(57)【要約】  プロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合し、両方向において増幅を始動することができる、プロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を増幅するための、具体的には閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成するためのプライマー。
2013535210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖型直鎖状デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を生成するためのインビトロ無細胞法であって、
（ａ）少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１種のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、前記少なくとも１種のプライマーが、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップと、
（ｂ）閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件下で、（ａ）で生成された増幅ＤＮＡを少なくとも１つのプロテロメラーゼと接触させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ鋳型が、別の鎖の鎖置換複製を介して複製された鎖の置換によって前記鋳型の増幅を促進する条件下でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが配列番号２のｐｈｉ２９もしくはその変異体であり、かつ／または前記プロテロメラーゼが配列番号１５のバクテリオファージＮ１５  ＴｅｌＮもしくはその変異体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を増幅するためのインビトロ無細胞法であって、
少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１種のプライマーの存在下、別の鎖の鎖置換複製を介して複製された鎖の置換によって前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、前記少なくとも１種のプライマーが、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップ
を含む方法。
【請求項５】
前記鋳型の増幅が、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型の増幅が、単一種のプライマーの存在下で行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーが、下記：
配列番号３０  ＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴ／ＣＧＡ／ＴＴＡＡＣＡＣＡＣ
配列番号３１  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡ／ＧＣＴ／ＡＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３２  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ
配列番号３３  ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣ
配列番号３４  ＣＡＣＡＣＡＡＴＡ／ＴＧＣ／ＴＣＣＡＴ
配列番号３５  ＡＴＧＧＡ／ＧＣＡ／ＴＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３６  ＣＧＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡ
配列番号３７  ＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴ
配列番号３８  ＣＡＴＡＴＣＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣ
配列番号３９  ＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧ
配列番号４０  ＴＡＴＡＴＴＡＡ／ＴＡＡＡＡ／ＴＴ／ＡＡＡＴＣＡＴ
配列番号４１  ＡＴＡＴＡＡＴＴ／ＡＴＴＴＴ／ＡＡ／ＴＴＴＡＧＴＡ
から選択される配列からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
増幅されたＤＮＡが、前記ＤＮＡ鋳型から増幅されたＤＮＡ配列のタンデム単位を含むコンカテマーを含む、先行のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３に従属している場合、または請求項１〜３に従属している請求項５〜７に従属している場合、前記コンカテマーが、前記プロテロメラーゼによって増幅されたＤＮＡ配列の単一単位に分解される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項４に従属している場合、または請求項４に従属している請求項５〜７に従属している場合、前記コンカテマーが、制限エンドヌクレアーゼによって増幅されたＤＮＡ配列の単一単位に分解される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
プロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合し、両方向において増幅を始動することができるプライマー。
【請求項１２】
場合によりホスホロチオエート結合を含む、長さにして６〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載のプライマー。
【請求項１３】
前記パリンドローム配列の半分にのみ特異的に結合する、請求項１１または１２に記載のプライマー。
【請求項１４】
配列番号２５〜２９の配列のいずれか１つに結合することができる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項１５】
下記：
配列番号３０  ＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴ／ＣＧＡ／ＴＴＡＡＣＡＣＡＣ
配列番号３１  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡ／ＧＣＴ／ＡＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３２  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ
配列番号３３  ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣ
配列番号３４  ＣＡＣＡＣＡＡＴＡ／ＴＧＣ／ＴＣＣＡＴ
配列番号３５  ＡＴＧＧＡ／ＧＣＡ／ＴＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３６  ＣＧＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡ
配列番号３７  ＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴ
配列番号３８  ＣＡＴＡＴＣＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣ
配列番号３９  ＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧ
配列番号４０  ＴＡＴＡＴＴＡＡ／ＴＡＡＡＡ／ＴＴ／ＡＡＡＴＣＡＴ
配列番号４１  ＡＴＡＴＡＡＴＴ／ＡＴＴＴＴ／ＡＡ／ＴＴＴＡＧＴＡ
から選択される配列からなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプライマー、および少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含むキット。
【請求項１７】
（ａ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼであり、かつ／または
（ｂ）キットが、少なくとも１つのプロテロメラーゼ、および場合により請求項１〜３、もしくは請求項１〜３に従属している請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法において使用するための使用説明書をさらに含む、
請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
宿主における抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
前記抗原をコードする前記ＤＮＡ鋳型を用いて、請求項１〜３または請求項１〜３に従属している請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
前記抗原が前記宿主において発現され、前記抗原に対する免疫応答を誘導するように、前記抗原をコードする、得られた閉鎖型直鎖状ＤＮＡを前記宿主に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子を含む医薬組成物を製造するための方法であって、請求項１〜３または請求項１〜３に従属している請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに、得られた閉鎖型直鎖状ＤＮＡを製剤化するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテロメラーゼ標的配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型を増幅するためのパリンドロームプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
大量のＤＮＡを増幅するための従来の細胞ベースの方法はコストが高い。例えば、細菌の使用は、高価な発酵器での大容量でのその増殖を必要とし、培養物の汚染を防ぐために、発酵器は無菌状態に維持する必要がある。また、細菌を溶解させて、増幅されたＤＮＡを放出させる必要もあり、ＤＮＡは他の細菌成分から清浄化および精製されなければならない。特に、ＤＮＡワクチンまたは他の治療用ＤＮＡ剤を生成する場合、哺乳動物に対して毒性である内毒素の存在を排除するために高い純度が要求される。
【０００３】
コストの問題に加えて、多くの場合、細菌の使用は、増幅プロセスの確実性に関する困難性を示す場合がある。細菌細胞の複雑な生化学的環境では、所望のＤＮＡ産物の品質および収量を制御することは困難である。時には、細菌が、増幅されたＤＮＡ内のクローニングされた必要とされる遺伝子を変化させて、それを、必要とされる目的に対して役に立たないものにしてしまう場合がある。また、組換え事象は、対象とするＤＮＡの確実な生成において問題をもたらす場合がある。ＤＮＡの増幅のための無細胞酵素法は、宿主細胞の使用のための要件を回避させ、したがって有利である。
【０００４】
例えば、医薬用ＤＮＡカセットの製造は、ほとんど、細菌プラスミドへのそれらの挿入および細菌発酵法でのそれらの増幅だけを利用する。
【０００５】
技術プロセスでのこの現状は、多くの点で、このようなＤＮＡ医薬の製造を改良するための機会を制限している。さらに、プラスミド製品は、本質的に、その医薬機能に必要ないヌクレオチド配列を含む点で粗精製ＤＮＡ分子である。したがって、ＤＮＡ医薬などのＤＮＡ製品の製造の分野では、大量のＤＮＡを増幅するための改良された方法を提供する必要性がある。特に、閉鎖型直鎖状ＤＮＡなどの特別な形態のＤＮＡを増幅するための改良された方法を提供する必要性がある。閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子は、ＤＮＡの他の形態と比較して、改善された安定性および安全性を有するため、治療的用途に対して格別な有用性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＤＮＡ鋳型を増幅するための少なくとも単一種（single species）のプライマーの使用に関する。プライマーは、直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡ（閉鎖型（closed）直鎖状（linear）ＤＮＡ）を生成するために使用することができる。鋳型ＤＮＡは、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含む。本発明のプライマーは、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合し、両方向において増幅を始動する（prime）ことができる。こうして、単一種のプライマーだけが、各鋳型を始動するために必要とされる。さらに、増幅されたＤＮＡ産物の均質性に関して、他の形態のプライマーと比較して恩恵が得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、以下を提供する：
プロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合し、両方向において増幅を始動することができるプライマー。
閉鎖型直鎖状デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を生成するためのインビトロ無細胞（cell-free）法（process）であって、
（ａ）少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１種（one species）のプライマーの存在下、該鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、少なくとも１種のプライマーが、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップと、
（ｂ）閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件下で、（ａ）で生成された増幅ＤＮＡを少なくとも１つのプロテロメラーゼと接触させるステップと
を含む方法。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を増幅するためのインビトロ無細胞法であって、
少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１種のプライマーの存在下、別の鎖の鎖置換複製（strand displacement replication）を介して複製された鎖の置換によって該鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、該少なくとも１種のプライマーが、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップ
を含む方法。
【０００８】
さらに、本発明は、本発明の方法において必要なコンポーネントを提供するキットにも関する。したがって、本発明は、本発明による少なくとも１種のプライマー、および少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含むキットを提供する。キットは、少なくとも１つのプロテロメラーゼ、および場合により本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡを増幅するための方法において使用するための使用説明書をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バクテリオファージにおける直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡの複製およびプロテロメラーゼの役割を示す図である。Ａ．染色体外バクテリオファージ直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡの図示。＊＝テロメアのパリンドローム配列の中心。Ｒ配列は、Ｌ配列の逆方向パリンドローム反復である。Ｂ．宿主内でのバクテリオファージＤＮＡの複製：バブルはＤＮＡ鎖の複製を示す。ＲおよびＬに対する相補鎖の合成により、同一の二本鎖ＲＬ配列がもたらされる。Ｃ．プロテロメラーゼの作用により形成される産物。プロテロメラーゼはＲＬ配列に結合し、パリンドローム配列の中心点で反対鎖を切断し、連結して、テロメアを再形成させ、元の直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡの複製を完了させる。
【図２】その標的部位であるｔｅｌＲＬを含む環状二本鎖ＤＮＡに対する大腸菌（Escherichia coli）ファージＮ１５プロテロメラーゼ（ＴｅｌＮ）の作用を示す図である。ＴｅｌＲＬは、矢印により示される２８ｂｐの右腕（ｔｅｌＲ）および左腕（ｔｅｌＬ）を有する逆方向パリンドロームである。下線部の配列は、ｔｅｌＲＬパリンドローム中の不完全な部分を示している。中央の２２ｂｐの完全逆方向パリンドロームＴｅｌＯが、酵素ＴｅｌＮの結合に必要である。ＴｅｌＮはその中心点でこの２２ｂｐ配列を切断し、相補鎖の末端を結合させて、共有結合閉鎖型末端を形成させる。
【図３】種々の生物で見出されるプロテロメラーゼ標的配列の比較を示す図である。四角で囲まれた配列は、完全または不完全パリンドローム配列の範囲を示す。下線は、パリンドローム中の不完全な部分を示す。強調された塩基対配列は、全てのプロテロメラーゼ標的配列に共通であり、このことは、プロテロメラーゼの結合および作用に対するその重要性を示す。Ａ．大腸菌（Escherichia coli）ファージＮ１５。Ｂ．クレブシエラファージＰｈｉ  ＫＯ２。Ｃ．エルシニアファージＰｙ５４。Ｄ．ハロモナスファージＰｈｉ  ＨＡＰ。Ｅ．ビブリオファージＶＰ８８２。Ｆ．ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）プラスミドｌｐＢ３１．１６。四角で囲まれた配列は、各バクテリオファージについての完全または不完全パリンドローム配列の範囲を示す。Ｇ．バクテリオファージプロテロメラーゼの結合および作用に対するコンセンサス逆方向パリンドローム配列を示す。これは、２２塩基対の完全逆方向反復配列である（切断部位のそれぞれの側に１１塩基対）。コンセンサス配列は、Ａ〜Ｅについて示された強調された保存残基に由来する。保存された塩基対およびパリンドローム中でのそれらの位置を示す。ダッシュは、配列組成における柔軟性を示し、すなわち、塩基はＮ（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得る。
【図４】プロテロメラーゼＴｅｌＮのパリンドローム結合配列から形成されたテロメア末端を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡ鋳型の増幅を示す図である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅を開始するために、テロメア末端に結合し得る単一の特定のパリンドロームプライマーの例である。
【図５】プロテロメラーゼＴｅｌＮ（ｔｅｌＲＬ）についての逆方向パリンドローム結合配列を含む環状二本鎖ＤＮＡ鋳型の増幅を示す図である。ＤＮＡ増幅を開始するために、ｔｅｌＲＬ部位での２つの相補的ＤＮＡ鎖に特異的に結合し得る単一のパリンドロームプライマーの例である。
【図６】単一の特定のパリンドロームプライマーおよびＲＣＡ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼをＴｅｌＮプロテロメラーゼと組み合わせて用いる、閉鎖型直鎖状ＤＮＡのインビトロ製造についての具体的な方法を示す図である。  Ａ．閉鎖型直鎖状ＤＮＡ鋳型。Ｂ．環状二本鎖ＤＮＡ鋳型。ＲおよびＬは、ＴｅｌＮプロテロメラーゼ結合配列の右腕および左腕のＤＮＡ配列を示す。Ｃ．環状一本鎖ＤＮＡを形成させるための開始鋳型の変性。Ｄ．単一の特異的プライマーの結合。Ｅ〜Ｆ．ＲＣＡ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる一本鎖ＤＮＡ鋳型からのローリングサークル増幅（rolling circle amplification）。Ｇ．プロテロメラーゼ結合配列（ＲＬ）により分離された、増幅された鋳型の単一単位を含む長いコンカテマー二本鎖ＤＮＡの形成。Ｈ．ＲＬ配列に特異的なＴｅｌＮプロテロメラーゼとの接触。プロテロメラーゼは、ＲＬ部位でコンカテマーＤＮＡを切断し、相補鎖を連結して、直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡ鋳型の増幅コピーを生成させる。
【図７Ａ】Ａ．ランダムヘキサマーと単一の特異的プライマー配列である配列番号３２、３３、３４および３５を用いた、４．３ｋｂの二本鎖環状鋳型からのｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼによる３０℃でのコンカテマーＤＮＡ生成の速度を示す図である。増幅されたコンカテマーＤＮＡをＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。ｘ軸：時間（時）；ｙ軸：ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。  ＤＮＡ合成の初期速度：●ランダムヘキサマープライマー（８８μｇ／ｍｌ／時）  ■配列番号３２（２５μｇ／ｍｌ／時）  ▲配列番号３３（１０μｇ／ｍｌ／時）  ▼配列番号３４（１７．５μｇ／ｍｌ／時）  ◆配列番号３５（１１μｇ／ｍｌ／時）
【図７Ｂ】Ｂ．ランダムヘキサマーと単一の特異的プライマー配列である配列番号３２および３３を用いた、４．３ｋｂの二本鎖環状鋳型からのｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼによる３４℃でのコンカテマーＤＮＡ生成の速度を示す図である。増幅されたコンカテマーＤＮＡをＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。ｘ軸：時間（時）；ｙ軸：ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。  ＤＮＡ合成の初期速度：●ランダムヘキサマープライマー（３２．５μｇ／ｍｌ／時）  ■配列番号３２（１５μｇ／ｍｌ／時）  ▲配列番号３３（５．２μｇ／ｍｌ／時）
【図８Ａ】Ａ：ＤＮＡのローリングサークル増幅における３０℃での単一のオリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較を示す図である。ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたコンカテマーＤＮＡ産物の電気泳動ゲル。レーン１〜５は、鋳型ＤＮＡ増幅の１時間後のＨｉｎｄＩＩＩ消化された産物を示し、レーン６〜１０は増幅２時間後、レーン１１〜１５は増幅４時間後、レーン１６〜２０は増幅６時間後を示す。ＤＮＡ増幅反応を以下のように始動した：レーン１、６、１１、１６（ランダムヘキサマー）、レーン２、７、１２、１７（配列番号３２（１１マー）プライマー）、レーン３、８、１３、１８（配列番号３３（１１マー）プライマー）、レーン４、９、１４、１９（配列番号３４（１５マー）プライマー）およびレーン５、１０、１５、２０（配列番号３５（１５マー）プライマー）。  分離された試料は、レーン２（１２５ｎｇ）、レーン３（４８ｎｇ）、レーン４（９０ｎｇ）、レーン５（７０ｎｇ）、レーン８（１００ｎｇ）、レーン９（２００ｎｇ）およびレーン１０（１３１ｎｇ）を除いて、２５０ｎｇのコンカテマーＤＮＡの消化から誘導された。４．３ｋｂの特異的生成バンドは、矢印によって指示された各レーンにおいて明確に見られる。
【図８Ｂ】Ｂ．ＤＮＡのローリングサークル増幅における３４℃での単一のオリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較を示す図である。ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたコンカテマーＤＮＡ産物の電気泳動ゲル。レーン１〜３は、鋳型ＤＮＡ増幅の１時間後のＨｉｎｄＩＩＩ消化された産物を示し、レーン４〜６は増幅２時間後、レーン７〜９は増幅４時間後、レーン１０〜１２は増幅６時間後、レーン１３〜１５は増幅９時間後を示す。ＤＮＡ増幅反応を以下のように始動した：レーン１、４、７、１０、１３（ランダムヘキサマー）、レーン２、５、８、１１、１４（配列番号３２（１１マー）プライマー）、レーン３、６、９、１２、１５（配列番号３３（１１マー）プライマー）。分離された試料は、レーン１（５ｎｇ）、レーン３（６３ｎｇ）およびレーン６（１０６ｎｇ）を除いて、２５０ｎｇのコンカテマーＤＮＡの消化から誘導された。４．３ｋｂの特異的生成バンドは、矢印によって指示された各レーンにおいて明確に見られる。
【図８Ｃ】Ｃ．ＤＮＡのローリングサークル増幅における３４℃での単一のオリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較を示す図である。プロテロメラーゼＴｅｌＮ消化されたコンカテマーＤＮＡ産物の電気泳動ゲル。レーン１〜３は、鋳型ＤＮＡ増幅の１時間後のＴｅｌＮ消化された産物を示し、レーン４〜６は増幅２時間後、レーン７〜９は増幅４時間後、レーン１０〜１２は増幅６時間後、レーン１３〜１５は増幅９時間後を示す。ＤＮＡ増幅反応を以下のように始動した：レーン１、４、７、１０、１３（ランダムヘキサマー）、レーン２、５、８、１１、１４（配列番号３２（１１マー）プライマー）、レーン３、６、９、１２、１５（配列番号３３（１１マー）プライマー）。分離された試料は、レーン１（５ｎｇ）、レーン３（６３ｎｇ）およびレーン６（１０６ｎｇ）を除いて、２５０ｎｇコンカテマーＤＮＡの消化から誘導された。４．３ｋｂの特異的生成バンド（このケースでは閉鎖型直鎖状ＤＮＡ）は、矢印によって指示された各レーンにおいて明確に見られる。
【図９】エンドヌクレアーゼ消化された増幅産物についての濃度測定量（Densitometry trace）を示す図である。矢印は４．３ｋｂの特異的産物を示す。Ａ．レーン１１〜１５の濃度測定量、図８Ａにおける上部から下部パネル。Ｂ．レーン１０〜１２の濃度測定量、図８Ｂにおける上部から下部パネル。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列の説明
配列番号１は、バチルスバクテリオファージｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼの核酸配列である。
配列番号２は、配列番号１によりコードされるバチルスバクテリオファージｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ピロコッカス属種Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメラーゼＩの核酸配列である。
配列番号５は、配列番号４によりコードされるバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列である。
配列番号６は、ハロモナスファージｐｈｉＨＡＰ−１プロテロメラーゼ核酸配列の核酸配列である。
配列番号７は、配列番号６によりコードされるハロモナスファージｐｈｉＨＡＰ−１プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号８は、エルシニアファージＰＹ５４プロテロメラーゼの核酸配列である。
配列番号９は、配列番号８によりコードされるエルシニアファージＰＹ５４プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。 
配列番号１０は、クレブシエラファージｐｈｉＫＯ２プロテロメラーゼの核酸配列である。
配列番号１１は、配列番号１０によりコードされるクレブシエラファージｐｈｉＫＯ２プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ビブリオファージＶＰ８８２プロテロメラーゼの核酸配列である。
配列番号１３は、配列番号１２によりコードされるビブリオファージＶＰ８８２プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１４は、大腸菌（Escherichia coli）バクテリオファージＮ１５プロテロメラーゼ（ｔｅｌＮ）および二次免疫リプレッサー（ｃＡ）核酸配列の核酸配列である。
配列番号１５は、配列番号１４によりコードされる大腸菌（Escherichia coli）バクテリオファージＮ１５プロテロメラーゼ（ｔｅｌＮ）のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、バクテリオファージプロテロメラーゼ標的配列中に存在する完全逆方向反復のコンセンサス核酸配列である。
配列番号１７は、大腸菌（E. coli）ファージＮ１５およびクレブシエラファージｐｈｉＫＯ２由来の２２塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号１８は、エルシニアファージＰＹ５４由来の２２塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号１９は、ハロモナスファージｐｈｉＨＡＰ−１由来の２２塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号２０は、ビブリオファージＶＰ８８２由来の２２塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号２１は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）プラスミドｌｐＢ３１．１６由来の１４塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号２２は、ビブリオファージＶＰ８８２由来の２４塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号２３は、エルシニアファージＰＹ５４由来の４２塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号２４は、ハロモナスファージｐｈｉＨＡＰ−１由来の９０塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号２５は、プロテロメラーゼ標的配列を含む大腸菌（E. coli）ファージＮ１５由来の核酸配列である。
配列番号２６は、プロテロメラーゼ標的配列を含むクレブシエラファージｐｈｉＫＯ２由来の核酸配列である。
配列番号２７は、プロテロメラーゼ標的配列を含むエルシニアファージＰＹ５４由来の核酸配列である。
配列番号２８は、プロテロメラーゼ標的配列を含むビブリオファージＶＰ８８２由来の核酸配列である。
配列番号２９は、プロテロメラーゼ標的配列を含むボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）プラスミドｌｐＢ３１．１６由来の核酸配列である。
配列番号３０は、配列番号２５のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３１は、配列番号２５のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３２は、配列番号２５または配列番号２６のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３３は、配列番号２５または配列番号２６のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３４は、配列番号２５のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３５は、配列番号２５のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３６は、配列番号２７のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３７は、配列番号２７のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３８は、配列番号２８のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号３９は、配列番号２８のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号４０は、配列番号２９のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号４１は、配列番号２９のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、プロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を増幅するための、典型的には、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子を生成するためのプライマー、それらのプライマーを用いた方法、およびそれらのプライマーを含むキットに関する。
【００１２】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子は、典型的には、ヘアピンループとも記載される共有結合閉鎖型末端を含み、この場合、相補的ＤＮＡ鎖間の塩基対形成は存在しない。ヘアピンループが、相補的ＤＮＡ鎖の末端同士を結合させる。このタイプの構造は、典型的には、閉鎖型構造で末端ヌクレオチドを封じ込めること（sequestering）により、染色体ＤＮＡの欠失または損傷を防ぐために、染色体のテロメア末端で形成される。本明細書に記載される閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子の例では、ヘアピンループは相補的に塩基対形成したＤＮＡ鎖に隣接し、「ドギーボーン」型構造を形成する（図１に示されている）。
【００１３】
本発明のプライマーは、ＤＮＡ鋳型内に含まれるプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができる。プライマーは、両方向において増幅を始動することができ、そのため、鋳型あたりただ１種のプライマー分子が必要とされる。閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成する従来の方法は、複数のランダムプライマーを利用していた。これは複数の独立した始動事象、よって高レベルの増幅をもたらすが、プライマーはコード配列内で結合する可能性があり、したがって、このような配列を十分に増幅できない。プロテロメラーゼ標的配列への本発明のプライマーの特異的結合は、鋳型の非常に多数の完全なコピーを確実にする。
【００１４】
したがって、本発明者らによって得られたランダムプライマーとの比較データによって示されるように、本発明のプライマーを用いることで、産物ＤＮＡの増幅されたコピーのより均一な集団の提供が可能となる。
【００１５】
典型的には、本発明のプライマーは、所定のパリンドローム配列の半分にのみ結合しまたは特異的に結合して、プライマー内およびプライマー間の結合の出現を最小にする。プライマーの長さは様々であってもよく、例えば、長さにして１２、１５、１８、２０、３０または５０ヌクレオチドである。プライマーは、パリンドローム配列の半分の全体または一部を覆う、長さにして６〜５０、１２〜５０、１８〜５０、２５〜５０または３５〜５０ヌクレオチドであってもよい。プライマーの長さは、プロテロメラーゼ酵素の結合および機能を改善するために、所定の鋳型において、存在するパリンドローム配列を超えて導入される相補的な追加のパリンドローム配列に伸長してもよい。プライマーは未標識であってもよく、または１つまたは複数の標識、例えば放射性核種もしくは蛍光色素を含んでもよい。また、プライマーは、典型的には、プライマーが加水分解に対する抵抗性を改善されるように、化学的に修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、プライマーは、好ましくは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含んでもよい。
【００１６】
プライマー設計および製造の日常的な方法を、任意の同定されたプロテロメラーゼ標的配列に特異的に結合することができるプライマーの生成に適用してもよい。プライマーの長さ／配列は、典型的には、増幅ステップにおいて用いられる温度で鋳型に結合することができるように、温度検討に基づいて選択してもよい。
【００１７】
最適には、本発明のプライマーは、相補（ｃｏｎｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列を分離するために、変性後にＤＮＡ鋳型に効率的に結合する。標準的な増幅法における変性は、典型的には、高温の「融解」ステップを伴う。したがって、プライマーは、二本鎖ヌクレオチドが一本鎖に分離する温度である融解温度、すなわちＴｍによって画定され得る。
【００１８】
本発明の方法は、プロテロメラーゼ標的配列を含む鋳型の配列を増幅するための上記プライマーを利用する。この方法は、別の鎖の鎖置換複製を介して複製された鎖の置換によって該鋳型の増幅を促進する条件下で鋳型ＤＮＡを増幅する単一のステップを含んでもよい。これは、好都合には、ランダムプライマーを用いて行われる鎖置換増幅反応において増幅された産物ＤＮＡの様々な不均質性と関連した問題に対処する。
【００１９】
本発明の好ましい方法は、ＤＮＡ増幅ステップ、および増幅されたＤＮＡを閉鎖型直鎖状ＤＮＡに変換するさらなるステップを包含する方法において、本発明のプライマーを利用することによって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子のハイスループット生成を提供する。
【００２０】
本発明の方法は、インビトロ無細胞環境において行われ、例えば、限定されないが、細菌繁殖に必要な外部配列を有するＤＮＡ鋳型の使用が挙げられる。下記に概説するように、したがって、本発明の方法は、問題になるベクター配列を欠損し、特に治療的使用に適している閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子を生成するために用いることができる。
【００２１】
閉鎖型ＤＮＡ分子は、治療薬、すなわち、インビボで遺伝子産物を発現させるために用いることができるＤＮＡ医薬として、格別な有用性を有する。これは、それらの共有結合閉鎖型構造が、エキソヌクレアーゼなどの酵素による攻撃を防ぎ、このことが、露出したＤＮＡ末端を有する「開放型」ＤＮＡ分子と比較して、遺伝子発現の増強された安定性および長期性をもたらすためである。直鎖状二本鎖開放型末端カセットは、宿主組織に導入された場合、遺伝子発現に関して不十分であることが実証されている。これは、細胞外空間でのエキソヌクレアーゼの作用によるカセットの不安定性に起因している。
【００２２】
また、ＤＮＡ末端を共有結合閉鎖型構造の内部に封じ込めることは他の利点も有する。ＤＮＡ末端がゲノムＤＮＡに組み込まれることが防止され、したがって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子は改善された安全性を有する。また、閉鎖型直鎖状構造は、宿主細胞内でのＤＮＡ分子のコンカテマー化を防ぎ、したがって、遺伝子産物の発現レベルを、より繊細に調節することができる。本発明は、鋳型特異的ＤＮＡ増幅、およびプロテロメラーゼによる増幅ＤＮＡの特異的プロセシングを含む、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子の生成のためのインビトロ無細胞法を提供する。
【００２３】
典型的には、本発明の方法は、特にＤＮＡワクチンにおける、宿主細胞でのインビトロ発現のためのＤＮＡを生成するために用いることができる。典型的には、ＤＮＡワクチンは、感染性生物のＤＮＡの改変型をコードする。ＤＮＡワクチンは対象に投与され、そこで次に感染性生物の選択されたタンパク質を発現し、典型的に防御的であるタンパク質に対する免疫応答を惹起する。また、ＤＮＡワクチンは、癌免疫療法アプローチにおける腫瘍抗原をコードする場合もある。
【００２４】
ＤＮＡワクチンは、多数の状態の治療または予防のための抗原をコードする核酸配列を含むことができ、限定されないが、状態は以下を含む：癌、アレルギー、毒性、および限定されないが、真菌、ウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、ＨＳＶ２／ＨＳＶ１、インフルエンザウイルス（Ａ、ＢおよびＣ型）、ポリオウイルス、ＲＳＶウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス群、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプステイン・バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス；細菌、例えばヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、クラミジア、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、シゲラ属、サルモネラ属、コレラ菌（Vibrio cholerae）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、シュードモナス属、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ属、野兎病菌（Franciscella tularensis）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、ペスト菌（Yersinia pestis）、連鎖球菌（Ａ型およびＢ型）、肺炎球菌、髄膜炎菌（Meningococcus）、インフルエンザ菌（ｂ型）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、カンピロバクター症、カタラリス菌（Moraxella catarrhalis）、ドノバン症（Donovanosis）、および放線菌症；真菌病原体、例えばカンジダ感染およびアスペルギルス症；寄生性病原体、例えばテニア属、吸虫、回虫、アメーバ症、ランブル鞭毛虫症（Giardiasis）、クリプトスポリジウム属、住血吸虫属（Schistosoma）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、トリコモナス症および旋毛虫病（Trichinosis）などの病原体による感染。
【００２５】
ＤＮＡワクチンは、アデノウイルス科（例えば、ヒトアデノウイルスを含む）、ヘルペスウイルス科（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＥＢＶ、ＣＭＶおよびＶＺＶを含む）、パポバウイルス科（例えば、ＨＰＶを含む）、ポックスウイルス科（例えば、天然痘およびワクシニアを含む）、パルボウイルス科（例えば、パルボウイルスＢ１９を含む）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルスを含む）、コロナウイルス科（例えば、ＳＡＲＳを含む）、フラビウイルス科（例えば、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイルスを含む）、ピコルナウイルス科（ポリオウイルス、ライノウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスを含む）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルスを含む）、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルスおよびエボラウイルスを含む）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよび麻疹ウイルスを含む）、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルスを含む）、ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルスを含む）、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスを含む）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶを含む）およびヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスを含む）のメンバー由来の抗原をコードする核酸配列を含むことができる。
【００２６】
抗原は、獣医学的疾患に関与する病原体に由来するものであってもよく、特に、ウイルス性病原体に由来するものであってもよく、例えば、レオウイルス（アフリカウマ病ウイルスまたはブルータングウイルスなど）およびヘルペスウイルス（ウマヘルペスを含む）を含んでもよい。抗原は、口蹄疫ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ＳＡＲＳ、西ナイルウイルスおよびハンターンウイルスに由来するものであってもよい。抗原は、免疫不全ウイルスに由来するものであってもよく、例えば、ＳＩＶまたはネコ免疫不全ウイルスに由来するものであってもよい。
【００２７】
また、本発明の方法により生成されるＤＮＡワクチンは、腫瘍抗原をコードする核酸配列を含んでもよい。腫瘍関連抗原の例としては、限定されないが、精巣癌抗原（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、ＭＡＧＥファミリーのメンバー（ＭＡＧＥ１、２、３など）、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＳＸ−２、分化抗原、例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２およびＣＥＡ、突然変異型自己抗原およびウイルス腫瘍抗原、例えば、癌原性ＨＰＶタイプに由来するＥ６および／またはＥ７が挙げられる。特定の腫瘍抗原のさらなる例としては、ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｐ９７、ベータ−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、Ｐ１Ａ、ＥｐＣａｍ、メラノーマ抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量メラノーマ抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭ（前立腺ムチン抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、前立腺分泌タンパク質、α−フェトプロテイン、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＴＡＧ−７２、ＢＲＣＡ−１およびＢＲＣＡ−２抗原が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の方法は、他のタイプの治療用ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子治療で用いられるものを生成することができる。例えば、このようなＤＮＡ分子は、機能的遺伝子を発現するために用いることができ、この場合、対象は、その遺伝子の機能不全型により引き起こされる遺伝的障害を有する。このような疾患の例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症が挙げられる。遺伝子治療が有用であり得る他の疾患には、炎症疾患、自己免疫疾患、慢性疾患および感染性疾患が含まれ、例えば、ＡＩＤＳ、癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症、種々の貧血、サラセミアおよび血友病をはじめとする種々の血液障害、ならびに肺気腫などの障害が挙げられる。固形腫瘍の治療のために、毒性ペプチド（すなわち、リシン、ジフテリア毒素およびコブラ毒因子などの化学療法剤）をコードする遺伝子、ｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、形質転換癌遺伝子に対してアンチセンスのｍＲＮＡ配列をコードする遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および他のサイトカインなどの抗新生物ペプチド、または形質転換癌遺伝子のトランスドミナント劣性突然変異体を発現させてもよい。
【００２９】
また、治療用ＤＮＡ分子の他のタイプも、本発明の方法による生成について意図される。例えば、活性なＲＮＡ形態に転写されるＤＮＡ分子、例えば小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を本発明の方法に従って生成してもよい。
【００３０】
治療用途を有するＤＮＡ分子の生成を対象とする実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、典型的には、１つまたは複数のプロモーターまたはエンハンサーエレメント、および対象となるｍＲＮＡもしくはタンパク質をコードする遺伝子または他のコード配列を含む発現カセットを含む。ＤＮＡワクチン分子または遺伝子治療のためのＤＮＡ分子の生成を対象とする特定の実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、対象となるタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された真核生物プロモーター、ならびに場合によりエンハンサーおよび／または真核生物転写終結配列からなる発現カセットを含む。典型的には、ＤＮＡ鋳型は、遺伝子を維持するために通常用いられるベクター、例えば、プラスミドなどの染色体外遺伝的エレメントの形態であってもよい。
【００３１】
「プロモーター」は、ポリヌクレオチドの転写を開始および調節するヌクレオチド配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより抑制される）、および構成的プロモーターを含み得る。「プロモーター」または「制御エレメント」なる用語は、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。
【００３２】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらの通常の機能を果たすように構成されたエレメントの配置を意味する。したがって、核酸配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、その配列の発現をもたらすことができる。その発現をもたらすように機能する限り、プロモーターは配列に連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、それでもコード配列に「作動可能に連結された」とみなすことができる。したがって、「作動可能に連結された」なる用語は、転写複合体によるプロモーターエレメントの認識に際して、対象となるＤＮＡ配列の転写の開始を可能にする、プロモーターエレメントと対象となるＤＮＡ配列とのいかなる距離または方向も包含するものと意図される。
【００３３】
本発明によれば、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子は、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡ鋳型から増幅されたＤＮＡに対するプロテロメラーゼの作用によって生成される。
【００３４】
プロテロメラーゼ標的配列は、ＤＮＡ鋳型中でのその存在が、プロテロメラーゼの酵素活性による閉鎖型直鎖状ＤＮＡへのその変換を可能にするいずれかのＤＮＡ配列である。言い換えれば、プロテロメラーゼ標的配列は、共有結合閉鎖型直鎖状ＤＮＡを形成するために、プロテロメラーゼによる二本鎖ＤＮＡの切断および再連結に必要である。
【００３５】
典型的には、プロテロメラーゼ標的配列は、任意の完全なパリンドローム配列、すなわち二回の回転対称を有する任意の二本鎖ＤＮＡ配列（本明細書中で完全逆方向反復とも記載される）を含む。図３に示されるように、種々の中温性バクテリオファージ、および細菌プラスミドに由来するプロテロメラーゼ標的配列は全て、完全逆方向反復を含むという共通の特徴を共有する。完全逆方向反復の長さは、具体的な生物によって異なる。ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）においては、完全逆方向反復は、長さにして１４塩基対である。種々の中温性バクテリオファージにおいては、完全逆方向反復は長さにして２２塩基対以上である。また、いくつかのケース（例えば、大腸菌（E. coli）Ｎ１５）においては、中央の完全逆方向パリンドロームが、逆方向反復配列に挟まれ、すなわち、より長い不完全逆方向パリンドロームの一部分を形成している（図２および３を参照されたい；下線部の塩基は、逆方向反復の対称性が妨げられている箇所を示す）。
【００３６】
本発明で用いられるプロテロメラーゼ標的配列は、好ましくは、長さにして少なくとも１４塩基対の二本鎖パリンドローム（完全逆方向反復）配列を含む。好ましい完全逆方向反復配列には、配列番号１６〜２１の配列およびその変異体が含まれる。配列番号１６（ＮＣＡＴＮＮＴＡＮＮＣＧＮＮＴＡＮＮＡＴＧＮ）は、中温性バクテリオファージ完全逆方向反復についての２２塩基のコンセンサス配列である。図３に示されるように、完全逆方向反復の塩基対は、種々のバクテリオファージ間である種の位置で保存されているが、他の位置では配列の柔軟性が可能である。したがって、配列番号１６は、本発明の方法におけるバクテリオファージプロテロメラーゼとの使用に関して、完全逆方向反復配列の最小限のコンセンサス配列である。
【００３７】
配列番号１６により画定されるコンセンサス内において、配列番号１７（ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ）は、大腸菌（E. coli）ファージＮ１５（配列番号１５）、およびクレブシエラファージＰｈｉ  ＫＯ２（配列番号１１）プロテロメラーゼとの使用に関して、特に好ましい完全逆方向反復配列である。また、配列番号１６により画定されるコンセンサス内において、配列番号１８〜２０：
配列番号１８（ＧＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣ）、
配列番号１９（ＣＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＧ）、
配列番号２０（ＧＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣ）、
は、それぞれ、エルシニアファージＰＹ５４（配列番号９）、ハロモナスファージｐｈｉＨＡＰ−１（配列番号７）、およびビブリオファージＶＰ８８２（配列番号１３）由来のプロテロメラーゼとの使用に関して、特に好ましい完全逆方向反復配列である。配列番号２１（ＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴ）は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）プロテロメラーゼとの使用に関して、特に好ましい完全逆方向反復配列である。この完全逆方向反復配列は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）に含まれる直鎖状共有結合閉鎖型プラスミドであるｌｐＢ３１．１６に由来する。この１４塩基の配列は、バクテリオファージの２２ｂｐのコンセンサス完全逆方向反復（配列番号１６）よりも短く、これは、細菌のプロテロメラーゼ同士が、バクテリオファージプロテロメラーゼに対する特異的標的配列の要件において異なっている場合があることを示している。しかしながら、全てのプロテロメラーゼ標的配列は、完全逆方向反復という共通の構造モチーフを共有している。
【００３８】
完全逆方向反復配列は、本発明の方法において用いられる特異的なプロテロメラーゼの要件に応じて、長さにして２２ｂｐよりも長い場合がある。こうして、いくつかの実施形態においては、完全逆方向反復は、長さにして少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０または少なくとも１００塩基対であってもよい。このような完全逆方向反復配列の例としては、配列番号２２〜２４およびその変異体が挙げられる：
配列番号２２（ＧＧＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣ）
配列番号２３
（ＡＣＣＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴ）
配列番号２４
（ＣＣＴＡＴＡＴＴＧＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＣＡＴＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＡＴＡＴＡＧＧ）
配列番号２２〜２４およびその変異体は、それぞれ、ビブリオファージＶＰ８８２（配列番号１３）、エルシニアファージＰＹ５４（配列番号９）およびハロモナスファージｐｈｉ  ＨＡＰ−１（配列番号７）に由来するプロテロメラーゼとの使用に関して特に好ましい。
【００３９】
完全逆方向反復には、追加の逆方向反復配列が隣接していてもよい。隣接する逆方向反復は、完全反復または不完全反復であってもよく、すなわち、完全に対称的または部分的に対称的であってもよい。隣接する逆方向反復は、中央のパリンドロームに連続または不連続であり得る。プロテロメラーゼ標的配列は、長さにして少なくとも１４塩基対の完全逆方向反復配列を含む不完全逆方向反復配列を含んでもよい。一例は、配列番号２９である。不完全逆方向反復配列は、長さにして少なくとも２２塩基対の完全逆方向反復配列を含み得る。一例は、配列番号２５である。
【００４０】
特に好ましいプロテロメラーゼ標的配列は、配列番号２５〜２９の配列またはその変異体を含む。
配列番号２５：
（ＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡ）
配列番号２６
（ＡＴＧＣＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＴＡＡＴＡＣＡ）
配列番号２７
（ＴＡＧＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴＴＡＣＴＧ）
配列番号２８：
（ＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＧＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴ）
配列番号２９
（ＴＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＧＴＡ）
【００４１】
本発明の好ましいプライマーは、配列番号２５〜２９の配列のいずれか１つに特異的に結合することができる。例えば、本発明の好ましいプライマーは、以下：
配列番号３０  ＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴ／ＣＧＡ／ＴＴＡＡＣＡＣＡＣ
配列番号３１  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡ／ＧＣＴ／ＡＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３２  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ
配列番号３３  ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣ
配列番号３４  ＣＡＣＡＣＡＡＴＡ／ＴＧＣ／ＴＣＣＡＴ
配列番号３５  ＡＴＧＧＡ／ＧＣＡ／ＴＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３６  ＣＧＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡ
配列番号３７  ＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴ
配列番号３８  ＣＡＴＡＴＣＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣ
配列番号３９  ＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧ
配列番号４０  ＴＡＴＡＴＴＡＡ／ＴＡＡＡＡ／ＴＴ／ＡＡＡＴＣＡＴ
配列番号４１  ＡＴＡＴＡＡＴＴ／ＡＴＴＴＴ／ＡＡ／ＴＴＴＡＧＴＡ
から選択される配列を含んでもよく、またはその配列からなってもよい。
【００４２】
配列番号３０〜３５の配列は、配列番号２５への特異的な結合に適している。これらのプライマーのうち、配列番号３２は、大腸菌（E. coli）ファージＮ１５プロテロメラーゼ認識配列と組み合わせて、本発明の方法における使用に特に好ましい。これは、１を超えるアニーリング温度での最良のＤＮＡ増幅率を与えることが示されたためである。
【００４３】
また、配列番号３２および３３の配列は、配列番号２６への特異的な結合に適している。配列番号３６および３７の配列は、配列番号２７への特異的な結合に適している。配列番号３８および３９の配列は、配列番号２８への特異的な結合に適している。配列番号４０および４１の配列は、配列番号２９への特異的な結合に適している。
【００４４】
配列番号２５〜２９の配列は、上記の完全逆方向反復配列を含み、さらに、関連する生物に由来する隣接配列を含む。配列番号２５の配列またはその変異体を含むプロテロメラーゼ標的配列は、配列番号１５の大腸菌（E. coli）Ｎ１５  ＴｅｌＮプロテロメラーゼおよびその変異体との組み合わせにおける使用に好ましい。配列番号２６の配列またはその変異体を含むプロテロメラーゼ標的配列は、配列番号１１のクレブシエラファージＰｈｉ  Ｋ０２プロテロメラーゼおよびその変異体との組み合わせにおける使用に好ましい。配列番号２７の配列またはその変異体を含むプロテロメラーゼ標的配列は、配列番号９のエルシニアファージＰＹ５４プロテロメラーゼおよびその変異体との組み合わせにおける使用に好ましい。配列番号２８の配列またはその変異体を含むプロテロメラーゼ標的配列は、配列番号１３のビブリオファージＶＰ８８２プロテロメラーゼおよびその変異体との組み合わせにおける使用に好ましい。配列番号２９の配列またはその変異体を含むプロテロメラーゼ標的配列は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）プロテロメラーゼとの組み合わせにおける使用に好ましい。
【００４５】
上記のパリンドロームまたはプロテロメラーゼ標的配列のいずれかの変異体には、そのホモログまたは突然変異体が含まれる。突然変異体には、天然の配列に対する、切断、置換または欠失が含まれる。変異体配列は、ＤＮＡ鋳型中のその存在が、プロテロメラーゼの酵素活性による閉鎖型直鎖状ＤＮＡへのその変換を可能にするいずれかの配列である。これは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形成に関する適切なアッセイの使用によって容易に決定することができる。当該技術分野において説明されているいずれかの適したアッセイを用いることができる。適切なアッセイの例には、Ｄｅｎｅｋｅら，ＰＮＡＳ（２０００）９７，７７２１−７７２６に記載されている。好ましくは、変異体は、天然の配列で観察されるのと同等のプロテロメラーゼ結合性および活性を可能にする。本明細書中に記載されるパリンドローム配列の好ましい変異体の例としては、完全反復構造を保存し、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形成を可能にする能力を保持している、切断型パリンドローム配列が挙げられる。しかしながら、変異体プロテロメラーゼ標的配列は、それらがプロテロメラーゼ活性に対する基質として機能することができれば、もはや完全なパリンドロームを保存していないように改変することができる。
【００４６】
当業者は、上記で概説した原理に基づいて、本発明における使用のための適切なプロテロメラーゼ標的配列を同定し適当なプライマーを設計することが容易にできることを理解すべきである。候補プロテロメラーゼ標的配列は、上記のアッセイを用いて、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形成を促進するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。
【００４７】
ＤＮＡ鋳型は、１を超えるプロテロメラーゼ標的配列、例えば、２、３、４、５、１０またはそれを超えるプロテロメラーゼ標的配列を含むことができる。複数のプロテロメラーゼ標的配列の使用は、より長いＤＮＡ分子からの、対象となる配列を含む短い閉鎖型直鎖状ＤＮＡの切り出しを可能にすることができる。特に、ＤＮＡ鋳型中の１つまたは複数の対象となる配列には、いずれかの側（すなわち、５’および３’）で、プロテロメラーゼ標的配列が隣接していることができる。次に、２つの隣接するプロテロメラーゼ配列は、プロテロメラーゼの作用のもとで、増幅されたＤＮＡから閉鎖型直鎖状ＤＮＡとしての対象となるそれぞれの短い配列の切り出しを媒介することができる。ＤＮＡ鋳型は、いずれかの側でプロテロメラーゼ標的配列が隣接している１つまたは複数の対象となる配列（好ましくは、発現カセット）を含むことができる。ＤＮＡ鋳型は、上記のようにプロテロメラーゼ標的配列が隣接している、２、３、４、５またはそれを超える対象となる配列を含むことができる。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、いずれかの側でプロテロメラーゼ標的配列が隣接している発現カセットを含むＤＮＡ鋳型を用いる。発現カセットは、好ましくは、対象となるコード配列に作動可能に連結された真核生物プロモーター、および場合により真核生物転写終結配列を含む。この実施形態においては、鋳型ＤＮＡの増幅、および本発明によるプロテロメラーゼとの接触に続いて、発現カセットが、増幅された鋳型から閉鎖型直鎖状ＤＮＡとして放出される。鋳型ＤＮＡ中の不要な配列は、同時に、結果として産物から除去される。
【００４９】
このような不要なまたは外部配列（細菌配列またはベクター配列とも記載される）としては、細菌性複製起点、細菌性選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを挙げることができる。このような配列の除去は、外来性の遺伝的物質を含まない「最小限の」発現カセットを作り出す。また、上記のタイプの細菌性配列は、いくつかの治療的アプローチでは問題を引き起こす場合がある。例えば、哺乳動物細胞内では、細菌／プラスミドＤＮＡは、クローニングされた遺伝子を不活性化させ、対象となるタンパク質の持続的な発現を達成することができないようにする場合がある。また、細菌繁殖で用いられる抗生物質耐性遺伝子は、ヒトの健康に対してリスクをもたらす場合がある。さらに、細菌プラスミド／ベクターＤＮＡは、望ましくない非特異的な免疫応答を引き起こし得る。細菌性ＤＮＡ配列の特異的な特徴であるメチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチド（典型的には、ＣｐＧモチーフとして知られる）の存在もまた、望ましくない免疫応答をもたらす場合がある。
【００５０】
特に、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ産物がＤＮＡワクチンであるいくつかの実施形態においては、産物の配列中にＣｐＧモチーフを残すことができる。これは、ＣｐＧモチーフが、コードされるタンパク質に対する免疫応答に有利なアジュバント効果を有し得るためである。
【００５１】
上記で概説したように、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むいずれのＤＮＡ鋳型が本発明の方法に従って増幅してもよい。したがって、ＤＮＡワクチンおよび他の治療用ＤＮＡ分子の生成が好ましいが、本発明の方法は、いずれのタイプの閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成するためにも用いることができる。ＤＮＡ鋳型は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡまたは一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡであり得る。二本鎖ＤＮＡ鋳型は、開環状二本鎖ＤＮＡ、閉環状二本鎖ＤＮＡ、開放型直鎖状二本鎖ＤＮＡまたは閉鎖型直鎖状二本鎖ＤＮＡであってもよい。好ましくは、鋳型は、閉環状二本鎖ＤＮＡである。閉環状ｄｓＤＮＡ鋳型は、ＲＣＡ  ＤＮＡポリメラーゼとの使用のために特に好ましい。環状ｄｓＤＮＡ鋳型は、細菌繁殖のための遺伝子の維持のために典型的に用いられるプラスミドまたは他のベクターの形態であり得る。したがって、本発明の方法は、いずれかの市販のプラスミドまたはその他のベクター、例えば市販のＤＮＡ医薬を増幅し、次に、増幅されたベクターＤＮＡを閉鎖型直鎖状ＤＮＡに変換するために用いることができる。
【００５２】
ＤＮＡポリメラーゼがニック入りＤＮＡ鎖から増幅を開始することができる鎖置換型ポリメラーゼである場合、開環状ｄｓＤＮＡを鋳型として用いることができる。この実施形態においては、鋳型を、１つまたは複数の部位で鋳型中のＤＮＡ鎖にニックを入れる１つまたは複数の酵素とともに予めインキュベートすることができる。
【００５３】
また、閉鎖型直鎖状ｄｓＤＮＡを鋳型として用いることもできる。閉鎖型直鎖状ＤＮＡを鋳型として用いる場合、鋳型ＤＮＡの増幅を促進する条件の前またはその間に、鋳型ＤＮＡを変性条件でインキュベートし、一本鎖環状ＤＮＡを形成させることができる。閉鎖型直鎖状ｄｓＤＮＡ鋳型（出発材料）は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ産物と同一であってもよい。したがって、鋳型は、それ自体が、閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成するためのインビトロ無細胞法、例えば、本発明による方法の産物である閉鎖型直鎖状ＤＮＡであってもよい。閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成するための方法は、典型的には、
（ａ）少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１種のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップと、
（ｂ）閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件下で、（ａ）で生成された増幅ＤＮＡを少なくとも１つのプロテロメラーゼと接触させるステップと
を含むことができる。
【００５４】
好ましくは、ステップ（ａ）における少なくとも１種のプライマーは、本発明によるプライマーである。すなわち、少なくとも１種のプライマーは、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができる。
【００５５】
換言すると、本発明による方法は、
（ａ）少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型を、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、１種または複数種のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップと、
（ｂ）閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件下で、（ａ）で生成された増幅ＤＮＡを少なくとも１つのプロテロメラーゼと接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）を繰り返すステップであって、ＤＮＡ鋳型がステップ（ｂ）の閉鎖型直鎖状ＤＮＡ産物であるステップと、
（ｄ）（ｃ）で生成された増幅ＤＮＡについてステップ（ｂ）を繰り返すステップと、場合により、
（ｅ）さらなるラウンドのステップ（ｃ）および（ｄ）を行うステップであって、ステップ（ｃ）の各繰り返しについての鋳型がステップ（ｄ）の従前の繰り返しの産物を含むステップと
を含んでもよい。
【００５６】
承認されるであろうが、ステップ（ｃ）〜（ｅ）の追加は、産物および鋳型が同じである循環反応を提供し、これは、少量の出発鋳型からこの方法を容易にスケールアップすることができる。
【００５７】
好ましくは、ステップ（ａ）および（ｃ）における少なくとも１種のプライマーは、本発明によるプライマーである。すなわち、少なくとも１種のプライマーは、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができる。
【００５８】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ鋳型は、典型的には、対応する直鎖状鋳型よりも狭い温度範囲で融解し再アニーリングし、これは、相補鎖が各末端で互いに結合され、それにより再アニーリングがより容易となるためである。したがって、本発明の好ましいプライマーは、この狭い温度範囲内でパリンドローム配列に高い親和性で結合する。温度範囲は、典型的には、５０℃〜９５℃である。したがって、本発明のプライマーのＴｍは、好ましくは、４５℃〜６０℃、５５℃〜７０℃、６５℃〜８０℃または７５℃〜９５℃である。
【００５９】
上記で概説した通り、ＤＮＡ鋳型は、典型的には、上記の通りの発現カセットを含み、すなわち、対象とするタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された真核生物プロモーター、および場合により真核生物転写終結配列を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる発現カセットを含む。場合により、発現カセットは、上記に定義される最小限の発現カセットであってもよく、すなわち、典型的には以下のもの：（ｉ）細菌性複製起点；（ｉｉ）細菌性選択マーカー（典型的には抗生物質耐性遺伝子）および（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧモチーフからなる群より選択される、１つまたは複数の細菌配列またはベクター配列を欠いていてもよい。
【００６０】
ＤＮＡ鋳型は、当該技術分野において知られている任意の方法によって、その方法における使用に十分な量で提供することができる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成することができる。ＤＮＡ鋳型がｄｓＤＮＡである場合、少なくとも９４℃の温度で予めインキュベートすることにより、変性した一本鎖として増幅ステップに供することができる。したがって、本発明の方法は、好ましくは、ｄｓＤＮＡ鋳型を変性させて、一本鎖ＤＮＡを提供するステップを含む。あるいは、ｄｓＤＮＡ鋳型は、二本鎖形態で提供することができる。ＤＮＡ鋳型の全体または選択された一部を反応中に増幅することができる。
【００６１】
ＤＮＡ鋳型の増幅を促進する条件下で、該鋳型を少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと接触させる。任意のＤＮＡポリメラーゼを本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡを増幅するための方法において用いることができる。任意の市販のＤＮＡポリメラーゼが本発明のこの方法における使用に適している。２、３、４、５またはそれを超える異なるＤＮＡポリメラーゼを用いることができ、例えば、その１つはプルーフリーディング機能を備え、１つまたは複数の他のものは備えていない。異なるメカニズムを有するＤＮＡポリメラーゼを用いることができ、例えば、鎖置換型ポリメラーゼおよび他の方法によりＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。鎖置換活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの適した例は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６２】
ＤＮＡポリメラーゼが非常に安定であり、その結果、その活性がプロセス条件下での長時間のインキュベーションによって実質的に低下しないことが好ましい。したがって、好ましくは、酵素は、限定されないが、温度およびｐＨを含むプロセス条件の範囲で長い半減期を有する。また、ＤＮＡポリメラーゼが、製造プロセスに適した１つまたは複数の特性を有することが好ましい。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、例えばプルーフリーディング活性を有しながら、高い忠実度を有する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼが、高い処理能力、高い鎖置換活性、ならびにｄＮＴＰおよびＤＮＡに対して低いＫｍを示すことが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼが、非特異的エキソヌクレアーゼ活性を示さないことが好ましい。
【００６３】
当業者は、所定のＤＮＡポリメラーゼが、市販のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ｐｈｉ２９、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）およびバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、それぞれ配列番号２、３および５により示される特性と比較して、上記で画定された特性を示すか否かを決定することができる。Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。高い処理能力に言及する場合、これは、典型的には、鋳型との結合／解離あたりにＤＮＡポリメラーゼ酵素により付加されるヌクレオチドの平均数、すなわち、１回の結合事象から得られるプライマー伸長の長さを意味する。
【００６４】
鎖置換型ポリメラーゼは、本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡを増殖するための方法における使用に好ましい。鎖置換型ポリメラーゼは、プロテロメラーゼの使用を必要としない本発明のＤＮＡ増幅のための方法でも用いられる。好ましい鎖置換型ポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９（配列番号２）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）（配列番号３）およびＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（配列番号５）またはそれらのいずれかの変異体である。配列番号２、３および５の変異体は、プロテロメラーゼ酵素との関連で、下記で定義する通りのものであってもよい。「鎖置換」なる用語は、ＤＮＡ合成中に二本鎖ＤＮＡの領域に遭遇した際に、相補鎖を置換するＤＮＡポリメラーゼの能力を説明するために、本明細書中で用いられる。
【００６５】
鎖置換型増幅法は、新規のＤＮＡ鎖の合成を継続するために、二本鎖ＤＮＡは障害とならないため、変性サイクルは効率的なＤＮＡ増幅に本質的でないという点において、ＰＣＲベースの方法とは異なることを理解すべきである。対照的に、ＰＣＲ法は、二本鎖ＤＮＡを融解し、新規の一本鎖鋳型をもたらすために、増幅プロセスの各サイクルにおける変性ステップ（すなわち、９４℃以上まで温度を上昇させること）を必要とする。
【００６６】
本発明の方法に使用される鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、少なくとも２０ｋｂ、より好ましくは少なくとも３０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、もしくは少なくとも７０ｋｂまたはそれを超える処理能力（プライマー伸長の長さ）を有する。特に好ましい実施形態においては、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼに匹敵するまたはそれを超える処理能力を有する。
【００６７】
好ましい鎖置換複製プロセスは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。ＲＣＡなる用語は、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させながら、環状ＤＮＡ鋳型鎖の周囲を連続的に進行するＲＣＡ型ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書中ではＲＣＡポリメラーゼとも称される）の能力を説明する。これは、増幅されたＤＮＡの複数の反復を有する直鎖状の一本鎖産物の形成をもたらす。これらの直鎖状の一本鎖産物は、多重ハイブリダイゼーション、プライマー伸長および鎖置換事象の基礎として働き、コンカテマー二本鎖ＤＮＡ産物（これもまた増幅されたＤＮＡの複数の反復を含む）の形成をもたらす。したがって、コンカテマー二本鎖ＤＮＡ産物中には、それぞれの増幅された「単一単位」ＤＮＡの複数コピーがある。
【００６８】
ＲＣＡポリメラーゼは、本発明の方法における使用に特に好ましい。ＲＣＡ型鎖置換複製プロセスの産物は、慣用的には、単一単位ＤＮＡを放出させるための複雑な処理を必要とする。有利なことに、本発明によれば、プロテロメラーゼ触媒機能の使用は、この処理を単一のステップで行うことを可能にする。また、プロテロメラーゼの使用は、この構造を有する分子を形成させるために追加の処理ステップ（複数可）を必要とすることなく、所望の閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構造を直接的に生成させる。
【００６９】
ＤＮＡ鋳型のＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１種の本発明のプライマーとの接触は、ＤＮＡ鋳型へのプライマーのアニーリングを促進する条件下で行う。条件には、プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする一本鎖ＤＮＡの存在が含まれる。また、条件には、鋳型へのプライマーのアニーリングを可能にする温度および緩衝液も含まれる。適切なアニーリング／ハイブリダイゼーション条件は、プライマーの性質に応じて選択してもよい。本発明で用いられる好ましいアニーリング条件の例としては、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２の緩衝液が挙げられる。アニーリングは、変性に続いて、所望の反応温度までの非常に制御された段階的な冷却により行ってもよい。１分あたりの摂氏温度の典型的な冷却速度は、１．０〜５．０であるが、好ましくは０．１〜１．０、０．３〜１．０、０．５〜１．０、または０．７〜１．０である。冷却中、温度は、１〜１０分間の冷却範囲内の特定の温度で保持されて、鋳型アニーリングプロセスにとって、プライマーについて最適な温度プロフィールを作り出すことができる。これは、鋳型自体の復元前に、鋳型へのプライマーの最大結合を可能にするのに有利である。
【００７０】
ＤＮＡ鋳型がＤＮＡポリメラーゼおよび１種または複数種のプライマーに接触すると、次いで、該鋳型の増幅を促進する条件下でのインキュベーションステップが行われる。好ましくは、条件は、別の鎖の鎖置換複製を介して複製された鎖の置換によって、該鋳型の増幅を促進する。条件は、通常は２０〜９０℃の範囲内の、ＤＮＡの増幅を可能にする任意の温度の使用を含む。好ましい温度範囲は、約２０〜約４０℃または約２５〜約３５℃であり得る。
【００７１】
典型的には、適切な温度は、具体的なＤＮＡポリメラーゼが至適活性を有する温度に基づいて選択される。この情報は、一般的に利用可能であり、当業者の一般的知識の一部を形成する。例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、適した温度範囲は、約２５〜約３５℃、好ましくは約３０℃となる。当業者は、本発明の方法による効率的な増幅のための適した温度を慣習的に特定することができる。例えば、方法は、ある範囲の温度にて行うことができ、増幅されたＤＮＡの収量をモニタリングして、所与のＤＮＡポリメラーゼに関する至適温度範囲を同定することができる。
【００７２】
ＤＮＡ鋳型の増幅を促進する他の条件は、ＤＮＡポリメラーゼおよび１つまたは複数のプライマーの存在を含む。また、条件には、４種類全てのｄＮＴＰ、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、適した緩衝剤／ｐＨおよび酵素の性能または安定性に必要とされる他の因子の存在も含まれる。適した条件には、当該技術分野において知られているＤＮＡポリメラーゼ酵素の活性をもたらすために用いられる任意の条件が含まれる。
【００７３】
例えば、ｐＨは、３〜１０の範囲内、好ましくは５〜８または約７、例えば約７．５であり得る。ｐＨは、１つまたは複数の緩衝剤の使用により、この範囲内に維持することができる。このような緩衝液としては、限定されないが、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、トリズマ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、トリシン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ビシン、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ、リン酸塩、クエン酸−リン酸水素ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム−酢酸、イミダゾールおよび炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムが挙げられる。また、反応物は、二価金属の塩、限定されないが、塩化物、酢酸塩および硫酸塩を含む、例えばマグネシウム（Ｍｇ２＋）およびマンガン（Ｍｎ２＋）の塩を含んでもよい。また、一価金属の塩も含めることができ、それは、例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩、例えば、塩化カリウムである。含めることができる他の塩は、アンモニウム塩、特に硫酸アンモニウムである。
【００７４】
さらに、界面活性剤を含めることができる。適した界面活性剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびそのいずれかの誘導体が挙げられる。また、安定化剤を反応物に含めることができる。任意の適した安定化剤、特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および他の安定化タンパク質を用いることができる。また、反応条件は、ＤＮＡを弛緩させ、鋳型の変性をより容易にする薬剤を添加することによっても改善することができる。このような薬剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、グリセロールおよびベタインが挙げられる。
【００７５】
当業者は、それらの一般的知識に基づいて、本発明の方法のために増幅およびインキュベーション条件を改変し、最適化することができることを理解すべきである。同様に、特定の薬剤の具体的な濃度は、当該技術分野における従前の例に基づいて選択することができ、一般的知識に基づいてさらに最適化することができる。一例として、当該技術分野におけるＲＣＡベースの方法で用いられる適切な反応緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％グリセロール、０．２ｍＭ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ｄＮＴＰである。本発明のＲＣＡ増幅で用いられる好ましい反応緩衝液は、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰである。この緩衝液は、ｐｈｉ２９  ＲＣＡポリメラーゼを用いる使用に特に適切である。
【００７６】
また、反応条件は、１つまたは複数の追加のタンパク質の使用を含んでもよい。ＤＮＡ鋳型は、少なくとも１つのピロホスファターゼ、例えば、酵母無機ピロホスファターゼの存在下で増幅してもよい。２、３、４、５種類またはそれを超える種類のピロホスファターゼを用いることができる。これらの酵素は、鎖複製中にｄＮＴＰからＤＮＡポリメラーゼにより生成されるピロリン酸塩を分解することができる。反応物におけるピロリン酸塩の形成は、ＤＮＡポリメラーゼの阻害を引き起こす場合があり、ＤＮＡ増幅の速度および効率を低下させる場合がある。ピロホスファターゼは、ピロリン酸塩を非阻害的リン酸塩に分解することができる。本発明の方法における使用に適したピロホスファターゼの例は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃから市販されているサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）ピロホスファターゼである。
【００７７】
一本鎖ＤＮＡを安定化させるために、任意の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）を本発明の方法に用いることができる。ＳＳＢＰは、生存細胞の本質的な成分であり、ｓｓＤＮＡに関わる全てのプロセス、例えば、ＤＮＡ複製、修復および組換えに関与する。これらのプロセスにおいて、ＳＳＢＰは、形成されたｓｓＤＮＡに一時的に結合し、ｓｓＤＮＡ構造の安定化を助けることができる。本発明の方法における使用に関して適したＳＳＢＰの例は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販されているＴ４遺伝子３２タンパク質である。
【００７８】
増幅ステップに加えて、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの増幅に関する本発明の方法は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成のための処理ステップもまた含む。増幅されたＤＮＡを、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件下で、少なくとも１つのプロテロメラーゼと接触させる。プロテロメラーゼに基づくこの単純な処理ステップは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子の生成のために用いられる他の方法と比較して有利である。増幅ステップおよび処理ステップは、同時にまたは並行して行うことができる。しかしながら、好ましくは、増幅ステップおよび処理ステップは、処理ステップが増幅ステップに続いて（すなわち、増幅されたＤＮＡに対して）行われるように逐次的に行う。
【００７９】
本発明で用いられるプロテロメラーゼは、共有結合閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子を生成するために、プロテロメラーゼ標的部位を含む鋳型を切断し、再結合させることができる任意のポリペプチドである。したがって、プロテロメラーゼは、ＤＮＡ切断機能および連結機能を有する。プロテロメラーゼ型の活性を有する酵素は、テロメアリゾルバーゼとしても説明されている（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）において）。プロテロメラーゼに対する典型的な基質は、環状二本鎖ＤＮＡである。このＤＮＡがプロテロメラーゼ標的部位を含む場合、酵素はこの部位でＤＮＡを切断し、末端を連結して、直鎖状二本鎖共有結合閉鎖型ＤＮＡ分子を作り出すことができる。プロテロメラーゼ標的部位の要件は、上記で検討している。これもまた上記で概説したように、所定のポリペプチドがプロテロメラーゼ標的部位を含む鋳型からの閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を触媒する能力は、当該技術分野において説明されている任意の適したアッセイを用いて決定することができる。
【００８０】
プロテロメラーゼ酵素は、バクテリオファージにおいて説明されている。いくらかの溶原菌においては、バクテリオファージは、共有結合閉鎖型末端を有する直鎖状二本鎖を含む染色体外ＤＮＡとして存在する。このＤＮＡの複製および共有結合閉鎖型末端（またはテロメア末端）の維持は、この酵素、プロテロメラーゼの活性に依存する。ウイルスＤＮＡの複製におけるプロテロメラーゼの役割を図１に図示する。この触媒活性の例は、大腸菌（Escherichia coli）に感染するバクテリオファージであるＮ１５由来の酵素ＴｅｌＮによりもたらされる。ＴｅｌＮは、環状二本鎖ＤＮＡ中の特異的ヌクレオチド配列を認識する。この配列は、２２塩基対の逆方向完全反復（ｔｅｌＯ）が連なる２つの半分であるｔｅｌＲおよびｔｅｌＬを含む、ｔｅｌＲＬと称される若干不完全な逆方向パリンドローム構造である（図２を参照されたい）。２つのｔｅｌＲＬ部位は、直鎖状プロファージＤＮＡに作用する特異的ＤＮＡポリメラーゼの最初の活性によって環状二本鎖ＤＮＡにおいて形成される。ＴｅｌＮは、この環状ＤＮＡを２つの同一の直鎖状プロファージＤＮＡ分子に変換し、複製サイクルを完了させる。ｔｅｌＲおよびｔｅｌＬは、直鎖状プロファージＤＮＡの閉鎖型末端を含み、ＤＮＡが同様にしてさらに複製されるのを可能にする。
【００８１】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡの増幅に関する本発明の方法は、少なくとも１つのプロテロメラーゼの使用を必要とする。本発明のこの方法は、２、３、４、５種類またはそれを超える種類のプロテロメラーゼなどの１を超えるプロテロメラーゼの使用を含むことができる。適切なプロテロメラーゼの例としては、ハロモナス・アクアマリナ（Halomonas aquamarina）由来のｐｈｉＨＡＰ−１（配列番号７）、エルシニア・エンテロリティカ（Yersinia enterolytica）由来のＰＹ５４（配列番号９）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来のｐｈｉＫＯ２（配列番号１１）およびビブリオ属種（Vibrio sp.）由来のＶＰ８８２（配列番号１３）、ならびに大腸菌（Escherichia coli）由来のＮ１５（配列番号１５）などのバクテリオファージに由来するもの、またはそれらの任意の変異体が挙げられる。バクテリオファージＮ１５プロテロメラーゼ（配列番号１５）またはその変異体の使用が、特に好ましい。
【００８２】
配列番号７、９、１１、１３および１５の変異体には、そのホモログまたは突然変異体が含まれる。突然変異体には、天然の配列に対して切断、置換または欠失が含まれる。変異体は、上記のようにプロテロメラーゼ標的部位を含む鋳型から閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成しなければならない。
【００８３】
本明細書中で言及される任意のホモログは、典型的には機能的ホモログであり、典型的には天然のタンパク質の関連領域に対して少なくとも４０％相同である。相同性は、公知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えば、その初期設定で用いて）相同性を算出するために用いることができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７−３９５）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、（典型的にはその初期設定で）相同性を算出するまたは配列同士を並べるために用いることができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／））を通して公衆に利用可能である。
【００８４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的解析を行う；例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率を示す。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、ある配列が別の配列に類似しているとみなされる。
【００８５】
変異体ポリペプチドは、天然のタンパク質に対して少なくとも４０％の同一性を有する配列を含む（またはそれからなる）。好ましい実施形態において、変異体配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００個もしくはそれを超える連続するアミノ酸にわたって、または変異体の全体配列にわたってさえ、天然のタンパク質の特定の領域に対して少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。あるいは、変異体配列は、全長天然タンパク質に対して、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。典型的には、変異体配列は、少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０または６０個またはそれ未満の突然変異（そのそれぞれが、置換、挿入または欠失であり得る）によって、天然のタンパク質の関連領域とは異なる。本発明の変異体配列は、上記で言及した配列の長さのいずれかにわたって、具体的な相同性％値のいずれかと同じである、全長天然タンパク質の特定の領域との同一性％を有し得る（すなわち、少なくとも４０％、５５％、８０％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％の同一性を有し得る）。
【００８６】
また、天然のタンパク質の変異体には切断も含まれる。変異体がなおも上記の閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成することができる限り、任意の切断を用いることができる。切断は、典型的には、触媒活性に本質的ではなく、かつ／またはフォールディングしたタンパク質のコンホメーション、特に活性部位のフォールディングに影響しない配列を除去するためになされる。また、切断は、プロテロメラーゼポリペプチドの溶解性を改善するためにも選択してもよい。適切な切断は、Ｎ末端またはＣ末端からの種々の長さの配列の体系的な切断によって、慣用的に特定することができる。
【００８７】
さらに、天然のタンパク質の変異体は、天然のタンパク質の特定の領域に対する１つまたは複数の、例えば、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜４０、またはそれを超えるアミノ酸挿入、置換または欠失を有する突然変異体を含む。欠失および挿入は、好ましくは、触媒ドメインの外側でなされる。挿入は、典型的には、例えば、組換え発現の目的で、天然のタンパク質に由来する配列のＮ末端またはＣ末端でなされる。置換もまた、典型的には、触媒活性に本質的ではなく、かつ／またはフォールディングしたタンパク質のコンホメーションに影響しない領域でなされる。このような置換は、酵素の溶解性または他の特性を改善するために行うことができる。一般的には好ましくないが、置換はまた、活性部位でまたは第２スフェアで、すなわち、活性部位のアミノ酸のうち１つまたは複数の位置もしくは方向に影響するまたはそれに接触する残基で行うことができる。これらの置換は、触媒特性を改善するために行うことができる。
【００８８】
好ましくは、置換は、１つまたは複数の保存的変化を導入するものであり、保存的変化は、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で、アミノ酸を置換する。導入されたアミノ酸は、それが置換したアミノ酸に対して、類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有し得る。あるいは、保存的変化は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入するものであり得る。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野において周知であり、表Ａに規定されるように２０種の主要なアミノ酸の特性に従って選択することができる。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
変異体が、天然のタンパク質に匹敵するまたは同じ効率で、上記のように閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生成することができることが特に好ましい。
【００９１】
上記で概説したように、本発明の方法によるＤＮＡの増幅は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくはＲＣＡ  ＤＮＡポリメラーゼによって行うことが好ましい。インビトロ無細胞法におけるＲＣＡ  ＤＮＡポリメラーゼとプロテロメラーゼとの組み合わせは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成において驚くべき効率および簡潔性を可能にする。
【００９２】
上記で検討したように、長い直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子を、最初に鎖置換反応で形成させ、これが続いて新たな鋳型として働き、その結果二本鎖分子が形成される（図４）。二本鎖分子は、鎖置換型ポリメラーゼの前進作用により形成された増幅ＤＮＡのタンデム単位の連続的な連なりを含む（コンカテマー）。これらのコンカテマーＤＮＡ産物は、増幅された鋳型ＤＮＡの複数の反復を含む。したがって、本発明の方法で生成されるコンカテマーは、ＤＮＡ鋳型から増幅された配列の複数単位を含む。コンカテマーは、増幅される対象の単一単位の長さに応じて、増幅された配列の１０、２０、５０、１００、２００、５００もしくは１０００またはそれを超える単位を含み得る。コンカテマーは、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、より好ましくは少なくとも３０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、もしくは少なくとも７０ｋｂまたはそれを超える大きさであってもよい。
【００９３】
多くの実施形態において、例えばＤＮＡ医薬の製造では、増幅されたＤＮＡは、単一単位としての使用のために必要とされる。したがって、このようなコンカテマーは、増幅されたＤＮＡの単一単位を放出するためのプロセシングを必要とする。このコンカテマーＤＮＡを増幅されたＤＮＡの単一単位に変換するために、正確に切断することが必要であり、対になった鎖の末端は再連結を必要とする。
【００９４】
本発明によれば、これは、ＤＮＡ鋳型への制限エンドヌクレアーゼ部位の組み込みによって行ってもよい。すなわち、制限エンドヌクレアーゼをコンカテマーとともにインキュベートして、その認識部位で切断し、単一単位を放出してもよい。次に、制限エンドヌクレアーゼの作用によって形成された開放型直鎖状二本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼ酵素とともにインキュベートして、単一単位ＤＮＡを共有結合的に閉鎖させてもよい。当業者に知られている任意の適した制限エンドヌクレアーゼを用いてもよい。例えば、適した制限エンドヌクレアーゼには、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＸｍｎＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓａＩ、ＢｃｉＶＩおよびＡｌｗＮＩまたは任意の他の鋳型適合性単一部位特異的酵素が挙げられる。制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡリガーゼ酵素を用いた使用に適した条件は、当業者に知られている。
【００９５】
しかしながら、本発明によれば、閉鎖型直鎖状単一単位ＤＮＡへのコンカテマーＤＮＡのプロセシングは、好ましくは、単一の酵素、プロテロメラーゼの使用により達成する。これは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子の生成のための方法での有利な簡潔性および経済性を表す。第１に、単一単位の切断および再連結が、単一の酵素とのインキュベーションによって達成される。第２に、単一単位はまた、所望の閉鎖型直鎖状構造を有して放出され、したがって、（すなわち、共有結合閉鎖型環状単一単位ＤＮＡから）この構造を生成するための追加の処理ステップを必要としない。
【００９６】
したがって、好ましくは、ＤＮＡ鋳型から増幅されたＤＮＡを、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件下で、少なくとも１つのプロテロメラーゼとともにインキュベートする。言い換えれば、この条件は、ヘアピン末端を有する共有結合閉鎖型直鎖状ＤＮＡを形成させるための、プロテロメラーゼ標的配列を含む二本鎖ＤＮＡの切断および再連結を促進する。閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件は、一般には２０〜９０℃の範囲において、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を可能にする任意の温度の使用を含む。温度は、好ましくは、２５〜４０℃の範囲内、例えば、約２５〜約３５℃、または約３０℃であってもよい。具体的なプロテロメラーゼに対する適切な温度は、ＤＮＡポリメラーゼのための温度条件との関連で上記に概説した原則に従って選択することができる。配列番号１５の大腸菌（E. coli）バクテリオファージＴｅｌＮプロテロメラーゼとの使用のために適した温度は、約２５〜約３５℃、例えば約３０℃である。
【００９７】
また、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成を促進する条件は、プロテロメラーゼおよび適切な緩衝剤／ｐＨ、ならびに酵素の性能または安定性に必要とされる他の因子の存在も含む。適切な条件には、当該技術分野において知られているプロテロメラーゼ酵素の活性をもたらすために用いられる任意の条件が含まれる。例えば、大腸菌（E. coli）バクテリオファージＴｅｌＮプロテロメラーゼを用いる場合、適した緩衝液は、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，  ｐＨ７．６；５ｍＭ  ＣａＣｌ２；５０ｍＭグルタミン酸カリウム；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）であってもよい。また、最適な活性および安定性を維持するための薬剤および条件は、ＤＮＡポリメラーゼについて列挙されたものから選択することもできる。
【００９８】
いくつかの実施形態においては、プロテロメラーゼの活性のために、ＤＮＡ増幅のために用いるのと同じ条件を用いることが可能であり得る。特に、同じ条件の使用は、ＤＮＡ増幅およびプロテロメラーゼによる処理が同時にまたは並行して行われる場合に説明される。他の実施形態においては、最適なＤＮＡポリメラーゼ活性をもたらすために用いられる条件が、次善のプロテロメラーゼ活性をもたらす場合、反応条件を変化させることが必要であり得る。特定の薬剤の除去および反応条件の変更は、ろ過、透析および当該技術分野において知られている他の方法によって達成可能であり得る。当業者は、最適なＤＮＡポリメラーゼ活性および／またはプロテロメラーゼ活性を可能にする条件を容易に同定することができる。
【００９９】
特に好ましい実施形態においては、ＲＣＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはｐｈｉ２９によるＤＮＡの増幅での使用のために、ＤＮＡ増幅は、２５〜３５℃、例えば、約３０℃の温度にて３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰと実質的に同一であるまたは本質的にそれらからなる緩衝条件下で行う。次に、プロテロメラーゼでの処理ステップは、好ましくは、ＴｅｌＮを用いて、かつ／または好ましくは２５〜３５℃、例えば約３０℃の温度にて、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．６；５ｍＭ  ＣａＣｌ２；５０ｍＭグルタミン酸カリウム；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）と実質的に同一であるまたは本質的にそれらからなる緩衝条件下で行うことができる。
【０１００】
本発明の方法での使用における全ての酵素およびタンパク質は、組換え的に、例えば細菌中で生成することができる。組換え発現を可能にする、当業者に知られている任意の手段を用いることができる。対象タンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドまたは他の形態の発現ベクターを細菌に導入することができ、その結果、それはコードされたタンパク質を発現する。例えば、配列番号２、５、７、９、１１、１３または１５の発現のために、ベクターは、それぞれ、配列番号１、４、６、８、１０、１２または１４の配列を含むことができる。典型的には、続いて、発現されたタンパク質は、例えばアフィニティータグを用いて十分な量で精製され、本発明の方法における使用に適した形態で提供される。組換えタンパク質生成のためのこのような方法は、その一般な知識に基づいて、当業者には慣用的に利用可能である。上記の議論は、本明細書中で論じたいずれのタンパク質の供給にも適用される。
【０１０１】
ＤＮＡ鋳型をＤＮＡポリメラーゼと接触させることによって得られる増幅されたＤＮＡは、プロテロメラーゼまたは他の酵素との接触の前に精製することができる。したがって、本発明の方法は、ＤＮＡ鋳型から増幅したＤＮＡを精製するステップをさらに含むことができる。しかしながら、好ましい実施形態において、該方法は、プロテロメラーゼまたは他の酵素との接触に先立つ増幅ＤＮＡの精製を含むことなしに行われる。これは、増幅ステップおよび処理ステップを、典型的には同じ容器または溶液中で、連続的に行うことができることを意味する。このようないくつかの実施形態においては、該方法は、プロテロメラーゼ活性をもたらす緩衝液の添加（すなわち、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形成を促進する条件を提供するために）を含む。同様に、制限エンドヌクレアーゼ活性をもたらす緩衝液は、適切な場合に添加してもよい。
【０１０２】
プロテロメラーゼの作用による閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成に続いて、閉鎖型直鎖状ＤＮＡの増幅に関する本発明の方法は、直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡ産物を精製するステップをさらに含むことができる。同様に、本発明の他のプロセスに従って増幅されたＤＮＡもまた精製してもよい。上記で言及した精製は、典型的には、任意の望ましくない産物を除去するために行われる。精製は、当該技術分野において知られている任意の適切な手段によって行うことができる。例えば、増幅されたＤＮＡまたは直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡの処理は、フェノール／クロロホルム核酸精製または核酸を選択的に結合するカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎから市販されているもの）の使用を含むことができる。当業者は、増幅されたＤＮＡの単離における使用のための適した精製技術を慣用的に同定することができる。
【０１０３】
直鎖状共有結合閉鎖型ＤＮＡまたは本発明に従って生成されたＤＮＡの別の形態が生成され、十分な量で精製されると、本発明の方法は、ＤＮＡ組成物、例えば、治療用ＤＮＡ組成物としてのその製剤化をさらに含んでもよい。治療用ＤＮＡ組成物は、上記で言及したタイプの治療用ＤＮＡ分子を含む。このような組成物は、所望の経路による投与に適した形態、例えば、噴霧、注射用組成物または経口投与、粘膜投与もしくは局所投与に適した製剤において治療上有効量のＤＮＡを含む。
【０１０４】
慣用の医薬調製物としてのＤＮＡの製剤化は、当業者に利用可能な標準的な製薬製剤化学および方法を用いて行うことができる。任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を用いてもよい。補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などは、賦形剤またはビヒクル中に存在してもよい。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般には、不適切な毒性なしに投与することができる製薬用物質であり、ワクチン組成物の場合には、該組成物を受ける個体における免疫応答を誘導しないものである。適した担体は、リポソームであってもよい。
【０１０５】
薬学的に許容される賦形剤としては、限定されないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられる。また、薬学的に許容される塩をそれに含めることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱物酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を挙げることができる。また、必要ではないが、調製物が、ペプチド、タンパク質または他の同様の分子が組成物中に含まれる場合特にそれらに対する安定化剤として働く薬学的に許容される賦形剤を含むことも好ましい。ペプチドに対する安定化剤としても作用する適した担体の例としては、限定されないが、製薬等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが挙げられる。他の適切な担体としては、これもまた限定されないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の詳細な検討は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)（参照により本明細書中に組み入れられる）において利用可能である。
【０１０６】
本発明の方法は、インビトロの無細胞環境において行われる。すなわち、この方法は、宿主細胞の不存在下で行われ、典型的には、精製された酵素成分の使用を含む。したがって、適用可能である場合にはプロテロメラーゼまたは他の酵素による処理を含めた鋳型ＤＮＡの増幅は、典型的には、適切な容器内の溶液中で反応成分を接触させることにより行われる。場合により、特定の成分を固体支持体に結合させたものなどの固定化形態で提供してもよい。
【０１０７】
本発明の方法は、任意のスケールで行うことができることを理解すべきである。しかしながら、この方法が、商業的または産業的スケールで、すなわち、ミリグラム以上の量で増幅されたＤＮＡを生成するスケールでＤＮＡを増幅するために行われることが好ましい。該方法により、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも２０ミリグラム、少なくとも５０ミリグラムまたは少なくとも１００ミリグラムの増幅されたＤＮＡが生成されることが好ましい。好ましくは、本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡを増幅するための方法において増幅されたＤＮＡに由来する最終的な閉鎖型直鎖状ＤＮＡ産物をミリグラム以上の量で生成することもできる。該方法により、少なくとも１ミリグラム、少なくとも２ミリグラム、少なくとも５ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも２０ミリグラム、少なくとも５０ミリグラム、または少なくとも１００ミリグラムの閉鎖型直鎖状ＤＮＡが生成されることが好ましい。
【０１０８】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために必要なコンポーネントを含むキットを提供する。このキットは、本発明による少なくとも１種のプライマー、および少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。キットは、少なくとも１つのプロテロメラーゼ、および場合により本明細書中に記載された閉鎖型直鎖状ＤＮＡを増幅するための方法において使用するための使用説明書をさらに含んでもよい。
【０１０９】
キットは、２、３、４、５種類またはそれを超える種類のＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。好ましくは、キットは、少なくとも１つの鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、さらにより好ましくはＲＣＡ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。キットが、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）もしくはＢｓｔ  １  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）またはそれらの任意の変異体を含むことが特に好ましい。いくつかの実施形態において、他の方法によってＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼを含めてもよい。
【０１１０】
キットは、好ましくは、少なくとも１つのプロテロメラーゼを含む。キットは、２、３、４種類またはそれを超える種類のプロテロメラーゼを含んでもよい。プロテロメラーゼは、配列番号５、７、９、１１、１３もしくは１５またはそれらの任意の変異体のいずれかから選択することができる。キットが、大腸菌（E. coli）Ｎ１５  ＴｅｌＮ（配列番号１５）またはその変異体を含むことが特に好ましい。
【０１１１】
キットは、上述されるものなどの制限エンドヌクレアーゼを含み、好ましくは鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせてもよい。
【０１１２】
キットは、好ましくは、以下から選択される配列を含むまたはそれらの配列からなる少なくとも１つのプライマーを含んでもよい：
配列番号３０  ＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴ／ＣＧＡ／ＴＴＡＡＣＡＣＡＣ
配列番号３１  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡ／ＧＣＴ／ＡＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３２  ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ
配列番号３３  ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣ
配列番号３４  ＣＡＣＡＣＡＡＴＡ／ＴＧＣ／ＴＣＣＡＴ
配列番号３５  ＡＴＧＧＡ／ＧＣＡ／ＴＡＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号３６  ＣＧＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡ
配列番号３７  ＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴ
配列番号３８  ＣＡＴＡＴＣＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣ
配列番号３９  ＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧ
配列番号４０  ＴＡＴＡＴＴＡＡ／ＴＡＡＡＡ／ＴＴ／ＡＡＡＴＣＡＴ
配列番号４１  ＡＴＡＴＡＡＴＴ／ＡＴＴＴＴ／ＡＡ／ＴＴＴＡＧＴＡ
【０１１３】
また、キットは、少なくとも１つの一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）を含んでもよい。好ましいＳＳＢＰは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販されているＴ４遺伝子３２タンパク質である。２、３、４種類またはそれを超える種類のＳＳＢＰをキットに含めることができる。キットは、ピロホスファターゼをさらに含むことができる。好ましいピロホスファターゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販されているサッカロミセス・セレビジエ（S. cerevisiae）ピロホスファターゼである。いくつかの実施形態において、２、３、４、５種類またはそれを超える種類のピロホスファターゼを含めることができる。キットは、本明細書中に記載されている任意のＤＮＡポリメラーゼ、プロテロメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＳＳＢＰまたはピロホスファターゼを含むことができる。また、キットは、ｄＮＴＰ、適切な緩衝液、ならびに本明細書中に記載されるＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくはプロテロメラーゼ酵素性能または安定性に必要な他の因子も含むことができる。
【実施例】
【０１１４】
［実施例１］
二本鎖環状ＤＮＡ鋳型からの閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成
プロテロメラーゼＴｅｌＮ結合配列を含む二本鎖環状ＤＮＡをＤＮＡ鋳型として用いる。プロテロメラーゼＴｅｌＮ結合部位を含むパリンドローム配列の半分の部分に相補的な単一のパリンドロームオリゴヌクレオチドを用いて、両鎖を特異的に始動する。適切なプライマーの例には、配列番号３０〜３５が含まれる。二本鎖環状鋳型の変性、および単一のプライマーのアニーリングは、例えば、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むアニーリング／変性緩衝液中で行われる。変性は、９５℃まで加熱し、この温度にて１〜１０分間維持し、続いて、特異的プライマーの鋳型への最大結合のために最適化された、注意深く制御された冷却プロフィールによって行われる。次に、温度は、適切なＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に最適となるように下げられる。適切な酵素は、３０℃にて最適に作用する枯草菌（Bacillus subtilis）ファージｐｈｉ２９から単離されたｐｈｉ２９である。
【０１１５】
次に、酵素ｐｈｉ２９およびＰＰｉ（酵母無機ピロホスファターゼ）を含む適切な容量の反応緩衝液をアニーリングされたＤＮＡ／プライマー反応に添加する。反応混合物は、約３０℃にて５〜２０時間の間、またはそれより長期間インキュベートされる。適切な反応緩衝液は、典型的には、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む。
【０１１６】
続いて、ＲＣＡによって増幅されたコンカテマーＤＮＡは、３０℃にてプロテロメラーゼＴｅｌＮとともに、適切な緩衝液、例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ中で、反応が完了するまでインキュベートされる。得られた閉鎖型直鎖状ＤＮＡ産物は、例えば、精製される量に応じて、ゲル電気泳動または適切なクロマトグラフィー法によって精製してもよい。
【０１１７】
［実施例２］
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ鋳型からの閉鎖型直鎖状ＤＮＡの生成
プロテロメラーゼＴｅｌＮの結合配列を含むテロメア末端を含有する閉鎖型直鎖状ＤＮＡをＤＮＡ鋳型として用いる。鋳型のテロメア末端を含むパリンドローム配列の半分の部分に相補的な単一のパリンドロームオリゴヌクレオチドを特異的プライマーとして用いる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型上の２つの同一部位に結合する。適切なプライマーの例には、配列番号３０〜３５が含まれる。
【０１１８】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ鋳型の変性、および単一のプライマーのアニーリングは、例えば、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むアニーリング／変性緩衝液中で行われる。変性は、９５℃まで１分間加熱し、この温度にて１〜１０分間維持し、続いて、特異的プライマーの鋳型への最大結合のために最適化された、注意深く制御された冷却プロフィールによって行われる。次に、温度は、適切なＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に最適となるように下げられる。適切な酵素は、３０℃にて最適に作用する枯草菌（Bacillus subtilis）ファージｐｈｉ２９から単離されたｐｈｉ２９である。
【０１１９】
次に、酵素ｐｈｉ２９およびＰＰｉ（酵母無機ピロホスファターゼ）を含む適切な容量の反応緩衝液をアニーリングされたＤＮＡ／プライマー反応に添加する。反応混合物は、約３０℃にて５〜２０時間の間、またはそれより長期間インキュベートされる。適切な反応緩衝液は、典型的には、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む。
【０１２０】
続いて、ＲＣＡによって増幅されたコンカテマーＤＮＡは、３０℃にてプロテロメラーゼＴｅｌＮとともに、適切な緩衝液、例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ中で、反応が完了するまでインキュベートされる。得られた閉鎖型直鎖状ＤＮＡ産物は、例えば、精製される量に応じて、ゲル電気泳動または適切なクロマトグラフィー法によって精製してもよい。
【０１２１】
実施例２の方法は、産物が鋳型と同一である環状反応を提供し、したがって、方法のステップの追加のサイクルを行うことによって、非常に少量の鋳型から反応を容易にスケールアップさせる方法を提供する。
【０１２２】
［実施例３および４］（材料および方法）
ＤＮＡ増幅のための条件
プロテロメラーゼＴｅｌＮ結合配列およびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む４．３ｋｂの環状二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ鋳型として用いた。ＴｅｌＮ結合配列は、逆方向パリンドロームを構成する。パリンドロームＴｅｌＮ結合部位の半分における配列に相補的な異なる長さのオリゴヌクレオチドを単一の特異的プライマーとして用いた。このようなプライマーは、ＤＮＡ鋳型のＴｅｌＮ配列内の反対鎖上の同一部位に結合し、反対方向にＤＮＡ合成を開始する。こうして、ただ単一のオリゴヌクレオチドが、各鎖を始動するために必要とされる。試験されるプライマーの例には、配列番号３０〜４２から選択される。
【０１２３】
環状二本鎖ＤＮＡ鋳型の変性および単一のプライマーの初期アニーリングは、１ｎｇ  ＤＮＡ鋳型、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＫＣｌ、および１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、５０μｌ体積の緩衝液において行われた。単一プライマーの濃度は１０ｍＭであったが、比較の目的のために含められたランダムヘキサマーの濃度は５０ｍＭであった。変性は、９５℃まで１分間加熱し、次に、２分間、２５℃に急速に冷却することによって行われた。続いて、温度は、枯草菌（Bacillus subtilis）ファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅のために選択された温度に変化させた。ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、２５〜３５℃の範囲内で、最適には３０℃にて機能する。
【０１２４】
ＤＮＡ増幅は、酵素ｐｈｉ２９（０．０４μＭ）および酵母無機ピロホスファターゼ（０．５Ｕ／ｍｌ）を含む５０μｌ反応緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３０ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ）をアニーリングされたＤＮＡ／プライマー反応混合物に添加することによって行われた。反応は、最大２０時間、３０℃および３４℃にて行われた。
【０１２５】
次に、ローリングサークル増幅反応（ＲＣＡ）におけるｐｈｉ２９酵素によって生成されたコンカテマーＤＮＡは、プロテロメラーゼＴｅｌＮまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼのいずれかを用いて処理された。両酵素は、鋳型と同一サイズの産物を生成するようにコンカテマーＤＮＡを切断するが、ＴｅｌＮ産物は共有結合閉鎖型末端を有する。反応条件は以下の通りであった：
【０１２６】
ＨｉｎｄＩＩＩ反応条件
ＨｉｎｄＩＩＩ消化について、コンカテマーＤＮＡの反応試料は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量され、可能であれば、４０Ｕ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ、ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＯＡｃ、１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２および１ｍＭジチオスレイトールを含む２０μｌの緩衝液／酵素あたり２５０ｎｇに調整された。反応物を３０分間、３７℃にてインキュベートした。
【０１２７】
ＴｅｌＮ反応条件
ＴｅｌＮ切断／結合について、コンカテマーＤＮＡの試料は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量され、可能であれば、８ｐｍｏｌ  ＴｅｌＮプロテロメラーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールを含む２０μｌの緩衝液／酵素あたり２５０ｎｇに調整された。反応物を３０℃にて１．５時間インキュベートした。
【０１２８】
ゲル電気泳動
２０μｌの消化されたＤＮＡ産物は、４μｌのゲルローディング緩衝液と混合され、０．８％アガロースゲルにローディングされた。混合物を電気泳動によって分離し、ＤＮＡを視覚化するために臭化エチジウムを用いて染色した。参照のための５μｌ  ＤＮＡラダーのローディングは、４．３ｋｂ  ＤＮＡ産物の同定を可能にした。
【０１２９】
ゲル画像化
画像分析は、ＳｙｎＧｅｎｅ  ＧｅｎｅＳｎａｐソフトウェアを用いて、ＵＶ条件下で行われた。ゲル画像の濃度測定量は、ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて行われた。濃度測定画像は、ランダムヘキサマーと比較して、単一の特異的プライマー由来の４．３ｋｂ産物の純度のより明確な比較を可能にする。
【０１３０】
［実施例３］
３０℃でのＤＮＡのローリングサークル増幅における単一のオリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較
ＲＣＡによる鋳型ＤＮＡ増幅反応は、３０℃にてランダムヘキサマー、１１マーのプライマー（配列番号３２および３３）（各プライマーについて融解温度は約３２℃）、および１５マーのプライマー（配列番号３４および３５）（融解温度は３６℃〜３９℃）を用いて行われた。
【０１３１】
反応物は、１時間、２時間、４時間、６時間および９時間後に分析された。反応物からのコンカテマーＤＮＡ試料をＨｉｎｄＩＩＩ処理に供し、従前に記載したようにゲル電気泳動によって産物を分離した。記載されるようにＳｙｎＧｅｎｅ  ＧｅｎｅＳｎａｐ分析ソフトウェアを用いてゲルを分析した。結果を図７Ａ、８Ａおよび９Ａに示す。各プライマーについてのｐｈｉ２９によるＲＣＡ反応速度は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法を用いることによって、各時間点でコンカテマーＤＮＡ定量から計算された。
【０１３２】
結果
図７Ａに示されるように、３０℃にて、単一の特異的プライマー（１１マーの配列番号３２と３３、および１５マーの配列番号３４と３５）の各々は、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼによる４．３ｋｂの環状二本鎖ＤＮＡ鋳型の増幅を始動することができた。各プライマーについての反応速度を示す。使用された単一のプライマーの濃度（１０ｍＭ）にて、プライマーの配列番号３２（１１マー）および配列番号３４（１５マー）は、プライマーの配列番号３３（１１マー）および配列番号３５（１５マー）よりも良好に機能した。プライマーの配列番号３２と３４を用いたＤＮＡ増幅の速度は、ランダムヘキサマーと比較して遅かったが、それらは同じ最終ＤＮＡ収量に達した。
【０１３３】
ランダムヘキサマープライマーは、最良の単一のプライマー（配列番号３２）よりも良好な反応速度を与えたが、使用された濃度（５０ｍＭ）は、単一の始動反応について使用した濃度（１０ｍＭ）よりも５倍大きかったことに気付くべきである。プライマーの二量体形成を防ぐために、単一プライマーの濃度を最適化することは、反応のより高い速度を生成する場合がある。
【０１３４】
また、反応は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いたｐｈｉ２９反応のコンカテマーＤＮＡ産物を処理することによって形成された開放型末端直鎖状二本鎖の４．３ｋｂ産物の純度を比較することによってモニターされた（図８Ａ）。比較された試料は、各々、２５０ｎｇのＤＮＡ消化物由来であった。ランダムヘキサマーと単一の１１マーのプライマー（配列番号３２）を用いて行われた増幅のウェル内に残存するＤＮＡは、ほぼ確実に、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断することができない、メッシュされた（meshed）一本鎖ＤＮＡであった。これは、共通して、ｐｈｉ２９ポリメラーゼを用いたＲＣＡ反応において観察される（レーン１、６、１１、１６および１７）。
【０１３５】
図８Ａにおけるデータ（レーン１１〜２０）は、３０℃にて、単一の特異的プライマーの各々が、少ない無関係なバンドと４．３ｋｂ産物バンド周辺のより低レベルのスメアを示すランダムヘキサマープライマーよりも明確な４．３ｋｂ産物を生じさせたことを明示する。例えば、レーン１１とレーン１２〜１５、およびレーン１６とレーン１７〜２０を比較されたい。また、これは図９Ａの濃度測定データからも観察することができる。
【０１３６】
ヘキサマープライマーが、ＤＮＡ鋳型に対してランダムにＤＮＡ合成を開始し、結果として、ｐｈｉ２９ポリメラーゼがより多様なコンカテマーの長さを作り出すことができるため、この驚くべき観察を説明することができる。したがって、より多くのＤＮＡの不用な断片がＨｉｎｄＩＩＩによる処理後に形成され、これは、電気泳動ゲルにおいて余剰なバンドとスメアによって現れる。
【０１３７】
これは、ＤＮＡ生成法において特に重要である。鎖置換型ローリングサークルＤＮＡポリメラーゼ（例えばｐｈｉ２９）を用いた単一の特異的プライマーの使用は、基質の産物へのより効率的な変換をもたらす。さらに、産物は、より容易にかつコスト効率よく精製される。こうして、単一の特定のパリンドロームプライマーは、ランダムヘキサマーなどのプライマーの混合物と比較して重要な利点を有する。
【０１３８】
［実施例４］
３４℃でのＤＮＡのローリングサークル増幅における単一オリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較
ＲＣＡによる鋳型ＤＮＡ増幅反応は、ランダムヘキサマー、ならびに１１マーのプライマー（配列番号３２および３３）（融解温度は約３２℃である）を用いて、３４℃にて行われた。反応物は、１時間、２時間、４時間、６時間および９時間後に分析された。反応物からの別々のコンカテマーＤＮＡ試料をＨｉｎｄＩＩＩおよびプロテロメラーゼＴｅｌＮ処理に供し、従前に記載したようにゲル電気泳動によって産物を分離した。記載した通りに画像分析ソフトウェアを用いてゲルを分析した。結果は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物については図８Ｂに示され、ＴｅｌＮ消化されたコンカテマーＤＮＡについては図８Ｃに示される。
【０１３９】
結果
３４℃は、ランダムヘキサマーのアニーリングよりも鋳型に対する１１マーのアニーリングについてより最適な温度であることが期待されたが、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ活性については最適な３０℃を超える。
【０１４０】
ランダムヘキサマープライマーおよび各々の単一の特異的プライマー（１１マーの配列番号３２および３３）は、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼによる４．３ｋｂの環状二本鎖ＤＮＡ鋳型の増幅を始動することができた。各プライマーの反応速度を図７Ｂに示す。使用された単一のプライマー濃度（１０ｍＭ）にて、プライマーの配列番号３２（１１マー）は、プライマーの配列番号３３（１１マー）よりも良好に機能したが、ランダムヘキサマーによって達成された速度には達しなかった。再度、従前に記載した通り、１０ｍＭの単一プライマーの濃度は、ランダムヘキサマー（５０ｍＭ）について使用された濃度と比較して、反応に対して次善であったことが考えられる。これは、観察されたより低い反応速度を説明するものである。
【０１４１】
全３つのプライマータイプを用いて、３４℃におけるＤＮＡ合成の速度は、３０℃においてよりも有意に低く、これは、恐らく、この温度において次善に作用する酵素に起因していた。
【０１４２】
また、反応は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いたｐｈｉ２９反応のコンカテマーＤＮＡ産物を処理することによって形成された開放型末端直鎖状二本鎖の４．３ｋｂ産物の純度を比較することによってモニターされた（図８Ｂ）。比較された試料は、各々、２５０ｎｇのＤＮＡ消化物由来であった。ランダムヘキサマーと単一の１１マーのプライマー（配列番号３２）を用いて行われた増幅のウェル内に残存するＤＮＡは、ほぼ確実に、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断することができない、メッシュされた一本鎖ＤＮＡであった（レーン７および１０）。
【０１４３】
図８Ｂにおけるデータ（レーン７〜１５）は、３４℃にて、単一の特異的プライマーの各々がやはり、少ない無関係なバンドと４．３ｋｂ産物バンド周辺のより低レベルのスメアを有するランダムヘキサマープライマーよりも明確な４．３ｋｂ産物を生じさせたことを明示する。また、これは図９Ｂの濃度測定データからも観察することができる。これは、これらの３つのタイプのプライマーを用いた、３０℃で行われた観察と類似している。
【０１４４】
さらに、ｐｈｉ２９酵素のＤＮＡコンカテマー産物がプロテロメラーゼＴｅｌＮにより消化され、閉鎖型直鎖状の４．３ｋｂ産物を生成した場合、結果は、ランダムヘキサマープライマーおよび２つの１１マーのプライマー（配列番号３２および３３）による同一の性能を示した（図８Ｃ）。比較された試料は、再度、２５０ｎｇのＤＮＡ消化物由来であった。
【０１４５】
得られた結果は、単一の特定のオリゴヌクレオチドプライマーが、最終生成物の質に関して、ランダムヘキサマープライマーの混合物より性能が優れていたものとなり得ることを示す。
【０１４６】
本発明の配列
【０１４７】
【表２】
2013535210.tif 000004
【０１４８】
【表３】
2013535210.tif 000005
【０１４９】
【表４】
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2013535210.tif 000007
【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
【表９】
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2013535210.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2013535210.tif 000021
【図８Ａ】
2013535210.tif 000022
【図８Ｂ】
2013535210.tif 000023
【図８Ｃ】
2013535210.tif 000024
【図９】
2013535210.tif 000025
【国際調査報告】
2013535210.tif 000026
2013535210.tif 000027
2013535210.tif 000028
2013535210.tif 000029
2013535210.tif 000030