(57)【要約】  抗アレルギー作用（即ちアレルギー予防及び／又は治療の意味の抗アレルギー作用）を有する非生存型プロバイオティクス組成物を製造するプロセスが開示される。前記プロセスは、（ａ）回分処理を用いて適切な培地中でＬＧＧを培養する工程と、（ｂ）前記培養の段階の対数増殖期後期で前記培養上清を採取する工程と、（ｃ）前記組成物を得るために前記培養上清から液体物を除去する工程と、を含む。さらに、上記工程により得られるタンパク性混合物を含む組成物が開示される。さらに、好ましくは妊娠中の女性、乳児又は幼児用の食事療法用製品及び特定の医療目的の食品に適用される食事慮法用製品における前記組成物の使用が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー疾患の治療又は予防に用いられる、タンパク性混合物を含む組成物であって、前記組成物が、ＬＧＧ（ラクトバチルスＧｏｌｄｉｎ  Ｇｏｒｂａｃｈ乳酸菌）回分培養過程の対数増殖期後期の培養上清から得られることを特徴とする組成物。
【請求項２】
アレルギー疾患の治療又は予防に用いられる前記組成物が、
（ａ）回分処理を用いて適切な培地中でＬＧＧを培養し、
（ｂ）前記培養の段階の対数増殖期後期で前記培養上清を採取し、ここで前記対数増殖期後期は前記ＬＧＧ回分培養過程の誘導期と静止期の間の期間の後半に対応し、
（ｃ）前記培養上清の成分の分子量を６ｋＤａより大きく保つよう、任意的に、前記培養上清から低分子量の成分を除去し、そして
（ｄ）前記組成物を得るために前記培養上清から液体物を除去する
ことによって得られることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記対数増殖期後期が、前記ＬＧＧ回分培養過程の誘導期と静止期の間の期間の後半の四分の一の部分、好ましくは前記対数増殖期の０．７５から０．８５の時間が経過した部分に対応することを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＬＧＧ回分培養がＴｗｅｅｎ８０を含まない培地中で実施され、前記培地が、任意的に、オレイン酸、アマニ油、オリーブ油、菜種油、ヒマワリ油及びこれらの混合物からなる群から選択される油成分を含むことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＬＧＧ回分培養が、中性ｐＨ、好ましくはｐＨ６で、生理的温度、好ましくは３７℃で実施されることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が乾燥された形態、好ましくはスプレー乾燥又は凍結乾燥された形態であることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記培養上清に、マルトデキストリンＤＥ２９などの薬学的に許容されるキャリア物質が添加されていることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン及びミネラルを含む栄養学的に完全な乳児又は幼児用調製粉末において、前記乳児又は幼児用調製粉末が請求項１−７の何れか一項に記載の組成物をさらに含むことを特徴とする乳児又は幼児用調製粉末。
【請求項９】
前記乳児又は幼児用調製粉末の形態が、食事療法用製品、好ましくは栄養製品、であるか又は前記食事療法用製、好ましくは栄養製品、に添加される添加物であることを特徴とする請求項１−７の何れか一項に記載の乳児又は幼児用調製粉末。
【請求項１０】
前記食事療法用製品が、一以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ’ｓ）、好ましくはアラキドン酸（ＡＲＡ）又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ’ｓ）をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の乳児又は幼児用調製粉末。
【請求項１１】
前記食事療法用製品が、タンパク質又は多糖類などの通常母乳中に存在する一以上の生物学的に活性な成分をさらに含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の乳児又は幼児用調製粉末。
【請求項１２】
前記食事療法用製品が、好ましくは消化されにくいオリゴ糖、消化されにくい多糖類及びこれらの混合物からなる群から選択される一以上のプレバイオティクスをさらに含むことを特徴とする請求項９−１１の何れか一項に記載の乳児又は幼児用調製粉末。
【請求項１３】
前記食事療法用製品が、出産前、乳児若しくは幼児用の調製粉乳若しくは栄養組成物若しくはサプリメント又は病人用特別食又は特定の医療目的の食品であることを特徴とする請求項９−１２の何れか一項に記載の乳児又は幼児用調製粉末。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクス菌種であるラクトバチルスＧｏｌｄｉｎ  Ｇｏｒｂａｃｈ乳酸菌（ＬＧＧ）から得られる非生存型(non-viable)生物活性物質の採取方法に関する。特に、本発明は、前記採取方法を用いて得られる抗アレルギー性プロバイオティクス物質を作成するプロセス及び前記プロバイオティクス物質を含む食事療法用製品又は栄養製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルスＧＧ乳酸菌（ラクトバチルスＧ．Ｇ．，菌株ＡＴＣＣ５３１０３）は、ヒトの消化管に自然に存在する細菌である。ラクトバチルスＧＧ乳酸菌は一般的に認識される健康効果に関してよく研究されている細菌である。ラクトバチルスＧＧ乳酸菌はプロバイオティクスとして広く認識され、したがって乳製品、栄養補助食品、調製粉乳などの多くの栄養製品に含まれる。
【０００３】
現在、当該分野において、プロバイオティクスは、適量の摂取により摂取した人の健康に良い効果をもたらす生きた微生物として定義される。しかしながら、プロバイオティクスの生きた性質が原因でプロバイオティクスを栄養製品のなかに取り込もうとする際に課題が生じる。この課題はとりわけ使用されるプロバイオティクス菌種の種類、製品を摂取する個人の健康状態又はその両方への依存の度合いによって異なる。またプロセス技術の観点からも生きた微生物を製品に取り込むには高いハードルを超えなければならない。このことは特に、例えば調製粉乳などの粉末製品のような長期保存製品のなかにプロバイオティクスを取り込もうとする際に重要となる。また、栄養製品の母体の複雑さが増すほど課題も大きくなる。
【０００４】
特に、妊娠中の女性、乳児及び幼児用の栄養製品では、プロバイオティクス細菌の使用における安全性と有効性がさらに議題となる。具体的な安全性の問題に関して、考えられる栄養利用上の効果、抗生物質に対する耐性の変化の排除並びに腸管定着、免疫反応及び感染症への短期及び長期効果が考慮される。このことは、プロバイオティクスが上記の製品に使用できないことを意味するものではないが、生菌又は生存型細菌(viable bacteria)の使用において実用上の複雑さを増す。
【０００５】
一方で、特に乳児及び幼児用の栄養製品の場合、プロバイオティクスの有益な効果の提供に関して重要な要求がある。また、小売販路又は病院を介して入手可能な周囲温度にさらされる栄養製品に含まれる生菌の安定性及び生命力を確保することは、特に難しい。細菌製品の使用において（処理された）培養上清の応用を用いた場合に大きな利点がある。
【０００６】
乳児は成人に比べて腸内の微生物叢が極めて未発達であることが知られている。成人の微生物叢が有害なものと有益なものとを含む１０13個以上５００種類に及ぶ微生物から構成される一方で、乳児の微生物叢にはその何分の一しか含まれない。両者は絶対数であるが種の多様性がある。乳児の腸は、出生時は無菌状態であるが、産道、初期環境及び摂取するものから腸内細菌叢を得る。腸内細菌叢の個体数は新生児初期において非常に不安定であるので、乳児の腸内で有害な細菌と有益な細菌とのデリケートなバランスを維持するのは大抵難しく、したがって免疫システムの正常機能力が低下する。
【０００７】
調製粉乳で育てられた乳児と母乳で育てられた乳児とでは腸内の細菌の種類が異なることから、調製粉乳で育てられた乳児において上記のバランスを維持することは特に難しい。母乳で育てられた乳児の便には主にビフィズス菌が含まれ、まれに連鎖球菌や乳酸菌が含まれる。一方で、調製粉乳で育てられた乳児の細菌叢はより多様であり、ビフィズス菌及びバクテロイデス並びにより病原性種であるブドウ球菌、大腸菌及びクロストリジウム属を含む。母乳で育てられた乳児と調製粉乳で育てられた乳児の便に含まれるビフィズス菌のさまざまな種も異なる。母乳で育てられた乳児と調製粉乳で育てられた乳児とで糞便細菌叢が異なる原因としてさまざまな要因が提示され、そのなかには、母乳に含まれるたんぱく質含有量が少ない及びタンパク質の成分が異なる、母乳に含まれるリン含有量が少ない、母乳に含まれるオリゴ糖の種類が豊富である、母乳に含まれる免疫機能の多数の液性及び細胞仲介物質に関する要因が挙げられる。（非特許文献１）。
【０００８】
正常腸内細菌叢の確立は健康と病気に多大な影響を与える。腸内微生物叢の主な機能は、宿主の観点から考えると、腸への病原体の定着の防止及び病原性となり得る微生物の増殖の抑制であり、これにより腸管内の感染症に対する自然抵抗力が高まる。プロバイオティクスは上記の効果を発揮するために病原性細菌が腸細胞に結合することを防止する。これは抗菌性化合物を産生することにより直接的に達成されるか又は短鎖揮発性脂肪酸の合成を介して腸管腔のｐＨを変えることにより間接的に達成される。
【０００９】
さらに、正常微生物叢は、胃腸免疫を刺激し、粘膜ＩｇＡの産生を促し、抗炎症性サイトカインの局所的産生を刺激し、そしてアレルギー性炎に特徴的な炎症誘発性サイトカインの産生を減少させ得る。食品アレルギー、アトピー性皮膚炎及びアトピーの主な予防法に関する最適な研究を対象とした調査によれば、臨床症状の制御及び局所的及び全身炎症マーカーの減少（非特許文献２、非特許文献３）が示すとおり、プロバイオティクス療法がアレルギー性炎を軽減することが分かった。
【００１０】
上記の観点から、当然のことながら、プロバイオティクスを含む栄養製品、食事療法用製品及び特に乳児用調製粉乳を提供することが一般的に所望される。「乳児用調製粉乳」なる用語は、母乳の代わりに用いられて乳児の栄養要求を満たす組成物を意味する。
【００１１】
また、当然のことながら、特に乳児用調製粉乳においては、生菌又は生存型細菌を取り込むことなくプロバイオティクスを取り込むことが所望される。要するにこれには「非生存型プロバイオティクス」が必要とされる。
【００１２】
そのような非生存型プロバイオティクスの研究が現在行われている。しかしながら、例えばＴａｏらによる論文（非特許文献４）のなかで述べられているように、プロバイオティクスは多くの病気の経過を改善すると考えられるが、プロバイオティクスの作用メカニズムはほとんど解明されていない。最近になって、プロバイオティクスの作用及び宿主細胞との相互作用の背後にあるメカニズムを理解するための試みが行われた。粘液産生の上方調節、上皮バリア機能の改善、ＩｇＡ産生の増大及び腸管上皮上の癒着部をめぐる競争の増大、並びに病原菌の増殖を抑制する有機酸、アンモニア、過酸化水素及びバクテリオシンの産生に関する多くの考えられる異なるメカニズムが提示されてきた。これに関し、ＴａｏらはＬＧＧからの可溶性因子の効果に関する研究を示し、ＬＧＧ−ＣＭ限外ろ過液の低分子量画分（ＭＷ＜１０ｋＤａ）にある程度の生物活性があるという結論に至った。同様の教示が特許文献１に示され、この中では、生きた細菌の代わりに、無菌のプロバイオティクスから得られた組成物であって特に低分子量画分（ＭＷ＜１０ｋＤａ）の組成物を特に炎症性大腸炎（ＩＢＤｓ）の治療に使用する。非生存型プロバイオティクスに関する他の文献として、例えば特許文献２は細菌の消炎作用及びそれから得られる分泌製品に関し、特許文献３には乳酸菌種により得られたペプチドの消炎作用及び抗アレルギー作用に関する。
【００１３】
特許文献４には非病原性微生物から取得可能なタンパク質又は同等のポリペプチドが記載されており、前記タンパク質は粘膜結合活性を有し、分子量が２０−４０ｋＤ、好ましくは２０−３０ｋＤである。この開示の主旨は、特に粘膜結合タンパク質及びポリペプチドを識別するためのスクリーニング法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】公報番号ＵＳ２００７／１２３４６０
【特許文献２】公開番号ＵＳ２００４／２０８８６３
【特許文献３】米国特許第７０５２８９６号
【特許文献４】米国特許第６５０６３８９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Agostoni著, 乳児用の栄養製品に含まれるプロバイオティクス細菌, ＥＳＰＧＨＡＮ栄養学委員会によるコメント, J. Pediatr. Gastro. Nutri, 38:365-374(April 2004)
【非特許文献２】Miraglia del Giudice M, De Luca MG著, 食品アレルギー及びアトピー性皮膚炎の臨床管理におけるプロバイオティクスの役割, J Clin Gastroenterol, 2004, 38(6Suppl):S84-5
【非特許文献３】Prescott S, Bjorksten B著, アレルギー性疾患の予防又は治療のためのプロバイオティクス, J. Allergy Clin. Immunol, 2007;120:255-262
【非特許文献４】Tao et al.著, Am J. Physiol Cell Physiol, 290:C1018-C1030(2006)
【非特許文献５】Baena-Cagnani著, 幼少期のぜんそくにおける食品アレルギーの作用, Allergy. Clin. Immun. 1(2):145-149(2001)
【非特許文献６】Martinez, F.著, 就学前児童における喘鳴及びぜんそくの進行, Pediatr. 109:362-367(2002)
【非特許文献７】Martinez, F.著, 出生後間もない時期におけるウイルス及びアトピー性感作, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162:S95-S99(2000)
【非特許文献８】IHi, et al.著, 出生から７歳までのアトピー性皮膚炎の自然経過及びぜんそくとの関連, Clin. Exp. Allergy 27:28-35(1997)
【非特許文献９】Weil, G., et al.著, 寄生虫病の母親の子供における寄生蠕虫への出産前アレルギー感作, J. Clin. Invest. 71:1124-1129(1983)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記の従来技術文献には、抗アレルギー活性を支持する非生存型プロバイオティクス物質をＬＧＧから得るための適切で簡単な発酵方法及び採取方法は記載されていない。
【００１７】
さらに、分泌型細菌製品の採取には、培地から所望されない成分を奪うことが容易でないという問題がある。これは特に乳児用調製粉乳又は臨床栄養など比較的弱い対象用の栄養製品に関係する。この問題は、培養上清から特定の成分が最初に隔離され、精製され、その後栄養製品の中に適用された場合には生じない。しかしながらより完全な培養上清の使用が望ましく、これによりプロバイオティクス（即ちＬＧＧ）の自然作用がより反映された組成物を提供することができる。しかしながら、現在、特に乳児用調製粉乳などに用いられる非生存型プロバイオティクス物質のベースとして培養上清自体を使用することはできない。したがって、これを解決する方法の提供がさらに所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の一以上の問題に対処するために、本発明は、一側面において、タンパク性混合物を含む組成物であって、前記組成物が、アレルギー疾患の治療又は予防に用いられるものであり、ＬＧＧ回分培養過程の対数増殖期後期の培養上清から得られることを特徴とする組成物を提供する。
【００１９】
別の側面において、本発明は、ＬＧＧ培地から抗アレルギー活性を有する組成物を採取する方法にあえい、該方法は、適切な培地中でＬＧＧを培養し、ＬＧＧ菌数増加の対数増殖期後期を測定し、そして前記対数増殖期後期の培養上清を細菌培養物から分離させる。
【００２０】
さらなる側面において、本発明は、ＬＧＧ回分培養過程の対数増殖期後期において培養上清から得られる非生存型プロバイオティクス組成物を含む食事療法用製品、及び上記組成物の栄養製品の添加物としての使用を提供する。
【００２１】
さらに別の側面において、本発明は、対象のアレルギー疾患の治療又は予防の方法を提供する。前記方法は、ＬＧＧ回分培養過程の対数増殖期後期において培養上清から得られる非生存型プロバイオティクス物質を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】培養した際の経時的なＬＧＧ菌数の増加を示すグラフであり、図１ａはこれを培地の光学濃度（ＯＤ６００）及びｐＨ変化として示したものであり、図１ｂはプレーティング法により測定された菌数を示す。
【図２】ＬＧＧ培養採取の異なる段階（ＭＪ１、ＭＪ２、ＭＪ３）におけるサイトカインＩＬ−１０の産生を示す。
【図３】インビボオボアルブミン（ＯＶＡ）感作の時系列を示し、本発明の組成物の試験には新生児マウスモデルを用いた。
【図４】ＯＶＡモデルが適用されたマウスであって、生きたＬＧＧ及びＬＧＧ上清を含む異なる組成物を用いて経口治療されたマウスの染色した肺組織の顕微鏡画像を示す。
【図５】ＯＶＡアレルギー動物の肺のアレルギー細胞浸潤を表わすグラフであり、ＬＧＧ及びＬＧＧ上清が与えられた両マウスにおける肺洗浄液中のアレルギー（好酸性）細胞の減少を示す。
【図６】図６a−cは、アレルギー疾患の炎症過程に関する三つの異なるサイトカインについてのインビトロ反応を示すグラフであり、データは、ＬＧＧ上清により産生された抑制性（ＩＬ−１０）サイトカインによる優れた刺激を示す。
【図７】本発明のＬＧＧ培養上清の出産前後期の投与についてのインビボ調査の図解である。
【図８】アレルギー反応性の結果を示すグラフであり、本発明のＬＧＧ上清を出産前後期に投与したときに肺洗浄液中のアレルギー（好酸性）細胞が減少したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、広い意味で、ＬＧＧ回分培養から抗アレルギー活性を有する培養上清（「使用済み培地」とも呼ばれる）を採取することができるという見識に基づいている。本発明に関連して、「抗アレルギー」なる用語は「アレルギー予防活動及び抗アレルギー治療活動」の意味を含む。
【００２４】
本発明者は、理論にとらわれることなく、上記活動が、ＬＧＧ回分培養の対数期（対数増殖期）後期に培地中に放出された成分からなる混合物（タンパク性物質を含み、可能性として（エキソ）多糖類物質を含む）に起因すると考える。本明細書ではこの組成物を「本発明の培養上清」と呼ぶ。
【００２５】
ＬＧＧは、健康な人の腸内細菌叢から隔離されたプロバイオティクス菌種である。このことは、本明細書に参照することにより全内容が盛り込まれるＧｏｒｂａｃｈらによる米国特許第５，０３２，３９９号に開示されている。ＬＧＧは大抵の抗生物質に対して耐性があり、酸及び胆汁の存在下で安定であり、人の腸内細菌叢の粘膜細胞に貪欲に付着する。ＬＧＧは多くの人において１−３日間生存し、対象の３０％においては最大７日間生存する。定着能に加え、ＬＧＧは粘膜免疫反応に有益な影響を及ぼす。ＬＧＧは、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション寄託機関に受入番号ＡＴＣＣ５３１０３として寄託されている。
【００２６】
細菌の回分培養において認識されている段階は当業者に周知である。これらの段階は、「誘導期」、上記の「対数増殖期」（「対数期」又は「指数期」）、「静止期」及び「死滅期」（又は「対数減少期」）である。生菌が存在する全ての段階において、細菌は培地から栄養素を代謝して培地中に物質を分泌（付与、放出）する。増殖期の与えられた時点における分泌物の組成は通常予想できない。
【００２７】
本発明において、分泌物は対数増殖期後期に採取される。対数増殖期後期は、対数増殖期中期（対数増殖期の持続期間の中間時点であり、したがって対数増殖期後期は誘導期と静止期の間の期間の後半を指す）の後に起こる。特に本明細書で用いる「対数増殖期後期」なる用語は、ＬＧＧ回分培養過程の誘導期と静止期の間の期間の後半の四分の一の部分を指す。本発明によれば、好ましくは対数増殖期において７５％から８５％が経過した時点で培養上清を採取し、最も好ましくは対数増殖期の約５／６が経過した時点で培養上清を採取する。
【００２８】
「培養」又は「育てる」なる用語は、適切な培地の上又は中での微生物の増殖を指し、微生物とはこの場合ＬＧＧである。そのような培地は種類がさまざまであり、当該分野の慣例では特に培養液である。好ましい培養液は、例えば乳酸菌の培養に一般的に用いられるＭＲＳ培養液である。ＭＲＳ培養液は一般的にポリソルベート、アセテート、マグネシウム及びマンガンを含み、これらは栄養分に富んだベースであり乳酸菌の特別な増殖要因として作用することが知られている。典型的な組成物には、カゼインから得られるペプトンが１０．０、肉エキスが８．０、酵母エキスが４．０、Ｄ（＋）ブドウ糖が２０．０、リン酸水素二カリウムが２．０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０が１．０、クエン酸三アンモニウムが２．０、酢酸ナトリウムが５．０、硫酸マンガンが０．０４含まれる（量の単位はｇ／リットル）。
【００２９】
本発明の培養上清の使用は乳児用調製粉乳としての使用が好ましい。本明細書において、本発明を完全利用するために、ＬＧＧ培地から採取された組成物がそのような調製粉乳において望ましくない又は法的に禁止された成分（培地中に存在する可能性がある）を含まないことを確保することが望ましい。ＭＲＳ培養液中に通常存在するポリソルベートを参照すると、細菌培養用の培地は、乳化非イオン界面活性剤、例えばポリエトキシレートソルビタン(polyethoxylated sorbitan)及びオレイン酸がベースのもの（典型的に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０などのＴｗｅｅｎ（登録商標）ポリソルベートとして入手可能）を含み得る。これらの界面活性剤はアイスクリームなどの食品に大抵含まれており、一般的に安全と認識されているものの、上記した界面活性剤の全てが法的権限の管轄内で望ましいとされているわけではなく、あるいは乳児用調製粉乳又は臨床栄養などの比較的弱い対象用の栄養製品中の使用に許されているわけでもない。
【００３０】
したがって本発明は、好ましい実施形態において、上記のポリソルベートの使用を回避した培地の使用にも関連する。そのために、本発明の好ましい培地は、Ｔｗｅｅｎ８０を含まず、且つオレイン酸、アマニ油、オリーブ油、菜種油、ヒマワリ油及びこれらの混合物のなかから選択される油成分を含んでもよい。当然のことながら、ポリソルベート界面活性剤を実質的に又は完全に含まない場合に油成分の利益が十分に得られる。
【００３１】
最も好ましくは、ＭＲＳ培養液はＴｗｅｅｎ８０を含まず、且つ上記した油のうちの一以上並びにペプトン（典型的に１０ｇ／Ｌ）、肉エキス（典型的に８ｇ／Ｌ）、酵母エキス（典型的に４ｇ／Ｌ）、Ｄ（＋）ブドウ糖（典型的に２０ｇ／Ｌ）、リン酸水素二カリウム（典型的に２ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム三水和物（典型的に５ｇ／Ｌ）、クエン酸三アンモニウム（典型的に２ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（典型的に０．２ｇ／Ｌ）及び硫酸マンガン四水和物（典型的に０．０５ｇ／Ｌ）を含む。
【００３２】
前記培養は一般的に２０℃から４５℃、好ましくは３５℃から４０℃、そして最も好ましくは３７℃の温度で実施される。
【００３３】
培養上清を採取する培養中の好ましい時点、即ち上記の対数増殖期後期中の時点、は、例えばＯＤ６００ｎｍ及びブドウ糖濃度に基づいて決定することができる。ＯＤ６００ｎｍとは６００ｎｍにおける光学濃度であり、これは培地中の細菌濃度と互いに直接関係する周知の濃度測定である。
【００３４】
上記の事項に加え、ＬＧＧを含む乳酸菌の回分培養は当業者にとって一般常識である。したがってこれらの方法についてのさらなる説明は本明細書では不要である。
【００３５】
好ましくは、本発明の組成物は大規模発酵作用（例えば１００Ｌ以上の発酵装置、好ましくは約２００Ｌ以上の発酵装置が用いられる）により製造される。
【００３６】
本発明の組成物は、細菌培養から培養上清を分離する任意の周知技法を用いて採取ができる。そのような技法は当該分野において周知であり、例えば遠心分離、ろ過、沈殿などを含む。
【００３７】
上清はすぐに使用されてもよくあるいは将来使用するために貯蔵されてもよい。後者の場合、上清は通常冷蔵、冷凍又は凍結乾燥される。上清は所望に応じて濃縮又は希薄できる。
【００３８】
本発明に基づいて採取された組成物はタンパク性組成物を含むと考えられる。「タンパク性」なる用語は当業者に周知であり、組成物に一以上のペプチド、タンパク質又はアミノ酸残基を含む他の化合物が含まれることを示す。
【００３９】
化学物質に関して、本発明の培養上清の組成物は、さまざまな分子量の複数のアミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質からなる混合物である。前記組成物は多糖類構造をさらに有すると考えられる。
【００４０】
本発明は、従来技術と異なり、好ましいことに完全な即ち未分画の培養上清に関連する旨を強調しておく。上記の対数増殖期後期における採取の賢明な選択及び上清のほぼ全成分の保持はこれを用いた際の驚くべき結果の取得に寄与すると考えられ、特に抗アレルギー活性の観点、より具体的には妊娠中及び授乳中の女性に出産前後期に投与した際の乳児及び新生児における抗アレルギー活性の観点から、驚くべき結果が得られると考えられる。
【００４１】
完全な培養上清とは、より具体的には、おおまかに６ｋＤａよりも低い低分子量の成分がほぼ除去されたものを指す。このことは、組成物が好ましくは乳酸及び／又は乳酸塩を含まないという事実に関係する。したがって本発明の好ましい上清は分子量が６ｋＤａよりも大きく、これは乳酸及び乳酸塩を除去して得られる典型的な上清である。これは通常、ろ過又はカラム・クロマトグラフィーを伴う。実際、このろ過による残余分は分子量の範囲が６ｋＤａよりも大きいものである（言い換えると、６ｋＤａよりも小さな成分はろ過される）。
【００４２】
本発明の上清の組成物は、通常はタンパク性であるだけではなく多糖類特にエキソ多糖類（ＬＧＧにより産生される糖残留物からなる高分子量ポリマー）をも含む。本発明者は、理論にとらわれることなく、対数増殖期中期又は静止期などのその他の段階から採取された組成物と比べて、上記の対数増殖期後期から採取されたタンパク性物質の量と炭水化物物質の量の比が抗アレルギー作用に寄与すると考える。
【００４３】
本発明に基づき採取された培養上清は、発見された抗アレルギー活性から利益を得るようさまざまな形態で使用することができる。そのような使用は、通常、本発明の組成物をこの組成物を必要とする対象に何らかの形で投与することを伴う。これに関し、培養上清は、例えば経口投与のためにカプセルに入れられて使用されてもよく、又は飲み物などの液体栄養組成物に入れられて使用されてもよく、又は培養上清はさらなる使用の前に処理されてもよい。後者が好ましい。
【００４４】
そのような処理は、通常、上清の全体的に液体である連続相からタンパク性組成物を分離することを伴う。これは、好ましくは、スプレー乾燥、又は冷凍乾燥（凍結乾燥）などの乾燥法を用いて行われる。スプレー乾燥が好ましい。スプレー乾燥法の好ましい実施形態では、スプレー乾燥を行う前に、マルトデキストリンＤＥ２９などのキャリア物質が添加される。このことは、乳酸（ＬＧＧから産生され、使用済み培地中に存在する）が液体であるような条件下での乾燥粉末の作成の観点からも有利と考えられる。
【００４５】
本発明の組成物は、抗アレルギー（予防及び／又は治療の）活性を有することが分かっている。抗アレルギー活性は、例えば新しく開発されたアレルギー感作及び肺炎症の新生児マウスモデルを用いて測定される。このモデルは、実際には、いわゆるＯＶＡモデルを適用するものであり、ＯＶＡモデルはアレルギー疾患及びぜんそくの免疫病理学の研究並びに抗アレルギー活性がある化合物の識別に広く用いられている。アレルギー疾患には、これらに限定されないが、ぜんそく（アレルギーによるものを含む）、アトピー性湿疹（これもアレルギーによるものを含む）、食品アレルギー並びにアレルギー性鼻炎及び結膜炎が含まれる。
【００４６】
本発明の組成物が有益な抗アレルギー作用を発揮するために、本発明の組成物は、対象、好ましくは人間によって消化される。特に、好ましい実施形態では前記対象は妊娠中の女性、授乳中の女性、新生児、乳児又は幼児である。上記したように、「非生存型プロバイオティクス」物質を使用する利点は、乳児用の栄養製品において最も大きな利益を得る。「乳児」なる用語は生後約一歳未満の人間を意味する。
【００４７】
当然ながら、対象による消化には本発明の組成物の経口投与が必要となる。本発明に係る組成物の投与の形態は重要ではない。いくつかの実施形態では、組成物は、タブレット、丸薬、カプセル化、カプレット、ジェルカプセル、カプセル、油滴又は小袋を用いて対象に投与される。別の実施形態では、組成物は糖類、油脂、多糖類で包まれる。
【００４８】
さらに別の実施形態では、組成物は食品又は飲料製品に添加され摂取される。食品又は飲料製品は、継続調製粉乳、成長期の牛乳、飲み物、牛乳、ヨーグルト、フルーツジュース、フルーツから作られるジュース、チュアブル錠、クッキー、クラッカー又は粉ミルクなどの幼児用栄養製品でもよい。他の実施形態では、製品は乳児用調製粉乳又は母乳強化剤などの乳児用栄養製品でもよい。
【００４９】
別個の調剤の形であるいは栄養食品を介して添加された本発明の組成物は、通常はアレルギーの治療又は予防に対する有効量が投与される。有効量は、一日当たり体重一キロ当たりのプロバイオティクス生菌の細胞相当量で好ましくは１ｘ１０4から約１ｘ１０12個に相当し、より好ましくは１０8から１０9に相当する。細胞相当量への逆算は十分当業者の知識の範囲内である。
【００５０】
本発明の組成物が乳児用調製粉乳を介して投与された場合、乳児用調製粉乳は栄養学的に完全で且つ適切な種類及び量の脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン及びミネラルを含む。脂質又は脂肪は典型的に約３から約７ｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。脂質源は任意の周知のもの又は当該分野で用いられるものでよく、例えばヤシ油、大豆油、パームオレイン、ココナツ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド油、高オレイン酸ベニバナ油などの植物油である。タンパク質の量は典型的に約１から約５ｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。タンパク質源は任意の周知のもの又は当該分野で用いられるものでよく、例えば無脂肪乳、乳漿タンパク、カゼイン、大豆タンパク、（部分的又は広範囲にわたって）加水分解されたタンパク質、アミノ酸などである。タンパク質の量は典型的に約８から約１２ｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。炭水化物源は任意の周知のもの又は当該分野で用いられるものでよく、例えば乳糖、ブドウ糖、固体状コーンシロップ、マルトデキストリン、ショ糖、でんぷん、固体状ライスシロップなどである。
【００５１】
便利なことに、市販の出産前、早期、乳児及び幼児用の栄養製品を用いてもよい。例えば、Ｅｘｐｅｃｔａ（登録商標）Ｅｎｆａｍｉｌ（登録商標）、Ｅｎｆａｍｉｌ（登録商標）早期調製粉乳、Ｌａｃｔｏｆｒｅｅ（登録商標），Ｎｕｔｒａｍｉｇｅｎ（登録商標），Ｇｅｎｔｌｅａｓｅ（登録商標），Ｐｒｅｇｅｓｔｉｍｉｌ（登録商標），ＰｒｏＳｏｂｅｅ（登録商標），Ｅｎｆａｋｉｄ（登録商標），Ｅｎｆａｓｃｈｏｏｌ（登録商標），Ｅｎｆａｇｒｏｗ（登録商標），Ｋｉｎｄｅｒｃａｌ（登録商標）（米国インディアナ州エバンズビルにあるＭｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙから販売されている）に、本発明の組成物の適切なレベルを補充して本発明の方法の実施において使用してもよい。
【００５２】
一実施形態において、本発明の組成物を一以上の生存型プロバイオティクスと組み合わせてもよい。当該分野で周知の任意の生存型プロバイオティクスは本実施形態に受け入れられ目的の結果を達成する。
【００５３】
生存型プロバイオティクスを本発明の組成物と組み合わせて投与する場合、生存型プロバイオティクスの量は一日当たり体重一キロ当たり約１ｘ１０4から１ｘ１０12コロニー形成単位（ｃｆｕ）に相当してもよい。別の実施形態では、生存型プロバイオティクスは一日当たり体重一キロ当たり約１ｘ１０6から１ｘ１０12ｃｆｕでもよい。さらに別の実施形態では、生存型プロバイオティクスは一日当たり体重一キロ当たり約１ｘ１０9ｃｆｕでもよい。さらに別の実施形態では、生存型プロバイオティクスは一日当たり体重一キロ当たり約１ｘ１０10ｃｆｕでもよい。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の組成物を一以上のプレバイオティクスと組み合わせてもよい。「プレバイオティクス」とは、プロバイオティクスの成長及び／又は活動を促進する消化されにくい食品成分を意味する。当該分野で周知の任意のプレバイオティクスは本実施形態に受け入れられ所望の結果を達成する。本発明に有用なプレバイオティクスは、乳糖、グルコオリゴ糖、イヌリン、ポリデキストロース、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、乳果オリゴ糖、キシロオリゴ糖及びゲンチオオリゴ糖を含んでもよい。
【００５５】
本発明のさらに別の実施形態では、乳児用調製粉乳はＬＣＰＵＦＡｓなどのその他の活性剤を含んでもよい。適切なＬＣＰＵＦＡｓは、これらに限定されないが、［アルファ］リノール酸、［ガンマ］リノール酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）及び／又はドコサヘキサエン酸を含む。実施形態では本発明の組成物はＤＨＡと組み合わせて投与される。別の実施形態では本発明の組成物はＡＲＡと組み合わせて投与される。さらに別の実施形態では本発明の組成物はＤＨＡ及びＡＲＡの両方と組み合わせて投与される。ＤＨＡ，ＡＲＡ又はこれらの組み合わせを含む市販の乳児用調製粉乳に本発明の組成物を補充して本発明で使用してもよい。例えば、ＤＨＡ及びＡＲＡの有効量を含むＥｎｆａｍｉｌ（登録商標）ＬＩＰＩＬ（登録商標）は、市販されており、これに本発明の組成物を補充して本発明に利用してもよい。ＡＲＡを含む場合、本発明の実施形態におけるＡＲＡの有効量は典型的に一日当たり体重一キロ当たり約５ｍｇから約１５０ｍｇである。本発明の一実施形態では、この量は一日当たり体重一キロ当たり約１０ｍｇから約１２０ｍｇの間でさまざまである。別の実施形態では、この量は一日当たり体重一キロ当たり約１５ｍｇから約９０ｍｇの間でさまざまである。さらに別の実施形態では、この量は一日当たり体重一キロ当たり約２０ｍｇから約６０ｍｇの間でさまざまである。乳児用調製粉乳を利用する場合、乳児用調製粉乳中のＤＨＡの量は約５ｍｇ／１００ｋｃａｌから約８０ｍｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。本発明の一実施形態ではＤＨＡの量は約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌから約５０ｍｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまであり、そして別の実施形態では約１５ｍｇ／１００ｋｃａｌから約２０ｍｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。本発明のある実施形態ではＤＨＡの量は約１７ｍｇ／１００ｋｃａｌである。乳児用調製粉乳を利用する場合、乳児用調製粉乳中のＡＲＡの量は約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌから約１００ｍｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。本発明の一実施形態ではＡＲＡの量は約１５ｍｇ／１００ｋｃａｌから約７０ｍｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。別の実施形態ではＡＲＡの量は約２０ｍｇ／１００ｋｃａｌから約４０ｍｇ／１００ｋｃａｌの間でさまざまである。本発明のある実施形態ではＡＲＡの量は約３４ｍｇ／１００ｋｃａｌである。乳児用調製粉乳を利用する場合、乳児用調製粉乳に当該分野で周知の標準技法を用いてＤＨＡ及びＡＲＡを含む油を補充してもよい。例えば、調製粉乳中に通常存在する高オレイン酸ヒマワリ油などの油を同量のＤＨＡ及びＡＲＡと置き換えることにより調製粉乳に添加してもよい。別の例として、ＤＨＡ及びＡＲＡを用いることなく調製粉乳中に通常存在する残りの全ての脂質の混合を同量のＤＨＡ及びＡＲＡを含む油と置き換えて調製粉乳に添加してもよい。ＤＨＡ及びＡＲＡの供給源は利用する場合には当該分野で周知の任意のものでよく、例えば水産油、魚油、単細胞油、黄卵脂質、脳脂質などでよい。いくつかの実施形態では、ＤＨＡ及びＡＲＡは、単細胞Ｍａｒｔｅｋ油、ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）又はそのバリエーションから得られる。ＬＣＰＵＦＡ源の残りが乳児に大きな悪影響を与えないならばＤＨＡ及びＡＲＡは自然形態でもよい。あるいは、ＤＨＡ及びＡＲＡを精製した形態で使用してもよい。本発明の実施形態では、ＤＨＡ及びＡＲＡの供給源は、参照により全開示が本明細書に盛り込まれる米国特許第５，３７４，５６７号、第５，５５０，１５６号及び第５，３９７，５９１号に教示された単細胞油である。しかしながら、本発明はそのような油にのみ限定されない。一実施形態ではＥＰＡを含むＬＣＰＵＦＡ源を本発明の一以上の組成物と組み合わせて使用する。別の実施形態ではＥＰＡを実質的に含まないＬＣＰＵＦＡ源を本発明の一以上の組成物と組み合わせて使用する。例えば、本発明の一実施形態では、１００ｋｃａｌ当たり約１６ｍｇよりも少ないＥＰＡを含む乳児用調製粉乳に本発明の組成物を補充する。別の実施形態では、１００ｋｃａｌ当たり約１０ｍｇよりも少ないＥＰＡを含む乳児用調製粉乳に本発明の組成物を補充する。さらに別の実施形態では、１００ｋｃａｌ当たり約５ｍｇよりも少ないＥＰＡを含む乳児用調製粉乳に本発明の組成物を補充する。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、微量のＥＰＡも含まない本発明の組成物が補充された乳児用調製粉乳である。本発明の組成物をＤＨＡ及び／又はＡＲＡと共に提供することにより、これらの物質を含む調製粉乳の抗アレルギー作用に関して補完的又は相乗的効果が得られると考えられる。
【００５７】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の栄養製品は、通常母乳に含まれる一以上の生物活性物質、例えばタンパク質又は多糖類など、を含む。
【００５８】
本発明の組成物は、好ましくはアレルギー及び／又はその症状を予防、軽減、改善、又は治療するために使用される。
【００５９】
アレルギーは「正常時には耐性があり通常は無害である物質に対する異常な過敏症」として定義される。アレルギーの症状は鼻水からアナフィラキシーショックに及ぶ。５０００万人近いアメリカ人がアレルギー疾患に苦しんでおり、この疾患の発症は増加している。
【００６０】
アレルギー反応は二つの基本的な段階を伴う。第一段階では、アレルゲンへの即時型過敏反応の初期段階が発展する。アレルゲンが免疫システムと最初に接触した時にはアレルギー反応は起こらない。代わりに、免疫システムは自ら次のアレルゲンとの接触に対して準備する。スカベンジャー細胞でありいわゆる樹枝状細胞であるマクロファージは、侵入してきたアレルゲンを囲んで破壊する。前記細胞は次にその細胞壁上のアレルゲン片を体の免疫反応の主要なオーケストレーターであるＴリンパ球に提示する。この認識信号及び種々の非認識信号（例えばサイトカイン）は、天然型Ｔ細胞を活性化させて、Ｔ細胞をＴ細胞エフェクター亜集団へ分化させるよう指示する。アレルギー性カスケード反応のキープレーヤーはＴｈ−２表現型（ＴＨ−２）のＴ細胞である。ＴＨ−２型Ｔ細胞は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を含む種々のサイトカインの分泌により特徴づけられる。サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１３は、次にＢリンパ球を活性化させて、特定のアレルゲンに対する亜網Ｅの抗体（ＩｇＥ）を産生する。エフェクター細胞（マスト細胞及び好塩基球）の表面上の特定のＩｇＥ抗体とアレルゲンとの相互作用は、即時型過敏反応の初期段階を引き起こす。
【００６１】
このマスト細胞活性化は、通常アレルゲンへの第二の又はさらなる暴露の後数分以内で生じる。感作段階中に生成されたマスト細胞上のＩｇＥ抗体はアレルゲンを認識して侵入物と結合する。アレルゲンが受容体と結合すると、マスト細胞中の顆粒が中身を放出する。この中身即ちメディエータは、ヒスタミン、血小板活性化因子、プロスタグランジン、サイトカイン及びロイコトリエンなどの炎症性物質である。これらのメディエータが実際にアレルギー攻撃を引き起こす。ヒスタミンは粘液生成を促進させて充血、腫れ及び炎症を引き起こす。プロスタグランジンは気道を収縮させるとともに血管を拡張する。
【００６２】
アレルギー性免疫反応の第二段階の特徴は、アレルゲンへの暴露の後に好酸球などの炎症細胞が気道に浸透することである。感作と炎症の間の重要な関連は、ＩｇＥ合成に係るだけでなく好酸球補充、活性化及び生存にも関与するメディエータを分泌するＴ細胞によって代表される。組織マスト細胞及び隣接細胞は化学伝達物質を生成し、この化学伝達物質は、循環好塩基球、好酸球及びその他の細胞に対してその組織に移動して異物と戦う助けをするよう信号を送る。好酸球は、炎症を持続させて組織破壊を引き起こし、そして自らさらなる免疫細胞を補充する化学物質を分泌する。この段階はアレルゲン暴露の後数時間から数日の間に生じ、数時間あるいは数日間続く。
【００６３】
呼吸アレルギーは特殊な種類のアレルギーであり気道に影響を及ぼす。鼻から肺への気道の内壁は構造が似ており、多くの場合アレルギー性プロセスによる同様の影響を受ける。したがって、鼻又は洞に影響を及ぼすアレルゲンは肺にも影響御及ぼす可能性がある。
【００６４】
例えば、花粉症とも知られるアレルギー性鼻炎は、空気中のアレルゲンに対する鼻及び気道の粘膜のアレルギー反応が原因で起こる。アレルギー性鼻炎の症状は、多くの場合、鼻、のど及び目のかゆみ並びに過度のくしゃみである。多くの場合その後に続いて鼻づまりや鼻水が生じる。
【００６５】
気道の一部の領域のアレルゲンは気道の他の領域に影響を与え得るので、鼻孔中の鼻炎は肺の下気道で生じる一層深刻な疾患であるぜんそくにつながる可能性がある。ぜんそくの特徴は、気道過敏性、息切れ、息を吐く時の喘鳴、空咳及び胸苦しさの発生である。繰り返されるアレルゲン暴露により気道内の炎症免疫反応が持続し、結果として気道がリモデリングされて一般的に知られる慢性ぜんそくとなる。アレルギー性鼻炎をもつ全ての人がぜんそくの症状を発症するわけではないが、多くの人、特に再発性の治療されていないアレルギーを持つ人において、肺炎症移行がみられる。アレルギー性鼻炎を持つ人の約四十パーセントが実際に本格的なぜんそくを発症する。
【００６６】
アレルギー性鼻炎を伴う鼻炎が鼻洞に到達した場合、鼻洞が自ら細菌を取り除けない副鼻腔炎又は鼻副鼻腔炎とよばれる不快な感染症を引き起こす可能性がある。その症状は、鼻づまり、鼻水、のどの痛み、発熱、頭痛、倦怠感及び咳並びに前頭部及び頬の後ろの痛み、さらには歯やあごの痛みを含む。
【００６７】
呼吸アレルギーは最も多い子供の病気の一つである。成人と同様に、子供の呼吸アレルギーは最も多い傾向としてアレルギー性鼻炎及びぜんそくの形で表れる。
【００６８】
呼吸アレルギーの予防は乳児や幼児において特に重要であり、なぜならアレルゲンへの初期アレルギー感作が正常な免疫反応の成熟の遅れと関連するからである。また一般的にアレルギー感作はアトピー性疾患の発症の第一段階と考えられる。非特許文献５参照。多くの場合、年少期に発症したぜんそくはアトピーと関連し、したがって初期アレルギー感作は持続型ぜんそくにも大きく関与すると考えられる。非特許文献６参照。
【００６９】
アレルギー感作とぜんそくの間に強い関連があるだけでなく、この関連は年齢に依存するとも考えられる。生まれてから最初の数年のうちにアレルゲン感作する幼児は少ないものの、この期間に感作した幼児の大部分が後年ぜんそくに似た症状を発症する。非特許文献７参照。したがって、初期アレルギー感作及びアレルギー反応性を予防する方法を見つけて後年の呼吸アレルギーを予防することは重要である。
【００７０】
健康と病気の多くの側面は幼年期だけでなく妊娠中にも決定されることを示す証拠が増えている。このことは、出生時の免疫反応が最初の感作現象である子宮内暴露と関係するようなアレルギー疾患において特にそうである。例えば、アレルゲンに特有のＴ細胞が出生時にすでに存在し、且つ食品に対する初期感作が呼吸アレルギーの後年の発症についての予測因子として認識される。非特許文献８参照。加えて、肺の発達は受精後非常に早いうちにはじまり、出生後少なくとも二年又は三年間続く。したがって、出産前及び出産後の気道の発達が、乳児及び幼児における呼吸アレルギーの原因において重要となる。
【００７１】
さらに、ヒトの胎児は、妊娠初期にＩｇＥ産生Ｂ細胞を発達させるとともに、さまざまな胎内感染において観測されるＩｇＭ反応と同様にして適当な抗原に応じて活性化ＩｇＥ抗体を産生することができることも示されている。非特許文献９参照。このことは、出産前及び出産後両方のアレルギー感作の予防が、呼吸アレルギーに対して重要であることをも示している。
【００７２】
呼吸アレルギーに対する従来の薬には、抗ヒスタミン剤、局所鼻用ステロイド薬、充血除去剤及びクロモリン溶液がある。従来の薬に代わる薬として、プロバイオティクスが特定の種類のアレルギーを改善する治療法となる可能性が浮上した。生きた又は生存型プロバイオティクスの使用における上記欠点に関して、本発明は、製品中のアレルギー疾患及び／又はその症状を予防、軽減、改善又は治療する機能を果たすそのようなプロバイオティクスを置き換えることができる点で特に有益である。これを達成するために、組成物は、好ましくは食事療法製品又は栄養製品を介して投与され、より好ましくは出産前、乳児若しくは幼児用調製粉乳若しくは栄養組成物、病人用特別食又は特定の医療目的の食品（即ち限定された医療目的が標示付き食品）を介して投与され、最も好ましくは上記のとおり乳児用調製粉乳又は妊娠中若しくは授乳中の女性用の出産前後期の栄養製品を介して投与される。さらに、本発明はプロバイオティクスを改善された方法で提供することができる。例えば、本発明に係る非生存型プロバイオティクスから得られた物質は産業環境において標準化された再現可能な方法で製造することができ、これにより生きたプロバイオティクスに固有な問題が回避される。また、非生存型性質によって、特に乾燥粉末として提供された際に、本発明の物質は、アレルギー反応又は疾患の予防又は治療のために栄養組成物中に適切な用量で適切に取り込むことができる。
【００７３】
以下、限定を目的としない例及び添付の図面を参照して本発明を説明する。
【００７４】
例１
回分発酵過程において、生理的条件下でＬＧＧを培養した。ｐＨを、３３％ＮａＯＨを添加することによりｐＨ６で一定に維持し、温度を３７℃に維持した。かくはん速度は５０ｒｐｍであり、上部空間をＮ2で洗い流した。以下の培地（適合ＭＲＳ培養液）が提供された（表１）。
【００７５】
【表１】
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細菌の増加を図１ａ及び図１ｂに示す。
【００７６】
図１ａは、ｐＨの変化、滴定されたＮａＯＨ（３３％）の量（ＤＭ塩基＝用量モニター塩基）及びＬＧＧ発酵中のＯＤ６００を示す。図中に添えられたキャプションについて説明する。ｐＨ及びＯＤ６００測定により発酵槽内の細菌の増加を測定することができる。ここで、ｐＨを６に維持するために必要とされるＮａＯＨの添加は乳酸産生（即ち細菌代謝活性）と相関関係があり、そしてＯＤ６００は発酵槽内の細菌数と相関関係を有する密度測定である。
【００７７】
図１ｂにおいて縦軸は培地中の細菌数を対数表示で示す。横軸は時間を示す。
【００７８】
三点の時点において培養上清のサンプルを採取した（図中、ＭＪ１、ＭＪ２及びＭＪ３で示す）。
【００７９】
例２
例１と類似して、修正された培地に基づいてＬＧＧ培養を実施した。ここで、Ｔｗｅｅｎは存在せず、油を以下のとおり添加した。
（ａ）オレイン酸   １ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ及び４ｇ／ｋｇの濃度にて
（ｂ）アマニ油     １ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ及び４ｇ／ｋｇの濃度にて
（ｃ）オリーブ油   １ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ及び４ｇ／ｋｇの濃度にて
（ｄ）菜種油              １ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ及び４ｇ／ｋｇの濃度にて
（ｅ）ヒマワリ油   １ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ及び４ｇ／ｋｇの濃度にて
【００８０】
上記の試験（ａ）−（ｅ）の全てにおいて、Ｔｗｅｅｎを含む培地での増加に匹敵する良好なＬＧＧ増加が観測された。加えて、驚くべきことにＬＧＧをＴｗｅｅｎ又は油を全く添加することなく培養することに成功した。
【００８１】
例３
この例では、例１で得られた上清を、抗アレルギー及び抗炎症活性のために当該分野で受け入れられているＲＡＷ２６４細胞（マウスマクロファージ細胞株）インビトロモデルを用いてスクリーニングした。ＲＡＷ細胞培養物により、他の上清サンプル採取物に比べて、ＬＧＧ培養のＭＪ２での上清サンプル採取物を用いた培養中に抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生が大幅に増加したことが示された。図２参照。
【００８２】
例４
オボアルブミン（ＯＶＡ）感作モデルにおいて、例１で得られた培養上清ＭＪ２と生存型ＬＧＧ菌との比較を行った。当該分野で広く受け入れられているこのインビボモデルは、通常若い又は成体マウスに適用される。この例では、従来モデルを適用して幼少期のアレルギーの調査を行った。したがって、新生児Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ＬＧＧ又は全ＬＧＧ培養上清を、一日おきに六週間、胃内投与した。動物を４２日目及び５６日目にオボアルブミン（ＯＶＡ）で感作し、その後６１日目、６２日目及び６３日目に抗原投与しＯＶＡエアロゾルに暴露した。このタイムスケジュールを図３に示す。実験の気管支ぜんそくのパラメータを、肺機能分析、組織構造及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）に基づいて評価した。全身のアレルギー反応を抗体レベル及びサイトカイン反応に基づいて評価した。後者は、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び再刺激流入領域リンパ節細胞培養の両方で測定した。生存型ＬＧＧ及びＬＧＧ上清への暴露が気管炎症及び杯細胞過形成を減少させることがわかった。肺組織の部位の組織染色（図４）により、ＯＶＡアレルギー動物において炎症細胞浸潤の増加及び杯細胞過形成が観測されたのに対して、ＬＧＧ又はＬＧＧ上清で処理された動物においてはほぼ正常な肺構造及び組織構造が観測された。図４において、「陰性対照群」は抗原投与を施していない且つＬＧＧ又はＬＧＧ上清を適用していないものを意味し、「陽性対照群」はＯＶＡ抗原投与を施し且つＬＧＧ又はＬＧＧ上清を適用していないものを意味し、「生存型ＬＧＧ」は抗原投与を施し且つ生存型ＬＧＧを適用したものを意味し、「ＬＧＧ上清」は抗原投与を施し且つ本発明のＬＧＧ上清治療を施したものを意味する。
【００８３】
さらに、浸潤性炎症細胞（好酸球）の発生が観測された。図５は、ＯＶＡアレルギー動物の肺において、生存型ＬＧＧ又はＬＧＧ上清を用いて処理したことにより、好酸球浸潤の増加が大きく減少したことを示す。図５において、縦軸はアレルギー細胞の増加のパーセンテージを示す。横軸には以下のサンプルが示され、それらのサンプルは、「陰性対照群」即ちＯＶＡ抗原投与なし且つ治療なし、「陽性対照群」即ちＯＶＡ抗原投与あり且つ治療なし、「ＬＧＧ全体」即ちＯＶＡ抗原投与の後生存型ＬＧＧを用いて治療したもの、「ＬＧＧ上清」即ちＯＶＡ抗原投与の後本発明のＬＧＧ上清を用いて治療したものである。
【００８４】
例５
この例は、リンパ節から分離された細胞のインビトロ培養の測定（周知の方法で実施）を反映する。ＯＶＡアレルギーマウスからの再刺激リンパ節細胞培養における典型的なＴｈ２サイトカインプロファイルは、ＩＬ−５の増加並びに低いＩＬ−１０及びＩＦＮ−γ反応を示した。全（生存型）ＬＧＧ又は本発明のＬＧＧ上清を用いた治療は、これらの培養におけるＩＬ−５反応の低下並びにＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生の大きな活性化から明らかなように、抗アレルギー効果を示した。このことは図６に示される。
【００８５】
例６
この例は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスでのオボアルブミン（ＯＶＡ）アレルギーモデルにおける本発明のＬＧＧ培養上清の出産前後期の投与を表わす。妊娠中及び授乳中の母親に、一日おきにＬＧＧ上清を胃内投与した。母親の子供は感作され、そしてＯＶＡを用いて抗原投与された。この試験の概要を図７に示す。
【００８６】
気管支ぜんそくの実験的パラメータを、肺機能分析、組織構造及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）に基づいて評価した。全身のアレルギー反応を、抗体レベル及びサイトカイン反応に基づいて評価した。後者はＢＡＬと流入領域リンパ節細胞培養の両方で測定した。図８は一目瞭然の結果を示し、ＬＧＧ上清を用いて治療された動物における炎症細胞（好酸球、マクロファージ）の浸潤が低下したことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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