(57)【要約】  本発明は、ウィルス感染力が有意レベル未満に低減され、かつ高い酵素活性を有する膵酵素調合物（ＰＥＰ）を含む医薬組成物を提供する。これらＰＥＰは、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、非エンベロープウィルス（例えば、ブタパルボウィルス（ＰＰＶ）、ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ−２）、ブタ脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ））、およびエンベロープウィルス（例えば、水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）およびインフルエンザＡ（ＩＦＡ））を含むことができる。本発明にはまた、これらの医薬組成物を投与することによる膵機能不全の治療方法、およびＰＥＰをβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で処理してウィルス感染価を低減することによるその医薬組成物の製造方法が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）１種類または複数種類の膵酵素と、（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオン酸、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、またはこれらの混合物とを含むことを特徴とするウィルス感染性を減少させた膵酵素調合物（ＰＥＰ）。
【請求項２】
請求項１に記載の膵酵素調合物において、（ｉ）１種類または複数種類の膵酵素と、（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオン酸とを含むことを特徴とする調合物。
【請求項３】
請求項１に記載の膵酵素調合物において、前記調合物が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されない調合物よりも少なくとも１対数低いブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のウィルス感染価を有することを特徴とする調合物。
【請求項４】
請求項１に記載の膵酵素調合物において、前記調合物が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されない調合物よりも少なくとも１対数低い非エンベロープウィルスのウィルス感染価を有することを特徴とする調合物。
【請求項５】
請求項１に記載の膵酵素調合物において、前記調合物が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されない調合物よりも少なくとも１対数低いエンベロープウィルスのウィルス感染価を有することを特徴とする調合物。
【請求項６】
請求項１に記載の膵酵素調合物において、前記調合物が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されない調合物よりも少なくとも１対数低いブタ脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）のウィルス感染価を有することを特徴とする調合物。
【請求項７】
請求項１に記載の膵酵素調合物において、前記調合物が、ＰＥＰ１ｇ当たり約１０３ＦＦＩＤ５０未満のブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のウィルス感染価を有することを特徴とする調合物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の膵酵素調合物において、前記調合物中の少なくとも１種類の膵酵素が動物供給源から得られることを特徴とする調合物。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の膵酵素調合物において、１種類または複数種類の酵素が、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼから選択されることを特徴とする調合物。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の膵酵素調合物において、前記調合物がパンクレリパーゼを含むことを特徴とする調合物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の前記調合物と、任意選択で薬学的に許容できる医薬品添加剤とを含むことを特徴とするウィルス感染価を減少させた医薬組成物。
【請求項１２】
ウィルス感染価を減少させた膵酵素調合物（ＰＥＰ）において、（ｉ）前記ＰＥＰが、約１，０００〜約６０，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含み、かつ（ｉｉ）前記ＰＥＰが、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されないＰＥＰよりも少なくとも１対数低いブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のウィルス感染価を有するＰＥＰと、
任意選択で１種類または複数種類の薬学的に許容できる医薬品添加剤と
を含むことを特徴とする固体経口剤形。
【請求項１３】
請求項１２に記載の固体経口剤形において、前記剤形が、散剤、錠剤、ミニタブレット、マイクロタブレット、プリル剤、またはカプセル剤の形態であることを特徴とする剤形。
【請求項１４】
ウィルス感染価を減少させた膵酵素調合物（ＰＥＰ）において、（ｉ）前記ＰＥＰが、約１，０００〜約６０，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含み、かつ（ｉｉ）前記ＰＥＰが、ＰＥＰ１ｇ当たり約１００ＦＦＩＤ５０未満のＰＰＶ感染価を有するＰＥＰと、
任意選択で１種類または複数種類の薬学的に許容できる医薬品添加剤と
を含むことを特徴とする固体経口剤形。
【請求項１５】
ウィルスが減少／不活性化された膵酵素調合物（ＰＥＰ）において、（ｉ）前記ＰＥＰが、約２，５００〜約４５，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含み、かつ（ｉｉ）前記ＰＥＰが、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されないＰＥＰよりも少なくとも１対数低いブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のウィルス感染価を有するＰＥＰと、
任意選択で１種類または複数種類の薬学的に許容できる医薬品添加剤と
を含むことを特徴とする固体経口剤形。
【請求項１６】
請求項１５に記載の固体経口剤形において、前記剤形が、散剤、錠剤、ミニタブレット、マイクロタブレット、プリル剤、またはカプセル剤の形態であることを特徴とする剤形。
【請求項１７】
ウィルスが減少／不活性化された膵酵素調合物（ＰＥＰ）において、（ｉ）前記ＰＥＰが、約２，５００〜約４５，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含み、かつ（ｉｉ）前記ＰＥＰが、ＰＥＰ１ｇ当たり約１００ＦＦＩＤ５０未満のＰＰＶ感染価を有するＰＥＰと、
任意選択で１種類または複数種類の薬学的に許容できる医薬品添加剤と
を含むことを特徴とする固体経口剤形。
【請求項１８】
ウィルス感染価を減少させた膵酵素調合物（ＰＥＰ）において、（ｉ）前記ＰＥＰが、約１，０００〜約６０，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含み、かつ（ｉｉ）前記ＰＥＰが、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で前処理されており、かつＢＰＬで処理されないＰＥＰよりも少なくとも１対数低いブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のウィルス感染価を有するＰＥＰと、
３−ヒドロキシプロピオン酸、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、またはこれらの混合物と、
任意選択で１種類または複数種類の薬学的に許容できる医薬品添加剤と
を含む固体経口剤形において、前記剤形が、散剤、錠剤、ミニタブレット、マイクロタブレット、プリル剤、またはカプセル剤の形態であることを特徴とする固体経口剤形。
【請求項１９】
請求項１８に記載の固体経口剤形において、前記ＰＥＰが、約２，５００〜約４５，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含むことを特徴とする剤形。
【請求項２０】
ウィルス感染価を減少させた膵酵素調合物（ＰＥＰ）において、（ｉ）前記ＰＥＰが、約１，０００〜約６０，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約３，０００〜約３６０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含み、かつ（ｉｉ）前記ＰＥＰが、ＰＥＰ１ｇ当たり約１００ＦＦＩＤ５０未満のＰＰＶ感染価を有するＰＥＰと、
３−ヒドロキシプロピオン酸、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、またはこれらの混合物と、
任意選択で１種類または複数種類の薬学的に許容できる医薬品添加剤と
を含む固体経口剤形において、前記剤形が、散剤、錠剤、ミニタブレット、マイクロタブレット、プリル剤、またはカプセル剤の形態であることを特徴とする剤形。
【請求項２１】
請求項２０に記載の固体経口剤形において、前記ＰＥＰが、約２，５００〜約４５，０００ＵＳＰユニットのリパーゼ、約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのプロテアーゼ、および約７，５００〜約２７０，０００ＵＳＰユニットのアミラーゼを含むことを特徴とする剤形。
【請求項２２】
請求項１１に記載の前記医薬組成物の治療に有効な量を患者に投与することを含むことを特徴とするそれを必要とする前記患者の膵機能不全の治療方法。
【請求項２１】
膵酵素調合物（ＰＥＰ）の調製方法において、（ａ）β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を、１種類または複数種類の膵酵素を含有する調合物と、前記調合物中のウィルス感染価を低減させるのに十分な時間のあいだ反応させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、ＢＰＬとの反応後の前記調合物中の非エンベロープウィルスの前記ウィルス感染価が、ＢＰＬとの反応前の前記調合物の非エンベロープウィルスの前記ウィルス感染価と比べて少なくとも１対数低いことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法において、ＢＰＬとの反応後の前記調合物中のエンベロープウィルスの前記ウィルス感染価が、ＢＰＬとの反応前の前記調合物のエンベロープウィルスの前記ウィルス感染価と比べて少なくとも１対数低いことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載の方法において、ＢＰＬとの反応後の前記調合物中のブタパルボウィルス（ＰＰＶ）またはブタ脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）の前記ウィルス感染価が、ＢＰＬとの反応前の前記調合物のＰＰＶまたはＥＭＣＶの前記ウィルス感染価と比べてそれぞれ少なくとも１対数低いことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２１乃至２４のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ａ）が、
（ｉ）ＢＰＬを、１種類または複数種類の膵酵素の前記調合物を含有する溶液または懸濁液に加えること、および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記溶液中のＢＰＬを、前記溶液中の前記ウィルス感染価を減少させるのに十分な時間のあいだインキュベートすること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法において、ステップ（ｉ）が、１ｍＬ当たりＰＥＰを約１００〜約２００ｍｇ含む溶液または懸濁液に、ＢＰＬを約０．００４％〜１．０％（ｖ／ｖ）加えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２１乃至２６のいずれか１項に記載の方法において、前記反応が約３０分間〜約７２時間行われることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２１乃至２７のいずれか１項に記載の方法において、前記反応が約５〜約５０℃の温度で行われることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２１乃至２８のいずれか１項に記載の方法において、前記膵酵素を含有する前記調合物とＢＰＬの前記反応後に、前記ＢＰＬを（ｂ）インキュベートするステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）で形成された前記溶液または懸濁液にＢＰＬ不活性化剤を加えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法において、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）で形成された前記溶液または懸濁液を凍結し、次いでそれを凍結乾燥することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法において、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）で形成された前記溶液または懸濁液を、前記ＢＰＬを３−ヒドロキシプロピオン酸に分解するのに十分な時間インキュベートすることを含み、かつ前記溶液が水溶液であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年３月１９日出願の米国仮特許出願第６１／３１５，８１３号に関する利益を主張し、これにより参照により援用される。
【０００２】
本発明は、ウィルス感染価を減少させた膵酵素調合物、具体的にはβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で処理したそのような調合物と、それらを含有する医薬組成物と、それらの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
膵外分泌機能不全は、膵疾患（例えば、慢性膵炎、嚢胞性線維症、重症急性壊死性膵炎、および膵癌）、セリアック病およびクローン病などの膵外性疾患、ならびに胃腸および膵臓の外科的切除の主たる結果である。膵外分泌機能を元へ戻すことは、栄養不良に関連する病的状態および死亡を避けるために重要である。膵外分泌機能不全の一療法は、栄養分の胃排出時に十分な活性リパーゼを十二指腸内腔に与えるための膵酵素の経口投与である。
【０００４】
動物供給源から得られる膵酵素調合物（ＰＥＰ）は、様々な膵酵素欠乏および消化性障害を患っている患者における膵酵素欠乏症を部分的に改善するために過去７０年にわたって様々な形態で使用されてきた。ＰＥＰは、一般には、脂肪、タンパク質、および糖の消化に重要なリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを含む少なくとも３つのカテゴリーの組合せを含有する。パンクレリパーゼとして知られている一種のＰＥＰが、カプセル中に組み込まれた腸溶コーティング粒子の形態で市販されており、そのカプセルはパンクレリパーゼを１カプセル当たり３５，０００ＵＳＰユニットまで含有する（例えば、ＰＡＮＣＲＥＣＡＲＢ（登録商標）（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ．）、ＵＬＴＲＡＳＥ（登録商標）（Ａｘｃａｎ  Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）、ＰＡＮＣＲＥＡＺＥ（商標）（ＭｃＮｅｉｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＯＴＡＺＹＭＥ（登録商標）（Ｏｒｇａｎｏｎ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）、ＺＥＮＰＥＰ（登録商標）（Ｅｕｒａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＣＲＥＯＮ（登録商標）（Ｓｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．））。これらの酵素は動物供給源から単離されるので、それらはブタから得られる材料の場合、非エンベロープウィルス（例えば、ブタパルボウィルス（ＰＰＶ）、ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ−２）、ブタ脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ））およびエンベロープウィルス（例えば、水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）およびインフルエンザＡ（ＩＦＡ））などのウィルスによる汚染の影響を受けやすい。ｆｄａ.ｇｏｖ／ｏｈｒｍｓ／ｄｏｃｋｅｔｓ／ａｃ／ｃｄｅｒ０８.ｈｔｍ＃ＡｎｔｉｖｉｒａｌＤｒｕｇｓでＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ上で入手できる２００８年１２月に保存されたＦＤＡ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｄｒｕｇｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇからの情報を参照されたい。
【０００５】
幾種類かのウィルスは化学薬品または他の手法を用いて不活性化することができることが報告されている。例えば、Ｍａｙｒ著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ，ｐａｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ，Ｂｅｒｌ  Ｍｕｎｃｈ  Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．２００１，１１４：１８４〜７、ならびにＡｒｇｕｅｌｌｏ  Ｖｉｌｌａｒｅｓの論文、Ｖｉｒａｌ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔｓ：ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ．１９９１，１０：４５９〜８０、ならびにＨｏｒｏｗｉｔｚの論文、Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，１９：４１７〜３０、ならびにＥｐｓｔｅｉｎおよびＦｒｉｃｋｅの論文、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．１９９０，１１４：３３５〜４０、ならびにＳｔｅｐｈａｎの論文、Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＨＩＶ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ／ＵＶ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｓｔｕｄ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．１９８９，５６：１２２〜７、ならびにＳｔｅｐｈａｎの論文、Ｖｉｒｕｓ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｌａｂｉｌｅ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ，Ｂｅｉｔｒ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒ．１９８９，２４：４０〜５、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎらの論文、Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ  ｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｂｏｏｓｔｅｒ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｒａｂｉｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７，８０：８６１〜８、ならびにＰｒｉｎｃｅらの論文、Ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ／ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｒｅｖ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９８３，５：９２〜１０７、ならびに米国特許出願公開第２００６／０１１５３７６号明細書を参照されたい。
【０００６】
最近、ウィルスを含まないまたはウィルス感染力を低減させた活性酵素の服用量を含有する経口ＰＥＰの栄養補助食品の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、膵酵素調合物（ＰＥＰ）を化学試薬すなわちβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で処理することによって、ＰＥＰ中のウィルスをＰＥＰの酵素活性をなくすことなく効果的に不活性化することができることを発見した。いかなる理論に拘束されるものではないが、ＢＰＬによるウィルスのこの不活性化はウィルスゲノムのアルキル化に基づく。本発明者らはまた、ウィルス以外のＰＥＰ成分、例えばＢＰＬのアルキル化活性を潜在的に減少させる可能性のある膵酵素または核酸が、ＰＥＰ中のウィルスの不活性化を妨げないことを発見した。
【０００８】
本発明の一実施形態は、ウィルス感染力を減らしたＰＥＰである。この調合物は、（ｉ）ＢＰＬで処理した１種類または複数種類の膵酵素と、（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオン酸（すなわち、ＢＰＬの加水分解生成物）、ＢＰＬ、またはこれらの混合物とを含む。好ましくはＰＥＰは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書（これにより参照により援用される）に記載されているＰＰＶ  ＦＦＩＤ感染性試験によって測定される約１０３ＦＦＩＤ５０／ｇＰＥＰ未満のＰＰＶウィルス感染価を有する。好ましくはＰＥＰは、ＢＰＬで処理されない類似の調合物よりも少なくとも１対数低いウィルス感染価を有する。ただし、ウィルス感染価は非エンベロープウィルス、エンベロープウィルス、ＰＰＶ、ＥＭＣＶ、またはこれらの組合せの感染価である。
【０００９】
別の実施形態は、（ｉ）ＢＰＬで処理した１種類または複数種類の膵酵素（またはＰＥＰ）と、（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオン酸、ＢＰＬ、またはこれらの混合物とを含むウィルス感染力を低減させた医薬組成物である。さらに別の実施形態は、治療に有効な量の本発明のＰＥＰまたは医薬組成物を患者に投与することによって、それを必要とする患者の膵機能不全を治療する方法である。
【００１０】
さらに別の実施形態は、（ａ）１種類または複数種類の膵酵素を含有する調合物を、その調合物のウィルス感染価を減少させるのに十分な時間、ＢＰＬと反応させるステップを含むＰＥＰの調製方法である。一実施形態ではステップ（ａ）の反応は、（ｉ）１種類または複数種類の膵酵素の調合物を含有する溶液または懸濁液にＢＰＬを加え、（ｉｉ）ステップ（ａ）の溶液中のＢＰＬを、その溶液中のウィルス感染価を低減させるのに十分な時間インキュベートすることによって行われる。この方法は、（ｂ）ステップ（ａ）の反応後にＢＰＬを不活性化するステップをさらに含むことができる。ＢＰＬは、水溶液中でインキュベートすることによって、または不活性化剤（チオ硫酸ナトリウムなど）を加えることによって、またはステップ（ａ）で形成される溶液を凍結し、次いでそれを凍結乾燥することによって不活性化することができる。
【００１１】
本発明の任意の実施形態における膵酵素は、遺伝子組み換えにより形成することも、また動物供給源（ブタ、ヒツジ、およびウシ）から得ることもできる。好適な膵酵素には、これらに限定されないがリパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、および上記のいずれかの任意の組合せが挙げられる。膵酵素の好ましい混合物は、ブタ由来のパンクレリパーゼである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本発明によれば当業界の技術の中には非常に多くの手段および手法、例えば分子免疫学、細胞免疫学、薬理学、および微生物学で一般に使用されているものがある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＨｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＨｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＨｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｃｏｉｃｏら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＨｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＨｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、およびＥｎｎａら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＨｏｂｏｋｅｎ，ＮＪの記述、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）を参照されたい。
【００１３】
用語「患者」は、ヒトまたは他の動物を指す。
【００１４】
よく用いられる略語は下記の尺度、技法、特性、または化合物に対応する。すなわち、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」または「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、また「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味する。
【００１５】
用語「ＵＳＰユニット」は、ビタミンまたは薬物の効力、すなわちその予想される生物学的効果を測定するために用いられる単位を指す。この単位が適用される各物質に対して米国食品医薬品局は、１ＵＳＰユニットの用量に関係する生物学的効果を決めている。次いでその物質の他の量もこの標準単位の観点から表すことができる。ほとんどの場合、ＵＳＰユニットは国際単位（ＩＵ）に等しい。
【００１６】
アミラーゼ活性の１ＵＳＰユニットは、本明細書中に参照により援用されるパンクレリパーゼに関する公式モノグラフ（２００９年米国薬局方３２／国民薬品集２７）に基づくアミラーゼ活性の測定法の条件下で０．１６μＥｑのグリコシド結合が１分間に加水分解されるような初速度でデンプンを分解するパンクレリパーゼの量中に含まれる。
【００１７】
リパーゼ活性の１ＵＳＰユニットは、本明細書中に参照により援用されるパンクレリパーゼに関する公式モノグラフ（２００９年米国薬局方３２／国民薬品集２７）に基づくリパーゼ活性の測定法の条件下で１．０μＥｑの酸をｐＨ９．０および３７℃で１分間に遊離させるパンクレリパーゼの量中に含まれる。
【００１８】
プロテアーゼ活性の１ＵＳＰユニットは、本明細書中に参照により援用されるパンクレリパーゼに関する公式モノグラフ（２００９年米国薬局方３２／国民薬品集２７）に基づくプロテアーゼ活性の測定法の条件下で、２８０ｎｍにおいて１５ｎｍｏｌのチロシンと同じ吸光度を与えるトリクロロ酢酸によって沈殿しないペプチドの量が１分間に遊離されるような初速度でカゼインを加水分解するパンクレリパーゼの量中に含まれる。
【００１９】
膵酵素調合物（ＰＥＰ）
好適な膵酵素調合物（ＰＥＰ）は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼなどの消化酵素の混合物を含有することができる。これらＰＥＰは動物供給源から得ることができる。動物から得られるＰＥＰは、少なくとも１種類または複数種類のウィルス、例えばＰＰＶ、ＰＣＶ−２、ＥＭＣＶ、ＶＳＶ、およびインフルエンザＡと、核酸とで汚染されていてもよい。ＰＥＰはまた、イソプロパノール（ＩＰＡ）の残留量を含有することもできる。
【００２０】
ＰＥＰ中に存在することができる活性酵素には、これらに限定されないがパンクレリパーゼ（リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの混合物）またはパンクレアチンなどの膵酵素が挙げられる。ＰＥＰ中に存在することができる他の活性酵素には、（ｉ）これらに限定されないが、トリプシンすなわちＥ．Ｃ．（酵素委員会番号）３．４．４．４と、キモトリプシンすなわちＥ．Ｃ．３．４．４．５と、キモトリプシンＢすなわちＥ．Ｃ．３．４．５．６と、パンクレアトペプチダーゼＥすなわちＥ．Ｃ．３．４．４．７と、カルボキシペプチダーゼＡすなわちＥ．Ｃ．３．４．２．１と、カルボキシペプチダーゼＢすなわちＥ．Ｃ．３．４．２．２とを含めた活性プロテアーゼ、（ｉｉ）これらに限定されないが、グリセロールエステルヒドロラーゼ（リパーゼ）すなわちＥ．Ｃ．３．１．１．３と、ホスホリパーゼＡ２すなわちＥ．Ｃ．３．１．１．４と、ステロールエステルヒドロラーゼすなわちＥ．Ｃ．３．１．１．１３とを含めた活性リパーゼ、（ｉｉｉ）これらに限定されないが、リボヌクレアーゼすなわちＥ．Ｃ．２．７．７．１６およびデオキシリボヌクレアーゼすなわちＥ．Ｃ．３．１．４．５などのヌクレアーゼ、および（ｉｖ）α−アミラーゼすなわちＥ．Ｃ．３．２．１．１などの活性アミラーゼが挙げられる。
【００２１】
一つの好ましい実施形態ではＰＥＰは、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼを含めた膵酵素の混合物と、任意選択でリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼとを含む。これらの酵素は、ブタ、ヒツジ、およびウシなどの動物供給源から得ることができる。コリパーゼもまたＰＥＰ中に含まれてもよい。本明細書中で使用される用語「酵素」には、すでに活性化されている形態だけでなく、哺乳動物の小腸液中で活性形態に転換され得る酵素原前駆体もまた含まれることを理解されたい。
【００２２】
一実施形態ではＰＥＰは、約６９〜約１２０Ｕ  ＵＳＰ／ｍｇのリパーゼ活性と、約２１６Ｕ  ＵＳＰ／ｍｇ以上のアミラーゼ活性と、約２６４Ｕ  ＵＳＰ／ｍｇ以上のプロテアーゼ活性と、約２６４Ｕ  ＵＳＰ／ｍｇ以上の総プロテアーゼ活性とを有するパンクレリパーゼである。
【００２３】
ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のリパーゼ活性は、約１，０００〜約１５０，０００国際単位（Ｕ）の範囲であることができる。ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のアミラーゼ活性は、約３，０００〜約５００，０００Ｕの範囲であることができる。ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のプロテアーゼ活性は、約３，０００〜約５００，０００Ｕの範囲であることができる。別の実施形態ではＰＥＰは、約２，０００〜約７５，０００ＵＳＰユニットのリパーゼと、約８，０００〜約２５０，０００Ｕのプロテアーゼと、約８，０００〜約２５０，０００Ｕのアミラーゼとを含む。さらに別の実施形態ではＰＥＰは、約２，０００〜約４０，０００ＵＳＰユニットのリパーゼと、約８，０００〜約１６０，０００Ｕのプロテアーゼと、約８，０００〜約１６０，０００Ｕのアミラーゼとを含む。
【００２４】
ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のリパーゼ活性は、約３，０００〜約２５，０００ＩＵ、約４，５００〜約２５，０００ＩＵ、例えば約４，５００〜約５，５００ＩＵ、約９，０００〜約１１，０００ＩＵ、約１３，５００〜約１６，５００ＩＵ、また約１８，０００〜約２２，０００ＩＵであることができる。ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のアミラーゼ活性は、約８，１００〜約１８０，０００ＩＵ、例えば約８，０００〜約４５，０００ＩＵ、約１７，０００〜約９０，０００ＩＵ、約２６，０００〜約１３５，０００ＩＵ、約３５，０００〜約１８０，０００ＩＵであることができる。ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のプロテアーゼ活性は、約８，０００〜約１３４，０００ＩＵ、例えば約８，０００〜約３４，０００ＩＵ、約１７，０００〜約６７，０００ＩＵ、約２６，０００〜約１００，０００ＩＵ、約３５，０００〜約１３４，０００ＩＵであることができる。一実施形態ではリパーゼ活性が、約４，５００〜約５，５００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性が、約８，０００〜約４５，０００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性が、約８，０００〜約３４，０００ＩＵの範囲にある。別の実施形態ではリパーゼ活性が、約９，０００〜約１１，０００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性が、約１７，０００〜約９０，０００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性が、約１７，０００〜約６７，０００ＩＵの範囲にある。さらに別の実施形態ではリパーゼ活性が、約１３，５００〜約１６，５００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性が、約２６，０００〜約１３５，０００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性が、約２６，０００〜約１００，０００ＩＵの範囲にある。さらに別の実施形態ではリパーゼ活性が、約１８，０００〜約２２，０００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性が、約３５，０００〜約１８０，０００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性が、約３５，０００〜約１３４，０００ＩＵの範囲にある。さらに別の実施形態ではリパーゼ活性が、約５，０００または約３０，０００リパーゼＰｈＥｕｒであることができる。
【００２５】
ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のアミラーゼ／リパーゼ（ＵＳＰユニット）の比は、約１．８〜約８．２、例えば約１．９〜約８．２、また約２．０〜約８．２の範囲であることができる。ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のプロテアーゼ／リパーゼの比は、約１．８〜約６．２、例えば約１．９〜約６．１、また約２．０〜約６．１の範囲であることができる。
【００２６】
一実施形態ではＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のアミラーゼ：リパーゼの比は、約１〜約１０、例えば約２．３８〜約８．７５の範囲であることができる（ただし、アミラーゼの定量はＵＳＰに準拠して行う）。ＰＥＰ（ＢＰＬ処理前または後）中のプロテアーゼ：リパーゼの比は、約１．００〜約８．００、例えば約１．８６〜約５．１３の範囲であることができる（ただし、プロテアーゼの定量はＵＳＰに準拠して行う）。
【００２７】
一実施形態ではＰＥＰは、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを含有し、（ｉ）ＰＥＰ中のアミラーゼ対リパーゼの比が、約３：１〜約６：１の範囲にあり、かつ（ｉｉ）プロテアーゼ対リパーゼの比が、約３：１〜約６：１（ＵＳＰユニットで測定される）の範囲にある。
【００２８】
下記の表は、追加の好適な膵酵素混合物を提供する。ただし、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの量は、ＵＳＰユニットで与えられる。
2013522285.tif 000002
【００２９】
別の実施形態ではリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの活性は、下記の表ＡおよびＢに記載されたものであることができる。
2013522285.tif 000003
2013522285.tif 000004
2013522285.tif 000005
【００３０】
下記は、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼの単位を換算するための表である。
2013522285.tif 000006
【００３１】
これらの酵素は濃縮形態であることができる。これらの酵素はアモルファス粉末または結晶形であることができる。ＰＥＰ溶液は製造中に濾過することができる。ＢＰＬ処理後のＰＥＰ中のリパーゼ活性は、一般にＰＥＰ１ｍｇ当たり約２４ＵＳＰユニット以上、より好ましくはＰＥＰ１ｍｇ当たり約３９ＵＳＰユニット以上またはＰＥＰ１ｍｇ当たり約７５ＵＳＰユニット以上である。一実施形態ではＢＰＬ処理後のＰＥＰ中のリパーゼ活性は、ＰＥＰ１ｍｇ当たり約８６〜約１２０ユニットである。ＢＰＬ処理後のＰＥＰ中のプロテアーゼ活性は、一般にＰＥＰ１ｍｇ当たり約１００ユニット以上、好ましくはＰＥＰ１ｍｇ当たり約２００ユニット以上またはＰＥＰ１ｍｇ当たり約２４０ＵＳＰユニット以上である。一実施形態ではＢＰＬ処理後のＰＥＰ中のプロテアーゼ活性は、ＰＥＰ１ｍｇ当たり約２８０〜約４４０ＵＳＰユニットである。ＢＰＬ処理後のＰＥＰ中のアミラーゼ活性は、一般にＰＥＰ１ｍｇ当たり約１００ＵＳＰユニット以上、好ましくはＰＥＰ１ｍｇ当たり約２００ＵＳＰユニット以上である。一実施形態ではＢＰＬ処理後のＰＥＰ中のアミラーゼ活性は、ＰＥＰ１ｍｇ当たり約２１０〜約５７０ＵＳＰユニットである。
【００３２】
ＰＥＰ中に見出される感染性ウィルス粒子または感染性ウィルスは、ブタ供給源中に見出されるものを含めた任意の型のもの、例えばＰＰＶであることができる。ＰＰＶは、非エンベロープ小型ＤＮＡウィルス（Ｂｅｒｇｅｒｏｎらの論文、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９７（１）：８６〜９８、およびＪ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６  Ａｐｒｉｌ；７０（４）：２５０８〜２５１５、ならびにＳｉｍｐｓｏｎらの論文、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００２，３１５（５）：１１８９〜９８、ならびにＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｋｅｒｒら編）中のＳｚｅｌｅｉらの記述（２００６）Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｐｐ．４３４〜４４５，Ｈｏｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）であり、ＰＥＰ中で見出されるウィルスの中では最も著名である。ＰＰＶは、環境中および製造中の高度の安定性を有し、それは加水分解酵素および比較的高い温度に対して抵抗性があり、かつ広いｐＨ範囲にわたって感染性であり続ける。ＰＰＶは高度に抵抗性であるので、ＰＥＰ中に見出すことができる他のウィルスのモデルウィルスであることができる。
【００３３】
ＰＥＰ中に見出すことができる他の非エンベロープウィルスには、ＥＭＣＶ（ブタ脳心筋炎ウィルス、これはまたＭＥＶとしても知られる）、ブタ肝炎ウィルス（ＨＥＶ（ブタ肝炎Ｅウィルス）を含めた）、ＳＶＤＶ（ブタ水疱性病ウィルス、これはまたＰＥＶ９としても知られる）、水疱性発疹ウィルス、ブタサーコウィルス１（ＰＣＶ１（ブタサーコウィルス１）およびＰＣＶ２（ブタサーコウィルス２）を含めた）、ブタロタウィルス（ロタＡ）、レオウィルス（レオ３として知られるレオウィルス３型を含めた）、口蹄病ウィルス、ブタテッショウウィルス（ＰＴＶ１、これはまたＰＥＶ１としても知られる）、ブタアデノウィルス、およびブタ呼吸器コロナウィルスが挙げられる。仮性狂犬病ウィルス、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウィルス）、ＩＦＡ（インフルエンザＡ）、狂犬病ウィルス、アフリカブタコレラウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ブタコレラウィルス、西ナイルウィルス、スイポックスウィルス、ハンタウィルス、ブタサイトメガロウィルス、ブタ向リンパ球性ヘルペスウィルス、ブタ内在性レトロウィルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス、パラミクソウィルス、およびニワトリ脳脊髄炎ウィルスなどのエンベロープウィルスもまたＰＥＰ中に見出すことができる。ｆｄａ.ｇｏｖ／ｏｈｒｍｓ／ｄｏｃｋｅｔｓ／ａｃ／ｃｄｅｒ０８.ｈｔｍ＃ＡｎｔｉｖｉｒａｌＤｒｕｇｓでＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ上で入手できる２００８年１２月に保存されたＦＤＡ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｄｒｕｇｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇからの情報を参照されたい。もしかするとＰＥＰはまた、突発出現ウィルス、例えば突発出現エンベロープまたは非エンベロープ外来性物質（例えばエボラウィルス）または変異ウィルスを含有することもある。ＰＥＰ中に見出すことができる他のウィルスには、仮性狂犬病ウィルス、ウシウィルス性下痢ウィルス、ピコルナウィルス科（ブタピコルナウィルスを含めた）、レオウィルス科（ブタレオウィルスを含めた）、アストロウィルス科（ブタアストロウィルスを含めた）、アデノウィルス科（ブタアデノウィルスを含めた）、およびヘペウィルス科（ブタヘペウィルスを含めた）が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では感染性ＰＰＶウィルスの許容レベルは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書に記載のＰＰＶ  ＦＦＩＤ感染性試験法によって測定されるＰＥＰ１ｇ当たり約１０５ＦＦＩＤ５０未満（約１０４．５ＴＣＩＤ５０に相当する）、好ましくはＰＥＰ１ｇ当たり約１０３ＦＦＩＤ５０未満、最も好ましくはＰＥＰ１ｇ当たり約１０２ＦＦＩＤ５０未満である。別の実施形態では別の感染性ウィルス、例えばＥＭＣＶ、ＨＥＶ、ＳＶＤＶ、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、ＶＳＶ、およびＩＦＡの許容レベルは、一般に利用可能な分析手法の検出限界未満（例えば、ＰＥＰ１ｇ当たり感染性ウィルス粒子約１０２個未満）、好ましくはＰＥＰ１ｇ当たり感染性ウィルス粒子約０個である。ウィルス粒子のレベルは、下記で考察するようにＢＰＬを用いたＰＥＰの処理の前、後、または前および後の両方で測定することができる。
【００３５】
これに加えてＢＰＬは、抗微生物剤として（例えば抗菌剤として）働くこともできる。
【００３６】
ＰＥＰは、例えば、意図する投与経路および標準製薬法に関して選択される適切な医薬品添加剤、増量剤、および／または担体と混ぜ合わせて医薬組成物中に組み込むか、医薬組成物の形にすることができる。本発明の組成物は、ヒトに使用する際に任意の好都合な方法で投与されるように製剤化することができる。ＰＥＰは、経口剤形として投与することができる。経口剤形には、散剤、錠剤、ミニタブレット、マイクロタブレット、非剤皮剤形、剤皮剤形、ミクロスフェア、プリル剤、キャプレッツ、ジェルキャップス、カプセル剤、および医療食が挙げられる。例えば錠剤は、当業界で知られている圧縮技術によって製造することができる。一般にはこれらの酵素は、酸が介在するリパーゼ不活性化を避けるために、また栄養分と同時の酵素の胃排出を確実にするために腸溶コーティングされたミニミクロスフェアの形態で経口投与される。
【００３７】
好適な薬学的に許容できる医薬品添加剤には、これらに限定されないが増量剤、結合剤、滑沢剤、滑剤、崩壊剤、および着色剤が挙げられる。保存料、安定剤、染料、および香味料などの他の成分も剤形中に含めることができる。保存料の例には、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤および沈殿防止剤もまた含めることができる。治療に使用される薬学的に許容できる医薬品添加剤、増量剤、および担体は製薬業界で知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ著、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．２００５）に記載されている。
【００３８】
β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）
β−プロピオラクトン（ＢＰＬ、２−オキセタノン）は、四員環を有するラクトン系列の小有機化合物である。これは、わずかに甘い臭気を有する透明無色の液体であり、高度に水溶性である。その高い水溶解度および小さなサイズのためにＢＰＬは、高粘度を有しかつ多粒子状物質を含む溶液、例えば高いタンパク質含量を有する溶液中に容易に拡散する。β−プロピオラクトンは水とゆっくり反応し、加水分解して非毒性化合物である３−ヒドロキシプロピオン酸（ヒドロアクリル酸）を生成する。したがってＢＰＬ活性は自己限定性であり、残余の毒性汚染物質は何も存在しない。
【００３９】
一実施形態によればＢＰＬは、ＰＥＰの患者への投与にとって許容できるレベルまでウィルス感染力を低減させるために、ＰＥＰを含有する水性または有機溶液または懸濁液に有効量が加えられる。例えば一実施形態では、１ｍＬ当たり約１００〜約２００ｍｇのＰＥＰを含有する溶液に約０．００４％〜約１．０％（ｖ／ｖ）のＢＰＬが加えられる。好ましい実施形態では、１ｍＬ当たり約１００〜約２００ｍｇのＰＥＰを含有する溶液に約０．１％〜約０．８％（ｖ／ｖ）のＢＰＬが加えられ、または１ｍＬ当たり約１００〜約２００ｍｇのＰＥＰを含有する溶液に約０．２％〜約０．４％（ｖ／ｖ）のＢＰＬが加えられる。いかなる特定の理論にも拘束されることなく本発明者らは、ＢＰＬがウィルスをアルキル化することによってそれらを不活性化すると理論づけている。したがって、ＢＰＬによる処理後のウィルス感染力の低減したＰＥＰは、不活性ウィルスを含有することができる。
【００４０】
このＢＰＬ含有ＰＥＰを、約３０分〜約４８分または約７２時間（またはそれ以上）インキュベートすることができる。一実施形態によればＢＰＬ含有ＰＥＰは、例えば約５〜約５０℃で、約１５〜約４０℃で、あるいは室温または約２５℃で約２４〜約７２時間、または約４８時間インキュベートされる。別の実施形態ではＢＰＬ含有ＰＥＰは、例えば約１５〜約４０℃、または室温、または約２５℃で約１５分間〜約２時間（例えば約３０分間）インキュベートされる。別の実施形態ではＢＰＬ含有ＰＥＰは、約４℃で約１５分間〜約１２時間（例えば約４時間）インキュベートされる。
【００４１】
インキュベーション後、このＢＰＬを不活性化することもでき、かつ／またはＰＥＰから除去することもできる。ＢＰＬは、水性媒体中でインキュベートして非毒性の３−ヒドロキシプロピオン酸を形成することによって不活性化することができる。水中でのＢＰＬの最大半減期は、２５℃で約２１０分以下である（ＨｏｆｆｍａｎおよびＷａｒｓｈｏｗｓｋｙの論文、Ｂｅｔａ−Ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ  Ｖａｐｏｒ  ａｓ  ａ  Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９５８，６：３５８〜３６２）。ＢＰＬ不活性化の速度は、緩衝液のｐＨ、温度、およびイオン強度などの環境因子に左右される（ＢｕｄｏｗｓｋｙおよびＺａｌｅｓｓｋａｙａの論文、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ（Ｖ）Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａ  ｇｉｖｅｎ  ｅｘｔｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９１，９：３１９〜３２５）。ＢＰＬは加水分解によって、また分子を不活性化に向けるアルキル化反応によって消費される。したがって２０℃で８時間のインキュベーション後、ＢＰＬのレベルを少なくとも８分の１に減らすことができる。
【００４２】
（ｉ）１種類または複数種類の膵酵素と、（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオン酸、ＢＰＬ、またはこれらの混合物とを含有する、ＢＰＬによる処理後のウィルス感染力を低減させたＰＥＰは、ＢＰＬで処理されない調合物よりも、下記で考察するウィルス感染活性の測定方法の一つ、例えば米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書に記載のＰＰＶ  ＦＦＩＤ感染性試験法によって測定される少なくとも約１対数低い、または少なくとも約２対数低い、または少なくとも約３対数低い、または約１対数低い、または約２対数低い、または約３対数低いウィルス感染力を有することができる。このＰＥＰの関係のあるウィルス感染性は、そのＰＥＰ中の非エンベロープウィルス、エンベロープウィルス、全ウィルス、または特定のウィルス（例えばＰＰＶまたはＥＭＣＶ）のそれであることができる。
【００４３】
ＢＰＬを迅速に不活性化する一つの方法は、ＢＰＬ不活性化剤、例えばチオ硫酸ナトリウムをＢＰＬに加えることによるものである。下記実施例中の１００ｍＭチオ硫酸ナトリウムの最終濃度は、４℃で数分以内での完了に当たってＢＰＬを不活性するのに十分以上であった。一実施形態ではＢＰＬの中和に使用されるチオ硫酸ナトリウムの最低濃度は、約１．７倍モル過剰量である（例えば、０．４％ＢＰＬ（ｖ／ｖ）（６３．６１ｍＭ）溶液に、少なくとも１０分の１の体積の１．０８Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液を混合することになる）。
【００４４】
ＢＰＬ含有ＰＥＰはまた、凍結し、凍結乾燥してそのＢＰＬを不活性化することもできる。試料を急速凍結してＰＰＶとＢＰＬの不活性化反応を停止することができる。凍結された材料の貯蔵の間にＢＰＬは氷の存在下でゆっくり分解し、部分的に蒸発する可能性がある。これらの条件下で追加のＰＰＶ不活性化がゆっくり起こる可能性もまたある。例えばこの調合物を急速凍結用のアセトンとドライアイスの混合物中に置き、続いて−８０℃で貯蔵した後、−４５℃で約２日間凍結乾燥することができる。この実験における凍結乾燥の長さは、その試料の量に左右される。一般に量が少ないほど必要とする時間は短い。
【００４５】
ウィルス感染活性の測定
最初のまた処理後のＰＥＰ中のウィルスの活性は、当業界で知られている任意の方法で行うことができる。好ましくは１種類または複数種類のウィルス感染力は、処理されたＰＥＰ中で測定される。一実施形態ではＰＰＶ、ＥＭＣＶ、ＰＣＶ−２、および／または他のウィルスのウィルス感染力が測定される。
【００４６】
一実施形態では感染性試験は組織培養ウェル中で成長させた細胞培養液を使用し、それらに試料を加え、細胞の感染を観察する。
【００４７】
例えば、２種類の調合物を１つの９６ウェルプレート上でＰＰＶまたは別のウィルスについて、陽性対照を別の並行プレート上でインキュベートしながら試験することができる。ＰＰＶの場合、塗布に先立って試料を細胞培地中で段階希釈（例えば、合計８希釈度の場合、各段階で１：４）し、その試料を細胞培養液と共に５％ＣＯ２中で３７℃で少なくとも５日間インキュベートすることができる。試料を取り出し、パラホルムアルデヒドにより細胞を固定した後、各ウェルについてＰＰＶ（または他の）ウィルス感染の存在を、抗ＰＰＶ抗体により標準的な免疫蛍光測定法を用いて監視する。陽性に染まった細胞を含有するウェルの数を表に記録する。蛍光巣感染量（ＦＦＩＤ５０）をＫａｒｂｅｒの式
ＦＦＩＤ５０＝１０（Ｄ−０．５ｄ＋ｄ（Ｓ））
に従って計算する。
式中、Ｄ＝その特定の希釈度での全反復測試験のあらゆるウェル中の少なくとも１個の感染蛍光巣の存在に基づき１００％感染をはっきり示す最高希釈度のｌｏｇ１０であり、ｄ＝希釈度の係数のｌｏｇ１０であり、またＳ＝希釈度ごとのウェルの数に対する感染を有するウェルの総数の比である。すべてのデータを、１ｇの乾燥ＰＥＰ、例えばパンクレリパーゼ、加工された試料の体積を考慮に入れた後の試料、および希釈度に関して計算し直す。幾つかの実施形態では６個の並行ウェルを用いて測定を数回繰り返して感染性ウィルスのレベルを定量化する。
【００４８】
ウィルス感染力を測定するための他の測定法には、Ｍａｈｙ，Ｂ．Ｗ．Ｊ．およびＫａｎｇｒｏ，Ｈ．Ｏ．編（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．２５〜４６中のＨｉｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｊ．Ｃ．およびＫｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．の記述、Ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎで考察されているＴＣＩＤ５０測定法が挙げられる。
【００４９】
ＰＥＰの酵素の活性が、ウィルス感染力を検出するために使用される細胞に対して毒性である可能性があり、かつそれら酵素はまた、他の経路により試験細胞株のウィルス感染を阻害する可能性もある。調合物中に存在する他の化合物もまた、ウィルス、例えばＰＰＶの感染を妨害する可能性がある。細胞の増殖がＰＰＶ複製にとっては必要であるので、これらの細胞増殖抑制剤または毒性酵素のいずれかの存在は、ウィルス感染の有効性をさらに低減させ、ＰＥＰ試料中のウィルス感染力の正確な決定を妨げる可能性がある。したがってＰＰＶ活性の決定に先立ってＰＥＰ試料を処理することが役立つことがある。処理後、例えば下記で述べるように、試料を元の試料の量に等しいかまたはそれ未満の量の細胞培地中に溶解して感染性測定の感度を保つことができる。
【００５０】
本明細書中に参照により援用される米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書は、酵素調合物（例えば膵酵素調合物）中のＰＰＶなどの感染性非エンベロープウィルスを検出するための再現性のある、かつ効率的な方法を提供し、この方法は、そのウィルス感染力の決定に先立って調合物を処理することによる。この方法は、ＰＥＰ試料から毒性のある酵素物質を実質的に取り除くと同時に感染性非エンベロープウィルスを保存する。
【００５１】
この方法のステップは、
（ａ）調合物の試料をクロロホルムで少なくとも２回抽出して上部相と下部相を有する清澄試料を生成するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）からの上部相の分割量をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈殿させるステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの生成物を緩衝液中に懸濁させるステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの生成物をＰＥＧで沈殿させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）からの生成物を溶液中に懸濁させるステップ、
（ｆ）生成物（ｅ）から余分のＰＥＧおよび微粒子をクロロホルムによって除去するステップ（これは（ｉ）ステップ（ｅ）において、より少量の１０分の１の量中に懸濁させて全体の感度を１０倍まで増大させること、および（ｉｉ）最も希釈度の低いステップから大部分の毒性のある試料の残存する妨害物質を除去することを可能にする）、および
（ｇ）その溶液中の感染性ウィルスの存在を検出する、またはその量を測定するステップ
を含む。
【００５２】
熱不活性化、長期貯蔵、超遠心分離、および他の抽出法もまた、ある種の環境下では感染性ウィルスの測定に先立つ試料の処理に役立つ可能性がある。
【００５３】
ＰＣＶ−２およびＥＭＣＶなどの他のウィルスの不活性化のレベルは、ＴＣＩＤ５０測定法（Ｍａｈｙ，Ｂ．Ｗ．Ｊ．およびＫａｎｇｒｏ，Ｈ．Ｏ．編（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．２５〜４６中のＨｉｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｊ．Ｃ．およびＫｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．の記述、Ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）を用いて測定することができる。
【００５４】
酵素活性の測定
ＰＥＰの酵素（例えばプロテアーゼ、リパーゼ、およびアミラーゼ）の酵素活性は、例えば米国薬局方（ＵＳＰ）モノグラフに基づく方法（米国薬局方および国民薬品集（ＵＳＰ３１／ＮＦ２６）、２００８年、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ（ＭＤ）：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて求めることができる。
【００５５】
ＰＥＰによる治療方法
ウィルス感染力を低減させたＰＥＰまたはそのＰＥＰを含有する医薬組成物の有効量を投与して、患者の脂肪便を抑えること、あるいは部分的または完全な膵外分泌機能不全を有する患者を治療することができる。この膵機能不全は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、アルコールの使用または他の原因による慢性膵炎、重症急性壊死性膵炎、膵癌、外科手術（膵頭十二指腸切除術またはホイップル法、ウィルズンク管によるまたはよらない注入、膵全摘術）、閉塞（膵管および胆管結石症、膵臓および十二指腸新生物、管狭窄）、他の膵疾患（例えば、遺伝性、外傷後、および同種移植膵炎、ヘモクロマトーシス、シュバックマン症候群、脂肪腫症、および副甲状腺機能亢進）、セリアック病およびクローン病などの膵外性疾患、混和不良（ビルロートＩＩ胃切除術、他の種類の胃バイパス手術、ガストリノーマ）、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病によって引き起こされるものであることができる。
【００５６】
「治療に有効な量」とは、一般には、状態、障害、または健康状態を治療するために患者（ヒトなど）に投与される場合にそのような治療を行うのに十分な化合物または組成物の量を指す。この「治療に有効な量」は、化合物または組成物、疾患およびその重症度、ならびに年齢、体重、体調、および治療される動物の感応性によって変わることになる。
【実施例】
【００５７】
ＢＰＬを用いたＰＰＶおよびＥＭＣＶの不活性化を検討するために２組の実験を行った。実施例１〜７は、ＢＰＬがＰＥＰ調合物中のＰＰＶおよびＥＭＣＶを不活性化することを示す。実施例の第二の組（実施例８〜１１）は、ＢＰＬと共に２５℃で３０分間インキュベートし、続いてチオ硫酸ナトリウムによって、または凍結とそれに続く凍結乾燥によって残余のＢＰＬを不活性化した後のＰＥＰ調合物中のウィルス不活性化の度合いを求めた。ＢＰＬ処理ＰＥＰの酵素活性は、実施例８〜１１で述べる試料についてもまた求めた。
【００５８】
実施例１：ＰＥＰ調合物中での０．１〜０．８％（ｖ／ｖ）の間の濃度を有するＢＰＬによるＰＰＶの不活性化（ＰＰＶは希釈法を用いて滴定した）
２つの異なるロットからのパンクレリパーゼ散剤を、それぞれ１００ｍＭトリス（ｐＨ＝８．３）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。３８ｍＬのパンクレリパーゼ溶液に、２ｍＬの非精製ＰＰＶウィルスストック（標準的プロトコル（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．編（１９９０）ＣＲＣ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１１〜３０中のＡｒｅｌｌａらの記述、Ｐｈｙｓｉｃｉｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）を用いて調製された）を加えた。このウィルスを、室温で１日間の緩やかな振とうを用いてＰＥＰと混合した。このＰＰＶをスパイクしたパンクレリパーゼストックから分割量を採取し、それぞれを異なる濃度のＢＰＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手できる）（対照を除く）と共に室温（２０℃）で４８時間インキュベートした。ウィルス不活性化のレベルを、スパイクされたウィルスの力価が高いので１，０００倍以上の段階希釈を用いたＰＰＶ感染力の滴定によって測定した。ＦＦＩＤ５０の決定は、米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書のＰＰＶ  ＦＦＩＤ感染性測定法に記載されている蛍光測定法を用いて行った。
【００５９】
結果を表１に示す。
2013522285.tif 000007
【００６０】
実施例２：ＰＥＰ調合物中での０．１〜０．８％（ｖ／ｖ）の間のＢＰＬ濃度を用いたＥＭＣＶの不活性化
４つの異なるロットのパンクレリパーゼ散剤を１００ｍＭトリス（ｐＨ＝８．３）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＥＭＣＶウィルスストック（Ｍｅｎｇ  ＸＪ、Ｐａｕｌ  ＰＳ、Ｖａｕｇｈｎ  ＥＭ、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＪの論文、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３，５：２５４〜８により調製した）をパンクレリパーゼと、そのパンクレリパーゼの最終濃度が１００ｍｇ／ｍＬになるように室温で１日間の緩やかな振とうを用いて混合した。このＥＭＣＶをスパイクしたパンクレリパーゼストックから分割量を採取し、それぞれを異なる濃度のＢＰＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手できる）（対照を除く）と共に室温（２０℃）で４８時間インキュベートした。不活性化のレベルは、段階希釈を用いてＶＥＲＯ細胞に対するＥＭＣＶ感染力を滴定し、Ｍａｈｙ，Ｂ．Ｗ．Ｊ．およびＫａｎｇｒｏ，Ｈ．Ｏ．編（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．２５〜４６）中のＨｉｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｊ．Ｃ．およびＫｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．の記述、Ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎに記載されているＴＣＩＤ５０を求めることによって測定した。
【００６１】
結果を表２に示す。
2013522285.tif 000008
【００６２】
実施例３：ＰＥＰ調合物中での０．０４〜０．２５％（ｖ／ｖ）の間の濃度を有するＢＰＬによるＰＰＶの不活性化（ＰＰＶはクロロホルム／ＰＥＧ法を用いて滴定した）
ＰＥＧで精製したＰＰＶを米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書に記載されている感染性測定法に対して使用したことを除いて実施例１で述べた実験を繰り返した。
【００６３】
結果を表３に示す。もしかするとこれら方法（１０倍未満の初期希釈度を実施例１の場合の１，０００倍希釈度の代わりに使用した）の感度が高いせいで、多少高い残存感染力が観察された。表３は、０．２５％ＢＰＬがウィルスを元の感染力の約０．０２％（約５，０００〜５０，０００分の１に減少）まで不活性化させたことを示す。
2013522285.tif 000009
【００６４】
実施例４：ＰＥＰ中でのＢＰＬ濃度０．０４〜０．２５％（ｖ／ｖ）による内在性ＰＰＶの不活性化
追加のＰＰＶを加えなかったことを除いて実施例１で述べた実験を繰り返した。実施例３と同様に、感染性測定はＰＥＧ／クロロホルム精製後に行った。
【００６５】
結果を表４に示す。表４は、ＢＰＬがＰＥＰの内在性ＰＰＶを不活性化することを示す。実施例３では、０．００２％の残存感染力（すなわち、０．２５％のＢＰＬで約５０，０００分の１に不活性化）を測定することができたが、実施例４では不活性化の完全な割合を測定するのに十分な内在性ウィルスが存在しないのでそれを得ることができなかった。米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書に記載されているＰＰＶ  ＦＦＩＤ感染性測定法を用いた場合、ＰＥＰ１ｇ当たり６３ＦＦＩＤ５０がこの実験で検出することができるウィルスの最低レベルであった。
2013522285.tif 000010
【００６６】
実施例５：より高濃度のＰＥＰ中での０．００４〜０．４％（ｖ／ｖ）の間のＢＰＬ濃度を用いたＰＰＶの不活性化（ＰＰＶは希釈法を用いて滴定した）
この実験の焦点は、不活性化手順の効率に及ぼすＰＥＰ濃度の増加の影響を測定すること、およびより低濃度範囲のＢＰＬを評価することであった。
【００６７】
ＰＰＶウィルスストック（標準的プロトコル（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．編（１９９０）ＣＲＣ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１１〜３０中のＡｒｅｌｌａらの記述、Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）を用いて調製された）を水で希釈し、この溶液（１．４２×１０１０ＦＦＩＤ５０ＰＰＶウィルスを含有する）を用いて０．５ｇのＰＥＰ散剤を懸濁させ、ＰＥＰ１ｍＬ当たり２００ｍｇの最終濃度を得た。
【００６８】
ＢＰＬの添加に先立って管を２５℃で１時間インキュベートした。ＢＰＬをＰＥＰ溶液に直接加える（０．４体積％の最終濃度の場合）か、０．０４体積％および０．００４体積％の最終濃度の場合にはＢＰＬを最初にそれぞれ１０倍および１００倍に希釈した。ＢＰＬの添加後、溶液をさらに混合し、２５℃で所定の時間（１、２、４、６、または８時間）インキュベートした。チオ硫酸ナトリウム溶液は、各不活性化実験の当日に新たにを調製された。ＢＰＬ不活性化のこの期間が経過した後、余分のＢＰＬの反応を止めるためにＰＥＰ溶液にチオ硫酸ナトリウムを加え、激しく混合し、４℃で少なくとも６時間インキュベートした。このステップの後、米国特許出願公開第２００９／０２２６４１４号明細書に記載されている感染性滴定実験を行った。すべての実験は、各時点について３個の並行試料を用いて行った。
2013522285.tif 000011
【００６９】
実施例６：４℃における０．８％（ｖ／ｖ）ＢＰＬによるＰＰＶの不活性化
実施例１の場合と同様に調製した試料を４℃において０．８％（ｖ／ｖ）ＢＰＬで４時間処理した。
2013522285.tif 000012
【００７０】
実施例７：４℃での０．４％ＢＰＬによるＰＥＰ試料の処理によるＰＰＶ不活性化の速度
実施例１で述べたのと同じ方法で調製した試料を水性媒体（すなわち水とイソプロピルアルコールの混合物）中で４℃で処理した。ＰＰＶ感染力を希釈法によって求めた。表７に例示したように４５分間の処理後に２対数の減少を得ることができる。
2013522285.tif 000013
【００７１】
実施例８〜１１
振とう時を除いてその時間の大部分を氷上に保った５０ｍＬプラスチック管を頻繁に混合することによって、４．５ｇのパンクレリパーゼ（ＰＥＰ）散剤を４４ｍＬの氷冷１００ｍＭトリス（ｐＨ＝８．３）中に溶解した。この溶解試料に、１ｍＬ（２×０．５ｍＬ）のＰＰＶストック（標準的プロトコル（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．編（１９９０）ＣＲＣ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１１〜３０中のＡｒｅｌｌａらの記述、Ｐｈｙｓｉｃｉｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）を用いてＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａでて調製された）、１０７ＦＦＩＤ５０／ｍＬをスパイクし（実施例８および表８参照）、さらに１０分間混合した。
【００７２】
この溶解パンクレリパーゼの３分割量を管（Ａ〜Ｃ）に移し、それらに（Ａ）（ＢＰＬなし−対照）、（Ｂ）（０．４体積％ＢＰＬ）、または（Ｃ）（０．８体積％ＢＰＬ）を加えた。ボルテックスマシンによる短時間の混合の後、管を２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの終りにそれら管を氷上に移し、直ちに各実験条件から４分割量を新しい管（ａ〜ｄ）に移した。これらの管を、急速凍結用のアセトン／ドライアイスの混合物中に入れた。その後、それら試料を−８０℃で貯蔵した。
【００７３】
残りの溶液から、各実験（３回測定を用いた）からの分割量を、チオ硫酸ナトリウムを含有する細胞培地中で１００倍に希釈し、微量のクロロホルムで補った。試料を短時間混合し、４℃で少なくとも６時間保ってからＦＦＩＤ５０感染価決定のためにさらに希釈した。実施例９を参照されたい。
【００７４】
上記実験をもう２回繰り返した（全体で実験１〜３）。
【００７５】
これら凍結試料を−４５℃で２日間凍結乾燥し、そのパンクレリパーゼ散剤を４〜１０℃に保った。すべての実験からの試料ａ〜ｂを水に溶解した。感染性測定は、最も低い希釈段階として４００倍希釈試料を用いる希釈試料で行ってＦＦＩＤ５０を求めた。異なる実験の結果の比較を容易にするために、得られた感染価データのすべてを比感染価（ＰＥＰ１ｇ当たりのＦＦＩＤ５０）に換算した。実施例１０および表１０を参照されたい。
【００７６】
すべての実験からの試料ｃ〜ｄについては、ＵＳＰ３１のモノグラフに基づく方法を用いてリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの酵素活性を試験した。実施例１１および表１１を参照されたい。
【００７７】
実施例８の結果：ストックＰＰＶの生成および滴定
新鮮なウィルスストックを生成し滴定した。ＰＥＰ試料からのウィルスの回復をスパイク後にもまた求めた。同等のＰＰＶ力価がこれらの試料から回復された（表８）。
2013522285.tif 000014
【００７８】
実施例９の結果：ＢＰＬによるＰＰＶの不活性化とそれに続くチオ硫酸ナトリウムを用いたＢＰＬの不活性化
表９は、ＢＰＬによる２５℃で３０分間のＰＰＶの不活性化、およびそれに続くＢＰＬ含有ＰＥＰ溶液をチオ硫酸ナトリウムと共に４℃で少なくとも６時間インキュベートすることによるそのＢＰＬの不活性化の結果を提示する。上記で考察したようにＰＰＶスパイク後のＢＰＬ不活性化についての３つの独立した実験の後に、チオ硫酸ナトリウムによるＢＰＬの不活性化が続いた（各実験に対して３回の並行繰返し）。
2013522285.tif 000015
【００７９】
実施例１０の結果：ＢＰＬによるＰＰＶの不活性化とそれに続くそのＢＰＬを不活性化するための試料の凍結／凍結乾燥
ＢＰＬによる２５℃で３０分間の不活性化、続いて凍結とその後に続く凍結乾燥により不活性化したＰＰＶを含有するＰＥＰ試料の不活性化の結果を、表１０に提示する。
2013522285.tif 000016
2013522285.tif 000017
【００８０】
実施例１１の結果：これら試料のＢＰＬ処理および凍結／凍結乾燥後の酵素活性
表１１は、２５℃で３０分間のＢＰＬ処理とそれに続く凍結および凍結乾燥（実施例１０の試料の場合と同じ処理）後のパンクレリパーゼの分割量のリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼ活性を提示する。
2013522285.tif 000018
【００８１】
実施例８〜１１の考察
パンクレリパーゼ試料を、ＢＰＬとそれに続くチオ硫酸ナトリウムによる処理を用いたＰＰＶ不活性化の直後に試験した場合、そのウィルス感染価は、０．４体積％のＢＰＬ存在下で室温で３０分間インキュベートすると６０分の１未満に減少した。さらに０．８％ＢＰＬは、同一条件下でＰＰＶを３桁（ｍａｇｎｉｔｕｄｅｓ ｏｆ ｏｒｄｅｒ）不活性化する。表９を参照されたい。
【００８２】
表１１に示すように０．４％ＢＰＬおよび０．８％ＢＰＬで処理した凍結乾燥試料は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼ活性の大部分を維持した。これらの結果は、ＰＥＰがウィルス不活性化後に高い酵素活性を維持することができることを実証した。
【００８３】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の熟練者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により援用される。
【００８４】
前述の記述から当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確かめることができ、また本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更および修正を行って、それを様々な利用法および条件に適応させることができる。
【国際調査報告】
2013522285.tif 000019
2013522285.tif 000020
2013522285.tif 000021
2013522285.tif 000022