(57)【要約】  血管内皮増殖因子Ａ（VEGFA）は、細胞によって産生される化学シグナルであり、新生血管の成長を刺激するが、ＶＥＧＦＡの過剰発現は、望ましくない生理状態を引き起こす可能性がある。新たなｓｉＲＮＡの同定、及びこれらｓｉＲＮＡのサイレンシング能力をｉｎ  ｖｉｖｏで改善する修飾によって、上記の過剰発現に関連する課題に対処するための治療組成物及び方法が発明された。
2013539456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦＡの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで低減するための方法であって、ｓｉＲＮＡを被検者に投与することを含み、前記ｓｉＲＮＡが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列である配列を含む、上記方法。
【請求項２】
前記被検者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被検者がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、長さ１７〜３０塩基対である二重らせん領域と、突出部領域なしか、１つの突出部領域又は２つの突出部領域とからなり、各突出部領域が、６以下の塩基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが、長さ１７〜３０塩基対である二重らせん領域を有するｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡが、（ａ）センス鎖と（ｂ）アンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各々が、長さ１９〜３６ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記センス鎖内で、１位及び２位のヌクレオチド、すべてのＣヌクレオチド及びＵヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を有し、センス鎖の他のすべてのヌクレオチドが、２’ＯＨ基を有し；
（ｂ）前記アンチセンス鎖内で、すべてのＣヌクレオチド及びＵヌクレオチドが、２’フルオロ修飾を有し、アンチセンス鎖の他のすべてのヌクレオチドが、２’ＯＨ基を有し、アンチセンス鎖の１位のヌクレオチドが、５’リン酸化されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖の２つの３’モスト塩基がＵＵである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンス鎖が、長さ２１塩基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記センス鎖が、長さ１９塩基であり、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖が、長さ１９塩基対の二重らせん領域を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖の３’末端に結合するコレステロール部分をさらに含み、前記コレステロール部分が、Ｃ５リンカーによって結合され、前記二重らせん領域が、前記センス鎖の６位、１３位及び１９位にミスマッチを含み、前記位置が、前記センス鎖の５’末端に対して決定され、前記センス鎖は５’突出部領域を含まない、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖の３’末端に結合するコレステロール部分をさらに含
み、前記コレステロール部分が、Ｃ５リンカーによって結合され、前記二重らせん領域が、前記センス鎖の６位、１３位及び１９位にミスマッチを含み、前記位置が、前記センス鎖の５’末端に対して決定され、前記センス鎖は５’突出部領域を含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖が、長さ２１塩基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記センス鎖が、長さ１９塩基であり、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖が、長さ１９塩基対の二重らせん領域を形成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチセンス鎖が、配列番号５４を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記センス鎖内の６位、１３位及び１９位の前記ミスマッチヌクレオチドが、アンチセンス鎖の相補的ヌクレオチドと同じである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療有効量のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物であって、前記ｓｉＲＮＡが、
（ａ）長さが１９〜３６塩基であり、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列を有する、アンチセンス鎖と、
（ｂ）長さが１９〜３６塩基であるセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖とセンス鎖が、１７〜３０塩基対の二重らせん領域を形成し、両鎖が、前記二重らせん領域内で、少なくとも７５％相補的である、上記医薬組成物。
【請求項１８】
前記二重らせん領域内で、６位、１３位又は１９位の１つ以上の位置にミスマッチがあり、前記位置は、前記センス鎖の５’末端に対して決定される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記センス鎖内で、１位及び２位ならびにすべてのＣ及びＵが、２’−ＯＭｅ修飾を有し、センス鎖の他のすべての位置が、２’−ＯＨ基を有し、前記アンチセンス鎖のすべてのＣ及びＵが、２’−Ｆ修飾を有し、アンチセンス鎖の他のすべてのヌクレオチドが、２’−ＯＨ基を有し、アンチセンス領域の１位ヌクレオチドが、リン酸化されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記センス鎖が、長さ１９塩基であり、前記アンチセンス鎖が、長さ２１塩基であり、アンチセンス鎖の２つの３’モスト塩基がＵＵ突出部である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
コレステロール部分が、Ｃ５リンカーによって前記センス領域の３’末端に結合されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第61/368,385号明細書の利益を請求する。尚、上記文献の全開示内容は、あたかもその全文が本明細書に記載されているのと同様に、参照として本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、ｓｉＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、新たな血管の形成を伴う生理的プロセスである。このプロセスの重要な部分は、血管内皮増殖因子（「VEGF」又は「VEGFA」）の産生であるが、この因子は、細胞
によって産生され、新たな血管の成長を刺激する化学シグナルである。
【０００４】
上記のプロセスは、ＶＥＧＦＡが細胞によって分泌され、１つ以上のコグネイト受容体、例えば、膜貫通タンパク質キナーゼＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ−１及びＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ−１／ＫＤＲに結合すると開始される。ＶＥＧＦＡが膜貫通タンパク質に結合すると、シグナルカスケードが開始され、これが最終的に新生血管形成を起こす。
【０００５】
血管新生は、正常かつ不可欠な身体の発育及び調節の一部をなしていると言える。残念なことに、血管新生は、いくつかの望ましくない病態、例えば、網膜症、乾癬、癌、浸出型加齢黄斑変性（ARMD）、及び慢性関節リウマチなどにも関連している可能性がある。これらの病態において、また他の病態でも、ＶＥＧＦＡ及び付随する血管形成の増加の両方が高レベルで存在する。従って、ＶＥＧＦＡの産生の制御を中心とした治療的戦略の開発が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＶＥＧＦＡ発現の抑制のための組成物及び方法、ならびにＶＥＧＦＡの過剰発現に関連する病態の治療に関する。従って、本発明は、ＶＥＧＦＡの産生を全部又は一部抑制するｓｉＲＮＡを導入するためのキット、ｓｉＲＮＡ及び方法を提供する。
【０００７】
第１の実施形態によれば、本発明は、ＶＥＧＦＡの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列を含むｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、ヒトに）投与することを含む。
【０００８】
第２の実施形態によれば、本発明は、ＶＥＧＦＡの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列を含むｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与することを含む。
【０００９】
第３の実施形態によれば、本発明は、ＶＥＧＦＡの発現を抑制するための方法を提供す
る。本方法は、最初の２つの実施形態のいずれかに関わるｓｉＲＮＡを投与することを含み、ｓｉＲＮＡは、以下の修飾：センス鎖内のすべてのＣ及びＵヌクレオチド、ならびにセンス鎖の最初の２つの５’ヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）修飾、アンチセンス鎖内のＣ及びＵヌクレオチドすべての２’フルオロ修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位ヌクレオチドの５’リン酸化の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖内のすべてのＣ及びＵヌクレオチドに２’−Ｏ−アルキル修飾を有し、アンチセンス鎖に少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜６ヌクレオチドからなる１つ以上の突出部を有する。いくつかの実施形態では、前述した修飾のすべてが存在し、これらの修飾しか存在せず、従って、Ｇ及びＡヌクレオチドで、センス鎖の１位及び２位に位置するもの以外は、すべて２’−ＯＨ基を有する。
【００１０】
第４の実施形態によれば、本発明は、ＶＥＧＦＡの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、初めの３つの実施形態のいずれかに関わるｓｉＲＮＡを投与することを含み、ｓｉＲＮＡは、以下の修飾：Ｃ５リンカーにより結合されたコレステロール部分、ならびにセンス鎖の６位、１３位及び１９位の１つ以上の位置におけるミスマッチの１つ以上を有し、ここで、センス鎖は長さが１９ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖も長さ１９ヌクレオチドである（突出部を除く）。センス鎖における位置は、センス鎖の５’末端から測定するが、ここで、センス鎖の最初の５’ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合する５’−モスト（most）ヌクレオチドとして識別される。このように、上記の定義では、５’センス鎖の突出部ヌクレオチドは、計数計画に含まれない。これら実施形態には、５’突出部がないものもある。上記実施形態のいくつかでは、１〜６塩基の１つ又は２つの３’突出部があるか、又は突出部はない。いくつかの実施形態では、６位、１３位及び１９位を除いて、二重らせん領域内に、１００％相補性が存在する。
【００１１】
第５の実施形態によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される少なくとも２つのｓｉＲＮＡのプールを提供する。
【００１２】
第６の実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示する１つ以上のｓｉＲＮＡの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
第７の実施形態によれば、本発明は、治療有効量のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を提供し、ｓｉＲＮＡは、（a）長さが１９〜３６塩基であり、配列番号２、４、６、８、１０
、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列を含むアンチセンス鎖；及び（ｂ）長さが１９〜３６塩基であるセンス鎖からなり、アンチセンス鎖とセンス鎖は、１７〜３０塩基対の二重らせん領域を形成し、二重らせん領域内に少なくとも７５％相補性が存在する。ｓｉＲＮＡの二重らせん領域が、長さ１９塩基対より長い場合には、追加の（センス及びアンチセンス）配列をアンチセンス鎖の３’末端と、センス鎖の５’末端に付加する。
【発明の効果】
【００１４】
本明細書に記載する方法、ｓｉＲＮＡ及び医薬組成物の使用によって、ＶＥＧＦＡを効率的かつ有効にサイレンシングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（Ａ）及び（Ｂ）は、Ａｃｃｅｌｌ分子として修飾してから、ラット内に硝子体内（IVT）注射により送達した２つのＶＥＧＦＡ  ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング活性を示す。
【００１６】
【図２】ｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＡ３．２（Ａｃｃｅｌｌ分子として修飾した）についての用量応答曲線のグラフである。
【００１７】
【図３】（Ａ）及び（Ｂ）は、別のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＡ３．７（Ａｃｃｅｌｌ分子として修飾した）についての用量応答曲線のグラフである。
【００１８】
【図４】（Ａ）及び（Ｂ）は、Ａｃｃｅｌｌ分子として修飾し、ラット内にＩＶＴ注射により送達したｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＡ３．７についての８週間までの作用の持続を示す。
【００１９】
【図５】（Ａ）及び（Ｂ）は、Ａｃｃｅｌｌ分子として修飾したｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＡ３．７による、ラット酸素誘導網膜症（OIR）におけるＶＥＧＦＡ発現及び網膜前血管新生の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
別途記載のない限り、又は文面から明らかである場合を除いて、下記の用語及びフレーズは、以下に記載する意味を有するものとする。
【００２１】
２’修飾
２’修飾とは、概してリボヌクレオチド内のリボース糖の２’位に位置するヒドロキシル基の、別の部分、例えば、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−イソプロピルなどの−Ｏ−アルキル基、又はフルオロ基のような別の基による置換を意味する。−Ｏ−アルキル修飾が存在する場合、いくつかの実施形態では、同じ−Ｏ−アルキル基がすべての−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチドに存在する。その他のタイプの２’修飾として、ハロゲン基、例えば、２’フルオロ、又は２’ブロモがある。
【００２２】
“Ａｃｃｅｌｌ”  ｓｉＲＮＡ
「Ａｃｃｅｌｌ」という用語は、以下のものを含む好ましいｓｉＲＮＡ構造を意味する：センス鎖が、長さ１９ヌクレオチドであり、（１）１及び２位（５’末端から数えて）に２’−Ｏ−メチル修飾；（２）すべてのＣ及びＵに２’−Ｏ−メチル修飾；さらには（３）Ｃ５リンカーを介して３’末端と結合したコレステロールを有する。アンチセンス鎖は、長さ２１ヌクレオチドであり、５’リン酸修飾を有し、すべてのＣ及びＵに２’Ｆ修飾を含み、センス鎖と対合すると、２ヌクレオチド突出部を形成し、（１）突出部の２つのヌクレオチド同士の間、及び（２）二重らせん領域の３’モストヌクレオチドと、突出部の第１ヌクレオチドとの間に、チオリン酸修飾を含む。さらに、Ａｃｃｅｌｌ分子は、６位、１３位、及び１９位（センス鎖の５’末端から数えて）にミスマッチを含む。いずれの場合にも、これらのミスマッチは、センスヌクレオチドを別の塩基で置換することにより生成される。このようにして、アンチセンス鎖は、標的分子と完全な相補性を保持する。さらに詳細については、米国特許出願公開第2009/0209626A1号明細書を参照されたい。尚、この文献の開示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【００２３】
相補的
「相補的」という用語は、相互に塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を意味する。塩基対は、概して、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位同士の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック型（例えば、
A〜T、A〜U、C〜G）、又は、二重らせんの形成を可能にする別のいずれかの方式で塩基対合することができる。当業者であれば、ＤＮＡに対してＲＮＡを用いるとき、チミンではなくウラシルが、アデノシンと相補的であると考えられる塩基であることは認識している。しかし、本発明に関して、Ｕを示すとき、別途記載のない限り、Ｔに置き換えられる可能性も含まれる。
【００２４】
完全な相補性、すなわち１００％相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合することができる状況を指す。完全ではない相補性とは、２つの鎖の全部ではないが、いくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができる状況を指す。例えば、２つの２０量体の場合、各鎖の２つの塩基対だけが互いに水素結合することができれば、このポリヌクレオチド鎖は、１０％相補性を呈示する。同じ例で、各鎖の１８塩基対が互いに水素結合することができれば、このポリヌクレオチド鎖は、９０％相補性を呈示する。いくつかの実施形態において、二重らせん領域内で、少なくとも７５％相補性、少なくとも８０％相補性、少なくとも９０％相補性、少なくとも９５％相補性又は１００％相補性が存在する。
【００２５】
コンジュゲート部分
本発明のコンジュゲート部分（単に「コンジュゲート」とも呼ぶ）は、ヌクレオチドと直接又は間接的に連結され、様々な手段によって細胞内への進入をターゲティングすることができる部分である。例えば、コンジュゲート部分は、天然状態の脂質であってもよい。従って、脂質に基づくコンジュゲート部分は、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびに脂肪酸、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノールエライジン酸、リノレン酸、及びミリスチン酸などがある。この他に、コンジュゲート部分は、天然状態のタンパク質性であってよく、膜転移（例：TAT、ペネトラチ
ン、MAP）又はカチオン性（例：ポリ（リシン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（ヒスチジ
ン）、ポリ（リシン／アルギニン／ヒスチジン）、若しくはプロタミン）のペプチドがある。
【００２６】
これ以外にも、コンジュゲート部分は、例えば、特定の受容体をターゲティングするか、又はそれ自体を膜に挿入することができ、しかも、エンドサイトーシス経路によって吸収されうる小分子であってもよい。従って、アダマンタン、多環芳香族炭化水素（例えば、ナフタレン、フェナンスレン、又はピレン）、大環状分子、ステロイド、又はその他の化学スカフォールドに基づく小分子はすべて、本発明に関して考えられるコンジュゲートである。
【００２７】
さらに別の実施形態では、コンジュゲート部分は、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリ（アルキルピリジニウム）塩、又はカチオン性アルブミンに基づいていてもよい。
【００２８】
場合によっては、コンジュゲート部分は、受容体のためのリガンドであるか、又は、後に受容体と結合する分子と会合することもできる。このクラスには、胆汁酸、小分子薬物リガンド、ビタミン、アプタマー、炭水化物、ペプチド（限定するものではないが、ホルモン、タンパク質、タンパク質断片、抗体又は抗体フラグメントなど）、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）、毒素（例えば、細菌毒素）などが含まれる。また、天然状態でステロイドであるコンジュゲート、例えば、コレステロール、コレスタノール、コラン酸、スチグマステロール、プレグネロン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロン、テストステロン、エスラジオール、エルゴステロールなども含まれる。本発明の好ましいコンジュゲート部分は、コレステロール（CHOL）、コレスタノール（CHLN）、コラン酸（CHLA）、スチグマステロール（STIG）、及びエルゴステロール（ERGO）である。
【００２９】
別の実施形態では、特定の受容体をターゲティングする分子は、他の供給源に結合したｓｉＲＮＡの起こりうる減少を排除するように修飾する。例えば、コレステロールに結合したｓｉＲＮＡが正常な血清の存在下に置かれると、この材料の有意な画分が、血清中のアルブミン及び／又は他のタンパク質と会合することから、ｓｉＲＮＡは、例えば、ＬＤＬとの相互作用に利用できなくなる。このために、本発明のコンジュゲート部分は、それらの意図する標的（例えば、LDL）と結合、又は会合し続けるが、意図しない結合パート
ナー（例えば、血清アルブミン）に対しては、より低い親和性を有するように修飾することができる。
【００３０】
二重らせん領域
「二重らせん領域」というフレーズは、ワトソン−クリック型塩基対合、又は相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチド鎖間の安定化二重らせんを可能にする他の方式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的又は実質的に相補的ポリヌクレオチドの領域を指す。
【００３１】
二重らせん領域のサイズの例として、限定するものではないが、１７〜３０塩基対、１７〜２５塩基対、１７〜２３塩基対、１８〜３０塩基対、１８〜２５塩基対、１８〜２３塩基対、１９〜３０塩基対、１９〜２５塩基対、１９〜２３塩基対が含まれる。二重らせん領域は、塩基対の長さ、及びその範囲にわたる相補性の程度によって定義される。
【００３２】
従って、二重らせん領域が、ヌクレオチドの２つの個別の鎖、すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖から形成される場合、各鎖が、二重らせんの一部であるヌクレオチドと、５’末端又は３’末端のどちらかで二重らせんの一部ではないヌクレオチドを含みうることは留意することが重要である。アンチセンス鎖において標的と相補的なすべてのヌクレオチドが、二重らせん領域の一部であり、従って、センス鎖に、相補的ヌクレオチドを有するように、ｓｉＲＮＡを設計することができる。しかし、アンチセンス鎖が、３’末端及び／又は５’末端のどちらかにも、センス鎖に相補的ヌクレオチドは有していないが、標的に相補的ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖内のヌクレオチドの連続的区間の一部であるヌクレオチドを含むように、ｓｉＲＮＡを設計することも可能である。
【００３３】
例として、センス鎖は、１９個のヌクレオチドを含み、また、アンチセンス鎖は、２１個のヌクレオチドを含んでよい。アンチセンス鎖の２つの３’モストヌクレオチドを除くすべてのヌクレオチドが、センス鎖の１９ヌクレオチドと相補的であってよく、また、アンチセンス鎖の２１ヌクレオチドの全区間は、標的の２１ヌクレオチドの区間と相補的であってよい。あるいは、アンチセンス鎖の２つの３’モストヌクレオチドが、標的の一部と相補的ではないように選択してもよいし、これらをランダムに、又はプロセッシングを促進するように選択して、一方又は両方が、標的の２つのヌクレオチドと相補的であるか、又は相補的ではないようにしてもよく、ここで、上記２つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の他の１９ヌクレオチドが相補的であるヌクレオチドと隣接している。
【００３４】
さらに、様々な実施形態では、二重らせん領域内で、ミスマッチなし、１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、４つのミスマッチ、又は５つのミスマッチがあってもよい。
【００３５】
ミスマッチ
「ミスマッチ」という用語は、ワトソン−クリック型塩基対合が、センス鎖のヌクレオチドとアンチセンス鎖のヌクレオチドとの間に起こらない状況を意味する。ミスマッチの例として、限定するものではないが、Ｇに対しＡ、Ａに対しＣ、Ｃに対しＵ、Ｇに対しＵ、Ａに対しＡ、Ｇに対しＧ、Ｃに対しＣ、Ｕに対しＵなどがある。
【００３６】
リンカー
リンカーは、２つ以上の他の部分に結合する部分である。定義又は慣例に制限される意図はないが、本願では、リンカーの長さは、コンジュゲート部分をリンカーと連結させる原子と、オリゴヌクレオチドと結合している末端リン酸部分の酸素原子（これを介してリンカーはオリゴヌクレオチドに連結している）との間の最短距離を示す原子の数を数えることにより表される。例えば、コンジュゲート部分が、カルバミン酸結合を介してリンカーと連結している実施形態では、リンカーの長さは、カルバミン酸結合の窒素原子とリン酸結合の酸素原子との間の最短距離を示す原子の数として表す。環構造が存在する場合、最短の経路を示す環の周囲の原子を数えるのが好ましい。
【００３７】
本発明の組成物及び方法で用いることが可能なコンジュゲートリンカーの構造の非制限的例として、限定するものではないが、β−アミノ−１，３−ジオール、β−アミノ−１，２−ジオール、ヒドロキシプロリノール、ω−アミノ−アルカノール、ジエタノールアミン、β−ヒドロキシ−１，３−ジオール、β−ヒドロキシ−１，２−ジオール、β−チオ−１，３−ジオール、β−チオ−１，２−ジオール、β−カルボキシ−１，３−ジオール、β−カルボキシ−１，２−ジオール、ω−ヒドロキシ−アルカノール、ω−チオ−アルカノール、ω−カルボキシ−アルカノール、機能性オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパルギルアミン、及びプロパルギルアルコールに基づくリンカー／リンカー化学が含まれる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、リンカーは、コンジュゲート部分との結合部位を提供するだけでなく、支持体との結合及びオリゴヌクレオチド合成の開始のための機能性部位も提供する。好ましくは、これらの部位は、コンジュゲート修飾固体支持体の合成中にこれらを化学的に識別できるようにするため、ヒドロキル基であり、最も好ましくは、第１ヒドロキシル基及び第２ヒドロキシル基である。一方のヒドロキシル基、好ましくは第１ヒドロキシル基は、当業者に十分に理解される方法によって、保護基で保護するが、この保護基は、オリゴヌクレオチドの合成の第１ステップとして除去することができる。好ましくは、上記保護基は、発色団であり、固体支持体に結合したコンジュゲート部分の量の推定に使用することができ、最も好ましくは、保護基は、トリフェニルメチル（Tr）、モノメトキシトリフェニルメチル（MMTr）、ジメトキシトリフェニルメチル（DMTr）及びトリメトキシトリフェニルメチル（TMTr）から選択される。もう１つのヒドロキシル基、好ましくは第２ヒドロキシル基は、当業者には十分に理解される方法によって、固体合成支持体上の官能基と共役結合反応することができる機能性テザーと誘導体化する。好ましいテザーは、例として、ジカルボン酸、例えば、コハク酸、グルタル酸、テレフタル酸、シュウ酸、ジグリコール酸、及びヒドロキノン−０，０’−二酢酸がある。上記テザーのカルボン酸官能性の１つは、ヒドロキシルと反応して、エステル結合を提供し、この結合は塩基性試薬（水酸化物、炭酸塩又はアミン）を用いて切断が可能であるが、他方のカルボン酸官能性は、通常、支持体上のアミン官能性とのアミド結合の形成により、合成支持体と反応する。リンカーはまた、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに他の望ましい特性、すなわち、改善された水溶性、コンジュゲート部分とオリゴヌクレオチドとの間の最適な距離、可変性（又はその欠失）、特異的配向、枝分れなども付与しうる。
【００３９】
好ましくは、リンカーとコンジュゲート部分の間の化学結合は、カルバミン酸結合であるが、それ以外の化学作用（chemistries）も本発明の範囲に含まれる。コンジュゲート
部分との化学結合を形成するリンカー上の官能基の例として、限定するものではないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル及びプロパルギルがある。リンカーとコンジュゲートとの間に形成される化学結合の例として、限定するものではないが、カルバミン酸、エーテ
ル、エステル、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、ホスホジエステル、チオリン酸エステル、ホルホロジチオエート（phorphorodithioate）ジチオリン酸（phosphorodithioate）、スルホンアミド、スルホン酸、スルホン、スルホキシド、尿素、ヒドラジド、オキシム、感光性結合、Ｃ−Ｃ結合形成基、例えば、Diels-Alder環状付加対又は閉環メタセ
シス対、及びMichael反応対に基づくものがある。一般に、コンジュゲート部分は、天然
又は化学的に組み込んだ適切な官能基を有することになる。従って、リンカーは、コンジュゲート部分の官能基と効率的かつ安定的に反応するように選択された官能基と合成することができる。
【００４０】
同じ長さを有するが、２つ以上のコンジュゲートと結合することができるリンカーもまた具体的に考慮される。
【００４１】
別の実施形態では、リンカーは、ヌクレオシド誘導体であってよい。ヌクレオシドは、例えば、リボヌクレオシド、２’−デオキシリボヌクレオシド、又は２’−修飾−２’−デオキシリボヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−メチル若しくは２’−フルオロであってよい。ヌクレオシドは、例えば、アラビノヌクレオシド又は２’−修飾アラビノヌクレオシドであってよい。当業者には公知の方法を用いて、プリン及びピリジミンヌクレオシドを塩基の特定の部位で修飾することにより、コンジュゲート部分の結合のためのリンカー及び官能基を用意してもよい。例えば、ウリジン及びシチジンのようなピリミジンヌクレオシドは、ウラシル又はシトシン塩基の５位で、酢酸第二水銀、パラジウム触媒、及びアリル試薬、例えば、アリルアミン、アリルアルコール、又はアクリル酸を用いて修飾することができる。あるいは、５−ヨードピリミジンを、５位で、パラジウム触媒、及びプロパルギル試薬、例えば、プロパルギルアミン、プロパルギルアルコール又はプロパルギル酸を用いて修飾することができる。これ以外にも、ウリジンを４位で、トリアゾール又は塩化スルホニルによる活性化、続いて、ジアミン、アミノアルコール又はアミノ酸との反応によって修飾してもよい。同様に、シチジンを４位で、重亜硫酸塩での処理、続いて、ジアミン、アミノアルコール又はアミノ酸との反応により修飾してもよい。同様に、プリンを７、８又は９位で、類似タイプの反応配列を用いて修飾してもよい。
【００４２】
好ましい実施形態では、リンカーは、長さが約３〜約９原子である。従って、リンカーは、長さが３、４、５、６、７、８、又は９原子であってよい。好ましくは、リンカーは、長さが５、６、７又は８原子である。より好ましくは、リンカーは、長さが５又は８原子である。最も好ましくは、リンカーは、直鎖Ｃ５リンカーである。すなわち、コンジュゲート部分をリンカーと連結する原子と、オリゴヌクレオチドと結合している末端リン酸部分の酸素原子（これにより、リンカーはオリゴヌクレオチドと結合している）との間に５個の炭素原子がある。従って、コンジュゲート部分が、カルバミン酸結合を介してＣ５リンカーと連結している場合、カルバミン酸結合の窒素原子とリン酸結合の酸素原子との間に５つの炭素原子が存在する。
【００４３】
１つの好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したＣ５リンカー（５炭素リンカー）であり、このようにして、Ｃｈｏｌ−Ｃ５コンジュゲート−リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介して、二重らせんのセンス及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’末端に結合する場合、得られるコンジュゲート−リンカー−オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる：
【化１】
2013539456.tif 000003
【００４４】
別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したＣ３リンカーであり、このようにして、Ｃｈｏｌ−Ｃ３コンジュゲート−リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’末端に結合する場合、得られるコンジュゲート−リンカー−オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる：
【化２】
2013539456.tif 000004
【００４５】
別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したＣ８リンカー（８炭素リンカー）であり、このようにして、Ｃｈｏｌ−Ｃ８コンジュゲート−リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’末端に結合する場合、得られるコンジュゲート−リンカー−オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる：
【化３】
2013539456.tif 000005
【００４６】
別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したＰＲＯリンカー（４炭素リンカー）であり、このようにして、Ｃｈｏｌ−ＰＲＯコンジュゲート−リンカーを形成する。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したＰＩＰリンカー（６炭素リンカー）であり、このようにして、Ｃｈｏｌ−ＰＩＰコンジュゲート−リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’末端に結合する場合には、得られるコンジュゲート−リンカー−オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる：
【００４８】
別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカー
は、カルバメート基を介してコレステロールに結合したＣ６−ＨＰ（「ＨＰ６」とも呼ばれる）リンカー（９炭素リンカー）であり、このようにして、Ｃｈｏｌ−Ｃ６−ＨＰコンジュゲート−リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’末端に結合する場合には、得られるコンジュゲート−リンカー−オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる：
【化４】
2013539456.tif 000006
【００４９】
ヌクレオチド
別途記載のない限り、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はその修飾された形態、及びその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びその誘導体及び類似体、ならびにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及びその誘導体及び類似体を有する種が含まれる。いくつかの実施形態では、すべてのヌクレオチドは、修飾又は非修飾Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵからなる群から選択される。
【００５０】
ヌクレオチド類似体としては、塩基、糖及び／又はリン酸塩の化学構造に修飾を有するヌクレオチド、限定するものではないが、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、及び５−ブロモ−ウラシルの置換；ならびに２’−位糖修飾、限定するものではないが、２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、又はＣＮ（ここで、Ｒはアルキル部分である）などの基で置換される糖修飾リボヌクレオチドなどが含まれる。ヌクレオチド類似体はまた、塩基（例えば、イノシン、キューオシン、キサンチン）、糖（例えば、２’−メチルリボース）、非天然のリン酸ジエステル結合（例えば、メチルホスホネート、チオリン酸エステル）及びペプチドを有するヌクレオチドも含むものとする。
【００５１】
修飾塩基とは、１つ以上の原子又は基の置換又は付加によって修飾されているヌクレオチド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、及びキューオシンを指す。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドを含むことができるタイプの修飾のいくつかの例として、限定するものではないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、又はアセチル化塩基があり、これらは単独でも、組み合わせてもよい。より具体的な例としては、例えば、５−プロピルウリジン、５−プロピルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、ならびに５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−メチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、その他のチオ塩基、例えば、２−チオウリジン及び４−チオウリジン及び２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチル及び置換されたナフチル基、あらゆるＯ−及びＮ−アルキル化プリン及びピリミジン、例え
ば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル及び修飾フェニル基、例えば、アミノフェノール又は２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８−置換アデニン及びグアニン、５−置換ウラシル及びチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、及びアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドがある。修飾ヌクレオチドには、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド、さらには、糖又はリボシルではない類似体を有するヌクレオチドも含まれる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、及びその他の糖、ヘテロ環、又は炭素環式化合物であってもよいし、それらに基づいていてもよい。
【００５２】
ヌクレオチドという用語は、当分野でユニバーサル塩基として知られるものも含むものとする。例えば、ユニバーサル塩基としては、限定するものではないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、又はネブラリンがある。「ヌクレオチド」という用語はまた、リボシル３’酸素のアミン基による置換から得られるＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートを含むものとする。
【００５３】
さらに、ヌクレオチドという用語は、検出可能な標識、例えば、ヌクレオチドに結合した放射性若しくは蛍光部分、又は質量標識を有する種も含む。
【００５４】
製薬上許容される担体
「製薬上許容される担体」というフレーズは、本発明の組成物を動物又はヒトなどの生物に送達するための製薬上許容される塩、溶剤、懸濁剤又はビヒクルを意味する。担体は、液体、半固体又は固体でよいが、往々にして、希釈剤、賦形剤、又は塩と同義に用いられる。「製薬上許容される」というフレーズは、開示されるあらゆる原材料、賦形剤、担体、希釈剤又は成分が、適度な利益／リスク比に比例する不当な有害副作用（例えば、毒性、分離及びアレルギー応答）なしに、ヒト及び／又は動物への使用に適したものであることを意味する。例えば、Remington's Pharmaceutical  Science 16thedition, Osol, A. Ed.（1980）を参照されたい。
【００５５】
リボヌクレオチド及びリボ核酸
「リボヌクレオチド」という用語及び「リボ核酸」（RNA）というフレーズは、少なく
とも１つのリボヌクレオチド単位を含む、修飾若しくは非修飾ヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分（これは、リボシル部分の１’位にＮ−グリコシド結合で結合された窒素塩基を有する）の２’位に結合したヒドロキシル基と、別のヌクレオチドとの結合を可能にするか、又は結合を排除する部分を含む。
【００５６】
センス鎖／アンチセンス鎖
「センス鎖」というフレーズは、全部又は一部が、標的核酸配列、例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列と同じである配列を含むポリヌクレオチドを指す。「アンチセンス鎖」というフレーズは、全部又は一部が、標的核酸配列、例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列の補体である配列を含むポリヌクレオチドを指す。
【００５７】
ｓｉＲＮＡの配列が記載される場合、慣例により、別途記載のない限り、これはセンス鎖の配列であり、また、相補的アンチセンス鎖も含まれる。二重らせんｓｉＲＮＡ（２つの個別の鎖から形成される）の場合には、一方の鎖はセンス鎖で、他方の鎖はアンチセンス鎖であってよい。突出部が存在する場合、「センス領域」というフレーズは、突出部領域以外のセンス鎖のヌクレオチド配列部分を指すことがある。同様に、「アンチセンス領域」というフレーズは、突出部領域以外のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列部分を指す
ことがある。ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡである場合、２つの個別の鎖はなく、「センス領域」は、全部又は一部が、標的配列と同じ配列を有する二重らせん領域の一部であり、「アンチセンス領域」は、全部又は一部が、標的核酸配列及びセンス領域と相補的なヌクレオチドの配列を指す。
【００５８】
センス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、例えば、１９〜３６塩基、１９〜３０塩基、１９〜２５塩基及び１９〜２３塩基である。これらの鎖長さは、考えられる突出部領域を含む。
【００５９】
ｓｉＲＮＡ
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（RNAi）経路を誘導する低分子阻害ＲＮＡ二重らせんを指す。本明細書で用いられるように、これらの分子は、長さが異なり（一般に、１７〜３０塩基対と突出部）、アンチセンス鎖における標的ｍＲＮＡに対し様々な程度の相補性を含みうる。全部ではないが、一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端に非対合の突出塩基を有する。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、２つの個別の鎖からなる二重らせんと、別途明示しない限り、一本鎖も含み、これら一本鎖は、二重らせん領域を含むヘアピン構造を形成することができ、ｓｈＲＮＡと呼ばれる。
【００６０】
ｓｉＳｔａｂｌｅ
「ｓｉＳｔａｂｌｅ」という用語は、特定の二重らせんに関連する化学的修飾パターンを指す。具体的には、ｓｉＳｔａｂｌｅ  ｓｉＲＮＡは、以下の構造を含む：センス鎖は、長さ１９ヌクレオチドであり、（１）１位及び２位（５’末端から数えて）に２’−Ｏ−メチル修飾を、（２）すべてのＣ及びＵに２’−Ｏ−メチル修飾を有する。アンチセンス鎖は、長さ２１ヌクレオチドであり、５’リン酸修飾を有し、すべてのＣ及びＵに２’Ｆ修飾を含み、センス鎖と対合すると２ヌクレオチド突出部を形成すると共に、（１）突出部の２つのヌクレオチドの間、及び（２）二重らせん領域の３’モストヌクレオチドと、突出部の最初のヌクレオチドとの間に、チオリン酸修飾を含む。詳細については、米国特許出願公開第2007/0269889A1号明細書を参照されたい。
【００６１】
標的
「標的」という用語は、本文献全体を通じて様々な異なる形態で用いられ、それが用いられる状況に応じて定義される。「標的ｍＲＮＡ」とは、特定のｓｉＲＮＡを向けることができるメッセンジャーＲＮＡを指す。「標的配列」及び「標的部位」とは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、様々な程度の同一性を示し、アンチセンス鎖が、様々な程度の相補性を呈示する、ｍＲＮＡ内の配列を指す。「ｓｉＲＮＡ標的」というフレーズは、ｓｉＲＮＡが向けられる遺伝子、ｍＲＮＡ、又はタンパク質を意味しうる。同様に、「標的サイレンシング」は、遺伝子、又は対応するｍＲＮＡ若しくはタンパク質の状態を意味しうる。
【００６２】
治療有効量
ＶＥＧＦＡ特異的ｓｉＲＮＡをコードする配列を含む組成物の「治療有効量」（すなわち有効用量）は、ＶＥＧＦＡ標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を少なくとも１０％阻害する量である。より高い阻害率（％）、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも８５、少なくとも９０％以上が、いくつかの実施形態において好ましいと考えられる。当業者であれば、いくつかの要因が、被検者を有効に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与える可能性があり、限定するものではないが、疾患又は障害の重症度、治療歴、被検者の健康状態及び／若しくは年齢、ならびに存在する他の疾患などが包まれることを理解されよう。さらに、治療有効量を用いた被検者の治療は、単一の治療又は一連の治療を含みうる。場合によっては、ｓｉＲＮＡの一時発現が望ましいこともある。
ｓｉＲＮＡをコードする構築物に誘導プロモーターが含まれる場合には、発現を誘導するのに用いる適切な用量の物質を被検者に送達した後、発現をアッセイする。
【００６３】
組成物の適切な用量は、調節しようとする発現又は活性に関する分子（ｓｉＲＮＡをコードする配列）の能力に応じて変動する。これら分子の１つ以上を動物（例えば、以下のような哺乳動物：ヒト若しくはその他の霊長類、例えば、チンパンジー、オランウータン、類人猿、サルなど、又はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ラット、ヒツジ、若しくはマウス）に投与して、１つ以上の標的ポリペプチドの発現又は活性を調節することができる。医師は、例えば、まず比較的低い用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで用量を増加していくことができる。さらに、特定の被検者の具体的用量レベルが、使用する具体的化合物の活性、被検者の年齢、体重、健康状態、性別、及び治療食、投与時間、投与経路、排出の速度、何らかの薬物の組合せ、及び調節しようとする発現又は活性の程度を含む様々な要因に応じて変動することは理解されよう。
【００６４】
ＶＥＧＦＡ特異的ｓｉＲＮＡの治療有効量は、ＶＥＧＦＡの発現増大に関連する病態、疾患、又は障害、例えば、限定するものではないが、乾癬、癌、慢性関節リウマチ、眼の血管新生、血管形成の異常、網膜血管透過性、網膜浮腫、糖尿病網膜症（特に、増殖性糖尿病網膜症）、糖尿病黄斑浮腫、浸出型加齢黄斑変性、網膜虚血に関連する続発症、及び眼球後区血管新生を治療するのに有用である。
【００６５】
好ましい実施形態
以下に、本発明を好ましい実施形態に関して説明することにする。これらの実施形態は、本発明の理解を助けることを目的として提示するのであって、本発明をいかようにも制限することを意図するものではなく、また、制限すると解釈すべきではない。本発明の開示内容を読んで当業者に明らかになる代替物、変更及び同等物はすべて、本発明の精神及び範囲に含まれるものとする。
【００６６】
さらに、本発明は、ＲＮＡ干渉を実施するための組成物又は方法に関する入門書ではない。当業者には公知の基本的概念については詳細に記載していない。
【００６７】
第１の実施形態によれば、本発明は、ＶＥＧＦＡの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで低減するための方法であって、ｓｉＲＮＡを生物に投与することを含み、ｓｉＲＮＡが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列を含む方法を提供する。
【００６８】
被検者は、ＲＮＡｉ経路を有するどんな生物であってもよく、このような生物として、限定するものではないが、哺乳動物、鳥類又は爬虫類が含まれる。哺乳動物の例として、限定するものではないが、ヒト、サル、類人猿、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス及びラットが含まれる。
【００６９】
さらに、センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重らせんは、少なくとも１つの突出部を含むことができ、各突出部は、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。突出部は、例えば、以下に位置することができる。
【００７０】
センス鎖の５’末端；
【００７１】
センス鎖の３’末端；
【００７２】
センス鎖の５’及び３’末端；
【００７３】
アンチセンス鎖の５’末端；
【００７４】
アンチセンス鎖の３’末端；
【００７５】
アンチセンス鎖の５’及び３’末端；
【００７６】
センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端；
【００７７】
センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端。
【００７８】
いくつかの実施形態では、突出部は、長さが６ヌクレオチド以下であり、好ましい実施形態では、突出部は、アンチセンス鎖の３’末端に存在する。すなわち、アンチセンス領域の３’モストヌクレオチドに結合している。さらに好ましくは、アンチセンス鎖の３’末端に存在する突出部は、長さが２ヌクレオチドである。突出部におけるヌクレオチドについての塩基の選択は、任意の方法で実施してよい。すなわち、突出部は、標的ｍＲＮＡと塩基対合しても、しなくてもよい。便宜上かつ単純化のために、２ヌクレオチド突出部は、通常、ＵＵ突出部である（しかし、AA、GG、CC、AC、CA、AG、GA、GC、及びCGジヌクレオチド突出部及びその他も考慮される。Vermeulen et al.（2005）RNA11（5）:674-682を参照）。好ましくは、突出部のヌクレオチド同士の結合、及び二重らせんの末端ヌクレオチドと突出部の最初のヌクレオチドとの結合は、チオリン酸結合である。１つの特に好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置するＵＵ突出部を含み、アンチセンス鎖において、３’末端Ｕを第２Ｕヌクレオチドと結合するチオリン酸結合、及び第２Ｕヌクレオチドを次のヌクレオチド（５’方向で）と結合するチオリン酸結合を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、センス鎖の５’末端及び／又はセンス鎖の３’末端及び／又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又はアンチセンス鎖の３’末端は、末端リン酸基を含む。好ましくは、末端リン酸基は、アンチセンス鎖の５’末端に位置する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはない（すなわち、リボース糖の各々の２’位はＯＨ部分を有する）。別の実施形態では、１つ又は２つ以上の化学修飾がある。例えば、以下：
（１）センス鎖の１位及び２位ならびにすべてのＣヌクレオチド及びすべてのＵヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル修飾（例えば、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル、Ｏ−ｎ−プロピル、Ｏ−イソプロピルなど）；
（２）コンジュゲート部分が、リンカーとコンジュゲート部分（例えば、コレステロール部分）を含む、又はこれらから実質的に構成される、又はこれらから構成され、上記リンカーが、センス鎖の最後のヌクレオチドの３’位に結合している、上記コンジュゲート部分；
（３）アンチセンス鎖のすべてのＣ及びＵヌクレオチドの２’フルオロ修飾又はアンチセンス鎖の少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾；
（４）アンチセンス鎖の第一のヌクレオチドの５’位でのリン酸化、また、すべての他のヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、非修飾であってもよい；
（５）１つ以上の突出部；ならびに
（６）どちらかの鎖の任意の突出部のヌクレオチドと結合した１つ以上のチオリン酸修飾
の１つ以上又は全部があってもよい。
【００８１】
突出部が存在するいくつかの実施形態では、２’−Ｏ修飾は、センス鎖の突出部のＣ及びＵに出現してもよいし、２’−フルオロ修飾は、アンチセンス鎖のＣ及びＵに出現してもよい。別の実施形態では、２’−Ｏ修飾及び２’−フルオロは、二重らせん領域のヌクレオチド内にしか出現しない。さらに、いくつかの実施形態では、それぞれの鎖で、前述した２’Ｃ及びＵのすべてが修飾されている（突出部領域が存在すれば、これを含む、又は除く）ことが望ましい場合もある。しかし、別の実施形態では、各鎖又はいずれかの鎖で、すべてではないいくつかのＣ及びＵが前述の修飾を含むことが望ましい。すべてではないいくつかのＣ及びＵが修飾されている場合、Ｃ及びＵ修飾の合計数は、例えば、ある絶対数によって選択され、例えば、１〜８、又は２〜７、又は３〜６の数が修飾されている。あるいは、この数は、例えば、修飾されない数に関して決定することができ、例えば、１を除くすべて、２を除くすべて、３を除くすべて、４を除くすべて、５を除くすべて、６を除くすべて、７を除くすべて、８を除くすべての数のＣ又はＵが非修飾である。別の実施形態では、１つ以上の特定の位置、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及びもし存在すれば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０位の１つ以上の位置で２’修飾を省くのが好ましい場合もある。当業者であれば、好ましくは各鎖が少なくとも１つのＣ又はＵヌクレオチドを含むことは認識されよう。さらに、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖で、０〜３０又は０〜２５又は０〜２３又は０〜１９又は１〜３０又は１〜２５又は１〜２３又は１〜１９又は３〜３０又は３〜２５又は３〜２３又は３〜１９又は５〜３０又は５〜２５又は５〜２３又は５〜１９又は７〜３０又は７〜２５又は７〜２３又は７〜１９又は１０〜３０又は１０〜２５又は１０〜２３又は１０〜１９又は８〜１５又は１０〜１２ヌクレオチドに２’フルオロ基を有することが好ましい場合もある。修飾ヌクレオチドは、すべてピリミジンであるか、すべてプリンであってもよいし、プリンとピリミジンの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の全ヌクレオチドが２’フルオロ基を有するが、この鎖は、少なくとも１つのピリミジン、少なくとも１つのプリンを含んでもよいし、すべてピリミジン、すべてプリンであるか、又はプリンとピリミジンの組合せを有してもよい。さらにいくつかの実施形態では、２’フルオロ基は、もし存在すれば、いずれかの突出部ヌクレオチドにあるが、別の実施形態では、突出部ヌクレオチドは、このような修飾を含まない。同様に、いくつかの実施形態では、センス鎖上で、０〜３０又は０〜２５又は０〜２３又は０〜１９又は１〜３０又は１〜２５又は１〜２３又は１〜１９又は３〜３０又は３〜２５又は３〜２３又は３〜１９又は５〜３０又は５〜２５又は５〜２３又は５〜１９又は７〜３０又は７〜２５又は７〜２３又は７〜１９又は１０〜３０又は１０〜２５又は１０〜２３又は１０〜１９又は８〜１５又は１０〜１２ヌクレオチドに、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）基を有するのが好ましい場合もある。修飾ヌクレオチドは、すべてピリミジンであるか、すべてプリンであってもよいし、プリンとピリミジンの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、センス鎖の全ヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル基を有するが、この鎖は、少なくとも１つのピリミジン、少なくとも１つのプリンを有してもよいし、すべてピリミジン、すべてプリンであるか、又はプリンとピリミジンの組合せを有してもよい。さらにいくつかの実施形態では、２’−Ｏ−アルキル基は、もし存在すれば、いずれかの突出部ヌクレオチドにあるが、別の実施形態では、突出部ヌクレオチドは、このような修飾を含まない。
【００８２】
アンチセンス鎖に少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル基を有する実施形態では、例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２の修飾が存在してもよい。別の実施形態では、ちょうど１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のこうした修飾が存在してもよい、これらの少なくとも１つの修飾は、例えば、３’アンチセンス突出部領域及び／又は二重らせん領域内のアンチ鎖の５’末端から測定して、アンチセンス鎖の１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２位の１つ以上の位置に位置してもよい。
【００８３】
非制限的例として、アンチセンス鎖の１、２、３、４、５、６、７又は８位のどの位置に単一の２’−Ｏ−アルキル修飾（例えば、メチル）があってもよい。あるいは、ＵＵ突出部の２つのヌクレオチドの１つ又はこれらヌクレオチドの両方に単一の２’−Ｏ−アルキル修飾があってもよい。２’−Ｏ−アルキル修飾の他の組合せとして、限定するものではないが、１位と２位、１位と３位、１位と４位、１位と５位、１位と６位、１位と７位、１位と８位、２位と３位、２位と４位、２位と５位、２位と６位、２位と７位、２位と８位、３位と４位、３位と５位、３位と６位、３位と７位、３位と８位、４位と５位、４位と６位、４位と７位、４位と８位、５位と６位、５位と７位、５位と８位、６位と７位、６位と８位、７位と８位、１位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、２位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、３位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、４位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、５位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、６位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、７位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、または８位とＵＵ突出部における２つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方の組合せが含まれる。
【００８４】
さらに、アンチセンス鎖に存在する少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾があるいくつかの実施形態では、Ａ又はＧ塩基だけがこの修飾を含み、これにより、すべてのＣ及びＵ塩基がフルオロ基で修飾されるように、位置を選択する。別の実施形態では、１つ以上のＣ又はＵ塩基が、２’−Ｏ−アルキル修飾を含む。このような場合、ｓｉＲＮＡは、２’−Ｏ−アルキル修飾を有していないＣ及びＵ塩基はすべて２’フルオロ修飾を有するように設計することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが、１７〜３０塩基対又は１８〜３０塩基対又は１９〜３０塩基対又は１９〜２３塩基対又は１９〜２１塩基対又は１８〜２３塩基対の二重らせん領域を含む。二重らせん領域が長さ１７塩基対で、１９量体アンチセンス配列が得られる場合、アンチセンス１９量体の３’末端の２つの塩基は、突出部を形成する可能性がある。
【００８６】
二重らせん領域内に、１００％の相補性又は１００％に満たない相補性、例えば、少なくとも８０％の相補性、少なくとも８５％の相補性、少なくとも９０％の相補性、又は少なくとも９５％の相補性がありうる。一実施形態では、センス鎖の６位又は１３位、又は１９位、又は６位と１３位又は１３位と１９位又は６位と１９位、又は６位、１３位及び１９位を除いて、１００％の相補性がある。この例では、指定位置にミスマッチがある。ミスマッチは、センス鎖におけるヌクレオチドの同一性を変更することによって、二重らせんに導入する。このようにして、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの領域との１００％の相補性を保持する。さらに、本明細書で用いるように、鎖内の位置番号は、二重らせん領域の第一の、すなわち５’モストヌクレオチドに対し該当するヌクレオチドの位置を指している。従って、センス鎖の１位は、センス鎖の５’モストヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖の５’モストヌクレオチドである。２位は、それぞれの鎖の１位のすぐ下流（又は３’）にある位置である。
【００８７】
前述したように、いくつかの実施形態では、ミスマッチをセンス鎖に導入する。いくつかの実施形態では、ミスマッチの位置に導入されたヌクレオチドは、通常、その特定のセンス鎖ヌクレオチドと結合するアンチセンス鎖のヌクレオチドと同じ同一性又は化学的性質を有する。従って、例えば、センス鎖に１９ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖に１９ヌクレオチドを含み、いずれの鎖にも突出部のない二本鎖分子がある場合、ミスマッチ
をセンス鎖の６位（この鎖の５’末端から数えて）に導入すると、センス鎖の上記位置のヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１４位のヌクレオチドと、ワトソン−クリック型対合をしない。さらに、アンチセンス鎖の１４位のヌクレオチドが、例えば「Ｃ」であれば、ミスマッチは、センス鎖の６位に「Ｃ」を導入することによって達成される。こうした変更の結果、センス鎖の６位に位置するヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡの標的領域において対応するヌクレオチドとの同一性をもはや有していない。しかし、例えば、１４位に位置するアンチセンスヌクレオチドは、標的領域のヌクレオチドとの相補性を保持する。
【００８８】
二重らせんオリゴヌクレオチド複合体におけるコンジュゲート−リンカーの位置は、結合される単数または複数の鎖（例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方）、修飾される鎖内の単数または複数の位置（すなわち、鎖内のヌクレオチド位置）、及び修飾されるヌクレオチド上の位置（例えば、糖、塩基）に関して、変動する可能性がある。コンジュゲート−リンカーは、１つ以上の鎖の５’及び／又は３’末端に配置することができる。例えば、コンジュゲート−リンカーは、センス鎖の５’末端及び／又はセンス鎖の３’末端及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に配置することができる。コンジュゲート−リンカーは、ホスホジエステル結合を介して、鎖の５’及び／又は３’末端に結合させることができる。好ましい実施形態では、コンジュゲート−リンカーは、ホスホジエステル結合を介して、センス鎖の一端又は両端に、さらに好ましくはセンス鎖の３’末端に結合させる。
【００８９】
コンジュゲート−リンカーはまた、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の内部位置に結合させてもよい。さらに、ヌクレオチドの複数の位置、例えば、ウリジンの５位、シチジンの５位、シチジンの４位、グアノシンの７位、アデノシンの７位、グアノシンの８位、アデノシンの８位、アデノシンの６位、リボースの２’位、リボースの５’位、及びリボースの３’位をコンジュゲートと核酸の結合に用いることができる。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８から選択される配列を含む少なくとも１つのｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に導入することを含む、遺伝子サイレンシングの方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの受動的取込みを可能にすることにより、又はベクターの使用によって導入することができる。
【００９１】
本明細書に開示するどの方法及びキットも、単分子ｓｉＲＮＡ、２つの個別のポリヌクレオチド鎖からなるｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せのいずれを使用することもできる。さらには、本明細書に開示するどの方法も、様々な異なるプロトコルを用いて、遺伝子サイレンシングに使用することができる。１つの非制限的例では、同じ遺伝子をターゲティングする２つ以上のｓｉＲＮＡを同時に投与することができる。個別のｓｉＲＮＡの場合と同様に、２つ以上のｓｉＲＮＡを単回用量若しくは単一トランスフェクションで、複数回用量で、又は状況に応じて、投与することができる。
【００９２】
一実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦＡの過剰発現に関連する疾患を治療する薬剤の製造を目的とする、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現及び／又は活性を阻害する化合物の使用を提供する。薬剤は、例えば、経口、非経口（皮下、筋内、又は静脈内を含む）、直腸、経皮、口腔、又は鼻内に投与することができる。薬剤は、本明細書に記載する化合物のいずれか１つ以上を含んでいてよい。
【００９３】
干渉ＲＮＡは、眼組織注射、例えば、眼周囲、結膜、眼球鞘下、眼房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、球後、又は小管内注射により；カテーテル又はその他の留置装置、
例えば、網膜ペレット、眼内挿入物、座薬、又は多孔性、非多孔性、若しくはゼラチン質材料を含むインプラントを用いて、眼への直接適用により；局部点眼液又は軟膏により；又は盲嚢中の、若しくは強膜に隣接して（経強膜）移植した、若しくは強膜中の（内強膜）、若しくは眼内の徐放装置によって、眼に直接送達してよい。前房内注射は、薬剤が線維柱帯網に到達することができるように、角膜から前房中に実施してよい。小管内注射は、シュレム管に排液する静脈集合路（venous collector channels）内か、又はシュレム
管内に実施してよい。
【００９４】
眼への送達のために、干渉ＲＮＡを、眼科学的に許容される防腐剤、補助溶剤、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、バッファー、塩化ナトリウム、又は水性の滅菌点眼懸濁液若しくは溶液を形成するための水と組み合わせてもよい。溶液製剤は、干渉ＲＮＡを生理学的に許容される等張性水性バッファーに溶解させることによって調製することができる。さらに、溶液は、干渉ＲＮＡの溶解を助けるために、許容される界面活性剤を含んでもよい。化合物の定着を改善するために、粘度上昇剤、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを本発明の組成物に添加してもよい。
【００９５】
滅菌眼軟膏製剤を調製するためには、干渉ＲＮＡを適切なビヒクル、例えば、鉱油、液体ラノリン、又は白色ワセリン中で、防腐剤と組み合わせる。滅菌眼ゲル製剤は、当分野で公知の方法に従い、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（BF Goodrich，Charlotte，NC）などの組合せから調製した親水性塩基中に干渉ＲＮＡを懸濁させることによって調製することができる。眼内注射には、例えば、ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX）を用いてもよい。本発明の他の組成物は、干渉ＲＮＡが眼に浸透しにくい場合、クレメフォール（cremephor）cremophor等の浸透促進剤及びTWEEN（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレエート、Sigma
Aldrich, St. Louis，MO）を含有してもよい。
【００９６】
本発明はまた、製剤上許容される担体中に本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物も提供する。従って、別の実施形態では、本発明は、治療有効量のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物に関し、ｓｉＲＮＡは、（ａ）二重らせん領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖であって、二重らせん領域は、長さが１７〜３０塩基対であり、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８からなる群から選択される配列を有するアンチセンス鎖を含む、上記鎖と；（ｂ）上記アンチセンス領域に対し１００％相補的であるか、１つ以上の位置にミスマッチを有するセンス領域とから構成される。一例では、上記分子は、１９塩基の二本鎖複合体と、センス領域の６位、１３位又は１９位に位置するミスマッチとを形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖から構成され、前記位置は、二重らせん領域の一部であるセンス鎖の５’モストヌクレオチドに対して決定される。上に記載したすべてのものについて、以下の修飾を採用することができる：センス領域１位及び２位ならびにすべてのＣ及びＵが、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、センス領域の他のすべての２’位置が、２’−ＯＨ基を有する；アンチセンス領域のすべてのＣ及びＵが２’−Ｆ修飾され、アンチセンス領域の他のすべてのヌクレオチドが２’−ＯＨ基を有する；また、アンチセンス領域の１位のヌクレオチドがリン酸化されて、アンチセンス領域の３’末端に結合するＵＵ突出部がある；アンチセンス鎖の二重らせん領域の、突出部の２つのヌクレオチド同士、ならびに突出部の第一のヌクレオチドと３’モストアンチセンスヌクレオチドとのヌクレオチド間結合は、チオリン酸結合である；ならびに、コレステロール部分が、Ｃ５リンカーによってセンス領域の３’末端に結合されている。さらに別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、前述したものと同じ特徴を有するが、アンチセンス鎖は、２’−Ｆ修飾ではなく、少なくとも１つの２’−Ｏ−
Ｍｅ修飾を有する。
【００９７】
製剤上許容される担体は、１つ以上の賦形剤、例えば、ビヒクル補助剤、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、等張化剤、安定剤及び湿潤剤を含んでもよい。さらには、いくつかの実施形態において、例えば、コアセルベーション技術により、又はコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル又はマイクロエマルション）中での界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）により、ｓｉＲＮＡをマイクロカプセル中で送達する。
【００９８】
現在知られている方法、又は今後知られるようになる方法、及び本発明の開示内容から、当業者が、ｓｉＲＮＡによる細胞膜の貫通を可能にする上で本発明に関して有用であろうと判断する方法のいずれかによって、細胞又は生物にｓｉＲＮＡを導入することができる。このような方法として、限定するものではないが、任意のトランスフェクション方法、例えば、DEAE-Dextran、リン酸カルシウム、カチオン性脂質／リポソーム、ミセル、圧力操作、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノポレーション、ベクター（例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細胞融合物など）の使用、ポリヌクレオチドと特異的コンジュゲート又はリガンド（例えば、抗体、抗原、又は受容体など）との結合、受動的導入、ｓｉＲＮＡの取込みを促進する部分のｓｉＲＮＡへの添加などを用いたトランスフェクションが含まれる。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、以下の病態：乾癬、癌、慢性関節リウマチ、眼の血管新生、血管形成の異常、網膜血管透過性、網膜浮腫、糖尿病網膜症（特に、増殖性糖尿病網膜症）、糖尿病黄斑浮腫、浸出型加齢黄斑変性、網膜虚血に関連する続発症、及び眼球後区血管新生の１つ以上を治療、阻害又は改善するための薬剤の製造において、ＶＥＧＦＡをターゲティングするｓｉＲＮＡの使用を特徴とする。本発明のｓｉＲＮＡのレシピエントは、例えば、前述した疾患の１つ以上に罹患している人でよい。
【０１００】
ｓｉＲＮＡの用量は、好ましくは治療有効量である。治療有効量は、少なくとも部分的に、治療しようとする生物の年齢、体重及び罹患の状態又は重症度によって、決定される。
【０１０１】
本発明のｓｉＲＮＡの例には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、及び８８から選択されるアンチセンス配列と、表１の対応するセンス鎖が含まれ得る。
【０１０２】
表１は、実施例のセクションに記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した４２の非修飾ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性を示す。
【表１】
2013539456.tif 000007
2013539456.tif 000008
【０１０３】
表２は、非修飾及びｓｉＳｔａｂｌｅ修飾フォーマットにおけるｓｉＲＮＡのサイレンシング活性を示す。具体的には、Ｄ及びＥ列のデータは、２４時間時点の非修飾分子から得られたものである。Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ列のデータは、７２時間後のｓｉＳｔａｂｌｅ修飾分子から得られたものである。Ｆ及びＧ列のデータは、ｓｉＲＮＡを１００ｎＭ濃度の細胞にトランスフェクトして得られたものである。
【表２】
2013539456.tif 000009
【０１０４】
上に挙げた二重らせんはミスマッチを含まないことに留意されたい。本発明は、具体的に挙げるｓｉＲＮＡと、これらを含む医薬組成物及びそれらを使用するための方法を含む。本発明はまた、前述したものと類似しているが、センス鎖の６位若しくは１３位若しくは１９位、又はセンス鎖の６位と１３位の両方若しくは１３位と１９位の両方若しくは６位と１９位の両方又はセンス鎖の６位、１３位及び１９位の全部に異なる塩基を有するｓｉＲＮＡも含む。従って、これら位置のいずれかに、表１又は２において、Ｕに相補的なＡがある場合、Ｕ、Ｃ又はＧを挿入してもよく、表１又は２において、Ａに相補的なＵがある場合、Ａ、Ｃ又はＧを挿入してもよく、表１又は２において、Ｇに相補的なＣがある場合、Ｕ、Ａ又はＧを挿入してもよく、表１又は２において、Ｃに相補的なＧがある場合、Ｕ、Ｃ又はＡを挿入してもよい。さらにまた、これらｓｉＲＮＡのいずれかが突出領域、例えば、ＵＵ３’アンチセンス突出部及び／又はＵＵ３’センス突出部を含んでもよい。
【０１０５】
さらに別の例として、一実施形態では、本発明は、表２に記載のｓｉＲＮＡ、又はセンス鎖が、６位、１３位及び１９位に位置する３つのミスマッチヌクレオチドを有し、アンチセンスには相補的ヌクレオチドを有する点で、表２のものとは異なるｓｉＲＮＡ、例えば、センス鎖が、６位、１３位及び１９位に位置する３つのミスマッチヌクレオチドを有する以外は、ｖｅｇｆａ３．７と同じセンス及びアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、１つ以上、例えば、２つ又は３つのミスマッチ塩基が逆鎖の塩基と同じであり、それ以外のミスマッチ塩基は二重らせんに存在しないように選択される。非制限的例として、ｖｅｇｆａ３．７の場合、二重らせんは、以下の通りでよい：
ＳＳ−５’ＡＧＡＧＡＵＡＡＧＡＧＡＵＡＧＵＧＵＡ３’（配列番号91）
ＡＳ−３’ＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＣＡＡ５’（配列番号54）
【０１０６】
この二重らせんは、本明細書に開示する他の任意の二重らせんと同様に、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに３’突出部を含んでもよい。非制限的例として、ジヌクレオチド突出部、例えば、ＵＵがあってもよい。この突出部は、センス鎖に存在するが、アン
チセンス鎖には存在しない；アンチセンス鎖には存在するが、センス鎖には存在しない；両鎖に存在するか、又はどちらの鎖にも存在しなくてもよい。各突出部は、突出部のヌクレオチド同士の標準的ヌクレオチド間結合と、二重らせんの適切な鎖の３’末端との標準的結合を有するように構築してもよいし、又は突出部において、突出部の２つのヌクレオチド同士、ならびに突出部の最初のヌクレオチドと、この鎖の二重らせん領域の３’モストアンチセンスヌクレオチドとの結合はチオリン酸結合であってもよい。従って、例えば、前段落のｖｅｇｆａ３．７二重らせんにおいて、配列番号５４は、ＵＵ３’アンチセンス突出部を含んでもよく、これは、突出部のヌクレオチド同士の間、若しくは突出部と配列番号５４の３’との間にチオリン酸結合を含まないか、又はこれらの位置の一方若しくは両方にチオリン酸結合があってもよい。
【０１０７】
別途記載のない限り、前述した実施形態の各々の特徴はいずれも、他の実施形態のいずれに用いてもよい。ただし、こうした使用が実施形態と不適合であるか、調和しない場合を除く。
【０１０８】
ある程度詳細に本発明を説明してきたが、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限する意図はなく、また、制限すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のための一般技法
【０１１０】
試験のためのｓｉＲＮＡ選択
【０１１１】
ＶＥＧＦＡのすべての変異体をターゲティングすることができるｓｉＲＮＡの収集物を同定した（NM 001025366、NM 003376、NM 001025367、NM 001025368、NM 001033756、NM 001025369、NM 001025370）。表１は、センス及びアンチセンス鎖配列（５’→３’）に
沿ったｓｉＲＮＡの一覧を示す。
【０１１２】
各ｓｉＲＮＡの相対官能性を評価するために、２’ＡＣＥ化学（米国特許第6,008,400
号明細書；米国特許第6,111,086号明細書；米国特許第6,590,093号明細書；Scaringe (2000) Methods in Fnzymology 317:3-18; Scaringe(2001)Methods 23(3):206-217）を用い
て配列を合成し、次に、製造者のプロトコル（96ウェルフォーマットにおいてウェル当たり10,000細胞、100nMsiRNA,0.2μlDharmalFECT1／ウェル）を用いて、脂質媒介トランス
フェクションによりHeLa細胞（ATCC、#CCL-2）にトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、全細胞生存性及びｍＲＮＡでの標的ノックダウン及びタンパク質レベルを決定した。すべてのアッセイは３回反復して、ｓｉＲＮＡの選択群について実施し、ｓｉＲＮＡ／標的ｍＲＮＡ対のＩＣ５０を確認するため、用量曲線（0.001、0.01、0.1、1.0、10.0及び100nM）を実施した。正及び負の対照がすべての実験に含まれ、これらは、非ターゲティング対照（NTC＃5センス鎖配列：5'-UGGUUUACAUGUCGACUAAUU-3'（配列
番号89））及びPPIBをターゲティングする正の対照（センス鎖配列：5'-ACAGCAAAUUCCAUCGUGU-3'（配列番号90））からなる。注記：これらの試験に用いられる正の対照の分子は
、以下の修飾を含む：センス鎖は、鎖の５’末端から数えて最初の２つのヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾を含み；アンチセンス鎖は、５’リン酸基を含み；センス及びアンチセンスの両鎖は、３’末端に２ヌクレオチドＵＵ突出部を含む。
【０１１３】
標的ｍＲＮＡ及びタンパク質ノックダウン分析
【０１１４】
トランスフェクションから７２時間後、分枝ＤＮＡアッセイ（QuantiGeneScreen Kit, Panomics)を用いて、標的ｍＲＮＡノックダウンを決定した。PPIBの発現を基準ｍＲＮＡ
として用いて、標的ｍＲＮＡノックダウンを、対応する非ターゲティング対照（NTC）に
対しさらに基準化した。トランスフェクションから７２時間後、トランスフェクトした細胞からの上澄みに対してＶＥＦＧＡ  ＥＬＩＳＡアッセイを実施することにより、タンパク質発現を評価した。ＥＬＩＳＡは、５０μＬの上澄みを用いて、製造者の指示に従い実施した（Human VEGFA ELISA kit, Thermo Scientific）。吸光度を分光光度計で４５０ｎＭにて読み取った。データを、対応するＮＴＣ対照に対し基準化した。
【０１１５】
細胞生存性アッセイ
【０１１６】
トランスフェクションから７２時間後、細胞生存性をレサズリンアッセイにより評価した。レサズリンを培地に直接添加し、プレートを１〜１．５時間インキュベートした後、Wallac VICTOR 2（Perkin Elmer Life Sciences)プレートリーダーで蛍光を測定した（励起530nm、放射590nm及び1秒暴露）。データを、対応するＮＴＣ対照に対し基準化した。
【０１１７】
試験のためのｓｉＲＮＡ設計
【０１１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で試験するｓｉＲＮＡ構成は、（１）標準的非修飾設計（１９塩基対二重らせん、センス及びアンチセンス両鎖の３’末端にＵＵ突出部）と、（２）安定化設計（１９塩基対二重らせん；センス鎖修飾：ヌクレオチド１及び２（鎖の５’末端から数えて）に２’−Ｏ−メチル修飾、さらに、すべてのＣ及びＵに２’−Ｏ−メチル修飾；アンチセンス鎖修飾：５’末端ヌクレオチドにリン酸エステル、すべてのＣ及びＵに２’Ｆ修飾、３’末端に２ヌクレオチド（UU）突出部、ならびに突出部の２つのヌクレオチド同士の間、及び二重らせんの最初の（３’モスト）ヌクレオチドと突出部の最初のヌクレオチドとの間のチオリン酸ヌクレオチド間修飾）とを含む。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、ｓｉＲＮＡは以下の設計を含む：
・１９ｂｐ二重らせん
・センス鎖修飾
・ヌクレオチド１及び２（鎖の5’末端から数えて）に２’−Ｏ−メチル修飾
・すべてのＣ及びＵに２’−Ｏ−メチル修飾
・Ｃ５リンカーを用いて３’末端に結合させたコレステロール（2009年8月20日に公
開された米国特許出願公開第2009/0209626号明細書を参照のこと。尚、その開示内容は、全文が本明細書に記載されているのと同様に、参照として本明細書に組み込むものとする）
・アンチセンス鎖修飾
・５’リン酸
・すべてのＣ及びＵに２’Ｆ
・３’末端に２つのヌクレオチド（UU）突出部
・突出部の２つのヌクレオチド同士の間、及び二重らせんの最初の（3’モスト）ヌ
クレオチドと突出部の最初のヌクレオチドとの間のチオリン酸ヌクレオチド間修飾。
【０１２０】
さらに、６位、１３位及び１９位のミスマッチは、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で用いる分子に組み込んだ。すべてのケースで、ｓｉＲＮＡの両鎖間のミスマッチは、センス鎖のヌクレオチドが、その位置で一般的に対合する塩基（アンチセンス鎖の）と同一性を有するようにヌクレオチドを変更することにより達成した。従って、例えば、センス鎖６位でセンス−アンチセンス対が、通常、Ｕ−Ａであれば、この対をＡ−Ａに転換することによってミスマッチを導入する。同様に、センス鎖６位でセンス−アンチセンス対が、Ｇ−Ｃである場合には、ミスマッチはＣ−Ｃとなる。このようにして、ミスマッチを二重らせんに組み込むが、アンチセンス鎖は、意図する標的の逆相補配列を保持する。
【０１２１】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験の結果
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験したすべての配列の性能を表１に示す。多くの配列が、ＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方で７０％を超える遺伝子ノックダウンをもたらすことが観察され、そのような配列として、例えば、Ｖｅｇｆａ２．２、２．３、２．４、２．１２、３．１、３．２、３．３、３．５及び３．７がある。さらに、収集物のサブセットを安定化設計について試験したところ、全体性能が、非修飾状態で観察されたものと同等が、又はそれより優れていることがわかった（例えば、Vegfa2.1、3.2、3.3を参照）。表２が示すように、非修飾及び修飾状態の両方で、ＲＮＡノックダウンのＩＣ５０は、約０．１１→２３ｎＭの範囲であり、また、タンパク質ノックダウンのＩＣ５０は、約０．１７→３．１７ｎＭの範囲であった。これらの結果に基づき、２つの配列、Ｖｅｇｆａ３．２及び３．７は、以前記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ設計（「Ａｃｃｅｌｌ」と呼ぶ）を用いて再合成した。これらの実験の結果については、添付の図面を参照にして、さらに詳しく説明することにする。
【０１２３】
図１（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ、ラット網膜において、注射から７２時間後の、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現に対するＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ  ｓｉＲＮＡの硝子体内（IVT）注射の作用を示す。Lewisラットは、１ＸｓｉＲＮＡバッファー（Dharmacon)に再懸濁させたＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．２、Z  ＶＥＧＦＡ３．７又はＡ
ｃｃｅｌｌ非標識対照＃１（NTC1）ｓｉＲＮＡの１０μｇＩＶＴ注射（OD）を受けた。Ａｃｃｅｌｌ  ＮＴＣ１ｓｉＲＮＡセンス鎖配列は、５’−ＵＧＧＵＵＡＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ−３’（配列番号92）であり、Ａｃｃｅｌｌ  ＮＴＣ１ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖配列は、５’−ＵＵＡＧＵＣＧＡＣＡＵＧＵＡＡＡＣＣＡＵＵ−３’（配列番号93）である。対側の眼（OS）は処理しなかった。注射から７２時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。（図１(Ａ)）Ｔｒｉｚｏｌ（Invitrogen)を用いて、全ＲＮＡを抽出
し、ＶＥＧＦＡ及びβ−アクチン（ACTB）ｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ ｑＲＴ−ＰＣ
Ｒアッセイ（AppliedBiosystems）により決定した。ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現をβ−ア
クチン発現に対し基準化した。（図１(Ｂ))RIPAバッファー（Pierce)を用いて、タンパク質を抽出してから、ラットＶＥＧＦＡタンパク質レベルをELISA（R&D Systems)により決
定した。ＶＥＧＦＡタンパク質発現を、BCAアッセイ（Pierce)により決定した全タンパク質に対し基準化した。データは、平均値（n=6）±標準偏差（エラーバー）として表す。
＊：ＮＴＣ１に対してＰ＜０．００１。いずれのＶＥＧＦＡ  ｓｉＲＮＡも有意にＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現を低減し、ＶＥＧＦＡ３．７はまた、ＶＥＧＦＡ及びタンパク質も有意に低減した。ＮＴＣ１対照ｓｉＲＮＡは，ＶＥＧＦＡ発現に対する作用は、あったとしても極めてわずかであった。
【０１２４】
図２は、ラット網膜におけるＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．２ｓｉＲＮＡと対照ｓｉＲＮＡについての用量応答曲線の比較を示す。Lewisラットは、１ＸｓｉＲＮＡバッファー
（Dharmacon)に再懸濁させたＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．２又はＡｃｃｅｌｌ  ＮＴＣ１対照ｓｉＲＮＡの１〜２５μｇＩＶＴ注射（OD）を受けた。対側の眼（OS）は処理しなかった。注射から７２時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。ＴｒｉｚｏｌＰｌｕｓ（Invitrogen)を用いて、全ＲＮＡを抽出し、ＶＥＧＦＡ及びβ−アクチンｍＲＮ
ＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（Applied Biosystems)により決定し
た。ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現をβ−アクチンｍＲＮＡに対し基準化した。データは、基準化ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現についての平均ＯＤ：ＯＳ比（処理した眼と非処理の眼におけるＶＥＧＦＡレベルの比）（n=6）±標準偏差（エラーバー）として表す。＊、＊＊
：Ａｃｃｅｌｌ  ＮＴＣ１に対して、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ  ｓｉＲＮＡ３．２の量を増加して硝子体内注射すると、２５μｇでＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現のほぼ完全なサイレンシングを達成する用量応答が得られた。
【０１２５】
図３（Ａ）及び（Ｂ）は、ラット網膜におけるＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ｓｉ
ＲＮＡと対照ｓｉＲＮＡについての用量応答曲線の比較を示す。Lewisラットは、１Ｘｓ
ｉＲＮＡバッファー（Dharmacon)に再懸濁させたＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７又はＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７切断部位ミスマッチ（CS MM）対照ｓｉＲＮＡの１〜５０
μｇＩＶＴ注射（OD）を受けた。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ＣＳ  ＭＭ対照ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ標的配列に対する３ヌクレオチドミスマッチを除いて、Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ｓｉＲＮＡと同じ配列を有する。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ＣＳ  ＭＭ  ｓｉＲＮＡセンス鎖配列は、５’−ＡＧＡＧＡＵＡＡＣＵＣＡＵＡＧＵＧＵＡ−３’（配列番号９４）；Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ＣＳ  ＭＭ対照ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖配列は、５’−ＡＡＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＵＵＣＵＣＵＵＵ−３’（配列番号９５）である。対側の眼（OS）は処理しなかった。注射から７２時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。（図３(Ａ)）Trizol（Invitrogen)を
用いて、全ＲＮＡを抽出し、ＶＥＧＦＡ及びβ−アクチンｍＲＮＡレベルをTaqman ｑＲ
Ｔ−ＰＣＲアッセイ（Applied Biosystems)により決定した。ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現
をβ−アクチンｍＲＮＡ発現に対し基準化した。（図３(Ｂ))RIPAバッファー（Pierce)を用いて、タンパク質を抽出してから、ラットＶＥＧＦ−ＡレベルをELISA（R&D Systems)
により決定した。ＶＥＧＦＡタンパク質発現を、BCAアッセイ（Pierce)により決定した全タンパク質レベルに対し基準化した。データは、基準化ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の平均ＯＤ：ＯＳ比（n=6）±標準偏差（エラーバー）として表す。＊：Ｐ＜０
．０３、＊＊：Ｐ＜０．０００２、＃：Ｐ＜０．００５。硝子体内注射Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ｓｉＲＮＡは、５μｇという低い用量で、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でＶＥＧＦＡ発現に有意な低減を引き起こした。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ｓｉＲＮＡは、２５μｇｓｉＲＮＡで、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ発現が＞７０％阻害、ＶＥＧＦＡタンパク質発現が約８０％阻害に達する用量応答を呈示した。対照ｓｉＲＮＡによる、ＶＥＧＦＡ発現の非ＲＮＡｉ媒介阻害も観察された。この効果については、ＶＥＧＦＡタンパク質は、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡほど顕著ではなかった。
【０１２６】
図４（Ａ）及び（Ｂ）は、Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ｓｉＲＮＡの作用の持続時間を示す。Lewisラットは、１ＸｓｉＲＮＡバッファー（Dharmacon)に再懸濁させたＡ
ｃｃｅｌｌＶＥＧＦＡ  ３．７  ｓｉＲＮＡ又はＡｃｃｅｌｌ  ＮＴＣ１対照ｓｉＲＮＡの２５μｇＩＶＴ注射（OD）を受けた。対側の眼（OS）は処理しなかった。注射から１、３、７、１４、２８、４２、及び５６時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ（図４(Ａ)）とＶＥＧＦＡタンパク質（図４(Ｂ)）の発現を前掲の実施例に記載したように評価した。データは、基準化ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の平均ＯＤ：ＯＳ比（n=6）±標準偏差（エラーバー）として表す。＊、＃：ＮＴ
Ｃ１に対してＰ＜０．００１、Ｐ＜０．００２。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ｓｉＲＮＡを硝子体内注射すると、２４時間以内に、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の有意な阻害を引き起こした。阻害は、数週間持続した。
【０１２７】
図５（Ａ）及び（Ｂ）は、ラット酸素誘導網膜症（OIR）モデル（Penn et al., Pediatr. Res. 36:724-731, 1994から改変）における、ＶＥＧＦＡタンパク質発現及び網膜前血管新生の阻害をそれぞれ示す。１４日の５０％〜１０％Ｏ２の循環後、新生Sprague Dawleyラットを室内空気（21%O2）に７日間暴露した（生後１５〜２１日、すなわちP15〜P21
）。Ｐ１５及びＰ１８日に、ラットは、１ＸｓｉＲＮＡバッファー（Dharmacon)に再懸濁させたＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ  ｓｉＲＮＡ３．７又はＡｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ＣＳ  ＭＭ対照ｓｉＲＮＡの２５μｇＩＶＴ注射（OS）を受けた。対側の眼（OD）は、ビヒクル（1XsiRNAバッファー）で処理した。注射量は１μｌであった。Ｐ２１日に、
眼を採取し、網膜を解剖により分離した。（図５(Ａ)）RIPAバッファー（Pierce)を用い
て、タンパク質を抽出し、ＶＥＧＦＡタンパク質レベルをELISA（R&D Systems)により決
定した。ＶＥＧＦＡタンパク質発現をBCAアッセイ（Pierce)により決定した全タンパク質レベルに対し基準化した。データは、平均基準化ＶＥＧＦＡタンパク質発現（n=7）±標
準偏差（エラーバー）として表す。＊：Ｐ＜０．０３。（図５(Ｂ)）網膜を１０％中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定し、ADPase染色に付した後、全取付け物としてスライドに固定した。Nikon Coolscope（登録商標）を用いて、画像を取得し、網膜当たり１２セク
ターの各々を血管新生の存在又は非存在について評価することにより、時間スコア（clockhour score）を取得した（n=6〜8）。＃：Ｐ＜０．０５。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３
．７  ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦＡタンパク質発現に有意な低減（約４０％）を引き起こし、網膜前血管新生の約８８％阻害を達成した。Ａｃｃｅｌｌ  ＶＥＧＦＡ３．７  ＣＳ  ＭＭ対照ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ発現又は血管新生のいずれにも有意な作用をもたらさなかった。
【０１２８】
当業者であれば認識されるように、ラットで得られた観測値をヒトに外挿することは公知である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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