(57)【要約】EVDPIGHLY HLA-A1複合体に対する結合特性を有し、TCR α可変ドメイン及び/又はTCR β可変ドメイン中に親和性を増大させる特定変異を有する所定の野生型TCRを含んでなるＴ細胞レセプター(TCR)。このTCRは養子療法に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
EVDPIGHLY(配列番号１) HLA-A1複合体への結合特性を有し、TCR α可変ドメイン及びTCR β可変ドメインを含んでなり、TCR α可変ドメインが、以下の変異：すなわち
50Iの50Vへの変異；
51Qの51Rへの変異；
52Sの52Pへの変異；
53Sの53Yへの変異
の少なくとも１つが存在することを除き、配列番号２のK1〜P114のアミノ酸配列を有し；及び/又はTCR β可変ドメインが、以下の変異：すなわち
50Fの50Tへの変異；
51Sの51Dへの変異；
52Eの52Mへの変異；
53Tの53Lへの変異；
54Qの54Lへの変異.
の少なくとも１つが存在することを除き、配列番号３のK1〜T112のアミノ酸配列を有することを特徴とするＴ細胞レセプター(TCR)。
【請求項２】
配列番号８及び９のα鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含んでなる請求項１に記載のTCR。
【請求項３】
配列番号10及び11のβ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含んでなる請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項３】
α鎖TRAC定常ドメイン及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメイン有するか、又はTRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合が欠失するように短縮又は置換により改変されたα鎖TRAC及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメインを有する先行する請求項のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項４】
αβへテロ二量体TCRであり、システイン残基がTRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57から置換されたα鎖及びβ鎖定常ドメイン配列を有し、該システインがα定常ドメインとβ定常ドメインとの間でジスルフィド結合を形成している、先行する請求項のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項５】
先行する請求項のいずれか１項に記載のTCRをコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を単一のオープンリーディングフレーム中又は２つの別個のオープンリーディングフレーム中に含んでなるTCR発現ベクターを有する細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクターと、請求項１〜４のいずれか１項に記載のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターとを有する細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のTCRを表面に提示する細胞。
【請求項１１】
配列番号８のα鎖可変ドメイン及び配列番号３のβ鎖を有するTCRを提示する請求項８に記載の細胞。
【請求項１２】
配列番号９のα鎖可変ドメイン及び配列番号３のβ鎖を有するTCRを提示する請求項８に記載の細胞。
【請求項１３】
配列番号２のα鎖及び配列番号10のβ鎖可変ドメインを有するTCRを提示する請求項８に記載の細胞。
【請求項１４】
配列番号２のα鎖及び配列番号11のβ鎖可変ドメインを有するTCRを提示する請求項８に記載の細胞。
【請求項１５】
１又はそれより多い医薬的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の細胞を複数含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド-HLA-A1複合体として提示される(MAGE-3タンパク質に由来する)EVDPIGHLYペプチドに結合し、天然型MAGE-A3 TCR α及び/又はβ可変ドメインと比較して変異しており、前記複合体に関して参照MAGE-A3 TCRのものの少なくとも２倍の結合親和性及び/又は結合半減期を有するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
EVDPIGHLY(配列番号１)ペプチドは、既知のMAGE-3タンパク質のアミノ酸残基番号168〜176に相当する。MAGE-3タンパク質は、メラノーマその他の固形腫瘍(例えば、頭部頸部扁平上皮ガン、肺ガン、膀胱ガン、胃ガン及び食道ガン)を含む多くの腫瘍タイプで発現する。MAGE-3ペプチドEVDPIGHLY(配列番号１)は、最も十分に特徴付けられたMAGE-3エピトープである。これは、HLA-A1制限Ｔ細胞及びHLA-B35制限Ｔ細胞の両方に認識される。これは、ペプチド-パルスされたHLA-A1ポジティブ標的細胞及びMAGE-3-発現HLA-A1ポジティブメラノーマ細胞株に対して細胞傷害活性を惹起することができる。ワクチンとして使用されるこのペプチドは、そのような患者の一部において、腫瘍退縮を誘導し、CTL応答を惹起することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、EVDPIGHLY HLA-A1複合体は、本発明のTCRが標的することができるガンマーカーを提供する。例えば、本発明のTCRはＴ細胞に形質転換され得、このことで、Ｔ細胞は、養子療法として知られる治療プロセスにおける患者への投与のために、当該HLA複合体を提示する腫瘍細胞を破壊できるようになる。この目的のためには、TCRは、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度(off-rate)を有することが望ましい。親和性の劇的増加は、TCR遺伝子-改変CD8 Ｔ細胞における抗原特異性の喪失に関連付けられており、この喪失は、これらTCR-トランスフェクトCD8 Ｔ細胞の非特異的活性化をもたらす。よって、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより幾らか高いが、劇的には高くない親和性及び/又は劇的には遅くない解離速度を有するTCRが、養子療法には好まれる(Zhaoら，(2007) J Immunol. 179: 5845-54；Robbinsら，(2008) J Immunol. 180: 6116-31；及び公開されたWO 2008/038002を参照)。
【０００４】
TCRは、国際免疫遺伝学(International Immunogenetics；IMGT)のTCR命名法を使用して説明され、IMGTのTCR配列についての公開データーベースに関連する。天然型α-βへテロ二量体TCRはα鎖及びβ鎖を有する。広義には、各鎖は、可変領域、連結領域及び定常領域を含んでなり、β鎖はまた、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域を含有するが、この多様性領域は、しばしば、連結領域の一部と見なされる。各可変領域は、フレームワーク配列中に埋め込まれた３つのCDR(相補性決定領域)を含んでなり、その１つはCDR3と名付けられた超可変領域である。フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により識別される幾つかのタイプのα鎖可変(Vα)領域及び幾つかのタイプのβ鎖可変(Vβ)領域が存在する。VαタイプはIMGT命名法では独特なTRAV番号で指称される。よって、「TRAV21」は、独特なフレームワーク配列及びCDR1配列及びCDR2配列、並びにCDR3配列(TCR間で保存されるアミノ酸配列により部分的に規定されるが、TCR間で変化するアミノ酸配列も含む)を有するTCR Vα領域を規定する。同様に、「TRBV5-1」は、独特なフレームワーク配列及びCDR1及びCDR2配列を、部分的にのみ規定されるCDR3配列と共に有するTCR Vβ領域を規定する。
【０００５】
TCRの連結領域は、同様に、独特なIMGT TRAJ及びTRBJ命名法により規定され、定常領域もIMGT TRAC及びTRBC命名法により規定される。
β鎖多様性領域は、IMGT命名法では略号TRBDで呼ばれ、上記のように、TRBD/TRBJ連鎖領域は、しばしば、一緒に連結領域と見なされる。
αβTCRのα鎖及びβ鎖は、一般に、各々が２つの「ドメイン」、すなわち可変ドメイン及び定常ドメインを有すると考えられている。可変ドメインは可変領域及び連結領域の連鎖からなる。したがって、本明細書及び特許請求の範囲において、用語「TCR α可変ドメイン」とはTRAV及びTRAJ領域の連鎖をいい、用語 TCR α定常ドメインとは細胞外TRAC領域又はＣ末端短縮型TRAC配列をいう。同様に、用語「TCR β可変ドメイン」とは、TRBV及びTRBD/TRBJ領域の連鎖をいい、用語 TCR β定常ドメインとは、細胞外TRBC領域又はＣ末端短縮型TRBC配列をいう。
【０００６】
IMGT命名法により規定される独特な配列は、広く知られており、TCR分野の当業者に利用可能である。例えば、それらはIMGTの公開データベースに見出すことができる。「T cell Receptor Factsbook」(2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8もまた、IMGT命名法により規定される配列を開示しているが、公開日及びその後のタイムラグのため、その情報は、時に、IMGTデータベースを参照して確認する必要がある。
【０００７】
本発明者らは、天然型MAGE-3 TCR(Pierre G. Coulie博士(Cellular Genetics Unit, University of Louvain, Avenue Hippocrate 74, UCL 7459, B-1200 Brussels, Belgium)からのクローンEB81-103；Karanikasら(2003)「Monoclonal anti-MAGE-3 CTL responses in melanoma patients displaying tumor regression after vaccination with a recombinant canarypox virus.」J. Immunol. 171(9): 4898-904も参照)が下記のα鎖及びβ鎖Ｖ、Ｊ及びＣ遺伝子を使用していることを確証した：
α鎖-  TRAV21*01/TRAJ28/TRAC (天然型MAGE-A3 TCR α鎖の細胞外配列を配列番号２に示す)
β鎖: -  TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 (天然型MAGE-A3 TCR β鎖の細胞外配列を配列番号３に示す)(注記：TRBV5-1配列は２つの対立遺伝子多形(allelic variant)(IMGT命名法においてそれぞれTRBV5-1*01及び*02と指称される)を有し、上記の天然型MAGE-A3 TCRクローンはバリエーション*01を有する。同様に、TRBJ2-7配列は２つの既知のバリエーションを有し、上記のTCRクローン中には*01配列が存在する。限定詞「*」がないことは、該当する配列に関して唯１つの対立遺伝子のみが知られていることを意味する)。
【０００８】
用語「野生型TCR」、「天然型TCR」、「野生型MAGE-A3 TCR」及び「天然型MAGE-A3 TCR」は、本明細書中で同義に使用され、配列番号２及び３の細胞外α鎖及びβ鎖を有する天然に存在するTCRをいう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明によれば、
EVDPIGHLY(配列番号１) HLA-A1複合体への結合特性を有し、TCR α可変ドメイン及びTCR β可変ドメインを含んでなり、TCR α可変ドメインが、以下の変異：すなわち
50Iの50Vへの変異；
51Qの51Rへの変異；
52Sの52Pへの変異；
53Sの53Yへの変異
の少なくとも１つが存在することを除き、配列番号２のK1〜P114のアミノ酸配列を有し；及び/又はTCR β可変ドメインが、以下の変異：すなわち
50Fの50Tへの変異；
51Sの51Dへの変異；
52Eの52Mへの変異；
53Tの53Lへの変異；
54Qの54Lへの変異.
の少なくとも１つが存在することを除き、配列番号３のK1〜T112のアミノ酸配列を有することを特徴とするＴ細胞レセプター(TCR)が提供される。
【００１０】
本発明のTCRは、好ましくは、EVDPIGHLY-HLA-A1複合体について、配列番号６の細胞外α鎖配列及び配列番号７の細胞外β鎖配列を有する参照MAGE-A3 TCRのものの少なくとも２倍の結合親和性及び/又は結合半減期を有する。
【００１１】
配列番号６は、C162がT162(すなわちTRACのT48)から置換されていることを除き、天然型α鎖細胞外配列(配列番号２)であることに留意すべきである。同様に、配列番号７は、C169がS169(すなわちTRBC2のS57)から置換され、A187がC187から置換され、D201がN201から置換されていることを除き、天然型β鎖細胞外配列(配列番号３)である。天然型α鎖及びβ鎖細胞外配列に関するこれらシステイン置換により、リフォールドした可溶性TCR(すなわち、細胞外α鎖及びβ鎖をリフォールドすることにより形成されたTCR)を安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になる。安定ジスルフィド連結した可溶性TCRを参照TCRとして使用することにより、結合親和性及び結合半減期のより簡便な評価が可能になる。配列番号２及び３の天然型α鎖及びβ鎖に関する配列番号６のα鎖中及び配列番号７のβ鎖中の他の変異は、天然型配列と比較して結合親和性にも結合半減期にも影響しないという意味で「サイレント」である。よって、本発明のTCRは、EVDPIGHLY-HLA-A1複合体に関して、参照MAGE-A3 TCRのものの少なくとも２倍の結合親和性及び/又は結合半減期を有する場合、当該TCRは、暗に、上記天然型MAGE-A3 TCRクローンに関する基準も満たす。
「配列番号６の細胞外α鎖配列及び配列番号７の細胞外β鎖配列を有する参照MAGE-A3 TCR」は、同義語として、下記で、「参照TCR」又は「参照MAGE-A3 TCR」と呼ぶ。
【００１２】
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)は、任意の適切な方法により決定することができる。TCRの親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解される。T1/2は、ln2/解離速度(koff)として算出される。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち疎水性膜貫通ドメイン残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。したがって、所与のTCRは、当該TCRの可溶形態がEVDPIGHLY-HLA-A1複合体に関する結合親和性及び/又は結合半減期を有するという要件を充足すれば、該要件を充足すると理解されるべきである。好ましくは、所与のTCRの結合親和性又は結合半減期は、数回、例えば３回又はそれより多い回数、同じアッセイプロトコルを用いて測定し、その結果の平均をとる。好ましい実施形態では、これら測定は、本明細書中の実施例３の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を用いてなされる。参照MAGE-A3 TCRは、この方法によって測定したときの約250μMのKDを有し、koffは約0.2 s-1(すなわち、T1/2は約３秒)であった。
【００１３】
本発明のTCRは、許容し得るEVDPIGHLY HLA-A1複合体特異性(例えば、参照MAGE A3 TCRに類似する特異性)を維持しつつ、EVDPIGHLY HLA-A1複合体に関して、参照MAGE-A3 TCRのものの少なくとも２倍の親和性及び/又は結合半減期を有する。養子療法用のＴ細胞のトランスフェクションに必要とされるTCRは、前記EVDPIGHLY HLA-A1複合体に関して、参照MAGE-A3 TCRと比べて、(依然としてそれぞれ天然型TCRのものの少なくとも２倍であるが)幾らかより高い親和性及び/又はより長い結合半減期を有するべきである。
例えば、本発明のTCRは、当該複合体に関して、約６μM〜約70μMのKDを有し、及び/又は当該複合体に関して約１〜約11 sの結合半減期(T1/2)を有し得る。
【００１４】
本発明の目的のためには、TCRは、少なくとも１つのTCR α及び/又はTCR β可変ドメインを有する部分である。一般には、これらは、TCR α可変ドメイン及びTCR β可変ドメインの両方を含んでなる。これらは、αβへテロ二量体であってもよいし、単鎖形式であってもよい。養子療法における使用のためには、αβへテロ二量体TCRは、例えば、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を有する完全長鎖としてトランスフェクトされ得る。所望であれば、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合が存在してもよい(例えばWO 2006/000830を参照)。
【００１５】
形式に関わらず、本発明のTCRは、配列番号２及び３の細胞外α鎖及びβ鎖配列を有する天然型MAGE-A3 TCRと比較して、α可変ドメイン(配列番号２のK1からP114まで伸びる)及び/又はβ可変ドメイン(配列番号３のK1からT112まで伸びる)において変異している。天然型MAGE-A3又は参照MAGE-A3 TCRは、本発明のTCRとEVDPIGHLY HLA-A1複合体との間の相互作用に関して高い親和性及び/又は緩徐な解離速度を引き起こす種々の変異を導入することが可能な鋳型として使用することができる。本発明の実施形態には、少なくとも１つの相補性決定領域(CDR)及び/又は可変ドメインフレームワーク領域中で、配列番号２のK1からP114まで伸びるα鎖可変ドメイン及び/又は配列番号３のK1からT112まで伸びるβ鎖可変ドメインと比較して変異しているTCRが含まれる。
【００１６】
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにするもの、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて実施することができる。これら方法は、分子生物学の標準的教科書の多くに詳細に説明されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)変異誘発及び制限酵素-ベースのクローニングに関しての更なる詳細については、Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Pressを参照。LIC手順についての更なる情報は、Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30-6に見出すことができる。
本発明の高親和性MAGE-3 TCRを作製する１つの方法は、WO 2004/044004に開示されているようなTCRをディスプレイするファージ粒子の多様性ライブラリからの選択である。
天然型MAGE-A3 TCR又は参照MAGE-3 TCRのものに類似するVα及びVβ遺伝子を使用し、したがって類似する可変ドメインアミノ酸配列を含んでなる任意のαβ TCRは、好都合な鋳型TCRを作製し得ることに留意すべきである。そして、鋳型αβ TCRの可変ドメインの一方又は両方をコードするDNA中に、本発明の変異TCRを作製するために必要な変化を導入することが可能である。当業者に明らかなように、必要な変異は、多くの方法、例えば部位特異的変異誘発により導入し得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本発明のTCRは、50I、51Q、52S又は53Sの１又はそれより多い位置でアミノ酸残基が変異していることを除き、配列番号２のK1からP114まで伸びるα鎖可変ドメインを有し、及び/又は50F、51S、52E、53T又は54Qの１又はそれより多い位置でアミノ酸残基が変異していることを除き、配列番号３のK1からT112まで伸びるβ鎖可変ドメインを有する。例えば、本発明のTCRは、配列番号２に示される番号付けを用いてα鎖可変ドメインアミノ酸残基50V、51R、52P又は53Yの１又はそれより多く及び/又は配列番号３に示される番号付けを用いてβ鎖可変ドメインアミノ酸残基50T、51D、52M、53L又は54Lの１又はそれより多くを有し得る。
本発明の具体的TCRには、配列番号８及び９のα鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つ及び/又は配列番号10及び11のβ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含んでなるものが含まれる。よって、野生型α鎖の可変ドメイン配列(配列番号２のK1〜P114)を有するTCRは、配列番号10及び11の１つを有するβ鎖と会合していてもよい。或いは、配列番号８及び９の１つを有するα鎖は、野生型β鎖の可変ドメイン配列(配列番号３のK1〜T112)と会合していてもよい。或いは、配列番号８及び９の１つを有するα鎖は、配列番号10及び11の１つを有するβ鎖と会合していてもよい。
【００１８】
上記TCRの表現型上サイレントなバリアントもまた、本発明の一部を構成する。用語「表現型上サイレントなバリアント」とは、定常ドメイン及び/又は可変ドメインに、ペプチド-HLA複合体との相互作用に関する親和性及び/又は解離速度を変化させない変更が組み込まれていることを除き、本発明のTCRと配列が同一であるTCRをいう。そのようなバリアントの１例は、TCR α定常ドメインが、配列番号２の番号付けを用いて、135セリン(Ｓ)アミノ酸残基から置換されたフェニルアラニン(Ｆ)アミノ酸残基を含む本発明のTCRにより提供される。
上記のとおり、本発明のαβへテロ二量体TCRは、定常ドメイン間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。このタイプの好ましいTCRとして、TRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57がシステイン残基で置換され、該システインがTCRのTRAC定常ドメイン配列とTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列との間でジスルフィド結合を形成していることを除き、TRAC定常ドメイン配列及びTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列を有するものが挙げられる。
【００１９】
前段で言及した導入鎖間結合を有していてもいなくても、本発明のαβへテロ二量体TCRは、TRAC定常ドメイン配列及びTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列を有し得、該TCRのTRAC定常ドメイン配列及びTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合により連結され得る。
本発明のαβへテロ二量体TCRは養子療法に有用性を有するので、本発明は、本発明のTCRを提示する単離細胞、特に単離Ｔ細胞を包含する。本発明のTCRをコードするDNA又はRNAでのＴ細胞のトランスフェクションに適切な多くの方法が存在する(例えば、Robbinsら，(2008) J. Immunol. 180: 6116-6131)を参照)。本発明のTCRを発現するＴ細胞は、MAGE-3+ HLA-A1+ガンの養子療法ベースの治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法を実施することができる多くの適切な方法が存在する(例えば、Rosenbergら，(2008) Nat Rev Cancer 8 (4): 299-308を参照)。
【００２０】
養子療法における使用のために、本発明はまた、単一オープンリーディングフレーム又は２つの別個のオープンリーディングフレームに本発明のTCRをコードする核酸を含んでなるTCR発現ベクターを有する細胞を包含する。本発明のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクター及び本発明のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターを有する細胞もまた、本発明の範囲に包含される。
養子療法における使用を意図される本発明のTCRは、トランスフェクトＴ細胞により発現されるとグリコシル化される。周知であるように、トランスフェクトTCRのグリコシル化パターンは、トランスフェクト遺伝子の変異により改変し得る。
【００２１】
患者への投与には、本発明のTCRでトランスフェクトされたＴ細胞は、医薬組成物中で医薬的に許容され得るキャリアと共に提供され得る。本発明に従う細胞は、通常、医薬的に許容され得るキャリアを通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。これは、単位剤形で提供され得、一般に、密封された容器中で提供され、キットの一部として提供され得る。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用のための指示書を含む。キットは、複数の単位剤形を含み得る。
医薬組成物は、静脈内経路による投与に適合させ得る。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分をキャリア又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造し得る。
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は異常、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して広範囲に変化し得、最終的には医師が使用すべき適切な投薬量を決定する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】Ａ：TRAV21*01/TRAJ28/TRAC遺伝子を使用した天然型MAGE-A3 TCR α鎖の細胞外アミノ酸配列(配列番号２)を示す。Ｂ：参照MAGE-A3 TCR α鎖とも呼ばれる可溶性の野生型MAGE-A3 TCR α鎖をコードするDNA配列を示す。
【図１−２】Ｃ：ＢのDNA配列から生じるが、細菌における効率的発現用に挿入された導入リーディングメチオニンのない、可溶性の野生型MAGE-A3 TCR又は参照MAGE-A3 TCRのα鎖細胞外アミノ酸配列(配列番号６)を示す。
【図２−１】Ａ：TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2遺伝子を使用した天然型MAGE-A3 TCR β鎖の細胞外アミノ酸配列(配列番号３)を示す。
【図２−２】Ｂ：参照MAGE-A3 TCR β鎖とも呼ばれる可溶性の野生型MAGE-A3 TCR β鎖をコードするDNA配列を示す。
【図２−３】Ｃ：ＢのDNA配列から生じるが、細菌における効率的発現用に挿入された導入リーディングメチオニンのない、可溶性の野生型MAGE-A3 TCR又は参照MAGE-A3 TCRのβ鎖細胞外アミノ酸配列(配列番号７)を示す。
【図３】本発明に従うMAGE-A3 TCRバリアントのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図４】本発明に従うMAGE-A3 TCRバリアントのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図５−１】Ａ：Ｔ細胞の形質導入用の野生型MAGE-A3-特異的TCR遺伝子(ブタテシオウイルス-1 2A配列(太字及び下線)を有するWT α鎖-2A-WT β鎖構築物)のDNA配列を示す。
【図５−２】Ｂ：Ｔ細胞形質導入用の野生型MAGE-A3-特異的TCRのアミノ酸配列を示す。
【図５−３】図５−２の続きである。
【図６】ELISPOTアッセイにおける一連の標的細胞に対する、MAGE-A3 TCR-形質導入Ｔ細胞のIFN-γ放出を示す。
【図７】MAGE-A3-形質導入Ｔ細胞による腫瘍細胞株の殺傷を試験した細胞毒性アッセイを示す。
【実施例】
【００２３】
実施例
本発明を、以下の実施例で図面に言及しながら更に説明する。
図1A及び2Aはそれぞれ、TRAV21*01/TRAJ28/TRAC遺伝子を使用した天然型MAGE-A3 TCR α鎖及びTRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2遺伝子を使用した天然型MAGE-A3 TCR β鎖の細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号２及び３)を示す。
図1B及び2Bはそれぞれ、参照MAGE-A3 TCR α鎖及びβ鎖とも呼ばれる可溶性の野生型MAGE-A3 TCR α鎖及びβ鎖をコードするDNA配列を示す。これら配列は、非天然型ジスルフィド結合を形成する追加のシステイン残基を含む。追加のシステイン残基をコードする変異コドンを太字で示す。NdeI及びHindIII制限酵素認識配列は下線が付されている。
図1C及び2Cはそれぞれ、図1B及び2BのDNA配列から生じるが、細菌における効率的発現用に挿入された導入リーディングメチオニンのない、可溶性の野生型MAGE-A3 TCR又は参照MAGE-A3 TCRのα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号６及び７)を示す。導入システインを太字及び下線で示す。
【００２４】
図3A-Bは、本発明に従うMAGE-A3 TCRバリアントのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。変異残基を太字及び下線で示す。
図4A-Bは、本発明に従うMAGE-A3 TCRバリアントのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。変異残基を太字及び下線で示す。
図5Aは、Ｔ細胞の形質導入用の野生型MAGE-A3-特異的TCR遺伝子(ブタテシオウイルス-1 2A配列(太字及び下線)を有するWT α鎖-2A-WT β鎖構築物)のDNA配列を示す。
図5Bは、図５のDNA配列から生じる、Ｔ細胞形質導入用の野生型MAGE-A3-特異的TCRのアミノ酸配列を示す。
【００２５】
図６は、ELISPOTアッセイにおける一連の標的細胞に対する、MAGE-A3 TCR-形質導入Ｔ細胞のIFN-γ放出を示す。これら図は、天然型MAGE-A3 TCRを形質導入したＴ細胞と比較して、より高親和性のMAGE-A3 TCRを形質導入したＴ細胞の特異的活性化の増大を示す。
図７は、MAGE-A3-形質導入Ｔ細胞による腫瘍細胞株の殺傷を試験した細胞毒性アッセイを示す。
【００２６】
実施例１
pGMT7-ベースの発現プラスミド中への参照MAGE-A3 TCR α鎖及びβ鎖可変領域配列のクローニング
参照MAGE-A3 TCR可変αドメイン及びTCR可変βドメインを、MAGE-3 Ｔ細胞クローン(Pierre Coulie University of Louvain(ベルギー)のクローンEB81-103)から単離したトータルcDNAからPCR増幅した。α鎖の場合、制限部位NdeI及び細菌中での効率的発現開始用に導入したメチオニンをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドA1(ggaattccatatgaaacaagaagttactcaaattcc 配列番号14)と、制限部位SalIをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドA2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg 配列番号15)とを使用してα鎖可変領域を増幅する。β鎖の場合、制限部位NdeI及び細菌中での効率的発現開始用に導入したメチオニンをコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドB1(gaattccatatgaaagctggagttactcaaactccaag 配列番号16)と、制限部位AgeIをコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドB2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc 配列番号17)とを使用してβ鎖可変領域を増幅する。
【００２７】
Sambrook及びRussellによるMolecular Cloning a Laboratory Manual(第３版)に記載の標準的方法によって、α可変領域及びβ可変領域を、Cα又はCβを含有するpGMT7-ベースの発現プラスミド中にクローニングした。Applied Biosystems 3730xl DNA分析器を使用してプラスミドを配列決定した。
NdeI及びSalIで切断されたTCR α鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びXhoIで切断されたpGMT7＋Cαベクター中にライゲートした。NdeI及びAgeIで切断されたTCR β鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びAgeIで切断された別個のpGMT7＋Cβベクター中にライゲートした。
【００２８】
ライゲーション
ライゲートしたプラスミドを、コンピテントなEscherichia coli株XL1-blue細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン含有LB/アガープレート上にプレートした。37℃にて一晩のインキュベーション後、単一コロニーを採取し、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのLB中で一晩37℃にて振盪しながら増殖させる。Miniprepキット(Qiagen)を使用してクローン化プラスミドを精製し、Applied Biosystems 3730xl DNA分析器を使用してプラスミドを配列決定した。
図1C及び2Cはそれぞれ、図1B及び2BのDNA配列から生じるが、細菌における効率的発現用に挿入された導入リーディングメチオニンのない、可溶性ジスルフィド連結参照MAGE-A3 TCRのα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号６及び７)を示す。リフォールディングに際してへテロ二量体TCRを形成する人工的な鎖間ジスルフィド結合を提供するように、α鎖及びβ鎖の定常領域においてシステインが置換されたことに留意すべきである。導入システインを太字及び下線で示す。図1B及び2BのDNA配列中の制限酵素認識配列に下線を付す。
【００２９】
実施例２
可溶性参照MAGE-A3 TCRの発現、リフォールディング及び精製
実施例１で製造したように、TCR α鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、E.coli株Rosetta(DE3)pLysS中に別々に形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、〜0.6-0.8のOD600までTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中37℃にて増殖させた後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、Beckman J-6B中での4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採取した。MgCl2及びDNaseIの存在下に25ml Bug Buster (NovaGen)で細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離器における13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。その後、３回の界面活性剤洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCI pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、4,000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA、pH8.0中での同様な洗浄によって、界面活性剤及び塩を除去した。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質収率を６Ｍグアニジン-HClで溶解することによって定量し、OD測定はHitachi U-2001分光光度計で行った。次いで、消光率を用いてタンパク質濃度を算出した。
【００３０】
約15mgのTCR β鎖及び15mgのTCR α鎖の可溶化封入体を凍結ストックから解凍し、10mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈して、完全な鎖変性を確実にした。その後、十分に還元及び変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、0.5リットルのリフォールディング緩衝液：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素中に注入した。酸化還元カップル(システアミン塩酸及びシスタミン二塩酸)をそれぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで添加し、約５分後に変性TCR鎖を添加した。溶液を〜30分間放置した。リフォールドしたTCRを、透析チューブ材セルロース膜(Sigma-Aldrich；Product No. D9402)中、10ＬのH2Oに対して５℃±３℃にて18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃にて更に〜８時間継続した。
POROS 50HQアニオン交換カラムに透析後のリフォールド産物をロードし、６カラム容量を超える10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させ、Akta精製機(GE Healthcare)を使用することによって、ミスフォールド産物、変性産物及び不純物から、可溶性TCRを分離した。次いで、ピーク画分を４℃にて保存し、クーマシー-染色SDS-PAGEにより分析後、プールし濃縮した。最後に、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したGE Healthcare Superdex 75HRゲル濾過カラムを使用して、可溶性TCRを精製し、特徴付けた。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮後、BIAcore表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
【００３１】
実施例３
結合特徴決定
BIAcore分析
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore 3000TM)を使用して、可溶性TCRのペプチド-MHCリガンドへの結合を分析することができる。これは、ストレプトアビジン-被覆結合表面(センサチップ)に固定可能な可溶性ビオチン化ペプチド-HLA(「pHLA」)複合体の製造によって容易になる。センサチップは、４つの異なるpHLA複合体へのＴ細胞レセプター結合の同時測定を可能にする４つの個別のフローセルを含んでなる。pHLA複合体の手動注入により、固定化クラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することができる。
ビオチン化クラスＩ HLA-A*01分子を、構成成分のサブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体からインビトロでリフォールドさせ、続いて精製及びインビトロ酵素的ビオチン化を行った(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)。HLA-A*01-重鎖を、当該タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと置き換わるＣ末端ビオチン化タグと共に適切な構築物中で発現させた。〜75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。MHC軽鎖又はβ2-ミクログロブリン(β2m)もまたE.coli中で適切な構築物から封入体として〜500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
【００３２】
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％純度まで精製した。合成ペプチド(MAGE-A3 EVDPIGHLY)をDMSO中に最終濃度４mg/mlに溶解した。β2m及び重鎖の封入体を６Ｍグアニジン-HCl、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中で別々に変性させた。0.4Ｍ L-アルギニン、100mM Tris pH8.1、3.7mMシスタミン二塩酸、6.6mMシステアミン塩酸を含有するリフォールディング緩衝液を調製し、＜５℃に冷却した。好ましくは、ペプチドを先ずリフォールディング緩衝液に加え、続いて変性β2mを添加した後、変性重鎖を加えた。MAGE-A3 EVDPIGHLYペプチドをリフォールディング緩衝液に４mg/リットル(最終濃度)にて加えた。次いで、30mg/リットルのβ2m、続いて30mg/リットルの重鎖(最終濃度)を加えた。少なくとも１時間４℃にて完全にリフォールドさせた。
10容量の10mM Tris pH8.1中に透析することにより緩衝液を交換した。溶液のイオン強度を十分に低減させるために２回の緩衝液交換が必要であった。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS 50HQアニオン交換カラム(８mlのベッド容積)にロードした。Akta精製装置(GE Healthcare)を使用して、10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaCl線形グラジエントでタンパク質を溶出させた。HLA-A*01-ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加え、該画分を氷上で冷却した。
【００３３】
ビオチンタグ化pHLA分子を、10mM Tris pH8.1, ５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化させたGE Healthcare迅速脱塩カラムを用いて緩衝液交換した。溶出直後に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を添加した：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2、及び５μg/ml BirA酵素(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15に従って精製)。その後、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してビオチン化pHLA-A*01分子を精製した。GE Healthcare Superdex 75 HR 10/30カラムを、濾過PBSで予め平衡化した。１mlのビオチン化反応混合物をロードし、Akta精製装置(GE Healthcare)を使用してカラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化pHLA-A*01分子は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。タンパク質濃度はクーマシー-結合アッセイ(PerBio)を用いて決定した。ビオチン化pHLA-A*01分子のアリコートを−20℃にて冷凍保存した。
【００３４】
このような固定化複合体は、Ｔ細胞レセプター及びコレセプターCD8αα(共に、可溶相で注入し得る)の両方に結合することができる。TCRを可溶相又は固定相で使用する場合、可溶性TCRのpHLA結合特性は質的及び量的に同様であると認められる。これは可溶種の部分活性についての重要なコントロールであり、またビオチン化pHLA複合体が、非ビオチン化複合体と同程度に生物学的に活性であることを示唆するものである。
BIAcore 3000TM表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサは、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの、応答単位(RU)で表された屈折指数の変化(レセプターリガンド相互作用を検出し、親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である)を測定する。BIAcore実験は、PBS緩衝液(Sigma, pH7.1〜7.5)をランニング緩衝液として、タンパク質サンプルの希釈物の調製に使用して、温度25℃にて実施した。ストレプトアビジンは、標準アミンカップリング法によりフローセルに固定化した。pHLA複合体は、ビオチンタグを介して固定化した。次いで、可溶性TCRを、種々のフローセルの表面上を一定の流速で通過させ、その際のSPR応答を測定することによりアッセイを実施した。
【００３５】
平衡結合定数
上記BIAcore分析法を使用して、平衡結合定数を決定した。ジスルフィド連結可溶性へテロ二量体形態の参照MAGE-A3 TCRの系列希釈物を調製し、５μl/分の一定流速にて２つの異なるフローセル上に注入した：１つは〜1000RUの特異的EVDPIGHLY HLA-A*01複合体を被覆し、２つ目は〜1000RUの非特異的HLA-A2-ペプチド(KIFGSLAFL(配列番号18))複合体を被覆した。応答は、コントロールセルからの測定値を用いて、各濃度に関して規格化した。規格化データ応答をTCRサンプルの濃度に対してプロットし、平衡結合定数KDを算出するために、非線形曲線フィッティングモデルにフィットさせた(Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2nd Edition) 1979, Clarendon Press, Oxford)。ジスルフィド連結可溶形態の参照MAGE-A3 TCR(実施例２)は、KDが約250μMであることが証明された。同じBIAcoreデータからT1/2は約３秒であった。
【００３６】
動力学的パラメータ
上記BIAcore分析法を用いて、平衡結合定数及び解離速度も決定した。
TCR(下記実施例４参照)に関して、KDは、解離速度定数koff及び会合速度定数konを実験的に測定することにより決定した。平衡定数KDはkoff/konとして算出した。
TCRは、１つは〜300RUの特異的EVDPIGHLY HLA-A*01複合体で被覆し、２つ目は〜300RUの非特異的HLA-A1-ペプチド複合体で被覆した２つの異なるセル上に注入した。流速は50μl/分に設定した。代表的には、250μlのTCRをKDの〜10倍に等しい濃度で注入した。その後、応答がベースラインに復帰するか又は＞２時間が経過するまで、緩衝液を流した。動力学的パラメータはBIAevaluationソフトウエアを用いて算出した。解離相を一次指数関数減衰式にフィットさせた。これにより半減期の算出が可能になった。
【００３７】
実施例４
参照MAGE-A3 TCRのバリアントの作製
ファージディスプレイは、より高い親和性変異体を同定するために、MAGE-A3 TCRバリアントのライブラリを作製することができる１つの手段である。Liら(2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354に記載されたTCRファージディスプレイ及びスクリーンニング法を、実施例２のMAGE-A3 TCRに適用した。
配列番号２に示される番号付けを用いてα鎖可変ドメインアミノ酸残基50V、51R、52P又は53Yの１又はそれより多く及び/又は配列番号３に示される番号付けを用いてβ鎖可変ドメインアミノ酸残基50T、51D、52M、53L又は54Lの１又はそれより多くを有し、参照MAGE-A3 TCRの少なくとも２倍の親和性及び/又は結合半減期(したがって、暗示的に、天然型TCRの少なくとも２倍の親和性及び/又は結合半減期)を有するTCRを同定した。
【００３８】
より高親和性のTCRのα鎖可変領域アミノ酸配列の具体例(配列番号８及び９)及びβ鎖可変領域アミノ酸配列の具体例(配列番号10及び11)をそれぞれ図3A〜B及び図4A〜Bに示す。これらα鎖はCDR2で変異しており、β鎖はCDR2で変異している。
上記実施例２の方法(人工的な鎖間ジスルフィド結合を提供するように定常領域中に導入したシステインを含む)を使用してTCRへテロ二量体をリフォールドさせた。この方法で、(ａ)参照TCR β鎖と、可変ドメイン(配列番号８及び９)を含むα鎖とからなるTCR；(ｂ)参照TCR α鎖と、β鎖可変ドメイン(配列番号10及び11)を含むβ鎖とからなるTCR；及び(ｃ)変異可変ドメインを含むβ鎖及びα鎖の種々の組合せからなるTCRを作製した。
【００３９】
これら可溶性ジスルフィド連結MAGE-A3 TCRとEVDPIGHLY HLA-A*01複合体との間の相互作用を、上記のBIAcore法を使用して分析した。結合データを表１に示す。
【００４０】
【表１】
2013535199.tif 000002
【００４１】
実施例５
天然型MAGE-A3 TCRのバリアントでのＴ細胞のトランスフェクション
(ａ)293T細胞のExpress-In-媒介一過性トランスフェクションによるレンチウイルスベクターの作製
第３世代レンチウイルスパッケージングシステムを使用して、所望のTCRをコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターをパッケージする。Express-In-媒介トランスフェクション(Open Biosystems)を用いて、293T細胞を４つのプラスミド(実施例5cに記載されるTCR α鎖-P2A-TCR β鎖の単一ORF遺伝子を含む１つのレンチウイルスベクター及び感染性であるが非複製性であるレンチウイルス粒子の構築に必要な他の構成要素を含む３つのプラスミド)でトランスフェクトする。
トランスフェクションのために、細胞がプレート上に一様に分布し、50％を僅かに超えるコンフルーエンスである指数増殖期の293T細胞のT150フラスコを１つ準備する。Express-Inアリコートを室温にする。滅菌15ml円錐管中に３mlの無血清培地(RPMI 1640＋10mM HEPES)を配置する。174μlのExpress-In試薬を無血清培地中に直接添加する(これにより、試薬 対 DNAの重量比は3.6：１となる)。３〜４回円錐管を倒置して十分に混合し、室温にて５〜20分間インキュベートする。
【００４２】
別の1.5mlマイクロチューブ中で、15μgのプラスミドDNAを、予め混合したパッケージングミックスアリコート(18μgのpRSV.REV(Rev発現プラスミド)、18μgのpMDLg/p.RRE(Gag/Pol発現プラスミド)、７μgのpVSV-G(VSV糖タンパク質発現プラスミド)を含有、通常〜22μl)に添加し、DNAミックスの均質性を確実にするためにピペッティングを行う。DNAミックスに〜１mlのExpress-In/無血清培地を滴下して加え、次いで穏やかにピペッティングを行った後、Express-In/無血清培地の残余分に移し戻す。管を３〜４回倒置させ、室温にて15〜30分間インキュベートする。
古い培養培地を細胞のフラスコから除去する。Express-In/培地/DNA(３ml)複合物を、正立させた293T細胞のフラスコの底に直接添加する。細胞が覆われるようにフラスコをゆっくりと横にし、確実に一様分布するようにフラスコを非常に穏やかに振盪させる。１分後、22mlの新鮮培養培地(R10＋HEPES：RPMI 1640、10％熱不活化FBS、１％ Pen/Strep/L-グルタミン、10mM HEPES)を加え、インキュベーターに注意深く戻す。37℃/５％CO2にて一晩インキュベートする。24時間後、パッケージされたレンチウイルスベクターを含有する培地を採集する。
【００４３】
パッケージされたレンチウイルスベクターを採集するため、細胞培養上清を0.45ミクロンのナイロンシリンジフィルターに通して濾過し、培養培地を10,000ｇにて18時間(又は112,000ｇにて２時間)遠心分離し、上清のほとんどを除去し(ペレットを廃棄しないように注意する)、残る数mlの上清(通常、チューブあたり31mlの出発容量から約２ml)中にペレットを再懸濁する。１mlアリコートに小分けして、ドライアイス上で素早く凍結させ、−80℃で貯蔵する。
【００４４】
(ｂ)興味対象遺伝子を含有するパッケージされたレンチウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入
パッケージされたレンチウイルスベクターの形質導入前に、ヒトＴ細胞(必要に応じてCD8若しくはCD4又はその両方)を、健常ボランティアの血液から単離する。これら細胞を計数し、48ウェルプレートにおいて、50U/mlのIL-2を含有するR10中１×106細胞/ml(0.5ml/ウェル)にて、予め洗浄した抗-CD3/CD28抗体-被覆マイクロビーズ(Dynal T cell expander, Invitrogen)と３ビーズ/細胞の比で一晩インキュベートする。
一晩の刺激後、0.5mlのニート(neat)のパッケージされたレンチウイルスベクターを、所望の細胞に添加する。37℃/５％ CO2にて３日間インキュベートする。形質導入の３日後、細胞を計数し、0.5×106細胞/mlに希釈する。必要に応じてIL-2を含有する新鮮培地を添加する。形質導入の５〜７日後ビーズを除去する。細胞を計数し、IL-2を含有する新鮮培地を２日間隔で交換又は添加する。細胞を0.5×106〜１×106細胞/mlに維持する。細胞は、３日目からフローサイトメトリにより分析することができ、５日目から機能アッセイ(例えば、IFNγ放出についてのELISpot)に使用することができる。10日目から又は細胞がゆっくりと分裂し、サイズが減少しはじめると、貯蔵のために、少なくとも４×106細胞/バイアル(90％ FBS/10％ DMSO中１×107細胞/ml)のアリコートで細胞を凍結させる。
【００４５】
(ｃ)上記方法(ａ)及び(ｂ)によるＴ細胞トランスフェクションのための野生型(wt)TCR遺伝子
図5Aは、(最大ヒト細胞発現用にコドン-最適化された)天然型MAGE-A3 TCRをコードするDNA配列(配列番号12)である。これは、全長α鎖(TRAV21)-ブタテシオウイルス-１ 2A-全長β鎖(TRBV5-1)の単一オープンリーディングフレーム構築物である。2A配列には下線を付す。当該配列の前には、2A配列のタンパク質分解性除去を補助するためのフリン切断部位をコードするヌクレオチドが存在する(図5Bとの関連で下記で更に議論する)(配列番号13)。mRNAのタンパク質翻訳の間の、2A配列の３'末端でのペプチド結合スキッピングは、２つのタンパク質：１)αTCR鎖-2A融合物、２)βTCR鎖を生じる。配列番号12は、NheI及びSalI制限部位(下線)を含む。
【００４６】
図5Bは、図5Aに対応するアミノ酸配列(配列番号13)である。
図5Bにおいて：
M1〜S19は、野生型α鎖TCRの成熟により除去されるリーダー配列である；
K20〜S227は野生型α鎖配列(配列番号２)に相当する；
K20〜R254は野生型α鎖細胞外ドメインに相当する；
I255〜L271は成熟TCRのα鎖膜貫通領域である；
W272〜S274は成熟TCRのα鎖細胞内領域である；
R277〜R280は、ゴルジ体において、P2A配列A285〜P303のタンパク質分解的除去を補助するフリン切断部位である；
G275、S276、S281〜G284、R304は、フリン切断及びP2A配列の全機能を可能にするフレキシブルリンカーである；
M305〜V323は、野生型β鎖TCRの成熟により除去されるリーダー配列である；
K324〜D565は野生型β鎖配列(配列番号３)に相当する；
K324〜E585は野生型β鎖細胞外ドメインに相当する；
I586〜V607は成熟TCRのβ鎖膜貫通領域である；
K608〜G614は成熟TCRのβ鎖細胞内領域である。
【００４７】
(ｄ)野生型及び高親和性MAGE TCRをトランスフェクトしたＴ細胞
上記(ａ)及び(ｂ)に記載された手順に従って、MAGE-A3 αwt_2A_βwt TCR遺伝子(配列番号12(図5A))をpELNSxvレンチベクター中に、両DNA構築物に特有なNheI及びSalI制限部位を用いて挿入し、トランスフェクトＴ細胞を作製した。
Ｔ細胞は、(ａ)野生型α鎖(配列番号２)の可変ドメイン配列(K1〜P114)と配列番号10又は11の一方を有するβ鎖可変ドメインとが会合したTCR；又は(ｂ)配列番号８又は９の一方を有するα鎖可変ドメインと野生型β鎖(配列番号３)の可変ドメイン配列(K1〜T112)とが会合したTCR；又は(ｃ)配列番号８又は９の一方を有するα鎖可変ドメインと配列番号10又は11の一方を有するβ鎖可変ドメインとが会合したTCRをコードすること以外は同様にして、配列番号12(図5A)と同一の遺伝子のトランスフェクションにより作製してもよい。
【００４８】
実施例６
腫瘍細胞株に対する、MAGE-A3親和性向上TCR-形質導入Ｔ細胞の、野生型親和性と比較して増大した活性化
Elispotプロトコル
以下のアッセイを行って、腫瘍細胞株に対する、TCRを形質導入した細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)の活性化を証明した。ELISPOTアッセイを用いて測定したときのIFN-γ産生を、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)活性化についての読取値(read-out)として使用した。
試薬
アッセイ培地：10％ FCS(Gibco, Cat# 2011-09)、88％ RPMI 1640(Gibco, Cat# 42401)、１％グルタミン(Gibco Cat# 25030)及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco Cat# 15070-063)
洗浄緩衝液：0.01Ｍ PBS/0.05％ Tween 20 
PBS(Gibco Cat# 10010)
ヒトIFNγ ELISPOT PVDF-酵素キット(Diaclone, France；Cat# 856.051.020)は必要な他の試薬を全て含む(捕捉及び検出抗体、スキムミルク粉、BSA、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ及びBCIP/NBT溶液並びにヒトIFN-γ PVDF ELISPOT 96ウェルプレート)
【００４９】
方法
標的細胞の調製
この方法で使用した標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞であった：共にHLA-A1+ MAGE+であるHCT-116結腸直腸ガン腫及びNCI-H1975非小細胞肺ガン腫。HLA-A1+ MAGE-であるN3正常ヒト表皮メラノサイトをネガティブコントロールとして使用した。十分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)を、Megafuge 1.0(Heraeus)において、1200rpmにて10分間の遠心分離で３回洗浄した。その後、細胞をアッセイ培地に106細胞/mlにて再懸濁した。
エフェクター細胞の調製
この方法で使用したエフェクター細胞(Ｔ細胞)は、CD4+及びCD8+ Ｔ細胞(PBLから(CD4及びCD8ネガティブ単離キット(Dynal)を用いて)ネガティブ選択により取得)の１:１ミックスであった。細胞を抗CD3/CD28被覆ビーズ(T cell expander, Invitrogen)で刺激し、興味対象の完全αβTCRをコードする遺伝子を有するレンチウイルスを形質導入し(実施例５に記載され、図5Bに示される構築物に基づいて)、形質導入後10〜13日まで50U/mlのIL-2を含有するアッセイ培地中で拡大させた。次いで、これら細胞をアッセイ培地中に配置した後、Megafuge 1.0(Heraeus)において、1200rpmにて10分間の遠心分離で洗浄した。その後、細胞をアッセイ培地に４×必要な最終濃度にて再懸濁した。
【００５０】
ELISPOT
プレートを下記のとおり準備した：100μlの抗-IFN-γ捕捉抗体を、プレートあたり10mlの滅菌PBS中に希釈した。次いで、100μlの希釈した捕捉抗体を各ウェル中に小分けした。その後、プレートを４℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄して(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー；Dynex)、捕捉抗体を除去した。次いで、100μlの滅菌PBS中２％スキムミルクを各ウェルに添加し、プレートを室温にて２時間インキュベートすることによって、プレートをブロックした。その後、スキムミルクをプレートから洗い流し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ELISPOTプレートをペーパータオル上で軽く叩いたりはじいたりして残る全ての洗浄緩衝液を除去した。
その後、アッセイの構成成分をELISPOTプレートに以下の順序で添加した：
50μlの標的細胞  106細胞/ml(合計50,000 標的細胞/ウェルを得る)
200μl/ウェルの最終容量を得るに十分な培地(アッセイ培地).
50μlのエフェクター細胞(5,000の形質導入CD4/8+混合細胞/ウェル)
【００５１】
次いで、プレートを一晩インキュベートした(37℃/５％CO2)。翌日、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。次いで、100μlの一次検出抗体を各ウェルに添加した。一次検出抗体は、Diacloneキットで供給される検出抗体のバイアルに550μlの蒸留水を添加して調製した。その後、100μlのこの溶液を10mlのPBS/１％ BSA(単一プレートに必要な量)に希釈した。次いで、プレートを室温にて少なくとも２時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、プレートをペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。
【００５２】
二次検出は、100μlの希釈ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼを各ウェルに添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートすることにより実施した。ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼは、10μlのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼを10mlのPBS/１％ BSA(単一プレートに必要な量)に添加することにより調製した。その後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。次いで、100μlのBCIP/NBT溶液(Diacloneキットで供給)を各ウェルに添加した。発色の間、プレートをホイルで覆い、５〜15分間放置した。この間、発色中のプレートをスポットについて定期的に検査して、反応を終了させる最適な時間を決定した。水道水を満たしたシンク中でプレートを洗浄して発色反応を終了させ、振って乾燥させた後、３つの構成パーツに分解した。その後、プレートを50℃にて１時間乾燥させた後、ルミノスポットプレートリーダー(CTL；Cellular Technology Limited)を用いて膜上に形成されたスポットを計数した。
【００５３】
結果
種々のMAGE-A3-ポジティブ腫瘍細胞株及びコントロール腫瘍細胞株に対する活性化TCR-形質導入Ｔ細胞によるIFNγ放出をELISPOTアッセイにより試験した(上記のとおり)。各ウェルで観察されたELISPOTスポット数をPrism(Graph Pad)を用いてプロットした。
ａ)TCR No:1、ｂ)TCR No:2、ｃ)TCR No:3、ｄ)TCR No:4又はｅ)TCR No:5(下記表に記載のとおり)を発現するCD4+Ｔ細胞、CD8+Ｔ細胞又はCD4+/CD8+混合Ｔ細胞を、MAGE-A3+ HLA:A1+腫瘍細胞株HCT-116若しくはNCI-H1975又はMAGE-A3- HLA:A1+ N3メラノサイトと共にインキュベートした。非形質導入Ｔ細胞(Nt)もまたネガティブコントロールとして使用した。
【００５４】
【表２】
2013535199.tif 000003
【００５５】
図６は、TCR No:1-形質導入Ｔ細胞が、腫瘍細胞株に対してIFNγを放出しなかったことを証明する。TCR No:2-形質導入Ｔ細胞は、HCT-116結腸直腸ガン腫細胞に対してのみIFNγを放出した。
親和性向上MAGE-A3 TCR No:3-、4-及び5-形質導入Ｔ細胞は、多くがHCT-116細胞に応答したが、NCI-H1975細胞にも応答した。
【００５６】
実施例７
腫瘍細胞株に対する、MAGE-A3親和性向上TCR-形質導入Ｔ細胞の、野生型より増大した細胞傷害性
このアッセイは、51Cr放出放射活性細胞毒性アッセイに代替する比色アッセイであり、細胞溶解に際して放出される酵素である酪酸デヒドロゲナーゼ(LDH)を定量的に測定する。培養上清中の放出LDHは、テトラゾリン塩(INT)の赤色ホルマザン産物への変換を生じる、30分間のカップリング酵素アッセイで測定する。生じた色量は、溶解細胞数に比例する。吸光度データは、標準の96ウェルプレートリーダーを用いて490nmで収集する。
【００５７】
材料
−  CytoTox96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega)(G1780)は、基質ミックス、アッセイ緩衝液、溶解溶液及び停止溶液を含む。
−  培養培地：10％ FCS(熱不活化, Gibco, cat# 10108-165)、フェノールレッド含有88％ RPMI 1640(Invitrogen, cat# 42401042)、１％グルタミン、200mM(Invitrogen, cat# 25030024)、１％ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen cat# 15070063)。
−  アッセイ培地：10％ FCS(熱不活化, Gibco, cat# 10108-165)、フェノールレッド不含88％ RPMI 1640(Invitrogen, cat# 32404014)、１％グルタミン、200mM(Invitrogen, cat# 25030024)、１％ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen cat# 15070063)。
−  Nuncマイクロウェル丸底96ウェル組織培養プレート(Nunc, cat# 163320)
−  Nunc-ImmunoプレートMaxisorb(Nunc, cat# 442404)
【００５８】
方法
標的細胞の調製
このアッセイで使用した標的細胞(Ｔ)は、shRNAによりMAGE-A3/6タンパク質発現をノックダウンしたか又はしていないHCT-116結腸直腸ガン腫細胞株(HLA-A1+ MAGE-A3+)であった(ノックダウンは下記のとおり実施)。標的細胞はアッセイ培地中に調製した：標的細胞濃度は、50μl中１×104細胞/ウェルとなるように２×105細胞/mlに調整した。
【００５９】
siRNAによるMAGE-A3/6ノックダウン
製造業者の指示書に記載されるように、HCT-116細胞に、MAGE-A3/6 shRNA(Santi Cruz Biotech, cat# sc-45284-V)をコードするレンチウイルス粒子を形質導入した。簡潔には、96ウェル平底組織培養プレートのウェルあたり４×104細胞をプレートし(100μl/ウェル)、一晩インキュベートして接着させた。概ね50％コンフルーエントを目標とした。翌日、10μlの培地を10μlの100μg/mlポリブレン(培養培地中に希釈；Santa Cruz Biotech, cat# sc-134220)と交換して、ウェルあたり５μg/mlの最終濃度を得た。shRNAレンチウイルス粒子-含有上清を、室温にてゆっくりと解凍して穏やかに混合した。次いで、ウェルあたり60μlのレンチウイルス粒子-含有上清を加え、更に40μlの培養培地を加えて、ウェルあたり200μlの総容量を得、細胞を一晩インキュベートした。18時間後、培地を穏やかに除去し、ポリブレンを含まない200μlの新鮮培養培地と交換した。翌日、0.25％トリプシン-EDTA(Invitrogen, cat# 25200)で細胞を剥離し、shRNA-発現細胞の選択用に５μg/mlピューロマイシン塩酸塩(Santa Cruz Biotech, cat# sc-108071)を含有する新鮮培地中での拡大のために６ウェルプレート中に播種した。数回の拡大の後、細胞を凍結させた。MAGE-A3/6タンパク質発現ノックダウンはウェスタンブロットにより評価した。
【００６０】
エフェクター細胞の調製
このアッセイで使用したエフェクター細胞(Ｅ)は、前述(実施例７)のとおり刺激し、形質導入し、拡大したCD8+及びCD4+混合Ｔ細胞(１：１)であった。エフェクター 対 標的比は1.25：１であった。エフェクター細胞はアッセイ培地中に調製した。細胞濃度は、50μl中1.25×105となるように2.5×105/mlに調整した。
【００６１】
アッセイ準備
アッセイの構成要素をプレートに下記の順序で添加した：
−  アッセイ培地(ウェルあたり計150μlとなるよう)
−  各ウェルに、50μlの標的細胞(上記で説明したとおり調製)
−  各ウェルに50μlのエフェクター細胞(上記で説明したとおり調製)
幾つかのコントロールを下記に説明するとおり調製した：
−  エフェクター自発放出：50μlのエフェクター細胞単独
−  標的細胞自発放出：50μlの標的細胞単独
−  標的最大放出：50μlの標的細胞単独＋10μlのジギトニン(40μg/ml最終が得られるように600μg/ml)
−  アッセイ培地コントロール：150μlの培地単独
−  溶解溶液用のアッセイ培地容量コントロール：150μlの培地＋10μlのジギトニン
【００６２】
全てのウェルは３連(in triplicate)で150μlの最終容量で準備する。
プレートを250×ｇにて４分間遠心分離した後、37℃にて24時間インキュベートした。プレートを250×ｇにて４分間遠心分離した。アッセイプレートの各ウェルからの50μlの上清を、平底96ウェルNunc Maxisorbプレートの対応するウェルに移した。基質ミックスを、アッセイ緩衝液(12ml)を使用して再構成した。次いで、50μlの再構成基質ミックスをプレートの各ウェルに添加した。プレートをアルミニウムホイルで覆い、室温にて30分間インキュベートした。50μlの停止溶液をプレートの各ウェルに添加して反応を停止させた。490nmでの吸光度を、停止溶液の添加後１時間以内にELISAプレートリーダーで記録した。
【００６３】
結果の計算
培養培地のバックグランド吸光度値の平均を、実験、標的細胞自発放出及びエフェクター細胞自発放出の全ての吸光度値から減算した。
容量補正コントロールの吸光度値の平均を、標的細胞最大放出コントロールについて得られた吸光度値から減算した。
最初の２工程で得られた補正値を下記式で使用して、パーセント細胞傷害性を算出した：
％細胞傷害性＝100×(実験−エフェクター自発−標的自発)/(標的最大−標的自発)
【００６４】
結果
図７中のグラフは、TCR No:1、TCR No:2又はTCR No:3を発現するように形質導入されたＴ細胞(下記表のとおり)による結腸直腸ガン腫細胞の特異的殺傷を示す。TCR No:2-形質導入Ｔ細胞及びTCR No:3-形質導入Ｔ細胞は、野生型TCR No:1-形質導入Ｔ細胞と比較して増大した細胞傷害性で、MAGE-A3-発現HCT-116結腸直腸ガン腫細胞を殺傷する。この殺傷は、HCT-116細胞(T(M-))におけるMAGE-A3/6タンパク質発現のshRNAノックダウンにより減少する。
【００６５】
【表３】
2013535199.tif 000004
【図１−１】
2013535199.tif 000005
【図１−２】
2013535199.tif 000006
【図２−１】
2013535199.tif 000007
【図２−２】
2013535199.tif 000008
【図２−３】
2013535199.tif 000009
【図３】
2013535199.tif 000010
【図４】
2013535199.tif 000011
【図５−１】
2013535199.tif 000012
【図５−２】
2013535199.tif 000013
【図５−３】
2013535199.tif 000014
【図６】
2013535199.tif 000015
【図７】
2013535199.tif 000016
【配列表】
2013535199000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月27日(2013.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EVDPIGHLY(配列番号１) HLA-A1複合体への結合特性を有し、TCR α可変ドメイン及びTCR β可変ドメインを含んでなり、TCR α可変ドメインが、以下の変異：すなわち
50Iの50Vへの変異；
51Qの51Rへの変異；
52Sの52Pへの変異；
53Sの53Yへの変異
の少なくとも１つが存在することを除き、配列番号２のK1〜P114のアミノ酸配列を有し；及び/又はTCR β可変ドメインが、以下の変異：すなわち
50Fの50Tへの変異；
51Sの51Dへの変異；
52Eの52Mへの変異；
53Tの53Lへの変異；
54Qの54Lへの変異.
の少なくとも１つが存在することを除き、配列番号３のK1〜T112のアミノ酸配列を有することを特徴とするＴ細胞レセプター(TCR)。
【請求項２】
配列番号８及び９のα鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含んでなる請求項１に記載のTCR。
【請求項３】
配列番号10及び11のβ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含んでなる請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項４】
α鎖TRAC定常ドメイン及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメイン有するか、又はTRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合が欠失するように短縮又は置換により改変されたα鎖TRAC及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメインを有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項５】
αβへテロ二量体TCRであり、システイン残基がTRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57から置換されたα鎖及びβ鎖定常ドメイン配列を有し、該システインがα定常ドメインとβ定常ドメインとの間でジスルフィド結合を形成している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCRをコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を単一のオープンリーディングフレーム中又は２つの別個のオープンリーディングフレーム中に含んでなるTCR発現ベクターを有する細胞。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクターと、請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターとを有する細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCRを表面に提示する細胞。
【請求項１０】
配列番号８のα鎖可変ドメイン及び配列番号３のβ鎖を有するTCRを提示する請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
配列番号９のα鎖可変ドメイン及び配列番号３のβ鎖を有するTCRを提示する請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
配列番号２のα鎖及び配列番号10のβ鎖可変ドメインを有するTCRを提示する請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
配列番号２のα鎖及び配列番号11のβ鎖可変ドメインを有するTCRを提示する請求項９に記載の細胞。
【請求項１４】
１又はそれより多い医薬的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の細胞を複数含んでなる医薬組成物。
【国際調査報告】
2013535199.tif 000017
2013535199.tif 000018
2013535199.tif 000019