(57)【要約】  配列および長さが非常に短いものから非常に長いものまで変化するＣＤＲ３を有する抗体を調製し、特定するための構成と方法が提供される。そのＣＤＲ３を有する抗体をコードするライブラリーも提供される。ライブラリーは、既存の核酸ライブラリーを改変することにより提供できる。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、
各Ｘ１〜Ｘ８が、それぞれ独立に、表 ３０１０に示す各位置Ｘ１〜Ｘ８で最も高頻度で発生するアミノ酸により占められ；
残基Ｘ８〜Ｘ１１のいずれか１つが、それぞれ独立に、欠けているか、または表３０１０に示すＸ８と同じ分布を有し；さらに
Ｘ１２〜Ｘ１４が、ヒトＪＨの残基１００〜１０２に対応するライブラリー。
【請求項２】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、
各Ｘ１〜Ｘ８が、それぞれ独立に、表 ３０１０に示す各位置Ｘ１〜Ｘ８で最も高頻度で発生する１１個のアミノ酸により占められ、Ｇｌｙは、他のものより３倍高頻度で発生し、ＡＡＴの２〜１１は同じ頻度であり；
残基Ｘ９〜Ｘ１１のいずれか１つが、それぞれ独立に、欠けているか、または位置Ｘ８で使われるものと同じ分布を有し；さらに
Ｘ１２〜Ｘ１４が、ヒトＪＨの残基１００〜１０２に対応するライブラリー。
【請求項３】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７であり、
Ｘ１〜Ｘ４が、それぞれ独立に、欠けているか、または、表３００８に示すＸ１〜Ｘ４と同じ分布を有し；
Ｘ５〜Ｘ１２の０、１、２、３、４、または５個がそれぞれ独立に欠けているか、または、独立にヒトＤセグメントのＸ５〜Ｘ１２に対応する位置で最も高頻度に発生するアミノ酸により占められ；
Ｘ１３およびＸ１４が、それぞれ独立に、欠けているか、または、表７５のＤＪ  ｆｉｌｌで最も高頻度で発生する５〜１２アミノ酸により占められ、；さらに
Ｘ１５〜Ｘ１７が、ヒトＪＨの残基１００〜１０２に対応するアミノ酸により占められているライブラリー。
【請求項４】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７であり、
Ｘ１〜Ｘ４が、それぞれ独立に、欠けているか、または、表３００８に示すＸ１〜Ｘ４と同じ分布を有し；
Ｘ５〜Ｘ１２の０、１、２、３、４、または５個がそれぞれ独立に欠けているか、または、独立にヒトＤセグメントのＸ５〜Ｘ１２に対応する位置で最も高頻度に発生するアミノ酸により占められ；
Ｘ１３およびＸ１４が、それぞれ独立に、欠けているか、または、表７５のＤＪ  ｆｉｌｌで最も高頻度で発生する５〜１２アミノ酸により占められ、；さらに
Ｘ１５〜Ｘ１７が、ヒトＪＨの残基１００〜１０２に対応するアミノ酸により占められているライブラリー。
【請求項５】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１であり、ここで、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱで、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄの比率は、２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６であり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０であり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖの比率は、１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２であり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）で、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９：＊であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）で、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９：＊であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）で、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９：＊であり；
Ｘ９は、Ｆであり；
Ｘ１０は、Ｄであり；さらに
Ｘ１１は、Ｙであり、長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：２：３：３：２で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項６】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、ここで、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱで、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄの比率は、２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６であり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０であり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖの比率は、１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２であり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）で、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｄ：Ａ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、１７９：９２：８６：７４：７０：６９：５６：５５：４４：４１：３９：＊であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１０は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１２は、Ｆであり；
Ｘ１３は、Ｄであり；さらに
Ｘ１４は、Ｙであり；
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項７】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、ここで、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ：Ｒ：Ｌ、Ｉ、：Ｈ、Ｔ、またはＱで、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄの比率は、２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６であり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０であり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖの比率は、１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２であり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｄ：Ａ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７９：９２：８６：７４：７０：６９：５６：５５：４４：４１：３９であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ（欠失）で、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１０は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１２は、Ｆであり；
Ｘ１３は、Ｄであり；さらに
Ｘ１４は、Ｙであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項８】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｇ３−Ｘ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、ここで、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱで、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９であり；
Ｘ３は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０であり；
Ｘ５は、Ｇであり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９であり；
Ｘ７は、同等の頻度でＲまたは、欠失（Δ）しており；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１０は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊であり；
Ｘ１２は、Ｆであり；
Ｘ１３は、Ｄであり；さらに
Ｘ１４は、Ｙであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項９】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６であり、ここで、
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）で、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊であり；
Ｘ３は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ａ、またはＩで、Ｙ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｈ：Ｐ：Ｓ：Ｌ：Ｎ：Ａ：Ｉの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ４は、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｒ、またはＨで、Ｙ：Ｇ：Ｓ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｅ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｈの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ５は、Ｄであり；
Ｘ６は、Ｓであり；
Ｘ７は、Ｓであり；
Ｘ８は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、またはＮで、Ｇ：Ａ：Ｄ：Ｐ：Ｖ：Ｌ：Ｓ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｎの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ９は、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｄ、Ｇ、Ｎで、Ｙ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ｗ：Ｈ：Ｒ：Ｆ：Ｄ：Ｇ：Ｎの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ１０は、Ｙ、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｇ、Ｗ、Ｈ、Ｄ、Ｖで、Ｙ：Ｓ：Ｐ：Ｌ：Ｒ：Ｆ：Ｇ：Ｗ：Ｈ：Ｄ：Ｖの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ１１は、Ｇであり；
Ｘ１２は、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｐ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｎ：Ｈ：Ｔ：Ｙ：Δの比率は、１８５：１０１：９６：９２：８８：６７：４８：４３：３６：３５：３３：＊であり；
Ｘ１３は、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｔ、またはΔで、Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｐ：Ｓ：Ｎ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｖ：Ｔ：Δの比率は、２０４：１０３：９６：７８：７２：６７：６７：４５：４２：３６：３４：＊であり；
Ｘ１４は、Ｆであり；
Ｘ１５は、Ｄであり；さらに
Ｘ１６は、Ｙであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項１０】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９であり、ここで、
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）で、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊であり；
Ｘ３は、Ｇまたは所定の長さ分布により決まる比率のΔであり；
Ｘ４は、Ｇまたは所定の長さ分布により決まる比率のΔであり；
Ｘ５は、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｒ、またはＨで、Ｙ：Ｇ：Ｓ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｅ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｈの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ６は、Ｄであり；
Ｘ７は、Ｓであり；
Ｘ８は、Ｓであり；
Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、Ｙであり；
Ｘ１１は、Ｙ、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｇ、Ｗ、Ｈ、Ｄ、またはＶで、Ｙ：Ｓ：Ｐ：Ｌ：Ｒ：Ｆ：Ｇ：Ｗ：Ｈ：Ｄ：Ｖの比率は、５０：５：５：５：５：５：５：５：５：５：５であり；
Ｘ１２は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｈ、Ｗ、またはＶで、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｈ：Ｗ：Ｖの比率は、５０：５：５：５：５：５：５：５：５：５：５であり；
Ｘ１３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１５であり；
Ｘ１４は、Ｇまたは所定の長さ分布により決まる比率のΔであり；
Ｘ１５は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１５であり；
Ｘ１６は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１５であり；
Ｘ１７は、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、またはＨで、Ｆ：Ｇ：Ｐ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｔ：Ｎ：Ｈの比率は、５００：１０３：６６：６２：６１：５２：４５：３２：２８：２８：２２であり；
Ｘ１８は、Ｄであり；さらに
Ｘ１９は、Ｙであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：Ｌｅｎ１７：Ｌｅｎ１８：Ｌｅｎ１９：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項１１】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３であり、ここで、
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）で、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ、：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｒ、Ｔ、またはＶで、Ｄ：Ｇ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ｎ：Ａ：Ｈ：Ｆ：Ｒ：Ｔ：Ｖの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ４は、Ｙであり；
Ｘ５は、Ｇであり；
Ｘ６は、Ｄであり；
Ｘ７は、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｄ、またはＥで、Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｓ：Ｈ：Ｇ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｄ：Ｅの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｎ、またはＨで、Ａ：Ｆ：Ｇ：Ｐ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ｔ：Ｎ：Ｈの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ１１は、Ｆであり；
Ｘ１２は、Ｄであり；さらに
Ｘ１３は、Ｉであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項１２】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３であり、ここで：
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔで、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、またはＫで、Ｇ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｗ：Ａ：Ｄ：Ｌ：Ｅ：Ｋの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ４は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、またはＥで、Ｙ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｆ：Ａ：Ｖ：Ｐ：Ｌ：Ｅの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ５は、Ｓであり；
Ｘ６は、Ｓであり；
Ｘ７は、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、またはＬで、Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｄ：Ｎ：Ｐ：Ａ：Ｖ：Ｙ：Ｔ：Ｌの比率は、１０：１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ８は、Ｗであり；
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、またはＴで、Ｙ：Ｓ：Ｇ：Ｄ：Ｐ：Ｒ：Ａ：Ｆ：Ｈ：Ｋ：Ｔの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、もしくはＫで、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｆ：Ａ：Ｄ：Ｋの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１、またはＸ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｋ、もしくはΔで、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｆ：Ａ：Ｄ：Ｋ：Δの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ１１は、Ｆであり；
Ｘ１２は、Ｄであり；さらに
Ｘ１３は、Ｌであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項１３】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７であり、ここで：
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）で、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｌ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｓ：Ｔ：Ｅ：Ｈ：Ｖ：Ｙ：Ａ：Ｌ：Δの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ４は、Ｙ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｐ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ａ、またはＬで、Ｙ：Ｄ：Ｇ：Ｈ：Ｐ：Ｎ：Ｒ：Ｓ：Ｖ：Ａ：Ｌの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ５は、Ｃｙｓであり；
Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷで、Ｓ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷで、Ｇ：Ｓ：Ｄ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷで、Ｇ：Ｔ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ９は、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷで、Ｓ：Ｇ：Ｔ：Ｄ：Ｒ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：であり１；
Ｘ１０は、Ｃｙｓであり；
Ｘ１１は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｎ、またはＫで、Ｙ：Ｆ：Ｗ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｈ：Ａ：Ｌ：Ｎ：Ｋの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
Ｘ１２は、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、またはΔで、Ｓ：Ｇ：Ｔ：Ｒ：Ａ：Ｄ：Ｙ：Ｗ：Ｐ：Ｌ：Ｆ：Δの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ１３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔで、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
Ｘ１５は、Ｆであり；
Ｘ１６は、Ｄであり；さらに
Ｘ１７は、Ｌであり、
長さ（Ｌｅｎ）の分布は、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：Ｌｅｎ１７：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６で、さらに＊は、Δの比率は各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失するという前提の下で所定の長さ分布により求められることを示す、ライブラリー。
【請求項１４】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２であり、ここで、
Ｘ１は、表３０１０、３０２０〜３０２７の位置１に示すいずれかのアミノ酸タイプであり、
Ｘ２は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置２に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ３は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置３に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ４は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置４に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ５は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置５に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ６は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置６に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ７は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置７に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ８は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置８に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ９は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置９に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ１０は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置１０に示すいずれかのＡＡＴであり、
Ｘ１１は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置１１に示すいずれかのＡＡＴであり、さらに
Ｘ１２は、表３０１０または３０２０〜３０２７の位置１２に示すいずれかのＡＡＴであり、アミノ酸Ｘ３〜Ｘ９のいずれかは独立に除外可能である、ライブラリー。
【請求項１５】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが実施例１４または実施例１５に記載のように、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２をコードする多様化ＤＮＡ配列を含むライブラリー。
【請求項１６】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが実施例９または実施例１６に記載のように、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３において多様性を有する軽鎖をコードする多様化ＤＮＡ配列を含むライブラリー。
【請求項１７】
ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、その抗体ファミリーの少なくとも一部の多様性をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーであって、ベクターまたは遺伝子パッケージが請求項１４、１５または１６に記載の多様性をコードする多様化ＤＮＡ配列を含むライブラリー。
【請求項１８】
多様化されたファミリーがＦａｂである請求項１〜１７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１９】
多様化されたファミリーがｓｃＦｖである請求項１〜１８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２０】
多様化されたファミリーがＩｇＧである請求項１〜１９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２１】
Ｆａｂがファージミド上に提示される請求項１４に記載のライブラリー。
【請求項２２】
メンバーが、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２における多様性を含む請求項１〜２１のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２３】
メンバーが、さらにフレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をコードする請求項１〜２２のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２４】
ＦＲ領域１〜４が、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２５】
メンバーが、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１−４をコードする請求項１〜２４のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２６】
メンバーが、３−２３ＨＣフレームワークを含む請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２７】
メンバーが、さらにＬＣ可変領域を含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２８】
ＬＣ可変領域が、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む請求項２３記載のライブラリー。
【請求項２９】
少なくとも１０４、１０５１０６、１０７、１０８、１０９１０１０、１０１１の多様化メンバーを有する請求項１〜２８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項３０】
実施例１３、１４、および１６に記載のように、ｐＭＩＤ５５Ｆ中で構築されたＦａｂのライブラリー。
【請求項３１】
各対の片方の酵素が少なくとも４塩基の５’オーバーハングを生成し、もう一方の酵素が少なくとも４塩基の３’オーバーハングを形成するように、対の制限酵素を有するファージミドベクター中で構築されたＦａｂのライブラリー。
【請求項３２】
対の制限酵素認識部位が、４００〜７００の塩基で隔てられている請求項２７に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年９月１４日出願の米国特許出願番号第６１／２４２、１７２号の優先権を主張する。当該先願の開示（参照により本出願に組み込まれる）は、本出願の開示の一部と見なされる。
【背景技術】
【０００２】
背景
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のファミリーの多様なメンバーを個別に提示し、提示および発現し、または含め、さらに、少なくとも一部のアミノ酸の多様なファミリーをまとめて提示し、または提示および発現し、または含める遺伝子パッケージのライブラリーを調製することは、今日では、当技術分野で普通に行われていることである。多くの通常のライブラリーでは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、抗体（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ（ＶＨおよびＶＬの複合体）、Ｆａｂ（ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬの複合体）、全抗体、またはミニボディ（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３に結合したＶＬに結合したＶＨからなるダイマー））である。それらは、１つまたは複数のヒト抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含むことが多い。
【０００３】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質ライブラリーは、いくつかの方法で製作されている。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９６、ｐｐ．５７−８６（２０００）を参照。１つの方法は、ナイーブまたは免疫した天然のドナーの多様性を取り込むことである。別の方法は、合成による多様性を有するライブラリーを生成することである。第３の方法は、最初の２つの方法を組み合わせることである（Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３、ｐｐ．３４４−８（２００５））。通常は、これらの方法で作られた多様性は、配列の多様性、すなわち、ライブラリーの各メンバーは同じ長さであるが、異なるアミノ酸またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質鎖中で得た位置の多様性を持つことにより、他のファミリーメンバーとは異なるという多様性に限られる。しかし、天然の多様なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、アミノ酸配列のみの多様性に限定されていない。例えば、ヒト抗体は、アミノ酸配列の多様性に限定されず、アミノ酸鎖の長さの点でも多様性がある。
【発明の概要】
【０００４】
要約
抗体では、ＨＣの長さの多様性は、例えば、可変領域の再構成の間に起こる。例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７０、ｐｐ．５８７−９７（１９９７）を参照。可変（Ｖ）遺伝子の連結（Ｊ）遺伝子への結合により、例えば、重鎖抗体配列の約半分のＣＤＲ３中の認識可能な多様性（Ｄ）セグメントを含むことになり、その結果、多様な長さのアミノ酸をコードする領域を生成する。長いＨＣ  ＣＤＲ３を有する抗体では、Ｄセグメントが認められることが多い。表７６に示すように、ＣＤＲ３の長さ中央値は、全体で１１．５、Ｄセグメントの無いＣＤＲで９．５、さらにＤセグメントを有するＣＤＲで１３．８である。また、次記も抗体遺伝子セグメントの結合の間に起こる可能性がある：（ｉ）Ｖ遺伝子の末端で、０からいくつかの塩基の欠失または改変がある；（ｉｉ）Ｄセグメントの５’または３’末端で、０から多くの塩基の除去または改変がある；（ｉｉｉ）多くの非ランダム塩基が、ＶおよびＤの間に（ＶＤ  ｆｉｌｌ）、ＤおよびＪの間に（ＤＪ  ｆｉｌｌ）、またはＶおよびＪの間に（ＶＪ  ｆｉｌｌ）挿入される；および（ｉｖ）Ｊの５’末端が除去またはいくつかの塩基の改変があるように編集される。これらの再構成により、アミノ酸配列および長さに関し多様性のある抗体を生成する。異なる長さのＨＣ  ＣＤＲ３は、異なる形状に折り畳まれ、新規の抗原結合形状を抗体に付与するかことができる。さらに、ＶＤ  ｆｉｌｌおよびＤＪ  ｆｉｌｌ位置に可変長を有することにより、Ｄセグメントは、別の種類の多様性、すなわち、位置の多様性を付与する。ＣＤＲ３の高次構造は、ＣＤＲ３の長さおよび配列の両方に依存する。例えば、長さ８のＨＣ  ＣＤＲ３および任意の配列は、例えば、長さ２２のＣＤＲ３の性質をうまく模倣することはできないことを忘れてはならない。
【０００５】
本開示で示されるように、免疫系は、ＣＤＲ、特に、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、およびＬＣ  ＣＤＲ３の長さの異なる抗体を産生する。好ましい実施形態は、種々の異なるＨＣ  ＣＤＲ３長さを含むライブラリーである。例えば、一実施形態では、抗体の約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または１００％が、Ｄセグメントを含まず、例えば、８、９、１０、および１１の長さが、例えば、Ｌｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：１：２：２：１の比率（例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３ライブラリー＃１バージョン３）のＨＣ  ＣＤＲ３の抗体ライブラリーである。一実施形態では、抗体ライブラリーは、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または１００％のライブラリーメンバーが、Ｄセグメントを含まず、例えば、５、６、７、８、９、１０、および１１、の長さが、例えば、Ｌｅｎ５：Ｌｅｎ６：Ｌｅｎ７：Ｌｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：１：１：１：１：１：１：１または３：２：２：２：１：１：１または１：１：１：２：２：２：３の比率のＨＣ  ＣＤＲ３である。一部の実施形態では、抗体ライブラリーは、抗体の約６０％、５０％、４０％が、Ｄ３−２２．２（例えば、実施例１のライブラリー番号３）の一部であり、さらに、例えば、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：：１０：８：６：５：３の長さ分布であるＨＣ  ＣＤＲ３を有する。異なる標的は、異なる長さ分布を必要とする可能性がある。
【０００６】
アミノ酸配列の多様性のみを含むライブラリーは、従って、ライブラリーが模倣を意図しているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の天然の多様性を反映していない点で不都合がある。さらに、長さの多様性は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの最終的機能に重要である可能性がある。例えば、抗体領域を含むライブラリーに関して、ライブラリー中に配列および長さの両方の多様性がない場合は、ライブラリーの遺伝子パッケージを使って提示した、提示および発現した、またはそれに含まれている多くのペプチド、ポリペプチド、タンパク質は、正しく折り畳まれないか、抗原に対する結合が不都合になる可能性がある。 
【０００７】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提示し、提示および発現し、または含むこのような遺伝子パッケージライブラリーのさらなる不都合は、天然の多様性に基づくメンバーに焦点を合わせておらず、従って、最も機能性がありそうな、少なくとも免疫原性がありそうなメンバーに焦点を合わせていることである。むしろ、ライブラリーでは、通常、各ＣＤＲ位置で可能な限り多くの多様性または多彩性を含むことが試みられる。このことにより、ライブラリー構築が時間のかかる、必要とされる効率を有しないものなる。また、完全な多様性を獲得しようとして生成された大きな数のメンバーは、必要以上に選別を厄介なものする。このことは、ライブラリーの多くのメンバーが機能性ではない、または非特異的に粘着性である場合には特に、当てはまる。
【０００８】
合成ライブラリー構築上の労力に加えて、免疫原性の問題がある。例えば、全ＣＤＲ残基がＴｙｒ（Ｙ）またはＳｅｒ（Ｓ）のライブラリーがある。これらのライブラリーから選択された抗体（Ａｂ）は高親和性および特異性を示すが、全く異常な組成物は自らを免疫原性にする。
【０００９】
本発明は、充分にヒト免疫系由来で有り、また、免疫原性になることが少ないと思われる抗体を生成することに関する。本発明のライブラリーは、Ｖ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ融合体由来の可能な限り多くの残基を保持する。免疫原性のリスクを減らすために、生殖系列からの変化が結合親和性を維持するのに必要か否かを判断するために生殖系列に戻って、フレームワークおよびＣＤＲの両方の各非生殖系列アミノ酸を変えるのは、用意周到である。従って、各可変位置で生殖系列に側へ偏りのあるライブラリーは、不必要な非生殖系列アミノ酸を有する抗体を単離する可能性を減らすであろう。
【００１０】
抗体は、大きなタンパク質で、いろんな形の分解を受けやすい。１つの分解のタイプは、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基（特に、Ａｓｎ−グリシンまたはＧｌｎ−グリシンの形）の脱アミド化およびＡｓｐ残基の異性化である。他のタイプの分解は、メチオニン、システイン、およびトリプトファンの酸化である。ＣＤＲ中の外部のシステインは、抗体の構造に悪影響する望ましくないジスルフィド、または二量体化する、またはシステイニル化または他の成分の付加を受けやすい抗体をもたらす可能性がある。従って、一部の実施形態では、メチオニン、システイン、およびトリプトファンを、ライブラリーの抗体のＣＤＲから除外することができる。他の実施形態では、メチオニンおよびシステインを除外することができる。別のタイプの分化は、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドの開裂である。別のタイプの分解は、Ｎ末端ＧｌｕまたはＧｌｎからピログルタマートの形成である。問題のある配列の発生を最小限にしたライブラリーの提供は、好都合である。
【００１１】
真核細胞中で発現した場合、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）（ＸはＰではない）を含む配列は、多くの場合、Ａｓｎ（Ｎ）残基でグリコシル化される。Ｉｎ大腸菌では、これらの配列は、グリコシル化されず、従って、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を含む配列は、結合物として単離可能であるが、ＩｇＧとしてＣＨＯ細胞中で発現した場合は、グリコシル化のために使用できない。従って、一部の実施形態では、いずれかのＣＤＲ中にＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を含む抗体配列の単離の可能性を最小化、または排除するために、ＮまたはＳの比率を減らしている。あるいは、ＮをＱで置き換え、Ｎ結合型グリコシル化をさせないで、アミド官能性にさせることもできる。一部の実施形態では、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）配列を有するメンバーの割合は、２％、１％、０．５％、０．１％未満、またはＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）は、ライブラリー中に存在しない。
【００１２】
重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含むタンパク質（例えば、抗体、例えば、抗体がヒトの天然に存在する抗体をモデルにしているという意味でのヒト抗体）の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリーが提供される。特定の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、また、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＳｅｒ（Ｓ）リッチであっても、および／または多様化Ｄ領域を含んでも、および／または実際の抗体のＨＣ  ＣＤＲ３の特定の部分で最もよく見られるアミノ酸分布を使用しても、および／または伸張ＪＨ領域を含んでもよい。例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３は、例えば、本明細書の実施例で提供されるように、Ｊｓｔｕｍｐ位置でＴｙｒリッチ（例えば、約２０％、２５％、２８％、３０％、３５％、４０％Ｔｙｒ）および／またはＤセグメントでＴｙｒリッチ（例えば、約１５％、１９％、２０％、２５％Ｔｙｒ）であってもよい。また、このようなＨＣ  ＣＤＲ３を含むライブラリーが提供される。
【００１３】
一部の実施形態では、ライブラリーの各メンバーのＨＣ  ＣＤＲ３は、４〜１６アミノ酸を含む。一部の実施形態では、９および１０の長さを有するＨＣ  ＣＤＲ３は、ライブラリー中で同量であると思われる。一部の実施形態では、ライブラリーのＨＣ  ＣＤＲ３は、ＣＤＲ３長さ中央値９．５を有する。一部の実施形態では、ライブラリーのＨＣ  ＣＤＲは、ＣＤＲ３長さ中央値７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５または８．７５を有する。一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の最初の５〜７、８または９アミノ酸は、許容アミノ酸タイプ（ａｌｌｏｗｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｙｐｅ）（ＡＡＴ）であり、これらは、実際のＶＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の、例えば表３０１０に示す抗体配列の抽出検体）中で、各位置の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４の最も多く発生しているアミノ酸のいずれかである。一部の実施形態では、許容アミノ酸タイプは、実際のＶＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の、例えば表３０１０に示す抗体配列の検体採取）で見られる頻度に比例して許容される。一部の実施形態では、許容アミノ酸は、表３０２０〜表３０２８のいずれかに示す頻度に比例して許容される。一部の実施形態では、Ｊｓｔｕｍｐの長さは、Ｄセグメントを欠くＨＣ  ＣＤＲ３に存在する実際のＨＣ  ＣＤＲ３に見られるＪｓｔｕｍｐをモデルにしている。一部の実施形態では、Ｊｓｔｕｍｐの長さは、１〜９アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｊｓｔｕｍｐが無い。全ての実施形態で、ライブラリーのＦＲ４は、ヒトＪＨ領域から採取される。
【００１４】
一部の実施形態では、例えば、タンパク質分解、等の負の特性に関連しているため、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置（例えば、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐの位置）で５〜１２の最も多く存在するアミノ酸の内の１つのアミノ酸は、許容されない。例えば、アミノ酸（またはアミノ酸の組み合わせ）が、例えば、酸化、脱アミド化、異性化、酵素的開裂、等により分解されるので、ＨＣ  ＣＤＲの位置（例えば、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐの位置）で高頻度に存在するアミノ酸は、ある位置では許容されない。一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置（例えば、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐの位置）で５〜１２の最も多く存在するものの内の１つではないアミノ酸は、例えば、それが有益な特性と関連しているため、許容される。２つの有益な特性は、結合特異性および高親和性である。抗体は、形、疎水性、および／またはチャージに関して抗原と相補的であることにより抗原に結合する。従って、一部の実施形態では、許容アミノ酸は、ＣＤＲの形、疎水性、および／またはチャージを変えないアミノ酸、好ましくは、例えば、任意の位置で、不安定性または反応活性を引き起こさないもの、例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＶａｌ、であってもよい。
【００１５】
一部の態様では、本開示は、対応する位置の実際の抗体で最も高頻度で見られる各多様化位置での５〜１２の許容アミノ酸の間における多様性に制限することによりさらに多くの割合の有用な抗体を収容するライブラリーを特徴とする。一部のケースでは、免疫系は、これらのＡＡＴの一部を他のものよりさらに高頻度で使用する。例えば、１０の位置で多様化を許容するライブラリーでは、各位置での許容アミノ酸の数の２０から１４への低減により、配列の数が３５倍超まで減少する；１０位置での許容アミノ酸タイプの１１への低減により、可能な配列の数が３９５倍まで減少する。除外された多くの配列は、免疫系が結合剤を作りそうになく、従って有益な結合剤になる可能性が少ないものである。一部の実施形態では、許容アミノ酸は、それらが有益な特性を有しているために、１４ＡＡＴから選択される。例えば、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、およびＬｙｓは、不安定性の原因にならず、多くの位置に導入可能である；Ｔｒｐは有用であるが、大きな疎水性を導入し、酸化されうる。他の実施形態では、許容アミノ酸は、それらが負の特性を有しているために、１４ＡＡＴから選択されない。例えば、ＡｓｎおよびＧｌｎは、脱アミド化を介して不安定性につながる可能性がある。さらに、ＭｅｔおよびＣｙｓは、除外できる。他方、トリプトファンは、ＰｈｅまたはＴｙｒよりずっと大きな側鎖を有する。従って、一部の実施形態では、Ｔｒｐは、ライブラリーに許容可能であるが、その位置での許容アミノ酸は、また、受け入れ難い親和性の低下なしにＴｒｐを置換可能な、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであってもよい。他の実施形態では、Ｔｒｐ残基は、ＨＣ  ＦＲ４の最初の位置のＴｒｐ１０３等の抗体の構造に重要であり、従って、例えば、固定する。他の実施形態では、トリプトファンは、負の特性、例えば、不溶性または酸化感受性を有する場合が有り、従って、所与の位置の１４最多頻度出現ＡＡＴ中にある場合は、選択されない。 
【００１６】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらにＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １）を特徴とする。このＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５であり、Ｘ１−Ｘ８は５〜１２の許容アミノ酸を有し、これらは、実際のＶＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中の）中のこれらの位置で最多頻度出現ＡＡＴである。各Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、独立に、欠けていてもよい。一実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表３０１０に示される実際のＶＪ  ｆｉｌｌ中の各位置で最多頻度出現５〜１２アミノ酸である。一部の実施形態では、各位置で最もよく見られる許容アミノ酸は、実際の抗体（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）のその位置で最も多く見られるものである。好ましい実施形態は、（例えば、対応する）ヒトＪＨの残基９４〜１０２（表３に示す）由来のＪｓｔｕｍｐとしてＸ９〜Ｘ１５を有する。好ましい実施形態は、多様化Ｘ１０〜Ｘ１５を有する。各Ｘ１０〜Ｘ１５は、独立に欠けていてもよい。
【００１７】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらにＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーを特徴とする。ここで、ＨＣ  ＣＤＲ３は、４〜１２の長さを有し、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２を有し、各Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９およびＸ１０、は、独立に欠けていてもよい。各位置での許容アミノ酸タイプおよび特性は、ＨＣ  ＣＤＲ３にＤセグメントを有さない抗体中でＡＡＴが出現する頻度を反映した表から取り出した。この表の使用法は、実施例で明らかにされる。
【００１８】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらにＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーを特徴とする。ここで、ＨＣ  ＣＤＲ３は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２を有し、Ｘ１〜Ｘ９は、実際のＶＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）中のこれらの位置で最も多く出現するＡＡＴである５〜１２の許容アミノ酸を有する。各Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、およびＸ１２は、独立に、欠けていてもよい。一部の実施形態では、メンバーは、長さ４〜１２のＨＣ  ＣＤＲ３を有する。一実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表３０１０に示す実際のＶＪ  ｆｉｌｌの各位置で最も多く出現する５〜１２アミノ酸である。一部の実施形態では、許容アミノ酸タイプは、表３０１０に示す比率で存在する。一部の実施形態では、許容アミノ酸タイプは、例えば、表３０２０〜３０２８のいずれかに示す比率で存在する。一部の実施形態では、各位置の最も多く出現する許容アミノ酸は、実際の抗体（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）のその位置で最も多く出現するものである。一部の実施形態では、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２が存在する場合は、その中で、Ｘ１０、Ｘ１１および／またはＸ１２は、（例えば、対応する）ヒトＪＨの残基１０２ａ〜１０２ｃ由来のＪｓｔｕｍｐを有するアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ１０、Ｘ１１および／またはＸ１２のアミノ酸の比率は、実施例１１にあるように、Ｊｓｔｕｍｐ位置を有するＶＪ  ｆｉｌｌ位置の平均値であってもよい。
【００１９】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらにＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ９８）を特徴とする。ここで、ＨＣ  ＣＤＲ３は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１を有し、Ｘ１〜Ｘ８は、実際のＶＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）のこれらの位置で最も多く出現するＡＡＴである５〜１２の許容アミノ酸を有する。各Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１は、独立に欠けていてもよい。一部の実施形態では、メンバーは、４〜１１または５〜１１の長さのＨＣ  ＣＤＲ３を有する。一実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表３０１０に示される実際のＶＪ  ｆｉｌｌの各位置で最も多く出現する５〜１２アミノ酸である。一実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表３０１０に示す比率で存在する。一部の実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表３０２０〜３０２８のいずれかに示す比率で存在する。一部の実施形態では、最も多く見られる各位置の許容アミノ酸は、実際の抗体（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）のその位置で最も多く出現するものである。一部の実施形態では、Ｘ９、Ｘ１０および／またはＸ１１が存在する場合は、その位置のアミノ酸は、（例えば、対応する）ヒトＪＨの残基１０２ａ〜１０２ｃ由来のＪｓｔｕｍｐのアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ９、Ｘ１０および／またはＸ１１のアミノ酸の比率は、実施例１１のように、Ｊｓｔｕｍｐ位置を有するＶＪ  ｆｉｌｌ位置の平均であってもよい。
【００２０】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらにＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ２）を特徴とする。ここで、ＨＣ  ＣＤＲ３は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１を有し、Ｘ１〜Ｘ８は、実際のＶＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）のこれらの位置で最も多く出現するＡＡＴである５〜１２の許容アミノ酸を有する。各Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、独立に、欠けていてもよい。一実施形態では、各位置で最も多く存在するアミノ酸は、表３０１０Ａおよび表３０１０Ｂに示す５〜１２の実際のＶＪ  ｆｉｌｌの各位置で最も多く出現するアミノ酸である。あるいは、表２２１１Ａおよび表２２１１Ｂに示す分布を使うことも可能である。一実施形態では、Ｘ９、Ｘ１０および／またはＸ１１は、（例えば、対応する）ヒトＪＨの残基１００〜１０２由来のＪｓｔｕｍｐのアミノ酸であってもよい。別の実施形態では、Ｘ９、Ｘ１０および／またはＸ１１は、多様化可能である。
【００２１】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらにＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ３）を特徴とする。ここで、ＨＣ  ＣＤＲ３は、ａ）０〜４のＶＤ  ｆｉｌｌのアミノ酸、ｂ）３以上のＤセグメントのアミノ酸の全体または断片、ｃ）０〜４のＤＪ  ｆｉｌｌのアミノ酸、およびｄ）０〜９のＪｓｔｕｍｐのアミノ酸、を含む。一部の実施形態では、０〜４のＶＤ  ｆｉｌｌのアミノ酸は、これらの位置の実際のＶＤ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）で見られる５〜１２ＡＡＴを許容する。一部の実施形態では、各位置で最も多く見られる許容アミノ酸は、実際の抗体（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）のその位置で最も多く出現するものである。一実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表３００８に示す実際のＶＤ  ｆｉｌｌの各位置の５〜１２の最も多く出現するアミノ酸で、それぞれは、独立に、欠けていてもよい。あるいは、各位置の許容アミノ酸は、表２２１２ＡおよびＢの実際のＶＤ  ｆｉｌｌの各位置で５〜１２の最も多く出現するアミノ酸である。一部の実施形態では、ＶＤ  ｆｉｌｌ中の許容アミノ酸は、実際の抗体（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）中で見られる頻度に比例して許容される。一部の実施形態では、ＤセグメントまたはＤセグメントの断片は、実際の抗体で最も多く出現するＤセグメントまたはその断片をモデルにしている。一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリーで使われたＤセグメントの断片は、実際の抗体（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）で最も多く出現する断片をモデルにしている。一部の実施形態では、Ｃｙｓ残基を含むＤセグメントは、固定された（多様化されていない）Ｃｙｓ残基を有する。一部の実施形態では、０〜４ＤＪ  ｆｉｌｌアミノ酸は、実際のＤＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）で見られる５〜１２ＡＡＴであってもよい。一部の実施形態では、ＤＪ  ｆｉｌｌの各位置で最も多く出現する許容アミノ酸は、実際のＤＪ  ｆｉｌｌ（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）で最も多く出現するＡＡＴである。一実施形態では、各位置の許容アミノ酸は、表７５または２２１７に示す実際のＤＪ  ｆｉｌｌの各位置で最も多く出現する５〜１２のＡＡＴであり、または、それぞれは、独立に、欠けていてもよい。一部の実施形態では、ＤＪ  ｆｉｌｌ中で許容されるアミノ酸は、実際のＤＪ  ｆｉｌｌの各位置（例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で）の頻度に比例して許容される。一部の実施形態では、Ｊｓｔｕｍｐアミノ酸は、実際のＪｓｔｕｍｐｓ、例えば、表３００６に示すＪｓｔｕｍｐ、のアミノ酸の出現をモデルにしている。全ての実施形態で、ＦＲ４は、存在する場合は、ＨＣ  ＣＤＲ３中のＪｓｔｕｍｐに対応する。
【００２２】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置（例えば、ＶＤ  ｆｉｌｌ、Ｄセグメント、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐ中）の５〜１２ＡＡＴの１つであるアミノ酸は、例えば、タンパク質分解、等の負の特性に関連するため、許容されない。例えば、ＨＣ  ＣＤＲの位置（例えば、ＶＤ  ｆｉｌｌ、Ｄセグメント、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐ中）で出現頻度の高いアミノ酸は、アミノ酸（またはアミノ酸の組み合わせ）が、例えば、酸化、脱アミド化、異性化、酵素的開裂、等により分解されるために、その位置で許容され得ない。一部の実施形態では、例えば、有益な特性、例えば、本明細書記載の有益な特性に関連するために、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置（例えば、ＶＤ  ｆｉｌｌ、Ｄセグメント、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐ中）の５〜１２の最も多く存在するアミノ酸ではないアミノ酸が許容される。
【００２３】
多様化Ｄ領域は、１つまたは複数のアミノ酸の改変が導入されている（例えば、天然のＤ領域の配列に比べて；例えば、停止コドンは、Ｔｙｒ残基に変更できない）Ｄ領域である。本明細書に、「Ｄ領域」および「Ｄセグメント」は、区別無く使用され、同じことを意味する。
【００２４】
伸張ＪＨ領域は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、ＪＨ領域のフレームワーク配列のアミノ末端（例えば、ＷＧＱ…、で始まる、例えば、ＦＲ４配列のアミノ末端（表３参照））に存在するＪＨ領域である。例えば、ＪＨ１は、伸張ＪＨ領域である。他の例では、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６は、伸張ＪＨ領域である。ゲノムのＣＤＲ３およびＦＲ４の一部になるセグメントは、ＪＨセグメント：ＪＨ１〜ＪＨ６と呼ぶ。これらのセグメントがＶをＣＨ１に連結することから、「Ｊ」は「連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）」を表す。これらのセグメントは通常は、強力に保存されたＴｒｐ１０３−Ｇｌｙ１０４から始まるＦＲ４をもたらす。Ｔｒｐ−Ｇｌｙの前に、ＪＨは、もしあれば、ＣＤＲ３の一部と見なされる４〜９の別のアミノ酸を有する。最も多く見られるＪＨの改変は、５’末端での種々の大きさの切断である。ＣＤＲ３に見つかるが、ＪＨから取り込んで生じたアミノ酸は、本明細書では、「Ｊ  ｓｔｕｍｐ」または「Ｊｓｔｕｍｐ」（両者は同じ）と呼ぶ。すなわち、Ｊｓｔｕｍｐは、ＪＨ遺伝子から来たＣＤＲ３の一部で、ＤＮＡの調査またはアミノ酸配列により特定できる。「Ｊｓｔｕｍｐ」および「伸張Ｊ領域」は、同じものを指し、同じ意味を有する。
【００２５】
ライブラリーのＪｓｔｕｍｐの長さの設計については、表３００６から知ることができる。表３００６は、ＪＨおよびＣＤＲ３中にＤセグメントがあるか無いかでソートした０〜９の長さのＪｓｔｕｍｐを有する多くの抗体を示す。Ｎは、断端の長さである。各エントリーは、定められた長さのＪｓｔｕｍｐを有する抗体がどのくらいあるかを示す。例えば、ＪＨ２に基づくライブラリーが必要な場合、大きな割合（７０４／９６５）のＤセグメントのないケースで完全長の断端が存在することがわかる。他方、ＪＨ１では、多くのケースで、Ｊｓｔｕｍｐは０、１、または２残基である。ＪＨ４−含有Ａｂは、ＦＤＹの断端を有する強い傾向がある。
【００２６】
ＣＤＲ３の解析で、最初にＪｓｔｕｍｐを見付け、それを削除した。残りの部分では、Ｄセグメントを検索した。Ｄセグメントが見つかった場合は、Ｄセグメントの前にある任意のアミノ酸を「ＶＤ  ｆｉｌｌ」として記録する。ＤおよびＪｓｔｕｍｐ（またはＪｓｔｕｍｐが無い場合は、Ｊ）の間の任意のアミノ酸を「ＤＪ  ｆｉｌｌ」と呼ぶ。Ｄセグメントが無い場合は、ＦＲ３およびＪｓｔｕｍｐ（またはＪｓｔｕｍｐが無い場合は、Ｊ）の間のアミノ酸を「ＶＪ  ｆｉｌｌ」または「リードイン（Ｌｅａｄ−ｉｎ）、Ｄなし」と呼ぶ。
【００２７】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含む（例えば、組み込む）ベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ４）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、各Ｘ１〜Ｘ８はそれぞれ、独立に、例えば、本明細書記載の抗体配列の、例えば、抽出検体中で、例えば、表３０１０に示す、Ｘ１〜Ｘ８の各位置で最も多く存在するアミノ酸、で占められる；残基Ｘ８〜Ｘ１１のいずれか１つは、独立に、欠けているか、またはＸ８と同じ分布を有し、例えば、独立に、それぞれＸ８に対応する、例えば、本明細書記載の、例えば、表３０１０に示す、例えば、抗体配列の抽出検体（例えば、天然の抗体配列）の、位置で最も多く存在するアミノ酸により占められ、さらにＸ１２〜Ｘ１４は、例えば、表 ３に示すように、ヒトＪＨの残基１００〜１０２に対応する。一部の実施形態では、メンバーには、フレームワーク領域４（ＦＲ４）が含まれ、ＦＲ４は、同じヒトＪＨに対応する。あるいは、Ｎ、Ｓ、またはＴの割合は、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を含むメンバーの割合を最小化することで減らすことができる。
【００２８】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、抗体ペプチドは、Ｆａｂである。
【００２９】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、抗体ペプチドは、ｓｃＦｖである。
【００３０】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、メンバーには、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２の多様性を含む。
【００３１】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３における多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーには、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の多様性を含む。
【００３２】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ライブラリー中のＨＣ  ＣＤＲ３の長さ分布は、長さ９が１０％、長さ１０が１０％、長さ１１が２０％、長さ１２が３０％、長さ１３が２０％、および長さ１４が１０％である。
【００３３】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、メンバーは、さらに、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【００３４】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域１〜４をコードし、例えば、実施例４３に示すように、ＶＨ３〜６６由来のＣＤＲ１〜３を多様化する。
【００３５】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域１〜４をコードし、実施例４４に示すように、トラスツジマブ（ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）由来のＣＤＲ１〜３を多様化する。
【００３６】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【００３７】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【００３８】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【００３９】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ライブラリーは、多様化ＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【００４０】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【００４１】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【００４２】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、使用したファージは、Ｍ１３由来である。
【００４３】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、抗体断片は、Ｍ１３由来ファージミド上に提示される。
【００４４】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ＨＣは、Ｍ１３のＩＩＩタンパク質に結合される。一部の実施形態では、Ｍ１３のＩＩＩは完全長である。一部の実施形態では、Ｍ１３のＩＩＩは、ＩＩＩｓｔｕｍｐである。
【００４５】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５１０６、１０７、１０８、１０９１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【００４６】
本明細書記載の態様の一部の実施形態では、１つの位置（または位置（複数））に最も多く存在するアミノ酸（またはアミノ酸（複数））に分解が生ずる場合は、そのアミノ酸またはアミノ酸（複数）は、ライブラリーの１つまたは複数のＸ１〜Ｘ１４の位置に存在しないか、または、例えば、実際の抗体（例えば、本明細書記載の、例えば、抗体の抽出検体、）中のアミノ酸出現頻度に比べて、任意の定められた位置でアミノ酸（またはアミノ酸（複数））の出現頻度の比率が減少している。例えば、ＨＣ  ＣＤＲ（例えば、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐ）の位置で最も多く出現するアミノ酸が、例えば、酸化、脱アミド化、異性化、酵素的開裂、等により、アミノ酸（またはアミノ酸の組み合わせ）が、分解するという理由で、その位置で許容されない場合もある。一部の実施形態では、ＨＣＣ  ＤＲ３中の１つの位置（例えば、ＶＪ  ｆｉｌｌおよび／またはＪｓｔｕｍｐ）で５〜１２の最も多く出現するアミノ酸ではないアミノ酸が、例えば、有益な特性、例えば、本明細書記載の有益な特性に関連しているために、許容される。
【００４７】
また、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２の設計、およびＣＤＲに多様性を有するＶＫＩＩＩＡ２７ライブラリーが提供される。特に、ＬＣ  ＣＤＲ１およびＬＣ  ＣＤＲ３における長さの多様性が許容される。本明細書記載のＨＣ  ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３の１つまたは複数の位置での（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または全ての位置での）多様性をさらに有することが可能である。 例えば、ライブラリーは、本明細書記載のように、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３の１つまたは複数の位置での（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの位置での）多様性を有することが可能である。
【００４８】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ５）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７であり、
Ｘ１〜Ｘ４は、それぞれ独立に、欠けているか、またはＸ１〜Ｘ４と同じ分布を有し、例えば、本明細書記載の、例えば、表３００８に示すように、例えば、抗体配列の抽出検体（例えば、天然に存在の抗体配列）中の、例えば、それぞれ独立に、最も多く出現するアミノ酸により占められ、
Ｘ５〜Ｘ１２の２、３、４、５、６、７、または８つは、それぞれ独立に、欠けているか、または独立に、Ｘ５〜Ｘ１２に対応する位置、例えば、本明細書記載のヒトＤセグメントの、例えば、抗体配列の抽出検体（例えば、天然の抗体配列）、で最も多く出現するアミノ酸により占められており、
Ｘ１３およびＸ１４は、それぞれ独立に、欠けているか、または表７５のＤＪｆｉｌｌ中の最も多く出現する５〜１２アミノ酸によって占められて、さらに
Ｘ１５〜Ｘ１７は、例えば、表３に示すような、ヒトＪＨの残基１００〜１０２に対応するアミノ酸により占められる。
【００４９】
一部の実施形態では、Ｘ５〜Ｘ１２は、Ｄ３−２２．２の５〜８アミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｄ３−２２．２の断片は、ＹＹＤＳＳＧＹＹの多様化バージョンである。
【００５０】
一部の実施形態では、Ｘ３およびＸ４は、欠けており、Ｘ１およびＸ２は存在している。
【００５１】
一部の実施形態では、Ｘ１３およびＸ１４は存在している。
【００５２】
一部の実施形態では、Ｘ１３およびＸ１４は、表７５のＰ１およびＰ２位置、例えば、抗体配列の抽出検体（例えば、天然の抗体配列）で、最も多く出現する５〜１２アミノ酸により独立に占められる。一部の実施形態では、Ｘ１３およびＸ１４は、表７５のＰ１およびＰ２位置、例えば、抗体配列の抽出検体（例えば、天然の抗体配列）で最も多く出現する５〜１２アミノ酸により、表７５に示す比率で、独立に占められる。
【００５３】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２の多様性を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、１つの位置（または位置（複数））に最も多く存在するアミノ酸（またはアミノ酸（複数））に分解が生ずる場合は、そのアミノ酸またはアミノ酸（複数）は、ライブラリーの１つまたは複数のＸ１〜Ｘ１４の位置に存在しないか、または、例えば、実際の抗体（例えば、本明細書記載の、例えば、抗体の抽出検体、）中のアミノ酸出現頻度に比べて、任意の定められた位置でアミノ酸（またはアミノ酸（複数））の出現頻度の比率が減少している。
【００５５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３の多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３の多様性を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【００５７】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【００５８】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【００５９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【００６０】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【００６１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【００６３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【００６４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【００６５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５１０６、１０７、１０８、１０９１０１０、１０１１、または３ｘ１０１１の多様なメンバーを有する。
【００６６】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（ライブラリーＰ６５）（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ６）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含みＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１であり：
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱ、を、例えば、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑが２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０の比率で、または（ＯＲＣＢＵ）による比率（他の比率の表現形式も使用可能）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩ、を、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉが１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９（ＯＲＣＢＵ）（０．２１２３：０．１６２１：０．１１３０：０．０９４７：０．０８６８：０．０５５９：０．０５２５：０．０５０２：０．０４００：０．０３３１：０．０３３１：０．０３３１：０．０３３１の比率も同じ）の比率であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤ、を、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄが２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６（ＯＲＣＢＵ）の比率であり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤ、を、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄが２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０（０．２５３０：０．１２４１：０．１０９６：０．０７７１：０．０７５９：０．０７１１：０．０７１１：０．０５６６：０．０５６６：０．０５６６：０．０４８２の比率も同じ）（ＯＲＣＢＵ）の比率であり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶ、を、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖが１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２（ＯＲＣＢＵ）の比率であり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、を、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δが１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９：＊（ＯＲＣＢＵ）の比率であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、を、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δが１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９：＊（ＯＲＣＢＵ）の比率であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、を、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δが１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９：＊（ＯＲＣＢＵ）の比率であり；
Ｘ９はＦであり；
Ｘ１０はＤであり；さらに
Ｘ１１はＹである。
【００６７】
「＊」は、Δの比率が長さの配分で決定されることを示す。さらに、例えば、長さの配分は、Ｌｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：２：３：３：２である。Δの比率は、各欠失可能コドンが同じ頻度で欠失したという規則による所定の長さにより決定される。他の長さ配分も使用可能である。
【００６８】
位置２では、Ｎは、０．０３３１の頻度で発生し、また、位置４でのＳとＴの組み合わせの頻度は０．１８で、従ってＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）は、０．００６の頻度で発生し、これは受入可能である。位置２の割合を減らすことができる。あるいは、ＮをＱで置換可能である。
【００６９】
例えば、表６５０３および６５０４の比率、または表６５０５および６５０６の比率は、一部のメンバーは、Ｘ６〜Ｘ８が欠けており（すなわち、ＣＤＲ３長さ８を有する）、一部のメンバーは、Ｘ７〜Ｘ８が欠けており（すなわち、ＣＤＲ３長さ９を有する）、さらに一部のメンバーは、Ｘ８が欠けている（長さ１０を有する）ことを理解した上でＸ１〜Ｘ８に対して使用可能である。
【表１】
2013504602.tif 000002
【表２】
2013504602.tif 000003
【００７０】
９６〜９８でＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の出現の可能性が０．００４３６で、これは、受入可能である。９６でのＮを減らす、あるいは除去することができる。あるいは、ＮをＱで置換することも可能である。
【表３】
2013504602.tif 000004
【表４】
2013504602.tif 000005
【００７１】
これにより、９６〜９８でＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の出現の可能性が０．００６５となり、受入可能である。９６でのＮの出現の可能性を減らす、あるいは除去することができる。
【００７２】
Δ（デルタ）は、３つの位置で許容され、メンバーは、ｘｘｘ、ｘｘｄ、ｘｄｘ、ｄｘｘ、ｘｄｄ、ｄｘｄ、ｄｄｘ、およびｄｄｄとして表され、ｘは、欠失可能な位置にあるアミノ酸であり、ｄは、欠失があることを意味する。長さ分布がＬｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：２：３：４：５の場合、ｄｄｄのコピーが２つ、ｘｄｄ、ｄｘｄ、およびｄｄｘのコピーが３つ、ｘｘｄ、ｘｄｘ、およびｄｘｘのコピーが４つ、さらにｘｘｘのコピーが５つ必要である。従って、最初の位置でｘを有する数は、（３＋２＊４＋５）＝１６である。最初の位置でｄを有する数は、（２＋３＊２＋４）＝１２である。故に、Δの割合は、１２／（１２＋１６）＝０．４２８となる。１７３．．．３９の合計は８１５である。Δ（デルタ）の割合Ｄは、ｄ／（８１５＋ｄ）＝０．４２８である。従って、Δは６０９．８となる。他の位置でも同じである。異なる長さ分布では、異なる比率のΔ（デルタ）になる。
【００７３】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６よりも大きい。一部の実施形態では、多様性は３Ｅ８である。
【００７４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【００７６】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【００７８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【００７９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【００８０】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【００８１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【００８２】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【００８３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【００８７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【００８８】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ９９）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１であり：
Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、ＴまたはＱ、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｙ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ｒ：Ａ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、表６５０１で提供されるものであり； 
Ｘ２は、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｉ、Ｋ、ＮまたはＱ、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｙ：Ｒ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｉ：Ｋ：Ｎ：Ｑの比率は、表６５０１で提供されるものであり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤ、であり、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄの比率は、表６５０１で提供されるものであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤ、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、表６５０１で提供されるものであり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶ、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖの比率は、表６５０２で提供されるものであり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、表６５０２で提供されるものであり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、表６５０２で提供されるものであり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、であり、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、表６５０２で提供されるものであり；
Ｘ９は、Ｆであり；
Ｘ１０は、Ｄであり；さらに
Ｘ１１は、Ｙである。
【表５】
2013504602.tif 000006
【表６】
2013504602.tif 000007
【００８９】
９６〜９８でのＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の出現可能性は、０．００２２であり、受入可能である。９６でのＮを減らす、または削除することが可能である。あるいは、ＮをＱで置換することも可能である。
【００９０】
Δ（デルタ）は、３つの位置で許容され、メンバーは、ｘｘｘ、ｘｘｄ、ｘｄｘ、ｄｘｘ、ｘｄｄ、ｄｘｄ、ｄｄｘ、およびｄｄｄと表される。ここで、ｘは、欠失可能な位置にアミノ酸があることを、また、ｄは、欠失があることを意味する。長さ分布が、Ｌｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：２：３：４：５である場合は、ｄｄｄの２つのコピー、ｘｄｄ、ｄｘｄ、およびｄｄｘの３つのコピー、ｘｘｄ、ｘｄｘ、およびｄｘｘの４つのコピー、およびｘｘｘの５つのコピーが必要となる。従って、最初の位置でｘを有する数は、（３＋２＊４＋５）＝１６である。最初の位置でｄを有する数は、（２＋３＊２＋４）＝１２である。故に、Δの割合は、１２／（１２＋１６）＝０．４２８となる。１７３．．．３９の合計は８１５である。Δ（デルタ）の割合Ｄは、ｄ／（８１５＋ｄ）＝０．４２８である。従って、Δは６０９．８となる。他の位置でも同じである。異なる長さ分布では、異なる比率のΔ（デルタ）になる。
【００９１】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６よりも大きい。一部の実施形態では、多様性は３Ｅ８である。
【００９２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【００９６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【００９７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【００９８】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【００９９】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０１００】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１０５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０１０６】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １００）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１であり：
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｅ：Ｇ：Ｈ：Ｉ：Ｌ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｉ：Ｋ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｎ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ＹまたはΔ（欠失）、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙ：＊の比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ８は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｆ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ＹまたはΔ（欠失）、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｆ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙ：＊の比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ１０は、例えば、本明細書記載の、例えば、実施例１１にあるように、ＤまたはΔ（欠失）であり；さらに
Ｘ１１は、Ｙである。
【０１０７】
Δ（デルタ）は、２つの位置で許容され、メンバーは、ｘｘｘ、ｘｘｄ、ｘｄｘ、ｄｘｘ、ｘｄｄ、ｄｘｄ、ｄｄｘ、およびｄｄｄと表される。ここで、ｘは、欠失可能な位置にアミノ酸があることを、また、ｄは、欠失があることを意味する。長さ分布が、Ｌｅｎ８：Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：：２：３：４：５である場合は、ｄｄｄの２つのコピー、ｘｄｄ、ｄｘｄ、およびｄｄｘの３つのコピー、ｘｘｄ、ｘｄｘ、およびｄｘｘの４つのコピー、およびｘｘｘの５つのコピーが必要となる。従って、最初の位置でｘを有する数は、（３＋２＊４＋５）＝１６である。最初の位置でｄを有する数は、（２＋３＊２＋４）＝１２である。故に、Δの割合は、１２／（１２＋１６）＝０．４２８となる。１７３．．．３９の合計は８１５である。Δ（デルタ）の割合Ｄは、ｄ／（８１５＋ｄ）＝０．４２８である。従って、Δは６０９．８となる。他の位置でも同じである。異なる長さ分布では、異なる比率のΔ（デルタ）になる。
【０１０８】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６よりも大きい。一部の実施形態では、多様性は３Ｅ８である。
【０１０９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０１１３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１１４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１１５】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０１１６】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０１１７】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１２２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０１２３】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０１）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８であり：
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｅ：Ｇ：Ｈ：Ｉ：Ｌ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｉ：Ｋ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｎ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙ：＊の比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｆ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、Ａ：Ｄ：Ｆ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ８は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、で、例えば、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率である。
【０１２４】
Δ（デルタ）は、２つの位置で許容され、メンバーは、ｘｘｘ、ｘｘｄ、ｘｄｘ、ｄｘｘ、ｘｄｄ、ｄｘｄ、ｄｄｘ、およびｄｄｄと表される。ここで、ｘは、欠失可能な位置にアミノ酸があることを、また、ｄは、欠失があることを意味する。長さ分布が、Ｌｅｎ６：Ｌｅｎ７：Ｌｅｎ８：：２：３：４である場合は、ｄｄｄの２つのコピー、ｘｄｄ、ｄｘｄ、およびｄｄｘの３つのコピー、ｘｘｄ、ｘｄｘ、およびｄｘｘの４つのコピーが必要となる。従って、最初の位置でｘを有する数は、（３＋２＊４＋５）＝１６である。最初の位置でｄを有する数は、（２＋３＊２＋４）＝１２である。故に、Δの割合は、１２／（１２＋１６）＝０．４２８となる。１７３．．．３９の合計は８１５である。Δ（デルタ）の割合Ｄは、ｄ／（８１５＋ｄ）＝０．４２８である。従って、Δは６０９．８となる。他の位置でも同じである。異なる長さ分布では、異なる比率のΔ（デルタ）になる。
【０１２５】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６よりも大きい。一部の実施形態では、多様性は３Ｅ８である。
【０１２６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０１３０】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１３１】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１３２】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０１３３】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０１３４】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１３９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０１４０】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０２）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５であり：
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ、例えば、Ａ：Ｄ：Ｅ：Ｇ：Ｈ：Ｉ：Ｌ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｉ：Ｋ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｎ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率であり；
Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ、例えば、Ａ：Ｄ：Ｇ：Ｌ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｖ：Ｗ：Ｙの比率は、本明細書記載の、例えば、実施例１１にある比率である。
【０１４１】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６よりも大きい。一部の実施形態では、多様性は３Ｅ８である。
【０１４２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０１４６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１４７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１４８】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０１４９】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０１５０】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１５５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０１５６】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ７）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱ、で、例えば、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄの比率は、２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖの比率は、１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｄ：Ａ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δの比率は、１７９：９２：８６：７４：７０：６９：５６：５５：４４：４１：３９：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ９は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１０は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１１は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１２は、Ｆであり；
Ｘ１３は、Ｄであり；さらに
Ｘ１４は、Ｙであり；
さらに、例えば、長さ分布は、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６である。長さ分布に従って各位置でのデルタの割合が決まるが、この場合、各欠失可能位置で同じ確率で欠失するという条件下で、デルタが許容される。一部の実施形態では、ｎ１〜ｎ６は全て１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１、ｎ２＝２、ｎ３＝４、ｎ４＝８、ｎ５＝８、およびｎ６＝１６である。
【０１５７】
あるいは、アミノ酸は、表６５１１Ａ、６５１１Ｂ、および６５１１Ｃに示す比率で使用可能である。ＨＣ  ＣＤＲ３の各位置に対し、３列：アミノ酸のタイプ、混合物がその位置のＡＡＴとなる場合の割合、および最小ＡＡＴに対するそのＡＡＴの比率（最小ＡＴＴを１とした場合の比率）が示されている。
【表７】
2013504602.tif 000008
【表８】
2013504602.tif 000009
【表９】
2013504602.tif 000010
【０１５８】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ４に同じである。
【０１５９】
一部の実施形態では、多様性は５Ｅ８である。
【０１６０】
一部の実施形態では、多様性は、２Ｅ９である。
【０１６１】
一部の実施形態では、多様性は、６Ｅ１０である。
【０１６２】
一部の実施形態では、Ｘ１１は、欠けている。
【０１６３】
一部の実施形態では、Ｘ１０およびＸ１１は欠けている。
【０１６４】
一部の実施形態では、Ｇｌｙ残基がＸ１１の後ろに挿入されている。
【０１６５】
一部の実施形態では、Ｇｌｙ−ＧｌｙがＸ１１の後ろに挿入されている。
【０１６６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０１６７】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０１７０】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１７１】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１７２】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０１７３】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０１７４】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１７９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０１８０】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ８）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱ、で、例えば、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄの比率は、２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖの比率は、１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｄ：Ａ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７９：９２：８６：７４：７０：６９：５６：５５：４４：４１：３９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ、で、例えば、ｉＧ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１０は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１２は、Ｆであり；
Ｘ１３は、Ｄであり；さらに
Ｘ１４は、Ｙである。
【０１８１】
長さの比率を、Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１、ｎ２＝２、ｎ３＝４、ｎ４＝２、ｎ５＝１である。長さ分布に従って各位置でのデルタの割合が決まるが、この場合、各欠失可能位置で同じ確率で欠失するという条件下で、Δが許容される。長さ分布が１：２：４：２：１の場合は、ｘｘｘｘ（ｘはアミノ酸）のコピーが１つ、ｘｘｘｄ、ｘｘｄｘ、ｘｄｘｘ、ｄｘｘｘ（ｄは欠失）のコピーが２つ、ｘｘｄｄ、ｘｄｘｄ、ｘｄｄｘ、ｄｘｘｄ、ｄｘｄｘ、およびｄｄｘｘのコピーが４つ、ｘｄｄｄ、ｄｘｄｄ、ｄｄｘｄ、およびｄｄｄｘのコピーが２つ、さらにｄｄｄｄのコピーが１つ、必要である。位置１でｘを含む変種は、（１＋２＊３＋４＊３＋２＊１）＝２１である。１位置１でｄを含む変種は、（２＋４＊３＋２＊３＋１）＝２１である。従って、各欠失可能位置でΔは、２１／（２１＋２１）＝０．５０の割合で存在するはずである。
【０１８２】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ４に同じである。
【０１８３】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６より大きい。一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ８より大きい。
【０１８４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０１８８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１８９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０１９０】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０１９１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０１９２】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１９７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０１９８】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ９）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｇ３−Ｘ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱ、で、例えば、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑの比率は、２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉの比率は、１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄの比率は、２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ５は、Ｇであり；
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖの比率は、１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ７は、同じ頻度でＲまたは欠けて（Δ）おり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δの比率は、１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ９は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１０は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１１は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１２は、Ｆであり；
Ｘ１３は、Ｄであり；さらに
Ｘ１４は、Ｙである。
【０１９９】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝ｎ６＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１、ｎ２＝２、ｎ３＝４、ｎ４＝４、ｎ５＝４、およびｎ６＝４である。ｎ１〜ｎ６の他の値も使用可能である。デルタの比率（デルタが許容される場合）は、ｎ１〜ｎ６の値と各欠失可能位置で同じ頻度で欠失するという規則に従って決定される。
【０２００】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ４と同じである。
【０２０１】
一部の実施形態では、多様性は５Ｅ８である。
【０２０２】
一部の実施形態では、多様性は９Ｅ８である。
【０２０３】
一部の実施形態では、多様性は２Ｅ９である。
【０２０４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０２０８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２０９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２１０】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０２１１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０２１２】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０２１７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０２１８】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６であり、
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ａ、またはＩ、で、例えば、Ｙ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｈ：Ｐ：Ｓ：Ｌ：Ｎ：Ａ：Ｉの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ４は、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｒ、またはＨ、で、例えば、Ｙ：Ｇ：Ｓ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｅ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｈの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ５は、Ｄであり；
Ｘ６は、Ｓであり；
Ｘ７は、Ｓであり；
Ｘ８は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、またはＮ、で、例えば、Ｇ：Ａ：Ｄ：Ｐ：Ｖ：Ｌ：Ｓ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｎの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ９は、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、で、例えば、Ｙ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ｗ：Ｈ：Ｒ：Ｆ：Ｄ：Ｇ：Ｎの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１０は、Ｙ、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｇ、Ｗ、Ｈ、Ｄ、Ｖ、で、例えば、Ｙ：Ｓ：Ｐ：Ｌ：Ｒ：Ｆ：Ｇ：Ｗ：Ｈ：Ｄ：Ｖの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１１は、Ｇであり；
Ｘ１２は、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｐ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｎ：Ｈ：Ｔ：Ｙ：Δの比率は、１８５：１０１：９６：９２：８８：６７：４８：４３：３６：３５：３３：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１３は、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｔ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｐ：Ｓ：Ｎ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｖ：Ｔ：Δの比率は、２０４：１０３：９６：７８：７２：６７：６７：４５：４２：３６：３４：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１４は、Ｆであり；
Ｘ１５は、Ｄであり；さらに
Ｘ１６は、Ｙである。
【０２１９】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝４、ｎ２＝４、ｎ３＝４、ｎ４＝２、ｎ５＝１である。Δの比率は、各欠失可能な位置で同頻度で欠失するという前提の下、長さ分布により求められる。唯一可能なＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）は、Ｘ８〜Ｘ１０の位置であり、その頻度は非常に低く、受入可能である。Ｘ８位置でＮをＱに代えることができる。
【０２２０】
一部の実施形態では、多様性は、３．３Ｅ９である。一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６より大きい。
【０２２１】
一部の実施形態では、多様性は、５Ｅ８より大きい。
【０２２２】
一部の実施形態では、多様性は、２Ｅ９より大きい。
【０２２３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０２２５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０２２７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２２８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２２９】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０２３０】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０２３１】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０２３６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０２３７】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １１）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９であり、
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２ｉｓＧ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｇまたは、所定の長さ分布により定まる比率のΔであり；
Ｘ４は、Ｇまたは、所定の長さ分布により定まる比率のΔであり；
Ｘ５は、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｒ、またはＨ、で、例えば、Ｙ：Ｇ：Ｓ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｅ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｈの比率は、３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ６は、Ｄであり；
Ｘ７は、Ｓであり；
Ｘ８は、Ｓであり；
Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、Ｙであり；
Ｘ１１は、Ｙ、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｇ、Ｗ、Ｈ、Ｄ、またはＶ、で、例えば、Ｙ：Ｓ：Ｐ：Ｌ：Ｒ：Ｆ：Ｇ：Ｗ：Ｈ：Ｄ：Ｖの比率は、５０：５：５：５：５：５：５：５：５：５：５（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１２は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｈ、Ｗ、またはＶ、で、例えば、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｈ：Ｗ：Ｖの比率は、５０：５：５：５：５：５：５：５：５：５：５（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１５（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１４は、Ｇまたは、所定の長さ分布により定まる比率のΔであり；
Ｘ１５は、Ｘ１３に同じであり；
Ｘ１６は、Ｘ１３に同じであり；
Ｘ１７は、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、またはＨ、で、例えば、Ｆ：Ｇ：Ｐ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｔ：Ｎ：Ｈの比率は、５００：１０３：６６：６２：６１：５２：４５：３２：２８：２８：２２（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１８は、Ｄであり；さらに
Ｘ１９は、Ｙである。
【０２３８】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：Ｌｅｎ１７：Ｌｅｎ１８：Ｌｅｎ１９：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１０、ｎ２＝８、ｎ３＝６、ｎ４＝４、およびｎ５＝１である。ｎ１〜ｎ５の他の値も使用可能である。Δが許容される位置でのΔの比率は、各欠失可能位置では、同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。このライブラリーでは、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）は生じない。
【０２３９】
一部の実施形態では、Ｘ１７は、Ｆである。
【０２４０】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、１．Ｅ６より大きい。
【０２４１】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、５Ｅ８である。
【０２４２】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、２Ｅ９である。
【０２４３】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、２．６Ｅ９である。
【０２４４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０２４５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０２４８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２４９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２５０】
一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０２５１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０２５２】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０２５７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０２５８】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １２）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３であり、
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ、：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｒ、Ｔ、またはＶ、で、例えば、Ｄ：Ｇ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ｎ：Ａ：Ｈ：Ｆ：Ｒ：Ｔ：Ｖの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ４は、Ｙであり；
Ｘ５は、Ｇであり；
Ｘ６は、Ｄであり；
Ｘ７は、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｄ、またはＥ、で、例えば、Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｓ：Ｈ：Ｇ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｄ：Ｅの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ９は、Ｘ８と同じであり；
Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｎ、またはＨ、で、例えば、Ａ：Ｆ：Ｇ：Ｐ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ｔ：Ｎ：Ｈの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１１は、Ｆであり；
Ｘ１２は、Ｄであり；さらに
Ｘ１３は、Ｉである。
【０２５９】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１、ｎ２＝３、ｎ３＝６、ｎ４＝６である。ｎ１〜ｎ４の他の値も使用可能である。欠失可能位置でのΔの比率は、各欠失可能位置では同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。
【０２６０】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ３と同じである。
【０２６１】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６よりも大きい。一部の実施形態では、多様性は、３Ｅ７である。
【０２６２】
一部の実施形態では、多様性は、３Ｅ８である。
【０２６３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０２６４】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０２６５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０２６７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２６８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２６９】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０２７０】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０２７１】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０２７２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０２７３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０２７４】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０２７５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０２７６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０２７７】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １３）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３であり：
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ、で、例えば、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ３は、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、またはＫ、で、例えば、Ｇ：Ｐ：Ｒ：Ｓ：Ｔ：Ｗ：Ａ：Ｄ：Ｌ：Ｅ：Ｋの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ４は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、またはＥ、で、例えば、Ｙ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｆ：Ａ：Ｖ：Ｐ：Ｌ：Ｅの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ５は、Ｓであり；
Ｘ６は、Ｓであり；
Ｘ７は、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、またはＬ、で、例えば、Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｄ：Ｎ：Ｐ：Ａ：Ｖ：Ｙ：Ｔ：Ｌの比率は、１０：１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ８は、Ｗであり；
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、またはＴ、で、例えば、Ｙ：Ｓ：Ｇ：Ｄ：Ｐ：Ｒ：Ａ：Ｆ：Ｈ：Ｋ：Ｔの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、またはＫ、で、例えば、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｆ：Ａ：Ｄ：Ｋの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）、またはＸ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｋ、もしくはΔで、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｆ：Ａ：Ｄ：Ｋ：Δの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１１は、Ｆであり；
Ｘ１２は、Ｄであり；さらに
Ｘ１３は、Ｌである。
【０２７８】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１、ｎ２＝２、ｎ３＝４、およびｎ４＝８である。各欠失可能位置でのΔの比率は、各欠失可能位置では同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。
【０２７９】
一部の実施形態では、Ｘ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、またはＫ、で、例えば、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｆ：Ａ：Ｄ：Ｋの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）である。
【０２８０】
一部の実施形態では、Ｘ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｋ、またはΔ、で、例えば、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｆ：Ａ：Ｄ：Ｋ：Δの比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊（ＯＲＣＢＵ）である。
【０２８１】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ２と同じである。
【０２８２】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６より大きい。一部の実施形態では、多様性は、２．３Ｅ７である。
【０２８３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０２８４】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０２８５】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０２８６】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０２８７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２８８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０２８９】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０２９０】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０２９１】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０２９２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０２９３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０２９４】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０２９５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０２９６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０２９７】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリー（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １４）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、ＨＣ  ＣＤＲ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７であり：
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔ（欠失）、で、例えば、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δの比率は、２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ａ：Ｖ：Ｔ：Ｋ：Ｄ：Ｑ：Δの比率は、171:153:107:83:81:51:40:40:34:32:30:* (ORCBU) であり;
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｌ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｐ：Ｓ：Ｔ：Ｅ：Ｈ：Ｖ：Ｙ：Ａ：Ｌ：Δの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ４は、Ｙ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｐ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ａ、またはＬ、で、例えば、Ｙ：Ｄ：Ｇ：Ｈ：Ｐ：Ｎ：Ｒ：Ｓ：Ｖ：Ａ：Ｌの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ５は、Ｃｙｓ；
Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷ、で、例えば、Ｓ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ７は、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷ、で、例えば、Ｇ：Ｓ：Ｄ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷ、で、例えば、Ｇ：Ｔ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ９は、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷ、で、例えば、Ｓ：Ｇ：Ｔ：Ｄ：Ｒ：Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｎ：Ｖ：Ｗの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１０は、Ｃｙｓであり；
Ｘ１１は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｎ、またはＫ、で、例えば、Ｙ：Ｆ：Ｗ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｈ：Ａ：Ｌ：Ｎ：Ｋの比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１２は、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、またはΔ、で、例えば、Ｓ：Ｇ：Ｔ：Ｒ：Ａ：Ｄ：Ｙ：Ｗ：Ｐ：Ｌ：Ｆ：Δｏｆ２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔ、で、例えば、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｉ：Ｙ：Δの比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊（ＯＲＣＢＵ）であり；
Ｘ１４は、Ｘ１３と同じであり；
Ｘ１５は、Ｆであり；
Ｘ１６は、Ｄであり；さらに
Ｘ１７は、Ｌである。
【０２９８】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：Ｌｅｎ１７：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６とする。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝ｎ６＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１０、ｎ２＝１０、ｎ３＝８、ｎ４＝８、ｎ５＝６、およびｎ６＝３である。各欠失可能位置でのΔの比率は、各欠失可能位置では同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。
【０２９９】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ２と同じである。
【０３００】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６より大きい。一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ９である。
【０３０１】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ１０である。
【０３０２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０３０３】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０３０４】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０３０５】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０３０６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０３０７】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０３０８】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０３０９】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０３１０】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０３１１】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０３１２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０３１３】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０３１４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０３１５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０３１６】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様な抗体ファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリーを特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含み、また、ライブラリーのＨＣ  ＣＤＲ３は、本明細書記載のＨＣ  ＣＤＲ３ライブラリーの組み合わせである。例えば、ライブラリーは、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ５、Ｂｉｏｂｌｉｏｔｅｃａ  ６、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ９９、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １００、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０１、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０２、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ７、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ８、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ９、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １１、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １２、Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １３および／またはＢｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １４、由来のＨＣ  ＣＤＲ３を有するメンバーを含む（または、それから構成される）。一実施形態では、ライブラリーのメンバーは、次のライブラリー由来のＨＣ  ＣＤＲ３を有する：Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ５、６および７；Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ６、９９および１００；Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ９９、１００、および１０１；Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １００、１０１および１０２；Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  ７、８および９；Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １０、１１および１２；ならびにＢｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １２、１３および１４。
【０３１７】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、ＦＲ４は、ＪＨ２と同じである。
【０３１８】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ６より大きい。一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ９である。
【０３１９】
一部の実施形態では、多様性は、１．Ｅ１０である。
【０３２０】
一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。一部の実施形態では、メンバーは、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に多様性を含む。
【０３２１】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に多様性を含む。
【０３２２】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＦＲ３領域を含む。
【０３２３】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＦＲ３領域の最後の位置はＬｙｓである。
【０３２４】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０３２５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより調製される。
【０３２６】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０３２７】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０３２８】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０３２９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０３３０】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０３３１】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０３３２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０３３３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０３３４】
一部の態様では、本開示は、本明細書記載のライブラリー、例えば、実施例に記載のライブラリーを特徴とする。
【０３３５】
また、上記ライブラリーの作成および選別方法ならびにこのような選別により得られたＨＣ  ＣＤＲ３および抗体が提供される。これらの方法を実施するための組成物とキットも、また、本明細書で記載される。
【０３３６】
一部の態様では、本開示は、ヒト抗体ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリー（例えば、多様な抗体ファミリー）のメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、さらに、多様なファミリーの少なくとも一部をまとめて提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのフォーカストライブラリー（ｆｏｃｕｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）を特徴とする。ここで、ベクターまたは遺伝子パッケージは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３、例えば、本明細書記載のＨＣ  ＣＤＲ３をコードする多様化ＤＮＡ配列を含む。
【０３３７】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｄ領域（例えば、多様化Ｄ領域）（またはその断片（例えば、３以上のＤ領域、例えば、多様化Ｄ領域、のアミノ酸、））および／またはＪＨ領域（例えば、伸張ＪＨ領域）由来のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、０〜４のＶＤ  ｆｉｌｌ残基、Ｄ領域由来の３〜１０残基、０〜４のＤＪ  ｆｉｌｌ残基、および０〜９のＪｓｔｕｍｐ残基を含む。一部の実施形態では、Ｄ領域由来の３〜１０残基が多様化される。一部の実施形態では、多様性は、Ｄ領域由来のアミノ酸タイプがその位置で最も多く出現するタイプであるように作られる。
【０３３８】
一部の実施形態では、ライブラリー（例えば、そのベクターまたは遺伝子パッケージ）は、Ｄ領域またはＤ領域の断片（例えば、そこで、領域がＪＨ領域に隣接する）を含む。
【０３３９】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＪＨ領域、例えば、伸張ＪＨ領域を含む。他の実施形態では、ＪＨのＦＲ４部分のみが含まれる。
【０３４０】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｄ領域またはＤ領域の断片（例えば、そこで、領域がＪＨ領域に隣接する）由来のアミノ酸を含む。
【０３４１】
一部の実施形態では、Ｄ領域は、Ｄ３−２２．２、Ｄ３−３．２、Ｄ６−１９．１、Ｄ３−１０．２、Ｄ６−１３．１、Ｄ５−１８．３、Ｄ３−１０．１、Ｄ６−１３．２、Ｄ１−２６．３、Ｄ３−１０．１、Ｄ３−１６．２、Ｄ４−１７．２、Ｄ６−１９．２、Ｄ３−１０．３、Ｄ３−９．２、Ｄ５−１２．３、Ｄ２−１５．２、Ｄ６−６．１、Ｄ１−２６．１、Ｄ２−２．２、Ｄ６−６．２、Ｄ２−２．３、Ｄ４−２３．２、Ｄ５−２４．３、Ｄ３−３．３、Ｄ３−３．１、Ｄ１−７．３、およびＤ６−１９．３、からなる群より選択される。
【０３４２】
Ｄセグメント、Ｄセグメントの断片、多様化Ｄセグメント、または多様化Ｄセグメントの断片、を含む一部の実施形態では、ＦＲ３およびＤセグメントまたはその断片の間にＶＤ  ｆｉｌｌがある。Ｄセグメント、Ｄセグメントの断片、多様化Ｄセグメント、または多様化Ｄセグメントの断片、を含む一部の実施形態では、ＦＲ３およびＤセグメントまたはその断片の間にＶＤ  ｆｉｌｌがない。
【０３４３】
Ｄセグメント、Ｄセグメントの断片、多様化Ｄセグメント、または多様化Ｄセグメントの断片、を含む一部の実施形態では、Ｄセグメントまたはその断片およびＪＨ領域の間にＤＪ  ｆｉｌｌがある。Ｄセグメント、Ｄセグメントの断片、多様化Ｄセグメント、または多様化Ｄセグメントの断片、を含む一部の実施形態では、Ｄセグメントまたはその断片およびＪＨ領域の間にＤＪ  ｆｉｌｌがある。
【０３４４】
一実施形態では、ライブラリーは、いくつかのサブライブラリーを含む。例えば、ライブラリーは、次のメンバーを有する、例えば、５Ｘ１０９の多様性のサブライブラリーを含むことができる：
１）例えば、１０９のＬＣ、例えば、多様化ＶＫＩＩＩ  Ａ２７ＬＣ、のプール由来の抽出検体、
２）例えば、１０８のＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のプール由来の抽出検体、ならびに
３）ＦＲ３：：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３：：ＦＲ４を含むＨＣ  ＣＤＲ３多様性（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １５）。ここで、Ｘ１−．．．−Ｘ６は、天然のＶＪ  ｆｉｌｌ領域で観察されるアミノ酸を有することが許容され、Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０は、ＶＪ  ｆｉｌｌ由来か、または欠けており、さらにＸ１１〜Ｘ１３は、ＦＲ４の形成に使われるＪＨのＪｓｔｕｍｐの残基７、８、および９に対応する。この成分は、選択可能な比率の１０、１１、１２、および１３のＣＤＲ３長さを有する。例えば、比率は、１：２：２；２に設定可能である。第２の成分は、ＬＣおよびＨＣ  ＣＤＲ１＆２の同じプールから形成され、一方、ＨＣ  ＣＤＲ３は、（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １６）ＦＲ３：：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６：：ＦＲ４の形を有する。ここで、Ｘ１−Ｘ２は、ＶＤ  ｆｉｌｌ分布から取り込むか、またはそれぞれ独立に、欠けており、Ｘ３−Ｘ１１は、多様化Ｄセグメントであり、Ｘ１２−Ｘ１３は、ＤＪ  ｆｉｌｌ分布から取り込むか、それぞれ欠けており、さらにＸ１４−Ｘ１５−Ｘ１６は、例えば、ＪＨ４のＪｓｔｕｍｐであり、さらにＦＲ４は、ＪＨ４に適合する。第３の成分（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ  １６）は、異なるＤセグメントおよび異なる分布のＶＤおよびＤＪ  ｆｉｌｌ残基を有しうる。
【０３４５】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、ＪＨ領域由来のアミノ酸を含む。ＪＨ領域は、伸張ＪＨ領域であってもよい。一部の実施形態では、伸張ＪＨ領域は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６からなる群より選択される。
【０３４６】
一部の実施形態では、Ｄ領域は、１つまたは複数のシステイン（Ｃｙｓ）残基を含み、一部の実施形態では、１つまたは複数のＣｙｓ残基は一定に保たれる（例えば、改変されない）。
【０３４７】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３（例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３をコードするＤＮＡ）は、ＦＲ３およびＤ領域の間に１つまたは複数のＶＤ  ｆｉｌｌコドンを含み、各ＶＤ  ｆｉｌｌコドンは、それぞれ、ＮＮＫ、ＴＭＹ、ＴＭＴ、またはＴＭＣ（ＳもしくはＹをコードするＴＭＹ、ＴＭＴ、またはＴＭＣ）である。
【０３４８】
一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３（例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３をコードするＤＮＡ）は、Ｄ領域およびＪＨの間に１つまたは複数のフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ）コドンを含み、各フィリングコドンは、それぞれ、ＮＮＫ、ＴＭＹ、ＴＭＴ、またはＴＭＣである。
一部の実施形態では、ライブラリー（例えば、ライブラリーのベクターまたは遺伝子パッケージ）は、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、および／または軽鎖をさらに含み、さらに、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２も多様性を含み、または軽鎖は、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＨＣ  ＣＤＲ２、および／または軽鎖（例えば、カッパまたはラムダ軽鎖）（それぞれ）に多様性を含む。例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３多様性は、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、および／または軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ、ＣＤＲ２、および／またはＬＣ  ＣＤＲ３中の多様性をベースに構築できる（例えば、ライブラリーメンバーはＨＣ  ＣＤＲ３に多様性を含むことができ、また、ＨＣ  ＣＤＲ１および／またはＨＣ  ＣＤＲ２、および／またはＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、および／またはＬＣ  ＣＤＲ３中に多様性を含むことができる）。例えば、軽鎖の多様性は、ＨＣ多様性と同じＤＮＡ分子にコードでき、またはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子にコードできる。
【０３４９】
一部の態様では、本開示は、ライブラリーを多様化する方法を提供し、その方法は、本明細書記載のライブラリーを変異誘発することを含む。
【０３５０】
一部の実施形態では、変異誘発には、エラープローンＰＣＲを含む。
【０３５１】
一部の実施形態では、変異誘発には、ｗｏｂｂｌｉｎｇを含む。
【０３５２】
一部の実施形態では、変異誘発には、ｄｏｂｂｌｉｎｇ（下記で定義）を含む。
【０３５３】
一部の実施形態では、変異誘発により、ＨＣ  ＣＤＲ３当たり、平均で約１〜約１０変異（例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０変異；例えば、塩基の改変）が導入される。
【０３５４】
「Ｗｏｂｂｌｉｎｇ」は、元の配列が尊重されるようにして多様化ＤＮＡを作る方法である。元の配列が、例えば、ＧＣＴと一緒にコードされうるＡｌａを有する場合、混合物（０．７Ｇ、０．１Ａ、０．１Ｔ、０．１Ｃ）を最初の位置に、（０．７Ｃ、０．１Ａ、０．１Ｔ、０．１Ｇ）を第２の位置に、さらに（０．７Ｔ、０．１Ａ、０．１Ｇ、０．１Ｃ）を第３の位置に使用できる。「ドーピング（ｄｏｐｉｎｇ）」の他の比率も使用できる。これにより、Ａｌａを約５０％の確率で出現させ、一方、Ｖ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｐ、およびＳは、約７％の確率で出現する。他のＡＡタイプの出現頻度はもっと低い。
【０３５５】
一部の態様では、本開示は、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１−２レパートリー（例えば、精製レパートリー）を維持し、合成ＨＣ  ＣＤＲ３および／またはＬＣ多様性を構築することに関する。
【０３５６】
一部の実施形態では、本開示は、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより多様化した重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を提示するカセット、例えば、表４００に示すカセットを含むカセット、を提供する。
【０３５７】
一部の態様では、本開示は、生殖系列フレームワーク領域を有する軽鎖のライブラリーを特徴とし、結合部位から離れた残基、または埋め込み側鎖を有する残基が一定になるようにＣＤＲが改変される。一部の実施形態では、可変ＤＮＡ合成方法は、（例えば、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより）生殖系列配列が最も可能性のあるものになるように使われる。
【０３５８】
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示の抗原結合可変領域をコードする多様なメンバーのライブラリーを特徴とする。
【０３５９】
一部の実施形態では、メンバーは、フレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。一部の実施形態では、ＦＲ領域１〜４は、３−２３由来のＦＲ領域１〜４に対応する。
【０３６０】
一部の実施形態では、メンバーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【０３６１】
一部の実施形態では、メンバーは、３−２３ＨＣフレームワークを含む。
【０３６２】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【０３６３】
一部の実施形態では、ライブラリーは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【０３６４】
一部の実施形態では、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ＬＣフレームワークを含む。
【０３６５】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーで、例えば、ファージディスプレイライブラリーである。
【０３６６】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【０３６７】
一部の実施形態では、ＬＣのライブラリーは、種々の長さのＬＣ  ＣＤＲ１を有する。一部の実施形態では、ＬＣのライブラリーは、長さ１１または１２のＬＣ  ＣＤＲ１を有する。一部の実施形態では、ＬＣのライブラリーは、種々の長さのＬＣ  ＣＤＲ２を有する。一部の実施形態では、ＬＣのライブラリーは、長さ７または８のＬＣ  ＣＤＲを有する。一部の実施形態では、ＬＣのライブラリーは、種々の長さのＬＣ  ＣＤＲ３を有する。一部の実施形態では、ＬＣのライブラリーは、長さ７、８、９、または１０のＬＣ  ＣＤＲ３を有する。一部の実施形態では、ＬＣ  ＣＤＲ１およびＬＣ  ＣＤＲ３の長さは、改変される。一部の実施形態では、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３の長さが、改変される。一部の実施形態では、ＬＣ  ＣＤＲの１７の位置が改変され、実際のＬＣで見られるタイプに従って１１のアミノ酸タイプを各改変位置に配置させる。一部の実施形態では、各改変位置で最も可能性のあるアミノ酸タイプは、生殖系列タイプである。
【０３６８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、対の制限酵素を使って構築され、対の内の１つの酵素は、少なくとも４塩基の５’オーバーハングを生成し、もう一方の酵素は、少なくとも４塩基の３’オーバーハングを生成する。
【０３６９】
一部の態様では、本開示は、ライブラリーメンバーを選択する方法を特徴とし、本明細書記載のライブラリーを標的と接触させ、メンバーを前記標的に結合させ、さらに標的に結合したメンバーを回収することを含む。
【０３７０】
これらの本発明の実施形態、他の実施形態、およびその特徴および特性は、以降の説明、図および請求項から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０３７１】
詳細な説明
抗体（「Ａｂ」）は、特定の標的に対するＡｂの親和性および特異性を決定に関与する領域にその多様性を集中させる。これらの領域は、配列および／または長さに関して多様化することができる。通常、それらは両方向で多様である。しかし、ヒト抗体ファミリー内では、配列および長さ両方における多様性は、真にランダムではない。むしろ、ＣＤＲの特定の位置では、一部のアミノ酸残基が優先され、あるＣＤＲ長さが優先される。これらの優先を伴う多様性により、抗体ファミリーの天然の多様性が説明される。
【０３７２】
本発明の実施形態により、および下記でさらに十分に説明されるように、約３〜約３５アミノ酸長さの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含む多様なヒト抗体ファミリーメンバーをコードするベクターおよび遺伝子パッケージのライブラリーを調製し使用することができる。特定の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、また、ＹおよびＳがリッチでありおよび／または多様化Ｄ領域を含みうる。また、このようなＨＣ  ＣＤＲ３を含むフォーカストライブラリーが提供される。
【０３７３】
免疫細胞が抗体重鎖を構築する場合、ＶセグメントをＤセグメントに連結し、ＤセグメントをＪセグメントに連結する。Ｄセグメントは、任意選択であり、ヒトＡｂの約５０％が認識可能なＤセグメントを有する。細胞は、接合部位（Ｖ−対−Ｄ、Ｄ−対−Ｊ、またはＶ−対−Ｊ）で多くの塩基の削除および付加の両方の編集を行うことができるが、完全にランダムというわけではない。最初に、再構成された抗体は、細胞の表面に提示され、抗原（Ａｇ）に結合すると、細胞は刺激され、体細胞変異を行って親和性を改善する。特定の場所が、持続性Ａｇに対するより優れた結合剤の探索に際し、特定の一連の変異に充分耐えられるようにコードされたホットスポットが、免疫グロブリン生殖系列遺伝子中に存在する。元来、一部の変異は、フレームワーク位置にあるが、ほとんどは、相補性決定領域（ＣＤＲ）中にある。高度の配列多様性のみならず、長さ多様性も示すことから、特に興味深いのは重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３である。ＣＤＲがランダムＤＮＡで置換された抗体（Ａｂ）ライブラリーを構築し、有用なＡｂが得られている。しかし、一部の治療用Ａｂは、大きな抗原性を示す。ヒト生殖系列にさらに近いＡｂは、抗原性が少なくなる可能性がある。
【０３７４】
定義
Ｄ領域によりコードされたアミノ酸配列およびその使用頻度を表２０に示す。Ｄ領域遺伝子は、「Ｄ３−３」等の名前が付けられている。これらは、３つの順方向の読み枠のいずれかで使用できる。アミノ酸配列は、「Ｄ３−３．２」または「Ｄ３−３（２）」等の名称が付けられている（２つめの読み枠の使用を示す）。用語の「Ｄ領域」および「Ｄセグメント」は、同義に使用され、ヒト免疫グロブリン遺伝子の多様性領域によりコードされたＤＮＡまたはアミノ酸配列を意味する。
【０３７５】
本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例および添付の請求項に採用した特定の用語を、便宜上、ここで定義する。
【０３７６】
単数形の「a」,「an」,および「the」は、文脈から別義が指示されていない限り、複数の参照を含む。
【０３７７】
用語の「親和性」または「結合親和性」は、見かけの結合定数またはＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、例えば、特定の標的分子に対し少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有しうる。第２の標的に比べ、第１の標的に対する結合タンパク質のより大きい親和性結合は、第２の標的に対するＫＡ（ＫＤの数値）よりも第１の標的に対する結合で大きいＫＡ（または、より小さいＫＤの数値）により示すことができる。このようなケースでは、結合タンパク質は、第２の標的（例えば、第２の高次構造の同じタンパク質またはその模倣体；または第２のタンパク質）に比べ、第１の標的（例えば、第１の高次構造のタンパク質またはその模倣体）に対し特異性がある。結合親和性の差（例えば、特異性または他の比較に対して）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、または１０５倍であってもよい。
【０３７８】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを使って）を含む種々の方法により測定できる。結合親和性を測定するための代表的条件は、トリス緩衝液（ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）を使用するものである。これらの技術は、結合タンパク質（または標的）濃度の関数として、結合しているおよび遊離の結合タンパク質の濃度を測定するために使用可能である。結合している結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、遊離の結合タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度および標的上の結合タンパク質に対する結合部位の濃度と、（Ｎ）を標的分子当たりの結合部位の数として、次の式により、関係付けられる。
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／ＫＡ）＋［Ｆｒｅｅ］）
【０３７９】
例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析のような方法を使って測定した場合のように、親和性の定量的測定値を得るには十分な場合もあるので、ＫＡの正確な測定を行うことがいつでも必要なわけではないが、その測定値はＫＡに比例するため、比較、例えば、より高い親和性の例えば、２倍高い親和性であるかどうかの判定を行い、例えば、機能性アッセイ、例えば、インビトロもしくはインビボアッセイによる活性を使って、親和性の定量的測定値を得たり、あるいは親和性の推定値を得ることができる。
【０３８０】
用語の「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略）を含むことができる。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。重鎖および軽鎖は、それぞれ、ＨＣおよびＬＣと省略もできる。用語の「抗体」は、抗原結合抗体断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅＷｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；２６（３）：６２９−３９．））ならびに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ）の構造的特徴を有しうる。抗体は、任意のソース由来でよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）および霊長類化生物が好ましい。
【０３８１】
ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と命名されたより保存的な領域で区切られた「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と命名された超可変領域に細分割することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に決定されている（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９１）「免疫学的対象タンパク質の配列」、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照、また、ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋも参照）。Ｋａｂａｔ定義が本明細書で使用される。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端側からカルボキシ末端側へ次の順に配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０３８２】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常部の全体または一部を含むことができ、それにより、それぞれ、免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成できる。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合により、相互に連結している。ＩｇＧでは、重鎖定常部は、３つの免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常部は、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常部は、通常、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダのタイプがある。一実施形態では、抗体は、グリコシル化されている。抗体は、抗体依存性細胞障害性および／または補体媒介細胞障害性の機能をもつことができる。
【０３８３】
１つまたは複数の抗体の領域は、ヒトまたは実質上ヒトであってもよい。例えば、１つまたは複数の可変領域は、ヒトまたは実質上ヒトであってもよい。例えば、１つまたは複数のＣＤＲ例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３は、ヒトであってもよい。各軽鎖ＣＤＲは、ヒトであってもよい。ＨＣ  ＣＤＲ３は、ヒトであってもよい。１つまたは複数のフレームワーク領域、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４は、ヒトであってもよい。例えば、Ｆｃ領域は、ヒトであってもよい。一実施形態では、全フレームワーク領域は、ヒト、例えば、ヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを作る造血細胞または非造血細胞由来由来である。一実施形態では、ヒト配列は、例えば、生殖系列核酸によりコードされている生殖系列配列である。一実施形態では、選択Ｆａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、最も類似性のある霊長類生殖系列遺伝子、特にヒト生殖系列遺伝子中の対応する残基のアミノ酸タイプに変換することができる。１つまたは複数の定常部は、ヒトまたは実質上ヒトであってもよい。例えば、免疫グロブリン可変ドメイン、定常部、定数ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ）、または全体抗体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または１００％が、ヒトまたは実質上ヒトであってもよい。
【０３８４】
抗体の全体または一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされうる。代表的ヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常部遺伝子、ならびに多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ＫＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常部遺伝子によりコードされている。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸ｓ）および他の上述の定常部遺伝子の１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸をコード）によりコードされている。ＨＣ  ＣＤＲ３が、約３アミノ酸残基から３５アミノ酸残基超まで変動することにより、ヒトＨＣの長さは、大きく変化する。
【０３８５】
本明細書では、用語の「Ｄセグメント」および「Ｄ領域」は互換的に使用され、同義である。これらの用語は、ＤＮＡおよびアミノ酸の両方を表し、どちらの意味であるかは文脈から明らかであることを理解されたい。
【０３８６】
「ライブラリー」または「ディスプレイライブラリー」は、ヌクレオチドのコレクション、例えば、ＤＮＡ、クローン内配列コレクションを指す；または遺伝的に多様なポリペプチドのコレクションを指し、選択または選別して個別のポリペプチドまたはポリペプチドの混合集団を提供することができる複製可能なディスプレイパッケージとして提示される。
【０３８７】
本明細書で使用される用語の「パッケージ」は、複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージを指し、粒子が表面にポリペプチドを提示している。パッケージは、表面に抗原結合ドメインを提示するバクテリオファージであってもよい。このタイプのパッケージは、ファージ抗体（ｐＡｂ）と呼ばれている。
【０３８８】
「所定の標的」は、開示されているいずれかの方法により、同一性が使用する前に既知である標的分子を指す。
【０３８９】
本明細書で使われる用語の「複製可能なディスプレイパッケージ」は、複製する能力のある粒子を提供する、遺伝情報を有する生物学的粒子を指す。粒子は、表面に少なくともポリペプチドの一部を提示することができる。ポリペプチドは、粒子にネイティブな、および／または人工的に粒子またはその祖先の中に挿入された遺伝情報によりコードされうる。提示ポリペプチドは、特異的結合対、例えば、免疫グロブリン分子、酵素または受容体、等に基づく重鎖または軽鎖ドメイン、のいずれかのメンバーであってもよい。粒子は、例えば、ウイルス、例えば、ｆｄまたはＭ１３等のバクテリオファージであってもよい。粒子は、ファージミドであってもよい。
【０３９０】
用語の「ベクター」は、宿主生物体中で複製可能なＤＮＡ分子を指し、その中へ遺伝子が挿入され、組換えＤＮＡ分子を構築する。「ファージベクター」は、ファージゲノムの改変により得られたベクターであり、バクテリオファージ用の複製起点を含むが、プラスミド用の複製起点は含まない。「ファージミドベクター」は、プラスミドゲノムの改変により得られたベクターであり、バクテリオファージ用の複製起点およびパッケージングシグナル、ならびにプラスミド複製起点を含む。ファージミドを有する細胞がヘルパーファージに感染すると、ヘルパーファージゲノムは、全ての必要な遺伝子を供給し、Ｆ＋大腸菌に感染性であるが、多くの場合、ファージミドゲノムを含む粒子の構築を行わせる。ファージミドは、また、ディスプレイ遺伝子を含み、コードされたＦａｂまたはｓｃＦｖは、粒子上に提示される。ファージミドは、遺伝子および遺伝子によりコードされたタンパク質の間のコネクターとしての役割を果たす。
【０３９１】
オリゴヌクレオチドの考察で、「［ＲＣ］」の表記は、表記のオリゴヌクレオチドの逆相補配列が使用されるべきものであることを示す。
【０３９２】
ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３
重鎖（「ＨＣ」）生殖細胞系列遺伝子（ＧＬＧ）３−２３（ＶＰ−４７としても知られる）は、全ヒトＡｂの約１２％を占め、本発明の好ましい実施形態のフレームワークとして望ましい。しかし、他のよく知られたフレームワーク、例えば、４−３４、３−３０、３−３０．３および４−３０．１、もまた、本発明のフォーカスト多様性の原則から解離することなく使用可能であることは理解されるべきである。
【０３９３】
さらに、ＪＨ４（ＹＦＤＹＷ１０３ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１））は、ネイティブ抗体のＪＨ３より頻繁に出現する。従って、ＪＨ４は、本発明のフォーカストライブラリーにとって好ましい。しかし、ＪＨ３（ＡＦＤＩＷ１０３ＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号２））、ＪＨ６（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷ１０３ＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３））、ＪＨ１、ＪＨ２、またはＪＨ５は、同様に使用可能である。ＪＨ２は、全ての他のヒトＪＨ中のＱＧの代わりに、１０５〜１０６の位置にＲＧを有するといる利点がある。ＪＨ３は、Ｍ１０８の欠点がある。少なくとも１つの標的に対しＥＬＩＳＡ陽性であった２１、５７８Ａｂコレクションにおいて、我々は、ＤＮＡ配列の分析により８２８ＪＨ１、１、３１１ＪＨ２、５、４７１ＪＨ３ｓ７、９１７ＪＨ４、１、３６０ＪＨ５、および４、７０１ＪＨ６を確認した。ＪＨに２重下線の部分があれば、それはＣＤＲ３の一部であると見なせる。表３で、ＪＨのＦＲ４部分は、一重下線付きとした。
【０３９４】
各アミノ酸が、これらの２１５７８ＡｂのＨＣ  ＣＤＲ３中に出現する頻度を表にまとめ、表７５の全体および％の表記の列に記入した。ここで留意すべきは、最も多く出現するアミノ酸は、Ｔｙｒ（１５．６％）で、その後は順にＧｌｙ（１３．７％）、Ａｓｐ（１２．５％）、Ｓｅｒ（８．２％）、およびＡｒｇ（５．１％）となることである。従って、一実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３に置換するのに好ましいアミノ酸タイプは、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、およびＲである。
【０３９５】
表７５の他の列は、ＣＤＲを次のように解析した場合のアミノ酸の頻度を示す。最初に、正しいＪＨセグメントを決める。ＣＤＲ３の一部がＪＨ由来の場合は、これを「Ｊｓｔｕｍｐ」として取り出す。残りを、Ｄセグメントに関して調査する。ＤセグメントのＤＮＡにマッチングすると、スコアリングアルゴリズムにより、最初のマッチングに対し１ポイントを割り当て、第２のマッチングに対し２ポイントを付加し、第３のマッチングに対し３ポイントを、さらに第４のマッチングおよびその後の全マッチングに対し４ポイントを付加する。ミスマッチが見つかった場合は、次のマッチング時の付加を１ポイントに戻す。９超の連続マッチングが見つかるか、または点数が４１を超えると、Ｄセグメントと特定される。これらの条件で、２１、５７８Ａｂの内の１１、１４９がＤセグメントを有し、１０、４３９が有していなかった。
【０３９６】
Ｄが無い場合は、ＣＤＲ３は、ＶＪ  ｆｉｌｌおよびＪｓｔｕｍｐに分割される。留意すべきは、ＶＪ  ｆｉｌｌ中では、Ｔｙｒリッチではなく、アミノ酸の４．６％を占めるに過ぎないことである。Ｊｓｔｕｍｐでは、Ｔｙｒは高度に濃縮され、アミノ酸の２６．５％を占める。
【０３９７】
Ｄ領域がある場合は、ＣＤＲ３は、ＶＤ  ｆｉｌｌ（おそらく空の）、Ｄ、ＤＪ  ｆｉｌｌ、およびＪｓｔｕｍｐ（おそらく空の）に分割される。Ｔｙｒは、ＤおよびＪｓｔｕｍｐ由来の部分にのみ顕著である。Ｔｙｒは、ＶＤ  ｆｉｌｌおよびＤＪ  ｆｉｌｌ中には、２％未満である。他方では、Ｇｌｙは、Ｊｓｔｕｍｐ以外の全領域で顕著である。
【０３９８】
また、表７５は、Ｃｙｓ（Ｃ）およびＭｅｔ（Ｍ）はまれであることを示す。通常使用されるＪＨ６は、１つのＭを含むとはいえ（表３）、Ｍｅｔは、Ｊｓｔｕｍｐ中では、約５％レベルまで増える。
【０３９９】
天然では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、長さが変動する。ヒトＨＣの約半分は、成分：Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎにより構成され、ＶはＶ遺伝子であり、ｎｚは、基本的にランダムな一連の塩基であり、Ｄは、両末端で高度に編集されることが多いＤセグメントであり、ｎｙは、基本的にランダムな一連の塩基であり、さらにＪＨｎは、５’末端で高度に編集されることが多い６つのＪＨセグメントの１つである。Ｄセグメントは、ＩｇＧの折り畳みを可能とするスペーサーセグメントを提供しているように見える。最大の多様性は、ＶのＤとの、およびＤのＪＨとの接合部に認められる。
【０４００】
Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＳＪ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭ、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ＥＬ、Ｂｕｃｋ  Ｄ、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ｖ２７０：５８７−９７．）は、ヒト免疫系は、複数のＤセグメントおよび組換えＤセグメントを挿入しないことを示した。それにもかかわらず、Ｄセグメントは、ＨＣ  ＣＤＲ３の良好な成分として選択されており、本発明は、Ｄセグメント、Ｄセグメントの断片、多様化Ｄセグメント、および多様化Ｄセグメント断片を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【０４０１】
ヒトＤセグメントは、いくつかの非常に大きな偏りを有する。ヒトＤセグメント中の５２３アミノ酸の分布は、Ｙ７０（１２．６％）、Ｌ６３（１１．４％）、Ｖ５４４（９．７％）、Ｇ５４（９．７％）、Ｉ４３（７．７２％）、Ｔ４２（７．６％）、Ｓ３５（６．３％）、Ｗ２５４．５％）、Ｄ２１（３．８％）、Ａ２２（４．０２％）、Ｒ２０（３．６％）、ＴＡＧ１３（２．３％）、Ｎ１６（２．９％）、Ｑ１３（２．３％）、Ｃ１０（１．８％）、Ｅ１０（１．８％）、Ｆ１０（１．８％）、Ｍ７（１．３％）、ＴＧＡ１０（１．８％）、ＴＡＡ９（１．６％）、Ｐ５（０．９％）、Ｈ２（０．４％）、およびＫ１（０．２％）である。不対Ｃｙｓを有するが、また、ＴＧＡ停止コドンも有し、従ってほとんど使用されないＤ（２−８ＲＦ１）がある。従って、Ｄセグメントは、本来疎水性である。ヒトＨＣ  ＣＤＲ３中のアミノ酸の出現頻度を表７５に示す。この頻度には、類似性と相違点の両方がある。ＨＣ  ＣＤＲ３全体では、Ｔｙｒが最も多く出現し、Ｇｌｙのみが近い位置にある（Ｔｙｒの出現頻度の９６％）。Ａｓｐ（Ｔｙｒの出現頻度の７５％）、Ｓｅｒ（Ｔｙｒの出現頻度の５３％）。全Ｄセグメントを同じとして計算すると、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅは、Ｄセグメント中で比較的よく出現する。免疫系は、Ｄセグメントを均等の頻度では使用しない。表２０は、Ｄセグメントの利用頻度を示す。使用されることが多いＤセグメントは、極めてＴｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐリッチである。Ａｒｇは、使用頻度の高い大抵のＤセグメント中に認められず、また、Ａｒｇは、いずれのＪＨセグメントのＣＤＲ部分にもコードされていない。Ａｒｇは、Ｖ、Ｄ、およびＪ、またはＶおよびＤ、ＤおよびＪ、もしくはＶおよびＪの間のフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）領域中の変異によって顕在化するようになる。この検体では、全アミノ酸の５０％が、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇである。本発明の一実施形態では、「親の」ＨＣ  ＣＤＲ３配列の置換は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、およびＡｒｇからなる一連のアミノ酸に限定される。本発明の一実施形態では、Ａｒｇは、ＶおよびＤの間、ＤおよびＪの間、またはＶおよびＪの間のフィラー領域で出現が多くなる。
【０４０２】
本発明の好ましいライブラリーでは、両タイプのＨＣ  ＣＤＲ３が使用される。特定可能なＤセグメントが無いＨＣ  ＣＤＲ３では、構造は、Ｖ：：ｎｚ：：ＪＨｎ（ｎ＝１、６）であり、ＪＨは、通常、５’末端で編集される。特定可能なＤセグメントを有するＨＣ  ＣＤＲ３では、構造は、Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎである。
【０４０３】
本明細書では、約３〜約３５アミノ酸長さのＨＣ  ＣＤＲ３が提供される。特定の実施形態では、また、ＨＣ  ＣＤＲ３は、ＹおよびＳリッチであってもよく、および／またはＤ領域が存在する場合は、多様化Ｄ領域を含んでもよい。例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３は、約４３％〜約８０％のＹおよび／またはＳ残基を含んでもよく、例えば、残基の約４３％、約４８％、約６９％、約６３％、約７１％、約６２％、約５８％、約６８％、約８０％、約７７％、または約４０％超、もしくは約４０％〜約１００％未満、がＹおよび／またはＳである。例えば、ＣＤＲ３中の残基の全てがＹおよび／またはＳというわけではない。特定の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、伸張ＪＨ領域を含んでもよい。本発明の好ましいライブラリーの代表的ＨＣ  ＣＤＲ３成分の設計は、実施例１、２、および３で提示し、説明する。
【０４０４】
一部の実施形態では、多様性（例えば、ＣＤＲ中の、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域（例えば、ＣＤＲ近傍のまたは隣接したフレームワーク領域、例えば、ＣＤＲ３、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３）が生成され、例えば、ＣＤＲ（例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３）、またはフレームワーク領域（例えば、ＣＤＲ近傍のまたは隣接したフレームワーク領域、例えば、ＣＤＲ３、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ３）当たりにして、平均で約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、または約１〜約１０変異（例えば、塩基変化）を作り出す。一部の実施形態では、変異誘発は、既知の結合界面またはそれと思われる領域を標的とする。さらに、変異誘発は、ＣＤＲ近傍のまたはそれに隣接したフレームワーク領域を対象にすることができる。抗体の場合では、例えば、正確にステップを踏んだ改善を行うために、変異誘発は、また、１つまたは２、３のＣＤＲに限定されうる。同様に、特定されたリガンドが酵素の場合は、変異誘発は、活性部位および近傍に結合可能な抗体を提供可能である。特定の実施形態では、ＣＤＲまたはフレームワーク領域（例えば、本明細書記載のＨＣ  ＣＤＲ３）は、エラープローンＰＣＲに供し、多様性を作り出すこともできる。この手法は、「スロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）」型のＰＣＲを使用し、この方法では、ポリメラーゼは、かなり高いエラー割合（２％まで）で野性型配列を増幅するが、これについては、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ、ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２３４：４９７−５０９およびＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１：１１−１５、に一般的に記載されている。他の代表的変異誘発技術には、ランダム開裂を使ったＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９−３９１；「核酸シャフリング」と命名されている）、ＲＡＣＨＩＴＴ（登録商標）（Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：６４８７−６５０４）、カセット変異導入（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および変性オリゴヌクレオチドの組み込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３：３２４５）が含まれる。
【０４０５】
本発明の一部の実施形態では、残基の半分以上がＳｅｒまたはＴｙｒであるＤセグメントが選択される（例えば、Ｄ１−２６．３、Ｄ２−２．２、Ｄ２−１５．２、Ｄ３−１０．２、またはＤ３−２２．２）。一部の実施形態では、Ｄ領域またはＤ領域の一部をコードするＤＮＡが合成される場合、各ＳｅｒまたはＴｙｒ残基は、コードされたアミノ酸がＳｅｒまたはＴｙｒとなるようにＴＭＴ、ＴＭＣ、またはＴＭＹによりコードされる。一部の実施形態では、Ｄ領域またはＤ領域の断片用の一部または全部のコドンは、Ｄ領域（またはその断片）のアミノ酸が最も可能性の高いコドンとなるように合成されるが、他のアミノ酸も許容される。
【０４０６】
一部の実施形態では、本明細書記載のＨＣ  ＣＤＲ３配列は、構造中の目的のＨＣ  ＣＤＲ３をコードする配列をＫａｎＲ遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子に融合し、カナマイシン耐性を選択することにより、読み取り枠の選択を行うことが可能である。停止コドンまたはフレームシフトを有する潜在的ＣＤＲ３を含む細胞は抗生物質耐性が無く、その配列は除去されることになる。
【０４０７】
抗体配列を解析する方法
抗体配列は、同じ多様性プールを使って構築され、Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ、（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３、ｐｐ．３４４−８（２００５））により記載されているＦＡＢ−３１０およびＦＡＢ−４１０ライブラリーから入手している。約８９標的由来の大きなコレクションが集められた。１つの分析で、アミノ酸配列が調査された。１９、０５１異なるＣＤＲ３配列のセットが見つかり、ＪＨ配列が特定され、Ｊｓｔｕｍｐが除去され、Ｄセグメントが調査され、さらにＶＪ、ＶＤ、Ｄセグメント、およびＤＪ分布が特定された。２つ目の分析で、ＣＤＲ３およびＦＲ４のＤＮＡが調査された。２１、５７８ＣＤＲ３：：Ｆｒ４断片のセットが特定された。差異はサイレント変異によるもので、これは、異なるＤＮＡを有するＡｂに同じＡＡ配列を持たせる。ＤＮＡ分析は、一部の目的にはこちらの方が少しは良い場合もあるが、差は重要でなく、両方の分析とも有効である。１０標的の１つに結合した1,707 Abのサブセットでも非常によく似た結果が得られた。非常に短いＣＤＲ３、および特定のＤセグメントの選択に対しては特に、数をさらに増やして詳細を得た。８〜１０標的に対する５００抗体でさえ、全て別々の結合剤が含まれる場合は特に、非常に類似した状況を与えると思われる。
【０４０８】
ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３ライブラリーおよびヒト抗体重鎖ＣＤＲ３を含むライブラリーの構築方法
抗体ライブラリーは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を有するタンパク質を含むタンパク質のコレクションである。例えば、ラクダ化可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）は、ただ１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質のライブラリーのための足場として使用可能である。別の例では、タンパク質は、対を作ることが可能な２つの可変ドメイン配列、例えば、ＶＨおよびＶＬドメインを含む。抗体ライブラリーは、抗体コード配列を含む、例えば、本明細書で提供されるＨＣ  ＣＤＲ３をコードする配列を含む、核酸ライブラリー（抗体コードライブラリー）から調製可能である。
【０４０９】
ディスプレイライブラリーが使用される場合には、抗体コードライブラリーの各メンバーは、それがコードする抗体と結合することが可能である。ファージディスプレイの場合には、抗体タンパク質は、ファージコートタンパク質と（直接または間接的に）物理的に結合する。典型的な抗体ディスプレイライブラリーメンバーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドを提示する。ディスプレイライブラリーメンバーは、ディスプレイ抗体をＦａｂ断片（例えば、２つのポリペプチド鎖を使って）または単鎖Ｆｖ（例えば、一本のポリペプチド鎖を使って）として提示できる。他の形式も使用可能である。
【０４１０】
Ｆａｂおよび他の形式の場合のように、提示された抗体は、軽鎖および／または重鎖の一部として１つまたは複数の定常部を含むことができる。一実施形態では、各重鎖は、１つの定常部、例えば、Ｆａｂの場合のように、を含む。他の実施形態では、追加の定常部を含む。有用な抗原結合部位を有すると特定された後で分子に１つまたは複数の定常部を付加することも可能である。例えば、米国公開特許２００３−０２２４４０８を参照。
【０４１１】
抗体ライブラリーは、多くのプロセスにより構築可能である（例えば、ｄｅＨａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−８、およびＨｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（３）：３４４−８、を参照）。
【０４１２】
ライブラリー構築の特定の実施形態では、本明細書記載のＣＤＲ３を含む重鎖ならびにカッパおよびラムダ軽鎖は、別々のベクター中で最もうまく構築される。最初、合成遺伝子を設計し、合成可変ドメインのそれぞれを組み込む。軽鎖は、ＡｐａＬＩ（シグナル配列の最末端の位置）またはＳｐｅＩ部位（シグナル配列中の位置）およびＡｓｃＩ（停止コドンの後部位置）の制限酵素部位で結合することができる。重鎖は、ＳｆｉＩ（Ｐｅ１Ｂシグナル配列内の位置）およびＮｏｔＩ（ＣＨ１およびアンカータンパク質の間のリンカー中の位置）の制限酵素部位で結合できる。Ｐｅ１Ｂ以外のシグナル配列、例えば、Ｍ１３ｐＩＩＩシグナル配列、もまた使用可能である。
【０４１３】
初期の遺伝子は、所望のＣＤＲの代わりに「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列として作られる。「スタッファー」は、切り取られ、多様性ＤＮＡにより置換されるが、機能性抗体遺伝子の発現をさせない配列である。例えば、スタッファーは、正確な完成したライブラリーベクター中には無いいくつかの停止コドンおよび制限酵素部位を含むこともできる。スタッファーは、高頻度で出現するいずれか１つのＣＤＲ配列を避けるために使用される。
【０４１４】
本発明の別の実施形態では、重鎖およびカッパまたはラムダ軽鎖は、これらの鎖のクローニングを可能にする適切な制限酵素部位を有する単一ベクターまたは遺伝子パッケージ（例えば、提示用の、または提示し発現用の）中で構築される。このようなベクターを構築するプロセスは、当技術分野でよく知られ、広範に使用されている。重鎖およびカッパ軽鎖ライブラリーならびに重鎖およびラムダ軽鎖ライブラリーは、別々に調製されるのが好ましい。
【０４１５】
提示が、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上で行われるのが最も好ましい。好ましいベクターには、Ｍ１３の全遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、およびディスプレイカセットが含まれる。好ましいベクターは、多様な遺伝子ファミリーのメンバーの導入と除去を可能とする制限酵素部位もカセットとして一緒に提供する。好ましいベクターは、ファージの増幅に使われる増殖条件下の再構成に対し安定である。
【０４１６】
別の好ましい本発明の実施形態では、本発明の方法により獲得される多様性は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提示させ、および／または発現するファージミドベクター（例えば、ｐＭＩＤ２１（表３５に示すＤＮＡ配列））を使って、提示させ、および／または発現させることができる。このようなベクターは、また、他のベクターまたはファージを使ったその後の提示、および／または発現のために、多様性を保存可能である。
【０４１７】
さらに他の実施形態では、軽鎖急速最適化または「ＲＯＬＩＣ」と名付けられた方法は、２００８年２月１３日出願の米国特許出願番号６１／０２８、２６５、２００８年４月１０日出願の米国特許出願番号６１／０４３、９３８、および２００９年２月１３日出願の米国特許出願番号１２／３７１、０００、に記載され、大きな集団のＬＣがファージベクター中に挿入され、それらをファージ上に提示させる。小さな集団（例えば、３、１０、または２５）のＨＣは、大腸菌中に挿入され、ＨＣ、例えば、本明細書記載のＣＤＲ３を有するＨＣ、が周辺質中に分泌される。大腸菌は、次に、大きな集団のＬＣをコードするファージベクターに感染し、ファージ上にＨＣ／ＬＣタンパク質対を産生する。ファージ粒子は、ＬＣ遺伝子のみを保有する。
【０４１８】
別の態様では、重鎖の経済的選択または「ＥＳＣＨ」と名付けられた方法で、これも、２００８年２月１３日出願の米国特許出願番号６１／０２８、２６５、２００８年４月１０日出願の米国特許出願番号６１／０４３、９３８、および２００９年２月１３日出願の米国特許出願番号１２／３７１、０００、に記載され、小さい集団のＬＣを、ベクター中に挿入し、分泌させることができる。新規ＨＣファージライブラリーは、本明細書で提供されるように構築され、ＣＤＲ３を含む。ＬＣおよびＨＣは、次に、ずっと効率的な感染の方法により組み合わせることができる。小さな一連の効率的ＨＣが選択されるとすぐに、これらは、そのまま使用して、ＲＯＬＩＣに供し、最適ＨＣ／ＬＣ対形成を得るか、または古典的選択用のＬＣのＦａｂライブラリー中にクローンを作ることができる。
【０４１９】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法で獲得された多様性は、提示させ、および／または真核細胞中での発現に適したベクター、例えば、酵母細胞中の、例えば、発現用の酵母ベクター、を使って発現させることができる。
【０４２０】
他の型のタンパク質ディスプレイには、細胞ベースディスプレイ（例えば、国際特許ＷＯ０３／０２９、４５６参照）；リボソームディスプレイ（例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２およびＨａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７−９２参照）；タンパク質−核酸融合体（例えば、米国特許第６、２０７、４４６号参照）；および非生物学的タグへの固定化（例えば、米国特許第５、８７４、２１４号参照）が含まれる。
【０４２１】
本開示のライブラリーから単離された抗体を解析して、ＬＣのタイプおよび最も近い生殖系列遺伝子を判定することができる。好ましい実施形態では、非生殖系列フレームワーク残基は、結合親和性および特異性が、受け入れられないほどは悪影響を受けていない限り、生殖系列アミノ酸に戻される。置換は、集団または単体として実行可能である。ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６（５）：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９−８１７、で開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥ総覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫによる編集）。抗体は、結合特性が実質的に保持されている限りにおいて、フレームワーク領域の１つまたは複数の非生殖系列アミノ酸を対応する抗体の生殖系列アミノ酸に戻すことにより、「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｅｄ）」される。類似の方法を定常部、例えば、定数免疫グロブリンドメインで使用することができる。
【０４２２】
例えば、抗体は、例えば、フレームワーク、ＣＤＲ、または定常部中に、１つ、２つ、または３つ以上のアミノ酸置換を含み、参照生殖系列配列に対しさらに類似性を高くすることができる。１つの代表的な生殖系列化方法には、単離抗体の配列に対して類似の（例えば、特定のデータベースで最も類似性の高い）１つまたは複数の生殖系列配列を特定することを含むことができる。次に、変異（アミノ酸レベルでの）は、漸増的にまたは他の変異と組み合わせて、単離抗体中に作られる。例えば、一部または全部の可能な生殖系列変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーが作られる。次に、変異抗体を評価し、例えば、単離抗体に関連し、その時点でも有用な（例えば、機能活性を有する）１つまたは複数の追加の生殖系列残基を有する抗体を特定する。一実施形態では、可能な限り多くの生殖系列残基が単離抗体中に導入される。
【０４２３】
一実施形態では、変異誘発を使って、１つまたは複数の生殖系列残基をフレームワークおよび／または定常部中に置換または挿入する。例えば、生殖系列フレームワークおよび／または定常部残基は、改変される非可変領域に対し類似の（例えば、最も類似の）生殖系列配列由来でありうる。変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合または他の機能活性）を評価して、生殖系列残基または残基に耐容性がある（すなわち、活性を抑止しない）か否かを判断することができる。フレームワーク領域でも類似の変異誘発を行うことができる。
【０４２４】
生殖系列配列の選択を種々の方法で行うことができる。例えば、生殖系列配列は、所定の選択または類似性基準、例えば、少なくとも、あるパーセンテージ同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一性に適合する場合に選択される。少なくとも２、３、５、または１０生殖系列配列を使って選択を行うことができる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合には、類似の生殖系列配列の特定には、１つのこのような配列の選択を含むことができる。ＣＤＲ３の場合には、類似の生殖系列配列の特定には、１つのこのような配列の選択を含むことができるが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別々に寄与する２つの生殖系列配列の使用を含めてもよい。他の実施形態では、１つまたは２つ超の生殖系列配列が使用され、例えば、コンセンサス配列を形成する。
【０４２５】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および軽鎖の多様性
ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、および軽鎖の多様性をベースにして、ＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリーを構築することを理解されるべきである。軽鎖の多様性は、ＨＣ多様性と同じＤＮＡ分子にコードしても、またはＬＣおよびＨＣ多様性を別々のＤＮＡ分子にコードしてもよい。表２２に、シグナル配列：：ＶＨ：：ＣＨ１：：Ｈｉｓ６：：Ｍｙｃ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐの融合物を示す。ＣＤＲ１は、残基３１〜３５を含む；残基３１、３３、および３５に多様性がある。一実施形態では、残基３１、３３、および３５は、システイン以外のどのアミノ酸タイプであってもよい。ＣＤＲ２は、残基５０〜６５を含む。５０、５２、５２ａ、５６、および５８の位置に多様性がある。一実施形態では、残基５０、および５２はＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｔｙｒであってもよい；残基５２ａは、ＰｒｏまたはＳｅｒであってよく、さらに残基５６および５８は、Ｃｙｓ以外のどのアミノ酸タイプであってもよい。ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、５．Ｅ７、または１．Ｅ８であるＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性に挿入される。
【０４２６】
一実施形態では、残基３１、３３、３５、５０、５２、５６、および５８は、ＣｙｓとＭｅｔ以外のどのアミノ酸タイプであってもよく、残基５２ａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであってもよい。ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、５．Ｅ７、または１．Ｅ８であるＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性に挿入される。
【０４２７】
一実施形態では、ＨＣの多様性は、軽鎖の多様性を含むベクター（ファージまたはファージミド）に挿入される。この多様性は、少なくとも、２５、５０、１００、５００、１．Ｅ３、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、または１．Ｅ７である。ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも、２２１、２７２、５００、１０００、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、１．Ｅ８、または１．Ｅ９である。
【０４２８】
一実施形態では、ＨＣの多様性は、ファージタンパク質、例えば、ＩＩＩ、ＶＩＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩ、もしくはＩＸまたは、提示をさせるに十分なこれらの内の１つの断片上に提示するファージベクターに挿入され、さらに、各細胞が軽鎖を分泌する細胞コレクションに感染することにより、軽鎖がＨＣと結合される。細胞中のこの軽鎖の多様性は、少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、または１００である。ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも、２２１、２７２、５００、１０００、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、１．Ｅ８、または１．Ｅ９である。
【０４２９】
表３０は、Ｐｌａｃプロモーターの制御下の重鎖用のディスプレイカセットである、ｂｌａ遺伝子を保有するファージベクターＤＹ３ＦＨＣ８７（配列番号８９４）の配列を示す。ＤＹ３ＦＨＣ８７は、さらにＭ１３全遺伝子を含む。ｐＬＣＳＫ２３（配列を表４０に示す）（配列番号８９６）、等のベクター中に軽鎖の多様性を有するＦ＋大腸菌細胞に感染させる。ベクターｐＬＣＳＫ２３は、ＫａｎＲ遺伝子を有する。Ｐｌａｃプロモーターの制御下、シグナル配列（塩基２２１５〜２２７７）を有する塩基２２１５から始まる遺伝子、塩基２２７８〜塩基２５９８のＶＬ（この配列中、ＶＬは（配列番号８９７）で示される配列をコードする）、塩基２５９９〜２９２２のＣｋａｐｐａ、２９２３〜２９３１にＮｏｔＩ部位を可能とするリンカー、およびＶ５タグ（塩基２９３２〜２９７３）、がある。２２５９〜２２７１にＳｆｉＩ部位、および２６０２〜２６０５にＫｐｎＩ部位があり、Ｖｋａｐｐａの容易な置換を可能にする。（配列番号８９７）は、分泌されるタンパク質の位置の例である。ＣＫａｐｐａおよびＶ５タグは一定であることは理解されるべきである。表１９に示された全てのタンパク質（ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、およびＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５）は、カルボキシ末端に結合したこれらの配列を有すると思われる。
【０４３０】
軽鎖の多様性
表８００は、３−２３と対を形成することが多いことが知られているカッパＬＣ（軽鎖）を示し、また、ＬＣＫ１（Ｏ１２）：：ＪＫ１は、３−２３に基づく１つのＨＣの５つのＣＤＲ変異と一緒に、タンパク質標的に対する高親和性Ａｂを作る。Ｏ１２は、頻繁に使用されるＶＫＩである。遺伝子は、各ＣＤＲが様々な集団で置換できるように、シグナル配列（ＡｐａＬＩ）、ＦＲ１（ＸｈｏＩ、ＳｇｆＩ）、ＦＲ２（ＫｐｎＩ）、ＦＲ３（ＸｂａＩ）、およびＦｒ４：：Ｃｋａｐｐａ（ＢｓｉＷＩ）の位置に別々の有用な制限酵素部位を配するように設計された。
【０４３１】
表３００１は、Ａ２７ＶＫを有する１４８３ＬＣ中の各ヒトＪＫの使用頻度を示す。ＪＫ１が最も使用頻度が多く、ＪＫ２がその次である。
【０４３２】
ヒトＬＣでは、ＣＤＲ３は、最重要であり、ＣＤＲ１は、その次に重要である。ＣＤＲ２は滅多にＡｇと接触しない。多様性は、表９００と表１０００（ＣＤＲ１）、表１１００と表１２００（ＣＤＲ２）、表１３００、１４００、と１５００（ＣＤＲ３）に示すようにＣＤＲに導入される。重鎖（ＥＳＨＣ）の経済的選択のために、少数の、例えば、表１２００のＣＤＲ３の多様性を有する５０ＬＣを選択して、ｐＬＣＳＫ２４で発現させて周辺質に分泌させる。各細胞株が、例えば、５０未満のＬＣを含むようにいくつかの細胞株を維持する場合、より多くのＬＣを使用可能である。
【０４３３】
表９００は、ＬＣ  ＣＤＲ１の多様性を示す。ライブラリーは、「許容（ａｌｌｏｗｅｄ）」で示されるＡＡタイプの追加の多様性と共にＯ１２残基を含むことができる；表９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００では、「許容（ａｌｌｏｗｅｄ）」を「追加の許容タイプ（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｌｌｏｗｅｄ  ｔｙｐｅ）」と解釈する。Ｏ１２はＲ２４ＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ３４を有する。他のＶＫ１位置では、２４にＱがある。他の位置では、２５にＭがある。Ｓ２６およびＱ２７は、ＶＫＩ中で不変である。他のＶＫＩ位置では、２８にＤまたはＧがある。Ｉ２９およびＬ３３は、ＶＫＩ中で不変で、側鎖は内向きである。他のＶＫＩ位置では、表９００の位置３０、３１、３２、および３４で多様性が許容される。表９００では、１１の位置の７つの位置のみで多様化され、全体多様性は、５７６である。
【０４３４】
表１０００は、ＬＣ  ＣＤＲ１に対するさらに高いレベルの多様性を示す。この場合、１１の位置の内の８つは、多様化されている。不変なのは、結合部位から離れているか、または埋設側鎖を有するものである。
【０４３５】
表１１００は、ＣＤＲ２の低いレベルの多様性を示す。ＣＤＲ２は、抗原結合部位から離れており、この場合の多様性は、それほど有用ではないとおもわれる。実際、ＧＬの多様性は非常に限定されている。表１１００は、ＧＬの多様性を含む。表１２００は、高いレベルの多様性を含み、１９２０配列が許容される。
【０４３６】
表１３００は、ＬＣ  ＣＤＲ３の低いレベルの多様性、２１６０配列、を示す。表１４００は、１０５、８４０配列を許容する、より高いレベルを示す。
【０４３７】
ＲＯＬＩＣの対しては、表９００、１１００、および１３００に示される多様性を有し、約３ｘ１０７ＬＣが産生される。
【０４３８】
重鎖の多様性
ＡｂＨＣ（重鎖）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に多様性を有する。ＣＤＲ３の多様性は、配列と長さの両方の多様性があるため、特に複雑である。配列の多様性はランダムではない。Ａｂ遺伝子を作る細胞は、ＶセグメントをＤセグメントに、さらにこれをＪＨセグメントに連結する。Ｄセグメントは、任意選択である；天然のヒトＡｂの約半分でＤを有するのが認められる。Ｖ−Ｄ、Ｄ−Ｊ、またはＶ−Ｊ境界で、０から多くの塩基の範囲で追加または削除が行われて大幅に編集されている。生殖系列Ｖ：：Ｄ：：Ｊを有するＡｂは生殖系列Ａｂと見なすことができる。
【０４３９】
ヒトＤセグメントを表２０に示す。各生殖系列（ＧＬ）Ｄセグメントは、３つの順方向読み枠の内のいずれかのＡｂ遺伝子中に現れる可能性がある。一部の読み枠では、いくつかのＤセグメントが停止コドンをコードする。これらのＤセグメントが改変停止コドンと一緒に現れることは滅多にない。表２０は、２１、５７８の異なるＨＣ  ＣＤＲ３の試料での各Ｄセグメントの頻度を示す。本明細書のＤセグメントを含む実施例のほとんどは、かなりよく出現する（全観察Ｄの内の２％超の）Ｄを使っている。
【０４４０】
一態様では、本発明は、３−２３（または別のＶＨ、例えば、４−３４）を次のいずれか１つと融合することによりＡｂＨＣ遺伝子を作り上げることを含む：ａ）（Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｒ、Ｎ）を含むセットから選択される多くのアミノ酸、ｂ）Ｄ領域、ｃ）ＪＨ領域、およびｄ）ＪＨ領域のＦＲ４部分。これらの融合体は、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に合成多様性を有するＧＬ３−２３または３−２３であってもよい。ＨＣ  ＣＤＲ３の長さは、約３〜約２４のいずれの数でもよい。ライブラリーは、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０の長さのＨＣ  ＣＤＲ３を有するメンバーを含むのが好ましい。あるいは、長さは、５、８、１１、１４、１７、および２０または他の任意の組み合わせであってもよい。
【０４４１】
表２１は、６〜２０の長さを有する適切なＣＤＲ３の設計例を示す。２列目の大文字で記載されたコドンは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより合成される。３列目は、ドーピングのレベルを示す。表１００は、種々の長さのＨＣ  ＣＤＲ３の組み合わせ可能な比率を示し、この組み合わせにより、ほぼ全てのタンパク質標的に結合するＡｂを含むことが期待されるライブラリーを形成する。他の比率も使用可能である。
【表１０】
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【０４４２】
長さ６について、表２１に４つの例を示す。例えば、６ａは、ｗｏｂｂｌｉｎｇによる最初の６つのＡＡと共にＪＨ１に直接結合したＶＨ（３−２３）を有し、６ｂは、第２の読み枠でＤ４−１７に結合したＴｙｒを有し（Ｄ４−１７はＪＨ１のＦＲ４のＡＡに結合している）、さらに６ｃは、ＪＨ１のＦＲ残基に結合したＤ５−５（３）を有する。これらは、異なる種類の多様性を与えるので、全てを含めるのが好ましいが、これらの１つのみを含むライブラリーでも有用なＡｂを与えるはずである。
【０４４３】
長さ８に関しては、表２１は、３つの例を示している。８ａは、全ＪＨ１に融合したＹＹを有し、一方、８ｂは、ＪＨ１のＦＲ領域に融合しているＤ６−１３（１）に融合した１つのＹを有する。長さ１０、１２、１４、１６、および２０もまた、表２１に示す。ＨＣ  ＣＤＲ３多様性は、合成多様性を含む生殖系列３−２３または３−２３に組み込む事ができる。あるいは、異なるＶＨ、例えば、４−３４を使用可能である。
【０４４４】
ＲＯＬＩＣは、小集団のＨＣを可溶性タンパク質としてＦ＋大腸菌中で発現させる方法である。この集団は、ＬＣ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐ融合体を持つファージに感染する。産生ファージがＨＣを産生する細胞の周辺質からＨＣを得る。これらのファージは、固定化標的に結合され、結合剤は非結合剤と分離される。回収ファージが増殖する場合、回収ファージは、自分の由来のものと同じタイプの細胞を見付けて、ＬＣとＨＣの間の結合を続けなければならないために、集団のサイズは重要である。従って、各細胞株中でＨＣの数は小さいことが望ましい。また、各細胞株中で１０、２０、３０、または４０までの異なるＨＣを有する細胞株の数を維持することが望ましい。従って、我々は１、２、４、６、８、１０、２４、４８、または９６細胞株を有することができ、また、同じ数のファージ産生、選択、および増幅を平行して行うことができる。１または２ラウンド後、ＥＬＩＳＡアッセイによりコロニーで標的に結合するファージの産生を試験する。各ＥＬＩＳＡ＋コロニーは、有用なＬＣおよび有用なＨＣを含むが、それらは同じＤＮＡ片上のものではない。それにもかかわらず、各ＬＣおよび各ＨＣの開始点と終点を判断でき、従って、コロニーに対しＰＣＲを使って、ディスプレイファージまたはファージミドまたはＦａｂ産生プラスミドに挿入可能なＦａｂディスプレイまたはＦａｂ分泌カセットを産生できる。
【０４４５】
ＨＣの効率的選択（ＥＳＨＣ）で、我々は、ＲＯＬＩＣでＬＣとＨＣの役割を逆転させ、ＬＣがＦ＋大腸菌の周辺質中に可溶性タンパク質として産生されるように、プラスミド中にＬＣを挿入する。ＬＣ遺伝子を含まないファージベクター中でＨＣ多様性を産生する。次にＬＣ産生Ｆ＋大腸菌にＨＣ保有ファージに感染させる。そして、ＨＣ遺伝子を保有するファージならびにＨＣおよびＬＣ両方のタンパク質を得る。これらのファージを標的に結合させ選択する。多くのＡｂでは、ＬＣは、許容性であり、結合親和性には大きく貢献しない。最良のＬＣの選択は、大きく親和性を増大するが、通常は、非常に限られたＬＣレパートリーを有するＦａｂを選択できるにすぎない。従って、我々は、ＬＣ産生Ｆ＋大腸菌のフレームワーク領域中に、好ましくは、生殖系列の、小さいＬＣセットを置く。例えば、ＬＣ細胞株中に２５ＬＣがあれば、作成の必要な細胞形質転換体の数を２５倍減らすことができる。
【０４４６】
記載のライブラリーは、ある範囲のＨＣ  ＣＤＲ３長さを有する。適切な折り畳みを容易にするには、ＨＣ  ＣＤＲ３は、ＪＨセグメントの大部分、全部またはフレームワーク部分に結合したＤセグメントを有するか、またはＤセグメントなしで直接結合する。配列は、ｗｏｂｂｌｉｎｇによるＤＮＡ合成を使って多様化する。これは理論的には、任意のアミノ酸タイプを任意の位置に置くことを許容するが、実際の配列は、親の配列および遺伝暗号表に近いＡＡタイプの方に大きく偏っている。
【０４４７】
ＥＳＨＣを使うことにより、合成ＨＣ  ＣＤＲ３多様性の新設計を試作できる。示した例では、我々は、例えば、５０ＬＣのプールを使用する。５ｘ１０８ＨＣのライブラリー、ならびにずっと努力が少なくて済むに古いタイプの２．５ｘ１０１０のライブラリーは、うまく機能するはずである。
【０４４８】
配列をｗｏｂｂｌｉｎｇする場合、最初のコドンの選択がライブラリー中に見られるＡＡ混合物に影響する。表３００は、どのアミノ酸置換が、各開始親コドンからの１、２、または３塩基変化を必要とするかを示す。例えば、Ａｌａに対しｇｃｔまたはｇｃｃから開始する場合、全３つの停止コドンは、３つの塩基変化を要求し、これは希である。７６：８：８：８混合物を使う場合は、Ａｌａは、５７％のケースで出現する（０．７６＊０．７６）。Ｖ、Ｇ、Ｔ、Ｐ、Ｓは、それぞれ、約６％、Ｄは、３％で出現する。Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、およびＲは、約１０倍少なくなる。Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｋ、Ａｍ、Ｏｃ、およびＯｐは、さらに希である。ｇｃａから開始する場合、Ｅは１つの塩基変化を必要とするのみでＤに置換できるが、オパールおよびオーカー停止コドンには、２つの塩基変化が必要なだけであり、これは好ましくない。好ましいコドンには、スター印（＊）でマークした。セリンの選択は我々の願望を複雑化し、を高頻度でＳをＹで置換させる。これは、ＯｐおよびＯｃを２つの塩基変化のみで親とは異なるグループに移動させる。この問題は、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ＫａｎＲまたはＡｍｐＲの前にＨＣ  ＣＤＲ３レパートリーを挿入した後、耐性で選択し、その結果、停止コドンを含むメンバーを除去することにより克服できる。さらに、ライブラリーは、停止コドンの代わりにＱを挿入するｓｕｐＥ大腸菌を使って産生することもできる。
【表１１】
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【０４４９】
ライブラリーの使用方法
オフ速度選択。遅い解離速度は、特にポリペプチドおよび標的の間の相互作用に関して、高親和性を予測させるため、本明細書記載の方法は、標的との結合相互作用に関する所望の動力学的解離速度（すなわち、低速度）を有するリガンドを単離するために使用可能である。
【０４５０】
ディスプレイライブラリーから低速解離抗体を選択するために、ライブラリーは、固定化標的に接触されられる。固定化標的は、次に、非特異的または弱い結合抗体を除去する第１の溶液で洗浄される。次に、結合は、飽和量の遊離標的、すなわち、粒子に結合していない標的の複製物を含む第２の溶液で溶出される。遊離標的は、標的から解離する抗体に結合する。溶出抗体の再結合は、固定化標的の圧倒的に低い濃度に比べて飽和量の遊離標的により妨げられる。
【０４５１】
第２の溶液は、実質的に生理的な、または厳格（例えば、低ｐＨ、高ｐＨ、または高塩）な溶液条件とすることが可能である。典型的には、第２の溶液の溶液条件は、第１の溶液の溶液条件と同じである。第２の溶液の画分を時間順に集め、始めの画分と後の画分を区分する。後の画分は、初めの画分中の生体分子よりも、低速度で標的から解離した抗体を含む。さらに、延長したインキュベーション後でも標的に結合したまま残っている抗体を回収することも可能である。これらは、不安定化条件を使って解離させることも、または標的に結合したままで増殖することも可能である。例えば、標的に結合したファージを細菌性細胞に接触させることも可能である。
【０４５２】
特異性による選択または選別。本明細書記載のディスプレイライブラリー選別方法には、非標的分子に結合する抗体を破棄する選択または選別プロセスを含んでもよい。非標的分子の例には、例えば、標的分子とは構造的に異なる炭水化物分子や、例えば、標的分子とは異なる生物学的特性を有する炭水化物分子が含まれる。硫酸化炭水化物の場合には、非標的は、硫酸塩のない、または異なる位置に硫酸塩がある同じ炭水化物でありうる。リンペプチドの場合には、非標的は、リン酸塩のない、または異なるリンペプチドの同じペプチドでありうる。
【０４５３】
一実施形態では、いわゆる「負の選択」ステップが、標的と関連する非標的分子の間、および標的と関連するが異なる非標的分子との間で分別するために使用される。ディスプレイライブラリーまたはそのプールを非標的分子に接触させる。非標的に結合しないメンバーを集め、その後の標的分子への結合による選択に、またはその後の負の選択にも使われる。負の選択ステップは、標的分子に結合するライブラリーメンバーを選択の前、または後で行うことができる。
【０４５４】
別の実施形態では、選別ステップが使われる。ディスプレイライブラリーメンバーを標的分子への結合により単離した後、各単離ライブラリーメンバーを非標的分子（例えば、上に挙げた非標的）に結合する能力に関し試験する。例えば、高スループットＥＬＩＳＡ選別を使用して、このデータを得ることができる。ＥＬＩＳＡ選別は、各ライブラリーメンバーの標的への結合に関する定量的データを得るために使用することもできる。非標的および標的結合データを、比較して（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを使って）標的に特異的に結合するライブラリーメンバーを特定する。
【０４５５】
特定の実施形態では、本発明のＣＤＲ３を含む抗体は、炭水化物に結合することができる。炭水化物結合に関して抗体を評価する方法には、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、イムノブロッティング、および蛍光標識細胞分取が含まれる。これらの方法は、閾値、例えば、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、または１０ｐＭ超の閾値より優れたＫＤを有する抗体を特定するために使用される。
【０４５６】
ＥＬＩＳＡ。ディスプレイライブラリーによりコードされたタンパク質は、また、ＥＬＩＳＡアッセイを使って結合特性により選別できる。例えば、各タンパク質を、底面を標的、例えば、一定量の標的、でコートしたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄し、非特異的に結合したポリペプチドを除去する。次いで、プレートに結合したタンパク質の量をポリペプチド、例えば、ポリペプチドのタグまたは定常部、を認識できる抗体でプレートを調べることにより測定する。抗体は、適切な基質が供給されると熱量測定用生成物を産生するアルカリフォスファターゼ、等の酵素に結合される。タンパク質は細胞から精製することができる、またはディスプレイライブラリーフォーマットで、例えば、繊維状バクテリオファージコートへの融合体として、アッセイできる。あるいは、標的分子、例えば、炭水化物成分を含む標的、を発現している細胞（例えば、生または固定）を、マイクロタイタープレートに播種し、ディスプレイライブラリー中に存在する、またはディスプレイライブラリーから選択して得たペプチド／抗体の親和性を試験するために使用できる。
【０４５７】
ＥＬＩＳＡアッセイの別の方法では、多様性鎖ライブラリーの各ポリペプチドを使って、マイクロタイタープレートの異なるウエルをコートする。次いで、ＥＬＩＳＡにより一定の標的分子を使って各ウエルを検索する。
【０４５８】
細胞結合アッセイ。抗体は、１つまたは複数の細胞型、例えば、造血性細胞、と相互作用する能力を評価できる。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）は、タンパク質と細胞の間の相互作用を試験する１つの代表的方法である。細胞への結合の前、または後で、抗体に直接または間接的にフルオロフォアで標識付けして、次に、細胞をＦＡＣＳソーターでカウントする。
【０４５９】
他の細胞型についても、当技術分野で既知の方法により、ＦＡＣＳ用に調製可能である。
【０４６０】
均質結合アッセイ。候補ポリペプチドの標的との結合交互作用は、ホモジニアスアッセイ、すなわち、アッセイの全成分を添加後、追加の液体操作は必要ないアッセイ、を使って分析可能である。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）はホモジニアスアッセイとして使用可能である（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５、６３１、１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４、８６８、１０３号を参照）。第２の分子が第１の分子に近接して存在する場合、第１の分子（例えば、画分中で特定された分子）上のフルオロフォア標識を、その放射蛍光エネルギーが第２の分子（例えば、標的）上の蛍光標識により吸収されうるように選択する。第２の分子上の蛍光標識は、転移エネルギーまで吸収すると蛍光を発する。標識間のエネルギー転移効率は、分子を隔てている距離に関係するので、分子間の空間的関係が評価できる。分子間で結合が起こる状況では、アッセイでの「受容体」分子標識の蛍光の発光は、最大となるはずである。ＦＲＥＴによるモニタリング用に設定された結合イベントは、当技術分野でよく知られた標準的蛍光定量的検出手段によって（例えば、蛍光光度計を使って）、好都合に測定可能である。第１または第２の結合分子の量を滴定することにより、結合曲線を作成して平衡結合定数を推定することができる。
【０４６１】
ホモジニアスアッセイの別の例は、Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄｅｎ  Ｃｏｎｎ．）である。Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎは、２つの標識付けしたビーズを使う。１つのビーズは、レーザーで励起されると、一重項酸素を生成する。一重項酸素が第１のビーズから拡散してもう一つのビーズに衝突すると、もう一つのビーズは、光信号を生成する。その光信号は、２つのビーズが近接している場合のみ発生する。１つのビーズは、ディスプレイライブラリーメンバーに付着でき、もう一つの方は、標的に付着可能である。信号を測定し、結合の強さを決定する。
【０４６２】
候補ポリペプチドをディスプレイライブラリー担体、例えば、バクテリオファージに付着したままで、ホモジニアスアッセイを行うことができる。
【０４６３】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）。ディスプレイライブラリーから単離された分子と標的間の結合相互作用は、ＳＰＲを使って分析可能である。ＳＰＲまたは生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）は、相互作用物のどちらも標識しないで、生体分子特異的相互作用をリアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面の質量変化（結合イベントを示す）は、表面近傍の光の屈折率の変化を生ずる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折度の変化は、検出可能なシグナルを生成し、生物学的分子間のリアルタイムの反応の指標として測定される。ＳＰＲを使った方法は、例えば、米国特許第５、６４１、６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）「表面プラズモン」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５、およびＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるオンラインリソースに記載されている。
【０４６４】
ＳＰＲからの情報は、生体分子の標的への結合に関する平衡解離定数（ＫＤ）、ならびにｋｏｎおよびｋｏｆｆを含む動力学的パラメーターの正確で定量的な測定値を得るために使用できる。このようなデータは、異なる生体分子を比較するのに使用できる。例えば、多様性鎖ライブラリーから選択された拡散にコードされたタンパク質を比較して、標的に対する高親和性を有する、または小さいｋｏｆｆを有する個々のタンパク質を特定することができる。この情報はまた、構造活性相関（ＳＡＲ）を明らかにするためにも使用できる。例えば、成熟型親タンパク質の動力学的および平衡結合パラメーターを親タンパク質のパラメーターと比較できる。特定の結合パラメーター、例えば、高親和性および強い差異ｋｏｆｆと関連する所与の位置の変異体アミノ酸を特定できる。この情報を構造モデリング（例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー最小化、または結晶学またはＮＭＲによる構造決定を使った）と組み合わせることもできる。結果として、タンパク質とその標的との間の物理的相互作用の理解が得られ、他の設計プロセスの導入に役立てることができる。
【０４６５】
タンパク質アレイ。ディスプレイライブラリーから特定されたタンパク質を固体支持体上に、例えば、ビーズまたはアレイ上に固定化できる。タンパク質アレイに関しては、各ポリペプチドを、支持体のユニークなアドレス位置に固定化する。通常、アドレスは二次元アドレスである。ポリペプチドアレイを作る方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８、ｅ３、Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１、に記載されている。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓが市販しているロボット装置を使って高速でアレイ用ポリペプチドを形成できる。アレイ基板は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面改質ガラスであってもよい。また、アレイには、多孔性基板、例えば、アクリルアミド、アガロース、または別のポリマーが含まれうる。
【０４６６】
ベクター
また、本発明のいずれかの態様による方法を実施するのに使用するベクターも提供される。１つのこのようなベクターは、通常、単鎖バクテリオファージ用の複製起点を有し、ｓｂｐメンバー核酸を含むか、またはファージカプシドタンパク質の成熟コード配列の５’末端領域に挿入するための制限部位を有し、さらに、前記部位の上流のカプシドタンパク質外因性ポリペプチドの融合体を細胞周辺腔へ導く分泌リーダーをコードする配列を有する。
【０４６７】
ベクターは、コードする遊離型ポリペプチドの発現のために、ＨＣ  ＣＤＲ３挿入部位を有するファージベクター（例えば、ＤＹ３Ｆ８７ＨＣ）であってもよい。ベクターは、可溶性軽鎖発現用のプラスミドベクター、例えば、ｐＬＣＳＫ２３であってもよい。
【０４６８】
ｐＬＣＳＫ２３によりコードされた軽鎖の多様性は、１０、１５、２０、２５、３０、または５０であってもよい。多様性ＬＣは、フレームワーク領域で生殖系列であること、およびＣＤＲ３および／またはＣＤＲ１に多様性を有すること、等の特定の所望の特性を有するように構築または選択することができる。生殖系列は、利用頻度の高いもの、例えば、カッパではＶＫ１＿２−Ｏ２、ＶＫ３＿１−Ａ２７、ＶＫ３＿５−Ｌ６、ＶＫ３＿３−Ｌ２およびラムダではＶＬ２＿２ａ２、ＶＬ１＿１ｃ、ＶＬ１＿１ｇ、ＶＬ３＿３ｒであってもよい。
【０４６９】
例えば、以下のタンパク質用の遺伝子をｐＬＣＳＫ２３に挿入可能である。
【０４７０】
ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５、およびＶＫ１ＧＬＯ１２−ＪＫ３（アミノ酸配列を表１９に示す）。
【表１２】
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【０４７１】
キット
また、本発明のいずれかの態様による方法を実施するのに使用するキットが提供される。キットは、必要なベクターを含んでもよい。１つのこのようなベクターは、通常、単鎖バクテリオファージ用の複製起点を有し、ｓｂｐメンバー核酸を含むか、またはファージカプシドタンパク質の成熟コード配列の５’末端領域に挿入するための制限部位を有し、さらに、前記部位の上流のカプシドタンパク質外因性ポリペプチドの融合体を細胞周辺腔へ導く分泌リーダーをコードする配列を有する。
【０４７２】
また、上記で定義したＨＣ  ＣＤＲ３および上記定義の方法のいずれかを使って得られるＨＣ  ＣＤＲ３および断片ならびにその誘導体を含むポリペプチドをコードするパッケージも提供される。誘導体は、別の分子、例えば、酵素またはＦｃテイルに融合したポリペプチドを含むこともできる。
【０４７３】
キットには、コードされた遊離型ポリペプチド発現用のＨＣ  ＣＤＲ３挿入部位を有するファージベクター（例えば、ＤＹ３Ｆ８７ＨＣ）を含めてもよい。また、キットには、可溶性軽鎖発現用プラスミドベクター、例えば、ｐＬＣＳＫ２３を含めてもよい。また、キットには、適切な細胞株（例えば、ＴＧ１）を含めてもよい。
【０４７４】
ｐＬＣＳＫ２３によりコードされる軽鎖の多様性は、１０、１５、２０、２５、３０、または５０であってもよい。多様性ＬＣは、フレームワーク領域で生殖系列であること、およびＣＤＲ３および／またはＣＤＲ１に多様性を有すること、等の特定の所望の特性を有するように構築または選択することができる。生殖系列は、利用頻度の高いもの、例えば、カッパではＶＫ１＿２−Ｏ２、ＶＫ３＿１−Ａ２７、ＶＫ３＿５−Ｌ６、ＶＫ３＿３−Ｌ２およびラムダではＶＬ２＿２ａ２、ＶＬ１＿１ｃ、ＶＬ１＿１ｇ、ＶＬ３＿３ｒであってもよい。
【０４７５】
例えば、以下の配列用の遺伝子をｐＬＣＳＫ２３に挿入可能である。
【０４７６】
ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５、およびＶＫ１ＧＬＯ１２−ＪＫ３（アミノ酸配列を表１９に示す）。
【０４７７】
キットは、方法を実行するために必要な補助的成分を含むこともできるが、当然ながらこのような成分の特性は採用される特定の方法に依存する。有用な補助的成分には、ヘルパーファージ、ＰＣＲプライマー、緩衝液、および／または、種々の種類の酵素が含まれうる。緩衝液および酵素は、通常、本明細書記載の戦略に従って、再構成したまたは未再構成の免疫グロブリン遺伝子由来のＦｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列の調製を可能にするために使われる。
【０４７８】
多様性の導入方法
多様性を有するＤＮＡを生成する多くの方法がある。１つの方法は、混合ヌクレオチド合成（ＭＮＳ）を使うことである。ＭＮＳの１つの方式では、表５に示す等モルの混合物のヌクレオチドを使う。例えば、ＮＮＫコドンを使って、２０全てのアミノ酸および１つのＴＡＧ停止コドンを得る。分布は、３（Ｒ／Ｓ／Ｌ）：２（Ａ／Ｇ／Ｖ／Ｔ／Ｐ）：１（Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ）である（例えば、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＬｅｕのそれぞれが３、等）。本明細書で「ｗｏｂｂｌｉｎｇ」と名付けられた別の方法では、混合ヌクレオチドを使うが、等モル量ではない。例えば、親コドンがＴＴＣ（Ｐｈｅをコード）である場合、Ｔの代わりに（０．０８２Ｔ、０．０６Ｃ、０．０６Ａ、および０．０６Ｇ）の混合物を使用し、Ｃの代わりに（０．０８２Ｃ、０．０６Ｔ、０．０６Ａ、および０．０６Ｇ）の混合物を使用することができる。これによりＴＴＣまたはＴＴＴ（Ｐｈｅをコード）が５９％、Ｌｅｕが１３％、Ｓ／Ｖ／Ｉ／Ｃ／Ｙが約５％の確率、および他のアミノ酸タイプがより低頻度で現れることになろう。
【０４７９】
Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｕｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４５：３４０−３（２００８））は、多様化ＤＮＡの合成方法を記載している。この場合、ＩＩ型制限酵素を使ってトリヌクレオチドを固定ヘアピンオリゴヌクレオチド（ＰＨＯＮ）から、いわゆる「スプリンカー」に移行させる。欧州特許１１８１３９５、欧州特許１４１１１２２、欧州特許１３１４７８３および欧州特許出願０１１２７８６４．５、欧州特許出願０４００１４６２．３、欧州特許出願０８００６４７２．８も参照のこと。固定ＰＨＯＮおよびスプリンカーの混合物を使って、設計者が決めた比率で所望のアミノ酸タイプが許容されたライブラリーを構築することができる。従って、１つのアミノ酸タイプが、例えば、８２％の確率で存在し、１８の他のアミノ酸タイプ（Ｃｙｓ以外は全て非親アミノ酸タイプ）がそれぞれ２％の確率で存在するように指定することができる。本明細書では、このような合成を、「ｄｏｂｂｌｉｎｇ」（ディジタルｗｏｂｂｌｉｎｇ）と呼ぶことにする。一部の態様では、ｄｏｂｂｌｉｎｇがｗｏｂｂｌｉｎｇより好ましいが、ｗｏｂｂｌｉｎｇは有用な実施形態を提供する。これは、遺伝暗号表の構造がｗｏｂｂｌｉｎｇに主に保存的置換を作らせることが理由の１つである。Ｄｏｂｂｌｉｎｇは、不必要なアミノ酸タイプを排除する可能性を与える。ＣＤＲでは、不対システインが、治療薬として承認されているＡｂ中でさえ、知られているが、一部の実施形態では、これを避けることが望まれる。一部の実施形態では、システインの対を含むＤ領域を多様化する際、シスチンは、変えることを許容されない。理由は、ジスルフィドクローズドループは重要な構造要素であり、また、不対システインが望まれないからである。
【０４８０】
さらに、親アミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を合成し、フレームワーク領域の変位が避けられるようにフレームワーク領域を含むプライマーを使ってそのＤＮＡをエラープローンＰＣＲに供することができる。
【表１３】
2013504602.tif 000016
【表１４】
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【０４８１】
実施例
本発明は、さらに、以下の実施例により説明されるが、これら実施例は決して制限するものと解釈されるべきものではない。本出願を通して引用された全ての参照、出願中特許および特許公報の内容は、ここで明示的に参照によって組み込まれる。
【０４８２】
理論実験例１：非常に短いＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリー
非常に短いＨＣ  ＣＤＲ３が当技術分野で報告されている。Ｋａｄｉｒｖｅｌｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：８１４９−５４には、連鎖球菌タイプＢ  ＩＩＩ  Ａｇ（ＧＢＳ−Ａｇ）に結合するが、肺炎球菌カプセルＡｇには結合しない抗体中の４つのアミノ酸のＨＣ  ＣＤＲ３配列が記載されている。ＧＢＳ−Ａｇは、規則的間隔でシアル酸付加されている。肺炎球菌カプセルＡｇ（ＳＰＣ−Ａｇ）は、非常に似ているがシアル酸基が欠けている。このような短いＨＣ  ＣＤＲ３は、その中に炭水化物が結合できる幅が広い溝を作り、このようなＡｂは実在する抗体ライブラリーの中では、極めて希である。従って、現在のライブラリーは、炭水化物に対する大きな多様性のある潜在的結合剤を提供しない。
【０４８３】
Ａｂ  １Ｂ１は、ＧＢＳ−Ａｇと結合するマウスｍＡｂである；Ａｂ  １ＱＦＵは、既知の３Ｄ構造および最も近い配列を有するｍＡｂである；さらに１ＮＳＮは、長さ４のＨＣ  ＣＤＲ３を有する既知の３Ｄ構造の抗体である。３−２３ＨＣ構造の調査では、Ｒ９４のＣα（ＦＲ３の終わり）からＷ１０４のＣα（ＦＲ４の始まり）までの距離は約１０Åである。１Ｂ１（ＮＷＤＹ（配列番号：２９））のＣＤＲ３は、ＡＡが小さい側鎖のみを有する必要はなく、または、ほとんどがグリシンである必要もないことを示す。３つのアミノ酸（ＡＡ）で１０Åの橋をかけることができるが、ＰＰＰではうまくいかない。実際、３ＡＡの短さのＣＤＲ３の２、３のＦａｂを得たが、これは希である。
【０４８４】
短い、および非常に短いＨＣ  ＣＤＲ３について述べてきたが、短いＨＣ  ＣＤＲ３（例えば、３〜５アミノ酸のＨＣ  ＣＤＲ３）を有する多くのメンバー（例えば、メンバーの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％超）を含むＡｂライブラリーを作ることに関して誰も提案してこなかった。有効なライブラリーを構築する１つの手法は、最初に、Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ結合から生じるアミノ酸配列を設計することである。ＣＤＲ３長さ３、４、または５に対し、表７に示すアミノ酸配列から出発する。例えば、配列Ｖ−３ＪＨ１は、３−２３ＦＲ３（ＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号：３０））のＣ末端に続く、Ｎ末端からＦＲ４を開始するＴｒｐ−Ｇｌｙの前の３つのアミノ酸までトリミングしたＪＨ１を示す。Ｖ−３ＪＨ２は、ＦＲ３の末端に続く、トリミングしたＪＨ２を示す。Ｖ−３ＪＨ６の後の配列は、ＦＲ４をヒトＤセグメントから取り出した三量体に結合し、次にヒトＪＨセグメントのＦＲ４領域に結合して構築される。３Ｄ３−３．３．２は、２番目のアミノ酸から開始される第３の読み枠によるセグメントＤ３−３由来の三量体である。５Ｄ５−１２．２．３は、アミノ酸３から開始される読み枠２のＤ５−１２由来の五量体である。一部の生殖細胞系列Ｄセグメントは停止コドンを含み、これは停止コドンを編集して除去しても、それでも天然抗体中に現れるのである。ここで、ＴＡＡおよびＴＡＧコドンからの最もありそうな変化は、Ｔｙｒ（Ｙ）への変化であり、ＴＧＡ停止コドンは、Ｔｒｐ（Ｗ）に最も変異しそうであると仮定する。表２０は、ヒトＤセグメントのアミノ酸配列を示す；停止コドンのタイプは、ＴＡＧを＊で、ＴＡＡを＠で、およびＴＧＡを＄で示す。表１１には、ヒトＤセグメントから構築することができる２６６の異なる三量体を示す。ＴＡＡおよびＴＡＧ停止コドンは、「ｙ」（すなわち、小文字）で示されるＴｙｒに変わった。また、これらは、１つの塩基変化によりＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕに変わることができる。ＴＡＧは、１つの塩基変化によりＴｒｐならびにＴｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、およびＬｅｕに変わることができる。表１２は、ヒトＤセグメントのトリミングにより得ることができる２６６の異なる四量体を示す。表１３は、ヒトＤセグメントのトリミングにより得ることが可能な２１５の五量体を示す。表１４は、ヒトＤセグメントのトリミングにより得ることができる１５５の五量体を示す。構築するライブラリーは、ＨＣ  ＣＤＲ１およびＨＣ  ＣＤＲ２に実質的な多様性を有する。ＨＣ  ＣＤＲ３の配列多様性は、短いが受容可能な配列を有することよりも重要性が少ないかもしれない。ＪＨセグメントまたはＤセグメントの断片（例えば、３以上のアミノ酸）の多様性は、ヒト免疫系により構築可能な配列で、そのために免疫原子の少ないと思われる配列を提供する。
【０４８５】
一実施形態では、Ｃｙｓを含有する三量体、四量体、および五量体は除去される。
【０４８６】
一実施形態では、Ｃｙｓまたは停止コドンを含むＤ断片由来のアミノ酸を含む三量体、四量体、および五量体は除去される。
【０４８７】
表１１の三量体、表１２の四量体、表１３の五量体を使って構築される短いライブラリーは、実質的な多様性：それぞれ、２６６、２６６、および２１５を有する。これは、それぞれ、８０００、１６００００、および３２０００００の数のこれらの長さを有するペプチドに匹敵するものである。
【０４８８】
Ｖ−３Ｄ１−１．１．１−ＪＨ１は、ＦＲ３の終わりの部分と、それに続く、Ｄ１−１（ＲＦ１）由来の３つのアミノ酸、すなわち、ＧＴＴ（配列番号：２５７）を含む。Ｖ−３Ｄ１−１．２−ＪＨ１は、親ＣＤＲ３としてＤ１−１（ＲＦ１）のアミノ酸２−４を使う。Ｖ−３Ｄ３−３．３．３−ＪＨ２は、ＦＲ３の末端と、それに続くＤ３−３（ＲＦ３）のアミノ酸３−５を含む。本発明は、ＦＲ３：：（３つ、４つまたは５つの、停止コドンを含まないヒトＤセグメントのＡＡ）：：ヒトＪＨ由来ＦＲ４、を含む任意のアミノ酸配列を含む。不対Ｃｙｓ残基を含むＤ領域の断片は、不対Ｃｙｓ残基を含まないものより好ましくない。ＪＨ３には、ＦＲ４の開始を決めるＴｒｐ−Ｇｌｙのコドンの前に、４つのコドンしかないために、Ｖ−５ＪＨ３では、「ｙ」で示されるＴｙｒが存在する。Ｖ−５ＪＨ４には、同じ理由で、「ｓ」で示されるＳｅｒがある。ｗｏｂｂｌｉｎｇを使う場合、好ましい純度レベルは、０．７５〜０．９０である。本発明には、Ｖ−３ＪＨからＶ−３ＪＨ６まで、Ｖ−４ＪＨ１からＶ−４ＪＨ６まで、およびＶ−５ＪＨ１からＶ−５ＪＨ６までの配列、および同配列を含むライブラリーが含まれる。本発明には、また、ＣＤＲ領域がヒトＤ領域由来の３、４、または５アミノ酸セグメントにより置換された配列、および同配列を含むライブラリーが含まれる。本発明には、さらに、親の配列がＣＤＲ３領域で変異しているＤＮＡ、および同ＤＮＡを含むライブラリーが含まれる。好ましい実施形態は、ＣＤＲ３当たりの塩基変化の平均数が１つ、２つまたは３つのものである。変異誘発の方法には、エラープローンＰＣＲ、ｗｏｂｂｌｉｎｇ、およびｄｏｂｂｌｉｎｇが含まれる。
【表１５】
2013504602.tif 000018
【表１６】
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【０４８９】
あるいは、ＸｂａＩからＢｓｔＥＩＩまでの領域に対応し、ＫまたはＲである残基９４、これに続く３、４、または５ＮＮＫコドン、さらにＦＲ４のＷＧ．．．が続く、配列を有するＤＮＡの３つの断片を合成することもできる。許容される多様性は、２０３＋２０４＋２０５＝３、３６８、０００である。増幅後、これらのＤＮＡ分子は、比率１：１０：１００（短い配列が相対的にオーバーサンプリングになるように）で混合し、ＨＣ  ＣＤＲ１／２多様性を有するカッパライブラリーをコードするファージミドに挿入する。１ｘ１０９のライブラリーは、大きな多様性を生じ、小から中位の突出のある標的に結合する抗体を単離可能とするはずである。例えば、種々の炭水化物、規則性のよくないループ状タンパク質（ＧＰＣＲ等）は非常に短いＨＣ  ＣＤＲ３を有することにより形成された抗体中の溝の恩恵を受けることができる。また、ラムダライブラリーも構築できる。ＡＡ配列の比率は、１：２０：４００であり、より短い配列をより高濃度に採取することが重要であろう。Ａｂ中に大きな、幅の広い溝を作るには、正確に１つの３ＡＡのＣＤＲ３が必要で、４ＡＡのＣＤＲ３になるとおそらく隙間ができてゆるゆるになり、５ＡＡではもっとゆるゆるになるであろう。この例では、ＷＧモチーフ以降にＦＲ４のＪＨ６タイプを使っている。
【０４９０】
現在のカッパライブラリーから、例えば、ａ）フレームワーク領域で生殖系列である、ｂ）ＣＤＲに適切な多様性がある、およびｃ）３−２３と孔および対の孔を作るタイプである、２５カッパ軽鎖のコレクションを選択することができる。これらのＬＣは、ＫａｎＲを保持し、ファージパッケージングシグナルを持たないベクターから大腸菌中で作られる。次に、ＬＣを有さないファージベクター中でＨＣライブラリーを構築する。ＬＣ産生細胞をＨＣファージに感染させることによりＨＣおよびＬＣを交差させる。選択されたＨＣファージは、ＥＬＩＳＡ＋ファージを産生する細胞のＬＣと組み合わすことができ、またはＨＣは全ＬＣ多様性を有するｐＭＩＤ２１に挿入することができる。あるいは、選択ＨＣをｐＨＣＳＫ８５に挿入し、ＲＯＬＩＣと一緒に使用して、我々の収集の全ＬＣと結合させることができる。ラムダＬＣも値用可能である。従って、ファージ中の１ｘ１０９ＨＣのライブラリーは、１．２ｘ１０１１（１．ｘ１０９ｘ１１７）のＦａｂライブラリーに拡張可能である。１ｘ１０７ＣＤＲ１−２を１０６ＨＣ  ＣＤＲ３と合わせると、各ＣＤＲ３が５０ＣＤＲ１−２と結合した５ｘ１０７のライブラリーを作ることができる。５ｘ１０７ＨＣのファージ中ライブラリーは、６ｘ１０９の旧型ライブラリーと類似の結果を与えることができる。
【表１７】
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【０４９１】
あるいは、現在のＨＣ多様性を挿入するＤＹ３Ｆ８７ＨＣにし、上述のＣＤＲ３多様性を、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片としてその多様性中に挿入することができる。例えば、２５ＬＣライブラリーをｐＬＣＳＫ２３に挿入し、ＴＧ１大腸菌中に細胞株を生成するために使用する。これらの細胞を新規ＨＣ  ＣＤＲ３（およびＣＤＲ１−２）多様性を有するＤＹ３Ｆ８７ＨＣファージに感染させる。この感染により得たファージを所望の標的に対する結合を使って選択する。２〜４ラウンドの選択後、選択されたＨＣをｐＨＣＳＫ２２に挿入し、細胞株を生成するのに使用する。この細胞株は、ＲＯＬＩＣと共に使用して、選択されたＨＣをＲＯＬＩＣＬＣライブラリー中の全ＬＣと組み合わせることができる。このように、１．Ｅ９のライブラリーにより、通常なら、１．Ｅ１６のライブラリーの構築が必要となるはずのＡｂが得られる（ＬＣ多様性を１．Ｅ７と仮定して）。
【０４９２】
非常に短いHC CDR3を有するライブラリーのさらなる実施例
一実施形態では、ライブラリーは、長さ３のＰ１−Ｐ２−Ｐ３のＣＤＲ３を有し、ここで、Ｐ１の許容アミノ酸タイプは表３３０５の実際のＡｂで見られるもの、およびＨｉｓとＡｌａから選択され、Ｐ２の許容アミノ酸タイプは表３３０５の実際のＡｂで見られるものから選択され、また、Ｐ３の許容アミノ酸タイプは表３３０５の実際のＡｂで見られるものから選択される。例えば、ライブラリーは、アミノ酸配列ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを含み、ここで：
Ｘ１は、Ｇ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、またはＡで、比率は、５０００：９３８：９３８：９３８：６２５：３１３：３１３：３１３：３１３：３１３：３１３であってもよく、
Ｘ２は、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、またはＹで、比率は、３４３８：１５６３：１２５０：６２５：６２５：３１３：３１３：３１３：３１３：３１３：３１３：３１３：３１３であってもよく、さらに
Ｘ３は、Ｙ、Ｌ、Ｒ、Ｖ、Ｆ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｉ、またはＴで、比率は、１８７５：１５６３：１２５０：１２５０：９３８：９３８：６２５：６２５：３１３：３１３：３１３、であってもよい。
【０４９３】
このライブラリーの多様性は、ＨＣ  ＣＤＲ３で１、５７３である。Ｍｅｔは、位置Ｘ１で出現するが、ＣＤＲ３中のメチオニンを選択するのは望ましくないので、これを除外する。ＡｌａおよびＨｉｓは、調査した３２抗体の検体中のＰ１位置には現れないが、より多くの配列多様性を得るためにＰ１位置にＡｌａおよびＨｉｓを含める。３つの位置に任意のアミノ酸を許容すると、８０００配列になる。ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫは、ＸｂａＩ部位で始まるＦＲ３の一部である。ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳは、ＢｓｔＥＩＩ部位を含むＦＲ４である。ＪＨ１およびＪＨ４のＦＲ４配列は、同等である。最も好ましい構築方法は、ｄｏｂｂｌｉｎｇによるものである。ＨＣ  ＣＤＲ１とＣＤＲ２およびＬＣにも多様性があることを理解されたい。これらの１、５７３配列からの方が、除外した６、４２７（８０００−１５７３）からより多くの機能する抗体を得られそうである。
【０４９４】
一実施形態では、ライブラリーは、長さ４のＣＤＲ３を有し、この場合、許容アミノ酸タイプは、表３３０６に示される実際のＡｂで見られるものから選択される。例えば、ライブラリーは、アミノ酸配列ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを有し、ここで：
Ｘ１には、Ｄ、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、またはＹが許容され、その比率は、２７：２１：９：８：６：５：５：４：４：２：２：２：２：２：２：２であり；
Ｘ２には、Ｇ、Ｌ、Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｋ、Ｖ、またはＷが許容され、その比率は、１８：１７：１６：１１：７：５：５：４：４：４：２：２：２：２（Ｍｅｔは除外）であり；
Ｘ３には、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｑ、Ｔ、またはＹが許容され、その比率は、３０：２３：９：６：６：４：４：４：３：３：３：３であり；さらに
Ｘ４には、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｆ、Ｓ、またはＴが許容され、その比率は、３７：８：８：６：６：５：５：５：５：４：４：３である。
このライブラリーのＣＤＲ３の多様性は、３２、２５６で、一方ＮＮＫ方式で４倍にすると１６０、０００アミノ酸配列が許容される。
【０４９５】
一実施形態では、ライブラリーは、長さ５のＣＤＲ３を有し、この場合、許容アミノ酸タイプは、表３３０７に示される実際のＡｂで見られるものである。例えば、ライブラリーは、アミノ酸配列ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを有し、ここで：
Ｘ１には、Ｇ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、またはＷが許容され、その比率は、４０：１２：１０：８：７：７：６：５：４：３：２：２であり；
Ｘ２には、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｗ、またはＳが許容され、その比率は、１６：１２：１１：９：９：７：７：６：６：５：５：４であり；
Ｘ３には、Ｇ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ａ、Ｋ、Ｍ、Ｐ、Ｄ、またはＥが許容され、その比率は、３９：１８：１２：６：６：５：４：４：３：３：２：２であり；
Ｘ４には、Ｄ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｅ、Ｓ、Ｙ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、またはＬが許容され、その比率は、３８：３１：６：５：４：４：３：２：２：２：２であり；さらに
Ｘ５には、Ｙ、Ｖ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｈ、またはＬが許容され、その比率は、３７：１２：１１：１０：６：６：４：４：３：３：３である。
このＣＤＲ３ライブラリーは、ＮＮＫによる５倍の３、２００、０００に比べ、２０９、０８８配列を許容する。長さ５のＣＤＲ３を有する実際のＡｂには、ほとんど、または全く見られないＡＡＴを除外すると、配列の数は１５倍減少する。Ｍｅｔが位置４に現れるが、ＣＤＲ３中のメチオニンを選択するのは望ましくないので、これを除外する。
【０４９６】
理論実施例２：非常に長いＨＣ  ＣＤＲ３を有するライブラリー
Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４  ３３８：２９９−３１０．および米国公開特許２００５０１１９４５５Ａ１）には、２０アミノ酸までの長さに制限されたＣＤＲ中でＹおよびＳのみが許容されたライブラリーから選択された高親和性Ａｂの報告がある。１つまたは複数の次の形の多様性のＨＣ  ＣＤＲ３を有するライブラリーから高親和性Ａｂを生成することが可能である：ａ）ＹまたはＳを許容するいくつかの（全部ではない）部位の多様性、ｂ）４〜６ＮＮＫコドンを含む多様性、ｃ）Ｄセグメントを導入した多様性（Ｄに多様化がある場合、または無い場合）、および／またはｄ）エラープローンＰＣＲを使った多様性。すでにＨＣ  ＣＤＲ３が長さ中央値１３で約８〜約２２の範囲にあるＡｂ領域の試料作成をした。従って、ＨＣ  ＣＤＲ３が約２３ＡＡまたは約３５ＡＡのライブラリーが可能であり、特定のタイプの標的に対して有利な点がある可能性がある。例えば、ＧＰＣＲは、多状態を持つと考えられる細胞の脂質二重層を貫通する７つのヘリカルセグメントを有する膜内在性タンパク質である。非常に長いＨＣ  ＣＤＲ３を有する抗体は、７つの鎖により形成された溝に合致する隆起を形成できる。ＧＰＣＲに結合するＡｂを見付けることは困難であったが、全メンバーが非常に長いＨＣ  ＣＤＲ３を有するライブラリーの意図的構築により、この問題を改善することができる。長さを、例えば、１つのライブラリー中で２３、２４、または２５、さらに２つ目で３３、３４、または３５、と幾分可変できる。
【０４９７】
以下は、多くの代表的設計である。ＣＤＲ３を分解し、Ｘの値に応じて、種々の部分に異なる関係を持たせることにより多様性を生成させる。完全長ＪＨ１を使用し、一部の設計では、ＪＨ１のＣＤＲ３部分に多様性を許容することにより多様性を得た。他のＪＨも使用可能である。設計では、Ｄセグメントは、Ｙに富むか、またはＳリッチのジスルフィドループを有する。ヒトＤセグメントのアミノ酸配列を表３に示す。Ｄ領域がＳまたはＹを有するか、または他の許容された組み合わせのある場所は、特に、変化に富む。表３には、ヒトＪ領域のアミノ酸配列および２１、５７８Ａｂ中のその頻度を示す。
【０４９８】
各ライブラリーは、少なくとも４つの方法で構築可能である：１）特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを最初に合成し、エラープローンＰＣＲを行う、２）ライブラリーは、ｗｏｂｂｌｉｎｇにより、またはヌクレオチドの混合物を使って合成できる、３）ライブラリーは、ｄｏｂｂｌｉｎｇを使って構築できる、さらに４）ルート（２）または（３）の後に、エラープローンＰＣＲを行う。ルート（１）の例として、設計１２で、配列番号９１１に示すように、配列番号９０８をコードするＤＮＡを合成できる。このＤＮＡは、配列番号９０９および配列番号９１０に示すプライマーを使ってエラープローンＰＣＲを行うことができる。これらのプライマーは、フレームワーク領域を包含するので、エラーは、ＣＤＲ３中でのみ発生する。
【０４９９】
ＣＤＲ３長さ２３の、例えば、２ｘ１０９メンバーを有するＨＣのライブラリーおよびＨＣ  ＣＤＲ３長さ約３５の、２ｘ１０９メンバーを有する２番目のライブラリーを構築できる。あるいは、ＤＮＡを混合して、４ｘ１０９の１つのライブラリーを構築できる。
【０５００】
次の設計のそれぞれでは、アミノ酸配列は、ＦＲ３の末端であるＹＹＣＡ（Ｋ／Ｒ）で始まる。また、開始配列を生殖系列の３−２３であるＹＹＣＡＫに制限することも、本発明の範囲に含まれる。ＦＲ４は、ＷＧで始まり、太字で示している。
【０５０１】
設計１
配列番号８９８は、ＦＲ３の末端を含み、これは、ＶおよびＤの間に免疫系が位置するフィラー配列によく見られるタイプの２つの残基（ＤＧ）に結合される。これらの次に、Ｄ２−２．２が続くが、これは、それがジスルフィドループを有し、ＳｅｒとＴｙｒ残基に富んでいるために、好ましい。この後に、ＹＧＹＳＹが続き、これは、ＴｙｒとＳｅｒ残基に富んでおり、さらにその後に完全長ＪＨ１が続く。
【０５０２】
ＯＮ−Ｃ２３Ｄ２２２−２では、ＮＮＫコドンが配列番号８９８で示されるアミノ酸配列をコードするコドンにより置換される。次に、このＤＮＡをエラープローンＰＣＲに供し、適切なレベルの多様性を導入する。二重下線部分に相当するプライマーがエラープローンＰＣＲの間の変異をＣＤＲ３に限定する。
【表１８】
2013504602.tif 000021
【０５０３】
設計１（Ｃ２３Ｄ２２２）は、ＲまたはＫである９４、次いで、２Ｘ、ループ中に２つのＸを有する第２の読み枠によるＤ２−２、その後に続く２つのＸ、およびＪＨ１を有する。Ｄ２−２の第２の読み枠はジスルフィド閉ループを有し、その中に２点での多様性が導入されている。このＣＤＲ３は、２３の長さである。カッパＬＣおよびＨＣ  ＣＤＲ１／２のライブラリーに挿入するために増幅してＸｂａＩおよびＢｓｔＥＩＩに結合する前に、．．．ＹＹＣＡまで、およびＷＧＱＧ．．．からのＤＮＡを含むプライマーを使って、ＣＤＲ３のエラープローンＰＣＲを行うことができる。従って、固定して示しているＡＡは、少し変えることが許容されている。ＰＣＲオーバーラップ領域の一部であるＡＡは、最終的に非エラープローンＰＣＲにより増強される。エラープローンＰＣＲは、必ずしも設計に必要な要素ではない。
【表１９】
2013504602.tif 000022
【表２０】
2013504602.tif 000023
【０５０４】
設計２（Ｃ２３Ｄ３１０）は、ＲまたはＫとして９４、２つのＸ、第５および第８残基をＸに変えたＤ３−１０（ＲＦ２）、２Ｘ、ＳＹＹ、およびＪＨ１を有する。ＣＤＲ３は、２３ＡＡの長さで、エラープローンＰＣＲを使って、さらに多様化可能である。
【表２１】
2013504602.tif 000024
【表２２】
2013504602.tif 000025
設計３（Ｃ２３Ｄ３１０Ｂ）は、ＲまたはＫとして９４、ＸＺ、第２、第３、第５、および第７残基をＺ（Ｙ｜Ｓ）に、また、第８残基をＸに変えたＤ３−１０（ＲＦ２）、ＺＸＺＹＺ、およびＪＨ１（ＥをＸに変えて）を有する。Ｚは、ＹまたはＳである。ＣＤＲ３は、２３ＡＡ長さで、エラープローンＰＣＲを使ってされに多様化可能である。
【表２３】
2013504602.tif 000026
【表２４】
2013504602.tif 000027
【０５０５】
設計４は、長さ３５のＣＤＲ３を有する。残基９４は、ＫまたはＲでよく、次にＹＹＳ：：Ｘ：：ＳＹＹ：：Ｘ：：Ｄ３−２２（第２のＲＦの１つのＳをＸに変え、また３Ｚに変えて）：：Ｘ：：ＹＹＳ：：Ｘ：：ＹＺＺＺ：：ＪＨ１（２Ｚに変える）の配列。エラープローンＰＣＲを使って、さらに多様化可能である。
【表２５】
2013504602.tif 000028
【表２６】
2013504602.tif 000029
設計５（Ｃ２３Ｄ２２２ｂ）は、設計１類似であるが、Ｚ（ＹまたはＳ）可変コドンを多用している。このＣＤＲ３は、２３の長さである。
【表２７】
2013504602.tif 000030
【表２８】
2013504602.tif 000031
【表２９】
2013504602.tif 000032
【表３０】
2013504602.tif 000033
【表３１】
2013504602.tif 000034
【表３２】
2013504602.tif 000035
【表３３】
2013504602.tif 000036
設計９
設計９は、Ｄセグメントが右に移動していることを除いて、設計８に類似である。
【表３４】
2013504602.tif 000037
【表３５】
2013504602.tif 000038
【表３６】
2013504602.tif 000039
設計１０（Ｃ２４Ｄ３１０Ｂ）は、設計３に類似であるが、ＣＤＲ３は、長さ２４である。設計１０は、９４がＲまたはＫで、それに続いて、ＸＺＺ、第２、第３、第５および第７残基をＺ（Ｙ｜Ｓ）とし、さらに第８残基をＸに変えたＤ３−１０（ＲＦ２）、ＺＸＺＹＺ、ならびにＪＨ１（ＥをＸに変えて）と続く配列を有する。Ｚは、ＹまたはＳである。ＣＤＲ３は、２４ＡＡの長さで、エラープローンＰＣＲによりさらなる多様化が可能である。
【表３７】
2013504602.tif 000040
【表３８】
2013504602.tif 000041
【表３９】
2013504602.tif 000042
【０５０６】
設計１３
設計１３は、定常部全体にわたりオーバーラップする２つのＤＮＡ断片作ることができるようにＺの集団の中央に生殖細胞系列Ｄセグメントを置いている。ＨＣ  ＣＤＲ３は、３４の長さで、多様性は、２２３〜８ｘ１０６である。
【表４０】
2013504602.tif 000043
【０５０７】
設計１４
設計１４は、Ｄセグメントがほとんど生殖系列であること以外は、設計９と類似である。
【表４１】
2013504602.tif 000044
【０５０８】
設計１５
設計１５は、オーバーラップ中に５つの２方向フリップフロップの多様性を許容する。３２オーバーラップ配列があるのみで、ミスマッチがあったとしても、許容された多様性が変わることはないであろう。
【表４２】
2013504602.tif 000045
【０５０９】
設計１６
設計１６は、３５の長さのＣＤＲ３を提供する。オーバーラップ中に４つの２方向フリップフロップがあり、従って、１６配列になる。
【表４３】
2013504602.tif 000046
Ｃ３４Ｄ２２５．２ＡおよびＣ３４Ｄ２２５．２Ｂをこの混合物に添加した場合、長さ３３、３４、および３５の長さのＣＤＲ３が得られる。
【表４４】
2013504602.tif 000047
【０５１０】
【表４５】
2013504602.tif 000048
【０５１１】
【表４６】
2013504602.tif 000049
【０５１２】
【表４７】
2013504602.tif 000050
設計１９は、長さ３５のＣＤＲ３を有する。残基９４は、ＫまたはＲでよく、ＺＺＺＺＺＺＺＺＺ：：Ｄ３−２２（６つのＹをＺとして含む第２ＲＦ）：：ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ：：ＪＨ１（１Ｚを含む）の配列である。エラープローンＰＣＲを使って、さらに多様化可能である。
【表４８】
2013504602.tif 000051
【０５１３】
【表４９】
2013504602.tif 000052
【０５１４】
設計２０は、３３、３４、または３５の長さのＣＤＲ３を有する。残基９４は、ＫまたはＲでよく、ＺＺＺＺＺＺ（Ｚ）ＺＺ：：Ｄ３−２２（６つのＹをＺとして含む第２ＲＦ）：：ＺＺＺＺＺＺＺ（Ｚ）ＺＺＺ：：ＪＨ１（１Ｚを含む）．（Ｃ３５Ｄ３２２ＡＪＨ１＿Ｔ）、（Ｃ３４Ｄ３２２ＡＪＨ１＿Ｔ）、（Ｃ３５Ｄ３２２ＡＪＨ１＿Ｂ）、および（Ｃ３４Ｄ３２２ＡＪＨ１＿Ｂ）のＰＣＲによる結合で、長さならびに配列の多様性が得られる。
【表５０】
2013504602.tif 000053
【０５１５】
停止コドンに対する選択：
これらのライブラリーの一部はＮＮＫコドンを有するため、ライブラリーは、いくつかのＴＡＧ停止コドンを持つことになる。ｂｌａ遺伝子用のシグナル配列および実際のｂｌａタンパク質の間のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位に増幅ＤＮＡを挿入し、Ｓｕｐ０細胞中で発現させることにより、ＴＡＧを有するクローンを除去することができる。ＢｌａＲコロニーは、ＴＡＧ停止コドンを含まない。別の方法としては、カナマイシン耐性遺伝子の前にＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を挿入し、ＫａｎＲで選択することができる。次に、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩカセットをファージライブラリー中に導入することができる。
【０５１６】
また、ｗｏｂｂｌｉｎｇはいくつかの停止コドンを許容するため、ｂｌａ遺伝子用のシグナル配列および実際のｂｌａタンパク質の間のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位に増幅ＤＮＡを挿入し、Ｓｕｐ０細胞中で発現させることにより、停止コドンを有するクローンを除去してライブラリーを改善することができる。ＢｌａＲコロニーは、ＴＡＧ停止コドンを含まない。別の方法としては、カナマイシン耐性遺伝子の前にＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を挿入し、ＫａｎＲで選択することができる。次に、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩカセットをファージライブラリー中に導入することができる。
【表５１】
2013504602.tif 000054
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【表５２】
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表１１：ヒトＤセグメントから抽出可能な三量体
【０５１７】
表１１〜１４で、アミノ酸配列中の小文字は、停止コドンが小文字の残基に変えられたことを示す。例えば、アミノ酸配列「ｙＬＥ」では、Ｔｙｒ残基が停止コドンの位置に導入された。
【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【０５１８】
実施例３：６〜２０の長さのＨＣ  ＣＤＲ３。
合成ＨＣ  ＣＤＲ３へのＤセグメントの挿入により、より大きな安定性とさらに低い免疫原性を得ることができる。ＶＨを任意選択のある長さのフィラーに結合し、これをＤセグメント、任意選択の第２のフィラーおよびＪＨに結合することにより、アミノ酸レベルでライブラリーの設計を行った。長さ６または８のライブラリーに対しては、ＶＨと短いフィラーの後に完全長ＪＨを連結できる。表２０は、１つまたは別の標的に対する結合によりＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０から選択した２１、５７８Ａｂの抽出検体中におけるＤセグメントの頻度を示す。検体中で、１０、４３９Ａｂは、検出可能なＤセグメントを有していなかった（すなわち、９以下の連続塩基であり、４２未満のスコアであった）。Ｄセグメントが使われている場合は、Ｄ３−２２．２（１２９０）、Ｄ３−３．２（１２３６）、Ｄ６−１９．１（８６６）、Ｄ３−１０．２（７２４）、Ｄ６−１３．１（６３８）、Ｄ５−１８．３（４０４）、Ｄ３−１０．１（３９６）、Ｄ６−１３．２（３８３）、Ｄ１−２６．３（３３３）、Ｄ３−１０．１（３９６）、Ｄ３−１６．２（３０５）、Ｄ４−１７．２（２９７）、Ｄ６−１９．２（２８６）、Ｄ３−１０．３（２８１）、Ｄ３−９．２（２３９）、Ｄ５−１２．３（２３５）、Ｄ２−１５．２（２３３）、Ｄ６−６．１（２２１）、Ｄ１−２６．１（１９１）、Ｄ２−２．２（１７５）、Ｄ６−６．２（１４５）、Ｄ２−２．３（１４２）、Ｄ４−２３．２（１３６）、Ｄ５−２４．３（１２６）、Ｄ３−３．３（１２１）、Ｄ３−３．１（１１４）、Ｄ１−７．３（１１１）、およびＤ６−１９．３（１０６）のＤセグメントが多い。括弧中の数字は、２１、５７８Ａｂ検体中の表記名称Ｄセグメントの出現回数である。一実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲ３は、ライブラリーのほとんどのメンバーがヒトＤセグメントから取り出した３〜１０アミノ酸セグメントを有するように構築される。一部の実施形態では、Ｄセグメントは、多様化される。一部の位置は固定され、他の位置を多様化して、Ｄセグメントのアミノ酸がその位置で最も出現頻度の多いアミノ酸であるようにすることができる。
【０５１９】
親のアミノ酸配列が設計されるとすぐに、エラープローンＰＣＲ、ｗｏｂｂｌｉｎｇ、およびｄｏｂｂｌｉｎｇ、等のいくつかの方法により多様化可能である。表１４は、ヒトＤ領域から誘導されうる六量体の数を示す。一実施形態では、システイン残基を含む六量体は除外される。一実施形態では、停止コドンを含むＤ領域の断片は除外される。一実施形態では、Ｄ領域で見つかったどのＴＡＧコドンも、ＴＣＧ、ＴＴＧ、ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＡＡＧ、ＴＡＴ、およびＧＡＧを含むセットから選択されるコドンで置換される。一実施形態では、Ｄ領域で見つかったどのＴＡＡコドンも、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＴＡＴ、およびＧＡＡを含むセットから選択されるコドンで置換される。一実施形態では、Ｄ領域のどのＴＧＡも、ＴＧＧ、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＡＧＡ、およびＧＧＡを含むセットから選択されるコドンにより置換される。
【０５２０】
表２１は、６〜２０アミノ酸のＣＤＲ３用の代表的親アミノ酸配列を示す。これらの親配列は、ＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性と組み合わせてライブラリーを形成することができる。ＣＤＲ３領域が、例えば、ＣＤＲ３のｗｏｂｂｌｉｎｇ、ｄｏｂｂｌｉｎｇ、またはエラープローンＰＣＲにより多様化される場合は、有用性が改善されそうである。表２１で、配列６ａは、全ＪＨ１に融合した３−２３由来のＶＨ末端を含む。配列６ｂは、３−２３の末端を含み、これにＹ、Ｄ４−１７（ＲＦ２）、ＪＨ１のＦＲ４領域と順に結合している。配列６ｃは、３−２３の末端を含み、これにＤ５−５（ＲＦ３）、さらにＪＨ１のＦＲ４部分が続く。配列６ｄは、３−２３の末端を含み、これに、ＳＹが結合し、さらにＳＹに全ＪＨ４が結合している。表２１は、ＣＤＲ３のｗｏｂｂｌｉｎｇに適切と思われるドーピングのレベルを示すが、他のレベルも充分使用可能である。他のＤ領域またはＤ領域の断片も使用可能である。他のＪＨ配列の使用可能である。
【表５７】
2013504602.tif 000068
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2013504602.tif 000070
表２２：ＨＣディスプレイカセット  
表２２のアミノ酸配列は、配列番号８９２である。
表２２のＤＮＡ配列は、配列番号８９３である。
【表５８】
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表２５：生殖系列Ｏ１２カッパ軽鎖試料を含むＤＹ３Ｆ８５ＬＣのＤＮＡ配列。  示した抗体配列は、実際の抗体の形であるが、特定の抗原に対する結合については特定されていない。
各行で、感嘆符（！）の後の全ての記載は、コメントである。
ＤＹ３Ｆ８５ＬＣのＤＮＡは、配列番号２７である。
【表５９】
2013504602.tif 000075
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2013504602.tif 000077
【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【０５２１】
実施例４：ＣＤＲのＤｏｂｂｌｉｎｇ
次の実施例は、合成ライブラリー構築におけるｄｏｂｂｌｉｎｇの使用に関する典型例を示す。親３−２３重鎖（ＨＣ）をＣＤＲ１、２、および３で多様化する。この多様性は、合成的に多様化されたＡ２７軽鎖（ＬＣ）と組み合わされる。多様性は次の通り：
【０５２２】
実施例４．１  ＨＣ  ＣＤＲ１
次のｄｏｂｂｌｉｎｇの多様性により、５、８３２変異体が許容される。表５０参照。位置３１で、Ｓｅｒは、生殖系列（ＧＬ）アミノ酸タイプである。従って、Ｓｅｒを、例えば、他のタイプより３倍多く出現する可能性があるようにつくる。１８タイプが許容されるので、Ｓｅｒは１５％の確率で許容され、他の全てが５％で許容される。従って、ＡＡタイプの選択を行わなければ、位置３１でＳｅｒを有するＡｂをより多く単離するであろう。同様に、３３の位置で、ＧＬＡＡタイプは、Ａｌａであり、Ａｌａを、例えば、他のもの（５％）より３倍多く（１５％）出現する可能性があるように作る。位置３５では、ＳｅｒはＧＬＡＡタイプで、Ｓｅｒを、例えば、他のものより３倍多く現れる可能性があるように作る。このような全位置で、ＣｙｓとＭｅｔを除外した。Ａｂの溶解度と反応性に悪影響を与える有用でないジスルフィド、および露出した不対システインを所望しないので、Ｃｙｓを除外する。露出メチオニン側鎖は、結合特性および保存可能期間を変化させる可能性がある酸化の対象であるという理由で、除外する。生殖系列アミノ酸タイプを他のＡＡタイプより、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍多く存在する可能性があるように作成することが可能である。従って、ＧＬＡＡＴは、許容ＡＡＴの２／１９、３／２０、４／２１、５／２２、６／２３、７／２４、８／２５９／２６、または１０／２７の構成要素になることができる。
【０５２３】
表５４は、位置５３にＮを許容しないＨＣ  ＣＤＲ１の多様性を示す。Ｓｅｒは、位置５５ではＧＬＡＡＴであり、位置５３でＮを許容することにより、位置５３〜５５でＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を作る確率が高いであろう。位置５３のＡはＧＬＡＡＴであり、位置５１〜５３でのＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）形成の可能性は低いために、位置５５のＮは保持される。
【表６４】
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【表６５】
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【０５２４】
本開示の全体を通して、「許容」と示されているアミノ酸は、所与の位置で使用可能なアミノ酸である。例えば、表５０で、位置３１で許容アミノ酸「ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＮＰＱＲＳＴＶＷＹ」が示されている。これは、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの全てが位置３１で許容されることを示している。
【０５２５】
実施例４．２：ＨＣ  ＣＤＲ２
ＣＤＲ２では、位置５０、５２、５２ａ、５６、および５８で多様性が許容される（表５１に示すように）。５０、５２、５６、および５８では、ＣｙｓとＭｅｔを除く全アミノ酸タイプを許容し、ＧＬＡＡタイプを３倍多く現れる可能性があるように作成する。ＧＬＡＡタイプを、他のＡＡタイプより２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍多く現れる可能性があるように作成することが可能である。
【０５２６】
表５５は、位置５０〜５２でのＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の高出現頻度を避ける修正された多様性を示す。表５４と５５を使って、ＨＣ  ＣＤＲ１／ＣＤＲ２の多様性２．１８４Ｅ９を得る。位置５２、５６、および５８では、ＣｙｓとＭｅｔを除く全てのアミノ酸タイプが許容される。位置５０では、Ｃ、Ｍ、およびＮ以外の全てのＡＡＴが供される。ＧＬＡＡタイプが、例えば、３倍、多く現れる可能性があるように作成される。ＧＬＡＡタイプを、他のタイプよりも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍多く現れる可能性があるように作成することができる。
【表６６】
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【表６７】
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【０５２７】
表５０および表５１に示すＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性を組み合わせた多様性は、２．４５Ｅ９となる。
【０５２８】
実施例４．３：別の好ましい形のＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性を表１９０に示す。これらの多様性は、一部は、種々のソース由来の抗体の調査をもとにしたものである。この多様性のバージョン１では、ＣＤＲ１は１９４４配列が許容される。この実施形態では、位置３１は、ＤＧＡＳＮＲのみが許容される。位置３３と３５では、ＣｙｓとＭｅｔを除く全てのＡＡＴが許容される。Ｃｙｓは、所望でない異質のジスルフィドまたは露出された不対シスチン（両方とも好ましくない）を防ぐために除外される。Ｍｅｔは、メチオニンが選択されるのを防ぐために除外される。結合部位にメチオニンがあると、Ａｂの保存可能期間を短くする傾向がある。結合部位でのＭｅｔの酸化は、Ａｂの結合特性を変化させる可能性が非常に高い。位置３１、３３、および３５は、これらの位置のアミノ酸側鎖が、抗体結合部位の方を向いているという理由で、多様性付与の目的のために選択される。このような位置にあるメチオニンは、酸化されると結合特性を大きく変える可能性が高い。表１９０の多様性のバージョン２では、位置３１は、ＣｙｓとＭｅｔ以外の任意のＡＡＴに対して許容されている。多様性は、５、８２２である。
【０５２９】
ＣＤＲ２の多様性のパターンは、バージョン１および２に対し同じである。それぞれは、ＣＤＲ２で１．４９Ｅ６アミノ酸配列を許容する。位置５０では、ＹＲＷＶＧＳＥＡが許容され、陽（Ｒ）または陰（Ｅ）電荷が選択できる。位置５２では、ＣｙｓとＭｅｔ以外の全てのＡＡＴが許容される。位置５２ａでは、小さい、および嵩高い側鎖の両方が許容される。５３では、ＤＧＡＳＮＲが使用でき、陽性のおよび陰性の側鎖ならびに水素結合側鎖が許容される。５５では、ＧまたはＳが許容される。５６では、ＣｙｓとＭｅｔ以外の全てのＡＡＴが許容される。５８では、ＹＲＷＶＧＳＥＡが許容される。組み合わされた多様性は、２．９Ｅ９および８．７Ｅ９である。どの置換であっても、抗体を破壊するとは考えられないので、アンダーサンプリングが許容される。５．Ｅ８の抽出検体は、ＣＤＲ１−２の非常に有益な多様性を与えるであろう。２．Ｅ９の抽出検体が好ましい。５．Ｅ９の抽出検体ならさらに好ましい。
【０５３０】
バージョン３では、位置５４でＧｌｙおよびＰｈｅが許容される。これは、ＡｂをＣＤＲ２中の１−６９に似させる；１−６９は、ウイルス標的の結合剤として選択されることが多い。さらに、位置５３の許容ＡＡＴにＩｌｅが追加された。バージョン３では、位置３３、５２、５３、および５６からＮを除外した。５３でＱが許容される。バージョン３のＣＤＲ１の多様性は１８９０である。ＣＤＲ２の多様性は５．９７Ｅ＋０６である。組み合わされた多様性は、１．１３Ｅ＋１０である。１．Ｅ６、３．Ｅ６、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８または３．Ｅ８のライブラリーが適切であろう。
【０５３１】
バージョン１、２、および３で、許容ＡＡＴのリスト中の最初のＡＡＴは、生殖細胞系列ＡＡＴである。これは、他の全てのＡＡＴより２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、または１０−倍出現頻度が高い可能性がある。
【０５３２】
ＦＲ２中の特有のＢｓｔＸＩ制限酵素部位のために、ＣＤＲ１とＣＤＲ２を組み換えることができる。
【表６８】
2013504602.tif 000090
2013504602.tif 000091
【０５３３】
実施例４．４  長さ３、４、５のＨＣ  ＣＤＲ３
ｄｏｂｂｌｉｎｇにより非常に短いＣＤＲ３を作製可能である。表７は、ＣＤＲ３長さ３用のいくつかの親配列を示す。９４では、多くのＶＨ３がＡｒｇを有し、この変化を許容するが、Ｌｙｓが３倍多く現れる可能性があるように作成する。９５では、ＪＨ１のこの位置にＦが認められる。さらに、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、およびＡｒｇならびに小さいもの、大きいもの、プラス電荷、およびマイナス電荷を許容する。９６では、ＪＨ１はＱを有する。Ｑは、Ｇｌｕに非常に似ているので、酸性の代替ＡＡとしてＧｌｕ、ならびにＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕを許容する。９７では、ＨｉｓはＪＨ１由来の生殖系列ＡＡである。マイナスチャージ（Ｄ）、プラスチャージ（Ｒ）、小極性（Ｓ）、大きな疎水性（Ｙ）、および脂肪族（Ｌ）を許容する。親配列がライブラリーの４．５％を占めるが、これをＣＤＲ１およびＣＤＲ２の大きな多様性と組み合わせる。ｄｏｂｂｌｉｎｇは全部で３６０配列をあたえる。最も出現頻度が少なそうな配列は、１／１７９２の確率で発生する。最も発生頻度の大きい（親）配列は、約１／２２の確率で発生する。Ｋ９４を３−２３用の生殖系列であるＬｙｓとして維持することも、また、本発明の範囲に含まれる。
【表６９】
2013504602.tif 000092
【０５３４】
表６１は、ｄｏｂｂｌｉｎｇを行った長さ３のＨＣ  ＣＤＲ３を示す。ここで、Ｋ９４をＷ１０３として固定している。「親」のＤセグメントアミノ酸を他の許容ＡＡタイプより５倍多く現れる可能性があるように作成した。
【表７０】
2013504602.tif 000093
【０５３５】
この実施例では（表６２、表８由来のＶ−４ＪＨ２を使って）、９４をＬｙｓに固定している。９５には、ＪＨ２はＴｙｒを有しているが、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、およびＬｅｕを許容して、抗原に適合させるために、サイズ、チャージ、および疎水性を変えることができるようにする。９６でＪＨ２はＰｈｅを有するが、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、およびＬｅｕを許容した。９７では、ＪＨ２はＡｓｐを有するが、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕを許容した。９８では、ＪＨ２は、Ｌｅｕを有するが、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、およびＡｒｇを許容した。このパターンでは、７５０の異なる配列を与え、この中で親が最も多く現れそうである（１／１８）。最も出現が少なそうな配列は、１／４６０８の確率で発生し、最も発生しそうなものに比べ２５６倍少ない。
【０５３６】
【表７１】
2013504602.tif 000094
【０５３７】
表６３では、表８由来のＶ−４Ｄ３−１０．１ａ−ＪＨ２のｄｏｂｂｌｉｎｇがある。９４で、ＬｙｓおよびＡｒｇを許容し、Ｌｙｓ（親の）がＡｒｇより存在の可能性が４倍高い。９５では、Ｄ３−１０．１ａ（すなわち、第１の読み枠によるＤ３−１０で、ＡＡ１から開始）は、Ｌｅｕを有する；ＳＹＤＲを許容し、同様に他のタイプのＡＡよりＬｅｕの存在の可能性が４倍高い．９６では、Ｄ３−１０．１ａはここでもＬｅｕを有し、これに対しても同じ選択を許容する。９７では、Ｄ３−１０．１ａは、Ｔｒｐを有し、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、およびＡｒｇを許容するが、同様にＴｒｐの存在の可能性が４倍高い。９８では、Ｄ３−１０．１ａは、Ｐｈｅを有し、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、およびＡｒｇを同様に許容する。
【表７２】
2013504602.tif 000095
【０５３８】
実施例４．５：長さ１０〜２０のＨＣ  ＣＤＲ３
ＨＣ  ＣＤＲ３
長さ１６ＣＤＲ３を含む２つのサブライブラリー：
【表７３】
2013504602.tif 000096
【表７４】
2013504602.tif 000097
【０５３９】
表６５は、配列番号８９８のｄｏｂｂｌｉｎｇによる多様性を示す。全体の多様性は、２．１Ｅ１３である。１．Ｅ８、３．Ｅ８、５．Ｅ８、１．Ｅ９、または５．Ｅ９の多様性を作る合成法は、適切な多様性を得る見本になるであろう。配列番号８９８の設計については、前に考察した。配列番号８９８のｄｏｂｂｌｉｎｇでは、ほとんどの位置で、他のＡＡタイプより３倍多い親のＡＡタイプの出現を許容することになる。親がＴｙｒである位置では、従って、ＴｙｒとＳｅｒを等量とし、Ｌｅｕの頻度をこれらの半分とする。Ｃｙｓ残基は固定する。各親ＡＡタイプは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕ（親が疎水性、例えば、Ｐｈｅ、の場合は、Ｌｅｕは除外されうる）の内の１つになるよう許容される。親配列は、１／１．Ｅ８で発生する。最も可能性の少ない配列は、１／９．５Ｅ１６で発生する。ライブラリーが実際に親配列を含むことは重要ではなく、多くの親に似た配列を含むことが重要である。従って、１．Ｅ７、５．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、または５．Ｅ９を含むライブラリーは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３の多様性と組み合わせると、多くの貴重なＡｂを含むライブラリーを提供できることになる。
【表７５】
2013504602.tif 000098
【０５４０】
実施例４．６  ｙｙｃａｋＧＳＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＦＤＹｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ（配列番号９３１）のＤｏｂｂｌｉｎｇ（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ６１）
表８０は、配列番号９３１のｄｏｂｂｌｉｎｇの結果を示し、長さ１５のＨＣ  ＣＤＲ３の例である。位置９４は、ＦＲ３の一部で、一定に保持される。位置９５および９６は、「親」アミノ酸タイプ高頻度で使われるセット（ＹＧＤＲＳ）から選択され、Ｇ９５およびＳ９６である。次の１０箇所の位置は、Ｄ２−１５．２（中程度の頻度で使われるジスルフィド閉ループ含有Ｄセグメント）から組み込まれる。最後の３箇所の位置は、表３に示すように、ＪＨ４の位置１００、１０１、および１０２由来である。各位置で、他の許容タイプよりも、親アミノ酸タイプが３倍多く現れる可能性があるように作成する。Ｃｙｓ残基は固定する。１０２ｅでは、ＹＧＳＲＤよりもＰｈｅが３倍多く現れる可能性がある（すなわち、Ｐｈｅは、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｒ、またはＤのいずれかのアミノ酸よりも３倍多く現れる可能性がある）。多様性は、１．４６Ｅ９が得られる。親配列は、１／６．９Ｅ４で出現することが期待される。それぞれが単独で置換された配列になるのは、約１／３の可能性となる；２つ共に置換されるのは、１／９の可能性となる、等々。他のＡＡタイプを全て含む配列の発生確率は、１／１．１Ｅ１１に過ぎない。
【０５４１】
表２１の他の配列のそれぞれも、同じ手法でｄｏｂｂｌｉｎｇ可能である。
【表７６】
2013504602.tif 000099
【０５４２】
実施例４３：フレームワークとしてＶＨ３−６６の使用
本発明の方法は３−２３以外のＨＣにも使用可能である。例えば、ＶＨ３−６６に対し使用可能である。表３５００には、ＳｆｉＩからＮｈｅＩまでのこの遺伝子の部分が、本開示の他の例のいずれかのＳｆｉＩ−ＮｈｅＩ部分を置換し、実行可能なディスプレイまたは発現遺伝子を産生することができるという点で、本開示のベクターと適合する遺伝子を示す。表３５００ｎ遺伝子は、５’側でＳｆｉＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｒＧＩ、およびＢｌｐＩ、ならびに３’側でＸｂａＩおよびＳａｌＩに取り囲まれたＣＤＲ１を有する。ＣＤＲ２は、５’側でＸｂａＩおよびＳａｌＩ、ならびに３’側でＸｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＡｐａＬＩに結合している。ＣＤＲ３は、５’側でＸｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＡｐａＬＩ、ならびに３’側でＢｓｔＥＩＩ、ＳａｃＩ、およびＮｈｅＩに結合している。
【０５４３】
トラスツズマブは、３−６６に類似のフレームワークを有する。Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９、３２３：１６１０−４）は、トラスツズマブをベースにして、ＨＣ中の残基を多様化し、抗体の二重結合を最適化した。多様化した位置は、ＣＤＲ１の３０〜３３、ＣＤＲ２の５０、５２−５４、５６、および５８、ならびにＣＤＲ３の９５〜１００であった。我々は、位置ＨＣ  ＣＤＲ１の３０−３３、ＨＣ  ＣＤＲ２の５０、５２−５４、５６、および５８、ならびにＬＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ３に多様性を導入する予定である。このような状況に対し、本開示のいずれのＣＤＲ３設計も導入可能である。制限酵素部位が異なるので、プライマーは異なるであろうが、当業者なら、設計を容易に適合させることができる。
【表７７】
2013504602.tif 000100
2013504602.tif 000101
【０５４４】
実施例４４：多様化トラスツズマブ
表３５０８は、ファージ上でトラスツズマブのＨＣを提示するために使用可能な遺伝子断片を示す。本開示のいずれかのベクターを使って、ＳｆｉＩからＮｈｅＩへのセグメントの置換により、トラスツズマブのＨＣの発現または発現と提示を行うベクターを産生する。トラスツズマブのＬＣまたはＬＣのライブラリー、例えば、多様化Ａ２７ＬＣのライブラリーを使うこともできる。表３５０８で、残基の上部のアステリスクは、Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９、３２３：１６１０−４）がＨＥＲ２ならびにＶＥＧＦの両方に結合するトラスツズマブをベースにした抗体の結合を微調整してその位置を多様化したことを示す。トラスツズマブは、２アミノ酸のＪｓｔｕｍｐを有するＪＨ４を使用することに注意のこと。
【０５４５】
多様性は、星印の位置でＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２中に導入可能である。さらに、本開示のＣＤＲ３多様化用のいずれかの設計をトラスツズマブのフレームワークに容易に適応させて、類似の提示を可能にすることができる。
【表７８】
2013504602.tif 000102
2013504602.tif 000103
【０５４６】
実施例５：合成軽鎖多様性
全抗体を作るためには、重鎖のライブラリーを軽鎖のライブラリー（ＬＣ）と組み合わせる必要がある。天然のＡｂでは、ＨＣがほとんどの結合を行い、多くのライブラリーがＬＣに対しわずかの注目しか払っていない、またはＬＣの多様性をヒトドナーから得ているということがよく見受けられる。十分な多様性もって、ほとんどの標的に対する良好な結合剤を得るために、ヒト免疫系が通常提供するものを超える多様化プログラムを設計した。にもかかわらず、プログラムは、天然のＡｂで見られるのと同じ種類の変化であるが、それより少し多くの変化を有する完全機能性ＬＣを得るよう設計される。ＶｋａｐｐａＩＩＩ  Ａ２７がＬＣとして選択された。
【０５４７】
ドナーから提供されたカッパおよびラムダＬＣを含むライブラリー由来の、１２６６Ａｂのコレクションを分類した。ＶＫＩＩＩの中で、Ａ２７が最も頻度が高く（表６６）、またＨＣ３−２３との対形成も良好である。
【０５４８】
Ａ２７のＣＤＲは、１２、７、および９アミノ酸を含む。１４７６  Ａ２７  ＬＣのコレクション中で、１２９１は長さ１２のＣＤＲ１を有し、１８１は長さ１１のＣＤＲ１を有する（表３００５）。同じ検体中で、１４３９は長さ７のＣＤＲ２を有し、３７は長さ８のＣＤＲ２を有する。ＣＤＲ３で、頻度の高い長さは、８（１７９）、９（８３５）、１０（３１２）、および１１（８８）である。これらの位置の全てに対する多様性の導入は、うまくいかない可能性がある：すなわち、ａ）多くの不安定、または非機能性のメンバーが存在する可能性がある、およびｂ）一部の位置での多様性が結合の改善を支援しない可能性がある。そこで、可変位置の数を２８から１６に減らした。ＣＤＲ１で１つのアミノ酸の欠失を許容する。長さ８、９、および１０のＣＤＲ３を許容する。
【０５４９】
Ａ２７ＬＣを有する１ＱＬＲの３Ｄ構造を調査した。１ＧＬＲ構造は、ＲＣＤＢタンパク質データベースから公に入手可能である。これにより、表６８でマークした残基が可変用に有用であるように見える。Ｔ５６は、ＨＣ  ＣＤＲ３中でＨｉｓから約１０Aである。５６での変化は、有用である可能性がある。Ｇ２４は、ＨＣ  ＣＤＲ３中の原子から約７Aに過ぎない。生殖系列はＲ２４である；従って、２４での変化は有用である可能性がある。
【０５５０】
表６９は、ｐＭＩＤ２１中で使用するために設計したディスプレイカセットを示す。従って、選択された制限酵素はｐＭＩＤ２１中で他の部位を持てない。ＳｐｅＩは、ｉｉｉシグナル配列中にあり、ＡｓｃＩは、停止コドンの丁度後ろにあるため、全体ＬＣが挿入されるか、または除去されることになる。ＸｍａＩ、ＰｐｕＭＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、およびＢｌｐＩは、ＣＤＲ１の前にある。ＳａｃＩＩはＦＲ２中にあり、ＣＤＲ１とＣＤＲ２分離する。あるいは、ＡｖｒＩＩ部位を同じ位置に挿入可能である。ＢｓｐＥＩおよびＸｈｏＩ部位はＦＲ３中にあり、ＫｐｎＩ部位はＦＲ４中にある。
【０５５１】
１４３９Ａ２７配列を集め、ＣＤＲ中で起こっていることを分析した。表７０、表３００２（ＣＤＲ１）、表３００３（ＣＤＲ２）、および表３００４（ＣＤＲ３）は、分析結果を示す。表７０では、我々のライブラリー由来のＡｂで何がわかるか、また、各位置で何を導入するかを示す。特に表７０は、各位置に対する生殖系列ＡＡＴ以外の各タイプのアミノ酸の数を示す。全体の要約は、表３００１〜３００３に示す。位置は、３つのカテゴリーに入る：生殖系列アミノ酸タイプ（ＡＡＴ）として固定した位置、生殖系列の親から変更した位置、および挿入される位置。生殖系列ＡＡＴを５５％の確率でコード化する、生殖系列ＡＡＴを変化させる場合は、それぞれ７％の確率で許容される５つのＡＡＴ、およびそれぞれ２％の確率で許容されるさらに５つのＡＡＴが存在する。一部のケースでは、かなり高い頻度で出現するＡＡＴは除外される。ＭｅｔまたはＣｙｓ残基は許容されない。Ａｓｎは、次の生殖系列ＡＡＴがＧｌｙの場合は、除外される。生殖系列ならびに最も多く出現する１０の変異（全１９の可能な変異体ではなく）を選択することにより、配列の数を約１４、２８５倍減らす。
【０５５２】
表７７０は、Ａ２７ＣＤＲ１およびＣＤＲ３中の多様性パターンを示す。このパターンは、１３バージョンのＣＤＲ１および２３バージョンのＣＤＲ３を許容する。これらを組み合わせると、全体多様性は２９９となる。
【表７９】
2013504602.tif 000104
【０５５３】
ＣＤＲ１
Ｒ２４、Ａ２５、およびＳ２６は、手を貸すには結合部位から離れすぎているため、固定される。Ｖ２９の側鎖は、埋没しているので、この位置はＶａｌとして固定される。他の位置では、ＹまたはＳ、電荷のフリップフロップ（問題にしている位置で検体がより多くのＥまたはＤを有する場所に依存して、ＲＥまたはＲＤ）ならびによく出現する他のタイプが許容される。多様性のこのパターンは、「他の」ＡＡが５％置換される場合は、親配列を０．８％にし、「他の」ＡＡが６．５％置換される場合は、親配列を０．１％にして、さらに「他の」ＡＡが９％置換される場合は、親配列を０．０２％にするが、これをエクセルのスプレッドシートを使って求めた。１５５の検体の内、１７が１つのＡＡを欠失している（１ＱＬＲを含む）；従って、約８％のメンバーが欠失したＳ３０ａを有するよう配置する。
【０５５４】
ＣＤＲ２
１ＱＬＲの検査により、ＣＤＲ２は結合部位から幾分離れていることが解った。これが、このＣＤＲの残基を固定するという示唆となった。３Ｄ構造の調査は、Ｇ５０、Ｓ５３、およびＴ５６の多様性は、有用でありうることを示唆している。Ｓ５３は、１５５の検体中で最も変化しているが、このことは、これらの変化が有用であることを立証するものではない。１ＱＬＲでは、Ｇ５０はＲ５０に変異している。Ｔ５６の側鎖は、ＨＣ  ＣＤＲ３の方を向いており、ＨＣ  ＣＤＲ３中の原子から約１１Åである。
【０５５５】
ＣＤＲ３
Ｑ８９およびＱ９０は埋没しており、天然では、これらはほとんど変化していない；従って、これらの残基は変えない。Ｙ９１は、ＨＣ  ＣＤＲ３の方向に寄せられており、ここでの変化は結合部位を変える可能性があり、変化が発生している。Ｇ９２では、φ＝−８０およびψ＝−１５であり、Ｇｌｙ以外の挿入はありうる；天然ではそれが４７／１５５ケースで起きている。Ｓ９３は頻繁に変化または欠失する。Ｓ９３での、メンバーの１０％の欠失を許容する。Ｓ９４は、ひどく露出しており、大きく変化している。Ｐ９５は露出させ、変化させる。Ｐ９５の後ろの１つのアミノ酸の挿入がメンバーの３０％に対し許容される。Ｌ９６はＨＣ  ＣＤＲ３の方に寄せられており、ここでの変化は結合部位に影響を与えると思われ、天然では変化が発生している。Ｔ９７は埋没しており、一定に保持された／アミノ酸は変化させない。
【０５５６】
親配列は、０．０００２４６または１／４．０６Ｅ３の確率で現れる。与えられた多様性は、約２．１Ｅ１２である。
【表８０】
2013504602.tif 000105
【表８１】
2013504602.tif 000106
2013504602.tif 000107
【表８２】
2013504602.tif 000108
【０５５７】
表７２は、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の頻度を減らすよう調節されたＮの頻度を有するＡ２７カッパＬＣの多様性パターンを示す。２８の位置では、位置３０がほとんどＳであるために、ＮはＱに変えられている。Ｘ３０ａが存在し、Ｘ３２でＳが高頻度グループにある場合、Ｓ３１が優勢であるために、位置３０では、Ａは高頻度グループに移動され、Ｎは低頻度グループに移動されている。ＳがＸ３２で高頻度グループにあるために、位置３０ａでは、Ｄは高頻度グループに移動され、Ｎは低頻度グループに移動されている。５２がＳに固定されているため、位置５０では、ＮはＱに変えられている。９４がほとんどＳであるために、位置９２では、Ｎは低頻度グループに移動され、Ｒは、高頻度グループに移動されている。表７０に従ってＬＣ多様性を構築することは、好ましい実施形態である。
【表８３】
2013504602.tif 000109
2013504602.tif 000110
【表８４】
2013504602.tif 000111
【０５５８】
表７３は、Ａ２７カッパＬＣに対する別の多様性を示す。位置２８では、Ｎは許容されず、Ｑが許容される。位置３０では、Ｎは許容されず、Ｑが許容される。Ｓが位置３４で０．１５頻度でしか存在しないので、位置３２では、Ｎが保持される。これらの変化は、表７１に比べて、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の頻度を減らす。
【表８５】
2013504602.tif 000112
【０５５９】
親配列は、５．３２Ｅ−５または１／１．８８Ｅ４で出現する。
【０５６０】
単一の置換を有する配列は、見込み１．１Ｅ−５および７．５Ｅ−６の可能性で発生する。
【０５６１】
親ＡＡを含まない配列は、１／６．７Ｅ１６で起こる。
【０５６２】
許容多様性は、約２．３５Ｅ１２である。
【表８６】
2013504602.tif 000113
【表８７】
2013504602.tif 000114
【０５６３】
実施例６：ＨＣ  ＣＤＲ３  １６ｄ用のＷｏｂｂｌｉｎｇによるＤＮＡ（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ４４）
表４００は、ＦＲ３中のＸｂａＩ部位からＦＲ４中のＢｓｔＥＩＩ部位までのＤＮＡセグメントを示す。ＨＣ  ＣＤＲ３は、ＳＹＳＹ：：Ｄ２−２（２）：：ＱＨと、これに続くＪＨ１のＦＲ４領域からなる。ＱＨは、ＪＨ１の生殖系列中に認められる。Ｖ−Ｄ−Ｊ連結中で、免疫細胞がＶ、Ｄ、およびＪの末端を編集することが多い。従って、実際の免疫グロブリン遺伝子構築および成熟に際し可能性の高いものに対応した構築を行う。ｗｏｂｂｌｉｎｇによる合成によって、３−２３のＤ領域、または少し編集していくつかの変異を伴うＪＨ１との結合由来のものに似ている大きな遺伝子コレクションが得られる。ライブラリー１６ｄでは、おそらくジスルフィドを形成すると思われる２つのシステインがあり、これらはｗｏｂｂｌｉｎｇされない。
【０５６４】
表５００は、１６ｄライブラリーの各位置でのアミノ酸タイプの期待される分布を示す。ｗｏｂｂｌｉｎｇによるドーピングは、７３：９：９：９に設定された。最も可能性の高い配列は、表２１中の１つであり、４．８Ｅ−５の頻度で存在するはずである。配列の５５％のみが停止コドンを持たず、７４％がオーカー停止コドンまたはオパール停止コドンがない。ライブラリーがｓｕｐＥ細胞中で発現する場合は、これは重要な数である。本明細書の別の場所で考察したように、停止コドンを有する配列を除去することは、有益であろう。Ｓで始まるこれらの位置が、Ｓを５４％の確率で有し、Ｙを５．４％の確率で有すると予測され、一方、Ｙで始まるこれらの位置が、Ｙを４４％の確率で有し、Ｓを７．２％の確率で有することが理解されよう。各位置で、７〜９ＡＡタイプが１％超で存在する。１４多様化位置がある。最も効率的に標本抽出される配列では、約８１４＝４．３Ｅ１２に達する。
【表８８】
2013504602.tif 000115
【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【０５６５】
実施例７：合成ＨＣ  ＣＤＲ３のさらなる例
ヒトＦａｂ（ＦＡＢ−３１０およびＦＡＢ−４１０）の２つのライブラリーを解析した。これらのライブラリーのＨＣ  ＣＤＲ３をドナーＩｇＭ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅により得た。従って、これらの抗体は、ヒトＡｂを構築する際に免疫系が実際に行っている公平な状況を示してくれる。使ったプライマーは、全ＪＨおよび全ＶＨ領域の捕捉を可能とした。
【０５６６】
８８標的の内の少なくとも１つの標的に対してＥＬＩＳＡ陽性であった２４、０２６Ａｂを収集した。むろん、１９、９１９は異なるＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列を有している。このコレクションでは、免疫系が行っている本当の状態を知りたいので、親和性成熟由来のＡｂは除外した。さらに、２つ以上の標的に対して結合したＡｂを除外した。理由は、この現象が、これらのＡｂの粘着性を示しているからである。これにより入力数が２０、６７１に減少し、また、特徴的なＡｂの数が８６標的に対する１９、０５１に減った。
【０５６７】
ＣＤＲ３を数段回に分けて解析した。最初に、ＣＤＲ３およびＦＲ４の最後の４つのアミノ酸を結合し、対応する残基の６つのヒトＪＨ配列を比較した。ＣＤＲ３を最も整合性のよいＪＨに割り当て、一番小さい番号を付けたＪＨにする。ＪＨの決定後、アルゴリズムにより、ＣＤＲ３のどの部分がＪＨ由来かを決定する。表２２１で示すように、最大長のＪＨ（ＪＨ６）は、ＦＲ４の開始を定めるＴｒｐ−Ｇｌｙの前に９つのアミノ酸を有する。位置９から始めて位置１の方へと順に、アミノ酸の２つのミスマッチが発生するまで、または１つの配列がなくなるまで、決定したＪＨをＣＤＲ３の実際のアミノ酸と比較する。表２２４０は、アルゴリズムの例を示す；表２２４０で、Ｍは整合を意味し、Ｘは不整合を意味する。２つのエラーが見つかると、アルゴリズムは、１つ前の整合したアミノ酸に戻る（もしあれば）。整合したアミノ酸（０〜９）は、そのＪＨに対しＪＨｓｔｕｍｐが割り当てられ、その配列はＣＤＲ３から取り除かれる。ＪＨｓｔｕｍｐ（右側位置合わせ）の一覧表を、表２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、および２２１０に示す。
【０５６８】
最も使用頻度が高いので、ＪＨ４（表２２８）を使用する。表２２８から、Ｙ６がほとんど欠失しているのが解る。Ｆ７は、５０％を少し超える程度存在し、他方、Ｄ８Ｙ９はほとんどの検体中に存在する。（Ｆ／ｘ）７  Ｄ８  Ｙ９．Ｆ７のＨＣ  ＣＤＲ３末端が、例えば、５０％の確率で、存在し、一方、ｘがＤＪ  ｆｉｌｌでよく見られる１０の他のアミノ酸タイプのコレクションを示すように配置されたライブラリーを作成可能である。
【０５６９】
残りのＣＤＲ３残基は、Ｄセグメントを探す。最長のＤセグメントは１２残基を含む。従って、残りのＣＤＲ３の前と後ろに１１ブランクを付加する。次に、各Ｄをこの配列上にスライドし、次の点数を付ける。整合すると１ポイントを付加、２番目の整合が続くと２ポイントを付加し、さらに、これに３番目の整合が続くと３ポイントを付加する。４つ以上の整合が連続する場合は、４番目とそれ以降に対し３ポイントを付与する。最高の点数のＤセグメントをＣＤＲ３に割り当てる。Ｄセグメントとして受け入れるには、５以下のＤ残基に対しては、６ポイントが必要であり、さらに長いＤに対しては、７ポイントが必要である。表２０に示すように、１９、０５１Ａｂの内、８、５７２（４５％）でＤとして特定できるものがなかった。
【０５７０】
Ｄセグメントがある場合は、次に、残りのＣＤＲ３残基を：ａ）ＶＤ  ｆｉｌｌ、ｂ）Ｄ由来部分、およびｃ）ＤＪ  ｆｉｌｌに分ける。ＶＤ  ｆｉｌｌおよびＤＪ  ｆｉｌｌは空でもよい。Ｄセグメントが無い場合は、次に、残りのＣＤＲ３を「ＶＪ  ｆｉｌｌ」とする。
【０５７１】
最もよく現れるＤセグメントは３−２２．２（１２４６、ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ）、３−３．２（１２０５、ＹＹＤＦＷＳＹＹＮ）、３−１０．２（７５２、ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ）、６−１９．１（６７２、ＧＹＳＳＧＷＹ）、および６−１３．１（５７０、ＧＹＳＳＳＷＹ）である。表２２２９はＤ３−２２．２の断片の発生頻度を、表２２３０はＤ３−２．２の断片の発生頻度を示す。「正確（Ｅｘａｃｔ）」は１９、０５１ＣＤＲ３中で正確にこの配列が生じた回数を示し、一方、「包括的（Ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）」はそのＤセグメントの、より大きな断片中での出現を含めて現れた配列の回数を示す。
【０５７２】
D３−２２．２は非常によく現れるので、ＹＹＤＳＳＧ（低レベルの変異を有する）またはＹＤＳＳＧＹ含めてライブラリーを構築可能である。Ｄ３−３．２もまた、非常によく現れ、ＹＤＦＷＳＧおよびＤＦＷＳＧＹは高頻度で発生する。従って、これらの配列の出現可能性が非常に高いライブラリーは魅力的である。また、よく現れるこれらのＤセグメントの断片をＣＤＲ３内の諸処に移動して多様性を生成することも可能である。
【０５７３】
表２２３は、１９、０５１ＣＤＲ３の構成を示す。チロシンは、最もよく現れるアミノ酸タイプで、次に、グリシン、アスパラギン酸、セリン、フェニルアラニン、アラニン、およびアルギニンとなる。
【０５７４】
あるいは、配列はＤＮＡレベルで解析することもできる。各アミノ酸がこれらの２１５７８ＡｂのＨＣ  ＣＤＲ３中で出現する頻度を表７５で一覧表にし、合計および％の列中に示した。最頻出アミノ酸はＴｙｒ（１５．６％）で、Ｇｌｙ（１３．７％）、Ａｓｐ（１２．５％）、Ｓｅｒ（８．２％）、およびＡｒｇ（５．１％）がこの順で続くことに留意されたい。従って、一実施形態では、ＣＤＲ３中に置換して入れるのに好ましいアミノ酸タイプはＹ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、およびＲである。
【０５７５】
表７５の他の列は、ＣＤＲを以下のように細かく分析した場合のアミノ酸の頻度を示す。最初に正確なＪＨセグメントを決める。ＣＤＲ３の一部がＪＨ由来であれば、これを「Ｊｓｔｕｍｐ」として除く。残りでＤセグメントを調べる。ＤセグメントのＤＮＡに整合すると、採点アルゴリズムにより、最初の整合に対し１ポイントを割り当て、２つ目の連続した整合に対し２ポイント付加し、３つめの連続整合に対し３ポイントを付加する。４つ以上の連続整合に対しては４ポイントを付加する。不整合が見つかると、次の整合の値を１に戻す。９を超える連続整合が見つかるか、または点数が４１を超えると、Ｄセグメントであると特定される。この条件で、２１、５７８中の１１、１４９にＤセグメントがあり、１０、４３９にＤセグメントがなかった。
【０５７６】
Ｄが無い場合には、ＣＤＲ３はＶＪｆｉｌｌおよびＪｓｔｕｍｐに分けられる。ＶＪ  ｆｉｌｌ中では、Ｔｙｒはリッチでなく、アミノ酸の４．６％を占めるに過ぎないことに留意されたい。Ｊｓｔｕｍｐ中では、Ｔｙｒは非常にリッチであり、アミノ酸の２６．５％占める。
【０５７７】
Ｄ領域がある場合は、次に、ＣＤＲ３をＶＤ  ｆｉｌｌ（おそらく空）、Ｄ、ＤＪ  ｆｉｌｌ、およびＪｓｔｕｍｐ（おそらく空）に分ける。Ｔｙｒは、ＤおよびＪｓｔｕｍｐ由来の部分中でのみ顕著である。Ｔｙｒは、ＶＤ  ｆｉｌｌおよびＤＪ  ｆｉｌｌ中では、２％未満である。他方、Ｇｌｙは、Ｊｓｔｕｍｐ以外の全位置で多く見られる。
【０５７８】
また、表７５はＣｙｓ（Ｃ）およびＭｅｔ（Ｍ）はまれであることを示す。Ｊｓｔｕｍｐ中では、よく現れるＪＨ６は１つのＭを含む（表３）とはいえ、Ｍｅｔは約５％レベルまで上昇する。アミノ酸配列解析とＤＮＡ配列解析では、基本的に同じ答えが得られる。
【０５７９】
表２２１４は、各アミノ酸タイプ（ＡＡＴ）が出現する可能性のあるＨＣ  ＣＤＲ３中の場所を示す。表２２１４は、高レベルのＴｙｒは、ＪｓｔｕｍｐおよびＤセグメント経由でのみＨＣ  ＣＤＲ３に入るようになることを示す。最もよく使用されるＤセグメントは、Ｙ、Ｇ、およびＳリッチである。最初の列は、領域の名称の列挙したもので、２つめの列は、ＡＡが出現する回数を示す。３つめの列は、出現したアミノ酸の数である。４つめの列は、そのＡＡＴの％である。５つめの列は、その領域（Ｊｓｔｕｍｐ等）を含むＡｂの数である。
【０５８０】
Ａｌａは、「ＶＪ  ｆｉｌｌ」、Ｊｓｔｕｍｐ、ＶＤ  ｆｉｌｌ、Ｄセグメント、およびＤＪ  ｆｉｌｌのそれぞれに４〜６％現れる。Ｃｙｓは、約１％の希さであるＤセグメント以外の全セグメント中で極々希である。ＡｓｐはＪｓｔｕｍｐ中に非常に多く、ＶＤ  ｆｉｌｌ（１０％）およびＤＪ  ｆｉｌｌ（８％中には多く見られるが、ＤセグメントおよびＶＪ  ｆｉｌｌ中には平均的な出現に過ぎない。Ｇｌｕは、ＶＪおよびＶＤ  ｆｉｌｌの両方で３〜５％認められるが、他の場所では希である。ＰｈｅはＪｓｔｕｍｐではリッチであるが他の場所では希である。ＪＨ６が１つのＧｌｙを含むとはいえ、Ｇｌｙは、Ｊｓｔｕｍｐ以外のどの場所でもリッチであるＨｉｓはどこでも少ないが、特に、ＪｓｔｕｍｐおよびＤセグメントで少ない。ほとんど使われないＪＨ１はＪＨから提供されたＨｉｓのみを含む。Ｉｌｅは、頻繁に使用されるＪＨ３がＩｌｅを提供することが多いＪｓｔｕｍｐ中以外では、平均値以下である。ＪＨ３の検体よりもＩｌｅが少ないことに留意されたい。Ｌｙｓはほとんど使われず、特に、ＪｓｔｕｍｐおよびＤセグメント中では使われない。ＬｅｕはＪｓｔｕｍｐ中を除いて平均レベル（約５％）で認められる。ＪＨ中のＬのみがほとんど使われないＪＨ２中に存在する。Ｍｅｔはほとんど使われず、ＪＨ６によって、Ｊｓｔｕｍｐ中でのみ平均的使用度になっている。Ａｓｎはほとんど使われず、ＤＪ  ｆｉｌｌ中でのみ平均的使用度になっている。Ｐｒｏは、ＤＪ  ｆｉｌｌおよびＶＤｆｉｌｌ中で平均を少し上回って使用される。Ｇｌｎはほとんど使用されない。ＡｒｇはＶＪ  ｆｉｌｌ、ＶＤ  ｆｉｌｌ、およびＤＪ  ｆｉｌｌ中で平均レベルの約２倍の頻度で使用されるが、Ｊｓｔｕｍｐからは排除されている。また、Ｄセグメント中では平均以下である。Ｓｅｒは、Ｄセグメント中で非常によく使用され、ＶＪ  ｆｉｌｌ、ＶＤ  ｆｉｌｌ、およびＤＪ  ｆｉｌｌ中で平均以上に使われるが、Ｊｓｔｕｍｐ中ではほぼ排除されている。Ｔｈｒは、平均以下で使用され、Ｊｓｔｕｍ中では排除に近い状態である。Ｖａｌは平均レベルかそれ以下で使われる。Ｔｒｐは、平均の５．３８％にまで上昇するＤセグメント中以外では、平均以下で使用される。
【０５８１】
ＴｙｒはＪｓｔｕｍｐおよびＤセグメント中でのみ非常に高頻度で使用される。ＴｙｒはＶＪ  ｆｉｌｌ、およびＤＪ  ｆｉｌｌ中では平均レベル使用され、ＶＤ  ｆｉｌｌ中では平均以下で使用される。ＤセグメントおよびＪｓｔｕｍｐをライブラリーの一部として使用して、天然では安定で特異的な抗体を得るのに好ましいことが示された予備構築構成のライブラリー中に挿入する。さらに、Ｔｙｒがまれにしか見られない領域で、Ｔｙｒを除外するか、または低レベルに限定することにより、ＶＪ  ｆｉｌｌ、ＶＤ  ｆｉｌｌ、およびＤＪ  ｆｉｌｌ中で免疫系が使用するアミノ酸タイプを含むより多くのメンバーが提供される。
【０５８２】
表２２４は、１９、０５１Ａｂ中の長さの分布を示す。ＨＣ  ＣＤＲ３の長さ中央値は１１．８５である。最短ＨＣ  ＣＤＲ３は、長さ２で、ＳＹ、ＤＬ、およびＤＭが例として使用される。全てのこれらのＡｂは、ＦＲ４中に相当な数の変異を有し、おそらく無視されるべきである。３２の異なる長さ３のＨＣ  ＣＤＲ３はさらに正常である。表２２２１に示すように、最長ＨＣ  ＣＤＲ３は長さ３６である。これは、コレクション中の１９、０５１のＨＣ  ＣＤＲ３のそれぞれに対する分析の例として有用である。（出力は４３００ページにおよび、印刷不可能である）。最後のＮＷＦＤＰはＪＨ５由来で、ＹＹＤＦＷＳＧＹはＤ３−３．２由来で、ＤＴＡＰＴはＶＤ  ｆｉｌｌセグメントであり、ＦＧＳＤＬＷＲＧＴＮＱＴＶＷＹＱＰＡはＤＪ  ｆｉｌｌであることがわかる。ＤＪ  ｆｉｌｌは、１８残基中にただ１つのＹを含み、ＶＤ  ｆｉｌｌは、Ｙを含まないことに留意されたい。表記の「ｉｅ６＝０」は、残基６〜９でのＪＨ５の整合にエラーがなかったことを示し、他方、「ｉｅ１０＝０」は、１０〜２０での整合にエラーがなかったことを示す。
【０５８３】
種々のＤセグメントは、全ＪＨと関連があるが、いくつかの偏りがある。最もよく現れるＤセグメントは、３−２２．２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ）であり、表２２３１に示すように、６３、４２、４２６、５１８、５７、および１２７単離体が、ＪＨとそれぞれ関連している。全Ａｂの約６．５％はＤ３−２２．２の断片を有し、７．５％がＪＨ４を有するが、一方、３．１％のみがＪＨ６を有する。Ｄ３−３．２は、ＪＨ４（５．０％）に対するよりも多くＪＨ６（１０．３％）に結合し、もう一方への偏りがある。
【０５８４】
表２２１１Ａおよび表２２１１Ｂは、ＶＪ  ｆｉｌｌ中のアミノ酸の分布を示す。表２２１１Ａは全体およびＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４に対する分布を示す。表２２１１Ｂは、位置Ｐ５〜Ｐ８に対する分布を示す。Ｇｌｙは全ての位置で最もよく現れることに留意されたい。さらに、Ｒは常にＫより多く現れ、ＤはＥより多く現れ、さらにＳは常に非常によく現れる。チロシンは、全体および大抵の位置で５％未満の出現確率である。Ｐ１およびＰ２では、Ｔｙｒは非常に希である。Ｐ３では、Ｔｙｒは５．２％になり、Ｐ４では、Ｔｙｒは７．６％に達する。次の位置で、Ｔｙｒは５％（ランダムアミノ酸出現が予測される量）に近い。
【０５８５】
本発明のライブラリーは、事前形成Ｄセグメントまたはその一部を含まないＨＣ  ＣＤＲ３を含有する。本発明の他のライブラリーは、事前形成Ｄセグメントまたはその一部、またはＤセグメントまたはその一部が最も出現の可能性が高い配列で、その多様性が実際の抗体中で頻繁に認められるアミノ酸タイプの組み込みを可能にする多様性パターンを有するＨＣ  ＣＲＤ３を含む。
【０５８６】
ライブラリー１バージョン１は、３つの形を取りうる。第１の形では、各変化位置の名称を付けた各アミノ酸が同じ出現可能性で許容される。第２の形では、各アミノ酸が許容されるが、最初のアミノ酸が、例えば、同頻度で許容されている他のものの３倍出現の可能性が多い。第３の形では、次の比率が使用される。
【０５８７】
ライブラリー１、バージョン１（Ｂｉｂｌｉｏｔｅｃａ４）最も単純な形のＨＣ  ＣＤＲ３は予備形成Ｄセグメントを含まないものである。天然のＡｂでは、これらはＤセグメントを持たないものよりも短い傾向がある。従って、好ましい抗体ライブラリーは、下記のようなＨＣ  ＣＤＲ３を有してもよい：
【０５８８】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４、ここで、
【０５８９】
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱが許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ１、％（すなわち、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑ：：２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０（ＯＲＣＢＵ））（コロンと小数点を避けるために、全パーセンテージを１０倍した。）で示される頻度であり；
【０５９０】
Ｘ２は、ｉｓＧ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩで許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ２、％（すなわち、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉ：：１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９；これは０．２１２３：０．１６２１：０．１１３０：０．０９４７：０．０８６８：０．０５５９：０．０５２５：０．０５０２：０．０４００：０．０３３１：０．０３３１：０．０３３１：０．０３３１に等しい）（ＯＲＣＢＵ）で示される頻度であり；
【０５９１】
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｔ、またはＤで許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ３、％（すなわち、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｖ：Ｗ：Ｔ：Ｄ：：２０３：１３０：９２：６１：６０：５４：５２：４８：４８：４２：３６）（ＯＲＣＢＵ）で示される頻度であり；
【０５９２】
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤで許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ４、％（すなわち、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｗ：Ｙ：Ｖ：Ｐ：Ｔ：Ｄ：：２１０：１０３：９１：６４：６３：５９：５９：４７：４７：４７：４０（これは０．２５３０、０．１２４１、０．１０９６、０．０７７１、０．０７５９、０．０７１１、０．０７１１、０．０５６６、０．０５６６、０．０５６６、０．０４８２に等しい）（ＯＲＣＢＵ）で示される頻度であり；
【０５９３】
Ｘ５は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｔ、Ｐ、またはＶで許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ５、％（すなわち、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｗ：Ｄ：Ｔ：Ｐ：Ｖ：：１９０：９６：８９：７１：６４：５９：５９：５６：４６：４３：４２）（ＯＲＣＢＵ）で示される頻度であり；
【０５９４】
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶで許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ６、％（すなわち、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｐ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：：１７３：９３：８８：７３：７１：６３：５８：５７：５６：４４：３９）（ＯＲＣＢＵ）で示される頻度であり；
【０５９５】
Ｘ７は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、またはΔ（アミノ酸なし）で許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ７、％（すなわち、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｄ：Ａ：Ｙ：Ｔ：Ｗ：Ｖ：Δ：：１７９：９２：８６：７４：７０：６９：５６：５５：４４：４１：３９：＊）（ＯＲＣＢＵ）で示され、Δは所定の長さ分布により決まる頻度を有し；
【０５９６】
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔで許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ８、％（すなわち、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δ：：１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊）（ＯＲＣＢＵ）で示され、Δは所定の長さ分布により決まる頻度を有し；
【０５９７】
Ｘ９は、Ｘ８と同じで；
【０５９８】
Ｘ１０は、Ｘ８と同じで；
【０５９９】
Ｘ１１は、Ｘ８と同じで；
【０６００】
Ｘ１２は、Ｆであり；
【０６０１】
Ｘ１３は、Ｄであり；
【０６０２】
Ｘ１４は、Ｙである。長さ分布は、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５である。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝１である。一部の実施形態では、ｎ１＝１０、ｎ２＝８、ｎ３＝６、ｎ４＝４、およびｎ５＝３である。他の長さ分布も使用可能である。各欠失可能位置でのΔの比率は、各欠失可能位置では、同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。Ｎは、ＨＣ  ＣＤＲ３の第２の位置のみで許容される。Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の頻度は、０．００５４のみで、これは受容可能である。第２の位置からＮを減らすか、または除去可能である。
【０６０３】
長さ分布を、例えば、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：１：５：７：９：８とする。Δが起こりうる位置が４つある。ｘｘｘｘ（ｘはアミノ酸）の８つのコピーが必要である。また、ｘｘｘｄ、ｘｘｄｘ、ｘｄｘｘ、およびｄｘｘｘ（ｄは欠失）の９つのコピーが必要である。さらに、ｘｘｄｄ、ｘｄｘｄ、ｘｄｄｘ、ｄｘｘｄ、およびｄｄｘｘの７つのコピーが必要である。さらに、ｘｄｄｄ、ｄｘｄｄ、ｄｄｘｄ、およびｄｄｄｘの５つのコピーおよびｄｄｄｄの１つのコピーが必要である。位置１にｘを有する項目を全部加算すると、合計は（８＋２７＋２１）＝５６になり、一方、位置１にｄを有するものの合計は（９＋１４＋１５＋１）＝３９になる。従って、Δは、各Δ許容位置でコドンの３９／（３９＋５６）を埋め合わせているはずである。
【０６０４】
ＦＲ４は、ＪＨ４と同じであろう。許容長さは、９、１０、１１、１２、１３、および１４であり、これらの長さは、１：２：３：３：２：１の比率で許容され、予測される長さ中央値は１１．５である。許容多様性は６Ｅ１１である。１．Ｅ８の検体は、この長さの範囲の、Ｄ領域の欠けたＣＤＲ３を有するＡｂの適切な提示する可能性がある。５．Ｅ８の検体は、さらに好ましく、２．Ｅ９の検体は、最も好ましい。
【０６０５】
さらなる好ましいライブラリーは、ａ）残基１１の欠失、ｂ）残基１０および１１の欠失、ｃ）残基１１の後ろに挿入されたＧｌｙ、またはｄ）残基１１の後ろに挿入されたＧｌｙ−Ｇｌｙ、を有するであろう。
【０６０６】
別の好ましい実施形態を次に示す：
ＨＣ  ＣＤＲ３ライブラリー＃１バージョン２
（注意）Δは、コドンのないことを意味する。これは、位置8,9,10,および11で使われる。
許容長さは、10,11,12,13,および14で、比率は、4:4:4:3:3である。
【表９７】
2013504602.tif 000125
2013504602.tif 000126
【０６０７】
Ｎは、ＨＣ  ＣＤＲ３の２番目の位置のみで許容され、頻度は０．０３３１である。ＳおよびＴは、４番目の位置で出現し、頻度は０．１２４１および０．０５６６である。従って、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の頻度は、０．００６で、これは受容可能である。２番目の位置でのＮの頻度は、減らすまたは除去可能である。
【０６０８】
許容される多様性は、５．２Ｅ１１である。いずれの設計配列も、メンバーの折り畳みおよび一部の抗体への結合を妨げることが可能とは考えられない。従って、アンダーサンプリングも許容される。本設計の１．Ｅ６メンバーを含むライブラリーは、多くの標的に対する結合剤としての有用な多様性を含む。１．Ｅ７のライブラリーはさらに好ましい。本設計の１．Ｅ８メンバーのライブラリーはさらに好ましい。有用なライブラリーを得ることを目的として５．Ｅ１１メンバーを作成するというようなことは、全く必要なことではない。
ＨＣ  ＣＤＲ３ライブラリー＃１バージョン３  
長さ9および10を同じ存在可能性で有する。
長さは、8, 9, 10,および 11であってもよい; これらの比率は1:2:2:1である。
ライブラリー #1-V3 タイプ 1 は、全許容アミノ酸タイプを同じ存在可能性で有する;
ライブラリー #1-V3 タイプ 2は、他のタイプより３倍多い存在の可能性を有する１番目を除いて、全許容アミノ酸タイプを同じ存在可能性で有する;
ライブラリー #1-V3 タイプ 3 は、全許容アミノ酸タイプを下記の比率で含む。
（注意）Δはコドンのないことを意味する。これは、位置6, 7,および8で使われる。
【表９８】
2013504602.tif 000127
【０６０９】
Ｎは、ＨＣ  ＣＤＲ３の２番目の位置のみで許容され、頻度は０．０３３１である。ＳおよびＴは、４番目の位置で出現し、頻度は０．１２４１および０．０５６６である。従って、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）の頻度は、０．００６で、これは受容可能である。２番目の位置でのＮの頻度は、Ｎの頻度を減らすか、またはＮをＱ．．で置換することにより、減らすか、または除去可能である。
【０６１０】
許容多様性は３Ｘ１０８である。１．Ｅ６を含有するライブラリーは、多くの標的に対する結合剤を含むことになる。１．Ｅ７のライブラリーは好ましい。１．Ｅ８を有するライブラリーはさらに好ましい。
【０６１１】
ライブラリー２は、３つの形を取り得る。第１の形では、各変化位置の名称を付けた各アミノ酸が同じ出現可能性で許容される。第２の形では、各アミノ酸が許容されるが、最初のアミノ酸が、例えば、同頻度で許容されている他のものの３倍出現の可能性が多い。第３の形では、下記の比率が使用される。
【０６１２】
ライブラリー  Ｎｏ．２：別の好ましい抗体ライブラリーは、次のＨＣ  ＣＤＲ３を有しうる：
【０６１３】
Ｘ１−Ｘ２−Ｇ３−Ｘ４−Ｇ５−Ｘ６−（Ｒ／Δ）７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４、ここで、
【０６１４】
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、またはＱが許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ１、％（すなわち、Ｇ：Ｄ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｉ：Ｈ：Ｔ：Ｑ：：２１７：１８５：８４：８３：７１：６８：５８：４３：３３：２８：２５：２０）で示される頻度であり；
【０６１５】
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＩが許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ２、％（すなわち、Ｇ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ｐ：Ｖ：Ａ：Ｔ：Ｄ：Ｋ：Ｎ：Ｑ：Ｉ：：１８６：１４２：９９：８３：７６：４９：４６：４４：３５：２９：２９：２９：２９）で示される頻度であり；
【０６１６】
Ｘ３は、隣接残基により決まる種々の方式でＣＤＲ３を折り畳むことを可能にするＧであり；
【０６１７】
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＤが許容され、その頻度は表２２１１ＡのＰ４、％であり；
【０６１８】
Ｘ５は、隣接残基により決まる種々の方式でＣＤＲ３を折り畳むことを可能にするＧであり；
【０６１９】
Ｘ６は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｗ、またはＶが許容され、その頻度は表２２１１ＢのＰ６、％であり；
【０６２０】
Ｘ７は、長さ分布により決まる頻度でＲが許容され、または欠けており；
【０６２１】
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、またはΔが許容され、その頻度は表２２１１ＢのＰ８、％（すなわち、Ｇ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｄ：Ｐ：Ｙ：Ａ：Ｔ：Ｆ：Ｖ：Δ：：１４１：９４：９３：８３：７８：６９：６５：５９：４７：４１：４１：＊）であり、Δは長さ分布により決まる頻度を有し；
【０６２２】
Ｘ９は、Ｘ８と同じであり；
【０６２３】
Ｘ１０は、Ｘ８と同じであり；
【０６２４】
Ｘ１１は、Ｘ８と同じであり；
【０６２５】
Ｘ１２は、Ｆであり；
【０６２６】
Ｘ１３は、Ｄであり；
【０６２７】
Ｘ１４は、Ｙである。
【０６２８】
長さ分布は、Ｌｅｎ９：Ｌｅｎ１０：Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５である。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝１である。Δを許容する位置のΔの割合は、各欠失可能位置では、同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。
【０６２９】
ＦＲ４は、ＪＨ４と同じであろう。許容長さは、９、１０、１１、１２、１３、および１４であり、これらの長さのＣＤＲ３を得る見込みを表２２１５に示す。一部の位置を固定することにより、多様化位置での抽出検体のレベルを増やし、ＤＮＡの合成を促進できる。
【０６３０】
許容多様性は、９Ｅ８である。１．Ｅ８の検体は、この長さの範囲で、Ｄ領域を欠いたＣＤＲ３を有するＡｂの適切な発現を提供する可能性がある。５．Ｅ８の検体は、より好ましく、また、２．Ｅ９の検体は最も好ましい。
【０６３１】
ライブラリー３は、３つの形を取り得る。第１の形では、各変化位置の名称を付けた各アミノ酸が同じ出現可能性で許容される。第２の形では、各アミノ酸が許容されるが、最初のアミノ酸が、例えば、同頻度で許容されている他のものの３倍出現の可能性が多い。第３の形では、下記の比率が使用される。
【０６３２】
ライブラリー  Ｎｏ．３：１９、０５１Ｆａｂの検体中のほぼ半分のＡｂが、認識できるＤセグメントで、変異のある断片のみの場合が最も多く、含んでいた。我々の検体中で最もよく現れるＤセグメントは、Ｄ３−２２．２で、１２４６回（６．５％）認められている。Ｄ３−３．２は、Ａｂ収集対象とした８６標的中の７２で見られている。表２２２９は、Ｄ３−２２．２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ）のＮ量体の集計を示す。ライブラリー３は、ＶＤ  ｆｉｌｌで見られる構成を有する０〜２残基、次いで、いくつかの変異のある８量体ＹＹＤＳＳＧＹＹ、次に、ＤＪ  ｆｉｌｌ（表２２１７）で見られるアミノ酸を有する１〜３残基、続いて、ＪＨ４由来のＦＤＹ、を含む。従って、１つの好ましい抗体ライブラリーは、次のＨＣ  ＣＤＲ３を有しうる：
【０６３３】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ５−Ｓ６−Ｓ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６、ここで、
【０６３４】
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔが許容され、その比率は、表２２１２Ａで示されるＰ１、％（すなわち、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δ：：２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊）で、Δは設計された長さ分布により決まるレベルであり；
【０６３５】
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔが許容され、その比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（表２２１２Ａで示されるＰ２、％）で、Δの割合は長さ分布から決定され；
【０６３６】
Ｘ３は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ａ、またはＩ（すなわち、表２２３２Ａ中のＰ２の最初の１１アミノ酸）が許容され、その比率は、Ｙ：Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｈ：Ｐ：Ｓ：Ｌ：Ｎ：Ａ：Ｉ：：３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６３７】
Ｘ４は、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｒ、またはＨ（すなわち、表２２３２Ａ中のＰ３の最初の１１アミノ酸）が許容され、その比率は、Ｙ：Ｇ：Ｓ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｅ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｈ：：３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６３８】
Ｘ５は、Ｄ（表２２３２ＡのＰ４）；
【０６３９】
Ｘ６は、Ｓ（表２２３２ＡのＰ５）；
【０６４０】
Ｘ７は、Ｓ（表２２３２ＢのＰ６）；
【０６４１】
Ｘ８は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、またはＮ（表２２３２ＢのＰ７）が許容され、その比率は、Ｇ：Ａ：Ｄ：Ｐ：Ｖ：Ｌ：Ｓ：Ｒ：Ｔ：Ｙ：Ｎ：：３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６４２】
Ｘ９は、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｄ、Ｇ、Ｎ（表２２３２ＢのＰ８）が許容され、その比率は、Ｙ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ｗ：Ｈ：Ｒ：Ｆ：Ｄ：Ｇ：Ｎ：：３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６４３】
Ｘ１０は、Ｙ、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｇ、Ｗ、Ｈ、Ｄ、Ｖ（表２２３２ＢのＰ９）が許容され、その比率は、Ｙ：Ｓ：Ｐ：Ｌ：Ｒ：Ｆ：Ｇ：Ｗ：Ｈ：Ｄ：Ｖ：：３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６４４】
Ｘ１１は、Ｇであり；
Ｘ１２は、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、またはΔ（ＡＡは表２２１７のＰ２の最初の１１アミノ酸である）が許容され、その比率は、Ｇ：Ｐ：Ｄ：Ｒ：Ｓ：Ｌ：Ａ：Ｎ：Ｈ：Ｔ：Ｙ：Δ：：１８５：１０１：９６：９２：８８：６７：４８：４３：３６：３５：３３：＊であり；
【０６４５】
Ｘ１３は、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｔ、またはΔが許容され、その比率は、Ｇ：Ｄ：Ｒ：Ｐ：Ｓ：Ｎ：Ｌ：Ａ：Ｙ：Ｖ：Ｔ：Δ：：２０４：１０３：９６：７８：７２：６７：６７：４５：４２：３６：３４：＊であり；
【０６４６】
Ｘ１４は、Ｆであり；
【０６４７】
Ｘ１５は、Ｄであり；
【０６４８】
Ｘ１６は、Ｙである。
【０６４９】
長さ分布は、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５である。一部の実施形態では、ｎ１＝１０、ｎ２＝８、ｎ３＝６、ｎ４＝５、およびｎ５＝３である。他の長さ分布も使用可能である。
【０６５０】
許容多様性は、３．３Ｅ９である。１．Ｅ８の検体は、この長さの範囲で、Ｄ３−３．２を含むＣＤＲ３を有するＡｂの適切な発現を提供する可能性がある。５．Ｅ８の検体は、より好ましく、また、２．Ｅ９の検体は最も好ましい。許容長さは、１２、１３、１４、１５、および１６である。ライブラリー３の所定の分布に対する長さを表２２１９に示す。
【０６５１】
ＶＤ  ｆｉｌｌの長さ中央値は０．５残基である。従って、３−２２．２（ＹＹＤＳＳＧＹ、太字ＡＡは固定）の変異バージョンの残基２〜８をコードする領域の前に、０、１、または２残基が許容される。
【０６５２】
Δが使用されるために、ちょうど私が調べたＦａｂの検体の場合のように、固定ＤＳＳモチーフがＣＤＲ３中の異なる位置に現れる。ＤＳＳ中のいずれかの側鎖が抗原（Ａｇ）に接触することは必ずしも必要ではなく、むしろこれらの残基は、Ａｇに結合するために残りのＣＤＲを正しい形状に保持する構造の形成を支援することができる。ＤＳＳの１つまたは複数の側鎖が実際にＡｇに接触することも、また可能である。ＰＤＢファイル３Ｈ４２に含まれるＡｂで、Ｄ３−３．２（ＹＤＦＷＳＡＹＹ、ＧからＡへの変異を含む）関連断片の主鎖は、ベータループを作り、全ての側鎖が抗原または抗体の他の部分に接触する。この構造をループの最初および末端に移動し、それを種々のＨＣ  ＣＤＲ１／２およびＬＣ環境中に埋め込むことにより、広範な種々の結合特異性を創出できるであろう。よく見られることおよび固定したＤＦＷＳにより粘着性抗体を得られる可能性があることが１つの理由で、Ｄ３−３．２よりもＤ３−２２．２を選定した。
【０６５３】
ライブラリー  Ｎｏ．４：ライブラリーは、ライブラリー３に類似であるが、ＣＤＲ３がさらに長い。表２２６１Ａおよび表２２６１Ｂは、観察されたＤ３−２２．２含有ＣＤＲ３の長さを示す；ピークは、１３〜１６にある。ライブラリー４は、ＶＤ  ｆｉｌｌに見られる構成を有する０〜４残基、次に、いくつかの変異のある８量体ＹＤＦＷＳＧＹＹ、次にＤＪ  ｆｉｌｌに見られるアミノ酸を有する３〜４残基、およびこれに続くＪＨ４由来のＦＤＹを含む。従って、好ましい抗体ライブラリー以下のＨＣ  ＣＤＲ３を有しうる：
【０６５４】
Ｘ１−Ｘ２−（Ｇ／Δ）３−（Ｇ／Δ）４−Ｘ５−Ｄ６−Ｓ７−Ｓ８−Ｇ９−Ｙ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−（Ｇ／Δ）１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｆ１７−Ｄ１８−Ｙ１９、ここで、
【０６５５】
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔが許容され、その比率は、表２２１２ＡのＰ１、％（すなわち、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δ：：２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊）（ライブラリー３と同様に）で示され、Δは長さ分布により決まる頻度で使われ；
【０６５６】
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔが許容され、その比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（表２２１２のＰ２、％に示す。Δの割合は長さ分布により決まる頻度であり（ライブラリー３のように））；
【０６５７】
Ｘ３は、Ｇまたは長さ分布により決まる比率のΔであり；
【０６５８】
Ｘ４は、Ｇまたは長さ分布により決まる比率のΔであり； 
【０６５９】
Ｘ５は、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ａ、Ｒ、またはＨ（すなわち、表２２３２ＡのＰ３の最初の１１個のアミノ酸）が許容され、その比率は、Ｙ：Ｇ：Ｓ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｅ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｈ：：３０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１（ライブラリー３のＸ４のように）であり；
【０６６０】
Ｘ６は、Ｄであり；
【０６６１】
Ｘ７は、Ｓであり；
【０６６２】
Ｘ８は、Ｓであり；
【０６６３】
Ｘ９は、Ｇであり；
【０６６４】
Ｘ１０は、Ｙであり；
【０６６５】
Ｘ１１は、Ｙ、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｇ、Ｗ、Ｈ、Ｄ、またはＶが許容され、その比率は、Ｙ：Ｓ：Ｐ：Ｌ：Ｒ：Ｆ：Ｇ：Ｗ：Ｈ：Ｄ：Ｖ：：５０：５：５：５：５：５：５：５：５：５：５であり；
【０６６６】
Ｘ１２は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｆ、Ｌ、Ｄ、Ｈ、Ｗ、またはＶが許容され、その比率は、Ｙ：Ｐ：Ｓ：Ｇ：Ｒ：Ｆ：Ｌ：Ｄ：Ｈ：Ｗ：Ｖ：：５０：５：５：５：５：５：５：５：５：５：５であり；
【０６６７】
Ｘ１３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔが許容され、その比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
【０６６８】
Ｘ１４は、Ｇまたは長さ分布により決まる比率のΔであり；
【０６６９】
Ｘ１５は、Ｘ１３と同じであり；
【０６７０】
Ｘ１６は、Ｘ１３と同じであり；
【０６７１】
Ｘ１７は、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、またはＨが許容され、その比率は、Ｆ：Ｇ：Ｐ：Ｓ：Ｒ：Ｄ：Ｌ：Ａ：Ｔ：Ｎ：Ｈ：：５００：１０３：６６：６２：６１：５２：４５：３２：２８：２８：２２（表２２１７中の全体（ＯＡ）に示される比率である）であり；
【０６７２】
Ｘ１８は、Ｄであり；
【０６７３】
Ｘ１９は、Ｙである。
【０６７４】
長さ分布は、Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：Ｌｅｎ１７：Ｌｅｎ１８：Ｌｅｎ１９：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６：ｎ７：ｎ８である。一部の実施形態では、ｎ１＝１０、ｎ２＝９、ｎ３＝８、ｎ４＝７、ｎ５＝６、ｎ６＝５、ｎ７＝５、およびｎ８＝５である。他の長さ分布も使用可能である。各欠失可能位置のΔの割合は、各欠失可能位置では、同じ頻度で欠失が起こるという前提の下で、長さ分布により求められる。
【０６７５】
許容多様性は、２．６Ｅ９である。１．Ｅ８の検体は、この長さの範囲で、Ｄ３−３．２を含むＣＤＲ３を有するＡｂの適切な発現を提供する可能性がある。５．Ｅ８の検体は、より好ましく、また、２．Ｅ９の検体は最も好ましい。許容長さは１２〜１９である。ライブラリー４の所定の長さ分布を表２２２０に示す；あるいは、他の長さ分布、例えば、０．２：０．２：０．１：０．１：０．１：０．１：０．１：０．１を使うこともでき、これは、長さ中央値が１４となる。
【０６７６】
ライブラリー  Ｎｏ．５：セグメントＤ４−１７．２は幾分出現頻度が高い（３８６／１９、０５１または２％）ことがわかっており、また、短い（ＤＹＧＤＹ）。ＤＹおよびＹＤの両方がＤセグメント中に見つかったとしても、ＤＹの方がＹＤよりＣＤＲ３中での出現頻度が高い。Ｄ４−１７．２は２つのＤＹジペプチドを含む。従って、好ましいライブラリーは、０〜２アミノ酸、続いてＤＹＧＤＹ（下線の残基は固定）、次に０〜２アミノ酸、これに続けてＪＨ３のＡＦＤＩ（下線の残基は固定）、を含むＣＤＲ３を有する。表２２８０は、我々のＡｂ検体中で認められた３８６Ｄ４−１７．２断片の集計結果を示す。位置１０で許容されるアミノ酸タイプの独自性はライブラリー４の位置１７から受け継いだもので、また、頻度はＡを最も出現頻度の高いアミノ酸タイプにするために選択される。位置１と５の分布を使ってライブラリーの位置３と７で使われるアミノ酸タイプを選択した。ＦＲ４は、ＪＨ３のＦＲ４部分と同一である。すなわち、ＣＤＲ３は：
【０６７７】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ４−Ｇ５−Ｄ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｆ１１−Ｄ１２−Ｉ１３を有し、ここで、
【０６７８】
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔが許容され、その比率は、表２２１２ＡのＰ１、％（すなわち、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δ：：２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊）で示され、Δは長さ分布により決まる頻度で使われ；
【０６７９】
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔが許容され、その比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（表２２１２のＰ２、％で示され、Δの割合は長さ分布により決まり）；
【０６８０】
Ｘ３は、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｒ、Ｔ、またはＶが許容され、その比率は、Ｄ：Ｇ：Ｐ：Ｌ：Ｓ：Ｎ：Ａ：Ｈ：Ｆ：Ｒ：Ｔ：Ｖ：：１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６８１】
Ｙ４は、Ｙであり；
【０６８２】
Ｇ５は、Ｇであり；
【０６８３】
Ｄ６は、Ｄであり；
【０６８４】
Ｘ７は、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｄ、またはＥが許容され、その比率は、Ｙ：Ｆ：Ｌ：Ｓ：Ｈ：Ｇ：Ｐ：Ａ：Ｒ：Ｄ：Ｅ：：１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６８５】
Ｘ８は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔが許容され、その比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
【０６８６】
Ｘ９は、Ｘ８に同じであり；
【０６８７】
Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｎ、またはＨ、が許容され、その比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６８８】
Ｆ１１は、Ｆであり；
【０６８９】
Ｄ１２は、Ｄであり；さらに
【０６９０】
Ｉ１３は、Ｉである。
【０６９１】
許容長さは、９、１０、１１、１２、および１３である。長さ分布を表２２１９に示すが、表中の各長さから３を引いたものが実際の長さである。例えば、表２２１９の長さ１２は、ライブラリー５の長さ９に対応する。許容多様性は３．０Ｅ７である。３．０Ｅ８形質転換体を含む構成では、基本的にライブラリーの完全多様性が含まれることになる。メンバーの約１／４が完全なＤＹＧＤＹ配列を含み；１／４がＤＹＧＤｘ（ｘはＹではない）を含み、１／４がｘＹＧＤＹ（ｘはＤではない）を含み、さらに１／４がｘＹＧＤｘ（最初のｘはＤではなく、２番目のｘはＹではない）を含むと思われる。ＤＹＧＤＹをひとまとめにしている４つの位置でΔが割り付けられているため、ＤＹＧＤＹは９つの構成が許容される：ｘｘＤＹＧＤＹｘｘｘＦＤＩ（Ｌ＝１３）、ｘｘＤＹＧＤＹｘｘＦＤＩ（Ｌ＝１２）、ｘｘＤＹＧＤＹｘＦＤＩ（Ｌ＝１１）、ｘＤＹＧＤＹｘｘｘＦＤＩ（Ｌ＝１２）、ｘＤＹＧＤＹｘｘＦＤＩ（Ｌ＝１１）、ｘＤＹＧＤＹｘＦＤＩ（Ｌ＝１０）、ＤＹＧＤＹｘｘｘＦＤＩ（Ｌ＝１１）、ＤＹＧＤＹｘｘＦＤＩ（Ｌ＝１０）、およびＤＹＧＤＹｘＦＤＩ（Ｌ＝９）。
【０６９２】
例えば、ある程度の多様性を有する６−１９．１（ＧＹＳＳＧＷＹ）または６−１３．１（ＧＹＳＳＳＷＹ）の断片を含む他のライブラリーを構築可能である。これらのＤセグメントは、注目すべき割合の天然抗体中に存在し、自らの１０〜１４範囲のＣＤＲ３をＡｂに貸し出している。より短いＣＤＲ３のライブラリーの構築はさらに容易に思われる。これらのライブラリーで、１つまたは２つの残基は固定される。例えば、Ｓ３、Ｓ４、およびＷ６は、一定に保持し、他の位置で多様化を許容することができる。さらに、例えば、０〜２アミノ酸をＤセグメントの前に有し、さらに、例えば、ＤとＪの間にアミノ酸が無いようにすることにより、異なる位置にＤセグメントを出現させることが可能である。好ましい実施形態では、ＪＨ２はＸＦＤＬ  Ｊｓｔｕｍｐ（ＸはＹ側に偏っている）と一緒に使われる。これにより、１１〜１３の長さのＣＤＲ３が得られる。表２２７３は、Ｄ６−１３．１、Ｄ６−１９．１、およびこれらの非常に類似したＤセグメントの混合物中のＡＡＴの頻度を示す。
【０６９３】
ライブラリー  Ｎｏ．６：ライブラリー６は、ＪＨ２に結合した６−１９．１（ＧＹＳＳＧＷＹ）および６−１３．１（ＧＹＳＳＳＷＹ）の混合物を組み込む。従って、好ましいライブラリーは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｓ５−Ｓ６−Ｘ７−Ｗ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｆ１１−Ｄ１２−Ｌ１３を有し、ここで：
【０６９４】
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔが許容され、その比率は、表２２１２ＡのＰ１、％（すなわち、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δ：：２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊）で示され、Δは長さ分布により決まる頻度で使われ；
【０６９５】
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔが許容され、その比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０で：＊（表１２のＰ２、％。Δの割合は長さ分布により決まる）であり；
【０６９６】
Ｘ３は、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、またはＫが許容され、その比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６９７】
Ｘ４は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、またはＥが許容され、その比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０６９８】
Ｓ５は、Ｓであり；
【０６９９】
Ｓ６は、Ｓであり；
【０７００】
Ｘ７は、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、またはＬが許容され、その比率は、１０：１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７０１】
Ｗ８は、Ｗであり；
【０７０２】
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、またはＴが許容され、その比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７０３】
Ｘ１０は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、またはＫが許容され、その比率は、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７０４】
Ｆ１１は、Ｆであり；
【０７０５】
Ｄ１２は、Ｄであり；
【０７０６】
Ｌ１３は、Ｌである。
【０７０７】
２つの位置が欠失を許容するため、長さは、１１、１２、または１３で、長さ分布Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：１：２：１は、各欠失可能位置で５０％欠失に対応する。長さ分布は、例えば、Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：：１：５：７である。Δが起こりうる位置が２つある。ｘｘ（ｘはアミノ酸）の７つのコピーならびにｘｄおよびｄｘ（ｄは欠失）の５つのコピーが必要である。さらに、ｄｄの１つのコピーが必要である。位置１にｘを有する項目を加算すると、合計で（７＋５）＝１２となり、位置１がｄである項目を加算すると合計で（５＋１）＝６となる。従って、Δは、ｐ各Δ許容位置でコドンの６／（６＋１２）＝０．３３３を埋め合わせているはずである。
【０７０８】
可能な配座はｘｘＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹｘＦＤＬ（Ｌ＝１３）、ｘＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹｘＦＤＬ（Ｌ＝１２）、またはＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹｘＦＤＬ（Ｌ＝１１）である。下線のアミノ酸は固定される。ＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹでは、約１／２のメンバーが示されたＡＡを有するように、下線のないアミノ酸が多様化される。他の１０種のタイプは表２２７３から選択される。全ての他のＡＡは同じ比率を与えられる。このライブラリーでは、ＦＲ３は固定されたＫ９４で終わる。ＦＲ４はＪＨ２：ＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ由来である。これにより、他のＪＨで認められる少々厄介なＧＱＧ配列を避けられる。許容多様性は２．３Ｅ７である。
【０７０９】
あるいは、ライブラリーで：
Ｘ１０を、Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｋ、またはΔが許容され、その比率を、１０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：２０、とすることもできる。
これにより、比率が１：３：３：１である１０、１１、１２、または１３の長さが許容される。配座は、ｘｘＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹｘＦＤＬ（Ｌ＝１３）、ｘＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹｘＦＤＬ（Ｌ＝１２）、ＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹｘＦＤＬ（Ｌ＝１１）、ｘｘＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹＦＤＬ（Ｌ＝１２）、ｘＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹＦＤＬ（Ｌ＝１１）、またはＧＹＳＳ（Ｇ／Ｓ）ＷＹＦＤＬ（Ｌ＝１０）である。許容多様性は２．５Ｅ７である。２．Ｅ８の検体は適切であるが、１．Ｅ９の検体が好ましい。
【０７１０】
ライブラリー  Ｎｏ．７：ライブラリー７は、Ｄセグメント前後の多くの残基に多様性を有するＤ２−１５．２（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ）の多様化バージョンを含む。０〜２アミノ酸、Ｄ２−１５．２、０〜２アミノ酸、およびＦＤＬを含む；ＦＲ４はＪＨ２と同等である（そのためＧＱＧを含めない）．このライブラリーでは、ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ１５−Ｄ１６−Ｌ１７を含み、ここで：
【０７１１】
Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｐ、またはΔが許容され、その比率は、表２２１２ＡのＰ１、％（すなわち、Ｄ：Ｇ：Ｖ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｒ：Ｌ：Ｔ：Ｈ：Ｐ：Δ：：２１４：１９２：９２：９０：８６：５２：５０：３９：３２：３２：２５：＊）で示され、Δは長さ分布により決まる頻度で使われ；
【０７１２】
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、またはΔが許容され、その比率は、１７１：１５３：１０７：８３：８１：５１：４０：４０：３４：３２：３０：＊（表１２のＰ２、％に示す。Δの割合は長さ分布により決まる）であり；
【０７１３】
Ｘ３は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｌ、またはΔが許容され、その比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
【０７１４】
Ｘ４は、Ｙ．Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｐ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ａ、またはＬが許容され、その比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７１５】
Ｃ５は、Ｃｙｓであり；
【０７１６】
Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷが許容され、その比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７１７】
Ｘ７は、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷが許容され、その比率は、２０：２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７１８】
Ｘ８は、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷが許容され、その比率は、２０：２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７１９】
Ｘ９は、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＷが許容され、その比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７２０】
Ｃ１０は、Ｃｙｓであり；
【０７２１】
Ｘ１１は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｎ、またはＫが許容され、その比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１であり；
【０７２２】
Ｘ１２は、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、またはΔが許容され、その比率は、２０：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
【０７２３】
Ｘ１３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはΔが許容され、その比率は、５：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：＊であり；
【０７２４】
Ｘ１４は、Ｘ１３に同じであり；
【０７２５】
Ｆ１５は、Ｐｈｅであり；
【０７２６】
Ｄ１６は、Ａｓｐであり；さらに
【０７２７】
Ｌ１７は、Ｌｅｕである。
【０７２８】
長さ分布は、Ｌｅｎ１１：Ｌｅｎ１２：Ｌｅｎ１３：Ｌｅｎ１４：Ｌｅｎ１５：Ｌｅｎ１６：Ｌｅｎ１７：：ｎ１：ｎ２：ｎ３：ｎ４：ｎ５：ｎ６：ｎ７である。一部の実施形態では、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝ｎ４＝ｎ５＝ｎ６＝ｎ７＝１である。ｎ１＝１、ｎ２＝２、ｎ３＝４、ｎ４＝５、ｎ５＝４、ｎ６＝３、ｎ７＝２の長さ分布で、１３および１４の間の長さ中央値が得られる。他の長さ分布も使用可能である。
【０７２９】
１７の位置を命名したが、その内の６つは欠けている。従って、許容長さは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および１７である。許容多様性は５．４Ｅ１２である。１．Ｅ８の許容配列を含むライブラリーは、有用な多様性を与えると思われる。１．Ｅ９を含むライブラリーはさらに好ましい。固定された対のシスティン残基の存在のために、構造的制約が強いられ、Ａｂの結合特性に悪影響が出ると思われる。
【０７３０】
ジスルフィド閉ループは、１６の構成として出現可能である：１）ｘｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘｘＦＤＬ、２）ｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘｘＦＤＬ、３）ＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘｘＦＤＬ、４）ＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘｘＦＤＬ、５）ｘｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘＦＤＬ、６）ｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘＦＤＬ、７）ＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘＦＤＬ、８）ＸＣＸＸＸＸＣＸＸｘＦＤＬ、９）ｘｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸＦＤＬ、１０）ｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸＦＤＬ、１１）ＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸＦＤＬ、１２）ＸＣＸＸＸＸＣＸＸＦＤＬ、１３）ｘｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＦＤＬ、１４）ｘＸＸＣＸＸＸＸＣＸＦＤＬ、１５）ＸＸＣＸＸＸＸＣＸＦＤＬ、および１６）ＸＣＸＸＸＸＣＸＦＤＬ。
【０７３１】
３〜１２で許容されるアミノ酸タイプの独自性は表２２９３から受け継いだもので、Ｄ２−１５．２、Ｄ２−２．２およびこれらの混合物に対してタイプの集計結果を示す。
【０７３２】
実施例５０：ＨＣ ＣＤＲ３にＤセグメントを含まないライブラリー。
本実施例の目的は、１０ｎＭ未満の親和性を有する生理活性抗体を、ほぼどのタンパク質標的に対しても選択可能な十分な多様性を有するヒトＡｂのライブラリーを提供することである。Ａｂライブラリーのパフォーマンス改善の方法は、２通りある：ａ）Ｄセグメントを含まないＨＣ  ＣＤＲ３の長さは、文献記載より短い（９．５ｖｓ１２．５）、およびｂ）アミノ酸分布が、Ｄセグメントを有さないＡｂで見られるものにより近い。
【０７３３】
ＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０由来のＡｂ１９、０５１の分析により、５、５２３（１／４超）が識別可能なＤセグメントを有さない（すなわち、Ｄセグメントから来た３つの連続するＡＡが無い）ことが示された。全ＨＣ  ＣＤＲ３の長さ中央値は１２に近いが、Ｄセグメントを欠くＡｂは、長さ中央値９．３ＡＡである。ＡＡＴの分布は、また、ＤのないＡｂでは大きく異なる。ＨＣ  ＣＤＲ３の全体集団では、Ｔｙｒが最もよく現れる。Ｄのない集団では、Ｔｙｒは、約２．５％でのみ存在し、Ｇｌｙが最もよく現れるＡＡＴである。ＭｅｔおよびＣｙｓは、Ｄのない集団では基本的に欠けている。分布は位置依存性である。すなわち、ＨＣ  ＣＤＲ３の最初の位置のＡＡＴの頻度は、位置２とは異なり、また位置２の頻度は位置３の頻度とは異なる、等々。
【０７３４】
本発明のＡｂは、ファージ、ファージミド、または酵母上で提示可能である。記載した多様性は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＩｇ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、等）中で具体化することが可能である。
【０７３５】
提案された抗体（Ａｂ）ライブラリーは、ファージミドまたはファージ上で提示されることになる。全ての多様性は、合成によるものとなる。全ての重鎖（ＨＣ）フレームワークは３−２３であり、全ての軽鎖（ＬＣ）フレームワークはＡ２７となる。
【０７３６】
各可変位置で、１１以上のアミノ酸タイプが供される。
【０７３７】
ＨＣ多様性：
相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のＨＣ多様性は、位置３１、３３、および３５にあり、ＣｙｓまたはＭｅｔ以外のどのアミノ酸タイプ（ＡＡＴ）も許容され、５、８３２変異体が生成する。ＣＤＲ２は、位置５０、５２、５２ａ、５６、および５８で変化する。位置５０、５２、５６、および５８では、ＣｙｓおよびＭｅｔ以外の全てのＡＡＴが許容される。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のこれらの位置のそれぞれで、生殖系列（ＧＬ）ＡＡＴは、非ＧＬＡＡＴよりも３倍高い出現可能性がある。位置５２ａでは、ＧＰＳＹを同じ出現可能性で許容する。これにより、４１９、９０４ＣＤＲ２変異体が得られる。ＨＣ  ＣＤＲ１〜２で許容される多様性は２．４５Ｅ９である。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２にユニークな部位（ＢｓｔＸＩ）があり、必要に応じ、どちらか一方に多様性を導入することができる。１．Ｅ８単離体のみを作製する場合、許容多様性（表２００に示すように）の約４％のみを得ることになる。全ＣＤＲ１多様性を入手し、また全ＣＤＲ２多様性を入手できるが、全ての組み合わせを入手することはできない。従って、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間の異なる制限酵素部位がある場合は、ＣＤＲ１の多様性を選択物中に挿入し、選択したＣＤＲ２との全ての組み合わせを検証して、逆にＣＤＲ２の多様性を選択したＡｂに挿入することができる。
【表９９】
2013504602.tif 000128
【０７３８】
ＨＣ  ＣＤＲ３多様性は、Ｄセグメントのない、許容長さが８〜１１の、さらに長さ中央値が９．５（許容多様性３．６１Ｅ８、実際の多様性２．７１Ｅ８（ポアソン統計および５Ｅ８単離物（７５％抽出検体）を仮定して）のサブライブラリーである。表２０１は、種々の数の単離物（Ｎｉｓｏｌａｔｅｓ）に対し予測可能な区別できるＣＤＲ３の数（Ｎｄ）を示す。
【表１００】
2013504602.tif 000129
【０７３９】
表２０２は、ＨＣ  ＣＤＲ３の一実施形態に使用可能なアミノ酸タイプ（ＡＡＴ）の分布を示す。別の実施形態では、表３でゼロ以外のエントリーを有する各ＡＡＴは、その位置でゼロ以外のエントリーを有する全ての他のＡＡＴと同じ確率を有する。これらは、識別可能なＤセグメントを持たないＡｂの各位置で１１または１２の最もよく見られるＡＡＴとして選択された。数は、特定のｉ：ｉ＋１、ｉ：ｉ＋２、およびｉ：ｉ＋３の対の頻度を変えるために調節された。１００、１０１、および１０２に対して示されているＡＡＴの”−”は、アミノ酸がその位置に無く、ＣＤＲ３が短いことを意味する。これらの比率でのアミノ酸の脱落部分により、比率１：２：２：１の場合に、おおざっぱに、長さで８：９：１０：１１になる。
【表１０１】
2013504602.tif 000130
【０７４０】
ＬＣ多様性
全てのＬＣは、Ａ２７（ＶＫ−ＩＩＩ）フレームワークを有する（表２０４）。ＣＤＲ１の位置２７、２８、３０、３１、３１ａ、３２、および３４で、変化が許容される。ＣＤＲ２の位置５０、５３、および５６で変化が供される。ＣＤＲ３の位置９１〜９６で変化が許容される。ＪＫ４およびＪＫ３が好ましい。許容多様性は、４．６Ｅ１６である。実際の多様性は、１．Ｅ８より大きくするべきである。各可変位置で１１以上のＡＡＴが許容され、ＧＬＡＡＴは他の１０ＡＡＴのそれぞれよりも高い出現可能性を有する。ユニーク部位（ＸｈｏＩ）をＣＤＲ２とＣＤＲ３の間で操作してＣＤＲ１−２およびＣＤＲ３が別々に操作されるようにできる。ユニークＳａｃＩＩ部位は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間にある。
【０７４１】
表２０９は、一実施形態で、多様性をＬＣ  ＣＤＲ１中へ導入するために使用するための分布を示す。別の実施形態では、表２０９のゼロ以外のエントリーを有する各ＡＡＴが、ゼロ以外のエントリーを有する他の全てのＡＡＴと同じ頻度で使われる。表２１０は、一実施形態における、ＬＣ  ＣＤＲ２の分布を示す。別の実施形態では、表２１０のゼロ以外のエントリーを有する各ＡＡＴが、表２１０のゼロ以外のエントリーを有する他の全てのＡＡＴと同じ頻度で使われる。表２１１は、一実施形態で使われるＬＣ  ＣＤＲ３の分布を示す。別の実施形態では、ゼロ以外のエントリーを有するＡＡＴが同じ頻度で使われる。表２１２は、各ＬＣ  ＣＤＲで許容される多様性を示す。
【０７４２】
表２１３は、ベクターｐＭ２１Ｊの注釈付きＤＮＡ配列を示す。注釈の無いＤＮＡ配列は、表２１５にある。
【０７４３】
【表１０２】
2013504602.tif 000131
2013504602.tif 000132
【表１０３】
2013504602.tif 000133
【表１０４】
2013504602.tif 000134
【表１０５】
2013504602.tif 000135
【０７４４】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含むサブライブラリーを構築可能である。これら２つのＣＤＲの許容多様性は、２．５７Ｅ９である；１．Ｅ７を含有する検体で十分であろう。１．Ｅ８を有する検体はさらに良い。１．Ｅ９を有する検体はまたさらに良い。１．Ｅ８のＣＤＲ１〜２のサブライブラリーを２Ｅ７のＣＤＲ３のライブラリーと組み合わせると、許容多様性は２Ｅ１５になるが、１．Ｅ８の抽出検体でも多くの有用なカッパ軽鎖を含むであろう。１．Ｅ９の検体が好ましい。
【表１０６】
2013504602.tif 000136
【０７４５】
全体ライブラリー
全体の多様性は、１．Ｅ１０より大きく、おそらく、５．Ｅ１０になると思われる。各多様性の領域は、ライブラリーの多様性を最初の単離物セット中に挿入するのに適した一対のユニークな制限酵素部位に結合される。多様性は、別々のプラスミド中のそれぞれの多様性ユニット（ＨＣ  ＣＤＲ１〜２、ＨＣ  ＣＤＲ３（４バージョン）、ＬＣ  ＣＤＲ１−２、およびＬＣ  ＣＤＲ３）で維持することができる。
【表１０７】
2013504602.tif 000137
2013504602.tif 000138
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
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【表１１４】
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【表１１５】
2013504602.tif 000151
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【表１１６】
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【表１１７】
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【表１１８】
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【表１１９】
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【表１２０】
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【表１２１】
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【表１２２】
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【表１２３】
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【表１２４】
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【表１２５】
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【表１２６】
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【表１２７】
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【表１２８】
2013504602.tif 000167
【０７４６】
表３００７は、全体ＨＣ  ＣＤＲ３中、および領域ＶＪ  ｆｉｌｌ、ＶＤ  ｆｉｌｌ、Ｄセグメント、ＤＪ  ｆｉｌｌ、およびＪｓｔｕｍｐ中での塩基の使用頻度を示す。ＶＪ  ｆｉｌｌはＧの頻度が高く、これはこの領域での高いＧｌｙの使用率と整合することがわかる；ＶＪ  ｆｉｌｌは、塩基の２３％を占める。ＶＤ  ｆｉｌｌは、Ｇが多いが、この領域のＧｌｙリッチと一致する。ＶＤ  ｆｉｌｌは短く、塩基の９％を占めるにすぎない。Ｄ由来の配列がＣＤＲ３塩基の約２６％を提供し、ＴおよびＧがリッチでＡはＣより多い。これは、Ｔｙｒの多い部分（ＴＡｙ）と整合する。Ｄ領域由来の部分では、ＴＡＴコドンの数がＴＡＣより７８４７〜５９４６多い。ＤＪ  ｆｉｌｌは、Ｇの使用頻度が最も高く、３９％である。Ｊｓｔｕｍｐ中では、Ｔの頻度が非常に高く、３５％である。Ｊｓｔｕｍｐでは、ＴＡＣコドンの数がＴＡＴコドンより２３１７０〜１１６６多い。
【表１２９】
2013504602.tif 000168
【表１３０】
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【表１３１】
2013504602.tif 000170
【表１３２】
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【表１３３】
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【表１３４】
2013504602.tif 000173
【表１３５】
2013504602.tif 000174
【０７４７】
表２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、および２２１０は、ＪＨ１〜ＪＨ６の分布を示す。
【表１３６】
2013504602.tif 000175
【表１３７】
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【表１３８】
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【表１３９】
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【表１４０】
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【表１４１】
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【表１４２】
2013504602.tif 000181
【表１４３】
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【表１４４】
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【表１４５】
2013504602.tif 000184
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【表１４６】
2013504602.tif 000186
【表１４７】
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【表１４８】
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【表１４９】
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【表１５０】
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【表１５１】
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【表１５２】
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【表１５３】
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【表１５４】
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【表１５５】
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【表１５６】
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【表１５７】
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【表１５８】
2013504602.tif 000199
【０７４８】
下に示す表３０２０〜３０２７は、ＨＣ  ＣＤＲ３ライブラリーの構築に使用可能な好ましい比率のアミノ酸タイプ（ＡＡタイプ）を示す。ＣＤＲの長さは、４〜１４が可能である。表は、位置１〜１２の比率を示す。長さ１３および１４に対しては、位置９の比率が１回または２回繰り返される。
【０７４９】
長さ１１に対しては、表の位置９を除くか、または表の位置９と１０の平均値を使用し、実際の位置９および実際の位置１０用の位置１１の表の値を作ることができる。表の位置１２は位置１１で使われる。
【０７５０】
長さ１０に対しては、表の位置８と９を除き、表の１０、１１、および１２を位置８、９、および１０として使用できる。あるいは、実際の位置８は、表の８と表の１０の平均である；実際の位置９は、表の９と表の１１の平均である；さらに、実際の位置１０は、表の１２である。
【０７５１】
長さ９に対しては、表の位置７、８、９を除き、表の位置１０、１１、および１２を使用できる。あるいは、位置８、９、および１０を除くことができる。あるいは、９、１０、および１１を除くことも可能である。あるいは、表の位置１１、１２、および１３を除くこともできる。あるいは、実際の位置７は、表の位置７および１０の平均であってもよい；位置８は、表の位置８および１１の平均である；また位置９は表の位置９および１２の平均である。
【０７５２】
長さ８に対しては、表の位置［６、７、８、および９］；［７、８、９、および１０］；［８、９、１０、および１１］；または［９、１０、１１、および１２］を除外可能である。あるいは、表の位置１〜５を使用可能である；表の位置６を除外可能である。；表の位置７および１１の平均は実際の位置６に使用できる；表の位置８および１２の平均は実際の位置７に使用できる；また、表の位置９および１２の平均は実際の位置８に使用できる。
【０７５３】
長さ７に対しては、表の位置［５、６、７、８、および９］；［６、７、８、９、および１０］；［７、８、９、１０、および１１］；または［８、９、１０、１１、および１２］を除外可能である。あるいは、表の位置５および６を除外可能で、表の位置７および１１の平均を実際の位置５に使用できる；表の位置８および１２の平均を実際の位置６に使用できる；および表の位置９および１２の平均を実際の位置７に使用できる。あるいは、表の位置１〜４を使用できる；表の位置８および９を除外できる；表の位置５および１１の平均を実際の位置５に使用できる；表の位置６および１２の平均を実際の位置６に使用できる；および表の位置７および１２の平均を実際の位置７に使用できる。
【０７５４】
長さ６に対しては、表の位置［４、５、６、７、８、および９］；［５、６、７、８、９、および１０］；［６、７、８、９、１０、および１１］；または［７、８、９、１０、１１、および１２］を除外可能である。あるいは、表の位置１〜３を含めてもよい；表の位置４、５および６を除外できる；表の位置７および１１の平均を実際の位置４に使用できる；表の位置８および１２の平均を実際の位置５に使用できる；および表の位置９および１２の平均を実際の位置６に使用できる。あるいは、表の位置１〜３を含めてもよい；表の位置７、８および９を除外できる；表の位置４および１０の平均を実際の位置４に使用できる；表の位置５および１１の平均を実際の位置５に使用できる；および表の位置６および１２の平均を実際の位置６に使用できる。
【０７５５】
長さ５に対しては、表の位置［３、４、５、６、７、８、および９］；［４、５、６、７、８、９、および１０］；［５、６、７、８、９、１０、および１１］；または［６、７、８、９、１０、１１、および１２］を除外可能である。あるいは、表の位置１および２を含めてもよい；表の位置３、４、５および６を除外でき、表の位置７および１１の平均を実際の位置３に使用できる；表の位置８および１２の平均を実際の位置４に使用できる；また、表の位置９および１２の平均を実際の位置５に使用できる。あるいは、表の位置６、７、８および９を除外可能で、表の位置３および１１の平均を実際の位置３に使用できる；表の位置４および１２の平均を実際の位置４に使用できる；また、表の位置５および１２の平均を実際の位置５に使用できる。
【０７５６】
長さ４に対しては、表の位置［２、３、４、５、６、７、８、および９］；［３、４、５、６、７、８、９、および１０］；［４、５、６、７、８、９、１０、および１１］；または［５、６、７、８、９、１０、１１、および１２］を除外可能である。あるいは、表の位置１を使用可能である；表の位置２、３、４、５および６を除外可能であり、表の位置７および１１の平均を実際の位置２に使用できる；表の位置８および１２の平均を実際の位置３に使用できる；また、表の位置９および１２の平均を実際の位置４に使用できる。あるいは、表の位置５、６、７、８および９を除外可能である。また、表の位置２および１１の平均を実際の位置２に使用できる；表の位置３および１２の平均を実際の位置３に使用できる；さらに表の位置４および１２の平均を実際の位置４に使用できる。
【０７５７】
表３０２０〜３０２７は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒの比率を変えることにより表３０１０から得られた比率を示す。ライブラリーは、いずれかの比率のセットを用いて構築可能である。ＨＣ  ＣＤＲ３、または実際に合成抗体の全ＣＤＲ中の各位置でＴｙｒおよびＳｅｒのみが許容される場合に有用な抗体を得ることができるという証拠がある。このような抗体は高親和性と良好な特異性を有すると報告されているが、臨床試験に持ち込んだものは誰もいない。他のＡＡタイプを含めることは、治療薬として有用な抗体を得るのに重要である可能性がある。
【０７５８】
実施例８：４〜１２の長さで、Ｄセグメントを持たないＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリー。
この実施例は、高頻度のＴｙｒを有するように調節した表３０２３、表３０１０を使用する。長さ１２に対しては、メンバーは、表３０２３に示すＡＡタイプ分布を有する。長さ１１に対しては、先頭の８つの位置を表３０２３Ａ、Ｂに示している。９番目の位置は、表の９番目と１０番目の位置の平均の分布を有する：Ａ：０．０３６４、Ｄ：０．０２１５、Ｆ：０．５２８１、Ｇ：０．０１１６、Ｌ：０．０３２７、Ｐ：０．０６００、Ｒ：０．０７３７、Ｓ：０．０１１６、Ｔ：０．０３２３、Ｖ：０．０３２７、Ｗ：０．０１９５、Ｙ：０．０１３９９。位置１０および１１は、表中の「１１」および「１２」の列に示された分布を使用する。この実施例では、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置は、１〜１２の番号を付けている。これらは位置９５、９６、．．．１０２ｄに対応する。
【０７５９】
長さ１０に対しては、位置１〜７は、表３０２３Ａ、Ｂに示されている。位置８は、表の位置８および１０の平均である：Ａ：０．０４０３４、Ｄ：０．０１８４、Ｆ：０．５１６７、Ｇ：０．０１１６、Ｌ：０．０４４１３、Ｐ：０．０５３７１、Ｒ：０．０７５６、Ｓ：０．０１１６、Ｔ：０．０３３２、Ｖ：０．０２７７、Ｗ：０．０２７２、Ｙ：０．１４０。位置９は、表の位置９および１１の平均である：Ａ：０．０３６４、Ｄ：０．５２１５、Ｆ：０．０２８１４、Ｇ：０．０１１６０、Ｌ：０．０３２７、Ｐ：０．０６００、Ｒ：０．０７３７、Ｓ：０．０１１６、Ｔ：０．０３２３、Ｖ：０．０３２７、Ｗ：０．０１９５、Ｙ：０．１３９９。位置１０は、表中の位置「１２」の列の数値を使う。
【０７６０】
長さ９に対しては、位置１〜７は、表３０２３に示されている。位置８および９は、表中で位置「１１」および「１２」の列の数値を使う。
【０７６１】
長さ８に対しては、表の位置１〜５が使われる。位置６〜８は、表３０３１に示されている。
【０７６２】
長さ７に対しては、位置１〜４は、表３０２３に示されている。位置５〜７が表３０３２に示され、表３０１０の位置５と１０、６と１１、および７と１２の平均が使われる。
【０７６３】
長さ６に対しては、位置１〜３は、表３０２３に示されている。位置４〜６は表３０３３に示され、表の位置４と１０、５と１１、および６と１２の平均が使われる。
【０７６４】
長さ５に対しては、位置１〜５は、表３０２３Ａ、Ｂに示されている。
【０７６５】
長さ４に対しては、位置１〜３は、表３０２３Ａに示され、位置４は、表３０２３Ｂにある位置「１２」の列の数値を使う。すなわち、表の位置４〜１１は除かれる。
【０７６６】
異なる長さの比率は、標的に応じて変化しうる。例えば、長さの短いメンバーが多い場合は、ペプチド、小タンパク質、炭水化物、および糖タンパク質は、ライブラリー由来のより良好は結合剤を与えることができる。長いメンバーが多い場合は、大きなタンパク質が、より良好は結合剤を与えることができる。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：１：１：１：１：１：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：３：３：２：２：２：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：１：１：１：１：２：２：２：３：３。各長さに対し、例えば、２．Ｅ６メンバーおよび全体で１．８Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ３が得られる。この多様性は、例えば、２．Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ１／２の多様性のライブラリーと組み合わせて、例えば、１．Ｅ９のＨＣを作製できる。
【０７６７】
ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、実施例４．１および実施例４．２、実施例４．３、または実施例１５に示すＨＣ  ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性と組み合わされる。ＬＣ多様性は、実施例５、実施例９、または実施例１６に示されている。好ましいベクターは、ｐＭＩＤ５５Ｆで、構築方法は、実施例９に示されている。
【表１５９】
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【表１６０】
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【表１６１】
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【表１６２】
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【表１６３】
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【表１６４】
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【表１６５】
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【表１６６】
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【表１６７】
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【表１６８】
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【表１６９】
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【表１７０】
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【表１７１】
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【表１７２】
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【表１７３】
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【表１７４】
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【表１７５】
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【表１７６】
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【表１７７】
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【表１７８】
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【表１７９】
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【０７６８】
実施例９：ＬＣライブラリー
４０のＶｋａｐｐａ生殖系列遺伝子がある。ＣＤＲでは、これらは表３６００の多様性を示す。本発明の一実施形態は、ＬＣ  ＣＤＲの多様化位置（ＣＤＲ１：２７〜２８、３０〜３２；ＣＤＲ２：５０、５３、５６、およびＣＤＲ３：９１〜９６）が変えられて、ａ）Ａ２７の生殖系列残基が５０％の確率で存在し（表３６０１〜３６０３の「許容ＡＡＴ」列中の最初のＡＡＴが生殖系列ＡＡＴである）、ｂ）各位置で１０タイプの最もよく見られるＡＡＴが含まれ、さらにｃ）各位置で見られる全ＡＡＴが等頻度で含まれているライブラリーに関する。これは、一部の位置では、１２以上の許容ＡＡＴを有することを意味する。ライブラリーの一部で、２つの位置でアミノ酸を含まないことが許容され、これらは、表３６０１および３６０３の「許容ＡＡＴ」列中の「＊」で示される３０ａおよび９３である。すなわち、ＣＤＲ１は、１１または１２長さで、ＣＤＲ３は、８または９長さでありうる。これは、ＣＤＲ１に対して２．９Ｅ６の多様性、ＣＤＲ２に対して１．８Ｅ３の多様性、およびＣＤＲ３に対して３．４Ｅ６の多様性を与える。全体の許容多様性は、１．８Ｅ１６である。実際のライブラリーは、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、または３．Ｅ９の実際のメンバーを有することができる。これらは、０．１、０．３、１．、３．、または１０倍多いメンバーを有するＨＣライブラリーと組み合わせて、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、３．Ｅ９、１．Ｅ１０、３．Ｅ１０、１．Ｅ１１、または５．Ｅ１１メンバーを作ることができる。
【０７６９】
ライブラリーは、表３６１０および表３６１１で示されるように、ベクターｐＭＩＤ５５Ｆ中で構築される。ベクターｐＭＩＤ５５Ｆは、多様性をベクター中に効率的に導入するように設計されている。ベクター中の各ＣＤＲは２つの停止コドンを持つ。最初に、４つのライブラリーが構築される：ＨＣ  ＣＤＲ１−ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１−ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３。これらのライブラリーそれぞれ、１．Ｅ６、３．Ｅ６、１．Ｅ７、または３．Ｅ７メンバーを有するであろう。ＨＣのライブラリーは、ＣＤＲ３多様性をＸｂａＩ−ＡｐａＩ断片としてＨＣ  ＣＤＲ１−ＣＤＲ２多様性中に導入することにより構築される。このＨＣライブラリーは、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、または５．Ｅ９メンバーを有するはずである。ＸｂａＩおよびＡｐａＩは反対の極性を有し、ＸｂａＩは５’オーバーハングを生成し、ＡｐａＩは、３’オーバーハングを生成する。
【０７７０】
ＬＣのライブラリーは、ＣＤＲ１−ＣＤＲ２多様性をＳａｃＩ／ＸｈｏＩ断片としてＣＤＲ３多様性中に導入することにより構築される。ＳａｃＩは、３’オーバーハングを生成し、ＸｈｏＩは、５’オーバーハングを生成する。このＬＣライブラリーは、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、または５．Ｅ９メンバーを有するであろう。Ｆａｂライブラリーは、ＬＣをＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてＨＣ多様性中に導入することにより構築される。ＳａｃＩは、３’オーバーハングを生成し、ＥｃｏＲＩは、５’オーバーハングを生成する。最終ライブラリーは、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、３．Ｅ９、１．Ｅ１０、３．Ｅ１０、１．Ｅ１１、または５．Ｅ１１メンバーを有するであろう。ライブラリーの構築に使った全制限酵素は、高濃度で入手可能であり、完全に切断する。使った各酵素ペア−は、片方が５’オーバーハングを生成し、他方が３’オーバーハングを生成する。
【表１８０】
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【表１８１】
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【表１８２】
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【表１８３】
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【表１８４】
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【表１８５】
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【０７７１】
実施例１０：４〜１２の長さを有し、ＤセグメントのないＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリー
この実施例は、高頻度Ｇｌｙを有するように調節した表３０２１、表３０１０を使用する。長さ１２に対しては、メンバーは、表３０２１に示すＡＡタイプ分布を有する。長さ１１に対しては、最初の８つの位置は、表３０２１Ａ、Ｂに示されている。９つめの位置は、表の９番目と１０番目の位置の平均の分布を有する：Ａ：０．０３６４、Ｄ：０．０２１５、Ｆ：０．５２８１、Ｇ：０．１４００、Ｌ：０．０３２７、Ｐ：０．０６００、Ｒ：０．０７３７、Ｓ：０．０１１６、Ｔ：０．０３２３、Ｖ：０．０３２７、Ｗ：０．０１９５、Ｙ：０．０１１５。位置１０および１１は、表で「１１」および「１２」列に示された分布を使う。この実施例では、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置は１〜１２の番号が付けられている。これらは、位置９５、９６、．．．１０２ｄに対応する。
【０７７２】
長さ１０に対しては、位置１〜７は、表３０２１Ａ、Ｂに示されている。位置８は、表の位置８および１０の平均である：Ａ：０．０４０３、Ｄ：０．０１８４、Ｆ：０．５１６７、Ｇ：０．１４００、Ｌ：０．０４４１３、Ｐ：０．０５３７１、Ｒ：０．０７５７、Ｓ：０．０１１５、Ｔ：０．０３３２、Ｖ：０．０２７７、Ｗ：０．０２７２、Ｙ：０．０１２。位置９は、表の位置９および１１の平均である：Ａ：０．０３６４、Ｄ：０．５２１５、Ｆ：０．０２８１、Ｇ：０．１４０、Ｌ：０．０３２７、Ｐ：０．０６００、Ｒ：０．０７３７、Ｓ：０．０１１５、Ｔ：０．０３２３、Ｖ：０．０３２７、Ｗ：０．０１９５、Ｙ：０．０１１５。位置１０は、位置「１２」列に示されている比率を使う。
【０７７３】
長さ９に対しては、位置１〜６は表３０２１に示されている。位置７は、表の位置７と１０のへいきんである。すなわち：Ａ：０．０４５５、Ｄ：０．０１９６、Ｆ：０．５０、Ｇ：０．１４０、Ｌ：０．０４３２、Ｐ：０．０５４８、Ｒ：０．０８５３、Ｓ：０．０１１５、Ｔ：０．０３８２、Ｖ：０．０２１５、Ｗ：０．０２８８、Ｙ：０．０１１５。位置８および９は、位置「１１」および「１２」列の比率を使う。
【０７７４】
長さ８に対しては、位置１〜５は表の比率をそのまま使う。位置６〜８は表３６２０に示されている。
【０７７５】
長さ７に対しては、位置１〜４は表３０２１に示されている。位置５〜７は、表３６２１に示されており、表３０２１の位置５と１０、６と１１、および７と１２の平均が使われる。
【０７７６】
長さ６に対しては、位置１〜３は表３０２１に示されている。位置４〜６は表３６２２に示されており、表の位置４と１０、５と１１、および６と１２の平均が使われる。
【０７７７】
長さ５に対しては、位置１〜５は表３０２１Ａ、Ｂに示されている。
【０７７８】
長さ４に対しては、位置１〜３は表３０２１Ａに示されており、位置４は表３０２１Ｂの「１２」の列の比率を使い、表の位置４〜１１の列を除外する。
【０７７９】
異なる長さの比率は、標的に応じて変化しうる。例えば、長さの短いメンバーが多い場合は、ペプチド、小タンパク質、炭水化物、および糖タンパク質は、ライブラリー由来のより良好は結合剤を与えることができる。長いメンバーが多い場合は、大きなタンパク質が、より良好は結合剤を与えることができる。
本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：１：１：１：１：１：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：３：３：２：２：２：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：１：１：１：１：２：２：２：３：３。例えば、２．Ｅ６メンバーおよび全体で１．８Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ３が得られる。この多様性は、例えば、２．Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ１／２の多様性のライブラリーと組み合わせて、例えば、１．Ｅ９のＨＣを作製できる。
【０７８０】
ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、実施例４．１および実施例４．２、または実施例４．３、に示すＨＣ  ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性と組み合わされる。ＬＣ多様性は、実施例５、実施例９、または実施例１５に示されている。好ましいベクターは、ｐＭＩＤ５５Ｆで、構築方法は、実施例９に示されている。
【表１８６】
2013504602.tif 000242
【表１８７】
2013504602.tif 000243
【表１８８】
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【０７８１】
実施例１１：５〜１１長さを有しＤセグメントのないＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリー
この実施例は、高頻度ＧｌｙおよびＳｅｒおよび低頻度Ｔｙｒを有するように調節した表３０２４、表３０１０を使用する。長さ１１に対しては、最初の８つの位置は、表３０２４Ａ、Ｂに示されている。９つめの位置は、表中の９番目と１０番目の位置の平均の分布を有する：Ａ：０．０２９、Ｄ：０．０１７、Ｆ：０．５２２、Ｇ：０．１１１４、Ｌ：０．０２６、Ｐ：０．０４７８、Ｒ：０．０５８６、Ｓ：０．１１１４、Ｔ：０．０２５７、Ｖ：０．０２６、Ｗ：０．０１５５、Ｙ：０．００９１。位置１０および１１は、表中の「１１」および「１２」の列で示されている分布を使う。この実施例では、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置は、１〜１１の番号を付けている。これらは、位置９５、９６、．．．１０２ｃに対応する。
【０７８２】
長さ１０に対しては、位置１〜８は、表３０２４Ａ、Ｂに示されている。位置９は、表の位置９および１１の平均である：Ａ：０．０２９、Ｄ：０．５１７、Ｆ：０．０２２４、Ｇ：０．１１１４０、Ｌ：０．０２６、Ｐ：０．０４７７、Ｒ：０．０５８６、Ｓ：０．１１１３、Ｔ：０．０２５７、Ｖ：０．０２６、Ｗ：０．０１５５、Ｙ：０．００９１。位置１０は、表の位置「１２」の列の分布を使用する。
【０７８３】
長さ９に対しては、位置１〜６は、表３０２４Ａ、Ｂに示されている。位置７は、表の位置７および１０の平均である。すなわち、Ａ：０．０３６２、Ｄ：０．０１５６、Ｆ：０．５０、Ｇ：０．１１１４０、Ｌ：０．０３４３６、Ｐ：０．０４３６、Ｒ：０．０６７８、Ｓ：０．１１１４、Ｔ：０．０３０４、Ｖ：０．０１７１、Ｗ：０．０２２９、Ｙ：０．００９１。位置８および９は、表中の位置「１１」および「１２」の列の分布を使う。
【０７８４】
長さ８に対しては、位置１〜５は、表のままである。位置６〜８は、表３６３０に示されている。
【０７８５】
長さ７に対しては、位置１〜４は、表３０２４に示されている。位置５〜７は、表３６３１に示され、表３０２４の位置５と１０、６と１１、および７と１２の平均値が使われる。
【０７８６】
長さ６に対しては、位置１〜３は、表３０２４に示されている。位置４〜６は、表３６３２に示され、表の位置４と１０、５と１１、および６と１２の平均値である。
【０７８７】
長さ５に対しては、位置１〜５は、表３０２４Ａ、Ｂに示されている。
【０７８８】
異なる長さの比率は、標的に応じて変化しうる。例えば、長さの短いメンバーが多い場合は、ペプチド、小タンパク質、炭水化物、および糖タンパク質は、ライブラリー由来のより良好は結合剤を与えることができる。長いメンバーが多い場合は、大きなタンパク質が、より良好は結合剤を与えることができる。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：：１：１：１：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：：３：２：２：２：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：：１：１：１：２：２：２：３。各長さに対し、例えば、２．Ｅ６メンバーおよび全体で１．４Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ３が得られる。この多様性は、例えば、２．Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ１／２の多様性のライブラリーと組み合わせて、例えば、１．Ｅ９のＨＣを作製できる。
【０７８９】
ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、実施例４．１および実施例４．２、または実施例４．３、に示すＨＣ  ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性と組み合わされる。ＬＣ多様性は、実施例５、実施例９、または実施例１５に示されている。好ましいベクターは、ｐＭＩＤ５５Ｆで、構築方法は、実施例９に示されている。
【表１８９】
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【表１９０】
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【表１９１】
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【０７９０】
実施例１２：別のＨＣ  ＣＤＲ３ライブラリー
表３０１０、３０２０、３０２１、３０２２、３０２３、３０２４、３０２５、３０２６、または３０２７に示す比率を様々な手法で使用することが可能である。例えば、表３０２３および表３１００に従ってライブラリーの構築に使用できる。表３１００から、ソースの表３０１０、３０２０〜３０２７の１つの中のどの列を使えばよいかを知ることができる。最初、「長さ」と標識付けした列から長さを選択する。次に、「長さ」の右側の行中の位置を選択する。表３１００のエントリーから、ソースの表どの列を使うかを知ることができる。
【０７９１】
表３０２３をソースの表であると仮定する。長さ８のメンバーに対し、位置１に比率は、表３０２３の位置１からもたらされる。位置２に対しては、比率は、列の「位置２」から来ることになる。位置３、４、５に対しても、同様な方法が使える。表３１００に示すように、位置６〜８（最後の３つの位置）に対する比率は、表３０２３の「位置１０」、「位置１１」、および「位置１２」の列から来ることになる。長さ９のメンバーに対しては、位置１〜５は、長さ８のメンバーと同様である。位置６は、位置５の繰り返しである。長さ１０に退位しては、表３０２３の位置５の比率を３回繰り返す。長さ１１に対しては、表３０２３の位置５の比率を４回繰り返す。長さ１２に対しては、表３０２３の位置５の比率を５回繰り返す。いくつかの位置で構成を繰り返すことで、必要な混合物の数を減らすことができる。ＤセグメントのないＨＣ  ＣＤＲ３の位置における大抵の変化は、最初の４つまたは５つの位置で発生する。
【０７９２】
ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、実施例４．１および実施例４．２、または実施例４．３、に示すＨＣ  ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性と組み合わされる。ＬＣ多様性は、実施例５、実施例９、または実施例１５に示されている。好ましいベクターは、ｐＭＩＤ５５Ｆで、構築方法は、実施例９に示されている。
【表１９２】
2013504602.tif 000248
【０７９３】
実施例１３：４〜１２の長さを有するＨＣ  ＣＤＲ３のライブラリー
表３０２８Ａおよび表３０２８Ｂは、表３０１０からＳｅｒおよびＧｌｙの比率を増やし、Ｔｙｒの比率を減らして、算出した比率を示す。長さ１２に対しては、比率は表３０２８Ａおよび３０２８Ｂ中にある。長さ１１に対しては、最初の８つの位置は、表３０２８Ａ、Ｂに示されている。位置９、１０、および１１は、表３０２８Ａ、Ｂの位置１０、１１、および１２のカラムの比率を使う。すなわち、標識付けした列「９」を除外する。この実施例では、ＨＣ  ＣＤＲ３の位置は、１〜１２と番号付をされている。これらは、完全ＨＣ中の位置９５、９６、．．．１０２ｄに対応する。
【０７９４】
長さ１０に対しては、位置１〜７は、表３０２８Ａ、Ｂに示されている。位置８〜１０は、表３０２８Ａ、Ｂの位置１０〜１２の列に示された比率である。すなわち、列８と９は除外される。
【０７９５】
長さ９に対しては、表３０２８Ａ、Ｂの列７、８、および９が除外される。
【０７９６】
長さ８に対しては、表３０２８Ａ、Ｂの列６、７、８、および９が除外される。
【０７９７】
長さ７に対しては、表３０２８Ａ、Ｂの列５、６、７、８、および９が除外される。
【０７９８】
長さ６に対しては、表３０２８Ａ、Ｂの列５、６、７、８、９、および１０が除外される。
【０７９９】
長さ５に対しては、表３０２８Ａ、Ｂの列４、５、６、７、８、９、および１０が除外される。
【０８００】
長さ４に対しては、表３０２８Ａ、Ｂの列５〜１２が除外される。
【０８０１】
異なる長さの比率は、標的に応じて変化しうる。例えば、長さの短いメンバーが多い場合は、ペプチド、小タンパク質、炭水化物、および糖タンパク質は、ライブラリー由来のより良好は結合剤を与えることができる。長いメンバーが多い場合は、大きなタンパク質が、より良好は結合剤を与えることができる。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：１：１：１：１：１：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：３：３：２：２：２：１：１：１：１。本発明の一実施形態では、下記の比率の長さの成分を有する：Ｌ４：Ｌ５：Ｌ６：Ｌ７：Ｌ８：Ｌ９：Ｌ１０：Ｌ１１：Ｌ１２：：１：１：１：１：２：２：２：３：３。各長さに対し、例えば、２．Ｅ６メンバーおよび全体で１．８Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ３が得られる。この多様性は、例えば、２．Ｅ７のＨＣ  ＣＤＲ１／２の多様性のライブラリーと組み合わせて、例えば、１．Ｅ９のＨＣを作製できる。
【０８０２】
ＨＣ  ＣＤＲ３の多様性は、実施例４．１および実施例４．２、または実施例４．３、に示すＨＣ  ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性と組み合わされる。ＬＣ多様性は、実施例５、実施例９、または実施例１５に示されている。好ましいベクターは、ｐＭＩＤ５５Ｆで、構築方法は、実施例９に示されている。
【０８０３】
実施例１４：ＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２
表５４は、ＨＣ  ＣＤＲ１の５、５０８配列を許容する多様性を示す。位置３１で、Ｓｅｒは、生殖系列（ＧＬ）アミノ酸タイプである。従って、Ｓｅｒを、例えば、他の各ＡＡＴより、４倍出現可能性を高くする。１８タイプが許容されるため、Ｓｅｒは約１９％（４／２１）の確率で許容され、他の各ＡＡＴは約４．７％の確率で許容される（ＣとＭな除外される）。従って、位置３１でＡＡタイプの選択をしない場合は、Ｓｅｒ含有抗体が単離される可能性が最も高い。同様に、位置３３では、ＧＬのＡＡタイプはＡｌａであり、Ａｌａを、例えば、他のもの（５％）より、４倍（２０％）出現可能性を高くする（Ｃ、Ｎ、およびＭは除外される。３５がＳ側に偏っており、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を避けるため、Ｎは除外される）。位置３５では、ＳｅｒはＧＬのＡＡタイプであり、例えば、他のものより４倍出現可能性を高くする。全３つの位置で、ＣｙｓとＭｅｔは除外される。抗体の溶解度と反応性に悪影響を与える恐れのある余計なジスルフィドまたは不対システインの露出を避けるため、Ｃｙｓは除外される。露出メチオニン側鎖が酸化の対象になり、この酸化が結合特性および保存可能期間を変える可能性があるため、Ｍｅｔは除外される。
【０８０４】
ＣＤＲ２では、多様性は、位置５０、５２、５２ａ、５６、および５８で許容される（表５５に示されるように）。Ａｔ５０、５２、５６、および５８では、ＣｙｓとＭｅｔを除く全アミノ酸タイプが許容され、ＧＬのＡＡタイプの出現可能性が他より４倍高くされる。
【０８０５】
表５４と表５５に示すＣＤＲ１およびＣＤＲ２の組み合わされた多様性は、２．１９Ｅ９である。
【０８０６】
実施例１５：ＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の好ましい形の多様性
ＨＣ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の好ましい形の多様性を表１９１に示す（構成は表１９０に示す）。これらの多様化は、一部は、種々のソース由来の抗体の調査に基づいている。この実施形態では、位置３１は、ＳＡＤＧＱＲＹのみが許容される。位置３３では、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＭｅｔを除く全ＡＡＴが許容される。位置３５では、ＣｙｓとＭｅｔを除く全ＡＡＴが許容される。望ましくない無関係のジスルフィドまたは露出不対システィン（両方とも望ましくない）を防ぐため、Ｃｙｓは除外される。Ｍｅｔはメチオニンが選択されるのを防ぐため、除外される。３５がＳｅｒ側に偏っており、Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）配列の発生を最小限に留めるべきなので、位置３３のＡｓｎは除外される。結合部位にＭｅｔがあると、抗体の保存可能期間が短くなる傾向がある。結合部位でのＭｅｔの酸化は、Ａｂの結合特性を変化させる可能性が非常に高い。これらのアミノ酸の側鎖が、抗体結合部位の方を向いているために、位置３１、３３、および３５が、多様性付与の目的のために選択される。このような位置のメチオニンは、酸化されると、結合特性を大きく変える可能性がある。
【０８０７】
ＧｌｙおよびＰｈｅが位置５４で許容され、Ｇｌｙは、例えば、Ｐｈｅの６倍の頻度である。これは、抗体をＣＤＲ２の１−６９に似させる；１−６９は、ウイルス標的の結合剤として選択されることが多い。表１９１では、Ｎは位置３３、５２、５３、および５６から除外される。Ｑは位置５３で許容される。許容多様性は、２０１６（ＣＤＲ１）、４．６６Ｅ＋０６（ＣＤＲ２）、および９．４０Ｅ＋０９（両方）である。さらに、位置５３で許容ＡＡＴに対し、Ｉｌｅが追加される。理由は、１−６９では、この位置にＩｌｅがあるからである。
【０８０８】
各位置で、ＧＬのＡＡＴは、他の各ＡＡＴより、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍出現頻度が高い可能性がある。
【０８０９】
ＦＲ２中のユニークなＢｓｔＸＩ制限酵素部位のために、ＣＤＲ１をＣＤＲ２と組み換えることができる。
【表１９３】
2013504602.tif 000249
【０８１０】
実施例１６：ＬＣライブラリー
４０  Ｖｋａｐｐａ生殖系列遺伝子がある。ＣＤＲでは、これらは、表３６００に示す多様性を示す。本発明の一実施形態は、ＬＣ  ＣＤＲ（ＣＤＲ１：２７〜２８、３０〜３２；ＣＤＲ２：５０、５３、５６、およびＣＤＲ３：９１〜９６）の多様化位置が変えられ、ａ）Ａ２７の生殖系列残基が５０％の確率で存在し（表４６０１〜４６０３の「許容ＡＡＴ」列中の最初のＡＡＴが生殖系列ＡＡＴである）、ｂ）各位置で１０タイプの最もよく見られるＡＡＴが含まれ、さらにｃ）各位置で見られる全ＡＡＴが等頻度で含まれているライブラリーが含まれ、さらに、ｄ）Ｎ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）を有するメンバーの割合が、２％、１％、０．５％、０．１％未満であるか、またはＮ−Ｘ−（Ｓ／Ｔ）が許容されないライブラリーに関する。これは、一部の位置では、１１以上の許容ＡＡＴを有することを意味する。ライブラリーの一部で、２つの位置でアミノ酸を含まないことが許容され、これらは、表４６０１および表４６０３の「許容ＡＡＴ」列中の「＊」で示される３０ａおよび９３である。すなわち、ＣＤＲ１は、１１または１２長さで、ＣＤＲ３は、８または９長さでありうる。これは、ＣＤＲ１に対して２．９４Ｅ＋０６の多様性、ＣＤＲ２に対して１．８５Ｅ＋０３の多様性、およびＣＤＲ３に対して３．１７Ｅ＋０６の多様性を与える。全体の許容多様性は、１．８Ｅ１６である。実際のライブラリーは、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、ｏｒ３．Ｅ９の実際のメンバーを有することができる。これらは、０．１、０．３、１．、３．、または１０倍多いメンバーを有するＨＣライブラリーと組み合わせて、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、３．Ｅ９、１．Ｅ１０、３．Ｅ１０、１．Ｅ１１、または５．Ｅ１１メンバーを作ることができる。
【０８１１】
Ｖ２９を固定するため、位置２７では、Ｎが許容される。位置３０でＳｅｒがＧＬのＡＡＴであり、この位置で最も出現頻度が高いＡＡＴであるため、位置２８で、Ｎは、Ｑに変えられる。３１でＳｅｒはＧＬのＡＡＴであり、位置３０ａでアミノ酸を有するメンバーに影響を与えるので、位置３０では、ＮはＱに変えられる。Ｓが３２で許容され、Ｑが３０ａで許容されるため、３０ａでは、Ｎは除外される。Ｌ３３を固定するため、Ｎは３１で許容される。
【０８１２】
Ｓ５１が固定されるため、位置５０でＮがＱに変えられる。Ａ５５が固定されるため、Ｎは位置５３で許容される。残基５８がＳでもＴでもないため、Ｎは５６で許容される。
【０８１３】
Ｓが９３でＧＬのＡＡＴであるため、位置９１で、ＮはＱに変えられる。
【０８１４】
ライブラリーは、表３６１０および表３６１１で示されるように、ベクターｐＭＩＤ５５Ｆ中で構築される。ベクターｐＭＩＤ５５Ｆは、多様性をベクター中に効率的に導入するように設計されている。ベクター中の各ＣＤＲは２つの停止コドンを持つ。最初に、４つのライブラリーが構築される：ＨＣ  ＣＤＲ１−ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１−ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３。これらのライブラリーそれぞれ、１．Ｅ６、３．Ｅ６、１．Ｅ７、または３．Ｅ７メンバーを有するであろう。ＨＣのライブラリーは、ＣＤＲ３多様性をＸｂａＩ−ＡｐａＩ断片としてＨＣ  ＣＤＲ１−ＣＤＲ２多様性中に導入することにより構築される。このＨＣライブラリーは、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、または５．Ｅ９メンバーを有するはずである。ＸｂａＩおよびＡｐａＩは反対の極性を有し、ＸｂａＩは５’オーバーハングを生成し、ＡｐａＩは、３’オーバーハングを生成する。
【０８１５】
ＬＣのライブラリーは、ＣＤＲ１−ＣＤＲ２多様性をＳａｃＩ／ＸｈｏＩ断片としてＣＤＲ３多様性中に導入することにより構築される。ＳａｃＩは、３’オーバーハングを生成し、ＸｈｏＩは、５’オーバーハングを生成する。このＬＣライブラリーは、１．Ｅ７、３．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、または５．Ｅ９メンバーを有するであろう。Ｆａｂライブラリーは、ＬＣをＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてＨＣ多様性中に導入することにより構築される。ＳａｃＩは、３’オーバーハングを生成し、ＥｃｏＲＩは、５’オーバーハングを生成する。最終ライブラリーは、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９、３．Ｅ９、１．Ｅ１０、３．Ｅ１０、１．Ｅ１１、または５．Ｅ１１メンバーを有するであろう。ライブラリーの構築に使った全制限酵素は、高濃度で入手可能であり、完全に切断する。使った各酵素ペア−は、片方が５’オーバーハングを生成し、他方が３’オーバーハングを生成する。
【表１９４】
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【表１９５】
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【表１９６】
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【表１９７】
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【表１９８】
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【表１９９】
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【０８１６】
参考文献
本出願全体を通して引用された参照文献、発行特許、広告または非広告特許出願ならびに下記リストに記載されたものを含む全ての引用文献の内容は、本明細書により参照によってその全体が明示的に組み込まれる。矛盾が生じた場合は、本明細書に記載の全ての定義を含め、本出願が優先する。
・米国公開特許 2005-0119455A1
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4: Zhang Y, Yeh S, Appleton BA, Held HA, Kausalya PJ, Phua DC,
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【０８１７】
等価物
多くの本発明の実施形態を説明してきた。それにも関わらず、本発明の趣旨と範囲から乖離することなく様々な改変を行うことが可能であることは理解されよう。従って、他の実施形態も、次の請求項の範囲に入る。
【国際調査報告】
2013504602.tif 000264
2013504602.tif 000265
2013504602.tif 000266