(57)【要約】  本発明は、下記式（Ｉ）のポリケチド分子またはその薬学上許容される塩：2013509377.tif 000012（式中、Ｒ１は水素原子または（Ｃ１−Ｃ７）アルキル基である）、ならびに、その調製方法および特に抗癌剤としての、その使用に関する。
2013509377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩：
【化１】
2013509377.tif 000009
（式中、Ｒ１は水素原子または（Ｃ１−Ｃ７）アルキル基である）。
【請求項２】
下記連続的工程を含んでなる方法により得られる、請求項１に記載の化合物：
（ｉ）Hemimycale種海綿動物の凍結乾燥物をクロロホルム、次いで、水−エタノール溶液で浸漬し、続いて、濾過して濾液を得、その後、該濾液を濃縮して、抽出物を得る工程、
（ｉｉ）前述の工程（ｉ）で得られた抽出物を水とジクロロメタンとで分液し、得られた水相と有機相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出し、新たに得られた水相と有機相を分離し、それによって得られた２つの有機相を合わせ、濃縮して、脱塩抽出物を得る工程、
（ｉｉｉ）前述の工程（ｉｉ）で得られた脱塩抽出物を水−メタノール溶液およびヘキサンに溶解し、回収し、メタノール相を濃縮してメタノール抽出物を得る工程、
（ｉｖ）前述の工程（ｉｉｉ）で得られたメタノール抽出物からＲ１＝Ｈである式（Ｉ）の化合物を単離する工程、および
（ｖ）所望により、Ｃ−（１）のカルボン酸をエステル化してＲ１＝（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである式（Ｉ）の化合物を得、かつ／または前述の工程（ｉｖ）で得られた化合物を塩化し、それによって得られた化合物を反応混合物から単離する工程。
【請求項３】
前記海綿動物Hemimycale種が、バヌアツ共和国のトレス諸島を起源とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
以下の化合物から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物：
【化２】
2013509377.tif 000010
および
【化３】
2013509377.tif 000011
。
【請求項５】
医薬として使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
癌の治療を目的とする医薬として使用するための、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項８】
下記連続的工程：
（ｉ）Hemimycale種海綿動物の凍結乾燥物をクロロホルム、次いで、水−エタノール溶液で浸漬し、続いて、濾過して濾液を得、その後、該濾液を濃縮して抽出物を得る工程、
（ｉｉ）前述の工程（ｉ）で得られた抽出物を水とジクロロメタンとで分液し、得られた水相と有機相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出し、新たに得られた水相と有機相を分離し、それによって得られた２つの有機相を合わせ、濃縮して、脱塩抽出物を得る工程、
（ｉｉｉ）前述の工程（ｉｉ）で得られた脱塩抽出物を水−メタノール溶液およびヘキサンに溶解し、回収し、メタノール相を濃縮してメタノール抽出物を得る工程、
（ｉｖ）前述の工程（ｉｉｉ）で得られたメタノール抽出物からＲ１＝Ｈである式（Ｉ）の化合物を単離する工程、および
（ｖ）所望により、Ｃ−（１）のカルボン酸をエステル化してＲ１＝（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである式（Ｉ）の化合物を得かつ／または前述の工程（ｉｖ）で得られた化合物を塩化し、それによって得られた化合物を反応混合物から単離する工程
を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法。
【請求項９】
前記海綿動物Hemimycale種が、バヌアツ共和国のトレス諸島を起源とする、請求項８に記載の合成方法。
【請求項１０】
Ｒ１＝Ｈである請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物から、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ７）アルキル基を表す請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、下記連続的工程：
（ａ）Ｃ−（１）のカルボン酸をエステル化し、Ｒ１＝（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである式（Ｉ）の化合物を得る工程、
（ｂ）所望により、前述の工程（ａ）で得られた化合物を塩化する工程、および
（ｃ）前述の工程（ａ）または（ｂ）で得られた化合物を反応混合物から単離する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、海綿動物から抽出されたポリケチド型分子およびその類似体、抽出および半合成の方法、並びに医薬としての、特に癌の治療用の、該化合物の使用に関する。
【０００２】
海綿動物は、生物活性二次代謝産物、特にアルカロイドの生産について証明されてから、数十年来ずっと多くの研究の中心になっていた。
【０００３】
こうして、本発明者らは海綿動物Hemimycale種から抗癌活性を有する新規ポリケチド型分子を単離することができた。
【０００４】
よって、本発明の対象は、下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩：
【化１】
2013509377.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子または（Ｃ１−Ｃ７）アルキル基、例えば、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、例えば、メチルである）
である。
【０００５】
「（Ｃ１−Ｃ７）アルキル」基とは、本発明によれば、１〜７個、例えば、１〜４個、特に１個の炭素原子を含む飽和直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を意味する。例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシル基が挙げられる。特にメチル基である。
【０００６】
本発明では、「薬学上許容される」とは、一般的に安全であり、毒性がなく、生物学的にも他の点でも望ましくないものではない医薬組成物の調製において有用であること、およびヒト用医薬品使用と同様に動物用にも許容されることを意味する。
【０００７】
化合物の「薬学上許容される塩」とは、本明細書に定義するとおり薬学上許容され、かつ親化合物の所望の薬理学的活性を有する塩を意味する。薬学上許容される塩は、より詳しくは、塩基付加塩である。そのような塩は、親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンによって置き換えられるか、または有機塩基または無機塩基と配位結合する場合に形成される。許容される有機塩基としては、ジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエタノールアミン、トロメタミンなどが挙げられる。許容される無機塩基としては、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムが挙げられる。
【０００８】
前記式（Ｉ）の分子中に存在する不斉原子の数を考えると、後者は異なる立体配置をとり得る。本発明による化合物は、特に、その抽出様式により定義される、特に下記連続的工程を含んでなる方法により得られる、構造の化合物である：
（ｉ）Hemimycale種海綿動物の凍結乾燥物をクロロホルム、次いで、水−エタノール溶液（特に１０／９０  水／エタノール）で浸漬（maceration）し、続いて、濾過して濾液を得、その後、該濾液を濃縮して抽出物を得る工程、
（ｉｉ）前述の工程（ｉ）で得られた抽出物を水とジクロロメタンとで分液し、得られた水相と有機相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出し、新たに得られた水相と有機相を分離し、それによって得られた２つの有機相を合わせ、濃縮して、脱塩抽出物を得る工程（無機塩は水相中に除去されている）、
（ｉｉｉ）前述の工程（ｉｉ）で得られた脱塩抽出物を水−メタノール溶液（特に１０／９０  水／メタノール）およびヘキサンに溶解し（reprise）、回収し、メタノール相を濃縮してメタノール抽出物を得る工程、
（ｉｖ）前述の工程（ｉｉｉ）で得られたメタノール抽出物からＲ１＝Ｈである式（Ｉ）の化合物を単離する工程、および
（ｖ）所望により、Ｃ−（１）のカルボン酸をエステル化してＲ１＝（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである式（Ｉ）の化合物を得、かつ／または前述の工程（ｉｖ）で得られた化合物を塩化し、それによって得られた化合物を反応混合物から単離する工程。
【０００９】
この方法の範囲内で、使用される海綿動物Hemimycale種は、より詳しくは、バヌアツ共和国のトレス諸島を起源とし得るものである。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物は、より詳しくは、
【化２】
2013509377.tif 000004
および
【化３】
2013509377.tif 000005
から選択される。
【００１１】
本発明のもう１つの対象は、医薬として、特に癌の治療を目的とする、使用のための上記で定義した式（Ｉ）の化合物である。
【００１２】
本発明はまた、医薬の調製のための、特に癌の治療を目的とする、前述の式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。
【００１３】
本発明はまた、増殖性疾患、例えば、癌を治療する方法にも関し、その方法は、それを必要とする人に上記で定義した式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含んでなる。
【００１４】
本発明のもう１つの対象は、上記で定義した少なくとも１種の式（Ｉ）化合物と、薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物である。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内経路または経口経路による投与のために処方される。
【００１６】
有効成分としての本発明の化合物は、例えば、単回投与では、１日０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの間で含まれる用量で用いられる。
【００１７】
本発明の特定の実施形態では、前記医薬組成物は、医薬として、例えば、癌の治療のために用いられる。
【００１８】
本発明のもう１つの対象は、前記で定義した化合物を合成する方法であり、その方法は、下記連続的工程：
（ｉ）Hemimycale種海綿動物の凍結乾燥物をクロロホルム、次いで、水−エタノール溶液（特に１０／９０  水／エタノール）で浸漬し、続いて、濾過して濾液を得、その後、該濾液を濃縮して抽出物を得る工程、
（ｉｉ）前述の工程（ｉ）で得られた抽出物を水とジクロロメタンとで分液し、得られた水相と有機相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出し、新たに得られた水相と有機相を分離し、それによって得られた２つの有機相を合わせ、濃縮して、脱塩抽出物を得る工程、
（ｉｉｉ）前述の工程（ｉｉ）で得られた脱塩抽出物を水−メタノール溶液（特に１０／９０  水／メタノール）およびヘキサンに溶解し、回収し、メタノール相を濃縮してメタノール抽出物を得る工程、
（ｉｖ）前述の工程（ｉｉｉ）で得られたメタノール抽出物からＲ１＝Ｈである式（Ｉ）の化合物を単離する工程、および
（ｖ）所望により、Ｃ−（１）のカルボン酸をエステル化してＲ１＝（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである式（Ｉ）の化合物を得、かつ／または前述の工程（ｉｖ）で得られた化合物を塩化し、それによって得られた化合物を反応混合物から単離する工程
を含む。
【００１９】
この方法に使用される海綿動物は、より詳しくは、バヌアツ共和国のトレス諸島を起源とし得るものである。
【００２０】
Ｒ１＝Ｈである本発明による化合物の単離（工程ｉｖ）は、特にシリカゲルクロマトグラフィーにより実施することができる。得られた生成物は、次いで、当業者に周知の技術により、特に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、精製することができる。
【００２１】
工程（ｖ）でのカルボン酸のエステル化は、当業者に周知のプロトコールにより実施することができる。メチルエステルを得ることが望まれる場合には、その反応は、トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ２）の存在下で実施することができる。
【００２２】
工程（ｖ）の塩化工程は、前記化合物と薬学上許容される塩基（例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなど）との単純な混合により実施することができる。
【００２３】
それによって得られた化合物は、当業者に周知の方法により（例えば、抽出、溶媒の蒸発によりまたはその代わりとして沈澱および濾過によるなど）反応混合物から分離することができる。
【００２４】
その化合物は、必要に応じてさらに、当業者に周知の技術により（その化合物が結晶性であるならば再結晶により、蒸留により、シリカゲルクロマトグラフィーにより、またはその代わりとして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるなど）精製することができる。
【００２５】
本発明の対象はまた、Ｒ１＝Ｈである前記で定義した式（Ｉ）の化合物から、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ７）アルキル基を表す前記で定義した化合物を合成する方法にも関し、その方法は、下記連続的工程：
（ａ）Ｃ−（１）のカルボン酸をエステル化して、Ｒ１＝（Ｃ１−Ｃ７）アルキルである式（Ｉ）の化合物を得る工程、
（ｂ）所望により、前述の工程（ａ）で得られた化合物を塩化する工程、および
（ｃ）前述の工程（ａ）または（ｂ）で得られた化合物を反応混合物から単離する工程
を含んでなる。
【００２６】
工程（ａ）：
カルボン酸のエステル化は、当業者に周知のプロトコールにより実施することができる。メチルエステルを得ることが望まれる場合には、その反応は、トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ２）の存在下で実施することができる。
【００２７】
工程（ｂ）：
塩化工程は、前記化合物と薬学上許容される塩基（例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなど）との単純な混合により実施することができる。
【００２８】
工程（ｃ）：
それによって得られた化合物は、当業者に周知の方法により（例えば、抽出、溶媒の蒸発によりまたはその代わりとして沈澱および濾過によるなど）反応混合物から分離され得る。
その化合物は、必要に応じてさらに、当業者に周知の技術により（その化合物が結晶性であるならば再結晶により、蒸留により、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、またはその代わりとして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるなど）精製することができる。
次の実施例において本発明を限定されない方法でより詳細に記載する。
【実施例】
【００２９】
実施例１：化合物Ｉ−１（Ｒ１＝Ｈである式（Ｉ）の化合物）の抽出
バヌアツ共和国のトレス諸島で５ｋｇの新鮮なHemimycale種海綿動物を収集し、次いで、凍結乾燥して６５０ｇの凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物をクロロホルム、次いで、水−アルコール溶液（１０：９０は１０％の水と９０％のエタノールを表している）で連続して６時間浸漬させた。この２番目の工程を２回繰り返した。得られた濾液を一緒に合わせ、濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して水性シロップが得られるまで濃縮した。水性シロップをジクロロメタンと酢酸エチルとで連続して分液して抽出物から無機塩を（水相中に）除去した。脱塩抽出物（４２ｇ）を水−メタノール溶液（１０：９０）に溶解し、次いで、ヘキサンで分液して大部分の無極性分子を除去した。それによって２つの抽出物、ヘキサン抽出物（２４ｇ）およびメタノール抽出物（１８ｇ）を得た。薬理学的活性を示したのはメタノール抽出物だけであった。
薬理学的活性試験と、分取スプリットを備えたネガティブエレクトロスプレーイオン化モード（ＥＳＩ−）での液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を用いる分析および精製との両方を組み合わせたモニタリング方法により、ｍ／ｚ  １０６１．８；１０５９．４；１０７７．７；１０９３．３（ＥＳＩ−では＋／−０．４）を有する分子ファミリーを明らかにすることが可能となった。その中で最も重要なイオンはｍ／ｚ  １０６１．８である。
【００３０】
メタノール抽出物について、酢酸エチルおよびメタノールの漸増極性溶出による標準シリカカラムでの「フラッシュ」（または「ステップワイズ」）型クロマトグラフィーを実施して、７画分を得た。次いで、薬理学的活性を示した画分番号４〜７をメタノール溶出によるＬＨ２０カラムでのクロマトグラフィーに付した。最後の精製を、水・アセトニトリル勾配を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ＲＰ  Ｃ１８）により実施して、分子量１０６２（量０．５ｍｇ、海綿動物の凍結乾燥物に対して収率０．００００７７％）；ＨＲＥＳＩＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  １０６１，６７８０（Ｍ−Ｈ）−、Ｃ５９Ｈ９７Ｏ１６についての計算値  ｍ／ｚ  １０６１．６７８２の活性分子を得た。
【００３１】
（ＨＲＥＳＩＴＯＦＭＳ＝高分解能エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析）
このようにして分子Ｉ−１を得た。
【化４】
2013509377.tif 000006
1H NMR (500MHz, メタノール-d4)δ = 7.10 (1H, dd, J = 15.1 Hz, J = 11.1 Hz, H-3), 6.45 (1H, dd, J = 15.0 Hz, J = 10.7 Hz, H-5), 6.27 (1H, dd, J = 15.0 Hz, J = 11.0 Hz, H-4), 6.17 (1H, dd, J = 15.3 Hz, J = 10.7 Hz, H-6), 5.95 (1H, br. s., H-15), 5.90 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-2), 5.87 (1H, dd, J = 15.1 Hz, J = 8.7 Hz, H-7), 5.55 (1H, dt, J = 14.8 Hz, J = 7.3 Hz, H-34), 5.34 (1H, dd, J = 15.3 Hz, J = 8.5 Hz, H-35), 5.16 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-17), 4.42 (1H, ddd, J = 11.3 Hz, J = 7.5 Hz, J = 3.5 Hz, H-19), 4.32 (1H, d, J = 11.3 Hz, H-40), 4.27 (1H, s, H-22), 4.11 (1H, ddd, J = 11.1 Hz, J = 7.7 Hz, J = 3.5 Hz, H-37), 3.99 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-13), 3.66 - 3.74 (2H, m, H-31, 45), 3.59 - 3.66 (1H, m, H-29), 3.57 (1H, dd, J = 9.6 Hz, J = 2.0 Hz, H-11), 3.40 (3H, s, H-29a), 3.39 (3H, s, H-9a), 3.33 (3H, s, H-27a), 3.32-3.34 (1H, m, H-27), 3.27 (1H, dd, J = 6.7 Hz, J = 4.6 Hz, H-9), 2.74 - 2.87 (1H, m, H-18), 2.48 - 2.61 (1H, m, H-8), 2.29 - 2.39 (1H, m, H-36), 2.20 - 2.27 (1H, m, H-33), 2.02 - 1.22 (22H, m, H-10, 12, 20, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 39, 42, 43, 44), 1.82 (3H, s, H-16a), 1.69 (3H, s, H-14a), 1.15 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-46), 1.10 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-18a), 1.11 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-36a), 1.07 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-8a), 0.98 - 1.02 (1H, m, H-25), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-24a), 0.93 (3H, d, H-12a), 0.91 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-42a), 0.89 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-32a), 0.85 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-10a)
13C NMR (126MHz, メタノール-d4) δ = 178.4 (C-41), 177.0 (C-23), 174.1 (C-1), 142.8 (C-7), 142.7 (C-3), 139.8 (C-5), 137.4 (C-14), 135.4 (C-16), 133.2 (C-34), 132.5 (C-35), 131.7 (C-15), 131.6 (C-17), 130.9 (C-6), 130.7 (C-4), 127.6 (C-2), 88.3 (C-9), 82.8 (C-19), 82.1 (C-13), 80.9 (C-37), 79.1 (C-27), 77.0 (C-29), 76.4 (C-21), 75.5 (C-11), 72.5 (C-22), 72.0 (C-31), 68.7 (C-45), 68.2 (C-40), 59.6 (C-9a), 57.9 (C-29a), 56.5 (C-27a), 43.6 (C-36), 41.5 (C-8), 41.4 (C-39), 40.8 (C-26), 40.8 (C-28), 40.6 (C-32), 40.1 (C-10), 39.3 (C-18), 39.3 (C-24), 38.5 (C-12), 38.0 (C-44), 37.7 (C-33), 33.7 (C-42), 33.0 (C-30), 32.2 (C-20), 32.1 (C-43), 28.0 (C-25), 26.7 (C-38), 23.6 (C-46), 17.9 (C-16a), 17.2 (C-36a), 17.2 (C-18a, 8a), 14.4 (C-32a), 14.0 (C-14a), 13.4 (C-42a), 13.1 (C-24a), 13.0 (C-10a), 7.6 (C-12a)
【００３２】
実施例２：分子Ｉ−１からのメチルエステルＩ−２の調製
【化５】
2013509377.tif 000007
５０μｌのメタノールに溶解させた分子Ｉ−１の溶液５０μｇに、トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ２）１滴を加えた。その反応物を周囲温度で１０分間攪拌し、最後に少量の窒素噴射により乾燥させ、ＥＳＩ−モードでＬＣ／ＭＳにより分析した。その反応物は総てｍ／ｚ  １０７５．４（Ｍ−Ｈ）−の極性がより低いメチルエステルを形成した。
【００３３】
実施例３：ヒト癌細胞株パネルの増殖阻害
癌性細胞［細胞株Ａ５４９（非小細胞肺癌）、ＢｘＰＣ３（膵臓癌）、ＬｏＶｏ（結腸癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫）およびＳＫ−ＯＶ−３（卵巣癌）］を、１０％の胎児ウシ血清（１００μｌ／ウェル、考察する細胞株に応じて１〜３．１０４細胞／ｍｌ）添加、フェノールレッド(Seromed)無添加のＲＰＭＩ  １６４０培地が入った９６−ウェルプレートで培養した。５％ＣＯ２のインキュベーター内での３７℃で２４時間のインキュベーション後に、その培地を、試験する化合物（分子Ｉ−１）を含有する培地と交換し、その後、プレートをさらに４８時間インキュベートした。ＡＴＰ−ｌｉｔｅ−Ｍ（商標）キットに入っている細胞溶解溶液、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを製造業者(Packard, Rungis, France)推奨のとおり用いて、培地中へのＡＴＰ放出後の発光の測定により細胞生存を評価した。各実験条件を六連で少なくとも３回試験した。下の表は、分子Ｉ−１のＩＣ５０データ（Ｍで表される）を、試験した異なる細胞株に応じて示している。
【００３４】
【表１】
2013509377.tif 000008
【００３５】
実施例４：細胞表現型の説明（免疫蛍光および顕微鏡）
ＨｅＬａ腫瘍性細胞（ヒト癌腫）を、２４ウェル培養プレート中に入れた１２ｍｍ径ガラススライド上で２４時間培養した（１ウェル当たり７．１０３細胞）。
【００３６】
次いで、それらの細胞を試験濃度の分子Ｉ−１により新たに２４時間処理した。処理終了時にスライドを回収し、従前に記載されているとおり細胞を固定し細胞膜浸透化処理した(Lajoie-Mazenc I. et al., Journal of Cell Science 107, 2825-2837 (1994))。次いで、γ−チュブリンおよびα−チュブリンを、１／１０００希釈した特異的一次抗体（それぞれ：Ｒ７５ウサギポリクローナル抗体(Lajoie-Mazenc I. et al.)；クローンＢ−５−１−２モノクローナル抗体、Sigma-Aldrich, France）により標識し（２時間−３７℃）、その後、対応する蛍光二次抗体（１／１０００希釈したＡｌｅｘａ−５６８抗マウスおよびＡｌｅｘａ−４８８抗ウサギ；４５分−３７℃）により明らかにした。ＤＮＡをＤＡＰＩ（０．２μｇ／ｍｌ−１５分−３７℃）で標識した。種々の標識後、スライドを乾燥させ、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入液(AbCys, France)で封入した後、落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ；対物レンズ  ｘ６３  Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ＮＡ，  １．４; ZEISS, France)により観察した。
【００３７】
５．１０−９Ｍ〜５．１０−８Ｍの間では、間期細胞に微小管細胞骨格はなかった（α−チュブリンにより標識）。中心体は分離されていることが多く、通常γ−チュブリンにより標識された。
【００３８】
１０−９Ｍ〜５．１０−８Ｍの間の用量効果により、有糸分裂細胞は前中期に遮断され微小管は存在しなかった（α−チュブリン標識）。分離された２つの中心体が通常存在し、γ−チュブリンにより標識された。
【国際調査報告】
2013509377.tif 000013
2013509377.tif 000014
2013509377.tif 000015
2013509377.tif 000016
2013509377.tif 000017
2013509377.tif 000018