(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３又はその変異体を含む組成物の有効量をヒトに投与する工程を包含する、ヒトの健康を向上させるための方法に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ２１６６１）又はバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体を含む組成物の有効量をヒトに投与する工程を包含する、ヒトの健康を向上させるための方法。
【請求項２】
前記組成物が、前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３により生成された代謝産物をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、胃腸障害を予防又は処置するのに有効な量でヒトに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記胃腸障害の少なくとも１つの症状が、軽減又は緩和される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記症状が、下痢である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記症状が、腹部痙攣である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記症状が、胃腸管の炎症である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記胃腸障害が、急性下痢、クロストリジウム・ディフィシル関連感染症、炎症性腸疾患、過敏性腸障害、及び抗生物質関連下痢からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、健全な腸微生物叢を維持するのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、ヒトにおける病原性細菌の増殖を減少させるのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原性細菌が、クロストリジウム属種、カンピロバクター属種、リステリア属種及びエシェリキア・コリからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、キャリアをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、他のプロバイオティクスと共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記他のプロバイオティクスが、サッカロミセス・ボウラディである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、胃腸障害を予防又は処置するために使用される薬物と共に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物が、抗生物質又は抗炎症薬である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、前記抗生物質の投与の完了後に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、１日に１キログラム当たり約１×１０４ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３〜１日に１キログラム当たり約１×１０１２ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の割合で、約３〜約７日間経口投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトにおける胃腸障害の少なくとも１つの症状を軽減するための組成物であって、（ｉ）前記障害の少なくとも１つの症状を軽減するのに有効な量のバチルス・サブティルスＱＳＴ７１３と、（ｉｉ）食料又は水以外の飲料とを含む、組成物。
【請求項２１】
前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の前記有効な量が、約１×１０３ＣＦＵ／ｇ食料〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇ食料である、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／３１４，９９７号に対する優先権を主張するものである。上述の出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
[0002]  本発明は、プロバイオティクスの分野、及びヒトの健康を特に胃腸障害を予防又は処置することによって改善するそれらの能力に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  バチルス属には、とりわけ農業、動物栄養及びヒトの健康の分野において無数の用途を有する非常に多くの内生胞子形成細菌が含まれる。現在いくつかのバチルスの菌株が、腸の健康を増進するためのプロバイオティクスとしての使用向けに販売されている。種々の商品がバチルス・ズブチリス、バチルス・リケニフォルミス、及びバチルス・コアギュランスの菌株を含有しているが、全てのバチルス菌株が有効なプロバイオティクスであるわけではなく、安全性及び有効性を判断するためには個別に評価されなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]  本発明は、ヒトに投与された場合にそのヒトの健康を向上させるバチルス・ズブチリスの菌株を提供する。具体的には、本発明は、胃腸障害を処置又は予防するのに有効な量でバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体、及び／又はバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体の代謝産物をヒトに投与することによってヒトの健康を向上させる方法に関する。このような投与は、そうした障害（例えば、下痢、腹部痙攣及び胃腸管の炎症）の症状を軽減、緩和又は予防し得る。
【０００５】
[0005]  本発明の組成物は、キャリア（例えば、腸溶コーティング）と組み合わせて胃腸障害を処置又は予防するのに有効な量でバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体及び／又はバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体の代謝産物を含み得る。他の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体、及び／又はバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体の代謝産物と、（ｉ）他のプロバイオティクス（例えば、サッカロミセス・ボウラディ）、（ｉｉ）胃腸障害を処置若しくは予防するために使用される薬物（例えば、抗炎症薬又はインターフェロン）、又は（ｉｉｉ）食料若しくは水以外の飲料（例えば、牛乳、又はレモネード、ジュース若しくは茶などの水のみからなるのではない飲料）若しくは粉ミルクとを含み得る。
【０００６】
[0006]  一部の実施形態において、本発明の組成物は、健康な腸微生物叢を維持するのに有効な量で投与される。他の実施形態において、本発明の組成物は、ヒトにおける病原性細菌の増殖を減少させるのに、又は病原体の毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）が減少するように病原性細菌の毒性因子を変化させるのに、有効な量で投与される。
【０００７】
[0007]  投与は、当該組成物のみ若しくは当該組成物を食料若しくは飲料と組み合わせて食べる若しくは飲むことによって、又は当該組成物を含む丸剤を飲みこむことによって、成し遂げられ得る。１つの実施形態において、この飲料は水ではない（例えば牛乳であり得る）又は水のみからなるのではない（例えばレモネード又はジュース又は茶であり得る）。
【０００８】
当該組成物の投与は、ヒトが胃腸障害の症状に見舞われた後、そのような症状を緩和するために、比較的短い期間行われ得る。また、投与は、胃腸障害の症状が発生又は再発するのを防ぐために、毎日又は他の一定間隔で行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[0008]  図１は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の、クロストリジウム属の種々の分離株に対する有効性についての試験の結果を示すものである。
【図２】[0009]  図２は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理を施した無細胞調製物の、クロストリジウム属の種々の分離株に対する有効性についての試験の結果を表わすものである。
【図３】[0010]  図３は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の、リステリア属の種々の分離株に対する有効性についての試験の結果を示すものである。
【図４】[0011]  図４は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理を施した無細胞調製物の、リステリア属の種々の分離株に対する有効性についての試験の結果を表わすものである。
【図５】[0012]  図５は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の、サルモネラ属の種々の分離株に対する有効性についての試験の結果を示すものである。
【図６】[0013]  図６は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理を施した無細胞調製物の、サルモネラ属の種々の分離株に対する有効性についての試験の結果を表わすものである。
【図７】[0014]  図７は、病原体に対するバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の有効性を試験するためにＱＳＴ７１３（縦）及びクロストリジウム・パーフリンジェンスの種々の分離株（横）の交差画線培養が行われた、寒天平板を示している。
【図８】[0015]  図８は、病原体に対するバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の有効性を試験するためにＱＳＴ７１３（縦）及びカンピロバクター・ジェジュニの種々の分離株（横）の交差画線培養が行われた、寒天平板を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[0016]  本発明は、プロバイオティクスとしてヒトの健康を向上させるのに有効な、バチルス・ズブチリス菌株ＱＳＴ７１３及び／又はその代謝産物の新規使用に関する。プロバイオティクスは、有害な細菌（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridia dificile））の低減を含め健全な腸微生物叢を維持するために、及び胃腸障害の症状を緩和するために、ヒトの健康用途において使用される。
【００１１】
[0017]  本発明は、（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、（ｉｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の無細胞調製物、又は（ｉｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の代謝産物を含む、組成物を患者に投与することによってヒトの健康を向上させる（治療又は非治療的）方法を包含する。
【００１２】
[0018]  バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、その上清、及びその代謝産物、並びに植物病原体及び昆虫を制御するためのそれらの使用方法は、米国特許第６，０６０，０５１号明細書、同第６，１０３，２２８号明細書、同第６，２９１，４２６号明細書、同第６，４１７，１６３号明細書、及び同第６，６３８，９１０号明細書に、十分に記載されている。これらの特許においては、この菌株は、ＡＱ７１３と呼ばれている。バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、１９９７年５月７日にＮＲＲＬに受託番号Ｂ２１６６１で寄託された。本明細書におけるＱＳＴ７１３への言及は、いずれもバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３に言及するものである。
【００１３】
[0019]  バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３株は、ある特定の特性を有しており、驚くべきことに、これが、この菌株をヒトの健康を向上させるのによく適したものとすることが見出された。ＱＳＴ７１３の胞子は、低いｐＨで生存可能であり、ＱＳＴ７１３の細胞は、（促進栄養素条件（conducive nutrient condition）が与えられて）４．５もの低いｐＨで増殖する。ＱＳＴ７１３はまた、実施例２に示されるように、集合又はスウォーミングし、その結果、病原性細菌を競合排除（outcompete）し減少させる能力を有している。いかなる特定の理論によっても限定されることを望むものではないが、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、（ｉ）抗菌性代謝産物を生成すること、（ｉｉ）病原体よりも多くの栄養素及び／若しくは付着場所を使用することによって病原体と競合し、それにより腸内の病原性細菌の有効な定着を妨げること、（ｉｉｉ）免疫調節、並びに／又は（ｉｖ）病原体の毒性が減少することになるような細菌病原体の毒性因子の変更を含む、多岐にわたる作用様式によってヒトの健康を向上させると考えられる。
【００１４】
[0020]  本発明の１つの態様において、ヒトに投与される組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の全ての同定特性を有するＱＳＴ７１３の変異体を含む。そのような変異体は、ＱＳＴ７１３に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のＤＮＡ配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、変異体は、自然突然変異体である。自然突然変異体という用語は、変異原の意図的な使用なしに、ＱＳＴ７１３から生じる変異体をいう。そのような自然突然変異体は、典型的な方法（例えば、親がそれに対して感受性のある特定の抗生物質の存在下でバチルス・ズブチリス菌株を培養し、生物活性の改善について、又は本出願においては、胃腸障害の症状を軽減することによるなどのヒトの健康を向上させる能力の改善について、任意の耐性変異体を試験することによって、得られ得る。自然突然変異体を同定するための他の方法は、当業者には知られているであろう。
【００１５】
[0021]  本出願におけるバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３又はその変異体への言及は全て、自然から単離され、例えば実験室内又は工業条件下で、人によって培養されている細菌に言及するものである。
【００１６】
[0022]    バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞は、胞子（休眠中である）として、栄養細胞（増殖中である）として、移行状態細胞（増殖期から胞子形成期に移行中である）として、又はこれらの種類の細胞の全ての組み合わせとして、本発明の組成物中に存在し得る。一部の実施形態において、組成物は、主として胞子を含む。他の実施形態において、組成物は、胞子と、下記のように細胞が胞子を形成する前の発酵の間に細胞によって生成された、代謝産物とを含む。
【００１７】
[0023]  ＱＳＴ７１３又はその変異体の代謝産物としては、リポペプチド（例えば、イツリン、サーファクチン、プリパスタチン、及びアグラスタチン）及び抗菌特性を有する他の化合物が挙げられる。ＱＳＴ７１３のリポペプチド代謝産物は、米国特許第６，２９１，４２６号明細書及び同第６，６３８，９１０号明細書に詳細に記載されている。
【００１８】
[0024]  本発明の組成物は、米国特許第６，０６０，０５１号明細書に記載されている培地及び他の方法を使用することによるなどの、当該技術分野において周知の方法に従って、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３又はその変異体を培養することによって得られ得る。従来の大規模微生物培養方法としては、液内発酵、固体発酵、又は液体表面培養が挙げられる。発酵の終わり近くに、栄養素が枯渇すると、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞は、増殖期から胞子形成期への移行を開始し、その結果、発酵の最終生成物は、主として胞子、代謝産物及び残留発酵培地となる。胞子形成は、このバチルス・ズブチリスの自然の生活環の一部であり、一般に、栄養素制限に応答して細胞により開始される。発酵は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の高レベルのコロニー形成単位を得るように、そして胞子形成を促進するように構成される。発酵の結果として生じる培養培地中の細菌細胞、胞子及び代謝産物は、直接使用されても、従来の工業的方法（例えば、遠心分離、接線流濾過、深層濾過、及び蒸発）によって濃縮されてもよい。一部の実施形態において、濃縮された発酵ブロスは、残留発酵ブロス及び代謝産物を除去するために、例えばダイアフィルトレーション工程によって、洗浄される。
【００１９】
[0025]  発酵ブロス又はブロス濃縮物は、キャリアを添加して又は添加せずに、従来の乾燥工程又は方法（例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、又は蒸発）を用いて乾燥され得る。結果として生じる乾燥生成物は、例えば粉砕又は造粒によって、さらに処理されて、特定の粒径又は物理的形態を達成し得る。後述されるキャリアは、乾燥後にも添加され得る。
【００２０】
[0026]  ＱＳＴ７１３の発酵ブロスの無細胞調製物は、当該技術分野において公知の任意の手段（例えば、抽出、遠心分離及び／又は発酵ブロスの濾過）によって得られ得る。当業者は、いわゆる無細胞調製物が、細胞を除去するために使用される技術（例えば、遠心分離の速度）によっては、細胞が全くないわけではないことがあり得、ほぼ無細胞又は実質的に無細胞であることを理解するであろう。結果として生じる無細胞調製物は、乾燥され得、且つ／又はヒトへのその投与の助けとなる成分と共に製剤化され得る。発酵ブロスについて上で記載された濃縮方法及び乾燥技術が、無細胞調製物にも適用可能である。
【００２１】
[0027]  ＱＳＴ７１３の代謝産物は、米国特許第６．０６０，０５１号明細書に示されている方法に従って得られ得る。用語「代謝産物」は、本明細書で使用される場合、半純粋な代謝産物及び純粋若しくは実質的に純粋な代謝産物、又はバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３から分離されていない代謝産物を指し得る。リポペプチド及びＱＳＴ７１３の他の殺菌性代謝産物は、６００キロダルトン〜１００ダルトンの間である。したがって、一部の実施形態においては、無細胞調製物がＱＳＴ７１３の発酵ブロスの遠心分離によって作製された後、代謝産物は、分子量カットオフ（例えば、６００ｋＤａ未満、５００ｋＤａ未満、４００ｋＤａ未満などの分子量）に基づき代謝産物を異なる画分に分類するサイズ排除濾過によって精製され得る。発酵ブロスの製剤化について上で記載された濃縮方法及び乾燥技術が、代謝産物にも適用可能である。
【００２２】
[0028]  本発明の組成物は、回収、有効性若しくは物性を改善するために、並びに／又は包装及び投与を助けるために、細胞、無細胞調製物又は代謝産物を含む組成物に添加される、不活性な製剤用成分であるキャリアを含み得る。そのようなキャリアは、個々に又は組み合せて添加され得る。一部の実施形態において、キャリアは、発酵ブロスを濃縮した後、並びに乾燥の間及び／又は乾燥の後に、添加される。従来の固体キャリアは、シリコン、デンプン、タルク、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、メチルセルロース、アルギナート、デキストラン、アラビアゴム及び当業者に周知の他の従来のキャリアである。他の製剤用成分（例えば、希釈剤、結合剤、滑沢剤、色素及び矯味矯臭剤）もまた、使用され得る。
【００２３】
[0029]  １つの実施形態において、本発明の組成物は、固形製剤（例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤及びカシェ剤（wafer））又は液剤（例えば、懸濁剤）の形態であり得る。本発明の組成物はまた、食料又は飲料（患者の特定の栄養要求に対して医師によって処方された医療食品、粉ミルク、健康食品、及び栄養補助食品を含む）に組み込まれ得る。あるいは、組成物は、消費の直前に食料又は飲料（例えば、水又は水以外の飲料（すなわち、水を用いて製造されていない又は水のみからなるのではない飲料））と混合するための粉末、顆粒又は液体の形態で調製され得る。
【００２４】
[0030]  組成物がＱＳＴ７１３若しくはその変異体の代謝産物、又はＱＳＴ７１３若しくはその変異体の栄養細胞、又はＱＳＴ７１３若しくはその変異体の無細胞調製物を含む実施形態において、当該組成物は、胃の中ではそのままの状態であるが小腸又は大腸に到達すると溶解し、代謝産物（例えば、バクテリオシン及び／又はリポペプチド）及び／又は栄養細胞を放出する腸溶コーティングを用いて製剤化され得る。
【００２５】
[0031]  組成物が食料又は飲料と別個に処方される実施形態において、処方された組成物中の（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体、（ｉｉ）ＱＳＴ７１３若しくはその変異体の無細胞調製物、（ｉｉｉ）ＱＳＴ７１３若しくはその変異体の代謝産物、又は（ｉｖ）細胞及び代謝産物の組み合わせの、重量／重量ベース（ｗ／ｗ）の濃度は、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％であり得る。一部の実施形態、例えば、濃縮処方ブロスが洗浄され、加熱なしで（例えば凍結乾燥により）乾燥された実施形態においては、最終組成物中のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３又はその変異体の濃度は、約９０％〜約１００％であり得る。
【００２６】
[0032]  本発明の組成物は、ヒトに投与／食物として供給されて、腸の健康又はそのようなヒトの総合的な全身状態を改善し得る。当該組成物は、治療用途及び非治療的用途の両方のために投与され得る。本発明の組成物の有効量は、ヒトの健康を、当該組成物は投与されていないがそれ以外は当該組成物を与えられたヒトと同じ食事を投与され且つ当該組成物を投与されたヒトと同じ障害若しくは症状を有するか又は同じ障害の同じ危険に曝されているヒトと比較して、向上させるのに有効な量である。あるいは、有効量は、胃腸障害の再発を防止する、又は胃腸障害の症状を軽減するのに必要とされる量である。
【００２７】
[0033]  １つの実施形態において、組成物は、胃腸障害に罹患した又は胃腸障害の危険に曝されているヒトの健康を、そのような障害の症状を軽減すること又はそのような障害の発生率若しくは再発率を低下させることによって、向上させるために使用される。胃腸障害としては、急性下痢（例えば、旅行者下痢又は食中毒若しくは風邪に起因する胃腸炎）、炎症性腸疾患、過敏性腸障害、抗生物質関連下痢、及びクロストリジウム・ディフィシル関連下痢が挙げられる。過敏性腸疾患の主要形態は、クローン病及び潰瘍性大腸炎である。そのような胃腸障害の症状は周知であり、例えば、下痢、腹痛、体重減少、胃腸管の炎症及び嘔吐が挙げられる。
【００２８】
[0034]  したがって、上記のことに鑑みて、本出願の実施形態は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体に由来する無細胞調製物、又はＱＳＴ７１３若しくはその変異体の代謝産物を含む組成物をヒトに投与／食物として供給することによって、正常な体重増加を回復させる、健全な腸微生物叢を維持する、下痢を軽減する、及び胃腸管の炎症を減少させるというような、非治療的方法に関する。
【００２９】
[0035]  腸微生物叢の維持は、本発明の方法が適用されなかったヒトと比較して、公衆衛生上懸念される有害な病因性微生物を（殺す又はその増殖を阻害することによって）減少させること、及び／又は有益な細菌（例えば、乳酸菌及びビフィズス菌）を増加させること若しくはその健全なレベルを維持することをいう。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、有益な細菌の方の増加は、そのような細菌の増殖を刺激することによって、又は単に、病原性細菌を選択的に減少させ、それにより、増殖するため及び腸壁に付着するためのより多くの場所並びに／又は栄養素及び成長因子へのより効率的なアクセスを有益な細菌に与えることによって、もたらされ得ると考えられる。さらに、又はあるいは、有益な細菌は、病原性細菌の毒性因子を変化させ得、そうして、病原性細菌の毒性を低減させ得る。本発明の方法によって減少させ得る有害な病因性細菌としては、クロストリジウム属種（例えば、パーフリンジェンス及びディフィシル（dificile））、リステリア属種（例えば、モノサイトゲネス、ゼーリゲリ及びウェルシメリ）、サルモネラ属種（例えば、エンテリカ、アリゾナエ、チフィムリウム、エンテリティディス及びボンゴリ）、エシェリキア・コリ、エンテロコッカス属種（例えば、フェカーリス及びフェシウム）、カンピロバクター、アエロモナス属種、スタフィロコッカス・アウレウス、シゲラ・ディゼンテリエ及びビブリオ属種が挙げられる。一部の実施形態において、有害な病因性微生物は、約０．５ｌｏｇ、約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、又は約５ｌｏｇ減少し得る。
【００３０】
[0036]  本発明の方法はまた、治療量の抗生物質の投与後に、病原性細菌の増殖を阻害することによって及び／又は有益な細菌の増殖を増大若しくは維持することによって正常な腸バランスを回復させるためにも使用され得る。用語「治療量」は、ヒトにおける病状を改善する又は逆転させるのに十分な量をいう。
【００３１】
[0037]  別の態様において、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、ＱＳＴ７１３及びその変異体の無細胞調製物、並びにＱＳＴ７１３及びその変異体の代謝産物を含む本発明の組成物は、他のプロバイオティクス（例えば、他の細菌胞子形成因子）若しくはプレバイオティクスをさらに含み得る、又は他のプロバイオティクス（例えば、他の細菌胞子形成因子）若しくはプレバイオティクスと共に投与され得る。プロバイオティクスの例は、Hong,H.A.他「The use of bacterial spore formers as probiotics」FEMS Microbiology Reviews 29(2005)813-835に示されている。プレバイオティクスは、腸でのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３若しくはその変異体の増殖及び／又は活性を刺激する化合物（例えば、イヌリン、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖及びダイズオリゴ糖を含むオリゴ糖、並びに遊離ヌクレオチド）である。
【００３２】
[0038]  別の態様において、本発明の組成物は、止瀉薬、ガス抑制剤（anti-gas agent）、食物繊維、抗生物質（例えば、メトトレキサート）、抗炎症薬、アミノ酸、電解質、ビタミン及びミネラルを含み得る、又はそれらと共に（同時に又は異なる時間に）投与され得る。
【００３３】
[0039]  組成物がＱＳＴ７１３又はその変異体を含む実施形態において、当該細菌は、ヒトの健康を向上させるのに有効な量で投与されるべきである。組成物が胃腸障害を処置又は予防するために投与されることになる実施形態において、それらは、そのような障害に罹患している又はそのような障害の危険に曝されている患者に対し、体重１キログラム当たり約１×１３ＣＦＵのバチルス・ズブチリス〜体重１キログラム当たり約１×１０１５のバチルス・ズブチリスの用量で投与されるべきである。別の実施形態においては、１キログラム当たり約１×１０４ＣＦＵのバチルス・ズブチリス〜１キログラム当たり約１×１０１１のバチルス・ズブチリスが、投与されるべきである。さらに別の実施形態においては、１キログラム当たり約１×１０５ＣＦＵのバチルス・ズブチリス〜１キログラム当たり約１×１０１０のバチルス・ズブチリスが、投与されるべきである。さらに別の実施形態においては、１キログラム当たり約１×１０６ＣＦＵのバチルス・ズブチリス〜１キログラム当たり約１×１０９のバチルス・ズブチリスが、投与されるべきである。一部の実施形態において、この用量は、体重１キログラム当たり約１×１０３ＣＦＵのバチルス・ズブチリス、１キログラム当たり約１×１０４又は約１×１０５又は約１×１０６又は約１×１０７又は約１×１０８又は約１×１０９又は約１×１０１０又は約１×１０１１又は約１×１０１２ＣＦＵのバチルス・ズブチリスである。当該組成物は、典型的に、経口投与され、数日間毎日上記の用量で投与される。当該組成物は、最初に症状が緩和された後、最初に使用された用量よりも少ない用量でより長い期間にわたって投与され得る。予防目的のためには、当該組成物は、毎日又は他の一定間隔で投与され得る。
【００３４】
[0040]  本発明の組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて調合薬として経口投与され得る。最適な投与量レベルは、とりわけ組成物の（ｉ）腸内の病原性細菌を阻害若しくは減少させる能力を様々な用量で、（ｉｉ）有益な細菌のレベルを増大若しくは維持する能力及び／又は（ｉｉ）ヒトの健康を向上させる能力を様々な用量で、評価することによって、当業者により容易に決定され得る。
【００３５】
[0041]  以下の実施例は、純粋に本発明を説明する目的で示されており、本発明を限定する目的では示されていない。
【００３６】
実施例１−病原体に対するＱＳＴ７１３無細胞調製物の有効性についてのインビトロ調査
[0042]  ＱＳＴ７１３の無細胞調製物を、クロストリジウム属（クロストリジウム・パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４及びクロストリジウム・パーフリンジェンスの２つの環境分離株）；リステリア属（リステリア・モノサイトゲネスＡＴＣＣ１９１１６及び１９１１１、リステリア・ゼーリゲリＡＴＣＣ３５９６８及びリステリア・ウェルシメリＡＴＣＣ３５８９７）；サルモネラ属（サルモネラ・エンテリカＡＴＣＣ１０３９８、サルモネラ・アリゾナエＡＴＣＣ１３３１４及びサルモネラ・ボンゴリＡＴＣＣ４３９７５）；及びエシェリキア・コリに対する抗菌活性について、キルビー・バウアー及び最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）法を使用して、試験した。
【００３７】
[0043]  無細胞調製物は、下記の表１に示されるような標的病原体を培養した培地に対応する培地でＱＳＴ７１３を培養し、その培養物を２３℃で１５分間にわたり３０００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、それを０．４５μｍのＮａｌｇｅｎｅフィルターユニットに通して濾過することによって、調製した。熱安定性について試験するために、無細胞調製物の一部を、キルビー・バウアー及びＭＩＣのそれぞれの試験の前１時間にわたり、５０℃に加熱した。
【表１】
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【００３８】
[0044]  キルビー・バウアー試験においては、２ｍｍの滅菌濾紙ディスクを、ＱＳＴ７１３上清に浸漬し、滅菌条件下で風乾した。次いで、これらのディスクを、標的病原体の菌叢上に置き、一晩インキュベートし、阻害ゾーンを測定した。阻害ゾーンは、クロストリジウム属標的及びリステリア属標的について認められた。
【００３９】
[0045]  ＭＩＣ法においては、マイクロタイタープレートのウェルに、１×１０５に希釈した各標的病原体７５μＬを接種した。上記の無細胞調製物を、１：２、１：１０及び１：５０の最終希釈で、各ウェルに加えた。プレートを、３７℃及びＯＤ６００で一晩インキュベートし、Ｗａｌｌａｃｈマイクロタイターリーダーで読み取った。無細胞調製物（熱処理ありと熱処理なしの両方）は、クロストリジウム属標的及びリステリア属標的に対して著しく有効であり、且つサルモネラ属及びエシェリキア・コリの増殖を阻害した。ただし、これらの最後の２つの病原体については、キルビー・バウアープレート上に、阻害ゾーンは認められなかった。クロストリジウム属、リステリア属及びサルモネラ属についてのデータを、図１〜６に示す。
【００４０】
実施例２−種々の細菌に対するＱＳＴ７１３の有効性についてのインビトロ調査
[0046]  バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の粉末製剤を、次の細菌：クロストリジウム・パーフリンジェンス、エシェリキア・コリ、サルモネラ・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニ、及びリステリア・モノサイトゲネスの、種々の環境分離株に対する有効性について試験した。この粉末製剤は、発明を実施するための形態において上で記載されたように、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を（発酵の終わり近くに、栄養素が枯渇すると、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞が増殖期から胞子形成期への移行を開始し、その結果、発酵の最終生成物が主として胞子、代謝産物及び残留発酵培地となるように）発酵させ、その発酵ブロスを濃縮し、乾燥させることによって、調製した。この粉末製剤は、１４．６％の濃縮乾燥ブロス及び８５．４％の（上記の実行可能な手段から選択される）製剤用不活性物質を有し、最低でおよそ７．３×１０９ＣＦＵのバチルス・ズブチリス／グラム、最高でおよそ１×１０１０ＣＦＵのバチルス・ズブチリス／グラムを含有していた。この製剤を、本明細書において組成物１と呼ぶことにする。組成物１の原液を、この溶液が１ｍＬ当たりおよそ１×１０９ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを含有することになるように、０．２グラムの製剤化された粉末を１．８ｍＬの滅菌蒸留水に添加することによって調製した。試験生物を、５％羊血を含むトリプチカーゼソイ寒天に、４種までの生物が単一の寒天プレートに各々が寒天プレートを横切る単一の直線をなして画線された状態で、画線した。この生物を、一晩乾燥させた。次いで、この接種されたプレートに、上記の製剤化されたＱＳＴ７１３の懸濁液を、試験生物に対して直角に交わるように、綿棒で画線塗布した。クロストリジウム・パーフリンジェンス及びカンピロバクター・ジェジュニの分離株を、Ｃａｍｐｙガス雰囲気（１０％ＣＯ２、５％Ｏ２、８％Ｎ２）中、４１±２℃で一晩インキュベートした。好気性であるその他の分離株は、Ｃａｍｐｙガスなしで、３６±２で一晩インキュベートした。ＱＳＴ７１３は、エシェリキア・コリの阻害はもたらさなかったが、クロストリジウム・パーフリンジェンス、サルモネラ・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニ及びリステリア・モノサイトゲネスの分離株のうちのいくつかの阻害をもたらした。さらに、一部の例においては、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、病原性細菌の侵略的な競合的駆逐（aggressive competitive overgrowth）を示した。結果を下記の表にまとめる。この表に報告された阻害ゾーンは、バチルス増殖物（growth）の端から試験生物の増殖物の始まりまでを測定したものである。さらに、クロストリジウム・パーフリンジェンス及びカンピロバクター・ジェジュニのプレートの写真を、それぞれ図７及び図８に示す。
【表２】
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【００４１】
実施例３−ラット（ヒトにおける大腸炎のモデル）における誘導された大腸炎の処置における経口投与されたバチルスＱＳＴ７１３の有効性の測定
［予言的実施例（Prophetic Example）］
[0047]  この試験では、２，４，５−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸投与によって誘導されたラットにおける大腸炎に対してＱＳＴ７１３の有効性を調査する。
【００４２】
調査計画：
[0048]  雄のＷｉｓｔａｒ白ラットを、この調査全体を通して使用する。処置期間の開始時に、動物は１０〜１２週齢である。動物に、それらが試験施設に到着するとすぐ、それらが良好な状態にあることを確実にするために、獣医の監督下で完全な臨床検査を行う。動物を、少なくとも７日間、調査条件に馴化させる。動物を無作為に選択し、ポリカーボネートケージ（長さ４２１×幅２９０×高さ１９０ｍｍ）に割り当てる。動物室及び試験室条件を、次のように設定する。温度：２２±３℃、相対湿度：５０±２０％、明／暗サイクル：１２時間／１２時間（明０７．００ＡＭ〜１９．００ＰＭ）及び換気：濾過された再循環されない空気をおよそ７サイクル／時間。全ての動物は、ラット用ペレット餌及び精製水に（ＴＮＢＳ投与前の一晩の絶食を除いて）制約なしに自由にアクセスできる。
【００４３】
[0049]  反復試験において、大腸炎の誘導日を１日目として設定する。大腸炎は、一晩の絶食後に、肛門に対して近位側８ｃｍのところへの１００ｍｇ／Ｋｇ体重でのＴＮＢＳの単回直腸内投与を使用して誘導される。大腸炎陰性コントロール群には、１日目に生理食塩水（動物１匹当たり０．５ｍＬを１回）を直腸内投与する。大腸炎陰性及び大腸炎陽性コントロール群には、１日目から７日目まで（７日目を含む）、４時間の投与間隔で１日３回、１０ｍＬ／ｋｇで蒸留水を経口投与する。
【００４４】
[0050]  反復試験において、ＴＮＢＳ誘導大腸炎の群を、１日目から７日目まで（７日目を含む）、４時間の投与間隔で１日３回、ＱＳＴ７１３（それぞれ１．５×１０Ｅ８  ＣＦＵ／Ｋｇ又は１．５×１０Ｅ９  ＣＦＵ／Ｋｇ）で；１日目から７日目まで（７日目を含む）メサラジン（２５０ｍｇ／Ｋｇ／日）で；１日目に単回用量としてインフリキシマブ（３ｍｇ／Ｋｇ）で、又は１日目から７日目まで（７日目を含む）、４時間の投与間隔で１日３回、サッカロミセス・ボウラディ（１．５×１０Ｅ８  ＣＦＵ／Ｋｇ）で処置する。
【００４５】
[0051]  初回又は単回（インフリキシマブの場合）の処置用量を、ＴＮＢＳの投与後２時間以内（蒸留水、ＱＳＴ７１３、サッカロミセス・ボウラディ及びメサラジン）又は３時間以内（インフリキシマブ）に投与する。静脈内注入されたインフリキシマブ以外は、全ての処置薬を強制経口投与する。１日２回の観察を、臨床徴候及び死亡数について行う。動物の体重を、１日目、４日目及び７日目に記録する。８日目に動物を殺し、長さ５ｃｍの結腸部分（肛門に対して近位側１０ｃｍから５ｃｍまで）を切除する。これらの部分を、長手方向に切開する。生理食塩水で洗浄することによって内容物を除去し、次の尺度を使用して、肉眼的形態に評点をつける：０＝潰瘍も炎症もなし、１＝潰瘍はなく局所的な充血のみ、２＝充血を伴わない潰瘍形成、３＝１部位のみでの潰瘍形成及び炎症、４＝２部位以上の潰瘍形成及び炎症、並びに５＝２ｃｍよりも大きく広がる潰瘍形成。それぞれの５ｃｍ結腸部分の重量もまた、炎症により誘発された水腫を評価するために記録する。
【００４６】
試験調製物
[0052]  水中５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ（アメリカ合衆国カリフォルニア州セントルイスSigma-aldrich）を、５０％エタノールで２．５％溶液に希釈する。用量体積は、４ｍＬ／Ｋｇ体重である。マルト及びシクロデキストリンキャリア上で乾燥させたＱＳＴ７１３（アメリカ合衆国カリフォルニア州デイビスAgraQuest Inc.）発酵ブロスを、１．５×１０Ｅ７及び１．５×１０Ｅ．８  ＣＦＵ／ｍＬの濃度となるように、蒸留水中に懸濁させる。用量体積は、１０ｍＬ／Ｋｇ体重である。サッカロミセス・ボウラディ（ベルギー王国ブリュッセルEnterol.RTM.,Biodiphar）を、１．５×１０Ｅ７  ＣＦＵ／ｍＬの濃度となるように、蒸留水中に懸濁させる。用量体積は、１０ｍＬ／Ｋｇ体重である。メサラジン（インド国ムンバイMesacol.RTM.,Sun Pharmaceutical Ind.Ltd）錠を、乳棒及び乳鉢を使用して粉砕し、１ｍＬ当たり２５ｍｇの５−アミノサリチル酸を含有する蒸留水中溶液を、調製する。用量体積は、１０ｍＬ／Ｋｇ体重である。Ｒｅｍｉｃａｄｅ  ＲＴＭ（インフリキシマブ）（オランダ国ライデン、セントコア・ビーブイ）を、まず１０ｍＬの注射用水で再構成し、２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように生理食塩水を用いてさらに希釈する。使用される用量体積は、１．５ｍＬ／Ｋｇ体重である。全ての体重依存用量は、測定された最新の個体体重に基づいて投与する。新鮮な調製物を、それぞれの投与の前に作製する。調製物は、それぞれの投薬の前に、激しく攪拌する。
【００４７】
予想される結果及び検討：
[0053]  一部の動物は、ＴＮＢＳでの大腸炎の誘導後の下痢の軽度の徴候を示す。１日目から７日目まで（７日目を含む）に異なる処置群において記録された下痢の観測数（及び冒された動物数）を記録する。大腸炎陽性コントロール群は、大腸炎に伴う実質的な体重減少を示す。処置薬は全て大腸炎が体重増加に及ぼす負の影響を著しく抑制するのであるが、ＱＳＴ７１３処置薬は、下痢の統計的に有意な減少及び改善した体重増加を示すことが予想される。
【００４８】
ＱＳＴ７１３及びメサラジンは、大腸炎陽性コントロール群のものと明確に区別され得る、結腸部分重量及び結腸壁についての肉眼的形態評点を、常にもたらすことが予想される。
【００４９】
[0054]  ＱＳＴ７１３及びＭｅｓａｃｏｌで処置されたＴＮＢＳ誘導大腸炎のラットにおける結腸壁の健康状態は、大腸炎に冒されていないラットにおける健康状態と肉眼的に同じであることが予想される。長手方向に切開した結腸部分の目視検査は、陽性コントロール群、サッカロミセス・ボウラディ及びインフリキシマブ処置群において存在する潰瘍形成及び壊死組織領域、並びにＱＳＴ７１３群及びメサラジン群におけるそれらの不在を示すことが予想される。処置期間の終了時に、インフリキシマブで処置されたラットの平均体重増加及び結腸部分重量のデータは、両方の試験において大腸炎陰性コントロール群のデータ及び大腸炎陽性コントロール群のデータの中間にある。ＱＳＴ７１３で処置されたラットの結腸部分においては、潰瘍形成がなく、これらの部分の大多数で充血のみが観察されることが予想される。ＱＳＴ７１３は、ＴＮＢＳの直腸内投与によって誘導されるようなラット結腸壁における炎症を明らかに和らげること、少なくともより高い投与割合については、この処置からのデータと大腸炎陰性コントロール群のデータとの差異が統計的に認められ得ないほどまでに、明らかに和らげることが予想される
【００５０】
結論
[0055]  この調査は、ラットにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘導大腸炎に対するバチルス「ＱＳＴ７１３」の有効性を確認し、記録をとるため、且つその有効性をサッカロミセス・ボウラディ（プロバイオティクス）、メサラジン及びインフリキシマブ（標準薬）の有効性と比較するために計画され、実施されるものである。このラットモデルは、十分に確立され、信頼性が高く、ＩＢＤの処置を目的とする薬物の有効性を調査するために広く使用されている。大腸炎の誘導後に何の処置もなければ、数匹のラットは、恐らく、下痢の軽度の徴候を示し、概して、残りの試験期間全体を通して体重を減らし続けるであろう。それらの結腸の腸壁の肉眼的形態は、恐らく、炎症、潰瘍形成及びさらには壊死によって特徴付けられるであろう。１．５×１．０Ｅ８  ＣＦＵ／Ｋｇの用量で３回／日のＱＳＴ７１３での、又は３回の１．５×１０Ｅ９  ＣＦＵ／Ｋｇ／日での、一連の処置が、陰性コントロール群の結腸壁健康状態及び抗炎症薬の標準薬メサラジンで処置された群の結腸壁健康状態と統計的に同一の結腸壁健康状態をもたらすことが予想される。
【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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