(57)【要約】  照射吸収ナノ粒子の標的化送達ならびに細胞および組織の熱アブレーションのためのＤＮＡデンドリマーが提供される。また、ＤＮＡデンドリマーの作成方法および使用方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子および少なくとも１つのターゲティング成分に結合したＤＮＡデンドリマー。
【請求項２】
少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子が、炭素ベースのナノ粒子または金属ナノ粒子である請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項３】
少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項２に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項４】
照射吸収ナノ粒子が、ナノ球体、ナノロッド、ナノシェル、ナノケージ、ナノチューブまたは表面増強ラマン散乱ナノ粒子である請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項５】
ＤＮＡデンドリマーのアームに結合したキャプチャーオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子および少なくとも１つのターゲティング成分の内の片方または両方が、キャリアオリゴヌクレオチドのキャプチャーオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡデンドリマーに結合している請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項６】
キャプチャーオリゴヌクレオチドが、延長オリゴヌクレオチドの末端に結合し、延長オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡデンドリマーのアームにハイブリダイズしている請求項５に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項７】
照射吸収ナノ粒子が、ビオチン／ストレプトアビジンによりＤＮＡデンドリマーに結合している請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項８】
ＤＮＡデンドリマーのアームに結合した追跡標識をさらに含む請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項９】
ターゲティング成分が、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、抗体断片または受容体リガンドである請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１０】
デンドリマーが、架橋されたモノマーを含む請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１１】
細胞または組織の熱アブレーション方法であって、
ａ）細胞または組織を請求項１に記載のＤＮＡデンドリマーをターゲティング成分が細胞または組織上の相補的な標的に結合するように接触させるステップ；および
ｂ）ＤＮＡデンドリマーに結合した細胞または組織を、ＤＮＡデンドリマーに結合したナノ粒子に熱を放出させ、それにより、ＤＮＡデンドリマーに結合した細胞または組織の熱アブレーションを起こさせるのに充分な出力と時間で外部的に印加された電磁照射に暴露するステップ、
を含む方法。
【請求項１２】
細胞または組織を、ＤＮＡデンドリマーとインビボまたはエクスビボで接触させる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞または組織が、固形腫瘍、血液中腫瘍細胞、転移癌、微生物および生物学的移植材料からなる群より選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡデンドリマーの成分を別々に投与し、投与後に細胞または組織上で構築させる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
熱アブレーションＤＮＡデンドリマーおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含み、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーが、少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子および少なくとも１つのターゲティング成分を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
生理学的に適合する水性緩衝液を含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
非経口投与用に処方されている請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つのターゲティング成分および少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子をＤＮＡデンドリマーのアームに結合することを含む熱アブレーションＤＮＡデンドリマーの作成方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのターゲティング成分および少なくとも１つの照射吸収ナノ粒子の片方または両方が、キャリアオリゴヌクレオチドのキャプチャーオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、アーム末端でＤＮＡデンドリマーのアームに結合している請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡデンドリマーのアームにハイブリダイズし、その末端にキャプチャーオリゴヌクレオチドを有する延長オリゴヌクレオチドをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡデンドリマーのアームに結合した追跡標識をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
薬物としての使用のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項２３】
薬物が、非経口的に投与される請求項２２に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項２４】
薬物が、静脈内に投与される請求項２３に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項２５】
薬物の製造のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマーの使用。
【請求項２６】
細胞または組織の画像処理の方法であって、
ａ）ターゲティング成分が、細胞または組織上の相補的な標的に結合し、ＤＮＡデンドリマーが、少なくとも１つの金属照射吸収ナノ粒子を含むように、細胞または組織に請求項１に記載のＤＮＡデンドリマーを接触させるステップ；および
ｂ）細胞または組織に結合した金属照射吸収ナノ粒子を使って、細胞または組織を画像処理するステップ、
を含む方法。
【請求項２７】
ＤＮＡデンドリマーの成分を別々に投与し、投与後に細胞または組織上で構築させる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞または組織を、インビボで接触させる請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、照射吸収ナノ粒子の標的化送達を使った細胞および組織の熱アブレーションのための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
３ＤＮＡ（登録商標）デンドリマーは、ＤＮＡ単独からなる、特許権により保護されている樹状分子である。分類上は、デンドリマーは、相互に接続した天然または合成単量体サブユニットから構築される複雑な、高度に分岐した分子である。３ＤＮＡ（登録商標）デンドリマーは、ＤＮＡモノマーから構築され、それぞれのＤＮＡは、各鎖の中央部に位置する配列相補性領域を共有する２つのＤＮＡ鎖から作られる（図１）。モノマーは、製造プロセス中で組み合わされ、異なるサイズと形状のＤＮＡデンドリマーが調製される（図２）。ＤＮＡデンドリマーが時間経過に伴い崩壊するのを防ぐために、ＵＶ光を使って、化学的「スポット溶接」が、ソラレン架橋剤のインターカレーションおよび活性化を介してプロセス中に成長している構築物に付加される。デンドリマーは、超遠心分離後の変性ショ糖勾配によりサイズと分子量に応じて精製される（図３）。
【０００３】
ＤＮＡデンドリマーは、多くの種々の異なる型の分子および粒子に共有結合および非共有結合する能力を有する。これらの分子および粒子は、典型的には、ＤＮＡデンドリマーに対するシグナル伝達およびターゲティングデバイスとして使用されており、特異的分子標的に対するＤＮＡデンドリマーのターゲティング、およびシグナル伝達成分の検出により標的に対するデンドリマーの結合の検出を可能とする。シグナル生成成分には、多くの蛍光染料、ハプテン、酵素およびその他の分子材料、ならびに粒子、例えば、金ナノ粒子および量子ドットが含まれる。ターゲティングデバイスには、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、ハプテン、アプタマー、ペプチド、その他が含まれる。これらのＤＮＡデンドリマー構築物は、様々なインビトロへの適用、通常は、特異的核酸およびタンパク質の検出におけるシグナル増幅器として使用されているが、電子デバイスにおける検出にも使用される。用途には、ＤＮＡおよびタンパク質マイクロアレイのシグナル増幅、ＥＬＩＳＡならびにＥＬＯＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、等が含まれる。標識した標的化ＤＮＡデンドリマーの使用に関する調査研究が広範囲にわたり報告されており、これらの材料は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  ＬＬＣ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）により研究成果として販売・製造されており、入手可能である。
【０００４】
ＤＮＡデンドリマーは、また、インビトロおよびインビボ適用の両方で送達およびトランスフェクションデバイスとしての潜在的用途があることが示された。例えば、米国特許公開第２００５／００８９８９０号、同２００８／１４７５２６号および国際公開第２０１０／０１７５４４号を参照。これらの特許は、参照によってその全体が組み込まれる。特に、ＤＮＡデンドリマーは、標的細胞上の表面特徴部に結合して積荷（例えば、薬剤）の送達を受けるターゲティングデバイス（例えば、細胞エンドサイトーシス内部移行イベントを誘発することができる細胞表面特性に対し特異的な抗体）に結合する。積荷は、標的ＤＮＡデンドリマーと受動的に結合し、デンドリマーとの単なる空間的会合により細胞中に入るか、または積荷は、多くの付着方策により直接デンドリマーに結合することができる。
【０００５】
１００〜２０００ワット（１３．５６ＭＨｚの波長）のＲＦ場に５分間曝された金ナノ粒子（および銀、カドミウム、鉄、等の他の金属を含むナノ粒子）は、インビトロおよびインビボの両用途での細胞の熱アブレーション用として使用されている。例えば、Ｃａｒｄｉｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １４４：１２５−１３２、およびＧａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｊ．Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：２を参照。これらの文献は、参照によってその全体が組み込まれる。このような方法は、高周波アブレーション（ＲＦＡ）とも呼ばれ、診療に使用されて腫瘍の治療が行われている。しかし、現在の治療は、腫瘍中に針電極を直接挿入することが必要な侵襲的方法であり、特に比較的大きな腫瘍に対しては、完全に腫瘍破壊を行うことが困難であり、また、治療は、熱損傷を受ける電極周辺の悪性および正常組織の両方に対し相対的に非特異的であることから、腫瘍の治療用の熱アブレーションの改良技術開発に対する特段の必要性がある。焦点を絞った外部ＲＦエネルギー場によるヒト組織への浸透は効果的であるが、外部エネルギーソースの使用は、悪性細胞に対し熱治療を標的化するＲＦＡに特異的に反応する細胞内または腫瘍内試薬の存在が必要である。さらに、ターゲティングまたはキャリア分子により送達される熱アブレーション能力を最大化し、従って、患者に送達されるべき熱アブレーション組成物の量を最小限に抑え、組成物自体のあらゆる潜在的毒性を減らす組成物と方法が必要である。さらに、ナノ粒子を標的組織に送達するために、キャリアは、細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを避けるために充分大きく無ければならないが、しかし、血液循環から腫瘍組織に入る（例えば、血管外遊走により）のに充分小さくなければならない。このことが、このような組成物に対し寸法的制約を課すことになる。
【発明の概要】
【０００６】
要約
本発明は、遠隔電磁場、例えば、高周波（ＲＦ）または赤外場の使用によりインサイツに加熱可能な粒子を含むＤＮＡデンドリマーの使用、ならびにその調製を含む。電磁場の存在下、発熱する要素を含む粒子と結合したＤＮＡデンドリマーは、インビトロ、エクスビボおよびインビボ適用で標的に熱アブレーションを加えることができるデバイスとして好適である。標的細胞および組織の熱アブレーション効率の顕著な増加は、デンドリマー分子当たり複数の金属ナノ粒子を含むＤＮＡデンドリマーの使用により、特に、ＤＮＡデンドリマーが目的標的細胞および組織の表面に対し粒子積載デンドリマーを標的化できるターゲティング装置も含む場合、達成可能である。
【０００７】
本発明の熱アブレーションを目的としたデンドリマーの適用には、１）罹患細胞および組織、例えば、腫瘍中に濃縮された癌細胞、全身転移細胞、または白血病および他のリンパ増殖性疾患に見られるような血液中癌細胞の熱アブレーション；２）それ以外の方法では手術的に除去する意外に術がない細胞および組織のアブレーション；３）他の治療に対し耐性を示すインビボの微生物（例えば、抗生物質耐性細菌および他の生物）のアブレーション；４）移植器官、血液製剤および骨髄を含む移植の前の細胞、組織および器官のエクスビボ治療；ならびに５）広範囲のインビボ、エクスビボおよびインビトロプロセスを含む熱反応ナノ装置の近くで利益が得られると思われる他の適用、が含まれる。
【０００８】
内在性または外因性のタンパク質ヌクレアーゼによるＤＮＡデンドリマーの分解の可能性を考慮すれば、インビトロ、エクスビボおよびインビボの生存細胞の存在中でＤＮＡデンドリマーの安定性は、また、重大な対象事であり、例えば、以前のデータは、ＤＮＡデンドリマーは、新しいヒトまたは動物血清の存在下、数分間を超えて無傷で生存できないことを示していた。予想外にも、インターカレーション架橋剤ソラレンおよび結合標識（および他の）成分（例えば、ＦＩＴＣ）およびタンパク質（例えば、ターゲティング抗体）を含むＤＮＡデンドリマーは、ヒトまたは動物血清試料の存在下、ヌクレアーゼ分解に対し非常に耐性があることを見出した。国際公開第２０１０／０１７５４４号参照。本特許は、参照によってその全体が組み込まれる。非樹状単鎖ＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ分子は、通常、ヌクレアーゼの存在下、かなり急速に分解することから、これは驚くべき結果であった。
【０００９】
熱アブレーションの標的は、主に、生きているおよび生物学的対象を含むが、無生物対象でも、非常に小容量の粒子積載ＤＮＡデンドリマー内に含まれる高温度への露出により特定のプロセスに対し価値を付加すると思われる熱アブレーションに対して、デンドリマーを使うことにより利益が得られる可能性がある。ナノ粒子を含む標的ＤＮＡデンドリマーによる熱アブレーションの使用により、エレクトロニクスおよび材料等の種々のナノ粒子の製造への適用を含む、広範囲のナノ材料が利益を得ることができる。
【００１０】
一態様では、本発明は、１つまたは複数のターゲティング成分および電磁エネルギーによりインサイツで発熱することができる１つまたは複数の照射吸収ナノ粒子に結合したＤＮＡデンドリマーに関する。特定の実施形態では、ＤＮＡデンドリマーと結合している照射吸収ナノ粒子は、外部からの印加電磁照射により、少なくとも４０℃、４０〜５０℃、５０〜６０℃、６０〜７０℃または７０〜８０℃まで発熱することができる。さらなる特定の実施形態では、ターゲティング成分は、細胞表面上の腫瘍特異的または腫瘍関連抗原、例えば、受容体を認識し、結合する抗体である。またさらなる特定の実施形態では、照射吸収ナノ粒子は、金ナノ粒子である。またさらなる特定の実施形態では、電磁エネルギーは、ＲＦ照射である。
【００１１】
別の態様では、本発明は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを作成する方法に関し、この方法は、ＤＮＡデンドリマーに共有結合した１つまたは複数の照射吸収ナノ粒子および１つまたは複数のターゲティング成分を含む。具体的態様では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡデンドリマーアームに付加でき、ナノ粒子に結合した相補的なオリゴヌクレオチドは、キャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる。ターゲティング成分は、また、ＤＮＡデンドリマーアーム上のキャプチャー配列に相補的なオリゴヌクレオチドに共有結合し、キャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。キャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション後、相補的なオリゴヌクレオチドの片方または両方は、任意選択で、ＤＮＡデンドリマーのキャプチャーオリゴヌクレオチドと架橋してもよい。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを使った細胞または組織の熱アブレーション方法、ならびに組成物を提供する。例えば、ＤＮＡデンドリマーのターゲティング成分を細胞または組織上の相補的な標的に結合させる条件下で、細胞表面上の特徴部位を標的とする熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを含む医薬組成物を細胞または組織と接触させることができる。次に、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーと結合した細胞または組織は、外部的に印加された電磁照射、例えば、ＲＦ照射中に、結合ナノ粒子に対し熱放出させるのに充分な出力で少しの間暴露される。ナノ粒子は、電磁照射、例えば、ＲＦ照射に暴露され、それにより、ナノ粒子が少なくとも４０℃、４０〜５０℃、５０〜６０℃、６０〜７０℃、または７０〜８０℃の熱を生じ、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに結合した細胞または組織の熱アブレーションが起こることが好ましい。具体的実施形態では、インビトロで細胞培養中の細胞が、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーと接触下、外部ソースからの細胞培養を標的としたＲＦ照射等の電磁照射に暴露されて、標的細胞の熱アブレーションが実行される。別の具体的実施形態では、細胞または組織は、インビボまたはエクスビボで熱アブレーションＤＮＡデンドリマーとの接触下、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに結合した細胞または組織を標的とした外部ソースからのＲＦ照射等の電磁照射に暴露され、細胞または組織の熱アブレーションが実行される。インビボまたはエクスビボでの熱アブレーションのための細胞および組織の例には、腫瘍および生物学的移植材料が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】は、照射吸収ナノ粒子で標識したオリゴヌクレオチドを延長オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡデンドリマーのアームにハイブリダイズする種々の方法を示す図である。
【図２】は、図１に示す結合照射吸収ナノ粒子を有するＤＮＡデンドリマーへのターゲティング成分の結合を示す図である。
【図３】は、照射吸収ナノ粒子で標識したオリゴヌクレオチドの延長オリゴヌクレオチドおよび非球状ＤＮＡデンドリマーのアームに対するハイブリダイゼーションを示す図である。
【図４】は、照射吸収ナノ粒子で標識したオリゴヌクレオチドのＤＮＡデンドリマーモノマーの延長オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを示す図である。
【図５】は、照射吸収ナノ粒子で標識したオリゴヌクレオチドの直鎖ＤＮＡデンドリマーに対するハイブリダイゼーションを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の実施例は、制限の意図はなく、また、それらに対する修飾および変更は、当業者の知識の範囲内で十分可能である。
【００１５】
詳細な説明
本明細書で使われる用語の「熱アブレーションＤＮＡデンドリマー」は、共有結合または非共有結合でａ）１つまたは複数のターゲティング成分およびｂ）１つまたは複数の照射吸収ナノ粒子に結合したＤＮＡデンドリマーを指す。
【００１６】
本明細書で使われる用語の「ターゲティング成分」または「ターゲティングデバイス」は、細胞または組織の表面上の相補的な分子を認識し、これに結合する分子を指す。ターゲティング成分の非制限的例には、抗体、抗体断片、結合タンパク質およびペプチド、受容体ならびに受容体に対するリガンドが含まれる。
【００１７】
本明細書で使われる用語の「照射吸収ナノ粒子」は、電磁照射（例として、赤外、近赤外（ＮＩＲ）および高周波（ＲＦ）照射を含む）を吸収し、吸収エネルギーを変換して、局所的高熱を作り出すのに使用できる熱を放出するナノ粒子を指す。
【００１８】
電磁照射への暴露に関連して本明細書で使われる用語の「外部ソース」または「外部から印加した」は、患者の身体または細胞もしくは組織培養液の外部から細胞または組織標的を狙って電磁照射することを指す。生物医学的な目的のために目的部位に電磁照射を送達するこの方法は、部位に埋め込まれた針またはプローブ経由で標的部位に送達される従来方法とは区別されるべきである。
【００１９】
ＤＮＡデンドリマーに関連して本明細書で使われる用語「アーム」は、ＤＮＡデンドリマーを形成するモノマーの単鎖末端を指し、機能性分子、例えば、検出、送達およびキャプチャー試薬のハイブリダイゼーションまたは結合に利用される。
【００２０】
最初の実施形態では、本発明は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを提供する。熱アブレーションデンドリマーは、１つまたは複数のデンドリマーアームに結合した１つまたは複数のターゲティング成分および１つまたは複数のデンドリマーアームに結合した１つまたは複数の照射吸収ナノ粒子を含む。ターゲティング成分およびナノ粒子の片方または両方が、ＤＮＡデンドリマーに直接共有結合可能である。あるいは、図１と図２に示すように、ターゲティング成分およびナノ粒子の片方または両方が、ターゲティング成分またはナノ粒子をＤＮＡデンドリマーに運ぶオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりＤＮＡデンドリマーに結合可能である。さらなる別の態様では、ターゲティング成分およびナノ粒子の片方または両方が、ターゲティング成分またはナノ粒子に結合したキャリアオリゴヌクレオチドのＤＮＡデンドリマーへのハイブリダイゼーションによりＤＮＡデンドリマーに結合可能である。キャリアオリゴヌクレオチドは、任意選択で、ＤＮＡデンドリマーに架橋してもよい。
【００２１】
熱アブレーションＤＮＡデンドリマーのＤＮＡデンドリマー成分は、当技術分野で既知のいずれのＤＮＡデンドリマー、例えば、米国特許第５、１７５、２７０号、同５、４８４、９０４号、同５、４８７、９７３号、同６、１１０、６８７号および同６、２７４、７２３号に記載されているようなＤＮＡデンドリマーであってもよく、また、非球状、および３次元的または球状ＤＮＡデンドリマーであってもよい。３次元または球状ＤＮＡデンドリマーは、一層、二層、三層または四層ＤＮＡデンドリマーでもよく、また、五層以上であってもよい。最初の具体的な例では、ＤＮＡデンドリマーは、少なくとも四層を含む。非球状直鎖ＤＮＡデンドリマーは、３次元ＤＮＡデンドリマーよりもよりコンパクトな構造ならびにデンドリマー量に対するより高い比率のナノ粒子を与え、これにより、組織中への取り込みを改善し、熱アブレーション効率を高めることができる。例えば、図３、図４および図５は、照射吸収ナノ粒子で標識したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした種々のタイプの非球状および直鎖ＤＮＡデンドリマーを示す。一部の例では、約３０〜３５のナノ粒子が、４つの鎖のみからなる直鎖ダイマーＤＮＡデンドリマーに結合することができる。
【００２２】
３次元ＤＮＡデンドリマーの層の数または直鎖ＤＮＡデンドリマーの鎖の数は、ＤＮＡデンドリマーのサイズを決める。これを使って、本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを選択し、最適化できる。その理由は、サイズが、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーの熱アブレーション標的部位に接近する能力、および、インビボ適用に際し非経口的に投与する場合、食細胞のクリアランスを回避する能力に影響を与えるためである。従って、開業医は、層または鎖の数に基づいて選択されたサイズのＤＮＡデンドリマーを構築し、非経口の投与で目的の半減期および所望量の熱アブレーション能力の送達を得ることができる。例えば、四層ＤＮＡデンドリマーは、通常、直径約１７０ｎｍであり、食細胞によるクリアランスを特に受けやすいとは思われない。また、実質的な数のターゲティング成分および実質的な数の照射吸収ナノ粒子を運ぶのに充分であり、目的の細胞または組織に対する熱アブレーション効力および効率的ターゲティングを提供できる。
【００２３】
ＤＮＡデンドリマーコアのモノマーは、インビボでの使用の間の安定性を確保するために、例えば、ソラレンと架橋してもよい。しかし、架橋なしで（すなわち、モノマーのアームのハイブリダイゼーションのみに基づいて）構築されたＤＮＡデンドリマーは、３７℃で安定であり、従って、インビボでハイブリダイゼーションを維持することが予測される。さらに、アームの結合部位は、典型的には、３１ヌクレオチド以上の長さで、推定Ｔｍは、６５℃であり、モノマーの「ウエスト」は、少なくとも５０ヌクレオチド長さで、８０〜９０℃超のＴｍであると推定される。これらの理由により、架橋試薬がインビボでの使用に望ましくないと考えられる場合でも、ハイブリダイゼーションのみで構築された本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、インビボの温度下で安定であると予測される。
【００２４】
熱アブレーションＤＮＡデンドリマーのアームに結合した照射吸収ナノ粒子は、選択した適用における熱アブレーションの所望効力を生成するのに適するどのような数で存在してもよい。デンドリマー当たりのナノ粒子の数は、結合するＤＮＡデンドリマーのサイズにより制限されるが、ＤＮＡデンドリマーのサイズは、前に考察したように、適宜変えることができることは理解されよう。また、少なくとも一部の利用可能なデンドリマーアームは、ターゲティング成分の結合用として、未結合のまま残すことができることも理解されよう。一例として挙げるが、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、１５〜１２００照射吸収ナノ粒子、２５〜５００照射吸収ナノ粒子、５０〜３５０照射吸収ナノ粒子、１００〜５００照射吸収ナノ粒子、２００〜４００照射吸収ナノ粒子、または約３００照射吸収ナノ粒子を含んでもよい。照射吸収ナノ粒子は、典型的には、約５〜２０ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、または２０ｎｍのサイズである。
【００２５】
熱アブレーションＤＮＡデンドリマーのアームに結合したターゲティング成分は、選択された適用における標的組織または細胞に対する所望の程度の結合を得るのに適するどのような数で存在してもよい。デンドリマー当たりのターゲティング成分の数は、結合するＤＮＡデンドリマーのサイズにより制限されるが、ＤＮＡデンドリマーのサイズは、前に考察したように、適宜変えることができることは理解されよう。また、少なくとも一部の利用可能なデンドリマーアームは、照射吸収ナノ粒子の結合用として、未結合のまま残すことができることも同様に理解されよう。一例として挙げるが、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、外部から印加された電磁照射、例えば、ＲＦ照射を使って、少なくとも４０℃、４０〜５０℃、５０〜６０℃、６０〜７０℃または７０〜８０℃へのインサイツ加熱を提供するのに充分な照射吸収ナノ粒子の数を含むことができる。本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、デンドリマーのサイズと構造（直鎖または３次元）に応じて、平均で、１未満〜１００超、２〜１２０、１５〜５０または３０〜３５のアームに結合したターゲティング成分を有してもよい。具体的な例では、約２５ターゲティング成分を四層ＤＮＡデンドリマーに結合することができる。
【００２６】
２つ目の実施形態では、本発明は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを作成する方法を提供する。ＤＮＡデンドリマーの構築方法は前に参照している。次に、ターゲティング成分および照射吸収ナノ粒子を、ＤＮＡデンドリマーのアームに結合できる。最初の例では、ターゲティング成分および／または照射吸収ナノ粒子は、当技術分野で既知の化学結合を介してＤＮＡデンドリマーのアームに直接結合される。しかし、２つめの例では、ターゲティング成分および／または照射吸収ナノ粒子は、ＤＮＡデンドリマーのアームに結合したキャプチャーオリゴヌクレオチドを介してＤＮＡデンドリマーに結合される。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、通常、ＤＮＡデンドリマーアームの末端に結合している。典型的には、ＤＮＡデンドリマーアームの末端に結合しているが、また、その末端にハイブリダイズでき、任意選択で、それと架橋するか、または以下に示すように延長オリゴヌクレオチドを使ってアームに結合することができる。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ターゲティング成分またはナノ粒子に結合した相補的なキャリアオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションのために一定量の特異的な一定の配列を提供する。キャリアオリゴヌクレオチドは、各成分により占有される所望の数のＤＮＡデンドリマーアームを生成する一定の濃度で、キャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるために、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、また、ターゲティング成分およびＤＮＡデンドリマーに結合したナノ粒子の数を制御する手段も提供する。このように、キャリアオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション濃度と容量は、デンドリマー当たりのナノ粒子およびターゲティング成分の数を調整するために、変えることができる。
【００２７】
相補的なキャリアオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに際して、ターゲティング成分またはナノ粒子は、ワトソン・クリック塩基対形成によりＤＮＡデンドリマーのアームに結合する。図２は、デンドリマーのアームに結合したキャプチャー配列にハイブリダイズしたキャリアオリゴヌクレオチドを介したＤＮＡデンドリマーに対するターゲティング抗体の結合を示す。任意選択で、ハイブリダイズしたキャリアオリゴヌクレオチドは、次に、ＤＮＡデンドリマーのアームに、例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに架橋することにより、共有結合してもよい。１つのこのような方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ架橋試薬、例えば、ソラレン（例えば、２、４、トリメチルソラレン）をオリゴヌクレオチド中に組み込み、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをＵＶ光に暴露することが含まれる。ターゲティング成分は、タンパク質またはペプチドを結合させオリゴヌクレオチドを得るための当技術分野で既知の縮合化学反応、例えば、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な化学反応を使って、キャリアオリゴヌクレオチドに結合させてもよい。照射吸収ナノ粒子は、例えば、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｊａｖｉｅｒ、ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９（６）：１３０９−１３１２に記載の方法を使ってキャリアオリゴヌクレオチドに結合してもよい。簡単に述べれば、ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドが、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）で還元され、コロイド状金ナノ粒子の溶液に添加される。複合体をＰＢＳの濃度増加により１Ｘ  ＰＢＳ濃度に達するまで熟成する。未反応キャプチャーオリゴヌクレオチドを遠心分離で除去する。ターゲティング成分および／または照射吸収ナノ粒子が、キャリアオリゴヌクレオチドに結合される場合は、インビボでの分解を防ぐために、二重鎖が少なくとも４０℃、４０〜７０℃、５０〜７０℃または６０〜７０℃のＴｍを有するように、キャリアおよびキャプチャーオリゴヌクレオチドの配列および長さを選択することは、インビボでの使用にとって有益である。
【００２８】
具体的実施形態では、ターゲティング成分を、上述のように、キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的なキャリアオリゴヌクレオチドを介してＤＮＡデンドリマーに結合させてもよく、また、ナノ粒子を、デンドリマーアームのＤＮＡに直接結合してもよく、またはナノ粒子に結合した相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりアームにハイブリダイズしてもよい（図１、上段参照）。この実施形態では、ターゲティング成分を有するキャリアオリゴヌクレオチドを、デンドリマーアーム（キャプチャーオリゴヌクレオチドの追加により延長された）の末端配列へのハイブリダイゼーションにより、同じアームの内部セグメント上に照射吸収ナノ粒子に結合するための充分な空間を残す。例えば、内部セグメントのＤＮＡのビオチン化およびストレプトアビジンコートナノ粒子のビオチンへの結合によりナノ粒子に結合可能である。
【００２９】
さらなる具体的実施形態では、ＤＮＡデンドリマーの未結合アームは、延長オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより延長可能である（図１および図２、下段参照）。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、キャリアオリゴヌクレオチド／ターゲティング成分へのハイブリダイゼーションのために延長オリゴヌクレオチドの末端に結合もしくは他の方法で結合することもでき、または、ターゲティング成分を、延長オリゴヌクレオチドに直接結合することができる。延長オリゴヌクレオチドは、キャプチャーオリゴヌクレオチド単独よりもＤＮＡデンドリマーのコアから遠い距離にターゲティング成分を置くために使用でき、従って、複数の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーが細胞または組織に結合する場合に、立体障害を低減することができる。すなわち、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、比較的短い（２５〜４０ヌクレオチドの長さのオーダー）が、延長オリゴヌクレオチドは、特定の適用の場合の立体障害を低減または克服するのに必要ないずれの長さも可能である。例えば、延長オリゴヌクレオチドは、６０〜１４０ヌクレオチド長さ、８０〜１３０ヌクレオチド長さ、１００〜１２５ヌクレオチド長さまたは１２４ヌクレオチド長さであってもよい。一例として挙げるが、１２４ヌクレオチド延長オリゴヌクレオチドは、デンドリマーアームに対するハイブリダイゼーション後、８５〜９０ヌクレオチド延長部を提供できる。また、延長オリゴヌクレオチドを使って、デンドリマーのアームとキャプチャーオリゴヌクレオチドの間の延長オリゴヌクレオチドの非ハイブリダイズセグメントは、追加の標識またはナノ粒子結合オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションに利用可能である（図１および図２、下段参照）。
【００３０】
最初の態様では、延長オリゴヌクレオチドは、一定のヌクレオチド配列を有してもよい。一定のヌクレオチド配列は、任意の選択された配列でよいが、非生物的配列が好ましい。別の態様では、延長オリゴヌクレオチドは、ホモポリマー配列（例えば、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＧ）またはポリ（ｄＣ））でもよく、また、反復配列を含んでもよい。延長オリゴヌクレオチドが、反復配列を含む場合は、反復は、通常、２〜１５ヌクレオチド、２〜１２ヌクレオチド、２〜１０ヌクレオチドまたは２〜８ヌクレオチドの長さである。しかし、反復配列は、延長オリゴヌクレオチド中で少なくとも２回出現する場合は、任意の長さでよいことは理解されよう。反復配列を使った最適標識オリゴヌクレオチドを調製する有用な方法は、米国特許第６０７２０４３号および同６０４６０３８号に記載されている。
【００３１】
第３の実施形態では、本発明は、選択細胞または組織の標的熱アブレーションのための熱アブレーションＤＮＡデンドリマーの使用方法を提供する。一般的に、ＲＦ照射等の電磁照射の露出時間と出力は、所望の結果、熱アブレーションの標的とされる細胞または組織の特性、および選択熱アブレーションＤＮＡデンドリマーの熱生成および細胞ターゲティング能力に基づいて選択される。熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに結合した細胞または組織は、１Ｗ〜２０００Ｗ、１０Ｗ〜１５００Ｗ、１０Ｗ〜２００Ｗ、または約５０Ｗの出力で１分〜２時間、または所望の程度の熱アブレーションが得られるまで、外部ソースからの電磁場中に暴露することができる。これらの方法の具体的実施形態では、細胞または組織は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーにインビトロで、例えば、細胞または組織培養液中で接触させられる。さらなるこれらの方法の具体的実施形態では、細胞または組織は、インビボで、例えば、ヒトに対する非経口の投与により、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに接触させられる。インビボでの使用の一例では熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、静脈内にまたは針もしくはカテーテルにより一群の細胞または組織に直接に投与できる。このような投与は、外部電磁場への暴露の前のボーラス注射であっても、持続注入であってもよい。投与後、一般的には、電磁場への露出の前に、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーが標的細胞または組織に結合するのに充分な時間を許容するのが望ましい。熱アブレーションＤＮＡデンドリマーが静脈内に投与される場合は、標的細胞または組織に結合するために必要な時間は、デンドリマーの循環と標的部位での蓄積のために必要な時間が原因で、直接注射の場合よりも、長くなると思われる。
【００３２】
選択細胞または組織の標的熱アブレーション用に使用する場合は、熱アブレーションの対象として選択された細胞または組織に接触させる前に、ＤＮＡデンドリマーを構築してもよい。すなわち、熱アブレーションをインビボで行う予定である場合は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、患者への投与の前に完全に組み上げてもよい（照射吸収ナノ粒子およびターゲティング成分に結合したデンドリマーの形に）。熱アブレーションを、インビトロまたはエクスビボで行う予定の場合は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、熱アブレーションを行う細胞または組織に接触させる前に完全に構築してもよい。あるいは、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーの成分を別々に投与し、標的細胞または組織上で、投与後構築を可能とすることにより、インビボで構築してもよい。例えば、ＤＮＡデンドリマー（結合した照射吸収ナノ粒子またはターゲティング成分を持たない）を投与し、続いて、ターゲティング成分および照射吸収ナノ粒子を順次または同時に投与する。別の例では、ターゲティング成分を、投与し、続いて、ＤＮＡデンドリマーおよび照射吸収ナノ粒子を順次または同時に投与する。この逐次構築手法は、また、インビトロおよびエクスビボでの使用にも提供できる。
【００３３】
具体的使用方法では、本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、記載のように、腫瘍、例えば、肝臓癌、消化管癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、およびＤＮＡデンドリマーにより標的化可能で、外部電磁場暴露を適用できるいずれかの他の局在型固形腫瘍のアブレーションに使用可能である。さらなる具体的使用方法では、本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、記載のように、血液中腫瘍細胞、例えば、白血病もしくはリンパ腫細胞のアブレーションを目的として、または癌転移病巣の熱アブレーションを目的として使用可能である。さらに、本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、微生物、例えば、ボレリア、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡを含む）、およびバンコマイシン耐性細菌のアブレーションに使用可能である。エクスビボでの適用では、生物学的材料、例えば、器官、細胞および移植用組織は、移植の前に、望ましくない細胞、例えば、癌細胞を切除するために、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを使って処理することができる。具体的な例では、本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、自家骨髄移植に使用して、患者への骨髄の再導入の前に癌患者の穿刺骨髄から癌細胞を除去することができる。
【００３４】
第４の実施形態では、本発明は、記載した癌および腫瘍の治療方法での使用のための熱アブレーションＤＮＡデンドリマーを含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、通常、全身性または局所的非経口投与、例えば、シリンジまたはカテーテルを使って、静脈内投与または治療部位への直接注射用として処方される。医薬組成物は、通常、当技術分野で知られているように、少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む。例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、４ｔｈｅｄ．」（２００３）Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．Ｃｏｗｅ、ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｈｉｃａｇｏを参照。薬学的に許容可能なキャリアおよび賦形剤には、安定化剤、緩衝剤、可溶化剤、等、例えば、デンプン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、ショ糖、等が含まれる。適切な医薬組成物の処方は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、中に認められる。本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、水溶液に可溶であり、これにより、生理学的に親和性のある水性緩衝液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、生理食塩水または生理的な塩緩衝液中での医薬組成物の調製が可能となる。
【００３５】
いずれかの前出の実施形態で、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに結合したターゲティング成分は、熱アブレーション対象細胞または組織上の選択標的に特異的に結合するいずれの成分であってもよい。選択標的への特異的結合には、熱アブレーション対象細胞または組織に対する独占的結合のみでなく、熱アブレーション対象細胞または組織と、熱アブレーションの標的になっていない細胞または組織の間の差次的結合が含まれる。例えば、同じ標的を呈示している他の細胞または組織に比較して、より高い標的密度を示す細胞または組織は、より大きな量のＤＮＡデンドリマーの結合および、その結果としての、照射吸収ナノ粒子へのより多くの暴露に基づいて、選択的にアブレーションされうる。ターゲティング成分には、タンパク質、ペプチドおよびアプタマーが含まれる。具体的実施形態では、このようなターゲティング成分は、抗体または抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、およびミニボディを含む）であってもよい。抗体または抗体断片は、熱アブレーション対象細胞または組織の表面の結合相手、好ましくは、熱アブレーション標的ではない他の細胞または組織から標的細胞または組織を識別する特異的結合相手を標的とする。熱アブレーションの標的の細胞または組織が、悪性細胞または腫瘍である場合、抗体または抗体断片は、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原、例えば、αフェトプロテイン、癌胎児抗原、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原、またはｒａｓもしくはｐ５３遺伝子産物、に結合できる。あるいは、ターゲティング成分の抗体または抗体断片は、熱アブレーションの標的細胞または組織の表面の受容体、例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２に結合できる。細胞または組織の表面のペプチドまたはタンパク質、例えば、ＬＨＲＨペプチドまたはインテグリンも、抗体または抗体断片の標的とすることができる。あるいは、さらなる具体的実施形態では、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに結合したターゲティング成分は、細胞または組織表面上の受容体に対するリガンドであってもよい。このようなリガンドは、通常、ペプチドまたは低分子タンパク質、例えば、ＴＮＦ−α、リンホトキシン、形質転換増殖因子−β、インスリン、インスリン様増殖因子−１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＳＨ、およびＡＣＴＨである。
【００３６】
前出の実施形態のいずれかで、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーに結合した照射吸収ナノ粒子は、電磁エネルギー、例えば、ＲＦエネルギーを吸収し、そのエネルギーを熱として放出する、金属のナノ粒子および炭素ベースナノ粒子を含む任意の組成物であってよい。このような照射吸収ナノ粒子は、当技術分野で既知のナノ球体、ナノロッド、ナノシェル、ナノケージ、ナノチューブ、または表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）ナノ粒子の形態であってもよい。具体的な例では、ナノ粒子は、炭素、銀または金を含む。さらなる具体的な例では、ナノ粒子には、金が含まれるが、金は医学適用における先使用の利点があり、従って、医学上の受容性が証明されている。
【００３７】
前出の実施形態のいずれかで、本発明の熱アブレーションＤＮＡデンドリマーは、本明細書記載のいずれかの方法と構造によるデンドリマーアームに結合した追跡標識を含んでもよい。追跡標識は、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーの位置検出とモニターを可能とし、これは、目的標的部位にデンドリマーを蓄積させるために投与後に時間が必要な場合のインビボでの適用に、特に、有用である。追跡標識を含めることにより、デンドリマーの時間による蓄積をモニターでき、標的部位へ外部電磁場を適用する最適時間を決定することができる。有用な追跡標識には、蛍光の標識、例えば、近赤外蛍光染料（光学的画像処理用）、放射性標識、例えば、１８Ｆ（ＰＥＴスキャンに使用される放射性トレーサ）、および造影剤、例えば、ガドリニウム（ＭＲＩで使用される常磁性材料）が含まれる。
【００３８】
特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティング成分および少なくとも１つの金属の照射吸収ナノ粒子を含む本発明のＤＮＡデンドリマーは、また、インビボ、エクスビボまたはインビトロでの造影剤として使用してもよい。この実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは、患者、細胞培養または組織に投与され、画像処理のために、対象細胞または組織の標的と結合させる。熱の生成のために結合ＤＮＡデンドリマーを外部電磁場に露出させる代わりに、ＤＮＡデンドリマーに結合した照射吸収ナノ粒子を検出する画像処理技術により結合ＤＮＡデンドリマーの位置が検出される。例えば、画像処理ＤＮＡデンドリマーは、反射率イメージング（Ｊａｖｉｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、同上）、光熱干渉コントラスト（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）、暗視野画像処理、走査電子顕微鏡、蛍光顕微鏡、光音響トモグラフィー、光干渉断層法、磁気共鳴画像、およびラマン分光法、のための分子特異的造影剤として使用可能である（概説：Ｃａｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００８：１１７−３２）。
【００３９】
細胞または組織の画像処理の目的で使用される場合、ＤＮＡデンドリマーは、細胞または組織に接触の前に構築してもよい。すなわち、画像処理がインビボで行われる予定の場合は、ＤＮＡデンドリマーは、（結合した照射吸収ナノ粒子およびターゲティング成分に結合したデンドリマー）患者への投与の前に完全に構築してもよい。画像処理が、インビトロまたはエクスビボで行われる予定の場合、ＤＮＡデンドリマーは、細胞または組織に接触させる前に完全に構築してもよい。あるいは、ＤＮＡデンドリマーは、ＤＮＡデンドリマーの成分を別々に投与して、標的細胞または組織上で、投与後にインビボで構築させてもよい。例えば、ＤＮＡデンドリマー（照射吸収ナノ粒子またはターゲティング成分に結合していない）を投与し、続いて、ターゲティング成分および照射吸収ナノ粒子を順にまたは同時に投与してもよい。別の例では、ターゲティング成分を投与し、続いて、ＤＮＡデンドリマーおよび照射吸収ナノ粒子を順にまたは同時に投与してもよい。また、この逐次構築手法は、インビトロおよびエクスビボでの使用にも適用可能である。
【００４０】
実施例
実施例１：キャプチャーオリゴヌクレオチド含有ＤＮＡデンドリマーの製造
ＤＮＡデンドリマーを、以前に開示のように製造した（例えば、米国特許第５、１７５、２７０号、同５、４８４、９０４号、同５、４８７、９７３号、同６、１１０、６８７号および同６、２７４、７２３号を参照。これらの特許は、参照によってその全体が組み込まれる。簡単に述べれば、ＤＮＡデンドリマーは、ＤＮＡモノマーから構築され、各モノマーは、各鎖の中央部の位置の相補性配列の領域を共有する２つのＤＮＡ鎖から作られる。２つの鎖をアニールしモノマーを形成する場合、得られた構造は、４つの単鎖「アーム」に隣接する中央部の二重鎖「ウエスト」を有するものとして記述できる。このウエスト−プラス−アーム構造は、基本的な３ＤＮＡ（登録商標）モノマーから構成される。各５つのモノマー型の末端の単鎖アームは、的確で特異的な方式で相互作用するように設計された。相補的なモノマーアーム間の塩基対形成は、モノマー層の逐次追加によるデンドリマーの定方向構築を可能とする。デンドリマーの各層の構築には、ＤＮＡ鎖が相互に共有結合する結果、変性条件に影響されない完全に共有結合の分子が形成される架橋プロセスを含めた（変性条件の影響を受けると、デンドリマー構造の変形の原因となる）。さらに、相補的なキャプチャーオリゴの役割をする３８塩基オリゴヌクレオチドを、以下に示す、単純Ｔ４ＤＮＡリガーゼ依存性連結反応により、利用可能なデンドリマーアームの５′末端に結合した：
【００４１】
重複デンドリマーアームおよびキャプチャーオリゴヌクレオチドの隣接部分にオーバーラップし、キャプチャーオリゴヌクレオチドをデンドリマーアームの末端に架橋結合する「架橋オリゴヌクレオチド」を利用して、単純核酸連結反応により、３８塩基ＤＮＡキャプチャーオリゴヌクレオチドをデンドリマーアームの末端に共有結合させる。架橋結合オリゴヌクレオチドを、隣接デンドリマーアームおよびキャプチャーオリゴヌクレオチド配列のそれぞれの少なくとも５塩基とオーバーラップさせて、核酸リガーゼ酵素（このましくはＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素）の連結反応活性を促進した。各配列の少なくとも７塩基のオーバーラップが好ましい。デンドリマーが非デンドリマー核酸または他の分子の特異的ターゲティング用として使用される場合は、架橋結合オリゴは、その相補的配列のための核酸遮断薬としても使用可能である。
【００４２】
下記成分を微量遠心管チューブに添加した：
１Ｘ  ＴＥ緩衝液中の４層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）  ５．４μＬ（２６８０ｎｇ）
ａ（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４マー）（５０ｎｇ／μＬ）  ２．７μＬ（１３４ｎｇ）
１０Ｘ  リガーゼ緩衝液  １０．２μＬ
ヌクレアーゼ不含水  ８１．７μＬ
Ｃａｐ０３キャプチャーオリゴ（３８マー）（５０ｎｇ／μＬ）  ４．０μＬ（２００ｎｇ）
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ）  １０．０μＬ（１０ユニット）
【００４３】
最初の４つの反応剤を一緒に添加し、６５℃に加熱後、室温に冷却した。その後、５番目と６番目の反応剤を添加し、４５分間インキュベートした。２．８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加して連結反応を停止させた。サイズ排除スピンカラムを使って、非結合オリゴヌクレオチドを除去した。金ナノ粒子および抗体をＤＮＡデンドリマーに結合させる後続ステップで使うために、Ｃａｐ０３配列と結合したデンドリマーを、１Ｘ  ＴＥ緩衝液中で５０ｎｇ／μＬに調整した。
【００４４】
実施例２：ビオチン標識オリゴヌクレオチド結合金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）およびキャリアオリゴヌクレオチド結合ターゲティング抗体のＤＮＡデンドリマーへの付加
下記成分を微量遠心管チューブに添加した：
Ｃａｐ０３配列結合４層ＤＮＡデンドリマー（５０ｎｇ／μＬ）  ５０．０μＬ
ｃ（＋）３′末端ビオチン標識オリゴ（５００ｎｇ／μＬ）  ２．６μＬ
ａ（＋）５′末端ビオチン標識オリゴ（５００ｎｇ／μＬ）  ２．６μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ４．０μＬ
２、４、８トリメチルソラレン飽和エタノール溶液  ７．０μＬ
【００４５】
上記反応剤を一緒に添加し、よく混合後、６５℃の水の容器中へ入れ、４２℃までゆっくり冷却した。ＵＶ光（３２０〜４００ｎｍ）への１０分間（Ｘ２）の暴露により、ビオチン化されたオリゴをＤＮＡデンドリマーのアームに共有結合させる架橋を開始する。サイズ排除スピンカラムを使用して非架橋オリゴヌクレオチドを除去する。少量の蛍光ｃ（＋）および／またはａ（＋）オリゴを一部の調製物に添加し、蛍光標識を付加してデンドリマーの細胞表面への結合の追跡を支援する。
【００４６】
ターゲティング抗体を最初の共有結合により、標準架橋縮合反応を使って完全抗体または抗体断片（ＦａｂまたはＦａｂ′（２））を結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを付加しているＤＮＡデンドリマーに結合させ、続いて、抗体結合オリゴヌクレオチドをデンドリマーアーム上の相補的配列にハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションは、３１塩基対を含み、６５℃超の融解温度であるため、生理的な温度と条件下で安定な抗体結合デンドリマー複合体を提供する。ターゲティング抗体のデンドリマーへの結合と同時に、ストレプトアビジン−ＡｕＮＰを適切な化学量論比で添加し、予めデンドリマー構造を付加しているビオチン成分に結合させた。
【００４７】
下記成分を微量遠心管チューブに添加した：
Ｃａｐ０３配列を結合した４層ビオチン化ＤＮＡデンドリマー  ５０．０μＬ
ＰＢＳ中５０％エチレングリコールまたは等価物  １２５．０μＬ  
（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｒｅｅｚｅ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
１Ｘ燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）  ５７．０μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ４．３μＬ
予め抗Ｃａｐ０３オリゴを共有結合した抗体（抗ヒトＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍａｂ）（オリゴとして１０ｎｇ／ｇＬ）  １３．７μＬ
ストレプトアビジン−ＡｕＮＰ（２０ｎｍ）（ＢＢＩＬｔｄ．）（１ｍＬ当たり１．７ｘ１０１２ＡｕＮＰ）  １９．５μＬ
【００４８】
上記反応剤を配合し、ゆっくり混合後、３７℃で３０分間インキュベートする。この配合物は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。
【００４９】
上記ビオチン−ストレプトアビジン結合方法を使って、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、および２０ｎｍの金ナノ粒子を有する下記の金ナノ粒子結合ＤＮＡデンドリマーを作成した：
【表１】
2013520516.tif 000003
【００５０】
実施例３：オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによるＡｕＮＰおよびキャリアオリゴヌクレオチド結合ターゲティング抗体のＤＮＡデンドリマーへの付加
金ナノ粒子（または他の標識成分）を結合した低分子ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド（および他の生化学的類似体）を、デンドリマーマトリックス構造の末端部のデンドリマー「アーム」単鎖核酸配列にハイブリダイズする。これらの標識オリゴヌクレオチドは、典型的ワトソン・クリック塩基対形成のみにより結合可能であるか、または、ハイブリダイズした隣接ＤＮＡ鎖上のチミン間で共有結合を形成するＵＶ活性化したソラレンインターカレーターの使用により、デンドリマー構造をさらに共有結合で架橋することができる。
【００５１】
下記成分を微量遠心管チューブに添加した：
Ｃａｐ０３配列を結合した４層ＤＮＡデンドリマー（５０ｎｇ／ｇＬ）  ５０．０μＬ
予めｃ（＋）オリゴに結合させた金ナノ粒子（５００ｎｇ／μＬ）  ２．６μＬ
予めａ（＋）オリゴに結合させた金ナノ粒子（５００ｎｇ／μＬ）  ２．６μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ４．０μＬ
２、４、８トリメチルソラレン飽和エタノール溶液  ７．０μＬ
【００５２】
上記反応剤を一緒に添加し、よく混合した後、６５℃の水の容器に入れ、ゆっくり４２℃に冷却する。ＵＶ光（３２０〜４００ｎｍ）に１０分間（Ｘ２）暴露することにより、ＡｕＮＰオリゴをＤＮＡデンドリマーアームに共有結合させる架橋イベントを開始する。非架橋オリゴヌクレオチドを、サイズ排除スピンカラムの使用により除去する。少量の蛍光ｃ（＋）および／またはａ（＋）オリゴを一部の調製物に添加し、蛍光標識を付加し、デンドリマーの細胞表面への結合の追跡に役立てる。
【００５３】
上記の具体的容量は、デンドリマー当たり約３００個のナノ粒子を含むデンドリマーの合成のためのものである。ｃ（＋）およびａ（＋）オリゴヌクレオチドの容量の変更は、デンドリマー当たりのナノ粒子の数を変えるのに使用できる。
【００５４】
標準架橋縮合反応を使った最初の共有結合によりＤＮＡオリゴヌクレオチドを完全抗体または抗体断片（ＦａｂまたはＦａｂ′（２））に結合させ、続いて、抗体結合オリゴヌクレオチドをデンドリマーアームの相補的配列にハイブリダイズすることにより、ターゲティング抗体をＤＮＡデンドリマーに結合させた。このハイブリダイゼーションは、３１塩基対を含み、６５℃超の融解温度を有するため、生理的な温度と条件下で安定な抗体結合デンドリマー複合体を提供する。
【００５５】
下記成分を微量遠心管チューブに添加した：
Ｃａｐ０３配列と金ナノ粒子を結合した４層ＤＮＡデンドリマー（５０ｎｇ／μＬ）  ５０．０μＬ
ＰＢＳ中５０％エチレングリコールまたは等価物  １２５．０μＬ
（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｒｅｅｚｅ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
ＩＸ燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）  ５７．０μＬ
５Ｍ  ＮａＣｌ  ４．３μＬ
予め共有結合した抗Ｃａｐ０３オリゴを有する抗体（抗ヒトＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍａｂ）（オリゴとして１０ｎｇ／μＬ）  １３．７μＬ
【００５６】
上記反応剤を配合し、ゆっくり混合した後、３７℃で３０分間インキュベートする。この配合物は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。
【００５７】
実施例４：インビトロ細胞培養により成長させた癌細胞の熱アブレーション用修飾デンドリマーの使用
癌試験細胞を、培養液中で、通常は、最適成長培地を含む９６ウエル平底ポリスチレンプレートを用いて成長させた。一例では、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を、ウエル当たり４〜８０００細胞の濃度で、１００μＬの１０％ＦＢＳ、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、２５ｍＭＬ−グルタミンおよびゲンタマイシン硫酸塩（１０ｍｇ／Ｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０中に播種した。細胞が集密的（ウエル当たり１５〜２０、０００細胞）になるまで、２〜３日成長させた。
【００５８】
上記のように、ＤＮＡデンドリマーを、具体的製造条件に応じて、デンドリマー当たり６個未満から９００個超の範囲の金ナノ粒子を含むように製造した（上記製造プロセス参照）。マイクロタイタープレートウエル中で、デンドリマー量で０．５〜１０ｎｇ／μＬの最終濃度になるように、培養Ｈｅｐ  Ｇ２細胞にＤＮＡデンドリマーを加えた。細胞およびデンドリマーを、１５〜１８０分間インキュベートし、３７℃でデンドリマーを細胞表面に結合させた。標準的蛍光顕微鏡を使って蛍光標識を含むデンドリマーの細胞表面への結合を確認した。
【００５９】
デンドリマーに結合した培養Ｈｅｐ  Ｇ２細胞は、出力範囲０〜２０００ワットで１３．５６ＭＨｚの電波を発生する可変出力ＲＦ場発生装置により生成されるＲＦ場に暴露される。トランスミッションヘッド（集束エンドファイアーアンテナ回路）を、生存細胞から約２〜３ｃｍの位置に保持し、０〜５分間、ＲＦ場に暴露した。ＭＴＴ試薬（黄色ＭＴＴ（３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾールは、生きている細胞のミトコンドリア中で紫色のホルマザンに還元される）の使用を含む、標準的色素排除法の使用により細胞死がモニターされる。この有色溶液の吸光度は、分光光度計により特定の波長を測定することにより定量可能である。この減少は、ミトコンドリア還元酵素が活性の場合のみ起こり、従って、変化は、生存可能な（生きている）細胞の数に直接関連付けることができる。金ナノ粒子含有ＤＮＡデンドリマー存在下の顕著な熱アブレーションの成功は、金ナノ粒子を含まない細胞およびデンドリマー含有対照ウエルとの比較で、細胞の過剰死亡により確認される。
【００６０】
実施例５：インビボの癌細胞の熱アブレーションのための修飾デンドリマーの使用
修飾デンドリマーは、例えば、Ｃａｒｄｉｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １４４：１２５−１３２およびＧａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｊ．Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：２、に記載の方法と装置を使ってインビボでの癌細胞の熱アブレーション用として使用可能である。これらの文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月22日(2013.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの照射吸収金属ナノ粒子および少なくとも１つのターゲティング成分に結合したＤＮＡデンドリマー。
【請求項２】
少なくとも１つの照射吸収金属ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項３】
照射吸収ナノ粒子が、ナノ球体、ナノロッド、ナノシェル、ナノケージ、ナノチューブまたは表面増強ラマン散乱ナノ粒子である請求項１または２に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項４】
ＤＮＡデンドリマーのアームに結合したキャプチャーオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つの照射吸収金属ナノ粒子および少なくとも１つのターゲティング成分の内の片方または両方が、キャリアオリゴヌクレオチドのキャプチャーオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡデンドリマーに結合している請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項５】
キャプチャーオリゴヌクレオチドが、延長オリゴヌクレオチドの末端に結合し、延長オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡデンドリマーのアームにハイブリダイズしている請求項５に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項６】
照射吸収金属ナノ粒子が、ビオチン／ストレプトアビジンによりＤＮＡデンドリマーに結合している請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項７】
ＤＮＡデンドリマーのアームに結合した追跡標識をさらに含む請求項１から６のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項８】
ターゲティング成分が、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、抗体断片または受容体リガンドである請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項９】
デンドリマーが、架橋されたモノマーを含む請求項１から８のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１０】
熱アブレーションＤＮＡデンドリマーおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含み、熱アブレーションＤＮＡデンドリマーが、少なくとも１つの照射吸収金属ナノ粒子および少なくとも１つのターゲティング成分を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
生理学的に適合する水性緩衝液を含む請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
非経口投与用に処方されている請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬物としての使用のための請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１４】
非経口または静脈投与の使用のための請求項１３に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１５】
細胞または組織の熱アブレーションでの使用もしくは細胞または組織の画像処理のための請求項１３または１４に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１６】
インビボまたはインビトロでの細胞または組織を含む請求項１５に記載のＤＮＡデンドリマー。
を含む方法。
【請求項１７】
細胞または組織が、固形腫瘍、血液中腫瘍細胞、転移癌、微生物および生物学的移植材料からなる群より選択される請求項１５から１６に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１８】
、細胞または組織上の投与後アセンブリの使用のための請求項１３から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１９】
細胞または組織の熱アブレーションでの使用もしくは細胞または組織の画像処理のための請求項１から９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
インビボまたはインビトロでＤＮＡデンドリマーに細胞または組織を接触させるための請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
細胞または組織が、固形腫瘍、血液中腫瘍細胞、転移癌、微生物および生物学的移植材料からなる群より選択される請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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