(57)【要約】本発明は、P2X7受容体誘導性アポトーシスががん細胞に特異的であり得ることを実証する。P2X7リガンドBzATPによる処理は、関連する炎症性変化も異常な皮膚または全身性の作用も伴わずに、細胞のアポトーシスを増加させた。DMBA/TPAで処理したマウスにおいて、BzATPは乳頭腫皮膚形成を減少させた。BzATPはまた、生じた乳頭腫の萎縮を誘導し、生じた乳頭腫の底部で増殖しているケラチノサイトにおいてアポトーシスを促進した。これらのデータから、(a) P2X7が表皮細胞のアポトーシスを調節すること；(b) インビボにおいて、P2X7受容体を活性化する薬物の局所投与が、表皮の前悪性病変の発達および進行を阻害し得ることが示される。2013503868.tif 000027
2013503868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) i) 複数の悪性がん細胞を含む対象；
ii) 該がん細胞においてアポトーシスを誘導し得るP2X7受容体アゴニスト
を提供する段階、
b) アポトーシスが誘導されるような条件下で該がん細胞に該アゴニストを投与する段階
を含む方法。
【請求項２】
アゴニストがBzATPを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
アポトーシスががん細胞を死滅させる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
投与段階が、皮内、腫瘍内、経皮、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、および皮下からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
投与段階がTNFαをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
がん細胞が上皮細胞に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
がん細胞が扁平上皮がんを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
a) i)複数の良性がん細胞を発達させるリスクがある対象；
ii) 該がん細胞においてアポトーシスを誘導し得るP2X7受容体アゴニスト
を提供する段階、
b) アポトーシスが誘導されるような条件下で該対象に該アゴニストを投与し、それによって該がん細胞の発達を予防する段階
を含む方法。
【請求項９】
アゴニストがBzATPを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
アポトーシスが発達中のがん細胞を死滅させる、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
投与段階が、皮内、腫瘍内、経皮、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、および皮下からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
投与段階がTNFαをさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
発達中のがん細胞が上皮細胞に由来する、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
発達中のがん細胞が乳頭腫を含む、請求項8記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、がんの治療および予防の分野に関する。がんは過剰増殖の疾患であると考えられており、本発明はこの過剰増殖を減少させるための方法を提供する。例えば、本方法は本明細書において、細胞内アポトーシスの誘導を引き起こし、それによってがん性成長の防止ならびに/またはがんの腫瘍サイズおよび数の減少を引き起こす。特異的膜受容体アゴニスト(すなわち、例えば、P2X7受容体アゴニスト)の投与は、本明細書において、がんの成長および進行を軽減することが示される。
【背景技術】
【０００２】
背景
がんは、環境毒素、疾患、微生物感染、および/または遺伝的素因を包含する多くの病因を有する疾患である。したがって、それぞれの原因因子は、通常様々な生体組織で現れる様々な種類のがんを引き起こすことができ、そしてこれを実際に引き起こす。結果として、様々ながんの種類の大部分の進行を遅らせるかまたは防ぐのに有効な治療アプローチは1つも同定されていない。すべてのがん疾患の間で現在認められている唯一の共通点は、無制御な細胞成長速度によって示される。
【０００３】
上皮細胞成長に関する現在の理論は、細胞分裂促進刺激とアポトーシスの効果のバランスを取る調節経路を予測している。Croker et al., 「Cancer stem cells: implications for the progression and treatment of metastatic disease」 J Cell Mol Med 2008, 12:374-390（非特許文献１）；およびRodriguez-Nieto et al., 「Role of alterations in the apoptotic machinery in sensitivity of cancer cells to treatment」 Curr Pharm Des 2006, 12:4411-4425（非特許文献２）。アポトーシスは、炎症反応を刺激することのない、選択的細胞消失の宿主ゲノムによって調製される恒常的過程であると考えられている。Wyllie et al., 「Cell death: the significance of apoptosis」 Int Rev Cytol 1980, 68:251-306（非特許文献３）；Ellis et al., 「Mechanisms and functions of cell death」 Annul Rev Cell Biol 1991, 7:663-698（非特許文献４）；およびFawthrop et al., 「Mechanisms of cell death」 Arch Toxicol 1991, 65:437-444（非特許文献５）。アポトーシス細胞死の調節不全は、疾患の状態および新生物形質転換に結びつけられている。Soti et al., 「Apoptosis, necrosis and cellular senescence: chaperone occupancy as a potential switch」 Aging Cell 2003, 2:39-45（非特許文献６）；およびRenvoize et al., 「Apoptosis: identification of dying cells」 Cell Biol Toxicol 1998, 14:111-120（非特許文献７）。現在の抗がん療法はすべて、正常な非がん性細胞は様々な治療(すなわち、例えば、放射線および/または化学療法)の影響を受けやすいという共通した問題を共有している。
【０００４】
無制御な成長速度に共通する一様な機構に向けられる、がん治療に関する単一の一様なアプローチが、当技術分野において必要である。成功の可能性を有する1つのアプローチは、アポトーシスが優勢となるように、非がん性組織において細胞増殖/アポトーシス恒常性が影響を受けないように、細胞増殖/アポトーシス恒常性のバランスを取り戻すことに関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Croker et al., 「Cancer stem cells: implications for the progression and treatment of metastatic disease」 J Cell Mol Med 2008, 12:374-390
【非特許文献２】Rodriguez-Nieto et al., 「Role of alterations in the apoptotic machinery in sensitivity of cancer cells to treatment」 Curr Pharm Des 2006, 12:4411-4425
【非特許文献３】Wyllie et al., 「Cell death: the significance of apoptosis」 Int Rev Cytol 1980, 68:251-306
【非特許文献４】Ellis et al., 「Mechanisms and functions of cell death」 Annul Rev Cell Biol 1991, 7:663-698
【非特許文献５】Fawthrop et al., 「Mechanisms of cell death」 Arch Toxicol 1991, 65:437-444
【非特許文献６】Soti et al., 「Apoptosis, necrosis and cellular senescence: chaperone occupancy as a potential switch」 Aging Cell 2003, 2:39-45
【非特許文献７】Renvoize et al., 「Apoptosis: identification of dying cells」 Cell Biol Toxicol 1998, 14:111-120
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明は、がんの治療および予防の分野に関する。がんは過剰増殖の疾患であると考えられており、本発明はこの過剰増殖を減少させるための方法を提供する。例えば、本方法は本明細書において、細胞内アポトーシスの誘導を引き起こし、それによってがん性成長の防止ならびに/またはがんの腫瘍サイズおよび数の減少を引き起こす。特異的膜受容体アゴニスト(すなわち、例えば、P2X7受容体アゴニスト)の投与は、本明細書において、がんの成長および進行を軽減することが示される。
【０００７】
1つの態様において、本発明は、P2X7アゴニスト(すなわち、例えば、3'-O-(4-ベンゾイルベンゾイル)アデノシン三リン酸；BzATP)を投与する段階を含む、がんを治療するための方法を意図する。1つの態様において、P2X7アゴニストはアポトーシスを活性化する。1つの態様において、がんは乳頭腫を含む。1つの態様において、がんは上皮がんを含む。1つの態様において、乳頭腫においてアポトーシスが活性化される。1つの態様において、上皮がんにおいてアポトーシスが活性化される。1つの態様において、アポトーシスは非がん性組織において活性化されない。
【０００８】
1つの態様において、本発明は、a) i) 複数の悪性がん細胞および複数の非がん細胞を含む対象を提供し、ii) 該がん細胞においてアポトーシスを誘導し得るP2X7受容体アゴニストを提供する段階；b) アポトーシスが誘導されるような条件下で該がん細胞に該アゴニストを投与する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、アゴニストはBzATPを含む。1つの態様において、アポトーシスはがん細胞を死滅させる。1つの態様において、該アゴニストは非がん性細胞においてアポトーシスを誘導しない。1つの態様において、投与段階は、皮内、腫瘍内、経皮、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、および皮下からなる群より選択される。1つの態様において、投与段階はTNFαをさらに含む。1つの態様において、がん細胞は上皮細胞に由来する。1つの態様において、がん細胞は扁平上皮がんを含む。1つの態様において、がん細胞はP2X7受容体を含む。1つの態様において、非がん細胞はP2X7受容体を含む。
【０００９】
1つの態様において、本発明は、a) i)複数の良性がん細胞を発達させるリスクがある対象を提供し、ii) 該がん細胞においてアポトーシスを誘導し得るP2X7受容体アゴニストを提供する段階；b) アポトーシスが誘導されるような条件下で該対象に該アゴニストを投与し、それによって該がん細胞の発達を予防する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、アゴニストはBzATPを含む。1つの態様において、アポトーシスは該発達中のがん細胞を死滅させる。1つの態様において、投与段階は、皮内、腫瘍内、経皮、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、および皮下からなる群より選択される。1つの態様において、投与段階はTNFαをさらに含む。1つの態様において、発達中のがん細胞は上皮細胞に由来する。1つの態様において、発達中のがん細胞は乳頭腫を含む。1つの態様において、対象は複数の非がん性細胞をさらに含む。1つの態様において、該アゴニストは非がん性細胞においてアポトーシスを誘導しない。1つの態様において、がん細胞はP2X7受容体を含む。1つの態様において、非がん性細胞はP2X7受容体を含む。
【００１０】
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体遺伝子エンハンサー領域に結合し得る化合物を投与し、エンハンサー領域がP2X7受容体発現を増加させることにより、がんを治療および/または予防する方法を意図する。1つの態様において、P2X7遺伝子はエンハンサー領域(すなわち、例えば、+222/+232)を含む。1つの態様において、該化合物はP2X7受容体発現調節タンパク質を調節する。1つの態様において、調節タンパク質は、p300、Elk-1、E47、E11aE、E2F、またはp53を含む群より選択され得るがこれらに限定されない。1つの態様において、推定エンハンサー領域+222/+232の配列は、p300、Elk-1、E47、E11aE、E2F、またはp53を含む群より選択されるがこれらに限定されない調節タンパク質の結合部位を含む。
【００１１】
定義
本明細書において用いられる「がん」という用語は、発がん性細胞に典型的な特徴、例えば、無制御な増殖、特殊化した機能の喪失、不死性、顕著な転移能、抗アポトーシス活性の顕著な増加、迅速な成長および増殖速度、ならびにある種の特徴的な形態および細胞マーカーを有する細胞の任意の存在を指す。ある状況では、がん細胞は腫瘍の形態をしており、そのような細胞は動物内で局所的に存在している場合もあれば、または独立した細胞、例えば白血病細胞として血流中を循環している場合もある。対象の体内のがん細胞の数は、直接測定することにより、または原発もしくは転移腫瘍塊のサイズから推定することにより決定することができる。例えば、対象内のがん細胞の数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、またはがん細胞の特徴的表面マーカーを検出するように設計された他の技法により測定することができる。
【００１２】
本明細書において用いられる「がん細胞の増殖を阻害する」という用語は、がん細胞を死滅させること、またはがん細胞の成長を永久にもしくは一次的に停止するかもしくは遅らせることを意味する。miRNA遺伝子産物および/またはmiRNA遺伝子発現阻害化合物の投与後に、対象内のがん細胞の数が一定のままであるかまたは減少する場合に、がん細胞の増殖の阻害が推測され得る。そのような細胞の絶対数は増加するが、腫瘍成長の速度が減少する場合にも、がん細胞増殖の阻害が推測され得る。
【００１３】
本明細書において用いられる「検出する」という用語は、病態生理学的状態の存在の可能性に関する間接的証拠を得ること、または病態生理学的状態(すなわち、例えば、上皮がん)の発生に対する生物の素因を評価することを指す。
【００１４】
本明細書において用いられる「診断する」という用語は、病態生理学的状態(すなわち、例えば、上皮がん)の実際の存在を実証する科学的証拠を確立することを指す。
【００１５】
本明細書において用いられる「腫瘍」または「乳頭腫」という用語は、悪性であるか良性であるかにかかわらずすべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。腫瘍のサイズは、直接的な視覚的観察により、またはX線、磁気共鳴画像法、超音波、およびシンチグラフィーを含むがこれらに限定されない画像診断法によって確認することができる。腫瘍のサイズを確認するために用いられる画像診断法は、造影剤と共に、またはこれを伴わずに用いられ得る。腫瘍のサイズは、組織塊の触診、またはノギスなどの測定器を用いた組織塊の測定といった物理的手段によって確認することもできる。
【００１６】
本明細書において用いられる「前がん性」という用語は、悪性腫瘍またはがんをもたらし得る変化に関する特徴を有する細胞または組織を指す。例として、子宮、皮膚、結腸、卵巣、乳房、または前立腺における腺腫性成長が含まれるが、これらに限定されない。例として、前がん性病変が臨床的に同定可能であるか否かにかかわらず、異形成母斑症候群、ポリポーシス症候群、前立腺異形成、および他のそのような新生物に加えて、異常な新生物もまた含まれる。
【００１７】
本明細書において用いられる「腫瘍細胞の死滅」という用語は、腫瘍細胞増殖に関連する機能を阻止することによる、または腫瘍細胞増殖に関連する経路を阻止するように結合することによる腫瘍細胞増殖の任意の阻害を指す。例えば、mRNA(すなわち、例えば、P2X7 mRNA)の阻害は、腫瘍細胞増殖をもたらす経路を阻止し得る。
【００１８】
本明細書において用いられる「抗P2X7抗体」という用語は、P2X7の遺伝子、mRNA、cDNA、またはそれらのサブ配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体または抗体断片を指す。これらの抗体は、腫瘍細胞成長において抗増殖活性を媒介し得る。
【００１９】
本明細書において用いられる「イムノアッセイ」という用語は、抗体と抗原との間の結合相互作用を利用する任意のアッセイを指す。典型的には、イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、および/または定量化するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用する。
【００２０】
タンパク質またはペプチドに言及する場合の、本明細書において用いられる「抗体に特異的に(または選択的に)結合する」または「〜と特異的に(または選択的に)免疫反応性である」という用語は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団における前記タンパク質の存在を決定する任意の結合反応を指す。例えば、指定のイムノアッセイ条件下で、特異的抗体は特定のタンパク質にバックグラウンドの少なくとも2倍のレベルで結合し、かつ試料中に存在する他のタンパク質には有意な量で実質的に結合しない。このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択された抗体を必要とし得る。例えば、特定のP2X7ポリペプチドに対して産生された抗体は、P2X7ポリペプチドと特異的に免疫反応性であり、かつ特定のP2X7ポリペプチドの多型変種、オルソログ、および対立遺伝子を除く他のタンパク質とは免疫反応性でない抗体のみを得るように選択され得る。
【００２１】
本明細書において用いられる「がん症状」という用語は、特定のがん型と一致する、対象の健康状態および/または医学的状態の観察可能な変化を指す。一般に、がん症状には、体重減少、疲労、限局性腫脹、または限局痛が含まれ得るが、これらに限定されない。がん型はそれぞれ、異なるがん型で起こり得るまたは起こり得ない症状を含む。例えば、子宮がんの症状には、異常出血、少量の出血、または腟からの分泌物が含まれるが、これらに限定されない。一方、子宮頸がんの症状には、持続的な腟分泌物、異常なおよび/もしくは大量の腟出血、食欲不振、骨盤痛および/もしくは背部痛、一方の脚の腫脹、または骨折が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書において用いられる「疑われる」または「疑うこと」という用語は、対象(すなわち、例えば、患者および/または哺乳動物)が疾患または他の医学的状態(すなわち、例えば、がん)に罹患している可能性があると結論づける、がん症状の観察に基づいた医学的推論を指す。
【００２３】
本明細書において用いられる「診断を必要とする」という用語は、少なくとも1つの過剰メチル化遺伝子領域(すなわち、例えば、過剰メチル化P2X7遺伝子領域)を含む患者または対象(すなわち、例えば、哺乳動物)を指す。
【００２４】
本明細書において用いられる「治療を必要とする」という用語は、疾患または他の医学的状態(すなわち、例えば、がん)と診断された患者または対象(すなわち、例えば、哺乳動物)を指す。
【００２５】
本明細書において用いられる「局所的な」という用語は、治療薬の非-非経口投与を指す。局所投与には外用または腫瘍内が含まれ得るが、これらに限定されない。局所投与中には最小量の全身分布が予測されるが、無症状の閾値を維持することが予測される。
【００２６】
本明細書において用いられる「検出する」という用語は、疾患の存在の可能性に関する間接的証拠を得ること、および/または疾患(すなわち、例えば、子宮がん)の発生に対する生物の素因を評価することを指す。
【００２７】
本明細書において用いられる「診断する」という用語は、疾患(すなわち、例えば、子宮がん)の実際の存在を実証する科学的証拠を確立することを指す。
【００２８】
本明細書において用いられる「腫瘍」という用語は、悪性であるか良性であるかにかかわらずすべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。腫瘍のサイズは、直接的な視覚的観察により、またはX線、磁気共鳴画像法、超音波、およびシンチグラフィーを含むがこれらに限定されない画像診断法によって確認することができる。腫瘍のサイズを確認するために用いられる画像診断法は、造影剤と共に、またはこれを伴わずに用いられ得る。腫瘍のサイズは、組織塊の触診、またはノギスなどの測定器を用いた組織塊の測定といった物理的手段によって確認することもできる。
【００２９】
本明細書において用いられる「前がん性」という用語は、悪性腫瘍またはがんをもたらし得る変化に関する特徴を有する細胞または組織を指す。例として、子宮、皮膚、結腸、卵巣、乳房、または前立腺における腺腫性成長が含まれるが、これらに限定されない。例として、前がん性病変が臨床的に同定可能であるか否かにかかわらず、異形成母斑症候群、ポリポーシス症候群、前立腺異形成、および他のそのような新生物に加えて、異常な新生物もまた含まれる。
【００３０】
本明細書において用いられる「〜のリスクがある」という用語は、患者を特定の疾患または苦痛にかかりやすくさせ得る、患者によって示される医学的状態または複数の医学的状態を指す。例えば、これらの状態は、行動的、感情的、化学的、生化学的、または環境的影響を含むがこれらに限定されない影響によって起こり得る。
【００３１】
本明細書において用いられる「有効量」という用語は、臨床的に有益な結果(すなわち、例えば、症状の軽減)を達成する、治療薬を含む薬学的組成物の特定の量を指す。そのような組成物の毒性および治療有効性は、例えばLD50(集団の50％に致死的な用量)およびED50(集団の50％に治療上有効な用量)を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび付加的な動物試験から得られたデータは、ヒト使用のための投与量の範囲を規定する上で使用され得る。そのような化合物の投与量は、毒性のほとんどないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【００３２】
治療を受けた対象と未治療の対象を比較して、任意の症状の発現に関連する場合の、「軽減する」、「阻害する」、「縮小する」、「抑制する」、「減少させる」、「妨げる」、および文法的同等物(「より低い」、「より小さい」等を含む)は、医学的に熟練した任意の職員によって臨床的に関連があると認められる任意の量だけ、治療を受けた対象における症状の量および/または大きさが未治療の対象よりも低いことを意味する。1つの態様において、治療を受けた対象における症状の量および/または大きさは、未治療の対象における症状の量および/または大きさよりも少なくとも10％低い、少なくとも25％低い、少なくとも50％低い、少なくとも75％低い、および/または少なくとも90％低い。
【００３３】
本明細書において用いられる「阻害化合物」という用語は、結合パートナーがその天然リガンドに対して無応答となる条件下で結合パートナーと相互作用し得る(すなわち、例えば、付着し得る、結合し得る等)任意の化合物を指す。阻害化合物には、有機低分子、抗体、およびタンパク質/ペプチドが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書において用いられる「付着する」という用語は、媒質(または担体)と薬物との間の任意の相互作用を指す。付着は可逆的であっても不可逆的であってもよい。そのような付着には、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力、または摩擦等が含まれるが、これらに限定されない。薬物は、それが浸透する、取り込まれる、コーティングされる、懸濁される、溶解する、混合される等の場合に、媒質(または担体)に付着する。
【００３５】
本明細書において用いられる「媒質」という用語は、治療点(例えば、創傷、手術部位等)に薬物を送達するための担体または媒体として役立つ任意の材料または材料の組み合わせを指す。したがって、すべての実用的な目的のために、「媒質」という用語は、「担体」という用語と同義であると考えられる。媒質は担体を含み、該担体は薬物または薬物に付着し、該媒質は治療点への該担体の送達を促進することが、当業者によって認識されるべきである。さらに、担体は付着した薬物を含むことができ、該担体は治療点への該薬物の送達を促進する。好ましくは、媒質は、発泡体、ゲル(ヒドロゲルを含むが、これに限定されない)、キセロゲル、微粒子(すなわち、ミクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル等)、生体接着剤、または液体を含むがこれらに限定されない群より選択される。ヒドロゲル、生体接着剤、発泡体、または液体と微粒子の組み合わせを含む媒質が、本発明によって具体的に意図される。好ましくは、ヒドロゲル、生体接着剤、および発泡体は、本明細書において意図されるポリマーのいずれか1つまたは組み合わせを含む。本発明によって意図される任意の媒質は、制御放出製剤を含み得る。例えば、場合によっては、媒質は、およそ1日〜6カ月持続する期間にわたって、薬物の制御および持続放出を提供する薬物送達システムを構成する。
【００３６】
本明細書において用いられる「薬物」または「化合物」という用語は、望ましい効果を達成する、投与が可能な任意の薬理学的活性物質を指す。薬物または化合物は、合成または天然の非ペプチド、タンパク質またはペプチド、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、多糖または糖であってよい。
【００３７】
本明細書において用いられる、薬物または化合物を「投与される」または「投与する」という用語は、薬物または化合物が患者にその意図される効果を及ぼすように、患者に薬物または化合物を提供する任意の方法を指す。例えば、投与の1つの方法は、これらに限定されないがカテーテル、アプリケーター銃、シリンジ等のような医療機器を使用する間接的な機構による。投与の第2の例示的な方法は、局所的組織投与(すなわち、例えば、血管外留置)、経口摂取、経皮パッチ、外用、吸入、坐薬等の直接的な機構による。
【００３８】
本明細書において用いられる「患者」という用語は、ヒトまたは動物であり、入院している必要はない。例えば、外来患者、養護施設にいる人は「患者」である。患者はいかなる年齢のヒトまたは非ヒト動物を含んでよく、したがって患者には成体および幼生(すなわち、子供)の両方が含まれる。「患者」という用語が医学的治療の必要性を指摘することは意図されず、したがって患者は、臨床であろうと基礎科学研究を支持するものであろうと、自発的または非自発的に実験の一部となり得る。
【００３９】
本明細書において用いられる「親和性」という用語は、物質または粒子を化学結合させてそれを維持する、物質または粒子間の任意の引力を指す。例えば、受容体に対して高い親和性を有する阻害化合物は、受容体が天然リガンドと相互作用するのを妨げる上で、親和性の低い阻害剤よりも大きな有効性を提供する。
【００４０】
本明細書において用いられる「〜に由来する」という用語は、化合物または配列の供給源を指す。ある観点では、化合物または配列は生物または特定の種に由来し得る。別の観点では、化合物または配列はより大きな複合体または配列に由来し得る。
【００４１】
本明細書において用いられる「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基からなり、炭素、水素、窒素、水素、通常は硫黄といった元素を含む、(酵素または抗体のような)多くの天然の極めて複雑な物質のいずれかを指す。一般に、タンパク質は、数百以内のオーダーを有するアミノ酸を含む。
【００４２】
本明細書において用いられる「ペプチド」という用語は、一方の酸のアミノ基ともう一方の酸のカルボキシル基との結合により、2つまたはそれ以上のアミノ酸に由来する様々なアミドのいずれかを指し、通常はタンパク質の部分加水分解によって得られる。一般に、ペプチドは、数十以内のオーダーを有するアミノ酸を含む。
【００４３】
本明細書において用いられる「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに投与された場合に、副作用、アレルギー反応、またはその他の有害反応をもたらさない分子的実体および組成物を指す。
【００４４】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、ありとあらゆる溶媒、または水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合物、および植物油を含むがこれらに限定されない分散媒、コーティング、等張吸収遅延剤、リポソーム、市販の洗浄剤等を含む。補助的な生理活性成分もまた、そのような担体中に取り込まれ得る。
【００４５】
本明細書において用いられる「精製された」または「単離された」という用語は、様々な他の成分を除去するための処理(すなわち、例えば、分画)に供されたペプチド組成物であって、その発現される生物活性を実質的に保持する組成物を指し得る。「実質的に精製された」という用語が用いられる場合、この表記は、タンパク質またはペプチドが、組成物の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれ以上(すなわち、例えば、重量/重量および/または重量/容積)を構成するなど、組成物の主要な成分を形成する組成物を指す。「均一になるまで精製された」という用語は、単一のタンパク質種が存在するように(すなわち、例えば、SDS-PAGEまたはHPLC解析に基づく)、「見かけ上均一」になるまで精製された組成物を含むように用いられる。精製された組成物は、いくらかの微量な不純物が残存し得ることを意味するものではない。
【００４６】
本明細書において用いられる「実質的に精製された」という用語は、それらの天然環境から取り出され、単離され、または分離され、かつ天然に会合している他の成分を少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、およびより好ましくは90％含まない分子、核酸またはアミノ酸配列のいずれかを指す。したがって、「単離されたポリヌクレオチド」とは、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００４７】
本明細書において用いられる「生体適合性」という用語は、宿主に実質的有害反応を誘発しない任意の材料を指す。外来物を生体内に導入する場合、その物体が、宿主に負の影響を及ぼす炎症反応などの免疫反応を誘発することが、常に懸念される。本発明との関連において、生体適合性は、設計された適用に従って評価される：例えば；包帯は皮膚と生体適合性であると見なされるのに対して、埋め込み型医療機器は身体の内部組織と生体適合性であると見なされる。好ましくは、生体適合性材料には生分解性材料および生物学的安定性材料が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書において用いられる「生分解性」という用語は、生細胞もしくは生物、または水を含むそれらの過程によって生化学的に作用を受け、分子構造が変化するように低分子量の生成物に分解され得る任意の材料を指す。
【００４９】
本明細書において用いられる「生体侵食性」という用語は、分子構造が変化しないように、いかなる長期炎症作用も生じることなく、付着している表面から離れて機械的に磨減する任意の材料を指す。ある意味では、生体侵食は、安定した低分子量の生成物が最終的に溶解される「生分解」の最終段階を示す。
【００５０】
本明細書において用いられる「生体再吸収性」という用語は、身体組織内にまたは身体組織を通して同化される任意の材料を指す。生体再吸収過程は、生分解および/または生体侵食の両方を利用し得る。
【００５１】
本明細書において用いられる「生体安定性」という用語は、目的の期間にわたって生理環境内で残存し、医学的に有益な効果をもたらす任意の材料を指す。
【００５２】
本明細書において用いられる「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらの断片または一部を指し、ならびに一本鎖または二本鎖であってよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAを指す。
【００５３】
本明細書において用いられる「単離された核酸」という用語は、その天然状態から取り出された(例えば、細胞から取り出され、好ましい態様においては他のゲノム核酸を含まない)任意の核酸分子を指す。
【００５４】
本明細書において用いられる「アミノ酸配列」および「ポリペプチド配列」という用語は互換性があり、アミノ酸の配列を指す。
【００５５】
(「所与のタンパク質の一部」にあるように)タンパク質に関連する場合の、本明細書において用いられる「一部」という用語は、そのタンパク質の断片を指す。断片は、4個のアミノ酸残基から、全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸までのサイズの範囲であってよい。
【００５６】
ヌクレオチド配列に関して用いられる場合の「一部」という用語は、そのヌクレオチド配列の断片を指す。断片は、5ヌクレオチド残基から、全ヌクレオチド配列マイナス1核酸残基までのサイズの範囲であってよい。
【００５７】
「抗体」という用語は、免疫原(抗原)により動物において誘発された免疫グロブリンを指す。抗体は、免疫原中に含まれるエピトープに対する特異性を示すことが望ましい。「ポリクローナル抗体」という用語は、形質細胞の2つ以上のクローンから産生された免疫グロブリンを指す；対照的に、「モノクローナル抗体」は、形質細胞の単一クローンから産生された免疫グロブリンを指す。
【００５８】
抗体とタンパク質またはペプチドの相互作用に関して用いられる場合の「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、相互作用がタンパク質上の特定の構造(すなわち、例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味する；言い換えれば、抗体は、タンパク質全体に対するよりもむしろ特定のタンパク質構造を認識して結合している。例えば、抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識された「A」と抗体とを含む反応中にエピトープAを含むタンパク質(または遊離の非標識A)が存在すれば、抗体に結合する標識Aの量は減少する。
【００５９】
本明細書において用いられる「有機低分子」という用語は、調剤に一般的に用いられる有機分子に匹敵するサイズの任意の分子を指す。本用語は、生体高分子(例えば、タンパク質、核酸等)を除外する。好ましい有機低分子は、およそ10 Daから約5000 Daまで、より好ましくは2000 Daまで、および最も好ましくは約1000 Daまでの範囲のサイズである。
【００６０】
本明細書において用いられる「アンチセンス」という用語は、特定のRNA配列(例えば、mRNA)に相補的なRNA配列に関して用いられる。アンチセンスRNAは、コード鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに対して関心対象の遺伝子を逆方向に接続することによる合成を含む任意の方法によって生成することができる。この転写鎖は、ひとたび細胞内に導入されると、細胞によって産生された天然mRNAと結合して二本鎖を形成する。次に、これらの二本鎖は該mRNAのさらなる転写またはその翻訳を阻止する。このようにして、突然変異表現型が作出され得る。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス鎖に関して(-)(すなわち、「マイナス」)という表記が用いられる場合があり、センス(すなわち、「プラス」)鎖に関して(+)という表記が用いられる場合がある。
【００６１】
本明細書において用いられる「P2X7受容体を含む細胞」という用語は、P2X7受容体を提示する身体組織に由来する任意の細胞を指し、その受容体の活性化によってアポトーシスが誘導される。例えば、そのような細胞には、上皮細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞、骨髄細胞、筋肉細胞、造血細胞、白血球細胞、胃腸細胞、尿路細胞、生殖腺細胞、腎細胞、膵細胞、網膜細胞、前立腺細胞、肺細胞、または腎臓細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
本特許の書類は、カラーで作成された図面を少なくとも1つ含む。カラー図面を含む本特許の複写は、請求および必要な手数料の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。
【図１】表皮細胞におけるP2X7発現を示す例示的なデータを示す。パネルa〜dは、2〜6回繰り返したうちの代表的なものである。顕微鏡写真aおよびb：ヒト正常ケラチノサイトのP2X7 mRNAインサイチューハイブリダイゼーション；a アンチセンスプローブ、b センスプローブ(×10)。顕微鏡写真cおよびd(×40)：培養ヒト正常ケラチノサイト(c)およびSCC-9細胞(d)のP2X7免疫染色；矢印は細胞膜を示す。cおよびdにおいて、抗P2X7抗体に対する免疫反応性は、P2X7抗原とのプレインキュベーションにより阻止された(表示せず)。顕微鏡写真e：ヒト正常ケラチノサイト(K)およびSCC-9(S-9)細胞におけるP2X7免疫染色(白バー)およびP2X7 mRNA qPCR(E-カドヘリンmRNAに対して正規化、黒バー)の定量的解析(平均値±SD、n＝3)；*‐p＜0.01。e中の挿入図：アポトーシスに及ぼすATPによる処理の効果。ヒト正常ケラチノサイト(K)およびSCC-9(S-9)細胞を、250μM ATPで8時間処理した；対照‐処理なし。3回の実験の平均値±SDを示す。*および**‐kと比較してp＜0.03〜0.01；***‐対照と比較してp＜0.01。AU‐任意単位。顕微鏡写真fおよびg：マウス背面皮膚の横断切片(×10)；f‐P2X7免疫染色、g‐位相。f中の垂直矢印は表皮を示し、水平矢印は毛幹を示す。
【図２】図2Aは、ヒト正常ケラチノサイトにおけるATPおよびBzATPのアポトーシス用量依存性効果を示す例示的なデータを示す(3回の実験の平均値、変動範囲3〜8％)。挿入図a：単独または併用したATP、BzATP、およびTNFαによる処理のアポトーシスに及ぼす効果(平均値±SD、n＝3〜5)。データは、未処理細胞(ベースライン条件)におけるアポトーシスレベル(＝1)に対して正規化した。*‐p＜0.01。挿入図b：培養ヒト正常ケラチノサイト(K)およびSCC-9(S-9)細胞の馴化培地中のATPの定常状態レベル(平均値±SD、n＝3)。図2Bおよび2Cは、ヒト全長P2X7 cDNA(N末端でMycタグ化)のMDCK細胞における異種発現、ならびにベースラインのアポトーシスおよびBzATP誘導性アポトーシス(100μM、8時間)に及ぼす処理の効果を示す例示的なデータを示す。細胞はまた、媒体(対照)；アンチセンスP2X7オリゴヌクレオチド(ASO)、またはランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチド(RCO)と共に処理した(平均値±SD、n＝3)。WT‐野生型。挿入図：平面軸(a)および垂直軸(b)においてレーザー共焦点顕微鏡観察により捉えられた、N-Myc-hP2X7-MDCK細胞におけるP2X7免疫反応性。図2C〜2Eは、ランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチド(RCO)(c)またはアンチセンスP2X7オリゴヌクレオチド(ASO)(dおよびe)で処理したN-Myc-hP2X7-MDCK細胞から得られた溶解物のウェスタン免疫ブロットを示す例示的なデータを示す(n＝3)。cおよびdレーンは、最初に抗Myc抗体でブロットし、抗P2X7抗体でリプローブしたゲルを示す。実験は3回繰り返し、同様の結果が得られた。*および**‐WT-MDCKと比較してp＜0.01。AU‐任意単位。
【図３】表皮アポトーシスに及ぼすインビボでのBzATP効果を示す例示的なデータを示す。図3A〜F：実験1：同一マウスの背面皮膚の前方領域(対照)および後方領域(BzATP処理)から得られた横断切片(×40)。切片を抗P2X7抗体で免疫染色し、核の形態用にDAPIで共染色した。d中の矢印は、凝縮、断片化、および濃縮の段階にある、表皮の基底/傍基底領域におけるP2X7陽性表皮細胞の核を示す。図G〜L：実験-2：横断切片(×10)を、H&Eで染色するか(g、h)、抗Ki67抗体で免疫染色するか(i、j)、またはTUNEL(アポトーシス)について染色した(k、l)。l中の矢印は、表皮の基底層/傍基底層(水平矢印)および毛幹(垂直矢印)内のBzATP処理細胞におけるTUNEL染色の増加を示す。図M〜X：実験-2：抗P2X7抗体で免疫染色し、TUNEL(アポトーシス)について共染色した横断切片(m〜r、×10；s〜x ×20)。r中の矢印は、BzATP処理動物の基底層/傍基底層(水平矢印)の表皮細胞および毛幹(垂直矢印)内における、P2X7免疫反応性とTUNELの共局在を示す。実験は3〜5回繰り返し、同様の結果が得られた。パネルxは、基底層/傍基底層および毛幹内の、BzATP処理動物由来の表皮細胞における、P2X7免疫反応性と共局在するTUNEL染色の増強を示す。実験は3〜5回繰り返し、同様の結果が得られた。
【図４】DMBA/TPA処理マウスにおける、皮膚乳頭腫形成に及ぼすBzATP効果を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-3として記載されている。DMBA/TPA群(黒丸、n＝15)およびDMBA/TPA＋BzATP群(白丸、n＝14)で得られたデータの平均値(±SEM)を示す。図4A：少なくとも1つの乳頭腫を有する動物の割合。図4B：動物当たりの乳頭腫数。図4C：平均乳頭腫サイズ(mm [最大病変寸法])。
【図５】本明細書において実施例-3として記載される処理後のDMBA/TPA処理マウスおよびDMBA/TPA＋BzATP処理マウスにおける皮膚乳頭腫の肉眼的形態の例証的写真を示す。c中の矢印は、萎縮の様々な段階にある乳頭腫を示す。図5Aおよび5Bは、ヘマトキシリン/エオシン(H&E)染色を示す。図5Cおよび5Bは、TUNEL染色を示す(c、d)(×10)。d中の矢印は、乳頭腫における増殖ケラチノサイトの基底層/傍基底層でのTUNEL染色の増加を示す。
【図６】インビボでのマウスにおけるDMBA/TPA誘発性皮膚病変の代表的な写真、およびBzATPと共に処理した場合の効果を示す。DおよびE中の矢印は、萎縮中の乳頭腫を示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。
【図７】インビボでのマウスにおけるDMBA/TPA誘発性皮膚病変の、H&E染色により組織学的に評価した代表的な組織学的横断切片、およびBzATPと共に処理した場合の効果を示す。
【図８】皮膚病変を有する生存マウスの割合に及ぼす、DMBA/TPA(黒印)またはDMBA/TPA＋BzATP(白印)による局所処理の効果の概要を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。(平均データとして表示；標準偏差(SD)は3〜11％の範囲である)。図8A：処理の0〜12週時の皮膚病変は乳頭腫であった。処理の14〜28週時の皮膚病変は、がん性病変(扁平上皮紡錘細胞がん、丸)、または非がん性病変(現存するもしくは萎縮中の乳頭腫、三角)のいずれかとして分類された。図8B：処理の14〜28週時の皮膚病変は、がん性病変(扁平上皮紡錘細胞がん、丸)、または非がん性病変(現存するもしくは萎縮中の乳頭腫、三角)のいずれかとして分類された。
【図９】図9A〜9Cは、生存動物当たりの平均皮膚病変数に及ぼす、DMBA/TPA(黒印)またはDMBA/TPA＋BzATP(白印)による局所処理の効果の概要を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。値は平均値を示し、標準偏差は5〜9％の範囲であった。
【図１０】DMBA/TPA(黒印)またはDMBA/TPA＋BzATP(白印)による局所処理の効果の概要を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。値は平均値を示し、標準偏差は2〜18％の範囲であった。図10A：0〜12週目の間の平均病変サイズ。図10B：動物当たりの全病変量が＞10 mm3である生存マウスの割合。図10C：動物当たりの全病変量が＞200 mm3である生存マウスの割合。
【図１１】DMBA/TPA(黒印)またはDMBA/TPA＋BzATP(白印)による局所処理の効果の概要を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。図11A：がん状態の事象までの時間。図11B：生存率。
【図１２】マウスにおけるP2X7免疫反応性を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。図12A：正常表皮。図12B：正常表皮のH&E染色した並列横断切片。図12C：乳頭腫表皮。図12D：乳頭腫表皮のH&E染色した並列横断切片。図12E：がん性表皮。図12F：がん性表皮のH&E染色した並列横断切片。図12G：対をなす組織学的正常組織と組織学的がん性組織との間で比較したP2X7免疫反応性の解析。バーは、マウス5匹の組織におけるレベルの平均値(±SD)である。正常組織データを、各場合において任意値10に対して正規化した。*‐p＜0.01。AU‐任意単位。図12H：マウスの正常皮膚組織およびがん皮膚組織におけるP2X7タンパク質アッセイ。ゲル電気泳動により分画した溶解物を抗P2X7抗体で免疫ブロットし、膜を抗GAPDH抗体でリプローブした。正常組織データを、各場合において任意値10に対して正規化した。*‐p＜0.01。AU‐任意単位。挿入図：同一動物から得られた組織学的正常組織および組織学的がん性組織の溶解物のウェスタン免疫ブロット。2匹のさらなるマウスの組織においても、同様の結果が得られた。バーは、マウス3匹の組織におけるP2X7特異的75 KDaバンドのデンシトメトリー結果の平均値(±SD)を示す。図12I：動物3匹から得られた組織学的正常組織および組織学的がん性組織におけるP2X7 mRNAレベル(GAPDH mRNAに対する)。正常組織データを、各場合において任意値10に対して正規化した。*‐p＜0.01。AU‐任意単位。
【図１３】アポトーシスに及ぼす、BzATPによる局所処理のインビボでのマウス(n＝5)における効果を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-5として記載されている。剪毛した前方皮膚領域にBzATP(B)を適用し、平行して、剪毛した後方皮膚領域に対照(C)を適用した。水平線は、前方背面皮膚領域と後方背面皮膚領域の模式的分離を示す。A〜Iのデータは、動物5匹における類似の結果の代表的なものである。図13A：未処理対照マウスの肉眼的形態。図13B：BzATP処理した前方皮膚のH&E染色横断切片。図13C：対照後方皮膚のH&E染色横断切片。図13D：TdT不在下での対照後方皮膚のTUNEL染色横断切片。図13E：TdT不在下でのBzATP処理前方皮膚のTUNEL染色横断切片。図13F：TdT存在下での対照後方皮膚のTUNEL染色横断切片。図13G：TdT存在下でのBzATP処理前方皮膚のTUNEL染色横断切片。矢印：基底層/傍基底層の表皮細胞(水平矢印)および表皮毛幹細胞(垂直矢印)におけるTUNEL染色の増強。図13H：対照後方皮膚におけるDAPIによる核染色。図13I：BzATP処理前方皮膚におけるDAPIによる核染色。矢印：凝縮、断片化、および濃縮の進行段階にある、表皮の基底/傍基底領域における表皮細胞の核。
【図１４】皮膚アポトーシスに及ぼす、BzATPによる局所処理のインビボでのマウスにおける効果を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-6として記載されている。動物(n＝5)を、週に2回局所適用したBzATPで16週間処理した。アッセイは3〜5回繰り返し、同様の傾向が得られた。図14A：BzATPで処理した背面皮膚の肉眼的形態。図14B：BzATPで処理した背面皮膚をH&E染色した横断切片。図14C：媒体で処理した背面皮膚の肉眼的形態。図14D：媒体で処理した背面皮膚をH&E染色した横断切片。図14E：媒体で処理した背面皮膚をP2X7免疫染色した横断切片。図14F：BzATPで処理した背面皮膚をP2X7免疫染色した横断切片。図14G：媒体で処理した背面皮膚をTUNEL染色した横断切片。図14H：BzATPで処理した背面皮膚をTUNEL染色した横断切片。図14I：低倍率での、共局在を示す図14Eと図14Gのマージ。図14J：低倍率での、共局在を示す図14Fと図14Hのマージ。矢印：基底層/傍基底層の表皮細胞(水平矢印)および表皮毛幹細胞(垂直矢印)における、P2X7免疫反応性と共局在するTUNEL染色の増加。図14K：高倍率での、共局在を示す図14Eと図14Gのマージ。図14L：高倍率での、共局在を示す図14Fと図14Hのマージ。
【図１５】図15A〜15Hは、DMBA/TPA誘発性の皮膚乳頭腫(図15A〜15D)および皮膚がん(図15E〜15H)における、BzATPによる処理のP2X7発現およびアポトーシスに及ぼす効果を示す例示的なデータを示す。処理は、本明細書において実施例-4として記載されている。アッセイは4回繰り返し、同様の傾向が得られた。図15C、15D、15G、および15Hは、それぞれ図15A、15B、15E、および15Fの並列横断切片である。
【図１６】培養マウスケラチノサイトにおける、BzATPのアポトーシスに及ぼす効果を示す例示的なデータを示す。いずれの実験においても、アポトーシスのレベルは、対照細胞における任意値2 AUに対して正規化した。AU＝任意単位。図16A：培養マウス正常(野生型、C57B1)ケラチノサイトにおけるBzATP用量反応効果(平均値±SD、n＝3)。細胞を、表示濃度のBzATPのうちの1つで8時間処理した。アポトーシスの変化は、可溶化DNAの観点から測定した。図16B、培養マウス正常ケラチノサイト(野生型、C57B1)を、100μMアンチセンスP2X7オリゴヌクレオチド(ASO)またはランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチド(RCO)で14時間前処理した後、100μM BzATPで8時間処理した。対照＝ASOの媒体で処理した細胞。値は、各条件につき3回の実験の平均値(±SD)である。挿入図：ASOまたはRCOで処理した細胞の溶解物の抗P2X7抗体によるウェスタン免疫ブロット(n＝2)。アポトーシスの変化は、可溶化DNAの観点から測定した。図16C：培養マウス正常ケラチノサイト(野生型、C57B1；黒三角)、またはC57B1バックグラウンドのP2X7欠損マウス(P2X7-/- Pfizer；白丸；またはP2X7-/- GSK；黒丸)から得られたケラチノサイトにおけるBzATP時間応答効果。値は、各条件につき3回の実験の平均値(±SD)である。アポトーシスの変化は、細胞死検出ELISAを用いて測定した。
【図１７】マウス野生型正常ケラチノサイトにおけるBzATPの効果を示す例示的なデータを示す。BaATPを100μMで添加した(矢印)。Ca2+o＝細胞外カルシウム。図17A：1.2 mM Ca2+(上方トレース)または1.2 mM Ca2+＋1.2 mM EGTA(下方トレース)を含む培地中の細胞質カルシウムの変化(ΔCa2+i)の時間的経過。図17B：臭化エチジウム(Eth-Br)の流入の時間的経過。図17C：ΔCa2+iとEth-Br流入とを比較する用量反応プロファイル。細胞を各BzATP濃度で8時間処理した。BzATPを添加してから2分後に、ΔCa2+i(白丸)のレベルを測定した；BzATPを添加してから5分後に、Eth-Br蛍光(黒丸)の変化を測定した。値＝平均値±SD。実験は3回繰り返した。AU＝任意単位。
【図１８】100μMアンチセンスP2X7オリゴヌクレオチド(ASO)またはランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチド(RCO)で14時間前処理した後、100μM BzATPで8時間処理した培養マウス野生型正常ケラチノサイトの、BzATP処理に及ぼすアンチセンスP2X7オリゴヌクレオチドの影響を示す例示的なデータを示す。対照＝ASOの媒体で処理した細胞。実験は2回繰り返し、同様の傾向が得られた。図18A：細胞質カルシウムの変化(ΔCa2+i)。図18B：臭化エチジウム(Eth-Br)の流入。
【図１９】図19Aは、BzATP誘導性アポトーシスの細胞外カルシウム(Ca2+o)への依存性を示す例示的なデータを示す。培養マウス野生型正常ケラチノサイトを、表示のCa2+o濃度のうちの1つを含む培地に移し10分間おいた。Ca2+oの対照(生理的)レベルは1.2 mMであり、Ca2+oのレベルは1.2 mM EGTAを添加することにより調節した。細胞を100μM BzATPまたは媒体(対照)で処理し、8時間後にアポトーシスの変化を測定した。アポトーシスは、可溶化DNAの観点から測定した。値は、3回の実験の平均値(±SDである)。アポトーシスのレベルは、未処理細胞における任意値2に対して正規化した。AU＝任意単位。*＝Ca2+o 1.2 mMと比較してp＜0.01。図19Bは、8時間インキュベートした50μMカスパーゼ阻害剤による、マウス野生型正常ケラチノサイトにおけるBzATP誘導性アポトーシス(100μM、8時間)の調節を示す例示的なデータを示す。アポトーシスは、可溶化DNAの観点から測定した。値は、3回の実験の平均値(±SDである)。アポトーシスのレベルは、未処理細胞における任意値2に対して正規化した。AU＝任意単位。*＝対照と比較してp＜0.01。
【図２０】マウス野生型正常ケラチノサイトにおける、[3H]-チミジン取り込みに及ぼす、アンチセンスP2X7オリゴヌクレオチド(ASO)またはランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチド(RCO)による前処理(いずれも100μMで14時間)、およびBzATPによる処理(100μM、8時間)の影響を示す例示的なデータを示す(値は平均値±SDである、n＝4)。
【図２１】図21Aは、短い細胞内N末端；細胞外ドメインを含む2つの膜貫通(TM)セグメント；および長い細胞内C末端を示す、P2X7受容体単量体の予測構造の1つの態様を示す。図21Bおよび図21Cは、P2X7受容体リガンドATPおよびBzATPの構造態様を示す。図21Dは、P2X7受容体の発現、作用機構、および制御の1つの態様を図示する。機能的P2X7受容体はグリコシル化G共役膜結合型タンパク質であり、その天然リガンドはATPである。活性化は、該受容体のGRK-3媒介性リン酸化(pi-P2X7-R)、および形質膜へのβ-アレスチン-2(β-arr-2)の動員を促進する。活性化された受容体は、1つまたは複数のシグナル伝達経路の促進を誘導し得る。β-アレスチン結合は、ヘテロ三量体Gタンパク質(a、b、g)からの該受容体の脱共役を促進し、エンドサイトーシスのためにダイナミン関連機構内の該受容体をクラスリン被覆ピットに標的化する。エンドサイトーシスに続いて、様々な細胞ドメインへの受容体隔離、再利用、および分解が起こり得る。P2X7受容体のグリコシル化は、PKAのβ2-アドレナリン受容体(β-AR)による活性化によって制御され、P2X7受容体の脱グリコシル化および受容体分解の増強が生じる。PKA効果は、EGF-EGFR系の作用により調節を受ける；これは、β-AR内部移行のPI3K依存的阻害の促進、およびβ-AR再利用の促進を伴い、それによってリガンド結合に際した活性化に利用できる形質膜中のβ-ARのプールを増加させる。図21Eは、P2X7単量体のホモ(3)オリゴマー化を伴うリガンド誘導性の細孔形成の1つの態様を図示する。細胞は、全長受容体(四角形)に加えて、切断型のP2X7、例えば全長P2X7型とヘテロオリゴマー化して非機能的細孔を生じ得るP2X7-j変種(三角形)を発現する。P2X7とP2X7-jを共に発現する宿主細胞におけるデータから、図中に示される4種の複合体の形成が示唆された(括弧内の数字は発現の程度である)。F. 上皮細胞における生理的P2X7媒介性アポトーシスの経路。ATPによるP2X7受容体(P2X7R)の活性化は、細孔形成およびCa2+の無制御な流入を誘導し、これはミトコンドリアの透過化およびカスパーゼ9/7/3媒介性アポトーシスの活性化を引き起こす。
【図２２】P2X7受容体の発現、活性化、および動態を調節および制御する考えられ得る機構の模式図を示す。
【図２３】図23A：試験の設計、Fu et al., 「Activation of P2X(7)-mediated apoptosis Inhibits DMBA/TPA-induced formation of skin papillomas and cancer in mice」 BMC Cancer 9:114 (2009)。表示の時点で、マウスの剪毛した背面皮膚に薬物を局所適用した。DMBAおよびTPAによる処理に応答した、乳頭腫および皮膚がんの形成の段階を示す。図23B〜E：インビボでのDMBA/TPA誘発性皮膚病変の代表的な写真。図23F〜I：正常およびインビボでのDMBA/TPA誘発性病変の、H&Eにより組織学的に評価した代表的な皮膚横断切片。
【図２４】がん状態の事象までの時間(A)および動物の生存率(B)に及ぼす、DMBA/TPA(実線)またはDMBA/TPA＋BzATP(破線)による局所処理の効果の概要を示す。
【図２５】マウス正常皮膚組織(A)、乳頭腫組織(C)、および皮膚がん組織(E)におけるP2X7免疫反応性を示す例証的データを示す；B、D、Fは、それぞれH&Eにより染色した並列横断切片である。G、対をなす組織学的正常組織と組織学的がん性組織との間で比較したP2X7免疫反応性の解析。バーは平均値(±SD、n＝5)である。H. 組織学的正常組織および組織学的がん性組織におけるP2X7 mRNAレベル(GAPDH mRNAに対する)(平均値±SD、n＝3)。GおよびHにおいて、データは任意値10に対して正規化した。*‐p＜0.01。AU‐任意単位。
【図２６】皮膚アポトーシスに及ぼす、インビボでのBzATPによる局所処理の効果を示す例証的データを示す。A〜J：マウスを、剪毛した背面皮膚に週に2回局所適用したBzATP(F〜J)、または媒体(対照、A〜E)のいずれかで16週間処理した。実験の終了時に、動物を安楽死させ、H&E(A、F)；およびP2X7免疫染色＋TUNEL(アポトーシス)共染色(B〜E、G〜J)用に、それぞれの動物背面皮膚領域から条片を採取した。I中の矢印は、基底層/傍基底層の表皮細胞(水平矢印)および表皮毛幹細胞(垂直矢印)における、P2X7免疫反応性と共局在するTUNEL染色の増加を示す。EおよびJは、DおよびIをより高倍率にしたものである。K〜N：マウスを、剪毛した前方皮膚領域に4週間にわたり週に2回局所適用したBzATP、および平行して、剪毛した後方皮膚領域に適用した媒体(対照)で処理した。実験の終了時に、動物を安楽死させ、H&E染色(K、M)およびTUNEL染色(L、N)用に、各動物から皮膚横断切片を作製した。N中の矢印は、基底層/傍基底層の表皮細胞(水平矢印)および表皮毛幹細胞(垂直矢印)におけるTUNEL染色の増強を示す。O〜V：DMBA/TPA誘発性の皮膚乳頭腫(O〜R)および皮膚がん(S〜V)における、P2X7発現およびアポトーシスに及ぼすBzATPによる処理の効果。P、R、T、Vは、それぞれO、Q、S、Uの並列横断切片である。
【図２７】P2X7遺伝子の活性プロモーターの下流にあるCpGリッチな547 nt DNA領域(+26/+573)の提唱される模式図の1つの態様を示す。黒楕円は、P2X7転写を阻害することが実験的に見出されたCpG部位を示す。上向きの矢印は、培養子宮頸部細胞およびインビボでの子宮頸部上皮組織において過剰メチル化されることが実験的に見出されたCpG部位を示す。斜線の四角は、転写エンハンサー活性を有することが実験的に見出されたシス領域である。水平の二方向性矢印は、DNA-タンパク質複合体を形成することが見出された、シスエンハンサー領域内の4つの推定部位を示す。
【図２８】活性プロモーター(黒背景中の白字、nt -158/+32)；プロモーターの下流の547 nt CpGリッチ領域(下線、nt- +26/+573)；エキソン1(下線およびイタリック体、nt +92/+216)；およびイントロン1の近位部(エキソン1の遠位、下線、nt +217から開始)を含む、ヒトP2X7の5'領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 62)の1つの態様を示す。ヌクレオチドは、転写開始部位(TpIs)(+1；GenBank Y12851によるnt 1683)に対して番号づけした。活性プロモーター塩基/領域内のTpISおよびTATA様配列を、太字および二重下線で示す。CpGジヌクレオチドを、太字および二重下線で示す。垂直の太い白矢印は、MaeII感受性CpG部位(nt +193/+194、+211/+222、および+330/+331)を示す。垂直の太い黒矢印は、BstUI感受性CpG-CpG部位(nt +461/+462および+463/+464)を示す。DNAメチル化実験のために、547 nt CpGリッチ領域を、セグメント-1(nt +26/+247)、セグメント-2(nt +223/+399)、およびセグメント-3(nt +352/+573)に細分した。
【図２９】P2X7活性プロモーター領域の解明の1つの態様を示す。図29A：ヒトP2X7遺伝子の5'領域の1.7 kb DNAセグメント内の領域に相当するcDNA断片をルシフェラーゼベクターに挿入し、P2X7-ルシフェラーゼレポーターをHEK293にトランスフェクトし、P2X7プロモーター活性をルシフェラーゼ活性(Fluc/Rluc)の変化の観点から測定した。データ(平均値±SD、3つ組での3〜5回の実験)を、空ベクターをトランスフェクトした細胞で記録されたFluc/Rluc(＝1)に対して正規化した。*‐残りのものと比較してp＜0.01。図29B：P2X7 TpISの確認。2つの潜在的TpISおよびそれらの関連TATA様領域を変異させ、P2X7転写に及ぼす影響を図29Aと同様に判定した(平均値±SD、3つ組の3〜5回の実験)。*‐-158/+32と比較してp＜0.01。図29C：P2X7転写は、活性プロモーターの下流のエフェクターによって調節を受ける。P2X7 -158/+32ルシフェラーゼレポーターまたはP2X7 -158/+573ルシフェラーゼレポーターをHEK293細胞にトランスフェクトし、P2X7プロモーター活性を、ルシフェラーゼ活性の変化の観点から(Fluc/Rluc、上パネル)、またはFluc/GAPDH mRNAの変化の観点から(下パネル)測定した。3つ組での1〜3回の実験の平均値(±SD)を示す。Fluc/GAPDH mRNAのデータは、空ベクターをトランスフェクトした細胞で記録されたもの(＝0)に対して正規化した。*‐p＜0.01。
【図３０】hEVEC細胞およびHeLa細胞における、P2X7 mRNA発現に及ぼすAza-dC(1μM)による処理の効果を示す例示的なデータを示す。AおよびBのデータは、t＝0時のhEVEC細胞におけるレベル(＝1)に対して正規化した。3つ組での3〜6回の実験の平均値±SD。図30A：P2X7 mRNAの定常状態レベル。(p＜0.01) 図30B：P2X7受容体タンパク質レベル。挿入図：20×での免疫蛍光データ。(p＜0.01) 図30C：アザ-dC後のBzATP誘導性アポトーシス(任意単位[A.U.])。アポトーシスの程度(任意単位[A.U.])は、未処理細胞で測定されたレベルに対して正規化した。*‐p＜0.05；**‐p＜0.01。
【図３１】ルシフェラーゼ-158/+32レポーター構築物およびルシフェラーゼ-158/+573レポーター構築物をトランスフェクトしたHEK293細胞における、転写の変化に及ぼす過剰メチル化および脱メチル化の影響を示す例示的なデータを示す(3つ組での2回の実験の平均値±SD)。過剰メチル化アッセイは、トランスフェクションの前に、試験プラスミドをCpG-メチラーゼM.SssIと共にインキュベートすることによって行い、転写の変化をルシフェラーゼ活性(Fluc/Rluc)の変化の観点から測定した。脱メチル化アッセイは、トランスフェクトした細胞をアザ-dCで処理する(1μMで48時間)ことにより行った。転写の変化は、Fluc/GAPDH mRNAレベルの変化の観点から測定した。データは、対照細胞におけるレベル(＝1)に対して正規化した。*‐p＜0.01。
【図３２】P2X7プロモーターの下流のCpGリッチな547 nt領域内の転写調節シスエレメントを解明するために使用した構築物のいくつかの態様を示す。構築物は、表示のセグメントのうちの1つが結合したP2X7活性プロモーターを含み、これをルシフェラーゼベクターに挿入し、HEK293細胞にトランスフェクトした。プロモーター活性を、ルシフェラーゼ活性の変化の観点から測定した(Fluc/Rluc、3つ組での2回の実験の平均値±SD)。図32A：P2X7活性プロモーター(-158/+32)の下流の547 nt領域の表示のセグメントのうちの1つが結合した該プロモーターを含むcDNA断片を構築した。*‐-158/+32と比較してp＜0.01；**‐-158/+232と比較してp＜0.05〜0.01。図32B：P2X7転写に及ぼす、該プロモーターの下流の547 nt領域内のCpG部位における変異の影響。WT‐野生型。*‐各場合において野生型配列と比較してp＜0.01。
【図３３】図33Aは、P2X7活性プロモーターの下流にある547 nt領域のそれぞれセグメント1、2、および3内のCpG部位+193/+194(および/または+211/+212)、+330/+331、および+461/+462(および/または+463+464)のシトシンのメチル化に及ぼす、HeLa細胞におけるアザ-dCによる処理(1μM、48時間)の効果を示す例示的なデータを示す。CpG部位のシトシンのメチル化は、ゲノムDNA亜硫酸水素塩変換法に続いて遺伝子特異的PCRおよび制限酵素切断を用いて、CpG部位での切断の観点から判定した。左向き矢印は、CpG部位での非切断断片(破線)および切断断片(実線)に相当するバンドを示す。M‐マーカー。対照は、CpGメチラーゼSssIでインビトロにおいて処理した、一定分量のヒト胎盤ゲノムDNA(H.G.-DNA)であった。図33Bは、一定分量のヒト胎盤ゲノムDNAを様々なモル濃度のSssIと混合し、セグメント-1内のCpG部位+193/+194(および/または+211/+212)における切断の程度を測定して得られた例示的なデータを示す。データは、1μg DNAを含む反応混合物において得られた効果(100％)に対して正規化した。図33C〜Eは、培養ヒト上皮子宮頸部細胞におけるCpG部位のシトシンのメチル化状態を示す例示的なデータを示す。図33F〜Hは、インビボでのヒト子宮頸部組織におけるCpG部位のシトシンのメチル化状態を示す例示的なデータを示す。図33Iは、ヒト子宮頸部の組織における、CpG部位での制限酵素切断の程度を示す例示的なデータを示す。データは、各症例において正常組織および扁平上皮がん組織を含む、対をなす10組の子宮頸部標本から作成した。解析に利用可能であったのは、セグメント1および3に関しては9症例であり、ならびにセグメント2に関しては8症例であった。線は、同一患者に由来する対をなす組織(正常[N]およびがん[Ca])をつないでいる。
【図３４】P2X7プロモーターの下流にある547 nt領域内の代表的なDNA-タンパク質結合の解明を示す例示的なデータを示す。表示のcDNA断片は本明細書中に示してある。表4を参照されたい。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用いて、DNA-タンパク質複合体を検出した。右向き矢印は、移動したバンドを示す。実験は2回繰り返した。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
発明の詳細な説明
本発明は、がんの治療および予防の分野に関する。がんは過剰増殖の疾患であると考えられており、本発明はこの過剰増殖を減少させるための方法を提供する。例えば、本方法は本明細書において、細胞内アポトーシスの誘導を引き起こし、それによってがん性成長の防止ならびに/またはがんの腫瘍サイズおよび数の減少を引き起こす。特異的膜受容体アゴニスト(すなわち、例えば、P2X7受容体アゴニスト)の投与は、本明細書において、がんの成長および進行を軽減することが示される。
【００６４】
抗アポトーシス機構は、がんの発生に寄与し得る。P2X7系は上皮細胞におけるアポトーシス促進性調節因子であると考えられており、P2X7媒介性アポトーシスの増強は、上皮がんの化学予防および治療のための薬理学的様式として提唱されている。
【００６５】
P2X7媒介性アポトーシスの機構の理解が高まることで、皮膚新生物を直接かつ特異的に標的化するための戦略が生まれた。本発明の機構を理解する必要はないが、本明細書において提示されるデータにより、アポトーシスの上方制御とがんの予防および治療が初めて直接関連づけられると考えられる。例えば、齧歯類がんモデルにおいて有意な抗腫瘍効果が達成され、アポトーシスのP2X7による制御に影響を及ぼす化合物ががん(すなわち、例えば、上皮がん)を予防および治療するのに有用である可能性が高い。
【００６６】
本明細書において考察されるデータにより、P2X7媒介性アポトーシスの薬理学的活性化(すなわち、例えば、BzATPなどのP2X7受容体アゴニストによる)が、上皮乳頭腫および/または扁平上皮紡錘細胞がんの化学的誘発(すなわち、例えば、DMBA/TPAによる)形成を阻害することが実証される。BzATPなどのP2X7アゴニストは、細胞内アポトーシスを増加させると考えられる。
【００６７】
1つの態様において、本発明は、P2X7誘導性アポトーシスを活性化し得る少なくとも1つの化合物を含む組成物を意図する。1つの態様において、化合物はBzATPを含む。本発明の機構を理解する必要はないが、インビボにおいて、P2X7誘導性アポトーシスは新生物の発生および進行を制御し得ると考えられる。1つの態様において、新生物は上皮新生物を含む。1つの態様において、上皮新生物は外胚葉層に由来する。1つの態様において、外胚葉層新生物は、皮膚新生物および乳房新生物からなる群より選択される。1つの態様において、上皮新生物は尿生殖洞に由来する。1つの態様において、尿生殖洞は膀胱新生物を含む。1つの態様において、上皮新生物は遠位中腎傍管に由来する。1つの態様において、遠位中腎傍管は、子宮頸部新生物および子宮内膜新生物からなる群より選択される。Li et al., 「The P2X7 Receptor: A novel biomarker of uterine epithelial cancers」 Cancer Epidemiol Biomarkers Preven 2006, 15:1-8；Li et al., 「Decreased expression of P2X7 in endometrial epithelial pre-cancerous and cancer cells」 Gynecol Oncology 2007, 106:233-243；Zhou et al., 「Micro-RNAs miR-186 and miR-150 downregulate expression of the pro-apoptotic purinergic P2X7 receptor by activation of instability sites at the 3'-untranslated region of the gene that decrease steady-state levels of the transcript」 J Biol Chem 2008, 283:28274-28286；およびLi et al., 「P2X7 receptor expression is decreased in epithelial cancer cells of ectodermal, uro-genital sinus, and distal paramesonephricduct origin」 (Submitted, 2009)。
【００６８】
I. がん
がんは、体内の異常な細胞の無制御な成長であると考えられている。がん性細胞は悪性細胞とも称され、体内の正常細胞に由来する。体内の細胞の成長が制御不能であり、細胞があまりにも速く分裂する場合に、がんが生じるようである。細胞が死滅の仕方を「忘れる」場合にも(すなわち、例えば、アポトーシスの減少)、がんは生じ得る。多くの様々な種類のがんが存在する。がんは、肺、結腸、乳房、皮膚、骨、または神経組織を含むがこれらに限定されないほとんどすべての器官または組織で発生し得る。
【００６９】
がんには、ベンゼンおよび他の化学物質、毒キノコ、および落花生植物において増大し得る一種の毒物(すなわち、例えば、アフラトキシン)、ウイルス、放射線、日光、またはタバコを含むがこれらに限定されない多くの原因が存在する。しかしながら、多くのがんの原因は依然として不明である。米国の男性に最もよく見られるがんには、皮膚がん、前立腺がん、肺がん、および結腸がんが含まれるが、これらに限定されない。米国の女性では、最もよく見られるがんには、乳がん、皮膚がん、肺がん、および結腸がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
いくつかの他の種類のがんには、脳がん、子宮頸がん、ホジキンリンパ腫、腎がん、白血病、肝がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、皮膚がん、精巣がん、甲状腺がん、または子宮がんが含まれるが、これらに限定されない。がんの症状は、腫瘍の種類および位置に依存する。例えば、肺がんは、咳嗽、息切れ、または胸痛を引き起こし得る。結腸がんは、多くの場合に、下痢、便秘、および血便を引き起こし得る。一部のがんでは、症状が全くない場合もある。胆嚢がんなどのある種のがんでは、疾患が進行期に達するまで症状が出ない場合が多い。以下の症状は、大部分のがんに伴って起こり得る：悪寒、疲労、発熱、食欲不振、倦怠感、寝汗、または体重減少。
【００７１】
がんを同定するための共通した試験には、生検、血液化学検査、x線、全血球計算、コンピュータ断層撮影スキャン、または磁気共鳴画像スキャンが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７２】
従来の治療法は、がんの種類およびその病期によって異なる。がんの病期とは、がんがどの程度成長したか、および腫瘍がその元の位置から拡散したかどうかを指す。がんが一カ所に限局し、拡散していない場合、現在の治療法は手術、放射線、および/または化学療法に向かう。これは、皮膚がん、ならびに肺、乳房、および結腸のがんでよくあることである。
【００７３】
A. 上皮がん
上皮がんはよく見られ、通常は進行性でかつ致死的な生物学的臨床的挙動を呈する。上皮とは、体表を裏打ちする組織である。本発明の機構を理解する必要はないが、本発明はどのように上皮がんが発生するかのよりよい理解をもたらすと考えられる。1つの態様において、本発明は、発生の初期にがんを検出し、結果としてより早い治療および生存率の改善をもたらすための方法を意図する。1つの態様において、本発明は上皮がんを治療する方法を意図する。1つの態様において、本発明は、上皮がんを予防する方法(すなわち、例えば、予防的治療)を意図する。
【００７４】
上皮がんはよく見られると考えられており、進行性でかつ潜在的に致死的な生物学的臨床的挙動を呈し得る。本発明の機構を理解する必要はないが、本発明のいくつかの態様は：i) 上皮がん発生の理解の向上；ii) 早期がん検出の改善；iii) 早期がん治療の改善；iv) がん治療のための新たな様式および方向性；ならびにv) 上皮がん予防の改善をもたらし得ると考えられる。
【００７５】
がんの発生は、腫瘍抑制因子およびアポトーシス関連遺伝子を含む腫瘍制御遺伝子の不活化と関連していると考えられている。遺伝子の不活化は、遺伝子突然変異に起因する対立遺伝子消失またはヘテロ接合性喪失染色体部位、欠失、ならびにゲノム再構成の結果であり得る。一部のがんは、4p15.3、10q24、5q35、3p12.3、および11q24における単一対立遺伝子ヘミ接合性欠失を含むいくつかのゲノム変化を示す。Wistuba et al., 「Deletions of chromosome 3p are frequent and early events in the pathogenesis of uterine cervical carcinoma」 Cancer Res. 57:3154-3158 (1997)；Chu et al., 「Monoclonality and surface lesion specific microsatellite alterations in premalignant and malignant neoplasia of uterine cervix: a local field effect of genomic instability and clonal evolution」 Genes Chromosomes Cancer 24:127-134 (1999)；およびHamoudi et al., 「Identification of novel prognostic markers in cervical intraepithelial neoplasia using lDMAS (loh data management and analysis software)」 BMC Bioinformatics 6:18 (2005)。あるいは、他の研究から、染色体11q23における腫瘍抑制遺伝子の消失の可能性が実証されている。Lai et al., 「Hypermethylation of two consecutive tumor suppressor genes, BLU and RASSF1A, located at 3p21.3 in cervical neoplasias」 Gynecol Oncol. 104:629-635 (2007)。
【００７６】
II. アポトーシス
上皮細胞成長の現在の理論は、細胞分裂促進刺激とアポトーシスの協調した作用による調節を予測している[1,2]。アポトーシスは、炎症反応を刺激することのない、選択的細胞消失の宿主ゲノムによって調製される恒常的過程である[3-5]。以前の研究から、アポトーシスは有害刺激、例えば飢餓、炎症、感染、放射線照射等に応答して活性化されることが示された。より最近のデータから、組織の発達および分化の制御、細胞分裂促進作用の調節、ならびに老化に伴う細胞死および組織喪失の制御を含むアポトーシスの生理的役割が示唆され、アポトーシス細胞死の調節不全は疾患の状態に結びつけられている[6]。
【００７７】
アポトーシスは、多細胞生物において起こり得るプログラム細胞死の過程であると考えられている。プログラム細胞死は、特徴的な細胞形態および死をもたらす一連の生化学的事象を伴い、より具体的な表現では、ブレブ形成、膜の非対称性および付着の喪失といった細胞膜に対する変化、細胞収縮、核の断片化、クロマチン凝縮、ならびに染色体DNA断片化を含む様々な形態変化を引き起こす一連の生化学的事象を伴う。その結果が生物に損傷を与えない細胞残屑の処分の過程により、アポトーシスは壊死と区別される。
【００７８】
急性の細胞傷害から生じる外傷性細胞死の1つの形態である壊死とは対照的に、アポトーシスは一般に、生物の生活環において利点を付与する。例えば、発生中のヒト胚における手指および足指の分化は、手指間の細胞がアポトーシスするために起こる；その結果として、指が分離する。平均的なヒト成体では、毎日500億〜700億個の細胞がアポトーシスのために死滅する。8〜14歳の平均的な子供では、1日におよそ200億〜300億個の細胞が死滅する。1年当たりでは、これは、個体の体重に等しい細胞塊の増殖およびその後の破壊に相当する。過剰なアポトーシスは、虚血性損傷におけるような発育不全を起こす一方、量が不十分であると、がんなどの無制御な細胞増殖が生じる。
【００７９】
細胞が修復の域を越えた損傷を受ける、ウイルスに感染する、または飢餓などのストレス状態にある場合に、アポトーシスは起こり得る。電離放射線または毒性化学物質によるDNA損傷もまた、腫瘍抑制遺伝子p53の作用を介してアポトーシスを誘導し得る。アポトーシスの「決定」は、その細胞自身、周囲の組織、または免疫系の一部である細胞からもたらされ得る。このような場合、アポトーシスは損傷を受けた細胞を除去するように機能し、その細胞が生物からさらなる栄養を奪い取るのを防ぐか、またはウイルス感染のさらなる拡大を停止させる。
【００８０】
以下にさらに考察するように、アポトーシスはがんを防ぐ役割も担い得る。突然変異または生化学的阻害のために細胞がアポトーシスを起こすことができないと、細胞は分裂し続け、腫瘍へと発達し得る。例えば、パピローマウイルスによる感染は、ウイルス遺伝子が、アポトーシス経路の重要なメンバーである細胞のp53タンパク質を妨げる原因となる。細胞のアポトーシス機能におけるこの妨害は、子宮頸がんの発生において役割を果たす。
【００８１】
成体生物において、細胞の数は、細胞死および細胞分裂(すなわち、増殖)を介して比較的一定に保たれている。細胞が機能障害を起こすかまたは罹患した場合には、細胞は置き換えられなければならないが、増殖は細胞死によって相殺されなければならない。この制御機構は、内部状態を一定の限度内に維持するために生物によって必要とされる恒常性の一部である。恒常性は、組織における有糸分裂(細胞分裂)の速度が細胞死と釣り合っている場合に達成される。この平衡が乱されると、潜在的に致死性な2つの障害のうちの1つが起こり得る：i) 細胞はそれらが死滅するよりも速く分裂し、効果的に腫瘍を発生する；またはii) 細胞はそれらが死滅するよりも遅く分裂し、細胞喪失を引き起こす。
【００８２】
恒常性は、複雑な一連の反応、すなわち様々な種類の細胞シグナル伝達を必要とする生物内で進行中の過程を伴う。いかなる機能障害も疾患をもたらし得る。例えば、シグナル伝達経路の調節不全は、がんのいくつかの形態に結びつけられている。膵臓腺がん組織において、抗アポトーシスシグナルを伝達する経路が活性化されることが見出されている。
【００８３】
A. アポトーシスの機構
組織学的に、アポトーシスは、DNA断片化、クロマチン凝縮、膜のブレブ形成、細胞外基質からの細胞脱離、細胞の円形化および収縮、ならびに形質膜脂質構成の変化を特徴とし得る。通常、アポトーシスの最終段階は、カスパーゼと称される一連のタンパク質分解酵素によって誘導され、カスパーゼは、タンパク質分解のカスケードにおいて互いに切断して活性化し[14]、エフェクターカスパーゼ7および3で終結する[15]。
【００８４】
いくつかの細胞経路が、カスパーゼファミリーのプロテアーゼの活性化およびアポトーシスの誘導に関与する。1つの態様において、本発明は、アポトーシスが、a) 内因性のミトコンドリア経路；またはb) 外因性の細胞死受容体経路を含むがこれらに限定されない経路を伴い得る方法を意図する。[16]
【００８５】
内因性経路を介するアポトーシスは、主にミトコンドリアの変化を特徴とする。ミトコンドリア障害およびDNA損傷を引き起こす刺激(がん治療薬および電離放射線照射など)、酸化ストレス、低酸素、細胞脱離、および細胞障害をもたらす刺激によって、作用が引き起こされる[17]。これらの多様な刺激からのシグナルはミトコンドリアに収束し、そこでアポトーシスシグナルの伝播が、アポトーシスを促進するタンパク質(例えば、Bax、Bak、Bok、Bad、Bid、Bik、Bim、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa、および Bcl-B)または抑制するタンパク質(例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bfl-1/Al、Bcl-W、およびBcl-G)によって調節を受ける[18,19]。アポトーシス促進性シグナルは、ミトコンドリア外膜の透過化を引き起こし、シトクロムcおよびSmac/Diabloを含むタンパク質のミトコンドリア膜間腔から細胞質への放出を促進する。次に、放出されたシトクロムcは、カスパーゼアダプターであるアポトーシスプロテアーゼ活性化因子-1(Apaf-1)と結合し、それによってプロカスパーゼ9を活性化し、アポトソーム複合体を形成する[20]。アポトソームは、カスパーゼ6、7、および3などのいくつかの下流エフェクターカスパーゼを活性化し、DNA断片化および細胞死をもたらす[21,22]。アポトーシス促進性シグナルの作用は、アポトーシス阻害タンパク(IAP)、例えば、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、サバイビン、XIAP、ブルス(Bruce)、ILP-2、およびリビン(Livin)によって調節され得る[23]。IAPはカスパーゼを直接阻害する、ならびに/またはそれらのユビキチン化およびプロテアソーム媒介性分解を触媒する。このバランスは、IAPへの結合に関して活性カスパーゼと競合する、SMACおよびHtrA2などのIAPの内因性阻害因子によって精密に調節を受ける[24]。Bcl-XLなどの抗アポトーシスシグナルは、Apaf-1と結合してこれを不活化することができ、またミトコンドリアからのSmac/DIABLOタンパク質の放出を促進することができ、それによってIAPを不活化する[25]。
【００８６】
アポトーシスの外因性経路は、免疫系の細胞が、TNF受容体1(TNFR1)、TNF受容体2(TNFR2)、CD95/Fas/Apo1、および細胞死受容体(腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド[TRAIL]-TRAIL受容体)3-6(DR3-6)などの細胞表面細胞死媒介性受容体のリガンド媒介性活性化を通して、「不健全な」細胞においてアポトーシスを引き起こす機構である[15,17]。
【００８７】
これらの受容体にそれらそれぞれのリガンドが結合すると、受容体オリゴマー化および細胞死シグナルアダプタータンパク質の動員が起こる。例えば、FasにFasリガンド(Fas-L)が、またはTRAIL-R1にTRAILが結合すると[26]、FADD(Fas関連デスドメイン)が動員され、TNFR1にTNFが結合すると、TRADD(TNFR関連デスドメイン)が動員される[22]。オリゴマー化された受容体と動員されたFADDまたはTRADDは、DISC(細胞死誘導シグナル伝達複合体)と称される複合体を形成し、これはイニシエーターカスパーゼ(カスパーゼ8および10)に結合することができ、続いてカスパーゼ7および3の活性化を引き起こして、アポトーシスをもたらす[13,15]。
【００８８】
最近の研究は、内因性および外因性アポトーシス経路の任意分類の欠如を強調している。第一に、いくつかのシグナルは両経路を活性化することができ、これら2つのアポトーシス経路間には広範なクロストークが存在する。例えば、転写因子NF-kβは、FLIP、Bcl-XL、XIAP、およびcIAP1などの抗アポトーシス遺伝子の転写を活性化し得るが、NF-kβはまた、Fas、Fas-L、TRAIL-R1、およびTRAIL-R2などのアポトーシス誘導遺伝子の発現を増強し得る[27]。
【００８９】
外因性細胞死受容体経路が免疫系の細胞に限定されないこと、および「不健全な」細胞の成長制御が、増殖細胞を含むほとんど/すべての組織で機能することが、最近のデータによってさらに示唆された。このように、P2X7受容体機構は、通常の生理的条件下においてある種の上皮細胞の成長を制御し、本明細書において検討されるように、P2X7媒介性アポトーシスの障害は、そのような組織において新生物形質転換に寄与し得る。そのような発見から、細胞恒常性を維持する上でのアポトーシスの生理的役割が示唆される。
【００９０】
アポトーシスの理解の向上により、がん細胞の死滅を誘導し得るか、または確立された細胞毒性薬および放射線療法に対してがん細胞を感作させ得る標的化療法の基礎が提供された[24,28,29]。以前の報告は、がん細胞におけるアポトーシスの選択的誘導ががん療法に潜在的に有用であり得ることを示唆する薬剤および方法の概要を述べた[13,24,25,30-32に概説されている]。そのようなアポトーシス機構には、i) 細胞表面細胞死受容体であるFas、TRAIL、およびTNF受容体の活性化；ii) EGFR、MAPK、およびPI3Kを介する細胞生存シグナル伝達の阻害；iii) Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバーと抗アポトーシスメンバーとの間のバランスの変更；iv) XIAP、サバイビン、およびc-IAP2などの抗アポトーシスタンパク質の下方制御；e) プロテアソーム阻害剤；f) 非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)およびCOX-2阻害剤；g) ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)リガンド；またはh) DNAメチル化が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
しかしながら、本研究の広がりにもかかわらず、アポトーシス経路を直接標的化する治療法の少数しか臨床試験にまで進んでおらず、米国食品医薬品局による承認を得たものはまだない。上記のような薬剤を用いて開始された臨床試験のうち、多くは、i) 有効性の低さ[33]；ii) 毒性[34]；iii) TRAILと結合しアポトーシスを阻害するデコイ受容体(DcR1、DcR2、およびオステオプロゲリン)の存在[35]；iv) 低ガンマグロブリン血症を伴う免疫不全の誘発の懸念；またはv) リンパ腫を発症しやすい傾向[36]を含むがこれらに限定されない問題のために、価値が限られた。
【００９２】
B. アポトーシスとがん
アポトーシスの欠損は、がんの発生において役割を果たし得る[7-9]。実際に、がんの顕著な特徴の1つは、アポトーシスを逃れる機構の発達であり、アポトーシス促進性シグナルの消失および抗アポトーシス機構の獲得は、腫瘍形成およびがん表現型に寄与する。したがって、アポトーシス機構の欠損は、遺伝的に不安定ながん細胞が排除を回避できるようにし、がん治療に対する耐性を付与する[10-11]。アポトーシスは炎症反応も免疫反応も誘発しないため、この種の細胞死は、様々な治療によるがん細胞死滅の好ましい方法である。がん細胞におけるアポトーシスの選択的誘導は、多くのがんの有望な治療アプローチとして出現し[13]、アポトーシス経路の調節は、i) 腫瘍細胞死の誘導；ii) 化学療法、放射線療法、および他の標的化療法に対する反応の亢進；またはiii) 新生物形質転換の防止を含むがこれらに限定されない機構に関与し得る。
【００９３】
外胚葉、尿生殖洞、および遠位中腎傍管のがん上皮細胞における機能的P2X7受容体のレベルは、正常細胞と比較してより低いことが報告されている(下記参照)。P2X7受容体のより少ない発現は、新生物形質転換の結果である可能性がある。このように、子宮内膜細胞および膀胱細胞では、P2X7受容体の低発現は前がん性細胞および早期がん性細胞において既に認められたが、過形成性良性細胞では認められなかった[39,82,104]。本明細書において示されるデータが実証するように、がん発生の早期に、発がん過程によってP2X7の発現低下が誘導された可能性がある。あるいは、低レベルの該受容体を発現している細胞において、新生物形質転換が優先的に引き起こされた可能性がある。この可能性は子宮頸部上皮におけるデータによって支持され、この場合、P2X7受容体の低発現が異形成(前がん性)細胞において既に認められた[39,82,104]。異形成ががんに進行する事例はほとんどないため[109]、該受容体の低発現が新生物形質転換に先行した可能性がある。したがって、欠陥のあるP2X7発現機構を有する細胞がアポトーシスを回避し、発がん刺激を受けやすく、そして新生物形質転換を起こしやすくなった。
【００９４】
いずれの筋書きにおいても、受容体発現の低下によるアポトーシスの減少は新生物細胞の成長を促進し得るため、P2X7受容体の低発現はがん発生を促進し得る。最近の研究は、悪性形質転換を起こすリスクのある組織において、P2X7媒介性アポトーシスの増強ががん発生を阻害し得るという仮説を試験した[55]。
【００９５】
II. P2X受容体ファミリー
ヒトP2X7受容体遺伝子は染色体12q24に局在し、13のエキソンを含む。Buell et al., 「Gene structure and chromosomal localization of the human P2X7 receptor」 Receptors Channels 5:347-354 (1998)。P2X7受容体遺伝子におけるいくつかの遺伝子突然変異が記載されているが、子宮頸がんに関するものはない。Feng et al., 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem. 281:17228-17237 (2006)。子宮頸がんにおける公知の染色体異常の全体的有病率は低いため、遺伝子突然変異は本疾患の主要な病因因子と見なされ得ない。
【００９６】
P2X7受容体は、膜結合型のリガンド作動性チャネルであるP2ヌクレオチド受容体のP2Xサブファミリーに属し得ることが報告された。Buell et al, 1996；Soto et al, 1997；Dubyak and el-Moatassim, 1993；Ralevic and Burnstock, 1998；Khakh et al, 2001。例えば、ヌクレオチド、アデノシン三リン酸(ATP)は、天然のP2X7受容体リガンドであると考えられている。Dubyak and el-Moatassim, 1993；Ralevic and Burnstock, 1998。ATPは細胞によって構成的に分泌され、細胞外液中のATPレベルは低マイクロモル範囲で存在し得ることが報告された。Sperlagh et al, 1998；Grahames et al, 1999；Henriksen and Novak, 2003；Loomis et al, 2003；Wang et al, 2004a。初期の研究から、他の種類のATP受容体とは対照的に、P2X7受容体の活性化は比較的高濃度のリガンドを必用とし得ることが示唆された。Ralevic et al., 「Receptors for purines and pyrimidines」 Pharmacol Rev 1998, 50:413-492。しかしながら、本明細書において示されるデータから、P2X7媒介性アポトーシスの閾値効果がナノモル濃度のATPで起こることが実証され、細胞外液中に存在するATPレベルが、P2X7受容体を活性化するのに十分であることが示唆された。
【００９７】
P2X7受容体活性化の1つの細胞に対する効果は、形質膜における細孔の形成を伴い得る。Wang et al., 「Anti-apoptotic effects of estrogen in normal and in cancer human cervical epithelial cells」 Endocrinology 2004, 145:5568-5579。例えば、子宮上皮細胞において、P2X7受容体細孔の形成は、ミトコンドリアのカスパーゼ-9経路の活性化と平行して、P2X7-細孔を介するCa2+の流入を伴うと考えられる機構によりアポトーシスを誘導する。North RA, 「Molecular physiology of P2X receptors」 Physiol Rev 2002, 82:1013-1067；Wang et al.,「Anti-apoptotic effects of estrogen in normal and in cancer human cervical epithelial cells」 Endocrinology 2004, 145:5568-5579；およびFeng et al., 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 2006, 281:17228-17237。細胞外ATPに対する短時間の曝露によるP2X7受容体活性化は、Ca2+、Na+、およびK+流入を見かけ上可能にする陽イオンチャネルを開口することが報告された。Surprenant et al, 1996。さらに、ATPに対するより長い曝露は、形質膜における細孔形成を誘導し得る。Virginio et al, 1999。
【００９８】
P2X7受容体は、増殖細胞によって発現されるため、細胞成長において役割を果たすと考えられている。Li et al., 「The P2X7 Receptor: A novel biomarker of uterine epithelial cancers」 Cancer Epidemiol Biomarkers Preven 2006, 15:1-8。さらに、P2X7受容体の活性化はアポトーシスを誘導し、それによって細胞成長に調節的影響を及ぼすことが報告された。Wang et al., 「EGF facilitates epinephrine inhibition of P2X7-receptor mediated pore formation and apoptosis: a novel signaling network」 Endocrinology 2005, 146:164-174。
【００９９】
P2X7媒介性アポトーシスはまた、IL-1β(Ferrari et al, 1997a)、TRAIL(Aggarwal et al, 1999)、p38/JNK/SAPK(Humphreys et al, 2000)、および NF-κB(Ferrari et al, 1997b)を含むがこれらに限定されない細胞内シグナル伝達機構を伴い得る。P2X7受容体活性化の他の細胞に対する効果は、受容体合成(Guerra et al, 2003)、グリコシル化(Feng et al, 2005)、輸送および形質膜局在性(Li et al, 2000；Bobanovic et al, 2002；Gu et al, 2000)、オリゴマー化(Khakh et al, 2001；Feng et al, 2006)、ならびに活性化後の内部移行、再利用、および分解(Wang et al 2005；Feng et al, 2006)によって決定され得る。
【０１００】
最近まで、P2X7受容体のインビボでの生物学的役割に関しては、比較的ほとんど知られていなかった。初期の研究から、P2X7受容体が、ランゲルハンス島および炎症性樹状上皮細胞において、ならびに培養された未熟樹状上皮細胞において発現するという理由で、炎症過程および免疫過程における該受容体の関与が示唆された。Georgiou et al. 2005；Mutini et al, 1999。乾癬およびアトピー性皮膚炎の病変皮膚においてP2X7の過剰発現が認められ、そこでは強力なP2X7免疫反応性が基底層の細胞膜に限局していた。Pastore et al, 2007。P2X7は、正常ケラチノサイトによるケモカイン分泌において役割を果たすことが示唆されたが、得られるデータには一貫性がない。例えば、1つの研究は、培養正常ケラチノサイトをP2X7特異的アゴニストである2',3'-0-(4-ベンゾイルベンゾイル)-アデノシン5'-三リン酸(BzATP)で処理すると、IL-6放出が増加すると報告したのに対し、第2の報告は、BzATPによりケモカイン分泌が減少したことを見出した。それぞれ、Inoue et al, 2007；およびPastore et al, 2007。
【０１０１】
研究により、上皮成長の制御におけるP2X7の役割も示唆されたが、大部分の研究は観察的であった。i) 正常組織、Greig et al, 2003a；ii) 前がん性上皮組織、Slater and Barden, 2005；および皮膚がん細胞、Greig et al,2003b；White et al, 2005；およびPastore et al, 2007において、P2X7受容体発現が認められた。P2X7受容体免疫反応性は、表皮の基底/傍基底成長部を含む表皮全体に認められた。Greig et al, 2003a。P2X7受容体は、ヒト胎児表皮細胞(すなわち、例えば、周皮)において8〜11週という早さで検出され、該受容体はカスパーゼ-3およびTUNEL染色と共局在した。Greig et al, 2003c。P2X7受容体とそのようなアポトーシス関連マーカーとの共局在は成体ヒト表皮においても報告され、最近の研究から、正常ケラチノサイトおよびがんケラチノサイトにおけるBzATP誘導性細胞死が報告された。Greig et al., 2003a、Greig et al, 2003b；およびSlater & Barden, 2005。
【０１０２】
これらの既存の観察データから、P2X7が上皮細胞の成長を調節し得ることが示唆されるが、表皮層におけるP2X7受容体の生物学的役割に関してはほとんど知られていない。例えば、以前のいずれの研究も、P2X7受容体の生物学的役割をインビボで実験的に調べていない。本明細書に示されるデータにより、P2X7受容体が、表皮上皮細胞の成長の制御においてインビボでの生理的役割を有することが実証される。このデータから、この成長制御がアポトーシス機構を通して起こり得ること、および該受容体の薬理学的刺激が表皮新生物の発生を阻害し得ることも示唆される。例えば、培養ヒト正常ケラチノサイトおよび/またはがんケラチノサイトにおいて収集された本データは、P2X7受容体がアポトーシスの調節を通して細胞の成長を制御するという直接的証拠を提供する。具体的には、以下において考察されるインビボでのマウスデータにより、局所的に適用されたP2X7受容体アゴニストが、DMBA/TPA誘発性の乳頭腫形成を阻害することが示される。
【０１０３】
ヒトP2X7転写物の翻訳産物は、形質膜を横断すること、ならびに以下のトポロジーを有する2つの細胞内ドメインおよび1つの細胞外ドメインを有することが予測される、595 aaの直鎖状ポリペプチドである。図21Aを参照されたい。P2X7ポリペプチドは、以下の領域を含み得る：
a) β2インテグリン、受容体様チロシンホスファターゼ(RPTP)、α-アクチン、ホスファチジルイノシトール4-キナーゼ、膜結合型グアニル酸キナーゼ、およびいくつかの熱ショックタンパク質を含むいくつかのタンパク質と細胞内複合体を形成するN末端(aa 1〜25)[45]。これらの複合体は、いくつかのP2X7依存性シグナル伝達を媒介し得る。
b) 第1膜貫通セグメント(aa 26〜46)。
c) リガンド結合部位[46-49]、ならびにAsn187、Asn213、およびAsn241が機能性を付与するのに必要とされる5つの推定Nグリコシル化部位[43]を含む細胞外ドメイン(aa 47〜334)[参考文献50；およびGorodeski、未発表データ]。
d) 第2膜貫通セグメント(aa 335〜355)。
e) 細孔形成に必要とされる[50、51]長いC末端(aa 356〜595)[43]。P2X7のカルボキシ末端尾部内のドメインはまた、形質膜において該受容体の輸送を指示し、かつ該受容体の発現を安定化する[50-54]。
【０１０４】
機能的P2X7受容体は、グリコシル化G共役膜結合型タンパク質である。図21Dを参照されたい。[41,42,47,48,55]。P2X7受容体の天然リガンドはATPである。図21Bを参照されたい。[47,48]。ATPは、高ナノモル、低マイクロモル濃度で細胞外液中に存在し[40,56-60]、これは該受容体を活性化するのに十分である[38,40-42,55]。細胞外液中のATPの調節が記載された[例えば、46,61,62]。
【０１０５】
ATPによるP2X7受容体の活性化は、IL-1β[63]、TNFα-TRAIL[64]、ならびにp38、JNK/SAPK[65]、およびNF-kβカスケード[66]を含む様々なシグナル伝達経路を刺激することができ、そのうちのいくつかはアポトーシスを誘導し得る。上皮細胞において、量的に顕著なアポトーシス促進性P2X7効果は、400〜900ダルトンの分子の流入を可能にする直径〜4 nmの細孔の形質膜における形成を伴う。図21Eを参照されたい。[38,40-42,49,55]。その最大サイズでは、細孔はCa2+に対して比較的透過性があるが、他の陽イオンに対しては依然として選択的であり、陰イオンに対しては不透過性である[49]。P2X7細孔形成は、受容体分子[67-69]およびパネキシン[70,71]の形質膜への動員、ならびに受容体3オリゴマーから構成される複合体の形成を伴う。図21Dを参照されたい。[47-50]。P2X7分子はまたP2X4受容体分子と構造的相互作用を形成することができ[73,74]、これは細孔を安定化し得る[75]。
【０１０６】
例えば、ヒト子宮腟部、子宮頸管内、および子宮内膜細胞、ならびにヒトケラチノサイトといった上皮細胞において、P2X7受容体の活性化は細孔形成およびCa2+の無制御な流入を誘導し、これはミトコンドリア損傷とそれに続くカスパーゼ9/7/3媒介性アポトーシスの活性化を引き起こす。図21Fを参照されたい。[38,40-42,55]。
【０１０７】
他のG共役タンパク質受容体と同様に、活性化は、チロシン、セリン、およびスレオニン残基におけるP2X7受容体のGRK-3媒介性リン酸化、ならびに形質膜へのβ-アレスチン-2の動員を促進する[42]。β-アレスチン結合は、ヘテロ三量体Gタンパク質からの該受容体の脱共役を促進し、活性化リン酸化受容体分子は様々なシグナル伝達経路の促進に関与する[42]。しかしながら、残存する活性化受容体分子の大部分はエンドサイトーシスによって内部移行し、β-アレスチン結合は、ダイナミン関連機構内の該受容体をクラスリン被覆ピットに標的化する。エンドサイトーシスに続いて、様々な細胞ドメインへの受容体隔離、再利用、および分解が起こる。図21Dを参照されたい。[42]。
【０１０８】
A 生化学
P2X7は、上皮組織において作動するいくつかのアポトーシス促進系の1つである[37,38]。P2X7受容体は増殖細胞によって発現され[39]、該受容体の活性化は、上皮細胞の成長を直接制御するアポトーシスを誘導する[38,40-42]。
【０１０９】
ヒトP2X7遺伝子は染色体12q24の55 kb領域内に位置し、595アミノ酸(aa)ポリペプチドをコードする13のエキソンを有する[43]。P2X7転写開始部位(TpIS)は、ヒトP2X7遺伝子[GenBank Y12851]のヌクレオチド(nt) 1683におけるアデニン(+1)であり、nt -32/-28にTTAAA配列を有し、nt -158/+32内に活性プロモーター領域を有する[44]。
【０１１０】
ATPの細胞外定常状態レベルがわずかに高ナノモル、低マイクロモル範囲内であることから、ATP(EC50 100μM)およびBzATP(EC50 35μM)に対するP2X7受容体の低親和性は[38,40,42,55]、アポトーシスに対するP2X7受容体機構の提唱される生理学的意義に対して異常である。この疑問は、該受容体の生物学的役割を参照することにより答えが得られる。上皮細胞において、P2X7受容体は、アポトーシスの誘導を通して細胞の成長を制御する[38]。P2X7受容体がその天然リガンドであるATPに対して高親和性であることは、該受容体が構成的に活性化され、細胞死を誘導するため、正常細胞にとって不利である。細胞は、P2X7受容体の発現および活性を調節するための機構を考案したようであり、該受容体の低親和性は、受容体活性化を制御するため、および細胞死を回避するための付加的な生理学的機構であり得る。図22を参照されたい。通常の条件下では、ATPの細胞外レベルは、受容体活性化の閾値に相当する範囲内にある[38,40,42,49,55]。したがって、受容体プールのごく一部のみが活性化され、ほんのわずかな細胞しかアポトーシスを起こさないという可能性が高い。この仮説は、正常皮膚では、P2X7受容体を発現しているケラチノサイトにおけるベースラインのアポトーシスの程度は低いという、インビボにおけるマウスデータによって支持される。図26Cおよび26L、[55]を参照されたい。
【０１１１】
B. 細胞局在性
P2X7媒介性アポトーシスの制限因子は、P2X7受容体の細胞における発現である[42,50]。P2X7受容体の局在性は免疫法を用いることによって研究されており、P2X7免疫反応性は様々な細胞の位置で認められた。形質膜における共局在は最も重要な全長活性受容体を反映するが[42,50]、切断型(例えば、P2X7-jタンパク質)もまた形質膜に分別され得る[50]。細胞質において認められたP2X7免疫反応性は、形質膜に挿入される途中である新たに形成された受容体、または活性化後の内部移行した、分解された、または再利用された受容体を反映する[50]。核周囲/核のP2X7免疫反応性が上皮細胞[76-78]および非上皮細胞[79,80]において記載されたが、その生物学的意義は不明である。
【０１１２】
例えば子宮頸部および子宮内膜といったいくつかの種類の上皮組織において、P2X7受容体は主に形質膜の頂端ドメインに分別される[81,82]。子宮内膜において、該受容体の頂端発現は組織分化のレベルに依存し、形質膜の頂端領域への分別は、月経周期の後期増殖期にある女性の組織において最も高い[82]。これらの知見の生物学的意義は不明である。
【０１１３】
C. 調節
P2X7系の活性を決定する1つの要因は、全長機能的受容体の形質膜における発現の程度である[42,50]。P2X7系はインビボにおける強力なアポトーシス促進性因子であり、細胞は、該受容体の発現および機能を調節および制御する機構を発達させた[55]。
【０１１４】
1. 転写調節
P2X7転写は、活性プロモーターの下流のnt領域+222/+232および+403/+573内に位置する2群のシス調節エンハンサーエレメントにより調節を受ける。図22を参照されたい[44]。相関データから、これらの領域が転写因子p300、Elk-1、E47、EIIaE、E2F、およびp53の結合部位を含み[44]、これらの転写因子は、エンハンサー領域とプロモーター領域からのシグナルを統合し、細胞成長およびアポトーシスを調節し得ることが示唆される[83-90]。これらの転写因子のうちのいくつか、例えばE47[85]およびp53[90]の抑制または欠如は、がんの発生に結びつけられている。腫瘍抑制因子p53は、細胞周期進行および細胞死の調節に関与する遺伝子の発現を制御し[90]、P2X7発現は、p53タンパク質レベル[91]およびp53アポトーシス経路の活性化[92]と相関する。
【０１１５】
P2X7転写は、クラスター化するかまたはエンハンサー部位と共局在するシトシン-ホスホジエステル-グアノシン(CpG)部位のメチル化シトシンによって制御される。図22を参照されたい。[44]。CpG部位+211/+212、+330/+331、および+461/+464のシトシンは、インビボにおいて構成的にメチル化され、これらの部位の過剰メチル化はP2X7転写を阻害する[44]。逆に、脱メチル化薬、例えば5-アザ-2'-デオキシシチジン(アザ-dC)による細胞の処理は、おそらくCpG部位+211/+212、+330/+331、および+461/+464のシトシンの脱メチル化を誘導することにより、P2X7 mRNAを上方制御する[44]。P2X7プロモーターの下流にある過剰メチル化CpGが転写を阻害する分子機構は、おそらくは、推定エンハンサー領域内の転写因子認識部位の空間的高次構造の調節を伴う[44]。
【０１１６】
2. 転写後調節
全長ヒトP2X7 3'-非翻訳領域(3'UTR)は、P2X7転写物に不安定性を付与する配列を含む[93,94]。ヒトポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)は転写後のP2X7 mRNAと相互作用して、(3'UTR)-P2X7 mRNAを不安定化する[93]。対照的に、PARPの阻害は、P2X7 mRNAの安定性を高めることによりP2X7関連アポトーシスを増強する。図22、[93]を参照されたい。
【０１１７】
ヒトP2X7 3'UTRはまたマイクロRNA(miRNA)の標的部位を含む。miRNAとは、mRNA標的を調節する小さな非コードの18〜25 nt RNAである[95]。ヒトP2X7 3'UTRはmiR-186およびmiR-150の結合部位を含み、これらはP2X7転写物に不安定性を付与する[94]。miR-186およびmiR-150の過剰発現はP2X7 mRNAの合成を阻害するのに対して[94]、miR-186およびmiR-150の阻害はP2X7 mRNAの合成を上方制御し[94]、リガンド誘導性のP2X7アポトーシス促進効果を高める。図22を参照されたい。[94, 96]。
【０１１８】
3. 受容体グリコシル化の調節
P2X7受容体の膜発現および機能性は、該受容体のグリコシル化に依存する。グリコシル化は、ゴルジ輸送、輸送、および形質膜中への該受容体の挿入を促進するのに対し、受容体の脱グリコシル化は受容体機能を無効にする[41]。P2X7受容体のグリコシル化は、プロテインキナーゼ-A(PKA)のβ2-アドレナリン受容体(β2-AR)による活性化によって制御され、P2X7受容体の脱グリコシル化および受容体分解の増強が生じる[41]。PKA効果は、上皮増殖因子(EGF)の作用により調節を受ける；これは、β2-AR内部移行のホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)依存的阻害の促進、およびβ2-AR再利用の促進を伴い、それによってリガンド結合に際した活性化に利用できる形質膜中のβ2-ARのプールを増加させる。図21Dおよび図22を参照されたい。[41]。
【０１１９】
4. 受容体オリゴマー化の調節
P2X7媒介性アポトーシスは、リガンド誘導性の細孔形成を伴い[47-49]、これは全長受容体のホモ(3)オリゴマー化に依存する。図21Eを参照されたい。[47-50]。P2X7受容体のオリゴマー化はP2X7単量体の利用能に依存し、全長P2X7型とヘテロオリゴマー化して非機能的細孔を生じ得る切断型のP2X7の存在によって影響を受ける[50]。選択的スプライシングから生じる、ヒトP2X7の5つの切断変種が以前に報告された(P2X7-b、P2X7-e、P2X7-g、P2X7-i、およびP2X7-j)[50,54,96]。いずれも野生型P2X7受容体のカルボキシ末端を欠いており、いくつか(P2X7-bおよびP2X7-j)は、宿主細胞において単独で発現させた場合に、細孔形成およびアポトーシス誘導において効果がないことが示されている[50]。
【０１２０】
P2X7-j型は、正常上皮細胞およびがん上皮細胞において天然に発現される[50]。これは野生型P2X7の近位248アミノ酸から構成され、そのカルボキシ末端において10アミノ酸の変化したストレッチを有する。これは、細胞内カルボキシ末端全体、第2膜貫通ドメイン、および細胞外ループの遠位1/3を含む、P2X7の遠位337アミノ酸を欠いている。異種発現させた場合、P2X7特異的リガンドBzATPによる処理によって微量なチャネル活性が誘発されるが、これは細孔形成およびアポトーシスを誘導することができない[50]。宿主細胞においてP2X7-jと全長P2X7を共に発現させると、P2X7-jとP2X7の間のヘテロオリゴマー化および非機能的P2X7-j/P2X7ヘテロオリゴマーの形成が起こる[50]。
【０１２１】
P2X7とP2X7-jを共に発現する宿主細胞におけるオリゴマー生成物の解析により、以下の相対発現順での4種の三量体複合体の形成が示唆された。図21Eを参照されたい。[50]：
・[P2X7-j]3 (70％)
・[P2X7-j]2/[P2X7] (15％)
・[P2X7]3 (10％)
・[P2X7]2/[P2X7-j] (5％)
【０１２２】
これらのうち、[P2X7]3 のみが機能的細孔を形成し[50]、P2X7とP2X7-jの共発現は不活性複合体の形成を支持することが示される。このデータから、両受容体型を発現する細胞において、多量のP2X7-jまたは少量の全長P2X7受容体が、非機能的細孔の形成の可能性を高め、アポトーシスの誘導を無効にする傾向があることが示唆される。図22を参照されたい。
【０１２３】
5. P2X7媒介性アポトーシスのエストロゲンによる調節
エストロゲン反応性組織では、エストロゲンへの曝露により、細胞に対する成長促進効果が誘導される。過去には、この効果の大部分はエストロゲン依存的な細胞分裂促進刺激の活性化を伴うと考えられていた。しかしながら、最近のデータから、この効果の一部がエストロゲン誘導性の抗アポトーシス効果の結果であることが示されている。ヒトの正常およびがん性のエストロゲン反応性子宮上皮細胞を用いる実験から、エストロゲンが、ベースラインのアポトーシス(主にP2X7受容体によって媒介される[38])およびP2X7により増強されるアポトーシス[40]を阻害することが示された。これらの細胞において、P2X7媒介性アポトーシスは、P2X7細孔を介したCa2+の流入、およびミトコンドリアのカスパーゼ-9経路によるアポトーシスの誘導を伴う[38, 40-42]。エストロゲンによる処理は、カスパーゼ9のP2X7受容体誘導性活性化を阻止するが、アポトーシス阻害の機構は正常細胞とがん細胞とでは異なる。正常細胞では、エストロゲンで処理すると、P2X7誘導性のカルシウム流入の減少により細胞質カルシウムの低下が起こる。対照的に、がん細胞では、エストロゲンは抗アポトーシス因子Bcl-2の活性を上方制御する[40]。
【０１２４】
D. 生物学的効果
P2X7受容体の活性化は多くの効果を促進する[46-49]。組織/器官レベルにおいて、P2X7は微生物感染に対する自然免疫反応に関与する。ATPによるP2X7の結合は、インフラマソーム活性化およびIL-1βなどの炎症性サイトカインの分泌[例えば、63, 97, 98]、ならびに活性酸素種(ROS)の産生を促進し得る。マクロファージにおいて、P2X7は、MAPKであるERK1/2およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ複合体を通してROS産生を促進する[99]。P2X7効果はまた、神経系[100]、骨格系[101]、および上皮系[102]の機能も調節する。細胞レベルにおいて、P2X7受容体活性化の非アポトーシス効果は膜反応を伴い、P2X7受容体発現細胞と他の細胞型との直接的相互作用を調節する細胞表面の脂質およびタンパク質組成のプロファイルを変更する。この反応はまた、P2X7受容体発現細胞と、炎症、免疫、および組織損傷に対する応答を増幅または調節する他の細胞との間の遠隔通信のために、細胞外区画中への生理活性タンパク質、脂質、および大きな膜複合体の放出を誘導し得る[103]。
【０１２５】
しかしながら、P2X7受容体活性化の顕著な特徴は細胞死の誘導/増強である。初期の研究は、白血球系列の細胞におけるP2X7受容体活性化のサイトゾル効果について報告した。最近の研究は、上皮細胞におけるP2X7受容体活性化のアポトーシス促進効果に着目した。
【０１２６】
1. 正常上皮細胞の成長
正常ヒト上皮子宮細胞(すなわち、例えば、子宮腟部、子宮頸管内、または子宮内膜)および表皮細胞、ならびに正常マウス表皮ケラチノサイトにおけるデータから、以下を含むがこれらに限定されない理由により、P2X7系が上皮細胞成長の調節において生理的役割を果たすことが示唆される：
a) P2X7受容体は、ベースラインのアポトーシスの制御に必要かつ十分である[38-42,50,55,94]。
b) 該受容体の合成を阻止すると、ベースラインのアポトーシスが消失する[38-42,50,55,94]。
c) ベースラインのアポトーシスは、ATPによるP2X7受容体の活性化の結果である[38-42,50,55,94]。
d) P2X7受容体の天然リガンドであるATPは、該受容体の活性化に十分な濃度で細胞外液中に存在する[38,40,55]。
e) ATPは細胞によって構成的に分泌され、傍分泌/自己分泌様式で作用する[46-49]。
f) 通常の生理的条件下において、他のアポトーシス促進系、例えばFasおよびTNF機構は、ベースラインのアポトーシスの媒介においてわずかな役割を果たす[38]。
g) 上皮細胞において、P2X7受容体は主に、上皮の増殖能を決定する予備細胞において発現される[39]。
【０１２７】
正常重層上皮におけるP2X7受容体の発現プロファイルは、細胞成長の制御におけるその基礎的役割を説明する。例えば子宮腟部[39,82]または表皮[55,76,105]といった重層上皮において、細胞は、基底層/傍基底層に存在する予備細胞から増殖する。これらの細胞は基底膜上に位置し、一生を通じて分裂し続ける。皮膚では、予備細胞の大きなプールが毛幹内にも見出され得る[105]。傍基底層の表面は、代謝的に活性のある細胞の層(子宮頸部における中間、皮膚における顆粒)、および末端分化を起こす細胞の層(子宮頸部における表面細胞、皮膚における移行細胞)である。非角質化重層上皮(例えば、子宮頸部)とは対照的に、皮膚はまた扁平な死細胞の層から構成される表面角質層も含む[105]。
【０１２８】
正常重層上皮において、P2X7免疫反応性は、基底層/傍基底層において(および皮膚内の毛幹において)強く；上皮の中間子宮腟部層において、および表皮顆粒層においてより低く；表面(子宮腟部)、ならびに移行層および角質層(皮膚)においてより強い[39,76,82,104]。P2X7受容体タンパク質とは対照的に、P2X7 mRNAは主に基底層/傍基底層に認められ、より表面の層には認められない[39]。したがって、非増殖層におけるP2X7免疫反応性は、末端分化を起こす死細胞に捕捉された受容体を表し、おそらくはこれが末端分化に付随するアポトーシスを媒介する[105]。しかしながら、この機能はその主要な役割の二次的なものであり、主要な役割は増殖予備細胞の成長の調節である。予備細胞は発がん刺激の標的であり、新生物形質転換を起こすリスクがある；これらの細胞における新規合成された受容体の強力な発現から、P2X7受容体が予備細胞の成長を直接制御することが示唆される[55]。
【０１２９】
2. がん上皮細胞の成長
P2X7受容体活性化は、正常上皮細胞およびがん上皮細胞の両方においてアポトーシスを増強し得るが、ある種のがん性上皮細胞は、それぞれの正常細胞よりも低下したアポトーシス効果を有する。例えば、がん子宮腟部細胞、がん子宮頸部細胞、がん子宮内膜細胞、およびがんケラチノサイトをP2X7受容体特異的アゴニストBzATPで処理すると、それぞれの正常細胞よりも2〜5倍低いアポトーシスが起こる[38,40,55]。そのような細胞において主にP2X7系により決定されるベースラインのアポトーシスもまた[38,40,55]、正常細胞よりもがん細胞において少ない[38,40,55]。最近のデータから、がん細胞におけるP2X7媒介性アポトーシスの減弱が、主にがん細胞におけるP2X7受容体(mRNAおよびタンパク質)の細胞レベルの低下に起因することが示される[41,42,44,50,55,94]。
【０１３０】
がん上皮細胞と正常上皮細胞におけるP2X7受容体発現の差が記載された[82]。機能的な全長P2X7受容体を検出するために、十分に特徴づけられた免疫法を用いる最近の研究は、以下のように上皮がP2X7受容体発現に関連して分類され得ることを報告した：
a) 正常細胞とがん細胞において同様の発現傾向を有する上皮、例えば結腸[82]。
b) 正常細胞よりもがん細胞においてP2X7の発現が高い上皮、例えば甲状腺[82,106]。
c) 正常細胞よりもがん細胞においてP2X7の発現が低い上皮。これらには、外胚葉に由来する上皮(皮膚および乳房)、尿生殖洞に由来する上皮(膀胱および子宮腟部)、および遠位中腎傍(ミュラー)管に由来する上皮(子宮頸部および子宮内膜)が含まれる[39,50,55,76,82,104]。そのような組織では、P2X7発現は新生物の初期に既に低下している。
【０１３１】
したがって、初期胚事象は、生命の後期におけるP2X7発現調節の型を刷り込み得る。
【０１３２】
P2X7多型が記載されており、リンパ球および単球において、機能喪失をもたらす点突然変異、例えば、1513A＞C (E496A)、1729T＞A (I568N)、946G＞A (R307Q)、1068G＞A (A348T)、1096C＞G (T357S)、および1405A＞G (Q460R)；または機能獲得をもたらす点突然変異、例えば489C＞T (H155Y)が同定された。1352T>C (P451L)変化は、マウス胸腺細胞において細胞死を損なう。P2X7受容体のプロモーター領域における多型も報告されており、ある変種は結核に対する防御と関連していた。さらなるP2X7遺伝子変種は一塩基多型コンソーシアムデータベースに含まれたが、それらの機能的意味はまだ決定されていない[50]。がん上皮細胞において多くの点突然変異が見出されたが[データは表示せず]、P2X7の遺伝子突然変異がこれらの組織においてがんの発生に影響を及ぼすという証拠はない。
【０１３３】
遺伝子突然変異とは対照的に、転写、mRNA安定性、グリコシル化、およびオリゴマー化の後生的制御の違いが、がん上皮細胞における機能的P2X7受容体の発現の減弱を説明し得ることが研究から見出された。例えば以下の通りである。
【０１３４】
過剰メチル化
遺伝子の過剰メチル化は、腫瘍抑制遺伝子の抑制を誘導し、がんの発生を引き起こし得る[107]。子宮頸部細胞において、エンハンサー部位と共局在する領域内のCpG部位+193/+194(および/または+211/+212)、+330/+331、および+461/+462(および/または+463+464)は、P2X7転写の方向依存的阻害性シスエレメントである[44]。培養された子宮頸部細胞およびインビボでの子宮頸部上皮組織のデータから、がん細胞においてこれらのCpG部位内のシトシンが過剰メチル化されることが示された[44]。さらに、P2X7プロモーターの下流にあるCpG部位内のシトシンの過剰メチル化は、がん子宮頸部細胞におけるP2X7 mRNAおよびタンパク質の発現低下と相関し[44]、シス調節エレメントの過剰メチル化を介したP2X7の転写減少ががん発生において役割を果たすことが示唆される。
【０１３５】
定常状態レベル
がん上皮細胞におけるP2X7の定常状態レベルの低さは、マイクロRNAの作用による該転写物の分解の増強の結果であり得る[94]。miRNAは、細胞成長の調節に関与するゲノム領域に存在し、ヒトがんにおいて異常に発現されたmiRNAは、腫瘍形成またはアポトーシスに関与するタンパク質コード遺伝子の転写の安定性を調節し得る[94]。ヒト3'UTR-P2X7内の配列は、P2X7転写物に不安定性を付与するmiR-186およびmiR-150の標的部位を示す[94]。がん上皮細胞は、正常細胞よりも高レベルのマイクロRNA、miR-186およびmiR-150を発現し[94]、miR-186およびmiR-150の発現上昇は、がん細胞において優先的にP2X7転写物の分解を促進する。
【０１３６】
グリコシル化
P2X7受容体のグリコシル化は、受容体機能にとって重要である。上皮細胞において、P2X7受容体のグリコシル化はEGFR/PI3K/β2-AR/PKA系によって制御され、β2-AR機構によるPKAの活性化はP2X7受容体の脱グリコシル化を誘導する[41]。β2-ARの作用はEGFRとの同時活性化により促進され、これはがん上皮細胞において過剰発現される場合が多い。それぞれ、図21Dおよび22、[41]および[108]を参照されたい。したがって、EGFRの過剰発現は、2つの群の機構によって新生物に寄与し得る：その細胞分裂促進性の影響による；およびP2X7媒介性アポトーシスの抑止(P2X7受容体のPKA媒介性脱グリコシル化を介した該受容体の発現低下)による。
【０１３７】
スプライシング変種
選択的スプライシングから生じるヒトP2X7の9つのスプライス変種が以前に報告され、そのうちP2X7-jが上皮細胞において最も広く存在する。P2X7-jは全長受容体とヘテロオリゴマー化して、不活性複合体の形成をもたらし得る。ある種のがん細胞において減少する全長P2X7とは対照的に、そのような細胞におけるP2X7-jの発現は比較的安定している。この不均衡は、アポトーシスの欠損およびがん細胞の成長増大をもたらす不活性P2X7-j/P2X7ヘテロオリゴマーの形成を支持する。図21E、[50]を参照されたい。
【０１３８】
III. がん治療
いくつかの報告から、ヒトにおけるがん治療およびがん予防として、P2X7受容体によって媒介されるアポトーシス促進活性を潜在的に用いることができることが示唆される[110]。しかしながら、本発明までは、標的組織特異性、および有効な治療の薬理学的特性の理解が把握されなかったため、そのような抗新生物様式の開発は臨床的に妥当ではなかった。
【０１３９】
現在のところ、P2X7受容体は、ATP依存性P2ヌクレオチドプリン受容体のファミリーのメンバーであると考えられている。P2受容体アゴニストの抗新生物特性に関する初期のデータにより、P2受容体の天然リガンドであるATPによる全身的または腹腔内治療を用いるインビボ研究が促された。[111]
【０１４０】
進行がん患者におけるATPの静脈内注入を用いるがん治療が報告された。例えば、進行非小細胞肺がん患者における無作為化臨床試験により、疲労、食欲、体重、筋力、機能状態、生活の質、および血清アルブミン濃度に及ぼすATP治療の有益な効果が示され、悪液質患者において効果が顕著であった[112]。ATP治療は、体重減少患者のサブグループにおいて生存期間延長と関連していた(対照患者で3.5カ月であるのに対してATP治療患者では9.3カ月)；しかしながら、試験群全体では、ATPは腫瘍病期および生存期間に効果を及ぼさなかった[113]。このデータから、体脂肪量、脂肪を除く量、および体細胞量、ならびにエネルギー摂取に及ぼすATPの有益な効果は、肝臓エネルギーレベルの回復によるエネルギー摂取の維持に起因することが示唆された。それぞれ、[114, 115]。
【０１４１】
上記の試験から、末期がん患者の緩和ケアは、静脈内ATPを用いると有用であり得ることが示唆されるが、後から考えれば、抗がん様式としての全身性ATPの使用は失敗した可能性が高いことが明らかである。ATPの全身投与は、体全体のP2受容体を標的とする。細胞は2種類以上のP2受容体を発現し、ATPに対する反応は、活性化されるP2受容体の種類に依存する。また、細胞型に応じて、いくつかの受容体サブタイプ(すなわち、例えば、P2Y1、P2X5、およびP2X7)の活性化は細胞数の減少をもたらすのに対し、他の受容体サブタイプ(すなわち、例えば、P2Y2)の活性化は細胞数の増加をもたらし得る[116]。加えて、例えば末梢Tリンパ球などのいくつかの細胞型では、P2X7受容体の活性化は細胞分裂促進反応をもたらし得る[117]。
【０１４２】
細胞外液中でのエクトATPアーゼ分解によるようなATPの不安定性は、ATPの有効性に悪影響を及ぼし得る別の要因である[118]。例えば、抗悪液質効果は、ATPの分解産物であるアデノシンによって起こった可能性があり、アデノシンは体重減少の軽減に有効である[119]。エクト-ATPアーゼは、血漿および細胞外液中において公知である[61]。さらに、ATPが、P2X7受容体の薬理学的活性化に必要とされる濃度範囲に達した可能性は低い[38,40,42,55]。
【０１４３】
したがって、組織特異性の欠如、およびこれらの試験時におけるATP全身投与後のATP薬理学の乏しい理解により、これらの臨床的失敗の理論的根拠が提供される。
【０１４４】
最近の研究では、ヌードマウスにおいて、移植された前立腺がん細胞および膀胱がん細胞から生じる腫瘍に及ぼすATPの腹腔内投与の効果が調べられた。それぞれ[120]、[121]。データから、新たに移植されたがん細胞の成長の44〜69%が減少し、宿主マウスに有害作用がないことが示された。移植された膀胱がんおよび前立腺がんの成長減少は、ATPの抗新生物効果の概念実証を提供する。[119]。これらの考察に基づいて、当技術分野は、抗新生物様式としてのATPの使用は非特異的反応をもたらし得ること、およびヒトにおける抗新生物治療様式としてATPが使用されるべきではないことを示唆している。代わりに、がん細胞の成長を媒介するのに選択的であるP2受容体調節因子(すなわち、例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト)の使用に着目すべきである[116]。
【０１４５】
1つの態様において、本発明は、１つのそのようなATPアゴニストとしてのBzATPを含む組成物を意図する。BzATPは、P2X7媒介性アポトーシスを活性化し、表皮新生物の成長を調節するために用いられた[55}。BzATPは、亜ミトコンドリア粒子のATPアーゼに対する部位特異的アデニンヌクレオチド結合を調べるために、光活性化が可能な共有結合アフィニティープローブとして最初に合成され使用された[122]。水溶液中で弱酸(ATP4-)として挙動するATPとは対照的に、BzATPは、ベンゾイル-ベンゾイル環によってもたらされる親油性特徴を有し、これは表皮を通したその浸透を説明し得る。図21Cを参照されたい。BzATPは、生体液中で、ならびに広範囲の温度およびpHにわたって比較的安定な化合物であるが、血清アルブミンおよび様々な血漿脂質がBzATPと結合して、P2X7受容体におけるその効力を軽減し得る[123]。BzATPは、2'(3')-O-(4-ベンゾイル-ベンゾイル)アデノシン-5'-三リン酸(C24H24N5O15P3、MW＝715.39)、またはトリ-トリエチルアンモニウム塩、C24H24N5O15P3.C18H45N3、MW＝1018.97)のいずれかの形態で市販されている。いずれのBzATP型も、同様の抗アポトーシス効果を発揮することが示されている(データは表示せず)。
【０１４６】
BzATPはP2X7受容体の強力かつ有効なリガンドであり、効力はATPよりも5〜10倍高い[42,50]。P2X7受容体の活性化はリガンドの持続的な存在を必要とし、BzATPによる処理は長期にわたるP2X7効果を発揮する[124]。研究がなされた大部分の細胞型において、BzATPは特異的P2X7受容体アゴニストであることが示されたが[46-48]、一部の細胞型では、BzATPは、特定のP2受容体サブタイプ：i) P2Y1受容体[125-127]；ii) P2Y2受容体[128]、ならびにiii) P2X1、P2X2、およびP2X3受容体[48,129]に応じて、弱いアゴニストまたは弱いアンタゴニストとして作用し得る。海馬苔状線維における研究から、BzATPはエクト-ヌクレオチダーゼによって細胞外でBz-アデノシンに異化され得、これは次にヌクレオシド輸送体を介して細胞内で輸送され得ることが示唆された。[130]。ひとたび細胞内で輸送されると、ベンゾイル-ベンゾイル基が細胞内エステラーゼにより除去され得、アデノシンが細胞外空間に放出され、それによってアデノシン受容体が活性化される。
【０１４７】
そのような個々の報告にもかかわらず、BzATPを用いる大部分の研究は、観察される主な効果がP2X7受容体の活性化の結果であることに同意している[131]。ヒトおよび齧歯類のケラチノサイトを含む様々な上皮細胞型は、BzATP効果がBzATPの分解産物(例えば、Bz-アデノシン5'-二リン酸ADP[BzADP]、アデノシン5'-一リン酸[AMP]、またはアデニン)によって媒介されないことを示した。加えて、アデノシン5'-二リン酸(ADP)、AMP、アデノシン、またはアデニンによる処理は、細胞にアポトーシス促進効果を及ぼさなかった(データは表示せず)。
【０１４８】
本明細書において示されるデータから、皮膚乳頭腫および皮膚がんを発生するリスクがある部位において皮膚に局所適用されたBzATPが、BzATPで処理された動物において、乳頭腫および皮膚がんの50％の阻害を示したことが実証される。BzATP処理の主な標的が、P2X7受容体を発現する予備細胞であることもさらに示される。正常皮膚において、BzATPは、P2X7受容体の活性化によって潜在的に誘導され得る炎症変化も萎縮変化も誘発することなく、予備細胞のアポトーシスを増強した[46-49]。具体的には、BzATPは、組織の喪失、菲薄化、または潰瘍化を誘導しなかった。対照的に、BzATPによる処理は乳頭腫形成を阻害し、かつこれは乳頭腫の皮膚がんへの形質転換を阻害した。DMBA/TPAマウスモデルにおいて、大部分の早期乳頭腫は組織学的に良性であるが、一部は扁平上皮がんに進行する[132,133]。がんに発達するリスクのある乳頭腫は、表皮予備細胞の増殖能の増加によって特徴づけられる[132]。P2X7媒介性アポトーシスは、ゆっくりと成長している正常細胞にはほとんど影響を及ぼさないが、迅速に成長している細胞の増殖を制御し、BzATPは、前がん性細胞の発生および皮膚がんとなるそれらの形質転換を制御することにより、皮膚化学防御の可能性を有する。[55] BzATPはまた、インビボにおいて進行がん細胞のアポトーシスも誘導したが、その効果は、これらの細胞におけるP2X7受容体の低発現によって限定された。それぞれ図26T、26V、および図26S、26Uを参照されたい。P2X7受容体レベルは、P2X7転写を制御するCpG部位のシトシンの脱メチル化を誘導することにより、正常細胞およびがん細胞において上昇させることができる。図22；[44]を参照されたい。
【０１４９】
まとめると、これらのデータから、P2X7媒介性アポトーシスの薬理学的増強が、皮膚がんにとっての予防および早期皮膚がん性病変にとっての治療であることが示唆される。
【０１５０】
最初の研究は低BzATP用量のBzATPを使用し、局所的または全身性の有害事象を全く引き起こさなかった。このことは、皮膚に局所投与した場合に、BzATPが、高い治療プロファイルおよび低い毒性薬理学的プロファイルを有する化学療法成長防止薬候補であり得ることを意味する。口腔粘膜、外陰部および腟の上皮、ならびに子宮腟部を含む他の上皮も、BzATPによる局所治療の潜在的標的として考えられ得る。これらの扁平重層上皮は、表現型的に皮膚に類似している；それらの予備細胞はP2X7受容体を発現し、該受容体の活性化はアポトーシスを誘導する。これらの組織のがんは通常は前悪性病変から発達し、皮膚と同様に、がんリスクは0.1％から20％まで異なり得る[134-136]。本発明の機構を理解する必要はないが、BzATPによるP2X7依存性アポトーシスの活性化は、前がん性および早期がん性上皮病変の新たな化学療法成長防止様式であり得ると考えられる。
【０１５１】
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体を活性化する段階を含む、がんを治療および予防するための方法を意図する。例えば、本明細書に示されるデータから、P2X7媒介性アポトーシスが皮膚上皮細胞の成長を制御することが示される。特に、P2X7特異的アゴニストリガンド(すなわち、例えば、BzATP)の局所適用は、インビボでのマウスにおいてDMBA/TPA誘発性乳頭腫の形成を阻害する。本発明の機構を理解することは必要ではないが、観察される阻害は、P2X7誘導性アポトーシスの活性化と関連する機構によって媒介され得ると考えられる。
【０１５２】
本明細書に示されるデータから、P2X7受容体が、BzATPアポトーシス促進効果を媒介するのに必要かつ十分であることもまた示される。正常ヒトケラチノサイトおよびヒトSCC-9細胞の馴化培地のATP濃度が高ナノモル範囲であることは、アポトーシスおよび成長のインビボ細胞調節においてP2X7受容体機構が役割を果たし得るという示唆を支持する。したがって、ATPは細胞によって細胞外環境に分泌され得、結果として生じた定常状態ATPレベルは、P2X7受容体を活性化し、アポトーシスを誘導するのに十分である。ATPの定常状態細胞外レベルは正常ケラチノサイトとSCC-9細胞の間で類似しているため(下記参照)、P2X7媒介性アポトーシスが主に該受容体の発現に依存し得ることが推測される。(Wang et al, 2004a；Feng et al, 2005)。他の種類の上皮細胞では、正常上皮細胞に対してがん細胞において、P2X7 mRNAレベルおよびP2X7受容体レベルのより低い細胞での発現が見られる。この発現低下は、正常細胞と比較したがん細胞におけるP2X7媒介性ベースラインのアポトーシス速度および/またはリガンド誘導性アポトーシスの低下と関連していた。(Wang et al, 2004a；Li et al, 2006；Li et al, 2007)。アポトーシスの欠損はがんをもたらし得るため、これらのデータは生物学的かつ臨床的に重要である可能性がある。Gasser and Raulet, 2006；Kujoth et al, 2006；Rodriguez-Nieto and Zhivotovsky, 2006。さらに、P2X7受容体の細胞での発現低下は、原因として上皮がんの発生に関係し得る。
【０１５３】
1つの態様において、本発明は、P2X7媒介性アポトーシスを制御することにより表皮細胞の成長を調節するための方法を意図する。1つの態様において、表皮細胞は胚芽表皮細胞を含む。1つの態様において、制御段階はP2X7受容体を活性化する薬物を含み、活性化に際して皮膚新生物の形成が阻害される。
【０１５４】
A. 抗がん剤のスクリーニング
処理の20週間以内に皮膚扁平上皮がんを誘発し得るDMBA/TPAマウス皮膚化学発がんモデル系を用いることにより、潜在的に有効な薬物をスクリーニングすることができる。がん発生の過程において、通常は皮膚乳頭腫が最初に生じる(すなわち、最初のDMBA/TPA曝露後6〜15週間以内。Glick et al, 2007。このモデルを使用して以下で考察されるデータから、P2X7受容体の薬理学的刺激が表皮乳頭腫の発生を阻害し得ることが初めて示された。具体的には、DMBA/TPA処理マウスをBzATと共に処理した場合に、乳頭腫形成の発生率が低下した。1つの態様において、動物当たりの平均乳頭腫数が約25%減少した。1つの態様において、平均乳頭腫サイズが約45%減少した。1つの態様において、処理された乳頭腫はより高頻度に萎縮した。本発明の機構を理解する必要はないが、インビボにおけるP2X7受容体の薬理学的活性化が、DMBA/TPA誘発性皮膚乳頭腫の形成を阻害することができ、形成された乳頭腫の萎縮を促進することができると考えられる。
【０１５５】
さらに、BzATP処理効果は、潜在的にP2X7作用に関連し得る炎症性皮膚変化を全く誘発しないと考えられる。Dubyak and el-Moatassim, 1993；Ralevic and Burnstock, 1998。また、BzATP処理は皮膚に対して他の肉眼的影響も微視的影響をもたらさず、菲薄化または潰瘍化などの、過剰なアポトーシスの結果であり得る異常な変化も認められなかった。BzATP処理中にKi67レベルは変化せず、それによって、BaATP効果が主にP2X7受容体媒介性効果に起因するという結論が支持されることに留意されたい。
【０１５６】
本発明までは、BzATPによって増強されるP2X7アポトーシスがDMBA/TPA誘発性乳頭腫形成を阻害する機構は不明であった。発がん物質(例えば、DMBA/TPA)は増殖(胚芽)細胞の無制御な成長を促進し得ると一般に考えられているが、細胞成長の根本的な生化学的制御は、P2X7媒介性アポトーシスによって制御され得る(下記参照)。したがって、DMBA/TPAによって誘発された乳頭腫の成長および発達は、BzATP-P2X7のアポトーシス活性によって釣り合いが取られた可能性がある。1つの可能性は、これら2つの効果が互いに独立しているということ、ならびに乳頭腫の発生および成長速度が、これら2つの対立する刺激による細胞成長の調節への寄与に依存するということである。別の仮説は、P2X7受容体の活性化が、DMBA/TPAの細胞および分子増殖効果を阻害するというものである。ケラチノサイトにおいてP2X7受容体の活性化がアポトーシスを誘導するシグナル伝達経路および分子機構は、明白に特徴づけられていない。
【０１５７】
1つの態様において、本発明は、少なくとも乳頭腫形成の部分阻害を含む、がんを治療するための方法を意図する。1つの態様において、阻害はP2X7受容体アゴニストによる治療の結果である。1つの態様において、P2X7アゴニストはBzATPを含む。1つの態様において、該アゴニストは局所適用として提供される。1つの態様において、局所適用はおよそ1μg/cm2 BzATPの濃度を含む。本発明の機構を理解する必要はないが、これらの阻害効果は、乳頭腫形成を阻害するのに、高用量であるほど効果が高いというように用量依存性であると考えられる。
【０１５８】
DMBA/TPAマウスモデルにおいて、大部分の早期乳頭腫は組織学的に良性であるが、一部は扁平上皮がんの病期に進行する。Glick et al, 2007。このモデルにおける悪性転換の可能性は、微小環境影響とは無関係に、主として細胞自律的である。Woodworth et al, 2004。がんに発達するリスクのある乳頭腫は、通常、基底層および基底上層におけるケラチノサイトの増殖増加によって特徴づけられる。Glick et al, 2007。この特徴は、以下の理由から関連性がある：(a) P2X7受容体は、表皮(Greig et al, 2003a；および本明細書において示されるデータ)を含む正常重層上皮(Li et al, 2006)の基底層/傍基底層において発現する；(b) 基底層/傍基底層におけるP2X7受容体の発現低下が、重層上皮の前悪性病変において既に同定されている(Li et al, 2006)；(c) BzATPによる処理は、基底層/傍基底層においてP2X7受容体の活性化を誘導した(本明細書において示されるデータ)；および(d) BzATP処理は、既に発生した乳頭腫の底部にあるケラチノサイト増殖物の基底層/傍基底層においてもアポトーシスを促進した。図5B(d)を参照されたい。したがって、BzATPは、乳頭腫の成長に対して予防効果および治療効果の両方を有し得る。
【０１５９】
1つの態様において、本発明は、ヒト上皮がんを治療するための方法を意図する。1つの態様において、P2X7受容体はほとんどの種類の上皮細胞によって発現される。Surprenant et al, 1996；Ralevic and Burnstock, 1998；Khakh et al, 2001；Wang et al, 2004b；Feng et al, 2006；Li et al, 2006；Li et al, 2007。上皮がんは通常は前悪性病変から発生し、P2X7受容体の発現低下は早期前悪性病変において既に起こっていると考えられる。Li et al, 2006；Li et al, 2007。例えば口腔粘膜(白板病)、子宮頸部(異形成)、および表皮(光線角化症)といった重層上皮の前悪性病変のがんリスクは、0.1％から20％まで異なり得るが、現在のところ、どの病変ががんに進行するかを予測することは難しい。Reibel, 2003；Fu and Cockerell, 2003；Lindeque, 2005。
【０１６０】
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体を活性化し得る少なくとも1つの化合物を含む組成物を意図し、活性化に際しては、リスクのある個体において上皮病変の成長および進行が阻害される。1つの態様において、化合物はBzATPを含む。本明細書において記載されるデータにより、BzATPが皮膚を通して吸収され得、薬物適用部位の上皮の胚芽層内の細胞を特異的に標的化し得ることが示される。本発明の機構を理解する必要はないが、P2X7受容体の薬理学的活性化は、壊死および炎症反応または免疫反応を誘発することなく、アポトーシスを通して前悪性病変の成長および進行を制御し得ると考えられる。
【０１６１】
B. 細胞内P2X7発現
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体遺伝子発現を増加させる段階を含む、がんを治療するための方法を意図する。本発明の機構を理解する必要はないが、マウスがんケラチノサイトにおけるBzATPのアポトーシス促進効果の低下は、おそらくはP2X7受容体の低発現の結果であると考えられる。
【０１６２】
1. 正常細胞
本明細書において示されるデータにより、P2X7受容体が表皮細胞において発現することが確認された。培養ヒト正常ケラチノサイトにおけるインサイチューハイブリダイゼーションアッセイにより、核周囲/細胞質領域においてアンチセンス全長P2X7 cDNAプローブの結合が検出され、センスP2X7 cDNAプローブに対する反応は認められなかった。それぞれ図1Aおよび図1Bを参照されたい。同様に、培養ヒト正常ケラチノサイトにおいて、P2X7免疫反応性が細胞質および形質膜に認められた。図1Cを参照されたい。
【０１６３】
2. ヒト表皮扁平上皮がん-9細胞
子宮上皮における以前の研究により、P2X7 mRNAおよびP2X7受容体レベルが、対応する正常上皮細胞と比較してがん細胞においてより低いことが示された。Li et al, 2006；Li et al, 2007。本明細書において示されるデータから、表皮細胞における類似の傾向が示される。図1Cおよび1Dを参照されたい。P2X7免疫反応性は、正常ケラチノサイトよりもSCC-9細胞において3倍低かった。図1Cおよび1Dを参照されたい。同様に、P2X7 mRNAレベルも、正常ケラチノサイトよりもSCC-9細胞において6倍低かった。図1Eを参照されたい。P2X7受容体発現の低下は、これらの細胞におけるアポトーシスの減少と相関した。例えば、ベースラインのアポトーシスおよびATP誘導性アポトーシスの両方が、正常ケラチノサイトよりもSCC-9細胞においてより低かった。図1E、挿入図を参照されたい。
【０１６４】
3. マウス皮膚がん細胞
BzATPの細胞に対する効果は、P2X7受容体によって媒介されると考えられている。Dubyak et al., 「Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides」 Am J Physiol 1993, 265:C577-C606；およびRalevic et al., 「Receptors for purines and pyrimidines」 Pharmacol Rev 1998, 50:413-492。
【０１６５】
本明細書において提供されるデータにより、マウスの正常細胞、乳頭腫細胞、およびがん皮膚細胞はP2X7受容体を発現するが、がん皮膚細胞レベルは正常皮膚細胞または乳頭腫細胞のいずれよりも有意に低かったことが示される。図12を参照されたい。正常皮膚を含む組織横断切片の抗P2X7受容体抗体による免疫染色から、主に表皮において増殖ケラチノサイトおよび表皮毛幹内に局在する強力な免疫反応性が明らかになった。図12Aおよび12Bを参照されたい。
【０１６６】
乳頭腫において、P2X7免疫反応性は正常組織と同様に強力であり、これは主に、発達中の乳頭腫の底部にある増殖ケラチノサイト内に局在した。それぞれ図12Cおよび12Dを参照されたい。対照的に、がん組織におけるP2X7免疫反応性は、正常表皮組織または乳頭腫組織よりも有意に低かった。それぞれ12Eおよび12Fを参照されたい。しかしながら、P2X7免疫反応性は、正常組織よりもがんにおいて4倍低かった。図12Gを参照されたい。
【０１６７】
この免疫染色データはウェスタンブロット実験により確認された。P2X7特異的バンド(すなわち、例えば、75 kDa)の定量的アッセイから、正常細胞よりもがん組織において密度が5倍低いことが明らかにされた。図12Hを参照されたい。P2X7 mRNA実験によりさらなる確認が得られ、この場合、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)アッセイによって、がん組織よりも正常組織においてP2X7 mRNA/GAPDH mRNA比が5倍低いことが明らかにされた。図12Iを参照されたい。まとめると、これらのデータから、マウス皮膚がん組織におけるP2X7受容体発現レベルが、マウス正常皮膚組織よりも4〜5倍低いことが示される。
【０１６８】
乳頭腫組織およびがん組織に関して当技術分野で許容される組織モデルにおいて、P2X7発現およびアポトーシス(TUNELによって測定される)に及ぼすBzATPの効果を判定した。これらの研究において、DMBA/TPA誘発性乳頭腫の横断切片におけるP2X7免疫反応性は、ベースラインの強度またはBzATP処理後のいずれにおいても正常細胞と異ならなかった。図15Aおよび図15Bを参照されたい。しかしながら、対照的に、皮膚がんの横断切片におけるP2X7免疫反応性のベースラインの強度は、正常組織および乳頭腫組織よりも有意に低かった。それぞれ図12Aならびに図15Aおよび15Bを参照されたい。しかしながら、乳頭腫と同様に、BzATPによる処理はがん細胞におけるP2X7受容体発現に影響を及ぼさなかった。それぞれ図15Eおよび15Fを参照されたい。
【０１６９】
TUNEL染色は、DMBA/TPA群の乳頭腫およびがん組織の横断切片において弱かった。それぞれ図15Cおよび15Gを参照されたい。正常皮膚の横断切片においても、同様の知見が観察された。図13Fおよび14Gを参照されたい。対照的に、TUNEL染色は、DMBA/TPA＋BzATP群の乳頭腫およびがん組織の横断切片においてより強力であった。図15Dおよび15Hを参照されたい。DMBA/TPA＋BzATP群のマウスから得られた乳頭腫では、TUNEL染色の増強により、発達中の乳頭腫の底部で増殖しているケラチノサイトの基底層/傍基底層が修飾された。図15Dを参照されたい。これらのデータから、BzATPはP2X7受容体発現に影響を及ぼさないが、それにもかかわらずP2X7媒介性アポトーシスが増加することが示唆される。
【０１７０】
形態的には、BzATPはDMBA/TPA誘発性乳頭腫の形成を遅らせ、より少なくかつ小さな乳頭腫をもたらした。本発明の機構を理解する必要はないが、一部の乳頭腫は自発的に退縮および萎縮した可能性があると考えられる。Glick et al., 「The high-risk benign tumor: evidence from the two stage skin cancer model and relevance for human cancer」 Mol Carcinogenesis 2007, 46:605-610。
【０１７１】
しかしながら、乳頭腫の大多数(すなわち、例えば、約2/3)は扁平上皮紡錘細胞がんに進行するか、または非がん性病変として存続した。非がん性病変としての存続は、BzATP処理後に増加した。例えば、BzATPと共に処理したマウスにおいて、がんを有する動物の14週時の割合はDMBA/TPA＋BzATP群よりも低く(50％対80％)、比較的安定していた。対照的に、がんを有する動物の割合はDMBA/TPA群において着実に増加し、24週時には100％に達した。これらのデータから、BzATPによる局所処理はDMBA/TPA誘発性皮膚乳頭腫の形成を阻害し、これはまたがん細胞への乳頭腫細胞形質転換も阻害し得ることが示唆される。
【０１７２】
BzATPは、14〜28週時の動物当たりのがん性病変の数、および14〜22週時の＞10 mm3のがん性病変を有する動物の割合にほとんど影響を及ぼさなかった。対照的に、23週後には、＞10 mm3のがん性病変を有する生存動物の割合はDMBA/TPA群において増加し、この割合はDMBA/TPA＋BzATP群では減少した。これらのデータから、BzATPによる局所処理が、皮膚新生物の発生に阻害効果を及ぼすことが示唆される。
【０１７３】
興味深いことに、15〜24週時には、がん性病変を有する動物の中で、200 mm3よりも大きな病変を有する生存動物の割合が、DMBA/TPA群よりもDMBA/TPA＋BzATP群においてより高い傾向があった。BzATPは培養正常ケラチノサイトにおいてDNA合成を促進しなかったため、この効果は増殖の増大によって説明することができない。代わりに、この効果は、生存曲線(図11Bを参照されたい)と、より小さなおよびより大きなサイズのがん性病変を有する動物の割合を比較することによって説明することができる。図10Bおよび10Cを参照されたい。したがって、DMBA/TPA群におけるがん関連死は、より多くの場合により小さな病変と関連したが、DMBA/TPA＋BzATP群におけるがん関連死は、比較的より大きな病変と関連した。このことから、BzATPによる処理はまた、がんが発生した動物の寿命を延長させたことが示唆される。
【０１７４】
B. P2X7媒介性細胞アポトーシス
1つの態様において、本発明は、P2X7媒介性細胞アポトーシスを誘導する段階を含む、がんを治療するための方法を意図する。本発明の機構を理解する必要はないが、P2X7依存性アポトーシスは、表皮新生物を含むがこれに限定されないがんの発生および進行を制御する役割を担うと考えられる。
【０１７５】
P2X7機構が、アポトーシスの活性化および調節を通して上皮細胞の成長を制御することが以前に示唆された。Wang et al, 2004a。インビボにおけるBzATPの細胞に対する効果をより良く理解するため、正常マウスにおいて、皮膚の形態および組織像、P2X7抗体の免疫反応性、ならびにアポトーシスに及ぼすBzATPの効果を実験によって調べた。
【０１７６】
1. 外因性BzATPのインビトロ効果
最初に、ATPおよびP2X7特異的アゴニストBzATPの、アポトーシスに必要な用量を決定した。ケラチノサイトおよびSCC-9細胞をATPまたはP2X7特異的アゴニストBzATPで処理すると、用量依存様式でアポトーシスが増強された。図2Aを参照されたい。ATPは100 nM濃度でアポトーシスを誘導するのに有効であることが観察され得た。このデータから、BzATP(100μM)と1μMまたは250μMいずれかのATPとの併用時のアポトーシス促進効果が相加的ではないことも示された。対照的に、BzATPと併用したTNFαによるアポトーシスの誘導は相加的であった。図2A、挿入図aを参照されたい。これらのデータから、ATPは、BzATPと同じ機構、すなわちP2X7受容体機構を介してアポトーシスを誘導するが、TNFαはそうではないことが示唆される。細胞内ATPレベルは、それぞれ610±50 nMおよび460±250 nMであると観察された。これらのデータから、ATPはP2X7媒介性アポトーシスを活性化するのに十分な濃度範囲内に維持されることが示される。図2A、挿入図bを参照されたい。
【０１７７】
ケラチノサイトは異なる種類のプリン受容体を発現すること、およびP2X7受容体に加えて、ATP関連アポトーシスは他の種類のプリン受容体によって媒介された可能性があり得ることが示唆された。Burnstock, 2006。上記のデータはこの推測を支持しない。第一に、アポトーシスを誘導するためのATP濃度閾値は、P2X7媒介性効果と一致する。Dubyak and el-Moatassim, 1993；およびRalevic and Burnstock, 1998。第二に、低濃度(1μM)または高濃度(250μM)のATPと高濃度のBzATP(100μM)の併用時のアポトーシス促進効果は相加的反応をもたらさず、ATPとBzATPが共通の機構(おそらくP2X7受容体)を介して作用することが示唆された。対照的に、BzATPとTNFαの併用時のアポトーシス促進効果は相加的反応をもたらし、BzATPとTNFαが異なる機構(すなわち、例えば、それぞれP2X7受容体とTNFα-TRAIL経路)を介して作用することが示唆された。Aggarwal and Rath, 1999。第三に、本データは、BzATP＋TNFαのアポトーシス促進効果がBzATPのみの効果よりも高かったことから、ATP/BzATPアポトーシス促進反応が、細胞がアポトーシスを起こす能力の限界に起因して非相加的であったという可能性を除外した。
【０１７８】
2. インビトロ組換えP2X7発現
N末端がN-Mycでタグ化されたヒト全長P2X7受容体を異種発現するMDCK細胞(N-Myc-hP2X7-MDCK)を用いて、P2X7受容体経路を研究した。MDCKは、P2X7受容体の内因性発現を欠いている上皮細胞である。Feng et al, 2006；およびLi et al, 2006。
【０１７９】
N-Myc-hP2X7-MDCK細胞のレーザー共焦点顕微鏡観察により、形質膜を修飾するP2X7免疫反応性が示された。図2B、挿入図：パネルaおよびbを参照されたい。N-Myc-hP2X7-MDCK細胞溶解物のウェスタンブロットから、抗Myc抗体および抗P2X7抗体による75 kDa型の同時免疫反応性が明らかになった。図2B、挿入図：パネルc〜eを参照されたい。これらのデータは、機能的P2X7受容体の発現を示唆する以前の報告と一致する。Feng et al, 2006。そのような発現の確認は、75 kDa P2X7受容体の発現を阻害するアンチセンスP2X7オリゴヌクレオチドによるN-Myc-hP2X7-MDCK細胞の処理によって判定された。ランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチドによる処理は、そのような効果を及ぼさなかった。図2B、挿入図：パネルcおよびdを参照されたい)。
【０１８０】
MDCK細胞におけるヒト全長P2X7受容体の異種発現がベースラインのアポトーシスおよびアゴニスト誘導性アポトーシスに及ぼす効果を試験するため、N-Myc-hP2X7-MDCK細胞をBzATPで処理した。P2X7の内因性発現を欠いている野生型(WT) MDCK細胞を対照細胞株として用いた。Feng et al, 2006。WT-MDCK細胞において、BzATPによる処理はアポトーシスを誘導しなかった。図2Bを参照されたい。対照的に、N-Myc-hP2X7-MDCK細胞のベースラインのアポトーシスはWT-MDCK細胞よりも1.5倍高く、BzATPによる処理によりアポトーシスは2.5倍増強された。図2C；Wang et al, 2004aを参照されたい。アンチセンスP2X7オリゴヌクレオチドまたはランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチドによるWT-MDCK細胞の処理は、アポトーシスに影響を及ぼさなかった。図2Bを参照されたい。対照的に、アンチセンスP2X7オリゴヌクレオチドによるN-Myc-hP2X7-MDCK細胞の処理は、ベースラインのアポトーシスおよびBzATPによって増強されるアポトーシスの両方を阻害したが、ランダム-対照P2X7オリゴヌクレオチドではそのようなことはなかった。図2Cを参照されたい。これらのデータから、P2X7受容体がBzATP依存性アポトーシスを媒介するのに十分かつ必要であることが示される。
【０１８１】
3. 正常組織に及ぼすインビボBzATP効果
形態学的および生化学的にヒト皮膚に類似しているマウス皮膚におけるP2X7免疫反応性が、主に胚芽基底/傍基底表皮細胞において、ならびに毛幹および毛根の胚芽基底細胞において認められた。図1Fおよび1Gを参照されたい。さらに、正常表皮細胞、培養細胞、およびインビボでのマウス皮膚におけるP2X7受容体発現レベルは、他の種類の正常ヒト上皮で報告されたものと類似していた。図1Cおよび1F；Li et al, 2006；ならびにLi et al, 2007を参照されたい。また、ヒト子宮上皮において、上皮細胞の成長がP2X7媒介性アポトーシスによって制御されることが報告された。Wang et al, 2004a；Li et al, 2006；およびLi et al, 2007。
【０１８２】
a. BzATPのインビボにおける許容性および短期効果
剪毛した背面皮膚の後方部に、BzATP(200μl中に100μM [20 nmol、14.3μg、1.0μg/cm2])を4週間にわたり週に2回適用した。BzATPの濃度/用量および処理の頻度は、上記の細胞培養データに基づいて選択した。剪毛した背面皮膚の前方部に媒体含有溶液を4週間にわたり週に2回適用することにより、各動物をそれ自体の対照とした。
【０１８３】
動物は処理を順調に許容し、身体特性、動物の行動、摂食習慣、または動物の体重に顕著な変化は認められなかった(表示せず)。BzATPまたは媒体溶液による処理はまた、背面皮膚に目に見える影響を及ぼさなかった。図13Aを参照されたい。組織学的H&E評価により、後方(BzATP)または前方(対照)皮膚背面部から得られた横断切片において相違は示されなかった。図13Bおよび13Cを参照されたい。背面皮膚の後方(BzATP処理)部の横断切片において、凝縮、断片化、および濃縮の様々な段階にある核を有する表皮基底/傍基底P2X7陽性細胞の数の増加が認められた。図3D、矢印を参照されたい。これらのデータから、BzATPによる処理によって表皮細胞のアポトーシスが増強されたことが示唆された。
【０１８４】
また、TUNEL染色により、BzATPによる局所処理がインビボにおいて皮膚アポトーシスに及ぼす効果も調べた。陰性対照実験は、マウス皮膚の横断切片において最小の自己蛍光を示した。図13Dおよび13Eを参照されたい。未処理マウスの皮膚横断切片では、かすかなTUNEL染色が表皮を修飾するにすぎなかった。図13Fを参照されたい。対照的に、BzATP処理マウスの皮膚横断切片では、多くの表皮基底/傍基底細胞および表皮毛幹細胞がTUNEL陽性に染まった。図13Gを参照されたい。加えて、BzATP処理皮膚の横断切片のDAPI染色から、対照と比較して、凝縮、断片化、および濃縮の進行段階にある核の割合がより高いことが明らかになった。それぞれ図13Iおよび図13Hを参照されたい。
【０１８５】
b. BzATPのインビボ長期効果
剪毛した背面皮膚の表面に、BzATPを計16週間にわたり週に2回局所適用した。対照群は、背部を剪毛し、媒体のみで処理したマウスを含んだ。長期BzATP処理は、動物の処理した皮膚の肉眼的外観に顕著な影響を及ぼさなかった。それぞれ図14Aおよび14C 対 図14Bおよび14Dを参照されたい。さらに、行動、摂食習慣、または体重に対する影響も認められなかった(データは表示せず)。ALT(SGPT)およびAST(SGOT)の平均血清レベルは4群の間で同様であり、マウスの標準範囲内であった(表示せず)。
【０１８６】
背面皮膚の横断切片の組織学的評価により、対照群とBzATP群において、動物から得られた標本に差がないことが示された。図3Gおよび3Hならびに図14Eおよび14Fを参照されたい。また、対照群およびBzATP群から得られた横断切片において、Ki67免疫反応性に有意差は認められなかった。図3Iおよび3Jを参照されたい。対照的に、BzATP群では、対照群と比較して表皮ケラチノサイトおよび毛幹ケラチノサイトにおいてTUNEL染色が有意に増強され、TUNEL染色はP2X7免疫反応性と共局在した。図3K〜3Xを参照されたい。
【０１８７】
BzATP処理マウスの表皮において、TUNEL染色は主に基底層/傍基底層に認められた。図3Lおよび3R、水平矢印；図3Vおよび3X、ならびに図14Gおよび14Hを参照されたい。さらに、P2X7免疫反応性と共局在するのTUNEL染色の増強は、主に基底層/傍基底層に限局した。図3T〜3X、図14Iおよび14J(低倍率)、ならびに図14Kおよび14L(高倍率)を参照されたい。BzATP群からの横断切片における表皮でのTUNEL染色の画像解析から、平均画素密度(±SD)が、対照群からの表皮横断切片における0.8±0.2に対して、5.2±0.3であることが明らかになった(p＜0.01、n＝3)。
【０１８８】
BzATP処理マウスの皮膚において、TUNEL染色はまた、対照群と比較して毛幹ケラチノサイトにおいても有意に増強された。図3Lおよび3R、垂直矢印；ならびに図3Vおよび3Xを参照されたい。TUNEL染色はまたP2X7免疫反応性と共局在した。図3T〜3Xを参照されたい。BzATP群からの毛幹横断切片におけるTUNEL画素密度の画像解析は、対照群からの毛幹横断切片における1.1±0.3に対して、6.1±0.8であった(p＜0.01、n＝3)。
【０１８９】
まとめると、これらのデータから、BzATPによる処理が増殖中の表皮ケラチノサイトおよび毛幹ケラチノサイトにおいてアポトーシスを上方制御することが示される。しかしながら、正常マウス皮膚において、BzATP処理およびアポトーシスの増強は皮膚の形態または組織像に影響しなかった。
【０１９０】
4. がん性組織発達に対するインビボBzATP
P2X7受容体の活性化が表皮新生物の発生を阻害し得るという仮説を試験するために、実験を行った。これらの実験では、DMBAでの局所処理による腫瘍の開始、およびその後のTPAでの局所処理による腫瘍の促進を伴う2段階DMBA/TPA皮膚新生物モデルを使用した。Agarwal et al, 2005；およびGuo et al, 2006。マウスの背面皮膚を剪毛し、剪毛した背面皮膚にDMBAを局所適用より1度適用した。剪毛した背面皮膚への局所適用によるTPA処理は1週間後に開始し、12週間にわたり週に2回継続した。
【０１９１】
上皮がんは通常は例えば乳頭腫のような前悪性病変から発生し、前悪性上皮病変のがんリスクは、0.1％から20％まで異なり得る。48. Reibel J, 「Prognosis of oral pre-malignant lesions: Significance of clinical, histopathological, and molecular biological characteristics」 Crit Rev Oral Biol Med 2003, 14:47-62：Fu et al., 「The actinic (solar) keratosis: A 21st century perspective」 Arch Dermatol 2003, 139:66-70；およびLindeque B G, 「Management of cervical premalignant lesions」 Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2005, 19:545-561。
【０１９２】
動物を3群に分割した：背部を剪毛し、媒体のみで処理した対照マウス(n＝15)；DMBA/TPA処理マウス(n＝15)；および-2週(すなわち、DMBAの2週間前)から週に2回、BzATPと共に処理したDMBA/TPA処理マウス(n＝14)。いずれの処理も、剪毛した背面皮膚に局所適用した。DMBA後の5週目から〜12週目まで週に1度、乳頭腫の発生をモニターした。エンドポイントは、少なくとも1つの乳頭腫を有する動物の割合；動物当たりの乳頭腫数；および平均乳頭腫サイズ(mm [最大病変寸法])であった。対照群の動物はいずれも乳頭腫を生じず、それらについてはさらに考察しない。
【０１９３】
DMBA/TPA群の動物15匹中14匹(93％)およびDMBA/TPA＋BzATP群の動物14匹中12匹(78％)が、12週時に少なくとも1つの皮膚乳頭腫を生じた。図5Aを参照されたい。事象までの時間データ(すなわち、例えば、「無乳頭腫」状態のカプラン・マイヤー解析)を用いたところ、DMBA/TPA群とDMBA/TPA＋BzATP群の間のログランク検定は有意ではなかった(p＝0.273)。しかしながら、5〜12週時の乳頭腫保有率の個別の解析は、処理の6週時に境界域の(p＝0.055)結果を示した。具体的には、少なくとも1つの乳頭腫を有するものは、DMBA/TPA群では13/15(86.7％)であり、DMBA/TPA＋BzATP群では7/13(53.8%)であった。
【０１９４】
DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群において、動物当たりの平均乳頭腫数は12週の試験期間にわたって増加したが、DMBA/TPA＋BzATP群における乳頭腫の増加はDMBA/TPA群よりも小さかった。図5Bを参照されたい。DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群の5〜12週目の独立標本t検定から、8週時および9週時の境界域の有意差(p＝0.051、0.057)、ならびに10週時の有意差(それぞれ動物当たりの乳頭腫2.3±0.34および1.23±0.34[平均値±SEM]、p＝0.033)が明らかになった。反復測定分散分析(ANOVA)により、DMBA/TPA曲線およびDMBA/TPA＋BzATP曲線について、有意な時間効果(p＜0.01)、境界域の群効果(p＝0.067)、および有意でない時間*群交互作用効果(p＝0.290)が得られた。後者により、DMBA/TPA曲線およびDMBA/TPA＋BzATP曲線に関して平行な非交互作用傾向が示される。
【０１９５】
DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群において、動物当たりの平均乳頭腫サイズは12週の試験期間にわたって増加したが、DMBA/TPA＋BzATP群における増加はDMBA/TPA群よりも小さかった。図5Cを参照されたい。DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群の5〜12週目の独立標本t検定から、平均サイズについてすべての週において有意差が明らかになった(各p値は0.005〜0.029の範囲)。よって、例えば、12週時の動物当たりの乳頭腫サイズ(mm)は、それぞれ5.86±0.91対3.46±0.73(平均値±SEM)であった(p＝0.01)。同様に、反復測定ANOVAにより、DMBA/TPA曲線およびDMBA/TPA＋BzATP曲線について、有意な時間効果(p＜0.01)、有意な群効果(p＝0.011)、および有意でない時間*群交互作用効果(p＝0.113)が得られた。後者により、この場合も同様に、DMBA/TPA曲線およびDMBA/TPA＋BzATP曲線に関して平行な非交互作用傾向が示される。
【０１９６】
興味深いことに、BzATPと共に処理したマウスにおいてDMBA/TPA処理により誘発された乳頭腫は、肥大が少なく、かつめったに潰瘍化および壊死を示さなかった。図5A(c)を参照されたい。また、これらのマウスにおいて、形成された乳頭腫は高頻度で様々な程度の萎縮を示した。図5A(c)、矢印を参照されたい。
【０１９７】
まとめると、これらのデータから、DMBA/TPA処理マウスにおいて、皮膚に局所適用したBzATPと共に行った処理は、乳頭腫形成の発生率を減少させる傾向にあったことが示される；これにより、動物当たりの平均乳頭腫数は約25%減少し、平均乳頭腫サイズは約45%減少した。加えて、BzATPと共に処理したマウスにおいて、形成された乳頭腫はより高頻度で萎縮を起こした。
【０１９８】
10週時に、2つの処理群それぞれの動物1匹から、大きな乳頭腫(すなわち、例えば、直径5 mm超)の生検を行った。これらの組織を、顕微鏡によるH&E評価、Ki67免疫染色、およびTUNELについてアッセイした。組織構造にも組織像にもKi67免疫反応性においても、2群間に差は認められなかった。それぞれ、図5B(a,b)を参照されたい；および表示せず。DMBA/TPA群の動物に由来する乳頭腫組織は、弱いTUNEL染色を示した。図5B(c)を参照されたい。対照的に、DMBA/TPA＋BzATP群の動物に由来する乳頭腫組織は、乳頭腫上皮領域の基底/傍基底領域において強力なTUNEL染色を示した。図5B(d)、矢印を参照されたい。
【０１９９】
28週後、DMBA/TPAの局所投与により誘導された病変は、扁平上皮紡錘細胞がんの形成に進行した。図6および7を参照されたい。以下に示されるデータが示すように、14週後には乳頭腫の約1/3が萎縮し、残りは非がん性乳頭腫として存続するか、またはがん性病変に形質転換した。がん性病変はすべて既存の乳頭腫から生じ、対照群の動物はいずれも皮膚病変を生じなかった。図6Aを参照されたい。DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群において、非罹患正常皮膚の形態的または組織学的特徴に有意差は認められなかった。それぞれ図6A〜Iおよび図7A〜Bを参照されたい。同様に、DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群において、乳頭腫の形態的および組織学的特徴に有意差は認められなかった。それぞれ図6B〜Eおよび図7C〜Dを参照されたい。
【０２００】
14週後、DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群の両方において、一部の乳頭腫は元のままであるのに対し、その他は萎縮し始めた。図6D〜Eおよび図7Eを参照されたい。しかしながら、両群において大部分の乳頭腫(すなわち、例えば、約2/3)は、紡錘細胞への変化を伴う扁平上皮がんへのがん性形質転換を起こした。図7F〜Iを参照されたい。2群において、がんの形態的および組織学的特徴に有意な変化は認められなかった。それぞれ、図6F〜Iを参照されたい、および表示せず。
【０２０１】
全体的に見て、本データから、DMBA/TPAに曝露された皮膚領域に局所適用されたBzATPと共に行った処理は、皮膚がんに進行する皮膚病変の発生率およびパターンを変化させたことが示される。BzATPの効果を評価するため、DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群における皮膚病変の変化を、処理の長さに関連して比較した。乳頭腫およびがん性病変の形成は時間に関連していたため(すなわち、例えば、13〜14週目の間に顕著なカットオフが起こる；図8Aを参照されたい)、0〜12週目および14〜28週目に関して、データを別々に解析した。
【０２０２】
0〜12週目の間に、乳頭腫を有する生存動物の割合は、DMBA/TPA群よりもDMBA/TPA＋BzATP群においてより低い傾向があり、乳頭腫を有する生存動物の割合の個別の解析は、処理の5週時に有意であった((p＜0.05)：それぞれ48±12％対80±10％)。14〜21週目の間における任意の皮膚病変を有する生存動物の割合は、2群で類似していた。それにもかかわらず、任意の皮膚病変を有する生存動物の割合は、22〜28週目には群の間で有意に異なった。図8Aを参照されたい。
【０２０３】
28週の期間中に、非がん性病変(すなわち、例えば、現存する乳頭腫および萎縮中の乳頭腫)を有する生存動物の割合は、両群において減少した。対照的に、DMBA/TPA群におけるがん性病変を有する生存動物の割合は着実に増加し、一方でDMBA/TPA＋BzATP群では、がん性病変を有する生存動物の割合は時間と共に減少した。例えば、28週目では、DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群におけるがん性病変を有する生存動物の割合は、それぞれ100％および43±9％であった。図8Bを参照されたい。
【０２０４】
両群において、生存動物当たりの平均乳頭腫数は0〜12週目の間に増加したが、DMBA/TPA＋BzATP群における増加はDMBA/TPA群よりも小さい傾向があった。図9Aを参照されたい。独立標本t検定から、10週時の有意差(すなわち、例えば、それぞれ動物当たりの乳頭腫2.3±0.5および1.2±0.4[平均値±SD]、p＜0.04)が明らかになった。また、反復測定分散分析により、0〜12週目の間のDMBA/TPA曲線およびDMBA/TPA＋BzATP曲線について、有意な時間効果(p＜0.01)が得られた。図9Aを参照されたい。14〜28週目の間では、生存動物当たりの平均全病変数は2群間で有意に異ならなかった。図9Aを参照されたい。両群において、平均非がん性病変数は14〜28週の期間にわたって減少した。図9Bを参照されたい。しかしながら、平均がん性病変数は同じままであった。図9Cを参照されたい。
【０２０５】
両群の動物を、動物当たりの病変の全体サイズ(mm3)に関して比較した。両群において、生存動物当たりの平均全体乳頭腫サイズは0〜12週目の間に増加したが、DMBA/TPA＋BzATP群における増加はDMBA/TPA群よりも小さかった。図6B、6C、および10Aを参照されたい。独立標本t検定から、平均全体乳頭腫サイズについてすべての週において有意差が明らかになった(p＜0.01〜0.03)。図10Aを参照されたい。例えば、12週目には、動物当たりの平均全体乳頭腫サイズ(mm3)は、それぞれ5.8±1.1対3.4±1.0(平均値±SD)(p＜0.01)であった。同様に、反復測定分散分析により、DMBA/TPAデータセットおよびDMBA/TPA＋BzATPデータセットの両方について、有意な時間効果(p＜0.01)；有意な群効果(p＜0.02)；および有意でない時間*群交互作用効果(p＞0.1)が得られた。有意でない時間*群交互作用効果により、DMBA/TPA群とDMBA/TPA＋BzATP群の間の非交互作用傾向が示される。
【０２０６】
14〜28週目の間では、2群間の病変サイズの変動が大きかった。本発明の機構を理解する必要はないが、この変動は、いくつかの病変が他の病変に対して比例しない過剰成長を起こしたためであったと考えられる。図6D〜6Iを参照されたい。このため、2群間の平均病変サイズの比較は不可能になった。しかしながら、両群における大部分の非がん性病変が10 mm3よりも小さい傾向があったため、＞10 mm3の非がん性病変を有する動物の割合は両群において低かった(すなわち、例えば、＜10％)。例えば10B、三角を参照されたい。＞10 mm3のがん性病変を有する生存動物の割合を示すデータを2群間で比較した。28週後、DMBA/TPA群よりもDMBA/TPA＋BzATP群において、＞10 mm3のがん性病変を有する生存動物の割合が有意に、より小さいことが認められた。例えば、28週目には、＞10 mm3のがん性病変を有する生存動物の割合は、DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群においてそれぞれ81％±8％および16±4%であった。図10Bを参照されたい。
【０２０７】
DMBA/TPA＋BzATP群の5匹のマウスは、比較的大きながん性病変を生じたにもかかわらず、正常な体重を維持し、かつ正常な行動を示しながら生存した。図6Iを参照されたい。対照的に、より小さながん性病変を有するDMBA/TPA群の大部分のマウスは、全身状態の不良および過剰な腫瘍量のために、IACUC安楽死要件を満たした。図6Hを参照されたい。＞200 mm3のがん性病変を有する生存動物の割合の解析から、DMBA/TPA群よりもDMBA/TPA＋BzATP群において動物の割合がより高いという傾向が示されたが、その差は統計的有意性に達しなかった。図10Cを参照されたい。
【０２０８】
事象までの時間データ解析を用いたところ、がん性病変の発生は、DMBA/TPA群よりもDMBA/TPA＋BzATP群において有意に、より遅くかつより低いことが見出された。図11Aを参照されたい。DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群の生存曲線を、各群の事象(すなわち、例えば、がんによる死亡)および事象までの時間(週)に基づいて作成した。ログランク検定を用いて、群に基づく生存曲線を比較した。2群間の全生存率は統計的に異ならなかったが、DMBA/TPA＋BzATP群と比較してDMBA/TPA群においてより早く死亡する傾向が認められた。図11Bを参照されたい。
【０２０９】
5. BzATPにより増強されるアポトーシスの機構
a. P2X7受容体発現
BzATPのアポトーシス促進性の皮膚への効果の機構をより良く理解するために、野生型マウスから、ならびにP2X7受容体欠損P2X7-/- Pfizer(Pf)マウスおよびP2X7-/- GSKマウスから得られた培養初代マウスケラチノサイトを実験で使用した。
【０２１０】
野生型マウスケラチノサイトにおいて、BzATPは用量依存様式でアポトーシスを増強した。効果は50 nMという低いBzATPレベルで始まり、100〜250μMで最大効果に達し、BzATP EC50は10μMと推定された。図16Aを参照されたい。P2X7受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理すると、P2X7受容体の発現は減少した。図16B、挿入図を参照されたい。P2X7受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ベースラインのアポトーシスを阻害し、BzATPのアポトーシス促進効果を阻止した。図16Bを参照されたい。本発明の機構を理解する必要はないが、アポトーシス促進効果は、細胞によって分泌されるATPにより傍分泌的に誘導される可能性が高いと考えられる。ランダム-対照オリゴヌクレオチドによる前処理は、P2X7受容体発現に影響を及ぼさなかった。図16B、挿入図を参照されたい。ベースラインのアポトーシスまたはBzATPにより誘導されるアポトーシスもまた、ランダム-対照オリゴヌクレオチドにより影響を受けなかった。図16Bを参照されたい。
【０２１１】
BzATPのアポトーシス促進効果の、P2X7受容体の発現への依存性は、P2X7受容体欠損マウスから得られたケラチノサイトを用いる実験においてさらに実証された。野生型マウスケラチノサイトと比較して、P2X7-/- PfケラチノサイトおよびP2X7-/- GSKケラチノサイトのいずれにおいても、100μM BzATPによる処理はアポトーシスを誘導することができなかった。図16Cを参照されたい。
【０２１２】
b. カルシウム細孔形成
1つの態様において、本発明は、P2X7媒介性カルシウム細孔(すなわち、例えば、カルシウムチャネル)の活性化を含む、がんを治療するための方法を意図する。本発明の機構を理解する必要はないが、P2X7依存性アポトーシスは、P2X7によって制御される細孔を介したカルシウム流入により媒介され得、ミトコンドリアのカスパーゼ-9経路を伴うと考えられる。
【０２１３】
子宮上皮細胞および他の種類の細胞において、P2X7受容体依存性アポトーシスは、P2X7細孔を介する、アゴニスト誘導性の急性のカルシウム流入を伴う。マウスケラチノサイトにおけるBzATP誘導性アポトーシスがP2X7細孔の形成を伴うかどうかを理解するために、細胞質カルシウムレベル、および臭化エチジウム流入の測定によるP2X7細孔の形成を測定することによって、P2X7受容体のBzATPによる活性化を実験で比較した。Feng et al., 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 2006, 281:17228-17237。
【０２１４】
マウス野生型ケラチノサイトにおいて、1.2 mM Ca2+溶液中の100μM BzATPによる処理は、細胞質カルシウムの急性の増加を誘導し、これは少なくとも6分間持続した。逆に、1.2 mM EGTAを該溶液に添加した場合には(すなわち、低カルシウム溶液)、BzATPは細胞質カルシウムの短期急上昇を誘導し、これは急速に正常レベルに戻った(すなわち、細胞質カルシウムの長期の持続的な増加は消失した)。図17Aを参照されたい。本発明の機構を理解する必要はないが、細胞質カルシウムの短期に急上昇する増加は、おそらくは細胞内貯蔵からのカルシウム放出を表すと考えられる。さらに、低カルシウム細胞外培地に浸漬された細胞において、細胞質カルシウムの長期的増加が欠如したことから、細胞質カルシウムのBzATP誘導性の長期的増加はカルシウム流入を伴うことが示されると考えられる。
【０２１５】
マウス野生型ケラチノサイトを用いる実験により、BzATPによる処理が、細胞質カルシウムの増加と類似した時間経過で、臭化エチジウムの流入の急性の増加を誘導したことも明らかになった。図17Bを参照されたい。細胞質カルシウムと臭化エチジウムのプロファイルの比較から、BzATPに対する同様の用量依存性が実証された。図17Cを参照されたい。さらに、これらのプロファイルはBzATPへのアポトーシスの用量依存性と類似しており、50〜100 nMで閾値効果および100〜250 nMで最大前の反応が得られた。図16Aを参照されたい。
【０２１６】
c. 細胞質カルシウムおよび流入
アポトーシスに及ぼすBzATPの効果と同様に、P2X7受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドによる前処理は、細胞質カルシウムのBzATP誘導性の増加および臭化エチジウムのBzATP誘導性の増加を阻止した。それぞれ図18Aおよび18Bを参照されたい。ランダム-対照オリゴヌクレオチドによる前処理は、BzATPに対する反応に影響を及ぼさなかった。
【０２１７】
d. 細胞外カルシウム依存性
マウス野生型ケラチノサイトにおいて、細胞外カルシウムを低下させると、用量依存様式で、ベースラインのアポトーシスが減弱され、かつBzATP誘導性アポトーシスが阻止された。図19Aを参照されたい。本発明の機構を理解する必要はないが、BzATPにより増強されるアポトーシスはカスパーゼ-9およびカスパーゼ-3を伴うと考えられる。例えば、カスパーゼ-9阻害剤(すなわち、例えば、LEHD-FMK)によるマウス野生型ケラチノサイトの処理は、BzATP誘導性アポトーシスを阻止したが、カスパーゼ-8阻害剤(すなわち、例えば、IETD-FMK)は有意な影響を及ぼさなかった。図19Bを参照されたい。ターミナルカスパーゼ-3の特異的阻害剤(すなわち、例えば、DEVD-FMK)または非特異的汎カスパーゼ阻害剤(すなわち、例えば、zVAD-FMK)を含むがこれらに限定されない陽性対照も同様に、BzATP誘導性アポトーシスを阻止した。図19Bを参照されたい。
【０２１８】
e. 細胞増殖に及ぼす効果
DMBA/TPA＋BzATP群の一部の動物における大きながん性病変の発達が、BzATPの細胞分裂促進効果の結果であるかどうかを判定するために、マウス野生型正常ケラチノサイトにおいて、BzATPに応答したDNA合成の速度([3H]-チミジン取り込みの観点から)を測定した。P2X7受容体アンチセンスP2X7オリゴヌクレオチドまたはランダム-対照オリゴヌクレオチドによる前処理、およびBzATPによる処理は、[3H]-チミジン取り込みに有意な影響を及ぼさなかった。図20を参照されたい。
【０２１９】
本データから、正常皮膚におけるBzATPの主な標的は、表皮基底層/傍基底層および毛幹の増殖ケラチノサイトであることが示された。これらのP2X7受容体発現細胞において、BzATPは、炎症変化を誘発することなくアポトーシスを増強した。P2X7欠損正常ケラチノサイト、およびアンチセンスP2X7オリゴヌクレオチドで処理した正常ケラチノサイトにおける実験により、P2X7受容体がBzATPのアポトーシス促進効果の必要なメディエーターであることが示され、BzATPの効果がP2X7媒介性アポトーシスの増強によって媒介されることが示唆される。正常皮膚と同様に、乳頭腫組織におけるBzATPの主な標的は、発達中の乳頭腫の底部にある、P2X7受容体を発現している増殖ケラチノサイトであった。この知見は、マウスDMBA/TPAモデルにおいて、がんに発達するリスクのある乳頭腫は、該乳頭腫の基底層および傍基底層における迅速に増殖しているケラチノサイトによって特徴づけられるという事実に関連している。Glick et al., 「The high-risk benign tumor: evidence from the two stage skin cancer model and relevance for human cancer」 Mol Carcinogenesis 2007, 46:605-610。
【０２２０】
BzATPによる処理によって、DMBA/TPA誘発性乳頭腫の発生率およびそれらのがんへの形質転換が減少したことから、BzATP作用の細胞機構は、悪性形質転換の可能性を有する増殖中の乳頭腫ケラチノサイトのアポトーシスの増強を伴った可能性が高い。正常皮膚と乳頭腫組織との間のBzATP効果の相違の1つは、乳頭腫の発達および成長を阻害しながらも、前者において肉眼的影響が欠如していることであった。このように、正常マウスにおいてBzATPで16週間処理すると、増殖ケラチノサイトではアポトーシスが増加したが、この処理により、強力なアポトーシス促進薬に予測されるような皮膚の菲薄化または潰瘍化は起こらなかった。
【０２２１】
同様に、DMBA/TPA＋BzATP群(30週間のBzATP処理)とDMBA/TPA群の動物の間で、非罹患正常皮膚の形態的および組織学的特徴に有意差は認められなかった。しかしながら、DMBA/TPA＋BzATP群では、アポトーシスの増強が乳頭腫発生の阻害を伴った。正常組織と乳頭腫組織との間のBzATP効果の相違は、それぞれのケラチノサイトの成長速度の差と関連している可能性がある。正常皮膚細胞はゆっくりと成長しており、それらの全成長速度は見かけ上BzATPによって影響を受けない。対照的に、速く増殖している乳頭腫ケラチノサイトでは、BzATP誘導性アポトーシスによって成長が遅延および阻害される。正常マウスにおけるデータから、BzATPによる局所処理が有害な全身作用を引き起こさないことも示され、皮膚に局所適用した場合の該薬物の比較的安全なプロファイルが示唆された。これらのデータから、BzATPが皮膚から基底/傍基底表皮領域および毛幹に吸収されることが示される。本データから、BzATPの主な効果が、迅速に成長している増殖ケラチノサイトを標的化する、適用部位におけるアポトーシスの誘導であることも示唆される。
【０２２２】
3つのアッセイ：インサイチュー免疫反応性、ウェスタンブロット、およびqPCRにより明らかなように、乳頭腫とは対照的に、DMBA/TPA誘発性がん細胞におけるP2X7受容体の発現レベルは低かった。これらの知見は、非黒色腫皮膚がん細胞、子宮がん、膀胱がん、および乳房上皮がんにおいて報告された知見と類似している。Greig et al., 「Expression of purinergic receptors in non-melanoma skin cancers and their functional roles in A431 cells」 J Invest Dermatol 2003, 121:315-327；Li et al., 「The P2X7 Receptor: A novel biomarker of uterine epithelial cancers」 Cancer Epidemiol Biomarkers Preven 2006, 15:1-8；Li et al., 「Decreased expression of P2X7 in endometrial epithelial pre-cancerous and cancer cells」 Gynecol Oncology 2007, 106:233-243；Zhou et al., 「Micro-RNAs miR-186 and miR-150 downregulate expression of the pro-apoptotic purinergic P2X7 receptor by activation of instability sites at the 3'-untranslated region of the gene that decrease steady-state levels of the transcript」 J Biol Chem 2008, 283:28274-28286；およびLi et al., 「P2X7 receptor expression is decreased in epithelial cancer cells of ectodermal, urogenital sinus, and distal paramesonephric-duct origin」 (submitted, 2009)。これらの知見から、がん細胞の迅速な増加は、P2X7受容体の低発現および減弱されたP2X7媒介性アポトーシスに一部起因する可能性があることが示唆される。BzATPによる処理は、低レベルのP2X7受容体を発現しているがん細胞においてさえアポトーシスを増強したが、その効果は正常細胞または乳頭腫細胞よりも小さかった。
【０２２３】
最近まで、P2X7受容体と細胞アポトーシスとの間の関連性についてはほとんど知られてなかった。本明細書に示されるデータから、P2X7受容体誘導性アポトーシスが、P2X7細孔を介するカルシウム流入の増大に依存する可能性があり、おそらくカスパーゼ-9‐ミトコンドリア経路によって媒介され得ることが示唆される。
【０２２４】
本研究における以下の実験的知見は、この仮説を支持する：
(a) BzATPによる処理は、細孔の形成およびカルシウム流入の増大を誘導した；
(b) BzATP誘導性のアポトーシス、細孔形成、および増大されかつ延長されたカルシウム流入は、P2X7受容体の発現に極めて依存した；
(c) BzATP誘導性のアポトーシス、細孔形成、およびカルシウム流入の増大は、BzATPに対する類似の用量依存性を有した；
(d) BzATP誘導性の細孔形成およびカルシウム流入の増大は、BzATPの添加後間もなく(30〜60秒)始まった。対照的に、BzATP誘導性アポトーシスは、遺伝子媒介性の効果と相応して、BzATPによる数時間の処理を必要とした；
(e) BzATP誘導性アポトーシスは、1.2 mMの生理的濃度の細胞外カルシウムの存在、およびカルシウム流入に依存した；ならびに
(f) BzATP誘導性アポトーシスは、カスパーゼ-9およびカスパーゼ-3の阻害剤と共に行う処理によって阻止され得たが、カスパーゼ-8の阻害剤と共に行う処理では阻止され得なかった。
カスパーゼ-3はカスパーゼカスケードの最終段階であるため、本結果の考えられ得る解釈は、P2X7受容体によるアポトーシスはカスパーゼ-9(ミトコンドリアの)経路によって媒介されるというものである。Fawthrop et al., 「Mechanisms of cell death」 Arch Toxicol 1991, 65:437-444；およびSoti et al., 「Apoptosis, necrosis and cellular senescence: chaperone occupancy as a potential switch」 Aging Cell 2003, 2:39-45。まとめると、本明細書に示されるデータから、P2X7受容体のBzATP依存的活性化は、形質膜における細孔の形成を伴うということ、およびP2X7細孔を介するCa2+の促進された無制御な流入が、ミトコンドリアのカスパーゼ-9経路によりアポトーシスを促進するということが示唆される。P2X7細孔は、パネキシンおよびP2X7分子の外部ドメインから構成されるチャネルから形成され、その形成はP2X7受容体/アゴニスト相互作用に依存すると考えられている。Feng et al., 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 2006, 281:17228-17237；Locovei et al., 「Pannexin1 is part of the pore forming unit of the P2X7R death complex」 FEBS Lett 2007, 581:483-488；およびIglesias et al., 「P2X7 receptor-Pannexin1 complex: Pharmacology and signaling」 Am J Physiol Cell 2008, 295:C752-C760。
【０２２５】
本明細書において、乳頭腫ケラチノサイトはP2X7受容体を発現することが示される；したがって、インビボでの乳頭腫細胞におけるP2X7受容体の高い発現レベル、およびBzATPに応答した顕著なアポトーシス効果は、乳頭腫発生に及ぼすBzATPの阻害効果を説明することができる。対照的に、皮膚がん細胞におけるBzATPのより低い効果は、該がん細胞におけるP2X7受容体の低い発現レベルによって説明することができる。現在のところ、新生物への形質転換がP2X7受容体発現を減少させるのか、または既に低レベルのP2X7受容体を発現している細胞において、新生物への形質転換が優先的に引き起こされるのかは、ほとんどわかっていない。前者の可能性は、子宮内膜細胞および膀胱細胞におけるデータによって支持され、この場合、P2X7受容体の低発現は前がん性細胞および早期がん性細胞では既に認められたが、過形成性良性細胞では認められなかった。Li et al., 「Decreased expression of P2X7 in endometrial epithelial pre-cancerous and cancer cells」 Gynecol Oncology 2007, 106:233-243。したがって、発がん過程によって、がん発生の初期段階にP2X7発現が減少した可能性がある。その一方で、低レベルの該受容体を発現している細胞において、新生物への形質転換が優先的に引き起こされるという可能性は、子宮頸部上皮おけるデータによって支持され、この場合、P2X7受容体の低発現が異形成細胞において既に認められている。Li et al., 「The P2X7 Receptor: A novel biomarker of uterine epithelial cancers」 Cancer Epidemiol Biomarkers Preven 2006 15:1-8。子宮頸部異形成症例のごく一部のみががんに進行するため、子宮頸部におけるP2X7受容体の低発現が新生物形質転換に先行する可能性がある。Walboomers et al., 「Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide」 J Pathol 1999, 189:12-19：Raab et al., 「Long-term outcome and relative risk in women with atypical squamous cells of undetermined significance」 Am J Clin Pathol 1999, 112:57-62；およびSong et al., 「Risk factors for the progression or persistence of untreated mild dysplasia of the uterine cervix」 Int J Gynecol Cancer 2006, 16:1608-1613。したがって、P2X7媒介性アポトーシスの抑止が、発がん刺激を受けやすく、新生物形質転換を支持する遺伝的に異常な細胞の保存の原因である可能性がある。Staibano et al., 「Prognostic value of apoptotic index in cutaneous basal cell carcinomas of head and neck」 Oral Oncol 1999, 35:541-547。
【０２２６】
本データは、BzATP処理マウスにおいて、乳頭腫およびがんの形成の部分的阻害(すなわち、例えば、〜50％)しか示さなかった。インビトロ実験では、比較的低用量(すなわち、1μg/cm2 BzATP)を使用した。したがって、より高用量および/またはより頻繁な適用により、サイズおよび頻度の両方において、乳頭腫およびがんの、より大きな阻害が生じ得ると予測される。
【０２２７】
IV. P2X7受容体発現の調節
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体発現を上方制御するための方法を意図する。本発明の機構を理解する必要はないが、そのような受容体発現の上方制御は、P2X7受容体の細胞表面密度を増加させると考えられる。
【０２２８】
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体の細胞表面密度を増加させることにより、がんを治療および/または予防するための方法を意図する。1つの態様において、細胞表面はがん細胞表面を含む。1つの態様において、細胞表面は乳頭腫細胞表面を含む。1つの態様において、P2X7受容体細胞密度の増加はアポトーシスを誘導する。
【０２２９】
A. 活性プロモーター領域の解明
活性プロモーター領域および転写開始部位(TpIS)を規定するため、ヒトP2X7遺伝子の5'領域における1.7 kb DNAセグメントを包含する一連のcDNA断片を作製した。ヌクレオチドは、ヒトP2X7遺伝子(GenBank Y12851)のnt 1683に相当する、その後解明されたTpIS (+1)に対して番号づけした。最初の実験は、-1664/+32 から-53/+32 ntまでの範囲のcDNA断片を含んだ。図28および29Aを参照されたい。cDNA断片をルシフェラーゼベクターに挿入し、P2X7-ルシフェラーゼレポーターを、P2X7の内因性発現を欠いているHEK293細胞にトランスフェクトした。-1664/+32から-158/+32 ntまでの範囲の断片には有意なプロモーター活性が認められたが、それよりも短い断片は有意なプロモーター活性を欠いていた。-1179/-380 ntのcDNA断片は有意なプロモーター活性を欠いており、nt -380よりも上流にはプロモーター活性がほとんどないことが示唆された。最大のプロモーター活性は、-158/+32 nt断片を用いる実験において認められ、本データから、ヒトP2X7遺伝子の活性プロモーターの位置が-158/+32 nt領域にあることが示唆された。図29Aを参照されたい。
【０２３０】
改良5' RACE法を用いて、TpISを解明した。配列決定により、2つの考えられ得るTpISが、その後規定されたTpISの上流に見出された：+1 ntおよび-73 ntにおけるアデニン塩基。図28を参照されたい。この2つを区別するため、TpIS相当領域を、(-1) CATTからGTAAにおよび(-73) AGGGからTATAに変異させた。変異させた領域を有する断片をルシフェラーゼベクターに挿入し、HEK293細胞にトランスフェクトした。結果から、(-73) AGGG→TATA構築物では70％のルシフェラーゼ活性があるが、(-1) CATT→GTAA構築物では30％のルシフェラーゼ活性しかないことが示された。図29Bを参照されたい。
【０２３１】
配列解析から、その後規定されたTpISの上流に位置する2つのTATA様配列も示唆された：-32 ntにおけるTTAAAおよび-102 ntにおけるTTATC。図28を参照されたい。変異解析から、(-32) TTAAA→TCCAA構築物では50％のルシフェラーゼ活性があり、(-102) TTATC→CCATC構築物ではルシフェラーゼ活性に変化がないことが明らかになった。図29Bを参照されたい。まとめると、これらのデータから、+1 nt部位におけるTpISおよび-32 nt部位におけるTATA様配列TTAAAが示唆される。
【０２３２】
B. 転写を阻害する、TpISの遠位にある領域
活性プロモーターの下流にあるヒトP2X7遺伝子(GenBank Y12851)の配列解析から、+26〜+573 nt領域において、シトシン-ホスホジエステル-グアノシン(CpG)ジヌクレチド部位が異常に高濃度であることが明らかになった。わずかに4つのCpG部位を含む-158/+32の190 bp活性プロモーター領域とは対照的に、547 ntのこの領域は20のCpG部位を含む。CpG部位内のシトシンのメチル化の変化が、遺伝子機能を調節することが報告されている。Chen et al., (2006) 「Establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mammals」 Curr Top Microbiol Immunol 301:179-201。したがって、活性プロモーターの下流にある該領域内のCpG部位のメチル化状態の変化は、P2X7転写を調節する可能性がある。図28を参照されたい。
【０２３３】
Fluc/Rlucを用いて測定されるように、断片-158/+573を含む構築物は、-158/+32構築物と比較して転写が低かった。図29C(上パネル)を参照されたい。本データは、エンドポイントとしてFluc/GPDH mRNAを測定することにより再現された。図29C(下パネル)を参照されたい。2つの異なる方法間のデータが類似していることがわかり、それによって、活性P2X7プロモーターの下流の+33〜+573 nt領域内に含まれるシス調節エレメントが転写を阻害し得ることが示される。
【０２３４】
C. P2X7受容体発現およびアポトーシスを増加させる脱メチル化
1. P2X7 mRNAレベルを上昇させるアザ-dC
DNAメチル化の変化がP2X7遺伝子転写を調節するかどうかを判定するため、培養子宮頸部細胞を脱メチル化剤5-アザ-2'-デオキシシチジン(アザ-dC)で処理し、P2X7 mRNA定常状態レベルに及ぼす効果を測定した。実験のため、細胞を、予備実験においてほぼ最大の効果を発揮した1μMアザ-dC(表示せず)で処理した。
【０２３５】
P2X7 mRNA定常状態レベルのベースラインのレベル(CK-18に対する)は、HeLaがん子宮頸部上皮細胞よりも正常hEVEC細胞においてより高く、アザ-dCで処理すると、hEVEC細胞およびHeLa細胞の両方でP2X7 mRNAが増加した。図30Aを参照されたい。その効果は時間に依存し、P2X7 mRNAの増加は処理の18〜24時間後に既に観察された。hEVEC細胞では、P2X7 mRNAのレベルが上昇し続けたのに対し、HeLa細胞では、P2X7 mRNAレベルは24時間後に横ばいとなり、その後低下し始めたが、処理の開始後少なくとも72時間はベースラインと比較して上昇したままであった。
【０２３６】
2. P2X7タンパク質レベルを上昇させるアザ-dC
P2X7タンパク質に及ぼすアザ-dCの効果を、抗P2X7抗体に対する細胞免疫反応性の変化の観点から判定した。未処理のhEVEC細胞では、抗P2X7受容体抗体による染色により、均一なP2X7免疫反応性が明らかになった。図30B、挿入図を参照されたい。さらに、1μMアザ-dCで48時間処理すると、P2X7免疫反応性は有意に増加した。HeLa細胞においても、同様の効果が認められた(データは表示せず)。アザ-dC処理細胞におけるP2X7免疫蛍光密度の画像解析から、hEVEC細胞およびHeLa細胞の両方について、処理の48時間後に、P2X7免疫反応性が2倍増加したことが明らかになった。図30Bを参照されたい。
【０２３７】
3. P2X7媒介性アポトーシスを増加させるアザ-dC
ベースラインのアポトーシスは、HeLa細胞よりもhEVEC細胞において2倍高かった。P2X7受容体特異的アゴニストBzATPで処理すると、hEVEC細胞ではアポトーシスは2.5倍増加したが、この処理はHeLa細胞には有意な効果を及ぼさなかった。Aza-dCで処理すると、hEVEC細胞ではベースラインのアポトーシスは穏やかに増加し、HeLa細胞ではベースラインのアポトーシスが有意に(2倍)増加した。Aza-dCで前処理し、BzATPと共に処理したhEVEC細胞では、BzATPのみで処理した細胞よりも多くのアポトーシスが起こったが、その効果は穏やかであった。図30Cを参照されたい。
【０２３８】
対照的に、Aza-dCで前処理し、BzATPと共に処理したHeLa細胞では、BzATPのみで処理した細胞よりも2.5倍多くのアポトーシスが起こり、アポトーシスの程度は、同様の条件下でhEVEC細胞において観察されたものとほぼ同じであった。図30Cを参照されたい。本発明の機構を理解する必要はないが、Aza-dCが、おそらくはP2X7 mRNAレベルおよびP2X7タンパク質受容体レベルの発現を上方制御することにより、正常およびがんの子宮頸部細胞をBzATPのアポトーシス促進効果に、より感受性にしたと考えられる。
【０２３９】
アポトーシス自体がP2X7 mRNAの増加を促進し得るのかどうかを判定するため、hEVEC細胞およびHeLa細胞を無血清培地中で14時間インキュベートした。Wang et al., (2005) 「EGF facilitates epinephrine inhibition of P2X7-receptor mediated pore formation and apoptosis: a novel signaling network」 Endocrinology 146:164-174。結果(表示せず)から、hEVEC細胞およびHeLa細胞におけるP2X7 mRNA定常状態レベルは、血清欠乏細胞および血清曝露細胞において同様であることが示された。
【０２４０】
D. P2X7遺伝子のメチル化状態
メチル化状態の変化がP2X7転写に及ぼす影響を、ルシフェラーゼP2X7 -158/+32レポーター構築物および/またはルシフェラーゼP2X7 -158/+573レポーター構築物をトランスフェクトしたHEK293細胞において評価した。過剰メチル化アッセイは、トランスフェクション前の、試験プラスミドとCpG-メチラーゼM.SssIとのインキュベーションを伴い、脱メチル化アッセイは、トランスフェクトした細胞をアザ-dCで処理することにより行った。
【０２４１】
過剰メチル化は、ルシフェラーゼP2X7 -158/+32レポーター構築物またはルシフェラーゼP2X7 -158/+573レポーター構築物のいずれかをトランスフェクトしたHEK293細胞において、ルシフェラーゼmRNAレベルに有意な影響を及ぼさなかった。図31を参照されたい。-158/+32 nt構築物を発現する細胞では、アザ-dCによる処理によって誘導された脱メチル化もまた、ルシフェラーゼmRNAレベルに有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、-158/+573 nt構築物を発現する細胞では、アザ-dCによりルシフェラーゼmRNAレベルが2倍上昇した。図31を参照されたい。
【０２４２】
メチル化状態は、非特異的なプロモーター調節因子ではない可能性がある。例えば、CK-18およびGAPDH mRNA定常状態レベルに及ぼす脱メチル化および過剰メチル化の影響を測定したところ、アザ-dCによるその後の処理は定常状態レベルに有意な影響を及ぼさなかった(データは表示せず)。同様に、ルシフェラーゼP2X7 -158/+32レポーターまたはルシフェラーゼP2X7 -158/+573レポーターのいずれかをトランスフェクトしたHEK293細胞においても、脱メチル化アッセイおよび過剰メチル化アッセイは、GAPDH mRNAの定常状態レベルに有意に影響しなかった(データは表示せず)。
【０２４３】
まとめると、これらのデータは、活性P2X7プロモーターの下流領域が、DNAのメチル化を調節することによって転写を調整していることを示唆している。
【０２４４】
E. CpG部位およびP2X7遺伝子メチル化状態
1. P2X7転写を阻害する下流のCpG部位
ルシフェラーゼベクターに挿入したcDNA断片を用いて、活性P2X7プロモーター(nt -158/+32)の下流にある547 nt領域内のCpG部位を評価した。例えば、P2X7-ルシフェラーゼレポーターをHEK293細胞にトランスフェクトし、P2X7転写をルシフェラーゼ活性の観点から測定した。図32を参照されたい。
【０２４５】
断片-158/+221におけるルシフェラーゼ活性は低く、活性プロモーター単独(nt -158/+32)の活性と比較して約10％であった。断片-158/+232におけるルシフェラーゼ活性はより高く、活性プロモーターと比較して約75％であった。断片-158/+337および-158/+402におけるルシフェラーゼ活性は、断片-158/+232よりもそれぞれ25％および50％だけ低かった。断片-158/+470および-158/+503におけるルシフェラーゼ活性は、断片-158/+232における活性と同様であった。断片-158/+573におけるルシフェラーゼ活性は低く、断片-158/+32(活性プロモーター)における活性の約10％であった。図32Aを参照されたい。
【０２４６】
プロモーターの下流にある547 nt領域内のCpG部位がP2X7転写に影響を及ぼすかどうかを判定するため、選択されたCpG部位を変異させた。図32Bを参照されたい。以下の変異によって、ルシフェラーゼ活性が有意に増加した：+211/+212 (CG/AA)、+257/+258 (CG/TT)、+278/+279 (CG/TT)、+319/+320 (CG/AT)、+330/+331 (CG/AT)、+424/+425 (CG/TT)、+453/+454 (CG/TT)、および+461/+464 (CGCG/ATTA)。これらのデータから、CpG +211/+212、+257/+258、+278/+279、+319/+320、+330/+331、+424/+425、+453/+454、および2つのCpG複合体+461/+464が、P2X7転写を阻害することが示唆される。
【０２４７】
2. 下流のP2X7 CpG部位の構成的過剰メチル化
活性P2X7プロモーターの下流のCpGリッチな547 nt領域は、メチル化状態の変化に基づいて転写を調節し得る。547 nt領域内の選択されたCpG部位内のシトシンのメチル化状態を、i) 正常な培養ヒト子宮頸部上皮細胞；ii) がん性の培養ヒト子宮頸部上皮細胞；iii) 正常な生検切除ヒト子宮頸部上皮組織；およびiv)がん性の生検切除ヒト子宮頸部上皮組織において測定した。
【０２４８】
アザ-dC処理したHeLa細胞から関心対象のcDNAセグメント(すなわち、例えば、セグメント1〜3)を作製し、ゲノムDNA亜硫酸水素塩変換法、ならびにその後の遺伝子特異的PCRおよび制限酵素切断により解析した。増幅されたセグメントを制限酵素で切断して、CpG部位の潜在的メチル化感受性シトシンを検出した。+193/+194およびまたは+211/+212部位(セグメント-1)、ならびに+330/+331部位(セグメント-2)はMaeIIで切断し、+461/+462およびまたは+463/+464部位(セグメント-3)はBstUIで切断した。図28を参照されたい。
【０２４９】
アザ-dCによる脱メチル化により、全3つのセグメントにおいて、CpG部位における制限酵素切断は減少した。デンシトメトリースキャンにより、CpG部位における切断の程度(非切断＋切断バンドに対する切断バンドのデンシトメトリーの比率[％]の観点から規定)が、セグメント-1では22％から5％に；セグメント-2では65％から43％に；およびセグメント-3では48％から22％に減少したことが示された。これらのデータから、アザ-dCが、547 bp領域のCpG部位内のシトシンの脱メチル化を誘導したことが示唆され、使用した方法の妥当性が確認された。図33Aを参照されたい。
【０２５０】
インビトロにおいてCpGメチラーゼSssIで処理したヒト胎盤ゲノムDNAを、陽性対照として使用した。図33Bを参照されたい。一定分量の胎盤DNAを様々な量のSssIと混合し、メチル化の程度をCpG部位における切断の観点から判定した。メチラーゼSssIの非存在下におけるメチル化の程度は小さかったが、メチル化の程度は、反応混合物中の胎盤DNAに対するSss1の量に関して用量依存様式で増加した。図33Aと図33Bを比較されたい。
【０２５１】
そのようなCpG部位内のシトシンのメチル化状態を、インビトロの培養正常ヒト子宮頸部細胞とがんヒト子宮頸部細胞との間で、およびインビボでの正常ヒト子宮頸部上皮組織とがんヒト子宮頸部上皮組織との間で比較した。それぞれ図33C〜Eおよび図33F〜Iを参照されたい。結果から、培養正常上皮子宮頸部細胞よりも培養がん細胞において、切断の程度がより大きいことが明らかになった。子宮組織横断切片からマイクロダイセクションによって得られた標本を用いて、ヒト子宮頸部上皮組織において同様の実験を行った。実験では、各症例において正常組織および扁平上皮がん組織を含む、10名の患者に由来する対をなす標本を使用した。セグメント1および3に関しては9症例で、ならびにセグメント2に関しては8症例で、十分な量の組織が利用可能であった。これらの結果からもまた、正常組織よりもがん組織において切断の程度がより大きいことが示された。図33F〜Hを参照されたい。
【０２５２】
培養子宮頸部細胞におけるデータの半定量的解析から、正常細胞よりもがん細胞において、全3つのセグメントにおいて、切断画分の程度が5〜10倍高いことが示された。表6を参照されたい。
【０２５３】
（表６）培養がん子宮頸部細胞および培養正常子宮頸部細胞における、P2X7活性プロモーターの下流のCpG部位+193/+194(および/または+211/+212)(セグメント1)；+330/+331(セグメント2)；および+461/+462(および/または+463+464)(セグメント-3)における切断画分の程度(非切断＋切断バンドに対する切断バンドのデンシトメトリーの比率[％]の観点から)(3〜4回の実験の平均値±SD)。*‐P＜0.01。
2013503868.tif 000003
これらのデータから、正常子宮頸部細胞よりもがん子宮頸部細胞において、試験したCpG部位におけるシトシンの過剰メチル化の程度がより大きいことが示唆される。インビボでの子宮頸部上皮組織においても、同様の傾向が得られた。正常組織およびがん組織における[切断]/[非切断＋切断]画分のデンシトメトリー比率は、同一患者から得られた。本結果から、セグメント-1の8/9症例(p＜0.05)；セグメント-2の7/8症例(p＜0.01)、およびセグメント-3の8/9症例(p＜0.05)において、対応する正常組織よりもがん症例において切断画分の程度がより大きいことが示された。図33Iを参照されたい。
【０２５４】
まとめると、これらのデータから、培養子宮頸部細胞およびインビボでの子宮頸部において、活性P2X7プロモーターの下流にある547 bp領域内のCpG部位+193/+194(およびまたは+211/+212)、+330/+331、および+461/+462(およびまたは+463/+464)内のシトシンが、正常上皮細胞よりもがん細胞においてより高い程度まで過剰メチル化されることが示唆される。
【０２５５】
F. エンハンサー領域のDNA-タンパク質結合部位
本明細書に示されるデータから、P2X7プロモーターエンハンサー領域が転写調節因子と結合し得ることが実証される。さらに、転写活性のCpG部位過剰メチル化状態による媒介が、エンハンサー領域の近接性によって説明され得る。本明細書に記載されるような4つの増幅断片を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用いて、活性P2X7プロモーターの下流の547 bp領域内のnt +222/+232および+401/+573を含むがこれらに限定されない推定P2X7エンハンサー領域が、タンパク質結合部位を含むことが示された。表4を参照されたい(下記参照)。EMSAにより、+217/+237断片中の第1シフトバンド；+401/+530断片中の第2シフトバンド；ならびに+401/+573断片中の第3、第4、第5、および第6シフトバンドが同定された。図34を参照されたい。(図7)。これらのデータから、+217/+237および+476/+573領域におけるDNA-タンパク質複合体の存在が示される。
【０２５６】
G. メチル化CpG領域に結合するP2X7発現調節タンパク質
1つの態様において、本発明は、P2X7受容体遺伝子エンハンサー領域に結合し得る化合物を投与し、エンハンサー領域がP2X7受容体発現を増加させることにより、がんを治療および/または予防する方法を意図する。1つの態様において、P2X7遺伝子はエンハンサー領域(すなわち、例えば、+222/+232)を含む。1つの態様において、該化合物はP2X7受容体発現調節タンパク質を調節する。1つの態様において、調節タンパク質は、p300、Elk-1、E47、E11aE、E2F、またはp53を含むがこれらに限定されない群より選択され得る。1つの態様において、推定エンハンサー領域+222/+232の配列は、p300、Elk-1、E47、E11aE、E2F、またはp53を含むがこれらに限定されない群より選択される調節タンパク質の結合部位を含む。
【０２５７】
P300は、ヒストンをアセチル化し、エンハンサー領域とプロモーター領域からのシグナル伝達を統合することによって、転写を促進することが報告されている。Li et al., (2002) 「Acetylation of p53 inhibits its ubiquitination by Mdm2」 J Biol Chem 277:50607-50611。Elk-1は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路の活性化に応答したリン酸化により、転写を調節することが報告されている。Yang et al., (2006) 「Convergence of the SUMO and MAPK pathways on the ETS-domain transcription factor Elk-1」 Biochem Soc Symp 73:121-129。E47は、E2A遺伝子によってコードされるE2タンパク質ファミリーのメンバーであることが報告されており、細胞の発生および分化を調節し得る。例えば、E47活性の抑制または不在は、がんの発生に結びつけられている。Yang et al., (2008) 「E47 controls the developmental integrity and cell cycle quiescence of multipotential hematopoietic progenitors」 J Immunol 181:5885-5894。推定P2X7エンハンサー領域+401/+573の配列のバイオインフォマティクス解析により、p300、Elk-1、およびE47、ならびにEIIaE、E2F、およびp53の推定結合部位が明らかになった。EIIaEおよびE2FはまたEタンパク質ファミリーのメンバーであり、いずれも細胞周期進行を制御し、E2F-1の過剰発現はアポトーシスを活性化し得る。Mathis et al., (1981) 「Specific in vitro initiation of transcription on the adenovirus type 2 early and late EII transcription units」 Proc Natl Acad Sci USA 78:7383-7387；Hamel et al., (1992) 「Transcriptional repression of the E2-containing promoters EIIaE, c-myc, and RB1 by the product of the RB1 gene」 Mol Cell Biol 12:3431-3438；Zheng et al., (1999) 「Structural basis of DNA recognition by the heterodimeric cell cycle transcription factor E2F-DP」 Genes Dev 13:666-674；およびPardee et al., (2004) 「Regulation in S phase by E2F」 Cell Cycle 3:1091-1094。
【０２５８】
P53腫瘍抑制転写因子は、細胞周期進行および細胞死の調節に関与する遺伝子の発現において役割を果たすと考えられている。Laptenko et al., (2006) 「Transcriptional regulation by p53: one protein, many possibilities」 Cell Death and Differentiation 13:951-961。さらに、P2X7受容体の活性化とp53アポトーシス経路との間、および/またはP2X7受容体の発現上昇とp53タンパク質レベルとの間に関連性がある可能性がある。Schulze-Lohoff et al., (1998) 「Extracellular ATP causes apoptosis and necrosis of cultured mesangial cells via P2Z/P2X7 receptors」 Am J Physiol 275:F962-F971；およびTurner et al., (2007) 「Increased expression of the pro-apoptotic ATP-sensitive P2X7 receptor in experimental and human glomerulonephritis」 Nephrol Dial Transplant 22:386-395。
【０２５９】
本明細書に示されるデータから、推定エンハンサー+222/+232および+401/+573領域が構成的メチル化CpGと共に局在するか、または該推定エンハンサー領域に構成的メチル化CpGが隣接していることが示される。本発明の機構を理解する必要はないが、阻害性CpGと推定エンハンサーの結合部位との関連性から、過剰メチル化CpGが、エンハンサー転写因子とそれらの同族DNA結合ドメインとの相互作用を調節することによってP2X7転写を阻害するような遺伝子発現調節機構が示唆されると考えられる。結果として、さらに、これらのCpGの脱メチル化によってP2X7転写が増加すると考えられる。
【０２６０】
1つの態様において、本発明は、P2X7転写調節を調節することにより、がんを治療および予防するための方法を意図する。図27を参照されたい。P2X7受容体の転写は、転写因子の結合部位を含む、活性P2X7プロモーターの下流のnt +222/+232および+401/+573に位置するシスエンハンサーエレメントによって調節され得る。P2X7受容体の転写は、エンハンサーに隣接するメチル化CpG部位+193/+194(および/または+211/+212)、+330/+331、および+461/+462(および/または+463+464)によって負に制御される。-158/+573 nt構築物を発現する細胞における転写は、活性プロモーター(nt -158/+32)を発現する細胞における転写と比較してより低いため、本データから、ベースラインの条件下では、推定阻害因子の効果が推定エンハンサーの効果を上回ることが示唆される。
【０２６１】
本データから、細胞が、P2X7受容体の発現および活性を調節して、不必要なアポトーシスを回避するための機構を設けた可能性があることが実証される。例えば、P2X7プロモーターの下流の転写のエンハンサーは、隣接する過剰メチル化CpG部位によって制御され得る。さらに、P2X7転写物が、マイクロRNAの作用によって転写後に分解され得ることが報告されている。Zhou et al., (2008) 「Micro-RNAs miR-186 and miR-150 downregulate expression of the pro-apoptotic purinergic P2X7 receptor by activation of instability sites at the 3'-untranslated region of the gene that decrease steady-state levels of the transcript」 J Biol Chem 283:28274-28286。本発明の機構を理解する必要はないが、がん細胞におけるCpGの過剰メチル化によるP2X7受容体の発現低下を説明する仮説は、i) がん過程の二次的なものであり得る；またはii) アポトーシスが無効になったことによって細胞ががんを発生しやすくなるというように、発がん刺激に先行し得ると考えられる。
【０２６２】
要約すると、本明細書に示されるデータから、P2X7転写は、活性プロモーターの下流の547 nt領域内に位置する2群の方向依存的シス調節エンハンサー(すなわち、例えば、セグメント+222/+232および+403/+573)によって調節され得ることが示唆される。1つの態様において、調節エンハンサーは、共に局在またはクラスター化するCpG部位を含む。1つの態様において、CpG部位は阻害性シスエレメントを含む。本発明の機構を理解する必要はないが、阻害性シスエレメントは、シトシン過剰メチル化の量により調節され得ると考えられる。1つの態様において、P2X7遺伝子内の子宮頸部細胞CpG部位には、+211/+212、+330/+331、および+461/+464が含まれるが、これらに限定されない。1つの態様において、子宮頸部細胞CpG部位は、正常子宮頸部細胞よりもがん細胞においてより高い程度まで過剰メチル化されている。本発明の機構を理解する必要はないが、そのようなCpG過剰メチル化の増加がP2X7受容体発現の減少をもたらし、それによって細胞アポトーシスが減少すると考えられる。
【０２６３】
要約すると、上記のデータから以下のことが示唆される：
・P2X7受容体の発現低下はアポトーシスの割合の減少を伴い、それによって細胞ががんを発生しやすくなる可能性がある。
・P2X7転写は、活性プロモーターの下流の547 nt領域(+26/+573)内に位置するエンハンサー領域によって調節され得る。
・P2X7転写は、クラスター化するおよび/またはエンハンサー部位と共に局在するCpG部位におけるシトシンの過剰メチル化状態により制御され得る。
・例えば子宮頸部がん細胞といった上皮がん細胞におけるP2X7受容体の低発現は、隣接するCpG部位の過剰メチル化状態の増加による転写エンハンサー(すなわち、例えば、プロモーターの下流の547 nt領域内に位置するエンハンサー)の阻害によって一部決定され得る。
【０２６４】
V. P2X7受容体アゴニストの投与
P2X7受容体アゴニストは、これらの化合物を対象に送達するのに適した任意の手段によって対象に投与することができる。例えば、P2X7受容体アゴニストは、腸内または非経口投与経路に適した方法によって投与することができる。本発明に適した腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれるが、これらに限定されない。適切な非経口投与経路には、血管内投与(すなわち、例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および脈管構造へのカテーテル設置)；組織周囲および組織内注射(すなわち、例えば、腫瘍周囲および腫瘍内注射、網膜内注射、または網膜下注射)；皮下注入(すなわち、例えば、浸透圧ポンプによる)を含むがこれに限定されない、皮下注射または沈着；例えばカテーテルまたは他の留置装置(すなわち、例えば、網膜ペレット、または坐薬、または多孔性物質、非多孔性物質、もしくはゼラチン状物質を含むインプラント)による、関心対象の組織への直接適用；および吸入が含まれるが、これらに限定されない。別の投与経路には、腫瘍への直接的な注射および/または注入が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６５】
リポソームは、P2X7受容体アゴニストを対象に送達するために用いられる。リポソームは、遺伝子産物または核酸の血中半減期を延ばすこともできる。本発明において使用するのに適したリポソームは、標準的な小胞形成性脂質から形成することができ、これには一般に中性または負に荷電したリン脂質、およびコレステロールなどのステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、所望のリポソームサイズおよび血流内でのリポソームの半減期などの要因を考慮することにより左右される。リポソームを調製するために、様々な方法を用いることができる。Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)；および米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、および第5,019,369号、これらの開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６６】
本方法に使用するためのリポソームは、リポソームががん細胞を標的とするようなリガンド分子を含み得る。腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体のような、がん細胞に広く認められる受容体に結合するリガンドが好ましい。
【０２６７】
本方法に使用するためのリポソームを、単核性マクロファージ系(「MMS」)および網内系(「RES」)による排除を回避するように修飾することもできる。このような修飾リポソームは、表面上に、またはリポソーム構造に取り込まれた、オプソニン作用阻害成分を有する。1つの態様において、本発明のリポソームはオプソニン作用阻害成分およびリガンドの両方を含み得る。
【０２６８】
本発明のリポソームの調製に使用するためのオプソニン作用阻害成分は、典型的には、リポソーム膜に結合している大きな親水性ポリマーである。本明細書で用いる場合、オプソニン作用阻害成分は、例えば脂溶性アンカーの膜自体への挿入により、または膜脂質の活性基に直接結合することにより、それが化学的または物理的に膜と付着している場合に、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン作用阻害性親水性ポリマーは、MMSおよびRESによるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形成する。米国特許第4,920,016号の開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６９】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害成分は、好ましくは、約500〜約40,000ダルトン、およびより好ましくは約2,000〜約20,000ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。このようなポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)の誘導体；例えば、メトキシPEGまたはメトキシPPG、およびPEGステアリン酸またはPPGステアリン酸；ポリアクリルアミドまたはポリN-ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直線状、分枝状、またはデンドリマー状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；カルボキシル基またはアミノ基が化学的に結合しているポリアルコール、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドGM1などのガングリオシドが含まれるが、これらに限定されない。PEG、メトキシPEG、もしくはメトキシPPG、またはそれらの誘導体のコポリマーも適している。加えて、オプソニン作用阻害ポリマーは、PEGと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであってもよい。オプソニン作用阻害ポリマーはまた、アミノ酸もしくはカルボン酸、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナンを含む天然多糖；アミノ化多糖もしくはオリゴ糖(直線状または分岐状)；または、例えばカルボン酸の誘導体との反応の結果としてカルボキシル基と結合した、カルボキシル化多糖もしくはオリゴ糖であってもよい。好ましくは、オプソニン作用阻害成分は、PEG、PPG、またはそれらの誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは、「PEG化リポソーム」と称される場合がある。
【０２７０】
オプソニン作用阻害成分を、リポソーム膜に結合させることができる。例えば、PEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル-エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Na(CN)BH3、および例えば60℃の30:12比のテトラヒドロフランと水のような溶媒混合液を使用する還元的アミノ化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０２７１】
オプソニン作用阻害成分で修飾されたリポソームは、修飾されていないリポソームよりも循環血液中にはるかに長く留まる。この理由から、このようなリポソームは「ステルス」リポソームと称される場合がある。ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」微小血管系によって供給され、組織に蓄積することが知られている。したがって、このような微小血管系の欠陥を特徴とする組織、例えば固形腫瘍には、これらのリポソームが効率良く蓄積する。Gabizon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 18:6949-6953 (1988)。加えて、RESによる取り込みの減少は、肝臓および脾臓へのリポソームの著しい蓄積を防ぐことにより、ステルスリポソームの毒性を減少させる。したがって、オプソニン作用阻害成分で修飾されたリポソームは、miRNA遺伝子産物またはmiRNA遺伝子発現阻害化合物(またはこれらをコードする配列を含む核酸)を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０２７２】
VI. P2X7受容体アゴニストの薬学的製剤
P2X7受容体アゴニスト化合物は、好ましくは、対象に投与する前に、場合によっては「医用薬剤」と称される薬学的組成物として製剤化される。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌であり、かつ発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で用いられる「薬学的製剤」には、ヒトおよび獣医学使用のための製剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されている。
【０２７３】
本発明によって意図される薬学的製剤は、薬学的に許容される担体と混合された、少なくとも1つのP2X7受容体アゴニスト(例えば、0.1〜90重量％)、または薬学的に許容されるその塩を含む。本発明の薬学的製剤はまた、リポソームおよび/または薬学的に許容される担体によって封入され得る少なくとも1つのP2X7受容体アゴニストを含み得る。1つの態様において、薬学的組成物は、BzATPを含むがこれに限定されないP2X7受容体アゴニストを含む。薬学的に許容される好ましい担体は、水、緩衝水、生理食塩水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０２７４】
本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および/または添加剤を含み得る。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびpH調整剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のある緩衝液(例えば、トロメタミン塩酸塩)、キレート剤(例えば、DTPAまたはDTPA-ビスアミドなど)もしくはカルシウムキレート錯体(例えば、カルシウムDTPA、CaNaDTPA-ビスアミドなど)の添加物、または任意にカルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加物(例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム)が含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物は、液体形態で使用するために包装することができ、または凍結乾燥することもできる。
【０２７５】
本発明の固体の薬学的組成物には、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される従来の非毒性固体担体を用いることができる。
【０２７６】
例えば、経口投与のための固体の薬学的組成物は、上記の担体および賦形剤のいずれか、ならびに10〜95％、好ましくは25％〜75％の、少なくとも1種のP2X7受容体アゴニストを含み得る。エアロゾル(吸入)投与のための薬学的組成物は、上記のようなリポソーム中に封入される0.01〜20重量％、好ましくは1〜10重量％の、少なくとも1種のP2X7受容体アゴニスト、および噴霧剤を含み得る。必要に応じて、担体、例えば鼻腔内送達ではレシチンを含めることもできる。
【実施例】
【０２７７】
実験
化学物質はすべて、他に特に規定のない限り、Sigma Chemical(St. Louis, MO)から入手した。免疫染色およびウェスタンブロット用の一次抗体は、以下の通りであった：機能的全長P2X7受容体を認識するウサギポリクローナル抗P2X7受容体抗体は、Alomone Laboratories(Jerusalem, Israel)による；ウサギ抗GAPDH抗体は、BD Transduction Laboratories(Lexington, KY)による。二次抗体は、ヤギ抗ウサギAlexa Fluro抗体(Invitrogen)であった。Leu-Glu-His-Asp-O-メチル-フルオロメチルケトン(LEHD-FMK；SEQ ID NO:1)、Ile-Glu-Thr-Asp-O-メチル-フルオロメチルケトン(IETD-FMK：SEQ ID NO: 2)、ベンジルオキシ-バリン-アラニン-アスパラギン酸-O-メチル-フルオロメチルケトン(zVAD-FMK：SEQ ID NO: 3)、およびAsp-Glu-Val-Asp-O-メチルフルオロメチルケトン(DEVD-FMK：SEQ ID NO: 4)はCalbiochem La Jolla, CA)によるものであり、50μMの濃度で使用した。
【０２７８】
実施例I
ヒトケラチノサイトの細胞培養およびトランスフェクション
ヒト正常ケラチノサイトの初代培養物は、廃棄された包皮から作製した。承認されたIRBプロトコール08-06-28に従って、Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital CASE Medical Centerの新生児室において、男性新生児の非儀式的な割礼後に組織を入手した。ヒト表皮扁平上皮がん-9(SCC-9)細胞およびメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞(MDCK、株II)は、ATCCから入手した。MDCK細胞はP2X7受容体の内因性発現を欠いており、異種トランスフェクション発現実験には、テトラサイクリン調節性リプレッサーを発現するMDCK細胞(Feng et al, 2006)を使用した。
【０２７９】
MDCK細胞におけるP2X7受容体の誘導発現のために、N末端に結合させたMycタグを含むヒトP2X7遺伝子(NM_002562)を、Hind IIIおよびNot I部位を有するpcDNA4/TOベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。プライマー、トランスフェクションの方法、および安定なMDCKクローンの作製を記述した(Feng et al, 2006)。安定なクローンは、テトラサイクリン不含培地および100μg/ml zeosin中で維持した。Myc-P2X7遺伝子の発現を100 ng/mlドキシサイクリンにより誘導し、安定なMDCK細胞におけるMyc-P2X7タンパク質の発現をRT-PCRにより確認した(Feng et al, 2006)。細胞培養物は、記載される通りに維持した(Wang et al, 2005；Feng et al, 2006；Li et al, 2006；Li et al, 2007)。
【０２８０】
実施例II
タンパク質アッセイ
免疫染色およびウェスタンブロットを記述した(Wang et al, 2005；Feng et al, 2006；Li et al, 2006；Li et al, 2007)。ヒト由来細胞(ケラチノサイトおよびSCC-9)およびMDCK細胞を用いるアッセイでは、ウサギポリクローナル抗P2X7受容体抗体(Alomone Laboratories、Jerusalem, Israel)；マウス抗c-Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz, CA)；マウス抗E-カドヘリン抗体(Invitrogen、http://www.invitrogen.com)；および抗チューブリン抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa、Iowa City, IAによる)を使用した。マウス組織を用いるアッセイでは、ウサギ抗P2X7受容体抗体、ウサギポリクローナル抗Ki67抗体(Dako、http://www.dako.com)、およびヤギ抗ウサギAlex Fluro 546二次抗体(Invitrogen)を使用した。
【０２８１】
免疫蛍光データの画像解析を記述した(Li et al, 2007)。代表的な視野を捉え、Adobe Photoshopに保存した。各画像につき代表的な視野を3〜5つ選択することにより、UN-SCAN-IT(Silk Scientific、Orem UT)を用いて画像をスキャンした。プログラムソフトウェアを用いて、各視野における光強度をデジタル化し、視野当たりの平均画素密度を決定した。
【０２８２】
共焦点レーザー顕微鏡観察を記述した(Feng et al, 2005)。簡潔に説明すると、MDCK細胞を35-mmガラス底培養ディッシュ(MatTek Corporation、Ashland, MA)にプレーティングした。細胞を抗P2X7受容体抗体で免疫染色し、インサイチューで平面画像および垂直画像を得た。
【０２８３】
実施例III
P2X7 mRNAインサイチューハイブリダイゼーション
全長P2X7 cDNA鋳型のアンチセンスプローブおよびセンスプローブ用のプライマーを記述した(Li et al, 2006)。アッセイのために、培養細胞をポリリジン被覆カバーガラス上にプレーティングし、サブコンフルエンスになるまで培養液中で培養した。Nikon Eclipse 80i顕微鏡(Melville, NY)を用いて、染色を評価した。
【０２８４】
実施例IV
リアルタイムPCR
全RNAをRNeasyミニキット(QIAGEN、Valencia, CA)によって抽出し、記載されている通りに一段階リアルタイムqPCRを行った(Li et al, 2006；Li et al, 2007)。P2X7、E-カドヘリン、およびサイトケラチン-18(CK-18)(データの正規化のために使用)のプライマー、ならびにPCR条件を記述した(Li et al, 2006；Li et al, 2007)。記載されている通りに、Ctの観点から相対定量(RQ)を算出した(Li et al, 2006; Li et al, 2007)。
【０２８５】
実施例V
ATPアッセイ
細胞をプレート上で培養し、300μl量のリンゲル液中で維持した。安定化の20分後に、分割量50μlの馴化培地を回収し、記載されている通りに、ホタルルシフェラーゼ-ルシフェリンと関連した化学発光法によりアッセイした(Wang et al, 2004a)。気泡を形成させたリンゲル液を、バックグラウンドATPを測定するためのブランクとして使用し、培地中のATPは、ATP濃度が判明している試料の検量線から決定した。ATPの検出下限は0.25 nMであった。
【０２８６】
実施例VI
アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、可溶化DNAの割合の観点から(Wang et al, 2004a)、または市販の細胞死検出ELISAキット(Roche Applied Science、Nutley, NJ)を用いることにより(Feng et al, 2006)、定量化することができる。
【０２８７】
組織横断切片でのTUNELアッセイは、製造業者のプロトコールに従ってDeadEnd(商標) 蛍光定量的TUNELシステム(Promega、Madison, WI)を用いて行った。TUNEL-P2X7共染色に関しては、組織横断切片を最初にTUNELについてアッセイし、その後P2X7免疫染色した。改良された組み合わせ方法により、無視できるほどの交差蛍光干渉しか生じなかった。
【０２８８】
培養マウスケラチノサイトのアポトーシスは、可溶化DNAの割合の観点から、または市販の細胞死検出ELISAキット(Roche Applied Science、Nutley, NJ)を用いることにより定量化した。それぞれ、Wang et al., 「P2X7-receptor mediated apoptosis of human cervical epithelial cells」 Am J Physiol 2004, 287:C1349-C1358；およびFeng et al., 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 2006, 281:17228-17237。
【０２８９】
実施例VII
P2X7アンチセンスオリゴヌクレオチド
以前に記載された方法を用いて、ヒトP2X7遺伝子(NM_002562)の公開された配列から、P2X7特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)およびランダム対照オリゴヌクレオチド(RCO)を設計した。Zhu et al, 2006。エキソン7(nt 724〜741)のコード領域にハイブリダイズする20merASO、およびRCOの配列は、以下の通りであった：
2013503868.tif 000004
。RCOでは、オリゴヌクレオチドがASOと同じ長さ(20mer)および同じGC含量(33％)を有するように、アンチセンス配列をアデニンおよびチミン残基でランダムに置換した。RCOは、P2X7遺伝子に対するクロスハイブリダイゼーションが起こらないように設計した。P2X7 mRNA発現に及ぼすASOおよびRCOの影響を評価するため、培養細胞を10μM濃度のASOまたはRCOで、またはこれらなしで処理した。2日後にqPCRアッセイを行い、3日後にウェスタンブロットおよびアポトーシス測定を行った。
【０２９０】
実施例VIII
動物実験
本実施例では、インビボにおいて、P2X7媒介性アポトーシスの薬理学的活性化ががん発生をどの程度まで阻害し得るかを評価する。[55]。
【０２９１】
本実験系は、齧歯類およびヒトの両方において、P2X7系がケラチノサイトの成長の制御において重要な役割を果たすという理論的根拠に基づいた、マウス皮膚がんモデルであった[45-49,55]。皮膚病変は2段階の手順により誘導し、これは、7,12-ジメチル-ベンズ(a)アントセラン(DMBA)による腫瘍の開始、および12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート(TPA)による腫瘍の促進を伴う。図23Aを参照されたい。DMBAおよびTPAを、マウスの剪毛した背面皮膚に局所適用した。対照動物は、DMBA/TPAまたはBzATPのみのいずれかで処理した。処理の28週間後(DMBA/TPA群およびDMBA/TPA＋BzATP群について)または4週間後および16週間後に(BzATP群のみについて)、データを評価した。
【０２９２】
マウスを用いる実験は、承認されたCWRU IACUC IRBプロトコール[2006-0141]に従って行った。実験では、6〜8週齢FVB雌マウス(Charles River、Wilmington, MAから入手)を使用した。Oster動物クリッパー(Mountain Home, AR)を用いて動物の背面皮膚(約3×5 cm)を剪毛した後、Nair(登録商標) 脱毛ローションを毎週適用した。処理は、剪毛した背面皮膚に以下の薬物を1回または複数回直接適用することを含んだ：DMBA(50μg/200μlアセトン [950μM、190 nmol、3.3μg/cm2])；TPA(3μg/200μlアセトン [20μM、4 nmol、0.2μg/cm2])；BzATP(14.3μg/プロピレングリコール[PG]/エタノール[EtOH]の2.3/1 vol/vol溶液200μl [100μM、20 nmol、1.0μg/cm2])；またはBzATP媒体のみ(200μl PG/EtOH)。DMBAは1度適用し、TPAおよびBzATPは週に2回適用した。マウスにおける皮膚新生物を「2段階」法により誘導し、これは、7,12-ジメチルベンズ(a)アントセラン(DMBA)の局所処理による腫瘍開始、およびその後の12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート(TPA)の局所処理による腫瘍の促進を伴った。Guo et al., 「Disruption of EphA2 receptor tyrosine kinase leads to increased susceptibility to carcinogenesis in mouse skin」 Cancer Res 2006, 66:7050-7058。BzATPの濃度/用量および処理の頻度は、培養細胞でのデータに基づいて選択した(上記参照)。
【０２９３】
剪毛した背面皮膚を、2つの均等な前方部および後方部に分割した。各動物を、前方皮膚領域に4〜16週間にわたり週に2回局所適用したBzATPで処理した；平行して、後方皮膚領域に4週間にわたり週に2回、媒体のみを適用した。実験の終了時に、頸椎脱臼によって動物を安楽死させ、顕微鏡によるH&E組織評価およびP2X7免疫染色のために、各動物の前方および後方皮膚領域から背面皮膚条片を採取した。
【０２９４】
各動物より、ALT(SGPT)アッセイおよびAST(SGOT)アッセイ用に、眼球後静脈群から血液試料を採取した。加えて、顕微鏡によるH&E組織評価、Ki67免疫染色、およびTUNEL法によるDNA断片化のインサイチュー検出のために、各動物から背面皮膚条片を採取した。
【０２９５】
一部の動物群において、DMBA/TPA処理を用いることにより、BzATPを共に投与した場合および共に投与しなかった場合の両方で、がん性病変が生じた。対照、処理なし；DMBA＋TPA；およびDMBA/TPA＋BzATP。BzATPによる処理は、DMBA/TPA処理の2週間前に開始した。7〜16週間後に、エンドポイントを判定した。エンドポイントは、少なくとも1つの乳頭腫を有する動物の割合；動物当たりの乳頭腫数；および平均乳頭腫サイズ(最大病変寸法において測定されたmm)であった。一部の動物では、小型回転式ElliptiPunch刃(HUOT、Menomonee Falls, WI)を用いて、乳頭腫の生検を行った。生検組織を、顕微鏡によるH&E組織評価、Ki67免疫染色、およびTUNELについてアッセイした。
【０２９６】
小型回転式ElliptiPunch刃(HUOT、Menomonee Falls, WI)を用いて、生存動物1匹において皮膚乳頭腫の生検を行った。28週よりも前の安楽死(頸椎脱臼による)の判断基準はMontgomery指針に従い、これには、過剰な腫瘍量を有するか、またはサイズにかかわらず、出血、壊死、もしくは感染した潰瘍病変を有する動物が含まれた。Hetherington et al., 「Mouse care and husbandry」 In: Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach Edited by: Jackson IJ, Abbott CM. Oxford University Press; 2000:1-25。残りのすべての生存動物を安楽死させた28週時に、実験を終了した。死亡後、以下のように、すべての皮膚病変から代表的な試料を採取した：i) DMBA/TPA群‐乳頭腫4例およびがん試料26例；ならびにii) DMBA/TPA-BzATP群‐乳頭腫2例およびがん試料12例。すべての動物に対して、転移および表皮以外の腫瘍の存在に関する死後検査を行った(いずれも認められなかった)。
【０２９７】
大部分の病変は、1症例における実際の組織学的診断、典型的な形態的外観、ならびにこのモデルおよび方法論を用いて他から得られた幅広い経験に基づいて、乳頭腫と定義された。Guo et al., 「Disruption of EphA2 receptor tyrosine kinase leads to increased susceptibility to carcinogenesis in mouse skin」 Cancer Res 2006, 66:7050-7058；およびGlick et al., 「The high-risk benign tumor: evidence from the two stage skin cancer model and relevance for human cancer」 Mol Carcinogenesis 2007, 46:605-610。14〜28週目に生検された病変は、がん(死亡時に各症例において診断される通り)、または現存するもしくは萎縮中の乳頭腫(死亡時に診断された)もしくは死亡前に消失した病変を含む非がん性病変のいずれかと定義された。
【０２９８】
主な結果は以下の通りであった：
(a) DMBA/TPAの局所投与は、5〜12週時に皮膚乳頭腫を誘発し、その後扁平上皮紡錘細胞がんを誘発した。図23B〜Iを参照されたい。
(b) 0〜12週時に、乳頭腫の発生率は、BzATPと共に処理した動物において約50％だけ低かった。
(c) がん性病変の発生は、DMBA/TPA群よりもDMBA/TPA＋BzATP群において有意により遅くかつより低かった。28週時には、がん性病変の発生率は、BzATPと共に処理した動物において約50％だけ低かった。図24Aを参照されたい。
(d) 生存率は、DMBA/TPA＋BzATP群よりもDMBA/TPA群においてより早く死亡する傾向を示した。図24Bを参照されたい。
(e) 正常皮膚において、P2X7免疫反応性は主に、基底/傍基底層の増殖ケラチノサイトおよび毛幹内に局在した。図25Aおよび図25Bを参照されたい。
(f) 乳頭腫において、P2X7免疫反応性は正常組織と同様であり、これは主に、発達中の乳頭腫の底部にある増殖ケラチノサイト内に局在した。図25Cおよび図25Dを参照されたい。
(g) がん細胞において、P2X7免疫反応性およびP2X7 mRNAレベルは、正常表皮細胞または乳頭腫細胞よりも4〜5倍低かった。図25E〜Hを参照されたい。
(h) BzATPによる処理は、
i) 正常皮膚(図26A〜Nを参照されたい)；
ii) DMBA/TPA誘発性乳頭腫ケラチノサイト(図26O〜Rを参照されたい)、および
iii) DMBA/TPA誘発性がん細胞(図26S〜Vを参照されたい)
におけるP2X7受容体発現細胞のアポトーシスを上方制御した。
がん細胞におけるこの効果は、正常ケラチノサイトまたは乳頭腫ケラチノサイトよりも小さかった。図26を参照されたい。
(i) BzATPによる処理は、皮膚の形態および組織学的特徴に有意な影響を及ぼさなかった。図6Aおよび6Bを参照されたい。
(j) BzATPによる局所処理は、動物の行動、摂食習慣、体重、および肝機能に有意な影響を及ぼさなかった。
【０２９９】
要約すると、P2X7受容体特異的リガンドBzATPによる局所処理により、マウスにおけるDMBA/TPA誘発性皮膚乳頭腫および皮膚がんの発生が50％だけ減少した。BzATPは、増殖ケラチノサイトにおいてアポトーシスを増強することが認められた。BzATPによる局所処理は、局所的または全身性の有害作用を引き起こさなかった。
【０３００】
実施例IX
ALT(SGPT)アッセイおよびAST(SGOT)アッセイ
アッセイでは、Pointe Scientific(Canton MI)から入手した液体ALT試薬セットおよび液体AST試薬セット(それぞれCat # A7526-150aおよびA7561-150)を使用し、供給業者の説明書に従って実施した。
【０３０１】
実施例X
データ解析
乳頭腫またはがん性病変を有する生存動物の割合を、試験期間にわたり各週ごとに算出し、カイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定により群間で比較した。事象までの時間データを用いてがん性病変の形成の差を評価し、カプラン・マイヤー法(ログランク検定を伴う)を用いて群間の差を比較した。
【０３０２】
動物当たりの平均病変数を各週ごとに算出し、独立標本t検定により群間で比較した。加えて、反復測定ANOVAを用いて、群間で時間効果および病変数を調べた。
【０３０３】
0〜12週目に関しては、平均病変サイズを同様に比較した。14〜28週目に関しては、非がん性病変およびがん性病変を≦10 mm3対＞10 mm3に分類し、生存動物における＞10 mm3の病変の割合を、カイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定により群間で比較した。がん性病変はまた、≦200 mm3対＞200 mm3に分類した。
【０３０４】
がん発生(14〜28週目について)および生存率(0〜28週目について)はカプラン・マイヤー法を用いて評価し、ログラング検定により群間で比較した。培養細胞データについては、群間の差の有意性を、t検定により、またはチューキー・クレーマー多重比較事後検定解析を伴う一元配置もしくは二元配置ANOVAにより評価した。
【０３０５】
実施例XI
マウスケラチノサイト細胞培養
本実験では、6〜8週齢野生型C57B1マウス(Charles River、Wilmington, MA)；C末端のアミノ酸506〜532の欠失により構築されたP2X7-/- Pfizerマウス(Solle et al., 「Altered cytokine production in mice lacking P2X(7) receptors」 J Biol Chem 2001, 276:125-32)、またはエキソン1の開始部位にlacZ遺伝子が挿入され、結果として該受容体のノックアウトを生じるP2X7-/- GSKマウスから作製された表皮ケラチノサイトの初代培養物を使用した。Sikora et al., 「Purinergic signaling regulates radical-mediated bacterial killing mechanisms in macrophages through a P2X7-independent mechanism 」 J Immunol 1999, 163:558-61。P2X7-/- PfizerマウスおよびP2X7-/- GSKマウスは、C57B1バックグラウンドで作製された。
【０３０６】
マウスケラチノサイトの初代培養物は、改良コラゲナーゼ-EDTA法により作製した。Li et al., 「Decreased expression of P2X7 in endometrial epithelial pre-cancerous and cancer cells」 Gynecol Oncology 2007, 106:233-243。全表皮および真皮の一部を含む腹側表層皮膚領域を剥離し、この細胞懸濁液をPBSで洗浄し、40-μm細胞濾過器を通して濾過した。洗浄を繰り返した後、回転している細胞を、I型コラーゲン被覆フィルター上に1×105個細胞/cm2の密度でプレーティングし、24〜48時間後に実験に使用した。
【０３０７】
以前に記載された方法を用いて、マウスP2X7遺伝子(アクセッション番号AJ009823)の公開された配列から、P2X7特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)およびランダム対照オリゴヌクレオチド(RCO)を設計した。Chessell et al., 「Cloning and functional characterisation of the mouse P2X7 receptor」 FEBS Lett 1998, 439:26-30；およびZhu et al., 「Changes in Tight Junctional Resistance of the Cervical Epithelium are Associated with Modulation of Content and Phosphorylation of Occludin 65 KDa and 50 KDa forms」 Endocrinology 2006, 147:977-989。
【０３０８】
エキソン13(nt 1467〜1486)のコード領域にハイブリダイズする20merASO、およびRCOの配列は、以下の通りであった：
2013503868.tif 000005
。これらの配列は、P2X7遺伝子に対するクロスハイブリダイゼーションが起こらないように設計した。P2X7 mRNA発現に及ぼすASOおよびRCOの影響を評価するため、培養細胞を100μM ASOまたはRCOで、またはこれらなしで14時間処理した。
【０３０９】
実施例XII
細胞質カルシウム(Ca2+i)アッセイおよび臭化エチジウムアッセイ
培養細胞におけるCa2+iの変化を、動的共焦点レーザー走査顕微鏡観察を用いて、細胞内Fluo-4蛍光の変化の観点から測定した。培養マウスケラチノサイトに5μM Fluo-4/AMを負荷し、Zeiss LSM 510倒立リアルタイム共焦点顕微鏡で撮影した。潅流液に添加した100μM BzATPによる処理後10〜15秒間隔で、488 nm/505 nm (exc/emi)における画像を収集した。臭化エチジウム流入実験については、マウスケラチノサイトを培養したガラス底ディッシュを、顕微鏡に設置した。記載される通りに潅流液に5μM臭化エチジウムを添加する前、および添加した後30秒間隔で、画像(488 nm/505 nm [exc/emi]で収集)を撮影した。基礎強度値を減算することにより、MetaVueソフトウェア(Fryer Company Inc.、Huntley, IL)を用いて、照合画像から平均蛍光強度を定量化した。
【０３１０】
実施例XIII
DNA合成アッセイ
DNA合成の変化は、記載されている通りに[3H]-チミジン取り込みの観点から測定した。Wang et al., 「EGF facilitates epinephrine inhibition of P2X7-receptor mediated pore formation and apoptosis: a novel signaling network」 Endocrinology 2005, 146:164-174。3つ組試料の放射活性(dpm/Bio-Radタンパク質アッセイ溶液[Hercules, CA]によって測定されたmgタンパク質)を、βシンチレーション計測(Beckman LS1801シンチレーションカウンター)により測定した。
【０３１１】
実施例IVX
P2X7受容体活性化に及ぼすBzATP効果
BzATP処理は、マウス乳頭腫およびマウスがん細胞において、インビボでアポトーシスを増強することが報告された。それぞれ図26P、26R、および図26T、26Vを参照されたい、[55]での報告通り。
【０３１２】
乳頭腫細胞における効果は、がん細胞よりも大きかった。図26Rと26Vを比較されたい。乳頭腫細胞およびがん細胞において、ベースラインのアポトーシスおよびBzATPにより誘導され増強されるアポトーシスは、受容体発現と相関した。それぞれ図26P、26T、および図26R、26Vを参照されたい。乳頭腫ケラチノサイトにおいて該受容体の密度が高いことは、ベースラインのアポトーシスが高いこと、およびBzATPにより増強されるアポトーシスの程度が高いことと関連した。図26Oおよび図26Qを参照されたい。対照的に、がん細胞において該受容体の密度が低いことは、ベースラインのアポトーシスが低いこと、およびBzATPにより増強されるアポトーシスの程度が低いことと関連した。図26Sおよび図26Uを参照されたい。正常上皮細胞およびがん上皮細胞の細胞外液中のATPの定常状態レベルは、類似していることが報告されている[38,40,42,55]。したがって、上記のマウスデータから、インビボにおいて、受容体活性化およびアポトーシスの程度は、ATPに対するその親和性によるのではなく、主に受容体発現のレベルによって決まることが示唆される。図26を参照されたい。
【０３１３】
BzATPによるマウスのインビボ処理は、乳頭腫およびがんの形成の50％の阻害をもたらした。本実験では、培養細胞におけるアポトーシスに必要な100μMの最大前濃度に基づいて算出された、比較的低用量の1μg/cm2 BzATPを使用した[38,40-42,50,55]。BzATP処理は、BzATPが適用部位から吸収され、P2X7受容体発現予備細胞のその予定の標的において十分高濃度に達することを予測して、皮膚に該薬物を週に2回適用することを伴った。結果から、BzATPが、基底層/傍基底層および毛幹におけるP2X7受容体発現細胞のアポトーシスを上方制御することが示された。しかしながら、組織レベルが、BzATPの予測された100μM濃度に達したかどうかは不明であり、この効果が低組織レベルのBzATPによって誘導された可能性がある。理論的には、標的皮膚予備細胞において、より高濃度のBzATPを提供することによって、皮膚乳頭腫および皮膚がんのより大きな阻害をもたらすことが可能であると考えられる。
【０３１４】
薬物動態に加えて、本データから、どの種類のケラチノサイト予備細胞がBzATPに反応したのかという疑問も提起される。正常皮膚では、BzATPによる処理により、増殖中のP2X7受容体発現細胞のすべてではないが大部分においてアポトーシスが誘導された。図26Nを参照されたい。
【０３１５】
実施例XV
P2X7遺伝子プロモーターエンハンサー部位の同定
細胞培養
正常ヒト子宮腟部上皮の十分に特徴づけられたモデルであるヒト子宮腟部-腟上皮細胞(hEVEC)の初代培養物を、廃棄された正常子宮腟部-腟組織から作製した。Wang et al., (2004) 「P2X7-receptor mediated apoptosis of human cervical epithelial cells」 Am J Physiol 287:C1349-C1358。ヒト子宮頸部上皮がん細胞株(Caski、Hela、Siha、およびHT3)、およびP2X7の内因性発現を欠いているヒト胚性腎臓293細胞(HEK293)は、ATCCから入手した。細胞培養条件を記述した。Feng et al., (2006) 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 281:17228-17237。
【０３１６】
プロモーター領域の解明
ヒトP2X7遺伝子(GenBank Y12851)のプロモーター領域の解明には、HindIII尾部付加センスプライマーおよびNcoI尾部付加アンチセンスプライマー(InVitroge、Carlsbad CA)を使用した。表1を参照されたい。
【０３１７】
（表１）プロモーター領域解明用のプライマー。セグメントは、転写開始部位に対して番号づけしてある。
2013503868.tif 000006
【０３１８】
対応するcDNA断片を、ヒトゲノムDNAを用いてPCRにより合成した。PCR断片をHindIIIおよびNcoIで消化し、迅速DNAライゲーションキット(Roche、Indianapolis, IN)を用いて、HindIIIおよびNcoI部位を有するpGL3エンハンサーベクター(Promega、Madison, WI)に連結した。本実験、および以下に記載されるすべての実験におけるレポーターは、配列決定により確認した。
【０３１９】
2.5×105個細胞/ウェルの密度で6-ウェルプレートに14時間前にプレーティングしたサブコンフルエントな培養HEK293細胞に対して、pGL3ルシフェラーゼエンハンサーベクター(5064 nt)を含む対照プラスミドまたは試験プラスミド(P2X7-ルシフェラーゼ)をトランスフェクトした。培養液を、2.5μl Fugene 6(Roche)および対照ベクターまたは試験ベクターのDNA 750 ngを含む100μl無血清培地/ウェルを添加した新鮮培地に交換した。ルシフェラーゼ活性を測定するには、細胞にウミシイタケルシフェラーゼと30 ngのpRL-CMVベクター(Promega)とを共にトランスフェクトした。Zhou et al.、(上記参照)。インキュベーションの完了時に、細胞を回収し、溶解緩衝液中で24時間維持した(Promega)；Dual-Luciferaseレポーターアッセイシステム(Promega)を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を連続して測定し、ルシフェラーゼ活性をFluc/Rlucの観点から決定した。P2X7 mRNAおよびホタルルシフェラーゼ(Fluc) mRNAの変化を測定するには、細胞を溶解した後、RNAを抽出した。P2X7 mRNAレベルおよびFluc mRNAレベルは、リアルタイムPCR(qPCR)により、サイトケラチン-18(CK-18)またはGAPDHに対して測定し、蛍光の閾値サイクル(Ct)の観点で表した。P2X7、Fluc、CK-18、およびGAPDH用のプライマーを記述した。Li et al., (2006) 「The P2X7 Receptor: A novel biomarker of uterine epithelial cancers」 Cancer Epidemiol Biomarkers Preven 15:1-8、Feng et al., (2006) 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 281:17228-17237：Li et al., (2007) 「Decreased expression of P2X7 in endometrial epithelial pre-cancerous and cancer cells」 Gynecol Oncology 106:233-243；Zhou et al., (2008) 「Micro-RNAs miR-186 and miR-150 downregulate expression of the pro-apoptotic purinergic P2X7 receptor by activation of instability sites at the 3'-untranslated region of the gene that decrease steady-state levels of the transcript」 J Biol Chem 283:28274-28286。
【０３２０】
改良されたcDNA末端の5'迅速増幅法(5'-RACE)を、表示のプライマー(InVitrogen)と共に使用した。表2を参照されたい。
【０３２１】
（表２）A. 転写開始部位(TpIS)解明用のプライマー。B. TATA様部位解明用のプライマー。
2013503868.tif 000007
2013503868.tif 000008
【０３２２】
Invitrogen SuperScript(登録商標) III逆転写酵素(InVitrogen)を用いて、逆転写(RT)によるクローニングを55℃で行った(合計20μg RNA/反応)。ビオチン標識プライマーをRTに使用してcDNAを生成した後、cDNA産物を濃縮し、その精製を容易にするために、ビオチン標識cDNAをDynabeadsと混合した。このために、RT反応物を40μl Dynabeads M-280ストレプトアビジン(Invitrogen)と25℃で30分間混合した；10 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA、および2 M NaClを含む緩衝液でビーズを洗浄し、ビーズに付着しているcDNAに、ターミナルトランスフェラーゼ(Promega)を用いて、dATPを37℃で20分間および70℃で10分間かけて尾部を付加した。アンカーTTTおよび遺伝子特異的ネステッドプライマーのプライマー対を用いて、PCRを行った。100倍希釈した第1 PCR産物を用いて、アンカープライマーおよびネステッドHindIIIアンチセンスプライマーで第2 PCRを行った。その結果得られたcDNA断片を、HindIII部位を有するpGL3エンハンサーベクターにクローニングし、配列決定により確認した。この配列から、アデニンで始まる主要なTpISが同定され、これを部位+1と指定した(公開されたヒトP2X7遺伝子配列[GenBank Y12851]のnt 1683)。
【０３２３】
プロモーター領域内の関心対象の領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発では、断片-158〜+32を含むpGL3エンハンサーベクターレポーターおよびPCR法を使用した。関心対象の領域および変異は以下の通りであった：nt -1〜+3 (CATT/GTAA)；nt -31〜-30 (TA/CC)；nt -73〜-70 (AGGG/TATA)；およびnt -102〜-101 (TT/CC)。プライマーを表2に示す(上記参照)。
【０３２４】
P2X7プロモーターの下流にある547 nt領域内のCpG部位における変異は、以下のプライマーを使用して、以下の通りであった：+211/+212 (CG/AA)、+257/+258 (CG/TT)、+278/+279 (CG/TT)、+319/+320 (CG/AT)、+330/+331 (CG/AT)、+424/+425 (CG/TT)、+461/+464 (CGCG/ATTA)、+453/+454 (CG/TT)、+475/+476 (CG/TT)、+498/+499 (CG/TT)、および+548/+549 (CG/TT)。表3を参照されたい。
【０３２５】
（表３）CpG突然変異誘発実験用のプライマー
2013503868.tif 000009
【０３２６】
野生型配列または変異体配列を含む、下流の547 nt領域が結合したP2X7活性プロモーターから構成されるcDNA断片をルシフェラーゼベクターに挿入し、HEK293細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性の観点から、プロモーター活性を測定した。
【０３２７】
P2X7受容体免疫染色
ウサギポリクローナル抗P2X7受容体抗体(一次、Alomone Laboratories、Jerusalem, Israelによる)[9]およびヤギ抗ウサギAlexa Fluro 594(二次、Invitrogenによる)を、以前に記載された方法において使用した。Li et al., (2006) 「The P2X7 Receptor: A novel biomarker of uterine epithelial cancers」 Cancer Epidemiol Biomarkers Preven 15:1-8；Fu et al., (2009) 「Activation of P2X7-mediated apoptosis inhibits DMBA/TPA-induced formation of skin papillomas and cancer in mice. BMC Cancer 9:114；およびLi et al., (2007) 「Decreased expression of P2X7 in endometrial epithelial pre-cancerous and cancer cells」 Gynecol Oncology 106:233-243。
【０３２８】
蛍光顕微鏡Nikon Eclipse 80i(Nikon、Melville NY)において、免疫蛍光を取得した。免疫蛍光データの画像解析を行い、細胞当たりの平均画素密度の観点で表示した。Feng et al., (2006) 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 281:17228-17237。
【０３２９】
アポトーシスアッセイ
Roche細胞死検出ELISAキット(Roche)を用いて、アポトーシスを定量化した。Feng et al., (2006) 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 281:17228-17237。
【０３３０】
インビトロメチル化アッセイ
対照プラスミド(pGL3ルシフェラーゼエンハンサーベクター)または試験プラスミド(P2X7プロモーター-ルシフェラーゼ)を、製造業者のプロトコール(New England Biolabs、Ipswich, MA)に従って、CpG-メチラーゼM.SssI(シトシン残基にメチル基を付加する)とのインキュベーションにより、トランスフェクションの前にインビトロでメチル化した。
【０３３１】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
P2X7プロモーターの挿入物を有するpGL3エンハンサーベクターを鋳型として使用し、LightShift(登録商標) 化学発光EMSAキット(Pierce、Rockford, IL)を用いてアッセイを行った。簡潔に説明すると、ビオチン標識断片を、表示のような少なくとも1つのプライマーを用いてPCRにより増幅した。表4を参照されたい。
【０３３２】
（表４）電気泳動移動度シフトアッセイ用のプライマー
2013503868.tif 000010
【０３３３】
増幅後、P2X7プロモーター断片を1.5％アガロースゲル上で分離し、アガロースゲル抽出キット(QIAGEN)を用いて抽出した。結合反応は、2μl結合緩衝液、0.5μg HeLaScribe核抽出物(Promega)、40 fmolビオチン標識オリゴヌクレオチド、および1μl ポリ(dI-dC)を含む全量20μL中で、EMSAキットシステムを用いて室温で30分間行った。形成されたDNA-タンパク質複合体を、1×Tris-ホウ酸-EDTA緩衝液中の4％ポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動により分画した。氷上で1時間かけて、ゲルを正荷電ナイロン膜に100 Vにて電気泳動で転写し、直ちにUVトランスイルミネーターで架橋結合させた。ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートおよびLightShift化学発光基質(Pierce)を用いて、ビオチン末端標識DNAを検出し、ナイロン膜をx線フィルムに3分間露光させて、可能なDNA-タンパク質結合反応を検出した。
【０３３４】
ヒト組織
廃棄されたヒト子宮組織を、DNAメチル化解析に使用した。組織は、施設内倫理委員会により承認された研究プロトコール12-03-50および03-90-300に従って、Human Tissue Procurement Facility of University Hospital CASE Medical Center, Case Western Reserve University、Cleveland Ohioから入手した。当初、患者の診断を確立するために病理学部門によって調製されたパラフィン包埋ブロックから、子宮頸部セグメントの横断切片を取得した。アッセイのために、さらなる並列10μm切片を切断し、標準的手順に従ってスライドを作製した。各症例について、H&E染色したスライドを用いて、正常またはがん性の子宮頸部上皮領域を同定した。マイクロダイセクションにより、染色していないスライドの対応する領域から、組織上皮断片を採取した。組織材料を100μl消化緩衝液(50 mM Tris pH 8.5、0.5％ Tween 20、200μg/mlプロテイナーゼ-K)中に分散させ、42℃で一晩インキュベートし、80℃で10分間インキュベートすることによりプロテイナーゼ-Kを失活させた。
【０３３５】
DNAメチル化解析
アッセイでは、亜硫酸水素ナトリウム処理したDNAのPCR産物におけるメチル化依存性の配列差を明らかにするために、制限酵素消化を使用する複合亜硫酸水素塩制限解析(COBRA)の方法を使用した。Xiong et al., (1997) 「COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay」 Nucleic Acid Research 25:2532-2534。簡潔に説明すると、亜硫酸水素塩処理したゲノムDNA非メチル化シトシンはチミジンに変換されるのに対して、メチル化シトシン残基はシトシンとして保持される。増幅段階がそれらの元のメチル化状態によって鋳型間を識別しないように、CpGジヌクレオチドを含まないPCRプライマーを用いて、関心対象のDNAセグメントを増幅する。PCR産物を、CpGを含む配列を認識する制限酵素で消化する。シトシン残基のメチル化状態に従って、亜硫酸水素塩変換中にCpG配列が保持された場合に、切断が起こる。消化したPCR産物をゲル電気泳動により分解および分離し、臭化エチジウムで染色する。
【０３３６】
プロモーターの下流のCpGリッチ領域のクローニング
TpIS、nt +1に対するnt +26/+573の547 bp領域内で、メチル化のパターンを決定した。図28を参照されたい。関心対象の領域を任意に、以下のプライマーが用いられる、セグメント-1(nt +26/+247)、セグメント-2(nt +223/+399)、およびセグメント-3(nt +352/+573)と命名した、部分的に重複する3つのセグメントに分割した。表5を参照されたい。
【０３３７】
（表５）セグメント1〜3を使用する実験用のプライマー
2013503868.tif 000011
使用するPCR条件(アニーリング温度)および制限酵素は、以下の通りであった：セグメント-1 560C(MaeII)；セグメント-2 560C(MaeII)；セグメント-3 590C(BstUI)。
【０３３８】
DNAメチル化の評価
DNA精製キット(Promega)を用いて、培養細胞およびヒト組織からゲノムDNAを抽出した。CpG非関連シトシンをウラシル(およびチミジン)に変換するため、1μgのゲノムDNAを2 M NaOHで37℃にて10分間変性させた；30μlの10 mMヒドロキノンを添加し、この溶液を3 M亜硫酸水素ナトリウム(pH 5)と共に暗下で53℃にて16時間インキュベートした。処理後、DNAをDNA精製キット(Promega)によって精製した。この溶液を2 M NaOHと共に室温でインキュベートし、100％エタノールで沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、20μlの蒸留水に再懸濁した。亜硫酸水素塩処理したDNAをPCR(95℃ 5分/95℃ 30秒/55〜59℃ 45秒/および72℃ 45秒、37サイクル)により増幅した。PCR産物を制限酵素で消化し、6％ポリアクリルアミドゲルで4 Wにて3時間分離し、かつ増幅産物を配列決定により精度についてチェックした。DNAメチル化実験の陽性対照は、CpG-メチラーゼM.SssIで処理したヒト胎盤ゲノムDNAであり、陰性対照は水であった。DNAメチル化を、以前にメチル化された部位の切断バンドに相当する低MWバンドの新規出現を示す試料の観点から、ポリアクリルアミドゲル写真より判定した。メチル化の程度を、非メチル化＋メチル化バンド(低MWバンド＋高MWバンド)の密度に対する切断断片(低MWバンド)の強度の観点から、デンシトメトリーによって測定した。デンシトメトリーは、記載されている通りに行った。Feng et al., (2006) 「A truncated P2X7 receptor variant (P2X7-j) endogenously expressed in cervical cancer cells antagonizes the full-length P2X7 receptor through hetero-oligomerization」 J Biol Chem 281:17228-17237。
【０３３９】
ゲノムDNAシトシン(メチルシトシンではない)をウラシルに変換するための亜硫酸水素塩法の効率を確認するため、亜硫酸水素塩で処理したゲノムDNAを、セグメント1および2用のプライマーで増幅した。PCR産物をPCR精製キット(QIAGEN)で精製し、ベクターpCR II-TOPO(Invitrogen)にクローニングした。サブクローンで大腸菌(E. coli)の細菌型BL21を形質転換し、37℃で一晩培養した。PCR産物を含むプラスミドをミニプレップキット(Promega)で抽出し、配列決定した。結果から(表示せず)、メチルシトシンを除くすべてのゲノムDNAシトシンがウラシルに変換されたことが確認された。
【０３４０】
データ解析
データは、GraphPad Instat(GraphPad Software Inc.、San-Diego, CA)を用いて解析した。群間の差の有意性は、t検定により、またはチューキー・クレーマー多重比較事後検定解析を伴う一元配置もしくは二元配置ANOVAにより評価した。
【０３４１】
供給品
化学物質はすべて、他に特に規定のない限り、Sigma Chemical(St. Louis, MO)から入手した。
【０３４２】
アルファベット順参考文献
2013503868.tif 000012
2013503868.tif 000013
2013503868.tif 000014
2013503868.tif 000015
2013503868.tif 000016
【０３４３】
番号付き参考文献
2013503868.tif 000017
2013503868.tif 000018
2013503868.tif 000019
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【図１−１】
2013503868.tif 000028
【図１−２】
2013503868.tif 000029
【図１−３】
2013503868.tif 000030
【図２−１】
2013503868.tif 000031
【図２−２】
2013503868.tif 000032
【図２−３】
2013503868.tif 000033
【図３−１】
2013503868.tif 000034
【図３−２】
2013503868.tif 000035
【図３−３】
2013503868.tif 000036
【図３−４】
2013503868.tif 000037
【図４−１】
2013503868.tif 000038
【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
2013503868.tif 000041
【図６】
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【図７−１】
2013503868.tif 000043
【図７−２】
2013503868.tif 000044
【図８−１】
2013503868.tif 000045
【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
2013503868.tif 000048
【図１０−１】
2013503868.tif 000049
【図１０−２】
2013503868.tif 000050
【図１０−３】
2013503868.tif 000051
【図１１】
2013503868.tif 000052
【図１２−１】
2013503868.tif 000053
【図１２−２】
2013503868.tif 000054
【図１３−１】
2013503868.tif 000055
【図１３−２】
2013503868.tif 000056
【図１４−１】
2013503868.tif 000057
【図１４−２】
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【図１５−１】
2013503868.tif 000059
【図１５−２】
2013503868.tif 000060
【図１６】
2013503868.tif 000061
【図１７】
2013503868.tif 000062
【図１８】
2013503868.tif 000063
【図１９】
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【図２０】
2013503868.tif 000065
【図２１】
2013503868.tif 000066
【図２２】
2013503868.tif 000067
【図２３】
2013503868.tif 000068
【図２４】
2013503868.tif 000069
【図２５】
2013503868.tif 000070
【図２６】
2013503868.tif 000071
【図２７】
2013503868.tif 000072
【図２８】
2013503868.tif 000073
【図２９】
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【図３０】
2013503868.tif 000075
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2013503868.tif 000079
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月31日(2012.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本明細書において用いられる「P2X7受容体を含む細胞」という用語は、P2X7受容体を提示する身体組織に由来する任意の細胞を指し、その受容体の活性化によってアポトーシスが誘導される。例えば、そのような細胞には、上皮細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞、骨髄細胞、筋肉細胞、造血細胞、白血球細胞、胃腸細胞、尿路細胞、生殖腺細胞、腎細胞、膵細胞、網膜細胞、前立腺細胞、肺細胞、または腎臓細胞が含まれるが、これらに限定されない。
[本発明1001]
a) i) 複数の悪性がん細胞を含む対象；
ii) 該がん細胞においてアポトーシスを誘導し得るP2X7受容体アゴニスト
を提供する段階、
b) アポトーシスが誘導されるような条件下で該がん細胞に該アゴニストを投与する段階
を含む方法。
[本発明1002]
アゴニストがBzATPを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
アポトーシスががん細胞を死滅させる、本発明1001の方法。
[本発明1004]
投与段階が、皮内、腫瘍内、経皮、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、および皮下からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
投与段階がTNFαをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
がん細胞が上皮細胞に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
がん細胞が扁平上皮がんを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
a) i)複数の良性がん細胞を発達させるリスクがある対象；
ii) 該がん細胞においてアポトーシスを誘導し得るP2X7受容体アゴニスト
を提供する段階、
b) アポトーシスが誘導されるような条件下で該対象に該アゴニストを投与し、それによって該がん細胞の発達を予防する段階
を含む方法。
[本発明1009]
アゴニストがBzATPを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
アポトーシスが発達中のがん細胞を死滅させる、本発明1008の方法。
[本発明1011]
投与段階が、皮内、腫瘍内、経皮、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、および皮下からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1012]
投与段階がTNFαをさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1013]
発達中のがん細胞が上皮細胞に由来する、本発明1008の方法。
[本発明1014]
発達中のがん細胞が乳頭腫を含む、本発明1008の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０８】
エキソン13(nt 1467〜1486)のコード領域にハイブリダイズする20merASO、およびRCOの配列は、以下の通りであった：
2013503868.tif 000080
。これらの配列は、P2X7遺伝子に対するクロスハイブリダイゼーションが起こらないように設計した。P2X7 mRNA発現に及ぼすASOおよびRCOの影響を評価するため、培養細胞を100μM ASOまたはRCOで、またはこれらなしで14時間処理した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３２】
（表４）電気泳動移動度シフトアッセイ用のプライマー
2013503868.tif 000081
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013503868000001.app
【国際調査報告】
2013503868.tif 000082