(57)【要約】本発明は、３’末端で効率的に修飾可能な高純度のＲＮＡを合成するための基盤的要素と方法を提供する。逆方向ＲＮＡモノマーホスホルアミダイトは、５’→３’方向のＲＮＡ合成のために開発されたもので、これにより、高純度のオリゴ合成ができ、３’末端に様々な修飾をクリーンにかつ効率的に導入することが可能である。本明細書に開示する逆方向ＲＮＡアミダイトを用いた自動オリゴ合成では、工程ごとのカップリング効率が向上し、これにより、より高純度を実現し、非常に長いオリゴヌクレオチドを生産する能力が向上している。本発明の合成プロセスにおける逆方向ＲＮＡホスホルアミダイトの利用により、Ｎ＋１種を含まないオリゴヌクレオチドが得られる。
2013520438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ又はＩｄ：
【化１】
2013520438.tif 000120
[式中、
Ｊは、Ｈ、
【化２】
2013520438.tif 000121
、又は
【化３】
2013520438.tif 000122
であり、
【化４】
2013520438.tif 000123
はＪがＯ原子に結合する位置を示し；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）である場合：
【化５】
2013520438.tif 000124
Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＶ）又は（Ｖ）である場合：
【化６】
2013520438.tif 000125
Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基であり、ここで、核酸塩基は以下から選択され：Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルアミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ−３メチルチミン、５−アセトキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ−４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ−３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アセトキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；
ここで、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、以下により置換されていてもよく：フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；＝ＣＲ８Ｎ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；及び
【化７】
2013520438.tif 000126
ここで、核酸塩基内の置換可能な酸素原子は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（フェニル）２で置換されていてもよい]で表される化合物。
【請求項２】
式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ又はＩｄ：
【化８】
2013520438.tif 000127
[式中、
Ｊは、Ｈ、
【化９】
2013520438.tif 000128
、又は
【化１０】
2013520438.tif 000129
であり、
【化１１】
2013520438.tif 000130
はＪがＯ原子に結合する位置を示し；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）である場合：
【化１２】
2013520438.tif 000131
Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＶ）又は（Ｖ）である場合：
【化１３】
2013520438.tif 000132
Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；ただし、Ｒ４が−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ１１）３であって、２つのＲ１１基がともにメチルである場合、もう１つのＲ１１基はｔ−ブチルでなく、又は、Ｒ４が−Ｏ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３である場合、３つのＲ１１基のすべてがイソプロピルとなることはなく；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基である]で表される化合物。
【請求項３】
Ｊが
【化１４】
2013520438.tif 000133
又は
【化１５】
2013520438.tif 000134
であり、
【化１６】
2013520438.tif 000135
は、ＪがＯ原子に結合する位置を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式Ｉａ又はＩｂ：
【化１７】
2013520438.tif 000136
で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｚが非置換若しくは置換アリール基、非置換若しくは置換トリアリールメチル基、非置換若しくは置換トリチル基、非置換若しくは置換テトラヒドロピラニル基、又は非置換若しくは置換９−フェニルキサンチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚがジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アニシル−１−ナフチルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、又はｐ−トリルジフェニルメチルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｚが下記の構造式：
【化１８】
2013520438.tif 000137
式中、
【化１９】
2013520438.tif 000138
は３’酸素原子への結合を示し、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは独立して以下の構造式から選択される：
【化２０】
2013520438.tif 000139
で表される、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｚが４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又は４，４’，４”−トリメトキシトリチルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子が、＝ＣＨＮ（ＣＨ３）２；Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、＝Ｃ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）２；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド、及び
【化２１】
2013520438.tif 000140
により置換されていてもよい、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３が、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ５、又は−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒ４が−−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ１１）３である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ４が−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ（ＣＨ３）３）又は−Ｏ−ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ３）２）３）である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
以下の構造式の１つ：
【化２２】
2013520438.tif 000141
で表される化合物、又はその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
以下の構造式の１つ：
【化２３】
2013520438.tif 000142
で表される化合物、又はその塩である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
以下の構造式の１つ：
【化２４】
2013520438.tif 000143
で表される化合物、又はその塩である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
以下の構造式の１つ：
【化２５】
2013520438.tif 000144
で表される化合物、又はその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
以下の構造式の１つ：
【化２６】
2013520438.tif 000145
で表される化合物、又はその塩である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ３がＣＨ２ＣＨ２ＣＮである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
以下の構造式の１つ：
【化２７】
2013520438.tif 000146
で表される化合物、又はその塩である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
以下の構造式の１つ：
【化２８】
2013520438.tif 000147
で表される化合物、又はその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
以下の構造式の１つ：
【化２９】
2013520438.tif 000148
で表される化合物、又はその塩である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
以下の構造式の１つ：
【化３０】
2013520438.tif 000149
で表される化合物、又はその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
以下の構造式の１つ：
【化３１】
2013520438.tif 000150
で表される化合物、又はその塩である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
以下の構造式の１つで表される化合物：
【化３２】
2013520438.tif 000151
[式中、
Ｙは、それぞれ独立して、酸素又は硫黄であり；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、Ｒ４がリボース構造の中にある場合、Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、Ｒ４がアラビノース構造の中にある場合、Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基であり、ここで、核酸塩基は以下から選択され：Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルアミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ−３メチルチミン、５−アセトキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ−４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ−３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アセトキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；
ここで、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、以下により置換されていてもよく：フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；＝ＣＲ８Ｎ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；及び
【化３３】
2013520438.tif 000152
ここで、核酸塩基内の置換可能な酸素原子は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（フェニル）２で置換されていてもよく；
Ｒ２０は、Ｈ、−Ｏ−Ｚ、又はＲ２１であり；
Ｒ２１は、３’官能基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；そして、
ｎは、０〜１５０である］
又は、その塩。
【請求項２５】
Ｒ２１が、
ａ）シアノエチルホスフェート−ポリエチレングリコールｖ、ここで、ｖは２〜１００で、グリコール単位の数を表す；
ｂ）コレステロール、ビオチン、フルオレセイン類、シアニン色素類、ソラレン、テトラメチルローダミン色素、ダブシル色素、Ｃ−３ジスルフィド、Ｃ−６ジスルフィド、対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、ＣＦ３Ｃ（＝Ｏ）又はフタルアミド又はＦＭＯＣで保護された末端アミノ基を有する対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、アミン保護基で保護された（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−アミン、アジド基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、アセチレン（Ｃ≡ＣＨ）基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、と結合されたシアノエチルホスフェート−リンカー；
ｃ）ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−エタン−２−オール−、ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−プロパン−３−オール−；
ｄ）末端ヒドロキシを有する（Ｃ１−Ｃ５０）アルキレン；
ｅ）脂質、カルボキシル基、又はペプチド；又は、
ｆ）分枝ホスホルアミダイト
である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
ｎが５〜７５である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
９７％を超える純度を有し、５’ホスホルアミダイトヌクレオシドから合成した、合成ＲＮＡ分子。
【請求項２８】
ＲＮＡオリゴマー及びそのエナンチオマーの合成のための、５’−から３’−方向への結合形成によるオリゴヌクレオチドの作製方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）下記の構造式で表される担体に結合した化合物から、Ｚ保護基を切断し、
【化３４】
2013520438.tif 000153
これにより、構造式（ＸＸ）で表される化合物を形成する；
【化３５】
2013520438.tif 000154
ｂ）構造式ＸＸで表される化合物を、構造式ＸＸＩの化合物と反応させ、
【化３６】
2013520438.tif 000155
これにより、下記構造式で表される２−ｍｅｒ化合物を形成する；
【化３７】
2013520438.tif 000156
ｃ）２−ｍｅｒ化合物をキャッピング剤と反応させる；
ｄ）２−ｍｅｒ化合物の三価の亜リン酸基を酸化又は硫化し、構造式ＸＸＩＩの化合物を形成する；
【化３８】
2013520438.tif 000157
ｅ）構造式ＸＸＩＩで表される化合物からＺ保護基を切断し、構造式ＸＸＩＩＩの化合物を形成する；
【化３９】
2013520438.tif 000158
ｆ）構造式ＸＸＩＩＩで表される化合物を、下記の構造式で表される化合物と反応させ：
【化４０】
2013520438.tif 000159
これにより、下記構造式ＸＸＩＶで表される３−ｍｅｒを形成する；
【化４１】
2013520438.tif 000160
ｅ）構造式ＸＸＩＶで表される化合物からＺ保護基を切断する；
ｇ）工程ａ）からｅ）をｎ回繰り返し、下記構造式で表されるオリゴヌクレオチド又はその塩を形成する：
【化４２】
2013520438.tif 000161
式中、
Ｊは、
【化４３】
2013520438.tif 000162
又は
【化４４】
2013520438.tif 000163
であり、
【化４５】
2013520438.tif 000164
はＪがＯ原子に結合する位置を示し；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）である場合：
【化４６】
2013520438.tif 000165
Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＶ）又は（Ｖ）である場合：
【化４７】
2013520438.tif 000166
Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基であり、ここで、核酸塩基は以下から選択され：Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルアミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ−３メチルチミン、５−アセトキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ−４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ−３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アセトキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；
ここで、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、以下により置換されていてもよく：フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；＝ＣＲ８Ｎ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；及び
【化４８】
2013520438.tif 000167
ここで、核酸塩基内の置換可能な酸素原子は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（フェニル）２で置換されていてもよく；
ｎは１〜１５０である；
又はその塩。
【請求項２９】
Ｙ基が、それぞれ独立して、硫化により導入されてホスホロチオエート結合を形成するか、又は酸化により導入されてリン酸結合を形成する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ３基が酸化後に脱離してリン酸結合を形成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ３基が硫化後に脱離してホスホロチオエート結合を形成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
核酸塩基保護基が塩基で脱保護される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
塩基がアンモニア水、メタノール性アンモニア、又はエタノール性アンモニアから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ４が−ＯＳｉ（Ｒ１１）３である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
−ＯＳｉ（Ｒ１１）３をフッ化物塩で切断する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
フッ化物塩がフッ化テトラエチルアンモニウムである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
下記の構造式： 
【化４９】
2013520438.tif 000168
で表される化合物を３’官能基と反応させ、これにより下記の構造式：
【化５０】
2013520438.tif 000169
（式中、Ｒ２１は３’官能基又はその塩である）
で表される化合物を形成する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ２１が、
ａ）シアノエチルホスフェート−ポリエチレングリコールｖ、ここで、ｖは２〜１００で、グリコール単位の数を表す；
ｂ）コレステロール、ビオチン、フルオレセイン類、シアニン色素類、ソラレン、テトラメチルローダミン色素、ダブシル色素、Ｃ−３ジスルフィド、Ｃ−６ジスルフィド、対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、ＣＦ３Ｃ（＝Ｏ）又はフタルアミド又はＦＭＯＣで保護された末端アミノ基を有する対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、アミン保護基で保護された（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−アミン、アジド基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、アセチレン（Ｃ≡ＣＨ）基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、と結合されたシアノエチルホスフェート−リンカー；
ｃ）ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−エタン−２−オール−、ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−プロパン−３−オール−；
ｄ）末端ヒドロキシを有する（Ｃ１−Ｃ５０）アルキレン；
ｅ）脂質、カルボキシル基、又はペプチド；又は、
ｆ）分枝ホスホルアミダイト
である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
請求項２８に記載の方法により作製され、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、又は逆相クロマトグラフィーによる合成ＲＮＡ分子の精製後の純度が９７％以上である、ＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３’末端で効率的に修飾可能な高純度のＲＮＡを合成するための基盤的要素と方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
３’→５’方向の所定配列のＲＮＡの合成は、現在では確立されており、多様な治療用のＲＮＡアプタマー、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び生物学的に活性なＲＮＡ分子の合成と開発に利用されている。ＲＮＡの化学合成は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビボ転写による合成などに見られるような、合成の規模による非効率性や制約を回避することができるため、望ましいとされている（Helm, M., et al., RNA, 5:618-621, 1999参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。ＲＮＡの化学合成は、ＲＮＡの構造や機能の研究に望ましく、官能基の部位特異的導入など、多くの有用な修飾を選択的に行うことができる；例えば、ＲＮＡ三次構造のプローブとしてのジスルフィド架橋結合（Maglott, E.J., Glick, G.D., Nucl, Acids Res., 26: 1301-1308, 1999参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０００３】
この方法では、適切なＮ−保護基を有するリボヌクレオシドが用いられる：通常、５’−保護基、例えばジメトキシトリフェニル、すなわちＤＭＴ基；２’−保護基（最も一般的なものはｔ−ブチルジメチルシリルエーテル）；及び、３’−ホスホルアミダイト（最も一般的なものはシアノエチルジイソプロピル）。この成分は、さらに、適切なＮ−保護基を有するヌクレオシドとカップリングされ、リボヌクレオシドの２’又は３’コハク酸塩は固体担体に付加される。成分１と５’−ＯＨ−ｎ−保護−２’，３’−保護−ヌクレオシドのカップリングは、活性剤の存在下で、液相中でも達成され、二量体とオリゴリボヌクレオチドを生じ、続いて酸化され（３’→５’方向合成）、さらに、３’→５’ヌクレオチド間結合を有する保護化ジヌクレオチドを生じる（Ogilvie, K.K., Can. J. Chem., 58: 2686, 1980）（スキーム１）。
【０００４】
これらの合成ＲＮＡの多くは、オリゴヌクレオチドの３’−末端の修飾又はラベリングを必要とする。脂溶性長鎖リガンド又は発色団を必要とする３’−末端修飾ＲＮＡを３’→５’合成方法を用いて合成することは困難で、合成は難しく、一般的にはカップリング効率が低くなり、最終オリゴヌクレオチドの純度が低くなる。通常はさらに精製が必要となる。そのため、ＲＮＡ分子を短時間に高純度で、かつ３’末端の修飾が可能な形で合成するための新たな合成方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、３’末端で効率的に修飾可能な高純度のＲＮＡを合成するための基盤的要素と方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に開示する逆方向ＲＮＡアミダイトを用いた自動オリゴ合成では、工程ごとのカップリング効率が向上し、これにより、より高純度を実現し、非常に長いオリゴヌクレオチドを生産する能力が向上している。本発明の合成プロセスにおける逆方向ＲＮＡホスホルアミダイトの利用により、Ｎ＋１種を含まないオリゴヌクレオチドが得られる。Ｎ＋１種は、ＨＰＬＣ分析／精製又はゲル精製の際に所望のピークが広がる不純物につながる。Ｎ＋１種は、同一のカップリングサイクル中に、１つの核酸塩基ではなく２つの核酸塩基が付加することで生じる。
【０００７】
第1の実施形態では、本発明は式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ又はＩｄに示す化合物、又はその塩に関する：
【０００８】
【化１】
2013520438.tif 000003
式中、Ｊは、Ｈ、
【化２】
2013520438.tif 000004
、又は
【化３】
2013520438.tif 000005
であり、
【化４】
2013520438.tif 000006
はＪがＯ原子に結合する位置を示し；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）である場合：
【０００９】
【化５】
2013520438.tif 000007
Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＶ）又は（Ｖ）である場合：
【００１０】
【化６】
2013520438.tif 000008
Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基であり、ここで、核酸塩基は以下から選択され：Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルアミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ−３メチルチミン、５−アセトキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ−４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ−３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アセトキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；
ここで、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、以下により置換されていてもよく：フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；＝ＣＲ８Ｎ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；及び
【００１１】
【化７】
2013520438.tif 000009
ここで、核酸塩基内の置換可能な酸素原子は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（フェニル）２で置換されていてもよい。
【００１２】
第２の実施形態では、本発明は式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ又はＩｄに示す化合物、又はその塩に関する：
【００１３】
【化８】
2013520438.tif 000010
式中、
Ｊは、Ｈ、
【化９】
2013520438.tif 000011
、又は
【化１０】
2013520438.tif 000012
であり、
【化１１】
2013520438.tif 000013
はＪがＯ原子に結合する位置を示し；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）である場合：
【００１４】
【化１２】
2013520438.tif 000014
Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＶ）又は（Ｖ）である場合：
【００１５】
【化１３】
2013520438.tif 000015
Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；ただし、Ｒ４が−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ１１）３であって、２つのＲ１１基がともにメチルである場合、もう１つのＲ１１基はｔ−ブチルでなく、又は、Ｒ４が−Ｏ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３である場合、３つのＲ１１基のすべてがイソプロピルとなることはなく；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基である。
【発明の効果】
【００１６】
逆方向ＲＮＡモノマーホスホルアミダイトは、５’→３’方向のＲＮＡ合成のために開発されたもので、これにより、高純度のオリゴ合成ができ、３’末端に様々な修飾をクリーンにかつ効率的に導入することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＢＴＴを活性化剤として、カップリング時間２分で合成した粗ＲＮＡ：ＲＥＶ−２’−ＯＭｅ−ＢＴＴ−ｒＵｍｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｍｒＡ（配列番号１）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）分析のグラフを示す（ＢＴＴ：５−ベンジルチオ−１−Ｈ−テトラゾール）。純度：ＵＶ２００ｎｍ：時間＝２１．８３７；７８．９５％。
【図２】図２は、ＥＴＴ（エチルチオテトラゾール）を活性化剤として（０．２５Ｍ）、カップリング時間４分で合成した粗ＲＮＡ（脱塩）：ＲＥＶ−２’−ＯＭｅ−ホスホロチオエート−オリゴｒＵｍｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｍｒＡ（配列番号１）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）分析のグラフを示す。ＥＳＩ／ＭＳ（粗産物）実際のＭＷ：６９７１．１；実測値：６９７２．０。純度：ＵＶ２００ｎｍ：時間＝２３．０４６；８９．０９％。
【図３】図３は、カップリング時間４分で合成した粗ＲＮＡ（脱塩）：ＲＥＶ−２’−ＯＭｅ−ホスホジエステル−オリゴｒＵｍｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｍｒＡ（配列番号１）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）分析のグラフを示す。純度：ＵＶ２００ｎｍ：時間＝２２．３９６；８９．０３％。
【図４】図４は、カップリング時間４分で合成した粗ＲＮＡ（脱塩）：ＲＥＶ−ホスホジエステル−オリゴｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｒＣ（配列番号３）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）分析のグラフを示す。ＥＳＩ／ＭＳ粗ＲＮＡ（脱塩）；計算値ＭＷ：６５９８．９。純度：ＵＶ２００ｎｍ：時間＝２２．６１３；９５．２９％。
【図５】図５は、カップリング時間６分で合成した粗ＲＮＡ（脱塩）：ＲＥＶ−ホスホジエステル−オリゴｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｒＣ（配列番号３）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）分析のグラフを示す。純度：ＵＶ２００ｎｍ：時間＝２２．８７９；９３．６９％。
【図６】図６は、３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｇ−（Ｎ−ｉＢｕ）−５’−ホスホルアミダイト（ロット＃ＮＳ−４２−１９）の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトラムを示す；０〜２００ｐｐｍの範囲の分析で１００％。同様の結果が、３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ａ（Ｎ−Ｂｚ）−５’−ホスホルアミダイト；３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｃ−（Ｎ−Ａｃ）−５’−ホスホルアミダイト；及び３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｕ−５’−ホスホルアミダイトについても得られた。
【図７】図７は、３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｇ（Ｎ−ｉＢｕ）−５’−ホスホルアミダイト（ロット＃ＮＳ４２−１９）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す；（純度：保持：時間＝７．４１８、７．７５４；９９．６４％）。同様の結果が、３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ａ（Ｎ−Ｂｚ）−５’−ホスホルアミダイト（純度：保持：時間＝５．０６７、６．３９１；９８．８９％）；３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｃ（Ｎ−Ａｃ）−５’−ホスホルアミダイト（純度：保持：時間＝４．６１８、６．０６４；９９．０４％）；及び３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｕ−５’−ホスホルアミダイト（純度：保持：時間＝４．２１３、５．０９８；９８．６６％）についても得られた。
【図８】図８は、大規模オリゴヌクレオチド合成によりカップリング時間６分で合成した粗ＲＮＡ：ＲＥＶ−ＲＮＡ−Ｍｅ−チオ−ｒＵｍｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｍｒＡ（配列番号１）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）分析のグラフを示す。マススペクトル；実際値：６９７１．１；実測値：６９７１．７。純度：ＵＶ２００ｎｍ：時間＝２２．４０８；９２．６３％、さらにＨＰＬＣで２４．０８７；９８．０１％に精製。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、常法（３’→５’方向）により作製した粗２１−ｍｅｒＲＮＡ；粗産物純度；７０．７３％（図９Ａ）、及び、逆方向ＲＮＡ合成方法（５’→３’方向）により作製した粗２１−ｍｅｒＲＮＡ；粗産物純度；７８．５５％（図９Ｂ）の電気泳動図のグラフである。Ｅｘｐｅｄｉｔｅモデル８９０９−１ｕｍｏｌｅスケール。
【図９Ｂ】同上。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、常法（３’→５’方向）により作製した、３’−コレステロールＣＰＧを有する粗２１−ｍｅｒＲＮＡ；粗産物純度；８２．８３％（図１０Ａ）、及び、逆方向ＲＮＡ合成方法（５’→３’方向）により作製した、３’−コレステロールＣＰＧを有する粗２１−ｍｅｒＲＮＡ；粗産物純度；８５．７６％（図１０Ｂ）の電気泳動図のグラフである。Ｅｘｐｅｄｉｔｅモデル８９０９−１ｕｍｏｌｅスケール。
【図１０Ｂ】同上。
【図１１】図１１は、逆方向ＲＮＡ合成方法（５’→３’方向）により作製した、３’−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール；ＭＷ２０００）を有する粗２１−ｍｅｒＲＮＡの電気泳動図のグラフである。Ｅｘｐｅｄｉｔｅモデル８９０９−１ｕｍｏｌｅスケール。ＰＥＧ−２０００は、最終段階として、対応するホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ；ＣＬＰ−３１１９；計算分子量：８６８４．１、測定分子量：８６８１．１）を介して付加した。粗産物純度；９１．８７％
【図１２】図１２は、分枝アミダイト（Ｉ）のＰＡＧＥ分析の写真である。ビスペグ化ＲＮＡ；レーン１；ＢＰＢ及びキシレンシアノール；レーン３−粗オリゴ；レーン５−逆相ＨＰＬＣ、精製オリゴ；（カップリング時間−４分；ＥＴＴ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
関連出願
本出願は、米国を指定国として２００９年９月８日に提出され、英語で公開され、２００８年９月６日に提出された米国仮特許出願第６１／１９１，０６５号の権利を主張する、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５０６３号の一部継続出願である、２０１０年２月１９日に提出された米国特許出願第１２／７０８，８２７号に基づく優先権を主張する。
上記出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００１９】
本発明の例示的実施形態の説明を以下に示す。ここに記載するすべての特許文献、公開出願、及び参考文献は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００２０】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、Ｊは
【００２１】
【化１４】
2013520438.tif 000016
又は
【化１５】
2013520438.tif 000017
であり、ここで、
【化１６】
2013520438.tif 000018
はＪがＯ原子に結合する位置を示す。
【００２２】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は、式Ｉａ又はＩｂ：
【００２３】
【化１７】
2013520438.tif 000019
で表されるか、又はその塩である。
【００２４】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、Ｚは、非置換若しくは置換アリール基、非置換若しくは置換トリアリールメチル基、非置換若しくは置換トリチル基、非置換若しくは置換テトラヒドロピラニル基、又は非置換若しくは置換９−フェニルキサンチルである。
【００２５】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、Ｚは、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アニシル−１−ナフチルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、又はｐ−トリルジフェニルメチルである。
【００２６】
第１又は第２の実施形態のさらに別の態様では、Ｚは、下記の構造式で表され：
【００２７】
【化１８】
2013520438.tif 000020
式中、
【化１９】
2013520438.tif 000021
は３’酸素原子への結合を示し、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは独立して以下の構造式から選択される：
【００２８】
【化２０】
2013520438.tif 000022
【００２９】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、Ｚは、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又は４，４’，４”−トリメトキシトリチルである。
【００３０】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、＝ＣＨＮ（ＣＨ３）２；Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、＝Ｃ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）２；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド、及び
【００３１】
【化２１】
2013520438.tif 000023
により置換されていてもよい。
【００３２】
第１又は第２の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ３は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ５、又は−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒ４は−−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ１１）３である。
【００３３】
第１又は第２の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ４は、−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ（ＣＨ３）３）又は−Ｏ−ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ３）２）３）である。
【００３４】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００３５】
【化２２】
2013520438.tif 000024
又はその塩である。
【００３６】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００３７】
【化２３】
2013520438.tif 000025
又はその塩である。
【００３８】
第１又は第２の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ３は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。
【００３９】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００４０】
【化２４】
2013520438.tif 000026
又はその塩である。
【００４１】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００４２】
【化２５】
2013520438.tif 000027
又はその塩である。
【００４３】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００４４】
【化２６】
2013520438.tif 000028
又はその塩である。
【００４５】
第１又は第２の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ３はＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。
【００４６】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００４７】
【化２７】
2013520438.tif 000029
又はその塩である。
【００４８】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００４９】
【化２８】
2013520438.tif 000030
又はその塩である。
【００５０】
第１又は第２の実施形態の１つの態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００５１】
【化２９】
2013520438.tif 000031
又はその塩である。
【００５２】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００５３】
【化３０】
2013520438.tif 000032
又はその塩である。
【００５４】
第１又は第２の実施形態の別の態様では、化合物は以下の構造式の１つで表されるか：
【００５５】
【化３１】
2013520438.tif 000033
又はその塩である。
【００５６】
第３の実施形態では、本発明は、以下の構造式の１つで表される化合物又はその塩に関する：
【００５７】
【化３２】
2013520438.tif 000034
式中、
Ｙは、それぞれ独立して酸素又は硫黄であり；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、Ｒ４がリボース構造の中にある場合、Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、Ｒ４がアラビノース構造の中にある場合、Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基であり、ここで、核酸塩基は以下から選択され：Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルアミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ−３メチルチミン、５−アセトキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ−４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ−３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アセトキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；
ここで、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、以下により置換されていてもよく：フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；＝ＣＲ８Ｎ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；及び
【００５８】
【化３３】
2013520438.tif 000035
ここで、核酸塩基内の置換可能な酸素原子は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（フェニル）２で置換されていてもよく；
Ｒ２０は、Ｈ、−Ｏ−Ｚ、又はＲ２１であり；
Ｒ２１は、３’官能基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；そして、
ｎは、０〜１５０である；
又は、その塩。
【００５９】
第３の実施形態の１つの態様では、Ｒ２１は、
ａ）シアノエチルホスフェート−ポリエチレングリコールｖ、ここで、ｖは２〜１００で、グリコール単位の数を表す；
ｂ）コレステロール、ビオチン、フルオレセイン類、シアニン色素類、ソラレン、テトラメチルローダミン色素、ダブシル色素、Ｃ−３ジスルフィド、Ｃ−６ジスルフィド、対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、ＣＦ３Ｃ（＝Ｏ）又はフタルアミド又はＦＭＯＣで保護された末端アミノ基を有する対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、アミン保護基で保護された（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−アミン、アジド基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、アセチレン（Ｃ≡ＣＨ）基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、と結合されたシアノエチルホスフェート−リンカー；
ｃ）ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−エタン−２−オール−、ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−プロパン−３−オール−；
ｄ）末端ヒドロキシを有する（Ｃ１−Ｃ５０）アルキレン；
ｅ）脂質、カルボキシル基、又はペプチド；又は、
ｆ）分枝ホスホルアミダイト、である。
【００６０】
第３の実施形態の別の態様では、ｎは５〜７５である。あるいは、ｎは７６〜１５０である。あるいは、ｎは１０〜２５である。あるいは、ｎは２５〜５０である。あるいは、ｎは５０〜７５である。あるいは、ｎは７５〜１００である。
【００６１】
第３の実施形態の別の態様では、Ｚは、非置換若しくは置換アリール基、非置換若しくは置換トリアリールメチル基、非置換若しくは置換トリチル基、非置換若しくは置換テトラヒドロピラニル基、又は非置換若しくは置換９−フェニルキサンチルである。
【００６２】
第３の実施形態の別の態様では、Ｚは、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アニシル−１−ナフチルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、又はｐ−トリルジフェニルメチルである。
【００６３】
第３の実施形態のさらに別の態様では、Ｚは、下記の構造式で表され：
【００６４】
【化３４】
2013520438.tif 000036
式中、
【化３５】
2013520438.tif 000037
は３’酸素原子への結合を示し、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは独立して以下の構造式から選択される：
【００６５】
【化３６】
2013520438.tif 000038
【００６６】
第３の実施形態の１つの態様では、Ｚは、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又は４，４’，４”−トリメトキシトリチルである。
【００６７】
第３の実施形態の別の態様では、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、＝ＣＨＮ（ＣＨ３）２；Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、＝Ｃ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）２；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド、及び
【００６８】
【化３７】
2013520438.tif 000039
により置換されていてもよい。
【００６９】
第３の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ３は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ５、又は−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒ４は−−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ１１）３である。
【００７０】
第３の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ４は、−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ（ＣＨ３）３）又は−Ｏ−ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ３）２）３）である。
【００７１】
第３の実施形態のさらに別の態様では、Ｒ３は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。
【００７２】
本発明の第４の実施形態は、９７％を超える純度を有する、５’ホスホルアミダイトヌクレオシドから合成した合成ＲＮＡ分子である。
【００７３】
第１及び第２の実施形態、並びにその態様の化合物は、以下の方法において用いることができる。
【００７４】
本発明の第５の実施形態は、ＲＮＡオリゴマー及びそのエナンチオマーの合成のための、５’−から３’−方向への結合形成によるオリゴヌクレオチドの作製方法であって、該方法は以下の工程を含む：
ａ）下記の構造式で表される担体に結合した化合物から、Ｚ保護基を切断し、
【００７５】
【化３８】
2013520438.tif 000040
これにより、構造式（ＸＸ）で表される化合物を形成する；
【００７６】
【化３９】
2013520438.tif 000041
ｂ）構造式ＸＸで表される化合物を、構造式ＸＸＩで表される化合物と反応させ、
【００７７】
【化４０】
2013520438.tif 000042
これにより、下記構造式で表される２−ｍｅｒ化合物を形成する；
【００７８】
【化４１】
2013520438.tif 000043
ｃ）２−ｍｅｒ化合物を、例えば酸無水物などのキャッピング剤と反応させ、未反応の３’ヒドロキシ基をブロックする；
ｄ）２−ｍｅｒ化合物の三価の亜リン酸基を酸化又は硫化し、構造式ＸＸＩＩの化合物を形成する；
【００７９】
【化４２】
2013520438.tif 000044
ｅ）構造式ＸＸＩＩで表される化合物からＺ保護基を切断し、構造式ＸＸＩＩＩの化合物を形成する；
【００８０】
【化４３】
2013520438.tif 000045
ｆ）構造式ＸＸＩＩＩで表される化合物を、下記の構造式で表される化合物と反応させ：
【００８１】
【化４４】
2013520438.tif 000046
これにより、酸化又は硫化の後、下記構造式ＸＸＩＶで表される３−ｍｅｒを形成する；
【００８２】
【化４５】
2013520438.tif 000047
ｅ）構造式ＸＸＩＶで表される化合物からＺ保護基を切断する；
ｇ）工程ａ）からｅ）をｎ回繰り返し、下記構造式で表されるオリゴヌクレオチド又はその塩を形成する：
【００８３】
【化４６】
2013520438.tif 000048
式中、
Ｊは、
【化４７】
2013520438.tif 000049
又は
【化４８】
2013520438.tif 000050
であり、
【化４９】
2013520438.tif 000051
はＪがＯ原子に結合する位置を示し；
Ｑは、ａ）結合基及び切断されてヒドロキシ基を形成することが可能なスペーサーからなる担体；又はｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルであり；
Ｒ１は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ２は、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ２０）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、ここで、アルキル基又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
又は、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４〜７員環の非芳香族ヘテロシクリルを形成し、形成されたヘテロシクリルは、ＮＨ、ＮＲ７、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｒ３は、リン酸保護基であり；
Ｒ４は、−−ハロ、−−Ｒ５、−−ＮＲ７Ｒ８、−−ＯＲ９、−−ＳＲ１０、又は２’−ブロッキング基であるか；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）である場合：
【００８４】
【化５０】
2013520438.tif 000052
Ｒ４はさらにＯ−Ｓｉ（Ｒ１１）３又はＯ−ＣＨ２−Ｓｉ（Ｒ１１）３から選択され；又は、構造式Ｉａ又はＩｂが（ＩＶ）又は（Ｖ）である場合：
【００８５】
【化５１】
2013520438.tif 000053
Ｒ４はさらに−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１２から選択され；
Ｒ５は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換フェニルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択される介在ヘテロ原子を含んでいてもよく；また−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＯＲ９、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ベンジル若しくは置換ベンジル、−ＳＲ１０；又は−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で終端していてもよく；
Ｒ６は、−Ｈ又は−Ｏ−Ｚであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ８は、それぞれ、Ｈ又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ９は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１０は、それぞれ独立して、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＣＨ３；置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基であり；
Ｒ１２は、それぞれ独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル基、又は置換若しくは非置換アリール基であり；
Ｚは、酸分解性保護基であり；
Ｂｎは、水素、又は各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基であり、ここで、核酸塩基は以下から選択され：Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルアミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ−３メチルチミン、５−アセトキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ−４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ−３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アセトキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；
ここで、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、以下により置換されていてもよく：フルオレニルメチルオキシカルボニル；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；＝ＣＲ８Ｎ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）ＣＦ３；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ８（ＣＨ２）１−１６ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）−フタルイミド；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−１６−フタルイミド；及び
【００８６】
【化５２】
2013520438.tif 000054
ここで、核酸塩基内の置換可能な酸素原子は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（フェニル）２で置換されていてもよく；そして
ｎは１〜１５０である；
又は、その塩。
【００８７】
別の態様では、Ｙ基は、それぞれ独立して、硫化により導入されてホスホロチオエート結合を形成するか、又は酸化により導入されてリン酸結合を形成する。
【００８８】
別の態様では、Ｒ３基は酸化後に脱離してリン酸結合を形成する。
【００８９】
別の態様では、Ｒ３基は硫化後に脱離してホスホロチオエート結合を形成する。
【００９０】
別の態様では、核酸塩基保護基は塩基で脱保護される。
【００９１】
別の態様では、塩基はアンモニア水、メタノール性アンモニア、又はエタノール性アンモニアから選択される。
【００９２】
別の態様では、Ｒ４は−ＯＳｉ（Ｒ１１）３である。
【００９３】
別の態様では、方法は、−ＯＳｉ（Ｒ１１）３をフッ化物塩で切断する工程をさらに含む。
【００９４】
別の態様では、フッ化物塩はフッ化テトラエチルアンモニウムである。
【００９５】
別の態様では、下記の構造式：
【００９６】
【化５３】
2013520438.tif 000055
で表される化合物を３’官能基と反応させ、これにより下記の構造式：
【００９７】
【化５４】
2013520438.tif 000056
（式中、Ｒ２１は３’官能基又はその塩である）
で表される化合物を形成する工程をさらに含む。
【００９８】
別の態様では、Ｒ２１は、
ａ）シアノエチルホスフェート−ポリエチレングリコールｖ、ここで、ｖは２〜１００で、グリコール単位の数を表す；
ｂ）コレステロール、ビオチン、フルオレセイン類、シアニン色素類、ソラレン、テトラメチルローダミン色素、ダブシル色素、Ｃ−３ジスルフィド、Ｃ−６ジスルフィド、対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、ＣＦ３Ｃ（＝Ｏ）又はフタルアミド又はＦＭＯＣで保護された末端アミノ基を有する対称及び非対称炭化水素鎖（Ｃ２−Ｃ５０）、アミン保護基で保護された（Ｃ１−Ｃ１６）アルキレン−アミン、アジド基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、アセチレン（Ｃ≡ＣＨ）基で保護された（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン−アミン、と結合されたシアノエチルホスフェート−リンカー；
ｃ）ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−エタン−２−オール−、ＤＭＴ基又は他の酸分解性基で保護されたシアノエチルホスフェート−プロパン−３−オール−；
ｄ）末端ヒドロキシを有する（Ｃ１−Ｃ５０）アルキレン；
ｅ）脂質、カルボキシル基、又はペプチド；又は、
ｆ）分枝ホスホルアミダイト、
である。
【００９９】
別の態様では、本特許請求された方法により作製され、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、又は逆相クロマトグラフィーによる合成ＲＮＡ分子の精製後の純度が９７％以上のＲＮＡ分子である。
【０１００】
略語の一覧：
ｍＡ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン
ｒＡ＝アデノシン
ｒＣ＝シチジン
ｒＵ＝ウリジン
ｒＧ＝グアノシン
２’−ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル
ＢＴＴ＝５−ベンジルチオ−１−Ｈ−テトラゾール
ホスホロチオエート＝硫黄によりＰ＝Ｓとして五価の酸化状態であるリン
Ｍｅ−ＴＨＩＯ＝ホスホチオエート
ＣＥ＝キャピラリー電気泳動
ＭＷ＝分子量
ＥＳＩ／ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＢＤＭＳ＝ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
Ａｃ＝アセチル（−ＣＯＣＨ３）
Ｂｚ＝ベンゼン
ｉＢｕ＝イソブチル（２−メチルプロピル）
ＴＯＭ＝トリイソプロピルシロキシメチル
ＴＨＩＯ＝ホスホロチオエート、すなわち、リン（Ｖ）に結合した硫黄（Ｐ＝Ｓ）
【０１０１】
本発明の化合物は、下記で表される化合物：
【０１０２】
【化５５】
2013520438.tif 000057
又はその塩である。
【０１０３】
特定の実施形態では、化合物は以下の構造式で表され：
【０１０４】
【化５６】
2013520438.tif 000058
それぞれβ−Ｄ−リボース、β−Ｌ−リボース、α−Ｄ−リボース及びα−Ｌ−リボースに相当する。
【０１０５】
別の実施形態では、化合物は以下の構造式で表され：
【０１０６】
【化５７】
2013520438.tif 000059
それぞれβ−Ｄ−アラビノース、β−Ｌ−アラビノース、α−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−アラビノースに相当する。
【０１０７】
ある実施形態では、Ｒ６は−Ｈ又は−Ｏ−Ｚである。特定の実施形態では、Ｒ６は−Ｏ−Ｚであり、化合物は以下の構造式で表される：
【０１０８】
【化５８】
2013520438.tif 000060
【０１０９】
ある実施形態では、Ｚは酸分解性保護基である。酸分解性保護基は、ブレンステッド酸又はルイス酸と接触することで取り除くことができる保護基である。酸分解性保護基は、当業者に周知である。トリチル基は、通常、アルコキシ基などの電子供与性置換基によって置換される。好適な酸分解性保護基は、例えば４，４’−ジメトキシトリチル（以下「ＤＭＴ」）などの置換又は非置換トリチルである。
【０１１０】
特定の実施形態では、Ｚは、非置換若しくは置換アリール基、非置換若しくは置換トリアリールメチル基、非置換若しくは置換トリチル基、非置換若しくは置換テトラヒドロピラニル基、又は非置換若しくは置換９−フェニルキサンチルである。より具体的な実施形態では、Ｚは以下の群から選択される：トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル、ＤＭＴ］、４，４’，４”−トリメトキシトリチル、及び９−フェニルキサンチル。別の特定の実施形態では、Ｚは４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又は４，４’，４”−トリメトキシトリチルである。
【０１１１】
別の実施形態では、Ｚは、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アニシル−１−ナフチルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、又はｐ−トリルジフェニルメチルである。
【０１１２】
別の特定の実施形態では、Ｚは下記の構造式で表される：
【０１１３】
【化５９】
2013520438.tif 000061
式中、
【化６０】
2013520438.tif 000062
は３’酸素原子への結合を示し、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは独立して以下の構造式から選択される：
【０１１４】
【化６１】
2013520438.tif 000063
【０１１５】
「アルキルエステル」基とは、−Ｃ（Ｏ）−部分を介して分子の残りの部分に結合しているＣ１−Ｃ１８の炭素鎖を意味する。炭素鎖は、直鎖でも分岐鎖でもよく、飽和でも不飽和でもよく、またＯ、ＮＨ、ＮＲ４、又はＳなどの介在ヘテロ原子を含んでいてもよい。
【０１１６】
「脂肪族基」は、本明細書において、完全に飽和した、又は１以上の非共役二重結合を含む、直鎖若しくは分岐Ｃ１−Ｃ１８炭化水素、又は、完全に飽和した、又は１以上の非共役二重結合を含む、環状Ｃ３−Ｃ１８炭化水素を含む。アルキル基は、完全に飽和した直鎖若しくは分岐Ｃ１−Ｃ８炭化水素又はＣ３−Ｃ８環状炭化水素である。脂肪族基は、好適にはアルキル基である。
【０１１７】
「アルキル」とは、単独で使用された場合、又は、「アリールアルキル」や「シクロアルキルアルキル」などのより大きな部分の一部として使用された場合、１〜１８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐炭化水素ラジカルを意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｎ−へキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどが含まれる。
【０１１８】
「アルキレン」とは、１〜１８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐炭化水素ジラジカルを意味し、例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）などが含まれる。
【０１１９】
「アルケニル」とは、１〜１８個の炭素原子と１以上の二重結合を有する直鎖又は分岐炭化水素ラジカルを意味する。
【０１２０】
「アルキニル」とは、１〜１８個の炭素原子と１以上の三重結合を有する直鎖又は分岐炭化水素ラジカルを意味する。
【０１２１】
「シクロアルキル」とは、３〜２０個の炭素原子を有する、単環式、二環式若しくは三環式の飽和炭化水素環を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［４．４］ノナン、アダマンチルなどが含まれる。
【０１２２】
アルキル基、アセチル基、又はシクロアルキル基は、ＮＨ、ＮＲ５、Ｏ及びＳから独立して選択されえる介在ヘテロ原子を含んでいてもよい。アルキル又はシクロアルキルは、最大１０個の介在ヘテロ原子を含むことができる。具体的には、介在ヘテロ原子の数は、１、２、３、又は４個であり得る。介在ヘテロ原子を有するアルキル基の例としては、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、−ＳＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ３などが含まれる。介在ヘテロ原子を含むシクロアルキル基の例としては、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロフラニル、チザオリジニル（thizaolidinyl）などが含まれる。
【０１２３】
「アリール」とは、単独で使用された場合、又は、「アリールアルキル」などのより大きな部分の一部として使用された場合、６〜１０員の炭素環式芳香族単環式又は多環式環構造を意味する。例としては、フェニル及びナフチルが含まれる。また、「アリール」には、非芳香族炭素環又はヘテロシクリル基と融合したフェニル環も含まれる。「アリール」は、「芳香族基」、「アリール環」、「芳香族環」、「アリール基」及び「芳香族基」の用語と互換的に用いられる場合がある。
【０１２４】
「ヘテロ」とは、環構造中の少なくとも１員の炭素原子が、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子で置換されていることを意味する。ヘテロ環は、１、２、３又は４員の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい。
【０１２５】
「ヘテロシクリル」とは、３〜２０個、３〜１２個、又は３〜８個の原子からなる、飽和又は不飽和の非芳香族単環式又は多環式環構造であって、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１から４個の環ヘテロ原子を含んでいるものを意味する。例としては、ヘテロシクリルには、ピロリジン、ピロリジン−２−オン、１−メチルピロリジン−２−オン、ピペリジン、ピペリジン−２−オン、２−ピリドン、４−ピリドン、ピペラジン、１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジン、ピペラジン−２−オン、５，６−ジヒドロピリミジン−４−オン、ピリミジン−４−オン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、イソオキサゾリジン、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオラン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、１，３−ジチアン、１，４−ジチアン、オキサゾリジン−２−オン、イミダゾリジン−２−オン、イミダゾリジン−２，４−ジオン、テトラヒドロピリミジン−２（１Ｈ）−オン、モルフォリン、Ｎ−メチルモルフォリン、モルフォリン−３−オン、１，３−オキサジナン（ｏｘａｚｉｎａｎ）−２−オン、チオモルフォリン、チオモルフォリン１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−１，２，５−チアオキサゾール１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−２Ｈ−１，２−チアジン１，１−ジオキシド、ヘキサヒドロ−１，２，６−チアジアジン１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−１，２，５−チアジアゾール１，１−ジオキシド、及びイソチアゾリジン１，１−ジオキシドが含まれる。
【０１２６】
「ヘテロシクリル」はさらにヘテロアリール基を含む。「ヘテロアリール」とは、５〜１０員の一価のヘテロ芳香族単環式及び多環式環ラジカルであって、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含んでいるものを意味する。また、「ヘテロアリール」には、非芳香族炭素環又はヘテロシクリル基と融合した単環式ヘテロアリール環も含まれる。ヘテロアリール基には、フリル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリジニル−Ｎ−オキシド、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾ［ｂ］フリル、ベンゾ［ｂ］チエニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾジオキソリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、シンノリニル、フタルジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８−ナフチリジニル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル−１−オキシド、１，２，５−チアジアゾリル−１，１−ジオキシド、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，４−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、テトラゾリル、及びプテリジニルが含まれる。本明細書において、「ヘテロアリール」、「ヘテロアリール環」及び「ヘテロアリール基」は互換的に用いられる。
【０１２７】
アミン保護基、ヒドロキシ保護基、及びチオール保護基は、当業者において周知である。アミン保護基の例については、Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wiley & Sons, Inc.の３０９〜４０５ページを参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。好適には、アミンはアミド又はカルバメートとして保護される。ヒドロキシ保護基の例については、同文献の１０〜１４２ページを参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。好適なヒドロキシ保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基である。チオール保護基の例については、同文献の２７７〜３０８ページを参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１２８】
本明細書において、「環外アミン」とは、ヌクレオシドの塩基に結合しているアミンを意味する。例えば、アデニンの環外アミンは下記のように示される。
【０１２９】
【化６２】
2013520438.tif 000064
環外アミンは、（例えばベンゾイルで）保護されるか、又はホルムアミジンとして保護され得る（例えば、−Ｎ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）２）。
【０１３０】
「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書において、天然のオリゴヌクレオチド、例えばリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」という）、及び修飾糖部分、修飾リン酸部分、又は修飾核酸塩基を含む核酸が含まれる。糖部分の修飾は、ヘキソース環、シクロペンチル環、又はシクロへキシル環によるリボース環の置換を含む。さらに、天然の核酸のＤ−リボース環はＬ−リボース環で置換することができ、天然の核酸のβ−アノマーは、α−アノマーで置換することができる。また、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の脱塩基部分を含む場合がある。修飾リン酸部分は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスフェート、及びホスホルアミデートを含む。これらの核酸類似体は当業者に周知である。上記のものを２つ以上混合して含むオリゴヌクレオチドも作製でき、例えば、デオキシリボ−及びリボヌクレオシドの混合物を含むオリゴヌクレオチド、特にデオキシリボヌクレオシドと２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドとの混合物が挙げられる。ヌクレオシドの混合物を含むオリゴヌクレオチドの例としては、リボザイムなどがある。
【０１３１】
キメラオリゴヌクレオチドは、配列内にホスホジエステル及びホスホロチオエート結合の両方、及び／又はリボース若しくはアラビノース糖又は修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドであり、例えば、２’−フルオロ、２’−Ｏメチル、２’−Ｏ−，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド、逆脱塩基、逆チミジンを配列内又は末端に有する。
【０１３２】
合成オリゴヌクレオチドは、好適には、２〜約１５０個の核酸塩基を有する。より好適には、合成オリゴヌクレオチドは、２〜約７５個の核酸塩基を有する。現在の治療用途の合成オリゴヌクレオチドの多くは、８〜４０個の核酸塩基からなる。
【０１３３】
ヌクレオシド塩基
本発明の化合物は、Ｂｎで表されるヌクレオシド塩基を含む。Ｂｎは、水素、又は、各環外アミンがアミン保護基で官能化されていてもよい、置換されていてもよい核酸塩基である。
【０１３４】
ヌクレオシド塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルなどの天然の塩基と、以下などの修飾塩基がある：
ａ）以下から選択される１から３個の基で置換されたアデニン又はグアニン：
ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、−Ｏ−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、トリアゾリル、及びアミノアリル、ここで、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４；−（ＣＨ２）ｍ−アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−アミノ−ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−フタルイミドで置換されていてもよい
ｂ）以下から選択される１から３個の基で置換されたウラシル又はシトシン：
ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、−Ｏ−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、オキソ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、トリアゾリル、及びアミノアリル、ここで、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４；−（ＣＨ２）ｍ−アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−アミノ−ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、又は−（ＣＨ２）ｍ−フタルイミドで置換されていてもよい
ｃ）以下により置換されていてもよいチミン、ピリミジン又はピリドン：ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、−Ｏ−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、オキソ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、トリアゾリル、及びアミノアリル、ここで、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４；−（ＣＨ２）ｍ−アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−アミノ−ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、又は−（ＣＨ２）ｍ−フタルイミドで置換されていてもよく、ただし、形成される核酸塩基はウラシル又はシトシンではない；
ｄ）以下により置換されていてもよいプリン：ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、−Ｏ−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、オキソ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、トリアゾリル、及びアミノアリル、  ｗｈｅｒｅｉｎ  ｔｈｅ  アルキル、  アルケニル  ｏｒ  アルキニル  ｉｓ  ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  −Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４；  −（ＣＨ２）ｍ−アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、  −（ＣＨ２）ｍ−アミノ−ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、  ｏｒ  −（ＣＨ２）ｍ−フタルイミド；ここで、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４；−（ＣＨ２）ｍ−アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−アミノ−ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、又は−（ＣＨ２）ｍ−フタルイミドで置換されていてもよく；ただし、形成される核酸塩基はアデニン又はグアニンではない；又は
ｅ）Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ−１−メチルアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、エテノアデニン、イソグアニン、Ｎ１−メチルグアニン、７−ヨード−７−デアザグアニン、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨード−６−オキソプリン、５−ヨード−５−メチル−７−デアザグアニン、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）１−８−フタルイミド（pthlamide）で置換された７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−アミノグアニン、ヒポキサンチン、６−メトキシプリン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−ブロモプリン、８−アミノプリン、８−アルキルアミノプリン、８−アルキルアミノプリン、チミン、Ｎ３メチルチミン、５−アクロキシメチルシトシン、５−アザシトシン、イソシトシン、Ｎ４（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、Ｎ３（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシチジン、５−プロピニルシトシン、５−ヨード−シトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−メチルシトシン、エテノシトシン、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されたシトシン及びウラシル、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−フタルイミドで置換されたシトシン及びウラシル、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、Ｎ３−チオベンゾイルエチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−アクロキシメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、４−チオウラシル、Ｎ−３−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、４−トリアゾリル−５−メチルウラシル、２−ピリドン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、及び４−オキソ−５−メチルピリミジン；ここで、これらはそれぞれ以下により置換されていてもよい：ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、−Ｏ−Ｓｉ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）３、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、オキソ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、トリアゾリル、及びアミノアリル、ここで、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４；−（ＣＨ２）ｍ−アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−アミノ−ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、又は−（ＣＨ２）ｍ−フタルイミドで置換されていてもよい；
ここで、群ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）における、核酸塩基内又は環外アミン上の置換可能な窒素原子は、（イソブチリル、フェノキシアセチル、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、イソプロピルフェノキシアセチル、アセチル、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルホルムアミジン、ｐ−クロロベンゾイル、ｏ−クロロベンゾイル、ｏ−ニトロベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、フルオレニルメチルオキシカルボニル、ニトロフェニルエチル、フタロイル、ベンジル（Ｂｎ）基、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）基、及び＝ＣＲ１５Ｎ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、により置換されていてもよく、
Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ、独立して、置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基、又は置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル基であり；そして、
ｍは、それぞれ独立して、０〜１２である。
【０１３５】
保護化ヌクレオシド塩基は、塩基の反応性官能基が保護されているヌクレオシド塩基である。同様に、保護化ヘテロ環は、ヘテロ環の反応性置換基が保護されているヘテロ環である。一般的に、ヌクレオシド塩基又はヘテロ環は、アミド又はカルバメートなどのアミン保護基で保護可能なアミン基を有する。例えば、アデニン及びシトシンのアミン基は、一般的に、それぞれベンゾイル及びアルキルエステル保護基で保護されており、グアニンのアミン基は、一般的に、イソブチリル基、アセチル基、又はｔ−ブチルフェノキシアセチル基で保護されている。一方、他の保護方法も利用することができる。例えば、迅速な脱保護化のためには、アデニン及びグアニンのアミン基はフェノキシアセチル基で保護され、シトシンのアミン基はイソブチリル基又はアセチル基で保護される。核酸塩基保護基又はヘテロ環保護基の除去のための条件は、用いられる保護基によって異なる。アミド保護基が用いられる場合は、濃縮水酸化アンモニウム溶液、Ｎ−メチルアミン溶液、又はｔ−ブチルアミンの水酸化アンモニウム溶液などの塩基溶液でオリゴヌクレオチドを処理することで除去することができる。
【０１３６】
また、ヌクレオシド塩基には、イソシチジン（ｉｓｏＣ）及びイソグアノシン（ＩｓｏＧ）も含まれる。ＩｓｏＣとＩｓｏＧは、ワトソン・クリック型の塩基対形成機構を利用するために用いられ、これは以下に示すようにｉｓｏＣとｉｓｏＧの間に３つの水素結合が形成される：
【０１３７】
【化６３】
2013520438.tif 000065
これらの塩基は、平行及び逆平行の二本鎖の両方で対を形成することができ、また、鎖の伸長やＰＣＲ等において、ＤＮＡ配列内でＤＮＡポリメラーゼによって認識される。そのため、これらの分子は、診断及び治療用途のＲＮＡ配列の一部として、非常に重要である（S.C.Jurczyk, et al., Helvetica Chimica Acta., 81, 793-811, 1998；及びC. Roberts, et al., Tetrahedron Lett., 36, 21, 3601-3604, 1995参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１３８】
また、ヌクレオシド塩基には、７−デアザ−リボヌクレオシド類も含まれる。これらの７−デアザ−リボヌクレオシド類（７−デアザグアノシン、アデノシン、イノシンを含む）は、さらに７位に様々な置換基を導入することで修飾することができる。例えば、修飾には、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードなど）、アルキニル、トリメチルシリルアルキニル、プロピニルアミノトリフルオロメチル、又はプロピニルアミノフタルアミドの付加が含まれ得る。（Xiaohua Peng and Frank Seela, International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, IRT-XVII, Sep 3-7, 2006, page 82, Bern, Switzerland参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１３９】
特に、７−デアザ−２’−デオキシヌクレオシドは、ＲＮＡ配列内で、d-グアノシン塩基に代えて組み込むことができ、その結果、オリゴデオキシヌクレオチドの固定（clamping）が減少し、それにより配列解析での分解能が向上する。この修飾は、相補的配列にハイブリダイゼーションさせる際の配列のｔｍ値を低下させない。この修飾は、ＤＮＡ及びＲＮＡの診断及び治療分野のための重要な生物学的性質を多く有する（N. Ramazaeva, et al., XIII International Round Table; Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Application, Montpellier, France Sep. 6-10, 1998, poster 304；Ramazaeva, N., et al., Helv. Chim. Acta 1997, 80, 1809 及び同文献内で参照される参考文献；Sheela, F. et al., Helvetica Chimica Acta, 73: 1879, 1990参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。ＲＮＡ分子は二次構造を形成する傾向が強いため、ＲＮＡではＧ−Ｃ塩基対形成の効果がより強く表れている。７−デアザ−リボグアノシンによるグアノシンの置換は、ＲＮＡ治療及び診断において非常に重要である。７−置換−７−デアザ−リボヌクレオシドは、Ｇ−Ｃ塩基対形成の特性を阻害することなく、様々なリガンドや発色基を７位に付加する可能性を有するため、重要である。
【０１４０】
７−デアザ−リボヌクレオシドの合成は、提案する３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｎ−保護−β−Ｄ−７-デアザ−グアノシン−５’−ホスホルアミダイトを介して達成することができる（スキーム１）：
【０１４１】
【化６４】
2013520438.tif 000066
【０１４２】
スキーム１：２’−ＴＢＤＭＳ−３’−ＤＭＴ−７−デアザ−ｒ−Ｇ(ｎ−ｉｂｕ)の合成：
化合物（ｉｉ）の合成；トリクロロ酢酸及びジクロロメタンを溶媒として用いて、化合物（ｉ）からＤＭＴを選択的に除去し、（ｉｉ）を得る。化合物（ｉｉｉ）；工程ａ；塩化ベンゾイル（１．１当量）／ピリジン溶媒（１０倍ｖ／ｖ）を用いて、０〜５℃で選択的５’−ベンゾイル化を行い、５’−ベンゾイル基を生成し；続いて検査とカラム精製を行う；（ｉｉｉ；工程ｂ）；次に、ピリミジン中、ＤＭＴクロリド反応を室温で２４時間行い、続いて検査を行う；その後、カラムクロマトグラフィーにより、化合物（ｉｉｉ）が得られる。化合物（ｉｖ）；ピリジンを溶媒として、ｉｖを２ＮのＮａＯＨ水溶液と反応させ、２ＮのＮａＯＨ水溶液との選択的反応により、５’−ベンゾイルの選択的除去を行い、その後、ピリジニウムＤｏｗｅｘカチオン交換樹脂による中和、続いてＤｏｗｅｘ樹脂を除去するための濾過を行い、粗生成のｉｖの水溶液を得て、その後クロマトグラフィーにより精製した（ｉｖ）を得る。化合物（ｖ）；ＴＨＦ中、ｎ，ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチル−クロロ試薬（１．１当量）のジイソプロピルエチルアミン（２当量）溶液で（ｉｖ）をホスフィチル化し、粗生成のｖｉを得て、その後クロマトグラフィーを行い、純粋なホスホルアミダイト（ｖ）を得る。
【０１４３】
３’−ＤＭＴ−Ｌ−リボヌクレオシドオリゴヌクレオチドの合成は、適切に環外アミンを保護したＬ−リボヌクレオシドを介して達成することができる。３’−ＤＭＴ−Ｌ−ｒ−Ｇ(ｎ−ｉｂｕ)−５’−ホスホルアミダイトの典型的な例を以下に示す：
【０１４４】
７−デアザ−リボヌクレオシドの合成は、３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｎ−保護−β−Ｌ−７−デアザ−グアノシン−５’−ホスホルアミダイトを介して達成することができる（スキーム２）：
【０１４５】
【化６５】
2013520438.tif 000067
【０１４６】
スキーム２：
Ｏ−アセチル−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−リボース（ｉｉ）を、１−アセチル−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｄ−リボースの合成と同様に合成した。Ｎ−イソブチリルグアニンは、まず、ビスシリルトリメチルアセトアミダイト（acetamidite）（ＢＳＡ；５当量）で処理して、シリル誘導体に変換する。その後、Ｌ−糖（ｉｉｉ）を、ＳｎＣｌ４（Ｓｎ（ＩＶ）塩化物）の存在下で、シリル化ｎ−イソブチリル−グアニンと融合させ、完全に保護された粗生成のトリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−Ｌ−グアノシンを生成した。この化合物を、シリカゲル（メッシュサイズ７０〜２３０；Ｍｅｒｃｋシリカゲル）を用いたカラムクロマトグラフィーで精製した。次に、完全に保護された精製中間化合物を、調整された加水分解条件下、２ＮのＮａＯＨのピリジン／メタノール（８０：２０）溶液で、２０分、５〜１０℃で選択的に加水分解し、続いて、反応混合物をＤｏｗｅｘ−ピリジニウムカチオン交換樹脂で中和し、５’，３’，２’−トリヒドロキシ−Ｌ−グアノシン（ｎ−ｉｂｕ）を生成した。粗生成化合物を酢酸エチル、続いてジエチルエーテルで洗い、溶媒と副生成物の安息香酸を除去し、純粋な５’，３’，２’−トリ−ヒドロキシ−Ｌ−グアノシン（ｎ−ｉｂｕ）を得た。次に、乾燥させた化合物を、ＤＭＴ−クロリド（ＤＭＴクロリド；１．２当量）の無水ピリジン（５’，３’，２’−トリヒドロキシ−Ｌ−グアノシン（ｎ−ｉｂｕ）に対して１０倍）溶液により、５℃で３〜４時間処理し、粗生成の５’−ＤＭＴ−２’，３’−ジヒドロキシ−Ｌ−グアノシン（ｎ−ｉｂｕ）（ｉｖ）を得た。これをシリカゲル（７０〜２３０メッシュ、Ｍｅｒｃｋ等級）カラムで精製した。純粋な画分をまとめ、純粋な５’−ＤＭＴ−２’，３’−ジヒドロキシ−Ｌ−グアノシン（ｎ−ｉｂｕ）（ｉｖ；トリヒドロキシ化合物からの収率７０〜７５％）を得た。２’及び３’−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシドの混合物を得るため、２’−シリル化を行い、これからカラムクロマトグラフィーによって純粋な５’−ＤＭＴ−２’−シリル−Ｌ−Ｇ（ｎ−ｉｂｕ）ヌクレオシド（ｖ）を分離した。この化合物から、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％溶液（ｖ／ｖ））を用いて、室温で１０分間処理して、ＤＭＴ基を選択的に除去した。反応混合物を、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液により０℃で反応停止し、中和して、粗生成の５，３’−ジヒドロキシ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−Ｇ−（Ｎ−ｉｂｕ）を得た。この化合物を、シリカゲル（７０〜２３０メッシュ；Ｍｅｒｃｋ等級）を用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、純粋な５’，３’−ジヒドロキシ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−Ｇ−（Ｎ−ｉｂｕ）を得た。この化合物を、塩化ベンゾイル（１．１当量；−１０〜０℃）により１．５時間処理して選択的５’−ベンゾイル化を行い、化合物（ｖｉ）を得た。この化合物を同様に精製し、純粋な５’−Ｏ−ベンゾイル−３’−ヒドロキシ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−Ｇ−（Ｎ−ｉｂｕ）（化合物ｖｉ）を得た。続いて、十分に乾燥させた化合物（ｖｉ）を、ＤＭＴ−クロリド（２．５当量；ピリジンｗ／ｖ；１：１０）と室温で２４時間反応させ、化合物（ｖｉｉ）を得た。精製した（ｖｉｉ）をシリカゲルカラム���ロマトグラフィーで精製した。その後、精製したｖｉｉを２ＮのＮａＯＨにより５℃で３０分間、選択的加水分解を行い、続いて反応混合物をＤｏｗｅｘ−ピリジニウムカチオン交換樹脂で中和し、５’−ＯＨ，３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−ｒＧ−ｎ−ｉｂｕ（化合物ｖｉｉｉ）を得た。粗生成化合物をシリカゲルカラム（７０〜２３０メッシュ、Ｍｅｒｃｋシリカゲル）クロマトグラフィーで精製した。純粋なｖｉｉｉを得るための次のクロマトグラフィーは、ＴＨＦ中、ｎ，ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチル−クロロ試薬（１．１当量）のジイソプロピルエチルアミン（２当量）溶液を用いたｖｉｉｉのホスフィチル化によって行い、粗生成のｉｘを得て、その後、クロマトグラフィーを行って純粋な５’−ホスホルアミダイト（ｉｘ）を得た。
【０１４７】
ヌクレオシド塩基には、脱塩基ヌクレオシドも含まれる。ＤＮＡの脱塩基部位は、糖分解結合が失われることにより、化学的又は酵素的に発生する。結果として生じるプリン／ピリミジン部位はコード情報を失い、ポリメラーゼによる塩基の誤取り込みにつながり、また、突然変異誘発に重要な役割を果たしている可能性がある。これらは最終的に、メチレン基で２’−デオキシリボースの１位が修飾されたテトラヒドロフラン誘導体に変換される。アミダイトを有する２デオキシ及び２−ヒドロキシ−Ｄ−リボースのＣＥホスホルアミダイトは、ともにすでに合成されている。逆方向ＲＮＡ修飾により、このようなＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、修飾ＲＮＡの効率的な合成が可能になる（Takeshitsa, M., et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 10171-10179；及び、Kalnik, M.W., et. al., Biochemistry, 1988, 27, 924-931を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１４８】
脱塩基ヌクレオシドは、３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｎ−保護ヌクレオシドホスホルアミダイトに同様に適用可能な方法により合成でき、以下のスキームで示される：
【０１４９】
【化６６】
2013520438.tif 000068
スキーム：１，１ジヒドロ−Ｄリボース−３−ＤＭＴ−２’−シリル−ホスホルアミダイト。化合物（ｉ）はＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．より入手；（ｉｉ）標準条件でＴＢＤＭＳクロリドの選択的導入を達成（この段階で形成される異性体は簡便に分離可能）；（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）５−ＤＭＴ基の選択的除去の後、５−位の選択的ベンゾイル化；（ｖ）ＤＭＴクロリド反応により３−位にＤＭＴを導入；（ｖｉ）５−位のベンゾイルを除去した後、リン酸化し、クロマトグラフィーで精製。
【０１５０】
ヌクレオシド塩基には、２−アミノプリンヌクレオシドも含まれる。２−アミノプリンは、その蛍光特性から、変異原性の研究のためのオリゴヌクレオチドに組み入れられる修飾核酸塩基類似体である。アデニン及びグアニンとの構造的類似性により、配列中のアデノシン又はグアノシンに代えて置換することで、酵素学研究における重要なツールとされている（Schmidt, S. et al., Nucleosides & Nucleotides, 14(6), 1445-1452, 1995；及びMcLaughlin, L.W. et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16, 5631参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。２−アミノプリンヌクレオシドの代表的構造の１つは、２−アミノプリン３’−ＤＭＴ−２’−シリル−５’−ホスホルアミダイトであり、以下の構造式で表される：
【０１５１】
【化６７】
2013520438.tif 000069
【０１５２】
ヌクレオシド修飾体：
５−ヒドロキシメチルウリジン及びシチジンは、本発明に含まれるヌクレオシド修飾体である。５’ヒドロキシメチル修飾体は、−ＯＡｃ（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３）によって保護され、５−アセトキシメチルシトシン及び５−アセトキシメチルウラシルを生成する。
【０１５３】
５−ヒドロキシメチルシトシンを含むオリゴデオキシヌクレオシドの固相合成及び制限酵素切断については、例えば、"Cytosine methylation and study of its effect"; Severine Tardy - Planechaud, June Fujimoto, Susan S. Lin and Lawrence C. Sowers; Nucleic Acids Research, Vol. 25, No. 3, 553-558(1997)などに記載されている（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１５４】
【化６８】
2013520438.tif 000070
【０１５５】
他の修飾核酸塩基としては、１，Ｎ６−エテノアデノシン、３，Ｎ４−エテノシチジン、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）ピレン修飾、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）ペリレン修飾、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）アクリレート−Ｃ−６アミノリンカー（ＴＦＡ保護）、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）アクリレート−Ｃ−２アミノリンカー（ＴＦＡ保護）、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）アクリレート−Ｃ−６アミノリンカー（ＦＭＯＣ保護）、５’−ＰＴ修飾因子担体、Ｃ−５ピレン−ｒ−ウリジン、Ｃ−５ペリレン−ｒ−ウリジン、（５，６）−ピロール−ｒ−シチジンが含まれる。
核酸塩基修飾体を含む本発明の代表的化合物を以下に示す：
【０１５６】
【化６９】
2013520438.tif 000071
【０１５７】
８−メチルグアノシン：８−メチルグアノシンが、オリゴヌクレオチドアプタマーの設計及びＺ  ＤＮＡ安定化剤に関して非常に有用な修飾体であるといういくつかの報告が発表されている。例えば、8-Methylguanosine: A Powerful DNA Stabilizer; Yan Xu, Reiko Ikeda and Hiroshi Sugiyama, J.AM.Chem. Soc. 2003, 125, 13519-13524 -13519を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。８−メチルグアノシンを含む本発明の代表的化合物の１つを以下に示す：
【０１５８】
【化７０】
2013520438.tif 000072
【０１５９】
５−アザシチジン：５−アザシチジンは、逆方向ＲＮＡシントンとしての利用が提案されている。５−アザ−シチジンは、周知の抗癌剤である。５−アザシチジンを含む本発明の代表的化合物の１つを以下に示す：
【０１６０】
【化７１】
2013520438.tif 000073
【０１６１】
２，６−ジアミノプリンリボシド；例として、Pasternak, A., Nucleic Acids Research 2007 35(12):4055-4063を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。該文献では、２，６−ジアミノプリンリボシドと組み合わせた２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド塩基の使用、並びに、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖の熱力学的特性に対する２，−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリン及びＬＮＡ−２，６−ジアミノプリンリボシドの影響が報告されている。
【０１６２】
核酸塩基保護基
核酸塩基の保護基は、当技術分野において公知である。例えば以下を参照：
【０１６３】
１．ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びｎ−イソブチリル保護基の利用に関して、RNA synthesis using phosphoramidites with Labile Base Protection: Users Bulletin, Applied Biosystems, Number 69, Instructions for 380B, 392 and 394 synthesizers（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１６４】
２．オリゴヌクレオチドプローブ及び修飾ＬＣＡＡ（長鎖アルキルアミノ）−ＣＰＧ（細孔制御ガラス）担体を含むリンカーの調製のための新たな反応中間体としてのＮ６フェノキシアセチルデオキシアデノシン誘導体の合成は、Edyta Krzymanska-Olejnik and Ryszard W. Adamiak, Nucleosides & Nucleotides, 10(1-3), 595-597 (1991)に記載されている（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１６５】
プロパルギル修飾オリゴヌクレオチドの合成に関しては、逆方向合成プロセスによって、２’−プロパルギル−３’−ＤＭＴ−５’−ホスホルアミダイトシントンを配列内に組み込むことができる。ホスホルアミダイトは、さらに、様々なレポータープローブを導入する試薬と反応することができるフリーなヘキシルリンカーを有する前駆オリゴヌクレオチドを得るために、２’−ヘキシン末端基を有していると考えられる。米国特許第５，７４４，５９５号、Srivastava, et al.を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０１６６】
【化７２】
2013520438.tif 000074
2013520438.tif 000075
【０１６７】
３．固相合成した、部分的にメチルホスホン酸で修飾したオリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成のために、容易に除去可能な２−（アセトキシ−メチル）ベンゾイル（ＡＭＢ）基を塩基保護基として用いることで固相合成した、部分的にメチルホスホン酸で修飾したオリゴデオキシ−ヌクレオチドの利用は、当技術分野において公知である。例えば、W.H.A. Kuijpers, et al., Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No.15 3493-3500を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。ＡＭＢ保護基は、メタノール・炭酸カリウム中で生成された。しかし、メチルホスホン酸結合の炭酸カリウム／メタノールに対する不安定性から、この脱保護試薬の使用は除外された。その後、別のＡＭＢ除去試薬として、飽和アンモニア・メタノール溶液が見出された。ＡＭＢ保護基とアンモニア／メタノールの脱保護試薬との組み合わせは、メチルホスホン酸修飾ＤＮＡフラグメントの合成を顕著に向上させることが実証された。室温で一晩、穏やかに処理することで、ＡＭＢ基の完全な除去が十分にでき、これに対し、従来法により保護したオリゴヌクレオチドは、より長時間、高温で塩基性条件にさらす必要がある。
【０１６８】
【化７３】
2013520438.tif 000076
（本発明者らの逆方向ＲＮＡシントンについて提案するＡＭＢ−保護核酸塩基）
【０１６９】
４．以下の核酸塩基保護基は、非常に有用であることが見出され、本発明者らの発明「N-pent-4-enoyl (PNT) Group As a Universal Nucleobase Protector」のモノマーの核酸塩基保護に取り入れられることが期待される。例えば、"Applications in the Rapid and Facile Synthesis of Oligonucleotides, Analogs, and conjugates", Radhakrishan P. et al., Tetrahedron, Vol. 53, No. 8, pp. 2731-2750, 1997を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。上記文献には、ＰＮＴヌクレオシドホスホルアミダイトをＰＮＴヌクレオシドＨ−ホスホン酸及びＰＮＴヌクレオシドホスホンアミダイトと共に用いた、アンチセンス薬としての欠失骨格オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）の合成、並びに、生物可逆的オリゴヌクレオチド複合体の調製におけるＰＮＴ基の利用が記載されている。
【０１７０】
ペンタ−４−エノイル基：新規アミン保護基；例として、Robert Madsen, Carmichael Roberts and Bert Fraser-Reid, J Org.Chem., 60, 7920-7926, (1995)を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。一級及び二級アミンをＮ−ペンタ−４−エノイル誘導体として保護することで、Ｎ−ペンタ−４−エンアミドが生成され、結晶性が高いことが見出された。脱保護は、ＴＨＦ水溶液中、３当量のヨードを用いて緩やかな条件で処理することで、迅速かつ効率的に行われた。脱保護に酸化剤が必要であるが、ｐ−メトキシベンジルエーテル及び硫化アルキルを含む酸化可能な官能基性は生じない。ペンタ−４−エノイル基を含む、本発明の代表的化合物の１つを以下に示す：
【０１７１】
【化７４】
2013520438.tif 000077
【０１７２】
環外アミン保護基としてのスクシニル基。環外アミン上のスクシニル基は、オリゴヌクレオチドの固相合成において、さらに誘導体化する／様々な担体を付着させるために利用することができる。スクシニル基を含む、本発明の代表的化合物の１つを以下に示す：
【０１７３】
【化７５】
2013520438.tif 000078
【０１７４】
さらに、３’，５’保護ヌクレオシドの環外アミンは、５’→３’方向の合成において、固体担体に付着可能なスクシンイミジル基によって、下記構造３などのように誘導体化することができる。
【０１７５】
【化７６】
2013520438.tif 000079
【０１７６】
逆方向ＲＮＡ合成プロセスを用いた、ロック核酸（登録商標）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド及びホスホルアミダイト（ＬＮＡ）ともよばれる）の取り込み：立体構造的に制限されたオリゴヌクレオチド類似体の新規のクラスである２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド及びホスホルアミダイト（構造１〜６）は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ配列に対して高い結合能を有することが示されている。多様な治療及び診断用途の合成ＤＮＡ、ＲＮＡ及びキメラ体の評価に向けて、現在、様々な２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド及びホスホルアミダイトの評価が行われている１−５。所定配列のオリゴヌクレオチドの合成に用いられる最も一般的なホスホルアミダイトシントンは、ＬＮＡ−Ｃ（ｎ−ｂｚ）−５’−ＤＭＴ−３’−シアノエチルホスホルアミダイト（１）、ＬＮＡ−Ｃ（ｎ−ａｃ）−５’−ＤＭＴ−３’−シアノエチルホスホルアミダイト（２）、ＬＮＡ−チミジン−５’−ＤＭＴ−３’−シアノエチルホスホルアミダイト（３）、ＬＮＡ−Ａ（ｎ−ｂｚ）−５’−ＤＭＴ−３’−シアノエチルホスホルアミダイト（４）、ＬＮＡ−Ｇ（ｎ−ジメチルホルムアミジン）−５’−ＤＭＴ−３’−シアノエチルホスホルアミダイト（５；Ｒ；ジメチルホルムアミジン）である。
【０１７７】
２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド及びホスホルアミダイトオリゴは、遺伝子調節、遺伝子発現、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、及び細胞へのＲＮＡの送達のためのオリゴヌクレオチドの設計や効率向上に役立つことが示されている。また、ＤＮＡ及びＲＮＡの安定性を高めることが示されている１−５。当技術分野で現在報告されている２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド及びホスホルアミダイトは、５’−ＤＭＴ及び３’ホスホルアミダイト官能基を有している（６）。
【０１７８】
【化７７】
2013520438.tif 000080
【０１７９】
これらのユニットをオリゴヌクレオチド及びシントンに有し、３’−ＤＭＴ及び５’ホスホルアミダイト（構造７）を構成する、当技術分野で報告されている本発明者らの発明において提案される２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシドの組込みは、本発明者らの発明による逆方向ＲＮＡ合成に従う。
【０１８０】
【化７８】
2013520438.tif 000081
【０１８１】
２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド及びホスホルアミダイトを含む、本発明の化合物を以下に示す：
【０１８２】
【化７９】
2013520438.tif 000082
【０１８３】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド−３’−ＤＭＴヌクレオシド、５’−ホスホルアミダイト、及び５’−担体の合成スキーム：
【０１８４】
【化８０】
2013520438.tif 000083
【０１８５】
以下の参考文献の内容は、参照により本明細書に取り込まれる：
１．A.A.Koshlin, S.K. Singh, P.Nielsen, V.K.Rajwanshi, R.Kumar, M. Meldgaard, C.E. Olsen and J. Wengel, Tetrahedron, 1998m54, 3607-3630
２．S.K.Singh, P.Neilsen, A.A. Koshkin, and J. Wengel, Chem.Comm., 1998, (4), 455-456
３．D.A.Braasch, D.R.Corey, Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510
４．J.S.Jespen, M.D.Sorensen, and J. Wengel, Oligonucleotide, 2004, 14, 130-146
５．B.Vester and J. Wengel, Biochemistry, 2004, 43, 13233-41
６．S.Obika, D.Nanbu, Y. Hari, J-i Andoh, K-i Morio, T. Doi, T. Imanashi, Tet. Lett, 39 (30), 5401-4, 1998
【０１８６】
オリゴヌクレオチドへの糖の導入
糖
本発明の化合物は、例えばリボース又はアラビノースを含んでいてもよい。アラビノースヌクレオシドは、リボースヌクレオシドに関して説明したものと同様の方法により作製することができる。合成の例を以下のスキームに示す：
スキーム：２’−アラビノース逆方向アミダイト合成：
【０１８７】
【化８１】
2013520438.tif 000084
【０１８８】
３’ヒドロキシ基の保護：
一連のトリアリールメチル基は、これまでに、デオキシヌクレオシドの５’−ヒドロキシ保護基として研究され、オリゴヌクレオチド合成におけるトリチルの除去に関して評価が行われていた。得られた異なる色のカチオンは、比色観察及びオリゴ合成に用いられたヌクレオシドの識別に非常に有用であった（"Color coded triarylmethyl protecting groups useful for deoxypolynucleotide synthesis"; E.F. Fisher and M.H. Caruthers, Nucleic Acids Research, Vol. 11, 5, 1589-1599 (1983)を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。本発明で用いられるトリアリールメチル基には、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アニシル−１−ナフチルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、及びｐ−トリルジフェニルメチルが含まれる。
【０１８９】
また、トリアリールメチル３’ヒドロキシ保護基は下記式で表され；
【０１９０】
【化８２】
2013520438.tif 000085
式中、
【化８３】
2013520438.tif 000086
は３’酸素原子への結合を示し、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは独立して以下の構造式から選択される：
【０１９１】
【化８４】
2013520438.tif 000087
【０１９２】
３’ヒドロキシ保護剤としてのテトラヒドロピラニル及びメトキシテトラヒドロピラニル基、並びに酸性条件下での除去。例として、"Synthesis of oligonucleotides with sequences identical with or analogous to the 3'-end of 16 S ribosomal RNA of E coli: preparation A-C-C-U-C-C via modified phosphotriester method"; J.H.van Boom, P.M. J. Boom, P.M.J. Burgers, G. van der Marel, C.H.M. Verdegaal and Mrs. G. Willeを参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。１つの代表的な３’メトキシテトラヒドロピラニル基を以下に示す：
【０１９３】
【化８５】
2013520438.tif 000088
【０１９４】
リン酸保護基（Ｒ３で表す）
本明細書において、「リン酸保護基」とは、本発明の分子中に存在する場合、オリゴヌクレオチドの形成の後に脱離する部分を意味する。例えば、リン酸部分はシアノエチル保護基で保護することができる。ヌクレオチド間リン酸形成のためのシアノエチル保護基は、β脱離機構によって脱離し、アクリロニトリル及びホスホジエステルオリゴヌクレオチドがもたらされることは、周知である（スキーム３）。
【０１９５】
スキーム３．塩基：Ｂを介したシアノエチルリン酸基の脱離
【０１９６】
【化８６】
2013520438.tif 000089
【０１９７】
リン酸保護基には、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ５、又は−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３が含まれ、そして、Ｒ４は−−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ５）３である。その他のリン酸保護基も当技術分野で公知であり、（２−アセトキシフェノキシ）エチル（ＡＰＯＥ）（Cheruvallath, Z.S., et. al; Org. Process Res. Dev., 2006, 10 (2), pp 251-256を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）、及び、２−ベンズアミドエチル基（Guzaev AP, J Am. Chem. Soc. 2001 Feb 7;123(5):783-93を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）が含まれる。
【０１９８】
２’−ブロッキング基は、下記の構造式で表される２−Ｏ−無水核酸塩基である：
【０１９９】
【化８７】
2013520438.tif 000090
【０２００】
３’官能基
本発明は、高純度のＲＮＡの合成、具体的には合成ＲＮＡのオリゴヌクレオチドの３’−末端に選択した基を導入することを目的としている。このようなＲＮＡ分子は、治療学、診断学、薬剤設計、及び細胞環境内でのＲＮＡ配列の選択的阻害による細胞内に存在する異なる種類のＲＮＡの機能遮断などに適用することができる。
【０２０１】
オリゴヌクレオチドは、哺乳類細胞で非常に容易に取り込まれることが確認されている。取り込みは、核集積を引き起こすことが確認されている。脂溶性分子をオリゴヌクレオチドに付加すると、取り込みの特性が大幅に向上することが確認されている。具体的には、コレステロールとポリ−Ｌ−リジンの付加について詳細な研究が行われている。
【０２０２】
その他のＲＮＡ複合体には、ペプチド−ＲＮＡ複合体が含まれる。ペプチド転移ＲＮＡ分子は、リボソーム内で起きるタンパク質の生合成、及び遺伝子コードから機能性タンパク質への翻訳における重要な分子である。これらは、一般的に、ＲＮＡを固定して区分化する上で重要な役割を果たし、リポソーム中に集まっている（Lazar, A. et al., International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, IRT-XVII, Sep 3-7, 2006, page 47, Bern, Switzerlandを参照；参照によりその内容が本明細書に取り込まれる）。
【０２０３】
これらの官能基のペプチド付加は、一般的に３’−末端で起こり、「３’官能基」と呼ばれる。
【０２０４】
本明細書において、「３’官能基」とは、ＲＮＡ分子の３’末端に付加した部分を意味する。本明細書に記載する逆方向合成方法は、オリゴヌクレオチド鎖の末端に、ある部分を付加する。３’官能基は、脂肪酸やコレステロールなどの脂質、ステロイド、ペプチド、酵素、標識（蛍光、化学発光、又は放射標識の部分を含む）などを含んでもよい。
【０２０５】
３’官能基は、以下に示すホスホルアミダイトリンカーの反応によって導入されてもよい：
【０２０６】
１．ＲＮＡへの３’官能基の付加により、両親媒性の３’−ペプチジル−ＲＮＡ複合体を得る。このような分子は、天然ペプチド−トランスファーＲＮＡによく似ている。このようなＲＮＡの合成は、上記参照の著者らによって固体担体上で実施されている。ＲＮＡは、様々なペプチドとのアミド結合によって、１つのペプチドに連結される。例えば、下記の構造式で表される化合物は、本明細書に開示する逆方向合成方法を用いて、３’末端に付加させることができる：
【０２０７】
【化８８】
2013520438.tif 000091
【０２０８】
２．ＲＮＡの３’−末端へのビオチンの付加
ビオチンアミダイトを介した３’−ビオチン付加は、単一の工程で可能であり、ビオチンＣＰＧは使用しない。一般的に、高純度のオリゴヌクレオチドを得るため、固相オリゴヌクレオチド合成によるビオチン付加に、保護されたビオチンアミダイトが用いられる。「保護ビオチン」は当技術分野で公知である。例えば、U. Pieles, B.S. Sproat and G. M. Lamm, Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 15, 4355 (1990)を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。本発明において用いることができる代表的な保護ビオチンの１つを以下に示す：
【０２０９】
【化８９】
2013520438.tif 000092
【０２１０】
３．３’官能基のためのジスルフィドリンカー
本発明者らによる発明のオリゴヌクレオチドは、−ＳＨ基を作ることができるジスルフィドリンカーによって、３’−末端で誘導体化することができる。続いて、末端ＳＨ官能基又は活性化スルフィドを有する酵素とカップリングすることで、ジスルフィド結合オリゴ−酵素複合体が得られる。代表的なジスルフィドリンカーの１つを以下に示す：
【０２１１】
【化９０】
2013520438.tif 000093
これらのジスルフィドリンカーホスホルアミダイトは、オリゴヌクレオチドの３’−末端に簡便に付加することができる。リン酸を介して３’−末端に付加された付加ジスルフィドは、その後、当技術分野で公知のスルフィドカップリング又は交換反応によって、様々なペプチド、酵素と結合することができる。
【０２１２】
３’−チオール修飾の付加に関しては、容易に利用できるアミダイト、すなわちＣ−３ジスルフィド、Ｃ−６ジスルフィドからの３’−ジスルフィドを用いることができる。フリーなスルフヒドリル基を含むオリゴヌクレオチド、及びその後のチオール特異的プローブの付加についてはすでに示されており、３’末端へのチオ基の付加に変更することができる（Connolly, B.A. NAR, 13, 12, 4485, 1985を参照；参照によりその内容が本明細書に取り込まれる）。５’−末端にフリーなスルフヒドリル基を含むオリゴヌクレオチドプローブは合成されており、チオ特異的プローブによるさらなる誘導体化も行われている。Ｓ−トリフェニル−Ｏ−シアノエチルホスホルアミダイト−２−メルカプトエタノール及び他のアルキル鎖は合成可能で、オリゴヌクレオチドの３’−末端に取り込むことができる。
【０２１３】
４．複数の基を付加するための３’−分枝リンカー
核酸アッセイのシグナル増幅マルチマーとしての分枝オリゴヌクレオチドの合成は、T. Horn, et al., Nucleotides and Nucleotides, 895&6,) 875-877 (1989)に記載されている（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２１４】
酵素プローブは、"Highly sensitive detection of DNA using enzyme linked DNA- probes using colorimetric and fluorometric detection", Akira Murakai, et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, No.14, 5587 (1989) に記載されている（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２１５】
分枝ホスホルアミダイトは、オリゴヌクレオチド末端に付加することができる。分枝ホスホルアミダイトは、様々なレポーター分子、発色団、酵素、リガンド、ポリエチレングリコール、ペプチド、又は本明細書に記載するその他の３’官能基の付加に用いることができる。分枝オリゴヌクレオチドは、糖の３’−ヒドロキシを下記構造式の化合物と反応させることで作製される：
【０２１６】
【化９１】
2013520438.tif 000094
ＤＭＴ保護基は、本明細書に記載する他の適切なヒドロキシ保護基で置換することができる。オリゴヌクレオチドの３’−末端への対称分枝アミダイトの付加は、その後、リガンドによって修飾することができる。これらは、様々なレポーター分子、発色団、酵素、ジスルフィド結合、リガンド、ポリエチレングリコール、ペプチドなどの付加に利用することができる。熱量測定や蛍光定量の検出には、単一又は複数ユニットの酵素を付加することができる。
【０２１７】
このような分枝アミダイトは、オリゴヌクレオチド３’−末端への付加に非常に大きな可能性をもたらす。代表的な化合物としては以下のものが含まれる：分枝アミダイト（Ｉ）：
【０２１８】
【化９２】
2013520438.tif 000095
（分枝アミダイトＩ）；（配列番号５）
分枝アミダイト（Ｉ）は、オリゴヌクレオチドの３’−末端に付加したＤＭＴ基を置換した後のポリエチレングリコールの付加を示す。このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＡＧＥ分析により精製及び解析されている（図１２）。
【０２１９】
また、オリゴヌクレオチドの３’−末端への付加には、膨大な数の応用が可能である。コレステロールや、Ｃ−１８、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールなどの長鎖脂肪族鎖などの大きな分子は、ＲＮＡの３’−末端に直接カップリングによって付加することができる。
【０２２０】
ＰＥＧ２０００アミドやＰＥＧ４０００アミダイトなど、ＲＮＡの３’−末端へのポリエチレングリコールの付加が達成されている。
【０２２１】
ＳｉＲＮＡのセンス鎖（３’−末端）のオーバーハングの修飾は、アンチセンスＳｉＲＮＡ鎖が標的認識を誘導するため、標的ｍＲＮＡの認識には影響しないと考えられる。ＳｉＲＮＡの送達を向上するための有用な修飾の設計が可能である。
【０２２２】
蛍光、化学発光、及び酵素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた、非放射性同位体ハイブリダイゼーション分析方法や診断への適用が、当技術分野で公知である（Urdea, M. et al., NAR, 16, 11, 1988を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。また、放射性標識のポリヌクレオチドプローブは、特異的ハイブリダイゼーションによる相補的核酸の検出に幅広く応用されている。本明細書に開示する逆方向合成方法は、長鎖オリゴヌクレオチド（１００個の塩基を含むものなど）の標識に用いることができる。本明細書に開示する逆方向合成方法により付加できる標識としては、例えば、フルオレセイン；テキサスレッド；ローダミン；イソルミノールなどの化学発光分子；西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素；アルカリホスファターゼ標識；及び酵素が含まれる。
【０２２３】
２’置換基
２’シリルエーテルは広く開発が行われ、優れた安定性を有することが知られている。シリルエーテルの加溶媒分解は広く研究され、高分子のアルキルシリルエーテルは高い安定性を有することが知られている；（Bazani, B. and Chvalowski, V., Chemistry of Organosilicon Compounds, Vol. 1, Academic Press, New York, 1965を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。その後、Ogilvieらにより、オリゴリボヌクレオチド合成のための２’−ヒドロキシ保護基として、詳細な研究が実施された（Ogilvie, K.K., et al., Tetrahedron Letters, 15: 2861-2864, 1974；及びOgilvie, K.K., et al.. J Carbohydrate Nucleosides Nucleotides, 3: 197-227, 1976；Ogilvie, K.K. Proceedings of the 5th International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications, Rideout, J.L., Henry , D.W., and Beacham L.M., III, eds., Academic, London, pp. 209-256,1983を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２２４】
リボヌクレオシドの２’−ヒドロキシル上のｔ−ブチルジメチルシリル保護基は、３’−ホスホルアミダイトの作製、及び、オリゴヌクレオチド合成への利用に最適な基とされており、３’−ヒドロキシル位に非常に容易に移動することが示されている（Ogilvie, K.K., and Entwistle, D.W. Carbohydrate Res., 89; 203-210, 1981；及びWu, T., and Ogilvie, K.K. J. Org. Chem., 55: 4717-4734, 1990を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。このような移動は、所望のホスホルアミダイトの合成を複雑化し、対応する異性体をきれいに分離して最終モノマーの混成を防ぐ効率的な方法が必要とされている。一方、３’ヒドロキシルへの移動は、逆方向（５’→３’）合成では要因とならない。
【０２２５】
代表的な２’アミノ保護基は、以下の構造式で表される化合物を含む：
【０２２６】
【化９３】
2013520438.tif 000096
【０２２７】
２’−フルオロ−３’−ＤＭＴ−ヌクレオシド−５’−ホスホルアミダイト
２’−フルオロ置換基は、下記の提案する３’−ＤＭＴ−２’−フルオロ−Ｎ−保護−ヌクレオシド−５’−ホスホルアミダイトの合成により取り込むことができる：
【０２２８】
【化９４】
2013520438.tif 000097
【０２２９】
また、２’−フルオロ置換基は、下記の提案する２’−フルオロ−３’−ＤＭＴ−Ｎ−保護（短時間で脱保護する基を用いる）ヌクレオシド−５’−ホスホルアミダイトの合成により取り込むことができる：
【０２３０】
【化９５】
2013520438.tif 000098
【０２３１】
選択的５’−レブリニル保護に続いて結晶化を行い、化合物（ｉｉ）を得る；ＤＭＴ−Ｃｌ反応により化合物（ｉｉｉ）を得て、続いてアンモニアと４〜５分間反応させて化合物（ｉｖ）を得る。その後、標準的なホスフィチル化の化学プロセスにより５’−ホスホルアミダイトを合成して（ｖ）を得ることができる。
【０２３２】
標準的なＪｏｎｅｓプロセスは、２’−アラビノースフルオロヌクレオシド（ＦＡＮＡ）の調製にも用いることができる。このプロセスは以下を含む：（ｉ）を（ｉｉ）に変換する工程；ａ；ＴＭＳクロリドによる過渡保護；続いてフェノキシアセチルクロリド／ピリジンと反応；ｂ；アンモニア水溶液で２〜４分間処理してＴＭＳ基を選択的に除去；ｃ；フェノキシアセチル保護−２’−フルオロヌクレオシドを結晶化。
【０２３３】
ヌクレオシドの糖部分の２’−フルオロ修飾（２’−リボフルオロ−２’−デオキシ又は２’−アラビノフルオロ−２’−デオキシ−ヌクレオシドのいずれか）（ＦＡＮＡ）は、アンチセンス、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどの様々なクラスのＤＮＡ及びＲＮＡの設計に、重要な用途を有することが見出されている。これらのユニットをオリゴヌクレオチドに選択的に導入するには、固相オリゴヌクレオチド合成の後に、慎重な脱保護が必要となる。アンモニア脱保護を荒く行った場合、オリゴヌクレオチドの脱ピリミジン化が起こり、糖部分からフッ素が失われることが実証されている。従って、オリゴヌクレオチド内のすべての修飾ヌクレオシドユニットが、緩和な塩基脱保護に適合するような、ヌクレオシドの環外官能基の最適化された保護基の開発が、全般的に必要とされている。
【０２３４】
そのため、フルオロヌクレオシドユニットからフッ素が失われることを最小限に抑えるために、ＦＭＯＣ、フェノキシアセチル、第三級ブチルフェノキシアセチル（ｔ−ＢＰＡＣ）、イソプロピルフェノキシアセチル（ｉｓｏＰｒＰＡＣ）及び、窒素がアセチルで保護されたグアノシンＮ−２（Ｎ−アセチルグアノシン）などのいくつかの保護基が利用されている。そのため、逆方向ＲＮＡ合成ユニットは、不安定な保護基で保護されている必要があり、これにより、オリゴヌクレオチド合成後に緩和な脱保護条件で除去することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡ合成における当技術の現状では、同様に、シアノエチルホスホルアミダイトの化学反応などの緩和なリン酸脱保護基が用いられている。
【０２３５】
ＦＭＯＣ保護基の脱保護は、様々な非常に緩和な塩基性反応条件で実施されている。（Heikkila, J. and Chattopadhyaya, J., Acta Chem. Scand. B 37, No.3, 263-265, 1983を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。）ＦＭＯＣ保護基の求核性置換が起きるアンモニア水条件の脱保護か、以下に示すような、ＦＭＯＣ−活性水素基のＢ−脱離が起きるトリエチルアミンなどの非求核性塩基による方法のどちらも用いることができる：
ＦＭＯＣ−β−脱離の機構
【０２３６】
【化９６】
2013520438.tif 000099
【０２３７】
従って、オリゴヌクレオチドからのＦＭＯＣ保護基を除去する条件は調節することができ、塩基保護基としてのＦＭＯＣは、β−脱離のプロセスにより、シアノエチル基を除去するβ−脱離プロセスと同様にして、取り除くことができる。例えばフェノキシアセチル基又はアルキル化フェノキシアセチル基などを含む他の保護基も、本明細書に記載する逆方向合成方法に用いることができ、高純度の脱保護オリゴヌクレオチドを生成することができる。
【０２３８】
そのため、本プロセスは、アンモニアを含まないオリゴ合成の利用に対して非常に魅力的な可能性をもたらす。さらに、本プロセスは、固体担体上のオリゴの完全な脱保護に向けたデオキシオリゴヌクレオチドを提供する可能性も有する。本技術又はプロセスは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ，ＲＮＡチップのための高純度オリゴヌクレオチドだけでなく、チップを用いた技術に必要とされるようなリボヌクレオチドも提供する可能性を有する。
【０２３９】
従って、これらの塩基保護基は、シアノエチルリン酸保護基とともに、合成したデオキシオリゴヌクレオチド及びリボオリゴヌクレオチドから担体上で、好適には非水性塩基を用いて、Ｎ−保護基及びシアノエチル基の両方を完全に取り除く可能性を提供し、多くの診断用途を支援する。
【０２４０】
ＦＭＯＣ保護基は、ペプチド合成において非常によく確立されており、段階的ペプチド合成におけるアミノ酸のα−アミノ基のアミノ基保護に関して好適な試薬の１つである（Carpino, L.A., and Han, G. Y., J. Amer. Chem. Soc., 92: 5748, 1970を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。別のＮ−保護基は、シチジン、アデノシン、グアノシン、及び対応する２’−デオキシリボヌクレオシドのアミノ官能基を保護する２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）である（J. Heikkila, J. et al., Acta Chem. Scand B 37: 857-864, 1983を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。ＮＰＳの環外アミンへの付加は、下記の構造式で表される：
【０２４１】
【化９７】
2013520438.tif 000100
【０２４２】
ホスホルアミダイト
ジアルキルアミノホスホルアミダイトを用いたＲＮＡ合成におけるヌクレオチド間ｎ結合の形成に関する研究；G. Gasparutto, D. Molko & R. Teoule, Nucleosides & Nucleotides, 9(8), 1087-1098 (1990)、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。オリゴヌクレオチド合成においてテストした様々な５’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｕ−３’−ｎ，ｎ−ジアルキルアミノシアノエチルホスホルアミダイトのうち、ｎ，ｎ−ジエチル及びｎ−エチル，ｎ−メチルアミノ保護が、４分間のカップリングによるｒＵのホモポリマーを形成した際に、平均９７％の最も良いカップリング結果を示すことが、上記著者らにより見出された。例えば、５’ジエチルアミノ−シアノエチルを、本明細書に開示する発明に用いることができる。
【０２４３】
クリックケミストリーを用いた逆方向ＲＮＡ合成プロセスによる２’又は３’官能基の付加
第一銅を触媒とした、アジドと末端アルキンとのヒュスゲン１，３−双極性環化付加は、クリックケミストリーで用いられるクリック反応の確立された例である（Broggl, J., et al., International Round Table Conference on Nucleosides, Nucleotides and Nucleicv acids, Sep 3-7, 2006, Bern, Switzerland, , p. 348を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２４４】
本発明の３’−ＤＭＴ−２’−アルキン−５’−ホスホルアミダイト化合物は、ＲＮＡの３’−末端の修飾及び様々な高分子の付加の更なる優位性をもたらすと考えられる。逆方向ＲＮＡ合成プロセスは、固相オリゴヌクレオチド合成において、オリゴの３’−末端及び内部位置での様々な修飾の導入を可能にすると考えられる：
【０２４５】
【化９８】
2013520438.tif 000101
【０２４６】
５’−固体担体を用いて、逆方向アミダイト、すなわち３’−ＤＭＴ−２’−アルキン−５’−ホスホルアミダイトのオリゴ合成が起きる。発色団、リガンド、生物学的に重要なポリペプチド、コレステロール、及びポリエチレングリコールなどの高分子は、クリックケミストリーによって位置特異的に付加することができる：
【０２４７】
【化９９】
2013520438.tif 000102
【０２４８】
固相担体上でのクリックケミストリープロセスでは、すべての反応物が取り除かれたクリーンな環化付加生成物が得られ、続いてオリゴヌクレオチドの遊離が起こる。修飾体には、分子センサーに用いられ、「クリックケミストリー」によりオリゴヌクレオチドに付加される高効率のクエンチャー色素が含まれる。クリックケミストリーで用いることができる、本発明の化合物のための提案する合成を、以下のスキームに示す：
【０２４９】
【化１００】
2013520438.tif 000103
【０２５０】
コンビナトリアル「クリックケミストリー」のための構成要素が開発されている；複数サイクルのクリック反応を行い、様々な発色団及び他の高分子を単一又は複数ユニット有するオリゴヌクレオチドを生成する。本発明者らは、固体担体を用いたオリゴヌクレオチド自動合成で高純度のＤＮＡ／ＲＮＡベースのプローブを合成するための「クリック」反応に向けた、触媒による１，３−環化付加の効率を向上させた。また、分子センサーに用いられ、クリックケミストリーによりオリゴヌクレオチドに付加される、新規の高効率のクエンチャー色素の開発も行った。
【０２５１】
以下の引用文献は、参照によりその内容が本明細書に取り込まれる：
１．V. V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599
２．A. V. Ustinov, et al., Tetrahedron, 2007, 64, 1467-1473
３．Agnew, B. et al., 米国特許出願第２００８００５０７３１／Ａ１号
４．X. Ming, P.Leonard, D. Heindle and F. Seela, Nucleic Acid Symposium Series No. 52, 471-472, 2008
５．Srivastava, S. et al., 米国特許第５，７４４，５９５号
６．M. Manohoran, K. L. Tivel, and P. D. Cook, Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651-3654
７．G. S. Rule, J. Frim, J. E. Thompson, J. R. Lepock, and J. Kruuv, Cryobiology, 1978 15, 408-414
８．C. J. Yu, Y. Wan, H. Yowanto, J. li, C. Tao, M. D. James, C.L. Tan, G. F. Blackburn, and T.J. Meade, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 11155-11161
【０２５２】
ＲＮＡの３’−末端へのビオチン付加
一般的に、保護されたビオチンアミダイトは、高純度のオリゴヌクレオチドを得るために、固相オリゴヌクレオチド合成によるビオチンの付加に用いられる。「保護ビオチン」は当技術分野で公知である（U. Pieles, B.S. Sproat and G. M. Lamm, Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 15, 4355 (1990)を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２５３】
【化１０１】
2013520438.tif 000104
【０２５４】
３’−ヒドロキシの保護：
１．別のトリアリールメチル保護基：例えば、"Color coded triarylmethyl protecting groups useful for deoxypolynucleotide synthesis"; E.F. Fisher and M.H. Caruthers, Nucleic Acids Research, Vol. 11, 5, 1589-1599 (1983)を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。報告されているトリアリールメチル基としては、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アニシル−１−ナフチルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシル−１−ナフチルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｏ−アニシルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、ｐ−トリルジフェニルメチルが含まれる。別のトリアリールメチル保護基は、下記の構造式で表される：
【０２５５】
【化１０２】
2013520438.tif 000105
式中、
【化１０３】
2013520438.tif 000106
は３’酸素原子への結合を示し、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは独立して以下の構造式から選択される：
【０２５６】
【化１０４】
2013520438.tif 000107
【０２５７】
２．保護剤としてのテトラヒドロピラニル基及びメトキシテトラヒドロピラニル基の利用と、３’−保護基のための酸性条件下での除去。この保護基は酸性条件下で除去することができる。例えば、"Synthesis of oligonucleotides with sequences identical with or analogous to the 3'- end of 16 S ribosomal RNA of E coli: preparation A-C-C-U-C-C via modified phosphotriester method"; J.H.van Boom, P.M. J. Boom, P.M.J. Burgers, G. van der Marel, C.H.M. Verdegaal and Mrs. G. Willeを参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。メトキシテトラヒドロピラニルを含む、本発明の代表的な化合物の１つを以下に示す：
【０２５８】
【化１０５】
2013520438.tif 000108
【０２５９】
逆方向ＲＮＡ法の優位性
本発明者らは、ＢＴＴを活性化剤として用いて、カップリング時間２分で完全長オリゴを合成した。得られた粗生成オリゴの純度は、ＨＰＬＣで７８．９５％であった。ＥＴＴを活性化剤として用いて、カップリング時間４分で行うことも可能で、得られた粗生成オリゴの純度は８９．０９％であった。逆方向プロセスによる粗生成オリゴの純度は、通常９０％の範囲である。本発明者らは、逆方向ＲＮＡ法を大規模合成（１２ｕｍｏｌスケール）に用いて、カップリング時間６分で同様の結果を得た（粗生成オリゴは約９２％、精製オリゴは約９８％）。本発明者らは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエート／ホスフェート混合骨格鎖を、カップリング効率やオリゴヌクレオチドの質を低下させることなく合成することができた。一方、従来（３’→５’）方向の合成では、粗生成オリゴの純度は８０％の範囲であり、純度を約９０％に高めるためにはいくつかの精製工程が必要となる。従来のＲＮＡ合成では、所望のバンドの両側に不純物が生じる。逆方向ＲＮＡ合成では、カップリング時間２分でもＮ＋１不純物が一切生じず、ＨＰＬＣによる追跡では、ピークの右側は極めて直線的である。以前は、逆方向ＲＮＡ合成；５’→３’は、オリゴヌクレオチドの粗生成純度が、ＨＰＬＣで約８０％であった。現在、逆方向ＲＮＡ合成；５’→３’は、おそらく、モノマーシントンの純度の向上、及び／又は、ＥＴＴを活性化剤として用いることでカップリング時間が１０分から４分に短縮されたことにより、粗生成オリゴの純度は９０％程度である。
【０２６０】
逆方向ＲＮＡ合成方法を用いた、オリゴヌクレオチドへの発色団及びクエンチャー色素の付加の代表的例：
１．２’−プロパルギルシントン及びアジド結合クエンチャー色素（ＣｈｅｍＧｅｎｅが所有するクエンチャービスアゾ色素）を用いた逆方向ＲＮＡ合成：
【０２６１】
【化１０６】
2013520438.tif 000109
２．２’−プロパルギルシントン及びアジド結合発色団（６−ＦＡＭ）を用いた逆方向ＲＮＡ合成（複数内部組み込み）：
【０２６２】
【化１０７】
2013520438.tif 000110
２．２’−プロパルギルシントン及びアジド結合発色団（フェロシン（Ferrocine））を用いた逆方向ＲＮＡ合成；３’−末端付加
【０２６３】
【化１０８】
2013520438.tif 000111
４．２’−プロパルギルシントン及びアジド結合発色団（６−ＦＡＭ）を用いた逆方向ＲＮＡ合成（単一内部組み込み）：
【０２６４】
【化１０９】
2013520438.tif 000112
【０２６５】
リンカー（Ｌ）は２工程のプロセスで付加することができる。（ａ）３’−末端塩基が、簡便に除去されてフリーな３’−ヒドロキシル基を生じる保護基を有する、（ｂ）スクシンイミジルカーボネートによりフリーな３’−ヒドロキシル基を活性化し、続いてスクシンイミジルカーボネートとアミン末端リンカーの反応により構造２を得る。構造１は、ホスホルアミダイト官能基を有するリンカーとの最終的なカップリングにより得られる。
【０２６６】
【化１１０】
2013520438.tif 000113
【０２６７】
リンカー、発色団のリスト（Ｌ１及びＬ２と呼ぶ）
Ｌは、ヌクレオシドに付加されたリンカー、発色団、蛍光色素、蛍光ヌクレオシド、蛍光分子に由来し、またホスホルアミダイトとして結合することができ、又はＮＨＳエステルなどの活性エステルに由来することができる。リストには以下のものが含まれる：
【０２６８】
３’−末端又は内部位置でのオリゴのさらなる誘導体化のための官能基；
アミノ修飾因子Ｃ−３、アミノ修飾因子（Ｃ−６）、アミノ修飾因子Ｃ−１２、
アミノ修飾因子Ｃ−５−ｄＵ、アミノ修飾因子Ｃ−５−ｄＵ、３’−チオール修飾因子（Ｃ−６スペーサー）、チオール修飾因子（Ｃ６−ジスルフィド）、カルボキシ修飾因子（及びスペーサー）、カルボキシ修飾因子（Ｃ−１０スペーサー）、Ｃ−８（アミノ修飾因子−Ｃ６−スペーサー）−ｒ−アデノシン、ＦＭＯＣ保護アミノ修飾因子−５−ｒシチジン（スペーサー）、ＦＭＯＣ保護アミノ修飾因子−Ｃ−５ウリジン（スペーサー）、３’−チオール修飾因子（Ｃ−３スペーサー）ジスルフィド
【０２６９】
オリゴヌクレオチドの３’−化学リン酸化
ホスフェート−オン−リン酸化試薬（スルホニルジエタノールモノＤＭＴ、モノホスホルアミダイト）、ビスシアノエチルリン酸化試薬
【０２７０】
オリゴヌクレオチドへの３’−アルデヒド付加：
３’−アルデヒド修飾因子Ｃ−２スペーサー、ホルミルインドール
【０２７１】
オリゴヌクレオチドへのスペーサー付加：
オリゴヌクレオチドの３’−末端と、ペプチド、アミノ酸、発色団、ポリエチレングリコール、非対称ダブラー（doubler）、対称ダブラー、長鎖トレブラー（trebler）、トレブラーなどのその後の付加との間にスペースを生じさせる
【０２７２】
配列上の３’末端又は配列内での発色団、色素の付加：
本発明のプロセスにより合成したオリゴヌクレオチドの内部位置又は３’−末端への発色団、色素及びスペーサーの付加は、簡便に行うことができる；
ダブシル及びスペーサー、ダブシル−Ｃ−５ウリジン又は２’−デオキシウリジン、ビオチン及びスペーサー、ビオチン及びテトラエチレングリコールスペーサー、ビオチン−Ｃ−５デオキシチミジン、ビオチン−Ｃ−５ウリジン、ビオチン（テトラエチレングリコールスペーサー）、５−（スペーサー）フルオレセイン、６−（スペーサー）フルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−（スペーサー）ヘキサクロロフルオレセイン、５−（スペーサー）テトラクロロフルオレセイン、６−（スペーサー）ヘキサクロロフルオレセイン、６−（スペーサー）テトラクロロフルオレセイン、フルオレセイン−Ｃ−５デオキシチミジン、フルオレセイン−Ｃ−５−ｒＵ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）（ｃｙ色素は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃの登録商標；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ｅｐｏｃｈ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｅｐｏｃｈ  Ｋｏｋｉｍｏ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、Ｅｐｏｃｈ  Ｇｉｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｅｐｏｃｋ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｅｃｌｉｐｓｅ色素はＥｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．の登録商標）、ＢＨＱ−０（登録商標）、ＢＨＱ−１（登録商標）、ＢＨＱ−２（登録商標）、ＢＨＱ−３（登録商標）（ＢＨＱ色素はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．の登録商標）。
【０２７３】
その他の様々な色素付加、例えば、Ｃ−５ピレン−ｒ−ウリジン、Ｃ−５ペリレン−ｒ−ウリジン、（５，６）−ピロール−ｒ−シチジン、スペーサーに付加したアクリジン色素、スペーサーに付加したジニトロフェニルアミン、３−ＯＨを介してスペーサーに付加したコレステロールテトラエチレングリコール、フラン環を介してスペーサーに付加したソラレン、スペーサーを介して付加したエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ピューロマイシン。
【０２７４】
その他のリンカーとしては、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）アクリレートビオチン、Ｃ−５（ｒＵ及びｒＣ）フルオレセイン、６−ＦＡＭ、５−ＦＡＭ、Ｔａｍｒａ、ローダミン、アクリレートが含まれる。
【０２７５】
活性化剤の使用。本発明の５’−ホスホルアミダイトとヒドロキシ基との間にオリゴヌクレオチド結合を形成する方法におけるカップリングの工程で、活性化剤を添加することができる。活性化剤は選択されたもので、アミダイト窒素の活性化及びその後のプロトン化を行うことができる。活性化剤は、テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、エチルチオテトラゾール、ジシアノジイミダゾールから選択される。ヒドロキシル基先端とカップリングする反応のためのアミダイト結合を活性化させる活性化剤は、リン酸塩を形成する。
【０２７６】
【化１１１】
2013520438.tif 000114
【０２７７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ合成への逆方向ＲＮＡ合成の利用
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一般的に、高度に保存された、２０〜２５ヌクレオチドの長さを有する非コードＲＮＡで、メッセンジャーＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に配列特異的にハイブリダイズし、標的のメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害するか又は直接分解することで、標的遺伝子の発現を調節しており、植物や動物などに存在する。この新たなクラスのＲＮＡは、１９９３年にDr. Victor Ambroseの研究室でC. elegansにおいて最初に発見された（Lee R.C., et al. (1993), 14. Cell 75: 843-854；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。現在では、これらのＲＮＡは、ヒトにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発見を含め、ほぼすべての種において確認されている（Lim L.P., et al. (2003), Science 299: 1540；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。各ｍｉＲＮＡは複数の遺伝子を調節していると考えられ、高等真核生物では数百ものｍｉＲＮＡ遺伝子が存在すると予測されることから、ｍｉＲＮＡがもたらす可能性のある調節回路は膨大な数となる。いくつかの研究グループから、ｍｉＲＮＡは、初期発生と同程度に多様なプロセス（Reinhart 2000）、細胞増殖及び細胞死（Brennecke 2003）、アポトーシス及び脂質代謝（Xu 2003）において、主要な制御因子として機能する可能性があるという根拠が示されている。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、免疫応答、細胞周期調節、代謝、ウイルス複製、幹細胞分化、及びヒト発生を含む多数の生物学的プロセスにおいて、不可欠な役割を担っていることが示されている。多くのｍｉｃｒｏＲＮＡは、複数の種にわたって保存されており、重要な生物学的経路の調節因子としてのこれらの分子の進化上の重要性が示されている。一方で、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現又は機能は、癌、心不全、及びウイルス感染などを含む多くの病態で大きく変化している。ｍｉＲＮＡを用いた薬剤によるヒト疾患の標的経路は、強力な新しい治療方法の可能性を意味する。
【０２７８】
逆方向ＲＮＡ合成方法は、これらのＲＮＡの合成において、細胞内環境でのこれらのＲＮＡの安定性を高めるための修飾を行い、また、取り込みと治療展開のためのリガンド又は輸送剤の組み込みを行う可能性を提供する。
【０２７９】
ＲＮＡｉ合成への逆方向ＲＮＡ合成の利用
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による遺伝子発現のサイレンシングは、選択的遺伝子阻害、及び様々な生化学的、薬理学的プロセスの制御及び管理への利用の可能性をもたらす方法として研究が進んできた。初期の研究では、Caenorhabditis elegansにおけるＲＮＡ干渉は、２１及び２２ヌクレオチドのＲＮＡ配列によってもたらされることが示されている（Fire et al., Nature, 391: 806-811, 1998を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。これは、さらに、小分子の二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の特異的阻害が２１及び２２ヌクレオチドのＲＮＡによってもたらされるという一般的現象として確認された（Genes Dev., 15: 188-200, 2001を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。その後、上記研究は多くの研究により確認され、ＲＮＡｉは、選択的で特異性の高い遺伝子阻害及び制御の強力なツールとして確立された（Nishikura, K., Cell, 107, 415-418, 2001；Nykanen, A., et al., Cell, 107: 309-321, 2001；Tuschl, T., Nat. Biotechnol., 20: 446-448, 2002；Mittal, V., Nature Rev., 5, 355-365, 2004；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6047-6052, 2002；Donze, O. & Picard, D., Nucl. Acids. Res., 30, e46, 2002；Sui, G.,et al.., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5515-5520, 2002；及びPaddison, P.J. et al., Genes Dev., 16, 948-959, 2002を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。天然の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ配列に限らず、ｓｉＲＮＡの作用のために２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）を配列に導入して化学修飾したＲＮＡも、哺乳類細胞内で同様又はより高いＲＮＡ干渉を引き起こすことが示されている（Dowler, T., et al., Nucl Acids Res., 34, 1669-1675, 2006を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２８０】
ｓｉＲＮＡの特性を向上するため、骨格化学の変化、２’−糖修飾、及び核酸塩基修飾などを含むその他の様々な修飾が研究され、そのうちのいくつかは最近レビューされている（Nawrot, B, and Sipa, K., Curr. Top. Med. Chem., 6: 913-925, 2006；及びManoharan, M., Curr. Opin. Chem. Biol., 8, 570-579, 2004を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。ｓｉＲＮＡのＰＳ修飾は耐用性が高いが、毒性の増加や多少の効率の低下が一部の報告で指摘されている（Harborth, J, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 13, 83-105, 2003を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。また、２’−Ｏ−メチル修飾も挙げられるが、Ａ形（ＲＮＡ様）らせんを維持しており、配列内のこのような修飾の数により、ｓｉＲＮＡ活性を保持又は低下させることが示されている（Chiu, Y.L., Rana, T.M., RNA, 9 :1034-1048, 2003を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。また、センス鎖において、ｓｉＲＮＡ活性を失わずに、配列の広範囲な２’−Ｏ−メチル修飾が可能であることも示されている（Kraynack,B.A., Baker, B.F., RNA, 12: 163-176, 200を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２８１】
担体及び結合基
担体物質（本明細書の構造式において、「Ｑ」で表す）は、非膨潤性の固体担体である。担体物質は、固体、液体、又はゲルの形態があり得る。「結合基」は、ヌクレオシドを担体に連結するカルボニルなどの部分であり、適した結合基は以下の項に記載する。担体物質Ｑは、ａ）結合基と、切断されてヒドロキシ基を形成しうる、例えばスクシニル、ヒドロキノリル、オキサリルなどのスペーサーとからなる担体、又は、ｂ）脂肪族鎖、芳香族基、置換若しくは非置換芳香族、置換若しくは非置換フェノキシ、又はレブリニルである。また、不可逆性のリンカーも用いることができる。
【０２８２】
「結合基及びスペーサー」は、ヌクレオシドを担体に連結するカルボニルなどの部分であり、適した結合基は以下の項に記載する。
【０２８３】
最もよく用いられる２つの固相物質は、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）とマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）である。ＣＰＧは、通常、その孔径で定義される。オリゴヌクレオチドの化学的性質では、５００Å、１０００Å、１５００Å、２０００Å及び３０００Åの孔径が、それぞれ、約５０−ｍｅｒ、８０−ｍｅｒ、１００−ｍｅｒ、１５０−ｍｅｒ及び２００−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製に用いることができる。さらなる処理に適した天然のＣＰＧを作製するには、材料の表面を（３−アミノプロピル）トリエトキシシランで処理し、アミノプロピルＣＰＧを得ることができる。アミノプロピルのアームをさらに伸長させて、長鎖アミノアルキル（ＬＣＡＡ）ＣＰＧを得ることもできる。該アミノ基は、その後、オリゴヌクレオチド合成に適したリンカーの基準点として用いることができる。オリゴヌクレオチド合成に適したＭＰＰＳは、低膨潤性で、高度に架橋されたポリスチレンであり、ジビニルベンゼン（ｍｉｎ  ６０％）、スチレン、及び４−クロロメチルスチレンを孔形成剤の存在下で重合させることで得られる。得られたマクロ多孔性クロロメチルＭＰＰＳは、アミノメチルＭＰＰＳに変換される。
【０２８４】
担体物質をオリゴヌクレオチド合成に適したものにするため、非ヌクレオシドリンカー（汎用担体）又はヌクレオシドスクシネートを、常法により、固体担体物質中で共有結合によって反応性アミノ基に付加する。残った未反応のアミノ基は、無水酢酸でキャップされる。例えば、合成は、非ヌクレオシドリンカーが担体物質に付加した汎用担体から開始する。５’−末端ヌクレオシド残基のそれぞれのホスホルアミダイトは、標準的手順によるオリゴヌクレオチド鎖構築の１回目の合成サイクルで、汎用担体に結合される。その後、鎖構築を完了するまで継続し、続いて、担体が結合したオリゴヌクレオチドが脱保護される。汎用固体担体の特性は、オリゴヌクレオチドの放出が５’−末端ヌクレオチド残基の５’−Ｏを汎用リンカーに付加するＰ−Ｏ結合の加水分解により起こることである。この方法の重要な利点は、合成するオリゴヌクレオチドの配列に関わらず、同じ担体が使える点である。
【０２８５】
また、５’−末端ヌクレオチド残基の５’−ヒドロキシ基は、最も多くの場合、５’−Ｏ−スクシニルアームを介して担体に付加している。オリゴヌクレオチド鎖構築は、５’−末端から２番目のヌクレオチド残基のそれぞれのホスホルアミダイト構成要素のカップリングから開始する。ヌクレオシド担体上で合成されたオリゴヌクレオチドの５’−末端ヒドロキシ基は、汎用担体に適用される条件よりも幾分緩和された条件で、脱保護される。
【０２８６】
別の結合基としては、ヒドロキノンスペーサーであるＱ−担体が含まれ、スクシニル担体と比べて簡便に切断される（University Technologies International, LP(UTI) & Publication; R.T. Pon and S.Y. Yu, Tetrahedron Lett., 1997, 38, 3327-3330を参照；参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。構造式は：担体−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−５’−ヌクレオシドであり、以下の構造式で表される：
【０２８７】
【化１１２】
2013520438.tif 000115
【０２８８】
オリゴヌクレオチド合成のための固体担体
現在、オリゴヌクレオチド合成に用いることができる担体は、非常に様々なものがあり、異なるタイプのオリゴヌクレオチドに採用するものを選択することができる。重要な担体技術及び説明の一部を以下の項に記載する。
【０２８９】
Richard T. Pon; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Unit 31, Feb. 2000を参照（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。担体の物理的及び化学的特性、並びにオリゴヌクレオチド合成の様々な化学的性質に対する適合性は、このマニュアルに記載されている。
【０２９０】
汎用担体は、オリゴヌクレオチドでの重要な利用が見出されている。Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発したＵｎｙＬｉｎｋｅｒ技術は、個々のＤＮＡ又はＲＮＡ塩基の誘導体化に比べて、単一分子を用いたオリゴヌクレオチドの合成が可能である。Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ分子の切断は穏やかに行われ、３’−末端ヌクレオシド上のフリーな３’−末端ヒドロキシル基を組み込む。本発明は、このＵｎｙｌｉｎｋｅｒ分子を、本発明者らの５’−→３’−オリゴヌクレオチド合成プロセスのオリゴヌクレオチドの５’−末端に導入することを提案した。固相オリゴヌクレオチド合成の後、汎用担体は簡便に取り除かれ、フリーな５’−末端ヒドロキシ基を生成する。Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、３’−→５’−オリゴヌクレオチド合成の実施に対して、この分子の知的財産権を有しており、下記の特許に含まれている；（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）：
２００３年１１月１３日に提出された米国特許出願第６０／５２０．１７９号（ＤＶＣＭ０００９ＵＳ．Ｌ）（名称：Supports for oligomer synthesis）；２００３年１２月１６日に提出された米国特許出願第６０／５３０．４７７号（ＤＶＣＭ００１０ＵＳ．Ｌ）（名称：Supports for oligomer synthesis）。この汎用担体技術に関するＩｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌの研究者らによる後続の公表文献が報告されている。
【０２９１】
ある汎用担体が、ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＬＬＣによって述べられている。同社では、様々なリガンド、官能基を３’−末端に導入することができる、変換可能な固体担体について述べている。本発明では、この固体担体を、本発明者らの５’−位での官能基化のプロセスに用いることを提案した。汎用担体について示したＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＬＬＣの文献では、３’−→５’−方向のオリゴヌクレオチド合成に関する適用の詳細について述べられている：A conformationally Preorganized Universal Support for Efficient Oligonucleotide Synthesis, Andre P. Guzaev & Muthiah Manoharan, J. Am. Chem.Soc, 2003, 125, 2380-2381（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【０２９２】
Ｎｉｔｔｏ  ＰｈａｓｅＲ（日東電工テクニカルコーポレーションの登録商標）。Ｎｉｔｔｏ  ＰｈａｓｅＲ担体は、治療用途レベルのＤＮＡ及びＲＮＡの合成に利用できる可能性が実証されている。Ｎｉｔｔｏ  ＰｈａｓｅＲ担体は、日東電工テクニカルコーポレーションの完全所有子会社であるＫｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓが販売している。この担体は、本発明者らのプロセス及び発明において、ヌクレオシドの５’−位付加の担体として用いることができる。本発明者らの優れた逆方向ＲＮＡ合成プロセスとこの担体を組み合わせることで、高品質のオリゴヌクレオチドの合成が期待される。
【０２９３】
Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．は、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）のビーズ表面への付加に関して、様々なリンカー／スペーサーのＣＰＧの利用について報告している（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．のウェブサイトを参照）。
【０２９４】
ＧＥ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）の一部門であるＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ２００として知られる、オリゴヌクレオチド合成のためのカスタム担体について述べている（apczech.cz/pdf/df-primer support.pdf）。この担体は、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、オリゴヌクレオチド合成及びオリゴヌクレオチド鎖伸長におけるカスタム塩基付加、フルオレセイン、ダブシル、リン酸−オン試薬などの様々な発色団のラべリングに適していることが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅによって示されている。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔは、２０〜２５０ｕｍｏｌｅ／ｇレベルから処理される。しかし、本発明者らが知る限りでは、５’−→３’方向ＲＮＡ合成は知られていないか、又は提案されていない。
【０２９５】
以下の化合物は、本発明の化合物ではない：
【０２９６】
【化１１３】
2013520438.tif 000116
【実施例】
【０２９７】
合成スキームの詳細をスキーム１に示す：
【０２９８】
【化１１４】
2013520438.tif 000117
式中、Ｂ＝ａ）Ａ（Ｎ−Ｂｚ）、ｂ）Ｃ（Ｎ−Ｂｚ）、ｃ）Ｃ（Ｎ−Ａｃ）、ｄ）Ｇ（Ｎ−ｉＢｕ）；ｅ）Ａ（Ｎ−ｔＢＰａｃ）、ｆ）Ｃ（Ｎ−ｔＢＰａｃ）、ｇ）Ｇ（Ｎ−ｔＢＰａｃ）、ｈ）Ａ（Ｎ−Ｐａｃ）、ｉ）Ｃ（Ｎ−Ｐａｃ）、ｊ）Ｇ（Ｎ−Ｐａｃ）、ｋ）Ｕ。
【０２９９】
２’，３’−イソプロピリデン官能基を用いて、ｎ−保護リボヌクレオシドのリボースの２’，３’ヒドロキシル基を保護する。スキーム（１）には、複数の好適なｎ−保護基が示されている。続いて、５’−ヒドロキシル基を、好適にはベンゾイル基で保護し、一般構造２１の化合物を得る。その後、イソプロピリデン基を、当技術分野で公知の緩和な酸性条件下で、選択的に取り除く。この工程により、一般式２２の化合物を得る。続いて、ＴＢＤＭシリルクロリド（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド）との反応により、一般式２３のモノシリル化合物を得る。本発明者らは、このプロセスでは３’−ＴＢＤＭＳ基、すなわち２４の構造の化合物の形成は好ましくないことを観察した。ほとんどの場合、化学的及び分析的手法により２３の構造であることが確認されたクリーンな生成物が観察された。
【０３００】
精製は、上記プロセスの各工程で、結晶化又はカラムクロマトグラフィーによって行う。その後、ピリジン中、ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−クロリド）との反応により、一般構造２６の３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−ｎ−保護ヌクレオシドを得る。各化合物は、カラムクロマトグラフィーにより完全に精製した。
【０３０１】
本発明者らはＴＢＤＭＳ基を用いて２’−ＴＢＤＭＳエーテルを生成したが、この工程では他のシリルエーテルも用いることができる。水性／メタノール性ＮａＯＨの加水分解を入念に行い、フリーな５’−ヒドロキシル基を有する一般構造２７の化合物を得た。
【０３０２】
水性又はメタノール性塩基を用いた５’−ベンゾイルの選択的除去は、当技術分野で公知である。化合物３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−ｎ−保護ヌクレオシド（構造２７）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。精製した化合物（構造２７）は、続いて、ｎ，ｎ−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホンアミドクロリド又は２−シアノエチル，ｎ，ｎ，ｎ，ｎ−テトライソプロピルホスファンなどのリン酸化試薬でリン酸化し、対応するホスホルアミダイト（構造１６）を生成する。ｎ，ｎ−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホンアミドクロリド又は２−シアノエチル，ｎ，ｎ，ｎ，ｎ−テトライソプロピルホスファンのリン酸化試薬は、ともにＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．が製造したものが市販されており、対応するホスホルアミダイトを生成するリン酸化の方法は、当技術分野で公知である。
【０３０３】
逆方向ＲＮＡ合成のための高純度な３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−ヌクレオシド−５’−ホスホルアミダイトの大規模合成。７０〜１００ｇの量のホスホルアミダイトの典型的な合成を、以下の例で説明する。それぞれのホスホルアミダイト合成プロセスは、３１Ｐ  ＮＭＲ分析で１００％の純度、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析で９８％を超える純度が示される。品質管理データは、別の表に示す。
【０３０４】
３’−ＯＤＭＴ−２’ＯＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）−５’−ＯＰの合成
工程（ａ）：５’ＯＤΜΤ−２’ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）を、文献に記載された公知の方法により作製する。
工程（ｂ）：５’ＯΗ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ−（ｎ−ｉｂｕ）：
５’−Ｏ−ＤΜΤ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）；３０ｇｍを、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％溶液、ｗ／ｖ；２当量）に取り、５’−位からのＤＭＴ基の選択的除去を行った。混合物を勢いよく振とうし、反応が進むと暗紫色になる透明な溶液を得た。溶液を室温でさらに１０分間撹拌した。その後、反応混合物を、炭酸水素ナトリウムの１０％水溶液（０５℃に予冷）により、０℃で反応停止し、ｐＨを７〜８に中和した。有機層を飽和食塩水で１回洗い、次に無水硫酸ナトリウムを通し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル（７０〜２３０メッシュ；Ｍｅｒｃｋ等級）のカラムクロマトグラフィーで精製し、純粋な５’，３’−ジヒドロキシ−２’−ＴＢＤＭＳ−７デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）を得た；収量１５ｇｍ（８５％）；ｔｌｃ  ｒｆ．＝０．２（溶媒系（５：３：２）：Ｃｈｌ：Ｈｅｘ：アセトン）。
工程（ｃ）：５’−ＯＢｚ−２’ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ−（ｎ−ｉｂｕ）：
５’ＯΗ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ−（ｎ−ｉｂｕ）を５’−位で選択的にベンゾイル化した。５’ＯΗ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ−（ｎ−ｉｂｕ）（１５ｇｍ）を無水ピリジン中（１０倍ｗ／ｖ；１５０ｍｌ）に取り、無水条件で−１０〜０℃にした。塩化ベンゾイル（１．１当量、４．１０ｍｌ）を一度に加え、混合物を同じ温度で１．５時間撹拌した。混合物を低温のメタノールで反応停止し、真空中で溶媒を除去した。混合物をクロロホルムで抽出し、飽和炭酸水素水溶液で洗い、次に飽和食塩水で１回洗った。有機層を無水硫酸ナトリウムに通し、その後、低真空下で溶媒を除去した。残渣をエチルエーテルと酢酸エチルの混合物中で結晶化させて精製し、１７ｇｍの純粋な化合物を得た。ＨＰＬＣ純度９９％。ｒｆ．＝０．５。（溶媒系（５：３：２）：Ｃｈｌ：Ｈｅｘ：アセトン）。
工程（ｄ）：５’−ＯＢｚ−３’−ＯＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）
前工程の化合物；５’−ＯＢｚ−２’ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ−（ｎ−ｉｂｕ）（１７ｇ）を無水ピリジンで２回乾燥させ、ピリジン（ｗ／ｖ；１：１０、１７０ｍｌ）に取り、溶液を水分から保護して０〜５℃にした。ＤＭＴ−クロリド（２５．２ｇ；２．５当量）を溶液に加え、反応混合物を室温で２４時間撹拌し、冷却したメタノールで反応停止した。溶液を真空中で蒸発させ、酢酸エチルに抽出してまとめた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、次に飽和食塩水で洗い、その後、有機層を無水硫酸ナトリウムに通した。溶液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）で精製して、９ｇｍの純粋産物をＨＰＬＣの純度９８％で得るとともに、未反応の出発物質（８ｇｍ）も回収された。
工程（ｅ）：５’−；ＯＨ−３’−ＯＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）
前工程で得られた化合物（６．０ｇ）を、２ＮのＮａＯＨのピリジン：メタノール６０ｍｌ（８０：２０）溶液の管理加水分解条件のもと、５〜１０℃で３０分間、選択的に加水分解し、続いて反応混合物をＤｏｗｅｘ−ピリジニウムカチオン交換樹脂で中和し、その後、濾過してＤｏｗｅｘ樹脂を取り除き、粗生成物を得た。溶媒を蒸発させ、続いて残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、純粋な化合物を得た；収量４．０ｇ。ＨＰＬＣ純度９８．５％、Ｍａｓｓ及び１Ｈ  ＮＭＲ。
工程（ｆ）：３’−ＯＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−７−デアザｒＧ（ｎ−ｉｂｕ）−５’−シアノエチルホスホルアミダイト：
前工程で得られた化合物を無水アセトニトリルで２回、完全に脱水した。脱水した生成物を、乾留したテトラヒドロフランに加えた。続いて、ジイソプロピルエチルアミン（２．０当量）を、無水条件で撹拌しながら、反応混合物に加えた。反応混合物にジイソプロピル２−シアノエチルクロロ試薬（１．１当量）を加えた。混合物を室温で２．０時間撹拌した。粗反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム（０℃に冷却）で反応停止し、過量の酢酸エチルで希釈した。有機層を飽和食塩水で１回洗った。有機層を無水硫酸ナトリウムに通した。溶媒を真空中で除去し、粗反応混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２３０〜４００メッシュ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ等級）で精製し；（精製の溶媒系；クロロホルム：酢酸エチル：トリエチルアミン＝４５：４５：１０）、純粋なホスホルアミダイトを得た。ＨＰＬＣ純度＞９８％。３１Ｐ  ＮＭＲ、１Ｈ  ＮＭＲ、ＭＡＳＳｈｎｍｒ  ｍａｓｓ  ＨＰＬＣ。カップリング効率の試験は、＞９８％のカップリングを示した。
【０３０５】
３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−ｒＵホスホルアミダイトの合成
工程（ａ）１−ＯＡｃ−２，３，５−トリ−Ｏ−ｂｚ−Ｌ−リボース（シリル化ウラシルの使用）
当技術分野で公知の１−アセチル−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｄ−リボースの合成と同様の方法で、１−Ｏ−アセチル−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−リボース（ｉ）を合成した。
工程（ｂ）：２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−ウリジン
ヘキサメチルジシラザン（ヘキサメチルジシラザン；ＨＭＤＳ；２０当量）による処理で、シリル化ウラシルを生成した。その後、シリル化ウラシルを、塩化スズ（ＩＶ）の存在下で１−Ｏ−アセチル−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−リボースと融合させた（触媒としてＳｎＣｌ４）。粗生成物を固体の炭酸水素ナトリウムで中和し、その後、アセトニトリルと濾過した。固体を取り除いた。濾液を真空中で蒸発させた。粗化合物をシリカゲルカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ；７０〜２３０メッシュ）のカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な画分を蒸発させ、生成物の特徴をＨＰＬＣ、ＵＶ及びＥＳＩ／ＭＳで調べた。
工程（ｃ）：２，３，５−トリ−ヒドロキシ−Ｌ−ウリジン（Ｌ−ウリジン）：
工程（ｂ）で得られた、純粋な完全に保護された中間化合物を、水性アンモニア（２９％）のピリジン溶液（５０：５０；ｖ／ｗ）により、３７℃で３６時間加水分解し、粗生成物を得た。粗化合物をジエチルエーテル、次に酢酸エチルで洗い、溶媒と安息香酸を除去した。その後、化合物をエタノール中で結晶化した。乾燥した純生成物の収率８０％。生成物をＨＰＬＣ、ＵＶ及びＥＳＩ／ＭＳで分析した。
工程（ｄ）２’，３’−イソプロピリジン−Ｌ−ｒＵ
乾燥した化合物を、蒸留したアセトン（前駆物質の乾燥重量に対して６倍）に加えた。触媒量のＨ２ＳＯ４を加えた後、混合物を室温で撹拌し、続いて２，２，ジメトキシプロパン（Ｌ−ｒＵに対して４当量）を加え、さらにアセトンで希釈し、１時間撹拌した。その後、炭酸ナトリウムを反応混合物に加え、ｐＨを中性にした。混合物を濾過して固体を除去し、濾液を真空中で濃縮した。粗生成の（２’，３’イソプロピリデン−ＬｒＵ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７０〜２３０メッシュサイズ）で精製し、純粋な化合物を得た。溶媒系；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９０：１０）、収率８５％。生成物の特徴をＵＶ、ＪＰＬＣ及びＥＳＩ／ＭＳで調べた。Ｔｌｃ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９：１）；ｒｆ．０．４５）；純度、乾燥化合物の＞９８％。
工程（ｅ）５’−Ｏ−Ｂｚ−２’，３’−イソプロピリジン−Ｌ−ｒＵ：
工程（ｄ）で得られた生成物を無水ピリジン（１０倍）に入れ、塩化ベンゾイル（１．１当量）を０〜５℃で加え、反応混合物を０〜５℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を低温のメタノールで反応停止した後、粗反応混合物をまとめ、溶媒を除去した。その後、粗反応生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した；溶媒系（Ｃｈｌ：ヘキサン：アセトン＝５０：３０：２０）。純粋な乾燥生成物の特徴をＵＶ、ＨＰＬＣ及びＥＳＩ／ＭＳで調べた。収率；８０％。
工程（ｆ）５’−Ｏ−Ｂｚ−Ｌ−ｒＵ
前工程で得られた生成物をジオキサン（純粋な乾燥固体に対して５倍）に入れ、２ＮのＨＣｌ（５倍Ｖ；Ｖ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を、固体の炭酸水素ナトリウムによって、０℃でｐＨが中性になるまで加えて反応停止した。溶媒を濾過し、濾液を蒸発乾固させた。残渣をアセトニトリル中で結晶化し、純粋な生成物を乾燥させて、ＵＶ、ＨＰＬＣ及びＥＳＩ／ＭＳで特徴を調べた。収率７５％。
工程（ｇ）５’−Ｏ−Ｂｚ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−ｒＵ：
前記生成物を無水テトラヒドロフラン（１０倍ｗ／ｖ）に入れ、撹拌しながら乾燥条件で硝酸銀／ピリジン複合体を加え、次にＴＢＤＭＳ−クロリド（１．１当量）を加えた。反応混合物を室温で８時間撹拌した。粗生成のＴＬＣでは、２つの大きなスポットが形成された。反応混合物を１００倍の過量の酢酸エチルで希釈した。有機層を飽和重炭酸塩、次に飽和食塩水で洗った。有機層を、無水硫酸ナトリウムを通して濾過した。その後、有機層を蒸発乾固させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製した。純物質のバンドについて、ＵＶ、ＨＰＬＣ、１Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ／ＭＳで特徴を調べた。所望の２’−異性体の収率は約５５％。
工程（ｈ）５’−Ｏ−Ｂｚ−２’−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−ｒＵ
十分に乾燥させた前記工程の化合物を無水ピリジン（１０倍；ｗ／ｖ）に入れ、溶液にＤＭＴ−クロリド（ＤＭＴクロリド；２．５当量）を加えた。反応混合物を２４時間撹拌し、粗生成物を得た。冷却したメタノール（反応に用いたＤＭＴ−クロリドに対して２当量）で反応を停止した。その後、粗混合物を真空中で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；２３０〜４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ等級）で精製した。純物質の画分をまとめ、濃縮し、得られた生成物の特徴をＵＶ、ＨＰＬＣ、１Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ／ＭＳにより調べた。収率；８５％。
工程（ｉ）５’−ＯΗ−２’−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−ｒＵ
前記工程で得られた純生成物をピリジン／メタノール（５０：５０Ｖ；Ｖ）中に入れ、２Ｎ  ＮａＯＨを用いて、５℃で３０分間処理し、その間、ｐＨは１２．５〜１３に維持した。３０分後、反応混合物にＤｏｗｅｘ−ピリジニウムカチオン交換樹脂を加えて中和し、粗生成物を得た。粗化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（シリカゲル２３０〜４００メッシュ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ等級）。純物質の画分をまとめ、溶媒を除去した。乾燥させた生成物を、ＨＰＬＣ、ＵＶ、１−Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ／ＭＳで分析し、特徴を調べた。収率；９０％。
工程（ｊ）３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−Ｌ−ｒＵ−５’−シアノエチルホスホルアミダイト
純粋な乾燥生成物を、ＴＨＦ中、ｎ，ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルクロロ試薬（１．１当量）のジイソプロピルエチルアミン溶液（２当量）で、１．５時間、室温で反応させてホスフィチル化した。粗反応物は一般的方法で行い、続いてカラムクロマトグラフィーにより純生成物を得た。生成物を、ＵＶ、ＨＰＬＣ、１Ｈ  ＮＭＲ、ＥＳＩ／ＭＳ及び３１  Ｐ  ＮＭＲで分析し、特徴を調べた。
【０３０６】
オリゴヌクレオチド１の合成：オリゴヌクレオチド１は、５’→３’方向のＲＥＶ−ＲＮＡホスホルアミダイト化学作用を用いて、１μｍｏｌスケールで合成した。合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９００合成装置により、標準的なＲＮＡ１μｍｏｌサイクル、及びモノマーと固体担体のカップリング時間４．０分で行った。
【０３０７】
用いたアミダイト（用いた活性化剤の表を参照）：
（１）Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（Ａ−Ｎ−Ｂｚ）、ＬＯＴ＃ＡＬ３００−２
（２）Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（Ｃ−Ｎ−Ａｃ）、ＬＯＴ＃ＮＳ１４３−１９
（３）Ｎ２−イソブトリル−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−グアノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（Ｇ−Ｎ−Ｉｂｕ）、ＬＯＴ＃ＮＳ４２−１９
（４）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト、ＬＯＴ＃ＮＳ１４７−１９
用いた製品：
（５）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−５’−スクシニルＣＰＧ１０００Ａ、トリチル値；２８．４ｕｍ／ｇｍ、ＬＯＴ＃ＮＳ２４−１９
（６）ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオン）、ＬＯＴ＃ＡＧＯ１５
（７）エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）；（０．２５Ｍ）、ＬＯＴ＃ＤＰ１５２−４
【０３０８】
１．０ｕｍｏｌホスホジエステル及びホスホロチオエートに関する一般的手順：
上述したアミダイト（固体）は、それぞれ、２０ｍＬの促進ボトル（expedite bottle）に入れ、無水アセトニトリルに溶解して０．０７５Ｍの溶液を作る。ボトルはアルゴンで洗い、ねじ蓋で密閉したのち素早く振とうし、固体を完全に溶解させる。Ｇ−Ｎ−Ｉｂｕの無水アセトニトリルへの溶解度は限られているため、Ｇ−Ｎ−Ｉｂｕを５０％無水ジクロロメタンに溶解し、続いて無水アセトニトリルを加え、５０：５０のジクロロメタン：アセトニトリル溶液を作製する。モノマー溶液のボトルは、以下のように合成装置に回して取り付ける：アミダイトＮｏ．１をポート番号６；アミダイトＮｏ．２をポート番号７；アミダイトＮｏ．３をポート番号８；アミダイトＮｏ．４をポート番号９。また、製品番号５を入れた１．０ｕｍの促進カラム（expedite column）を用意し、合成装置に取り付けた。
【０３０９】
表に示す主要な特徴の概要に従って合成を完了した後、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）固体担体を３．０ｍｌのジエチルエーテルで洗い、２ｍｌのマイクロチューブに移した。オリゴヌクレオチド１は、１ｍｌの４０％メチルアミン水溶液中で、３０分間、６５℃でインキュベートすることで、ＣＰＧから切断し、脱保護を行った。上清を取り除き、ＣＰＧを１ｍｌの水で洗った；上清はまとめて乾燥させた。ｔ−ブチル−ジメチルシリル保護基は、新鮮な１２．０％のフッ化テトラエチルアンモニウムのＤＭＳＯ溶液５００ｕｌにより、４５℃の超音波浴で１時間処理することで、ＲＮＡ残渣から取り除いた。オリゴヌクレオチド１は、１．５ｍｌのｎ−ブタノールに沈殿させた；試料を−２０℃で１時間冷却し、その後、１０，０００ｇで１０分間遠心分離を行った。上清をデカントし、ペレットをｎ−ブタノールでもう１回洗い、最後に５００ｕｌのエタノールで洗い、再度、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清をデカントした。ペレットを１０００ｕｌのＭＱ水に溶解し、ＯＤを調べた（粗脱塩）。その後、イオン交換ＨＰＬＣにより、バッファーＡ（＝１０．０％、０．５Ｍトリス及び１０．０％ＡＣＮ、ｐＨ７．５）とバッファーＢ（バッファーＡに１．０Ｍ塩化リチウムを加えたもの）の直線濃度勾配を用いて、オリゴヌクレオチド１を精製した。
【０３１０】
試料全量をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（１．０ｃｍｘ２５ｃｍ）に充填し、５％〜７５％のアセトニトリルの直線濃度勾配を用いて、４０分で溶離させた。試料は２６０ｎｍで測定し、所望のオリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、２％ＬｉＣｌＯ４のアセトン溶液を５．０ボリューム加えて沈殿させ、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットはエタノールで洗った。
【０３１１】
オリゴヌクレオチド２：オリゴヌクレオチド２は、５’→３’方向のＲＥＶ−ＲＮＡホスホルアミダイト化学作用を用いて、１μｍｏｌスケールで合成した。合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９００合成装置により、標準的なＲＮＡ１μｍｏｌサイクル、及びモノマーと固体担体のカップリング時間４．０分で行った。
【０３１２】
用いたアミダイト（用いた活性化剤の表を参照）：
（１．）Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（ｒＡ）、ＬＯＴ＃ＡＬ３００−２
（２．）Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（ｒＣ）、ＬＯＴ＃ＮＳ１４３−１９
（３．）Ｎ２−イソブトリル−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−グアノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（ｒＧ）、ＬＯＴ＃ＮＳ４２−１９
（４．）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト（ｒＵ）、ＬＯＴ＃ＮＳ１４７−１９
（５．）Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−Ｍｅ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト、ＬＯＴ＃１３３−８ＳＳ
（６．）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−５’−スクシニルＣＰＧ１０００Ａ（ｒＵ）、ＴＶ−８．４ｕｍ／ｇｍ、ＬＯＴ＃ＮＳ２４−１９
（７．）エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）；（０．２５Ｍ）、ＬＯＴ＃ＤＰ１５２−４
【０３１３】
上述したアミダイト（固体）は、それぞれ、２０ｍＬの促進ボトル（expedite bottle）に入れ、無水アセトニトリルに溶解して０．０７５Ｍの溶液を作る。Ｇ−Ｎ−Ｉｂｕの無水アセトニトリルへの溶解度は限られているため、Ｇ−Ｎ−Ｉｂｕを５０％無水ジクロロメタンに溶解し、続いて無水アセトニトリルを加え、５０：５０のジクロロメタン：アセトニトリル溶液を作製する。モノマー溶液のボトルは、以下のように合成装置に回して取り付ける：アミダイトＮｏ．１をポート番号６；アミダイトＮｏ．２をポート番号７；アミダイトＮｏ．３をポート番号８；アミダイトＮｏ．４をポート番号９；アミダイトＮｏ．５をポート番号５。また、製品番号６を入れた１．０ｕｍの促進カラム（expedite column）を用意し、合成装置に取り付けた。オリゴヌクレオチド２では、硫化試薬のジメチルアミノ−メチリデン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアノゾリン−３−チオン（ＤＤＴＴ）をピリジン：アセトニトリル（９０：１０）に溶解し、０．１Ｍの溶液を作製した。この試薬は、合成装置の補助ポートに置いた。
【０３１４】
合成の後、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）固体担体を３．０ｍｌのジエチルエーテルで洗い、２ｍｌのマイクロチューブに移した。オリゴヌクレオチドは、１ｍｌの４０％メチルアミン水溶液中で、３０分間、６５℃でインキュベートすることで、ＣＰＧから切断し、脱保護を行った。上清を取り除き、ＣＰＧを１ｍｌの水で洗った；上清はまとめて乾燥させた。ｔ−ブチル−ジメチルシリル保護基は、新鮮な１２．０％のフッ化テトラエチルアンモニウムのＤＭＳＯ溶液５００ｕＬにより、４５℃の超音波浴で１時間処理することで、ＲＮＡ残渣から取り除いた。オリゴヌクレオチドは、１．５ｍｌのｎ−ブタノールに沈殿させた；試料を−２０℃で１時間冷却し、その後、１０，０００ｇで１０分間遠心分離を行った。上清をデカントし、ペレットをｎ−ブタノールでもう１回洗い、５００ｕｌのエタノールで洗い、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清をデカントした。ペレットは１０００ｕｌのＭＱ水に溶解し、ＯＤを調べた（粗脱塩）。
【０３１５】
オリゴヌクレオチドは、その後、イオン交換ＨＰＬＣにより、バッファーＡ（＝１０．０％、０．５Ｍトリス及び１０．０％ＡＣＮ、ｐＨ７．５）とバッファーＢ（バッファーＡに１．０Ｍ塩化リチウムを加えたもの）の直線濃度勾配を用いて精製した。試料全量をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（１．０ｃｍｘ２５ｃｍ）に充填し、１５％〜９５％の直線濃度勾配を用いて、４０分で溶離させた。試料は２６０ｎｍで測定し、所望のオリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、２％ＬｉＣｌＯ４のアセトン溶液を５．０ボリューム加えて沈殿させ、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットはエタノールで洗った。
【０３１６】
逆方向合成方法により合成したオリゴヌクレオチドの配列
【０３１７】
【表１】
2013520438.tif 000118
【０３１８】
逆方向ＲＮＡ方法により合成した７６ｍｅｒホスホジエステルＲＥＶ−ホスホジエステル
７６ｍｅｒホスホジエステルＲＥＶ−ホスホジエステル  −  ＯＬＩＧＯ−７６ｍｅｒ  ｒＧｒＣｒＣｒＣｒＧｒＧｒＡｒＵｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＧｒＧｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＡｒＵｒＣｒＡｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＵｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＧｒＧｒＵｒＣｒＣｒＡｒＧｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＣｒＣｒＵｒＧｒＵｒＵｒＣｒＧｒＧｒＧｒＣｒＧｒＣｒＣｒＡ（配列番号４）は、カップリング時間６分で合成された。従来法（３’→５’）と逆方向ＲＮＡ合成方法（５’→３’方向）の両方により合成された７６ｍｅｒを比較するため、Ｐａｇｅ分析を行った。分析結果のゲルでは、従来法により合成した７６ｍｅｒに比べて、逆方向ＲＮＡ合成方法により合成した７６ｍｅｒは、欠失配列（例えば、７５ｍｅｒ、７４ｍｅｒなど）が少ないことが示された。
【０３１９】
大規模オリゴヌクレオチド合成：
末端に２’−Ｏ−メチル塩基（配列番号２）を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの１２ｕｍｏｌスケールの合成を行った。次のデータが得られている（ａ）トリチルのヒストグラム；（ｂ）合成された粗生成オリゴのＣＥ（キャピラリーゲル電気泳動）；（ｃ）精製したオリゴヌクレオチドのＣＥ及びＨＰＬＣ；（ｄ）分子量決定のためのＥＳＩ−ＭＳ分析。
【０３２０】
一般的手法
１２．０ｕｍｏｌのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド：
オリゴヌクレオチド１及び２に関する上記のものと同様にして、アミダイト及び製品を準備し、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９００合成装置による合成を行った。スケール、モノマー、カップリング時間、活性化剤、ＤＤＴＴ／ヨード試薬について、下記の表に記載する。
【０３２１】
【表２】
2013520438.tif 000119
カップリング時間４分及び６分でのオリゴ合成の表
【０３２２】
表に示す主要な特徴の概要に従って合成を完了した後、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）固体担体を１５ｍｌのジエチルエーテルで洗い、８ｘ２ｍｌのマイクロチューブに移した。オリゴヌクレオチドは、１ｍｌの４０％メチルアミン水溶液中で、３０分間、６５℃でインキュベートすることで、ＣＰＧから切断し、脱保護を行った。上清を取り除き、ＣＰＧを１ｍｌの水で洗った；上清はまとめて乾燥させた。ｔ−ブチル−ジメチルシリル保護基は、新鮮な１２．０％のフッ化テトラエチルアンモニウムのＤＭＳＯ溶液５００ｕｌにより、４５℃の超音波浴で１時間処理することで、ＲＮＡ残渣から取り除いた。オリゴヌクレオチドを１．５ｍｌのｎ−ブタノールに沈殿させた；試料を−２０℃で１時間冷却し、その後、１０，０００ｇで１０分間遠心分離を行った。上清をデカントし、ペレットをｎ−ブタノールでもう１回洗い、最後に５００ｕｌのエタノールで洗い、再度、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清をデカントした。ペレットを１０００ｕｌのＭＱ水に溶解し、ＯＤ’ｓを調べた（粗脱塩）。
【０３２３】
上記で得られた粗生成ＲＮＡの純度は、ＨＰＬＣ又はＣＥ分析により、９０〜９２％の範囲であった。続いてイオン交換又は逆相ＨＰＬＣによる精製を行う。精製の結果、ＲＮＡの純度は９２％〜９８％となる。
【０３２４】
精製の詳細
オリゴヌクレオチドは、その後、イオン交換ＨＰＬＣにより、バッファーＡ（１０．０％、０．５Ｍトリス及び１０．０％ＡＣＮ、ｐＨ７．５）とバッファーＢ（バッファーＡに１．０Ｍ塩化リチウムを加えたもの）の直線濃度勾配を用いて精製した。
【０３２５】
試料全量をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（１．０ｃｍｘ２５ｃｍ）に充填し、６０％〜１００％のバッファーＢの直線濃度勾配を用いて、４０分間で溶離させた。試料は２６０ｎｍで測定し、所望のオリゴヌクレオチドピークに対応するピークを回収し、２％ＬｉＣｌＯ４のアセトン溶液を５．０ボリューム加えて沈殿させ、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットはエタノールで洗った。収率：３４３．０ＯＤ（２６０ｎｍ）；純度（ＣＥ分析）；９８．０１％。
【０３２６】
配列表：
略記：
ｍＡ；（２’−Ｏメチル−ｒ−アデノシン）；ｒＣ；（ｒ−シチジン）；ｒＧ（ｒ−グアノシン）；ｒＵ（ｒ−ウリジン）
【０３２７】
ＲＥＶ−ＲＮＡ−Ｍｅ−配列（メトキシあり）
配列：ｒＵｍｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｍｒＡ（配列番号１）
【０３２８】
ＲＥＶ−ＲＮＡ−Ｍｅ−ＴＨＩＯ−カップリング時間４分
配列：ｒＵ−ｐ（ｓ）ｍｒＡ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＡ−ｐ（ｓ）ｒＧ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＵ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＵ−ｐ（ｓ）ｒＡ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＡ−ｐ（ｓ）ｒＵ−ｐ（ｓ）ｒＡ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＧ−ｐ（ｓ）ｒＡ−ｐ（ｓ）ｒＣ−ｐ（ｓ）ｒＡ−ｐ（ｓ）ｍｒＡ−ｐ（ｓ）（配列番号２）
【０３２９】
ＲＥＶ−ＲＮＡ−カップリング時間４分（メトキシなし）
配列：ｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＡｒＣ（配列番号３）
【０３３０】
７６ＭＥＲ
配列：ｒＧｒＣｒＣｒＣｒＧｒＧｒＡｒＵｒＡｒＧｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＧｒＧｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＡｒＵｒＣｒＡｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＵｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＧｒＧｒＵｒＣｒＣｒＡｒＧｒＧｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＣｒＣｒＵｒＧｒＵｒＵｒＣｒＧｒＧｒＧｒＣｒＧｒＣｒＣｒＡ（配列番号４）
【０３３１】
本発明は、例示的実施形態を参照して具体的に記載及び説明されているが、当業者においては、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態や詳細の様々な変更を行い得ることが理解されよう。
【図１】
2013520438.tif 000170
【図２】
2013520438.tif 000171
【図３】
2013520438.tif 000172
【図４】
2013520438.tif 000173
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013520438.tif 000177
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2013520438.tif 000181
【図１１】
2013520438.tif 000182
【図１２】
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【国際調査報告】
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