(57)【要約】  本発明は、貯蔵において、ペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、酵母、細菌（プロバイオティクス細菌など）、ウィルス、及び／又は細胞懸濁液などの繊細な生物活性物質を保存するための組成物及び乾燥方法に関する。当該組成物は、炭水化物成分、及びガラス増強剤成分を含み、ここで炭水化物成分は、二糖（類）、オリゴ糖（類）、及び多糖（類）の混合物を含み、そしてガラス増強剤は、有機酸のイオン及びタンパク質加水分解物を含む。当該組成物は、すべての固形成分を溶液中に分散し、その後、瞬間凍結して小さなビーズ、糸状のもの、又は液滴を形成する。凍結ビーズ、糸状のもの、又は液滴の好ましい乾燥方法は、短いパージ及び２０００ｍトール未満の真空圧力下、凍結粒子の構造安定化ステップにより開始し、続いて２０００ｍトール超の真空圧力下、所望の温度で第一乾燥ステップを行う。当該物質の第二及び最終乾燥ステップの間、全真空圧力及び高温を適用して、乾燥物質の最終的に所望する水分活性を実現する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の全重量基準で、約０．５％〜９０％の間を含む炭水化物成分；及び約０．５％〜４０％の間の加水分解された動物タンパク質又は植物タンパク質を含むタンパク質成分を含む生体物質のための乾燥安定化組成物。
【請求項２】
前記炭水化物成分が、オリゴ糖、多糖、及び二糖からなる群から選択される少なくとも１つの糖であり、ここで前記炭水化物成分の全重量基準で、前記オリゴ糖が、約５％〜１０％の間、二糖が４０％〜８０％の間、多糖が５％〜１０％の間である、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項３】
前記生体物質が、生細胞、死細胞、又は弱毒化細胞、微生物、ウィルス、細菌、プロバイオティクス細菌、植物及び土壌細菌、又は酵母、細胞培養物、タンパク質、組み換えタンパク質、酵素、ペプチド、ホルモン、ワクチン、抗生物質、薬物、及びそれらの混合物を含む、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項４】
前記加水分解されたタンパク質成分が、加水分解カゼイン、加水分解ホエイタンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解大豆タンパク質、及びそれらの混合物を含む、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項５】
前記炭水化物成分が、多糖、オリゴ糖、二糖、及びそれらの混合物を含む、請求項１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項６】
前記多糖成分が、セルロースアセテートフタレート（CAP）、カルボキシ‐メチル‐セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（HPMC)、メチルセルロース、カラギナン、ゲランガム、グアガム、アラビアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び加工デンプン、並びにそれらの混合物を含む、請求項２に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項７】
前記オリゴ糖成分が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト‐オリゴ糖（FOS）、ガラクト‐オリゴ糖（GOS)、マンナン‐オリゴ糖（MOS）、及びそれらの混合物である、請求項２に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項８】
前記二糖成分が、トレハロース、スクロース、ラクトース、及びそれらの混合物である、請求項５に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項９】
組成物の全重量基準で、約０．５％〜９０％の間を含む炭水化物成分；約０．５％〜４０％の間の加水分解された動物タンパク質又は植物タンパク質を含むタンパク質成分、及び約０．５％〜２０％の間のカルボン酸を含むカルボン酸成分を含む、生体物質のための乾燥安定化組成物。
【請求項１０】
前記カルボン酸成分が、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸、及びそれらの塩、又はそれらの混合物を含む、請求項９に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１１】
前記炭水化物成分が、約５％〜１０％の間を含むオリゴ糖、４０％〜８０％の間を含む二糖、及び５％〜１０％の間を含む多糖を含む、請求項９に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１２】
前記生体物質が、生細胞、死細胞、又は弱毒化細胞、微生物、ウィルス、細菌、プロバイオティクス細菌、植物及び土壌細菌、又は酵母、細胞培養物、タンパク質、組み換えタンパク質、酵素、ペプチド、ホルモン、ワクチン、抗生物質、薬物、及びそれらの混合物を含む、請求項９に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１３】
前記加水分解されたタンパク質成分が、加水分解カゼイン、加水分解ホエイタンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解大豆タンパク質、及びそれらの混合物を含む、請求項９に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１４】
前記炭水化物成分が、多糖、オリゴ糖、二糖、及びそれらの混合物を含む、請求項９に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１５】
前記多糖成分が、セルロースアセテートフタレート（CAP）、カルボキシ‐メチル‐セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（HPMC)、メチルセルロース、カラギナン、ゲランガム、グアガム、アラビアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び加工デンプン、並びにそれらの混合物を含む、請求項１１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１６】
前記オリゴ糖成分が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト‐オリゴ糖（FOS）、ガラクト‐オリゴ糖（GOS)、マンナン‐オリゴ糖（MOS）、及びそれらの混合物である、請求項１１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１７】
前記二糖成分が、トレハロース、スクロース、ラクトース、又はそれらの混合物である、請求項１４に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項１８】
前記組成物がアモルファスガラス状の状態で乾燥される、請求項１又は９に記載の生体物質のための乾燥安定化組成物。
【請求項１９】
二糖／オリゴ糖／多糖の重量比が、約１０：０．２：０．１〜約１０：２：１である、請求項２又は１１に記載の乾燥安定化組成物。
【請求項２０】
前記乾燥が、凍結乾燥、空気乾燥、真空乾燥、流動床乾燥（fluid bed drying）、及び噴霧乾燥からなる群から選択される１以上のプロセスである、乾燥方法。
【請求項２１】
生体物質のための乾燥安定化組成物の調製方法であって、以下：
（ａ）水性溶媒中で生体物質と、請求項１又は９に記載の組成物の混合物とを混合して、粘性のあるスラリーを形成し；
（ｂ）液体窒素中で前記スラリーを瞬間凍結して、固形凍結粒子、ビーズ、液滴、又は糸状のもの（string）を形成し；
（ｃ）真空下、製剤温度をその凍結温度超で、蒸発によって前記製剤の第一液体乾燥ステップを行い；
（ｄ）最大真空及び２０℃以上の温度で、前記製剤の水分活性を減少させるために十分な時間、前記製剤の第二乾燥を行うこと
を含む、方法。
【請求項２２】
前記第一乾燥ステップを開始する前に、前記固形凍結粒子の順化ステップをさらに含む、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項２３】
前記乾燥安定化組成物がアモルファスガラス状の状態で乾燥される、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項２４】
前記スラリーが、瞬間凍結の前に、ｐＨ若しくは温度変化により、又はポリマー鎖の架橋によりフイルムヒドロゲルに固められる、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項２５】
前記スラリーが所望の形状に形成される、請求項２４に記載の調製方法。
【請求項２６】
前記順化ステップが、真空下及び前記製剤凝固点未満の温度で行われる、請求項２２に記載の調製方法。
【請求項２７】
前記順化ステップが０〜６０分の間で行われる、請求項２２に記載の調製方法。
【請求項２８】
前記第一液体乾燥ステップが２０００ｍトール超の真空圧力下で行われる、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項２９】
前記乾燥安定化組成物が、自由流動性粉末（free flowing powder）に切断され、破砕され、製粉され、又はそれぞれ微粉末化（pulverize）される、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項３０】
前記粉末が約１０００μｍ未満の粒子サイズを有する、請求項２９に記載の調製方法。
【請求項３１】
前記乾燥安定化組成物の水分活性（Ａｗ）が０．３未満のＡｗである、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項３２】
前記製剤が、再構成液体（reconstituted liquid）、微粉末（ground powder）、錠剤、ペレット、カプセル、食品又は飼料の形態である、請求項１又は９に記載の乾燥安定化組成物を含む経口送達製剤。
【請求項３３】
前記生体物質が、製剤の保存可能期間の間、安定である、請求項１又は９に記載の組成物を含む経口送達製剤。
【請求項３４】
前記製剤が食品、動物飼料、栄養補助食品、医薬品、又はワクチン製品として消費される、請求項１又は９に記載の乾燥安定化組成物を含む経口送達製剤。
【請求項３５】
前記組成物が、バー、液体栄養剤（liquid formula）、コロイド状懸濁液、粉末、錠剤、カプセルの形態で、食品、食品添加物、動物飼料、動物飼料添加物、栄養補助食品、医薬品、又はワクチン製品として消費される、請求項１又は９に記載の生体物質のための乾燥安定化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１０年８月１３日に米国特許商標庁に出願された米国仮特許出願第６１／３７３，７１１号の利益を主張する。その全内容は参考として本明細書に組み込まれているものとする。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ガラス状の乾燥構造について安定化生体物質の分野に関する。
【０００３】
高温多湿での長期貯蔵中の生体物質の構造と機能の保存は、食品、栄養補助食品、及び医薬品産業にとって根本的に重要である。タンパク質、酵素、細胞、細菌、及びウィルスなどの繊細な生体物質は、その後の使用のためにしばしば長期間貯蔵しなければならない。単純な凍結は、乾燥が最終製品にとって有害又は適切でない場合、しばしば行われる。乾燥状態での貯蔵に関して、凍結乾燥が従来から最も一般的な方法である。周囲空気乾燥、周囲温度での真空下乾燥（真空乾燥）、又は温風と液滴の霧状ミストとを接触することによる乾燥（噴霧乾燥）、及び脱水（desiccation）による乾燥などの他の方法は、生菌又は弱毒化した細菌、及びウィルスなどの繊細な生物活性に対して一般的に適切ではない。これらの方法で使用される高い乾燥温度は、生物活性自体に著しい損傷をもたらす。
【０００４】
しばしば凍結乾燥プロセスは、遅い乾燥プロセスの間の氷結晶の形成のために、生物活性剤に対して活性の著しい減少及び損傷をもたらす。凍結乾燥は、凍結と乾燥の両方に起因するストレスを兼ね備えている。このプロセスの凍結ステップは、タンパク質及び酵素の変性、並びに細胞の破裂などの望まない影響を有するであろう。凍結により引き起こされる損傷は、溶液に凍結保護化合物又は凍結防止剤を添加することにより、ある程度、回避することができる。そのような保護剤は、一般的に凍結中に細胞膜及びタンパク質を保護し、貯蔵中に安定性を高めるために製剤（formulation）に添加される高い溶解性の化学物質である。一般的な安定剤は、高濃度でスクロース、トレハロース、グリセロール、又はソルビトールなどの糖（類）を含む（Morganら、2006; Capelaら、2006）。スクロース及びトレハロースなどの二糖（類）は、良好な保護特性を有する天然の凍結保護物質である。トレハロースは、干ばつの間、仮死状態で生き残っている植物及び有機体から実際に単離されたので、特に魅力的な凍結保護物質である。トレハロースは、さまざまな生体物質に関して効果的な保護剤であることが示されている（Crowe, J. H., 1983を参照）。いくつかの特許では、凍結、乾燥及び再水和中にタンパク質、並びに酵素、血清、血清補体、抗体、抗原、蛍光タンパク質、及びワクチン成分などの他の生体高分子を保護するために、トレハロース又はトレハロースと他の凍結保護物質との組み合わせの使用を開示する（米国特許第５，５５６，７７１号）。
【０００５】
しかしながら、唯一の凍結保護物質としてトレハロース又は他の二糖（類）若しくは単糖（類）の使用に伴ういくつかの欠点がある。トレハロースは、細胞内容積内の有効成分を保護するために細胞内に十分に浸透しない場合があり、それは凍結乾燥された物質の貯蔵における不安定性に繋がるかもしれない。さらに、所定の保存媒体の６０重量％超のトレハロース濃度が必要な場合がある。トレハロースの使用に伴うさらにより深刻な問題は、トレハロースを単独で使用して保存された生体物質が、長期間、特に高温及び／又は多湿環境で保存されたものに関して貯蔵安定性がないことである。従って、最適な製剤及び乾燥物質の十分な貯蔵安定性を達成しながら乾燥による損失を最小限にする乾燥プロセスを開発する重要な課題が存在する。
【０００６】
トレハロース及び凍結乾燥プロセスに伴ういくつかの問題は、特定の製剤及びガラス状態、特に糖ガラスの状態で真空乾燥することにより解決されてきた（米国特許第６，１９０，７０１）。それらの製剤において、生物活性剤は、高温多湿などの過酷な環境に対してガラス状マトリックス内に保護される。しかしながら、それらの製剤において、環境中の湿気としての水の存在は、可塑剤として作用し、ガラス状マトリックスのガラス転移温度（Tg）の低下に影響を及ぼす。高い水分含量では、Ｔｇは、乾燥製剤が、室温で望まないラバー又はプラスチック状の状態である程度まで著しく低くなる。
【０００７】
製剤のガラス形態を保つ利点は、固体の増加した物理的安定性及び有害な分子間反応の減少を含む。ガラス状態及び転移温度に関するような水食品（water-food）ポリマー相互作用の物理化学の詳細な議論は、M. Le Mesteら、2002年に見られる。しかしながら、物理的不安定性及び高い化学反応性などのアモルファス系の限界は、それらの大規模な商業化において障害となる。
【０００８】
従って、広範囲の生体物質に関して有用な、安定化組成物のための必要性が存在する。凍結乾燥プロセス及び常温乾燥を伴う乾燥プロセスの両方で効果的に使用される安定化組成物のための必要性がさらに存在する。現在使用されているものよりも安価である組成物混合物のための必要性もある。最終的に重要なことは、再水和でかなりの量の活性をまだ保持しつつ、物質の輸送及び貯蔵中に遭遇するかもしれない高温及びさまざまな程度の湿度で、長期間にわたって生体物質の保存に関して安定な媒体を提供する組成物混合物の必要性がある。
【０００９】
これらのすべての必要性が、本発明の組成物混合物、乾燥方法、及び結果として生じる保存された生体物質組成物により満たされる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、貯蔵においてペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、酵母、細菌（プロバイオティクス細菌など）、ウィルス及び／又は細胞懸濁液などの繊細な生物活性物質のための組成物と乾燥方法を含む。
【００１１】
本発明の組成物は、二糖（類）、オリゴ糖（類）、及び多糖（類）の炭水化物混合物、並びに有機酸、好ましくはクエン酸又はアスコルビン酸のイオンを含む。製剤は、溶液中にすべての固形成分を分散することにより調製する。溶液は、液体窒素又はドライアイスなどの公知の方法により瞬間凍結（snap-frozen）され、小さなビーズ、糸状のもの（string）、又は液滴（droplet）を形成する。凍結ビーズは、凍結状態での後の使用のためにディープフリーザー（−３０℃〜−８０℃の間）で貯蔵でき、又は従来の凍結乾燥機中で乾燥するために凍結状態でトレーに設置できる。好ましい乾燥方法は、任意により、短いパージ、及び２０００ｍトール未満の真空圧力下、凍結粒子の構造安定化ステップにより開始され、続いて２０００ｍトール超の真空圧力下、所望の温度で第一乾燥ステップを行う。物質の第二及び最終乾燥ステップの間、全真空圧力及び高温が適用され、乾燥物質の望ましい最終水分活性を達成する。
【００１２】
一つの具体的な実施態様では、生体物質は、生菌（例えばプロバイオティック細菌）を含む。適切な微生物の例は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、デバリオマイセス（Debaromyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、及びトルロプシス（Torulopsis）などの酵母、アスペルギルス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizooopus）、ムコール（Mucor）、ペニシリウム（Penicillium）、及びトルロプシス（Torulopsis）などのカビ、並びにビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属、フゾバクテリウム（Fusobacterium）属、メリソコッカス（Melissococcus）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、コクリア（Kocuria）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）属、バチルス（Bacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ウェイセラ（Weissella）属、アエロコッカス（Aerococcus）属、オエノコッカス（Oenococcus）属、及びラクトバチルス（Lactobacillus）属などの細菌が挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロバイオティック微生物の具体的な例は、以下の種によって表され、それらの種の中ですべての培養バイオタイプが含まれる。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）、バチルス・メセンテリカス（B. mesentericus）、バチルス・プミラス（B. pumilus）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・ナットー（B. natto）、バクテロイデス・アミロフィルス（Bacteroides amylophilus）、バクテロイデス・カピローサス（Bac. capillosus）、バクテロイデス・ルミニコーラ（Bac. ruminicola）、バクテロイデス・スイス（Bac. suis）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム（B. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・テルモフィルム（B. thermophilum）、カンジダ・ピントレペシイ（Candida pintolepesii）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、エンテロコッカス・クレモリス（Enterococcus cremoris）、エンテロコッカス・ダイアセチラクチス（E. diacetylactis）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・インターメディウス（E. intermedius）、エンテロコッカス・ラクチス（E. lactis）、エンテロコッカス・ムントディ（E. muntdi）、エンテロコッカス・サーモフィルス（E. thermophilus）、大腸菌（Escherichia coli）、クリベロミセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（L. alimentarius）、ラクトバチルス・アミロボラス（L. amylovorus）、ラクトバチルス・クリスパタス（L. crispatus）、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・クルバタス（L. curvatus）、ラクトバチルス・セロビオサス（L. cellobiosus）、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種・ブルガリカス（L.delbrueckii ss. bulgaricus）、ラクトバチルス・ファルシミニス（L. farciminis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・ラクティス（L. lactis）、ラクトバチルス・プランタルム（L. plantarum）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（L. johnsonii）、バチルス・ロイテリ（L. reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・サケイ（L. sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ペジオコッカス・セレヴィシエ（ダムノサス）（P.cereviseae（damnosus））、ペジオコッカス・アシジラクティシー（Pediococcus acidilactici）、ペジオコッカス・ペントサセウス（P. pentosaceus）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Propionibacterium freudenreichii）、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Prop. shermanii）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、スタフィロコッカス・キシローサス（Staph. xylosus）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Streptococcus infantarius）、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種・サーモフィラス（Strep. salivarius ss. thermophilus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Strep. thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Strep. lactis）。
【００１３】
一つの実施態様では、製剤は、二糖（類）、オリゴ糖（類）、多糖（類）の炭水化物混合物を含み、ここで生物活性物質が、組み込まれている。適切な多糖（類）の例は、セルロースアセテートフタレート（CAP）、カルボキシ‐メチル‐セルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、カラギナン、ゲランガム、グアガム、アラビアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び加工デンプンが挙げられるが、これらに限定されない。適切なオリゴ糖（類）の例は、シクロデキストリン、イヌリン、ＦＯＳ、マルトデキストリン、デキストランなど、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。適切な二糖（類）の例は、ラクトース、トレハロース、スクロースなどが挙げられるが、これらに限定されない。一つの具体的な実施態様では、好ましい多糖は、アルギン酸ナトリウム又はゲランガムである。好ましくは、炭水化物組成物は、全乾燥物質の重量パーセントで０．１〜１０％の多糖（類）、１〜１０％のオリゴ糖（類）、及び１０〜９０％の二糖（類）を含む。さらなる実施態様では、炭水化物混合物は、１０：０．１〜４：０．１〜２の重量比で二糖（類）、オリゴ糖（類）、及び多糖（類）を含み、より好ましくはここで二糖（類）／オリゴ糖（類）／多糖（類）が、約１０：０．２：０．１〜約１０：２：１の重量比である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施態様では、炭水化物混合物中の多糖（類）は、二価の金属イオンで架橋し、フイルムヒドロゲルを形成する。
【００１５】
別の実施態様では、組成物は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸などの有機酸の塩を含むガラス増強（enhancing）化合物のかなりの量を含む。塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのカチオンを含んでもよい。例としては、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、アスコルビン酸ナトリウムなどが挙げられる。高いガラス転移温度（Tg）及び高い溶解性を有する塩が好ましい。最も好ましい有機酸は、クエン酸及びその塩（例えばクエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム、クエン酸三ナトリウム水和物）並びにアスコルビン酸及びその塩（例えばアスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸マグネシウム）である。乾燥組成物中のクエン酸塩又はアスコルビン酸塩の好ましい全量は、炭水化物化合物のモルに対するイオンのモル比が、約０．０１〜約０．３、より好ましくは約０．１〜約０．２である。
【００１６】
他の有用なガラス増強剤（enhancer）は、タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド、及びアミノ酸が挙げられる。これらは、ゼラチン、アルブミン、ホエイタンパク質、大豆タンパク質、カゼイン、カゼイネート、免疫グロブリン、エンドウ豆タンパク質、綿実タンパク質、又は他の食品、及び乳タンパク質又は植物性タンパク質、及び／又はそれらの加水分解物を含む。ポリアミノ酸の例としては、ポリアラニン、ポリアルギニン、ポリグリシン、ポリグルタミン酸などが挙げられる。有用なアミノ酸は、リジン、グリシン、アラニン、アルギニン又はヒスチジン、及び疎水性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなど）、及びベタインなどのメチルアミンが挙げられる。乾燥組成物中のタンパク質、タンパク質加水分解物、及びアミノ酸の好ましい全量は、炭水化物混合物の全質量の約１％〜約３０％であり、最も好ましくは炭水化物混合物の全質量の約５％〜約２０％である。理想的には、一般に安全と認められる（GRAS）化合物である化合物が、ＧＲＡＳでないものよりも選ばれる。
【００１７】
組成物中のガラス増強剤の適切な量が、乾燥組成物の望ましい特徴に依拠してもよいことに留意すべきである。ガラス増強剤の適切な量の決定は、所望の貯蔵条件に従ってなされるべきである。例えば、炭水化物混合物及びタンパク質又はタンパク質加水分解物を含む組成物は、２５℃及び２５ＲＨなどの温和な温度及び相対湿度で貯蔵される間、生体物質の化学的安定性を高めるために使用できる。クエン酸イオンは、高温多湿暴露で、付加された安定化の利益を得るために、ガラス増強剤を含むことが好ましいかもしれない。あるいは、クエン酸イオン及び／又はアスコルビン酸イオンと、タンパク質又はタンパク質加水分解物などの他のガラス増強剤との組み合わせが、組成物を構成するためにより好ましい場合があるかもしれない。
【００１８】
生体物質及び組成物の好ましい混合プロセスは、生体物質を含む濃縮培地又は媒体溶液（media solution）中に全乾燥組成物を添加する方法である。培地中の生体物質の重量質量（weight mass）は、典型的に約５％〜３０％ｗ／ｖの間、より好ましくは約１０％〜２０％ｗ／ｖの間である。培地中の組成物混合物の添加された重量質量は、典型的に約１０％〜約６０％の間、より好ましくは約２０％〜４０％の間である。混合されたスラリー中の最終固形分含量は、約２０％〜約６０％、より具体的に約３０％〜約５０％である。好ましくは、溶液は、粘性溶液中で物質の可溶化を助けるために室温又は少し加温されて（例えば２０℃〜４０℃）混合される。本発明のバリエーションでは、製剤中の炭水化物混合物の全量は、乾燥ステップの間に生じるかもしれないラバー状態の形成又は過度の泡形成を回避しながら、効率的な乾燥を可能にする所望の製剤粘度及び密度を達成するために調節される。好ましいスラリー粘度は、約１０００ｃＰ〜５０００００ｃＰ、最も好ましくは約１００００ｃＰ〜約３０００００ｃＰの範囲である。最終スラリーの所望の粘度及び密度は、任意の当該技術分野において公知の方法により、例えば炭水化物混合物中の多糖（類）の量をわずかに調節することにより、又は空気、窒素、二酸化炭素、アルゴンなどのガスを脱気又は注入することにより達成される。
【００１９】
本発明の生体物質スラリーは、典型的に−３０℃〜−１８０℃の間で瞬間凍結され、より好ましくは製剤を液体窒素バス内に噴霧し、滴下し、又は注入することにより液体窒素中で瞬間凍結させる。凍結形態又は乾燥のままでの後の使用のために、液体窒素バスから粒子、ビーズ、糸状のもの、又は液滴を採取し、及び凍結乾燥機又は真空乾燥機で乾燥し、又は代替的に冷蔵庫（−３０℃〜−８０℃の間）でそれらを保存する。
【００２０】
一般的に、有用である乾燥プロセス技術は、噴霧乾燥；凍結乾燥に続いて粉を微粉末にするための製粉；冷表面の上に噴霧、続いて微粉末化された粉の昇華及び採取；スラリーの凍結温度超の温度（−２０℃〜５０℃）で、真空オーブン又は遠心エバポレーター中で非凍結溶液の蒸発乾燥、続いて所望の粒子サイズへの製粉を含む。生じた粉末粒子は、表面上にコーティングされた大部分のガラス物質を内部に有するガラス状又は結晶質である。ガラス状物質での生体物質のコーティングの利点は、製品の物理的安定性を増加すること、及び粒子内の有害な分子間の反応の減少することである。好ましい実施態様では、凍結粒子は、トレー上に充填され、早急に真空乾燥室（chamber）に移動され、ここで乾燥プロセスが、以下の３つの主なステップについて行われる。ステップは、（１）任意に、短いパージ及び２０００ｍトール未満の真空圧力下、凍結粒子の構造安定化ステップ、（２）２０００ｍトール超の真空圧力下、及びスラリーの凝固点超の温度での第一乾燥ステップ、並びに（３）０．３以下のＡｗに乾燥製剤の水分活性が減少するために十分な時間、全真空圧力及び高温でガラス状アモルファス物質の第二乾燥及び最終乾燥ステップを含む。
【００２１】
乾燥され、安定した生体組成物（biological composition）は、フレークとして直接使用でき、又は粉末にし、約１０μｍ〜約１０００μｍの平均粒子サイズに篩過できる。製剤は、濃縮粉末として、再構成溶液（例えば飲料）としてヒトを含む動物に直接投与でき、又は既存の食品若しくは飼料中にフレーク若しくは粉末形態のいずれかで組み込むことができる。
【００２２】
本発明のこれらの及び他の利点及び特徴は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明でより完全に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、市販のプロバイティクス細菌及び本発明の乾燥組成物中のプロバイオティクス細菌の加速安定性を示す。
【図２】図２は、加速貯蔵条件下（３７℃、３３％ＲＨ）、本発明の組成物中のプロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei））の安定性について、ガラス増強剤と炭水化物組成物の間のさまざまなモル比の影響を示す。
【図３】図３は、プロバイオティクス細菌（L. acidophilus）の貯蔵安定性に対する本発明の組成物の影響を示す。乾燥プロバイオティクス細菌の安定性を、２４℃、３３％ＲＨの加速貯蔵条件で５３７日間試験した。
【図４】図４は、プロバイオティクス細菌（L. acidophilus）の貯蔵安定性に対するさまざまなガラス増強剤の影響を示す。乾燥プロバイオティクス細菌の安定性を、２４℃、４３％ＲＨの加速貯蔵条件で１８０日間試験した。
【図５】図５は、プロバイオティクス細菌（ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis））の貯蔵安定性（３５℃、４３％ＲＨ)に対してさまざまなタンパク質加水分解物／糖の比率の影響を示す。
【図６】図６は、バイオティクス細菌（ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus））の最大安定性に関するｐＨの最適化を示す（４０℃、３３％ＲＨで８週間の加速貯蔵条件）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様のみを示す目的のために使用され、限定することを意図していないと理解すべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用するように、単数「a」、「an」及び「the」は、その内容が別に明示されない限り、複数対象を含む。従って、例えば「タンパク質」とは、単数タンパク質又は２以上のタンパク質の組み合わせを含むことを意味し；「酵素」、「細菌」などは、単数又はいくつかの種類の混合物などを含むことを意味する。
【００２５】
本発明を説明し、請求する際に、以下の定義とともに次の用語を用いる。
【００２６】
「生体物質（Biological material）」、「生体組成物（biological composition）」又は「生物活性製剤（bioactive formulation）」とは、調合物（preparation）を意味し、そしてそれらは明白に効果的な生物活性成分又は剤の生物活性を可能にするような形態である。
【００２７】
「ガラス増強剤（glass enhancer）」とは、臨界温度（ガラス転移温度（Tg））未満でアモルファス又はガラス状構造を形成する能力を有する化合物である。仮にガラス増強剤がそのＴｇ未満で乾燥されたら、ガラスを形成する。しかしながら、仮にガラス増強剤が、そのＴｇ超で乾燥されたら、続いてガラスを形成しない。ガラス状構造の形成の間に、生体物質を、ガラス構造内に組み込むことができるようになる。本発明での使用に関して適切なガラス増強剤は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸などの有機酸の塩を含むが、それらに限定されない。塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩などのカチオンを含んでもよい。他の有用なガラス増強剤は、タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド、及びアミノ酸を含む。ガラス形成剤の組み合わせは、単一組成物内にまた企図される。本発明の目的のためにガラス状構造を得るために使用されるプロセスは、一般的に溶媒昇華及び／又は蒸発技術である。理想的には、ＧＲＡＳ化合物である化合物が、ＧＲＡＳでないものと比べて好ましい。
【００２８】
「炭水化物」又は「ポリヒドロキシ化合物」とは、主に炭素、水素及び酸素からなる糖（類）化合物を意味する。糖は一般的に、線状又は非線状形状で結合した繰り返し構造単位の糖骨格を構成し、そのいくつかは、正又は負に荷電した化学基を含む。繰り返し単位は、２〜数百万の範囲でもよい。有用な糖（類）は、還元及び非還元糖、還元及び非還元糖アルコール、二糖（類）、オリゴ糖（類）、水溶性多糖（類）、並びにそれらの誘導体が挙げられる。２つの単糖（類）が一緒に結合して二糖（類）を形成する。二糖（類）を形成するために使用される２つの単糖（類）は、同じでも、異なってもよい。本発明の炭水化物混合物中で使用できる二糖（類）の例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマストースが挙げられる。硫酸化二糖（類）が、使用されてもよい。少数の単糖（類）が一緒に結合して（一般的に３〜１０）、オリゴ糖を形成する。オリゴ糖を形成するために使用される単糖（類）は、同じ又は異なる糖（類）の成分でもよい。使用のために適切なオリゴ糖（類）の例は、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクト‐オリゴ糖（類）（FOS）、ガラクト‐オリゴ糖（類）（GOS）、マンナン‐オリゴ糖（類）（MOS）及びそれらの混合物が挙げられる。多数の単糖（類）が一緒に結合して（一般的に１０超）多糖（類）を形成する。多糖（類）を形成するために使用される単糖（類）は、同じ又は異なる糖の成分でもよい。使用のために適切な多糖（類）の例は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒプロメロース；可溶性デンプン又はデンプン画分、キサンタンガム、グアガム、ペクチン、カラギーン、ガラクトマンナン、ゲランガム、それらの任意の誘導体を含み、セルロースアセテートフタレート（CAP）、カルボキシ‐メチル‐セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸塩、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（HPMC）、アラビアガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び加工デンプン、並びにシクロデキストリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「安定した（stable)」製剤又は組成物とは、その中の生物活性物質が、貯蔵に関して、その物理的安定性、化学的安定性、及び／又は生物活性を本質的に保持するものである。安定性は、選択された温度と湿度の条件下、選択された期間の間、測定してもよい。トレンド分析は、物質を実際その期間の間貯蔵する前に、予想される貯蔵可能期間を推定するために使用できる。生菌に関して、例えば安定性は、温度、湿度及び期間のあらかじめ定義された条件下、乾燥製剤の１ ｌｏｇのＣＦＵ／ｇを失う時間として定義される。
【００３０】
細菌に関して「生存能力（Viability）」とは、細菌の生育に適切な栄養培地上でコロニーを形成する能力（CFU又はコロニー形成単位）を意味する。ウィルスに関して生存能力とは、適切な宿主細胞中に感染及び繁殖し、宿主細胞の菌叢に対してプラークの形成を生じるための能力を意味する。
【００３１】
「周囲」室温又は条件は、所定の環境での任意の所定の時間によるものである。典型的に、周囲室温は、２２〜２５℃であり、周囲大気圧及び周囲湿度は、容易に測定され、時期、天候及び気候条件、標高などに依拠して変化するであろう。
【００３２】
乾燥製剤組成物の文脈において「水分活性（water activity）」又は「Ａｗ」とは、水の利用可能性を意味し、系における水のエネルギー状態を表す。これは、同じ温度においてサンプル上の水蒸気圧を純水のもので割ったものとして定義される。純粋な蒸留水は、正確に１又はＡｗ＝１．０の水分活性を有する。
【００３３】
貯蔵安定性の文脈において「相対湿度」又は「ＲＨ」とは、所定の温度での空気中の水蒸気の量を意味する。相対湿度は、通常、空気を飽和するために必要な湿度未満であり、飽和湿度の百分率で表される。
【００３４】
「乾燥」及びそれらのバリエーションとは、脱水又は無水、すなわち実質的に液体を欠いている物理的状態を意味する。乾燥は、例えば噴霧乾燥、流動床乾燥（fluidized bed drying）、凍結乾燥、及び真空乾燥が挙げられる。
【００３５】
「凍結乾燥」又はフリーズドライとは、急速な凍結、及び凍結状態での脱水（時々、昇華という）による乾燥形態の組成物の調製を意味する。凍結乾燥は、ポリマーの結晶化を生じる温度で行われる。このプロセスは、凍結生成物を維持するために十分な圧力、好ましくは約２０００ｍトールより低い圧力で、真空下行われてもよい。
【００３６】
本明細書で記載されるプロセスに関して「第一乾燥（Primary drying）」又は「液体乾燥」とは、凍結粒子を融解する時間から第二乾燥を開始する時点までに行う脱水乾燥を意味する。典型的に、第一乾燥の大部分は、生成物温度を熱源温度よりも大幅に低く維持しつつ、大規模な蒸発によって行う。このプロセスは、融解された生成物を維持するために十分な圧力、好ましくは約２０００ｍトール超の圧力で真空下行ってもよい。
【００３７】
本明細書で記載されるプロセスに関して「第二乾燥」とは、製剤の凍結温度超の温度で、及び熱源温度に近い温度で行う乾燥ステップを意味する。このプロセスは、製剤の水分活性を減らすのに十分な圧力、好ましくは約１０００ｍトール未満の圧力で真空下行われてもよい。典型的な製剤乾燥プロセスでは、第二乾燥ステップは、製剤の水分活性を０．３以下のＡｗに低減する。
【００３８】
本発明の組成物及び乾燥方法は、乾燥状態で著しく延長された寿命を有するペプチドタンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、酵母、細菌、ウィルス及び／又は細胞懸濁液などの繊細な生体物質を含む費用効率の高い、及び産業的に拡張可能な凍結、又は乾燥製剤を提供するという問題を解決する。本発明は、高溶解性化合物のアモルファスガラス状構造により取り囲まれている生体物質を含む貯蔵組成物及び乾燥方法を提供する。凍結及び乾燥プロセスは、液体スラリー中で生体物質及び組成物を混合し、液体窒素中で前記化合物スラリーを瞬間凍結して液滴、糸状のもの又はビーズを形成し、高真空下、凍結粒子をパージし、次に、組成物に熱を供給しつつ、減圧状態の下、水分を蒸発することにより糖ガラス形成で生物活性物質を乾燥することを含む。
【００３９】
本発明は、十分な活性を保持しつつ、生体物質をガラス状構造で保護できるという卓越した発見に基づく。生体物質が、本発明による組成物混合物及び真空乾燥と組み合わされた場合、長期間の過酷な温度及び湿度の暴露の間、優れた安定性を実現した。本発明は、生体物質、可溶性炭水化物の混合物、及びガラス増強カルボン酸塩を含む組成物を含む。本発明の化合物は、一般的な乾燥プロセスの下、単純に乾燥させた粘性のない又は濃縮された糖を含む組成物と、本質的にそれらの物理的構造及び機能が異なる。例えば、米国特許第６，９１９，１７２号では、経肺投与のためのエアロゾル化された粉末組成物を開示し、そしてそれは、さまざまな炭水化物及びクエン酸ナトリウムの混合物を含む。しかしながら、この特許で記載された組成物は、高濃度の糖（類）を有する溶液の乾燥の間、付加される安定性ために、及び所望の物理的構造の形成のために不可欠であるタンパク質の化合物を欠いている。この特許に記載される組成物は、粘度又はヒドロゲル構造も欠いており、そしてそれは、増強されたガラス形成のために融解又は凍結されていない溶液の効果的な乾燥を可能にする。対照的に、本発明の組成物及び乾燥プロセスは、生体物質の優れた安定性を実現しつつ、これらのすべての問題を克服する。
【００４０】
増強されたガラス状構造は、先行技術では、通常、効果的な乾燥を容易にするために真空下、泡形成又は沸騰することにより実現していた。泡形成ステップは、一般的に沸騰が激しく、溶液が噴出する結果となったが、これは非凍結溶液の乾燥において避けられない結果であり、バイアル又は容器中の溶液の非常に低い充填能力（loading capacity）しか実現できない（例えば、米国特許第６，５３４，０８７号を参照のこと。ここでは、泡形成した最終生成物の厚さは２ｍｍ未満である）。本発明の組成物及び乾燥方法は、製剤の沸騰及び泡形成を避け、それによって物質の乾燥面積あたりのはるかに高い充填を可能にし、その結果として、特に設計された容器及びトレー又は装置を使用せずに、容易にスケールアップして、物質を大量製造することができる。
【００４１】
幅広い生体物質が、本発明の組成物と共に使用でき、本発明の水性貯蔵媒体を形成する。この貯蔵媒体は、次に、本発明の乾燥プロセスに供し、生体物質の安定な乾燥粉末を作製することができる。これらの生体物質は、膵酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラクターゼ、デヒドロゲナーゼなどの酵素；インスリンなどのタンパク質；ワクチン；アデノウィルスなどのウィルス；原核細胞（バクテリアを含む）及び真核細胞を含む細胞、薬物、核酸、及び脂質小胞を含む他の生体物質が挙げられるが、限定されない。
【００４２】
プロバイオティクス細菌は、本発明の組成物及び乾燥方法から特に利益を得ることが示される。安定な乾燥プロバイオティクス粉末は、プロバイオティクス細菌の生、凍結又は乾燥培養物と炭水化物及びガラス増強化合物の混合物とを混合し、液体窒素で粘性のある製剤を瞬間凍結して凍結固形液滴、糸状のもの又はビーズを形成し、並びにパージし及び凍結粒子の構造を安定化するために十分な真空圧力を最初に適用して、凍結温度超に製剤温度を増加して、及び２０℃以上の熱源を供給して第一水除去を容易にすることで真空乾燥することを含む本発明の組成物及び本発明の方法により調製される。凝固点超に製剤の温度を維持することは、真空圧力を調節し、及び製剤に熱を伝導することより遂行できる。乾燥プロセスを終え、そしてさらに０．３以下のＡｗに製剤の水分活性を低減するために、最大真空圧力及び７０℃までの高温で、第二乾燥ステップが適用される。そのような組成物は、４０℃及び３３％ＲＨで６０日以上などの過酷な貯蔵条件で、安定性を維持できる。
【００４３】
組成物の調製
本発明による生体物質の安定な凍結又は乾燥粉末の調製のための組成物は、炭水化物混合物及びガラス増強剤を含む。そのような物質は、好ましい生体物質と混合した場合、液体窒素中でビーズ、糸状のもの、又は液滴を形成し、及び本発明の方法により効率良くアモルファスガラス状構造に乾燥させ、前記生物活性物質の貯蔵及び投与のための大量の安定な乾燥組成物を提供することができる（乾燥後の異なる製剤の物理的観測及び水分活性（Ａｗ）に関して図１を参照）。炭水化物混合物は、製剤に構造的安定性を提供し、及び／又は生物活性物質に物理的及び化学的保護効果を提供し、並びに再構築又は再水和の際の悪影響を予防し又は低減する。
【００４４】
炭水化物混合物中の多糖画分は、真空圧力下で製剤に増粘粘度（thickening viscosity）及び製剤密度特性のより良い制御を提供し、本発明の乾燥製剤組成物にさらなる構造強度を提供する。特に生物にとって好ましい多糖（類）は、水溶性ガムであり、それは穏やかな温度で粘性のあるゲルを形成するそれらの独特の特徴のためである。特定の濃度でガムは、製剤に適切な粘度及び密度を提供し、特定の粘度で第一液体乾燥ステップの間に製剤の効果的な乾燥を可能にすることにより、真空下、製剤構造を効果的に安定にすることも見出した。特定のガムは、二価又は多価カチオンと架橋することによりヒドロゲルも形成でき（例えばアルギン酸塩、ペクチン、キトサン）、又は温度若しくはｐＨを変化することによりヒドロゲルも形成できる（例えばゼラチン、ＣＭＣ、ＣＡＰ、ゲランガム）。ヒドロゲル化溶液は、非凍結溶液の真空乾燥に伴う問題を防ぐ。
【００４５】
炭水化物混合物中の二糖（類）は、さまざまな糖（類）及び糖アルコール（類）を含む。好ましい二糖（類）は、凍結温度（例えば−２０℃未満）で、及び水分除去の間に、製剤中の生物活性物質を結晶化させず及び／又は損傷させず又は不安定にさせないものである。例えば、生物活性物質を、スクロース、ラクトース又はトレハロースなどのガラスを形成する糖（類）中に物理的に組み込むことで、乾燥プロセス全体を通じて分子構造の保持を促進でき、そして乾燥状態においてアモルファスマトリックスに構造上の剛性を付与することができる。適切な二糖（類）は、乾燥中に失われた水和水を効果的に置換して、細胞膜への損傷及び酵素の変性を防ぐ（Croweらによるレビュー、1998年を参照）。組成物中の二糖（類）の他の機能は、有害な光、酸素、酸化剤及び水分への暴露から生物活性物質を保護することを含むことができる。適切な二糖（類）は、溶液に容易に溶解しなければならない。トレハロースは、干ばつの間休眠状態を保つ植物及び有機体（例えば細菌、カビ並びに昆虫及び線形動物などの無脊椎動物）において見出された非還元二糖であるため、特に魅力的な保護剤である。トレハロースは、タンパク質並びに酵素、血清、抗体、抗原及びワクチン成分などの他の生体高分子を含むさまざまな生体物質に対して効果的な保護剤であることを示す（Sanchezら、1999, Intl. J. Pharm. 185, 255-266; Esquisableら、1997, J. Microencapsulation, 14, 627-638）。いくつかの場合では、結晶の形成を防止し、長期間の貯蔵条件において乾燥生物活性物質製剤の安定性を高め、費用を低減するために、トレハロース及びスクロースの混合物などの２以上の異なる二糖（類）を含むことが有益である可能性がある。
【００４６】
炭水化物混合物中のオリゴ糖画分は、イヌリン、マルトデキストリン（類）、デキストラン（類）、フルクト‐オリゴ糖（類）（FOS）、ガラクト‐オリゴ糖（類）（GOS）、マンナン‐オリゴ糖（類）（MOS）及びそれらの組み合わせを含む。オリゴ糖（類）は、さまざまな貯蔵された生体物質のための保護剤としてトレハロース単独での使用に伴ういくつかの問題を軽減する。脱水及び再水和中に生体物質を保護するために非常に有用であるが、安定剤としてトレハロース単独では、特に高温及び／又は多湿環境で、長期間の所望の貯蔵安定性を提供しない。この問題は、本発明において、炭水化物混合物にオリゴ糖（類）、好ましくはイヌリンの添加で解決した。
【００４７】
炭水化物組成物中の糖（類）の好ましい質量比は、二糖（類）／オリゴ糖（類）／多糖（類）が１０：０．１〜４：０．１〜２であり、より好ましくはここで二糖（類）／オリゴ糖（類）／多糖（類）の重量比が、約１０：０．２：０．１〜約１０：２：１である。好ましくは、炭水化物混合物は、全乾燥物質の重量％において、１０〜９０％の二糖（類）、1〜１０％のオリゴ糖（類）、及び０．１〜１０％の多糖（類）を含む。
【００４８】
本発明のガラス構造増強剤は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸などの有機酸の塩が挙げられる。塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、緩衝塩、リン酸緩衝液などのカチオンを含んでもよい。例では、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、リン酸緩衝塩などか挙げられる。一般的に、多価のアニオンは、一価のアニオンよりも高いＴｇでより容易にガラスを形成する。好ましいアニオンは、結晶化を抑制するために高いＴｇ及び十分な溶解性を有し、それにより強固なガラス状構造を形成する。いくつかの場合では、有機塩の混合物（例えばクエン酸ナトリウム及びアスコルビン酸ナトリウム）は、有用であるかもしれない。クエン酸ナトリウムは、糖分子のヒドロキシル基と相互作用し、そのカルボキシル基を介して結合を形成して、そしてガラス状になるスクロースのガラス転移温度について劇的な増大をもたらすことが見出された（Ketsら、2004. Citrate increases glass transition temperature of vitrified sucrose preparation Cryobiology, 48:46-54）。クエン酸ナトリウムは、ＧＲＡＳとして認められた一般的な食品添加物である（21 CFR 184.1751 - Sodium citrate）。組成物中のクエン酸ナトリウムのさらなる機能は、その緩衝能に関連し、そして凍結中に液体媒体のｐＨについて劇的な変化を防止し、そしてそれは凍結乾燥しているタンパク質の変性を引き起こす可能性がある。
【００４９】
組成物の安定性をさらに増大するためにその中に含まれる他の適切なガラス増強剤は、タンパク質、炭水化物加水分解物、ポリペプチド、及びアミノ酸が挙げられる。好ましくは、カゼイン又はエンドウタンパク質であり、より好ましくは加水分解カゼイン又は加水分解エンドウ豆タンパク質が使用される。「加水分解されたタンパク質」とは、部分的又は完全に、酸又は酵素による加水分解に供されて、約１ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する加水分解されたタンパク質を生じたタンパク質を意味する。好ましくは、少なくとも２０％のタンパク質基質が、２００〜２０００ダルトンの分子量を有するペプチドに変換される。加水分解されたタンパク質は、完全なタンパク質と大体同じアミノ酸組成を有しており、任意の数の商業的供給源から得ることができる。加水分解されたタンパク質は低刺激性であるため、乳児及び高齢者などの過敏な消費者用の特定の食品において有利に使用することができる。
【００５０】
組成物中で使用されるガラス増強剤の量は、全体の組成及びその目的とする乾燥貯蔵条件に依拠して変化できる。一般的に、全炭水化物に対するガラス増強剤のモル比は、約０．０１〜約０．３であろう。好ましい組成物は、約０．１〜０．２のモル比で含む。
【００５１】
好ましい組成物は、少なくとも二糖、オリゴ糖、及び多糖を含む約０．５％〜約９０％の炭水化物成分、並びに約０．５％〜約４０％の加水分解されたタンパク質を含むタンパク質成分を含む。より好ましくは、組成物は、約３０％〜約７０％の炭水化物成分、並びに約１０％〜約４０％のタンパク質、加水分解されたタンパク質、及びカルボン酸などのガラス増強剤成分を含み、ここで炭水化物成分は、約１０％〜９０％、より好ましくは約４０％〜８０％の二糖；約１％〜約１０％、より好ましくは約５％〜１０％のオリゴ糖；及び約０．１〜約１０％、より好ましくは約５％〜約１０％の多糖を含む。組成物はさらに、他のガラス増強剤と考えられる有機酸の塩を含み、及び組成物の全重量基準で、約０．５％〜２０％の間のカルボン酸を含む。
【００５２】
生体物質及び本発明の安定化組成物を含む溶液は、約２０重量％〜約６０重量％、好ましくは約３０重量％〜５０重量％の十分な量の全固形分（構成成分−水などの溶媒）を含むことができる。全固形分の主要部は、生物活性物質、炭水化物組成物、及びガラス増強剤からなってもよい。例えば、生物活性物質は、約５％〜３０％ｗ／ｖ、好ましくは約１０〜２０％ｗ／ｖの範囲の濃度で製剤中に存在できる。培地中の組成物混合物の重量質量は、典型的に約１０％〜約６０％の間であり、好ましくは約２０〜４０％の間である。本発明の製剤の粘度は、典型的に１０００センチポアズ（ｃＰ）超であり；より好ましくは、５０００ｃＰ超であり；最も好ましくは１００００ｃＰ超である。
【００５３】
安定な乾燥製剤を調製するための方法
さまざまな乾燥技術が、組成物を乾燥するために効果的に使用することができる。これらの方法は、凍結乾燥又は真空乾燥よりも複雑でなく及び高価でない一方で、一般的に生体物質に対してより有害である。多くの生体物質は、凍結乾燥又は冷気乾燥（chill drying）を使用した場合よりも周囲又はより高い温度で行う方法を使用して保存した場合のほうが、著しい立体構造変化及び望まない反応をより生じやすい。結果として、現在知られている保護剤を使用した場合でも、多くの再水和された生体物質の活性は、それ自体で十分ではなく、そして仮に低温乾燥により貯蔵した場合よりも著しく低い。
【００５４】
生物活性物質を含む安定な乾燥製剤を調製するための好ましい方法は；（１）水溶液中で本発明の組成物と生物活性物質とを混合することにより粘性のあるスラリーを調製し、（２）スラリー製剤を瞬間凍結して固形凍結粒子を形成し、（３）任意により、短時間、高真空圧力に凍結粒子を供して粒子をパージし、及びそれらの構造を安定化し、（４）製剤凍結温度超の温度で水分を蒸発することにより水を除去し、（５）さらに全真空及び高温下、製剤水分活性を０．３Ａｗ未満に低減することを含む。
【００５５】
例えば、生物活性物質の乾燥形態は、組成物粉末混合物を含む溶液又は懸濁液内に配合することができる。組成物混合物は、生物活性物質と冷却し及び混合する前に、低いせん断応力撹拌で温水溶液中に溶解できる。培養されたウィルス又は細菌などの生物活性物質は、製剤内に再懸濁する前に、遠心分離又は濾過により濃縮し及び培地から分離することができる。あるいは、製剤中の水全体は、濃縮された生体物質の液体について提供される。懸濁液は、室温よりわずかに高い温度で維持され、及び乾燥組成物粉末混合物は、生体物質を含む温かい懸濁液（２５℃〜４０℃）にゆっくりと添加される。懸濁液は、すべての成分が完全に分散又は溶解されるまで遊星型ミキサー（planetary mixer）中で穏やかに撹拌し、そして均質なスラリーを得る。
【００５６】
さまざまな溶液は、次に、金属イオンを添加することにより、又はスラリーの温度若しくはｐＨを変化することにより、架橋してヒドロゲルを形成することができ（多糖の特性に依拠して）、その後、本発明の乾燥方法により乾燥できる。あるいは、スラリーは、ドライアイス又は液体窒素バス中に、ノズルを通じて噴霧し、滴下し、又は注入することにより瞬間凍結して小さな粒子又は固形液滴繊維又はビーズを形成することができる。凍結固形粒子は、安定な凍結生成物として後の使用のために又は乾燥まで、−３０℃〜−８０℃の間のディープフリーザーで保存することができる。好ましい乾燥方法は、生成物の温度がその凍結温度よりもわずかに高い温度に維持される真空乾燥である。凍結液滴又はビーズは、約０．１ｋｇ／ｓｑ ｆｔ〜約１．５ｋｇ／ｓｑ ｆｔの充填能力でトレー上に置かれ、本発明の方法により乾燥させる。好ましくは、乾燥プロセスは、短いパージステップにより開始され、そしてそれは、開始温度への生成物順化を可能にし、凍結粒子の構造を緩和し及び安定することを可能にし、余分な空気を脱気する。典型的に、パージステップは、生成物粘度及びトレーの充填に依拠して１〜６０分間行う。ビーズ又は粒子は、全パージステップの間、固形凍結形態で維持するべきである。生成物温度が、その後、その凍結温度超に至り、そして第一乾燥ステップは、すべての自由な水が生成物から蒸発するまで行う。一旦、製剤温度が所望の温度に達したら、その温度を維持するために加熱を調節し、そして蒸発による第一液体乾燥ステップが進められる。このステップでは、製剤が既に融解し、沸騰又は泡形成せずに、加速された水の蒸発が起こる。乾燥プロセスは、最大真空及び高温で、さらなる第二乾燥段階（phase）で完了する。
【００５７】
先行技術における典型的な方法は、大規模な泡形成及び／又は飛散、並びに繊細な生物学的製剤を損傷する可能性がある激しい沸騰を伴い、そして高い充填能力での工業的にスケールアップに関して問題を引き起こす（例えば、米国特許第６，５３４，０８７号を参照し、ここでは適用される真空圧力が、激しい沸騰又は泡形成を引き起こす）。しかしながら、現在の組成物及び方法は、著しく早い乾燥速度を達成し、そして製剤の高い充填能力を可能にしつつ、任意の沸騰又は泡形成を回避する。加えて、粘性のある液体スラリーの完全及び効果的な脱気は、困難であり、そして長期間必要であるかもしれない。これらの障害は、沸騰及び過剰な泡形成なしにガラス状構造を形成する効果的な第一液体乾燥を可能にする適切な組成物を使用することにより、本発明においてすべて解決される。スラリー又は粘性のあるシロップと対照的にトレー上への固形凍結粒子の充填は、先行技術により与えられるものよりもトレー上の乾燥面積当たりはるかに高い充填能力を可能にする。
【００５８】
本発明の一つの好ましい例では、生体物質は生きている濃縮プロバイオティクス細菌培養物である。粉末組成物混合物は、好ましくは１〜４％のアルギン酸ナトリウム又はゲランガム、５０〜７５％のトレハロース、１〜１０％のイヌリン又はＦＯＳ、１０〜２０％のカゼイン加水分解物、ホエイ加水分解物、エンドウ豆タンパク質加水分解物、又は綿実タンパク質などのタンパク質分解物、及び１〜１０％のクエン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウムを含む。プロバイオティクス細菌培養物は、生、凍結又は乾燥粉末状態で既に乾燥されていてもよい。組成物混合物に濃縮プロバイオティクス細菌培地を添加して、溶液混合物の固形分含量を４０〜６０％（ｗ／ｗ）にし、及びリン酸又はクエン酸イオンでｐＨを６．５〜７．５に調節する。溶液を、すべての成分が完全に溶解するまで、室温（一般的に２５℃〜３７℃の間）よりわずかに高い温度で混合する。粘性のあるスラリーを液体窒素中に滴下して小さな液滴又はビーズを形成し、その後液体窒素から取り除き、バッグ中に詰め、乾燥までディープフリーザーにおいて−８０℃で、貯蔵する。
【００５９】
生きているプロバイオティクス細菌の典型的な乾燥方法は、１００〜１５００ｇ／ｓｑ ｆｔの間の充填能力で、均質な層でトレー上に固形凍結ビーズを広げ、そしてトレーを早急に凍結乾燥機に設置する。真空圧力をその後、凍結乾燥機のサイズ及び熱源の種類に依拠して約１０００ｍトール以下で適用し、棚温度を、粒子を維持するために約−２０℃〜約−３０℃に調節する。固形凍結ビーズを、約１〜約６０分間パージしてもよく、真空を２０００〜１００００ｍトールの間に調節してもよく、１０℃〜＋０℃の間に製剤温度を上げるために熱伝導を増加してもよい。これらの温度及び真空圧力条件は、トレーの充填に依拠して、数時間から２４時間まで持続してもよい第一液体乾燥ステップの間、維持される。第一乾燥プロセスの間のある時点で、溶媒の蒸発速度が遅くなり、そして乾燥室への熱の過剰な供給のため、製剤温度が上昇し始める。この点は、本発明における第一乾燥ステップの終わりを示す。溶媒が製剤から追い出されているときに、溶液中のガラス形成化合物が濃縮されるようになり、そして液体として流出するのが終わるまで、さらに濃縮され、アモルファス及び／又は安定なガラス状構造を形成する。
【００６０】
第二乾燥ステップが、その後、最大真空及び３０℃〜５０℃の間の製剤温度で続く。第二乾燥ステップの目的は、残留している封入された又は結合された水分を除去し、そして周囲温度での長期間の貯蔵において安定である組成物を提供することである。第二乾燥ステップは、数時間続いてもよく、そしてその終点は、製剤が完全に乾燥し、及びその水分活性が０．３Ａｗ未満になったときである。
【００６１】
本発明の乾燥方法によって、アモルファスガラス状構造内に閉じ込められている生物活性のある物質を生じ、それによりアモルファスガラス状組成物内での化合物及び他の分子の移動性が大幅に低くなることに起因して、タンパク質のアンフォールディング又は変性を抑制し、及び分子相互作用又は交差反応を著しく遅くする。アモルファス固体構造が、そのガラス転移温度未満の温度で維持され、及び残留水分が比較的低く（すなわちＡｗ０．５未満）維持される限り、プロバイオティクス細菌は、相対的に安定を維持することができる。いくつかの生体物質は、より結晶状態で良好であるかもしれないので、ガラス状構造の実現は、長期安定性のための必要条件ではないことに留意すべきである。
【００６２】
乾燥ガラス状構造は、一体として使用でき、所望の形状若しくはサイズに切断でき、又は湿性若しくは乾燥凝集化、造粒化、錠剤化、圧密化、ペレット化、若しくは任意の他の種類の送達プロセスなどの簡易な下流プロセスを提供する自由流動性粉末（free flowing powder）に破砕し及び製粉化できる。破砕、製粉、粉砕、又は微粉砕のプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ハンマーミル、エアーミル、インパクトミル、ジェットミル、ピンミル、ウィリーミル（Wiley mill）、又は同様の粉砕装置を使用することができる。好ましい粒子サイズは、約１０００μｍ未満であり、好ましくは５００μｍ未満である。
【００６３】
本明細書に記載された組成物及び方法は、周囲温度超及び相対湿度超で、長期貯蔵の間、生体物質を安定化し、そしてその活性を保持する。例えば、組成物は、それらを高温（例えば４０℃）及び高い湿度（例えば３３％ＲＨ）に供し、及び製剤の生物学的活性を測定することにより安定性に関して試験する。生きているプロバイオティクス細菌に関する例として、これらの研究の結果は、これらの組成物中に処方された細菌が、少なくとも６０日間安定であることを示す。安定性は、１ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇの力価損失（potency loss）の時間として定義される。そのような製剤は、高濃度の生物学的に活性な物質が使用された場合でさえ安定である。従って、これらの製剤は、長期間、室温又は室温超の温度で出荷し及び貯蔵することができることにおいて有益である。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例は、例示のために提供するが、本発明を限定するものではない。
【００６５】
実施例１
乾燥及び安定組成物の調製
基本的な炭水化物混合物
約７０ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約５ｇのインスタント（instant）イヌリン（Cargill Minneapolis, MN）、及び約３ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を、乾燥形態で均質に混合した。
【００６６】
基本的なガラス増強剤混合物
約１７ｇのカゼイン加水分解物（限外濾過された加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）、及び５ｇのクエン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を、乾燥形態で均質に混合した。
【００６７】
プロバイオティクス細菌の安定化
生の濃縮ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）（１０％固形分で１００ｍｌ、発酵回収物から直接）をブレンダーに添加し、そして３５℃で保持した。約７８ｇの基本炭水化物混合物、及び約２２ｇの基本ガラス増強剤混合物をプロバイオティクス細菌培養物にゆっくりと添加し、そして３５℃で１０分間、混合を行った。次に、粘性のあるスラリーを、穿孔底部を有する容器に移し、そして液体窒素を含むバス内に滴下した。その後、ビーズを液体窒素から除去し、そして早急に乾燥に移した。
【００６８】
プロバイオティクス細菌を含む凍結ビーズの乾燥
凍結ビーズを、２００ｇ／ｓｑ ｆｔの充填能力でトレー上に広げ、そして早急に凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚に設置した。次に、真空を２０００〜２７００ｍトールの間に調節し、そして棚の温度を＋３０℃上げた。これらの温度及び真空圧力設定を、５時間維持した。任意により、凍結ビーズの温度を、約１０００ｍトールで真空圧力を適用し、及び１０分間パージすることを固形凍結ビーズに行うことにより、第一液体乾燥を開始する前に、約−２０℃に順化した。次に、第一乾燥ステップを、２０００〜２７００ｍトールに真空圧力を調節し、そして棚温度を＋３０℃上げて行った。これらの温度及び真空圧力設定を5時間維持した。その後、第二乾燥ステップを、完全真空（１５０〜２００ｍトール）で、棚温度を３０℃〜５０℃の間に維持して、さらに３時間行った。製剤を完全に乾燥し、そしてその水分活性を、Ａｗ＝０．２３でＨｙｇｒｏｐａｌｍ Ａｗ１機器（Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY）により測定した。
【００６９】
実施例２
乾燥プロバイオティクス細菌の貯蔵安定性
図１は、実施例１由来の乾燥安定プロバイオティクス細菌及び市販の乾燥プロバイオティクス細菌（Culturelle, Amerifit, Inc., Cromwell, CT）の４０℃、３３％ＲＨ及び３０℃、４３％ＲＨの２つの異なる加速貯蔵条件下での貯蔵安定性を示す。市販のプロバイオティクス細菌は、加速貯蔵条件下、最初の数週間以内でその生存能力を失ったが、一方で本発明のプロバイオティクス細菌の乾燥組成物は、６０日後、３０℃、４３％ＲＨで１．１８ ｌｏｇのみを失い、４０℃、３３％ＲＨで１．０９ ｌｏｇのみを失った。
【００７０】
実施例３
プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）を含む安定な乾燥組成物のスケールアップ製造
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）（商業的供給源由来の４００ｇの凍結濃縮物）を、３７℃で、ジャケット付き二重遊星型ミキサー（jacketed dual planetary mixer）（DPM, 1qt, Ross Engineering Inc. Savannah, GA）中で解凍し、そして固形分含量を、蒸留水で１０重量％に調節した。約２１２ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約２０ｇのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN）、約１２ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）、約１３６ｇのカゼイン加水分解物（限外濾過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）、及び２０ｇのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を、乾燥形態で均質に混合した。粉末混合物を、プロバイオティクス培養物にゆっくりと添加し、そして４０ＲＰＭ、３７℃で、１０分間撹拌を行った。次にスラリーを、穿孔底部を有する容器に移し、そして液体窒素を含むバス内に滴下した。その後、ビーズを液体窒素から除去し、密封されたアルミホイルバッグに移し、そして数週間の間、ディープフリーザー中で、−８０℃で貯蔵した。
【００７１】
乾燥に関して、凍結ビーズを、５００〜１５００ｇ／ｓｑ ｆｔの範囲の充填能力でトレー上に均一に広げ、そしてトレーを、凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis Gardiner, NY）中の棚に設置した。第一液体乾燥ステップを、２０００〜２７００ｍトールの間に真空圧力を調節することにより開始し、そして生成物温度は上がり、−１０〜−５℃の間で安定した。時間とともに（約１０〜１６時間）、生成物温度が、約２０〜２５℃に上昇し、その時点で、第二乾燥ステップを、最大真空（１５０〜２００ｍトール）で開始し、そして生成物温度を、３０〜４０℃の間でさらに１４時間維持した。製剤を、完全に乾燥し、そして０．２３Ａｗの水分活性を記録した。
【００７２】
実施例４
プロバイオティクス細菌（ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis））を含む安定な乾燥組成物のスケールアップ製造
ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）（商業的供給源由来の４００ｇの凍結濃縮物）を、３７℃で、ジャケット付き二重遊星型ミキサー（DPM, 1qt, Ross Engineering Inc. Savannah, GA）中で解凍した。約２１２ｇのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約２０ｇのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN）、約１２ｇのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）、及び２０ｇのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を、乾燥形態で均質に混合した。粉末混合物を、プロバイオティクス培養物にゆっくりと添加した。約１３６ｇのエンドウ豆タンパク質加水分解物（限外濾過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を、８０ｇの蒸留水に溶解し、そして混合物を、完全に溶解するまで手短にレンジ加熱するか、又はウォーターバス中で６０℃に加温し、そしてその後、約３５℃まで冷却した。乾燥混合粉末及びエンドウ豆タンパク質加水分解物を含む溶液を、プロバイオティクス細菌濃縮物に添加し、４０ＲＰＭ、３７℃で２０分間、混合を行った。次にスラリーを、穿孔底部を有する容器に移し、そして液体窒素を含むバス内に滴下した。その後、ビーズを液体窒素から除去し、密封されたアルミホイルバッグに移し、そして数週間の間、ディープフリーザー中で、−８０℃で貯蔵した。
【００７３】
乾燥に関して、凍結ビーズを、８００ｇ／ｓｑ ｆｔの充填能力でトレー上に均一に広げ、そしてトレーを、凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis Gardiner, NY）中の棚に設置した。第一液体乾燥ステップを、２０００〜２７００ｍトールの間に真空圧力を調節することにより開始し、そして生成物温度は上がり、−１０〜−５℃の間で安定した。時間とともに（約１０〜１６時間）、生成物温度が、約２０〜２５℃に上昇し、その時点で、第二乾燥ステップを、最大真空（１５０〜２００ｍトール）で開始し、そして生成物温度を、３０〜４０℃の間でさらに１４時間維持した。製剤を、完全に乾燥し、そして０．２３Ａｗの水分活性を記録した。
【００７４】
実施例５
プロバイオティクス細菌（ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis））を含むヒドロゲル製剤の調製
ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）の濃縮されたプロバイオティクススラリーを、実施例１に従って調製する。基本製剤に、０．５ｇのリン酸水素カルシウムを添加し、続いて０．５ｇのグルコノラクトンを添加する。スラリーを、次の２時間の間室温で硬化させ、固形ヒドロゲルを形成させる。フィルムゲルを、市販のスライサー／シュレッダーを使用して、薄くて長い糸状のものにスライスする。薄い糸状のものを、湿潤状態でトレー上に直接充填するか、又は液体窒素中で瞬間凍結し、５００ｇ／ｓｑ ｆｔの充填能力でトレー上に充填し、そして実施例３で記載したように、乾燥のために凍結乾燥機中に設置する。製剤の水分活性（Ａｗ）は、０．０５（HygroPalm Aw1, Rotonic Huntington, NYで測定）である。乾燥製剤は、標準ハンマー製粉装置を使用して、微粉にさらに粉砕し、５０〜２５０ミクロンスクリーンを通して篩過する。
【００７５】
実施例６
ガラス増強剤及び炭水化物混合物の間のモル比の最適化
ガラス増強剤及び炭水化物混合物のさまざまなモル割合を含むいくつかの組成物を、実施例１に従って調製した。プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei））の濃縮された培養物を、商業的供給源から取得し、そしてスラリーを、瞬間凍結及びパージステップなしで、湿潤形態でトレー上に早急に充填した以外は実施例１に記載したように乾燥組成物を調製した。スラリーを、第一及び第二乾燥段階の間に、棚の温度を４０℃まで上げたことを以外は、実施例１及び３に記載したように第一及び第二段階で乾燥した。安定な粉末を、３７℃、３３％ＲＨで８４日間、加速貯蔵条件に供した。図２は、乾燥細菌の安定性に関するさまざまなモル比の影響を示す。結果は、最適なガラス増強剤と炭水化物混合物の間のモル比が、約０．１２〜０．１５であることを示唆した。
【００７６】
実施例７
プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・アシドフィラス（L. acidophilus））の貯蔵安定性に関する本発明の組成物の効果
実施例１に記載したように、炭水化物混合物及びガラス増強剤混合物を含む組成物を調製した。プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・アシドフィラス（L. acidophilus））の濃縮された培養物を、商業的供給源から取得し、実施例１及び３に記載したように乾燥組成物で調製し、適切な粉末を、２４℃、３３％ＲＨで５３７日間、加速貯蔵条件に供した。図３は、本発明の組成物で処方されたプロバイオティクス細菌の優れた安定性を示す。結果は、プロバイオティクス細菌の生存能力が、特定の条件下で５３７日の貯蔵を過ぎて、０．１８ ｌｏｇのみ低下したことを示す。
【００７７】
実施例８
プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・アシドフィラス（L. acidophilus））の貯蔵安定性に関するさまざまなガラス増強剤化合物の効果
実施例１で記載したような炭水化物混合物と、カゼイン加水分解物及びクエン酸ナトリウム若しくはアスコルビン酸ナトリウム又は両方の組み合わせを含むガラス増強剤とを含むいくつかの組成物を調製した。プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・アシドフィラス（L. acidophilus））の濃縮された培養物を、商業的供給源から取得し、そしてスラリーを、瞬間凍結及びパージステップなしで、湿潤形態でトレー上に早急に充填した以外は実施例１に記載したように乾燥組成物を調製した。スラリーを、実施例１及び３に記載したように第一及び第二段階で乾燥し、そして安定な粉末を、２４℃、４３％ＲＨで１８０日間、加速貯蔵条件に供した。図４は、乾燥細菌の安定性に関するさまざまなガラス増強化合物の影響を示す。結果は、顕著なより良い安定性が、タンパク質加水分解物に加えてさらにガラス増強剤の包含により得られることを示唆した。特に、酢酸ナトリウム及びアスコルビン酸ナトリウムの等量の包含が、最も安定な組成物を提供した。実施例５及び６の両方の結果は、さまざまなガラス増強剤が、菌株に依拠して、より効果的になるかもしれないし、さらに不安定化するように働くかもしれないことを示唆した。
【００７８】
実施例９
プロバイオティクス細菌（ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis））の貯蔵安定性に関するさまざまなタンパク質加水分解物／糖比の効果
実施例１で記載したような炭水化物組成物及びガラス増強剤を含むいくつかの組成物、並びに同じ量であるがさまざまな比のエンドウ豆タンパク質加水分解物／トレハロース及びアスコルビン酸ナトリウムを含む又は含まない組成物を調製した。プロバイオティクス細菌（ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis））の濃縮された培養物を商業的供給源から取得し、実施例１及び３に記載されたように乾燥組成物で調製し、そして安定な粉末を３５℃、４３％ＲＨで７週間、加速貯蔵条件に供した。図５は、乾燥細菌の安定性に関するアスコルビン酸ナトリウムを含む又は含まない、１：４、１：２．５、及び１：１．５の比のエンドウ豆タンパク質加水分解物／トレハロースの効果を示す。結果は、顕著により良い安定性が、エンドウ豆タンパク質加水分解物／トレハロースの比率を増加することで得られることを示唆した。特に、エンドウ豆タンパク質加水分解物／トレハロースの１：１．５の比が、より安定な組成物を提供した。より高いエンドウ豆タンパク質加水分解物／トレハロース比でのアスコルビン酸ナトリウムの包含が、アスコルビン酸ナトリウムを除いた製剤と比較してより優れた安定性を生じる。
【００７９】
実施例１０
プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus））の最大安定性に関するｐＨの最適化
実施例１で記載したような炭水化物混合物及びガラス増強剤を含むいくつかの組成物を、異なるｐＨで調製した。プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus））の濃縮された培養物を、商業的供給源から取得し、そして実施例１及び３に記載されたような乾燥組成物で調製した。安定な粉末を、４０℃、３３％ＲＨで８週間、加速貯蔵条件に供した。図６は、乾燥細菌の安定性に関するスラリーのｐＨの影響を示す。結果は、最適な安定性が中性ｐＨ（約７）で達成したことを示唆した。
【００８０】
実施例１１
酵素を含む安定な乾燥粉末
４０重量％のフィターゼ（BASF, GmBH）を含むヒドロゲル製剤を、実施例１及び４に記載したような４００ｇの炭水化物混合物と、２００ｇのガラス増強剤混合物と、４００ｇのフィターゼとを水１０００ｍｌで混合することにより調製した。細かく刻んだヒドロゲル製剤を、液体窒素中で瞬間凍結し、そして５０℃の第一及び第二乾燥温度で、真空オーブン中で乾燥した。乾燥製剤の充填及び貯蔵安定性の決定のために、乾燥サンプルを微量遠心チューブ中で正確に重量測定する（＜１００ｍｇ）。200μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する。製剤をボルテックスによってＤＭＳＯ緩衝液中に溶解する。このサンプルに、０．０５ＮのＮａＯＨ、０．５％のＳＤＳ、及び０．０７５Ｍのクエン酸（三ナトリウム塩）を含む０．８ｍｌの溶液を添加する。チューブを、４５℃で１０分間、超音波破砕し、続いて５０００ｒｐｍで１０分間、手短に遠心分離する。透明なＤＭＳＯ／ＮａＯＨ／ＳＤＳ／クエン酸塩の溶液のアリコートを、マイクロプレートのウェルに入れ、ブラッドフォード（Bradford）アッセイ方法を使用してタンパク質含量を分析する。９５℃に２０分間の暴露の後の安定な酵素乾燥組成物の安定性は、本発明の組成物を含まない乾燥酵素よりも顕著に高い。
【００８１】
実施例１２
伝染性サケ貧血（ISAV）を含む安定な乾燥粉末
ＩＳＡＶワクチン（Novozyme, Denmark）の濃縮スラリーを、ＩＳＡＶワクチン濃縮物、炭水化物混合物、及びガラス増強剤を含むスラリーに、０．５％酢酸を含む２０ｍｌの４％キトサン溶液を添加したこと以外は実施例４に従って調製する。０．５ｇのリン酸水素カルシウムを添加し、続いて０．５ｇのグルコノラクトンを添加する。スラリーを、次の２時間の間室温で硬化させ、固形ヒドロゲルを形成させる。フィルムゲルを、市販のスライサー／シュレッダーを使用して、薄くて長い糸状のものにスライスする。薄い糸状のものを、湿潤状態でトレー上に直接充填するか、又は液体窒素中で瞬間凍結し、１５００ｇ／ｓｑ ｆｔの充填能力でトレー上に充填し、そして実施例３で記載したように、乾燥のために凍結乾燥機中に設置する。製剤の水分活性（Ａｗ）は、０．２５である。乾燥製剤は、標準ハンマー製粉装置を使用して、微粉にさらに粉砕し、５０〜１５０ミクロンスクリーンを通して篩過する。安定な乾燥ＩＳＡＶ組成物を、乾燥組成物で流通飼料を上塗りし、そして大西洋サケに与えることにより、経口ワクチン接種のために使用する。
【００８２】
実施例１３
外来種の餌の調製
本発明に従った具体的に標的とした外来種のためのペレット餌を、農薬を含んで調製する。実施例９に記載したように２００ｇの製剤を調製し、そして２００ｇの水を添加する。この溶液に９０ｇのロテノン及び０．５ｇのリン酸水素カルシウムを添加し、続いて０．５ｇのグルコノラクトンを添加する。スラリーを、標準工業用噴霧乾燥機で早急に噴霧乾燥し、そして乾燥製剤を、環境又はすぐ近くの生態系に毒の有害な影響を及ぼすことなく標的とする具体的な外来種のために使用する。
【００８３】
実施例１４
保護された植物プロバイオティクス細菌製剤の調製
リゾバクテリア（Rhizobacteria）などの生物学的な制御剤を、実施例４に従って乾燥組成物で調製する。乾燥リゾバクテリア（Rhizobacteria）組成物の有効性を、ノトバイオート条件下、レタスの生育について評価する。植物あたりのリゾバクテリア（Rhizobacteria）乾燥組成物の１００ｍｇ投与量を、砂を有するジャー内に植菌し、そして催芽（２４時間）したレタス芽生えを植えた。滅菌したホーグランド（Hoagland）溶液の５ｍｌ栄養素投与量を、ジャー中の植物に与えた。ジャーを、２８℃、１２時間日長で維持された生育室において無作為に設置する。植菌後、７日間隔毎で、植物及び付着した砂を、ジャーから注意深く除いた。根を滅菌リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で洗浄し、そして根長測定を記録する。
【００８４】
参照文献
本明細書で引用する参照文献の内容は、すべての目的のために参照により援用する。
【００８５】
米国特許及び特許出願参照文献
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米国特許第６，１９０，７０１号  Composition and method for stable injectable liquids  １９９９年３月  Roserら
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米国特許第６，９６４，７７１号  Method for stably incorporation substances within dry, foamed glass matrices  １９９７年９月  Roserら
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他の参照文献
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2013535222.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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