(57)【要約】  単離された毛包から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成させる方法が開示される。方法は、（ａ）単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること；（ｂ）毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること；（ｃ）少なくとも一種の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること；及び（ｄ）前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、ｉＰＳ細胞が形成されるまで培養し、それによりｉＰＳ細胞を生成させることを含む。ｉＰＳ細胞の集団及び使用も開示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のことを含むことを特徴とする、単離された毛包から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成させる方法：
（ａ）単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること；
（ｂ）毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること；
（ｃ）少なくとも一種の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること；及び
（ｄ）前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、ｉＰＳ細胞が形成されるまで培養し、それによりｉＰＳ細胞を生成させること。
【請求項２】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、単離された毛包の細胞を解離させることによって生成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コロニーは、２０〜３０個の毛包ケラチン生成細胞を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと２時間未満の間、接触させられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと１時間未満の間、接触させられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスはレンチウイルスであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、三代より多く継代されていないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、二〜三代継代されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記解離させることは、トリプシンを使用して行われることを特徴とする、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記感染させることは、約２００ｇ〜約１０００ｇの遠心力での遠心分離中に行われることを特徴とする、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記感染させることは、２５℃〜３７℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記フィーダー細胞は、３Ｔ３細胞又はマウスの胚性フィーダー細胞（ＭＥＦ細胞）を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子は、ＬｏｘＰ部位をさらにコードすることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＰＳ細胞をｃｒｅリコンビナーゼ酵素と接触させることによって工程（ｄ）の後に前記核酸分子を除去することをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４及びＣ−ＭＹＣからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２及びＫＬＦ４であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２及びＣ−ＭＹＣであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子は、配列番号１に規定される配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記感染されたケラチン生成細胞を培養する時間の少なくとも一部の間、前記培養培地は小分子を含むことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記小分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ又はＭＥＫ）阻害剤とＧＳＫ−３阻害剤の組み合わせ；及びＬ型カルシウムチャンネルアゴニストからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、パルネート（トラニルシプロミン）であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記分離させることは、ＥＤＴＡを使用して行われることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られることを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）。
【請求項２７】
請求項２６に記載のｉＰＳ細胞の細胞系。
【請求項２８】
組織再生における使用のための、請求項２６に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項２９】
前記組織再生は、心臓組織の再生であることを特徴とする、請求項２８に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項３０】
請求項２６に記載のｉＰＳ細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３１】
以下のことを含むことを特徴とする、系譜特異的な細胞を生成させる方法：
（ａ）請求項１に記載の方法に従ってｉＰＳ細胞を生成させること；及び
（ｂ）エクスビボで前記ｉＰＳ細胞を系譜特異的な細胞へと分化させ、それにより前記系譜特異的な細胞を生成させること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞からの、特に引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞からの多能性幹の生成の分野に関する。さらに、本発明は、多能性幹細胞の治療的使用、及び医薬スクリーニング及び疾患モデリングにおけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、ヒトの胚性幹細胞（（ｈＥＳ細胞）に類似する多能性状態に再プログラムされたヒトの体細胞である。ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ４（オクタマ−４，ＰＯＵ５Ｆ１としても知られる）、Ｓｏｘ２（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２）、Ｋｌｆ４（クルッペル様因子４）、及びｃ−Ｍｙｃ又はＮａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を含む転写因子の規定された組を導入することによって生成される（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｙｕら、２００７）。誘導多能性の将来性のある達成は、再生医療にとって大きな見込みを保持する。患者特異的なｉＰＳ細胞は、新薬の開発のための有用なプラットホーム、並びに疾患の作用機構の新しい洞察を提供することができ、この洞察は、細胞及び組織置換治療を開発するために最終的に使用されることができる（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ及びＥｇｇａｎ  ２０１０）。
【０００３】
ヒトのｉＰＳ細胞は、外科手術を介して収集された組織から単離された様々な種類の体細胞（最も一般的には繊維芽細胞）から生成されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｌｏｗｒｙら、２００８；Ｐａｒｋら、２００８；Ｈｕａｎｇｆｕら、２００８ｂ；Ｓｏｌｄｎｅｒら、２００９）。血液は、大部分の患者から容易に得られる細胞源であるが、ヒトの末梢血細胞の実際の再プログラミングプロトコールは、まだ成功していない。最近の研究によれば、臍帯血由来の内皮細胞をｉＰＳ細胞に再プログラミングすることが報告されている（Ｈａａｓｅら、２００９）。しかし、臍帯血は、大部分の患者から直接得られることはできず、従って、特定の疾患をモデルするための好適な源ではない。
【０００４】
Ａａｓｅｎらは、皮膚生検又は引き抜かれたヒトの毛髪由来のヒト一次ケラチン生成細胞の再プログラミングを報告している（Ａａｓｅｎら、２００８）。しかし、既存の方法で得られた再プログラミング効率は、治療用途及び他の用途のために必要な多数のｉＰＳ細胞の一貫した生成を可能にしない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の発見は、ヒトの毛髪からｉＰＳ細胞を誘導するための効率的で再現可能な方法を証明する。生成されたｉＰＳ細胞は、多能性であり、三層の胚葉のいずれにもさらに分化することができ、例えば機能的な心筋細胞に発育することができる。さらに、このプロトコールは、ヒト細胞のための単一のレンチウイルスベクターを使用してヒトのケラチン生成細胞からヒトのｉＰＳ細胞を生成させるための今まで記載されている方法の中で最も効率的な方法であり、研究及び臨床応用のためのヒトの疾患の実験モデルを生成させるために好適である。
【０００６】
本発明のある実施形態の側面によれば、以下のことを含むことを特徴とする、単離された毛包から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成させる方法が提供される：
（ａ）単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること；
（ｂ）毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること；
（ｃ）少なくとも一種の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること；及び
（ｄ）前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、ｉＰＳ細胞が形成されるまで培養し、それによりｉＰＳ細胞を生成させること。
【０００７】
本発明のある実施形態の側面によれば、本明細書に記載の方法によって得られることを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が提供される。
【０００８】
本発明のある実施形態の側面によれば、本発明のｉＰＳ細胞を含むことを特徴とする医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明のある実施形態の側面によれば、以下のことを含むことを特徴とする、系譜特異的な細胞を生成させる方法が提供される：
（ａ）本明細書に記載の方法に従ってｉＰＳ細胞を生成させること；及び
（ｂ）エクスビボで前記ｉＰＳ細胞を系譜特異的な細胞へと分化させ、それにより前記系譜特異的な細胞を生成させること。
【００１０】
本発明のある実施形態によれば、前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、単離された毛包の細胞を解離させることによって生成される。
【００１１】
本発明のある実施形態によれば、前記コロニーは、２０〜３０個の毛包ケラチン生成細胞を含む。
【００１２】
本発明のある実施形態によれば、前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと２時間未満の間、接触させられる。
【００１３】
本発明のある実施形態によれば、前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと１時間未満の間、接触させられる。
【００１４】
本発明のある実施形態によれば、前記ウイルスはレンチウイルスである。
【００１５】
本発明のある実施形態によれば、前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、三代より多く継代されていない。
【００１６】
本発明のある実施形態によれば、前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、二〜三代継代されている。
【００１７】
本発明のある実施形態によれば、前記解離させることは、トリプシンを使用して行われる。
【００１８】
本発明のある実施形態によれば、前記感染させることは、約２００ｇ〜約１０００ｇの遠心力での遠心分離中に行われる。
【００１９】
本発明のある実施形態によれば、前記感染させることは、２５℃〜３７℃の温度で行われる。
【００２０】
本発明のある実施形態によれば、前記フィーダー細胞は、３Ｔ３細胞又はマウスの胚性フィーダー細胞（ＭＥＦ細胞）を含む。
【００２１】
本発明のある実施形態によれば、前記核酸分子は、ＬｏｘＰ部位をさらにコードする。
【００２２】
本発明のある実施形態によれば、方法は、前記ｉＰＳ細胞をｃｒｅリコンビナーゼ酵素と接触させることによって工程（ｄ）の後に前記核酸分子を除去することをさらに含む。
【００２３】
本発明のある実施形態によれば、前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる群から選択される。
【００２４】
本発明のある実施形態によれば、前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４及びＣ−ＭＹＣからなる群から選択される。
【００２５】
本発明のある実施形態によれば、前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２及びＫＬＦ４である。
【００２６】
本発明のある実施形態によれば、前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２及びＣ−ＭＹＣである。
【００２７】
本発明のある実施形態によれば、前記少なくとも一種の脱分化因子は、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２である。
【００２８】
本発明のある実施形態によれば、前記核酸分子は、配列番号１に規定される配列を含む。
【００２９】
本発明のある実施形態によれば、前記感染されたケラチン生成細胞を培養する時間の少なくとも一部の間、前記培養培地は小分子を含む。
【００３０】
本発明のある実施形態によれば、前記小分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ又はＭＥＫ）阻害剤とＧＳＫ−３阻害剤の組み合わせ；及びＬ型カルシウムチャンネルアゴニストからなる群から選択される。
【００３１】
本発明のある実施形態によれば、前記ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。
【００３２】
本発明のある実施形態によれば、前記リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、パルネート（Ｐａｒｎａｔｅ）（トラニルシプロミン）である。
【００３３】
本発明のある実施形態によれば、前記分離させることは、ＥＤＴＡを使用して行われる。
【００３４】
本発明のある実施形態によれば、本発明のｉＰＳ細胞の細胞系が提供される。
【００３５】
本発明のある実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、組織再生において使用される。
【００３６】
本発明のある実施形態によれば、前記組織再生は、心臓組織の再生である。
【００３７】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３８】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ−１Ｆ】図１Ａ−１Ｆは、毛包ケラチン生成細胞（ＨＦＫＴ）の誘導及びそれらの特性決定を示す。図１Ａは、無傷の引き抜かれた毛包の大部分を示す。図１Ｂは、細胞の酵素的除去後の単細胞懸濁物の生成を示す。図１Ｃは、引き抜かれた毛髪から単離されたＨＦＫＴが、不活性化３Ｔ３フィーダー細胞上に播種されて、継代の一日後に小さなコロニーとして出現したことを示す。図１Ｄは、継代の６日後の大きなコロニーを示す。図１Ｅは、ケラチン生成細胞のマーカーのＱＲＴ−ＰＣＲを示す。図１Ｆは、四つの再プログラミング因子の定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）が、ＨＦＫＴ，ＨａＣａｔ細胞及びｈＥＳ細胞（Ｈ９．２）から単離されたＲＮＡを使用して適用されたことを示す。分析は、内部コントロールとしてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現を使用して行われた。データは、ＨａＣａｔ細胞における遺伝子発現に対する相対値として示される。図中、ＲＱは、相対的な定量を意味する。
【００４０】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の生成及び特性決定を示す。図２Ａは、ＨＦＫＴの再プログラミング手順を示す。図２Ｂは、継代２９＋４３でのｈＥＳ細胞コロニーＨ９．２と比較した、継代２５でのＫＴＮ及びＫＴＲ源細胞に由来するＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の生成及び特性決定を示す。図２Ｃは、ＨＦＫＴドナー細胞中のＫ１４，Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの免疫染色（ＫＴＲ  Ｐ．２）、それらに由来するｉＰＳ細胞（ＨＦＫＴ−ｉＰＳ）の免疫染色（ＫＴＲ１３  ｐ．２２）、及びＨ９．２からのｈＥＳ細胞の免疫染色を示す。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色されている。スケールバーは、ＨＦＫＴのＫ１４染色以外は１００μｍを表わす。ＨＦＫＴのＫ１４染色では、スケールバーは、５０μｍを表わす。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の生成及び特性決定を示す。図２Ｄは、ＨＦＫＴドナー細胞についてのＥＳ細胞マーカーのＦＡＣＳ分析（ＫＴＲ  ｐ．２）、それらに由来するｉＰＳ細胞（ＨＦＫＴ−ｉＰＳ）についてのＥＳ細胞マーカーのＦＡＣＳ分析（ＫＴＲ１３  ｐ．２４）、及びＨ９．２からのｈＥＳ細胞についてのＥＳ細胞マーカーのＦＡＣＳ分析を示す。陽性細胞の割合、及び信号強度を示す幾何平均（Ｇ．Ｍ）が示されている。データは、二次抗体のみで染色された陰性コントロールに対する相対値で得られた。図中ｐ．２，ｐ．２２及びｐ．２４はそれぞれ、継代２，２２及び２４を意味する。ＫＴＮ及びＫＴＲはそれぞれ、個体Ｎ及びＲから得られたＨＦＫＴを意味する。
【００４１】
【図３Ａ】図３Ａは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の多能性を示す。図３Ａは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンＫＴＲ１３  Ｐ．２０について示された典型的なｈＥＳ細胞（Ｈ９．２）マーカーの免疫染色を示す。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色されている。スケールバーは、１００μｍを表わす。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の多能性を示す。図３Ｂは、三つの異なる継代：ｐ．５−７、ｐ．１２−１７及びｐ．２２−２５の後の未分化のＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローン中の再プログラミング因子の発現レベルのＱＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。分析は、ＧＡＰＤＨの内部コントロールを使用して行われた。データは、ｈＥＳ細胞の転写レベルに対する相対値として示される。
【００４２】
【図４】図４は、多能性遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＲＴ−ＰＣＲは、以下のサンプル：ｈＥＳ細胞−Ｈ９．２，ＨＦＫＴ，ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンＫＴＮ５，ＫＴＮ７，ＫＴＲ１２及びＫＴＲ１３に対して、以下の多能性遺伝子：Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｒｅｘ１，ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４に隣接するプライマーを使用して行われた。ＧＡＰＤＨが内部コントロールとして使用された。プライマーのリストは、表１に記載されている。
【００４３】
【図５Ａ−５Ｉ】図５Ａ−５Ｉは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の分化を示す。図５Ａは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞ＫＴＲ１３クローン由来の５日齢の胚様体（ＥＢ）を示す。同様の形態は、全てのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンについて得られた。図５Ｂ−Ｆは、ＫＴＲ１３クローン由来の２１日齢のＥＢの免疫染色は、中胚葉マーカータンパク質（ＳＭＡ−Ｂ，ＣＤ３１−Ｃ）、外胚葉マーカータンパク質（チューブリンβ３、ネスチン−Ｄ）、及び内胚葉マーカータンパク質（ＡＦＰ−Ｅ、グルカゴン−Ｆ）の発現を示す。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色されている。スケールバーは、チューブリンβ３及びネスチン染色以外は１００μｍを表わす。チューブリンβ３及びネスチン染色では、スケールバーは、２０μｍを表わす。図５Ｇ−Ｉは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞ＫＴＲ１３クローンから得られた奇形腫の形成を示す。図５Ｇは、ニューロン組織が外胚葉系譜を表わすことを示す。図５Ｈは、内胚葉形成を示す顕著な粘液形成細胞を有する内胚葉上皮を示す。図５Ｉは、脂肪細胞及び筋肉組織、並びに中胚葉形成を指し示す軟骨細胞領域を示す。スケールバーは、５０μｍを表わす。
【図５Ｊ】図５Ｊは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の分化を示す。図５Ｊは、分化後の再プログラミング因子の発現を測定するＱＲＴ−ＰＣＲを示す。分析は、ＧＡＰＤＨの内部コントロールを使用して行われた。データは、ｈＥＳ細胞（Ｈ９．２）の転写レベルに対する相対値として示される。図中、ＳＭＡは、平滑筋アクチンを意味する。ＡＦＰは、内胚葉アルファフィトタンパク質を意味する。
【００４４】
【図６Ａ】図６Ａは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の心臓分化を示す。図６Ａは、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞（ＣＭ）中の心臓タンパク質の免疫蛍光染色を示す。ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭからの微小切開収縮領域は、典型的な心臓繊維タンパク質について染色された。細胞（クローンＫＴＲ１３、３６日齢のＥＢ）は、抗心臓トロポニンＩ（緑色）、及び抗肉腫α−アクチン又はミオシン重鎖（ＭＨＣ、赤色）で共ラベルされた。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色されている。明らかな横紋を有する代表的な領域が、挿入物中に示されている。
【図６Ｂ−６Ｅ】図６Ｂ−６Ｅは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の心臓分化を示す。図６Ｂは、微小電極アレイ（ＭＥＡ）データ取得システムによって記録された細胞外エレクトグラムを示す。自発収縮ＥＢ（クローンＫＴＲ１３、２４日齢のＥＢ）は、記録電極上に播種された（左側のパネル）。ＭＥＡアレイから記録されたエレクトログラムの代表的な表示（中央のパネル）、及び電極Ｎｏ．４８からの代表的なアナログ記録（右側のパネル）が示されている。図６Ｃは、自発収縮ＥＢ（クローンＫＴＲ１３、３７日齢のＥＢ）からの代表的な活動電位記録を示し、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭのペースメーカー活性を示す。右側のパネルは、左側のパネルのドットで示された領域からとられた、拡大された時間スケールを示す。図６Ｄ−Ｅは、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭの［Ｃａ２＋］ｉ過渡現象（Ｄ）及び収縮（Ｅ）の同時記録を示し、代表的な実験（クローンＫＴＲ１３、３７日齢のＥＢ）におけるイソプロテレノールの効果を示し、イソプロテレノール濃度の増大に応答して収縮振幅が増大することを示す。コントロールは、賦型剤である。
【００４５】
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ−７Ｃは、ｌｏｘＰを含有するポリシストロニックレンチウイルスＳＴＥＭＣＣＡベクター（材料及び方法の欄参照）のＣｒｅ媒介除去を示す。図７Ａでは、二つのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンＫＴＲ１３及びＫＴＮ７からのレンチウイルスベクターの除去を証明するゲノムＰＣＲは、レンチウイルスベクターのＷＰＲＥ領域に隣接する二つのプライマーセットを使用して行われた。レーン１〜５は、ＷＰＲＥ９１４２−９６３３プライマーセットを使用して得られた１７３ｂｐのＰＣＲ産物を示す。レーン６〜１０は、ＷＰＲＥ９１４２−９６３３プライマーセットを使用して得られた４９１ｂｐのＰＣＲ産物を示す。レーン１及び６：Ｃｒｅ−ＫＴＮ７．３を除去されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン。レーン２及び７：Ｃｒｅ−ＫＴＲ１３．４を除去されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン。レーン３及び８：ＫＴＮ７  ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン。レーン４及び９：ＫＴＲ１３  ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン。レーン５及び１０：ＤＮＡなしの陰性コントロール。図７Ｂは、除去されたＣｒｅ−ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン中の再プログラミング因子の発現を測定するＱＲＴ−ＰＣＲを示す。分析は、ＧＡＰＤＨの内部コントロールを使用して行われた。データは、ｈＥＳ細胞の転写レベルに対する相対値として示される。図中、ＲＱは、相対的な定量を意味する。図７Ｃは、表を示す。
【００４６】
【図８】図８は、除去されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンＣｒｅ−ＫＴＮ７．３  ｐ．１５＋３３について示される典型的なｈＥＳ細胞マーカー：Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，ＳＳＥＡ４，Ｔｒａ１−６０及びＴｒａ１−８１の形態及び免疫染色を示す。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色されている。スケールバーは、１００μｍを表わす。
【００４７】
【図９Ａ−９Ｆ】図９Ａ−９Ｆは、除去されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンＣｒｅ−ＫＴＮ７．３  ｐ．１５＋２７由来の７日齢のＥＢの形態及び２１日齢のＥＢの免疫染色を示し、中胚葉マーカータンパク質（ＳＭＡ−Ｂ，ＣＤ３１−Ｃ）、外胚葉マーカータンパク質（チューブリンβ３、ネスチン−Ｄ）、及び内胚葉マーカータンパク質（ＡＦＰ−Ｅ、グルカゴン−Ｆ）の発現を示す。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色されている。スケールバーは、１００μｍを表わす。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、体細胞からの、特に引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞からの多能性幹の生成の分野に関する。さらに、本発明は、多能性幹細胞の治療的使用、及び医薬スクリーニング及び疾患モデリングにおけるそれらの使用にも関する。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００５０】
引き抜かれた毛包は、遺伝子疾患の研究のための、及び診断目的のための簡便なサンプル材料として使用されている。また、毛包は、生物医学的研究のための上皮細胞の興味深いモデルシステムも提供する（Ｌｉｍａｔら、１９８６）。
【００５１】
発表されているプロトコールに従った成体ヒト毛髪からのｉＰＳ細胞の生成効率は低いため、本発明者らは、かかる細胞を生成させるための新規な方法を工夫した。かかる方法は、引き抜かれた毛髪の外部毛根鞘からのケラチン生成細胞の単離、及び好適な培地中のフィーダー細胞上でのケラチン生成細胞の増殖を含む。さらに、本発明者らは、プロトコールの感染段階の前にフィーダー細胞を除去して、感染直後にそれらを再び与えることが必要であることを見出した。単離されたヒトケラチン生成細胞からのｉＰＳ細胞の成功した生成は、図１Ａ−Ｄ及び図２Ａ−Ｄに示されている。本発明者らは、いくつかのアッセイを使用して、生成された細胞の多能性を証明し（図３Ａ−Ｂ，４，５Ａ−Ｊ，８及び９Ａ−Ｆ）、さらに、これらの細胞がエクスビボで心臓系譜に分化できることを示した（図６Ａ−Ｅ）。
【００５２】
従って、本発明の一つの側面によれば、以下のことを含むことを特徴とする、単離された毛包から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成させる方法が提供される：
（ａ）単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること；
（ｂ）毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること；
（ｃ）少なくとも一種の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること；及び
（ｄ）前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、ｉＰＳ細胞が形成されるまで培養し、それによりｉＰＳ細胞を生成させること。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「多能性細胞」は、長期間（例えば、一年以上）にわたってインビトロで分割する能力を有する細胞であって、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の三層の胚葉の全てに由来する細胞に分化する特異的な能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は、様々な特定の組織に特異的な別個の異なる形態学的、細胞学的又は機能的な表現型を有する全範囲の娘細胞に分化する能力を有する。対照的に、多能性細胞の子孫は、それらの分化能力を漸進的に制限されており、いくつかの細胞は結局一つの運命のみを有する。
【００５４】
句「単離された毛包」は、付着した外部毛髪から除去された毛包を意味する。毛包は、内部毛根鞘（ＩＲＳ）によって包囲された毛軸の内部部分を含む同心層を含む。ＩＲＳは、末端分化したケラチン生成細胞からなり、毛包の最外層である外部毛根鞘（ＯＲＳ）によって取り囲まれている。
【００５５】
句「単離された毛包ケラチン生成細胞」は、毛包から得られたケラチン生成細胞の集団であって、立毛筋、皮脂腺、及びアポリン汗腺において見出されるような他の毛包細胞の少なくとも一部分を欠く集団を意味する。
【００５６】
一つの実施形態によれば、毛包ケラチン生成細胞の集団は、毛包ケラチン生成細胞の純粋な（少なくとも９０％純粋な）集団である。
【００５７】
毛包ケラチン生成細胞は、いかなる哺乳動物、例えばヒトに由来されることができる。
【００５８】
一つの実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、トリプシンを含むがこれに限定されない分散剤を使用して他の毛包細胞から分離される。機械的な分散も想定される。機械的な分散とトリプシン処理の組み合わせは、単一細胞の懸濁物の生成をもたらしうる。
【００５９】
トリプシン処理は、いかなる公知のプロトコールに従って行われることもでき、例えば、約０．１％のトリプシン及び約０．０２％のＥＤＴＡでのインキュベーションによって行われることができるが、これに限定されない。
【００６０】
上述の通り、単離された毛包ケラチン生成細胞は、毛包ケラチン生成細胞のコロニーの生成を可能にする条件下でフィーダー細胞上で培養される。
【００６１】
従って、例えば、ケラチン生成細胞は、得られるケラチン生成細胞の量に依存して、６ウェルプレートの一つ、二つ、又は三つのウェル中に（フィーダー細胞の層上に）播種されることができる。６ウェルプレートは、当該技術分野で一般的に使用されており、標準的なマイクロプレートの外部寸法を有する。６ウェルプレート中の一つのウェルは、約９．６ｃｍ２の増殖面積、及び約２ｍｌ〜約５ｍｌの作業容積を有する。
【００６２】
ケラチン生成細胞を培養するための想定される増殖培地は、ＤＭＥＭ及び／またはＤＭＥＭＦ１２を含むが、これらに限定されない。培地は、動物血清を含んでもよいし、含まなくてもよい。一つの実施形態によれば、培地は、上皮増殖因子を含む。特定の実施形態によれば、培地は、Ｇｒｅｅｎ培地（６０％のＤＭＥＭ，３０％のＤＭＥＭ  Ｆ−１２、１０％のウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、５μｇのインスリン、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．２ｎＭのアデニン、２ｎＭのトリヨードチロニン（Ｔ３）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）である。
【００６３】
ケラチン生成細胞の増殖を支持するために使用されるフィーダー細胞の特定の例は、増殖条件に依存し、以下のものから選択されることができるが、これらに限定されない：ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１６５８）、Ｊ２又はＪｍａｘ−３Ｔ３細胞（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、２００１参照）、Ｐａ−６細胞（理研生物質源センター細胞バンク、Ｋｏｙａｄａｉ、日本、カタログ番号ＲＣＢ１１２７）、又はＨＦＦ（ＡＴＴＣ  ＳＣＲＣ−１０４１）もしくはＨＤＦのような繊維芽細胞。所望により、細胞は、ゼラチンやコラーゲンなどの細胞非含有マトリックス上で培養されることができる。
【００６４】
特定の実施形態によれば、単離されたケラチン生成細胞は、３Ｔ３フィーダー細胞上で培養される。
【００６５】
使用前にフィーダー細胞を不活性化することは、一般的な慣習である。即ち、例えばフィーダー細胞を、マイトマイシンＣのようなＤＮＡ合成を阻害する化学薬剤にさらして、結果として細胞分裂を防止することによってフィーダー細胞の複製を防止する。特定の実施形態では、単離されたケラチン生成細胞の培養に使用されるフィーダー細胞は、後述の「材料及び方法」の欄に規定されるような不活性化されたＭＥＦフィーダー細胞を含む。
【００６６】
別の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、凍結されていない（即ち、新たに単離される）。
【００６７】
特定の実施形態では、レンチウイルスの感染のために最適なケラチン生成細胞の密度は、６ウェルプレートのウェル当たり約１００００〜６００００個及び２００００〜４００００個、好ましくは３００００個の範囲から選択される細胞密度で（即ち、１ｃｍ２当たり約１０００〜６０００個及び２０００〜４０００個、好ましくは３０００個の範囲から選択される細胞密度で）ケラチン生成細胞を播種することによって得られる。
【００６８】
好ましくは、ケラチン生成細胞は、感染の前に四代より多く継代されていない。
【００６９】
より好ましくは、ケラチン生成細胞は、感染の前に三代より多く継代されていない。
【００７０】
特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、感染の前に二〜三代継代されている。
【００７１】
約２０〜３０個のケラチン生成細胞のコロニーが形成されると、フィーダー細胞から分離される。
【００７２】
これは、当該技術分野で公知のいかなる方法によっても行われることができ、例えば、フィーダー細胞が可視的に分離され、ケラチン生成細胞がなおもプレートに接着しているまで、３７℃で８時間まで、（約０．０１％〜約０．０２％の濃度の）ＥＤＴＡ中で細胞をインキュベートすることを含むが、これに限定されない。
【００７３】
ケラチン生成細胞からｉＰＳ細胞を生成させるために、後述するように脱分化因子がケラチン生成細胞中で発現される。
【００７４】
脱分化因子の例は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
典型的には、四つの脱分化因子が細胞中で発現される。しかし、もし毛包ケラチン生成細胞中への導入後に、形質導入された細胞が、後述するように形質導入経路及び／又はクロマチンを変化させる分子を含む培地中でインキュベートされるなら、脱分化因子の数は、減少されることができる。
【００７６】
一つの実施形態によれば、方法は、Ｏｃｔファミリー又はＳｏｘファミリーに属する少なくとも一つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。
【００７７】
別の実施形態によれば、方法は、一つがＯｃｔファミリーに属し、もう一つがＳｏｘファミリーに属する少なくとも二つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。
【００７８】
Ｏｃｔファミリーに属するポリペプチドの例は、Ｏｃｔ３／４（ＮＭ＿０１３６３３、マウス及びＮＭ＿００２７０１、ヒト）、Ｏｃｔ１Ａ（ＮＭ＿１９８９３４、マウス及びＮＭ＿００２６９７、ヒト）、Ｏｃｔ６（ＮＭ＿０１１１４１、マウス及びＮＭ＿００２６９９、ヒト）を含む。Ｏｃｔ３／４は、ＰＯＵファミリーに属する転写因子であり、未分化細胞のマーカーとして報告されている（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ６０：４６１−７２，１９９０）。また、Ｏｃｔ３／４は、多能性の維持に関与することも報告されている（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ  ９５：３７９−９１，１９９８）。
【００７９】
Ｓｏｘ（ＳＲＹ−ボックス含有）ファミリーに属するポリペプチドの例は、Ｓｏｘ１（ＮＭ＿００９２３３、マウス及びＮＭ＿００５９８６、ヒト）、Ｓｏｘ３（ＮＭ＿００９２３７、マウス及びＮＭ＿００５６３４、ヒト）、Ｓｏｘ７（ＮＭ＿０１１４４６、マウス及びＮＭ＿０３１４３９、ヒト）、Ｓｏｘ１５（ＮＭ＿００９２３５、マウス及びＮＭ＿００６９４２、ヒト）、Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０１１４４１、マウス及びＮＭ＿０２２４５４、ヒト）及びＳｏｘ１８（ＮＭ＿００９２３６、マウス及びＮＭ＿０１８４１９、ヒト）を含み、好ましい例は、Ｓｏｘ２（ＮＭ＿０１１４４３、マウス及びＮＭ＿００３１０６、ヒト）を含む。
【００８０】
なお別の実施形態によれば、方法は、Ｏｃｔファミリーに属する一つのポリペプチド、Ｓｏｘファミリーに属する一つのポリペプチド、Ｎａｎｏｇ、及びｌｉｎ２８の四つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。
【００８１】
代替的に、方法は、Ｏｃｔファミリーに属する一つのポリペプチド、Ｓｏｘファミリーに属する一つのポリペプチド、Ｋｌｆ−４、及びｃ−Ｍｙｃの四つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。
【００８２】
本明細書中で上述した脱分化因子をケラチン生成細胞中で発現させることは、遺伝子操作によって行われることができ、例えば、発現コンストラクトを使用して行われることができる。本発明の発現ベクターを毛包ケラチン生成細胞中に導入するために、様々な方法を使用することができる。かかる方法は、例えば以下の文献に一般的に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（１９８９，１９９２，２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ら、編（１９９４，１９８９）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｌ．，編（１９９５）．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｖｅｇａ，Ｍ．Ａ．（１９９５）．Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｈ．（１９８７）．Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ；及びＧｉｌｂｏａ，Ｅ．ら（１９８６）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｔｒｏ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６），５０４−５１２。かかる方法は、例えば、安定な又は一過的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組換えウイルスベクターでの感染を含む。これらに加えて、陽性−陰性選択方法について、米国特許第５４６４７６４号及び第５４８７９９２号が参照される。
【００８３】
典型的には、核酸分子は、核酸配列の発現を駆動することができるプロモーターをさらに含む。かかるプロモーターは、延長因子１（Ｅｆ１）αプロモーターやサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの構成的に活性なプロモーター、又はポリシストロン的に編成されているので、全ての転写因子遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターである。
【００８４】
ウイルス感染によるケラチン生成細胞中への本発明の発現コンストラクトの導入は、リポフェクションやエレクトロポレーションなどの他の方法と比較して、形質転換及び増殖の効率の高さの点でいくつかの利点を提供する。特定の実施形態によれば、上述の脱分化因子をケラチン生成細胞中で発現させることは、（例えば、レンチウイルスを使用した）レトロウイルス形質導入によって行われる。ケラチン生成細胞を感染させるための想定されるカセットは、配列番号１に規定されている。他の想定されるウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含む。
【００８５】
特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞を感染させるためのカセットは、ＬＯＸＰ部位を含み、これにより、ｉＰＳ細胞の生成後の導入遺伝子の除去が、後述のようにｃｒｅリコンビナーゼ酵素と共にインキュベートすることによって行われることができる。除去可能な核酸分子は、当該技術分野で公知のいかなる他の除去可能なベクターであることもできる。
【００８６】
ウイルス組込みなしにｉＰＳ細胞を導入する他の方法も想定される。例えば、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、２００８、［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，９４５−９４９］及びＯｋｉｔａら、２００８、［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，９４９−９５３］を参照のこと。
【００８７】
特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、再プログラミングに必要な脱分化因子をコードする遺伝子を含むポリシストロン性核酸分子を含むレンチウイルスで感染される。好ましくは、ケラチン生成細胞の再プログラミングのために必要な全ての転写因子をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む単一のポリシストロン性レンチウイルスベクターが使用される。
【００８８】
好ましくは、感染工程は、ケラチン生成細胞及びウイルスを含む培養皿の（例えば、約２００〜１０００ｇの遠心力での）遠心分離中に行われる。一つの実施形態によれば、遠心分離工程（即ち、ケラチン生成細胞がウイルスと接触させられる時間）は、２時間以下であり、好ましくは１時間以下である。この実施形態による感染の想定される温度は、約２５℃〜３７℃である。
【００８９】
特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、約３２℃の温度で、約５００ｇの遠心力で、約５０分間の遠心分離を含む条件下での遠心分離中にレンチウイルスと接触させられる。
【００９０】
感染段階の直後に、培地は、（ウイルスを含まない）新鮮な培地及び新鮮なフィーダー細胞に交換される。典型的には、感染前に繊維芽細胞を培養するために使用された培地と同じ培地及びフィーダー細胞がこの段階で使用されるが、他の培地も想定される。従って、例えば、感染された毛包ケラチン生成細胞は、Ｇｒｅｅｎ培地及び３Ｔ３フィーダー細胞中で約４〜７日間培養されることができる。
【００９１】
本発明は、一回以上（例えば、二回又は三回）の感染を想定し、各回において感染の前にフィーダー細胞を除去して、感染後に交換する。
【００９２】
最後の感染後、培養条件は、多能性幹細胞の培養に適合されることができる。これは、有利である。なぜなら、繊維芽細胞とは異なり、ヒトの毛包細胞は、ｈＥＳ細胞条件では増殖することができないからである。従って、出現するｉＰＳ細胞は全て、極めて容易に観察され、単離され、さらに拡大されることができる真の安定なｉＰＳ細胞である。従って、例えば、培地は、胚性幹細胞培地（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９８）に交換されることができ、３Ｔ３フィーダー細胞は、マウスの胚性繊維芽（ＭＥＦ）フィーダー細胞に交換されることができる。好ましくは、ケラチン生成細胞は、感染の３〜６日後に、多能性幹細胞条件に移されるべきである。多能性幹細胞培地中での培養は、ｉＰＳ細胞のコロニーが観察されるまでの時間（例えば、１４〜２１日間）、行われることができる。
【００９３】
上述の通り、再プログラミングの効率、及び／又は効率的な再プログラミングのためにケラチン生成細胞中で発現されることが必要である脱分化因子の数は、例えばクロマチン修飾又はシグナル伝達経路を調節することによって減少されることができる（Ｆｅｎｇら、２００９）。従って、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ又はＭＥＫ）阻害剤とＧＳＫ−３阻害剤の組み合わせ；及びＬ型カルシウムチャンネルアゴニストが、（例えば、最終感染の二日後に）胚性幹細胞培地に添加されることができる。
【００９４】
一つの実施形態によれば、これらの薬剤は、多能性幹細胞培地中に、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間添加される。
【００９５】
特に、ヒストンメチルトランスフェラーゼは、ＢＩＸ−０１２９４，ＲＧ１０８及びＡＺＡからなる群から選択される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＶＰＡ，ＴＳＡ及びＳＡＨＡからなる群から選択される。ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であることができる。ＴＧＦ−β阻害剤は、Ａ−８３−０１であることができる。Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニストは、ＢａｙＫ８６４４であることができる。
【００９６】
本発明によれば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤及び／又はリジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、三つの転写因子のみの導入でケラチン生成細胞を再プログラミングすることを可能にすることが見出されている。
【００９７】
上述のことに鑑み、特定の実施形態では、ヌクレオチド配列によってコードされる転写因子の数は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤及び／又はリジン特異的なデメチラーゼ阻害剤などの小分子の存在下で感染されたケラチン生成細胞を培養することによって、４個未満、即ち１，２又は３個まで減少される。
【００９８】
特定の実施形態では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、パルネート（トラニルシプロミン）である。
【００９９】
特定の実施形態では、核酸配列は、ＯＣＴ４，ＳＯＸ２及びＫＬＦ４から選択される三つの転写因子をコードし、特に、核酸配列は、配列番号２に規定される核酸配列を有するカセットから転写される。
【０１００】
他の実施形態では、核酸配列は、ＯＣＴ４及びＳＯＸから選択される二つの転写因子をコードする。
【０１０１】
増殖因子は、胚性幹細胞培地ｂＦＧＦに添加されることができる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎ．Ｙ，米国；８ｎｇ／ｍｌ）。
【０１０２】
上述の通り、ケラチン生成細胞を感染させるためのカセットは、ＬＯＸＰ部位を含み、これにより、ｉＰＳ細胞の生成後の導入遺伝子の除去が、ｃｒｅリコンビナーゼ酵素と共にインキュベートすることによって行われることができる。かかるカセットを除去する方法は、Ｓｏｌｄｎｅｒら、２００９；Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら、２００８によって与えられる。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明は、上述の本発明の方法によって得られる誘導多能性幹細胞を提供する。本明細書で使用される用語「誘導多能性幹細胞」は、Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｒｅｘ１（亜鉛フィンガータンパク質４２（ＺＦＰ４２）としても知られる）、ＴＲＡ１−６０（腫瘍拒絶抗原１−６０）、ＴＲＡ１−８１（腫瘍拒絶抗原１−８１）、及びＳＳＥＡ４（段階特異的な胚抗原４）を含むがこれらに限定されないｈＥＳ細胞の表現型に関連した多能性マーカーを発現し、インビトロ及びインピボで三つの胚葉の全てに分化することができ、多くの継代にわたって培養中で増殖することができ、正常な核型を維持することができる細胞を意味する。
【０１０４】
以下の実施例４に示されるように、四つの選択されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンは、源のＨＦＫＴ及び多能性ｈＥＳ細胞と比較して、ケラチン生成細胞マーカー及び多能性マーカーの発現について十分に特徴付けられていた。本発明者らは、ｈＥＳ細胞と比較してＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞中では、Ｋ１４やＰ６３などのケラチン生成細胞マーカーがなお高度に発現されていることを見出した。このことは、以前に記載されたように「後成記憶」の保持を示唆する（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら、２００９；Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、２００９）。しかし、分析された全ての多能性マーカーは、ｈＥＳ細胞及びＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞において陽性であり、同様に発現されており、このことは、真の多能性ｉＰＳ細胞クローンが生成されたことを示す。特に、ｉＰＳ細胞クローンは、Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｒｅｘ１，ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１のような典型的なｈＥＳ細胞マーカーを発現することが見出された。
【０１０５】
どの遺伝子が細胞中で特異的に発現されているのかを決定するために、マイクロアレイ分析が本発明のこの側面のｉＰＳ細胞に対して行われることができる。この方法を使用して、ヒト毛包ケラチン生成細胞から生成されたｉＰＳ細胞は、他の多能性幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び皮膚から生成されたｉＰＳ細胞と比較されることができる。２倍以上アップレギュレーション又はダウンレギュレーションされている遺伝子は、有意に変化されたとみなすことができる。結果の確認は、例えばＲＴ−ＰＣＲ分析及び免疫染色を含む当該技術分野で公知のいかなる方法を使用して行うことができる。
【０１０６】
従って、ある実施態様では、本発明の誘導多能性幹細胞は、Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｒｅｘ１，ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１のような典型的なｈＥＳ細胞マーカーの発現によって特徴付けられることができる。
【０１０７】
構成的に活性なプロモーターを有するレンチウイルスベクターが再プログラミングのために使用されたので、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞における導入遺伝子の発現レベルは、対応するｈＥＳ細胞と比較して高いと予想された。興味深いことに、一つのクローン（ＫＴＮ７）におけるＫｌｆ４の高発現を除くと、調査された全てのクローンにおける再プログラミング因子の転写レベルは、ｈＥＳ細胞中で見出されるレベルと同様であった。以下の実施例で示される結果は、外来導入遺伝子のサイレンシングが、ヒトＳＴＥＭＣＣＡベクターによって生成されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン中で実際に生じることを示す。外来導入遺伝子は、ｉＰＳ細胞の継代中にさらにサイレンシングされた。これらのデータは、ヒトｉＰＳ細胞は、培養時にｈＥＳ細胞の遺伝子発現プロフィールと近くなる遺伝子発現プロフィールを採用していることを示す。
【０１０８】
本発明のＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞は、インビボ及びインビトロで三つの胚葉に自発的にさらに分化することができる。ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンの分化能力は、心筋細胞（ＣＭ）に特異的に分化するそれらの能力によって実施例５においてさらに示され、それらの分子的及び機能的特性について特性決定された。多数の筋フィラメントタンパク質の陽性免疫染色は、肉腫様構造の予備的な組織化が、他の細胞源からのｈＥＳ細胞由来のＣＭ及びｉＰＳ細胞由来のＣＭ（Ｇｅｒｍａｎｇｕｚら、２００９；Ｚｈａｎｇら、２００９）と同様にＨＦＫＴ  ｉＰＳ細胞−ＣＭでも発展しうることを示唆した。ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭの機能性についての証拠は、多電極アレイ（ＭＥＡ）データ取得システムによって記録される堅固な細胞外エレクトログラムによって、及び全細胞電流クランプによって記録される活動電位によって与えられた。さらに、ＣＭに典型的な興奮−収縮カップリング、及びβ−アドレナリン作用性刺激への応答は、細胞の［Ｃａ２＋］ｉ過渡現象及び収縮を測定することによって示された。従って、本発明者らは、機能的なＣＭに分化するＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の能力、及び治療及び研究目的のための細胞の代替的な源として役立つためのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の能力を初めて証明した。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明の誘導多能性幹細胞は、三つの胚葉の全ての誘導体を含む胚様体又は奇形腫に分化することができる。胚様体は、様々な細胞タイプに分化し、制限された範囲まで胚発生を反復する幹細胞の集合体である。奇形腫は、独立した胚細胞の発生によって生じた皮膚、毛髪、及び筋肉などの様々なタイプの組織からなる腫瘍である。
【０１１０】
本明細書中で使用される句「三つの胚葉の全ての誘導体」は、三つの胚葉（即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）のいずれかに由来する（即ち、発生した）、分化中の又は分化した細胞を意味する。
【０１１１】
本発明によれば、誘導多能性幹細胞は、機能的な心筋細胞、神経組織、内皮、上皮、脂肪細胞、又は筋肉組織、及び他の系譜特異的な細胞に分化できることが見出された。本発明は、かかる系譜特異的な細胞の生成について当該技術分野で公知のいかなるエクスビボ分化プロトコールの使用をも想定するということは理解されるだろう。
【０１１２】
特定の実施形態では、本発明の誘導多能性幹細胞から由来する胚様体は、機能的な心筋細胞、神経組織、内皮、上皮、脂肪細胞、筋肉組織（骨格筋、平滑筋、及び心筋を含む）、内皮先祖細胞、間葉先祖細胞、骨、軟骨、腱、及び靭帯組織、特に細胞外マトリックス生産細胞に分化できる。
【０１１３】
従って、本発明の方法は、上記のことに鑑み、組織再生、遺伝子治療、細胞治療、医薬スクリーニング、及び疾患モデリングのために使用されることができる幹細胞を提供する。例えば、細胞は、移植用の器官及び組織の生成のために使用されることができ、糖尿病、パーキンソン病のような神経変性疾患、肝臓病、心臓病、整形疾患、及び自己免疫疾患についての見込みのある代替治療を提供する。代替的に、細胞は、遺伝子置換治療を必要とする組織に機能的な遺伝子を提供するために使用されることができる。
【０１１４】
一つの側面において、本発明は、医薬的に許容可能なキャリアと、本明細書中に規定される方法によって生成される誘導多能性幹細胞とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
上述のように、本発明の誘導多能性幹細胞は、いかなる損傷した組織をも再生するために使用されることができる。特に、本発明は、本明細書中に規定される方法によって生成される誘導多能性幹細胞を機能的な心筋細胞に分化させ、それにより機能的な心筋細胞を得ることを含む、機能的な心筋細胞の生成方法；及び本発明の方法に従って得られた機能的な心筋細胞を損傷された組織と置換し、機能的な心筋細胞が機能的な心臓組織を形成し、それにより損傷された心臓組織を修復することを含む、損傷された心臓組織を修復する方法に向けられている。
【０１１６】
例えば、方法は、損傷された組織の領域中への直接注入、又は全身注入によって心筋細胞を再増大させ、細胞に心臓組織を形成させるために使用されることができる。
【０１１７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１１８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１１９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１２０】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１２１】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１２２】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１２４】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１２５】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１２６】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１２７】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１２８】
材料及び方法
引き抜かれた毛包からのケラチン生成細胞の誘導
ヒトの引き抜かれた毛髪は、Ｒａｍｂａｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈａｉｆａ，イスラエルでのヒト対象に対する実験についてのヘルシンキ委員会による許可３６１１に従って、同意書にサインした健康な志願者から得られた。毛包ケラチン生成細胞（ＨＦＫＴ）は、以前に記載された（Ｌｉｍａｔら、１９８６）ようにして、ただし微細な改変を加えて、誘導された。目に見える外部毛根鞘を有する１０本の毛髪が、頭皮から引き抜かれた。毛髪の束は、切断され、毛包は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＬ−グルタミン酸、及び４００Ｕ／ｍｌのペニシリン、４００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＰＳ）を含むＤＭＥＭ培地で１０ｃｍペトリ皿中で３７℃で４〜１８時間浸漬された。毛包は、ＰＢＳで洗浄され、０．１％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡ（ＰＢＳで希釈された）で被覆され、３７℃で３０分間インキュベートされた。単一細胞懸濁培養物は、１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭと共に毛包を激しくピペットで攪拌することによって得られた。解離されたケラチン生成細胞は、２００ｇで１０分間遠心分離され、Ｇｒｅｅｎ培地（６０％のＤＭＥＭ、３０％のＤＭＥＭ  Ｆ−１２、１０％のウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、５μｇのインスリン、０．５μｍ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．２ｎＭのアデニン、２ｎＭのトリヨードチロニン（Ｔ３）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）と共に、不活性化された３Ｔ３フィーダー層（２×１０４個の３Ｔ３細胞／ｃｍ２）上の６ウェルプレートの三つのウェルに播種された。分割のため、３Ｔ３細胞は、０．０２％のＥＤＴＡと共に３７℃で５分間インキュベートした後に除去された。培養物は、ＰＢＳで洗浄され、次に、分離されたケラチン生成細胞は、ＰＢＳ中の０．１％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡと共に３７℃で１０〜１５分間インキュベートすることによって単一細胞に解離された。
【０１２９】
細胞：
ヒトの包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）は、ＡＴＣＣ（ＰＣＳ−２０１−０１０）から得られた。２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ−１１２６８）、Ｈ９．２ｈＥＳ細胞が使用された（Ａｍｉｔら、２０００；Ａｍｉｔら、２００２）。繊維芽細胞（ＨＤＦ）及びＨＦＫＴは、二人の健康な個人から、皮膚打ち抜き生検及び引き抜かれた毛髪からそれぞれ得られた。
【０１３０】
ベクター：
ＨＦＦ感染用ベクター：ゼオマイシン抵抗性−ＰＢａｂｅ−ｅｃｏ（ＡｄｄＧｅｎｅ  ＩＤ：１０６８７）及びＰＭＸ  ＯＣＴ４／Ｓｏｘ２／ＫＬＦ４／ｃ−Ｍｙｃ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  １７２１７，１７２１８，１７２１９，１７２２０）。ＨＦＫＴ及びＨＤＦ感染用ベクター：１）ＰＭＸ  ＯＣＴ４／Ｓｏｘ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭｙｃとｐＵＭＶＣ及びｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ（ＡｄｄＧｅｎｅ  ＩＤ８４４９及び８４５４）；２）ｐＭＳＣＶ／Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４／ｃ−Ｍｙｃ（げっ歯類の幹細胞ウイルス、Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：２００７２，２００７３，２００７４，２００７６）；３）ＳＴＥＭＣＣＡカセット（配列番号１）を有するヒト単一ポリシストロニックレンチウイルスベクター。レンチウイルスは、以前に記述された（Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙら、２００６）ようにして、２９３Ｔパッケージング細胞中の五つのプラスミドトランスフェクション系を使用して生産された。
【０１３１】
ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）からのｉＰＳ細胞の生成：
ＨＦＦ細胞は、ｐＢａｂｅ−Ｅｃｏプラスミドで感染され、７日後に、４００ｎｇ／ｍｌのゾエシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択された。ｉＰＳ細胞の生成のため、フェニックスＥｃｏ細胞は、以下の四種類のレトロウイルスベクターのうちの一つでトランスフェクトされた：ｐＭＸ−Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４／ｃ−Ｍｙｃ。トランスフェクションの２日後、１０００００個のＨＦＦ−ｅｃｏ細胞は、以前に記述された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７）ようにして感染された。感染の２日後、ＨＦＦ−ｅｃｏ細胞は、様々な希釈度で分割され、ＭＥＦフィーダー層又はフィブロネクチンで被覆されたプレート上で培養された。感染の５日後、培地は、ｈＥＳ細胞培地又はＭＥＦならし培地で置換された。感染の約１４日後、小さなＥＳ細胞に似たコロニーが出現した。これらのコロニーは、後で機械的に単離され、さらなる分析のためにｈＥＳ細胞条件でＭＥＦ上で培養された。
【０１３２】
再プログラミング効率アッセイは、他のところで記述された（Ｌｏｗｒｙら、２００８）ようにしてＴｒａ１−６０の生体染色を使用して行われた。
【０１３３】
ヒトの皮膚繊維芽（ＨＤＦ）細胞からのｉＰＳ細胞の生成：
ＨＤＦ細胞は、以前に記述された（Ｐａｒｋら、２００８）ようにして由来された。細胞は、以下の４種類の因子Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを含むＳＴＥＭＣＣＡカセットを有するレンチウイルスベクターで、又は山中の再プログラミング遺伝子セット（Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ）を発現する四つの別個のレトロウイルスｐＭＸベクターで感染された。ｉＰＳ細胞の生成のため、ＳＴＥＭＣＣＡベクターは、ＨＦＫＴ由来のｉＰＳ細胞について上述されたようにして２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされた。ｐＭＸベクターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞中にトランスフェクトされ、７００００個のＨＤＦ細胞が、ＨＦＦ細胞について上述したようにして感染された。
【０１３４】
ＨＦＫＴからのｉＰＳ細胞の生成：
１日目に、３００００個のＨＦＫＴは、６ウェルプレートの一つのウェル中にＧｒｅｅｎ培地を補充された不活性化３Ｔ３フィーダー層（２００００個の細胞／ｃｍ２）上に播種された（Ｌｉｍａｔ及びＮｏｓｅｒ、１９８６）。２日目に、ウイルスは以下のようにして生産された：ヒト化されたタイプの単一レンチウイルスベクターＳＴＥＭＣＣＡカセット（配列番号１）は、五つのプラスミド：ＳＴＥＭ−ＣＣＡ，Ｇａｇ−Ｐｏｌ，ＲＥＶ，ＴＡＴ，ＶＳＶＧを、２０：１：１：１：２の割合で使用して２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって生成された（Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙら、２００６）。プラスミドの全量は１５μｇ  ＤＮＡであった。トランスフェクションは、ｊｅｔＰＥＩ（商標）試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクション（商標）、フランス）によって行われた。ｐＭＳＣＶレトロウイルスは、ｊｅｔＰＥＩ（商標）試薬を使用してベクターでトランスフェクトされたＰｈｅｏｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞において生成された。四つの導入遺伝子の全てからのウイルスを含む培地上澄みが回収され、１：１：１：１（ｐＭＳＣＶ／Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４／ｃ−Ｍｙｃ）の比で混合された。レトルウイルスベクターｐＭＸ−Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４／ｃ−Ｍｙｃは、以前に記述された（Ｐａｒｋら、２００８）ようにして生成された。培地はトランスフェクションの２４時間後（３日目）に、新鮮なものと置換された。トランスフェクションの４８時間後（４日目）、蓄積されたウイルス粒子は、０．４５μｍフィルターを通して濾過され、２μｇ／ｍｌのポリブレンを添加され、ＨＦＫＴの感染のために使用された。感染の直後に、３Ｔ３フィーダー細胞は、０．０２％のＥＤＴＡを使用して除去された。感染は、５００ｇで３２℃で５０分間の遠心分離中に行われた。その後、培地は、新鮮なＧｒｅｅｎ培地と置換され、新鮮な不活性化３Ｔ３フィーダー細胞が添加された。感染は、翌日（５日目）も繰り返された。感染の５日後（８日目）、感染されたケラチン生成細胞は、ＰＢＳ中の０．１％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，イスラエル）によって３７℃で１０分間分離され、２００ｇで１０分間遠心分離され、６ウェルプレートの六つのウェル中に、Ｇｒｅｅｎ培地と共に、不活性化マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上に播種された。翌日、培地は、８ｍｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎ．Ｙ，米国）を含むｈＥＳ細胞培地（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）で置換された。培地は２日目ごとに置換された。最終的に、感染されたケラチン生成細胞の播種の２１〜２５日後に、ｈＥＳ細胞様コロニーが出現し、さらに拡大されて分析されることができた。
【０１３５】
ｉＰＳ細胞の分化：
ｉＰＳ細胞のＥＢへの分化は、以前に記述された（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒら、２０００）ようにして行われた。簡単に述べると、ヒトのｉＰＳ細胞は、０．２％のＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ，米国）によって分離され、それらの凝集を可能にするために懸濁された。生じたＥＢは、８０％のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，米国）、２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ，イギリス）、１ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、及び１％の非必須アミノ酸（両方ともＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，米国）中で増殖された。自発的な分化のため、ＥＢは、懸濁液中で１４日間培養され、次に、ＤＮａｓｅを補充されたＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を使用して３７℃で１０分間解離された。解離したＥＢは、０．１％のゼラチンで被覆されたカバーガラス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）上でさらに７日間培養され、次に免疫染色アッセイが行われた。心臓への分化のためには、ＥＢは、懸濁液中で７日間培養され、次に、０．１％のゼラチンで被覆されたプレート上で培養され、その間に自発的に収縮するＥＢが観察された。心臓への分化の効率を評価するために、培養されたＥＢは、顕微鏡で監視され、培養の２〜３週間後に、培養されたＥＢの総数に対する収縮しているＥＢの数が計数された。奇形腫の生成のためには、２ｘ１０６個のｉＰＳ細胞は、レシピエントＳＣＩＤマウスの横腹中に注入された。腫瘍は、組織学的分析のために６〜８週間後に単離され、４％のパラホルムアルデヒド中で固定され、パラフィン中に埋入され、断片化された。パラフィン断片は、キシロール／キシレンによって脱パラフィン化され、次にプロパノールで再水和され、蒸留水で洗浄された。断片は、標準プロトコールに従ってヘマトキシリン及びエオシンで染色された。
【０１３６】
ＲＮＡ分析：
ＲＮＡは、Ａｕｒｕｍ（商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，米国）を使用して単離され、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって、製造者の指示に従って逆転写された。ＰＣＲは、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ）によって行われた。定量的リアルタイム（ＱＲＴ）ＰＣＲ分析は、三連で行われ、内部内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子発現によって正規化された。反応は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，イギリス）を使用してＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行われた。分析は、配列検出ソフトウェア（Ｖ．１．２；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において相対的定量化（ＲＱ）研究を使用して行われた。ＲＮＡ分析のために使用されたプライマーは、表１に示される。
【０１３７】
2013535966.tif 000002
【０１３８】
タンパク質分析：
免疫蛍光：
細胞は、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定され、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）中に浸漬され、次に、ＰＢＳ中で１０分間希釈された。一次抗体は、１％のＴｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中で希釈され、４℃で一晩、又は室温で１時間インキュベートされた。使用された抗体は、表２に示される。
【０１３９】
ロバ抗ウサギＣｙｅ  ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びロバ抗マウス／ヤギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）コンジュゲート化抗体は、二次抗体として使用された（１：１００）。細胞は、核染色のためにＤＡＰＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）でも染色され（１：１０００）、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００蛍光顕微鏡で、又はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａレーザー走査共焦点システム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，ドイツ）で検査された。
【０１４０】
2013535966.tif 000003
【０１４１】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析：
ｉＰＳ細胞及びｈＥＳ細胞は、０．２％のＩＶコラゲナーゼを使用して分離され、０．２５％のトリプシン及び０．０５％のＥＤＴＡを使用して単一細胞に解離された。ＨＦＫＴは、（０．０２％のＥＤＴＡでの３Ｔ３フィーダー細胞の除去後に）ＰＢＳ中の０．１％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡを使用して分離された。細胞は、４％のパラホルムアルデヒドを使用して１５分間固定された。細胞は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，米国）を使用してＦＡＣＳｃａｎシステムでフローサイトメトリーによって監視された。ＦＡＣＳのために使用された抗体は、表３に示される。
【０１４２】
［Ｃａ＋２］ｉ過渡現象及び収縮の測定：
［Ｃａ＋２］ｉ過渡現象及び収縮は、以前に記述された（Ｄｏｌｎｉｋｏｖら、２００６；Ｓｅｄａｎら、２００８）ようにして、それぞれｆｕｒａ−２蛍光（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，米国）及びビデオエッジ検出器を使用して、ＥＢの小さな解離した収縮領域において測定された。
【０１４３】
微小電極アレイ（ＭＥＡ）記録：
単極エレクトログラムは、以前に記述された（Ｍｅｉｒｙら、２００１；Ｒｅｉｓｎｅｒら、２００９）ようにして、微小電極アレイ（ＭＥＡ）（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，ドイツ）上に配置されたＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞（ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭ）から記録された。
【０１４４】
2013535966.tif 000004
＊  Ｋ−１４の細胞染色のために、細胞は、１％のサポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に１０分間浸漬された。細胞は、１％のサポニン及び０．５％のＢＳＡ（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳに希釈された抗Ｋ−１４で染色された。
ロバ抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）コンジュゲート化抗体は、Ｋ−１４染色のために０．５％のＢＳＡ又は１％のサポニンを含むＰＢＳ中に希釈されて（１：１００）、二次抗体として使用された。
【０１４５】
全細胞電流クランプ記録：電流クランプ研究のためにＨＦＫＴ−ｉＰＳＣ−ＣＭの解離の後に生成した自発的に打ち砕かれた小細胞クラスター又は単離された細胞は、フィブロネクチンで被覆されたカバーガラスの上で培養されて研究された。パッチピペット溶液は、１２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＥＧＴＡからなっていた（ｐＨ７．３）。浴溶液は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコースからなっていた（ｐＨ７．４）。（全ての材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国から購入された）。活動電位は、電流クランプモードを使用して記録された。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ，Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２２、及びｐＣｌａｍｐ１０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，米国）が、データの増幅、取得、及び分析のために使用された。
【０１４６】
短いタンデム繰り返しの分析及び核型分析：
短いタンデム繰り返し（ＳＴＲ）の分析は、様々な染色体から得られた配列を使用して行われ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０遺伝子分析器によって、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，イギリス）の指示に従って分析された。ＳＴＲプライマーは、表４に示されている。核型分析は、以前に記述された（Ａｍｉｔら、２００３）ようにして行われた。
【０１４７】
2013535966.tif 000005
【０１４８】
実施例１
引き抜かれた毛髪のＯＲＳからのケラチン生成細胞の導出及びそれらの特性決定
毛髪からｉＰＳ細胞を生成させるため、本発明者らは、引き抜かれた毛包からのｉＰＳ細胞の生成についてのＡａｓｅｎらのプロトコール（Ａａｓｅｎら、２００８）に従った。引き抜かれた毛髪は、ＭＥＦ−ならし培地を補充されたＭａｔｒｉｇｅｌ被覆皿上で少なくとも５日間、細胞が外部毛根鞘（ＯＲＳ）の外側に増殖するまで培養されたが、生存しかつ増殖している細胞は不十分な数しか単離できなかった。本発明者らは、毛髪を引き抜き、目に見える毛球及び無傷のＯＲＳ（図１Ａ）を有する少なくとも１０本の単一の毛髪を選択し、次に、それらを、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミンを補充されたＤＭＥＭと共に２４時間インキュベートし、次に、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して酵素的にＯＲＳから細胞を除去することによって、ケラチン生成細胞の単一細胞懸濁物を得た（図１Ｂ）。これらの単離されたケラチン生成細胞は、不活性化３Ｔ３フィーダー細胞上に播種され（図１Ｃ，Ｄ）、四代の継代数までさらに培養されることができた（Ｌｉｍａｔ及びＮｏｓｅｒ、１９８６）。
【０１４９】
それらの身元を証明するため、毛包由来の細胞は、ケラチン生成細胞マーカーＫ１４及びＰ６３について分析された。分析は、ＨａＣａｔ細胞（ヒトのケラチン生成細胞系）及びｈＥＳ細胞と比較したＱＲＴ−ＰＣＲによって行われた。結果は、ＨａＣａｔケラチン生成細胞におけるＫ１４及びＰ６３転写物の発現レベルと同様のＫ１４及びＰ６３転写物の高い発現レベルを示した。対照的に、両転写物は、ｈＥＳ細胞中では、ほとんど発現されなかった（図１Ｅ）。次に、再プログラミング因子の発現レベルが調査された。Ｋｌｆ１４の発現は、ｈＥＳ細胞中よりＨＦＫＴ及びＨａＣａｔ細胞中の方が１０倍高かった。一方、ｃ−Ｍｙｃは、三つの細胞タイプの全てにおいて同様に発現された。Ｏｃｔ４は、ＨＦＫＴ中では発現されず、Ｓｏｘは、ｈＥＳ細胞と比較してわずかに高く発現された（図１Ｆ）。
【０１５０】
実施例２
再プログラミング手順の最適化
効率的なＨＦＫＴ再プログラミングプロトコールを開発するため、本発明者らは、様々なウイルスベクター及び増殖条件を使用して、ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）及びヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）などの一般的な標的細胞の再プログラミングを最適化した。分析されたウイルスベクターは、四つ（Ｋｌｆ４，Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２及びｃ−Ｍｙｃ）又は三つ（Ｋｌｆ４，Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２）の再プログラミング因子を有するｐＭＸレトロウイルスベクター（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｎａｋａｇａｗａら、２００８）、Ａａｓｅｎら（Ａａｓｅｎら、２００８）によって改変されたｐＭＳＣＶレトロウイルスベクターセット、及び単一レンチウイルスＳＴＥＭＣＣＡベクターのヒト化バージョン（配列番号１）であった。
【０１５１】
2013535966.tif 000006
【０１５２】
ＨＦＦ細胞は、ＨＦＦ−Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃレセプター（ＨＦＦ−Ｅｃｏ）安定系の確立後に最も効率的に再プログラミングされた。再プログラミングのために、これらの細胞は、四つ又は三つの再プログラミング因子を有するｐＭＸレトロウイルスベクターでさらに感染された。感染後、様々な増殖条件が調査された（表５）。感染後に細胞を低密度で培養することが、非ｉＰＳ細胞の過剰増殖（これは、真のｉＰＳ細胞のコロニーをしばしば被覆してしまう）を回避するために重要であることが見出された。さらに、再プログラミング効率は、ｈＥＳ細胞培地を補充されたＭＥＦフィーダー層上で培養された細胞と比較して、フィーダー非含有条件で細胞を培養することによって１０〜５０倍も増大された。ＨＦＦ再プログラミング効率は、以前に記述された（Ｎａｋａｇａｗａら、２００８；Ｓｏｌｄｎｅｒら、２００９）ように、三つの因子のみが導入されたときに有意に減少したが、細胞がＭＥＦフィーダー層上ではなくフィーダー非含有条件で培養されたときに１０倍増大した（表５−ＨＦＦ）。
【０１５３】
三つの異なるウイルスベクターは、以前に記述された（Ｈｕａｎｇｆｕら、２００８ｂ）ように好適なパッケージングベクターを使用してＨＤＦ及びＨＦＫＴの再プログラミングについて調査された。ＨＤＦ及びＨＦＫＴの両方の細胞タイプがＳＴＥＭＣＣＡベクターで効率的に再プログラミングされたが、ｐＭＸ又はｐＭＳＣＶベクターセットを使用すると、ｉＰＳ細胞のコロニーは生成されなかったことが見出された（表５）。単離直後に感染された新鮮な細胞は、凍結されていた細胞よりずっと効率的に再プログラミングされることが見出された。フィーダー非含有条件でＨＤＦ及びＨＦＫＴをインキュベートすると、ＨＦＦ細胞とは異なり、再プログラミング効率は改善されなかった。このことは、効率的な再プログラミングプロトコールは、細胞タイプごとに専用に最適化されるべきであるということを示す。
【０１５４】
感染後の細胞密度は、繊維芽細胞についてのみ重要である。なぜなら、過度に密集した培養物は、迅速に増殖する非ｉＰＳ細胞の過剰増殖に導き、これらが真のｉＰＳ細胞のコロニーを被覆してしまうからである。しかし、ＨＦＫＴは、極めて感受性の細胞であり、ｈＥＳ細胞条件では増殖しないので、非ｉＰＳ細胞の増殖は再プログラミング培養では生じない。むしろ、真のｉＰＳ細胞のみが、ＳＴＥＭＣＣＡベクターでの再プログラミング後に出現する。この観察は、再プログラミングのための細胞源としてのＨＦＫＴの有意な利点を示す。
【０１５５】
以下の条件がＨＦＫＴのｉＰＳ細胞への再プログラミング効率を改善することが見出された（表６）。
１．ＨＦＫＴを感染後、Ｇｒｅｅｎ培地中で４〜７日間培養し、次にそれをＭＥＦフィーダー層及びｈＥＳ細胞条件に移す。ＭＥＦ＋ｈＥＳ細胞条件でのＨＦＫＴの培養は、それらの増殖を大きく阻害する。感染された細胞をそれらの最適培地（Ｇｒｅｅｎ培地）中で数日間増殖させることにより、それらの感染後増殖が促進されることが見出された。４〜７日後のｈＥＳ細胞条件へのそれらの移動は、それらの増殖を直ちに阻害するが、これらの条件では一層多くのｉＰＳ細胞が生成される。
２．８〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）の特異的阻害剤）の添加。
３．パルネート（Ｐａｒｎａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ；トラニルシプロミンとも称される）（リジン特異的デメチラーゼの阻害剤）との組み合わせでのＣＨＩＲ９９０２１の添加。
４．ＣＨＩＲ９９０２１単独、又はＣＨＩＲ９９０２１とパルネートとの組み合わせの添加後、本発明者らは、ｃ−Ｍｙｃを有さないｉＰＳ細胞を生成することができ、及び極めて低効率で、ｍｙｃ及びＫｌｆ４（ｉＰＳ細胞の二つの因子）を有さないｉＰＳ細胞を生成することができた。感染はそれぞれ、三つの再プログラミング因子Ｏｃｔ４，Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２のみを含み、ｃ−Ｍｙｃを含まない類似のポリシストロン性ベクター（チェリーベクター）によって、又は二つの再プログラミング因子Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２のみを含む類似のポリシストロン性ベクターによって行われた。
【０１５６】
ＣＨＩＲ９９０２１は、マウス胚の再プログラミング効率を増大させること、及び二つの因子Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４のみによってヒト一次皮膚由来ケラチン生成細胞の再プログラミングを可能にすることが示されている（Ｌｉ  Ｗ．ら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２００９  ２７：２９９２−３０００）。
【０１５７】
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【０１５８】
実施例３
ＨＦＫＴからの多能性幹細胞の誘導、及びＨＦＫＴ親細胞及びｈＥＳ細胞と比較したそれらの身元
ＨＦＫＴの再プログラミングのための手順は、図２Ａに示されている。ＫＴＮ及びＫＴＲケラチン生成細胞は、３６才及び４１才の二人の健康な女性（それぞれ「Ｎ」及び「Ｒ」と称される）の引き抜かれた毛髪から由来された。ＳＴＥＭＣＣＡベクターで感染された３００００個のケラチン生成細胞から開始して、約５〜９個のｉＰＳ細胞のコロニーが五つの独立した実験において単離された。重要なことに、インキュベーションの約３０日後に出現した全てのコロニーは、ｈＥＳ細胞の形態学的特徴と類似の形態学的特徴を示す真のｉＰＳ細胞であった（図２Ｂ）。全てのｉＰＳ細胞のコロニーは、機械的に取り上げられ、さらなる拡大及び分析のためにＭＥＦフィーダー層に移された。それらの核型は、分析され、二つのクローン以外は正常であることが見出された。二つのクローンのうち、一つはＸ染色体を欠失しており（４５，Ｘ０）、もう一つは、不安定な核型を有していた（データは示さず）。
【０１５９】
親ＫＴＲ／ＫＴＮ細胞と比較したＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の特異的な特性決定は、Ｋ１４タンパク質の分析によって行われた。Ｋ１４染色は、ＨＦＫＴにおける強い細胞質発現を示し、これはＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞では減少した（図２Ｃ）。ＦＡＣＳ分析により、７７％のＨＦＫＴがＫ１４タンパク質を発現したが、それらのｉＰＳ細胞誘導体のうち５０％だけがＫ１４陽性であることが示された。ｈＥＳ細胞におけるＫ１４タンパク質のレベルは３０％であった（図２Ｄ）。Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃタンパク質も、免疫染色によって分析され、ＨＦＫＴドナー細胞において高度に発現されること、及びそれらの発現レベルは、再プログラミング後も及びｈＥＳ細胞において大部分が維持されることが見出された（図２Ｃ）。次に、他のＥＳ細胞マーカーがＦＡＣＳ分析によって分析された。２５％のＨＦＫＴドナー細胞のみがＣＤ９０を発現したが、ＳＳＥＡ４タンパク質は、これらの細胞では発現されず、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞はＣＤ９０（９１％）及びＳＳＥＡ４（７３％）を陽性発現したことが見出された。これらのマーカーは、ｈＥＳ細胞でも同様に発現され、ＣＤ９０について８３％、ＳＳＥＡ４について６８％であった。ＣＤ２９の発現は、多能性後に減少したが、ＨＦＫＴは、このマーカーについて９５％陽性であり、それらから誘導されたｉＰＳ細胞及びｈＥＳ細胞は、顕著に減少したＣＤ２９のシグナルを示した。７０％の細胞は陽性であったが、シグナル強度は約７倍低かった（幾何平均パラメーターは、ＨＦＫＴについて３４．３であり、ｉＰＳ細胞及びｈＥＳ細胞について５であった）。これらの結果は、ヒトの包皮ケラチン生成細胞及びそれらのｉＰＳ細胞誘導体について得られたデータと一致する（Ａａｓｅｎら、２００８）。ＤＮＡフィンガプリント分析（短いタンデム繰り返し−ＳＴＲ）により、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンは、二つの異なる源（ＫＴＮ及びＫＴＲ細胞）から由来すること、及びｉＰＳ細胞のクローンの遺伝子プロフィールは、それらのドナー細胞のものと同一であることが確認された（表７）。
【０１６０】
2013535966.tif 000008
ＳＴＲ分析は、ｉＰＳ細胞のクローンＫＴＲ１２，ＫＴＲ１３及びそれらのＨＦＫＴ源細胞ＫＴＲ、並びにｉＰＳ細胞のクローンＫＴＮ３，ＫＴＮ７、及びそれらのＨＦＫＴ源細胞ＫＴＮについて行われた。陰性コントロールとして、非関連の個体について生成された非関連ＤＮＡが使用された。
【０１６１】
実施例４
ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンの多能性
詳細な特性決定を得るため、以下の四つのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンが選択された：ＫＴＮ細胞源から由来するＫＴＮ３及びＫＴＮ７、並びにＫＴＲ細胞源から由来するＫＴＲ１２及びＫＴＲ１３。これらのクローンは、４０代の継代数まで維持され、形態学的特徴及び核型の安定性においてｈＥＳ細胞に類似していた。ｉＰＳ細胞のクローンは、免疫染色（図３Ａ）及びＲＴ−ＰＣＲ分析（図４）によって証明されるように、Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｒｅｘ１，ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１などの典型的なｈＥＳ細胞マーカーを発現することが見出された。四つのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン全ての再プログラミング因子の転写レベルは、三つの異なる継代（つまり、５−７，１２−１７及び２２−２５）でＱＲＴ−ＰＣＲによって分析され、それらのｈＥＳ細胞対応物と比較された（図３Ｂ）。結果は、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２の転写レベルがｈＥＳ細胞のものと同様であることを示した。ｉＰＳ細胞の後の継代での減少したレベルは例外として、ｃ−Ｍｙｃの転写レベルは、ＫＴＮ７クローンを除いてｉＰＳ細胞及びｈＥＳ細胞とほぼ同様であった。ＫＴＮ７クローンは、ｈＥＳ細胞より２〜３倍高いレベルでｃ−Ｍｙｃを発現した。Ｋｌｆ４のｍＲＮＡは、二つのｉＰＳ細胞のクローン（即ち、ＫＴＮ７及びＫＴＲ１３）においてかなり高く、初期継代（５−６）においてそれぞれｈＥＳ細胞のレベルより約２７倍及び約４倍高かった。これらのレベルは、クローンＫＴＲ１３の後期継代（１５−２４）では減少し、通常のｈＥＳ細胞のレベルに到達した。クローンＫＴＮ７では、Ｋｌｆ４の転写レベルは、継代２３で減少したが、なおもｈＥＳ細胞より約２０倍高かった（図３Ｂ）。総合的に、これらの結果は、外来導入遺伝子は、ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンの大部分においてサイレンシングされており、それらの発現レベルは、通常のｈＥＳ細胞のレベルに到達するということを示唆する。
【０１６２】
細胞の分化能力を評価するため、四つのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンの分化が、胚様体（Ｅｂ）の生成によってインビトロで誘導され（図５Ａ−Ｆ）、奇形腫アッセイを使用してインビボで誘導された（図５Ｇ−Ｉ）。全てのクローンは、三層の胚葉の全てに分化した。ＥＢ免疫染色は、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の中胚葉マーカー及び内皮マーカーＣＤ３１（図５Ｂ，Ｃ）、外胚葉チューブリンβ３及びネスチン（図５Ｄ）、及び内胚葉α−フィトタンパク質（ＡＦＰ）及びグルカゴン（図５Ｅ，Ｆ）の発現を示した。ＳＣＩＤマウスにおけるｉＰＳ細胞のインビボ分化は、実質的な奇形腫の形成を誘導した。この奇形腫は、三層の胚葉の全てからの組織を含んでいた：神経組織（図５Ｆ）、内皮及び上皮（図５Ｈ）、及び脂肪細胞及び筋肉組織（図５Ｉ）。ＥＢへのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の分化後の再プログラミング因子の発現レベルも調査された。全体的に、ｉＰＳ細胞のクローンから由来するＥＢ中での導入遺伝子のレベルの減少は、ｈＥＳ細胞から由来するＥＢの場合と同様に１〜２倍であり時にはｈＥＳ細胞から由来するＥＢより大きいことさえあった。しかし、クローンＫＴＮ７は、分化後に、Ｈ９．２−ＥＢと比較して１０倍も高いＫｌｆ４の発現を維持した（図５Ｊ）。
【０１６３】
実施例５
ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の心臓分化
ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の分化能力をさらに評価するため、本発明者らは、機能的な心筋細胞（ＣＭ）に向かうそれらの系譜特異的な分化を調査した。四つのクローン全てからの未分化のｉＰＳ細胞は、懸濁液中で自発的にＥＢに分化し、次にゼラチンで被覆されたプレート上に配置された。ＥＢの自発的な収縮は、クローンＫＴＮ３，ＫＴＲ１２及びＫＴＲ１３からの培養されたＥＢ全ての３〜１０％において観察された（表８）。
【０１６４】
2013535966.tif 000009
【０１６５】
特に、クローンＫＴＮ７からの収縮ＥＢは、継代数３９まで見出されなかった。微小切開収縮領域の免疫蛍光染色（図６Ａ）により、細胞が心臓トロポニンＩ、α−肉腫アクチン、及びミオシン重鎖（ＭＨＣ）を発現すること、及び最も重要なことに、それらは横紋の領域を示すことが証明された。心臓トロポニン（高度に心臓特異的な筋繊維タンパク質）の蛍光シグナルと、他のタンパク質のそれぞれの蛍光シグナルとの間に重複が見出された。ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭの機能は、ＭＥＡデータ取得システムによって記録される堅固な細胞外エレクトログラムによって示され（図６Ｂ）、ＱＲＳ及びＴ様の複合体の存在を証明する。また、これらの細胞の機能能力の初期評価を与えるために、本発明者らは、解離された自発的収縮領域からの全細胞電流クランプ記録を行った。これらの代表的な記録（図６Ｃ）は、自発的に生成された活動電位の存在を証明し、これは顕著なペースメーカーとしての潜在能力である。
【０１６６】
細胞内Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）取り扱い機構及び機械的機能の基本特性を評価するため、［Ｃａ２＋］ｉ過渡現象及び収縮はそれぞれ、ｆｕｒａ−２蛍光及びビデオエッジ検出器によってＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭの小さな収縮クラスターから記録された。（０．６Ｈｚで刺激された）ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭからの［Ｃａ２＋］ｉ過渡現象及び収縮の代表的なトレース（それぞれ図６Ｄ，６Ｅ）は、ｈＥＳ細胞−ＣＭからのもの、及びＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭからのもの（Ｇｅｒｍａｎｇｕｚら、２００９）と同様であり、これらのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞−ＣＭが興奮−収縮結合機構の「心臓様」特徴を示すことを示唆する。さらに、β−アドレナリン作動シグナル伝達経路の機能の支持において、イソプロテレノールは、［Ｃａ２＋］ｉ過渡現象及び収縮の振幅の増大によって証明されるように、２〜３分以内に顕著な濃度依存的な陽性の変力性効果を生じた（図６Ｄ−Ｅ）。総合的に、これらの結果は、機能的なＣＭに分化するＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞の能力を証明する。
【０１６７】
実施例６
ｌｏｘ−Ｐ含有ＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスベクターのＣｒｅによって媒介される除去
ＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞は、再プログラミング導入遺伝子に隣接するｌｏｘ−Ｐ部位を含む除去可能なレンチウイルスベクターによって生成されたので、本発明者らは、ヒトＳＴＥＭＣＣＡカセットのＣｒｅ−リコンビナーゼ除去を行った。除去手順は、再プログラミング因子を有するＳＴＥＭＣＣＡカセット全体を含むレンチウイルスベクターの大部分を効率的に削除することができる。この目的のため、Ｐｕｒｏ抵抗性Ｃｒｅリコビナーゼプラスミドが二つのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローンＫＴＮ７及びＫＴＮ１３中に一過的に導入された。ピューロマイシン選択の後、小さなｉＰＳ細胞のコロニーが出現し、これらのコロニーは、採取され、レンチウイルスベクターの存在を分析するためにさらに拡大された。レンチウイルスベクターのＷＰＲＥ配列に隣接するプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲは、二つのＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞クローン（Ｃｒｅ−ＫＴＮ７.３及びＣｒｅ−ＫＴＲ１３.４）中の陽性バンドの存在を示さなかった。このことは、ＳＴＥＭＣＣＡカセットが細胞から成功裏に除去され（図７Ａ）、組み込まれたレンチウイルスベクターのうちの小さな残余しか残っていないことを示唆する。除去されたｉＰＳ細胞のクローンは、除去後、３０代の継代数まで培養され、正常な核型を有しており、形態学的に及びｈＥＳ細胞に典型的なマーカーの発現においてｈＥＳ細胞に類似していた（図８）。それらの多能性は、インビトロでのＥＢへの自発的な分化、及び三層の胚葉全ての検出によって証明された（図９Ａ−Ｆ）。ＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、未分化のＣｒｅによって媒介されるＨＦＫＴ−ｉＰＳ細胞のクローンにおける再プログラミング因子の転写レベルは、未分化のｈＥＳ細胞によって発現されるものと同様であることが証明された（図７Ｂ）。これはクローンＫＴＮ７におけるＫｌｆ４の転写レベルによって良く証明され、このレベルは、非除去クローンにおいて２０倍高く、除去後にｈＥＳ細胞のレベルに減少した（クローンＣｒｅ−ＫＴＮ７.３において）。さらに、ｃ−Ｍｙｃの転写レベルは、元のＫＴＮ７及びＫＴＲ１３クローンにおいてｈＥＳ細胞のレベルと比較して２〜３倍高く、除去後にｈＥＳ細胞のレベル以下に減少した。これらの結果は、望ましくない導入遺伝子発現の除去を示す。
【０１６８】
重要なことに、本発明者らは、ＫＴＮ７クローンは継代数３９まで収縮ＥＢを生成することができなかったが、その除去された誘導体（クローンＣｒｅ−ＫＴＮ７.３）は、比較的高い効率（約１３％、図７Ｃ及び表９）で収縮ＥＢに自発的に分化することができたことを示した。これらのデータは、組み込まれた再プログラミング遺伝子の除去が、特定の系譜への好適な分化のために極めて望ましいということを証明する。
【０１６９】
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【０１７０】
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【図１Ａ−１Ｆ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｅ】
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【図７Ａ−７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月29日(2013.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のことを含むことを特徴とする、単離された毛包から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成させる方法：
（ａ）単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること、但し、前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、毛包の細胞を解離させることによって生成される；
（ｂ）毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること；
（ｃ）少なくともＯＣＴ４及びＳＯＸ２の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること；及び
（ｄ）前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、ｉＰＳ細胞が形成されるまで培養し、それによりｉＰＳ細胞を生成させること。
【請求項２】
前記ウイルスはレンチウイルスを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子は、ＫＬＦ４及び／又はＣ−ＭＹＣをさらにコードすることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記コロニーは、２０〜３０個の毛包ケラチン生成細胞を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと２時間未満の間、接触させられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと１時間未満の間、接触させられることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、三代より多く継代されていないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、二〜三代継代されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記解離させることは、トリプシンを使用して行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記感染させることは、約２００ｇ〜約１０００ｇの遠心力での遠心分離中に行われることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記感染させることは、２５℃〜３７℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記フィーダー細胞は、３Ｔ３細胞又はマウスの胚性フィーダー細胞（ＭＥＦ細胞）を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子は、ＬｏｘＰ部位をさらにコードすることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＰＳ細胞をｃｒｅリコンビナーゼ酵素と接触させることによって工程（ｄ）の後に前記核酸分子を除去することをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも一種の脱分化因子は、Ｎａｎｏｇ及び／又はＬｉｎ２８をさらに含むことを特徴とする、請求項２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子は、配列番号１に規定される配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記感染されたケラチン生成細胞を培養する時間の少なくとも一部の間、前記培養培地は小分子を含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記小分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ又はＭＥＫ）阻害剤とＧＳＫ−３阻害剤の組み合わせ；及びＬ型カルシウムチャンネルアゴニストからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、パルネート（トラニルシプロミン）であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離させることは、ＥＤＴＡを使用して行われることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって得られることを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）。
【請求項２３】
請求項２２に記載のｉＰＳ細胞の細胞系。
【請求項２４】
組織再生における使用のための、請求項２２に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項２５】
前記組織再生は、心臓組織の再生であることを特徴とする、請求項２４に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項２６】
請求項２２に記載のｉＰＳ細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２７】
以下のことを含むことを特徴とする、系譜特異的な細胞を生成させる方法：
（ａ）請求項１に記載の方法に従ってｉＰＳ細胞を生成させること；及び
（ｂ）エクスビボで前記ｉＰＳ細胞を系譜特異的な細胞へと分化させ、それにより前記系譜特異的な細胞を生成させること。
【国際調査報告】
2013535966.tif 000048
2013535966.tif 000049