において、免疫原は、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体に吸着でき、吸着された免疫原／複合体を、次いで、アルミニウム塩と混合できる。別の実施形態において、２つの免疫原（同じまたは異なる）は、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体およびアルミニウム塩に別々に吸着でき、２つの吸着された成分を、次いで、混合できる。
【００７９】
いくつかの状況において、免疫原は、その吸着状態が、例えばｐＨもしくは温度の変化により、または成分を混合した後に変化してもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ［６７］およびｉｎ  ｖｉｖｏ［６８］でのアルミニウム塩からの抗原の脱離が公知である。ある吸着性粒子からの脱離、およびその後の異なる吸着性分子への再吸着が生じることができ、それにより、例えば免疫原をアルミニウム塩アジュバントから複合体へ、またはその逆に移動できる。いくつかの実施形態において、単一の抗原分子または複合体は、アルミニウム塩および複合体の両方に吸着して、２つの吸着性粒子の間にブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）を形成する。
【００８０】
免疫原が吸着性成分に吸着するならば、免疫原の全てが吸着することは必要でない。この状況は、吸着相と可溶性相との間の免疫原の固有の平衡により、または吸着性表面が飽和されるので生じることができる。よって、組成物中の免疫原は、完全または部分的に吸着されてよく、吸着された画分は、１または複数の異なる吸着性成分上（例えばアルミニウム塩および／またはオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体上）にあることができる。この状況において、吸着された画分は、組成物中の免疫原の全量の少なくとも１０％（重量）、例えば＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％またはそれより多くであってよい。いくつかの実施形態において、免疫原は、完全に吸着され、すなわち、複合体をバルクの液体媒体から分離するための遠心分離の後に、上清中で検出されない。他の実施形態において、しかし、具体的な免疫原はいずれも吸着されないことがある。
【００８１】
いくつかの状況において、複合体の免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよび／またはポリカチオン性ポリマー成分が、アルミニウム塩に吸着されることが可能である。好ましくは、しかし、複合体は、アルミニウム塩と混合した後にインタクトなままである。また、複合体がアルミニウム塩に吸着する（またはその逆）ことを回避するために、アルミニウム塩および複合体は、同様のゼロ電荷点（等電点）、例えば互いに１ｐＨ単位以内を有することが有用である。よって、有用な複合体は、１０〜１２のＰＺＣを有し、これは、約１１のＰＺＣを有する水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせるために有用である。
【００８２】
水中油型エマルジョン
ほとんどの実施形態は「水中油型」エマルジョンを含有しないが、例えば、免疫原性組成物が精製ＭｅｎＢ  ＬＯＳを含むいくつかの実施形態ではそれらの存在が許容される。水中油型エマルジョンは、典型的には、少なくとも１種の界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）であり、生体適合性である。
【００８３】
エマルジョン中の油滴は、一般的には、直径５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて安定なエマルジョンを得ることにより達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、フィルタ滅菌に供することができるので好ましい。いくつかの有用なエマルジョンにおいて、油滴の少なくとも８０％（数での）は、５００ｎｍ未満の直径を有する。
【００８４】
エマルジョンは、動物（例えば魚類）または植物の供給源からのもののような油を含むことができる。植物油の供給源は、堅果、種子および穀粒を含む。ピーナツ油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま種子油などを含む。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製し得る。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝可能であり、よって本発明の実施において用いてよい。動物の供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当該技術において周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において用い得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、５炭素イソプレンユニットで生化学的に合成され、一般的に、テルペノイドとよばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分岐不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンの飽和類似体であるスクワランも用いることができる。スクアレンおよびスクワランを含む魚油は、商業的な供給源から容易に入手可能であるか、または当該技術において公知の方法により得ることができる。スクアレンが好ましい。
【００８５】
その他の有用な油は、トコフェロールであり、これは、高齢の被験体（例えば６０歳以上の年齢）用のワクチンに有利に含まれる。なぜなら、ビタミンＥは、この被験体群における免疫応答に対して正の効果を有することが報告されているからである。これらは、エマルジョンの安定化を助け得る抗酸化特性も有する。様々なトコフェロール（α、β、γ、δ、εまたはξ）が存在するが、αが通常用いられる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物の代替として有用な防腐剤であることが公知である。
【００８６】
油の混合物、例えばスクアレンとα−トコフェロールを用いることができる。
【００８７】
２〜２０％（容量）の範囲の油含量が典型的である。
【００８８】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性比）により分類できる。本発明で有用ないくつかの界面活性剤は、少なくとも１０、例えば少なくとも１５または少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎとよばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのようなＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）を含む界面活性剤を用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンに含めるために最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ８０）である。
【００８９】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびオクトキシノールの組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【００９０】
界面活性剤の有用な量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズのその他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、例えば０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【００９１】
スクアレン含有エマルジョンが好ましい（特にポリソルベート８０を含むエマルジョン）。
【００９２】
本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、それらに限定されないが、以下のものを含む：
・スクアレンとポリソルベート８０とソルビタントリオレエートとのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの容量での組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量の点において、これらの比率は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ８５になる。このアジュバントは、参考文献６５の第１０章および参考文献７２の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［６９〜７１］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、シトレートイオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【００９３】
・スクアレンとトコフェロールとポリソルベート８０とのサブミクロンエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％ポリソルベート８０を有してよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供し得るので、好ましくは≦１（例えば、０．９０）である。スクアレンとポリソルベート８０とは、約５：２の容量比または約１１：５の重量比で存在してよい。あるこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳ中に溶解して２％溶液を得て、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次いで混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことにより作製できる。得られるエマルジョンは、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有する。エマルジョンは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）も含んでよい。この型の別の有用なエマルジョンは、１ヒト用量あたりに０．５〜１０ｍｇスクアレン、０．５〜１１ｍｇトコフェロールおよび０．１〜４ｍｇポリソルベート８０を含んでよい［７３］。
【００９４】
・スクアレンとトコフェロールとＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とのエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照のこと）も含んでよい。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してよい。
【００９５】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）とＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）とを含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０の質量比で含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいずれの寄与も含むべきである。エマルジョンは、スクアレンも含んでよい。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでよい。水相は、リン酸緩衝液を含有してよい。
【００９６】
・スクワランとポリソルベート８０とポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）とのエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中で処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント中で用いられている［７４］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクワラン、２．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。これは、「ＡＦ」アジュバントでのようにＴｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる［７５］（５％スクワラン、１．２５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。微小流動化が好ましい。
【００９７】
・スクアレンと水性溶媒とポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）と疎水性非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）とを含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または少なくとも９０％の油滴（容量による）が２００ｎｍ未満のサイズである［７６］。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１または複数も含んでよい。このエマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含んでもよい［７７］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してよい。
【００９８】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ［７８］のエマルジョン。アジュバント添加ワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【００９９】
・０．５〜５０％の油と、０．１〜１０％のリン脂質と、０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤とを含むエマルジョン。参考文献７９に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１００】
・代謝不可能油（例えば軽鉱油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））と少なくとも１種の界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性物質結合体（例えば脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生成される、参考文献８０に記載されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加物を含んでよい。
【０１０１】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えばコレステロール）とが、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン［８１］。
【０１０２】
・鉱油と、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）とを含むエマルジョン［８２］。
【０１０３】
・鉱油と、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）とを含むエマルジョン［８２］。
【０１０４】
上記のように、スクアレンを含む水中油型エマルジョンが特に好ましい。いくつかの実施形態において、ワクチン用量中のスクアレン濃度は、５〜１５ｍｇの範囲（すなわち、０．５ｍｌの用量の容量と仮定して１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度）であってよい。スクアレンの濃度［８３、８４］を、例えば用量あたり＜５ｍｇまたは用量あたり＜１．１ｍｇさえ含むように低減することが可能である。例えば、ヒト用量は、用量あたり９．７５ｍｇスクアレンを含むこともできる（ＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるように：０．５ｍｌの用量の容量中に９．７５ｍｇスクアレン、１．１７５ｍｇポリソルベート８０、１．１７５ｍｇソルビタントリオレエート）か、またはこれは、その部分的な量、例えば３／４、２／３、１／２、２／５、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９もしくは１／１０を含むこともできる。例えば、組成物は、用量あたり４．８７５スクアレン（よってポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートをそれぞれ０．５８８ｍｇ）、３．２５ｍｇスクアレン／用量、２．４３８ｍｇ／用量、１．９５ｍｇ／用量、０．９７５ｍｇ／用量などを含むこともできる。ＦＬＵＡＤ（商標）濃度のＭＦ５９のこれらの部分的な希釈物のいずれも、スクアレン：ポリソルベート−８０：ソルビタントリオレエートの比を８．３：１：１（質量）に維持しながら本発明で用いることができる。
【０１０５】
本発明で用いるためのさらなる抗原
本発明の組成物およびキットは、他の病原体、特に細菌および／またはウイルスからの１または複数のさらなる抗原を含むこともできる。好ましい１または複数のさらなる抗原は：
・肺炎球菌抗原
・ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）
・破傷風トキソイド（「Ｔ」）
・百日咳抗原（「Ｐ」）、これは、典型的に無細胞性である（「ａＰ」）
・Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）
・Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原
・結合体化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型莢膜糖（「Ｈｉｂ」）
・不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）
・結合体化Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ莢膜糖（「ＭｅｎＡ」）
・結合体化Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５莢膜糖（「ＭｅｎＷ１３５」）
・結合体化Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ莢膜糖（「ＭｅｎＹ」）
から選択される。
【０１０６】
１または複数のさらなる抗原を用いることができる。抗原の以下の組み合わせは、本発明の組成物およびキットにおいて用いるために特に好ましい：
・ＭｅｎＣ−ＰｎＣ。
・Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＭｅｎＣ。
・Ｄ−Ｔ−Ｐａ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ；Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ−ＭｅｎＣ；Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−ＭｅｎＣ；Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＭｅｎＣ−ＰｎＣ。
・Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−ＩＰＶ−ＭｅｎＣ；Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−ＭｅｎＣ−ＰｎＣ。
・Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−ＩＰＶ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ；Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ−ＭｅｎＡ。
・Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−ＩＰＶ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ−ＭｅｎＡ；Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢｓＡｇ−ＩＰＶ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ−ＰｎＣ。
【０１０７】
これらの組成物は、列挙した抗原からなるか、または追加の病原体からの抗原をさらに含むこともできる。よって、これらは、個別にまたはさらなるワクチンの成分として用いることができる。
【０１０８】
結合体化Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ糖
さらなる抗原は、結合体化髄膜炎菌抗原を含むことができる。結合体化髄膜炎菌抗原は、担体タンパク質と結合体化したＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの莢膜糖抗原を含む。血清群Ｃに対する結合体化１価ワクチンは、ヒトへの使用について承認されており、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）［８５］、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）およびＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標）を含む。血清群Ａ＋Ｃからの結合体の混合物が公知であり［８６、８７］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙからの結合体の混合物が報告されており［８８〜９１］、２００５年にＭＥＮＡＣＴＲＡ（商標）製品として承認された。
【０１０９】
本発明は、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹの１または複数、例えばＡ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、Ａ＋Ｃ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙからの糖を含むこともできる。
【０１１０】
髄膜炎菌血清群Ａの莢膜糖は、Ｃ３位およびＣ４位に部分的Ｏ−アセチル化を有する（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノースアミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ３位でのアセチル化は、７０〜９５％であり得る。糖を精製するために用いる条件は、脱Ｏ−アセチル化をもたらし得る（例えば塩基性条件下で）が、このＣ３位にてＯＡｃを保持することが好ましい。よって、好ましくは、マンノースアミン残基の少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多い）が、Ｃ３位にてＯ−アセチル化される。
【０１１１】
髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜糖は、Ｃ７残基またはＣ８残基にて典型的にＯ−アセチル（ＯＡｃ）基を有するシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）のα２→９結合ホモポリマーである。この化合物は、→９）−ＮｅｕｐＮＡｃ７／８ＯＡｃ−（α２→と表される。いくつかのＭｅｎＣ株（侵襲性単離株の約１２％）は、このＯＡｃ基を欠く多糖を生成する。ＯＡｃ基の存在または非存在は、ユニークエピトープを生じ、糖と結合する抗体の特異性は、Ｏ−アセチル化された株（ＯＡｃ−）および脱Ｏ−アセチル化された株（ＯＡｃ＋）に対するその殺菌性活性に影響し得る［９２〜９４］。許諾されたＭｅｎＣ結合体ワクチンは、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））およびＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）およびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標））糖の両方を含む。本発明で用いる血清群Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−株のいずれから調製してもよい。血清群Ｃ結合体の生成のために好ましい株は、好ましくは血清型１６、好ましくは血清サブタイプＰ１．７ａ，１のものである。よって、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，１  ＯＡｃ＋株が好ましい。Ｃ１１株のような血清サブタイプＰ１．１でのＯＡｃ＋株も有用である。
【０１１２】
血清群Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトース二糖単位のポリマーである。血清群Ｃの糖と同様に、これは、変動性のＯ−アセチル化を有するが、シアル酸７位および９位においてである［９５］。この構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→と記載される。
【０１１３】
血清群Ｙの糖は、二糖反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含む以外は、血清群Ｗ１３５の糖と同様である。血清群Ｗ１３５と同様に、これは、シアル酸７位および９位において変動性のＯ−アセチル化を有する［９５］。血清群Ｙの構造は：
→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→
と記載される。
【０１１４】
ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）およびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）製品は、ＣＲＭ１９７担体タンパク質を用い、この担体は、本発明に従って用いることもできる。ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標）製品は、破傷風トキソイド担体タンパク質を用い、この担体も、ジフテリアトキソイドを用いることができるのと同様に本発明に従って用いることができる。髄膜炎菌結合体のための別の有用な担体タンパク質は、既存する承認された結合体ワクチンのいずれにも存在しない、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのプロテインＤである。
【０１１５】
さらなる抗原の糖は、髄膜炎菌から調製される全長糖を含むこともでき、かつ／またはこれは、全長の糖のフラグメントを含むこともできる。さらなる抗原の糖は、好ましくは、細菌で見られる天然の莢膜糖より短い。よって、さらなる抗原の糖は、好ましくは解重合されており、この解重合は、糖の精製の後であるが、結合体化の前に生じる。解重合は、糖の鎖長を低減する。ある解重合法は、過酸化水素の使用を伴う［８８］。過酸化水素を糖に加え（例えば１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度を得るまで）、混合物を、次いで、所望の鎖長の低減が達成されるまでインキュベートする（例えば約５５℃にて）。別の解重合法は、酸加水分解を伴う［８９］。その他の解重合法は、当該技術において公知である。本発明に従って用いるための結合体を調製するために用いる糖は、これらの解重合法のいずれによっても得ることができる。解重合は、免疫原性のために最適な鎖長を提供し、かつ／または糖の物理的な管理のしやすさのために鎖長を低減するために用いることができる。好ましい糖は、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ）を有する：Ａ＝１０〜２０；Ｃ＝１２〜２２；Ｗ１３５＝１５〜２５；Ｙ＝１５〜２５。Ｄｐよりもむしろ分子量の点において好ましい範囲は、全ての血清群について＜１００ｋＤａ；５ｋＤａ〜７５ｋＤａ；７ｋＤａ〜５０ｋＤａ；８ｋＤａ〜３５ｋＤａ；１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ；１５ｋＤａ〜２２ｋＤａである。
【０１１６】
１：１０（すなわち過剰のタンパク質）〜１０：１（すなわち過剰の糖）の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：５〜５：１、１：２．５〜２．５：１または１：１．２５〜１．２５：１の比を有する髄膜炎菌結合体を、さらなる抗原において用いてよい。１：１の比を用いることができる。
【０１１７】
典型的に、組成物は、用量あたり１μｇ〜２０μｇ（糖として測定）の、存在するそれぞれのさらなる抗原血清群を含む。
【０１１８】
髄膜炎菌結合体は、アルミニウム塩アジュバントに吸着されていてよいし、吸着されていなくてもよい。
【０１１９】
髄膜炎菌結合体は、本発明に従って用いる前に凍結乾燥されてよい。凍結乾燥されるならば、組成物は、マンニトールのような安定化剤を含むこともできる。これは、塩化ナトリウムも含むこともできる。
【０１２０】
結合体化肺炎球菌の糖
さらなる抗原は、結合体化肺炎球菌抗原を含むことができる。結合体化肺炎球菌抗原は、担体タンパク質と結合体化したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの莢膜糖抗原を含む［例えば参考文献９６〜９８］。１種より多い血清型のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖を含むことが好ましい。２３の異なる血清型からの多糖の混合物が、５〜１１の異なる血清型からの多糖を有する結合体ワクチン［９９］と同様に、広く用いられている。例えば、ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）［１００］は、７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）からの抗原を含有し、各糖は、還元的アミノ化によりＣＲＭ１９７と個別に結合体化しており、０．５ｍｌ用量あたり２μｇの各糖（４μｇの血清型６Ｂ）を有する。
【０１２１】
さらなる抗原は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆについての糖抗原を含む。さらなる血清型は、好ましくは、１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖおよび１８Ｃから選択される。肺炎球菌血清型の７価（ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）におけるように）、９価（例えばＰＲＥＶＮＡＲからの７つの血清型と１および５）、１０価（例えばＰＲＥＶＮＡＲからの７つの血清型と１、５および７Ｆ）および１１価（例えばＰＲＥＶＮＡＲからの７つの血清型と１、３、５および７Ｆ）を網羅することが、特に有用である。
【０１２２】
結合体の糖部分は、肺炎球菌から調製される全長の糖を含むこともでき、かつ／またはこれは、全長の糖のフラグメントを含むこともできる。本発明に従って用いる糖は、好ましくは、髄膜炎菌結合体について上で記載したように、細菌で見られる天然の莢膜糖より短い。
【０１２３】
１：１０（すなわち過剰のタンパク質）〜１０：１（すなわち過剰の糖）の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：５〜５：１、１：２．５〜２．５：１または１：１．２５〜１．２５：１の比を有する肺炎球菌結合体を用いてよい。
【０１２４】
ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）製品は、ＣＲＭ１９７担体タンパク質を用い、この担体も、本発明に従って用いることができる。肺炎球菌の糖と用いるための代替の担体は、それらに限定されないが、破傷風トキソイド担体、ジフテリアトキソイド担体および／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ担体を含む。混合肺炎球菌血清型について複数の担体を用いることは、例えばＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ担体と、例えば破傷風トキソイド担体および／またはジフテリアトキソイド担体との両方を含むために有用であり得る［１０１］。例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆの１または複数（好ましくは全て）はＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ担体と結合体化し、血清型１８Ｃは破傷風トキソイドと結合体化し、血清型１９Ｆはジフテリアトキソイド担体と結合体化することもできる。
【０１２５】
典型的に、組成物は、用量あたり１μｇ〜２０μｇ（糖として測定）の、存在するそれぞれの血清型を含む。
【０１２６】
百日咳抗原
さらなる抗原は、百日咳抗原を含むことができる。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（不活化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形態での全細胞）または無細胞性のいずれかである。細胞性百日咳抗原の調製は、よく文書化されており［例えば参考文献１０２の第２１章を参照されたい］、例えばこれは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの第Ｉ相培養物の熱不活化により得ることができる。好ましくは、しかし、本発明は、無細胞性抗原を用いる。
【０１２７】
無細胞性抗原を用いる場合、以下の抗原の１、２または（好ましくは）３つを用いることが好ましい：（１）解毒化百日咳毒素（百日咳トキソイドまたは「ＰＴ」）；（２）繊維状ヘマグルチニン（「ＦＨＡ」）；（３）ペルタクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても公知）。これらの３つの抗原は、好ましくは、改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液体培地中で成長したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物からの単離により調製される。ＰＴおよびＦＨＡは、発酵ブロスから単離でき（例えばヒドロキシアパタイトゲルへの吸着により）、一方、ペルタクチンは、熱処理および凝結（例えば塩化バリウムを用いて）により細胞から抽出できる。抗原は、連続的なクロマトグラフィーおよび／または沈殿ステップにおいて精製できる。ＰＴおよびＦＨＡは、例えば、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製できる。ペルタクチンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製できる。ＦＨＡおよびペルタクチンは、本発明に従って用いる前にホルムアルデヒドで処理することもできる。ＰＴは、好ましくは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドで処理することにより解毒化される。この化学的解毒化手順の代替として、ＰＴは、酵素活性が変異誘発により低減されている［１０３］変異体ＰＴであってよいが、化学処理による解毒化が好ましい。
【０１２８】
無細胞性百日咳抗原は、好ましくは、１または複数のアルミニウム塩アジュバント上に吸着される。代替として、これらは、吸着していない状態で加えてよい。ペルタクチンを加える場合、これは、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバント上に既に吸着されている。ＰＴおよびＦＨＡは、水酸化アルミニウムアジュバントまたはリン酸アルミニウム上に吸着され得る。ＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンの全てを水酸化アルミニウムに吸着させることが最も好ましい。
【０１２９】
組成物は、典型的に、１〜５０μｇ／用量のＰＴ；１〜５０μｇ／用量のＦＨＡ；および１〜５０μｇのペルタクチンを含む。好ましい量は、約２５μｇ／用量のＰＴ、約２５μｇ／用量のＦＨＡおよび約８μｇ／用量のペルタクチンである。
【０１３０】
ＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンとともに、線毛（例えば凝集原２および３）を、無細胞性百日咳ワクチンに含めることが可能である。
【０１３１】
不活化ポリオウイルスワクチン
さらなる抗原は、不活化ポリオウイルス抗原を含むことができる。ポリオウイルスは、灰白髄炎を引き起こす。経口ポリオウイルスワクチンを用いるよりもむしろ、さらなる抗原は、参考文献１０２の第２４章により詳細に開示されるように、ＩＰＶを用いる。
【０１３２】
ポリオウイルスは、細胞培養において成長させてよく、好ましい培養は、サル腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞株を用いる。Ｖｅｒｏ細胞は、微小担体上で簡便に培養できる。成長後に、ビリオンを、限外ろ過、ダイアフィルトレーションおよびクロマトグラフィーのような技術を用いて精製することもできる。患者に投与する前に、ポリオウイルスは不活化されなければならず、これは、ホルムアルデヒドでの処理により達成できる。
【０１３３】
灰白髄炎は、３つの型のポリオウイルスのうちの１つにより引き起こされ得る。３つの型は類似しており、同一の症状を引き起こすが、これらは抗原として非常に異なり、１つの型による感染は、その他による感染に対して防御しない。よって、本発明において３つのポリオウイルス抗原：ポリオウイルス１型（例えばＭａｈｏｎｅｙ株）、ポリオウイルス２型（例えばＭＥＦ−１株）およびポリオウイルス３型（例えばＳａｕｋｅｔｔ株）を用いることが好ましい。ウイルスは、好ましくは、個別に成長、精製および不活化され、次いで、組み合わせて、本発明で用いるためのバルクの３価混合物を得る。
【０１３４】
ＩＰＶの量は、典型的に「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」［１０４］）で表される。用量あたりウイルスの型あたり１〜１００ＤＵ、例えば約８０ＤＵの１型ポリオウイルス、約１６ＤＵの２型ポリオウイルスおよび約６４ＤＵの３型ポリオウイルスを用いることが好ましい。
【０１３５】
ポリオウイルス抗原は、好ましくは、本発明の組成物を作製するために用いる前にいかなるアルミニウム塩アジュバントにも吸着されないが、これらは、貯蔵の間にワクチン組成物中のアルミニウムアジュバント（複数可）上に吸着されるようになってよい。
【０１３６】
ジフテリアトキソイド
さらなる抗原は、ジフテリアトキソイド抗原を含むことができる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅは、ジフテリアを引き起こす。ジフテリア毒素を処理して（例えばホルマリンまたはホルムアルデヒドを用いて）、注射後に特異的抗毒素抗体を誘導する能力を保持しながら、毒性を除去できる。これらのジフテリアトキソイドは、ジフテリアワクチンにおいて用いられ、参考文献１０２の第１３章により詳細に開示されている。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されるものである。ジフテリアトキソイドは、Ｃ．ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅを、成長培地（例えばＦｅｎｔｏｎ培地またはＬｉｎｇｇｏｕｄおよびＦｅｎｔｏｎ培地）中（これにウシ抽出物を補充することもできる）で成長させ、その後、ホルムアルデヒド処理、限外ろ過および沈殿を行うことにより得ることができる。トキソイド化した材料は、次いで、滅菌ろ過および／または透析を含むプロセスにより処理することもできる。
【０１３７】
ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １９９９」［１０５、１０６］を供給し、これは、アンプルあたり１６０ＩＵを含有する。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝結単位（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ）」または「限界凝結用量（ｌｉｍｅｓ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」）は、１国際単位の抗毒素と混合した場合に、最適に凝結した混合物を生成するトキソイドの量として定義される［１０７］。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ，Ｐｌａｉｎ」［１０８］を供給し、これは、アンプルあたり３００ＬＦを含有し、「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［１０９］も供給し、これは、アンプルあたり９００ＬＦを含有する。
【０１３８】
組成物は、典型的に、２０〜８０Ｌｆのジフテリアトキソイド、典型的に約５０Ｌｆを含む。
【０１３９】
ＩＵ測定により、組成物は、典型的に、少なくとも３０ＩＵ／用量を含む。
【０１４０】
ジフテリアトキソイドは、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着される。
【０１４１】
破傷風トキソイド
さらなる抗原は、破傷風トキソイド抗原を含むことができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉは、破傷風を引き起こす。破傷風毒素は、防御的トキソイドを得るように処理できる。トキソイドは、破傷風ワクチンにおいて用いられ、参考文献１０２の第２７章により詳細に開示されている。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されたものである。破傷風トキソイドは、Ｃ．ｔｅｔａｎｉを、成長培地（例えばウシカゼインに由来するＬａｔｈａｍ培地）中で成長させ、その後、ホルムアルデヒド処理、限外ろ過および沈殿を行うことにより得ることができる。材料は、次いで、滅菌ろ過および／または透析を含むプロセスにより処理することもできる。
【０１４２】
破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２０００」［１１０、１１１］を供給し、これは、アンプルあたり４６９ＩＵを含有する。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝結単位」または「凝結用量限界」）は、１国際単位の抗毒素と混合した場合に、最適に凝結した混合物を生成するトキソイドの量として定義される［１０７］。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｏｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［１１２］を供給し、これは、アンプルあたり１０００ＬＦを含有する。
【０１４３】
組成物は、典型的に、５〜５０Ｌｆのジフテリアトキソイド、典型的に約２０Ｌｆを含む。
【０１４４】
ＩＵ測定により、組成物は、典型的に少なくとも４０ＩＵ／用量を含む。
【０１４５】
破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着されてよいが、このことは必要でない（例えば全破傷風トキソイドの０〜１０％の吸着を用いることができる）。
【０１４６】
Ａ型肝炎ウイルス抗原
さらなる抗原は、Ａ型肝炎ウイルス抗原を含むことができる。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の作用物質の１つである。ＨＡＶワクチンは、参考文献１０２の第１５章に開示されている。好ましいＨＡＶ成分は、不活化ウイルスに基づき、不活化は、ホルマリン処理により達成できる。ウイルスは、ＭＲＣ−５細胞のようなヒト胚性肺二倍体線維芽細胞上で成長できる。好ましいＨＡＶ株はＨＭ１７５であるが、ＣＲ３２６Ｆも用いることができる。細胞は、ウイルス成長を可能にする条件下で成長できる。細胞を溶解し、得られた懸濁物を、限外ろ過およびゲル透過クロマトグラフィーにより精製できる。
【０１４７】
ＨＡＶ抗原の量は、ＥＵ（Ｅｌｉｓａ単位）において測定して、典型的に、少なくとも約５００ＥＵ／ｍｌである。
【０１４８】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
さらなる抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原を含むことができる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の作用物質の１つである。ＨＢＶビリオンは、外側のタンパク質コートまたはカプシドにより囲まれた内側のコアからなり、ウイルスコアはウイルスＤＮＡゲノムを含有する。カプシドの主要成分は、ＨＢＶ表面抗原またはより一般的に「ＨＢｓＡｇ」として公知のタンパク質であり、これは、典型的に、約２４ｋＤａの分子量を有する２２６アミノ酸のポリペプチドである。全ての既存するＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含有し、この抗原が正常なワクチン被接種者に投与される場合、これは、ＨＢＶ感染に対して防御する抗ＨＢｓＡｇ抗原の生成を刺激する。
【０１４９】
ワクチン製造のために、ＨＢｓＡｇは２つの方式で作製されている。第１の方法は、粒子状の形態の抗原を、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から精製することを含む。なぜなら、大量のＨＢｓＡｇが肝臓で合成され、ＨＢＶ感染の間に血流中に放出されるからである。第２の方式は、タンパク質を組換えＤＮＡ法により発現させることを含む。本発明の方法で用いるためのＨＢｓＡｇは、好ましくは、酵母細胞で組換え発現される。適切な酵母は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはＨａｎｅｎｓｕｌａ（例えばＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主を含む。
【０１５０】
ＨＢｓＡｇは、好ましくは、グリコシル化されていない。天然ＨＢｓＡｇ（すなわち血漿から精製された生成物におけるような）とは異なって、酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、一般的にグリコシル化されておらず、これは、本発明で用いるためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。なぜなら、これは免疫原性が非常に高く、血液生成物汚染の危険性なく調製できるからである。
【０１５１】
ＨＢｓＡｇは、通常、リン脂質を含む脂質マトリクスを含む実質的に球状の粒子の形態である（約２０ｎｍの平均直径）。酵母で発現されたＨＢｓＡｇ粒子は、天然ＨＢＶビリオンでは見出されないホスファチジルイノシトールを含むことがある。粒子は、免疫系を刺激するために非毒性量のＬＰＳも含むこともできる［１１３］。好ましいＨｂｓＡｇは、リン脂質、ホスファチジルイノシトールおよびポリソルベート２０を含む脂質マトリクスを含む粒子の形態にある。
【０１５２】
全ての公知のＨＢＶサブタイプは、共通決定因子「ａ」を含有する。その他の決定因子および副決定因子（ｓｕｂｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と組み合わせて、９つのサブタイプが同定されている：ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−およびａｄｒｑ＋。これらのサブタイプの他に、免疫化された個体で検出されたＨＢＶ変異体（「エスケープ変異体」）のようなその他の変種が出現している。本発明で用いるための最も好ましいＨＢＶサブタイプは、サブタイプａｄｗ２である。
【０１５３】
「Ｓ」配列に加えて、表面抗原は、プレＳ１および／もしくはプレＳ２配列の全体または一部分のようなプレＳ配列の全体または一部分を含むこともできる。
【０１５４】
ＨＢｓＡｇ精製のための好ましい方法は、細胞破壊の後に：限外ろ過；サイズ排除クロマトグラフィー；アニオン交換クロマトグラフィー；超遠心分離；脱塩；および滅菌ろ過を含む。溶解物は、細胞破壊の後に沈殿させ（例えばポリエチレングリコールを用いて）、ＨＢｓＡｇを溶液のままにして、限外ろ過の準備ができるようにしてもよい。
【０１５５】
精製の後に、ＨＢｓＡｇは、透析（例えばシステインとともに）に供してよく、これは、ＨＢｓＡｇ調製の間に用いられた可能性があるチメロサールのようなあらゆる水銀防腐剤を除去するために用いることができる［１１４］。
【０１５６】
ＨＢｓＡｇの量は、典型的にマイクログラムで表され、ワクチン用量あたりのＨＢｓＡｇの典型的な量は、５〜５μｇ、例えば１０μｇ／用量である。
【０１５７】
ＨＢｓＡｇは、最終ワクチンにおいて（周知のＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（商標）製品におけるように）水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されてよいか、または吸着されないままでもよいが、これは、一般的にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される［１１５］。
【０１５８】
結合体化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型抗原
さらなる抗原は、結合体化Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）抗原を含むことができる。Ｈｉｂは、細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは、典型的に莢膜糖抗原に基づき［例えば参考文献１０２の第１４章］、その調製は、よく文書化されている［例えば参考文献１１６〜１２５］。
【０１５９】
Ｈｉｂ糖は、特に小児におけるその免疫原性を増進するために担体タンパク質と結合体化させることができる。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ、血清群Ｂ髄膜炎菌からの外膜タンパク質複合体である。Ｈｉｂ結合体における担体タンパク質は、好ましくは髄膜炎菌結合体（複数可）における担体タンパク質（複数可）とは異なるが、いくつかの実施形態において同じ担体を用いることができる。
【０１６０】
破傷風トキソイドは、「ＰＲＰ−Ｔ」と一般的によばれる製品において用いられるように、好ましい担体である。ＰＲＰ−Ｔは、臭化シアンを用いてＨｉｂ莢膜多糖を活性化し、活性化された糖をアジピン酸リンカー（例えば（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、典型的に塩酸塩）とカップリングさせ、次いで、リンカー−糖の実体を破傷風トキソイド担体タンパク質と反応させることにより作製できる。
【０１６１】
結合体の糖部分は、Ｈｉｂ細菌から調製される全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）および／または全長ＰＲＰのフラグメントを含むこともできる。
【０１６２】
１：５（すなわち過剰のタンパク質）〜５：１（すなわち過剰の糖）の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：２〜５：１の比および１：１．２５〜１：２．５の比を有するＨｉｂ結合体を用いてよい。好ましいワクチンにおいては、しかし、担体タンパク質に対する糖の重量比は、１：２〜１：４、好ましくは１：２．５〜１：３．５である。破傷風トキソイドが抗原および担体タンパク質の両方として存在するワクチンにおいて、結合体中の担体タンパク質に対する糖の重量比は、１：０．３〜１：２であってよい［１２６］。
【０１６３】
Ｈｉｂ結合体の量は、通常、担体の選択による変動を回避するために、糖の質量で示される（すなわち、結合体（担体＋糖）全体の用量は、述べられる用量よりも多い）。用量あたりのＨｉｂ糖の典型的な量は、１〜３０μｇ、好ましくは約１０μｇである。
【０１６４】
Ｈｉｂ結合体の投与は、好ましくは、≧０．１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは≧１μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらし、これらは、標準的な応答閾値である。
【０１６５】
Ｈｉｂ結合体は、本発明に従ってそれらを用いる前に凍結乾燥されてよい。さらなる成分、例えば安定化剤を凍結乾燥する前に加えてもよい。含めるために好ましい安定化剤は、ラクトース、スクロースおよびマンニトール、ならびにそれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などである。最終ワクチンは、よって、ラクトースおよび／またはスクロースを含有することもできる。スクロース／マンニトール混合物を用いることにより、乾燥プロセスを速めることができる。
【０１６６】
Ｈｉｂ結合体は、アルミニウム塩アジュバントに吸着されても、吸着されなくてもよい。それらを水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させないことが好ましい。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドおよびポリマーとＭｅｎＢ抗原との混合
本発明の免疫原性組成物は、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体の水性懸濁物を抗原と混合することにより簡便に調製できる。複合体は、典型的に液体の形態で維持されるので、それらを共に処方する簡単な方式を提供する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、一方または両方の懸濁物は、混合が本発明の免疫原性組成物を提供するように免疫原を含む。
【０１６９】
２つの液体を混合する場合、混合のための容量比は、変動できる（例えば２０：１〜１：２０、１０：１〜１：１０、５：１〜１：５、２：１〜１：２など）が、理想的に約１：１である。２つの懸濁物中の成分の濃度は、混合の後に所望の最終濃度が達成されるように選択でき、例えば、１：１の混合により最終の所望の濃度が提供されるように両方を２×強度で調製することもできる。
【０１７０】
様々な濃度、例えば参考文献５８、６１、６２または１２７で用いられる濃度のいずれかのオリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを用いることができる。例えば、ポリカチオン性オリゴペプチドは、１１００μＭ、１０００μＭ、３５０μＭ、２２０μＭ、２００μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、１１μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭなどで存在できる。オリゴヌクレオチドは、４４ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１４ｎＭ、４．４ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭなどで存在できる。２０００ｎＭ未満のポリカチオン性オリゴペプチド濃度が典型的である。１：２５のモル比で混合される配列番号１および２について、本発明の３つの実施形態におけるｍｇ／ｍＬでの濃度は、よって、０．３１１と１．３２２、または０．１０９と０．４６３、または０．０３１と０．１３２であってよい。
【０１７１】
本発明のいくつかの免疫原性組成物は、アルミニウム塩と、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体とを含む。このような組成物において、アルミニウム塩と、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体とは、典型的にともに粒子状である。アルミニウム塩アジュバントの平均粒子径は、典型的に１〜２０μｍ程度である［６６、１２８］。これは、ＩＣ３１（商標）で見られる複合体についてのサイズ範囲でもある。このような粒子を組み合わせる場合、塩粒子の平均直径は、複合体の平均直径と実質的に同じであってよい。他の実施形態において、しかし、塩粒子の平均直径は、複合体の平均サイズよりも小さくてよい。他の実施形態において、塩粒子の平均直径は、複合体の平均サイズよりも大きくてよい。平均直径が異なる場合、より大きい直径は、少なくとも１．０５×、例えば１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、２×、２．５×、３×またはそれより大きい係数だけ大きくてよい。塩または複合体のいずれかが、ある範囲の直径を有する粒子を有するが、平均直径が異なるならば、それらの範囲は重複しても重複しなくてもよい。よって、最大の塩の粒子は、最小の複合体粒子よりも小さいか、または最大の複合体粒子は、最小の塩の粒子よりも小さくてよい。
【０１７２】
粒子は、一般的に滅菌ろ過するには大きすぎるので、本発明の免疫原性組成物の無菌性は、複合体と適当であればアルミニウム塩とを、滅菌条件下で調製し、次いで、それらを滅菌条件下で混合することにより典型的に達成される。例えば、複合体の成分は、滅菌ろ過できる。いくつかの実施形態において、これらの滅菌複合体を、次いで、オートクレーブした（滅菌）アルミニウム塩アジュバントと混合して、滅菌アジュバント組成物を得ることができる。この滅菌アジュバントを、次いで、滅菌免疫原と混合して、患者への投与のために適切な免疫原性組成物を得ることができる。
【０１７３】
アルミニウム塩粒子の密度は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの複合体の密度と典型的に異なり、このことは、２つの粒子を、密度、例えばスクロース勾配により分離できることを意味する。
【０１７４】
薬学的組成物
本発明の免疫原性組成物は、ＭｅｎＢ抗原とオリゴヌクレオチドおよびポリマーとに加えて、通常、成分を含み、例えば、これらは、１または複数の薬学的に許容される成分を典型的に含む。このような成分は、アジュバント組成物または別の組成物のいずれかを起源として、本発明の免疫原性組成物に存在してもよい。このような成分についての徹底的な議論は、参考文献１２９において入手可能である。
【０１７５】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような防腐剤を含むこともできる。ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（例えば＜１０μｇ／ｍｌ）、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい。水銀を含有しないワクチンは、より好ましい。防腐剤を含まないワクチンは、特に好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチン中に水銀化合物の代替として含めることができる。
【０１７６】
張度を制御するために、組成物は、ナトリウム塩のような生理的な塩を含むこともできる。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在し得るその他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムおよび／または塩化マグネシウムなどを含む。
【０１７７】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ（２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｍｇまたは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であってよい）の重量オスモル濃度を有してもよい。
【０１７８】
組成物のｐＨは、一般的に５．０〜８．１であり、より典型的に６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５または７．０〜７．８である。
【０１７９】
組成物は、好ましくは無菌性である。例えば用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的尺度）、好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含有する組成物は、好ましくは、非発熱性である。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【０１８０】
免疫原性組成物は、単回免疫化のための材料を含むこともでき、または多回免疫化のための材料を含むこともできる（すなわち「多回用量」キット）。多回用量の構成において、防腐剤を含むことが有用である。多回用量組成物において防腐剤を含む代替として（または追加で）、組成物は、材料の取り出すための無菌アダプタを有する容器中に含まれることがある。
【０１８１】
組成物は、一般的に投与の時点で水性の形態にある。ワクチンは、典型的に約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）は、時折、例えば小児に投与されることがある。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、より高い用量、例えば約１ｍｌで、例えば２つの０．５ｍｌ容量を混合した後に投与されることがある。
【０１８２】
組成物またはキット成分の包装
本発明の免疫原性組成物およびキット成分のために適切な容器は、バイアル、シリンジ（例えばディスポーザブルシリンジ）などを含む。これらの容器は、無菌でなければならない。容器を一緒に包装して、例えば同じ箱の中でキットを形成できる。
【０１８３】
成分がバイアル中にある場合、バイアルは、ガラスまたはプラスチック材料で作製できる。バイアルは、好ましくは、組成物をそこに加える前に滅菌される。ラテックス感受性の被験体に関する問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーで密閉され、全ての包装材料においてラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、単回用量のワクチンを含むこともでき、またはこれは１回より多い用量（「多回用量バイアル」）、例えば１０回用量を含むこともできる。有用なバイアルは、無色のガラスで作製される。ホウケイ酸ガラスが、ソーダ石灰ガラスよりも好ましい。バイアルは、ブチルゴムで作製されたストッパーを有してもよい。
【０１８４】
バイアルは、シリンジをキャップの中に挿入できるように適合されたキャップ（例えばルアーロック）を有することができる。バイアルキャップは、シールまたはカバーの内部にあり得、キャップにアクセスできる前にシールまたはカバーが除去されなければならない。バイアルは、特に多回用量バイアルについて、その内容物を無菌的に取り出すことを可能にするキャップを有してもよい。
【０１８５】
成分がシリンジ中に包装される場合、シリンジは、それに取り付けられた針を有してもよい。針が取り付けられていない場合、別個の針を、組み立てて使用するためにシリンジとともに供給することもできる。このような針は、鞘に入っていてもよい。シリンジのプランジャーは、吸引中にプランジャーが偶発的に外れることを防止するためにストッパーを有してもよい。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有してもよい。ディスポーザブルシリンジは、単回用量のワクチンを含有する。シリンジは、一般的に針の取り付け前に先端部を密閉するための先端部キャップを有し、先端部キャップは、ブチルゴムで作製されてよい。シリンジおよび針が別個に包装されているならば、針は、好ましくは、ブチルゴムの遮蔽物が装着される。有用なシリンジは、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ（商標）」の商標の下で市販されている。
【０１８６】
容器は、例えば小児への送達を容易にするために、半用量の容量を示すように印がつけられていてよい。例えば、０．５ｍｌ用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌ容量を示す印を有してもよい。
【０１８７】
複数成分の製品において、被験体への投与に必要とされる材料よりも多い材料を含み、材料の移動におけるいずれの非効率性にもかかわらず完全な最終用量の容量が得られるようにすることが通常である。よって、個別の容器は、例えば５〜２０容量％、過剰に充填されていてもよい。
【０１８８】
処置の方法および免疫原性組成物の投与
本発明の組成物は、ヒト被験体への投与のために適切であり、本発明は、本発明の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体における免疫応答を高める方法を提供する。
【０１８９】
本発明は、本発明のキットの容器の内容物を混合するステップと、混合された内容物を被験体に投与するステップとを含む、被験体における免疫応答を高める方法も提供する。
【０１９０】
本発明は、医薬品として用いるため、例えば被験体における免疫応答を高めることにおいて用いるための本発明の組成物またはキットも提供する。
【０１９１】
本発明は、被験体における免疫応答を高めるための医薬品の製造における、ＭｅｎＢ抗原（上で定義されるとおり）、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性ポリマーの使用も提供する。
【０１９２】
これらの方法および使用は、概して、抗体応答、好ましくは防御抗体応答を生成させるために用いられる。
【０１９３】
本発明の免疫原性組成物は、様々な方式で投与できる。通常の免疫化経路は、筋肉内注射（例えば腕または脚への）によるが、その他の利用可能な経路は、皮下注射、鼻内、経口、頬側、舌下、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）などを含む。
【０１９４】
本発明に従って調製される免疫原性組成物は、小児および成人の両方を処置するためのワクチンとして用いてよい。被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であってよい。ワクチンを受容する被験体は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳および好ましくは≧６５歳）、若年者（例えば≦５歳）、入院している被験体、健康管理従事者、軍人および軍関係者、妊娠している女性、慢性に疾病を有する人、免疫不全被験体、外国に旅行する人などであってよい。アルミニウム塩アジュバントは、乳児集団において日常的に用いられ、ＩＣ３１（商標）は、この年齢群においても有効である［１２７、１３０］。しかし、ワクチンは、これらの群だけに適切なわけではなく、集団においてより一般的に用いてよい。
【０１９５】
処置は、単回用量計画または多回用量計画によることができる。多回用量は、一次免疫化計画および／または追加免疫化計画で用い得る。多回用量計画において、様々な用量を、同じまたは異なる経路、例えば非経口の初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回刺激および非経口の追加刺激などにより与えてよい。１回より多い用量（典型的に２回用量）の投与は、免疫学的にナイーブな被験体において特に有用である。多回用量は、典型的に、少なくとも１週間（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与される。
【０１９６】
全般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または何か追加のものを含み得る（例えばＸ＋Ｙ）。
【０１９７】
「実質的に」との語は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことがある。必要であれば、「実質的に」との語を、本発明の定義から省くことができる。
【０１９８】
数値ｘに関する用語「約」は、任意選択であり、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１９９】
特に明記しない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合のいずれの特定の順序も必要としない。よって、成分は、任意の順序で混合できる。３つの成分がある場合、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次いでこの組み合わせを第３成分と組み合わせてよい、などである。
【０２００】
動物（特にウシ）材料を細胞の培養において用いる場合、これらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まず、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られなければならない。全体的に、細胞を、動物由来材料の完全な非存在下で培養することが好ましい。
【０２０１】
化合物を、組成物の一部として身体に投与する場合、その化合物は、適切なプロドラッグで代わりに置き換えてよい。
【０２０２】
細胞基質を再集合もしくは逆遺伝学の手順のため、またはウイルス成長のために用いる場合、これは、好ましくは、例えばＰｈ  Ｅｕｒ総則第５．２．３章にあるようなヒトワクチン生成における使用のために承認されたものである。
【発明を実施するための形態】
【０２０３】
アジュバント
ＩＣ３１複合体を、参考文献６２に開示されるようにして調製した。水酸化アルミニウムアジュバント懸濁物を、標準的な方法により調製する。組成物が水酸化アルミニウムアジュバントとＩＣ３１とを含む場合、アジュバントの組み合わせを、水酸化アルミニウムアジュバントをＩＣ３１複合体と混合することにより作製した。
【０２０４】
以下の髄膜炎菌（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のために、参考文献６２に開示されるようにして高濃度および低濃度（１０倍の違い）でＩＣ３１を調製し、そして水中スクアレンエマルジョンを調製した。髄膜炎菌（ｉｖ）のために、参考文献６５の第１０章に開示されるようにしてＭＦ５９を調製した。アジュバントの組み合わせを、ＭＦ５９をＩＣ３１ｈｉｇｈまたはＩＣ３１ｌｏｗと１：１容量比または５：１容量比のいずれかで混合することにより作製した。
【０２０５】
髄膜炎菌（ｉ）
参考文献１に開示される「５ＣＶＭＢ」ワクチンを構成する３つのポリペプチドに、水酸化アルミニウムおよび／またはＩＣ３１をアジュバント添加した。ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する（参考文献１および１３１を参照されたい）。
【０２０６】
第１組の実験において、９群のマウスに１０μｇの抗原、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび様々な用量のＩＣ３１を与えた。群に以下の９つの組成物を与え、群７〜９に１〜６と同じであるが異なって処方した抗原を与えた。
【０２０７】
【表１】
2013522287.tif 000002
マウスからの血清を、殺菌活性について髄膜炎菌株のパネルに対して試験した。
【０２０８】
実験ＭＰ０３からの殺菌性力価は、６つの異なる株Ａ〜Ｆに対して、以下のとおりであった：
【０２０９】
【表２】
2013522287.tif 000003
よって、唯一のアジュバントとしてＡｌ−Ｈを用いて得られた力価（群５）は、様々な比でＩＣ３１を加えることにより（群１〜４）パネルにわたって全般的に改善された。同じ効果は、異なる抗原処方を用いて見られた（群７および８を比較されたい）。
【０２１０】
さらに、ＩＣ３１を唯一のアジュバントとして用いた場合（群６および９）、殺菌性力価は、６つ全ての株において高い、またはＡｌ−ＨおよびＩＣ３１＋Ａｌ−Ｈよりも高いことが見出された。
【０２１１】
９つの組成物を、ｐＨおよび重量オスモル濃度について試験した。組成物１〜５、７および８について、ｐＨは６．２〜６．６の範囲にあった。組成物６および９は、わずかにより高いｐＨを６．９〜７．３の範囲に有した。全ての組成物の重量オスモル濃度は、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にあった。
【０２１２】
髄膜炎菌（ｉｉ）
ｆＨＢＰの３つの変種をＩＩ−ＩＩＩ−Ｉの順序で含有する３重融合ポリペプチド（参考文献６０に開示されるとおり；本明細書において配列番号１７）に、水酸化アルミニウムおよび／またはＩＣ３１をアジュバント添加した。
【０２１３】
第１組の実験において、６群のマウスに２０μｇの抗原（精製タグありまたはなし）、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび１００μｌのＩＣ３１を与えた。群に、以下のものを与えた：
【０２１４】
【表３】
2013522287.tif 000004
マウスからの血清を、殺菌性活性について髄膜炎菌株のパネルに対して試験した。
【０２１５】
実験ＭＰ０５からの血清を、株のパネルに対して再び試験した（合計２５）。群１（ＩＣ３１、タグなし）および群３（ＩＣ３１＋Ａｌ−Ｈ、タグなし）の株の５６％は、≧１：１０２４の力価を有したが、群５（Ａｌ−ＯＨ、タグなし）の株の３６％だけが≧１：１０２４の力価を有した。同様に、群１および３の株の７６％は、≧１：１２８の力価を有したが、この力価は、群５の株の６４％でのみ観察された。よって、精製タグの非存在下では、最高の殺菌性力価は、ＩＣ３１を用いて達成された。
【０２１６】
精製タグ付加抗原の殺菌性力価比較により、群２（ＩＣ３１、タグ）の株の８４％が≧１：１２８の力価を有したことが明らかになった。これとは対照的に、群４（ＩＣ３１＋Ａｌ−Ｈ）の株の８０％および群６（Ａｌ−ＯＨ）の株の７６％だけが≧１：１２８の力価を有した。よって、精製タグの存在下では、最高の殺菌性力価は、ＩＣ３１単独を用いて達成された。
【０２１７】
タグを含まない組成（１、３および５）を、ｐＨおよび重量オスモル濃度について試験した。ｐＨは、６．８７〜７．００の範囲であった。重量オスモル濃度は、３０２ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３０８ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であった。
【０２１８】
さらなる免疫原性実験は、ｆＨＢＰＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ抗原を、ＮａｄＡおよび２８７−９５３抗原（配列番号１３および１５）との組み合わせで実験ＭＰ０４において、同じ群分けおよび株パネルで用いた。群１および３は、群５におけるほんの８４％と比較して、試験した株の１００％において≧１：１２８の殺菌性力価を有した。≧１：１０２４のより厳しい閾値では、群１および３からの血清は、群５のほんの５６％と比較して、株の８８％に対して殺菌性であった。
【０２１９】
同様の結果が精製タグ付加抗原を用いて観察され、群２および４の８８％が、群６のほんの８０％と比較して、≧１：１２８の殺菌性力価を有した。
【０２２０】
よって、最高の抗髄膜炎菌免疫応答は、ＩＣ３１単独を用いて得られ、これは、少なくとも、ＩＣ３１＋Ａｌ−Ｈと同様に良好であり、Ａｌ−Ｈ単独よりも良好であった。
【０２２１】
髄膜炎菌（ｉｉｉ）
参考文献１に開示される「５ＣＶＭＢ」ワクチンを構成する３つのポリペプチドを、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する髄膜炎菌結合体の４価混合物と組み合わせた。混合物に、Ａｌ−Ｈおよび／またはＩＣ３１（高濃度または低濃度にて）をアジュバント添加した。殺菌性力価は、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのそれぞれからの１つの株を含むパネルに対して、以下のとおりであった：
【０２２２】
【表４】
2013522287.tif 000005
よって、血清群Ａに対する最良の力価は、ＩＣ３１単独を用いた場合に見られ、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する力価は、Ａｌ−Ｈ単独を用いた場合よりも高かった。
【０２２３】
髄膜炎菌（ｉｖ）
参考文献１の髄膜炎菌血清群Ｂワクチンからの抗原に、ＭＦ５９、ＩＣ３１ｈｉｇｈ、ＩＣ３１ｌｏｗまたはそれらの組み合わせをアジュバント添加した。免疫化したマウスからの血清を、様々な髄膜炎菌株に対するそれらの殺菌活性について試験した。代表的な結果は、以下を含む：
【０２２４】
【表５】
2013522287.tif 000006
ＩＣ３１単独の使用は、株Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦにおいて最高の殺菌性力価を、そして株Ａ、ＣおよびＧにおいて２番目に高い力価を惹起した。
【０２２５】
これらの髄膜炎菌Ｂタンパク質抗原は、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ抗原からの結合体化糖抗原とも組み合わせ、同じアジュバント混合物を用いて試験した。各血清群からの試験株に対する殺菌性力価は、以下のとおりであった：
【０２２６】
【表６】
2013522287.tif 000007
よって、最高の殺菌性力価は、ＩＣ３１を血清群Ａ、ＣおよびＷ１３５について用いた場合に見られた。
【０２２７】
髄膜炎菌（ｖ）
ｆＨＢＰの３つの変種（ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉの順序）＋９６１＋２８７−９５３を含有する組成物（ｒＭｅｎＢ１と称する）に、Ａｌ−Ｈ、ＩＣ３１またはＩＣ３１＋Ａｌ−Ｈをアジュバント添加した。これらの組成物を、Ａｌ−Ｈをアジュバント添加した９３６−７４１＋９６１＋２８７−９５３＋ＯＭＶを含む組成物（ｒＭｅｎＢ２）と比較した。
【０２２８】
免疫化したマウスからの血清を、１２の髄膜炎菌株に対するそれらの殺菌性活性について試験した。ＩＣ３１単独をアジュバント添加したｒＭｅｎＢ１は、いずれのその他の組成物よりも、試験した１２の株にわたってより高い％の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を惹起したことが見出された（例えばｒＭｅｎＢ２についての５０％の適用範囲と比較して＞９０％の適用範囲）。
【０２２９】
本発明は、例としてのみ記載され、本発明の範囲および精神内に留まったまま改変を行うことができることが理解される。
【０２３０】
参考文献
【０２３１】
【化１】
2013522287.tif 000008
【０２３２】
【化２】
2013522287.tif 000009
【０２３３】
【化３】
2013522287.tif 000010
【０２３４】
【化４】
2013522287.tif 000011
【配列表】
2013522287000001.app
【国際調査報告】
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2013522287.tif 000014
2013522287.tif 000015
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