(57)【要約】  本発明は、患者の炎症性腸疾患を、クローン病としてまたは潰瘍性大腸炎として分類するための方法に関し、前記方法は、患者からの試料中のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡは、miR15a, miR26a, miR29a, miR29b, miR30c, miR126*, miR127-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a, miR-146b-5p, miR150, miR-181d, miR-182, miR185, miR196a, miR199a-3p, miR199a-5p, miR199b-5p, miR-203, miR223, miR-299-5p, miR320a, miR324-3p, miR-328である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病としてまたは潰瘍性大腸炎として患者の炎症性腸疾患を分類するための方法であって、前記方法は、患者からの試料中のｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルを測定する工程であって、ここで前記ｍｉＲＮＡｓは、miR15a, miR26a, miR29a, miR29b, miR30c, miR126*, miR127-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a, miR-146b-5p, miR150, miR-181d, miR-182, miR185, miR196a, miR199a-3p, miR199a-5p, miR199b-5p, miR-203, miR223, miR-299-5p, miR320a, miR324-3p, miR-328であり、そして患者の試料中の前記ｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルを、前記ｍｉＲＮＡｓのコントロールプロファイルと比較することからなる工程であって、ここで前記発現プロファイル間の差異または類似性はクローン病または潰瘍性大腸炎を示す工程を含む、方法。
【請求項２】
試料が、患者の大腸で実施された内視鏡的生検から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が、患者の大腸の炎症のない粘膜において単離される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記キットが、（ｉ）患者から得られた試料中のｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルを測定するための手段、および（ｉｉ）ＣＤまたはＵＣとして前記発現プロファイルを分類するためのツールを含む、請求項１〜３のいずれか記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、患者の炎症性腸疾患を、クローン病としてまたは潰瘍性大腸炎として分類するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管の重度で再発性の免疫学的に媒介される慢性疾病である。ＩＢＤｓは、共生腸内細菌のサブセットに対する過度に活動的な炎症応答をもたらす種々の遺伝的異常によって特徴づけられる不均質な疾患である。
【０００３】
クローン病は、消化管の全ての部分および特に回腸および／または大腸に影響を及ぼし得、そして粘膜潰瘍、瘻孔および腸壁への炎症細胞の深い浸潤に至る。
【０００４】
潰瘍性大腸炎はしばしば大腸の下部部分および直腸において起こり、そして粘膜炎症は連続したパターンで盲腸にまで広がり得る。
【０００５】
診療では、ＩＢＤ大腸炎の患者の２０〜３０％を、通常の内視鏡的、放射線学的および病理組織学的基準に基づいてＣＤまたはＵＣと分類することができないが、この区別は、特に大腸切除を考察する場合には、治療選択肢を導くのに重要であり得る。
【０００６】
同様に、血清学的マーカー（好中球に対する自己抗体［ＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ］および抗微生物抗体［ＡＳＣＡ、抗ＯｍｐＣ、抗Ｉ２および抗ＣＢｉｒ１］）の感度は、ＣＤとＵＣとを区別するのには依然として不十分である。他方で、ＩＢＤｓの病因およびフレアの原因は、依然として主に不明であり、そしてＣＤおよびＵＣの特異的バイオマーカーもまた早期の診断を評価するために必要とされる。現在までに、厳密に特異的なバイオマーカーは依然として選出するのが困難である。
【０００７】
発明の要約：
本発明は、患者の炎症性腸疾患をＣＤとしてまたはＵＣとして分類するための方法に関し、前記方法は、患者からの試料中のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡは、miR15a, miR26a, miR29a, miR29b, miR30c, miR126*, miR127-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a, miR-146b-5p, miR150, miR-181d, miR-182, miR185, miR196a, miR199a-3p, miR199a-5p, miR199b-5p, miR-203, miR223, miR-299-5p, miR320a, miR324-3p, miR-328である。
【０００８】
発明の詳細な説明：
本発明者らの目的は、健康個体に対する、ＩＢＤ患者の無活動の炎症のない大腸粘膜におけるｍｉＲＮＡ遺伝子発現の変化を特定することであった。従って、本発明者らは、正常な健康組織と比較して、活動的なＵＣおよびＣＤを有する患者の静止状態の粘膜におけるｍｉＲＮＡ遺伝子発現のパターンのゲノム全体での変化を研究した。本発明者らは静止状態の粘膜組織において高度に変化した発現を有する２２個（ＵＣ）および３４個（ＣＤ）のｍｉＲＮＡのサブセットを同定し、１０個は炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において一般的に調節不全であった（表Ｂ）。より具体的には、本発明者らは、発現が、ＵＣ患者およびＣＤ患者の炎症のない大腸生検材料において統計学的に差がある１５個のｍｉＲＮＡを選択した（表Ｂおよび図１参照）。これらのｍｉＲＮＡおよび炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において一般的に調節不全である１０個を、その後、ＣＤとＵＣとを区別するその能力について試験した。ＵＣまたはＣＤとしての患者のパネルの臨床的分類に基づくと、２５個のｍｉＲＮＡの選択は、１６人中１５人の患者をその真のクラスに予測することができた（表Ｖ）。
【０００９】
従って、本発明は、患者の炎症性腸疾患をクローン病としてまたは潰瘍性大腸炎として分類するための方法に関し、前記方法は、患者からの試料中におけるｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡｓは、miR15a, miR26a, miR29a, miR29b, miR30c, miR126*, miR127-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a, miR-146b-5p, miR150, miR-181d, miR-182, miR185, miR196a, miR199a-3p, miR199a-5p, miR199b-5p, miR-203, miR223, miR-299-5p, miR320a, miR324-3p, miR-328である。
【００１０】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は、１９から２３までの長さのヌクレオチドも報告されているが、一般に２１から２２ヌクレオチド長である成熟したマイクロＲＮＡ（コードしていない小さなＲＮＡｓ）分子を指す。ｍｉＲＮＡｓは各々、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」：ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）からプロセシングされる。Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓはタンパク質をコードしない遺伝子から転写されるか、またはタンパク質をコードする遺伝子（イントロンまたはコードしていないエキソン内）に組み込まれている。「前駆体ｍｉＲＮＡｓ」は不完全に塩基対形成したステムを含むヘアピン構造に折りたたまれ、そして動物においてはＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒと呼ばれる２つのリボヌクレアーゼＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって触媒される２つの工程でプロセシングされる。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的にはステムの部分である。プロセシングされたｍｉＲＮＡｓ（また、「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は、特定のターゲット遺伝子（群）の転写後抑制（ダウンレギュレーション）を行なう大きなリボヌクレオタンパク質複合体（ｍｉＲＩＳＣｓ）へと構築される。
【００１１】
本発明に属する全てのｍｉＲＮＡｓはそれ自体公知であり、そしてそれらの配列は、データベースhttp://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?org=hsaから公共的に入手できる。本発明のｍｉＲＮＡｓを表Ａに列挙する。
【００１２】
【表１】
2013535971.tif 000002
【００１３】
表５の２５個のｍｉＲＮＡｓの中で、１０個は、炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において一般に調節不全として同定され、そして１５個は、ＵＣ患者およびＣＤ患者の炎症のない大腸生検材料において発現が統計学的に異なっていた（表Ｂおよび図１参照）。従って、炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において一般に調節不全である１０個のｍｉＲＮＡｓプロファイルは、患者が炎症性疾患を患っているという確認を可能とし、そして残りの１５個は、ＵＣとＣＤとを区別するために使用される。
【００１４】
【表２】
2013535971.tif 000003
【００１５】
「ｍｉＲＮＡプロファイル」という用語は、試料中の表ＡのｍｉＲＮＡｓの発現パターンに関するデータセットを指す。
【００１６】
「試料」という用語は、患者の大腸から得られた任意の試料を意味し、これは粘膜細胞を含む。前記試料は、in vitroにおける評価の目的で得られる。特定の態様において、試料は、患者の大腸において実施された内視鏡生検から得られる。前記の内視鏡生検材料は、大腸の種々の領域から採取され得る。別の特定の態様において、試料は、患者の大腸の炎症のない粘膜から単離され得る。結果として、本発明による方法の侵襲性は、患者を麻酔したりまたは患者の腸を空にしたりする必要がなく比較的限定されている。
【００１７】
別の特定の態様において、例えば核酸の分解を回避するために、試料をその使用前に処理し得る。細胞溶解、核酸の濃縮または希釈の技術は当業者には公知である。
【００１８】
患者から得られた試料中のｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルの測定は、多種多様な技術によって実施され得る。
【００１９】
例えば試料（例えば患者から調製された細胞または組織）に含まれるリボ核酸をまず、製造業者の指示に従って、標準的な方法のみに従ってまたは組み合わせて（例えば溶解酵素または化学試薬に基づいた溶解溶液または核酸結合樹脂）抽出する。その後、抽出されたｍｉＲＮＡｓをハイブリダイゼーション（例えばノザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。他の増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００２０】
特定の態様において、決定は、試料を、プローブまたはプライマーなどの選択試薬とハイブリダイズさせ、そしてそれにより試料中に元来あるｍｉＲＮＡｓの存在またはその量を検出することを含む。ハイブリダイゼーションは、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどの任意の適切な器具によって実施され得る。特定の態様において、ハイブリダイゼーションは、ｍｉＲＮＡアレイなどの試薬でコーティングされた基材上で実施される。基材は、固体または半固体基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体であり得る。基材は、種々の形状およびサイズ、例えばスライド、メンブラン、ビーズ、カラム、ゲルなどであり得る。ハイブリダイゼーションは、検出可能な複合体（例えばｍｉＲＮＡｓハイブリッド）が、試薬と試料のｍｉＲＮＡｓとの間で形成されるのに適した任意の条件下で行なわれ得る。
【００２１】
対象のｍｉＲＮＡｓに対して配列相補性または相同性を示す核酸は本明細書においてハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用性を見出す。このような核酸は、同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に対して少なくとも約８０％、より好ましくは８５％、そしてさらにより好ましくは９０〜９５％同一であると理解される。特定の態様において、ハイブリダイゼーションを検出するために検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利である。蛍光、放射能、酵素または他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）を含む多種多様な適切な指示薬が当技術分野において公知である。
【００２２】
プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイズするｍｉＲＮＡｓに対して「特異的」であり、すなわち、それらは好ましくは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下（最も高い融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。１×ＳＣＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）においてハイブリダイズする。
【００２３】
従って、本発明は、ｍｉＲＮＡアレイまたはｍｉＲＮＡプローブアレイの調製および使用に関し、これらは、空間的に離れた構成で支持体または支持体材料上に配置された複数のｍｉＲＮＡ分子に対して完全にまたはほぼ相補的または同一である核酸分子（プローブ）のマクロアレイまたはマイクロアレイである。マクロアレイは典型的にはニトロセルロースまたはナイロンのシートであり、その上にプローブがスポットされている。マイクロアレイでは核酸プローブをより濃く配置し、１０，０００個までの核酸分子を典型的には１〜４平方センチメートルの領域に装着させることができる。マイクロアレイは、核酸分子（例えば遺伝子、オリゴヌクレオチドなど）を基材上にスポットすることによって、またはin situで基材上でオリゴヌクレオチド配列を合成することによって製造され得る。スポットされたまたはin situで合成された核酸分子は、１平方センチメートルあたり約３０個またはそれ以上、例えば１平方センチメートルあたり約１００個またはさらには１０００個の非同一な核酸分子という高密度マトリックスパターンで適用され得る。マイクロアレイは典型的には、ニトロセルロースまたはナイロンに基づいたフィルターアレイの材料とは対照的に、コーティングされたガラスを固相支持体として使用する。ｍｉＲＮＡを補完する核酸試料の順序よく並べられたアレイを有することによって、各々のｍｉＲＮＡの位置（？？）を追跡することができ、そして元々の試料に関連づけることができる。複数の明確に異なる核酸プローブが固相支持体の表面に安定に結合されている多種多様な異なるアレイ器具は当業者に公知である。アレイにとって有用な基材としては、ナイロン、ガラス、金属、プラスチック、ラテックスおよびシリコンが挙げられる。このようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列または種類、プローブとアレイ表面との間の結合の性質（例えば共有結合または非共有結合等）などを含む多くの異なる様式において異なり得る。
【００２４】
ｍｉＲＮＡプローブのアレイまたはセットを調製し、そして／または試料中のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡプローブを標識した後、ターゲット核酸の集団をアレイまたはプローブとハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、このような条件は、所望であれば、実施される具体的なアッセイの観点から最適なレベルの特異性を与えるように調整され得る。適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、そしてこれはSambrook et al. (2001)に考察されている。多くの態様において特に興味深いのは、ハイブリダイゼーション中のストリンジェントな条件の使用である。ストリンジェントな条件は当業者に公知である。
【００２５】
あるいは、逆転写（ＲＴ）のためのステムループプライマー、続いてリアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用することによって、ｍｉＲＮＡｓ定量法を実施し得る。典型的には、前記方法は、ステムループプライマーをｍｉＲＮＡターゲットにアニーリングさせ、そして逆転写酵素の存在下において伸長する第１工程を含む。その後、ｍｉＲＮＡ特異的フォワードプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、およびリバースプライマーをＰＣＲ反応のために使用する。ｍｉＲＮＡｓの定量は、測定されたＣＴ値に基づいて推定される。
【００２６】
多くのｍｉＲＮＡ定量アッセイが、Qiagen (S.A. Courtaboeuf, France)またはApplied Biosystems (Foster City, USA)から市販されている。
【００２７】
ｍｉＲＮＡの発現プロファイルは、絶対発現プロファイルまたは標準化された発現プロファイルとして表現され得る。典型的には、ｍｉＲＮＡの発現を、関連性のないｍＲＮＡ（例えば恒常的に発現されているハウスキーピングｍＲＮＡ）の発現と比較することによって、ｍｉＲＮＡの絶対発現プロファイルを修正することによって発現プロファイルを標準化する。標準化のための適切なｍＲＮＡとしては、ハウスキーピングｍＲＮＡｓ、例えばＵ６、Ｕ２４、Ｕ４８およびＳ１８などが挙げられる。この標準化は、ある試料（例えば患者の試料）の発現プロファイルと別の試料の発現プロファイルとの比較を、または異なる起源からの試料間の比較を可能とする。
【００２８】
特定の態様において、本発明の方法はさらに、患者の試料中の前記ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを、前記ｍｉＲＮＡのリファレンスプロファイルと比較する工程を含み、前記発現プロファイル間の差異または類似は、クローン病または潰瘍性大腸炎を示す。本発明によるリファレンスプロファイルは疾患に特異的である。従って、リファレンスプロファイルは、組織リファレンス（このような組織はクローン病または潰瘍性大腸炎を示す）ににおける前記ｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルからなり得る。従って、リファレンスプロファイルは、ａ）クローン病または潰瘍性大腸炎からの組織試料を少なくとも１回収集し、ｂ）前記収集物に含まれる各組織試料について、前記ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを決定する工程を含む方法を実施することによって予め決定され得る。
【００２９】
典型的には、ＵＣまたはＣＤを示すリファレンスプロファイルを表Ｃに示す。
【００３０】
【表３】
2013535971.tif 000004
【００３１】
本明細書において使用する「アップレギュレート」という用語は、対応するｍｉＲＮＡの発現が、健康患者（例えばＩＢＤに罹患していない患者）において一般的に決定された発現と比較してアップレギュレートされていることを意味する。
【００３２】
本明細書において使用する「ダウンレギュレート」という用語は、対応するｍｉＲＮＡの発現が、健康患者（例えばＩＢＤに罹患していない患者）において一般的に決定された発現と比較してダウンレギュレートされていることを意味する。
【００３３】
本明細書において使用する「調節不全ではない」という用語は、対応するｍｉＲＮＡの発現が、健康患者（例えばＩＢＤに罹患していない患者）において一般的に決定された発現と同じレベルであることを意味する。
【００３４】
あるいは、発現プロファイルはスコアとして表現され得る。例えば、ｉ）プロファイルのあらゆるｍｉＲＮＡについて、試料中のその発現レベルを決定し、ｉｉ）あらゆるｍｉＲＮＡについて係数（アップレギュレートされている場合には正の係数、またはダウンレギュレートされている場合には負の係数）を割り当てることによって前記スコアを得ることができる。前記スコアの利点は、「カットオフ値」として表現され得るリファレンスプロファイルとの比較工程をより容易にすることである。例えば、リファレンス（「カットオフ」）値は、ＵＣまたはＣＤを示す組織試料におけるプロファイルについて計算されたスコアを示す。カットオフ値はまた、ＵＣまたはＣＤを示す組織試料について本発明の方法を実施することによっても予め決定され得る。特定の態様において、前記したようなカットオフ値は表中に報告され得、よって医師は、患者について得られたスコアを前記の値と比較することができ、そして患者がＵＣまたはＣＤを有するかどうかを容易に決定することができる。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法を実施するためのキットに関し、前記キットは、患者から得られた試料におけるｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルを測定するための手段を含む。前記キットは、前記したようなプローブ、プライマー、マクロアレイまたはマイクロアレイを含み得る。
【００３６】
例えば、前記キットは、通常ＤＮＡからなり、そして予め標識されていてもよい、前記に定義したような１セットのｍｉＲＮＡプローブを含み得る。あるいは、プローブは標識されていなくてもよく、そして標識のための成分が、キット中の別々の容器に含まれていてもよい。前記キットはさらに、ハイブリダイゼーション試薬または特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要とされる他の適切にパッケージングされた試薬および材料（適用可能である場合には固相マトリックス、および標準物質を含む）を含み得る。
【００３７】
あるいは、本発明のキットは、予め標識されていてもよいか、またはアフィニティ精製部分または付着部分を含み得る、増幅プライマー（例えばステムループプライマー）を含み得る。前記キットはさらに増幅試薬およびまた特定の増幅プロトコールに必要とされる他の適切にパッケージングされた試薬および材料を含み得る。
【００３８】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例および図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において差異的に変化した発現を有するｍｉＲＮＡ：箱ひげ図（Box-whisker plot）分析。ｍｉＲＮＡ発現を、ＵＣ患者およびＣＤ患者（８人の患者／ＩＢＤ）から得られた炎症のない大腸粘膜において測定し、そして健康コントロールにおいて測定したものに対してコンピューター計算した。ＵＣおよびＣＤの粘膜組織において統計学的に異なる発現の変化を有する６つのｍｉＲＮＡｓ（mir-150, mir-196b, mir-199a-3p, mir-199b-5p, mir-223およびmir-320a）に対応するデータを、箱ひげ図（箱、２５〜７５％；ひげ、１０〜９０％；線、中央値）として提示する；ｐ＜０．０５。
【００４０】
実施例：ｍｉＲＮＡ遺伝子発現は、ＵＣおよびＣＤの両方の大腸生検材料において変化している：
材料および方法：
ＩＢＤ患者およびコントロール：大腸ピンチ生検は、大腸内視鏡検査スクリーニングを受けた軽度から重度のＣＤ患者およびＵＣ患者並びに健康個体の内視鏡検査中に得られた（表Ｉ）（地域倫理委員会によって承認されたプロトコール）。
【００４１】
【表４】
2013535971.tif 000005
【００４２】
ＣＤおよびＵＣについての臨床疾患活動性を、ハーベイブラッドショウおよび大腸炎活動（ＣＡＩ）指数にそれぞれ従って評価した。各ＩＢＤ患者において、大腸組織の内視鏡的に炎症のない（無活動の）領域および炎症のある領域を穿刺した（１領域あたり５つの生検材料）。各領域からの３つの生検材料を、直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）への浸漬のために割り当て、その後、瞬間冷凍し、そして液体窒素中に保存した。２つは病理組織学的検査のために分離した。生検材料収集では、無活動領域および炎症のある領域は、大腸に沿って２０cm以上離した。健康コントロールにおいては、５つの生検材料を右大腸および左大腸の両方から穿刺し、そして前記のように処理した。合計で２６０個の生検材料を処理した。
【００４３】
病理組織学的分析：生検材料を慣用的にヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。粘膜損傷および炎症細胞浸潤の組織学的評価は、ＵＣおよびＣＤの両方の大腸における罹患を特徴づけることが以前に確証されたスコアを使用して、同じ消化管病理学者専門家によって等級づけられた。ｍｉＲＮＡ遺伝子発現の変化を、この組織学的ガイドラインに従って研究した。
【００４４】
ＲＮＡ単離：全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Invitrogen）を用いて生検材料から抽出し、その後、ＮＤ−１０００ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（NanoDrop Technologies）を使用して定量し、そして純度／完全性を、使い捨てＲＮＡチップ（Agilent RNA 6000 Nano LabChip kit）およびＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（Agilent Technologies, Waldbrunn, Germany）を使用して評価した。ＲＩＮ＞７を有するＲＮＡ調製物だけを、ｍｉＲＮＡ発現の分析のためにさらに処理した。
【００４５】
逆転写およびリアルタイムＱ−ＰＣＲ：３２１個の成熟したヒトｍｉＲＮＡを定量化するために設計されたＨｕｍａｎ Ｐａｎｅｌ Ｅａｒｌｙ Ａｃｃｅｓｓキット（TaqMan（登録商標）MicroRNAアッセイ; Applied Biosystems）を使用した。ｃＤＮＡを、ｍｉＲＮＡ特異的ステムループＲＴプライマーを使用して１０ngの全ＲＮＡから生成した。リアルタイムＱ−ＰＣＲアッセイを製造業者の指示に従って約１．３ngの全ＲＮＡに等価なｃＤＮＡのアリコートを使用して実施し、そしてＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Roche Diagnostics）で行なった。
【００４６】
リアルタイム定量ＰＣＲ結果の標準化：いくつかのＲＮＡ（Ｕ６、Ｕ２４、Ｕ４８およびＳ１８）を推定的な標準物質として試験し、そしてＵ６（遍在性の核内低分子ＲＮＡ）が最も信頼性があることが判明した。従って、ｍｉＲＮＡの発現をＵ６と比較してコンピューター計算し、そして閾値サイクル比較法（comparative threshold cycle method）（2-ΔΔCT）を使用して、炎症のないおよび炎症を有するＩＢＤ組織を健康コントロールと比較した。
【００４７】
統計学的分析：独立した数値の群を、ノンパラメトリックマンホイットニー検定に従って比較した。統計学的有意性はｐ≦０．０５と設定された。
【００４８】
結果：
ＩＢＤ組織におけるｍｉＲＮＡ発現の変化を調査する上での本発明者らの目的は、ＵＣ患者およびＣＤ患者の無活動の大腸粘膜における早期の上皮細胞機能異常を説明し得る特異的な改変について確認することであった（表Ｉ）。従って、本発明者らはグレード０および１の生検材料に焦点を当てたが、グレード２〜４（炎症を有する粘膜）も、疾患の両段階の比較のために研究した。
【００４９】
ｍｉＲＮＡ発現をリアルタイムＱ−ＰＣＲｍｉＲＮＡアッセイによって定量した。３２１個という多数のヒトｍｉＲＮＡ転写物（2-ΔCT）を測定して、予備実験は、健康コントロール組織の右大腸および左大腸間に有意差は全く観察されなかったことを示した。
【００５０】
変化した遺伝子発現を有するｍｉＲＮＡの選択についての本発明者らの厳しい基準に従って（10 x Log102-ΔΔCT > 7または< -7）、ＵＣ組織においてはアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの平衡がとれていたが（それぞれ５１．７％および４８．３％）、ＣＤ組織においては変化したｍｉＲＮＡの大半（８５．４％）がアップレギュレートされていた。
【００５１】
ＵＣ組織：ＵＣ組織においては１７３個のｍｉＲＮＡが検出レベルを超えて発現されていた（ＣＴ＜３５）。炎症のないＵＣ組織および健康コントロール組織を比較した場合に２２個のｍｉＲＮＡｓが差異的に発現され、１０個および１２個がそれぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートされていた。１７個のｍｉＲＮＡ（本発明者らの選択基準に一致しなかったmir-185、196a、214、376a、424を除く全て）が、無活動ＵＣ粘膜および炎症を有するＵＣ粘膜において類似した調節不全の発現を示した。
【００５２】
ＣＤ組織：ＣＤ組織においては２０４個のｍｉＲＮＡが検出レベルを超えて発現されていた。炎症のないＣＤ組織および健康コントロール組織を比較した場合に３４個のｍｉＲＮＡｓが差異的に発現されていると同定され、３０個および４個がそれぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートされていた。２８個のｍｉＲＮＡ（本発明者らの選択基準に一致しなかったmir-9*、30a*、30c、223、374a、451を除く全て）が、無活動ＣＤ粘膜および炎症を有するＣＤ粘膜において類似した調節不全の発現を示した。
【００５３】
最後に、本発明者らはまた、炎症を有するＵＣ組織またはＣＤ組織に特異的なｍｉＲＮＡ遺伝子発現の変化に気付いた（それぞれ７個および１３個のｍｉＲＮＡ）。
【００５４】
ＵＣ組織およびＣＤ組織：１０個のｍｉＲＮＡｓが、炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において共通して変化した発現を共有し、その中の７個（mir-30c、185および196aを除く全て）がまた、炎症を有するＵＣ生検材料およびＣＤ生検材料の両方において過剰発現されていた（表ＩＩ）。
【００５５】
【表５】
2013535971.tif 000006
【００５６】
相対的ｍｉＲＮＡ発現を、健康コントロールにおいて測定されたものに対してコンピューター計算した。炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織の両方においてカットオフ値（10 x log102-ΔΔCT > 7）と比較して共有された過剰発現を有するｍｉＲＮＡを列挙する。アクセッションナンバー、ＭＩＭＡＴ識別番号；平均±Ｓｅｍ（５〜８人の患者）。イタリック体（３つの下の列）、炎症を有するＵＣ（mir-185、196a）またはＣＤ（mir-30c）において過剰発現されないｍｉＲＮＡ。
【００５７】
さらに、１１個のｍｉＲＮＡｓが、無活動ＵＣおよびＣＤにおいて明確に異なる発現の変化を示した（図１）。
【００５８】
【表６】
2013535971.tif 000007
【００５９】
最後に、本発明者らは、教師なし分類法を使用してＣＤ患者およびＵＣ患者の炎症のない大腸生検材料における変化したｍｉＲＮＡ発現を分析した（コンパラティブマーカーセレクション（comparativeMarkerSelection）；「Broad Institute」ウェブサイトに保管されているGenePatternサーバー上でオンラインで計算；http://www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/）。これは、ＣＤとＵＣとを識別することを助ける４つのさらなるｍｉＲＮＡｓの選択を可能としたが、ｍｉＲＮＡ選択のための前記の基準とは一致しなかった（10 x Log102-ΔΔCT > 7または< -7）（表ＩＶ）。
【００６０】
【表７】
2013535971.tif 000008
【００６１】
ひとつだけ別に取り出す（leave-one-out）交差確認アルゴリズムとＫ最近傍分類法を使用して試験した場合（KNNXValidation；「Broad Institute」ウェブサイトに保管されているGenePatternサーバー上でオンラインで計算；http://www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/）、表ＩＩＩおよびＩＶに示された１５個のｍｉＲＮＡのセットは、１６人中１５人の患者の正しい分類を可能とした（以下の表Ｖ参照）。
【００６２】
【表８】
2013535971.tif 000009
【００６３】
合わせて考えると、これらのデータは明瞭に、変化したｍｉＲＮＡ遺伝子発現が、炎症のないＵＣ組織およびＣＤ組織において前から存在していることを示す。それらは、調節不全のｍｉＲＮＡ遺伝子発現が、環境因子またはＩＢＤ誘導物質に応答して炎症に対する無活動の粘膜組織の感作に重要な役割を果たし得、従って、炎症の開始および／または再発に寄与し得るという考えを支持する。
【００６４】
さらに、本発明者らは、ＩＢＤ患者の大腸つまみ取り生検材料（炎症を有さない領域）における変化したｍｉＲＮＡの特徴付けは、有用な診断ツールであることが分かり得ることを期待する。ＣＤおよびＵＣの両方において共通した変化した過剰発現を有する１０個のｍｉＲＮＡは、これらの患者を健康個体から区別するのを助け得る。表ＩＩＩおよびＩＶで示された１５個のｍｉＲＮＡは、ＣＤ患者とＵＣ患者とを区別するのに有用であることが分かるはずである。
【００６５】
参考文献
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2013535971.tif 000010
【配列表】
2013535971000001.app
【国際調査報告】
2013535971.tif 000011
2013535971.tif 000012
2013535971.tif 000013