(57)【要約】本発明は、非脂質エンベロープウイルスの除去を高めるための、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を精製するための方法を提供する。例えば、タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、前記タンパク質の等電点よりも高いｐＨの前記溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、前記陽イオン交換樹脂を第１の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、前記第１の洗浄緩衝液は、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、
前記タンパク質の等電点よりも高いｐＨの前記溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、
前記陽イオン交換樹脂を第１の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、前記第１の洗浄緩衝液は、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液以下であるｐＨを有することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液は、前記タンパク質の前記等電点を少なくとも１ｐＨ単位超えるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、
前記溶液を陽イオン交換樹脂に適用することと、
前記陽イオン交換樹脂を、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液の前記ｐＨよりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、第１の溶離液は、前記第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、
を含む、方法。
【請求項４】
前記第１の洗浄緩衝液の前記ｐＨは、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記タンパク質の前記等電点を少なくとも１ｐＨ単位超えるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、
前記タンパク質の前記等電点よりも高いｐＨの前記溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、
前記陽イオン交換樹脂を、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記タンパク質の前記等電点よりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、前記第１の溶離液は、前記第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、
を含む、方法。
【請求項６】
前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液は、前記タンパク質の前記等電点を少なくとも１ｐＨ単位超えるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の洗浄緩衝液の前記ｐＨは、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液の前記ｐＨを少なくとも１ｐＨ単位超えるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨは、７．０よりも大きい、請求項２、４、６、または７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液中の前記タンパク質は、少なくとも約１５０キロダルトンの分子質量を有するポリペプチドである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換樹脂は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホアルキル（ＳＰ、ＳＥ）、セルロースの硫酸化エステル、ヘパリン、およびメチルスルホネート（Ｓ）から成る群より選択される、負に帯電した基を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質は、血液凝固タンパク質である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記血液凝固タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子およびフォンウィルブランド因子から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
フォンウィルブラント（ＶＷＦ）含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、
前記タンパク質の等電点よりも高いｐＨの前記溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、
前記陽イオン交換樹脂を第１の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、前記第１の洗浄緩衝液は、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液以下であるｐＨを有することと、
を含む、方法。
【請求項１４】
ＶＷＦ含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、
前記溶液を陽イオン交換樹脂に適用することと、
前記陽イオン交換樹脂を、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記溶液の前記ｐＨよりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、前記第１の溶離液は、前記第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、
を含む、方法。
【請求項１５】
ＶＷＦ含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、
前記タンパク質の前記等電点よりも高いｐＨの前記溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、
前記陽イオン交換樹脂を、前記陽イオン交換樹脂に適用される前記タンパク質の前記等電点よりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、前記第１の溶離液は、前記第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２００９年８月２０日に出願された米国仮出願第６１／２３５，５７０号の優先権の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
概して、本発明は、非脂質エンベロープウイルスの除去を高めるための、ＶＷＦを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）は、大きさが約５００〜２０，０００ｋＤの範囲である一連の多量体として、血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって結合している２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットから成る。ＶＷＦは、損傷を受けた血管壁の内皮下層への初期の血小板粘着を媒介する。より大きい多量体だけが止血活性を呈する。内皮細胞が大きい重合体形態のＶＷＦを分泌し、低分子量を有するＶＷＦの形態のもの（低分子量のＶＷＦ）がタンパク質切断によって生じると考えられる。大きい分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベル−パラーデ小体の中に貯蔵されており、刺激に応じて遊離される。
【０００４】
ＶＷＦは、大部分が繰り返し領域から成るプレプロＶＷＦとして、内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの開裂に応じて、そのＣ末端領域でのジスルフィド結合を通してプロＶＷＦが二量体化する。二量体は、多量体化のためのプロトマーとしての役割を果たし、遊離末端間のジスルフィド結合によって制御される。多量体への組立の後には、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続く（非特許文献１）。
【０００５】
ＶＷＦのクローン化ｃＤＮＡから予測される一次翻訳産物は、２８１３残基の前駆体ポリペプチド（プレプロＶＷＦ）である。プレプロＶＷＦは、２２アミノ酸シグナルペプチドおよび７４１アミノ酸プロペプチドから成り、成熟ＶＷＦは、２０５０アミノ酸を含む（非特許文献２）。
【０００６】
ＶＷＦにおける欠陥は、フォンウィルブラント病（ＶＷＤ）の原因であり、多少に関わらず、顕著な出血表現型によって特徴付けられる。ＶＷＤ３型は、ＶＷＦが完全に欠損している最も重篤な型であり、ＶＷＤ１型は、ＶＷＦの量的な喪失に関連し、その表現型は非常に軽度なものであり得る。ＶＷＤ２型は、ＶＷＦの質的な欠陥に関連し、ＶＷＤ３型と同程度に重篤である。ＶＷＤ２型は、多くの亜型を有し、いくつかは、高分子量多量体の喪失または減少に関連付けられる。フォンウィルブランド症候群２ａ型（ＶＷＳ−２Ａ）は、中間および大きい多量体の双方の喪失によって特徴付けられる。ＶＷＳ−２Ｂは、最も高い分子量の多量体の喪失によって特徴付けられる。ＶＷＦに関連する他の病気および疾患は、当技術分野において知られている。
【０００７】
治療用タンパク質溶液からの非脂質エンベロープウイルスの除去または不活性化は、従来、高温（例えば、乾熱、蒸気加熱、低温殺菌）、高エネルギー光線を伴う照射（例えば、紫外（ＵＶ）線またはベータ放射線）、低ｐＨ、ナノ濾過のような物理的な方法を伴う処理によって、またはクロマトグラフィ法、特に親和性クロマトグラフィによって達成されてきた。しかしながら、これらの方法は、ナノフィルタを通過しない、および／または熱もしくは放射線で処理するとその効力または分子完全性を喪失する、ＶＷＦ等の高分子量タンパク質を精製する時には、しばしば効果がない。
【０００８】
現在の規制上のガイドラインは、製造業者に対して、組換え医薬品のための、脂質エンベロープウイルスおよび非脂質エンベロープウイルスの双方の低減および／または不活性化の問題に取り組むことを求めている。ＩＣＨの「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ，１９９８，６３（１８５）：５１０７４−５１０８４）は、製造業者に対して、製品の種類、製造プロセス、および潜在的なウイルス汚染の危険性を考慮して、ウイルス問題にどのように対処するか、柔軟性を与えている。これらのガイドラインは、ウイルス汚染の危険性が、細胞株に由来する全てのバイオテクノロジー製品に共通する特徴であると指摘している。そのような汚染は、深刻な臨床結果を招くことがあり、また、細胞株源自体（細胞基質）の汚染、または製造中の偶発的なウイルスの導入から生じ得る。
【０００９】
脂質エンベロープウイルスの不活性化は、有機溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理法によって極めて効果的に行うことができるが、非脂質エンベロープウイルス（ＮＬＥＶ）の不活性化または除去は、それらの小さいサイズおよび物理的安定性のため、困難であり得る。
【００１０】
したがって、従来の技術には、ＶＷＦの精製中に非脂質エンベロープウイルスを効率的に不活性化または除去するための方法を開発する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｅｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４（１９９１），２５７−２６１
【非特許文献２】Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｚ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｒｅ，Ｊ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，３０８−３１６（１９９３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、非脂質エンベロープウイルスの除去を高めるための、ＶＷＦを精製するための有効な方法を提供する。本発明は、高ｐＨで製品の充填ステップおよび洗浄ステップを行うことで、ＮＬＥＶの除去を高めるための、ＶＷＦ精製の新規の方法を提供する。
【００１３】
当技術分野において知られている、ＮＬＥＶからポリペプチドを精製するための１つの方法は、ナノ濾過の使用を伴う。ナノ濾過を使用したタンパク質およびウイルスの有効な分離の背景にある原則は、ポリペプチドとウイルスとの間のサイズ差を利用することである。有効な分離には、ポリペプチドがウイルスよりも小さい有効サイズを有することが必要とされ、これで、ポリペプチドがナノフィルタの細孔を通過することを可能にする一方で、ウイルスは保持される。しかしながら、ポリペプチドおよびウイルスが互いに同程度のサイズである場合は、ポリペプチドおよびウイルスの双方がナノフィルタの細孔を通過してしまう、またはどちらも通過しないので、分離に問題が生じる。本明細書に開示する方法は、ウイルスからポリペプチドを分離するために、ナノ濾過ではなく陽イオン交換樹脂を使用し、十分に高いｐＨで樹脂を充填および／または洗浄することによって、この問題を解決する。
【００１４】
理論に束縛されるものではないが、本明細書に開示する方法は、ポリペプチドが特定のサイズおよび／または立体配座であるポリペプチド溶液からのＮＬＥＶの改善された除去に有用である。十分に大きいサイズのポリペプチドは、ポリペプチドの等電点以上の局所的な帯電特性を有する可能性がある。すなわち、ポリペプチドの領域は、局所的な正電荷または負電荷を保持する可能性があり、それによって、ポリペプチドがカラム樹脂に吸着する一方で、ウイルスが通過することを可能にする。ポリペプチドの長さにわたるこの不均等な電荷分配は、高ｐＨでの樹脂の充填および／または洗浄にもかかわらず、ポリペプチドを樹脂に付着させたままにすることを可能にする。
【００１５】
本発明は、タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、溶液中のタンパク質を陽イオン交換樹脂上に充填することと、該樹脂を、タンパク質の等電点よりも高いｐＨの緩衝液で洗浄して、ウイルスを溶出することとを含む、方法を提供する。１つの態様において、ウイルスを溶出するために、タンパク質は、該タンパク質の等電点よりも高いｐＨの緩衝液中で樹脂上に充填される。別の態様において、タンパク質は、洗浄ステップで使用される緩衝液ではない緩衝液中で樹脂上に充填され、該樹脂は、その後、該タンパク質の等電点よりも高いｐＨである緩衝液で洗浄される。
【００１６】
一実施形態では、タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、該タンパク質の等電点よりも高いｐＨの溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を第１の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、該第１の洗浄緩衝液は、陽イオン交換樹脂に適用される溶液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。
【００１７】
１つの態様において、溶液のｐＨは、タンパク質の等電点を約１ｐＨ単位超える。他の態様において、溶液のｐＨは、約１．１、または約１．２、または約１．３、または約１．４、または約１．５、または約１．６、または約１．７、または約１．８、または約１．９、または約２．０、または約２．１、または約２．２、または約２．３、または約２．４、または約２．５、または約２．６、または約２．７、または約２．８、または約２．９、または約３．０、または約３．１、または約３．２、または約３．３、または約３．４、または約３．５、または約３．６、または約３．７、または約３．８、または約３．９、または約４．０、または約４．１、または約４．２、または約４．３、または約４．４、または約４．５、または約４．６、または約４．７、または約４．８、または約４．９、または約５．０、または約５．１、または約５．２、または約５．３、または約５．４、または約５．５、または約５．６、または約５．７、または約５．８、または約５．９、または約６．０以上のｐＨ単位であるか、またはタンパク質の等電点を超える。これらの実施形態において、ｐＨは、約７よりも大きい。関連する態様において、タンパク質含有溶液のｐＨは、約７．０である。他の態様において、タンパク質含有溶液のｐＨは、約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５、または約７．６、または約７．７、または約７．８、または約７．９、または約８．０、または約８．１、または約８．２、または約８．３、または約８．４、または約８．５、または約８．６、または約８．７、または約８．８、または約８．９、または約９．０、または約９．１、または約９．２、または約９．３、または約９．４、または約９．５、または約９．６、または約９．７、または約９．８、または約９．９、または約１０．０、または約１０．１、または約１０．２、または約１０．３、または約１０．４、または約１０．５、または約１０．６、または約１０．７、または約１０．８、または約１０．９、または約１１．０、または約１１．１、または約１１．２、または約１１．３、または約１１．４、または約１１．５、または約１１．６、または約１１．７、または約１１．８、または約１１．９、または約１２．０、または約１２．１、または約１２．２、または約１２．３、または約１２．４、または約１２．５、または約１２．６、または約１２．７、または約１２．８、または約１２．９、または約１３．０以上である。
【００１８】
別の実施形態では、タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、溶液を陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を、陽イオン交換樹脂に適用される溶液のｐＨよりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、第１の溶離液は、第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。１つの態様において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、陽イオン交換樹脂に適用される溶液のｐＨを約１ｐＨ単位超える。他の態様において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、約０．１、または約０．２、または約０．３、または約０．４、または約０．５、または約０．６、または約０．７、または約０．８、または約０．９、または約１．１、または約１．２、または約１．３、または約１．４、または約１．５、または約１．６、または約１．７、または約１．８、または約１．９、または約２．０、または約２．１、または約２．２、または約２．３、または約２．４、または約２．５、または約２．６、または約２．７、または約２．８、または約２．９、または約３．０、または約３．１、または約３．２、または約３．３、または約３．４、または約３．５、または約３．６、または約３．７、または約３．８、または約３．９、または約４．０、または約４．１、または約４．２、または約４．３、または約４．４、または約４．５、または約４．６、または約４．７、または約４．８、または約４．９、または約５．０、または約５．１、または約５．２、または約５．３、または約５．４、または約５．５、または約５．６、または約５．７、または約５．８、または約５．９、または約６．０、または約６．１、または約６．２、または約６．３、または約６．４、または約６．５、または約６．６、または約６．７、または約６．８、または約６．９、または約７．０、または約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５、または約７．６、または約７．７、または約７．８、または約７．９、または約８または約８．１、または約８．２、または約８．３、または約８．４、または約８．５、または約８．６、または約８．７、または約８．８、または約８．９、または約９、または約９．１、または約９．２、または約９．３、または約９．４、または約９．５、または約９．６、または約９．７、または約９．８、または約９．９、または約１０以上のｐＨ単位であるか、またはタンパク質の等電点を超える。これらの実施形態において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、約７よりも大きい。他の態様において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５、または約７．６、または約７．７、または約７．８、または約７．９、または約８．０、または約８．１、または約８．２、または約８．３、または約８．４、または約８．５、または約８．６、または約８．７、または約８．８、または約８．９、または約９．０、または約９．１、または約９．２、または約９．３、または約９．４、または約９．５、または約９．６、または約９．７、または約９．８、または約９．９、または約１０．０、または約１０．１、または約１０．２、または約１０．３、または約１０．４、または約１０．５、または約１０．６、または約１０．７、または約１０．８、または約１０．９、または約１１．０以上である。
【００１９】
ある実施形態において、溶液中のタンパク質は、少なくとも約１５０キロダルトンの分子質量を有するポリペプチドである。種々の態様において、溶液中のタンパク質は、少なくとも約１７５キロダルトン、または約１８０キロダルトン、または約１９０キロダルトン、または約２００キロダルトン、または約２１０キロダルトン、または約２２０キロダルトン、または約２３０キロダルトン、または約２４０キロダルトン、または約２５０キロダルトン、または約２６０キロダルトン、または約２７０キロダルトン、または約２８０キロダルトン、または約２９０キロダルトン、または約３００キロダルトン、または約３１０キロダルトン、または約３２０キロダルトン、または約３３０キロダルトン、または約３４０キロダルトン、または約３５０キロダルトン、または約３６０キロダルトン、または約３７０キロダルトン、または約３８０キロダルトン、または約３９０キロダルトン、または約４００キロダルトン、または約４１０キロダルトン、または約４２０キロダルトン、または約４３０キロダルトン、または約４４０キロダルトン、または約４５０キロダルトン、または約４６０キロダルトン、または約４７０キロダルトン、または約４８０キロダルトン、または約４９０キロダルトン、または約５００キロダルトン以上の分子質量を有するポリペプチドである。本明細書に記載されるように、ポリペプチドはまた、多量体構造から成り、そのような多量体構造は、種々の態様において、少なくとも約５００キロダルトンの分子量を有する。関連する態様において、多量体構造は、少なくとも約５１０、または約５２０、または約５３０、または約５４０、または約５５０、または約５６０、または約５７０、または約５８０、または約５９０、または約６００、または約６１０、または約６２０、または約６３０、または約６４０、または約６５０、または約６６０、または約６７０、または約６８０、または約６９０、または約７００、または約７１０、または約７２０、または約７３０、または約７４０、または約７５０、または約７６０、または約７７０、または約７８０、または約７９０、または約８００、または約８１０、または約８２０、または約８３０、または約８４０、または約８５０、または約８６０、または約８７０、または約８８０、または約８９０、または約９００、または約９１０、または約９２０、または約９３０、または約９４０、または約９５０、または約９６０、または約９７０、または約９８０、または約９９０キロダルトン、または約１メガダルトン、または約１．１メガダルトン、または約１．２メガダルトン、または約１．３メガダルトン、または約１．４メガダルトン、または約１．５メガダルトン、または約１．６メガダルトン、または約１．７メガダルトン、または約１．８メガダルトン、または約１．９メガダルトン、または約２．０メガダルトン、または約２．１メガダルトン、または約２．２メガダルトン、または約２．３メガダルトン、または約２．４メガダルトン、または約２．５メガダルトン、または約２．６メガダルトン、または約２．７メガダルトン、または約２．８メガダルトン、または約２．９メガダルトン、または約３．０メガダルトン、または約３．１メガダルトン、または約３．２メガダルトン、または約３．３メガダルトン、または約３．４メガダルトン、または約３．５メガダルトン、または約３．６メガダルトン、または約３．７メガダルトン、または約３．８メガダルトン、または約３．９メガダルトン、または約４．０メガダルトン、または約４．１メガダルトン、または約４．２メガダルトン、または約４．３メガダルトン、または約４．４メガダルトン、または約４．５メガダルトン、または約４．６メガダルトン、または約４．７メガダルトン、または約４．８メガダルトン、または約４．９メガダルトン、または約５．０メガダルトン以上の分子質量を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、陽イオン交換樹脂は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホアルキル（ＳＰ、ＳＥ）、硫酸、およびメチルスルホネート（Ｓ）から成る群より選択される、負に帯電した基、ならびに他の任意の負に帯電したリガンドを有する。
【００２１】
さらなる実施形態において、タンパク質は、血液凝固タンパク質である。種々の態様において、血液凝固タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子、ＦＩ（フィブリノゲン）、ＦＶ（プロアクセレリン）、ＦＸＩ（血漿−トロンボプラスチン前駆体）、およびＦＸＩＩＩ（フィブリン安定化因子）からなる群より選択される。
【００２２】
ある実施形態では、フォンウィルブラント（ＶＷＦ）含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、タンパク質の等電点よりも高いｐＨの溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を第１の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、該第１の洗浄緩衝液は、陽イオン交換樹脂に適用される溶液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、ＶＷＦ含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、溶液を陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を、陽イオン交換樹脂に適用される溶液のｐＨよりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、第１の溶離液は、第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。
【００２４】
さらなる実施形態では、ＶＷＦ含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、タンパク質の等電点よりも高いｐＨの溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を、陽イオン交換樹脂に適用されるタンパク質の等電点よりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、第１の溶離液は、第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の後に、（Ａ）銀染色、および（Ｂ）残存するｒＦＶＩＩＩに対するウエスタンブロット法分析を行った結果を示す図である。
【図２】ＭＭＶおよびレオウイルスをスパイクした試料による、ＵＮＯ  Ｓラン（ｒｕｎｓ）の染色されたゲルを示す図である。
【図３】ＭＭＶおよびレオウイルスをスパイクした試料による、ＵＮＯ  Ｓランの染色されたゲルを示す図である。
【図４】プロセス変形により得たｒＶＷＦの精製品を、天然状態のＶ８プロテアーゼでタンパク質消化し、生じたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで分離した結果を示す図である。
【図５】プロセス変形により得たｒＶＷＦの精製品を、変性状態のトリプシンでタンパク質消化し、生じたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで分離した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、非脂質エンベロープウイルスの除去を高めるための、ＶＷＦを生成する方法に関する。本発明の方法は、カラム（すなわち、クロマトグラフィ）にも、バッチ（すなわち、カラムハードウェアを伴わない）モードにも適用可能である。
【００２７】
本発明の方法は、非脂質エンベロープウイルスの除去を高めるための、陽イオン交換樹脂に関する精製方法を利用する。陽イオン交換クロマトグラフィを使用したＶＷＦ精製の以前の方法は、中性のｐＨで行われていた。これらの方法は、良好な収率および純度の精製ＶＷＦの製造を可能にするが、驚くべきことに、このプロセスは、非脂質エンベロープウイルスを除去する能力が全くなかった。
【００２８】
用語の定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、５ＴＨ  ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＰＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００２９】
本明細書に引用される各刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、それが本開示と矛盾しない範囲で、参照によりその全体が組み込まれる。
【００３０】
また、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に明示されていない限り、複数の参照先を含むことに留意されたい。
【００３１】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「発現する」、「発現している」、および「発現」という用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列の中の情報を明らかにすることを可能にする、または明らかにさせることを意味し、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を生成することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内で、または細胞によって発現して、タンパク質等の「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、結果として生ずるタンパク質も、「発現した」と言われる場合がある。発現産物は、細胞内の、細胞外の、または分泌型として特徴付けることができる。「細胞内」という用語は、細胞の内側を意味する。「細胞外」という用語は、細胞の外側を意味し、例えば、特定の種類の膜貫通タンパク質である。物質は、それが細胞上または細胞の内側のどこかから、大部分が細胞の外側に現れる場合に、細胞によって「分泌される」。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸残基で構成されるポリマー、その構造変異体、関連する自然発生の構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成非自然発生の類似体を指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を使用して調製することができる。「タンパク質」という用語は、一般的に、大きいポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、一般的に、短いポリペプチドを指す。「ポリペプチド」という用語は、重合体構造も含む。したがって、「ポリペプチド」は、単量体、二量体、三量体、またはそれよりも大きい多量体構造であってもよい。これらの多量体構造は、最高５メガダルトン以上になり得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「等電点」は、水溶液中のポリペプチドの正味の電荷がゼロである、ｐＨ値である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「フラグメント」は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さいポリペプチドまたはタンパク質の任意の部分を指すことを意味する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「類似体」は、構造が実質的に類似しており、かつ同じ生物活性を有するが、分子の全体またはそのフラグメントのいずれかに対して、様々な活性の程度を有することができる、２つ以上のポリペプチドのうちのいずれかを指す。類似体は、１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換を伴う１つ以上の突然変異に基づいて、それらのアミノ酸配列の組成が異なる。置換は、置換されているアミノ酸およびそれを置換するアミノ酸の物理化学的または機能的関連性に基づいて、保存的または非保存的であり得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、通常は分子の一部ではない付加的な化学的部分を含むように修飾された、ポリペプチド、タンパク質、またはその類似体を指す。そのような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期等を調節することができる。あるいは、この部分は、分子の毒性を低下させ、分子の望ましくない任意の副作用を除去または軽減する等が可能である。そのような効果を媒介できる部分については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。そのような部分を分子に連結するための手順は、当技術分野において周知である。例えば、変異体は、インビボでより長い半減期をタンパク質に与える、化学的修飾を有する血液凝固因子であってもよい。種々の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／またはポリシアル化によって修飾される。
【００３８】
組換え型ＶＷＦ
プレプロＶＷＦのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２で示され、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５５２およびＮＰ＿０００５４３で入手することが可能である。成熟ＶＷＦタンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号３で示される（完全長プレプロＶＷＦアミノ酸配列のアミノ酸７６４−２８１３に対応する）。
【００３９】
有用なｒＶＷＦの１つの形態は、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子をインビボで安定化する（例えば、結合する）特性、および任意に、薬理的に許容されるグリコシル化パターンを有するという特性を少なくとも持つ。その具体的な例には、Ａ２ドメインを伴わないためタンパク質分解に耐性があるＶＷＦ（Ｌａｎｋｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１００８−１０１３，１９９７）、および糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインと、コラーゲンおよびヘパリンの結合部位とを含むＶａｌ４４９からＡｓｎ７３０までのＶＷＦフラグメントが挙げられる（Ｐｉｅｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：１３３９−１３４７，１９８９）。ＶＷＦが少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を安定化する能力の測定は、当技術分野の状態において知られている方法に従って、ＶＷＦ欠損哺乳動物で行うことができる。
【００４０】
本発明のｒＶＷＦは、当技術分野において知られている任意の方法によって生成されてもよい。１つの具体的な実施例は、組換え型ＶＷＦを生成する方法に関して参照により本明細書に組み込まれる、１９８６年１０月２３日に公開された国際公開第ＷＯ８６／０６０９６号、および１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号に開示されている。したがって、（ｉ）例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介した、遺伝子操作による組み換えＤＮＡの生成、（ｉｉ）例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介した、トランスフェクションによる組換えＤＮＡの原核細胞または真核細胞への導入、（ｉｉｉ）例えば連続培養またはバッチ培養での、該形質転換された細胞の培養、（ｉｖ）例えば構成的または誘発によるＶＷＦの発現、（ｖ）例えば培地から、または形質転換された細胞を採取することによる該ＶＷＦの単離、（ｖｉ）例えば陰イオン交換クロマトグラフィまたは親和性クロマトグラフィを介して、精製されたｒＶＷＦを得ること、に関する方法は、当技術分野でよく知られている。組換え型ＶＷＦは、当技術分野においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して、形質転換された宿主細胞の中に作製してもよい。例えば、ポリペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を使用して、ＤＮＡから切除することができる。
【００４１】
あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホルアミド化法等の化学合成技術を使用して合成することができる。また、これらの技術の組み合わせを使用することができる。
【００４２】
本発明はまた、適切な宿主の中で本発明のポリペプチドをコードするベクターも提供する。ベクターは、適切な発現制御配列に操作可能に連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドをベクターの中に挿入する前または後のいずれかにこの操作可能な連結を生じさせる方法は、よく知られている。発現制御配列は、プロモーター、アクティベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。ポリヌクレオチドをその中に有する、結果として生じるベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、当技術分野においてよく知られている方法を使用して行うことができる。
【００４３】
本発明の実践に際しては、数多くの入手可能でかつよく知られている宿主細胞のうちのいずれかを使用してもよい。特定の宿主の選択は、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物学的安全性、およびコストを含む、当技術分野で認識される数多くの要因に依存する。全ての宿主細胞が個々のＤＮＡ配列の発現効率について同等とは限らないことを理解して、これらの要因のバランスを取らなければならない。これらの一般的なガイドラインの範囲内で、有用な微生物宿主細胞には、細菌、酵母および他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）の培養細胞、または当技術分野で知られている他の宿主が挙げられる。
【００４４】
次に、形質転換した宿主を培養して、精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現するように、従来の発酵条件で培養することができる。そのような発酵条件は、当技術分野においてよく知られている。最後に、当技術分野でよく知られている方法によって、培養物からポリペプチドを精製する。
【００４５】
本発明の化合物を発現させるために利用される宿主細胞に応じて、炭水化物（オリゴ糖）群を、タンパク質の中のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく付着させてもよい。一般にオリゴ糖が配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る場合、Ｏ−結合型オリゴ糖は、セリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着し、Ｎ−結合型オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着する。Ｘは、好ましくは、プロリンを除く１９の天然アミノ酸のうちの１つである。Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖、ならびに各型に見られる糖残基の構造は異なる。双方の型に一般的に見られる糖の１つの型は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合型オリゴ糖およびＯ−結合型オリゴ糖の双方の末端残基であり、その負電荷によって、グリコシル化化合物に酸性質を与え得る。そのような部位は、本発明の化合物のリンカーに組み込まれてもよく、好ましくは、ポリペプチド化合物の組換え体の生成中に、細胞によって（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ等の哺乳動物細胞内で）グリコシル化される。しかしながら、そのような部位は、当技術分野において知られている合成または半合成手順によって、さらにグリコシル化されてもよい。
【００４６】
あるいは、化合物は合成法によって作製してもよい。例えば、固相合成技術を使用してもよい。適切な技術は、当技術分野においてよく知られており、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｏｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：１０５−２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：２５７−５２７に記載されているものが挙げられる。固相合成は、小さいペプチドを作成する最も対費用効果の高い方法であるので、個々のペプチドを作成する好適な技術である。
【００４７】
ＶＷＦのフラグメント、変異体、および類似体
ポリペプチドフラグメント、変異体、または類似体を調製するための方法は、当技術分野でよく知られている。
【００４８】
ポリペプチドのフラグメントは、酵素的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）を使用し、さらに、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントを産生する組換え手段を使用して調整されるが、これに限定されない。多量体化ドメインまたは当技術分野において知られている任意の他の識別可能なＶＷＦドメイン等の、特定の活性を有するタンパク質の領域を含む、ポリペプチドフラグメントを産生してもよい。
【００４９】
ポリペプチドの変異体は、ヒト形態およびヒト以外の形態のＶＷＦ（例えば、マウスＶＷＦ）を含むことを意図している。また、例えばマウス／ヒト融合ポリペプチドを含む、キメラポリペプチドも、本明細書の方法によって意図されている。
【００５０】
ポリペプチド類似体を作製する方法もよく知られている。ポリペプチドのアミノ酸配列類似体は、置換類似体、挿入類似体、付加類似体、または欠失類似体とすることができる。ポリペプチドのフラグメントを含む欠失類似体は、機能または免疫原性活性に必須ではない、天然タンパク質の１つ以上の残基が欠損している。挿入類似体は、例えばポリペプチドの非末端でのアミノ酸の付加を伴う。この類似体は、免疫反応性エピトープの挿入、または単に単一の残基の挿入を含み得る。ポリペプチドのフラグメントを含む付加類似体は、タンパク質の両末端のうちのどちらかでの１つ以上のアミノ酸の付加を含み、例えば、融合タンパク質を含む。
【００５１】
置換類似体は、一般的に、タンパク質内の１つ以上の部位において一方の野生型のアミノ酸をもう一方のアミノ酸と交換するものであり、ポリペプチドの１つ以上の特性を、他の機能または特性を失うことなく、調節するように設計してもよい。１つの態様において、置換は、保存的置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸を、類似した化学的特性の側鎖を有するアミノ酸と置換することを意味する。保存的置換を行うための類似したアミノ酸には、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）を有するもの、塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）を有するもの、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）を有するもの、疎水性脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）を有するもの、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）を有するもの、小さい側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）を有するもの、または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）を有するもの、が挙げられる。
【００５２】
類似体は、それらが由来する組換え型ＶＷＦと実質的に相同であっても、または実質的に同一であってもよい。好適な類似体は、野生型ポリペプチドの生物活性（例えば、血液凝固活性）のうちの少なくとも一部を維持しているものである。
【００５３】
意図しているポリペプチド変異体は、ユビキチン化、ポリシアル化を含むグリコシル化、治療剤または診断剤との接合、標識化、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）等の共有結合重合体の付着、非加水分解性結合の導入、および通常はヒトタンパク質には生じないオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換等の技術によって化学修飾されるポリペプチドを含む。変異体は、本発明の非修飾分子と同じまたは本質的に同じ結合特性を維持している。そのような化学修飾には、ＶＷＦポリペプチドへの作用物質の直接的または間接的な（例えば、リンカーを介した）付着が挙げられる。間接的な付着の場合、リンカーは加水分解性であっても、または非加水分解性であってもよいと考えられる。
【００５４】
ペグ化ポリペプチド類似体の調製は、一般に、（ａ）結合構築体ポリペプチドが１つまたは複数のＰＥＧ基に付着する条件下でポリペプチドを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等）と反応させるステップと、（ｂ）反応生成物を得るステップとを含む。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比率が大きくなるにつれて、ポリペグ化された生成物の割合が高くなる。いくつかの実施形態において、結合構築体は、Ｎ末端に単一のＰＥＧ部分を有する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、インビボでより長い半減期を提供するために、血液凝固因子に付着させてもよい。ＰＥＧ基は、好都合な任意の分子量であってもよく、直鎖であっても、または分鎖でもよい。ＰＥＧの平均分子量は、約２キロダルトン（「ｋＤ」）〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、血液凝固因子の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、またはエステル基）に対するＰＥＧ部分上の天然または人工の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、またはエステル基）を通して、アシル化または還元的アルキル化を介して、または当技術分野において知られている任意の他の技術によって、血液凝固因子に付着する。
【００５５】
ポリシアル酸化されたポリペプチドを調製するための方法は、米国特許出願公開第２００６０１６０９４８号，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３４１：２６−３４，１９９７、およびＳａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １２：４２−５１，２００６に記載されている。簡単に説明すると、０．１ＭのＮａＩＯ４を含むコロミン酸溶液を暗所で室温にて撹拌してＣＡを酸化する。この活性化ＣＡ溶液を、例えば、暗所で０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、この溶液をｒＶＷＦ溶液に加えて、緩やかに振盪しながら暗所で室温にて１８時間インキュベートする。次いで、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、このｒＶＷＦ−ポリシアル酸接合体から遊離試薬を分離することができる。ｒＶＷＦとポリシアル酸との接合はまた、架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用して行ってもよい（Ｍｉｇｎｅａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：７９０−７９６，２００４）。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドである第２の作用物質との融合タンパク質であってもよいことをさらに意図している。一実施形態において、ポリペプチドである第２の作用物質は、酵素、成長因子、抗体、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、細胞接着分子、または前述のタンパク質のフラグメントもしくは活性ドメインであるが、これに限定されない。関連する実施形態において、第２の作用物質は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子等の、血液凝固因子である。意図している融合タンパク質は、当技術分野でよく知られている化学的技術または組換え技術によって作製される。
【００５７】
さらに、プレプロＶＷＦポリペプチドおよびプロＶＷＦポリペプチドが、本発明の製剤において治療効果を提供してもよいことも意図している。例えば、米国特許第７，００５，５０２号は、インビトロで血小板の存在下でのトロンビン産生を誘発する、大量のプロＶＷＦを含む医薬製剤を記載している。本発明は、天然の成熟ＶＷＦの組換え型、生物活性フラグメント、変異体、または類似体に加えて、本明細書に記載される製剤で、プレプロＶＷＦ（配列番号２で示す）またはプロＶＷＦポリペプチド（配列番号２のアミノ酸残基２３〜７６４）の組み換え型、生物活性フラグメント、変異体、または類似体を使用することを意図している。
【００５８】
熟練者であれば、天然分子と同一または類似の生物活性を有する、天然分子の生物活性フラグメント、変異体、または類似体をコードするために、フラグメント、変異体、および類似体をコードするポリヌクレオチドを容易に産生することができる。これらのポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技術、分子をコードするＤＮＡの消化／連結等を使用して調製することができる。したがって、当業者は、部位特異的突然変異誘発が挙げられるが、これに限定されない、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、改変されたコドンおよびミスセンス突然変異をもたらすために、ＤＮＡ鎖に単一塩基の変化を生じさせることが可能になるであろう。本明細書で使用する場合、「適度に厳重なハイブリッド化条件」という句は、例えば、５０％のホルムアミド中で、４２℃でハイブリッド化し、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で、６０℃で洗浄することを意味する。当業者であれば、ハイブリッド化する配列の長さおよびＧＣヌクレオチド塩基含有量に基づいて、これらの条件に変化が生じること理解するであろう。当技術分野出の標準的な配合は、正確なハイブリッド化条件を決定するのに適している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，９．４７−９．５１  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい。
【００５９】
ＶＷＦを生成する方法
産業的に、ＶＷＦ、特にヒト組換え型ＶＷＦ（ｒＶＷＦ）は、遺伝子操作されたＣＨＯ細胞株の中でｒＦＶＩＩＩとともに合成されて発現する。共発現したｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスでｒＦＶＩＩＩを安定化することである。ｒＶＷＦは、細胞の中でプロ形態として合成され、Ｎ末端に付着した大きいプロペプチドを含有する。小胞体およびゴルジ体の成熟に応じて、プロペプチドは、細胞プロテアーゼフリンの作用によって開裂され、同一のサブユニットの同種重合体として分泌され、発現したタンパク質の二量体から成る。
【００６０】
ＶＷＦの精製
本明細書では、タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、タンパク質の等電点よりも高いｐＨの溶液を、陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を第１の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、該第１の洗浄緩衝液は、陽イオン交換樹脂に適用される溶液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。
【００６１】
１つの態様において、溶液のｐＨは、タンパク質の等電点を約１ｐＨ単位超える。他の態様において、溶液のｐＨは、約１．２、または約１．４、または約１．６、または約１．８、または約２．０、または約２．２、または約２．４、または約２．６、または約２．８、または約３．０、または約３．２、または約３．４、または約３．６、または約３．８、または約４．０、または約４．２、または約４．４、または約４．６、または約４．８、または約５．０、または約５．５、または約６．０ｐＨ単位であるか、またはタンパク質の等電点を超える。
【００６２】
これらの実施形態において、ｐＨは、約７よりも大きい。他の態様において、ｐＨは、約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５、または約７．６、または約７．７、または約７．８、または約７．９、または約８．０、または約８．１、または約８．２、または約８．３、または約８．４、または約８．５、または約８．６、または約８．７、または約８．８、または約８．９、または約９．０、または約９．１、または約９．２、または約９．３、または約９．４、または約９．５、または約９．６、または約９．７、または約９．８、または約９．９、または約１０．０、または約１０．１、または約１０．２、または約１０．３、または約１０．４、または約１０．５、または約１０．６、または約１０．７、または約１０．８、または約１０．９、または約１１．０、または約１１．１、または約１１．２、または約１１．３、または約１１．４、または約１１．５、または約１１．６、または約１１．７、または約１１．８、または約１１．９、または約１２．０、または約１２．１、または約１２．２、または約１２．３、または約１２．４、または約１２．５、または約１２．６、または約１２．７、または約１２．８、または約１２．９、または約１３．０以上である。
【００６３】
別の実施形態では、タンパク質含有溶液から非脂質エンベロープウイルスを除去するための方法であって、溶液を陽イオン交換樹脂に適用することと、陽イオン交換樹脂を、陽イオン交換樹脂に適用される溶液のｐＨよりも高いｐＨの第１の洗浄緩衝液で洗浄することと、陽イオン交換樹脂を第２の洗浄緩衝液で洗浄して、溶出液を形成することであって、該第２の洗浄緩衝液は、第１の洗浄緩衝液以下であるｐＨを有することと、を含む、方法を提供する。１つの態様において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、陽イオン交換樹脂に適用される溶液のｐＨを約１ｐＨ単位超える。このステージに関して、イオン交換媒体は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であることを意図しているが、本方法の実践には、他の陽イオン交換システムを使用してもよい。これらの陽イオン交換系は、当業者に知られている。
【００６４】
他の態様において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、約１．１、または約１．２、または約１．３、または約１．４、または約１．５、または約１．６、または約１．７、または約１．８、または約１．９、または約２．０、または約２．１、または約２．２、または約２．３、または約２．４、または約２．５、または約２．６、または約２．７、または約２．８、または約２．９、または約３．０、または約３．１、または約３．２、または約３．３、または約３．４、または約３．５、または約３．６、または約３．７、または約３．８、または約３．９、または約４．０、または約４．１、または約４．２、または約４．３、または約４．４、または約４．５、または約４．６、または約４．７、または約４．８、または約４．９、または約５．０、または約５．１、または約５．２、または約５．３、または約５．４、または約５．５、または約５．６、または約５．７、または約５．８、または約５．９、または約６．０ｐＨ単位であるか、またはタンパク質の等電点を超える。これらの実施形態において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、約７よりも大きい。他の態様において、第１の洗浄緩衝液のｐＨは、約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５、または約７．６、または約７．７、または約７．８、または約７．９、または約８．０、または約８．１、または約８．２、または約８．３、または約８．４、または約８．５、または約８．６、または約８．７、または約８．８、または約８．９、または約９．０、または約９．１、または約９．２、または約９．３、または約９．４、または約９．５、または約９．６、または約９．７、または約９．８、または約９．９、または約１０．０、または約１０．１、または約１０．２、または約１０．３、または約１０．４、または約１０．５、または約１０．６、または約１０．７、または約１０．８、または約１０．９、または約１１．０、または約１１．１、または約１１．２、または約１１．３、または約１１．４、または約１１．５、または約１１．６、または約１１．７、または約１１．８、または約１１．９、または約１２．０、または約１２．１、または約１２．２、または約１２．３、または約１２．４、または約１２．５、または約１２．６、または約１２．７、または約１２．８、または約１２．９、または約１３．０以上である。
【００６５】
以下の実施例は、限定することを意図したものではなく、本発明の具体的な実施形態の例示に過ぎない。
【実施例】
【００６６】
実施例１
以下に記載されるアッセイで使用されるウイルスおよび細胞は、以下の通りである。
【００６７】
レオ−３（レオウイルス科；非エンベロープｄｓＲＮＡウイルス）、Ｄｅａｒｉｎｇ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２４）は、ＡＴＣＣから入手した。ウイルスは、増殖させて、ＥＣＡＣＣ（８４１１３００１）から入手したベロ細胞上に滴定した。ＭＭＶ（パルボウイルス科；非エンベロープｓｓＤＮＡウイルス）、原型株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４６））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した。ウイルスは、増殖させて、Ａ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．４）上に滴定した。ＰＰＶ（パルボウイルス科；非エンベロープｓｓＤＮＡウイルス）、テネシー株（ＢＲＦＦ  ＃ＰＰ９５１０２４）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｕｌｔｙ＆Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した。ウイルスは、増殖させて、ＰＫ−１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４８９）上に滴定した。ＥＭＣＶ（ピコルナウイルス科；非エンベロープｓｓＲＮＡ）（ＡＴＣＣ  ＃ＶＲ−１２９Ｂ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ウイルスは、増殖させて、ベロ細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＥＣＡＣＣ，＃８４１１３００１）上に滴定した。ＨａｄＶ（アデノウイルス科；非エンベロープｄｓＤＮＡ）、アデノイド７５株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ウイルスは、増殖させて、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）上に滴定した。
【００６８】
例示的なＶＷＦ精製プロセスに関係するステップは、以下を含む：
●  細胞培養上清の免疫親和性クロマトグラフィ
ｉ．フロースルー画分
●  陰イオン交換（例えば、トリメチルアミノエチル陰イオン交換カラム）
●  濾過（０．４５／０．２μｍ）
●  陰イオン交換（例えば、ＭｕｓｔａｎｇＱ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））
●  ウイルス不活性化（例えば、有機溶媒／界面活性剤処理を使用）
●  濾過（０．８／０．６５μｍ）
●  陽イオン交換（例えば、ＵＮＯ  Ｓカラム）
●  限外濾過／濃縮
●  濾過（０．４５／０．２μｍ）
●  ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））
【００６９】
ＵＮＯ  Ｓステップの最適化。ＵＮＯ  Ｓステップ中は、ｒＶＷＦが強陽イオン交換樹脂に結合される一方で、不純物の一部は通過する。伝導性を高めた緩衝液でカラムを洗浄した後に、結合したｒＶＷＦは、塩ステップでカラムから放出される。初期のウイルス除去実験中、このステップは、モデルのレオウイルスについては少なくとも顕著な除去率を示した。適用したパラメータの条件および対応する結果を、下記表１に列記する。
【００７０】
【表１】
2013502434.tif 000002
【００７１】
表１で分かるように、プロセスパラメータ（伝導性の調節、ｐＨ８．０、および洗浄緩衝液に対する添加物）の適度な変更は、ＭＭＶ除去率の顕著な改善をもたらさなかった。再現的にｐＨをさらに９．０まで高めたところ、ＭＭＶならびにレオウイルスについて２ｌｏｇを超える顕著な除去率をもたらした。このプロセスの変更を実行することは、技術的に容易であり、ｒＶＷＦの高ｐＨ環境への曝露を比較的に短く（最高６時間）保つことができる。結合したｒＶＷＦの溶出は、中性条件の下で行う。
【００７２】
プロセスのウイルス不活性化能の分析は、以下の式を使用して、ＣＰＭＰガイドライン２６８／９５の勧告に従って行った。
【００７３】
【数１】
2013502434.tif 000003
【００７４】
ここで、
Ｒ＝ウイルス低減率
Ｖ１＝出発材料の容積［ｍｌ］
Ｔ１＝出発材料中のウイルス濃度［ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］
Ｖ２＝ステップ後の材料の容積［ｍｌ］
Ｔ２＝ステップ後のウイルス濃度［ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］
【００７５】
Ｒを計算するために、処理前および処理後の各スパイクした試料の容積および力価を使用した。ウイルスが検出できなかった時は常に、検出限界を計算のためのウイルス力価とみなした。計算は、小数第２位で与えられるウイルス力価によって行い（ｌｏｇ１０［ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］）、最終結果、すなわち低減率（Ｒ）だけ、小数第１位に丸めた。
【００７６】
実施例２
ＵＮＯ  Ｓ溶出液は、不純物および生成物変異体の微量成分分析を容易にするために、３０ｋＤａカットオフの変性セルロース膜を使用した限外濾過によって、約８００μｇのｒＶＷＦ抗原／ｍｌに濃縮した。
【００７７】
ｒＶＷＦの試験
リストセチン活性。リストセチン補因子活性は、安定化した血小板および抗生物質「リストセチン」を含有するフォンウィルブラント試薬を使用した比濁分析によって測定する。試料（＝リストセチン補因子）中に含有されるフォンウィルブランド因子は、リストセチンの存在下で、安定化した血小板の凝集を引き起こす。凝集は、試薬調製物の濁度を低減し、吸光度の変化は、比濁分析計によって測定する。較正は、ＷＨＯ濃縮標準品＃００／５１４によって行う。
【００７８】
ＶＷＦ抗原。ＶＷＦ試料は、ＥＬＩＳＡアッセイ（２つのポリクローナル抗体によるダブルサンドイッチ方式）において、それらのｖＷＦ−抗原の含有量を検査する。マイクロタイタープレート上での呈色反応の測定は、４９０ｎｍで光度計によって行う。各試料の濃度は、コンピュータ支援のＥＬＩＳＡ分析プログラム（曲線アルゴリズム：３次回帰）によって標準曲線に対して計算する。全ての読み取り値は、ブランクに対して補正する。
【００７９】
ＦＶＩＩＩ結合活性。静的条件下でのｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合は、希釈されたＶＷＦ含有試料で一定量のｒＦＶＩＩＩをインキュベートすることによって、ＥＬＩＳＡ発色アッセイ（ＥＣＡ）によって決定した。形成されたＶＷＦ−ＦＶＩＩＩの複合物は、次いで、市販のポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体で被覆されたマイクロタイタープレートへ移した。インキュベーションの後、結合していないＦＶＩＩＩを、以降の洗浄ステップによって除去した。結合したＦＶＩＩＩは、市販のＦＶＩＩＩ発色アッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ試薬キット、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって定量化した。ブランク補正吸光度（４０５ｎｍでのｍＯＤ／ｍｉｎ）を、対数目盛で、ＶＷＦ：Ａｇ濃度に対してプロットした。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。還元的条件下での従来の８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ならびにクーマシーブルーおよび銀染色によるゲルの染色は、ｒＶＷＦのタンパク質組成の見識を提供することができる。分離したタンパク質バンドをニトロセルロース膜に移して、該タンパク質を、それぞれＶＷＦ、ＦＶＩＩＩ、およびフリンに対する適切な抗体で免疫学的に染色した後に、全タンパク質に対するＶＷＦ関連タンパク質の比較を行うことができる。
【００８１】
多量体分析。ＶＷＦの多量体構造は、高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動法によって分析する。簡潔には、試料を、０．３〜１．０ＩＵ／ｍｌのＶＷＦ：Ａｇの範囲で、同じ濃度に希釈し、トリス−ＥＤＴＡ−ＳＤＳ緩衝液およびアガロースゲル上で非還元的条件下で分離される多量体とともにインキュベートする。ＶＷＦ多量体は、ＡＬＰ発色現像キットを使用して、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体、その後の、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧによるゲル内免疫染色によって視覚化した。あるいは、アガロースゲルをブロット膜上にブロットし、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体、その後の、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗ウサギＩｇＧによって染色を行った。視覚化のために、ＶＷＦの検出感度を少なくとも２桁高める、電気化学発光を使用した。ＶＷＦ多量体および多量体構造のサイズ分布をそれぞれ分析するために、低分解能（１％のアガロース）および高分解能（２．５％のアガロース）条件を使用した。
【００８２】
ＨＰＬＣ分析。組換え型ＶＷＦは、逆転位相ＨＰＬＣ  Ｃ４−カラム上で分離される２つの主要なフラグメント（Ｎ末端およびＣ末端ホモ二量体フラグメント）を与えるために、自然条件下でＧｌｕＣ（Ｖ８プロテアーゼ）によって開裂することができる。フラグメントは、２８０ｎｍでＵＶ吸光度をモニタリングすることによって検出する。
【００８３】
ペプチドマッピング。ｒＶＷＦの一次構造を、ペプチドマッピング手法を使用して調査した。精製されたｒＶＷＦの試料を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、遊離スルフヒドリル基を、４−ビニルピリジンで閉鎖した。配列決定用グレードのトリプシンをｒＶＷＦに加えて、１８時間にわたって反応させた。結果として生じたペプチド混合物を、逆相クロマトグラフィによって分離した。溶出ペプチドを、２１４ｎｍでのオンラインＵＶ検出、およびオンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析法によって検出した。
【００８４】
脱アミド化されたｒＶＷＦの試験。イソアスパラギン酸（アスパラギンの脱アミド化に由来する１つの反応生成物）を検出するための分析法は、トリプシン消化、その後の、Ｐｒｏｍｅｇａ社によって供給されるＩＳＯＱＵＡＮＴ  Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した、タンパク質イソアスパラギン酸メチル基転移酵素（ＰＩＭＴ）の酵素反応を用いている。ＰＩＭＴは、カルボキシル位置で、基質Ｓ−アデノシル−Ｌメチオニン（ＳＡＭ）からイソアスパラギン酸へのメチル基の転移を触媒し、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を産生する。化学量論的に放出されたＳＡＨは、ＲＰ−ＨＰＬＣ法によって２６０ｎｍの波長で検出する。
【００８５】
異なるプロセスによって得られた製品の分析データを表２に要約する。
【００８６】
【表２】
2013502434.tif 000004
【００８７】
表２から分かるように、異なるプロセス変形によって精製されたｒＶＷＦの生化学的性質は、同等である。
【００８８】
ｒＶＷＦタンパク質の主なバンドは、全ての生成物において極めて類似しているが、不純物の程度は、残存するｒＦＶＩＩＩに対する銀染色およびウエスタンブロット分析の両方で、試料＃１（図１で、ＶＷＦ＃０７と記されている）においてより低い。ｒＦＶＩＩＩのバンドパターンは、全てのバッチ間で同等であり、これは、ｐＨ９．０という条件に起因するいかなる劣化も起こっていないことを示唆する。
【００８９】
低分解能および高分解能アガロースゲル電気泳動は、ｒＶＷＦ調製物の高い類似性を明らかにした。低分解能多量体分析による多量体組成に、違いは見られなかった。図２は、ＭＭＶおよびレオウイルスをスパイクした試料による、ＵＮＯ  Ｓランの染色されたゲルを示す。また、高分解能多量体分析は、ｐＨ９．０という条件に起因するいかなる損傷もｒＶＷＦ多量体に起こっていないことを示唆する、無傷の多量体パターンを明らかにした。図３は、ＭＭＶおよびレオウイルスをスパイクした試料による、ＵＮＯ  Ｓランの染色されたゲルを示す。
【００９０】
ＩＳＯＱＵＡＮＴアッセイでは、ｐＨ９．０でのｒＶＷＦの滞留時間のため、脱アミド化促進は検出されなかった。一般に、脱アミド化したｒＶＷＦのモル百分率は極めて低い。プロセス変形によって得られたｒＶＷＦの精製された調製物を、自然状態のＶ８プロテアーゼ（図４を参照）または変性状態のトリプシン（図５を参照）のいずれかによるタンパク質消化に供し、結果として生じたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって分離することで、全ての試料について類似したクロマトグラムをもたらした。
【００９１】
ピークパターンの中の僅かな差異は、調整物中の異なる量の不純物（図１で分かるように、主に残存するｒＶＷＦプロペプチド）の存在に起因するものであり、これは、質量分析法またはＮ末端配列分析によって確認した。
【００９２】
実施例３
ＭＭＶのスパイクを伴う高ｐＨの陽イオン交換クロマトグラフィによるｒＶＷＦの精製。
【００９３】
カラムの中に詰められたＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂は、１ＣＶの２ＭのＮａＣｌで活性化し、２５ＣＶの緩衝液（ｐＨ＝９．０）で平衡化した。その後に、１５ｍＳ／ｃｍの伝導性および９．０のｐＨに調整し、かつマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）でスパイクしたｒＶＷＦ含有溶液を、約１０．０ｃｍ／ｈの線流速でカラム上に充填した。次いで、カラムを、１０ＣＶの平衡緩衝液（ｐＨ＝９．０）で洗浄し、生成物を、６５ｃｍ／ｈの線流速で、３．５ＣＶの溶出緩衝液（ｐＨ＝７．５）で溶出させた。充填および洗浄段階中に上昇したｐＨは、樹脂に対するウイルス粒子の結合を大幅に低減したが、生成ＶＷＦの結合は完全に維持した。その結果、充填したウイルス粒子の大部分は、非結合（フロースルー）に見つかり、その生成物から分離した洗浄画分は、高収率で溶出液プールに回収された。表３の結果は、この手順を適用することによって、非エンベロープウイルスのマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）で２ｌｏｇのウイルス除去能力を得ることができたことを示している。
【００９４】
ＴＣＩＤ５０アッセイは、以下のように行った。簡潔には、試料の連続１／２ｌｏｇ希釈物を、適切な組織培養培地の中で調製し、１００μｌの各希釈物を、指標細胞叉を播種したマイクロタイタープレートの８つのウエルのそれぞれに加えた。次いで、細胞を、顕微鏡の下での細胞の視覚的検査によって細胞変性効果が評価される前に、３６℃±２℃で７日間インキュベートした。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）は、ポアソン分布に従って計算し、ｌｏｇ１０［ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］で表した。
【００９５】
【表３】
2013502434.tif 000005
【００９６】
精製は、１５ｍｍの直径および１４ｃｍのベッド高さを伴うカラムを使用して行った。示されるデータは、活性マウス微小ウイルスのウイルス力価である。
【００９７】
実施例４
レオ３型ウイルスのスパイクを伴う高ｐＨの陽イオン交換クロマトグラフィによるｒＶＷＦの精製。
【００９８】
カラムの中に詰められたＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂は、１ＣＶの２ＭのＮａＣｌで活性化し、２５ＣＶの緩衝液（ｐＨ＝９．０）で平衡化した。その後に、１５ｍｓ／ｃｍの伝導性および９．０のｐＨに調整し、かつ種々の非エンベロープウイルスでスパイクしたｒＶＷＦ含有溶液を、約１００ｃｍ／ｈの線流速でカラム上に充填した。次いで、カラムを、１０ＣＶの平衡緩衝液（ｐＨ＝９．０）で洗浄し、生成物を、６５ｃｍ／ｈの線流速で、３．５ＣＶの溶出緩衝液（ｐＨ＝７．５）で溶出させた。充填および洗浄段階中に上昇したｐＨは、樹脂に対するウイルス粒子の結合を大幅に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｌｙ）低減したが、生成ＶＷＦの結合は完全に維持した。その結果、充填したウイルス粒子の大部分は、非結合（フロースルー）に見つかり、その生成物から分離した洗浄画分は、高収率で溶出液プールに回収された。表４の結果は、この手順を適用することによって、非エンベロープウイルスのマウスレオウイルス３型（レオ−ＩＩＩ）で２ｌｏｇのウイルス除去能力を得ることができたことを示している。
【００９９】
【表４】
2013502434.tif 000006
【０１００】
精製は、１５ｍｍの直径および１４ｃｍのベッド高さを伴うカラムを使用して行った。示されるデータは、活性マウスレオウイルスＩＩＩ型（レオ−ＩＩＩ）のウイルス力価である。
【０１０１】
実施例５
標準的な手順（中性ｐＨ）に従ったＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  ＳでのｒＶＷＦの精製。
【０１０２】
カラムの中にパックされるＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂は、１ＣＶの２ＭのＮａＣｌで活性化し、２５ＣＶの緩衝液（ｐＨ＝６．５）で平衡化した。その後に、１５ｍＳ／ｃｍの伝導性および６．５のｐＨに調整し、かつ非エンベロープウイルスでスパイクしたｒＶＷＦ含有溶液を、約１００ｃｍ／ｈの線流速でカラム上に充填した。次いで、カラムを、１０ＣＶの平衡緩衝液（ｐＨ＝６．５）で洗浄し、生成物を、６５ｃｍ／ｈの線流速で、３．５ＣＶの溶出緩衝液（ｐＨ＝７．５）で溶出させた。試験を行った種々のウイルスのウイルス力価を、異なるクロマトグラフィ画分（充填、カラムフロースルー、洗浄、溶出、ポスト溶出液）で評価し、低減率を計算した。表５の結果は、ＶＷＦのための標準的な精製手順をＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓに適用することによる、非エンベロープウイルスの除去能力は、非脂質エンベロープウイルスの除去のための頑健なクロマトグラフィステップを主張するために試験を行った異なる型のウイルスには不十分であったことを示している。
【０１０３】
【表５】
2013502434.tif 000007
【０１０４】
低減率は、対数値において表され、充填画分中の総ウイルス充填量を溶出液画分中の総ウイルス充填量で割って計算される。
【図１】
2013502434.tif 000008
【図２】
2013502434.tif 000009
【図３】
2013502434.tif 000010
【図４】
2013502434.tif 000011
【図５】
2013502434.tif 000012
【配列表】
2013502434000001.app
【国際調査報告】
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2013502434.tif 000014
2013502434.tif 000015
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