(57)【要約】  ここに開示されているのは、無標識（Label-free）バイオセンサ(biosensor)を使用してヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈＥＲＧ）のイオンチャネル変調剤（modulator）を分類する方法である。ここに開示されているのは、無標識の共鳴導波路回折格子型（ＲＷＧ）バイオセンサを使用して、３種類の細胞株（内因的にｈＥＲＧを発現する天然細胞株、ｈＥＲＧを含まない天然細胞株、及び安定的にｈＥＲＧを発現した人工細胞株）におけるｈＥＲＧ変調剤のＤＭＲシグナルのパターンを明らかにすることであり、さらに、マーカ／細胞のパネル上で作用するｈＥＲＧ活性剤（activator）に対する変調剤分子の対応する変調インデックス、特に上記２つのｈＥＲＧ発現性細胞株における既知の活性剤であるマロトキシン（mallotoxin）のＤＭＲシグナルを明らかにすることである。
2013516173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＥＲＧ活性を変調する分子を分類する方法であって、
ａ．内因的にｈＥＲＧを発現する天然の細胞、安定してｈＥＲＧを発現する人工の細胞、及びその親であるｈＥＲＧを発現しない細胞の少なくとも３つの異なる細胞型を用いて個別に分子を培養するステップと、
ｂ．各細胞型上の分子によって誘発された細胞反応を無標識バイオセンサの細胞アッセイによって監視するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
ｃ．無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤を、前記分子の存在下の各細胞型を用いて培養するステップと、
ｄ．前記分子の存在下における各細胞型上の前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤によって誘発された細胞反応を監視するステップと、
ｅ．当該２つのｈＥＲＧを発現する細胞型における前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤によって誘発されたバイオセンサシグナルに対する分子のバイオセンサ変調インデックスを生成するステップと、
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤は、ｈＥＲＧ活性剤、ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤、又はｈＥＲＧ経路活性剤であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧ活性剤は、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、フルフェナム酸、ニフルム酸、及びジフルニサルからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧを発現する天然の細胞株は、白血病細胞株、胃癌細胞株、神経芽腫細胞株、乳癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、心血管細胞株、及び神経細胞株からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧを発現する天然の細胞株は、細胞株ＨＬ６０、細胞株ＳＧＣ７９０１、細胞株ＭＧＣ８０３、細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、細胞株ＭＣＦ−７、細胞株ＨＴ−２９、ＨＣＴ８、及び細胞株ＨＣＴ１１６からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧを発現しない天然の細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞株及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧを発現しない天然の細胞株は、細胞株ＨＥＫ−２９３及び細胞株ＣＨＯ−Ｋ１からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧを操作された細胞株は、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ又はＣＨＯ−ｈＥＲＧから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法であって、
前記分子のバイオセンサ変調インデックスは、前記分子の存在下における前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤のバイオセンサシグナルを、前記分子の非存在下における前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤のバイオセンサシグナルに対して正規化することによって生成されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記分子の効果とｈＥＲＧの既知の変調剤の効果とを比較するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧ変調剤は、ｈＥＲＧ活性剤、ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤、ｈＥＲＧ経路活性剤、ｈＥＲＧ遮断剤、又はｈＥＲＧ経路阻害剤であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧ変調剤は、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、ＡＧ−１２６、フルフェナム酸、ジフルニサル、ドフェチリド、チルホスチン５１、シサプリド、アステミゾール、又はセルチンドールからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記分子がｈＥＲＧ変調剤であるかどうかを判定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記分子がｈＥＲＧ変調剤に類似したバイオセンサインデックスを有している場合にｈＥＲＧ変調剤を同定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、
前記分子が既知のｈＥＲＧ活性剤に類似したバイオセンサインデックスを有している場合にｈＥＲＧ活性剤を同定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、
前記分子がｈＥＲＧ阻害剤に類似したバイオセンサインデックスを有している場合にｈＥＲＧ阻害剤を同定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、
ｈＥＲＧイオンフラックスアッセイ試験において前記分子をアッセイするステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記イオンフラックスアッセイはＲｂ＋イオンフラックスアッセイ、又は電気生理パッチクランプを用いたｈＥＲＧ電流アッセイであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法であって、
無標識バイオセンサアッセイにおいてｈＥＲＧ活性剤として同定される分子は、当該ｈＥＲＧイオンフラックスアッセイにおけるその作用に関わらずｈＥＲＧ活性剤と判定されことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載の方法であって、
無標識バイオセンサアッセイにおいて活性剤として同定されるがｈＥＲＧイオンフラックスアッセイにおいては活性剤として同定されない分子はｈＥＲＧ経路活性剤と判定されことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の方法であって、
無標識バイオセンサアッセイにおいて活性剤として同定され、かつｈＥＲＧイオンフラックスアッセイにおいても活性剤として同定される分子はｈＥＲＧイオンチャネル活性剤と判定されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年１２月３１日に出願された米国仮出願第６１／２９１７３１号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（human ether-a-go-go related gene （ｈＥＲＧ））は、電位依存性カリウムチャネル（KV11.1）における細孔を形成するαサブユニットをコード化する。ｈＥＲＧチャネルは、心筋細胞、ニューロン、膵臓β細胞、平滑筋、及びいくつかの癌細胞を含む様々な組織内において発現される。
【０００３】
ｈＥＲＧ電流は、活動電位の再分極において重要な心臓内の遅延整流電流Ｉｋｒの主要な成分として最もよく知られている。ｈＥＲＧチャネルにおける遺伝子の突然変異は、突然死を引き起こし得る病気である遺伝性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）の原因となることが知られている。ｈＥＲＧ電流を遮断することができる薬剤、すなわちｈＥＲＧチャネルのタンパク質輸送を阻害することができる薬剤は後天性（acquired）ＬＱＴを引き起こし得る。薬物誘発性の心リスクを最小化するために、研究新薬（Investigational New Drug）（ＩＮＤ）の申請を検討している全ての化合物は、ＩＣＨ  Ｓ７Ａガイドライン及びＩＣＨ  Ｓ７Ｂガイドラインに従ってかつＧＬＰ原則を遵守してｈＥＲＧ相互作用について試験されなければならない。一方、ｈＥＲＧチャネルタンパク質の突然変異はＱＴ延長症候群を引き起こすことも報告された。
【０００４】
ここに開示されているのは、ｈＥＲＧチャネル上の分子の作用、さらにｈＥＲＧチャネルを活性化又は阻害する所望の分子を同定する組成物及び方法である。
【発明の概要】
【０００５】
ここに開示されているのは、無標識（Label-free）バイオセンサ(biosensor)を使用してヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈＥＲＧ）のイオンチャネル変調剤（modulator）を分類する方法である。ここに開示されているのは、無標識の共鳴導波路回折格子型（ＲＷＧ）バイオセンサを使用して、３種類の細胞株（内因的にｈＥＲＧを発現する天然細胞株、ｈＥＲＧを含まない天然細胞株、及び安定的にｈＥＲＧを発現した人工細胞株）におけるｈＥＲＧ変調剤のＤＭＲシグナルのパターンを明らかにすることであり、さらに、マーカ／細胞のパネル上で作用するｈＥＲＧ活性剤（activator）に対する変調剤分子の対応する変調インデックス、特に上記２つのｈＥＲＧ発現性細胞株における既知の活性剤であるマロトキシン（mallotoxin）のＤＭＲシグナルを明らかにすることである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａ−図１Ｄは無標識ＲＷＧバイオセンサを用いた細胞アッセイによってｈＥＲＧ変調剤を評価及び分類する方法を示している。（Ａ）は大腸癌の細胞株であるＨＴ２９におけるｈＥＲＧ活性剤のマロトキシンＤＭＲシグナルであり、（Ｂ）は安定的にｈＥＲＧを発現した人工のＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるｈＥＲＧ活性剤のマロトキシンＤＭＲシグナルであり、（Ｃ）は天然のＨＥＫ２９３細胞におけるｈＥＲＧ活性剤のマロトキシンＤＭＲシグナルであり、（Ｄ）はＨＴ２９細胞株及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞株の両方におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対するマロトキシンの変調インデックスである。マロトキシンは１６マイクロモルであった。グラフＡ、Ｂ、及びＣには、それぞれ、賦形剤（すなわちバッファ）に対応する細胞の正味ゼロのＤＭＲシグナルのみがネガティブコントロールとして含まれた。各々平均化された反応を起こさせるために少なくとも２つの複製物が使用され、これは図２−図５についても同様である。
【図２】図２Ａ−図２Ｄは無標識ＲＷＧバイオセンサを用いた細胞アッセイによってｈＥＲＧ変調剤を評価及び分類する方法を示している。（Ａ）は大腸癌の細胞株であるＨＴ２９における抗炎症性薬剤のフルフェナム酸のＤＭＲシグナルであり、（Ｂ）は安定的にｈＥＲＧを発現した人工のＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるフルフェナム酸のＤＭＲシグナルであり、（Ｃ）は天然のＨＥＫ２９３細胞におけるフルフェナム酸のＤＭＲシグナルであり、（Ｄ）はＨＴ２９細胞株及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞株の両方におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対するフルフェナム酸の変調インデックスである。フルフェナム酸は全ての細胞において１０マイクロモルにてアッセイされ、マロトキシンは１６マイクロモルであった。グラフＡ、Ｂ、及びＣには、それぞれ、賦形剤（すなわちバッファ）に対応する細胞の正味ゼロのＤＭＲシグナルのみがネガティブコントロールとして含まれた。
【図３】図３Ａ−図３Ｄは無標識ＲＷＧバイオセンサを用いた細胞アッセイによってｈＥＲＧ変調剤を評価及び分類する方法を示している。（Ａ）は大腸癌の細胞株であるＨＴ２９におけるプロスタグランジンシンテターゼ阻害剤（inhibitor）のジフルニサルのＤＭＲシグナルであり、（Ｂ）は安定的にｈＥＲＧを発現した人工のＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるジフルニサルのＤＭＲシグナルであり、（Ｃ）は天然のＨＥＫ２９３細胞におけるジフルニサルのＤＭＲシグナルであり、（Ｄ）はＨＴ２９細胞株及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞株の両方におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対するジフルニサルの変調インデックスである。ジフルニサルは全ての細胞において１０マイクロモルにてアッセイされ、マロトキシンは１６マイクロモルであった。グラフＡ、Ｂ、及びＣには、それぞれ、賦形剤（すなわちバッファ）に対応する細胞の正味ゼロのＤＭＲシグナルのみがネガティブコントロールとして含まれた。
【図４】図４Ａ−図４Ｄは無標識ＲＷＧバイオセンサを用いた細胞アッセイによってｈＥＲＧ変調剤を評価及び分類する方法を示している。（Ａ）は大腸癌の細胞株であるＨＴ２９におけるＥＲＫ２阻害剤のＡＧ−１２６のＤＭＲシグナルであり、（Ｂ）は安定的にｈＥＲＧを発現した人工のＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるＡＧ−１２６のＤＭＲシグナルであり、（Ｃ）は天然のＨＥＫ２９３細胞におけるＡＧ−１２６のＤＭＲシグナルであり、（Ｄ）はＨＴ２９細胞株及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞株の両方におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対するＡＧ−１２６の変調インデックスである。ＡＧ−１２６は全ての細胞において１０マイクロモルにてアッセイされ、マロトキシンは１６マイクロモルであった。グラフＡ、Ｂ、及びＣには、それぞれ、賦形剤（すなわちバッファ）に対応する細胞の正味ゼロのＤＭＲシグナルのみがネガティブコントロールとして含まれた。
【図５】図５Ａ−図５Ｄは無標識ＲＷＧバイオセンサを用いた細胞アッセイによってｈＥＲＧ変調剤を評価及び分類する方法を示している。（Ａ）は大腸癌の細胞株であるＨＴ２９における強力なＥＧＦ受容体阻害剤のチルホスチン５１のＤＭＲシグナルであり、（Ｂ）は安定的にｈＥＲＧを発現した人工のＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるチルホスチン５１のＤＭＲシグナルであり、（Ｃ）は天然のＨＥＫ２９３細胞におけるチルホスチン５１のＤＭＲシグナルであり、（Ｄ）はＨＴ２９細胞株及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞株の両方におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対するチルホスチン５１の変調インデックスである。チルホスチン５１は全ての細胞において１０マイクロモルにてアッセイされ、マロトキシンは１６マイクロモルであった。グラフＡ、Ｂ、及びＣには、それぞれ、賦形剤（すなわちバッファ）に対応する細胞の正味ゼロのＤＭＲシグナルのみがネガティブコントロールとして含まれた。
【図６】図６Ａ−図６Ｂは２つの異なる濃度のＫＣｌの下でＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を用いた場合のｈＥＲＧ変調剤のＲｂ＋フラックス測定結果を示している。（Ａ）は５ｍＭのＫＣｌであり、（Ｂ）は４０ｍＭのＫＣｌである。ＫＣｌが５ｍＭに保たれていた際には、当該変調剤は１０マイクロモル又は５０マイクロモルにおいてアッセイされた。ＫＣｌが４０ｍＭに保たれていた際には、当該変調剤は１０ｍＭのみにおいてアッセイされた。
【図７】図７Ａ−図７ＢはＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるマロトキシンの用量依存性ＤＭＲシグナルを示している。（Ａ）はリアルタイムの動的反応である。（Ｂ）は刺激後１８分における振幅に基づいて計算されたマロトキシンＤＭＲシグナルであり、マロトキシンの用量の関数としてプロットされた。
【図８】図８Ａ−図８Ｂにおいて、（Ａ）は３つの異なるｈＥＲＧ遮断剤（blocker）であるシサプリド、アステミゾール、及びセルチンドールの各々の非存在下（コントロール）及び存在下における１６μＭのマロトキシンに対するＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞のＤＭＲシグナルを示している。各化合物は３０μＭであり、３０分間細胞を前処理するのに使用された。（Ｂ）はアステミゾールによるマロトキシンＤＭＲシグナルの用量依存性阻害結果を示している。
【図９】図９はＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるマロトキシンのロバストなＤＭＲシグナルを示している。１６マイクロモルのマロトキシンによって誘発された場合の平均化された細胞ＤＭＲ反応がネガティブコントロール（「バッファ」）と比較された。平均化された反応を計算するのに３２の複製物が使用された。
【図１０】図１０Ａ−図１０ＢはＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の電流におけるｈＥＲＧ変調剤の効果を示す電気生理学的ダイアグラムである。（Ａ）はニフルム酸であり、（Ｂ）はフルフェナム酸である。各分子は５０マイクロモルにてアッセイされた。グレーの曲線は変調剤の添加前におけるＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の電気生理学的記録を示し、黒の曲線は対応する変調剤の添加後における当該細胞の電気生理学的記録を示した。
【図１１】図１１Ａ−図１１ＢはＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の電流におけるｈＥＲＧ変調剤の効果を示す電気生理学的ダイアグラムである。（Ａ）はチルホスチンであり、（Ｂ）はジフルニサルである。各分子は５０マイクロモルにてアッセイされた。グレーの曲線は変調剤の添加前におけるＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の電気生理学的記録を示し、黒の曲線は対応する変調剤の添加後における当該細胞の電気生理学的記録を示した。
【図１２】図１２はＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の電流におけるＡＧ１２６の効果を示す電気生理学的ダイアグラムである。ＡＧ１２６は５０マイクロモルにてアッセイされた。グレーの曲線はＡＧ１２６の添加前におけるＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の電気生理学的記録を示し、黒の曲線はＡＧ１２６の添加後における当該細胞の電気生理学的記録を示した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
「組成物及び方法」
「ｈＥＲＧ」
ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈＥＲＧ）製品は、心筋活動電位の再分極を調節する遅延整流性Ｋ＋チャネルの急速成分（rapid component）における細孔を形成するサブユニットをコード化する。ｈＥＲＧは電位依存性イオンチャネルであり、かつ細胞の原形質膜においてカリウムイオンの移動を制御するのに関与する。科学文献においてｈＥＲＧの機能はイオン移動の制御及びそれによる細胞の生態の文脈内において大いに議論され記載されている。ｈＥＲＧイオンチャネルは大きな四量体のタンパク質であり、細胞背景によっては他のタンパク質と錯体を形成し得る。従って、当該細胞背景はｈＥＲＧの変調を観察するアッセイに影響を与えることがある。ここに開示されたアッセイは、３種類の細胞及び細胞株、すなわち、天然のｈＥＲＧ発現細胞株、ｈＥＲＧを発現しない天然の細胞株、及びｈＥＲＧを発現するように操作された人工の細胞株を使用する。無標識バイオセンサの細胞アッセイは光学バイオセンサを用いたＤＭＲシグナル又は電気バイオセンサを用いたインピーダンスシグナルなどの汎用の読み出し情報に依存しており、かつ当該バイオセンサのシグナルはしばしば対象となる標的（例えばｈＥＲＧチャネル）におけるシステム細胞生態情報を含んでいるため、単一のｈＥＲＧ発現細胞を用いたスクリーニング検査結果には高い確率で偽陽性のものが存在し得る。３つの細胞型を結合して無標識バイオセンサを用いたｈＥＲＧ変調を検出することは、偽陽性を大きく減少させるだけでなく、同定されたｈＥＲＧ変調電位の質を高めることができる。さらに、当該３つの細胞株を使用することによって、ｈＥＲＧ特有の変調剤の高い分解能の評価が作成される。また、ここに開示されたアッセイはマロトキシンなどのｈＥＲＧ活性剤を使用し、これによってｈＥＲＧを発現する細胞株の両方におけるｈＥＲＧ活性剤に誘発されたＤＭＲシグナルに対する分子の変調インデックスを生成する。当該変調インデックスはｈＥＲＧチャネル又はｈＥＲＧチャネルのシグナル伝達錯体上において作用する分子の作用モードを分類することに使用されることもできる。
【０００８】
心筋細胞において重要な役割を果たす一方、ｈＥＲＧチャネルの発現レベルが白血病、大腸癌、胃癌、乳癌、及び肺癌の細胞を含むいくつかの種類の癌細胞内において上昇したことを示す証拠が増えてきている。なぜ癌細胞内においてｈＥＲＧチャネルが多く発現されるかは明らかではないが、ｈＥＲＧチャネルが癌細胞の増殖に影響を与えることが示された。
【０００９】
ｈＥＲＧチャネルの機能はプロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣに関する経路によって変調される。ｈＥＲＧタンパク質がｃＡＭＰ依存性ＰＫＡの活性化によってリン酸化された際にｈＥＲＧ電流は急性的に阻害される。ｃＡＭＰレベルの上昇及びＰＫＡ活性の延長もｈＥＲＧタンパク質の発現を増大させることがある。さらに、ｈＥＲＧ電流はＰＫＡ及びＰＫＣを介してアドレナリン受容体によって変調されることがある。
【００１０】
ｈＥＲＧチャネルは様々な構造のチャネル遮断剤を収容することができる特有の細孔領域を有している。比較的大きな内部空洞及び当該チャネルの内部（Ｓ６）へリックスにおける特定の芳香族アミノ酸残基（Ｙ６５２及びＦ６５６）の存在は、ｈＥＲＧに異なる薬剤を収容及び結合させる重要な特徴である。
【００１１】
様々なｈＥＲＧチャネル遮断剤に加えて、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、マロトキシン、及びＡ−９３５１４２を含む７つのｈＥＲＧチャネル活性剤が同定された（Su, Z., et al. Electrophysiologic characterization of a novel hERG channel activator. Biochem Pharm 77:1383, 2009を参照）。これらｈＥＲＧ活性剤は異なる化学構造を有しており、かつ異なるメカニズムによってｈＥＲＧチャネルの活性を強化する。その中で、マロトキシン及びＡ−９３５１４２は電位依存性のチャネル活性化をシフトして脱分極電位を小さくすることができる。電気生理の研究は、１０マイクロモルのＭＴＸが最大活性電位の半分の電位（Ｖ１／２）を２５ｍＶの過分極方向へシフトすることを示した。これら既知のｈＥＲＧ活性剤の中で、ＰＤ−１１８０５７、ＮＳ３６２３、及びＲＰＲ２６０２４３は、心室内ＡＰ期間及びＱＴ間隔の両方を短くすることが示された。ＲＰＲ２６０２４３及びＰＤ−１１８０５７はドフェチリド（dofetilide）のＡＰ延長効果を逆行させることがある。これらチャネル活性剤の作用メカニズムは様々である。ＮＳ１６４３及びＮＳ３６２３はｈＥＲＧの電位依存性を右方向へシフトすることによってｈＥＲＧの不活性化を一次的に低減するが、両方の化合物はＳ５−ポア（pore）のリンカ（linker）と相互作用するように構成されておらず、ｈＥＲＧチャネルとの作用部位は未知である。マロトキシンは活性化曲線を大きく左方向へシフトするだけでなく非活性化を遅延させ、かつ不活性化への小さな効果を有している。
【００１２】
「ｈＥＲＧアッセイ」
薬剤の安全性の問題におけるｈＥＲＧチャネルの重要性により、ｈＥＲＧ機能のアッセイに対する様々な手法が開発されてきた。電気生理のマニュアルパッチクランプ法（manual patch clamp）は常にｈＥＲＧ研究における最適基準（gold standard）とされてきた。しかし、マニュアルパッチクランプは経験豊富な電気生理学者かつ大きな労力を必要とする。近年、ｈＥＲＧチャネル機能における化合物効果の高いスループットの試験を媒体に許容する自動化されたパッチクランプ法（例えばモレキュラーデバイス社のIonWorksなど）が開発されている。単一の破裂細胞（ruptured cell）からｈＥＲＧ活性を測定するパッチクランプとは異なり、蛍光膜電位のアッセイすなわちＲｂ＋フラックスアッセイは複数の細胞からｈＥＲＧチャネルの反応を測定する。さらに、生物化学的アッセイを使用してｈＥＲＧタンパク質に親和性を結合する化合物が測定されてきた。しかし、特に高いスループットの生理学的かつ機能的なアッセイの読み出し情報の欠如は、イオンチャネルに関する創薬においてボトルネックとされている。
【００１３】
無標識のバイオセンサ、特に光学バイオセンサの細胞アッセイは、その検知領域すなわち検出領域内における物質の再分配に敏感であるため、これらバイオセンサの細胞アッセイはイオンチャネルの活性を直接監視するのには適していないと一般に考えられている。しかし、少なくとも多くの癌細胞において、ｈＥＲＧは非常に大きなイオンチャネルであるため、大きなシグナル伝達錯体を形成する受容体チロシンキナーゼ及び／又はインテグリンを含むいくつかの他のシグナル伝達分子が共存しているはずである。ｈＥＲＧチャネルが細胞シグナル伝達に関与することを示す証拠が存在する。さらに、異なるメカニズムが介在しているが、最近発見されたいくつかのｈＥＲＧ活性剤は生理学的状態又はそれに近い状態のｈＥＲＧチャネルの活性化を引き起こすことができる。従って、我々は、無標識のＲＷＧバイオセンサの細胞アッセイが、細胞に電位を付加することなく、当該活性化及びそれに続くｈＥＲＧチャネルのシグナル伝達を直接アッセイすることができると推測した。
【００１４】
無標識の細胞アッセイは、バイオセンサの読み出しすなわち得られる出力シグナルの統合的かつ一般的な性質の故に、特異的ではないと広く考えられている。化合物に誘発されたバイオセンサの所定の出力シグナルは、候補となる異なる細胞プロセスすなわちシグナル伝達事象に由来するものである。さらに、ほぼ全ての化合物に共通して、複合薬理（polypharmacology）を有する化合物はこれらバイオセンサの細胞アッセイによって観測される化合物の作用モードの判定を複雑にする可能性がある。これに対処するために、ｈＥＲＧ変調剤をより特異的かつ確実に特性化する方法、同定する方法、及びスクリーニング検査する方法がここに開示されている。
【００１５】
例えばトール様（toll-like）受容体などの他のイオンチャネルのような他のタンパク質は、ここに開示された方法に従って同様にスクリーニング検査されかつ特性化されることができる。
【００１６】
特定の無標識の細胞アッセイ方法において、その１つは細胞株、標的、活性剤（すなわち変調剤）、及びマーカを有している。これらの組合せは様々な変調剤のアレイのアッセイに使用されることができる（例えば、国際公開第２００６１０８１８３号（発明者Fang, Y., et al.、発明の名称「Label-free biosensors and cells」）を参照）。
【００１７】
典型的な無標識の細胞アッセイ標的法は偽陽性を導出することが多い。これは、標的受容体のバイオセンサシグナルにおける統合的性質の故に無標識の細胞アッセイがしばしば経路レベルで分子のプロファイル作成を行う（profiling）（対象の標的だけでなく当該標的に関する経路上で作用する変調剤が共にスクリーニング検査によって検出されることを意味している）ためである。その結果、典型的な無標識の細胞アッセイ標的法はこれらに関与する経路及び標的に関する情報を導出するが、しばしば標的レベルでの特異性は低いものである。ここに開示された方法は、無標識の標的アッセイ及び経路アッセイから得られる情報を使用して標的レベルにおいて高い特異性のスクリーニング検査結果を実現する。
【００１８】
ここに開示された方法は、特定の標的上において作用する変調剤の、従来の無標識の統合された薬理方法よりも高い分解能の評価を提供し、当該従来の方法は例えば米国出願第１２／６２３，６９３号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods for Characterizing Molecules」、出願日２００９年１１月２３日）及び米国出願第１２／６２３，７０８号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods of creating an index」、出願日２００９年１１月２３日）に開示されている。米国出願第１２／６２３，６９３号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods for Characterizing Molecules」、出願日２００９年１１月２３日）及び米国出願第１２／６２３，７０８号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods of creating an index」、出願日２００９年１１月２３日）は、少なくとも無標識のアッセイ及び方法に関する材料について、参照することより本願に組み込まれているものとする。米国出願第１２／６２３，６９３号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods for Characterizing Molecules」、出願日２００９年１１月２３日）及び米国出願第１２／６２３，７０８号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods of creating an index」、出願日２００９年１１月２３日）に開示されている方法においては、マーカパネルが選択されてアッセイされており、この情報は当該マーカに接続された細胞の経路に関する情報を提供する。ここに開示された方法は、特定の標的における適切な経路に基づいて同定された細胞を使用する。特定の実施例において、米国出願第１２／６２３，６９３号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods for Characterizing Molecules」、出願日２００９年１１月２３日）及び米国出願第１２／６２３，７０８号（発明者はFang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E、発明の名称は「Methods of creating an index」、出願日２００９年１１月２３日）に開示された方法に使用されている情報は、ここに開示された方法に使用されることができる情報及び同定された細胞を提供するのに使用されることができる。
【００１９】
ここに開示されているのは従来未知であった活性を有する分子である。ここに開示されているのはｈＥＲＧイオンチャネルアッセイ及び無標識バイオセンサアッセイにおいて試験された３０００を超える化合物である。これら化合物は、BioMol 640というＦＤＡ承認済み薬剤ライブラリ、BioMol 80というキナーゼ阻害剤ライブラリ、BioMol ActiComライブラリ、コーニング社内部参照の化合物ライブラリ、及びコーニング社の内部化合物ライブラリを含む。ここに開示された方法に従って、これら化合物のサブセットはｈＥＲＧ変調剤として同定され、ｈＥＲＧ変調剤は、ｈＥＲＧ電流への影響の有無にかかわらずｈＥＲＧシグナル伝達を活性化するｈＥＲＧシグナル伝達活性剤、ｈＥＲＧ阻害剤、及びｈＥＲＧ活性剤の３つのクラスに分類されることができる。
【００２０】
従来のｈＥＲＧイオンチャネルアッセイは、イオン吸収アッセイを使用してＲｂ＋フラックスなどのイオンフラックスをアッセイすること、すなわちパッチクランプ法を用いてｈＥＲＧ電流を直接アッセイすることを含む。従来から、Ｒｂ＋フラックス及び／又はｈＥＲＧ電流を増加させる分子はｈＥＲＧ活性剤と称され、Ｒｂ＋フラックス及び／又はｈＥＲＧ電流を阻害する分子はｈＥＲＧ阻害剤と称されている。ここに開示された方法は、ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤及びｈＥＲＧ経路活性剤を含むｈＥＲＧ活性剤の異なるクラスを同定した。これらｈＥＲＧ活性剤は無標識バイオセンサの細胞アッセイを用いた場合の細胞における検出可能なバイオセンサシグナルとなる場合とならない場合がある。ｈＥＲＧシグナル伝達錯体又はｈＥＲＧを介したｈＥＲＧ発現細胞において検出可能なバイオセンサシグナルとなるｈＥＲＧ活性剤は無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤とも称される。ｈＥＲＧ経路活性剤は、細胞内においてｈＥＲＧ又はｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体を介してもたらされる細胞シグナル伝達を引き起こす分子である。これらｈＥＲＧ経路活性剤はｈＥＲＧシグナル伝達活性剤とも称される。ｈＥＲＧ経路活性剤は、従来的には、ｈＥＲＧイオンフラックス及び／又はｈＥＲＧ電流を増強するものについてはｈＥＲＧ活性剤、阻害するものについてはｈＥＲＧ阻害剤とすることができる。
【００２１】
本願のデータが開示するのは、従来は未知であった、ｈＥＲＧチャネルを介したイオンチャネルフラックス活性に依存するｈＥＲＧの細胞シグナル伝達活性又は依存しないｈＥＲＧの細胞シグナル伝達活性が存在するということである。ｈＥＲＧ経路活性剤は、ｈＥＲＧチャネルの直下又はｈＥＲＧチャネルに関するシグナル伝達錯体の下流にある特定の経路の活性化を導出し、そして細胞内の検出可能なバイオセンサシグナルを誘発することができる。これら経路は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の経路、インテグリン経路、又はこれら経路の組合せを含み得る。
【００２２】
本願のデータが明示するものの１つは、プロドラッグ及び薬剤が、従来のｈＥＲＧ活性剤として、またｈＥＲＧ経路活性剤として、ｈＥＲＧチャネルに異なった影響を及ぼし得るということである。
【００２３】
マロトキシンは市販されており、無標識のｈＥＲＧ経路活性剤であり（図１）、強力なｈＥＲＧイオンフラックス活性剤であり（図６）、強力なｈＥＲＧ電流活性剤である（データは示されていない）。
【００２４】
さらに同定されたのは、フルフェナム酸がｈＥＲＧ経路活性剤であり（図２）、弱いｈＥＲＧイオンフラックス活性剤であり（図６）、弱いｈＥＲＧ電流活性剤である（図１０Ｂ）ことである。
【００２５】
さらに同定されたのは、ジフルニサルがｈＥＲＧ経路活性剤であり（図３）、弱いｈＥＲＧイオンフラックス活性剤であり（図６）、ｈＥＲＧ電流阻害剤である（図１１Ｂ）ことである。
【００２６】
さらに同定されたのは、ＡＧ１２６が、特にＨＴ２９の内因性ｈＥＲＧチャネル錯体におけるｈＥＲＧ経路活性剤であり（図４）、ｈＥＲＧイオンフラックスに対する非エフェクタ（non-effector）であり（図６）、ｈＥＲＧ電流に対する非エフェクタである（図１２）ことである。
【００２７】
さらに同定されたのは、チルホスチン５１がｈＥＲＧ経路活性剤であり（図５）、弱いｈＥＲＧイオンフラックス活性剤であり（図６）、ｈＥＲＧ電流阻害剤である（図１１Ａ）ことである。
【００２８】
さらに同定されたのは、ニフルム酸がｈＲＥＧ経路活性剤であり（図示せず）、ｈＥＲＧ電流活性剤である（図１０Ａ）ことである。
【００２９】
さらに同定されたのは、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、フルフェナム酸、ニフルム酸、及びジフルニサルが無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤であることである。
【００３０】
ここに開示されているのは、ｈＥＲＧ変調剤、ｈＥＲＧ活性剤、無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤、ｈＥＲＧ経路活性剤、ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤、ｈＥＲＧ阻害剤、ｈＥＲＧ経路阻害剤、及びｈＥＲＧイオンチャネル阻害剤である。これらクラス及び各々の特定の例は例えばここに開示された方法において使用されることができる。
【００３１】
ここに開示された方法、並びに当該方法において使用される組成物及び化合物は、材料、物質、分子、及びリガンドなどの複数の異なるクラスから生ずることができる。さらに、例えばｈＥＲＧ活性化用のマーカとしてのマロトキシンなど、マーカと呼ばれる無標識バイオセンサアッセイ特有のこれらクラスの特定のサブセットも開示されている。
【００３２】
さらに、分子混合物などのこれらクラスの混合物も開示されており、かつここに開示された方法に使用される。
【００３３】
特定の方法において、未知の分子、試験分子、薬剤候補分子、及び既知の分子が使用される。
【００３４】
特定の方法又は状況において、変調が行われ又は変調剤がその機能を果たす。同様に、既知の変調剤が使用される。
【００３５】
特定の方法及び組成物において、細胞が関与しており、細胞が培養され、本明細書に記載しているように細胞培養物が使用される。
【００３６】
ここに開示された方法はバイオセンサを使用するアッセイを含む。特定のアッセイにおいて、バイオセンサはアゴニズムモード又はアンタゴニズムモードにおいて実行される。しばしば、当該アッセイは、材料、物質、又は分子などの１つ以上のクラスで細胞を処理することを含む。本明細書に記載しているように、物質はさらに処理されることができる。
【００３７】
特定の方法において、例えば細胞と分子とを接触させるステップが実行されることができる。ここに開示された方法において、ＤＭＲ反応などのバイオセンサ反応として表現される細胞反応などの反応が検出されることができる。これらの反応及び他の反応はアッセイされることができる。特定の方法において、バイオセンサからのシグナルはロバストなバイオセンサシグナルすなわちロバストなＤＭＲシグナルである。
【００３８】
ここに開示された方法は、無標識バイオセンサを使用して、一次プロファイル、二次プロファイル、及び変調プロファイルなどのプロファイルを生成することができる。これらプロファイル及び他のプロファイルは、分子に関するマーキング判定に使用されることができ、例えば本明細書に記載されているクラスに対して使用されることができる。
【００３９】
さらに、ここに開示されているのは、分子、細胞、材料、又はここに開示された物質などの化合物又は組成物のライブラリ及びパネルである。さらに、マーカパネル及び細胞パネルなどの特定のパネルが開示されている。
【００４０】
ここに開示された方法は様々な特徴を使用し、当該特徴は、バイオセンサシグナル、ＤＭＲシグナル、正規化すること、コントロール、ポジティブコントロール、変調比較、インデックス、バイオセンサインデックス、ＤＭＲインデックス、分子バイオセンサインデックス、分子ＤＭＲインデックス、分子インデックス、変調剤バイオセンサインデックス、変調剤ＤＭＲインデックス、分子変調インデックス、既知の変調剤バイオセンサインデックス、既知の変調剤ＤＭＲインデックス、マーカバイオセンサインデックス、マーカＤＭＲインデックス、マーカのバイオセンサインデックスを変調すること、ＤＭＲシグナルを変調すること、増強すること、及びインデックスの類似性である。
【００４１】
ここに開示されている組成物、化合物、又は他のものはここに開示されている方法によって特性化されることができる。
【００４２】
ここに開示されているのは、増強、阻害、及びこれらと同様の用語のような特性化に依存する方法である。
【００４３】
特定の方法においては、受容体すなわち細胞標的が使用される。特定の方法はシグナル伝達経路、分子処理された細胞、及び他の細胞プロセスに関する情報を提供することができる。
【００４４】
特定の実施例においては、特定の効能又は有効性が特性となり、その直接の作用（例えば薬剤候補分子）がアッセイされることができる。
【００４５】
ここに開示された方法は、サンプル上で又はサンプルと共に実行されることができる。
【００４６】
ここに開示されているのは、無標識バイオセンサの細胞アッセイを使用して、ｈＥＲＧイオンチャネルを介して直接作用する変調剤又はｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体を介して間接的に作用する変調剤を特性化する方法である。ここに開示されているのは、ｈＥＲＧ変調剤を特性化するために、３つの細胞型、すなわち、内因的にｈＥＲＧイオンチャネルを発現する癌細胞株、内因性ｈＥＲＧチャネルを含まない天然の細胞株、及び過剰にｈＥＲＧチャネルを発現する人工の細胞株を使用することである。さらに、ここに開示されているのは、ｈＥＲＧ変調剤の作用モードをさらに裏付ける読み出しとしてマロトキシン又他のｈＥＲＧ活性剤を使用することである。また、ここに開示されているのは、例えばＲｂ＋アッセイ、膜電位蛍光アッセイ、又はパッチクランプアッセイなどのイオンフラックスアッセイのようなさらなるアッセイを用いる方法である。
【００４７】
内因的にｈＥＲＧチャネルを発現する天然の細胞株は、白血病細胞株のＨＬ６０、胃癌細胞株のＳＧＣ７９０１及びＭＧＣ８０３、神経芽腫細胞株のＳＨ−ＳＹ５Ｙ、乳癌細胞株のＭＣＦ−７、並びにヒト大腸癌細胞のＨＴ−２９、ＨＣＴ８、及びＨＣＴ１１６を含むが、これらに限定されない。ｈＥＲＧを含まない天然の細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞株のＨＥＫ−２９３、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株のＣＨＯ−Ｋ１を含むが、これらに限定されない。過剰にｈＥＲＧを発現する人工の細胞株は、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ及びＣＨＯ−ｈＥＲＧ細胞を含むが、これらに限定されない。内因性ｈＥＲＧチャネルを有する一次細胞を含む心血管細胞又は神経細胞が使用されることもできる。
【００４８】
ｈＥＲＧ活性剤は、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、及びＡ−９３５１４２を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
ここに開示されているのはｈＥＲＧ活性を変調する分子を分類する方法であり、当該方法は、ａ．内因的にｈＥＲＧを発現する天然の細胞、安定的にｈＥＲＧを発現する人工の細胞、及びその親であるｈＥＲＧを発現しない細胞からなる３つの細胞型を用いて分子を個別に培養するステップと、ｂ．無標識バイオセンサの細胞アッセイによって各細胞型における分子に誘発された細胞反応を監視するステップと、を含む。
【００５０】
さらに、ここに開示されている方法は、ｃ．当該分子の存在下において各細胞型を用いて無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤を培養するステップと、ｄ．当該分子の存在下において各細胞型における当該無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤に誘発された細胞反応を監視するステップと、ｅ．当該２つのｈＥＲＧを発現する細胞型における当該無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤に誘発されたバイオセンサシグナルに対する分子のバイオセンサ変調インデックスを生成するステップと、をさらに含む。
【００５１】
さらに、ここに開示されている方法において、当該無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤はｈＥＲＧイオンチャネル活性剤又はｈＥＲＧ経路活性剤であり、当該ｈＥＲＧ活性剤は、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、フルフェナム酸、ニフルム酸、及びジフルニサルからなる群から選択され、当該ｈＥＲＧを発現する天然の細胞株は、白血病細胞株、胃癌細胞株、神経芽腫細胞株、乳癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、心血管細胞株、及び神経細胞株からなる群から選択され、当該ｈＥＲＧを発現する天然の細胞株は、細胞株ＨＬ６０、細胞株ＳＧＣ７９０１、細胞株ＭＧＣ８０３、細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、細胞株ＭＣＦ−７、細胞株ＨＴ−２９、ＨＣＴ８、及び細胞株ＨＣＴ１１６からなる群から選択され、当該ｈＥＲＧを発現しない天然の細胞株はヒト胚性腎臓細胞株及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株からなる群から選択され、当該ｈＥＲＧを発現しない天然の細胞株は細胞株ＨＥＫ−２９３及び細胞株ＣＨＯ−Ｋ１からなる群から選択され、当該ｈＥＲＧを操作された細胞株はＨＥＫ−ｈＥＲＧ又はＣＨＯ−ｈＥＲＧから選択され、当該分子のバイオセンサ変調インデックスは、当該分子の存在下における当該無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤のバイオセンサシグナルを、当該分子の非存在下における当該無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤のバイオセンサシグナルに対して正規化することによって生成され、上記特徴は１つの方法又はその任意の組合せに含まれ得るものである。
【００５２】
さらに、ここに開示されている方法は、当該分子の効果とｈＥＲＧの既知の変調剤の効果とを比較するステップをさらに含む。
【００５３】
ここに開示された方法において、当該ｈＥＲＧ変調剤は、ｈＥＲＧ活性剤、ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤、ｈＥＲＧ経路活性剤、ｈＥＲＧ遮断剤、又はｈＥＲＧ経路阻害剤であり、当該ｈＥＲＧ変調剤は、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、ＡＧ−１２６、フルフェナム酸、ジフルニサル、ドフェチリド、チルホスチン５１、シサプリド、アステミゾール、又はセルチンドールからなる群から選択され、上記特徴は１つの方法又はその任意の組合せに含まれ得るものである。
【００５４】
ここに開示された方法は、当該分子がｈＥＲＧ変調剤であるかどうかを判定するステップと、当該分子がｈＥＲＧ変調剤に類似したバイオセンサインデックスを有している場合にｈＥＲＧ変調剤を同定するステップと、当該分子が既知のｈＥＲＧ活性剤に類似したバイオセンサインデックスを有している場合にｈＥＲＧ活性剤を同定するステップと、当該分子がｈＥＲＧ阻害剤に類似したバイオセンサインデックスを有している場合にｈＥＲＧ阻害剤を同定するステップと、ｈＥＲＧイオンフラックスアッセイ試験において当該分子をアッセイするステップと、をそれぞれさらに含み、上記特徴は１つの方法又はその任意の組合せに含まれ得るものである。
【００５５】
さらに、ここに開示された方法において、当該イオンフラックスアッセイはＲｂ＋イオンフラックスアッセイ、又は電気生理パッチクランプを用いたｈＥＲＧ電流アッセイであり、無標識バイオセンサアッセイにおいてｈＥＲＧ活性剤として同定される分子は、当該ｈＥＲＧイオンフラックスアッセイにおけるその作用に関わらずｈＥＲＧ活性剤と判定され、無標識バイオセンサアッセイにおいて活性剤として同定されるがｈＥＲＧイオンフラックスアッセイにおいては活性剤として同定されない分子はｈＥＲＧ経路活性剤と判定され、無標識バイオセンサアッセイにおいて活性剤として同定され、かつｈＥＲＧイオンフラックスアッセイにおいても活性剤として同定される分子はｈＥＲＧイオンチャネル活性剤と判定され、上記特徴は１つの方法又はその任意の組合せに含まれ得るものである。
【００５６】
定義
ここに開示されている様々な実施例は、図がある場合には図を参照して詳細に説明される。様々な実施例に対する参照物は本開示の範囲を限定するものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書に記載されている例は限定的なものではなく、特許請求の範囲の実施可能な多くの実施例のいくつかを記載しているに過ぎない。
【００５７】
「不定冠詞、単数形（A）」
本明細書及び特許請求の範囲に使用されている「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の単数系の用語は明示されない限り複数の対象を含む。従って、例えば「薬剤担体」は２つ以上の担体の混合物等を含む。
【００５８】
「省略形（Abbreviation）」
当業者には広く知られている省略形が使用されることがある（例えば、時間に対する「ｈ」又は「ｈｒ」、グラムに対する「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルに対する「ｍＬ」、室温に対する「ｒｔ」、ナノメートルに対する「ｎｍ」、モルに対する「Ｍ」など）。
【００５９】
「約（About）」
例えば、組成物内の成分数、濃度、体積、処理温度、処理時間、収率、流速、圧力などの値、及びその範囲であって本開示の実施例に記載されているものに「約」が修飾されている場合、その数量は変化することを示し、当該変化は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、又は使用する製剤を作製するのに使用される典型的な測定手順及び取扱手順によって、これら手順における故意でない間違いによって、製品、原料、出発材料の純度、又は本方法を実施するのに使用される成分の差によって、及びこれらと同様の要因によって生じ得る。さらに、用語「約」は特定の初期濃度又は初期混合における組成物又は製剤の老化によって変化する量及び特定の初期濃度又は初期混合における組成物又は製剤の混合又は処理によって変化する量を含む。用語「約」が修飾されているかに関わらず、特許請求の範囲はこれら数量に均等なものを含む。
【００６０】
「アッセイすること（Assaying）」
アッセイすること、アッセイする等の用語は細胞又は分子などの物質の特性を判定するための分析をいい、当該特性は例えばリガンド又はマーカなどの１つ以上の外因性刺激剤に刺激された際の細胞の光学反応又は生体インピーダンス反応の有無、量、範囲、速度、動態、又は種類である。刺激剤に対する細胞反応のバイオセンサシグナルを生成することがアッセイであってもよい。
【００６１】
「反応をアッセイすること（Assaying the response）」
「反応をアッセイすること」等の用語は、当該反応を特性化する手段を使用することを意味する。例えば、分子が細胞に接触させられる場合、当該分子にさらされた当該細胞の反応をアッセイするのにバイオセンサが使用されることができる。
【００６２】
「アゴニズムモード及びアンタゴニズムモード（Agonism and antagonism mode）」
アゴニズムモード等の用語は、例えばＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルのきっかけとなる分子の能力を判定するために細胞が分子にさらされるようなアッセイをいい、一方、アンタゴニズムモードは、マーカに反応する細胞のバイオセンサシグナルを変調する分子の能力を判定するために細胞が分子の存在するマーカにさらされるようなアッセイをいう。
【００６３】
「バイオセンサ（Biosensor）」
バイオセンサ等の用語は、生物学的成分に物理化学的検出成分を組み合わせた検体を検出するデバイスをいう。典型的な場合バイオセンサは３つの部分からなり、当該部分は、生物学的成分又は要素（例えば、組織、微生物、病原体、細胞、又はこれらの組合せ）、検出要素（光学的、圧電的、電気化学的、温度的、又は磁気的などの物理化学的手法において機能するもの）、及び両成分に関するトランスデューサである。当該生物学的成分又は要素は、例えば、生細胞、病原体、又はこれらの組合せであることができる。実施例において、光学バイオセンサは、生細胞、病原体、又はこれらの組合せにおける分子認識事象又は分子刺激事象を定量化可能なシグナルへ変換する光学トランスデューサを含み得る。
【００６４】
「バイオセンサ反応（Biosensor response）」
「バイオセンサ反応」、「バイオセンサ出力シグナル」、「バイオセンサシグナル」等の用語は、細胞を有するセンサシステムの細胞反応に対する応答をいう。バイオセンサは細胞反応を定量化可能なセンサ反応へ変換する。バイオセンサ反応は、ＲＷＧ又はＳＰＲなどの光学バイオセンサによって測定された刺激に対する光学反応又は電気バイオセンサによって測定された刺激に対する細胞の生体インピーダンス反応である。本開示の実施例において、バイオセンサ反応は刺激に対する細胞反応に直結しているため、当該バイオセンサ及び当該細胞反応は同じ意味で使用され得る。
【００６５】
「バイオセンサシグナル（Biosensor signal）」
「バイオセンサシグナル」等の用語は、バイオセンサを用いて測定された細胞のシグナルであって、刺激に対する細胞の反応によって生成されたものをいう。
【００６６】
「細胞（Cell）」
細胞等の用語は、半透膜によって外部を囲まれた原形質の小さく通常は顕微鏡でしか見ることができない原形質のかたまりをいい、細胞は選択的に１つ以上の核及び様々なオルガネラを含み、細胞は生命体の全ての基本的な働きを単独で又は他の同様のかたまりと相互作用して行うことができ、細胞は独立して働くことができる生命体の最小の構造単位を形成し、細胞は人工の細胞構造、細胞モデルシステム、及び同様の人工細胞系を含む。
【００６７】
細胞は異なる細胞型を含むことができ、当該細胞型は例えば、特定の疾患に関する細胞、特定の起源に由来する細胞型、特定の標的に関する細胞型、又は特定の生理機能に関する細胞型である。さらに、細胞は、天然の細胞、人工の細胞、形質転換細胞、不死化細胞、一次細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞、又は細胞から派生した幹細胞であってもよい。
【００６８】
ヒトは約２１０の既知の異なる細胞型からなる。どのように細胞が準備されるか（例えば、人工的に作り出された、形質転換された、不死化された、又はヒトの体から新鮮分離されたなど）、及び、どこで（例えば、異なる年齢のヒトの体又は異なる病期のヒトの体など）細胞が得られたかを考慮すると、当該細胞型の数はほぼ無限である。
【００６９】
「細胞培養する（Cell culture）」
「細胞培養する」又は「細胞培養すること」は、管理された状況下において原核細胞又は真核細胞が培養されるプロセスをいう。「細胞培養する」は、多細胞真核生物、特に動物細胞から派生した細胞を培養することだけでなく、複合組織及び複合器官を培養することもいう。
【００７０】
「細胞パネル（Cell panel）」
「細胞パネル」等の用語は、少なくとも２つの細胞型を含むパネルをいう。当該細胞はここに開示されたものの任意の組合せであり得る。
【００７１】
「細胞反応（Cellular Response）」
「細胞反応」等の用語は、刺激に対する細胞の応答をいう。
【００７２】
「細胞プロセス（Cellular process）」
「細胞プロセス」等の用語は細胞内において又は細胞によって起こる応答をいう。細胞プロセスの例は、増殖、アポトーシス、壊死、分化、細胞シグナル変換、極性変化、移動、又は形質転換を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
「細胞標的（Cellular target）」
「細胞標的」等の用語はタンパク質又は核酸などのバイオポリマであって、当該バイオポリマの活性が外部刺激によって変形されることができるものをいう。細胞標的は、酵素、キナーゼ、イオンチャネル、及び受容体のような最も普及しているタンパク質である。
【００７４】
「特性化すること（Characterizing）」
「特性化すること」等の用語は、リガンド、分子、マーカ、又は細胞などの物質の特徴に関する情報を収集することをいい、例えばリガンド、分子、又は細胞に対するプロファイルを得ることをいう。
【００７５】
「含む（Comprise）」
本明細書及び特許請求の範囲を通して、単語「含む」、「含んでいる」、及びその変形は、「含むがこれに限定されない」という意味であり、例えば他の添加物、成分、整数、又はステップを除外するという意味ではない。
【００７６】
「基本的に構成されている（Consisting essentially of）」
実施例において、「基本的に構成されている」とは、例えば、表面組成、バイオセンサ表面上における表面組成、製剤又は組成物を構成又は使用する方法、及び本開示の物質、デバイス、又は装置について説明するものであり、これらが、特許請求の範囲に記載された成分又はステップに加えて、ここに開示されている組成物、物質、装置、及び方法を作製・構成及び使用することに関する基礎的かつ新規な特徴に大きな影響を与えない他の成分又はステップを含み得ることをいい、当該他の成分又はステップは、例えば、特定の反応剤、特定の添加剤若しくは材料、特定の作用物質、特定の細胞若しくは細胞株、特定の表面改質剤若しくは表面調節剤、特定のリガンド候補、又はこれらと同様の変更可能な構造体、材料、若しくはプロセスである。当該本開示の成分又はステップの基礎的な特徴に大きな影響を与え得る項目又は本開示に望ましくない特性を与え得る項目は、例えば、バイオセンサ表面に対する細胞の親和性低下、細胞表面受容体又は細胞内受容体に対する刺激剤の親和性異常、リガンド候補又は同様の刺激剤に対する異常な細胞活性又は逆の細胞活性、及びこれらと同様の特性を含む。
【００７７】
「成分（Components）」
ここに開示されているのは、開示された組成物を準備するのに使用される成分と、本明細書に開示された方法に使用される組成物自体と、である。これら及び他の材料は本明細書に開示されており、かつ、これら材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合において、これら分子の各々、集合的組合せ、及びその置換のうちの特定のものが明確に開示されていなくても、その各々は詳細に検討されて本明細書に記載されているものとする。従って、分子クラスＡ、Ｂ、及びＣと分子クラスＤ、Ｅ、及びＦとが開示され、分子の組合せ例Ａ−Ｄが開示されているならば、各々が個別に記載されていない場合であってもその各々は個別かつ集合的に検討されており、すなわち組合せＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆも開示されていることを意味する。同様にこれらのサブセット又は組合せも開示されているものとする。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブグループも開示されているものとする。このコンセプトは、ここに開示された組成物を作製及び使用する方法におけるステップ（これらに限定されない）を含む本願の全ての特徴に適用される。従って、実行されることができる様々な追加ステップが存在するならば、これら追加ステップの各々は開示された方法の任意の特定の実施例又は実施例の組合せに伴って実行されることができるものとする。
【００７８】
「接触させること（Contacting）」
接触させること等の用語は、少なくとも２つのもの、例えば分子、細胞、マーカ、化合物若しくは組成物、少なくとも２つの組成物、又は製品若しくは機械を含むこれらの任意のものの間に分子相互作用が起こり得る場合において、分子相互作用が起こり得るように近接させることを意味する。例えば、接触させることは、少なくとも２つの組成物、分子、製品、又は物質を、接触させるすなわちこれらが近接して混合又は触れるような状態にさせることをいう。例えば、組成物Ａの溶液と培養された細胞Ｂとを有しており、組成物Ａの溶剤を培養された細胞Ｂ上に注入することは、組成物Ａを細胞培養物Ｂに接触させることである。細胞をリガンドに接触させることは、リガンドを、当該細胞に対して、当該細胞が当該リガンドへのアクセスを有する状態を保証させることである。
【００７９】
ここに開示されている全てのものは、他のものに接触することができるものとする。例えば、細胞は、マーカすなわち分子、バイオセンサ等に接触することができる。
【００８０】
「化合物及び組成物（Compounds and compositions）」
化合物及び組成物は当該技術分野におけるその標準的な意味を有している。特定の指定物、例えば分子、物質、マーカ、細胞、又は試薬であってこれら指定物を含むもの、これら指定物で構成されているもの、及びこれら指定物で基本的に構成されているものが開示されているものとする。従って、特定の指定マーカが使用される場合、当該マーカを含む組成物、当該マーカで構成されている組成物、又は当該マーカで基本的に構成されている組成物も開示されているものとする。特定の指定物が作製される場合、当該指定物の化合物も開示されているものとする。例えば、ＥＧＦなどの特定の生物学的材料が開示されているならば、化合物の形態をとったＥＧＦも開示されているものとする。
【００８１】
「コントロール（Control）」
「コントロール」、「コントロールレベル」、又は「コントロール細胞」等の用語は、変化が測定される基準として定義されるものをいい、例えば、コントロールは実験によるものではなく所定のパラメータセットによるものであり、又はコントロールは前処理レベル若しくは後処理レベルに基づくものである。これらは試験の実行と同時、試験の実行前、若しくは試験の実行後に実行されるものであるか、又は予め決められた基準であり得る。例えば、コントロールは、並行試験として主体物、客体物、試薬等が試験手順、試験用の作用物質、試験変数等の不備・不作為を除いて処理される場合の試験結果、及び、試験効果の判断における比較基準として使用される試験結果をいう。従って、コントロールは、手順、作用物質、変数等に関する効果を判定するのに使用されることができる。例えば、細胞上の試験分子の効果が対象であるならば、ａ）当該分子の存在下における当該細胞の特性を記録し、ｂ）ａを実行した後に既知の活性若しくは活性不足を備えたコントロール分子又はコントロール組成物（例えばアッセイバッファ溶液（賦形剤））を追加してその効果を記録し、そして試験分子のコントロールに対する効果を比較することができる。特定の状況においては、一旦コントロールが実行されると当該コントロールは基準として使用されることができ、再度コントロール実験が行われる必要はなく、他の状況においては、コントロール実験は比較が行われる度に毎回実行されなければならない。
【００８２】
「化学用語（Chemistry terms）」
「アルキル（alkyl）」
本明細書で使用されている用語「アルキル」は、分岐型又は非分岐型の飽和炭化水素部分をいう。「非分岐型」又は「分岐型」アルキルは、非環状であり、飽和しており、かつ直鎖又は分岐鎖の炭化水素部分であって、１−２４個の炭素、１−１２個の炭素、１−６個の炭素、又は１−４個の炭素原子を有するものを含む。このようなアルキルラジカルの例は、メチル（methyl）、エチル（ethyl）、プロピル（propyl）、ブチル（butyl）、ペンチル（pentyl）、ヘキシル（hexyl）、ヘプチル（heptyl）、オクチル（octyl）、ｎ−プロピル、イソプロピル（iso-propyl）、ブチル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、アミル（amyl）、ｔ−アミル、ｎ−ペンチルなどを含む。低級アルキル（lower alkyl）は、非環状であり、飽和しており、かつ直鎖又は分岐鎖の炭化水素残基であって、１−４個の炭素原子を有するもの、すなわちＣ１−Ｃ４アルキルを含む。
【００８３】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲に亘って使用されている用語「アルキル」は、「非置換（unsubstituted）アルキル」と「置換（substituted）アルキル」の両方を含み、後者は上記のアルキルラジカルに類似したものであって、１つ以上の有機又は無機の置換基にさらに置換されたものを意味する。適切な置換基は、水素、アルキル、アルケニル（alkenyl）、アルキニル（alkynyl）、ヒドロキシル（hydroxyl）、シクロアルキル（cycloalkyl）、ヘテロシクリル（heterocyclyl）、アミノ（amino）、モノ置換（mono-substituted）アミノ、ジ置換（di-substituted）アミノ、非置換若しくは置換アミノ、カルボニル（carbonyl）、ハロゲン（halogen）、スルフヒドリル（sulfhydryl）、スルホニル（sulfonyl）、スルホナト（sulfonato）、スルファモイル（sulfamoyl）、スルホンアミド（sulfonamide）、アジド（azido）、アシルオキシ（acyloxy）、ニトロ（nitro）、シアノ（cyano）、カルボキシ（carboxy）、カルボアルコキシ（carboalkoxy）、アルキルカルボキサミド（alkylcarboxamido）、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド（dialkylcarboxamido）、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル（alkylsulfonyl）、アルキルスルフィニル（alkylsulfinyl）、チオアルキル（thioalkyl）、チオハロアルキル（thiohaloalkyl）、アルコキシ（alkoxy）、置換アルコキシ、ハロアルコキシ（haloalkoxy）、ヘテロアリール（heteroaryl）、置換ヘテロアリール、アリール（aryl）、又は置換アリールを含むが、これらに限定されない。当業者であれば、「アルコキシ」がエステル（ester）を形成するカルボニル置換「アルキル」の置換基であり得ることを理解するであろう。２つ以上の置換基が存在する場合、それらは同一のもの又は異なるものである。有機置換部分は、１−１２個の炭素原子、１−６個の炭素原子、又は１−４個の炭素原子を含み得る。当業者であれば、「アルキル」鎖上で置換された部分それ自体が上記したように必要に応じて置換されることができることを理解するであろう。
【００８４】
「アルケニル（alkenyl）」
本明細書で使用されている用語「アルケニル」は、上記アルキルの残基であって、炭化水素鎖の主鎖において少なくとも１つの炭素間二重結合を含むものをいう。その例は、ビニル（vinyl）、アリル（allyl）、２−ブテニル（2-butenyl）、３−ブテニル、２−ペンテニル（2-pentenyl）、３−ペンテニル、４−ペンテニル、２−ヘキセニル（2-hexenyl）３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル（2-heptenyl）、３−ヘプテニル、４−ヘプテニル、５−ヘプテニル、６−ヘプテニル等を含むが、これらに限定されない。用語「アルケニル」は直鎖及び分岐鎖のジエン（dienes）及びトリエン（trienes）を含む。
【００８５】
「アルキニル（alkynyl）」
本明細書で使用されている用語「アルキニル」は上記アルキルの残基であって、炭化水素鎖の主鎖において少なくとも１つの炭素間三重結合を含むものをいう。その例は、エチニル（ethynyl）、１−プロピニル（1-propynyl）、２−プロピニル、１−ブチニル（1-butynyl）、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル（1-pentynyl）、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル（1-hexnyl）、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル等を含むが、これらに限定されない。用語「アルキニル」はジイン（diynes）及びトリイン（triynes）を含む。
【００８６】
「シクロアルキル（cycloalkyl）」
本明細書で使用されている用語「シクロアルキル」は、飽和炭化水素構造であってその構造が少なくとも１つの環（ring）を形成するように閉じているものをいう。シクロアルキルは典型的な場合３−８個の環炭素を含む環状ラジカルであり、例えばシクロプロピル（cyclopropyl）、シクロブチル（cyclobutyl）、シクロペンチル（cyclypentyl）、シクロペニル（cyclopenyl）、シクロヘキシル（cyclohexyl）、シクロヘプチル（cycloheptyl）等である。シクロアルキルラジカルは多環（multicyclic）のものであってもよく、合計３−１８個の炭素、好ましくは４−１２個の炭素、又は５−８個の炭素を含み得る。その例は、デカヒドロナフチル（decahydronapthyl）、アダマンチル（adamantyl）等のラジカルを含む多環シクロアルキルである。
【００８７】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲に亘って使用されている用語「シクロアルキル」は、「非置換シクロアルキル」と「置換シクロアルキル」の両方を含み、後者は上記のシクロアルキルラジカルに類似したものであって、１つ以上の有機又は無機の置換基にさらに置換されたものを意味する。シクロアルキルは、ヒドロキシル、シクロアルキル、アミノ、モノ置換アミノ、ジ置換アミノ、非置換アミノ若しくは置換アミノ、カルボニル、ハロゲン、スフルヒドリル（sulfhydryl）、スルホニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、アジド、アシルオキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルコキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリール、又は置換アリールを含むが、これらに限定されない。シクロアルキルが２つ以上の置換基に置換される場合、それらは同一のもの又は異なるものである。当該有機の置換基は１−１２個の炭素原子、１−６個の炭素原子、又は１−４個の炭素原子を含み得る。
【００８８】
「シクロアルケニル（cycloalkenyl）」
本明細書で使用されている用語「シクロアルケニル」は、上記シクロアルキルラジカルであって、少なくとも１つの炭素間二重結合を含むものをいう。その例は、シクロプロペニル（cyclopropenyl）、１−シクロブテニル（cyclobutenyl）、２−シクロブテニル、１−シクロペンテニル（cyclopentenyl）、２−シクロペンテニル、３−シクロペンテニル、１−シクロヘキシル、２−シクロヘキシル、３−シクロヘキシル等を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
「アルコキシ（alkoxy）」
本明細書で使用されている用語「アルコキシ」は、上記アルキルの残基であって、酸素原子に直接結合して他の部分に結合するものをいう。その例は、メトキシ（methoxy）、エトキシ（ethoxy）、ｎ−プロポキシ（propoxy）、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ（butoxy）、ｔ−ブトキシ、イソブトキシ等を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
「モノ置換アミノ（mono-substituted amino）」
本明細書で使用されている用語「モノ置換アミノ」は、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、又はアリールアルキル（arylalkyl）（これらに限定されない）を含む１つの有機置換基に置換されたＮＨラジカルを含む部分をいう。モノ置換アミノ基の例は、メチルアミノ（methylamino）（−ＮＨ−ＣＨ３）、エチルアミノ（ethylamino）（−ＮＨＣＨ２ＣＨ３）、ヒドロキシエチルアミノ（hydroxyethylamino）（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）等を含む。
【００９１】
「ジ置換アミノ（di-substituted amino）」
本明細書で使用されている用語「ジ置換アミノ」は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル、又はアリールアルキル（これらに限定されない）から選択された同一又は異なる２つの有機ラジカルに置換された窒素原子を含む部分をいい、用語の定義はここに記載されているものと同じである。そのいくつかの例はジメチルアミノ（dimethylamino）、メチルエチルアミノ（methylethylamino）、ジエチルアミノ（diethylamino）等を含む。
【００９２】
「アジド（azide）」
本明細書で使用されている用語「アジド（azide）」、「アジド基（azido）」、及びその変形した用語は、一価の基−Ｎ３又は一価のイオン−Ｎ３を含む部分又は化合物をいう。
【００９３】
「ハロアルキル（haloalkyl）」
本明細書で使用されている用語「ハロアルキル」は、上記アルキルの残基であって、１つ以上のハロゲン、好ましくはフッ素、例えばトリフルオロメチル（trifluoromethyl）、ペンタフルオロエチル（pentafluoroethyl）等に置換されたものをいう。
【００９４】
「ハロアルコキシ（haloalkoxy）」
本明細書で使用されている用語「ハロアルコキシ」は、上記ハロアルキルの残基であって、酸素に直接結合してトリフルオロメトキシ（trifluoromethoxy）、ペンタフルオロエトキシ（pentafluoroethoxy）等を形成するものをいう。
【００９５】
「アシル（acyl）」
本明細書で使用されている用語「アシル」は１−８個の炭素を含むＲ基を有するＲ−Ｃ（Ｏ）−残基をいう。その例は、ホルミル（hormyl）、アセチル（acetyl）、プロピオニル（propionyl）、ブタノイル（butanoyl）、イソブタノイル、ペンタノイル（pentanoyl）、ヘキサノイル（hexanoyl）、ヘプタノイル（heptanoyl）、ベンゾイル（benzoyl）、天然アミノ酸若しくは非天然アミノ酸などを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
「アシルオキシ（acyloxy）」
本明細書で使用されている用語「アシルオキシ」は上記アシルラジカルが酸素に直接結合してＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−残基を形成したものをいう。その例はアセチルオキシ（acetyloxy）、プロピオニルオキシ（propionyloxy）、ブタノイルオキシ（butanoyloxy）、イソブタノイルオキシ、ベンゾイルオキシ（benzoyloxy）等を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
「アリール（aryl）」
本明細書で使用されている用語「アリール」は６−１８個の炭素、好ましくは６−１２個の炭素を含む環ラジカルであって、その中に少なくとも１つの芳香族残基を含むものをいう。当該アリールラジカルの例はフェニル（phenyl）、ナフチル（naphthyl）、及びイソクロマン（isochroman）ラジカルを含む。さらに、本明細書及び特許請求の範囲に亘って使用されている用語「アリール」は「非置換アリール」と「置換アリール」の両方を含み、後者は上記アリール環ラジカルであって１つ以上、好ましくは１−３個の有機又は無機の置換基に置換されたものを意味する。当該置換基は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、シクロアルキル、アミノ、モノ置換アミノ、ジ置換アミノ、非置換若しくは置換アミノ、カルボニル、ハロゲン、スルフヒドリル、スルホニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、アジド、アシルオキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環（heterocyclic ring）を含むが、これらに限定されない。環の用語はここに定義されている。当該有機の置換基は１−１２個の炭素原子、１−６個の炭素原子、又は１−４個の炭素原子を含み得る。当業者であれば、上記したように、「アリール」上で置換された部分それ自体が必要に応じて置換されることができることを理解するであろう。
【００９８】
「ヘテロアリール（heteroaryl）」
本明細書で使用されている用語「ヘテロアリール」は、上記アリール環ラジカルであって、少なくとも環炭素のうちの１つ、好ましくはアリール芳香族環の１−３個の炭素が、窒素、酸素、及び硫黄原子（これらに限定されない）を含むヘテロ原子に置換されたものをいう。ヘテロアリール残基の例は、ピリジル（pyridyl）、ビピリジル（bipyridyl）、フラニル（furanyl）、及びチオフラニル（thiofuranyl）残基を含む。置換された「ヘテロアリール」残基は、１つ以上の有機又は無機の置換基、好ましくはアリール基において上記した１−３個の置換基を有することができ、芳香族複素環の炭素原子となる。当該有機の置換基は１−１２個の炭素原子、１−６個の炭素原子、又は１−４個の炭素原子を含み得る。
【００９９】
「ヘテロシクリル（heterocyclyl）」
本明細書で使用されている用語「ヘテロシクリル」又は「ヘテロシクリル基」は、３−１６個のメンバ（member）、好ましくは４−１０個のメンバを有する非芳香族の単環又は多環のラジカル構造であって、少なくとも１つの環構造が１−４個のヘテロ原子（例えばO、N、Ｓ、Ｐ等）を含むものをいう。ヘテロシクリル基は、例えば、ピロリジン（pyrrolidine）、オキソラン（oxolane）、チオラン（thiolane）、イミダゾール（imidazole）、オキサゾール（oxazole）、ピペリジン（piperidine）、ピペラジン（piperazine）、モルホリン（morpholine）、ラクトン（lactones）、ラクタム（lactams）、アゼチジノン（azetidinones）、ピロリジノン（pyrrolidinones）、スルタム（sultams）、スルトン（sultones）等を含む。さらに、本明細書及び特許請求の範囲に亘って使用されている用語「ヘテロシクリル」は、「非置換アルキル」と「置換アルキル」の両方を含み、後者は上記アリール環ラジカルであって１つ以上、好ましくは１−３個の有機又は無機の置換基に置換されたものを意味する。当該置換基は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、シクロアルキル、アミノ、モノ置換アミノ、ジ置換アミノ、非置換若しくは置換アミノ、カルボニル、ハロゲン、スルフヒドリル、スルホニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、アジド、アシルオキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環を含むが、これらに限定されない。環の用語はここに定義されている。当該有機の置換基は１−１２個の炭素原子、１−６個の炭素原子、又は１−４個の炭素原子を含み得る。当業者であれば、上記したように、「ヘテロシクリル」上で置換された部分それ自体が必要に応じて置換されることができることを理解するであろう。
【０１００】
「ハロゲン（halogen）又はハロ（halo）」
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ（fluoro）、クロロ（chloro）、ブロモ（bromo）、又はヨード（iodo）基をいう。
【０１０１】
「部分（moiety）」
「部分」は分子（又は化合物、又は類似物質等）の一部をいう。「官能基（functional group）」は分子における特定の原子群である。部分は官能基であるか、１つ以上の官能基を含み得る。
【０１０２】
「エステル（ester）」
本明細書で使用されている用語「エステル」は式Ｃ（Ｏ）ＯＡで表されるものをいい、式中のＡは、上記した、アルキル、ハロゲン化（halogenated）アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル（cycloalkenyl）、ヘテロシクロアルキル（heterocycloalkyl）、又はヘテロシクロアルケニル（heterocycloalkenyl）基であり得る。
【０１０３】
「炭酸塩基（carbonate group）」
本明細書で使用されている用語「炭酸塩基」は式ＯＣ（Ｏ）ＯＲで表されるものをいい、式中のＲは、上記した、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル（aralkyl）、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、又はヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１０４】
「ケト基（keto group）」
本明細書で使用されている用語「ケト基」は式Ｃ（Ｏ）Ｒで表されるものをいい、式中のＲは、上記した、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、又はヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１０５】
「アルデヒド（aldehyde）」
本明細書で使用されている用語「アルデヒド」は式Ｃ（Ｏ）Ｈで表されるものをいう。
【０１０６】
「カルボン酸（carboxylic acid）」
本明細書で使用されている用語「カルボン酸」は式Ｃ（Ｏ）ＯＨで表されるものをいう。
【０１０７】
「カルボニル基（carbonyl group）」
本明細書で使用されている用語「カルボニル基」は式Ｃ＝Ｏで表されるものをいう。
【０１０８】
「エーテル（ether）」
本明細書で使用されている用語「エーテル」は式ＡＯＡ１で表されるものをいい、式中のＡ及びＡ１は、それぞれ無関係に、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニル基（これらは上記されている）であり得る。
【０１０９】
「ウレタン（urethane）」
本明細書で使用されている用語「ウレタン」は式ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ´で表されるものをいい、式中のＲ及びＲ´は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、又はヘテロシクロアルキル基（これらは上記されている）であり得る。
【０１１０】
「シリル基（silyl group）」
本明細書で使用されている用語「シリル基」は式ＳｉＲＲ´Ｒ´´で表されるものをいい、式中のＲ、Ｒ´、Ｒ´´は、それぞれ無関係に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、又はヘテロシクロアルキル基（これらは上記されている）であり得る。
【０１１１】
「スルホオキソ基（sulfo-oxo group）」
本明細書で使用されている用語「スフホオキソ基」は式Ｓ（Ｏ）２Ｒ、ＯＳ（Ｏ）２Ｒ、又はＯＳ（Ｏ）２ＯＲで表されるものをいい、式中のＲは、上記した、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、又はヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１１２】
「検出する（Detect）」
検出する等の用語は、本開示の装置及び方法の能力であって、分子又はマーカに誘発された細胞反応を発見又は検知し、かつ異なる分子に対する当該検知された反応を区別する能力をいう。
【０１１３】
「（薬剤候補分子の）直接作用（Direct action）」
「直接作用」等の用語は、細胞上において独立して作用する（薬剤候補分子の）結果をいう。
【０１１４】
「ＤＭＲシグナル（DMR signal）」
「ＤＭＲシグナル」等の用語は、光学バイオセンサを用いて測定された細胞のシグナルであって、刺激の際に細胞の反応によって生成されたものをいう。
【０１１５】
「ＤＭＲ反応（DMR response）」
「ＤＭＲ反応」等の用語は、光学バイオセンサを用いたバイオセンサ反応をいう。ＤＭＲは動的質量再分布すなわち動的な細胞物質の再分布をいう。Ｐ−ＤＭＲはポジティブなＤＭＲ反応であり、Ｎ−ＤＭＲはネガティブなＤＭＲ反応であり、ＰＲ−ＤＭＲは回復した（recovery）Ｐ−ＤＭＲ反応である。
【０１１６】
「薬剤候補分子（Drug candidate molecule）」
薬剤候補分子等の用語は、薬剤又はファーマコフォアとして機能する能力を試験される試験分子をいう。この分子は鉛分子と考慮されてもよい。
【０１１７】
「効能（Efficacy）」
効能等の用語は、理想的又は最適な条件下での所望の効果の大きさを生成する能力をいう。効能は、現実の条件下での変化に関するものである有効性（effectiveness）に関する概念とは区別されるものである。効能は、分子レベル、細胞レベル、組織レベル、又は系レベルにおける反応を起こす能力と受容体占有率との間の関係である。
【０１１８】
「ｈＥＲＧ変調剤（hERG modulator）」
ｈＥＲＧ変調剤は、直接的又は間接的にｈＥＲＧイオンチャネルの活性を変調することができる分子である。ｈＥＲＧチャネルの活性を直接変調するｈＥＲＧ変調剤は、ｈＥＲＧチャネルに結合して、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧを介したイオンフラックス、及び／又はｈＥＲＧを介した細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性に変化を起こす分子である。ｈＥＲＧチャネルの活性を間接的に変調するｈＥＲＧ変調剤は、細胞内のｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体に結合して、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧを介したイオンフラックス、及び／又はｈＥＲＧチャネル若しくはｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体を介した細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性に変化を起こす分子である。ｈＥＲＧ活性の変化については、変調剤の非存在下での細胞におけるｈＥＲＧチャネル又はｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体の基礎活性が参照される。
【０１１９】
「ｈＥＲＧ活性剤（hERG activator）」
ｈＥＲＧ活性剤は、適切な印加電圧においてｈＥＲＧチャネルを介した電流を増大させる分子、及び／又は適切なＫＣｌ濃縮物の存在下においてｈＥＲＧチャネルを介したイオンフラックスを増大させる分子、及び／又はｈＥＲＧチャネル又は細胞内のｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体を介した細胞シグナル伝達を引き起こす分子である。その例は、マロトキシン、フルフェナム酸、及びニフルム酸である。
【０１２０】
「ｈＥＲＧ経路活性剤（hERG pathway activator）」
ｈＥＲＧ経路活性剤はｈＥＲＧチャネル又は細胞内のｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体を介した細胞シグナル伝達を引き起こす分子である。ｈＥＲＧ経路活性剤は、ｈＥＲＧ電流の変化及び／又はｈＥＲＧチャネルを介したイオンフラックスの変化を引き起こす場合とそうでない場合がある。当該変化は増大する場合と減少する場合がある。例としてはジフルニサル、ＡＧ１２６、及びチルホスチン５１がある。
【０１２１】
「ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤（hERG ion channel activator）」
ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤は、ｈＥＲＧチャネルに直接結合してｈＥＲＧチャネルを活性化し、これによってｈＥＲＧ電流の増加、及び／又はｈＥＲＧイオンフラックスの増加、及び／又はｈＥＲＧチャネルを介した細胞シグナル伝達を導く分子である。その例はマロトキシン、フルフェナム酸、及びニフルム酸である。ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤は細胞シグナル伝達を引き起こす場合と引き起こさない場合とがある。
【０１２２】
「無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤（label-free biosensor hERG activator）」
無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤等の用語は、ｈＥＲＧ活性剤であって、無標識バイオセンサの細胞アッセイによってｈＥＲＧ発現細胞における検出可能なバイオセンサシグナルのきっかけとなることができる分子をいう。当該バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤は、ｈＥＲＧ活性剤、ｈＥＲＧ経路活性剤、又はｈＥＲＧイオンチャネル活性剤であり得る。その例は、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、フルフェナム酸、ニフルム酸、又はジフルニサルである。
【０１２３】
「ｈＥＲＧ阻害剤（hERG inhibitor）」
ｈＥＲＧ阻害剤は、ｈＥＲＧチャネル又はｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体に結合してｈＥＲＧ電流及び／又はｈＥＲＧイオンフラックスを阻害する分子である。
【０１２４】
「ｈＥＲＧ経路阻害剤（hERG pathway inhibitor）」
ｈＥＲＧ経路阻害剤は、ｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体に結合してｈＥＲＧ電流及び／又はｈＥＲＧイオンフラックスを阻害する分子である。その例はチロシン５１を含む。
【０１２５】
「ｈＥＲＧイオンチャネル阻害剤（hERG ion channel inhibitor）」
ｈＥＲＧイオンチャネル阻害剤は、ｈＥＲＧチャネルに直接結合してｈＥＲＧ電流及び／又はｈＥＲＧイオンフラックスを阻害する分子である。その例はドフェチリドを含む。
【０１２６】
「より高い（Higher）、阻害する（inhibit）等の単語」
より高い、増大する（increase）、上昇する（elevate）、上昇（elevation）等の用語、又はこれらの変形は、例えばコントロールと比較して、基礎レベルよりも大きく（高く）増大（上昇）することをいう。低い（low）、より低い（lower）、低下する（reduce）、減少する（decrease）、低下（reduction）等の用語、又はこれらの変形は、例えばコントロールと比較して、基礎レベルよりも小さく（低く）減少（低下）することをいう。例えば、基礎レベルは、アゴニスト又はアンタゴニストなどの分子を細胞に加える前すなわち当該分子の非存在下における通常の生体内レベルである。阻害する、阻害形態等の用語は低下させる又は抑制することをいう。
【０１２７】
「分子の存在下（In the presence of the molecule）」
「分子の存在下」等の用語は、培養された細胞が分子に接触又はさらされていることをいう。当該接触又はさらすことは刺激剤が細胞に接触する前又は同時に行われ得る。
【０１２８】
「インデックス（Index）」
インデックス等の用語はデータの集合をいう。例えば、インデックスは１つ以上の変調プロファイルを含む一覧、表、ファイル、又はカタログであり得る。インデックスはデータの組合せから生成されることもできる。例えば、ＤＭＲプロファイルは、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、及びＲＰ−ＤＭＲを含み得る。インデックスは、完成したプロファイルのデータ、Ｐ−ＤＭＲデータ、Ｎ−ＤＭＲデータ、ＲＰ−ＤＭＲデータ、これらの任意のデータ点、又はこれら若しくは他のデータの組合せを用いて生成され得る。インデックスはこのような情報の集合である。典型的な場合、インデックスを比較する際のインデックスは同様のデータ（すなわちＰ−ＤＭＲとＰ−ＤＭＲデータ）である。
【０１２９】
「バイオセンサインデックス（Biosensor index）」
「バイオセンサインデックス」等の用語は、バイオセンサデータの集合からなるインデックスをいう。バイオセンサインデックスは、一次プロファイル又は二次プロファイルなどのバイオセンサプロファイルの集合であり得る。当該インデックスは任意の種類のデータを含み得る。例えば、プロファイルのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータ点、Ｐ−ＤＭＲデータ点、その両方、又はインピーダンスデータ点からなることができる。当該インデックスはプロファイル曲線に関する全てのデータ点であってもよい。
【０１３０】
「ＤＭＲインデックス（DMR index）」
「ＤＭＲインデックス」等の用語はＤＭＲデータの集合からなるバイオセンサインデックスをいう。
【０１３１】
「既知の分子（Known molecule）」
既知の分子等の用語は、既知の薬理学的／生物学的／生理学的／病態生理学的な活性を有する分子をいい、その正確な作用モードは既知の場合未知の場合がある。
【０１３２】
「既知の変調剤（Known modulator）」
既知の変調剤等の用語は、標的の内の少なくとも１つが既知であり既知の親和性を有する変調剤をいう。例えば、既知の変調剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＡ阻害剤、ＧＰＣＲアンタゴニスト、ＧＰＣＲアゴニスト、ＰＴＫ阻害剤、抗体を中和させる上皮成長因子受容体、ホスホジエステラーゼ（phosphodiesterase）阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、又はＰＫＣ活性剤であり得る。
【０１３３】
「既知の変調剤のバイオセンサインデックス（Known modulator biosensor index）」
「既知の変調剤のバイオセンサインデックス」等の用語は、既知の変調剤に対して収集されたデータによって生成された変調剤のバイオセンサインデックスをいう。例えば、既知の変調剤のバイオセンサインデックスは、細胞パネル上において作用する既知の変調剤のプロファイル、及びマーカパネルに対する既知の変調剤の変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネル内の細胞用である。
【０１３４】
「既知の変調剤のＤＭＲインデックス（Known modulator DMR index）」
「既知の変調剤のＤＭＲインデックス」等の用語は、既知の変調剤に対して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスをいう。例えば、既知の変調剤のＤＭＲインデックスは、細胞パネル上において作用する既知の変調剤のプロファイル、及びマーカパネルに対する既知の変調剤の変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネル内の細胞用である。
【０１３５】
「リガンド（Ligand）」
リガンド等の用語は、物質、組成物、又は分子であって、生物学的目的を果たす生体分子に結合して当該分子との錯体を形成することができるものをいう。リガンドとその標的分子との間の実際の不可逆的な共有結合は生物系においては希少である。受容体に結合するリガンドは化学的配座すなわち受容体タンパク質の立体形状を変化させる。受容体タンパク質の配座状態は受容体の機能状態を決定する。結合傾向すなわち結合強度は親和性と呼ばれている。リガンドは、基質、遮断剤、阻害剤、活性剤、及び神経伝達物質を含む。放射性リガンドは放射標識付きリガンドであり、一方、蛍光リガンドは蛍光標識付きリガンドであり、その両方は、受容体生物学及び受容体生物化学の研究用のトレーサとしてしばしば使用されるリガンドと考慮されてもよい。リガンドと変調剤はほぼ同じ意味で使用される。
【０１３６】
「ライブラリ（Library）」
ライブラリ等の用語は集合をいう。ライブラリはここに開示された全てものの集合であり得る。例えば、インデックスの集合であるインデックスライブラリ、プロファイルの集合であるプロファイルライブラリ、ＤＭＥインデックスの集合であるＤＭＲインデックスライブラリ、分子の集合である分子ライブラリ、細胞の集合である細胞ライブラリ、及びマーカの集合であるマーカライブラリであってもよい。ライブラリは、例えば、ランダム又は非ランダムのもの、判定された又は未判定のものであってもよい。例えば、ここに開示されているのは既知の変調剤のバイオセンサインデックス又はＤＭＲインデックスのライブラリである。
【０１３７】
「マーカ（Marker）」
マーカ等の用語は、バイオセンサの細胞アッセイにおけるシグナルを生成するリガンドをいう。さらに、当該シグナルは、少なくとも１つの特定の細胞シグナル伝達経路及び／又は少なくとも１つの特定の標的介した少なくとも１つの特定の細胞プロセスの特性でなければならない。当該シグナルは、ポジティブ若しくはネガティブ、又はその組合せ（振動）であり得る。マロトキシンなどのｈＥＲＧチャネル活性剤は、ｈＥＲＧチャネルが安定して発現される又は細胞毎に内因的に発現されるＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞又はＨＴ２９細胞に対するマーカであり得る。
【０１３８】
「マーカパネル（Marker panel）」
「マーカパネル」等の用語は、少なくとも２つのマーカを含むパネルをいう。当該マーカは異なる経路、同一の経路、異なる標的、又は同一の標的に対するものであり得る。例えば、マロトキシンは、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞とＨＴ２９細胞の両方に対する単一のマーカとして使用されることができる。従って、ｈＥＲＧチャネル変調剤の同定及び区別において、マロトキシンは効果的なマーカパネルとして機能する。
【０１３９】
「マーカバイオセンサインデックス（Marker biosensor index）」
「マーカバイオセンサインデックス」等の用語は、マーカに対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサインデックスをいう。例えば、マーカバイオセンサインデックスは、細胞パネル上で作用するマーカのプロファイル、及びマーカパネルに対するマーカの変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネルにおける細胞用である。ｈＥＲＧチャネル変調剤の同定及び区別において、マーカバイオセンサインデックスは、３つの異なる細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞、及びＨＴ２９細胞）におけるマロトキシンの一次プロファイルと、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞及びＨＴ２９細胞におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対するマロトキシンの変調インデックスと、を含み、これらは図１に例示されている。
【０１４０】
「マーカＤＭＲインデックス（Marker DMR index）」
「マーカＤＭＲインデックス」等の用語は、マーカに対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサのＤＭＲインデックスをいう。例えば、マーカＤＭＲインデックスは、細胞パネル上で作用するマーカのプロファイル、及びマーカパネルに対するマーカの変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０１４１】
「材料（Material）」
材料は、物理的客体物の構造に進入するもの（化学的なもの、生物化学的なもの、生物学的なもの、又はその混合物）の有形部分である。
【０１４２】
「模倣する（Mimic）」
本明細書で使用されている「模倣する」等の用語は、対象となる客体物の１つ以上の機能を実行することをいう。例えば、分子模倣体は分子の１つ以上の機能を実行する。
【０１４３】
「変調する（Modulate）」
変調すること又はその変形は、細胞標的を介した細胞活性を増大、減少、又は維持することを意味する。これらの単語の内の１つが使用されている場合、コントロールから１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、若しくは１０００％増加する、又はコントロールから１％、５％、１０％、２０％、５０％、若しくは１００％減少し得ることが開示されているものとする。
【０１４４】
「変調剤（Modulator）」
変調剤等の用語は、細胞標的の活性を制御するリガンドをいう。変調剤は標的タンパク質などの細胞標的に結合するシグナル変調分子である。
【０１４５】
「変調比較（Modulation comparison）」
「変調比較」等の用語は、一次プロファイル及び二次プロファイルを正規化した結果をいう。
【０１４６】
「変調剤のバイオセンサインデックス（Modulator biosensor index）」
「変調剤のバイオセンサインデックス」等の用語は、変調剤に対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサインデックスをいう。例えば、変調剤のバイオセンサインデックスは、細胞パネル上で作用する変調剤のプロファイル、及びマーカパネルに対する変調剤の変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネルにおける細胞用である。図２−図５に例示されているように、ｈＥＲＧ変調剤のバイオセンサインデックスは、３種類の細胞（例えば、ＨＴ２９、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ、及びＨＥＫ２９３）における一次ＤＭＲシグナルと、ＨＴ２９細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるマロトキシンＤＭＲシグナルに対する変調剤の変調ＤＭＲインデックスと、を含む。
【０１４７】
「変調剤のＤＭＲインデックス（Modulator DMR index）」
「変調剤のＤＭＲインデックス」等の用語は、変調剤に対して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスをいう。例えば、変調剤のＤＭＲインデックスは、細胞パネル上で作用する変調剤のプロファイル、及びマーカパネルに対する変調剤の変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネルにおける細胞用である。図１ｄ−図５ｄに例示されているように、ｈＥＲＧ変調剤のＤＭＲインデックスは、変調剤によるＨＴ２９細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるマロトキシンＤＭＲシグナルの変調率である。
【０１４８】
「マーカのバイオセンサシグナルを変調する（Modulate the biosensor signal of a marker）」
「マーカのバイオセンサシグナルを変調する」等の用語は、マーカを用いた刺激に対する細胞のバイオセンサシグナル又はプロファイルの変化を引き起こすことをいう。
【０１４９】
「ＤＭＲシグナルを変調する（Modulate the DMR signal）」
「ＤＭＲシグナルを変調する」等の用語は、マーカを用いた刺激に対する細胞のＤＭＲシグナル又はプロファイルの変化を引き起こすことをいう。
【０１５０】
「分子（Molecule）」
本明細書で使用されている「分子」等の用語は、生物学的、生物化学的、又は化学的存在であって、確定的な分子量を有する分子又は化学分子の形態をとって存在するものをいう。分子等の用語は、化学的、生物化学的、又は生物学的分子をいい、そのサイズは問わない。
【０１５１】
いくつかの分子は炭素を含まない（酸素分子などの単純な気体分子及びいくつかの硫黄ベースのポリマなどのより複雑な分子を含む）が、多くの分子は有機分子と呼ばれる形態をとるもの（炭素原子を含む分子であり、特に共有結合によって接続されているもの）である。一般用語の「分子」は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド、有機薬剤、小さな分子、受容体、抗体、及び脂質などの分子における多数の記述的クラス又はグループを含む。適切な場合は、１つ以上のこれらのより記述的な用語（タンパク質などの多くのものは分子のグループと重複して記載されている）が、分子のサブグループに対する本方法の用途のために、分子がタンパク質などのサブクラスと一般クラスとしての「分子」との両方を示すことなく、本明細書において使用される。明記されない限り、単語「分子」は、特定の分子及びその塩（例えば薬剤学的に許容できる塩）を含む。
【０１５２】
「分子混合物（Molecule mixture）」
分子混合物等の用語は、少なくとも２つの分子を含む混合物をいう。当該２つの分子は、構造的に異なるもの（すなわち光学異性体（enantiomers））、組成的に異なるもの（例えば、プロテインアイソフォーム、グリコフォーム、又は異なるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の変形物を有する抗体など）、又は構造的及び組成的に異なるもの（例えば、未浄化の天然抽出物又は未浄化の合成化合物）であり得るが、これらに限定されない。
【０１５３】
「分子のバイオセンサインデックス（Molecule biosensor index）」
「分子のバイオセンサインデックス」等の用語は、分子に対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサインデックスをいう。例えば、分子のバイオセンサインデックスは、細胞パネル上で作用する分子のプロファイル、及びマーカパネルに対する分子の変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０１５４】
「分子のＤＭＲインデックス（Molecule DMR index）」
「分子のＤＭＲインデックス」等の用語は、分子に対して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスをいう。例えば、分子のＤＭＲインデックスは、細胞パネル上で作用する分子のプロファイル、及びマーカパネルに対する分子の変調プロファイルからなることができ、各マーカパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０１５５】
「分子インデックス（Molecule index）」
「分子インデックス」等の用語は分子に関するインデックスをいう。
【０１５６】
「分子処理された細胞（Molecule-treated cell）」
分子処理された細胞等の用語は、分子にさらされた細胞をいう。
【０１５７】
「分子変調インデックス（Molecule modulation index）」
「分子変調インデックス」等の用語は、細胞パネル上で作用するマーカパネルのバイオセンサ出力シグナルを変調する分子の能力を表示するインデックスをいう。当該変調インデックスは、分子の存在下におけるマーカを用いた刺激の際の細胞反応の特定のバイオセンサ出力シグナルのパラメータを、分子の非存在下におけるものに対して正規化することによって生成される。
【０１５８】
「分子薬理（Molecule pharmacology）」
「分子薬理」等の用語は、システム細胞生態（systems cell biology）又はシステム細胞薬理（systems cell pharmacology）をいい、すなわち細胞上で作用する分子の作用モードである。分子薬理は、毒性、特定の細胞プロセス（例えば、増殖、分化、活性酸素種シグナル伝達）に影響を与える能力、又は特定の細胞標的（例えば、ｈＥＲＧチャネル、ｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＪＡＫ２、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ２、若しくはアクチン）を変調する能力（これらに限定されない）によってしばしば特性化される。
【０１５９】
「正規化すること（Normalizing）」
正規化すること等の用語は、例えば少なくとも１つの共通変数を除去するために、データ、プロファイル、又は反応を調節することを意味する。例えば、２つの反応が生成され、その一方が細胞上で作用するマーカに対するものであり、他方が細胞上で作用するマーカ及び分子に対するものである場合、正規化することとは、分子の非存在下におけるマーカ誘発された反応と分子の存在下における当該反応とを比較してマーカのみによる反応を除去することをいい、これによって正規化された反応はマーカに対する分子の変調による反応を示すこととなる。変調比較はマーカの一次プロファイル及び分子の存在下におけるマーカの二次プロファイル（変調プロファイル）を正規化することによって得られる。
【０１６０】
「任意の（Optional）」
「任意の」、「任意で」等の用語は、その後に記載されている事象又は状況が発生する場合と発生しない場合があることを意味し、かつ当該記載が当該事象又は状況の発生する例と発生しない例とを含むことを意味する。例えば、「任意で組成物は組合せを含む」との表現は、当該組成物が異なる分子の組合せを含む場合と組合せを含まない場合とがあることを意味し、この表現は当該組合せと当該組合せではないこと（すなわち当該組合せの個別のメンバ）との両方を含む。
【０１６１】
「又は（Or）」
本明細書で使用されている「又は」等の用語は、特定の一覧の中の１のメンバ及び当該一覧のメンバの任意の組合せを含むことを意味する。
【０１６２】
「プロファイル（profile）」
プロファイル等の用語は、細胞などの組成物に対して収集されたデータをいう。プロファイルは上記したように無標識バイオセンサによって収集され得る。
【０１６３】
「一次プロファイル（Primary profile）」
「一次プロファイル」等の用語は、バイオセンサ反応又はバイオセンサ出力シグナルであり、すなわち分子が細胞に接触した際に得られたプロファイルをいう。典型的な場合、一次プロファイルは、最初の細胞反応を正味ゼロ（すなわち基準線（baseline））のバイオセンサシグナルに対して正規化した後に得られる。
【０１６４】
「二次プロファイル（Secondary profile）」
「二次プロファイル」等の用語は、分子の存在下におけるマーカに対する細胞のバイオセンサ反応又はバイオセンサ出力シグナルをいう。二次プロファイルは、マーカ誘発された細胞反応すなわちバイオセンサ反応を変調する分子の能力を示すものとして使用されることができる。
【０１６５】
「変調プロファイル（Modulation profile）」
「変調プロファイル」等の用語は、分子の存在下におけるマーカの二次プロファイルと分子の非存在下におけるマーカの一次プロファイルとの間の比較をするものである。当該比較物は、例えば、二次プロファイルから一次プロファイルを差し引くこと又は一次プロファイルから二次プロファイルを差し引くこと、すなわち一次プロファイルに対して二次プロファイルを正規化することによるものである。
【０１６６】
「パネル（Panel）」
パネル等の用語は、所定の組の試料（例えば、マーカ、細胞、又は経路）をいう。パネルはライブラリから試料を選定して作成され得る。
【０１６７】
「ポジティブコントロール（Positive control）」
「ポジティブコントロール」等の用語は、データ収集条件がデータ収集を導き得ることを示すコントロールをいう。
【０１６８】
「増強する（Potentiate）」
増強する、増強された等の用語は、分子によって引き起こされた細胞内のマーカのバイオセンサ反応の特定のパラメータを増大することをいう。分子の存在下における同一の細胞内におけるマーカの二次プロファイルと同一のマーカの一次プロファイルとを比較することによって、当該分子による細胞のマーカ誘発されたバイオセンサ反応の変調を計算することができる。ポジティブな変調は、マーカに誘発されたバイオセンサシグナルを増大させる分子を意味する。
【０１６９】
「効力（Potency）」
効力等の用語は、所定の強度の効果を得るのに必要な量で表された分子活性の測定結果をいう。例えば、高効力薬剤は少ない濃度でも大きな反応を引き起こす。効力は親和性及び効能に比例する。親和性は受容体に結合する薬剤分子の能力である。
【０１７０】
「刊行物（Publications）」
本願を通して、様々な刊行物が参照されている。これら刊行物の開示内容は、当該技術分野の状況をより完全に説明するために、その全てにおいて、参照することにより本願に組み込まれているものとする。開示された参照物は、当該参照物の属する文中において記載されている材料においても、個別かつ詳細に参照することにより本明細書に組み込まれているものとする。
【０１７１】
「受容体（Receptor）」
受容体等の用語は、細胞の原形質膜又は細胞質に組み込まれているタンパク質分子であって、可動性のシグナル伝達分子（又は「シグナル」分子）が結合し得るものをいう。受容体に結合する分子は「リガンド」と呼ばれ、ペプチド（神経伝達物質など）、ホルモン、調合薬、又は毒素であることができ、さらに受容体は、当該結合が起きた際に、通常は細胞反応を開始する構造変化に進入する。しかし、いくつかのリガンドは反応を誘発することなく受容体を遮断するのみである（例えばアンタゴニスト）。受容体におけるリガンド誘発された変化は、当該リガンドの生物学的活性を構成する生理学的変化を引き起こす。
【０１７２】
「ロバストなバイオセンサシグナル（Robust biosensor signal）」
「ロバストなバイオセンサシグナル」はバイオセンサシグナルであって、その振幅がノイズレベル又はネガティブコントロール反応よりも十分に（例えば、３倍、１０倍、２０倍、１００倍、又は１，０００倍）大きいシグナルである。しばしば、当該ネガティブコントロール反応はアッセイバッファ溶液（すなわち賦形剤）を加えた後の細胞のバイオセンサ反応である。当該ノイズレベルは他の溶液を加えない場合の細胞のバイオセンサシグナルである。細胞が他の溶液を加える前から溶液に浸されているのは影響しない。
【０１７３】
「ロバストなＤＭＲシグナル（Robust DMR signal）」
「ロバストなＤＭＲシグナル」等の用語は「ロバストなバイオセンサシグナル」のＤＭＲの形態をとったものをいう。
【０１７４】
「範囲（Ranges）」
範囲は、１の「約」に修飾された特定の値から、及び／又は他の「約」に修飾された特定の値まで、として本明細書において表現されることができる。このように範囲が表現された場合、他の実施例は、一方の特定の値から他方の特定の値までか、一方の特定の値以上か、又は他方の特定の値以下を含む。同様に、値が、先行詞「約」を使用することによって、近似値として表現された場合、この特定の値は他の実施例を形成する。さらに、当該範囲の終点の各々は、その他の終点に関連してかつ当該他の終点とは独立して重要なものである。さらに、本明細書には多数の値が開示されており、当該値の各々は、その値に加えて「約」に修飾された特定の値として本明細書に開示されているものとする。例えば、値「１０」が開示されているならば、「約１０」も開示されているものとする。さらに、当業者に適切に理解されるように、１の値が当該値「以下」と開示されている場合、「当該値以上」及びその値間の可能な範囲も開示されているものとする。例えば、値「１０」が開示されているならば、「１０以下」及び「１０以上」も開示されているものとする。さらに、本願を通して、データは多数の異なる形式で与えられており、このデータは、終点、始点、及び当該データ点の任意の組合せを表すものであるとする。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点１５が開示されているならば、１０より大きい、１５より大きい、１０以上、１５以上、１０未満、１５未満、１０以下、１５以下、１０、及び１５が１０と１５との間と同様に考慮され開示されているものとする。さらに、２つの特定の単位間の各単位も開示されているものとする。例えば、１０及び１５が開示されているならば、１１、１２、１３、及び１４も開示されているものとする。
【０１７５】
「反応（Response）」
反応等の用語は刺激に対する応答をいう。
【０１７６】
「サンプル（Sample）」
サンプル又はこれと同様の用語は動物、植物、真菌などであって、天然物、天然抽出物等、動物由来の組織若しくは器官、細胞（対象物内のもの、対象物から直接取出したもの、又は培養状態を維持している細胞若しくは培養された細胞株由来の細胞）、細胞溶解物（又は溶解物の一部）若しくは細胞抽出物、又は細胞若しくは細胞材料（例えば、ポリペプチド又は核酸）から派生した１つ以上の分子を含む溶液をいい、これらは本明細書に記載されているようにアッセイされる。サンプルは体液又は排出物（例えば、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁であるがこれらに限定されない）であって細胞又は細胞成分を含むものであってもよい。
【０１７７】
「シグナル伝達経路（Signaling pathway）」
「定義された経路を」等の用語は、シグナル（例えば外因のリガンド）を受信することから細胞の応答（例えば細胞標的の発現増大）までの細胞の経路である。場合によっては、受容体に結合するリガンドによって生じる受容体活性化は、リガンドに対する細胞反応に直結する。例えば、神経伝達物質ＧＡＢＡは、イオンチャネルの部分である細胞表面受容体を活性化することができる。ニューロン上のＧＡＢＡ  Ａ受容体に結合するＧＡＢＡは、当該受容体の一部である塩化物選択性イオンチャネルを開く。ＧＡＢＡ  Ａ受容体の活性化は、負の電荷を帯びた塩化物イオンが、ニューロンへ進入して活動電位を生成するニューロンの能力を阻害することを可能にする。しかし、多くの細胞表面受容体において、リガンド−受容体相互作用は細胞の応答に直結していない。活性化された受容体は、細胞の挙動におけるリガンドの最終的な生理学的効果が生成される前に、まず細胞内部の他のタンパク質と相互作用しなければならない。しばしば、いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動は受容体の活性化に従って変更される。受容体活性化によって誘発された細胞変化のすべてのセットはシグナル伝達機序すなわちシグナル伝達経路と呼ばれる。当該シグナル伝達経路は比較的単純であるか非常に複雑であり得る。
【０１７８】
「インデックスの類似性（Similarity of indexes）」
「インデックスの類似性」等の用語は、インデックスのパターン及び／又はスコアのマトリクスに基づいて、分子に対する２つのインデックス間又は少なくとも３つのインデックスの間の類似性を表現する用語である。当該スコアのマトリクスはその比較対象・比較相手となるもの（counterparts）に大きく関係しており、当該比較対象・比較相手は、例えば、対応する細胞内における異なる分子の一次プロファイルの特徴と、各マーカに対する異なる分子の変調プロファイルの性質及び割合と、である。例えば、より高いスコアはより類似する特性に対して与えられ、より低い又はネガティブのスコアはあまり類似していない特性に対して与えられる。分子変調インデックスに見られる変調はポジティブ、ネガティブ、及びニュートラルの３種類であるため、類似性マトリクスは比較的単純である。例えば、単純なマトリクスにおいて、同一の変調（例えばポジティブ変調）には＋１のスコアが割り当てられ、同一でない変調には−１のスコアが割り当てられる。
【０１７９】
代替として、異なるスコアが異なるスケールの変調タイプに与えられることもできる。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、１００％、２００％等のポジティブ変調に、それぞれ、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋２０、＋２０のスコアの与えられることができる。一方、ネガティブ変調に対しては、同様であるが反対のスコアが与えられることができる。この手法に従うと、図２ｄに示されているように、２つの細胞におけるマロトキシンに対するフルフェナム酸の変調インデックスは、フルフェナム酸が当該２つの細胞におけるマロトキシンに誘発されたバイオセンサ反応を別々に変調することを示しており、すなわちＨＴ２９（−９０％）とＨＥＫ−ｈＥＲＧ（約１２％）である。従って、フルフェナム酸の変調インデックスのスコア座標には、（−９，１）と割り当てられることができる。同様に、ジフルニサルに対するスコア座標は（−９，１）である。フルフェナム酸とジフルニサルとの間のスコアを比較することによって、両方の分子がｈＥＲＧチャネルにおいて同様の作用モードを示すことがわかる。
【０１８０】
「安定した（Stable）」
医薬組成物に関して使用される場合、「安定した」等の用語は、当業者の間では、特定の保存条件下での所定期間の活性材料の喪失が特定の量未満、通常は１０％未満であることを意味する。組成物が安定していると考慮されるのに必要な時間は、製品の用途に関係しており、かつ製品の生産、品質管理及び検査のための保管、最終的な使用の前に再度保管される卸売業者への輸送又は消費者への直接の輸送における商業的実用性によって定められる。数ヶ月の安全率を含めると、医薬品の最低製品寿命は通常１年であり、１８ヶ月よりも長いのが好ましい。本明細書で使用されている用語「安定した」は、これら市場の実情と、２度から８度の間の冷蔵状態などの容易に達成可能な環境条件で製品を保管及び輸送する能力と、を考慮している。
【０１８１】
「物質（Substance）」
物質等の用語は任意の物理的客体物をいう。材料は物質である。分子、リガンド、マーカ、細胞、タンパク質、及びＤＮＡは物質と考えられる。機械又は製品は、物質そのものではなく、物質から作られているものと考えられる。
【０１８２】
「対象物（Subject）」
本願を通して使用されている対象物等の用語は固体を意味する。従って、「対象物」は、例えば、犬、猫などの家畜化された動物、家畜類（牛、馬、豚、羊、ヤギなど）、実験動物（マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、哺乳類、ヒト以外の哺乳類、霊長類、ヒト以外の霊長類、齧歯動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の動物を含むことができる。１つの対象物の態様は、霊長類又はヒトなどの哺乳類である。対象物はヒト以外であってもよい。
【０１８３】
「試験分子（Test molecule）」
試験分子等の用語は、当該試験分子に関するいくつかの情報を得る手法において使用される分子をいう。試験分子は未知の分子又は既知の分子であることができる。
【０１８４】
「処理・治療すること（Treating）」
処理すること、処理等の用語は少なくとも２つの意味で使用されることができる。第１に、処理すること、処理等の用語は投与すなわち対象物に向けてとられる行為をいう。第２に、処理すること、処理等の用語は２つのものを混合することをいい、当該２つのものは例えば分子及び細胞などの２つ以上の物質である。この混合は、当該少なくとも２つの物質を接触し得る状態にさせる。
【０１８５】
治療すること、治療等の用語が疾病に関する文脈において使用される場合、これらは例えば治癒又は症状の軽減を暗示するものではない。治療学的用語又はこれと同様の用語が治療すること、治療等の用語に伴って使用される場合、基礎疾患の症状が軽減すること及び／又は基礎的な１つ以上の細胞的原因、生理学的原因、若しくは生物化学的原因、若しくは症状を起こす機序が軽減されることを意味する。この文脈において使用される軽減とは、単に疾病の生理学的状態だけでなく、疾病の分子状態を含む疾病の状態が比較的低減されることを意味する。
【０１８６】
「トリガ（Trigger）」
トリガ等の用語は反応などの事象を起こす又は開始する動作・作用をいう。
【０１８７】
「値（Values）」
組成物、要素、添加物、細胞型、マーカなどの態様及びそれらの範囲のために開示された特定かつ好ましい値は、説明のためだけのものであり、それらは、定義された他の値又は定義された範囲中の他の値を除外するものではない。本開示の組成物、装置及び方法は、それらが有するどんな値又は値のどんな組み合わせ、特定の値、さらなる特定の値及びここに開示された好ましい値のものも含む。
【０１８８】
従って、ここに開示された方法、組成物、製品及び機械は、本明細書に記載された様々な成分、ステップ、分子及び組成物等を含み、これらで構成され、又は本質的にこれらで構成されるような態様にて結合され得る。それらは、例えば、ここに定義したようなリガンドを含む分子を特性化する方法、ここに定義したようなインデックスを生成する方法、又は、ここに定義したような創薬の方法において使われることができる。
【０１８９】
「未知の分子（Unknown molecule）」
未知の分子等の用語は、未知の生物学的、薬理学的、生理学的、病態生理学的な活性を有する分子をいう。
【０１９０】
「電位依存性イオンチャネル」
電位依存性イオンチャネルは、心臓及び神経などの興奮組織内における細胞表面膜に亘るタンパク質である。チャネルを通過するイオンは心筋活動電位の基礎を形成する。ＮＡ＋イオン及びＣＡ２＋イオンの各々の流入は、脱分極の立ち上がり及び活動電位のプラトー相を制御する。Ｋ＋イオンの流出は、細胞膜を再分極し、活動電位を終端し、かつ筋肉の弛緩を可能にする。再分極電流の急速成分は、ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈＥＲＧ）によってコード化されたＫ＋チャネルを通過する。再分極障害は、活動電位の持続時間を延長し、弛緩を遅らせ、かつ心拍障害を進めることがある。活動電位の延長は、心電図（ＥＣＧ）上で測定されるＱＴ間隔の長期化として臨床的に検出される。薬剤誘発性のＱＴ延長は再分極障害による薬剤の深刻な合併症であり、これは致死の心室性不整脈のリスクの増大に関連する。薬剤誘発性のＱＴ延長は、ほぼｈＥＲＧのＫ＋チャネルの遮断に関連している。メタンスルホンアニリド、ドフェチリド、ＭＫ−４９９、及びＥ−４０３１などの薬剤の大量のものは、影響を受けやすい患者に対して命に関わる心臓発作及び心室性不整脈を起こすような心臓のｈＥＲＧなどのＫ＋イオンチャネルを遮断することが知られている。残念ながら、薬剤誘発性の心室性不整脈の発生率は低く、臨床試験では検出されない。
【０１９１】
テルフェナジン（抗ヒスタミン剤）、アステミゾール（抗ヒスタミン剤）、及びシサプリド（胃運動促進剤）などの非心血管性薬剤によってｈＥＲＧチャネルが遮断されることによる突然死は、市場からのこれら薬剤の撤退のきっかけとなった。近年、バイオックス（Vioxx）等の薬剤も危険な心臓副作用に関する懸念のために市場から撤退した。一方、Ｋ＋チャネルに関する心臓への安全性は監督機関の大きな懸念事項となっている。高い損耗率を抑えるために、創薬において、リード化合物（lead compounds）におけるｈＥＲＧチャネルの阻害活性をできるだけ早く選別して排除することが最優先となっている。
【０１９２】
薬剤分子のｈＥＲＧ遮断活性に対する特性を試験する現在の方法はいくつかの制限を有している。細胞ベースのパッチクランプ型電気生理学的試験すなわち動物試験に基づく手法は、心臓安全試験における正確さ及び出力の要求を満たすものではなく、技術的に困難である。他のアッセイは、結合の定量化及び検出に、放射性標識マーカ、蛍光マーカ、染料結合マーカ、又はビオチン化マーカを使用する。しかし、これらマーカの多くは標識後に活性を低下させる。さらに、放射性物質は、放射性化合物を取り扱う複雑なインフラ及びライセンスの必要性などの実施上の制限をもたらす。本明細書ではｈＥＲＧ  Ｋ＋チャネル、ｈＥＲＧ、ｈＥＲＧイオンチャネル、又はｈＥＲＧチャネルと呼ばれるこのチャネルの無差別な性質は、多様な化学構造（Cavalli, A., et al., J.Med. Chem. 2002, 45(18), 3844-53）との結合を導き、その相互作用によって致死的結果となる可能性を伴う。このことは、全ての新薬候補が天然型又は組み換え型で発現されたヒトのｈＥＲＧタンパク質（Bode, G., et al., Fundam. Clin. Pharmacol. 2002, 16(2), 105-18）を用いた機能的パッチクランプアッセイの試験を受ける米国食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）及び国際調和会議（International Congress of Harmonization）からの勧告をもたらした。自動化された高いスループットのパッチクランプ法が近年開発されたが、当該システムは専門のオペレータ、生細胞、及び多額の設備投資を必要とする（Bridgland-Taylor, M., et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2006, 54(2), 189-99; Dubin, A., et al., J. Biomol. Screen. 2005, 10(2), 168-81）。従って、薬剤候補などの分子とｈＥＲＧチャネルとの結合を特性化及び定量化する新規な組成物及び方法を開発する必要がある。
【０１９３】
ＫＣＮＨ２すなわちヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈＥＲＧ）はKv11.1カリウムイオンチャネルを形成するために結合するKv11.1のαサブユニットをコード化する。当該ｈＥＲＧ遺伝子は、小胞体においてはコアグリコシル化された未成熟の１３５ｋＤａタンパク質（Kv11.1）と訳され、ゴルジ体においては複雑にグリコシル化された成熟の１５５ｋＤａタンパク質に変換される。（Warmke, J.W.ら（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1994, 91(8), 3438-3442、参照することにより組み込まれている）は、ｈＥＲＧ遺伝子の配列及び構造とその野生型翻訳生成物のKv11.1とを開示している。ｈＥＲＧタンパク質の配列はSEQ ID NO: NP_000229に開示されている。ｈＥＲＧ遺伝子の配列はSEQ ID NO: NM_000238に開示されている。
【０１９４】
「アッセイ」
「高いスループットの機能的ｈＥＲＧイオンチャネルアッセイ」
ここに開示されているのは、高いスループット及び高い分解能で、内因的に過剰発現したｈＥＲＧイオンチャネル及び安定的に過剰発現したｈＥＲＧイオンチャネルをアッセイしてｈＥＲＧ変調剤をスクリーニング検査する方法である。無標識バイオセンサの細胞アッセイは、生細胞における受容体の生態の研究及び機能的読み出し（例えば動的質量再分布シグナル）の提供を可能にするものであると示されている。得られるＤＭＲシグナルは統合された細胞反応であり、イオンチャネル活性の全ての進化に従う。リアルタイムの動態は、イオンチャネル及びその調節タンパク質上で作用する変調剤の作用モードの分類を可能にする。
【０１９５】
無標識ＲＷＧバイオセンサはイオンチャネル変調剤を用いた刺激の際の細胞の統合された動態反応を測定するため、ここに開示されたバイオセンサアッセイはｈＥＲＧ変調剤を分類する新規な手法、特にｈＥＲＧチャネル又はｈＥＲＧに関するシグナル伝達錯体を介したシグナル伝達を活性化することができる変調剤に対する手法を提供するが、ｈＥＲＧ電流及び／又はｈＥＲＧチャネルを介したイオンフラックスに影響を与えるものと与えないものがある。
【０１９６】
ｈＥＲＧ活性剤（例えばマロトキシン）の非存在下又は存在下における異なる細胞の多重化された無標識読み出しを結合することは、ｈＥＲＧ変調剤を異なる区分に分類する効果的な手法を提供する。
【０１９７】
本方法及び本組成物は無標識バイオセンサの細胞アッセイに関するものである。細胞アッセイ用の無標識バイオセンサは、生物学的成分（すなわち生細胞）、検出要素、及び上記２つの要素に関するトランスデューサの３つの要素・部材からなるデバイスである。使用されるトランスデューサの種類に応じて、全ての細胞検知用の無標識バイオセンサは音響、電気、及び光学バイオセンサの３つの区分に大きく分類されることができる。
【０１９８】
「バイオセンサ」
「音響バイオセンサ」
水晶共振器などの音響バイオセンサは音波を用いて細胞反応を特性化する。音波は圧電物質を用いて一般的に生成されて受信される。しばしば音響バイオセンサは共振センサ構成にて操作するように構成される。典型的な構成においてこの石英ディスクは２つの金電極間に挟まれる。電極のＡＣシグナルは高感度共振回路として機能する結晶の励起及び振動を導く。出力センサシグナルは共振周波数及び運動抵抗である。バイオセンサ表面が固定されている場合、当該共振周波数の大部分は吸収された材料の全質量の線形関数である。液体環境下では音響センサ反応は、結合分子の質量だけでなく、形成された分子錯体又は生細胞の帯電及び粘弾性特性の変化にも敏感である。結晶に関する細胞の運動抵抗及び共振周波数を測定することによって、細胞付着及び細胞毒性を含む細胞プロセスがリアルタイムで調査されることができる。
【０１９９】
「電気バイオセンサ」
電気バイオセンサはインピーダンスを用いて細胞付着を含む細胞反応を特性化する。典型的な構成において、生細胞は統合された電極アレイが組み込まれたバイオセンサ表面に接触する。一定電圧かつ高周波数の小さなＡＣパルスが電極間に電場を生成するのに使用され、これは細胞の存在によって妨害される。当該電気パルス統合された電気回路を用いて当該回路内に生成され、回路を流れる電流は時間に従う。得られるインピーダンスは細胞層の導電性の変化の尺度である。細胞原形質膜は細胞間及び細胞下に電流を流れさせる絶縁材として機能する。インピーダンスベースの測定は、細胞付着、細胞拡散、細胞の微細動作、細胞の形態変化、細胞死、及び細胞シグナル伝達を含む幅広い細胞事象の研究に応用されている。
【０２００】
「光学バイオセンサ」
光学バイオセンサは表面に結合した電磁波を一次的に使用して細胞反応を特性化する。当該表面結合波は、光に励起された表面プラズモンを用いて金基板上において得られる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））か、又は回折格子に結合された導波モード共鳴を用いて誘電体基板上において得られる（共鳴導波路回折格子（ＲＷＧ））ことができる。ＳＰＲにおいて、読み出しは発生する反射光の強度が最小の共鳴角度である。同様に、ＲＷＧバイオセンサにおいて、読み出しは得られる光取り込み（incoupling）効率が最大の共鳴角度又は共鳴波長である。当該共鳴角度又は共鳴波長はセンサ表面又はその近傍における局所屈折率の関数である。アッセイにおいて数個のフローチャネルに限られるＳＰＲとは異なり、ＲＷＧバイオセンサは、機器及びアッセイの近年の進歩によって、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）及び細胞アッセイを受け入れる余地がある。典型的なＲＷＧにおいて、細胞は、高屈折率の材料を含むバイオセンサが組み込まれたマイクロタイタープレートのウェルに直接配置される。局所的な屈折率変化は、刺激された生細胞の動的質量再分布（ＤＭＲ）シグナルを導出する。これらバイオセンサは、受容体の生態、リガンドの薬理、及び細胞付着を含む様々な細胞プロセスの研究に使用されている。
【０２０１】
本発明は、好ましくは、コーニングＥｐｉｃ（登録済み）システムなどの共鳴導波路回折格子型バイオセンサを使用する。Ｅｐｉｃ（登録済み）システムは、市販の波長統合システムである角度インタロゲーションシステム又は波長走査型画像化システム（swept wavelength imaging system）（コーニング社、コーニング、ＮＹ）を含む。当該市販のシステムは、温度管理ユニット、光学検出ユニットから構成されており、さらにロボットを備えたオンボードの液体操作ユニットを含むか、又はロボットを備えた外部の液体補助システムを含む。当該検出ユニットは統合されたファイバ光学系の中央に設けられ、細胞反応の約７又は１５秒間隔での動態測定を可能にする。化合物溶液は当該オンボードの液体操作ユニット又は外部の液体補助システム（共に従来の液体操作システムを使用する）を用いて導入された。
【０２０２】
「バイオセンサとバイオセンサアッセイ」
無標識の細胞ベースアッセイは、一般的にバイオセンサを用いて生細胞における分子誘発性の反応を監視する。当該分子は天然のもの又は人工のものであることができ、精製されている又は浄化されていない混合物であることができる。典型的な場合、バイオセンサは、光学的トランスデューサ、電気的トランスデューサ、熱量的トランスデューサ、音響的トランスデューサ、磁気的トランスデューサなどのトランスデューサを用いて、バイオセンサに接触した細胞における分子認識事象又は分子誘発性の変化を定量化可能なシグナルに変換する。これら無標識のバイオセンサは分子相互作用の分析に使用されることができ、当該分析は、どのように分子錯体が形成及び分離するかを経時的に特性化すること、又は細胞反応についてはどのように細胞が刺激に対して反応するかを特性化することを含む。本方法に適用可能なバイオセンサは、例えば、表面プラズモン共鳴型（ＳＰＲ）バイオセンサ及び共鳴導波路回折格子型（ＲＷＧ）バイオセンサ、共鳴ミラー、エリプソメータなどの光学バイオセンサシステム、及び生体インピーダンスシステムなどの電気バイオセンサシステムを含む。
【０２０３】
「ＳＰＲバイオセンサとそのシステム」
ＳＰＲは入射光の範囲をカバーするプリズムに依存しており、プリズムは、くさび状の偏光された光を、導電性金属フィルム（例えば金）を含む平面ガラス基板に導き、これによって表面プラズモンを励起する。発生するエバネセント波は金層内の自由電子雲と相互作用して吸収され、電子電荷密度波（すなわち表面プラズモン）を生成し、反射光の強度を低下させる。この発生する強度が最小の共鳴角度は、センサ表面の反対の面にある金層に近接した溶液の屈折率の関数である。
【０２０４】
「ＲＷＧバイオセンサとそのシステム」
ＲＷＧバイオセンサは、例えば、基板（例えばガラス）、回折格子又は周期構造が組み込まれた導波路薄膜、及び細胞層を含み得る。ＲＷＧバイオセンサは、回折格子による光の導波路への共鳴結合を使用して溶液と表面との接触面における全反射を導き、これによって当該接触面において電磁場を生成する。この電磁場の性質は一過性のものであり、これは当該電磁場がセンサ表面から急激に減衰することを意味し、当該電磁場が初期値の１／ｅに減衰する距離は侵入深さとして知られており、侵入深さは特定のＲＷＧバイオセンサ構成の関数であるが、典型的な場合約２００ｎｍである。このタイプのバイオセンサはエバネセント波を利用してバイオセンサ表面又はその近傍における細胞層のリガンド誘発性変化を特性化する。
【０２０５】
ＲＷＧ機器は角度シフト又は波長シフトの測定に基づいたシステムへさらに分割されることができる。波長シフトの測定において、一定の角度の入射波長の範囲をカバーする偏光された光が使用されて導波路を照射し、特定の波長の光は当該導波路に結合されかつ当該導波路に沿って伝播する。一方、角度シフトの機器において、センサは単色光を用いて投射され、当該光が共鳴的に結合される角度が測定される。
【０２０６】
共鳴条件はバイオセンサの表面に直接接触している細胞層（例えば、細胞密度、細胞付着、及び細胞状態）の影響を受ける。リガンド又は検体が生細胞における細胞標的（例えば、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、キナーゼ）と相互作用した場合、細胞層内の局所的な屈折率の変化は共鳴角度（又は波長）のシフトとして検出されることができる。
【０２０７】
コーニング（登録済み）Ｅｐｉｃ（登録済み）システムは、無標識の生物化学的すなわち細胞ベースのアッセイのためにＲＷＧバイオセンサを使用する（コーニング社、コーニング、ＮＹ）。Ｅｐｉｃ（登録済み）システムは、ＲＷＧプレートリーダ及びＳＢＳ（生体分子スクリーニング協会）標準のマイクロタイタープレートで構成されている。当該プレートリーダにおける検出システムは、細胞のリガンド誘発性変化を受けると、統合されたファイバ光学系を用いて入射光の波長シフトを測定する。一組の照射−検出ヘッドは直線的に設けられ、これによって反射スペクトルは３８４ウェルのマイクロプレートのコラム内のウェルの各々から同時に収集される。プレート全体が走査され、センサの各々が複数回アドレス指定され、コラムの各々が順次アドレス指定される。入射光の波長は分析用に収集されかつ使用される。温度管理ユニットが機器に含まれることができ、これによって温度変化による入射波長の擬似シフトが最小限にする。測定された反応は細胞の集団の平均的な反応を表している。当該システムの様々な機能が自動化されることができ（例えばサンプルローディング）、また、多重化されることができる（例えば９６ウェル又は３８６ウェルのマイクロタイタープレート）。液体操作はオンボードの液体操作部又は外部の付属液体操作部によって行われる。特に、分子溶液は、下部に培養された細胞を含んでいる細胞アッセイプレートのウェルへ直接付加又はピペッティングされる。当該細胞アッセイプレートは細胞を覆う特定のアッセイバッファ溶液の領域を含む。さらに、特定の回数のピペッティングによる単純な混合ステップは分子付加ステップに組み込まれることができる。
【０２０８】
「電気バイオセンサとそのシステム」
電気バイオセンサは、基板（例えばプラスチック）、電極、及び細胞層で構成されている。この電気的検出方法において、細胞は基板上に設けられた小さな金電極上において培養され、システムの電気インピーダンスは時間に従う。当該インピーダンスは細胞層の導電性の変化の尺度である。典型的な場合、固定又は変更された周波数における小さな一定の電圧が電極又は電極アレイに加えられ、回路の電流が経時的に監視される。電流のリガンド誘発性変化は細胞反応の尺度を提供する。全ての細胞検知に対するインピーダンス測定は１９８４年に初めて実現された。それ以降、インピーダンスベースの測定は、細胞付着、細胞拡散、細胞の微細動作、細胞の形態変化、及び細胞死を含む幅広い細胞事象の研究に用いられている。従来のインピーダンスシステムは、小さな検出電極及び大きな基準電極を使用したため、大きなアッセイのばらつきに悩まされている。このばらつきを克服するために、CellKeyシステム（MDS Sciex社、南サンフランシスコ、ＣＡ）、RT-CES（ACEA Biosciences社、サンディエゴ、ＣＡ）などの最新世代のシステムは、微小電極アレイを有する集積回路を使用する。
【０２０９】
「高い空間分解能のバイオセンサ画像化システム（High Spatial Resolution Biosensor Imaging System）」
ＳＰＲ画像化システム、エリプソメトリ画像化システム、及びＲＷＧ画像化システムを含む光学バイオセンサ画像化システムは、高い空間分解能を提供し、本開示の実施例に使用されることができる。例えば、ＳＰＲイメージャ（登録済み）２（GWC Technologies社）は、プリズムに結合したＳＰＲを使用し、固定入射角度にてＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラを用いて反射光を収集する。表面の変化は反射率変化として記録される。従って、ＳＰＲ画像化は、すべてのアレイの要素に対する測定結果を同時に収集する。
【０２１０】
画像化ベースの用途にはＲＷＧバイオセンサに基づいた波長走査型光学インタロゲーションシステムが用いられることができる。このシステムにおいて、センサすなわちマイクロプレート型のＲＷＧバイオセンサのアレイに投射するのに高速の調節可能レーザ源が使用される。当該センサのスペクトルは、当該センサから反射された光学パワーをレーザ波長が走査する際の時間の関数として検出することによって解釈されることができ、コンピュータ化された共鳴波長インタロゲーションモデリングを用いた測定データの分析は、固定化受容体又は細胞層を有するバイオセンサの空間分解された画像の説明を与える。画像センサの使用は、画像化ベースのインタロゲーション構成につながる。二次元の無標識画像は部品を移動することなく得られることができる。
【０２１１】
一方、横磁場モードすなわちｐ−偏光されたＴＭ０モードの角度インタロゲーションシステムが使用されることもできる。このシステムは、約２００μｍｘ３０００μｍ又は２００μｍｘ２０００μｍの大きさのＲＷＧセンサに照射するような各光ビームアレイを生成する投光システムと、これらセンサから反射された光ビームの角度の変化を記録するＣＣＤカメラベースの受光システムと、で構成されている。アレイ化された光ビームは、回折光学レンズと組み合わせたビームスプリッタを用いて得られることができる。このシステムは、最大４９センサ（７ｘ７ウェルセンサアレイ内）が３秒ごとに同時にサンプリングされること又は全３８４ウェルのマイクロプレートが１０秒毎に同時にサンプリングされることを可能にする。
【０２１２】
さらに、波長走査型インタロゲーションシステムが使用されることもできる。このシステムにおいて、一定の角度の入射波長の範囲をカバーする偏光された光が導波路回折格子型バイオセンサに亘って照射及び走査されるのに使用され、各位置における反射光が同時に記録されることができる。走査中にバイオセンサにおける高分解能画像が得られることもできる。
【０２１３】
「生細胞における動的質量再分布（ＤＭＲ）シグナル」
細胞標的を介した刺激に対する細胞反応は、下流シグナル伝達網（downstream signaling networks）の空間的及び時間的動態によってコード化されることができる。このため、統合された細胞シグナル伝達をリアルタイムで監視することは、細胞の生態及び生理の理解に有益な生理的情報を提供することができる。
【０２１４】
共鳴導波路回折格子（ＲＷＧ）型バイオセンサを含む光学バイオセンサは、細胞物質の動的再分布に関する統合された細胞反応を検出し、細胞シグナル伝達の研究ための非侵襲的手段を提供することができる。全ての光学バイオセンサに共通することは、これらがセンサ表面又はそのごく近傍における局所屈折率の変化を測定するということである。原理上は、エバネセント波を用いて細胞内のリガンド誘発性変化を特性化することができれば、ほぼ全ての光学バイオセンサが細胞検知に適用可能である。エバネセント波は溶液−表面間の接触面における光の全反射によって作り出される電磁場であり、エバネセント波は、典型的な場合短い距離（約数百ナノメートル）だけ伸び、これは侵入深さ又は検知領域と呼ばれる溶液の特定の深さである。
【０２１５】
近年、理論的数学モデルが開発され、当該モデルは、リガンドを用いた刺激に反応する生細胞内において測定された光学シグナルのパラメータ及び性質を説明するものである。既知の細胞生物物理と組み合わせた３層の導波路システムに基づいたこれらモデルは、リガンド誘発性の光学シグナルを、受容体を仲介した特定の細胞プロセスへ結び付ける。
【０２１６】
バイオセンサは入射光による照射エリアに位置する細胞の平均的な反応を測定するため、高密度の細胞層が最適なアッセイ結果を得るのに使用され得る。バイオセンサの短い侵入深さに比べて細胞の寸法は大きいため、センサ構成は、基板、回折格子構造を有する導波路膜、及び細胞層の従来にない３層システムと考えられるものである。従って、リガンド誘発性の効果的な屈折率変化（すなわち検出シグナル）は、一次的には、細胞層の下部の屈折率変化に正比例する。
【０２１７】
【数１】
2013516173.tif 000003
【０２１８】
式中のＳ（Ｃ）は細胞層に対する感度であり、△ｎｃはバイオセンサに検知された細胞層のリガンド誘発性の局所屈折率の変化である。細胞内の所定の領域の屈折率は主にタンパク質などの生体分子の濃度によって決まるため、Δｎｃは検知領域内の分子集合体又は細胞標的の局所的な濃度のリガンド誘発性変化に正比例するとみなされることができる。バイオセンサ表面から離れて伸びるエバネセント波が急激に減衰する性質を考慮すると、リガンド誘発性の光学シグナルは以下の式によって与えられる。
【０２１９】
【数２】
2013516173.tif 000004
【０２２０】
式中の△Ｚｃは細胞層への侵入深さであり、αは特定の屈折増分（タンパク質では約０．１８／ｍＬ／ｇ）であり、ｚｉは質量の再分布が起こる距離であり、ｄは細胞層内の想像上のスライス厚である。ここでは細胞層は垂直方向において等間隔なスライスへ分割される。上記の式は、リガンド誘発性の光学シグナルがセンサ表面からの異なる距離において発生する質量再分布の総和であり、その各々が全体の反応に対して同じでない寄与を伴うことを示している。さらに、波長シフト又は角度シフトに関する検出シグナルは、主にセンサ表面に対して垂直に発生する質量再分布に一次的に敏感である。その動的性質により、当該シグナルは動的質量再分布（ＤＭＲ）シグナルとも呼ばれる。
【０２２１】
「細胞とバイオセンサ」
細胞は、受け取った情報を処理、コード化、及び統合する多数の細胞経路又は細胞機構に依存している。特にタンパク質標的への検体の結合を測定する光学バイオセンサを用いた親和性分析とは異なり、生細胞は非常に複雑かつ活発である。
【０２２２】
細胞シグナル伝達を研究するために、細胞培養によって得られる得る細胞はバイオセンサの表面に接触させられる。これら培養された細胞は３つの接触タイプを用いて細胞表面へ貼付けられ、当該接触タイプは焦点接触、密着接触、及び細胞外マトリクス接触であり、各々は当該表面からの特定の分離距離を有している。その結果、基礎の細胞膜は概して当該表面から約１０−１００ナノメートル離れている。浮遊細胞については、細胞は、細胞表面受容体の共有結合、細胞表面受容体の特定の結合、又は重力による単純な沈下によってバイオセンサ表面に接触させられ得る。このため、バイオセンサは細胞の下部を検知することができる。
【０２２３】
多くの場合、細胞は表面に依存した付着及び増殖を見せる。ロバストな細胞アッセイを達成するために、バイオセンサ表面は細胞付着及び細胞増殖を促進するコーティングを必要とする。しかし、表面特性は細胞の生態に直接の影響を与え得る。例えば、表面結合されたリガンドは細胞の反応に影響を与える場合があり、例えば細胞によって与えられた力の下でどのように変形するかに影響する基板材料の機械的適合性に影響を与える。培養条件（時間、血清濃度、密度など）が異なるために、得られた細胞状態は１の表面と他の表面とでは異なるものであり、さらに１の条件と他の条件とでは異なるものである場合がある。従って、バイオセンサベースの細胞アッセイを発達させるためには細胞状態を管理する特別な工夫が必要である。
【０２２４】
細胞は典型的な場合数十ミクロンの比較的大きい寸法を有する動的対象物である。刺激をしない場合でも、細胞は常に微細動作しており、これは、細胞より小さい分解能の微速度撮影の顕微鏡検査及びナノメートルレベルの生体インピーダンス測定によって組織培養において観測される動的変動及び細胞構造の再モデル化である。
【０２２５】
未刺激の条件下では、細胞は、概して、ＲＷＧバイオセンサを用いて検査された際に正味ゼロのＤＭＲ反応を生成する。これは、レーザスポットのサイズが大きいこと及び結合された光の伝播距離が長いことによる光学バイオセンサの空間分解能の低さが部分的に起因している。レーザスポットのサイズは調査されるエリアのサイズを決定し、通常は１度に１つの分析ポイントのみが追跡されることができる。従って、当該バイオセンサは、典型的な場合、光の入射領域に位置する大きな細胞集団の平均的な反応を測定する。細胞は単一細胞レベルで微細動作するが、検査された大きな細胞集団は平均的に正味ゼロのＤＭＲ反応を生じさせる。さらに、細胞内の巨大分子は、哺乳類の細胞の適切な場所に対して高度に組織化されかつ空間的に制限されている。細胞上及び細胞内のタンパク質の厳しく管理されている局在化は特定の細胞機能を判定しかつ反応する。なぜなら当該局所化は、細胞が、適切な相手と相互作用するタンパク質の特異性及び効率を制限し、かつタンパク質の活性構造及び失活構造を空間的に分離することを可能にする。この制御のために、未刺激の条件下では、検知領域内の細胞の局所的な質量密度は平衡状態に達し、正味ゼロの光学反応を導くこととなる。一貫した光学反応を得るために、分析される細胞は、従来の培養条件下において所定期間において培養され、これによってほとんどの細胞が単一の分裂周期を完了している。
【０２２６】
生細胞は、外因性シグナルを検知しそれに反応する優れた能力を有している。以前は、細胞シグナル伝達は、環境信号が単一の特定反応をもたらす反応の線状鎖を引き起こし得る線状の経路を介した機能と考えられていた。しかし、外部刺激に対する細胞反応がより複雑であるということが調査で示された。細胞が受信する情報が、シグナル伝達タンパク質の位相的再配置及びリン酸化反応の複雑な時間的及び空間的パターンへコード化及び処理され得ることが明らかになった。適切な場所に対するタンパク質の空間的及び時間的な標的化は、タンパク質間の相互作用の特異性及び効率を制限し、かつ細胞シグナル伝達及び細胞反応のタイミング及び強度を判定するのに極めて重要である。細胞骨格再構築、細胞周期チェックポイント及びアポトーシスなどの重要な細胞の判定は、活性化されたシグナル伝達物質の正確な時間管理及び相対的な空間的分散に依存する。従って、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）などの細胞標的を介した細胞シグナル伝達は、典型的な場合、規則的かつ調節された状態において進められ、一組の空間的及び時間的事象で構成されており、これらの多くは局所的な質量密度の変化すなわち細胞の局所的な細胞物質の再分布を導く。検知領域内において発生するこれら変化すなわち再分布は、光学バイオセンサを用いてリアルタイムで直接追跡されることができる。
【０２２７】
「ＤＭＲシグナルは生細胞の生理的反応である」
受容体の生態を研究する従来の薬理的手法との比較を通して、リガンドが細胞系において発現された受容体に特有のものである場合において、リガンド誘発性のＤＭＲシグナルが受容体特有のものであり、用量依存性のものであり、かつ可飽和のものであることが示されている。多くのＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）リガンドにおいて、従来の方法を用いて測定されたのとほぼ同一の効能（ＥＣ５０値によって測定されたもの）が見られた。さらに、ＤＭＲシグナルは、脱感作（desensitization）及び再感作（re-sensitization）が全てのＤＰＣＲに共通である場合、期待される脱感作パターンを示す。また、ＤＭＲシグナルはＧＰＣＲリガンドの忠実度を維持し、これは従来技術を用いて得られるものに類似している。さらに、バイオセンサは、完全アゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、及びアロステリック変調剤を識別することができる。総合すると、これらの研究成果は、ＤＭＲが生細胞の生理的反応を監視できることを示している。
【０２２８】
「ＤＭＲシグナルは生細胞内のリガンド−受容体の対のシステム細胞生態情報を含む」
リガンドを用いた細胞の刺激は一組の空間的及び時間的事象を導き、当該事象の非制限的な例は、リガンド結合、受容体活性化、タンパク質補充、受容体内在化、受容体再循環、二次メッセンジャーの変化、細胞骨格の再構成、遺伝子発現、及び細胞付着変化を含む。細胞事象の各々は特性（例えば、動態、持続時間、振幅、質量移動）を有しており、かつバイオセンサは検知領域内の質量再分布を含む細胞事象に一次的に敏感であるため、これら細胞事象はＤＭＲシグナル全体に別々に寄与し得る。リガンド誘発性のＤＭＲシグナルに対する細胞機序を解明するために、化学生物学的、細胞生物学的、及び生物物理学的手法が使用されることができる。近年、特定の細胞シグナル伝達成分における介入用の化学物質を直接使用する化学生物学が、生物学的課題に取り組むのに使用されている。これは、多くの異なる細胞標的の活性を具体的に制御する多くの変調剤を同定することによって可能となっている。この手法は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、Ｇｑ結合受容体及びＧｓ結合受容体を含む受容体を介したシグナル伝達及びそのネットワーク相互作用を解読するのに採用されている。
【０２２９】
ＥＧＦＲは受容体チロシンキナーゼのファミリに属する。ＥＧＦは、ＥＧＦＲの内因性のタンパク質チロシンキナーゼ活性に結合してそれを刺激し、主にＭＡＰＫ、Ａｋｔ、及びＪＮＫ経路を含むシグナル伝達カスケードを開始する。ＥＧＦ刺激中は、ＥＧＦＲを内因的に過剰発現する細胞株であるＡ４３１細胞における質量再分布を導く多くの事象が存在する。ＥＧＦＲシグナル伝達は細胞状態に依存することが知られている。その結果、ＥＧＦ誘発性のＤＭＲシグナルは細胞状態にも依存する。０．１％のウシ胎児血清内において２０時間の培養によって得られた静止細胞において、ＥＧＦ刺激は、（ｉ）シグナルが増加するポジティブ段階（Ｐ−ＤＭＲ）、（ｉｉ）遷移段階、及び（ｉｉｉ）減衰段階（Ｎ−ＤＭＲ）の３つの異なる連続的段階のＤＭＲシグナルを導く。化学生物学及び細胞生物学の研究が示していることは、ＥＧＦ誘発性のＤＭＲシグナルが、ＭＥＫを介して進み細胞分離を導くＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に一次的に関連していることである。以下の２つの証拠が示すのは、Ｐ−ＤＭＲが、細胞表面において活性化された受容体に対する細胞内標的の補充に大きく起因することである。第１に、ダイナミン活性又はクラスリン活性の遮断はＰ−ＤＭＲ事象の大きさにほとんど影響を与えない。ＥＧＦＲ活性化の２つの下流成分であるダイナミン及びクラスリンは、ＥＧＦＲの内在化及びシグナル伝達の実行に重要な役割を果たすものである。第２に、ＭＥＫ活性の遮断はＰ−ＤＭＲ事象を部分的に減衰させる。ＭＥＫはＭＡＰＫ経路内の重要な成分であり、受容体を用いた内在化に従って、ＥＧＦ刺激後にまず細胞質から細胞膜へ移行する。
【０２３０】
一方、Ｎ−ＤＭＲ事象は細胞分離及び受容体内在化に起因する。蛍光画像が示すのはＥＧＦ刺激が大量の内在化された受容体及び細胞分離を導くことである。受容体内在化又はＭＥＫ活性の遮断は細胞分離を妨害し、受容体内在化はダイナミン及びクラスリンの両方を必要とすることが知られている。これが示すことは、ダイナミン活性又はクラスリン活性の遮断が受容体内在化及び細胞分離の両方を阻害し、一方ＭＥＫ活性の遮断が細胞付着のみを阻害して受容体内在化を阻害しないということである。予想通り、ダイナミン阻害剤又はクラスリン阻害剤はＥＧＦ誘発性のＮ−ＤＭＲを完全に（約１００％）阻害し、一方ＭＥＫ阻害剤はＮ−ＤＭＲを部分的に（約８０％）減衰させる。さらに、蛍光画像は、ダイナミンの活性の遮断が受容体内在化を減衰させ、ＭＥＫではそうならないことを裏付ける。
【０２３１】
「ＤＭＲシグナルは生細胞上で作用するリガンドのシステム細胞薬理情報を含む」
ＤＭＲシグナルは細胞の下部にある細胞物質の動的再分布を含む多くの細胞事象における寄与からなる統合された細胞反応であるため、ＤＭＲシグナルなどのリガンド誘発性のバイオセンサシグナルはシステム細胞薬理情報を含んでいる。ＧＰＣＲはしばしば細胞内の強い挙動を示すことが知られており、かつ多くのリガンドは細胞構造の特定の部分を優先して有効なバイアスを誘発して経路バイアスされた効能を示すことが知られている。従って、どのように受容体の下流の細胞事象が測定されかつリガンド薬理に対する読み出しとして使用されるかに応じて、リガンドが複数の効能を有し得る可能性は十分ある。実際、ほとんどが経路バイアスされたものであり単一のシグナル伝達事象のみをアッセイする従来の細胞アッセイでは、ＧＰＣＲリガンドのシグナル伝達能力を体系的に示すことは困難である。しかし、無標識バイオセンサの細胞アッセイは細胞シグナル伝達の予備知識を必要とせず、経路バイアスされておらず、かつ経路に敏感なため、これらバイオセンサの細胞アッセイはリガンド選択性シグナル伝達及びリガンドのシステム細胞薬理の研究を受け入れる余地がある。
【０２３２】
「バイオセンサパラメータ」
ＲＷＧバイオセンサ又は生体インピーダンスバイオセンサなどの無標識バイオセンサはリガンド誘発性の細胞反応をリアルタイムで追跡することができる。非侵襲的かつ操作不要のバイオセンサの細胞アッセイは細胞シグナル伝達の予備知識を必要としない。得られるバイオセンサシグナルはリガンド薬理及び受容体シグナル伝達に関する高度な情報を含む。多重パラメータは刺激された細胞の動的バイオセンサ反応から抽出されることができる。これらパラメータは動態全体、段階、シグナル振幅、を含み、さらに１の段階から他の段階への遷移時間を含む動的パラメータ、及び各段階の動態を含むが、これらに限定されない（Fang, Y., and Ferrie, A.M. (2008) “label-free optical biosensor for ligand-directed functional selectivity acting on β2 adrenoceptor in living cells”. FEBS Lett. 582, 558-564; Fang, Y., et al., (2005) “Characteristics of dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label free optical biosensors”. Anal. Chem., 77, 5720-5725; Fang, Y., et al., (2006) “Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing”. Biophys. J., 91, 1925-1940 を参照）。
【実施例】
【０２３３】
【実施例１】
【０２３４】
無標識バイオセンサの細胞アッセイによる既知のｈＥＲＧ活性剤マロトキシンの特性
材料及び方法
細胞培養
全ての細胞培養試薬はインビトロジェンギブコ社（Invitrogen GIBCO）から購入した細胞培養である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣの指示に従って、１０％のウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含んだMEM-GlutoMax内に保存された。ＨＴ２９細胞は１０％のウシ胎児血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含んだMcCoy５Ａ培地内に保管された。ｈＥＲＧ安定発現ＨＥＫ細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）はSunら（J. Biol. Chem. 2006, 281, 5877）に従って保管された。細胞は週当たり１−２回二次培養され（subcultured）、１５未満の通過細胞が全ての実験に使用された。
【０２３５】
化合物
マロトキシン、ＡＧ−１２６、ニフルム酸、フルフェナム酸、ジフルニサル、ドフェチリド、及びチルホスチン５１はエンゾライフサイエンス社（Enzo Lifesciences）から購入された。シサプリド、アステミゾール、セルチンドール、フィブロネクチンはシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）から購入された。ドフェチリドはフィッシャーサイエンティフィック社（Fisher Scientific）から購入された。
【０２３６】
無標識バイオセンサの細胞アッセイ
Ｅｐｉｃ（登録済み）波長インタロゲーションシステム（コーニング社、コーニング、ＮＹ）が全ての細胞検知に使用された。このシステムは、温度管理ユニット、光学検出ユニット、及びオンボードのロボット付き液体操作ユニットで構成されている。当該検出ユニットは統合されたファイバ光学系の中央に設けられており、約１５秒間隔での細胞反応の動的測定を可能にする。
【０２３７】
細胞は、アッセイ前は、３８４ウェルのＥｐｉｃ（登録済み）細胞培養処理プレート（Corning Cat#5040）に１６−２０時間プレート化（plated）された（ＨＥＫ２９３細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞はウェル当たり１５０００細胞、ＨＴ２９細胞はウェル当たり３００００細胞）。ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞及びその親のＨＥＫ２９３細胞については、それぞれ１０μｌの５μｇ／ｍｌフィブロネクチンに覆われた。アッセイ前の１時間、細胞は、２０ｍＭのヘペス（Hepes）を含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含有するBioTek ELx405セレクトウォッシャによって２回洗浄された。細胞は、Ｅｐｉｃシステム内における２８度のウェル当たり４０μｌのＨＢＳＳ内において１時間培養された。各アッセイにおいては、１０μｌの化合物溶液（５倍）の添加後２分を基準線として開始され、細胞反応が１時間連続で記録された。
【０２３８】
全ての調査は管理された温度（２８度）において実施された。少なくとも２つの独立した実験が、各々少なくとも３つの複製物に対して行われた。アッセイの変動係数は１０％未満であった。全ての用量依存性反応がグラフパッドプリズム５（GraphPad Prism 5）を用いた非線形回帰法によって分析された。
【０２３９】
Ｒｂ＋フラックスアッセイ
Ｒｂ＋フラックスアッセイは上記文献（Sun, H., et al, J. Biol. Chem. 2006, 281, 5877）に記載してあるようにＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を用いて実施された。つまり、９６ウェルの組織培養処理プレート内においてウェル当たり５０，０００の細胞がアッセイ前に２０時間プレート化された。翌日、細胞は、５ｍＭのＲｂＣｌを含む完全細胞培地を用いて、５％の二酸化炭素と共に３７度で３時間培養された。その後、ＨＢＳＳ内で希釈された化合物（１０倍）が細胞培地に添加され、細胞はさらに１時間、５％の二酸化炭素と共に３７度で培養された。細胞はＲｂ＋のない細胞培地を用いて２回洗浄され、異なる濃度のＫＣｌを含むウェル当たり１８０μｌの細胞培地を用いて厳密に１０分間培養された。各ウェルにおける浮遊物は新しい９６ウェルのプレートに直ちに移動された。細胞はＨＢＳＳ内においてウェル当たり１８０μｌの０．５％トリトン１００に溶解した。各サンプルのＲｂ＋濃度がＩＣＲ８０００（Aurora Biomed社製）によって判定された。
【０２４０】
ｅ．IonWorksを用いた自動パッチクランプ記録
ｈＥＲＧチャネルを安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−ｈＥＲＧ）がＴ１７５フラスコ内において約７０％の密集度まで培養された。細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄され、２．５ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡが２．５ｍｌのＰＢＳに混合され、Ｔ１７５フラスコへ加えられた。細胞は希釈されたトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて３７度で２分間培養され、その後室温で約３分間連続して培養された。２０ｍｌの新鮮培地（fresh medium）が懸濁された細胞に加えられ、５０ｍｌのチューブに移動された。細胞は７５０ｒｐｍにおいて５分間遠心分離された。余分な培地は除去され、細胞は６ｍｌの外部バッファ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのヘペス、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）に懸濁された。その後細胞は４５０ｒｐｍにおいてさらに５分間遠心分離された。最後に、細胞は４ｍｌの外部バッファに懸濁され、血球計算機（hemacytometer）を用いて細胞数がカウントされた。細胞懸濁液は外部バッファを用いてｍｌ当たり２．５ｘ１０６細胞まで希釈された。４ｍｌの再懸濁された細胞がIonWorks内の細胞リザボに加えられた。４０ｍMのＫＣｌ、１００ｍＭのグルコン酸カリウム、３．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのヘペス、ｐＨ７．２５（ＫＯＨを用いて調節されたもの）を含む内部溶液が使用された。２００μｌのＤＭＳＯストックからの５ｍｇのアンフォテリシンＢが６５ｍｌの内部溶液に加えられ、ウェルが混合され、パッチプレート上の細胞の内部への電気接続を得た。
【０２４１】
化合物は１０ｍＭのＤＭＳＯストックから準備され、外部バッファ内において希釈され、３倍の化合物溶液を作製した。ウェル当たり６０μｌの３倍化合物溶液は３８４ウェルのプレートの列Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤに移動された。ｈＥＲＧチャネル活性剤と報告されているＰＤ１１８５７（シグマアルドリッチ社）が活性剤ポジティブコントロールとして使用された（最終濃度は３０μＭ及び５０μＭ）。ｈＥＲＧ遮断剤のドフェリチドは遮断剤ポジティブコントロールとして使用された（最終濃度は１００ｎＭ）。IonWorks Quattro PatchPlate PPCプレート（Cat#9000-0902, モレキュラーデバイス社）の最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。最終化合物濃度は５０μＭであった。各化合物は１つのＰＰＣプレートの４つのウェルに加えられた。
【０２４２】
ｈＥＲＧ電流はIonWorks Quattro（モレキュラーデバイス社）に記録された。ｈＥＲＧ電流を記録するために、細胞はまず−８０ｍＶにてクランプされ、次に＋４０ｍＶにて５秒間脱分極され、チャネルが活性化された。−３５ｍＶへの回帰を確保している間のテール電流が測定された。データ分析はIonWorks Quttro（登録済み）システムソフトウェアのバージョン２．０．４．４を用いて行われた。ウェルからのデータの５０ＭΩ未満のシール抵抗のもの又は０．１ｎＡ未満のｈＥＲＧテール電流のものは除外された。ｈＥＲＧテール電流比率（後化合物／前化合物）が平均的なＤＭＳＯコントロールの平均値＋２ＳＤ（標準偏差（standard deviation））よりも大きい場合に活性剤のヒットが選択された。ｈＥＲＧテール電流比率（後化合物／前化合物）が平均的なＤＭＳＯコントロールの平均値−２ＳＤ未満である場合に阻害剤のヒットが選択された。
【０２４３】
結果
ヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９、ＨＥＫ２９３、及びその人工のＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞株の３種類の細胞が使用された。ＨＴ−２９は内因的にｈＥＲＧチャネルを発現することが知られている。ＨＥＫ２９３は内因的に発現されたｈＥＲＧチャネルを含まない天然の細胞株であり、一方ＨＥＫ−ｈＥＲＧは安定的に発現されたｈＥＲＧチャネルを有する人工のＨＥＫ２９３細胞である。最近発見されたｈＥＲＧ活性剤であるマロトキシンは、生理的条件（すなわち１倍のＨＢＳＳのバッファ条件）又はそれに近い条件においてｈＥＲＧチャネルを活性化するのに使用された。
【０２４４】
図１に示されているように、１６マイクロモルの既知のｈＥＲＧ活性剤のマロトキシンは、ＨＴ２９細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞（それぞれ図１Ａ及び図１Ｂ）においてロバストなＤＭＲシグナルを引き起こすだけでなく、ＨＥＫ２９３細胞（図１Ｃ）においてネガティブコントロールに近い正味ゼロのＤＭＲシグナルを生じさせた。１６マイクロモルのマロトキシンを用いたＨＴ２９細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞の前処理は、１６マイクロモルのマロトキシンを用いた後続の刺激に対する両細胞の脱感作を完全に生じさせた。ＤＭＲ変調インデックスは、化合物（すなわちマロトキシン）の存在下における細胞株のマロトキシンＤＭＲシグナルを、当該化合物の非存在下における対応するＤＭＲシグナルに対して正規化することによって生成され、その変調比率は特定の時間（それぞれ、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞に対しては刺激後約１８分、ＨＴ２９細胞に対しては刺激後約５０分）におけるマロトキシンＤＭＲシグナルの大きさに基づいていた。マロトキシンは複合薬理を表示することが知られている。さらに、マロトキシンはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害剤となることが知られており、ＰＫＣはｈＥＲＧ活性化の下流シグナル伝達成分である。従って、細胞株が無標識バイオセンサ（すなわちＥｐｉｃ（登録済み）システム）を用いて個別にアッセイされる場合、マロトキシンがｈＥＲＧ活性剤となる作用モードを特定することは困難又はほぼ不可能である。実際、図２−図５に示したものを含む多くの化合物は、ＨＴ２９細胞、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞、又はその両方においてロバストなＤＭＲシグナルを導出するのみならず、両細胞株においてマロトキシンを変調する特定のパターンを生じさせた。しかし、ＨＴ２９細胞及びＨＥＫ２９３細胞におけるマロトキシン反応に対する化合物の変調インデックスを用いて試験された３つの細胞株に亘って化合物の一次ＤＭＲプロファイルを結合することは、当該化合物がｈＥＲＧ活性剤か否かを正確に同定することが可能である。図１に示されている結果は、マロトキシンがｈＥＲＧ活性剤であることと、ｈＥＲＧの活性化が２つのｈＥＲＧ発現細胞株において検出可能なバイオセンサ反応をもたらし得ることと、を確かに示している。
【０２４５】
これらの発見を裏付けるために、いくつかの追跡調査が行われた。第１に、マロトキシンがＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞において用量依存性ＤＭＲシグナルを生じさせることが示され、刺激後１８分におけるその振幅は可飽和であり、これは明らかな約２５μＭのＥＣ５０を導出している。興味深いことに、マロトキシンの用量が増えると、その光学反応は複雑になり、細胞の毒性成分を含む複雑なプロファイルへの用量依存性の切り替わりを見せた。実際、顕微鏡画像で確認すると（データは示されていない）、これら高用量のマロトキシンは細胞アポトーシスを引き起こした（データは示されていない）。
【０２４６】
第２に、マロトキシンンがｈＥＲＧ活性剤であることをＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を用いたＲｂ＋フラックスアッセイが裏付けた。図６ａに示されているように、細胞が５ｍＭのＫＣｌを含むバッファ溶液に保管された場合において、１０μＭ又は５０μＭのマロトキシンはＲｂ＋シグナル伝達を大きく増大させた。同様に、細胞が４０ｍＭのＫＣｌに保管された場合、１０μＭのマロトキシンはＲｂ＋シグナルを明らかに増大させた。一方、既知のｈＥＲＧ遮断剤のドフェチリドは、全ての３つのアッセイ条件下において、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞のＲｂ＋シグナルを抑制した。
【０２４７】
第３に、３つの既知のＨＥＲＫ遮断剤であるシサプリド、アステミゾール、及びセルチンドールのそれぞれを用いたＨＥＫ−ｈＲＥＧ細胞の前処理は、マロトキシンＤＭＲシグナルの用量依存性の抑制を導いた（図８、データは示されていない）。一方、２つの大コンダクタンスカリウム（ＢＫ）イオンチャネル遮断剤のパキシリン（paxilline）及びペニトレムＡ（penitrem A）はＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞のマロトキシンＤＭＲシグナルに影響を与えなかった（データは示されていない）。マロトキシンはＢＫチャネルを活性化することも知られている。しかし、これらの結果が示すことは、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるマロトキシンＤＭＲシグナルがｈＥＲＧチャネルの活性化に大きく起因しているということである。
【０２４８】
第４に、マロトキシンがｈＥＲＧ電流及びｈＥＲＧテール電流（データは示されていない）を著しく増大させることを、ＣＨＯ−ｈＥＲＧ細胞を用いたｈＥＲＧ電流の自動パッチクランプ記録が示した。
【０２４９】
同様に重要なことは、マロトキシンＤＭＲシグナルが非常にロバストかつ高度に再現性のあるものであることであり（図９）、これは、かかるバイオセンサによる細胞アッセイが高いスループットのスクリーニング検査に応用可能であることを示している。これは、ｈＥＲＧチャネルに対する生理的かつ機能的ＨＴＳアッセイを示す。
【０２５０】
同様に、低作用ｈＥＲＧ活性剤のＮＳ１６４３はＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞において検出可能なＤＭＲシグナルを誘発したが、その親のＨＥＫ−２９３細胞においては誘発しなかった（データは示されていない）。
【実施例２】
【０２５１】
無標識バイオセンサの細胞アッセイによるｈＥＲＧ活性を変調する化合物の能力特性
以下はマロトキシン及びＮＳ１６４３に対する実施例１に開示された方法と同じ方法であり、いくつかのよく知られている分子におけるｈＥＲＧ活性を変調する能力が調査されたものである。１０μＭの非ステロイド系抗炎症薬剤であるフルフェナム酸はＨＴ−２９細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞（それぞれ図２Ａ及び図２Ｂ）においてロバストなＤＭＲシグナルを導いたが、ＨＥＫ２９３細胞（図２Ｃ）においては導かなかった。フルフェナム酸はＨＴ−２９細胞においてマロトキシンＤＭＲシグナルを選択的に減衰させたが、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞（図２Ｄ）においては減衰させなかった。両方のｈＥＲＧ発現細胞株におけるフルフェナム酸のＤＭＲシグナルは対応するマロトキシンＤＭＲシグナルとは大きく異なるが、これら結果が示すことはフルフェナム酸が弱いｈＥＲＧ活性剤として機能することである。Ｒｂ＋フラックスアッセイによる追跡調査は、ＨＥＫ−ｈＥＲＧが５ｍＭのＫＣｌ内においてアッセイされた場合に、フルフェナム酸が小さくかつ用量依存的にＲｂ＋シグナルを増大させたことを示した（図６Ａ）。さらに、異種発現したｈＥＲＧチャネルを有する卵母細胞内のパルスを脱分極することによって誘発された外向き電流の大きさをフルフェナム酸（１００から５００μＭ）が強化することを文献調査が示した。また、０ｍＶまでの正電位において、初期の過渡成分はフルフェナム酸の存在下に表れていた。フルフェナム酸はｈＥＲＧチャネルの活性化速度を速め、不活性化を遅延させた。心筋活動電位を模倣する電位プロトコルを用いると、フルフェナム酸は、安定期中及び段階３の活動電位再分極中の両方における外向き電流を増大させた（Malykhina, A.P., et al., European Journal of Pharmacology 2002, 452, 269-277）。図１０Ｂに示されているように、これら発見に一致して、我々のパッチクランプ記録は同様の結果を導いた。曲線１０３０はフルフェナム酸を加える前のｈＥＲＧ電流を示しており、曲線１０４０はフルフェナム酸を加えた後のｈＥＲＧ電流を示している。
【０２５２】
ニフルム酸についても同様の結果が見られた（図１０Ａ）。曲線１０１０はニフルム酸を加える前のｈＥＲＧ電流を示しており、曲線１０２０はニフルム酸を加えた後のｈＥＲＧ電流を示している。ｈＥＲＧ電流はIonWorks Quattroに記録された。ｈＥＲＧ電流を記録するために、細胞はまず−８０ｍＶにてクランプされ、次に＋４０ｍＶにて５秒間脱分極され、チャネルが活性化された（図１０Ａの段階ａ）。−３５ｍＶへの回帰を確保している間のテール電流が２秒間測定された（図１０Ａの段階ｂ）。最終保持電位は−７０ｍＶにおけるものであった（図１０Ｂの段階ｃ）。フルフェナム酸及びニフルム酸の両方はテール電流を著しく増大させた（段階ｂ）。ニフルム酸がｈＥＲＧ活性剤であることは文献には報告されていなかった。
【０２５３】
同様に、１０μＭのプロスタグランジン合成酵素の阻害剤であるジフルニサルもＨＴ−２９においてロバストなＤＭＲシグナルを生じさせ（図３Ａ）、かつＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞において抑制されたＤＭＲシグナルを生じさせた（図３Ｂ）が、ＨＥＫ２９３細胞においては生じさせることはなかった（図３Ｃ）。ジフルニサルを用いた細胞の前処理は、マロトキシン（１６μＭ）に対してＨＴ２９細胞を完全に脱感作させたが、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞においてはそうではなかった（図３Ｄ）。５０μＭのジフルニサルのみがＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を維持した５ｍＭのＫＣｌにおいてＲｂ＋フラックスシグナルを検出可能なように増大させた（図６Ａ）。しかし、パッチクランプ記録はジフルニサルがｈＥＲＧ遮断剤として機能することを示し、これはｈＥＲＧテール電流の抑制からも明らかである（図１１Ｂ）。これら結果は、ジフルニサルが弱いｈＥＲＧ経路活性剤として機能するが、ｈＥＲＧ電流阻害剤としても機能することを示している。
【０２５４】
一方、ＥＲＫ２阻害剤のＡＧ−１２６もＨＴ２９においてＤＭＲシグナルを生じさせ、これは対応するジフルニサルのＤＭＲに類似している（図４Ａ）が、ＡＧ−１２６はＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞及びＨＥＫ−２９３細胞（それぞれ図４Ｂ及び図４Ｃ）においてはＤＭＲを生じさせなかった。さらに、ＡＧ−１２６はＨＴ−２９細胞のマロトキシンＤＭＲシグナルを部分的に減衰させたが、ＨＥＫ−２９３細胞ではそうでなかった（図４Ｄ）。また、ＡＧ１２６はｈＥＲＧイオンフラックス（図６）及びｈＥＲＧ電流（図１２）の両方にほとんど又は全く影響を与えない。これら結果は、ＡＧ−１２６がｈＥＲＧシグナル伝達経路変調剤として機能することを示している。
【０２５５】
興味深いことに、強力なＥＧＦＲ阻害剤のチルホスチン５１は、試験した３つ全ての細胞においてロバストであるが異なるＤＭＲシグナルを生じさせ（図５Ａ−図５Ｃ）、ＨＴ２９細胞におけるマロトキシンＤＭＲシグナルを部分的に減衰させた（図５Ｄ）。チルホスチン５１は複合薬理的化合物である。チルホスチンはそのＥＧＦＲへの阻害効果の他、ホスホジエステラーゼ４及びＰＫＣの活性を抑制する（データは示されていない）。チルホスチン５１はｈＥＲＧイオンフラックスにほとんど影響を与えない（図６）が、ｈＥＲＧテール電流を大きく抑制する（図１１Ａ）。これら結果は、チルホスチン５１がｈＥＲＧチャネルシグナル伝達経路変調剤及びｈＥＲＧ電流阻害剤として機能することを示している。
【０２５６】
興味深いことに、旧知のｈＥＲＧ遮断剤のセルチンドールは、試験された３つ全ての細胞株においてＤＭＲシグナルを生じさせなかった（データは示されていない）が、ＨＴ２９細胞及びＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるマロトキシンＤＭＲシグナルを用量依存的に減衰させた（図８）。さらに、セルチンドールは、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるｈＥＲＧを介したＲｂ＋イオンフラックスと、ＣＨＯ−ｈＥＲＧ細胞におけるｈＥＲＧ電流と、を阻害した。これら結果は、セルチンドールが旧知のｈＥＲＧ遮断剤であることを示唆している。
【０２５７】
これらの例は、３つの異なる細胞型における分子の一次プロファイルと、２つのｈＥＲＧ発現細胞上で作用するマロトキシン対分子のＤＭＲ変調インデックスと、を結合することによって、ここに開示された方法が、潜在するｈＥＲＧ変調剤を異なる分類へ分類する高分解能アッセイを提供することを明らかにした。同定されたこれらｈＥＲＧ変調剤のクラスは、ｈＥＲＧ活性剤（ｈＥＲＧ電流を増大させかつｈＥＲＧを介したシグナル伝達を生じさせる分子であり、例えば、マロトキシン、フルフェナム酸、及びニフルム酸）、ｈＥＲＧ経路活性剤（ｈＥＲＧ又はｈＥＲＧ関連の錯体を介したシグナル伝達を生じさせる分子であるが、ｈＥＲＧ電流又はｈＥＲＧイオンフラックスに影響を与えるものと与えないものとがあり、例えば、ジフルニサル及びチルホスチン５１）、ｈＥＲＧ経路遮断剤（ｈＥＲＧシグナル伝達を変調するがｈＥＲＧ電流又はｈＥＲＧイオンフラックスを阻害する分子であり、例えばＡＧ１２６）、ｈＥＲＧチャネル遮断剤（ｈＥＲＧ電流及びｈＥＲＧを介したシグナル伝達を阻害する分子であり、例えば、セルチンドール、ドフェチリド、アステミゾール、シサプリド）を含むが、これらに限定されない。
【０２５８】
参考文献
１．国際公開第２００６１０８１８３号、発明者：Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.M., Yuen, P.K. and Lahiri, J.、発明の名称「Optical biosensor and cells」
２．米国出願第１２／６２３，６９３号、発明者：Fang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E.、発明の名称「Methods for Characterizing Molecules」、出願日：２００９年１１月２３日
３．米国出願第１２／６２３，７０８号、発明者：Fang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J., and Tran, E.、発明の名称「Methods for creating an index」、出願日：２００９年１１月２３日
４．Malykhina, A.P., et al., “Fenamate-induced enhancement of heterologously expressed hERG currents in Xenopus oocytes”. European Journal of Pharmacology 2002, 452, 269-277
５．Sun, H., et al., “Chronic inhibition of cardiac Kir2.1 and hERG potassium channels by celastrol with dual effects on both ion conductivity and protein trafficking”. J. Biol. Chem. 2006, 281, 5877-5884
【図１Ａ】
2013516173.tif 000005
【図１Ｂ】
2013516173.tif 000006
【図１Ｃ】
2013516173.tif 000007
【図１Ｄ】
2013516173.tif 000008
【図２Ａ】
2013516173.tif 000009
【図２Ｂ】
2013516173.tif 000010
【図２Ｃ】
2013516173.tif 000011
【図２Ｄ】
2013516173.tif 000012
【図３Ａ】
2013516173.tif 000013
【図３Ｂ】
2013516173.tif 000014
【図３Ｃ】
2013516173.tif 000015
【図３Ｄ】
2013516173.tif 000016
【図４Ａ】
2013516173.tif 000017
【図４Ｂ】
2013516173.tif 000018
【図４Ｃ】
2013516173.tif 000019
【図４Ｄ】
2013516173.tif 000020
【図５Ａ】
2013516173.tif 000021
【図５Ｂ】
2013516173.tif 000022
【図５Ｃ】
2013516173.tif 000023
【図５Ｄ】
2013516173.tif 000024
【図６Ａ】
2013516173.tif 000025
【図６Ｂ】
2013516173.tif 000026
【図７Ａ】
2013516173.tif 000027
【図７Ｂ】
2013516173.tif 000028
【図８Ａ】
2013516173.tif 000029
【図８Ｂ】
2013516173.tif 000030
【図９】
2013516173.tif 000031
【図１０Ａ】
2013516173.tif 000032
【図１０Ｂ】
2013516173.tif 000033
【図１１Ａ】
2013516173.tif 000034
【図１１Ｂ】
2013516173.tif 000035
【図１２】
2013516173.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月28日(2012.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＥＲＧ活性を変調する分子を分類する方法であって、
ａ．内因的にｈＥＲＧを発現する天然の細胞、安定してｈＥＲＧを発現する人工の細胞、及びその親であるｈＥＲＧを発現しない細胞の少なくとも３つの異なる細胞型を用いて個別に分子を培養するステップと、
ｂ．各細胞型上の分子によって誘発された細胞反応を無標識バイオセンサの細胞アッセイによって監視するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧを発現する天然の細胞株は、白血病細胞株、胃癌細胞株、神経芽腫細胞株、乳癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、心血管細胞株、及び神経細胞株からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記分子の効果とｈＥＲＧの既知の変調剤の効果とを比較するステップをさらに含み、
任意で、前記ｈＥＲＧ変調剤は、ｈＥＲＧ活性剤、ｈＥＲＧイオンチャネル活性剤、ｈＥＲＧ経路活性剤、ｈＥＲＧ遮断剤、又はｈＥＲＧ経路阻害剤であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
ｃ．無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤を、前記分子の存在下の各細胞型を用いて培養するステップと、
ｄ．前記分子の存在下における各細胞型上の前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤によって誘発された細胞反応を監視するステップと、
ｅ．当該２つのｈＥＲＧを発現する細胞型における前記無標識バイオセンサのｈＥＲＧ活性剤に誘発されたバイオセンサシグナルに対する分子のバイオセンサ変調インデックスを生成するステップと、
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記ｈＥＲＧ活性剤はマロトキシンであり、前記ｈＥＲＧを発現する天然の細胞株は細胞株ＨＬ６０からなる群から選択され、前記ｈＥＲＧを発現しない天然の細胞株は細胞株ＨＥＫ−２９３及び細胞株ＣＨＯ−Ｋ１からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2013516173.tif 000037
2013516173.tif 000038
2013516173.tif 000039
2013516173.tif 000040
2013516173.tif 000041
2013516173.tif 000042