(57)【要約】本発明は、細胞において増加した活性、および従って増加したシグナル強度を有する、蛍光タンパク質、特に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｓ）に関する。本発明のさらなる局面は、細胞におけるタンパク質の発現および／または安定性を増加させるためのペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に対して少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号３の１〜４つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されており、前記の１〜４つのアミノ酸残基はＳ５８、Ｆ６１、Ｑ６２およびＫ１５８の群から選択される、配列に対して、少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％同一である、アミノ酸配列
を有する蛍光タンパク質。
【請求項２】
Ｓ５８がＴを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
Ｆ６１がＬを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
Ｑ６２がＣを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
Ｋ１５８がＴを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
配列番号４に対して同一であるアミノ酸配列を有する請求項１、２、４および５記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
そのＮ末端またはそのＣ末端において、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント、ここで前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む、に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含む、請求項１〜６のいずれか記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の蛍光タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子を含む発現構築物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか記載の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか記載の蛍光タンパク質、請求項８記載の核酸分子、請求項９記載の発現構築物、または請求項１０記載の融合タンパク質を含む細胞または組織。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか記載の少なくとも１つの蛍光タンパク質、請求項８記載の核酸分子、請求項９記載の発現構築物、請求項１０記載の融合タンパク質または請求項１１記載の細胞を含む、キット。
【請求項１３】
細胞中におけるタンパク質の発現および／または安定性を増加させるための、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント、ここで前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む、に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドの使用。
【請求項１４】
前記ペプチドが、前記タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合している、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記ペプチドがさらに、好ましくは前記タンパク質の抗体認識および／または精製のためのタグとして使用される、請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
前記タンパク質がレポータータンパク質である、請求項１３〜１５のいずれか記載の使用。
【請求項１７】
配列番号５に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１８】
細胞において発現しようとするタンパク質と、および配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント、ここで前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む、に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記ペプチドは、細胞において発現しようとするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合している、前記融合タンパク質。
【請求項１９】
細胞において発現しようとするタンパク質はレポータータンパク質である、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１７記載のペプチドまたは請求項１８もしくは１９記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２１】
配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント、ここで前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む、に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸分子の前又は後にマルチクローニングサイトを含む発現構築物。
【請求項２２】
配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント、ここで前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む、に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体。
【請求項２３】
請求項１７記載のペプチド、請求項１８または１９記載の融合タンパク質、請求項２０記載の核酸分子または請求項２２記載の抗体を含む細胞。
【請求項２４】
請求項１７記載の少なくとも１つのペプチド、請求項１８もしくは１９記載の融合タンパク質、請求項２０記載の核酸分子、請求項２１記載の発現構築物、請求項２２記載の抗体または請求項２３記載の細胞を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞において増加した活性、および従って増加したシグナル強度を有する蛍光タンパク質、特に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｓ）に関する。本発明のさらなる局面は、細胞においてタンパク質の発現および／または安定性を増加させるためのペプチドの使用に関する。
【０００２】
その容易に検出できる緑色の蛍光のために、オワンクラゲ（Aequorea victoria）というクラゲに由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、遺伝子の発現およびタンパク質の位置決定を研究するために幅広く使用されてきた。ＧＦＰ蛍光は基質または補因子を必要とせず；従って、多種多様な適用および細胞においてこのレポーターを使用することが可能である。
【０００３】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、２３８のアミノ酸からなるタンパク質であり（２６．９ｋＤａ）、これは青い光にさらされると明るい緑色の蛍光を示す。多くの他の海洋生物も同じような緑色蛍光タンパク質を有するが、ＧＦＰは伝統的にA. victoriaから初めて単離されたタンパク質を指す。A. victoria由来のＧＦＰは、３９５nmの波長において大きな励起ピークを、４７５nmにおいて小さな励起ピークを有する。その発光ピークは５０９nmにおいてであり、これは可視スペクトルのより低い緑色の部分にある。
【０００４】
ＧＦＰは、典型的なβバレル構造を有し、これはαへリックスと１つのβシートからなり、これは中心を通って走る発色団を含む。バレル（barrel）の内部へ面する側鎖はトリペプチドＳｅｒ６５−Ｔｙｒ６６−Ｇｌｙ６７において特異的な環化反応を誘導し、これにより発色団が形成される。翻訳後修飾のこの過程は成熟と呼ばれる。これらの側鎖との水素結合ネットワークおよび電子スタッキング相互作用は、野生型ＧＦＰおよびその数多くの誘導体の色に影響を及ぼす。バレルの堅く包まれた性質は、溶媒分子を排除し、発色団の蛍光が水によって消えるのを防御している。
【０００５】
幅広い用途の可能性および研究者の進化していく必要性に因り、ＧＦＰの多くの異なる突然変異体が工作されてきた（Shaner et al., 2005）。最初の主要な改良は、１９９５年に報告された単一点突然変異（Ｓ６５Ｔ）であった。この突然変異はＧＦＰのスペクトル特徴を劇的に改善し、その結果、増加した蛍光、光安定性が得られ、そしてピーク発光を５０９nmに維持しつつ主要な励起ピークを４８８nmにシフトした。これは、市販されているＦＩＴＣフィルターセットのスペクトル特徴に一致し、一般の研究者による使用の実用性が向上した。増強したＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を生じる３７℃フォールディング効率（Ｆ６４Ｌ）点突然変異体が１９９５年に発見され、そして哺乳動物細胞におけるＧＦＰの使用を促進した。あまり良好にフォールディングしないペプチドと融合した場合でさえもＧＦＰが迅速にフォールディングしそして成熟することを可能とする一連の突然変異に基づいたスーパーホルダーＧＦＰが２００６年に報告された。色突然変異体を含む多くの他の突然変異が作られ；特に、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質誘導体がある。ＢＦＰ誘導体はＹ６６Ｈ置換を含む。シアン誘導体における重要な突然変異はＹ６６Ｗ置換であり、これは発色団が、フェノール成分ではなくインドール成分と共に形成することを引き起こす。ＹＦＰ誘導体の赤色シフト波長はＴ２０３Ｙ突然変異によって達成され、そしてこれは置換チロシン残基と発色団との間のπ電子スタッキング相互作用に起因する。
【０００６】
多くの残基の半合理的な突然変異誘発により、フルオリン、および後にスーパーエクリプティック（super-ecliptic）フルオリンとして知られるｐＨ感受性突然変異体が得られた。シナプス小胞融合時のｐＨの急速な変化を活用することによって、シナプトブレビンにタグ化されたフルオリンを使用して、ニューロン中のシナプス活性を可視化した。
【０００７】
βバレル構造へのシステインの導入によって酸化還元感受性型のＧＦＰ（ｒｏＧＦＰ）を工作した。システインの酸化還元状態は、ｒｏＧＦＰの蛍光特性を決定する。
【０００８】
本発明の目的は、細胞において増加した活性、および従って増加したシグナル強度を有する蛍光タンパク質、特にＧＦＰｓを提供することであった。
【０００９】
本発明のこの目的は、配列番号３に対して少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号３の１〜４つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されており、前記の１〜４つのアミノ酸残基はＳ５８、Ｆ６１、Ｑ６２およびＫ１５８の群から選択される、配列に対して、少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列
を有する蛍光タンパク質によって解決される。
【００１０】
１つの態様において、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。しかしながら、例えば発色団の領域における単一のアミノ酸を交換することによって、蛍光タンパク質の色を、例えば黄色（ＹＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、青色（ＢＦＰ）および赤色（ＲＦＰ）に変化させることができることは当業者には公知である。
【００１１】
１つの態様において、蛍光タンパク質は、配列番号１１（ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して増加した活性を有する。好ましくは、増加した活性により、蛍光タンパク質を含む細胞の増加した蛍光強度が得られ、好ましくは、蛍光強度は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む細胞と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍増加している。
【００１２】
本明細書において使用する「活性」という用語は、蛍光タンパク質を含む細胞の蛍光強度を測定することによって好ましくは定量される、細胞中の蛍光タンパク質の活性を指すことを意味する。細胞中の蛍光タンパク質の活性は、細胞中のその濃度およびその実際の蛍光に依存し、濃度は、例えば、細胞内の発現レベルおよび／または安定性に依存する。それ故、本発明による蛍光タンパク質の「増加した活性」は、細胞中の増加した発現および／または増加した安定性（例えば減少した分解率に基づく）に起因し得るが、タンパク質それ自体の増加した蛍光にも起因し得る。特定の理論によって固めたくはないが、本発明者らは、本発明による蛍光タンパク質の増加した活性、および従って増加したシグナル強度は、主に、細胞中におけるその増加した発現に基づくと考える。
【００１３】
１つの態様において、Ｓ５８はＴを用いて置換されている。
【００１４】
１つの態様において、Ｆ６１はＬを用いて置換されている。
【００１５】
１つの態様において、Ｑ６２はＣを用いて置換されている。
【００１６】
１つの態様において、Ｋ１５８はＴを用いて置換されている。
【００１７】
１つの態様において、蛍光タンパク質は、配列番号４と同一であるアミノ酸配列を有する。好ましくは、蛍光タンパク質は、配列番号１１（ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して増加した活性を有する。好ましくは、増加した活性により、蛍光タンパク質を含む細胞の増加した蛍光強度が得られ、好ましくは、蛍光強度は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む細胞と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍増加している。
【００１８】
１つの態様において、蛍光タンパク質はさらに、そのＮ末端またはそのＣ末端において、好ましくはそのＣ末端において、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００１９】
好ましくは、そのＮ末端またはそのＣ末端において、好ましくはそのＣ末端において前記ペプチドをさらに含む蛍光タンパク質は、１０時間を超える、好ましくは１５時間を超える、より好ましくは２０時間を超える細胞内半減期を有する。
【００２０】
本明細書において使用する「細胞内半減期」という用語は、細胞中で発現された蛍光タンパク質からの蛍光シグナルの半分が消失し、そして半分が残っている時間を指すことを意味する。
【００２１】
本発明の目的はまた、前記に定義した蛍光タンパク質をコードする核酸分子によっても解決される。
【００２２】
本明細書において使用する「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。好ましい態様において、核酸分子はＤＮＡである。
【００２３】
１つの態様において、細胞、特に真核細胞におけるコードタンパク質の発現を増加させるために、核酸分子中のＲＮａｓｅＬ開裂部位（特にＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド）の数は減少している（PCT/EP2010/000271参照）。
【００２４】
本発明の目的はまた、前記に定義した核酸分子を含む発現構築物によっても解決される。
【００２５】
本明細書において使用する「発現構築物」という用語は、発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターを指すことを意味する。
【００２６】
本明細書において使用する「発現活性ＰＣＲ産物」という用語は、対象のＤＮＡ配列（例えばｃＤＮＡ、オープンリーディングフレーム、または発現ベクターに含まれる遺伝子）にフランキングする配列に対して相補的である２つのプライマーを使用してＰＣＲ増幅によって生成されたＰＣＲ産物を指すことを意味し、得られたＰＣＲ産物は、プロモーター、対象のＤＮＡ配列および転写終結配列を含み、そして宿主細胞にトランスフェクションされると対象のＤＮＡの発現を可能とする（また、Al-Zoghaibi et al., 2007参照）。
【００２７】
好ましくは、発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは例えば遺伝子工学において慣用的に使用される別のベクターである。
【００２８】
本発明の目的はまた、前記に定義した蛍光タンパク質を含む融合タンパク質によっても解決される。
【００２９】
本発明の目的はさらに、前記に定義した蛍光タンパク質、前記に定義した核酸分子、前記に定義した発現構築物または前記に定義した融合タンパク質を含む、細胞または組織によって解決される。
【００３０】
本明細書において使用する「細胞」という用語は、任意の原核細胞または真核細胞を指し、真核細胞が好ましい。原核細胞としては、Escherichia、Streptomyces、SalmonellaまたはBacillus種の細菌が挙げられる。適切な真核細胞としては、酵母、例えばSaccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris、昆虫細胞、例えばDrosophila S2またはSpodoptera Sf9細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。使用することのできる哺乳動物細胞としては、ヒトＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ−７、Ｈ９およびジャーカット細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７およびＣＶＩ、ウズラＱＣＩ−３細胞、マウスＬ細胞、ボーズ（Bowes）メラノーマ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。また、本発明の範囲内には、初代哺乳動物細胞または細胞株がある。初代細胞は、生物から直接的に得られた細胞である。適切な初代細胞は、例えば、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス初代肝細胞、心筋細胞および神経細胞、並びにマウス筋幹細胞（サテライト細胞）およびそれから誘導された安定で不死化された細胞株である。前記の（宿主）細胞のための適切な培養培地および条件は当技術分野において公知である。
【００３１】
本明細書において使用する「組織」という用語は、細胞と完全な生物との間の中間である細胞構成レベルを指す。従って、組織は、必ずしも同一ではないが同じ起源に由来する、一緒に特定の機能を実施する、細胞のアンサンブルである。
【００３２】
本発明の目的はまた、前記に定義した少なくとも１つの蛍光タンパク質、前記に定義した核酸分子、前記に定義した発現構築物、前記に定義した融合タンパク質または前記に定義した細胞を含むキットによって解決される。
【００３３】
キットの種々の成分は、１つ以上の容器に、例えば１つ以上のバイアルにパッケージングされ得る。バイアルは、成分の他に、保存のための保存剤または緩衝剤を含み得る。
【００３４】
本発明の別の局面は、細胞中におけるタンパク質、特に組換えタンパク質の発現および／または安定性を増加させるための、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは、少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドの使用に関する。
【００３５】
１つの態様において、前記ペプチドは、前記タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合している。好ましくは、前記ペプチドは前記タンパク質のＣ末端に融合している。
【００３６】
１つの態様において、前記ペプチドはさらに、好ましくは前記タンパク質の抗体認識（「エピトープタグ」）および／または精製（「アフィニティタグ」）のためのタグとして使用される。一般的に使用されるタグと同じように（例えばｍｙｃ、ＨＡ、Ｈｉｓ）、開裂部位（例えば特異的なプロテアーゼ部位）がペプチドとタンパク質との間に挿入されていれば、ペプチドは酵素的開裂によって除去され得る。
【００３７】
１つの態様において、タンパク質はレポータータンパク質である。
【００３８】
本明細書において使用する「レポータータンパク質」という用語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌ホルモン、分泌サイトカイン、β−ガラクトシダーゼ、および他の蛍光および生物発光タンパク質を含む（これに限定されない）、蛍光および非蛍光レポータータンパク質を指す。
【００３９】
本発明の別の局面は、配列番号５に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００４０】
本発明のさらなる局面は、細胞中において発現しようとするタンパク質と、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドとを含む融合タンパク質に関し、前記ペプチドは、細胞中において発現しようとするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合している。好ましくは、前記ペプチドは、細胞中において発現しようとするタンパク質のＣ末端に融合している。
【００４１】
１つの態様において、細胞中で発現しようとするタンパク質は、前記に定義したレポータータンパク質である。
【００４２】
好ましくは、融合タンパク質は、細胞中において発現しようとする、そのＮ末端またはＣ末端にペプチドを有さないタンパク質と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍増加した細胞内半減期を有する。
【００４３】
非蛍光タンパク質の場合、「細胞内半減期」という用語は単純に、細胞中において発現される非蛍光タンパク質の最初の量の半分が例えば分解に因り消失し、そして半分が残っている時間を指す。
【００４４】
本発明のまたさらなる局面は、前記に定義したペプチドをまたは前記に定義した融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００４５】
さらなる局面において、本発明は、細胞中において発現しようとするタンパク質、特に組換えタンパク質の発現および／または安定性を増加させる方法に関し、前記方法は、
−  前記に定義した融合タンパク質をコードする核酸分子を準備する工程；
−  核酸分子を発現ベクターに挿入（すなわちクローニング）する工程；および
−  発現ベクターを細胞中に形質転換、トランスフェクションまたは注入する工程
を含む。
【００４６】
さらなる局面において、本発明は、細胞中において発現しようとするタンパク質、特に組換えタンパク質の発現および／または安定性を増加させる方法に関し、前記方法は、
−  前記に定義した融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現活性ＰＣＲ産物を準備する工程；および
−  発現活性ＰＣＲ産物を細胞中にトランスフェクションまたは注入する工程
を含む。
【００４７】
本発明のさらなる局面は、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸分子の前後にマルチクローニングサイトを含む発現構築物に関する。
【００４８】
さらなる局面において、本発明は、細胞中において発現しようとするタンパク質、特に組換えタンパク質の発現および／または安定性を増加させる方法に関し、前記方法は、
−  細胞中において発現しようとするタンパク質をコードする核酸分子を準備する工程；
−  前記に定義した発現構築物に核酸分子を挿入（すなわちクローニング）する工程；および
−  発現構築物を細胞中に形質転換、トランスフェクションまたは注入する工程
を含む。
【００４９】
本発明のさらなる局面は、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体に関する。
【００５０】
「抗体」という用語は、ターゲット、抗原またはエピトープ（ここでは、前記に定義したペプチドまたはペプチドの一部）に対して親和性を有するポリペプチドを指し、そしてこれには天然に存在する抗体および工学操作された抗体の両方が含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニヤ化（veneered）、および一本鎖の抗体、並びに抗体のフラグメント（例えばＦｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ）を包含する。
【００５１】
本発明のさらなる局面は、前記に定義したペプチド、前記に定義した融合タンパク質、前記に定義した核酸分子または前記に定義した抗体、を含む細胞に関する。
【００５２】
本発明のさらなる局面は、前記に定義した少なくとも１つのペプチド、前記に定義した融合タンパク質、前記に定義した核酸分子、前記に定義した発現構築物、前記に定義した抗体または前記に定義した細胞、を含むキットに関する。
【００５３】
キットの種々の成分を、１つ以上の容器に、例えば１つ以上のバイアルにパッケージングし得る。バイアルは、成分の他に、保存のための保存剤または緩衝剤を含み得る。
【００５４】
本明細書において使用する「同一率（％）」という用語は、２つのアミノ酸配列間の配列同一性を指す。比較の目的でアラインさせ得る両配列中の位置を比較することによって同一性を決定することができる。比較した配列中における等価な位置が同じアミノ酸によって占有されている場合、その分子はその位置において同一であると判断される。
【００５５】
好ましくは、非同一性（例えば、最大で１８％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、または最大で１％）は、配列番号３のアミノ酸配列または配列（配列番号３の１〜４つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されており、前記の１〜４つのアミノ酸残基は、Ｓ５８、Ｆ６１、Ｑ６２およびＫ１５８の群から選択される）を有する蛍光タンパク質と比較して、あるいは、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を有するペプチドと比較して、蛍光タンパク質またはペプチドの活性または機能を変化させないアミノ酸交換に基づく。
【００５６】
一般に、当業者は、タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列におけるいくつかのアミノ酸交換は、タンパク質またはペプチドの機能、活性および／または（二次または三次）構造に対して全く影響を及ぼさないという事実を知っている。本明細書において開示したアミノ酸配列と比較してこのような「中性の」アミノ酸交換を有するアミノ酸配列は、本発明の範囲内に該当する。
【００５７】
本発明による蛍光タンパク質は、細胞において増加した活性、および従って増加したシグナル強度を示す。本発明による蛍光タンパク質は、遺伝子発現のモニタリングおよびタンパク質の位置決定を含む、多種多様な適用に有用である。
【００５８】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを、本発明による蛍光タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合させることによって、細胞中におけるその発現および／または安定性、および従ってその活性が有意に増加することを見出した。しかしながら、この原則は本発明の蛍光タンパク質に限定されず、任意の他のレポータータンパク質、または事実、細胞中において発現しようとする任意の他のタンパク質のために使用することができる。それは、組換えタンパク質に、特に、細胞中で発現することが一般的に難しいものにとって特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、種々の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｓ）を有する７５ngの発現プラスミドを用いてのトランスフェクションから２日後のＨｕｈ−７細胞の蛍光強度を示す。蛍光を、ＢＤ自動化バイオイメージ解析装置によって獲得したイメージから評価し、そしてＰｒｏＸｃｅｌｌアルゴリズムを使用して定量した。数値は、４つの異なるウェルからの平均＋/−ＳＥＭである。
【図２】図２は、ＥＧＦＰ、ｃｏｎＧＦＰまたは種々のｃｏｎＧＦＰ突然変異体を有する発現プラスミドから誘導された７５ngのＰＣＲ産物を用いてのトランスフェクションから１日後のＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度を示す。蛍光を、ＢＤ自動化バイオイメージ解析装置によって獲得したイメージから評価し、そしてＰｒｏＸｃｅｌｌアルゴリズムを使用して定量した。数値は、４つの異なるウェルからの平均＋/−ＳＥＭである。＊、＊＊および＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、＜０．００５および＜０．００１を示す。
【図３】図３は、そのＣ末端に融合した種々のペプチドを有するまたは有さない種々のＧＦＰ変異体を有する５０ngの発現プラスミドを用いてのトランスフェクションから１日後のＨｕｈ−７細胞の蛍光強度を示す。「ＰＥＳＴ」は、マウスＭＯＤＣ１遺伝子の不安定化ドメインを指す。蛍光を、ＢＤ自動化バイオイメージ解析装置によって獲得したイメージから評価し、そしてＰｒｏＸｃｅｌｌアルゴリズムを使用して定量した。数値は、４つの異なるウェルからの平均＋/−ＳＥＭを示す。
【図４】図４は、種々のペプチドがそのＣ末端に融合した種々のＧＦＰ変異体を有する５０ngの発現プラスミド（グレイの円柱）または７５ngのＰＣＲ産物（白い円柱）を用いてのトランスフェクションから２日後のＨｕｈ−７細胞の蛍光強度を示す。蛍光を、ＢＤ自動化バイオイメージ解析装置によって獲得したイメージから評価し、そしてＰｒｏＸｃｅｌｌアルゴリズムを使用して定量した。数値は、４つの異なるウェルからの平均＋/−ＳＥＭを示す。
【図５】図５は、ホタルルシフェラーゼｃＤＮＡまたはホタルルシフェラーゼとペプチド２（配列番号１０）からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する５０ngの発現プラスミドを用いてのトランスフェクションから２日後のＨｕｈ−７細胞のルシフェラーゼ活性を示す。ルシフェラーゼ活性を、９６ウェルの標準的なルミノメーターで測定した。数値は、４つの異なるウェルからの平均＋/−ＳＥＭを示す。
【図６】図６は、種々のＧＦＰ変異体を有するプラスミドによるトランスフェクションから１日後、そしてシクロヘキシミド（ＣＨＸ）によるその後の処理から３時間後、５時間後および７時間後のＨｕｈ−７細胞の蛍光強度を示す。蛍光を、ＢＤ自動化バイオイメージ解析装置によって獲得したイメージから評価し、そしてＰｒｏＸｃｅｌｌアルゴリズムを使用して定量した。数値は、４つの異なるウェルからの平均＋/−ＳＥＭを示す。
【００６０】
配列表
配列番号１は、ＧＦＰｋｎｏｗｎとも呼ばれ、そしてこれは、非常に良好なシグナル強度を有することが知られる６つのＧＦＰｓのアラインメントに基づく共通アミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号２は、種々のＧＦＰｓの２６個の公共で入手可能なＧｅｎＢａｎｋ記録のアラインメントに基づく共通アミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３はまたｃｏｎＧＦＰとも呼ばれ、そしてこれは配列番号１と配列番号２の組合せである。より具体的には、配列番号１を使用して、配列番号２のギャップ（Ｘａａ）を充填した。
【００６３】
配列番号４はまたｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱとも呼ばれ、そしてこれは突然変異Ｓ５８Ｔ、Ｋ１５８ＴおよびＱ６２Ｃを有するｃｏｎＧＦＰ（配列番号３）のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号５は、２３残基の人工ペプチド１のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号６は、Danio rerio神経接着分子Ｌ１２に由来する、３３残基のペプチド２のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号７は、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ（配列番号４）およびペプチド１（配列番号５）からなる融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号８は、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ（配列番号４）およびペプチド２（配列番号６）からなる融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号９は、ホタルルシフェラーゼおよびペプチド１（配列番号５）からなる融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号１０は、ホタルルシフェラーゼおよびペプチド２（配列番号６）からなる融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号１１は、A. victoria増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列である。
【００７１】
実施例
１．  材料および方法
１．１  プラスミド
推定ＧＦＰｓおよびその変異体のコード領域を最初に、以前に記載されているような（PCT/EP2010/000271）ＵＵ／ＵＡジヌクレオチド出現頻度減少アプローチを使用して最適化し、その後、カスタム遺伝子合成のために提出した。コード領域を、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使用してＣＭＶプロモーターの制御下において発現ベクターにサブクローニングした。
【００７２】
１．２  細胞株
ＨＥＫ２９３細胞株をAmerican Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD)から得、そして１０％ＦＢＳおよび抗生物質の補充されたＤＭＥＭ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で培養した。Ｈｕｈ−７細胞株もまた、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を有するＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
【００７３】
１．３  レポータートランスフェクションおよびレポーター活性評価
９６ウェルの透明な底の黒いマイクロプレート中の細胞を、リポフェクタミン２０００試薬（Invitrogen）を使用して５０〜１００ngのレポーターベクターを用いてトランスフェクションした。全てのトランスフェクションは、図の説明文に示したようにいくつかのリプリケートで実施した。リプリケートマイクロウェル間のＧＦＰ蛍光のばらつきは６％未満であった；従って、この最小のばらつきでも、実験はトランスフェクション標準化を保証しない（Al-Zoghaibi et al., 2007）。自動化レーザー焦点画像撮影を、ハイスループットBD Pathway 435イメージ解析装置（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用して実施した。４８２nmの波長を励起に使用した。画像処理、セグメンテーションおよび蛍光定量はProXcellプログラムによって促進され、そしてこれは以前に記載された（al-Haj et al., 2009）。データは、各ウェルの全蛍光強度の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として提示され、リプリケートの解読は、本文で示したように３から４の範囲であった。２つのデータ群を比較する場合にはスチューデントｔ検定を使用したが、３つ以上のデータ群を有する各データセットについては分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。
【００７４】
２．  結果
非常に良好なシグナル強度を有することが知られる６つの異なるＧＦＰｓ（Aequorea victoria、Pontellina plumata、Pitlosarcus、Montastrea cavernosa、Renilla mullerei、Clavulariidae clavulariaの生物に由来）のアミノ酸配列のアラインメントによって、共通アミノ酸配列ＧＦＰｋｎｏｗｎ（配列番号１）を得た。配列番号１のタンパク質をコードする化学的に合成されたＤＮＡを有するプラスミドを用いてトランスフェクションされた細胞は全く蛍光を示さなかった（図１参照）。
【００７５】
種々のＧＦＰｓの２６個の公共で入手可能なＧｅｎＢａｎｋ記録のアラインメントにより、別の共通アミノ酸配列（配列番号２）が得られ、これは、その化学的に合成されたＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクションした後に、非常に弱い蛍光を示した（データは示さず）。
【００７６】
共通配列ＧＦＰｋｎｏｗｎ（配列番号１）を使用して、配列番号２のギャップ（Ｘａａとして示す）を充填した。配列番号１と配列番号２の組合せにより、ｃｏｎＧＦＰ（配列番号３）が得られた。ｃｏｎＧＦＰのアミノ酸配列を用いてのＢＬＡＳＴ探索により、いくつかのヒットしか判明せず、８２％未満の配列同一性であり、これは野生型および人工のＧＦＰｓを含んでいた。
【００７７】
ｃｏｎＧＦＰ−ＤＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞は、いくつかの個々の野生型ＧＦＰｓ（Montastrea cavernosa，Puntellina plumate）よりも低い蛍光強度を示したが、A. victoriaＧＦＰｓ（ＥＧＦＰを含む）よりも有意により高かった（すなわち少なくとも２倍）（図１）。
【００７８】
次に、ｃｏｎＧＦＰのいくつかの突然変異体をコードするＤＮＡを合成し、そしてＨＥＫ２９３細胞において試験した。突然変異体はＳ５８Ｔ、Ｆ６１Ｌ、Ｑ６２ＣおよびＫ１５８Ｔを含んでいた。これらの突然変異体の組合せにより、さらに増加した蛍光強度が得られ、これは全ての場合においてＥＧＦＰよりも高かった（図２参照）。三重の突然変異体のｃｏｎＧＦＰ Ｓ５８Ｔ Ｋ１５８Ｔ Ｑ６２Ｃ（ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱとも呼ばれる、配列番号４）は、ｃｏｎＧＦＰよりも約５倍高く、そしてＥＧＦＰよりも約１０倍高い蛍光強度を有する最善の蛍光タンパク質を示した。
【００７９】
本発明による蛍光タンパク質の性能は、ペプチド１（配列番号５）、ペプチド２（配列番号６）またはペプチド２のフラグメント（少なくとも２５の連続したアミノ酸を有する）を、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に加えることによってさらに改善され、より特定すると、これらのペプチドの１つをコードするＤＮＡ配列が、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端または３’末端にインフレームで加えられた。
【００８０】
ペプチド１は、非常に不安定な遺伝子のＰＥＳＴ含有アミノ酸フラグメントの共通配列を示す。ＰＥＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）に富んだペプチド配列である。この配列は、短い細胞内半減期を有するタンパク質と関連し；従って、ＰＥＳＴ配列は、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用すると仮定されている。驚くべきことに、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱのＣ末端へのペプチド１の付加（ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ−１）により、この蛍光タンパク質を含むＨｕｈ−７細胞の蛍光強度は劇的に増加した（図３参照）。
【００８１】
同様に、Danio rerio（ゼブラフィッシュ）神経接着分子Ｌ１２に由来し、そしてＰＥＳＴ様ドメインを含む、ペプチド２を、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱのＣ末端に付加することにより（ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ−２）、蛍光強度は有意に増加した（図３）。
【００８２】
ペプチド１または２を、本発明による蛍光タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した場合に観察される効果は、これらの特定のタンパク質に限定されない。図４に示されるように、市販されているＧＦＰ（「Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ」）へのペプチドの融合によっても、「野生型」ＭｏｎｓｔｅｒＧＦＰを含むＨｕｈ−７細胞と比較して蛍光強度は増加した。
【００８３】
さらに、ペプチド（ここではペプチド２）は、Ｈｕｈ−７細胞中のホタルルシフェラーゼ活性を増加させた（図５）。
【００８４】
種々のＧＦＰ変異体の細胞内安定性を決定するために、Ｈｕｈ−７細胞を、「野生型」ＥＧＦＰ、そのＣ末端に融合したマウスＭＯＤＣ１ＰＥＳＴドメインを有するＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴｍｏｄｃ）、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ−Ｐ１およびｃｏｎＧＦＰ−ＳＫＱ−Ｐ２を発現しているプラスミドを用いてトランスフェクションした（図６参照）。２４時間後、細胞を、タンパク質合成阻害剤のシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を用いて処理した。ＣＨＸの非特異的な毒性のために、実験を６〜８時間以上は延ばすことができなかった。ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＰＥＳＴｍｏｄｃの両方が、有意な速度で減衰した。７時間後には、僅か５１％（ＥＧＦＰ）および４４％（ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴｍｏｄｃ）の蛍光活性しか残っていなかった。従って、タンパク質の推定される細胞内半減期は３〜４時間であった。ｃｏｎＧＦＰ−ＳＱＫの場合には、７時間後に８７％の蛍光活性が残っているが、ｃｏｎＧＦＰ−ＳＱＫ−Ｐ１および−Ｐ２（すなわちｃｏｎＧＦＰ−ＳＱＫと、本発明によるペプチド１または２とを含む融合タンパク質）はさらにより安定であり、７時間後に約９０％が残っていた。ｃｏｎＧＦＰ−ＳＱＫの半減期は１０時間を超える、より可能性があるのは２０時間を超えるようであり、そしてｃｏｎＧＦＰ−ＳＱＫ−Ｐ１および−Ｐ２の半減期は明らかに２０時間を超え、おそらく２４時間を超える。従って、本発明のペプチド１および２はＰＥＳＴモチーフを含むが、不安定化効果は全く観察されない（マウスＭＯＤＣ１ ＰＥＳＴドメインとは対照的に；図６参照）。
【００８５】
驚くべきことに、本発明によるペプチドは、それらが融合しているタンパク質の発現および／または細胞内安定性を増加させるようである。増加した細胞内安定性（または細胞内半減期）は、融合タンパク質の低下した分解率に基づき得る。
【００８６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月1日(2013.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に対して少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号３の１〜４つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されており、前記の１〜４つのアミノ酸残基はＳ５８、Ｆ６１、Ｑ６２およびＫ１５８の群から選択される、配列に対して、少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％同一である、アミノ酸配列
を有する蛍光タンパク質。
【請求項２】
Ｓ５８がＴを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
Ｆ６１がＬを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
Ｑ６２がＣを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
Ｋ１５８がＴを用いて置換されている、請求項１記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
配列番号４に対して同一であるアミノ酸配列を有する請求項１、２、４および５記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
そのＮ末端またはそのＣ末端において、配列番号５または配列番号６または配列番号６のフラグメント、ここで前記フラグメントは少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む、に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含む、請求項１〜６のいずれか記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の蛍光タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子を含む発現構築物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか記載の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか記載の蛍光タンパク質、請求項８記載の核酸分子、請求項９記載の発現構築物、または請求項１０記載の融合タンパク質を含む細胞または組織。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか記載の少なくとも１つの蛍光タンパク質、請求項８記載の核酸分子、請求項９記載の発現構築物、請求項１０記載の融合タンパク質または請求項１１記載の細胞を含む、キット。
【国際調査報告】
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