(57)【要約】  【解決手段】  医薬製剤がインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩はＡ４およびＡ８の１組のヒスチジン置換、および選択的にＡ２１の置換を含むインスリンＡ鎖配列を含む。前記製剤はさらに、インスリン類似体分子６個につき少なくとも約４個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液を含む。前記製剤は、皮下注射により長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成する。無亜鉛製剤では、前記インスリン類似体単量体が、ＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８置換を含まないが、それ以外は同一のインスリンまたはインスリン類似体と比較し、インスリン様成長因子受容体に対する親和性が低く、同種のインスリン受容体に対する親和性が少なくとも２０％であることを示す。  【選択図】      図１Ｆ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者を治療する方法であって、生理学的に有効な量のインスリン類似体または生理学的に許容できるその塩を含む医薬製剤を患者に投与する工程を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容できるその塩は、Ａ４およびＡ８に１組のヒスチジン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるＡ２１の置換とを有し、さらに６個のインスリン類似体分子につき少なくとも約４個の亜鉛イオンの相対濃度で亜鉛イオンを有するものである、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容できるその塩は、ｐＨ６．５〜７．５において微結晶インスリン懸濁液である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容できるその塩は、ｐＨ３．５〜５において透明な緩衝化されていない溶液として製剤化され、インスリン類似体分子６個につき４〜６個の亜鉛イオンの相対濃度で亜鉛イオンと、フェノールおよびメタクレゾールから選択される保存剤と、添加物とを含むものである、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子６個につき４〜６個の亜鉛イオンを含むように修飾された微結晶インスリン懸濁液として製剤化されるものである、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ２１の位置でグリシン置換による修飾を受けているものである、方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ２１の位置でアラニン、セリン、またはトレオニン置換による修飾を受けているものである、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ｂ鎖伸長による修飾を受け、１または２つのＣ末端塩基性残基を含むものである、方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ｂ鎖伸長による修飾を受け、少なくとも１つのＮ末端塩基性残基を含むものである、方法。
【請求項９】
請求項６記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ鎖伸長による修飾を受け、少なくとも１つのＮ末端塩基性残基を含むものである、方法。
【請求項１０】
インスリンＡ鎖ポリペプチドをコードする核酸であって、前記Ａ鎖ポリペプチドは配列ＩＤ番号４を有するものである、核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸配列を有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
医薬製剤であって、インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子６個につき少なくとも約４個の亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、Ａ４およびＡ８の１組のヒスチジン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるＡ２１の置換とを含むインスリンＡ鎖配列を含み、前記製剤の形態が長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤である、医薬製剤。
【請求項１４】
請求項１３記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、ｐＨ６．５〜７．５において微結晶インスリン懸濁液として製剤化されるものである、医薬製剤。
【請求項１５】
請求項１３記載の医薬製剤であって、この医薬製剤は、ｐＨ３．５〜５において透明な緩衝化されていない溶液として製剤化され、さらにフェノールおよびメタクレゾールから選択される保存剤と、添加物とを有するものである、医薬製剤。
【請求項１６】
請求項１３記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子６個につき４〜６個の亜鉛イオンを含むように修飾された微結晶性インスリン懸濁液として製剤化されるものである、医薬製剤。
【請求項１７】
請求項１４記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ２１の位置でＧｌｙ置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。
【請求項１８】
請求項１５記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ２１の位置でＧｌｙ置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。
【請求項１９】
請求項１６記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ２１の位置でＧｌｙ置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。
【請求項２０】
請求項１４、１５、または１６のいずれか１つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ２１の位置でＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。
【請求項２１】
請求項１３、１７、または２０のいずれか１つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ｂ鎖伸長による修飾を受け、１または２つのＣ末端塩基性残基を含むものである、医薬製剤。
【請求項２２】
請求項１３、１７、または２０のいずれか１つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ｂ鎖伸長による修飾を受け、１または２つのＮ末端塩基性残基を含むものである、医薬製剤。
【請求項２３】
請求項１３、１７、または２０のいずれか１つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ鎖伸長による修飾を受け、１または２つのＮ末端塩基性残基を含むものである、医薬製剤。
【請求項２４】
インスリン類似体の結晶製剤であって、前記インスリン類似体は、インスリン類似体分子６個につき少なくとも約４個の亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、Ａ４およびＡ８に１組のヒスチジン置換と、選択的にＡ２１の置換とを含むインスリンＡ鎖配列を含み、前記製剤は長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成し、前記インスリン類似体はｐＨ約６〜７．４で結晶性懸濁液を形成するものである、結晶製剤。
【請求項２５】
請求項１記載の方法において、前記インスリン類似体は皮下注射により長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成するものである、方法。
【請求項２６】
請求項１３、１７、または２０のいずれか１つに記載の医薬製剤において、前記製剤は皮下注射により長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成するものである、医薬製剤。
【請求項２７】
請求項１３、１７、または２０のいずれか１つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体またはその生理学的に許容されるその塩は、無亜鉛製剤において、同種の野生型インスリンと比較してＩ型インスリン様成長因子受容体に対する親和性が低く、且つ同種のインスリン受容体に対する野生型インスリンの少なくとも２０％の親和性を示すものである、医薬製剤。
【請求項２８】
医薬製剤であって、インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子６個につき少なくとも約４個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、Ａ４およびＡ８の１組のヒスチジン置換と、Ｂ２８のリジンまたはアスパラギン酸置換と、選択的にＢ２９のプロリン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるＡ２１の置換とを含むインスリンＡ鎖配列を含み、前記製剤の形態が長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤である、医薬製剤。
【請求項２９】
医薬製剤であって、インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子６個につき少なくとも約４個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、Ａ４およびＡ８の１組のヒスチジン置換と、Ｂ２８のシステイン、リジン、またはアスパラギン酸以外のアミノ酸置換と、選択的にＢ２９のプロリン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるＡ２１の置換とを含むインスリンＡ鎖配列を含み、前記製剤の形態が中間型亜鉛依存性皮下デポー剤である、医薬製剤。
【請求項３０】
医薬製剤であって、２若しくはそれ以上のインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、少なくとも１つのインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子６個につき少なくとも約４個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、Ａ４およびＡ８の１組のヒスチジン置換を含むインスリンＡ鎖配列を含み、前記製剤が長時間作用型、中間型、および／または短時間作用型の混合型亜鉛依存性皮下デポー剤を提供するものである、医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願書類の相互参照
この出願書類では、２０１０年２月２２日に提出され、係属中の米国仮出願第６１／３０６，７２２号の利益を請求する。
【０００２】
連邦政府の支援による研究開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所の約定番号ＮＩＨ  Ｒ０１  ＤＫ４０９４９、ＲＯ１ＤＫ０６９７６４、およびＲ０１−ＤＫ７４１７６によって授与された共同契約による政府支援によって行われた。米国政府は当該発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
１型糖尿病を治療するための強化インスリン療法では、インスリン製剤またはインスリン類似体製剤の皮下注射が必要である。投与法は、インスリンまたはインスリン類似体の数日間毎日注入、または持続皮下注射（「ポンプ療法」）から成る。血糖濃度の管理は食事中、食後、および食間、また睡眠・覚醒周期の間中求められる。持続注射が可能なポンプはごく少数の患者でしか使用されていないため、短時間作用型、中間型、および長時間作用型製剤を開発するためにかなりの努力が払われてきたが、これらの製剤は典型的にはヒトインスリン製剤、哺乳類インスリン製剤、またはインスリン類似体製剤と定義され、効果持続時間は約４、１２、および１８〜２４時間であるが、それぞれ７、１６、および３０時間まで効果が持続する可能性がある。長時間作用型インスリン製剤、または長時間作用型インスリン類似体製剤に特に関心が集まったのは、夜間低血糖および／または早朝高血圧を回避する必要性からであった。本発明は、長時間作用型インスリン類似体製剤の新規クラスの調製法に関する。このクラスの製剤は、２型糖尿病の治療にも有用と考えられる。
【０００４】
インスリンの投与は、糖尿病の治療として長い歴史を持つ。インスリンは、脊椎動物の代謝で中心的役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンには、２１残基を含むＡ鎖と３０残基を含むＢ鎖の２つの鎖が含まれる。ホルモンはＺｎ２＋−安定化六量体として膵臓β細胞に貯蔵されるが、血流中ではＺｎ２＋なしの単量体として機能する。
【０００５】
インスリンは単鎖前駆体であるプロインスリンの産物であり、プロインスリン内では、連結部位（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）とＡ鎖のＮ末端残基を結合している（図１Ａ）。人工単量体として核磁気共鳴法により最近決定されたプロインスリンの構造には、長年予想されていたとおり、インスリン様の中心部と不規則な連結ペプチドが含まれる（図１Ｂ）。３つの特異的ジスルフィド架橋（Ａ６〜Ａ１１、Ａ７〜Ｂ７、およびＡ２０〜Ｂ１９、図１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的折り畳みと共役していると考えられる。ＥＲからゴルジ装置に輸送された直後、プロインスリンは会合して、可溶性のＺｎ２＋配位六量体を形成する。未成熟分泌顆粒では、細胞内タンパク質分解による消化およびインスリンへの変換が起こった後、形態的に縮合する。成熟貯蔵顆粒中の亜鉛−インスリン六量体の結晶が、電子顕微鏡（ＥＭ）を使用することで観察された。本発明では、新規亜鉛含有マルチ六量体集合体に配向し、皮下注射での活性インスリン類似体の作用時間を変更する、インスリン類似体製剤について報告する。
【０００６】
糖尿病治療に使用するインスリン類似体のデザインでは、単量体、二量体、および六量体としてインスリンの３次元構造を利用した。インスリン単量体には３つのαヘリックス、２つのβターン、および２つの伸長セグメントが含まれる。前記Ａ鎖は、Ｎ末端のαへリックス（Ａ１〜Ａ８残基）、非標準的ターン（Ａ９〜Ａ１２）、第２のαへリックス（Ａ１２〜Ａ１８）、およびＣ末端の伸長（Ａ１９〜Ａ２１）から成る。前記Ｂ鎖には、Ｎ末端腕（Ｂ１〜Ｂ６）、βターン（Ｂ７〜Ｂ１０）、中心部のαへリックス（Ｂ９〜Ｂ１９）、βターン（Ｂ２０〜Ｂ２３）、βストランド（Ｂ２４〜Ｂ２８）、および可動性のＣ末端残基Ｂ２９−Ｂ３０が含まれる。前記２つの鎖は一箇所に集まり、３つのジスルフィド架橋（システインＡ６〜Ａ１１、Ａ７〜Ｂ７、およびＡ２０〜Ｂ１９）で安定化されたコンパクトな球状ドメインが形成する。様々な格子形式でＺｎ２＋配位インスリン六量体のＸ線結晶学的研究が広範に行われ、複数の結晶形から、Ｔ６、Ｔ３Ｒｆ３、およびＲ６と命名された３次元構造ファミリーが定義されている。各ケースにおいて、前記六量体の中心軸に沿って２つのＺｎイオンがあり（「軸上亜鉛イオン」）、それぞれに３つのヒスチジン側鎖が配位していることが分かり（ＨｉｓＢ１０）、さらに一部の結晶形では低親和性または部分的に占有された亜鉛結合部位が観察された。Ｔ状態のプロトマーは、溶液中のインスリン単量体構造に似ている。Ｒ状態のプロトマーはＢ鎖の二次構造が変化していることが示され、中央のαへリックスがＢ１（Ｒ状態）またはＢ３（不安定なＲｆ状態）に伸びている。３つの六量体ファミリーも、側鎖パッキングの細かい特徴が異なっている。
【０００７】
インスリン六量体の皮下分解は、注射したインスリン薬物動態の重要な伝達機構である可能性がある。したがって、インスリンの医薬製剤は亜鉛インスリン六量体の会合または分解を基にしていることが多い。例えば、即効性の類似体ではインスリン六量体の自己会合が限定されるか、六量体の分解が加速されると考えられる。他方、長時間作用型の類似体は、分解を遅延させるか、皮下デポー剤の沈殿および自己会合を促進することが多い。例えば、ヒューマログ（登録商標）およびノボログ（登録商標）のデザインおよび薬物動態に関して、構成インスリン類似体は六量体として注射するが、六量体は毛細血管に吸収されるために分解される必要がある。これらの類似体が置換されると、六量体の分解が促され、即効性のインスリン製剤が可能となる。対照的に、長時間作用型のランタス（登録商標）は主に単量体および二量体の溶液として注射され、この単量体および二量体は注射後、皮下組織および体液の緩衝作用により注入液のｐＨが上昇するにつれて沈殿し、アモルファスまたは微結晶デポーを形成する。これらの戦略は、一般的な原理、つまり、前記皮下デポー剤中の遊離インスリン単量体または二量体の利用効率と毛細血管への吸収率との関係に依存する。このように開発された様々なインスリン製剤は、一連の薬物動態学的特性を提供する。短時間作用型、中間型、および長時間作用型のインスリン製剤またはインスリン類似体製剤を組み合わせることにより、血糖濃度の変動を抑制し、したがって血糖管理を最適化する１日の投与デザインが可能となる。主な臨床製剤の種類は以下のとおりである。
標準的インスリン−即効性インスリン製剤は、中性ｐＨにて、可溶性亜鉛インスリン六量体の透明な溶液として製剤化される。最初は抗菌性保存剤として導入されたフェノール、メタクレゾール、またはメチルパラベンも前記六量体に結合し、Ｔ→Ｒ構造転移を誘導する。前記Ｒ６六量体が示す熱力学的および動力学的安定性は、古典的Ｔ６六量体よりも高い。類似の亜鉛ベースの六量体インスリン類似体製剤は、即効性製剤のヒューマログ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）およびノボログ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）に利用されている。
ＮＰＨインスリン−中間型インスリン製剤（ＮＰＨ；ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ）は、フェノール（またはメタクレゾール）および半化学量論的濃度のプロタミンを含むＲ６亜鉛インスリン六量体斜方晶の懸濁液、複数のアルギニン残基を含む小さな塩基性ペプチド混合物を基本としている。ＮＰＨインスリンのＸ線結晶学的研究では、前記結晶におけるこれらの塩基性ペプチドの位置が前記亜鉛インスリン六量体への結合様式を決定することを示唆している。混合投与を可能にするため、他にも即効性インスリン・リスプロ（ヒューマログ（登録商標）の有効成分）の類似ＮＰＨ製剤が開発された。しかし、ＮＰＨインスリンは製剤化が難しく、高価である。プロタミンは精液、通常は肉用牛の精液に由来する塩基性ペプチドの一群であり、ＮＰＨ結晶の形成は、均一な種晶の初期形成で構築される、厳格で複雑なプロセスである。さらに、ＮＰＨインスリンはフィブリル化する傾向がある。
レンテの原理−また、指定インスリン亜鉛懸濁液（ＩＺＳ）のヒトインスリンまたは動物インスリンによる持続的作用は、Ｔ６インスリン六量体懸濁液に過剰の亜鉛イオン（通常は六量体１個につき２０〜３０個）を加えることで得られる。このように過剰に使用することで、低親和性部位にも結合し、亜鉛インスリン複合体のアモルファス状沈殿物（セミレンテ、つまりＩＺＳアモルファス）または菱面体亜鉛Ｔ６インスリン微結晶懸濁液（ウルトラレンテ、つまりＩＺＳ結晶）が生成する。メチルパラベンは保存剤として利用されることが多く、前記Ｔ６亜鉛インスリン六量体の１面に結合する。ウルトラレンテ製剤はセミレンテ製剤よりも作用時間が長く、アモルファス状および結晶状粒子（ランテまたはＩＺＳ、混合型）を混合することで中間型の作用時間が得られる。製造においては、以下の２つの工程が行われる。
（１）前駆型インスリン結晶−最初の工程では、保存剤非存在下、亜鉛イオンおよび高（超生理学的）濃度の塩化物イオン（１．２Ｍ  ＮａＣｌ）を利用し、ｐＨ５．５で微結晶シードの懸濁液を生成する。前駆型結晶は空間群Ｒ３に属し、Ｔ３Ｒｆ３亜鉛インスリン六量体を含み、１つの六量体につき合計４つの亜鉛イオン（電荷＋８）と７つの塩化物イオン（電荷−７）が結合し、合わせて＋１となり、前記六量体の形式電荷となる。通常製剤のＲ６六量体とは異なり、前記前駆型六量体はＴ６三量体内に軸上の亜鉛イオンが１つのみ含まれる。他の３つの亜鉛イオンはＲｆ３三量体内の軸外にある。ＨｉｓＢ１０はＨｉｓＢ５および２つの塩化物イオンと協力してその立体配座を反転させ、４面体の亜鉛イオン結合部位を形成する。これらの軸外部位は、古典的Ｒ６六量体のフェノール結合ポケットの近くにある。ウルトラレンテ前駆型結晶の六量体内にある、軸外亜鉛イオン結合部位は、本発明の界面／六量体間亜鉛結合部位とは関係がない。
（２）ウルトラレンテインスリン結晶−ウルトラレンテ微結晶懸濁液を得るには、メチルパラベン、低濃度の塩化物イオン（１２０ｍＭ）、およびさらに高濃度の亜鉛イオンを含むｐＨ７．４の緩衝液中、前記シード結晶を希釈する。前記結晶は空間群Ｒ３のＴ６インスリン六量体から成る。前記製剤中の亜鉛イオン濃度が非常に高くなった結果（例えばインスリン分子１個あたり５個を超えるなど）、六量体に過剰な亜鉛イオンが観察される。通常の２つの軸上亜鉛イオンに加え、六量体中心部に位置する、相互排他的で非古典的な結合力の弱い結合部位２つのうち１つが部分的に占有されていることが観察される。その電子密度は、結合した塩化物イオンを解析するのに十分な質ではなかった。ウルトラレンテ成熟結晶の六量体内にある、軸外亜鉛イオン結合部位も、本発明の界面／六量体間亜鉛結合部位とは関係がない。
Ｂ鎖が伸長したインスリン類似体も知られており、１個の六量体に２個以上の亜鉛を持つ六量体を形成する。置換セットＧｌｙＡ２１−ＨｉｓＢ３１−ＨｉｓＢ３２、ＧｌｙＡ２１−ＨｉｓＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＡｒｇＢ３３、ＧｌｙＡ２１−ＡｌａＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＨｉｓＢ３３、およびＧｌｙＡ２１−ＡｌａＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＨｉｓＢ３３−ＡｒｇＢ３４を有するヒトインスリンは安定な複合体を形成し、六量体１個につきそれぞれ６．５、５．３、６．７、および５個の亜鉛を有する。これらの複合体（特にＧｌｙＡ２１−ＡｌａＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＨｉｓＢ３３−ＡｒｇＢ３４）も、イヌにおいて広範な薬物動態を示した。ここでは、各六量体内で、前記過剰な亜鉛イオンがＡ鎖のα−アミノ基とＢ鎖Ｃ末端の新しいヒスチジンの間を結合する可能性がある。
その他−インスリン類似体（インスリングラルギン、ランタス（登録商標）の有効成分、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）の透明な酸性溶液を皮下注射した後、持続的な作用が達成され、ヒトインスリンのポリペプチド配列を修飾することで等電点が７．０〜７．４にシフトした。皮下組織のｐＨ（ｐＨ  ７．４）で沈殿することにより、長時間作用型デポー剤が生成する。非極性部分によるインスリンの共有結合修飾によっても持続的な作用は達成され（インスリンデテミル、レベミル（登録商標）の有効成分、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、皮下デポー剤の疎水性を増大させ、血清アルブミンへの結合を可能にし、血流からのクリアランスを遅延させる。溶解性の差を利用した動物インスリン混合物（ブタおよびウシなど）には歴史的関心が持たれている。
【０００８】
本発明では、本明細書で提供されるインスリン類似体製剤の作用持続時間を延長する、非軸上亜鉛イオンの新規利用法を構築する。当該分野で既知のこれまでの亜鉛イオン利用法は以下のとおりである。通常のインスリン製剤およびヒューマログ（登録商標）およびノボログ（登録商標）の対応する即効性製剤では、亜鉛イオンを利用し、インスリン六量体の会合を管理し、安定化する。前記六量体は、中心部にある３本の折り重なった対称軸で関連付けられた３つのインスリン二量体から成る。各インスリン六量体またはインスリン類似体六量体には２つの亜鉛イオンが含まれ、これは前記六量体の３本の折り重なった対称軸上に位置する。これらの「軸上亜鉛イオン」には、ＨｉｓＢ１０イミダゾール環が配位している。前記Ｒ６六量体は、その配位構造が４面体と考えられるため、各亜鉛イオンは３つの対称性に関連するＨｉｓＢ１０残基に結合し、第４の配位部位は塩化物イオンが占めている。前記２つの軸上亜鉛イオン（＋４電荷）と２つの配位塩化物イオン（−２電荷）を合わせると、前記六量体の総形式電荷に＋２が加わる。この構造には非軸上亜鉛イオンはない。野生型ＮＰＨインスリン微結晶の単結晶Ｘ線回折研究では、１つの六量体に２つの軸上亜鉛イオンが示され、それ以上の亜鉛イオンはない。空間格子は斜方晶、空間群はＰ２１２１２１であり、本発明とは一致しない六量体−六量体パッキングパターンになっている（以下）。
【０００９】
現在、糖尿病治療に利用されているインスリン製剤の大部分にはインスリン類似体が含まれ、その配列は天然型ヒトインスリンとは異なる。インスリンのＡ鎖および／またはＢ鎖のアミノ酸置換については、皮下注射後のインスリン作用の薬物動態に及ぼすと考えられる好ましい効果が広く検討されてきた。当該分野で既知の例には、吸収の時間経過を加速または遅延させる置換が含まれる。前者の類似体は集合的に「摂食時」インスリン類似体と定義され、これは糖尿病患者がそのような即効性製剤を食事の時に注射することができるためであり、一方、吸収が遅延する野生型ヒトインスリンまたは動物インスリン（ブタインスリンまたはウシインスリンなど）では、これらの製剤を食事の３０〜４５分前に注射することが必要である。前記置換は、サブユニット界面の立体的または静電気的相補性を変化させることで前記亜鉛インスリン六量体を不安定化し、それによって皮下投与後の亜鉛インスリン六量体の急速な解離を促すようにデザインされている。「摂食時」インスリン類似体は、亜鉛−インスリン類似体六量体（ヒューマログ（登録商標）およびノボログ（登録商標））または平衡状態にある単量体、二量体、三量体、四量体、および六量体種を含む無亜鉛溶液（アビドラ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）として、ｐＨ７．４では透明な溶液として製剤化される。ヒューマログ（登録商標）およびノボログ（登録商標）は、ヒトインスリンおよび動物インスリンの通常製剤で長く利用されてきたものと同様、リン酸緩衝亜鉛溶液に製剤化されたが、当該分野で既知のこれまでの通常製剤とは異なり、亜鉛インスリン六量体として会合するため、フェノール、メタクレゾール、または他の特異的リガンドと結合し、前記変異インスリン六量体を安定化する必要がある。当該分野では、（システインを除く）様々なアミノ酸置換によるＰｒｏＢ２８の置換が、ＡｓｐＢ２８およびＬｙｓＢ２８と同程度、亜鉛インスリン六量体を不安定化することが知られており、選択的にＢ２９でのプロリンの置換を含む。
【００１０】
血糖濃度の基礎的管理の提供に１２〜２４時間かけてゆっくりと吸収されることを意図した長時間作用型インスリン類似体も、当該分野で知られている。これに限定されるものではないが、［ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ３１，ＡｒｇＢ３２］−インスリン（インスリングラルギンまたはランタス（登録商標））で例示される、そのような類似体には、インスリン類似体の等電点をｐＨ  ７．０〜７．４にシフトするようにデザインされたアミノ酸置換および／またはＡ鎖またはＢ鎖の伸長が含まれる。前記類似体は、典型的にはｐＨ５未満で可溶性インスリン単量体、二量体、およびより高次のオリゴマーを含む透明な溶液として製剤化され、この条件では亜鉛が介在した会合はＨｉｓＢ１０のプロトン付加によって十分に機能しなくなる。ｐＨが７．４にシフトするため、皮下組織にインスリン類似体が凝集および沈殿することで、長期的な吸収が達成される。ランタス（登録商標）として販売されているインスリン製剤には、不活性成分のメタクレゾール（２．７ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍＭ）、グリセロール（１７ｍｇ／ｍｌまたは１８５ｍＭ）、ポリソルベート−２０（２０ｍｇ／ｍｌ）、および（３０ｍｇ亜鉛イオン／ｍｌまたは０．５２ｍＭ）存在下、希釈ＨＣｌまたはＮａＯＨを一定量加えることでｐＨ４とした溶液中、０．６ｍＭとした活性類似体の［ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ３１，ＡｒｇＢ３２］−インスリン（グラルギン）が含まれる。ランタス（登録商標）のＵ−１００溶液には、０．６０ｍＭ［ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ３１，ＡｒｇＢ３２］−インスリンが含まれる。野生型インスリンのＡｓｎＡ２１は当該分野において、酸触媒化学変化を受けることが知られているため、ＧｌｙＡ２１置換の目的は、酸性溶液中でのそのような化学的分解を回避することである。
【００１１】
別のタイプの長時間作用型インスリン類似体も当該分野で既知であり、残基ＴｈｒＢ３０が除去され、Ｃ１４脂肪酸鎖がＬｙｓＢ２９の側鎖に接続しているインスリンデテミル（商標名レベミル（登録商標））により例示される（分子量５９１２．９ダルトン）。前記脂肪酸鎖は前記インスリン分子の疎水性を増大させ、前記皮下デポー剤の吸収遅延と関連している。前記脂肪酸鎖は前記インスリン類似体の血清アルブミンへの結合も媒介するため、循環血液中の寿命を長期化する。インスリンデテミルは、不活性添加物の塩化ナトリウム（１．１７ｍｇ／ｍｌ）、メタクレゾール（２．０６ｍｇ／ｍｌ）、フェノール（１．８０ｍｇ／ｍｌ  ｍＭ）、マンニトール（３０ｍｇ／ｍｌ）、および亜鉛イオン（６５．４ｍｇ／ｍｌまたは１．１ｍＭ）存在下、リン酸ナトリウム（二ナトリウム二水和物０．８９ｍｇ／ｍｌ）でｐＨ７．４に緩衝化した透明溶液中、可溶性亜鉛インスリン六量体（インスリン単量体単位で１４．２ｍｇ／ｍｌまたは２．５ｍＭ、Ｕ−１００溶液と定義）として製剤化される。亜鉛イオンの濃度は六量体１個につき亜鉛イオン約２．６個の比に対応する。インスリンデテミルのモル活性は、野生型ヒトインスリンと比較し、約４倍低下している。亜鉛イオンおよびフェノール存在下、ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０／Ｃ１４−ＬｙｓＢ２９修飾インスリン類似体の結晶構造は、その製剤に認められる結晶構造と似ているが同一ではなく、結晶格子の六量体間に脂肪酸が詰め込まれた天然様Ｒ６六量体を示している。皮下デポー剤で形成するようなインスリンデテミルの物理的状態または構造は、当該分野では知られていない。
【００１２】
したがって、亜鉛インスリン類似体の六量体表面および六量体間に新規亜鉛結合部位を形成するため、またそのようにすることで、長時間作用型の皮下タンパク質デポー剤を形成するために組み合わせることができる、いくつもの置換を有するインスリン類似体が必要である。
【００１３】
インスリンは脊椎動物インスリン関連タンパク質スーパーファミリーに属し、（インスリン自体に加え）インスリン関連成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、リラキシン、およびリラキシン関連因子などがある。これらのタンパク質は、相同的α−へリックスドメインおよびジスルフィド架橋を示す。タンパク質分解処理を行うインスリンおよびリラキシン関連因子には２つの鎖（ＡおよびＢと命名）が含まれるため、ＩＧＦはＡおよびＢドメイン、介在連結（Ｃ）ドメイン、およびＣ末端Ｄドメインを含む短鎖ポリペプチドである。６個のモチーフ特異的システインおよび特定のコア残基は脊椎動物のインスリン関連スーパーファミリーで広く保存されているが、他の残基は特定のタンパク質に限定され、機能的特異性を生じる。インスリンおよびＩＧＦｓは受容体チロシンキナーゼ（インスリン受容体（ＩＲ）およびクラスＩ  ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ））のリガンドとして機能するが、リラキシンおよび関連因子はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）に結合する。インスリンはＩＲに最も強く結合し、ＩＧＦ−１Ｒには弱く結合し、ＧＰＣＲに対する結合は検出されない。ＩＧＦ−ＩはＩＧＦ−１Ｒに最も強く結合し、ＩＲには弱く結合し、ＧＰＣＲに対する結合は検出されない。インスリンとＩＧＦ−１Ｒとの交差結合は、癌細胞の増殖に関連するものを含め、細胞増殖シグナル伝達経路を誘発する可能性がある。糖尿病治療におけるインスリン補充療法の長期的安全性は、そのような交差結合を抑制するアミノ酸置換を含むインスリン類似体を使用することにより向上させることができる。そのようなアミノ酸置換があると、ＩＧＦ−１Ｒに対してＩＲへのインスリン類似体の親和性比率が上昇する。したがって、それぞれの場合で野生型ヒトインスリンの特性と比較し、有効成分（インスリン類似体の単量体成分）がＩＧＦ−１Ｒに対する固有親和性を低下させ、ＩＧＦ−１Ｒと比較したＩＲへのインスリン類似体の親和性比率を上昇させる、長時間作用型インスリン類似体製剤が必要である。
【００１４】
インスリングラルギンはヒトインスリンよりも、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の１型受容体に強く結合する。この受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は細胞増殖シグナル伝達経路を介在し、アポトーシスを抑制することができる。ＩＧＦ−１Ｒ結合およびシグナル伝達増大の程度は、利用するアッセイがｉｎ  ｖｉｔｒｏであるのか、細胞を基本としているのかによって、１．４〜１４の係数であると推定された。そのようなＩＧＦ−１Ｒ結合およびシグナル伝達の増大は、培養中のヒト癌細胞株の増殖増加と関連している。製剤状態の［ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ３１，ＡｒｇＢ３２］−インスリン、または皮下デポー剤で形成するような［ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ３１，ＡｒｇＢ３２］−インスリンの物理的状態または分子構造については、当該分野では知られていない。
【００１５】
ＩＧＦ−１Ｒに対する相対的または絶対的親和性の上昇を示すインスリン類似体の安全性への懸念は、（ヒトインスリンに対して）ヒト癌細胞株の細胞培養研究でＡｓｐＢ１０−インスリンの分裂促進性が上昇したことから、また（ヒトインスリンの投与と比較して）ＡｓｐＢ１０−インスリンを投与したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで乳癌の発生数が増加したことから、１０年以上前に初めて持ち上がった。したがって、ＡｓｐＢ１０−インスリンは、ヒトで使用する臨床用インスリン類似体製剤としては追跡されなかった。最近、ランタス（登録商標）に類似の問題が持ち上がったが、ランタス（登録商標）もＩＧＦ−１Ｒに対する交差結合の増大、およびヒト細胞培養での分裂促進性の上昇を示す。ランタス（登録商標）を投与した欧州の糖尿病患者１２０，０００例以上を対象とした最近の後向き症例研究では、乳癌、前立腺癌、大腸癌、および膵臓癌など、様々な癌の発生数が用量依存的に増加することが示唆された。癌リスクの程度は、ＩＧＦ−１Ｒに対する交差結合レベルの増大だけでなく、ＩＲに対するランタス（登録商標）の親和性低下によっても上昇する可能性がある。そのため、現在の臨床的使用状況では、［ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ３１，ＡｒｇＢ３２］−インスリンの受容体結合の選択性（ＩＲ結合定数とＩＧＦ−１Ｒ結合定数の比）が、野生型インスリンまたは他のインスリン類似体と比較して異常に低下する。
【００１６】
ヒトインスリン自体はＩＧＦ−１Ｒに結合することができるが、界面活性剤で可溶化し、レクチン精製した受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親和性はＩＲへの結合親和性よりも３３３倍低かった。ヒューマログ（登録商標）およびノボログ（登録商標）などの摂食時インスリン類似体は、同レベルのＩＧＦ−１Ｒに対する交差結合を示す（ＩＧＦ−１Ｒ（ヒューマログ（登録商標）の有効成分）に対するインスリン・リスプロの交差結合はわずかに増加することが報告された）。疫学研究からは、内因性高インスリン血症（代謝症候群および２型糖尿病初期段階におけるインスリン抵抗性への代償性反応）と癌、特に直腸結腸癌の有病率上昇との関連性が明らかとなった。高用量のヒトインスリンまたはインスリン類似体を用いたインスリン抵抗性がみられる患者の治療は、癌リスクの増大とも関連している可能性があり、癌リスクの増大はＩＧＦ−１Ｒへの交差結合のベースラインレベルを反映している可能性がある。そのような患者では、ヒトインスリンおよび摂食時インスリン類似体のベースラインでの受容体特異性ですら、累積的な癌リスクについて長期的治療の安全性を確保するために十分厳密ではない可能性がある。理論による制約を受けることは望まないが、糖尿病治療用にデザインされたインスリン類似体の受容体結合選択性は、野生型ヒトインスリンの受容体結合選択性と同等であるか、それよりも大きくすることが賢明と考えられる。
【００１７】
インスリン類似体による血糖濃度の制御では、ヒトインスリンのような正確なレベルでのＩＲへの結合は必要ない。ＩＲに対する類似体の親和性低下は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、血流からのクリアランスの遅延によって相殺される可能性がある。このような相殺が起こるのは、インスリンのクリアランスがＩＲへの結合を介して行われるためである。それにもかかわらず、ＩＲへの親和性が３倍低下したインスリン類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ヒトインスリンと同程度の作用強度を示す。親和性のさらなる低下は、注入される類似体の量が増加することで相殺される可能性がある。このように親和性が低下したインスリン類似体の例は、インスリングラルギン（ランタス（登録商標））およびインスリンデテミル（レベミル（登録商標））である。ＩＲに対するインスリン類似体の親和性の変化は、通常、異常な比率の変化を反映しており、親和性の低下は、受容体における前記ホルモンの滞留時間短縮と関連しているが、親和性の上昇は、前記滞留時間の延長と関連している。滞留時間と代謝強度、または滞留時間と細胞増殖シグナル伝達との関連性は一般にどのようなものであるかは分かっていない。ＩＲ複合体におけるＡｓｐＢ１０―インスリンの滞留時間延長が、少なくとも一部は分裂促進性増大の根底にあることが提案された。理論による制約を受けることは望まないが、過去の経験から、ヒトインスリンに対してＩＲへのｉｎ  ｖｉｔｒｏの相対的親和性が２０％〜２００％であるインスリン類似体は、哺乳類の糖尿病治療に有効である可能性があることが分かった。
【００１８】
したがって、血糖濃度管理における類似体の生物学的活性を少なくとも一部維持しつつ、ＩＧＦ−１Ｒに対する交差結合が抑制された、作用持続時間が長いインスリン類似体が必要である。特に、皮下デポー剤からの吸収遅延を示すが、血糖濃度管理における前記類似体の生物学的活性を少なくとも一部持続しつつ、一度血流に吸収されるとＩＧＦ−１Ｒ親和性の低下を示すインスリン類似体が必要である。さらに、血糖濃度管理における類似体の生物学的活性を少なくとも一部維持しているが、ＩＧＦ−１Ｒ親和性が上昇せずに、等電点が中性に向かって増加を示すインスリン類似体が必要である。
【００１９】
インスリン類似体の生物学的、物理学的、および化学的性質は、Ａ鎖および／またはＢ鎖にアミノ酸置換があるため、またはＡ鎖および／またはＢ鎖が伸長し、より大きな分子を形成する可能性があるため、ヒトインスリンとは変化させることができる。２若しくはそれ以上の修飾を含む類似体の性質は、対応する単一の修飾を含む一連の類似体の性質を基に確実に予測することはできないことが、インスリン類似体の研究から示された。前記分子中の１つの位置でアミノ酸が置換または鎖が伸長すると、前記タンパク質の立体配座、動態、または溶媒和の変化に伝達される可能性があるため、前記分子中の別の位置でのアミノ酸置換の効果は、最初の修飾がない同じ置換の効果とは異なる可能性がある。予期せぬ修飾効果の伝達の例は、ＡｒｇＡ０−インスリン結晶構造のゆがみによって提供され、これは受容体結合の抑制と関連していた。したがって、ＡｒｇＡ０を含めるようにＡ鎖のＮ−末端を伸長すると、残基Ａ４、Ａ８、および他の部位の構造環境が変化する。１つ若しくはそれ以上の塩基性残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）を挿入するアミノ酸置換または鎖の伸長では、一般に等電点が中性にシフトし、このシフトの程度は、前記修飾と関連した構造、溶媒和、および伝達された立体配座の変化による影響を受けるため、観察されたｐＩｓは単離したアミノ酸の性質では十分な予測ができないことが経験から分かる。理論による制約を受けることは望まないが、２若しくはそれ以上の修飾を合わせた効果は、単一の修飾を含む類似体の性質を基に予測することはできないことが、経験から分かる。したがって、新たな修飾の組み合わせが、同時に糖尿病治療におけるインスリン類似体の治療目的での使用に新規の利点を提供する性質を有する可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、亜鉛インスリン類似体の六量体表面および六量体間に新規亜鉛結合部位を形成するため、またそのようにすることで、長時間作用型の皮下タンパク質デポー剤を形成するために組み合わせることができる複数のヒスチジン置換を含むインスリン類似体製剤に関する。より詳しくは、本発明はＡ２１に置換がある場合とない場合でＡ４およびＡ８に１組のヒスチジン置換を含むインスリン類似体を提供し、その皮下投与製剤を提供することで作用持続時間の延長を可能とする。いかなる特定の理論の特許性も条件として設けることは望まないが、これらの部位の側鎖は、それぞれがインスリン六量体に会合する時にＡ鎖表面から溶媒に突出していると考えられるため、新しい亜鉛イオン結合部位の一部を提供し、この結合部位を隣接する六量体からの相補的な側鎖の突出と合わせると、隣接するインスリン六量体間で亜鉛イオンが架橋する相互作用が可能になる。図１Ｅに示すとおり、野生型Ｔ３Ｒｆ３インスリン六量体は上の列（Ｔ３三量体、角の丸い長方形）と下の列（Ｒｆ３三量体、角のとがった長方形）を有し、それぞれ軸上に亜鉛イオンを含む（灰色の丸）。図１Ｆは、本製剤のＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８置換が起こると考えられる結晶格子における変異六量体の積み重ねを表した図を示している。架橋亜鉛イオン（黒丸）の層には、それぞれ各Ｔ状態プロトマー（図示せず）の残基ＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８と上記Ｒｆ状態プロトマーのＨｉｓＡ４’側鎖が配位している。いかなる特定の理論の特許性も条件として設けることは望まないが、この置換の組み合わせも前記インスリン類似体の受容体結合選択性を向上させ、ＩＧＦ−１Ｒの絶対的親和性を低下させる。
【００２１】
本発明の別の観点では、ｐＨ約４の長時間作用型インスリン類似体製剤が提供され、そのｐＨが約６〜７．４にシフトすると、微結晶懸濁液が生成する。特定の一実施例では、前記製剤がインスリン類似体分子６個あたり亜鉛イオン少なくとも約４個の相対濃度で亜鉛イオンを含む。したがって、前記製剤は生理学的ｐＨに曝露したために皮下デポーが形成するとすぐに、患者への皮下注射が可能である。前記製剤はさらに、同じ種の野生型インスリンと比較し、前記ＩＧＦ受容体に対する親和性が低く、同種のインスリン受容体に対する野生型インスリンの親和性を少なくとも２０％で維持すると考えられる。
【００２２】
インスリンの自然構造では、残基Ａ１−Ａ８がα−へリックスを有する。このセグメントは、インスリンおよびインスリン類似体のＩＲとＩＧＦ−１Ｒの両方への結合に寄与すると考えられる。理論の特許性を条件として設けることは望まないが、溶媒が曝露した残基ＧｌｕＡ４およびＴｈｒＡ８の置換（ＩＧＦ−Ｉでは保存されていない）は、インスリン類似体の前記ＩＲへの結合に対して十分耐性があるが、まだホルモン−受容体界面に近いと考えられる。ＧｌｙによるＡｓｎＡ２１の置換は、当該分野において、酸性条件で製剤化した場合にインスリン類似体の化学的分解を遅らせることが知られている。
【００２３】
したがって、亜鉛依存性長時間作用型皮下タンパク質デポー剤を提供し、Ｉ型ＩＧＦ受容体に対する交差結合が抑制され、インスリン受容体に対して高い親和性を保持しているインスリン類似体を提供することが望ましい。理論による制約を受けることは望まないが、インスリン類似体六量体の結合非軸上亜鉛イオンの２つの正電荷が、会合に依存した等電点のさらなるシフトに寄与する、インスリン類似体を提供することも望ましい。Ａ４およびＡ８の位置にある１組のヒスチジン側鎖が、結晶格子中のインスリン類似体六量体間の界面亜鉛イオン結合部位に寄与できるインスリン類似体を提供することも望ましい。ここでも理論による制約を受けることは望まないが、このような界面亜鉛イオンは六量体間の高次接触による会合を遅らせ、インスリン類似体の作用持続時間を延長すると考えられる。
【００２４】
インスリンまたはインスリン類似体のＡ１−Ａ８α−へリックスは、荷電部位、中性部位、α−へリックス双極子モーメント、および静電相互作用と組み合わさることで、その等電点（ｐＩ）に寄与する。ここでも理論による制約を受けることは望まないが、ｐＨ  ６．５を超えないｐＩの上方シフトは、（ＨｉｓのＧｌｕＡ４置換によって起こるような）酸性残基の除去で予想される。ｐＩのわずかな変化は、前記置換ヒスチジンの局所ｐＫａ（通常は６〜７）によって、Ａ４またはＡ８の位置におけるヒスチジン残基の挿入と関連している可能性がある。ここでも理論による制約を受けることは望まないが、ヒトインスリンでは位置Ａ４で酸性残基が観察される。Ｇｌｙ、Ａｌａまたは他の中性側鎖によるＡｓｎＡ２１の置換は、ｐＩに大きな変化を引き起こすと予想され、塩基性側鎖（ＡｒｇまたはＬｙｓ）による置換はｐＩをさらに上方シフトさせると予想され、（酸性溶液で保存した場合に天然ＡｓｎＡ２１側鎖の脱アミド化で起こるような）Ａｓｐの置換は、ｐＩを下方シフトさせると予想される。インスリン類似体の六量体表面に結合、または亜鉛インスリン類似体六量体間の界面部位に結合した非軸上亜鉛イオンも、前記六量体またはマルチ六量体複合体の全荷電に寄与することができ、皮下デポー剤同様、ｐＨ７．４で溶解性に影響する可能性がある。
【００２５】
したがって、上記の受容体結合特性を示し、また等電点が上方シフトしているが、中性を超えておらず、インスリン類似体六量体表面または六量体間の非古典的亜鉛イオンの結合において、前記アミノ酸置換とさらなる結合亜鉛イオンを組み合わせた効果のため、前記複合体がｐＨ７．４で皮下デポー剤として不溶性となるようなインスリン類似体を提供することも望ましい。
【００２６】
したがって、透明な溶液として酸性ｐＨで前記インスリン類似体の可溶性製剤を提供し、取り扱いが簡便で、シリンジにより皮下注入の投与量を正確に調節することができ、ペンにより正確な定量送達を提供することが望ましい。また、中性ｐＨでインスリン類似体の微結晶懸濁液を作る基礎として、結晶化の方法を提供することも望ましく、初回使用後の室温での有効期間および製剤の安定性が追加される。
【００２７】
一般に、患者を治療する方法は生理学的に有効な量のインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を患者に投与する工程を有し、前記類似体または生理学的に許容されるその塩は、Ａ４およびＡ８の位置で１組のヒスチジン置換により修飾し、Ａ２１でさらに修飾が可能なインスリンＡ鎖配列を含む。１つの実施例では、前記Ａ２１側鎖が天然型Ａｓｎ残基である。別の実施例では、前記Ａ２１側鎖がＧｌｙである。別の例では、前記Ａ２１置換をＡｌａ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒとすることができる。
【００２８】
インスリン類似体は、何らかの脊椎動物のインスリンの類似体または当該分野で既知の修飾Ｂ鎖を含むインスリン類似体とすることができ、皮下注入後の吸収が変化する。１つの実施例では、前記インスリン類似体が、ヒト、マウス、齧歯類、ウシ、馬、またはイヌインスリン類似体など、哺乳類のインスリン類似体である。１つの実施例では、前記インスリン類似体が、ヒツジ、クジラ、ラット、ゾウ、モルモット、またはチンチラのインスリン類似体である。
【００２９】
具体的なインスリン類似体には、配列ＩＤ番号４〜６または１４のいずれか１つで示されるＡ鎖配列と配列ＩＤ番号７〜１２のいずれか１つで示されるＢ鎖配列を含むものが含まれる。核酸は、これらの配列の１つを有するポリペプチドをコードする。そのような核酸は、宿主細胞の変換に利用される発現ベクターの一部と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１Ａは、Ａ鎖およびＢ鎖、および隣接する二塩基性切断部位（黒丸）とＣペプチド（白丸）で示される連結部位を含むヒトプロインスリン配列の略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、プロインスリンの構造モデルを提供し、インスリン様の部分と不規則な連結ペプチド（点線）から成る。
【図１Ｃ】図１Ｃは、部分的に単量体がアンフォールディングする、提案されたインスリンフィブリル化経路を示している。その天然型の状態は古典的な自己会合で保護されている（左端）。分解により、天然型単量体と部分的に折り畳まれた単量体の間で平衡に達する（それぞれ白三角形と台形）この部分的な折り畳みは、経路を外れた事象として完全にアンフォールディングされるか（白丸）、または途中で凝集して核を形成することによりプロトフィラメントになる（右端）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒトインスリン配列の略図であり、前記Ａ鎖の残基Ａ８の位置、および皮下注射後の吸収を早める当該分野で既知の前記Ｂ鎖の置換部位を示している。
【図１Ｅ】図１Ｅは、野生型Ｔ３Ｒｆ３インスリン六量体の略図であり、上の列（Ｔ３三量体、角の丸い長方形）と下の列（Ｒｆ３三量体、角のとがった長方形）を有し、それぞれ軸上に亜鉛イオンを含む（灰色の丸）。
【図１Ｆ】図１Ｆは、結晶格子状に積み重なった変異型六量体を示した略図であり、３つの架橋となる亜鉛イオン（黒丸）の層には、それぞれＴ状態プロトマー（角の丸い長方形）のＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８、またＲｆ状態プロトマー（角のとがった長方形）のＨｉｓＡ４f側鎖（垂直のセグメント）が配位している。
【図２ａ】図２ａは、野生型インスリンの配列および（上段の）インスリングラルギン（ランタス（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）と（下段の）本発明の類似体の修飾部位を示している。野生型Ａ鎖およびＢ鎖の配列は、黒色と灰色で示し、ジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、およびＡ２０−Ｂ１９）は黒線で示している。インスリングラルギンは、Ｂ鎖に２つの残基の伸長（ＡｒｇＢ３１およびＡｒｇＢ３２）と置換ＡｓｎＡ２１→Ｇｌｙ（上段で赤色）を含む。内因性皮下プロテアーゼは、伸長したインスリングラルギンＢ鎖から１つまたは２つのＡｒｇ残基をゆっくりと取り除き、一部は増大した分裂促進性を緩和することができる。本類似体には、１組（ｉ、ｉ＋４）の置換ＧｌｕＡ４→ＨｉｓおよびＴｈｒＡ８→Ｈｉｓ（下段）を含む。長時間作用型類似体のインスリンデテミル（レベミル（登録商標）、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、アルブミン結合要素（図示せず）が連結することで作用する。
【図２ｂ】図２ｂは、Ａ１−Ａ８α−へリックスの外面にあるＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８が形成した、想定される亜鉛イオン結合部位のインスリン単量体を表した部分のリボン状モデルを示している。Ａ鎖とＢ鎖のリボンは、それぞれ黒色および灰色で示されている。
【図２ｃ】図２ｃは、野生型Ｔ３Ｒｆ３インスリン六量体の構造を示している。前記六量体内の２つの軸上亜鉛イオンは中心部に並び、三量体が関連したＨｉｓＢ１０側鎖が配位している（薄灰色）。Ａ鎖は黒色、Ｂ鎖は灰色で示されている（Ｒｆ特異的Ｂ１−Ｂ８α−へリックス）。前記野生型構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（登録記号１ＴＲＺ）から入手した。
【図２ｄ】図２ｄは、変異型［ＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８］Ｔ３Ｒｆ３インスリン六量体の構造を示している。前記六量体内の２つの軸上亜鉛イオンは中心部に並び、三量体が関連したＨｉｓＢ１０側鎖が配位している（灰色）。前記変異型六量体には、前記Ｔ３三量体表面に３つの非古典的亜鉛イオンを含む（周辺の球）。灰色で示されているのは、隣接する六量体のＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８、および第３のＨｉｓＡ４の側鎖である。それぞれの場合において、Ａ鎖は黒色、Ｂ鎖は灰色で示されている（Ｒｆ特異的Ｂ１−Ｂ８α−へリックス）。
【図２ｅ】図２ｅは、Ｔ状態プロトマーのＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８によって形成した新しい亜鉛イオン結合部位を示した２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップ（１ｓで輪郭を示した立体構造のペア）を示している。歪んだ４面体配位は残基Ａ４’で完結し、隣接する六量体のＲｆ状態プロトマーに属している。
【図３Ａ】図３Ａは野生型六量体−六量体パッキングを示している。（左）各六量体において、上の三量体はＴ３構造、下の三量体はＲｆ３立体配座をとっている。軸上亜鉛イオン（大きな球）、およびＡ４およびＡ８残基近くの界面水分子（小さな球）が示されている。Ａ鎖は灰色、Ｂ鎖は黒色で示されている。ＴおよびＲプロトマーは、Ｂ１〜Ｂ９二次構造が伸長しているか（Ｔ）またはらせん形であるか（Ｒ）が異なり、残基Ｂ１およびＢ２は「不安定な」Ｒｆ状態で歪んでいる。（右）左の四角で囲んだ部分の拡大図。下に向かって見えるより大きな球は、下の六量体のＴ３三量体の軸上亜鉛イオンである。矢印は、上のＲｆ３三量体のＲｆ状態残基ＧｌｕＡ４’を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの亜鉛を介した六量体−六量体パッキングを示し、上の三量体はＴ３構造、下の三量体はＲｆ３立体配座をとっている。軸上亜鉛イオンおよびＡ４−Ａ８−Ａ４’が配位した亜鉛イオンが示されている。Ａ鎖は灰色、Ｂ鎖は黒色で示されている。（右）四角で囲んだ部分の拡大図。六量体−六量体の界面に３つの新しい亜鉛イオンが観察される。矢印は、（上の六量体の下の三量体に由来する）Ｒｆ状態の側鎖ＨｉｓＡ４’を示しており、これにより界面亜鉛結合部位が完結する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリン六量体のＴおよびＲｆ面を示したＣＰＫモデルを示している（左および右）。図３ｂに対して９０°回転させた図を示している。３つの非古典的亜鉛イオンは、ＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８の側鎖への結合が示される。白の十字は塩化物イオンの位置を示し、それ以外の配置は図３Ｂと同様である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、非古典的亜鉛イオン（大きな濃灰色の球）、塩化物イオン（重なっている薄灰色の球）、および３つの結合した水分子（小さな球）をＲｆプロトマーのＨｉｓＡ４’およびＴプロトマーのＨｉｓＡ４−ＨｉｓＡ８と関連させて示した立体構造のペアを示している。前記結合した水分子は、ＧｌｕＢ４’の側鎖カルボキシレート、ＴｙｒＢ２６’のパラ−ＯＨ、およびＰｒｏＢ２８’のカルボニル酸素（標識）が関与したＲｆ内の水素結合ネットワークに関与する。
【図３Ｅ】図３Ｅは、インスリンまたはインスリン類似体のＩＲへの高親和性結合（左側の３つの曲線、実線）およびＩＧＦ−１Ｒへの低親和性交差結合（右側の３つの曲線、点線）を調査した競合的置換アッセイの結果を示している。各群について、野生型インスリン（ｘ）、インスリングラルギン（■）、およびＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８−インスリン（▼）の結果が示されている。ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８−インスリンの受容体結合選択性が向上した結果、ＩＲ結合滴定が左方シフトし、ＩＧＦ−１Ｒ結合滴定が右方シフトしている。相対的親和性および解離定数を表２および３に示している。アッセイは亜鉛イオン非存在下にて行った。
【図３Ｆ】図３Ｆはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの結果を示している。ストレプトゾトシン誘発糖尿病雄ラットに野生型インスリン（ｘ）、インスリングラルギン（■）、ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８−インスリン（▼）、または対照緩衝液（Ｌｉｌｌｙ希釈液、●）を皮下注射した。時間０の用量は、野生型インスリン３．４４ｎｍｏｌｅｓ（注入量１００μｌ中２０ｍｇ）、インスリングラルギン１２ｎｍｏｌｅｓ（ランタス（登録商標）２．０Ｕに相当）、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリン１３．７ｎｍｏｌｅｓ、および無タンパク緩衝液１００μｌ（Ｌｉｌｌｙ希釈液）であった。血糖濃度は、示した時間で尾部の先端から測定した。各類似体は５匹のラット（平均±ＳＥＭ）で検討し、実験は２回繰り返し、同様の結果を得た。ラットの摂食時間は注射後６〜８時間とした。
【図４】図４は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病雄ラットに対照としてインスリン希釈液（丸）、インスリングラルギン（ランタス（登録商標）、四角）、リスプロインスリン（ヒューマログ（登録商標）、「Ｘ」）、またはＡ４およびＡ８の位置にＨｉｓ置換を含むインスリン類似体とヒューマログのリプスロ置換体（Ａ４Ａ８−リプスロ＋Ｚｎ、逆三角）を注射後の経時的血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示した図を示し、それ以外は図３ｆで上述したとおりである。
【図５】図５は、亜鉛を介したタンパク質の結合を可能とし、問題のタンパク質の長時間作用型デポー剤を形成するヒスチジン置換の利用を示した略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、インスリン類似体製剤の作用持続時間を延長させる、インスリン六量体間の非軸上界面亜鉛イオンの新しい利用法に関する。本発明は、長時間作用型皮下デポー剤を作成する新しい系を提供する。本発明では、インスリン類似体六量体表面およびインスリン類似体六量体間で結合し、これらの類似体のデポー剤が単量体のインスリン類似体を血流に放出させるのにかかる時間を延長させる、新規非軸上亜鉛イオンを利用する。本発明では、１型ＩＧＦ受容体に対するインスリン類似体の絶対的および相対的結合量を同時に減少させる方法についても提供する。この特徴を組み合わせることで、特に癌リスクについて、糖尿病治療の有効性および安全性が向上する。そのため、本発明は、ｐＨ４では透明な溶液として、または中性ｐＨ付近で微結晶の懸濁液として、亜鉛含有製剤とともに、Ａ４およびＡ８の位置に１組のヒスチジンアミノ酸置換が含まれるインスリン類似体を提供する。前記１組のＡ４−Ａ８置換はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒなど、Ａ２１の置換と組み合わせることができる。
【００３２】
本発明のインスリン類似体には、他にも修飾が含まれてもよい。本明細書およびその請求項で使用されているとおり、インスリン類似体の様々な置換は、置換されるアミノ酸、続いて選択的に上付き文字で示す前記アミノ酸の位置を示す慣習により記すことができる。問題となる前記アミノ酸の位置には、置換が位置するインスリンＡ鎖またはＢ鎖を含む。例えば、本発明のインスリン類似体には、Ｂ鎖のアミノ酸２８（Ｂ２８）におけるアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）またはリジン（ＬｙｓまたはＫ）のプロリン（ＰｒｏまたはＰ）との置換、またはＢ鎖のアミノ酸２９（Ｂ２９）におけるＰｒｏのＬｙｓとの置換、またはその組み合わせを含む可能性がある。これらの置換は、それぞれＡｓｐＢ２８、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９と示される。同様に、本発明のインスリンには、Ａ鎖アミノ酸Ａ０（つまり、ＧｌｙＡ１のＮ末端）におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、またはリジン（ＬｙｓまたはＫ）の付加も含むことができる。これらの付加は、それぞれＡｒｇＡ０、ＨｉｓＡ０、またはＬｙｓＡ０と示すことができる。さらに、本置換は置換ＰｈｅＢ１→Ｈｉｓの導入と組み合わせることもできる。他の記載がない限り、または内容から明らかであれば、本明細書で示すアミノ酸はＬアミノ酸とみなす。
【００３３】
本明細書で用いるとおり、「金属ステープル」または「金属ジッパー」は、２若しくはそれ以上の分子または分子複合体の２若しくはそれ以上のアミノ酸側鎖が問題の金属と結合している場合に形成される金属結合部位である。例えば、第１分子の１つの側鎖を第２分子の２つの側鎖と組み合わせ、亜鉛結合部位を形成することができる。したがって、インスリン三量体は軸上亜鉛イオンと一緒に「金属ステープル」となることは当該分野で周知である。しかし、亜鉛結合部位が導入されると、特定インスリン類似体の六量体によって六量体間に亜鉛ステープルが形成されるかもしれないことは、これまで知られていなかった。
【００３４】
本発明は、新規「亜鉛ステープル」を形成するインスリン六量体複合体を形成し、ＩＧＦ−１Ｒへの親和性低下を示すが、ＩＲに対する親和性の少なくとも一部を保持し、したがって生物活性を保持するインスリン類似体を提供する。本発明は、「亜鉛ステープル」六量体複合体を形成する、相対的亜鉛濃度が高いこれらの類似体製剤、および亜鉛濃度がさらに高い、これらの六量体複合体のランテ様結晶も提供する。いくつかの実施形態では、前記インスリン類似体が、前記インスリン類似体の六量体１個につき少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個の亜鉛イオンを含む。
【００３５】
患者を治療する方法は、前記患者にインスリン類似体を投与する工程を有する。１つの実施形態では、前記インスリン類似体が、同時に中性への等電点（ｐＩ）の上方シフトを引き起こし、すなわち亜鉛ステープルインスリン六量体を会合させる、前記Ａ鎖の修飾を含むインスリン類似体である。別の実施形態では、前記修飾が前記無亜鉛単量体のＩＧＦ−１Ｒへの親和性も低下させる。別の実施形態ではまた、前記インスリン類似体がＡ２１の位置に置換を含み、酸性条件で製剤化する際に前記インスリン類似体の化学的分解を防ぐ。前記インスリン類似体は、シリンジ、定量ペン、または他の適切な装置を用いて皮下注射により投与される。
【００３６】
また、酸性ｐＨで十分な濃度の亜鉛イオンを用いて製剤化した類似体のＡ４およびＡ８の位置に１組のヒスチジン置換を導入することも可能であり、２つの同時メカニズム、つまり主にＧｌｕＡ４の負電荷がなくなったために等電点が高くシフトし（およそ６．５〜６．６）、古典的軸上亜鉛イオンに加えて非軸上亜鉛イオンが結合するため、亜鉛インスリン六量体の純等電点がさらにシフトするというメカニズムにより、ｐＨ  ７．４で類似体に不溶性を与えると想定される。皮下デポー剤のインスリン類似体の溶解性を低下させる目的でＡ４およびＡ８に同じ置換を導入すると、インスリンおよびインスリン類似体と１型ＩＧＦ受容体との交差結合との関連性が提案された、潜在的癌リスクが低下する。
【００３７】
また、上記類似体と１型ＩＧＦ受容体との交差結合を減少させるという１若しくはそれ以上の目的のため、（これに限定されるものではないが、これらのタイプの混合物を含め、通常型、ＮＰＨ、セミ−ランテ、およびランテなど）他のクラスのインスリン類似体製剤において、Ａ２１における置換の有無に関係なく、Ａ４およびＡ８の位置に同時に置換を導入することも可能であると想定される。ｐＨ  ７．４で通常の可溶性製剤とする目的では、１組のヒスチジン置換をＡ鎖またはＢ鎖の別の位置の置換と組み合わせる必要があり、この置換では１若しくはそれ以上の正電荷がなくなるか、または１若しくはそれ以上の負電荷が加わり、これによって、これに限定されるものではないが、塩化亜鉛、フェノール、メタクレゾール、グリセロール、リン酸ナトリウム緩衝液、および注射用水を含む当該分野で既知の添加物存在下、ｐＨ  ７．４でヒトインスリン製剤などを可溶性とするため、前記ｐＩを十分低下させる。Ａ４およびＡ８における１組のヒスチジン置換と組み合わせた場合、ｐＩを低下させる置換の例には、これに限定されるものではないが、ＧｌｕＡ１４、ＡｓｐＡ２１、ＧｌｕＡ２１、ＡｓｐＢ９、ＧｌｕＢ９、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ１０、ＡｌａＢ２２、ＳｅｒＢ２２、ＡｓｐＢ２８、ＡｓｐＢ２８−ＰｒｏＢ２９、ＡｓｐＢ２８−ＡｌａＢ２９、ＡｌａＢ２９、およびＰｒｏＢ２９、またはその組み合わせを含む。
【００３８】
Ａ４およびＡ８における１組のヒスチジン置換は、インスリン類似体と１型ＩＧＦ受容体との交差結合を減少させ、前記インスリン類似体に対する固有の親和性を維持しながら、ｐＩを中性に上方シフトさせる可能性があることが発見された。
【００３９】
ｐＨ  ７．４で亜鉛を含まないようにすると、［ＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８］−インスリンは非常に溶けやすいが、インスリン類似体分子６個につき４〜６個の亜鉛イオンを追加すると、亜鉛−タンパク質複合体が沈殿することも発見された。この複合体はｐＨ  ７．０〜８．４では不溶性であるか、やや溶けにくいが、ｐＨ約４では可溶性である。理論による制約を受けることは望まないが、このｐＨ依存性の不溶性は、軸上および非軸上結合亜鉛イオンをいずれも含む亜鉛タンパク質複合体がｉｎ  ｖｉｔｒｏで等電的に沈殿するためである。
【００４０】
［ＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８］−インスリンは、ｐＨ  ４．０で緩衝化されていない、モル比で６個のインスリン分子につき５．２個の亜鉛イオンを含む溶液に製剤化し、その後、ストレプトゾトシンにより糖尿病とした雄Ｌｅｗｉｓラットに皮下注射すると、ランタス（登録商標）の薬理作用と同等の期間および範囲に血糖濃度の管理が延長されることも発見された。理論による制約を受けることは望まないが、この長期的作用は、軸上および非軸上結合亜鉛イオンをいずれも含む亜鉛タンパク質が等電的に皮下沈殿するためである可能性が高い。
【００４１】
１個の六量体につき２個の軸上亜鉛イオンと３個の非軸上亜鉛イオンを含む亜鉛インスリン類似体六量体は、前記Ｒ３結晶格子の連続する六量体間で結合するため、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの結晶は容易に成長することも発見された。後者の界面亜鉛イオンは、１個の六量体中のＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８による４面体配位、隣接する六量体のＨｉｓＡ４’、および結合塩化物イオンを示す。前記３つの結合亜鉛および塩化物イオンは前記六量体にそれぞれ＋６および−３の正式電荷を加え、正味の正式電荷は＋３となる。これらの追加電荷は、ＨｉｓによるＧｌｕＡ４の置換によって達成される正式電荷＋６に追加される。理論による制約を受けることは望まないが、３つの非軸上亜鉛イオンがあるために上記のｐＨ依存性の不溶性が得られ、亜鉛タンパク質複合体は推定上、皮下等電沈殿する可能性がある。
【００４２】
一般に、脊椎動物のインスリン類似体または生理的に許容されるその塩はインスリン類似体を有し、インスリンＡ鎖およびＢ鎖を含む。本発明のインスリン類似体は、残基Ｂ１および／またはＢ３１のＢ鎖における伸長塩基性アミノ酸の置換など、他の修飾を含んでもよい。１つの例では、前記脊椎動物のインスリン類似体がヒト、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、またはウマインスリン類似体などの哺乳類インスリン類似体である。その開示がこの参照により本明細書に組み込まれる、同時係属の米国特許第１２／４１９，１６９号明細書でより詳細に説明されるとおり、本発明のインスリン類似体には、Ｂ鎖Ｃ末端とＡ鎖Ｎ末端の間のつなぎなど、他の修飾も含むことができる。
【００４３】
薬学的組成は、上記インスリン類似体を有することもでき、作用時間を延長させるためには、亜鉛イオンまたはタンパク質集合体および六量体の界面ステープリングを導くことができる他の二価金属イオンを含んでいる必要がある。亜鉛イオンは、前記インスリン類似体の六量体１個につき４．０〜７．０のモル比または５．０〜６．０のモル比のレベルで、そのような組成に含まれることもある。さらに遅い吸収でも六量体複合体を形成するため、亜鉛イオンはより高いモル比で含まれる可能性もあり、そのような高いモル比では、亜鉛イオンが界面［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］関連亜鉛ステープル結合部位に加え、弱い亜鉛結合部位を占めることになる。そのような製剤では、前記インスリン類似体濃度は典型的には約０．１〜約３ｍＭと考えられる。
【００４４】
添加物には、グリセロール、グリシン、他の緩衝剤および塩、およびフェノールおよびメタクレゾールなどの抗菌性保存剤を含むことができ、後者の保存剤は前記六量体の安定性を高めることが知られている。そのような薬学的組成を用い、前記組成の生理的有効量を糖尿病または他の病状を有する患者に投与することで、前記患者を治療することができる。
【００４５】
Ａ鎖をコードする配列を含むインスリン類似体コード化ポリぺプチドをコードする配列を有する核酸は、Ａ４およびＡ８にヒスチジン置換の組み合わせを有し、Ａ２１にさらに置換を有する場合と置換がない場合がある。特定の配列は、核酸配列が導入される種の好適なコドンの利用によって変化する可能性がある。前記核酸は、野生型インスリンの他の修飾もコードする。前記核酸配列は、前記ポリペプチドまたは修飾プロインスリン類似体の別の位置に関連のない置換または伸長を含む修飾Ａ鎖またはＢ鎖配列をコードすることもある。前記核酸は発現ベクターの一部でもあり、このベクターは大腸菌細胞株などの原核宿主細胞、または出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）またはメタノール資化酵母（Ｐｉｓｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株または細胞株などの真核細胞株のような宿主細胞に挿入される可能性がある。
【００４６】
本発明の類似体内では関連性のない置換または鎖の伸長が組み合わさり、Ｂ１３の位置の置換、またはＡ０、Ａ２２、Ｂ０、またはＢ３１の位置でのＡｒｇまたはＬｙｓによる鎖の伸長によってその等電点をさらに上方に、または負電荷を挿入するか、正電荷を除く置換により下方に変化させる可能性があると想定される。例えば、前記置換はＡｌａＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＨｉｓＢ３３−ＡｒｇＢ３４、ＨｉｓＢ３１−ＨｉｓＢ３２、ＨｉｓＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＡｒｇＢ３３、またはＡｌａＢ３１−ＨｉｓＢ３２−ＨｉｓＢ３３と組み合わさっているかもしれない。この後者の場合、さらなる六量体内亜鉛結合が本発明の六量体内亜鉛結合を補い、前記亜鉛を六量体比に引き上げ、前記六量体複合体をさらに安定化させる。
【００４７】
本発明の置換はＢ鎖の修飾と組み合わせることもでき、この好ましくない性質を軽減するＩＧＦ−１Ｒ交差結合を増加させるが、この例には、１若しくは２塩基性残基（ＡｒｇＢ３１、ＬｙｓＢ３１、ＡｒｇＢ３１−ＡｒｇＢ３２、ＡｒｇＢ３１−ＬｙｓＢ３２、ＬｙｓＢ３１−ＡｒｇＢ３２、およびＬｙｓＢ３１−ＬｙｓＢ３２など）によるＢ鎖の伸長またはＡｓｐまたはＧｌｕによるＨｉｓＢ１０の置換が含まれる。例は、（これに限定されるものではないが）インスリングラルギン（ランタス（登録商標））によって提供され、インスリングラルギンはｐＨ  ４で製剤化されるが、皮下デポー剤では生理的ｐＨで凝集する。
【００４８】
さらに、本発明の１組のヒスチジン置換は、既存のインスリン類似体または修飾インスリンに存在するいずれかの変化、または通常のインスリン、ＮＰＨインスリン、ランテインスリン、またはウルトラランテインスリンなど、様々な医薬製剤と組み合わせて利用することができると想定される。本発明のインスリン類似体は、ヒトインスリン類似体に存在する置換を含み、臨床的には利用されていないが、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９の置換またはＡｓｐＢ９置換を含むＤＫＰ−インスリンなど、まだ実験的には有用である。ただし、本発明はヒトインスリンおよびその類似体に限定されない。また、これらの置換は、限定されない例により、ブタ、ウシ、ウマ、およびイヌインスリンなどの動物インスリンで行われると想定される。さらに、ヒトインスリンと動物インスリンとの類似性、および過去のヒト糖尿病患者における動物インスリンの利用を考慮し、インスリン配列中の他のわずかな修飾、特に「保存的」置換と考えられるこれらの置換が導入されるとも想定される。例えば、本発明から離れずに、同様の側鎖を持つアミノ酸グループ内でアミノ酸のさらなる置換が行われることもある。これには、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）およびメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）などの中性疎水性アミノ酸が含まれる。同様に、中性極性アミノ酸はグリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、およびアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群内で互いに置換される可能性がある。塩基性アミノ酸はリジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸はアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。
【００４９】
比較のため、配列ＩＤ番号１として、ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を示す。配列ＩＤ番号２としてヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を示す。比較のため、配列ＩＤ番号３としてヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を示す。
配列ＩＤ番号１（プロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列ＩＤ番号２（Ａ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列ＩＤ番号３（Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００５０】
本発明のインスリン類似体は天然型インスリンと同様のインスリン受容体親和性を有するが、１型ＩＧＦ受容体に対する親和性は低下していると想定される。インスリンまたはインスリン類似体の活性は、以下に本明細書でより詳細に説明するとおり、受容体結合アッセイにより決定することができる。相対活性は、競合的置換アッセイの曲線を当てはめることで得られるとおり、ホルモン−受容体解離定数（Ｋｄ）に関して、または放射活性物質で標識したヒトインスリン（１２５Ｉ標識インスリンなど）または放射活性物質で標識した高親和性インスリン類似体など、特異的に結合する標識ヒトインスリンの５０パーセントを移動するために必要な非標識インスリンまたはインスリン類似体の濃度であるＥＤ５０値に関して定義することができる。代わりに、活性は単純に通常のインスリンの割合として表すことができる。インスリン様成長因子受容体に対する親和性は、測定されるＩＧＦ−１Ｒとの置換と同じ方法で測定することもできる。特に、インスリン類似体は通常のインスリンの２５、５０、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または２００パーセント以上など、インスリンの２０〜２００パーセントの活性を有するが、ＩＧＦ−１Ｒに対する親和性は、通常のインスリンの１０、２０、３０、または５０パーセントなど、通常のインスリンの５０パーセント以下であることが望ましい。クリアランスが遅いため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体結合活性が２０％の低さであるとしても、インスリン類似体はまだ糖尿病治療に有用である可能性がある。
【００５１】
インスリン類似体の合成。ジチオスレイトール（７ｍｇ）存在下、０．１Ｍグリシン緩衝液中（ｐＨ  １０．６、１０ｍｌ）で、Ａ鎖（４１ｍｇ）およびＢ鎖類似体（２１ｍｇ）のＳスルホン化誘導体の相互作用により鎖を組み合わせた。各組み合わせの混合物のＣＭ−５２セスロースクロマトグラフィーにより、遊離Ｂ鎖が混入したタンパク質の塩酸塩を一部単離することができる。最終的な精製は、逆相ＨＰＬＣにより達成される。［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの予想される分子量は、ＭＡＬＤＩ質量分析により確認された。最終的な収率（６．１ｍｇ）は、野生型インスリンの制御合成で得られた収率と同等であった。［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−ＤＫＰ−インスリンの対応する収率は８．８ｍｇであった。
【００５２】
等電点電気泳動。天然の状態でのインスリンおよびインスリン類似体のｐＩ値は、ｐＨ  ３〜１０のプレキャストＩＥＦゲルを用い、ＩＥＦゲル電気泳動により測定した（１２５×１２５ｍｍ、３００μｍ、ＳＥＲＶＡＬＹＴ（登録商標）Ｐｒｅｃｏｔｅｓ（登録商標）、ＳＥＲＶＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ（ハイデルベルク）製、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（米国ニューヨーク州Ｈａｕｐｐａｕｇｅ）より入手）。製造業者のプロトコールによれば、Ｐｒｅｃｏｔｅｓ（登録商標）は水平型ＩＥＦ装置であるＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に構成する。この装置は、予め循環型水浴（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）を用いて４℃に冷却してから、熱交換効率を上げるため、ＰＲＥＣＯＴＥ  ＩＥＦゲルは軽油でコーティングした電気泳動ベッドに入れた。前記ゲルは、ろ紙の芯を用い、ゲルの両端をＡｎｏｄｅ  Ｆｌｕｉｄ  ｐＨ３およびＣａｔｈｏｄｅ  Ｆｌｕｉｄ  ｐＨ  １０（いずれもＳＥＲＶＡ）で湿らせて電極に接続した。サンプルをローディングする前に、高電源供給（ＬＫＢモデル２１９７）を用いて３０分間、２００ボルトの初期電圧設定および５００ボルトの最終設定で前記ゲルをプレフォーカスした。サンプルとＩＥＦの標準品をローディングした後（５〜１０μＬ、ローディングするタンパク質濃度は５〜１０μｇ）、等電点電気泳動法は５００〜２０００ボルトで２時間、または最終電圧の２０００ボルトに達するまで行い、この後さらに１５分間電気泳動を続けた。ＩＥＦの後、ＳＥＲＶＡマニュアルのプロトコールに従い、前記ゲルを２０分間２０％トリクロロ酢酸２００ｍｌで固定し、脱イオン水２００ｍｌで１分間洗い流し、Ｓｅｒｖａ  Ｖｉｏｌｅｔ  １７溶液で染色し、８６％リン酸で脱染した。使用したＩＥＦ標準タンパク質（ＳＥＲＶＡ製）は以下のとおりであり、それぞれのｐＩ値を括弧に示す：ウマ心臓チトクロムＣ（１０．７）、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（９．５）、レンズマメレクチン（８．３、８．０、７．８）、ウマ筋肉ミオグロビン（７．４、６．９）、ウシ赤血球炭酸脱水酵素（６．０）、牛乳β−ラクトグロビン（５．３、５．２）、大豆トリプシンインヒビター（４．５）、クロカビグルコースオキシダーゼ（４．２）、クロカビアミログルコシダーゼ（３．５）。前記タンパク質サンプルのｐＩ値は、前記ＩＥＦの泳動距離とｐＨ勾配の線形回帰プロットを比較することにより決定した。
【００５３】
受容体発現プラスミド。エピトープタグを付けたＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの発現については、前記哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋をＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから入手し、ＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限部位の間にあるＦＬＡＧ  Ｍ２エピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）のインフレーム３回繰り返し配列をコードするインフレーム・オリゴヌクレオチドカセットをサブクローニングすることで、Ｃ末端エピトープのタグを修飾した。ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲのＢイソ型をコードするそれぞれのｃＤＮＡについては、すでに報告されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ  ８４，  ｐｐ．  ５２３７−５２４１  （１９８７））。部位特異的突然変異誘発による停止コドンの直前にある３’末端のインフレームＣ末端Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーをコードするＢａｍＨＩ部位の導入により、修飾発現ベクターにサブクローニングするため、修飾した。
【００５４】
受容体ｃＤＮＡの発現。トランスフェクションＤＮＡはすでに説明したとおりに調製した。前記受容体ｃＤＮＡは、ポリエチレンイミンを用いて一時的にＰＥＡＫ  ｒａｐｉｄ細胞に発現させた。細胞はトランスフェクション後３日で採取し、この時受容体の発現が最大となった。溶解は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８．０）から成り、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む緩衝液中で達成した。溶解物はアッセイで必要になるまで−８０℃で保存した。
【００５５】
受容体結合アッセイ。ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲ−Ｂ結合アッセイは、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒらがすでに説明したマイクロタイタープレート抗体捕獲法の変法により行った。抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ（リン酸緩衝生理食塩水中４０μｇ／ｍｌ溶液が１００μｌ／ウェル）を用い、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を一晩４℃でインキュベートした。洗浄およびブロッキングはすでに説明したとおりに行った。ＩＲ−ＢまたはＩＧＦ−１Ｒの全長をコードし、Ｃ末端ＦＬＡＧタグが付いたｃＤＮＡを用いて一時的にトランスフェクトした２９３  ＰＥＡＫ細胞の洗剤溶解物（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｌｙｓａｔｅｓ）は、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）クロマトグラフィーにより部分的に精製し、受容体前駆体の溶解物を枯渇させた。次に、抗体でコーティングしたプレートにおいて、コムギ胚芽溶出物を１時間室温でインキュベートし、受容体を固定化した。結合していないタンパク質を除去するため広範に洗浄した後、説明したとおり、標識インスリントレーサー（１２５Ｉ−［ＴｙｒＡ１４］−インスリン）または標識ＩＧＦ−Ｉトレーサー（１２５Ｉ−Ｔｙｒ３１−ＩＧＦ−Ｉ）と非標識インスリン類似体を用いた競合的結合アッセイを行った。アッセイの同じセットでコントロールリガンドとしてインスリンまたはＩＧＦ−Ｉ受容体を用い、すべてのインスリン類似体をアッセイした。相同競合的アッセイの結合データは２部位連続モデルを用いた非線形回帰分析により分析し、インスリンおよびＩＧＦ−Ｉの解離定数を求めた。異種競合的実験の結合データはＷａｎｇの方法により分析したが、この方法では、正確な数学的表現を用いて２つの異なるリガンドの受容体への競合的結合を説明する。
【００５６】
当該分野で周知のインスリン類似体に関する代表的な結合研究を表１にまとめている。ＩＲ（イソ型Ｂ）に対するインスリンの親和性はＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−Ｉの親和性と同等であるため（それぞれの場合でＫｄは約０．０４ｎＭ）、カラム４に示すとおり、ＩＲとＩＧＦ−１Ｒそれぞれの％親和性（カラム２および３）の比から、前記インスリン類似体の絶対的特異性の推定が示される。ヒトインスリンの特異性（列１）に対して正規化すると、相対的特異性の推定が得られる。相対的特異性が１以上（１未満）であると、受容体結合の厳密性が上昇（低下）したことが示される。このアッセイでは、ＡｓｐＢ１０−インスリンのＩＧＦ−１Ｒに対する親和性が上昇したことが示されるが、ＩＲに対する親和性はより顕著に上昇しているため、相対的特異性は１以上である。インスリングラルギン（ランタス（登録商標））にはＡｓｎＡ２１→Ｇｌｙの置換とＢ鎖の２残基の伸長（ＡｒｇＢ３１およびＡｒｇＢ３２）が含まれ、これにより、ＩＧＦ−１Ｒに対する絶対的親和性が上昇、ＩＲに対する絶対的親和性が低下し、受容体結合の相対的厳密性が低下したことが示される。本発明のインスリン類似体は反対の性質を示し、ＩＧＦ−１Ｒに対する絶対的親和性が低下し、受容体結合の相対的厳密性が上昇する。
【００５７】
【表１】
2013520175.tif 000003
【００５８】
Ａ鎖アミノ酸置換の新規組み合わせを含むインスリンのＡ鎖類似体は、変異型Ａ鎖の化学的全合成によって作成した。野生型Ｂ鎖は酸化的亜硫酸分解によりヒトインスリンの市販製剤から入手し、ＤＫＰ  Ｂ鎖は同様に化学的全合成により作成した。各ケースのインスリン類似体はインスリン鎖を組み合わせて入手し、その後クロマトグラフィー精製を行った。各ケースの分子量予測値を質量分析により確認した。
【００５９】
Ａ４およびＡ８の位置に１組のヒスチジン置換を含み、ＡｓｎＡ２１のＧｌｙによる置換があるインスリン類似体とＡｓｎＡ２１の置換がないインスリン類似体を合成し、野生型ヒトＢ鎖（配列ＩＤ番号３）との関連で配列ＩＤ番号４として示す。ヒトインスリンとこれらの類似体の特性を比較すると、Ａ１、Ａ８の置換がＩＧＦ−１Ｒに対する類似体の親和性を低下させ、ＩＲとＩＧＦ−１Ｒに対する親和性の比を増加させる一般的効果が示される（表２）。
配列ＩＤ番号４（Ａ４およびＡ８の１組のヒスチジン置換）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ
Ｘａａ＝Ａｓｎ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ
【表２】
2013520175.tif 000004
【００６０】
配列ＩＤ番号５または６および２０〜２１のＡ鎖ポリペプチド配列を有するインスリン類似体は、野生型インスリンＢ鎖（配列ＩＤ番号３）またはインスリングラルギンなどのインスリン類似体と共に同様に調整した。亜鉛イオンの非存在下、（無亜鉛ヒトインスリンに認められるベースライン値の５．６から）等電点の値が６．６に上方シフトすることは、等電点ゲル電気泳動により確認した。この目的を達成するため、研究ではｐＨ  ３〜１０のプレキャストＩＥＦゲル（１２５×１２５ｍｍ、３００μｍ、ＳＥＲＶＡＬＹＴ（登録商標）Ｐｒｅｃｏｔｅｓ（登録商標）、ＳＥＲＶＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ（ハイデルベルク）製、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（米国ニューヨーク州Ｈａｕｐｐａｕｇｅ）より入手）を利用した。製造業者のプロトコールによれば、Ｐｒｅｃｏｔｅｓ（登録商標）は水平型ＩＥＦ装置であるＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に構成する。この装置は、予め循環型水浴（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）を用いて４℃に冷却してから、熱交換効率を上げるため、ＰＲＥＣＯＴＥ  ＩＥＦゲルを軽油でコーティングした電気泳動ベッドに入れた。前記ゲルは、ろ紙の芯を用い、ゲルの両端をＡｎｏｄｅ  Ｆｌｕｉｄ  ｐＨ  ３およびＣａｔｈｏｄｅ  Ｆｌｕｉｄ  ｐＨ  １０  （いずれもＳＥＲＶＡ）で湿らせて電極に接続した。サンプルをローディングする前に、高電源供給（ＬＫＢモデル２１９７）を用いて３０分間、２００ボルトの初期電圧設定および５００ボルトの最終設定で前記ゲルをプレフォーカスした。サンプルとＩＥＦの標準品をローディングした後（５〜１０μＬ、ローディングするタンパク質濃度は５〜１０μｇ）、等電点電気泳動法は５００〜２０００ボルトで２時間、または最終電圧の２０００ボルトに達するまで行い、この後さらに１５分間電気泳動を続けた。ＩＥＦの後、ＳＥＲＶＡマニュアルのプロトコールに従い、前記ゲルを２０分間２０％トリクロロ酢酸２００ｍｌで固定し、脱イオン水２００ｍｌで１分間洗い流し、Ｓｅｒｖａ  Ｖｉｏｌｅｔ  １７溶液で染色し、８６％リン酸で脱染した。使用したＩＥＦ標準タンパク質（ＳＥＲＶＡ製）は以下のとおりであり、それぞれのｐＩ値を括弧に示す：ウマ心臓チトクロムＣ（１０．７）、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（９．５）、レンズマメレクチン（８．３、８．０、７．８）、ウマ筋肉ミオグロビン（７．４、６．９）、ウシ赤血球炭酸脱水酵素（６．０）、牛乳β−ラクトグロビン（５．３、５．２）、大豆トリプシンインヒビター（４．５）、クロカビグルコースオキシダーゼ（４．２）、クロカビアミログルコシダーゼ（３．５）。ヒトインスリンまたは本発明のインスリン類似体のｐＩ値は、前記ＩＥＦ標準品の泳動距離とｐＨ勾配の線形回帰プロットと比較することにより決定した。
配列ＩＤ番号５（ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８置換）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列ＩＤ番号６（ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８，ＧｌｙＡ２１置換） 
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ
配列ＩＤ番号７（ＨｉｓＢ１  Ｂ鎖）
Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００６１】
受容体結合アッセイ―相対活性は、野生型および変異型ホルモン―受容体複合体に関する解離定数の比として定義する。データは非特異的結合（１ｍＭヒトインスリン存在下、関連する膜に残った放射能量）について補正した。すべてのアッセイについて、競合するリガンドがない状態で結合したトレーサーの割合は、リガンドを枯渇させた人工物を回避するため、１５％未満とした。単離したインスリンハロ受容体（イソ型Ｂ）に対するインスリン類似体の相対的親和性は、当該分野で周知のマイクロタイタープレート抗体捕獲法により検討した。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）は、ＡＵ５  ＩｇＧ（リン酸緩衝生理食塩水中、４０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）を用いて４℃で一晩インキュベートした。結合データは２部位連続モデルにより分析した。ＩＧＦ  Ｉ型受容体を用いた対応するマイクロタイタープレート抗体アッセイを利用し、この相同的受容体への交差結合を評価した。
【００６２】
齧歯類のアッセイ―オスＬｅｗｉｓラット（平均体重約３００ｇ）は、ストレプトゾトシンにより糖尿病にした。皮下注射後の血糖濃度に対するインスリン類似体の作用は、臨床用血糖測定器（Ｈｙｐｏｇｕａｒｄ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメーター）を用い、野生型インスリンまたは緩衝液のみ（グリセリン１６ｍｇ、メタクレゾール１．６ｍｇ、フェノール０．６５ｍｇ、およびリン酸ナトリウム３．８ｍｇ（ｐＨ７．４）；Ｌｉｌｌｙ希釈剤）との関連で評価した。野生型インスリンおよび［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンは、上述の緩衝液において無亜鉛で作られた。また、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンおよびインスリングラルギンは、５．２：１の比のＺｎＣｌ２：インスリン単量体、２５ｍＭメタクレゾール、および１８５ｍＭグリセロールを含む希釈ＨＣ（ｐＨ４）に溶解した。ラットには、ラット１匹（野生型インスリンでは、これは２ＩＵ／ｋｇ体重に相当）につき３．４４ｎｍｏｌｅｓのインスリンまたはインスリン類似体（約１２〜１３．７ｎｍｏｌｅｓ）を用い、１００μｌの緩衝液中、時間ｔ＝０で皮下注射した。中性の無亜鉛製剤については、時間０および９０分まで１０分ごとにクリップを止めた尾の先端から採血した。酸性亜鉛製剤については、時間０、１、２、４、６、１０．８、および２４時間で採血した。
【００６３】
［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの結晶構造は以下に説明するとおり決定し、１六量体あたりの亜鉛イオン数を計測、視覚化し、Ａ４およびＡ８の位置での１組のヒスチジン置換が結晶格子中で六量体間の界面亜鉛イオンを結合させるか否かを検討した。亜鉛イオンおよびフェノール存在下、結晶を増殖させ、Ｔ３Ｒｆ３六量体を生成した。前記構造は解像度１．９Åで分子置換により得られた（表３）。類似体の六量体会合様式（図２ｄ）は、野生型インスリン（図２ｃ）と同一である。ＴおよびＲｆプロトマーのそれぞれの立体配座は、野生型インスリンと基本的に同一である。提案された受容体結合表面では、摂動の伝達は起こらない。
【００６４】
野生型および変異型六量体は、それぞれ２つの軸上Ｚｎイオンを含み、Ｔ３およびＲｆ３三量体に１つずつ含まれる（図２ｃ、２ｄでは、中心の球が重なっている）。各部位の配位は、三量体が関連したＨｉｓＢ１０側鎖と歪んだ四面体構造を介する（図２ｃ、ｄの六量体の中心の薄灰色）。前記Ｒｆ３三量体では、第４リガンドが塩化物イオンであり、一方Ｔ３三量体では、この部位は（Ｒｆ３三量体よりも露出している）、塩化物イオンまたは結合した水イオンが部分的に占有している。これらの特徴は野生型構造と一致している。同様の条件で成長した野生型結晶でも観察されるとおり、前記Ｒｆ３三量体は３つの結合フェノール分子を含む（図示せず）。したがって、前記Ａ４およびＡ８の置換は、受容体結合に対するインスリン再編成の古典的モデルであるＴＲ転位を阻害しない。
【００６５】
前記変異型Ｔ３Ｒｆ３六量体には、Ｔ状態の表面でさらに３つの三量体関連Ｚｎイオンが含まれる（図２ｂおよび２ｄにおける赤紫色の球）。これらの新規Ｚｎイオンには、界面部位のＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８が部分的に配位している。末梢Ｚｎ結合部位の典型的な電子密度は、歪んだ４面体の位置を定義する（図２ｅ）。配位は塩化物イオン、および隣接する六量体のＲｆプロトマーに属する「ステープル」ＨｉｓＡ４側鎖によって完了する（図２ｅの標識Ａ４’および図３ｂの茶色矢印）。隣接する六量体の相対するＴおよびＲｆ面の図は、図３ｃに示している（図３ｂに示した方向から９０°回転）。前記塩化物イオンの結合は、Ｒｆプロモーターに結合した３つの水分子（図３ｄの立体ペアの小さな球）のネットワークによっても安定化し、ＲｆのＨｉｓＡ８は亜鉛結合部位から移動している。そのため、３つの非古典的Ｚｎイオンは格子中の隣接する六量体のＴ３およびＲｆ３三量体を結合し（大きな球、図３ｂおよびｄ）、一部は野生型の界面で通常結合する水分子を移動する（図３ａの小さな球）。Ｎ−Ｚｎ２＋の結合距離および角度は、軸上金属イオン結合部位と同様である。ＨｉｓＡ４およびＨｉｓＡ８の側鎖の立体配座はＴプロトマーとＲｆプロトマーでは異なる。
【００６６】
ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒへのホルモンの結合研究は、相対的親和性および受容体結合の選択性を評価するために行われた（図３ｅおよび表２）。リガンドは無亜鉛単量体として特徴付けられた。ヒトインスリンのＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲへの結合と比較し（それぞれ、図３ｅの×印でデータポイントを記した実線と点線）、インスリングラルギン（四角印でデータポイントを記した実線と点線）は、ＩＲへの親和性が２倍低下し、ＩＧＦ−１Ｒへの親和性が３倍上昇していることが示される。一方、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンはＩＲに対して天然型同様の親和性を示したが（図３ｅの逆三角印の実線）、ＩＧＦ−１Ｒへの親和性は６倍低下した（逆三角印の点線、右へシフトしている）。そのため、インスリングラルギンの受容体結合選択性は約６倍低下しているが、［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンは７．５（±２．５）倍上昇している。これは、インスリングラルギンと比較し、少なくとも３０倍改善したことを示している。
【００６７】
［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの力価および作用持続時間は、インスリングラルギンと比較し、ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットで検討した（図３ｆ）。齧歯類における長時間作用型インスリン類似体による血糖管理（５〜１０時間）はヒト（１８〜２４時間）よりも短く、これはおそらく皮下デポー剤のサイズが小さいためである。［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンおよびインスリングラルギンは、（ランタス（登録商標）同様）希釈ＨＣｌ（ｐＨ  ４．０）に溶解し、Ｚｎ２＋：インスリンのモル比は５．２：１であった。血糖管理の時間経過および範囲は２つの類似体を注射した場合で同様であった（図３ｆの点線および点線／波線）。速効性の管理は、Ｌｉｌｌｙ希釈液の無亜鉛ヒトインスリンによって提供された（図３ｆでは、約３時間で線が終わっている）。ラットは夜間しか摂食しないため、昼間のインスリン注入の効果は昼間絶食であることの影響を受け、希釈液のみを注入して管理を行った（図３ｆの波線）。無亜鉛中性Ｌｉｌｌｙ希釈液において［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの対照研究も行い、その時間経過は野生型インスリンの管理と同様であった（図示せず）。無亜鉛グラルギンはやや溶けにくいため、中性ｐＨでは検討しなかった。
【００６８】
Ｘ線結晶学−１：１．７の比のＺｎ２＋とタンパク質単量体および３．５：１の比のフェノールとタンパク質単量体存在下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で懸滴蒸気拡散により結晶を成長させた。液滴の構成は、１ｍｌのタンパク質溶液（０．０２Ｍ  ＨＣｌ中８ｍｇ／ｍｌ）と１ｍｌの貯留液（０．３８Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、９％アセトン、４．８３ｍＭフェノール、および０．８ｍＭ酢酸亜鉛、ｐＨ  ８．４）を混合したものであった。各液滴は１ｍｌの貯留液に懸濁した。結晶は室温で２週間後に得られた。データはレーヨンループに取り付けた単一の結晶から収集し、１００゜Ｋに急速冷凍した。バークレー国立研究所において、ＣＣＤ検出装置を用い、シンクロトロン放射で３２．０５〜１．９０Åの反射を測定した。データはＤＴＲＥＫプログラムで処理した。前記結晶は空間群Ｒ３に属し、単位格子のパラメータはａ＝ｂ＝７８．０９Å、ｃ＝３６．４０Å、α＝β＝９０Å、γ＝１２０Åである。前記構造は、ＣＮＳを利用した分子置換により決定した。したがって、天然型ＴＲ二量体を用いてモデルを得た（水分子、亜鉛および塩化物イオンをすべて除いた後のタンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ：ＰＤＢ）の識別コード１ＲＷＥ）。１５．０〜４．０Åの解像度でデータを解析後、回転関数の最適な解の座標を用い、並進関数検索を行った。全体の異方性温度因子およびバルク溶媒の補正により、ＣＮＳを利用した剛体の微調整では、解像度１９．２〜３．０ÅのデータでＲおよびＲｆｒｅｅの値はそれぞれ０．３２５および０．３４４となった。微調整のサイクル間では、２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃマップは解像度３．０Åまでのデータを用いて計算し、亜鉛および塩化物イオンとフェノール分子をプログラムＯにより前記構造に構築した（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ａ．，  Ｖｏｌ．  ４，  ｐｐ．  １１０−１１９  （１９９１））。水分子はＤＤＱプログラムにより計算および確認した（Ｆｏｃｃｏ  Ｖａｎ  Ａｋｋｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｍ  Ｈｏｌ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  １９９９，  Ｄ５５，  ２０６−２１８）。その配置はＰＲＯＣＨＥＣＫにより連続的にモニターし（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐｐ．  ２８３−２９１  （１９９３））、微調整が進むと亜鉛イオンおよび水分子は異なるマップに構築された。（特に、各単量体のＢ鎖Ｎ末端の最初の８残基に関する）ｏｍｉｔ  ｍａｐの計算、さらに微調整はＣＮＳを利用して行い、最大尤度でのねじれ角の動態および共役勾配の微調整を行った。
【００６９】
【表３】
2013520175.tif 000005
【００７０】
前記インスリン類似体のｐＨ依存性の溶解性は、ＤｉＭａｒｃｈｉらの方法の変法により評価した（Ｋｏｈｎ，Ｗ．Ｄ．，Ｍｉｃａｎｏｖｉｃ，Ｒ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｖｉｃｋ，Ａ．Ｍ．，Ｋａｈｌ，Ｓ．Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｓｔｒｉｆｌｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｓｈａｎｇ，Ｊ．，Ｂｅａｌｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ  ＤｉＭａｒｃｈｉ，Ｒ．Ｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２８，９３５−４８（２００７））。手短に言えば、野生型ヒトインスリン、インスリングラルギン、または［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンはｐＨ  ４．０の希釈ＨＣｌを含む緩衝化されていない溶液中、０．６０ｍＭで作成し、溶液の組成は医薬製剤のランタス（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）に採用されているものと同様であり、０．５２ｍＭ  ＺｎＣｌ２、２０ｍｇ／ｍｌの８５％ｖｏｌ／ｖｏｌグリセロール溶液（最終濃度１８５ｍＭ）、および抗菌性保存剤として２．７ｍｇ／ｍｌメタクレゾール（２５ｍＭ）を含んでいた。３つのタンパク質は、それぞれこのｐＨ  ４．０の溶液では０．６０ｍＭを超える溶解性を示す。同一の一定量（１０ｍｌ）を取り除き、様々なｐＨ値（５．０〜９．０の範囲）で緩衝液中に５０倍希釈し、最終容積を５００ｍｌとした。それぞれのｐＨ値を５．０、６．０、７．４、８．０、８．５、および９．０に再調整した。前記希釈液は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１４０ｍＭ  ＮａＣｌで構成され、ｐＨ値は希釈ＨＣｌまたはＮａＯＨで調整した。次に、複数のサンプルを２０回反転させて混合し、微小遠心分離で５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。次に、上清２００ｍｌを各試験管から２回取り除き、分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、２５ｃｍ×０．４６ｃｍ）に注入し、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの溶出勾配をつけた。各ケースにおいて、単一の溶出ピークが観察され、製造業者のソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を用い、積分によりその面積を定量化した。前記野生型インスリンのｐＨ７．４〜９．０での値では、溶解性と関係のない消失をコントロールでき、回復率（％）は典型的には８５〜９０％の範囲であった。ＤｉＭａｒｃｈｉらの結果と一致し、ｐＨ７．４におけるインスリングラルギンの溶解性は１〜２ｍＭであることが分かった。この限定的な溶解性は、亜鉛対類似体のモル比５．２：６（すなわち、六量体１個につき亜鉛５．２個）と２．２：６（六量体１個につき亜鉛２．２個）で同様であり、グラルギン六量体において亜鉛イオンが軸上にあることの役割と一致していた。ｐＨ  ７．４における［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−インスリンの溶解性は、六量体１個につき亜鉛イオン５．２個のモル比で１〜２ｍＭであることも分かった。
【００７１】
本発明の製剤は中間型インスリン類似体を提供し、これにはリスプロインスリン（ヒューマログ（登録商標）のＬｙｓＢ２およびＰｒｏＢ２９も含まれ、亜鉛イオンおよびフェノールとともにｐＨ  ４で透明な溶液として容易に製剤化される。Ａ４およびＡ８の位置にリスプロおよびヒスチジン置換を含むインスリン類似体（ＨｉｓＡ４，Ａ８  ＫＰ−ｉｎｓ）および野生型ヒトインスリン（ＨＩ）の代表的な結合研究は、ヒトインスリン受容体イソ型Ａ（ＨＩＲＡ）、ヒトインスリン受容体イソ型Ｂ（ＨＩＲＡ）、およびインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）との関連で、表４に示している。表４に示したとおり、ＨｉｓＡ４，Ａ８  ＫＰ−ｉｎｓはＨＩＲＡおよびＨＩＲＢに対する親和性がＨＩと同等であるが、ＨＩと比較し、ＩＧＦ−１Ｒに対する親和性は大きく低下している（４倍以上低下）。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
図４は、図３ｆに列挙した条件下での、糖尿病雄ラットの血糖値の時間経過を示している。［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−ＫＰインスリン、リスプロインスリン、およびインスリングラルギンは（ランタス（登録商標）同様）希釈ＨＣｌ（ｐＨ  ４．０）に溶解し、Ｚｎ２＋：インスリンのモル比は５．２：１であった。［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］−ＫＰインスリンの血糖管理の時間経過は、インスリングラルギンは（ランタス（登録商標））よりも短いが、リスプロインスリン（ヒューマログ（登録商標））よりも長く、この製剤が中間型インスリン類似体製剤となることを示している。さらに、ＨｉｓＡ４，Ａ８  ＫＰ−ｉｎｓの結晶は、上述の条件と同様の条件下で得られた。理論に縛られることは望まないが、リスプロ置換の六量体不安定化効果は［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］置換の六量体複合体安定化効果とは異なり、少なくとも部分的に相殺され、中間型類似体になると考えられる。
【００７４】
［ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８］インスリン類似体にはＡｓｐＢ２８などの他の置換も含まれ、他の中間型インスリン類似体製剤が得られることも想定される。タンパク質構造の表面にヒスチジン側鎖など、１組の亜鉛配位アミノ酸側鎖を組み込む方法は、他のタンパク質でも利用され（図５）、インスリン同様、タンパク質六量体などの高次構造を安定化できることも、さらに想定される。より詳しくは、我々は、αへリックスを含むタンパク質における１組のヒスチジン置換によってできた側鎖は、他のポリマーの相補的側鎖と配位し、マルチポリマー複合体を形成することができると予想した。治療に有用なαへリックスを含むタンパク質の例は、エリスロポエチンおよび哺乳類の成長ホルモンである。
【００７５】
前述の開示に基づき、本明細書で提供されるとおりＡ鎖置換の組み合わせを含むインスリン類似体は、インスリン受容体のヒトインスリンに対する親和性を少なくとも２０％保持しながら、亜鉛イオン存在下で製剤化するとインスリン作用の持続時間が長くなり、同時に、Ｉ型ＩＧＦ受容体に対する絶対的および相対的親和性が低下を示すことは、今や明らかであろう。
【００７６】
配列
配列ＩＤ番号１（プロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列ＩＤ番号２（Ａ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列ＩＤ番号３（Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号４（Ａ４およびＡ８に１組のヒスチジン置換）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ
Ｘａａ＝  Ａｓｎ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号５（ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８置換）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列ＩＤ番号６（ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８，ＧｌｙＡ２１置換）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ
配列ＩＤ番号７（ＨｉｓＢ１  Ｂ鎖）
Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号８（リスプロ−Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号９（アスパルト−Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号１０（ＡｓｐＢ１０−Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号１１（ＤＫＰ  Ｂ鎖配列）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
配列ＩＤ番号１２（グラルギンＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
配列ＩＤ番号１３（グラルギンＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ
配列ＩＤ番号１４（ＡｒｇＡ０，ＨｉｓＡ４，ＨｉｓＡ８，ＧｌｙＡ２１置換）
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ  
【図１Ａ】
2013520175.tif 000007
【図１Ｂ】
2013520175.tif 000008
【図１Ｃ】
2013520175.tif 000009
【図１Ｄ】
2013520175.tif 000010
【図１Ｅ】
2013520175.tif 000011
【図１Ｆ】
2013520175.tif 000012
【図２ａ】
2013520175.tif 000013
【図２ｂ】
2013520175.tif 000014
【図２ｃ】
2013520175.tif 000015
【図２ｄ】
2013520175.tif 000016
【図２ｅ】
2013520175.tif 000017
2013520175.tif 000018
【図３Ａ】
2013520175.tif 000019
【図３Ｂ】
2013520175.tif 000020
【図３Ｃ】
2013520175.tif 000021
【図３Ｄ】
2013520175.tif 000022
【図３Ｅ】
2013520175.tif 000023
【図３Ｆ】
2013520175.tif 000024
【図４】
2013520175.tif 000025
【図５】
2013520175.tif 000026
【配列表】
2013520175000001.xml
【国際調査報告】
2013520175.tif 000031
2013520175.tif 000032
2013520175.tif 000033