(57)【要約】  本発明は、インビトロでの細胞増殖阻害のための及び腫瘍の治療のための、アポトーシス促進性剤として有用なキメラポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列（Ｉ）を含むペプチド：
Ｘ１−ＫＫＫＩＫＲＥＩ−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−ＥＴＬＤＧＩ−Ｘ５−ＥＱＷＡ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ７  （Ｉ）（配列番号：１）
［配列中、
Ｘ１は、アミノ酸なし、リシン残基、またはバリン−リシンであり；
Ｘ２は、アミノ酸なし、リシン残基、またはリシン−イソロイシンであり；
Ｘ３は、アミノ酸なし、または１個〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、バリンまたはイソロイシンであり；
Ｘ５は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
Ｘ６は、アルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｘ７は、アミノ酸なし、またはグルタミン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである］、
配列（Ｉ）から１以上の化学修飾により得られるタンパク質分解耐性ペプチド、または
配列（Ｉ）から１以上の同類置換により得られる実質的なホモログペプチド。
【請求項２】
Ｘ１がバリン−リシンであり；
Ｘ２がリシン−イソロイシンであり；および
Ｘ３がアミノ酸なしである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ４がバリンであり；
Ｘ５がフェニルアラニンであり；および
Ｘ６がヒスチジンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＧＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２）である、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＧＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３）である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
インビトロでの細胞増殖の阻害のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドを、医薬上許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍の処置のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
ヒト患者における癌腫瘍の処置のための、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
癌腫瘍がリンパ腫である、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
癌腫瘍が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である、請求項１０に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス促進性キメラペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アポトーシスは、分化、細胞数の制御および損傷を受けた細胞の除去に重要な、調節された過程である。アポトーシス調節の不具合は、自己免疫疾患、神経変性疾患および癌などの様々な疾患に共通する特徴である。アポトーシスは、細胞に内在する自殺プログラムの活性化を通じて生じ、内部シグナルおよび外部シグナルにより実行される。アポトーシスの過程は、さまざまなフェーズに分けることができ、それらは最終的に細胞破壊に導くシグナルを活性化する。アポトーシスは、幅広い死の刺激により誘導されるが、アポトーシスの実行段階は、とりわけ標的タンパク質を切断し細胞の形態変化を導くカスパーゼによって実行される。
【０００３】
リン酸化は、多くの疾患状態に寄与する細胞生理学の調節メカニズムおよび異常調節に重大な役割を果たす。癌などの疾患に対するキナーゼ機能における改変については、多くのことが知られているが、これらの同じ過程におけるホスファターゼの具体的な役割はほとんど特徴づけられないままである。セリン／チロシンホスファターゼは、その基質特異性および阻害剤に対する感受性に応じて、通常、１型（ＰＰ１）または２型（ＰＰ２）に分類される。ＰＰ１は、触媒サブユニットと多種多様な調節サブユニットまたはターゲッティング・サブユニットとの特異的な相互作用により生じるホロ酵素ファミリーを示す。ＰＰ１は、多様な細胞プロセス、例えば細胞周期の進行、増殖、タンパク質合成、筋収縮、炭水化物代謝、転写、細胞質分裂、神経シグナリングを調節する主要な真核生物のホスファターゼである。細胞周期の間に、ＰＰ１活性は、リン酸化により調節される。ＰＰ１は、これらの細胞機能に必須の脱リン酸化タンパク質（dephosphorylating protein）による有糸分裂移行（mitotic transition）に役割を果たす。サイクリン依存性キナーゼによるＰＰ１αの３２０番目のスレオニンでのリン酸化が、その酵素活性を阻害することが示された。一致して、ｃｄｋリン酸化に耐性のあるＰＰ１αの構成的突然変異は、細胞が細胞周期のＳ期に入るのを妨げる。さらに、ＩＬ−２欠乏誘導型のアポトーシスは、ＰＰ１αホスファターゼを通じたＢａｄ脱リン酸化を調節することによって作動すること（Ayllon et al., 2000）、およびＰＰ１αはカスパーゼ−９と会合して、その脱リン酸化を誘導し、結果として、そのプロテアーゼ活性を誘導すること（Dessauge et al., 2006）が示された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ayllon, C. Martinez-A. A. Garcia, X. Cayla, and A. Rebollo (2000). Protein phosphatase 1-a is a Ras-activated Bad phosphatase that regulates IL-2 deprivation-induced apoptosis. EMBO J. 19: 1-10.
【非特許文献２】Dessauge, X. Cayla, A. Fleischer, A. Ghadiri, M. Duhamel, and A. Rebollo: Caspase-9-dependent apoptosis is induced by serine/threonine phosphatase PP1a. J. Immunol. 2006. 177, 2441-2451.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、二量体または三量体酵素の巨大なファミリーを意味する。ＰＰ２Ａコア酵素は、触媒Ｃサブユニット（ＰＰ２Ａｃ）と構造Ａサブユニットから成る。第三のサブユニット（Ｂ）は、最終的にコアに結合し、これらのＢサブユニットはＰＰ２Ａホロ酵素の基質特性および局在の両方を調節する。Ａサブユニットは、主として、構造的役割を果たし、単一アミノ酸の改変は、特異的なＢサブユニットの結合を乱す。これは、ＡサブユニットがＰＰ２Ａホロ酵素の構成を調節することを示唆する。さまざまなＰＰ２Ａ複合体は、さまざまな細胞プロセス、例えば細胞増殖、生存、接着性、細胞骨格の動態および悪性転換に関係しているとされる。
【０００６】
ＰＰ２Ａのアポトーシスにおける役割は、カスパーゼ−３、Ｂｃｌ−２およびアデノウイルスＥ４ｏｒｆ４タンパク質との相互作用により示唆される。抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−２の活性は、Ｓｅｒ７０でのリン酸化により調節され、これは、その抗アポトーシスの役割に必要であり、ＰＰ２Ａにより元に戻され得る。さらに、Ｓｅｒ７０でのＢｃｌ−２のＩＬ−３またはブリオスタチン−１誘導性のリン酸化に続いて、増大したＢｃｌ−２およびＰＰ２Ａとの会合が生じ、その後、Ｂｃｌ−２の脱リン酸化が生じる。最終的に、ＰＰ２Ａは、ＮＦκＢ、ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路などのアポトーシスシグナルのモジュレーションを介して、アポトーシスを調節する。
【０００７】
ＰＰ１／ＰＰ２Ａタンパク質と相互作用する透過性ペプチドを設計した。このアプローチは、「ドラッグ・ホスファターゼ・テクノロジー（ＤＰＴ）」と称され、Guergnon et al, 2006および国際特許出願の国際公開第２００３／０１１８９８号および第２００４／０１１５９５号に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、以下のアミノ酸配列（Ｉ）を含む、またはから成るペプチドを提供する：
Ｘ１−ＫＫＫＩＫＲＥＩ−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−ＥＴＬＤＧＩ−Ｘ５−ＥＱＷＡ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ７  （Ｉ）（配列番号：１）
［配列中、Ｘ１は、アミノ酸なし（vacant）、リシン残基、またはバリン−リシンであり；
Ｘ２は、アミノ酸なし、リシン残基、またはリシン−イソロイシンであり；
Ｘ３は、アミノ酸なし、または１個〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、バリンまたはイソロイシンであり；
Ｘ５は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
Ｘ６は、アルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｘ７は、アミノ酸なし、またはグルタミン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである］。
【０００９】
好ましい実施形態において、前記ペプチドは、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＧＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２）であり、本開示内容において“ＤＰＴ−Ｃ９ｈ”とも称する。
【００１０】
配列（Ｉ）から１以上の化学修飾により得られるタンパク質分解耐性ペプチド、または配列（Ｉ）から１以上の同類置換により得られる実質的なホモログペプチドもまた包含する。
【００１１】
本発明のさらなる対象は、本明細書に記載のペプチドを、医薬上許容される担体と共に含む医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＤＰＴ−Ｃ９とＰＰ２Ａｃとの相互作用を示すイムノブロット。  対照のストレプトアビジン−セファロース単独、またはＤＰＴ−Ｃ９、ＤＰＴ−Ｃ９ｒ、ＤＰＴ−ｓｈ１もしくはＣ９ペプチドに対してコンジュゲートしたものを、ＴＳ１αβ細胞（ポイントあたり１０７細胞）からのＩＬ−２刺激後の細胞抽出物とインキュベートした。溶解産物中の未結合タンパク質またはプルダウン実験での結合タンパク質の特定は、ＰＰ２ＡｃまたはＰＰ１ｃに対する抗体を用いたイムノブロッティングにより実施した。
【図２】細胞死に対するＤＰＴ−Ｃ９ペプチドの効果を示すグラフ。  ＤＰＴ−Ｃ９、ＤＰＴ−Ｃ９ｒ、ＤＰＴ−ｓｈ１またはＣ９ＩＬ−２ペプチドの非存在下または存在下で６時間培養したＩＬ−２刺激後のＴＳ１αβ細胞を、培養培地中１５０μＭで３７℃にて４時間培養し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで４時間維持し、フロウサイトメトリーにより分析した。ＳＤはｎ＝３で示される。
【図３】細胞死に対するＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドの効果を示す一連のグラフ。  ネズミＩＬ−２刺激後の細胞を、ＤＰＴ−Ｃ９ｈまたはＣ９ｈペプチドの非存在下または存在下（１５０μＭで、３７℃にて４時間）で培養し、次いで、ＩＬ−２を含むまたは含まない培養培地に移した。ヒト細胞を、ＤＰＴ−Ｃ９ｈまたはＣ９ｈペプチドの非存在下または存在下（１５０μＭで、３７℃にて４時間）で培養し、その後、アポトーシス分析した。ＳＤはｎ＝３で示される。
【図４】ＨＤ（健康な提供者）細胞と比較した、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）に対するＤＰＴ−Ｃ９ｈのアポトーシス効果を示すグラフ。  ＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）は、健康な提供者およびＣＬＬ患者からFicoll勾配遠心分離により単離し、完全ＲＰＭＩ培地で培養し、１５０μＭのＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドで処理した。処置３時間で、細胞を洗浄し、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。アポトーシスは洗浄後６時間にアネキシン染色およびＢ細胞特異マーカー（図４Ａ）、ならびにＴ細胞、ＮＫ細胞および単球特異マーカー（図４Ｂ）を用いて評価した。アポトーシスは、Ｃ９ｈペプチドで処理した細胞と比較したパーセンテージとして表される。
【図５】様々なＣＬＬ患者におけるＤＰＴ−Ｃ９ｈ処置の効果を示す一連のグラフ。  ＰＢＭＣは、健康な提供者および３つの異なるタイプのＣＬＬ患者：処置中の患者、未処置の患者および耐性患者から、Ficoll勾配遠心分離により単離した。細胞は、完全ＲＰＭＩ培地中で維持し、１５０μＭのＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドで３時間処理し、次いで洗浄し、完全培地に移した。試料は、洗浄後の様々な時点で分析した。アポトーシスは、アネキシン染色により評価した。異なる集団を、特異マーカーを用いて選択した。アポトーシスは、対照の未処置細胞と比較したパーセンテージとして表す。
【図６】骨髄細胞におけるＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドの効果を示す一連のグラフ。  骨髄由来の単球細胞を、健康な提供者およびＣＬＬ患者からFicoll勾配遠心分離により単離した。細胞は、図５で示されるように処理し、アポトーシスをアネキシン染色により評価した。アポトーシスは、対照の未処置細胞と比較したパーセンテージとして表す。
【図７】ＣＬＬ耐性細胞におけるＤＰＴ−Ｃ９ｈ処置の効果を示す２つのグラフ。  ＰＢＭＣは、図５で示されるように処理した。３０時間で、１５０μＭのＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドを培地に再度加え、３時間後に、アポトーシスを評価した。異なる細胞集団は、Ｂ細胞特異マーカーを用いて（図７Ａ）、ならびにＴ細胞、ＮＫ細胞および単球細胞特異マーカーを用いて（図７Ｂ）選択した。アポトーシスは、対照の未処理細胞と比較した。
【図８】乳癌異種移植片のヒトモデルから単離した乳癌細胞に対するＤＰＴ−Ｃ９ｈの効果を示す一連のグラフ。  細胞は、１５０μＭのペプチドを含めたＲＰＭＩ完全培地中で３時間培養した。次いで、細胞を洗浄し、完全培地に再懸濁し、アポトーシスは異なる時点で評価した。ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞系は対照として含めた。アポトーシスは、対照の未処置細胞と比較したパーセンテージとして表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳しい説明）
本発明者らは、今や、ＰＰ２Ａが、ＰＰ１α／カスパーゼ−９と相互作用し、３分子複合体（trimolecular complex）を形成することを示した。本発明者らは、カスパーゼ−９タンパク質のＣ末端部分からの特定の配列が、ＰＰ２Ａｃ結合ドメインであることを見出した。ＰＰ１−ＰＰ２Ａと相互作用する透過性ペプチドと融合させた場合、それは、ヒト細胞の生存を調節解除することができる治療分子となる。
【００１４】
これに基づき、本発明は、アポトーシス促進性キメラポリペプチドを提供する。
【００１５】
定義：
用語「患者」は、処置の必要性があり、アポトーシス促進性効果が望まれるヒトまたは非ヒト動物を意味し、好ましくは哺乳動物であり、例えば雄、雌、成体および子供である。
【００１６】
本明細書で用いられる、用語「処置」または「治療」は、治療的および／または予防的処置を含む。より具体的には、治療的処置は、症状の緩和、改善および／または消失、軽減および／または安定化（例えば、より進行したステージへ移行させないこと）、ならびに特定疾患の症状の進行における遅延のいずれかを意味する。
【００１７】
予防的処置は、発症を止めること、進行の危険性を軽減すること、発病率を低下させること、発症を遅らせること、進行を弱めること、ならびに特定疾患の症状の発症までの時間を延ばすことのいずれかを意味する。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「同類置換」は、アミノ酸残基を、ペプチドの全体的な立体配置および機能を変えずに、他のアミノ酸残基に置き換えることを意味し、限定するものではないが、アミノ酸を類似する特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族およびその他の類似する特性など）を有するアミノ酸に置き換えることを含む。類似の特性を有するアミノ酸は、当分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、親水性−塩基性アミノ酸であり、相互に置換可能であり得る。同様に、イソロイシン、疎水性アミノ酸は、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換可能である。中性の親水性アミノ酸は、他のアミノ酸と置換可能であり、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが挙げられる。「置き換える」または「修飾する」によって、本発明は、天然のアミノ酸から改変された又は修飾されたアミノ酸を含む。
【００１９】
そのようなものとして、本発明の文脈において、同類置換は当分野では、あるアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸で置換することと認識されていると、理解されるべきである。同類置換の例を、以下の表１に記載する。
【表１】
2013504518.tif 000002
【００２０】
別には、保存アミノ酸は、Lehninger, 1975に記載されるようにグループ分けすることができ、以下の表２で記載されるものである。
【表２】
2013504518.tif 000003
【００２１】
さらに別のものとして、例示的な同類置換を、以下の表３に記載する。
【表３】
2013504518.tif 000004
【００２２】
ペプチド調製：
本明細書に記載のペプチドは、当業者には既知の標準的な合成方法、例えば化学合成または遺伝子組換えを用いて合成することができる。好ましい実施形態において、ペプチドは、既に適切な順序のアミノ酸配列を有する実施済みのフラグメントの縮合によるか、あるいは縮合の間に、ペプチド結合に関与する官能基を除いたアミノ酸の官能基を保護しながら既に調製された複数フラグメントの縮合のいずれかによる、アミノ酸残基の逐次縮合によって得られる。具体的には、ペプチドは、もともとMerrifieldにより記載された方法に従って合成することができる。
【００２３】
ペプチドの特徴：
本発明に有用なペプチドは、カスパーゼ−９タンパク質フラグメントに連結された透過性ペプチドからなるキメラ合成ペプチドから得られる合成ペプチドである。
【００２４】
１つの実施形態によれば、本発明に有用なペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む、またはから成る：
Ｘ１−ＫＫＫＩＫＲＥＩ−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−ＥＴＬＤＧＩ−Ｘ５−ＥＱＷＡ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ７  （Ｉ）（配列番号：１）
［配列中、Ｘ１は、アミノ酸なし、リシン残基、またはバリン−リシンであり；
Ｘ２は、アミノ酸なし、リシン残基、またはリシン−イソロイシンであり；
Ｘ３は、アミノ酸なし、または１個〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、バリンまたはイソロイシンであり；
Ｘ５は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
Ｘ６は、アルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｘ７は、アミノ酸なし、またはグルタミン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである］。
【００２５】
Ｘ３が１個〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列の場合、もっとも好ましくは、前記ペプチドが患者に投与された場合にＸ３が天然タンパク質または抗体と反応も結合もしない。
【００２６】
好ましい実施形態において、
Ｘ１はバリン−リシンであり；
Ｘ２はリシン−イソロイシンであり；および
Ｘ３はアミノ酸なしである。
【００２７】
他の好ましい実施形態において、
Ｘ４はバリンであり；
Ｘ５はフェニルアラニンであり；および
Ｘ６はヒスチジンである。
【００２８】
好ましいペプチドは、
ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＧＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２）であるか、または
ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＧＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３）である。
【００２９】
本明細書に記載のペプチドのＮ末端およびＣ末端は、タンパク質分解に対して場合により保護されていてもよい。例えば、Ｎ末端は、アセチル基の形態であってもよいし、および／またはＣ末端はアミド基の形態であってもよい。タンパク質分解に耐性となるペプチドの内部修飾も想定され、例えば、少なくとも−ＣＯＮＨ−ペプチド結合は、（ＣＨ２ＮＨ）還元性結合、（ＮＨＣＯ）レトロインバルソ結合（retro-inverso bond）、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合（carba bond）、（ＣＯ−ＣＨ２）セトメチレン結合（cetomethylene bond）、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン結合（alcene bond）または−ＣＨ＝ＣＨ−結合により修飾および置換される。本発明のペプチドは、Ｄ型のアミノ酸からなるものであってよく、それは、タンパク質分解に対して耐性なペプチドを与える。それらは、例えば、少なくとも２つのアミノ酸残基をオレフィン側鎖、好ましくはＣ３−Ｃ８アルケニル鎖、好ましくはペプテン−２−イル鎖を用いて修飾し、続いてWalensky et al, Science, 2004, 305:1466-1470に記載される、いわゆる「ステープル（staple）」技術に従い、前記鎖を化学架橋することにより分子内架橋させ、安定化させることができる。例えば、ｉ番目およびｉ＋４からｉ＋７番目のアミノ酸を、反応性のオレフィン残基を示す非天然のアミノ酸で置換することができる。これらのタンパク質分解耐性化学修飾ペプチドはすべて、本発明に包含される。
【００３０】
１つ以上の同類置換により配列（Ｉ）から得られる実質的なホモログペプチドもまた包含される。好ましくは、これらのホモログペプチドは、２個のシステイン残基を含まず、そのため環化を避けられる。２つのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似する残基により置換される場合、またはアミノ酸の８０％超が同一である場合、または約９０％超、このましくは約９５％超が類似する（機能的に同一）である場合に、「実質的にホモログ」または「実質的に類似」する。好ましくは、類似配列またはホモログ配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, GCGパッケージ用のProgram Manual、バージョン7, Madison, Wisconsin）パイルアップ（pileup）プログラムまたは当分野で公知のいずれかのプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を用いたアライメントにより特定される。
【００３１】
本発明の他の態様において、尿クリアランスの低下および用いられる治療用量を減らすために、ならびに血漿中での半減期を延ばすために、ペプチドを、そのＣ末端またはリシン残基でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、特にＰＥＧ１５００または４０００ＭＷに共有結合させる。さらに他の実施形態において、ペプチドの半減期は、ペプチドを薬物送達システムのための生分解性および生体適合性のポリマー材料に含め、マイクロスフェアを形成させることによって延ばせる。ポリマーおよびコポリマーは、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）(US2007/0184015、SoonKap Hahn et alに例示されるよう)である。
【００３２】
本明細書に記載のペプチドは、インビトロでの細胞増殖の阻害に有用である。
【００３３】
それらペプチドは、治療剤としても有用である。
【００３４】
前記ペプチドは、好ましくはヒト患者における、腫瘍、具体的には癌腫瘍の処置に有用である。
【００３５】
様々なタイプの癌には、限定するものではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨性肉腫、骨原性肉種、脊索腫、血管肉腫、内皮肉種（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉種（lymphangioendothelio-sarcoma）、滑液膜腫、中皮腫、骨髄原発性肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、肺癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛膜癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌腫、膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【００３６】
より具体的には、本明細書に記載されるペプチドは、ＰＰ１および／またはＰＰ２Ａのダウンレギュレーションを示す癌、または抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２、ＰＰ１およびＰＰ２Ａと相互作用し、それらにより制御されるアポトーシス調節因子の過発現を示す癌の処置に有用である。
【００３７】
ヒトｂｃｌ−２遺伝子の高発現レベルは、ほとんどの濾胞性Ｂ細胞リンパ球および多くの大細胞非ホジキンリンパ腫を含み、ｔ（１４；１８）染色体転座を有する全てのリンパ腫で見出された。ｂｃｌ―２遺伝子の高発現レベルは、プレＢ細胞タイプのリンパ球性白血球、神経芽腫、鼻咽頭癌、ならびに腺癌である多くの前立腺癌、乳腺癌および結腸腺癌を含み、ｔ（１４；１８）染色体転座を有さない白血病でも見出された。とりわけ、Ｂｃｌ−２の過発現は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）で見出された（Deng et al, 2009; Prickett et al, 2004）。
【００３８】
好ましい実施形態において、癌腫瘍は、かくしてリンパ腫、特に白血病、例えば慢性リンパ球性白血病である。
【００３９】
さらに、ペプチドは、転移の処置に用いることができる。
【００４０】
医薬組成物：
本ペプチドは、静脈内、経口、経皮、皮下、粘膜、筋肉内、肺内、鼻腔内、非経口、直腸、経膣およい局所を含む、いずれかの好都合な経路により投与することができる。経鼻経路が特に興味深い。
【００４１】
有利なことに、腫瘍内投与もまた考えられる。
本ペプチドは、医薬上許容される担体とともに処方される。
【００４２】
用量は、当業者により、アポトーシス促進性効果が達成されるよう選択されるが、それは投与経路および用いられる剤形に依存する。
【００４３】
本発明のさらなる態様および利点は、以下の実験の項で開示し、それらは例示と考えるべきであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
実施例：
実施例１：アポトーシス促進性ペプチドの同定
材料
細胞
本実施例では、以下の細胞を用いた。
ＴＳ１αβは、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−９存在下で独立して増殖できる、ヒトＩＬ−２受容体のα鎖およびβ鎖を安定的にトランスフェクトしたネズミＴ細胞系である（Pitton et al, 193）。
【００４５】
ＣＴＬＬは、増殖がＩＬ−２に依存したネズミＴ細胞系である。ＣＴＬＬは、５％熱−非動化したウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミンおよび５ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−２を補充したＰＲＭＩ−１６４０で培養した。
【００４６】
ＪｕｒｋａｔおよびＤａｕｄｉ細胞は、５％熱−非動化したウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび２ｍＭのグルタミンを補充したＰＲＭＩ−１６４０で培養した。
【００４７】
ＨｅＬａ細胞は、１０％熱−非動化したウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭで培養した。
【００４８】
リンフォカイン、抗体、キットおよび試薬
ヒトｒＩＬ−２は、Chiron（Paris, France）から提供された。抗カスパーゼ−９抗体はNeo markersから、抗−プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１ｃ）抗体はSanta Cruz、CalbiochemまたはTransduction Laboratoriesから提供された。アポトーシス促進研究で用いたポリクローナルＰＰ２Ａ抗体は、上記のものである（Ayllon et al, 2000）。アネキシンＶ−ＦＩＴＣは（Beckman Coulter）Immunotech（Marseille, France）から提供された。ペルオキシダーゼ（ＰＯ）コンジュゲート・ヤギ抗−ウサギ、−マウス、またはテンジクネズミＩｇ抗体はDako（Glostrup, Denmark）から提供された。
【００４９】
ペプチド
ペプチドは、自動マルチペプチド合成装置で、固相法および標準的なＦｍｏｃ化学により合成した。ペプチドの純度および組成は、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析により確認した。
【００５０】
方法
ペプチド合成および配列
ＮＨ２−ビオチン化ペプチドは、自動マルチペプチド合成装置で、固相法および標準的なＦｍｏｃ化学により合成した。ペプチドの純度および組成は、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析により確認した。ペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用競合研究に用いた。
【００５１】
固定化ペプチド合成
カスパーゼ−９全体をカバーするオーバーラッピング・ペプチドは、以前に記載されたように（Frank and Overwin, 1996; Gausepohl et al., 1992）、アミノ誘導体化セルロースメンブレンへの自動スポット合成により調製した。メンブレンをブロックし、ＰＰ２Ａｃ（または、他のＰＰ２Ａホロ酵素もしくはサブユニット）と一緒にインキュベートし、複数回の洗浄工程の後に、抗−ＰＰ２Ａｃ抗体、次いでＰＯ−コンジュゲート二次抗体と一緒にインキュベートした。タンパク質相互作用を、ＥＣＬシステムを用いて可視化した。
【００５２】
ビオチン化ペプチドの細胞内検出
対数増殖期の細胞を、ＰＢＳで２回リンスした。合計６×１０４の細胞を、２４ウェルプレートにシードし、ＰＲＭＩ−１６４０中で３７℃にてインキュベートした。２４時間後に、ビオチン化ペプチドを添加し、細胞を細胞内分析のためにインキュベートした（４時間）。細胞を、ＰＢＳでリンスし、０．１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定化し、１０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを加えた。次いで、細胞をＰＢＳでリンスし、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と共に５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡により分析した。
【００５３】
ネズミ・カスパーゼ−９配列を含有するセルロース結合ペプチドに対するＰＰ２Ａ結合アッセイ
ネズミ・カスパーゼ−９配列全体をスキャンする２２２のオーバーラップドデカペプチドを、Frank et al, 1993に記載されたように、アミノ誘導体化セルロースメンブレンに対して自動スポット合成（Abimed, Langerfeld, Germany）により調製した。メンブレンを、SuperBlock（Pierce）を用いて飽和させ、精製したＰＰ２Ａｃサブユニットと一緒にインキュベートし、複数回の洗浄工程後に、抗ＰＰ２Ａｃ抗体、続いてＰＯコンジュゲート二次抗体と一緒にインキュベートした。陽性スポットを、ＥＣＬシステムを用いて可視化した。
【００５４】
ビオチン化ペプチドと細胞内のタンパク質ターゲットとの相互作用を決定するためのプルダウンアッセイ
ビオチン化ペプチドを、０〜１００μＭ（溶解産物を用いて終濃度で）にて室温で２時間、３０μｌのストレプトアビジン・コートした免疫磁性ビーズ（Calbiochem, San Diego CA）と一緒に前インキュベートした。この時間の間に、対数増殖期のＴＳ１αβ細胞１０７を、まず２回ＰＢＳで洗浄し、次いで氷上で１０分間４００μｌの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのオルトバナデート、Ｒｏｃｈｅ製の「完全ＥＤＴＡフリー」のプロテアーゼインヒビターカクテル）を用いて溶解させた。
【００５５】
溶解産物を、１３０００ｇで１０分間４℃にて浄化し、ストレプトアビジン・コートした免疫磁性ビーズと会合されるビオチン化ペプチドと共に、２時間４℃でインキュベートした。ビオチン化ペプチドを、ストレプトアビジンビーズを用いてプルダウンし、２回、氷上の７００μｌの溶解バッファー中で洗浄した。次いで、結合したタンパク質および未結合の溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、およびＰＰ１ｃまたはＰＰ２Ａｃ抗体を用いたウェスタン・ブロッティングで分析した。
【００５６】
細胞死アッセイ
本発明者らは、アポトーシス細胞の細胞膜中のホスファチジルセリン（ＰＳ）の外層リーフレット・エクスポージャー（outer leaflet exposure）のアッセイのために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣコンジュゲートキット（Roche）を用いた。染色は、製造業者の指示に従って実施した。合計１０５の細胞を、ＦＡＣＳキャリバー・サイトフルオメーター（Calibur cytofluometer； BD Biosciences）でのフロウサイトメトリーにより分析した。ネクローシス細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により排除し、単独のアネキシンＶ陽性細胞をアポトーシスと判断した。アポトーシス分析に関し、異なるペプチドを１５０μＭで用いた。
【００５７】
結果
ＰＰ２Ａｃ相互作用に関与するネズミ・カスパーゼ−９配列のインビトロ同定
インビトロでＰＰ２Ａｃに結合できるカスパーゼ−９配列を含有するペプチドを同定するために、ネズミ・カスパーゼ−９タンパク質（ＮＣＢＩアクセス番号  ＮＰ＿０５６５４８から推定される配列）からの一連の２２２のオーバーラップドデカペプチドをセルロールメンブレンに結合させ、精製したＰＰ２Ａｃサブユニットと一緒にインキュベートした。精製した触媒ＰＰ２Ａｃサブユニットに結合する４個のオーバーラップ配列を有するペプチドを同定した：
ペプチド１：  ＹＩＥＴＬＤＧＩＬＥＱＷ（配列番号：８）
ペプチド２：      ＥＴＬＤＧＩＬＥＱＷＡＲ（配列番号：９）
ペプチド３：          ＬＤＧＩＬＥＱＷＡＲＳＥ（配列番号：１０）
ペプチド４：              ＧＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：１１）
ＰＰ２Ａｃ結合部位：ＹＩＥＴＬＤＧＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：５）
【００５８】
興味深いことに、メンブレンを二量体ＡＣまたは三量体ＡＢａＣホロ酵素と一緒にインキュベートした場合には、類似の結果が見られたが、精製したＡまたはＰＰ２Ａ−Ｂａサブユニットを用いた場合には相互作用するスポットは検出されなかった（データは示さない）。これらを併せると、これらの結果は、ネズミ・カスパーゼ−９タンパク質の４０１番目〜４１８番目の残基（カスパーゼ−９のａａ４０１〜４１８）に対応する新たなＰＰ２Ａｃ結合部位を同定した。さらに、二量体ＡＣおよび三量体ＡＢａＣホロ酵素の結合は、ＰＰ２Ａｃの結合領域が調節サブユニットの存在下でさえアクセス可能であることを示している。
【００５９】
カスパーゼ−９（ａａ４０１〜４１８）ＰＰ２Ａｃ結合配列を含有する新たな透過性ペプチド、ＤＰＴ−Ｃ９の設計および特徴づけ
本発明者らは、カスパーゼ−９（ａａ４０１〜４１８）ＰＰ２Ａｃ結合ドメインを含有する、Ｃ９と称する非細胞透過性ペプチドを化学合成した（表１）。加えて、本発明者らは、このＣ９配列の細胞内での効果を分析するために、新たなＤＰＴ−透過性ペプチドを２つ作り出した。
【００６０】
ＤＰＴ−Ｃ９と称する最初の透過性ペプチドは、ＤＰＴ−ｓｈ１シャトルの１２ａａ残基およびＣ９配列の融合の結果得られる配列を有する。陰性対照として用いられる、第二のペプチドは、ＤＰＴ−ｓｈ１およびＣ９リバース配列の融合の結果得られる２つの部分から成る（bi-partite）配列もまた有する。表１は、これらの異なるペプチドの配列を示す。
【００６１】
【表４】
2013504518.tif 000005
【００６２】
ＰＰ２Ａｃと相互作用するＤＰＴ−Ｃ９の能力を決定するために、本発明者らは、ビオチン化ペプチドまたはビーズ単独と共にインキュベートしたＩＬ−２刺激後の細胞の細胞抽出物を用いて、プルダウン実験を実施した。シャトルＤＰＴ−Ｓｈ１および対照の透過性ペプチドＴａｔ（配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号：１２から成る）は取り込まれ、同様にして、ペプチドＤＰＴ−Ｃ９およびＤＰＴ−Ｃ９ｒは取り込まれた。対照的に、カスパーゼ−９のＰＰ２Ａｃとの相互作用部位単独を含有する配列（Ｃ９）は取り込まれなかった（データは示さない）。
【００６３】
図１で示されるように、本発明者らは、Ｃ９およびＤＰＴ−Ｃ９の両方が明らかにＰＰ２Ａｃと相互作用することを見出した。反対に、ＤＰＴ−ｓｈ１およびＤＰＴ−Ｃ９ｒはＰＰ２Ａｃと相互作用しない。本発明者らは、ＰＰ１ｃの存在を検出できなかった（図１）、またＣ９もしくはＤＰＴ−Ｃ９に会合するカスパーゼ−９の存在は検出できなかった（データは示さない）。
【００６４】
アポトーシスに対するＤＰＴ−Ｃ９の効果
アネキシンＶおよびＰＩのフロウサイトメトリー検出を用いて、本発明者らは、ＩＬ−２存在下で培養したＴＳ１αβ細胞におけるアポトーシスを誘導するＤＰＴ−Ｃ９の能力を分析した。図２で示すように、非透過性Ｃ９ペプチドと対照的に、ＤＰＴ−Ｃ９は６倍のアポトーシス増加を誘導した。期待されたように、ＤＰＴ−ｓｈ１シャトルまたはＤＰＴ−Ｃ９ｒは陰性対照として挙動する。これらを併せると、これらの結果は、ＤＰＴ−Ｃ９がネズミＴＳ１αβリンパ球における細胞死を誘導することを示す。
【００６５】
アポトーシスに対するＤＰＴ−Ｃ９ｈの効果
図３で示されるように、ＤＰＴ−Ｃ９ｈ、ヒトＣ９配列のホモログは、Ｊｕｒｋａｔ、ＤａｕｄｉおよびＨｅＬａヒト細胞において５倍のアポトーシス増加を誘導した。興味深いことに、ＤＰＴ−Ｃ９とは反対に、ＤＰＴ−Ｃ９ｈはネズミＴＳ１αβまたはＣＴＬＬ細胞において細胞死を引き起こすことができない。
【００６６】
結論
本発明者らは、ＰＰ２Ａｃ結合配列、ネズミ・カスパーゼ−９のＣ末端部分に位置するカスパーゼ−９（ａａ４０１−４１８）ドメインを特徴づけた。本発明者らは、ヒト・カスパーゼ−９由来のホモログＰＰ２Ａｃ結合配列（ヒト・カスパーゼ−９（ａａ３６３−３８０）ドメインに対応する）を同定した。さらに、機能的アポトーシス実験で組合せたプルダウン分析により、本発明者らは、ＴＳ１αβリンパ球での様々な経路を調節解除する、ＤＰＴ−Ｃ９と称する新たな分子を特徴づけた。加えて、ＤＰＴ−Ｃ９とは反対に、ＤＰＴ−Ｃ９ｈは、ヒト形質転換細胞系で細胞死を特異的に誘導するが、ネズミリンパ球では効果を示さない。
【００６７】
ＤＰＴ−Ｃ９およびＤＰＴ−Ｃ９ｈは、様々な疾患、特に腫瘍を処置するのに有用な新たなアポトーシス促進性分子である。
【００６８】
さらに、ＤＰＴ−Ｃ９およびＤＰＴ−Ｃ９ｈは、ＰＰ２ＡｃおよびＰＰ２Ａ会合パートナーを単離するための分子ツールである。
【００６９】
細胞において、ＰＰ２Ａｃが遊離分子として見出されなかったことは特筆すべきことである。ＰＰ２Ａｃは通常、構造サブユニット（ＡサブユニットまたはＰＲ６５）に結合する。別には、ＰＰ２Ａｃは哺乳動物のα４、酵母Ｔａｐ４２に関係するタンパク質とも結合することができる。
【００７０】
Ｔａｐ４２／α４は、ｍＴＯＲキナーゼによりリン酸化されると、Ｎ末端の規則性（ordered）ヘリックスドメインを介してＰＰ２Ａｃと相互作用する。さらに、Brautiganグループの以前の研究で、ＰＰ２Ａｃの塩基性の電荷残基が、ＰＲ６５／Ａまたはα４／Ｔａｐ４２タンパク質の負電荷残基に結合するのに必要であることが示された。興味深いことに、マウス・カスパーゼ−９から推定される、Ｃ９ドメインのヘリックス構造は、負の静電ポテンシャル、また好都合なＰＰ２Ａｃとの相互作用を作り出すことができる酸性の電荷（Ｄ／Ｅ）残基を幾つか含有する。同様の刺激が、ヒト・カスパーゼ−９配列を用いても潜在的に生じる。
【００７１】
これらを併せると、これらの観察結果は、Ｃ９／Ｃ９ｈ配列を有するＤＰＴ−Ｃ９およびＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドが、ＰＰ２Ａｃおよび会合パートナーの同定および簡便な精製を可能にする。プロテオーム解析と組合せたプルダウンアッセイに基づいて、ＤＰＴ−Ｃ９／ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドは、機能的細胞内分子複合体におけるＰＰ２Ａタンパク質およびＰＰ２Ａ会合タンパク質の容易な単離および同定を可能にし得る。この新しいアプローチは、通常のマイクロシスチン・ベースの親和性技術よりもより特異的である。これは、それらの技術がＰＰ１タンパク質とＰＰ２Ａタンパク質とを区別できないからである。加えて、これらのプルダウン・ストラテジーは、これらの複合体でのＰＰ２Ａｃに付随するホスファターゼ活性を決定することを可能にする。
【００７２】
実施例２：臨床前評価  ＤＰＴ−Ｃ９ｈ
材料および方法
細胞集団の単離
健康な提供者からの新鮮な血液を、Etablissement Francais du Sangにより採取した。ＣＬＬおよび骨髄試料は、治験倫理委員会（institutional ethics committee）に承認されたプロトコルに従って、Hematology Serviceから入手した。
【００７３】
末梢血（ＰＢＭＣ）から単離した単球細胞は、Ficoll勾配遠心分離により調製した。
【００７４】
Ｔ細胞は、抗ＣＤ３ Dynal磁性ビーズによる陽性選択を用いてＰＢＭＣから単離した。
【００７５】
Ｂ細胞および単球は、Dynal陰性単離キット（Invitrogen）を用いて単離した。
【００７６】
ＮＫ細胞は、ＮＫセル・アイソレーションキットＩＩ（Miltenyi Biotec）、非接触ＮＫ細胞の単離のための間接磁性標識システムを用いて単離した。
【００７７】
単離したＴ細胞、Ｂ細胞、単球細胞およびＮＫ細胞の純度は、最大９５％に達した。
【００７８】
アネキシン染色によるアポトーシス検出
合計２．５×１０５細胞を、氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷冷結合バッファーで希釈し、アネキシンおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。試料は氷上、暗所で１０分間維持し、次いでフロウサイトメトリーにより分析した。
【００７９】
ペプチド合成および配列
ＮＨ２−ビオチン化ペプチドは、自動マルチペプチド合成装置で、固相法および標準的なＦｍｏｃ化学により合成した。ペプチドの純度および組成は、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析により確認した。
【００８０】
結果
ＣＣＬ患者におけるＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドの効果
本発明者らは、ＰＢＭＣにおけるアポトーシスを誘導するためのＤＰＴ−Ｃ９ｈの能力を分析した。図４および５は、ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドが、ＣＬＬ患者由来の初代Ｂ細胞において透過性およびアポトーシス性の特徴を示すが、健康な提供者由来のものでは示さないことを表す。さらに、ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドは、ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞さらにヒト単球では効果を示さない。
【００８１】
ＣＬＬ耐性患者におけるＤＰＴ−Ｃ９ｈの効果
興味深いことに、ＤＰＴ−Ｃ９ｈは、従来の化学療法治療に耐性なＣＬＬ患者由来のＢ細胞において、アポトーシスを誘導することができる（図６）。ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドは、従来の化学療法治療に耐性なＣＬＬ患者由来のＴ細胞およびＮＫ細胞および単球に対して効果を示さない。
【００８２】
骨髄細胞に対するＤＰＴ−Ｃ９ｈの効果
図７で示されるように、ＤＰＴ−Ｃ９ｈは、ＣＬＬ患者由来の骨髄Ｂ細胞における細胞透過性およびアポトーシス性活性を有し、健康な提供者由来の骨髄Ｂ細胞に対して効果を示さない。ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドは、ＣＬＬ患者由来の骨髄Ｂ細胞にも健常患者由来の骨髄Ｂ細胞に対しても、効果を示さない。
【００８３】
乳癌のインビボ・ヒト異種移植片に対する、および乳癌細胞系に対するＤＰＴ−Ｃ９ｈの効果
最終的に、図８で示されるように、ＤＰＴ−Ｃ９ｈは乳癌のインビボ・ヒト異種移植片から単離された細胞系、ならびに乳癌細胞系ＭＣＦ７において劇的なアポトーシス効果を示した。
【００８４】
結論
上記の結果は、ＤＰＴ−Ｃ９ｈが健康な細胞と腫瘍細胞とを区別することができることを示す。このＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドの健康な提供者とＣＬＬ患者との間の選択的効果は、おそらく、他のパートナーとの会合により誘導される複合体、ＰＰ１／カスパーゼ−９／ＰＰ２Ａｃ複合体の立体構造変化に因るものであろう。
【００８５】
最終的に、ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドは、少なくとも１８時間、培養培地中で安定であることが示された。
【００８６】
引用文献
-Ayllon, C. Martinez-A. A. Garcia, X. Cayla, and A. Rebollo (2000). Protein phosphatase 1-a is a Ras-activated Bad phosphatase that regulates IL-2 deprivation-induced apoptosis. EMBO J. 19: 1-10.
-Deng X, Gao F, and W. Stratford May. Dephosphorylation and up-regulation of Bcl2-p53 binding Protein phosphatase 2A inactivates Bcl-2's antiapoptotic function by dephosphorylation and up-regulation of Bcl2-p53 binding. Blood. 2009 Jan 8;113(2):422-8.
-Dessauge, X. Cayla, A. Fleischer, A. Ghadiri, M. Duhamel, and A. Rebollo: Caspase-9-dependent apoptosis is induced by serine/threonine phosphatase PP1a. J. Immunol. 2006. 177, 2441-2451.
-Frank, R. and Overwing, H. 1996. Spot synthesis: epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membrane. Meth. Mol. Biol. 66, 149-169.
-Gausepohl, H., Boulin, C., Kraft, M. and Frank, R.W. (1992) Automated multiple peptide synthesis. Pept Res, 5, 315-320.
-Garcia, X. Cayla, J. Guergnon, F, Dessauge, V, Hospital, MP, Rebollo, A, Fleischer, A. Rebollo. Serine/threonine protein phosphatases PP1 and PP2A are key players in apoptosis. Biochimie. (2003) 85 :721-726.
-Guergnon, F. Dessauge, V. Dominguez, J. Viallet, X. Cayla, A. Rebollo, V.Yuste, S.Susin, PE. Bost and A. Garcia Use of penetrating peptides interacting with PP1/PP2A proteins as a basis for a new Drug Phosphatase Technology. Mol. Pharmacol. (2006) 69: 1115-1124. 
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【図１】
2013504518.tif 000006
【図２】
2013504518.tif 000007
【図３】
2013504518.tif 000008
【図４】
2013504518.tif 000009
【図５】
2013504518.tif 000010
【図６】
2013504518.tif 000011
【図７】
2013504518.tif 000012
【図８】
2013504518.tif 000013
【配列表】
2013504518000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月29日(2011.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013504518000001.app
【国際調査報告】
2013504518.tif 000014
2013504518.tif 000015
2013504518.tif 000016