(57)【要約】  本発明は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態などの腫瘍関連疾患を含む、ＧＴ４６８を発現する細胞に関連する疾患を治療するおよび／または予防するための治療薬として有用な抗体を提供する。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＴ４６８に結合する能力を有し、且つ以下の活性：
（ｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞の死滅化、
（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞の増殖の阻害、
（ｉｉｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞のコロニー形成の阻害、ならびに
（ｉｖ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞の転移の阻害
の１またはそれ以上を有する抗体。
【請求項２】
１またはそれ以上の前記活性が、前記細胞によって発現されたおよび／または前記細胞の表面と結合したＧＴ４６８の細胞外ドメインへの前記抗体の結合によって誘導される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする前記腫瘍細胞が癌細胞である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記癌細胞が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態、ならびに肺の転移性癌から成る群より選択される癌に由来する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、または抗体のフラグメントである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ＧＴ４６８が配列番号：２に従うアミノ酸配列を有する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がＧＴ４６８に特異的に結合する、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＧＴ４６８の天然エピトープに結合する、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号：２〜１０および３５〜８２から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドまたはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体、または前記タンパク質もしくは前記ペプチドまたはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体を発現する核酸または宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって得られる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
（ｉ）アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１  １Ｃ１１  ２Ｂ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３９（４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３７（７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３６（１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３８（１８−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４０（６３−１Ａ−２），または  ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４２（３Ｅ５  ２Ｇ４）の下で寄託されたクローンによって産生されるまたは前記クローンから得られる抗体、
（ｉｉ）（ｉ）の下の前記抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、
（ｉｉｉ）（ｉ）の下の前記抗体の特異性を有する抗体、および
（ｉｖ）（ｉ）の下の前記抗体の抗原結合部分または前記抗原結合部位を含む抗体
から成る群より選択される抗体。
【請求項１１】
（ｉ）下の前記抗体の抗原結合部分または抗原結合部位が、（ｉ）の下の前記抗体の可変領域を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
【請求項１３】
アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１  １Ｃ１１  ２Ｂ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３９（４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３７（７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３６（１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３８（１８−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４０（６３−１Ａ−２），または  ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４２（３Ｅ５  ２Ｇ４）の下で寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１４】
治療薬に結合した、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体を含む複合体。
【請求項１５】
治療薬が、毒素、放射性同位体、薬剤または細胞傷害性物質である、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体および／または請求項１４もしくは１５に記載の複合体、ならびに医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体および／または請求項１４もしくは１５に記載の複合体と接触させることを含む方法。
【請求項１８】
ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を死滅させる方法であって、前記細胞を、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体および／または請求項１４もしくは１５に記載の複合体の有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１９】
ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の転移拡大を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体および／または請求項１４もしくは１５に記載の複合体の有効量と接触させることを含む方法。
【請求項２０】
被験者においてＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する疾患または障害を治療するまたは予防する方法であって、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体および／または請求項１４もしくは１５に記載の複合体、または請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記疾患または前記障害が腫瘍関連疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍関連疾患が癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態、ならびに肺の転移性癌から成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療のためのモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体に基づく癌療法は、臨床に導入されて成功を収め、過去１０年間にわたり腫瘍学における最も有望な治療法となってきた。
【０００３】
癌のための抗体に基づく治療法は、従来の薬剤と比較してより高い特異性とより低い副作用プロフィールの潜在的可能性を有する。その理由は、抗体による正常細胞と腫瘍細胞との正確な識別、ならびにそれらの作用機構が補体の活性化および細胞傷害性免疫細胞の動員といったより毒性の低い免疫学的抗腫瘍機構に基づくという事実にある。
【０００４】
抗体療法のための標的は、正常細胞と腫瘍細胞との間の適切な識別の基礎を形成する、特殊な性質を備える必要がある。明らかに、腫瘍細胞に排他的に限定され、正常組織では完全に検出不能である標的は、効率的で安全な抗体療法の開発のために理想的である。別の態様では、高レベルの過剰発現が治療ウインドウおよび低い副作用のための基礎となり得、これは、遺伝子増幅の結果として抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の良好な標的である、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ−２）に例示される。
【０００５】
腫瘍治療に関して既に承認されているまたは臨床開発中である抗体についての他の標的は、腫瘍細胞上の標的分子の数的過剰発現には基づかない、異なる性質を有する。プロテオグリカンＭＵＣ−１に対する抗体の場合は、標的の骨格内のペプチド反復エピトープが腫瘍細胞ではグリコシル化不十分であり、したがってその正常対応物へと変化する。ＣＤ２０（リツキシマブ）、ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）およびＣＤ２２（エプラツズマブ）に対する抗体の場合は、抗体標的が腫瘍細胞と正常リンパ球上で同等の発現レベルを有する。ここでは、標的陰性幹細胞が正常なリンパ球レパートリーを回復させるので、抗体による正常細胞の除去は耐容される。抗体標的の特異的な接近性他の例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡ９）である。どちらの抗原も、それぞれ結腸および腎臓の正常上皮で発現される。しかし、放射性標識イメージング抗体は、腫瘍と正常組織を正しく識別し、細胞傷害性抗体は良好に耐容される。これは、おそらく、ＩｇＧ抗体がアクセスできない正常上皮組織の管腔側でのＣＡ９およびＣＥＡの発現が制限されていることによると考えられる。抗原上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）もこのカテゴリーに属する。上皮細胞についての同型細胞接着分子として、Ｅｐ−ＣＡＭは細胞間隙に局在する。興味深いことに、高親和性抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体は非常に毒性が強いが、中間親和性の抗体は良好に耐容される。これは、正常細胞上のＥｐ−ＣＡＭ標的のアクセス可能性を示唆するだけでなく、抗体結合の動力学が治療ウインドウを開き得ることも指示する。
【０００６】
８つの抗体が腫瘍疾患の治療に関して承認されているが、それらのほとんどはリンパ腫および白血病における治療である（Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．＆  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１４７−１１５７）。３つのｍＡｂ、すなわちＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＡｖａｓｔｉｎおよびＥｒｂｉｔｕｘだけが、癌が引き起こす死亡の９０％以上を占める固形癌型を対象とする。残存する実質的な医学的必要性、承認されたｍＡｂが既に提供してきた重要な臨床的恩恵およびそれらの大きな商業的成功の全体が、広範囲の患者群のための抗体療法を開発することのみならず、それらの効果も改善しようとする革新的アプローチの波をもたらした（Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．＆  Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２，５２−６２；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １，１１８−１２９）。
【０００７】
次世代の改善された抗体に基づく癌療法の出現のために克服すべき課題の１つは、好ましい毒性／効果プロフィールのための鍵となる、適切な標的分子の選択である。
【０００８】
固形癌の治療のために現在使用可能な抗体は、正常組織でのそれらの標的の発現のために、抗体分子に組み込まれた作用機構の累積的な力を十分に発揮していない。例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの標的であるＨｅｒ２／ｎｅｕは、心筋を含む多くの正常ヒト組織で発現される（Ｃｒｏｎｅ，Ｓ．Ａ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｆａｎ，Ｌ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，４５９−４６５）。結果として、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、さもなければ許容されない毒性のために、低い免疫学的効力で設計されており、その最大有効用量で投与することができない。この「潜在的に鋭利なナイフの鈍化」がＨｅｒｃｅｐｔｉｎの治療効果を制限している。
【０００９】
毒性関連組織では発現しないことに加えて、腫瘍細胞の表面での堅固で高い発現および腫瘍促進機能の提示は、理想的な抗体標的のための望ましい特徴である（Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ，Ｐ．＆  Ｚｌｏｔｎｉｋ，Ａ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５，６４０−６４４）。
【００１０】
癌の抗体療法の新たな標的の発見のために総合的なデータ検索と実験による検証アプローチを使用して、発明者はＧＴ４６８を同定した。ＧＴ４６８は、様々な腫瘍型において、特に乳癌においてしばしば異常に活性化され、高発現される胎盤特異的遺伝子である。ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉを介したＧＴ４６８のサイレンシングは、運動性、移動および浸潤を大きく低下させ、Ｇ１／Ｓ細胞周期のブロックを誘導して、増殖をほぼ完全に廃する。ＧＴ４６８のノックダウンは、サイクリンＤ１の発現低下およびＡＫＴキナーゼのリン酸化減少に結びつく。さらに、ＧＴ４６８は癌細胞の表面に局在し、この分子の生物学的機能に拮抗する抗体にとってアクセス可能である。
【００１１】
ＧＴ４６８は、この分子を治療抗体のための極めて魅力的な標的にするいくつかの特性を備える。妊娠のような例外的な状態においてのみヒトの身体に出現する細胞系譜の分化抗原であるので、自己抗原がおそらくそうであるように健康な毒性関連組織には存在しない。様々な腫瘍実体におけるその高い存在率のゆえに、幅広い患者がＧＴ４６８標的療法による治療に適格となるであろう。例えば乳癌の場合は、患者の８２％がこの標的を担持する。これに対し、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの標的であり、この癌型の治療のために使用可能な唯一のｍＡｂであるＨｅｒ２／ｎｅｕは、乳癌患者の２０〜２５％においてのみ過剰発現される（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｓ．Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ，Ｊ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，７０７−７１２）。肺癌および胃癌に関しては、それぞれ症例の４２％および５８％においてＧＴ４６８が発現されるが、これらの癌型における適切な標的が存在しないため、今までのところ承認されたｍＡｂ治療はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．＆  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１４７−１１５７
【非特許文献２】Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．＆  Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２，５２−６２
【非特許文献３】Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １，１１８−１２９
【非特許文献４】Ｃｒｏｎｅ，Ｓ．Ａ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｆａｎ，Ｌ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，４５９−４６５
【非特許文献５】Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ，Ｐ．＆  Ｚｌｏｔｎｉｋ，Ａ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５，６４０−６４４
【非特許文献６】Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｓ．Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ，Ｊ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，７０７−７１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＧＴ４６８は生細胞上の抗体による標的となり得、そのような抗体は、増殖阻害のような抗腫瘍作用を促進し得る。ＧＴ４６８は増殖に関与するだけでなく、細胞の運動性、移動および浸潤にも関わる。最も興味深い点として、これらの性質すべてが、腫瘍表現型に実質的に寄与するのみならず、ヒト栄養膜の固有の性質でもあり、その生理的特徴は、速やかに成長し、子宮組織に効率よく侵入することである。ＡＤＣＣおよびＣＤＣのような免疫エフェクター機能を媒介するそれらの潜在能に加えて、これらの機能すべてに同時に干渉する、ＧＴ４６８に対するｍＡｂが構築できると期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、一般に、腫瘍関連疾患、例えば癌、特に乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態を含む、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に関連する疾患を治療するおよび／または予防するための治療薬として有用な抗体を提供する。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、ＧＴ４６８に結合する能力を有する抗体に関する。本明細書で述べる抗体は、好ましくは、ＧＴ４６８上に存在するエピトープ、好ましくはＧＴ４６８の細胞外ドメイン内に位置するエピトープ、より好ましくは配列番号：３〜１０および３５〜８２に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体である。好ましくは、抗体は、細胞表面上に位置するＧＴ４６８に結合する能力を有し、好ましくはＧＴ４６８の細胞外ドメイン内、好ましくはＧＴ４６８のアミノ酸残基２３〜２１２内に位置する１またはそれ以上のエピトープに結合し、最も好ましくは配列番号：３〜１０および３５〜８２のアミノ酸配列の１つの中に位置するエピトープに結合する。１つの好ましい実施形態では、抗体は配列番号：３〜１０および３５〜８２のアミノ酸配列の１またはそれ以上に特異的である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号：２のアミノ酸２９〜１１９、好ましくはアミノ酸２９〜２１２、より好ましくはアミノ酸２３〜２１２を含むペプチドに結合する能力を有する。
【００１６】
本発明に包含されるモノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ１〜４、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤ抗体を含む。１つの実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体、より詳細にはＩｇＧ１κまたはＩｇＧ１λアイソタイプである。別の実施形態では、抗体はＩｇＧ３抗体、より詳細にはＩｇＧ３κまたはＩｇＧ３λアイソタイプである。さらに別の実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体、より詳細にはＩｇＧ４κまたはＩｇＧ４λアイソタイプである。さらに別の実施形態では、抗体はＩｇＡ１またはＩｇＡ２抗体である。さらに別の実施形態では、抗体はＩｇＭ抗体である。
【００１７】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：７５〜７９に従うペプチドの１またはそれ以上に結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：７５に従うペプチドおよび／または配列番号：７６に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：７５に従うペプチドおよび配列番号：７６に従うペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号：７７に従うペプチドおよび／または配列番号：７８に従うペプチドおよび／または配列番号：７９に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：７８に従うペプチドおよび配列番号：７９に従うペプチドに結合するか、または配列番号：７７に従うペプチド、配列番号：７８に従うペプチドおよび配列番号：７９に従うペプチドに結合する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：４に従うペプチドまたは配列番号：８０に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：６に従うペプチドまたは配列番号：８１に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。好ましくは、本発明の抗体は前記ペプチドの１またはそれ以上に結合する。
【００１９】
さらなる実施形態では、配列番号：７５に従うペプチドおよび／または配列番号：７６に従うペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：７５に従うペプチドおよび配列番号：７６に従うペプチドに結合する抗体は、配列番号：４に従うペプチドまたは配列番号：８０に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。別の実施形態では、配列番号：７７に従うペプチドおよび／または配列番号：７８に従うペプチドおよび／または配列番号：７９に従うペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：７８に従うペプチドおよび配列番号：７９に従うペプチドに結合する、または配列番号：７７に従うペプチド、配列番号：７８に従うペプチドおよび配列番号：７９に従うペプチドに結合する抗体は、配列番号：６に従うペプチドまたは配列番号：８１に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。
【００２０】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：６０〜６６に従う、好ましくは配列番号：６１〜６６に従うペプチドの１またはそれ以上に結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：６０に従うペプチドおよび／または配列番号：６１に従うペプチドおよび／または配列番号：６２に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６０に従うペプチドおよび配列番号：６１に従うペプチドおよび配列番号：６２に従うペプチドに結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：６１に従うペプチドおよび／または配列番号：６２に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６１に従うペプチドおよび配列番号：６２に従うペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号：６４に従うペプチドおよび／または配列番号：６５に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６４に従うペプチドおよび配列番号：６５に従うペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号：６５に従うペプチドおよび／または配列番号：６６に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６５に従うペプチドおよび配列番号：６６に従うペプチドに結合する。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：８２に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。好ましくは、本発明の抗体は前記ペプチドに結合する。配列番号：８２に従うペプチドは、ペプチドのアミノ酸１と１６の間のジスルフィド結合の形成を助けるために付加されたＣ末端ＧＳリンカーを有する。このペプチドは、おそらくＧＴ４６８の天然立体配座に類似する。配列番号：８２に従うペプチドを免疫のために使用して得られたハイブリドーマ５１−１Ａ−１によって産生された抗体は、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖およびコロニー形成に対して強い阻害活性を示した。
【００２２】
さらなる実施形態では、配列番号：６４に従うペプチドおよび／または配列番号：６５に従うペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：６４に従うペプチドおよび配列番号：６５に従うペプチドに結合する抗体、または配列番号：６５に従うペプチドおよび／または配列番号：６６に従うペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：６５に従うペプチドおよび配列番号：６６に従うペプチドに結合する抗体は、配列番号：８２に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：５７〜６０に従うペプチドの１またはそれ以上に結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：５７に従うペプチドおよび／または配列番号：５８に従うペプチドおよび／または配列番号：５９に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：５７に従うペプチドおよび配列番号：５８に従うペプチドに結合するか、または配列番号：５７に従うペプチドおよび配列番号：５８に従うペプチドおよび配列番号：５９に従うペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号：５９に従うペプチドおよび／または配列番号：６０に従うペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：５９に従うペプチドおよび配列番号：６０に従うペプチドに結合する。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：３に従うペプチドを免疫のために使用して得られる。好ましくは、本発明の抗体は前記ペプチドに結合する。
【００２５】
好ましくは、本発明の抗体は、癌細胞、特に本明細書で言及する癌型の細胞に結合し、好ましくは、非癌性細胞には実質的に結合せず、より好ましくは胎盤細胞および精巣細胞以外の非癌性細胞には実質的に結合しない。好ましくは、癌細胞のようなＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞への前記抗体の結合は、前記細胞の死滅を媒介する、ならびに／または運動性、移動、浸潤、増殖および／もしくはコロニー形成などの、そのような細胞の１もしくはそれ以上の活性を阻害する。好ましくは、抗体は前記細胞の増殖および／またはコロニー形成を阻害する。
【００２６】
本発明の抗体による、細胞の死滅ならびに／または細胞の１もしくはそれ以上の活性の阻害、特に細胞増殖およびコロニー形成の阻害、は、好ましくは前記細胞によって発現されるおよび／または前記細胞の細胞表面と結合している、ＧＴ４６８への抗体の結合によって誘導される。そのような細胞の死滅および／または細胞の１もしくはそれ以上の活性の阻害は、本明細書で述べるように治療に利用できる。特に、細胞の死滅および／または細胞の増殖の阻害および／または細胞のコロニー形成の阻害は、癌転移を含む、癌を治療するまたは予防するために利用できる。細胞の運動性、移動、浸潤、増殖および／またはコロニー形成の阻害は、特に、癌の転移および癌細胞の転移拡大を治療するまたは予防するために利用できる。
【００２７】
ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、好ましくは癌細胞であり、特に、以下の癌疾患：乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態の腫瘍形成性癌細胞から成る群より選択される。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
【００２８】
本発明の抗体は、標的細胞傷害、すなわち腫瘍細胞の死滅をもたらすために１またはそれ以上の治療エフェクター成分、例えば放射性標識、細胞毒、治療用酵素、アポトーシスを誘導する物質等に結合し得る。
【００２９】
好ましくは、本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した溶解、アポトーシス、同型接着および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって細胞の死滅を媒介する。しかし、本発明はまた、抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した溶解、アポトーシス、同型接着および／または食作用を誘導せずに、細胞の死滅ならびに／または細胞の１もしくはそれ以上の活性の阻害、例えば細胞増殖およびコロニー形成の阻害のような本明細書で述べるその活性を及ぼす実施形態を包含する。例えば、本発明の抗体はまた、単に細胞表面上のＧＴ４６８に結合することによって、したがって、例えば細胞の増殖をブロックすることによっても作用を及ぼし得る。１つの実施形態では、本発明の抗体は細胞のＣＤＣ媒介性溶解を誘導しない。
【００３０】
好ましくは、細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解は、特定の実施形態では単球、単核細胞、ＮＫ細胞およびＰＭＮから成る群より選択される、エフェクター細胞の存在下で起こり、そして食作用はマクロファージによるものである。
【００３１】
１つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞、好ましくは乳癌細胞などの癌細胞の増殖を阻害するまたは低減する活性を有する。この活性は、ブロモデオキシウリジン（５−ブロモ−２−デオキシウリジン、ＢｒｄＵ）を使用したアッセイにおいてＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖を測定することにより、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で測定できる。ＢｒｄＵは、チミジンの類似体である合成ヌクレオシドであり、複製細胞の新たに合成されたＤＮＡに組み込まれて（細胞周期のＳ期の間に）、ＤＮＡ複製の間にチミジンを置換することができる。例えばＢｒｄＵに特異的な抗体を使用して、組み込まれた化学物質を検出することは、そのＤＮＡを活発に複製していた細胞を示す。細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＧＴ４６８発現癌細胞として使用できる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８の１またはそれ以上の増殖を阻害または低減し、好ましくは細胞株ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７の両方の増殖を阻害または低減し、最も好ましくは細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８のすべての増殖を阻害または低減する。これに関して本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ３５−４８Ｂ−１、３５−５０Ａ−２ａ、３８−１０Ｂ−１、３８−１Ａ−１、４５−２Ａ−１、４５−８Ａ−２、４８−３Ｂ−１、４８−４Ａ−１、４９−３Ａ−１、５１−１Ａ−１、５３−１３Ａ−２、５３−２９Ａ１、５６−４Ａ−２、６２−９Ｂ−１、７８Ｈ１１  １Ｈ６および４４−３Ａ−２によって産生されるおよび／または前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体および、特に、（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体、から成る群より選択される。これに関して本発明の特に好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ３５−４８Ｂ−１、４８−３Ｂ−１、５１−１Ａ−１および５６−４Ａ−２によって産生されるおよび／または前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体および、特に、（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体、から成る群より選択される。
【００３２】
１つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞、好ましくは乳癌細胞などの癌細胞のコロニー形成を阻害するまたは低減する活性を有する。この活性は、クローン原性アッセイにおいてインビトロで測定することができる。細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＧＴ４６８発現癌細胞として使用できる。クローン原性アッセイは、細胞の生存および増殖への特定物質の有効性を試験するための微生物学技術である。このアッセイは、増殖中の腫瘍細胞への薬剤または放射線の効果を測定するために癌の研究室においてしばしば使用される。実験は３つの主要な工程：（ｉ）細胞、特に癌細胞の試料に治療を適用する工程、（ｉｉ）組織培養容器に細胞を植える工程、および（ｉｉｉ）細胞を増殖させる工程を含む。生じたコロニーを固定し、染色して、計数する。コロニー形成は、個々の腫瘍細胞が器官に定着した場合の転移の形成に関して重要である。抗体の阻害活性は、転移の形成を抑制する上でのそれらの潜在能を示す。クローン原性アッセイにおいてコロニー形成を阻害または低減する活性を有する抗体は、特に本明細書で言及する癌型の、転移および癌細胞の転移拡大を治療するまたは予防するために特に有用である。これに関して本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４、７８Ｈ１１  １Ｈ６、１６−５Ｂ−１、２２−１Ａ−１、２９−８Ｂ−１および５１−１Ａ−１によって産生されるおよび／または前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体および、特に、（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体、から成る群より選択される。これに関して本発明の特に好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４、２９−８Ｂ−１および５１−１Ａ−１によって産生されるおよび／または前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体および、特に、（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体、から成る群より選択される。
【００３３】
１つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、上記で説明したようにＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害するまたは低減する活性を有し、且つ、上記で説明したようにＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のコロニー形成を阻害するまたは低減する活性を有する。これに関して本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ５１−１Ａ−１によって産生されるおよび／またはハイブリドーマ５１−１Ａ−１から得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体および、特に、（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体から成る群より選択される。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明は、（ｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に結合し、且つ（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現しないおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない細胞には結合しない抗体に関する。本発明の抗体は、好ましくは、（ｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅を媒介し、および／または前記細胞の増殖を阻害し、且つ（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現しないおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない細胞の死滅を媒介しない、および／または前記細胞の増殖を阻害しない。
【００３５】
本発明の抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、または抗体のフラグメントであり得、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体から成る群より選択され得る。
【００３６】
本発明の抗体は完全ヒト抗体を含む。そのような抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチを受けることにより、ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多重アイソタイプを産生することができる、非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスにおいて作製し得る。そのようなトランスジェニック動物はまた、米国特許出願第２００３／００１７５３４号に開示されているようなポリクローナル抗体を産生するためのトランスジェニックウサギであり得る。
【００３７】
ＧＴ４６８抗原への本発明の抗体の結合は、例えば補体系の活性化によって、ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介し得る、ならびに／またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞（例えば腫瘍細胞）の増殖を阻害し得る。あるいは、またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅を媒介することならびに／またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害することに加えて、ＧＴ４６８抗原への本発明の抗体の結合は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞（例えば腫瘍細胞）の運動性、移動、コロニー形成および／または浸潤を阻害することができ、したがって、腫瘍細胞の転移拡大を阻害し得る。ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅は、以下の機構：ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシス；ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のエフェクター細胞食作用；またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、の１またはそれ以上によって起こり得る。
【００３８】
本発明のすべての態様によれば、ＧＴ４６８は、好ましくはヒトＧＴ４６８であり、好ましくは配列番号：２に従うアミノ酸配列を有する、より好ましくは配列番号：２に従うアミノ酸配列の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する、特に配列番号：２のアミノ酸２３〜２１２にわたるアミノ酸配列を有するヒトＧＴ４６８である。
【００３９】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：３〜１０および３５〜８２のような、生細胞の表面に存在するＧＴ４６８の天然エピトープに結合する。さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗体は、癌細胞、好ましくは乳癌細胞に特異的である。好ましくは、本発明の抗体は、細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１のようなＧＴ４６８を発現する癌細胞に特異的であり、ＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞のようなＧＴ４６８を発現しない癌細胞には結合しない。
【００４０】
本発明のある実施形態では、ＧＴ４６８は細胞表面上で発現されるおよび／または細胞の表面と結合する。
【００４１】
本発明の抗体は、配列番号：２〜１０および３５〜８２から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、またはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体、または前記タンパク質もしくはペプチドまたはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体を発現する核酸または宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって入手し得る。好ましくは、本発明の抗体は、上記のタンパク質、ペプチドまたはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体に特異的である。免疫において使用されるタンパク質またはペプチドに関連して、誘導体は、それが由来するタンパク質またはペプチドと同じ免疫原性を有する、そのようなタンパク質またはペプチドの変異体に関する。特に、抗体、中でもモノクローナル抗体の作製のために免疫において使用される場合のタンパク質またはペプチドの誘導体は、前記タンパク質またはペプチドを免疫において使用した場合に得られる抗体と同じ特異性を有する抗体を提供する。例えば、そのような誘導体は、１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加を含み得る。特に、前記誘導体は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかまたはその両方にシステインなどの１またはそれ以上のアミノ酸の付加を含み得る。
【００４２】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１  １Ｃ１１  ２Ｂ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３９（４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３７（７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３６（１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３８（１８−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４０（６３−１Ａ−２），または  ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４２（３Ｅ５  ２Ｇ４）を有するクローンによって産生される。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、毒素、放射性同位体、薬剤または細胞傷害性物質などの治療薬に連結される。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマに関する。好ましいハイブリドーマは、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０），ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１  １Ｃ１１  ２Ｂ２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２），ＤＳＭ  ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３９（４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３７（７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３６（１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３８（１８−２Ａ−１），ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４０（６３−１Ａ−２），または  ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４２（３Ｅ５  ２Ｇ４）を有するものである。
【００４５】
本発明の抗体は、本明細書では、抗体の名称に言及することによっておよび／または抗体を産生するクローン、例えば４Ｅ９−１Ｈ９に言及することによって指定される。
【００４６】
好ましくは、本発明の抗体は、癌細胞および非悪性細胞を含む種々の細胞型によって発現されるＧＴ４６８変異体を識別する能力を有する。
【００４７】
本発明の抗体は、好ましくは、ＧＴ４６８に結合することにより、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅を媒介する。好ましくは、ＧＴ４６８は前記細胞の表面上で発現される。１つの実施形態では、本発明の抗体は、体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、例えばＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の少なくとも約２０〜４０％のＣＤＣ媒介性溶解、好ましくは約４０〜５０％のＣＤＣ媒介性溶解、より好ましくは５０％以上のＣＤＣ媒介性溶解を誘導する。あるいは、またはＣＤＣを誘導することに加えて、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば単球、単核細胞、ＮＫ細胞およびＰＭＮ）の存在下で、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシスを誘導する、ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の同型接着を誘導する、ならびに／またはマクロファージの存在下でＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用を誘導する能力を有し得る。本発明の抗体は、上述した機能特性の１またはそれ以上を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＣＤＣ媒介性溶解およびＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導し、より好ましくは、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導するが、前記細胞のＣＤＣ媒介性溶解は誘導しない。本発明の抗体についての例示的な標的細胞は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする癌細胞を含むが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体によって媒介される細胞の死滅はＧＴ４６８特異的である、すなわち本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅、好ましくはＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を媒介するが、ＧＴ４６８を発現しないおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない細胞の死滅は媒介しない。上述した抗体は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態などの癌の治療または予防において腫瘍細胞の死滅を媒介するために使用され得る。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
【００４８】
本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むがこれらに限定されない、様々な種に由来し得る。本発明の抗体はまた、１つの種、好ましくはヒトに由来する抗体定常領域が別の種に由来する抗原結合部位と組み合わされているキメラ分子を包含する。さらに、本発明の抗体は、非ヒト種に由来する抗体の抗原結合部位がヒト起源の定常領域およびフレームワーク領域と組み合わされているヒト化分子を包含する。
【００４９】
本発明の抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、ＩｇＧ２ａ（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３（例えばＩｇＧ３、κ、λ）およびＩｇＭ抗体を含む。しかし、ＩｇＧ１、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む、他の抗体アイソタイプも本発明に包含される。抗体は、全長抗体または、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖフラグメントもしくは二重特異性抗体を含む、その抗原結合フラグメントであり得る。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド（例えば重鎖可変領域または軽鎖可変領域など）、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域、を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を包含する。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号においてさらに開示されている。
【００５０】
本発明の抗体は、好ましくは約１〜１００ｎＭまたはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でＧＴ４６８から解離する。好ましくは、本発明の抗体は関連細胞表面抗原と交差反応せず、したがってそれらの機能を阻害しない。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、以下の性質：
ａ）ＧＴ４６８に対する特異性；
ｂ）約１００ｎＭまたはそれ以下、好ましくは約５〜１０ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは約１〜３ｎＭまたはそれ以下の、ＧＴ４６８への結合親和性；
ｃ）ＣＤ５５／５９陰性細胞またはＣＤ５５／５９陽性細胞に対して高レベルのＣＤＣを媒介する能力；
ｄ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する能力；
ｅ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシスを誘導する能力；
ｆ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の同型接着を誘導する能力；
ｇ）エフェクター細胞の存在下でＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＡＤＣＣを誘導する能力；
ｈ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞を有する被験者の生存を延長させる能力；
ｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を枯渇させる能力；
ｊ）低レベルのＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を枯渇させる能力；ならびに／または
ｋ）生細胞の表面でＧＴ４６８を凝集させる能力
の１またはそれ以上によって特徴づけることができる。
【００５２】
本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、誘導体化する、他の結合特異性部分に連結する、または他の結合特異性部分と共発現させることができる。特定の実施形態では、本発明は、ＧＴ４６８に対する少なくとも１つの第一結合特異性部分（例えば抗ＧＴ４６８抗体またはそのミメティック）、およびＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩなどのＦｃγ受容体、もしくは任意の他のＦｃ受容体）またはＴ細胞受容体、例えばＣＤ３に対する結合特異性のような、エフェクター細胞に対する第二結合特異性部分を含む、二重特異性または多重特異性分子を提供する。
【００５３】
したがって、本発明は、ＧＴ４６８と、Ｆｃ受容体またはＴ細胞受容体、例えばＣＤ３の両方に結合する二重特異性および多重特異性分子を包含する。Ｆｃ受容体の例は、ＩｇＧ受容体、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。ＩｇＡ受容体（例えばＦｃαＲＩ）などの他のＦｃ受容体も標的とすることができる。Ｆｃ受容体は、好ましくはエフェクター細胞、例えば単球、マクロファージまたは活性化単核細胞の表面上に位置する。好ましい実施形態では、二重特異性および多重特異性分子は、受容体の免疫グロブリンＦｃ（例えばＩｇＧまたはＩｇＡ）結合部位とは異なる部位でＦｃ受容体に結合する。それゆえ、二重特異性および多重特異性分子の結合は、生理的レベルの免疫グロブリンによってブロックされない。
【００５４】
さらに別の態様では、本発明の抗ＧＴ４６８抗体を誘導体化するか、別の機能的分子、例えば別のペプチドもしくはタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）に連結するまたは前記分子と共発現させる。例えば、本発明の抗体は、１またはそれ以上の他の分子実体、例えば別の抗体（例えば二重特異性または多重特異性抗体を作製するため）、細胞毒、細胞リガンドまたは抗原（例えばイムノトキシンなどの免疫複合体を作製するため）などに機能的に連結することができる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的会合または他の方法によって）。本発明の抗体は、他の治療成分、例えば放射性同位体、低分子抗癌薬、組換えサイトカインまたはケモカインに連結することができる。したがって、本発明は、多種多様な抗体複合体、二重特異性および多重特異性分子、ならびに融合タンパク質を包含し、これらのすべてが、ＧＴ４６８発現細胞および／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に結合し、他の分子をそのような細胞に標的するために使用できる。
【００５５】
一般に、本発明の目的において、本明細書で述べる抗体複合体、二重特異性および多重特異性分子、ならびに融合タンパク質などのすべての抗体誘導体は、「抗体」という用語に包含される。
【００５６】
さらなる態様では、本発明はまた、非免疫グロブリンドメインに由来するＧＴ４６８結合タンパク質、特に一本鎖タンパク質を考慮する。そのような結合タンパク質およびそれらの生産のための方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１０）：１２５７−１２６８に記載されている。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン由来の結合分子に関して本明細書で与えられる教示は、対応して非免疫グロブリンドメインに由来する結合分子にも適用されることが了解されるべきである。特に、非免疫グロブリンドメインに由来するそのような結合分子を使用して、前記標的を発現するおよび／またはその細胞表面と前記標的の結合を特徴とする細胞のＧＴ４６８をブロックし、したがって、本発明の抗体に関して本明細書で開示される治療効果、特に腫瘍細胞の増殖のような本明細書で開示される腫瘍細胞の１またはそれ以上の活性の阻害を生じさせることが可能である。
【００５７】
義務的ではないが、例えば抗体のＦｃ領域への融合によって、そのような非免疫グロブリン結合分子に抗体のエフェクター機能を付与することが可能である。
【００５８】
本発明は、一般に、細胞によって発現されるおよび／または細胞の表面と結合しているＧＴ４６８を標的とすることによる、疾患、特に腫瘍疾患の治療および／または診断を包含する。これらの方法は、そのような細胞の選択的検出および／または根絶を提供し、それによりＧＴ４６８を発現しないおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。治療または診断のための好ましい疾患は、腫瘍疾患、特に本明細書で述べるような癌疾患などの、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与するものである。
【００５９】
１つの態様では、本発明は、本発明の抗体の１つまたは本発明の抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物および診断組成物／キットを提供する。本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含有してもよく、場合により１またはそれ以上の補助剤、安定剤等を含有してもよい。特定の実施形態では、組成物は、異なるエピトープに結合するまたは、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＣを誘導することならびにアポトーシスを誘導することのような、異なる機能特徴を有する抗体の組合せを含有する。本発明のこの実施形態では、抗体は、組合せとして、例えば２またはそれ以上の抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体を含有する医薬組成物として使用され得る。例えば、異なるが補完的な活性を有する抗ＧＴ４６８抗体を、所望治療効果を達成するために単一療法において組み合せることができる。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＤＣを媒介する抗ＧＴ４６８抗体を、アポトーシスを誘導する別の抗ＧＴ４６８抗体と組み合せて含有する。別の実施形態では、組成物は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の極めて有効な死滅を媒介する抗ＧＴ４６８抗体を、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する別の抗ＧＴ４６８抗体と組み合せて含有する。
【００６０】
本発明はまた、本発明の２またはそれ以上の抗ＧＴ４６８抗体の同時投与または連続投与を含み、好ましくは、前記抗体の少なくとも１つはキメラ抗ＧＴ４６８抗体であり、そして少なくとも１つのさらなる抗体はヒト抗ＧＴ４６８抗体であって、それらの抗体はＧＴ４６８の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合する。好ましくは、本発明のキメラＧＴ４６８抗体を最初に投与し、次いで本発明のヒト抗ＧＴ４６８抗体を投与するが、ヒト抗ＧＴ４６８抗体は、好ましくは長期間にわたって、すなわち維持療法として投与する。
【００６１】
本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子および組成物は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖が阻害されるおよび／または前記細胞が死滅するように、前記細胞を前記抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子または組成物の有効量と接触させることにより、ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害するためならびに／またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を選択的に死滅させるための様々な方法において使用できる。１つの実施形態では、前記方法は、場合によりエフェクター細胞の存在下で、例えばＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用によって、またはこれらの機構の２もしくはそれ以上の組合せによって、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を死滅させることを含む。本発明の抗体を使用して阻害するまたは死滅させることができる、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、癌細胞を含む。
【００６２】
本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子および組成物は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する様々な疾患を、そのような疾患に罹患している患者に抗体を投与することによって治療するおよび／または予防するために使用できる。治療（例えば改善）できるまたは予防できる例示的な疾患は、腫瘍形成性疾患を含むが、これらに限定されない。治療できるおよび／または予防できる腫瘍形成性疾患の例は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態などの癌疾患を含む。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
【００６３】
１つの態様では、本発明は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の運動性、移動、浸潤、成長（増殖）およびコロニー形成から選択される１またはそれ以上の活性、好ましくは成長および／またはコロニー形成を阻害する方法であって、前記細胞を本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子または組成物の有効量と接触させることを含む方法に関する。ＧＴ４６８は、好ましくは前期細胞の表面上で発現される。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子または組成物を被験者に投与することを含む、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する疾患または障害を治療するまたは予防する方法に関する。好ましくは、前記疾患または障害は腫瘍関連疾患であり、特定の実施形態では、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。ＧＴ４６８は、好ましくは前記細胞の表面上で発現される。
【００６５】
本発明は、腫瘍疾患の予防および／または治療処置のため、すなわち腫瘍疾患を有するまたは腫瘍疾患を発症する危険性がある患者を治療するための、本明細書で述べる作用物質および組成物の使用を含み得る。１つの態様では、本発明は、本明細書で述べる作用物質および組成物の１またはそれ以上の投与を含む、腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００６６】
好ましくは、本明細書で述べる作用物質および組成物は、胎盤組織および／または精巣組織などの、組織または器官が腫瘍を有さない場合はその細胞がＧＴ４６８を実質的に発現するおよび／またはその細胞表面でのＧＴ４６８の発現を特徴とする組織または器官に、治療活性物質が送達されないまたは実質的に送達されないような方法で投与される。このために、本明細書で述べる作用物質および組成物を局所的に投与することができる。
【００６７】
１つの態様では、本発明は、本明細書で述べる治療方法において使用するための本明細書で述べる抗体を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べる治療方法において使用するために本明細書で述べる医薬組成物を提供する。
【００６８】
本発明の特定の実施形態では、抗体を投与される被験者は、化学療法剤、放射線または、サイトカインなどの、Ｆｃ受容体、例えばＦｃγ受容体の発現もしくは活性を調節する、例えば増強するもしくは阻害する作用物質で付加的に治療される。治療期間中に投与するための典型的なサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。典型的な治療薬は、中でも特に、ドキソルビシン、シスプラチン、タキソテール、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビンおよびシクロホスファミドなどの抗腫瘍薬を含む。
【００６９】
さらに別の態様では、本発明は、抗体を得るためにマウスなどの非ヒト動物をヒトＧＴ４６８またはそのペプチドフラグメントで免疫する免疫方法に関する。免疫のための好ましいペプチドは、配列番号：２〜１０および３５〜８２から成る群より選択されるものまたはそれらの誘導体である。したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：２〜１０および３５〜８２から成る群より選択されるペプチドまたはそれらの誘導体を使用した免疫によって得られるものである。同様に、ＧＴ４６８に対する抗体は、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物において作製できる。トランスジェニック非ヒト動物は、抗体の全部または一部をコードする重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスであり得る。
【００７０】
野生型ならびにトランスジェニック非ヒト動物は、ＧＴ４６８抗原ならびに／またはＧＴ４６８を発現する核酸および／もしくは細胞またはそのペプチドフラグメントの精製または冨化製剤で免疫することができる。好ましくは、非ヒト動物は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチを受けることにより、ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ）を産生することができる。アイソタイプスイッチは、例えば古典的または非古典的アイソタイプスイッチによって起こり得る。
【００７１】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、上述した非ヒト動物由来の単離されたＢ細胞を提供する。単離されたＢ細胞を、次に、不死化細胞への融合によって不死化して、本発明の抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供することができる。そのようなハイブリドーマ（すなわち本発明の抗体を産生する）も、本発明の範囲に包含される。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を使用して、患者から単離された生物学的試料においてＧＴ４６８またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を検出するおよび／またはその量を測定することを含む、腫瘍疾患の診断、検出または観測のための方法に関する。生物学的試料は、腫瘍疾患を有する、腫瘍疾患を有するもしくは腫瘍疾患に罹患することが疑われる、または腫瘍疾患の潜在的可能性を有する患者から単離され得る。
【００７３】
本発明による腫瘍疾患の診断、検出または観測のための方法の１つの実施形態では、生物学的試料および／または対照／標準試料は、腫瘍疾患による罹患に関して診断、検出または観測されることになる組織または器官に対応する組織または器官に由来する；例えば診断、検出または観測される腫瘍疾患は乳癌であり、生物学的試料および／または対照／標準試料は乳房組織である。そのような組織および器官を、例えば種々の腫瘍疾患および癌に関連して、本明細書で説明する。
【００７４】
腫瘍疾患の診断、検出または観測のための方法の１つの実施形態では、生物学的試料は、組織または器官が腫瘍を有さない場合はその細胞がＧＴ４６８を実質的に発現しないおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の実質的な結合を特徴としない組織または器官に由来する。好ましくは、前記組織は、胎盤組織または精巣組織以外の組織である。
【００７５】
典型的には、生物学的試料中の標的分子のレベルを標準レベルと比較し、前記標準レベルからの逸脱が被験者における腫瘍疾患の存在および／または病期を示す。標準レベルは、対照試料（例えば健常組織または健常被験者からの）において測定されたレベルまたは健常被験者からの平均レベルであり得る。前記標準レベルからの「逸脱」は、何らかの有意の変化、例えば少なくとも１０％、２０％または３０％、好ましくは少なくとも４０％または５０％、またはそれ以上の上昇または低下を表す。好ましくは、前記生物学的試料中のＧＴ４６８の存在またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の存在、または標準レベルと比較して高い、生物学的試料中のＧＴ４６８の量またはＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の量は、腫瘍疾患の存在を示す。
【００７６】
典型的には、本発明の方法における検出および／または量の測定は、標的分子に特異的に結合する標識抗体の使用を含む。
【００７７】
特定の態様では、本発明は、検出可能な標識に連結された本発明の抗体を患者に投与することを含む、腫瘍疾患の検出、すなわち腫瘍疾患の位置または部位、例えば特定の組織または器官の決定のための方法に関する。前記患者における組織または器官の標識化は、前記組織または器官における腫瘍疾患の存在または危険性を指示し得る。
【００７８】
本明細書で例示されるように、本発明の抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接入手できるか、またはクローニングして、宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはリンパ球細胞）において組換え発現させることができる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物および酵母などの真菌である。あるいは、本発明の抗体は、トランスジェニック非ヒト動物または植物において組換え生産することができる。しかし、本発明もまた、本明細書で開示される免疫方法を用いた免疫またはワクチン接種により、抗体が患者においてインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で生成される実施形態も考慮する。
【００７９】
本発明の抗体を作製するための好ましいハイブリドーマ細胞は、以下の名称とアクセッション番号を有する、ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されたものである：
１．２００７年３月１３日に寄託された、４Ｅ９−１Ｈ９、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２
２．２００７年３月１３日に寄託された、９Ｂ６−２Ａ９、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６
３．２００７年３月１３日に寄託された、５９Ｄ６−２Ｆ２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４
４．２００７年３月１３日に寄託された、６１Ｃ１１−２Ｂ５、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５
５．２００７年３月１３日に寄託された、７８Ｈ１１−１Ｈ６、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３
６．２００８年３月１１日に寄託された、２２−１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５
７．２００８年３月１１日に寄託された、２２−２Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３
８．２００８年３月１１日に寄託された、２２−９Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６
９．２００８年３月１１日に寄託された、２３−３３Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７
１０．２００８年３月１１日に寄託された、２３−１９Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１
１１．２００８年３月１１日に寄託された、Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４
１２．２００８年３月１１日に寄託された、４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２
１３．２００８年３月１１日に寄託された、４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８
１４．２００８年９月１日に寄託された、４２Ｈ１１  １Ｃ１１  ２Ｂ２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６１
１５．２００８年９月１日に寄託された、５１Ｇ６  ２Ｈ３  ２Ｂ４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６２
１６．２００８年９月１日に寄託された、１６−５Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４３
１７．２００８年９月１日に寄託された、２０−１１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５６
１８．２００８年９月１日に寄託された、２９−１Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４７
１９．２００８年９月２日に寄託された、２９−８Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６４
２０．２００８年９月１日に寄託された、３５−４８Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５９
２１．２００８年９月１日に寄託された、３５−５０Ａ−２ａ、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６３
２２．２００８年９月１日に寄託された、３８−１０Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５７
２３．２００８年９月１日に寄託された、３８−１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５８
２４．２００８年９月１日に寄託された、４４−３Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４８
２５．２００８年９月１日に寄託された、４５−２Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４９
２６．２００８年９月１日に寄託された、４５−８Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５０
２７．２００８年９月１日に寄託された、４８−３Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５１
２８．２００８年９月１日に寄託された、４８−４Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５２
２９．２００８年９月１日に寄託された、４９−３Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４６
３０．２００８年９月１日に寄託された、４９−８Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４５
３１．２００８年９月１日に寄託された、５１−１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９４４
３２．２００８年９月１日に寄託された、５３−１３Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５３
３３．２００８年９月１日に寄託された、５３−２９Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５５
３４．２００８年９月１日に寄託された、５４−４Ｂ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６０
３５．２００８年９月１日に寄託された、５６−４Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５４
３６．２００９年７月１６日に寄託された、６２−９Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３００１
３７．２０１０年２月１８日に寄託された、４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３９
３８．２０１０年２月１８日に寄託された、７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３７
３９．２０１０年２月１８日に寄託された、１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３６
４０．２０１０年２月１８日に寄託された、１８−２Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３８
４１．２０１０年２月１８日に寄託された、６３−１Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４０
４２．２０１０年３月３日に寄託された、３Ｅ５  ２Ｇ４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０４２。
【００８０】
本発明の好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生されるおよび上述したハイブリドーマから得られるものならびにそのキメラ化およびヒト化形態である。本発明のさらなる好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生されるおよび上述したハイブリドーマから得られる抗体の特異性を有するものならびに、特に、上述したハイブリドーマによって産生されるおよび上述したハイブリドーマから得られる抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含むものである。
【００８１】
好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１７もしくは２４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントのようなヒト重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を含む抗体を包含する。さらなる好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１８もしくは２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントのようなヒト軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体を包含する。特に好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１７もしくは２４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントのようなヒトＣＨに由来するアミノ酸配列を有するＣＨを含み、且つ配列番号：１８もしくは２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントのようなヒトＣＬに由来するアミノ酸配列を有するＣＬを含む抗体を包含する。
【００８２】
配列番号：１７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号：２０によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号：２４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号：２３によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号：１８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号：１９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号：２２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号：２１によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。
【００８３】
上記で使用される「フラグメント」または「アミノ酸配列のフラグメント」は、抗体配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮された抗体配列であり、抗体において前記抗体配列に置き換わった場合、ＧＴ４６８への前記抗体の結合および好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性溶解またはＡＤＣＣ媒介性溶解の機能を保持する配列に関する。好ましくは、アミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。本明細書で述べるアミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列をコードする核酸配列のそれぞれのフラグメントによってコードされ得る。
【００８４】
本発明はまた、本明細書で述べる抗体またはその部分、例えば抗体鎖をコードする遺伝子または核酸配列を含む核酸に関する。核酸は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは、例えば遺伝子工学において通常使用される、他のベクター内に含まれ得る。ベクターは、適切な宿主細胞中および適切な条件下でのベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含み得る。さらに、ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の適切な発現を可能にする発現制御エレメントを含み得る。そのような制御エレメントは当業者に公知であり、プロモータ、スプライスカセットおよび翻訳開始コドンを含み得る。
【００８５】
好ましくは、本発明の核酸は、真核細胞または原核細胞における発現を可能にする上記発現制御配列に作動可能に連結される。真核細胞または原核細胞における発現を確実にする制御エレメントは当業者に周知である。
【００８６】
本発明による核酸分子の構築のため、上記核酸分子を含むベクターの構築のため、適切に選択された宿主細胞へのベクターの導入のため、発現を生じさせるまたは達成するための方法は、当分野において周知である。
【００８７】
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００８８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ａ）正常組織、原発性乳癌試料および癌細胞株（１、ＭＣＦ−７；２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ；３、ＢＴ−５４９；４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；５、ＳＮＵ−１６；６、ＬＣＬＣ−１０３Ｈ；７、ＫＹＳＥ−５１０；８、ＫＹＳＥ−３０；９、ＥＦＯ−２７；１０、ＴＯＶ−２１Ｇ；１１、ＴＯＶ−１１２Ｄ；１２、ＣＡＯＶ−３；１３、ＥＦＯ−２１；１４、ＦＵ−ＯＶ−１；１５、ＬＮＣＡＰ；１６、ＣＡＰＡＮ−２）におけるエンドポイント３５サイクルＲＴ−ＰＣＲ。
【図１Ｂ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ｂ）正常組織（１、精巣；２、胎盤；３、脳；４、肺；５、乳房；６、結腸；７、肝臓；８、胃；９、腎臓；１０、前立腺；１１、膵臓；１２、卵巣；１３、脾臓；１４、皮膚；１５、心筋；１６、子宮内膜；１７、静止ＰＢＭＣ；１８、増殖ＰＢＭＣ；１９、副腎）、原発性乳癌標本および（Ｃ）癌細胞株における定量的４０サイクルリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
【図１Ｃ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ｂ）正常組織（１、精巣；２、胎盤；３、脳；４、肺；５、乳房；６、結腸；７、肝臓；８、胃；９、腎臓；１０、前立腺；１１、膵臓；１２、卵巣；１３、脾臓；１４、皮膚；１５、心筋；１６、子宮内膜；１７、静止ＰＢＭＣ；１８、増殖ＰＢＭＣ；１９、副腎）、原発性乳癌標本および（Ｃ）癌細胞株における定量的４０サイクルリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
【図１Ｄ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ｄ）ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９乳癌細胞におけるｓｉＲＮＡを介したＧＴ４６８サイレンシングの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図１Ｅ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ｅ）ｓｉＲＮＡを介したＧＴ４６８タンパク質発現の低下のウエスタンブロット分析。対照細胞は、未処理であるかまたはスクランブル非サイレンシング二本鎖（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。
【図１Ｆ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ｆ）正常および腫瘍ヒト組織におけるＧＴ４６８タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。
【図１Ｇ】ＧＴ４６８は、癌細胞で異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ｇ）ＧＴ４６８特異的抗体を使用した正常ヒト乳房組織（左）および乳癌（右）に由来する切片の免疫組織化学。
【図２Ａ】ＧＴ４６８は細胞表面結合タンパク質である。ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１）または非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）でのトランスフェクション後の抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体による（Ａ）メタノール固定および（Ｂ）非固定ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９乳癌細胞の染色。
【図２Ｂ】ＧＴ４６８は細胞表面結合タンパク質である。ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１）または非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）でのトランスフェクション後の抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体による（Ａ）メタノール固定および（Ｂ）非固定ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９乳癌細胞の染色。
【図３Ａ】ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の運動性、移動および浸潤を促進する。（Ａ）上部ならびに下部チャンバーに添加した５％ＦＣＳによるトランスウエル移動アッセイにおける化学運動性（運動性）分析を１２時間後に実施した。
【図３Ｂ】ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の運動性、移動および浸潤を促進する。（Ｂ）勾配を得るために５％ＦＣＳを下部チャンバーだけに添加してから１２時間後のトランスウエル移動アッセイにおけるＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９細胞の走化性分析。
【図３Ｃ】ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の運動性、移動および浸潤を促進する。（Ｃ）５％ＦＣＳを化学誘引物質として下部チャンバーに添加した２４時間後のＭａｔｒｉｇｅｌへの走化性浸潤の分析。
【図４Ａ】ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の増殖を促進する。（Ａ）ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖によってノックダウンを開始させてから７２時間後のＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９細胞における増殖の分析。
【図４Ｂ】ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の増殖を促進する。（Ｂ）種々の細胞周期状態の細胞画分の棒グラフとして示す、ＧＴ４６８サイレンシングの開始から７２時間後の細胞の細胞周期分析。
【図４Ｃ】ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の増殖を促進する。（Ｃ）ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後にアネキシンＶ染色によって測定した細胞のアポトーシス。アネキシンＶ染色に対する陽性対照として、細胞を６μＭカンプトテシンで１２時間処理した。
【図５】ＧＴ４６８は機能拮抗性抗体による標的となり得る。種々の量の抗ＧＴ４６８抗体および対照抗体（アイソタイプ対照）と共に４８時間インキュベートした後のＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９細胞の増殖分析。
【図６Ａ】サイクリンＤ１およびＡＫＴキナーゼはＧＴ４６８機能に関与する。細胞をＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖で７２時間処理した後のサイクリンＤ１の（Ａ）定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図６Ｂ】サイクリンＤ１およびＡＫＴキナーゼはＧＴ４６８機能に関与する。細胞をＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖で７２時間処理した後のサイクリンＤ１の（Ｂ）ウエスタンブロット分析。
【図６Ｃ】サイクリンＤ１およびＡＫＴキナーゼはＧＴ４６８機能に関与する。（Ｃ）ＧＴ４６８ノックダウンの７２時間後のウエスタンブロット分析。
【図６Ｄ】サイクリンＤ１およびＡＫＴキナーゼはＧＴ４６８機能に関与する。細胞をＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖で７２時間処理した後のサイクリンＤ１の（Ｄ）抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体での処理の１時間後のＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化のウエスタンブロット分析。
【図７】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清は、免疫のために使用したペプチドとのみ反応性である。
【図８】ＧＴ４６８に対して惹起した抗体を含有するハイブリドーマ上清による、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰ構築物でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の染色。ハイブリドーマ上清はＧＴ４６８−ｅＧＦＰを発現する細胞を特異的に染色する。
【図９】ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。ハイブリドーマ上清と共に７２時間インキュベートした後の種々の癌細胞株の増殖分析。
【図１０Ａ】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するための（Ａ）粗溶解物（ＣｒＥＬＩＳＡ）または（Ｂ）ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８溶解物（Ａ）または免疫のために使用したそれぞれのペプチド（Ｂ）とのみ反応性である。
【図１０Ｂ】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するための（Ａ）粗溶解物（ＣｒＥＬＩＳＡ）または（Ｂ）ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８溶解物（Ａ）または免疫のために使用したそれぞれのペプチド（Ｂ）とのみ反応性である。
【図１１】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのフローサイトメトリ分析。すべてのハイブリドーマ上清はＧＴ４６８トランスフェクト細胞の特異的染色を示したが、モックトランスフェクト細胞では染色を認めなかった。
【図１２】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。すべてのハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物と特異的反応性を示したが、モックトランスフェクト細胞の溶解物はシグナルを示さなかった。モック溶解物中のハイブリドーマ上清２３−３３Ａ−１のかすかなシグナルは、ＨＥＫ  ＧＴ４６８溶解物のスピルオーバーによるものである。
【図１３】ＧＴ４６８タンパク質における抗体結合エピトープを同定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清２２−１Ａ−１、２３−３３Ａ−１および２３−１９Ａ−１は各々、ＧＴ４６８の線状エピトープに対する反応性を示唆する２つのオーバーラップペプチドへの結合を示した。２２−２Ａ−１および２２−９Ｂ−１の結合パターンは、ＧＴ４６８タンパク質の配座エピトープ（不連続エピトープ）に対する反応性を示唆する。
【図１４】ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間または１２０時間インキュベートした後の種々の癌細胞株の増殖分析。
【図１５】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのフローサイトメトリ分析。ハイブリドーマ上清はＧＴ４６８ａａ１１６〜２１２でトランスフェクトした細胞の特異的染色を示したが、モックトランスフェクト細胞では染色を認めなかった。
【図１６Ａ】ＧＴ４６８を内因性に発現する非固定腫瘍細胞（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞）へのモノクローナル抗体の特異的結合を測定するためのフローサイトメトリ分析。ＧＴ４６８を発現しないＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞を陰性対照として使用した。抗体は、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞に結合することができる。
【図１６Ｂ】ＧＴ４６８を内因性に発現する非固定腫瘍細胞（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞）へのモノクローナル抗体の特異的結合を測定するためのフローサイトメトリ分析。ＧＴ４６８を発現しないＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞を陰性対照として使用した。抗体は、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞に結合することができる。
【図１７】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。すべてのハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物と特異的反応性を示したが、モックトランスフェクト細胞の溶解物はシグナルを示さなかった。
【図１８】ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間インキュベートした後の種々の癌細胞株の増殖分析。
【図１９】ＧＴ４６８を内因性に発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞のコロニー形成への、ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体の阻害活性を分析するためのクローン原性アッセイ。細胞を抗体と共にインキュベートすることによりコロニー形成が低減または阻害された。
【図２０Ａ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した、正常組織におけるＧＴ４６８発現の定量。３名の個人からの組織を各々の正常組織型に関して試験した。微量のＧＴ４６８転写産物だけが４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ後に正常組織において検出できた。発現カットオフ値（点線、すべての正常組織の平均発現＋３ＳＴＤ（９９％パーセンタイル値））を超える正常組織は胎盤と精巣だけであった。誤差バー、ＳＴＤ。乳癌（図１参照）に加えて、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌および頭頸部癌からの試料においてＧＴ４６８の高発現が認められた。
【図２０Ｂ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した、正常組織におけるＧＴ４６８発現の定量。３名の個人からの組織を各々の正常組織型に関して試験した。微量のＧＴ４６８転写産物だけが４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ後に正常組織において検出できた。発現カットオフ値（点線、すべての正常組織の平均発現＋３ＳＴＤ（９９％パーセンタイル値））を超える正常組織は胎盤と精巣だけであった。誤差バー、ＳＴＤ。乳癌（図１参照）に加えて、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌および頭頸部癌からの試料においてＧＴ４６８の高発現が認められた。
【図２１】癌細胞株におけるＧＴ４６８発現のウエスタンブロット分析。ＧＴ４６８の発現は、ＧＴ４６８発現プラスミド（陽性対照）、ＳＫ−ＢＲ−３（乳癌）、ＢＥＷＯ（胎盤性絨毛癌）、ＪＡＲ（胎盤性絨毛癌）、ＨＣＴ−１５（結腸癌）、ＬｎＣａＰ（前立腺癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＪＥＧ−３（胎盤性絨毛癌）、ＪＩＭＴ−１（乳癌）、ＬＡ１−５５ｎ（神経芽細胞腫）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＢＴ−２０（乳癌）およびＮＣＩ−Ｈ９２９（骨髄腫）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において検出された。ＭｅｌＨＯ（悪性黒色腫）およびＮＵＧＣ４（胃癌）は試験陰性であった。
【図２２】ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間インキュベートした後のＧＴ４６８陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞およびＧＴ４６８陰性ＮＵＧＣ４胃癌細胞の増殖分析。
【図２３】ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物と特異的反応性を示したが、モックトランスフェクト細胞の溶解物はシグナルを示さなかった。
【図２４】抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体での処置は、ヌードマウスにおけるＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌異種移植腫瘍の増殖を減弱させる。ＢＥＷＯ細胞の皮下注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回、２週間にわたって処置した。
【図２５】ＧＴ４６８タンパク質における抗体結合エピトープを同定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清２９−８Ｂ−１、３５−４８Ｂ−１、４４−３Ａ−２、４９−３Ａ−１、４９−８Ａ−１、５１−１Ａ−１、５３−１３Ａ−２、６２−９Ｂ１、３Ｅ５  ２Ｇ４、４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７、７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４、１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４、１８−２Ａ−１および６３−１Ａ２は各々、ＧＴ４６８の線状エピトープに対する反応性を示唆する１またはそれ以上のオーバーラップペプチドへの結合を示した。２９−１Ａ−２および５４−４Ｂ−２の結合パターンは、ＧＴ４６８タンパク質の配座エピトープ（不連続エピトープ）に対する反応性を示唆する。
【図２６Ａ】抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体での処置は、実験的転移アッセイにおいてＭＣＡＦ−７乳癌細胞の転移拡大を有意に低減する。１×１０６のＭＣＦ−７細胞の静脈内注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回処置した。動物の肺における転移腫瘍量を、接種の５週間後にヒトマイクロサテライトＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを使用した定量的ＰＣＲによって測定した。
【図２６Ｂ】抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体での処置は、実験的転移アッセイにおいてＭＣＡＦ−７乳癌細胞の転移拡大を有意に低減する。１×１０６のＭＣＦ−７細胞の静脈内注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回処置した。動物の肺における転移腫瘍量を、接種の５週間後にヒトマイクロサテライトＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを使用した定量的ＰＣＲによって測定した。
【図２７】ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。指示されているように精製モノクローナル抗体と共に７２時間インキュベートした後のＧＴ４６８陽性ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖分析。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
用語の定義
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。付加的な定義は詳細な説明全体にわたって示す。
【００９１】
「ＧＴ４６８」という用語は、好ましくはヒトＧＴ４６８、特に（ｉ）配列番号：１の核酸配列を含む核酸のような、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸または（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質に関し、そして前記配列のあらゆる変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、立体配座変異体、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを包含する。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常配列の変化に関するものであり、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、しばしば所与の遺伝子についての数多くの対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列が起源とするものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。「ＧＴ４６８」という用語は、（ｉ）ＧＴ４６８スプライス変異体、（ｉｉ）特にＮグリコシル化状態のような異なるグリコシル化を有する変異体を含む、ＧＴ４６８の翻訳後修飾変異体、（ｉｉｉ）ＧＴ４６８立体配座変異体、（ｉｖ）ＧＴ４６８癌関連およびＧＴ４６８非癌関連変異体を包含する。
【００９２】
１つの実施形態では、「ＧＴ４６８」という用語は、細胞外ドメインまたはエクトドメインに対応するＧＴ４６８の部分に関し、好ましくはＮ末端疎水性ドメインを含まないＧＴ４６８のアミノ酸配列に関する。「ＧＴ４６８」という用語は、配列番号：２のアミノ酸２９〜１１９、好ましくはアミノ酸２９〜２１２、より好ましくはアミノ酸２３〜２１２または配列番号：２の変異体の対応するアミノ酸を含むタンパク質を包含する。
【００９３】
本発明によれば、ＧＴ４６８についての「細胞外ドメイン」または「エクトドメイン」という用語は、ＧＴ４６８を発現する細胞の表面と結合して認められるＧＴ４６８の部分に関する。好ましくは、前記「細胞外ドメイン」または「エクトドメイン」は細胞外区画に存在する。ＧＴ４６８の「細胞外ドメイン」または「エクトドメイン」は、好ましくはＮ末端疎水性ドメインを欠く完全長ＧＴ４６８の部分を指す。本発明によれば、ＧＴ４６８についての「疎水性ドメイン」という用語は、細胞外ドメインの一部ではなく、好ましくはＧＴ４６８のＮ末端近傍に位置する疎水性配列を含むＧＴ４６８の部分に関する。ＧＴ４６８の「疎水性ドメイン」は、ＧＴ４６８の疎水性配列に先行し、Ｎ末端に位置する配列を含み得る。配列番号：２に関して、Ｎ末端疎水性ドメインは、好ましくはアミノ酸１〜２２を含む。本発明のＧＴ４６８ポリペプチドに関して同定されるいかなる疎水性ドメインまたは配列も、疎水性ドメインまたは配列を同定するために当分野で通常使用される基準に従って同定されることが了解される。疎水性ドメインの正確な境界は異なり得るが、おそらく本明細書で最初に同定されたドメインのいずれかの末端の約５アミノ酸以下が異なると考えられる。場合により、それゆえ、ＧＴ４６８ポリペプチドの細胞外ドメインは、本明細書で同定される疎水性ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれかの側に約５またはそれ以下のアミノ酸を含み得る。
【００９４】
「細胞表面」は、当分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合のためにアクセス可能な細胞の外側を含む。
【００９５】
「細胞の表面上で発現されるＧＴ４６８」という表現は、細胞によって発現されるＧＴ４６８が前記細胞の表面と結合して認められることを意味する。
【００９６】
ＧＴ４６８は、細胞の表面に位置し、細胞に添加されたＧＴ４６８特異的抗体による結合のためにアクセス可能である場合、前記細胞の表面と結合している。好ましい実施形態では、その細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、ＧＴ４６８を発現する細胞である。ＧＴ４６８が細胞によって発現される場合、前記細胞の表面と結合したＧＴ４６８は、発現されるＧＴ４６８の一部だけ、特に上記で定義したその細胞ドメインだけであってもよいことが了解されるべきである。
【００９７】
本発明によれば、発現および／または結合のレベルが胎盤細胞または胎盤組織における発現および／または結合と比較してより低い場合、ＧＴ４６８は細胞において実質的に発現されないおよび／または細胞表面と実質的に結合していない。好ましくは、発現および／または結合のレベルは、胎盤細胞または胎盤組織における発現および／または結合の１０％未満、好ましくは５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％または０．０５％未満であるかまたはさらにより低い。好ましくは、発現および／または結合のレベルが、脳、肺、乳房、結腸、肝臓、胃、腎臓、前立腺、膵臓、卵巣、脾臓、皮膚、心筋および子宮内膜の１またはそれ以上の非腫瘍形成性、非癌性組織における発現および／または結合のレベルを２倍程度、好ましくは１．５倍程度しか上回らず、好ましくは前記非腫瘍形成性、非癌性組織における発現および／または結合のレベルを超えない場合、ＧＴ４６８は細胞において実質的に発現されないおよび／または細胞表面と実質的に結合していない。好ましくは、発現もしくは結合のレベルが検出限界より下である場合および／または発現もしくは結合のレベルが細胞に添加されたＧＴ４６８特異的抗体による結合を可能にするには低すぎる場合、ＧＴ４６８は細胞において実質的に発現されないおよび／または細胞表面と実質的に結合していない。
【００９８】
本発明によれば、発現および／または結合のレベルが、脳、肺、乳房、結腸、肝臓、胃、腎臓、前立腺、膵臓、卵巣、脾臓、皮膚、心筋および子宮内膜の１またはそれ以上の非腫瘍形成性、非癌性組織における発現および／または結合のレベルを好ましくは２倍以上、好ましくは１０倍、１００倍、１０００倍または１００００倍上回る場合、ＧＴ４６８は細胞において発現されるおよび／または細胞表面と結合している。好ましくは、発現もしくは結合のレベルが検出限界より上である場合および／または発現もしくは結合のレベルが細胞に添加されたＧＴ４６８特異的抗体による結合を可能にするのに十分なだけ高い場合、ＧＴ４６８は細胞において発現されるおよび／または細胞表面と結合している。好ましくは、細胞において発現されるＧＴ４６８は、前記細胞の表面上で発現されるまたは表面上に露出されている。
【００９９】
「ラフト」という用語は、細胞の形質膜の外葉領域に位置するスフィンゴ脂質とコレステロールに富む膜マイクロドメインを指す。そのようなドメイン内で結合する特定のタンパク質の能力および「凝集体」または「巣状凝集体」を形成するそれらの能力は、タンパク質の機能を生じさせることができる。例えば、そのような構造体内へのＧＴ４６８分子の移行により、本発明の抗体が結合した後、形質膜において高密度のＧＴ４６８抗原−抗体複合体が形成される。そのような高密度のＧＴ４６８抗原−抗体複合体は、ＣＤＣの間の補体系の効率的な活性化を可能にし得る。
【０１００】
本発明によれば、「疾患」という用語は、癌、特に本明細書で述べる癌の形態を含む、何らかの病的状態を指す。
【０１０１】
「ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に関連する疾患」は、本発明によれば、疾患組織または器官の細胞における発現および／または結合が、好ましくは健常組織または器官での状態と比較して増大していることを意味する。増大は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上の増大を指す。１つの実施形態では、発現および／または細胞表面との結合は疾患組織においてのみ認められ、一方健常組織での発現は抑制されている。本発明によれば、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に関連する疾患は、癌疾患などの腫瘍疾患を含む。さらに、本発明によれば、癌疾患などの腫瘍疾患は、好ましくは、腫瘍細胞または癌細胞がＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とするものである。
【０１０２】
本明細書で使用される、「腫瘍疾患」、「腫瘍関連疾患」または「腫瘍形成性疾患」は、腫瘍および／または腫瘍転移の生成または生成する傾向をもたらし得る、異常に調節された細胞成長、増殖、分化、接着および／または移動によって特徴づけられる疾患を包含する。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな増殖を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。
【０１０３】
「腫瘍」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな増殖を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける細胞または組織の異常な群を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は、良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る、明確な組織塊を形成する。
【０１０４】
好ましくは、本発明による「腫瘍疾患」、「腫瘍関連疾患」または「腫瘍形成性疾患」は、癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、「腫瘍疾患」、「腫瘍関連疾患」または「腫瘍形成性疾患」は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞によって特徴づけられ、腫瘍細胞は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする。
【０１０５】
ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、好ましくは腫瘍細胞または癌細胞であり、好ましくは本明細書で述べる腫瘍および癌の腫瘍細胞または癌細胞である。好ましくは、そのような細胞は、胎盤細胞および／または精巣細胞以外の細胞である。
【０１０６】
本発明による好ましい癌疾患または癌は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される。１つの実施形態では、癌疾患は、肺の転移性癌から成る群より選択される。
【０１０７】
本発明によれば、「癌腫」は、器官の内層（上皮細胞）から発症する癌である。
【０１０８】
絨毛癌は、通常は胎盤の、悪性で栄養膜性および高侵襲性の癌である。絨毛癌は肺への早期血行性転移を特徴とする。
【０１０９】
肉腫は、中胚葉の増殖を生じさせる結合組織（骨、軟骨、脂肪）の癌である。これは、上皮起源である癌腫と大きく異なる。
【０１１０】
腎細胞癌または腎細胞腺癌としても知られる腎細胞癌腫は、血液をろ過して老廃物を除去する腎臓内の非常に小さな管である、近位曲尿細管の内層で発生する腎癌である。腎細胞癌腫は、成人における群を抜いて最も一般的なタイプの腎癌であり、すべての尿生殖器腫瘍の中で最も致死的である。腎細胞癌腫の異なるサブタイプは、明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌である。明細胞腎細胞癌は最も一般的な形態の腎細胞癌腫である。顕微鏡下で見た場合、明細胞腎細胞癌を構成する細胞は、非常に色が薄いまたは透明に見える。乳頭状腎細胞癌は２番目に頻度の高いサブタイプである。これらの癌は、腫瘍の、大部分ではないにせよ一部においては、小指様の突起（乳頭と呼ばれる）を形成する。
【０１１１】
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別の部分への癌細胞の拡がりを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および脈管に入るための内皮基底膜の貫入、および次に、血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発性腫瘍の除去後にも起こり、これは、腫瘍細胞または成分が残存し、転移潜在能を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
【０１１２】
続発性または転移性腫瘍の細胞はもとの腫瘍におけるものに類似する。これは、例えば、卵巣癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は異常な肝細胞ではなく異常な卵巣細胞で構成されることを意味する。肝臓における腫瘍は、その場合、肝癌ではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
【０１１３】
１つの実施形態では、本発明による癌は、転移性乳癌、好ましくは肺の転移性乳癌である。
【０１１４】
「疾患の治療」という用語は、疾患またはその症状を治癒する、期間を短縮する、改善する、予防する、進行もしくは悪化を遅らせるもしくは阻止する、または発症を予防するもしくは遅延させることを包含する。
【０１１５】
「患者」という用語は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長動物または別の動物、特に哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはマウスおよびラットなどのげっ歯動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【０１１６】
本発明によれば、試料は、本発明に従って有用な任意の試料、特に体液を含む組織試料および／または細胞試料のような生物学的試料であり得、パンチ生検を含む組織生検のような従来の方法で、および血液、気管支吸引液、痰、尿、便または他の体液を採取することによって入手し得る。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の画分を包含する。
【０１１７】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。「抗体」という用語はまた、すべての組換え形態の抗体、特に本明細書で述べる抗体、例えば原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体ならびに本明細書で述べる任意の抗原結合抗体フラグメントおよび誘導体を包含する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域から成る。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域から成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分できる。各々のＶＨとＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【０１１８】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子であって、分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインを含み得るかまたは可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）だけを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得るかまたは１もしくはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾され得る、例えばより厳密にヒト免疫グロブリンに類似するように修飾され得る。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えばマウス抗体からの６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。また別の形態は、もとの抗体に比べて変化した１またはそれ以上のＣＤＲを有する。
【０１１９】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の各々の一部が、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体内の対応する配列と相同であり、鎖の残りのセグメントは別の抗体内の対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点としては、可変領域が、例えばヒト細胞試料に由来する定常領域と組み合わせて、容易に入手可能なＢ細胞または非ヒト宿主生物からのハイブリドーマを使用して現在公知のソースから好都合に誘導できることである。可変領域は調製の容易さという利点を有し、特異性がソースに影響されないが、一方定常領域はヒトであるので、抗体を注射したとき非ヒトソースからの定常領域の場合よりもヒト被験者から免疫応答を惹起する可能性が低い。しかし、前記定義はこの特定例に限定されない。
【０１２０】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「結合部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインから成る一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結されていてもよい２またはそれ以上の単離ＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号にさらに開示されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは無傷抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【０１２１】
「エピトープ」という用語は、抗体に結合することができるタンパク質決定基を意味し、本明細書では「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。エピトープは、通常はアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群から成り、一般に特異的な三次元構造特徴ならびに特異的な電荷特徴を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われるが後者への結合は失われないという点で識別される。
【０１２２】
本明細書で使用される「不連続エピトープ」という用語は、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの別々の領域から形成されるタンパク質抗原上の立体配座エピトープを意味する。
【０１２３】
「二重特異性分子」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する任意の物質、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことが意図されている。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し得るまたはそれらと相互作用し得る。「多重特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」という用語は、３以上の異なる結合特異性を有する任意の物質、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことが意図されている。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合し得るまたはそれらと相互作用し得る。したがって、本発明は、ＧＴ４６８に対する、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体などの他の標的に対する、二重特異性、三重特異性、四重特異性および他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」という用語はまた、ダイアボディを包含する。ダイアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創製する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【０１２４】
本発明はまた、本発明において「抗体」という用語に包含される、本明細書で述べる抗体の誘導体を含む。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の物質または別の抗体の複合体を指す。本明細書で使用される場合、抗体が動物を免疫することによってまたは免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることによってある系から得られ、選択された抗体が、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、その抗体は特定の生殖細胞系配列に「由来」する。典型的には、特定生殖細胞系配列に由来する抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸の相違、より好ましくは５個以下、またはさらに一層好ましくは４、３、２または１個以下のアミノ酸の相違を示す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ抗体」という用語は、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を有する、共に連結された２またはそれ以上の抗体、それらの誘導体または抗原結合領域を指す。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、および標的細胞、例えば腫瘍細胞上の抗原またはエピトープに対する結合特異性を含む。
【０１２６】
本明細書で述べる抗体はヒト抗体であり得る。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。
【０１２７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体は、特定エピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、非ヒト動物、例えばマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１２８】
本明細書で使用される、「組換え抗体」という用語は、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって作製された、発現された、創製されたまたは単離された抗体などの、組換え手段によって作製される、発現される、創製されるまたは単離されるすべての抗体を包含する。
【０１２９】
本明細書で使用される、「トランスフェクトーマ」という用語は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌などの、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を包含する。
【０１３０】
本明細書で使用される、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物に関連して定義される。この用語は、トランスジェニック生物で構成されない生物において認められるものに対応する、および一般にトランスジェニック生物以外の種に由来するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指す。
【０１３１】
本明細書で使用される、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
【０１３２】
本明細書で述べる抗体は、好ましくは単離されている。本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図されている（例えば、ＧＴ４６８に特異的に結合する単離された抗体は、ＧＴ４６８以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ヒトＧＴ４６８のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、しかし、他の関連抗原、例えば他の種からの関連抗原（例えばＧＴ４６８種ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、実質的に他の細胞物質および／または化学物質不含であり得る。本発明の１つの実施形態では、「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、十分に定義された組成で組み合わされた抗体に関する。
【０１３３】
本発明による「結合」という用語は、好ましくは「特異的結合」に関する。「特異的結合」は、抗体などの物質が、それが特異的である抗原またはエピトープなどの（あらかじめ定められた）標的に対し、別の標的への結合に比べてより強く結合することを意味する。ある物質が第一標的に対して、第二標的についての解離定数（ＫＤ）よりも低い解離定数で結合する場合、その物質は第二標的に比べて第一標的により強く結合する。好ましくは、物質が特異的に結合する標的についての解離定数（ＫＤ）は、その物質が特異的に結合しない標的についての解離定数（ＫＤ）よりも１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに一層好ましくは１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍以上低い。典型的には、抗体は、約１×１０−７Ｍまたはそれ以下のＫＤに相当する親和性で結合し、あらかじめ定められた抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性より少なくとも２桁低いＫＤに相当する親和性で所定の抗原に結合する。
【０１３４】
本明細書で使用される、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図されている。
【０１３５】
本明細書で使用される、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【０１３６】
本明細書で使用される、「アイソタイプスイッチ」は、それによって抗体のクラスまたはアイソタイプがある１つのＩｇクラスからその他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
【０１３７】
１つの対象に適用される場合の、本明細書で使用される「天然に生じる」という用語は、対象が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、自然界で供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
【０１３８】
本明細書で使用される「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ基本的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードする立体配座においてＤ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して位置する、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子の遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定できる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組換え七量体／九量体相同性エレメントを有する。
【０１３９】
Ｖセグメントに関して本明細書で使用される「再編成されていない」または「生殖細胞系立体配置」という用語は、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントに直接隣接するように組み換えられていない立体配置を指す。
【０１４０】
本明細書で使用される、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図されている。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１４１】
本発明に従って述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、インビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動分画によって、精製された、または（ｖｉ）例えば化学合成によって、合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作のために利用可能な核酸である。
【０１４２】
核酸は、本発明によれば、単独でまたは同種もしくは異種であり得る他の核酸と組み合わせて存在し得る。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に関して同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結されており、「同種」という用語は、核酸が天然の状態でも発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「異種」という用語は、核酸が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
【０１４３】
ＲＮＡおよび／またはタンパク質もしくはペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列は、それらが、前記核酸の発現または転写が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が、次に、コード配列に機能的に連結された発現制御配列により機能的タンパク質へと翻訳される場合、前記発現制御配列の誘導は、コード配列内のフレームシフトを引き起こさずにまたは前記コード配列が所望タンパク質もしくはペプチドへと翻訳されることができない事態を伴わずに、前記核酸の転写を生じさせる。
【０１４４】
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモータ、リボソーム結合部位、エンハンサーおよび遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節され得る。発現制御配列の正確な構造は種または細胞型に応じて異なり得るが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。より詳細には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモータ配列を含有するプロモータ領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列を含み得る。
【０１４５】
本発明によれば、「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、発現される核酸配列に対して上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識および結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモータ領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識および結合部位を含み得る。プロモータは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモータは「誘導的」であり得、誘導物質に応答して転写を開始させ得るか、または転写が誘導物質によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導的プロモータの制御下にある遺伝子は、誘導物質が存在しない場合は発現されないかまたはわずかだけ発現される。誘導物質の存在下では、遺伝子のスイッチが入って作動するかまたは転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
【０１４６】
本発明による好ましいプロモータは、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼについてのプロモータ、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータ、ＣＭＶプロモータ、およびある部分または複数の部分が、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のような他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモータのある部分または複数の部分に融合しており、付加的なイントロンを含むかまたは含まない、それらの人工ハイブリッドプロモータ（例えばＣＭＶ）を包含する。
【０１４７】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの生産またはＲＮＡとタンパク質／ペプチドの生産を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定に行われ得る。
【０１４８】
好ましい実施形態では、核酸分子は、本発明によれば、適切な場合は核酸の発現を制御するプロモータと共に、ベクター内に存在する。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、核酸が、例えば原核細胞および／または真核細胞に導入され、適切な場合はゲノム内に組み込まれることを可能にする、前記核酸のための任意の中間媒体を含む。この種のベクターは、好ましくは細胞において複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１４９】
抗体の発現のためのベクターとして、抗体重鎖と軽鎖が異なるベクター内に存在するベクター型または重鎖と軽鎖が同じベクター内に存在するベクター型のいずれかが使用できる。
【０１５０】
特定核酸配列およびアミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して本明細書で与える教示は、前記特定配列と機能的に等価の配列、例えば特定アミノ酸配列の性質と同じまたは類似の性質を示すアミノ酸配列および特定核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の性質と同じまたは類似の性質を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じさせる、前記特定配列の修飾型にも関連するように解釈されるべきである。同様に、特定抗体または特定抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細書で与える教示は、特定抗体のアミノ酸配列および／または核酸配列と比較して修飾されているが機能的に等価であるアミノ酸配列および／または核酸配列を特徴とする抗体にも関連するように解釈されるべきである。１つの重要な性質は、抗体のその標的への結合を保持することまたは抗体のエフェクター機能を維持することである。好ましくは、特定配列に関して修飾された配列は、それが抗体内の前記特定配列に取って代わったときＧＴ４６８への前記抗体の結合を保持し、および好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性溶解またはＡＤＣＣ媒介性溶解の機能を保持する。
【０１５１】
特にＣＤＲ、超可変領域および可変領域の配列が、ＧＴ４６８に結合する能力を失わずに修飾され得ることは当業者に認識される。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書で特定される抗体の領域に同一であるかまたは高度に相同である。「高度に相同」により、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３または１または２の置換がＣＤＲ内で為され得ることが企図される。加えて、超可変領域および可変領域は、本明細書で特定して開示される領域と実質的な相同性を示すように修飾され得る。
【０１５２】
本明細書で述べる特定核酸はまた、特定の宿主細胞または生物においてコドン使用頻度を最適化するために修飾された核酸を含むことが了解されるべきである。生物間でのコドン使用頻度の相違は、異種遺伝子発現に関する様々な問題を導き得る。もとの配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを変化させることによるコドン最適化は、核酸が発現される同種または異種宿主における前記核酸の発現の最適化、特に翻訳効率の最適化をもたらすことができる。例えば、ヒトに由来し、抗体の定常領域および／またはフレームワーク領域をコードする核酸を、例えばキメラまたはヒト化抗体を作製するために本発明に従って使用する場合、特に、場合により本明細書で述べる他の生物に由来する核酸などの異種核酸に融合した、前記核酸を、マウスまたはハムスターなどのヒトとは異なる生物からの細胞において発現させる場合は、コドン使用頻度の最適化のために前記核酸を修飾することが好ましいと考えられる。例えば、それぞれ配列番号：１９および２０に従う核酸配列のような、ヒト軽鎖および重鎖定常領域をコードする核酸配列は、最適化されたコドン使用頻度をもたらすがアミノ酸配列の変化は生じさせない、１またはそれ以上、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０および好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０または１００までまたはそれ以上のヌクレオチド置換を含むように修飾することができる。そのようなヌクレオチド置換は、好ましくは、配列番号：１９および２０と、それぞれ、それらの修飾された対応物との以下のアラインメントに示す置換から選択され、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない、それぞれ配列番号：１９および２０内のヌクレオチドの置換に関するか、またはそれぞれヒト軽鎖および重鎖定常領域をコードする他の核酸配列内の対応位置での対応する置換に関する。好ましくは、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない、配列番号：１９および２０と、それぞれ、それらの修飾された対応物との以下のアラインメントに示す置換はすべて、それぞれヒト軽鎖および重鎖定常領域をコードする核酸配列内で生じる。
【０１５３】
配列番号：１９と配列番号：２１のアラインメント：
【０１５４】
【化１】
2013522329.tif 000002
【０１５５】
配列番号：２０と配列番号：２３のアラインメント：
【０１５６】
【化２】
2013522329.tif 000003
【０１５７】
さらに、本発明によれば、本明細書で述べるアミノ酸配列、特にヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を、所望アロタイプ、例えば白人母集団において認められるアロタイプに配列を適合させるように修飾することは望ましい場合がある。そのような修飾は、好ましくは配列番号：１７内の以下のアミノ酸置換：Ｋ９３Ｒ、Ｄ２３５ＥおよびＬ２３７Ｍ、または他のヒト重鎖定常領域内の対応する位置のアミノ酸置換から成る群より選択される。好ましくは、これらの修飾のすべてがヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列に含まれる。
【０１５８】
本発明によれば、「対応する位置」という用語は、２つの核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントにおいて互いに整列されるヌクレオチドまたはアミノ酸残基に関する。
【０１５９】
本発明によれば、核酸配列、アミノ酸配列またはペプチドの変異体、誘導体、修飾形態またはフラグメントは、好ましくは、それぞれそれが由来する核酸配列、アミノ酸配列またはペプチドの機能特性を有する。そのような機能特性は、他の分子との相互作用または他の分子への結合を含む。１つの実施形態では、核酸配列、アミノ酸配列またはペプチドの変異体、誘導体、修飾形態またはフラグメントは、それぞれそれが由来する核酸配列、アミノ酸配列またはペプチドと免疫学的に等価である。
【０１６０】
好ましくは、特定核酸配列と、前記特定核酸配列に関して修飾されたまたは前記特定核酸配列の変異体である核酸配列との間の相同性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ＧＴ４６８核酸変異体に関して、相同性の程度は、好ましくは少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００または少なくとも約６３０ヌクレオチドの領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、相同性の程度は、配列表に示す核酸配列などの参照核酸配列の全長に対して与えられる。好ましくは、２つの配列は、互いにハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができ、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションが参照できる。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを転写した膜を、例えば２×ＳＳＣ中室温で洗浄し、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中６８℃までの温度で洗浄する。
【０１６１】
本発明において、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０１６２】
好ましくは、実質的な相同性を示すアミノ酸配列間のような、特定アミノ酸配列と、前記特定アミノ酸配列に関して修飾されたまたは前記特定アミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは相同性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ＧＴ４６８ポリペプチド変異体に関して、類似性または相同性の程度は、好ましくは少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０または２１２アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または相同性の程度は、配列表に示すアミノ酸配列などの参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
【０１６３】
上述した修飾配列または配列変異体のすべてが本発明の範囲内である。
【０１６４】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の「配列相同性」は、２つの配列の間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を示す。
【０１６５】
「相同性パーセント」は最良アラインメント後に得られ、このパーセントは純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はランダムにおよびそれらの全長にわたって分布する。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、それらを最適に整列した後これらの配列を比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手動で行う以外に、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【０１６６】
相同性パーセントは、これら２つの配列間の相同性パーセントを得るために比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって算定される。
【０１６７】
「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似度に基づいて行われ得る。例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；（ｂ）極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む；（ｃ）正電荷を有する（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む；ならびに（ｄ）負電荷を有する（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。置換は、典型的には（ａ）〜（ｄ）の群内で行われ得る。加えて、グリシンとプロリンは、αへリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。一部の好ましい置換は、以下の群：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩにおいて行われ得る。公知の遺伝暗号、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を考慮して、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１６８】
本発明は、抗体の機能または薬物動態特性を変化させるためにＦｃ領域内で変更が加えられた抗体を包含する。そのような変更は、Ｃ１ｑ結合とＣＤＣまたはＦｃγＲ結合とＡＤＣＣの低下または上昇を生じさせ得る。置換は、例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基の１またはそれ以上において実施でき、それにより、修飾抗体と比較して、抗原に結合する能力を保持しながらエフェクター機能の変化を生じさせ得る。米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号参照。
【０１６９】
抗体のインビボ半減期は、分子が無傷ＣＨ２ドメインまたは無傷Ｉｇ  Ｆｃ領域を含まないようにＩｇ定常ドメインまたはＩｇ様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを修飾することによって改善できる。米国特許第６，１２１，０２２号および同第６，１９４，５５１号参照。インビボ半減期は、Ｆｃ領域内に突然変異を作製することによって、例えば２５２位のロイシンをトレオニンに置換することによって、２５４位のセリンをトレオニンに置換することによって、または２５６位のフェニルアラニンをトレオニンに置換することによってさらに延長できる。米国特許第６，２７７，３７５号参照。
【０１７０】
さらに、抗体のエフェクター機能を変化させるために抗体のグリコシル化パターンを改変することができる。例えば、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性を高め、ひいてはＮＫ細胞の存在下で抗体のＡＤＣＣ上昇を生じさせるために、通常はＦｃ領域の２９７位のＡｓｎに結合するフコース単位を付加しないトランスフェクトーマにおいて抗体を発現させることができる。Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ，２７７：２６７３３参照。さらに、ＣＤＣを改変するためにガラクトシル化の修飾が実施できる。
【０１７１】
あるいは、別の実施形態では、飽和突然変異誘発などにより、抗ＧＴ４６８抗体コード配列の全部または一部に沿ってランダムに突然変異を導入することができ、生じる改変された抗ＧＴ４６８抗体を結合活性に関してスクリーニングできる。
【０１７２】
本明細書で使用される、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指示することが意図されていることは了解されるべきである。突然変異または環境影響のいずれかのためにある種の修飾が後の世代で起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でないことがあるが、それでもなお本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に包含される。組換え宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞およびリンパ球細胞などのトランスフェクトーマを含む。
【０１７３】
本明細書で使用される、「被験者」という用語は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を包含する。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類等のような哺乳動物および非哺乳動物を包含する。
【０１７４】
「トランスジェニック動物」という用語は、１またはそれ以上の導入遺伝子、好ましくは重鎖および／もしくは軽鎖導入遺伝子、または導入染色体（動物の天然ゲノムＤＮＡに組み込まれているかまたは組み込まれていない）を含むゲノムを有し、好ましくは導入遺伝子を発現することができる動物を指す。例えば、トランスジェニックマウスは、マウスが、ＧＴ４６８抗原および／またはＧＴ４６８を発現する細胞で免疫された場合ヒト抗ＧＴ４６８抗体を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖導入染色体のいずれかを有し得る。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、例えばＨＣｏ７またはＨＣｏｌ２マウスなどのＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込まれ得るか、またはヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開公報第ＷＯ０２／４３４７８号に記載されているトランスクロモソーマル（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持され得る。そのようなトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチを受けることによりＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ）を産生することができると考えられる。
【０１７５】
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」とは、レベル、例えば細胞の増殖のレベルの全体的低下、好ましくは５％またはそれ以上、１０％またはそれ以上、２０％またはそれ以上、より好ましくは５０％またはそれ以上、最も好ましくは７５％またはそれ以上の全体的低下を生じさせる能力を意味する。
【０１７６】
「細胞の活性を阻害する」という語句または同様の語句は、細胞の活性の完全なまたは基本的に完全な阻害および細胞の活性の低下を包含する。好ましくは、前記細胞の活性の阻害は、腫瘍細胞の増殖を低減しおよび／または腫瘍細胞の死滅を誘導し、したがって、腫瘍阻害作用または腫瘍破壊作用を有する。
【０１７７】
ｍＡｂの作用機構
以下は、本発明の抗体の治療効果の基礎となる機構についての考察を提供するものであるが、いかなる意味においても本発明を限定するとみなされるべきではない。
【０１７８】
本明細書で述べる抗体は、好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して、免疫系の成分と相互作用し得る。本発明の抗体はまた、ペイロード（例えば放射性同位体、薬剤または毒素）を標的して腫瘍細胞を直接死滅させるためにも使用でき、または伝統的な化学療法剤と相乗作用的に使用して、化学療法剤のＴリンパ球への細胞傷害性副作用のために損なわれた可能性がある抗腫瘍免疫応答を含み得る補完的な作用機構を通して腫瘍を攻撃することができる。しかし、本発明の抗体はまた、単に細胞表面上のＧＴ４６８に結合することによって、したがって、例えば細胞の増殖をブロックすることによって、作用を及ぼし得る。
【０１７９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
ＡＤＣＣは、好ましくは抗体によって印づけられた標的細胞を必要とする、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表す。
【０１８０】
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と係合した場合に起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定細胞集団は規定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示を導く様々な程度の即時腫瘍破壊および腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導を直接誘導する機構とみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、抗腫瘍Ｔ細胞応答および宿主由来の抗体応答を導く。
【０１８１】
補体依存性細胞傷害
ＣＤＣは、抗体によって指令され得る別の細胞死滅方法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを指令する上でどちらも非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与する抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接する多数のＣ１ｑ結合部位の露出を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの露出されたＣ１ｑ結合部位は、それまでは低親和性のＣ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティの相互作用へと変換し、それが一連の他の補体タンパク質を含む事象のカスケードを開始させ、エフェクター細胞走化性／活性化物質Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解放出を導く。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の細孔を作り出す、膜傷害性複合体の形成で終了する。
【０１８２】
抗体の作製
本発明の抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルスもしくは発癌性形質転換または抗体遺伝子のライブラリを使用したファージディスプレイ技術も使用できる。
【０１８３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための好ましい動物系は、マウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は極めて広く確立された手順である。免疫プロトコールおよび融合のために免疫脾細胞を単離する技術は当分野において公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０１８４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための他の好ましい動物系は、ラットおよびウサギの系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）に記載されており、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
【０１８５】
さらに別の好ましい実施形態では、ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスとして知られるマウスを含み、本明細書では集合的に「トランスジェニックマウス」と称する。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の作製は、国際公開公報第ＷＯ２００４  ０３５６０７号の中でＣＤ２０に関して詳述されているように実施できる。
【０１８６】
モノクローナル抗体を作製するためのさらに別の方法は、規定された方法の抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することであり、例えばＢａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ参照。組換え抗体の作製の詳細については、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８およびＢｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＳＢＮ  １−５８８２９−０９２−１も参照のこと。
【０１８７】
免疫
ＧＴ４６８に対する抗体を作製するために、上述したように、組換え発現されたＧＴ４６８抗原もしくはそのフラグメントおよび／またはＧＴ４６８を発現する細胞の富化製剤である、ＧＴ４６８配列に由来する担体結合ペプチドでマウスを免疫することができる。あるいは、完全長ヒトＧＴ４６８（例えば配列番号：１）をコードするＤＮＡまたはそのフラグメント、特に配列番号：３〜１０および３５〜８２をコードするものでマウスを免疫することができる。ＧＴ４６８抗原の精製または富化製剤を使用した免疫が抗体を生じない場合は、免疫応答を促進するためにＧＴ４６８を発現する細胞、例えば細胞株でマウスを免疫することもできる。
【０１８８】
免疫応答は、免疫プロトコールの間に尾静脈または後眼窩の採血によって得られる血漿および血清試料で観測できる。十分な力価の抗ＧＴ４６８免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用できる。特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を高めるために、犠死および脾切除の３日前にＧＴ４６８発現細胞により腹腔内または静脈内経路でマウスを追加免疫することができる。
【０１８９】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫マウスから脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合することができる。生じたハイブリドーマを、次に、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。次に個々のウエルを、ハイブリドーマを分泌する抗体に関してＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。ＧＴ４６８発現細胞を使用した免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析により、ＧＴ４６８に対して特異性を有する抗体を同定できる。抗体分泌ハイブリドーマを再びプレートに植え付け、スクリーニングして、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は、限界希釈法によってサブクローニングできる。安定なサブクローンをその後インビトロで培養し、特性づけのために組織培養培地において抗体を生成することができる。
【０１９０】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体はまた、例えば、当分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて作製できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。
【０１９１】
例えば、１つの実施形態では、対象とする１または複数の遺伝子、例えば抗体遺伝子を、国際公開公報第ＷＯ８７／０４４６２号、同第ＷＯ８９／０１０３６号および欧州特許第ＥＰ３３８  ８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系または当分野で周知の他の発現系によって使用されるような、真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに連結することができる。クローニングされた抗体遺伝子を有する精製プラスミドを、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの真核生物宿主細胞、あるいは植物由来細胞、真菌または酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミンその他のような当分野で記述されている方法であり得る。宿主細胞へのこれらの抗体遺伝子の導入後、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマであり、その後それらを発現レベルに合わせて増幅し、抗体を生産するためスケールアップすることができる。これらの培養上清および／または細胞から組換え抗体を単離し、精製することができる。
【０１９２】
あるいは、クローン化した抗体遺伝子を、微生物、例えば大腸菌などの原核細胞を含む他の発現系において発現させることができる。さらに、抗体は、ヒツジおよびウサギからの乳もしくはニワトリからの卵などのトランスジェニック非ヒト動物において、またはトランスジェニック植物において生産できる；例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５−１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７；およびＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５−８３９参照。
【０１９３】
無傷抗体を発現するための部分抗体配列の使用（すなわちヒト化およびキメラ化）
ａ）キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素または放射性同位体で標識した場合、ヒトにおける治療用抗体として使用できる。非標識マウス抗体は、反復適用した場合ヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下をもたらす。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化またはヒト化した場合、低減するまたは完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をヒト重鎖および軽鎖の定常領域と連結することによって達成される（例えばＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８によって述べられているように）。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同じく好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製できる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭである。
【０１９４】
ｂ）ヒト化
抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体の間で多様である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる性質を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列に移植された特定の天然に生じる抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に生じる抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；およびＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから入手できる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞の成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ結合によって形成される、完全に構築された可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子配列はまた、可変領域全体にわたって個々に均一に高親和性の二次レパートリー抗体の配列とも異なる。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分では比較的低頻度である。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を有意に変化させない。このため、もとの抗体と類似の結合特性を有する無傷組換え抗体を再創製するために特定抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（国際公開公報第ＷＯ９９／４５９６２号参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分重鎖および軽鎖配列は、典型的にはこの目的のために十分である。部分配列を使用して、いずれの生殖細胞系可変および連結遺伝子セグメントが組み換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、生殖細胞系配列を使用して可変領域の欠けている部分を充填する。重鎖および軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の性質には寄与しない。欠けている配列を加えるために、クローン化されたｃＤＮＡ配列を連結またはＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あるいは、可変領域全体をひと組の短いオーバーラップするオリゴヌクレオチドとして合成し、ＰＣＲ増幅によって結合して完全な合成可変領域クローンを作製することができる。この工程は、特定の制限部位の除去もしくは組込み、または特定コドンの最適化のようなある種の利点を有する。
【０１９５】
天然配列と同じアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を創製するために、ハイブリドーマからの重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を使用して合成オリゴヌクレオチドの重複するセットを設計する。合成重鎖およびκ鎖配列は３つの方法で天然配列と異なるようにすることができる：オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を容易にするためにひと続きの反復ヌクレオチド塩基を中断する；最適翻訳開始部位をコザック規則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）に従って組み込む；およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を翻訳開始部位の上流に構築する。
【０１９６】
重鎖および軽鎖可変領域の両方について、最適化したコード鎖および対応する非コード鎖配列を、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０〜５０ヌクレオチドに分割する。したがって、各々の鎖について、オリゴヌクレオチドを１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複する二本鎖セットに構築できる。次にそのプールを鋳型として使用して１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生成する。典型的には、１つの可変領域オリゴヌクレオチドセットを２つのプールに分割し、それらを別々に増幅して２つのオーバーラップするＰＣＲ産物を生成する。次にこれらのオーバーラップ産物をＰＣＲ増幅によって組み合わせて完全な可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物に容易にクローニングできるフラグメントを作製するために重鎖または軽鎖定常領域のオーバーラップフラグメントをＰＣＲ増幅に含めることが望ましいと考えられる。
【０１９７】
再構築したキメラ化またはヒト化重鎖および軽鎖可変領域を、次に、クローン化したプロモータ、リーダー、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳、ポリアデニル化および転写終結配列と組み合わせて発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物を、単一ベクターに組み合わせるか、宿主細胞に同時トランスフェクトする、連続的にトランスフェクトするまたは別々にトランスフェクトすることができ、その後それらを融合して、両方の鎖を発現する宿主細胞を形成する。ヒトＩｇＧκについての発現ベクターの構築において使用するためのプラスミドを以下で述べる。ＰＣＲ増幅したＶ重鎖およびＶκ軽鎖ｃＤＮＡ配列を使用して完全な重鎖および軽鎖ミニ遺伝子を再構築し得るようにプラスミドを構築することができる。これらのプラスミドは、完全なヒト、またはキメラＩｇＧ１κもしくはＩｇＧ４κ抗体を発現するために使用できる。同様のプラスミドを、他の重鎖アイソタイプの発現のためまたはλ軽鎖を含む抗体の発現のために構築することができる。
【０１９８】
したがって、本発明の別の態様では、本発明の抗ＧＴ４６８抗体の構造特徴を利用して、ＧＴ４６８への結合のような、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する、構造的に関連したヒト化抗ＧＴ４６８抗体を創製する。より詳細には、マウスモノクローナル抗体の１またはそれ以上のＣＤＲ領域を組換えによって公知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組み合わせて、付加的な、組換え操作された本発明のヒト化抗ＧＴ４６８抗体を作製することができる。
【０１９９】
抗原発現細胞への結合
ＧＴ４６８に結合する抗体の能力は、実施例で述べるような標準的な結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光法およびフローサイトメトリ分析）を用いて測定することができる。
【０２００】
抗体の単離と特性づけ
抗ＧＴ４６８抗体を精製するため、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコで増殖させることができる。あるいは、抗ＧＴ４６８抗体は透析バイオリアクターで生産できる。上清をろ過し、必要に応じて濃縮した後、プロテインＧ−セファロースまたはプロテインＡ−セファロースによるアフィニティクロマトグラフィに供することができる。純度を保証するため、溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィによって検査することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、１．４３の吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を測定できる。モノクローナル抗体をアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
【０２０１】
選択した抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体がユニークなエピトープに結合するかどうかを調べるため、部位指定または多部位指定突然変異誘発が使用できる。
【０２０２】
アイソタイプの決定
精製抗体のアイソタイプを決定するため、様々な市販のキット（例えばＺｙｍｅｄ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるアイソタイプＥＬＩＳＡが実施できる。マイクロタイタープレートのウエルを抗マウスＩｇで被覆することができる。ブロックした後、プレートをモノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と周囲温度で２時間反応させる。次に、ウエルをマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ３、ＩｇＡまたはマウスＩｇＭ特異的ペルオキシダーゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開し、４０５〜６５０のＯＤで分析することができる。あるいは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４９３０２７）を、製造者によって述べられているように使用してもよい。
【０２０３】
フローサイトメトリ分析
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在またはＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、フローサイトメトリが使用できる。天然にまたはトランスフェクション後にＧＴ４６８を発現する細胞株とＧＴ４６８発現を欠く陰性対照（標準的な増殖条件下で増殖させた）を、ハイブリドーマ上清中または１％ＦＢＳを含むＰＢＡＳ中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、４℃で３０分間インキュベートすることができる。洗浄後、ＡＰＣまたはＡｌｅｘａ６４７で標識したＩｇＧ抗体を、一次抗体染色と同じ条件下でＧＴ４６８結合モノクローナル抗体に結合させることができる。単一生細胞にゲートをかける光散乱および側方散乱特性を用いたＦＡＣＳ装置でのフローサイトメトリによって試料を分析できる。単一測定においてＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体を非特異的結合抗体と区別するために、同時トランスフェクションの方法が使用できる。ＧＴ４６８と蛍光マーカーをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を上述したように染色することができる。トランスフェクトした細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出できる。トランスフェクト細胞の大部分は両方の導入遺伝子を発現するので、ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカー発現細胞に選択的に結合するのに対し、非特異的抗体は非トランスフェクト細胞に同等の比率で結合する。フローサイトメトリアッセイに加えてまたはその代わりに、蛍光顕微鏡検査を用いた選択的アッセイを使用し得る。細胞を上述したように正確に染色し、蛍光顕微鏡によって検査することができる。
【０２０４】
免疫蛍光顕微鏡検査
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在またはＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、免疫蛍光顕微鏡検査による分析が使用できる。例えば、自然にまたはトランスフェクション後にＧＴ４６８を発現する細胞株とＧＴ４６８発現を欠く陰性対照を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準的な増殖条件下でチャンバースライドガラスにおいて増殖させる。その後細胞をメタノールまたはパラホルムアルデヒドで固定するかまたは未処理のままにし得る。次に、細胞をＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体と２５℃で３０分間反応させることができる。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させ得る。その後、免疫蛍光顕微鏡によって細胞を検査できる。
【０２０５】
細胞をメタノール固定またはパラホルムアルデヒド固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した場合、細胞中の総ＧＴ４６８レベルが観察できる。生細胞および透過処理していないパラホルムアルデヒド固定細胞では、ＧＴ４６８の表面局在化が検査できる。加えて、密着結合へのＧＴ４６８のターゲティングは、ＺＯ−１などの密着結合マーカーとの共染色によって分析できる。さらに、抗体結合の作用および細胞膜内のＧＴ４６８局在が検査できる。
【０２０６】
ウエスタンブロット法
抗ＧＴ４６８  ＩｇＧを、ウエスタンブロット法によってＧＴ４６８抗原との反応性に関してさらに試験することができる。簡単に述べると、ＧＴ４６８を発現する細胞からの細胞抽出物と適切な陰性対照を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写し、ブロックして、試験するモノクローナル抗体でプローブする。抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを用いてＩｇＧ結合を検出し、ＥＣＬ基質で展開することができる。
【０２０７】
免疫組織化学
抗ＧＴ４６８マウスＩｇＧを、当業者に周知の方法である免疫組織化学によって、例えば、トランスフェクション後に、通常の外科手術の間に患者からまたは、ＧＴ４６８を発現する細胞株を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスから得た、非癌組織もしくは癌組織試料からのパラホルムアルデヒドもしくはアセトン固定した凍結切片またはパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を使用して、ＧＴ４６８抗原との反応性に関してさらに試験することができる。免疫染色のために、ＧＴ４６８に対して反応性の抗体をインキュベートし、次いで販売者の指示に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体またはヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートすることができる。
【０２０８】
インビトロでの抗体の食作用および細胞死滅化活性
ＧＴ４６８に特異的に結合することに加えて、抗ＧＴ４６８抗体は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用および死滅化を媒介するそれらの能力に関して試験することができる。インビトロでのモノクローナル抗体活性の試験は、インビボモデルにおける試験に先立つ初期スクリーニングを提供する。
【０２０９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：
簡単に述べると、健常ドナーからの多形核細胞（ＰＭＮ）、ＮＫ細胞、単球、単核細胞または他のエフェクター細胞をＦｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離、次いで夾雑赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクター細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清あるいは５％熱不活化ヒト血清を添加したＲＰＭＩに懸濁し、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする５１Ｃｒ標識標的細胞と、エフェクター細胞対標的細胞の様々な比率で混合することができる。あるいは、標的細胞を蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）で標識してもよい。死細胞から放出される増強リガンドとユウロピウムの高度蛍光キレートを蛍光光度計によって測定できる。別の選択的手法は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは生細胞によってのみ酸化され得る。次に精製抗ＧＴ４６８  ＩｇＧを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトＩｇＧが陰性対照として使用できる。アッセイは、使用するエフェクター細胞型に依存して３７℃で４〜２０時間実施できる。試料を、培養上清中の５１Ｃｒの放出またはＥｕＴＤＡキレートの存在を測定することによって細胞溶解に関して検定できる。あるいは、ルシファーイエローの酸化から生じる発光が生細胞の測定であり得る。
【０２１０】
抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体はまた、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で増強されるかどうかを調べるために様々な組合せで試験することができる。
【０２１１】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）：
モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体は、様々な公知の技術を用いてＣＤＣを媒介するそれらの能力に関して試験できる。例えば、補体用の血清は、当業者に公知の方法で血液から入手できる。ｍＡｂのＣＤＣ活性を測定するために、種々の方法が使用できる。例えば５１Ｃｒ放出を測定するかまたはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイを用いて膜透過性上昇を評価することができる。簡単に述べると、標的細胞を洗浄し、５×１０５／ｍｌを様々な濃度のｍＡｂと共に室温または３７℃で１０〜３０分間インキュベートすることができる。次に、血清または血漿を添加して２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度にし、細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液に添加できる。その後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙを用いたフローサイトメトリ分析によって混合物を直ちに分析できる。
【０２１２】
選択的アッセイでは、ＣＤＣの誘導を接着細胞上で測定することができる。このアッセイの１つの実施形態では、アッセイの２４時間前に細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに３×１０４／ウエルの密度で接種する。その翌日、増殖培地を取り出し、三組の細胞を抗体と共にインキュベートする。対照細胞は、それぞれバックグラウンド溶解および最大溶解の測定のために増殖培地または０．２％サポニンを含有する増殖培地と共にインキュベートする。室温で２０分間のインキュベーション後、上清を取り、ＤＭＥＭ中の２０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿または血清（あらかじめ３７℃に温めておく）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。各々の試料からのすべての細胞をヨウ化プロピジウム溶液（１０μｇ／ｍｌ）に添加する。次に、上清を、２．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有するＰＢＳに交換し、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅを用いて５２０ｎｍでの励起後の蛍光放出を６００ｎｍで測定する。特異的溶解の割合を以下のように算定する：特異的溶解％＝（試料蛍光−バックグラウンド蛍光）／（最大溶解蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００。
【０２１３】
モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害：
アポトーシスを開始させる能力に関して試験するため、モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体を、例えば、ＧＴ４６８陽性腫瘍細胞またはＧＴ４６８でトランスフェクトした腫瘍細胞と共に３７℃で約２０時間インキュベートすることができる。細胞を採取し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で洗浄して、ＦＩＴＣまたはＡＰＣと結合したアネキシンＶ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に暗所で１５分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）に添加し、フローサイトメトリによって直ちに評価できる（上記のように）。あるいは、モノクローナル抗体による細胞増殖の全般的阻害は市販のキットを用いて検出できる。ＤＥＬＦＩＡ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０２００）は、マイクロプレートにおける増殖細胞のＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みの測定に基づく非同位体免疫検定法である。取り込まれたＢｒｄＵは、ユウロピウム標識モノクローナル抗体を用いて検出される。抗体検出を可能にするため、細胞を固定し、Ｆｉｘ溶液を使用してＤＮＡ変性する。非結合抗体を洗い流し、ＤＥＬＦＩＡ誘導剤を添加して標識抗体からユウロピウムイオンを溶液中に解離し、溶液中で前記イオンはＤＥＬＦＩＡ誘導剤の成分と高度蛍光キレートを形成する。検出に時間分解蛍光光度法を用いて、測定された蛍光は、各々のウエルの細胞におけるＤＮＡ合成に比例する。
【０２１４】
前臨床試験
ＧＴ４６８に結合するモノクローナル抗体はまた、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞の増殖を制御する上でのそれらの効果を測定するため、インビボモデルにおいて（例えば、場合によりトランスフェクション後に、ＧＴ４６８を発現する細胞株を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫不全マウスにおいて）試験することができる。
【０２１５】
ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞を免疫無防備状態マウスまたは他の動物に異種移植した後、本発明の抗体を使用してインビボ試験を実施できる。腫瘍の形成または腫瘍関連症状を予防する抗体の作用を測定するため、腫瘍を有さないマウスに抗体を投与し、次いで腫瘍細胞を注射することができる。腫瘍の増殖、転移または腫瘍関連症状を低減するそれぞれの抗体の治療効果を測定するため、抗体を腫瘍担持マウスに投与することができる。抗体適用を、細胞増殖抑制薬、増殖因子阻害剤、細胞周期遮断薬、血管新生阻害剤または他の抗体などの他の物質の適用と組み合わせて、組合せの相乗作用効果および潜在的毒性を測定することができる。本発明の抗体によって媒介される毒性副作用を分析するため、動物に抗体または対照試薬を接種し、ＧＴ４６８抗体治療に関連する可能性がある症状に関して詳細に検討することができる。ＧＴ４６８抗体のインビボ適用の起こり得る副作用は、特に、胎盤を含むＧＴ４６８発現組織における毒性を含む。ヒトおよび他の種、例えばマウスにおいてＧＴ４６８を認識する抗体は、ヒトにおけるモノクローナルＧＴ４６８抗体の適用によって媒介される潜在的副作用を予測するために特に有用である。
【０２１６】
エピトープマッピング
本発明の抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９による「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）およびＯｌｗｙｎ  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｈａｙによる「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２４８の中で詳述されているように実施できる。
【０２１７】
Ｉ．ＧＴ４６８に結合する二重特異性／多重特異性分子
本発明のさらに別の実施形態では、ＧＴ４６８に対する抗体は、複数の結合部位または標的エピトープに結合する二重特異性または多重特異性分子を作成するために、誘導体化するまたは別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）に連結することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体、ペプチドまたは結合ミメティックなどの１またはそれ以上の他の結合分子に機能的に連結できる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的会合または他の方法によって可能である）。
【０２１８】
したがって、本発明は、ＧＴ４６８に対する少なくとも１つの第一結合特異性部分と２番目の標的エピトープに対する第二結合特異性部分を含む二重特異性および多重特異性分子を包含する。本発明の特定実施形態では、２番目の標的エピトープは、Ｆｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）もしくはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）、またはＴ細胞受容体、例えばＣＤ３である。それゆえ、本発明は、ＦｃγＲ、ＦｃαＲまたはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮ））と、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする標的細胞の両方に結合することができる二重特異性および多重特異性分子を包含する。これらの二重特異性および多重特異性分子は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞をエフェクター細胞に標的し、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性、例えばＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成を開始させ得る。
【０２１９】
本発明の二重特異性および多重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＧＴ４６８結合特異性部分に加えて、第三の結合特異性部分をさらに含み得る。１つの実施形態では、第三結合特異性部分は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによってＦｃ受容体または標的細胞抗原に対する結合決定基の作用の増強を生じさせる、抗体、機能的抗体フラグメントまたはリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第一および第二結合特異性部分が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は細胞傷害性Ｔ細胞に結合することができる（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または標的細胞に対する免疫応答の増大を生じさせる他の免疫細胞を介して）。
【０２２０】
１つの実施形態では、本発明の二重特異性および多重特異性分子は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体を結合特異性部分として含む。前記抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体であり得るか、またはＦｖもしくはＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている一本鎖構築物のようなその任意の最小フラグメントであり得る。抗体はまた、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号に開示されているような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であり得る。
【０２２１】
１つの実施形態では、本発明の二重特異性および多重特異性分子は、エフェクター細胞の表面上に存在するＦｃγＲまたはヒトＦｃαＲに対する結合特異性部分、および標的細胞抗原、例えばＧＴ４６８に対する第二結合特異性部分を含む。
【０２２２】
１つの実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、その結合がヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によってブロックされないモノクローナル抗体によって提供される。本明細書で使用される、「ＩｇＧ受容体」という用語は、第１番染色体に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分類される、合計１２の膜貫通型または可溶性受容体アイソフォームをコードする。１つの好ましい実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。
【０２２３】
これらの好ましいモノクローナル抗体の作製と特性づけは、国際公開公報第ＷＯ８８／０００５２号および米国特許第４，９５４，６１７号においてＦａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって記述されている。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合し、したがって、それらの結合は生理的レベルのＩｇＧによって実質的にブロックされない。本発明において有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体は、モノクローナル抗体２２のヒト化形態（Ｈ２２）である。Ｈ２２抗体の作製と特性づけは、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２および国際公開公報第ＷＯ９４／１０３３２号に記載されている。Ｈ２２抗体を産生する細胞株は、ＨＡ０２２ＣＬ１の名称の下に１９９２年１１月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、アクセッション番号ＣＲＬ  １１１７７を有する。
【０２２４】
さらなる他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、その結合が、好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によってブロックされない、ヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃα受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体によって提供される。「ＩｇＡ受容体」という用語は、第１９番染色体に位置する１個のα遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を包含することが意図されている。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａの数個の選択的にスプライシングされる膜貫通型アイソフォームをコードすることが公知である。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上で構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団では発現されない。ＦｃαＲＩはＩｇＡ１およびＩｇＡ２の両方に対して中等度の親和性を有し、前記親和性はＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインに暴露後に増大する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０）。ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側でＦｃαＲＩに結合する、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７と同定された４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体が記述されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４）。
【０２２５】
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、それらが、（１）主として免疫エフェクター細胞上で、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞上で発現される、（２）高レベル（例えば５，０００〜１００，０００／細胞）で発現される、（３）細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ、食作用）のメディエータである、（４）それらに標的される、自己抗原を含む抗原の抗原提示増強を媒介するので、本発明における使用のための好ましいトリガ受容体である。
【０２２６】
別の実施形態では、二重特異性分子は、一方の抗体が主としてＣＤＣを誘導することによって働き、他方の抗体が主としてアポトーシスを誘導することによって作用するような、補完的な機能活性を有する本発明に従った２つのモノクローナル抗体から成る。
【０２２７】
本明細書で使用される「エフェクター細胞特異的抗体」は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する抗体または機能的抗体フラグメントを指す。本発明における使用のための好ましい抗体は、内因性免疫グロブリンによって結合されない部位でエフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する。
【０２２８】
本明細書で使用される、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識期および活性化期ではなく、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞ならびに好塩基球を含む。一部のエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。好ましい実施形態では、エフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えば好中球はＡＤＣＣを誘導できる。例えば、ＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞を特異的に死滅させることおよび抗原を免疫系の他の成分に提示すること、または抗原を提示する細胞に結合することに関与する。他の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞または微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上での特定のＦｃＲの発現は、サイトカインのような体液性因子によって調節され得る。例えば、ＦｃγＲＩの発現はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）によって上方調節されることが認められている。この発現増強は、標的に対するＦｃγＲＩ担持細胞の細胞傷害活性を増大させる。エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食するまたは溶解することができる。
【０２２９】
「標的細胞」は、本発明の抗体によって標的され得る、被験者（例えばヒトまたは動物）における任意の望ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態では、標的細胞は、ＧＴ４６８を発現するもしくは過剰発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞である。ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、典型的には腫瘍細胞を含む。
【０２３０】
本発明の二重特異性および多重特異性分子は、化学的手法（例えばＤ．Ｍ．Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５８０７参照）、「ポリドーマ」技術（Ｒｅａｄｉｎｇへの米国特許第４，４７４，８９３号参照）、または組換えＤＮＡ技術を用いて作製できる。
【０２３１】
特に、本発明の二重特異性および多重特異性分子は、当分野で公知の方法を用いて、構成要素である結合特異性部分、例えば抗ＦｃＲ結合特異性部分と抗ＧＴ４６８結合特異性部分を結合することによって作製できる。例えば、二重特異性および多重特異性分子の各々の結合特異性部分を別々に作製し、その後互いに結合することができる。結合特異性部分がタンパク質またはペプチドである場合は、共有結合連結のために様々なカップリング剤または架橋剤が使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：８１−８３）、およびＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：２３６７−２３７５）によって述べられているものを含む。好ましい結合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、どちらもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手できる。
【０２３２】
結合特異性部分が抗体である場合は、それらを２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合できる。特に好ましい実施形態では、結合の前に、ヒンジ領域を奇数、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾する。
【０２３３】
あるいは、両方の結合特異性部分を同じベクター内にコードさせ、同じ宿主細胞において発現させ、構築することができる。この方法は、二重特異性および多重特異性分子がＭＡｂ×ＭＡｂ、ＭＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ'）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性および多重特異性分子、例えば二重特異性分子は、一本鎖二重特異性抗体のような一本鎖分子、１つの一本鎖抗体と１つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子、または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性および多重特異性分子はまた、一本鎖分子であり得るかまたは少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性および多重特異性分子を作製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；および同第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０２３４】
二重特異性および多重特異性分子の、それらの特異的標的への結合は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫検定法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物学的検定法（例えば増殖阻害）またはウエスタンブロット法によって確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に、特定対象とするタンパク質−抗体複合体の存在を、対象複合体に特異的な標識試薬（例えば抗体）を使用することによって検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体フラグメントを用いて検出できる。あるいは、複合体は様々な他の免疫検定法のいずれかを用いて検出できる。例えば、抗体を放射性標識し、放射免疫検定法（ＲＩＡ）において使用することができる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６参照）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によってまたはオートラジオグラフィによって検出できる。
【０２３５】
ＩＩ．免疫複合体
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性同位体などの治療成分または物質に結合した抗ＧＴ４６８抗体を特徴とする。そのような複合体を本明細書では「免疫複合体」と称する。１またはそれ以上の細胞毒を含有する免疫複合体を「免疫毒素」と称する。細胞毒または細胞傷害性物質は、細胞に有害であり、特に細胞を死滅させる任意の物質を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログを含む。
【０２３６】
本発明の免疫複合体を形成するための適切な治療薬は、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、治療薬は細胞傷害性物質または放射性毒性物質である。別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。さらに別の実施形態では、治療薬はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはリシンＡである。
【０２３７】
本発明の抗体はまた、癌などのＧＴ４６８関連疾患を治療するための細胞傷害性放射性薬剤を生成するために放射性同位体、例えばヨウ素−１３１、イットリウム−９０またはインジウム−１１１に結合することができる。本発明の抗体複合体は所与の生物学的応答を改変するために使用でき、薬剤成分は古典的化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤成分は、所望生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素もしくはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロンγなどのタンパク質；または、例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくは他の増殖因子などの生物学的応答調節剤を含み得る。
【０２３８】
そのような治療成分を抗体に結合するための技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）参照。
【０２３９】
さらなる実施形態では、本発明による抗体を、抗体を放射性同位体に結合することを可能にするリンカー−キレート化剤、例えばチウキセタンに連結する。
【０２４０】
ＩＩＩ．医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明の抗体の１つまたは本発明の抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されているような従来技術に従って医薬的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤と共に製剤し得る。１つの実施形態では、組成物は、異なる機構によって作用する本発明の複数の（例えば２またはそれ以上の）単離された抗体の組合せ、例えば、主としてＣＤＣを誘導することによって働く１つの抗体と主としてアポトーシスを誘導することによって作用する別の抗体の組合せを含む。
【０２４１】
本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち他の作用物質と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの抗炎症薬または少なくとも１つの免疫抑制剤と本発明の組成物を含み得る。１つの実施形態では、そのような治療薬は、ステロイド系薬剤またはＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）などの１またはそれ以上の抗炎症薬を含む。好ましい薬剤は、例えば、アスピリンおよび他のサリチル酸塩、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）およびセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）などのＣｏｘ−２阻害剤、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ、Ａｄｖｉｌ）、フェノプロフェン（Ｎａｌｆｏｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）およびインドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）などのＮＳＡＩＤを含む。
【０２４２】
別の実施形態では、そのような治療薬は、低用量シクロホスファミド、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ２または抗ＩＬ２受容体抗体のような、制御性Ｔ細胞の枯渇または機能的不活性化を導く物質を含む。
【０２４３】
さらに別の実施形態では、そのような治療薬は、タキソール誘導体、タキソテール、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ、Ｎｅｏｓａｒ）などの、１またはそれ以上の化学療法剤を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、好ましくは乳癌、肺癌、胃癌および／または卵巣癌、または、例えば本明細書で述べるような他の癌型に罹患している患者において治療効果を示す、化学療法剤と併用して投与し得る。
【０２４４】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、放射線治療および／または自己末梢幹細胞移植もしくは骨髄移植と併用して投与し得る。
【０２４５】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＰＣＡＭ抗体、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよび抗ＣＤ４０抗体から選択される１またはそれ以上の抗体と併用して投与し得る。
【０２４６】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、補体活性化を増強するために抗Ｃ３ｂ（ｉ）抗体と併用して投与し得る。
【０２４７】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体」は、生理的に適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を包含する。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性および多重特異性分子を、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するための物質で被覆し得る。
【０２４８】
「医薬的に許容される塩」は、親化合物の所望生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性作用も与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
【０２４９】
そのような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような非毒性無機酸から、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等のような非毒性有機酸から誘導されるものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属から、ならびにＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような非毒性有機アミンから誘導されるものを含む。
【０２５０】
本発明の組成物は、当分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者に認識されるように、投与の経路および／または方式は所望結果に依存して異なる。活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤のような、急速な放出から化合物を保護する担体と共に製造され得る。生分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などが使用できる。そのような製剤の製造のための方法は一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０２５１】
ある一定の投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、化合物の不活性化を防ぐ物質で化合物を被覆するかまたは化合物を前記物質と同時投与する必要があり得る。例えば、化合物を適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤中で被験者に投与し得る。医薬的に許容される希釈剤は、生理食塩水および水性緩衝液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルションならびに従来のリポソームを含む（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０２５２】
医薬的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。医薬活性物質のためのそのような媒質および物質の使用は当分野において公知である。従来の媒質または物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０２５３】
治療組成物は、典型的には製造および保存条件下で無菌且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬剤濃度に適した他の秩序構造体として製剤できる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の持続的吸収を生じさせることができる。
【０２５４】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは成分の組合せと共に適切な溶媒中に組み込み、その後滅菌精密ろ過することによって製造できる。
【０２５５】
一般に、分散液は、基本分散媒および上記に列挙したものの中から必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって製造される。滅菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、あらかじめ滅菌ろ過したその溶液から有効成分および任意の付加的な所望成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２５６】
投薬レジメンは、最適所望応答（例えば治療応答）を与えるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与し得るか、数回の分割用量を一定期間にわたって投与してもよく、または治療状況の緊急性によって指示されるのに比例して用量を低減または増加してもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために非経口組成物を投与単位形態で製剤することは特に好都合である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される被験者のための単一投与量として適する物理的に分離した単位を表す；各々の単位は、必要な医薬担体と共同して所望治療効果を生じさせるように計算された、あらかじめ定められた量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態についての詳細は、（ａ）活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を配合することの当分野に固有の限界によって決定され、直接それらに依存する。
【０２５７】
医薬的に許容される抗酸化剤の例は：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；および（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。
【０２５８】
治療組成物に関して、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、経直腸、経膣および／または非経口投与に適するものを含む。製剤は、単位投与形態で好都合に提供され得、薬学の技術分野において公知の任意の方法によって製造され得る。単一投与形態を生産するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される被験者および特定の投与方式に依存して異なる。単一投与形態を生産するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に治療効果を生じさせる組成物の量である。
【０２５９】
一般に、１００％のうちで、この量は約０．０１％〜約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の有効成分の範囲である。
【０２６０】
経膣投与に適する本発明の製剤はまた、適切であることが当分野において公知の担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤を含む。本発明の組成物の局所または経皮投与用の剤型は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を含む。活性化合物は、無菌条件下で、医薬的に許容される担体、および必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤または噴射剤と混合し得る。
【０２６１】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与方式を意味し、限定されることなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
【０２６２】
本発明の医薬組成物において使用し得る適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。
【０２６３】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤も含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順、ならびに種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含有することの両方によって確保し得る。また、糖類、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に含めることも望ましいと考えられる。加えて、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を含めることにより、注射用医薬形態の持続的吸収を生じさせ得る。
【０２６４】
１つの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、皮下注射によって結晶形態で投与される。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ，１００（１２）：６９３４−６９３９参照。本発明の化合物を薬剤としてヒトおよび動物に投与する場合、それらを単独で、または医薬的に許容される担体と組み合わせて、例えば０．０１〜９９．５％（より好ましくは０．１〜９０％）の有効成分を含有する医薬組成物として投与することができる。
【０２６５】
選択される投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって医薬的に許容される投与形態に製剤される。
【０２６６】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者への毒性を伴わずに、特定の患者、組成物および投与方式について所望治療応答を達成するために有効な有効成分の量が得られるように変化させ得る。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与の時間、使用される特定化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定組成物と併用される他の薬剤、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および病歴、ならびに医学技術分野において周知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０２６７】
当分野における通常技術を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルから開始し、所望効果が達成されるまで徐々に投与量を増加することができる。一般に、本発明の組成物の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最小用量である化合物の量である。そのような有効用量は、一般に上述した因子に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下経路であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。所望する場合は、治療組成物の有効１日用量を、１日を通じて適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量として、場合により単位投与形態で投与し得る。本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、医薬製剤（組成物）として本発明の化合物を投与することが好ましい。
【０２６８】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、毒性副作用を低減するために注入によって、好ましくは２４時間以上のような長期間にわたる緩徐な持続注入によって投与し得る。投与はまた、２〜２４時間、例えば２〜１２時間にわたる持続注入によって実施し得る。そのようなレジメンは、必要に応じて１回またはそれ以上、例えば６ヵ月後または１２ヵ月後に反復し得る。投与量は、抗ＧＴ４６８抗体を標的する抗イディオタイプ抗体を使用することにより、生物学的試料において投与後の循環モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体の量を測定することによって決定するまたは調整することができる。
【０２６９】
さらに別の実施形態では、抗体は、例えば週に１回、６ヵ月またはそれ以上の期間にわたるような、維持療法によって投与される。
【０２７０】
さらに別の実施形態では、本発明による抗体は、ＧＴ４６８に対する抗体の１回注入、次いで放射性同位体に結合したＧＴ４６８に対する抗体の注入を含むレジメンによって投与し得る。前記レジメンを、例えば７〜９日後に反復してもよい。
【０２７１】
治療組成物は、当分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または同第４，５９６，５５６号に開示されている装置のような、無針皮下注射装置で投与できる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬剤を供給するための移植可能な微量注入ポンプを開示する、米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する、米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する、米国特許第４，４４７，２３３号；持続的薬剤送達のための可変流量移植可能注入装置を開示する、米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬剤送達システムを開示する、米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬剤送達システムを開示する、米国特許第４，４７５，１９６号に記載されているものを含む。
【０２７２】
多くの他のそのようなインプラント、送達システムおよびモジュールが当業者に公知である。ある実施形態では、本発明の抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤できる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高度親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを越えることを確実にするため（所望する場合）、それらを、例えばリポソーム中に製剤することができる。リポソームを製造するための方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号参照。リポソームは、特定細胞または器官内に選択的に輸送され、したがって標的薬剤送達を促進する１またはそれ以上の部分を含有し得る（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的部分は、葉酸塩またはビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；および界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）を含む。
【０２７３】
本発明の１つの実施形態では、本発明の治療化合物はリポソームに製剤される。より好ましい実施形態では、リポソームは標的部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療化合物は、所望領域に近位の部位、例えば腫瘍の部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、また細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されねばならない。
【０２７４】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、胎盤を横切る輸送を防ぐまたは低減するように製剤できる。これは、当分野で公知の方法によって、例えば抗体のＰＥＧ化によってまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントの使用によって実施できる。さらに「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ  Ｃ，Ｚｈｕｏ  Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ  Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：１７７−１９０」；および「Ｌａｎｄｏｒ  Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：２７９−２８３」が参照できる。
【０２７５】
腫瘍治療のための「治療有効用量」は、完全または部分的であり得る、客観的腫瘍応答によって測定できる。完全応答（ＣＲ）は、疾患の臨床的、放射線医学的または他の証拠がないことと定義される。部分応答（ＰＲ）は、凝集腫瘍サイズの５０％以上の縮小から生じる。進行までの平均時間は、客観的腫瘍応答の持続性を特徴づける測定値である。
【０２７６】
腫瘍治療のための「治療有効用量」はまた、疾患の進行を安定化するその能力によっても測定できる。癌を抑制する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効果を予測する動物モデル系において評価できる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のインビトロアッセイにより、細胞増殖またはアポトーシスを阻害する化合物の能力を検査することによって評価できる。治療化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを縮小させるまたはさもなければ被験者において症状を改善することができる。当業者は、被験者の大きさ、被験者の症状の重症度、および選択される特定組成物または投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができる。
【０２７７】
組成物は無菌でなければならず、また組成物が注射器によって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の長期吸収を生じさせることができる。
【０２７８】
活性化合物が適切に保護されている場合、上述したように、化合物は、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に、経口投与し得る。
【０２７９】
ＩＶ．本発明の用途および方法
本発明の抗体（本明細書で述べる免疫複合体、二重特異性／多重特異性分子、組成物および他の誘導体を含む）は、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する疾患の治療を含む、数多くの治療上の有用性を有する。例えば、前記抗体は、本明細書で述べるような様々な疾患を治療するまたは予防するために、例えばインビトロもしくはエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で培養下の細胞に、または例えばインビボでヒト被験者に投与することができる。本明細書で使用される、「被験者」という用語は、ＧＴ４６８に対する抗体に応答するヒトおよび非ヒト動物を包含することが意図されている。好ましい被験者は、疾患細胞、特に正常細胞と比較して変化したＧＴ４６８の発現パターンおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の変化した結合パターンによって特徴づけられる細胞を死滅させることによって矯正または改善できる疾患を有するヒト患者を含む。
【０２８０】
例えば、１つの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍形成性疾患、例えば、乳癌を含む、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる疾患を有する被験者を治療するために使用できる。治療および／または予防できる腫瘍形成性疾患の例は、ＧＴ４６８を発現するすべての癌および腫瘍実体を包含し、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態を含む。これらの癌は、早期、中期または進行期、例えば転移であり得る。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
【０２８１】
本発明において述べる医薬組成物および治療方法はまた、本明細書で述べる疾患を予防するための免疫またはワクチン接種にも使用し得る。
【０２８２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８もしくは特定形態のＧＴ４６８のレベル、またはそれらの膜表面にＧＴ４６８を含む細胞のレベルを検出するために使用でき、その後、それらのレベルを上述したような特定の疾患または疾患症状に結びつけることができる。あるいは、抗体を使用して、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の機能を低下させるまたは前記細胞の機能と相互作用させて、それによりこれらの細胞を疾患の重要なメディエータとして関係づけることができる。これは、抗体とＧＴ４６８との間での複合体の形成を可能にする条件下で、試料および対照試料を抗ＧＴ４６８抗体と接触させることによって達成できる。抗体とＧＴ４６８との間で形成される任意の複合体を検出し、試料と対照試料、すなわち参照試料において比較する。
【０２８３】
本発明の抗体は、最初にインビトロでの治療または診断用途に関連するそれらの結合活性に関して試験することができる。例えば、本明細書で述べるフローサイトメトリアッセイを用いて抗体を試験できる。
【０２８４】
さらに、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害することおよび／または前記細胞を死滅させることを含む、少なくとも１つのエフェクター媒介性エフェクター細胞活性を開始させる抗体の活性を検定することができる。例えば、ＣＤＣおよび／またはアポトーシスを開始させる抗体の能力が検定できる。ＣＤＣ、同型接着、分子クラスタリングまたはアポトーシスを検定するためのプロトコールを本明細書で述べる。
【０２８５】
本発明の抗体は、以下の生物活性：ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖および／もしくは分化を阻害すること；ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を死滅させること；エフェクター細胞の存在下でＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用もしくはＡＤＣＣを媒介すること；補体の存在下でＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＣＤＣを媒介すること；ＧＴ４６８を発現するおよび／もしくはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシスを媒介すること；同型接着を誘導すること；ならびに／またはＧＴ４６８に結合したとき脂質ラフトへの移行を誘導すること、の１またはそれ以上をインビボまたはインビトロで誘発するために使用できる。
【０２８６】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、様々なＧＴ４６８関連疾患を治療する、予防するまたは診断するためにインビボまたはインビトロで使用される。ＧＴ４６８関連疾患の例は、中でも特に、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態などの癌を含む。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
【０２８７】
本発明の抗体組成物をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は、当分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
【０２８８】
上述したように、本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、１またはそれ以上の他の治療薬、例えば細胞傷害性物質、放射性毒性物質、抗血管新生薬および／または本発明の抗体に対する免疫応答の誘導を低減する免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、治療薬に連結し得るか（免疫複合体として）または治療薬とは別に投与することができる。後者（別途投与）の場合、抗体は、治療薬の前、後もしくは治療薬と同時に投与できるか、または他の公知の治療法、例えば抗癌療法、例えば放射線と同時投与できる。そのような治療薬は、中でも特に、上記で列挙したような抗腫瘍薬を含む。化学療法剤と本発明の抗ＧＴ４６８抗体の同時投与は、腫瘍細胞に細胞傷害作用を生じさせる異なる機構によって働く２つの抗癌剤を提供する。そのような同時投与は、薬剤に対する耐性の発現または腫瘍細胞を抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【０２８９】
本発明の別の特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを標的とする抗体および血管新生を阻害する１またはそれ以上の化合物を含む、抗血管新生薬で付加的に治療される。これらの薬剤による前処置または並行適用は、バルク腫瘍内への抗体の浸透を改善し得る。
【０２９０】
本発明の別の特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、ＥＧＦＲ受容体に結合するモノクローナル抗体ならびにＥＧＦＲ、Ｈｅｒ１またはＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体によって開始されるシグナル伝達を阻害する化合物を含む、増殖因子受容体シグナル伝達を阻害する化合物で付加的に治療される。
【０２９１】
標的特異的エフェクター細胞、例えば本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞も、治療薬として使用することができる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球であり得る。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧ受容体またはＩｇＡ受容体担持細胞を含む。所望する場合は、治療される被験者からエフェクター細胞を得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与できる。投与される細胞の数は約１０８〜１０９であり得るが、治療目的に依存して異なる。一般に、その量は、標的細胞、例えばＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞における局在化を得るため、および、例えば食作用によって細胞の死滅を生じさせるために十分な量である。投与経路も多様であり得る。
【０２９２】
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の技術と併用して実施できる。例えば、本発明の組成物および／またはこれらの組成物を有するエフェクター細胞を使用した抗腫瘍治療は、化学療法と共に使用できる。加えて、併用免疫療法は、２つの異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細胞の排除へと向かわせるために使用し得る。例えば、抗ＦｃＲＩまたは抗ＣＤ３に連結された抗ＧＴ４６８抗体をＩｇＧ受容体またはＩｇＡ受容体特異的結合物質と共に使用し得る。
【０２９３】
本発明の二重特異性および多重特異性分子はまた、細胞表面上の受容体をキャップし、除去することなどにより、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃαＲレベルを調節するために使用できる。抗Ｆｃ受容体の混合物もこのために使用できる。
【０２９４】
補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＭからの部分のような、補体結合部位を有する本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫複合体）も、補体の存在下で使用できる。１つの実施形態では、本発明の結合物質および適切なエフェクター細胞による、標的細胞を含む細胞の集団のエクスビボ治療は、補体または補体を含有する血清の添加によって補足できる。本発明の結合物質で被覆された標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善され得る。別の実施形態では、本発明の組成物で被覆された標的細胞はまた、補体によって溶解され得る。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は補体を活性化しない。
【０２９５】
本発明の組成物はまた、補体と共に投与することができる。したがって、抗体、多重特異性または二重特異性分子と血清または補体を含有する組成物は本発明の範囲内である。これらの組成物は、補体が抗体、多重特異性または二重特異性分子にごく近接して位置するという点で有利である。
【０２９６】
あるいは、本発明の抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清を別々に投与することができる。標的細胞への本発明の組成物の結合は、ＧＴ４６８抗原−抗体複合体の、細胞膜の脂質ラフトへの移行を生じさせ得る。そのような移行は、ＣＤＣを効率的に活性化および／または増強し得る高密度の抗原−抗体複合体を形成する。
【０２９７】
また、本発明の抗体組成物（例えば抗体および免疫複合体）ならびに使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、免疫抑制試薬、細胞傷害性物質もしくは放射性毒性物質などの１もしくはそれ以上の付加的な試薬、または１もしくはそれ以上の付加的な本発明の抗体（例えば補完的活性を有する抗体）をさらに含み得る。
【０２９８】
したがって、本発明の抗体組成物で治療される患者は、本発明の抗体の治療効果を高めるまたは増大させる、細胞傷害性物質または放射性毒性物質などの別の治療薬を付加的に投与され得る（本発明の抗体の投与前に、抗体の投与と同時にまたは抗体の投与後に）。
【０２９９】
他の実施形態では、例えば被験者をサイトカインで治療することにより、ＦｃγまたはＦｃα受容体の発現または活性を調節する、例えば増強するまたは阻害する物質で被験者を付加的に治療することができる。好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。本明細書で述べる抗体および医薬組成物の治療効果を高めるための他の重要な物質は、分枝グルコース残基のホモ多糖であり、様々な植物および微生物、例えば細菌、藻類、真菌、酵母および穀物によって生産されるβ−グルカンである。生物によって生産されるβ−グルカンのフラグメントも使用し得る。好ましくは、β−グルカンは、骨格グルコース単位の少なくとも一部、例えば骨格グルコース単位の３〜６％がβ（１，６）分枝などの分枝を有する、β（１，３）グルコースのポリマーである。
【０３００】
特定の実施形態では、本発明は、被験試料と対照試料を、抗体またはその部分とＧＴ４６８の間での複合体の形成を可能にする条件下で、ＧＴ４６８に特異的に結合する抗体と接触させることを含む、試料中のＧＴ４６８抗原の存在を検出する、またはＧＴ４６８抗原の量を測定するための方法を提供する。次に、複合体の形成を検出し、対照試料と比較して被験試料との間での複合体形成の差が被験試料中のＧＴ４６８抗原の存在を指示する。
【０３０１】
さらに別の実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の存在を検出するまたは前記細胞の量を測定するための方法を提供する。その方法は、（ｉ）検出マーカーに結合した本発明の組成物を被験者に投与すること；および（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を含む領域を同定するために、被験者を、前記検出マーカーを検出するための手段に暴露することを含む。
【０３０２】
上述した方法は、特に、癌疾患などのＧＴ４６８関連疾患を診断するためおよび／またはＧＴ４６８関連疾患の局在化のために有用である。好ましくは、対照試料中のＧＴ４６８の量よりも高い被験試料中のＧＴ４６８の量は、試料が由来する被験者、特にヒトにおけるＧＴ４６８関連疾患の存在を指示する。
【０３０３】
上述した方法において使用される場合、本明細書で述べる抗体は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第一もしくは第二標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するように第二標識と相互作用する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって移動度、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす、または（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原もしくはイオン錯体形成を生じさせる、ように機能する標識と共に提供され得る。蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定な同位体標識、同重体標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンなどの低分子有機分子、受容体または細胞接着タンパク質もしくはレクチンなどの結合分子のリガンド、結合剤の使用によって検出できる核酸および／またはアミノ酸残基を含む標識配列等のような構造体が、標識として適切である。標識は、非限定的に、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、イオパノ酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、ならびにフッ素−１８および炭素−１１などの陽電子放射体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１などのガンマ線放射体、フッ素およびガドリニウムなどの核磁気共鳴のための核種を含む。
【０３０４】
さらに別の実施形態では、本発明の免疫複合体を使用して、化合物（例えば治療薬、標識、細胞毒、放射性毒素、免疫抑制剤等）を抗体に連結することにより、ＧＴ４６８がその表面と結合している細胞にそのような化合物を標的することができる。したがって、本発明はまた、循環腫瘍細胞などの、ＧＴ４６８を発現するおよび／またはその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞をエクスビボまたはインビトロで局在化するための方法を提供する。
【０３０５】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０３０６】
実施例１：試験材料および方法
本明細書で言及する技術および方法は、それ自体公知の方法でおよび、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されているように、または以下で述べるように実施される。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は製造者の情報に従って実施される。
【０３０７】
組織および細胞株
組換えＤＮＡ作業は、公式の許可を得て、Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚ州政府の規則に従って実施した。組織は、通常診断または治療手順の間のヒト余剰材料として入手し、使用時まで−８０℃で保存した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＢＴ５４９をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。
【０３０８】
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡの抽出、第一鎖ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを先に記述されているように実施した（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。エンドポイント分析のためにＧＴ４６８特異的オリゴヌクレオチド（センス  ５'−ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＡＣ−３'；アンチセンス  ５'−ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＣ−３'、６０℃でアニーリング）を３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。リアルタイム定量的発現分析を４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて三重に実施した。ＨＰＲＴ（センス  ５'−ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＣＡ−３'；アンチセンス  ５'−ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ−３'、６２℃でアニーリング）に正規化した後、腫瘍試料中のＧＴ４６８転写産物を、ΔΔＣＴ計算を用いて正常組織と比較して定量化した。任意に選択した試料からの増幅産物のクローニングし、配列決定することによってＰＣＲ反応の特異性を確認した。
【０３０９】
バイオインフォマティクス
栄養膜特異的分子のインシリコクローニングのために、別のところで詳述されているデータマイニング法を修正し、適合させた（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｅｆｅｒｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｐ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｓａｈｉｎ，Ｕ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。簡単に述べると、ＧｅｎＢａｎｋの階層的キーワード検索をデジタルｃＤＮＡライブラリサブトラクションと組み合わせた。
【０３１０】
キーワード検索のために、ＥＮＴＲＥＺ  Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ）を使用して、胎盤または栄養膜組織で特異的に発現されると注釈されている遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋのヌクレオチド配列ファイルにアクセスした。冗長性を防ぐためにすべてのヒトヌクレオチド配列に対して各々のヌクレオチド配列についての配列相同性検索プログラムＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を連続的に実施した。２番目のフィルタとして、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）のＥＳＴデータベースに対する各々の対象ＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ検索によるキーワード検索によって得たすべてのクローンについて電子ノーザン（ｅＮｏｒｔｈｅｒｎ）を実施した。公知のいくつかのｃＤＮＡライブラリが正しく注釈されていないことを考慮に入れた（Ｓｃｈｅｕｒｌｅ，Ｄ．，ＤｅＹｏｕｎｇ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｉｎｎｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｐａｇｅ，Ｈ．，Ｊａｈａｎｚｅｂ，Ｍ．＆  Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，４０３７−４０４３）。
【０３１１】
デジタルサブトラクションのために、各々のプールが単一ライブラリまたは数個のライブラリのいずれかであり得る、ｃＤＮＡライブラリの２つのプール（ＡとＢ）の間で遺伝子発現を比較する、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｉｓｓｕｅｓ／ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ）の癌ゲノム解剖プロジェクト（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）のｃＤＮＡ  ｘＰｒｏｆｉｌｅｒツールを使用した。ｄｂＥＳＴにおけるすべてのｃＤＮＡライブラリを検索するために、プールＡとプールＢについての検索オプションを、生物については「ヒト」、ライブラリ群については「すべてのＥＳＴライブラリ」に設定した。検索オプション設定にマッチする胎盤および栄養膜組織から作製したすべてのｃＤＮＡライブラリを、混合組織ライブラリを除いてプールＡに割り当てた。プールＢについては、胎盤、栄養膜、精巣、卵巣および胎児の全身を除く正常組織から作製したすべてのｃＤＮＡライブラリを選択した。
【０３１２】
ＧＴ４６８プロモータ領域の分析のために、ＥＭＢＯＳＳ  ＣｐＧＰｌｏｔ（Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．＆  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６，２７６−２７７）ソフトウエアを使用した。さらに、ＧＴ４６８タンパク質配列の分析をＭＥＭＳＡＴ３（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，３０３８−３０４９）、ＴＭｐｒｅｄ（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．＆  Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｗ．（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４，１６６）、およびＧＯＲ  ＩＶ（Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｄ．Ｊ．＆  Ｒｏｂｓｏｎ，Ｂ．（１９７８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０，９７−１２０）で実施した。
【０３１３】
抗血清、免疫蛍光法および免疫化学
ＧＴ４６８のアミノ酸１１７〜１２７に対して惹起されるポリクローナル抗血清は、抗体受託生産サービス（Ｓｑｕａｒｉｘ，Ｍａｒｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって作製された。ＶＥＣＴＯＲ  ＮｏｖａＲＥＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、組織凍結切片に関して免疫組織化学を実施した。ウエスタンブロット分析のために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞から抽出した全タンパク質３０μｇを使用した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）に電気転写した。ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、サイクリンＤ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびβ−アクチン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に対して反応性の抗体で免疫染色を実施し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて一次抗体を検出した。
【０３１４】
ｓｉＲＮＡ二本鎖
ＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡ二本鎖（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（センス  ５'−ｒ（ＣＣＡ  ＵＧＡ  ＧＡＧ  ＵＡＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス  ５'−ｒ（ＵＵＧ  ＣＵＧ  ＧＣＵ  ＡＣＵ  ＣＵＣ  ＡＵＧ  Ｇ）ｄＡｄＧ−３'）は、ＧＴ４６８  ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０２１７９６．３）のヌクレオチド６７０〜６９０を標的した。対照として、スクランブルｓｉＲＮＡ二本鎖（センス  ５'−ｒ（ＵＡＡ  ＣＵＧ  ＵＡＵ  ＡＡＵ  ＣＧＡ  ＣＵＡ  Ｇ）ｄＴｄＴ−５'、アンチセンス  ５'−ｒ（ＣＵＡ  ＧＵＣ  ＧＡＵ  ＵＡＵ  ＡＣＡ  ＧＵＵ  Ａ）ｄＧｄＡ−３'）を使用した。ＧＴ４６８サイレンシング試験のために、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、細胞を１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ二本鎖でトランスフェクトした。すべての結果を、ヌクレオチド３４２〜３６２を標的する２番目のセットのＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡ二本鎖（センス  ５'−ｒ（ＧＧＵ  ＵＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＧＵ  ＣＣＡ  Ａ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス  ５'−ｒ（ＵＵＧ  ＧＡＣ  ＵＵＵ  ＧＵＣ  ＣＵＧ  ＡＡＣ  Ｃ）ｄＧｄＧ−３'）で再現した。
【０３１５】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の細胞増殖分析
ｓｉＲＮＡ二本鎖でのトランスフェクションの２４時間後に、１０％ＦＣＳを添加した培地で１×１０４細胞を４８時間培養した。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの取込みを測定することによって増殖を分析した。
【０３１６】
細胞周期分析
様々な濃度の１０％ＦＣＳを添加した培地で細胞を培養した。ｓｉＲＮＡ二本鎖でのトランスフェクションの７２時間後に細胞を採取し、ＥｔＯＨ固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した後、フローサイトメトリによるＤＮＡ含量分析に供した。細胞周期の異なる期にある細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）およびＦｌｏｗＪｏ（商標）（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）フローサイトメトリ解析ソフトウエアを使用して定量した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後および７２時間後にアポトーシス細胞をアネキシンＶ染色によって定量した。
【０３１７】
細胞移動およびインビトロ浸潤アッセイ
実験の前に１２時間無血清培地で培養した細胞に関して、８．０μｍ細孔膜を有するトランスウエルチャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において細胞移動アッセイを実施した。ｓｉＲＮＡ実験のために、上述したｓｉＲＮＡ二本鎖でのトランスフェクションの２４時間後に細胞を無血清条件に移した。無血清培地４００μｌ中の４×１０４細胞を上部チャンバーに加えた。下部チャンバーは、化学誘引物質として５％ＦＣＳを添加した培地８００μｌを含んだ。２４時間後、膜の下側に移動していた細胞を氷冷メタノールで固定した；膜を切り出し、顕微鏡スライドに載せて、蛍光顕微鏡検査のためにＨｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で封入した。５つのランダムな視野内の細胞（倍率１００倍）を各々の膜について計数した。すべての実験を三重に実施した。細胞の化学運動性への作用を、上部と下部の両方のチャンバーに化学誘引物質を添加して同じ実験設定を用いて分析した。インビトロ浸潤アッセイのために、無血清培地中で１ｍｇ／ｍｌに希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＮＪ）１００μｌで上部チャンバーを調製した。ゲル化のためにチャンバーを３７℃で５時間インキュベートした。
【０３１８】
抗体とのインキュベーション後の細胞増殖分析
内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＤＭＥＭ細胞培養培地で１：２に希釈したハイブリドーマ上清と共に７２時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの取込みを測定することによって増殖を分析した。
【０３１９】
あるいは、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７を、それぞれ、指示されている濃度で７２時間または１２０時間、ＤＭＥＭ細胞培養培地で希釈したＨＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清と共にインキュベートした。上述したように増殖を分析した。
【０３２０】
あるいは、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、および対照としてＧＴ４６８陰性黒色腫細胞株ＭｅｌＨｏを、ＤＭＥＭ（ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）またはＲＰＭＩ（ＭｅｌＨｏ）細胞培養培地で希釈したＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）と共に７２時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの取込みを測定することによって増殖を分析した。
【０３２１】
免疫蛍光顕微鏡検査
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在またはＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするため、免疫蛍光顕微鏡検査分析を使用した。ＧＴ４６８−ｅＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準的な増殖条件下でチャンバースライドにおいて増殖させた。次に細胞をメタノールまたはパラホルムアルデヒド／０．１％サポニンで固定した。細胞をＧＴ４６８に対する抗体と共に２５℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。
【０３２２】
ＧＴ４６８ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｐまたはＭｉｃｒｏｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ）を適切なＧＴ４６８ペプチド（５または１０μｇ／ｍｌ）で３７℃にて１時間被覆した。ＰＢＳ／３％ＢＳＡを用いて４℃で一晩ブロッキングを実施した。ＰＢＳで洗浄した後、プレートにハイブリドーマ上清（ＰＢＳ／３％ＢＳＡで１：５もしくは１：１０希釈、または２×ＰＢＳ／６％ＢＳＡ、ｐＨ７．３で１：２希釈）または精製抗体（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ、ｐＨ７．３で１μｇ／ｍｌに希釈）を負荷し、室温で１時間インキュベートした（９０ｒｐｍで軌道振とう）。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ、ｐＨ７．３中の二次抗体（ＨＲＰＯ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、９０ｒｐｍで軌道振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの最終洗浄工程後、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中の１ｍＭまたは１．５ｍＭ  ＡＢＴＳから成る基質溶液を添加した。使用の直前に、基質溶液に０．３μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を添加した。３０〜６０分後にＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で４０５ｎｍの吸収を測定した。
【０３２３】
ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
マウス脾細胞を、以下で述べる種々の免疫プロトコールを使用してあらかじめ免疫しておいた動物から単離し、標準プロトコールに基づきＰＥＧでマウス骨髄腫細胞株に融合した。生じたハイブリドーマを、次に、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ、ＧＴ４６８  ＣｒＥＬＩＳＡおよびＧＴ４６８−ｅＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用してＧＴ４６８特異性を有する免疫グロブリンの産生を免疫蛍光法（ＩＦ）によってスクリーニングした。
【０３２４】
免疫マウスからの脾リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＲＬ  ７３８６４１）を使用して２：１の比率でＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５９７）（または５６−４Ａ−２、６２−９Ｂ−１および６３−１Ａ−２の場合はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５８０））と融合した。細胞を平底マイクロタイタープレートに約３×１０４／ウエルで塗布し、次に１０％ウシ胎仔血清、２％ハイブリドーマ融合物およびクローニング用添加剤（ＨＦＣＳ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＲＬ  １  ３６３  ７３５）さらに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ  Ｈ０２６２）を含有する選択培地で約２週間インキュベートした。１０〜１４日後、個々のウエルをペプチド特異的ＥＬＩＳＡによって抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してスクリーニングした。抗体を分泌するハイブリドーマを再び植え付け、スクリーニングして、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングした。次に安定なサブクローンをインビトロで培養し、特性づけのために組織培養培地中で少量の抗体を生成した。親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡおよびＩＦによって）、各々のハイブリドーマから少なくとも１つのクローンを選択した。
【０３２５】
ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の精製
ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）を使用した一段階アフィニティクロマトグラフィを実施することにより、ハイブリドーマ上清から抗体を作製した。抗体アイソタイプに依存してｐＨ３．０〜ｐＨ４．０の１００ｍＭクエン酸塩で溶出した後、収集した画分を直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。さらなる実験のために抗体製剤をＰＢＳ  ５Ｌに対して２回透析し、滅菌ろ過して（０．２μｍ）、４℃で保存した。
【０３２６】
アイソタイピング
ハイブリドーマ上清のアイソタイピングのために、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者によって述べられているように使用した。
【０３２７】
ＧＴ４６８を発現する細菌の粗溶解物を使用したＣｒＥＬＩＳＡ手順
・抗原の調製
大腸菌ＸＬＯＬＲ細菌をＧＴ４６８  ｐＱＥプラスミドまたは挿入物なしｐＱＥ（「標準」と称する）のいずれかで形質転換し、ＬＢ培地でＡ６００ｎｍ〜０．３５Ｅに増殖させた。２ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導し、細胞を３７℃でさらに４時間増殖させた。タンパク質発現の適切な誘導とその反応速度をクマシーゲル分析によって観測した。細菌を遠心沈殿させ、０．２ｍＭプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ塩酸塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有する少量のＰＢＳ、ｐＨ７．２に再懸濁した。細胞を氷上に置き、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ａ  Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）によって破砕した。ＧＴ４６８および標準溶解物を、０．２ｍＭ  ＡＥＢＳＦおよび２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度に希釈した。アリコートを窒素中で衝撃凍結し、使用時まで−７０℃で保存した。
【０３２８】
・固相酵素免疫検定法の実施
使用前に、ＧＴ４６８ならびに標準溶解物を被覆緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７に希釈し、次に平底Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロウエルプレート（５０μｌ／ウエル、Ｎｕｎｃ）に移して、３７℃で２時間吸着させた。
【０３２９】
抗原の固定化後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でプレートを２回洗浄し、その後洗浄剤なしで２回洗浄した。１：１００希釈したヒト血清５０μｌを各ウエルについて添加し、周囲温度にて軌道振とう機で１時間インキュベートした。一部の実験では、ヒト血清を、アッセイに供する前に前処理した。
【０３３０】
各々個々の血清試料を、ＧＴ４６８または標準溶解物で被覆したウエルで並行して二重に試験した。プレートを上述したように再び洗浄し、３％（ｗ／ｖ）粉乳を含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で１：５０００希釈した５０μｌ／ウエルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを１００μｌ／ウエルの基質溶液［ＡＬＰ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１ｍｌにつき４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（Ｍｅｒｃｋ）２ｍｇ］で室温にて３０分間展開し、直ちにマイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｗａｌｌａｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で４０５ｎｍでの吸光度値を読み取った。
【０３３１】
フローサイトメトリ分析
ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドまたは挿入物なしのプラスミド（モック）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を採取し、氷冷メタノールで固定して、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで３０分間ブロックした。細胞をハイブリドーマ上清と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ／１  ＦＣＳで１０分間ずつ２回洗浄して、ヤギ抗マウスＣｙ３二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。
【０３３２】
さらに、ＧＴ４６８プラスミドＤＮＡまたは挿入物なしのプラスミド（モック）でトランスフェクトしたＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＮＵＧ−Ｃ４細胞またはＨＥＫ２９３細胞を採取し、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムでブロックした。細胞をハイブリドーマ上清と共にまたはＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで希釈した５μｇ／ｍｌの精製抗体と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで５分間ずつ３回洗浄して、ヤギ抗マウスＡＰＣ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＦＡＣＳａｒｒａｙを用いて細胞を分析した。
【０３３３】
クローン原性アッセイ
クローン原性アッセイまたはコロニー形成アッセイは、単一細胞がコロニーへと成長する能力を分析するインビトロでの細胞生存検定法である。コロニーを形成する能力へのＧＴ４６８抗体の有効性を調べるためにこのアッセイを実施した。ＧＴ４６８を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞を４８穴プレートに接種した（２０００細胞／ウエル）。ハイブリドーマ上清からのＦＰＬＣ精製抗体の存在下で（４５μｇ／ｍｌ）細胞を２週間増殖させ、すべてのアッセイを三重に実施した。コロニーを固定し、６％グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ）および０．５％クリスタルバイオレット（ｗ／ｖ）で染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓデジタルコンパクトカメラ（Ｃ−７５０  Ｕｌｔｒａ  Ｚｏｏｍ）を用いて、染色して乾燥したプレートから写真を撮影し、目視で分析した。
【０３３４】
ウエスタンブロット法
ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドまたは挿入物なしのプラスミド（モック）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の全細胞溶解物を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘベースの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＦ）を用いて調製した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ）に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ）に電気転写した。ＧＴ４６８に反応性のポリクローナル抗体（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）またはハイブリドーマ上清からのＦＰＬＣ精製抗体（５μｇ／ｍｌ）で免疫染色を実施し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で一次抗体を検出した。
【０３３５】
早期処置異種移植モデル
５×１０６のＧＴ４６８陽性ＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍細胞の接種の３日後に動物を精製モノクローナル抗体で処置した（２００μｇ静脈内、８動物／群）。抗体を週に２回、２週間投与した。カリパスを用いて腫瘍の成長を観測した。
【０３３６】
実験的転移アッセイ
エストロゲン依存性ＭＣＦ−７細胞の注射の１週間前に、１７β−エストラジオール持続放出型ペレット（１ｍｇ、６０日間放出；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）の皮下移植によって無胸腺ヌードマウスを作製した。１×１０６  ＭＣＦ−７の静脈内注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回処置した。細胞の注射の５週間後に無胸腺マウス（５〜８動物／群）の肺における腫瘍量の定量のためにリアルタイムＰＣＲを使用した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して肺組織からのＤＮＡを抽出し、ヒト第１７番染色体のαサテライト領域の２２６ｂｐフラグメント（センス  ５'−ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＡＧ−３'；アンチセンス  ５'−ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  Ｇ−３'）をＤＮＡ  ２００ｎｇから増幅した。腫瘍量（ＤＮＡコピー数）を、健常対照マウスからの正常肺に対して定量化した。
【０３３７】
実施例２：ＧＴ４６８は様々な腫瘍において異常に活性化され、高発現される
胎盤特異的栄養膜遺伝子を同定するため、もともと発明者が生殖細胞特異的分子のインシリコ同定のために開発したものである（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｅｆｅｒｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｐ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｓａｈｉｎ，Ｕ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）、ゲノム全体のデータマイニング法を適合させた。原則として、真正に胎盤特異的な遺伝子の予測のためにＧｅｎＢａｎｋの階層的キーワード検索をデジタルｃＤＮＡライブラリサブトラクションと組み合わせた。ＧＴ４６８はこのアプローチによって同定された。
【０３３８】
ＧＴ４６８  ｍＲＮＡを、正常組織および腫瘍組織標本の包括的なセットにおいてエンドポイントＲＴ−ＰＣＲおよび定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検討した。ＧＴ４６８発現が胎盤に限定されることが確認された。すべての他の正常組織標本では、転写産物の量は、高感度ＲＴ−ＰＣＲのちょうど検出限界であるかまたは検出限界未満である（図１Ａ、Ｂ、Ｃ、表１）。唯一の例外は精巣であるが、転写産物レベルは胎盤で認められるレベルより３〜４対数低い。
【０３３９】
表１：エンドポイントＲＴ−ＰＣＲによって分類した組織および細胞株におけるＧＴ４６８の発現
【０３４０】
【表１】
2013522329.tif 000004
【０３４１】
しかしながら、種々の癌型にわたる原発性腫瘍標本の３８％（８６／２２５）および腫瘍細胞株の５５％（２２／４０）において、さもなければ転写が厳密に制御されるこの遺伝子の異常な活性化が認められた。ＧＴ４６８の保有率および転写産物レベルは乳癌および乳癌細胞株において最も高かった（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。６２の原発性乳癌試料のうち４４（８２％）はＧＴ４６８発現に関して陽性（非栄養膜正常組織におけるバックグラウンドを少なくとも１００倍上回ると定義される）と評価され、２４％（１５／６２）は低発現（１００〜１０００倍）、４０％（２５／６２）は中発現（１０００〜１０，０００倍）、そして１７％（１１／６２）は高発現（＞１０，０００倍）を示した（図１Ｂ）。さらに、５０の肺癌試料のうち２１（４２％）ならびに胃癌および卵巣癌においてＧＴ４６８転写を認めた（表１）。ＧＴ４６８の誘導は、組織学的サブタイプ、腫瘍の病期または腫瘍悪性度と相関しなかった。
【０３４２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、微量のＧＴ４６８転写産物だけが４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ後に正常組織において検出できた。発現カットオフ値（点線、すべての正常組織の平均発現＋３ＳＴＤ（９９％パーセンタイル値））を超える正常組織は胎盤と精巣だけであった（図２０Ａ）。乳癌に加えて、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌および頭頸部癌からの試料においてＧＴ４６８の高発現を認めた（図２０Ｂ）。
【０３４３】
ＧＴ４６８発現プラスミド（陽性対照）、ＳＫ−ＢＲ−３（乳癌）、ＢＥＷＯ（胎盤性絨毛癌）、ＪＡＲ（胎盤性絨毛癌）、ＨＣＴ−１５（結腸癌）、ＬｎＣａＰ（前立腺癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＪＥＧ−３（胎盤性絨毛癌）、ＪＩＭＴ−１（乳癌）、ＬＡ１−５５ｎ（神経芽細胞腫）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＢＴ−２０（乳癌）およびＮＣＩ−Ｈ９２９（骨髄腫）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＴ４６８発現のウエスタンブロット分析は、これらの癌細胞株におけるＧＴ４６８の発現を明らかにした（図２１）。ＭｅｌＨＯ（悪性黒色腫）およびＮＵＧＣ４（胃癌）は試験陰性であった。
【０３４４】
実施例３：ＧＴ４６８は癌細胞の表面上に位置し、抗体にとってアクセス可能である
ＧＴ４６８特異的ペプチドエピトープ（配列番号：２のアミノ酸１１７〜１２７）に対するポリクローナルウサギ抗体（ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端）を惹起した。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＧＴ４６８の遺伝子サイレンシングによって抗体の特異性を確認した。ｓｉＲＮＡを排除するため、２組のＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖、スクランブル非サイレンシングオリゴヌクレオチドおよび非トランスフェクト細胞に関して標的活性実験を実施した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９をこれらのｓｉＲＮＡ二本鎖でトランスフェクトすることにより、対照と比較して構成的ＧＴ４６８  ｍＲＮＡ発現の８０〜９０％の安定で再現可能な低下が達成された（図１Ｄ）。この所見と一致して、ウエスタンブロット法でのＧＴ４６８の予測サイズに従って検出された２６ｋＤａのバンドは、両細胞株においてほぼ完全に消失し（図１Ｅ）、ＧＴ４６８タンパク質発現の堅固なノックダウンと抗体の特異性の両方を証明した。
【０３４５】
ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端での一次ヒト組織試料におけるＧＴ４６８タンパク質のウエスタンブロット染色は、この遺伝子が、それが発現される唯一の正常組織としての胎盤と同等のレベルで乳癌標本において検出可能であることを確認した（図１Ｆ）。ヒト乳癌組織切片でのウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端による免疫組織化学は、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＴ４６８  ｍＲＮＡ発現に関して陽性と分類された標本における特異的免疫反応性を示した。染色は腫瘍細胞集団に限定され、隣接間質細胞および非腫瘍性上皮細胞ならびに患者のマッチする正常組織は反応性ではなかった（図１Ｇ）。腫瘍細胞の免疫染色は形質膜において顕著であり、ＧＴ４６８が細胞表面タンパク質であることの証拠を提供した。
【０３４６】
ＧＴ４６８タンパク質配列のトポロジーのインシリコ解析は、アミノ酸５〜２２にわたる疎水性ドメイン、続いてアミノ酸２３〜２１２によって構成される大きな細胞外ドメインを予測した。ＧＴ４６８の細胞外部分のアミノ酸２９〜１１９は、トランケートされた透明帯（ＺＰ）ドメインである。ＺＰドメインは、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型、ウロモジュリン、糖タンパク質ＧＰ２ならびに精子受容体ＺＰ２およびＺＰ３を含む、様々な細胞外に露出された受容体様タンパク質において認められ（Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆  Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３００，２３７−２４０）、重合に関与する（Ｊｏｖｉｎｅ，Ｌ．，Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｌｉｔｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｓ．＆  Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．（２００６）ＢＭＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７，１１）。構成的に発現されるＧＴ４６８の細胞内局在を、おそらくこのタンパク質の細胞外部分にそのエピトープ（アミノ酸１１７〜１２７）を有する、ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端で染色したＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９乳癌細胞の免疫蛍光顕微鏡検査によって評価した。両細胞株は細胞膜において明確な染色を示した（図２Ａ）。ｓｉＲＮＡが誘導するＧＴ４６８発現のノックダウン後のシグナルの喪失は染色の特異性を確認した。最も重要な点として、特異的膜染色はメタノール固定細胞だけでなく非固定天然細胞でも認められ（図２Ｂ）、抗体のエピトープが細胞膜の透過処理なしでもアクセス可能であることを示唆し、したがってカルボキシ末端の細胞外局在という予測されたトポロジーを裏付けた。
【０３４７】
実施例４：ｓｉＲＮＡが誘導するＧＴ４６８の遺伝子サイレンシングは癌細胞の運動性、移動および浸潤を阻害し、増殖をブロックする
腫瘍細胞におけるＧＴ４６８の生物学的重要性を調べるため、基本的細胞機能へのそのｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングの影響を検討した。
【０３４８】
最初に、トランスウエル移動アッセイにおける乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９の性能を検討した。５％ＦＣＳを化学誘引物質としてシステムの上部および下部の両チャンバーに添加することによって評価した両細胞株の基線運動性（化学運動性）は、ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖によって実質的に阻害された（図３Ａ）。その結果として、細胞の指向性走化性遊走能の著明な低下も認められた（図３Ｂ）。さらに、細胞はＭａｔｒｉｇｅｌの障壁を突破して化学誘引物質勾配に沿って移動することができなかったので、細胞の化学浸潤活性はＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡ処理によって大きく影響された（図３Ｃ）。
【０３４９】
次に、ＤＮＡへのＢｒｄＵの取込みによって測定した腫瘍細胞増殖は、ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖により両細胞株において８０〜９０％低下することが認められた（図４Ａ）。細胞周期分析は、増殖ブロックのための基礎となる原因として、ＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における明確なＧ１／Ｓ停止を明らかにした（図４Ｂ）。細胞の生命力は影響を受けず、アネキシンＶでの染色はアポトーシス細胞死についての徴候を示さなかった（図４Ｃ）。
【０３５０】
実施例５：抗ＧＴ４６８抗体での癌細胞の処理は細胞増殖を阻害する
ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端および非反応性対照抗体と共にインキュベートしたＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９細胞の増殖を測定した。ＧＴ４６８のターゲティングは、濃度依存的に両細胞株の増殖の効率的な阻害を生じさせた（図５）。
【０３５１】
実施例６：ｓｉＲＮＡ誘導性サイレンシングの下流作用および抗体が誘導するＧＴ４６８の機能的拮抗作用
真核細胞の増殖と細胞周期進行はサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって支配される。個々のサイクリンは、一連のＣＤＫの活性を刺激することによって細胞周期の異なる時期に作用する。制限点制御はサイクリンＤおよびサイクリンＥ依存性キナーゼファミリーによって媒介される（Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．Ｏ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３，２６１−２９１；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，３６８９−３６９５）。ＧＴ４６８サイレンシングが、サイクリン発現の変化を介して認められた細胞周期調節不全を誘導するかどうかを検討するため、ＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡで処理したＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９乳癌細胞におけるサイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３およびサイクリンＥの発現を測定した。
【０３５２】
興味深いことに、リアルタイムＰＣＲによって測定したサイクリンＤ１転写産物の有意の減少（図６Ａ）ならびにウエスタンブロット法でのサイクリンＤ１タンパク質レベルの有意の低下（図６Ｂ）が、ＧＴ４６８ノックダウンの結果として起こった。分析した他のサイクリンに関しては転写レベルの変化を認めなかった。
【０３５３】
サイクリンＤ１は、細胞周期のＧ１期からＳ期への進行の主要調節因子であることが知られている。興味深いことに、散発性乳癌の腫瘍形成において、サイクリンＤ１の過剰発現が初期事象とみなされている（Ｃａｌｄｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｄａｌｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７，２６１−２７４；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４）。Ｄ型サイクリンは不安定であり、それらの誘導、合成および触媒パートナーとの集合はすべて、持続的なマイトジェンシグナル伝達に依存する。したがって、Ｄ型サイクリンは増殖因子センサーとして働き、細胞外因子に応答して活性なキナーゼを形成する（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３，１０５９−１０６５）。乳癌において、サイクリンＤ１発現がホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ依存性経路によって制御されることが示されている（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４；Ｄ'Ａｍｉｃｏ，Ｍ．，Ｈｕｌｉｔ，Ｊ．，Ａｍａｎａｔｕｌｌａｈ，Ｄ．Ｆ．，Ｚａｆｏｎｔｅ，Ｂ．Ｔ．，Ａｌｂａｎｅｓｅ，Ｃ．，Ｂｏｕｚａｈｚａｈ，Ｂ．，Ｆｕ，Ｍ．，Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ，Ｌ．Ｈ．，Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｔａｋｅｍａｒｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３２６４９−３２６５７；Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｒｉｍｅｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｂｅｌｌａｃｏｓａ，Ａ．，Ｍａｌｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ｅ．，Ｔｓｉｃｈｌｉｓ，Ｐ．Ｎ．＆  Ｒｏｓｅｎ，Ｎ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９８６４−２９８７２）。ＡＫＴは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）を不活性化し、それによってサイクリンＤ１の転写ならびにそのタンパク質分解による代謝回転および核内のそのタンパク質レベルを上昇させる（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４，Ｄｉｅｈｌ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．＆  Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，３４９９−３５１１；Ｒａｄｕ，Ａ．，Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｖ．，Ａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｈａｎａｆｕｓａ，Ｈ．＆  Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ，Ｍ．Ｍ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３，６１３９−６１４９）。加えて、ＡＫＴ経路は、ＧＴ４６８が明らかに関与する他の２つの細胞機能、癌細胞の運動性と移動の重要な調節因子である（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１６５５−１６５７；Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，２５７−２６２）。このことが我々に、ＧＴ４６８がＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９細胞におけるＡＫＴキナーゼの調節に影響を及ぼすかどうかを分析することを促した。
【０３５４】
ＰＩ３Ｋの過剰活性化に続くＡＫＴの構成的リン酸化および過剰活性化が腫瘍細胞において頻繁に認められる。ｓｉＲＮＡ技術によるＧＴ４６８のサイレンシング後のＡＫＴのＳｅｒ４７３リン酸化（ｐＡＫＴ）のレベルの定量および抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体によるその機能的拮抗作用はどちらも、特にＭＣＦ−７細胞においてｐＡＫＴレベルの著明な低下を生じさせ（図６Ｃ、Ｄ）、ＡＫＴキナーゼの活性化がＧＴ４６８の下流作用の遂行に関与することを示唆した。興味深いことに、ＰＴＥＮを欠き、それゆえより高いレベルのＰＩ３Ｋ過剰活性化を有するＢＴ−５４９細胞において、ｐＡＫＴの下方調節はより顕著ではなかった。
【０３５５】
実施例７：ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７／ＢＬ６マウスをＫＬＨ結合ペプチドで免疫した。ペプチド５０μｇおよびアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ  ５０μｌを１、１５、４５および８６日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスの血清中のＧＴ４６８に対する抗体の存在を２４、５７および９２日目にペプチド特異的ＥＬＩＳＡによって観測した。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出術の３日前に追加免疫した。
【０３５６】
配列番号：３〜１０に従う配列を有するペプチドを、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製のために使用した。例えば、配列番号：３のペプチドを使用した免疫はハイブリドーマ４Ｅ９−１Ｈ９および９Ｂ６−２Ａ９を生成し、配列番号：４のペプチドを使用した免疫はハイブリドーマ５９Ｄ６−２Ｆ２を生成し、そして配列番号：６のペプチドを使用した免疫はハイブリドーマ６１Ｃ１１−２Ｂ５および７８Ｈ１１−１Ｈ６を生成した。後者の抗体はＩｇＧ１アイソタイプであった。
【０３５７】
モノクローナル抗体の特異的結合を確実にするためにペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。ハイブリドーマ上清を、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドに対して１：５または１：１０希釈で試験した。対照として、すべてのハイブリドーマ上清を２つの無関係なペプチドに対して試験した。すべてのモノクローナル抗体は、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドとのみ特異的に反応した（図７）。
【０３５８】
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合を免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡検査によって分析した。ＧＴ４６８−ｅＧＦＰ融合構築物のトランスフェクションの２４時間後にＣＨＯ細胞をハイブリドーマ上清（１：５希釈）で染色した。ｅＧＦＰシグナルと二次抗マウス抗体（Ａｌｅｘａ５５）のシグナルを併合すると、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰトランスフェクト細胞の染色だけを示し、非トランスフェクト細胞は陰性であった（図８）。
【０３５９】
ＧＴ４６８へのモノクローナル抗体の結合が癌細胞の増殖に及ぼす影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１をハイブリドーマ上清（１：２希釈）と共に７２時間インキュベートした。細胞の増殖をＤＮＡへのＢｒｄＵの取込みによって測定した。モノクローナル抗体４Ｅ９  １Ｈ９は、使用した濃度で細胞の増殖を変化させなかったが、抗体９Ｂ６  ２Ａ９および５９Ｄ６  ２Ｆ２は、分析したすべての癌細胞株の増殖を明らかに低減した（図９）。
【０３６０】
したがって、細胞によって発現されるＧＴ４６８を選択的に標的するモノクローナル抗体を作製できることが示された。さらに、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖を阻害する、ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体を作製できることが示された。
【０３６１】
実施例８：ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドでの免疫とそれに続くペプチド／タンパク質注射から得られるＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７／ＢＬ６マウスを、１日目と１５日目にＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドおよびアジュバントとしてＰＥＩマンノースにより筋肉内（ｉ．ｍ．）経路で免疫した。その後、ペプチド５０μｇおよびアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ  ５０μｌ（腹腔内）、またはタンパク質１５０μｇおよび不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（皮下）を３０日目と４５日目に注射した。マウスの血清中のＧＴ４６８に対する抗体の存在をペプチド特異的ＥＬＩＳＡまたはＣｒＥＬＩＳＡによって観測した。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出術の３日前に追加免疫した。
【０３６２】
ＧＴ４６８  ＤＮＡを使用した２回の筋肉内免疫およびそれに続く組換えＧＴ４６８タンパク質の２回の皮下投与は、ハイブリドーマ２２−１Ａ−１、２２−２Ａ−１、２２−９Ｂ−１、２３−３３Ａ−１および２３−１９Ａ−１を生じさせた。ＧＴ４６８  ＤＮＡを使用した２回の筋肉内免疫およびそれに続く配列番号：１０に従うペプチドの２回の腹腔内投与は、ハイブリドーマＦ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２を生じさせた。ＧＴ４６８  ＤＮＡを使用した２回の筋肉内免疫およびそれに続く配列番号：３に従うペプチドの２回の腹腔内投与は、ハイブリドーマ４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０および４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４を生じさせた。
【０３６３】
以下の表は、得られた抗体およびそれらのアイソタイプを列記する。
【０３６４】
表２：ＧＴ４６８  ＤＮＡでの免疫およびそれに続くペプチド／他の注射によって得られたモノクローナル抗体
【０３６５】
【表２】
2013522329.tif 000005
【０３６６】
ハイブリドーマ２２−１Ａ−１、２２−２Ａ−１、２２−９Ｂ−１、２３−３３Ａ−１および２３−１９Ａ−１からのモノクローナル抗体の特異的結合を確実にするため、粗溶解物ＥＬＩＳＡ（ＣｒＥＬＩＳＡ）を実施した。ハイブリドーマ上清を、ＧＴ４６８  ｐＱＥ発現ベクターで形質転換した大腸菌の溶解物に対して試験した。対照として、ハイブリドーマ上清を、挿入物なしの（モック）ｐＱＥプラスミドで形質転換した大腸菌の溶解物に関して試験した。すべてのモノクローナル抗体は、特異的ＧＴ４６８溶解物とのみ特異的に反応した（図１０Ａ）。
【０３６７】
ハイブリドーマＦ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２、４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０および４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４からのモノクローナル抗体の特異的結合を確実にするため、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。ハイブリドーマ上清を、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドに対して試験した。対照として、ハイブリドーマ上清を無関係なペプチドに対して試験した。モノクローナル抗体は、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドとのみ特異的に反応した（図１０Ｂ）。
【０３６８】
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合を、上述したフローサイトメトリ分析によって分析した。モノクローナル抗体４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４のフローサイトメトリ分析のために、約４０％のトランスフェクション率で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を使用した。すべてのハイブリドーマ上清はＧＴ４６８トランスフェクト細胞の特異的染色を示し、モックトランスフェクト細胞では染色を認めなかった（図１１）。
【０３６９】
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合をウエスタンブロット法によって分析した。すべてのハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物と特異的反応性を示したが、モックトランスフェクト細胞の溶解物はシグナルを示さなかった（図１２；モック溶解物中のハイブリドーマ上清２３−３３Ａ−１のかすかなシグナルは、ＨＥＫ  ＧＴ４６８溶解物のスピルオーバーから生じると考えられる）。
【０３７０】
モノクローナル抗体が結合するＧＴ４６８タンパク質中のエピトープを同定するため、ペプチドＥＬＩＳＡを実施した。完全なＧＴ４６８タンパク質配列を、１１アミノ酸の重複を有する５１のオーバーラップペプチド（１５量体）のセットとして合成した。すべてのハイブリドーマ上清をこれらのペプチドへの特異的結合に関してＥＬＩＳＡで試験した。対照として、無関係なペプチドを使用した。すべての上清はＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示した。ハイブリドーマ上清２２−１Ａ−１、２３−３３Ａ−１および２３−１９Ａ−１は各々、２つのオーバーラップペプチドへの結合を示し、ＧＴ４６８の線状エピトープへの反応性を示唆した。２２−２Ａ−１および２２−９Ｂ−１の結合パターンはより複雑であり、ＧＴ４６８タンパク質の立体配座エピトープに対する反応性を示唆した。
【０３７１】
ＧＴ４６８へのモノクローナル抗体の結合が癌細胞の増殖に及ぼす影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０）またはＭＣＦ−７（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４）を、図１４に示されている濃度で精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間または１２０時間インキュベートした。ＤＮＡへのＢｒｄＵの取込みによって細胞の増殖を測定した。無関係な対照モノクローナル抗体は細胞の増殖を変化させなかったが、モノクローナル抗体４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０および４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４は、明らかに濃度依存的に細胞の増殖を低下させた（図１４）。
【０３７２】
実施例９：種々の免疫方法を用いて得られたＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７／ＢＬ６マウスを表３に示すように免疫した。ペプチド：ペプチド５０μｇおよびアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ  ５０μｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＤＮＡ：ＧＴ４６８プラスミドＤＮＡ  ２５μｇおよびアジュバントとしてＰＥＩマンノースを筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。組換えタンパク質：ＧＴ４６８タンパク質１５０μｇおよび不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。細胞：ＧＴ４６８プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした１〜２×１０７  ＨＥＫ２９３細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。一般に、免疫原を２週間ごとに投与した。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出術の３日前に追加免疫した。
【０３７３】
表３：免疫プロトコール
【０３７４】
【表３】
2013522329.tif 000006
【０３７５】
以下の表は、得られた抗体およびそれらのアイソタイプを列記する。
【０３７６】
表４：種々の免疫方法を用いて得られたモノクローナル抗体
【０３７７】
【表４】
2013522329.tif 000007
【０３７８】
実施例１０：ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体の試験
モノクローナル抗体が結合しているＧＴ４６８タンパク質のエピトープを同定するため、図１３および２５に示す１１アミノ酸の重複を有する５１のオーバーラップペプチド（１５量体）のセットを使用したペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。精製ハイブリドーマ上清を、各々、すべてのペプチドへの特異的結合に関してＥＬＩＳＡで試験した。対照として無関係なペプチドを使用した。配列番号：３のペプチドを免疫のために使用して、ハイブリドーマ４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７、７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４、１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４および３Ｅ５  ２Ｇ４を作製した。
【０３７９】
表５に示すように、１５の上清はＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示した。１５の上清のうちで、１３の上清は１個のペプチドまたは２もしくは３個の隣接ペプチドに結合し、ＧＴ４６８の線状エピトープの認識を示唆し、２つの上清は、少なくとも部分的に、非隣接ペプチドに結合し、エピトープの線状／立体配座の定義付けを示唆した。９の上清は、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡにおいてＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示さなかったが、ＦＡＣＳまたはＩＦでは結合を示し、ＧＴ４６８の非線状立体配座エピトープに対する反応性を示唆した。
【０３８０】
表５：ペプチド特異的ＥＬＩＳＡにおけるモノクローナル抗体の試験
【０３８１】
【表５】
2013522329.tif 000008
【０３８２】
ＧＴ４６８タンパク質への、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の特異的結合をフローサイトメトリ分析によって分析した。ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＧＴ４６８アミノ酸１１６〜２１２で安定にトランスフェクトした天然の非固定ＨＥＫ２９３細胞またはモックトランスフェクト細胞を、ＦＰＬＣで精製したハイブリドーマ上清（５μｇ／ｍｌ）で染色した。プラスミドｐＤｉｓｐｌａｙ−ＧＴ４６８アミノ酸１１６〜２１２において、ＧＴ４６８のアミノ酸１１６〜２１２をＣ末端でＰＤＧＦ受容体膜貫通ドメインに融合する。この構築物は、細胞の形質膜上でのＧＴ４６８アミノ酸１１６〜２１２の安定な発現を確実にする。細胞を、その天然立体配座のＧＴ４６８への結合を検出する非固定状態の上清で染色した。ハイブリドーマ上清はＧＴ４６８トランスフェクト細胞の特異的染色を示したが、モックトランスフェクト細胞では染色を認めなかった（図１５）。
【０３８３】
内因性にＧＴ４６８を発現する非固定腫瘍細胞への、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の特異的結合をフローサイトメトリ分析によって分析した。ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞を、内因性にＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞として使用し、ＧＴ４６８を発現しないＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞を陰性対照として使用した。天然の非固定細胞をＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（５μｇ／ｍｌ）で染色した。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の特異的染色を様々な程度に示した。上清の一部については細胞集団が有意に染色されるが（４２Ｈ１１  １Ｃ１１  ２Ｂ２、２２−１Ａ−１、３５−５０Ａ−２ａ、５４−４Ｂ−２）、別の上清では亜集団（細胞の約５％）だけが陽性である（図１６）。これは、強発現亜集団への結合を指示する。これらの結果は、抗体がＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞に結合できることを明らかにする。
【０３８４】
完全長ＧＴ４６８タンパク質への、ハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体の特異的結合をウエスタンブロット法によって分析した。ＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（５μｇ／ｍｌ）は、ＧＴ４６８発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物と特異的反応性を示したが、モックトランスフェクト細胞の溶解物はシグナルを示さず、ＧＴ４６８への結合が特異的であることを明らかにした（図１７、２３）。
【０３８５】
ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の増殖阻害活性を増殖アッセイにおいて分析した（図１８、２２）。内因性にＧＴ４６８を発現する乳癌細胞（ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）およびＧＴ４６８陰性ＭｅｌＨｏ黒色腫細胞またはＮＵＧＣ４胃癌細胞を９６穴プレートに接種し（５０００細胞／ウエル）、指示されている濃度のＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清と共にインキュベートした。７２時間後にＤＮＡへのＢｒｄＵの取込みによって細胞の増殖を測定した。すべての値を、ハイブリドーマ上清と共にインキュベートしていない対照細胞に正規化する。ＭｅｌＨｏまたはＮＵＧＣ４対照細胞では増殖阻害を認めなかった。ハイブリドーマ上清は、濃度依存的に様々な程度でＧＴ４６８発現乳癌細胞への特異的増殖阻害活性を示した。抗体の一部（３５−４８Ｂ−１、４８−３Ｂ−１、５１−１Ａ−１、５６−４Ａ−２）は、試験したＧＴ４６８陽性細胞株のすべてに有意の作用を示した。
【０３８６】
癌細胞の増殖へのＧＴ４６８抗体結合の影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現するＭＣＦ−７癌細胞を精製モノクローナル抗体と共に７２時間インキュベートした。対照抗体は細胞の増殖を変化させなかったが、抗体４Ａ５  １Ｅ１１  １Ｂ７、７Ｈ１２  ２Ｅ６  ２Ｃ４、１１Ｄ７  １Ｇ１０  ２Ｂ４、１８−２Ａ−１、６３−１Ａ−２および３Ｅ５  ２Ｇ４は癌細胞の増殖を低減した（図２７）。
【０３８７】
内因性にＧＴ４６８を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞のコロニー形成への、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の阻害活性を分析するため、クローン原性アッセイを実施した。細胞を４８穴プレートに接種し（３０００細胞／ウエル）、ＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（４５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。１４日間にわたって増殖させたコロニーをグルタルアルデヒドで固定し、目視評価のためにクリスタルバイオレットで染色した。細胞を抗体と共にインキュベートすることにより、コロニー形成が低減または阻害された（図１９）。コロニー形成は、個々の腫瘍細胞が器官に定着した場合の転移の形成に関して重要である。抗体の阻害活性は、転移の形成を抑制する上でのそれらの潜在能を示す。
【０３８８】
実施例１１：抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体での処置はヌードマウスにおいて異種移植腫瘍の増殖を減弱させる
ＧＴ４６８陽性ＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌細胞をヌードマウスに皮下注射し、動物を精製抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体で処置した。図２４は、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体での処置がヌードマウスにおいてＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌異種移植腫瘍の増殖を減弱させることを明らかにする。
【０３８９】
実施例１２：抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体での処置はヌードマウスの肺における転移腫瘍量を減少させる
ＭＣＦ−７細胞を、１７β−エストラジオール持続放出型ペレットの皮下移植によって前処置した無胸腺ヌードマウスに静脈内注射し、動物を精製抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体で処置した。細胞の注射の５週間後に無胸腺マウスの肺における腫瘍量の定量のために用いたリアルタイムＰＣＲは、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体で処置したマウスの肺における転移腫瘍量の有意の減少を明らかにした（図２６Ａ、Ｂ）。
【図３Ａ】
2013522329.tif 000009
【図３Ｂ】
2013522329.tif 000010
【図３Ｃ】
2013522329.tif 000011
【図７】
2013522329.tif 000012
【図１０Ａ】
2013522329.tif 000013
【図１０Ｂ】
2013522329.tif 000014
【図１３】
2013522329.tif 000015
【図２０Ａ】
2013522329.tif 000016
【図２０Ｂ】
2013522329.tif 000017
【図２４】
2013522329.tif 000018
【図２５】
2013522329.tif 000019
【図２６Ａ】
2013522329.tif 000020
【図２６Ｂ】
2013522329.tif 000021
【図１Ａ】
2013522329.tif 000022
【図１Ｂ】
2013522329.tif 000023
【図１Ｃ】
2013522329.tif 000024
【図１Ｄ】
2013522329.tif 000025
【図１Ｅ】
2013522329.tif 000026
【図１Ｆ】
2013522329.tif 000027
【図１Ｇ】
2013522329.tif 000028
【図２Ａ】
2013522329.tif 000029
【図２Ｂ】
2013522329.tif 000030
【図４Ａ】
2013522329.tif 000031
【図４Ｂ】
2013522329.tif 000032
【図４Ｃ】
2013522329.tif 000033
【図５】
2013522329.tif 000034
【図６Ａ】
2013522329.tif 000035
【図６Ｂ】
2013522329.tif 000036
【図６Ｃ】
2013522329.tif 000037
【図６Ｄ】
2013522329.tif 000038
【図８】
2013522329.tif 000039
【図９】
2013522329.tif 000040
【図１１】
2013522329.tif 000041
【図１２】
2013522329.tif 000042
【図１４】
2013522329.tif 000043
【図１５】
2013522329.tif 000044
【図１６Ａ】
2013522329.tif 000045
【図１６Ｂ】
2013522329.tif 000046
【図１７】
2013522329.tif 000047
【図１８】
2013522329.tif 000048
【図１９】
2013522329.tif 000049
【図２１】
2013522329.tif 000050
【図２２】
2013522329.tif 000051
【図２３】
2013522329.tif 000052
【図２７】
2013522329.tif 000053
【配列表】
2013522329000001.app
【国際調査報告】
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2013522329.tif 000056
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