(57)【要約】  本発明は、化学療法剤に対する白血病罹患個体の応答性を予測するための方法に関する。特に、本方法は、その個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定することを含む。本発明は、また、予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する白血病罹患個体の処置用の使用のためのチロシンキナーゼ阻害剤に関する。本発明は、また、個体が白血病を患っているか、または患う危険があるかどうかを診断するための方法に関する。
2013522613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法剤に対する白血病罹患個体の応答性を予測するための方法であって、該個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定することを含む方法。
【請求項２】
予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞が、個体が化学療法剤に応答する可能性が低いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも５０％の比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞が、個体が化学療法剤に応答する可能性が低いことを示す、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
化学療法剤が、アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、生物学的応答調節剤およびコルチコステロイドから成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
化学療法剤が、チロシンキナーゼ阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
化学療法剤が、メシル酸イマチニブまたはドキソルビシンである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
白血病が骨髄性白血病である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
白血病が、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病から成る群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
処置方式を計画するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定するステップが、少なくとも二つの異なる時点で繰り返される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する白血病罹患個体の処置用の使用のための化学療法剤。
【請求項１２】
個体が、最大で５０％の比率の細胞質ＤＮＡ発現白血病細胞を有する、請求項１１記載の化学療法剤。
【請求項１３】
化学療法剤が、メシル酸イマチニブまたはドキソルビシンである、請求項１１または１２記載の化学療法剤。
【請求項１４】
白血病が骨髄性白血病である、請求項１１〜１３のいずれか一項記載の化学療法剤。
【請求項１５】
予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する白血病罹患個体の処置用の使用のための、化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せ。
【請求項１６】
個体が、少なくとも５０％の比率の細胞質ＤＮＡ発現白血病細胞を有する、請求項１５記載の使用のための組合せ。
【請求項１７】
細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストが、ＰＣＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡ、ＰＣＮＡをターゲティングするｓｈＲＮａ、および配列番号：２の残基１４１〜１６０を含むｐ２１フラグメントから成る群より選択される、請求項１５または１６記載の使用のための組合せ。
【請求項１８】
化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せを含む治療法で処置されるために適する白血病罹患患者を選択するためのin vitro方法であって：
ａ）白血病細胞を含む生体試料を提供または入手するステップ；
ｂ）該生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定するステップ；および
ｃ）該患者が予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する場合に該患者を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
患者が、５０％よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する場合に、ステップ（ｃ）が、該患者を選択することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストが、ＰＣＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡ、ＰＣＮＡをターゲティングするｓｈＲＮａ、および配列番号：２の残基１４１〜１６０を含むｐ２１フラグメントから成る群より選択される、請求項１８または１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学療法剤に対する白血病罹患個体の応答性を予測するための方法に関する。特に、本方法は、その個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定することを含む。本発明は、また、予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する白血病罹患個体の処置用の使用のためのチロシンキナーゼ阻害剤に関する。本発明は、また、白血病を個体が患っているか、または患う危険が個体にあるかどうかを診断するための方法に関する。
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では、分化の多少進行した段階で遮断された未熟芽球系前駆細胞の蓄積を観察することができる。これらの細胞は分化せず、アポトーシス耐性である。正常な核型に関連する形態のＡＭＬについて、利用可能な非特異療法（例えばアントラサイクリンおよびシタラビン）が成功する確率がわずか５０％であることから、ＡＭＬ罹患患者の予後はかなり重篤である。ＡＭＬの際に、白血病細胞が増殖上の利点および一つまたは複数のアポトーシス経路に欠点を有することが実証された。アポトーシスにおけるこの欠点は、処置に対する耐性および患者の低い生存率に関連することが多い。
【０００３】
現在まで、ＡＭＬ罹患患者についてアポトーシス耐性をトリガーする処置の予後マーカーは存在せず、予後は重篤なままである。
【０００４】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、骨髄系列に属する循環細胞の増殖を特徴とする緩徐進行性のガンである。それらは、フィラデルフィア染色体の存在および構成性内因性キナーゼ活性を有するＢｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質の発現を特徴とする。メシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標）として市販されている）は、このキナーゼを特異的にターゲティングし、薬物としてうまく使用されている。しかしながら、メシル酸イマチニブ処置に対する耐性は、症例の５％〜１０％に発生するおそれがある。加えて、この処置の排除が再発につながることから、その処置は患者の１０％未満しか治癒できない。この耐性の基礎をなす分子メカニズムは、分かっていないが、白血病幹細胞の亜集団の内因性性質に関係する可能性がある。
【０００５】
したがって、ＣＭＬを患う患者のためにメシル酸イマチニブ処置耐性の予後マーカーを見出す必要がある。
【０００６】
ＰＣＮＡおよびアポトーシス調節
ＰＣＮＡは、ＤＮＡ複製に重要な役割を有する核タンパク質であって、増殖途中の細胞だけを修復すると長い間考えられてきた。
【０００７】
いくつかの研究から、骨髄芽細胞でのＰＣＮＡのより高い発現が脊髄形成異常症候群（Kracmarova et al. Leuk Lymphoma 2008; 49:1297-1305）および再発急性骨髄性白血病（Staber et al. Oncogene 2004; 23:894-904）における芽球の蓄積と相関することが実証されている。慢性骨髄性白血病では、ＰＣＮＡがアップレギュレーションされることが示され（Bruchova et al. Leuk Lymphoma 2002; 43:1289-1295）、低分子干渉ＲＮＡによるＰＣＮＡ発現のサイレンシングが白血病細胞のアポトーシス増加および増殖低下につながることが実証された（Merkerova et al. Leuk Res. 2007; 31:661-672）。
【０００８】
しかしながら、抗白血病処置に対する応答性のマーカーとしてのＰＣＮＡの潜在的使用は、検討されていない。加えて、白血病罹患患者からの細胞中のＰＣＮＡの細胞局在も検討されていない。
【０００９】
本発明者らは、最近、好中球ではミエロイド分化時に起こる再局在化のせいで、ＰＣＮＡが細胞質のみに局在することを示した。さらに本発明者らは、好中球ではサイトソルＰＣＮＡレベルが細胞生存率と平行して変化することを示した。より具体的には、サイトソルＰＣＮＡレベルは、アポトーシス時に減少し、生存因子Ｇ−ＣＳＦへのin vitroまたはin vivo曝露時に増加する。したがって、細胞質ＰＣＮＡは、好中球の寿命の細胞周期非依存性レギュレーターとして作用する。加えて本発明者らは、健常人においてＰＣＮＡが顆粒球分化前の骨髄系前駆細胞では核性であり、分化の終了時の成熟好中球では細胞質性のみになることを示した。そのうえ、核−細胞質輸送は一連の核外移行に依存する。
【００１０】
本発明者らは、健康対象から単離された骨髄前骨髄球から観察されたものとは対照的に、骨髄性白血病罹患患者の骨髄から単離された前骨髄球から細胞質ＰＣＮＡを検出できることを今回予想外に見出した。言い換えると、ＰＣＮＡの異所性局在がＡＭＬ罹患患者から観察される。
【００１１】
より具体的には、骨髄性白血病細胞系（例えばＵＴ７、ＨＬ６０）では、ＰＣＮＡが細胞質中に発現している。さらに、処置に耐性の骨髄性白血病細胞系（例えばドキソルビシン耐性ＵＴ７）では、感受性細胞系に比べて細胞質ＰＣＮＡレベルが増加している。ＡＭＬ罹患患者から単離された細胞では、いくつかの骨髄系前駆細胞が細胞質ＰＣＮＡを示し、一方で正常骨髄からの前駆細胞は、核ＰＣＮＡだけを担持する。
【００１２】
Ｋ５６２細胞系は、ＣＭＬ由来であって、フィラデルフィア染色体の存在およびＢｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質の発現を特徴とする。本発明者らは、ドキソルビシンおよびメシル酸イマチニブ耐性のこの細胞系で、細胞質ＰＣＮＡの発現が増加していたことを示した。Ｂｃｒ−Ａｂｌを安定トランスフェクションされた骨髄性細胞系ＵＴ７−９から同様の観察が行われた。したがって、ＰＣＮＡは、ＣＭＬにおけるメシル酸イマチニブ耐性の予後マーカーと見なすことができる。
【００１３】
このように本発明者らは、細胞質ＰＣＮＡが骨髄性白血病細胞におけるアポトーシス感受性の低下および薬物耐性の増加と関連するという証拠を提供した。したがって、ＡＭＬの場合、細胞質ＰＣＮＡは、移植に向けた決断を行うことを助けうる、処置に対する応答性の予後マーカーと見なすことができる。患者が化学療法による処置に応答する可能性が高い場合（低レベルの細胞質ＰＣＮＡ）、その患者に当該処置を施すことができる。逆に、患者が化学療法による処置に応答する可能性が低い場合（高レベルの細胞質ＰＣＮＡ）、その患者は移植を必要とするおそれがある。
【００１４】
化学療法剤に対する患者の応答性を予測するための方法
本発明は、化学療法剤に対する白血病罹患個体の応答性を予測するための方法であって、その個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率を決定することを含む方法に関する。
【００１５】
本明細書にわたり使用される「ＰＣＮＡ」という用語は、ヒト増殖性細胞核抗原タンパク質を表す。好ましい一態様では、「ＰＣＮＡ」は、配列番号：１の配列のタンパク質を表す。しかしながらこの用語は、また、配列番号：１のタンパク質のアレル変異体およびスプライス変異体を包含する。本発明の枠内で、ＰＣＮＡタンパク質は、細胞質ＰＣＮＡ、最も好ましくは骨髄芽球または前骨髄球中に見出される細胞質ＰＣＮＡである。
【００１６】
本明細書に使用される「白血病」という用語は、骨髄、循環白血球、ならびに脾臓およびリンパ節などの器官に波及する白血球のガンを表す。本明細書に使用されるように、この用語は、急性白血病（主に未熟な低分化細胞、通常は芽球形態から成る）、慢性白血病（より成熟した細胞を伴う）、および骨髄異形成症候群の全てを包含する。
【００１７】
白血病はどの種類の血球が冒されるかに応じて二つの群に細分類することができる。リンパ球性白血病は、リンパ系列に属する白血病細胞を伴い、一方で骨髄性白血病は、骨髄系列に属する白血病細胞を伴う。好ましくは、本発明による白血病は、骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病である。
【００１８】
白血病では、白血球（white blood cell）（leukocyteとも呼ばれる）は、正常なコントロールの消失により成長および増殖の調節不全ならびに分化の欠如を示す。そのような細胞は、「白血病細胞」と呼ばれる。白血病細胞は、骨髄芽球、前骨髄球および前単球などの骨髄系列前駆細胞（顆粒球、単球および樹状細胞に分化する）、またはリンパ芽球および前リンパ球などのリンパ系列前駆細胞（リンパ球、ナチュラルキラーおよび樹状細胞に分化する）である。好ましくは、「白血病細胞」という表現は、骨髄芽球または前骨髄球を表す。
【００１９】
白血病は、当業者に周知の異なる種類の処置で処置することができ、その中に化学療法が含まれる。化学療法は、「化学療法剤」と呼ばれる生化学剤（例えば化学分子、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド他）の使用に基づく処置である。例えば白血病の処置などの、ガンの処置に使用されるそのような化学療法剤には、例えば、アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗薬（例えばヌクレオシドアナログ）、抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、生物学的応答調節剤（ＩＦＮ）およびコルチコステロイドから成る群より選択される抗悪性腫瘍薬が含まれる。
【００２０】
特に、骨髄性白血病の処置に通常使用される化学療法剤には、ビンクリスチンなどのアルカロイド、ブスルファンなどのアルキル化剤、シタラビン、６−チオグアニンおよびヒドロキシウレアなどの代謝拮抗薬、ダウノルビシンおよびイダルビシンなどの抗生物質、メシル酸イマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、エトポシドおよびドキソルビシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ゲムツズマブ−オゾガマイシンなどのモノクローナル抗体ならびにＩＦＮ−αなどの生物学的応答調節剤が含まれる。
【００２１】
抗白血病化学療法に使用される薬物は、白血病の種類に応じて様々な可能性がある。特に、急性骨髄性白血病の場合に使用される化学療法剤には、例えば寛解導入療法としてのシタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、６−チオグアニン、エトポシド、および再発した場合のゲムツズマブ−オゾガマイシン（細胞傷害剤と結合されたリコンビナントモノクローナル抗体）が含まれる。
【００２２】
これと対照的に、慢性骨髄性白血病の場合に使用される化学療法剤には、例えば、第一選択処置としてのメシル酸イマチニブ、ならびにＡＢＬ−ＢＣＲ−陰性患者、メシル酸イマチニブ投与後に再発した患者、および／または急性転化を起こした患者の場合の、ダサチニブおよびニロチニブなどの他のキナーゼ阻害剤が含まれる。いずれにせよ、これらの処置に、同種骨髄移植が続く場合がある。
【００２３】
好ましい態様では、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である。「チロシンキナーゼ阻害剤」によって、リン酸基をＡＴＰからタンパク質中のチロシン残基に転移する酵素の生体活性を阻害することのできる分子が意味される。「トポイソメラーゼ阻害剤」によって、ＤＮＡ鎖のホスホジエステル主鎖の切断および再結合を触媒することによって、ＤＮＡ構造の変化をコントロールする酵素の生体活性を阻害することのできる分子が意味される。
【００２４】
別の好ましい態様では、本発明の化学療法剤は、メシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標）もしくはGlivec（登録商標）として市販されている）またはドキソルビシン（Myocet（登録商標）として市販されている）である。
【００２５】
実施例３に示すように、多量の細胞質ＰＣＮＡの存在は、骨髄性白血病細胞における薬物耐性に関連する。したがって、細胞質ＰＣＮＡは、薬物に対する患者の応答性を予測するためのマーカーとして使用することができる。
【００２６】
薬物に対する患者の「応答性を予測する」によって、異常な臨床的特徴の消散または改善の可能性を評価することが意味される。例えば、薬物に応答する白血病罹患患者において、その患者の応答がその薬物に応答する場合、正常血球数および正常な造血の回復（例えば＜５％の芽細胞）を観察することができ、白血病クローンを除去することができる。より具体的には、薬物に対する患者の「応答性を予測する」には、該薬物を用いた処置を受けてその患者が完全寛解、部分寛解、再発の危険が高いもしくは低い寛解を経る可能性が高いかどうか、または該処置が異常な臨床的特徴および／もしくは疾患の進展に顕著な効果を有さないかどうかを予測することが含まれる。
【００２７】
より正確には、本発明は、個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率の決定に基づく方法に関する。細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の「比率を決定する」によって、細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の数および核ＰＣＮＡだけを発現している白血病細胞の数を計数すること、ならびに全白血病細胞に対する細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比を計算することが意味される。細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の数の計数は、当業者に周知の様々な方法によって行うことができる。例えばそれは、免疫細胞化学法（実施例１参照）、ウエスタンブロット、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって行うことができる。
【００２８】
好ましい一態様では、予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞は、その個体が化学療法剤に応答する可能性が低いことを示す。「予め決められた閾値」という用語は、化学療法剤に対して良好な応答を示す白血病罹患個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の平均比率を表す。
【００２９】
より好ましくは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％または６０％の比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞は、その個体が化学療法剤に応答する可能性が低いことを示す。より好ましくは、少なくとも５０％の比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞は、その個体が化学療法剤に応答する可能性が低いことを示す。なおより好ましくは、少なくとも７０％、８０％または９０％の比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞は、その個体が化学療法剤に応答する可能性が低いことを示す。
【００３０】
患者の年齢、診断および病期に応じて、白血病罹患患者は、異なる手段によって処置される可能性がある。白血病のための一次処置は、ほとんど常に化学療法を伴う。しかしながらその代わりに、骨髄移植が、ことによると高用量化学療法および／または高線量放射線と組合せて行われることがある。例えば、より進行した、もしくはコントロール不能の病状に達した場合、または患者が化学療法に応答しないか、もしくは化学療法を耐容できない場合、骨髄移植が必要となりうる。しかしながら骨髄移植は、患者がこの手技のため死亡するおそれがあることから依然として有害であり、適合性のドナーを見つける必要がある。したがって骨髄移植は、一般に、患者が化学療法に応答しない場合にのみ行われる。
【００３１】
本発明による方法は、化学療法に対する患者の応答性を予測可能にし、したがって処置方式を計画することを助ける。特に、患者が化学療法に応答する可能性が低い場合、骨髄移植を（場合により高用量化学療法および／または高線量放射線と組合せて）直接選択することが得策である。
【００３２】
したがって好ましい一態様では、本発明の方法は、さらに、患者に対する処置方式を計画するステップを含む。
【００３３】
本出願において、「処置方式」という表現は、患者を処置するために使用される治療手段の種類を表す。白血病罹患患者の処置方式には、例えば単独または併用して行われる化学療法、生物療法、放射線療法、または骨髄移植が含まれうる。好ましくは、予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する患者の処置方式には、化学療法が含まれるべきである。同じく好ましくは、予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する患者の処置方式には、化学療法以外の処置手段が、単独または化学療法との組合せで含まれるべきである。そのような処置手段には、例えば生物療法、放射線療法および／または骨髄移植が含まれうる。
【００３４】
本発明の方法は、任意の生体試料に適用することができる。「生体試料」という用語は、白血病細胞を含有する任意の種類の生体試料を表す。生体試料は、例えば、血液などの生体液から得られた白血病細胞に該当する場合がある。生体試料は、最も好ましくは血液に該当する。生体液は、場合により白血病細胞に関して濃縮されていてもよく、または白血病細胞は、場合により生体液から単離されてもよい。白血病細胞の濃縮または単離は、例えば白血病細胞特異抗原に対する抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、または白血病細胞特異抗原に対する抗体をコーティングされた磁気ビーズもしくは他の固体支持体（例えばカラム）を使用して達成してもよい。
【００３５】
本発明の枠内で、個体は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３６】
白血病罹患個体の処置のための化合物
実施例３に示すように、細胞質ＰＣＮＡは、異なる化学療法剤に対する骨髄性白血病細胞系の耐性と関連する。したがって本発明は、さらに、予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する白血病罹患個体の処置用の使用のための化学療法剤に関する。
【００３７】
「処置」という用語は、治癒目的（病状の発展を軽減または停止することを目的にする）または予防目的（病状が出現する危険を下げることを目的にする）の処置を意味すると理解される。
【００３８】
本発明の化学療法剤は、本明細書上述の「化学療法剤に対する患者の応答性を予測するための方法」という標題の段落に記載された化学療法剤の任意の１種に該当する場合がある。好ましい一態様では、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である。最も好ましくは、それはメシル酸イマチニブまたはドキソルビシンである。
【００３９】
本発明の化学療法剤は、所期の目的を達成する任意の経路によって投与することができる。例えば、投与は、非限定的に皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、髄腔内、鼻腔内、経口、直腸、経皮、口内、表面、局所、吸入または皮下使用を含めたいくつかの異なる経路によって達成することができる。非経口経路が特に好ましい。
【００４０】
投与される薬用量は、個別の必要性、所望の効果および選択された投与経路に依存する。投与される薬用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば併用療法、処置の回数、ならびに望まれる効果の性質に依存することが理解されている。各処置に必要な合計用量は、多回投与または単回投与によって投与することができる。
【００４１】
所期のデリバリー経路に応じて、化学療法剤は、液体（例えば液剤、懸濁剤）、固体（例えば丸剤、錠剤、坐剤）または半固体（例えばクリーム剤、ゲル剤）の形態として製剤化することができる。
【００４２】
好ましい態様では、化学療法剤で処置されるべき個体は、骨髄性白血病を患う。より好ましくは、化学療法剤で処置されるべき個体は、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病を患う。
【００４３】
本発明は、また、予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する個体に本明細書定義の化学療法剤の有効量を投与するステップを含む、白血病を処置するための方法に関する。
【００４４】
「有効量」によって、処置されるべき疾患を予防、治療または減速することのできる化学療法剤の濃度を達成するために十分な量が意味される。そのような濃度は、当業者ならば日常的に決定することができる。実際に投与される化合物の量は、処置される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、対象の年齢、体重、および応答、対象の症状の重症度などの関連する状況に照らして、典型的には医師または獣医師によって決定される。薬用量は投与される薬物の安定性に依存しうることも、当業者によって認識されている。
【００４５】
本発明によると、化学療法剤で処置される個体は、予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する。「予め決められた閾値」という用語は、化学療法剤に対して良好な応答を示す白血病罹患患者の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の平均比率を表す。
【００４６】
好ましい一態様では、化学療法剤で処置されるべき個体は、最大で６０％、５５％、５０％、４５％または４０％の比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する。より好ましくは、化学療法剤で処置されるべき個体は、最大で３０％、２０％または１０％の比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する。
【００４７】
白血病の診断
本発明者らは、健康な対象から単離された骨髄前骨髄球から観察されるものとは対照的に、骨髄性白血病罹患患者の骨髄から単離された前骨髄球から細胞質ＰＣＮＡを検出できることを示した。
【００４８】
したがって、本発明の別の局面は、骨髄系列またはリンパ系列の前駆細胞が個体の生体試料中で細胞質ＰＣＮＡを発現するかどうかを決定することを含む、個体が白血病を患っているかどうかを診断するための方法に関する。この方法では、骨髄系列またはリンパ系列の前駆細胞からの細胞質ＰＣＮＡの検出は、その個体が白血病を患っていることを示す。
【００４９】
好ましい態様では、上記方法は、骨髄性白血病を診断するために使用される。この態様では、骨髄系列の前駆細胞、好ましくは前骨髄球が細胞質ＰＣＮＡを発現するかどうかが決定される。
【００５０】
細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の数の計数は、例えば実施例１に記載されているような、例えば免疫化学法などの当業者に周知の様々な方法によって行うことができる。
【００５１】
薬物モニタリングおよび処置の有効性のモニタリング
化学療法剤に対する白血病罹患個体の応答性を予測するための上記方法は、また、白血病の進行をモニタリングおよび／または処置の有効性をモニタリングするために有用である。そのような場合、本明細書上記の本発明による方法は、少なくとも二つの異なる時点で同じ患者の別の生体試料に関して繰り返される。それらの生体試料は、例えば抗白血病処置の開始前および開始後にそれぞれ採取された可能性がある。
【００５２】
したがって、本発明は：
ａ）個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率を決定するステップ；および
ｂ）その後の時点で採取された、同じ個体の別の生体試料にステップａ）を繰り返すステップ
から成るステップを含む、白血病の進行をモニタリングする方法であって、細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率の経時的な減少が、該個体の状態の改善を示す方法を提供する。
【００５３】
特に、該方法は、処置を受けている患者における細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率を決定することを含むことがあり、その際、多発性骨髄腫の処置の経過中での該比率および／または百分率における減少が、有効な処置を示す。
【００５４】
したがって本発明は、また：
ａ）白血病の処置の開始前の個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率を決定するステップ；ならびに
ｂ）該処置の開始後の該個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率を決定するステップ
から成るステップを含む、該処置の有効性をモニタリングする方法であって、細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率における経時的な減少が、該処置が該個体の処置に有効であることを示す方法に関する。
【００５５】
疾患の進行または処置の有効性のモニタリングは、典型的には発現される遺伝子の数を異なる時点で、例えば２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月間隔などで決定することによって行われる。
【００５６】
「細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率における減少」は、モニタリングが開始されたときの細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率を、任意の時点での細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率および／または百分率と比較することによって評価される。該減少は、好ましくは統計的に有意である。統計的に有意な減少は、例えば少なくとも５、１０、２５または５０％の減少に該当する場合がある。
【００５７】
化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せによって処置されるべき患者を選択するための方法
患者の応答性を予測するための上記方法は、また、処置方式を計画するために使用することができる。
【００５８】
処置方式を計画するために上記方法が使用される場合、それらの方法は、さらに、個体の生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率に基づき処置方式を計画するステップを含む。
【００５９】
典型的には、細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率が予め決められた閾値（該閾値は、その個体が化学療法剤単独に応答する可能性が低いことを示す）よりも高い場合、患者に化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せを含む処置方式が施される。他方で、細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率が該予め決められた閾値よりも低い場合、化学療法処置に応答する可能性が高いことから、該個体に化学療法剤が単独で与えられうる。
【００６０】
さらに一般に、細胞の細胞質中に高発現レベルのＰＣＮＡを示す患者は、化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せを含む治療法によって処置する必要がある。したがって、細胞質ＰＣＮＡは、患者の処置方式を選択するためのマーカーとして使用することができる。
【００６１】
したがって本発明は、化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せを含む治療法で処置するために適する白血病罹患患者を選択するためのin vitro方法であって：
ａ）白血病細胞を含む生体試料を提供または入手するステップ；
ｂ）該生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定するステップ；および
ｃ）予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する患者を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００６２】
本発明は、また、化学療法剤を含む治療法で処置するために適する白血病罹患患者を選択するためのin vitro方法であって：
ａ）白血病細胞を含む生体試料を提供または入手するステップ；
ｂ）該生体試料中の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞の比率を決定するステップ；および
ｃ）予め決められた閾値よりも低い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する患者を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００６３】
特定の一態様では、予め決められた閾値は、４０％に、より好ましくは５０％、５５％、６０％、７０％、８０％または９０％に等しい。最も好ましくは、該閾値は、５０％である。
【００６４】
化学療法剤は、本明細書上記に定義された任意の化学療法剤である。特定の一態様では、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である。別の好ましい態様では、本発明の化学療法剤は、メシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標）もしくはGlivec（登録商標）として市販されている）またはドキソルビシン（Myocet（登録商標）として市販されている）である。
【００６５】
白血病罹患個体の処置用の使用のための化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せ
本発明者らは、細胞質ＰＣＮＡが骨髄性白血病細胞におけるアポトーシスに対する感受性減少および薬物耐性増加に関連するという証拠を提供した（実施例３参照）。そればかりでなく本発明者らは、また、細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストがダウノルビシン耐性細胞をアポトーシスに対して感受性にすることができることを示した（実施例５および６参照）。
【００６６】
したがって本発明は、また、白血病罹患個体（該個体は、予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を有する）の処置用の使用のための、化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せ、および白血病罹患患者（該個体は、予め決められた閾値よりも高い比率の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞を生体試料中に有する）におけるアポトーシスに対して細胞を感受性にするために使用するための細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストの使用に関する。
【００６７】
特定の一態様では、化学療法剤と細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストとの組合せで処置されるべき個体は、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％または９０％、最も好ましくは少なくとも５０％の比率の細胞質ＤＮＡ発現白血病細胞を有する。
【００６８】
化学療法剤は、本明細書上記に定義された任意の化学療法剤である。特定の一態様では、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤である。別の好ましい態様では、本発明の化学療法剤は、メシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標）もしくはGlivec（登録商標）として市販されている）またはドキソルビシン（Myocet（登録商標）として市販されている）である。
【００６９】
本発明による「細胞質ＰＣＮＡアンタゴニスト」は、例えば、細胞質ＰＣＮＡの発現を低下または細胞質ＰＣＮＡの生体活性を阻害することができる。「細胞質ＰＣＮＡアンタゴニスト」は、例えばペプチド、小分子、核酸（例えばアンチセンス分子、ｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ）、抗体またはアプタマーに該当しうる。
【００７０】
特定の一態様では、該「細胞質ＰＣＮＡアンタゴニスト」は、ＰＣＴ出願PCT/EP2011/052760に定義されているように、増殖性細胞核抗原タンパク質（ＰＣＮＡ）と、ＰＣＮＡに結合しやすい少なくとも１種のポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物である。
【００７１】
特定の一態様では、細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストはペプチドである。本発明によるペプチドは、例えば、ＰＣＮＡまたはＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチド、例えばｐ２１、ＤＮＡポリメラーゼ、クランプローダー（Ｒｆｃ１、Ｒｆｃ３）、Ｆｌｐａ−エンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ−１）、ＤＮＡリガーゼ−１、トポイソメラーゼＩＩα、複製ライセンス因子（Ｃｄｔ１）、ヘリカーゼおよびＡＴＰａｓｅ（Ｒｒｍ３、ＷＲＮ、ＲＥＣＱ５）、ミスマッチ修復酵素（ＵＮＧ２、ＭＰＧ、ｈＭＹＨ、ＡＰＥ２）、ヌクレオチド除去修復酵素（ＸＰＧ）、ヒストンシャペロン（ＣＡＦ−１）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ−１）、クロマチンリモデリング因子（ＷＳＴＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）、姉妹染色分体接着因子（Ｅｃｏ１、Ｃｈｌ１）、細胞周期レギュレーター（ｐ５７）、およびアポトーシスレギュレーター（ＩＮＧ１ｂ、ｐ５３）などの少なくとも６、１０、１５または２０個の連続するアミノ酸のフラグメントに該当しうる。
【００７２】
特定の一態様では、そのペプチドは、ＰＣＮＡフラグメントを含むかまたはそれから成りうる。そのようなフラグメントは、好ましくは、ＰＣＮＡのドメイン間連結ループの少なくとも６、１０、１５または２０個の連続するアミノを含む。実際に、出願PCT/EP2011/052760に示されたように、ドメイン間連結ループに位置するＰＣＮＡフラグメントを含むペプチドは、好中球のアポトーシスをトリガーすることができる。
【００７３】
またはペプチドは、ｐ２１の少なくとも６、１０、１５または２０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むかまたはそれから成りうる。実際に実施例６に示されるように、ｐ２１ペプチドは、ダウノルビシン耐性ＨＬ６０におけるアポトーシスを回復させる。そのようなフラグメントは、好ましくはｐ２１の残基１４１〜１６０に及ぶｐ２１フラグメントの少なくとも６、１０、１５または２０個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれから成るか、または場合により細胞貫通ペプチド、例えば配列ＲＹＩＲＳのペプチドなどに融合された、ｐ２１の残基１４１〜１６０を含むかもしくはそれから成る。実際に、ＰＣＴ出願PCT/EP2011/052760に示されるように、カルボキシｐ２１ペプチドは、好中球のアポトーシスをトリガーすることができる。特定の一態様では、ペプチドは、配列番号：３の配列（ｐ２１の残基１４１〜１６０）または配列番号：４の配列（ＲＹＩＲＳタグに融合されたｐ２１の残基１４１〜１６０）を含むかまたはそれから成る。
【００７４】
本明細書に使用されるように、「ｐ２１」という用語は、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、ＣＡＰ２０、ＣＤＫＮ１、ＣＩＰ１、ＭＤＡ−６、ｐ２１ＣＩＰ１、ＳＤＩ１またはＷＡＦ１とも呼ばれるヒトｐ２１タンパク質を表す。好ましい態様では、「ｐ２１」は、配列番号：２の配列のタンパク質を表す。しかしながらこの用語は、また、配列番号：２のタンパク質のアレル変異体およびスプライス変異体を包含する。
【００７５】
本発明によるペプチドは、さらに、タグ、例えば細胞内へのペプチドの移行を高めるタグを含みうる。
【００７６】
別の態様では、細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストは、例えばＰＣＮＡｓをターゲティングするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの核酸である。実際に、本発明者らは、ｓｉＲＮＡによるＰＣＮＡ発現のノックダウンがダウノルビシン耐性ＨＬ−６０細胞をアポトーシスに感受性にすることを示した。
【００７７】
好ましい一態様では、白血病罹患個体の処置用の使用のための細胞質ＰＣＮＡアンタゴニストは、白血病細胞のアポトーシスを誘導する。化合物が白血病細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを判定することは、当業者に周知の様々な方法によって測定することができる。例えば、外在化したホスファチジルセリンの量を、例えばアネキシンＶのラベル化後に測定することによって定量することができる。そのような実験では、外在化したホスファチジルセリンは、蛍光色素と結合したアネキシンＶで染色することで、フローサイトメトリーによるアポトーシス細胞の検出を可能にすることができる。
【００７８】
雑誌論文または要約、公開されたまたは未公開の特許出願、公布された特許または任意の他の参考文献などの本明細書に引用された全ての参考文献は、引用された参考文献中に発表された全てのデータ、表、図面および本文を含めて、本明細書における参照により全体的に組入れられる。
【００７９】
本発明を、さらに、以下の実施例および図面を考慮して評価する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】健康なドナーおよび急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のドナーの骨髄細胞におけＰＣＮＡの発現を示す図である。ＰＣＮＡは、ウサギ抗ＰＣＮＡポリクローナル抗体を使用した免疫蛍光法によって検出した。ＭＰＯ陽性細胞（骨髄性細胞）は、マウス抗ＭＰＯモノクローナル抗体を使用した免疫蛍光法によって検出した。核は、hoechst染色によって視覚化し、細胞は共焦点走査顕微鏡によって視覚化した。
【図２】ドキソルビシンに感受性（Ｋ５６２Ｓ）または耐性（Ｋ５６２Ｒ）の骨髄性白血病細胞系におけるＰＣＮＡ発現を示す図である。ＰＣＮＡは、ウサギ抗ＰＣＮＡポリクローナル抗体を使用した免疫蛍光法によって検出した。細胞の核および細胞質の蛍光強度（％）は、Image J 1.42ソフトウェアによって定量した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである、ｐ＊＊＊＜０．００１（studentのｔ検定）。
【図３】メシル酸イマチニブに感受性（ＵＴ７／９Ｓ）または耐性（ＵＴ７／９Ｒ）の骨髄性白血病細胞系におけるＰＣＮＡ発現を示す図である。ＰＣＮＡは、ウサギ抗ＰＣＮＡポリクローナル抗体を使用した免疫蛍光法によって検出した。細胞の核および細胞質の蛍光強度（％）は、Image J 1.42ソフトウェアによって定量した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである、ｐ＊＜０．０１（studentのｔ検定）。
【図４】メシル酸イマチニブによるＵＴ７／９の薬物耐性の獲得を示す図である。アネキシンＶ−ＦＩＴＣの結合により評価されたホスファチジルセリンの外在化およびＦＡＣＳによる７−ＡＡＤの取込みによる、感受性ＵＴ７／９細胞（Ｓ）またはメシル酸イマチニブ耐性（Ｒ）ＵＴ７／９細胞の細胞死の分析。
【図５】メシル酸イマチニブおよびドキソルビシンによるＵＴ７／９およびＫ５６２の薬物耐性の獲得を示す図である。培養０日目（Ｄ０）および２日目（Ｄ２）での感受性細胞および耐性細胞中の生存細胞数の計数（感受性Ｋ５６２細胞またはドキソルビシン耐性Ｋ５６２細胞、および感受性ＵＴ７／９細胞またはメシル酸イマチニブ耐性ＵＴ７／９細胞）。
【図６】ドキソルビシンによる骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２の薬物耐性の獲得を示す図である。骨髄性白血病Ｋ５６２細胞系におけるシスプラチンによるＤＩＯＣ２取込みの阻害の分析。薬物耐性は、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）などのＡＢＣ輸送体によって仲介される。Ｋ５６２細胞を、シスプラチンの存在下または不在下でＤＩＯＣ２と共にインキュベーションし、細胞内に取込まれたＤＩＯＣ２の蛍光をＦＡＣＳによって評価した。Ｋ５６２−ドキソルビシン感受性細胞では、流出の欠如のせいでＤＩＯＣ２の高い蛍光が観察される。ＡＢＣ輸送体介在性薬物耐性の不在と一致して、シスプラチンの効果は観察されない。Ｋ５６２−ドキソルビシン耐性細胞では、ＤＩＯＣ２の低い蛍光がその流出のせいで観察されるが、その流出はシスプラチンによって後退した。それは、能動ＡＢＣ輸送体介在性薬物耐性の存在と一致する。
【図７】ｐ２１ペプチドがダウノルビシン耐性ＨＬ６０細胞におけるアポトーシスを回復させることを示す図である。ＨＬ６０ＳおよびＨＬ６０Ｒをｐ２１ペプチド（５０mM）またはグリオトキシン（１mg/ml）と共に一晩インキュベーションした。１５時間インキュベーション後に、アポトーシス性ＨＬ６０細胞の百分率に及ぼすｐ２１ペプチドの作用を、ＤｉＯＣ６のラベル化後のミトコンドリアの脱分極およびヨウ化プロピジウムラベル化後のＤＮＡ断片化によって測定した。データは、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。グリオトキシンは、ＨＬ６０Ｓにおけるミトコンドリア脱分極およびＤＮＡ断片化をトリガーするが、ＨＬ６０Ｒに作用を及ぼさない。ｐ２１ペプチドは、ＨＬ６０Ｓにおけるミトコンドリア脱分極に、比較的控えめな作用を有する。著しいことに、ｐ２１ペプチドは、ＨＬ６０Ｒにおいて低いが有意なミトコンドリア脱分極を誘導し、ＨＬ６０ＳよりもＨＬ６０Ｒに強力にＤＮＡ断片化を誘導する。
【図８】ダウノルビシン耐性ＨＬ−６０細胞においてグリオトキシン誘導アポトーシスに及ぼす、ＰＣＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡの作用を示す図である。Amaxa技法（kitVプログラムT019）を用いて、ＨＬ６０細胞に対照（ＣＴ）−ｓｉＲＮＡまたはＰＣＮＡ−ｓｉＲＮＡ（１mM）をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、ＨＬ６０細胞を１または２mg/mlグリオトキシンと共に４時間インキュベーションした。アポトーシス性ＨＬ６０細胞の百分率に及ぼすｓｉＲＮＡの作用を、ＤｉＯＣ６ラベル化後のミトコンドリア脱分極によって測定した。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。ＰＣＮＡの発現阻害は、グリオトキシン誘導アポトーシスを有意に増加させる。
【００８１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＰＣＮＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ｐ２１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ｐ２１の残基１４１〜１６０のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ＲＹＩＲＳタグに融合された、ｐ２１の残基１４１〜１６０のアミノ酸配列を示す。
【００８２】
実施例
実施例１：材料および方法
細胞培養
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００U/mlペニシリンおよび１００μg/mlストレプトマイシン）を補充したRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０中でＫ５６２およびＵＴ７．９細胞系（Klein et al. Int J Cancer 1976; 18:421-31、Koeffler et al. Blood 1980; 56:344-50, Chretien et al. Blood 1994; 83:1813-21）を培養した。細胞系を５％ＣＯ２中、３７℃で維持した。Ｋ５６２およびＵＴ７．９は、それぞれ１μMドキソルビシンおよび４μMイマチニブに耐性であった）。
【００８３】
ＤＩＯＣ２による薬物耐性の分析
アッセイは、ドキソルビシン耐性細胞における蛍光Ｐ−ｇｐ基質ＤｉＯＣ２（３−エチル−２−［３−（３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベンゾオキサゾリウムヨージド）の流出に基づき、その流出は、シスプラチンによって阻害することができる。この流出は、ドキソルビシン感受性細胞において不在であって、その結果としてＤＩＯＣ２の蓄積が生じる。ＤＩＯＣ２の蛍光は、フローサイトメトリーによって測定する。簡潔には、細胞１×１０６個/mlのＫ５６２をＤＩＯＣ２（５０ng/ml）の存在下でシスプラチン（２．５μg/ml）により３７℃で３０分間処置した。細胞をフローサイトメトリーによって分析する。
【００８４】
骨髄細胞の単離
骨髄細胞は、以前に記載されたように勾配パーコールによって単離した（Cowland et al. J Immunol. Methods 1999; 232:191-200）。
【００８５】
ＰＣＮＡタンパク質の分析
氷中に入れたＰＢＳ−３．７％ホルムアルデヒド中で細胞を２０分間固定し、０．２５％トリトン（×１００）を用いて室温で５分間透過性にし、続いて氷冷メタノールで１０分間透過性にした。加湿した暗チャンバー中でウサギ抗ＰＣＮＡポリクローナル抗体（Ａｂ５）（ＰＣ４７４, MERCK, Calbiochem, Germany）を使用して４５分間、続いてAlexa 555結合ウサギＩｇＧを使用して３０分間（２mg/ml、Molecular Probes（登録商標），Invitrogen）インキュベーションして免疫ラベリングを行った。核を２μg/ml Hoechstによって１５分間染色した。Fluoprepメディウムを使用してスライドをマウントし、Leica TCS SP5 AOBSイメージング顕微鏡X63およびLAS AFバージョン1.8ソフトウェアを用いた共焦点顕微鏡法によって分析した。定量ソフトウェアはImage Jである。
【００８６】
アポトーシスの分析
ホスファチジルセリンの外在化は、アネキシンＶ結合後のフローサイトメトリーによって測定した（Moriceau et al. J Immunol. 2009; 182:7254-7263）。
【００８７】
実施例２：ＰＣＮＡの細胞局在はアポトーシス耐性に関連している
本発明者らは、最近、好中球が、ＤＮＡスライディングクランプのファミリーに属する大量の増殖性細胞核抗原タンパク質（ＰＣＮＡ）を発現することを観察した。そのうえ本発明者らは、予想外に、骨髄性分化の際に再局在化が起こることが原因で、好中球においてＰＣＮＡが細胞質のみに局在することを発見した。顕著には、サイトソルＰＣＮＡレベルは、好中球の生存速度と並行して変化し、アポトーシス時に減少し、生存因子Ｇ−ＣＳＦへのin vitroまたはin vivo曝露時に増加した。そのうえ、ＰＣＮＡの過剰発現は、好中球に分化したＰＬＢ９８５骨髄性細胞をＴＲＡＩＬまたはグリオトキシンによって誘導されるアポトーシスに有意に大きく耐性にした。これらの結果は、細胞質ＰＣＮＡを、細胞周期に無関係な好中球寿命レギュレーターとして同定した。ＰＣＮＡがその生体活性を仲介するためのタンパク質プラットフォームとして作用するという知識に基づき、本発明者らは、ＰＣＮＡがその抗アポトーシス作用を発揮する分子メカニズムの一つ、すなわちそれがプロカスパーゼと結合してその活性化を阻害できることを同定した。
【００８８】
実施例３：細胞質ＰＣＮＡは、骨髄性白血病細胞系における薬物耐性と関連する
本発明者らは、次に、細胞質ＰＣＮＡが骨髄性白血病での細胞生存に関与できるかどうかを検討した。実際に本発明者らは、以前に、終末分化した細胞（ＭＰＯおよびＣＤ３５陽性）ではＰＣＮＡが細胞質中に局在したが、一方で分化初期に、前骨髄球では（ＣＤ３５陰性およびＭＰＯ陽性）、ＰＣＮＡは核に局在したことを示した。
【００８９】
急性骨髄性白血病では、アポトーシス耐性の前駆細胞の顆粒球分化および増殖に停止がある。興味深いことに、ＰＣＮＡの発現増加が骨髄性白血病細胞において報告されたが、ＰＣＮＡ局在の影響は検討されていなかった。
【００９０】
本発明者らは、ＡＭＬ患者の骨髄から単離された前骨髄球（ＭＰＯ陽性細胞）が細胞質ＰＣＮＡの強い発現を示したが、一方で健康な対象から単離された骨髄前骨髄球（ＭＰＯ陽性細胞）では細胞質ＰＣＮＡを検出できなかったことを免疫蛍光法によって示した（図１）。
【００９１】
本発明者らは、次に、細胞質ＰＣＮＡが白血病細胞系における薬物耐性に関与しうるかどうかを評価した。２種類の骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２およびＵＴ７．９を研究した。これらの細胞系は、ＢＣＲ−ＡＢＬの強い発現を慢性骨髄性白血病の発ガンに関与させる。この発現は、Ｋ５６２細胞に内因性であり、レトロウイルス遺伝子導入によってＵＴ７細胞で誘導され、クローンＵＴ７．９を発生する。クローンの耐性の出現は、メシル酸イマチニブまたはアントラサイクリン（ドキソルビシン様）処置によって観察され、この薬物耐性のメカニズムは、完全には理解されていなかった。本発明者らは、Ｋ５６２およびＵＴ７．９細胞系の薬物耐性を示したが、それらは、どちらもそれぞれの感受性細胞系に比べた増殖増加（図５）および細胞生存率増加（図４および６）として観察された。
【００９２】
免疫蛍光分析から、ドキソルビシン感受性Ｋ５６２細胞の３９％に比べて耐性細胞の６６％でＰＣＮＡが細胞質性であったことが示された（図２）。ＵＴ７／９細胞で類似の結果が見出され、メシル酸イマチニブ耐性細胞および感受性細胞においてそれぞれ５４％および２４％の細胞が細胞質ＰＣＮＡを提示していた（図３）。
【００９３】
これらの結果は、細胞質ＰＣＮＡが骨髄性白血病細胞系における薬物耐性と関連したことを示している。
【００９４】
実施例４：ＰＣＮＡの局在は、２群のＡＭＬ罹患患者の間の識別を可能にする
健康なドナーから単離されたＣＤ３４＋骨髄系前駆細胞を対照として使用した。これらの細胞では、３０％の細胞が細胞質中にＰＣＮＡを発現し、７０％の細胞が核のみにＰＣＮＡを発現する。定量を標準化するために回転ディスク顕微鏡を使用して蛍光分析を行った。この技法は、視野毎の細胞数、核面積、核内のＰＣＮＡ蛍光面積、細胞全体中のＰＣＮＡ蛍光面積などの異なるパラメーターを測定できるようにする。この技法は、ＣＤ３４＋対照細胞中のＰＣＮＡの分布を検証できるようにし：ＰＣＮＡ蛍光の３０％は細胞質内に、ＰＣＮＡ蛍光の７０％は核内にある。
【００９５】
次に、本発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＬＭ）罹患患者６人から単離された細胞を研究した。これらの患者は、コーチン（Cochin）病院のDidier Bouscary教授を長とする血液科で処置されている。
【００９６】
白血病患者の血液から単離された細胞のＰＣＮＡ免疫染色は、ＰＣＮＡ分布に高い不均一性を示す。この不均一性は、ＡＬＭで観察される臨床的不均一性と関係する可能性がある。したがって、２群の患者を識別することができる：群１（患者２人）では、ＰＣＮＡは主に核に発現され（７０％）、一方で群２（患者４人）では、ＰＣＮＡは主に細胞質に発現されている（６０％）。
【００９７】
このようにＰＣＮＡは、患者の群に応じて異なって局在する可能性がある。したがって、化学療法剤に対する応答性を予測するために、白血病患者をその比率またはそれらの患者の細胞質ＰＣＮＡ発現白血病細胞に応じて分類することができる。
【００９８】
実施例５：ｓｉＲＮＡによるＰＣＮＡ発現のノックダウンは、ダウノルビシン耐性ＨＬ−６０細胞を、グリオトキシンによって誘導されるアポトーシスに感受性にする
ｓｉＲＮＡを使用してＨＬ−６０細胞におけるＰＣＮＡ発現をノックダウンした。その細胞は、ダウノルビシンとグリオトキシン誘導アポトーシスの両方に耐性である。Amaxa技法（kitVプログラムT019）を使用してＨＬ６０細胞に対照（ＣＴ）−ｓｉＲＮＡまたはＰＣＮＡ−ｓｉＲＮＡ（１mM）をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、ＨＬ６０細胞を１または２mg/mlグリオトキシンと共に４時間インキュベーションした。アポトーシス性ＨＬ６０細胞の百分率に及ぼすｓｉＲＮＡの作用を、ＤｉＯＣ６ラベル化後のミトコンドリア脱分極によって測定した。
【００９９】
結果から、ＨＬ６０Ｒ細胞におけるＰＣＮＡ合成阻害が、グリオトキシン誘導アポトーシスを有意に増加させることが示される（図８）。これらのデータは、ＰＣＮＡが抗白血病処置における潜在的ターゲットであることを確認するものである。
【０１００】
実施例６：ｐ２１ペプチドはダウノルビシン耐性ＨＬ６０細胞におけるアポトーシスを回復させる。
ダウノルビシンに感受性のＨＬ−６０細胞（ＨＬ６０Ｓ）におけるアポトーシスを、ダウノルビシンに耐性のＨＬ−６０細胞（ＨＬ６０Ｒ）におけるアポトーシスと比較した。アポトーシスは、ミトコンドリアをターゲティングすることによりアポトーシスをトリガーするグリオトキシンまたはｐ２１ペプチドのいずれかによって誘導した。ｐ２１ペプチドは、ｐ２１の残基１４１〜１６０が細胞貫通ペプチドＲＹＩＲＳと融合したものに該当する。ＨＬ６０ＳおよびＨＬ６０Ｒをｐ２１ペプチド（５０mM）またはグリオトキシン（１mg/ml）と共に一晩インキュベーションした。１５時間インキュベーション後に、アポトーシス性ＨＬ６０細胞の百分率に及ぼすｐ２１ペプチドの作用を、ＤｉＯＣ６ラベル化後のミトコンドリア脱分極およびヨウ化プロピジウムラベル化後のＤＮＡ断片化によって測定した（図７）。
【０１０１】
グリオトキシンは、ＨＬ６０Ｓにおいてミトコンドリア脱分極をトリガーする（６０％）が、ＨＬ６０Ｒに作用しないことから、これらの後者の細胞がミトコンドリア経路を介してトリガーされるアポトーシスに耐性であることが確認されている。対照的にｐ２１ペプチドは、ＨＬ６０Ｓにおいてミトコンドリア脱分極に対してグリオトキシンよりも小さめの作用を有する。顕著には、ｐ２１ペプチドはＨＬ６０Ｒにおいて低いが有意なミトコンドリア脱分極を誘導した。
【０１０２】
アポトーシスの読出しとしてＤＮＡ断片化を使用して、本発明者らは、グリオトキシンがＨＬ６０Ｒ細胞ではなくＨＬ６０Ｓにアポトーシスを誘導することを確認した。興味深いことに、ｐ２１ペプチドは、ＨＬ６０ＳよりもＨＬ６０Ｒの方に大きな顕著な作用を有するように見え、ＨＬ６０Ｓよりも強力にＨＬ６０ＲにＤＮＡ断片化を誘導する。これらのデータは、ｐ２１ペプチドを抗白血病処置と組合せて使用して、アポトーシスを強化することができることを確認するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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