(57)【要約】単離された生物学的液体サンプル中のＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質の量の検出を用いて、中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄疾患を患う患者の病変についての組織病理を予測するための、ＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質の使用。さらに本発明は、ＣＮＳ脱髄疾患を患う患者の病変の組織病理学的な特性を確かめる方法、及び前記方法の実行のためのキットに関する。好ましくはＣＮＳ脱髄疾患は多発性硬化症であり、生物学的液体は脳脊髄液（ＣＳＦ）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された生物学的液体サンプル中のＦＧＦ−２タンパク質、アノスミン−１タンパク質又は両タンパク質の量を検出することにより、発生可能性のある、脱髄疾患好ましくは中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄疾患、を有する対象の病変についての組織病理を予測するための、ＦＧＦ−２タンパク質、アノスミン−１タンパク質又は両タンパク質の組み合わせの使用。
【請求項２】
単離された生物学的液体サンプル中のＦＧＦ−２タンパク質の量を検出することにより、発生可能性のある、好ましくはＣＮＳの脱髄疾患を有する対象の病変についての組織病理を予測するための、請求項１に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項３】
単離された生物学的液体サンプルが体液であり、好ましくは脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血清、血漿及び涙液を含むリストから選択される、請求項１又は２に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項４】
単離された生物学的液体サンプルがＣＳＦである、請求項３に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項５】
脱髄疾患がＣＮＳを冒し、多発性硬化症、デビック視神経脊髄炎、急性播種性脳炎、急性横断性脊髄炎、急性又は亜急性の出血性白質脳炎、急性播種性脱髄、びまん性硬化症、脳梁の中心性脱髄、橋中心髄鞘崩壊、亜急性壊死性脊髄炎、同心円性硬化症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病及びツェルウェガー症候群を包含するリストから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項６】
ＣＮＳ脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項５に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項７】
ＣＮＳ脱髄疾患が一次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、進行性再発寛解型多発性硬化症、二次進行型多発性硬化症、臨床分離症候群（ＣＩＳ）又は任意の臨床症状の多発性硬化症であり、好ましくは一次進行型多発性硬化症又は二次進行型多発性硬化症である、請求項６に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項８】
脱髄疾患が末梢神経系（ＰＮＳ）を冒し、好ましくはギラン・バレー症候群である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＦＧＦ−２タンパク質の使用。
【請求項９】
アノスミン−１タンパク質もまた、脱髄疾患、好ましくはＣＮＳ脱髄疾患の検出のためのバイオマーカーとして用いられることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
アノスミン−１タンパク質レベルもまた、単離された生物学的サンプル中で、好ましくは単離された生物学的液体中で検出されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
（ａ）対象からの単離された生物学的サンプル、好ましくは単離された生物学的液体を取得するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生物学的サンプル中のＦＧＦ−２タンパク質の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で検出された量を参照量と比較するステップと
を含む、ＣＮＳ脱髄疾患を有する対象又は患者の病変の組織病理を予測するのに有用なデータを取得する方法。
【請求項１２】
（ｄ）白質における少なくとも１つの慢性若しくは非活動性の病変の存在及び／又は灰白質の血液脳関門ダメージの実存を予測するステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）にて、ステップ（ｂ）で検出されたＦＧＦ−２タンパク質の量がステップ（ｃ）で比較される参照量より多いことが、白質における少なくとも１つの慢性若しくは非活動性の病変の存在及び／又は灰白質の血液脳関門ダメージの実存を指し示している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
単離された生物学的サンプルが生物学的体液であり、好ましくはＣＳＦ、血液、血清、血漿及び涙液を包含するリストから選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
脱髄疾患がＣＮＳを冒し、多発性硬化症、デビック視神経脊髄炎、急性播種性脳炎、急性横断性脊髄炎、急性又は亜急性の出血性白質脳炎、急性播種性脱髄、びまん性硬化症、脳梁の中心性脱髄、橋中心髄鞘崩壊、亜急性壊死性脊髄炎、同心円性硬化症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病及びツェルウェガー症候群を包含するリストから選択される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＮＳ脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＮＳ脱髄疾患が一次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、進行性再発寛解型多発性硬化症、二次進行型多発性硬化症、臨床分離症候群（ＣＩＳ）又は任意の臨床症状の多発性硬化症であり、好ましくは一次進行型多発性硬化症又は二次進行型多発性硬化症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
脱髄疾患がＰＮＳを冒し、好ましくはギラン・バレー症候群である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＧＦ−２タンパク質の量の検出がイムノアッセイを用いて行われる、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アノスミン−１タンパク質レベルもまた、対象からの単離された生物学的サンプル中で、好ましくは単離された生物学的液体中で検出されて参照量と比較され、前記サンプルがＦＧＦ−２タンパク質の検出に用いられたサンプルと同じであっても異なってもよい、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の任意の方法を行うためのキット。
【請求項２３】
脱髄疾患、好ましくはＣＮＳ脱髄疾患の検出のためのバイオマーカーとしてのアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項２４】
単離された生物学的サンプル中で、好ましくは単離された生物学的液体中で脱髄疾患を検出するための、請求項２３に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項２５】
単離された生物学的液体サンプル中のアノスミン−１タンパク質の量を検出することにより、発生可能性のある、脱髄疾患、好ましくはＣＮＳ脱髄疾患を有する対象の病変についての組織病理診断を予測するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項２６】
単離された生物学的液体サンプルが体液であり、好ましくはＣＳＦ、血液、血清、血漿及び涙液を包含するリストから選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項２７】
単離された生物学的液体サンプルがＣＳＦである、請求項２６に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項２８】
脱髄疾患がＣＮＳを冒し、多発性硬化症、デビック視神経脊髄炎、急性播種性脳炎、横断性脊髄炎、急性又は亜急性の出血性白質脳炎、急性播種性脱髄、びまん性硬化症、脳梁の中心性脱髄、橋中心髄鞘崩壊、亜急性壊死性脊髄炎、同心円性硬化症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病及びツェルウェガー症候群を包含するリストから選択される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項２９】
ＣＮＳ脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項２８に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項３０】
ＣＮＳ脱髄疾患が一次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、進行性再発寛解型多発性硬化症、二次進行型多発性硬化症、臨床分離症候群（ＣＩＳ）又は任意の臨床症状の多発性硬化症であり、好ましくは一次進行型多発性硬化症又は二次進行型多発性硬化症である、請求項２９に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項３１】
脱髄疾患がＰＮＳを冒し、好ましくはギラン・バレー症候群である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のアノスミン−１タンパク質の使用。
【請求項３２】
（ａ）対象からの単離された生物学的サンプル、好ましくは単離された生物学的液体を取得するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生物学的サンプル中のアノスミン−１タンパク質の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で検出された量を参照量と比較するステップと
を含む、脱髄疾患の検出のために、又はＣＮＳ脱髄疾患を有する対象若しくは患者の病変の組織病理を予測するのに有用なデータを取得する方法。
【請求項３３】
（ｄ）白質における少なくとも１つの慢性若しくは非活動性の病変の存在及び／又は灰白質における血液脳関門ダメージの実存を予測するステップ
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｄ）にて、ステップ（ｂ）で検出されたアノスミン−１タンパク質の量がステップ（ｃ）で比較される参照量より多いことが、白質における少なくとも１つの慢性若しくは非活動性の病変の存在及び／又は灰白質における血液脳関門ダメージの実存を指し示している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
単離された生物学的サンプルが生物学的体液であり、好ましくはＣＳＦ、血液、血清、血漿及び涙液を含むリストから選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
脱髄疾患がＣＮＳを冒し、多発性硬化症、デビック視神経脊髄炎、急性播種性脳炎、急性横断性脊髄炎、急性又は亜急性の出血性白質脳炎、急性播種性脱髄、びまん性硬化症、脳梁の中心性脱髄、橋中心髄鞘崩壊、亜急性壊死性脊髄炎、同心円性硬化症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病及びツェルウェガー症候群を含むリストから選択される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＣＮＳ脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＮＳ脱髄疾患が一次進行型多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、進行性再発寛解型多発性硬化症、二次進行型多発性硬化症、臨床分離症候群（ＣＩＳ）又は任意の臨床症状の多発性硬化症であり、好ましくは一次進行型多発性硬化症又は二次進行型多発性硬化症である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
脱髄疾患がＰＮＳを冒し、好ましくはギラン・バレー症候群である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
アノスミン−１タンパク質の量の検出がイムノアッセイを用いて行われる、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の任意の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学の分野に関する。具体的には、本発明は、単離された生物学的液体サンプル中のＦＧＦ−２及びアノスミン−１のタンパク質の量を検出することにより、中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄疾患を有する個体の病変についての組織病理を予測するための、タンパク質であるＦＧＦ−２及びアノスミン−１の使用に関連するものである。さらに本発明はＣＮＳの脱髄疾患を有する個体の病変の組織病理学的な特徴を理解する方法であって、かかる方法の実行のためのキットを用いる方法に関する。好ましくはＣＮＳ脱髄疾患は多発性硬化症であり、生物学的液体は脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【背景技術】
【０００２】
脱髄疾患は深刻な臨床的及び社会的問題である。脱髄疾患は、様々な理由のため、髄鞘に被覆された神経軸索へのダメージがある一連の神経系疾患であり、髄鞘は神経インパルス伝導を保護し促進するものである。脱髄疾患のうち最も蔓延しているものは多発性硬化症である。
【０００３】
多くの場合、多発性硬化症は、この病態の典型的な神経学的変質を伴った突発（又は急性期）を有する疾患として始まる。各々の突発の後には寛解期が続き、寛解期の後は、患者は異なる重症度を有する後遺症を被ることもあり、被らないこともある。大半の場合、多発性硬化症の突発期の後、疾患は患者が持続的な神経脱落を被る二次的な進行型へと派生し、障害は着実に進行性に増進する（Ｃｏｎｆａｖｒｅｕｘら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０００年、ｖｏｌ．３４３、１４３０〜１４３８ページを参照）。
【０００４】
多発性硬化症の場合、ＣＮＳにおけるミエリン産生細胞であるオリゴデンドロサイトは、脱髄プラークとしても知られる損傷領域において死滅する。オリゴデンドロサイトは出生前発達中及び出生後発達中にオリゴデンドロサイト前駆細胞から生じるが、このオリゴデンドロサイト前駆細胞は全哺乳類の成体の脳内にも存在する細胞である。損傷に応答して、オリゴデンドロサイト前駆細胞は損傷した脳領域へと動員されるが、病変の発展ステージによって、内部に入って髄鞘を修復することもあり、しないこともある（Ｗｏｌｓｗｉｊｋ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９８年、ｖｏｌ．１８、６０１〜６０９ページ、Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年、ｖｏｌ．２０、６４０４〜６４１２ページ、Ｃｈａｎｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００２年、ｖｏｌ．３４６、１６５〜１７３ページ；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．、２００２年、ｖｏｌ．３１、５２３〜５３６ページ；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ、２００８年、ｖｏｌ．３６３、１７１〜１８３ページを参照）。
【０００５】
近年における多発性硬化症を（治癒ではなく）緩和するための現存治療はＣＮＳにおける現存の炎症レベルを低減しようとするものだが、修復を必要とする領域へのオリゴデンドロサイト前駆細胞の動員を目的としたものではない。従って、幹細胞、間葉系細胞又はオリゴデンドロサイト前駆細胞自身（内因性の細胞を包含する）のいずれかを用いることによる細胞治療は、多発性硬化症の治療についての有望な将来である。従って、各々の多発性硬化症患者における再ミエリン化が可能な病変とそうでない病変との間のバランスを知ることが治療のタイプ（炎症性作用の緩和対回復性の細胞治療）を選択する際に非常に重要である。
【０００６】
多発性硬化症を有する患者のＣＮＳにおいて観察される脱髄病変は、ミエリン破壊細胞（リンパ球、マクロファージ及びミクログリア）の分布並びにミエリン破壊の度合いによって、組織病理学的に３つのタイプに分類され得る（Ｔｒａｐｐら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９年、ｖｏｌ．９８、４９〜５６ページ、Ｂｅｎｉｔｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７年、ｖｏｌ．２７、２３９６〜２４０２ページを参照）。
【０００７】
１．活動性病変：脱髄は完了していても、未完了でもよいが、ミエリン破壊細胞でその内側が満たされており、損傷領域の至る所に均等に分布する病変。活動性病変において、再ミエリン化は可能で（実際は部分的な再ミエリン化がある、いわゆる「シャドウプラーク」型である）、オリゴデンドロサイト前駆細胞を内部に有しており（従って、内部に入ることが可能である）、活動性病変は経時的な観点から最初に現れるものとして考えられる。
【０００８】
２．慢性病変：脱髄が完了していて、内側にミエリン破壊細胞がない病変であり、損傷の周辺領域に集積する。慢性病変における再ミエリン化（髄鞘の修復）は極めて望み薄であり、病変の端部に限られていて、内部にオリゴデンドロサイト前駆細胞はない（内部に入ることは不可能で、もしそうすれば細胞は死滅する）。慢性病変は活動性病変後の次のステップと考えられる。
【０００９】
３．非活動性病変：脱髄が完了していて、ミエリン破壊細胞がもはや病変の内部又は周辺のいずれにも存在しない病変。非活動性病変における再ミエリン化は実行可能でなく、内部にオリゴデンドロサイト前駆細胞も欠いていて、非活動病変は脱髄病変の最終ステップと考えられる。
【００１０】
多発性硬化症の炎症性環境は疾患の間ずっと連続するため、細胞治療を実施する際、成功確率は損傷がもっぱら活動性タイプである（それ故に修復されやすい）患者において、より高いであろう。しかしながら、多発性硬化症患者のＣＮＳに存在する損傷タイプについての唯一の信頼できる証拠は組織病理学的な解析である。明らかな理由のため、この組織病理学的解析は最も侵襲的な方法であり、ほとんど全ての場合において死後にのみ実行可能な（従って有用な）ものである。核磁気共鳴により取得される画像は、今日まで現存する侵襲性がより低くより鋭敏な方法であるにもかかわらず、多発性硬化症患者の損傷タイプ、損傷の発達状態、又は白質（圧倒的多数の髄鞘が見出される）においてのみならず灰白質においても発生可能性のある、神経細胞自体へのダメージを誘因し得る損傷の発展を特定するものではない（Ｂｒｅｘら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００２年、ｖｏｌ．３４６、１５８〜１６４ページ、Ｓｅｐｕｌｃｈｒｅら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００９年、ｖｏｌ．６６、１７３〜１７９ページ；Ｗｅｉｎｅｒ、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００９年、ｖｏｌ．６５、２３９〜２４８ページ）。前述のＳｅｐｕｌｃｈｒｅらの研究（Ｓｅｐｕｌｃｈｒｅら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００９年、ｖｏｌ．６６、１７３〜１７９ページ）は多発性硬化症患者における白質病変の存在と灰白質の萎縮との間の因果関係を立証するのに重要なステップであるが、Ｒｅｉｃｈｅｒｔらの論説（Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００９年、ｖｏｌ．６６、１５９〜１６０ページ）及びこれら因果関係が解析されているＡｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙの同じ巻においては、結論は「脳損傷のより鋭敏な測定が核磁気共鳴により達成されないうちは、Ｓｅｐｕｌｃｈｒｅらによる興味深い研究は多発性硬化症患者の脳組織の死後解析により確証されなければならない」と明確に述べられている。従って、非侵襲的な技術を用いることにより、ＣＮＳにおける病変のタイプや、白質、灰白質の両方におけるこれら病変又は発生可能性のある疾患発展の修復のためのより効率的な治療（臨床試験のデザインを包含する）を決定するのに用いられ得る（多発性硬化症患者のＣＳＦ又は血清に存在する）バイオマーカーを見出すことが必要である。
【００１１】
Ｓａｒｃｈｉｅｌｌｉらは多発性硬化症の診断／予後においてＦＧＦ−２測定の使用を記載するが、彼らはＦＧＦ−２のレベルを疾患の臨床的変異型に関連付けるに過ぎず、病変の組織病理を研究又は言及するものではない（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３５（２００８年）２２３〜２２８ページ）。
【００１２】
個体の脱髄病変の組織病理を知ることは極めて有用である。本発明に記載される使用及び方法により、脱髄病変は、もし個体が症状を有して、診断されることのある前に検出され得る。
【発明の説明】
【００１３】
本発明の著者は、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルを通じて、患者の脳損傷の度合い、髄鞘の回復性細胞であるオリゴデンドロサイト前駆細胞の移動を可能にする又は抑制する環境、灰白質における神経ダメージに関する発生可能性の予後診断及びそれらのための適切な治療の同定（臨床試験のデザインを包含する）を理解するための新たなツールを提供する。
【００１４】
本発明は従って、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１のレベルを分析するだけで多発性硬化症患者の白質における病変についての組織病理学的なカタログを作るための非侵襲的なツールを提供する。
【００１５】
本発明の実施例で実証されるように、ＣＳＦ中の分子であるＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルは、より侵襲的な検査を必要とせず又は診断の誤りなく、多発性硬化症を有する患者を包含するあらゆる神経系患者のＣＮＳ中に見出されるダメージの度合いについての唯一の信頼できる検査である生検があたかも実施されたのと同じ確実性のレベルで、多発性硬化症患者の中枢神経系（ＣＮＳ）の病変タイプの１つ又は複数を反映する。ＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルが対照の個体において見出されるレベルと同様である多発性硬化症患者は、多数の小さな活動性タイプの病変のみを呈する。一方、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１のレベルが対照者におけるレベルより顕著に高い（少なくとも２倍−２倍高い−）患者は、白質において大きな慢性又は非活動性タイプの病変を呈し、その病変は前記の例におけるものよりも数が少ないが、サイズが大きい。
【００１６】
さらに本発明は、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルが白質内の脱髄病変における髄鞘の回復性細胞の到達を可能にする又は抑制する分子環境の状態を反映することを示す。
【００１７】
ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルが対照患者において見出されるレベルと同様である患者において、活動性病変はオリゴデンドロサイト前駆細胞の運動源性化学誘引分子であるＦＧＦ−２の存在と関連している。ＦＧＦ−２は病変内の特定のミクログリア／マクロファージ細胞により発現されているが、ＦＧＦ−２又はその受容体のＦＧＦＲ１は脱髄プラークの近傍で決して検出されない。アノスミン−１などのオリゴデンドロサイト前駆細胞の移動を妨げる又は邪魔する分子の存在は活動性病変内で検出されないが、このことは活動性病変が発生可能性のある再ミエリン化のための、従って病変の修復のための正しい状況を呈することを明確に指し示している。ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルが非脱髄条件におけるレベルの少なくとも２倍の高さである多発性硬化症患者の場合、慢性及び／又は非活動性の損傷は、ＦＧＦ−２を発現する大量のマクロファージ／ミクログリアと、その周りのＦＧＦ−２の受容体であるＦＧＦＲ１を発現するオリゴデンドロサイト前駆体の両方を組織病理学的に呈する。ＦＧＦ−２は、修復されるべき脱髄領域に向けてオリゴデンドロサイト前駆体を誘引しようとする試みの中で運動源性化学誘引分子として働く。一方、このような高さのＣＳＦ中ＦＧＦ−２レベルを有する多発性硬化症患者において見出される慢性及び／又は非活動性の損傷は内側に高い存在量のアノスミン−１を示すが、アノスミン−１は損傷の回復性細胞であるオリゴデンドロサイト前駆体の移動に有害（抑制性の化学忌避物質）であり、そのためオリゴデンドロサイト前駆体は内部に入ることができず、従って髄鞘修復は行われない。
【００１８】
その上、多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルについての測定は、細胞のレベルと灰白質の血液脳関門状態の両方についての灰白質における変化を反映し、それ故に神経ダメージの発症を予見する。
【００１９】
ＣＳＦ中のＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１のレベルが脱髄病変のない個体と同様である多発性硬化症患者において、灰白質はＦＧＦ−２又はアノスミン−１を示さず、また血液脳関門の明らかな変質も示さないが、このことは神経細胞体についてのリスクがより低いことを意味する。対照的に、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルが脱髄のない場合よりも顕著に高い（少なくとも２倍高い）患者は、血液脳関門が損なわれた場所において、血液脳関門を再構築しようとする試みの中で、ＦＧＦ−２及びアノスミン−１を生産しそれらの共通受容体であるＦＧＦＲ１をも発現する血管周囲アストロサイトを示す。血液脳関門へのダメージは、さらに上の疾患ステージで、これらの領域において神経細胞体の中に病変をもたらす。これは、より重度の運動機能ダメージや、対象の認知機能における変質さえも引き起こし得る。
【００２０】
従って、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルの測定は、組織病理学的ダメージレベルについての、オリゴデンドロサイト前駆体を用いることによる修復への感受性についての、同様に灰白質のダメージについてのバイオマーカーとして機能を果たす。バイオマーカーは測定され得る物質で、その値が疾患を患っているか否かなどの生物学的状態に客観的に関連し得る物質である。バイオマーカーはまた治療への応答の研究においても用いられる。
【００２１】
従って、本発明の第一の態様は、単離された生物学的液体サンプル中のＦＧＦ−２、アノスミン−１又は両タンパク質の量を検出することにより、発生可能性のある、脱髄疾患好ましくはＣＮＳ脱髄疾患を有する個体の病変についての組織病理を予測するための、タンパク質であるＦＧＦ−２、アノスミン−１又は両タンパク質の使用に関する。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質は、単離された生物学的液体サンプル中のかかるタンパク質の量を検出することにより、発生可能性のある、脱髄疾患好ましくはＣＮＳ脱髄疾患を有する個体の病変についての組織病理を予測するのに用いられた。
【００２３】
好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質は、脱髄疾患を有する患者における仮説上の細胞治療の再ミエリン化バイオマーカーとして用いられた。ＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質は従って脱髄疾患と診断された患者の進展をモニターし、治療中及び治療後の進行をモニターするバイオマーカーとして機能することができるが、その理由はＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質が患者のミエリン形成状態を指し示していることによる。患者は例えばミエリン再生を目的とする細胞治療によって治療され得るが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２タンパク質若しくはアノスミン−１タンパク質又は両タンパク質は、少なくとも１つの慢性又は非活動性の脱髄病変の存在を予測するのに用いられる。好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２タンパク質が用いられる。好ましい実施形態において、アノスミン−１タンパク質が用いられる。好ましい実施形態において、両タンパク質の組み合わせが用いられる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、アノスミン−１タンパク質は、脱髄疾患好ましくはＣＮＳ脱髄疾患の検出のためのバイオマーカーとして用いられる。本発明の好ましい実施形態において、アノスミン−１タンパク質は単離された生物学的サンプル中で、好ましくは単離された生物学的液体中で脱髄疾患を検出するのに用いられる。
【００２６】
本説明で用いられる用語「単離された生物学的液体サンプル」又は単に「生物学的サンプル」は個体の生物学的液体を言い、当業者によりその目的のために機能することが知られる任意の方法により取得されるものである。
【００２７】
生物学的液体としては、生体から排泄又は分泌される液体、同様に正常時には排泄又は分泌されない液体を挙げることができる。生物学的液体としては、胎児を包囲する羊水、房水、腸液、リンパ液、母乳、粘液（鼻水及び痰を包含する）、唾液、皮脂（皮膚の油）、汗、尿、精液及び心嚢液を挙げることができる。単離された生物学的サンプルは例えば新鮮なもの、凍らせたもの又は固定されたものであり得るが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
好ましい実施形態において、単離された生物学的液体サンプルは任意の体液であり、好ましくはＣＳＦ、血液、血清、血漿及び涙液を包含するリストから選択される。より好ましい実施形態において、単離された生物学的液体サンプルはＣＳＦである。
【００２９】
本説明で用いられる用語「対象」は動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトに適用される。好ましくは、本用語はＣＮＳ脱髄疾患と診断されている個体を言う。対象は従って、脱髄疾患を患う患者又は健常な個体であることができる。
【００３０】
本説明で用いられる用語「ＣＮＳ脱髄疾患」はＣＮＳにおけるミエリンの喪失又は機能障害により特徴付けられる疾患を言う。
【００３１】
好ましい実施形態において、脱髄疾患はＣＮＳを冒し、多発性硬化症、デビック視神経脊髄炎、急性播種性脳炎、急性横断性脊髄炎、急性又は亜急性の出血性白質脳炎、急性播種性脱髄、びまん性硬化症、脳梁の中心性脱髄、橋中心髄鞘崩壊、亜急性壊死性脊髄炎、同心円性硬化症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病及びツェルウェガー症候群を包含するリストから選択される。
【００３２】
多発性硬化症は最も一般的なＣＮＳ脱髄疾患である。病理的知見としてはＣＮＳ白質の至る所での多発性の明確な脱髄領域が挙げられる。臨床所見としては失明、異常な外眼運動、感覚異常、麻痺、衰弱、構音障害、痙縮、運動失調及び膀胱機能障害が挙げられる。より好ましい実施形態において、ＣＮＳ脱髄疾患は任意の臨床的変異型の多発性硬化症である。
【００３３】
疾患の最も一般的な臨床的変異型は再発寛解型多発性硬化症、二次進行型多発性硬化症、一次進行型多発性硬化症、進行性再発型多発性硬化症及び臨床分離症候群（ＣＩＳ）である。
【００３４】
再発寛解型多発性硬化症は、神経機能障害の突発性又は急性再発性増悪、その後の部分的又は完全な回復により特徴付けられる多発性硬化症の最も一般的な臨床的変異型である。一般的な臨床所見としては視覚機能、運動機能、感覚機能又は膀胱機能の喪失が挙げられる。急性の脱髄症状の発現はＣＮＳ中のあらゆる所に起こり得るものであり、一般的に視神経、脊髄、脳、脳幹及び小脳を冒す。
【００３５】
二次進行型多発性硬化症は再発寛解型多発性硬化症の通常の臨床的経過である。突発の数及び障害の進行が減少する。
【００３６】
一次進行型多発性硬化症は当初からのゆっくりとした障害の進行により特徴づけられる。患者は再発を経験しないが、疾患の発症から着実な機能的減退がある。
【００３７】
最後に、進行性再発型多発性硬化症は前出の多発性硬化症よりもそれほど一般的でないが、一次進行型の経過を伴って始まり、突発を重ねる。
【００３８】
なおより好ましい実施形態において、ＣＮＳ脱髄疾患は多発性硬化症の一次進行型又は二次進行型の臨床的変異型である。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、脱髄疾患は末梢神経系（ＰＮＳ）を冒し、好ましくはギラン・バレー症候群である。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２及びアノスミン−１の両タンパク質は、脱髄疾患好ましくはＣＮＳ脱髄疾患の検出のためのバイオマーカーとして用いられる。好ましくは、両タンパク質のレベルは単離された生物学的サンプル中で、好ましくは単離された生物学的液体中で検出される。
【００４１】
本発明の第二の態様は、
（ａ）対象から単離された生物学的サンプル、好ましくは単離された生物学的液体を取得するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）に記載の生物学的サンプル中のＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１タンパク質の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で検出された量を参照量と比較するステップと
を含む、脱髄疾患の検出のために、又はＣＮＳ脱髄疾患を有する対象若しくは患者の病変の組織病理を予測するのに有用なデータを取得する方法（以後、本発明の方法）に関する。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、
（ｄ）個体の白質における少なくとも１つの慢性若しくは非活動性の病変の存在及び／又は灰白質における血液脳関門の変化の実存を予測するステップ
を含む。
【００４３】
本発明の方法のステップ（ｂ）及び／又は（ｃ）は、例えばステップ（ｂ）における量の検出のためのロボットセンサー機器又はステップ（ｃ）におけるコンピューター制御された比較を通じて、全体又は部分的に自動化され得る。上のステップに加えて、追加のステップ、例えばサンプルの前処理又は本方法により取得される結果の評価に関するステップが包含されてもよい。
【００４４】
本発明で用いられる用語「予測する」は、ＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１タンパク質の量の分析に基づく、並びに参照量に対する検出された量の比較に基づくサンプル分類方法を用いる際の、ＣＮＳの脱髄疾患を有する対象の病変をその組織病理学的特性、例えば白質に存在する病変タイプ又は灰白質における血液脳関門の変質の実存に従って分類する能力に関する。当該分野の専門家により理解されるこの識別は、分析されるサンプルの１００％において正確であることは意図されない。しかしながら、統計的に有意な数のサンプルが正確に分類されることが要求される。統計的に有意な量は、当業者により様々な統計ツールを用いることで、例えば信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデント検定又はフィッシャー判別式機能により立証され得るが、これらに限定されるものではない。好ましくは、信頼区間は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。好ましくは、ｐ値は０．１、０．０５、０．０１、０．００５又は０．０００１より小さい。好ましくは、本発明は分析される特定の群又は集団の対象の少なくとも６０％において、少なくとも７０％において、少なくとも８０％において、又は少なくとも９０％において疾患を正確に検出することが可能である。
【００４５】
本説明で用いられる用語「白質」は、主としてミエリン化された神経線維から構成されるＣＮＳの部分、より好ましくは脳の部分を言う。本説明で用いられる用語「灰白質」は、主に樹状突起及び神経細胞体から構成されていてミエリンを持たないＣＮＳの部分、より好ましくは脳の部分を言う。
【００４６】
線維芽細胞増殖因子−２タンパク質（ＦＧＦ−２）は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とも呼ばれ、線維芽細胞増殖因子ファミリーに属するＦＧＦ−２遺伝子によりコードされる。ＦＧＦ−２はＣＮＳの発達、創傷修復及び腫瘍増殖などの様々な生物学的プロセスに関係している。
【００４７】
本説明で用いられる用語「ＦＧＦ−２タンパク質」はヒトＦＧＦ−２遺伝子（ＧｅｎＩＤ：２２４７）の発現から生じる任意のタンパク質を言う。ＦＧＦ−２タンパク質の原型のアミノ酸配列は配列番号１（ＮＰ＿００１９９７．５）である。従って、用語「ＦＧＦ−２タンパク質」はアミノ酸配列が配列番号１であるタンパク質、その変異体又はタンパク質若しくはその変異体の断片をも言うが、ただし前記変異体又は断片が機能的等価物であるという条件の下である。
【００４８】
アノスミン−１細胞外マトリックスタンパク質は「カルマン症候群タンパク質」及び「接着分子様Ｘ連鎖性」としても知られているが、ヒト遺伝子ＫＡＬ１においてコードされ、ＣＮＳの発達及び病理学的条件（カルマン症候群、がん）の両方における多様な生物学的プロセスに関わっている。
【００４９】
本説明で用いられる用語「アノスミン−１タンパク質」はヒト遺伝子ＫＡＬ１（ＧｅｎＩＤ：３７３０）の発現から生じる任意のタンパク質を言う。アノスミン−１タンパク質の原型のアミノ酸配列は配列番号２（ＮＰ＿０００２０７．２）である。従って、用語「アノスミン−１タンパク質」はアミノ酸配列が配列番号２であるタンパク質、その変異体又はタンパク質若しくはその変異体の断片をも言うが、ただし前記変異体又は断片が機能的等価物であるという条件の下である。
【００５０】
本説明において用いられる意味では、用語「変異体」はＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質に実質的に相同であるタンパク質を言う。概して、変異体としてはアミノ酸の付加、欠失又は置換が挙げられる。用語「変異体」としてはグリコシル化、リン酸化又はメチル化などの翻訳後修飾から生じるタンパク質も挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本明細書で用いられるように、タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸配列の配列番号１及び／又は配列番号２と良好に整列するとき、すなわちタンパク質のアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、典型的には少なくとも８０％、好都合には少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％の同一性の度合いを示すとき、そのタンパク質は「ＦＧＦ−２又はアノスミン−１タンパク質に実質的に相同である」。
【００５２】
本説明で用いられる用語「同一性」は比較されている２つのアミノ酸配列の間の同一なアミノ酸の割合を言う。２つの配列間の同一性のパーセンテージは、例えば配列を比較するのに適したコンピュータープログラムの助力により、当業者により容易に同定され得る。
【００５３】
本説明で用いられる用語「断片」はＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質又はそれらの変異体の１つの一部を言う。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「機能的等価物」は当の変異体又は断片が本書類に記載される免疫学的性質を本質的に持つことを意味する。これら免疫学的性質は、本説明に付随する実施例に記載される方法などの従来の方法により決定され得る。
【００５５】
本説明で用いられる、個体からの単離された生物学的液体サンプル中の「ＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１タンパク質の量を検出すること」という句は、好ましくは半定量的又は定量的な、量又は濃度の測定を言う。測定は直接的又は間接的に実施され得る。直接的な測定はＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の量又は濃度についての、タンパク質から直接的に取得されるシグナルに基づく測定を言い、サンプル中に存在するタンパク質分子の数と直接的に相関する。このシグナル−強度シグナルとも言われ得る−は、例えばＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の化学的又は物理的性質の強度値を測定することにより、取得され得る。間接的な測定としては、二次成分（例えば遺伝子発現産物と異なる成分など）及び生物学的測定系（例えば細胞応答、リガンド、「タグ」又は酵素反応産物の測定など）から取得される測定が挙げられる。
【００５６】
本説明で用いられる用語「量」は、タンパク質の絶対量又は相対量、及びこれらに関連した又はこれらから生じることができる任意の他の値又はパラメーターを言うが、これらに限定されるものではない。かかる値又はパラメーターは、例えばイムノアッセイ、質量分析又は核磁気共鳴における強度値といった、タンパク質の物理的又は化学的性質のいずれかから直接的な測定により取得されるシグナルの強度値を含む。加えて、これらの値又はパラメーターとしては、例えば本書類の他の場所で記載される測定系のいずれかである間接的な測定により取得されるものが挙げられる。
【００５７】
本説明で用いられる用語「比較」は、本発明の方法のステップ（ａ）において取得される生物学的サンプル中のＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の量と、ＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の参照量との比較を言うが、これに限定されるものではない。本発明の方法の段落（ｂ）に記載される比較は、コンピューターに補助されて、又は手動で実施され得る。
【００５８】
本説明で用いられる用語「参照量」は、白質における少なくとも１つの慢性又は非活動性の損傷の有無及び／又は灰白質において血液脳関門が変化しているか否かによって、ＣＮＳの脱髄疾患を有する対象の損傷を分類するのに必要とされる発現産物の量を言う。
【００５９】
参照量は、ＣＳＦ中に存在するＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１発現量が知られていて、同様に白質又は灰白質における病変の組織病理学的な特性が知られている対象集団から、技術水準において知られる統計方法により計算され得る。ＣＳＦ中に存在するＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１発現量の検出並びに対象集団の白質又は灰白質における病変の組織病理学的な特徴についての解析は、従来技術に記載される任意の手法によりなされ得るが、かかる手法は本説明の実施例に記載の手法を限定することなく包含する。
【００６０】
好ましくは、参照量は閾値量を定義する。適切な参照量又は閾値量は、例えば同時に又は連続的に、問題の生物学的サンプルと一緒に分析され得る参照サンプルを用いることで本発明の方法により決定され得る。より好ましくは、閾値量は、対照者集団において見出される生理的な量についての正規分布の限界から得られ得る。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の方法のステップ（ｄ）にて、ステップ（ｂ）で検出されたＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１タンパク質の量がステップ（ｃ）で比較される参照量よりも多いことは、白質における少なくとも１つの慢性若しくは非活動性の損傷及び／又は灰白質における血液脳関門変化の実存を指し示している。好ましい実施形態において、対照者におけるＦＧＦ−２の量及びアノスミン−１の量は、少なくとも１つの慢性又は非活動性の脱髄病変を有する患者において検出される平均量に対して、平均して少なくとも２倍低い。
【００６２】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ステップ（ａ）における単離された生物学的サンプルは生物学的体液であり、好ましくはＣＳＦ、血液、血清、血漿及び涙液を包含するリストから選択される。より好ましくは、サンプルはＣＳＦである。
【００６３】
本発明の方法は、好ましくは上記の脱髄疾患に関連した組織病理を検出又は予測するのに用いられる。
【００６４】
好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の量の検出は特異的抗体とのインキュベーションによりイムノアッセイにおいて実施された。本説明で用いられる用語「イムノアッセイ」は抗体をサンプルと組み合わせた反応に基づく任意の分析技術を言う。従来技術において知られるイムノアッセイの例は、例えばイムノブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又はタンパク質マイクロアレイであるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本報告で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫学的に活性のある免疫グロブリン分子の一部、すなわちＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質と特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含有する分子を言う。免疫学的に活性のある免疫グロブリン分子の一部の例としては、抗体をペプシンなどの酵素で処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２が挙げられる。抗体はポリクローナル（典型的には異なる決定基又はエピトープに対して向けられる異なる抗体を包含する）であってもよく、又はモノクローナル（抗原内の単一の決定基に対して向けられる）であってもよい。モノクローナル抗体は遺伝的操作により生化学的に変質され得るものであり、又は合成されたものであってもよいが、このモノクローナル抗体はＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の認識に必要でない部分を全体的又は部分的におそらく欠いていて、付加的な有利な性質を抗体に伝える他の部分により置換されている。抗体はまた、組換え体、キメラ、ヒト化、合成又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。「組換え抗体又はポリペプチド（ｒＡＣ）」はポリペプチドをコードする核酸で形質転換又は形質移入された宿主細胞中で生産された抗体であるか、又は相同組換えの結果として生産されるポリぺプチドである。ＦＧＦ−２又はアノスミン−１タンパク質を認識する抗体は従来技術において知られたものであり、本説明の実施例に記載される抗体などであるが、これに限定されるものではない。
【００６６】
好ましい実施形態において、イムノアッセイはイムノブロットすなわちウエスタンブロットである。イムノブロットを実施するため、タンパク質抽出物が対象から単離された生物学的液体サンプルより取得され、タンパク質は、それらタンパク質を保持することが可能である支持媒体の中で電気泳動により分離される。分離後、タンパク質は、それらタンパク質がＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質を認識する特異的抗体を用いて検出され得る異なる媒体へと移される。
【００６７】
電気泳動は、ある一定の媒体（電気泳動バッファー）に溶解した高分子の、マトリックス又は格子支持体を通じた電場作用の結果としての運動又は移動に基づく動力学ベースの分析分離技術である。分子の挙動はその電気泳動移動度により与えられ、後者の分子の移動についてはその電荷、サイズ及び形状により与えられる。電荷／サイズが大きいほど、イオンは電場内部で早く移動する。電気泳動技術には、用いられる機器、支持体及び分離が行われる物理化学的条件の点で多くのバリエーションがある。電気泳動技術のいくつかのバリエーションとしては、例えばキャピラリー電気泳動、ろ紙電気泳動、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動又は二次元電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）であるが、これらに限定されるものではない。電気泳動は非変性条件又は変性条件において行われ得る。
【００６８】
いったんタンパク質が電気泳動により分離されると、検出の前に、タンパク質は支持体又は膜へと移され、この膜としては例えばＰＤＶＦ、ニトロセルロース又は酢酸セルロースがあるが、これらに限定されるものではない。膜はＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質を認識する特異的抗体（一次抗体とも呼ばれる）でハイブリダイズされる。次いで膜は、一次抗体を特異的に認識可能な、マーカー化合物とコンジュゲート又は連結された抗体（二次抗体とも呼ばれる）でハイブリダイズされる。代替的な実施形態において、ＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質を認識するのは抗体であり、その抗体はマーカー化合物に連結又は接合されていて、その使用は二次抗体を必要としない。いったんタンパク質が検出されると、タンパク質の相対的分子サイズは、そのタンパク質の移動を、同時に好ましくは同じ媒体中で検出されるサイズが知られている対照タンパク質の移動と比較することで決定され得る。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、イムノアッセイは酵素結合免疫吸着測定法すなわちＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡは免疫試薬（生物学的サンプルの抗原又は抗体）が固体媒体中で固定化され得るという前提に基づくもので、次いで系をマーカー化合物に結合することが可能である追加の試薬を含有する液相と接触させるものである。
【００７０】
ＥＬＩＳＡには異なるタイプがある。直接的なＥＬＩＳＡ又は単純な２層ＥＬＩＳＡにおいて、固体媒体は生物学的サンプルで被覆され、そしてＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質を認識しマーカー化合物にコンジュゲート又は付着された抗体でインキュベートされる。間接的なＥＬＩＳＡにおいて、固体媒体は生物学的サンプルで被覆され、ＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質を認識する一次抗体、次いでその一次抗体を認識しマーカー化合物にコンジュゲート又は付着された二次抗体でインキュベートされる。サンドウィッチＥＬＩＳＡすなわち抗原捕捉アッセイ及び免疫複合体による検出において、第一の抗体により認識されることでＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１がウェル中に保持されるよう、ウェルはＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１を認識して結合する第一の抗体で被覆され、問題の生物学的サンプルが加えられて、次いでＦＧＦ−２タンパク質又はアノスミン−１タンパク質を認識しマーカー化合物に結合した二次抗体が加えられる。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、イムノアッセイは、タンパク質の集合が固体媒体中に規則的に予め決められたパターンで固定化されたタンパク質マイクロアレイである。タンパク質マイクロアレイのデザインを考慮するのに重要な因子はいくつかあって、例えば固定化が起こる媒体の素質、タンパク質固定化技術、マイクロアレイの型式、用いられる捕捉剤又は検出方法などがある。本発明の第一及び第二の方法についてのこの好ましい態様を達成するのに用いられ得る異なる型式、媒体及び技術は、従来技術において知られている。
【００７２】
本説明で用いられる用語「マーカー化合物」は、ＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の量についての検出及び定量化を実現させる、発色性、発蛍光性、放射性及び／又は化学発光性のシグナルを生じることが可能な化合物を言う。マーカー化合物は放射性同位体、酵素、蛍光団、又は別の分子と組み合わせることが可能な若しくは検出され及び／若しくは直接的に定量されることが可能な任意の分子を含むリストから選択される。マーカー化合物は直接的に、又は別の化合物を通じて抗体に結合することが可能である。直接的に結合するマーカー化合物のいくつかの例として、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼなどの酵素、３３Ｐ又は３５Ｓなどの放射性同位体、フルオレセイン又は金属粒子などの蛍光団があり、それぞれ比色分析、オートラジオグラフィー、蛍光分析又は金属組織学による直接的な検出のためのものであるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２及びアノスミン−１タンパク質のレベルは同じ患者又は対象からの単離された生物学的サンプル中で検出され、そしてＦＧＦ−２及びアノスミン−１タンパク質のレベルは各参照レベルと比較される。ＦＧＦ−２レベルが検出される生物学的サンプルは、アノスミン−１レベルが検出されるのと同じ生物学的サンプルであってもよく、異なるものであってもよい。
【００７４】
本発明はまた、本発明の方法を行うのに要求される情報を含有するキットに関する。
【００７５】
従って、本発明の第三の態様は、本発明の方法についての任意の実施形態を行うためのキットに関する。
【００７６】
キットは、ＦＧＦ−２タンパク質及び／又はアノスミン−１タンパク質の量を本書類で前記される任意の方法を用いて検出するのに必要とされる全ての試薬を含有することが可能であり、これら試薬としては例えばＦＧＦ−２タンパク質及び／若しくはアノスミン−１タンパク質に対する特異的抗体、二次抗体又は陽性及び／若しくは陰性対照があるが、これらに限定されるものではない。キットはまた、バッファー、タンパク質抽出液、コンタミネーション防止剤、タンパク質分解阻害剤などを包含することもできるが、これらに限定されるものではない。加えて、キットはその実行及び最適化に要求される全ての媒体及び容器を包含してもよい。好ましくは、キットは本発明の方法を行うための説明書もまた包含する。
【００７７】
本発明で記載される方法及びキットは、ＣＮＳの脱髄疾患を有する対象の病変についての、白質における少なくとも１つの慢性又は非活動性の病変の有無に基づく分類を可能とする。本発明で記載される方法及びキットは従って、脱髄疾患を有する患者の治療（臨床試験を包含する）のタイプを選ぶのに有用であるが、その理由はＣＳＦ中のこの分子レベルが高いことはダメージの度合いがより大きいこと、従って再ミエリン化が不可能であることを指し示すためであり、この再ミエリン化は、どの供給源（自家移植、ドナーなど）であってもオリゴデンドロサイト前駆体（又は他の細胞タイプ）の移植の使用に基づく回復性細胞治療の使用を通じたものを包含する。一方、ＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルが非脱髄条件において見出されるレベルと同様であることは、脱髄疾患を有する患者のＣＮＳ中の病変は再生が可能であることを指し示し、従って、より大きな成功の期待を持って、同一の個体又はドナーのオリゴデンドロサイト前駆体（及び他のタイプの細胞）の移植を用いることによってかかる修復を助ける細胞治療の使用、又は内因性オリゴデンドロサイト前駆体の増強のための薬理治療の使用が可能である。
【００７８】
本発明で記載される方法及びキットは、ＣＮＳ脱髄疾患を有する対象の病変についての、灰白質において血液脳関門の変質があるか否かによる分類を可能とする。本発明で記載される方法及びキットは従って、脱髄疾患を有する患者の、神経細胞へのダメージの可能性に向かう発展、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１のレベルが非脱髄条件において見出されるレベルより顕著に高いことが見出される場合に起こる何かを予測するために有用である。従って、患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２及び／又はアノスミン−１のレベル測定は、神経修復だけでなく神経保護につながる、すなわち軸索を包囲する髄鞘を修復することより神経細胞を保護することに焦点を合わせた他の治療（新たな臨床試験のデザインを包含する）の使用の基礎となるものである。
【００７９】
本発明の態様の好ましい実施形態はＦＧＦ−２タンパク質の使用に関する。
【００８０】
本発明の態様の好ましい実施形態はアノスミン−１タンパク質の使用に関する。
【００８１】
本発明の態様の好ましい実施形態はＦＧＦ−２タンパク質及びアノスミン−１タンパク質の組み合わせの使用に関する。
【００８２】
本説明及び特許請求の範囲の全体にわたって、単語「含む」及びそのバリエーションは、他の技術的特徴、添加物、成分又はステップを除外することを意図されない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点及び特徴は本説明から部分的に推定され、本発明の実践から部分的に推定されるものであろう。以下の図及び実施例は説明として提供されるもので、本発明を限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルについての対照患者のレベルとの比較は、組織病理学的なレベルで白質における脱髄プラークのタイプを示すということを説明する図である。Ａ：対照患者及び多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２平均レベル。「＊＊」はｐ＜０．０１（ｔ  スチューデントｔ検定、又はノンパラメトリックなサンプルについてはマンホイットニー検定）である。Ｂ：ＦＧＦ−２のレベルと多発性硬化症患者の白質における病変タイプとの間の相関。ピアソン相関検定によって示される相関。Ｃ〜Ｄ：対照患者（Ｃ）、活動性病変を有する患者（Ｄ）及び非活動性病変を有する患者（Ｅ）の、ＨＬＤ−ＤＲ（ＭＨＣ−ＩＩ）についての二重免疫組織化学染色及びエリオクロムシアニンのミエリン染色。図の下は、各患者のＣＳＦ中で示されるＦＧＦ−２レベル。
【図２】多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルについての測定を用いるだけで、ＣＮＳ中に活動性病変のみを有する患者と少なくとも１つの慢性及び／又は非活動性の病変を有する患者とを区別することが可能であるということを示す図である。Ａ：組織切片からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット。Ｂ：セクションＡからのブロットの定量的分析は、活動性病変のみを持つ多発性硬化症患者並びに少なくとも１つの慢性及び／又は非活動性の損傷を有する多発性硬化症患者の両方が対照患者より有意に高いＦＧＦ−２のレベルを持つことを示す。一方、タンパク質抽出物中のＦＧＦ−２レベルの分析は、いずれの患者タイプ間でも差がないことを示す。Ｃ：Ａ〜Ｂにおいて表された同じ患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルの分析は、多発性硬化症患者の両群の間の有意な差を示す。
【図３】対照患者におけるレベルと比較した多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルは、オリゴデンドロサイト前駆体の移動に関連した分子環境を反映するということを説明する図である。Ａ〜Ｂ：アノスミン−１についての免疫標識を持たない活動性病変を示す、ＨＬＡ−ＤＲ（Ａ）又はアノスミン−１（Ｂ）についての二重免疫組織化学染色及びエリオクロムシアニンのミエリン染色（Ａ及びＢ）。Ｃ〜Ｄ：エリオクロムシアニン及びＨＬＡ−ＤＲ（Ｃ）で染色される病変領域はＦＧＦ−２（Ｄ）についての免疫標識を呈しないことを示す、慢性病変を有する患者の隣接する切片。Ｅ〜Ｆ：脱髄病変はアノスミン−１で満たされたように見えるということを示す、慢性病変のＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣ−ＩＩ）についての二重免疫組織化学染色及びエリオクロムシアニンのミエリン染色（Ｅ）並びにアノスミン−１（Ｆ）についての単純な免疫組織化学染色。各パネル対の右側に、これら写真で参照された各患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルが示される。
【図４】対照患者のレベルと比較した多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルと、灰白質における変質の存在との関係を示す図であり、両者はＦＧＦ−２及びアノスミン−１の発現並びに血液脳関門の完全性に関するものである。Ａ〜Ｆ：損傷患者におけるＦＧＦ−２及びアノスミン−１についての染色の強い増加を示す、対照患者（Ａ、Ｄ）及び多発性硬化症を有する患者（Ｂ〜Ｃ、Ｅ〜Ｆ）の大脳皮質におけるＦＧＦ−２（Ａ〜Ｃ）及びアノスミン−１（Ｄ〜Ｆ）についての免疫組織化学であり、血管周囲細胞に相当する。Ｇ〜Ｉ：血管周囲細胞のアストロサイト的な素質を実証する、この症例における血管周囲細胞のＦＧＦ−２（Ｇ）及びＧＦＡＰ（Ｈ）並びに核の対比染色を伴う両者の混合（Ｉ）についての二重蛍光免疫組織化学の例。Ｊ〜Ｏ：対照患者（Ｊ〜Ｌ）並びに白質における慢性及び非活動性の病変を有する患者（Ｍ〜Ｏ）の灰白質における、血液脳関門タンパク質ＺＯ−１についての染色（Ｊ、Ｍ）、ＦＧＦ−２と一緒の染色（Ｋ、Ｎ）、及び核の対比染色を伴うＺＯ−１、ＦＲＦ−２の２つの混合（Ｌ、Ｏ）を示す、二重蛍光免疫組織化学。血液脳関門の変質（Ｍ）はＦＧＦ−２陽性のアストロサイトの出現（Ｎ）に関連するということが示される。図の下部は、写真で参照された各患者について証明されたＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルを示す。
【図５−１】活動性病変のみが内側のＦＧＦ−２について免疫標識されたミクログリア／マクロファージ特性を有する細胞（図５Ａ〜Ｃ）、並びにそれぞれＣＤ６８（図５Ｄ〜Ｆ）及びＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｇ〜Ｉ）について二重に標識されて見える炎症性細胞を示すということを説明する図である。
【図５−２】対照的に、慢性及び非活動性の病変はＦＧＦ−２についてマークされた細胞を病変の内側には示さず、大半はプラーク周囲において示した（図５Ｊ〜Ｌ）。同様に、二重免疫染色はこれらの細胞をＨＬＡ−ＤＲについて免疫標識された（図５Ｍ〜Ｏ）、ミクログリア／マクロファージ特性を有する（図５Ｐ〜Ｒ）炎症性細胞として特徴付けた。さらに、慢性又は非活動性の損傷はＰＤＧＦＲαで免疫標識されたオリゴデンドロサイトの前駆体（図５Ｓ）をプラーク周囲において呈したが、このことはＧＦＡＰについての免疫標識（図５Ｕ〜Ｖ）ではなく、ＦＧＦＲ１についての免疫標識（図５Ｔ）を示す。
【実施例】
【００８４】
本特許書類で提供される以下の特定の実施例は、本発明の本質を説明するのに役立つ。これら実施例は説明の目的のみのために包含され、本明細書において請求される本発明の限定として解釈されるべきではない。従って下記の実施例は、特許請求の範囲を限定することなく本発明を説明するものである。
【００８５】
実施例１
本実施例において、発明者らは多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル測定は多発性硬化症患者の大脳皮質において組織学的に見出される病変タイプと相関するということを実証する。
【００８６】
組織とＣＳＦ両方の供給源として、様々な年齢の、異なるタイプの多発性硬化症を有する患者からのサンプルが用いられたが（表１）、全てＵＫ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ、ロンドン（英国）からのものであった。
【００８７】
【表１】
2013504075.tif 000002
【００８８】
病変の分類はＨＬＡ−ＤＲについての二重染色及びミエリンについてのエリオクロムシアニン組織学的染色により実施された。５０μｍ厚の組織切片は冷却源とつながれた滑走式ミクロトームを用いて取得され、回収されて使用するまで保存された。
【００８９】
最初に、洗浄の後、切片はクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を含有する培地中で９０℃で１０分間浸された。続いて、内因性ペルオキシダーゼが１０％メタノール及び３％Ｈ２Ｏ２を含んだリン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中での２０分間の前処理を用いることで不活化された。切片は次いで５％（ｖ／ｖ）健常ウマ血清及び０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ｖ／ｖ）を含んだリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を含有する培地中で１時間プレインキュベートされ、次いで抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１：２００）を含んだこの同じプレインキュベーション培地中で一晩インキュベートされた（４℃）。免疫組織化学的検出のため抗マウス二次抗体が用いられ、その後にＡＢＣ検出法及びＨ２Ｏ２存在下でのＤＡＢ色素原が続いて用いられ、一次抗体に結合する細胞が可視化された。
【００９０】
続いて、切片は室温で一晩、そしてさらに３７℃で２時間乾燥され、その後に切片は５分間アセトン中に浸されて、室温で３０分間乾燥を許された。切片はエリオクロムシアニンで１時間染色され、次いで水道水の流水中で洗浄され、その後に鑑別プロセスが次のように行われた。ｉ）５％鉄ミョウバン（ｗ／ｖ）で５分間、ｉｉ）水道水で洗浄、及びｉｉｉ）ホウ砂−フェリシアン化カリウム、それぞれ１％（ｗ／ｖ）及び１．２５％（ｗ／ｖ）で１０分間、顕微鏡下で色を調節。
【００９１】
多発性硬化症患者のＣＳＦは１４，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離され、感度限界が２ｐｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ−２に特異的なＥＬＩＳＡキットを用いることにより分析された。
【００９２】
多発性硬化症患者の組織及びＣＳＦ中のＦＧＦ−２免疫検出の存在の概要は表２に記載される。対照患者は脱髄病変を示さなかった（図１Ａ〜Ｃ）。ＦＧＦ−２のレベルが対照患者のレベルと同様であった多発性硬化症患者は白質のみにおいて、大量の、円形又は卵形の、ＭＨＣ−ＩＩに陽性の細胞で完全に満たされた血管周囲病変を示したが、これらの病変は全て活動性タイプとして分類された（図１Ａ〜Ｂ、Ｄ）。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルが対照患者のＣＳＦ中に存在するレベルよりはるかに高かった患者は、慢性又は非活動性の病変を、両方の又は活動性タイプの病変を持つ患者であっても常に呈した（図１Ａ〜Ｂ、Ｅ）。これらの慢性又は非活動性の病変は、病変の周りのＭＨＣ−ＩＩ陽性細胞により特徴付けられ、実質的にＭＨＣ−ＩＩ陽性細胞が内部に存在しない（慢性病変）か、又は完全にない（非活動性病変）ものである。これらの慢性又は非活動性の病変は常に大きく、組織ブロックあたりの発生数は少なかった。さらに、何らかの種類の損傷の存在は患者の年齢（ｒ＝０．０３５７、ｐ＝０．９３９）、死後間隔（ｒ＝−０．３２１、ｐ＝０．４８３）、同様に多発性硬化症のタイプに依存しなかった（表１及び２を参照）。
【００９５】
実施例２
本実施例において、発明者らはＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルを測定することにより２つの患者群の存在が定義され得るということを実証するが、これら２群はＦＧＦ−２が組織から直接的に測定される場合（ＷＢ）には区別できないものである。タンパク質は大脳皮質の組織切片から、タンパク質抽出キットを用いて固定された組織から抽出され、ＦＧＦ−２又はβ−チューブリン（ローディングの対照として）の存在はウエスタンブロット技術を用いて、ヤギで作られた一次ポリクローナル抗体（１：２００）又はマウスで作られた一次モノクローナル抗体（１：３０，０００）とハイブリダイズし、その後にそれぞれウマで作られた抗ヤギビオチン化二次抗体（１：５，０００）又はウサギで作られたＨＲＰコンジュゲートの抗マウスポリクローナル抗体とハイブリダイズして免疫検出された（図２Ａ）。ＦＧＦ−２の場合、検出はストレプトアビジン−ＨＲＰの結合により完了した。イムノブロットの定量化は、活動性病変のみを有するかかる患者と少なくとも１つの慢性及び／又は非活動性の病変を持った患者の両方が対照患者より顕著に高いＦＧＦ−２レベルを呈したことを示した（図２Ｂ）。一方、両患者群の間で統計的に有意な差は見出されなかった。タンパク質が大脳皮質から抽出されたのと同じ患者におけるＣＳＦのＥＬＩＳＡ分析（実施例１について記載されたのと同様のもの）（図２Ｃ）は、慢性及び／又は非活動性の病変を有する患者のみが活動性病変のみを有する患者及び対照患者より有意に高いＦＧＦ−２レベルを呈したことを示した。このことはＣＳＦ分析が多発性硬化症を有する患者に存在する組織病理を区別するのに適した方法であることを示したが、その理由は両タイプの患者が区別され得るためである。
【００９６】
実施例３
本実施例において、発明者らは多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベル及び／又はアノスミン−１レベルを測定することは白質の脱髄病変において見出される分子環境の良い生物指標であるということを実証する。
【００９７】
これを検証するため、同じ組織ブロックからの同じ切片又は隣接する切片におけるＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１又はアノスミン−１についての免疫組織化学染色及びエリオクロムシアニンのミエリン染色を用いて分析された。免疫染色に用いられたプロトコールは実施例１と同じものであったが、次のバリエーションを伴った。組織におけるＦＧＦ−２又はＦＧＦＲ１の免疫検出のため、ヤギで作られた異なるポリクローナル抗体（１：２５０  ｖ／ｖ）が用いられ、その後にウマで作られた抗ヤギポリクローナル抗体をビオチン化したもの（１：２００）及びＡＢＣ検出キットが用いられた。アノスミン−１の免疫染色のため、ウサギで作られたポリクローナル抗体（１：５００）が用いられ、この抗体は後にビオチン化されたヤギで作られたポリクローナル抗体（１：２００）に結合した。免疫標識のプロセスは同様であって、ＤＡＢ及びＨ２Ｏ２で曝露された。
【００９８】
対照患者及び多発性硬化症患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２検出は実施例１と同じ様式で実施された。
【００９９】
対照患者は用いられた抗体のいずれについても免疫染色を示さなかった。対照レベルと同様のＦＧＦ−２レベルを有する患者は活動性病変の中又は周りにＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１又はアノスミン−１についての免疫染色を示さなかった（図３Ａ〜Ｂ）。一方、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルが対照患者において検出されるレベルより顕著に高かった患者は慢性及び／又は非活動性の損傷の周りにＦＧＦ−２とＦＧＦＲ１の両方についての強い免疫染色を示した（図３Ｃ〜Ｄ）。加えて、各患者に存在する大きな慢性及び／又は非活動性の病変を完全に満たすことにより、強い免疫染色がアノスミン−１について観察された（図３Ｅ、Ｆ）。ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルが高い患者組織のいくつかにおいて見出された活動性病変は、対照者のレベルと同様のＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルを有する多発性硬化症患者において観察された病変との差を示さなかったが、このことはＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１及びアノスミン−１の存在は慢性又は非活動性の病変タイプに特異的であり、個体の年齢、多発性硬化症のタイプ又は死亡とサンプル採取との間の死後間隔には特異的でないことを指し示す。
【０１００】
実施例４
本実施例において、発明者らは一方で活動性病変における、他方で慢性及び非活動性の病変における、ＦＧＦ−２及びＦＧＦＲ１産生細胞の同一性を開示する。二重組織免疫染色は、ＦＧＦ−２についてのウサギポリクローナル抗体（１：２００  ｖ／ｖ）を炎症性細胞マーカーＨＬＡ−ＤＲについての抗体（上の実施例を参照）及びミクログリア／マクロファージに特異的なＣＤ６８についての抗体（マウスで作られたモノクローナル抗体、１：２００）と一緒に用いることで実施された。三重免疫組織化学染色もまたＦＧＦＲ１（ウサギで作られたポリクローナル抗体、１：５００  ｖ／ｖ）、ＰＤＧＦＲα（ウサギで作られたポリクローナル抗体、１：１００  ｖ／ｖ）及びＧＦＡＰ（マウスで作られたモノクローナル抗体、１：５００  ｖ／ｖ）について実施された。ＦＧＦＲ１の場合、免疫蛍光はビオチン化されたヤギで作られた抗ウサギ二次抗体、ＡＢＣキット、同様にチラミド増幅キット（ＴＳＡ）及びストレプトアビジンテキサスレッド（１：５００  ｖ／ｖ）を用いることにより増強された。ＧＦＡＰ可視化のため、Ａｌｅｘａ６３３に結合したロバで作られたマウスポリクローナル抗体が用いられ、ＰＤＧＦＲαのためにＡｌｅｘａ４８８に結合したロバで作られたウサギポリクローナル抗体が用いられた。加えて、核はヘキストで対比染色された。
【０１０１】
結果は、活動性病変のみが、病変の内側におけるＦＧＦ−２について免疫標識されたミクログリア／マクロファージ特性を有する細胞（図５Ａ〜Ｃ）、並びにＣＤ６８（図５Ｄ〜Ｆ）及びＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｇ〜Ｉ）について二重に標識されて見える炎症性細胞をそれぞれ示したことを示した。対照的に、慢性及び非活動性の病変はＦＧＦ−２について標識された細胞を病変の内側には示さず、大半はプラーク周囲において示した（図５Ｊ〜Ｌ）。同様に、二重免疫染色はこれらの細胞をＨＬＡ−ＤＲについて免疫標識された（図５Ｍ〜Ｏ）、ミクログリア／マクロファージ特性を有する（図５Ｐ〜Ｒ）炎症性細胞として特徴付けた。加えて、慢性及び非活動性の病変はプラーク周囲においてＰＤＧＦＲαで免疫標識されたオリゴデンドロサイト前駆体（図５Ｓ）を呈したが、このことはＧＦＡＰについての免疫標識（図５Ｕ〜Ｖ）ではなく、ＦＧＦＲ１についての免疫標識（図５Ｔ）を示した。この結果は実施例３に記載されたデータを確認及び拡張するもので、活動性病変のみを有する患者は細胞修復に好ましい環境を呈する一方、慢性及び／又は非活動性の病変を有する患者は病変の内部でなく周りにかかる微小環境を示し、それ故に修復を妨げるということを示す。患者のＣＳＦ中のＦＧＦ−２を測定することにより、多発性硬化症患者の普遍的な好ましい／阻害的な環境が知られ得る。
【０１０２】
実施例５
本実施例において、発明者らはＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルの測定は、白質における脱髄病変の存在にかかわらず、多発性硬化症患者の灰白質における変質と相関するということを示す。
【０１０３】
ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１及びアノスミン−１についての免疫染色並びにエリオクロムシアニンのミエリン染色に加えて、実施例１及び３に記載されたのと同様の方法で、二重免疫組織化学がＦＧＦ−２又はアノスミン−１及び血液脳関門の一部である閉鎖小帯に存在するタンパク質（ＺＯ−１）又はアストロサイトの典型的なマーカーであるグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対して行われた。ＧＦＡＰ検出はウサギで作られたポリクローナル抗体で実施され、後にこの抗体は蛍光分子に結合したロバで作られたウサギに対する二次ポリクローナル抗体に結合した。ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１及びアノスミン−１の免疫検出のため、実施例１及び３に記載されたものと同じプロトコールが続いたが、ＤＡＢ及びＨ２Ｏ２で曝露されること、チラミド技術を用いてシグナルを拡張すること、続いてＧＦＡＰの場合については異なる発光波長を有し、発光される蛍光から離れた蛍光分子に結合したストレプトアビジン分子を添加することは行われなかった。このプロトコールは１つ又は両方の色の蛍光を発する細胞の検出を実現させた。細胞外マトリックスタンパク質の特別な特性のため、アノスミン−１を検出するため、切片はクエン酸バッファー浴（ｐＨ６．０）を高温高圧で３分間用いることによりエピトープをアンマスクする特定の抗原回復プロセスを受けた。
【０１０４】
ＦＧＦ−２又はアノスミン−１及びＺＯ−１に対する二重免疫組織化学の場合、前の段落に記載されたプロトコールを完了する前に、１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）のプロテイナーゼＫでのプレインキュベーション（３７℃で１時間）、続いてアセトン中でのプレインキュベーション（３０分間、−１８℃）が処理された。ＺＯ−１の検出のため、ウサギで作られたポリクローナル抗体（１：１００、ｖ／ｖ）が用いられ、この抗体は翌日にＧＦＡＰについて記載されたものと同様の二次抗体に結合した。
【０１０５】
ＣＳＦ中のＦＧＦ−２の測定は上に示された３つの実施例と同じ方法で実施された。
【０１０６】
結果は、対照患者が灰白質におけるＦＧＦ−２又はアノスミン−１についての免疫標識（図４Ａ、Ｄ）、又は抗ＺＯ−１抗体でマークされた血液脳関門における変質（図４Ｊ〜Ｌ）を示さなかったことを明らかにした。ＣＳＦ中のＦＧＦ−２のレベルが対照者のレベルと同様であった多発性硬化症患者はいずれのマーカーの発現パターンにも変化を示さなかった。対照的に、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルが対照者のレベルよりはるかに高かった多発性硬化症患者は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１及びアノスミン−１に陽性の細胞を灰白質の血管周辺に示したが（図４Ｂ〜Ｃ、Ｅ〜Ｆ）、この細胞はＧＦＡＰに対する二重免疫組織化学（図４Ｇ〜Ｉ）により血管周囲アストロサイトとして同定された。その上、これらの新しい細胞はまた、脱髄プラークのない、いわゆる正常に見える白質という組織ブロックにも存在した。血液脳関門タンパク質ＺＯ−１の発現パターン解析は、これら患者の脱髄プラークのないブロックを包含する灰白質が非連続的な、この場合は断続的で不均等に見えるパターンを示したことを示したが、このことは灰白質の血液脳関門の破損（図４Ｍ〜Ｏ）を反映する。加えて、ＺＯ−１発現において見られた主要な変化はＦＧＦ−２陽性のアストロサイトの領域と空間的に一致したが、このことは血液脳関門の維持を達成するためのこのＦＧＦ−２分子のアップレギュレーションを指し示す。従って、ＣＳＦ中のＦＧＦ−２レベルを測定することは、脱髄が起きていない部位であっても、灰白質の血液脳関門の欠陥状態についての良い生物指標であり、将来の神経変性を回避するための予後検査として役立つことができる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５−１】
2013504075.tif 000008
【図５−２】
2013504075.tif 000009
【配列表】
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【国際調査報告】
2013504075.tif 000010
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2013504075.tif 000012
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