(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼの活性をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するための多機能ナノプラットフォームとともに、癌性組織または前癌性組織の存在を撮像し検出する方法、および治療のモニタリングを含むそれらの治療的処置を提供する。診断用ナノプラットフォームは、ナノ粒子を含み、標的プロテアーゼに特異的なコンセンサス配列を含むオリゴペプチド結合によって相互にまたは他の粒子と結合される。標的プロテアーゼによる配列の切断は、様々なセンサーを使用して検出することができ、診断結果は、癌の予後と相互に関連づけることができる。単独の非連結型ナノプラットフォームもまた、癌性組織の治療的温熱処置に適合させ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のナノ粒子および保護層を含む第１のナノプラットフォームと；
第２のナノ粒子および保護層を含む第２のナノプラットフォームと；
プロテアーゼコンセンサス配列を含む、該第１のナノプラットフォームと該第２のナノプラットフォームとの間のオリゴペプチド結合
とを備えた、プロテアーゼ活性を検出するためのナノプラットフォームアセンブリーであって、
該第１のナノプラットフォームまたは該第２のナノプラットフォームの少なくとも１つが、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む、ナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項２】
前記第１のナノ粒子および前記第２のナノ粒子が、それぞれ、コア/シェル型ナノ粒子である、請求項１に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項３】
各コアが、それぞれ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択される、請求項２に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項４】
前記コアが強常磁性Ｆｅコアである、請求項３に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項５】
各シェルが、それぞれ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項６】
前記シェルが酸化鉄を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項７】
前記第１のナノ粒子および前記第２のナノ粒子の、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ多点法による比表面積が少なくとも約２０ｍ２／ｇである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項８】
前記保護層が、それぞれ、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項９】
前記保護層の少なくとも１つがシロキサンナノ層である、請求項８に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１０】
前記シロキサンナノ層がアミノ官能性シロキサン層である、請求項８〜９のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１１】
前記シロキサンナノ層の周囲にリガンド単分子層をさらに含む、請求項９〜１０のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１２】
前記保護層の少なくとも１つがリガンド単分子層である、請求項８に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１３】
前記リガンド単分子層が、チオール、アルコール、ニトロ化合物、ホスフィン、ホスフィンオキシド、レソルシナレン、セレン化物、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、二硫化物、過酸化物、アミン、ニトリル、イソニトリル、チオニトリル、オキシニトリル、オキシシラン、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物およびセレン部分からなる群から選択される少なくとも１種のメンバーを含む、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１４】
前記官能基が前記保護層に直接結合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１５】
前記リガンド単分子層が、以下からなる群から選択されるリガンドを含む、請求項１４に記載のナノプラットフォームアセンブリー
【化１】
2013503634.tif 000061
、
【化２】
2013503634.tif 000062
、
【化３】
2013503634.tif 000063
およびそれらの組合せ
［式中、
ｎ＝２〜２５；
各Ｒ１は、保護ヒドロキシル基および非保護ヒドロキシル基からなる群から選択され；
各Ｒ２は、それぞれ、−ＯＨ、
【化４】
2013503634.tif 000064
【化５】
2013503634.tif 000065
【化６】
2013503634.tif 000066
【化７】
2013503634.tif 000067
および
【化８】
2013503634.tif 000068
（式中、
*は、Ｒ２が該リガンドと結合する原子であることを示し；
各Ｒ３は、それぞれ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ４）２、−Ｎ（Ｒ４）３＋、−ＮＨＲ４、−ＮＨ−ＣＯ−ＡＡ、および−ＣＯ−ＮＨ−ＡＡ（式中、各Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基からなる群から選択され、ＡＡは任意のアミノ酸である）からなる群から選択され；
Ｍは、Ｚｎ２＋、Ｐｄ２＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、Ｐｔ２＋、Ｎｉ２＋、Ｅｕ３＋およびＧｄ３＋からなる群から選択される）
からなる群から選択される］。
【請求項１６】
前記官能基が、プロテアーゼコンセンサス配列を介して前記保護層に結合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１７】
前記第１のナノ粒子と前記第２のナノ粒子との間の前記オリゴペプチド結合が前記官能基をさらに含む、請求項１６に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１８】
前記官能基がポルフィリンである、請求項１７に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１９】
前記ポルフィリンが、テトラカルボキシルフェニルポルフィリンおよびテトラヒドロキシフェニルポルフィリンからなる群から選択される、請求項１８に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２０】
前記プロテアーゼコンセンサス配列が、ＳＧＲＳＡ（配列番号２）、ＶＰＭＳＭＲＧＧ（配列番号３）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号４）、ＲＰＦＳＭＩＭＧ（配列番号５）、ＶＰＬＳＬＴＭＧ（配列番号６）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号７）、ＩＰＥＳＬＲＡＧ（配列番号８）、ＳＧＳＰＡＦＬＡＫＮＲ（配列番号９）、ＤＡＦＫ（配列番号１０）、ＳＧＫＰＩＬＦＦＲＬ（配列番号１１）、ＳＧＫＰＩＩＦＦＲＬ（配列番号１２）、ＧＰＬＧＭＬＳＱ（配列番号１３）、ＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号２５）、ＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号２６）、ＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号２７）、ＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号２８）、ＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号２９）、ＧＡＡＮＬＶＲＧ（配列番号７４）およびＰＲＡＧＡ（配列番号７５）からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項２１】
前記結合が、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号１８）、ＫＧＧＶＰＭＳＭＲＧＧＧＣ（配列番号３０）、ＫＧＧＩＰＶＳＬＲＳＧＧＣ（配列番号３１）、ＫＧＧＶＰＬＳＬＴＭＧＧＣ（配列番号３２）、ＫＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号３３）、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＣ（配列番号３４）、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号３５）、ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＫ（配列番号３６）、ＫＧＧＳＧＲＳＡＧＧＤ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧ（配列番号６４）、ＤＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＤ（配列番号６５）、ＤＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡＧＤ（配列番号６６）およびＮ末端において１つの残基およびＣ末端において１つまたは２つの残基が欠失していてよいそれらの変異体、ＫＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧ（配列番号６７）、ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号６８）、ＨＨＨＧＡＧＩＰＶＳＬＲＳＧＡＧ（配列番号７７）、ＨＨＨＧＡＧＲＰＦＳＭＩＭＧＡＧ（配列番号７８）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳＬＴＭＧＡＧ（配列番号７９）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳＬＹＳＧＡＧ（配列番号８０）、ＨＨＨＧＡＧＧＡＡＮＬＶＲＧＧＡＧ（配列番号８１）、ＨＨＨＧＡＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＡＧ（配列番号８２）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡＧ（配列番号８３）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮＧＡＧ（配列番号８４）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮＧＡＧ（配列番号８５）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＧＡＧ（配列番号８６）、ＨＨＨＧＡＧＰＲＡＧＡＧ（配列番号８７）、ならびにＮ末端において１つ、２つまたは３つの残基が欠失していてよい、配列番号７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６および８７の変異体からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項２２】
連結されたナノプラットフォーム間の距離が約５ｎｍ〜約７０ｎｍである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のアセンブリーと、薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む、組成物。
【請求項２４】
前記薬学上許容される担体が、水性バッファー、リポソームおよび腫瘍指向性細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記薬学上許容される担体が水性バッファーであり、バッファー１ｍｌ当たり約１００μｇ〜約５，０００μｇの前記ナノプラットフォームアセンブリーを含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍指向性細胞が、幹細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記幹細胞が、神経幹細胞、臍帯マトリックス幹細胞、骨髄幹細胞および脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）と、哺乳類の体液サンプルを接触させること；
（ｂ）該アッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；および
（ｃ）該アッセイ（被分析物）の光減衰における変化を検出すること
を含み、該変化が該プロテアーゼ活性に対応している、方法。
【請求項２９】
前記エネルギー源が、多色光源、レーザーおよびレーザーダイオードからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記変化がＵＶ／Ｖｉｓ分光計によって自動的に検出される、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記体液サンプルが、尿および血液からなる群から選択される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記光減衰における約０．００１〜約１の変化が、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプル中の前記アッセイ（被分析物）の濃度が、サンプル１ｍｌ当たり約１０μｇ〜約１，０００μｌのナノプラットフォームである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アッセイ（被分析物）の光減衰における前記変化が、約３０秒〜約２４時間の期間にわたって観察される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アッセイ（被分析物）の光減衰における前記変化が、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼの活性を示す、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロテアーゼ活性を癌の進行の予後と相互に関連づけることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｕＰＡおよびＭＭＰ−７の両方の活性、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性の欠如の検出が、血管新生の予後と相互に関連づけられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９の全ての活性の検出が、細胞浸潤の予後と相互に関連づけられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するための方法であって、
（ａ）請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｃ）該部位をエネルギー源に曝すこと；および
（ｄ）そのアッセイ（被分析物）の後方散乱スペクトルを検出すること
を含む、方法。
【請求項４０】
前記投与（ａ）が、癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の前記部位に直接前記組成物を注射することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与（ａ）が、前記哺乳類の血流に前記組成物を注射することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記エネルギー源が、多色光源、レーザーおよびレーザーダイオードからなる群から選択される、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記後方散乱スペクトルのシグナルが、癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の前記関係部位において周辺部位よりも強い、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記シグナルが、癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の前記関係部位において周辺部位よりも約２〜約１００倍強い、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記後方散乱スペクトルシグナルの消失を約３０秒〜約２４時間の期間にわたって検出することをさらに含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記後方散乱スペクトルの消失が前記アッセイ（被分析物）の光減衰における変化として検出され、該変化が前記プロテアーゼ活性を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記光減衰における約０．０５〜約１の変化が、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プロテアーゼ活性を癌の進行の予後と相互に関連づけることをさらに含む、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記部位への前記アッセイ（被分析物）の局在後１０分以内に検出されたプロテアーゼ活性が、前記癌性細胞または前記前癌性細胞が浸潤性である確率が高いことと相互に関連づけられる、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記アッセイ（被分析物）の局在後最初の３０分以内でのプロテアーゼ活性の不検出が、前記癌性細胞または前記前癌性細胞が浸潤性である確率が非常に低いことと相互に関連づけられる、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記後方散乱スペクトルシグナルの消失が、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼの活性を示す、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ｕＰＡおよびＭＭＰ−７の両方の活性の検出、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性の欠如が、血管新生の予後と相互に関連づけられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９の全ての活性の検出が、細胞浸潤の予後と相互に関連づけられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテアーゼ活性が、ＫＧＧＶＰＭＳ（配列番号４３）、ＭＲＧＧＧＣ（配列番号４４）、ＫＧＧＩＰＶＳ（配列番号４５）、ＬＲＳＧＧＣ（配列番号４６）、ＫＧＧＶＰＬＳ（配列番号４７）、ＬＴＭＧＧＣ（配列番号４８）、ＫＧＧＧＳＧＲ（配列番号４９）、ＳＡＧＧＧＣ（配列番号５０）、ＣＧＧＧＳＧＲ（配列番号５１）、ＳＡＧＧＣ（配列番号５２）、ＤＧＧＳＧＲ（配列番号５３）、ＳＡＧＧＫ（配列番号５４）、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲ（配列番号５５）、ＫＧＧＳＧＲ（配列番号５６）、ＳＡＧＧＤ（配列番号５７）、ＳＡＧＧＧ（配列番号６９）、ＤＧＧＧＳＧＲ（配列番号７０）、ＳＡＧＧＧＤ（配列番号７１）、ＤＧＡＧＳＧＲ（配列番号７２）およびＮ末端において１つの残基が欠失していてよいそれらの変異体、ＳＡＧＡＧＤ（配列番号７３  およびＣ末端において１つの残基が欠失していてよいそれらの変異体、ＨＨＨＧＡＧＶＰＭＳ（配列番号８８）、ＭＲＧＡＧ（配列番号８９）、ＨＨＨＧＡＧＩＰＶＳ（配列番号９０）、ＬＲＳＧＡＧ（配列番号９１）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＲ（配列番号９２）、ＨＨＨＧＡＧＲＰＦＳ（配列番号９３）、ＭＩＭＧＡＧ（配列番号９４）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳ（配列番号９５）、ＬＴＭＧＡＧ（配列番号９６）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳ（配列番号９７）、ＬＹＳＧＡＧ（配列番号９８）、ＨＨＨＧＡＧＧＡＡＮ（配列番号９９）、ＬＶＲＧＧＡＧ（配列番号１００）、ＨＨＨＧＡＧＰＱＧＬＡ（配列番号１０１）、ＧＱＲＧＩＶＧＡＧ（配列番号１０２）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＫＳＲ（配列番号１０３）、ＭＶＰＮＦＮＧＡＧ（配列番号１０４）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＩＦＲ（配列番号１０５）、ＳＷＡＮＦＮＧＡＧ（配列番号１０６）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＶＶＩＡ（配列番号１０７）、ＴＶＩＶＩＴＧＡＧ（配列番号１０８）、ＨＨＨＧＡＧＰＲ（配列番号１０９）、ＡＧＡＧ（配列番号１１０）、ならびにＮ末端において１つ、２つまたは３つの残基が欠失していてよい、配列番号８８、９０、９２、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９の変異体からなる群から選択される２つ以上のオリゴペプチド配列をもたらす、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法であって、
（ａ）請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｃ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｄ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得すること
を含む、方法。
【請求項５６】
前記ＭＲ画像データがコンピュータによって自動的に取得される、請求項５５に記載のＭＲＩ撮像方法。
【請求項５７】
前記取得済ＭＲ画像データから画像を自動的に作成することをさらに含む、請求項５５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記送信（ｃ）および前記取得（ｄ）を少なくとも約２日の期間にわたって繰り返すことをさらに含む、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記高周波パルスがＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌスピンエコー法のパルスシーケンス（ａ  Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ  ｓｐｉｎ−ｅｃｈｏ  ｐｕｌｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＭＲ画像データがＴ２強調画像である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記取得済Ｔ２値における変化を経時的に検出することをさらに含み、該変化がプロテアーゼ活性に対応している、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔ２値における約５倍〜約１０倍の変化が、癌の発生と相互に関連づけられる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｔ２値における約１０倍を超える変化が、転移性癌と相互に関連づけられる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｔ１値が経時的に実質的に変化しない、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記投与（ａ）から約１５分〜約２４時間後に前記取得（ｄ）が開始される、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記関係部位における前記ナノプラットフォームアセンブリーの濃度が、約１μｇ／ｇ組織〜約１，０００μｇ／ｇ組織である、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法であって、
（ａ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＳＧＲＳＡ（配列番号２）である請求項１〜１９および請求項２２のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｃ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｄ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得すること
を含む、方法。
【請求項６８】
前記ＭＲ画像データがプロテアーゼ活性を示し、
（ｅ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＶＰＬＳＬＴＭＧ（配列番号６）である請求項１〜１９および請求項２２のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｆ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｇ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｈ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得すること
：をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＭＲ画像がプロテアーゼ活性を示し、該活性が血管新生または転移の予後と相互に関連づけられる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
（ｉ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＶＰＭＳＭＲＧＧ（配列番号３）である請求項１〜１９および請求項２２のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｊ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｋ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（１）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得すること
をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
プロテアーゼ活性が前記ＭＲ画像データによって示されず、前記ＭＲ画像データが血管新生の予後と相互に関連づけられる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＭＲ画像データがプロテアーゼ活性を示し、該プロテアーゼ活性が転移の予後と相互に関連づけられる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記癌性細胞または前記前癌性細胞が、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、小児脳幹グリオーマ、成人脳腫瘍、小児悪性グリオーマ、小児上衣細胞腫、小児髄芽細胞腫、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児視経路および視床下部グリオーマ、乳癌、妊娠関連乳癌、小児乳癌、男性乳癌、小児カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、小児結腸直腸癌、食道癌、小児食道癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、成人グリオーマ、成人（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝細胞癌、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、小児腎臓癌、成人（原発性）肝臓癌、小児（原発性）肝臓癌、非小細胞肝臓癌、小細胞肝臓癌、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、黒色腫、成人悪性中皮腫、小児中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、小児多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、神経芽腫、非小細胞肺癌、小児卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、小児膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、小児腎細胞癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、小児皮膚癌、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、扁平上皮癌、胃癌、小児胃癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、小児甲状腺癌および膣癌からなる群から選択される癌に関連している、請求項２８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して前記第１のナノプラットフォームおよび前記第２のナノプラットフォーを加熱することをさらに含む、請求項２８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記関係部位の組織が少なくとも約４０℃に加熱される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
第１のナノ粒子と、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、金被覆層、およびそれらの組合せからなる群から選択される、該ナノ粒子周囲の保護層とを含む、ナノプラットフォーム。
【請求項７７】
ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む、請求項７６に記載のナノプラットフォーム。
【請求項７８】
前記保護層がシロキサンナノ層を含み、該シロキサンナノ層の周囲にリガンド単分子層をさらに含む、請求項７６〜７７のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項７９】
前記リガンド単分子層の周囲に金被覆層をさらに含む、請求項７８に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８０】
前記ナノ粒子がコア/シェル型ナノ粒子であり、該コアが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択され、該シェルが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８１】
前記コアが強常磁性Ｆｅコアである、請求項８０に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８２】
前記シェルが酸化鉄を含む、請求項８０〜８１のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８３】
Ｆｅ／ＦｅｘＯｙコア／シェル型ナノ粒子を含む、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８４】
発色団／発光団、量子ドット、ビオロゲン、およびそれらの組合せからなる群から選択される粒子と、プロテアーゼコンセンサス配列を含むオリゴペプチド結合によって結合される、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８５】
前記粒子が、有機色素、無機色素、フルオロフォア、ホスホフォア、それらの組合せ、およびそれらのメタレート錯体からなる群から選択される発色団／発光団である、請求項８４に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８６】
前記発色団／発光団が、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリトロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２，５−ジフェニルオキサゾール、ルブレンおよびＮ−（３−スルホプロピル）アクリジンからなる群から選択される有機色素である、請求項８５に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８７】
前記発色団／発光団が、ポルフィリン、フタロシアニン、クロリンおよびメタレート発色団からなる群から選択される無機色素である、請求項８５に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８８】
前記ポルフィリンが、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびメタレート−ＴＣＰＰからなる群から選択される、請求項８７に記載のナノプラットフォーム。
【請求項８９】
前記発色団／発光団が、ルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、イリジウム（ＩＩＩ）の３−（１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体およびイリジウム（ＩＩＩ）との３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体からなる群から選択されるメタレート発色団である、請求項８５に記載のナノプラットフォーム。
【請求項９０】
前記発色団／発光団が、リン光性色素、フルオレセイン、ローダミンおよびアントラセンからなる群から選択されるフルオロフォアまたはホスホフォアである、請求項８５に記載のナノプラットフォーム。
【請求項９１】
前記コンセンサス配列が、セリンプロテアーゼ切断配列、アスパラギン酸プロテアーゼ切断配列、システインプロテアーゼ切断およびメタロプロテアーゼ切断配列からなる群から選択される、請求項８４〜９０のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項９２】
他のナノプラットフォームと連結されていない、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項９３】
比吸収率が少なくとも約５０Ｗ／ｇである、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項９４】
請求項７６〜９３のいずれか一項に記載のナノプラットフォームと、薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む、組成物。
【請求項９５】
前記薬学上許容される担体が、水性バッファー、リポソームおよび腫瘍指向性細胞からなる群から選択される、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記薬学上許容される担体が、幹細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される腫瘍指向性細胞である、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記幹細胞が、神経幹細胞、臍帯マトリックス幹細胞、骨髄幹細胞および脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ａ）請求項９４〜９７のいずれか一項に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を局在させること；および
（ｃ）磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して前記ナノプラットフォームを加熱すること
を含み、その結果、該関係部位の組織が少なくとも約４０℃の温度に加熱される、方法。
【請求項９９】
前記加熱（ｃ）が約１０分〜約２時間行われる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記磁気Ａ／Ｃ−励起が約５０〜約５００ｋＨｚである、請求項９８〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組成物が、前記哺乳類の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約０．１０グラムの前記ナノプラットフォームを含む、請求項９８〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記組織が約４２℃〜約６０℃の温度まで加熱される、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記加熱（ｃ）が前記癌性細胞または前記前癌性細胞のアポトーシスをもたらす、請求項９８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
磁気Ａ／Ｃ−励起により哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害するための、請求項７６〜９３のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項１０５】
癌と診断された哺乳類において癌治療の経過をモニタリングする方法であって、
（ａ）請求項８４〜９１のいずれか一項に記載のナノプラットフォームを含む第１の診断アッセイ（被分析物）と、哺乳類の第１の体液サンプルを接触させること；
（ｂ）該第１のアッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；および
（ｃ）該第１の体液サンプルとの接触前の該第１のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、該第１のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける変化を経時的に検出すること
を含み、該変化が、該第１のサンプルにおける第１のプロテアーゼ活性レベルに対応している、方法。
【請求項１０６】
前記体液サンプルが、尿および血液からなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記エネルギー源が、タングステンランプ、レーザーダイオード、レーザー、生物発光、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０５〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
吸収スペクトルまたは発光スペクトルの最大値における約５ｎｍ〜約２００ｎｍの間の青方シフトが、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記変化が、前記体液サンプルとの接触前の前記アッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、新たな肉眼で見える色または発光バンドの出現を含み、該肉眼で見える色または発光バンドが、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記アッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける前記変化が、約１秒〜約３０分の期間にわたって観察される、請求項１０５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記哺乳類が癌治療中であり、
（ｄ）請求項８４〜９１のいずれか一項に記載のナノプラットフォームを含む第２の診断アッセイ（被分析物）と、前記哺乳類の第２の体液サンプルを接触させること；
（ｅ）該第２のアッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；
（ｆ）該体液サンプルとの接触前の該第２のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、該第２のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける変化を経時的に検出すること、ここで、該変化は、該第２のサンプルにおける第２のプロテアーゼ活性レベルに対応しており：および
（ｇ）該第２のプロテアーゼ活性レベルを前記第１のプロテアーゼ活性レベルと比較すること
をさらに含み、ここで、活性の増加は、前記癌治療を増やしまたは変更する予後と相互に関連づけられ、活性の減少は、前記癌治療を維持しまたは減少させる予後と相互に関連づけられる、請求項１０５〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記癌治療中に毎日工程（ｄ）〜（ｇ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記哺乳類が寛解期にあり、前記哺乳類における前記癌の再発を検出するために、前記癌治療後に毎月工程（ｄ）〜（ｇ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
鉄コアを有するコア/シェル型ナノ粒子を含み、Ｔ１増強ではｒ１が約１００ｍＭ−１ｓ−１より大きく、Ｔ２減衰ではｒ２が約−２，０００ｍＭ−１ｓ−１より大きい整数である、ＭＲＩ造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／２３９，３１３号の利益およびそれに基づく優先権を主張する。その米国仮特許出願に記載された全ての記載内容は引用することにより本明細書の一部とする。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）によって与えられた契約番号ＨＨＳＮ２６１２００８０００５９Ｃ、および米国国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（ＮＳＦ）によって与えられた契約番号０９３０６７３に基づき政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
以下の出願は、２０１０年８月２４日に作成され、ファイル名「４０８８４＿ＰＣＴ  ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ.ｔｘｔ」、１８ＫＢのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして提出された、コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）での配列表を含む。そのＣＲＦの内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【背景技術】
【０００４】
発明の分野
本発明は、診断アッセイ用多機能ナノプラットフォーム、癌性組織の撮像、モニタリング、および治療的処置に関する。
【０００５】
関連技術の説明
プロテアーゼ
図１に示されるように、複数種のプロテアーゼが癌における疾患の進行に関連しており、様々な癌細胞株により過剰発現されることが知られている。例としては、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰs）、組織セリンプロテアーゼおよびカテプシンが挙げられる。これらのプロテアーゼの多くは、癌細胞においてアップレギュレートされる（すなわち、腫瘍において健常組織よりも活性がずっと高い）か、誤発現される（すなわち、見られるはずのないコンパートメントで見られる）か、または胚発生に関連する（しかしながら、成体細胞ではほとんど見られない）。
【０００６】
２１種の異なる既知のＭＭＰが存在し、それらはそれらの基質に基づいて、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン、メタロエラスターゼ、エナメリシンおよび膜型ＭＭＰのファミリーに分類される。ＭＭＰは、通常、癌性細胞自身によって産生されるのではなく、腫瘍周囲の間質細胞によって産生され、いくつかの理由で癌の生存や進行に極めて重要である。第１に、ＭＭＰは、間質細胞および上皮細胞から細胞表面に結合された増殖因子を切断し、それらを放出し、癌細胞と相互作用して増殖を刺激する。第２に、ＭＭＰは、新しい血管の発生のために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を開くことによって、さらに血管新生促進因子を放出し、血管新生促進プロテアーゼカスケードを開始させることによって血管新生に役割を果たす。ＭＭＰは、ＥＣＭおよび基底膜（ＢＭ）を分解し、癌細胞が組織壁を通過できるようにして細胞浸潤に至らせることによって腫瘍転移に重要な役割を果たす。ＭＭＰはまたＥＣＭ断片およびＢＭ断片も放出し、それによって細胞移動が刺激される。
【０００７】
数種類のセリンプロテアーゼ、とりわけ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびプラスミンは、癌においても十分に裏付けられた役割を有する。プラスミノーゲン活性化系のウロキナーゼおよびいくつかの他の成分の上昇した発現レベルが腫瘍の悪性度と相互に関連づけられることが見出された。ｕＰＡは、その受容体ｕＰＡＲと結合する極めて特異的なプロテアーゼであり、不活性のプラスミノーゲン（チモーゲン）を切断して活性のプラスミンにする。これは、腫瘍において血管新生を引き起こす周知のカスケードにおける第一段階である。プラスミノーゲン活性化の結果として起こる組織分解が、組織浸潤を促進し転移に寄与すると考えられている。プラスミンは、タンパク質またはペプチドを切断し続ける（プロコラゲナーゼを活性化し、ＥＣＭを分解し、増殖因子を放出し／活性化するなど）幾分非特異的なプロテアーゼである。プラスミンは幾分非特異的でありコンセンサス配列を決定することが難しいが、ｕＰＡは明確に定義されたコンセンサス配列を有する。
【０００８】
カテプシンは、一部の例外を除いては、システインプロテアーゼである。カテプシンは、リソソーム／エンドソーム経路において見出されることが多く、通常低ｐＨ値で作用するが、一部のものは中性ｐＨでもなお活性である。３種類のカテプシン、Ｂ、ＤおよびＬは、中性ｐＨで活性であり、癌において誤発現されることが多く、細胞の外側で活性化を起こす。この細胞外活性化はＥＣＭ分解を引き起こし得る。
【０００９】
磁気共鳴撮像法
磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）は、体内の画像を取得するための非侵襲的診断ツールである。ＭＲＩは、腫瘍などの、生体組織の病理学的変化に関する情報を提供する（医療撮像法）。ＭＲ画像は、外部磁場において高周波（ＲＦ）パルスパターンを用いて励起されたプロトン（１Ｈ）のスピン緩和時間に基づく。Ｔ１緩和時間（スピン−格子または縦緩和時間）とＴ２緩和時間（スピン−スピンまたは横緩和時間）の変動は、そのＭＲ画像がどのようにして収集されたかによって種々の組織および病態の間に画像コントラストを作り出す。さらに詳しくは、患者をＭＲ磁石の磁場（Ｂ０）内に置いた場合、身体のプロトンは外部磁場（Ｂ０）の方向に並ぶ。加えて、各プロトンの磁軸がこの磁場の方向に回転（歳差運動）を始める。これらのプロトンには、磁気モーメントを持って、外部磁場と厳密に平行な方向に向かって歳差運動をするものもあれば、磁気モーメントを持って、その磁場とは逆平行に近い方向に向かって歳差運動をするものもある。これが患者の組織内で正味の磁気モーメントを作り出し、組織磁気（Ｍ）が外部磁場（Ｂ０）と厳密に平行に並ぶ。高周波（ＲＦ）短パルスを、プロトン磁気モーメントの方向を変えて種々の角度で患者に送ると、患者の体外に置かれたレシーバーコイルに電流が流れる。これらのシグナルを用いてＭＲ画像を再構成する。
【００１０】
画像を再構成するにはいくつかのＭＲシグナルが必要であり、いくつかのパルスを送信しなければならない。このパルスの送信と送信の間に、プロトンは、Ｔ１緩和とＴ２緩和という２つの異なる緩和プロセスを受ける。ＭＲＩ操作者は、パルスシーケンスおよびタイミングを変更することにより、組織コントラストを主としてＴ１の差により決定するか（Ｔ１強調画像）またはＴ２の差により決定するか（Ｔ２強調画像）を決める。例えば、Ｔ１強調画像の場合、強い磁気を示す組織は強いシグナルを誘導し、一般に画像は明るく見えるが、弱い磁気を示す組織は弱いシグナルを誘導し、暗く見える。パルスシーケンスは、ＭＲＩ測定プロセスのハードウエア面を制御するコンピュータプログラムにより実行する。Ｔ１は、プロトンの磁化がその元の値の６３％に回復した時間として定義される。Ｔ１緩和時間は、励起された１Ｈ核が外部磁場に対して再整列するのに必要な時間の尺度である。一般に、Ｔ１は、小さく、可動性の大きな分子（すなわち、体液）または大きく、可動性の小さい分子（すなわち、固体）を含む組織では長いが、大きさおよび可動性が中程度の分子（すなわち、脂肪）を含む組織では短い。Ｔ２緩和は、励起されたプロトンおよび付近の磁気核（１Ｈ、ならびに重要度は低いが１３Ｃおよび１５Ｎ）のエネルギー変化によって生じる。Ｔ２強調画像法は、ＲＦパルスの送信後に、外部磁場に対してある角度で配向したスピンの局部的ディフェーシング（位相コヒーレンスの喪失）に頼るものである。Ｔ２は、磁化（Ｍｘｙ）がその元の値の６３％を失った時間として定義される。体液および体液様組織は一般にＴ２が長く（ＭＲシグナルがゆっくり消失する）固体組織および物質はＴ２が短い。Ｔ２＊（Ｔ２スターとも呼ばれる）緩和時間は、Ｔ２緩和時間と、完全緩和に対する局部的磁場不均一の関与の２つの付加的成分を有する。外部パルスを印可しなければ、Ｔ２＊効果はコヒーレンスの急速な喪失、従って、横方向の磁化およびＭＲＩシグナルの喪失を生じ得る。その定義に基づけば、Ｔ２＊は常にＴ２より短い。
【００１１】
Ｍｚ（ｔ）：＝Ｍｚ，ｅｑ−［Ｍｚ，ｅｑ−Ｍｚ（０）］ｅ−ｔ／Ｔ１
Ｍｚ（ｔ）：核スピン磁化のｚ−成分
Ｍｚ，ｅｑ：Ｍｚの熱平衡値
Ｍｘｙ（ｔ）＝Ｍｘｙｅ−ｔ／Ｔ１
Ｍｘｙ（ｔ）：Ｂ０に対して垂直のＭの成分
【数１】
2013503634.tif 000002
γ：磁気回転比
ΔＢ０：局部的変動磁場の強度差
【００１２】
常磁性および超常磁性ＭＲＩ造影剤（磁性ナノ粒子「ＭＮＰ」など）を用い、組織内の１Ｈ核のＴ１および／またはＴ２緩和時間を変更することにより、画像を得る組織のシグナル強度を変化させることができる。一般に、陽性造影剤はＴ１緩和時間の短縮（Ｔ１強調画像ではシグナル強度の増強）をもたらし、ＭＲ画像で明るく見える。陰性造影剤はＴ１およびＴ２緩和時間の短縮をもたらし、ＭＲＩでは主として暗く見える。最も一般的なＭＲＩ造影剤はガドリニウム陽イオンの有機キレート剤に基づく。ヨード造影剤（Ｘ線またはＣＴで慣用される）よりも毒性は低いが、ガドリニウム剤は、何人かの透析患者に用いた場合、腎性全身性繊維症に関連づけられた。加えて、ガドリニウム造影剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで水と直接接触させて活性化させる必要がある。酸化鉄の小粒子も、ＭＲＩにおいて超常磁性媒体として用いられる。これらの薬剤は強いＴ１緩和特性を示し、また、それらの周囲環境に対する感受性の違いのために強く変動する局部的磁場を生じ、これが組織内の１ＨスピンのＴ２およびＴ２＊緩和を増強する。３００ｎｍ未満の小粒子酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮs）は数時間血管内に留まることができ、従って、血液プール剤として働き得る。しかしながら、それらはまた、細網内皮系によってすぐに取り込まれ、健康な組織に分布するようになり、肝臓に蓄積し得る。それらはまた、凝集して無効な大きさとなる傾向がある。２０ｎｍ以下のナノ結晶（流体力学的サイズ）の、単一で安定化された酸化鉄の水性分散物は、極小酸化鉄粒子（ＵＳＰＩＯ）として分類される。一般に、これらの材料は、Ｔ１強調ＭＲ画像では陽性コントラストを生じ、Ｔ２強調画像では陰性コントラストを生じる。水性ＵＳＰＩＯ分散物の典型的な緩和率は、６０〜１００ＭＨｚ（１．４〜２．３５Ｔ）の臨床用ＭＲＩ場で、Ｔ１増強に関してｒ１＝１０〜２０ｍＭ−１ｓ−１、Ｔ２減衰に関してはｒ２＝およそ−１００ｍＭ−１ｓ−１である。緩和率ｒ１およびｒ２は、組織中のプロトンスピンの縦緩和または横緩和をそれぞれ増強または低下させる薬剤の能力の指標である。
【００１３】
【数２】
2013503634.tif 000003
【００１４】
１つの市販の酸化鉄ＭＲＩ造影剤がＦｅｒｉｄｅｘ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）であり、直径４〜５ｎｍのγ−Ｆｅ２Ｏ３コアとデキストラン被覆からなる。
【００１５】
光後方散乱
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、電磁波が金属の伝導電子と相互作用する際に生じる。電磁波の周期的電場は、陽イオンの格子に対する共振周波数において伝導電子の集団振動を生じる。光はこの共振周波数において吸収されるか、または散乱する。吸収のプロセスは、入射共振光子の光子への変換または金属格子の振動を特徴とし、一方、散乱はあらゆる方向への共振光子の再発光である。これらの２つのプロセスのために、いずれの金属ナノ構造の実験的に観測可能なＳＰＲピークは吸収成分と散乱成分の双方を特徴とする。グスタフ・ミーは、球状ナノ物体に関するマックスウェルの方程式を解くことによって（貴）金属ナノ構造のＳＰＲスペクトルを算出する方法を開発する第一人者の科学者であった。この「ミー」理論はスフェロイド他ロッドになどの単純な幾何学を有する様々な物体に段階的に拡張された。しかしながら、マックスウェルの方程式の正確な解は、球体、同心球形殻、スフェロイドおよび無限円柱にのみ見出された。従って、他の幾何学に関してこの方程式を解くには概算が必要である。離散双極子近似（ＤＤＡ）は、いずれの幾何学にも容易に適合可能であることから、当技術分野で好ましい方法の選択肢である。
【００１６】
励起光源の波長よりも小さいナノ粒子の光減衰Ｅ（λ）は、
Ｅ（λ）＝Ｓ（λ）＋Ａ（λ）
であり、式中、λは波長であり、Ｓは散乱であり、Ａは吸光度である。減衰効率係数Ｑｅｘｔは散乱効率係数Ｑｓｃａの合計であり、吸収効率係数ＱａｂｓはＣｅｘｔを物理的断面積πＲ２で割った商と定義される。散乱効率係数および吸収効率係数は一般ミー理論に従って計算することができ、この理論を以下にある程度詳しく説明する。両方とも無限級数として表すことができる。
【００１７】
【数３】
2013503634.tif 000004
【００１８】
Ｒｅは屈折率の実部を表し、ｍは周囲媒体の屈折率ｎｍに対する球状ナノ粒子の屈折率ｎの比であり、ｘはサイズパラメーターである。λは入射波長であり、Ｒはナノ粒子の直径である。Ψηおよびξηはリッカチ−ベッセル（Ｒｉｃｃａｔｉ−Ｂｅｓｓｅｌ）関数である。ダッシュは括弧内の独立変数に関する１階の微分を表す。
【００１９】
【数４】
2013503634.tif 000005
【００２０】
Ａ（λ）はサンプルの吸光度または光学濃度であり、ε（Ｍ−１ｃｍ−１）はモル吸収係数（εａｂｓ）、散乱係数（εｓｃａ）または減衰係数（ｅｅｘｔ）であり、ｃ（Ｍ）は光吸収種および散乱種の濃度であり、λ（ｃｍ）は光路長である。
【００２１】
モル吸収係数および散乱係数は、下式：
【００２２】
【数５】
2013503634.tif 000006
（式中、ＮＡはアボガドロ数である）
によって、吸収および散乱断面に直接関係する。金属ナノ粒子は、有機色素および金属錯体に比べて著しく大きい吸収断面を示す。典型例は、癌細胞のレーザー誘起光熱温熱処置に用いられてきたナノスフェアであり、それらのプラズモン共鳴極大λ＝５２８ｎｍにおいて吸収断面２．９３×１０−１５ｍ２（ε＝７．６６×１０９Ｍ−１ｃｍ−１）を特徴とする。これは、慣用のＮＩＲ色素インドシアニングリーン（λ＝７７８ｎｍでε＝１．０８×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）または増感剤ルテニウム（ＩＩ）−トリス−ビピリジン（λ＝４５２ｎｍで１．５４×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）の吸収断面よりも５桁大きく、ローダミン−６Ｇ（λ＝５３０ｎｍでε＝１．１６×１０５Ｍ−１ｃｍ−１）またはマラカイトグリーン（λ＝６１７ｎｍでε＝１．４９×１０５Ｍ−１ｃｍ−１）の吸収断面よりも４桁大きい。金属ナノ粒子はまた同様に著しい光散乱特性も有する。直径８０ｎｍの金ナノスフェアは、３００ｎｍのポリスチレンビーズとほぼ同じミー散乱特性を有する（双方ともλ＝５６０ｎｍでＣｓｃａ＝１．２３×１０１４ｍ２を特徴とし、３．２２×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１のモル散乱係数に相当する）。この強い散乱は、フルオレセイン由来の光放出（蛍光）（λ＝５２１ｎｍでε＝９．２３×１０４Ｍ−１ｃｍ−１、放出量子収量はλ＝４８３ｎｍでΦ＝０．９８となる）よりも５桁大きい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
当技術分野では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで適用可能な、癌の進行および病期を定量的に検出する改良法が必要である。また、癌のｉｎ  ｖｉｖｏ特性決定の必要もあり、それにより最も悪性度の高い癌組織に処置を向けることができる。また、リアルタイム分解で実施および観察可能な、脳を含む身体のあらゆる部位における癌性組織の位置および拡大をｉｎ  ｖｉｖｏで撮像する必要もある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、ナノプラットフォームおよびプロテアーゼ活性を検出するためのナノプラットフォームアセンブリーを提供する。ナノプラットフォームアセンブリーは、第１のナノ粒子および保護層を含む第１のナノプラットフォームと、第２のナノ粒子および保護層を含む第２のナノプラットフォームと、第１のナノプラットフォームと第２のナノプラットフォームとの間のオリゴペプチド結合とを備えている。オリゴペプチド結合はプロテアーゼコンセンサス配列を含む。加えて、第１のナノプラットフォームまたは第２のナノプラットフォームの少なくとも１つは、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む。
【００２５】
本発明はまた、本発明のナノプラットフォームアセンブリーと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物も提供する。
【００２６】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するための方法もまた提供する。その方法は、本発明のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）と、哺乳類の体液サンプルを接触させることを含む。そのアッセイ（被分析物）は、次いで、エネルギー源に曝され、そのアッセイ（被分析物）の光減衰における変化が検出される。これらの変化はプロテアーゼ活性に対応している。
【００２７】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのさらなる方法もまた提供する。その方法は、本発明のナノプラットフォームアセンブリーと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を、哺乳類に投与することを含む。次いで、そのアッセイ（被分析物）を癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に局在させる。その領域は、次いで、エネルギー源に曝され、そのアッセイ（被分析物）の後方散乱スペクトルが検出される。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法を提供する。その方法は、本発明のナノプラットフォームアセンブリーと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与することを含む。次いで、そのアッセイ（被分析物）を癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に局在させる。その関係部位に高周波パルスが送信され、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データが取得される。
【００２９】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのさらなるＭＲＩ撮像方法もまた提供する。その方法は、アセンブリーの結合がプロテアーゼコンセンサス配列ＳＧＲＳＡ（配列番号２）を含む本発明のナノプラットフォームアセンブリーと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を哺乳類に投与することを含む。次いで、そのアッセイ（被分析物）を癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に局在させる。その関係部位に高周波パルスが送信され、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データが取得される。このアッセイの結果に応じて、他の特定コンセンサス配列を使用して撮像方法が繰り返される。
【００３０】
本発明はまた、第１のナノ粒子と、そのナノ粒子周囲の保護層とを含む治療用ナノプラットフォームも提供する。その保護層は、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３１】
本発明のナノプラットフォームと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物もまた提供する。
【００３２】
本発明はまた、哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害する方法も提供する。その方法は、本発明の治療用ナノプラットフォームと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与することを含む。次いで、そのアッセイ（被分析物）を癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に局在させる。そのナノプラットフォームは、次いで、磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して加熱され、その結果、その関係部位の組織が少なくとも約４０℃の温度に加熱される。
【００３３】
本発明はまた、磁気Ａ／Ｃ−励起により哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害するための治療用ナノプラットフォームにも関し、そのナノプラットフォームの磁気Ａ／Ｃ−励起によって癌性細胞または前癌性細胞が加熱される。
【００３４】
発明のＭＲＩ造影剤もまた本発明において提供する。ＭＲＩ造影剤は鉄コアを有するコア/シェル型ナノ粒子を含む。ＭＲＩ造影剤は、Ｔ１増強ではｒ１が約１００ｍＭ−１ｓ−１より大きく、Ｔ２減衰ではｒ２が約−２，０００ｍＭ−１ｓ−１より大きい整数である。
【００３５】
本発明はまた、哺乳類において癌治療の経過をモニタリングするためのさらなるナノプラットフォームアセンブリーにも関する。そのアセンブリーは、第１のナノ粒子および保護層を含むナノプラットフォームと、粒子と、そのナノプラットフォームとその粒子との間のオリゴペプチド結合とを備える。その結合は、プロテアーゼコンセンサス配列を含む。その方法は、ナノプラットフォームを含む第１の診断アッセイ（被分析物）と、哺乳類の第１の体液サンプルを接触させること；第１のアッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；および第１の体液サンプルとの接触前の第１のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、第１のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける変化を経時的に検出することを含み、その変化は、第１のサンプルにおける第１のプロテアーゼ活性レベルに対応している。このプロセスは癌治療中後半で繰り返され、後のプロテアーゼ活性レベルが初期（または第１の）プロテアーゼレベルと比較される。プロテアーゼ活性レベルの変化に基づいて、治療方法を増やし、減少させまたは変更すると決定される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】癌進行の４つの主要な段階とこれらの段階に関連しているプロテアーゼを示す。
【図２】ＣＤＩを使用し、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子周囲のアミノ基末端シロキサン保護層に対する、ドーパミン結合ステルスリガンドおよびビオチン化ドーパミン結合ステルスリガンドの統計的混合物を使用したビオチン標識を例示する。
【図３】ウロキナーゼ切断配列と連結している、化学的に結合されたポルフィリンを特徴とするステルスリガンド被覆を備えたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子を含む２つのナノプラットフォームの切断についての例示である。
【図４】２つのナノプラットフォーム間の連結の一部としてポルフィリンを利用する代替連結方法を示す。
【図５】リガンドが切断配列を用いて事前に連結された後にナノ粒子表面に結合されることによる代替アセンブリー方法を示す。
【図６】実施例３に記載される手順によるリガンドＡを合成するための反応スキームを示す。
【図７】実施例３のリガンドとのポルフィリン化合物の結合を示す。
【図８】ナノプラットフォームにビオチン標識を付けるための反応スキームを示す。
【図９】ナノ粒子との結合前のステルスリガンド連結の代替方法を示す。
【図１０】実施例１１の、（Ａ）リガンド安定化を行わなかったおよび（Ｂ）リガンド安定化を行ったＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のＴ１緩和時間のグラフである。
【図１１】実施例１１の、（Ａ）リガンド安定化を行わなかったおよび（Ｂ）リガンド安定化を行ったＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のＴ２緩和時間を示す。
【図１２】実施例１１において計算された−（ｒ２／ｒ１）の減少が擬一次反応速度論にほぼ従うことを示す。
【図１３】実施例１２の、「遊離」ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリン（ＴＣＰＰ）（ｉ）および亜鉛ドープナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリン（ｉｉ）を特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノプラットフォームの相対蛍光を示す。
【図１４】実施例１２の、亜鉛ドープナトリウムＴＣＰＰおよびナトリウムＴＣＰＰを特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子の蛍光強度を示す。
【図１５】実施例１２における、ＰＢＳ中の非結合ナトリウムＴＣＰＰの濃度の上昇に伴うＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームの蛍光を示す。
【図１６】実施例１２の、ポルフィリンが連結されたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームの蛍光顕微鏡検査を示す。
【図１７】実施例１３における光スイッチ系センサーを使用した、ＭＡＴＢ  ＩＩＩ型癌細胞を注入したラット尿中のアッセイ（被分析物）のデータを示す。
【図１８】図１７のデータを使用してλ＝６５６ｎｍにおいて生じたＴＣＰＰの発光の相対強度のプロットを示す。
【図１９】蛍光顕微鏡により記録した、実施例１４のマウスの右肢および左肢の単一光子計数スペクトルを示す。
【図２０】実施例１５の、観察されたプロテアーゼ切断反応速度論の、プロテアーゼ（ウロキナーゼ）濃度の関数としてのグラフである。
【図２１】実施例１６の、ウロキナーゼの存在下での水中ナノ粒子−ダイマーのＵＶ／Ｖｉｓ後方散乱スペクトルを示す。
【図２２】実施例１６の、時間経過に伴う光減衰変化を示すグラフである。
【図２３】実施例１６の、４４０ｎｍにおける光減衰を６００ｎｍにおける光減衰で割った値の時間に対するプロットを示す。
【図２４】実施例１７の、７．５×１０−６Ｍの濃度のＨ２Ｏ中ポルフィリン亜鉛錯体を伴った、「遊離」テトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４結合テトラカルボキシフェニルポルフィリンのＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す。
【図２５】実施例１９の２個体のマウスのＭＲＩ画像である。
【図２６】実施例２０の、温熱による腫瘍の抑制および制御の研究の平均腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。
【図２７】実施例２１の、様々なナノ粒子およびナノプラットフォームについての温熱試験での時間経過に伴う温度変化のグラフである。
【図２８】実施例２２の、様々なＦｅおよびＦｅ２Ｏ３ナノ粒子について計算された比吸収率を平均粒径の関数として示す。
【図２９】計算された比吸収率を、温熱処置に使用される磁場の形状の関数として示す。
【図３０】実施例２４の、リガンド結合に対して球状ナノ粒子の利用可能な表面積をそれらの直径の関数として示す。
【図３１】実施例２４の、ナノ粒子１個当たりのドーパミン結合リガンドの数をナノ粒子直径の関数として示す。
【図３２】実施例２４の、ナノ粒子表面で単分子層を形成するリガンドの数に対するナノ粒子直径変動の影響を示す。
【図３３】実施例２５の、癌治療のｉｎ  ｖｉｔｒｏモニタリングの結果のグラフである。
【図３４】実施例２６の、神経幹細胞（ＮＳＣ）生存率に対するナノ粒子の効果を示すグラフである。
【図３５】実施例２６の、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞生存率に対するナノ粒子の効果を示すグラフである。
【図３６】鉄の存在についてプルシアンブルー染色陽性を示す、実施例２６のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームが装入されたＮＳＣの、ヌクレアファストレッドで対比染色した明視野画像である。
【図３７】実施例２６のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームが装入されたＮＳＣの透過型電子顕微鏡画像である（倍率３０，０００×）。
【図３８】実施例２６のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームの装入効率を、様々な濃度のナノプラットフォームが装入されたＮＳＣ細胞１個当たりのＦｅ濃度に基づいて示すグラフである（ここで、「＊」は対照に対して統計的に有意な結果であることを示す（ｐ値０．０５未満））。
【図３９】実施例２６のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームが装入されたＮＳＣ、ならびにペレット状態およびアガロース固体中のＮＳＣ対照についての、ＡＭＦ後の温度測定を示すグラフである（ここで、「＊」は対照に対して統計的に有意な結果であることを示す（ｐ値０．０１未満））。
【図４０】図４０（Ａ）〜（Ｆ）は、実施例２６の黒色腫腫瘍担持マウスの組織切片の画像である。
【図４１】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞および生理食塩水を注射し、ＡＭＦを行わなかったマウスと、Ｂ１６−Ｆ１０および実施例２６のナノ粒子装入ＮＳＣを注射した（ＡＭＦ処置を行ったまたは行わなかった）マウスとの腫瘍容積を比較しているグラフである。
【図４２】図４２（Ａ）〜（Ｂ）は、実施例２６の、生理食塩水＋ＡＭＦ（Ａ）またはナノ粒子装入ＮＳＣ＋ＡＭＦ（Ｂ）で処置したマウスの黒色腫組織の２−Ｄゲルの画像である。
【図４３】実施例２６の、生理食塩水＋ＡＭＦまたはナノ粒子装入ＮＳＣ＋ＡＭＦで処置したマウスの黒色腫組織の同定されたタンパク質についての表である。
【図４４】実施例２７に記載される、Ａｕ被覆ナノプラットフォームおよびオリゴペプチド配列番号６６（Ｎ末端において１つの残基が欠失し、Ｃ末端において２つの残基が欠失している）を使用したナノプラットフォームアセンブリーの形成を示す概略図である。
【図４５】実施例２７の安定性試験の結果のグラフである。
【図４６】実施例２７のＡｕ被覆ナノプラットフォームの装入効率のグラフである（ここで、黒色の円はＢ１６Ｆ１０癌細胞によるＦｅ取込み（単位：Ｆｅのｐｇ数／細胞）を示し、四角は幹細胞によるＦｅ取込み（単位：Ｆｅのｐｇ数／細胞）を示し、三角はＭＳ−１上皮細胞によるＦｅ取込み（単位：Ｆｅのｐｇ数／細胞）を示し、これらは培養培地中のＦｅ濃度の関数として示している）。
【図４７】複数種のプロテアーゼの同時検出のために主要なステルス被覆ナノ粒子に複数種のシアニン色素を使用するナノプラットフォームの多重化についての概略図である。
【図４８】様々なシアニン色素の発光スペクトルのグラフである。
【図４９】実施例２８の、ナノ粒子の低重合（ｏｌｉｇｏｐｌｅｘｉｎｇ）を示す概略図である。
【図５０】実施例２９の、ナノ粒子が装入された単球／マクロファージの画像である。
【図５１】図５１（Ａ）〜（Ｄ）は、実施例３０の、Ｂ１６Ｆ１０転移性肺黒色腫を担持するマウスにおけるナノプラットフォーム造影剤を使用したＭＲＩ画像である。
【図５２】実施例３１の、シアニン色素を使用した光スイッチナノプラットフォームの注射から１時間後のマウスの画像である。
【図５３】実施例３１の、ＴＣＰＰおよびローダミン発色団を使用した光スイッチナノプラットフォームの注射から２時間後のマウスの画像である。
【図５４】実施例３１の、ＴＣＰＰおよびローダミン発色団を使用した光スイッチナノプラットフォームの注射から２４時間後のマウスの画像である。
【図５５】実施例２６のＸＲＤデータのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
本発明は、診断用、撮像用および治療用ナノプラットフォーム、ならびにそれを使用する方法を提供する。ナノプラットフォームは、様々なマルチタスクセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）（診断と治療を兼ね備えた）装置およびアッセイを作出するための一般的なプラットフォームとして設計されたナノスケール（＜１００ｎｍ）構造である。本発明のナノプラットフォームは、１以上の保護層を有する無機ナノ粒子コアを含む。その無機コアは、好ましくは、コア/シェル型ナノ粒子を含む。その保護層は、好ましくは、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、およびそれらの組合せからなる群から選択される。また、そのような保護層に加えて金被覆も使用することができる。ナノプラットフォームは、その保護層に結合された化学結合官能基（すなわち、分子または化合物）をさらに含むことができる。これらの官能基は、好ましくは、組織、好ましくは標的癌性組織に局在し、そのような組織によって選択的に取り込まれる。また、保護層と官能基は、ナノプラットフォームの特性（溶解度など）を改変するためにも利用することができる。好ましい官能基は、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、官能基は保護層に直接結合されるであろう。他の実施形態では、官能基は、オリゴペプチド結合によって単分子層に結合され、そのようなオリゴペプチド結合が標的組織内でプロテアーゼによって選択的に切断されるであろう。これらのオリゴペプチド結合によって２つ以上のナノプラットフォームをともに連結することもできる。ナノプラットフォームはまた、これらのオリゴペプチド結合によって発色団および色素などの粒子と連結することもできる。さらなる実施形態では、２つのナノプラットフォームを連結するオリゴペプチド結合とともに、ポルフィリン化合物を使用することができる。これらの多機能ナノプラットフォームの成分の特定の組合せを、癌性組織の画像診断、検出、モニタリング、および治療的処置に適合させることができることは理解されるであろう。
【００３９】
無機ナノ粒子コア
前述のとおり、ナノプラットフォームは、好ましくは、無機コアを含み、この無機コアはナノ粒子を含む。本明細書において「ナノ粒子」とは、は、サイズが１００ｎｍより小さい金属粒子を意味する。好ましいナノ粒子は、二成分磁性であり、金属または金属合金のコアと金属シェルを含むと考えられる。好ましいコアは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択される。さらに好ましくは、ナノ粒子は強常磁性Ｆｅコアを特徴としている。好ましいシェルは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物（例えば、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＦｅｘＯｙ（非化学量論的酸化鉄）、ＣｕＯ、Ｃｕ２Ｏ、ＮｉＯ、Ａｇ２Ｏ、Ｍｎ２Ｏ３）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。特に好ましいナノ粒子は、超常磁性Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４コアシェル型ナノ粒子である。好適なナノ粒子は、ＮａｎｏＳｃａｌｅ(登録商標)  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｎｈａｔｔａｎ,  Ｋａｎｓａｓ）から入手可能である、限定されるものではないが、Ｎａｎｏ  Ａｃｔｉｖｅ(登録商標)という名称で入手可能なものが含まれる。
【００４０】
ナノ粒子は、好ましくは、平均全直径が約３ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、さらに好ましくは約７ｎｍ〜約１０ｎｍである。ナノ粒子のコアは、好ましくは、直径が約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約３ｎｍ〜約１８ｎｍ、より好ましくは約５ｎｍ〜約９ｎｍである。コア/シェル型ナノ粒子の金属シェルは、好ましくは、厚さが約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、より好ましくは約１ｎｍ〜約２ｎｍである。ナノ粒子はまた、好ましくは、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）多点法による比表面積が約２０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇ、より好ましくは約５０ｍ２／ｇ〜約３５０ｍ２／ｇ、さらに好ましくは約６０ｍ２／ｇ〜約８０ｍ２／ｇである。ナノ粒子は、好ましくは、細孔幅が１７．０００Å〜３０００．０００Åの間の細孔のＢａｒｒｅｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）法による吸着累積表面積が約２０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇ、より好ましくは約５０ｍ２／ｇ〜約１５０ｍ２／ｇである。ナノ粒子はまた、好ましくは、細孔幅が１７．０００Å〜３０００．０００Åの間の細孔のＢＪＨ法による脱着累積表面積が約５０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇ、より好ましくは約５０ｍ２／ｇ〜約１５０ｍ２／ｇである。ナノ粒子集団は、好ましくは、実質的に単分散であり、非常に狭いサイズ／質量サイズ分布を有する。より好ましくは、ナノ粒子集団は、多分散性指数が約１．２〜約１．０５である。本発明のナノプラットフォームに使用されるナノ粒子は分離した粒子であることが特に好ましい。すなわち、ナノ結晶（すなわち、ナノ結晶粒子）のクラスター形成を避けることが好ましい。
【００４１】
保護層
無機コアは、好ましくは、１以上の保護層で被覆される。一態様では、ナノ粒子は、有機官能性シロキサン保護層、より好ましくはアミノ官能性シロキサン（ＡＳＯＸ）層で被覆されている。シロキサン層は、生理学的条件下で生物腐食からコアを好ましくは守る。好ましいアミノ官能性シロキサンは、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−（トリメトキシシリル）プロパンニトリルおよび３−（トリエチオキシシリル）プロパンニトリル（３−（ｔｒｉｅｔｈｙｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅｎｉｔｒｉｌｅ）からなる群から選択される。好適なシロキサンは購入可能であるが、公知の方法（すなわち、クロロアルキルトリメトキシシランのアミノ分解またはシアノアルキルトリメトキシシランの水素化）によって合成することもできる。シロキサン層の厚さは、最終用途に応じて変更することができ、ナノプラットフォームの時間量はｉｎ  ｖｉｖｏで維持されるであろう。好ましくは、ナノプラットフォームは、アミノシロキサン層で被覆された鉄含有ナノ粒子を含む。アミノシロキサン層の厚さに応じて、鉄含有ナノ粒子は、約２日〜約２週間以内に生物腐食し、鉄カチオンを放出することが好ましいであろう。これらの鉄カチオンは、活性酸素種（ＲＯＳ）の鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）強化化学によって腫瘍組織への酸化的損傷を高めることが有利であろう。古典的な「ステルス」リガンド層（下に論じる）が生体適合性に影響を及ぼすのに対し、保護アミノシロキサン層の最適な厚さは、二成分磁性ナノ粒子ナノプラットフォームからの鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）放出の反応速度論を制御するであろう。
【００４２】
ナノ粒子ダイマーの錯体形成およびナノ粒子アセンブリーの安定化のために、ナノ粒子は、好ましくは、リガンドの層で「ステルス」被覆されまたは安定化される。安定化したナノ粒子は、好ましくは、ナノ粒子の周囲に保護層を含む。ステルス被覆は、ナノ粒子に直接付着させることができ、またはシロキサン保護層の周囲に第２の単分子層として加えてもよい。例えば、好ましい組合せは、ドーパミン−ステルスリガンド層で囲まれたアミノシロキサン層である。本明細書において「安定化」とは、ナノ粒子を被覆し保護するか、またはナノ粒子に特性を付与するためのリガンドシェルの使用を意味する。ステルス被覆は、ナノプラットフォームが細網内皮系を避けることができるようにし、診断および治療のための哺乳類体内での少なくとも２日間、好ましくは約２日〜約１４日間のナノプラットフォームの使用を可能にする。
【００４３】
リガンドは、ナノ粒子の金属表面に求引される官能基を含む。好ましくは、リガンドは、チオール、アルコール、ニトロ化合物、ホスフィン、ホスフィンオキシド、レソルシナレン、セレン化物、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、二硫化物、過酸化物、アミン、ニトリル、イソニトリル、チオニトリル、  オキシニトリル、オキシシラン、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物およびセレン部分からなる群から選択される少なくとも１つの基を含む。好ましい保護層は、アルカンチオレート単分子層、アミノアルキルチオレート単分子層、アルキルチオールスルフェート単分子層および有機フェノール（例えば、ドーパミンおよびその誘導体）からなる群から選択される。リガンドの特に好ましいクラスは、ドーパミン含有アンカーを含むオリゴエチレングリコール単位を含む。リガンド層の厚さは、個々のリガンドの長さに応じて調整することができ、好ましくは約１５ｎｍ未満、より好ましくは約２．９ｎｍ〜約７ｎｍである。例えば、テトラエチレングリコールリガンドは約２．９ｎｍの長さを有し、一方、オクタエチレングリコールリガンドは約４．２ｎｍの長さを有する。
【００４４】
特に好ましいリガンドはドーパミン含有アンカーを有し、以下からなる群から選択される。
【化１】
2013503634.tif 000007
、
【化２】
2013503634.tif 000008
、
【化３】
2013503634.tif 000009
、
およびそれらの組合せ、
［式中、ｎ＝２〜２５（好ましくは、３〜１１）、各Ｒ１は、保護ヒドロキシル基および非保護ヒドロキシル基からなる群から選択され、各Ｒ２は、それぞれ、−ＯＨ、
【化４】
2013503634.tif 000010
【化５】
2013503634.tif 000011
【化６】
2013503634.tif 000012
【化７】
2013503634.tif 000013
および
【化８】
2013503634.tif 000014
（式中、＊は、Ｒ２が該リガンドと結合する原子であることを示し、各Ｒ３は、それぞれ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ４）２、−Ｎ（Ｒ４）３＋、−ＮＨＲ４、−ＮＨ−ＣＯ−ＡＡ、および−ＣＯ−ＮＨ−ＡＡ（式中、各Ｒ４は、アルキル基（好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル基）からなる群から選択され、ＡＡは任意のアミノ酸である）からなる群から選択され、Ｍは、Ｚｎ２＋、Ｐｄ２＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、Ｐｔ２＋、Ｎｉ２＋、Ｅｕ３＋およびＧｄ３＋からなる群から選択される）からなる群から選択される］。存在する場合には、好ましい保護基は、ベンジル基、シロキシル基、カルボン酸エステル基および［１，３］ジオキソール（アセトニド）基からなる群から選択される。好ましくは、リガンドは親水性である。より好ましくは、リガンドはオクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ値）が少なくとも約５、好ましくは約２〜約−１．５である。ドーパミンアンカーは溶解を促進する。例えば、テトラエチレングリコールは、オクタノール／水分配係数がｌｏｇＰ＝−１．２６であり、一方、ドーパミン結合テトラエチレングリコールリガンドはｌｏｇＰが−０．２である。同じく、オクタエチレングリコールのｌｏｇＰは−１．８８であり、一方、ドーパミン結合オクタエチレングリコールのｌｏｇＰは−１．１６である。
【００４５】
オリゴペプチド結合との結合に対して、好ましいリガンドは、オリゴペプチド結合の末端システインのチオール基と反応し易いものが好ましいであろう（下に論じる）。Ｃ末端側のグリシンは、他のナノ粒子上のリガンドのアルコール官能基とエステル結合によって結合され、ナノ粒子ダイマーを形成するであろう。
【００４６】
下にさらに論じるように、リガンドは、ナノ粒子との結合前に、またはナノ粒子をステルス被覆した後で結合することができる。ステルス被覆の前にリガンドを相互に結合する場合、存在するならば、保護基を、水素／パラジウム炭素を使用して１段階で脱保護することができる。
【００４７】
ナノ粒子表面は、リガンドで本質的に完全に覆われることが好ましい。すなわち、ナノ粒子の表面の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは約１００％にリガンドが結合していると考えられる。単分子層を形成するのに必要なリガンドの数は、ナノ粒子（および単分子層）のサイズによって異なり、実施例２２に記載される分子モデリング法またはリガンドモデリング法を使用して計算することができる。例えば、２０ｎｍ径のナノ粒子は完全表面被覆におよそ１，０３０のステルスリガンドが必要であり、一方、１２ｎｍ径のナノ粒子は完全表面被覆に４１２のドーパミン−ステルスリガンドが必要である。
【００４８】
様々なナノ粒子の表面にまたはシロキサン保護層にリガンドを結合するための様々な技術は当技術分野で公知である。例えば、ナノ粒子をリガンド含有溶液に混合して、ナノ粒子表面の被覆を促進してよい。あるいは、被覆がナノ粒子に付着するまたはナノ粒子と結合するように気相の被覆材料にナノ粒子を曝すことによって、ナノ粒子に被覆を加えてよい。リガンドは共有結合によってナノ粒子またはシロキサン保護層と結合することが好ましい。シロキサン保護層周囲のドーパミン含有リガンド単分子層では、両方のフェノール基がシロキサン保護層の末端アミノ基と常に結合するとは限らないことに留意されたい。しかしながら、ドーパミン含有ステルスリガンドの結合にはナノ粒子との１つのカルバミン酸結合の形成で十分である。
【００４９】
リガンドがオリゴペプチド配列を介してすでに結合されている場合の好ましいリガンド結合方法は以下である。結合するリガンドの化学量論的混合物（ナノ粒子の質量に対する重量で、好ましくは約１／１、より好ましくは、約１０／１）を、無水ＴＨＦ中のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子と反応させることができる。混合物を、次いで、好ましくは少なくとも約３０秒間、より好ましくは約１分〜約５分間音波処理し、その後、約５分〜約２４時間連続攪拌する。リガンド置換は、所望により、ＨＰＬＣを使用して追跡調査することができる。ステルス被覆の完了後、強力な磁石を用いて二成分磁性ナノ粒子を沈降させ／分離することができる。それらの粒子を、さらに、ＴＨＦに再懸濁し、再び回収することが好ましい。少なくとも約１０秒間、好ましくは約３０秒間の音波処理、続いて、約５分間の攪拌を行うことにより、ナノ粒子を液体媒体に再分散させる。洗浄／再分散のプロセスは、ナノ粒子を水性バッファー（例えば、ＰＢＳ）に移す前に、最大約２５回、好ましくは最大約１０回繰り返すことができる。残留溶媒をアルゴン流中で除去することもできることは理解されるであろう。さらに、モノマーおよびオリゴマーに対する（望まれる）ダイマーの量は、ゲル浸透クロマトグラフィーを使用して決定されることが好ましい。
【００５０】
また、ナノ粒子の安定性をさらに高め、生物腐食からそれらを守るために、金被覆層を使用することもできる。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験またはｉｎ  ｖｉｖｏ試験での使用前に、被覆ナノ粒子（結合しているかどうかに関係なく）をさらに、再蒸留し滅菌したＨ２Ｏに懸濁し／溶解することが好ましい。
【００５２】
官能基
上に示したとおり、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、標的組織による選択的取込みのための官能基が結合されているリガンドの層で被覆されている。好ましい官能基は、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン標識、色素、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５３】
ポルフィリン（クロリンおよびバクテリオクロリンを含む）は、細胞膜でポルフィリン受容体を過剰発現する癌細胞による選択的取込みを誘発することが見出されている。ＬＤＬ−受容体（低密度リポタンパク質）は、癌細胞で過剰発現され、ポルフィリンを、単独でおよび／または同時脂質取込み機構によって取り込む能力を有する。ポルフィリン、クロリンまたはバクテリオクロリンの疎水性が高くなるほど、ＬＤＬ−受容体によって促進され得る取込みは容易になる。有利には、癌細胞によるこの迅速な取込みによって癌性組織でポルフィリンドープナノプラットフォームの蓄積が起こり、肝臓または脾臓などの他の組織ではわずかに蓄積するだけである。存在する場合には、ナノプラットフォームには、好ましくはナノ粒子１個当たり少なくとも約１個のポルフィリンが結合されており、好ましくはナノ粒子１個当たり約２〜約２０のポルフィリンが結合されており、さらに好ましくはナノ粒子１個当たり約５〜約１０のポルフィリンが結合されているであろう。特に好ましいポルフィリンは、メタレート型および非メタレート型のテトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびテトラヒドロキシフェニルポルフィリンからなる群から選択される。
【００５４】
ビオチン標識は、ナノプラットフォームの溶解度を高め、事実上全ての哺乳類細胞による非常に迅速な取込みプロセスを誘発する。そのような細胞によるナノプラットフォームの可能な限り迅速な取込みならびに可能な限り高いペイロードを確実にするために、ビオチン標識の程度を変更することができる。そのような目的では、種々の割合の非標識リガンドおよびビオチン標識リガンドをナノ粒子と混合することができる。例えば、好ましいＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のビオチン標識を示している図２のスキームを参照。好ましくは、標識リガンドに対して非標識リガンドは、約１：１〜約２００：１の割合で混合される。それらの同様の立体要求性から、リガンドは、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子間で統計的分布に従う可能性がもっとも高く、ポアソン分布によって示すことができる（実施例２４参照）。結果として、ナノ粒子１個当たりのビオチン化有機リガンドの数は変動するが、その分布は相対的に狭いことが好ましく：９５％を超えるナノ粒子で、互いからの最大偏差が相対パーセント１０％未満であることが好ましい。さらに、最適構造を特徴とするナノプラットフォームが最初に取り込まれるため、細胞装入中に速度論的選択プロセスが存在するであろう。存在する場合には、ナノプラットフォームは、好ましくは、ナノ粒子１個当たり少なくとも約１つのビオチン標識、好ましくは約１つ〜約５０のビオチン標識、さらに好ましくはナノ粒子１個当たり約２つ〜約１０のビオチン標識を有するであろう。
【００５５】
オリゴペプチド結合およびコンセンサス配列
好適なオリゴペプチド結合は、標的プロテアーゼのコンセンサス配列、末端カルボン酸基（Ｃ末端）および末端アミン基（Ｎ末端）を含むであろう。オリゴペプチドはまた、好ましくは、Ｃ末端にチオール基、Ｎ末端にカルボン酸基も含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴペプチドリンカーは、プロテアーゼコンセンサス配列Ｎ末端の少なくとも１０個のアミノ酸の親水性領域および切断配列Ｃ末端の連結領域を含み、ここで、そのＣ末端連結領域はその末端にチオール反応性基を含む。さらに好ましくは、オリゴペプチドのＣ末端は、システイン残基、リジンまたはアスパラギン酸塩を含む。オリゴペプチドのＮ末端親水性領域は、好ましくは、過剰正電荷または負電荷を約１：１の割合で有する。Ｎ末端親水性領域はまた、好ましくは、互いに水素結合を形成することが可能なアミノ酸残基も含む。
【００５６】
特に好ましいＣ末端連結領域は、ＧＧＧＣ（配列番号１４）、ＡＡＡＣ（配列番号１５）、ＳＳＳＣ（配列番号１６）、ＴＴＴＣ（配列番号１７）、ＧＧＣ（配列番号３８）、ＧＧＫ（配列番号３９）、ＧＣ（配列番号４０）、ＧＧＤ（配列番号４２）、ＧＸＧＤ（配列番号５８）およびＧＸＧＸＧＤ（配列番号５９）（ここで、Ｘはシステインまたはリジン以外の任意のアミノ酸である）からなる群から選択される配列を含む。特に好ましい、オリゴペプチドＮ末端領域は、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ（配列番号１）、ＫＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ（配列番号１９）、ＫＫＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ（配列番号２０）、ＣＧＧＧ（配列番号２３）、ＫＧＧＧ（配列番号２４）、ＫＧＧ（配列番号３７）、ＫＧＸＧ（配列番号６０）およびＫＧＸＧＸＧ（配列番号６１）（ここで、Ｘはシステインまたはリジン以外の任意のアミノ酸である）、ならびにＤＧＸＧ（配列番号６２）およびＤＧＸＧＸＧ（配列番号６３）（ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である）からなる群から選択される配列を含む。Ｎ末端はまた、リジン、オルニチン、２，４  ジアミノ酪酸および２，３  ジアミノプロプリオニック酸（２，３  ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群から選択される１つ以上の末端基も含むことができる。別の好ましいオリゴペプチドは、以下の一般的構造を有する：
【化９】
2013503634.tif 000015
式中の「配列」は、本明細書において記載されるオリゴペプチドまたはコンセンサス配列のいずれであってもよい。そのようなオリゴペプチドは購入可能であるが、公知の方法（例えば、改良メリフィールド合成）を使用して合成することもできる。
【００５７】
好ましくは、オリゴペプチド結合に使用されるコンセンサス配列は、セリンプロテアーゼ切断配列、アスパルチルプロテアーゼ切断配列、システインプロテアーゼ切断配列およびメタロプロテアーゼ切断配列からなる群から選択される。さらに好ましくは、コンセンサス配列は、ウロキナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ、カテプシンおよびゼラチナーゼからなる群から選択されるプロテアーゼの切断配列を含む。特に好ましいプロテアーゼおよびそれらの対応するコンセンサス配列を下の表Ｉに挙げる。
【００５８】
【表１】
2013503634.tif 000016
【００５９】
図１に関しては、癌の進行における多くの特異的な事象と上述のプロテアーゼが関係付けられている。疾患進行の段階は、４つの事象、すなわち、初期突然変異、細胞生存／腫瘍進行、血管新生（新しい血管の発生）および浸潤／組織リモデリングに分けられる。各段階に関係している一連のプロテアーゼにより、癌がどの程度進行し、予後がどうなるかのイメージをうまく描くことができる。選択したプロテアーゼに最も好ましいオリゴペプチド配列を下の表に挙げ、切断点を「−」で示している。
【００６０】
【表２】
2013503634.tif 000017
【００６１】
さらに図１に関連して、本発明のアッセイを用いて正確な癌予後を決定することができる。特に、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−７が本発明のアッセイによって検出されるが、他の２種のプロテアーゼが本発明のアッセイによって検出されない場合には、癌予後は細胞生存／腫瘍進行である。本発明のアッセイによってｕＰＡおよびＭＭＰ−７が検出される（がＭＭＰ−１またはＭＭＰ−２が検出されない）場合には、予後は血管新生である。４種全てのプロテアーゼが検出される場合には、予後は浸潤および最終的な転移である。従って、これらの４種のプロテアーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ測定によって、癌性組織の進行の空間分解測定が可能であり、治療を体内の最も活発な腫瘍へ導くことができるより詳細な予後を可能にする。
【００６２】
プロテアーゼが存在することにより、ナノプラットフォームアセンブリーのコンセンサス配列が切断され、この切断によって起こる変化を本発明のＭＲＩアッセイおよび光後方散乱アッセイによって検出する。そのため、ナノプラットフォームの標的とされるプロテアーゼに応じて、以下の配列の２つ以上が結果として生じるであろう：ＫＧＧＶＰＭＳ（配列番号４３）、ＭＲＧＧＧＣ（配列番号４４）、ＫＧＧＩＰＶＳ（配列番号４５）、ＬＲＳＧＧＣ（配列番号４６）、ＫＧＧＶＰＬＳ（配列番号４７）、ＬＴＭＧＧＣ（配列番号４８）、ＫＧＧＧＳＧＲ（配列番号４９）、ＳＡＧＧＧＣ（配列番号５０）、ＣＧＧＧＳＧＲ（配列番号５１）、ＳＡＧＧＣ（配列番号５２）、ＤＧＧＳＧＲ（配列番号５３）、ＳＡＧＧＫ（配列番号５４）、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲ（配列番号５５）、ＫＧＧＳＧＲ（配列番号５６）、ＳＡＧＧＤ（配列番号５７）、ＳＡＧＧＧ（配列番号６９）、ＤＧＧＧＳＧＲ（配列番号７０）、ＳＡＧＧＧＤ（配列番号７１）、ＤＧＡＧＳＧＲ（配列番号７２）（およびＮ末端において１つの残基が欠失していてよいそれらの変異体）、ＳＡＧＡＧＤ（配列番号７３）（およびＣ末端において１つの残基が欠失していてよいそれらの変異体）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＭＳ（配列番号８８）＊、ＭＲＧＡＧ（配列番号８９）、ＨＨＨＧＡＧＩＰＶＳ（配列番号９０）＊、ＬＲＳＧＡＧ（配列番号９１）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＲ（配列番号９２）＊、ＨＨＨＧＡＧＲＰＦＳ（配列番号９３）＊、ＭＩＭＧＡＧ（配列番号９４）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳ（配列番号９５）＊、ＬＴＭＧＡＧ（配列番号９６）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳ（配列番号９７）＊、ＬＹＳＧＡＧ（配列番号９８）、ＨＨＨＧＡＧＧＡＡＮ（配列番号９９）＊、ＬＶＲＧＧＡＧ（配列番号１００）、ＨＨＨＧＡＧＰＱＧＬＡ（配列番号１０１）＊、ＧＱＲＧＩＶＧＡＧ（配列番号１０２）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＫＳＲ（配列番号１０３）＊、ＭＶＰＮＦＮＧＡＧ（配列番号１０４）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＩＦＲ（配列番号１０５）＊、ＳＷＡＮＦＮＧＡＧ（配列番号１０６）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＶＶＩＡ（配列番号１０７）＊、ＴＶＩＶＩＴＧＡＧ（配列番号１０８）、ＨＨＨＧＡＧＰＲ（配列番号１０９）＊またはＡＧＡＧ（配列番号１１０）（ここで、＊は、配列がＮ末端において１つ、２つまたは３つの残基が欠失していてよい包含される配列変異体を示す）。
【００６３】
ナノプラットフォーム構造
連結されたナノプラットフォームは、プロテアーゼ検出（例えば、ＭＲＩ造影剤または光後方散乱）に使用することが好ましいであろう。診断用ナノプラットフォームは、様々な方法で連結することができる。一実施形態では、ナノプラットフォームアセンブリーは、１以上のオリゴペプチド結合によってともに連結された少なくとも２つナノプラットフォームを含むであろう。前述のとおり、オリゴペプチド結合は、ナノプラットフォームそれぞれのナノ粒子に、またはナノ粒子の周囲の１以上の単分子層に直接結合することができる。ナノ粒子は、化学的に結合された官能基（ポルフィリンまたはビオチン標識など）を特徴としていることがある。そのような官能基は、ナノ粒子または保護層に直接結合されることがあるし、またはオリゴペプチド結合によって（単分子層を備えているまたは備えていない）ナノ粒子に結合されることもある。図３は、ウロキナーゼのコンセンサス配列を含むオリゴペプチド結合によって結合された超常磁性Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子を含む２つのナノプラットフォームを例示している（正確な縮尺ではない）。「Ｐ」は、ポルフィリン（テトラ−４−カルボキシフェニルポルフィリン、ＴＣＰＰなど）を表しており、ポルフィリンはＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子のステルス被覆と結合している。
【００６４】
いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子を１以上のオリゴペプチド結合によって中心構造に結合することができる。好適な中心構造は、ナノ粒子およびポルフィリンからなる群から選択される。図４は、ポルフィリン中心構造を利用した２つのナノプラットフォームの連結を示しており、このポルフィリン中心構造は、ナノ粒子のステルス被覆と連結された４つの切断配列を特徴としている。図４９に示されるように、複数のナノプラットフォームを同時に連結して、オリゴマー複合体を形成することもできる。これらのナノプラットフォームまたはナノ粒子のオリゴマーはナノ粒子以外の粒子（下に記載する）をオリゴマーマトリックスの一部としてさらに含むことができる。ナノプラットフォームはまた、本明細書に論じられるように、官能性をもたせることもできる。
【００６５】
セラノスティックプラットフォームの様々な成分は種々の順序で組み立てることができると理解される。例えば、ナノ粒子をステルス被覆し、その後、オリゴペプチド配列を介して連結することができる。同様に、リガンドをまず、標的切断配列を含むオリゴペプチドを介して連結し、その後、ナノ粒子と結合することができる。図５はこのプロセスを例示している。ポルフィリンはリガンド層に被覆前に結合してよくまたは後に結合してもよい。とにかく、連結されたナノプラットフォーム間の距離は、好ましくは約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、より好ましくは約１０ｎｍ〜約３０ｎｍである。
【００６６】
癌性組織の治療的処置用のナノプラットフォームは連結しないこと(非連結)が好ましいであろう。これらのナノデバイスは、好ましくは、コア／シェル型ナノ粒子とステルスリガンド被覆を含むであろう。いくつかの実施形態では、ナノプラットフォームはまた、好ましくは、シロキサン保護層も含むであろう。さらに好ましくは、ナノプラットフォームは、化学的に結合された官能基（ポルフィリン、ビオチン標識、およびそれらの組合せなど）を特徴としているであろう。この場合も、ナノプラットフォームの成分を様々な順序で組み立てることができる。治療用ナノプラットフォームは、癌性組織の温熱処置に特に適している。
【００６７】
検出または処置の方法にかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用では、ナノプラットフォームは、約２日〜約５日後に生物腐食し、約１０日後に患者の組織から除去されることが好ましい。より好ましくは、シロキサン保護層を含むナノプラットフォームは、約５日〜約１５日後に生物腐食し、約３０日後に患者の組織から除去されるであろう。逆に言えば、ナノプラットフォームは、投与後少なくとも２日間は生物腐食することなくｉｎ  ｖｉｖｏで滞留することが好ましいであろう。
【００６８】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合、ナノプラットフォームは、凝固せず、別個の単一ナノ構造または連結型ナノ構造として滞留することが好ましい。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合、投与されたナノプラットフォームの大多数が癌性組織に取り込まれ、そこに局在することが好ましいであろう。すなわち、肝臓または脾臓などの健常組織ではナノプラットフォームはわずかな量でしか見出されないであろう。例えば、１５０μｇのナノプラットフォームがＩＶ注射により投与された場合には、ナノプラットフォーム総投与量の少なくとも約５０％が標的組織（腫瘍）に局在することが好ましく、一方、そのナノプラットフォームの約１０％未満が健常組織に局在することが好ましい。５００μｇのナノプラットフォームが投与された（２４時間以内に各回２５０μｇの２回の連続したＩＶ注射）場合には、ナノプラットフォーム総投与量の少なくとも約３０％〜約５０％が標的組織（腫瘍）に局在する。
【００６９】
粒子
いくつかの実施形態では、ナノプラットフォームは、（上記のように、第２のナノプラットフォームの代わりとして）粒子と結合しているであろう。例えば、ナノプラットフォームのリガンド保護層は、オリゴペプチド結合（例えば、配列番号６６変異体）によって、下に示す、ＴＣＰＰなどの粒子と結合することができる。
【化１０】
2013503634.tif 000018
これらの実施形態は、哺乳類において癌治療の経過をモニタリングするアッセイおよび方法に特に有用である。下により詳細に論じるように、プロテアーゼ活性の測定に使用されるセンサーのタイプに応じて、複数の異なるタイプの粒子を使用して、これらのナノプラットフォームアセンブリーを形成することができる。好ましくは、粒子の励起スペクトルおよび発光スペクトルの最大値は６５０〜８００ｎｍの間である。診断アッセイでの使用に好ましい粒子は、発色団／発光団（色素）、量子ドット、ビオロゲン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００７０】
１．発色団／発光団
本発明のアッセイでの使用に好適な発色団／発光団粒子としては、任意の有機色素または無機色素、フルオロフォア、ホスホフォア（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｅｓ）、光吸収ナノ粒子（例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ）、それらの組合せ、またはそれらのメタレート錯体が挙げられる。好ましくは、発色団／発光団粒子は約１００ｎｍ未満のサイズを有する。
【００７１】
好適な有機色素は、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリトロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２，５−ジフェニルオキサゾール、ルブレンおよびＮ−（３−スルホプロピル）アクリジンからなる群から選択される。好ましいクマリンの具体的な例としては、７−アミノクマリン、７−ジアルキルアミノクマリンおよびクマリン１５３が挙げられる。好ましいベンゼンの例としては、１，４−ビス（５−フェニルオキサゾール−２−イル）ベンゼンおよび１，４−ジフェニルベンゼンが挙げられる。好ましいシアニンの例としては、オキサシアニン、チアシアニン、インドシアニン、メロシアニンおよびカルボシアニンが挙げられる。他の例示的なシアニンとしては、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ、ＥＣＦ、Ｃ３−オキサシアニン、Ｃ３−チアシアニン色素（ＥｔＯＨ）、Ｃ３−チアシアニン色素（ＰｒＯＨ）、Ｃ５−インドシアニン、Ｃ５−オキサシアニン、Ｃ５−チアシアニン、Ｃ７−インドシアニン、Ｃ７−オキサシアニン、ＣｙｐＨｅｒ５、Ｄｙｅ−３３、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｃｙ５．０、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３Ｃｙ５  ＥＴ、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．０、Ｃｙ３．５、Ｃｙ２、ＣＢＱＣＡ、ＮＩＲ１、ＮＩＲ２、ＮＩＲ３、ＮＩＲ４、ＮＩＲ８２０、ＳＮＩＲ１、ＳＮＩＲ２、ＳＮＩＲ４、メロシアニン５４０、ピナシアノールヨージド、１，１−ジエチル−４，４−カルボシアニンヨージド、Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌ、Ｄｙｅ−１０４１またはＤｙｅ−３０４が挙げられる。
【００７２】
ナノプラットフォームでの使用に特に好ましい有機色素はシアニン色素である。蛍光シアニン色素は、ナノ粒子と連結され、Ｆｅ（０）−コアのプラズモンにより迅速な蛍光消光を起こす。これは、そのテザーがシアニン色素のＦｏｒｓｔｅｒ半径より小さい（Ｃｙ３．０およびＣｙ３．５では５〜６ｎｍ、Ｃｙ５．０およびＣｙ５．５では６〜７ｎｍ、Ｃｙ７およびＣｙ７．５ではおよそ７ｎｍ）場合に限り観察される。リガンド（約２．８４ｎｍ）と切断配列中の１２以下のアミノ酸残基からなるテザーの最大長さ（最大４ｎｍ）は、Ｃｙ３．ｘおよびＣｙ５．ｘ色素との使用にはより短い切断配列（ｕＰＡおよびＭＭＰ類）が好適であることを示しているが、カテプシンは、好ましくは、Ｃｙ５．ｘおよびＣｙ．７．ｘ色素と連結され、連結されたシアニン色素の最適消光を可能にする。シアニン類の全てにおいて、それらの発光極大はヒト尿の自発蛍光に対して赤方シフトしている。図４７に示されるように、最大４種の酵素の活性を同時に測定するために、複数種のシアニンを単一ナノ粒子と連結して、低重合ナノプラットフォームを作出することができる。電磁スペクトルのＵＶＡ領域または青色領域において４種全ての色素が同時に励起され得る、または各色素が個別に励起され得る。全てのシアニン色素は、（蛍光一重項状態に典型的な）それらの発光極大に対して２０〜２５ｎｍ青方シフトした励起極大を示す。ＮＳ−Ｃｙ３．０（λｅｘ＝５３８、λｅｍ＝５６０）、ＮＳ−Ｃｙ５．５（λｅｘ＝６３９、λｅｍ＝６６０）、ＮＳ−Ｃｙ７．０（λｅｘ＝７４０、λｅｍ＝７６０）およびＮＳ−Ｃｙ７．５（λｅｘ＝８０８、λｅｍ＝８３０）の発光スペクトルを図４８に示している。
【００７３】
好適な無機色素は、メタレート型および非メタレート型のポルフィリン、フタロシアニン、クロリン（例えば、クロロフィルＡおよびＢ）およびメタレート発色団からなる群から選択される。好ましいポルフィリンは、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびＺｎ−ＴＣＰＰからなる群から選択される。好ましいメタレート発色団は、ルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、イリジウム（ＩＩＩ）の３−（１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体およびイリジウム（ＩＩＩ）との３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体からなる群から選択される。
【００７４】
好適なフルオロフォアおよびホスホフォアは、リン光性色素、フルオレセイン、ローダミン（例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ）およびアントラセン（例えば、９−シアノアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニル−エチニル）アントラセン）からなる群から選択される。
【００７５】
２．量子ドット
量子ドットは、周期表の第ＩＩ族〜第ＶＩ族または第ＩＩＩ族〜第Ｖ族の元素の原子で構成された半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＰ）である。量子ドットの光学的特性は、（通常安定化している）シェルを合成することによって操作することができる。そのような量子ドットはコア−シェル型量子ドット（例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＣｄＳｅ）として公知である。同一材料でサイズが異なる量子ドットは、異なる色の光を放出し得る。それらの輝度は、３つの空間次元全てにおける電子の閉じ込めによるエネルギー準位の量子化に起因する。バルク半導体において、電子−正孔対は、各タイプの半導体に特有のボーア励起子半径内で結合される。量子ドットはボーア励起子半径よりも小さく、離散エネルギー準位の出現をもたらす。半導体の価電子帯（ｔｈｅ  ｖａｌａｎｃｅ）と伝導帯との間のバンドギャップΔＥは、ナノ結晶のサイズおよび形状の関数である。量子ドットは、従来の有機フルオロフォアよりも若干低い放出量子収量を特徴としているが、ずっと大きな吸収断面と非常に低い光退色速度を有する。量子ドットのモル吸光係数は、約１０５〜１０６Ｍ−１ｃｍ−１であり、色素よりも１０〜１００倍大きい。
【００７６】
コア／シェル型量子ドットは、より低いバンドギャップのコアの周りにより高いバンドギャップのシェルを有し、シェルによる吸収なく光を放出する。シェルはコアの表面無放射発光を皮膜保護し、それにより光ルミネセンス量子収量を高め、自然分解を防止する。Ｉ型量子ドット（例えばＣｄＳｅ／ＺｎＳ）のシェルは、コアよりも高いエネルギーの伝導帯と低いエネルギーの価電子帯を有し、コア内に電子と正孔をともに閉じ込めることとなる。ＩＩ型量子ドット（例えば、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅ）のシェルの伝導帯と価電子帯は、コアよりもエネルギーがともに低いかまたはともに高いかである。そのため、電子および正孔の運動が一次元に制限される。コア−シェル型界面における励起子の放射再結合はＩＩ型発光を生じさせる。ＩＩ型量子ドットは、バンド端近傍で間接半導体として挙動し、そのため、吸収は赤色および近赤外にまで及ぶ。合金半導体量子ドット（ＣｄＳｅＴｅ）も使用することができるが、Ｉ型およびＩＩ型が最も好ましい。合金組成および内部構造は変更することができ、それによって粒子のサイズを変えることなく光学的特性を調整することが可能である。これらの量子ドットは、最大８５０ｎｍまで発光することができるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的アッセイ用の近赤外蛍光プローブを開発するために使用することができる。
【００７７】
特に好ましい量子ドットは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型量子ドット、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅコア／シェル型量子ドット、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅコア／シェル型量子ドットおよび合金半導体量子ドット（例えば、ＣｄＳｅＴｅ）からなる群から選択される。量子ドットは、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合には腎経路によって排出されるのに十分小さいことが好ましい。より好ましくは、量子ドットは、直径約１０ｎｍ未満、さらに好ましくは直径約２ｎｍ〜約５．５ｎｍ、最も好ましくは直径約１．５ｎｍ〜約４．５ｎｍである。複数のセンサー（多重検出）を作出するために異なる色の発光が必要である場合には、量子ドットコアのサイズを変えて異なる発光波長を与えることによりこれを達成することができる。量子ドットは、ナノ粒子に関して上述のように、安定化してもよくまたは安定化しなくてもよい。量子ドットの安定化に好ましいリガンドはレソルシナレンである。
【００７８】
細胞送達
いくつかの実施形態では、ナノプラットフォームおよびアセンブリーは、癌性組織への細胞の標的化送達のために細胞に装入することができる。本明細書において記載される方法の各々では、細胞送達を用いて癌性組織へのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を達成してもてよい。細胞送達は、本明細書において論じられる磁気温熱処置に特に好ましい送達方法である。癌性組織へのナノプラットフォームの送達に好ましい細胞としては、任意の腫瘍指向性細胞が挙げられる。好ましい細胞としては、幹細胞、単球、マクロファージ、およびそれらの組合せが挙げられる。癌性組織への選択的送達に特に適している幹細胞としては、神経幹細胞（ＮＳＣ）、臍帯マトリックス幹細胞、骨髄幹細胞および脂肪由来間葉系幹細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞に鉄／酸化鉄ナノプラットフォームおよびアセンブリーが装入され、そのような装入は、総Ｆｅ濃度約１ｍｇ／ｌ〜約２５０ｍｇ／ｌ（好ましくは約１０ｍｇ／ｌ〜約１００ｍｇ／ｌ）を与えるレベルでナノプラットフォームおよびアセンブリーを含有する好適な培養培地（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）など）中で約１〜約７２時間（好ましくは約１２〜約２４時間）細胞をインキュベートすることによる。好ましくは、各細胞に装入されるＦｅの量は、一細胞当たり約０．１ｐｇ（ピコグラム）〜約１０ｐｇ／細胞（より好ましくは約１ｐｇ／細胞〜約５ｐｇ／細胞）である。
【００７９】
本発明の方法
本発明のナノプラットフォームの１つの利点は、利用可能なセンサー技術に合わせてナノ粒子、粒子、保護層または官能基を変更し、さらに、癌性組織における酵素活性を検出するための様々なセンサー技術を用いることによって、ナノデバイスおよびアッセイを適合させ得る柔軟性である。有利には、同じナノプラットフォームを癌性組織の標的化治療的処置にも使用することができる。
【００８０】
ナノプラットフォームを使用して、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、小児脳幹グリオーマ、成人脳腫瘍、小児悪性グリオーマ、小児上衣細胞腫、小児髄芽細胞腫、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児視経路および視床下部グリオーマ、乳癌、妊娠関連乳癌、小児乳癌、男性乳癌、小児カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、小児結腸直腸癌、食道癌、小児食道癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、成人グリオーマ、成人（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝細胞癌、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、小児腎臓癌、成人（原発性）肝臓癌、小児（原発性）肝臓癌、非小細胞肝臓癌、小細胞肝臓癌、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、黒色腫、成人悪性中皮腫、小児中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、小児多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、神経芽腫、非小細胞肺癌、小児卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、小児膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、小児腎細胞癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、小児皮膚癌、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、扁平上皮癌、胃癌、小児胃癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、小児甲状腺癌および膣癌からなる群から選択される癌に関連している癌性細胞または前癌性細胞を検出することができる。
【００８１】
また、アセンブリーを使用して、哺乳類において癌治療の経過をモニタリングすることもできる。
【００８２】
下に論じるｉｎ  ｖｉｖｏ方法の各々では、任意の好適な方法を使用して（限定されるものではないが、静脈内、皮下、または腫瘍部位（すなわち、腫瘍中または腫瘍周辺）内もしくは腫瘍部位近くへの直接局所注射によるなど）ナノプラットフォームを投与することができる。これらの投与経路は、本明細書において論じられるリポソーム送達または細胞送達方法とともに使用するためにも適している。
【００８３】
検出および撮像法
１．磁気共鳴撮像法
本発明の一態様では、本発明のナノプラットフォームは、組織または生体サンプル中のプロトン（１Η）のスピン緩和時間に基づいて働く。診断用ナノプラットフォームは、組織またはサンプル中の１Η核のＴ１緩和時間および／またはＴ２緩和時間を変化させるＭＲＩ造影剤として働く。ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像法では、これは撮像する組織のシグナル強度を変化させる。連結型ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）、または連結型ナノプラットフォームを含む組成物は、好ましくは、薬学上許容される担体を用いて哺乳類に投与される。ナノプラットフォームは、血流中への静脈内（ＩＶ）注射により投与することができる。好ましくは、約２００μｇの連結型ナノプラットフォームをＩＶ注射により投与する。あるいは、水性バッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））に溶解した連結型ナノプラットフォームを、局所部位に（例えば、腫瘍部位中または腫瘍部位近くに直接）注射により投与することができる。また、リポソーム送達（熱不安定性リポソームなど）を使用してもよい。細胞送達を使用することもできる。
【００８４】
ＭＲＩデータの取得はほぼ注射直後に開始することができる。ＭＲＩデータの取得は好ましくは、ナノプラットフォーム造影剤が癌性細胞により取り込まれ、身体またはサンプルの標的領域に局在したところで開始する。標的組織中のナノプラットフォームアッセイ（被分析物）の濃度は好ましくは、約１ｇ／ｇ組織〜約１，０００μｇ／ｇ組織、より好ましくは約１０μｇ／ｇ組織〜約２５０μｇ／ｇ組織である。有意味なデータは、いつデータ取得を開始するかによって、好ましくは、連結型ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）の注射から約１５分〜約２４時間後、より好ましくは約３０分〜約５時間後に取得される。ＲＦ短パルスを対象とする領域またはサンプルに送信する。パルスシーケンスを、組織コントラストが主としてＴ１（Ｔ１強調画像）の違いによって左右されるか、Ｔ２（Ｔ２強調画像）の違いによって左右されるかによって改変することができる。自動データ収集および解析は、ＭＲＩ装置から送信または収集されたデータを好ましくはリアルタイムで評価するためのコンピュータプログラム（すなわち、アルゴリズム）を用いて実行することができる。パルスシーケンスパラメーターは、コントラストを最大にするために機器の操作者がさらに調節することができる。
【００８５】
本発明の方法において使用される好ましいシーケンスは、Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ  Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌスピンエコーシーケンス（ａ  Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ  ｓｐｉｎ−ｅｃｈｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。このシーケンスは、９０°励起パルスの後に、シグナルの完全減衰を達成するために使用者が設定した時間列によって隔てられた一連の１８０°再収束パルスにより誘導されるエコートレインを用いる。このスピンエコーの間にデータを取得する。ＣＰＭＧスピンエコーシーケンスはＴ２強調画像を形成する。このパルスシーケンスおよびＭＲデータ取得プロセスを、ナノプラットフォームが生物腐食し始めるまで（シロキサン保護層を用いる場合には、少なくとも約２日、好ましくは約５〜１５日）の所定の期間、複数のデータセットを収集するのに必要な回数繰り返すことができる。繰り返しＭＲＩスキャンの合計回数および頻度は使用する機器によって異なることが理解されよう。有利には、結果は、ナノプラットフォームの投与後約１時間以内に読み取ることができる。次に、これらデータセットを比較して変化を判定することができる。標的プロテアーゼが存在すれば、ナノプラットフォーム間のオリゴペプチド結合が切断され、ナノプラットフォームが分離する。結果として、好ましくは、Ｔ２の劇的な変化がＭＲＩデータにおいて経時的に観察される。一般に、Ｔ２に見られる変化が大きいほど、癌性組織の活性が高い。好ましくは、Ｔ２の変化が約５倍より大きい（好ましくは約５〜約１０）ことが発達中の癌に関連付けられ、より好ましくは、Ｔ２の変化が約１０倍より大きいことが、活発な（転移性の）癌に関連付けられる。Ｔ１観察値は実質的に変化しないことが特に好ましい。
【００８６】
本発明のＭＲＩ造影剤は好ましくは、Ｔ１増強に関して約１００ｍＭ−１ｓ−１より大きいｒ１およびＴ２減衰に関して約−２，０００ｍＭ−１ｓ−１より大きい整数（すなわち、−３，０００ｍＭ−１ｓ−１は−２，０００ｍＭ−１ｓ−１より大きいと考えられる）のｒ２を有する。
【００８７】
強いＴ１強調は、反転回復パルスを用いることにより得ることができる。このシーケンスでは、取得シーケンスには１８０°ＲＦパルスが先行し、これにより縦磁化が反転する。次に、この縦磁化が平衡に向かって回復する間にシグナルを得る。反転パルスと最初の取得シーケンスの間の間隔を反転時間ＴＩと呼ぶ。回復速度はＴ１に反比例する。
【００８８】
次に、この取得データを用いて画像を作成することができる。さらに詳しくは、用いたパルスシーケンスに応じて、コンピュータはあるソフトウエアプログラムを用いてデータに基づく画像を構築する。好適なＭＲ装置およびプログラムは当技術分野で公知である。プロテアーゼ配列の切断によって生じたＴ１またはＴ２の変化は、コントラストの増強および画像の経時的変化として視覚的に認識できることが理解されよう。例えば、データ取得は、Ｔ２時間が長いほど作成される画像を明るくするように設定することもできるし、あるいはＴ２時間が短いほど明るい画像が得られるように設定することもできる。一般に、強いシグナルほど明るい画像に関連づけるのが好ましい。別の例では、データ取得は、（本発明のＭＲＩアッセイ（被分析物）によって誘導される）Ｔ２時間が短いほど作成される画像が明るく見えるように設定することができる。あるいは、Ｔ２値は、例えば、画像を赤く見せるよなカラーコードとすることもできる。アッセイ（被分析物）が反応するにつれ、短いＴ２値ほど作成される画像の赤みが経時的に増す。ＭＲＩ操作者は複数の異なるパラメーターを取扱い、複数の異なる方法で画像を構築するのに十分な情報を構成することができることが理解されよう。
【００８９】
ＭＲＩは、身体のどこであれ、プロテアーゼ活性の空間分解ｉｎ  ｓｉｔｕ測定および癌性組織の撮像を可能とすることが有利である。また、アッセイ（被分析物）のｉｎ  ｖｉｖｏ時間の延長も、はるかに低いプロテアーゼレベルの検出を可能とし、癌性細胞または前癌性細胞のより早期の検出を可能とする。加えて、ガドリニウム造影剤とは異なり、本発明によれば、とりわけＴ２強調画像において十分なＭＲＩコントラストを観察するためにｉｎ  ｖｉｖｏ水とナノプラットフォームＭＲＩ造影剤との直接的接触の必要はない。
【００９０】
さらなる実施形態によれば、疾患の進行を診断する方法が提供される。この方法では、ウロキナーゼのコンセンサス切断配列（ＳＧＲＳＡ、配列番号２）を含む診断用ナノプラットフォームを投与し、上記したようにＭＲＩデータを取得する。ＭＲＩアッセイにおいてウロキナーゼ活性が見られれば、マトリライシンのコンセンサス配列（ＭＭＰ−７）を用いた診断用ナノプラットフォームを２日後に静注し、その後、ＭＲＩデータを取得する。マトリライシン活性が検出されれば、予後は血管新生または転移となる。確認のため、コラゲナーゼのコンセンサス配列（ＭＭＰ−１）を含むナノプラットフォームを２日後に静注する。アッセイが陰性であれば、予後は血管新生となる。アッセイが陽性であれば、予後は転移となる。最初のウロキナーゼＭＲＩアッセイが陰性であった場合には、２日後にコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）感受性ＭＲＩ造影剤を２日後に投与する。有利には、最新のＭＲＩ装置（Ｂ＞＞２テスラ）を用いれば、癌関連プロテアーゼを過剰発現する癌性組織を撮像する際にミリメートルの分解能が得られる。その後、この組織を切除するか、または単独療法として、もしくは温度感受性ナノゲル、リポソームまたはミセルによって送達される抗癌薬と組み合わせて温熱療法により処置することができる。アッセイ時間もまた予後と相関させることができる。一般に、浸潤性の高い癌ほど、所与のプロテアーゼ濃度が高く、ｒ２／ｒ１に見られる変化がより速いことを意味する。
【００９１】
２．光後方散乱
本発明のさらなる態様において、本発明のナノプラットフォームは光後方散乱に基づいて機能する。光散乱は、入射光波が表面で（吸収されず）反射される物理的プロセスである。光の吸収と再放出を必要とする蛍光／燐光検出方法とは対照的に、散乱中に光の吸収は起こらない。また、これは、散乱電磁波の周波数が変わらないということも意味している。マクロスコピック表面では、反射の法則によって反射の性質を言い表すことができる。しかしながら、ナノスコピック粒子では、すでに述べたとおり、反射ははるかに複雑なプロセスである。ナノプラットフォームアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで行えることが好ましい。光後方散乱アッセイは、黒色腫などの表面癌の検出および撮像に特に有利である。
【００９２】
ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法
ナノプラットフォームアッセイを使用して、生物学的流体（哺乳類の尿または血液のサンプルなど）を含む体液サンプルにおけるプロテアーゼ活性を検出し得る。一態様では、尿サンプルを哺乳類から採取し、連結型ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）と物理的に混合する。好ましくは、尿中のナノプラットフォームの濃度は、尿１ｍｌ当たり約１０〜約１，０００μｇのナノプラットフォーム、より好ましくは尿１ｍｌ当たり約５０〜約２５０μｇのナノプラットフォームである。励起は、好ましくは、多色光源、レーザーおよびレーザーダイオードからなる群から選択される、適当な波長のエネルギー源により行われる。使用される波長は、ナノプラットフォームアセンブリーに使用される粒子によって異なるであろう。好ましくは、そのような波長は、約２００ｎｍ〜約１，０００ｎｍの間に及ぶ。後方散乱光は、入射のエネルギー源と同じ周波数を有するであろう。尿サンプル中のプロテアーゼによるオリゴペプチド結合の切断に伴う後方散乱シグナルの消失は、光減衰における変化として約３０秒〜約２４時間、より好ましくは約２分〜約１時間の期間にわたって観察されるであろう。プロテアーゼが存在することにより、光減衰において約０．００１〜約１の典型的な変化が観察されるであろう。よって、本発明の方法では、光減衰におけるこの変化が、哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示すことが好ましい。血液を哺乳類から採取し、上述のように尿と同様に解析することができる。
【００９３】
これらのアッセイの（生物学的流体からの）結果は、さらに、好ましいプロテアーゼ、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−７に関して上述したように、検出された特定のプロテアーゼ活性に基づいて、または下に論じるように、アッセイの速度に基づいて、癌の進行の予後と相互に関連づけることができる。
【００９４】
ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏ方法
代替実施形態では、連結型ナノプラットフォームを使用したプロテアーゼ活性の検出を哺乳類においてｉｎ  ｖｉｖｏで行い得る。診断用ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）、またはそのアッセイ（被分析物）を含む組成物は、好ましくは、薬学上許容される担体（すなわち、バッファーまたはリポソーム）を用いて投与される。そのアッセイ（被分析物）は、血流への注射により静脈内に投与することができる。あるいは、水性バッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））に溶解したアッセイ（被分析物）を、局所部位に（例えば、腫瘍部位中または腫瘍部位近くに直接）注射により投与することができる。ナノプラットフォームは、ＰＢＳ１ｍｌ当たり約１００〜約５，０００μｇ、より好ましくはＰＢＳ１ｍｌ当たり約２００〜約５００μｇの濃度で利用されることが好ましい。また、リポソーム送達（熱不安定性リポソームなど）を使用してもよく、細胞送達を使用することもできる。
【００９５】
一度、連結型ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）が癌性組織の近くに存在すると、多色光源、レーザーおよびレーザーダイオードからなる群から選択されるエネルギー源を用いて関係部位に励起が誘導される。光線またはレーザー光線が組織に入るに伴って、後方散乱光が、光ファイバー装置によって記録されることが好ましい。後方散乱光は入射光と同じ周波数を有し、そのシグナルは連結型ナノプラットフォームの存在下で、それらの不在下よりもずっと強い（最大約２〜約１００倍強い）であろう。そのため、そのようなシグナルは、ナノプラットフォームが集まる癌性組織において、周囲の健常組織よりも強いことが好ましい。癌性組織中のプロテアーゼによるオリゴペプチド結合の切断に伴う後方散乱シグナルの消失は、光減衰における変化として約３０秒〜約２４時間、より好ましくは約２分〜約１時間の期間にわたって観察されるであろう。とりわけ、そのシグナルは、健常組織よりもなお強いであろう。プロテアーゼが存在することにより、光減衰において約０．０５〜約１の典型的な変化が観察されるであろう。よって、本発明の方法では、光減衰におけるこの変化が、哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示すこと好ましい。それらのアッセイの結果は、さらに、下により詳細に論じるように、検出された特定のプロテアーゼ活性に基づいて、癌の進行の予後と相互に関連づけることができる。
【００９６】
いずれのセンサー方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を使用しても、本発明のアッセイ時間は、サンプルまたは組織中に存在するプロテアーゼの濃度に依存する。切断速度は、プロテアーゼ濃度の増加の桁ごとに３〜５倍増すであろう。浸潤性腫瘍が存在していると、アッセイ時間がほんの一瞬であることもある。健常組織では、活性の検出に約２４時間かかることもある。従って、アッセイが速いほど、浸潤性がより高い腫瘍となり、腫瘍の転移能の可能性も大きくなる。固形腫瘍の転移能判定のための、ナノ粒子に基づいたｉｎ  ｖｉｖｏナノセンサーの構築でプロテアーゼ特異的オリゴペプチドを使用することによって、内科医および外科医は第一により進行した腫瘍を標的とすることが可能になる。アッセイ（被分析物）が腫瘍部位（または推測腫瘍部位）に直接注射される場合、注射から約３０分後に結果を判定することができることが好ましい。アッセイ（被分析物）が静脈内に投与される場合には、ＩＶの投与後約１時間以内（アッセイ（被分析物）が標的部位に達することを可能にするため）に、また投与から２４時間後までに結果を読み取ることができる。いずれの場合においても、一度、そのアッセイ（被分析物）が腫瘍の近くに存在すると、１０分以内に検出されたプロテアーゼ活性が、腫瘍が浸潤性である確率が高いことと相互に関連づけられ得る。最初の３０分以内に活性が検出されなければ、腫瘍が浸潤性である確率が非常に低いことが好ましい。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、１０分以内に検出されたプロテアーゼ活性が、腫瘍が浸潤性である確率が高いことと相互に関連づけられ得るのに対し、アッセイ（被分析物）とのサンプルの接触から最初の３０分以内での活性の欠如は、腫瘍が浸潤性である確率が非常に低いことと相互に関連づけられ得る。この反応速度は、アッセイ完了（および結果）に数時間かかる公知の検出方法と比べて明白な利点を与えている。
【００９７】
３．ＦＲＥＴ系センサー
ナノプラットフォームは、非同一粒子間（すなわち、ナノ粒子またはナノ粒子とポルフィリン）での表面プラズモン共鳴およびＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく検出方法にも好適である。ＦＲＥＴとは、２粒子間のエネルギー移動を言い表している。表面プラズモン共鳴は、粒子を励起するために使用される。当初励起状態にあるドナー粒子は、このエネルギーを極めて近傍にあるアクセプター粒子に無放射双極子間結合を介して移動させることができる。要するに、それらの粒子がオリゴペプチドによって結合されると、ドナー粒子の励起によりアクセプターから発光が観察される。一度、酵素により粒子間の結合が切断されると、ＦＲＥＴの変化が観察され、発光スペクトルが変化する。ドナー発光のみ観察される。より詳細には、両方の粒子がいわゆるＦｏｒｓｔｅｒ距離内にあるならば、２粒子間でエネルギー移動が起こり、吸光度および発光の赤方シフトが観察される。この超高速プロセス中に、第１の粒子の電子励起状態、すなわち、表面プラズモンのエネルギーが少なくとも部分的に第２の粒子へと移動する。これらの条件下で、第２の粒子から光が放出される。しかしながら、一度、２粒子間の結合が酵素により切断されると、光は第１の粒子からのみ放出され、吸収および発光のはっきりした青方シフトが観察される。これは、両方の粒子間の距離が大幅に増加したためである。
【００９８】
ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法
ナノプラットフォームを使用して、生物学的流体（哺乳類の尿または血液のサンプルなど）を含む体液サンプルにおけるプロテアーゼ活性を検出し得る。一態様では、尿サンプルを哺乳類から採取し、ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）と物理的に混合する。好ましくは、尿中の発光団の濃度は、約１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、より好ましくは約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−８Ｍである。励起は、好ましくは、タングステンランプ、レーザーダイオードおよびレーザーからなる群から選択される、適当な波長のエネルギー源により行われる。使用される波長は、ナノプラットフォームアセンブリーに使用される粒子によって異なるであろう。好ましくは、そのような波長は、約４００ｎｍ〜約１，０００ｎｍの間、より好ましくは、約５００ｎｍ〜８００ｎｍの間に及ぶ。浸潤性腫瘍が存在している場合には、尿サンプル中のプロテアーゼによるオリゴペプチドリンカーの切断に伴う粒子の吸収および発光における変化は、約１秒〜約３０分、好ましくは約３０秒〜約１０分の期間にわたって観察されるであろう。プロテアーゼが存在することにより、約５〜約２００ｎｍの間の典型的な吸収および発光の青方シフトが観察されるであろう。よって、本発明の方法では、吸収スペクトルまたは発光スペクトルの最大値における５〜２００ｎｍの間の青方シフトが、哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示すこと好ましい。
【００９９】
血液を哺乳類から採取し、上述の尿と同様に解析することができる。好ましくは、血液サンプル中のアッセイ（被分析物）の濃度は、約１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、より好ましくは約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−８Ｍである。使用される波長は、ナノプラットフォームアセンブリーに使用される粒子によって異なるであろう。好ましくは、そのような波長は、約５００ｎｍ〜約１，０００ｎｍの間、より好ましくは約６００ｎｍ〜８００ｎｍの間に及ぶ。より好ましくは、血液の自己吸収が強いことから、励起は、Ｔｉ−サファイア−レーザーによる波長約８００ｎｍでの多光子励起を用いて行われる。浸潤性腫瘍が存在している場合には、発光における変化は、約１秒〜約３０分、好ましくは約３０秒〜約１０分の期間にわたって観察されるであろう。尿の場合と同様に、血液中にプロテアーゼが存在することにより、約５〜約２００ｎｍの間の典型的な発光の青方シフトが観察されるであろう。これが、哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示すことが好ましい。
【０１００】
これらのアッセイの（尿または血液からの）結果は、さらに、上述のように、検出された特定のプロテアーゼ活性またはアッセイの速度に基づいて、癌の進行の予後と相互に関連づけることができる。
【０１０１】
また、そのようなアッセイを使用して、治療中または治療の合間に患者の血液または尿中の様々なプロテアーゼの存在およびレベルを決定することにより、患者において癌治療の経過を経時的にモニタリングすることができる。アッセイは、患者が治療を受けている間、毎日実施することができ、プロテアーゼ活性レベルを初期レベルとその後のレベルとの間で比較することができる。同様に、患者が寛解に至った後も、癌再発の早期検出を容易にするために、アッセイを定期的に（すなわち、毎月）行ってよい。よって、アッセイは、アッセイ結果に基づいた、癌の重篤度が減少しているかまたは増加しているかの判定に役立つ。
【０１０２】
ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏ方法
光後方散乱検出方法に関して上記したように、ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）を投与することができる。一度、そのアッセイ（被分析物）が癌性細胞の近くに存在すると、アッセイ（被分析物）を励起するために１本または２本の交差するＴｉ：サファイアレーザーを使用することが好ましい。他の好適な励起源としては、Ｎｄ：ＹＡＧ−レーザー（第１高調波（１，０６４ｎｍ））、およびＮｄ：ＹＡＧ−レーザーの第２高調波（５３２ｎｍ）によって作動するあらゆる種類の色素レーザーが挙げられる。次いで、アッセイ（被分析物）からの光の放出を、カメラ、顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して解析する。癌部位から放出された光は、癌部位において標的プロテアーゼの活性がより高いため、健常組織部位から放出された光とは異なる色を有する。そのため、有利には、腫瘍学者または外科医には癌性組織は視覚的に識別可能である。例えば、ナノプラットフォームを使用して癌性組織の境界を画定し、健常組織を可能な限り多く保存しながら癌性組織および腫瘍の除去を容易にすることができる。好ましくは、Ｔｉ：サファイアレーザーを多光子励起のために約８３０ｎｍの波長に合わせて、励起ではなく光の放出だけを観測することができるようにする。それらのアッセイ結果は、さらに、検出されたプロテアーゼ活性に基づいて、癌の進行の予後と相互に関連づけることができる。
【０１０３】
４．光スイッチ系センサー
別の態様では、アッセイ（被分析物）は、オリゴペプチド結合によってポルフィリンまたは他の有機発色団または無機発色団と結合された１以上の保護層を有するナノ粒子を含むナノプラットフォームを利用する。この方法では、コア／シェル型ナノ粒子の表面プラズモンは、結合しているポルフィリンからの励起状態の発光スペクトルを消光することができる。一度、プロテアーゼによりコンセンサス配列が切断されると、ポルフィリンが放出され光を発する。これを本明細書では「酵素誘発光スイッチ」という。有利には、新たな発光／蛍光バンドの出現によってずっと感度の高い検出が可能になる。好ましくは、励起は、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ（単光子励起）または約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ（多光子励起）の波長で行われる。ポルフィリンの励起は、好ましくは、８７０ｎｍでのＴｉ：サファイアレーザーによる三光子励起を用いて行われる。次いで、アッセイ（被分析物）からの発光を、カメラ、顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して解析する。光スイッチ系センサーは、ＦＲＥＴ系センサーに関して上述のものと全く同じ手法で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）で利用することができる。いずれのセンサー方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を使用しても、本発明のアッセイ時間は、サンプルまたは組織中に存在するプロテアーゼの濃度に依存し、光後方散乱方法に関して論じられたように、癌の重篤度と直接相関し得る。
【０１０４】
この方法は、癌の進行および治療の経過のモニタリングに特に適している。一態様では、癌と診断された哺乳類から第１のサンプル（尿など）を採取し、ナノプラットフォームアッセイ（被分析物）と混合する。次いで、そのアッセイ（被分析物）を、好適な励起源を使用して励起し、発光（または吸収）スペクトルを解析する。さらに、本明細書において記載されているように、酵素加水分解の速度を癌の重篤度と相互に関連づけることができる。また、患者からサンプルを経時的に採取し比較して、癌の重篤度が増加しているかまたは減少しているかを判定することもできる。例えば、癌の初期診断に基づいて患者から第１のサンプルを採取し、第１のアッセイにかけることができる。第１の治療コースを受けた後に、その患者から第２のサンプルを採取し、第２のアッセイにかけることができる。次いで、それらの結果を第１のアッセイの結果と比較して、酵素活性レベルが増加したかまたは低下したを判定することができる。そのレベルが低下していたならば、その治療は効果があり、その治療コースを維持すべきである（あるいは減少させるべきかもしれない）という予後である。そのレベルが上昇していたならば、治療を増やすかまたは変更する必要があるという予後である。レベルが劇的に低下するならば、予後は寛解に向いている可能性があり、治療を中止することができる。さらに、アッセイを定期的に行って、癌の再発を検出することができる。それゆえ、それらのアッセイ結果により、特定の治療コースが癌の治療に効果的であるかどうかを判定することができる。
【０１０５】
光スイッチ方法はまた、ＦＲＥＴ系センサーに関して上記したように、外科手術時の癌性組織および腫瘍の境界の同定にも好適であり、より正確な組織切除を可能にする。
【０１０６】
治療的処置
温熱療法（細胞増殖温度の数度高い温度に細胞を加熱すること）は、細胞死（再生能）に至らせることができ、また、放射線および化学療法薬に対する細胞の感受性を高めることもできる。多くの癌細胞は、健常細胞よりもわずかに温熱療法の影響を受けやすいが、体の全部分が無差別に加熱されると、健常細胞は運命を共にすることが多くある。そのため、温熱処置を癌細胞に選択的に向ける方法の開発は、この分野において残っている課題の１つである。これは、ヒトの体内の固形腫瘍を治療しようとする場合だけでなく、転移性癌の治療にも等しく重要である。
【０１０７】
本発明の方法では、治療用（非連結）ナノプラットフォーム、またはそのナノプラットフォームを含む組成物は、哺乳類に、好ましくは薬学上許容される担体を用いて投与される。そのナノプラットフォームは、局所部位に（例えば、腫瘍部位中または腫瘍部位近くに直接）注射により投与することができる。ナノプラットフォームは、血流への注射により静脈内に投与することができる。各回のナノプラットフォーム投与量は、好ましくは患者の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約０．１０ｇ、より好ましくは患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１０〜約０．０２５ｇである。癌性組織へのナノプラットフォームのリポソーム送達（熱不安定性リポソームなど）を使用してもよい。しかしながら、温熱処置では、癌性組織へのナノプラットフォームの細胞送達が特に好ましい。加熱されると、送達細胞は死滅し、それらの装入物を癌性組織に直接放出する。
【０１０８】
一度、ナノプラットフォームが癌細胞によって取り込まれ、癌組織内に局在されたら、磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して標的関係部位が加熱される。励起は、好ましくは、約５０から約５００ｋＨｚまで、好ましくは約１００から約３００ｋＨｚまでに及ぶ周波数で行われる。好ましくは、Ａ／Ｃ磁気加熱は、癌性組織へのナノプラットフォーム送達から約１２時間〜約３日後に開始する。磁気Ａ／Ｃ−励起によってナノプラットフォームの温度が上昇し、この熱が、次いで、癌性組織内に分散され癌性組織の温度が上昇し、その結果、増殖阻害、そして細胞死をもたらす。ナノプラットフォームは標的癌性組織によって選択的に取り込まれるため、熱は標的組織に比較的限局してとどまり、周囲の健常組織に対する損傷を最小限に抑える。好ましくは、標的組織は、少なくとも約４０℃、より好ましくは約４２℃〜約６０℃、さらに好ましくは約４５℃〜約５０℃の温度に加熱される。治療期間は、好ましくは、約１０分〜約２時間、より好ましくは約１０分〜約１時間である。加熱の温度および期間は治療目的に応じて変更することができる。
【０１０９】
プラズモンによる強いＡ／Ｃ−磁気温熱療法によって生じる高温度（＞６０℃）では、周囲緩衝液中の細胞およびミトコンドリア膜の部分炭化、広範なタンパク質変性および部分溶解が観察される。これらのプロセスは、細胞腫脹、クロマチン消化、ならびに原形質膜およびオルガネラ膜の破壊を特徴とする壊死（制御されない、未熟細胞の死）をもたらし、続いて、大量のＤＮＡ加水分解、小胞体の空胞化、オルガネラ破壊（とりわけ、ミトコンドリアおよびリソソーム）、最終的には、細胞溶解をもたらす。リソソームに対する損傷によって、通常、リソソームシステインプロテイナーゼ（カスパーゼおよび他のプロテアーゼ）の放出が誘発され、それらの酵素は、多くの重要な細胞構造物をまず溶解し、その後、死細胞から放出される。それらは、隣接する細胞のさらなる細胞死の連鎖反応を誘発することができる。
【０１１０】
約４３℃〜約４５℃の中温に加熱されると、癌細胞の重要なタンパク質は損傷を受け（例えば、ミスフォールドされ）かつ／または細胞膜が周囲の水性媒体に部分的に溶解する。間質および小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）からのカルシウムの流入は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの大量移動を同時に進行させる。癌細胞の「正常な」代謝からこのようにはずれることで、最終的には、アポトーシス（プログラム細胞死）に至ることがある。温熱療法後、ＴＲＡＩＬ（（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド）の大幅な増加が観察される。要するに、温熱療法は細胞アポトーシスを誘導し、このアポトーシスは、腫瘍壊死因子ファミリーの細胞死膜受容体の活性化の結果としてカスパーゼ−３および他のカスパーゼにより媒介される。アポトーシスは周囲の健常組織に対する損傷がより少ないことから、癌性組織の温熱処置では、壊死に対してアポトーシスが好ましい。
【０１１１】
長時間（約１時間より長く、好ましくは約１時間〜約２時間の間）約４３℃〜約４５℃の間の温度が維持されるならば、抗腫瘍免疫応答が著しく増強され得ることは見出されている。加えて、熱に曝された細胞で大量に生産される熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は、強力な免疫モジュレーターであり、腫瘍に対する先天性免疫応答および適応免疫応答の両方の刺激をもたらし得る。温熱療法による免疫刺激には、免疫細胞の挙動に対する熱の直接の効果だけでなくｈｓｐの放出によって媒介される間接的な効果の両方が含まれる。
【０１１２】
最適な加熱が得られるように、すでに記載したとおり、ナノプラットフォームに利用されるナノ粒子は、非常に狭いサイズ／質量分布を有することが好ましい。加えて、ナノ粒子は、強常磁性の鉄−コアを特徴とすることが好ましい。超常磁性鉄は、温熱療法用の既存の超常磁性酸化鉄と比べて、より高い磁気モーメントとより高い飽和磁化を有する。これにより、組織中のナノプラットフォーム濃度を既存の処置よりも低下させることができ、患者処置時のＡ／Ｃ−磁気加熱時間も短縮させることもできる。さらに好ましくは、ナノ粒子は、鉄コア周囲のＦｅ３Ｏ４シェルも特徴とする。特に好ましい治療用ナノプラットフォームは、シロキサン保護層とリガンド単分子層で囲まれたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４コア／シェル型ナノ粒子を含む。Ａ／Ｃ磁気温熱療法にとって重要な因子はナノ粒子の比吸収率、すなわちＳＡＲであり、これはＳＡＲ＝Ｃ＊ΔＴ／Δｔ（式中、Ｃはサンプルの比熱容量であり、Ｔおよびｔはそれぞれ、温度および時間である）によって決定される。よって、治療用ナノプラットフォームは、好ましくは、比吸収率（ＳＡＲ）が少なくとも約５０Ｗ／ｇ、好ましくは約１００〜約５，０００Ｗ／ｇ、より好ましくは約１，５００〜約２，０００Ｗ／ｇであろう。
【０１１３】
ＳＡＲは、材料特性に対して非常に敏感な因子である。多磁区粒子では主加熱は磁壁の移動によるヒステリシス損失であるが、小粒子の場合はそうではない。単磁区磁性ナノ粒子におけるＳＡＲの２つの主要な寄与機構は、ブラウン緩和（全ナノ粒子の回転）とネール緩和（粒子の回転を伴わないランダムなスピンフリップ）である。２つの機構間の遷移は様々な材料の５〜１２ｎｍの間で起こるが、周波数によっても変わる。好ましいナノ粒子は鉄（０）−コアの超常磁性によりネール緩和が支配的であろう。
【０１１４】
ヒトの体は、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋に対して、他の多くの金属（例えば、Ｃｄ２＋）よりもずっと優れた耐性を示す。鉄の耐容１日上限摂取量（ＵＬ）は成人１日当たり４５ｍｇである。撮像手法または処置手法でより多くの鉄の摂取を必要とするならば、キレート化処理が適している。最も広く使用されている鉄キレート化剤であるデスフェリオキサミンは、成人の血流から１日当たり鉄最大７０ｍｇを取り出す。セラノスティックナノ粒子の完全生物腐食が５日であると仮定するならば、撮像または処置では１度に５７５ｍｇの鉄を与えることができる。さらなるシロキサン−保護層が存在するならば、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルスナノ粒子の寿命は延長され、ナノプラットフォーム中の鉄の用量は単回投与で約２．３ｇまで増加させることができる。加えて、過剰量のＦｅ３＋は体内の活性酸素種（ＲＯＳ）の量を著しく増加させ、腫瘍抑制をさらに強化する可能性がある。
【０１１５】
有利には、温熱処置は、上記した撮像方法および検出方法のすぐ後に行うことができた。すなわち、患者における撮像および検出に利用された同じナノプラットフォームまたはアッセイ（被分析物）を、次に、検出された癌性組織を即座に治療するために使用することができ、ナノプラットフォームまたは他の薬剤を追加投与しない。
【実施例】
【０１１６】
次の実施例により本発明による好ましい方法を述べる。しかしながら、これらの実施例は例示として示すものであって、本発明の全範囲に対する制限と解釈してはならないと理解されるべきである。
【０１１７】
実施例１
有機ステルスリガンドの合成
この実施例では、ナノ粒子のステルス被覆の３つの異なるリガンドを合成する。各反応生成物の分析を、４００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（Ｖａｒｉａｎ；カンザス州立大学）を使用したプロトンＮＭＲ（１Ｈ  ＮＭＲ）および／または炭素−１３  ＮＭＲ（１３Ｃ  ＮＭＲ）により、そしてエレクトロスプレー源を備えたハイブリッドトリプル四重極／リニアイオントラップ質量分析計（４０００  Ｑ−ＴＲＡＰ（登録商標）,  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ,  ＣＡ）を使用したエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＭＳ−ＥＳＩ）により行った。
【０１１８】
Ａ．リガンドＡ合成
１．ドーパミンのＢｏｃ保護
【化１１】
2013503634.tif 000019
メタノール（８ｍｌ）中のドーパミン（３１０ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、Ｎ２下で５分間攪拌した。その溶液に１．８ｍｍｏｌトリエチルアミン（ＴＥＡ）、続いて、Ｂｏｃ無水物（３９３ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をＮ２下で１２時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。残る残渣を４０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、１．０Ｎ  ＨＣｌおよびブライン各５ｍｌで３回洗浄した。次いで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機相を−５℃で３時間維持した。白色の沈殿物が現われ、濾取した。総収率８５％。
【０１１９】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  １．７３  （ｓ,  ９Ｈ）；  ２．４８  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．０２  （ｑ,  ２Ｈ）；  ６．４０  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．５４  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．６１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．８３  （ｔ,  １Ｈ）；  ６．８５  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．７６  （ｓ,  １Ｈ）.
【０１２０】
２．Ｂｏｃ−ドーパミンのベンジル保護
【化１２】
2013503634.tif 000020
３．４７グラムのＢｏｃ保護ドーパミンを１００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。次いで、１２．６グラムのＫ２ＣＯ３を加え、その系をＮ２下で保護した。次に、その溶液に４．６９グラムの（２当量）臭化ベンジルを滴下した。混合物を暗所で室温で２４時間攪拌した。次いで、得られた固体をセライトのショートパッドで濾過することにより取り出し、濾過ケークを１００ｍｌのエーテルで３回洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を氷水（５０ｍｌ）およびブライン（１５ｍｌ）で３回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、１５０ｍｌに濃縮した。−５℃で５時間置いた後、白色の沈殿物が現われ、真空濾取した。総収率９０％。
【０１２１】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＣＤＣｌ３）  Δ：  １．４５  （ｓ,  ９Ｈ）；  ２．７０  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．３１  （ｑ.  ２Ｈ）；  ４．４９  （ｓ,  １Ｈ）；  ５．１５  （ｄ,  ４Ｈ）；  ６.７１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．８０  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．８８  （ｄ,  １  Ｈ）；  ７．３２  （ｔ,  ２Ｈ）；  ７．３７  （ｔ,  ４Ｈ）；  ７．４５  （ｄ,  ４Ｈ）.
【０１２２】
３．Ｂｏｃ基の脱保護
【化１３】
2013503634.tif 000021
４．３グラムのベンジル保護Ｂｏｃ−ドーパミンを１５０ｍｌの５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ＣＨ２Ｃｌ２溶液に溶解し、室温で５時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、透明な油状物質を得た。総収率１００％。
【０１２３】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＣＤＣｌ３）  Δ：  ２．７９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．０８  （ｍ,  ２Ｈ）；  ５．１１  （ｓ,  ４Ｈ）；  ６．６８  （ｄ,  １  Ｈ）；  ６．７５  （ｓ,  １Ｈ）；  ６.９０  （ｄ,  １Ｈ）；  ７．３２  （ｔ,  ２Ｈ）；  ７．３５  （ｔ,  ４Ｈ）；  ７．４２  （ｄ,  ４Ｈ）.  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＣＤＣｌ３）  Δ：  ３２．９０；  ４１．８５；  ７１.５０；  ７２．００；  １１５．６０；  １１６．２５；  １２２．３０；  １２７．６０；  １２７．８５；  １２８．３５；  １２８．４５；  １２８．６３；  １２８．８５；  １３６．７０：  １３６．８５；  １４８．４５；  １４９．００；  １６０．８８；  １６１．２０；  １６１．５８；  １６１．９０.
【０１２４】
４．アミド形成
【化１４】
2013503634.tif 000022
１．４３グラムのベンジル保護ドーパミンおよび０．４３グラムの無水コハク酸（１：１モル比）を６ｍｌのピリジンに溶解した。その溶液を室温で５時間攪拌した。溶媒をトルエン（５×５ｍｌ）との共蒸発により除去した。白色の固体を得、ＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した。真空下での乾燥後、１．４グラムの生成物を得た。総収率７５％。
【０１２５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  ２．２９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ２．４２  （ｔ,  ２Ｈ）；  ２．６０  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．２１  （ｑ,  ２Ｈ）；  ５．０９  （ｄ,  ４Ｈ）；  ６．７１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．９４  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．９６  （ｄ,  １Ｈ）；  ７．３２  （ｔ,  ２Ｈ）；  ７．３８  （ｄ,  ４Ｈ）；  ７．４５  （ｔ,  ４Ｈ）；  ７．９０  （ｔ,  １Ｈ）；  １２．０８  （ｓ,  １Ｈ）.  ＭＳ−ＥＳＩ＋：  ｍ／ｚ  ４３４．２.分子量:４３３.
【０１２６】
５．エステル形成
【化１５】
2013503634.tif 000023
０．９６４グラムの、上のステップ４の反応生成物および０．４２６グラムの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（１：１モル比）を１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、室温で１０分間攪拌した。次に、その溶液に０．４３３グラムのテトラエチレングリコール、続いて、５ｍｇのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加えた。室温で１２時間の攪拌後、有機相を１０％Ｈ３ＰＯ４溶液（１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）およびブライン（１０ｍｌ）で３回洗浄した。次いで、有機相を無水Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥させた。真空下での溶媒除去後、残渣をカラムに載せ、１：１  アセトン／塩化メチレンで溶出した。０．４２グラムの生成物ｉｉ（ベンジル保護ドーパミン含有テトラエチレングリコール）を得た。総収率４０％。０．４グラムの副生成物ｉｉｉも単離した。
【０１２７】
生成物ｉｉの１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＣＤＣｌ３）  Δ：  ２．３９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ２．５７  （ｔ,  １Ｈ）；  ２．７０  （ｑ,  ４Ｈ）；  ３．４４  （ｑ,  ２Ｈ）；  ３．６０  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．６５  （幅広  １２Ｈ）；  ４．２４  （ｔ,  ２Ｈ）；  ５．１５  （ｄ,  ４Ｈ）；  ５．７４  （ｔ,  １Ｈ）；  ６．７１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．８１  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．８９  （ｄ,  １Ｈ）；  ７．３１  （ｔ,  ２Ｈ）；  ７．３７  （ｔ,  ４Ｈ）；  ７.４６  （ｄ,  ４Ｈ）.  ＭＳ−ＥＳＩ＋：  ｍ／ｚ  ６１０．４.分子量６０９．３.
【０１２８】
６．リガンドを作製するための脱ベンジル化
【化１６】
2013503634.tif 000024
０．３４グラムのベンジル保護ドーパミン含有テトラエチレングリコール（ｉｉ）を５０ｍｌのメタノールに溶解した。次に、７７ｍｇのパラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）をＮ２下で加えた。３回の排気後、１気圧のＨ２を加え、混合物を室温で２４時間攪拌した。セライトのショートパッドで濾過することにより触媒を除去した。次いで、溶媒を真空下で除去し、０．２３グラムの生成物（リガンドＡ）を得た。総収率１００％。
【０１２９】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  ２．３３  （ｔ,  ２Ｈ）；  ２．４８  （ｑ,  ２Ｈ）；  ３．１５  （幅広い多重線,  ４Ｈ）；  ３．４１  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．４９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．５１  （幅広い多重線,  ８Ｈ）；  ３．５９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ４．１１  （ｔ,  ２Ｈ）；  ６．４１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６.５５  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．６１  （ｄ,  １Ｈ）.
【０１３０】
Ｂ．リガンドＢ合成
【化１７】
2013503634.tif 000025
１．０グラムのベンジル保護ドーパミン含有テトラエチレングリコール（上のＡ．５．の生成物ｉｉ）を、０．０２０グラムのＤＭＡＰの存在下、１当量のＦｍｏｃグリシンおよび１．２当量のＥＤＣで処理して、９５％を上回るカップリング生成物を得た。ベンジル基およびＦｍｏｃ基を同時に、１０ｍｌのＣＨ３ＣＮの存在下、水素／パラジウム炭素（Ｈ２／Ｐｄ（Ｃ））で脱保護した。セライトのショートパッドで濾過することにより触媒を除去した。次いで、その溶媒を真空下で除去し、リガンドＢを得た。総収率３５％。
【０１３１】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  ２．３３  （ｔ,  ２Ｈ）；  ２．４６  （ｑ,  ２Ｈ）；  ３．１４  （ｑ,  ２Ｈ）；  ３．４１  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．４９  （ｔ,  ４Ｈ）；  ３．５１  （幅広い多重線,  ８Ｈ）；  ３．５９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ４．１０  （ｔ,  ２Ｈ）；  ４．５７  （ｔ,  ２Ｈ）；  ６．４３  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．５５  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．６１  （ｄ,  １Ｈ）；  ７．９０  （ｔ,  １Ｈ）；  ８．６２  （ｓ,  １Ｈ）；  ８．７３  （ｓ,  １Ｈ）.  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  ２８．９８；  ２９．８５；  ３４．７３；  ６０．２５；  ６３．３３；  ６８．３０；  ７２．３８；  １１５．４９；  １１５．９６；  １１９．２２；  １３０．２５；  １４３．５４；  １４５．０７；  １７０．４８；  １７２．４８.
【０１３２】
Ｃ．リガンドＣ合成
１．ウレタン形成
【化１８】
2013503634.tif 000026
１．４３グラムのベンジル保護ドーパミン（上のＡ．３．のもの）を、０．８３グラムのテトラエチレングリコール（１：１比）および０．５０グラムのカルボニル−ビス−イミダゾール（ＣＤＩ）とともに、５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した。その溶液を室温で１時間、次いで、６０℃で４時間攪拌した。次いで、溶媒を、トルエン（５×５ｍｌ）との共蒸発により除去した。白色の固体を得、ＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した。真空乾燥後、１．６６グラムの生成物を得た。総収率：７０％。
【０１３３】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＣＤＣｌ３  Δ：  ２．４０  （ｓ,  １Ｈ）；  ２．８８  （ｍ,  ４Ｈ）；  ３．２６  （ｑ,  ２Ｈ）；  ３．６８  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．６６  （幅広  １２Ｈ）；  ４．２５  （ｔ,  ２Ｈ）；  ５．１８  （ｄ,  ４Ｈ）；  ５．７４  （ｔ,  １Ｈ）；  ６．７１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６．８１  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．８９  （ｄ,  １Ｈ）；  ７．３１  （ｔ,  ２Ｈ）；  ７.３７  （ｔ,  ４Ｈ）；  ７．４６  （ｄ,  ４Ｈ）,  ８．２４  （ｓ,  １Ｈ）.  ＭＳ−ＥＳＩ＋：  ｍ／ｚ  ５５３．２.
【０１３４】
２．リガンドＣを作製するための脱保護
【化１９】
2013503634.tif 000027
０．３５グラムのベンジル保護ドーパミン含有テトラエチレングリコールリガンドを５０ｍｌのメタノールに溶解した。７７ｍｇのＰｄ／ＣをＮ２下で加えた。３回の排気後、１気圧のＨ２を加え、混合物を室温で２４時間攪拌した。セライトのショートパッドで濾過することにより触媒を除去した。真空下での溶媒除去後、０．２３５グラムの生成物（リガンドＣ）を得た。総収率：９８％。
【０１３５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  ２．４３  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．４５  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．４９  （ｔ,  ２Ｈ）；  ３．５４  （幅広い多重線,  １０Ｈ）；  ３．６０（ｔ,  ２Ｈ）；  ４．１１  （ｔ,  ２Ｈ）；  ６．４１  （ｄ,  １Ｈ）；  ６.５５  （ｓ,  １Ｈ）；  ６．６１  （ｄ,  １Ｈ）.
【０１３６】
実施例２
非メタレート型ポルフィリンの合成
【化２０】
2013503634.tif 000028
この実施例では、非メタレート型テトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）を合成した。まず、１．５０グラムの４−カルボキシベンズアルデヒドを８０ｍｌの酢酸に溶解した。その溶液を１００℃に加温し、続いて、１０ｍｌの酢酸中の０．６７グラムのピロールの溶液の滴下を２０分かけて行った。添加が完了したら、得られた溶液を１３０℃までゆっくりと加温し、１３０℃で時間維持した。次いで、混合物を８０℃に冷却した。次に、１００ｍｌの９５％エタノールを加え、３時間攪拌しながら温度を室温に下げた。次いで、混合物を−１５℃で２４時間保存した。紫色の固体を真空濾取した。次いで、濾過ケーキを５ｍｌの冷５０／５０エタノール／酢酸で３回洗浄し、高真空下（油ポンプ）で一晩乾燥させた。０．５１グラムの純粋生成物を得た。総収率２５．５％。
【０１３７】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  −２．９４  （ｓ,  ２Ｈ）；  ８．３５  （ｄ,  ８Ｈ）；  ８．３９  （ｄ,  ８Ｈ）；  ８．８６  （ｓ,  ８Ｈ）；  １３．３１  （ｓ,  ４Ｈ）.  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ,  ＤＭＳＯ−ｄ６）  Δ：  １１９．３１  ；  １２７．９０；  １３０．５１  ：  １３４，４４；  １４５．４２：  １６７．４６.  ＭＳ−ＥＳＩ＋：  ｍ／ｚ  ７９１．２.分子量７９０．２.
【０１３８】
実施例３
リガンドＡの代替合成方法
合成はベンジル保護ドーパミンより開始し、このベンジル保護ドーパミンをまず、無水コハク酸と反応させ、次いで、ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）と反応させて、ＨＯＢＴ−活性エステル（Ｉ）を選択的に形成する。この活性エステルを市販のテトラエチレングリコールまたはオクタエチレングリコールと反応させて化合物（ＩＩ）とし、この化合物（ＩＩ）を、次いで、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中、Ｈ２／Ｐｄ（Ｃ）で脱保護し、化合物（ＩＩＩ）を得る。この反応スキームを図６に示す。
【０１３９】
全ての段階での精製は、固定相として中性シリカを、溶出剤としてｎ−ヘキサン／酢酸エチルを用いる下降カラムクロマトグラフィーにより行うことができる。分子モデリングによれば、オクタエチレングリコールリガンドは３．７ｎｍの長さであるのに対し、テトラエチレングリコールリガンドは２．５ｎｍの長さである。
【０１４０】
ポルフィリンは、ナノ粒子の安定化の前に、リガンドと結合させることができる。この実施形態では、図７で示されるように、化合物ＩＩをメタレート型（Ｍ＝Ｚｎ２＋またはＰｄ２＋）または非メタレート型（Ｍ＝２Ｈ）テトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）と、カップリング剤としてＤＣＣおよびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してＴＨＦ中で反応させ、続いて、ＴＨＦ中、Ｈ２／Ｐｄ（Ｃ）での脱保護を行うことができる。得られた化合物（ＩＶ）は、移動相としてＨ２Ｏ／アセトニトリル勾配を用いる下降カラムクロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製することができる。
【０１４１】
実施例４
ドーパミン含有リガンドでのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の安定化
この実施例では、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４コア／シェル型ナノ粒子を、上の実施例１で合成したリガンドＡおよびＢを使用して安定化させ、続いて、実施例２で合成したポルフィリンの結合を行った。ナノ粒子は、ＮａｎｏＳｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｍａｎｈａｔｔａｎ,  ＫＳ）から入手した。Ｆｅ（０）−コアは直径が約５．４ｎｍであった。Ｆｅ３Ｏ４シェルの厚さは約１．５ｎｍであった。
【０１４２】
まず、２６ｍｇのドーパミン含有リガンドＡおよび５ｍｇのドーパミン含有リガンドＢを５ｍｌのＴＨＦに溶解した。次に、１０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を加え、続いて、６０分間の音波処理を行った。次いで、安定化させたナノ粒子を、磁石を使用して集めた。次いで、得られた固体を１ｍｌのＴＨＦで３回洗浄し、５ｍｌのＴＨＦに再び溶解した（分散させた）。各リガンドの結合を下に示す（ここでは、ｎ＝３）。
【化２１】
2013503634.tif 000029
【０１４３】
次に、その懸濁液に、実施例２で合成した、１７ｍｇのテトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）を、２ｍｇのＤＭＡＰおよび４ｍｇのＥＤＣとともに加え、続いて、６０分間の音波処理を行った。固体を磁石により集め、３ｍｌのＴＨＦで、洗液が無色になるまで（約８回）洗浄した。次いで、固体を真空下で乾燥させた。８．９ｍｇの固体（安定化させたナノ粒子）を得た。総収率２０％。ポルフィリン結合を下に示す。
【化２２】
2013503634.tif 000030
【０１４４】
実施例５
ビオチン標識ドーパミン含有リガンドによるＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の修飾
この実施例では、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４コア／シェル型ナノ粒子を、上の実施例１で合成したリガンドＣを使用して安定化させ、続いて、ビオチン標識の結合を行った。ナノ粒子は、ＮａｎｏＳｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｍａｎｈａｔｔａｎ,  ＫＳ）から入手した。Ｆｅ（０）−コアは直径が約５．４ｎｍであった。Ｆｅ３Ｏ４シェルの厚さは約１．１ｎｍであった。
【０１４５】
まず、３０ｍｇのリガンドＣを５ｍｌのＴＨＦに溶解した。次に、１０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を加え、続いて、６０分間の音波処理を行った。次いで、安定化させたナノ粒子を、０．５Ｔ鉄磁石（Ｖａｒｉａｎ）を使用して集めた。次いで、得られた固体を１ｍｌのＴＨＦで３回洗浄し、５ｍｌのＴＨＦに再び溶解した（分散させた）。
【化２３】
2013503634.tif 000031
【０１４６】
次に、その懸濁液に２０ｍｇのビオチン、２ｍｇのＤＭＡＰおよび４ｍｇのＥＤＣを加え、６０分間音波処理した。固体を、磁石を使用して集め、ＴＨＦで、上清が無色になるまで（３ｍｌで約８回）洗浄した。固体を真空下で乾燥させ、８．７ｍｇの褐色の固体を得た。
【化２４】
2013503634.tif 000032
【０１４７】
次いで、ビオチン標識ナノ粒子の溶解度を測定した。ガラスキュベットに入った０．２５ｍｇのナノ粒子にリン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝６．８）を滴下した。その懸濁液をマイクロマグネティックスターラー（Ｆｉｓｈｅｒ）で連続攪拌した。懸濁液の光散乱を７００ｎｍで記録した。一度、粒子が溶解したら、７００ｎｍでの減衰（すなわち、光の吸収および散乱）はＥ＝０．０１未満に低減した。溶解度は１０５ｍｇ／ｍｌであることが分かった。
【０１４８】
実施例６
シロキサン被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の合成
この実施例では、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４コア／シェル型ナノ粒子をアミノシロキサン（ＡＳＯＸ）保護層で被覆した。ナノ粒子は、ＮａｎｏＳｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｍａｎｈａｔｔａｎ,  ＫＳ）から入手した。Ｆｅ（０）−コアは直径が約５．４ｎｍであった。Ｆｅ３Ｏ４シェルの厚さは約１．５ｎｍであった。
【０１４９】
まず、２０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を１０ｍｌのＴＨＦに懸濁し、続いて、３０分間の音波処理を行った。１５００ｒｐｍでの低速遠心分離による沈降により、溶解していない固体を分離した。透明な溶液を別の試験管へ移し、その溶液に０．３ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシシランを加えた。１０時間の音波処理後、強力な磁石を使用してナノ粒子を集め、溶液を慎重に除去した。ＴＨＦ（３×５ｍｌ）での洗浄および真空下での乾燥の後、７．５ｍｇのＡＳＯＸ保護ナノ粒子を集めた。
【０１５０】
実施例７
ＡＳＯＸ保護Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子へのドーパミン含有リガンドの結合
この実施例では、実施例５のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ＡＳＯＸナノ粒子（ｎａｎａｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を、実施例１で合成したドーパミン含有リガンドＡ〜Ｃで被覆し、続いて、ポルフィリン（ｐｏｒｈｒｙｉｎｓ）およびビオチン標識それぞれの結合を行った。
【０１５１】
Ａ．ポルフィリン結合
まず、２６ｍｇのリガンドＡおよび５ｍｇのリガンドＢを５ｍｌのＴＨＦに溶解した。次に、１０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ＡＳＯＸナノ粒子および３．０ｍｇのＣＤＩを加え、続いて、６０分間の音波処理を行った。磁石を使用してナノ粒子を集め、固体をＴＨＦ（３×１ｍｌ）で洗浄し、５ｍｌのＴＨＦに再び溶解した（分散させた）。次に、その懸濁液に１７ｍｇのＴＣＰＰポルフィリン、２ｍｇのＤＭＡＰおよび４ｍｇのＥＤＣを加え、６０分間音波処理した。固体を、０．５Ｔ鉄磁石（Ｖａｒｉａｎ）を使用して集め、ＴＨＦ（８×３ｍｌ）で、洗液が無色になるまで洗浄した。固体を真空下で乾燥させ、９．０ｍｇの固体を得た。水溶解度：５２ｍｇ／ｍｌ。
【０１５２】
Ｂ．ビオチン標識
まず、３０ｍｇのリガンドＣを５ｍｌのＴＨＦに溶解した。次に、１０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ＡＳＯＸナノ粒子および３．０ｍｇのＣＤＩを加え、続いて、６０分間の音波処理を行った。０．５Ｔ鉄磁石(Varian)を使用してナノ粒子を集めた。固体をＴＨＦ（３×１ｍｌ）で洗浄し、５ｍｌのＴＨＦに再び溶解した（分散させた）。次いで、その懸濁液に２０ｍｇビオチン、２ｍｇのＤＭＡＰおよび４ｍｇのＥＤＣを加え、６０分間音波処理した。固体を磁気作用により集め、ＴＨＦで（上清が無色になるまで、少なくとも８×３ｍｌで）洗浄した。固体を真空下で乾燥させ、８．０ｍｇの褐色の固体を得た。ビオチン標識ナノ粒子の溶解度は２０５ｍｇ／ｍｌに劇的に増加した。
【０１５３】
ビオチン標識についての代替方法を、図８に、ドーパミン結合オリゴエチレングリコールステルスリガンドとＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ＡＳＯＸナノ粒子を使用して示している。リガンド上の遊離脂肪族ヒドロキシル基により、十分に確立されているＥＤＣ化学を用いたエステル結合によってビオチン標識の結合が可能である（ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール、ＣＤＩ：１，１−カルボニルジイミダゾール）。
【０１５４】
実施例８
代替ナノプラットフォームアセンブリー方法Ａ
この実施例では、ナノ粒子−ナノ粒子アセンブリーを、まず、ドーパミンアンカーをプロテアーゼコンセンサス配列と連結することにより調製した。次いで、ドーパミンアンカーを使用して、２つのナノ粒子を同時に結合し、続いて、ナノ粒子の残りの表面のドーパミン結合（単座配位子（ｍｏｎｏｄｅｎｄａｔｅ  ｌｉｇａｎｄ）での被覆を行った。
【０１５５】
Ａ．酸塩化物リガンド保存溶液
【化２５】
2013503634.tif 000033
まず、５０ｍｇのベンジル保護ドーパミン含有アンカーＡを５ｍｌの塩化メチレンに溶解した。次に、その溶液に２１．３ｍｇ（１当量）の塩化シアヌル、１当量のＥｔ３Ｎおよび２ｍｇのＤＭＦを加えた。室温で３時間の攪拌後、白色の沈殿物が現われた。事前に乾燥させたセライトのショートパッドで濾過することにより沈殿物を取り出し、濾液を真空濃縮させ、４８ｍｇの白色の固体を得た。次いで、２０ｍｌの乾燥ＴＨＦを加えて、その固体を溶解し、保存溶液を作製した。
【０１５６】
Ｂ．切断配列との連結
【化２６】
2013503634.tif 000034
次に、５．６ｍｇの標的プロテアーゼ切断配列（ＤＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＤ、配列番号６５）を５ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、続いて、１ｍｇのＥｔ３Ｎおよび１ｍｇのＤＭＡＰともに、１ｍｌのドーパミンアンカー酸塩化物保存溶液（前のステップで作製）の添加を行った。その溶液を室温で１２時間攪拌した。次いで、溶媒を真空下で除去した。エーテル（３×３ｍｌ）での残渣の洗浄後、４．６ｍｇの灰白色の固体を得た。
ＭＳ−ＥＳＩ−：  ｍ／ｚ  １,４６３．７.分子量：１,４６２．７.
【０１５７】
Ｃ．第２のベンジル保護ドーパミン含有アンカーの付加
【化２７】
2013503634.tif 000035
次いで、４．６ｍｇの生成物Ｃを３ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、続いて、０．６ｍｇ（１当量）のＣＤＩの添加を行った。その溶液を室温で３０分間攪拌した。次に、１．２ｍｇ（１．１当量）のドーパミン含有アンカーＤを加えた。その溶液を室温で６時間攪拌し、その時点において、ＴＬＣによりＤの大部分が消失したことが示された。その溶液を２０ｍｌのエーテルに注ぎ入れ、有機相を冷１Ｎ  ＨＣｌ（３×２ｍｌ）、冷水（３×２ｍｌ）およびブライン（１×２ｍｌ）で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４での乾燥後、溶媒を真空下で除去し、３．１ｍｇの固体Ｅを得た。
【０１５８】
Ｄ．脱ベンジル化
【化２８】
2013503634.tif 000036
３．１ｍｇの生成物Ｅを５ｍｌのメタノールに溶解し、続いて、３ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃの添加を行った。その系を、攪拌しながら１気圧のＨ２雰囲気に１２時間曝露した。目の細かい濾紙で濾過することにより触媒を除去した。溶媒除去後、２．３ｍｇの透明な油状物質Ｆを得た。
【０１５９】
Ｅ．ナノ粒子アセンブリー
【化２９】
2013503634.tif 000037
最終的に、２．３ｍｇの連結したドーパミン含有アンカーＦを５ｍｌのＴＨＦに溶解し、続いて、３ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＮａｎｏＳｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の添加を行った。その懸濁液を室温で１時間音波処理し、ナノ粒子を強力な磁石により集め、ＴＨＦ（５ｘ３ｍｌ）で洗浄した。真空下で２時間の乾燥後、２．２ｍｇの連結型ナノ粒子を得た。次いで、ナノ粒子の残りの表面をリガンドで被覆することができる。あるいは、連結型ドーパミンアンカーの結合までにナノ粒子をすでにステルス保護していてよく、またはシロキサン保護層を有していてもよい。
【０１６０】
実施例９
代替アセンブリー方法Ｂ
この手法では、４つの標的プロテアーゼコンセンサス配列をテトラカルボキシルフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）と連結させる。もう一方の端で、切断配列を２つのステルス被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子またはＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯｘナノ粒子のグリシンチップと連結させる。
【０１６１】
Ａ．酸溶液
【化３０】
2013503634.tif 000038
まず、６ｍｇのポルフィリン（ＴＰＰ−ＣＯＯＨ）を３ｍｌの塩化チオニルに溶解した。その溶液を８５℃で２時間還流した。過剰の塩化チオニルを真空下で除去した、固体を高真空下で６時間さらに乾燥させた。
【０１６２】
Ｂ．ポルフィリン−切断配列結合
【化３１】
2013503634.tif 000039
５ｍｌ乾燥ＤＭＦへの固体の溶解後、３２ｍｇ（４当量）の切断配列（ＤＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＤ；配列番号６５）、続いて、０．０５ｍｌのＥｔ３Ｎおよび２ｍｇのＤＭＡＰを加えた。その溶液を室温で１８時間攪拌した。質量スペクトルにより出発材料と、ジペプチド配列が結合したポルフィリンの消失が示された。ＭＳ−ＥＳＩ−：  Ｍ／Ｚ  ２,８８４．３.分子量：２,８８３．３.
【０１６３】
Ｃ．ステルス被覆ナノ粒子
【化３２】
2013503634.tif 000040
ステルス被覆ナノ粒子を、８ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を５ｍｌのＴＨＦに懸濁することにより調製し、続いて、２０ｍｇのドーパミン含有テトラエチレングリコールリガンドの添加を行った。混合物を６０分間音波処理した。次いで、ナノ粒子を強力な磁石により集め、過剰のリガンドをＴＨＦ（５×３ｍｌ）によりを洗い流した。
【０１６４】
Ｄ．ポルフィリン結合
【化３３】
2013503634.tif 000041
ドーパミンテトラエチレングリコール修飾した（すなわち、ステルス被覆した）Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を５ｍｌのＴＨＦに懸濁し、続いて、１ｍｌのポルフィリン連結切断配列ＤＭＦ溶液の添加を行い、６ｍｇのＥＤＣを加えた。混合物を室温で６０分間音波処理した。再び、ナノ粒子を磁石により集め、ＴＨＦ（１０×３ｍｌ）で洗浄した。真空下での乾燥後に、６．２ｍｇのポルフィリン連結型ステルス被覆ナノ粒子を得た。
【０１６５】
実施例１０
ステルスリガンド結合の代替方法
この実施例では、図９の反応スキームにより、２つのドーパミン含有リガンドを連結した。出発リガンド（Ｉ）は、ウロキナーゼの切断配列の末端システインのチオール基と反応し易い。他の切断配列も、それらの末端システイン基を介して連結されると思われる。グリシンは、十分に確立されているＥＤＣ／ＨＯＢＴ化学を用いて、エステル結合によって第２のリガンド（ＩＩ）のアルコール官能基と結合される。次いで、リガンドは、すでに記載したとおり、水素／パラジウム炭素により１段階で脱保護することができる。
【０１６６】
実施例１１
ＮＭＲ緩和時間の測定
水中での１Ｈ−スピンのＴ１およびＴ２緩和挙動に対する様々な濃度の本発明のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子ＭＲＩ造影剤の影響を、４００ＭＨｚ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ，磁場強度９．４Ｔ）を用いて測定した。テトラエチレングリコールリガンドで安定化したナノ粒子および非ステルス被覆ナノ粒子を用いた。ステルス被覆ナノ粒子は化学的に結合されたポルフィリンを特徴とした（上の実施例４参照）。表ＩＶに示されるように、漸増濃度（０〜１６０μｇ）のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を１．０ｍｌのＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９０／１０ｖ／ｖ）に懸濁（非ステルス型）または溶解（ステルス被覆型）した。これに０．１ｍｌのＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９０／１０ｖ／ｖ／）に溶解した１．０×１０−１０ｍｏｌのウロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ）を加えた。これらのナノ粒子を、ウロキナーゼコンセンサス配列を介して連結した。Ｆｅコアの直径は５．４±１．１ｎｍであり、Ｆｅ３Ｏ４シェルの厚さは１．０±０．４ｎｍであった。近接すると（ｄ＜１０ｎｍ）、これらの磁性スピンは結合し、従って、これらの超常磁性体は磁場において互いに強度を増す。測定は標準的なＮＭＲ管にて３００Ｋで行った。標準的なＴ１およびＴ２パルスシーケンスを用いた。
【０１６７】
【表３】
2013503634.tif 000042
【０１６８】
【表４】
2013503634.tif 000043
【０１６９】
用いた磁場強度は臨床用ＭＲＩの場合よりも強かったが、より強い磁場で得られたデータは臨床用ＭＲＩ適用の半減期にちょうど匹敵するものである。
【０１７０】
ステルスリガンド被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、Ｔ１緩和率ｒ１＝１５０±２０ｍＭ  ｓ−１およびＴ２緩和率ｒ２＝−４３００±２５０ｍＭ、ならびにｒ２／ｒ１＝−２８を達成し、既存のＭＲＩ造影剤に比べてＴ１増強、Ｔ２減衰およびｒ２／ｒ１比において有利である。従前に報告されているＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏシミュレーションからの結果によれば、連結したＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、それらの半径を合わせたナノ粒子と同等の周囲の１Ｈ−スピンのＴ２緩和に影響を及ぼす。ウロキナーゼが存在すると、リンカーの特異的コンセンサス切断配列（ＳＧＲＳＡ、配列番号２）が切断されるので、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が分離される。結果として、この時、分離されたナノ粒子は、Ｔ２緩和時間をより低い程度に短縮する。
【０１７１】
リンカーのプロテアーゼ切断の後、ｒ１は若干増加して１８０±２０ｍＭｓ−１となり、ｒ２も増加して−２，３５０±２５０ｍＭｓ−１となり、ｒ２／ｒ１比は−１３となる。このＴ２の著しい変化は、Ｔ１がほぼ一定の値であることと相まって、Ｔ１強調ＭＲＩ画像とＴ２強調ＭＲＩ画像を種々の時点で比較することにより、哺乳類身体のプロテアーゼ活性の空間分解ｉｎ−ｓｉｔｕ測定を可能とする。
【０１７２】
結果を図１０〜１１に示している。線Ａは非ステルスリガンド被覆ナノ粒子である。線Ｂはステルスリガンド被覆ナノ粒子である。図１０は、非安定化二金属ナノ粒子およびテトラエチレングリコール安定化二金属ナノ粒子の双方がＴ１緩和時間を引き延ばすことを示している。テトラエチレングリコール層の存在は、周囲のＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ混合物に対するナノ粒子の磁性効果を阻害しなかった。これは、ガドリニウム系造影剤と比べた場合の、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の明確な利点である。観察された最大Ｔ１増強は１６倍であり、これは当技術分野で報告されている最良の結果に近い。
【０１７３】
図１１は、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を加えた際の著しいＴ２低下（最大５７分の１）を示している。Ｔ２に見られた有意な低下は、これらのナノ粒子がＭＲＩ造影剤として使用可能であることを示す。テトラ（エチレングリコール）リガンドの存在は、線Ｂで示されるように、いっそう有意なＴ２低下をもたらす。Ｔ２は、両粒子とも、ナノ粒子濃度がひと度１２０μｇ／ｍｌに達したところで増加した。
【０１７４】
図１２は、連結型ナノ粒子がウロキナーゼにより切断される場合の経時的な−（ｒ２／ｒ１）低下を示している。この測定のため、ウロキナーゼ切断配列（ＤＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡＧＤ、配列番号６６）が連結した、ポルフィリン標識ステルス被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の４０μｇを３００Ｋで０．９ｍｌのＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏに溶解した。これに、０．１ｍｌのＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９０／１０  ｖ／ｖ）に溶解した１．０×１０−１０ｍｏｌのウロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ）を加えた。測定は、４００ＭＨｚでＴ１およびＴ２を測定するための標準的パルスシーケンスを用い、３００Ｋで行った。その後、ｒ１およびｒ２値を計算し、図１２のグラフにプロットした。
【０１７５】
実施例１２
ＦＲＥＴ系アッセイ
遊離ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリン（ＰＢＳ中ｐＨ＝６．８）および亜鉛ドープナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンの蛍光を研究し、コア／シェル型Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子（ＮａｎｏＳｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；  Ｍａｎｈａｔｔａｎ,  Ｓ）、すなわち、化学的に結合されたメタレート型および非メタレート型テトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）を有するステルスリガンドを特徴としているナノ粒子について得られた結果を比較した。
【０１７６】
まず、「遊離」ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンおよび亜鉛ドープナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンの両方を、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子と連結した。ステルス保護Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子を調製するために、３５ｍｇのドーパミン−テトラエチレングリコールリガンドを５ｍｌのＴＨＦに溶解した。次に、１１．０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子を加え、室温で１時間音波処理した。ナノ粒子のコアの直径は約３〜５ｎｍであった。Ｆｅ３Ｏ４シェルの厚さは２ｎｍ未満であった。次いで、固体を磁石で集め、溶媒を慎重にデカントした。固体をＴＨＦ（３×３ｍｌ）で洗浄した。真空下で２時間の乾燥後、１０．０ｍｇのステルス保護ナノ粒子生成物を得た。
【０１７７】
次いで、オリゴペプチドリンカーをメタレート型ポルフィリンと結合した。まず、５．０ｍｇのポルフィリンを５．０ｍｌのＳＯＣｌ２中１００℃で３０分間還流した。次いで、過剰のＳＯＣｌ２を高真空下で除去し、得られた固体を真空下で３時間さらに乾燥させた。次に、そのポルフィリン固体に４ｍｇのオリゴペプチド配列および５ｍｌのＴＨＦを加え、室温で５時間攪拌した。次いで、ＴＨＦを真空下で除去し、緑色を帯びた固体を得た。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析により、少なくとも２つの連結型ポルフィリン種の混合物（ポルフィリンと連結したモノペプチドおよびジペプチド）が示された。同じ手法を使用して、オリゴペプチドリンカーを非メタレート型ポルフィリンと結合した。
【化３４】
2013503634.tif 000044
【０１７８】
ポルフィリンをナノ粒子と結合するために、メタレート型ポルフィリン−オリゴペプチド固体を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した。次に、５．０ｍｌのこの溶液を１０．０ｍｇのドーパミンテトラエチレングリコール連結Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子に加え、続いて、１．０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）および８．０ｍｇのＥＤＣを加えた。得られた懸濁液を室温で１時間音波処理した。固体沈殿物を磁石により集め、ＴＨＦ（８×２ｍｌ）で十分に洗浄した。次いで、サンプルを高真空下で５時間乾燥させた。８．０ｍｇの生成物を得た。その手順を繰り返し、非メタレート型ポルフィリンをナノ粒子と結合した。
【０１７９】
図１３に示されるように、両方の連結型ポルフィリンでは、ナノプラットフォームの濃度の増加とともに線状よりもわずかに発光強度が上昇している。これは、下に論じるように、Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動（ＦＲＥＴ）の最初の徴候である。図１３において１つのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子（ｄ＝２０ｎｍ）に対して連結されたポルフィリンの数は、４．８（Ｉ）および４．５（ＩＩ）であると推定された。
【０１８０】
図１４は、ＰＢＳ中、相対モル比９：１での、亜鉛ドープナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンおよびナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンの濃度依存を示している。λ＝６０９ｎｍでの第１の蛍光バンドは飽和を示しているのに対し、λ＝６５７ｎｍでの第２のバンドは、ｃ＝８．０×１０−６Ｍナノプラットフォームの濃度での強度の最大値を示している。濃度の増加とともに、Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動（ＦＲＥＴ）は増加する：ポルフィリンからポルフィリンへの励起状態の移動により内部（無放射）転換の程度が増加する。そのため、蛍光量子収量は、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４結合ポルフィリンのＦ＝０．０１１の最大値を超えない。亜鉛ドープナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンからの発光（λ１＝６０７ｎｍ、λ２＝６５７ｎｍ）は、「遊離」ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリン（λ１＝６５４ｎｍ、λ２＝７１８ｎｍ）のものより高エネルギーである。従って、ＦＲＥＴは「遊離」ポルフィリンに向けられ、「遊離」ポルフィリンはわずかな相対的発光増強を示す（Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子と結合した場合の図１５に示されるスペクトルの分析からｆ＜２．２）。図１４において１つのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子（ｄ＝２０ｎｍ）に対して連結されたポルフィリンの数は、５２であると推定される。
【０１８１】
約１×１０−８Ｍウロキナーゼの存在下でのＰＢＳ中のナノプラットフォームアセンブリー（１×１０−５Ｍ）の発光スペクトルを図１５に示している。非連結型ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンを、ＰＢＳ中相対モル比９：１の亜鉛ドープナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンおよびナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンを特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームに加えた。Ａ：ｃ＝２．８×１０−６Ｍにポルフィリンを加え、Ｂ：ｃ＝５．６×１０−７Ｍにポルフィリンを加え、Ｃ：ｃ＝８．４×１０−７Ｍにポルフィリンを加え、Ｄ：ｃ＝１．２×１０−７Ｍにポルフィリンを加えた。λ１＝６０７ｎｍにおいて蛍光バンドの低減の違いが肉眼で見える。他の２つの蛍光バンド（λ２＝６５４ｎｍ、λ３＝７１８ｎｍ）から生じる蛍光の濃度依存は非線形である。観察された非線形挙動の理由は、非メタレート型、非連結型ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンの蛍光量子収量の高さに見出すことができる。本発明者らはΦ＝０．０８２と推定した。これは連結状態よりもおよそ８倍高く、その場合、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を取り巻く領域での高ポルフィリン濃度により、ＦＲＥＴの増加、その結果として、励起状態の無放射失活に至る。
【０１８２】
図１６では、λ１＝６０７ｎｍ、λ２＝６５４ｎｍおよびλ３＝７１８ｎｍにおいて示された蛍光バンドの積分の比率を、添加した非連結型ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンのモル百分率（光学検出系を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＨＰ  １０５０）を使用するＨＰＬＣにより測定）に対してプロットしている。Ｒ＝Ι（λ２）／Ι（λ１）およびＲ＝Ι（λ３）／Ι（λ１）のプロットは、添加した非連結型ポルフィリンのモル百分率の増加とともに上昇する。それらは、添加した非連結型ナトリウムテトラカルボキシレートポルフィリンの０〜７モル％の濃度範囲では事実上線形である。従って、ウロキナーゼ−切断配列（ＳＲＧＳＡ、配列番号２）を切断する酵素ウロキナーゼによって「遊離型となる」ポルフィリンの濃度は、ナノプラットフォームの蛍光スペクトルを異なる時間間隔で記録し、３波長における蛍光強度を比較することにより測定することができる。とりわけ、単光子計数技術（蛍光顕微鏡検査法）を併用した場合には、３つの波長全てにより哺乳類組織におけるｉｎ  ｖｉｖｏ測定が可能になる。
【０１８３】
実施例１３
ｉｎ  ｖｉｔｒｏウロキナーゼセンサー
この実施例では、ＴＣＰＰを、ウロキナーゼ特異的切断配列（ＳＧＲＳＡ、配列番号２）を含有するオリゴペプチドを介してドーパミン−テトラエチレングリコールリガンドと連結した。このリガンドを、次いで、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子と結合した。アセンブリーは、実施例１２において上記したものと同じ手順を用いて調製するが、この場合には、１種類のポルフィリンのみ（すなわち、非メタレート型のみまたはメタレート型のみ）を使用した。
【０１８４】
内部Ｆｅコアのプラズモンバンドはその直径が小さいことからＵＶ／Ｖｉｓスペクトルには現われなかったが、ＴＣＰＰから生じる発光を消光することはできた。このタイプのセンサーは、有機消光剤（例えば、ビオロゲン）または無機消光剤（例えば、金属、合金およびコア／シェル型ナノ粒子）による発色団（例えば、ポルフィリン）の励起状態の消光に基づいている。ナノ粒子（約２ｎｍ）とポルフィリンとの近さから、コア／シェル型ナノ粒子の表面プラズモンは、化学的に結合されたポルフィリンからの発光スペクトルを消光することが可能である。一度、ウロキナーゼ切断によって放出されたら、発光は大幅に増加する。この発光増加は、スペクトル的に検出することができる。識別可能な発光スペクトルを特徴とする数種類の発色団を使用すると、様々な酵素の活性を同時に検出することができる。
【０１８５】
ウロキナーゼは哺乳類腎臓を通過することができ、尿で少なくとも一部の活性が維持され得ることから、ＭＡＴＢ  ＩＩＩ型癌細胞（浸潤性乳癌の齧歯類モデル）を注入したラットの尿の３サンプルを用いて光スイッチ機構を試験した。癌注入から５日後（対照）および３６日後にそれぞれ、サンプルを採取し、即座に−８０℃で冷凍した。試験の前に、尿サンプルを解凍し３７℃に加熱した。次の手順を用いて、各サンプルを試験した。
【０１８６】
ＴＣＰＰ−ナノ粒子ナノプラットフォームアセンブリーを、３０分間音波処理することにより再蒸留水に溶解した。次に、１００μｌの尿をナノプラットフォームアセンブリーの５×１０８Ｍ水溶液に加えた。温度を３４℃に一定に保った。蛍光スペクトルを２分ごとに記録した。
【０１８７】
図１７から分かるように、３６日の尿ではＴＣＰＰからの発光は経時的に着実に増加した。対照（５日の尿）は発光においてほとんど増加を示さなかった。図１０は、図１７に示す測定を用いてλ＝６５６ｎｍで生じたＴＣＰＰの発光の相対強度のプロットを示している。３６日の尿を用いてアッセイ（被分析物）を２回試験した。図１８の測定により、高度に再現性があることが分かる。
【０１８８】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｖｏウロキナーゼアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏウロキナーゼ−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ雌マウスにおいてアッセイ（被分析物）を試験した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ雌マウスには測定の１０日前にＢ１６Ｆ１９マウス黒色腫細胞を注入した。マウスに麻酔をかけ、その後、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子−ＴＣＰＰアセンブリーの溶液をマウスに、静脈内（ＩＶ）にまたは腫瘍への直接注射（ＩＴ）により投与した。ＩＶ用溶液を２００ｍｌのＰＢＳ中２００μｇのナノ粒子アセンブリーとした。ＩＴ用溶液を２００ｍｌのＰＢＳ中１００μｇのナノ粒子アセンブリーとした。アッセイ（被分析物）の活性を測定するために，マウスに再び麻酔をかけ、蛍光顕微鏡下に置き単一光子計数検出器を使用した。この機器は社内で組み立てた。ＩＲ領域のレーザー光（Ｔｉ：サファイア−レーザー、λ＝８７０ｎｍ、Ｐ＝６．５ｍＷ）を使用してマウスの後肢の腫瘍部位を励起した。
【０１８９】
蛍光顕微鏡（解像度：１ｍ×１ｍ×１ｍ）により記録した、マウスの右肢および左肢の単一光子計数スペクトルの結果を図１９に示している（赤色：左肢；青色：右肢）。Ａの囲みは、測定の３０分前にＩＴ注射したマウス１の結果を示している。Ｂの囲みは、測定の１２時間前にＩＶ注射したマウス２の結果を示している（腫瘍なし）。Ｃの囲みは、測定の１２時間前にＩＶ注射したマウス３の結果を示している（両方の肢に腫瘍を担持）。Ｄの囲みは、測定の２４時間前にＩＶ注射したマウス４の結果を示している。Ｅの囲みは、ＩＴ注射もＩＶ注射もしていない対照マウスの結果を示している。Ｆの囲みは、マウス７のＣの反復試験の結果である。
【０１９０】
ポルフィリン、ＴＣＰＰは、この励起波長での三光子励起を必要とする。腫瘍担持マウスの右肢で得られたシグナル強度が腫瘍サイズと相関するのに対し、左肢でのシグナルは明らかに相関しないことには注目すべきである。腫瘍によるナノ粒子アセンブリーの取込みが極めて迅速であるため、静注されたナノ粒子が遭遇する最初の腫瘍によってほほ全てが取り込まれるという説明が仮定とされる。ＩＴ注射はＩＶ注射よりも効果が低いことが見出された。これは、ウロキナーゼが切断配列の大部分を切断する時間がなく、ポルフィリンが光を発しないためである。
【０１９１】
実施例１５
ナノ粒子−ポルフィリンアセンブリー
この実施例では、ステルス保護Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を、標的プロテアーゼコンセンサス配列を介して１以上の有機クロリンおよび／またはフタロシアニンと結合した。それらの発光団は、６５０〜９００ｎｍの間の領域での異なる発光スペクトルを特徴とする。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を担持するＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒマウスに、ＰＢＳ中１００μｇのナノ粒子アッセイ（被分析物）を静注した。次いで、８００〜１，０５０ｎｍの範囲の波長でＴｉ：サファイアレーザーを使用して標的とされた領域を励起した。一度、そのナノプラットフォームが癌性組織の近くに存在すると、標的プロテアーゼによって結合が切断される。これによりナノ粒子による発光の消光が中断され、発光団は光を発する。光の強度は、酵素活性のレベルと直接相関している。加えて、腫瘍サイズと放出された光の強度との間に正相関が見出された。この機構は、腫瘍の位置決定を行うための目視基準として、また腫瘍除去手術時の発光用造影剤として使用することができた。図２０は、一般に観察されるプロテアーゼ切断反応速度論を、ｐＨ６．８および温度３６℃でのプロテアーゼ（ウロキナーゼ）濃度の関数としてを示している。
【０１９２】
実施例１６
光後方散乱センサー
この実施例では、ＵＶ／Ｖｉｓ−分光計を使用して、２つの異なる実験によりｕＰＡの活性を測定した。
【０１９３】
第１のナノプラットフォームを、ウロキナーゼコンセンサス配列（ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ、配列番号６８）を介して連結されたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノプラットフォームを使用して調製した。ナノプラットフォームには、リガンドステルス被覆を含めポルフィリンを結合した。進行性膵臓癌を有するラットのラット尿１００ｍｌを含有する３．０ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ＝６．８）に、０．０１０ｍｇの連結型ナノプラットフォームを溶解することにより溶液を調製した（推定ウロキナーゼ濃度：５×１０−１０Ｍ）。次いで、光線を使用してアッセイ（被分析物）を励起した。光学的特性における変化は、ウロキナーゼによるオリゴペプチド−リンカーの切断によりはっきりと識別可能である。１２０分間にわたるナノ粒子−ダイマーのＵＶ／Ｖｉｓ後方散乱スペクトルを図２１に示している。
【０１９４】
第２のナノプラットフォームアセンブリーを、実施例９に従って、ＴＣＰＰ−テザーを使用して調製した。１．０ｍｇのナノプラットフォームを３．０ｍｌの水性バッファー（０．０１Ｍ  ＰＢＳ）に溶解した。温度を３６．８℃で一定に維持した。次に、ウロキナーゼを濃度１×１０−１０Ｍで水性ＰＢＳ混合物に加えた。次いで、光線を使用してアッセイ（被分析物）を励起した。ＵＶ／Ｖｉｓ−分光計により、ｔ＝０分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分および４０分において、光減衰Ｅ＝吸収（Ａ）＋散乱（Ｓ）を記録した。ウロキナーゼを加えずに行った対照測定で示されているように、吸収スペクトルは４５分の間変化しないと想定した。それゆえ、一度、オリゴペプチド−テザーが酵素により切断されたら、観察できる減衰の変化は散乱の変化によるものである。図２２は、４０分の間の減衰の変化を示している。
【０１９５】
反応速度論を視覚化するために、４４０ｎｍにおけるシグナル強度を６００ｎｍにおけるシグナル強度で割った値を時間経過に対してプロットした。図２３により示されるように、直線の傾きが得られた。認められた反応速度論により組織中のプロテアーゼ量の推定が可能である。すなわち、切断の速度はウロキナーゼの濃度と直接関連しているため、切断の速度を腫瘍の浸潤性と相互に関連づけることができる。
【０１９６】
実施例１７
Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子アセンブリーの光物理的特性
Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子を、リガンド１〜３を使用して安定化させた。リガンド２〜３は、化学的に結合されたポルフィリンを特徴とするものである。ナノ粒子のコア直径は約５．４ｎｍであり、シェル厚さは約１．５ｎｍであった。
【０１９７】
リガンドを無水ＴＨＦ中のナノ粒子に加え（Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４の質量に対する重量で１０／１）、５分間音波処理し、次いで、２４時間連続攪拌した。次いで、被覆された二金属ナノ粒子を強力な永久磁石で分散媒から分離した。次いで、二成分磁性ナノ粒子をＴＨＦに再懸濁し、再び集めた。３０秒間の音波処理の後、５分間の攪拌を行い、ナノ粒子を液体媒体に再分散させた。洗浄／再分散のプロセスを１０回繰り返した。次いで、アルゴン流中で残留溶媒を除去した。最後に、被覆二成分磁性ナノ粒子を滅菌脱イオンＨ２Ｏに懸濁／溶解した。
【化３５】
2013503634.tif 000045
【化３６】
2013503634.tif 000046
【０１９８】
次いで、下の表Ｖに示す波長でＴｉ：サファイアレーザーを使用して励起を行った。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ（登録商標）２蛍光分光計（ＨＯＲＩＢＡ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ；  Ｅｄｉｓｏｎ,  ＮＪ）を使用して発光を観察した。表Ｖは、これらのナノアセンブリーの光物理的特性を示す。
【０１９９】
【表５】
2013503634.tif 000047
【０２００】
燐光量子収量は、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４結合ポルフィリンのΦ＝０．０１１の最大値を超えなかった。鉄（０）−コアの発光は検出できなかった。しかしながら、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の発光消光能力ははっきりと識別できた。非ナノ粒子結合ポルフィリンの燐光量子収量はおよそ２．２〜２．５倍高かった。
【０２０１】
図２４は、７．５×１０−６Ｍの濃度のＨ２Ｏ中ポルフィリン亜鉛錯体を伴った、「遊離」テトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４結合テトラカルボキシフェニルポルフィリンの典型的なＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを示している。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４とポルフィリンの割合は１：１．２であると推定される。図１１により分かるように、ソーレー帯（極めて強い近紫外帯）のピーク位置は、ＴＣＰＰではλ＝４１７ｎｍであり、Ｚｎ−ＴＣＰＰではλ＝４２５ｎｍである。吸収係数は、ＴＣＰＰでは４．８×１０５Ｍ−１ｃｍ−１であり、Ｚｎ−ＴＣＰＰでは４．１×１０５Ｍ−１ｃｍ−１であり、文献と一致している。ドーパミン−テトラ（エチレングリコール）ブリッジによる二成分磁性Ｆｅ／Ｆｃ３Ｏ４ナノ粒子との化学結合によってＴＣＰＰの吸収係数は２．１倍低下するが、Ｚｎ−ＴＣＰＰとの結合の場合にはわずかな低下（＜１．１）しか認められない。．
【０２０２】
実施例１８
ナノプラットフォームの溶解度およびＳＡＲ値
この実施例では、リガンド１〜７を使用した様々なナノ粒子アセンブリーの溶解度およびＳＡＲ値を評価した。リガンドを無水ＴＨＦ中のナノ粒子（下の表に記載）に加え（Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４の質量に対する重量で１０／１）、５分間音波処理し、次いで、２４時間連続攪拌した。次いで、被覆された二金属ナノ粒子を強力な永久磁石で分散媒から分離した。次いで、二成分磁性ナノ粒子をＴＨＦに再懸濁し、再び集めた。３０秒間の音波処理の後、５分間の攪拌を行い、ナノ粒子を液体媒体に再分散させた。洗浄／再分散のプロセスを１０回繰り返した。次いで、アルゴン流中で残留溶媒を除去した。最後に、被覆二成分磁性ナノ粒子を滅菌脱イオンＨ２Ｏに懸濁／溶解した。下のリガンド１〜７を使用した。
【化３７】
2013503634.tif 000048
【化３８】
2013503634.tif 000049
【化３９】
2013503634.tif 000050
【０２０３】
溶解度を決定するために、ガラスキュベットに入った０．２５ｍｇのナノ粒子にリン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝６．８）を滴下した。その懸濁液をマイクロマグネティックスターラー（Ｆｉｓｈｅｒ）で連続攪拌した。懸濁液の光散乱を７００ｎｍで記録した。一度、粒子が溶解したら、７００ｎｍでの減衰（すなわち、光の吸収および散乱）はＥ＝０．０１未満に低減した。
【０２０４】
比吸収率（ＳＡＲ）は、ＳＡＲ＝Ｃ＊ΔＴ／Δｔ（式中、Ｃはサンプルの比熱容量であり、Ｔは温度であり、ｔは時間である）によって計算される。ＳＡＲ値を決定するために、温熱療法装置を自社開発した。その装置は、サンプルの温度変化を測定するように改造された、耐久性のある改良型誘導加熱器を利用する。その構成では、温度変化を検出するためにリモートＩＲプローブを使用する。その装置は、リモート光ファイバーセンシングを利用し、その周波数は一定とする。
【０２０５】
表ＶＩ−ナノ粒子−リガンド組合せ（１〜４）の溶解度およびＳＡＲ値
【表６】
2013503634.tif 000051
【０２０６】
表ＶＩＩ−ナノ粒子−リガンド組合せ（５〜７）の溶解度およびＳＡＲ値
【表７】
2013503634.tif 000052
【０２０７】
【表８】
2013503634.tif 000053
【０２０８】
実施例１９
磁気共鳴画像法
２個体の８週齢ＣＢ５７ＢＬ／６雌マウス（この実験の前に安楽死させた）に０．５０ｍｌの水（Ａ）または磁性ナノ粒子（Ｂ〜Ｄ）を注射した。部位（Ｂ）は、５００ｍｇのステルス被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含んだ。部位（Ｃ）は、ポルフィリン連結ステルス被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を受けた骨髄から単離された、２５ｍｇのマウス幹細胞を含んだ。部位（Ｄ）は、５００ｍｇの市販の酸化鉄ナノ粒子（Ｆｅｒｉｄｅｘ（登録商標））を含んだ。日立７０００永久磁石型ＭＲＩを使用してＭＲＩデータを取得した。標準的なＴ１およびＴ２パルスシーケンスを用いた。図２５のＭＲ画像で示されるように、水の注射を除き、全ての注射で識別可能なＴ２コントラストを得た。
【０２０９】
実施例２０
Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒマウスにおけるＢＦ１６Ｆ１０黒色腫の温熱処置
この実施例では、大腿後部（ｕｐｐｅｒ  ｈｉｎｄ  ｌｅｇｓ）にＢＦ１６Ｆ１０黒色腫を有するＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒマウスに対する本発明のナノプラットフォームの効果を試験した。これらの実験には単独のナノ粒子を使用した（すなわち、ナノ粒子をプロテアーゼコンセンサス配列によって連結しなかった）。ＢＦ１６Ｆ１０を有するマウス２０個体の両肢大腿後部内にマウス黒色腫細胞を接種し、その後、４群に分けた。セラノスティックプラットフォームの注射は大腿後部内に直接とし、以下のとおり進めた。
・１群（「対照右肢」）には、６日目に、５０μＬのＰＢＳに溶解した、結合されたＴＣＰＰポルフィリンを特徴とするステルスリガンド被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子５０μｇを注射した。８日目に、１００μＬのＰＢＳ中１００μｇのナノ粒子を注射した。１０日目に、１５０μＬのＰＢＳ中１５０μｇのナノ粒子を注射した。最後に、１２日目に、１５０μＬのＰＢＳ中１５０μｇのナノ粒子を注射した。
・第２群（「実験右肢」）には、同じ注射スケジュールにより注射し、続いて、即座に温熱処置を１０分間行った。その温度は４９．８℃に上昇させ、これは、光ファイバー温度測定装置（Ｎｅｏｐｔｉｘ）を使用することにより確認された。
・第３群（「実験左肢」）には、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）だけを注射し、ＡＣ／磁気照射を行った。その温度は４２℃に上昇させた。
・第４群（「対照左肢」）には、処置しなかった。
【０２１０】
１４日目の後、マウスを安楽死させた。肺、脾臓および肝臓（極微量のみ）で微量のナノプラットフォームが見出された。プルシアンブルー染色を用いて、材料の大部分（６０％を超えると推定される）が腫瘍自体において残留鉄として見出された。
非処置黒色腫を対照として使用するならば、磁気温熱療法を使用した癌増殖阻害率は７６％である。温熱療法を行わなくてもナノプラットフォームの注射により癌増殖の５０％阻害がもたらされる。これは、ナノ粒子の生物腐食および活性酸素種の鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）強化化学によるものと考えられる。
【０２１１】
マウス肢における腫瘍細胞のインキュベーション日からの経過時間に対する平均腫瘍容積（ｍｍ３）を図２６に示している。図２６により分かるように、実験右肢（ナノプラットフォーム、続いて、温熱療法を行った）は非処置群と比べて腫瘍増殖の著しい阻害を示した。５回のＰＢＳ注射を受けたが温熱療法を行わなかったさらなる群を対照として使用するならば、磁気温熱療法を使用した増殖阻害率は７８％であった（グラフは示していない）。
【０２１２】
ポルフィリン結合を特徴とするナノ粒子も他の２つのマウス群に静注して、ナノプラットフォームのこの投与方法による腫瘍取込みを判定した。１群には、２００μｌのＰＢＳ中２００μｇのナノプラットフォームを静脈内に与え、一方、もう１つの群には、５００μｌのＰＢＳ中５００μｇのナノプラットフォームを静脈内に与えた。マウスを安楽死させ、調べた。この場合も、注射から１２時間に、投与されたナノプラットフォームの大部分（およそ６０％）が腫瘍で見出された。
【０２１３】
実施例２１
磁気加熱実験
この実施例では、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒマウスの大腿後部内に様々な溶液を注射した。次いで、注射部位を、Ａ／Ｃ磁場（３６６ｋＨｚ、Ｈ：５．０ｋＡｍ−１）を使用して加熱した。非加熱部位を対照とした。マウスの大腿後部において光ファイバープローブにより、時間経過に伴う温度変化（ΔΤ）をモニタリングした。それらの結果を図２７に示している。試験パラメーターは以下のとおりである。
【０２１４】
【表９】
2013503634.tif 000054
【０２１５】
実施例２２
ＳＡＲ値の計算および最適化
この実施例では、ＳＡＲ値に対する粒子サイズおよび磁場形状の影響を判定するために、理論計算を行った。まず、ＳＡＲ＝Ｃ＊ΔＴ／Δｔに基づいて、サイズの関数としてＳＡＲ値を計算した。市販のＦｅ２Ｏ３ナノ粒子を参照とした。図２８に示されるように、ナノ粒子の平均サイズ（直径、単位：ｎｍ）ならびにサイズ分布はＳＡＲに大きな影響を及ぼすことが見出された。それらの結果により、３６６ｋＨｚ磁気温熱療法装置では、ナノ粒子の最適サイズ分布は、Ｆｅナノ粒子についてはおよそ１０〜１２ｎｍ、Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子については１７〜１９ｎｍであった。緩やかな曲線は、より実際的な実験値を説明するサイズ分布のその後の広がりに一致する（対数正規サイズ分布のσ＝０〜０．５）。平均ナノ粒子サイズがほぼ望ましいならば、より狭いサイズ分布が望ましい。
【０２１６】
Ｆｅ（黒色）およびＦｅ２Ｏ３（白色）ナノ粒子のＳＡＲ値に対する磁場の形状（正弦、三角、四角）の影響も理論計算を用いて評価した。計算の概要を図２９に示している。計算結果により、四角磁場を使用するならば、（全ＳＡＲ値へのネール緩和の寄与増大により）ＳＡＲ値が著しく増加し得ることが示されている。
【０２１７】
実施例２３
ｉｎ  ｖｉｔｒｏナノデバイスデータ
この実施例では、様々なナノデバイスのＳＡＲ値、ΔＴｍａｘおよび溶解度を決定した。ナノデバイスにおけるナノ粒子の一部には、アミノシロキサン（ＡＳＯＸ）保護層および／またはビオチン標識を含めた。テトラエチレングリコールリガンドを使用した。そのリガンドは、結合されたポルフィリンの特徴のないものであった。社内で開発された磁気温熱療法装置によりＡ／Ｃ磁場（Ｈ：５．０ｋＡｍ−１、周波数３６６ｋＨｚ（矩形波パターン））を使用して磁気加熱を行った。その装置は、サンプルの温度変化を測定するように改造された耐久性のある誘導加熱器と、リモート光ファイバーセンシングを利用する。リモートＩＲプローブを使用して温度変化を検出した。上の実施例５において記載した試験を使用して、ナノプラットフォーム溶解度を決定した。それらの結果を下の表Ｘに示している。
【０２１８】
【表１０】
2013503634.tif 000055
【０２１９】
実施例２４
リガンドモデリング
この実施例では、ナノ粒子の完全表面被覆のために好適なリガンド数を決定するために計算を行った。計算では、ナノ粒子が完全な球の形である（この場合、表面積（Ａ）＝４πｒ２＝ｄπ２）と仮定する。球状ナノ粒子の表面積を、それらの直径の関数として図３０に示している。
【０２２０】
本発明のリガンドの「アンカー」であるドーパミン単位の空間要求性は、１．０９４ｎｍ２と計算された。さらなる計算を目的として、各リガンドは表面結合に対して同じ親和性を有し、そのため、ナノ粒子の表面において単分子層を形成するための複数のリガンドの結合は、ポアソン分布：
【数６】
2013503634.tif 000056
（式中、λは、期待発生回数であり、ｋは整数発生回数であり。ｆは、正確にｋ回発生する確率である）
によって示すことができると仮定する。図３１は、（完全表面被覆のための）ナノ粒子１個当たりのドーパミン結合リガンドの理想数をナノ粒子の直径の関数として示している。
【０２２１】
この発明モデルによれば、ナノ粒子表面で単分子層を形成するリガンドの数に対するナノ粒子直径変動の影響を識別することができる。これらの結果を図３２に示している。Ｌ：示した主直径；Ｌ０．９：主直径の９０相対％；Ｌ０．８：主直径の８０相対％；Ｌ１．１：主直径の１１０相対％；およびＬ１．２０：主直径の１２０相対％。
【０２２２】
実施例２５
治療のｉｎ  ｖｉｔｒｏモニタリング
この実施例では、ラットおよびマウスの尿に関して実施例１３および実施例１４で概説した同じ基本手順を用いて、癌と診断され様々な治療段階に達しているイヌのイヌ尿サンプルを解析した。３つのイヌ由来尿サンプルを、カンザス州立大学の獣医学研究室から入手した。それらのサンプルをコード番号によって識別し、各動物の健康状態が分からないまま解析を実施した。尿サンプルを採取し、実験まで−８０℃で保存した。実験は、１Ｍ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．２）中、３５℃で実施した。ナノプラットフォームを調製するため、ＴＣＰＰを、ウロキナーゼ特異的切断配列（ＳＧＲＳＡ、配列番号２）を含有するオリゴペプチドを介してドーパミン−テトラエチレングリコールリガンドと連結した。次いで、このリガンドを、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子と結合した。アセンブリーは、実施例１２において上記したものと同じ手順を用いて調製したが、この場合には、非メタレート型ポルフィリンのみを使用した。ＴＣＰＰ−ナノ粒子ナノプラットフォームアセンブリーを、３０分間の音波処理を用いてバッファーに溶解した。溶液中のナノ粒子の終濃度は１５ｍｇ／ｌであった。次に、その溶液２ｍｌを蛍光キュベットにとり、初期測定値を記録した。この溶液に、各尿サンプル２５μｌを加え、混合し、２分ごとに測定値を記録した。
【０２２３】
次いで、サンプルを解読し、それらの結果を解析した。サンプルＡは正常イヌのものであった。サンプルＢは、未分化肉腫（二次癌）と診断された、ドキソルビシン化学療法を受け、治療によく反応しているイヌのものであった。サンプルＣは、最近腎リンパ腫と診断された、病気のイヌのものであった。イヌ尿サンプルの添加後に発生した蛍光シグナルを時間に対してプロットした。時間と蛍光増強とのプロットにより各サンプル中に存在するウロキナーゼの量が示された。
【０２２４】
図３３に示されるように、癌と診断されたばかりのイヌ（サンプルＣ）から得られた尿サンプルは、蛍光の急上昇を示し、測定値は１分ごとに収集した。このサンプルは、他の２つのサンプルより速い酵素加水分解速度を示した。他の２つのサンプルは２分ごとに収集しただけである。化学療法を受けているイヌ（サンプルＢ）の尿サンプルは、対照（サンプルＡ）よりも検出できる蛍光増強を示したが、サンプルＣよりもまだずっと低かった。尿は、４００〜５００ｎｍ励起波長範囲で励起し得る蛍光分子を含む可能性があるため、アッセイの前のＵＶ分光法および蛍光分光法による尿サンプルの分析に重要である。そのデータにより、酵素活性レベルに基づいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌治療の経過をモニタリングし追跡するアッセイの能力が示される。
【０２２５】
実施例２６
ナノプラットフォームの幹細胞送達
本実施例では、ナノプラットフォームを癌性組織に送達するために幹細胞を用いた。
１．ポルフィリン連結ステルス被覆（二成分）磁性Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子
連結されたＴＣＰＰを特徴とする、ステルス被覆ドーパミン標識Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、Ｆｅ（ＩＩＩ）を還元した後にアミノシロキサンシェルを形成させることによって作製した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−コア／シェルナノ粒子はNanoScale Corporation (Manhattan, KS)によって合成された。ＣＤＩの存在下で有機ステルスリガンドを加えると、アミノシロキサン層の周囲にドーパミン結合有機ステルス層が結合した。最終工程は、テトラエチレングリコール単位の末端ヒドロキシル基とＴＣＰＰの１個のカルボン酸基を反応させることによる、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルスナノ粒子へのＴＣＰＰ標的単位の付加からなった。
【０２２６】
高分解能電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）によれば、このナノ粒子はナノロッド（長さ５〜１０ｎｍ、直径１〜４ｎｍ）からなることが明らかになった。水素化ホウ素ナトリウムの還元後、各ナノロッドは、Ｆｅ（０）コア（ＨＲＴＥＭ（格子定数：０．２８７ｎｍ）によって確認）およびＦｅ３Ｏ４シェル（厚さおよそ０．５０〜１．０ｎｍ）を含んでいた。これらのナノロッドは直径１６．０±１．５ｎｍのクラスターを形成する。これらのナノ粒子のＢＥＴ表面積は約７２．２ｍ２／ｇであり、幅１７．０００Å〜３０００．０００Åの管孔のＢＪＨ吸着累積表面積は８６．５ｍ２／ｇであり、幅１７．０００Å〜３０００．０００Åの管孔のＢＪＨ脱着累積表面積は９１．１ｍ２／ｇであった。位相解析（粉末Ｘ線回折−ＸＲＤ）は、ナノ粒子が構造上結晶性か非晶質かを決定するための粉末Ｘ線回折を用いて調べた。ＸＲＤの結果は図５５に示し、Ｆｅ３Ｏ４ならびにＦｅコア（非晶質酸化鉄を伴う）に関する主要な線を全て示す。
【０２２７】
アミノシロキサン（ＡＳＯＸ）層の合成は、文献からの手順を採用することによって実施した：２０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を１０ｍｌのＴＨＦに懸濁した。３０分間の音波処理後、低速遠心分離（１５００ＲＰＭ、５分）による沈降により、溶解していない固体（＜１ｍｇ）を分離した。透明な溶液を別の試験管へ移し、この溶液に０．３０ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシルシランを加え、続いて、音波処理を行った。次いで、被覆ナノ粒子を高速遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分）によって集めた。洗浄およびＴＨＦへの再分散の後、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子（７．５ｍｇ）を集め、高真空乾燥させ、アルゴン下で保存した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４クラスター全体を取り囲むアミノシロキサンシェルの厚さは２．０±０．４ｎｍであったが、これはＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子の平均直径２０±２．３ｎｍに一致する。プログラムＩＭＡＧＥ（ＮＩＨ）を用いたところ、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子の多分散性指数は１．１５であると判定された。
【０２２８】
ステルスリガンド層は、５．０ｍｌのＴＨＦに、２０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子および固体として加える１．０ｇのＣＤＩとともに４０ｍｇのドーパミン含有リガンド（Ｌ１）を溶解した後に音波処理を施すことによって合成した。次いで、これらのナノ粒子を高速遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分）によって集めた。洗浄およびＴＨＦへの再分散の後、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスナノ粒子（１５ｍｇ）を集め、高真空乾燥させ、アルゴン下で保存した。
【０２２９】
ポルフィリンは、５．０ｍｌのＴＨＦに、２０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルスナノ粒子および固体として加える１．０／０．０５ｇのＥＤＣ／ＨＯＢＴとともに２．５ｍｇのＴＣＰＰを溶解した後に音波処理を施すことによってナノ粒子に結合させた。次いで、これらのポルフィリン結合ナノ粒子を高速遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分）によって集めた。洗浄およびＴＨＦへの再分散の後、ＴＣＰＰ標識Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルスナノ粒子（１３．５ｍｇ）を集め、高真空乾燥させ、アルゴン下で保存した。ＵＶ／Ｖｉｓ分光法（λａｂｓ（ＴＣＰＰ）＝４１６ｎｍ、＝３６５，０００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いたところ、１個のステルス被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子に対して平均５±０．５のＴＣＰＰ単位が結合していたと判定された。このステルスリガンドの長さは２．５ｎｍであったので、得られたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルスナノ粒子の大きさは２５±２．３ｎｍ（直径）であった。
【０２３０】
ドーパミン−アンカーの空間要求は１．０９４ｎｍ２（ＡＭ１）である。直径２０ｎｍのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子は１１５０の有機リガンドと結合することができる。ポルフィリン標識の直径は１．９５ｎｍである（ＡＭ１）。リガンドＬ１／Ｌ１−ＴＣＰＰのモル比は１０００／３．５であった。ポアソン分布を仮定すると、選択された比率（ナノ粒子１個当たりＴＣＰＰ単位５）でＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルスナノ粒子の９９．３３％が、少なくとも１つの化学的に結合したＴＣＰＰ単位を特徴とする。有機的に被覆されたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の溶解度は２．２５ｍｇ／ｍｌであると判定され、本明細書に記載の磁場における比吸収率（ＳＡＲ）は６２０±３０Ｗｇ−１（Ｆｅ）であった。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルス−ＴＣＰＰナノ粒子のゼータ電位は、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  （Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、２９８Ｋ、０．１Ｍ  ＰＢＳバッファーにおいて３４ｍＶであると測定された。ＢＥＴ表面積は７２±２ｍ２ｇ−１であると測定された。
【０２３１】
２．Ｃ１７．２神経幹細胞およびＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞の組織培養
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ,  ＶＡ）から購入し、３７℃、５％二酸化炭素を含む加湿雰囲気下、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ,  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  Ｃａｒｌｓｂａｄ,  ＣＡ）中で維持した。
【０２３２】
Ｖ.  Ｏｕｒｅｄｎｉｋ  （Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；  Ｅｖａｎ Ｓｎｙｄｅｒの研究室で最初に開発）からの譲渡品であるＣ１７．２神経幹細胞（ＮＳＣ）は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。
【０２３３】
３．神経幹細胞およびＢ１６−Ｆ１０細胞に対するＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の細胞傷害性
Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＮａｎｏＳｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,  Ｍａｎｈａｔｔａｎ,  ＫＳ）の潜在的細胞傷害作用を、Ｃ１７．２  ＮＳＣおよびＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を種々の濃度のナノ粒子とともにインキュベートすることによって検討した（鉄含量によって測定）。ＮＳＣおよびＢ１６−Ｆ１０細胞を５０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌまたは２５μｇ／ｍｌの鉄濃度のナノ粒子を含有する個々の培地とともに一晩インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。細胞をトリプシン処理によって採取し、生細胞数および死細胞数を血球計およびトリパンブルー染色により計数した（生細胞は無色を呈し、非生細胞は青色に染まる）。ＮＳＣおよびＢ１６−Ｆ１０細胞を３回の独立した試験で用い、各試験は三反復した。
【０２３４】
Ｆｅ／Ｆ３Ｏ４ナノ粒子の毒性作用は、鉄濃度が増すとともに高まった。ＮＳＣについての種々の濃度のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子に対する細胞生存率評価を図３４に示し、Ｂ１６−Ｆ１０癌細胞については図３５に示している。興味深いことに、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、ＮＳＣよりもＢ１６−Ｆ１０細胞に強い毒性作用を示した。ＮＳＣは、２０μｇ／ｍｌの鉄濃度まではＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を十分許容した（図３４）しかしながら、Ｂ１６−Ｆ１０細胞数は、５μｇ／ｍｌの鉄濃度に曝した場合にのみ減少した（図３５）。
【０２３５】
４．幹細胞装入効率および装入法
Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のＮＳＣへの装入効率は、ペルルスのプルシアンブルー染色キット（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ,  Ｉｎｃ.,  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ,  ＰＡ）を用いて評価した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（２５μｇ／ｍｌ  Ｆｅ）を含有するＮＳＣ培地で一晩インキュベートした後、ＮＳＣをＤＭＥＭおよびＰＢＳで２回洗浄し、４％グルタルアルデヒドで１０分間固定した。固定済みＮＳＣを４％フェロシアン化カリウムおよび４％ＨＣｌ中で２０分インキュベートした。２０分インキュベートした後、ＮＳＣを１×ＰＢＳで２回洗浄し、ヌクレアファストレッド溶液で３０分対比染色した。画像をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ顕微鏡（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＪｅｎｏｐｔｉｋ  ＰｒｏｇＲｅｓ  Ｃ３カメラ（Ｊｅｎａ,  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取り込んだ。
【０２３６】
種々の鉄濃度のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を用いたＮＳＣの装入効率はまた、フェロジン鉄評価法（Ｒｉｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｏｌｏｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ.  Ａｎａｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.  ３３１  （２）  ３７０‐７５  （２００４））を用いて分光光度法により測定することもできる。一細胞当たりの鉄濃度を評価するために、各Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子濃度における細胞の全鉄濃度を全細胞数で割った。この方法のために、細胞を種々の濃度のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含有するＮＳＣ培地で一晩インキュベートした後、ＤＭＥＭおよび１×ＰＢＳで２回洗浄した。全てのＮＳＣ（対照細胞および種々の鉄濃度のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入された細胞）をトリプシン処理し、遠心分離し、２ｍｌの蒸留水に再懸濁した。次いで、０．５ｍｌの１．２Ｍ  ＨＣｌおよび０．２ｍｌの２Ｍアスコルビン酸を加え、６５〜７０℃で２時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。２時間後、６．５ｍＭのフェロジン（ＨＡＣＦＩ,  Ｌｏｖｅｌａｎｄ  ＣＯ）、１３．１ｍＭのネオクプロイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ,  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ）、２Ｍのアスコルビン酸（Ａｉｆａ  Ａｅｓａｒ,  Ｗａｒｄ  ｈｉｌｌ,  ＭＡ）および５Ｍの酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ,  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ）を含有する０．２ｍｌの試薬を加え、室温で３０分インキュベートした。３０分後、１０００ＲＰＭで５分、サンプルを遠心分離し、上清の光学濃度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ,  Ｃｏｌｕｍｂｉａ,  ＭＤ）により５６２ｎｍで測定した。標準曲線は０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの硫酸第一鉄アンモニウムサンプルを用いて作成した。その他の全ての試薬を含む水をブランクとして用いた。
【０２３７】
Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子はプルシアンブルー染色の後にＮＳＣに効率的に装入され、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子はＮＳＣに青色に染まる材料として検出された（図３６）。ＮＳＣの電子顕微鏡画像は、その細胞質に、装入されたＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を凝集体として示した（図３７）。９０％を超える細胞にＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されていた。ＮＳＣへのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の装入効率は、培地中のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の濃度が増すにつれ上昇した。２５μｇ／ｍｌの鉄を含有する培地でインキュベートした細胞では、一細胞当たり最高濃度１．６ｐｇの鉄が確認された（図３８）。
【０２３８】
ポルフィリンタグ付きＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子はＬＤＬ受容体により取り込まれた脂肪酸または疎水性タンパク質に吸着されたのでクラスターを形成した可能性があることから、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、装入された細胞の細胞質に、単一のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子としてではなく凝集体として見られた可能性がある。元々超常磁性であった粒子のクラスター形成はそれらの磁性挙動を強磁性への変化させた可能性がある。
【０２３９】
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＭＦにより誘導される温度変化
腫瘍を模した環境における、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されたＮＳＣによる温度上昇を確認するために、総Ｆｅ濃度１５μｇ／ｍｌとなるようにＮＳＣにＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を一晩装入した。実際の黒色腫に光学プローブを挿入することはできなかったが、これはそれを試みた際に、プローブによってできる侵入創傷からゼラチン質の腫瘍柔組織の漏出があったためである。このため、ＦｅＦｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されたペレット状のＮＳＣまたはＮＳＣ単独をアガロースとともに塗布し、これをマイクロ遠沈管内で固化させることによって腫瘍環境を模倣した。インキュベーション後、装入済みの細胞をＤＭＥＭで２回、１×ＰＢＳで２回洗浄して遊離のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を除去した。０．１％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を採取し、１×１０６細胞を、２ｍｌ遠沈管で遠心分離を行うことよってペレットとした。次に、細胞沈降物の上に１．５ｍｌの４％アガロース溶液を加え、腫瘍組織の細胞外マトリックスを模倣した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含まないペレット状ＮＳＣを含有するアガロース遠沈管を陰性対照として用い、上記したように作製した。実験は３反復で行った。各遠沈管をＡＭＦに曝す前に、遠沈管に２つの光学プローブを、１つはペレットに、もう１つはアガロース固体の中央に挿入した。遠沈管を１０分間ＡＭＦに曝し、これらのプローブで経時的な温度の違いを測定した。
【０２４０】
ＮＳＣ対照とＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子装入ＮＳＣの間で経時的温度上昇を比較した（図３９）。１０分のＡＭＦ曝露期間の後、対照とＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子装入細胞の間でペレット温度に有意な２．６℃の上昇が見られた（ｔ検定、ｐ値０．１）。さらに、アガロース固体の中央のペレットからは、両群とも残留熱による小さな温度上昇が見られ、ＡＭＦ曝露中、誘導コイルは若干熱を持ち、その熱を空気を介して遠沈管に伝える。
【０２４１】
比較的多量のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸナノ粒子を使用することによって腫瘍全域を加熱する必要はないことに注目すべきである。ナノロッドのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４クラスターのＦｅ（０）−コアは極めて小さいために、Ａ／Ｃ磁気加熱は主としてニール機構に従って起こり、ナノ粒子の局部的加熱をもたらす。より大きなナノ粒子（ｄ＞２０ｎｍ）はブラウンの加熱機構を特徴とし、ナノスケールレベルではるかに良好な攪拌が起こる。テトラエチレングリコール単位が存在すると水分子とナノ粒子の強固な結合が生じ、これがさらにその場の拡散を低下させ得る。従って、Ａ／Ｃ磁気加熱の際には、４５℃を超える温度を特徴とする「ホットスポット」が存在する可能性があり、腫瘍組織の全体温度がほとんど上昇しない場合であっても、細胞の複数の箇所に局部的損傷をもたらすことがある。
【０２４２】
６．ＮＳＣの選択的移植と磁気温熱療法の評価
雌Ｃ５７ＢＬ／６（６〜８週齢）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ,  ＭＡ）から入手した。マウスは、到着後１週間、馴化させるために保持し、カンザス州立大学の比較医学グループにおいて認可されたＩＡＣＵＣ指針に従って維持した。動物実験は全てこれらのＩＡＣＵＣ指針に従って行った。０日目に、３．５×１０５のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を２１個体のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射し、これらのマウスを３群に分けた。５日目に、鉄濃度２０μｇ／ｍｌでＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入された１×１０６のＮＳＣを２群（ＮＳＣ−Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（Ｉ群）とＮＳＣ−Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子＋ＡＭＦ（ＩＩ群））に静注し、同時に、生理食塩水をＩＩＩ群に注射した。腫瘍接種後９日目、１０日目および１１日目に、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されたＮＳＣを有するＩＩ群のマウスを、交番磁場装置（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ,  Ｐａｓａｄｅｎａ,  ＣＡ）を用い、毎日１０分間、ＡＭＦに曝した。周波数は一定とし（３６６ｋＨｚ、波形確立後）、磁場の大きさは５ｋＡ／ｍである。腫瘍容積は、８日目、１０日目および１２日目にカリパスを用いて測定し、式０．５ａ×ｂ２（式中、ａは腫瘍の長い方の直径、ｂは短い方の直径である）を用いて計算した。その後、１５日目に全てのマウスを安楽死させ、組織化学的研究のために組織を回収した。
【０２４３】
細胞投与の４日後に腫瘍切片において、有意な数のＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子装入ＮＳＣが確認された。画像を図４０（Ａ）〜（Ｆ）に示している。（Ａ）〜（Ｃ）：ナノ粒子装入ＮＳＣを施した後にＡＭＦ処置を行ったマウスの肺（Ａ）、肝臓（Ｂ）および腫瘍（Ｃ）の、プルシアンブルーで染色し、ヌクレアファストレッドで対比染色した組織切片（これらの腫瘍切片には青色に染まったＮＳＣが存在しないことに留意されたい）。（Ｄ）：ナノプラットフォームを施したが、ＡＭＦ処置を行わなかったマウスの腫瘍切片における陽性プルシアンブルー染色ナノ粒子装入ＳＣ。（Ｅ〜Ｆ）：ＴＵＮＥＬアッセイ：Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子装入ＮＳＣ＋ＡＭＦを用いた腫瘍担持マウスにおける緑色のアポトーシス細胞（Ｅ）に対して、生理食塩水のみで処置した腫瘍担持マウスにはアポトーシス細胞はほとんど存在しない（Ｆ）。腫瘍容積の比較を図４１にグラフで示している。最小の腫瘍容積はＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されたＮＳＣとＡＭＦを施した群で見られ、生理食塩水群に比べた場合の腫瘍容積の違いは１２日目において有意であった。ＮＳＣ−Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を施したが、ＡＭＦを行わなかった腫瘍担持マウスと生理食塩水群の間には有意差は無かった。１２日後、生理食塩水群には腫瘍サイズの増大のために腫瘍浸潤が見られたことから、１２日後には腫瘍容積の測定を行わなかった。
【０２４４】
これらの結果は、ｅｘ  ｖｉｖｏでＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入され、静脈投与された腫瘍指向性幹細胞が、Ａ／Ｃ磁場曝露の後に症状発現前の腫瘍の退縮をもたらし得ることを示す。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の細胞に基づく送達の利点は、他の送達法で見られるような細網内（単核食細胞）系における凝集を回避することであると思われる。
【０２４５】
７．組織学的解析
腫瘍量を評価するために腫瘍重を測定した。組織学的解析のため、腫瘍、肺、肝臓および脾臓を液体窒素中で急速冷凍した。組織をクリオスタット（Ｌｅｉｔｚ  Ｋｒｙｏｓｔａｔ  １７２０,  Ｇｅｒｍａｎｙ）で８〜１０μｍの切片とし、ＩＨＣ研究に用いた。これらの切片に、ペルルスのプルシアンブルー染色キットを用いてプルシアンブルー染色を行い、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されたＮＳＣを確認した。これらの組織切片におけるアポトーシス細胞の検出は、ＤｅａｄＥｎｄ蛍光測定ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ末端標識（ＴＵＮＥＬ）システム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,  Ｍａｄｉｓｏｎ,  ＷＴ）を製造者のプロトコールに従って用いて行った。
【０２４６】
Ａ／Ｃ磁場をかけなければ、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子装入ＮＳＣは腫瘍近傍または腫瘍内に見ることができたであろうが、それらはＡＭＦ曝露を受け実験終了時に評価した腫瘍内には見られなかった。プルシアンブルー陽性材料も腫瘍部位には認めることができなかったが、このことは、ＮＳＣが損傷を受け、装入物を放出し、その後、食細胞によってその部位から除去されたことを示す。Ａ／Ｃ磁場曝露を伴わないＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子装入幹細胞はそれ自体、有意ではないが測定可能な腫瘍抑制効果を備えていた。幹細胞に基づくアプローチのもう１つの利点は、生物腐食および界面活性剤放出からのそれらの効果が、それらが腫瘍に到達するまで送達幹細胞内に隠れて留まるということであった。従って、それらは、他所で引き起こす損傷を最小限にして、腫瘍における温熱療法効果を高めることができる。
【０２４７】
潜在的機構を検討するため、一部のマウスにおいて、最後のＡＭＦ処置から２４時間後に腫瘍を回収した。アポトーシス指数は、３回のＡＭＦの後にＮＳＣ−Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子ＩＶ移植群で増加していたことが分かり、このことは、この標的磁気温熱療法が最後の処置から２４時間後の細胞生存率に測定可能な効果を持っていたことを示す。これは、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が装入されたＮＳＣとその後にＡＭＦを施した群の皮下腫瘍容積が他のいずれの群の腫瘍容積よりも有意に小さくなった時点に相当する。従って、アポトーシスが腫瘍容積の低減に関与する機構であると思われる。
【０２４８】
８．二次元電気泳動（２−ＤＥ）のためのタンパク質調製
二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）解析に用いるために、生理食塩水またはＮＳＣ−Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子＋ＡＭＦを施したマウスから単離した黒色腫から総タンパク質を調製した。以下のプロトコールを従前に記載されているように用いた（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ.  Ａｎａｌ.  Ｃｈｅｍ.  ６８  （５）  ８５０‐５８  （１９９６））。要するに、黒色腫組織を、０．５ｍｌの溶解バッファー（８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％３−コラミドプロピル−ジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ）、１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌおよび０．２％両性電解質（ｐＨ３〜１０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ,  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ,  ＮＪ）の存在下で、Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐｅｓｔｌｅ  Ｍｏｔｏｒ  （ＫＯＮＴＥＳ,  Ｖｉｎｅｌａｎｄ,  ＮＪ）を用いてホモジナイズした。上清を回収した後、２容量の氷冷アセトンを用いて沈殿させた。最終的なタンパク質ペレットを１００μｌのサンプルバッファー（８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌおよび０．２％両性電解質（ｐＨ３〜１０））に溶解した。タンパク質濃度は、還元剤適合かつ界面活性剤適合タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ,  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ,  ＣＡ）を用いて測定した。
【０２４９】
２つのマウス群において差次的に発現される１２のタンパク質を表すゲルスポットを、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を同定するためのＭＡＳＣＯＴ同定検索ソフトウエアを用い、正確に位置決定した。これらのタンパク質スポットを図４２（Ａ）〜（Ｂ）に示している。これらのタンパク質サンプルを一次元目として３〜１０のライナーＩＰＧストリップを用いて特定し、１２％アクリルアミドゲルで電気泳動により分離し、Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ−２５０  （ｃｏｍｐａｎｙ）で染色した。矢印の数字はＭＡＬＤｌ−ＴＯＦ解析によって同定されたタンパク質スポットを意味する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用い、差次的に発現される１２のスポットを含む各タンパク質の同定を試みた。同定されたタンパク質は図４３の表に一覧化されている。ここから分かるように、ホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ−１）およびニューロテンシン受容体１タンパク質は、生理食塩水＋ＡＭＦ対照よりも、ＮＳＣ−Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の静脈投与の後にＡＭＦ処置を行ったマウス由来の腫瘍ではるかに発現が高かった。
【０２５０】
処置群には見られたが生理食塩水群には見られなかった７つのタンパク質スポットのうち（４反復、図４３の表を参照）、抗腫瘍効果を発揮する可能性があると特定された１つの候補タンパク質は、いくつかの腫瘍で過剰発現された際に抗血管新生タンパク質となるホスホグリセロキナーゼ−１（ＰＧＫ−１）である。しかしながら、前立腺癌でのＰＧＫ−１の過剰発現は腫瘍増殖の促進を示した。他方、生理食塩水対照群には存在し、処置群にが存在しなかったタンパク質スポットは５つあった。これらのうち１つは、ＮＦ−κＢを活性化することが知られるＴＮＦ受容体関連因子５（ＴＲＡＦ５）であった。もう１つのビリベルジンレダクターゼＢもＮＦ−κＢ発現を増強する。ＮＦ−κＢは、いくつかの腫瘍で、より浸潤性の高い状態へ遷移させる中枢的な担い手である。ビリベルジンＢは、顕微解剖された肝細胞癌において特異的なタンパク質マーカーとして同定され、メトトレキサート耐性結腸癌細胞で上昇し、腎臓癌で誘導される。従ってこれらの遺伝子のダウンレギュレーションは腫瘍サイズの退縮の要因となり得た可能性がある。予備的なものではあるが、これらの所見は、腫瘍指向性幹細胞によるＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の標的化送達後のＡＭＦによる腫瘍退縮の潜在的機構を解明するためのさらなる検討のバックグラウンドを提供する。
【０２５１】
９．統計分析
統計分析はＷｉｎＳＴＡＴ（Ａ−Ｐｒｏｍｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,  Ｌｅｈｉｇｈ  Ｖａｌｌｅｙ,  ＰＡ）を用いて行った。実験群の平均値を評価して、それらが正規性の仮定を満たすかどうか確認した。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ群間で腫瘍容積および腫瘍重における総合的な差の有意性を評価するために、分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計分析を行った。ｐ値が０．１未満であれば有意とみなした。有意なＡＮＯＶＡの後、多重比較のため、最小有意差（ＬＳＤ）を用いる事後解析を用いた。事後検定の有意性はｐ＜０．０５に設定した。グラフでは、全ての腫瘍容積および腫瘍重データを平均値＋／−標準誤差（ＳＥ）として表す。
【０２５２】
実施例２７
金被覆ナノプラットフォーム
この実施例では、ナノプラットフォームを、金被覆を用いて合成した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ−ナノ粒子を、２０ｍｇのＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を１０ｍＬのＴＨＦに懸濁することにより調製した。３０分間の音波処理後、低速度遠心分離（１５００ＲＰＭ、５分）による沈降により、溶解していない固体（＜１ｍｇ）を分離した。透明な溶液を別の試験管へ移し、その溶液に０．３０ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシルシランを加えた。１０時間の音波処理後、高速遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分間）によりナノ粒子を集めた。再分散およびその後のＴＨＦ（３×５０ｍｌ）への回収の後、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ−ナノ粒子（７．５ｍｇ）を集め、高真空乾燥させ、アルゴン下で保存した。
【０２５３】
アミノシロキサン保護Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／Ａｕ−ナノ粒子を、水性媒体中のＡｕ（ＩＩＩ）（０．５０ｍｇのＨ［ＡｕＣｌ４］）を、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ−ナノ粒子の末端アミノ基に事前吸着させることにより調製した。次いで、ナノ粒子を高速遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分間）により集め、エタノールに再分散させた。次いで、所望のＡｕ−シェルの厚さに応じて、２ｍｇ、４ｍｇまたは８ｍｇのＨ［ＡｕＣｌ４］を加え、続いて、１５分間の音波処理を行った。２０℃で５ｍｇのＮａＢＨ４を加えることにより、Ａｕ（ＩＩＩ）をＡｕ（０）へ還元した。プレシーディング技術により金−シェルが形成された。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子（１４．０ｇ）を遠心分離（１５，０００ＲＰＭ）により沈降させ、水（３×５０ｍｌ）への再分散および回収を３回行い、高真空乾燥させ、アルゴン下で保存した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子のクラスター形成により、それらの流体力学直径はかなり大きかった。典型値は５５０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲であり、１．３〜１．５の範囲の多分散性を有した。界面活性剤（ＳＤＳ、０．０１Ｍ）を添加した場合には、流体力学直径は２００±２０ｎｍに低減した。
【０２５４】
Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ／ステルス−ナノ粒子を、２段階アプローチにより、ドーパミン含有ステルスリガンド（図４４参照）をＡｕ−シェルと結合することにより調製した：Ａ）システインアミドおよびＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子（１０ｍｇ）を、ＴＨＦ中音波処理下で３０分間反応させ、続いて、連続した沈降（１５，０００ＲＰＭ）および再分散の処理を５回行った；Ｂ）次いで、ステルスリガンドを、ＴＨＦ中で十分に確立されているＣＤＩ法を用いて結合し、続いて、連続した沈降（１５，０００ＲＰＭ）および再分散の処理を５回行った。次いで、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ／ステルス−ナノ粒子（７ｍｇ）を高真空乾燥させ、アルゴン下で保存した。ナノ粒子の特性評価を表ＸＩに示す。
【０２５５】
【表１１】
2013503634.tif 000057
【０２５６】
エアレーションしたＰＢＳバッファー中で、上の表ＸＩから５つの異なるナノ粒子（０．５０ｍｇ／ｍｌ）を使用して安定性試験を行った。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ／ステルス−ナノ粒子の測定のため、０．０１ＭのＳＤＳを加えた。それらの結果を図４５に示している。非保護Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４−ナノ粒子は、１６時間以内に完全腐食および鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）の塩／水酸化物への化学変換を示した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルス−ナノ粒子への有機ステルス層の追加により、半減期は４時間（非保護）からおよそ２０時間へと延長された。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ−ナノ粒子上にアミノシロキサン保護層が存在することにより、ナノ粒子の寿命が１桁分、２４０時間へとさらに延長された。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子への第２の保護金層の追加により、約２．５００時間へと第２の増加が起こった。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ／ステルス−ナノ粒子への有機ステルス層の追加によりそれらの溶解度は著しく増加したが、エアレーションしたＰＢＳ中でのそれらの安定性にはほとんど影響を及ぼさなかった。
【０２５７】
プロテアーゼコンセンサス配列を含有するオリゴペプチドを、ミクロ不均一合成アプローチを用いて２５０ｍｇのバッチで合成し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇゲルから出発し、続いて、ピペリジン／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）での脱保護およびＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン）／ＤＭＦ中でＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１  １  ３  ３−テトラメチルウロニウム）を使用する次のＦｍｏｃ保護アミノ酸とのカップリングを行った。さらなるＦｍｏｃ保護アミノ酸の段階的追加により配列を合成した後、それを脱保護し、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を使用してＷａｎｇゲルから分離した。それらの配列（純度＞９９％）を下の表ＸＩＩに要約する。
【０２５８】
【表１２】
2013503634.tif 000058
【０２５９】
それらの配列を、蛍光色素としてのＴＣＰＰと、ステルス被覆に使用された同じドーパミンリガンドリンカーを使用して、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子およびステルス被覆Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子と結合した。各ＴＣＰＰ上のカルボン酸基の３つをメチルエステルとして保護し（カラムクロマトグラフィー後に使用可能）、次いで、ＴＣＰＰをＷａｎｇゲルの末端アミノ酸とアミド結合によって結合した後、そのペプチドを解離させた。ナノ粒子とのカップリングは、本明細書において記載されるように、ＥＤＣ／ＨＯＢＴを使用してエステル結合を形成することにより実施した。ドーパミンリガンドＣ（実施例１）およびＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ−ナノ粒子（ステルス被覆なし）を使用するこの反応スキームを図４４に示している。
【０２６０】
時間分解測定を使用して、癌関連プロテアーゼについての「光スイッチ」を示すことができる。発光結果は、時間相関単光子計数によって得た。これらの研究に使用される装置では、Ｔｉ：サファイアレーザーの第２高調波のおよそ１５ｎＪ、１５ｆｓパルスにより、繰り返し率８０ＭＨＺでサンプルを励起した。励起波長は４００ｎｍで一定とし、励起スポットサイズは約１ｍｍとした。低パルスエネルギーと相対的に大きいスポットサイズとのこの組合せにより、多光子励起が完全に回避されると予想される十分に低い出力密度がもたらされる。検出は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ６μ  ＭＣＰ  ＰＭＴおよび時間相関単光子計数エレクトロニクスを使用して行った。波長選択は、干渉フィルターを使用して行った。機器応答関数は、レーザー散乱を観察することにより決定し、約６０ｐｓ  ＦＷＨＭであった。偏光放射検出は、励起レーザーに対して垂直式の検出スキームで放射偏光子を使用して行った。
【０２６１】
ナノプラットフォームを、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、ＧＡＧＳＲＧＳＡＧＡＧ結合（Ｎ末端およびＣ末端の各々において１つの残基が欠失している配列番号６６）および非メタレート型ＴＣＰＰを使用して調製した。ナノプラットフォームをＰＢＳ（０．１μｇ／ｍｌ）に分散させ、続いて、１０分後にウロキナーゼの添加を行った。遊離ＴＣＰＰの発光寿命（単一指数関数的減衰）は約９ｎｓであった。際立って対照的に、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４結合ＴＣＰＰはナノ粒子のプラズモン消光効果により劇的に短縮された蛍光寿命を示した。金プラズモンの存在がナノ粒子の消光効果を増加させることが見出された。この系の全体的蛍光増強はおよそ７５であった（ウロキナーゼの添加から１０分後）。ＰＢＳ中１×１０−７Ｍウロキナーゼを添加した場合および添加しない場合の蛍光寿命（τ）および全体的減衰への相対寄与（ｆ）を下の表ＸＩＩＩに示す。
【０２６２】
【表１３】
2013503634.tif 000059
観察された寿命延長から、ＴＣＰＰはナノ粒子から部分的に脱着されていることが分かる。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４周囲の金シェルのプラズモンが少し蛍光を発するだけであることには注目すべきである。
【０２６３】
すでに記載したとおり、磁気加熱は、金被覆ナノ粒子を使用して実施した。ＳＡＲ率を３６６Ｈｚおよび１００ｋＨｚで決定して、種々の療法についてのそれらの可能性を判定した。３６６ＨｚのＡ／Ｃ磁気加熱場はより大きな加熱効果をもたらすが、その組織浸透は非常に限られるため、黒色腫および他の表面腫瘍の治療に主として好適である。１００Ｈｚは、深部組織用に確立されている周波数である。それらの結果を下の表ＸＩＶに示す。
【０２６４】
【表１４】
2013503634.tif 000060
【０２６５】
すでに記載した、細胞装入および生存率の研究も、Ａｕ被覆ナノ粒子を使用して実施した。細胞を様々なナノ粒子濃度を有する培地で２４時間インキュベートした。５つの化学的に結合されたＴＣＰＰ単位を特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルス−ナノ粒子をＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞、腫瘍指向性ＮＳＣおよびＭＳ−１上皮細胞に装入した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞および腫瘍指向性ＮＳＣ細胞の９０％を超えるものにナノ粒子が装入された。ＭＳ−１上皮細胞への装入は４倍効率が低かった。同じ数の結合ＴＣＰＰ単位を有するＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ／ステルス−ナノ粒子の取り込みはずっと遅かった（２０倍、装入は非常に非効率であった）。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／Ａｕ／ステルス−ナノ粒子はＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスよりも明らかに大きい（１８ｎｍに対して３０ｎｍ）ため、Ａｕ被覆ナノ粒子は、細胞標的部分としてポルフィリンを使用する場合、受容体により媒介される細胞取込みに利用可能な細孔サイズを超えたかもしれない。プルシアンブルー染色後、ＭＮＰは３種の細胞種全てにおいて青色に染色まる材料として検出された。２５μｇ／ｍｌ  Ｆｅ濃度でインキュベートした細胞で最も効率の良い装入が見られた。装入効率を図４６に示している。
【０２６６】
実施例２８
ナノプラットフォームオリゴマー
この実施例では、複数のナノ粒子を、プロテアーゼコンセンサス配列および各粒子間のリガンド結合を使用して同時に連結して、ナノプラットフォームオリゴマー（クラスター）を形成した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ／ステルス−ナノ粒子、ＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡ（Ｎ末端において１つの残基およびＣ末端において２つの残基を欠失している配列番号６６）オリゴペプチド配列およびドーパミン結合を使用したオリゴマーを図４９に示している。そのようなクラスターは、ナノ粒子１個〜２０個の間の任意のサイズを有してよく、本明細書において開示したコンセンサス配列のいずれかを含めることができた。そのようなクラスターには、最大４つの切断配列（例えば、ｕＰＡ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびカテプシンＤ）も使用することができた。ＭＲＩ測定は、記載のとおり、ＮＭＲ管にて（４００ＭＨｚ、Varian）、９０ｍｏｌ％のＨ２Ｏ、１０ｍｏｌ％のＤ２Ｏ）、アッセイ（被分析物）濃度（ウロキナーゼの場合）５μｇ／ｍｌの１ｍＬおよびＴ＝２９８Ｋを使用して実施した。測定前に、Ｈ２ＯのＴ１時間は３．００４秒であり、Ｔ２時間は０．０７５７９秒であった。次に、１ｍｌ当たり１×１０−１４ｍｏｌウロキナーゼを１ｍｌのＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９０／１０）に加えた。１０分後、Ｔ１は２．００３秒に減少し、Ｔ２は０．１３３４秒増加した。
【０２６７】
実施例２９
単球／マクロファージ送達
マウス腫瘍指向性単球／マクロファージ株（ＲＡＷ２６４．７  Ｍｏ／Ｍａ細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ,  Ｍａｎａｓｓａｓ,  Ｖ  Ａ）に、ビオチンタグ付きＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ＡＳＯＸ−ＴＣＰＰナノプラットフォームを装入して、癌性組織への送達についてのそれらの細胞の可能性を評価した。単球は、将来のヒト臨床試験のために容易に大量に得ることができる自己細胞であるため、この能力においてとりわけ魅力的である。それらはそれぞれの培養培地で培養される。
【０２６８】
ｓｉＲＮＡ結合磁性ナノ粒子およびＳＮ３８結合磁性ナノ粒子の取込みは、フェロジン分光光度定量法（Ｒｉｅｍｅｒ,  ｅｔ  ａｌ.  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ.,  Ａｎａｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.  ２００４,  ３３１,  ３７０‐５）を使用しておよびプルシアンブルー染色（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆｅ３Ｏ４  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ.,  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９,  ９,  ２８６６‐２８７１）により鉄含量について分析されている。単球／マクロファージまたは癌細胞には十分な磁性ナノ粒子を加え、一晩で培地中１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌ  Ｆｅ濃度に達した。インキュベーション後、ＰＢＳでの複数回の洗浄により過剰分を除去した。次いで、生細胞数を評価する、ＭＴＳアッセイであるＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ.,  Ｍａｄｉｓｏｎ,  ＷＴ）を使用して、細胞傷害効果について細胞を評価した。装入された単球／マクロファージをＰＡＮ  ０２細胞（１：１０比および１：５比）とともに、狭い組織培養用の「平らな管」、１０ｃｍ２表面積、で一晩プレート培養し、続いて、培地での洗浄を３回行った。これらの管は、交番磁場を作り出すために使用される誘導コイル内に楽に収めることができる。それらの管は、ＲＦコイル（１インチ直径、４回）の中央に置き、１０ｋＡ／ｍ、１００ｋＨｚ、正弦波パターンで、３０分間処理した。細胞生存率実験は処理の２４時間後および４８時間後に実施した。全ての条件を３反復で行い、２回繰り返した。ＭＴＳアッセイに加え、ＨＣＳ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ.,  Ｃａｒｌｓｂａｄ,  ＣＡ）を使用して、ミトコンドリア脱分極および細胞生存率を定量的に評価した。また、酸化的ストレスもＴｈｉｏｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ色素系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して還元グルタチオンの減少を検出することにより測定した。一部のウェルをトリプシン処理し、洗浄し、再プレート培養して、再付着し増殖する細胞の能力を評価した。図５０は、４時間後にナノ粒子が装入された単球／マクロファージを示している。装入された細胞は、結合しているポルフィリンにより青く見える。
【０２６９】
実施例３０
ＭＲＩ撮像法
この実施例では、Ｂ１６Ｆ１０転移性肺黒色腫を注入したＣ５７／ＢＬ６マウスにおいて、ナノプラットフォームをＭＲＩ造影剤として使用した。Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスナノプラットフォームをＮＳＣに装入し、それらをマウスに注射し、オクラホマイメージングセンターＭＲＩ施設で５００ＭＨｚ  ＮＭＲを使用してＴ１強調画像を収集した。ナノ粒子を含有する組織は画像がより明るく見える（矢印で示す）。それらの画像を図５１に示している：（Ａ）マウス断面、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスナノ粒子の筋肉内注射（５０マイクログラム）；（Ｂ）ナノ粒子の幹細胞送達後の肺黒色腫結節；（Ｃ）追加の肺黒色腫結節；および（Ｄ）幹細胞送達後の肝臓および腎臓中のナノ粒子。
【０２７０】
実施例３１
光スイッチ撮像法
この実施例では、組織切除に対するこの方法の有用性を示すために、ナノプラットフォームを使用して癌性組織を撮像した。転移性４Ｔ１（浸潤性乳癌モデル）癌を注入した雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをこれらの研究に使用した。撮像の１８日前に３個体のマウス全てに、それらの乳房脂肪体内に注入した。Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａイメージングシステムを用いて測定を行った。測定前と測定中にイソフルレンを用いてマウスに麻酔をかけた。ナノ粒子１個当たり３０＋／−５シアニン３．０色素を特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスナノ粒子（ｄ＝１６ｎｍ、Ｆｅコア  ｄ＝１０ｎｍ）を撮像用ナノプラットフォームとして使用した。オリゴペプチド結合に使用したｕＰＡ切断配列はＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡ（Ｎ末端において１つの残基およびＣ末端において２つの残基が欠失している配列番号６６）であった。シアニン色素は非常に疎水性であり（ｌｏｇ（オクタノール／水分配係数：６．０５））（Ｎ１：−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ、Ｎ２：−Ｃ８Ｆ１７）、そのため、その色素は切断位置に沈着した。１個体のマウスを対照とした。２個体目のマウスには、２００μｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇのナノプラットフォーム（Ｆｅ総量３．１ｍｇ）を与え、腫瘍部位内に直接注射した。３個体目のマウスには、２００μｌのＰＢＳに溶解した１ｍｇのナノプラットフォーム（Ｆｅ総量０．６２ｍｇ）を与え、腫瘍部位内に直接注射した。注射の１時間後に画像を撮影し、それらを図５２に示している（左：対照、中央：５ｍｇのナノプラットフォーム、右：１ｍｇのナノプラットフォーム）。励起は、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのＩＶＩＳ  ３Ｄ分子イメージングシステムを使用して５３５ｎｍで行った。発光は５６５ｎｍ（蛍光極大）で生じた。原発癌の部位周囲のハロは、癌細胞による組織浸潤を示している。それらの結果より、シアニンは、切断されて癌部位に沈着した状態であり、リンパ排出されにくいことが示される。
【０２７１】
同じ切断配列を介して結合された、ナノ粒子１個当たり３０＋／−５ＴＣＰＰ色素を特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスナノ粒子（ｄ＝１６ｎｍ、Ｆｅコア  ｄ＝１０ｎｍ）を撮像用ナノプラットフォームとして使用して、上に実験を繰り返した。蛍光色素としてローダミンＢを使用して別のナノプラットフォームを調製した。１個体のマウスを対照とし、注射は行わなかった。２個体目のマウスには、２００μｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇのＴＣＰＰナノプラットフォーム（Ｆｅ総量３．１ｍｇ）を与え、腫瘍部位内に直接注射した。３個体目のマウスには、２００μｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇのローダミンＢナノプラットフォーム（Ｆｅ総量３．１ｍｇ）を与え、腫瘍部位内に直接注射した。注射の２時間後に画像を撮影した。励起は４８０ｎｍで行い、ＴＣＰＰおよびローダミンＢ両方の蛍光は６００〜７５０ｎｍの間の統合間隔で生じた。ＴＣＰＰおよびローダミンＢマウスの画像を図５３に示している。図５３から分かるように、ＴＣＰＰは、（シアニンより）疎水性が高いことまたはリンパ排液経路より癌から出ていく親水性タンパク質と結合することのいずれかを理由に、リンパ排液経路を通って輸送される。同じ排出がローダミンＢでも見られた。図５４は、対照を含む同じマウスの画像を示しており、ナノプラットフォームの注射の２４時間後に撮影したものである。色素はリンパ系から除去されているが、転移性腫瘍には残っている。これらの画像を手がかりにして、外科医または腫瘍学者ならば、健常組織を可能な限り多く保存しながら、腫瘍を摘出することができるであろう。
【図１】
2013503634.tif 000069
【図２】
2013503634.tif 000070
【図３】
2013503634.tif 000071
【図４】
2013503634.tif 000072
【図５】
2013503634.tif 000073
【図６】
2013503634.tif 000074
【図７】
2013503634.tif 000075
【図８】
2013503634.tif 000076
【図９】
2013503634.tif 000077
【図１０】
2013503634.tif 000078
【図１１】
2013503634.tif 000079
【図１２】
2013503634.tif 000080
【図１３】
2013503634.tif 000081
【図１４】
2013503634.tif 000082
【図１５】
2013503634.tif 000083
【図１６】
2013503634.tif 000084
【図１７】
2013503634.tif 000085
【図１８】
2013503634.tif 000086
【図１９】
2013503634.tif 000087
【図２０】
2013503634.tif 000088
【図２１】
2013503634.tif 000089
【図２２】
2013503634.tif 000090
【図２３】
2013503634.tif 000091
【図２４】
2013503634.tif 000092
【図２５】
2013503634.tif 000093
【図２６】
2013503634.tif 000094
【図２７】
2013503634.tif 000095
【図２８】
2013503634.tif 000096
【図２９】
2013503634.tif 000097
【図３０】
2013503634.tif 000098
【図３１】
2013503634.tif 000099
【図３２】
2013503634.tif 000100
【図３３】
2013503634.tif 000101
【図３６】
2013503634.tif 000102
【図３８】
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【図３９】
2013503634.tif 000104
【図４０】
2013503634.tif 000105
【図４１】
2013503634.tif 000106
【図４２Ａ】
2013503634.tif 000107
【図４２Ｂ】
2013503634.tif 000108
【図４３】
2013503634.tif 000109
【図４４】
2013503634.tif 000110
【図４５】
2013503634.tif 000111
【図４６】
2013503634.tif 000112
【図５０】
2013503634.tif 000113
【図５１】
2013503634.tif 000114
【図５２】
2013503634.tif 000115
【図５３】
2013503634.tif 000116
【図５４】
2013503634.tif 000117
【図５５】
2013503634.tif 000118
【図３４】
2013503634.tif 000119
【図３５】
2013503634.tif 000120
【図３７】
2013503634.tif 000121
【図４７】
2013503634.tif 000122
【図４８】
2013503634.tif 000123
【図４９】
2013503634.tif 000124
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月16日(2012.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のナノ粒子および保護層を含む第１のナノプラットフォームと；
第２のナノ粒子および保護層を含む第２のナノプラットフォームと；
プロテアーゼコンセンサス配列を含む、該第１のナノプラットフォームと該第２のナノプラットフォームとの間のオリゴペプチド結合と
を備えた、プロテアーゼ活性を検出するためのナノプラットフォームアセンブリーであって、
該第１のナノプラットフォームまたは該第２のナノプラットフォームの少なくとも１つが、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む、ナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項２】
前記第１のナノ粒子および前記第２のナノ粒子が、それぞれ、コア/シェル型ナノ粒子である、請求項１に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項３】
各コアが、それぞれ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択される、請求項２に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項４】
前記コアが強常磁性Ｆｅコアである、請求項３に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項５】
各シェルが、それぞれ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項６】
前記シェルが酸化鉄を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項７】
前記第１のナノ粒子および前記第２のナノ粒子の、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ多点法による比表面積が少なくとも約２０ｍ２／ｇである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項８】
前記保護層が、それぞれ、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項９】
前記プロテアーゼコンセンサス配列が、ＳＧＲＳＡ（配列番号２）、ＶＰＭＳＭＲＧＧ（配列番号３）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号４）、ＲＰＦＳＭＩＭＧ（配列番号５）、ＶＰＬＳＬＴＭＧ（配列番号６）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号７）、ＩＰＥＳＬＲＡＧ（配列番号８）、ＳＧＳＰＡＦＬＡＫＮＲ（配列番号９）、ＤＡＦＫ（配列番号１０）、ＳＧＫＰＩＬＦＦＲＬ（配列番号１１）、ＳＧＫＰＩＩＦＦＲＬ（配列番号１２）、ＧＰＬＧＭＬＳＱ（配列番号１３）、ＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号２５）、ＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号２６）、ＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号２７）、ＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号２８）、ＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号２９）、ＧＡＡＮＬＶＲＧ（配列番号７４）およびＰＲＡＧＡ（配列番号７５）からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーと薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む、組成物。
【請求項１１】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を位置づけること；
（ｃ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｄ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得することを含む、方法。
【請求項１２】
前記ＭＲ画像データがＴ２強調画像であり、前記取得済Ｔ２値における変化を経時的に検出することをさらに含み、該変化がプロテアーゼ活性に対応している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法であって、
（ａ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＳＧＲＳＡ（配列番号２）である請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を位置づけること；
（ｃ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｄ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含む第１のＭＲ画像データを取得することを含む、方法。
【請求項１４】
前記第１のＭＲ画像データがプロテアーゼ活性を示し、
（ｅ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＶＰＬＳＬＴＭＧ（配列番号６）である請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｆ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を位置づけること；
（ｇ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｈ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含む第２のＭＲ画像データを取得することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のＭＲ画像がプロテアーゼ活性を示し、該活性が血管新生または転移の予後と相互に関連づけられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＶＰＭＳＭＲＧＧ（配列番号３）である請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｊ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を位置づけること；
（ｋ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（１）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含む第３のＭＲ画像データを取得することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１のナノ粒子と、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、金被覆層、およびそれらの組合せからなる群から選択される、該ナノ粒子周囲の保護層とを含む、ナノプラットフォーム。
【請求項１８】
ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む、請求項１７に記載のナノプラットフォーム。
【請求項１９】
前記保護層がシロキサンナノ層を含み、該シロキサンナノ層の周囲にリガンド単分子層をさらに含む、請求項１７または１８に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２０】
前記リガンド単分子層の周囲に金被覆層をさらに含む、請求項１９に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２１】
前記ナノ粒子がコア/シェル型ナノ粒子であり、該コアが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択され、該シェルが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２２】
前記コアが強常磁性Ｆｅコアである、請求項２１に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２３】
発色団／発光団、量子ドット、ビオロゲン、およびそれらの組合せからなる群から選択される粒子と、プロテアーゼコンセンサス配列を含むオリゴペプチド結合によって結合される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２４】
他のナノプラットフォームと連結されていない、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
【請求項２５】
請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のナノプラットフォームと、薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む、組成物。
【請求項２６】
哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ａ）請求項２５に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を位置づけること；および
（ｃ）磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して前記ナノプラットフォームを加熱すること
を含み、その結果、該関係部位の組織が少なくとも約４０℃の温度に加熱され、ここで、該加熱（ｃ）が該癌性細胞または該前癌性細胞のアポトーシスをもたらす、方法。
【請求項２７】
鉄コアを有するコア/シェル型ナノ粒子を含み、Ｔ１増強ではｒ１が約１００ｍＭ−１ｓ−１より大きく、Ｔ２減衰ではｒ２が約−２，０００ｍＭ−１ｓ−１より大きい整数である、ＭＲＩ造影剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
同じ切断配列を介して結合された、ナノ粒子１個当たり３０＋／−５ＴＣＰＰ色素を特徴とするＦｅ／Ｆｅ３Ｏ４／ステルスナノ粒子（ｄ＝１６ｎｍ、Ｆｅコア  ｄ＝１０ｎｍ）を撮像用ナノプラットフォームとして使用して、上に実験を繰り返した。蛍光色素としてローダミンＢを使用して別のナノプラットフォームを調製した。１個体のマウスを対照とし、注射は行わなかった。２個体目のマウスには、２００μｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇのＴＣＰＰナノプラットフォーム（Ｆｅ総量３．１ｍｇ）を与え、腫瘍部位内に直接注射した。３個体目のマウスには、２００μｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇのローダミンＢナノプラットフォーム（Ｆｅ総量３．１ｍｇ）を与え、腫瘍部位内に直接注射した。注射の２時間後に画像を撮影した。励起は４８０ｎｍで行い、ＴＣＰＰおよびローダミンＢ両方の蛍光は６００〜７５０ｎｍの間の統合間隔で生じた。ＴＣＰＰおよびローダミンＢマウスの画像を図５３に示している。図５３から分かるように、ＴＣＰＰは、（シアニンより）疎水性が高いことまたはリンパ排液経路より癌から出ていく親水性タンパク質と結合することのいずれかを理由に、リンパ排液経路を通って輸送される。同じ排出がローダミンＢでも見られた。図５４は、対照を含む同じマウスの画像を示しており、ナノプラットフォームの注射の２４時間後に撮影したものである。色素はリンパ系から除去されているが、転移性腫瘍には残っている。これらの画像を手がかりにして、外科医または腫瘍学者ならば、健常組織を可能な限り多く保存しながら、腫瘍を摘出することができるであろう。
本発明の具体的態様を以下に記載する。
（１）第１のナノ粒子および保護層を含む第１のナノプラットフォームと；
第２のナノ粒子および保護層を含む第２のナノプラットフォームと；
プロテアーゼコンセンサス配列を含む、該第１のナノプラットフォームと該第２のナノプラットフォームとの間のオリゴペプチド結合とを備えた、プロテアーゼ活性を検出するためのナノプラットフォームアセンブリーであって、
該第１のナノプラットフォームまたは該第２のナノプラットフォームの少なくとも１つが、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む、ナノプラットフォームアセンブリー。
（２）前記第１のナノ粒子および前記第２のナノ粒子が、それぞれ、コア/シェル型ナノ粒子である、（１）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（３）各コアが、それぞれ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択される、（２）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（４）前記コアが強常磁性Ｆｅコアである、（３）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（５）各シェルが、それぞれ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、（２）〜（４）のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（６）前記シェルが酸化鉄を含む、（２）〜（４）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（７）前記第１のナノ粒子および前記第２のナノ粒子の、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ多点法による比表面積が少なくとも約２０ｍ２／ｇである、（１）〜（６）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（８）前記保護層が、それぞれ、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、およびそれらの組合せからなる群から選択される、（１）〜（７）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（９）前記保護層の少なくとも１つがシロキサンナノ層である、（８）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１０）前記シロキサンナノ層がアミノ官能性シロキサン層である、（８）〜（９）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１１）前記シロキサンナノ層の周囲にリガンド単分子層をさらに含む、（９）〜（１０）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１２）前記保護層の少なくとも１つがリガンド単分子層である、（８）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１３）前記リガンド単分子層が、チオール、アルコール、ニトロ化合物、ホスフィン、ホスフィンオキシド、レソルシナレン、セレン化物、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、二硫化物、過酸化物、アミン、ニトリル、イソニトリル、チオニトリル、オキシニトリル、オキシシラン、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物およびセレン部分からなる群から選択される少なくとも１種のメンバーを含む、（１１）〜（１２）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１４）前記官能基が前記保護層に直接結合される、（１）〜（１３）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１５）前記リガンド単分子層が、以下からなる群から選択されるリガンドを含む、（１４）に記載のナノプラットフォームアセンブリー
【化１】
2013503634.tif 000125
、
【化２】
2013503634.tif 000126
、
【化３】
2013503634.tif 000127
およびそれらの組合せ
［式中、
ｎ＝２〜２５；
各Ｒ１は、保護ヒドロキシル基および非保護ヒドロキシル基からなる群から選択され；  各Ｒ２は、それぞれ、−ＯＨ、
【化４】
2013503634.tif 000128
【化５】
2013503634.tif 000129
【化６】
2013503634.tif 000130
、
【化７】
2013503634.tif 000131
、
および
【化８】
2013503634.tif 000132
（式中、
*は、Ｒ２が該リガンドと結合する原子であることを示し；
各Ｒ３は、それぞれ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ４）２、−Ｎ（Ｒ４）３＋、−ＮＨＲ４、−ＮＨ−ＣＯ−ＡＡ、および−ＣＯ−ＮＨ−ＡＡ（式中、各Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基からなる群から選択され、ＡＡは任意のアミノ酸である）からなる群から選択され；
Ｍは、Ｚｎ２＋、Ｐｄ２＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、Ｐｔ２＋、Ｎｉ２＋、Ｅｕ３＋およびＧｄ３＋からなる群から選択される）
からなる群から選択される］。
（１６）前記官能基が、プロテアーゼコンセンサス配列を介して前記保護層に結合される、（１）〜（１３）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１７）前記第１のナノ粒子と前記第２のナノ粒子との間の前記オリゴペプチド結合が前記官能基をさらに含む、（１６）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１８）前記官能基がポルフィリンである、（１７）に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（１９）前記ポルフィリンが、テトラカルボキシルフェニルポルフィリンおよびテトラヒドロキシフェニルポルフィリンからなる群から選択される、（１８）に記載のナノプラットフォーム。
（２０）前記プロテアーゼコンセンサス配列が、ＳＧＲＳＡ（配列番号２）、ＶＰＭＳＭＲＧＧ（配列番号３）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号４）、ＲＰＦＳＭＩＭＧ（配列番号５）、ＶＰＬＳＬＴＭＧ（配列番号６）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号７）、ＩＰＥＳＬＲＡＧ（配列番号８）、ＳＧＳＰＡＦＬＡＫＮＲ（配列番号９）、ＤＡＦＫ（配列番号１０）、ＳＧＫＰＩＬＦＦＲＬ（配列番号１１）、ＳＧＫＰＩＩＦＦＲＬ（配列番号１２）、ＧＰＬＧＭＬＳＱ（配列番号１３）、ＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号２５）、ＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号２６）、ＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号２７）、ＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号２８）、ＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号２９）、ＧＡＡＮＬＶＲＧ（配列番号７４）およびＰＲＡＧＡ（配列番号７５）からなる群から選択される、（１）〜（１９）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（２１）前記結合が、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号１８）、ＫＧＧＶＰＭＳＭＲＧＧＧＣ（配列番号３０）、ＫＧＧＩＰＶＳＬＲＳＧＧＣ（配列番号３１）、ＫＧＧＶＰＬＳＬＴＭＧＧＣ（配列番号３２）、ＫＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号３３）、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＣ（配列番号３４）、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号３５）、ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＫ（配列番号３６）、ＫＧＧＳＧＲＳＡＧＧＤ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧ（配列番号６４）、ＤＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＤ（配列番号６５）、ＤＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡＧＤ（配列番号６６）およびＮ末端において１つの残基およびＣ末端において１つまたは２つの残基が欠失していてよいそれらの変異体、ＫＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧ（配列番号６７）、ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ（配列番号６８）、ＨＨＨＧＡＧＩＰＶＳＬＲＳＧＡＧ（配列番号７７）、ＨＨＨＧＡＧＲＰＦＳＭＩＭＧＡＧ（配列番号７８）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳＬＴＭＧＡＧ（配列番号７９）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳＬＹＳＧＡＧ（配列番号８０）、ＨＨＨＧＡＧＧＡＡＮＬＶＲＧＧＡＧ（配列番号８１）、ＨＨＨＧＡＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶＧＡＧ（配列番号８２）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＲＳＡＧＡＧ（配列番号８３）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮＧＡＧ（配列番号８４）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮＧＡＧ（配列番号８５）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＧＡＧ（配列番号８６）、ＨＨＨＧＡＧＰＲＡＧＡＧ（配列番号８７）、ならびにＮ末端において１つ、２つまたは３つの残基が欠失していてよい、配列番号７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６および８７の変異体からなる群から選択される、（１）〜（１９）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（２２）連結されたナノプラットフォーム間の距離が約５ｎｍ〜約７０ｎｍである、（１）〜（２１）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリー。
（２３）上記（１）〜（２２）のいずれか一に記載のアセンブリーと、薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む、組成物。
（２４）前記薬学上許容される担体が、水性バッファー、リポソームおよび腫瘍指向性細胞からなる群から選択される、（２３）に記載の組成物。
（２５）前記薬学上許容される担体が水性バッファーであり、バッファー１ｍｌ当たり約１００μｇ〜約５，０００μｇの前記ナノプラットフォームアセンブリーを含む、（２３）〜（２４）のいずれか一に記載の組成物。
（２６）前記腫瘍指向性細胞が、幹細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される、（２４）に記載の組成物。
（２７）前記幹細胞が、神経幹細胞、臍帯マトリックス幹細胞、骨髄幹細胞および脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される、（２６）に記載の組成物。
（２８）哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するための方法であって、
（ａ）上記（１）〜（２２）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）と、哺乳類の体液サンプルを接触させること；
（ｂ）該アッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；および
（ｃ）該アッセイ（被分析物）の光減衰における変化を検出すること
を含み、該変化が該プロテアーゼ活性に対応している、方法。
（２９）前記エネルギー源が、多色光源、レーザーおよびレーザーダイオードからなる群から選択される、（２８）に記載の方法。
（３０）前記変化がＵＶ／Ｖｉｓ分光計によって自動的に検出される、（２８）〜（２９）のいずれか一に記載の方法。
（３１）前記体液サンプルが、尿および血液からなる群から選択される、（２８）〜（３０）のいずれか一に記載の方法。
（３２）前記光減衰における約０．００１〜約１の変化が、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、（２８）〜（３１）のいずれか一に記載の方法。
（３３）前記サンプル中の前記アッセイ（被分析物）の濃度が、サンプル１ｍｌ当たり約１０μｇ〜約１，０００μｌのナノプラットフォームである、（２８）〜（３１）のいずれか一に記載の方法。
（３４）前記アッセイ（被分析物）の光減衰における前記変化が、約３０秒〜約２４時間の期間にわたって観察される、（２８）〜（３３）のいずれか一に記載の方法。
（３５）前記アッセイ（被分析物）の光減衰における前記変化が、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼの活性を示す、（２８）〜（３４）のいずれか一項に記載の方法。
（３６）前記プロテアーゼ活性を癌の進行の予後と相互に関連づけることをさらに含む、（３５）に記載の方法。
（３７）ｕＰＡおよびＭＭＰ−７の両方の活性、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性の欠如の検出が、血管新生の予後と相互に関連づけられる、（３６）に記載の方法。
（３８）ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９の全ての活性の検出が、細胞浸潤の予後と相互に関連づけられる、（３６）に記載の方法。
（３９）哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するための方法であって、
（ａ）上記（２３）〜（２７）のいずれか一に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｃ）該部位をエネルギー源に曝すこと；および
（ｄ）そのアッセイ（被分析物）の後方散乱スペクトルを検出すること
を含む、方法。
（４０）前記投与（ａ）が、癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の前記部位に直接前記組成物を注射することを含む、（３９）に記載の方法。
（４１）前記投与（ａ）が、前記哺乳類の血流に前記組成物を注射することを含む、（４０）に記載の方法。
（４２）前記エネルギー源が、多色光源、レーザーおよびレーザーダイオードからなる群から選択される、（３９）〜（４１）のいずれか一に記載の方法。
（４３）前記後方散乱スペクトルのシグナルが、癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の前記関係部位において周辺部位よりも強い、（３９）〜（４２）のいずれか一に記載の方法。
（４４）前記シグナルが、癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の前記関係部位において周辺部位よりも約２〜約１００倍強い、（４３）に記載の方法。
（４５）前記後方散乱スペクトルシグナルの消失を約３０秒〜約２４時間の期間にわたって検出することをさらに含む、（３９）〜（４４）のいずれか一に記載の方法。
（４６）前記後方散乱スペクトルの消失が前記アッセイ（被分析物）の光減衰における変化として検出され、該変化が前記プロテアーゼ活性を示す、（４５）に記載の方法。
（４７）前記光減衰における約０．０５〜約１の変化が、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、（４６）に記載の方法。
（４８）前記プロテアーゼ活性を癌の進行の予後と相互に関連づけることをさらに含む、（３９）〜（４７）のいずれか一に記載の方法。
（４９）前記部位への前記アッセイ（被分析物）の局在後１０分以内に検出されたプロテアーゼ活性が、前記癌性細胞または前記前癌性細胞が浸潤性である確率が高いことと相互に関連づけられる、（３９）〜（４８）のいずれか一項に記載の方法。
（５０）前記アッセイ（被分析物）の局在後最初の３０分以内でのプロテアーゼ活性の不検出が、前記癌性細胞または前記前癌性細胞が浸潤性である確率が非常に低いことと相互に関連づけられる、（３９）〜（４８）のいずれか一に記載の方法。
（５１）前記後方散乱スペクトルシグナルの消失が、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼの活性を示す、（４５）〜（４８）のいずれか一に記載の方法。
（５２）ｕＰＡおよびＭＭＰ−７の両方の活性の検出、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性の欠如が、血管新生の予後と相互に関連づけられる、（５１）に記載の方法。
（５３）ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９の全ての活性の検出が、細胞浸潤の予後と相互に関連づけられる、（５１）に記載の方法。
（５４）前記プロテアーゼ活性が、ＫＧＧＶＰＭＳ（配列番号４３）、ＭＲＧＧＧＣ（配列番号４４）、ＫＧＧＩＰＶＳ（配列番号４５）、ＬＲＳＧＧＣ（配列番号４６）、ＫＧＧＶＰＬＳ（配列番号４７）、ＬＴＭＧＧＣ（配列番号４８）、ＫＧＧＧＳＧＲ（配列番号４９）、ＳＡＧＧＧＣ（配列番号５０）、ＣＧＧＧＳＧＲ（配列番号５１）、ＳＡＧＧＣ（配列番号５２）、ＤＧＧＳＧＲ（配列番号５３）、ＳＡＧＧＫ（配列番号５４）、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲ（配列番号５５）、ＫＧＧＳＧＲ（配列番号５６）、ＳＡＧＧＤ（配列番号５７）、ＳＡＧＧＧ（配列番号６９）、ＤＧＧＧＳＧＲ（配列番号７０）、ＳＡＧＧＧＤ（配列番号７１）、ＤＧＡＧＳＧＲ（配列番号７２）およびＮ末端において１つの残基が欠失していてよいそれらの変異体、ＳＡＧＡＧＤ（配列番号７３  およびＣ末端において１つの残基が欠失していてよいそれらの変異体、ＨＨＨＧＡＧＶＰＭＳ（配列番号８８）、ＭＲＧＡＧ（配列番号８９）、ＨＨＨＧＡＧＩＰＶＳ（配列番号９０）、ＬＲＳＧＡＧ（配列番号９１）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＲ（配列番号９２）、ＨＨＨＧＡＧＲＰＦＳ（配列番号９３）、ＭＩＭＧＡＧ（配列番号９４）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳ（配列番号９５）、ＬＴＭＧＡＧ（配列番号９６）、ＨＨＨＧＡＧＶＰＬＳ（配列番号９７）、ＬＹＳＧＡＧ（配列番号９８）、ＨＨＨＧＡＧＧＡＡＮ（配列番号９９）、ＬＶＲＧＧＡＧ（配列番号１００）、ＨＨＨＧＡＧＰＱＧＬＡ（配列番号１０１）、ＧＱＲＧＩＶＧＡＧ（配列番号１０２）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＫＳＲ（配列番号１０３）、ＭＶＰＮＦＮＧＡＧ（配列番号１０４）、ＨＨＨＧＡＧＳＬＬＩＦＲ（配列番号１０５）、ＳＷＡＮＦＮＧＡＧ（配列番号１０６）、ＨＨＨＧＡＧＳＧＶＶＩＡ（配列番号１０７）、ＴＶＩＶＩＴＧＡＧ（配列番号１０８）、ＨＨＨＧＡＧＰＲ（配列番号１０９）、ＡＧＡＧ（配列番号１１０）、ならびにＮ末端において１つ、２つまたは３つの残基が欠失していてよい、配列番号８８、９０、９２、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９の変異体からなる群から選択される２つ以上のオリゴペプチド配列をもたらす、（３９）に記載の方法。
（５５）哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法であって、
（ａ）上記（２３）〜（２７）のいずれか一に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｃ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｄ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得することを含む、方法。
（５６）前記ＭＲ画像データがコンピュータによって自動的に取得される、（５５）に記載のＭＲＩ撮像方法。
（５７）前記取得済ＭＲ画像データから画像を自動的に作成することをさらに含む、（５５）〜（５６）のいずれか一に記載の方法。
（５８）前記送信（ｃ）および前記取得（ｄ）を少なくとも約２日の期間にわたって繰り返すことをさらに含む、（５５）〜（５７）のいずれか一に記載の方法。
（５９）前記高周波パルスがＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌスピンエコー法のパルスシーケンス（ａ  Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ  ｓｐｉｎ−ｅｃｈｏ  ｐｕｌｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む、（５５）〜（５８）のいずれか一に記載の方法。
（６０）前記ＭＲ画像データがＴ２強調画像である、（５９）に記載の方法。
（６１）前記取得済Ｔ２値における変化を経時的に検出することをさらに含み、該変化がプロテアーゼ活性に対応している、（５８）〜（６０）のいずれか一に記載の方法。
（６２）前記Ｔ２値における約５倍〜約１０倍の変化が、癌の発生と相互に関連づけられる、（６１）に記載の方法。
（６３）前記Ｔ２値における約１０倍を超える変化が、転移性癌と相互に関連づけられる、（６１）に記載の方法。
（６４）前記Ｔ１値が経時的に実質的に変化しない、（５８）〜（６３）のいずれか一に記載の方法。
（６５）前記投与（ａ）から約１５分〜約２４時間後に前記取得（ｄ）が開始される、（５５）〜（６４）のいずれか一に記載の方法。
（６６）前記関係部位における前記ナノプラットフォームアセンブリーの濃度が、約１μｇ／ｇ組織〜約１，０００μｇ／ｇ組織である、（５５）〜（６５）のいずれか一に記載の方法。
（６７）哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞に関連しているプロテアーゼの活性を検出するためのＭＲＩ撮像方法であって、
（ａ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＳＧＲＳＡ（配列番号２）である（１）〜（（２２）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｃ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｄ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得することを含む、方法。
（６８）前記ＭＲ画像データがプロテアーゼ活性を示し、
（ｅ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＶＰＬＳＬＴＭＧ（配列番号６）である（１）〜（２２）のいずれか一に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｆ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｇ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（ｈ）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得すること：をさらに含む、（６７）に記載の方法。
（６９）前記ＭＲ画像がプロテアーゼ活性を示し、該活性が血管新生または転移の予後と相互に関連づけられる、（６８）に記載の方法。
（７０）（ｉ）前記プロテアーゼコンセンサス配列がＶＰＭＳＭＲＧＧ（配列番号３）である（１）〜（２２）のいずれか一項に記載のナノプラットフォームアセンブリーを含む診断アッセイ（被分析物）を含む組成物を哺乳類に投与すること；
（ｊ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に該アッセイ（被分析物）を局在させること；
（ｋ）該関係部位に高周波パルスを送信すること；および
（１）該関係部位についての、Ｔ１値およびＴ２値を含むＭＲ画像データを取得することをさらに含む、（６９）に記載の方法。
（７１）プロテアーゼ活性が前記ＭＲ画像データによって示されず、前記ＭＲ画像データが血管新生の予後と相互に関連づけられる、（７０）に記載の方法。
（７２）前記ＭＲ画像データがプロテアーゼ活性を示し、該プロテアーゼ活性が転移の予後と相互に関連づけられる、（７０）に記載の方法。
（７３）前記癌性細胞または前記前癌性細胞が、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、小児脳幹グリオーマ、成人脳腫瘍、小児悪性グリオーマ、小児上衣細胞腫、小児髄芽細胞腫、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児視経路および視床下部グリオーマ、乳癌、妊娠関連乳癌、小児乳癌、男性乳癌、小児カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、小児結腸直腸癌、食道癌、小児食道癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、成人グリオーマ、成人（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝細胞癌、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、小児腎臓癌、成人（原発性）肝臓癌、小児（原発性）肝臓癌、非小細胞肝臓癌、小細胞肝臓癌、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、黒色腫、成人悪性中皮腫、小児中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、小児多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、神経芽腫、非小細胞肺癌、小児卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、小児膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、小児腎細胞癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、小児皮膚癌、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、扁平上皮癌、胃癌、小児胃癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、小児甲状腺癌および膣癌からなる群から選択される癌に関連している、（２８）〜（７２）のいずれか一に記載の方法。
（７４）磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して前記第１のナノプラットフォームおよび前記第２のナノプラットフォーを加熱することをさらに含む、（２８）〜（７２）のいずれか一に記載の方法。
（７５）前記関係部位の組織が少なくとも約４０℃に加熱される、（７４）に記載の方法。
（７６）第１のナノ粒子と、シロキサンナノ層、リガンド単分子層、金被覆層、およびそれらの組合せからなる群から選択される、該ナノ粒子周囲の保護層とを含む、ナノプラットフォーム。
（７７）ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ビオチン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される官能基をさらに含む、（７６）に記載のナノプラットフォーム。
（７８）前記保護層がシロキサンナノ層を含み、該シロキサンナノ層の周囲にリガンド単分子層をさらに含む、（７６）〜（７７）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（７９）前記リガンド単分子層の周囲に金被覆層をさらに含む、（７８）に記載のナノプラットフォーム。
（８０）前記ナノ粒子がコア/シェル型ナノ粒子であり、該コアが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＦｅおよびＰｔからなる群から選択され、該シェルが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、（７６）〜（７９）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（８１）前記コアが強常磁性Ｆｅコアである、（８０）に記載のナノプラットフォーム。
（８２）前記シェルが酸化鉄を含む、（８０）〜（８１）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（８３）Ｆｅ／ＦｅｘＯｙコア／シェル型ナノ粒子を含む、（７６）〜（８２）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（８４）発色団／発光団、量子ドット、ビオロゲン、およびそれらの組合せからなる群から選択される粒子と、プロテアーゼコンセンサス配列を含むオリゴペプチド結合によって結合される、（７６）〜（８３）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（８５）前記粒子が、有機色素、無機色素、フルオロフォア、ホスホフォア、それらの組合せ、およびそれらのメタレート錯体からなる群から選択される発色団／発光団である、（８４）に記載のナノプラットフォーム。
（８６）前記発色団／発光団が、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリトロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２，５−ジフェニルオキサゾール、ルブレンおよびＮ−（３−スルホプロピル）アクリジンからなる群から選択される有機色素である、（８５）に記載のナノプラットフォーム。
（８７）前記発色団／発光団が、ポルフィリン、フタロシアニン、クロリンおよびメタレート発色団からなる群から選択される無機色素である、（８５）に記載のナノプラットフォーム。
（８８）前記ポルフィリンが、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびメタレート−ＴＣＰＰからなる群から選択される、（８７）に記載のナノプラットフォーム。
（８９）前記発色団／発光団が、ルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、イリジウム（ＩＩＩ）の３−（１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体およびイリジウム（ＩＩＩ）との３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体からなる群から選択されるメタレート発色団である、（８５）に記載のナノプラットフォーム。
（９０）前記発色団／発光団が、リン光性色素、フルオレセイン、ローダミンおよびアントラセンからなる群から選択されるフルオロフォアまたはホスホフォアである、（８５）に記載のナノプラットフォーム。
（９１）前記コンセンサス配列が、セリンプロテアーゼ切断配列、アスパラギン酸プロテアーゼ切断配列、システインプロテアーゼ切断およびメタロプロテアーゼ切断配列からなる群から選択される、（８４）〜（９０）のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
（９２）他のナノプラットフォームと連結されていない、（７６）〜（８３）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（９３）比吸収率が少なくとも約５０Ｗ／ｇである、（７６）〜（８３）のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム。
（９４）上記（７６）〜（９３）のいずれか一項に記載のナノプラットフォームと、薬学上許容される担体とを含む診断アッセイ（被分析物）を含む、組成物。
（９５）前記薬学上許容される担体が、水性バッファー、リポソームおよび腫瘍指向性細胞からなる群から選択される、（９４）に記載の組成物。
（９６）前記薬学上許容される担体が、幹細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される腫瘍指向性細胞である、（９５）に記載の組成物。
（９７）前記幹細胞が、神経幹細胞、臍帯マトリックス幹細胞、骨髄幹細胞および脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される、（９６）に記載の組成物。
（９８）哺乳類において癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ａ）上記（９４）〜（９７）のいずれか一項に記載の組成物を哺乳類に投与すること；
（ｂ）癌性細胞または前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の関係部位に前記アッセイ（被分析物）を局在させること；および
（ｃ）磁気Ａ／Ｃ−励起を使用して前記ナノプラットフォームを加熱すること
を含み、その結果、該関係部位の組織が少なくとも約４０℃の温度に加熱される、方法。
（９９）前記加熱（ｃ）が約１０分〜約２時間行われる、（９８）に記載の方法。
（１００）前記磁気Ａ／Ｃ−励起が約５０〜約５００ｋＨｚである、（９８）〜（９９）のいずれか一に記載の方法。
（１０１）前記組成物が、前記哺乳類の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約０．１０グラムの前記ナノプラットフォームを含む、（９８）〜（１００）のいずれか一に記載の方法。
（１０２）前記組織が約４２℃〜約６０℃の温度まで加熱される、（９８）〜（１０１）のいずれか一に記載の方法。
（１０３）前記加熱（ｃ）が前記癌性細胞または前記前癌性細胞のアポトーシスをもたらす、（９８）〜（１０２）のいずれか一に記載の方法。
（１０４）磁気Ａ／Ｃ−励起により哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の増殖を阻害するための、（７６）〜（９３）のいずれか一に記載のナノプラットフォーム。
（１０５）癌と診断された哺乳類において癌治療の経過をモニタリングする方法であって、
（ａ）上記（８４）〜（９１）のいずれか一に記載のナノプラットフォームを含む第１の診断アッセイ（被分析物）と、哺乳類の第１の体液サンプルを接触させること；
（ｂ）該第１のアッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；および
（ｃ）該第１の体液サンプルとの接触前の該第１のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、該第１のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける変化を経時的に検出することを含み、該変化が、該第１のサンプルにおける第１のプロテアーゼ活性レベルに対応している、方法。
（１０６）前記体液サンプルが、尿および血液からなる群から選択される、（１０５）に記載の方法。
（１０７）前記エネルギー源が、タングステンランプ、レーザーダイオード、レーザー、生物発光、およびそれらの組合せからなる群から選択される、（１０５）〜（１０６）のいずれか一に記載の方法。
（１０８）吸収スペクトルまたは発光スペクトルの最大値における約５ｎｍ〜約２００ｎｍの間の青方シフトが、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、（１０５）に記載の方法。
（１０９）前記変化が、前記体液サンプルとの接触前の前記アッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、新たな肉眼で見える色または発光バンドの出現を含み、該肉眼で見える色または発光バンドが、前記哺乳類における癌性細胞または前癌性細胞の存在を示す、（１０５）に記載の方法。
（１１０）前記アッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける前記変化が、約１秒〜約３０分の期間にわたって観察される、（１０５）〜（１０９）のいずれか一に記載の方法。
（１１１）前記哺乳類が癌治療中であり、
（ｄ）上記（８４）〜（９１）のいずれか一に記載のナノプラットフォームを含む第２の診断アッセイ（被分析物）と、前記哺乳類の第２の体液サンプルを接触させること；
（ｅ）該第２のアッセイ（被分析物）をエネルギー源に曝すこと；
（ｆ）該体液サンプルとの接触前の該第２のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルと比べての、該第２のアッセイ（被分析物）の吸収スペクトルまたは発光スペクトルにおける変化を経時的に検出すること、ここで、該変化は、該第２のサンプルにおける第２のプロテアーゼ活性レベルに対応しており：および
（ｇ）該第２のプロテアーゼ活性レベルを前記第１のプロテアーゼ活性レベルと比較することをさらに含み、ここで、活性の増加は、前記癌治療を増やしまたは変更する予後と相互に関連づけられ、活性の減少は、前記癌治療を維持しまたは減少させる予後と相互に関連づけられる、（１０５）〜（１１０）のいずれか一に記載の方法。
（１１２）前記癌治療中に毎日工程（ｄ）〜（ｇ）を繰り返すことをさらに含む、（１１１）に記載の方法。
（１１３）前記哺乳類が寛解期にあり、前記哺乳類における前記癌の再発を検出するために、前記癌治療後に毎月工程（ｄ）〜（ｇ）を繰り返すことをさらに含む、（１１１）に記載の方法。
（１１４）鉄コアを有するコア/シェル型ナノ粒子を含み、Ｔ１増強ではｒ１が約１００ｍＭ−１ｓ−１より大きく、Ｔ２減衰ではｒ２が約−２，０００ｍＭ−１ｓ−１より大きい整数である、ＭＲＩ造影剤。
【国際調査報告】
2013503634.tif 000133
2013503634.tif 000134
2013503634.tif 000135