(57)【要約】ミスフォールドしたまたは異常フォールドしたタンパク質の小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）を減少させるためのホロ毒素の使用が提供される。したがって、ホロ毒素は、ＥＲＡＤに関連する疾患の処置方法において使用することができる。ＥＲで分解されるミスフォールドしたタンパク質の例としては、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ΔＦ５０８変異タンパク質、多剤耐性１（ＭＤＲ１）のミスフォールドした変異体（Ｇ２６８Ｖ）、およびゴーシェ病細胞のグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＣ）酵素が挙げられる。適切なホロ毒素の例としては、リシン、志賀毒素、外毒素Ａ、プラスミド上にコードされた毒素、コレラ毒素、およびベロ毒素１（ＶＴ１）が挙げられる。ＶＴ１は、ベロ毒素Ａ、志賀様毒素１、志賀様毒素１、または志賀毒素１型としても知られる。Ａサブユニット（ｓｕｂｕｍｔ）活性部位の重要な残基が変異、例えば、Ｙ７７Ｓ変異およびＥ１６７Ｑ変異を起こした非毒性不活性ＶＴ１も使用することができる。
2013503112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤ介在性分解を阻止するためのホロ毒素の使用。
【請求項２】
前記ホロ毒素が、不活性化Ａサブユニットを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ホロ毒素が、ＥＲトランスロコンを阻害する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ホロ毒素が、ＥＲトランスロコンを占有する競合的阻害剤である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ホロ毒素が、ミスフォールドした機能性タンパク質をＥＲ関連分解から救出する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ホロ毒素が、リシン、志賀毒素、コレラ毒素、外毒素Ａおよびプラスミド上にコードされた毒素（Ｐｅｔ）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記ホロ毒素が、ベロ毒素である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記不活性化Ａサブユニットが、変異したアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記ホロ毒素が、変異した残基を７７位および１６７位の少なくとも１つに含むベロ毒素である、請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
前記変異した残基が、Ｙ７７ＳおよびＥ１６７Ｑの少なくとも１つである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳動物にホロ毒素を投与する工程を含む、ＥＲＡＤ関連疾患の治療方法。
【請求項１２】
前記ホロ毒素が、不活性化Ａサブユニットを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ホロ毒素が、リシン、志賀毒素、コレラ毒素、外毒素Ａおよびプラスミド上にコードされた毒素（Ｐｅｔ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＲＡＤ関連疾患が、ミスフォールドした機能性タンパク質のＥＲＡＤの結果として生じる病理学的状態である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＲＡＤ関連疾患が、関節炎、嚢胞性線維症、スフィンゴ糖脂質リソソーム蓄積症、脂質異常症の態様、高血圧、コレステロール生合成、α１−アンチトリプシン疾患、ゴーシェ病およびＨＩＶ感染由来の疾患からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ホロ毒素が、輸送停止配列を含むように改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホロ毒素が、小胞体阻害剤を組み込んでいる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害剤が、Ｓｅｃ６１阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害剤が、ＣＡＭ７４１またはイイヤレスタチンＩ（ＥｅｒＩ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＤＲ１変異体、ＣＦＴＲ変異体またはグルコセレブロシダーゼの１つを救出するための、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
ホロ毒素と医薬的に許容され得るアジュバントとを含む組成物。
【請求項２２】
前記ホロ毒素が、不活性化Ａサブユニットを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ホロ毒素が、ＥＲＡＤの阻害を向上させる実体を組み込むように改変されている、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミスフォールドしたタンパク質のＥＲ関連分解を阻止する方法に関する。本発明は、更に、ミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤ介在性分解を阻止するためのホロ毒素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体は、タンパク質翻訳および翻訳後修飾の品質管理において重要な役割を果たす。ＥＲ内の多くのシステムは、ミスフォールドしたタンパク質を検出するために存在する。ＥＲから細胞質への逆輸送に続く、複合体形成の選択とタンパク質分解による除去は、このプロセス（ＥＲＡＤ−小胞体関連分解）の中心原理である。このプロセスは、次いで、フォールディングしていないタンパク質の応答および他のＥＲストレス関連シグナル伝達経路を制御する。
【０００３】
多くの、おそらくは全ての遺伝性疾患には、所与のタンパク質の主要な機能には影響しないが、ＥＲ内でのタンパク質のフォールディングにわずかな変化を引き起こす変異が存在する。これにより、ミスフォールドしたタンパク質との認識がなされて、この品質管理メカニズムが始動し、その結果、このタンパク質は分解され、ゴルジ／ＴＧＮ／分泌小胞を通って細胞表面へ向かう順行性輸送または分泌を介した成熟ができなくなる。
【０００４】
そのように機能的であるにもかかわらずミスフォールドおよび分解される変異タンパク質を救出して、ＥＲＡＤの回避、成熟、および病原性表現型の機能的回復のための正しい位置への輸送を可能にすることを試みる多くの巧妙な手段が報告されている。このような手段の中には、化学的シャペロン、シャペロン阻害剤、酵素基質または阻害剤の使用が含まれる。またそのようなアプローチが大いに研究されてきた疾患としては、関節炎、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積症、脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）の態様、高血圧、コレステロール生合成およびα１−アンチトリプシン（ａｎｔｉｔｒｉｐｓｉｎ）疾患が挙げられる。
【発明の概要】
【０００５】
疾患におけるＥＲＡＤの重要性を考慮すると、ミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤ介在性分解を阻止する方法を開発することが望ましい。
【０００６】
本出願では、ホロ毒素が、ミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤ介在性分解を阻止するのに有効であることが明らかになった。
【０００７】
したがって、一態様では、ミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤ介在性分解を阻止するための、Ａサブユニットが任意選択的に不活性化されていてもよいホロ毒素の使用が提供される。
【０００８】
本発明は、更に、ＥＲトランスロコンを部分的に阻害し、これにより、ミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤ介在性分解を阻止するための、Ａサブユニットが任意選択的に不活性化されたホロ毒素の使用を提供する。
【０００９】
本発明は、更に、ＥＲトランスロコンを占有する競合的阻害剤としての、Ａサブユニットが任意選択的に不活性化されたホロ毒素の使用を提供する。
【００１０】
本発明は、更に、ミスフォールドした機能性タンパク質をＥＲ関連分解から救出するための、Ａサブユニットが任意選択的に不活性化されたホロ毒素の使用を提供する。
【００１１】
本発明を、以下の図面を参照して、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に従った、不活性化Ａサブユニット含有ＶＴ１を示すプラスミドを示す図である。
【図２】ＶＴおよび不活性化ＶＴ１が、ΔＦ５０８ＣＦＴＲをＥＲＡＤから保護することを示すウェスタンブロットの図である。
【図３】ＶＴおよび不活性化ＶＴが、ミスフォールドしたＭＤＲ１をＥＲＡＤから保護することを示すウェスタンブロットの図である。
【図４】コレラ毒素が、ＨｅＬａ細胞およびＢＨＫ細胞の両方において、ΔＦ５０８ＣＦＴＲをＥＲＡＤから保護することを示すウェスタンブロットの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、細胞表面からＥＲへの輸送を逆行させ、ＥＲに位置するＳｅｃ６１トランスロコンを部分的に阻害して、部分的にミスフォールドしているが機能性を有する変異タンパク質をＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）から回避させ、欠陥のある細胞表現型を救出するための、Ａサブユニットが任意選択的に不活性化されたホロ毒素の使用を提供する。
【００１４】
ＥＲへの輸送の逆行を受け、ここでタンパク質分解性活性型ＡサブユニットがＢサブユニットから分離し、細胞質にＳｅｃ６１トランスロコンを介して移行される、任意のホロ毒素が、部分的にミスフォールドしているが機能性を有する変異タンパク質を救出してＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）から回避させるための使用に利用し得る。本発明に従った使用に適するホロ毒素の例としては、リシン、志賀毒素または志賀様毒素（ベロ毒素−ＶＴ１など）、コレラ毒素、アブリン、モデシン、緑膿菌外毒素Ａ、および腸管凝集性大腸菌のプラスミド上にコードされた毒素（Ｐｅｔ）が挙げられる。細胞表面結合コレラ毒素、ベロ毒素およびリシンは、全てＥＲへの輸送の逆行を受け、ＥＲにおいてタンパク質分解性活性型ＡサブユニットがＢサブユニットから分離し、細胞質にＳｅｃ６１トランスロコンを介して移行される。これは、ＥＲ関連分解経路において、フォールディングされていないタンパク質のユビキチン化やプロテオソームによる細胞質消化のために除去することに利用されているトランスロコンと同一のものである。
【００１５】
選択されたホロ毒素のＡサブユニットは、本発明に従った使用のために、不活性化され得る。ホロ毒素のＡサブユニットを不活性化するための方法は、当該技術分野で十分確立されており、例えば、Ａサブユニット内にあるサブユニットＡ活性に必要な残基を変異させることが挙げられる。本発明の一実施形態では、Ａサブユニット活性部位の重要な残基が変異、例えば、Ｙ７７ＳおよびＥ１６７Ｑなどの変異を起こした非毒性ベロ毒素１が、好適に使用される。上記に参照した変異への改変、特に、上記で参照した変異で使用されるアミノ酸への改変、および図１に示されるものも、変異によりＡサブユニットが不活性化されることを条件として作製され得る。
【００１６】
Ａサブユニットは、細胞質に移行されるが、タンパク質合成を阻害することはできない。したがって、任意選択的に不活性化されたＡサブユニットは、部分的にミスフォールドしているが機能性を有する変異タンパク質をＥＲＡＤから救出するために、トランスロコンを占有する競合的阻害剤として機能する。例えば、任意選択的に不活性化されたベロ毒素１のＡサブユニットは、ΔＦ５０８ＣＦＴＲ変異体を救出するために有効である。
【００１７】
Ａサブユニットは、当該技術分野で公知の手法によって更に改変されて、より効率的なトランスロコンの阻害剤およびＥＲＡＤ阻止の改善を提供し得る。適切な改変としては、構成（ペプチド配列など）をＡサブユニットに付加して、Ａサブユニットのトランスロコン阻害機能を更に向上させることが挙げられる。例えば、ジフテリア毒素チャネルを阻害することが示されているヘキサヒスチジン配列、または、移行した分泌／膜タンパク質由来（例えばグリコホリンまたはＬＤＬ受容体由来）の１８〜２５無極性ペプチド配列−輸送停止配列−を付加して、トランスロコン通過の阻止を試み得る。別のアプローチとしては、Ｓｅｃ６１阻害剤（ＣＡＭ７４１など）のＡサブユニットへの結合、または小胞体（ＥＲ）関連タンパク質分解を阻止する阻害剤（化学的阻害剤、イイヤレスタチンＩ（ＥｅｒＩ）など）の結合が挙げられる。
【００１８】
上述のように、一実施形態において、本発明は、ベロ毒素（志賀毒素および志賀様毒素とも参照される）、特にベロ毒素の非毒性変異Ａサブユニットの、ＥＲを標的として、遺伝子的にミスフォールドしているが機能的であるタンパク質をトランスロコンの阻害により機能的に救出する機構としての使用を提供する。本明細書で述べたプロセスを記述するために、「細胞内処置（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ）」という用語を使用する場合がある。
【００１９】
代替実施形態においては、非毒性変異Ａサブユニットを含むコレラ毒素が、本明細書に記載されるように使用される。代替実施形態においては、非毒性変異Ａサブユニットを含むリシン毒素が、本明細書に記載されるように使用される。上記により、ベロ毒素の変異Ａサブユニットを利用する本発明の実施形態は、変異Ａサブユニットのみを含み得るが、コレラ毒素およびリシン毒素は、Ｂサブユニットおよび変異Ａサブユニットを含むであろうことが理解されるだろう。
【００２０】
別の実施形態では、Ｆａｂ抗体フラグメントまたはそのファージアナログが、細胞内区画内の結合タンパク質の選択的送達のために、ＥＲを標的とし得る。
【００２１】
本発明は更に、Ａサブユニットの修飾の、トランスロコン内での貯留を改善して本明細書に記載のアプローチの効力を向上させるための使用を含む。また、本発明は、不活性化リシン毒素に移入されたこのようなＡサブユニットのキメラの、任意の組織において部分的にミスフォールドしたタンパク質のＥＲＡＤを減少させる一層広範囲にわたる治療を提供するための使用を含む。加えて本発明は、本明細書に記載のように、更に修飾されて、タンパク質輸送、機能、選別、グリコシル化、および他の翻訳後修飾の欠陥を改良するために有用であり得る種々の分子、例えば、小胞体のルーメン内の変異タンパク質のフォールディングを補助するシャペロン（例えば、ゴーシェ病の変異グルコセレブロシダーゼを安定化するアンブロキソール）を輸送し得るＡサブユニットを提供する。
【００２２】
また、ＥＲＡＤの結果として生ずる疾患または他の方法でＥＲＡＤに起因する疾患（例えばＥＲＡＤ関連疾患）の処置方法が提供される。この方法は、対象（哺乳動物または非哺乳動物など）への、Ａサブユニットが任意選択的に不活性化されたホロ毒素の投与を含む。「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）を指す。
【００２３】
ＥＲＡＤ関連疾患は、ＥＲＡＤ自体が疾患の本質的な主体であることにより、機能的であるが部分的にミスフォールドした変異タンパク質を除去して疾患の症候を導く疾患である。幾つかの疾患においては、ＥＲＡＤ分解により、わずかにミスフォールドしているが他の点では機能的であるタンパク質が除去されることで、病理学的状態に至る。全てのそのような疾患が、本明細書に記載のトランスロコン阻止アプローチに基づく治療の候補となる。したがって、ＥＲＡＤ関連疾患としては、関節炎、嚢胞性線維症、スフィンゴ糖脂質リソソーム蓄積症、脂質異常症の態様、高血圧、コレステロール生合成、α１−アンチトリプシン疾患、ゴーシェ病およびＨＩＶ感染由来の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示のアプローチに基づく治療の候補となる他のＥＲＡＤ関連疾患は、以下の表１に示されているが、これは先にＨｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００５  １４（１７）：２５５９〜２５６９に示されたものである。表１に列挙される遺伝子は、強力なＥＲ貯留候補として同定された遺伝子である。それらには、変異の位置または実験データにより、フォールディングまたはトラフィッキングの欠陥が示唆される疾患が含まれている。本明細書で列挙される疾患には、ＥＲＡＤ分解と現在関連している公知の疾患の幾つかが含まれることが理解されるであろう。またＥＲＡＤ分解との関連が見出されている任意かつ全ての疾患が本発明の範囲内であると考えられることも理解されるだろう。
【００２４】
【表１】
2013503112.tif 000003
【００２５】
ホロ毒素は、単独で、または少なくとも１種の医薬的に許容され得るアジュバントと組み合わせて投与することができる。「医薬的に許容され得る」という表現は、医薬的および獣医学的分野における使用について許容され得ること、即ち、許容され得ない毒性がないことまたは他の点で不適切なものでないことを意味する。医薬的に許容され得るアジュバントの例には、希釈剤、賦形剤などが含まれる。一般的な薬物製剤の手引きについては、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５が参照され得る。アジュバントの選択は、意図する組成物の投与様式に依存する。本発明の一実施形態において、化合物は、注入による投与用または皮下もしくは静脈内の注射による投与用に製剤化され、無菌で発熱物質を含まない形態で、任意選択的に緩衝化もしくは等張性にされた水溶液として適宜利用される。したがって、化合物は、蒸留水中で、またはより好ましくは食塩水、リン酸緩衝食塩水または５％デキストロース溶液中で投与することができる。錠剤、カプセル剤または懸濁液による経口投与のための組成物は、糖（ラクトース、グルコースおよびショ糖など）、澱粉（トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉など）、セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースを含む）、粉末化トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油（ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油およびコーン油など）、ポリオール（プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど）、寒天、アルギン酸、水、等張食塩水、リン酸緩衝液などのアジュバントを使用して調製される。湿潤剤、潤滑剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、安定剤、錠剤化剤、酸化防止剤、保存料、着色剤および香味剤も存在し得る。クリーム、ローション、および軟膏も、適切な基材（トリグリセリド基材など）を使用して局所投与のために調製し得る。そのようなクリーム、ローションおよび軟膏は表面活性剤も含有し得る。例えば、経鼻送達用のエアロゾル製剤も、適切な噴射剤アジュバントを使用して調製し得る。他のアジュバントも、投与の仕方にかかわらずに組成物に添加することができ、例えば、抗微生物剤は、長期の貯蔵期間にわたる微生物の増殖を防止するために組成物に添加することができる。
【００２６】
加えて、本発明は、変異または非変異Ａサブユニットを含有する、使用されるホロ毒素の投与量の制御を提供する。ホロ毒素の投与量は、競合阻害が部分的となるように調整し得る。幾つかの適用においては、最大約１０％のＥＲＡＤ回避により欠陥表現型を十分に修正することができ、当該修正を達成するために適切な投与量は、当業者が容易に決定し得る。当業者に理解されるように、投与量は、使用されるホロ毒素、処置される疾患もしくは状態、および処置される対象によって変動し得る。一実施形態においては、約１〜１００ｎｇ／ｋｇの範囲、例えば、１０ｎｇ／ｋｇ、のホロ毒素投与量が用いられ得る。
【００２７】
本発明の一適用は、ＣＦ細胞における塩素輸送を増加させるためにΔＦ５０８ＣＦＴＲ変異を救出する実行可能な新たなアプローチを提供する。本発明は、嚢胞性線維症において最も一般的な変異に対する新たな治療アプローチを提供する。
【００２８】
本明細書に記載するＡサブユニット含有ホロ毒素は、親毒素に対する解毒剤として使用することができるが、その理由は、野生型ＡサブユニットのＥＲ移行が、触媒的不活性化Ａサブユニット含有ホロ毒素によるトランスロコンの部分的阻止のために抑制されるためである。本発明の一実施形態において、不活性化Ａサブユニット含有ホロ毒素は、輸送停止配列を含む。輸送停止配列の種類の例としては、限定するものではないが、ＶＦＩＶＳＶＧＳＦＩＴＳＶＬＦＩＶＩまたは９〜１８ロイシン残基を有する輸送停止配列が挙げられる。上記配列を様々な長さに改変したものも作製することができ、この伸長は２工程で付加し得る。
【００２９】
また本発明は、ポリロイシン輸送停止配列が付加されたＶＴ１ホロ毒素Ａサブユニットを提供する。輸送停止配列は、不活性化ＶＴ１のＡサブユニットのＮ末端に付加することができる。輸送停止配列は、一般に、約９〜１８個の疎水性アミノ酸残基を含む。この配列は、ＶＴ１のＡサブユニットのＮ末端に付加することで、トランスロコン阻害の効率を増加させることができる。更に、２個の塩基性アミノ酸を輸送停止配列のＣ末端に付加することで、移行停止効率が増加する。したがって、２個のリジンをポリロイシン輸送停止付加のＮ末端に付加することもできる。対照的に、Ｃ末端への負のアミノ酸残基の付加は、移行停止効率を減少させることが示されている。したがって、ＶＴ１のＡサブユニットへの輸送停止配列の付加は、改変されたホロ毒素の細菌合成を減少させる場合がある。ポリロイシン挿入物のＣ末端に負電荷を配置し、Ｎ末端に正電荷を配置させることは、Ｓｅｃ６１トランスロコンを介する順行移行時よりむしろ逆行時の輸送停止機能に有利となり得る。即ち、輸送停止配列は、毒素の細菌合成の間は最小限の効果を示すべきであり、ＥＲを標的とし、トランスロコンを介して細胞質へ逆移行されるときには最大限の効果を示すべきであるが、ＶＴ１のＡサブユニットがトランスロコンに侵入するときの方向（即ち、Ｎ末端が最初か、またはＣ末端が最初か）はわかっていない。本発明は、ポリロイシン挿入物のＣ末端に塩基性ジリジンモチーフが含まれ、Ｎ末端に酸性アスパラギン酸ダイマーが組み込まれている構築物を含み、また逆の構築物も含む。ホロ毒素構築物は、Ｎｏａｋｅｓ  ＫＬら、１９９９、および、Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  Ｊ、Ｈｕｅｓｃａ  Ｍ、Ａｒａｂ  Ｓ、Ｌｉｎｇｗｏｏｄ  ＣＡ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆａｃｉｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｌｉｄ／ｌｉｐｉｄ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４；２１７：１〜６に記載されているように、ベクター（ｐｕｃ１９など）で発現させることができ、作製されたホロ毒素は、Ｂサブユニット媒介Ｇｂ３アフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００３０】
輸送停止効力は、アミノ酸配列の疎水性にほぼ対応するが、Ｓａａｆ  Ａ．、Ｗａｌｌｉｎ  Ｅ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９８；２５１：８２１〜８２９に記載されるように、変動および例外が存在する。輸送停止配列ＣＦＩＶＳＶＧＳＦＩＴＳＶＬＦＩＶＩは、ＶＴ１のＡサブユニットに、この場合も両方の配置で、融合し得る。ＰＣＲプライマー伸長技術は、ＶＴ１のＡサブユニット遺伝子の５’末端に配列を付加するために使用することができる。全体の配列は、２工程により作製することができ、それぞれ９アミノ酸が付加される。ホロ毒素は、上述のように、アフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００３１】
本発明は、以下の実施例において、更に説明されるが、これらは限定として解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００３２】
＜ΔＦ５０８ＣＦＴＲを分解から救出するためのＶＴ１の使用＞
ΔＦ５０８ＣＦＴＲ発現ＨｅＬａ細胞を、野生型ＶＴ１または不活性ＶＴ１で、上記のように処理すると（Ａサブユニットの触媒作用残基は脱プリン変異のために必要とされる）、ΔＦ５０８ＣＦＴＲの分解からの明らかな救出が、早々に、毒素処理から２〜４時間以内に示された。
【００３３】
図２に示されるように、野生型ＣＦＴＲまたはΔＦ５０８ＣＦＴＲを発現するようにトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、ベロ毒素１、または、不活性化Ａサブユニットを含有するＶＴ１で処理した。不活性化毒素調製物は、野生型ＶＴ１よりも純度が低く、そのため高濃度で使用した。ＣＦＴＲの発現レベルは、細胞抽出物のウェスタンブロットにより測定した。野生型ＣＦＴＲ発現細胞においては、ＣＦＴＲの（コアがグリコシル化された）未成熟種およびその上にラクトサミンがグリコシル化された成熟種が検出される。ΔＦ５０８ＣＦＴＲにおいては、下のコアがグリコシル化された種のみが検出される。野生型ＣＦＴＲをＥＲＡＤに供し、ＶＴ１で処理すると、ＥＲＡＤの阻止により野生型ＣＦＴＲがわずかに増加する。ΔＦ５０８ＣＦＴＲにおいては、不活性化ＶＴ１と野生型ＶＴ１との両方が、未処理の対照細胞と比較して最大１０倍の発現レベルの増加を誘導し、ＥＲＡＤからの顕著な回避を示した。
【実施例２】
【００３４】
＜ＭＤＲＩ変異体を救出するためのＶＴ１の使用＞
ＥＲＡＤの阻害を更に確認するために、ＭＤＲ１のミスフォールドした変異体（Ｇ２６８Ｖ）が発現されるようにトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞へのＶＴ１および不活性ＶＴ１変異体の効果、薬物排出ポンプ（Ｌｏｏ  ＴＷ、Ｃｌａｒｋｅ  ＤＭ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９９；１３：１７２４〜１７３２に記載）。この場合も、図３に示されるように、ＶＴ１およびＶＴ１変異体の両方が、処理されなければＥＲＡＤによって分解されるＭＤＲ１の蓄積を誘導した。ＨｅＬａ細胞におけるＧ２６８Ｖ  ＭＤＲ１変異体の５〜２０倍の発現レベルの増加が、野生型または不活性化ＶＴ１ホロ毒素を用いた処理の２時間後に観察された。
【実施例３】
【００３５】
＜ΔＦ５０８ＣＦＴＲを救出するためのコレラ毒素の使用＞
コレラ毒素の、ΔＦ５０８ＣＦＴＲ発現に対するＢＨＫ細胞における効果（ＢＨＫ細胞は、ＶＴ１に対する感受性はないが、ほとんどの細胞のように、コレラ毒素に対する感受性は有する）を決定した。図４に示されるように、毒素が、ΔＦ５０８ＣＦＴＲのＥＲＡＤ回避をこれらの細胞で誘導することが示された。ΔＦ５０８ＣＦＴＲをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞、野生型またはΔＦ５０８ＣＦＴＲをトランスフェクトしたＢＨＫ細胞を、コレラ毒素で２時間処理し、野生型またはΔＦ５０８ＣＦＴＲのレベルをウェスタンブロットで監視した。１０ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素により、最大５倍のΔＦ５０８ＣＦＴＲの増加が誘導された。増加は、ＢＨＫ細胞およびＨｅＬａ細胞の両方でみられたが、この理由は、コレラ毒素が、これらの細胞株の両方で発現するＧＭ１ガングリオシドに結合するためである。
【実施例４】
【００３６】
＜ゴーシェ病細胞におけるＧＣＣを救出するためのＶＴ１の使用＞
ＶＴ１は、ゴーシェ病細胞におけるＧＣＣ酵素（グルコセレブロシダーゼ）のＥＲＡＤを減少し、より多量の酵素を成熟させ、潜在的に疾患の原因であるグルコシルセラミドの蓄積を減少させる。
【実施例５】
【００３７】
＜輸送停止配列含有不活性化ベロ毒素の構築＞
２つの異なる構築物を作製して、輸送停止アミノ酸を含有する不活性化ベロ毒素Ａタンパク質を生成した。一方の構築物は、９ロイシン輸送停止アミノ酸を有し、他方の構築物は、１８ランダムアミノ酸配列を有した。２セットのＰＣＲプライマー（表２）を使用して、それぞれの輸送停止アミノ酸含有不活性化ベロ毒素Ａタンパク質を生成した。第１のＰＣＲ増幅では、９ロイシンまたは１８ランダムアミノ酸を、不活性化ベロ毒素Ａタンパク質配列に、ｐＳＷ０９プラスミド（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６、２４：１１４２）を使用して導入した。第２のＰＣＲでは、２つの外部プライマーを使用し、輸送停止アミノ酸を含有する不活性化ベロ毒素Ａタンパク質全体を増幅した。プラスミドｐＳＷ０９は、ＶＴＡ配列に２つの変異：Ｙ７７ＳおよびＥ１６７Ｑを有する。ＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。得られたプラスミドは、輸送停止配列含有ベロ毒素Ａ変異体であった。
【００３８】
【表２】
2013503112.tif 000004
【００３９】
本発明を、例証的実施形態および実施例を参照して説明しているが、当該記述は限定の意味で解釈されることを意図していない。斯くして、例証的実施形態の様々な改変ならびに本発明の他の実施形態が、この記述を参照することで当業者に明らかとなるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、任意のそのような改変または実施形態を包含することが企図される。更に、特許請求の範囲の全てが、参照によって好ましい実施形態の記述に組み込まれる。
【００４０】
本明細書で参照されたいずれの刊行物、特許および特許出願も、各刊行物、特許または特許出願が全体として参照によって組み込まれるように具体的にかつ別個に示されるのと同じ程度に、全体として引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図１】
2013503112.tif 000005
【図２】
2013503112.tif 000006
【図３】
2013503112.tif 000007
【図４】
2013503112.tif 000008
【国際調査報告】
2013503112.tif 000009
2013503112.tif 000010
2013503112.tif 000011
2013503112.tif 000012