(57)【要約】  本願発明は生体分子のコンジュゲートを生成する方法であって、単一の単位操作に一体化される方法を対象とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化剤と接触させることで生体分子を活性化させる工程；
該活性化剤を除去する工程；および
該生体分子を活性化されたポリマーと反応させることにより該生体分子をコンジュゲートさせる工程；
を含む、生体分子のコンジュゲートを生成する方法であって、ここで該方法の工程が単一の単位操作に一体化されているところの、方法。
【請求項２】
単一の単位操作が一体化接線流濾過システムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体分子のコンジュゲートをコンジュゲートされていない生体分子より分離する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
生体分子のコンジュゲートがコンジュゲートされていない生体分子よりサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより分離される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
活性化剤が緩衝液交換、ｐＨ調整剤または還元剤より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
還元剤がジチオスレイトールまたはトリス２−カルボキシエチルホスフィンである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
生体分子が蛋白、多糖および核酸より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
蛋白が凝固因子、抗体、ホルモン、成長因子および酵素より選択される、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は生体分子のコンジュゲートを生成する方法であって、単一の単位操作に一体化される方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
生命工学の発展と共に、生物医薬品が満たされていない医療の要求に合致するように開発されてきた。しかしながら、該医薬品はインビボでの半減期が短いため、標的とする治療または予防の目的を達成するのに、患者は頻繁におよび／または多量に生物医薬品を摂取する必要がある。長期にわたる静脈内治療または頻回注入は患者の生活の質に影響を及ぼしうる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの種々のポリマーは、生体分子（例、蛋白）とコンジュゲートして、多くの生体分子の半減期および生物活性を強化することができる（Reddy, Ann, Pharmacother. 34: 915-923, 2000）。ポリマーのコンジュゲーションは、他の利点として、（ａ）製造プロセスの間の製品の安定性の改善；（ｂ）腎クリアランスの低下（Fungら、Polym. Prepr. 38: 565-566、1997）；腫瘍標的化の改善（Yowellら、Cancer Treat. Rev. 28 Suppl. A: 3-6, 2002）；抗原性および免疫原性の減少（Mullerら、Br. J. Haematol. 110: 379-384, 2000; Abshireら、Blood 96: 1709-1715, 2000）；およびより大きな耐性（Safraら、Ann. Oncol. 11: 1029-1033, 2000; Judsonら、Rur. J. Cancer 37: 870-877, 2001）を包含する。ＰＥＧ化はヒト成長因子（Kimら、Biomaterials 23: 2311-2317, 2002; Wuら、Protein Expr. Purif. 48: 24-27, 2006）、成長ホルモン放出因子（Piquetら、J. Vhromatogr. 944: 141-148, 2002）、アデノウイルスベクター（Etoら、Int. J. Pharm. 354: 3-8, 2008）およびプラスミドＤＮＡ（Hosseinkhaniら、J.Control Release, 97: 157-171, 2004）に適用されてきた。ＰＥＧ化のおかげで、多くのコンジュゲーション反応化合物（Robertsら、Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476, 2002）およびポリマー誘導体（欧州特許第１５７８８４１号）が開発された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
生体分子−ポリマーのコンジュゲーションの適用が増えているため、製造要件に合致する、簡易で再生可能で拡張可能な単位操作を開発することが必要となる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願発明は、活性化剤と接触させることにより生体分子を活性化させる工程；該活性化剤を除去する工程；および該生体分子を活性化されたポリマーと反応させることにより該生体分子をコンジュゲートさせる工程を含む、生体分子のコンジュゲートを生成する方法であって、該方法の工程が単一の単位操作に一体化されている方法を対象とする。該方法は生体分子のコンジュゲートをコンジュゲートされていない生体分子から分離する工程をさらに含んでもよい。一の実施態様において、生体分子のコンジュゲートはサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによりコンジュゲートされていない生体分子より分離される。
【０００５】
一の実施態様において、単一の単位操作は一体化接線流濾過システムである。もう一つ別の実施態様において、活性化剤は緩衝液交換、ｐＨ調節剤または還元剤より選択される。さらなる実施態様において、還元剤はジチオスレイトールまたはトリス２−カルボキシエチルホスフィンである。他の実施態様において、該ポリマーはポリエチレングリコールであり、生体分子は蛋白、多糖類および核酸より選択される。さらなる実施態様において、蛋白は凝固因子、抗体、ホルモン、成長因子および酵素より選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＰＥＧ化コントロール実施（run）のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を示す。
【図２】ＰＥＧ化コントロール実施からのカチオン交換クロマトグラフィーの溶出ピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】ＰＥＧ化コントロールからのカチオン交換クロマトグラフィーの溶出ピークのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４】ＴＦＦモードにて実施されるＰＥＧ化のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を示す。
【図５】実験室規模のＴＦＦ実施のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を示す。
【図６】実験室規模のＴＦＦ実施により産生されるＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩのＳＥＣ特性を示す。
【図７】パイロット規模のＴＦＦ実施のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本願発明は、記載の特定の装置またはその一部に限定されるものではなく、それ自体変化してもよいことが理解されるべきである。また、本願明細書に使用される用語は特定の実施態様だけを記載することを目的とし、本願発明の範囲を限定することを意図とせず、該範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるものであることも理解されるべきである。
【０００８】
本願明細書および添付した特許請求の範囲に使用される、単数形態の「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、特記しない限り、複数の形態を包含すると認識されるべきである。かくして、例えば「an agent」への言及は、一または複数の「agents」に言及するものであり、当業者に知られているその等価物なども包含する。特記しない限り、本願明細書にて使用するすべての技術的または化学的用語は、本願発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意義を有する。
【０００９】
生体分子のＰＥＧ化などのコンジュゲーションは、ランダムなコンジュゲーションであっても、または部位特異的コンジュゲーションであってもよい。いずれの場合でも、生体分子は、通常、ＰＥＧなどのポリマーの効果的なカップリングを可能とするように活性化される。ランダムなＰＥＧ化では、ＰＥＧはランダムな活性化アミノ酸残基と共有的にコンジュゲートされてもよい。通常、一のＰＥＧ化されている生体分子と、複数のＰＥＧ化されている生体分子の混合物が得られる。部位特異的ＰＥＧ化の場合、ＰＥＧ分子が生体分子の表面上の特定の部位にコンジュゲートしうるように、該生体分子は遺伝的に修飾されていてもよい。この方法は副生成物の形成を最小限とし、その後の、生成物と副生成物を分離する精製工程の負担を軽くする。
【００１０】
溶媒に暴露されている生体分子上の残基は、溶液のｐＨを調節するか、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を用いることで活性化されてもよい。還元後に、ＰＥＧ分子が共有結合を介してその活性化残基に結合されてもよい。還元剤を用いる場合、コンジュゲーション反応の前に該還元剤を除去する必要がある。実験室規模で還元剤を除去する場合に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が一般的方法である。
【００１１】
生体分子の効率的な最先端のコンジュゲーションは、一般に複数の単位操作、例えば、
−  通常、攪拌式活性化タンクなどの混合容器中で実施される、還元剤とのインキュベーション／制御式混合を介して活性化し；
−  典型的には、サイズ排除クロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフ法により、活性化剤を除去し；
−  通常、攪拌式コンジュゲーションタンクにて実施される、（ＰＥＧなどの）活性化ポリマーとのインキュベーション／制御式混合を介してコンジュゲートし；および
−  そのコンジュゲートされている生体分子を未反応の分子および副生成物からイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを用いて分離する、
操作を必要とする。
【００１２】
かかる方法は、複数のシステムを、商業的規模では、かなりの場所および手作業／単位操作間の移動を必要とする。加えて、ＳＥＣは商業的規模の製造を実施するのが困難であり、独立した単位操作としてセットアップする必要がある。
【００１３】
本願発明の方法は、接触／混合するための一体化接線流濾過を利用し、その後で反応体を除去することにより、活性化、活性化剤の除去およびコンジュゲーションの工程を単一の単位操作に一体化する。適当な分子量カットオフの膜を利用することで標的とする生体分子が保持されるが、濃度、ｐＨ、伝導度および緩衝液の種類などの物理化学的条件は活性化／コンジュゲーションの前、間または後で変化させてもよい。該システムにおける流体力学を調整することで最適濃度を調整することができ、所望により、膜表面にて局所的により高い接触濃度を達成させ、活性化およびコンジュゲーション工程をさらに最適化してもよい。この方法は、操作を容易にし、商業的規模の医薬の製造にて再現可能であり、拡張可能であり、かつ利用可能である。
【００１４】
本願発明の方法に用いることのできるポリマーの例として、限定されるものではないが、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール、デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物をベースとするポリマー、アミノ酸ポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸共重合ポリエチレン、無水リンゴ酸共重合ポリスチレン、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解物、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、およびそのいずれの均等物も挙げられる。ポリエチレングリコールの一例が、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。他の有用なポリアルキレングリコール化合物がポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ＰＥＧ−グリシドエーテル（ＥＰｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＯｌ−ＰＥＧ）、分岐したポリエチレングリコール、線状ポリエチレングリコール、フォーク状のポリエチレングリコールおよび複数のアームを有するか、超分岐したポリエチレングリコール（ｓｔａｒ−ＰＥＧ）である。
【００１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は水可溶性ポリ（酸化エチレン）を包含する。典型的には、ＰＥＧは次の構造：「−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−−」からなり、ここでｎは２〜４０００である。本願明細書で用いる場合、ＰＥＧはまた、末端酸素が置換されているかどうかに応じて、「−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−−ＣＨ２ＣＨ２−−」および「（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−−」を包含する。
【００１６】
ポリエチレングリコールはまた、限定するものではないが、ヒドロキシルまたはＣ１２０アルコキシ基などの、種々の末端または終点キャッピング基を有する構造を包含する。ポリエチレングリコールはまた、大半が、いわゆる５０％より多くが−−ＯＣＨ２ＣＨ２−−反復サブユニットを含有するポリマーを意味する。特定の形態に関して、ＰＥＧは多種の分子量、ならびに分岐、線状、フォーク状および多機能などの構造または形状とすることができる。
【００１７】
生体分子の例として、例えば、蛋白、多糖または核酸が挙げられる。蛋白は、限定されないが、凝固因子、抗体、ホルモン、成長因子および酵素を包含する。
【００１８】
本願明細書に記載の方法および材料は本願発明の代表例を意図とするものであり、本願発明の範囲は実施例の範囲によって限定されないことが理解されよう。当業者は開示されている方法および材料に基づき変更を加えて実施してもよく、かかる変形は本願発明の範囲内とみなされることを理解するであろう。
【実施例】
【００１９】
本願発明がより理解されるために、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明を目的とするに過ぎず、本願発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。本願明細書に記載の文献はすべてその内容を出典明示により本願明細書の一部とする。
実施例１：ＰＥＧ化
【００２０】
コントロールにて、トリス２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）ストック溶液を７．２ｍｌの精製されたｒＦＶＩＩＩ溶液（０．４μＭ）に充填した。還元した後、ｒＦＶＩＩＩ溶液中のＴＣＥＰをＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムを用いるＳＥＣにより除去した。ＰＥＧ固体を該ｒＦＶＩＩＩ溶液に３０μＭの最終ＰＥＧ濃度にまで充填した。該ｒＦＶＩＩＩをＰＥＧと一緒に２−８℃で１３時間インキュベートした。ＰＥＧ化インキュベーションの終わりに、バッチを３倍に希釈し、４ｍＬのカチオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填した。該カラムに結合したｒＦＶＩＩＩを分離し、グラジエントで溶出させた。
【００２１】
もう一つ別の実施では、６９５ｍＬの精製されたｒＦＶＩＩＩ溶液（０．４９μＭ）を５０ｃｍ２の３０ｋＤａの再生セルロース接線流濾過（ＴＦＦ）膜を備えた接線流セットアップのリテンテート（retentate）の容器に充填した。まず、５００ｍＬのペルメエート（permeate）をＴＦＦ膜を介して浸透させることでｒＦＶＩＩＩ溶液を１．７８μＭに濃縮した。濃縮の後に、ＴＣＥＰストック溶液を該濃縮されたｒＦＶＩＩＩ溶液に充填した。還元インキュベーションを３０分間続けた。リテンテートのクロス流速を４Ｌ／分／ｍ２に維持し、一方でペルメエートを０．７Ｌ／分／ｍ２でリテンテートの溶液に再循環して戻した。還元の後、リテンテートにあるＴＣＥＰを５倍量のＰＥＧ化緩衝液に対して透析濾過することで取り除いた。透析濾過の間に、リテンテートおよびペルメエートのサンプルを各透析濾過の後でＴＣＥＰ濃縮について分析するための容量で採取した。ＴＣＥＰを除去する透析濾過の最後に、ＰＥＧ固体をペルメエートの容器に充填し、３９μＭの最終のＰＥＧ濃度を得た。ｒＦＶＩＩＩをＰＥＧと一緒に約２時間インキュベートした。インキュベーションの間に、ペルメエートを４Ｌ／分／ｍ２でＴＦＦシステムを介する再循環に付すことで混合物が提供された。ＰＥＧ化のインキュベーションの最後に、リテンテートを集め、４倍に希釈した。希釈されたリテンテートの一部を５ｍＬのカチオン交換クロマトグラフィーのカラムに充填した。カラムに結合したｒＦＶＩＩＩを分離し、グラジエント溶出により溶出させた。
【００２２】
グラジエント溶出より得られるフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析性ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析し、その一方でリテンテートおよびペルメエートの試料を分析性ＨＰＬＣアッセイによりＴＣＥＰについて分析した。
【００２３】
コントロール実験のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を図１に示す。それはピーク１、２および３の３本の溶出ピークからなり、各々、４９．５％、５８％および６３．７％の緩衝液Ｂで溶出される。
【００２４】
溶出ピークを特徴付けるのにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた。ヨウ化バリウム染色剤はポリエチレングリコールと複合体を形成するため、まずＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをヨウ化バリウムで染色し、ポリエチレングリコールのｒＦＶＩＩＩのコンジュゲーションを確認した。画像を撮影した後、ゲルを脱染し、ついでクマシーブルーで再染色した。図２に示されるクマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＥＧ化の前にｒＦＶＩＩＩが、その分子量が８２ｋＤａと１１６ｋＤａの間にある、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含有することを示す。ＰＥＧ化の後で、ピーク１のｒＦＶＩＩＩの軽鎖は１８２ｋＤａより大きく上昇する。分子量の増加はポリエチレングリコールがＰＥＧ化の間に軽鎖にコンジュゲートしたことによるものであり、そのことがヨウ化バリウム染色剤により確認される。ピーク２はＰＥＧ化されていない種々の蛋白種を含有する。ピーク３に集められた種は重鎖およびＰＥＧ化されていない軽鎖を有する。
【００２５】
各溶出ピークからの試料をＳＥＣにより分析した。図３はピーク１（ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ）、ピーク２およびピーク３（ＰＥＧ化されていないｒＦＶＩＩＩ）のＳＥＣ分析の保持時間が、各々、１６．６分、１７．８分および１９．４分であることを示す。ＰＥＧされていないｒＦＶＩＩＩの保持時間がＰＥＧ化されているｒＦＶＩＩＩの保持時間よりも２．８分長いため、ＳＥＣ分析値をＰＥＧのｒＦＶＩＩＩ分子とのコンジュゲーションを確認するための直交法として用いてもよい。
【００２６】
ＰＥＧ化方法における付加的な工程がコンジュゲーション工程の前に還元剤を除去することである。表１はＴＦＦモードのＰＥＧ化にて集められたリテンテートおよびペルメエートが各容量の透析濾過の最後で同様のＴＣＥＰ濃度を有することを示す。リテンテートおよびペルメエートの両方にあるＴＣＥＰは４倍容量の透析濾過の後にアッセイの検出限界より下にまで減少する。このことは透析濾過が還元剤を取り除く上で効果的であることを示す。
表１
【表１】
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【００２７】
ＴＦＦモードのＰＥＧ化より回収される物質のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を図４に示す。図１と同様に、それも３本の溶出ピークからなり、ピーク１、２および３は、各々、４８．３％、５６．１％および６２．８％の緩衝液Ｂで溶出される。ピーク１の分析性ＨＰＬＣ−ＳＥＣの保持時間は１５．６分であり、それと比べてピーク３では１８．５分であった。これら２つのカチオン交換クロマトグラフィーの溶出ピークの間の保持時間の違い（２．９分）はコントロールアームの違いと一致する。このことはＴＦＦモードのＰＥＧ化法が生体分子−ポリマーのコンジュゲーションに含まれる工程を単一のＴＦＦ工程に一体化しうることを示す。
実施例２  整合性実験
【００２８】
複数の実験室規模の実施を行い、ＴＦＦモードのＰＥＧ化方法の整合性を評価した。７００−９００ｍＬの容量の精製されているｒＦＶＩＩＩを、５０−１００ｃｍ２の３０ｋＤａの再生セルロース膜を備えたUniflux（登録商標）ＴＦＦシステム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）に充填した。ｒＦＶＩＩＩ溶液を標的とする濃度にまで濃縮した。ＴＣＥＰをリテンテートの容器に充填し、２５０−４５０μＭの有効濃度を達成し、３０分間インキュベートした。還元した後、該システム中のＴＣＥＰを透析濾過により取り除いた。ＰＥＧを還元されたｒＦＶＩＩＩに充填し、１３−２６μＭの有効濃度を達成し、１０−１５時間インキュベートした。濃縮および透析濾過の間に利用される、リテンテートのクロス流速およびペルメエートの流速は、各々、６−１５Ｌ／分／ｍ２および０．５−２Ｌ／分／ｍ２である。ＰＥＧ化の後、リテンテートをＴＦＦシステムより取り出し、希釈し、５６ｍＬのカチオン交換クロマトグラフィーカラムに充填した。カラムに結合したｒＦＶＩＩＩを分離し、グラジエント溶出により溶出させた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により蛋白濃度を測定した。発色検定により試料の効能を測定した。
【００２９】
実験室規模の実施で使用された膜の面積を表に示す。ＴＦＦの実施について使用されるｒＦＶＩＩＩ溶液の初期濃度は３５μｇ／ｍＬから５５μｇ／ｍＬの範囲である。該溶液はその後で還元およびＰＥＧ化の前に１０倍まで濃縮された。
表２
【表２】
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【００３０】
実験室規模のＴＦＦ実施のカチオン交換クロマトグラフィー溶出特性を図５に示す。これらの特性は、ＰＥＧ化されているｒＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ化されていないｒＦＶＩＩＩおよび他のｒＦＶＩＩＩ関連の種を含有する、図４に示される特性と同様である。
【００３１】
図６に示されるＨＰＬＣ−ＳＥＣの分析性溶出特性は、ＰＥＧ化されているｒＦＶＩＩＩがモノＰＥＧ化されていることを示す。表３に要約されるＨＰＬＣ−ＳＥＣ保持時間はＰＥＧ化されているｒＦＶＩＩＩがＰＥＧ化されていないｒＦＶＩＩＩよりも２．５−２．６分早く溶出されることを示す。このことは実施例１の観察と一致する。
表３
【表３】
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【００３２】
ＴＦＦ実施のＰＥＧ化の効率を該プロセスの中間体の有効性を用いて計算した。効率は他の蛋白のＰＥＧ化と同等な４８−７２％（ＴＡＢＬＥ）の範囲にある（Brocchiniら、Adv. Drug Deliv. Rev. 60: 3-12, 2008；Schiavonら、Farmoco 55: 264-269, 2000；Leeら、Bioconjug. Chem. 18: 1728-1734, 2007）。この実施例はＴＦＦモードのＰＥＧ化が文献に報告されているＰＥＧ化の効率に相当する効率を再生しうることを示す。
実施例３  パイロット規模のＴＦＦモードのＰＥＧ化
【００３３】
パイロット規模のＴＦＦモードのＰＥＧ化を行い、該プロセスの拡張性を明らかにした。これらの実施にて、約２５ＬのｒＦＶＩＩＩ溶液を０．５ｍ２の再生セルロース膜を備えたＴＦＦスキッドに移した。該ｒＦＶＩＩＩ溶液を濃縮し、６００μＭの有効濃度のＴＣＥＰで還元させた。還元させた後に、ＴＣＥＰをＰＥＧ化緩衝液に対して透析濾過することで除去した。ＰＥＧを還元されたｒＦＶＩＩＩに充填し、効果的な４０μＭの濃度を達成した。濃縮および透析濾過の間に用いられたクロス流速および浸透流速は、各々、７Ｌ／分／ｍ２および１Ｌ／分／ｍ２であった。ＰＥＧ化インキュベーションの最後に、リテンテートを収穫し、希釈し、４Ｌのカチオン交換クロマトグラフィーカラムに充填した。カラムに結合した蛋白を分離し、グラジエント溶出により溶出した。
【００３４】
ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを分析性ＨＰＬＣ−ＳＥＣで分析し、その一方でＰＥＧ化効率を発色検定により測定される有効性に基づいて算定した。
【００３５】
該パイロット規模のＴＦＦモードのＰＥＧ化のカチオン交換クロマトグラフィーの溶出特性を図７に示す。上記した実施例に示されるように、該溶出特性はＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩピークおよび他のｒＦＶＩＩＩ関連の種を含有する。ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、適当なグラジエント溶出でのカチオン交換クロマトグラフィーにより他の種より分離され得る。
【００３６】
ＰＥＧ化されている、およびＰＥＧ化されていないｒＦＶＩＩＩの保持時間を表４に要約する。これら２つのｒＦＶＩＩＩ種の間の保持時間の違いは３分である。ＰＥＧ化の効率は４０−５５％の範囲にあった。これらはまた、上記した実施例に示される効率と一致する。この実施例はＴＦＦモードのＰＥＧ化が拡張可能であり、矛盾しないことを示した。
表４
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2013520441.tif 000015
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