(57)【要約】  分枝状ＤＮＡ複合体の形成促進を通じた核酸検出方法が開示される。同一反応混合物におけるＰＣＲ、加熱変性及び混成化を統合して行うことによって、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと複数の増幅された標的ＤＮＡとの間における分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡの自己組立てを促進させることで、標的核酸の検出信号及び敏感度を劇的に増加させることができる。
2013520987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出しようとする標的核酸分子の全体または一部と相補的な配列を含む核酸プローブの存在下で、前記標的核酸分子の増幅、加熱変性と混成化とを同一の反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）内で統合して行い、前記核酸プローブに複数の増幅された核酸分子が混成化され、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップ、及び
前記混成化された分枝状核酸複合体を検出するステップを含む
ことを特徴とする試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２】
前記増幅は、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）で行う
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項３】
前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップにおいて、前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体は、自己組立てされる
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項４】
前記分枝状核酸複合体の形成を促進するステップは、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を利用して温度、温度サイクルの時間及び温度サイクルの数を調節することで行われる
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の核酸分子の検出方法。
【請求項５】
前記試料は、全血、血清、体液、生体組職、細胞、微生物、ウイルスまたはウイルス粒子を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項６】
前記試料は、核酸分子の分離及び精製過程を経ていない試料である
ことを特徴とする請求項５に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項７】
前記増幅と混成化とを行う前に、前記試料中の核酸を露出させるために界面活性剤処理、酵素処理または加熱処理を行う
ことを特徴とする請求項６に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項８】
前記検出しようとする標的核酸分子は、細胞−無含有試料内に存在するもの、ウイルス粒子または非真核細胞の中に存在するもの、及び病原体の核酸分子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項９】
前記検出しようとする標的核酸分子は、突然変異した配列を含み、前記プローブは、前記突然変異した配列を含む標的核酸分子に相補的である
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１０】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子である
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１１】
前記標的核酸分子は、ＲＮＡ分子を含み、
前記混成化された分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップは、前記標的ＲＮＡ分子の逆転写、増幅、加熱変性及び混成化を同一の反応混合物内で統合して行うことを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１２】
前記増幅は、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）で行う
ことを特徴とする請求項１１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１３】
前記核酸プローブは、一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１４】
前記核酸プローブは、溶液内に存在するかまたは固体支持体上に存在し、単一容器内でまたは固体支持体上で前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップが行われる
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１５】
前記固体支持体上に存在する核酸プローブは、３'または５'末端がリンカー分子を通じて前記固体支持体上に固定された
ことを特徴とする請求項１４に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１６】
前記検出は、二重鎖ＤＮＡと結合する検出可能な標識と前記混成化された分枝状核酸複合体とを接触させて、標識された複合体を形成して検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１７】
前記検出は、前記増幅時に標識されたヌクレオチドまたは標識されたＰＣＲプライマーを使用して増幅された標的ＤＮＡに混入された標識を通じて検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１８】
前記標識は、蛍光性標識である
ことを特徴とする請求項１６または１７に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１９】
前記検出は、前記増幅時にビオチン標識されたＰＣＲプライマーを使用して、発色酵素が結合されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を利用して検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２０】
検出しようとする標的核酸分子を非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＣＲ）を行って増幅するステップ、
前記増幅された標的核酸分子を含む反応混合物の全体を前記標的核酸分子の全体または一部と相補的な配列を含む核酸プローブが存在する溶液または固体支持体の表面に伝達するステップ、
前記溶液中でまたは前記固体支持体上で混成化を行い、前記核酸プローブと複数の増幅された核酸分子とが混成化されて、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップ、及び
前記混成化された分枝状核酸複合体を検出するステップ
を含み、
前記反応混合物に対する加熱変性は、前記反応混合物を前記溶液または固体支持体の表面に伝達するステップの前にまたは後に行われる
ことを特徴とする試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２１】
前記試料は、全血、血清、体液、生体組職、細胞、微生物、ウイルスまたはウイルス粒子を含む
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２２】
前記検出しようとする標的核酸分子は、細胞−無含有試料内に存在するもの、ウイルス粒子または非真核細胞の中に存在するもの、及び病原体の核酸分子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２３】
前記検出しようとする標的核酸分子は、突然変異した配列を含み、前記プローブは、前記突然変異した配列を含む標的核酸分子に相補的である
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２４】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子を含む
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２５】
前記標的核酸分子がＲＮＡ分子を含み、前記増幅ステップで逆転写と非対称ポリメラーゼ連鎖反応とが統合されて行われる
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２６】
前記核酸プローブは、一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列である
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２７】
前記固体支持体上に存在する核酸プローブは、３'または５'末端がリンカー分子を通じて前記固体支持体上に固定された
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２８】
前記検出は、二重鎖ＤＮＡと結合する検出可能な標識と前記混成化された分枝状核酸複合体とを接触させて、標識された複合体を形成して検出する
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２９】
前記検出は、前記増幅過程中に標識されたヌクレオチドまたは標識されたＰＣＲプライマーを使用して増幅された標的ＤＮＡに混入された標識を通じて検出する
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項３０】
前記標識は、蛍光性標識である
ことを特徴とする請求項２８または２９に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項３１】
前記検出は、前記増幅時にビオチン標識されたＰＣＲプライマーを使用して、発色酵素が結合されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｂｉｄｉｎ）を利用して検出する
ことを特徴とする請求項２０に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡの形成促進を通じた検出信号及び敏感度が劇的に増加した核酸検出方法に関し、より詳しくは、溶液内または固体支持体の表面で同一反応混合物におけるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）及び混成化を統合して行うことによって、短い核酸プローブと複数の増幅された標的ＤＮＡとの間における分枝状ＤＮＡの自己組立て（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を促進させることで、標的核酸の検出信号及び敏感度を劇的に増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、一本鎖の短い核酸プローブ（一般的に、ＤＮＡまたはＰＮＡ）を利用した診断方法は、疾病原因遺伝子、突然変異、感染源（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、ウイルス、微生物など）、ジェノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、遺伝子の発現などの確認または検出のような多様な目的のために使用される。短い核酸プローブは、大体ガラス板、金属板、ビーズなどの多様な固体表面に固定させて使用されている。例えば、短い核酸プローブを利用したＤＮＡマイクロアレイ（または、ＤＮＡチップ）の主な長所のうち一つは、多くの異なった標的核酸配列を同時に分析することができるという点である。このような技術は、病院やクリニックにおける診断用として採用されており、また、臨床診断において便利な使用及び／または信頼性のある決定のために、その他の多様な技術が統合され、最適化されている。
【０００３】
短い核酸プローブを利用した診断方法は、一般的に、下記のような長いプロセスが要求される。（ａ）生物試料（例えば、組職、細胞、血液、血清、体液など）から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出、（ｂ）標的核酸の増幅、及び（ｃ）最終的に、増幅された核酸配列と固体（例えば、ガラススライド或いはビーズ）表面上に固定された短い核酸プローブとの混成化。ここで、ＲＮＡ配列を検出するための場合には、増幅前にＲＮＡを逆転写反応によってＤＮＡに先ず転換させる。
【０００４】
前記標的核酸の検出のために要求される通常のプロセスから分かるように、短い核酸プローブを利用した分子生物学的診断方法は、労働が多く投与され、手数が掛かり、また多くの時間が消費される。従って、核酸配列を便利かつ経済的で、高い処理量で分析するための簡素化された工程が要求され、これは、病院及びクリニックにおける臨床診断のために特に重要である。
【０００５】
また他の重要なイッシューは、混成化された生成物の検出のために使用される方法の 敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）である。検出敏感度は、感染源（例えば、ウイルス、微生物など）の検出において特に重要であり、また、治療の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のために重要である。例えば、感染源の治療の成功可否が人間の体液（例えば、血液）の中に残っている残留感染源の数によって判断され得る。また他の例として、癌治療の成功可否が癌原因遺伝子の存在（従って、癌細胞の存在）によって判断され得る。
【０００６】
一般的に、固体表面に固定された短い核酸プローブを利用した標的核酸配列の検出敏感度は、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）の敏感度より数倍さらに低いと知られている。従って、短い核酸プローブを利用した検出敏感度を向上させることができる方法、理想的には、１個の標的分子の検出が可能な水準に向上された敏感度を有する検出方法を開発することが必要である。
【０００７】
診断対象の核酸の増幅を経ず、標識が多く連結されている分枝状ＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ）を合成し、これをニ分節オリゴヌクレオチドプローブ（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅ）、即ち、分枝状ＤＮＡと混成化を通じて固体上のキャプチャープローブに結合された診断対象の核酸と連結するオリゴヌクレオチドを通じて高いシグナルと敏感度とを得る診断方法が用いられるが、このためには、分枝状ＤＮＡを外部で合成し、固体上に固定されるキャプチャープローブ以外に診断対象を認識するニ分節オリゴヌクレオチドも合成しなければならない。この技術は、敏感度は高いが、時間が長くかかり、多くの過程を経なければならないという短所がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願は、前述した問題点を解決するために案出されたもので、短い核酸プローブを利用して標的核酸を検出する方法において、短い核酸プローブと複数の増幅された標的ＤＮＡとの間の分枝状ＤＮＡ複合体の自己組立て（自己組織化）促進を通じて、検出信号及び敏感度を劇的に増加させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願の一側面によると、検出しようとする標的核酸分子の全体または一部と相補的な配列を含む一本鎖核酸プローブの存在下で、前記標的核酸分子の増幅と混成化とを統合して行い、前記核酸プローブに複数の増幅された核酸分子が混成化され、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップ、及び前記混成化された分枝状核酸複合体を検出するステップを含む試料中の標的核酸分子の検出方法が提供される。
【００１０】
一具現例によると、前記増幅は、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＣＲ）で行うことができるが、これに限らず、通常のＰＣＲを行う場合にも、プライマー濃度を過量に使用する場合、分枝状核酸複合体の形成の促進が可能である。
【００１１】
一具現例によると、前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップにおいて、前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体は、自己組立てされることができるが、これに限らない。
【００１２】
一具現例によると、前記分枝状核酸複合体の形成を促進するステップは、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を利用して温度、温度サイクルの時間及び温度サイクルの数を調節することで行われることができるが、これに限らない。
【００１３】
前記標的核酸分子の増幅と混成化との統合は、固体支持体の表面（例えば、マイクロアレイの表面、容器或いはチューブ内の表面、或いはビーズ表面など）でまたは容器内の溶液中で同一反応混合物内で増幅と混成化とが行われることを意味し、固体支持体または容器にサーマルサイクラーを結合させることで、前記固体支持体または容器の温度、温度サイクルの時間及び数を調節して増幅と混成化とを統合して行うことが容易にでき、このような調節をプログラム化して検出過程を自動化することが可能である。前記増幅及び混成化の統合と関連した内容は、本願の発明者による国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９３９５により詳細な説明が記載されており、前記特許文献は、内容全体が本明細書に統合される。
【００１４】
一具現例によると、前記試料は、全血、血清、体液、生体組職、細胞、微生物、ウイルスまたはウイルス粒子を含有することができるが、これに限らず、検出しようとする標的核酸が含まれることができるものであれば、どの試料でも構わない。
【００１５】
一具現例によると、前記試料は、核酸分子の分離及び精製過程を経ていない試料であってもよいが、これに限らず、核酸分子の分離及び精製過程を経た試料も当然に使用されることができる。
【００１６】
一具現例によると、前記試料が核酸分子の分離及び精製過程を経ていない試料である場合、前述した増幅及び混成化を統合して行う前に、前記試料中の核酸を露出させるために界面活性剤処理、酵素処理または加熱処理を追加で行うことができるが、これに限らない。核酸分子の分離及び精製過程を経ず、増幅及び混成化を統合して行うことと関連した内容は、本願の発明者による国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４８０９により詳細な説明が記載されており、前記特許文献は、内容全体が本明細書に統合される。
【００１７】
一具現例によると、前記検出しようとする標的核酸分子は、細胞−無含有試料内に存在するもの、ウイルス粒子または非真核細胞の中に存在するもの、病原体の核酸分子などであってもよいが、これに限らない。
【００１８】
一具現例によると、前記検出しようとする標的核酸分子は、突然変異した配列を含む核酸分子であり、前記プローブは、前記突然変異した配列を含む標的核酸分子に相補的であってもよいが、これに限らない。
【００１９】
一具現例によると、前記標的核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子であってもよいが、これに限らない。
【００２０】
一具現例によると、前記標的核酸分子は、ＲＮＡ分子であり、前記混成化された分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップは、前記標的ＲＮＡ分子の逆転写、増幅及び混成化を統合して行うことができるが、これに限らない。ここで、前記増幅は、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）で行われることができるが、これに限らず、通常のＰＣＲを行う場合にも、プライマー濃度を過量に使用する場合、分枝状核酸複合体の形成の促進が可能である。
【００２１】
一具現例によると、前記核酸プローブは、一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列であってもよいが、これに限らない。
【００２２】
一具現例によると、前記核酸プローブは、溶液内に存在するかまたは固体支持体上に存在することができるが、これに限らない。前記核酸プローブが溶液内に存在する場合、標的核酸分子の増幅と混成化とが単一容器内で統合して行われることができる。また、前記核酸プローブが固体支持体上に存在する場合、固体支持体上で標的核酸分子の増幅と混成化とが統合して行われることができる。
【００２３】
前記固体支持体としては、多様な固体表面が利用されることができ、例えば、プラスチックチューブ、プラスチック容器（ｗｅｌｌ）、ガラス容器、ビーズ（ｂｅａｄ）、ガラススライド、金属表面などが利用されることができる。また、前記固体支持体は、多数の核酸プローブが付着したマイクロアレイであってもよい。
【００２４】
一具現例によると、前記固体支持体上に存在する核酸プローブは、３'または５'末端がリンカー分子を通じて前記固体支持体上に固定されることができるが、これに限らない。ここで、前記リンカー分子は、核酸プローブを固体支持体上に連結することができる多様な物質が使用されることができる。例えば、ガラススライドなどの固体支持体の表面を多様な化合物質でコーティングして、核酸プローブを表面に付着するようにすることができる。前記化学物質は、プローブ（ＤＮＡまたはＰＮＡ）を固体支持体の表面に付着させなければならないだけでなく、非−特異的結合及びノイズを最小化しなければならず、例えば、ＤＮＡの付着のためのアミン、エポキシ、またはアルデヒド基の供給源としてシラン、シリルまたはポリ−Ｌ−リシンなどを含有することができる。バイオチップに使用するための樹状突起（ｄｅｎｄｒｏｎまたはｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）が開発されており、リンカー分子として樹状突起を使用することで、キャプチャープローブの間の空間を調節することができ、これで、立体妨害が減るとともに、敏感度が増加されることができる。また、このような効果は、他の方法でも可能であり、例えばストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたガラススライドの表面にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）−核酸プローブを付着することで、このような現象を再現することができるであろう。
【００２５】
一具現例によると、前記検出は、二重鎖ＤＮＡと結合する検出可能な標識と前記混成化された分枝状核酸複合体とを接触させて、標識された複合体を形成して検出することができ、または、前記増幅時に標識されたヌクレオチドまたは標識されたＰＣＲプライマーを使用して増幅された標的ＤＮＡに混入された標識を通じて検出することができるが、これに限らず、当該技術分野で公知の多様な検出手段を通じて増幅された標的分子の検出が可能である。
【００２６】
例えば、増幅反応のための反応混合物中に蛍光標識されたｄＮＴＰを含ませることで、増幅された核酸物質を標識することが可能であり、他の例として、放射性同位元素を標識として使用することも可能である。また、電気化学的検出及び二重鎖核酸結合剤の使用、例えば結合された物質をチップまたはスライドの表面から除去する洗滌または洗浄ステップの以後に有利に使用されるＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎの使用などが用いられる。また、標的核酸の増幅時にビオチン標識されたＰＣＲプライマーを使用することで、発色酵素が結合されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｂｉｄｉｎ）を利用して検出が行われることができる。また、当業者に公知の他の検出手段を使用することができ、蛍光以外の例として、放射活性または化学発光残基を有する標識化や、化学的、酵素的、物理化学的または抗原−抗体結合過程に基づいた他の手段が挙げられる。例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、ローダミン、フルオレセイン、フィトエリスリン、ルミノール、イソルミノール、アグリジウムエステルまたは蛍光性ミクロスフェアなどが検出可能な残基として使用されることができる。
【００２７】
一方、固体支持体上の増幅された物質の分析は、当業者に公知の任意の適合した手段によって行うことができる。例えば、混成化以後のＤＮＡ分析で行われることができる一般的な例として、イメージ獲得のための市販されている共焦点レーザースキャナー及び蛍光強度分析のための定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェアなどを使用することができる。
【００２８】
本願の他の側面によると、検出しようとする標的核酸分子を非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）を行って増幅するステップ、前記増幅された標的核酸分子を含む反応混合物の全体を前記標的核酸分子の全体または一部と相補的な配列を含む一本鎖核酸プローブが存在する溶液または固体支持体の表面に伝達するステップ、前記溶液中でまたは前記固体支持体上で混成化を行い、前記核酸プローブと複数の増幅された核酸分子とが混成化されて、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップ、及び前記混成化された分枝状核酸複合体を検出するステップを含む試料中の標的核酸分子の検出方法が提供される。
【００２９】
ここで、固体支持体に固定された核酸プローブを使用することは、核酸プローブと形成された分枝状核酸複合体を容易に分析するための方法である。例示的具現によると、溶液状態でも非対称ＰＣＲと短い核酸プローブとの混成化を経て分枝状ＤＮＡが形成されることを測定することができる。
【００３０】
一具現例によると、前記非対称ＰＣＲ反応が前記固体支持体の表面から分離した容器またはコンテナの内で行われ、反応混合物の全体を核酸プローブが固定された固体支持体の表面に伝達することができるが、これに限らない。
【００３１】
連鎖非対称ＰＣＲを分離して行う場合においても、その反応混合物全体を核酸プローブが固定された支持体の表面に伝達することで、分枝状核酸複合体の形成が促進されることができる。ここで、非対称ＰＣＲを分離して行うことを除いた残りの構成は、前述した統合して行う場合と同様に行われることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本願の一実施例によると、ＤＮＡチップ技術の使用を通じて、基礎研究分野だけでなく、分子診断における標的核酸分子の検出において、高い信号を有する標的核酸分子１個水準の検出敏感度（従って、高い水準の信頼度）を有する標的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出が可能である。ＤＮＡマイクロアレイによる高い信頼度（高い信号）で標的ＤＮＡ１個分子の検出は前例がなく、このような敏感度は、最新の定量ＰＣＲの性能に相応するか遥かに優れている。
【００３３】
本願の一実施例によると、核酸プローブをビーズに付着して非対称ＰＣＲと混成化を行った後、ビーズを回収して分枝状ＤＮＡ形成を測定することができ、核酸プローブをプラスチック或いはガラス容器やチューブの表面に付着して非対称ＰＣＲと混成化を行った後、分枝状ＤＮＡ形成を測定することができる。このような例は、本願の技術が多様な診断方法に活用されることができるということを示す。上記の例は、診断を自動化することにも活用することができる。
【００３４】
本願の一実施例による、統合された非対称ＰＣＲ及び混成化によって得られた信号は、市販中のＤＮＡチップ診断キットによって推薦される通常のプロトコルより少なくともさらに２５〜３０倍高いため、統合されたプロセスの高い敏感度は、感染源、例えばウイルス及び微生物の検出及び動静だけでなく、身体内の感染源の存否の決定などの多くの活用可能性を有し、また、このような統合されたプロセスは、多くの普通の細胞の中で癌細胞の検出のために使用されることができる。
【００３５】
本願で明示する統合過程を通じた分枝状ＤＮＡ複合体の自己組立ては、遺伝子診断の自動化にも活用可能である。即ち、ＰＣＲ過程に必要な装置と混成化に必要な装置とを統合することができるだけでなく、これに必要なプロセス、即ちサンプルのピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）及び移動などを単純化することができるという効果もある。
【００３６】
既存の標識分子が結合された分枝状ＤＮＡを合成し、これを固体に結合されたキャプチャープローブと混成化される診断対象の核酸と相補的な配列と、分枝状ＤＮＡと相補的な配列部位を有したニ分節オリゴヌクレオチド（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を通じて連結させ、シグナルと敏感度とを上げる技術が発表されたが、これは、本願で明示される自己組立て（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を通じた分枝状ＤＮＡ複合体組立てとは性格上全く異なる技術であり、ＰＣＲを通じた診断対象の遺伝子を増幅し、分枝状ＤＮＡ複合体形成を通じたシグナルと敏感度とをより高める技術である。また、統合過程（ＰＣＲ、加熱変性、混成化）が同一のＰＣＲ反応混合物で進行され、過程が簡便化されるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＨＰＶ  ＤＮＡのジェノタイピングのために使用されたＨＰＶ  ＤＮＡのＬ１領域を図式的に示す図面であり、フォワード（Ｆ）ＰＣＲプライマー、リバース（Ｒ）ＰＣＲプライマー及びＨＰＶ１６キャプチャープローブとして使用した２９ヌクレオチド（ｎｔ）を示す図面である。
【図２】混成化の過程を示すものである。（ａ）は、１次的に２９ｎｔキャプチャープローブと、Ｒプライマーによって生成されたリバース鎖とが結合された構造であり、（ｂ）では、（ａ）で形成された結合体に二つのＦプライマーによって生成されたフォワード鎖が二つ結合され、これにより二つのリバース鎖が結合することができる部位が露出されたことを示し、（ｃ）は、（ｂ）で形成された結合体に二つのリバース鎖が結合され、二つのフォワード鎖が結合することができる部位が露出されたことを示す。●と○とは、標識分子を意味する。
【図３】キャプチャープローブと非対称ＰＣＲ生成物との間の凝集物（または、分枝状ＤＮＡ）の組立てを証明する電気泳動結果のイメージである。（ａ）は、対称（Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲと非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲとをＨＰＶ１６  Ｌ１部位と完全に相補的な配列を有したプライマーセットＡで行った結果であり、（ｂ）は、ジェノタイピング用プライマーセットＢで実験した結果である。（ａ）及び（ｂ）の各レーンは、下記の通りである。レーン１：対称ＰＣＲ＋混成化、レーン２：対称ＰＣＲ＋キャプチャープローブ＋混成化、レーン３：非対称ＰＣＲ＋混成化、レーン４：非対称ＰＣＲ＋キャプチャープローブ＋混成化。
【図４】分枝状ＤＮＡ複合体が正常な二本鎖ＤＮＡではなく、一本鎖部位とギャップ（ｇａｐ）を含んでいることを示す電気泳動結果のイメージである。（ａ）ＥｔＢｒで染色したイメージ、（ｂ）Ｃｙ５イメージ。非対称ＰＣＲ＋混成化：レーン１：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマー、レーン２：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒプライマー非対称ＰＣＲ＋キャプチャープローブ＋混成化：レーン３：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマー、レーン４：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒプライマー。レーン３、４ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理した場合：レーン５：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマー、レーン６：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒプライマー。
【図５】分枝状ＤＮＡ内に存在するキャプチャープローブ当たり結合されたフォワードとリバース鎖の数を決定する実験結果を示す電気泳動結果のイメージである。（ａ）ＥｔＢで染色したイメージ、（ｂ）Ｃｙ５イメージ。キャプチャープローブなしに統合過程を進行した場合：レーン１：Ｃy５−ＧＰ４Ｒ、レーン２：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆ。キャプチャープローブを含んだ統合過程：レーン３：Ｃｙ５−キャプチャープローブ、レーン４：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒ、レーン５：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆ。
【図６】分枝状ＤＮＡが形成される条件に関する実験結果である。（ａ）キャプチャープローブの存在下に非対称ＰＣＲを進行し、停止された状態（レーン１）、非対称ＰＣＲの後、変性過程なしに混成化を進行した場合（レーン２）、非対称ＰＣＲの後、９５℃で変性させ、５０℃で混成化を進行した場合（レーン３）。（ｂ）非対称ＰＣＲを進行し、変性、そして混成化をするが、キャプチャープローブを添加しない場合（レーン１）、非対称ＰＣＲ、加熱変性（ｈｅａｔ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の後、キャプチャープローブを添加し、混成化をした場合（レーン２）、ＰＣＲ、加熱変性の後、キャプチャープローブとＥＤＴＡとを共に添加し、混成化をした場合（レーン３）。
【図７】ガラススライド上に固定化されたＨＰＶ１６プローブと混成化に起因した、ＰＣＲ生成物と一本鎖ＰＣＲ生成物との量の増加によって得られる信号を示すグラフである。
【図８】非対称ＰＣＲとこれに続く混成化がＤＮＡマイクロアレイスライドの表面で行われた時、信号が数倍増加することを証明するグラフである。
【図９】ＤＮＡマイクロアレイスライドの表面における統合された非対称ＰＣＲ、加熱変性及び混成化（−●−）によって、スライド上に適用された１個分子の標的ＤＮＡを高い信号で検出することを証明するグラフである。
【図１０】多様なプロセスによって得られた信号を比較したグラフである。
【図１１】逆転写、増幅及びガラス表面に固定化されたキャプチャープローブ（Ａ２−Ｐ）との混成化による、慢性骨髓性白血病細胞（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ）におけるキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）ＢＣＲ  Ｂ３−ＡＢＬ  Ａ２  ＲＮＡ検出を図式的に示す図面である。
【図１２】ＤＮＡマイクロアレイスライドの表面における統合された逆転写、非対称ＰＣＲ、加熱変性及び混成化によるＲＮＡ検出信号及び敏感度の劇的な増加を証明するグラフである（１．スライドの表面で逆転写、非対称ＰＣＲ、加熱変性、混成化を統合したプロセス、２．３ｘＳＳＣの中で固定化されたプローブと逆転写／非対称ＰＣＲ生成物の混成化、３．３ｘＳＳＣの中で固定化されたプローブと逆転写／対称ＰＣＲ生成物の混成化）。
【図１３】対称ＰＣＲでプライマーの濃度を増加させた場合、信号の大きな増加を示すグラフである。
【図１４】マイクロアレイスライド上の統合された逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化に加熱された慢性骨髓性白血病細胞抽出物（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ−ｅｘｔｒａｃｔ）の直接的な添加によるキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＲＮＡの検出を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
本願で使用される大部分の用語は、当業者が認知することができるはずであるが、それにもかかわらず、以下の定義は、本願の理解を助けるために提示される。しかし、明示的に定義されていない場合、用語は、当業者によって当時に受け入れられる意味を取ることで解釈されなければならない。
【００３９】
『非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）』は、増幅された一本鎖ＤＮＡを生成することができるＰＣＲ方法であって、二つのプライマーのうち一つを過量に使用して過剰のプライマーを通じて一本鎖ＤＮＡを増幅させることができる方法をいう。
【００４０】
『分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡ』は、三つ以上の一本鎖ＤＮＡが互いに部分的に混成化されて、側鎖を有した凝集された（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）形態のＤＮＡを意味する。
【００４１】
『混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）』は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡの２本の鎖の間の二重螺旋（ｄｕｐｌｅｘ）の形成または塩基相補性によるＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖との間の二重螺旋の形成を意味する。
【００４２】
『ＤＮＡ変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）』は、相補的なＤＮＡ鎖が混成化を通じて二本の二重螺旋を有したＤＮＡを形成するためには、一本鎖のＤＮＡを形成する必要があるが、通常、９０℃以上の温度で二本のＤＮＡ鎖が分離される。ｐＨ１３−１４でも二本のＤＮＡ鎖が分離される。本特許で明示した９４℃或いは９５℃では、基本的に同一の結果、即ち二本のＤＮＡが一本に分離される。
【００４３】
『固体支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）』は、本願で使用される場合、標的核酸を検出するためのキャプチャープローブが付着することができる基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を意味する。好ましくは、多数のキャプチャープローブのアレイを結合させることができるガラススライド、金属、プラスチックのような平面の基板であってもよいが、ガラス、プラスチック、或いは高分子ビーズ（ｂｅａｄ）などの球状の基材も可能であり、ガラスやプラスチックの容器、即ちチューブ（ｔｕｂｅ）のような多様な材質の基材が使用されることができる。
【００４４】
『増幅』は、特定核酸のコピー数を増大させることを意味する。
【００４５】
『検出する』という用語またはその変形は、定量的及び定性的検出方法の両方を含む意味である。
【００４６】
『含む』または『有する』などの用語は、明細書上に記載された特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはこれらを組合したものが存在することを指定するものであり、一つまたはそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはこれらを組合したものなどの存在または付加可能性を予め排除しないことと理解されなければならない。
【００４７】
以下、本願による核酸検出方法を実施するための具体的な内容を図面を参照して説明する。
【００４８】
本願は、液体内、或いは固体表面で統合されたＤＮＡ鎖の非対称増幅、加熱変性（ｈｅａｔ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）と混成化とによって固定化されたキャプチャー核酸プローブと増幅された標的ＤＮＡとの間に分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡの形成を促進する方法を含む。ＤＮＡチップ技術の使用を通じて、基礎研究だけでなく、分子診断における標的核酸分子の検出において、高い信号を有する標的核酸分子１個水準の検出敏感度（従って、高い水準の信頼度）の劇的な増加をもたらすことができる。前記技術は、溶液内や固体支持体の表面における逆転写、非対称増幅及び混成化の統合によって高い敏感度と信号とを有するＲＮＡ分子の検出にも適用されることができる。
【００４９】
図１に示すように、ＤＮＡチップによるＤＮＡの診断途中に、標的ＤＮＡを含む小さな部分（ｓｍａｌｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）のＤＮＡが増幅される（また、増幅中に標識化されることができる）。
【００５０】
図２は、混成化の過程を示すものであり、（ａ）は、混成化の過程中に１次的に２９ｎｔキャプチャープローブと、Ｒプライマーによって生成されたリバース鎖とが結合された構造を表示し、リバース鎖にフォワード鎖が結合することができる二つの部位が露出されている。（ｂ）は、（ａ）で形成された結合体に二つのＦプライマーによって生成されたフォワード鎖が二つ結合され、これにより二つのリバース鎖が結合することができる部位が露出される。（ｃ）は、（ｂ）で形成された結合体に二つのリバース鎖が結合され、二つのフォワード鎖が結合することができる部位が露出される。このような過程が続くと、一つのオリゴヌクレオチドプローブに複数のＰＣＲ鎖が結合された非常に巨大な複合体、即ち分枝状ＤＮＡが形成される。標識されたＰＣＲ産物を使用する場合、シグナルが大幅に増加されることができる。ＰＣＲプライマー末に連結された●と○とは、標識分子を意味する。図２に示すように、前記増幅されたＤＮＡは、増幅されたＤＮＡの小さな部分に対応する短いキャプチャー核酸プローブと混成化される。理論的に、増幅されたＤＮＡの相補的な鎖（図１におけるリバースプライマー（Ｒ）によって延長された鎖）がキャプチャープローブと二重螺旋の構造を形成した後、結合された増幅されたＤＮＡ鎖の相当部分が他の増幅された鎖（図１におけるフォワードプライマー（Ｆ）によって延長された鎖）と二重螺旋の構造を形成するために開かれるようになる［図２（ａ）］。リバース鎖にフォワード鎖が結合した後［図２（ｂ）］、フォワード鎖に開かれた二つの領域は、二つのリバース鎖の結合に利用されることができ、それによって、分枝状ＤＮＡ（または、凝集されたＤＮＡ）構造を形成する（図２（ｃ）の提案されたモデル参照）。理論的に、このような形態の結合は、複数回繰り返されるであろう。各ＰＣＲ鎖が標識化された場合、これは、検出信号及び敏感度に大きな増加をもたらすことができる。
【００５１】
キャプチャープローブと非対称ＰＣＲ生成物との間の大きい分枝状ＤＮＡ複合体の形成
増幅されたＤＮＡ及びキャプチャープローブの間の分枝状ＤＮＡの組立てを証明するために、二つのプライマーセットを使用した。ＨＰＶ１６  ＤＮＡのうち、Ｌ１遺伝子と完全に相補的なプライマーセットＡと４０余個のＨＰＶウイルス種（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のＬ１部位を増幅することができるように、プライマーセットＡに幾つかの配列変化を導入したプライマーセットＢを使用した。その理由は、ＨＰＶに感染したか否か及びＨＰＶ  ｔｙｐｅの診断のためにも、分枝状ＤＮＡ複合体技術を活用することができる根拠を提示するためである。これらのプライマー配列は、下記実施例１に記載した。図３の（ａ）に示すように、プライマーセットＡを利用した非対称ＰＣＲ生成物を９５℃で変性させ、キャプチャープローブと混成化した後、電気泳動をすれば、３２０ｂｐのＰＣＲ生成物より８倍も大きくみえる２５００ｂｐのＤＮＡバンドが見られる。 電気泳動像のＤＮＡの移動性は、ＤＮＡ３次元的構造に敏感であるので、正確なサイズは見積もり難いが、２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡは、キャプチャープローブと非対称ＰＣＲ産物との間に形成されたＤＮＡ複合体であることには違いない。対称ＰＣＲ産物の場合、２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡの量は非常にわずかである（図３の（ａ）、レーン２）。ジェノタイピング用プライマーセットを使用した時も、２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡ複合体が組立てられる（図３の（ｂ））。フォワード鎖とリバース鎖とをそれぞれＣｙ５で標識した場合、２５００ｂｐ位置のＤＮＡは、キャプチャープローブとフォワード鎖とリバース鎖とを全て含んでおり（図４のレーン３と４）、この構造は、正常な二本鎖のＤＮＡではなく、図２で示すように、一本鎖のＤＮＡ部位とｇａｐを含んでおり、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する場合、分解される（図４、レーン５と６）。また、非対称ＰＣＲを行う場合、６００ｂｐ位置にあるＤＮＡが生成されるが（図３と４）、これは、Ｃｙ５リバースプライマーによってのみ標識され、Ｓ１ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）によって分解されたことをみると、非対称ＰＣＲによって生成された一本鎖ＤＮＡであるとみられる。一本鎖ＤＮＡは、電気泳動像の二本鎖ＤＮＡと異なる移動性を有することは、よく知られた事実である。
【００５２】
分枝状ＤＮＡ複合体内のキャプチャープローブ当たりフォワード鎖及びリバース鎖の数
非対称ＰＣＲを利用した統合過程（プローブが存在する状態でＰＣＲ、加熱変性、混成化を進行）を行うが、ＰＣＲプライマー二つとキャプチャープローブとのうち一つだけＣｙ５に標識されるようにして得られた産物を電気泳動し、２５００ｂｐ位置にある分枝状ＤＮＡのＣｙ５の強度を測定して比較した（図５の（ｂ）参照）。こうして得られた結果をみると、キャプチャープローブ当たりリバース鎖三つとフォワード鎖二つとが結合されている。即ち、図２（ｃ）の構造と類似している。従って、各鎖が標識された場合、キャプチャープローブ当たり五つのシグナルを得ることができるという結論が得られる。
【００５３】
分枝状ＤＮＡ複合体の組立てを促進させる条件
分枝状ＤＮＡ複合体は、非対称ＰＣＲの過程中にキャプチャープローブを含んでも自己組立てされるが、非対称ＰＣＲ後に熱処理による変性過程を経た後、混成化をする場合、分枝状ＤＮＡ組立てが約５倍促進される（図６の（ａ）、レーン３）。混成化の過程中にＥＤＴＡを添加してＤＮＡ生成を抑制する場合、分枝状ＤＮＡ組立てが顕著に減る（図６の（ｂ））。この結果は、混成化の過程中にＰＣＲ反応混合物内に存在するＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ生成過程によって分枝状ＤＮＡの組立てが促進されることを意味する。非対称ＰＣＲの後、熱処理を通じた変性過程を経ないと、混成化の過程中に自己組立てが促進されない（図６の（ａ）、レーン２）。従って、分枝状ＤＮＡ複合体の組立ての促進のためには、ＰＣＲ後の熱処理を通じた変性が必ず必要である。これは、二本のＰＣＲ産物が熱処理によって一本鎖が形成され、ＰＣＲプライマーが結合されなければ、混成化の過程中に新しいＤＮＡが生成されないということも意味する。
【００５４】
固体表面で分枝状ＤＮＡ複合体の組立ての証拠
分枝状ＤＮＡの組立てに対する追加の証拠が、一本鎖ＤＮＡ、非対称ＰＣＲ生成物及び対称ＰＣＲ生成物と、ガラススライド上に固定化されたキャプチャー核酸プローブとの混成化によって得られた信号の比較によって得られた。図７に示すように、一本鎖ＤＮＡ量の飽和によって得られた信号は、約１０,０００ユニット（ｕｎｉｔ）であり、これは、固定化されたキャプチャープローブ及び相補的な一本鎖ＤＮＡ（約２０ｐｍｏｌ／３０μｌ）の間に形成された１００％二重螺旋によって得られる最大信号を意味する。さらに多い量の二重螺旋ＤＮＡが添加された時（例えば、１５０ｐｍｏｌ）に得られる検出可能な信号はなかった。一方、非対称ＰＣＲ生成物は、一本鎖ＤＮＡによって得られた信号よりさらに数倍大きい信号を生成した。これは、１個分子以上の非対称ＰＣＲ生成物が、図２に示した分枝状のＤＮＡの形成によって、それぞれの固定化されたキャプチャープローブに結合されることを強く提案する。この実験では、非対称ＰＣＲの場合、信号が非常に高く、実験結果を適正な限度内で比較することができるように、蛍光で標識されたプライマーを非蛍光プライマーで１０倍に希釈した。
【００５５】
スライド上の混成化の途中の１回（ｏｎｅ  ｒｏｕｎｄ）のＤＮＡ複製の重要性
標識化された非対称ＰＣＲ生成物を精製し、スライド上に固定されたキャプチャープローブと混成化させた時、完全な非対称ＰＣＲ反応混合物の存在下で、信号が数倍増加した（図８の右側から２番目の棒）。増加の程度は、固定化されたキャプチャープローブの表面における統合された非対称ＰＣＲ、加熱変性及び混成化によって得られた信号と非常に類似している（図８の一番右側の棒）。これは、混成化ステップ（通常、５０〜６０℃）の間の１回（ｏｎｅ  ｒｏｕｎｄ）のＤＮＡ複製が信号の増加に重要であることを提示する。これを証明するまた一つの例は、下記の通りである。混成化の過程中に増加するシグナルは、混成化の過程中に添加した標識されたＰＣＲプライマーによるということである（図８の左側から３番目と５番目の棒を比較）。前記結果は、信号の劇的な増加がチューブにおける非対称ＰＣＲを行い、全体含有物をマイクロアレイスライド上のチャンバに伝達し、熱処理後の混成化を行うことによって、またはＤＮＡマイクロアレイの表面における統合された非対称ＰＣＲ及び混成化によって得られることができるということも証明する。
【００５６】
マイクロアレイスライド上の統合された非対称ＰＣＲ及び混成化の高い敏感度
前述したように、ＤＮＡマイクロアレイによる標的ＤＮＡの検出敏感度は、リアルタイムＰＣＲよりさらに数桁倍（ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）で低いと知られている。マイクロアレイスライド上の統合された非対称ＰＣＲ及び混成化の敏感度を測定するために、階段希釈されたＨＰＶ１６ＤＮＡを非対称ＰＣＲ混合物に添加し、統合されたＰＣＲ、加熱変性及び混成化を固定化されたＨＰＶ１６キャプチャープローブの表面で行った。図９に示すように、１個分子のＨＰＶ１６ＤＮＡが高い信号で検出され、ＨＰＶ１６ＤＮＡの１〜１００００個分子の間に扇形的な比例関係があった。図９で示すように、多様な方式で製造された標識されたＤＮＡとの適切な比較のために、標識されたＰＣＲプライマーを５倍の非標識プライマーで希釈した。実際に、得られた信号は、レーザースキャナーによる検出上限を超過した。ＤＮＡマイクロアレイによる高い信頼度（高い信号）で標的ＤＮＡ１個分子の検出は、前例がなく、このような敏感度は、最新の定量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＰＣＲの性能に相応するか、反ってさらに優れている。
【００５７】
統合された非対称ＰＣＲ及び混成化によって得られた信号は、市販中のＤＮＡチップ診断キットによって推薦される通常のプロトコルより少なくともさらに２５〜３０倍高い（図１０）。通常のプロセスは、マイクロアレイスライド上で精製されたＰＣＲ生成物をｂｕｆｆｅｒ溶液（例えば、３ｘＳＳＣ或いは６ｘＳＳＣ）上における混成化を推薦する。統合されたＤＮＡマイクロアレイの表面における非対称ＰＣＲ、加熱変性及び混成化によって得られた信号（コラム４）は、通常のプロセス、即ち、精製された対称ＰＣＲ生成物（コラム１）によって得られた信号に比べてさらに３０倍大きく、統合された対称ＰＣＲ及び混成化によって得られた信号（コラム２）または精製された非対称ＰＣＲ生成物の混成化による信号（コラム３）に比べてさらに５倍大きい。
【００５８】
統合されたプロセスの高い敏感度は、感染源、例えばウイルス及び微生物の検出及び動静だけでなく、身体内の感染源の存否の決定などの多くの活用可能性を有する。また、統合されたプロセスは、多くの普通の細胞の中で癌細胞の検出のために使用されることができる。
【００５９】
統合されたプロセスによる高い敏感度のＲＮＡの検出
ＲＮＡゲノムを含有するウイルスを含む多くの感染源及び診断は、ＲＮＡの検出と関連する。時には、感染性ウイルスの存否決定は、ＲＮＡ試料の精製と濃縮後の定量ＰＣＲによって測定される。本願では、ＲＮＡから混成化までの統合されたプロセスがマイクロアレイの表面上で行われることができるということを見出した。統合されたプロセスの中に非対称ＰＣＲを含ませることで、検出信号及び敏感度を大きく増加させることができる。図１２に示すように、ＤＮＡマイクロアレイの表面上における統合された逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化は、１〜１０個分子のＲＮＡを容易に検出することができる（図１２の１）。図１２で添加した研究対象のＲＮＡが１０,０００個である場合を比較した時、非対称ＰＣＲ及び混成化によって得られたシグナルが非対称ＰＣＲのみを行った時より（図１２の２）さらに５倍高い。
【００６０】
また、図１３のラインｃ及びｄに示すように、フォワード及びリバースプライマーを両方１０倍増加させた統合された対称ＰＣＲ及び混成化によっても、信号の大きな増加が得られることができる。しかし、敏感度の増加の程度は、非対称ＰＣＲによって得られる水準に及ばない（図１３のラインａとｃ比較）。
【００６１】
統合されたプロセスと単純核酸抽出過程の結合
通常の方法は、研究或いは診断対象の検体から核酸を分離精製し、精製された核酸を対象遺伝子の増幅及び混成化に利用する。しかし、検体と診断目的とによって検体（特に、血液、血清、細胞など）を簡単に処理した後、診断対象の遺伝子を増幅することができる。従って、このような過程は、遺伝子診断を自動化するのに有益に活用されることができる。
【００６２】
図１４で示すように、慢性骨髓性白血病細胞を熱処理をする場合、この際放出される核酸を統合過程、即ち直接逆転写、ＰＣＲ及び混成化の過程と連携して使用することができる。シグナルと敏感度とが精製されたＲＮＡと類似した様相を示す。従って、このような過程は、遺伝子診断を簡素化し、また自動化に有用に活用されることができる。
【００６３】
非対称ＰＣＲ産物による分枝状ＤＮＡの組立てに関する意見
対称ＰＣＲ産物は、非対称ＰＣＲ産物や一本鎖に比べてキャプチャープローブに結合する速度や効率性が非常に低い。これは、対称ＰＣＲ産物が変性後、復元（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）（二本の鎖が二重螺旋に戻る過程）がキャプチャープローブと結合する速度や効率性よりさらに高いためであるとみられる。特に、固体表面に固定されたキャプチャープローブと混成化する速度は、さらに低い。一方、一本鎖ＤＮＡは、キャプチャープローブと衝突する確率がさらに高いため、混成化の速度や効率が高い。これは、実験的に証明された事実である。非対称ＰＣＲの場合、一本鎖ＤＮＡが追加で生成されるので、この一本鎖がキャプチャープローブと結合することができる速度や効率が対称ＰＣＲ産物より高い。ここに関する報告は、既にある。図２（ａ）から分かるように、分枝状ＤＮＡが形成されるためには、一旦キャプチャープローブと相補性がある一本鎖が先ず結合しなければならない。このような点で、非対称ＰＣＲ産物が対称ＰＣＲ産物より分枝状ＤＮＡ形成においてさらに有利である。そして、分枝状ＤＮＡの組立てがＰＣＲ反応混合物内で混成化の過程中に促進される理由は、ｏｎｅ  ｒｏｕｎｄ  ＤＮＡの生成によるものということ以外には、さらに詳しいメカニズムは未だ不明の状態である。
【００６４】
［実施例１］
ＨＰＶ  ＤＮＡの検出のためのＰＣＲ及び混成化の条件
ＨＰＶ１６ＤＮＡの検出のために使用されたキャプチャープローブ及びＰＣＲプライマーを図１に示し、その具体的配列は、下記の通りである。
ＰＣＲプライマーセットＡ：
ＨＰＶ１６Ｌ１部位と全ての配列が相補的なプライマー
フォワードプライマー（Ｆ）：５'−ＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧ−３'（配列番号１）
リバースプライマー（Ｒ）：５'−ＧＣＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＡＣＣＡＴＡＧＡＡＣＣＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号２）
ＰＣＲプライマーセットＢ：
４０余種のＨＰＶのジェノタイピングのために使用される共通のプライマーは、わずかな配列の違いを有した全ての種のＨＰＶ  Ｌ１部位を認識するように製造された。
フォワードプライマー（ＧＰ４Ｆ）：５'−ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧ−３'（配列番号３）
リバースプライマー（ＧＰ４Ｒ）：５'−ＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＡＣＴＡＧＧ−３'（配列番号４）
キャプチャープローブ：
ＨＰＶ１６キャプチャープローブ：５'−ＣＴＣＴＧＧＧＴＣＴＡＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＴＴ−３'（配列番号５）
ＨＰＶ１8キャプチャープローブ：５'−ＣＡＣＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧ−３'（配列番号６）
【００６５】
ＰＣＲプライマーは、Ｃｙ３またはＣｙ５のうち一つを連結して５'末端を標識化させた。キャプチャープローブは、通常、５'末端に末端アミン基を有し、その間にカーボンリンカーを有する。
【００６６】
プライマー及びキャプチャープローブは、（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｋ０２７１８及び韓国公開特許第１０−２００６−００１９０４２号に記載されたように）ＨＰＶのＬ１領域から来由したものであり、本文で使用したキャプチャープローブの特異性は、既に証明されている（韓国公開特許第１０−２００６−００１９０４２号；Ｋｉｍ  ＫＴ、Ｎａ  ＣＨ、Ｙｕｎ  ＹＭ、Ｈｗａｎｇ  ＴＳ、Ｋｉｍ  ＳＮ、Ｃｈａｅ  ＣＢ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０  ３９６：１３９−１４５）。
【００６７】
対称ＰＣＲ反応混合物の製造
ＰＣＲ反応混合物（３０μｌ）は、下記を含有する。３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.３）、３０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、５ｐｍｏｌのＣｙ３標識されたフォワードプライマー、５ｐｍｏｌのＣｙ３標識されたリバースプライマー、ＤＮＡ鋳型。
【００６８】
非対称ＰＣＲ反応混合物の製造
下記を除いて、前記対称ＰＣＲ反応混合物と同一である。５ｐｍｏｌのＣｙ３標識されたフォワードプライマー及び５０ｐｍｏｌのＣｙ３標識されたリバースプライマー。
【００６９】
ＰＣＲサイクル
ＰＣＲは、下記のように行った。９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分の３０回サイクル、そして最後に７２℃で５分。
ＰＣＲ生成物の精製
Ｑｉａｇｅｎが提供したプロトコルに従い、ＰＣＲ生成物をガラスメンブレンに結合させ、ガラス（ｆｒｅｅ）プライマーから精製した。
【００７０】
ＰＣＲ生成物の２本の鎖の分離
ＰＣＲ生成物の２本の鎖の分離のために、プライマーのうち一つは、５'末端をビオチンで標識化し、残りのプライマーは、Ｃｙ３で５'末端を標識化した。ＰＣＲの後、ＰＣＲ生成物を前述した方法で精製した。精製された生成物を磁性ビーズに結合されたストレプトアビジンに結合させ、９５℃に加熱してＣy３標識化された鎖を放出させた（ｒｅｌｅａｓｅ）。放出された鎖を回収し、定量した。
【００７１】
［実施例２］
非対称ＰＣＲ生成物及びキャプチャープローブの間で分枝状ＤＮＡ複合体（凝集されたＤＮＡ）の形成
キャプチャープローブとＰＣＲ生成物とを混成化する場合、ＰＣＲ生成物よりさらに大きいＤＮＡ複合体が形成されることを証明するために、ＨＰＶ１６プラスミドを対称及び非対称ＰＣＲを通じて増幅し、５分間９５℃で熱処理し、ＨＰＶ１６キャプチャープローブと５０℃で一時間混成化を行った。そして、ＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、結果を図３に示した。
【００７２】
図３は、キャプチャープローブと非対称ＰＣＲ生成物との間の凝集物（または、分枝状ＤＮＡ）の組立てを証明する電気泳動結果のイメージである。（ａ）対称（Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲと非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲとをＨＰＶ１６Ｌ１部位と完全に相補的な配列を有したプライマーセットＡで行った後、反応混合物に２９ｎｔＨＰＶ１６キャプチャープローブを添加し、９５℃でＤＮＡを変性させ、５０℃で混成化を進行した。この全ての過程は、同一のＰＣＲ反応混合物内で進行された。ＤＮＡをポリアクリルアミド電気泳動で分離した後、ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した結果を示す。対称ＰＣＲの場合、ＦプライマーとＲプライマーとが１：１で存在し、非対称ＰＣＲの場合、本願では、ＲプライマーとＦプライマーとが１０：１で存在した。レーン１：対称ＰＣＲ＋混成化、レーン２：対称ＰＣＲ＋キャプチャープローブ＋混成化、レーン３：非対称ＰＣＲ＋混成化、レーン４：非対称ＰＣＲ＋キャプチャープローブ＋混成化。レーン３、４で６００ｂｐ位置にあるＤＮＡは、非対称ＰＣＲによって生成された一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡ（３２０ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、電気泳動像の二鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）ＰＣＲ産物（３２０ｂｐ）より移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）が遅い。レーン４で２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡは、分枝状ＤＮＡ複合体であった。分枝状ＤＮＡも、二本鎖ＤＮＡより移動性が遅い。（ｂ）ジェノタイピング用プライマーセットＢで実験した結果である。レーンの説明は、図３のＡと同一である。ジェノタイピング用プライマーで対称ＰＣＲを行った場合、非特異的なＤＮＡが生成されるが、キャプチャープローブの存在下に分枝状ＤＮＡが組立てられなかった。
【００７３】
図３のＡから分かるように、ＰＣＲプライマーセットＡを利用した非対称ＰＣＲ生成物は、キャプチャープローブとＰＣＲ生成物（３２０ｂp）よりさらに大きい２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡ複合体を形成した。一方、対称ＰＣＲ産物の場合、キャプチャープローブの存在下に２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡ複合体が非常にわずかな量が形成された。ジェノタイピングのためのプライマーセットＢを利用して増幅されたＤＮＡの場合にも（図３の（ａ））、非対称ＰＣＲ産物がキャプチャープローブの存在下に２５００ｂｐ位置にあるＤＮＡ複合体を形成し、対称ＰＣＲ産物は、キャプチャープローブと複合体とを組立てることができなかった。ＤＮＡは、電気泳動像の移動性が３次構造に敏感であるので、正確なサイズや構造は分からなかった。対称ＰＣＲでジェノタイピング用ＰＣＲプライマーを使用する場合、非特異的な産物（６００ｂｐ位置）が示された。しかし、これらは、図３の（ｂ）から分かるように、ＤＮＡ複合体の生成に関与しない。
【００７４】
［実施例３］
複合体の構造に関する情報を得るために、非対称ＰＣＲをジェノタイピング用プライマーＣｙ５−ＧＰ４Ｆ或いはＣｙ５−ＧＰ４Ｒプライマーの存在下に進行し、９５℃で変性させ、キャプチャープローブと混成化をし、ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを一本鎖に特異なＳ１ヌクレアーゼで処理し、電気泳動をした後、Ｃｙ５イメージをＬＡＳ４０００イメージ分析機でスキャンし、その結果を図４に示した。
【００７５】
図４は、分枝状ＤＮＡ複合体が正常な二本鎖ＤＮＡではなく、一本鎖部位とｇａｐを含んでいることを例示する。ジェノタイピング用プライマーセットＢを利用した非対称ＰＣＲとして、Ｃｙ５で標識されたフォワードプライマー或いはＣｙ５で標識されたリバースプライマーの存在下にＰＣＲを進行した後、キャプチャープローブを添加し、９５℃で変性させ、５０℃で混成化をした。ＤＮＡを精製した後、一本鎖に特異な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、ＤＮＡを電気泳動で分析した。（ａ）ＥｔＢｒで染色したイメージ、（ｂ）Ｃｙ５イメージ。非対称ＰＣＲ＋混成化：レーン１：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマー、レーン２：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒプライマー非対称ＰＣＲ＋キャプチャープローブ＋混成化、レーン３：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマー、レーン４：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒプライマー。レーン３、４ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理した場合：レーン５：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマー、レーン６：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒプライマー。
【００７６】
２５００ｂｐ位置にある分枝状ＤＮＡは、キャプチャープローブ、フォワード鎖、そしてリバース鎖を含んでいることが分かり、Ｓ１ヌクレアーゼによって分解されることをみると（図４）、図２で示す構造のように、一本鎖部位とｇａｐを有している可能性が高い。非対称ＰＣＲの場合、６００ｂｐ位置にＣｙ５−ＧＰ４Ｒプライマーで生成されたリバース鎖が生成されるが、Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆプライマーを使用する場合、同じ位置にＤＮＡがない（図４の（ｂ））。従って、６００ｂｐ位置にあるＤＮＡは、非対称ＰＣＲによって生成されたリバース一本鎖ＤＮＡである。このＤＮＡは、Ｓ１ヌクレアーゼによって分解される（図４）。一本鎖ＤＮＡも、二重螺旋ＤＮＡと電気泳動上の移動性が異なるということは、よく知られた事実である。
【００７７】
［実施例４］
分枝状ＤＮＡ複合体内のキャプチャープローブ当たりリバース鎖及びフォワード鎖の数
キャプチャープローブを含む統合過程（非対称ＰＣＲ、変性、混成化）を進行するが、二つのジェノタイピング用ＰＣＲプライマーとキャプチャープローブとのうち一つをＣｙ５で標識した。電気泳動後のＣｙ５イメージをＬＡＳ４０００  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒを利用して分析し、その結果を図５に示した。
【００７８】
図５は、分枝状ＤＮＡ内に存在するキャプチャープローブ当たり結合されたフォワードとリバース鎖との数を決定する実験結果を示す。ジェノタイピング用プライマーとＨＰＶ１６キャプチャープローブとがある状態で、非対称ＰＣＲを行い、９５℃で変性させ、５０℃で混成化を進行した。この過程は、二つのプライマーとキャプチャープローブとのうち一つはＣｙ５で標識されたものを使用し、電気泳動後のＬＡＳ４０００  ｉｍａｇｅｒでスキャンし、２５００ｂｐ位置の分枝状ＤＮＡの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を比較した。（ａ）ＥｔＢｒで染色したイメージ、（ｂ）Ｃｙ５イメージ。キャプチャープローブなしに統合過程を進行した場合：レーン１：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒ、レーン２：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆ。キャプチャープローブを含んだ統合過程：レーン３：Ｃｙ５−キャプチャープローブ、レーン４：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｒ、レーン５：Ｃｙ５−ＧＰ４Ｆ。
【００７９】
２５００ｂｐ位置にある分枝状ＤＮＡ複合体内にある三つのＤＮＡ、即ち、キャプチャープローブ、リバース鎖、フォワード鎖のシグナル強度を比較した。その結果、プローブ当たり三つのリバース鎖と二つのフォワード鎖とが含まれていることが分かった。
【００８０】
［実施例５］
一本鎖ＤＮＡ、対称ＰＣＲ生成物及び非対称ＰＣＲ生成物の混成化パターン
ジェノタイピング用プライマーを利用して多様な量のｓｓＤＮＡ、対称ＰＣＲ生成物及び非対称ＰＣＲ生成物を３０μｌ  ６ｘＳＳＣで溶解させ、９４℃で５分間加熱した後、直ちに氷水（ｉｃｅ−ｗａｔｅｒ）で冷却させた。加熱された混合物をＨＰＶ１６キャプチャープローブが固定されたマイクロアレイの上部に結合されたチャンバに添加し、５０℃で１時間インキュベーション（混成化）した。インキュベーションの後、チャンバを開いて（ｐｉｌｌｅｄ  ｏｆｆ）、ガラススライドを下記の溶液にそれぞれ５分間漬けた。１ｘＳＳＣ−０.１％ＳＤＳ、０.１ｘＳＳＣ−０.１％ＳＤＳ及び１ｘＳＳＣ。最後に、スライドを脱イオン水で洗い流した後、乾燥させた。
【００８１】
乾燥したガラススライドをレーザースキャナー（Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏ）でスキャンし、その蛍光イメージをスキャンして、蛍光スポット（ｓｐｏｔ）の強度を定量した。
【００８２】
この実験では、他のＤＮＡ製造法によって得られた結果との適切な比較のために、非標識化されたプライマーで１０倍希釈されたＣｙ３−標識化プライマーの存在下でＰＣＲを行い、結果を図７に示した。
【００８３】
図７は、ガラススライド上に固定化されたＨＰＶ１６プローブと混成化に起因した、ＰＣＲ生成物と一本鎖ＰＣＲ生成物との量の増加によって得られる信号を示すグラフである。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（−▲−）は、Ｃｙ３標識されたリバースプライマーによって延長されたもので、ＰＣＲ生成物から精製されたものであり、その信号は、固定化されたキャプチャープローブを飽和させたｓｓＤＮＡの量（即ち、固定化されたプローブと形成された１００％二重螺旋ＤＮＡに相応する量）によって得られたものである。非対称ＰＣＲ生成物（−●−）で得られた信号は、ｓｓＤＮＡで得られた飽和信号を遥かに超過する。他のＤＮＡで得られた結果と適切に比較するために、Ｃｙ３−標識化プライマーは、非標識化プライマーで１０倍希釈された。対称ＰＣＲの生成物（−■−）は、本実験条件で殆どシグナルの増加を示さない。
【００８４】
図７に示すように、固定化されたＨＰＶ１６オリゴヌクレオチドは、約２５ｐｍｏｌでｓｓＤＮＡで飽和され、約１０,０００ユニットの信号が得られた。この数値は、ＨＰＶ１６キャプチャープローブとｓｓＤＮＡとの間に形成された１００％二重螺旋によって得られた信号に相応する値である。対称ＰＣＲ生成物は、１５０ｐｍｏｌでも有意味な水準の二重螺旋を形成しなかった。一方、非対称ＰＣＲ生成物は、ｓｓＤＮＡの飽和量によって得られたものより大きい倍数でさらに高い信号が生成された。これは、固定化されたＨＰＶ１６オリゴヌクレオチドプローブの単一分子に１個分子以上の非対称ＰＣＲ生成物が付着したことを意味する。対称ＰＣＲ生成物によると、固定されたプローブとの二重螺旋の形成が微々たる理由は、対称ＰＣＲ生成物の二つの相補的な鎖の間の二重螺旋の圧倒的な自己組立てと固定化されたオリゴヌクレオチドとの非常に微々たる相互作用に起因するであろう。
【００８５】
［実施例６］
溶液内で混成化の過程中のＤＮＡ生成が分枝状ＤＮＡ組立てを促進
ＨＰＶ１６キャプチャープローブの存在下に、実施例１のように非対称ＰＣＲを行い、９５℃で加熱した後（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、５０℃で１時間混成化を進行する時も、分枝状ＤＮＡが組立てられた（図６の（ａ））。これに比べて、非対称ＰＣＲのみを行った場合や、非対称ＰＣＲの後、熱を加えずに混成化を行う場合、分枝状ＤＮＡの組立てが不完全であった（図６の（ａ））。この結果は、変性後の混成化の過程中に分枝状ＤＮＡの組立てが促進されることを意味する。混成化の過程中にＤＮＡ生成に必要な全ての要素が存在するので、１回ＤＮＡ合成（ｏｎｅ−ｒｏｕｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が重要であることも意味する。混成化の過程中にＥＤＴＡを添加すると、ＤＮＡ合成が停止されるが、このような場合、分枝状ＤＮＡの組立てが顕著に減少した（図６の（ｂ））。プライマーセットＡやＢを利用して非対称ＰＣＲを行っても、同一の結果が得られた。
【００８６】
図６は、分枝状ＤＮＡが形成される条件に関する実験結果である。（ａ）キャプチャープローブの存在下に非対称ＰＣＲを進行し、停止された状態（レーン１）、非対称ＰＣＲの後、変性過程なしに混成化を進行した場合（レーン２）、非対称ＰＣＲの後、９５℃で変性させ、５０℃で混成化を進行した場合（レーン３）。（ｂ）非対称ＰＣＲを進行し、変性、そして混成化をするが、キャプチャープローブを添加しない場合（レーン１）、非対称ＰＣＲ、加熱変性（ｈｅａｔｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の後、キャプチャープローブを添加し、混成化をした場合（レーン２）、ＰＣＲ、加熱変性後にキャプチャープローブとＥＤＴＡとを共に添加し、混成化をした場合（レーン３）。全ての実験は、ＰＣＲ反応混合物内で行われた。
【００８７】
［実施例７］
ＤＮＡチップ表面で混成化の過程中にＤＮＡ生成が分枝状ＤＮＡの組立てを促進
非標識されたプライマーで５倍希釈したことを除き、実施例１のような標識されたプライマーを利用して、１０５コピーのＨＰＶ１６プラスミドで非対称ＰＣＲ（３０μｌ）を行った（図８）。大量に収得するために、非対称ＰＣＲを多数のチューブで行った。ＰＣＲの後、生成物をガラスメンブレンに結合させて精製した。精製されたＰＣＲ生成物を下記のような多様なバッファーでインキュベーションした。１ｘＰＣＲバッファー、追加で下記を含む１ｘＰＣＲバッファー（それぞれ及び組合せで、図８参照）：４ｄＮＴＰ、Ｔａｑ重合酵素、非標識プライマー、標識されたプライマー（非標識プライマーで５倍希釈される）。混合物をマイクロアレイ（ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１8キャプチャープローブが固定される）の表面に結合されたチャンバに伝達した。スライドを９５℃で５分間熱処理した後、５０℃で１時間インキュベーションした。洗浄した後、スライドを蛍光イメージ及び定量のためにスキャンした。図８から分かるように、ＰＣＲに必要な全ての要素が含まれた溶液で混成化を進行する場合、シグナルが大幅に増加する。これは、ＤＮＡチップ上で非対称ＰＣＲ、加熱変性、混成化を同一のＰＣＲ反応混合物内で統合して進行する時、得られたシグナルと類似している（図８）。この結果は、また混成化の過程中にＤＮＡ生成過程が分枝状ＤＮＡの組立てを促進することも意味する。
【００８８】
図８は、非対称ＰＣＲとこれに続く混成化がＤＮＡマイクロアレイスライドの表面で行われた時、信号が数倍増加することを証明するグラフである。ここで、Ｃｙ３−標識化非対称ＰＣＲ生成物を精製した後、多様な条件下で混成化させ、その結果をＤＮＡマイクロアレイスライドの表面における同一のＰＣＲ反応混合物中で行われた統合された非対称ＰＣＲ及び連続的な混成化（一番右側のコラム）と比較した。結果は、混成化の過程中に起こるＤＮＡ複製が（右側から二番目のコラム）信号の上乗効果に重要であることを示す。
【００８９】
［実施例８］
統合された非対称ＰＣＲ及び混成化による検出の敏感度
階段希釈された（ｓｅｒｉａｌｌｙ  ｄｉｌｕｔｅｄ）ＨＰＶ１６プラスミドを固定されたＨＰＶ１６及びＨＰＶ１8キャプチャープローブを含むスライド上でＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲの最後に、スライドを洗浄及びスキャンするか、またはＰＣＲ混合物を９５℃で加熱し、５０℃で１時間インキュベーションして同一の反応混合物で混成化を持続させた。多様なＰＣＲ生成物から得られた結果と適切な比較のために、Ｃｙ３標識されたＰＣＲプライマーを５倍非標識プライマーで希釈した。
【００９０】
図９に示すように、階段希釈されたＨＰＶ  ＤＮＡを非対称ＰＣＲで増幅させた時、１個分子のＨＰＶ  ＤＮＡを高い信号で検出することができた。また、信号とスライド上の適用されたＨＰＶ  ＤＮＡの数（適用されたＤＮＡの１〜１０,０００コピー）の間に扇形的な関係があった。
【００９１】
反対に、他の形態のＰＣＲの信号及び敏感度は、スライド上の統合された非対称ＰＣＲ及び混成化に比べて遥かに低かった。
【００９２】
［実施例９］
多様な過程によって得られた信号の比較
既に報告されたように、スライド上の統合された対称ＰＣＲ及び混成化は、精製されたＰＣＲ生成物をスライド上で混成化する場合に比べて、５倍の信号増加をもたらす。精製された非対称ＰＣＲ生成物は、通常の工程（即ち、スライド上で精製された対称ＰＣＲの混成化）に比べて、約５倍〜６倍の信号の増加をもたらす。しかし、非対称ＰＣＲ及び混成化をスライド上で行った場合、追加的な５倍の信号の増加があった（図９の棒４参照）。従って、結果的に、対称ＰＣＲ生成物を精製した後、混成化する通常の方法（図９の棒１）より、約３０倍の高い信号を示す。このような信号（それによる敏感度）の劇的な増加は、相当予測し難い発見である。
【００９３】
［実施例１０］
ＲＮＡの検出のための統合された逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化による信号及び敏感度の劇的な増加
慢性骨髓性白血病細胞株Ｋ５６２（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｋ５６２）を培養液で成長させてＲＮＡを抽出した。キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）ＢＣＲ−ＡＢＬ（ｔｙｐｅ  Ｂ３−Ａ２）ＲＮＡの含量をリアルタイム定量ＰＣＲで測定した。単一ステップ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）逆転写及びＰＣＲ反応混合物（総３０μｌ）を下記のように準備した。４ｄＮＴＰ、バッファー、逆転写酵素及びＤＮＡ重合酵素を含有する１２μｌプレミックス（ｐｒｅｍｉｘｅｄ）反応混合物（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｃｏ.）、標識されたリバース（Ａ２−Ｒ）及びフォワード（Ｂ２−Ｆ）プライマー（非標識されたプライマーで２倍希釈される）、ＲＮＡ。
【００９４】
非対称ＰＣＲのために、通常５ｐｍｏｌのＣｙ３−フォワードプライマー及び５０ｐｍｏｌのＣｙ５−リバースプライマーを添加した。対称ＰＣＲのために、それぞれ５ｐｍｏｌの標識されたフォワード及びリバースプライマーを添加した。
【００９５】
サーマルサイクリングは、下記の通りである。４５℃で３０分、９５℃で５分、（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で１５秒）の４５回サイクル。
【００９６】
ＣＭＬフュージョン転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）の検出のために使用されたキャプチャープローブ及び遺伝子特異的（ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＲＴ−ＰＣＲプライマーを図１１に示し、その配列は、下記の通りである。
フォワードプライマー（Ｂ２−Ｆ）：５'−ＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧ−３'（配列番号７）
リバースプライマー（Ａ２−Ｒ）：５'−ＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴ−３'（配列番号８）
ＡＢＬ  Ａ２キャプチャープローブ（Ａ２−Ｐ）：５'−ＧＴＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣ−３'（配列番号９）
【００９７】
統合された逆転写、ＰＣＲ及び混成化のために、組合された反応混合物をＤＮＡマイクロアレイの上部面に結合されたチャンバに伝達し、そのスライドをＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）のヒーティングブロック上に位置させた。前述したように、サーマルサイクリングを行った。ＰＣＲサイクルの最後に、前記ガラスを９５℃で５分間加熱し、所定期間の間５５℃でインキュベーション（混成化）した。
【００９８】
図１２は、ＤＮＡ検出の場合と同様に、逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化の統合された工程を通じて、通常の工程に比べて信号及び敏感度の劇的な増加をもたらすということを示す（図１２、ライン１及び３の比較）。１〜１０個分子のＲＮＡが高い信頼度（高い信号）で検出されることができる。これは、通常の工程（即ち、チューブにおけるＲＴ−ＰＣＲとマイクロアレイスライド上の混成化、図１２のライン３）に比べて敏感度が１００倍〜１０００倍増加したものである。
【００９９】
また、ＤＮＡの検出の場合と同様に、逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化の統合は、スライド上におけるＲＴ−ＰＣＲを単独で行う場合に比べて、大きな増加を示した（図１３のラインａ及びｂの比較）。フォワード及びリバースプライマーを全てさらに高い濃度で添加して統合されたプロセスを通じた対称ＰＣＲでも、恐らく分枝状ＤＮＡの形成促進によって信号が大きく増加した（図１３のラインｃ及びｄ参照）。しかし、検出の敏感度は、非対称ＰＣＲを含む統合されたプロセスほど高くはなかった（図１３のラインａ及びｃ比較）。
【０１００】
［実施例１１］
マイクロアレイスライド上の統合された逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化システムに加熱された細胞抽出物の直接添加によるキメリックＢＣＲ−ＡＢＬ  ＲＮＡの検出
階段希釈された慢性骨髓性白血病細胞（Ｋ５６２）をペレット化（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）し、５０μｌＣｈｅｌｅｘ−ｒｅｓｉｎ（ＢｉｏＲａｄ）に懸濁した。９５℃で５分間加熱及び遠心分離後、５μｌの上層液を実施例７に記載された反応混合物に添加した。全体混合物をマイクロアレイスライドの上部に結合されたチャンバに伝達し、実施例７に記載されたように、統合された逆転写、非対称ＰＣＲ及び混成化を行った。洗浄されたスライドをレーザースキャナーでスキャンした。その結果を図１４に示した。細胞抽出物及び精製されたＲＮＡの両方でキメラＢＣＲ／ＡＢＬ  ＲＮＡの類似した検出信号及び敏感度を示す。これは、ＲＮＡを細胞から分離精製しなくても、細胞を簡単な熱処理をすれば、精製されたＲＮＡと類似した診断結果が得られるということを証明する。
【０１０１】
上記では、本願の好ましい実施例を参照して説明したが、該当の技術分野で通常の知識を持った者なら、下記の特許請求の範囲に記載された本願の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本願を多様に修正及び変更させる可能性があることを理解することができるであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上、説明したように、分枝状ＤＮＡ複合体の形成促進を通じた核酸検出方法に関し、同一反応混合物におけるＰＣＲ、加熱変性及び混成化を統合して行うことによって、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと複数の増幅された標的ＤＮＡとの間における分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡの自己組立てを促進させることで、標的核酸の検出信号及び敏感度を劇的に増加させることができ、多様な診断及び検出に活用されることができ、診断方法の自動化にも寄与することで、革新的な疾病診断及び治療技術を提示することができる。
【図１】
2013520987.tif 000003
【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月5日(2012.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出しようとする標的核酸分子の全体または一部と相補的な配列を含む核酸プローブの存在下で、前記標的核酸分子の増幅、加熱変性と混成化とを同一の反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）内で統合して行い、前記核酸プローブに複数の増幅された核酸分子が混成化され、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップ、及び
前記混成化された分枝状核酸複合体を検出するステップを含む
ことを特徴とする試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２】
前記増幅は、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）で行う
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項３】
前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップにおいて、前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体は、自己組立てされる
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項４】
前記増幅と混成化とを行う前に、前記試料中の核酸を露出させるために界面活性剤処理、酵素処理または加熱処理を行う
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項５】
前記検出しようとする標的核酸分子は、突然変異した配列を含み、前記プローブは、前記突然変異した配列を含む標的核酸分子に相補的である
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項６】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子である
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項７】
前記標的核酸分子は、ＲＮＡ分子を含み、
前記混成化された分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップは、前記標的ＲＮＡ分子の逆転写、増幅、加熱変性及び混成化を同一の反応混合物内で統合して行うことを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項８】
前記核酸プローブは、一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項９】
前記核酸プローブは、溶液内に存在するかまたは固体支持体上に存在し、単一容器内でまたは固体支持体上で前記分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップが行われる
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１０】
前記固体支持体上に存在する核酸プローブは、３'または５'末端がリンカー分子を通じて前記固体支持体上に固定された
ことを特徴とする請求項９に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１１】
前記検出は、二重鎖ＤＮＡと結合する検出可能な標識と前記混成化された分枝状核酸複合体とを接触させて、標識された複合体を形成して検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１２】
前記検出は、前記増幅時に標識されたヌクレオチドまたは標識されたＰＣＲプライマーを使用して増幅された標的ＤＮＡに混入された標識を通じて検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１３】
検出しようとする標的核酸分子を非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＣＲ）を行って増幅するステップ、
前記増幅された標的核酸分子を含む反応混合物の全体を前記標的核酸分子の全体または一部と相補的な配列を含む核酸プローブが存在する溶液または固体支持体の表面に伝達するステップ、
前記溶液中でまたは前記固体支持体上で混成化を行い、前記核酸プローブと複数の増幅された核酸分子とが混成化されて、分枝状（ｂｒａｎｃｈｅｄ）核酸複合体の形成を促進するステップ、及び
前記混成化された分枝状核酸複合体を検出するステップ
を含み、
前記反応混合物に対する加熱変性は、前記反応混合物を前記溶液または固体支持体の表面に伝達するステップの前にまたは後に行われる
ことを特徴とする試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１４】
前記検出しようとする標的核酸分子は、突然変異した配列を含み、前記プローブは、前記突然変異した配列を含む標的核酸分子に相補的である
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１５】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子を含む
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１６】
前記標的核酸分子がＲＮＡ分子を含み、前記増幅ステップで逆転写と非対称ポリメラーゼ連鎖反応とが統合されて行われる
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１７】
前記核酸プローブは、一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列である
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１８】
前記固体支持体上に存在する核酸プローブは、３'または５'末端がリンカー分子を通じて前記固体支持体上に固定された
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項１９】
前記検出は、二重鎖ＤＮＡと結合する検出可能な標識と前記混成化された分枝状核酸複合体とを接触させて、標識された複合体を形成して検出する
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【請求項２０】
前記検出は、前記増幅過程中に標識されたヌクレオチドまたは標識されたＰＣＲプライマーを使用して増幅された標的ＤＮＡに混入された標識を通じて検出する
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料中の標的核酸分子の検出方法。
【国際調査報告】
2013520987.tif 000023
2013520987.tif 000024
2013520987.tif 000025
2013520987.tif 000026