(57)【要約】  Ｅ２ａ、Ｓ４（ｏｒｆ６）、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子およびパルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニットに関するアデノウイルスＤＮＡ配列を含むアデノウイルス由来ヘルパーウイルスが記載される。また、種々のアデノウイルス由来ヘルパーウイルス／ベクターの使用に基づく、組換えパルボウイルス（粒子）を効率的に作製する方法も記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアデノウイルスＤＮＡ配列：
（ａ）Ｅ２ａ遺伝子；
（ｂ）Ｅ４（ｏｒｆ６）遺伝子；
（ｃ）ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子；および
（ｄ）パルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニット
を含む、アデノウイルス由来ヘルパーウイルス。
【請求項２】
前記パルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニットの発現がＣＭＶプロモーターの制御下にある、請求項１に記載のアデノウイルス由来ヘルパーウイルス。
【請求項３】
（ｉ）哺乳動物細胞が（ａ）ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子を欠く組換えパルボウイルスベクター、（ｂ）パルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクター、および（ｃ）Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４（ｏｒｆ６）遺伝子およびＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子由来のアデノウイルスＤＮＡ配列を含むアデノウイルス由来ヘルパーベクターでトランスフェクトされること、ならびに
（ｉｉ）前記組換えパルボウイルスが哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されること
を特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）哺乳動物細胞に（ａ）ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子を欠く組換えパルボウイルス、および（ｂ）請求項１または２に記載のアデノウイルス由来ヘルパーウイルスを感染させること；および
（ｉｉ）前記組換えパルボウイルスが前記哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されること
を特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞がＮＢＫ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えパルボウイルスがＨ−１またはＭＶＭに由来する、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘルパーウイルス／ベクターのアデノウイルスＤＮＡ配列がＡｄ５に由来する、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えパルボウイルスベクターにおいて、前記ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子が導入遺伝子により置換される、請求項３〜８のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入遺伝子の発現がＰ３８プロモーターの制御下にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入遺伝子がマーカータンパク質をコードする遺伝子である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記導入遺伝子が治療用または免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療用タンパク質が細胞傷害性ポリペプチド、サイトカインおよび／またはケモカインである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項３〜１３のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる組換えパルボウイルス。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えパルボウイルスを含有する細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組換えパルボウイルスと薬学上許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
遺伝子療法または腫瘍を治療する方法に用いられる請求項３〜１３のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる組換えパルボウイルス。
【請求項１８】
請求項１または２に記載のアデノウイルス由来ヘルパーウイルス／ベクターと組換えパルボウイルスを含有する組成物。
【請求項１９】
前記アデノウイルス由来ヘルパーウイルスおよび前記組換えパルボウイルスが導入遺伝子を含有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物を含有する細胞。
【請求項２１】
遺伝子療法または腫瘍の治療を目的とする医薬組成物の製造のための、請求項３〜１３のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる組換えパルボウイルスまたは請求項１８もしくは１９に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅ２ａ、Ｅ４（ｏｒｆ６）、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子およびパルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニットに関するアデノウイルスＤＮＡ配列を含むアデノウイルス由来ヘルパーウイルスに関する。本発明はまた、種々のアデノウイルス由来ヘルパーウイルス／ベクターの使用に基づく、組換えパルボウイルス（粒子）を効率的に作製する方法にも関する。
【０００２】
パルボウイルスは二十面体の一本鎖ＤＮＡウイルスである。それらのゲノムは約５．１キロベースであり、それぞれ非構造（ＮＳ１およびＮＳ２）タンパク質および構造（ＶＰ１およびＶＰ２）タンパク質の発現を駆動するＰ４プロモーターおよびＰ３８プロモーターを含む。パルボウイルスはディペンドウイルスおよびエリスロウイルスとともにパルボウイルス(Parvovirinae)科に属す。ディペンドウイルスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ: adeno-associated viruses）を含む。これらのウイルスは、その名が示すように、増殖的感染サイクルをアデノウイルスのようなヘルパーウイルスに依存する［非特許文献１］。他方、エリスロウイルスおよびパルボウイルスは自律性があり、ヘルパーウイルスなしでそれらの増殖周期を全うすることができる。エリスロウイルスには、ヒトに対して病原性があることが知られているＢ１９が含まれる。
【０００３】
齧歯類パルボウイルスはヒトにとっては非病原性であり、腫瘍親和性および腫瘍溶解性を示し、このことは齧歯類パルボウイルスを癌療法に極めて魅力的な薬剤とする。齧歯類パルボウイルスの固有の抗新生物能をさらに増強するため、癌細胞に抗腫瘍導入遺伝子を送達するための組換えウイルスが作出された。この方法論は、ＶＰキャプシド遺伝子を特定の導入遺伝子で置換することからなる［非特許文献２］。これらのベクターはＮＳ１／２コード配列（パルボウイルスＰ４プロモーターの制御下）と、ウイルスＤＮＡの増幅およびパッケージングに必要なパルボウイルスゲノムテロメアを保持する。着目する導入遺伝子は一般にＰ３８プロモーターの制御下で発現され、ＮＳ１タンパク質によってトランスで強く活性化される。前記組換えウイルスの生産はＶＰタンパク質をトランスで提供する生産細胞でのみ起こり得る。ウイルスゲノムにおいてキャプシドコード領域を欠失させると、最大およそ２５００ｎｔの導入遺伝子を挿入する機会が得られるが、大きなＶＰ欠失は、おそらくは重要なウイルスパッケージングシス作用要素の抑制のために、生産力価を著しく低下させる［非特許文献２］。このようにして作出された組換えパルボウイルスベクターは複製に欠陥があり、複製可能な同じものに比べてさらなる治療上の安全性という利点を提供する。組換えパルボウイルスにより首尾よく形質導入される導入遺伝子の例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（例えば、プロドラッグであるガンシクロビルと併用される）［非特許文献３］またはアポプチン［非特許文献４］などの毒性遺伝子が挙げられる。これらの導入遺伝子発現するビリオンは、野生型ウイルスに比べて改善された抗新生物活性を有する。また、インターロイキン−２（ＩＬ−２）または単球走化性タンパク質(Monocyte Chemotactic Protein)１もしくは３（ＭＣＰ−１）のようなサイトカイン類またはケモカイン類［非特許文献５〜８］、インターフェロン−γ−誘導性タンパク質(Interferon-y-inducible protein)（ＩＰ−１０）［非特許文献９］といった免疫調節遺伝子をコードする組換えパルボウイルスも作出されている。これらのビリオンは、種々のin vitroおよびin vivo腫瘍モデルで強力な抗腫瘍バイスタンダー効果を誘導する。最近、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）とＩＰ−１０を形質導入する組換えウイルスの組合せを用いて抗腫瘍相乗作用が見られた［非特許文献１０］。
【０００４】
ＡＡＶ複製に対するアデノウイルスのヘルパー活性は鋭意研究されている。アデノウイルスＥ１Ａタンパク質は、ＡＡＶ−２  Ｐ５  ｒｅｐプロモーターと結合してこれを活性化することによりＡＡＶ遺伝子発現の活性化に必須である［非特許文献１２］。同様に、別のアデノウイルスタンパク質Ｅ２Ａは、ＡＡＶ−２  Ｐ５プロモーターの転写を活性化する［非特許文献１３］。Ｅ２Ａはまた、ウイルス関連ＲＮＡ  Ｉ（ＶＡＩ  ＲＮＡ）と共働してＡＡＶ−２  ＲＮＡの翻訳を促進するものと思われる［非特許文献１４］。アデノウイルスＥ４（ｏｒｆ６）は、in vitroおよびin vivoの双方でウイルスＤＮＡ複製の律速段階である、一本鎖組換えＡＡＶ−２ゲノムの二本鎖ゲノムへの変換を促進する［非特許文献１５］。ＶＡＩ  ＲＮＡはまた、ＡＡＶ−５の複製も助けることができる。ＶＡＩ  ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）と物理的に相互作用する（そうでなければこのキナーゼはウイルスタンパク質の生産を遮断する抗ウイルス性免疫応答を惹起する）ことが記載されている［非特許文献１６］。
【０００５】
組換えＡＡＶ−２を用いた研究によれば、ヘルパー効果にはアデノウイルス遺伝子の少数の一部で十分であることが確認されている。Ｅ１遺伝子をトランスで供給するＨＥＫ２９３細胞では、組換えＡＡＶ−２の十分な生産のための最少の遺伝子セットはＥ２ａ、Ｅ４（ｏｒｆ６）およびＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子である［非特許文献１７、非特許文献１８］。この遺伝子セットを含有するｐＸＸ６と呼ばれるヘルパープラスミドは現在、アデノウイルスを含まない組換えＡＡＶ−２の生産に用いられている［非特許文献１８］。このプラスミドは、感染力のあるアデノウイルスと同様の方法でＡＡＶ−２の生産を助ける［非特許文献１８、非特許文献１９］。アデノウイルス遺伝子（Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子）はまた、ＨＥＫ２９３細胞でのヒトエリスロウイルスＢ１９ＤＮＡ複製およびウイルス生産を可能とする（そうでなければ、この細胞はＢ１９を許容しない）［非特許文献２０］。
【０００６】
しかしながら、アデノウイルスと自律性パルボウイルスとの間の相互作用は依然としてあまり探求されていない。正常ヒト胚肺細胞の二次培養物におけるＨ−１パルボウイルスの複製は、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルス血清型１２を同時感染させない限り、開始されない［非特許文献２１］。さらに、アデノウイルス血清型２は、ＨｅＬａ細胞において、ＭＶＭｐパルボウイルスＤＮＡ複製の増強を誘導し、宿主の仁からアデノウイルス複製工場にＭＶＭｐ  ＤＮＡを再局在させる［非特許文献２２］。
【０００７】
臨床応用のための組換えパルボウイルス（ｒｅｃ．ＰＶ）の開発および至適化における主要な挑戦の１つが、生産されるウイルスの量を増やすことである。それらは非増殖性であるために、その生産はパッケージング細胞系統（通常はヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３または２９３Ｔ）へのパルボウイルスゲノム成分のトランスフェクション効率にのみ依存する。また、ＶＰタンパク質を構成的に発現するパッケージング細胞系統を使用しても、組換えパルボウイルスの生産は有意に改善されない［非特許文献１１］。組換えパルボウイルス生産を増大させる手段を開発することがなお極めて重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Atchison, R.W., B.C. Casto, and W.M. Hammon, Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science, 1965. 149: p. 754-6.
【非特許文献２】Kestler, J., et al., cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on automous parvoviruses. Hum Gene Ther, 1999. 10(10): p. 1619-32.
【非特許文献３】Dupont, F. , et al., Tumor-selective gene transduction and cell killing with an oncotropic automous parvovirus-based vector. Gene Ther, 2000. 7(9): p. 790-6.
【非特許文献４】Olijslagers, S., et al., Potentiation of a recombinant oncolytic parvovirus by expression of Apoptin. Cancer Gene Ther, 2001. 8(12): p. 958-65.
【非特許文献５】El Bakkouri, K. , et al., In vivo anti-tumour activity of recombinant MVM parvoviral vectors carrying the human interleukin-2 cDNA. J Gene Med, 2005. 7(2): p. 189-97.
【非特許文献６】Haag, A., et al . , Highly efficient transduction and expression of cytokine genes in human tumor cells by means of automous parvovirus vectors; generation of antitumor responses in recipient mice. Hum Gene Ther, 2000. 11(4): p. 597-609.
【非特許文献７】Wetzel, K. , et al., Transduction of human MCP-3 by a parvoviral vector induces leukocyte infiltration and reduces growth of human cervical carcinoma cell xenografts . J Gene Med, 2001. 3(4): p. 326-37.
【非特許文献８】Wetzel, K. , et al . , MCP-3 (CCL7) delivered by parvovirus MVMp reduces tumorigenicity of mouse melanoma cells through activation of T lymphocytes and NK cells. Int J Cancer, 2007. 120 (6) : p. 1364-71.
【非特許文献９】Giese, N.A., et al., Suppression of metastatic hemangiosarcoma by a parvovirus MVMp vector transducing the IP-10 chemokine into immunocompetent mice. Cancer Gene Ther, 2002. 9(5) : p. 432-42.
【非特許文献１０】Enderlin, M., et al., TNF-alpha and the IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-lO/CXCL-10) delivered by parvoviral vectors act in synergy to induce antitumor effects in mouse glioblastoma. Cancer Gene Ther, 2009. 16(2): p. 149-60.
【非特許文献１１】Brandenburger, A. and S. Russell, A novel packaging system for the generation of helper-free oncolytic MVM vector stocks. Gene Ther, 1996. 3(10): p. 927-31.
【非特許文献１２】Chang, L.S., Y. Shi, and T. Shenk, Adeno-associated virus P5 promoter contains an adenovirus E1A-inducible element and a binding site for the major late transcription factor. J Virol, 1989. 63(8): p. 3479-88.
【非特許文献１３】Carter, B.J., B.A. Antoni, and D.F. Klessig, Adenovirus containing a deletion of the early region 2A gene allows growth of adeno-associated virus with decreased efficiency. Virology, 1992. 191(1): p. 473-6.
【非特許文献１４】Janik, J.E., et al., Efficient synthesis of adeno-associated virus structural proteins requires both adenovirus DNA binding protein and VA I RNA. Virology, 1989. 168(2): p. 320-9.
【非特許文献１５】Fisher, K.J., et al . , Transduction with recombinant adeno-associated virus for gene therapy is limited by leading-strand synthesis. J Virol, 1996. 70(1): p. 520-32.
【非特許文献１６】Nayak, R. and D.J. Pintel, Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper ａdenovirus type 5 virus-associated RNA. J Virol, 2007. 81(21): p. 11908-16.
【非特許文献１７】Grimm, D. and J.A. Kleinschmidt, Progress in adeno-associated virus type 2 vector production: promises and prospects for clinical use. Hum Gene Ther, 1999. 10(15): p. 2445-50.
【非特許文献１８】Xiao, X., J. Li, and R.J. Samulski, Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol, 1998. 72(3): p. 2224-32.
【非特許文献１９】Grimm, D., et al., Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther, 1998. 9(18): p. 2745-60.
【非特許文献２０】Guan, W., et al., The genome of human parvovirus b19 can replicate in nonpermissive cells with the help of adenovirus genes and produces infectious virus. J Virol, 2009. 83(18): p. 9541-53.
【非特許文献２１】Ledinko, N. and H.W. Toolan, Human adenovirus type 12 as a "helper" for growth of H-1 virus. J Virol, 1968. 2(2): p. 155-6.
【非特許文献２２】Fox, E., P.T. Moen, Jr., and J.W. Bodnar, Replication of minute virus of mice DNA in adenovirus-infected or adenovirus-transformed cells. Virology, 1990. 176(2): p. 403-12.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、本発明が基礎とする課題は、組換えパルボウイルス生産の効率を高めるための手段を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この技術的課題は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施形態を提供することによって解決される。驚くことに、組換えパルボウイルスの生産もまた、アデノウイルス遺伝子の手助けから利益を得ることができることが判明した。組換えパルボウイルスの生産は、従来、ＨＥＫ  ２９３Ｔ生産細胞において、この細胞を組換えパルボウイルスゲノムおよびキャプシドＶＰ遺伝子を担持するプラスミドでトランスフェクトすることによってなされてきた。用いられるプロトコールでは、最良の条件下で生産細胞あたり０．１〜０．５形質導入単位（ＴＵ: transduction unit）の範囲という極めて低い力価の組換えパルボウイルスが得られるにすぎない。さらに、プラスミドトランスフェクション効率の違いによって、得られる力価に大きな変動もある。この方法で生成されるウイルスは複製欠陥型であるが、ウイルスゲノムとキャプシド遺伝子の間の相同組換えを介して再構成される複製能を有するウイルス（ＲＣＶ: replication competent viruses）が一部少数含まれる［１１］。これらのＲＣＶは最終的なウイルス原株の望ましくない混入物であるため、組換えパルボウイルス生産の際にはそれらの生成を制限することが重要である。
【００１１】
本発明に至る実験では、生産細胞をアデノウイルス由来プラスミドｐＸＸ６でトランスフェクトするかまたはそれらに組換えアデノウイルス−５（Ａｄ−５）を感染させるかのいずれかによって細胞に導入されたアデノウイルス遺伝子を用いた組換えパルボウイルス生産の効率は有意に高めることができた。この新たなプロトコールを用いると、より短い時間（３日ではなく２日）で１０倍を超える高い力価に達した。生成されたＲＣＶのパーセンテージはアデノウイルスを用いないプロトコールに匹敵する。これらの結果から、パルボウイルスキャプシド遺伝子ユニットを担持する新規な複製欠陥型組換えＡｄ−５ベクター（Ａｄ−ＶＰヘルパー）が作出された。このヘルパーウイルスを使用したところ、ＮＢ３２４Ｋ（ＮＢＫ）などの他の生産細胞でも組換えパルボウイルスが作出でき、組換えウイルスに品質に影響を及ぼすことなくより高いウイルス力価が得られた。重要なことには、Ａｄ−ＶＰヘルパーを使用すると、トランスフェクション工程を用いなくてすむ。このプロセスは標準化することができ、再現性があり、生産時間とコストの両方が削減される。
【００１２】
要約すると、
アデノウイルス５由来ベクター、例えばｐＸＸ６（トランスフェクションにより供給）およびＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３（トランスフェクションおよびＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３−ＣＭＶ／ＧＦＰ組換えウイルスの形態での感染により供給）を使用すると、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞における組換えパルボウイルスの生産が１０倍を超えて高まる。
【００１３】
アデノウイルス由来ベクターによってもたされる生産増は、組換えパルボウイルスの送達様式（プラスミドトランスフェクションかウイルス感染）、ならびにＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞内でのパルボウイルス導入遺伝子の大きさおよび性質に依存しない。
【００１４】
ｐＸＸ６は組換えパルボウイルスの生産を加速化し、生産時間を３日から２日に短縮する。
【００１５】
ｐＸＸ６は、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞内でのパルボウイルスＤＮＡの複製を有意に増強し、加速化する。
【００１６】
ｐＸＸ６は、望ましくない複製能を有するウイルス（ＲＣＶ）の生成を促進せず、ｐＸＸ６に基づくプロトコールを用いて得られるＲＣＶのレベルは、従来のアプローチを用いて得られるものと同程度の低さである。
【発明の効果】
【００１７】
Ａｄヘルパー遺伝子ならびにパルボウイルスキャプシド遺伝子ユニットを含有するＡｄ−ＶＰヘルパーウイルスは、トランスフェクション工程を必要とすることなく、Ａｄ−ＶＰヘルパーウイルスを選択された組換えパルボウイルスと組み合わせて感染させることにより組換えパルボウイルスの増幅を可能とする。これにより生産時間とコスト（例えば、トランスフェクション試薬および人員に関して）が有意に削減される。
【００１８】
さらに、例えばＮＢＫ細胞など、トランスフェクトが難しいがＰＶの優れた生産株である細胞系統の使用が可能となるので、用いるパッケージング細胞系統の選択におけるこれまでの制限が克服される。これにより、例えばバイオリアクターで組換えパルボウイルスの大規模生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アデノウイルスに基づくプラスミドは組換えパルボウイルスの生産を高める。  組換えパルボウイルスを生産するために、６ｃｍディッシュに播種したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰおよびｐＣＭＶ／ＶＰでトランスフェクトした。同時に、それらをアデノウイルス由来プラスミドｐＸＸ６で同時トランスフェクトし、またはしなかった。トランスフェクション３日後に細胞を培地とともに回収し、凍結と解凍を３回繰り返して溶解させた。材料および方法の節に記載されているように、等量の粗ウイルス抽出液を形質導入アッセイにおいて新鮮なＮＢＫ細胞に適用した。  Ａ：形質導入アッセイからの顕微鏡写真の代表例であり、コンフルエント細胞層からＧＦＰ陽性細胞を示す。顕微鏡写真は同じカメラ設定で撮影したので、緑色細胞のスコア数の違いはウイルス接種物の違いに相当する。  Ｂ：ウエスタンブロット解析。形質導入アッセイからの３反復サンプルをプールし、タンパク質を抽出した。５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。抗ＮＳ１、−ＧＦＰおよび−アクチン抗体（負荷対照として使用）、陰性対照であるｎｅｇ．（非トランスフェクト細胞）を用いて免疫ブロットを行った。  Ｃ：形質導入アッセイの定量。細胞をＰＶ−ＧＦＰ、もしくはｐＣＭＶ／ＶＰと示されたプラスミドの組合せでトランスフェクトしたか、またはＤＮＡの添加なしとした（−）。ｐＸＸ６またはｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３をヘルパープラスミドとして用い、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏを、この図に示されるように同量を含む対照充填ＤＮＡとして用いた。バーは３反復の平均と標準偏差を示す。データバーの上の値は、陰性対照に対する、アデノウイルスヘルパープラスミドの存在下で得られたウイルス力価生産の変化倍率を示す。ＴＵは、形質導入単位を示す。
【図２】組換えパルボウイルス生産はｐＸＸ６アデノウイルス由来プラスミドにより高まる。  １７５ｃｍ２フラスコに播種したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、ｐＸＸ６を伴って、または伴わずに、ｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰ、ｐＣＭＶ／ＶＰでトランスフェクトした。感染３日後に細胞を回収し、０．５ｍｌ  ｖＴＥバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．３］、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、凍結と解凍を３回繰り返して溶解させた。粗ウイルス抽出液を、ウイルス力価を測定するための種々のアッセイに用いた。バーは異なる反復の平均と相対的標準偏差を示す。データバーの上の値は、ｐＸＸ６の不在下に対する存在下でのウイルス生産の変化倍率を示す。ウイルス力価は、パルボウイルス特異的定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定されるＶｇ／ｍｌ、形質導入アッセイの結果としてのＴＵ／ｍｌ、またはパルボウイルス特異的ハイブリダイゼーションアッセイによるＲＵ／ｍｌで示す。生産された複製能を有するパルボウイルスはプラークアッセイにより測定し、結果を得られたＴＵに対する得られたＰＦＵの比として表した。Ｖｇはウイルスゲノム；ＴＵは形質導入単位；ＲＵは複製単位；ＰＦＵはプラーク形成単位である。
【図３】アデノウイルスヘルパープラスミドまたは組換えＡｄ−ＧＦＰウイルスは、長い導入遺伝子を担持する組換えパルボウイルスの生産を高める。  ６ｃｍディッシュに播種したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、ヘルパープラスミドとしてのｐＸＸ６もしくはｐＶＡＥ２ＡＥ４−５のいずれかを添加して、またはＤＮＡを添加せずに（−）、ｐｒｅｃ．ＰＶ−ルシフェラーゼとｐＣＭＶ／ＶＰの混合物でトランスフェクトした。並行して、パルボウイルスプラスミドのトランスフェクション１時間後に、１組のディッシュに精製した組換えＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３−ＣＭＶ／ＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）を、示されたＭＯＩ（ＧＦＵ／細胞）で感染させた。３日後、細胞を図１の凡例に示されるように処理した。粗ウイルス抽出液を用いてＮＢＫ細胞に感染させ、４８時間後、材料および方法の節に示されるように、全ＮＢＫ抽出液をルシフェラーゼアッセイに用いた。バーは３反復の平均と相対的標準偏差を表す。データバーの上の値は、陰性対照に対する、ルシフェラーゼ生産の変化倍率を示す。ＧＦＵは緑色蛍光単位、ＲＬＵは相対的ルシフェラーゼ単位である。
【図４】ｐＸＸ６は組換えパルボウイルス生産を加速化する。  １０ｃｍディッシュに播種したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、ｐＸＸ６プラスミドを伴ってまたは伴わずに、ｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰ、ｐＣＭＶ／ＶＰでトランスフェクトした。トランスフェクション後、示された時間に細胞を培地ごと回収した。回収物の半分を先に示したように溶解させて形質導入アッセイに用い、もう半分をサザンブロット解析に用いた。  Ａ：形質導入アッセイの結果。バーは３反復の平均と相対的標準偏差を表す。データバーの上の値は、ｐＸＸ６の不在下に対する存在下でのウイルス力価生産の変化倍率を示す。  Ｂ：サザンブロット解析。ウイルスＤＮＡを粗ＤＮＡ細胞溶解液から抽出し、１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロンメンブランに転写した。このメンブランをパルボウイルス特異的［３２Ｐ］標識ＤＮＡプローブとともにインキュベートし、オートラジオグラフィーに付した。Ｎｅｇ．は陰性対照（非トランスフェクト細胞）である。  Ｃ：ｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰのみでトランスフェクトし、７２時間後に回収した対照細胞。ＴＵは形質導入単位；ｍＲＦは単量体複製型(monomeric replicative form)；ｄＲＦは二量体複製型(dimeric replicative form)である。
【図５】ｐＸＸ６はトランスフェクション／感染に基づくプロトコールにおいて組換えパルボウイルス生産を増大させる。  ６ｃｍディッシュに播種したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をｐＣＭＶ／ＶＰ、＋／−ｐＸＸ６でトランスフェクトし、次いでｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰに感染させた。３日後、細胞を培地ごと回収し、凍結と解凍を３回繰り返して溶解させた。粗ウイルス抽出液を用いて、上記のように形質導入アッセイによりウイルス力価を測定した。全インプットウイルス量および全アウトプットウイルス量が示される。データバーの上の値は、生産中のインプットウイルスの増幅率を示す。ＴＵは形質導入単位である。
【図６】組換えＡｄ−ＶＰヘルパーウイルスを用いた種々の組換えパルボウイルスの生産  Ａ：６ウェルプレートに播種したＮＢＫ細胞に精製したＡｄ−ＶＰヘルパーウイルスをＭＯＩ１０（Ａｄ−Ｘ単位／細胞）で感染させ、次いで、以下の組換えパルボウイルス：ｈＨ−１−ＧＦＰ、Ｈ−１−ＧＦＰ、ＭＶＭ−ＧＦＰまたはＣｈｉ−ｈＨ−１−ＧＦＰ［２３］を、０．１ＧＦＵ／細胞、またはＨ−１−ＧＦＰでは０．５ＧＦＵ／細胞のＭＯＩで重複感染させた。感染１日後、培地を交換し、３日後に細胞を培地ごと回収し、凍結と解凍を３回繰り返して溶解させた。粗ウイルス抽出液を用いて、形質導入アッセイによりウイルス力価を測定した。バーは３反復（Ｈ−１−ＧＦＰでは２反復）の平均と相対的標準偏差を表す。データバーの上の値は、インプットとして用いたウイルスに対して生産されたウイルス力価の変化倍率を示す。ウイルス力価はＧＦＵ／ｍｌとして示す。  Ｂ：生産される複製能を有するパルボウイルス（ＲＣＶ）の、Ａｄ−ＶＰヘルパー不在（−）条件に対する存在（＋）条件における比。ＲＣＶ力価はＮＢＫ細胞でのプラークアッセイにより測定し、ＰＦＵ／ｍｌで表した。ＧＦＵは緑色蛍光単位；ＰＦＵはプラーク形成単位である。
【図７】Ａｄ−ＶＰヘルパープラスミドの概略マップ
【発明を実施するための形態】
【００２０】
よって、第１の態様において、本発明は、以下のアデノウイルスＤＮＡ配列：
（ａ）Ｅ２ａ遺伝子；
（ｂ）Ｅ４（ｏｒｆ６）遺伝子；
（ｃ）ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子；および
（ｄ）パルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニット
を含む、アデノウイルス由来ヘルパーウイルスに関する。
【００２１】
アデノウイルス由来ヘルパーウイルスは、パルボウイルスを形成するために必要なヘルパーウイルスの全てのＤＮＡ配列、すなわち、好ましくは、ＤＮＡ配列（ａ）〜（ｄ）のみを含有する。このようなＤＮＡ配列は好ましくはアデノウイルス５に由来する。組換えパルボウイルスの作製の出発材料として好適なヘルパーベクターＤＮＡ配列は独国特許出願第１９６４４５００．０−４１号に記載されており、すなわち、Ａｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡはｐＤＧプラスミドに由来してもよく、これらは個々のオリジナルプロモーターによるか、または異種プロモーターによって制御される。
【００２２】
本明細書で用いる「アデノウイルス由来ヘルパーウイルス」という表現は、（ａ）〜（ｄ）に挙げられているオリジナル遺伝子を有するウイルスに関するだけでなく、例えばヌクレオチドの欠失または挿入を含むがなお所望の生物学的機能を有するタンパク質をコードする、改変遺伝子を有するウイルスにも関する。当業者ならば、一般的な方法の手段により、改変遺伝子が所望の生物学的機能を有する産物をなおコードするかどうかを判定することができる。また、当業者は、本発明のウイルスに特徴的な個々の遺伝子の供給源を知っている。上記のＤＮＡ配列および適当であればさらなる配列を含むウイルスの構築には、当技術分野で公知の一般法を使用することができる。これらの方法には、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)に記載されているように、in vitro組換え技術、合成法およびin vivo組換え法が含まれる。
【００２３】
本明細書で用いる「パルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニット」という表現は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする遺伝子に関する。なお、ＶＰ３はＶＰ２の切断産物である。
【００２４】
好ましくは、パルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニットは、哺乳動物において活性な構成プロモーターまたは誘導プロモーター、および（ｃ）ポリアデニル化シグナルの制御下にある。本明細書で用いる「哺乳動物において活性な構成プロモーターまたは誘導プロモーター」という表現は、哺乳動物において所望のＤＮＡ配列の転写を可能とするプロモーターの全て、とりわけ強い発現をもたらすもの、好ましくは、異種プロモーターを含む。好適なプロモーターは当業者に公知であり、例えば、構成プロモーターのＣＭＶおよびサイトケラチンＫ１４プロモーター、または誘導プロモーターのＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）、メタロチオネインおよびテトラサイクリン制御プロモーター系（Ｔｅｔ−ｏｎ／−ｏｆｆ）が含まれる。
【００２５】
さらに、アデノウイルス由来ヘルパーウイルスまたは組換えパルボウイルスベクタープラスミドは、標的細胞に首尾よく導入されたことを確認するために検出可能な表現型マーカーをコードする遺伝子を含み得る。好ましくは、このマーカータンパク質は蛍光タンパク質である。これにより、所望の標的細胞のトランスフェクションが容易に確認される。蛍光タンパク質をコードする好適な遺伝子の例としては、ｒｆｐ−（赤）、ｇｆｐ−（緑）、ｃｆｐ−（青）およびｙｆｐ−（黄）遺伝子があり、ｒｆｐ−（赤）（Ｄｓｒｅｄ−ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が好ましい。マーカータンパク質の発現を駆動するのに好適なプロモーターの例としては、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターおよびＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）ｔｋプロモーターがあり、ＲＳＶプロモーターが好ましい。発現カセット（プロモーター／マーカー遺伝子／ポリアデニル化部位）が、ベクター内の当業者に容易に判定できる好適な部位に挿入される。
【００２６】
本明細書で用いる「パルボウイルス」には、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む全てのパルボウイルスを包含する。自律性パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属およびコントラウイルス属のメンバーが含まれる。自律性パルボウイルスの例としては、限定されるものではないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルスおよびＢ１９ウイルスが挙げられる。他の自律性パルボウイルスも当業者に知られている；例えば、B. N. Fields et al., VIROLOGY, 第2巻第69章(第3版, Lippincott-Raven Publishers)参照。
【００２７】
ディペンドウイルス属はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、これには限定されるものではないが、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶおよびヒツジＡＡＶが含まれる；例えば、B. N. Fields et al., VIROLOGY, 第2巻第69章(第3版, Lippincott-Raven Publishers)参照。
【００２８】
好ましくは、「ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子を欠く組換えパルボウイルスベクター」は、以下の構造：ＴＲ−ｒｅｐ（ＮＳ１／ＮＳ２）−（任意の導入遺伝子）−ＴＲ［ＴＲ；末端反復］を有する。
【００２９】
第２の態様において、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞が（ａ）ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子を欠く（しかし、ＮＳ１／２コード配列を好ましくはパルボウイルスＰ４プロモーターの制御下に保持する）組換えパルボウイルスベクター、（ｂ）パルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクター、および（ｃ）Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４（ｏｒｆ６）遺伝子およびＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子由来のアデノウイルスＤＮＡ配列を含むアデノウイルス由来ヘルパーベクターでトランスフェクトされること、ならびに（ｉｉ）前記組換えパルボウイルスが哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されることを特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法に関する。
【００３０】
ヘルパーベクターは、当技術分野で公知のいずれのベクターであってもよい。例示的ベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、裸のＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）およびウイルスベクターが挙げられる。好ましいウイルスベクターとしては、ＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、バキュロウイルスおよびレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクター、より好ましくは、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【００３１】
組換えパルボウイルス粒子は、上記ベクター（ａ）〜（ｃ）を許容細胞（この用語は当技術分野で理解されている（例えば「許容」細胞はウイルスによる感染または形質導入が可能である））に導入することにより生産される。限定されるものではないが、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、陽イオンまたは陰イオンリポソーム、およびリポソームと核局在シグナルとの組合せをはじめ、ベクターを許容細胞に導入するいずれの方法も使用可能である。
【００３２】
当技術分野で公知の好適な許容哺乳動物細胞はいずれも、パルボウイルスの生産に使用可能である。また、複製欠陥ヘルパーウイルスから欠損した機能を提供するトランス補足パッケージング細胞系統も好ましく、例えば、２９３細胞、９１１細胞、ＨｅＬａ−Ｅ１細胞、６３３細胞または他のＥ１ａトランス補足細胞がある。
【００３３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ  ２９３またはＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞である。
【００３４】
第３の態様において、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞に（ａ）ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子を欠く（しかし、ＮＳ１／２コード配列を好ましくはパルボウイルスＰ４プロモーターの制御下に保持する）組換えパルボウイルス、および（ｂ）本発明のアデノウイルス由来ヘルパーウイルスを感染させること；および（ｉｉ）前記組換えパルボウイルスが前記哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されることを特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法に関する。
【００３５】
本発明の新規なアデノウイルス由来ヘルパーウイルス（Ａｄ−ＶＰヘルパーウイルス）を用いれば、感染にのみ基づくプロトコールが使用可能であり、トランスフェクションの必要が避けられる。これにより、トランスフェクションは難しいがＨＥＫ  ２９３Ｔ、例えばＮＢＫ細胞よりもパルボウイルスの複製に許容性が高い細胞系統においてパルボウイルスの生産を行う可能性が開ける。よって、本発明の該方法の好ましい実施形態では、哺乳動物細胞系統はＮＢＫである。本適用に使用可能な細胞系統の他の例は、ＮＢ−Ｅ、ＳｉＨａまたはＡ９である。
【００３６】
好ましくは、組換えパルボウイルスはパルボウイルスＨ−１またはＭＶＭに由来する。
【００３７】
本発明の該方法の好ましい実施形態では、組換えパルボウイルスベクターにおいて、ＶＰ１遺伝子およびＶＰ２遺伝子は導入遺伝子、すなわち、少なくとも１つのＴＲが隣接する異種遺伝子により置換される。
【００３８】
好ましくは、導入遺伝子は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である非構造タンパク質ＮＳ１によりトランスで強く活性化される、Ｈ−１ＰＶの自己Ｐ３８プロモーターまたはマウスの自律性パルボウイルス微小ウイルスの制御下にある。
【００３９】
好ましくは、導入遺伝子は、
（ａ）マーカータンパク質、例えば上記のタンパク質；または
（ｂ）治療用遺伝子、例えば、細胞傷害性ポリペプチド、サイトカインもしくはケモカイン、または免疫原性ポリペプチド（ワクチン；腫瘍サプレッサーまたはＲＮＡ干渉分子および／またはＲＮＡｉ発現カセット（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）として用いられる）
をコードする遺伝子である。
【００４０】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる組換えパルボウイルスならびにこのような組換えパルボウイルスを含有する細胞も提供する。
【００４１】
最後に、本発明はまた、本発明の組換えパルボウイルスと薬学上許容される担体を含有する医薬組成物、ならびに遺伝子療法または腫瘍を処置する方法に用いるための本発明の組換えパルボウイルスの使用に関する。このような薬剤の好適な担体および製剤は当業者に公知である。好適な担体としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。担体の種類は本発明のヘルパーベクターおよび組換えパルボウイルスをどのように投与するかによって異なる。好適な用量は担当医によって決められ、例えば、患者の年齢、性別および体重、疾患の重篤度、投与の種類などの種々の要因に依存する。
【００４２】
遺伝子療法は、本発明のヘルパーベクターを用いて作製された組換えパルボウイルス粒子を用いて行うことができ、これらの細胞は該ウイルス粒子とともにインキュベートすることにより形質導入／感染を受ける。これらの細胞は生物体に存在してもよく、被感染細胞には有針注射、ジェット注射またはパーティクルガンにより到達可能である。他方、被形質導入細胞はまた、生物体から単離した後、生物体外で感染させた後に再び生物体に戻すこともできる。このような細胞は自己細胞と呼ばれる。さらに、前記生物体については、形質導入に同種細胞を使用することもできる。これに関しては、これらの細胞がその生物体に対応するＨＬＡ型に属すことが好都合である。当業者ならば、ある特定のＨＬＡ型を有する細胞を提供する方法を知っている。本発明の組換えパルボウイルス（粒子）はまた、化学療法、すなわち腫瘍療法に対するアジュバント適用にも有用である。
【００４３】
Ａｄ−ＶＰヘルパーの用途は、組換えパルボウイルスの生産に限定されない。Ａｄ−ＶＰヘルパーは癌療法においてｒｅｃＰＶとの併用も可能である。これにより腫瘍部位で二次的なｒｅｃＰＶ複製が可能となり、パルボウイルスの治療効力が増す。さらに、Ａｄ−ＶＰヘルパーに第２の抗癌導入遺伝子を挿入することもでき、併用処置の治療能がさらに増す。
【００４４】
よって、本発明はまた、本発明のヘルパーウイルスと組換えパルボウイルスを含む（医薬）組成物に関する。好ましくは、両成分は、治療用ポリペプチド、例えば、抗癌ポリペプチドをコードする（異なる）導入遺伝子を含有する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
材料および方法
（Ａ）細胞
ＨＥＫ  ２９３ＴおよびＮＢ３２４Ｋ（ＮＢＫ）細胞を、それぞれ１０％（ＤＭＥＭ）または５％ウシ胎仔血清（ＭＥＭ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）または改変イーグル培地（ＭＥＭ）で培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２および湿度９２％で維持した。
【００４６】
（Ｂ）プラスミドおよびウイルス
ｐＨ−１−ＥＧＦＰは、ＳａｃＩ／ＮｏｔＩ制限部位を用い、ｐＣｈｉ−ｈＨ−１−ＥＧＦＰ［２３］からｐｓｒ１９−Ｈ−１−Δ８００［２］へＥＧＦＰ遺伝子をサブクローニングすることによって得た。ｐｈＨ−１−Ｌｕｃは［２］に記載されているｐｈＨ１Δ１６００ｌｕｃである。
【００４７】
精製Ａｄ−ＧＦＰウイルスはＤｒ．Ｌａｕｒｅｎｔ  Ｍａｉｌｌｙ（国立保健医学研究所（Ｉｎｓｅｒｍ）Ｕ７４８生物学研究所、ストラスブール、フランス）から厚意により譲渡されたものであり、１ＧＦＵは４８時間以内に１個の２９３Ｔ細胞を緑にすることができるということに基づき、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に対して緑色蛍光単位／ｍｌ［ＧＦＵ／ｍｌ］で力価を測定した。
【００４８】
ｐＡｄ−ＶＰヘルパープラスミド（このベクターの概略マップは図７に示されている）は、ＡｄＥａｓｙ（商標）アデノウイルスベクター系（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品、ヴァルドブロン、ドイツ）を用い、製造者の説明書に従い、ｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３［２４］とｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ／ＶＰ（Ｈ−１）ベクターをＢＪ５１８３細菌中で組み換えることによって作出した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ／ＶＰ（Ｈ１）は、ＰｍｅＩ消化を用いてｐｃＤＮＡ５−ＣＭＶ／ＶＰ（Ｈ−１）からＶＰ領域をサブクローニングし、それをＥｃｏＲＶで消化したｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの製品）に再びライゲーションすることにより作出した。ｐｃＤＮＡ５−ＣＭＶ／ＶＰ（Ｈ−１）は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用い、領域をｐＶＰ−ｓｕｂからｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）へサブクローニングすることにより作出した。ｐＶＰ−ｓｕｂは、まず、ＨｐａＩ制限部位をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫプラスミド（ｐＢＳＫ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリンカーに挿入し、その後、それに、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｐａＩ制限部位を用い、ＶＰ遺伝子ユニットを含有する、ｐ（ＢＫ）ＣＭＶ／ＶＰ（Ｈ−１）プラスミド［２］由来のＨ−１ＰＶゲノムの２６４７−４６８０ｎｔ断片をサブクローニングすることにより構築した。
【００４９】
Ａｄ−ＶＰヘルパーウイルスは従来、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞での３回の生産で作製し、その後、二重ＣｓＣｌ勾配によって精製し、アデノ−Ｘ（商標）ラピッド・タイター・キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、サン・ジェルマン・アン・レー、フランス）を用いて力価を測定した。
【００５０】
（Ｃ）トランスフェクション
図１、３、４および５に示される実験に関して、トランスフェクションはＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マンハイム、ドイツ）を用い、若干変更した製造者の説明に従って行った。プラスミドを血清不含培地で終濃度２０ｎｇ／μｌとなるように希釈した。次に、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを１：２．５の比（μｇ  ＤＮＡ：μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ）で加え、この混合物を室温で３０〜６０分間インキュベートした。その後、この混合物を細胞に滴下した。図２に関しては、トランスフェクションは［２５］に記載のようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｇｍｂｈ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて行った。
【００５１】
６ｃｍディッシュ形式では、８×１０５  ２９３Ｔ細胞／ディッシュを播種した。１日後、細胞を、記載した場合のみ、以下の量でトランスフェクトした：１．２μｇ組換えパルボウイルスベクター、２．４μｇ  ｐＣＭＶ／ＶＰ、３μｇ  ｐＸＸ６、５．２μｇ  ｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３および３または５．２μｇ  ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（対照充填ＤＮＡとして使用）。１０ｃｍディッシュ形式および１７５ｃｍ２フラスコでは、細胞数およびプラスミド量は比例して調整し、２．５倍および６倍した。
【００５２】
（Ｄ）抗体
以下の抗体をウエスタンブロット解析に用いた：ポリクローナル抗ＮＳ１  ＳＰ８抗血清（Ｄｒ．  Ｎａｔｈａｌｉｅ  Ｓａｌｏｍｅ、ＤＫＦＺ、ハイデルベルク、ドイツから厚意により譲渡）、ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ハイデルベルク、ドイツ）およびマウスモノクローナル抗アクチン（クローンＣ４、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、イルキルシュ、フランス）。
【００５３】
（Ｅ）ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を用いた。２．５×１０４  ＮＢＫ細胞／ウェルを４８ウェルプレートに播種し、翌日、種々の希釈率の粗ウイルス抽出液０．１ｍｌを感染させた。感染４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μｌの１倍の受動的溶解バッファーで溶解させた。１０μｌの細胞溶解液を５０μｌのルシフェラーゼ基質と混合し、生じた発光を、照度計Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ドライアイヒ、ドイツ）を用いて１０秒間測定した。
（Ｆ）ウイルス力価の測定
形質導入アッセイ
２．５×１０４  ＮＢＫ細胞／ウェルを４８ウェルプレートに播種し、翌日、種々の希釈率の粗ウイルス抽出液０．１ｍｌを感染させた。感染７２時間後、ＧＦＰ陽性細胞を、蛍光顕微鏡を用いて計数した。ウイルス力価（形質導入単位／ｍｌ［ＴＵ／ｍｌ］）を次のように計算した：緑色細胞の数×希釈倍率×１０。
【００５４】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
粗ウイルス抽出液をベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼウルトラピュアグレード（Ｓｉｇｍａ）（５０Ｕ／ｍｌ、３７℃、３０分）で消化し、トランスフェクトされたプラスミドを残してゲノムＤＮＡを除去した。ウイルスからウイルスＤＮＡを放出させるために、各サンプル１０μｌを、５６℃で３０分間、全４０μｌのアルカリ性溶解バッファー（ＴＥバッファー中１ＭのＮａＯＨ）に溶解させた。溶解は９６０μｌの４０ｍＭ  ＨＣｌを加えることで停止させた。
【００５５】
ウイルスＤＮＡの定量は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＮＳ１特異的ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ダルムシュタット、ドイツ）を用いたリアルタイムｑＰＣＲにより行い、ＳＤＳ  ２．１ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の手段により分析した。要するに、パルボウイルスＤＮＡを増幅し、ＮＳ１特異的５’ＦＡＭ−ＭＧＢ３’標識ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いて検出した。ＮＳ１配列を含むプラスミドを１０１〜１０８コピー／反応の範囲で連続希釈し、ｑＰＣＲの標準化に用いた。各反応混合物（２０μｌ）は、１×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．３μΜ標識ＮＳ１−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、０．３μΜの各プライマーおよび３μｌの鋳型からなった。
【００５６】
ウイルスＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ
ＮＢＫ細胞を６ｃｍディッシュに５×１０５細胞／ディッシュの密度で播種した。翌日、粗ウイルス抽出液を１０ー４〜１０ー７（１：１０段階）で連続希釈した後、総容量４００μｌでＮＢＫ細胞の感染に用いた。１０分おきにプレートを振盪させながら３７℃で１時間インキュベートした後、各ディッシュに５ｍｌの培地を加えた。感染７２時間後、細胞層をＰＢＳで洗浄し、２５ｍｍ径のニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ダッセル、ドイツ）を細胞の上にのせ、１００μｌのＰＢＳで湿らせた。次に、これらのフィルターを、変性バッファー（０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび１．５Ｍ  ＮａＣｌ）で飽和させたワットマン濾紙上に逆さまに置いた。５分後、フィルターを中和バッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１．５Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡで飽和させたワットマン濾紙に移した。５分後、ＤＮＡを８０℃で２時間焼き付けることにより固定した。プレハイブリダイゼーションは３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）、１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０×デンハート液および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で１時間行った。ハイブリダイゼーションはｐＭＶＭプラスミドのＥｃｏＲＶ（ｎｔ３８５）〜ＥｃｏＲＩ（ｎｔ１０８４）断片に相当する放射性プローブを加えることにより行い、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。６５℃で一晩インキュベートした後、フィルターを６５℃で３０分間洗浄バッファー１（３×ＳＳＣ（ｐＨ７）、１％ＳＤＳ）で、次いで、６５℃で３０分間洗浄バッファー２（０．３×ＳＳＣ（ｐＨ７））で洗浄した。その後、フィルターをワットマン濾紙上に置き、プラスチックホイルで覆い、−８０℃で一晩、ラジオグラフィーフィルムに露光した。感染細胞は、放射性標識ウイルスＤＮＡのためにフィルム上で黒い点を呈する。ウイルス力価（複製単位（ＲＵ）／ｍｌ［ＲＵ／ｍｌ］）を次のように計算した：黒い点の数×希釈倍率×７．５。
【００５７】
プラークアッセイ
単層で増殖させたＮＢＫ細胞に粗ウイルス抽出液の連続希釈物を１時間感染させた後、接種物をＢａｃｔｏ（商標）寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）上層（最小必須培地［＋］Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン中０．６８％）に置き換えた。感染５日後、ＰＢＳで希釈したＢａｃｔｏ（商標）−寒天（０．８５％）を含有するニュートラルレッド（０．２ｍｇ／ｍｌ）を加えることによって、生細胞を１８時間染色した。プラークを計数し、力価をプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌとして表した。
【００５８】
（Ｇ）ＤＮＡ抽出およびサザンブロット法
組換えウイルスの生産中に生産されたウイルスＤＮＡ中間体の分析のために、ｖＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．７］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と２×Ｈｉｒｔバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．４］、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．２％ＳＤＳ）の混合物（１：１）で細胞抽出液を調製し、次いで４６℃、６０回／分の回転下で１８時間、プロテイナーゼＫ（４００μｇ／ｍｌ）で消化した。次に、ＤＮＡを０．５μｍおよび０．４μｍのニードルを数回通して剪断し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、最後にＤｐｎＩ消化を行ってウイルスゲノムを担持する細菌プラスミドを除去した。
【００５９】
ＤＮＡサンプル（２ｇ）を１％アガロースゲル電気泳動により分画した。ゲルにおけるＤＮＡ変性および中和の後、従来のサザントランスファー手順によりＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンメンブラン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写し、次いで膜にＵＶ架橋させた。次に、メンブラン上に存在するウイルス中間体を、ウイルスＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイのフィルターに用いたものと同じ手順で検出した。
【００６０】
実施例２
アデノウイルス遺伝子は組換えパルボウイルス生産を高める
本試験では、アデノウイルス遺伝子が組換えパルボウイルス生産を高めることができるかどうかを検討した。この目的で、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、ＧＦＰ導入遺伝子を担持する組換えパルボウイルスプラスミド（ｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰ）、Ｈ−１パルボウイルスキャプシドタンパク質をコードするプラスミド（ｐＣ  Ｖ／ＶＰ）およびアデノウイルス５由来プラスミドｐＸＸ６で一時的に同時トランスフェクトした。ｐＸＸ６はＥ２ａ、Ｅ４（ｏｒｆ６）およびＶＡＩ  ＲＮＡアデノウイルス遺伝子を含有し、ＡＡＶ生産を促進するのに十分である［１７、１８］。
【００６１】
トランスフェクション３日後、細胞を溶解し、ｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰウイルス生産を実施例１に記載されているように形質導入アッセイにより評価した。従って、これらのウイルス生産細胞からの細胞抽出液を用いて新鮮なＮＢＫ細胞に接種を行った。４８時間後、ＧＦＰ陽性ＮＢＫ細胞を蛍光顕微鏡によりモニタリングした（図１Ａ）。ｐＸＸ６およびパルボウイルスプラスミドでトランスフェクトされた細胞からの抽出液では、パルボウイルスプラスミド単独でトランスフェクトされた細胞に比べて陽性緑色細胞の数がはるかに多くなり、このことはパルボウイルスプラスミド単独でトランスフェクトされた細胞からの溶解液に含まれる組換えパルボウイルスの量が少なかったことを示す。ウエスタンブロット解析によれば、ｐＸＸ６条件で得られた抽出液で感染させたＮＢＫ細胞では、高レベルのパルボウイルスＮＳ１とともに高レベルのＧＦＰタンパク質が確認された（図１Ｂ）。
【００６２】
組換えパルボウイルスの生産が付加的アデノウイルス要素の存在によってさらに改善可能であるかどうかを調べるために、パルボウイルス生産の増強におけるｐＸＸ６とより完成度の高いｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３ベクターの効果を比較した。トランスフェクション３日後に、上記のようにウイルス形質導入アッセイを行った。図１Ｃに示されるように、ｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３とｐＸＸ６は双方とも、陰性対照または充填条件と比較して１０倍を超える有意なウイルス生産増を見せる。アデノウイルスヘルパーは１０６緑色形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌを達成可能であり、これは播種した生産細胞あたり平均５ＴＵに相当する。ｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３とｐＸＸ６は双方とも、これらの実験条件下で匹敵する組換えパルボウイルスの生産増をもたらし、ｐＸＸ６に含まれる遺伝物質でこの効果の誘導に十分であることを示唆する。
【００６３】
ｐＸＸ６の助けで生産された組換えパルボウイルスの量を慎重に定量するために、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を１７５ｃｍ２フラスコに播種した後、ｐＸＸ６を伴って、または伴わずにｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰ、ｐＣＭＶ／ＶＰで同時にトランスフェクトした。トランスフェクション３日後に、細胞をｖＴＥバッファーに溶解させた（図２の凡例参照）。細胞溶解液に含まれる生産ウイルスを、キャプシド封入パルボウイルスゲノムの濃度を測定するパルボウイルス特異的定量的ＰＣＲを用いて直接定量し、ウイルスゲノム（Ｖｇ）／ｍｌで表した。さらに、これらの細胞溶解液をＮＢＫ指標細胞の感染に用い、ウイルス力価を、ｉ）形質導入アッセイ（ＧＦＰ陽性細胞を計数し、ウイルス収量を形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌとして表した）、およびｉｉ）パルボウイルス特異的ハイブリダイゼーションアッセイ（ウイルスＤＮＡ複製を保持する細胞の数を、ＮＳ放射性標識プローブを用いて検出した）により定量した。そして、生産されたウイルスの濃度を複製単位（ＲＵ）／ｍｌとして表した。図２は、種々のアッセイの全てにおいてｐＸＸ６プラスミドの存在下でウイルス生産の有意な増大が確認されたことを示す。
【００６４】
次に、ｐＸＸ６が望ましくない複製能を有するパルボウイルス（ＲＣＶ）のより高い同時生産をもたらし得るかどうかを検討した。ＲＣＶを、ＮＢＫ細胞に対する従来のパルボウイルスプラークアッセイを用いて測定したところ、得られたＰＦＵ／ＴＵの比はｐＸＸ６によっては影響を受けず（図２、右のパネル）、このことはｐＸＸ６がＲＣＶの生産性を高めず、従って、生産される組換えウイルスの品質を保持することを示す。
【００６５】
図１および２に示される結果を確認するために、より長いリポーター導入遺伝子であるｐｒｅｃ．ＰＶ−ルシフェラーゼ（ｐｒｅｃ．ＰＶ−Ｌｕｃ）（従前に用いたＧＦＰ導入遺伝子の場合の７３１ｎｔの代わりに１６５６ｎｔの挿入）を担持する別の組換えパルボウイルスを用いて同様の実験を行った。より長い導入遺伝子（８００ｎｔを越える）を担持するパルボウイルスの生産は、より短いもの（８００ｎｔまで）を用いた生産よりもいっそう効率が低いことが知られている［２］。違うアデノウイルスヘルパープラスミドｐＶＡＥ２ＡＥ４−５のパルボウイルスの生産を高める能力もまた調べた。このベクターは違うプラスミド骨格にｐＸＸ６と同様のアデノウイルス遺伝子を有する［２６］。細胞をｐｒｅｃ．ＰＶ−Ｌｕｃ、ｐＣＭＶ／ＶＰ、およびアデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６もしくはｐＶＡＥ２ＡＥ４−５の一方で同時にトランスフェクトし、またはＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３−ＣＭＶ／ＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）ウイルスに感染させた（０．１〜５ＧＦＵ／細胞の範囲のＭＯＩ（図３参照））。トランスフェクション／感染３日後に、組換えパルボウイルス生産の収量を、ルシフェラーゼ形質導入アッセイを用いて評価した。
【００６６】
図３で得られた結果により、組換えパルボウイルス生産に対するｐＸＸ６の増強効果が確認され（およそ２４倍）、異なるより長い導入遺伝子を担持する他のパルボウイルスに対するこのベクターの明確な効果が一般化される。ｐＶＡＥ２ＡＥ４−５も同程度にパルボウイルスの生産を高め、見られた増加を担う要素はｐＸＸ６およびｐＶＡＥ２ＡＥ４−５の共通のアデノウイルス配列内にあり、プラスミド骨格には無いことが確認される。組換えアデノウイルスによる感染もパルボウイルス生産を高めたので、見られたヘルパー効果はアデノウイルス遺伝要素を（トランスフェクションまたは感染により）生産細胞に導入するために選択された方法には依存しないはずである。ｒｅｃ．ＰＶ−Ｌｕｃ生産の最大増加（およそ３０倍）は、Ａｄ−ＧＦＰをＭＯＩ  １で用いて得られた。これらの条件下では、感染２日後に生産細胞において１００％のアデノウイルスＧＦＰ形質導入が見られた。Ａｄ−ＧＦＰをＭＯＩ  ２および５で用いた場合には細胞毒性が見られ（データは示されていない）、このことはこれらの条件下でなぜ低いパルボウイルス力価が得られたかを説明する。アデノウイルスを用いて見られた生産増は、おそらくアデノウイルス形質導入率が高いためにトランスフェクトされたヘルパープラスミドの場合よりもやや高かった。これらの結果を合わせると、アデノウイルスゲノム要素の存在が組換えパルボウイルスの生産を高めることが証明される。
【００６７】
実施例３
ｐＸＸ６は組換えパルボウイルス生産を加速化する
経時的推移実験では、ｐＸＸ６がウイルス生産の速度論に影響を及ぼすかどうかを検討した。細胞をまず、ｐＸＸ６を伴って、または伴わずに、ｐｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰ、ｐＣＭＶ／ＶＰで同時にトランスフェクトし、トランスフェクション１２、２４、４８および７２時間後にウイルス生産を評価した。
【００６８】
これまでのように、ｐＸＸ６の存在は組換えパルボウイルスの生産を大幅に高める（図４）。この効果は２４時間後に見ることができるが（９．２倍）、生産収量が最大となる（１．５×１０６ＴＵ／ｍｌ）４８時間目により明確になる（３０．４倍）。ｐＸＸ６の不在下でのウイルス生産はずっと低い効率であった（最大力価：１．３×１０５ＧＦＵ／ｍｌ）。組換えパルボウイルスが通常では生産７２時間後に回収されることは重要なことである。
【００６９】
よって、組換えパルボウイルス生産においてアデノウイルス要素を用いるとウイルス力価が増大し、生産時間が２４時間短縮される。サザンブロット（図６Ｂ）によれば、トランスフェクション４８時間および７２時間後に、ｐＸＸ６の存在下で生産されたウイルスＤＮＡの量の増加が確認された。単量体複製パルボウイルスＤＮＡ型（ｍＲＦ）はｐＸＸ６条件では大幅に高濃度となり、２４時間目にすでに検出可能であり、４８時間目および７２時間目に強く増強された。二量体複製ＤＮＡ型（ｄＲＦ）は、４８時間および７２時間の生産時点でｐＸＸ６の存在下でのみ明確に検出された。よって、ｐＸＸ６はウイルスＤＮＡの複製を増大させるだけでなく、加速化もする。
【００７０】
実施例４
ｐＸＸ６はまたトランスフェクション／感染に基づくプロトコールにおいて組換えパルボウイルス生産を高める
組換えパルボウイルスは、生産細胞を２つのプラスミド（１つはＶＰキャプシドタンパク質をコードし、もう１つは目的の導入遺伝子を担持する残りのパルボウイルスゲノムを含有する）で同時にトランスフェクトすることにより、慣例的に生産される。ウイルス感染はトランスフェクションより良好な遺伝子送達法であるので、本発明者らは当該プロトコールのトランスフェクション工程をできる限り感染に置き換えることを目的とした。１つの可能性は、ＶＰ含有プラスミドでトランスフェクトされた許容細胞を感染させることにより組換えパルボウイルスを増幅することであろう。この場合、トランスフェクションはＶＰ−プラスミドにのみ限定され、一方、パルボウイルス組換えゲノムはウイルス感染によって送達される。しかしながら、実験室でのこれらの実験では、この方法を用いて組換えパルボウイルスを生産できなかった。このｐＸＸ６のヘルパー機能を考えて、この場合にｐＸＸ６の導入が組換えパルボウイルスの生産を救済できるかどうかを検討した。細胞をｐＸＸ６と組み合わせて、または組み合わせずにｐＣＭＶ／ＶＰでトランスフェクトした後、ｒｅｃ．ＰＶ−ＧＦＰに感染させた。結果は、ｐＸＸ６プラスミドの存在下でのみ接種物として用いたウイルス用量の有意な増幅（およそ１７倍）を示した（図５、データは示されていない）。これらの結果は、ｐＸＸ６が単独トランスフェクションに基づくプロトコールにおいて組換えパルボウイルスの生産を助けるだけでなく、組換えウイルスＤＮＡの供給源として感染力のあるウイルス粒子が用いられる場合にも組換えパルボウイルスの生産を助けることを示す。このことは、組換えパルボウイルスの２回目の増幅にｐＸＸ６を使用する可能性を裏付ける。
【００７１】
実施例５
組換えＡｄ−ＶＰヘルパーウイルスを用いた組換えパルボウイルスの生産
ＶＰ−プラスミドトランスフェクションを避け、単にヘルパーウイルスの同時感染によりウイルス増幅を可能とするために、パルボウイルス生産を助けるのに必要なＡｄ遺伝子だけでなくパルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニットも担持するアデノウイルスを用いて組換えパルボウイルスが生産可能かどうかを調べた。ＶＰ遺伝子をｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３およびｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ／ＶＰの組換えにより、ｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３にクローニングし［２４］、ｐＡｄ−ＶＰヘルパー構築物を作出した。Ａｄ−ＶＰヘルパーウイルスは従来、ＨＥＫ  ２９３Ｔで生産されてきた。Ａｄ−ＶＰヘルパーの形状および力価は、対照として用いるＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３ウイルスと同様であった（データは示されていない）。
【００７２】
新規なＡｄ−ＶＰヘルパーウイルスを用いれば、感染のみに基づくプロトコールを用いることができ、トランスフェクションの必要が避けられる。このことは、トランスフェクトは難しいが、ＨＥＫ  ２９３Ｔよりもパルボウイルス複製に許容度が高い細胞系統、例えばＮＢＫ細胞において生産を行う可能性を拓く。
【００７３】
ＮＢＫ細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日、以下の組換えパルボウイルス：ｈＨ−１−ＧＦＰ、Ｈ−１−ＧＦＰ、ＭＶＭ−ＧＦＰまたはＣｈｉ−ｈＨ−１−ＧＦＰのうちの１つとともに精製Ａｄ−ＶＰヘルパーに感染させた。感染３日後に細胞を溶解し、形質導入アッセイを用い、生産された組換えウイルスの力価を測定した。従前のように、複製能を有するウイルスの生産を制御するためにプラークアッセイを行った。
【００７４】
この手順を用いると、図１Ｃで得られるようなトランスフェクションに基づくプロトコールを用いる場合の２〜５倍の力価が得られた（データは示されていない）。重要なことには、この手順はＡｄ−ＶＰヘルパーの不在下で行われた生産に比べてＲＣＶ混入率を引き上げることはなかった。これらの結果は、組換えパルボウイルスの生産にＡｄ−ＶＰヘルパーを使用する有効性を強調する。
【００７５】
結論として、Ａｄ−ＶＰヘルパー手順は以下の利点を与える：（ｉ）ウイルス原株の品質に影響を及ぼさずに高力価で組換えパルボウイルスの生産を可能とすること、（ｉｉ）生産時間を１日短縮すること（データは示されていない）、（ｉｉｉ）ウイルス感染のみに基づき、トランスフェクション工程の必要が避けられること、（ｉｖ）パルボウイルス複製に対してＨＥＫ  ２９３Ｔよりも許容度が高いが、トランスフェクションが難しいためにこれまで使用できなかった細胞系統（例えば、ＮＢＫ）において組換えパルボウイルスの生産を可能とすること、および（ｖ）トランスフェクション試薬、時間および人員のコストを削減するので、より経済的なプロセスであること。
【００７６】
参照文献
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【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
2013539957.tif 000009
2013539957.tif 000010
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2013539957.tif 000014
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