(57)【要約】本発明は、本明細書において定義される一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）の化合物を含む、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、低酸素損傷、壊死及び／又は虚血性再潅流損傷に関連した疾患の予防または治療のための医薬組成物、ならびに抗酸化効果を有するインドール化合物を含有する化粧品組成物に関するものである。
2013508452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、治療上有効量の下記一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）の化合物、その製薬的に許容される塩またはその異性体、及び製薬的に許容可能な担体を含む、酸化的ストレスと関連した疾患の予防及び治療のための医薬組成物：
【化１】
2013508452.tif 000013
（１）
［式中、ｎａは０〜３の数であり、
Ａaは、それぞれＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有する５員のヘテロアリールまたは複素環を表し、
Ｒ1aは、Ｒ5a−Ｘa−Ｂa−Ｘ’a−
｛式中、Ｂaは直接結合を表すか、またはそれぞれＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１〜４個のヘテロ原子を有する３〜１０員の複素環若しくはヘテロアリール表し、
Ｘa及びＸ’aは、それぞれ独立して、直接結合を表し、または−ＮＲ6a−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ6a−、−ＣＯ2−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ma−、−Ｏ−（ＣＨ2）ma−、−（ＣＨ2）ma−Ｏ−、−（ＣＨ2）ma−、−ＮＲ6aＣＯ−、−（Ｒ6aＯ）2Ｐ（Ｏ）−及び−ＮＨＣＯ2−（ここで、ｍａは０〜３の数であり、Ｒ6aは水素、アルキルまたはシクロアルキルを表す）よりなる群から選ばれ、
Ｒ5aは水素、ニトリル、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル若しくはアリールを表し、またはそれぞれ、Ｎ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１若しくは３個のヘテロ原子を有し、場合によりオキソまたはアルキルで置換された単環または縮合環の３〜１０員複素環またはヘテロアリールを表すか、または
Ｒ5a及びＲ6aは一緒になって４〜８員環を形成することができる｝
を表し、
Ｒ2aは、−（ＣＲ8aＲ9a）pa−Ｙa−Ｒ7a
｛式中、ｐａは０〜２の数であり、
Ｒ8a及びＲ9aは、それぞれ独立して、水素またはアルキルを表すか、または一緒になって４〜８員を形成することができ、
Ｙaは直接結合を表すか、または−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ6a−、−ＮＲ6aＣ（Ｏ）−、−ＣＯ2−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ6a−、−Ｓ（Ｏ）qa−、及び−Ｓ（Ｏ）qaＮＲ6a−（ここで、ｑａは０〜２の数である）よりなる群から選ばれ、
Ｒ7aは水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル若しくはアリールを表すか、またはそれぞれ、Ｎ、Ｓ及びＯから選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有し、場合によりオキソを含む３〜１０員複素環若しくはヘテロアリールを表す｝
を表し、
Ｒ3aは水素、アルキル、−（ＣＨ2）qa−シクロアルキルまたは−（ＣＨ2）qa−複素環を表し、
Ｒ4aは、−（ＣＨ2）pa−Ｄa−Ｒ10a
（ここで、Ｄaは直接結合を表すか、場合によりオキソを含むシクロアルキルを表すか、アリールを表すか、またはそれぞれＮ、Ｓ及びＯから選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有する３〜１０員複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ10aは水素、ハロゲン、アミノ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルまたは−（ＣＨ2）pa−ＮＲ8aＲ9aを表す）を表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、ハロアルキル、アルキルスルホニル、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルコキシ及びオキソからなる群から選ばれた一つ以上である。）］；
【化２】
2013508452.tif 000014
（２）
［式中、
ｎｂは１〜３の数であり、
ｍｂは０または１であり、
Ａbは直接結合を表すか、フェニルを表すか、または窒素原子を１〜２個有する６員ヘテロアリールを表し、
ＸbはＣまたはＮを表し、ただし、ＸbがＮの場合ｍｂは０であり、ＸbがＣの場合ｍｂは１であり、
Ｒ1bは水素、アルキル、−（ＣＨ2）rbＮＲ7bＲ8b、または−（ＣＨ2）rbＣＯ2Ｈ
（ここで、ｒｂは１〜５の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは、それぞれ独立して、水素、アルキルまたはアルキルカルボニルを表すか、一緒になって、一つのメチレンが場合によりＮ原子により代替されていてもよいアルキルで場合により置換されていてもよいアルキレン鎖を形成することができる）を表し、
Ｒ2bは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ若しくはトリアルキルシリルを表すか、または
−（ＣＨ2）pbＣＯ2Ｒ7b、−（ＣＨ2）pbＯＲ7b、−（ＣＨ2）pbＮＲ7bＲ8b、−ＮＨＲ10b、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ7b、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ10b、−（ＣＨ2）pbＳ（Ｏ）2Ｒ7bまたは（ＣＨ2）pb−複素環−Ｒ10b（ここで、ｐｂは０〜３の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは上記と同義であり、Ｒ10bは水素、オキソ、アルキルスルホニル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルまたは複素環を表す）を表し、
Ｒ3bは水素、シアノ、ハロゲン、アルキル若しくはフェニルを表すか、または−（ＣＨ2）nb−複素環若しくは−（ＣＨ2）nb−アリール（ここで、ｎｂは０〜３の数である）を表し、
Ｒ4bは、−ＹbＲ11b
｛式中、Ｙbは直接結合であるか、または−（ＣＲ7bＲ8b）pbＹ’b−（ここで、ｐｂは０〜３の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは上記定義と同義であり、Ｙ’bは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ12b−、−ＮＲ12bＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、−Ｓ（Ｏ）qb−、及び−Ｓ（Ｏ）qbＮＲ12b−（ここで、Ｒ12bは水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、ｑｂは０〜２の数である）よりなる群から選ばれる）を表し、
Ｒ11bは水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、カルボキシ、アルキル及び−（ＣＨ2）tbＢb−Ｒ13b（式中、ｔｂは０〜３の数であり、Ｂbは複素環、ヘテロアリールまたはアリールを表し、Ｒ13bは水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオール、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニルまたはアルキルスルホニルを表す）よりなる群から選ばれる｝
を表し、
Ｒ5bは水素、アルキル、シクロアルキル、複素環またはヘテロシクリルアルキルを表し、
Ｒ6bは−（ＣＲ7bＲ8b）pb−Ｚb−Ｄb−Ｗb−Ｒ14b
｛式中、Ｚbは直接結合を表すか、または−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、及び−Ｓ（Ｏ）yb−（ここで、ｙｂは１または２の数である）よりなる群から選ばれ、
Ｄbは直接結合を表すか、又はシクロアルキル、ヘテロアリール若しくは複素環を表し、
Ｗbは直接結合を表すか、または−ＮＲ7b−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、−Ｓ（Ｏ）yb−、−Ｓ（Ｏ）ybＮＲ12b−若しくは−ＮＲ12bＳ（Ｏ）yb−を表し、
Ｒ14bは水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、複素環、ヘテロアリール、アリールまたはアラルキルを表す｝
を表し、
Ｒ5b及びＲ6bは共にアルキレン鎖を表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である。）］；
【化３】
2013508452.tif 000015
（３）
［式中、Ｂcはアリールを表し、またはＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれる１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ7cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロまたはアルコキシを表し、
Ｒ8cはＣ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、複素環、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル−アルキルまたは複素環−アルキルを表し、
Ｒ9cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロ、アルコキシ、アリルオキシ、アルキルアミノまたはアリールアミノを表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、Ｃ1−Ｃ6−アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、ハロゲノ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ、アリール−Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である）］。
【請求項２】
活性酸素種（ＲＯＳ）または活性窒素種（ＲＮＳ）により媒介される酸化的ストレスにより引き起こされる疾患の予防及び治療のための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
虚血性再潅流損傷を抑制する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ミトコンドリア機能障害を抑制する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア性筋障害、脳障害、乳酸アシドーシス、脳卒中様発作；:mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes）、ＭＥＲＲＦ症候群（赤色ぼろ線維を伴うミトコンドリア異常を伴うミオクローヌスてんかん；myoclonus epilepsy with ragged-red fibers）またはカーンズ・セイヤー症候群（Kearns-Sayre syndrome）の予防及び治療のための請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
低酸素損傷（hypoxic injury）を抑制する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
細胞壊死を抑制する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨＭＧＢ１（High Mobility Group Box 1）を分泌する細胞の壊死を抑制する請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＨＭＧＢ１により媒介される疾患の予防または治療のための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
炎症により媒介される疾患または炎症に関連する疾患の予防または治療のための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
敗血症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、肝硬変、出血性疾患、様々な壊死性疾患、ウイルス感染またはバクテリア感染による疾患の予防または治療のための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
肝疾患、心臓疾患、血管疾患、退行性脳疾患、虚血性再潅流損傷に起因する疾患またはウイルスまたはバクテリアによる感染疾患の予防または治療のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
肝移植、肝切除、肝塞栓、肝繊維症、肝硬変、アルコール性／非アルコール性脂肪肝、及びウイルスまたは薬物による肝炎の予防または治療のための請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
不整脈、心臓麻痺または心筋梗塞の予防または治療のための請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ルーゲーリッグ病、脳卒中、認知症、パーキンソン病またはハンティングトン病の予防または治療のための請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
インフルエンザ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶウイルス感染またはバクテリア感染により引き起こされる疾患の予防または治療のための請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
虚血性再潅流損傷が、ミトコンドリア機能低下、低酸素損傷、ＨＭＧＢ１放出または細胞壊死によるものであることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
肝移植、肝切除、肝塞栓、肝繊維症、肝硬変、アルコール性／非アルコール性脂肪肝、及びウイルスまたは薬物による肝炎の予防または治療のための請求項３または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
不整脈、心臓麻痺または心筋梗塞の予防または治療のための請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
下記一般式（３）の化合物、その製薬的に許容される塩またはその異性体：
【化４】
2013508452.tif 000016
（３）
［式中、Ｂcはアリールを表し、またはＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれる１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ7cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロまたはアルコキシを表し、
Ｒ8cはＣ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、複素環、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル−アルキルまたは複素環−アルキルを表し、
Ｒ9cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロ、アルコキシ、アリルオキシ、アルキルアミノまたはアリールアミノを表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、Ｃ1−Ｃ6−アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、ハロゲノ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ、アリール−Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である。）］。
【請求項２１】
Ｂcがアリールを表し、またはＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれる１〜２個のヘテロ原子を有する５〜６員の複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ7cが水素、ハロゲン、ニトリルまたはアルコキシを表し、
Ｒ8cがＣ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、複素環、アリールアルキル、シクロアルキル−アルキルまたは複素環−アルキルを表し、
Ｒ9cが水素、ハロゲン、ニトリル、アルコキシ、アリルオキシ、アルキルアミノまたはアリールアミノを表す、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｂcがフェニルまたはピリジンを表し、
Ｒ7cが水素、ハロゲンまたはアルコキシを表し、
Ｒ8cがＣ1−Ｃ6−アルキル、複素環、シクロアルキル−アルキル、複素環−アルキルまたはアリールアルキルを表し、
Ｒ9cが水素、ハロゲンまたはアルコキシを表す、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ8cがシクロペンチルまたはテトラヒドロピランを表す、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２４】
下記群から選ばれる請求項２０に記載の化合物：
シクロペンチル−（２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン、
（２−フェニル−３Ｈ−ベンズイミダゾール−４−イル）−（テトラヒドロ−フラン−４−イル）−アミン、
シクロペンチル−（２−ピリジン−２−イル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン。
【請求項２５】
活性成分として、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）の化合物、その製薬的に許容される塩またはその異性体、及び許容可能な担体を含む、抗酸化効果を有する化粧品組成物：
【化５】
2013508452.tif 000017
（１）
［式中、ｎａは０〜３の数であり、
Ａaは、それぞれＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有する５員ヘテロアリールまたは複素環を表し、
Ｒ1aは、Ｒ5a−Ｘa−Ｂa−Ｘ’a−
｛式中、Ｂaは直接結合を表すか、またはそれぞれＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１〜４個のヘテロ原子を有する３〜１０員の複素環またはヘテロアリール表し、
Ｘa及びＸ’aは、それぞれ独立して、直接結合を表すか、または−ＮＲ6a−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ6a−、−ＣＯ2−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ma−、−Ｏ−（ＣＨ2）ma−、−（ＣＨ2）ma−Ｏ−、−（ＣＨ2）ma−、−ＮＲ6aＣＯ−、−（Ｒ6aＯ）2Ｐ（Ｏ）−及び−ＮＨＣＯ2−（ここで、ｍａは０〜３の数であり、Ｒ6aは水素、アルキルまたはシクロアルキルを表す）よりなる群から選ばれ、
Ｒ5aは水素、ニトリル、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル若しくはアリールを表すか、またはそれぞれ、Ｎ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１または３個のヘテロ原子を有し、場合によりオキソまたはアルキルで置換された単環若しくは縮合環の３〜１０員複素環またはヘテロアリールを表すか、または
Ｒ5a及びＲ6aは一緒になって４〜８員環を形成することができる｝
を表し、
Ｒ2aは、−（ＣＲ8aＲ9a）pa−Ｙa−Ｒ7a
｛式中、ｐａは０〜２の数であり、
Ｒ8a及びＲ9aは、それぞれ独立して、水素またはアルキルを表すか、または一緒になって４〜８員を形成することができ、
Ｙaは直接結合を表すか、または−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ6a−、−ＮＲ6aＣ（Ｏ）−、−ＣＯ2−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ6a−、−Ｓ（Ｏ）qa−、及び−Ｓ（Ｏ）qaＮＲ6a−（ここで、ｑａは０〜２の数である）よりなる群から選ばれ、
Ｒ7aは水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル若しくはアリールを表すか、またはそれぞれ、Ｎ、Ｓ及びＯから選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有し、場合によりオキソを含む３〜１０員複素環若しくはヘテロアリールを表す｝
を表し、
Ｒ3aは水素、アルキル、−（ＣＨ2）qa−シクロアルキルまたは−（ＣＨ2）qa−複素環を表し、
Ｒ4aは、
−（ＣＨ2）pa−Ｄa−Ｒ10a（ここで、Ｄaは直接結合を表すか、場合によりオキソを含むシクロアルキルを表すか、アリールを表すか、またはそれぞれＮ、Ｓ及びＯから選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有する３〜１０員複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ10aは水素、ハロゲン、アミノ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルまたは−（ＣＨ2）pa−ＮＲ8aＲ9aを表す）を表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、ハロアルキル、アルキルスルホニル、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルコキシ及びオキソからなる群から選ばれた一つ以上である。）］；
【化６】
2013508452.tif 000018
（２）
［式中、
ｎｂは１〜３の数であり、
ｍｂは０または１であり、
Ａbは直接結合を表すか、フェニルを表すか、または窒素原子を１〜２個有する６員ヘテロアリールを表し、
ＸbはＣまたはＮを表し、ただし、ＸbがＮの場合ｍｂは０であり、ＸbがＣの場合ｍｂは１であり、
Ｒ1bは水素、アルキル、−（ＣＨ2）rbＮＲ7bＲ8b、または−（ＣＨ2）rbＣＯ2Ｈ
（ここで、ｒｂは１〜５の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは、それぞれ独立して、水素、アルキルまたはアルキルカルボニルを表すか、一緒になって一つのメチレンが場合によりＮ原子により代替されていてもよいアルキルで場合により置換されていてもよいアルキレン鎖を形成することができる）を表し、
Ｒ2bは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ若しくはトリアルキルシリルを表すか、または−（ＣＨ2）pbＣＯ2Ｒ7b、−（ＣＨ2）pbＯＲ7b、−（ＣＨ2）pbＮＲ7bＲ8b、−ＮＨＲ10b、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ7b、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ10b、−（ＣＨ2）pbＳ（Ｏ）2Ｒ7bまたは（ＣＨ2）pb−複素環−Ｒ10b（ここで、ｐｂは０〜３の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは上記と同義であり、Ｒ10bは水素、オキソ、アルキルスルホニル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルまたは複素環を表す）を表し、
Ｒ3bは水素、シアノ、ハロゲン、アルキル若しくはフェニルを表すか、または−（ＣＨ2）nb−複素環または−（ＣＨ2）nb−アリール（ここで、ｎｂは０〜３の数である）を表し、
Ｒ4bは、−ＹbＲ11b
｛式中、Ｙbは直接結合であるか、または−（ＣＲ7bＲ8b）pbＹ’b−（ここで、ｐｂは０〜３の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは上記定義と同義であり、
Ｙ’bは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ12b−、−ＮＲ12bＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、−Ｓ（Ｏ）qb−、及び−Ｓ（Ｏ）qbＮＲ12b−（ここで、Ｒ12bは水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、ｑｂは０〜２の数である）よりなる群から選ばれる）を表し、
Ｒ11bは水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、カルボキシ、アルキル及び−（ＣＨ2）tbＢb−Ｒ13b（ここで、ｔｂは０〜３の数であり、Ｂbは複素環、ヘテロアリールまたはアリールを表し、Ｒ13bは水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオール、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニルまたはアルキルスルホニルを表す）よりなる群から選ばれる｝
を表し、
Ｒ5bは水素、アルキル、シクロアルキル、複素環またはヘテロシクリルアルキルを表し、
Ｒ6bは−（ＣＲ7bＲ8b）pb−Ｚb−Ｄb−Ｗb−Ｒ14b
｛式中、Ｚbは直接結合を表すか、または−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、及び−Ｓ（Ｏ）yb−（ここで、ｙｂは１または２の数である）よりなる群から選ばれ、
Ｄbは直接結合を表すか、又はシクロアルキル、ヘテロアリール若しくは複素環を表し、
Ｗbは直接結合を表すか、または−ＮＲ7b−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、−Ｓ（Ｏ）yb−、−Ｓ（Ｏ）ybＮＲ12b−若しくは−ＮＲ12bＳ（Ｏ）yb−を表し、
Ｒ14bは水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、複素環、ヘテロアリール、アリールまたはアラルキルを表す｝
を表し、
Ｒ5b及びＲ6bは共にアルキレン鎖を表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である。）］；
【化７】
2013508452.tif 000019
（３）
［式中、Ｂcはアリールを表し、またはＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれる１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ7cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロまたはアルコキシを表し、
Ｒ8cはＣ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、複素環、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル−アルキルまたは複素環−アルキルを表し、
Ｒ9cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロ、アルコキシ、アリルオキシ、アルキルアミノまたはアリールアミノを表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、Ｃ1−Ｃ6−アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、ハロゲノ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ、アリール−Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である）］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドール化合物を含む、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、低酸素損傷、細胞壊死及び／又は虚血性再潅流損傷に関連した疾患の予防及び治療のための医薬組成物、及び抗酸化効果を有するインドール化合物を含む化粧品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人体を含む生物は、呼吸過程を通してエネルギーを得て、新進代謝をする過程で吸入酸素の約２％は“酸素毒”と呼ばれる活性酸素種（ＲＯＳ）に変換される。活性酸素種は、フリーラジカル（Free Radical；遊離基の電子を有する原子や分子の総称）を有する酸素を意味し、広範囲には脂質ペルオキシド（lipid peroxide）、脂質ペルオキシラジカル（lipid peroxy radical）、ペルオキシナイトライト（peroxy nitrite）などが含まれる。このような活性酸素種は、不安定なものであり、従って、周囲の物質と反応性が非常に強く、細胞内タンパク質や脂質分子はもちろん、遺伝情報を含有したＤＮＡにまでも酸化的損傷を与え、結果的には細胞に致命的被害を与えることが知られている。他方では、マクロファージや好中球のような免疫系細胞においては、むしろ活性酸素種の生成を誘発させることによって、外部から侵入した病原菌を殺す有用な役割も果たしている。しかし、活性酸素種が細胞内シグナル伝達における重要な役割を果たしているケースと、最近認められたケースとは異なり、細胞に損傷を引き起こし、これにより、活性酸素種は細胞に様々な損傷を誘発し、生命体に害を与えるものと一般に認識されている。したがって、酸素毒から細胞を保護するために、細胞自身が抗酸化剤成分（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオン（glutathione）のような小ペプチド（small peptide）や抗酸化酵素（例えば、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオン−依存性ペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）等）を有している。
【０００３】
今まで知られている活性酸素種（ＲＯＳ）や抗酸化酵素（antioxidant enzyme）が関与される疾患や代謝の例は以下とおりである。
１．インスリン依存性糖尿病の場合は、ＲＯＳの異常発現によって、膵臓β−細胞が損傷して生ずる。
２．現在、臨床的に多大な関心を持つダウン症候群は、２１位染色体の異常によって引きこされており、この場合２１位染色体に位置しているＳＯＤ（superoxidedismutase）という抗酸化酵素が異常発現する。
３.早老症（progeria）の場合、患者細胞で測定される抗酸化酵素（カタラーゼ、グルタチオン−依存性ペルオキシダーゼ）が低い酵素活性を示す。
４．正常細胞が癌細胞化される過程においても、種々癌誘発物質投与または照射時、細胞でＲＯＳが旺盛に生成される。
５．その他にも、ＲＯＳは動脈硬化、アルツハイマー病、虚血性疾患などに関与することが知られている。
【０００４】
正常な細胞でも代謝中に、ある程度のフリーラジカル、活性酸素種及び過酸化物が生成されている。しかし、生体内では、これらに対する防御機構として、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等の抗酸化酵素と共に、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、ユビキノン（ubiquinone）、尿酸などのような抗酸化物質が存在し、自らを保護している。このような生体防御機構に異常が生じるか、各種物理的、化学的要因によって活性酸素種の生成が生体防御系の容量を超えるようになったとき、酸化的ストレス（oxidative stress）が誘導される。ヒトの疾患が生体内の酸化的ストレスと抗酸化性防御機序との不均衡と関係があれば、理論的に抗酸化性物質を追加すると、酸化性被害を制限したり、疾患等の追加進行を制限したりすることができる。したがって、このような活性酸素種を消去できるフリーラジカルスカベンジャーまたは過酸化物生成抑制物質のような抗酸化性生体機能物質は、現在、高分子、食品、化粧品などの多様な分野で広く使われている。最近、種々疾患と関連した生理現象で活性酸素種が関与するという事実が明らかになるにつれて、これらの酸化物に起因する老化及び各種疾患の抑制または治療剤として期待されており、それを用いた治療剤の開発にも次第に関心が増加する傾向にあり、実際に、米国の場合、健康補助食品として販売されている。
【０００５】
酸化的ストレスが老化をはじめとして、各種疾患を引き起こす重要な原因であることが立証されることによって、活性酸素種の消去活性を有する抗酸化性生体機能物質の老化抑制及び疾患の治療剤として可能性が大きく浮上しており、酸化的ストレスによる老化及び各種疾患の治療機能を有しうる新しい抗酸化性生体機能物質の開発が求められている。
【０００６】
また、多くの抗酸化剤があるが、大部分がミトコンドリアへまで効率的に伝達されず、その効能が弱いか、小さい。抗酸化剤がミトコンドリアへまで伝達されることは、上記疾患を治療する際に非常に重要である。ＭｉｔｏＱのような化合物の場合、同様に、コエンザイムＱ１０をミトコンドリアまでターゲッティング（targeting）されるペプチドとコンジュゲイション（conjugation）させて治療剤としての可能性を開いた。
【０００７】
他方、このような酸化ストレスは、虚血性再潅流損傷の主作用機序として報告されている。虚血性疾患は、切除術、臓器移植、塞栓、心筋梗塞、脳卒中などを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、低酸素損傷、細胞壊死及び／又は虚血性再潅流損傷に関連した疾患の予防及び治療用として有用な医薬組成物、及び抗酸化効果を有する化粧品組成物を提供することをその技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、活性成分として、治療上有効量の下記一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）の化合物、その製薬的に許容される塩またはその異性体、及び製薬的に許容可能な担体を含む酸化的ストレスと関連した疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供する。
【００１０】
【化１】
2013508452.tif 000003
（１）
上記一般式（１）において、各置換基は国際出願公開ＷＯ２００９／０２５４７７号に具体的に定義されている：
［式中、ｎａは０〜３の数であり、
Ａaは、それぞれＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１〜３個のヘテロ原子を含む５員ヘテロアリールまたは複素環を表し、
Ｒ1aはＲ5a−Ｘa−Ｂa−Ｘ’a−
｛式中、Ｂaは直接結合を表すか、またはそれぞれＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１〜４個のヘテロ原子を含む３〜１０員複素環またはヘテロアリール表し、
Ｘa及びＸ’aは、それぞれ独立して、直接結合を表すか、または
−ＮＲ6a−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ6a−、−ＣＯ2−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ma−、−Ｏ−（ＣＨ2）ma−、−（ＣＨ2）ma−Ｏ−、−（ＣＨ2）ma−、−ＮＲ6aＣＯ−、−（Ｒ6aＯ）2Ｐ（Ｏ）−及び−ＮＨＣＯ2−（ここで、ｍａは０〜３の数であり、Ｒ6aは水素、アルキルまたはシクロアルキルを表す）よりなる群から選ばれ、
Ｒ5aは水素、ニトリル、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル若しくはアリールを表すか、またはそれぞれ、Ｎ、Ｏ及びＳ原子から選ばれた１または３個のヘテロ原子を有し、場合によりオキソまたはアルキルで置換された単環若しくは縮合環の３〜１０員複素環またはヘテロアリールを表すか、または
Ｒ5a及びＲ6aは共に結合して４〜８員環を形成することができる｝
を表し、
Ｒ2aは−（ＣＲ8aＲ9a）pa−Ｙa−Ｒ7a
｛式中、ｐａは０〜２の数であり、
Ｒ8a及びＲ9aは、それぞれ独立して、水素またはアルキルを表すか、または共に結合して４〜８員を形成することができ、
Ｙaは直接結合を表すか、または−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ6a−、−ＮＲ6aＣ（Ｏ）−、−ＣＯ2−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ6a−、−Ｓ（Ｏ）qa−、及び−Ｓ（Ｏ）qaＮＲ6a−（ここで、ｑａは０〜２の数である）よりなる群から選ばれ、
Ｒ7aは水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル若しくはアリールを表すか、またはそれぞれ、Ｎ、Ｓ及びＯから選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有し、場合によりオキソを含む３〜１０員複素環若しくはヘテロアリールを表す｝
を表し、
Ｒ3aは水素、アルキル、−（ＣＨ2）qa−シクロアルキルまたは−（ＣＨ2）qa−複素環を表し、
Ｒ4aは−（ＣＨ2）pa−Ｄa−Ｒ10a
（ここで、Ｄaは直接結合を表すか、場合によりオキソを含むシクロアルキルを表すか、アリールを表すか、またはそれぞれＮ、Ｓ及びＯから選ばれた１〜３個のヘテロ原子を含む３〜１０員複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ10aは水素、ハロゲン、アミノ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルまたは−（ＣＨ2）pa−ＮＲ8aＲ9aを表す）を表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、ハロアルキル、アルキルスルホニル、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルコキシ及びオキソからなる群から選ばれた一つ以上である。）］
【００１１】
【化２】
2013508452.tif 000004
（２）
上記一般式（２）において、各置換基は国際出願公開ＷＯ２００９／０２５４７８号に具体的に定義されている：
［式中、ｎｂは１〜３の数であり、
ｍｂは０または１であり、
Ａbは直接結合を表すか、フェニルを表すか、または窒素原子を１〜２個含む６員ヘテロアリールを表し、
ＸbはＣまたはＮを表し、ただし、ＸbがＮの場合ｍｂは０であり、ＸbがＣの場合ｍｂは１であり、
Ｒ1bは水素、アルキル、−（ＣＨ2）rbＮＲ7bＲ8b、または−（ＣＨ2）rbＣＯ2Ｈ（ここで、ｒｂは１〜５の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは、それぞれ独立して、水素、アルキルまたはアルキルカルボニルを表すか、共に場合により一つのメチレンがＮ原子により代替され、アルキルで置換されていてもよいアルキレン鎖を形成することができる）を表し、
Ｒ2bは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ若しくはトリアルキルシリルを表すか、または
−（ＣＨ2）pbＣＯ2Ｒ7b、−（ＣＨ2）pbＯＲ7b、−（ＣＨ2）pbＮＲ7bＲ8b、−ＮＨＲ10b、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ7b、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ10b、−（ＣＨ2）pbＳ（Ｏ）2Ｒ7bまたは（ＣＨ2）pb−複素環−Ｒ10b（ここで、ｐｂは０〜３の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは上記と同義であり、Ｒ10bは水素、オキソ、アルキルスルホニル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルまたは複素環を表す）を表し、
Ｒ3bは水素、シアノ、ハロゲン、アルキル若しくはフェニルを表すか、または−（ＣＨ2）nb−複素環若しくは−（ＣＨ2）nb−アリール（ここで、ｎｂは０〜３の数である）を表し、
Ｒ4bは−ＹbＲ11b
｛式中、Ｙbは直接結合であるか、または−（ＣＲ7bＲ8b）pbＹ’b−
（ここで、ｐｂは０〜３の数であり、Ｒ7b及びＲ8bは上記定義と同義であり、
Ｙ’bは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ12b−、−ＮＲ12bＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、−Ｓ（Ｏ）qb−、及び−Ｓ（Ｏ）qbＮＲ12b−（ここで、Ｒ12bは水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、ｑｂは０〜２の数である）よりなる群から選ばれる）を表し、
Ｒ11bは水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、カルボキシ、アルキル及び−（ＣＨ2）tbＢb−Ｒ13b（ここで、ｔｂは０〜３の数であり、Ｂbは複素環、ヘテロアリールまたはアリールを表し、Ｒ13bは水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオール、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニルまたはアルキルスルホニルを表す）よりなる群から選ばれる｝
を表し、
Ｒ5bは水素、アルキル、シクロアルキル、複素環またはヘテロシクリルアルキルを表し、
Ｒ6bは−（ＣＲ7bＲ8b）pb−Ｚb−Ｄb−Ｗb−Ｒ14b
｛式中、Ｚbは直接結合を表すか、または−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、及び−Ｓ（Ｏ）yb−（ここで、ｙｂは１または２の数である）よりなる群から選ばれ、
Ｄbは直接結合を表すか、又はシクロアルキル、ヘテロアリール若しくは複素環を表し、Ｗbは直接結合を表すか、または−ＮＲ7b−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12b−、−Ｓ（Ｏ）yb−、−Ｓ（Ｏ）ybＮＲ12b−若しくは−ＮＲ12bＳ（Ｏ）yb−を表し、Ｒ14bは水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、複素環、ヘテロアリール、アリールまたはアラルキルを表す｝
を表し、
Ｒ5b及びＲ6bは共にアルキレン鎖を表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である）］
【００１２】
【化３】
2013508452.tif 000005
（３）
［式中、Ｂcはアリールを表し、またはＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれる１〜２個のヘテロ原子を含む４〜８員の複素環若しくはヘテロアリールを表し、
Ｒ7cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロまたはアルコキシを表し、
Ｒ8cはＣ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、複素環、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル−アルキルまたは複素環−アルキルを表し、
Ｒ9cは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトリル、ニトロ、アルコキシ、アリルオキシ、アルキルアミノまたはアリールアミノを表し、
（上記で、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、置換基はヒドロキシ、ハロゲン、ニトリル、アミノ、Ｃ1−Ｃ6−アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、ハロゲノ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ、アリール−Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ及びオキソよりなる群から選ばれる一つ以上である。）］
【００１３】
本発明に係る一般式（１）、（２）または（３）化合物の定義において、用語‘アルキル’は脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。アルキルは、アルケニル若しくはアルキニル部位を含まない飽和アルキルであるか、または少なくとも一つのアルケニル若しくはアルキニル部位を含む不飽和アルキルであってもよい。“アルケニル”は、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含有する基を意味し、“アルキニル”は、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を含む基を意味する。アルキルは単独でまたはアルコキシのように組み合わせて使用されたとき、分岐状または直鎖状であってもよい。
【００１４】
アルキル基は、特に定義されない限り、１〜２０個の炭素原子を有することができる。また、アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を有する中程度の大きさのアルキルでもよい。アルキル基は１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであってもよい。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニルなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ1−Ｃ4−アルキルは、アルキル鎖に１〜４個の炭素原子を有し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルよりなる群から選ばれる。
【００１５】
用語‘アルコキシ’は、特に定義されない限り、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルオキシを意味する。
【００１６】
用語‘シクロアルキル‘は、特に定義されない限り、飽和脂肪族３〜１０員を意味する。典型的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに制限されない。
【００１７】
用語‘アリール（aryl）’は、共有π電子系を有する少なくとも一つの環、例えば、単環式または縮合多環式（即ち、隣接した炭素原子対を分けて有する環）基を含む。即ち、本明細書で、アリールは、特に定義されない限り、フェニル、ナフチルなどを含む４〜１０員、好ましくは６〜１０員芳香族単環式または多環式環を意味する。
【００１８】
用語‘ヘテロアリール’は、特に定義されない限り、Ｎ、Ｏ及びＳ原子よりなる群から選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有し、ベンゾまたはＣ3−Ｃ8シクロアルキルと縮合することができる芳香族３〜１０員、好ましくは４〜８員、より好ましくは、５〜６員を意味する。単環式ヘテロアリールの例には、チアゾール、オキサゾール、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラゾール、トリアゾール、トリアジン、チアジアゾール、テトラゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジンなどが挙げられるが、これらに制限されない。二環式ヘテロアリールの例には、インドール、インドリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンズチアジアゾール、ベンズトリアゾール、キノリン、イソキノリン、プリン、フロピリジンなどが上げられるが、これらに制限されない。
【００１９】
用語‘複素環’は、特に定義されない限り、Ｎ、Ｏ及びＳ原子よりなる群から選ばれた１〜３個のヘテロ原子を有し、ベンゾまたはＣ3−Ｃ8−シクロアルキルと縮合することができ、飽和または１若しくは２個の二重結合を含有する３〜１０員、好ましくは４〜８員、より好ましくは、５〜６員を意味する。複素環の例には、ピロリン、ピロリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピラン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ヒドロフランなどが上げられるが、これらに制限されない。
【００２０】
本明細書で使われた他の用語と略語は、特に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者が通常的に使われる意味を有するものと理解される。
【００２１】
本発明の一般式（１）または一般式（２）の化合物の好ましい具体例は、以下の通りに挙げられる：
化合物１：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−酢酸
化合物２：｛（Ｓ）−２−［５−メチル−７−（テトラヒドロピラン−４−イルアミノ）−１Ｈ−インドール−２−イル］−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル｝−酢酸
化合物３：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−オキサゾール−４−イル］−酢酸
化合物４：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−酢酸
化合物５：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−フェノキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−酢酸
化合物６：４−｛２−［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−フェノキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−エチル｝−ピペラジン−２−オン
化合物７：シクロペンチル−（２−｛（Ｓ）−４−［２−（３−メチル−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７−イル）−エチル］−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル｝−５−フェノキシ−１Ｈ−インドール−７−イル）−アミン
化合物８：（（Ｓ）−２−｛７−［（テトラヒドロピラン−４−イルメチル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル）−酢酸
化合物９：（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］−アミン
化合物１０：［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−（テトラヒドロピラン−４−イル）メチル−アミン
化合物１１：［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−ビス−［（テトラヒドロピラン−４−イル）メチル］−アミン
化合物１２：｛４−［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イルアミノ］−ピペリジン−１−イル｝−（テトラヒドロピラン−３−イル）メタノン
化合物１３：［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−（１−メチルスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミン
化合物１４：（（Ｓ）−２−｛５−メチル−７−［（テトラヒドロピラン−４−イルメチル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル）−酢酸
【００２２】
本発明に係る一般式（３）の化合物のうち、好ましい化合物は、以下とおりである：
Ｂcはアリールを表し、またはＮ、Ｏ及びＳ原子から選ばれる１〜２個のヘテロ原子を含む５〜６原義複素環あるいはヘテロアリールを表し、
Ｒ7cは水素、ハロゲン、ニトリル又はアルコキシを表し、
Ｒ8cはＣ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、複素環、アリールアルキル、シクロアルキル−アルキルまたは複素環−アルキルを表し、
Ｒ9cは水素、ハロゲン、ニトリル、アルコキシ、アリルオキシ、アルキルアミノまたはアリールアミノを表す。
【００２３】
より好ましくは、一般式（３）の化合物で、Ｂcはフェニルまたはピリジンを表す。
【００２４】
より好ましくは、Ｒ7cは水素、ハロゲンまたはアルコキシを表し、最も好ましくは水素を表す。
【００２５】
より好ましくは、Ｒ8cはＣ1−Ｃ6−アルキル、複素環、シクロアルキル−アルキル、複素環−アルキルまたはアリールアルキルを表し、最も好ましくはシクロペンチル、テトラヒドロピランを表す。
【００２６】
より好ましくは、Ｒ9cは水素、ハロゲンまたはアルコキシを表し、最も好ましくは水素を表す。
【００２７】
本発明に係る一般式（３）の代表的な化合物には下記化合物が含まれる：
シクロペンチル−（２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン
（２−フェニル−３Ｈ−ベンズイミダゾール−４−イル）−（テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミン
シクロペンチル−（２−ピリジン−２−イル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン
【００２８】
本発明の医薬組成物は、酸化的ストレスによる疾患の予防及び治療に効率的に使用することができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、活性酸素種（ＲＯＳ）または活性窒素種（ＲＮＳ）により媒介される酸化的ストレスによる疾患の予防及び治療に効率的に使用することができる。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、虚血性再潅流損傷を抑制することができる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、低酸素損傷により媒介される疾患の予防及び治療に効率的に使用することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、細胞壊死により媒介される疾患の予防及び治療に効率的に使用することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、ミトコンドリア機能障害を抑制することができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア性筋障害、脳障害、乳酸アシドーシス、脳卒中様発作；mitochondrial myopathy,encephalopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes）、ＭＥＲＲＦ症候群（赤色ぼろ線維を伴うミトコンドリア異常を伴うミオクローヌスてんかん；myoclonus epilepsy with ragged-red fibers）またはカーンズ・セイヤー症候群（Kearns-Sayre syndrome）の予防及び治療に効率的に使用することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、ＨＭＧＢ１を分泌する細胞の壊死を抑制することができる。
【００３６】
また、本発明の医薬組成物はＨＭＧＢ１により媒介される疾患、特に炎症によって媒介されるか、または炎症関連疾患を予防及び／又は治療でき、このような疾患は、例えば、敗血症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、肝硬変、出血性疾患、様々な壊死性疾患、ウイルス感染またはバクテリア感染疾患などがある。
【００３７】
本発明によって予防および／または治療される疾患は、例えば、肝疾患、心臓疾患、血管疾患、退行性脳疾患、虚血性再潅流損傷から由来する疾患及びウイルスまたはバクテリアによる感染疾患；肝移植、肝切除、肝塞栓、肝繊維症、肝硬変、アルコール性／非アルコール性脂肪肝、及びウイルスまたは薬物（例えば、抗癌剤、アセトアミノフェンなど）による肝炎；不整脈、心臓麻痺、心筋梗塞などの心臓及び心血管疾患；ルーゲーリッグ病、脳卒中、認知症、パーキンソン病及びハンティングトン病気等の退行性脳疾患；虚血性再潅流損傷に由来する糖尿性複合症、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中；インフルエンザー、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどの種々ウイルス感染または種々バクテリア感染により誘導される疾患などがある。
【００３８】
本発明において、肝疾患は肝移植、肝切除、肝塞栓、肝繊維症、肝硬変、アルコール性／非アルコール性脂肪肝、及びウイルスまたは薬物（例えば、抗癌剤、アセトアミノフェンなど）による肝炎よりなる群から選ばれた一つ以上であってもよい。
【００３９】
本発明において、心臓または心血管疾患は不整脈、心臓麻痺、心筋梗塞、心不全症及び狭心症よりなる群から選ばれた一つ以上であってもよい。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、虚血性再潅流損傷から由来した肝疾患、心臓または心血管疾患の予防及び治療に効率的に使用することができ、ここで虚血性再潅流損傷は、ミトコンドリア機能低下、低酸素損傷及び／又は細胞壊死によるものであってもよい。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、虚血性再潅流損傷から由来した糖尿性複合症、動脈硬化及び脳卒中よりなる群から選ばれた一つ以上の予防および治療のために効果的に使用することができる。
【００４２】
本発明の一般式（１）または一般式（２）の化合物の具体的な合成例は、国際出願公開ＷＯ２００９／０２５４７７及び国際出願公開ＷＯ２００９／０２５４７８にそれぞれ開示されている。
【００４３】
本発明は、また、上記一般式（３）の化合物及びそれらを製造する方法を提供する。以下では、本発明に対する理解を助けるために一般式（３）化合物の製造方法を例示的な反応式に基づいて説明するが、本発明が属する分野における通常の知識を有した者であれば、一般式（３）の構造に基づいて様々な方法により、一般式（３）の化合物を製造することができる。このような方法は、いずれも本発明の範疇に含まれるものである。即ち、本明細書に記載されるか、先行技術に開示された種々合成法を任意に組み合わせ、一般式（３）の化合物を製造することができる。これは、本発明の範囲内に属するものであり、一般式（３）化合物の製造方法が下記説明されたものに制限されない。
【００４４】
まず、一般式（３）の化合物は、下記反応式１の方法に従って、一般式（４）の化合物のニトロ基を還元して、一般式（５）の化合物のアミン化合物を製造し、形成されたアミン基に対して一般式（６）の化合物と還元性アミノ化反応を行うことによって合成することができる：
（反応式１）
【化４】
2013508452.tif 000006
（式中、Ｂc、Ｒ7c、Ｒ8c及びＲ9cは、一般式（３）の定義と同義であり、
Ｒ10cはアルキル、シクロアルキル、複素環、ヘテロアリール又はアリールを表し、
Ｒ11cは水素、アルキルを表し、又は
Ｒ10c及びＲ11cは環化してシクロアルキルまたは複素環を形成することができる）
【００４５】
一般式（５）の化合物は、一般式（４）の化合物に還元によって製造することができる。還元反応は、酸触媒と金属を用いるか、または水素ガス存在下、金属触媒を用いて行うことができる。
【００４６】
酸触媒と金属の使用を含む還元反応で使用することができる酸の例は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸、塩化アンモニウムのようなアミン酸塩、好ましくは塩酸、酢酸または塩化アンモニウムなどである。酸の使用量は、一般式（４）の化合物１当量に対して、通常０．０１〜１０当量であり、好ましくは０．１〜５当量である。用いられる金属の例は、鉄、亜鉛、リチウム、ナトリウム、スズ（通例的に、塩化スズ）などであり、特に好ましくは鉄、亜鉛、塩化スズなどである。金属の使用量は、一般式（４）の化合物１当量に対して、通常１〜２０当量であり、好ましくは１〜１０当量である．酸触媒存在下の金属反応は、不活性溶媒中で行うことができる。不活性溶媒の例には、メタノール、エタノールなどのアルキルアルコール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル、酢酸エチルのようなアルキルエステルなどであり、好ましくはメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチルなどである。反応温度は、通常−１０〜２００℃であり、好ましくは２５〜１２０℃であり反応時間は通常１０分〜６０時間、好ましくは１０分〜１２時間である。
【００４７】
水素ガス存在下で金属触媒の使用を含む還元反応で使用することができる金属触媒の例は、パラジウム、ニッケル、プラチナ（platinum）、ルテニウム（ruthenium）、ロジウム（rhodium）などであり、特に好ましくはパラジウム、ニッケルなどである。金属触媒の使用量は、一般式（２）の化合物１当量に対して、通常０．００１〜２当量であり、好ましくは０．０１〜１当量である。水素ガスの圧力は、通常１〜１０気圧であり、好ましくは１〜３気圧である。反応は不活性溶媒、例えば、メタノール、エタノールなどのアルキルアルコール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル、酢酸メチル、酢酸エチルなどのアルキルアセテートなどであり、好ましくはメタノール、エタノール、酢酸エチルなどで行うことができる。金属触媒の使用を含む還元反応において、反応温度は通常−１０〜２００℃、好ましくは２５〜５０℃であり、反応時間は通常１０分〜６０時間、好ましくは１０分〜１２時間である。
【００４８】
一般式（６）化合物は商業的に購入可能であり、一般式（５）化合物のアミン基に対する還元性アミノ化反応を通して製造することができる。
【００４９】
還元性アミノ化反応は、還元剤とアルデヒドまたはケトンとの反応を通して行うことができ、必要に応じて酸触媒を使用することができる。アルデヒドまたはケトンの量は、一般式（５）の化合物１当量に対して、通常１〜１０当量であり、好ましくは１〜３当量である。用いられる還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）、ナトリウムトリアセトキシ−ボロハイドライド｛ＮａＢＨ（ＯＡｃ）3｝などである。還元剤使用量は一般式（５）の化合物１当量に対して、通常１〜１０当量であり、好ましくは１〜３当量である。用いられる酸触媒は、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸、塩化アンモニウムのようなアミン酸塩などであり、特に好ましくは塩酸、酢酸などである。酸の使用量は、一般式（５）の化合物１当量に対して通常０.１〜１０当量であり、好ましくは１〜５当量である。反応は、不活性溶媒、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタンなどのクロロアルカン、好ましくはジクロロエタン、クロロホルムなどで行くことができる。反応温度は、通常−１０〜１００℃、好ましくは−１０〜５０℃であり、反応時間は通常１０分〜６０時間、好ましくは１０分〜１２時間である。
【００５０】
一般式（４）の化合物は、下記反応式２で示されるように、一般式（７）の化合物のアルデヒド化合物を、一般式（８）の化合物と連結反応及び環化反応によって製造することができる：
（反応式２）
【化５】
2013508452.tif 000007
（式中、Ｂc、Ｒ7c及びＲ9cは上記一般式（３）の定義と同義である）
【００５１】
まず、一般式（７）の化合物のような商業的に購入可能なアルデヒドと商業的に購入可能な一般式（８）の化合物のようなジアミン化合物を加熱撹拌して、環化する。次に、酸触媒の存在下で加熱すれば、一般式（４）の化合物のような化合物を得ることができる。用いられる酸触媒は、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸、塩化アンモニウムのようなアミン酸塩などであり、特に好ましくは塩酸、酢酸などである。酸の使用量は一般式（５）の化合物１当量に対して、通常０．１〜１０当量であり、好ましくは１〜５当量である。場合によって、反応は、溶媒として酢酸のような有機酸を用いて行うことができる。
【００５２】
本明細書で、“製薬的に許容される塩”には、製薬的に許容されるアニオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などの有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸などにより形成された酸付加塩が含まれる。また、製薬的に許容される塩基付加塩には、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどにより形成されたアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩；リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン、トリエチルアミンなどの有機塩などが含まれる。本発明に係る一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）の化合物は、通常的な方法によりその塩に転換することができ、塩の製造は別途の説明がなくても、上記一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）の構造に基づいて当業者が容易に行うことができる。
【００５３】
本明細書で、“異性体（isomer）”は、同じ化学式または分子式を有するが、光学的または立体的に異なる形態を有する化合物またはその塩を意味する。本発明に係る一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）の化合物は、不斉炭素中心を有することができるので、立体異性体（ＲまたはＳ異性体）、ラセミ体、ジアステレオマーの混合物、または個々のジアステレオマーなどの形態で存在してもよい。二重結合を有するとき、幾何異性体（トランス、シス型異性体）の形態で存在し得る。これら全ての異性体及びその混合物も本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
以下では、特に説明がない限り、それぞれの一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）の化合物には、製薬的に許容されるその塩及び異性体が含まれる。これらは全て、本発明の範疇に含まれるものである。説明の便宜のために、本明細書では、これらを一般式（１）の化合物として簡単に表現する。
【００５５】
上述の“医薬組成物”は、必要に応じて、本発明の化合物と共に、製薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。医薬組成物は、生物体内に化合物が投与されることを容易にする。化合物を投与する様々な技術が存在しており、そこには、経口、注射、エアゾール、非経口及び局所投与などが含まれるが、これらに制限されない。
【００５６】
本明細書で、“担体”は、細胞または組織内に化合物の付加を容易にする物質を意味する。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞または組織内に多くの有機化合物の投入を容易にするのに通常使われる担体である。
【００５７】
本明細書で、“希釈剤”は、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解させる水で希釈される物質として定義される。バッファー溶液に溶解されている塩は、当該分野で希釈剤として使われている。通常使われるバッファー溶液は、ヒト溶液の塩形態を摸倣しているホスフェートバッファー食塩水である。バッファー塩は、低い濃度で溶液のｐＨを制御できるため、バッファー希釈剤が化合物の生物学的活性を変形させることは稀である。
【００５８】
本明細書で、“製薬的に許容される”は、化合物の生物学的活性と物性を損傷しない性質を意味する。
【００５９】
本発明の化合物は、所望の目的によって、様々な製薬的投与形態に剤形化することができる．本発明に係る医薬組成物を製造する際に、活性成分、具体的に、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）の化合物、その製薬的に許容される塩または異性体を製造しようとする製剤によって選択できる様々な製薬的に許容される担体と共に混合する。例えば、本発明に係る医薬組成物は、所望の目的によって、注射用製剤、経口用製剤等に剤形化することができる。
【００６０】
本発明の化合物は当分野において知られている製薬用担体と賦形剤を利用する当分野において知られている方法で製剤化され、単位用量のまたは多用量の容器に入れることができる。製剤の形態は、油または水性媒体中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であり、通常の分散剤、懸濁剤または安定化剤を含有することができる。また、例えば、使用前に無菌、発熱物質が除去された水に溶かして使用する乾燥粉末の形態であってもよい。本発明の化合物は、また、カカオバターまたはその他グリセリドのような通常の坐剤基剤を利用して坐剤形態に製剤化してもよい。経口投与用固体投与形態は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が可能である。特にカプセル剤と錠剤が有用である。錠剤及び丸剤は腸溶性錠剤として製造することが好ましい。固体投与形態は、本発明の化合物をスクロース、ラクトース、デンプンなどの一つ以上の不活性希釈剤及びステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、崩壊剤、結合剤などの担体と混合することによって製造することができる。
【００６１】
本発明は、また、活性成分として、上記一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）の化合物、その製薬的に許容される塩またはその異性体、及び許容可能な担体を含む、抗酸化効果を有する化粧品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００６２】
本発明の医薬組成物は、優れた抗酸化活性を有することによって、様々な酸化的ストレスに起因する疾患を効率的に予防又は治療することができる。
【００６３】
また、本発明の医薬組成物は、心筋細胞のミトコンドリア機能障害、低酸素損傷、壊死及び虚血性再潅流損傷を抑制することによって、心臓及び心血管疾患を効率的に予防または治療することができる。また、冠動脈迂回術、冠動脈経皮形成術などの手術療法または血栓溶解剤などを用いた薬物療法のような再潅流療法手術時に、心臓保護剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］−アミン（化合物９）の細胞内での抗酸化効果を、ＤＨＲ１２３プローブを用いて評価した写真である。
【図２】化合物９の細胞内での抗酸化効果をＭｉｔｏＳＯＸ  ｒｅｄ  プローブを用いて評価した写真である。
【図３】化合物９を処理した群と処理しない群との肝臓の左葉を比較した写真である。
【図４】化合物９を処理したときと処理しなかったときの虚血性再潅流損傷後のＡＬＴとＡＳＴ値を示したグラフである。
【図５】化合物９を１３ｍｇ／ｋｇ投与した群と投与しない群との組織染色の比較を示す写真である（ＩＲ：虚血再灌流損傷）。
【図６】化合物９を投与した群と投与しない群の顕微鏡上での比較結果を示すグラフである（肝細胞変性、肝類洞のうっ血、炎症性細胞浸潤）。
【図７】化合物９を４．５ｍｇ／ｋｇ投与した群と虚血及び再潅流損傷対照群のＨＭＧＢ１レベルの比較を示すグラフである。
【図８】化合物９を処理した群と処理しない群との、虚血性再潅流損傷後のミトコンドリア複合体Ｉ活性の比較を示すグラフである。
【図９】化合物９処理後のＨＭＧＢ１放出を測定したグラフである。
【図１０】化合物９処理後、化合物９によるＡＴＰ量の変化を測定したグラフである。
【図１１】細胞壊死に対して化合物９の保護効果を示すために、ＦＤＡとＰＩ二重染色したＨ９Ｃ２細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１２】細胞壊死に対して化合物９の保護効果を示すために、直接数えた細胞数を示すグラフである。
【図１３】細胞壊死に対して化合物９の保護効果を示すために、ＦＡＣＳ分析結果を示すグラフである。
【図１４】ミトコンドリアの膨張に対する化合物９の抑制効果を示すグラフである。
【図１５】化合物９のミトコンドリア保護効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】虚血性再潅流損傷（Ｉ／Ｒ）モデルで左室膨脹に対する化合物９の抑制効果を示すグラフである。
【図１７】Ｉ／Ｒ損傷後、左室の画分短縮に対する化合物９の抑制効果を示すグラフである。
【図１８】化合物９とシクロスポリンＡを比較するＭＴ（Massoｎ-Trichrome）染色法によって心臓繊維化を示すイメージである。
【図１９】実験例２の肝臓手術を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
本発明は、下記実施例を参照して詳細に説明されるが、本発明の範囲がこれらによって制限されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
実施例１：シクロペンチル−（２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミンの製造
工程Ａ：４−ニトロ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
３−ニトロ−ベンゼン−１，２−ジアミン（１．０ｇ、６．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かした溶液に、ベンズアルデヒド（０．６９ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で２日間撹拌した。反応完結後、溶媒を真空留去し、残渣をカラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（１．１ｇ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (500HMz, DMSO); δ 8.68 (s, 1H), 7.43~7.31 (m, 5H), 7.18 (s, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.36 (t, 1H), 6.29 (d, 1H)
【００６７】
工程Ｂ：７−ニトロ−２−フェニル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
工程Ａで得られた４−ニトロ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（１．１ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を酢酸（１０ｍＬ）に溶かし、８０℃で３時間撹拌した。反応完結後、水を加え、酢酸エチルで抽出し、１Ｎ−水酸化ナトリウムで洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ液を減圧下で蒸留し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（０．９１、収率８３％）を得た。
1H-NMR (400HMz, DMSO); δ 13.3 (br s, 1H), 8.37 (d, 2), 8.15 (d, 2H), 7.65~7.56 (m, 3H), 7.46 (t, 1H)
【００６８】
工程Ｃ：２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イルアミン
工程Ｂで得られた７−ニトロ−２−フェニル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（０．１３７ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）と水（５ｍＬ）で溶かした。溶液に鉄粉（０．４０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）と塩化アンモニウム（０．３９ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応完結後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ液を減圧下で蒸留し、残渣をカラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（０．１２ｇ、収率７９％）を得た。
1H-NMR (500HMz, DMSO); δ 12.5 (s, 1H), 8.10 (d, 2H), 7.55~7.45 (m, 3H), 6.87 (t, 1H), 6.67 (d, 1H), 6.32 (d, 1H), 5.21 (s, 2H)
【００６９】
工程Ｄ：シクロペンチル−（２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン
工程Ｃで得られた２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イルアミン（０．０４０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（５ｍＬ）に溶かした。溶液に、酢酸（０．０１２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、シクロペンタンオン（０．０４８ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）とトリアセトキシ−水素化ホウ素ナトリウム（０．０４９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応完結後、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ液を減圧下で蒸留し、残渣をカラム・クロマトグラフィーで精製して、表題の化合物（０．０２６ｍｇ、収率４９％）を得た。
1H-NMR (40HMz, CDCl3); δ 9.36 (br s, 1H), 8.02 (m, 2H), 7.56~7.45 (m, 3H), 7.17 (t, 1H), 6.83 (d, 1H), 6.47 (d, 1H）5.06 (br s, 1H), 4.02 (m, 1H), 2.13 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.69 (m, 4H)
【００７０】
実施例２:（２−フェニル−３Ｈ−ベンズイミダゾール−４−イル）−（テトラヒドロ−フラン−４−イル）−アミンの製造
実施例１の工程Ｃで得られた２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イルアミン（０．０４０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）とテトラヒドロ−フラン−４−カバーアルデヒド（０．０２６ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｄと同様の方法により、表題の化合物（０．０３０ｍｇ、収率５１％）を得た。
1H-NMR (40HMz, CDCl3); δ 8.02 (m, 2H), 7.56~7.45 (m, 3H), 7.17 (t, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.44 (d, 1H）4.05 (dd, 1H), 3.45 (td, 2H), 3.27 (d, 2H), 2.02 (m, 1H), 1.85 (m, 2H), 1.45 (m, 2H)
【００７１】
実施例３：シクロペンチル−（２−フェニル−２−イル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン
２−カルボキシアルデヒド、３−ニトロ−ベンゼン−１，２−ジアミン及びシクロペンタノンを用いて、実施例１と同様の方法により、表題の化合物を得た。
1H-NMR (40HMz, CDCl3); δ 1.64 (m, 6H), 2.10 (m, 2H), 4.14 (s, 1H), 6.38~6.34 (d, 1H), 6.69~ 6.71 (d, 1H), 7.09~7.13 (t, 1H), 7.25~7.26 (m, 1H), 7.75~7.79 (m, 1H), 8.40~8.41 (d, 1H), 8.54~8.55 (m, 1H).
【００７２】
以下に、本発明の効果を以下の実験例により説明する。実験例に用いられた化合物は以下のとおりである。
化合物１：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−酢酸
化合物２：｛（Ｓ）−２−［５−メチル−７−（テトラヒドロピラン−４−イルアミノ）−１Ｈ−インドール−２−イル］−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル｝−酢酸
化合物３：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−オキサゾール−４−イル］−酢酸
化合物４：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−酢酸
化合物５：［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−フェノキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−酢酸
化合物６：４−｛２−［（Ｓ）−２−（７−シクロペンチルアミノ−５−フェノキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−４,５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル］−エチル｝−ピペラジン−２−オン
化合物７：シクロペンチル−（２−｛（Ｓ）−４−［２−（３−メチル−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７−イル）−エチル］−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル｝−５−フェノキシ−１Ｈ−インドール−７−イル）−アミン
化合物８：（（Ｓ）−２−｛７−［（テトラヒドロピラン−４−イルメチル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル）−酢酸
化合物９：（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１,１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］−アミン
化合物１０：［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−（テトラヒドロピラン−４−イル）メチル−アミン
化合物１１:［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−ビス−［（テトラヒドロピラン−４−イル）メチル］−アミン
化合物１２：｛４−［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イルアミノ］−ピペリジン−１−イル｝−（テトラヒドロピラン−３−イル）メタノン
化合物１３：［５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−（１−メチルスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミン
化合物１４:（（Ｓ）−２−｛５−メチル−７−［（テトラヒドロピラン−４−イルメチル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−４，５−ジヒドロ−チアゾール−４−イル）−酢酸
実施例１：シクロペンチル−（２−フェニル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−アミン
実施例２：（２−フェニル−３Ｈ−ベンズイミダゾール−４−イル）−（テトラヒドロ−フラン−４−イル）−アミン
【００７３】
実験例１：壊死阻害剤の抗酸化効果（anti-oxidant effect）
各化合物に対する抗酸化効果を測定するために、下記実験を実施した：総抗酸化効果を測定するＤＰＰＨ方法、ジヒドロローダミン（Dihydrorhodamine）１２３を用いた抗酸化効果測定法、細胞に酸化的ストレスを引き起こすｔＢＯＯＨを用いる壊死阻害測定法、ＯＮＯＯ−（ペルオキシ亜硝酸）の除去能力の測定方法、並びに各化合物等のＨ2Ｏ2（過酸化水素）及びｔＢＯＯＨに対した直接的な抗酸化効果の測定方法を用いた。
【００７４】
実験例１−１：ＤＰＰＨを用いた抗酸化効果測定
ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）は、安定なフリーラジカルであり、紫色を有している。ＤＰＰＨが化合物により還元されれば、ＤＰＰＨのカラーが黄色に転換される原理を用いて、特定化合物の抗酸化効果を測定した。ＤＰＰＨは５１７ｎｍで強い吸収を示し、還元させると、カラーが黄色に転換され、５１７ｎｍでの吸収される程度が減る。この時、オリジナルの吸収を５０％程度に減少させる化合物の濃度をＩＣ50値とした。
【００７５】
ＤＭＳＯに２００μｍのＤＰＰＨ溶液（１８０μＬ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに分注し、２０００μｍから連続的に２倍希釈した、化合物（２０μＬ）を、ＤＰＰＨが入っているプレートに加えた。それらをよく混合し、室温で３０分間放置した。３０分後、５１７ｎｍでのＯ．Ｄ．値をｓｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＥＬＩＳ  Ａｒｅａｄｅｒで測定した。その結果を表１に示した。
【表１】
2013508452.tif 000008
【００７６】
実験例１−２：ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ１２３）を用いた抗酸化効果測定
ジヒドロローダミン１２３自体は非蛍光性であるが、ＲＯＳ（活性酸素種）やＲＮＳ（活性窒素種）によって酸化されると、ローダミン１２３に転換される。細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで化合物の抗酸化効果はこれら特性により測定した。Ｈ９Ｃ２細胞を９６ウェルプレートに１．５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルに分注した。翌日、細胞を、最高濃度から連続的に３倍希釈した各化合物で１時間前処理した後、ＤＨＲ１２３  １２．５μｍストック溶液１０μＬ（最終濃度１.２５μｍ）で３７℃培養器にて３０分間処理した。３０分が経過したら、直ちにｔＢＯＯＨ（４００μＭ）で処理し、２時間インキュベーションした。次いで、４８０ｎｍで励起して、５３８ｎｍで放出される蛍光をｓｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｇｅｍｉｎｉ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒで測定した。ここで、ＩＣ25とは、酸化ストレスの増加によってＤＨＲ１２３の酸化により発せられたｔＢＯＯＨ処理２時間後の蛍光を１００％としたときの２５％の抑制を引き起こす化合物の濃度を意味する。実験結果を表２に示す。さらに、化合物が実際に細胞に対する抗酸化効果を有しているかを確かめるために、上記アッセイが終わった後、９６ウェルプレートにて細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＰＢＳ（１００μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、各細胞の蛍光を免疫蛍光顕微鏡検査（光学顕微鏡：オリンパス社製）で測定（細胞内のＤＨＲ１２３により、酸化に比例して蛍光が発される）した。結果を図１に示す。また、ＭｉｔｏＳＯＸ  ｒｅｄ  ｐｒｏｂｅ（最終濃度：５μｍ）を用いて、同じ方法でスーパーオキシドの生成阻害を測定した。
【表２】
2013508452.tif 000009
【００７７】
実験例１−３  ｔＢＯＯＨにより誘導される酸化ストレスに対する細胞保護効果
ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＯＯＨ）は、様々な細胞で酸化ストレスを誘発して細胞壊死を誘導することが知られている。したがって、抗酸化効果による細胞壊死の阻害は、ｔＢＯＯＨをＨ９Ｃ２細胞に処理することによって測定した。Ｈ９Ｃ２細胞を９６ウェルプレートに１．５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルで分注した。翌日、細胞を各化合物で前処理した後、ｔＢＯＯＨ（最終濃度：４００μｍ）で２時間、処理した。ホルムアルデヒド（５０μＬ）を各ウェルに加えて、細胞を固定した。３０分間細胞を固定し、蒸留水で３回洗浄した。その後、プレートを５０℃乾燥器で完全に乾燥し、ＳＲＢ溶液を加えて、残っているタンパク質量を染色した。プレートを１％酢酸で洗浄し、乾燥した。次に、プレートに１０Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（１００μＬ）を加えて、染料を再溶解し、ｓｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｅｌｉｓａ  ｒｅａｄｅｒで、５９０ｎｍと６５０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定することで、ＩＣ50を求めた。ＩＣ50とはｔＢＯＯＨ処理によって誘導される細胞の壊死を５０％保護する化合物の濃度を意味する。実験結果を下記表３に示す。
【表３】
2013508452.tif 000010
【００７８】
実験例１−４：ジヒドロローダミン１２３を用いたＯＮＯＯ−（ペルオキシナイトライト）除去能の測定
ＲＮＳの一種として知られているＯＮＯＯ−は、酸化ストレスで非常に重要な役割を果たしている。従って、壊死阻害剤のＯＮＯＯ−除去能を評価することは非常に重要である。ＤＨＲ１２３  ｐｒｏｂｅはＯＮＯＯ−により酸化されることはよく知られている。従って、このような特性を用いることによって、各化合物の効果を測定した。
各化合物を５０μＭから連続的に３倍希釈して、１０μＬを９６−ウェルプレートの各ウェルに分注した。その後、測定混合物（１０μＭ  ＤＨＲ１２３、１×ＰＢＳ、１００μＭ  ＤＰＴＡ（ＯＮＯＯ−なしに））１７０μＬを各ウェルに加えた。最後に、ＯＮＯＯ−溶液（最終濃度：１μｍ）２０μＬを加えて、反応を開始した。ＩＣ50とはＯＮＯＯ−によるＤＨＲ１２３の酸化を５０％阻害する化合物の濃度を意味する。
【００７９】
化合物のＯＮＯＯ−除去能の構造−活性連関性（ＳＡＲ）の結果を表４に示す。
【表４】
2013508452.tif 000011
【００８０】
実験例１−５：Ｈ2Ｏ2及びｔＢＯＯＨに対する直接的な抗酸化効果
インドール構造を有する壊死阻害剤の抗酸化効果を調べるために、特定のＲＯＳであるＨ2Ｏ2（ハイドロゲンペルオキシド）とｔＢＯＯＨに対する直接的な抗酸化効果を評価した。
【００８１】
ＤＭＥＭ完全培地（１００μＬ）で希釈した各化合物（１０μＬ）に、ＤＨＲ１２３ｐｒｏｂｅ（最終濃度：１．２５μＭ）１０μＬを加えた。Ｈ2Ｏ2およびｔＢＯＯＨを下記表５に示された濃度になるよう加え、２時間後、波長４８０ｎｍ（ｅｘ）／５３８ｎｍ（ｅｍ）にてｓｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｇｅｍｉｎｉを用いて蛍光を測定した。ここで、ＩＣ25とはＨ2Ｏ2およびｔＢＯＯＨによるＤＨＲ１２３の酸化により発される蛍光を１００％としたとき、２５％の減少をもたらす化合物の濃度を意味する。
【表５】
2013508452.tif 000012
【００８２】
実験例２：ビーグル犬における虚血及び再潅流による肝損傷に対する化合物９の保護効果
実験デザイン：
８．５〜１１．５ｋｇの２７匹の健常なビーグル犬が実験のために選ばれた。この実験は牙山病院倫理委員会の承認を受けて遂行された。肝臓のグリコーゲン蓄積を最小化するために術前に犬を２４時間絶食し、毛を除去した。犬は対照群Ａ（ｎ＝９）、Ｂ（ｎ＝６）、Ｃ（ｎ＝６）、Ｄ（ｎ＝６）に無作為に群分けした。気管内挿管が行われ、ｚｏｌｅｔｉｌと２．５％エンフルランで一般的な麻酔を行った。セファゾリンとケトロラックは倫理委員会で承認された手順に従って抗生剤と鎮痛剤としてそれぞれ使用した。
【００８３】
手術手順：
犬を暖かい毛布を敷いた、左、右側に温水入れボトルのある手術台に横にした。左外頸静脈と右側大伏在静脈は２１ゲージＩＶカテーテルで開放されたアプローチを通して挿管した。右側内部頸動脈を切開し、手術の間、血流動態をよく把握するために、迂回挿管した。完全な静脈内接近が得られた後、２．５％エンフルランの吸入により麻酔を維持した。クリスタルロイド溶液は１５ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で投与した。
薬物処置群であるＢ、Ｃ、及びＤにＩＶで左側肝臓の流動を閉塞する２０分前に、それぞれ１３ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇの薬物を投与した。併用用量及び点滴はＣmax１２．５ｍｇ／ｍＬ（ａｔ  ２０ｍｉｎ）がＣss５ｍｇ／ｍＬになるように行った。全ての犬は手術する間、１５分毎に血圧、心臓脈動数、呼吸率及び動脈血酸素飽和度を点検しながらモニタリングした。手術はＴ字型切開により遂行された。肝十二指腸間膜は腹膜小網を分けた後、隔離された。膽嚢と肝の４番目の葉を確保し、ｈｉｌａｒ構造に沿ってやさしく上側にサーチしていった。図１９のａは、Ｃａｎｔｌｉｅ’ｓ  ｌｉｎｅに沿って分けられ肝臓の左葉と右葉を示している。１９のｂは典型的なｈｉｌａｒ構造を示している。ヒトでは右側茎が肝臓体積の６０−７０％を占める。左側肝臓の流動を９０分間、閉塞して、虚血損傷を誘導後、クランプを離して６０分間再潅流損傷を誘導した（図１９のｃ）。したがって、このモデルは９０分虚血損傷と６０分再潅流損傷を利用するシステムである。手術後、腹腔と皮膚を閉じた。
【００８４】
血液サンプリングと生検：
全血液検査値（ＦＢＥ；Ｈｂ、ＷＣＣ、ＨＣＴ、Ｐｌｔ、ＭＣＲ、ＭＣＨ及びＭＣＨＣ）、肝機能テスト（ＬＦＴ；ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ、及び総ビリルビン）、ウレア及び電解質（Ｕ＆Ｅ；ＢＵＮとクレアチン）、肝生検（組織病理及びＨ＆Ｅ染色）並びにＨＭＧＢ１測定を含む血液サンプリング及び肝生検を予め決まった間隔で行った。光学及び電子マイクロ写真が肝細胞の形状を分析するために使われた。ビーグル犬は継続的な鎮痛剤投与及び軟らかい高タンパク食を提供することによって、手術後、暖かく清潔な環境に保った。そして、手順に従い４８時間後に屠殺した。結果を図３、４及び５に示す。
【００８５】
ＩＲ損傷後組織学的分析：
肝生検体を固定と脱水後に、パラフィン包埋を経て４μｍの厚さに切断した後、マイヤーヘマトキシリン−エオシン方法を通して染色し、光学顕微鏡で観察した。全てのサンプルは無作為に分配され、ｂｌｉｎｄで分析された。サンプルは肝細胞変性と壊死、類洞及び門脈鬱血、そして炎症細胞沈着のために分析された。組織観察は移転報告方法（Hafez T et al., Journal of Surgical Research 2007; 138: 88-99）に従って定量的な方法で等級化−（０（０％、なし）、１（１−２５％、軽微）、２（２６−５０％、中程度）、または３（５１−１００％、顕著）−した。結果を図６に示す。
【００８６】
ＨＭＧＢ１測定：
ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して販売元のプロトコールに従い測定した。結果を図７に示す。
【００８７】
ミトコンドリア複合体Ｉ活性測定：
肝組織は氷冷バッファーＡ（３２０ｍｍスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で２回洗浄した。それらを小片に切断し、１ｇ当たり４ｍＬ  ＡＴバッファー（７５ｍＭスクロース、２２５ｍＭ  マンにトール、１ｍＭ  ＥＧＴＡ及び０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）をガラス−テフロン  ホモジナイザーに入れてホモジナイズした。ホモジネートを４℃で５分間、１０００ｇで遠心分離し、上清を再び２回１３０００ｇで遠心分離した。ミトコンドリアが豊富化された塊をミトコンドリア複合体Ｉ活性の測定に用いた。複合体Ｉ活性（ＮＡＤＨ：ＣｏＱ酸化還元酵素）はデシルウビキノン（decylubiquinone）存在下に、ＮＡＤＨのロテノン感受性の減少を３４０ｎｍでモニタリングすることにより測定した。結果を図８に示す。
【００８８】
実験例３：ｔＢＯＯＨ処理後のＨＭＧＢ１放出に対する化合物９の抑制効果
細胞の壊死が起こるとき、ＨＭＧＢ１が放出されることはよく知られている。従って、酸化的ストレスを与えるｔＢＯＯＨ４００μｍ濃度での処理後、ＨＭＧＢ１放出に対する化合物９の抑制効果を試験した。
Ｈ９Ｃ２細胞を１．５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルで分注した。翌日、化合物９を３０分間、１０μＭ濃度で処理した。ｔＢＯＯＨ（最終濃度４００μＭ）で処置した後、上清（５０μＬ）を時間別に採取し、ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡを用いてＨＭＧＢ１のレベルを測定した。結果は図９に示す。
【００８９】
実験例４：ｔＢＯＯＨ処理後の全ＡＴＰ量の変化の観察
細胞は壊死の過程でＡＴＰ量が減少を示す。ＡＴＰ量の維持は細胞の生存に非常に重要である。従って、ｔＢＯＯＨで処理した後、ＡＴＰ量の変化を観察した。
Ｈ９Ｃ２細胞を１．５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルにて分注し、翌日、化合物９を３０分間、１０μｍ濃度で処理した。ｔＢＯＯＨ（最終濃度：４００μｍ）で処理した後、細胞内に残っているＡＴＰ量をＡＴＰモニタリングキット（Perkin ElmerLife Sciences）を用いて測定した。その結果を図１０に示す。
【００９０】
実験例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血性再潅流損傷後の細胞壊死に対する化合物９の保護効果
虚血性再潅流損傷後、Ｈ９Ｃ２細胞の壊死に対する化合物９の保護効果を測定するために、以下の実験を実施した：ＦＤＡおよびＰＩの二重染色法、細胞数測定法、ＦＡＣＳ分析法、及びミトコンドリアの膨張測定法。
細胞培養及び低酸素損傷の条件：
Ｈ９Ｃ２細胞をＦＢＳと抗生剤が含有するＤＭＥＭ培地で培養した。細胞の８０−９０％が融合したとき、上記実験を行った。実験２４時間前に、Ｈ９Ｃ２細胞を３５ｍｍフラスコと１５０ｍｍフラスコとに接種した。細胞の約８０％が融合したとき、０．５％ＦＢＳと抗生剤が含有されたＤＭＥＭ培地に変えた。細胞は２４時間、低酸素チェンバーで培養した。２３．５時間後に、低酸素チェンバー内で各種化合物［０．０１％ＤＭＳＯ、化合物９（２０μｍ）、ビタミンＣ（１０μｍ）、及びｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２０μｍ）］で細胞を処理した。細胞を３７℃培養器に移し、再培養直前に４００μｍのＨ２Ｏ２で細胞を処理した。再酸素化（Reoxygenation）を１．５時間行った。
【００９１】
実験例５−１：Ｈ９Ｃ２における虚血性再潅流損傷後の、ＦＤＡとＰＩ二重染色による保護効果の測定
３５ｍｍ蛍光用フラスコで培養されたＨ９Ｃ２細胞をＦＤＡ／ＰＩで二重染色した。ＦＤＡ（フルオレセイン二酢酸、シグマ社製）とＰＩ（propidium iodide）原液を準備した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４．５μＬのＦＤＡ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）と４μＬのＰＩ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍＬの細胞培地に加えた。蛍光顕微鏡によりＦＤＡ／ＰＩ染色画像を得た。実験結果を図１１に示す。
【００９２】
実験例５−２：Ｈ９Ｃ２における虚血性再潅流損傷後の、ＦＤＡとＰＩ二重染色細胞の細胞数計測による保護効果の測定
実験例５−１で蛍光顕微鏡によりＦＤＡ／ＰＩ染色画像を得た後、生細胞と死細胞の数をＩｍａｇｅ  Ｐｒｏを使用して計測した。実験結果を図１２に示す。
【００９３】
実験例５−３：Ｈ９Ｃ２における虚血性再潅流損傷後の、アネキシンＶとＰＩ二重染色細胞のＦＡＣＳ分析による保護効果の測定
アポトーシスまたは壊死細胞をＦＩＴＣおよびアネキシンＶアポトーシス検出キットで染色し、フローサイトメーターを用いて分析した。３５ｍｍフラスコで培養した細胞を、ＰＩおよびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ処理の、無処理、単独及び二重染色の３群に分けた。再酸素化後、収集された細胞を１０分間、４℃、２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清培地を除去し、アネキシンＶ−結合緩衝溶液で再懸濁した細胞をＰＩ（５μＬ）とアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ）で１５分間、暗室で染色後、ＦＡＣＳ分析を行った。実験結果を図１３に示す。
【００９４】
実験例５−４：Ｈ９Ｃ２における虚血性再潅流損傷後の、ミトコンドリア膨脹に対する抑制効果の測定
ミトコンドリア膨脹測定のため１５０ｍｍフラスコで培養されたＨ９Ｃ２細胞を使用した。O．０５％トリプシンで細胞を回収した後、４℃、２０００ｒｐｍで、１０分間、遠心分離した。上清を除去後、細胞をＰＢＳで洗浄した。２０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間、再遠心分離した後、上清を捨てた。得られた細胞塊を５００μＬのろ過単離バッファー（filrated isolating buffer）（３００ｍＭマンニトール、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ウシ血清アルブミン）に加え、次の実験に用いた。シリンジで破砕された細胞をトリパンブルー染色液でテストした。大部分の細胞が砕かれたら、直ちに４分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。ミトコンドリアを含む上清を集め、１０分間４℃、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨てた後、ミトコンドリア塊を１００μＬのインキュベーションバッファー（１５０ｍ  ＭＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４））に再懸濁した。タンパク質濃度は、タンパク質定量キットで定量した。単離したミトコンドリアタンパク質の一定量を９６ウェル培養プレートに分注し、分光光度計を用いて５１３ｎｍで測定した。実験結果を図１４に示す。
【００９５】
実験例５−５：Ｈ９Ｃ２における虚血性再潅流損傷後の、Ｍｉｔｏ  ＴｒａｃｋｅｒおよびＰＩ二重染色の使用によるミトコンドリア混濁及び核壊死の測定
ミトコンドリア視角化及び３Ｄイメージ：
３５ｍｍ蛍光フラスコで培養されたＨ９Ｃ２細胞のミトコンドリアを視角化するため、ＤＭＳＯに溶かした１ｍＭ  Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭを用意した。細胞を培地で洗浄後、０．５ｍＭ  Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭとＰＩ（４μＬ）溶液を使用して二重染色した。１時間後、細胞を蛍光顕微鏡で分析し、Ｉｍａｒｉｓプログラムを用いて３Ｄイメージを得た。
【００９６】
電子顕微鏡：
フラスコの底にカーバースリップのある２４ウェルプレートで培養されたＨ９Ｃ２細胞を用いた。細胞を２％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．４）で固定した。細胞をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄後、１％ＯｓＯ4及び１．５％カリウムで１時間、後固定をした。細胞をＰＢＳ緩衝溶液と蒸留水で２回連続的に洗浄し、ろ過した０．５％酢酸ウラニルを用いて、４℃にて一晩細胞を処理した。細胞を蒸留水で２回洗浄し、エタノールで脱水し、２回に亘ってそれぞれ１時間、Ｅｐｏｎに包埋した。細胞を６０℃で、２日間、Ｅｐｏｎ内でポリマー化し、電子顕微鏡分析を行った。
【００９７】
蛍光免疫染色：
ＯＣＴ−包埋組織断片を０．０５％氷冷ＴＢＳＴで３回に亘って１０分ずつ洗浄した。組織断片を１％ＢＳＡ含有ブロッキング溶液で、１時間、室温で処理した。重鎖心臓ミオシン免疫蛍光染色のために、１次抗体として抗マウス重鎖心臓ミオシン（１：１００、Abcam）で組織断片を処理した。組織断片をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、２次抗体のｄｏｎｋｅｙ抗マウス  ６３３ＩｇＭ（Invitrogen）で染色し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。コムギ胚芽凝集素染色のために、組織断片を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５コムギ胚芽凝集素（Invitrogen）で１０分間、３７℃で処理した。アルファ−サルコメアアクチン免疫蛍光染色のために、組織切片を１次抗体の抗アルファ−サルコメアアクチンで処理し、４℃で、２４時間培養した。組織切片を０．０５％ＴＢＳＴで２回洗浄後、２次抗体のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｄｏｎｋｅｙ抗−マウスＩｇＧ（Invitrogen）で染色をした。組織切片を５秒間ヘマトキシリン（Sigma）で染色し核染色した。組織切片をマウントした後、蛍光顕微鏡でイメージを得た。結果を図１５に示す。
【００９８】
実験例６：ＳＤラットにおける虚血／再潅流による心臓損傷に対する化合物９の保護効果
動物の管理：
２７０−３６０ｇの雄性ＳＤラットをソウル大学校動物センターから購入した。マウスを明暗周期１２時間のセミ特定病原体未感染状態（semi-specific pathogen free）で、温度および湿度はそれぞれ２２℃、５５％に維持した。標準の固形ｒｏｄｅｎｔ  ｃｈｏｗ及び水道水を制限なく供給した。全ての実験動物は実験遂行前１週間、適応期間を有しており、ソウル大学校病院のＩＡＣＵＣの承認のもとで進められた。
【００９９】
手術準備：
1週間の適応期間後、ラットをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、YuhanCorp., Seoul, Korea）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、Bayer, Shawnee Mission, Kansas）の混合物を腹腔注入して麻酔した。適当な麻酔と基本心エコー検査の評価後、全ての動物に１００％酸素を提供した。
４５分間、ＬＡＤを一時結紮して虚血性再潅流を誘導した。ＬＡＤは動脈上にポリエチレン−１０管のある８−０  Ｅｔｈｉｌｏｎ（Ethicon）を用いて、４５分間、結紮した。虚血は、心筋と心室頻脈の漂白により肉眼で確認した。
ラットを、対照群（０．９％生理食塩水５ｍＬ）、シクロスポリン処理群（２５ｍｇ／ｋｇ、０．９％生理食塩水の５ｍＬ）、及び化合物９を処理群（３０ｍｇ／ｋｇ、５％デキストロースの５ｍＬ）の３群に分類して実験した。薬物は、動物輸液ポンプを使用して尾静脈を通して２０分間継続して注入した。
結紮とポリエチレン−１０管を除去することによって再潅流を開始し、最初の数分で損傷された心筋の典型的な充血変化による特徴を再潅流として定義した。緩くなった縫合断片を終了について虚血領域を定義するために残した。
手術後、化合物９を処理した群は３日間、一日に一度、同じ量の薬を経口投与した。残りの群も同じ容量で投与した。
【０１００】
心エコー検査による梗塞されたラット心臓の機能分析：
麻酔下で左側半胸郭の毛を除去した。経胸壁心エコー検査は冠動脈結紮の直前に遂行し、リニアアレイトランスデューサが取り付けられたドップラー心エコーシステムを用いて、データを収集した。心臓は胸骨傍長軸短軸像の２次元モードを使用してイメージ化した。乳頭筋を含む短軸像は心室中隔とＬＶ後壁に垂直にＭ−モードカーソルを位置させるために使用した。訓練期間の間に得られたイメージは記録しなかった。左心室拡張末期（ＬＶＥＤＤ）及び収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）は、American Society of Echocardiographyの最先端方法によって測定した。ＬＶのパーセント（％）短縮率は、１００×（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤの式で求めた。
【０１０１】
梗塞されたラット心臓の組織分析：
心筋虚血後、３日目に、ラットを麻酔した。梗塞サイズを評価するために、パラフィン包埋されたＬＶ切片を４μｍスライスに切断した。好中球はヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡で観察した。各切片の１ｍｍ2面積内の炎症細胞の数を数えた。イメージ分析システム（Image Pro version 4.5; MediaCybernetics, Bethesda, Maryland, USA）を用いて、マッソン・トリクローム染色された繊維化面積を分析した。繊維化面積は、各心臓で２個の独立された切片を用いて行い、数値分析のために平均値が使用された。
【０１０２】
免疫組織学染色と分析のために、ラット心臓の８μｍ切片を用いたＯＣＴ−化合物（Tissue-Teck, Sakura, Torrance, California）に入れ、急速冷却保管した。染色は、動物当たり（ｎ＝３）１０個の任意のＨＰＦ内に陽性細胞数を測定して定量した。アポトーシスを評価するためにＴＵＮＥＬアッセイ（Chemicon S7100 kit, Chemicon, Temecula, California, USA）とＣａｓｐａｓｅ−３に対する免疫組織染色法を行った。ＴＵＮＥＬまたはｃａｐａｓｅ−３に対する陽性細胞は、各動物当たり最小限３個の別の切片に対して、１０個の別の顕微鏡領域を決めて測定した。
【０１０３】
免疫蛍光染色は、抗心臓トロポニンＩ（Santa Cruz Biotechnology）で行った。即ち、グリーンＦＩＴＣを結合させたヤギ抗−ラビットＩｇＧ抗体（Molecular Probes）を検出に用いた。レッドＰＩ染色は核を示すために、Ｆｌｕｒｏ  ３５０によるブルーＡｌｅｘａ  ＨＭＧＢ１染色は核を示すために染色した。赤色Ｄｉｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＭＳＣと緑色コネキシン−４３または心臓トロポニンＩ発現の共局在化は、蛍光顕微鏡（LSM 510 META, Carl Zeiss, Peabody, Massachusetts, USA）で観察した。
【０１０４】
梗塞サイズ測定：心筋の虚血性再潅流損傷（Ｉ／Ｒ）７２時間後に決定された梗塞サイズはＡＡＲ（area at risk）パーセンテージで評価した。ＬＶ（左心室）に対するＡＡＲの比率は、Ｉ／Ｒで影響を受けた心筋組織の程度を示す。ＩＳ／ＡＡＲ比率は損傷された心筋内におけるＩＳを決定するための正確な指標であり、薬物処理効果を評価できる主要エンドポイントである。ＡＡＲを決定するために、左側冠状動脈を再び結紮し、４％Ｅｖａｎｓ青色色素を逆行方法で胸部大動脈を通して注入した。迅速に心臓を取り出し、０．９％生理食塩水に入れ、洗浄後、冷凍庫（−２０℃）に保管した。心臓を５個の１ｍｍクロス切片に切断した。心臓切片はまたホルムアルデヒドに入れる前１５分間３７℃の１％塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液に保管した後、ホルムアルデヒド溶液に入れた。正常組織は赤く染色され、梗塞組織は白く染色された。心臓切片は顕微鏡下、デジタルモード（Canon EOS 400D）で写真撮影し、ＩＳ、ＡＡＲ、及び全ＬＶ面積はＩｍａｇｅＰｒｏ   ソフトウェア（version 1.34）で測定した。
【０１０５】
数値分析：
全てのデータを平均値（ＳＥ）で表した。継続された変数をスチューデントのｔ検定によって比較し、多重比較はボンフェローニ事後的補正（Bonferroni post hoc correction）により分散分析法で行った。Ｐ＜０．０５値であれば、統計的に有意性あるものと判断し、全ての分析をＳＰＳＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １７．０ （SPSS, Chicago, Illinois, USA）を用いて行った。
左室膨脹（ＬＶ）に対する化合物９の抑制効果を図１６に、Ｉ／Ｒ損傷後、ＬＶ短縮率に対する化合物９の抑制効果を図１７に、心筋線維症に対して、化合物９とＣｓＡを比較分析した結果を図１８にそれぞれ示す。
【図１】
2013508452.tif 000020
【図２】
2013508452.tif 000021
【図３】
2013508452.tif 000022
【図４】
2013508452.tif 000023
【図５】
2013508452.tif 000024
【図６】
2013508452.tif 000025
【図７】
2013508452.tif 000026
【図８】
2013508452.tif 000027
【図９】
2013508452.tif 000028
【図１０】
2013508452.tif 000029
【図１１】
2013508452.tif 000030
【図１２】
2013508452.tif 000031
【図１３】
2013508452.tif 000032
【図１４】
2013508452.tif 000033
【図１５】
2013508452.tif 000034
【図１６】
2013508452.tif 000035
【図１７】
2013508452.tif 000036
【図１８】
2013508452.tif 000037
【図１９】
2013508452.tif 000038
【国際調査報告】
2013508452.tif 000039
2013508452.tif 000040
2013508452.tif 000041
2013508452.tif 000042