(57)【要約】  溶液構成物質の数を決定する方法は、第１の数の溶液構成物質を第１の試験位置に導入する工程、導入された第１の数の溶液構成物質のための第１の結合環境を確立する工程、第１の複数の溶液構成物質に結合させることにより第１の残余数の溶液構成物質を作製する工程、第１の残余数の溶液構成物質のための第２の結合環境を確立する工程、第１の残余数の溶液構成物質に由来する第２の複数の溶液構成物質に結合させることにより第２の残余数の溶液構成要素を作製する工程、結合した第１の複数の溶液構成物質と関連する第１のシグナルを取得する工程、結合した第２の複数の溶液構成要素と関連する第２のシグナルを取得する工程、ならびに取得した第１のシグナルおよび取得した第２のシグナルに基づいて目的の構成物質の第２の数を決定する工程を含む。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液構成物質の数を決定する方法において、
第１の数の溶液構成物質を第１の試験位置に導入する工程と、
前記第１の試験位置で第１の複数の溶液構成物質を結合させることにより第１の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
前記第１の残余数の溶液構成物質に由来する第２の複数の溶液構成物質を結合させることにより第２の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
結合した前記第１の複数の溶液構成物質と関連する第１のシグナルを取得する工程と、
結合した前記第２の複数の溶液構成物質と関連する第２のシグナルを取得する工程と、
得られた前記第１のシグナルおよび得られた前記第２のシグナルに基づいて、第１の目的の溶液構成物質の第２の数を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の試験部位から第２の試験部位に前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
前記第１の試験部位から第２の試験部位に、それぞれ複数の捕捉プローブに結合した複数の分析物を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記輸送された複数の結合した分析物を、それぞれ複数の捕捉プローブから遊離させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程は、
前記輸送された複数の結合した分析物の温度を改変することにより、前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程は、
前記輸送された複数の結合した分析物を脱ハイブリダイゼーション溶液にさらすことにより、前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
マイクロ流体工学技術を用いて前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
毛細管流動を用いて前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
磁気ビーズを用いて前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
前記第１の残余数の溶液構成物質に作用する電荷を改変することにより前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の残余数の溶液構成物質に由来する第３の複数の溶液構成物質を結合させることにより第３の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
結合した前記第３の複数の溶液構成物質と関連する第３のシグナルを取得する工程と、
得られた前記第１のシグナル、得られた前記第２のシグナル、および得られた前記第３のシグナルに基づいて、第２の目的の溶液構成物質の第３の数を決定する工程と、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
分析物捕捉システムに含まれる分子の数を決定する方法において、
第１の数の溶液構成物質を第１の試験位置に導入する工程と、
前記第１の試験位置で第１の複数の溶液構成物質を第１の割合の複数の捕捉プローブに結合させることにより第１の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
第２の試験位置で前記第１の残余数の溶液構成物質に由来する第２の複数の溶液構成物質を第２の割合の複数の捕捉プローブに結合させることにより第２の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
結合した前記第１の複数の溶液構成物質と関連する第１のシグナルを取得する工程と、
結合した前記第２の複数の溶液構成物質と関連する第２のシグナルを取得する工程と、
得られた前記第１のシグナルおよび得られた前記第２のシグナルに基づいて、目的の分子の第２の数を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項１３】
前記第１の複数の溶液構成物質は、目的の分子からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の捕捉プローブは、目的の分子からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
複数の第１の捕捉プローブと、
複数の第２の捕捉プローブと、
溶液中の第１の数の分析物を、前記複数の第１の捕捉プローブの近くの位置から前記複数の第２の捕捉プローブの近くの位置に移動させるための輸送システムと、
コマンド指示が保存されたメモリと、
プロセッサであって、
第１の複数の結合した第１の捕捉プローブと関連する第１のシグナルを取得し、
第２の複数の結合した第２の捕捉プローブと関連する第２のシグナルを取得し、
得られた前記第１のシグナルと得られた前記第２のシグナルに基づいて第１の目的の構成物質の第１の数を決定するための、
コマンド指示を実行するように構成されたプロセッサと、を含む、連続サンプリングシステム。
【請求項１６】
複数の第３の捕捉プローブであって、
プロセッサが、
第３の複数の結合した第３の捕捉プローブと関連する第３のシグナルを取得し、
得られた前記第１のシグナル、得られた前記第２のシグナル、および得られた前記第３のシグナルに基づいて、第２の目的の構成物質の第２の数を決定するための、
コマンド指示を実行するようにさらに構成された、複数の第３の捕捉プローブ、をさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第１の目的の構成物質は、捕捉プローブである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第１の目的の構成物質は、溶液内の分析物である、請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、診断試験、より具体的には、親和性に基づく診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]特にここ数十年で、生化学および医学の分野における広範囲に及ぶ科学的研究により、様々な疾患および身体状態が、人体における分子的変化により表されるという事実が示されてきた。多くの場合、分子的変化の早期検出は、状態のより早期の診断を可能にし、状態を効率的に治療する可能性を有意に増加させる。
【０００３】
[0003]多くの分子的変化は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの分析物分子を検出および定量するためのアッセイを用いて同定される。これらのアッセイは、分析物分子の捕捉分子への特異的結合に基づくものであり、結合した分析物分子の量は、典型的には、試験溶液中の分析物分子の総数に比例する。この型の検出方法は、「親和性アッセイ」と記述され、通常、検出または定量しようとする分析物を含有する試験溶液を、捕捉分子のセット（プローブスポットとも呼ばれる）と接触させることから始まる。試験溶液を捕捉分子と接触させた時、特定の割合の分析物が捕捉分子に結合するであろう。十分な時間量の後、試験溶液を除去し、捕捉分子に結合した分析物分子の存在（または量）を検出する。
【０００４】
[0004]典型的には、親和性アッセイは、捕捉分子のそれぞれのセットが通常は単一のデータ点のみを生じるという事実により限定される。単一のデータ点は、一般的には、特に、システムに未知の要素が存在する場合、正確な結果を計算するには不十分である。そのような未知の要素は、交叉反応分子、すなわち、目的の分析物とは異なるが、それにもかかわらず、捕捉分子に結合し、かくして、定量結果を役に立たないものにし、偽陽性の原因となる分子の存在であってよい。
【０００５】
[0005]別の未知の要素は、周囲温度または捕捉分子の密度であってよい。例えば、分子は通常、捕捉分子により表面上に固定される。捕捉分子を含む試験部位を調製する一つの方法は、密着焼付けである。密着焼付けに関して、表面上に沈着した捕捉分子の密度は、あるバッチから次のバッチに２倍変化することが多い。Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ  ２９，  Ｎｏ  ２４，  ｐｐ．  ５１６３〜５１６８，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより報告されたように、捕捉分子の密度は、結合する分析物の量に強く影響する。従って、密着焼付けを行った捕捉分子を用いるアッセイは、有効かつ意味のある結果を得るには、煩わしい外部較正方法（標準曲線など）に依存する。
【０００６】
[0006]親和性アッセイを実施する装置および方法が必要である。正確な結果を得る多重アッセイ、タンパク質アレイ、側方流動装置、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、またはビーズに基づくアッセイなどの低費用のアッセイ、およびそのようなアレイの使用方法がさらに必要である。試験溶液内の分析物の数を決定することができる親和性アッセイを実施するための方法およびシステムは有益であろう。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]一実施形態に従えば、溶液構成物質の数を決定する方法は、第１の数の溶液構成物質を第１の試験位置に導入する工程、導入された第１の数の溶液構成物質のための第１の結合環境を確立する工程、第１の複数の溶液構成物質に結合させることにより第１の残余数の溶液構成物質を作製する工程、第１の残余数の溶液構成物質のための第２の結合環境を確立する工程、第１の残余数の溶液構成物質に由来する第２の複数の溶液構成物質に結合させることにより第２の残余数の溶液構成要素を作製する工程、結合した第１の複数の溶液構成物質と関連する第１のシグナルを取得する工程、結合した第２の複数の溶液構成要素と関連する第２のシグナルを取得する工程、ならびに取得した第１のシグナルおよび取得した第２のシグナルに基づいて目的の構成物質の第２の数を決定する工程を含む。
【０００８】
[0008]別の実施形態においては、分析物捕捉システムに含まれる分子の数を決定する方法は、第１の数の溶液構成物質を第１の試験位置に導入する工程、第１の複数の溶液構成物質を第１の割合の複数の捕捉プローブに第１の試験位置で結合させることにより第１の残余数の溶液構成物質を作製する工程、第１の残余数の溶液構成物質に由来する第２の複数の溶液構成物質を第２の割合の複数の捕捉プローブに第２の試験位置で結合させることにより第２の残余数の溶液構成物質を作製する工程、結合した第１の複数の溶液構成物質と関連する第１のシグナルを取得する工程、結合した第２の複数の溶液構成物質と関連する第２のシグナルを取得する工程、ならびに得られた第１のシグナルおよび得られた第２のシグナルに基づいて目的の分子の第２の数を決定する工程を含む。
【０００９】
[0009]さらに別の実施形態においては、連続サンプリングシステムは、複数の第１の捕捉プローブ、複数の第２の捕捉プローブ、溶液中の第１の数の目的の分析物を、複数の第１の捕捉プローブに近い位置から複数の第２の捕捉プローブに近い位置に移動させるための輸送システム、コマンド指示が保存されるメモリ、ならびに第１の複数の結合した第１の捕捉プローブと関連する第１のシグナルを取得し、第２の複数の結合した第２の捕捉プローブと関連する第２のシグナルを取得し、得られた第１のシグナルと得られた第２のシグナルに基づいて目的の構成物質の第１の数を決定するための、コマンド指示を実行するように構成されたプロセッサを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0010]検出されたシグナルを増加させる他の分子を含むサンプル中の目的の分子の数の決定を可能にする連続サンプリングに単一のサンプルをさらすように構成された連続サンプリングシステムを示す図である。
【図２】[0011]マイクロアレイの形態でいくつかの異なる試験部位を提供するためのプラットフォームを示す図である。
【図３】[0012]サンプルを複数の捕捉プローブ部位にさらすためにプラットフォーム上の様々な試験部位で試験溶液を連続的にサンプリングするのに用いることができる手順を示す図である。
【図４】[0013]試験溶液内の目的の分析物を、捕捉プローブの第１のセットに隣接する位置に輸送するように課されたアレイ上の試験部位の概略図である。
【図５】[0014]第１の試験部位で結合していない試験溶液内の目的の分析物を、捕捉プローブの第２のセットに隣接する位置に輸送するように課された図４のアレイ上の第２の試験部位の概略図である。
【図６】[0015]試験溶液が異なる捕捉プローブ部位を通過して流動する時に、試験溶液から目的の分析物を捕捉する側方流動技術を含む連続サンプリングシステムの概略図である。
【図７】[0016]試験溶液中の捕捉された目的の分析物を用いて、試験溶液中の分析物の初期数を決定するのに用いることができるデータを提供するためにサンプリングされる分析物の残余数を提供する連続サンプリングシステムを示す図である。
【図８】試験溶液中の捕捉された目的の分析物を用いて、試験溶液中の分析物の初期数を決定するのに用いることができるデータを提供するためにサンプリングされる分析物の残余数を提供する連続サンプリングシステムを示す図である。
【図９】試験溶液中の捕捉された目的の分析物を用いて、試験溶液中の分析物の初期数を決定するのに用いることができるデータを提供するためにサンプリングされる分析物の残余数を提供する連続サンプリングシステムを示す図である。
【図１０】試験溶液中の捕捉された目的の分析物を用いて、試験溶液中の分析物の初期数を決定するのに用いることができるデータを提供するためにサンプリングされる分析物の残余数を提供する連続サンプリングシステムを示す図である。
【図１１】試験溶液中の捕捉された目的の分析物を用いて、試験溶液中の分析物の初期数を決定するのに用いることができるデータを提供するためにサンプリングされる分析物の残余数を提供する連続サンプリングシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0017]本発明の原理の理解を促すために、ここで図面に例示され、以下の明細書に記載される実施形態を参照する。それによって本発明の範囲に対する限定が意図されるものではないことが理解される。さらに、本発明は例示される実施形態に対する任意の変更および改変を含み、また、本発明が属する分野の当業者が通常行うであろう本発明の原理のさらなる適用を含むことが理解される。
【００１２】
[0018]様々な親和性アッセイが、質量作用の法則に従って機能し、所与の親和性定数およびプローブ密度に関して、プローブに結合する分析物の割合が一定であり、分析物濃度の関数ではないことを予測する。質量作用の法則は、
【数１】
2013517478.tif 000002
（式中、
ｂanalyteは結合した分析物分子の数であり、
ｎanalyteは試験溶液中の全分析物分子の数であり、
ｎprobesは全プローブ分子の数であり、
ｋａは分析物分子とプローブ分子との結合定数であり、
ＮＡはアボガドロ数であり、
Ｖは試験溶液の体積であり、および
ａanalyteは結合した分析物の割合である）
として表される。
【００１３】
[0019]図１を参照して、全体として命名される連続サンプリングシステム１００の説明を記載する。サンプリングシステム１００は、Ｉ／Ｏ装置１０２、処理回路１０４およびメモリ１０６を含む。Ｉ／Ｏ装置１０２は、ユーザーインターフェース、グラフィカルユーザーインターフェース、キーボード、ポインティングデバイス、遠隔および／またはローカル通信回線、表示装置、ならびに外部で生成された情報をサンプリングシステム１００に提供し、サンプリングシステム１００の内部情報を外部に通信することができる他の装置を含む。
【００１４】
[0020]処理回路１０４は、好適には、マイクロプロセッサおよびその関連電気回路などの一般的な目的のコンピュータ処理回路であってよい。処理回路１０４は、それに起因する操作を実行するために操作可能である。
【００１５】
[0021]メモリ１０６内には、様々なプログラム指令１０８がある。プログラム指令１０８のいくつかは以下により完全に説明され、処理回路１０４および／または必要に応じて、任意の他の構成要素によって実行可能である。関連データベース１１０もメモリ１０６内に位置する。
【００１６】
[0022]サンプリングシステム１００はさらに、輸送制御システム１１２および環境検出器一式１１４を含む。輸送制御システム１１２は、この例では、図２に記載のマイクロアレイ１２０に関して、試験溶液を移動させるように構成される。様々な方法を用いて、マイクロアレイプラットフォーム１２０を形成させることができる。例えば、米国特許第５，８０７，５２２号は、マイクロアレイを形成させる方法を開示する。マイクロアレイプラットフォーム１２０は、いくつかの異なるサブアレイ１２２を含む。サブアレイ１２２は、分析物プローブからなるいくつかの試験部位１２４を含む。サブアレイ１２２の数ならびにそれぞれのサブアレイ１２２内の試験部位１２４の数は、本発明の範囲内で変化してもよい。試験部位１２４での試験溶液の正確な温度を、本実施形態では、検出器一式１１４により検出することができる。
【００１７】
[0023]前記システム１００はさらに、センサー１１６を含む。センサー１１６は、システム１００の他の構成要素と共に、単一の装置中に含まれていてもよい。あるいは、システム１００の１つまたは複数の構成要素を、システム１００の他の構成要素から遠くに離れて位置してもよい別の装置として提供することができる。
【００１８】
[0024]試験部位１２４を、目的の分析物を捕捉するのに有効な捕捉剤または分析物プローブと共に調製する。サンプリングシステム１００に関するさらなる詳細は、図３の手順１３０を参照して提供される。プロセッサ１０４は、図３の手順１３０の少なくともいくつかを実行するプログラム指令１０８を実行する。異なる実施形態においては、手順１３０を、特定の基準に応じてより多いか、またはより少ない工程を含むように改変することができる。
【００１９】
[0025]ブロック１３２では、目的の分析物を同定し、マイクロアレイ１２０上の目的の分析物およびプローブ分子のｋａを取得し（ブロック１３４）、関連データベース１１０に保存する（ブロック１３６）。次いで、試験サンプル中に存在する可能性がある干渉またはノイズの潜在的な供給源を同定する（ブロック１３８）。シグナル干渉の同定は、例えば、同定されたプローブ分子に対しても親和性を有するサンプル内の可能性のある分子または潜在的な分子の同定を含んでもよい。次いで、プローブ分子のノイズのそれぞれの供給源に関するｋａを同定し（ブロック１４０）、親和性データベース１１０の１つに保存する（ブロック１４２）。
【００２０】
[0026]ブロック１４４では、それぞれの試験部位１２４中に所望の量の選択されたプローブ分子を沈着させることにより、マイクロアレイプラットフォーム１２０を調製する。代替的な実施形態においては、試験部位１２４のサブセットを、第１のプローブ分子を用いて調製することができるが、試験部位１２４の別のサブセットを第２のプローブ分子を用いて調製して、単一のマイクロアレイプラットフォーム１２０内で２つの別々の試験を行うことができる。単一のマイクロアレイプラットフォーム１２０内で追加の構成を用いてもよい。例えば、１つのサブアレイ１２２の中のそれぞれの試験部位を、同じプローブ分子を用いて調製することができるが、別のサブアレイ１２２は異なるプローブ分子を含む。この実施形態において特定のプローブ分子を用いて調製された試験部位１２４の数を、上記で同定された潜在的に干渉する分子型＋目的の分析物の数と少なくとも同じとなるように選択する。
【００２１】
[0027]一度、マイクロアレイ１２０を調製したら、試験サンプルを試験部位１２４の選択されたセットに導入する（ブロック１４６）。試験サンプルは、いくつかの目的の分析物ならびにいくつかの干渉分析物を含む。未だ確立されていない場合、試験部位１２４のそれぞれの選択されたセット内の環境を制御して、サンプル内の目的の分析物を所望の試験部位１２４または試験部位１２４のセットに局在化させる（ブロック１４８）。この例では、目的の分析物は帯電しており、輸送制御システム１１２を用いて試験サンプル内の電気力を確立する。かくして、輸送制御システムは、図４に記載のように、試験サンプル内の目的の分子を所望の試験部位１２４に輸送する。
【００２２】
[0028]図４は、試験サンプル１５０により被覆された試験部位１２４１および試験部位１２４２を記載する。目的の分析物１５２は負に帯電しており、干渉分析物１５４も同様である。輸送制御システム１１２は試験部位１２４１に正電荷を加え、目的の分析物１５２および干渉分析物１５４を負に帯電させて、試験部位１２４２から離れさせ、試験部位１２４１の上に集める。
【００２３】
[0029]次いで、試験サンプル１５０を所定の時間インキュベートする（ブロック１５６）。インキュベーション中に、試験部位１２４のそれぞれの選択されたセット内の実際の試験環境を、環境検出器一式１１４によりモニターし、確立された試験環境を示すデータを処理回路１０４に提供する（ブロック１５８）。いくつかの実施形態においては、環境をモニターしなくてもよい。環境データは、温度、および試験部位１２４１と１２４２との間の電位差を含んでもよい。インキュベーション中に、目的の分析物１５２のいくらかおよび干渉分析物１５４のいくらかは、試験部位１２４１で試験プローブ１６０により結合する。
【００２４】
[0030]サンプル１５０を十分にインキュベートした時、輸送制御システム１１２は試験部位１２４２に正電荷を加え、目的の分析物１５２および干渉分析物１５４を負に帯電させ、図５に記載のように、結合していないものは試験部位１２４１から離れ、試験部位１２４２の上に集まる（ブロック１６０）。次いで、試験サンプル１５０を所定の時間インキュベートする（ブロック１６２）。インキュベーション中に、試験部位１２４のそれぞれの選択されたセット内の実際の試験環境を、環境検出器一式１１４によりモニターし、確立された試験環境を示すデータを処理回路１０４に提供する（ブロック１６４）。環境データは、温度、および試験部位１２４１と１２４２との間の電位差を含んでもよい。インキュベーション中に、目的の分析物１５２のいくらかおよび干渉分析物１５４のいくらかは、試験部位１２４２で試験プローブ１６０により結合する。
【００２５】
[0031]サンプル１５０を十分にインキュベートした時、試験部位１２４を洗浄し（ブロック１６６）、センサー１１６を用いて、結合した目的の分析物１５２および結合した干渉分析物１５４を検出する（ブロック１６８）。親和性アッセイにおいて分析物の結合を定量するには、様々な検知方法を用いることができる。そのような検知方法としては、発光、蛍光、比色分析、電気化学、電気抵抗、および磁気的読出しが挙げられる。検知方法は、好ましくは、結合したプローブ数の高精度の指示を提供する。試験部位１２４１および１２４２中の結合したプローブ数と関連するシグナルに基づいて、サンプル内の１つまたは複数の目的の分析物の数を、処理回路１０４により算出する（ブロック１７０）。
【００２６】
[0032]試験部位１２４の選択されたセットの特定の１つに関してセンサー１１６により得られるシグナルは、目的の分子を含むシグナル、および干渉分子などのそれぞれのノイズ源に対する寄与因子の合計であるため、１つまたは複数の目的の分析物の数の算出が可能である。それぞれの寄与因子に起因するシグナルの相対的な割合は、特定の寄与因子の量、他の寄与因子の量、およびそれぞれの寄与因子の最初に沈着した捕捉プローブに対する相対的親和性に依存する。その関係は、以下の式：
Ｓ１＝ａ１−１ｎ１−１＋ａ１−２ｎ１−２＋・・・・ａ１−ｘｎ１−ｘ
（式中、
Ｓ１は、試験部位１２４１中の結合したプローブ１６０と関連するシグナルであり、
ａ１−１は、試験部位１２４１中のプローブ１６０に結合する分析物（１〜ｘ）の割合であり、および
ｎ１−１は、試験部位１２４１にある同定された分析物（１〜ｘ）のサンプル中の数である）
で表される。
【００２７】
[0033]同様に、試験部位１２４２でのシグナルの関係は、以下の式：
Ｓ２＝ａ２−１ｎ２−１＋ａ２−２ｎ２−２＋・・・・ａ２−ｘｎ２−ｘ
（式中、
Ｓ２は、試験部位１２４２中の結合したプローブ１６０と関連するシグナルであり、
ａ２−１は、試験部位１２４２中のプローブ１６０に結合する分析物（１〜ｘ）の割合であり、および
ｎ２−１は、試験部位１２４２にある同定された分析物（１〜ｘ）のサンプル中の数である）
で表される。
【００２８】
[0034]試験部位１２４２での分析物の数は試験サンプル中の分析物の元の数−試験部位１２４１で結合した分析物の数に等しいため、試験部位１２４２でのシグナルに関する式は、
Ｓ２＝ａ２−１（１−ａ１−１）ｎ１−１＋ａ２−２（１−ａ１−２）ｎ１−２＋・・・・ａ２−ｘ（１−ａ１−ｘ）ｎ１−ｘ
と書き換えることができる。
【００２９】
[0035]２つの分析物の場合については、前記式を、
【数２】
2013517478.tif 000003
に分解することができる。
[0036]従って、プローブ分子の数が制御されるため、それぞれの分析物について、結合した分析物の割合を、親和性定数およびプローブ密度の関数として決定することができる。かくして、初期試験溶液１５０中のそれぞれの分析物の数を決定することができる。
【００３０】
[0037]例えば、ある状況における試験サンプル１５０は、目的の分析物の１０６個の分子および目的の分析物に非常に類似する別の分析物の１０６個の分子の数を含み、かくして、交叉反応性を特徴付ける。親和性定数（ｋａ）およびプローブ密度は、目的の分析物の分子の４０％および他の分析物の６０％が捕捉分子に結合することを予測する。従って、目的の分析物の４００，０００個の分子および他の分析物の６００，０００個の分子が試験部位１２４１で捕捉され、１，０００，０００個の結合したプローブ（Ｓ１）に対応するシグナルを得るであろう。
【００３１】
[0038]残余数の目的の分析物および他の分析物を試験部位１２４１に移動させる際に、目的の分析物の４００，０００個の分子が存在し、試験溶液１５０中には目的の分析物の６００，０００個の分子が残されるであろう。従って、インキュベーション後、目的の分析物の２４０，０００個の分子および他の分析物の２４０，０００個の分子が試験部位１２４２に結合するであろう。次いで、シグナルＳ２は、４８０，０００個の結合したプローブに相当するであろう。上記の式において、算出された結合割合と得られたシグナルとを置換すれば、
【数３】
2013517478.tif 000004
が得られる。
【００３２】
[0039]かくして、多部位連続サンプリングシステムを、プリント基板、ガラス、プラスチック基質上で、または金、ガラス、エポキシ、ポリマー、もしくはゲルコーティングを含むＣＭＯＳチップ上で、またはさらには、９６穴プレートなどのウェルプレート中に組入れることができる。必要に応じて、対照、読出し、およびまた、対照の検知手段をプリント基板またはＣＭＯＳチップ中に提供することができる。ＣＭＯＳ技術は、複数の検知部位をごく近くに組上げることができる。これは、試験部位間の非制御環境因子の均一性を維持するのに役立つ。必要に応じて、シグナルの評価およびアッセイデータを、ＣＭＯＳチップ上にハードコード化することができる。
【００３３】
[0040]上記の実施形態における輸送制御システム１１２は、試験サンプル内の分析物を移動させるための電界を含んでいた。電界は、タンパク質またはＤＮＡ鎖などの、溶液中にある場合に正味の電荷を有する分析物を輸送するのに有用である（例えば、Ｄａｌｉｂｏｒ  Ｈｏｄｋｏら、「ＣＭＯＳ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ＣＭＯＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７を参照されたい）。
【００３４】
[0041]また、帯電した分析物および電気的に中性の分析物を、ピペットまたは液体処理装置を用いて大量に移動させることもできる。電気的に中性の分析物および帯電した分析物の両方について、他の輸送制御システムを用いて、試験溶液を連続的にサンプリングすることができる。輸送制御システムにおいて特に有用であり得る技術としては、全試験溶液をチップレベルで１つのプローブスポットから別のプローブスポットへ移動させるマイクロ流体工学が挙げられる。マイクロ流体工学手法としては、ＡＪ  Ｔｕｄｏｓ、「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  ｔｏｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ、２００１により報告された外部または内部のマイクロポンプおよびバルブにより微小に組上げられたチャンネルを介して液体の流動の制御を可能にする連続流動マイクロ流体工学が挙げられる。連続流動システム２００を図６に記載する。
【００３５】
[0042]図６を参照すると、連続流動輸送システムは、捕捉プローブ２０４を通過する試験サンプル２０２の流動を引き起こす。センサー２０６１〜３は流動経路に沿って位置し、分析物２０８を捕捉したプローブ２０４の数を検出するために構成される。分析物の捕捉は試験溶液内の分析物の数の関数であるため、試験溶液内の分析物の数が減少するにつれて捕捉の速度は減少する。従って、センサー２０６１によって得られるシグナルは、センサー２０６２により生成されるシグナルよりも大きい。かくして、図６の実施形態における分析物分子の数の算出は、上記の例における分析物分子の数の算出と同様の様式で算出される。
【００３６】
[0043]輸送システムにおいて用いることができる他の技術としては、Ｖｉｊａｙ  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ、「Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ」、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００４、４、３１０〜３１５により報告された絶縁体上でのエレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）、またはＡｃｈｉｍ  Ｗｉｘｆｏｒｔｈ、「Ｆｌａｔ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ：  Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ｐｌａｎａｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ０５により報告された表面音響波などの別個のマイクロ流体工学が挙げられる。また、液体試験溶液を、リポーターまたは捕捉分子のいくつかの領域を含む、多孔性膜により移動させる側方流動システムを組入れることもできる。電界に加えて、磁界を用いて溶液内の分析物を輸送することができる。分析物分子を磁気ビーズまたは帯電した標識で標識して、分析物の輸送を補助することができる。
【００３７】
[0044]図４の実施形態は、残余数の中にある分析物が、結合していない分析物である残余数の溶液構成物質を作製するが、残余数の溶液構成物質を、図７乃至図１１のサンプリングシステム２２０によって達成されるものなどの結合した分析物を用いて生成させることもできる。
【００３８】
[0045]図７は、いくつかの分析物２２４を含む試験溶液２２２を記載する。いくつかのプローブ２２８を含む試験片２２６を、矢印２３０により示されるように溶液２２２の中に入れることにより、残余数の溶液構成物質を生成させる。次いで、試験片２２６を、プローブ２２８に結合したいくつかの分析物２２４と共に除去する（図８）。プローブ２２８に結合した分析物の数を示す第１のシグナルを、試験片２２６から取得することができる。シグナルを取得する前に、試験片２２６を洗浄して、試験片２２６に付着するようになったが、プローブ２２８に結合していない分析物を除去することができる。
【００３９】
[0046]次いで、試験片２２６を、図９に示される溶液２３２に浸す。プローブ２２８から分析物２２４を除去するように溶液２３２を選択するか、または溶液２３２内の環境を制御して、分析物２２４とプローブ２２８との結合を破壊することができる。かくして、溶液２３２内の分析物２２４は、残余数の溶液構成物質を形成する。
【００４０】
[0047]次いで、いくつかのプローブ２４２と共に第２の試験片２４０を、図１０に矢印２４４で示されるように溶液２３２にさらす。次いで、試験片２４０を、プローブ２４２に結合したいくつかの分析物２２４と共に除去する（図１１）。プローブ２４２に結合した分析物の数を示す第２のシグナルを、試験片２４０から取得することができる。シグナルを取得する前に、試験片２４０を洗浄して、試験片２４０に付着するようになったが、プローブ２４２に結合していない分析物を除去することができる。試験溶液２２２中の分析物の数の決定を、プローブ密度および得られたシグナルと共に、プローブおよび分析物の親和性定数を用いて算出することができる。
【００４１】
[0048]環境を制御して分析物２２４とプローブ２２８との結合を破壊するサンプリングシステム２２０の実施形態においては、結合が破壊された後に試験片２２６を除去することができる。次いで、溶液２３２中の環境を制御して結合させ、試験片２２６を再導入することができる。溶液２３０中の分析物２２４のプローブ２２８への結合は、溶液２３０中の分析物２２４の数の関数であろう。かくして、溶液２３０から結合した分析物２２４の数は、溶液２３２から結合した分析物２２４の数よりも少ないであろう。
【００４２】
[0049]図３の手順を改変して、様々な状況に適合させることができる。例えば、前記システムはプローブよりもむしろ液体を輸送してもよい。この状況では、試験溶液をプローブスポットと接触するように移動させ、インキュベートする。次いで、初期溶液を除去し、結合した分析物の測定値を取得する。次いで、分析物または干渉構成物質を含まない流体をプローブスポットと接触させ、インキュベートし、結合した分析物のいくらかを溶液中に行かせることができる。次いで、流体を除去し、減少した数の結合した分析物を用いてプローブスポットを測定する。
【００４３】
[0050]別の状況では、干渉分析物の結合効率が未知である場合でも、目的の分析物の数よりも非常に多い干渉分析物の数を含む溶液を決定することができる。具体的には、結合効率が小さい限り、干渉分析物分子の数は、干渉分析物のいくらかが捕捉プローブに結合した場合でも一定であると仮定することができる。かくして、連続サンプル中の第１および第２シグナル間のシグナルの減少は、単に目的の分析物の数の変化に起因する。従って、試験溶液中の分析物の数は、以下の式：
【数４】
2013517478.tif 000005
に従って決定される。
[0051]図３の手順をさらに改変して、試験プラットフォームの異なるバッチを較正することができる。単一の結合分析物を含む試験溶液を用いることにより、残余数の分析物を、図３の手順などの様式で取得することができる。次いで、初期溶液および残留溶液に由来する結合した分析物と関連するシグナルを用いて、式：
【数５】
2013517478.tif 000006
に従って、元の溶液中の分析物の数を確認することができる。この式では、結合効率は必要ない。従って、この式を、結合効率が未知である状況で用いることができる。
[0052]さらに、例えば、上記の段落４４に記載の式を用いて、試験溶液（Ｓ１）および残留溶液（Ｓ２）から得られるシグナルを、以下の式：
【数６】
2013517478.tif 000007
（式中、ｎ１＝ｎanalyteである）
に従って決定する。かくして、捕捉分子に結合する分析物分子の割合が未知である状況については、溶液中の分析物の数を、式：
【数７】
2013517478.tif 000008
に従って決定することができる。
【００４４】
[0053]上記の段落４４に記載の式はまた、干渉分析物が溶液中に存在する状況において有用である。この状況では、試験溶液（Ｓ１）および残留溶液（Ｓ２）から得られるシグナルを、以下の式：
【数８】
2013517478.tif 000009
に従って決定する。かくして、捕捉分子に結合する分析物分子の割合が未知である状況については、干渉種を含む溶液中の分析物の数を、式：
【数９】
2013517478.tif 000010
に従って決定することができる。
【００４５】
[0054]一度、元の溶液中の分析物の数が確認されたら、捕捉プローブ分子の数を、上記の質量作用の法則を用いて決定することができる。この手法を改変して、温度などの、分析物と捕捉分子の特定の組合せに関して結合効率に影響する他の未知の要素を相殺することができる。
【００４６】
[0055]本発明を図面および前記説明において詳細に例示および説明してきたが、同じ事は特性において例示的なものであり、制限的なものではないと考えるべきである。好ましい実施形態が提示されたに過ぎず、本発明の精神の範囲内にある全ての変化、改変およびさらには応用も保護されるのが望ましいことが理解される。
【図１】
2013517478.tif 000011
【図２】
2013517478.tif 000012
【図３】
2013517478.tif 000013
【図４】
2013517478.tif 000014
【図５】
2013517478.tif 000015
【図６】
2013517478.tif 000016
【図７】
2013517478.tif 000017
【図８】
2013517478.tif 000018
【図９】
2013517478.tif 000019
【図１０】
2013517478.tif 000020
【図１１】
2013517478.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月19日(2012.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液構成物質の数を決定する方法において、
第１の数の溶液構成物質を第１の試験位置に導入する工程と、
前記第１の試験位置で第１の複数の溶液構成物質を結合させることにより第１の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
前記第１の残余数の溶液構成物質に由来する第２の複数の溶液構成物質を結合させることにより第２の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
結合した前記第１の複数の溶液構成物質と関連する第１のシグナルを取得する工程と、
結合した前記第２の複数の溶液構成物質と関連する第２のシグナルを取得する工程と、
得られた前記第１のシグナルおよび得られた前記第２のシグナルに基づいて、第１の目的の溶液構成物質の第２の数を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の試験部位から第２の試験部位に前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
前記第１の試験部位から第２の試験部位に、それぞれ複数の捕捉プローブに結合した複数の分析物を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記輸送された複数の結合した分析物を、それぞれ複数の捕捉プローブから遊離させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程は、
前記輸送された複数の結合した分析物の温度を改変することにより、前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程は、
前記輸送された複数の結合した分析物を脱ハイブリダイゼーション溶液にさらすことにより、前記輸送された複数の結合した分析物を遊離させる工程、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
マイクロ流体工学技術を用いて前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
毛細管流動を用いて前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
磁気ビーズを用いて前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程は、
前記第１の残余数の溶液構成物質に作用する電荷を改変することにより前記第１の残余数の溶液構成物質を輸送する工程、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の残余数の溶液構成物質に由来する第３の複数の溶液構成物質を結合させることにより第３の残余数の溶液構成物質を作製する工程と、
結合した前記第３の複数の溶液構成物質と関連する第３のシグナルを取得する工程と、
得られた前記第１のシグナル、得られた前記第２のシグナル、および得られた前記第３のシグナルに基づいて、第２の目的の溶液構成物質の第３の数を決定する工程と、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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