(57)【要約】  本開示は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ／ＣＤ８７）に結合し、及び／又はその活性を調節する結合剤（例として抗体）、抗体を含む組成物、及び抗体又は組成物の使用を伴う方法に関する。
2013522167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合し、ｕＰＡＲへの結合についてインテグリンと競合する、結合剤。
【請求項２】
前記インテグリンがβ１インテグリンである、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
前記インテグリンがα５β１又はα３β１インテグリンである、請求項２に記載の結合剤。
【請求項４】
ｕＰＡＲへの結合についてクローン３Ｃ６由来の抗体と競合する、請求項１に記載の結合剤。
【請求項５】
ａ）図１に記載の３Ｃ６  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、
ｂ）図１に記載の３Ｃ６  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、及び
ｃ）図１に記載の３Ｃ６  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の結合剤。
【請求項６】
ａ）図１に記載の３Ｃ６  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、
ｂ）図１に記載の３Ｃ６  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び
ｃ）図１に記載の３Ｃ６  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３
を含む、請求項５に記載の結合剤。
【請求項７】
ａ）３Ｃ６のＶＨの完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む重鎖、及び
ｂ）３Ｃ６のＶＬの完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項６に記載の結合剤。
【請求項８】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体に特異的に結合し、
ａ）図１に記載の２Ｅ９  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、
ｂ）図１に記載の２Ｅ９  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、及び
ｃ）図１に記載の２Ｅ９  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３
を含む、単離された抗体。
【請求項９】
ａ）２Ｅ９のＶＨの完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに
ｂ）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を含み、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が
（ｉ）２Ｅ９ｌのＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに
（ｉｉ）２Ｇ１０のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
からそれぞれ独立して選択される軽鎖
を含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
ａ）２Ｅ９の完全長ＶＨに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む重鎖、及び
ｂ）２Ｅ９の完全長ＶＬに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
ｕＰＡＲへの結合についてクローン２Ｅ９由来の抗体と競合する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体に特異的に結合し、
ａ）図１に記載の２Ｇ１０  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、
ｂ）図１に記載の２Ｇ１０  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、及び
ｃ）図１に記載の２Ｇ１０  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３
を含む、単離された抗体。
【請求項１３】
ｂ）２Ｇ１０の完全長ＶＨに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに
ｃ）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を含み、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が
（ｉ）２Ｇ１０のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、
（ｉｉ）１Ｆ６のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）１Ｄ５のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、
（ｉｖ）３Ｈ７のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、
（ｖ）２Ｂ８のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに
（ｖｉ）４Ｂ６のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
からそれぞれ独立して選択される軽鎖
を含む、請求項１２に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
ａ）２Ｇ１０の完全長ＶＨに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む重鎖、及び
ｂ）２Ｇ１０の完全長ＶＬに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１２に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
ｕＰＡＲへの結合についてクローン２Ｇ１０由来の抗体と競合する、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１６】
放射標識されている、請求項１、８又は１２に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１に記載の結合剤又は請求項８若しくは１２に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の結合剤及び抗体を含む第二の結合剤を含み、抗体を含む前記第二の結合剤がｕＰＡＲへの結合についてウロキナーゼと競合する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記第二の抗体が請求項８又は１２に記載の抗体である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項８に記載の抗体及び請求項１２に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の結合剤又は請求項８若しくは１２に記載の抗体をがん性の疑いがある細胞と接触させること、
前記細胞に結合した前記結合剤又は前記抗体を検出すること
を含む、がん細胞を検出する方法。
【請求項２２】
前記細胞ががんを持つ疑いがある対象の中にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記がん細胞が乳がん細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合剤又は前記抗体が検出可能に標識されている、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出することが前記対象の組織を撮像することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が放射標識されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出することが単一光子放射型コンピュータ断層撮影を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
がんを持つ対象を治療する方法であって、前記対象に請求項１７に記載の組成物を投与することを含み、前記投与することが前記対象中のがん細胞の増殖を低減させる、又はがん細胞の移動若しくは転移を低減させる、方法。
【請求項２９】
抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を結合する結合剤を求めてスクリーニングする方法であって、
ａ）ｕＰＡＲを候補の剤と接触させること、
ｂ）前記候補の剤のｕＰＡＲとの結合を検出すること
を含み、前記検出することが、前記候補の剤の非存在下でのβ１インテグリンへのｕＰＡＲの結合と比べた、前記候補の剤の存在下でのβ１インテグリンへのｕＰＡＲの結合の減少を検出することを含む、方法。
【請求項３１】
前記結合を検出することがｕＰＡＲ活性の調節を検出することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出することが酵素結合免疫吸着測定法を利用することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出することがプロテアーゼ活性を検出することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記候補の剤が抗体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の結合剤又は請求項８若しくは１２に記載の抗体、及び
ｕＰＡＲを発現する細胞を検出するための試薬
を含む、対象中のがん細胞を検出するためのキット。
【請求項３６】
ｕＰＡＲを含む細胞を、第一のｕＰＡＲシグナル伝達経路を阻害するｕＰＡＲ結合剤と接触させること、及び
前記細胞を、第二のｕＰＡＲシグナル伝達経路を阻害する抗ｕＰＡＲ抗体と接触させること
を含む、ｕＰＡＲシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項３７】
ｕＰＡＲ結合剤が、ｕＰＡＲへのｕＰＡの結合により仲介されるシグナル伝達を阻害する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗ｕＰＡＲ抗体が、ｕＰＡＲへのインテグリンの結合により仲介されるシグナル伝達を阻害する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
インテグリンがβ１インテグリンである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１０年２月１２日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３０４，３３４号の優先権の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は米国国立衛生研究所により付与された助成金番号ＣＡ０７２００６及びＣＡ１２８７６５、並びに米国国立総合医科学研究所により付与された助成金番号０７３２１０の下での政府支援を使用してなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ又はＣＤ８７（表面抗原分類８７））は３つの相同なシステインリッチドメインからなる４５〜５５ｋＤａのグリコシル化タンパク質である。このタンパク質はグリコシルホスファチジルイノシトールのアンカーを通じて細胞膜の細胞外側単分子膜に局在する。ｕＰＡＲは炎症、転移及び浸潤、組織リモデリング、血管新生及び細胞接着を包含する幅広い種々の細胞プロセスを仲介する。
【０００４】
これらのプロセスの多くは、細胞表面において様々なリガンドが膜結合ｕＰＡＲへと高度に特異的に結合することにより開始される。１つのかかる相互作用はｕＰＡＲとｕＰＡとの間にあり、細胞外及び細胞内の両方のシグナル伝達イベントを仲介する。
【０００５】
細胞外プロｕＰＡのｕＰＡＲへの結合はその活性化を促進する。結果としてｕＰＡはプラスミンなどのプロテアーゼを活性化し、プロテアーゼは直接的及び間接的に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解する。さらに、プラスミンはプロｕＰＡを活性化することができ、これはＥＣＭ分解を加速する正のフィードバックループをもたらす。ｕＰＡＲはまた、増殖性のシグナル伝達経路を活性化することにより細胞内で働くことも可能である。ｕＰＡＲはＲＧＤ非依存的な細胞のシグナル伝達及び移動を仲介する複合体においてインテグリンファミリー接着受容体と直接的に会合するものと見られている。したがって、ｕＰＡＲはがんの発達及びがんの転移において役割を果たす。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ／ＣＤ８７）に結合してその活性を調節する剤（例として抗体）、剤を含む組成物、及び組成物の使用を伴う方法に関する。
【０００７】
また本開示により提供されるのは、１つ若しくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域及び／又は１つ若しくは複数のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体であり、ここで抗体はｕＰＡＲ結合についてｕＰＡ及び／又はインテグリンタンパク質などのリガンドと競合するものである。抗体を用いる方法、異なる抗体の組み合わせ及びそれらの組成物もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ファージディスプレイにより同定されたｕＰＡＲ結合Ｆａｂについての配列相同性を示す図である。パネルＡ、２２個の固有のクローンの重鎖及び軽鎖タンパク質配列は、パーセント同一性樹形図を生成するように整列された。パネルＢ、固有のＦａｂ各々のＣＤＲループ配列は整列され、配列同一性を指し示すように網掛けされた。Ｈ１、Ｈ２及びＨ３はそれぞれ重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をいう。同様にＬ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をいう。
【図２】Ｆａｂ存在下でのｕＰＡのｕＰＡＲへの結合を示す図である。ｕＰＡ非存在下で結合されたＦａｂに対するｕＰＡ存在下で結合されたＦａｂの比はパーセンテージとして報告される。
【図３】一過性トランスフェクションによるＩｇＧ発現を示す図である。パネルＡ、Ｆａｂ配列はｐＴＴ５−ＳＰ−Ｈ１中に重鎖及び軽鎖配列を独立してサブクローニングすることによりＩｇＧ１スキャフォールド上に移植された。パネルＢ、精製された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図４】ｕＰＡＲ抗体の相互作用の平衡アフィニティー決定を示す図である。分析物（ｕＰＡＲ）濃度に対する分析物インジェクションの間の最大表面プラスモン共鳴応答のパーセントが示される。２Ｅ９（白丸）、１Ａ８（白の四角）、２Ｇ１０（黒の菱形）及び２Ｂ１（ｘ）についてのカーブフィッティングは、表中にまとめられるＫＤ値を生じさせた。
【図５】ヒト抗ｕＰＡＲ抗体を使用したＨＥＫ細胞表面ｕＰＡＲの検出を示す図である。（パネルＡ〜Ｄ）、白のプロファイルは対照の全ヒトＩｇＧでの染色を表し、網掛けのプロファイルはヒト抗ｕＰＡＲ抗体での染色を表す。ヒト抗ｕＰＡＲ抗体の同一性は網掛けされたプロファイル内に指し示される（パネルＡ＝１Ａ８、パネルＢ＝２Ｂ１、パネルＣ＝２Ｅ９、パネルＤ＝２Ｇ１０）。
【図６】ヌードマウス中の腫瘍異種移植片のインビボ画像である。腫瘍は２Ｇ１０  ＩｇＧを用いて標識されるか、又はルシフェラーゼ発現細胞を通じて可視化された。上段左：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウス。上段右：２Ｇ１０  ＩｇＧで標識されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウス。中段左：ＭＣＦ−７／Ｌｕｃ＋腫瘍を有するマウス。中段右：２Ｇ１０  ＩｇＧで標識されたＭＣＦ−７腫瘍を有するマウス。下段：可視化のためにルシフェリンと接触させたＭＣＦ−７／Ｌｕｃ＋腫瘍を有するマウス。円で囲まれた領域は標識された２Ｇ１０  ＩｇＧ又はルシフェラーゼ活性に由来する高シグナルの領域を指す。
【図７】Ｈ１２９９細胞中のｕＰＡ／ｕＰＡＲが仲介する浸潤及びシグナル伝達の阻害を示す図である。パネルＡ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤実験の結果は未処理の対照で観察される浸潤のパーセント阻害として表現される。パネルＢはＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ）のリン酸化に対する抗体の効果について試験する実験の結果を描写する。
【図８】推定ｕＰＡＲ／β１インテグリンアンタゴニストとしての３Ｃ６の決定を示す図である。パネルＡはＥＲＫのリン酸化に対する抗体の効果を描写する。パネルＢは２Ｇ１０（ｕＰＡＲ／ｕＰＡアンタゴニスト）が３Ｃ６（ｕＰＡＲ／β１インテグリンアンタゴニスト）と直接的に比較される接着アッセイを示す。パネルＣは２つの異なるＥＣＭコーティングに対する抗体処理の接着を比較する正規化グラフである。
【図９】３Ｃ６は細胞表面ｕＰＡＲに結合し、α５β１インテグリンとのｕＰＡＲの会合を抑制することを示す図である。パネルＡはｕＰＡＲ発現細胞への結合実験の結果を描写する。パネルＢはｕＰＡＲのβ１インテグリンとの会合に対する抗体の効果を調査する免疫沈降実験の結果を描写する。
【図１０】２Ｇ１０及び３Ｃ６細胞を用いた組み合わせ処理はＭａｔｒｉｇｅｌ／コラーゲンＩ及びコラーゲンＩの中を通ったＨ１２９９の浸潤潜在力を減少させる相乗効果をもたらすことを示す図である。実験は、抗体を使用して前処理され、コラーゲンＩコーティングされた（パネルＡ）又はＭａｔｒｉｇｅｌ／コラーゲンＩコーティングされた（パネルＢ）２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの表面膜上に播種されたＨ１２９９細胞を用いて行われた。
【図１１】高レベルのｕＰＡＲを発現するがん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び低レベルのｕＰＡＲを発現する別のがん細胞株（ＭＣＦ−７）への２Ｇ１０  Ｆａｂの結合を示す図である。Ｆｉｔｃ蛍光は結合した抗体の量を指し示す。細胞はまた抗体非存在下でも分析された。
【図１２】２つの異なるがん細胞株を注射された免疫不全マウスのインビボ画像である。高レベルのｕＰＡＲを発現するがん細胞株はＭＤＡ−ＭＢ−２３１で、低レベルのｕＰＡＲを発現するがん細胞株はＭＣＦ−７である。触知可能な腫瘍が出現した後、２ｎｍｏｌの標識２Ｇ１０  ＩｇＧ又は３Ｃ６  ＩｇＧがマウス中に注射された。
【図１３】Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識２Ｇ１０  Ｆａｂ（パネルＡ）又はｆｉｔｃ標識３Ｃ６  Ｆａｂ（パネルＢ）で染色されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の蛍光顕微鏡写真である。細胞はまたＤＡＰＩでも染色された。パネルＣ、パラフィン包埋された乳房腫瘍の２Ｇ１０  Ｆａｂ染色。
【図１４】２Ｇ１０  ＩｇＧ注射（２５０μＣｉ）後４８時間時に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−２Ｇ１０を使用して撮像されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植マウスのＡｍｉｒａ処理された描写である。ＣＴの骨格画像は白色で見られることができる。濃い灰色は腫瘍を表す。パネルＡ、腹側；パネルＢ、９０°における矢状断図；パネルＣ、背側；パネルＤ、１８０°における矢状断図。矢印は抗体が結合する位置を指し、これは腫瘍の位置に相当する。
【図１５】２Ｇ１０  Ｆａｂを使用して処理された又は未処理のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞増殖抑制状態を実証するフローサイトメトリーのグラフである。
【図１６】アラニンスキャニングされたｕＰＡＲ変異体を用いた３Ｃ６についてのエピトープマッピング実験を示す図である（パネルＡ）。ｕＰＡＲ構造の正面（上）及び背面（下）の描写。矢印はインテグリン結合部位を指す（パネルＢ）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合する剤（例として抗体、アプタマー及び／又はペプチドなど）、剤を含む組成物、及び組成物の使用を伴う方法に関する。本明細書に開示される剤及び使用方法は、他のタンパク質へのｕＰＡＲの結合を破壊することによりｕＰＡＲを調節することができる。
【００１０】
本明細書に開示される一定の抗体は、ｕＰＡＲ結合についてヒトＦａｂファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることにより見出された。抗体及びｕＰＡＲについてのいくつかの研究は、抗体がｕＰＡ及び／又はインテグリンタンパク質などのリガンドのｕＰＡＲへの結合を妨げるという特徴、同様に抗体を、ｕＰＡＲを発現する細胞に特異的にするという他の特徴を含むことを明らかにする。本明細書に提示されるデータは、方法及び組成物中のｕＰＡＲ結合を破壊する剤（例として抗体）の適用を支持するが、この適用は複数のタイプのヒト疾患（例としてがん）の診断及び治療を包含するものである。
【００１１】
スクリーニングの方法もまた、相手へのｕＰＡＲ結合を特異的に阻害する／破壊するｕＰＡＲ結合剤を同定する又は設計するために提供される。
【００１２】
１つ又は複数の本開示の組成物を含有するキット、同様に本開示の方法における使用のための説明書を有するキットもまた提供される。
【００１３】
本発明及び本発明の具体的な実施形態が記述される前に、本発明は、それ自体としてもちろん変動し得ることから、記述される特定の実施形態に限定されないと理解されるものである。また本明細書に用いられる用語法は単に特定の実施形態を記述する目的であり、限定的であることは意図されないと理解されるものでもあるが、これは本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。
【００１４】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間にある、文脈が他を明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１までの値、及びその定められた範囲の中の任意の他の定められた又は間にある値は本発明の範囲内に含まれると理解される。定められた範囲中に何らかの具体的に除かれる限界値があるなら、これらのより狭い範囲の上限及び下限がより狭い範囲の中に独立して包含され得ることも本発明の範囲内に含まれる。定められた値が限界値の一方又は両方を包含する場合、それら包含される両限界値のいずれかを除く範囲もまた本発明中に包含される。
【００１５】
他に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に記述されるものと類似又は等価である任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において用いることもできるが、代表的な方法及び材料がここで記述される。本明細書に述べられる全ての刊行物は、刊行物が引用されるのに関係した方法及び／又は材料を開示及び記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。それ故に、例えば「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は複数のかかる抗原を包含し、「ペプチド（ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は１つ又は複数のペプチド及び当業者に知られるその等価物その他を包含する。
【００１７】
本明細書で議論される刊行物は、ただ本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供される。本明細書中の何物も、本発明が先行発明によりかかる刊行物に先立つ権利を与えられないという承認として解釈されるものではない。さらに提供される刊行物の日付は、独立して確認されることが必要であろう実際の発行日と異なることがある。
【００１８】
定義
組成物、かかる組成物を含有する医薬製剤、並びにかかる組成物を生産及び使用する方法を記述する場合、以下の用語は他に指し示されない限り以下の意味を持つ。下に定義されるあらゆる成分が種々の置換成分で置換され得ること、及び各定義はそれらの範囲内でかかる置換された成分を包含するように意図されることも理解されるべきである。
【００１９】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は本出願全体にわたって交換可能に用いられ、共有結合性で付着された少なくとも２個のアミノ酸を意味するものであって、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド及びそれらの断片を包含する。タンパク質は天然起源のアミノ酸及びペプチド結合、又は合成のペプチド模倣構造から成り立ち得る。それ故に本明細書に用いられる「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は天然起源及び合成のアミノ酸の両方を意味する。例えばホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは本発明の目的のために考えられるアミノ酸である。「アミノ酸」はまたプロリン及びヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を包含する。側鎖は（Ｒ）又は（Ｓ）配置のいずれかであり得る。通常、アミノ酸は、グリシン以外は（Ｓ）又はＬ配置である。非天然起源の側鎖が用いられる場合、非アミノ酸置換基は、例えばインビボの分解を妨げる又は遅延させるために用いられ得る。天然起源のアミノ酸が用いられてもよく、タンパク質は、内因性又は遺伝子組換えで発現させたもののいずれかである細胞性タンパク質であってもよい。場合によっては、本発明のタンパク質は当該技術分野で理解される任意のタンパク質のインビボ又はインビトロのタンパク質合成技術を用いて合成してもよい。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は融合タンパク質を包含し、この融合タンパク質はＮ末端のメチオニン残基を伴った又は伴わない異種のアミノ酸配列との融合タンパク質、異種及び同種のリーダー配列との融合物；免疫学的にタグ付加されたタンパク質；検出可能な融合相手との融合タンパク質、例として蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを融合相手として包含する融合タンパク質；その他を包含するが、これらに限定されるものではない。ポリペプチドは任意のサイズであり得るもので、用語「ペプチド」とは長さが５〜５０残基（例として８〜２０残基）であるポリペプチドをいう。場合によっては、タンパク質は、他のペプチド又は非ペプチド分子の共有結合性又は非共有結合性の付着により修飾されていてもよく、この分子は、下により詳細に記述される蛍光色素、ポリエチレングリコール若しくは他のポリマー、ビオチン、酵素、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、治療薬又は化学療法剤からなる分子又は組成物を１つ又は複数包含するが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書の「核酸」により、ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの両方を含有する分子のいずれかが意味される。核酸は天然起源であっても又は合成で作られたものであってもよく、１つ又は複数のヌクレオチドが天然起源のヌクレオチドを超えて修飾される、天然起源ポリヌクレオチドのアナログをそれ自体として包含する。
【００２１】
本明細書に用いられる用語「内因性」とは、生物内にある天然起源のタンパク質などの生体分子をいう。
【００２２】
抗体にコンジュゲートされた担体の文脈において用いられる用語「担体」は、ペプチド又はタンパク質の担体、非ペプチド又はタンパク質の担体（例として非ペプチドポリマー）を包含する。
【００２３】
用語「細胞表面抗原」（又は「細胞表面エピトープ」）とは、少なくとも１つの細胞周期又は細胞の発生ステージの間、細胞外でのアクセスが可能な細胞表面上の抗原（又はエピトープ）をいい、細胞周期の全ステージの間、細胞外でのアクセスが可能な抗原を包含する。本文脈における「細胞外でのアクセスが可能な」とは、細胞膜の透過を必要とせずに細胞の外側に供給された抗体により結合することができる抗原をいう。
【００２４】
本明細書に用いられる用語「化学療法」とは剤（例として薬剤、抗体など）、とりわけ興味深いがんの治療を伴う疾患の治療におけるがん性の細胞を選択的に破壊する剤（複数可）の使用をいう。
【００２５】
本明細書に用いられる「がん細胞」とは新生物性の細胞表現型を呈する細胞をいい、例えば異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存的成長阻害の喪失、足場非依存的な成長潜在力、免疫不全の非ヒト動物モデルにおいて腫瘍の成長及び／若しくは発達を促す能力、並びに／又は任意の適当な細胞変質の指標のうちの１つ又は複数により特徴づけられ得る。「がん細胞」は本明細書で「腫瘍細胞」又は「がん性の細胞」と交換可能に用いられ得るもので、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍その他のがん細胞を範囲に含む。
【００２６】
用語「コンジュゲートされる」とは、１つの目的分子を第二の目的分子と近位で会合させる、共有結合性又は非共有結合性のいずれか、通常は共有結合性の化学結合を一般にいう。
【００２７】
用語「抗原」及び「エピトープ」は当該技術分野でよく理解されており、免疫系の構成成分、例として抗体又はＴ細胞抗原受容体により特異的に認識される高分子（例としてポリペプチド）の部分をいう。本明細書に用いられるように、用語「抗原」は抗原性のエピトープ、例として抗原性のエピトープである抗原の断片を範囲に含む。エピトープは溶液中で、例として他の分子から離れて、抗体により認識することができる。エピトープがクラスＩ又はクラスＩＩの主要組織適合複合体分子と会合される場合、エピトープはＴ細胞抗原受容体により認識することができる。
【００２８】
用語「誘導体」及び「変異体」とは、本開示の化合物及び抗体に由来する構造又は配列を持つ任意の化合物又は抗体をいうがこれらに限定されるものではなく、それらの構造／配列は本明細書に開示されるものと十分に類似しており、その類似性に基づき、当業者により、特許請求の範囲に記載される及び／又は参照される化合物又は抗体と同じ又は類似の活性及び有用性を呈するものと期待されるであろうものである。場合によっては、変異体は本開示の少なくとも１つの化合物又は抗体と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上、相同又は同一であり得る。
【００２９】
本明細書で提供される用語である組成物の「有効量」は、非致死性だが、望まれる有用性を提供するのに十分な組成物の量を意味するように意図される。例えば、障害又は感染症を治療するのに好ましい応答を対象の中で誘発することについて、有効量は例としてがん転移のコントロールを提供するように、がん細胞を除去するように、細菌又はウイルス感染を減少させるように障害に関連した症状を除去する又は減少させる量である。下に指摘されるであろうように、必要とされる正確な量は、種、年齢、対象の全身の病態、治療される病態又は疾患の重症度、用いられる特定の組成物、その投与様式その他によって対象ごとに変動するであろう。それ故に、正確な「有効量」を特定するのは不可能である。一方、適当な有効量は単なる日常的な実験を用いて当業者により決定され得る。
【００３０】
用語「免疫療法」とは、疾患抗原への免疫応答を調節することによる疾患（例としてウイルス若しくは細菌感染症、又はがん）の治療をいう。本出願の文脈において、免疫療法とは抗体（例としてモノクローナル抗体）の投与により対象中で抗菌及び／又は抗がん免疫応答を提供することをいう。
【００３１】
本明細書に用いられる用語「と組み合わせて」とは、例えば第二の療法の投与の全過程の間、第一の療法が投与される場合；第一の療法が第二の療法の投与と重複している期間に投与される場合、例として第二の療法の投与前に第一の療法の投与が始まり、第二の療法の投与が終わる前に第一の療法の投与が終わる場合；第一の療法の投与前に第二の療法の投与が始まり、第一の療法の投与が終わる前に第二の療法の投与が終わる場合；第二の療法の投与が始まる前に第一の療法の投与が始まり、第一の療法の投与が終わる前に第二の療法の投与が終わる場合；第一の療法の投与が始まる前に第二の療法の投与が始まり、第二の療法の投与が終わる前に第一の療法の投与が終わる場合の使用をいう。そのように、「と組み合わせて」は２以上の療法の投与を伴う処方計画をいうこともできる。本明細書に用いられる「と組み合わせて」はまた、同じ又は異なる製剤で、同じ又は異なる経路により、及び同じ又は異なる剤形タイプで投与され得る２以上の療法の投与をいう。
【００３２】
用語「単離される」は、天然で化合物に付随する構成成分の全て又はいくつかから化合物が分離されることを意味するように意図される。「単離される」はまた、製造（例として化学合成、組換え発現、培地その他）の間に化合物に付随する構成成分の全て又はいくつかから分離された化合物の状態をいう。
【００３３】
用語「抗体」とは、抗原についてのポリペプチドの特異的な結合アフィニティーを授ける相補性決定領域（ＣＤＲ）からなるポリペプチドをいう。「抗体」は抗体が任意の目的クラス（例としてＩｇＭ、ＩｇＧ及びそれらのサブクラス）に属し得るポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製物を範囲に含み、同様にハイブリッド抗体、改変抗体（ａｌｔｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、共有結合的修飾抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）分子、Ｆｖ断片、ファージ上に提示される一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体（例として一本鎖Ｆａｂ）、単一ドメイン抗体、アフィボディ、二特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び元の抗体分子の免疫学的結合特性を呈するそれらの機能的断片を包含する調製物を範囲に含む。本明細書に記述される抗体は、例として放射性同位体、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質その他で検出可能に標識されていてもよい。抗体は他の成分にさらにコンジュゲートされていてもよく、他の成分は細胞傷害性分子又は（例としてがん細胞への抗がん薬剤の送達を提供するための）他の分子、特異的な結合ペアのメンバー、例としてビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合ペアのメンバー）その他のなどである。抗体はまた、ポリスチレンプレート又はビーズ、試験紙その他の支持体（例として固体支持体）に結合していてもよい。
【００３４】
抗体はカッパ及びラムダ軽鎖並びにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖又は他種の等価物を包含することができる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（通常は約２５ｋＤａ又は約２１４アミノ酸である）はＮＨ２末端において約１１０アミノ酸の可変領域を、及びＣＯＯＨ末端においてカッパ又はラムダ定常領域を含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａ又は約４４６アミノ酸である）は、可変領域（約１１６アミノ酸である）及び前述の重鎖定常領域の１つ、例としてガンマ（約３３０アミノ酸である）を同様に含む。
【００３５】
軽鎖又は重鎖の可変領域はＣＤＲとも呼ばれる３つの高頻度可変領域により割り込まれた「フレームワーク」領域（ＦＲ）から一般に構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの広さは正確に定義されている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｅ．Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年、及びＬｅｆｒａｎｃら、ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３、Ｄ５９３〜Ｄ５９７ページを参照）。Ｋａｂａｔ番号付けシステムについての詳細な議論はｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上に提供される。ＣＤＲ及びフレームワークの配列はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによっても定義され得る。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は構成軽鎖及び重鎖の組み合わされたフレームワーク領域であり、ＣＤＲを配置及び整列するのに機能する。抗原のエピトープへの結合は、ＣＤＲによって主に担われている。
【００３６】
用語「モノクローナル抗体」とは均一な抗体集団を持つ抗体組成物をいう。この用語はそれが作られる様式により限定されない。この用語は免疫グロブリン分子全体、同様にＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ファージ上に提示される一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、抗体の抗原結合部分及び非抗体タンパク質を含む融合タンパク質、並びに元のモノクローナル抗体分子の結合特性を呈する他の分子を範囲に含む。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作る方法は当該技術分野で知られており、より十分に下に記述される。
【００３７】
抗体の特性の文脈における用語「抗体の特異的な結合」又は「抗原特異的な抗体」とは、異なる抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体の能力をいう。ある実施形態において、特異的な結合相互作用は試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを（又は「標的」抗原と「非標的」抗原とを）、いくつかの実施形態において約１０から１００倍以上よりも大きく（例として約１０００又は１０，０００倍より大きく）識別するであろう。抗体−抗原複合体において特異的に結合する場合の抗体と抗原との間のアフィニティーは、１０−６Ｍより小さい、１０−７Ｍより小さい、１０−８Ｍより小さい、１０−９Ｍより小さい、１０−９Ｍより小さい、１０−１１Ｍより小さい、又は約１０１２Ｍより小さいかそれ以下のＫＤ（解離定数）により特徴づけられることができる。
【００３８】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸側鎖の化学的及び物理的特性（例として電荷、サイズ、疎水性／親水性）を共有する別のアミノ酸残基へのあるアミノ酸残基の置換をいう。「保存的置換」はｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒというアミノ酸残基のグループ内での置換を包含するように意図されるが、これらに限定されるものではない。本明細書に開示される抗体の文脈における保存的アミノ酸置換は、抗体と目的のプロテアーゼとの間の相互作用を保存するように選択される。サイズ、化学的特性及び／又は形状を保存することができる他の保存的置換はｖａｌ、ｔｈｒ；ａｓｐ、ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ；ｌｅｕ、ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ；ｌｙｓ、ｌｅｕ；ｔｒｐ、ｐｈｅ及びｔｙｒ；並びにａｌａ、ｖａｌ、ｔｙｒを包含する。
【００３９】
用語「薬学的に許容される」とは、生物学的に又はその他の点で望ましくないものでない材料、すなわち、望ましくない生物学的作用を何ら引き起こすことなく、又はそれが含有される医薬組成物のその他の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、選択された医薬品有効成分と一緒に個体に投与され得る、医学的に許容される品質及び組成の材料をいう。
【００４０】
本明細書に用いられる用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、対象への目的化合物（複数可）の投与のための薬学的に許容される媒体を提供する任意の適切な物質をいう。「薬学的に許容される賦形剤」は薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される添加物及び薬学的に許容される担体といわれる物質を範囲に含むことができる。
【００４１】
用語「精製される」は、目的の化合物が天然で化合物に付随する構成成分から分離されて濃縮された形態で提供されることを意味するように意図される。「精製される」はまた、製造（例として化学合成、組換え発現、培地その他）の間に化合物に付随することができる構成成分から分離され、濃縮された形態で提供される目的の化合物をいう。典型的に、化合物は少なくとも重量で５０％から６０％であって、天然で関連する又は製造の間に関連する有機分子を含まない場合に、実質的に純粋である。一般に、調製物は重量で少なくとも７５％、より通常は少なくとも９０％、一般に少なくとも９９％は目的の化合物が占める。実質的に純粋な化合物は、例えば天然資源（例として細菌）からの抽出により、化合物を化学的に合成することにより、又は精製と化学修飾との組み合わせにより得られることができる。実質的に純粋な化合物はまた、例えば目的の抗体を結合する化合物を持つ試料を濃縮することによっても得られることができる。純度は、任意の適当な方法、例としてクロマトグラフィー、質量分析、ＨＰＬＣ分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などにより、測定することができる。
【００４２】
用語「対象」はヒト、哺乳類及びｕＰＡＲを任意の形式で含有する他の動物にわたることが意図される。用語「対象」、「宿主」、「患者」及び「個体」は診断又は療法が望まれる任意の哺乳動物の対象、とりわけヒトをいうように本明細書で交換可能に用いられる。他の対象はウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを包含し得る。
【００４３】
本明細書に記述されるがん療法及び診断の文脈において、「対象」又は「患者」は、腫瘍を持つ、持つ疑いがある又は腫瘍を発達させるリスクがある対象をいうように本明細書で交換可能に用いられる。場合によっては、がんは活性のある及び／又は制御不全のｕＰＡＲを発現するがん性の細胞に関連したものである。かかる対象から得られる試料は、本開示の方法における使用に同じく適している。
【００４４】
本明細書に用いられるように、用語「決定すること」、「測定すること」、及び「査定すること」及び「アッセイすること」は交換可能に用いられ、量的及び質的な決定の両方を包含する。
【００４５】
特許請求の範囲はあらゆる任意選択の又は代わりの要素を除くように立案され得ることがさらに留意される。そのように、この記載は特許請求の範囲の要素の列挙又は「否定的な」限定の使用に関係した「ただ」、「単に」その他の除外的な用語法の使用のための先行詞として機能を果たすことが意図される。
【００４６】
本明細書中で引用される全ての刊行物及び特許はあたかも個々の各刊行物又は特許が参照により組み込まれると具体的に個別で指し示されたように本明細書に参照により組み込まれ、刊行物が引用されるのに関係した方法及び／又は材料を開示し記述するように参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引用は出願日より前の開示のためであり、本発明が先行発明によりかかる刊行物に先立つ権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認されることが必要であろう実際の発行日と異なることがある。参照により本明細書に組み込まれる文書中で設定された用語の定義が本明細書に明示的に定義される用語の定義と矛盾する限りにおいて、本明細書で設定される定義が優先される。
【００４７】
本明細書で利用可能な方法及び組成物の例が最初により高度に詳細に記述され、本開示の方法における使用を見出し得る様々の具体的な組成物、製剤、キットその他の概説、同様に本開示の方法及び組成物が使用を見出す代表的な適用の議論がその後に続く。
【００４８】
ｕＰＡＲ結合剤
本開示はｕＰＡＲ結合剤（例として抗ｕＰＡＲ抗体、「ｕＰＡＲ抗体」ともいわれる）を提供する。ｕＰＡＲ結合剤の例はアプタマー（核酸及び／又はペプチド）、抗体、小分子及び他の生体分子を包含するが、これらに限定されるものではない。剤が抗体である場合、抗体は全抗体（例としてＩｇＧ）、その抗原結合断片、一本鎖Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（例として二特異性抗体又はＶＨＨ）、Ｆａｂ’２、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）及び抗体の部分を含む合成ｕＰＡＲ抗体を包含する。主題の剤の標的であるｕＰＡＲは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体、ウロキナーゼ受容体、ｕＰＡ受容体又はＣＤ８７（表面抗原分類８７）としても知られている。ｕＰＡＲは３つの異なるＬｙ−６／ｕＰＡＲ／アルファニューロトキシンファミリーのドメインから構成される。３つのドメインは全て、一次的なリガンドであるウロキナーゼの高アフィニティーの結合に関与する。一次的なリガンドであるウロキナーゼのほか、ｕＰＡＲはビトロネクチン、ｕＰＡＲ関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ）及び膜タンパク質のインテグリンファミリーを包含するいくらかの他のタンパク質と相互作用する。
【００４９】
本明細書に用いられるように、「ｕＰＡＲ」とはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体をいい、そのアミノ酸配列が天然起源の対立遺伝子変異体及び／又はそのアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるものを包含する。変異体は発現ががんに関連する変異を包含することもできる。多くの哺乳動物のｕＰＡＲ及びそれらの相当するアイソフォームが当該技術分野で知られている。例えば、最も長いヒトアイソフォームのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２６５０．１及びＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ０３４０５として利用可能である。
【００５０】
リガンド及び／又はインテグリンのｕＰＡＲへの結合は増殖に導くことができるシグナル伝達に関与する。活性化されたｕＰＡＲにより開始される一定のシグナル伝達カスケードは細胞の形状、接着及び移動性の制御を仲介し、それ故に細胞浸潤において役割を果たす。したがって、ｕＰＡ及び／又はインテグリン（例としてα５β１又はα３β１などのβ１インテグリン）などのリガンドがｕＰＡＲに結合するのを妨げることで、増殖性のシグナル伝達カスケードの作用及び血管新生につながるそれらのシグナルを低減させることができる。主題の結合剤は、ｕＰＡＲに結合するタンパク質（例としてインテグリン及び／又はリガンド）との競合的結合のみならずｕＰＡＲ仲介性の細胞シグナル伝達の強力な阻害をも可能にするという特徴を呈することができる。本開示のｕＰＡＲ結合剤は種々の適用における使用を見出すことができ、この使用はｕＰＡＲシグナル伝達に関連した疾患又は病態を患う宿主を治療する様々な方法における使用、同様にｕＰＡＲ発現に関連した様々な疾患及び病態の診断における使用を包含する。例えば、抗体などである主題の剤はｕＰＡＲ上のインテグリン結合部位に特異的であり、がん細胞の増殖又は転移を阻害するのに用いられ得る。主題の剤のさらなる使用が後述される。
【００５１】
ｕＰＡＲ発現細胞は本開示のｕＰＡＲ抗体の標的としての機能を果たすことができる。例えば、本開示のｕＰＡＲ結合剤（例として抗体）は、表面に露出したｕＰＡＲを発現するヒト細胞を結合するように用いることができる。ｕＰＡＲを発現する細胞は主題の抗体を用いて標識されるが、ｕＰＡＲを発現しない細胞は標識されないように、結合は特異的であり得る。細胞中で発現されるｕＰＡＲは内因性のもの、組換え体、天然起源の変異体及びアイソフォーム、並びに／又はヒトｕＰＡＲのホモログ（マウス、ラット、ウシ、霊長類など）であり得る。とりわけ、がん細胞により発現されるｕＰＡＲ分子は、主題の抗体により結合されうる。かかる抗体は診断方法における使用のためにがん細胞（例としてｕＰＡＲ陽性がん）を特異的に標識するのに有用であり得るもので、後により詳細に記述される。
【００５２】
参考として、ｕＰＡＲのアミノ酸配列を下に提供する。ｕＰＡＲのアミノ酸配列はまた、３ＢＴ１として同定されている、ＲＳＣＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ中に見出することができる。ｕＰＡＲ中でのアミノ酸残基の位置をいうのに本開示中で用いられる番号付けシステムは、以下のアミノ酸配列の文脈におけるものとなる。
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYR (配列番号1)
【００５３】
本開示はインテグリンのｕＰＡＲへの結合と競合する及び／又は結合を破壊するｕＰＡＲ剤（例として抗体）を提供する。インテグリンはα５β１又はα３β１などのβ１インテグリンを範囲に含む。剤はそれ故にインテグリンの細胞（例として、ｕＰＡＲを発現するヒト細胞）への結合を阻害することにおける使用を見出す。例えば、クローン３Ｃ６の抗体はα５β１及びα３β１インテグリンのｕＰＡＲへの結合を阻害する。この阻害はインテグリンとｕＰＡＲとの間の相互作用に関与するエピトープ（例としてインテグリン結合部位）への抗体の結合、又はｕＰＡＲがインテグリンへのｕＰＡＲのアフィニティーを減少させるような方法で修飾されるための結合部位の外側のエピトープ（例としてアロステリック部位）への抗体の結合に起因し得る。そのように、本開示のｕＰＡＲ抗体はインテグリン結合部位（例としてα５β１及び／又はα３β１インテグリン結合部位）中に位置するエピトープに結合する抗体と競合することができる。本開示の抗体の１つ又は複数のエピトープはドメインＩＩＩ中に見出されることができ、これはアミノ酸残基およそ１９２位からおよそ２７５位までのｕＰＡＲのアミノ酸配列に相当する。ドメインＩＩＩの外側の他のエピトープはまた、ｕＰＡＲへのインテグリン又は本開示の抗体の結合アフィニティーにも寄与し得る。
【００５４】
本開示の抗体は、Ｄ２６２、Ｅ２０８、Ｅ２３０、Ｈ２４９及びＳ１５６の残基のうちの１つ又は複数を包含するエピトープに結合する抗体と競合することができるものを包含し、ここでＳ１５６はドメインＩＩ中に位置するが、これ以外は全てドメインＩＩＩ中に位置する。例えば、抗体は残基Ｅ２０８を包含するエピトープに結合する、又はこのエピトープに結合する抗体と競合することができる。別の例において、エピトープは残基Ｈ２４９及びＤ２６２を包含することができる。あるいは、エピトープはＥ２３０又はＳ１５６を包含する。詳細については実施例１６及び図１６を参照されたい。
【００５５】
本開示はまた、ｕＰＡＲへのｕＰＡの結合と競合する及び／又は阻害する剤を提供する。ｕＰＡＲの内因性リガンドであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼとしても知られる）は、ＩＵＭＢＭ酵素命名法に従ってＥＣ３．４．２１．７３として記述されるプロテアーゼ活性を呈する酵素ファミリーの一員である。ｕＰＡＲ抗体は、ｕＰＡが結合するのと同じｕＰＡＲの部位又はｕＰＡ結合部位の外側の異なる部位（例としてアロステリック部位）に抗体が結合する場合は、競合的阻害により、又は非競合的阻害により、ｕＰＡＲへのｕＰＡの結合を減少させることができる。ｕＰＡＲへのｕＰＡの結合を阻害することができる抗体の例は、クローン２Ｅ９由来の抗体及びクローン２Ｇ１０由来の抗体を包含する。
【００５６】
そのように、本開示のｕＰＡＲ抗体は、ｕＰＡ結合部位中に位置するエピトープに結合する抗体と競合することができる。ｕＰＡ結合部位の１つ又は複数のエピトープはｕＰＡＲのドメインＩ及び／又はドメインＩＩ中に見出することができる。ドメインＩはアミノ酸残基およそ１位からおよそ８０位までのｕＰＡＲのアミノ酸配列に相当する。ドメインＩＩはアミノ酸残基およそ９１位からおよそ１９１位までのｕＰＡＲのアミノ酸配列に相当する。
【００５７】
上述のとおり、ｕＰＡＲについての抗体のアフィニティーは解離定数ＫＤにより記述され得る。本開示の抗体は、例えばｕＰＡＲについてのＫＤが約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約７５０ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満又は約５０ｐＭ未満のものを包含する。例えば、クローン２Ｇ１０由来の二価ＩｇＧ抗体はＫＤが約４０．５ｎＭである。本開示の抗体の他の例についてのＫＤ値は図４を参照されたい。
【００５８】
本開示のｕＰＡＲ抗体はｕＰＡＲリガンド又はインテグリンの結合に関連した細胞のシグナル伝達の減少を促進する抗体を包含する。かかる抗体は例えばｕＰＡＲへの結合により細胞の増殖を減少させることにおける使用を見出すことができる。細胞のシグナル伝達作用は細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、マイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）、及び／又は微小管関連タンパク質キナーゼなどのｕＰＡＲシグナル伝達に関連したキナーゼのリン酸化レベルの調節（例として減少）により査定することができる。例えば、本開示の抗体はｕＰＡＲ依存的なＥＲＫリン酸化を阻害し、結果としてＥＲＫ活性化を阻害することができるものを包含する。本開示の抗体はフィブロネクチン依存的なＥＲＫリン酸化を阻害することができるものを包含する。本開示の抗体は細胞表面ｕＰＡＲへの結合により細胞の増殖の阻害を促進することができるものを包含する。
【００５９】
本開示の抗体は、細胞外マトリックス中へのｕＰＡＲ発現細胞の浸潤の減少を促進することができるもの、及び／又はｕＰＡＲ発現細胞の接着（例としてフィブロネクチン又はビトロネクチン依存的な接着）の減少を促進することができるものを包含する。細胞の浸潤能力はがん細胞の転移潜在力と相関した表現型である。例えば、図１中の抗体（例としてクローン２Ｅ９、２Ｇ１０及び３Ｃ６由来の抗体）はがん細胞浸潤の阻害を促進する。クローン３Ｃ６由来の抗体はフィブロネクチン又はビトロネクチン依存的な細胞接着の減少も促進する。本開示の抗体はｕＰＡＲ発現がん細胞の移動を低減させることにおける使用を見出すことができるものを包含する。
【００６０】
アミノ酸配列
本開示のｕＰＡＲ結合剤は、ｕＰＡＲのリガンド結合領域及び／又はインテグリン結合領域中のエピトープを結合する抗体を包含する。主題の抗体のいくつかの例は図１中に提示され、下に記述される。
【００６１】
本開示の抗体は、図１中でそれぞれＨ１、Ｈ２及びＨ３として指定されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２又はＶＨＣＤＲ３と約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖ＣＤＲを１、２又は３個持つ抗体を包含する。本開示の抗体は、図１中でそれぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３として指定されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２又はＶＬＣＤＲ３と約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖ＣＤＲを１、２又は３個持つ抗体を包含する。全てのＣＤＲは同一の抗体由来でもよく、又は図１中に収載される及び／若しくは下に記述される異なる抗体から独立して選択してもよい。
【００６２】
ＶＨ及びＶＬのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）により分離される。ＦＲのアミノ酸配列は本明細書に開示されるｕＰＡＲ抗体のＦＲにより説明される。ｕＰＡＲ抗体は、ＦＲ又は本明細書に開示されるフレームワーク領域と異なるアミノ酸配列を持つ他のリンカーを含有するものを包含する。保存的アミノ酸置換はまた、ＣＤＲ、フレームワーク領域又はリンカー領域の任意のアミノ酸残基について考えられ得る。他の置換が図１、パネルＢ中で提供されるアラインメントに基づいて考えられてもよい。
【００６３】
抗体の重鎖又は軽鎖ポリペプチド内の任意選択のリンカーは、アミノ酸残基又は非ペプチドポリマーを含んでもよい。リンカーの長さは約１から約１００までのモノマー、例として約２から約５まで、約７から約１０まで、約１０から約１５まで、約１５から約２０まで、約２０から約２５まで、約２５から約３０まで、約３０から約５０まで、約５０から約７５まで、又は約７５から約１００までのモノマーであり得る。
【００６４】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、３Ｃ６  ＶＬとして記載されるアミノ酸配列の連続する一続きと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を持つ軽鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。
【００６５】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、２Ｅ９  ＶＬとして記載されるアミノ酸配列の連続する一続きと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を持つ軽鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。
【００６６】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、２Ｇ１０  ＶＬとして記載されるアミノ酸配列の連続する一続きと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を持つ軽鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。
【００６７】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、３Ｃ６  ＶＨとして記載されるアミノ酸配列の連続する一続きと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を持つ重鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。
【００６８】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、２Ｅ９  ＶＨとして記載されるアミノ酸配列の連続する一続きと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を持つ重鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。
【００６９】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、２Ｇ１０  ＶＨとして記載されるアミノ酸配列の連続する一続きと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を持つ重鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。
【００７０】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、図１中に収載される抗体のいずれかにおいて表現される軽鎖又は重鎖ポリペプチド配列を含む抗体を包含する。かかる抗体はまた、図１中に収載される抗体のような任意のＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）を包含することもできる。
【００７１】
本開示のｕＰＡＲ抗体の例は、図１中の軽鎖ポリペプチド可変領域のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）を１つ又は複数含む軽鎖ポリペプチド、及び図１中の任意の重鎖ポリペプチド可変領域のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）を１つ又は複数含む重鎖ポリペプチドを含む抗体を包含する。上に記載される１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸残基は、主題の抗体中で欠失され、挿入され、又は置換され得る。保存的置換もまた存在し得る。
【００７２】
本開示のｕＰＡＲ抗体は任意のサブクラス（例としてＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＭ）に属し得る。抗体は完全にヒトのものであっても、又はヒト化モノクローナル抗体であってもよい。ヒト及び非ヒトのアミノ酸配列から構成されるキメラ抗体もまた本開示により考えられる。本開示の抗体は、抗体、及び本明細書に記述される抗体、例として本明細書に例示される抗体のいずれかにより結合されるエピトープの結合を競合する抗体の免疫学的結合特性を呈することが可能な抗体断片を範囲に含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖免疫グロブリン（例として重鎖又はその部分及び軽鎖又はその部分が融合されたもの）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ｓｃＦｖ、アフィボディ、ミニ抗体、Ｆａｂミニ抗体並びに二量体ｓｃＦｖ、並びに特異的な抗原結合領域が形成されるよう立体構造中にＶＬ及びＶＨドメインを含む任意の他の断片を包含するが、これらに限定されるものではない。一本鎖抗体を包含する抗体断片は可変領域（複数可）を単独で含んでもよく、又は以下のものの全体又は部分と組み合わせて含んでもよい：重鎖定常ドメイン又は重鎖上の、例としてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３といったその部分、膜貫通及び／又は細胞質ドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン、例としてＣカッパ若しくはＣラムダドメイン、又は軽鎖上のその部分。また本開示中で包含されるのは、可変領域（複数可）とＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃカッパ、Ｃラムダ、膜貫通及び細胞質ドメインとの任意の組み合わせである。１つ又は複数の抗体断片はまた環化形として提供してもよい。
【００７３】
本開示はまた、望まれる特性（例として血清半減期の増加、抗がん活性など）を提供することができる成分へのコンジュゲーションにより修飾される剤（例として抗体）を提供する。かかる抗体コンジュゲートは下により詳細に記述される。
【００７４】
アミノ酸及び核酸配列
ｕＰＡＲ結合剤は図１中及び下に収載される任意の配列の連続配列と少なくとも８０％（例として少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％）同一である連続アミノ酸配列を含むことができる。
【００７５】
2B3 VH:
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYSSSWYSVGNYGIDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号2)
【００７６】
2B3 VL:
QAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRRDIDIGTARIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDLYTEKASGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCLIWHNNAWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (配列番号3)
【００７７】
2B7 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRIVINVDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAAYYCARDPGGPLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号4)
【００７８】
2B7 VL:
QSVVTQPPSVSGAPGQRVIISCTGSSSNIGAGFDVHWYQQLPGTVPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKAGTSASLAITGLQAEDEADYYCQAYDDSLQGYVFGTGTKLTVVGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (配列番号5)
【００７９】
2B8 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSKSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPGGPLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICYVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号6)
【００８０】
2B8 VL:
LDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAFQTPLTFGGGTKMEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号7)
【００８１】
2B11 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDSGLGSDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号8)
【００８２】
2B11 VL:
LDIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCQAPHDIKNNLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLETGVPSRFSGSGSGTNFVLTISSLQPEDIATYYCQQFDDLPLTFGGGTKVDMKRTVAAPSVFIFPPSDEQLESGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号9)
【００８３】
2D5 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRIIINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPGGPLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号10)
【００８４】
2D5 VL:
LDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQTISSSLAWYQQKPGKAPNLLIYKASTLEGGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号11)
【００８５】
2E7 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRIIINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPGGPLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号12)
【００８６】
2E7 VL:
LDIQLTQSPPSLSASVGDRVTITCQAPHDIKNNLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLETGVPSRFSGSGSGTNFVLTISSLQPEDIATYYCQQFHDLPLTFGGGTKVDMKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号13)
【００８７】
2E9 VH:
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEDYDYVWGSYRQYPSRYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号14)
【００８８】
2E9 VL:
QSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGYKYASWYQQKPGQSPVLIIYQDKKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTSVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (配列番号15)
【００８９】
2G10 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRIIINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPGGPLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号16)
【００９０】
2G10 VL:
LDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSIRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号17)
【００９１】
2G12 VH:
EVQLVDTGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDWGRNIAVAGTLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号18)
【００９２】
2G12 VL:
LSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGQKYVSWYQQRPGQSPLLVIFQDDKRPSGIPERISGSNSGHTATLTISATQAMDEAEYFCQAWDSNTAPYVFGTGTQVTVLSQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (配列番号19)
【００９３】
3C6 VH:
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGRRFGDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号20)
【００９４】
3C6 VL:
QPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPPGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHSPFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (配列番号21)
【００９５】
3C7 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRIIINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPGGPLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号22)
【００９６】
3C7 VL:
LDIQLTQSPPSLSASVGDRVTITCQAPHDIKNNLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLETGVPSRFSGSGSGTNFVLTISSLQPEDIATYYCQQFDDLPLTFGGGTKVDMKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHEVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号23)
【００９７】
3D6 VH:
QVQLQQSGPGLVNPSQTLSVTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITIKPDTSKNQFSLQLNSVTPDDTAVYYCARDPGGSLDDSFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号24)
【００９８】
3D6 VL:
LDIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCQAPHDIKNNLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLETGVPSRFSGSGSGTNFVLTISSLQPEDIATYYCQQFDDLPLTFGGGTKVDMKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号25)
【００９９】
3H7 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITIKPDTSKNQFSLQLNSVTPDDTAVYYCARDPGGSLDDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号26)
【０１００】
3H7 VL:
LDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAFQTPLTFGGGTKMEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号27)
【０１０１】
4B6 VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRIIINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPGGPLDDSYDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号28)
【０１０２】
4B6 VL:
LEIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAFQTPLTFGGGTKMEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号29)
【０１０３】
4C1 VH:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISASGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKERPDYDFWSAFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (配列番号30)
【０１０４】
4C1 VL:
LDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号31)
【０１０５】
剤がＩｇＧ抗体である場合、ＩｇＧのＶＨはＣ末端において付加的なＦｃ領域を含有し得る。Ｆｃ領域は以下の配列の連続配列と少なくとも８０％（例として少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％）同一である連続アミノ酸配列を含んでもよい。
LLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号32)
【０１０６】
一定のＣＤＲが下の表中に別々に収載される。他のＣＤＲは図１、パネルＢ中に見出すことができる。
【０１０７】
【表１】
2013522167.tif 000003
【０１０８】
組換え抗体
本開示の剤は組換え法により生産される抗体であり得る。かかる抗体は、図１中に収載される抗体のいずれか及び／又は上で収載される配列のいずれかの連続配列と少なくとも８０％（例として少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％）同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドの発現により生産することができる。核酸のパーセント同一性は比較される配列のうちのより短いものに基づく。初期パラメーターを用いてフィルターを用いないＢＬＡＳＴＮ（２．０．８）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２ページ）などの周知のプログラムが配列比較を行うのに利用してもよい。本開示の抗体をコードする核酸の例は下で後に議論される。
【０１０９】
組換え抗体を生産する方法は当該技術分野で知られている。例えば、抗体又はせめて重鎖ポリペプチドＣＤＲ又はせめて軽鎖ポリペプチドＣＤＲをコードする核酸は、宿主細胞中に直接的に導入され、その細胞はコードされた抗体の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。組換え抗体は宿主細胞中の内因性グリコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化されていてもよく、非グリコシル化されていてもよく、又は変化したグリコシル化パターンを持っていてもよい。
【０１１０】
組換え抗体はキメラ抗体を包含する。キメラ抗体はヒト及び非ヒトの部分を含む免疫グロブリン分子である。より具体的には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域（又は可変領域）は非ヒト（例としてマウス）起源であり、キメラ抗体の定常領域（免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を授ける）はヒト起源である。キメラ抗体は非ヒト抗体分子の抗原結合特異性及びヒト抗体分子により授けられるエフェクター機能を持つことができる。キメラ抗体を生成する多数の方法が当業者に周知である。代替的なアプローチは、組換えＤＮＡ技術によりヒト定常領域に非ヒト抗体のＣＤＲ領域を連結することによるヒト化抗体の生成である。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３ページ（１９８９年）を参照されたい。
【０１１１】
ヒト抗体
ｕＰＡＲ結合剤は完全ヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、特徴的にはヒトのポリペプチド配列から主に構成される。主題のヒト抗体は、幅広い種々の方法により生産することができる（例としてＬａｒｒｉｃｋら、米国特許第５，００１，０６５号を参照）。ヒト抗体はＨａａｒｄら（１９９９年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７４、１８２１８〜１８２３０ページに記述されるような完全ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリに由来してもよい。
【０１１２】
ヒト抗体は、トリオーマ細胞（３つの細胞の子孫、このうち２つはヒトで１つはマウスである）中で初めに生産することもできる。抗体をコードする遺伝子は次いでクローニングされて他の細胞、とりわけ非ヒト哺乳動物細胞中で発現される。トリオーマ技術によりヒト抗体を生産するための一般的なアプローチは、Ｏｓｔｂｅｒｇら  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９８３年、２：３６１〜３６７ページ、Ｏｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号、及びＥｎｇｅｌｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号により記述されている。トリオーマはヒト細胞から作られる普通のハイブリドーマよりも安定的に抗体を生産することが見出されている。したがって、本開示はｕＰＡＲに結合する抗体をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子（例として２Ｅ９、２Ｇ１０又は３Ｃ６をコードする核酸）を考える。核酸配列は下で後に記述されるであろう。
【０１１３】
コンジュゲート
本開示のｕＰＡＲ結合剤は、目的の成分への化学的コンジュゲーションにより修飾することができる。例えば、剤は異なるタイプの第二の分子に（例として核酸が非核酸に、又はペプチドが非ペプチドに）コンジュゲートされ得る。剤が抗体である場合、第二の分子にコンジュゲートされた抗体は「抗体コンジュゲート」といわれる。主題の抗体コンジュゲートは、細胞、とりわけがん細胞の成長を改変するのに有用であり得る。剤を含有する組成物はコンジュゲートの凝集物を範囲に含むことができるが、これはコンジュゲート凝集物が細胞により容易に取り込まれるためである。
【０１１４】
コンジュゲートされた剤は、望まれる活性を保持する一方、付加的な望まれる特性を分け与えるためにコンジュゲートの第二分子の特性を活用する。例えば、主題の剤（例として抗体）を第二の分子にコンジュゲートすることができるが、この第二の分子は、溶解性、保存又は他の取り扱い特性、細胞透過性、半減期に役立ち、特定の細胞（例として神経細胞、白血球など）又は細胞位置（例としてリソソーム、エンドソーム、ミトコンドリアなど）、組織又は他の身体位置（例として血液、神経組織、特定の器官など）を標的にすることなどにより放出及び／又は分布をコントロールするものである。他の例はアッセイ、追跡その他のための色素、蛍光団又は他の検出可能な標識若しくはレポーター分子のコンジュゲーションを包含する。より具体的には、主題の抗体は第二の分子にコンジュゲートされることができ、この第二の分子はペプチド、ポリペプチド、色素、蛍光団、ルシフェラーゼ、核酸、炭水化物や、ドデシルアミン、オレオイルアミンその他などのＮ−ラウロイル、Ｎ−オレオイル、脂肪族アミンのＮ−脂肪族アシル基を包含する脂質成分の付着物などの脂質その他である。
【０１１５】
本開示は、コンジュゲートされていない材料と比べて細胞の取り込みを改変する成分を含むコンジュゲートされた剤をさらに提供する。コンジュゲートは、コンジュゲートされていない材料と比べて増加した細胞の取り込みを呈し得る。代替的な実施形態において、コンジュゲートは、コンジュゲートされていない材料と比べて減少した細胞の取り込みを呈する。この態様において、細胞の取り込み効率は、エンドサイトーシスを促進又は阻害する小さい有機若しくは無機の分子、ポリマー、ペプチド又はタンパク質に連結することにより増加又は減少することができる。例えば、所定の抗体は、標的受容体のリガンド又は別の抗体などのエンドサイトーシスのメカニズムによってより容易に貪食される大分子に連結されうる。抗体又は、他のリガンドは次いでエンドサイトーシスにより内部に入ることができ、エンドサイトーシス小胞がリソソームと融合すると酸加水分解又は酵素活性によりペイロードが放出される。そのように、コンジュゲートは、コンジュゲートされていない剤と比べてエンドサイトーシスが増加したものであってもよい。細胞の取り込みを減少させるため、コンジュゲートは細胞表面上で抗体を保持するリガンドを包含することができるが、これは細胞の取り込みをコントロールするものとして有用であり、又は場合によっては、ある細胞タイプの中で取り込みを減少させる一方で他の細胞タイプの中で取り込みを増加させることができる。
【０１１６】
コンジュゲートされた剤の他の特徴は、コンジュゲートがコンジュゲートされていない剤と比べて毒性を低減させることを包含し得る。別の特徴はコンジュゲートがコンジュゲートされていない材料よりも効率的にがん細胞を標的にし得ることである。付加的な例は、本開示の抗体を補完し、増強し、亢進し、又はそうでなければ本開示の抗体に関係して相乗的に作動することができる１つ又は複数の分子とコンジュゲートされた本開示の抗体を包含する。例えば、剤が抗体である場合、抗体は細胞の殺傷又はクリアランスをさらに促進するため、がん又は細菌細胞の部位への送達のための抗がん薬を任意選択で付着されていることができ、ここで抗がん薬は例として抗増殖成分（例としてＶＥＧＦアンタゴニスト、例として抗ＶＥＧＦ抗体又はアプタマー）、毒素（例として抗がん毒素、例としてリシン、シュードモナスエクソトキシンＡその他）、放射性核種（例として９０Ｙ、１３１Ｉ、１７７Ｌ、ホウ素中性子捕獲のための１０Ｂその他）、抗がん薬（例としてドキソルビシン、カリケアマイシン、マイタンシノイドＤＭ１、オーリスタチン、カウペシタビン（ｃａｕｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、５−フルオロウリシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｃｉｌ）、ロイコボリン、イリノテルカン（ｉｒｉｎｏｔｅｒｃａｎ）その他）であり、及び／又は抗体は改善された薬物動態学的プロファイルを提供するように任意選択で（例としてＰＥＧ化、高グリコシル化その他により）修飾することができる。
【０１１７】
本開示は、ｕＰＡＲ結合剤が異種のタンパク質を包含するように修飾された組換え融合抗体、すなわちクローン由来の抗体の一部でないポリペプチドに連結された組換え融合抗体を範囲に含むと考える。例えば、３Ｃ６重鎖ポリペプチド若しくは２Ｇ１０軽鎖ポリペプチド、２Ｅ９抗体断片又はそれらの任意の組み合わせは、レポータータンパク質又は望まれる抗がん作用を持つタンパク質につながれ得る。レポータータンパク質は蛍光タンパク質であっても又はルシフェラーゼであってもよい。抗体はまた、第二の抗体（又はせめてその抗原結合部分）にコンジュゲートされていてもよいが、この第二の抗体は例として、血管新生の主要メディエーターである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して向けられる抗体などの血管新生性又は増殖性の因子に特異的に結合する抗体であり、この抗体がコンジュゲートを特異的ながん細胞へと向けさせて抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦを不活性化し、それ故に血管新生を阻害する。核酸配列が提供される場合に目的の融合タンパク質を生産する方法は当該技術分野で周知である。
【０１１８】
ｕＰＡＲ結合剤はまた、直接的に又は間接的にのいずれかで検出可能に標識され得る。直接的な標識は放射性同位体（例として１２５Ｉ；３５Ｓ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃその他）；産物がシグナルを生成する酵素（例としてルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼその他）；蛍光標識（例としてフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンその他）；ＥＤＴＡなどの金属キレート基を通じて抗体に付着される蛍光発光金属、例として１５２Ｅｕ又はランタニド系列の他の金属；化学発光化合物、例としてルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩その他；生物発光化合物、例としてルシフェリン；蛍光タンパク質；又はＭＲＩ造影剤その他を包含する。間接的な標識は、主題の抗体に特異的な第二の抗体（上記のように標識される）；及び特異的な結合ペア、例としてビオチン−アビジンその他を包含する。
【０１１９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾抗体
コンジュゲートの例は１つ又は複数のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）成分を含有するよう修飾された剤（例として抗体）を包含する。かかる抗体は「ＰＥＧ化された剤」といわれる。剤が抗体である場合、抗体はＰＥＧ化された抗体、例としてｕＰＡＲに特異的に結合するＰＥＧ化された組換え抗体を包含する。抗体のＰＥＧ化に適している方法及び試薬は当該技術分野で周知である。一般的に、抗体へのコンジュゲーションに適しているＰＥＧは、一般に室温で水可溶性であり、一般式がＲ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒであり、式中Ｒは水素又はアルキル若しくはアルカノール基などの保護基、ｎは１から１０００までの整数である。Ｒが保護基である場合、一般に１から８個までの炭素を持つ。
【０１２０】
ＰＥＧはアミノ基との反応性がある官能基を生成するよう修飾された水酸基を少なくとも１つ持ち得るが、ここでアミノ基は例としてリジン残基のイプシロンアミノ基、ポリペプチドＮ末端における遊離アミノ基、又はアスパラギン、グルタミン、アルギニン若しくはヒスチジンのアミノ基などの任意の他のアミノ基である。
【０１２１】
ＰＥＧはまた、抗体ポリペプチド中の遊離カルボキシル基との反応性があるように誘導体化されていてもよい。重鎖又は軽鎖ポリペプチドのカルボキシル末端における遊離カルボキシル基との反応性がある適切なＰＥＧの誘導体は、ＰＥＧアミン及びＰＥＧのヒドラジン誘導体（例としてＰＥＧ−ＮＨ−ＮＨ２）を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
付加的なＰＥＧの誘導体は末端のチオカルボン酸基である−ＣＯＳＨを含むが、この基はアミノ基と選択的に反応してアミド誘導体を生成するものである。他の実施形態において、ＰＥＧはＰＥＧ鎖の末端においてＮ−ヒドロキシスクシンイミダートなどの反応性エステルを含む。かかるＮ−ヒドロキシスクシンイミダート含有ＰＥＧ分子は選ばれたアミノ基と中性の６．５〜７．５などの特定のｐＨ条件で反応する。
【０１２３】
ＰＥＧは抗体のアミノ酸残基に直接的に又はリンカーを通じてコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体ポリペプチドに付加され、リンカー修飾された抗体ポリペプチドを形成する。かかるリンカーは様々な機能性、例としてリンカー修飾された抗体ポリペプチドにＰＥＧ試薬をカップリングするためのスルフヒドリル、アミノ又はカルボキシル基などの反応性基を提供する。抗体ポリペプチドにコンジュゲートされ得るＰＥＧは直鎖状である。他の実施形態において、抗体ポリペプチドにコンジュゲートされるＰＥＧは分枝状である。分枝状ＰＥＧ誘導体は例として「スターＰＥＧ（ｓｔａｒ−ＰＥＧ）」及び多分岐ＰＥＧの誘導体といった当該技術分野で知られているものである。
【０１２４】
医薬組成物
本開示は１つ又は複数のｕＰＡＲ結合剤（例として抗体）を含有する医薬組成物を提供する。本開示の組成物は２以上のタイプの剤（例として抗体）を含有するものを範囲に含む。組成物は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又はそれ以上の異なるタイプの剤（例として抗体）を含有し得る。主題の組成物中の剤が抗体である場合、抗体はそのアミノ酸配列、コンジュゲーションによる修飾、アフィニティー、結合するｕＰＡＲのエピトープ、及び／又はｕＰＡＲにより仲介される細胞シグナル伝達に対する作用の点で異なり得る。例えば、組成物はインテグリン（例としてβ１インテグリン）のｕＰＡＲへの結合と競合する第一の抗体、及びｕＰＡＲへの結合についてウロキナーゼと競合する第二の抗体を含有し得る。あるいは、組成物はｕＰＡＲに結合し、ウロキナーゼのｕＰＡＲへの結合と競合する第一の抗体、及びｕＰＡＲに結合し、ウロキナーゼのｕＰＡＲへの結合と競合し、第一の抗体の結合と競合する又は競合しない第二の抗体を含有してもよい。組み合わされた抗体を有する組成物の例は、クローン３Ｃ６由来の抗体並びにクローン２Ｇ１０及び／又は２Ｅ９由来の抗体の両方を含有するものである。
【０１２５】
関係する例において、組成物は第一のｕＰＡＲシグナル伝達経路を阻害する第一の結合剤（例として抗ｕＰＡＲ抗体）；及び第二のｕＰＡＲシグナル伝達経路を阻害する第二の結合剤（例として抗ｕＰＡＲ抗体）を含有することができる。１つ又は複数の結合剤により影響される異なるｕＰＡＲシグナル伝達経路はクロストークし得る。本明細書に用いられる「クロストーク」とは、シグナル誘導条件が複数の応答及び／又はシグナル伝達経路を活性化できるように１つ又は複数のシグナル構成成分が共有される異なるシグナル伝達経路をいう。１つ又は複数のシグナル伝達経路を阻害する剤を１つ又は複数含有する主題の組成物は、がん細胞の細胞接着、増殖及び／又は移動を相乗的に阻害することができる。例えば、結合剤により阻害されうるあるシグナル伝達経路はｕＰＡＲへのｕＰＡの結合により仲介される一方、別の経路はｕＰＡＲへのインテグリン（例としてβ１インテグリン）の結合により仲介される。
【０１２６】
主題の組成物中に包含され得る他の剤は、病態を治療するのに有用な剤を包含する。例えば、下で後に議論される併用療法は、１つ又は複数の主題の抗体に加えて１つ又は複数の薬剤を含有する主題の組成物を用い得る。
【０１２７】
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を包含することができ、これは水性溶液（例として生理食塩水）などの溶液であることができる。組成物は生理的条件に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される補助剤を含有してもよく、この補助剤はｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤その他であり、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムその他である。
【０１２８】
本開示の抗体は、下に記述される方法における使用のため、非経口投与用に処方することができる。抗体が注射可能な液体として投与される場合（静脈内、動脈内、又は組織中に直接的に投与される実施形態においてなど）、抗体製剤は、使用準備済の剤形として提供してもよく、又は薬学的に許容される担体及び賦形剤から構成される再構成可能な保存安定粉末若しくは液体として提供してもよい。
【０１２９】
医薬組成物は塩、例としてＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例としてトリスバッファー、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；界面活性剤、例としてＴｗｅｅｎ−２０などの非イオン性界面活性剤など；プロテアーゼ阻害剤；グリセロール；その他のうちの１つ又は複数を含有することもできる。
【０１３０】
医薬製剤中の剤（例として抗体）の濃度は重量で約０．１％未満、通常は２％又は少なくとも約２％から、２０％から５０％以上までも変動することができ、選択される特定の投与様式及び患者のニーズに従って、液体の容量、粘度などにより一次的に選択されるであろう。結果として生じる組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアロゾルその他の形態であり得る。
【０１３１】
本開示の組成物は治療的に有効な量の主題の剤（例として抗体）、同様に必要な場合は任意の他の適合性構成成分を包含することができる。「治療的に有効な量」により、個体へのその量の投与が単回投与、同一の又は異なる抗体又は組成物の一連の一部としてのどちらであっても、望まれる作用（例として細胞増殖の阻害）を提供するのに有効であることが意味される。治療的に有効な量は投与計画及び対象の病態の診断解析（例としてｕＰＡＲ特異的な抗体を用いて細胞表面エピトープの有無についてモニターすること）その他に関係して調整することができる。
【０１３２】
本開示の文脈における動物、例としてヒトに投与される組成物の量は、合理的な期間にわたって動物中で予防的又は治療的応答をきたすのに十分であるべきで、投与の目標、治療される個体の健康及び物理的なコンディション、年齢、望まれる回復の度合、抗体組成物の製剤、治療する臨床医の医学的状況についての査定及び他の関連性のある因子に依存して変わる。当業者は投薬が利用される特定の化合物の強さ、動物の病態及び動物の体重、同様に病気の重症度及び疾患のステージを包含する種々の因子に依存することも認識するであろう。用量のサイズはまた、特定の化合物の投与に付随する可能性があるあらゆる有害な副作用の存在、特質及び広さにより決定されるであろう。それ故に量は比較的広い範囲の中になるであろうと予想されるが、それでもなお上述の特徴などの対象の様々な特徴を通じてルーチン的に決定することができる。
【０１３３】
また、適切な用量及び投薬計画は望まれる成長抑制性の応答に影響することが知られている抗がん剤との比較により決定することができる。かかる投薬は著しい副作用のない低用量の細胞成長阻害をもたらす投薬を包含する。一定の化合物を妥当な用量で適切な投与を伴って使用することで、本開示の化合物は、例として細胞成長の部分的阻害から本質的に完全な阻害までの幅広い範囲の細胞内作用を提供することができる。投薬治療は単一の用量スケジュールであっても複数の用量スケジュール（例として漸増用量及び維持用量を包含する）であってもよい。下に指し示されるように、主題の組成物は他の剤と一緒に投与してもよく、それ故に用量及び処方計画はこの文脈において、その上、対象のニーズに合わせるように変動することができる。
【０１３４】
生産方法
剤が抗体である場合、抗体はハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組み合わせの使用を包含する当該技術分野で知られている幅広い種々の技術を用いて調製することができる。例えば、抗体は、全抗体又はＦａｂをコードする発現カセットを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は哺乳動物細胞から作られ得る。抗体はまた、ｕＰＡＲを含有する免疫原性組成物を使用して免疫された動物宿主由来のハイブリドーマ細胞から単離してもよい。
【０１３５】
抗ｕＰＡＲ抗体の抗原結合断片を包含する抗ｕＰＡＲ抗体はまた、遺伝子工学により生産してもよい。タンパク質が組換え技術を用いて生産される場合、タンパク質は任意の適切なコンストラクト及び任意の適切な宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質として生産しても又は分泌タンパク質として生産してもよく、ここで宿主細胞は原核生物又は真核生物の細胞、例えばそれぞれ細菌（例として大腸菌）又は酵母宿主細胞などであることができる。
【０１３６】
宿主細胞として用いられ得る真核生物細胞の例は酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び／又は植物細胞を包含する。哺乳動物宿主細胞が用いられる場合、細胞はヒト細胞（例としてＨｅｌａ、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例としてＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞及びＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例としてＣｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１）及びハムスター細胞（例としてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）のうちの１つ又は複数を包含し得る。
【０１３７】
初めの抗原特異性を保持する１つの重鎖遺伝子及び１つの軽鎖遺伝子を各々含有するベクターは、発現ベクター中への抗体をコードする核酸の適当なセクションの挿入により生産され得る。重鎖及び軽鎖を共発現する（例えばインタクトな抗体、抗体分子のＦａｂ断片又は抗原結合断片を含む）クローンのライブラリもまた生成することができる。これらの遺伝子を保有するベクターは、宿主（例として細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は他の適切なタンパク質生産宿主細胞）中にコトランスフェクトされ得る。あるいは、重鎖及び軽鎖は単一のベクター中に挿入されて宿主（例として細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は他の適切なタンパク質生産宿主細胞）中にトランスフェクトしてもよい。
【０１３８】
遺伝的材料を宿主細胞中に導入する方法は、例えば形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法、カチオン性ペプチドに基づく方法、ポリエチレンイミンに基づく方法その他を包含する。伝達の方法は、導入される抗体をコードする核酸の安定発現を提供するように、例えば抗生物質耐性マーカーの選択（例としてゲンチマイシン（ｇｅｎｔｉｍｙｃｉｎ）、アンピシリン、カナマイシン、Ｇ４１８その他を用いて）、又は代謝マーカーの選択（例としてメチオニンスルホキシイミンを伴った又は伴わない無グルタミン培地におけるグルタミン合成の選択、又はメトトレキサートを伴った又は伴わないＤＨＦＲの選択）をさせることなどにより選択することができる。抗体をコードする核酸は遺伝性のエピソーム要素（例としてプラスミド）として提供されることができ、又はゲノムに組み込まれることができる。目的抗体の生産における使用のための種々の適当なベクターは市販されている。抗体遺伝子の合成がトランスフェクトされた宿主中で誘導される場合、重鎖及び軽鎖のタンパク質は、抗原又は免疫原との結合をアッセイすることで検出されることができ、当該技術分野で知られている技術を用いて単離することができる活性のある抗体を生産するために自己組織化する。
【０１３９】
一本鎖Ｆｖ及び他の抗体を生産するのに用いることができる技術のさらなる例は、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９１年、２０３：４６〜８８ページ；及びＳｋｅｒｒａら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８〜１０４０ページに記述されるものを包含する。抗体は当該技術分野で知られている種々の技術、張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又は表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、及びチェインシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を用いてヒト化することができる。抗体の単離及び精製は当該技術分野で知られている技術を用いて達成されることができ、重量で少なくとも５０％から６０％であって、抗体が天然で関連する又は製造の間に関連する有機分子を含まない抗体含有調製物を提供することができる。
【０１４０】
核酸
本開示は、例として重鎖及び軽鎖をコードする又は重鎖及び軽鎖の断片をコードする発現カセットの発現により、本明細書に開示されるｕＰＡＲ抗体を発現する細胞を考える。コードする核酸の例は、図１中に表現されるＣＤＲと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一であるＣＤＲを１つ又は複数含むポリペプチドをコードする核酸を包含する。別の例において、抗体は図１中に表現される軽鎖及び重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖及び重鎖ＣＤＲポリペプチド配列を１つ又は複数持つ。
【０１４１】
ｕＰＡＲに結合する抗体の重鎖をコードする核酸配列の例は、配列番号＼＼及び＼＼を包含する。ｕＰＡＲに結合する抗体の軽鎖をコードする核酸配列の例は、配列番号＼＼及び＼＼を包含する。本開示は主題の抗体の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのＣＤＲ又は軽鎖ポリペプチドの少なくとも１つのＣＤＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞をさらに考える。
【０１４２】
主題の剤が（例として組換え抗体を生産するために）核酸によりコードされる場合、核酸は下に収載される任意の配列の連続配列と少なくとも８０％（例として少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％）同一である連続核酸配列を含むことができる。
【０１４３】
1A8 VH:
GCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACAAGAGATCCGGGGGGGGCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号45)
【０１４４】
1A8 VL:
CTTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGTATCTGTAGGAGACAGAGTCACCCTCACTTGCCAGGCGAGTCAGGTCATTAACAACCACTTAAATTGGTATCAACAACAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTACGATGCATCCAATCTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCGGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTCTGATAATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTAGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号46)
【０１４５】
1D5 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGCGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGAATCTGTGAAAAGTCGAATAGTCATCAACGTAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号47)
【０１４６】
1D5 VL:
CTTGAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCGTAATAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAGTCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号48)
【０１４７】
1F6 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCCGTGAAAAGTCGAATAATTATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCTACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号49)
【０１４８】
1F6 VL:
CTTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCGTAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTATTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCGGGCACAGATTTTACACTGAGAATTAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACCCCGTTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号50)
【０１４９】
1G9 VH:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTAAACGCCCACCCGATTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号51)
【０１５０】
1G9 VL:
CTTGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGATGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号52)
【０１５１】
2B1 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGTAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGGAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATTATGATTATGCAGTCTCTGTGAAAGGTCGAATAACCTTCACCCCAGACACATCCAAGAACCAGGTCTCCCTGCACCTGAACGCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号53)
【０１５２】
2B1 VL:
CTTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACTATCACTTGCCAGGCGCCTCACGACATTAAGAACAATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTTCGACGCATCTAATTTGGAGACGGGAGTCCCATCAAGATTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAAATTTTGTGCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTCATGATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGACATGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号54)
【０１５３】
2B3 VH:
CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCCTATAGCAGCAGCTGGTACAGCGTTGGGAACTACGGTATAGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号55)
【０１５４】
2B3 VL:
CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTCTTCCCTCTCTGCATCTCCTGGAGCATCAGCCAGTCTCACCTGCACCTTACGCAGAGACATTGATATTGGAACCGCCAGGATTTACTGGTACCAACAGAAGCCAGGGAGCCCCCCCCAGTATCTCCTGAACTACAAATCAGACTTGTACACGGAGAAGGCCTCTGGAGTCCCCAGCCGCTTCTCTGGATCCAAGGATGCTTCGGCCAATGCAGGCATTTTGCTCATCTCTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCTGATTTGGCACAACAATGCTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA (配列番号56)
【０１５５】
2B7 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGCGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGAATCTGTGAAAAGTCGAATAGTCATCAACGTAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGCGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号57)
【０１５６】
2B7 VL:
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCGCCAGGTCAGAGGGTCATCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGCTTTGATGTACACTGGTATCAGCAGCTTCCAGGAACAGTCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACACAAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGGCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGGCTTATGACGACTCCCTGCAAGGTTATGTCTTCGGCACAGGGACCAAGTTAACCGTCGTCGGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA (配列番号58)
【０１５７】
2B8 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAAGAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGCCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCTACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号59)
【０１５８】
2B8 VL:
CTTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCGTAGTAATGGATACAACTATTTAGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTACTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCGGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTTTTCAAACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGATGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号60)
【０１５９】
2B11 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATTCGGGACTGGGGTCAGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号61)
【０１６０】
2B11 VL:
CTTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACTATCACTTGCCAGGCGCCTCACGACATTAAGAACAATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTTCGACGCATCTAATTTGGAGACGGGAGTCCCATCAAGATTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAAATTTTGTGCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTGATGATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGACATGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGGAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号62)
【０１６１】
2D5 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCCGTGAAAAGTCGAATAATTATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号63)
【０１６２】
2D5 VL:
CTTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATTACTTGCCGGGCCAGTCAGACTATAAGTAGTTCGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATAAGGCGTCTACATTAGAAGGTGGGGTCCCCTCGCGTTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACACTACCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号64)
【０１６３】
2E7 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGTAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGGAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATTATGATTATGCAGTCTCTGTGAAAGGTCGAATAACCTTCACCCCAGACACATCCAAGAACCAGGTCTCCCTGCACCTGAACGCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号65)
【０１６４】
2E7 VL:
CTTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACTATCACTTGCCAGGCGCCTCACGACATTAAGAACAATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTTCGACGCATCTAATTTGGAGACGGGAGTCCCATCAAGATTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAAATTTTGTGCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTCATGATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGACATGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号66)
【０１６５】
2E9 VH:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGAGGATTATGATTACGTTTGGGGGAGTTATCGACAATACCCCAGTCGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号67)
【０１６６】
2E9 VL:
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAATTTGGGGTATAAATATGCTTCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGATCATCTATCAAGATAAGAAGCGGCCCTCTGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCACTTCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA (配列番号68)
【０１６７】
2G10 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCCGTGAAAAGTCGAATAATTATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号69)
【０１６８】
2G10 VL:
CTTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCGTAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTATTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCGGGCACAGATTTTACACTGAGAATTAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACCCCGTTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号70)
【０１６９】
2G12 VH:
GAGGTGCAGCTGGTGGACACTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGAAAGATTGGGGAAGAAATATAGCAGTGGCTGGTACCCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号71)
【０１７０】
2G12 VL:
CTTTCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCGGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATTACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGACAAAAGTATGTTTCATGGTATCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCTACTGGTCATCTTTCAAGATGACAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGAATCTCTGGCTCCAACTCTGGGCACACAGCCACTCTGACCATCAGCGCGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGAGTATTTCTGTCAGGCGTGGGACAGTAACACTGCCCCTTATGTCTTCGGAACTGGGACCCAGGTCACCGTCCTAAGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGCTCT (配列番号72)
【０１７１】
3C6 VH:
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCAGAAGGTTCGGGGATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号73)
【０１７２】
3C6 VL:
CAGCCTGTGCTGACTCAGCCCCCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCCCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAATTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCACTCCCCCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGCTCT (配列番号74)
【０１７３】
3C7 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCCGTGAAAAGTCGAATAATTATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号75)
【０１７４】
3C7 VL:
CTTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACTATCACTTGCCAGGCGCCTCACGACATTAAGAACAATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTTCGACGCATCTAATTTGGAGACGGGAGTCCCATCAAGATTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAAATTTTGTGCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTGATGATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGACATGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACGAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号76)
【０１７５】
3D6 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAACCCCTCGCAGACCCTCTCAGTCACATGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGGAGGACATACTACAGGTCGAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAAACCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGTCTCTCGATGATTCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号77)
【０１７６】
3D6 VL:
CTTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACTATCACTTGCCAGGCGCCTCACGACATTAAGAACAATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTTCGACGCATCTAATTTGGAGACGGGAGTCCCATCAAGATTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAAATTTTGTGCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTGATGATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGACATGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号78)
【０１７７】
3F7 VH:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGGAGACCCTGTCCCTCACTTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCTTCAGCAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATTTCTGACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCCAGTCTCGAGTCACCATATCATTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAACTCTGTGACCGCCACAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCGCCTATTCATGATTACGTTTGGGGGAGTTATCGCCGCCCCTCGCGAGAATATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号79)
【０１７８】
3F7 VL:
CTTAATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTTACTATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCGTTGCCAGCAACTATGTCCACTGGTACCAGCAGCGACCGGGCAGTTCCCCCTCCATTCTAATCCATGAGTTTAACATAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCAGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGACGACTGAGGACGAGGCTGATTACTATTGTCAGTCTTCTGTCAACAACCTTCAATGGGTGCTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA (配列番号80)
【０１７９】
3H7 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCGAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAAACCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGTCTCTCGATGATTCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号81)
【０１８０】
3H7 VL:
CTTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCGTAGTAATGGATACAACTATTTAGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTACTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCGGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTTTTCAAACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGATGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号82)
【０１８１】
4B6 VH:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCCGTGAAAAGTCGAATAATTATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATCCGGGGGGGCCTCTCGATGATAGTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号83)
【０１８２】
4B6 VL:
CTTGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCGTAGTAATGGATACAACTATTTAGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTTTTCAAACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGATGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号84)
【０１８３】
4C1 VH:
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGCTAGTGGTGGTAGCACAGACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTTCAAATGAGCAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAAAGAGCGTCCGGATTACGATTTTTGGAGTGCGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT (配列番号85)
【０１８４】
4C1 VL:
CTTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCGGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCCTCCGACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (配列番号86)
【０１８５】
重鎖のＣ末端において任意選択で存在するＦｃ領域は、以下のＤＮＡ配列の連続配列と８０％（例として少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％）の同一性を持つ連続ヌクレオチド配列によりコードすることができる。
TTGCTAGCACCcTcCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCcTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTcCTACAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGgACAAGAGCAGGTgGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGgCTCTGCACaAcCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (配列番号87)
【０１８６】
診断方法
本開示は原位置の又は対象から単離された生物学的試料中のｕＰＡＲを検出する方法を提供する。一定のがん（例として転移性がん）はｕＰＡＲを過剰発現することから、ｕＰＡＲの検出は診断、療法の選出及び予後に役立つことができる。主題の方法は、細胞を含有する試料を主題の剤（例として抗体）と接触させること；及び試料中の細胞への主題の剤（例として抗体）の結合を直接的に又は間接的に検出することを一般に伴う。細胞がｕＰＡＲ陽性細胞（例としてがん細胞）を持つ疑いがある若しくは持つことが知られている患者、治療を受ける患者、又は治療への感受性について試験される患者から得られた生物学的試料中にある場合、細胞はインビトロのものであることができる。細胞はインビボのものであることができ、例として細胞はがん細胞を持つことについての疑いがある患者、治療を受ける患者、又は治療への感受性について試験される患者中のものである。
【０１８７】
ｕＰＡＲを結合する抗体は、当該技術分野で知られている免疫診断技術において抗ｕＰＡＲ抗体を用いて、検出可能なレベルのｕＰＡＲを発現する細胞（例としてがん細胞）を持つ又は持つ疑いがある対象の生物学的試料中でｕＰＡＲ発現細胞を検出するのに用いることができる。本開示は、ｕＰＡＲ発現がん細胞の検出の目的に適している抗体を提供する。主題の抗体を用いて検出することができるがん細胞のいくつかの例は乳房のがん細胞を包含する。主題の方法により検出することができる乳がん細胞の例は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体について陰性であるトリプルネガティブのがん細胞を包含する（Ｐａｌ  ＳＫら（２００９年）Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ６３：２６９〜２７４ページ；Ａｈｍａｄ  Ａら（２００９年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０８：９１６〜９２５ページ）。検出することができる他のがんは、卵巣、前立腺、精巣、結腸、直腸、肺、脳、血液、骨、骨髄中のがん、又は白血病、線維肉腫及び神経膠芽腫を包含するがこれらに限定されない身体中の任意の他の器官若しくは組織中のがんを包含する。
【０１８８】
かかる診断は本明細書に開示される療法を受け入れられる患者を同定するのに、及び／又は療法への応答をモニターするのに有用であることができる。
【０１８９】
適切な免疫診断技術はインビトロ及びインビボの方法（例としてイメージング）の両方を包含するが、これらに限定される必要はない。本明細書に用いられる語句「インビボイメージング」とは、生きた哺乳類の全身において検出可能なタンパク質（例として検出可能に標識された３Ｃ６）の存在を検出する方法をいう。蛍光抗体及びルシフェラーゼがコンジュゲートされた抗体などの光学的に検出可能な剤又は放射性標識された剤はインビボイメージングにより検出され得る。インビボイメージングは２次元、同様に３次元の哺乳類画像を提供するのに用いられ得る。電荷結合素子カメラ、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＭＯＳ又は３次元断層撮影装置がインビボイメージングを行うのに用いられ得る。例えば、Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ＪＥ（２００８年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．４０：２５３〜２６１ページは、インビボイメージングのためのコンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、超音波検査、陽電子放出断層撮影、単一光子放射型コンピュータ断層撮影などの使用を概説する。生きた動物中のルシフェラーゼ発現のリアルタイムイメージングのために検出可能な標識を用いる方法は、本明細書に開示される主題の方法における使用に容易に適合させることができる（例としてＧｒｅｅｒ  ＬＦら（２００２年）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １７：４３〜７４ページ）。生きた動物中の蛍光タンパク質のインビボイメージングは、例としてＨｏｆｆｍａｎ（２００２年）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ９：７８６〜７８９ページに記述される。いくつかの実施形態において、インビボイメージングは生きた組織を透過するように設計された波長の光を発光する標識を検出することにより実施してもよい。かかる標識は赤外及び近赤外の色素又はタンパク質などの長波長発光の蛍光色素又はタンパク質を包含し、この色素又はタンパク質は約６００ｎｍから約８００ｎｍ、約６５０ｎｍから約８００ｎｍ又は約７００ｎｍから約８００ｎｍの範囲で発光する色素又はタンパク質を包含するが、これらに限定されるものではない。あるいは、生きた組織を透過する光を発するように設計された標識は非蛍光試薬を包含してもよく、この試薬は赤色シフトされたルシフェラーゼを包含するが、これに限定されるものではない。
【０１９０】
インビボイメージングはコンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、超音波検査、陽電子放出断層撮影、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）などを伴うこともできる（詳細についてはＢｕｒｄｅｔｔｅ  ＪＥ（２００８年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、４０：２５３〜２６１ページを参照）。ＳＰＥＣＴはまた、主題の方法の中で統合Ｘ線ＣＡＴ（ＣＴ）スキャナ（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）を使用して用いることもできる。上記の多くのインビボイメージング方法からの情報は対象中の抗体の３次元分布を提供することができる。より詳細については実施例１４を参照されたい。
【０１９１】
主題の方法を用いて検出される細胞がインビボのものである場合、方法は患者中の特定のｕＰＡＲ陽性細胞の有無及び／又はｕＰＡＲ陽性細胞の位置を決定することができる。例えば主題の方法は、ｕＰＡＲについて陽性のがん細胞が元の腫瘍から離れて移動したのかどうか、リンパ節中のｕＰＡＲについて陽性のがん細胞の有無の決定を助けることができ、及び／又はｕＰＡＲ陽性細胞を含有するリンパ節の同定を助けることができる。いくつかの実施形態において、本方法は、ｕＰＡＲ陽性がん細胞に向けられた抗がん治療を包含する抗がん治療の進行を追跡するのに用いられ得るが、これは例えばインビボで腫瘍サイズの何かしらの減少又は増加を検出することによる。本方法は局所注射を通じて主題の抗体を投与することを伴うことができ、局所注射は例として腫瘍部位若しくはｕＰＡＲを発現する細胞を持つ疑いがある部位におけるもの、又は注入（例として動脈又は静脈注入）を包含するが、これらに限定されない、抗体を全身的に投与することによるもの、又は注射（例として静脈内、動脈内、髄腔内、頭蓋内、皮下、筋肉内又は当該技術分野で知られている他の注射の方法）によるものである。
【０１９２】
本方法がインビトロのものである場合、生物学的試料はｕＰＡＲが存在し得る任意の試料であることができ、組織、細胞全体及びそれらの抽出物を包含するが、これらに限定されるものではない。例えばアッセイは、組織学的な組織試料中の細胞上のｕＰＡＲの検出を伴うことができる。例えば組織試料は、（例としてホルマリン処理により）固定され、支持体中（例としてパラフィン中）に包埋されて提供してもよく、又は凍結された非固定されていない組織であってもよい。
【０１９３】
アッセイは幅広い種々の形態を取ることができ、競合、直接反応又はサンドイッチタイプのアッセイなどがある。アッセイの例は、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識及び仲介イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）など；ビオチン／アビジンタイプのアッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降、蛍光活性化細胞分取その他を包含する。反応は一般に、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識などの検出可能な標識又は色素分子、又は試料中の抗原と、抗原と反応する抗体との間の複合体の形成を検出する他の方法を包含する。
【０１９４】
アッセイは、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体からの液相中の結合していない抗体の分離を伴うことができる。用いることができる固体支持体は、ニトロセルロース（例として膜又はマイクロタイターウェルの形態で）；ポリ塩化ビニル（例としてシート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例としてビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリビニリジンフルオライド；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答ビーズその他などの基板を包含する。
【０１９５】
固体支持体が用いられる場合、固体支持体は通常は最初に、構成成分が支持体に十分に固定されるように適切な結合条件下で固相構成成分（例として抗ｕＰＡＲ抗体）と反応する。時折、支持体への固定は、より良好な結合特性を有するタンパク質に、又は抗体結合活性又は特異性を著しく喪失することなく支持体上の抗体の固定を提供するタンパク質に、抗体を最初にカップリングすることにより増強することができる。適切なカップリングタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を包含する血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン及び当業者に周知の他のタンパク質などの高分子を包含するが、これらに限定されるものではない。抗体を支持体に結合させるのに用いることができる他の分子は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーその他を包含するが、ここで抗体を固定するのに用いられる分子は抗原に特異的に結合する抗体の能力に悪影響を与えないという条件である。かかる分子及びこれらの分子を抗体にカップリングする方法は当業者に周知である。
【０１９６】
固体支持体が固相構成成分と反応した後、あらゆる非固定の固相構成成分は洗浄により支持体から除去され、支持体に結合している構成成分は次いで適切な結合条件下でｕＰＡＲを含有する疑いがある生物学的試料と接触させられる。あらゆる非結合のリガンドを除去するように洗浄した後、第二のバインダー成分が適切な結合条件下で添加されるが、ここで第二のバインダーは結合したリガンドと選択的に会合する能力がある。次いで当該技術分野で周知の技術を用いて第二のバインダーの有無が検出することができる。
【０１９７】
あるいは抗体は、例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｌ又は１つ若しくは複数の主題の抗体のＦｃ領域を認識する抗体に共有結合的に付着されたビーズ又は他の固体表面を１つ又は複数の主題の抗体と接触させることを通じて、ビーズに非共有結合的にカップリングしてもよい。ビーズ又は他の固体表面は次いで試験される組織、細胞又は抽出物と接触させてもよく、あるいは洗浄され、集められて（例として遠心分離により）、抗体−抗原複合体の有無を決定するのに分析してもよい。
【０１９８】
ＥＬＩＳＡ法を用いることができ、この方法では、マイクロタイタープレートのウェルを主題の抗ｕＰＡＲ抗体を使用してコーティングする。ｕＰＡＲを含有する又は含有する疑いがある生物学的試料（例として活性があるｕＰＡＲを発現する腫瘍細胞）が次いでコーティングされたウェルに添加される。抗体を結合させるのに十分なインキュベーション時間の後、プレート（複数可）は結合していない成分を除去するように洗浄され、検出可能に標識された第二の結合分子が添加される。第二の結合分子はあらゆる捕捉された抗原と反応するようにされ、プレートが洗浄されて、当該技術分野で周知の方法を用いて第二の結合分子の有無が検出される。
【０１９９】
望まれる場合、生物学的試料（例としてｕＰＡＲ発現細胞）由来の結合されたｕＰＡＲの有無は、抗体リガンドに対して向けられた抗体を含む第二のバインダーを用いて容易に検出することができる。例えば、多数の抗ウシ、抗ウサギ、抗ウマ、抗ラット、抗マウス及び抗ヒトの免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、当業者に知られている方法を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はウレアーゼなどの検出可能な酵素標識に容易にコンジュゲートされ得るものとして、当該技術分野で知られている。適当な酵素基質が次いで検出可能なシグナルを生成するよう用いられる。他の関係する実施形態において、競合的なタイプのＥＬＩＳＡ技術が当業者に知られる方法を用いて実施することができる。
【０２００】
アッセイはまた、抗体とｕＰＡＲとが沈殿条件下で複合体を形成するように、溶液中でも実行することもできる。例えば抗体は、直接的な化学的又は間接的カップリングなどによる当該技術分野で知られているカップリング技術を用いて固相粒子（例としてアガロースビーズその他）に付着させることができる。抗体がコーティングされた粒子は、次いで、ｕＰＡＲを含有する疑いがある生物学的試料と適切な結合条件下で接触させるが、これは、洗浄及び／又は遠心分離を用いて沈殿させ、試料から分離することができる粒子−抗体−ｕＰＡＲ複合体凝集物の形成を提供するためである。反応混合物は、上記の免疫診断法などの多数の標準的な方法のいずれかを用いて、抗体−抗原複合体の有無を決定するよう分析することができる。
【０２０１】
アッセイはまた、蛍光活性化細胞分取ＦＡＣＳにより溶液中で実行されることもできる。例えばｕＰＡＲを含む又は含む疑いがあることが知られている生物学的試料は、本発明の抗体と接触させてもよい。主題の抗体は、本明細書に記述される又は一般に当該技術分野で知られているように、直接的に標識されていてもよく（例として蛍光で標識される）、又は間接的に標識されていてもよい（例として二次抗体を通じて）。生物学的試料は次いでＦＡＣＳ装置を用いてカウントされ、場合によってはソートしてもよい。場合によっては固定された細胞がカウント又はソートしてもよく、他の場合には生きた細胞がカウント又はソートしてもよい。
【０２０２】
診断アッセイ中で用いられる試験試料はｕＰＡＲが存在し得る任意の試料であることができ、細胞及び組織並びにそれらの抽出物を包含するが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、とりわけがん細胞の検出を伴う実施形態などにおいて、インタクトな生きた細胞を含有する、診断される対象からの試料を用いてアッセイを実行するのが望ましいであろう。ｕＰＡＲ検出は次いで細胞の細胞外表面上で査定することができる。
【０２０３】
診断アッセイは原位置で実行されることもできる。例えば抗ｕＰＡＲ抗体は検出可能に標識され、細胞表面のｕＰＡＲの発現により特徴づけられるがんを持つ疑いがある対象に投与され、当該技術分野で利用可能なイメージング法を用いて検出される検出可能に標識された抗体に結合されることができ、このイメージング法は本明細書に記述されるインビボイメージング法を包含するが、これに限定されるものではない。
【０２０４】
本明細書に記述される診断アッセイは、抗体に基づく療法を用いた療法をより受け入れやすい又はより受け入れにくいがんを対象が持つかどうかを決定するのに、同様に対象における治療の進行をモニターするのに用いることができる。診断アッセイはまた、他の併用療法の経過を査定するのに用いてもよい。それ故に診断アッセイは、臨床医による療法及び治療計画の選択を知らせることができる。
【０２０５】
ｕＰＡＲは抗体の特異的結合の検出により、例として図１に収載される抗体の抗原結合特異性を持つモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異的結合の検出により検出することができる。例えば、３Ｃ６反応性抗原、２Ｅ９反応性抗原及び／又は２Ｇ１０反応性抗原はがん細胞の細胞表面上に存在し得る。抗原は透過処理された試験細胞中で検出されることもできる。例えば、正常細胞中の抗体染色パターンと違う３Ｃ６抗体（又は３Ｃ６の抗原結合特異性を持つ抗体）での染色パターンを呈する試験がん細胞は、３Ｃ６反応性抗原を呈するがん性の細胞として同定される。かかるがんはそれ故に、３Ｃ６反応性抗原に特異的に結合する抗体（例として３Ｃ６）を使用した療法を受け入れられる。
【０２０６】
前記の方法に従ってｕＰＡＲでの免疫により生成される抗体を包含する上記のアッセイ試薬は、上記のイムノアッセイを実行するため、適切な説明書及び他の必要な試薬と共にキットの形で提供することができる。キットは、用いられる特定のイムノアッセイによって、適切な標識及び他の包装された試薬及び材料（すなわち洗浄バッファーその他）を含有することもできる。上記のものなどの標準的なイムノアッセイはこれらのキットを用いて実行することができる。
【０２０７】
治療方法
本開示のｕＰＡＲ結合剤（例として抗体）は、ｕＰＡＲ発現細胞により仲介される増殖性障害の治療のための治療法としての使用を見出すことができる。例えば、１つ又は複数のｕＰＡＲ結合剤（例として抗体）は、ｕＰＡＲ発現がんの療法（予防及び診断後の療法を包含する）において、又はがん細胞がｕＰＡＲを発現するがんの診断において用いることができる。ｕＰＡＲ発現がんを持つ、持つ疑いがある、又はｕＰＡＲ発現がんを発達させるリスクがある対象は、本明細書に記述される療法及び診断について考えられる。かかる対象から得られる試料は、本開示の方法における使用に同じく適している。
【０２０８】
「治療」により、宿主を苦しめる病態に関連した症状のせめて寛解が達せられることが意味されるが、ここで寛解はパラメーター、例として治療されている病態に関連した症状の大きさのせめて低減をいうように広い意味で用いられる。それ自体として治療はまた、宿主が病態、又はせめて病態を特徴づける症状にそれ以上苦しまないように、病的状態又はせめてそれに関連した症状が完全に阻害される、例として発生するのを妨げられる、又は止められる、例として終結させられる状況を包含する。それ故に治療は、（ｉ）予防、すなわち、例として有害な状態への疾患の進行を妨げることといった臨床症状を発達させないようにさせることを包含する、臨床症状の発達のリスクを低減させること；（ｉｉ）阻害、すなわち、臨床症状の発達又はさらなる発達を抑止すること、例として腫瘍の負荷を減少させるように及び／又はがん転移を減少させるように例として活性のある疾患を緩和する又は完全に阻害すること、を包含する。かかる治療はまた、病的状態若しくはより進んだ疾患状態に向けた病的状態の進行又はせめてそれらに関連した症状が、低減され又は失速する状況も包含する。場合によっては、治療は、１つ又は複数の主題の抗体の投与を含む治療を受ける患者集団と治療を受けない対照集団との間の平均生存時間がより大きくなる状況を包含する。場合によっては、平均生存時間の増加は統計的に有意であり得る。
【０２０９】
種々の宿主が本方法に従って治療可能である。一般にかかる宿主は「哺乳類」又は「哺乳動物」であり、これらの用語は食肉目（例としてイヌ及びネコ）、齧歯目（例としてマウス、モルモット及びラット）及び霊長目（例としてヒト、チンパンジー及びサル）を包含する哺乳綱内の生物を記述するのに広く用いられる。多くの実施形態において、宿主はヒトであろう。場合によっては、宿主は胸腺欠損、ヌード又はその他の免疫不全である齧歯類（例としてマウス、ラット又はモルモット）であってもよい。場合によっては、宿主は、別の種由来のヒトの又は他の哺乳動物のがん細胞が宿主中に導入され、次いで１つ又は複数の主題の抗体が結果として生じる腫瘍を治療するために投与される異種指向性がんモデルを表してもよい。
【０２１０】
がん治療の方法において、ｕＰＡＲに特異的な１つ又は複数の剤（例として抗体）を投与することは、抗体に曝露されたがん性細胞の増殖の低減及び／又はがん細胞の転移阻害の低減を促進する。本方法はｕＰＡＲに特異的な１つ又は複数の剤（例として抗体）を含有する薬学的に許容される製剤の有効量を対象に投与することを伴う。剤は細胞成長及び／又は転移を遅延させる又はそうでなければ抑止する作用を持つことができる。がん細胞に対する剤の作用は用量依存的であることができ、それ故に調整可能である。
【０２１１】
関係する実施形態において、治療される対象は、非がん性の細胞と比べて過度に活性のある又は過度に大量のｕＰＡＲを発現する細胞を所有する。ｕＰＡＲはがん細胞などの細胞表面上に発現することができる。この態様は、ｕＰＡＲを発現する又は呈示する細胞は本開示の結合抗体を使用した治療をより受け入れることができるという点で、本開示の方法の文脈において有益であることができる。抗体は、例えばｕＰＡＲの存在が検出可能でない時点で療法が開始される場合に対象に投与されることができ、それ故に限定的であることは意図されない。疾患症状の最初の徴候の前に、潜在的な疾患の最初の徴候の際に又は疾患の診断の前若しくは後に抗体療法を開始することも可能である。
【０２１２】
がん
ｕＰＡＲ結合剤（例として抗体）組成物は、細胞外でのアクセスが可能な細胞表面上にｕＰＡＲを発現するがんの治療中の抗がん療法において用いられ得る。
【０２１３】
正常なヒト組織中のｕＰＡＲ及びプラスミノーゲン活性化系の他のメンバーの存在は、一過性で低い存在量であるように見える。この存在は、転移性がん細胞を包含するがん細胞などの異常な細胞の中でのみ高頻度である。ｕＰＡＲの高レベルの発現は主にがん細胞中に存在することから、主題の組成物を使用した治療は、存在を検出してがんの成長を局在化させるのに用いることができ、かつ、がん増殖の成長を遮断することができる。ｕＰＡＲは非がん性の細胞と比較してがん細胞上でより高いレベルで発現し得るが、これは本明細書に開示される療法の限定ではないことに留意すべきである。
【０２１４】
本明細書に記述される主題の組成物は、例えば例として腫瘍サイズを低減させるといったがん性細胞の増殖を低減させるため、腫瘍の負荷を低減させるため、転移潜在力を減少させるため（例としてがん細胞の移動を低減させるため）及び／又は患者における転帰を改善するため、対象（例としてヒト患者）に投与することができる。言い換えれば、組成物は、例としてがん転移につながるあらゆるシグナル伝達イベントを減少させることにより、細胞成長、細胞分裂を低減させるのに、及び／又はがん細胞の浸潤性を減少させるのに用いることができる。がんの浸潤性を減少させるいくつかの方法は、がん細胞の元のがん部位を離れる能力を低減させること、がん細胞の移動能力及び移動後のがん細胞の身体領域への付着能力を低減させることを伴う。
【０２１５】
とりわけ抗体療法を受け入れられるがんは、細胞増殖のマーカー（例としてＫｉ−６７抗原）を実験することにより、及び／又は１つ若しくは複数の主題の抗体（例として３Ｃ６、２Ｇ１０、２Ｅ９）により若しくはｕＰＡＲに特異的な他の抗体により（例としてインビトロアッセイにおけるように）結合されるｕＰＡＲの存在／アクセス可能性を実験することにより、同定することができる。
【０２１６】
がんのタイプ
抗がん療法が前記の抗体組成物の投与を含む場合、抗がん療法はとりわけがん細胞に向けられたものであることができる。例えば１つ又は複数の主題の抗体（例として３Ｃ６、２Ｇ１０、２Ｅ９）は、ｕＰＡＲ発現がん細胞を結合し得る。例において説明されるように、３Ｃ６、２Ｇ１０及び２Ｅ９は、結合するのに、同様にｕＰＡＲの様々な機能的活性を阻害するのに高度に有効である。
【０２１７】
ｕＰＡＲを呈示するがんの例は上皮起源のがん細胞を包含するが、これに限定されるものではない。いくつかの例は、扁平上皮癌、血液系新生物、胃がん、リンパ節、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん及び免疫学的な障害である。他のより具体的ながんの例は、上で議論されるように、乳がん（例としてトリプルネガティブの乳房腫瘍）、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、白血病、線維肉腫、神経膠芽腫及び前立腺がんを包含する。
【０２１８】
併用療法
本明細書に記述される治療方法は、１つ又は複数の他の療法と組み合わせたｕＰＡＲ剤（例として抗体）の投与を包含することができる。下の併用療法は、１つの療法のみが投与される処方計画と比べて相加的又は相乗的な利点を提供することができる。
【０２１９】
併用療法の例は、２以上のタイプの剤（例として抗体）を対象に投与することを伴う。医薬組成物について上記されるように、治療方法は、例えば１つ又は複数の主題の抗体を包含する異なるタイプの抗体を少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又はそれ以上、同時に又は順次投与することを伴い得る。抗体は、結合するｕＰＡＲのエピトープが相違してもよい。本方法は、例えば、療法の必要がある対象にクローン３Ｃ６由来の抗体並びにクローン２Ｇ１０及び／又は２Ｅ９由来の抗体を投与することを伴ってもよい。抗体はまた、ｕＰＡＲのエピトープと同一のもの又は重複しているものを結合してもよい。本方法は、例えば各々ｕＰＡＲとｕＰＡとの間の相互作用を阻害する２以上の抗体、若しくは各々ｕＰＡＲとインテグリンとの間の相互作用を阻害する２以上の抗体、若しくは各々ｕＰＡＲとビトロネクチンとの間の相互作用を阻害する２以上の抗体、若しくは各々ｕＰＡＲとｕＰＡＲＡＰとの間の相互作用を阻害する２以上の抗体を投与することを伴ってもよく、又は本方法はｕＰＡＲに結合するが１つ又は複数の先の相互作用を阻害しない２以上の抗体を投与することを伴ってもよく、又はそれらの任意の組み合わせを伴ってもよい。
【０２２０】
併用療法の方法は、様々なやり方でがんを治療することができる。主題の組成物について上述されるように、主題の方法は、１つ又は複数のｕＰＡＲシグナル伝達経路を阻害する１つ又は複数の剤を利用することができる。２以上のシグナル伝達経路が剤による標的にされる場合、がん細胞の細胞接着、増殖及び／又は移動の相乗的阻害が存在することができる。例えば、結合剤により阻害することができるあるシグナル伝達経路はｕＰＡのｕＰＡＲへの結合により仲介される一方、別の経路はインテグリン（例としてα５β１又はα３β１などのβ１インテグリン）のｕＰＡＲへの結合により仲介される。
【０２２１】
主題の抗体と一緒に投与されてもされなくてもよい付加的な標準抗がん治療薬は、免疫療法、化学療法剤及び外科手術（例として下にさらに記述されるもの）を包含するが、これらに限定されるものではない。加えて主題の抗体の治療的投与は、抗がん療法を使用した対象の治療後の処置であることもでき、ここで抗がん療法は例えば外科手術、放射線療法、化学療法剤の投与その他であることができる。抗ｕＰＡＲ抗体を利用する免疫療法と組み合わせて主題の抗体を用いたがん療法は、とりわけ興味深い。
【０２２２】
例えば主題の抗体は、１つ若しくは複数の化学療法剤（例としてシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン（ＣＨＯＰ））と組み合わせて、並びに／又は放射線治療と組み合わせて、並びに／又は外科的介入（例として腫瘍を除去するための外科手術前後のもの）、放射線療法、骨髄移植、生物学的応答調節物質治療及び先のものの一定の組み合わせと組み合わせて、投与することができる。放射線療法は、ビームなどの外部から適用される線源又は小放射線源の移植によるもののいずれかから送達されるＸ線又はガンマ線を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２２３】
組み合わせでの使用に適している化学療法剤（ｕＰＡＲ抗体と別々に処方されるか、共に処方されるかのいずれか）は、種々の剤を包含することができる。かかる剤の例は下により詳細に議論される。
【０２２４】
化学療法剤はがん細胞の増殖を低減させる非ペプチド性（すなわち非タンパク質性）化合物であってもよく、細胞傷害剤及び細胞増殖抑制剤を範囲に含む。化学療法剤の非限定的な例は、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ツルニチニチソウ）アルカロイド及びステロイドホルモンを包含する。
【０２２５】
細胞の増殖を低減させるように働く剤は、当該技術分野で知られていて、広く用いられる。かかる剤はナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩及びトリアゼンなどのアルキル化剤を包含し、メクロレタミン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチルＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスフォルアミン、ブスルファン、ダカルバジン及びテモゾロミドを包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２２６】
代謝拮抗剤は葉酸アナログ、ピリミジンアナログ、プリンアナログ及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤を包含し、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン及びゲムシタビンを包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２２７】
適切な天然物及びそれらの誘導体（例としてツルニチニチソウアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン及びエピポドフィロトキシン）は、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド、例としてビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなど；ポドフィロトキシン、例としてエトポシド、テニポシドなど；抗生物質、例としてアントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びモルフォリノ誘導体など；フェノキシゾンビスシクロペプチド（ｐｈｅｎｏｘｉｚｏｎｅ  ｂｉｓｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）、例としてダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例としてブレオマイシン；アントラキノン配糖体、例としてプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例としてミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン（ａｚｉｒｉｎｏｐｙｒｒｏｌｏ  ｉｎｄｏｌｅｄｉｏｎｅ）、例としてマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例としてシクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシンなど；その他を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２２８】
他の抗増殖性の細胞傷害剤は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イフォスアミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）及びドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）である。
【０２２９】
抗増殖活性を持つ微小管作用剤（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）もまた使用に適していて、アロコルヒチン（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（例としてＮＳＣ３３４１０）、ドルスタチン１０（ｄｏｌｓｔａｔｉｎ１０）（ＮＳＣ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ＴＡＸＯＬ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステリン（ｔｒｉｔｙｌ  ｃｙｓｔｅｒｉｎ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン；エポチロンＡ、エポチロンＢ、ディスコデルモリドを包含するがこれらに限定されない天然及び合成エポチロン；エストラムスチン、ノコダゾールその他を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２３０】
使用に適しているホルモン調節因子及びステロイド（合成アナログを包含する）は、例としてプレドニゾン、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド；エストロゲン及びプロゲスチン、例としてカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェンなど；並びに副腎皮質抑制剤、例としてアミノグルテチミド；１７α−エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（フェアストン）及びＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）を包含するが、これらに限定されるものではない。エストロゲンは増殖及び分化を刺激し、それ故エストロゲン受容体に結合する化合物はこの活性を遮断するのに用いられる。コルチコステロイドはＴ細胞の増殖を阻害し得る。
【０２３１】
他の化学療法剤は、金属錯体、例としてシスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、カルボプラチンなど；ウレア、例としてヒドロキシウレア；及びヒドラジン、例としてＮ−メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフールなどを包含する。他の目的抗増殖剤は、免疫抑制剤、例としてミコフェノール酸、サリドマイド、デソキシスパガリン（ｄｅｓｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、アザスポリン（ａｚａｓｐｏｒｉｎｅ）、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）；ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ＺＤ１８３９、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルフォリニル）プロポキシ）キナゾリン）などを包含する。
【０２３２】
プロテオソーム阻害剤、及びキナーゼ阻害剤、
【０２３３】
「タキサン」は、パクリタキセル、同様に任意の活性のあるタキサン誘導体又はプロドラッグを包含する。「パクリタキセル」（例えばドセタキセル、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル製剤）、パクリタキセルの１０−デスアセチルアナログ及びパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアナログなどのアナログ、製剤及び誘導体を包含することが本明細書で理解されるべきである）は当業者に知られている技術を利用して容易に調製され得るし、又は例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．（タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）由来のＴ７４０２、又はタキサス・ヤナネンシス（Ｔａｘｕｓ  ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓ）由来のＴ−１９１２）を包含する種々の市販源から得られ得る。
【０２３４】
パクリタキセルとは、通常の化学的に利用可能な形態のパクリタキセルのみならず、アナログ及び誘導体（例として上述のＴＡＸＯＴＥＲＥ  ドセタキセル）並びにパクリタキセルコンジュゲート（例としてパクリタキセルＰＥＧ、パクリタキセルデキストラン又はパクリタキセルキシロース）をもいうことが理解されるべきである。
【０２３５】
用語「タキサン」内にまた包含されるのが、親水性誘導体及び疎水性誘導体の両方を包含する種々の知られている誘導体である。タキサン誘導体は、ガラクトース及びマンノース誘導体；ピペラジノ；タキサン誘導体；６−チオ誘導体；スルフェンアミド誘導体；並びにタキソール誘導体を包含するが、これらに限定されるものではない。タキサン誘導体はさらにパクリタキセルのプロドラッグを包含し得る。
【０２３６】
併用療法が投与される場合、抗体組成物の投与以外の療法又は治療は、主題の抗体の投与と同時から投与の前又は後の５時間以上までの間のいつでも、例として投与の前又は後の１０時間、１５時間、２０時間以上において投与することができる。例として主題の抗体が別の治療的処置の前又は後に投与される場合、主題の抗体及び他の治療的介入は、順次投与又は適用することができる。あるいは例として主題の抗体及び第二の療法が同時に投与され、例として第二の療法が薬剤である時に対象に投与される２つの別々の製剤又は単一の組成物中に組み合わされたものとして主題の抗体と一緒に投与することができる場合、主題の抗体及び他の療法は同時に投与される。上に説明されるように順次投与されるか同時に投与されるかにかかわらず、治療は本開示の目的のために一緒に又は組み合わせて投与されると考えられる。
【０２３７】
投薬
本方法において、有効量の剤（例としてｕＰＡＲ抗体）を必要とする対象に投与される。例えばいくつかの実施形態において、ｕＰＡＲ結合剤はｕＰＡＲ発現がん細胞の成長及び／又は増殖の阻害を促進することができる。投与される量は、投与の目標、治療される個体の健康及び物理的なコンディション、年齢、望まれる回復の度合、主題の剤の製剤、治療する臨床医の医学的状況についての査定及び他の関連性のある因子によって変動することができる。投与される量は、通例の臨床試験を通じて決定することができる比較的広い範囲の中になるであろうと予想される。例えばがん細胞の成長を阻害するのに利用される主題の剤の量は、その他の点で不可逆的に対象に毒性となる量（すなわち最大耐性用量）のおおよそを超えない。他の場合において、この量は毒性の閾値の前後か又はずっと低いものであるが、なお有効な濃度範囲にあり、又は閾値用量と同じくらい低い。
【０２３８】
個々の用量は対象に対する測定可能な作用を生み出すのに必要とされる量を典型的に下回らず、抗体の吸収、分布、代謝及び排泄（「ＡＤＭＥ」）についての薬物動態及び薬理に基づいて、それ故に対象内での組成物の性質に基づいて決定され得る。これは投与の経路、同様に投薬量についての考慮を包含していて、例えば非経口の（全身性又は局所性作用のために消化管以外の経路により適用される）適用のために調整することができる。例えば主題の抗体の投与は典型的には注射を通じたものであり、注射はしばしば静脈内、筋肉内、腫瘍内、頭蓋内、動脈内、眼球内、髄腔内、又はそれらの組み合わせである。
【０２３９】
ｕＰＡＲ結合剤（例として抗体）は注入又は局所注射により投与され得る。剤はまた、がん性の細胞を除去するための外科的介入などの他の治療的介入の前に、同時に、又は後に投与されることもできる。上述のとおり、ｕＰＡＲ抗体はまた併用療法の一部として投与されることもでき、併用療法においては免疫療法、がん化学療法又は放射線療法のうちの少なくとも１つが対象に投与される（上に詳細が記述される）。
【０２４０】
剤の性質及び対象内でのその相当する生物学的活性は、目的の標的に存在する剤の画分に対して典型的に判断される。例えばひとたび投与された抗体は、がん細胞及びがん性の組織の中でｕＰＡＲ又は材料を濃縮する他の生物学的標的と共に集積することができる。それ故に目的の標的中に経時的に集積するように抗体が投与される投与計画は、個々の用量を低下させるための戦略の一部であることができる。このことはまた、例えばインビボでより緩徐に取り除かれる抗体の用量はインビトロのアッセイから計算される有効濃度と比べてより低下させることができる（例としてインビトロの有効量はｍＭ濃度に近く、対してインビボはｍＭ濃度より少ない）ことも意味する。
【０２４１】
例として用量又は投与計画の有効量は、ｕＰＡＲを阻害又は結合する所定の抗体のＩＣ５０から判断することができる。「ＩＣ５０」により、インビトロの５０％阻害に必要とされる薬剤の濃度が意図される。あるいは有効量は所定の抗体濃度のＥＣ５０から判断することができる。「ＥＣ５０」により、インビボの最大作用の５０％を得るのに必要とされる血漿濃度が意図される。
【０２４２】
一般的に、本開示のｕＰＡＲ結合剤に関して、有効量は計算されるＩＣ５０の２００倍を通常は超えない。典型的に、投与される抗体の量は計算されるＩＣ５０の約２００倍未満、約１５０倍未満、約１００倍未満であり、多くの実施形態では約７５倍未満、約６０倍、５０倍、４５倍、４０倍、３５倍、３０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍未満、さらに約８倍未満又は２倍である。１つの実施形態において、有効量は計算されるＩＣ５０の約１倍から５０倍、時に計算されるＩＣ５０の約２倍から４０倍、約３倍から３０倍又は約４倍から２０倍である。他の実施形態において有効量は計算されるＩＣ５０と同じであり、ある実施形態において有効量は計算されるＩＣ５０より多い量である。
【０２４３】
有効量は計算されるＥＣ５０の１００倍を超えないものであり得る。例えば投与される抗体の量は計算されるＥＣ５０の約１００倍未満、約５０倍未満、約４０倍、３５倍、３０倍又は２５倍未満であり、多くの実施形態では約２０倍未満、約１５倍未満、さらに約１０倍、９倍、９倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍又は１倍未満である。１つの実施形態において、有効量は計算されるＥＣ５０の約１倍から３０倍、時に計算されるＥＣ５０の約１倍から２０倍、又は約１倍から１０倍である。他の実施形態において有効量は計算されるＥＣ５０と同じであり、ある実施形態において有効量は計算されるＥＣ５０より多い量である。
【０２４４】
有効量はアッセイから、安全性及び漸増及び量域臨床試験、個々の臨床医−患者関係、同様に本明細書に記述され下の実施例部で説明されるものなどのインビトロ及びインビボのアッセイから容易に経験的に決定することができる。
【０２４５】
ＩＣ５０は、インビトロで剤がｕＰＡＲ（例としてｕＰＡＲ単独、又はインテグリンを伴うｕＰＡＲなどの複合化されたｕＰＡＲ）に結合するのを阻害することにより計算され得る。この態様は、３Ｃ６抗体がｕＰＡＲに結合するのを阻害する目的の剤の能力を査定することにより行われることができる。一般的に本手法は、標準的なＥＬＩＳＡにより行われるが、これはプレートが例に記述されるようにｕＰＡＲを使用して、濃度約１μｇ／ｍｌでコーティングされ、次いで抗体結合の阻害及びＩＣ５０を決定するため、実験例に記述されるように処理され利用されるものである。これらの剤及び本目的の様々な態様に適している他の剤が利用することができる。
【０２４６】
投与の経路
方法を実施するのにおいて、投与の経路（主題の剤が療法又は診断の必要がある対象中に持ち込まれるパス）は変動し得るが、ここでは主題の抗体についての代表的な投与の経路が下により高度に詳細に記述される。主題の剤単独又は上記の組み合わせは、全身的に（例として非経口投与により、例として静脈内経路により）、又は局所的に（例として局所の腫瘍部位において、例として腫瘍内投与により（例として固形腫瘍中に、リンパ腫又は白血病における転移リンパ節中に）、固形腫瘍を供給する血管内への投与など）、投与することができる。
【０２４７】
非経口投与に適している製剤は、水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液を包含し、この注射溶液は抗酸化剤、バッファー、静菌薬、並びに製剤を予定される受容者の血液と等張にする溶質、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び保存料を包含することができる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含有することができる。製剤は単回用量又は複数回用量でアンプル及びバイアルなどの密封容器中に存在することができ、例えば注射については水などの滅菌液体賦形剤の使用直前の添加のみを必要とする冷凍乾燥された（凍結乾燥された）コンディションで保存することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、前記の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【０２４８】
本開示の製剤は、吸入を通じて投与されるエアロゾル製剤にされることもできる。これらエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素その他などの加圧された許容される噴霧剤中に入れられることができる。これらエアロゾル製剤はまた、噴霧器又はアトマイザ中での使用のためなどの非加圧調製物のための医薬としても処方され得る。
【０２４９】
坐薬製剤はまた、乳化基剤又は水可溶性基剤などの種々の基剤と混合することによって提供される。膣投与に適している製剤はペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体として存在し得る。
【０２５０】
シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁液などの直腸投与のための単位剤形が投与され得るが、ここで各投薬単位は抗体組成物を含有する組成物の予め決められた量を含有する。同様に注射又は静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水又は別の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物中で抗体を含み得る。
本明細書に用いられる用語「単位剤形」とはヒト及び動物の対象のための単位の投薬として適切な物理的に分離した単位をいい、各単位は薬学的に許容される希釈剤、担体又は媒体との関連において望まれる作用を生み出すのに十分な量に計算された、本開示の化合物の予め決められた量を含有する。新規の単位剤形の明細は、利用される特定の化合物及び達せられる作用、並びに宿主中での各化合物に関連した薬力学に依存する。
【０２５１】
スクリーニングの方法
本開示のスクリーニング方法は、ｕＰＡＲを結合する結合剤についてのスクリーニングに利用することができる。本方法は、ｕＰＡＲを候補の剤と接触させること及び候補の剤のｕＰＡＲとの結合を検出することを伴うことができる。本方法はまた、ｕＰＡＲを候補の剤と接触させること、並びにｕＰＡＲを候補の剤と接触させるステップの前、後又は最中にｕＰＡＲを１つ又は複数の知られているｕＰＡＲのリガンドと接触させること、次いで候補の剤のｕＰＡＲとの結合、又は１つ若しくは複数のリガンドのｕＰＡＲとの結合、又は候補の剤及び１つ若しくは複数のｕＰＡＲリガンド両方の結合を検出することを伴ってもよい。本方法はまた、ｕＰＡＲ結合剤をスクリーニングするための、抗体、アプタマーをコードするコンストラクトのライブラリ、及び／又は小分子のライブラリの使用を伴ってもよい。結合剤は、その強力なｕＰＡＲ活性の阻害、成熟したｕＰＡＲの発現の阻害、及び／又はｕＰＡＲと相互作用するタンパク質（リガンド及び／又はインテグリン、例としてβ１インテグリン）についての結合アフィニティーの阻害で選択され得る。本方法は当該技術分野で知られている方法に従って遂行され得る。
【０２５２】
簡潔には、ｕＰＡＲ（例としてｕＰＡＲ単独又はそのリガンド及び／又はインテグリンと複合化したｕＰＡＲ）は候補の剤と接触させられる。候補の剤のｕＰＡＲへの結合は、ｕＰＡＲについての結合アフィニティーがあるかを見るために測定される。リガンド（例としてｕＰＡ、ビトロネクチン及び／又はｕＰＡＲＡＰ）への、又はインテグリンファミリーのメンバーへのｕＰＡＲの結合を破壊する候補の剤の能力もまた査定される。ｕＰＡＲのその相互作用する相手（例としてβ１インテグリン）への結合を破壊するのに有効な候補の剤は、診断的及び治療的組成物並びに使用方法において用いられる可能性のある剤に選択される。ｕＰＡＲのその相互作用する相手への結合を破壊することができる候補の剤は、ｕＰＡＲのその相互作用する相手への結合アフィニティーを競合的に又は非競合的に減少させることができるものを範囲に含む。
【０２５３】
可能性のある剤のスクリーニングに用いられ得るｕＰＡＲは、前記のｕＰＡＲを包含する。主題のスクリーニング方法において用いられる代表的なｕＰＡＲは、完全長ｕＰＡＲ、成熟ｕＰＡＲ、ＧＰｉアンカーを欠くｕＰＡＲの断片などのｕＰＡＲの断片、ｕＰＡＲ単独又は１つ若しくは複数のリガンドに若しくはインテグリンファミリーのメンバーに結合したｕＰＡＲを包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２５４】
スクリーニング方法の例において、ｕＰＡＲ（例としてｕＰＡ又はβ１インテグリンの存在下又は非存在下のｕＰＡＲ）は、疎水性の吸着、ビオチン−アビジン相互作用及びＮｉ２＋−６×Ｈｉｓ相互作用などの共有結合性又は非共有結合性の相互作用を通じて、ＥＬＩＳＡプレート上又はビーズ上に固定され得る。候補の剤の集団は次いで固定化ｕＰＡＲと共にインキュベートされ、洗浄され、回収される。選択の間、結合された候補は回収されて同定される。複数の連続的な選択ラウンドは、ｕＰＡＲに特異的な結合剤として働く候補の選択を確実にする。プラズマ共鳴、ウエスタンブロット、機能アッセイ（例として浸潤性、プロテアーゼ活性及び／又は下流標的のリン酸化）、蛍光活性化細胞分取などの他の方法はまた、ｕＰＡＲを結合できる、又はｕＰＡＲを結合して１つ若しくは複数のリガンド若しくはβ１インテグリンへのその相互作用を阻害できる剤をスクリーニングして選ぶのに用いることもできる。方法がプロテアーゼアッセイを伴う場合、蛍光発生ペプチド又は発色基質（例としてｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ  ＵＫ）が当該技術分野で知られている方法に従って用いられてもよい（例としてＺｉｍｍｅｒｍａｎら（１９７８年）ＰＮＡＳ  ７５：７５０〜７５３ページ）。切断される基質の量又は基質が切断される速度の変化を検出することにより、剤は、ｕＰＡＲに結合されるプロテアーゼ活性の量を変化させるその能力に基づいて選択されるであろう。スクリーニング方法において利用される様々なアッセイは、候補の剤の存在下又は非存在下でのｕＰＡＲの結合及び／又は活性を比較することを伴うことができる。
【０２５５】
候補のｕＰＡＲ結合剤はまた、剤がリガンド結合部位又はインテグリン結合部位のいずれかについてのアフィニティーを持つことが知られている部位を含有するように操作してもよい。
【０２５６】
また本開示により考えられるのは、本明細書に記述される候補のｕＰＡＲ結合剤をコードする核酸コンストラクトのライブラリである。ライブラリは、本明細書に開示されるあらゆる抗体に共通するポリペプチド領域（例としてフレームワーク領域又は重鎖ＣＤＲ３）を１つ又は複数持つであろう複数の候補のプロテアーゼ結合剤をコードする。
【０２５７】
キット及びシステム
また提供されるのが、上記のように本方法を実施することにおける使用を見出し得るキット及びシステムである。例えば、キット及びシステムは抗ｕＰＡＲ抗体（例として３Ｃ６、２Ｅ９若しくは２Ｇ１０又は本明細書に記述される任意の抗体）、かかる抗体をコードする核酸（特に３Ｃ６、２Ｅ９又は２Ｇ１０の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲをコードする核酸）、又はかかる核酸を含有する組換え細胞などの本明細書に記述される組成物の１つ又は複数を包含し得る。キットの他の任意選択の構成成分は、抗ｕＰＡＲ抗体を投与するための及び／又は診断アッセイを実施するためのバッファーなどを包含する。キットの組換え核酸はまた、非３Ｃ６、２Ｅ９又は２Ｇ１０コード核酸の定常領域へのそれらのライゲーションを促進するため、制限部位、マルチクローニングサイト、プライマー部位などを持ってもよい。キットの様々な構成成分は別々の容器中に存在してもよく、又はある適合性構成成分は望まれる場合は単一の容器中で予め組み合わされていてもよい。
【０２５８】
本方法を実施するためのキット及びシステムは、本明細書に記述される抗体組成物を包含する１つ又は複数の医薬製剤を包含し得る。そのように、キットは１つ又は複数の単位投薬として存在する単一の医薬組成物を包含してもよい。なお他の実施形態において、キットは２以上の別々の医薬組成物を包含してもよい。
【０２５９】
上の構成成分に加えて、キットは方法を実施するための説明書をさらに包含し得る。これらの説明書は種々の形態でキットの中に存在してもよく、そのうちの１つ又は複数はキット中又はキット上に存在してもよい。これら説明書が存在し得る１つの形態は、適切な媒体又は基板上に印刷された情報としてのものであり、例として情報が印刷された１枚又は複数枚の紙、キットの包装の中又は上、添付文書の中などである。なお別の手段は、情報が記録されているコンピュータ読み取り可能な媒体、例としてフロッピーディスク、ＣＤ、フラッシュドライブ、サムドライブなどであろう。存在し得るなお別の手段は、離れたサイトにおける情報にアクセスするためにインターネットを通じて用いられ得るウェブサイトのアドレスである。任意の好都合な手段がキット中に存在し得る。
【０２６０】
キットは細胞増殖性疾患を患う宿主を治療することにおける使用のために提供され得る。このキットは、ｕＰＡＲに特異的な抗体並びに対象中のがん細胞の成長及び／又は転移を阻害することによりがん性の病態を患う宿主を治療する方法における医薬組成物の有効な使用のための説明書を含む医薬組成物を包含する。かかる説明書は、適当な取り扱い特性、投与計画及び投与の方法その他を包含し得るのみならず、疾患に関連したｕＰＡＲについて対象を任意選択でスクリーニングするための説明書をさらに包含することができる。この態様は本開示の抗体を使用した治療への対象の潜在的な応答性を判断するのにおいてキットの実施者を補助することができるが、これはがんのタイプ及び成長ステージに対する治療のタイミング及び持続期間を包含するものである。それ故に別の実施形態において、キットは、細胞外でのアクセスが可能ながん細胞表面上のｕＰＡＲを検出するための、３Ｃ６、２Ｅ９及び／又は２Ｇ１０などの抗体又は他の試薬をさらに包含してもよい。キットはまた、蛍光団などの検出可能な標識とのコンジュゲートを含有する抗体を包含してもよい。
【０２６１】
本明細書で利用される用語「システム」とは、本方法を実施する目的のために寄せ集められた単一の又は不同性の組成物中に存在する、本明細書に記述される抗体及び１つ又は複数の第二の治療剤の収集物をいう。例えば、寄せ集められて対象に共投与される別々に得られたｕＰＡＲに特異的な抗体及び化学療法剤形は、本開示によるシステムである。
【０２６２】
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであり、決してその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２６３】
本明細書に記述される実施例及び実施形態は単に説明の目的であること、並びにそれらに照らした様々な修飾又は変更は当業者に示唆されるであろうもので、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に包含されるものであることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は全ての目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６４】
材料と方法
以下の方法及び材料が下の実施例において用いられた。
【０２６５】
ｕＰＡＲの発現及び精製
ヒト可溶性ｕＰＡＲのｃＤＮＡ（残基１〜２７７）は昆虫細胞発現ベクターｐＡＣｇｐ６７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にライゲーションされた。ｐＡＣｇｐ６７及びＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ  ＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、製造業者のプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）９（Ｓｆ９）細胞中にコトランスフェクトされた。感染細胞の培養上清はトランスフェクション後７日で収集された。
【０２６６】
ｕＰＡＲは抗体アフィニティークロマトグラフィーにより捕捉され、溶出され、次いで一晩透析された後、溶出のために０から１ＭまでのＮａＣｌの直線勾配を用いてＭｏｎｏＱ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラム上で高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより精製された。
【０２６７】
ファージディスプレイライブラリの構築
完全なヒトナイーブＦａｂファージディスプレイライブラリはｄｅ  Ｈａａｒｄら（１９９９年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８〜１８２３０ページにより記述される方法を用いて構築された。簡潔には、末梢血リンパ球ＲＮＡがｃＤＮＡに変換された。結果として生じたライブラリは、重鎖にＣ末端へキサヒスチジン及びｃ−ｍｙｃタグを融合するファージミドベクター中にクローニングされた。大スケールのファージレスキューはＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて実施された。
【０２６８】
ファージディスプレイのパニング
ヒト可溶性ｕＰＡＲは５０ｍＭ炭酸ナトリウム  ｐＨ９．５中の１０μｇ／ｍｌでＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６ウェルマイクロプレート（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に固定され、結合されていないｕＰＡＲが洗浄により除去された。ｕＰＡＲコーティングされたウェルは次いでミルクでブロッキングされ、洗浄され、予めブロッキングされた一定分量のファージライブラリがウェル間に分配された。結合されていないファージが洗浄で除かれ、結合されたファージは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ））ＴＧ１細胞を添加することにより回収された。感染ＴＧ１細胞は選択プレート上に広げられ、一晩増殖され、プレートのスクレーピングにより収集された。ファージは液体培地中でＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ感染を使用して増幅された。Ｆａｂをディスプレイするファージが培養上清から収集され、ＰＥＧ沈殿により濃縮された。
【０２６９】
第二及び第三のパニングのラウンドは第一ラウンドと同様に実行されたが、弱く結合されたファージを除去するためにいっそうストリンジェントにされた。
【０２７０】
培養上清中のＦａｂの発現
ファージ感染された大腸菌ＴＧ１コロニーは選択培地中で増殖され、対数増殖を示す培養液へのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；終濃度１ｍＭ）の添加によりＦａｂ発現が誘導された。培養液は一晩振とうされ、周辺質のＦａｂ発現が誘導されて、その小部分が培養上清中に漏出した。一晩のインキュベーションに続いて、漏出したＦａｂを含有するＴＧ１培養上清が遠心分離により集められた。
【０２７１】
周辺質画分の調製
９６ウェルプレートスケールで増殖され、ＩＰＴＧによりＦａｂ発現を誘導されたファージ感染ＴＧ１培養液からの細胞ペレットは、５０μｌの１００ｍＭトリス  ｐＨ８．０、２５％グルコース、１００μｇ／ｍｌ鶏卵白リゾチーム中に再懸濁され、室温で３０分間振とうされた。３００μｌの氷冷水が次いで添加され、強力なピペッティングで混合された。周辺質画分は遠心分離により清澄化された。
【０２７２】
Ｆａｂの精製
個々のＦａｂクローンは大腸菌ＢＬ２１細胞中で（ＴＧ１細胞について記述されるように）発現された。周辺質画分は、製造業者のプロトコールに従ってＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を用いた固定化ニッケルキレートクロマトグラフィーにより精製された。
【０２７３】
精製されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標品を用いたＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して濃度が推定された。各Ｆａｂは、製造業者のプロトコールに従ってＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロットにより発現を分析された。ウエスタンブロットは、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）化学発光試薬（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を用いてＴｙｐｈｏｏｎ撮像装置（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）上で可視化された。
【０２７４】
ｕＰＡＲのＥＬＩＳＡ
ｕＰＡＲ結合Ｆａｂは、５０μｌの１μｇ／ｍｌ  ｕＰＡＲでコーティングされたＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート上で検出された。Ｆａｂ（培養上清、周辺質画分、又は２２．５μｇ／ｍｌの精製されたタンパク質のいずれか）はプレートのウェルにアプライされ、次いで洗浄された。結合されたＦａｂは１００μｇ／ｍｌのＨＲＰコンジュゲートされた抗ｍｙｃ抗体クローン９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出された。ｕＰＡＲでコーティングされていない３つのウェルは非特異的なＦａｂ結合の対照として包含された。培養上清を用いたＥＬＩＳＡアッセイについて、結合された９Ｅ１０−ＨＲＰは、製造業者のプロトコールに従って４５０ｎｍでのエンドポイント解析のための１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出された。全ての他の実験について、結合された９Ｅ１０−ＨＲＰはＴＭＢ基質存在下の６５０ｎｍでの吸光度の変化速度として検出された。
【０２７５】
配列解析
全３６個のｕＰＡＲ結合クローンの重鎖及び軽鎖の発現カセットが配列決定された。重鎖及び軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）はＣｌｕｓｔａｌＷ２サーバー（Ｌａｒｋｉｎら（２００７年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：２９４７〜２９４８ページ）上で整列された。
【０２７６】
競合的ＥＬＩＳＡ
９５μｌの各Ｆａｂは、６ｎＭの高分子量ｕＰＡ（ＨＭＷ−ｕＰＡ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）と組み合わされた。結果として生じた混合物は、前のセクション中で記述されたｕＰＡＲコーティングされたマイクロプレートウェルと共にインキュベートされた。ｕＰＡＲでコーティングされないウェルは、ＨＭＷ−ｕＰＡの何らかの非特異的結合についての対照のために包含された。ｕＰＡＲでコーティングされＨＭＷ−ｕＰＡなしで全てのＦａｂに対してインキュベートされたウェルは、非特異的なプロテアーゼ活性の対照のために包含された。最大のｕＰＡ結合は、何らのＦａｂなしでＨＭＷ−ｕＰＡをｕＰＡＲコーティングされたウェルと共にインキュベートすることにより決定された。結合されていないＦａｂ及びＨＭＷ−ｕＰＡは洗浄により除去された。結合されたＨＭＷ−ｕＰＡの量は、発色性のｕＰＡ基質であるＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ（登録商標）ＵＫ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて処理されたウェル中でタンパク質分解活性をアッセイすること、及び４０５ｎｍでの吸光度の変化速度をモニターすることにより測定された。ウェルはさらにアッセイされ、前のセクション中で記述されたように９Ｅ１０−ＨＲＰを用いて結合されたＦａｂの存在が検出された。
【０２７７】
Ｆａｂ存在下でのｕＰＡ活性
Ｆａｂは２つのやり方でｕＰＡの直接的な阻害について試験された。第一に、１μｇ／ｍｌのＨＭＷ−ｕＰＡがｕＰＡＲコーティングされたプレート中でインキュベートされた；結合されていないＨＭＷ−ｕＰＡは洗浄により除去され、Ｆａｂは２５μｇ／ｍｌでウェルに添加された。Ｆａｂの存在下及び非存在下でのＨＭＷ−ｕＰＡの活性は上記のように測定された。第二に、１０ｎＭ  ＨＭＷ−ｕＰＡ及び低分子量ｕＰＡ（ＬＭＷ−ｕＰＡ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）が４５０ｎＭ  Ｆａｂの存在下及び非存在下でマイクロタイタープレート中でインキュベートされた。ＨＭＷ−ｕＰＡ及びＬＭＷ−ｕＰＡの活性は、上記のようにタンパク質分解活性をアッセイすることにより３連で測定された。
【０２７８】
ヒトＩｇＧ１抗体の発現及び精製
重鎖及び軽鎖Ｆａｂ配列はＰＣＲにより増幅され、ｐＴＴ５ベクター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ）の改変体であるベクターｐＴＴ５−ＳＰ−Ｈ１中に別々にクローニングされた。重鎖及び軽鎖発現ベクターはＮＥＢ  Ｔｕｒｂｏ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ）中に形質転換され、大スケールのプラスミド調製がＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施された。全ての完全長抗体発現クローンの配列が確認された。
【０２７９】
ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｕｎｃｉｌのＹｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒからの寛大な贈与物であるＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ１細胞は、５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補われたＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に順応された。ｐＴＴ５プラスミドをコードする重鎖及び軽鎖は、製造業者のプロトコールに従ってｊｅｔＰＥＩ（商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を使用して細胞中にコトランスフェクトされた。細胞はトランスフェクション後４日から５日間インキュベートされ、その後ＩｇＧ含有使用済み培地が収集された。ＩｇＧはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）アフィニティーカラム上で精製され、１００ｍＭクエン酸塩  ｐＨ３．０で溶出され、中和され、ＰＢＳに対して一晩透析されて、４℃で保存された。ＩｇＧ発現レベルはＥａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）及び２８０ｎｍでの分光光度の読み取りを用いて決定された。
【０２８０】
表面プラスモン共鳴
ｕＰＡＲと１Ａ８、２Ｂ１、２Ｇ１０及び２Ｅ９との間の相互作用アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅ  １０００を用いた平衡表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により決定された。結合力の作用を抑制するため、抗体はＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップの表面上に固定され、可溶性ｕＰＡＲが分析物として流された。４個のＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップフローセルは製造業者のプロトコールに従って、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用して順次処理された。１Ａ８、２Ｂ１、２Ｅ９及び２Ｇ１０  ＩｇＧは各々１０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０中で５μｇ／ｍｌに希釈され、次いでおよそ２７００の相対応答単位を得るように別々のフローセルに固定された。抗体固定後、フローセルは１Ｍエタノールアミン  ｐＨ８．５でブロッキングされた。基準表面を提供するＥＤＣ／ＮＨＳ活性化の後、各ＣＭ５チップ上のフローセルはすぐに１Ｍエタノールアミン  ｐＨ８．５を使用して処理された。
【０２８１】
可溶性ヒトｕＰＡＲは４５０ｎＭ、２２５ｎＭ、１１２．５ｎＭ、５６．２５ｎＭ、２８．１３ｎＭ、１４．１ｎＭ、７ｎＭ、３．５ｎＭ、１．８ｎＭ及び０ｎＭの濃度でフローセルに対してインジェクトされた。結合されたｕＰＡＲは１０ｍＭグリシン  ｐＨ１．５を使用して除去された。機器応答値が記録され、解析のためにＳｃｒｕｂｂｅｒ２（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）中にインポートされた。データは二重参照法（２６）を用いて正規化され、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２中で実行される一部位結合モデルを用いて解析された。応答値はインジェクションの最終の１分間にわたる０．０５％未満の変化により判定される安定なプラトーに到達した。
【０２８２】
フローサイトメトリー
ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３ｕＰＡＲ細胞のいずれかのコンフルエントなフラスコはＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して処理された。収集された細胞はＳｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に再懸濁され、５ｘ１０５又は１ｘ１０６個のいずれかの細胞が抗体染色のためにチューブに移された。１Ａ８、２Ｂ１、２Ｅ９、２Ｇ１０及び全ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）は終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加された。２Ｇ１０及び３Ｃ６  Ｆａｂは終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添加された。抗体添加後、全ての試料は４℃で３０分間ローテータ上でインキュベートされ、遠心分離により収集され、５００μｌのＳｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁された。ＩｇＧ試料は再懸濁され、２０μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートされたマウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートされ、一方、Ｆａｂ試料はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートされたマウス抗ｃＭｙｃモノクローナル抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共にインキュベートされた。５ｘ１０５個の細胞がＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーターを使用して分析された。データ解析はＦｌｏｗＪｏバージョン７．２．４を使用して実施された。
【０２８３】
マウス異種移植片の生成
皮下のＭＣＦ−７／Ｌｕｃ＋（ルシフェラーゼを発現するＭＣＦ−７細胞）及び同所性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｌｕｃ＋腫瘍異種移植片は、ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ乳がん細胞株を使用して生成された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞は安定的にルシフェラーゼを発現するように改変されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であり、そのため腫瘍はインジェクトされたルシフェリンの生物発光検出を通じて撮像されることもできる。
【０２８４】
ＩｇＧの蛍光標識
２Ｇ１０  ＩｇＧは製造業者のプロトコールに従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識された。タンパク質はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＦＰＬＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上で未反応の色素から精製された。標識の度合いは製造業者のプロトコール中で指示されるようにＵＶ／Ｖｉｓ分光光度法を用いて決定された。１モルの２Ｇ１０  ＩｇＧあたりで平均１５モルの色素が達せられた。
【０２８５】
マウスの光学的イメージング
マウスは次のように取り扱われ、注射され、撮像された。簡潔には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０標識２Ｇ１０  ＩｇＧがマウス１匹あたり〜０．２５ｎｍｏｌ  ＩｇＧに達するように尾静脈注射により投与された。画像は規定の間隔でＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５０．２ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いてＩＶＩＳ  ５０上で蛍光モードで集められた。ｕＰＡＲ陽性腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及びｕＰＡＲ陰性腫瘍（ＭＣＦ−７）の両方について各々２匹のマウスが撮像された。生物発光画像もまた前記のように得られた。全てのインビボ研究は機関の承認の下で指示されたように実施された。
【０２８６】
接着アッセイ
細胞接着アッセイは前記のように実施された（Ｗｅｉら（２００７年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：３９２９〜３９３９ページ）。簡潔には、Ｈ１２９９細胞（２ｘ１０５個）は抗ｕＰＡＲ  Ｆａｂ（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＲＧＤペプチド又はＲＡＤペプチド（０．４ｍＭ）を伴って又は伴わずに、フィブロネクチン（ＦＮ）コーティングされた（１０μｇ／ｍｌ）プレート上に播種された。付着された細胞はメタノールで固定され、ギムザ染色が５５０ｎｍでの光学濃度を測定することによる比色分析のために用いられた。ＦＮはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。ＲＧＤ及びＲＡＤペプチドはＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入された。
【０２８７】
ＥＲＫリン酸化アッセイ
血清枯渇させたＨ１２９９細胞は、表面に結合された内因性ｕＰＡを除去するために５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０で３分間洗浄され、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５を使用して氷上で１０分間中和された。細胞は１０μｇ／ｍｌの１Ａ８、２Ｂ１、２Ｅ９、２Ｇ１０又は対照ヒトＩｇＧを使用して３７℃で１時間前処理された。プロｕＰＡは１０ｎＭになるように添加され、ＥＲＫ活性化を惹起するために３７℃で５分間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞はプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補われたＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解され、リン酸化及び全ＥＲＫについてブロットされた（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ＦＮ刺激性のＥＲＫリン酸化の場合においては、細胞は溶解前にＦＮ（１０μｇ／ｍｌ）コーティングされた表面上で３０分間培養された。
【０２８８】
浸潤アッセイ
Ｈ１２９９ヒト肺がん細胞（１ｘ１０５個）は１Ａ８、２Ｂ１、２Ｅ９、２Ｇ１０又は対照ヒトＩｇＧ（各１０μｇ／ｍｌ）を使用して、及び２Ｇ１０、３Ｃ６、２Ｇ１０＋３Ｃ６  Ｆａｂ（各１０μｇ／ｍｌ）を使用して、３７℃で１時間前処理された。細胞は次いでＦＮをプレコーティングされた底部を有するＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に播種され、次いで５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ中で一晩培養された。ウシ胎仔血清が下のチャンバーに添加された。２４時間後、膜の上部チャンバー面上のＭａｔｒｉｇｅｌ及び細胞が除去され、膜の底部チャンバー面上の細胞はメタノールで固定され、ギムザで染色され、１０％酢酸中で抽出され、５９５ｎｍにおいてプレートリーダー中で測定された。全てのアッセイは３連で実施され、データは抗体によるパーセント阻害として表現された：％阻害＝（（ＯＤ５９５，Ａｂ−ＯＤ５９５，Ｃｔｒｌ）／ＯＤ５９５，Ａｂ）ｘ１００。
【０２８９】
抗ｕＰＡＲ共免疫沈降
Ｈ１２９９細胞（１ｘ１０７個）はプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）及び１ｍＭ  ＰＭＳＦを補われたＴｒｉｔｏｎ溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で溶解された。清澄化された溶解液は最初に抗ｕＰＡＲ  Ｆａｂ（１０μｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間、次いでＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）と共に１時間、最後に５０μｌの混合されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅビーズと共に一晩、インキュベートされた。免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにｕＰＡＲ及びαＶインテグリンについてのウエスタンブロット分析に供された。抗ｕＰＡＲモノクローナル抗体（Ｒ２）はＭｉｃｈａｅｌ  Ｐｌｏｕｇ（Ｆｉｎｓｅｎ  Ｌａｂ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）からの寛大な贈与物であった。抗αＶインテグリンポリクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）から購入された。
【０２９０】
実施例１  ファージディスプレイはｕＰＡＲ結合Ｆａｂを同定する
パニングの前に、マイクロプレート表面への非変性ｕＰＡＲの結合がｕＰＡＲコーティング表面への高分子量ｕＰＡ（ＨＭＷ−ｕＰＡ）の結合を検出することにより確認された。ＨＭＷ−ｕＰＡの結合は、ｕＰＡＲコーティングされたプレートをＨＭＷ−ｕＰＡと共にインキュベートしてストリンジェントに洗浄した後に、ｕＰＡ基質であるｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ  ＵＫを使用したマイクロプレートウェル内の特異的なタンパク質分解活性の存在により検出される。
【０２９１】
ヒトｕＰＡＲを結合する能力があるＦａｂが３ラウンドのパニングの後に得られたが、このパニングにおいては弱く結合されたＦａｂ提示ファージを除去するための洗浄がいっそうストリンジェントにされた。３８４個の独立したクローンがパニングの最終ラウンドから評価された。これらのＦａｂを細菌中で発現させることができることを確認するため、培養上清（ＩＰＴＧ添加後に漏れたＦａｂの小画分がその中にある）がｕＰＡＲに結合する能力があるＦａｂの存在について試験された。これら３８４個のクローンから、９６個が再現性のあるｕＰＡＲ結合に基づいてさらなる分析のために選択された。周辺質タンパク質画分が次いで９６個のクローンから調製された。これらの画分を使用したＥＬＩＳＡ分析は、培養上清のそれと比較してより強く、より一貫性のシグナルを与えた。９６個のクローンのうち、３６個の候補がバックグラウンドの８倍を超える強さの平均シグナルを有するｕＰＡＲの強いバインダーとして確認された。
【０２９２】
実施例２  配列解析及び小スケール発現は固有のＦａｂを同定する
３６個の候補は配列決定され、１００ｍｌ培養スケールでの発現について評価された。重鎖及び軽鎖発現カセットの配列決定は、３６個の候補のうちの２２個が固有のＦａｂ配列を持つことを明らかにした。これらの配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントは、κ又はλ軽鎖を持つことにより定義される２つの別個の抗体グループを有するパーセント同一性樹状図を生じさせた（図１、パネルＡ）。いくつかの高度に関係した配列のサブグループはκ軽鎖グループ内にあることが明白な一方、比較的低い度合いの配列類似性を有する８個の抗体はλ軽鎖グループ内にあることが明白である。図１のパネルＡ中で、同一クローンの数が重複したＦａｂ配列について括弧の中に指し示される。軽鎖同一性（κ又はλ）により定義されるＦａｂのサブグループもまた標識される。垂直の線は８２％の配列同一性の閾値を指し示す。８２％カットオフの右側に枝分かれする配列は等価と考えられる。
【０２９３】
固有のＦａｂ各々の６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアラインメント（図１、パネルＢ）は、ＣＤＲ配列が図１、パネルＡの樹状図中で観察されるサブグループ分けパターンを決定することを示す。抗体ＣＤＲ間の最も低い対配列同一性は２２％であった。各ＣＤＲループの名称はアラインメントの上に指し示される。８２％より高い配列同一性を有するＦａｂ重鎖及び軽鎖タンパク質配列は一緒にグループ化された（囲み内）。
【０２９４】
２２個の固有のＦａｂの大腸菌中での発現レベルは１００ｍｌ培養液のＩＰＴＧ誘導の後に決定された。ヒスチジン−タグ付加された周辺質画分からのＦａｂは浸透圧ショックにより得られ、ニッケルをキレートしたセファロースカラム上で精製され、ウエスタンブロットにより発現について分析された。アスタリスクは大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（商標）Ｂ細胞中で発現しなかったＦａｂクローンを指し示す。２Ｅ９以外の残りのＦａｂの小スケール発現は、２５０μｇ／Ｌ大腸菌培養液を生じさせた。生じたＦａｂ  ２Ｅ９の発現は５倍低かった。
【０２９５】
精製されたＦａｂはｕＰＡＲ  ＥＬＩＳＡによりさらに性質決定された。結合された抗体の初めの測定は異なるＦａｂ間の大きなばらつきを呈したが、固定化ｕＰＡＲへのｕＰＡ結合を測定する対照実験は同様のばらつきを示さなかったことから、これらの差異は異なるＦａｂ間の結合様式又はアフィニティーの本来の不同性を反映することが示唆される。
【０２９６】
さらなる探求のためのＦａｂのリストは、個々のクローンをその配列及び細菌の発現能力に基づいてクラスター化することにより狭められた。８２％より高い又は８２％と等しい配列類似性を有する配列は一緒にクラスター化された（図１）。これらのグループ分けから、代表的なクローンが大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（商標）Ｂ細胞中の発現レベルに基づいて各グループから選択されたが、これは囲みの左側に指し示され、このようにさらなる分析のためにＦａｂのリストを１２個のクローンに狭めるものである。
【０２９７】
実施例３  競合的ＥＬＩＳＡはｕＰＡＲ結合についてｕＰＡと最も競合的なものとして２Ｅ９及び２Ｇ１０を同定する
精製された１２個の残りのクローン由来のＦａｂは、固定化ｕＰＡＲへの結合についてｕＰＡと競合する能力について分析された。ｕＰＡの存在は、各Ｆａｂの存在下及び非存在下での結合されたタンパク質分解活性の量により測定された（図２）。ｕＰＡの存在は結合されたタンパク質分解活性の量により決定されたもので、反応進行曲線からの初期速度として報告される。最大のｕＰＡ結合はＦａｂなしでｕＰＡをインキュベートすることにより決定されたもので、「Ｆａｂなし」と標識される。データは、ｕＰＡＲ結合についてｕＰＡと競合しないＦａｂから最大の競合を示すＦａｂまで、左から右にプロットされる。１Ａ８及び２Ｂ１について、ｕＰＡの存在下及び非存在下でｕＰＡＲに結合されるＦａｂの量はＥＬＩＳＡにより決定された。このアッセイはｕＰＡ／ｕＰＡＲ相互作用のコンペティターとして２Ｅ９及び２Ｇ１０を同定した。対照は、これらの抗体がｕＰＡのタンパク質分解活性を直接的に阻害しないことを示した。
【０２９８】
競合的ＥＬＩＳＡのデータはまた、１Ａ８及び２Ｂ１はｕＰＡＲ結合についてｕＰＡと競合しないことも示唆した。これらのＦａｂは弱いｕＰＡコンペティターではないことを検証するため、ｕＰＡ非存在下で結合されたＦａｂに対するｕＰＡ存在下で結合されたＦａｂの比が計算された（図２、挿入図）。ｕＰＡの存在下及び非存在下で結合されるＦａｂの量は同じｕＰＡＲコーティングされたウェル中で決定されたもので、それ故、Ｆａｂのいくらかの損失は測定間の処理に起因すると予想される。このアッセイは１Ａ８及び２Ｂ１がｕＰＡＲ上の非ｕＰＡ結合部位を結合することを検証した。２つの最も強い非競合的バインダーである１Ａ８及び２Ｂ１、並びに２つの最も強い競合的阻害剤である２Ｇ１０及び２Ｅ９がさらなる分析のために選ばれた。
【０２９９】
実施例４  哺乳動物細胞中の完全長ＩｇＧ発現は大量の抗体を生産する
１Ａ８、２Ｂ１、２Ｇ１０及び２Ｅ９の重鎖及び軽鎖配列は、ＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ１細胞中への一過性トランスフェクションによる高レベル発現のため哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５−ＳＰＨ１中にクローニングされた。この一過性発現ベクターのプラスミドマップは図３に示される。所定の抗体について、ｐＴＴ５−ＳＰ−Ｈ１重鎖ベクター及びｐＴＴ５−ＳＰ−Ｈ１軽鎖ベクターの両方が発現のためＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ１細胞中にコトランスフェクトされた。変動する比の重鎖及び軽鎖発現プラスミドのコトランスフェクションは、重鎖及び軽鎖ＤＮＡの等量は軽鎖プラスミド粒子が重鎖プラスミド粒子と比較してわずかに過剰であることに相当し、これが最も高いレベルの抗体を生産することを明らかにした。１μｇ：４μｌの全ＤＮＡ：ＰＥＩ比、及びサブコンフルエントなＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞の維持は、９０％より高いトランスフェクション効率をもたらした。トランスフェクション後の収集に最適な時間は４から５日であった。抗体発現収量は配列依存的で、１ｍｌスケールで２０ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌ培養上清の間、大スケールの試験（５００ｍｌ）において１０ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌの間で変動した。
【０３００】
実施例５  表面プラスモン共鳴はｕＰＡＲについての低いｎＭアフィニティーを明らかにする
ｕＰＡＲと抗体１Ａ８、２Ｂ１、２Ｇ１０及び２Ｅ９との間の一価の相互作用アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅ  １０００を用いた平衡表面プラスモン共鳴法により決定された。分析物（ｕＰＡＲ）濃度に対する機器応答の解析は、ナノモルの範囲中にある一価の解離定数を生じさせた（図４）。
【０３０１】
実施例６  フローサイトメトリーはｕＰＡＲ発現細胞の特異的標識を示す
同定された抗体のｕＰＡＲを結合する能力は、ｕＰＡＲが細胞表面上に提示されることから、フローサイトメトリーにより分析された。膜結合されたヒトｕＰＡＲを安定発現するＨＥＫ−２９３細胞は完全長の抗ｕＰＡＲ  ＩｇＧ又はアイソタイプ対照で標識された。抗ｕＰＡＲ  ＩｇＧは抗ヒトＦｃ  ＦＩＴＣ−コンジュゲート二次抗体を使用して検出された。標識された細胞はフローサイトメーター上で分析された（図５）。ヒト抗ｕＰＡＲ抗体の相対的染色強度を定量化するため、同じゲート（図５中に示される水平の線）が各試料に適用された。ｕＰＡＲ発現についての細胞染色陽性の％はゲートの上に指し示される。試験された全ての抗体はｕＰＡＲ発現ＨＥＫ−２９３細胞の力強い標識を指し示したが、ｕＰＡＲ発現を欠く元のＨＥＫ−２９３細胞の標識は示さなかった。
【０３０２】
同様の実験ががん細胞株を用いて２Ｇ１０  Ｆａｂについて行われた。ＭＣＦ−７（低ｕＰＡＲ発現）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（高ｕＰＡＲ発現）は、ｕＰＡＲの相対的発現が以前に性質決定されている２つの乳がん細胞株である。ＭＣＦ−７細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は２Ｇ１０と接触させられ、２Ｇ１０の結合は２つの細胞株間を区別することが可能であったが、これはｕＰＡＲのレベルと一致していた（図１１）。
【０３０３】
実施例７  ＩｇＧはｕＰＡＲ陽性腫瘍を標識するが、ｕＰＡＲ陰性腫瘍を標識しない
インビボでの抗体の結合を試験するため、蛍光で標識された２Ｇ１０  ＩｇＧはヌードマウス中のｕＰＡＲを発現する乳房腫瘍異種移植片を撮像するのに用いられた。ｕＰＡＲを発現することが知られるがん細胞株は、フローサイトメトリーを通じて２Ｇ１０結合について予めスクリーニングされた。２つの乳房細胞株、２Ｇ１０により標識される能力についてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及び検出可能に標識される能力がないことについてＭＣＦ−７が選ばれた。図６中の代表的なマウスにおいて示されるように、２Ｇ１０  ＩｇＧはｕＰＡＲ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片を標識することが可能であったが、ＭＣＦ−７移植片を標識することは不可能であった。図はＭＤＡ−ＭＢ−２３１についての２４時間時を示すが、シグナル強度が最も高かった時にシグナルは１週間にわたって持続したことは、これらの抗体が好ましい薬物動態を持つであろうことを示唆する。
【０３０４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片から切片が採取されてパラフィン中に包埋された。ｕＰＡＲについて探索するため、これらの切片はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識２Ｇ１０  Ｆａｂ（パネルＡ）及びＦＩＴＣ標識３Ｃ６  Ｆａｂ（パネルＢ）で標識された（図１３）。２Ｇ１０及び３Ｃ６の染色パターンは異なり、この差は２Ｇ１０及び３Ｃ６が異なるｕＰＡＲエピトープに結合することを示唆する。パラフィン包埋された高悪性度の乳房腫瘍を染色する２Ｇ１０  Ｆａｂの染色能力が図１３のパネルＣ中に示される。その後にパラフィン包埋が続くホルマリン固定のより厳しい保存条件の下、２Ｇ１０はそのｕＰＡＲエピトープに結合することが可能であった。２Ｇ１０染色はいくつかの細胞中で他よりも強いことが見出された。高強度の染色細胞はマクロファージであろう。これらの抗体はｕＰＡＲに特異的であることが見出されたが、それはパラフィン包埋された膜結合ｕＰＡＲを過剰発現する操作されたＨＥＫ２９３細胞株に対する探索が高い結合シグナルをもたらす一方、元のＨＥＫ２９３細胞株はそうでないためである。
【０３０５】
追加のインビボ実験が高又は低ｕＰＡＲ発現細胞株（それぞれＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）を移植された免疫不全マウスを用いて行われた（図１２）。触知可能な腫瘍が現れる移植後期間の後、２ナノモルの標識２Ｇ１０又は３Ｃ６  ＩｇＧ抗体がマウス中に注射された。注射４８時間後、抗体で染色されたマウスの写真が撮影された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来のｕＰＡＲ発現腫瘍中で抗体の取り込みが観察されたが、ｕＰＡＲ欠損細胞（ＭＣＦ−７）由来の腫瘍中では観察されなかった。抗体アンタゴニスト２Ｇ１０及び３Ｃ６の両方とも同じ結果を生み出した（上の２列及び下の２列）。
【０３０６】
実施例８  ２Ｅ９及び２Ｇ１０はＨ１２９９の浸潤を減少させる
Ｈ１２９９細胞もまた、ｕＰＡＲへのｕＰＡ結合に依存的な様式で、Ｍａｔｒｉｇｅｌなどの細胞外マトリックス構成成分の中を通って移動する又は浸潤することがインビトロで示されている（Ｔａｎｇら（２００８年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２１：３７４７〜３７５６ページ）。インビトロでの強いＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤表現型は、インビボでのがん細胞の転移潜在力と相関すると思われる。図６のパネルＡ中に示される実験のため、Ｈ１２９９細胞は抗体（１０μｇ／ｍｌ）：２Ｅ９、２Ｇ１０、２Ｂ１及び１Ａ８を使用して前処理され、その後に２４時間、Ｍａｔｒｉｇｅｌを浸潤させられた。中を通って移動してフィルターの底部に付着された細胞は固定され、ギムザで染色され、１０％酢酸で抽出された。細胞の浸潤性はＯＤ５９５ｎｍを測定することにより評価される。Ｈ１２９９細胞によるＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤に対する抗体１Ａ８、２Ｂ１、２Ｇ１０及び２Ｅ９の作用の解析は、２Ｇ１０及び２Ｅ９はいずれも移動を阻害する能力がある一方、１Ａ８及び２Ｂ１はその能力がないことを示す（図７、パネルＡ）。
【０３０７】
実施例９  ２Ｅ９及び２Ｇ１０はＨ１２９９細胞中のｕＰＡ依存的なＥＲＫリン酸化を減少させる
ヒト肺がん細胞株Ｈ１２９９は、ｕＰＡのｕＰＡＲへの結合により仲介されるシグナル伝達イベントに依存的な増殖促進性のＥＲＫリン酸化及び活性化を呈する。この細胞株はｕＰＡ結合が引き金になるｕＰＡＲ依存的な増殖促進性シグナルを阻害する抗ｕＰＡＲ抗体の能力を試験するのに用いられた。内因性ｕＰＡＲを発現するＨ１２９９細胞は血清枯渇され、酸洗浄され、抗体（１０μｇ／ｍｌ）を使用して前処理され、次いでプロｕＰＡ（１０ｎＭ）と共にインキュベートされた。溶解液は抗ｐＥＲＫ（上部パネル）及び抗全ＥＲＫ（下部パネル）を使用してイムノブロットされた（図７、パネルＢ）。
【０３０８】
結果は、抗体１Ａ８及び２Ｂ１は試験された条件下でＥＲＫリン酸化を阻害しないことを実証する。一方、２Ｅ９及び２Ｇ１０はｕＰＡＲへのｕＰＡ結合と競合するもので、ＥＲＫリン酸化を阻害することが可能である。
【０３０９】
実施例１０  ３Ｃ６はＨ１２９９細胞中でＦＮ依存的なＥＲＫリン酸化を減少させ、ＦＮ及びＶＮ依存的な接着を抑制する
Ｈ１２９９細胞中のＦＮ依存的なＥＲＫリン酸化の活性化は、ｕＰＡＲ／β１／ＦＮ複合体の形成に依存的である。固有の抗ｕＰＡＲ  ＦａｂのいずれかがｕＰＡＲ／β１相互作用を妨害するかを決定するため、ＦＮコーティングされたウェル中に播種されたＨ１２９９細胞中のＥＲＫリン酸化を減少させる能力が試験された。実施例９における実験と同様に、Ｈ１２９９細胞は血清枯渇され、酸洗浄され、Ｆａｂ（１０μｇ／ｍｌ）：２Ｂ１、２Ｂ７、２Ｂ１１、２Ｄ５、２Ｅ９、２Ｇ１０、２Ｇ１２、３Ｃ６及び４Ｃ１を使用して前処理され、ＦＮコーティングされた表面（１０μｇ／ｍｌ）上で３０分間培養されて、その後溶解された。溶解液は抗ｐＥＲＫ（上部）及び抗全ＥＲＫ（下部）を使用してイムノブロットされた（図８、パネルＡ）。３Ｃ６はＦＮ依存的なＥＲＫリン酸化を顕著に減少させることが可能であるとして同定された。
【０３１０】
３Ｃ６の機能的作用をさらに性質決定するため、ＦＮ接着アッセイが利用された。β１／ＦＮ相互作用は、ＲＧＤペプチドによる拮抗に感受性であるｕＰＡＲ非依存的な背景において、及びＲＧＤペプチドに耐性であるｕＰＡＲ依存的な背景において、発生することができる（Ｗｅｉら（２００７年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：３９２９〜３９３９ページ）。Ｈ１２９９細胞は、抗ｕＰＡＲ抗体及びＲＧＤ又はＲＡＤペプチドを伴って又は伴わずに、ＦＮコーティングされた（１０μｇ／ｍｌ）又はＶＮコーティングされた（５μｇ／ｍｌ）９６ウェルプレート上に播種された。ＲＧＤペプチド及び３Ｃ６の両方の存在下で、ＦＮコーティングされたウェルへのＨ１２９９接着は完全に抑制された（図８、パネルＢ）。この作用の選択性は、ＲＡＤペプチド及び陰性対照としてのＦａｂ形態のｕＰＡコンペティターである２Ｇ１０の包含により検証された。
【０３１１】
ｕＰＡＲ／β１インテグリン仲介性の接着を破壊する３Ｃ６の能力は一般化可能かを決定するため、ｕＰＡＲ／α３β１仲介性Ｈ１２９９細胞のＶＮへの接着能力が性質決定された。ＦＮ接着アッセイと同様のアッセイにおいて、３Ｃ６はＲＧＤペプチドの存在下でＨ１２９９細胞のＶＮへの接着も妨げることができることが見出されたが（図８、パネルＢ）、このことは３Ｃ６が複数のβ１インテグリンとのｕＰＡＲ複合体の機能を特異的に遮断することが可能であることを示唆する。図８のパネルＣ中に見られるように、２つの異なるＥＣＭコーティングに対する各抗体処理についての接着を比較する正規化グラフが、ＲＧＤ処理されたウェルから読み取られた平均値をＲＡＤ処理されたウェルからの平均値で除算することにより得られた。３Ｃ６処理は２Ｇ１０処理よりも少なくとも４倍大きく、ｕＰＡＲ仲介性のインテグリン接着を破壊することが見出された。
【０３１２】
実施例１１  ３Ｃ６  ＦａｂはｕＰＡＲ過剰発現ＨＥＫ細胞を結合する
３Ｃ６は細胞の表面上に提示されるｕＰＡＲを認識することを確認するため、抗ｕＰＡＲ  ＩｇＧを性質決定するのに用いられたのと同じフローサイトメトリーアッセイがここで用いられた。３Ｃ６依存的な細胞の作用の調査はＦａｂ形態の抗体を使用してなされたことから、この形式の抗体（例としてＦａｂ）がフローサイトメトリーのために用いられた。２Ｇ１０  Ｆａｂは、細胞性ｕＰＡＲ発現ＨＥＫ−２９３細胞を結合する拮抗的な抗体の能力についてのベンチマークとして包含された。ｕＰＡＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞は、細胞表面のｕＰＡＲに結合する３Ｃ６の能力を確認するため、３Ｃ６及び２Ｇ１０で染色された。結果は図９のパネルＡ中に示される。破線の白いプロファイルは２Ｇ１０  Ｆａｂでの染色を表す。網掛けのプロファイルは３Ｃ６  Ｆａｂでの染色を表す。実線の白いプロファイルはＦａｂ染色はないが、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートされた二次を包含するものを表す。データは、たとえ２Ｇ１０  Ｆａｂほど頑強ではなくても、３Ｃ６がｕＰＡＲを過剰発現する細胞に結合することができることを指し示す。
【０３１３】
実施例１２  ３Ｃ６はＨ１２９９細胞中のｕＰＡＲ及びα５β１の会合を妨げる
３Ｃ６はα５β１インテグリンとのｕＰＡＲの会合を直接的に遮断したかを決定するため、３Ｃ６及び２Ｇ１０がＨ１２９９溶解液からｕＰＡＲを免疫沈降するのに用いられた。Ｈ１２９９溶解液は抗ｕＰＡＲ  Ｆａｂ（２Ｇ１０又は３Ｃ６）、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇアガロースと共にインキュベートされた。結果として生じた免疫沈降物は、ｕＰＡＲ及びα５β１インテグリンの両方についてのウエスタンブロットで分析された。
【０３１４】
結果として生じた免疫沈降物は、ｕＰＡＲ及びα５β１インテグリンの両方についてのウエスタンブロットで分析された。結果は、３Ｃ６はα５β１インテグリンとのｕＰＡＲの会合を妨げる一方、２Ｇ１０は妨げないことを指し示す（図９、パネルＢ）。
【０３１５】
実施例１３  ３Ｃ６はＨ１２９９の浸潤を減少させ、２Ｇ１０及び３Ｃ６は架橋されたマトリックスの中を通ったＨ１２９９浸潤を相乗的に阻害する
移動はＥＣＭの接着及び分解の調節を必要とする複雑な現象である。図７、パネルＡ中に示されるように、２Ｅ９及び２Ｇ１０によるｕＰＡＲ／ｕＰＡ複合体の拮抗はＨ１２９９細胞の浸潤を阻害する。３Ｃ６はｕＰＡＲ／β１複合体を拮抗することによる浸潤に対する同様の作用を持つかを決定するため、ｕＰＡコンペティターＦａｂである２Ｇ１０との３Ｃ６  Ｆａｂの潜在的な相乗作用がＭａｔｒｉｇｅｌ／コラーゲンＩ又はコラーゲンＩの中を通った細胞浸潤を遮断する能力について試験された。Ｈ１２９９細胞は抗体（２Ｇ１０、３Ｃ６及び２Ｇ１０／３Ｃ６を５〜１０μｇ／ｍｌで）を使用して前処理され、その後、コラーゲンＩコーティングされた（図１０、パネルＡ）又はＭａｔｒｉｇｅｌ／コラーゲンＩコーティングされた（図１０、パネルＢ）２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上部膜上に播種された（１０５個の細胞／ウェルを３連で）。細胞は２４時間インキュベートされた。中を通って移動してフィルターの底部に付着された細胞は固定され、ギムザで染色され、１０％酢酸で抽出された。細胞の浸潤性はＯＤ５９５ｎｍを測定することにより評価される。結果は、未処理の対照中で観察される阻害のパーセンテージとして表現される。図１０のパネルＡ中に示されるように、２Ｇ１０及び３Ｃ６  ＦａｂがコラーゲンＩの中を通った浸潤を阻害するだけでなく、組み合わされた投薬もまた相乗的な応答を呈する。
【０３１６】
追加として、より生理的に移動及びＥＣＭ分解に関連する手がかりを含有したマトリックスを提供するため、浸潤アッセイがＭａｔｒｉｇｅｌ及びコラーゲンＩの両方からなる基質に対して繰り返された。結果は、相乗的応答をもたらす同時的な２Ｇ１０及び３Ｃ６処理を伴うコラーゲンＩコーティングされたインサートで観察されたものと一致した（図１０、パネルＢ）。
【０３１７】
実施例１４  １１１ＩＮを使用したＤＯＴＡ−２Ｇ１０  ＩｇＧの放射標識及びインビボＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
放射標識のため、ＤＯＴＡ−２Ｇ１０  ＩｇＧは１×ＰＢＳで２μＭに希釈された。これは２５０μｇ／ｍｌ前後の重量体積濃度に相当する。２００μｌのＤＯＴＡ−２Ｇ１０  ＩｇＧ一定分量（５０μｇのＩｇＧ）は０．０１Ｎ  ＨＣｌ中で１２μｌの１１１ＩｎＣｌ３（２．５９ｍＣｉ）と共に３７℃で５０分間インキュベートされた。放射性ＴＬＣを用いて、ＤＯＴＡキレートを使用した１１１Ｉｎの標識効率は９０％と決定された。放射標識抗体は、１×ＰＢＳバッファーを使用して予め平衡化されたＰＤ−１０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、未反応の１１１ＩｎＣｌ３から分離された。０．５ｍｌの画分がカラムから集められ、放射性ＴＬＣにより放射標識ＩｇＧの存在についてアッセイされた。高放射性純度を有する画分は次いで、サイズがおよそ４００ｍｍ３のＭＤＡ−ＭＢ−３２１がん異種移植片を担う６週齢のヌードマウスの尾静脈中に注射された。注射は２５０μＣｉの２Ｇ１０  ＩｇＧを使用してなされた。マウスは次いでＧａｍｍａ  Ｍｅｄｉｃａ  Ｉｄｅａｓ  Ｘ−ＳＰＥＣＴ  ＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャナを用いて４８時間時に撮像された。ＣＴ及びＳＰＥＣＴ画像は製造業者により提供されたソフトウェアを用いて再構成され、融合された。データは次いでＶｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｍｉｒａソフトウェアを用いて解析された。１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−２Ｇ１０  ＩｇＧで標識されたＭＤＡ−ＭＢ−３２１異種移植片の処理された画像は、４つの異なる視野を伴って図１４中に示される。濃い灰色の領域により指し示されるように、２Ｇ１０はｕＰＡＲ発現腫瘍を特異的に標識した。ＭＤＡ−ＭＢ−３２１異種移植片の背側、腹側及び矢状断図もまた図１４中の様々なパネルで示される。
【０３１８】
実施例１５  ２Ｇ１０はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中で細胞増殖抑制状態を誘導可能である
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ヨウ化プロピジウム染色を用いて細胞死又は細胞増殖抑制特性の何らかのレベルを査定するため、１μＭの２Ｇ１０  Ｆａｂを使用して４日間処理された。細胞増殖抑制特性とは細胞の成長及び／又は分裂の阻害をいう。図１５中のフローサイトメトリー実験により示されるように、２Ｇ１０は処理された細胞中で細胞増殖抑制状態を誘導し、細胞をＧ０／Ｇ１細胞周期状態に捕捉した。
【０３１９】
実施例１６  アラニンスキャニングされたｕＰＡＲ変異体上の３Ｃ６のエピトープマッピング
インテグリンコンペティター抗体である３Ｃ６の結合エピトープについての初めの解析を提供するため、フローサイトメトリーに基づくエピトープマッピング研究がアラニンスキャニングされたｕＰＡＲの変異体に対して実行された。図１６、パネルＡ中に示されるのは、結果の描写である。各変異はｕＰＡＲのドメイン３中に位置し、３Ｃ６結合により弱く又はより強い程度に影響を与える。したがって、考慮される全てのｕＰＡＲ変異はｕＰＡＲのドメイン３中に存在し、これはβ１インテグリン結合への主要な貢献者として考えられる。この部位はｕＰＡ結合部位の反対側に位置する（図１６、パネルＢ）。
【０３２０】
先の発明は理解の明確性の目的のための説明及び例としていくらか詳細に記述されているが、一定の変更及び改変が添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなくなされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者に直ちに明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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