(57)【要約】  本発明は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法に関する。本発明の方法は、２−アルキル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸（２位のアルキル置換基は、エチルまたはメチルである）を使用する。本発明は、特にＮＭＲによるタンパク質の分析に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質および生体分子集合体中のバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法であって、
ａ）タンパク質を過剰発現する細菌を含有する培地中に、以下の式：
【化１】
2013516452.tif 000036
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有するアセトラクテートの誘導体を導入するステップを含む方法。
【請求項２】
ｂ）培地中に含有される細菌によりタンパク質を過剰発現させるステップと、
ｃ）タンパク質を精製するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アセトラクテート誘導体が、式Ｉ（式中、
Ｒ１は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ２は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ、１２ＣＨ３１２ＣＤ２、１２ＣＤ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１３ＣＤ２、１３ＣＤ３１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１２ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１２ＣＤ２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アセトラクテート誘導体が、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
を有する化合物からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アセトラクテート誘導体が、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸
を有する化合物の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アセトラクテート誘導体が、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸
の化合物の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
以下の式Ｉ−１：
【化２】
2013516452.tif 000037
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
の化合物。
【請求項８】
式Ｉ−１（式中、
Ｒ１は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ２は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ、１２ＣＨ３１２ＣＤ２、１２ＣＤ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１３ＣＤ２、１３ＣＤ３１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１２ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１２ＣＤ２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
の化合物の中から選択される式Ｉ−１の請求項７または８に記載の化合物。
【請求項１０】
以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸
の化合物の中から選択される式Ｉ−１の請求項７または８に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸
の化合物の中から選択される式Ｉ−１の請求項７または８に記載の化合物。
【請求項１２】
式Ｉ：
【化３】
2013516452.tif 000038
の化合物を製造するための方法であって、
ａ）炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基により、保護基、好ましくはメチルまたはエチル基で保護された１位にヒドロキシル基を有する３−オキソブタノエート誘導体をアルキル化するステップと、
ｂ）ステップａ）において得られた化合物をヒドロキシル化するステップと、
ｃ）必要に応じて、脱保護して２Ｈ原子で所望の１Ｈ原子を交換するステップと
を含み、
ヒドロキシル化するステップｂ）は、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でジメチルジオキシランを用いることにより行われる方法。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法により、分析するタンパク質を標識化するステップを含む、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法。
【請求項１４】
以下の式Ｉ：
【化４】
2013516452.tif 000039
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法。
【請求項１５】
以下の式Ｉ−１：
【化５】
2013516452.tif 000040
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質および生体分子集合体中のバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法、より具体的には、ロイシンおよびバリンのメチル基の立体特異的標識化、ならびにイソロイシンのγ２メチル基の特異的標識化のための方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、本方法において使用される特異的メチル標識化２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸および２−エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸（以下においてアセトラクテート誘導体と呼ばれる）、ならびにそのような特異的メチル標識化アセトラクテート誘導体を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＮＭＲ分光法は、構造決定のための、および低ナノモル範囲から数ミリモル範囲にわたる親和性と複合した生体分子相互作用をマッピングするための、確立された有効な方法である。
【０００４】
しかしながら、近年高分子量タンパク質のＮＭＲ分光法が発達しているものの、ＮＭＲスペクトルの低い分解能は、１メガダルトンまでの分子量を有するタンパク質等の巨大分子集合体へのこの方法の適用に対する主要な制限因子となっている。この発達は、新たな同位体標識化スキームの開発に強く関連している。完全に過重水素化されたタンパク質中のメチル基の選択的プロトン化と、横緩和最適化メチル分光法（メチル−ＴＲＯＳＹ）との組合せにより、局所構造および１メガダルトンまでの動的タンパク質集合体を、溶液ＮＭＲ分光法により調べることができるようになった。
【０００５】
そのような標識化プロトコルは、過重水素化培地中の唯一のプロトン源としての特異的［１Ｈ１３Ｃ］メチル標識化生合成前駆体の添加に依存している。
【０００６】
この手法は、検出可能な同位体スクランブリングなしに高レベルのメチルプロトン化を提供する。
【０００７】
バリン（Ｖａｌ）およびロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）は、メチル基がタンパク質において利用可能な全メチルプローブの５０％超を占めるため、非常に興味深いアミノ酸である。
【０００８】
過重水素化タンパク質中のＬｅｕおよびＶａｌメチル基のプロトン化は、一般に、そのようなアミノ酸の生合成における中間体であるメチルプロトン化２−オキソ−３−メチルブタン酸（以下でα−ケトイソバレレートと呼ばれる）を使用して達成される。
【０００９】
しかしながら、特に３０ｋＤａから１メガＤａの巨大タンパク質の場合、この標識化方法は、非常に多くのＮＭＲ可視メチルプローブに起因して、［１Ｈ１３Ｃ］関連スペクトルの過密化をもたらし得る。ＮＭＲスペクトルにおける重複は、部位特異的構造または緩和パラメータの測定を大きく複雑化し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄ．Ｎｅｒｉ、Ｔ．Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ、Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ、Ｈ．Ｓｅｎｎ、Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９、２８、７５１０〜７５１６頁
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／
【非特許文献３】Ｖ．Ｔｕｇａｒｉｎｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ２００４、２８、１６５〜１７２頁
【非特許文献４】Ｒ．Ｌｉｃｈｔｅｎｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４、１２６、５３４８〜５３４９頁
【非特許文献４】Ｓｏｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７、１２９、４７２〜４７３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、組換え過重水素化タンパク質中のバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法、より具体的には、ロイシン、バリンおよびイソロイシンのメチル基の標識化のための方法を提供することにより、この方法の欠点を克服することを目的とする。
【００１２】
この方法は、［１３Ｃ１Ｈ］−メチルＴＲＯＳＹスペクトルの分解能および感度の大幅な向上を提供し、巨大タンパク質における長距離にわたる構造的に重要な距離制限を検出するための能力を拡張する。この方法は、特に、巨大生体分子集合体内の分子間相互作用の調査に有用である。
【００１３】
さらに、この方法は、非標識化および標識化前駆体（グルコースまたはピルベート）の混合物を使用した従来の方法と比較して、低分子量および中分子量（すなわち１００ｋＤａ未満）のタンパク質に対し、ロイシンおよびバリンアミノ酸のメチル基の立体特異的帰属の大幅な改善を可能とする。この最近の方法は、Ｄ．Ｎｅｒｉ、Ｔ．Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ、Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ、Ｈ．Ｓｅｎｎ、Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９、２８、７５１０〜７５１６頁に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的のために、本発明は、タンパク質および生体分子集合体中のＶａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法、より具体的には、ＬｅｕおよびＶａｌのメチル基の立体特異的標識化、ならびにイソロイシンのγ２メチル基の特異的標識化のための方法であって、
ａ）タンパク質を過剰発現する細菌を含有する培地中に、以下でアセトラクテート誘導体とも呼ばれる、以下の式：
【００１５】
【化１】
2013516452.tif 000002
【００１６】
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有する２−アルキル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸（２位のアルキル置換基は、エチルまたはメチルである）を導入するステップを含む方法を提案する。
【００１７】
式Ｉ中、Ｘは、溶媒の性質に依存して１Ｈまたは２Ｈであってもよい交換可能な水素である。
【００１８】
この方法は、
ｂ）培地中に含有される細菌によりタンパク質を過剰発現させるステップと、
ｃ）タンパク質を精製するステップと
をさらに含む。
【００１９】
本発明の標識化方法の第１の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、式Ｉ（式中、
Ｒ１は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ２は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ、１２ＣＨ３１２ＣＤ２、１２ＣＤ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１３ＣＤ２、１３ＣＤ３１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１２ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１２ＣＤ２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有する。
【００２０】
本発明の標識化方法の第２の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
を有する化合物の群から選択される。
【００２１】
本発明の標識化方法の第３の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸
を有する化合物の群から選択される。
【００２２】
本発明の標識化方法の第４の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸
の化合物の群から選択される。
【００２３】
本発明はまた、以下の式Ｉ−１：
【００２４】
【化２】
2013516452.tif 000003
【００２５】
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
の化合物を提案する。
【００２６】
本発明の好ましい化合物は、式Ｉ−１（式中、
Ｒ１は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ２は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ、１２ＣＨ３１２ＣＤ２、１２ＣＤ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１３ＣＤ２、１３ＣＤ３１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１２ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１２ＣＤ２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
を有する化合物からなる群から選択される。
【００２７】
式Ｉのアセトラクテート誘導体の活性部分は、実際は以下の式：
【００２８】
【化３】
2013516452.tif 000004
【００２９】
（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｒ１およびＲ２は、式ＩおよびＩ−１の化合物に関して定義された通りである）
のアニオンであることに留意されたい。
【００３０】
第１の好ましい実施形態において、本発明の式Ｉ−１の化合物は、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
の化合物の中から選択される。
【００３１】
第２の好ましい実施形態において、本発明の式Ｉ−１の化合物は、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸
の化合物の中から選択される。
【００３２】
第３の好ましい実施形態において、本発明の式Ｉ−１の化合物は、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸
の化合物の中から選択される。
【００３３】
本発明はまた、以下の式Ｉ：
【００３４】
【化４】
2013516452.tif 000005
【００３５】
の化合物を製造するための方法であって、
ａ）炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基により、保護基、好ましくはメチルまたはエチル基で保護された１位にヒドロキシル基を有する３−オキソブタノエート誘導体をアルキル化するステップと、
ｂ）ステップａ）において得られた化合物をヒドロキシル化するステップと、
ｃ）必要に応じて、脱保護して２Ｈ原子で所望の１Ｈ原子を交換するステップと
を含み、
ヒドロキシル化するステップｂ）は、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でジメチルジオキシランを用いることにより行われる方法を提案する。
【００３６】
さらに、本発明はまた、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法を提案する。
【００３７】
第１の実施形態において、この方法は、本発明の標識化方法により、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。
【００３８】
第２の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ：
【００３９】
【化５】
2013516452.tif 000006
【００４０】
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。
【００４１】
第３の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ−１：
【００４２】
【化６】
2013516452.tif 000007
【００４３】
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下の説明を読めば、本発明がより良く理解され、また本発明の他の特徴および利点がより明確となる。
【００４５】
本発明の説明において、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００４６】
Ｖａｌは、アミノ酸バリンを示す。
【００４７】
Ｌｅｕは、アミノ酸ロイシンを示す。
【００４８】
Ｉｌｅは、アミノ酸イソロイシンを示す。
【００４９】
Ｃ（イタリック体）は、１３Ｃを示す。
【００５０】
Ｃは、１２Ｃを示す。
【００５１】
Ｄは、２Ｈを示す。
【００５２】
Ｈは、１Ｈを示す。
【００５３】
ｐｒｏＲ、ｐｒｏＳ：それぞれ非標識化ＬｅｕおよびＶａｌアミノ酸のγおよびβ炭素上のメチル基は同じであり、結果としてそれぞれ非標識化ＬｅｕおよびＶａｌアミノ酸のγおよびβ炭素はキラルではない。しかしながら、基Ｒ１およびＲ２が式Ｉのアセトラクテート誘導体において同じ様式で標識化されていない場合、結果的にそれぞれＬｅｕおよびＶａｌのγおよびβ炭素上のメチル基は異なって標識化され、この差により、それぞれＬｅｕおよびＶａｌのγおよびβ炭素はキラルとなる。これらのメチル基は、標識化がＲ配置を生じる場合ｐｒｏＲと示され、標識化がＳ配置を生じる場合ｐｒｏＳと示される。
【００５４】
「アセトラクテート誘導体」は、式Ｉの化合物およびその対応するエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルを示す。
【００５５】
生体分子集合体：タンパク質および他の基を含有する分子である。
【００５６】
本発明の標識化方法は、特異的に標識化されたメチルまたはエチル基を有するアセトラクテート誘導体の使用に基づく。これらのアセトラクテート誘導体は、対象タンパク質（複数可）を過剰発現する細菌を含有する培地中に導入される。
【００５７】
換言すれば、本発明の方法は、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅ生合成の初期段階中に生体内で生じるアセトラクテート誘導体中の標識化または非標識化アルキル基の立体特異的再配列に基づく。
【００５８】
タンパク質中のバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸のメチル基の特異的同位体標識化のための、本発明の提案される方法は、
ａ）タンパク質を過剰発現する細菌を含有する培地中に、以下の式：
【００５９】
【化７】
2013516452.tif 000008
【００６０】
（式中、
Ｘは、溶媒の性質に依存して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）である交換可能な水素であり、すなわち、Ｘは、溶媒がＨ２Ｏである場合１Ｈであり、Ｘは、溶媒がＤ２Ｏである場合２Ｈであり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有するアセトラクテートの誘導体を導入するステップを含む。
【００６１】
次いで、この方法は、対象タンパク質（複数種可）を過剰発現させるための培地を培養するステップと、タンパク質（複数種可）を精製および単離するステップとを含む。
【００６２】
好ましくは、式Ｉのアセトラクテート誘導体は、以下の式：
（Ｒ１は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ２は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ、１２ＣＨ３１２ＣＤ２、１２ＣＤ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１３ＣＤ２、１３ＣＤ３１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１２ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１２ＣＤ２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物からなる群から選択される。
【００６３】
これらのアセトラクテート誘導体は、以下の式１〜５７（式中、
（１３Ｃ）メチルは、メチル基の炭素原子が１３Ｃであることを意味し、
（１３Ｃ２）エチルは、エチル基の２個の炭素原子が１３Ｃであることを意味し、
２Ｈｎ（ｎ＝１、２、３、４または５である）は、ｎ個の水素原子が２Ｈであることを意味し、
Ｕは、全ての炭素原子が１３Ｃであることを意味する）：
１＝２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソブタン酸、
３＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
８＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１６＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
１８＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
１９＝２−（１’−（２Ｈ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２０＝２−（（１’−（２Ｈ２），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２３＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２５＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２６＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
２８＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（（２Ｈ５）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
２９＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３０＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
３１＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
３２＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３３＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（２’−（２Ｈ），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３５＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
３８＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４１＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
４２＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
４３＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
４４＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４８＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
５０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
５１＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２）−２’−（２Ｈ），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
５２＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
５３＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
５４＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
５５＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
５６＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
５７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸
を有する。
【００６４】
本発明の化合物の式をより良く例示するために、化合物１〜１８の発展した式を以下に示す。
【００６５】
これらの式中、Ｘは、２Ｈまたは１Ｈを示し、Ｄは、２Ｈを示し、Ｃ(イタリック体)は、１３Ｃを示し、Ｃは、１２Ｃを示す。
【００６６】
【化８】
2013516452.tif 000009
2013516452.tif 000010
2013516452.tif 000011
2013516452.tif 000012
2013516452.tif 000013
【００６７】
より具体的には、式１の化合物が本発明の方法において使用される場合、プロトン化メチル基はバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）であり、１２ＣＨ３である。
【００６８】
従って、この化合物により、ＬｅｕおよびＶａｌアミノ酸を含有するタンパク質の構造的研究を行うことができる。この化合物を用いた標識化により、アミノ酸ＶａｌおよびＬｅｕの立体特異性を決定することができ、また３０ｋＤａ未満のタンパク質において、０．０５Ｈｚまでの低さの弱い双極子およびスカラー相互作用を検出することもできる。
【００６９】
この式１の化合物（２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）−ブタン酸）により、以下の様式で、タンパク質中に組み込まれたアミノ酸ＬｅｕおよびＶａｌを標識化することができる。
【００７０】
【化９】
2013516452.tif 000014
【００７１】
この式１の化合物が、３００ｍｇ／ｌのこの式１の化合物を使用した重水素化Ｍ９培地中での大腸菌細胞を用いたヒトユビキチンおよび連鎖球菌のタンパク質Ｇ（ＧＢ３）の生成に使用される場合、これらのタンパク質内でＶａｌおよびＬｅｕのｐｒｏＳメチル基のみがプロトン化され、次いで得られた化合物のＮＭＲ  １Ｄスペクトルにおいて観察することができる。
【００７２】
式２の化合物（２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソブタン酸）により、１２ＣＨ３でＬｅｕおよびＶａｌのｐｒｏＲメチル基を立体特異的に標識化することができる。この化合物により、３０ｋＤａ未満のタンパク質において、構造的研究、立体特異的帰属、ならびに弱い双極子およびスカラー相互作用の検出をＮＭＲで行うことができる。
【００７３】
化合物２によるこれらのメチル基の立体特異的標識化は、アミノ酸ＬｅｕおよびＶａｌの以下の標識化をもたらす。
【００７４】
【化１０】
2013516452.tif 000015
【００７５】
この式２の化合物を含有する培地の培養により得られるタンパク質のＮＭＲ  １Ｄスペクトルにおいて、ロイシンおよびバリンのｐｒｏＲメチル基、より正確にはバリンのγ１メチル基およびロイシンのδ１メチル基のみを観察することができる。
【００７６】
式３の化合物により、１２ＣＨ３でＩｌｅのγ２メチル基を特異的に標識化することができる。この化合物により、３０ｋＤａ未満のタンパク質において、構造的研究、特異的帰属、ならびに弱い双極子およびスカラー相互作用の検出をＮＭＲで行うことができる。
【００７７】
式３の化合物（２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸）によるＩｌｅのγ２メチル基の標識化を、以下のスキームに示す。
【００７８】
【化１１】
2013516452.tif 000016
【００７９】
この化合物により、タンパク質および生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。
【００８０】
式４の化合物により、１３ＣＨ３でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を立体特異的に標識化することができる。この化合物により、タンパク質および巨大生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。
【００８１】
式４の化合物（２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸）によるバリンおよびバリンのｐｒｏＳメチル基の立体特異的標識化を、以下のスキームに示す。
【００８２】
【化１２】
2013516452.tif 000017
【００８３】
式４の化合物が、３００ｍｇ／Ｌの式４の化合物の存在下で重水素化Ｍ９培地中で大腸菌細胞を用いて生成された、４６８ｋＤａの１２量体プロテアーゼであるＴＥＴ２（Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＳＴＥＴ２）、およびリンゴ酸シンターゼＧ（ＭＳＧ）（Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＳＭＳＧ）の立体特異的標識化に使用される場合、得られる化合物のメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、メチル基の共鳴の半分のみを観察することができることを示す。
【００８４】
式５の化合物（２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸）により、１３ＣＨ３でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を立体特異的に標識化することができる。
【００８５】
この化合物により、タンパク質および巨大生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。
【００８６】
この式５の化合物による標識化は、以下のスキームに示されるように標識化されたアミノ酸ロイシンおよびバリンをもたらす。
【００８７】
【化１３】
2013516452.tif 000018
【００８８】
式５の化合物が、３００ｍｌ／Ｌの式５の化合物の存在下で重水素化Ｍ９培地中で大腸菌細胞を用いて生成された、４６８ｋＤａの１２量体プロテアーゼであるＴＥＴ２（Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＲＴＥＴ２）を得るために使用される場合、得られる化合物のメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、２個のメチル基上でプロトン化されるイソバレレートから生成されるＴＥＴ２のスペクトルと比較して、メチル基の共鳴の半分のみを示す。
【００８９】
式６の化合物（２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（１３Ｃ）メチルブタン酸）により、１３ＣＨ３でイソロイシンのγ２メチル基を標識化することができる。
【００９０】
この化合物により、タンパク質および巨大生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。
【００９１】
この化合物は、以下のスキームに示されるように標識化された（Ｌ）−イソロイシンをもたらす。
【００９２】
【化１４】
2013516452.tif 000019
【００９３】
３００ｍｇ／Ｌの式６の化合物の存在下で重水素化Ｍ９培地中で生成された、４６８ｋＤａの１２量体プロテアーゼであるＴＥＴ２（Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｉｌｅ−［１３Ｃ１Ｈ３］γ２ＴＥＴ２）のメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、イソロイシンのγ２メチル基のみを示す。
【００９４】
式７の化合物（Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸）により、タンパク質および巨大生体分子集合体中のバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を、液体ＮＭＲで立体選択的に帰属させることができる。
【００９５】
この化合物は、ロイシンおよびバリンの以下の標識化をもたらす。
【００９６】
【化１５】
2013516452.tif 000020
【００９７】
式８の化合物（Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソブタン酸）により、タンパク質および巨大生体分子集合体中のバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を、液体ＮＭＲで立体選択的に帰属させることができる。
【００９８】
式８の化合物は、タンパク質および生体分子集合体中のロイシンおよびバリンアミノ酸の以下の標識化をもたらす。
【００９９】
【化１６】
2013516452.tif 000021
【０１００】
式９の化合物（１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸）により、タンパク質および生体分子集合体中のイソロイシンのγ２メチル基を、液体ＮＭＲで帰属させることができる。
【０１０１】
イソロイシンは、以下に示されるように標識化される。
【０１０２】
【化１７】
2013516452.tif 000022
【０１０３】
式１０の化合物（２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸）により、１３ＣＤＨ２でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を立体特異的に標識化することができる。
【０１０４】
この化合物は、液体ＮＭＲによるタンパク質の２Ｈ動力学的研究に使用することができる。
【０１０５】
以下のスキームは、アミノ酸ロイシンおよびバリンがこの式１０の化合物で標識化される様式を示している。
【０１０６】
【化１８】
2013516452.tif 000023
【０１０７】
式１１の化合物（２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸）により、１３ＣＤＨ２でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を立体特異的に標識化することができる。
【０１０８】
この化合物は、液体ＮＭＲによるタンパク質の２Ｈ動力学的研究に使用することができる。この化合物は、以下のスキームに示す様式で、アミノ酸ロイシンおよびバリンを標識化する。
【０１０９】
【化１９】
2013516452.tif 000024
【０１１０】
式１２の化合物（２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸）により、１３ＣＤＨ２でイソロイシンのγ２メチル基を特異的に標識化することができる。
【０１１１】
この化合物は、液体ＮＭＲによるタンパク質の２Ｈ動力学的研究に使用することができる。
【０１１２】
式１２の化合物は、以下のスキームに示されるように（Ｌ）−イソロイシンを標識化する。
【０１１３】
【化２０】
2013516452.tif 000025
【０１１４】
式１３の化合物（２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸）により、１３ＣＨＤ２でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を立体特異的に標識化することができる。
【０１１５】
この化合物は、タンパク質の固体ＮＭＲ、および液体ＮＭＲによるタンパク質の動力学的研究に使用することができる。
【０１１６】
以下のスキームは、化合物１３がタンパク質中のロイシンおよびバリンを標識化する様式を示す。
【０１１７】
【化２１】
2013516452.tif 000026
【０１１８】
式１４の化合物（２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸）により、１３ＣＨＤ２でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を立体特異的に標識化することができる。
【０１１９】
この化合物は、タンパク質の固体ＮＭＲ、および液体ＮＭＲによるタンパク質の動力学的研究に使用することができる。
【０１２０】
この化合物は、以下のスキームに示されるようにロイシンおよびバリンを標識化する。
【０１２１】
【化２２】
2013516452.tif 000027
【０１２２】
式１５の化合物（２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸）により、１３ＣＨＤ２でタンパク質中のイソロイシンのγ２メチル基を特異的に標識化することができる。
【０１２３】
この化合物は、タンパク質の固体ＮＭＲ、および液体ＮＭＲによるタンパク質の動力学的研究に使用することができる。
【０１２４】
この化合物は、以下のスキームに示されるようにイソロイシンを標識化する。
【０１２５】
【化２３】
2013516452.tif 000028
【０１２６】
式１６の化合物（Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸）は、タンパク質の固体ＮＭＲに使用することができる。
【０１２７】
この化合物により、以下のスキームに示されるように、タンパク質中のバリンおよびロイシンの炭素鎖を、ならびに１３ＣＨＤ２でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を標識化することができる。
【０１２８】
【化２４】
2013516452.tif 000029
【０１２９】
式１７の化合物（Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸）は、タンパク質の固体ＮＭＲに使用することができる。
【０１３０】
この化合物により、以下のスキームに示されるように、タンパク質中のロイシンおよびバリンの炭素鎖を、ならびに１３ＣＨＤ２でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を標識化することができる。
【０１３１】
【化２５】
2013516452.tif 000030
【０１３２】
式１８の化合物（１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸）は、タンパク質の固体ＮＭＲに使用することができる。
【０１３３】
この化合物により、以下のスキームに示されるように、タンパク質中の炭素鎖を、および１３ＣＨＤ２でイソロイシンのγ２メチル基を標識化することができる。
【０１３４】
【化２６】
2013516452.tif 000031
【０１３５】
要約すると、式Ｉのアセトラクテート誘導体のうち、
１）ＮＭＲシグナルの帰属および／または構造的制限の測定により適切な誘導体は、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
を有し、
２）液体ＮＭＲによる動力学的研究、および固体ＮＭＲにおける使用に好ましく使用される誘導体は、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸
の化合物であり、また、
３）２Ｈ  ＮＭＲによる動力学的研究においては、好ましい式Ｉのアセトラクテート誘導体は、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸
を有する。
【０１３６】
式４の化合物を使用して、ＮＭＲ分光法により３Ｄ構造が決定されている最大モノマータンパク質（８２ｋＤａ）であるリンゴ酸シンターゼＧ（ＭＳＧ）に本発明の標識化方法を適用した。
【０１３７】
本発明の化合物４の存在下で大腸菌で過剰発現した特異的プロトン化ＭＳＧのメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルを、２−オキソ−３−（２Ｈ３）−３−（２Ｈ）−４−（１３Ｃ）−ケトイソバレレートの存在下で大腸菌で過剰発現したＭＳＧのメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルと比較した。
【０１３８】
これらのスペクトルの直接比較は、α-ケトイソバレレートを本発明の化合物と置き換えると、ＮＭＲスペクトルの感度が１．６倍（理論的には２倍）増加し、ピーク数が２つ減少することを示している。
【０１３９】
合成２−（１３Ｃ）メチル−４−（２Ｈ３）−アセトラクテート（式４の化合物）を使用してタンパク質を調製すると、Ｖａｌ−γ２およびＬｅｕ−δ２メチル基のシグナルのみを観察することができる。
【０１４０】
Ｖａｌ−γ１およびＬｅｕ−δ１メチル基のシグナルが存在しないことは、２−（Ｓ）−アセトラクテートの２位における１３Ｃ１Ｈ３メチル置換基が、生体内において、ケトール−イソメラーゼにより２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートのｐｒｏＳ位に立体特異的に移動すること、また、Ｌｅｕ／Ｖａｌ生合成経路の後続の段階においてメチル相互交換が生じないことを裏付けている。
【０１４１】
さらに、ＣＨ２ＤおよびＣＤ２Ｈアイソトポマーのシグナルは検出されなかったが、これは、Ｍ９／Ｄ２Ｏ培地へのアセトラクテートの導入後にＨ／Ｄ交換が生じないことを実証している。最後に、他のメチン、メチレンまたはメチル部位へのスクランブリングは検出されなかったが、これは、過剰のアセトラクテートが生体内で他の代謝経路に干渉しないことを示している。
【０１４２】
したがって、特異的に標識化されたアセトラクテートの使用は、検出可能なスクランブリングなしに、完全に過重水素化されたタンパク質バックグラウンドにおけるＬｅｕおよびＶａｌ側鎖の完全および立体特異的メチル標識化を実現するための効率的な方法である。
【０１４３】
アセトラクテート誘導体は、他の代謝経路内に組み込まれないため、これらの誘導体は、Ｉｌｅ−［ＣＨ３］δ１またはＡｌａ−［ＣＨ３］βメチル基の特異的標識化に提案されるもの等の他の前駆体と組み合わせて都合良く使用することができる。
【０１４４】
この新たな標識化スキームの明らかな第１の用途は、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅのメチル基の立体特異的帰属である。
【０１４５】
メチル共鳴を連続的に帰属された骨格核に関連付けるための効率的な方法が存在するものの、プロキラルメチル基の立体特異的帰属は依然として困難である。従来の手法では、断片的［１３Ｃ］標識化方法または小さいスカラーカップリングの測定が関与していた。
【０１４６】
これらの手法は、低分子量および中分子量のタンパク質には有用であることが示されているが、より大きなタンパク質へのその適用は困難である。それと比較して、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅメチル基の立体特異的帰属は、本発明による式４の化合物を用いて生成された特異的プロトン化タンパク質に対して記録された２Ｄメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルを視覚的に調べることにより、直接得ることができる。
【０１４７】
この方法は、Ｌｅｕ／Ｖａｌメチル基の９８％が立体特異的に明白に帰属されたＭＳＧ（８２ｋＤａ）に対して実証されるように、巨大タンパク質に直接適用可能である。
【０１４８】
メチル基の特異的プロトン化は、タンパク質における長距離にわたる距離制限を抽出するための有効な方法である。
【０１４９】
巨大タンパク質に対して、メチル間ＮＯＥの抽出は、一般に、１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ４Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルの低い固有分解能により妨げられる。
【０１５０】
本発明の方法によるプロキラルメチル基の立体特異的標識化を使用したスペクトルの単純化は、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒ  Ｈａｕｓｅｒ効果（ＮＯＥ）クロスピークの分析における曖昧さを大きく低減する。
【０１５１】
ｐｒｏＳおよびｐｒｏＲメチル基の間のＮＯＥは、立体特異的に標識化された試料を用いては検出されない。しかしながら、２−オキソ−３−（２Ｈ３）−３−（２Ｈ）−４−（１３Ｃ）−ケトイソバレレートの代わりに本発明の化合物４を使用すると、ｐｒｏＳメチル基のプロトン化レベルが理論的に２倍増加し、一方これは残りのＮＯＥクロスピークの強度を理論的に４倍増加させる。
【０１５２】
この感度の増幅は、より離れたｐｒｏＳメチル基間の構造的に重要な長距離にわたる新たなＮＯＥクロスピークの検出をもたらし、これにより、ｐｒｏＲメチル基が関与するＮＯＥの損失を補償する。
【０１５３】
４Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルから抽出された距離制限を比較すると、Ｌｅｕ／Ｖａｌメチル基の立体特異的標識化により、ＮＯＥが検出され得る距離閾値が約２０％増加することが明らかとなった。メチル基のプロキラル特異的標識化は、ＮＯＥ分析の時間を要するステップを単純化するための魅力的な手法であるだけでなく、巨大タンパク質において測定され得る構造的に重要な１Ｈ−１Ｈ距離の範囲を大きく拡張させる。
【０１５４】
本発明の方法はまた、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸の特異的同位体標識化、より具体的には、ＬｅｕおよびＶａｌのメチル基の特異的標識化、ならびにイソロイシンのγ２メチル基の特異的標識化に使用することができる。
【０１５５】
本発明の別の目的は、以下の式Ｉ−１：
【０１５６】
【化２７】
2013516452.tif 000032
【０１５７】
（式中、
Ｘは、溶媒の性質に依存して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）である交換可能な水素であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
のアセトラクテート誘導体である。
【０１５８】
本発明の好ましい化合物は、式Ｉ−１（式中、
Ｒ１は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ２は、以下の基：
１２ＣＨ３、１２ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＤ３、１３ＣＨＤ２、１３ＣＨ２Ｄ、１２ＣＨ３１２ＣＤ２、１２ＣＤ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１２ＣＤ２、１３ＣＨ３１３ＣＤ２、１３ＣＤ３１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２１２ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ１２ＣＤ２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
を有する。
【０１５９】
本発明の好ましい化合物は、以下の式２〜５７の化合物である。
２＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソブタン酸、
３＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
８＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１６＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
１８＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
１９＝２−（１’−（２Ｈ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２０＝２−（（１’−（２Ｈ２），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２３＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２５＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２６＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
２８＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（（２Ｈ５）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
２９＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３０＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
３１＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
３２＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３３＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（２’−（２Ｈ），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３５＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
３８＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４１＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
４２＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
４３＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
４４＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４８＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
５０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
５１＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２）−２’−（２Ｈ），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
５２＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
５３＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
５４＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２）ブタン酸、
５５＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ）ブタン酸、
５６＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
５７＝Ｕ−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸。
【０１６０】
これらの化合物のうち、以下の式の化合物が好ましい。
４＝２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（２Ｈ３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
３７＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
４６＝３，４−（１３Ｃ）−２−（２Ｈ５，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（１３Ｃ）−２−（１’−（２Ｈ２），１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸。
【０１６１】
しかしながら、さらに他の好ましい化合物は、以下の式を有する。
１３＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ２，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ２，１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（２Ｈ２），２’−（２Ｈ），２’−（１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸。
【０１６２】
本発明による他の好ましいアセトラクテート誘導体は、以下の式を有する。
１０＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ，１３Ｃ）ブタン酸。
【０１６３】
本発明はまた、式１、より具体的には式１〜１８の化合物を製造するための方法であって、
ａ）炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基により、保護基、好ましくはメチルまたはエチル基で保護された１位にヒドロキシル基を有する３−オキソブタノエートをアルキル化するステップと、
ｂ）ステップａ）において得られた化合物をヒドロキシル化するステップと、
ｃ）必要に応じて、脱保護して２Ｈ原子で所望の１Ｈ原子を交換するステップと
を含み、
ヒドロキシル化するステップｂ）は、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でジメチルジオキシランを用いることにより行われる方法を提案する。
【０１６４】
本発明の方法によるヒドロキシル化するステップｂ）により、方法の全収率を９０％超まで改善することができ、一方、先行技術により示唆されるように、このヒドロキシル化ステップを、触媒としてのコバルトまたはセリウムイオンの存在下で酸素分子を用いて行うと、方法の全収率は、他のいずれかのステップが変更されない限り、わずか約５０％である。
【０１６５】
本発明の標識化方法は、生体分子集合体に含まれるものを含むタンパク質のＮＭＲによる分析に特に適切である。
【０１６６】
したがって、本発明はまた、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法を提案する。
【０１６７】
第１の実施形態において、この方法は、本発明の標識化方法により、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。
【０１６８】
第２の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ：
【０１６９】
【化２８】
2013516452.tif 000033
【０１７０】
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。
【０１７１】
第３の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ−１：
【０１７２】
【化２９】
2013516452.tif 000034
【０１７３】
（式中、
Ｘは、１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して１２Ｃまたは１３Ｃであり、
Ｒ１は、炭素原子が１３Ｃまたは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ２は、炭素原子が１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して１３Ｃもしくは１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して１Ｈもしくは２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ１の水素原子およびＲ２の水素原子は、同時に全てが１Ｈまたは２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ１の全ての水素原子が２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に１２Ｃではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。
【０１７４】
本発明をより良く理解するために、本発明の標識化方法を行う例を以下に示す。この例は、例示のみを目的とし、決して本発明を制限しない。
【実施例】
【０１７５】
１．選択的メチル標識化アセトラクテートの合成
エチル２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート
エチル３−オキソブタノエート（Ａ）１２．１５ｍＬ（９５．４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３１４．５ｇ（１０４．９ｍｍｏｌ）およびヨウ化１３Ｃ−メチル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製）１５．０ｇ（１０４．９ｍｍｏｌ）の無水エタノール１２０ｍＬ中の混合物を、アルゴン下で９０時間４０℃に加熱した。濾過後、濾液を真空下で濃縮すると、生成物１２．３０ｇ（収率８９％）が得られたが、これはそれ以上精製することなく使用するのに十分純粋であった。1H NMR (CDCl3); 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.51 (dq, J = 7.2, 4.4 Hz, 1H), 2.25 (s, 3H), 1.35(dd, J = 130.4, 7.2 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
エチル２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート（Ｂ）
新しく調製したジメチルジオキシランにより、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でヒドロキシル化反応を行った。エチル２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート５０ｍｇ（０．３４５ｍｍｏｌ）の蒸留水３ｍＬ中の混合物に、Ｎｉ（ＯＡｃ）２．４Ｈ２Ｏ  ８．６ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）を、および０℃でジメチルジオキシラン（０．０５〜０．１０Ｍ）のアセトン中の未滴定溶液２０ｍＬを続けて添加した。得られた溶液を室温まで温め、２４時間撹拌した。次いで有機溶媒を真空下で蒸発させ、得られた水性残渣をジクロロメタンで抽出した（４回）。有機抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮すると、エチル２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート５１ｍｇ（０．３１７ｍｍｏｌ、収率９２％、変換率＞９０％）が無色液体として得られたが、これはそれ以上精製せずに使用するのに十分純粋であった。
NMR分光法:1H NMR (CDCl3); 4.25(q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.27 (s, 3H), 1.58 (d, 1JH-13C = 130.3 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（２Ｈ３）−ブタノエート（または２−（１３Ｃ）メチル−４−（２Ｈ３）−アセトラクテート）（式４の化合物）
エチル２−ヒドロキシ−２−（１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート（Ｂ）の４位のメチル基の脱保護およびプロトン交換を、ｐＨ１３のＤ２Ｏ中で達成した。典型的には、３００ｍｇのＢを０．１Ｍ  ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏ溶液２４ｍＬに添加した。脱保護は、ＮＭＲ分光法で観察されるように、即時的であった。４−メチルに対する交換の完了もまた、ＮＭＲ分光法によりリアルタイムで追跡した。末端メチル基の９７±１％のプロトンが、３０分後に交換され、一方２位のメチル置換基が、９８±１％のレベルでプロトン化されたままであった。脱保護反応は水酸化物イオンを消費するため、ｐＨ、ひいては重水素交換率は反応中に減少する。交換が完了したら、溶液をＤＣｌで中性ｐＨに調節し、Ｄ２Ｏ中の１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８）２ｍＬを添加した。次いで、式４の化合物の溶液を、必要となるまで−２０℃で保存した。
【０１７６】
【化３０】
2013516452.tif 000035
【０１７７】
２−（１３Ｃ）メチル−４−（２Ｈ３）−アセトラクテートの化学合成のための詳細なプロトコルを上に示す。１３Ｃ核は、イタリック体の太字で示されている。アセトラクテートに１３Ｃ１Ｈ３基を組み込んだ後の、Ｌｅｕ／Ｖａｌ生合成経路の異なる中間体における立体化学が図に示されている（Ｍ９／Ｄ２Ｏ系培地中での成長を想定）。各生合成中間体は、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）に従い命名されている。反応の触媒を担う酵素は、ＥＣ番号で示されている。ＥＣ１．１．１．８６：ケトール酸リダクトイソメラーゼ、ＥＣ４．２．１．９：ジヒドロキシ酸脱水酵素、ＥＣ２．６．１．４２：分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、ＥＣ２．３．３．１３：２−イソプロピルマレートシンターゼ、ＥＣ４．２．１．３３：３−イソプロピルマレート脱水酵素、ＥＣ１．１．１．８５：３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ。Ｌｅｕ／Ｖａｌ代謝経路に関するさらなる情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／でオンラインで見出すことができる。
２．大腸菌におけるメチル立体特異的標識化タンパク質の過剰発現
過剰発現タンパク質へのアセトラクテートの組込みの最適化
ユビキチンをモデル系として使用して、過剰発現タンパク質へのアセトラクテートの組込みレベルを決定するための初期実験を行った。ヒトＨｉｓタグユビキチン（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）遺伝子を有するｐＥＴ４１ｃプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換し、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＵ−［２Ｈ］，Ｕ−［１３Ｃ］，グルコースを含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地中で形質転換細胞を成長させた。６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．８に達したら、未標識化アセトラクテートを含有する溶液を添加した。さらに１時間後、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導した。誘導は、３７℃で３時間行った。Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ社製）クロマトグラフィーによりユビキチンを一段階で精製した。
【０１７８】
過剰発現タンパク質へのほぼ完全な組込みを達成するために必要なアセトラクテートの最適量を、異なる量の非標識化前駆体が０、１００、２００、３００および８００ｍｇ／Ｌの最終濃度まで誘導の１時間前に添加された一連の培地（それぞれ９０ｍＬ）中で算定した。精製タンパク質への組込みレベルを、直接検出１３Ｃ  １Ｄ  ＮＭＲにより監視した。過剰発現タンパク質に前駆体が組み込まれると、１３Ｃ−Ｌ、Ｖ残基は、１２Ｃ側鎖を有するアミノ酸により置き換えられる。定量化は、４つの分離されたＬｅｕ／Ｖａｌメチル共鳴（１９〜２１ｐｐｍ）のシグナルの積分値を、Ｉｌｅ、Ａｌａ（９〜１９ｐｐｍの間）のメチル基のシグナルに対して比較することにより行った。Ｍ９／Ｄ２Ｏ培地１リットル当たり純粋アセトラクテート３００ｍｇを添加することにより、他のアミノ酸生合成経路への検出可能なスクランブリングなしに、Ｌｅｕ／Ｖａｌ側鎖への９５％の組込みレベルが達成される。
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＳタンパク質の生成
過剰発現タンパク質（ＴＥＴ２またはＭＳＧ）のプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ７（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地に、２４時間にわたり３段階で徐々に馴化した。最終的培養において、９９．８５％Ｄ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ社製）で調製したＭ９培地中で細菌を３７℃で成長させた。Ｏ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．８に達したら、２−（１３Ｃ）メチル−４−（２Ｈ３）−アセトラクテート（式４の化合物）を含有する溶液（上述のプロトコルを用いて調製）を添加した。３００ｍｇ／Ｌの最終濃度までアセトラクテートを培地に添加した。１時間後、１ｍＭ（／０．１ｍＭ）の最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりＴＥＴ２（／ＭＳＧ）発現を誘導した。採取前に、３７℃（／２０℃）で３時間（／１２時間）発現を行った。ＭＳＧに対して、６００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＮＭＲ分光器で、Ｄ２Ｏ中３７℃で１３Ｃスペクトルを記録した。１３ＣスペクトルにおいてＬｅｕおよびＶａｌメチル炭素のシグナルのみが観察されたが、これは、アセトラクテートの１３Ｃ１Ｈ３基が他のアミノ酸の代謝経路内に組み込まれなかったことを示している。
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ｉｌｅ−［１３Ｃ１Ｈ３］γ２タンパク質の生成
過剰発現タンパク質（ＴＥＴ２またはＭＳＧ）のプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ７（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地に、２４時間にわたり３段階で徐々に馴化した。最終的培養において、９９．８５％Ｄ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ社製）で調製したＭ９培地中で細菌を３７℃で成長させた。Ｏ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．８に達したら、２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（１３Ｃ）ブタノエート（式６の化合物）を含有する溶液（上述のプロトコルを用いて調製）を添加した。３００ｍｇ／Ｌの最終濃度まで生成物を培地に添加した。１時間後、１ｍＭ（／０．１ｍＭ）の最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりＴＥＴ２（／ＭＳＧ）発現を誘導した。採取前に、３７℃（／２０℃）で３時間（／１２時間）発現を行った。
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３，１２Ｃ２Ｈ３］タンパク質の生成
比較を目的として、ＬｅｕおよびＶａｌメチル基を非立体特異的に１３Ｃ１Ｈ標識化した過重水素化タンパク質の生成を、本発明の前に使用されていたプロトコル、すなわち、Ｖ．Ｔｕｇａｒｉｎｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ２００４、２８、１６５〜１７２頁およびＲ．Ｌｉｃｈｔｅｎｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４、１２６、５３４８〜５３４９頁に記載のプロトコルを使用して達成した。
【０１７９】
このプロトコルは、上述のプロトコルであるが、誘導の１時間前に、３００ｍｇ／Ｌの標識化アセトラクテート（式４の化合物）の代わりに、１２５ｍｇ／Ｌの３−（２Ｈ３）メチル−３−（２Ｈ）−４−（１３Ｃ）−ケトイソバレレート（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を添加した。
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｕ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＳ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ｕ−［１３Ｃ１Ｈ３］−Ａｌａタンパク質の生成
上述の一般的プロトコルを使用して、Ｌｅｕ／Ｖａｌ  ｐｒｏＳメチル基およびＡｌａ位を立体特異的に１３Ｃ１Ｈ標識化した過重水素化タンパク質の生成を達成したが、誘導の１時間前に、３００ｍｇ／Ｌの標識化アセトラクテート（式４の化合物）と共に、８００ｍｇ／Ｌの２−（Ｓ）−２−（２Ｈ）−３−（１３Ｃ）−アラニン（ＣｏｒｔｅｃＮｅｔ社製）を添加した。８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＮＭＲ分光器で、Ｄ２Ｏ中３７℃で２Ｄ１３Ｃ−メチルＴＲＯＳＹスペクトルを記録した。アラニンメチル基ならびにＬｅｕおよびＶａｌ側鎖のｐｒｏＳメチル基の予測されるシグナルに対応するピークのみが観察されたが、これは、アセトラクテート誘導体を使用した標識化が他のメチル標識化プロセスに干渉しないことを示している。
タンパク質精製
最初にキレート化セファロースクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により、続いてゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によりリンゴ酸シンターゼＧ（ＭＳＧ）を精製した。精製後の典型的な最終収率は、６０〜８０ｍｇ／Ｌのメチル特異的プロトン化ＭＳＧであった。典型的なＮＭＲ試料中のＭＳＧの濃度は、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ７．０、非補正）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴを含有する１００％Ｄ２Ｏ緩衝液中１ｍＭであった。ＮＭＲデータは、３７℃で取得した。
【０１８０】
２つの陰イオン交換クロマトグラフィーステップ（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ、およびＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用し、続いてゲル濾過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によりＴＥＴ２を精製した。精製後の典型的な最終収率は、２０ｍｇ／Ｌのメチル特異的プロトン化ＴＥＴ２であった。このようにして調製された試料は、完全に活性であることが実証された（Ｌｅｕ−４−ニトロアニリドを使用した加水分解活性により測定）。ＴＥＴの最終ＮＭＲ試料は、Ｄ２Ｏ３００μＬに溶解した２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４、非補正）、２０ｍＭのＮａＣｌ中の約８０μＭのＴＥＴ２  １２量体（約１ｍＭのモノマー）からなっていた。ＮＭＲデータは、５０℃で取得した。
３．ＮＭＲ分光法
実験の詳細
ユビキチンおよびＭＳＧの全ての１Ｈおよび１３Ｃ  １Ｄ  ＮＭＲスペクトルは、極低温三重共鳴パルス場勾配プローブヘッドを備えた、６００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＶａｒｉａｎ  ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光器で記録した。
【０１８１】
２Ｄメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、極低温三重共鳴パルス場勾配プローブヘッドを備えた、８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＶａｒｉａｎ  ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光器で記録した。ＭＳＧ（／ＴＥＴ２）の１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣは、直接次元（最大ｔ２＝９９ｍｓ（／６０ｍｓ））において１２８８（／７８０）の複合データポイントで、および炭素次元（最大ｔ１＝１２８ｍｓ（／４７ｍｓ））において５１２（／３８０）のポイントで記録した。
【０１８２】
４Ｄ  ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ実験データは、極低温三重共鳴パルス場勾配プローブヘッドを備えた、８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＶａｒｉａｎ  ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光器で記録した。データは、３００ｍｓのＮＯＥ混合時間で、９６時間のＭＳＧの１ｍＭ試料で取得した。実験データは、間接１Ｈ次元（最大ｔ１＝３０ｍｓ）において２０の複合ポイント、第１および第２の炭素次元（最大ｔ２＝２１ｍｓおよびｔ３＝１１ｍｓ）において３６および１８の複合ポイント、ならびに直接次元（最大ｔ４＝８０ｍｓ）において２０１の複合ポイント、また増分当たり４スキャンで収集した。全てのデータは、ｎｍｒＰｉｐｅ／ｎｍｒＤｒａｗおよびＮＭＲＶｉｅｗを使用して処理および分析した。距離は、Ｓｏｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７、１２９、４７２〜４７３頁に記載のように、メチル特異的プロトン化タンパク質における離れたプロトン間のＮＯＥの完全緩和行列解析を用いて定量化した。
Ｌｅｕ／Ｖａｌメチル特異的標識化ＴＥＴ２試料（４６８ｋＤａ）に対して記録されたメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルの比較
３−（２Ｈ３）メチル−３−（２Ｈ）−４−（１３Ｃ）−ケトイソバレレートを使用して調製された、非立体特異的に［１３Ｃ１Ｈ３］−メチル標識化したＵ−［２Ｈ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１２Ｃ２Ｈ３，１３Ｃ１Ｈ３］ＴＥＴ２に対して、および２−（１３Ｃ）メチル−４−（２Ｈ３）−アセトラクテート（式４の化合物）を使用して調製された、立体特異的に標識化したＵ−［２Ｈ］，Ｕ−［１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＳＴＥＴ２に対して、８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＮＭＲ分光器で、Ｄ２Ｏ中５０℃で２Ｄ１３Ｃ−メチルＴＲＯＳＹスペクトルを記録した。非立体特異的標識化スキームを使用したＴＥＴ２集合体の調製では、アマスタチン誘導化学シフト変化の観察を大きく妨げるであろう相当量のクロスピーク重複を有するスペクトルが得られた（アマスタチンは、ＴＥＴ２の阻害剤である）。
【国際調査報告】
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