(57)【要約】【課題】ＦｎＩＩＩベース結合分子とターゲット分子との結合能力を改善する。【解決手段】βシート内のアミノ酸残基を使用して、結合表面の一部分を形成し、ターゲット分子に結合させることによって、ターゲット分子に対する結合に利用可能な表面領域が増加して結合が改善する。【選択図】図３Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのループ領域及び少なくとも１つの非ループ領域に１つ以上のアミノ酸置換を含むフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ドメインベースのクレードルポリペプチド。
【請求項２】
非ループ領域がβ鎖Ｃ、β鎖Ｄ、β鎖Ｆ及びβ鎖Ｇから成る群から選択される請求項１に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３】
ループ領域がＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ及びＦＧループから成る群から選択される請求項１又は２に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４】
２つのループ領域、及び／又は、２つの非ループ領域に１つ以上のアミノ酸置換を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５】
非ループ領域がβ鎖Ｃ及びβ鎖Ｆであり、ループ領域がＣＤループ及びＦＧループである請求項４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６】
β鎖のクレードル残基に１つ以上のアミノ酸置換が導入される請求項１〜５のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも１つのループ及び／又は非ループ領域に少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及び／又は、欠損を更に含む請求項１〜６のいずれか１項に記載クレードルポリペプチド。
【請求項８】
２つのループ領域、及び／又は、２つの非ループ領域に少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及び／又は、欠損を含む請求項７に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項９】
非ループ領域がβ鎖Ｃ及びβ鎖Ｆであり、ループ領域がＣＤループ及びＦＧループである請求項８に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１０】
非ループ領域における１つ以上のアミノ酸置換がＦｎＩＩＩドメインスキャフォールドの構造、及び／又は、ループ領域の形状を改変させない請求項１〜９のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１１】
非ループ領域における１つ以上のアミノ酸置換は非クレードル残基を除外する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１２】
ＦｎＩＩＩドメインがヒトフィブロネクチンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６番目のＦｎＩＩＩドメインである請求項１〜１１のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１３】
ＦｎＩＩＩドメインがヒトフィブロネクチンの７番目、１０番目又は１４番目のＦｎＩＩＩドメインである請求項１２に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１４】
ＦｎＩＩＩドメインがヒトフィブロネクチンの７番目のＦｎＩＩＩドメイン（ＦｎＩＩＩ０７）である請求項１３に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１５】
ＦｎＩＩＩドメインがヒトフィブロネクチンの１０番目のＦｎＩＩＩドメイン（ＦｎＩＩＩ１０）である請求項１３に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１６】
ＦｎＩＩＩドメインがヒトフィブロネクチンの１４番目のＦｎＩＩＩドメイン（ＦｎＩＩＩ１４）である請求項１３に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１７】
ＣＤループが約３〜１１残基長である請求項１〜１６のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１８】
ＣＤループが約４〜９残基長である請求項１７に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１９】
ＣＤループが５残基長である請求項１８に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２０】
ＦＧループが約１〜１０残基長である請求項１〜１９のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２１】
ＦＧループが約５又は６残基長である請求項２０に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２２】
ＦＧループが５残基長である請求項２１に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２３】
ＦＧループが６残基長である請求項２１に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２４】
ＦＧループの位置１がＧｌｙ残基であり、ＦＧループの位置２がＬｅｕ、Ｖａｌ又はＩｌｅ残基であり、ＦＧループの位置３が荷電性残基又は極性残基であり、ＦＧループの位置４がＰｒｏ残基であり、ＦＧループの位置５がＧｌｙ残基であり、そして、ＦＧループの位置６が極性残基である請求項２３に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２５】
ＦＧループの位置３、及び／又は、位置５がＧｌｙ残基である請求項２２に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２６】
β鎖Ｃが約６〜１４残基長であり、β鎖Ｆが約８〜１３残基長である請求項１〜２５のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２７】
β鎖Ｃが約８〜１１残基長である請求項２６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２８】
β鎖Ｃが９残基長である請求項２７に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項２９】
β鎖Ｃの位置２、位置４及び位置６が疎水性残基である請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３０】
β鎖Ｃの位置１、位置３、位置５及び位置７〜９が野生型配列から改変される請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３１】
β鎖Ｃの位置１がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３２】
β鎖Ｃの位置３が疎水性残基である請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３３】
β鎖Ｃの位置３がＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ及びＨｉｓから成る群から選択される請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３４】
β鎖Ｃの位置５及び位置７〜９がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項２６〜３３のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３５】
β鎖Ｆが約９〜１１残基長である請求項２６〜３４のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３６】
β鎖Ｆが１０残基長である請求項３５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３７】
β鎖Ｆの位置１、位置３、位置５及び位置１０が野生型配列に対して改変されている請求項３５又は３６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３８】
β鎖Ｆの位置１、位置３、位置５及び位置１０がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項３９】
β鎖Ｆの位置２、位置４及び位置６が疎水性残基である請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４０】
β鎖Ｆの位置７が疎水性残基である請求項３５〜３９のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４１】
β鎖Ｆの位置７がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＶａｌから成る群から選択される請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４２】
β鎖Ｆの位置８がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びＰｒｏから成る群から選択される請求項３５〜４１のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４３】
β鎖Ｆの位置９がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ及びＩｌｅから成る群から選択される請求項３５〜４２のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号１の位置３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び／又は、３９にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号１の位置３１、３３、３５、３７、３８、及び／又は、３９にアミノ酸置換を含む請求項４４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号１の位置３１、及び／又は、位置３３にアミノ酸置換を含む請求項４５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号１の位置４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、及び／又は、５１にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号１の位置４４、４５、４７、及び／又は、４９にアミノ酸置換を含む請求項４７に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号１の位置４０、４１、４２、４３、４４、及び／又は、４５にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号１の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、及び／又は、７６にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５１】
配列番号１の位置６７、６９、７１、７３、及び／又は、７６にアミノ酸置換を含む請求項５０に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５２】
配列番号１の位置７１、７３、７５、及び／又は、７６にアミノ酸置換を含む請求項５０に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号１の位置７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は、８６にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５４】
配列番号１の位置８４、及び／又は、位置８５にアミノ酸置換を含む請求項５３に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号１の位置８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は、９４にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号１の位置３１、３３、４７、４９、７３、及び／又は、７５にアミノ酸置換を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
［＊請求項５６］
配列番号９７の位置３３、３５、３７、３９、４０、及び／又は、４１にアミノ酸置換を含む請求項１４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５７】
配列番号９７の位置４２、４３、４４、４５、４６、４７、及び／又は、４８にアミノ酸置換を含む請求項１４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５８】
配列番号９７の位置７０、７２、７４、７６、及び／又は、７９にアミノ酸置換を含む請求項１４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号９７の位置８０、８１、８２、８３、８４、及び／又は、８５にアミノ酸置換を含む請求項１４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６０】
配列番号１２９の位置３１、３３、３５、３７、及び／又は、３９にアミノ酸置換を含む請求項１６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号１２９の位置４０、４１、４２、４３、及び／又は、４４にアミノ酸置換を含む請求項１６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号１２９の位置６６、６８、７０、７２、及び／又は、７５にアミノ酸置換を含む請求項１６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号１２９の位置７６、７７、７８、７９、８０、及び／又は、８１にアミノ酸置換を含む請求項１６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号４６８に記載のアミノ酸配列を含む請求項１４に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号４６９に記載のアミノ酸配列を含む請求項１５に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６６】
配列番号４７０に記載のアミノ酸配列を含む請求項１６に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項６７】
クレードルポリペプチドの部分が、クレードルポリペプチドのターゲット分子に対する結合親和性を増強する非ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドによって置き換えられた請求項１〜６６のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチドのキメラクレードルポリペプチド。
【請求項６８】
非ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドが抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はＴ細胞受容体の全部又は一部である請求項６７に記載のキメラクレードルポリペプチド。
【請求項６９】
ＣＤＲが単一ドメイン抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３である請求項６８に記載のキメラクレードルポリペプチド。
【請求項７０】
単一ドメイン抗体がナノボディである請求項６９に記載のキメラクレードルポリペプチド。
【請求項７１】
ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ又はＦＧループの一部又は全部がＣＤＲで置き換えられた請求項６８に記載のキメラクレードルポリペプチド。
【請求項７２】
請求項１〜７１のいずれか１項に記載の１つ以上のモノマークレードルポリペプチドの複数コピーを含む多重特異性クレードルポリペプチド。
【請求項７３】
リンカー配列によってモノマークレードルポリペプチド同士が連結された請求項７２に記載の多重特異性クレードルポリペプチド。
【請求項７４】
リンカー配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７１）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４７２）、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号４７３）及びＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号４７４）から成る群から選択される請求項７３に記載の多重特異性クレードルポリペプチド。
【請求項７５】
請求項１〜７４のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチドを複数含むクレードルライブラリ。
【請求項７６】
クレードルポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置３０、４１、４２、４３、４４、４５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、及び／又は、８５に１つ以上のアミノ酸置換を含む請求項７５に記載のクレードルライブラリ。
【請求項７７】
クレードルポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７４、７５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は、９４に１つ以上のアミノ酸置換を更に含む請求項７６に記載のクレードルライブラリ。
【請求項７８】
クレードルポリペプチドが、配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一である請求項７５に記載のクレードルライブラリ。
【請求項７９】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に少なくとも１個のアミノ酸挿入を更に含む請求項７５〜７８のいずれか１項に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８０】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に少なくとも２個のアミノ酸挿入を含む請求項７９に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８１】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に約２〜２５個のアミノ酸挿入を含む請求項８０に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８２】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に少なくとも１個のアミノ酸欠損を含む請求項７９〜８１のいずれか１項に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８３】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に少なくとも２個のアミノ酸欠損を含む請求項８２に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８４】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に約２〜１０個のアミノ酸欠損を含む請求項８３に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８５】
クレードルポリペプチドが、２つのループ領域に少なくとも２個のアミノ酸欠損を含む請求項７９、８３及び８４のいずれか１項に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８６】
クレードルポリペプチドが、少なくとも１つのループ領域に少なくとも１個のアミノ酸挿入と、１個のアミノ酸欠損とを含む請求項７９〜８５のいずれか１項に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８７】
クレードルポリペプチドが、同一のループ領域に少なくとも１個のアミノ酸の挿入及び欠損を含む請求項８６に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８８】
ターゲット分子と結合するように予め選択された請求項７９〜８７のいずれか１項に記載のクレードルライブラリ。
【請求項８９】
クレードルポリペプチドが、配列番号３、配列番号７９、配列番号８６及び配列番号４６８〜４７０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７５に記載のクレードルライブラリ。
【請求項９０】
クレードルライブラリが、少なくとも１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５個又はそれを上回る異なるクレードルポリペプチドを含む請求項７５に記載のクレードルライブラリ。
【請求項９１】
請求項１〜７４のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９２】
ポリヌクレオチドが発現構築物である請求項９１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
発現構築物が、細菌、酵母又は哺乳類のシステムにおいて、コードされるポリペプチドを発現することが可能である請求項９２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
請求項７５〜９０のいずれか１項に記載のクレードルライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項９５】
ａ）宿主細胞において、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるステップと、
ｂ）発現したクレードルポリペプチドを単離する、及び／又は、精製するステップとを含むクレードルポリペプチドの生成方法。
【請求項９６】
下記のステップを含む、選択結合活性又は選択酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在に関するスクリーニングにおいて有用なＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのクレードルライブラリを作製する方法：
（ｉ）天然ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのコレクションの中で、β鎖Ｃ及びβ鎖Ｆのアミノ酸配列並びにＣＤループ及びＦＧループのアミノ酸配列をアライメントするステップ、
（ｉｉ）アライメントしたβ鎖配列及びループ配列を長さに応じて区分するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の区分に従って選択した特定の長さのβ鎖又はループに関して、部位特異的アミノ酸頻度解析を実行して各β鎖又はループ位置におけるアミノ酸の頻度を決定するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において解析された（特定の長さの）ループ、β鎖及び長さの各々に関して、保存的又は選択半保存的なコンセンサスアミノ酸、及び、他の天然−変異アミノ酸の各々の位置を同定するステップ、
（ｖ）少なくとも１つの選択したループ、β鎖及び長さに関して、
（１）各β鎖又はループ位置において、コンセンサスアミノ酸、及び（コンセンサスアミノ酸が少なくとも５０％の選択閾値頻度と同等又はそれ未満の出現頻度を有するとき）単一の共通ターゲットアミノ酸及びいずれかの共生成アミノ酸をコードするコード配列のライブラリによって発現される突然変異誘導配列のクレードルライブラリを作製するか、又は、
（２）各β鎖又はループ位置において、コンセンサスアミノ酸、及び（コンセンサスアミノ酸が少なくとも５０％の選択閾値頻度と同等又はそれ未満の出現頻度を有するとき）他の天然−変異アミノ酸又はそれらの化学的均等物をコードするコード配列のライブラリによって発現される天然−変異組み合わせ配列のクレードルライブラリを作製するステップ（ただし、他の天然−変異アミノ酸は半保存アミノ酸及び可変アミノ酸を含み、可変アミノ酸は、その位置における出現率が選択最小閾値出現率を上回る）、
（ｖｉ）ＦｎＩＩＩフレームワークのコード配列に、前記コード配列のライブラリを組み込んで、ＦｎＩＩＩ発現ライブラリを作製するステップ、及び、
（ｖｉｉ）発現ライブラリのＦｎＩＩＩポリペプチドを発現させるステップ。
【請求項９７】
選択閾値頻度が１００％である請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
選択頻度が約５０〜９５％である請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
ステップ（ｉｉ）において、ＣＤループの長さ約３〜１１残基長に応じてループを区分する請求項９６〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
ＣＤループが約３〜９残基長である請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
ＣＤループが約４〜９残基長である請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
ＣＤループが５残基長である請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
ステップ（ｉｉ）において、ＦＧループの長さ約１〜１０残基長に応じてループを区分する請求項９６〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
ＦＧループが約５又は６残基長である請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
ＦＧループが５残基長である請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
ＦＧループが６残基長である請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
ＦＧループの位置１がＧｌｙ残基であり、ＦＧループの位置２がＬｅｕ、Ｖａｌ又はＩｌｅ残基であり、ＦＧループの位置３が荷電性残基又は極性残基であり、ＦＧループの位置４がＰｒｏ残基であり、ＦＧループの位置５がＧｌｙ残基であり、そして、ＦＧループの位置６が極性残基である請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ＦＧループの位置３、及び／又は、位置５がＧｌｙ残基である請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
ステップ（ｉｉ）において、β鎖Ｃの長さ約６〜１４残基長と、β鎖Ｆの長さ約８〜１３残基長とに応じてβ鎖を区分する請求項９６〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
β鎖Ｃが約８〜１１残基長である請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
β鎖Ｃが９残基長である請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
β鎖Ｃの位置２、位置４及び位置６が疎水性残基である請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
β鎖Ｃの位置１、位置３、位置５及び位置７〜９が、野生型配列から改変される請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
β鎖Ｃの位置１がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
β鎖Ｃの位置３が疎水性残基である請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
β鎖Ｃの位置３がＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ及びＨｉｓから成る群から選択される請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
β鎖Ｃの位置５及び位置７〜９がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
β鎖Ｆが約９〜１１残基長である請求項１０９に記載の方法
【請求項１１９】
β鎖Ｆが１０残基長である請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２０】
β鎖Ｆの位置１、位置３、位置５及び位置１０が、野生型配列から改変される請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
β鎖Ｆの位置１、位置３、位置５及び位置１０がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
β鎖Ｆの位置２、位置４及び位置６が疎水性残基である請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２３】
β鎖Ｆの位置７が疎水性残基である請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２４】
β鎖Ｆの位置７がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＶａｌから成る群から選択される請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２５】
β鎖Ｆの位置８がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びＰｒｏから成る群から選択される請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２６】
β鎖Ｆの位置９がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ及びＩｌｅから成る群から選択される請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２７】
天然ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドがヒトフィブロネクチンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び／又は１６番目のＦｎＩＩＩドメインの野生型アミノ酸配列を含む請求項９６〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
天然ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドがヒトフィブロネクチンの７番目、１０番目、及び／又は、１４番目のＦｎＩＩＩドメインの野生型アミノ酸配列を含む請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
請求項９６〜１２８のいずれか１項に記載のＦｎＩＩＩドメインポリペプチドクレードルライブラリ生成方法を使用する、設計された選択結合活性又は選択酵素活性を有する１つ以上のクレードルポリペプチドの存在に関するスクリーニング、に有用なクレードルライブラリ。
【請求項１３０】
ａ）請求項７５−９０及び請求項１２９のいずれか１項に記載のＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのクレードルライブラリと、ターゲット分子とを反応させるステップと、
ｂ）ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのクレードルライブラリをスクリーニングして、ターゲット分子に対する所望の結合親和性を有するものを選択するステップと、
を含むターゲット分子に対する所望の結合親和性を有するクレードルポリペプチドを同定する方法。
【請求項１３１】
選択したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するステップを更に含む請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
ターゲット分子が、リゾチーム、ヒトＦｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒトＳＵＭＯ１（small ubiquitin-like modifier 1）、ヒトユビキチン、ヒトＡｂｌ  ＳＨ２ドメイン、ヒトＳＦＭＢＴ２（Scm-like with four mbt domains 2）、ＳＣＭＨ１（sex comb on midleg homolog 1）ドメイン及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から成る群から選択される請求項１３０又は１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
請求項１３０〜１３２のいずれか１項に記載の方法を使用して選択したクレードルポリペプチド。
【請求項１３４】
配列番号４〜７８、配列番号８０〜８５、配列番号８７〜９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１〜１２８、配列番号１３０〜１４１、配列番号１４３、配列番号１４５〜１４７、配列番号１４９〜１５９、配列番号１６１〜１９９、配列番号２０１〜２３８及び配列番号２４０〜２７７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１３３に記載のクレードルポリペプチド。
【請求項１３５】
容器内に、請求項１〜７４、請求項１３３及び請求項１３４のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチドを含むキット。
【請求項１３６】
容器内に、請求項７５〜９０及び請求項１２９のいずれか１項に記載のクレードルライブラリを含むキット。
【請求項１３７】
容器内に、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載のクレードルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１３８】
容器内に、請求項７５〜９０及び請求項１２９のいずれか１項に記載のクレードルライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互引用】
【０００１】
本出願は、２０１０年７月３０日に出願された米国仮特許出願６１／３６９，１６０号、２０１０年７月３０日に出願された米国仮特許出願６１／３６９，２０３号、２０１０年７月３０日に出願された米国仮特許出願６１／３６９，２２２号、２０１１年４月１２日に出願された米国仮特許出願６１／４７４，６３２号、及び、２０１１年４月１２日に出願された米国仮特許出願６１／４７４，６４８号に関連する。前記出願の各々は、それらの全体が引用によって本願に組み込まれる。
【０００２】
［連邦政府により支援された研究開発の下でなされた発明の権利であることの宣言］
本発明の一部分は、国立保健研究機構からシカゴ大学が受託した研究契約Ｒ０１−ＧＭ７２６８８及びＵ５４  ＧＭ７４９４６の下での政府の支援によってなされた。（米国）政府は、本発明の一部分の権利を有する。
【０００３】
［ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出した配列リストの引用］
ＭＰＥＰセクション１７３０  ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ｃ）に規定された、ＵＳＰＴＯのＥＦＳ−ＷＥＢサーバを介した配列リストに関する、以下の電子的提出物の全体の内容は、全ての目的に関してその全体が引用によって本願に組み込まれる。配列リストは、電子的に提出された以下のテキストファイルにおいて確認される。
2013539362.tif 000002
【技術分野】
【０００４】
本出願は、新規のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（ＦｎＩＩＩ）ポリペプチド、そのようなＦｎＩＩＩポリペプチドの作製方法及び使用方法に関連する。より具体的には、本発明は、表面に露出したβシートの残基と、いくつかのＦｎＩＩＩドメイン（例えば、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４）のＣＤループ及びＦＧループとを一緒に使用するＦｎＩＩＩポリペプチドのライブラリに関連する。
【背景技術】
【０００５】
スキャフォールドベ−ス結合タンパク質は、特定のリガンドターゲットに結合するという点で抗体の合理的な代替物になる。これらのスキャフォールド結合タンパク質は、リガンド結合領域において複数の置換が許容され得る安定なフレームワークコアを有する、という特性を共有する。いくつかのスキャフォールドフレームワークは、βサンドイッチコアから延在するループを備えたタンパク質ドメイン構造（免疫グロブリンに類似する）を有する。スキャフォールドフレームワークコアは、合成の際に遺伝子操作することができ、異なる配列変異を含むライブラリを作製することに使用することができる。そのようなライブラリの配列多様性は、ループ構造などのタンパク質の外部表面やリガンド結合領域としての役割を果たすことが可能な他の外部表面などに集中する。
【０００６】
フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（ＦｎＩＩＩ）は、新規の結合タンパク質の生成において、有用な非抗体（代替）スキャフォールドとして確立されている。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＦｎＩＩＩは、分子の一端において表面に露出する３つのループ（抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に類似する）を有する。このスキャフォールドを使用する遺伝子操作手法は、これらの表面ループの長さ及びアミノ酸配列の両方を多種多様に変化させることによって作製される組み合わせ的ライブラリ（コンビナトリアルライブラリ）に基づく。種々の選択方法を使用して、そのようなライブラリから目的のターゲットに結合することが可能なＦｎＩＩＩ変異体を単離することができる。ＦｎＩＩＩスキャフォールドは、ジスルフィド結合が無く、細菌システムにおいて容易かつ高度に発現させることができ、比較的に小さいので、従来の抗体又はそのフラグメントに比べて多くの利点をもたらす。しかしながら、改善されたＦｎＩＩＩベースポリペプチド及びそのようなポリペプチドのライブラリの作製方法に関するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＦｎＩＩＩベースポリペプチドの少なくとも１つのループ領域の改変に加えて、ＦｎＩＩＩポリペプチドのβシートの改変が、ＦｎＩＩＩベース結合分子とターゲット分子との結合能力を改善するという予想外の発見に基づく。βシート内のアミノ酸残基を使用して、結合表面の一部分を形成し、ターゲット分子に結合させることによって、ターゲット分子に対する結合に利用可能な表面領域が増加して結合が改善する。βシートの改変は、ターゲットを区別することにも使用することができる。本発明は、全てのＦｎＩＩＩ分子（例えば、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４）のβ鎖内の改変、及び、ループ内の改変に関連する。特に、本発明は、ＦｎＩＩＩ分子（例えば、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４）のβ鎖Ｆ及び／又はβ鎖Ｃ内の改変、そして、ＦＧループ及びＣＤループ内の改変に関連する。
【０００８】
従って、１つの視点において、本発明は、少なくとも１つのループ領域、及び、少なくとも１つの非ループ領域に、１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｎＩＩＩドメインベースクレードル（cradle）ポリペプチドに関連する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、両方のβ鎖におけるアミノ酸置換と、ＦｎＩＩＩのＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、及び／又は、ＦＧループにおける置換とを組み合わせて含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、β鎖Ｃ、β鎖Ｄ、β鎖Ｆ、及び／又は、β鎖Ｇにおけるアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、２つのループ領域、及び／又は、２つの非ループ領域に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。非ループ領域は、β鎖Ｃ及びβ鎖Ｆであり得るし、ループ領域はＣＤループ及びＦＧループであり得る。いくつかの実施形態において、β鎖のクレードル残基に、１つ以上のアミノ酸置換を導入することができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、少なくとも１つのループ、及び／又は、非ループ領域に、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及び／又は、欠損を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、２つのループ領域、及び／又は、２つの非ループ領域に、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及び／又は、欠損を含むことができる。ここで、非ループ領域はβ鎖Ｃ及びβ鎖Ｆであり得るし、ループ領域はＣＤループ及びＦＧループであり得る。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、ヒトフィブロネクチンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６番目のＦｎＩＩＩドメインであり得る。いくつかの実施形態において、非ループ領域における１つ以上のアミノ酸置換は、ＦｎＩＩＩドメインスキャフォールドの構造、及び／又は、ループ領域の形状を改変させないものであり得る。いくつかの実施形態において、非ループ領域における１つ以上のアミノ酸置換は非クレードル残基を除外し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＣＤループは、約３〜１１残基長（残基の長さ）、約４〜９残基長又は５残基長であり得る。ＦＧループは、約１〜１０残基長、５残基長又は６残基長であり得る。ＦＧループの位置１はＧｌｙ残基であり得るし、位置２はＬｅｕ、Ｖａｌ又はＩｌｅ残基であり得るし、位置３は荷電性残基又は極性残基であり得るし、位置４はＰｒｏ残基であり得るし、位置５はＧｌｙ残基であり得るし、そして、位置６は極性残基であり得る。いくつかの実施形態において、ループの位置３、及び／又は、位置５は、Ｇｌｙ残基であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、β鎖の長さは、β鎖Ｃに関しては約６〜１４残基長、約８〜１１残基長又は９残基長であり得るし、β鎖Ｆに関しては約８〜１３残基長、約９〜１１残基長又は１０残基長であり得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｃの位置２、位置４及び位置６の残基は疎水性残基であり得るし、β鎖Ｃの位置１、位置３、位置５及び位置７〜９は野生型配列に対し改変させることができる。ここで、β鎖Ｃの位置１の残基をＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及び、Ａｒｇから成る群から選択することができる。β鎖Ｃの位置３の残基は、疎水性残基であり得るし、又は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ及びＨｉｓから成る群から選択することができる。β鎖Ｃの位置５、７、８及び９は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、β鎖Ｆの位置１、３、５及び１０の残基は、野生型配列に対し改変させることができる。ここで、β鎖Ｆの位置１、３、５及び１０の残基は、個々に、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから成る群から選択することができ、そして、β鎖Ｆの位置２、４及び６の残基は疎水性残基であり得る。β鎖Ｆの位置７の残基は疎水性残基であり得るし、又は、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＶａｌから成る群から選択することができる。β鎖Ｆの位置８の残基は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びＰｒｏから成る群から選択することができる。β鎖Ｆの位置９の残基は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ及びＩｌｅから成る群から選択することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号１の位置３０、３１、３３、３５、３７〜３９、４０〜４５、４７、４９、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は、８６のアミノ酸の１つ以上の置換に対応する置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号９７の位置３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４、及び／又は、８５のアミノ酸の１つ以上にアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号１２９の位置３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、及び／又は、８１のアミノ酸の１つ以上にアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号４６８、４６９及び４７０に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、ＦｎＩＩＩループ内の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０個又はそれを上回る、又は、そこにおいて導出可能な任意の範囲のアミノ酸挿入又は欠損によって改変することができる。いくつかの実施形態において、ＡＢループ、ＣＤループ及びＥＦループにおける置換は、個々に又は種々の組み合わせにおいて、特別に除外することができる。いくつかの実施形態において、ボトムループ（単数又は複数）における改変は、１、２、３、４、５個又は少数（fewer）の置換、挿入、及び／又は欠損に限定され得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、クレードルポリペプチドの結合特異性に寄与し得る。
【００１４】
本願によれば、少なくとも１つのループ領域及び少なくとも１つの非ループ領域に１つ以上のアミノ酸置換を含むキメラクレードルポリペプチドも提供される。ここで、クレードルポリペプチドの部分は、クレードルポリペプチドのターゲット分子に対する結合親和性を増強する非ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドによって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、キメラクレードルポリペプチドは、抗体又はＴ細胞受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の全部又は一部を含むことができる。ここで、ＣＤＲは、単一ドメイン抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３であり得る。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体はナノボディ（nanobody）であり得る。いくつかの実施形態において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ又はＦＧループの一部又は全部を、ＣＤＲで置き換えることができる。
【００１５】
更に、本願によれば、本願に開示された１つ以上のモノマークレードルポリペプチドの複数コピーを含む多重特異性クレードルポリペプチドが提供される。ここで、モノマークレードルポリペプチドは、リンカー配列によって連結され得る。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７１）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４７２）、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号４７３）及びＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号４７４）から成る群から選択され得る。
【００１６】
他の視点において、本発明によれば、両方のβ鎖におけるアミノ酸置換と、ＦｎＩＩＩのＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、及び／又は、ＦＧループにおけるアミノ酸置換とを組み合わせて有する複数（ないし多数）のクレードルポリペプチドを含むクレードルライブラリ（cradle library）が提供される。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置３０、４１、４２、４３、４４、４５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、及び／又は、８５に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号１の位置１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７４、７５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は、９４に１つ以上のアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号１と少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％同一であり得る。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、少なくとも１つのループ領域に、少なくとも１個、２個、又は約２〜２５個のアミノ酸挿入を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、少なくとも１つのループ領域に、少なくとも１個、２個又は約２〜１０個のアミノ酸の欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、２つのループ領域に少なくとも２個のアミノ酸の欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、少なくとも１つのループ領域に少なくとも１個のアミノ酸挿入と１個のアミノ酸欠損とを含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、同一のループ領域に少なくとも１個のアミノ酸の挿入及び欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルライブラリは、ターゲット分子と結合するように予め選択することができる。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号３、配列番号７９、配列番号８６及び配列番号４６８〜４７０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードルライブラリは、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、又はそれを上回る数の異なるポリペプチド変異体を含むことができる（なお、各数値の間の全ての数値や範囲も含まれる）。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列（該アミノ酸配列からライブラリが作製される）は、ヒトフィブロネクチンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６番目のＦｎＩＩＩドメインの野生型アミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、クレードルポリペ��チド配列は、５又は６残基を含むＦＧループ、３〜１１残基を含むＣＤループ、６〜１４残基を含むβ鎖Ｃ、８〜１３残基を含むβ鎖Ｆ、又は、これらのループ及び鎖の組み合わせであり得る。
【００１７】
本願によれば、更に、本願に記載の１つ以上のクレードルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現カセット又は発現構築物であり得る。いくつかの実施形態において、発現構築物は、宿主細胞（原核生物又は真核生物の細胞系統又はストレインなど）において、コードされるポリペプチドを発現することが可能である。いくつかの実施形態において、発現構築物は、本発明の分野において知られた１つ以上のポリペプチド発現システムにおいて機能し得る。いくつかの実施形態において、発現構築物は、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞及び同様のものにおいて機能し得る。
【００１８】
本願によれば、ａ）宿主細胞において本願に開示されたクレードルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるステップと、ｂ）発現したクレードルポリペプチドを単離する、及び／又は、精製するステップとを含むクレードルポリペプチドの生成方法が提供される。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、本願に記載の種々のアミノ酸置換、欠損、及び／又は、挿入の導入（engineering）を含むことができる。
【００１９】
更なる視点において、本願によれば、下記のステップを含む、選択結合活性又は選択酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在に関するスクリーニングにおいて有用なＦｎＩＩＩポリペプチドのクレードルライブラリを作製する方法が提供される。
（ｉ）天然ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのコレクションの中で、ＦＧループ及びＣＤループを、そして、好ましくは、β鎖Ｃ及びβ鎖Ｆのアミノ酸配列を、アライメントするステップ、（ｉｉ）アライメントしたループ配列及びβ鎖配列を長さに応じて区分（ないし分別（segregate））するステップ、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の区分ないし分別に従って選択したループ、β鎖及び長さに関して、部位特異的アミノ酸頻度解析を実行して各（ループ又はβ鎖）位置におけるアミノ酸の頻度を決定するステップ、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において解析されたループ、β鎖及び長さの各々に関して、各位置における保存的コンセンサスアミノ酸、又は、選択半保存的コンセンサスアミノ酸、及び、他の天然−変異アミノ酸の各々の位置を同定するステップ、（ｖ）少なくとも１つの選択したループ、β鎖及び長さに関して、（１）各ループ位置において、コンセンサスアミノ酸、及び、（コンセンサスアミノ酸が少なくとも５０％の選択閾値頻度と同等又はそれ未満の出現頻度を有するとき）単一の共通ターゲットアミノ酸及びいずれかの共生成アミノ酸をコードするコード配列のライブラリによって発現される突然変異誘導配列のライブラリを作製するか、又は、（２）各（β鎖又はループ）位置において、コンセンサスアミノ酸、及び、（コンセンサスアミノ酸が少なくとも５０％の選択閾値頻度と同等又はそれ未満の出現頻度を有するとき）他の天然−変異アミノ酸又はそれらの化学的均等物をコードするコード配列のライブラリによって発現される天然−変異組み合わせ配列のライブラリを作製するステップ（ただし、他の天然−変異アミノ酸は半保存アミノ酸及び可変アミノ酸を含み、可変アミノ酸は、その位置における出現率が選択最小閾値出現率を上回る）、（ｖｉ）ＦｎＩＩＩフレームワークのコード配列に、前記コード配列のライブラリを組み込んで、ＦｎＩＩＩ発現ライブラリを作製するステップ、及び、（ｖｉｉ）発現ライブラリのＦｎＩＩＩポリペプチドを発現させるステップ。
【００２０】
いくつかの実施形態において、クレードルライブラリは、（ａ）選択される天然ＦｎＩＩＩポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有する領域Ａ、ＡＢ、Ｂ、Ｃ、ＣＤ、Ｄ、Ｅ、ＥＦ、Ｆ及びＧと、（ｂ）（それぞれ）選択される長さ（length）を有する、ループ領域ＦＧ、ループ領域ＣＤ、及び／又は、β鎖Ｃ及びβ鎖Ｆを含み得るクレードルポリペプチドとを含むことができる。ここで、選択された長さの少なくとも１つの選択されるループ、及び／又は、β鎖領域は、各ループ位置において、保存的コンセンサスアミノ酸、もしくは、選択半保存的コンセンサスアミノ酸、及び、（コンセンサスアミノ酸は少なくとも５０％の選択閾値頻度と同等又はそれ未満の出現頻度を有するとき）単一の共通ターゲットアミノ酸及びいずれかの共生成アミノ酸、をコードするコード配列のライブラリによって発現される突然変異誘導配列のライブラリを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、（ａ）選択される天然ＦｎＩＩＩポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有する領域Ａ、ＡＢ、Ｂ、Ｃ、ＣＤ、Ｄ、Ｅ、ＥＦ、Ｆ及びＧと、（ｂ）（それぞれ）選択される長さ（length）を有するループ領域ＦＧ、ＣＤ及び非ループ領域Ｃ及びＦとを含むことができる。ここで、選択された長さの少なくとも１つの選択されたループ領域、及び／又は、β鎖領域は、各位置において、保存的コンセンサスアミノ酸もしくは選択半保存的コンセンサスアミノ酸、及び、（コンセンサスアミノ酸が少なくとも５０％の選択閾値頻度と同等又はそれ未満の出現頻度を有するとき）他の天然−変異アミノ酸、又は、それらの化学的均等物をコードするコード配列のライブラリによって発現される天然−変異組み合わせ配列のライブラリを含む（ただし、他の天然−変異アミノ酸は半保存アミノ酸及び可変アミノ酸を含み、可変アミノ酸は、その位置における出現率が選択最小閾値出現率を上回る）。
【００２２】
いくつかの実施形態において、クレードルライブラリは、アミノ酸位置が唯一のドミナントアミノ酸と、１つの変異アミノ酸とを含むのでない限り１００％の閾値（選択最小閾値出現率）を有することができるし、ドミナントアミノ酸及び変異アミノ酸は化学的に類似のアミノ酸である（この場合には、閾値は９０％である）。いくつかの実施形態において、クレードルライブラリは、選択したループ、β鎖、及び位置において少なくとも幾らか合理的な出現頻度（例えば、１０％）を有する全ての天然−変異又はそれらの化学的均等物を含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、クレードルライブラリは、ループ、β鎖又はそれらの組み合わせにおいてアミノ酸変異を含む天然−変異組み合わせ的ライブラリをスクリーニングすることによって同定される有益な突然変異を含む少なくとも１つ以上のＦＧループ及びＣＤループ、及び／又は、β鎖Ｃ及びβ鎖Ｆを有することができる。いくつかの実施形態において、ライブラリの１つ以上のメンバーを、ライブラリの他のメンバーから単離し、解析することができる。いくつかの実施形態において、クレードルライブラリをターゲット分子と結合するように予め選択し、そのような予め選択されたメンバーを選択アミノ酸位置において更に多様化させてターゲットクレードルライブラリを生成し、その後に特定の特徴又は特性についてスクリーニングすることができる。
【００２４】
更に、本発明によれば、ａ）本願に記載のＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのクレードルライブラリと、ターゲット分子とを反応させるステップと、ｂ）ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのクレードルライブラリをスクリーニングして、ターゲット分子に対する所望の結合親和性を有するものを選択するステップと、を含むターゲット分子に対する所望の結合親和性を有するクレードルポリペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、結合アッセイ（単数又は複数）を実行した後に、ターゲットに対する結合特異性、及び／又は、結合親和性などの特定の特徴を有する１つ以上のクレードルポリペプチドを選択することができる。いくつかの実施形態において、選択した１つ以上のライブラリメンバーのアミノ酸配列又は核酸配列を従来の方法を使用して決定することができる。次に、選択したＦｎＩＩＩポリペプチド（単数又は複数）の配列を、選択した配列に更なる置換を導入する第２次クレードルライブラリの作製に使用することができる。次に、第２次クレードルライブラリを、特定の特徴を有するＦｎＩＩＩポリペプチドに関してスクリーニングすることができる。このプロセスを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上繰り返すことができる。プロセスの繰り返しを追加することによって、クレードルライブラリが豊富になり、他の変異体を含む可能性を高めることができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、更に、ＦｎＩＩＩループ（複数）のみ又はＦｎＩＩＩβ鎖（複数）のみにアミノ酸置換を有するクレードルライブラリの第１次スクリーニングを実行するステップと、ＦｎＩＩＩループ（複数）又はＦｎＩＩＩβ鎖（複数）のみに存在する置換を使用して第２次スクリーニングを実行するステップとを含むことができる。いくつかの実施形態において、 第１次スクリーニングでＦｎＩＩＩループ（複数）に存在する置換のみを使用することができるし、そして、第２次スクリーニングでＦｎＩＩＩβ鎖（複数）に存在する置換のみを使用することができる。いくつかの実施形態において、第２次スクリーニングはＦｎＩＩＩループ（複数）及びβ鎖（複数）の両方における置換（複数）を使用することができる。いくつかの実施形態において、第１次スクリーニングで改変したＦｎＩＩＩアミノ酸残基を、第２次スクリーニングで改変することもできるし、改変しなくても良い。
【００２６】
本発明によれば、ターゲットを含むサンプルと、ターゲットに対して特異的に結合するＦｎＩＩＩ結合ドメインとを接触させるステップを含む、ターゲット分子検出方法も提供される。本発明によれば、（ａ）アミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させるステップと、（ｂ）変異ＦｎＩＩＩを発現する宿主細胞から発現変異ＦｎＩＩＩドメインを単離する、及び／又は、精製するステップとを含むＦｎＩＩＩ変異体の生成方法が提供される。
【００２７】
本発明によれば、本願に開示されたターゲット分子に対する所望の結合親和性を有するクレードルポリペプチドの同定方法を使用して選択されたクレードルポリペプチドが更に提供される。いくつかの実施形態において、クレードルポリペプチドは、配列番号４〜７８、配列番号８０〜８５、配列番号８７〜９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１〜１２８、配列番号１３０〜１４１、配列番号１４３、配列番号１４５〜１４７、配列番号１４９〜１５９、配列番号１６１〜１９９、配列番号２０１〜２３８及び配列番号２４０〜２７７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
更なる視点において、本発明は、本願に記載の複数（ないし多数）のクレードルポリペプチドを含むキットを提供する。本発明によれば、本願で開示のＦｎＩＩＩクレードルポリペプチドをコードする複数（ないし多数）のポリヌクレオチドキットも提供される。本発明によれば、更に、本願で開示のクレードルライブラリをコードするクレードルライブラリ、及び／又は、ポリヌクレオチドを含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、βスキャフォールド及びループ構造のコンピュータ支援型遺伝データベースバイオ検索及び描写を使用して、ＦｎＩＩＩクレードルライブラリを構築するための方法を例示する概略図である。
【００３０】
【図２Ａ】図２Ａは、野生型ＦｎＩＩＩ１０（配列番号１）の構造及び配列を示す。β鎖Ｃ及びβ鎖Ｆの特定の残基を伴うループＣＤ及びループＦＧは構造では黒色で示され、配列では黒色の太字で示される。
【００３１】
【図２Ｂ】図２Ｂは、クレードルによって形成される結合表面を示す。ループＣＤ及びループＦＧは黒色、シートＣは淡灰色、シートＦは濃灰色である。
【００３２】
【図３Ａ】図３Ａは、ＦｎＩＩＩドメインのリボン状図形におけるクレードル残基の位置を示す。ＦｎＩＩＩ０７ドメインのための構造はＲＣＳＢコード１ＦＮＦからであり、ＦｎＩＩＩ１０ドメインのための構造は１ＦＮＡからであり、ＦｎＩＩＩ１４ドメインのための構造は１ＦＮＨからである。
【００３３】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＦｎＩＩＩ１０分子でのクレードルの位置のボールスティック表示であり、ここで、クレードル残基は黒色であり、他の残基は白色である。
【００３４】
【図４Ａ】図４Ａは、ＰＦＡＭ系統ＰＦ０００４１で見られる哺乳類ＦｎＩＩＩドメインから計算された長さ分布（シートＣ）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＦＡＭ系統ＰＦ０００４１で見られる哺乳類ＦｎＩＩＩドメインから計算された長さ分布（ループＣＤ）を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＰＦＡＭ系統ＰＦ０００４１で見られる哺乳類ＦｎＩＩＩドメインから計算された長さ分布（シートＦ）を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＰＦＡＭ系統ＰＦ０００４１で見られる哺乳類ＦｎＩＩＩドメインから計算された長さ分布（ループＦＧ）を示す。
【００３５】
【図５Ａ】図５Ａは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（シートＣ、長さ９）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｂ】図５Ｂは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（シートＣ、長さ１０）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｃ】図５Ｃは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（ループＣＤ、長さ４）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｄ】図５Ｄは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（ループＣＤ、長さ５）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｅ】図５Ｅは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（ループＣＤ、長さ６）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｆ】図５Ｆは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（シートＦ、長さ１０）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｇ】図５Ｇは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（ループＦＧ、長さ５）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【図５Ｈ】図５Ｈは、クレードルの構造要素で見られる部位特異的アミノ酸分布（ループＦＧ、長さ６）を示す。上位５のアミノ酸の保存が示される。
【００３６】
【図６Ａ】図６Ａは、ＦｎＩＩＩ１０クレードル、ＦｎＩＩＩ１０トップ側及びＦｎＩＩＩ１０ボトム側結合部位の結合表面の比較を示すところのＦｎＩＩＩ１０クレードを示し、ＦｎＩＩＩ１０のリボン状図形において白色で示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＦｎＩＩＩ１０クレードル、ＦｎＩＩＩ１０トップ側及びＦｎＩＩＩ１０ボトム側結合部位の結合表面の比較を示すところのＦｎＩＩＩ１０クレードルの表面を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＦｎＩＩＩ１０クレードル、ＦｎＩＩＩ１０トップ側及びＦｎＩＩＩ１０ボトム側結合部位の結合表面の比較を示すところのＦｎＩＩＩ１０トップ側を示し、ＦｎＩＩＩ１０のリボン状図形において白色で示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＦｎＩＩＩ１０クレードル、ＦｎＩＩＩ１０トップ側及びＦｎＩＩＩ１０ボトム側結合部位の結合表面の比較を示すところのＦｎＩＩＩ１０トップ側の表面を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＦｎＩＩＩ１０クレードル、ＦｎＩＩＩ１０トップ側及びＦｎＩＩＩ１０ボトム側結合部位の結合表面の比較を示すところのＦｎＩＩＩ１０ボトム側を示し、ＦｎＩＩＩ１０のリボン状図形において白色で示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＦｎＩＩＩ１０クレードル、ＦｎＩＩＩ１０トップ側及びＦｎＩＩＩ１０ボトム側結合部位の結合表面の比較を示すところのＦｎＩＩＩ１０ボトム側の表面を示す。
【００３７】
【図７Ａ】図７Ａは、ＦｎＩＩＩ１０のシートＣ及びＦにおけるアミノ酸型の保存を示し、どの残基がクレードル分子で変異したか、また、どの残基が野生型のままであったかを示す、１〜１９番アミノ酸のシートＣ及びＦを有するＦｎＩＩＩ１０のリボン状図形である。各アミノ酸におけるＣαは球体で示され、Ｃβはアミノ酸Ｒ基の方向を示すスティックとして示される。変異したアミノ酸は灰色、変異しない（アミノ酸）は白色で示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＦｎＩＩＩ１０のシートＣ及びＦにおけるアミノ酸型の保存を示し、どの残基がクレードル分子で変異したか、また、どの残基が野生型のままであったかを示し、シートＣ及びＦの各位置におけるアミノ酸型の保存を示す表である。
【００３８】
【図８】図８は、抗体を結合することが知られているクレードル及びＣＤＲ−Ｈ３ドメインの変異した残基でのアミノ酸分布である。
【００３９】
【図９Ａ】図９Ａ−Ｆは、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４でのクレードルライブラリの設計（design）を描写する。図９Ａは、ループＣＤの長さ分布を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ループＦＧの長さ分布を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、シート及びループでのアミノ酸分布を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４（配列番号４６８〜４７０）でのクレードル残基のアライメントを示す。βシートは黒色の背景に白色の残基として示され、ループは黒字で示される。クレードル残基は、βシートのアミノ酸分布を表す太字Ｘと、添字として与えられるループ長の範囲を伴いループのアミノ酸分布を表わす太字Ｙとで示される。
【図９Ｅ】図９Ｅは、βシートＣ及びＦ並びにループＣＤ及びＦＧのクレードル残基を例示するＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４（配列番号９７、１００、１２９）のアライメントを示す。βシートは黒色背景上の白字の残基として示され、ループは太字で示された黒字のクレードル残基として示される。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ＦｎＩＩＩ構造要素残基範囲及びＦｎＩＩＩクレードル残基範囲が示される。
【００４０】
【図１０Ａ】図１０Ａ−Ｇは、モノボディ及びＳＩＭペプチドで共有されるエピトープ及びＳＵＭＯタンパク質におけるＳＩＭ結合部位の保存性を表す。図１０Ａには、ｙＳＵＭＯに結合するｙＳＭＢ−１モノボディの構造（左側）及びｈＳＵＭＯ−１１５（PDB ID 1Z5S）に結合するＳＩＭペプチド（右側）が表されている。ｙＳＵＭＯと複合体を形成する天然のＳＩＭペプチドの構造がないので、ｈＳＵＭＯ−１に結合するＳＩＭペプチドの構造が比較のために表されている。
【図１０Ｂ】図１０Ｂには、ｙＳＵＭＯにおけるＳＩＭ結合部位／ｙＳＭＢ−１エピトープ残基のアライメント及び、２つのヒトホモログであるｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２が表わされている（トップ、左側）（配列番号:297-299）。残基はその保存性スコアに従ってランク付けされている：３つのＳＵＭＯタンパク質全てに同一である残基（ｉ）、９の保存性スコアを有し類似する［残基］（ｉｉ）、及び８の保存性スコアを有し類似する［残基］（ｉｉｉ）。保存性スコアは、Ｊａｌｖｉｅｗ  ｐｒｏｇｒａｍ（Clamp, et al., Bioinformatics (2004) 20:426-427）を使用して、リビングストン及びバートン、Comput. Appl. Biosci. (1993) 9:745-756により概説される方法を使用して計算された。これらのスコアは、側鎖の化学的及び構造的な特性の保存性を反映する。ｙＳＵＭＯの構造が表されている（トップ、右側）。
【図１０Ｃ】図１０Ｃには、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２の全配列のアライメントが表されている（配列番号:300-302）。
【００４１】
【図１１Ａ】図１１Ａ−Ｃは、ＳＵＭＯターゲットクレードルライブラリのデザインを例示する。図１１Ａに表されているものは、ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯインターフェイスの構造である。ｙＳＵＭＯ構造は、複数の枝（sticks）として表されたエピトープ残基を有する表面として表されている。
【図１１Ｂ】図１１Ｂに表されているものは、ｙＳＵＭＯにおけるｙＳＭＢ−１エピトープ残基及びｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２において相当する残基の配列アライメント（トップ）である（配列番号:297-299）。下には、ＳＵＭＯターゲットライブラリで改変ないし多様化（varied）されたｙＳＭＢ−１の残基がリストされている。ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ構造におけるｙＳＭＢ−１残基とｙＳＵＭＯ残基との間の相互作用が線（lines）で示されている。各ｙＳＭＢ−１残基の下に、ＳＵＭＯターゲットライブラリにおける［各］位置で許容されるアミノ酸が、括弧で示された、これらのアミノ酸を導入するために使用される縮重コドンと並んでリストされている。
【図１１Ｃ】図１１Ｃに表されているものは、示されたＳＵＭＯターゲットライブラリで改変ないし多様化される位置が記載されたｙＳＭＢ−１構造のカートーン（cartoon）である。
【００４２】
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｃは、ＳＵＭＯターゲットライブラリ由来のモノボディの選択及び特徴付け（characterization）を例示する。図１２Ａには、ｙＳＵＭＯ（左側）及びｈＳＵＭＯ−１（右側）が、各ターゲットに結合するかのようにモデル化されたｙＳＭＢ−１パラトープ構造と共に表されている。モノボディの残基の位置が、示された残基番号のＣα原子に対応する球（複数）で表されている。ＦＧループ残基（７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び８５）及びスキャフォールド残基（３１、３３及び７３）が示されている。中央には、ＳＵＭＯターゲットライブラリにおけるモノボディの位置に導入されたアミノ酸の多様性をリストした表が表されている。各位置の野生型残基が、角括弧で示されている。
【図１２Ｂ】図１２Ｂに表されているものは、代表的なＳＰＲ結合トレース（traces）並びに、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１に対してリカバーされたモノボディのアミノ酸配列である（配列番号:303-318）。ＳＰＲから推定される解離係数が、全てのクローンについて与えられている。
【図１２Ｃ】図１２Ｃに表されているものは、４０のｙＳＵＭＯモノボディ及び４４のｈＳＵＭＯ−１モノボディの配列ロゴの代表例である。ｙＳＭＢ−１の野生型配列がトップに表されている（SEQ ID NO:303）。この描写において、個々の文字の相対的な高さは、アミノ酸がその位置においてどの程度頻繁にリカバーされているかを反映し、特定の位置における文字の積み重ねは、生じる頻度がより高いものから生じる頻度が低いものまでを順位付けしたものであり、個々の積み重ねの全体の高さは、それら位置における全体の配列保存性のレベルを反映する。これらの図は、ＷｅｂＬｏｇｏ（Crooks, et al., Genome Res. (2004) 14:1188-1190; Schneider and Stephens, Nucleic Acids Res. (1990) 18:6097-6100）を使用して作成した。
【００４３】
【図１３】図１３は、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１モノボディにおけるスキャフォールド残基の優先性についての論理的根拠（ないし原理：rationale）を表す。ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体（上側）及びモデル化されたｙＳＭＢ−１／ｈＳＵＭＯ−１複合体（下側）におけるスキャフォールド残基によって作られたコンタクト（contact）が表されている。モノボディスキャフォールドＲ３３と、ｈＳＵＭＯ−１のＫ２５との間の潜在的な立体的及び静電気的な衝突（clash）が円で囲まれている。
【００４４】
【図１４Ａ】図１４Ａ−Ｄは、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１結合モノボディにおける特異性を表す。図１４Ａには、２つのほぼ同一のｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１モノボディのアミノ酸配列が表されている（配列番号:303, 319-320）。モノボディＡは、ｈＳＵＭＯ１バインダとしてリカバーされ、モノボディＢは、ｙＳＵＭＯバインダとして［リカバーされた］。
【図１４Ｂ】図１４Ｂには、モノボディＡ及びＢのｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１への結合に関するファージＥＬＩＳＡデータが表されている。ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１の両方は、ＧＳＴ融合タンパク質として製造された。ＧＳＴへの結合は、陰性対照として表されている。
【図１４Ｃ】図１４Ｃには、３２のｈＳＵＭＯ−１モノボディのｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２への結合に関するファージＥＬＩＳＡデータが表されている。全てのＳＵＭＯタンパク質が、ＧＳＴ融合体として製造された。ＧＳＴへの結合は、陰性対照として表されている。
【図１４Ｄ】図１４Ｄには、ｈＳＵＭＯ−１に特異的なモノボディの配列アライメント及びｙＳＵＭＯとの交差反応が、配列ロゴ形式で表されている（図１３の配列ロゴの説明文を参照する）。野生型ｙＳＭＢ−１配列が、トップに表されている。図２５Ｃ［図１４Ｃ？］におけるクローン番号１、３、４、５、６、８、９、１２、１３、１７、１８、２０、２１、２３、３１及び３２は、交差反応性（cross-reactive）として分類された。残余の１６クローンは、特異的（specific）と分類された。
【００４５】
【図１５】図１５Ａ−Ｃは、クレードルライブラリから生じたモノボディについての代表的な結合データを表す。選択されたクローンのファージＥＬＩＳＡシグナルが表されている。図１５Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ、ｈＳＵＭＯ１、ヒトユビキチン及びＡｂｌＳＨ２をターゲットとしたＢＬ１ライブラリから選択されたクローンを表す。ＥＬＩＳＡウェルは、同属の（cognate）ターゲットで被覆された。左側のバー（bar）は、可溶性ターゲット（これは、競合剤として働く）の非存在下のデータを表し、中間のバーは、可溶性競合剤の存在下のデータを表す（ｈＳＵＭＯ１に関しては１００ｎＭ、及び、その他に関しては２００ｎＭである）。右側のバーは、ターゲットを含んでいないウェルへの結合を表す（陰性対照）。
【００４６】
【図１６Ａ】図１６Ａ−Ｅは、ｙＳＵＭＯ結合モノボディの特性を表す。図１６Ａは、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯアイソフォームの間の保存性スコアによって影付けされた酵母ＳＵＭＯ（ｙＳＵＭＯ）構造を表す（Livingstone and Barton, supra, 1993）。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ラベルされたベータ鎖Ａ−Ｇ及び、モノボディライブラリにおいて多様化された表面ループ（ＢＣループ、ＤＥループ、及びＦＧループ）を有するＦｎＩＩＩスキャフォールドの概略図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＳＰＲから［得られた］Ｋｄ値とｙＳＵＭＯ結合モノボディの可変ループのアミノ酸配列を表す（配列番号:321-329）。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、１：１結合モデルの生のデータ（raw data）（点線）のベットフィット（bet fit）（実線）から計算したキネティックパラメータと、ｙＳＵＭＯに結合する、ｙＳＭＢ−１及びｙＳＭＢ−２についてのＳＰＲトレースを表す。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、ｙＳＵＭＯ構造上に表される、ＮＭＲ化学シフト摂動からマップされたｙＳＭＢ−１及びｙＳＭＢ−２のエピトープを表す。
【００４７】
【図１７】図１７は、ｙＳＵＭＯ結合モノボディの配列及び親和性を表す（配列番号:321-415）。全てのｙＳＵＭＯ結合モノボディの可変ループのアミノ酸配列は、我々の研究室でリカバーした。入手可能な場合、ＳＰＲからのＫｄ値が与えられている。モノボディは、３つのライブラリのうち１つからの由来であった：ループの長さ及び配列が５０％のＹ及び５０％のＳの組み合わせを使用して多様化された、二元（binary）Ｔｙｒ／Ｓｅｒライブラリ（Koide, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2007) 104:6632-6637）；４０％のＹ、２０％のＳ、１０％のＧ及び５％の各Ｒ、Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ａ、の組み合わせを使用した「ＹＳＸ」ライブラリ（Olsen, et al., Nature (2010) 463:906-912）；又は、下記の「ＹＳＧＷ」ライブラリ、すなわち、ＢＣ及びＦＧループにおける、３０％のＹ、１５％のＳ、１０％のＧ、５％の各Ｗ、Ｆ、Ｒ、及び、２．５％の他の全ての各アミノ酸（システインを除く）、及び、位置５２の５０％のＧｌｙ、２５％のＴｙｒ及び２５％のＳｅｒの組み合わせ、及びＤＥループにおける位置５３−５５のＴｙｒ及びＳｅｒの５０／５０混合物を使用した「ＹＳＧＷ」ライブラリ（Wojcik, et al., supra, 2010）。
【００４８】
【図１８】図１８は、ｙＳＵＭＯ結合モノボディのエピトープマッピングＥＬＩＳＡを表す。３４のファージディスプレイｙＳＵＭＯ結合モノボディの結合は、１μＭ  ｙＳＭＢ−１競合剤の存在下及び非存在下でのＥＬＩＳＡによって測定した。クローン番号は、図２８における、それらの［番号の］ｙＳＭＢ−Ｘという形式に対応する。
【００４９】
【図１９Ａ】図１９Ａ−Ｂは、ｙＳＵＭＯ結合モノボディの特異性を表す。図１９Ａは、ファージＥＬＩＳＡを使用して解析された、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２への８のｙＳＵＭＯ結合モノボディの結合を表す。クローン番号は、図２７Ｃ及び２８におけるｙＳＭＢ−Ｘという形式である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２に結合するｙＳＭＢ−１（左欄）及びｙＳＭＢ−９（右欄）の平衡ＳＰＲ測定を表す。複数の濃度における平衡応答（左側パネル）を、単純な１：１結合モデルに適合させた（右側パネル）。
【００５０】
【図２０Ａ】図２０Ａ−Ｃは、モノボディｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体の結晶構造を表す。図２０Ａ、上側には、ｙＳＵＭＯ及びｙＳＭＢ−１が、枝（sticks）として表されたモノボディパラトープ残基と共に表されている；ＦＧループ残基及びスキャフォールド残基が示されている。ｙＳＵＭＯは、図１６Ｅと同じ配向（the same orientation）で表されている。下側に、表面として描かれたモノボディパラトープを記載した他の視点［の図］を表す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯインターフェイスの拡大図である。ｙＳＵＭＯ（表面／枝［で表されている］）は、エピトープの疎水性中心及び荷電／極性リム（rim）を含む残基で表されている。モノボディパラトープ残基は、図Ａと同様に表されている。
【図２０Ｃ】図２０Ｃ、左側及び中央は、ｙＳＵＭＯへのｙＳＭＢ−１と、ｈＳＵＭＯ１へのＲａｎＢＰ２のＳＩＭの結合モデルの比較を表す。これら両方は、ＳＵＭＯターゲットと分子間ベータシートを形成する（拡大された囲み）。右側：表示されたｙＳＵＭＯ表面と共に表される、ＲａｎＢＰ２  ＳＩＭ及びＳＩＭ模倣モノボディ残基の重ね合わせ（overlay）である。
【００５１】
【図２１Ａ】図２１Ａ−Ｂは、ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯインターフェイス解析を表す。図２１Ａは、ｙＳＭＢ−１パラトープにおける各残基による、埋められた表面領域を表す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、各アミノ酸型にり寄与された、ｙＳＭＢ−１及びｙＳＵＭＯの埋められた全表面積（buried surface area）のパーセントを表す。
【００５２】
【図２２Ａ】図２２Ａ−Ｆは、ＳＵＭＯターゲットライブラリ由来のｈＳＵＭＯ１結合モノボディを表す。図２２Ａは、ＳＵＭＯターゲットクレードルライブラリのデザインを表す。左側には、ｙＳＭＢ−１パラトープ残基（主鎖ないし骨格  枝／球）が、示されたＦＧループ及びスキャフォールド残基と共に表されている。ｙＳＵＭＯ（表面）は、枝として［表されている］ｙＳＭＢ−１エピトープ残基と共に表されている。ｙＳＵＭＯとｈＳＵＭＯ（複数）との間の保存性に関しては、ｙＳＵＭＯ残基、Ｆ３７、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｔ４３、Ｌ４８及びＲ５５は、完全に保存されており、Ｈ２３、Ｉ３５、Ｉ３９、Ｒ４７及びＡ５１は、保存的な置換（conservative substitution）であり、Ｎ２５、Ｅ３４、Ｆ３６、Ｅ５０及びＫ５４は、非保存的な置換である。ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２／３における各位置の残基型は、括弧内に表されている。右側は、ＳＵＭＯターゲットライブラリに使用されたアミノ酸多様性を表す。野生型ｙＳＭＢ−１残基は、角括弧内に表されている。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ＳＵＭＯターゲットライブラリ由来のｈＳＵＭＯ１結合モノボディのアミノ酸配列を表す。ＳＰＲからのＫｄ値も表されている。代表的なＳＰＲトレースが表されている。ボトムに、追加のｈＳＵＭＯ１結合モノボディ（hS1MB-22）及び、ＳＵＭＯターゲットライブラリからリカバーされた非常によく似たｙＳＵＭＯ結合モノボディ（ySMB-ST6）が、表されている（配列番号:303, 416-427）。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ｈＳＵＭＯ１構造上に表された化学シフト摂動によりマップされたｈＳ１ＭＢ−４のエピトープを表す。データは、図１６Ｅにおける同一のスキームを使用して現されている。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、（SEQ ID NO:303）配列ロゴとして表されたｙＳＵＭＯ−及びｈＳＵＭＯ１結合モノボディの配列保存性を表す（Schneider and Stephens, supra, 1990; Crooks, et al., supra, 2004）。個々の文字の高さは、どの程度頻繁に、アミノ酸がその位置においてリカバーされたかを反映し、［各］位置における文字の積み重ねは、生じる頻度がもっとも多いものからもっとも低いものまで順序付けしたものであり、積み重ねの全体の高さは、その位置における全体の保存性のレベルを反映する。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、ファージＥＬＩＳＡにより測定されたｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１へのｈＳ１ＭＢ−２２及びｙＳＭＢ−ＳＴ６の結合を表す。
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体におけるスキャフォールド残基により作られたコンタクト（左側）及び、モデル化されたｙＳＭＢ−１／ｈＳＵＭＯ−１複合体におけるスキャフォールド残基により作られたコンタクト（右側）を表す。モノボディ（枝：sticks）及びＳＵＭＯ残基（表面／枝）が示される。ｙＳＭＢ−１／ｈＳＵＭＯ１複合体は、ｙＳＭＢ−１複合体のｙＳＵＭＯ部分の、ｈＳＵＭＯ１構造との重ね合わせによりモデル化された。
【００５３】
【図２３】図２３は、ＳＵＭＯターゲットライブラリから単離されたｙＳＵＭＯ結合モノボディを表す。ＳＰＲからのＫｄ値と共に、ＳＵＭＯターゲットライブラリから、ｙＳＵＭＯに対してリカバーされたモノボディのアミノ酸配列（配列番号:303, 428-432）及び、代表的なＳＰＲトレースが表されている。
【００５４】
【図２４】図２４は、ｈＳＵＭＯ１結合モノボディのエピトープマッピングＥＬＩＳＡを表す。１６のファージディスプレイしたｈＳＵＭＯ１結合モノボディの、ｈＳＵＭＯ１への結合を、１μＭ  ｈＳ１ＭＢ−４競合剤の存在下又は非存在下でのＥＬＩＳＡにより測定した。クローン番号は、図２２Ｂ及び２６における、それらの［番号の］ｈＳ１ＭＢ−Ｘという形式に対応する。
【００５５】
【図２５Ａ】図２５Ａ−Ｂは、ｈＳＵＭＯ−１結合モノボディの特異性を表す。図２５Ａは、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２に結合する６つのｈＳＵＭＯ１結合モノボディのファージＥＬＩＳＡ由来の結合曲線を表す。追加のモノボディに関するデータは、図２６Ａに表されている。ファージ含有培地上清（タイター  〜１０８）の段階希釈液が使用された。吸光度値は、１ｃｍのパス長（path-length）にスケール化された。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２に結合するｈＳ１ＭＢ−４の平衡ＳＰＲ測定を表す。複数の濃度での平衡反応（左側パネル）が、単純な１：１結合モデル（右側パネル）に適合された。
【００５６】
【図２６Ａ】図２６Ａ−Ｂは、ｈＳＵＭＯ１結合モノボディの選択性を表す。図２６Ａは、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２に結合する１０つのｈＳＵＭＯ結合モノボディのファージＥＬＩＳＡ由来の結合曲線を表す。６つの追加のモノボディのデータが表されている。
【図２６Ｂ】図２６Ｂには、１６のｈＳＵＭＯ１結合モノボディのアミノ酸配列が表されており（配列番号:433-448）、ｙＳＵＭＯ[についての特異性因子]を上回る、ｈＳＵＭＯ１についてのこれらの特異性因子に従ってグループ分けされている。特異性因子とは、図２５Ａ及び図２６Ａに表されているタイトレーションファージＥＬＩＳＡ試験における、ｙＳＵＭＯについて測定された見掛けの親和性に対するｈＳＵＭＯ１について測定された見掛けの親和性の割合である。
【００５７】
【図２７Ａ】図２７Ａ−Ｃは、ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用及びＳＵＭＯ化におけるｈＳＵＭＯ１特異的モノボディの効果を表す。  図２７Ａ、左側は、ＳＩＭ含有ＲａｎＢＰ２の、ＳＵＭＯ化ＲａｎＧＡＰ（これは、ｈＳＵＭＯ１で修飾されている）との相互作用の概略図を表す。右側は、ＥＬＩＳＡにおける、モノボディｈＳ１ＭＢ−４の存在下でのＳＵＭＯ１−ＲａｎＧＡＰへのＲａｎＢＰ２の結合を表す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ＳＵＭＯ化カスケードにおけるＥ１及びＥ２依存性ステップの概略図を表す。共有結合中間体は、ＳＵＭＯと、Ｅ１（SAE1/2）及びＥ２（Ubc9）との間で引き続いて形成される。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用及びＳＵＭＯ化におけるｈＳＵＭＯ１特異的モノボディの効果を表す。図２７Ｃは、ｈＳ１ＭＢ−４（レーン３−５）及びｈＳ１ＭＢ−５（レーン６−８）の存在下に行なわれたＳＵＭＯ化反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。レーン１及び２は、それぞれ、ｙＳＭＢ−１が存在する陰性対照及びモノボディが存在しない陰性対照である。全ての反応は、ＳＡＥ１／２、Ｕｂｃ９、及びｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ３の両方を基質として含んでいた。各アイソフォームについてのＳＡＥ２−ＳＵＭＯ及びＵｂｃ９−ＳＵＭＯ共有結合中間体に対応するバンドが示されている。Ｈｉｓ６タグ化ＳＵＭＯ３（H6-SUMO3）が、ゲル上で、ｈＳＵＭＯ３からｈＳＵＭＯ１を区別するために使用された。
【００５８】
【図２８】図２８は、ｈＳＵＭＯ１コンジュゲーションのモノボディ阻害に関する提案された機構を表す。ｙＳＭＢ−１様モノボディのモデル化された構造は、Ｅ１−ｈＳＵＭＯ１複合体（PDB ID 3KYD）に結合した（Olsen, et al., supra, 2010）。結晶構造において、不規則なＳＡＥ１の長いループの軌道が、点線によって図示される。
【００５９】
【図２９Ａ】図２９Ａ−Ｂは、脱ＳＵＭＯ化におけるモノボディの効果を表す。図２９Ａは、ＹＦＰ−ｈＳＵＭＯ１−ＥＣＦＰ融合タンパク質がｈＳＵＭＯ１Ｃ末端ジグリシン配列で、ＳＥＮＰ１により開裂される、脱ＳＵＭＯ化解析（アッセイ）の概略図を表す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ｈＳＭＢ−４（レーン６−８）又はｈＳ１ＭＢ−５（レーン９−１１）の存在下に行なわれた脱ＳＵＭＯ化反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。ＳＥＮＰ１又はモノボディが存在しない対照（レーン１）、又は、ｙＳＵＭＯ特異的ｙＳＭＢ−１の存在下で行なわれるＳＥＮＰ１開裂を示す対照もまた表された（レーン２−５）。ＹＦＰ−ｈＳＵＭＯ１−ＥＣＦＰ融合体及びＹＦＰ−ｈＳＵＭＯ１及びＥＣＦＰ開裂産物に相当するバンドが、モノボディに相当するバンドと並んで示されている。
【００６０】
【図３０Ａ】図３０Ａ−Ｅは、モノボディライブラリデザインを表す。図３０Ａは、ＶＨＨスキャフォールド（左側）とＦｎＩＩＩ（ＦＮ３）スキャフォールド（右側）との比較を表す。２つのベータシート領域が、それぞれ、シアン及びブルーで色づけされている。ＶＨＨのＣＤＲ領域及び、ＦｎＩＩＩにおいて対応するループは、色づけされ、ラベルされている。ＦｎＩＩＩのベータ鎖が、Ａ−Ｇでラベルされている。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ターゲットである、マルトース結合タンパク質に結合したモノボディの構造を表す（Gilbreth, R. N., et al., J Mol Biol (2008) 381:407-418）。モノボディは、Ａと同じ方法で描写される。マルトース結合タンパク質の部分のみが、表面モデルとして表されている。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、Ｂのように描写されたＡｂｌ  ＳＨ２ドメイン（Wojcik, et al., supra, 2010）に結合したモノボディの構造を表す。
【図３０Ｄ】図３０Ｄは、ＦｎＩＩＩ構造において球として表された、クレードルライブラリにおいて多様化された残基の位置を表す。
【図３０Ｅ】図３０Ｅは、クレードルライブラリにおいて多様化された残基の位置を表す。
【００６１】
【図３１Ａ】図３１Ａ−Ｄは、モノボディライブラリデザイン及び生じたクローンを表す。図３１Ａは新しいクレードルライブラリから生じたモノボディのアミノ酸配列（図３１Ａ）（配列番号:449-457）及び「ループのみ」のライブラリ（図３１Ｂ）（配列番号:458-467）である。「Ｘ」は、３０％のＴｙｒ、１５％のＳｅｒ、１０％のＧｌｙ、５％のＰｈｅ、５％のＴｒｐ及び２．５％の（Ｃｙｓを除いた）他の全ての各アミノ酸の混合物を示す；「Ｂ」は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｙｒの混合物であり；「Ｊ」は、Ｓｅｒ及びＴｙｒの混合物であり；「Ｏ」は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＶａｌの混合物であり；「Ｕ」は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ及びＴｙｒの混合物であり；「Ｚ」は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ及びＴｈｒの混合物である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、「ループのみ」ライブラリから生じたモノボディのアミノ酸配列（配列番号:458-467）である。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、代表的なモノボディの酵母表面ディスプレイによる結合測定を表す。モノボディをディスプレイする酵母細胞の平均蛍光強度が、パネルＡで示されるようなターゲットの濃度の関数（function）としてプロットされている。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、代表的なモノボディのターゲット結合に関するＳＰＲセンサグラムを表す。薄（細）い線（thin line）は、１：１結合モデルの最も良好で広範囲な適合（fit）を表す。差し込み図は、センサグラムの濃度依存性解析及び１：１結合モデルの最も良い適合を表す。
【００６２】
【図３２Ａ】図３２Ａ−Ｄは、２つのライブラリ由来のモノボディの結晶構造を表す。構造は、同一の方向のモノボディで表されている。図３２Ａは、Ａｂｌ  ＳＨ２ドメインに結合するＳＨ１３モノボディの構造であって、図３０Ｃのように描写されたものを表す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、ＳＨ１３／Ａｂｌ  ＳＨ２複合体のＮＭＲに基づくエピトープマッピングを表す。モノボディ結合によって、球はそれぞれ、アミド共鳴が強く影響されたＡｂｌ  ＳＨ２の残基（＞１．５ピーク幅のシフト）、弱く影響された［Ａｂｌ  ＳＨ２の残基］（０．５−１．５ピーク幅のシフト）、及び、最小に影響された［Ａｂｌ  ＳＨ２の残基］（＜０．５ピーク幅のシフト）を表す。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体（左側）及びｙＳＭＢ−９／ｈＳＵＭＯ１複合体（右側）の結晶構造を表す。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、異なったモードを使用して、ターゲット上の同等のエピトープに結合した２つのモノボディを表す。左側のパネルは、Ｃにおいて表された２つの結晶構造と、重ねあわされたｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１の比較を表す。右側のパネルは、示されたモノボディについてのエピトープ（複数）と、同じ配向（orientations）においてｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１を表す。
【００６３】
【図３３】図３３は、ターゲット結合が破壊されたＣ鎖における残基の変異を表す。モノボディＧＳ５の残基３０、３１及び３３（図３１ＡのＧＳ５の配列を参照）は、変異を受け、それぞれの野生型のアミノ酸に戻された。ＧＳ５モノボディをディスプレイする酵母細胞の平均蛍光強度（黒丸）及び、変異体（白丸）は、ターゲットであるＧＦＰの濃度の関数（function）としてプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
Ｉ．定義
以下の用語は、本明細書に特段の記載がない限り、以下の意味を有する。
【００６５】
用語「フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン」又は「ＦｎＩＩＩドメイン」とは、任意の生命体（organism）に由来する野生型フィブロネクチンのドメイン（領域）を意味する。１つの特定の実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、ＦｎＩＩＩ０１、ＦｎＩＩＩ０２、ＦｎＩＩＩ０３、ＦｎＩＩＩ０４、ＦｎＩＩＩ０５、ＦｎＩＩＩ０６、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ０８、ＦｎＩＩＩ０９、ＦｎＩＩＩ１０、ＦｎＩＩＩ１１、ＦｎＩＩＩ１２、ＦｎＩＩＩ１３、ＦｎＩＩＩ１４、ＦｎＩＩＩ１５、ＦｎＩＩＩ１６及び同様のものから成る群から選択される。他の実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４から成る群から選択される。他の実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインはＦｎＩＩＩ０７である。他の実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインはＦｎＩＩＩ１０である。他の実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインはＦｎＩＩＩ１４である。
【００６６】
用語「ＦｎＩＩＩドメイン変異体」又は「変異ＦｎＩＩＩドメイン」とは、野生型ＦｎＩＩＩドメインに対し改変が施されたポリペプチド領域を意味する。改変（modifications）は、野生型ＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列と比較した場合の、１個以上のアミノ酸置換、欠損、及び／又は、挿入を含む。１つの実施形態において、ＦｎＩＩＩ変異又はＦｎＩＩＩ変異ドメインは、ヒトの１０番目ドメインのＦｎＩＩＩドメイン配列（配列番号１）に関して特異的な改変（alteration）を有する。１つの実施形態において、ＦｎＩＩＩ変異又はＦｎＩＩＩ変異ドメインは、ヒトの７番目のドメインのＦｎＩＩＩドメイン配列（配列番号９７）に関して特異的な改変を有する。１つの実施形態において、ＦｎＩＩＩ変異又はＦｎＩＩＩ変異ドメインは、ヒトの１４番目のドメインのＦｎＩＩＩドメイン配列（配列番号１２９）に関して特異的な改変を有する。用語「置換変異」とは、ペプチド配列における１つ以上のアミノ酸の、保存又は非保存アミノ酸（単数又は複数）での置き換えを含む。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメイン変異は、野生型ＦｎＩＩＩドメインに比べて、特定のターゲットに対する増加した結合特性を有する。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメイン変異は、野生型ＦｎＩＩＩドメインに比べて、ターゲット分子に対する結合に利用可能な増加した表面領域（ないし表面積）を有する。
【００６７】
用語「ＦｎＩＩＩドメインポリペプチド」とは、少なくとも１つのＦｎＩＩＩドメインを含むポリペプチドを意味する。「変異ＦｎＩＩＩドメインポリペプチド」又は「ＦｎＩＩＩドメインベースポリペプチド」とは、少なくとも１つのＦｎＩＩＩドメイン変異を含むポリペプチドを意味する。そのようなポリペプチドは、ターゲットポリペプチド又はターゲットタンパク質に対して特異的に結合可能であるものと考慮される。「ＦｎＩＩＩドメインベース分子」とは、ＦｎＩＩＩドメイン又はＦｎＩＩＩ変異ドメインのアミノ酸配列を有する分子を意味する。
【００６８】
「βシート（β sheet又はbeta sheet）」は、タンパク質における通常の（regular）二次構造の形状である。βシートは、少なくとも２つ又は３つのバックボーン水素結合によってラテラルに（laterally）結合したβ鎖から成り、一般的にはツイストしたひだ状のシートを形成する。「β鎖（beta strand又はβ strand）」は、典型的には３〜１０個のアミノ酸の長さ［アミノ酸長］のバックボーンがほとんど完全に延在した立体構造（extended conformation）を有するポリペプチド鎖のストレッチである。用語「β鎖Ａ（シートＡとも称される）」とは、ＡＢループの前方に存在するアミノ酸を意味する。用語「β鎖Ｂ（シートＢ）とも称される」は、ＡＢループとＢＣループとを連結するアミノ酸を意味する。用語「β鎖Ｃ（シートＣ又はβ１とも称される）」とは、ＢＣループとＣＤループとを連結するアミノ酸、例えば、配列番号１のアミノ酸位置３１〜３９を意味する。用語「β鎖Ｄ（シートＤ又はβ２とも称される）」とは、ＣＤループとＤＥループとを連結するアミノ酸、例えば、配列番号１のアミノ酸位置４４〜５１を意味する。用語「β鎖Ｅ（シートＥとも称される）」とは、ＤＥループとＥＦループとを連結するアミノ酸を意味する。用語「β鎖Ｆ（シートＦ又はβ３とも称される）」とは、ＥＦループとＦＧループとを連結するアミノ酸、例えば、配列番号１のアミノ酸位置６７〜７５を意味する。用語「β鎖Ｇ（シートＧ又はβ４とも称される）」は、ＦＧループの後方（下位）に存在するアミノ酸、例えば、配列番号１のアミノ酸位置８５〜９４を意味する。
【００６９】
ループは、（αへリックスやβシートと比較した場合に）順序が不規則（less ordered）でフレキシブルなアミノ酸のストレッチであり、典型的には、あるタンパク質内の異なる構成要素（other structural elements）を連結する。ＦｎＩＩＩという意味合いにおいて、ループは、ループが連結するβ鎖（の名前）によって命名される。例えば、β鎖Ａとβ鎖Ｂとを連結するループは、ＡＢループと命名される。用語「ＢＣループ」とは、配列番号１のアミノ酸２２〜３０に対応するアミノ酸を意味する。用語「ＣＤループ」とは、配列番号１のアミノ酸３９〜４５に対応するアミノ酸を意味する。用語「ＤＥループ」とは、配列番号１のアミノ酸５１〜５５に対応するアミノ酸を意味する。用語「ＦＧループ」とは、配列番号１のアミノ酸７６〜８７に対応するアミノ酸を意味する。用語「非ループ領域」とは、ループを形成しないポリペプチド配列の部分を意味し、βシート及びβ鎖を含むがそれらに限定されない。ＦｎＩＩＩという意味合いにおいて、非ループ領域はβ鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを含む。
【００７０】
用語「ライブラリ」は、異なるアミノ酸配列及び異なるタンパク質結合特性を有するポリペプチドのコレクション（例えば、複数ないし多数のポリペプチド）を意味する。いくつかの実施形態において、異なるバリエーション（複数）のＦｎＩＩＩドメインを有するポリペプチドを含む変異ＦｎＩＩＩドメインライブラリが提供される。特段の記載がない限り、ライブラリは、実際の物理的なポリペプチドのライブラリ、又は、ポリペプチドをコードする核酸のライブラリである。更なる実施形態において、生成されたライブラリについての情報、又は、生成され得る理論上のライブラリについての情報を含むデータベースが提供される。この情報は、潜在的可能性（ポテンシャル）を有する複数ないし多数の変異ＦｎＩＩＩドメインに関する記載又は構造を含む化合物データベースであり得る。
【００７１】
用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」とは、測定（ないし検出）可能で再現可能なＦｎＩＩＩドメイン変異の他の分子（ターゲットなど）に対する結合能力を意味し、生物学的分子を含む異種性の分子群の中にターゲット分子が存在することを決定付けるものである。例えば、ターゲットに対して特異的又は優先的に結合するＦｎＩＩＩドメイン変異体は、このターゲットに対して、より大きな親和性（affinity、avidity）でより容易に結合する、及び／又は、ほとんど又は全ての他の分子に対して結合する期間よりも長期間に渡って結合する。「特異的結合」は、必ずしも排他的結合である必要は無い（排他的結合であっても良いが）。
【００７２】
ターゲットに対して特異的に結合するポリペプチドは、室温で、生理的塩濃度かつ生理的ｐＨ条件の下で、少なくとも１ｘ１０−６Ｍの親和性（表面プラズモン共鳴によって測定される）を有する。そのような測定の例は、実施例に記載される。
【００７３】
用語「ターゲット」とは、ＦｎＩＩＩベース結合分子又は本願に記載のモノボディに対して特異的に結合するペプチド、抗原又はエピトープを意味する。ターゲットは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、及び／又は、脂質に存在するエピトープ（抗原決定基）を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
用語「非天然アミノ酸残基」は、哺乳類（ヒトなど）において天然に生じるＦｎＩＩＩドメインには存在しないアミノ酸残基を意味する。
【００７５】
用語「タグ」、「エピトープタグ」又は「親和性タグ」は、本願において互換可能なように使用され、通常は抗体又は他の結合パートナーによって特異的に認識される分子又は分子のドメインを意味する。これらの用語は同様に結合パートナー複合体も意味する。従って、例えば、ビオチン及びビオチン／アビジン複合体の両方が親和性タグとみなされる。親和性タグは、エピトープ／抗体の相互作用において認識されるエピトープに加えて、他の結合分子によって認識される「エピトープ」（例えば、受容体に結合するリガンド）、他のリガンドに結合してヘテロ二量体又はホモ二量体を形成するリガンド、Ｎｉ−ＮＴＡに結合するＨｉｓ６、アビジン、ストレプトアビジン、又は、抗ビオチン抗体に対して結合するビオチン、及び同様のもの）も含む。
【００７６】
ＦｎＩＩＩドメイン変異体という意味合いにおいて用語「コンジュゲート」は、ＦｎＩＩＩドメイン変異と非ＦｎＩＩＩドメイン変異との間の化学的連結（linkage）を意味する。コンジュゲートからは、いくつかの本発明の実施形態において生理学的な条件下でのアミノ酸残基同士の間に見られる通常のペプチド結合を除くことが特に考慮される。
【００７７】
用語「阻害ないし阻止する」、「減少させる」又は「妨げるないし防止する」、あるいはこれらの用語の任意のバリエーションは、特許請求の範囲、及び／又は、明細書において使用される場合に、所望の結果を達成するいずれかの測定可能な減少又は完全な阻害ないし阻止を含む。
【００７８】
本願において使用される用語「クレードル分子」又は「ＦｎＩＩＩベースクレードル分子」は、少なくとも１つのβ鎖及び少なくとも１つのループ領域に１つ以上の改変を含むように改変されるＦｎＩＩＩドメインを意味し、ループ領域は、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧから成る群から選択されるトップループ領域である。１つの実施形態において、クレードル分子は、少なくとも１つのβ鎖及び少なくとも１つのループ領域に１つ以上の修飾を含むように改変されるＦｎＩＩＩドメインを意味し、該ループ領域は、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦから成る群から選択されるボトムループ領域である。１つの実施形態において、クレードル分子は、少なくとも１つのβ鎖、ＢＣ、ＤＥ、及び、ＦＧから成る群から選択される少なくとも１つのトップループ領域、そして、ＡＢ、ＣＤ、及び、ＥＦから成る群から選択される少なくとも１つのボトムループ領域に、１つ以上の修飾を含むように改変されるＦｎＩＩＩドメインを意味する。トップ又はボトム領域の３つ全てのループがターゲット分子に対する結合に使用される必要はないと理解される。１つの実施形態において、クレードル分子は、少なくとも１つのβ鎖、トップＦＧループ領域、及び、ボトムＣＤループ領域に１つ以上の修飾を含むように改変されたＦｎＩＩＩドメインを意味する。
【００７９】
１つの実施形態において、クレードル分子は、シートＡ、シートＢ、シートＣ、シートＤ、シートＥ、シートＦ及びシートＧからから成る群から選択される少なくとも１つのβ鎖、そして、少なくとも１つのループ領域（ループ領域は、ＢＣ、ＤＥ、ＦＧから成る群から選択されるトップループ領域である）に、１つ以上の改変を含むように改変されたＦｎＩＩＩドメインを意味する。１つの実施形態において、クレードル分子は、シートＡ、シートＢ、シートＣ、シートＤ、シートＥ、シートＦ及びシートＧからから成る群から選択される少なくとも１つのβ鎖、そして、少なくとも１つのループ領域（ループ領域は、ＡＢ、ＣＤ、及び、ＥＦから成る群から選択されるボトムループ領域である）に１つ以上の改変を含むように改変されたＦｎＩＩＩドメインを意味する。１つの実施形態において、クレードル分子は、シートＡ、シートＢ、シートＣ、シートＤ、シートＥ、シートＦ及びシートＧから成る群から選択される少なくとも１つのβ鎖と、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧから成る群から選択される少なくとも１つのトップループ領域と、そして、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦから成る群から選択される少なくとも１つのボトムループ領域とにおいて、１つ以上の改変を含むように改変されるＦｎＩＩＩドメインを意味する。１つの実施形態において、クレードル分子は、β鎖Ｃと、トップＦＧループ領域と、ボトムＣＤループ領域とに１つ以上の修飾を含むように改変したＦｎＩＩＩドメインを意味する。１つの実施形態において、クレードル分子は、β鎖Ｃと、トップＦＧループ領域と、ＣＤループ領域とに１つ以上の改変を含むように改変されるＦｎＩＩＩドメインを意味する。１つの実施形態において、クレードル分子は、β鎖Ｆと、トップＦＧループ領域及びボトムＣＤループ領域とに１つ以上の改変を含むように改変されるＦｎＩＩＩドメインを意味する。
【００８０】
更なる実施形態において、２つ以上のクレードル分子は、互いに連結される。そのような分子は、本願において、「多重特異性クレードル分子」と称される。
【００８１】
クレードル分子を互いに（例えば、数珠繋ぎ（a pearl-like fashion）に）連結して、例えば、互いに連結される少なくとも２つのクレードル分子を含む多重特異性クレードル分子を形成することができる。いくつかの実施形態において、この多重特異性クレードル分子は、同一ターゲット分子（例えば、ターゲットＡ）の異なるターゲット領域に結合する。例えば、多重特異性クレードル分子において、一方のクレードル分子はターゲットＡの第１のターゲット領域に結合することができ、かつ、他方のクレードル分子はターゲットＡの第２のターゲット領域に結合することができる。このことは、ターゲット分子に対する多重特異性クレードル分子の親和性（ないし結合度：avidity）を増加させることに使用することができる。他の実施形態において、多重特異性クレードル分子は、複数のターゲット分子と結合する。例えば、多重特異性クレードル分子の一方のクレードル分子はターゲットＡに結合することができ、かつ、多重特異性クレードル分子の他方のクレードル分子はターゲットＢ（例えば、半減期延長剤）に結合することができる。更に、他の実施形態において、多重特異性クレードル分子は、ターゲットＡの異なるターゲット領域に結合する少なくとも２つのクレードル分子と、ターゲットＢの異なるターゲット領域に結合する少なくとも２つのクレードル分子とを含む。本発明の分野における通常の技術を有する者であれば、任意の数のクレードル分子をこの様式で連結して、同一のターゲット分子の異なるターゲット領域、又は、異なるターゲット分子と結合することが可能な多重特異性クレードル分子を作製できることが分かるだろう。１つの実施形態において、１つのクレードル分子のＣ末端領域が、他のクレードル分子のＮ末端領域に連結される。
【００８２】
用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体の可変ドメイン又はＴ細胞受容体に由来する高度可変ループ（hypervariable loop）を意味する。抗体可変領域におけるＣＤＲの位置は、公知文献等に定義されている（例えば、 Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991; MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 732-745, 1996; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273,927-948, 1997, Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77, 2003; Honegger and Plueckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-70, 2001; and Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987を参照、これらの文献は引用によって本願に組み込まれる。）。
【００８３】
用語「非ＦｎＩＩＩ部分（モイエティ）」とは、付与される分子に追加の機能を付加する生物学的物質又は化学物質を意味する。特定の実施形態において、非ＦｎＩＩＩ部分は、ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、インビボにおいてＦｎＩＩＩベース結合分子の半減期を増加（延長）する化学物質（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。
【００８４】
用語「クレードルライブラリ」とは、ＦｎＩＩＩポリペプチドライブラリを意味する。このＦｎＩＩＩポリペプチドライブラリにおいて、少なくとも１つのβ鎖、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループ領域から成る群から選択される少なくとも１つのトップループ、及び／又は、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ領域から成る群から選択される少なくとも１つのボトムループにおけるアミノ酸多様性（diversity）は、既知のＦｎＩＩＩ配列のコレクションの中に存在するアミノ酸変異によって決定されるか、又は、該アミノ酸変異を反映する。
【００８５】
用語「普遍的なＮ＋−結合ライブラリ」又は「Ｎ＋／−ライブラリ」とは、より洗練されたライブラリ、又は、より細かく調整（tuned）されたライブラリ（固定アミノ酸（fixed amino acid）の周辺に最も頻出するアミノ酸がライブラリデザインにおいて決定される）を意味する。これらのＮ＋／−ライブラリは、β鎖（例えば、シートＡ、シートＢ、シートＣ、シートＤ、シートＥ、シートＦ及びシートＧ、特にシートＣ及びＦ）、ボトムループ（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）、トップループ（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）や、あるいは、β鎖（例えば、シートＡ、シートＢ、シートＣ、シートＤ、シートＥ、シートＦ及びシートＧ、特にシートＣ及びＦ）、トップループ及びボトムループの任意の組み合わせ、におけるバリエーションで構築される（contructed）。「Ｎ＋／−ライブラリ」に関して、Ｎは、特定の位置における最も優性ないし支配的（predominant）なアミノ酸であり、上流又は下流のアミノ酸は、各々、＋Ｎ又は−Ｎと命名される。例えば、ＦｎＩＩＩの３Ｄ構造において、Ｎ＋３はＮの３位置上流のアミノ酸であり、その一方で、Ｎ−３はＮの３位置下流のアミノ酸である。同様に、Ｎ＋２及びＮ＋１は、それぞれ、Ｎの２位置上流、１位置上流のアミノ酸であり、その一方で、Ｎ−２及びＮ−１は、それぞれ、Ｎの２位置下流、１位置下流のアミノ酸である。Ｎを、最も優性的に豊富な（abundant）アミノ酸から、豊富さが劣るアミノ酸へ改変することの影響は、Ｎから１、２又は３位置離れたアミノ酸の豊富さで評価することができる。そのようなライブラリの設計において、固定された位置Ｎの周囲のアミノ酸の頻度及び豊富さが決定される。これらの差は、普遍的なフィブロネクチンボトムサイド結合ドメインライブラリ、トップサイド結合ドメインライブラリ、又は、ボトムサイド及びトップサイド結合ドメインライブラリの両者の組み合わせを生成することに使用することができる。
【００８６】
用語「保存アミノ酸残基」又は「固定アミノ酸」とは、所定の残基位置に関して、高い頻度、典型的には、少なくとも５０％以上（例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％）の頻度で生じると決定されたアミノ酸残基を意味する。所定の残基がそのような高い頻度で生じる、すなわち、約５０％の閾値を上回って生じると決定される場合には、その残基は保存されるものと決定することができ、本発明のライブラリにおいて、少なくとも解析されるループ領域のアミノ酸残基位置に関して、「固定された」又は「コンスタントな」残基と表わされる。
【００８７】
用語「半保存アミノ酸残基（semi-conserved）」とは、所定の残基位置に関して、２〜３個の残基が、高い頻度で生じると決定されたアミノ酸残基を意味する。２〜３個の残基、好ましくは２個の残基が約４０％の頻度であると同時に表わされる（すなわち、各々が約４０％の出現頻度を有する）場合、又は、２〜３個の残基が出現する場合であっていずれかの残基がより高い（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はより高い）頻度で出現する場合には、その残基は、半保存であると決定される。つまり、解析されるループ領域における少なくともそのアミノ酸残基位置に関して、本発明のライブラリにおいては、「半固定」であると表わされる。典型的には、半保存されたアミノ酸（コドン）位置においては、２〜３個の残基が適切に現われる限り、適切なレベルの突然変異／変異性が誘導される。つまり、２〜３個の残基の各々は、この位置においては、「半固定」であると言う事ができる。「選択的半保存アミノ酸残基」は、２個以上の半保存アミノ酸残基の中から選択されたいずれかのアミノ酸残基である。典型的には、その位置で最も高い出現頻度を有する残基であるが、それに限定されない。
【００８８】
用語「可変なアミノ酸残基」は、所定の残基位置に関してより低い頻度（２０％未満）で生じると決定されたアミノ酸残基を意味する。所定の１位置において多くの残基が出現する場合には、その残基位置は可変であると決定される。つまり、解析されたループ領域における少なくともそのアミノ酸残基位置に関しては、本発明のライブラリにおいて、可変であると表示される。典型的には、可変アミノ酸（コドン）位置においては、残基の正確なスペクトルが適切に現われる限り、適切なレベルの核酸突然変異／変異性が誘導される。もちろん、所望であれば、任意のアミノ酸残基位置に関する決定内容や変異性（すなわち、保存、半保存、又は、可変）は、本願に開示されたいずれかの突然変異誘導方法を使用して、適切に、表現、探索又は改変できると理解される。可変アミノ酸の出現頻度の上限閾値は、５〜１０％又はそれ未満であり得る。所定の位置においてこの閾値未満である場合には、その可変アミノ酸は天然−変異アミノ酸から除かれ得る。
【００８９】
用語「天然−変異アミノ酸」とは、選択した長さの選択したループにおける所定の位置において、各々の出現頻度に従って観察される保存、半保存及び可変アミノ酸残基を含む。天然−変異アミノ酸は、化学的に均等なアミノ酸によって置換することができるし、選択した出現頻度（例えば、５-１０％）未満の可変なアミノ酸残基や、他の天然−変異アミノ酸と化学的に均等なアミノ酸残基を除くことができる。
【００９０】
用語「突然変異誘導配列（mutagenesis sequences）のライブラリ」とは、各ループ位置において、保存コンセンサスアミノ酸又は選択的半保存コンセンサスアミノ酸、そして、（コンセンサスアミノ酸が選択した頻度の閾値（少なくも５０％）と同等又はそれ未満の出現頻度を有する場合には）単一の共通ターゲットアミノ酸、及び、任意の共生成アミノ酸をコードするコード配列のライブラリによって表示される、選択したＦｎＩＩＩループ及びループ長内の配列のライブラリを意味する。つまり、ターゲットアミノ酸の各々に関して、所定のループ内の配列のライブラリは、ループ（コンセンサスアミノ酸が所定の頻度の閾値と同等であるか又はそれ未満の出現頻度を有するループ）内の１位置から全ての位置の全ての組み合わせにおいて、ターゲットアミノ酸を含む。この閾値頻度が１００％に設定される場合には、ループ内の各位置が少なくとも１つのライブラリメンバーにおけるターゲットアミノ酸を含むだろう。「ライブラリ突然変異誘導配列」とは、Ｇｅｎｅａｒｔ又はＤＮＡ２．０などの商業的ベンダーを使用して、本願に開示された表及び図から生成することができる。
【００９１】
用語「天然−変異組み合わせ配列のライブラリ」とは、各ループ位置において、保存コンセンサスアミノ酸又は選択的半保存コンセンサスアミノ酸、そして、（コンセンサスアミノ酸が選択した頻度の閾値（少なくも５０％）と同等又はそれ未満の出現頻度を有する場合には）他の天然−変異アミノ酸（半保存アミノ酸及び可変アミノ酸（ただし、可変アミノ酸の存在割合は、その位置において選択した最小の閾値存在を上回る）を含む）又は化学的均等物をコードするコード配列のライブラリによって表される選択したＦｎＩＩＩβ鎖及びＦｎＩＩＩループ内の配列のライブラリを意味する。つまり、選択したβ鎖又はループにおける各アミノ酸位置に関して、天然−変異組み合わせ配列のライブラリは、その位置のコンセンサスアミノ酸に加えて、その位置において少なくとも何らかの最小の頻度（例えば、少なくとも５〜１０％の頻度）を有すると同定された他のアミノ酸変異、又は、化学的に均等なアミノ酸を含むだろう。更に、天然−変異は、コドン縮退を介してそのアミノ酸のコード配列が顕著な数の共生成アミノ酸を生成する場合には、置換されるか、又は、ドロップ（dropped）し得る。
【００９２】
用語「変異性プロファイル」、又は、「ＶＰ」（variability profile）は、各アミノ酸と、特定のβ鎖又はループ位置おける各アミノ酸の出現頻度のカタログ化を意味する。β鎖及びループ位置は、アライメントした（アラインした）フィブロネクチンのデータセットに由来する。
【００９３】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記載から明らかになるだろう。しかしながら、以下の詳細な記載及び特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すものだとしても、本発明の概念及び範囲内での種々の変化や改変は、この詳細な記載から本発明の分野において通常の技術を有する者には明白であるから、図表（illustration）のみで表され得ることが理解される。
【００９４】
ＩＩ．  ＦｎＩＩＩポリペプチド
フィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ポリペプチドとは、７つのβ鎖と、６つの連結ループ（３つはトップ部に位置し、３つはボトム部に位置する）とから成るＦｎＩＩＩ構造又はモチーフを有するモノマーのサブユニットを含むタンパク質の群を意味する。β鎖Ａ、Ｂ及びＥは、βサンドイッチ構造の片方側半分を形成し、β鎖Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧは、他方側半分を形成し、約９４アミノ酸の分子量及び約１０ＫＤａの分子量を有する。ＦｎＩＩＩドメインの全体的な折り畳み構造は、免疫グロブリンドメインの折り畳み構造と密接に関連する。そして、ＦｎＩＩＩのＮ端の近くに位置する３つのループ（ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループと命名される）は、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、それぞれ、立体構造的に類似すると考えられる。ＦｎＩＩＩのトップ及びボトムループは、典型的には、ターゲットに対する結合に使用されるというよりも、構造上の安定性をもたらすと思われている。しかしながら、本発明の方法は、トップ、ボトムループ、そしてβシートが、実際にターゲットに対する結合に使用されることができることを実証する。ＦｎＩＩＩ結合分子のライブラリは、トップループ、ボトムループ、又はトップ・ボトムループの任意の組み合わせと、表面に暴露したβシートの残基とを結合に使用することももたらすことができる。
【００９５】
１つの実施形態において、ＦｎＩＩＩポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するＦｎＩＩＩ１０である。
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr（配列番号１）
【００９６】
他の実施形態において、ＦｎＩＩＩポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するＦｎＩＩＩ７である。
Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala Asn Pro Asp Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr Thr Pro Asp Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly Gln Gln Gly Asn Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser Cys Thr Phe Asp Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val Tyr Thr Val Lys Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile Ile Pro（配列番号９７）
【００９７】
他の実施形態において、ＦｎＩＩＩポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するＦｎＩＩＩ１４である。
Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr（配列番号１２９）
【００９８】
ＩＩＩ．  ＦｎＩＩＩクレードル分子
本発明は、ＦｎＩＩＩクレードル分子及びそれを含むライブラリを生成する方法及び組成物に関連する。
【００９９】
本願に記載された方法に含まれる（用いられる）クレードル分子は、１以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠損により改変された野生型ＦｎＩＩＩ領域を含む点における変異体である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、クレードル分子は、Ｎ端又はＣ端において第２のペプチド又はポリペプチドに連結した変異ＦｎＩＩＩドメインを含む融合ポリペプチドである。他の実施形態において、クレードル分子は、変異ＦｎＩＩＩドメインと、第２のペプチド又はポリペプチド配列との間に挿入されるリンカーを含む。リンカーは、以下の記載においてより詳細に説明される。
【０１０１】
更に、本願に記載されたクレードル分子は、変異ＦｎＩＩＩドメインを含むアミノ酸配列のＮ端又はＣ端の何れかにおいて、任意の数の追加のアミノ酸残基を含むことができる。例えば、変異ＦｎＩＩＩドメインを含むアミノ酸配列のＮ端、Ｃ端の何れか、又は、Ｎ端及びＣ端の両方において、約３個〜約１０００個又はそれを上回るアミノ酸残基のアミノ酸配列が存在し得る。
【０１０２】
クレードル分子は、抗体エピトープ又は他のタグの追加を含むことができ、ポリペプチドの同定、ターゲッティング、及び／又は、精製を促進させることができる。タグとしての６ｘＨｉｓ及びＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）の使用がよく知られている。融合ジャンクションにおいて、又はその近傍において切断部位を有することは、精製の後に外来性のクレードル分子を除去することを容易にするだろう。クレードル分子に含まれ得る他のアミノ酸配列は、ヒドロラーゼなど酵素の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞のターゲッティングシグナル又は膜貫通領域などの機能的ドメインを含む。クレードル分子は、更に１つ以上の追加の組織ターゲッティング部分（モイエティ）を含むことができる。
【０１０３】
クレードル分子は、天然の配列に対するアミノ酸欠損、及び／又は、置換を有することができる。アミノ酸置換を有する配列は、欠損を有する配列、及び、欠損と置換とを有する配列として考慮される。いくつかの実施形態において、これらのクレードル分子は、更に挿入又は追加アミノ酸を含むことができる。
【０１０４】
置換又は置き換え変異体は、典型的には、タンパク質内の１つ以上のサイトにおける１つのアミノ酸から他のアミノ酸への交換を含み、クレードル分子の１つ以上の特徴を調節するように、特にその効果又は特異性を増強するように設計することができる。この種の置換は、保存的な置換であっても無くても良い。保存的な置換は、１つのアミノ酸を類似の形状及び電荷のアミノ酸で置き換える場合に相当する。変異ＦｎＩＩＩドメインのライブラリがアミノ酸配列の多様性を提供する役割を果たすので、結合選択性が保存される置換は必要とされない。しかしながら、使用される場合には、保存的な置換は本発明の分野において良く知られており、例えば、アラニンからセリンへの改変；アルギニンからリシンへの改変；アスパラギンからグルタミン又はヒスチジンへの改変；アスパラギン酸からグルタミン酸の改変；システインからセリンへの改変；グルタミンからアスパラギンへの改変；グルタミン酸からアスパラギン酸への改変；グリシンからプロリンへの改変；ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミンへの改変；イソロイシンからロイシン又はバリンへの改変；ロイシンからバリン又はイソロイシンへの改変；リシンからアルギニンへの改変；メチオニンからロイシン又はイソロイシンへの改変；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン又はメチオニンへの改変；セリンからスレオニンへの改変；スレオニンからセリンへの改変；トリプトファンからチロシンへの改変；チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニンへの改変；そして、バリンからイソロイシン又はロイシンへの改変を含む。上記のもの以外の改変は、一般的には、保存的な置換であるとは考えられていない。特に、上記の保存的な置換の１つ以上を実施形態として含むことができると考えられる。他の実施形態において、そのような置換は、特に除外される。更に、更なる実施形態において、保存的でない置換は変異体に採用される。
【０１０５】
欠損又は置換に加えて、クレードル分子は、１つ以上の残基の挿入を有することができる。
【０１０６】
変異ＦｎＩＩＩドメインは、天然の対応物（ないしカウンタパーツ）と立体構造的に均等であり得る。例えば、変異ＦｎＩＩＩドメインは、結合ターゲット、タンパク質又はペプチドセグメントのための適切な構造（structure）及び立体構成（conformation）を形成する。
【０１０７】
以下の記載は、クレードル分子のアミノ酸を改変してクレードル分子のライブラリ、又は第２世代クレードル分子を作製することについての考察である。例えば、ターゲットペプチド配列との間で相互作用する能力などの機能を視認可能なレベルで喪失すること無しに、あるアミノ酸をクレードル分子の他のアミノ酸に置換することができる。クレードル分子の機能的活性を定義するのは相互作用的なキャパシティ及びクレードル分子の性質であるので、あるアミノ酸置換はクレードル分子配列内に生じるが、それにもかかわらず類似の特徴を有するクレードル分子が生成される。
【０１０８】
そのような改変を生じさせる上で、アミノ酸の疎水性親水性（hydropathic）指標インデックスを考慮することができる。タンパク質の相互作用的な機能をもたらす疎水性親水性指標アミノ酸インデックスの重要性は、本発明の分野において一般的に理解される（Kyte and Doolittle, J Mol Biol. (1982) 157(1):105-32）。関連するアミノ酸の疎水性親水性指標の特徴が、結果として生じるタンパク質の二次構造に関与し、次に、そのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原及び同様のもの）の相互作用を定義することが理解される。
【０１０９】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に生じることも、本発明の分野において理解される。米国特許４，５５４，１０１号（本願に引用によって組み込まれる）は、タンパク質の最大の局部的平均親水性は、隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるので、タンパク質の生物学的な特徴と相関することを記載する。米国特許４，５５４，１０１号に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０ ± １）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（ ０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【０１１０】
アミノ酸を類似の親水性値を有する他のアミノ酸に置換すれば、生物学的に均等でかつ免疫学的に均等のタンパク質を生成することができると理解される。そのような改変において、アミノ酸の置換は、親水性値が±２以内であること、±１以内であること、±０．５以内であることが好ましく、より特別には同値であることが望ましい。
【０１１１】
上記概説に記載されたように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側鎖置換基の関連類似性（例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び同様のもの）に基づく。しかしながら、いくつかの視点において非保存的な置換が考えられる。いくつかの実施形態において、ランダムな置換も考えられる。種々の上述の特徴を考慮した置換の例は本発明の分野における通常の技術を有する者には良く知られており、以下のものを含む。アルギニン及びリシン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン。
【０１１２】
ＦｎＩＩＩポリペプチドは、ＦｎＩＩＩループ又はβ鎖において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０個又はそれを上回る、あるいは、各数値の間の任意の数（範囲）のアミノ酸を挿入すること又は欠損させることによって改変することができる。ループ領域の変異は、米国特許６，６７３，９０１号及び米国特許公開２０１１００３８８６６号（本願に引用によって組み込まれる）において議論されている。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、β鎖Ｃ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び／又は、３９に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｃ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置３１、３３、３５、３７、３８、及び／又は、３９に対応し得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｃ内のアミノ酸置換は、配列番号１の位置３１、及び／又は、３３に対応し得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ＣＤループ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置４０、４１、４２、４３、４４、及び／又は、４５に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、β鎖Ｄ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又は５１に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｄ内のアミノ酸置換は、配列番号１の位置４４、４５、４７又は４９に対応し得る。
【０１１６】
更なる視点において、β鎖Ｆ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、及び／又は、７６に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｆ内のアミノ酸置換は、配列番号１の位置６７、６９、７１、７３、及び／又は、７６に対応し得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｆ内のアミノ酸置換は、配列番号１の位置７１、７３、７５、及び／又は、７６に対応し得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ＦＧループ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は、８６に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、β鎖Ｇ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１の位置８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３又は９４に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｇ内のアミノ酸置換は、配列番号１の位置８４又は８５に対応し得る。
【０１１９】
クレードル分子は、配列番号１の位置３１、３３、４７、４９、７３、及び／又は、７５における１つ以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、更に、配列番号１のアミノ酸位置３０に対応するアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、配列番号１のアミノ酸位置４１、４２、４３、４４又は４５に対応する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。クレードル分子は、更に、配列番号１のアミノ酸位置 ７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４又は８５に対応する１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。１つの実施形態において、置換は、少なくとも１つのβ鎖内に生じ得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、クレードル分子は、配列番号１のアミノ酸に対応する１、２、３、４個又はそれを上回るアミノ酸の挿入、及び／又は、欠損を含み得る。挿入は、ポリセリン、ポリアラニン、ポリバリン、ポリスレオニン、又は、２０種のアミノ酸の中の任意の他のアミノ酸のポリマーのストレッチを含み得るが、それに限定されない。すなわち、組み合わせクレードル分子ライブラリを生成するように、ポリマーのストレッチの挿入後に突然変異が誘導されても、多様化されても良い。これらの挿入残基の多様化は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９種類の他の天然アミノ酸への改変を含む。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインクレードル分子のβ鎖（例えば、Ｃ、及び／又は、Ｆ）又はＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧループの１つ以上に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれを上回る隣接（contiguous）アミノ酸が挿入される。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、挿入又は欠損（欠失）のいずれか一方、あるいは、挿入及び欠損の両方を含むことができる。挿入及び欠損は、同一の位置に位置する必要はなく、互いに、遠位端又は近位端のサイトに位置することができる。挿入、及び／又は、欠損は、ＦｎＩＩＩドメインポリペプチドのループ又はβ鎖内に生じ得る。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩの少なくとも１つのループ領域は、少なくとも２個のアミノ酸挿入を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩの少なくとも１つの領域は、少なくとも１つのループ領域内に２〜２５個のアミノ酸挿入を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも２、３個、又はそれを上回るループ領域が挿入を含む。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩの少なくとも１つのループ領域を有するクレードル分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）のアミノ酸欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも２、３又は４個のループ、β鎖、部分又は領域は、少なくとも１個のアミノ酸欠損を含む。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、少なくとも１つのループ内に、及び少なくとも１つのβ鎖内に、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、同一のループ又はβ鎖領域内に挿入及び欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、少なくとも１つのβ鎖内に少なくとも１つの挿入又は欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、クレードル分子は、少なくとも１つのβ鎖及び少なくとも１つのループ領域内に少なくとも１つの挿入又は欠損を含むことができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９３、９５、及び／又は、９６（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）に対応する任意の１つ以上の位置における変異が、特に、請求の範囲に記載の実施形態に含まれ得る。他の実施形態において、アミノ酸位置１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９３、９５、及び／又は、９６、（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）に対応する任意の１つ以上の位置における変異は、特に除外することができる。他の実施形態において、アミノ酸位置３２、３４、３６、６８、７０、７２、７４、及び／又は、７５（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）に対応する任意の１つ以上の位置における変異は、特に除外することができる。これらの上述の位置は、ヒトＦｎＩＩＩの１０番目のドメインの配列（配列番号１）に基づくことが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、ヒトフィブロネクチンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６番目のＦｎＩＩＩドメインであり得る。いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、ヒトフィブロネクチンの７番目の、１０番目の又は１４番目のＦｎＩＩＩドメインであり得る。いくつかの実施形態において、他の生命体（organisms）におけるＦｎＩＩＩ変異は、ヒトＦｎＩＩＩとのそれらのアライメント（適合）に基づいて考察することもできる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、β鎖Ｃ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号９７の位置３３、３５、３７、３９、４０、及び／又は、４１に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＤループ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号９７の位置４２、４３、４４、４５、４６、４７、及び／又は、４８に対応し得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｆ内のアミノ酸置換は、配列番号９７の位置７０、７２、７４、７６、及び／又は、７９に対応し得る。いくつかの実施形態において、ＦＧループ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号９７の位置８０、８１、８２、８３、８４、及び／又は、８５に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、β鎖Ｃ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１２９の位置３１、３３、３５、３７、及び／又は、３９に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＤループ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１２９の位置４０、４１、４２、４３、及び／又は、４４に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、β鎖Ｆ内のアミノ酸置換は、配列番号１２９の位置６６、６８、７０、７２、及び／又は、７５に対応し得る。いくつかの実施形態において、ＦＧループ内の１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１２９の位置７６、７７、７８、７９、８０、及び／又は、８１に対応する１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
【０１２４】
他の実施形態において、配列番号９７のアミノ酸位置３４、３６、３８、７１、７３、７５、７７、及び／又は、７８（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）に対応する任意の１つ以上の位置における変異は特に除外することができる。他の実施形態において、配列番号１２９のアミノ酸位置３３２、３４、３６、３８、６７、６９、７１、７３、及び／又は、７４（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）に対応する任意の１つ以上の位置における変異は、特に除外することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、１つ以上の改変又は変異アミノ酸は、配列番号１の位置３０、３１、３３、４９、４７、７５、７６、８４、及び／又は、８５に対応することができる。いくつかの実施形態において、変異ＦｎＩＩＩドメインは、ＦｎＩＩＩの少なくとも１つのβ鎖及び少なくとも１つのループ領域に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸挿入又は欠損を含むことができる。いくつかの実施形態において、変異ＦｎＩＩＩドメインは、置換、欠損又は付加を有するＣＤ、ＦＧループ、及び／又は、ＣＤループ及びＦＧループの組み合わせ、そして、少なくとも１つのβ鎖に、アミノ酸挿入を含むことができる。いくつかの実施形態において、変異ＦｎＩＩＩドメインは、置換、欠損又は付加を有するループＢＣ、ＦＧ、及び／又は、ＢＣ及びＦＧループの組み合わせ、そして、少なくとも１つのβ鎖に、アミノ酸挿入を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１、９７及び１２９と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％、（各数値の間の全ての値及び範囲を含む）の同一性であり得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩクレードル分子は、以下のＦｎＩＩＩ残基置換（配列番号１に対応する）を含む（ただし、これらに限定されない）を含む、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを上回るアミノ酸置換を有することができる：すなわち、Ｒ３０Ａ、Ｒ３０Ｎ、Ｒ３０Ｄ、Ｒ３０Ｃ、Ｒ３０Ｑ、Ｒ３０Ｅ、Ｒ３０Ｇ、Ｒ３０Ｈ、Ｒ３０Ｉ、Ｒ３０Ｌ、Ｒ３０Ｋ、Ｒ３０Ｍ、Ｒ３０Ｆ、Ｒ３０Ｐ、Ｒ３０Ｓ、Ｒ３０Ｔ、Ｒ３０Ｗ、Ｒ３０Ｙ、Ｒ３０Ｖ、Ｙ３１Ａ、Ｙ３１Ｒ、Ｙ３１Ｎ、Ｙ３１Ｄ、Ｙ３１Ｃ、Ｙ３１Ｑ、Ｙ３１Ｅ、Ｙ３１Ｇ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｉ、Ｙ３１Ｌ、Ｙ３１Ｋ、Ｙ３１Ｍ、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｐ、Ｙ３１Ｓ、Ｙ３１Ｔ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｖ、Ｒ３３Ａ、Ｒ３３Ｎ、Ｒ３３Ｄ、Ｒ３３Ｃ、Ｒ３３Ｑ、Ｒ３３Ｅ、Ｒ３３Ｇ、Ｒ３３Ｈ、Ｒ３３Ｉ、Ｒ３３Ｌ、Ｒ３３Ｋ、Ｒ３３Ｍ、Ｒ３３Ｆ、Ｒ３３Ｐ、Ｒ３３Ｓ、Ｒ３３Ｔ、Ｒ３３Ｗ、Ｒ３３Ｙ、Ｒ３３Ｖ、Ｔ３５Ａ、Ｔ３５Ｒ、Ｔ３５Ｎ、Ｔ３５Ｄ、Ｔ３５Ｃ、Ｔ３５Ｑ、Ｔ３５Ｅ、Ｔ３５Ｇ、Ｔ３５Ｈ、Ｔ３５Ｉ、Ｔ３５Ｌ、Ｔ３５Ｋ、Ｔ３５Ｍ、Ｔ３５Ｆ、Ｔ３５Ｐ、Ｔ３５Ｓ、Ｔ３５Ｗ、Ｔ３５Ｙ、Ｔ３５Ｖ、Ｇ３７Ａ、Ｇ３７Ｎ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ３７Ｄ、Ｇ３７Ｃ、Ｇ３７Ｑ、Ｇ３７Ｅ、Ｇ３７Ｈ、Ｇ３７Ｉ、Ｇ３７Ｌ、Ｇ３７Ｋ、Ｇ３７Ｍ、Ｇ３７Ｆ、Ｇ３７Ｐ、Ｇ３７Ｓ、Ｇ３７Ｔ、Ｇ３７Ｗ、Ｇ３７Ｙ、Ｇ３７Ｖ、Ｅ３８Ａ、Ｅ３８Ｎ、Ｅ３８Ｒ、Ｅ３８Ｄ、Ｅ３８Ｃ、Ｅ３８Ｑ、Ｅ３８Ｇ、Ｅ３８Ｈ、Ｅ３８Ｉ、Ｅ３８Ｌ、Ｅ３８Ｋ、Ｅ３８Ｍ、Ｅ３８Ｆ、Ｅ３８Ｐ、Ｅ３８Ｓ、Ｅ３８Ｔ、Ｅ３８Ｗ、Ｅ３８Ｙ、Ｅ３８Ｖ、Ｔ３９Ａ、Ｔ３９Ｎ、Ｔ３９Ｒ、Ｔ３９Ｄ、Ｔ３９Ｃ、Ｔ３９Ｑ、Ｔ３９Ｅ、Ｔ３９Ｇ、Ｔ３９Ｈ、Ｔ３９Ｉ、Ｔ３９Ｌ、Ｔ３９Ｋ、Ｔ３９Ｍ、Ｔ３９Ｆ、Ｔ３９Ｐ、Ｔ３９Ｓ、Ｔ３９Ｗ、Ｔ３９Ｙ、Ｔ３９Ｖ、Ｇ４０Ａ、Ｇ４０Ｎ、Ｇ４０Ｒ、Ｇ４０Ｄ、Ｇ４０Ｃ、Ｇ４０Ｑ、Ｇ４０Ｅ、Ｇ４０Ｈ、Ｇ４０Ｉ、Ｇ４０Ｌ、Ｇ４０Ｋ、Ｇ４０Ｍ、Ｇ４０Ｆ、Ｇ４０Ｐ、Ｇ４０Ｓ、Ｇ４０Ｔ、Ｇ４０Ｗ、Ｇ４０Ｙ、Ｇ４０Ｖ、Ｇ４１Ａ、Ｇ４１Ｒ、Ｇ４１Ｎ、Ｇ４１Ｄ、Ｇ４１Ｃ、Ｇ４１Ｑ、Ｇ４１Ｅ、Ｇ４１Ｈ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｌ、Ｇ４１Ｋ、Ｇ４１Ｍ、Ｇ４１Ｆ、Ｇ４１Ｐ、Ｇ４１Ｓ、Ｇ４１Ｔ、Ｇ４１Ｗ、Ｇ４１Ｙ、Ｇ４１Ｖ、Ｎ４２Ａ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ４２Ｄ、Ｎ４２Ｃ、Ｎ４２Ｑ、Ｎ４２Ｅ、Ｎ４２Ｇ、Ｎ４２Ｈ、Ｎ４２Ｉ、Ｎ４２Ｌ、Ｎ４２Ｋ、Ｎ４２Ｍ、Ｎ４２Ｆ、Ｎ４２Ｐ、Ｎ４２Ｓ、Ｎ４２Ｔ、Ｎ４２Ｗ、Ｎ４２Ｙ、Ｎ４２Ｖ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｒ、Ｓ４３Ｎ、Ｓ４３Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｑ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｈ、Ｓ４３Ｉ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｋ、Ｓ４３Ｍ、Ｓ４３Ｆ、Ｓ４３Ｐ、Ｓ４３Ｔ、Ｓ４３Ｗ、Ｓ４３Ｙ、Ｓ４３Ｖ、Ｐ４４Ａ、Ｐ４４Ｒ、Ｐ４４Ｎ、Ｐ４４Ｄ、Ｐ４４Ｃ、Ｐ４４Ｑ、Ｐ４４Ｅ、Ｐ４４Ｇ、Ｐ４４Ｈ、Ｐ４４Ｉ、Ｐ４４Ｌ、Ｐ４４Ｋ、Ｐ４４Ｍ、Ｐ４４Ｆ、Ｐ４４Ｓ、Ｐ４４Ｔ、Ｐ４４Ｗ、Ｐ４４Ｙ、Ｐ４４Ｖ、Ｖ４５Ａ、Ｖ４５Ｒ、Ｖ４５Ｎ、Ｖ４５Ｄ、Ｖ４５Ｃ、Ｖ４５Ｑ、Ｖ４５Ｅ、Ｖ４５Ｇ、Ｖ４５Ｈ、Ｖ４５Ｉ、Ｖ４５Ｌ、Ｖ４５Ｋ、Ｖ４５Ｍ、Ｖ４５Ｆ、Ｖ４５Ｐ、Ｖ４５Ｓ、Ｖ４５Ｔ、Ｖ４５Ｗ、Ｖ４５Ｙ、Ｅ４７Ａ、Ｅ４７Ｒ、Ｅ４７Ｎ、Ｅ４７Ｄ、Ｅ４７Ｃ、Ｅ４７Ｑ、Ｅ４７Ｇ、Ｅ４７Ｈ、Ｅ４７Ｉ、Ｅ４７Ｌ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ４７Ｍ、Ｅ４７Ｆ、Ｅ４７Ｐ、Ｅ４７Ｓ、Ｅ４７Ｔ、Ｅ４７Ｗ、Ｅ４７Ｙ、Ｅ４７Ｖ、Ｔ４９Ａ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｄ、Ｔ４９Ｃ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｅ、Ｔ４９Ｇ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｐ、Ｔ４９Ｓ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｔ４９Ｖ、Ｖ５０Ａ、Ｖ５０Ｒ、Ｖ５０Ｎ、Ｖ５０Ｄ、Ｖ５０Ｃ、Ｖ５０Ｑ、Ｖ５０Ｅ、Ｖ５０Ｇ、Ｖ５０Ｈ、Ｖ５０Ｉ、Ｖ５０Ｌ、Ｖ５０Ｋ、Ｖ５０Ｍ、Ｖ５０Ｆ、Ｖ５０Ｐ、Ｖ５０Ｓ、Ｖ５０Ｔ、Ｖ５０Ｗ、Ｖ５０Ｙ、Ｄ６７Ａ、Ｄ６７Ｒ、Ｄ６７Ｎ、Ｄ６７Ｃ、Ｄ６７Ｑ、Ｄ６７Ｅ、Ｄ６７Ｇ、Ｄ６７Ｈ、Ｄ６７Ｉ、Ｄ６７Ｌ、Ｄ６７Ｋ、Ｄ６７Ｍ、Ｄ６７Ｆ、Ｄ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ｄ６７Ｔ、Ｄ６７Ｗ、Ｄ６７Ｙ、Ｄ６７Ｖ、Ｔ６９Ａ、Ｔ６９Ｒ、Ｔ６９Ｎ、Ｔ６９Ｄ、Ｔ６９Ｃ、Ｔ６９Ｑ、Ｔ６９Ｅ、Ｔ６９Ｇ、Ｔ６９Ｈ、Ｔ６９Ｉ、Ｔ６９Ｌ、Ｔ６９Ｋ、Ｔ６９Ｍ、Ｔ６９Ｆ、Ｔ６９Ｐ、Ｔ６９Ｓ、Ｔ６９Ｗ、Ｔ６９Ｙ、Ｔ６９Ｖ、Ｔ７１Ａ、Ｔ７１Ｒ、Ｔ７１Ｎ、Ｔ７１Ｄ、Ｔ７１Ｃ、Ｔ７１Ｑ、Ｔ７１Ｅ、Ｔ７１Ｇ、Ｔ７１Ｈ、Ｔ７１Ｉ、Ｔ７１Ｌ、Ｔ７１Ｋ、Ｔ７１Ｍ、Ｔ７１Ｆ、Ｔ７１Ｐ、Ｔ７１Ｓ、Ｔ７１Ｗ、Ｔ７１Ｙ、Ｔ７１Ｖ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｒ、Ｙ７３Ｎ、Ｙ７３Ｄ、Ｙ７３Ｃ、Ｙ７３Ｑ、Ｙ７３Ｅ、Ｙ７３Ｇ、Ｙ７３Ｈ、Ｙ７３Ｉ、Ｙ７３Ｌ、Ｙ７３Ｋ、Ｙ７３Ｍ、Ｙ７３Ｆ、Ｙ７３Ｐ、Ｙ７３Ｓ、Ｙ７３Ｔ、Ｙ７３Ｗ、Ｙ７３Ｖ、Ｖ７５Ａ、Ｖ７５Ｒ、Ｖ７５Ｎ、Ｖ７５Ｄ、Ｖ７５Ｃ、Ｖ７５Ｑ、Ｖ７５Ｅ、Ｖ７５Ｇ、Ｖ７５Ｈ、Ｖ７５Ｉ、Ｖ７５Ｌ、Ｖ７５Ｋ、Ｖ７５Ｍ、Ｖ７５Ｆ、Ｖ７５Ｐ、Ｖ７５Ｓ、Ｖ７５Ｔ、Ｖ７５Ｗ、Ｖ７５Ｙ、Ｔ７６Ａ、Ｔ７６Ｒ、Ｔ７６Ｎ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｃ、Ｔ７６Ｑ、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｇ、Ｔ７６Ｈ、Ｔ７６Ｉ、Ｔ７６Ｌ、Ｔ７６Ｋ、Ｔ７６Ｍ、Ｔ７６Ｆ、Ｔ７６Ｐ、Ｔ７６Ｓ、Ｔ７６Ｗ、Ｔ７６Ｙ、Ｔ７６Ｖ、Ｇ７７Ａ、Ｇ７７Ｒ、Ｇ７７Ｎ、Ｇ７７Ｄ、Ｇ７７Ｃ、Ｇ７７Ｑ、Ｇ７７Ｅ、Ｇ７７Ｈ、Ｇ７７Ｉ、Ｇ７７Ｌ、Ｇ７７Ｋ、Ｇ７７Ｍ、Ｇ７７Ｆ、Ｇ７７Ｐ、Ｇ７７Ｓ、Ｇ７７Ｔ、Ｇ７７Ｗ、Ｇ７７Ｙ、Ｇ７７Ｖ、Ｒ７８Ａ、Ｒ７８Ｎ、Ｒ７８Ｄ、Ｒ７８Ｃ、Ｒ７８Ｑ、Ｒ７８Ｅ、Ｒ７８Ｇ、Ｒ７８Ｈ、Ｒ７８Ｉ、Ｒ７８Ｌ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｍ、Ｒ７８Ｆ、Ｒ７８Ｐ、Ｒ７８Ｓ、Ｒ７８Ｔ、Ｒ７８Ｗ、Ｒ７８Ｙ、Ｒ７８Ｖ、Ｇ７９Ａ、Ｇ７９Ｒ、Ｇ７９Ｎ、Ｇ７９Ｄ、Ｇ７９Ｃ、Ｇ７９Ｑ、Ｇ７９Ｅ、Ｇ７９Ｈ、Ｇ７９Ｉ、Ｇ７９Ｌ、Ｇ７９Ｋ、Ｇ７９Ｍ、Ｇ７９Ｆ、Ｇ７９Ｐ、Ｇ７９Ｓ、Ｇ７９Ｔ、Ｇ７９Ｗ、Ｇ７９Ｙ、Ｇ７９Ｖ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｒ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０Ｃ、Ｄ８０Ｑ、Ｄ８０Ｅ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｈ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｌ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｐ、Ｄ８０Ｓ、Ｄ８０Ｔ、Ｄ８０Ｗ、Ｄ８０Ｙ、Ｄ８０Ｖ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８１Ｒ、Ｓ８１Ｎ、Ｓ８１Ｄ、Ｓ８１Ｃ、Ｓ８１Ｑ、Ｓ８１Ｅ、Ｓ８１Ｇ、Ｓ８１Ｈ、Ｓ８１Ｉ、Ｓ８１Ｌ、Ｓ８１Ｋ、Ｓ８１Ｍ、Ｓ８１Ｆ、Ｓ８１Ｐ、Ｓ８１Ｔ、Ｓ８１Ｗ、Ｓ８１Ｙ、Ｓ８１Ｖ、Ｐ８２Ａ、Ｐ８２Ｒ、Ｐ８２Ｎ、Ｐ８２Ｄ、Ｐ８２Ｃ、Ｐ８２Ｑ、Ｐ８２Ｅ、Ｐ８２Ｇ、Ｐ８２Ｈ、Ｐ８２Ｉ、Ｐ８２Ｌ、Ｐ８２Ｋ、Ｐ８２Ｍ、Ｐ８２Ｆ、Ｐ８２Ｓ、Ｐ８２Ｔ、Ｐ８２Ｗ、Ｐ８２Ｙ、Ｐ８２Ｖ、Ａ８３Ｒ、Ａ８３Ｎ、Ａ８３Ｄ、Ａ８３Ｃ、Ａ８３Ｑ、Ａ８３Ｅ、Ａ８３Ｇ、Ａ８３Ｈ、Ａ８３Ｉ、Ａ８３Ｌ、Ａ８３Ｋ、Ａ８３Ｍ、Ａ８３Ｆ、Ａ８３Ｐ、Ａ８３Ｓ、Ａ８３Ｔ、Ａ８３Ｗ、Ａ８３Ｙ、Ａ８３Ｖ、Ｓ８４Ａ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８４Ｎ、Ｓ８４Ｄ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ８４Ｑ、Ｓ８４Ｅ、Ｓ８４Ｇ、Ｓ８４Ｈ、Ｓ８４Ｉ、Ｓ８４Ｌ、Ｓ８４Ｋ、Ｓ８４Ｍ、Ｓ８４Ｆ、Ｓ８４Ｐ、Ｓ８４Ｔ、Ｓ８４Ｗ、Ｓ８４Ｙ、Ｓ８４Ｖ、Ｓ８５Ａ、Ｓ８５Ｒ、Ｓ８５Ｎ、Ｓ８５Ｄ、Ｓ８５Ｃ、Ｓ８５Ｑ、Ｓ８５Ｅ、Ｓ８５Ｇ、Ｓ８５Ｈ、Ｓ８５Ｉ、Ｓ８５Ｌ、Ｓ８５Ｋ、Ｓ８５Ｍ、Ｓ８５Ｆ、Ｓ８５Ｐ、Ｓ８５Ｔ、Ｓ８５Ｗ、Ｓ８５Ｙ、Ｓ８５Ｖ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｒ、Ｋ８６Ｎ、Ｋ８６Ｄ、Ｋ８６Ｃ、Ｋ８６Ｑ、Ｋ８６Ｅ、Ｋ８６Ｇ、Ｋ８６Ｈ、Ｋ８６Ｉ、Ｋ８６Ｌ、Ｋ８６Ｍ、Ｋ８６Ｆ、Ｋ８６Ｐ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ｗ、Ｋ８６Ｙ及びＫ８６Ｖ。
【０１２７】
更なる実施形態において、他のアミノ酸置換は、上記のアミノ酸置換の導入（位置）の前に、間に、後に導入することができる。他の置換（配列番号１に対応する）は、以下の置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個を含むが、それらに限定されない：すなわち、Ｗ２２Ａ、Ｗ２２Ｒ、Ｗ２２Ｎ、Ｗ２２Ｄ、Ｗ２２Ｃ、Ｗ２２Ｑ、Ｗ２２Ｅ、Ｗ２２Ｇ、Ｗ２２Ｈ、Ｗ２２Ｉ、Ｗ２２Ｌ、Ｗ２２Ｋ、Ｗ２２Ｍ、Ｗ２２Ｆ、Ｗ２２Ｐ、Ｗ２２Ｓ、Ｗ２２Ｔ、Ｗ２２Ｙ、Ｗ２２Ｖ、Ｄ２３Ａ、Ｄ２３Ｒ、Ｄ２３Ｎ、Ｄ２３Ｃ、Ｄ２３Ｑ、Ｄ２３Ｅ、Ｄ２３Ｇ、Ｄ２３Ｈ、Ｄ２３Ｉ、Ｄ２３Ｌ、Ｄ２３Ｋ、Ｄ２３Ｍ、Ｄ２３Ｆ、Ｄ２３Ｐ、Ｄ２３Ｓ、Ｄ２３Ｔ、Ｄ２３Ｗ、Ｄ２３Ｙ、Ｄ２３Ｖ、Ａ２４Ｒ、Ａ２４Ｎ、Ａ２４Ｄ、Ａ２４Ｃ、Ａ２４Ｑ、Ａ２４Ｅ、Ａ２４Ｇ、Ａ２４Ｈ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、Ａ２４Ｋ、Ａ２４Ｍ、Ａ２４Ｆ、Ａ２４Ｐ、Ａ２４Ｓ、Ａ２４Ｔ、Ａ２４Ｗ、Ａ２４Ｙ、Ａ２４Ｖ、Ｐ２５Ａ、Ｐ２５Ｒ、Ｐ２５Ｎ、Ｐ２５Ｄ、Ｐ２５Ｃ、Ｐ２５Ｑ、Ｐ２５Ｅ、Ｐ２５Ｇ、Ｐ２５Ｈ、Ｐ２５Ｉ、Ｐ２５Ｌ、Ｐ２５Ｋ、Ｐ２５Ｍ、Ｐ２５Ｆ、Ｐ２５Ｓ、Ｐ２５Ｔ、Ｐ２５Ｗ、Ｐ２５Ｙ、Ｐ２５Ｖ、Ａ２６Ｒ、Ａ２６Ｎ、Ａ２６Ｄ、Ａ２６Ｃ、Ａ２６Ｑ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｇ、Ａ２６Ｈ、Ａ２６Ｉ、Ａ２６Ｌ、Ａ２６Ｋ、Ａ２６Ｍ、Ａ２６Ｆ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ａ２６Ｗ、Ａ２６Ｙ、Ａ２６Ｖ、Ｖ２７Ａ、Ｖ２７Ｒ、Ｖ２７Ｎ、Ｖ２７Ｄ、Ｖ２７Ｃ、Ｖ２７Ｑ、Ｖ２７Ｅ、Ｖ２７Ｇ、Ｖ２７Ｈ、Ｖ２７Ｉ、Ｖ２７Ｌ、Ｖ２７Ｋ、Ｖ２７Ｍ、Ｖ２７Ｆ、Ｖ２７Ｐ、Ｖ２７Ｓ、Ｖ２７Ｔ、Ｖ２７Ｗ、Ｖ２７Ｙ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２８Ｒ、Ｔ２８Ｎ、Ｔ２８Ｄ、Ｔ２８Ｃ、Ｔ２８Ｑ、Ｔ２８Ｅ、Ｔ２８Ｇ、Ｔ２８Ｈ、Ｔ２８Ｉ、Ｔ２８Ｌ、Ｔ２８Ｋ、Ｔ２８Ｍ、Ｔ２８Ｆ、Ｔ２８Ｐ、Ｔ２８Ｓ、Ｔ２８Ｗ、Ｔ２８Ｙ、Ｔ２８Ｖ、Ｖ２９Ａ、Ｖ２９Ｒ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｖ２９Ｃ、Ｖ２９Ｑ、Ｖ２９Ｅ、Ｖ２９Ｇ、Ｖ２９Ｈ、Ｖ２９Ｉ、Ｖ２９Ｌ、Ｖ２９Ｋ、Ｖ２９Ｍ、Ｖ２９Ｆ、Ｖ２９Ｐ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｗ、Ｖ２９Ｙ、Ｇ５２Ａ、Ｇ５２Ｒ、Ｇ５２Ｎ、Ｇ５２Ｄ、Ｇ５２Ｃ、Ｇ５２Ｑ、Ｇ５２Ｅ、Ｇ５２Ｈ、Ｇ５２Ｉ、Ｇ５２Ｌ、Ｇ５２Ｋ、Ｇ５２Ｍ、Ｇ５２Ｆ、Ｇ５２Ｐ、Ｇ５２Ｓ、Ｇ５２Ｔ、Ｇ５２Ｗ、Ｇ５２Ｙ、Ｇ５２Ｖ、Ｓ５３Ａ、Ｓ５３Ｒ、Ｓ５３Ｎ、Ｓ５３Ｄ、Ｓ５３Ｃ、Ｓ５３Ｑ、Ｓ５３Ｅ、Ｓ５３Ｇ、Ｓ５３Ｈ、Ｓ５３Ｉ、Ｓ５３Ｌ、Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３Ｍ、Ｓ５３Ｆ、Ｓ５３Ｐ、Ｓ５３Ｔ、Ｓ５３Ｗ、Ｓ５３Ｙ、Ｓ５３Ｖ、Ｋ５４Ａ、Ｋ５４Ｒ、Ｋ５４Ｎ、Ｋ５４Ｄ、Ｋ５４Ｃ、Ｋ５４Ｑ、Ｋ５４Ｅ、Ｋ５４Ｇ、Ｋ５４Ｈ、Ｋ５４Ｉ、Ｋ５４Ｌ、Ｋ５４Ｍ、Ｋ５４Ｆ、Ｋ５４Ｐ、Ｋ５４Ｓ、Ｋ５４Ｔ、Ｋ５４Ｗ、Ｋ５４Ｙ、Ｋ５４Ｖ、Ｓ５５Ａ、Ｓ５５Ｒ、Ｓ５５Ｎ、Ｓ５５Ｄ、Ｓ５５Ｃ、Ｓ５５Ｑ、Ｓ５５Ｅ、Ｓ５５Ｇ、Ｓ５５Ｈ、Ｓ５５Ｉ、Ｓ５５Ｌ、Ｓ５５Ｋ、Ｓ５５Ｍ、Ｓ５５Ｆ、Ｓ５５Ｐ、Ｓ５５Ｔ、Ｓ５５Ｗ、Ｓ５５Ｙ又はＳ５５Ｖ。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩクレードル分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを上回るアミノ酸置換を有することができる。アミノ酸置換は、以下のＦｎＩＩＩ残基の置換（配列番号９７に対応する）を含むことができるがそれらに限定されない：すなわち、Ｇ３３Ａ、Ｇ３３Ｎ、Ｇ３３Ｒ、Ｇ３３Ｄ、Ｇ３３Ｃ、Ｇ３３Ｑ、Ｇ３３Ｅ、Ｇ３３Ｈ、Ｇ３３Ｉ、Ｇ３３Ｌ、Ｇ３３Ｋ、Ｇ３３Ｍ、Ｇ３３Ｆ、Ｇ３３Ｐ、Ｇ３３Ｓ、Ｇ３３Ｔ、Ｇ３３Ｗ、Ｇ３３Ｙ、Ｇ３３Ｖ、Ｒ３５Ａ、Ｒ３５Ｎ、Ｒ３５Ｄ、Ｒ３５Ｃ、Ｒ３５Ｑ、Ｒ３５Ｅ、Ｒ３５Ｇ、Ｒ３５Ｈ、Ｒ３５Ｉ、Ｒ３５Ｌ、Ｒ３５Ｋ、Ｒ３５Ｍ、Ｒ３５Ｆ、Ｒ３５Ｐ、Ｒ３５Ｓ、Ｒ３５Ｔ、Ｒ３５Ｗ、Ｒ３５Ｙ、Ｒ３５Ｖ、Ｔ３７Ａ、Ｔ３７Ｒ、Ｔ３７Ｎ、Ｔ３７Ｄ、Ｔ３７Ｃ、Ｔ３７Ｑ、Ｔ３７Ｅ、Ｔ３７Ｇ、Ｔ３７Ｈ、Ｔ３７Ｉ、Ｔ３７Ｌ、Ｔ３７Ｋ、Ｔ３７Ｍ、Ｔ３７Ｆ、Ｔ３７Ｐ、Ｔ３７Ｓ、Ｔ３７Ｗ、Ｔ３７Ｙ、Ｔ３７Ｖ、Ｔ３９Ａ、Ｔ３９Ｎ、Ｔ３９Ｒ、Ｔ３９Ｄ、Ｔ３９Ｃ、Ｔ３９Ｑ、Ｔ３９Ｅ、Ｔ３９Ｇ、Ｔ３９Ｈ、Ｔ３９Ｉ、Ｔ３９Ｌ、Ｔ３９Ｋ、Ｔ３９Ｍ、Ｔ３９Ｆ、Ｔ３９Ｐ、Ｔ３９Ｓ、Ｔ３９Ｗ、Ｔ３９Ｙ、Ｔ３９Ｖ、Ｐ４０Ａ、Ｐ４０Ｒ、Ｐ４０Ｎ、Ｐ４０Ｄ、Ｐ４０Ｃ、Ｐ４０Ｑ、Ｐ４０Ｅ、Ｐ４０Ｇ、Ｐ４０Ｈ、Ｐ４０Ｉ、Ｐ４０Ｌ、Ｐ４０Ｋ、Ｐ４０Ｍ、Ｐ４０Ｆ、Ｐ４０Ｓ、Ｐ４０Ｔ、Ｐ４０Ｗ、Ｐ４０Ｙ、Ｐ４０Ｖ、Ｔ４１Ａ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｎ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｃ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｍ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｐ、Ｔ４１Ｓ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｖ、Ｎ４２Ａ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ４２Ｄ、Ｎ４２Ｃ、Ｎ４２Ｑ、Ｎ４２Ｅ、Ｎ４２Ｇ、Ｎ４２Ｈ、Ｎ４２Ｉ、Ｎ４２Ｌ、Ｎ４２Ｋ、Ｎ４２Ｍ、Ｎ４２Ｆ、Ｎ４２Ｐ、Ｎ４２Ｓ、Ｎ４２Ｔ、Ｎ４２Ｗ、Ｎ４２Ｙ、Ｎ４２Ｖ、Ｇ４３Ａ、Ｇ４３Ｎ、Ｇ４３Ｒ、Ｇ４３Ｄ、Ｇ４３Ｃ、Ｇ４３Ｑ、Ｇ４３Ｅ、Ｇ４３Ｈ、Ｇ４３Ｉ、Ｇ４３Ｌ、Ｇ４３Ｋ、Ｇ４３Ｍ、Ｇ４３Ｆ、Ｇ４３Ｐ、Ｇ４３Ｓ、Ｇ４３Ｔ、Ｇ４３Ｗ、Ｇ４３Ｙ、Ｇ４３Ｖ、Ｑ４４Ａ、Ｑ４４Ｒ、Ｑ４４Ｎ、Ｑ４４Ｄ、Ｑ４４Ｃ、Ｑ４４Ｅ、Ｑ４４Ｇ、Ｑ４４Ｈ、Ｑ４４Ｉ、Ｑ４４Ｌ、Ｑ４４Ｋ、Ｑ４４Ｍ、Ｑ４４Ｆ、Ｑ４４Ｐ、Ｑ４４Ｓ、Ｑ４４Ｔ、Ｑ４４Ｗ、Ｑ４４Ｙ、Ｑ４４Ｖ、Ｑ４５Ａ、Ｑ４５Ｒ、Ｑ４５Ｎ、Ｑ４５Ｄ、Ｑ４５Ｃ、Ｑ４５Ｅ、Ｑ４５Ｇ、Ｑ４５Ｈ、Ｑ４５Ｉ、Ｑ４５Ｌ、Ｑ４５Ｋ、Ｑ４５Ｍ、Ｑ４５Ｆ、Ｑ４５Ｐ、Ｑ４５Ｓ、Ｑ４５Ｔ、Ｑ４５Ｗ、Ｑ４５Ｙ、Ｑ４５Ｖ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｒ、Ｇ４６Ｎ、Ｇ４６Ｄ、Ｇ４６Ｃ、Ｇ４６Ｑ、Ｇ４６Ｅ、Ｇ４６Ｈ、Ｇ４６Ｉ、Ｇ４６Ｌ、Ｇ４６Ｋ、Ｇ４６Ｍ、Ｇ４６Ｆ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ４６Ｓ、Ｇ４６Ｔ、Ｇ４６Ｗ、Ｇ４６Ｙ、Ｇ４６Ｖ、Ｎ４７Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｎ４７Ｄ、Ｎ４７Ｃ、Ｎ４７Ｑ、Ｎ４７Ｅ、Ｎ４７Ｇ、Ｎ４７Ｈ、Ｎ４７Ｉ、Ｎ４７Ｌ、Ｎ４７Ｋ、Ｎ４７Ｍ、Ｎ４７Ｆ、Ｎ４７Ｐ、Ｎ４７Ｓ、Ｎ４７Ｔ、Ｎ４７Ｗ、Ｎ４７Ｙ、Ｎ４７Ｖ、Ｓ４８Ａ、Ｓ４８Ｒ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｃ、Ｓ４８Ｑ、Ｓ４８Ｅ、Ｓ４８Ｇ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｉ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｋ、Ｓ４８Ｍ、Ｓ４８Ｆ、Ｓ４８Ｐ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ４８Ｗ、Ｓ４８Ｙ、Ｓ４８Ｖ、Ｅ７０Ａ、Ｅ７０Ｒ、Ｅ７０Ｎ、Ｅ７０Ｄ、Ｅ７０Ｃ、Ｅ７０Ｑ、Ｅ７０Ｇ、Ｅ７０Ｈ、Ｅ７０Ｉ、Ｅ７０Ｌ、Ｅ７０Ｋ、Ｅ７０Ｍ、Ｅ７０Ｆ、Ｅ７０Ｐ、Ｅ７０Ｓ、Ｅ７０Ｔ、Ｅ７０Ｗ、Ｅ７０Ｙ、Ｅ７０Ｖ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｃ、Ｎ７２Ｑ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ｇ、Ｎ７２Ｈ、Ｎ７２Ｉ、Ｎ７２Ｌ、Ｎ７２Ｋ、Ｎ７２Ｍ、Ｎ７２Ｆ、Ｎ７２Ｐ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２Ｔ、Ｎ７２Ｗ、Ｎ７２Ｙ、Ｎ７２Ｖ、Ｓ７４Ａ、Ｓ７４Ｒ、Ｓ７４Ｎ、Ｓ７４Ｄ、Ｓ７４Ｃ、Ｓ７４Ｑ、Ｓ７４Ｅ、Ｓ７４Ｇ、Ｓ７４Ｈ、Ｓ７４Ｉ、Ｓ７４Ｌ、Ｓ７４Ｋ、Ｓ７４Ｍ、Ｓ７４Ｆ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７４Ｔ、Ｓ７４Ｗ、Ｓ７４Ｙ、Ｓ７４Ｖ、Ｙ７６Ａ、Ｙ７６Ｒ、Ｙ７６Ｎ、Ｙ７６Ｄ、Ｙ７６Ｃ、Ｙ７６Ｑ、Ｙ７６Ｅ、Ｙ７６Ｇ、Ｙ７６Ｈ、Ｙ７６Ｉ、Ｙ７６Ｌ、Ｙ７６Ｋ、Ｙ７６Ｍ、Ｙ７６Ｆ、Ｙ７６Ｐ、Ｙ７６Ｓ、Ｙ７６Ｔ、Ｙ７６Ｗ、Ｙ７６Ｖ、Ｋ７９Ａ、Ｋ７９Ｒ、Ｋ７９Ｎ、Ｋ７９Ｄ、Ｋ７９Ｃ、Ｋ７９Ｑ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ７９Ｇ、Ｋ７９Ｈ、Ｋ７９Ｉ、Ｋ７９Ｌ、Ｋ７９Ｍ、Ｋ７９Ｆ、Ｋ７９Ｐ、Ｋ７９Ｓ、Ｋ７９Ｔ、Ｋ７９Ｗ、Ｋ７９Ｙ、Ｋ７９Ｖ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｒ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０Ｃ、Ｄ８０Ｑ、Ｄ８０Ｅ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｈ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｌ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｐ、Ｄ８０Ｓ、Ｄ８０Ｔ、Ｄ８０Ｗ、Ｄ８０Ｙ、Ｄ８０Ｖ、Ｄ８１Ａ、Ｄ８１Ｒ、Ｄ８１Ｎ、Ｄ８１Ｃ、Ｄ８１Ｑ、Ｄ８１Ｅ、Ｄ８１Ｇ、Ｄ８１Ｈ、Ｄ８１Ｉ、Ｄ８１Ｌ、Ｄ８１Ｋ、Ｄ８１Ｍ、Ｄ８１Ｆ、Ｄ８１Ｐ、Ｄ８１Ｓ、Ｄ８１Ｔ、Ｄ８１Ｗ、Ｄ８１Ｙ、Ｄ８１Ｖ、Ｋ８２Ａ、Ｋ８２Ｒ、Ｋ８２Ｎ、Ｋ８２Ｄ、Ｋ８２Ｃ、Ｋ８２Ｑ、Ｋ８２Ｅ、Ｋ８２Ｇ、Ｋ８２Ｈ、Ｋ８２Ｉ、Ｋ８２Ｌ、Ｋ８２Ｍ、Ｋ８２Ｆ、Ｋ８２Ｐ、Ｋ８２Ｓ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｗ、Ｋ８２Ｙ、Ｋ８２Ｖ、Ｅ８３Ａ、Ｅ８３Ｒ、Ｅ８３Ｎ、Ｅ８３Ｄ、Ｅ８３Ｃ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８３Ｇ、Ｅ８３Ｈ、Ｅ８３Ｉ、Ｅ８３Ｌ、Ｅ８３Ｋ、Ｅ８３Ｍ、Ｅ８３Ｆ、Ｅ８３Ｐ、Ｅ８３Ｓ、Ｅ８３Ｔ、Ｅ８３Ｗ、Ｅ８３Ｙ、Ｅ８３Ｖ、Ｓ８４Ａ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８４Ｎ、Ｓ８４Ｄ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ８４Ｑ、Ｓ８４Ｅ、Ｓ８４Ｇ、Ｓ８４Ｈ、Ｓ８４Ｉ、Ｓ８４Ｌ、Ｓ８４Ｋ、Ｓ８４Ｍ、Ｓ８４Ｆ、Ｓ８４Ｐ、Ｓ８４Ｔ、Ｓ８４Ｗ、Ｓ８４Ｙ、Ｓ８４Ｖ、Ｖ８５Ａ、Ｖ８５Ｒ、Ｖ８５Ｎ、Ｖ８５Ｄ、Ｖ８５Ｃ、Ｖ８５Ｑ、Ｖ８５Ｅ、Ｖ８５Ｇ、Ｖ８５Ｈ、Ｖ８５Ｉ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ｋ、Ｖ８５Ｍ、Ｖ８５Ｆ、Ｖ８５Ｐ、Ｖ８５Ｓ、Ｖ８５Ｔ、Ｖ８５Ｗ及びＶ８５Ｙ。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩクレードル分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを上回るアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換は、以下のＦｎＩＩＩ残基置換（配列番号１２９に対応する）を含むことができるが、それらに限定されない：すなわち、Ｇ３１Ａ、Ｇ３１Ｎ、Ｇ３１Ｒ、Ｇ３１Ｄ、Ｇ３１Ｃ、Ｇ３１Ｑ、Ｇ３１Ｅ、Ｇ３１Ｈ、Ｇ３１Ｉ、Ｇ３１Ｌ、Ｇ３１Ｋ、Ｇ３１Ｍ、Ｇ３１Ｆ、Ｇ３１Ｐ、Ｇ３１Ｓ、Ｇ３１Ｔ、Ｇ３１Ｗ、Ｇ３１Ｙ、Ｇ３１Ｖ、Ｑ３３Ａ、Ｑ３３Ｒ、Ｑ３３Ｎ、Ｑ３３Ｄ、Ｑ３３Ｃ、Ｑ３３Ｅ、Ｑ３３Ｇ、Ｑ３３Ｈ、Ｑ３３Ｉ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｋ、Ｑ３３Ｍ、Ｑ３３Ｆ、Ｑ３３Ｐ、Ｑ３３Ｓ、Ｑ３３Ｔ、Ｑ３３Ｗ、Ｑ３３Ｙ、Ｑ３３Ｖ、Ｄ３５Ａ、Ｄ３５Ｒ、Ｄ３５Ｎ、Ｄ３５Ｃ、Ｄ３５Ｑ、Ｄ３５Ｅ、Ｄ３５Ｇ、Ｄ３５Ｈ、Ｄ３５Ｉ、Ｄ３５Ｌ、Ｄ３５Ｋ、Ｄ３５Ｍ、Ｄ３５Ｆ、Ｄ３５Ｐ、Ｄ３５Ｓ、Ｄ３５Ｔ、Ｄ３５Ｗ、Ｄ３５Ｙ、Ｄ３５Ｖ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｒ、Ｖ３７Ｎ、Ｖ３７Ｄ、Ｖ３７Ｃ、Ｖ３７Ｑ、Ｖ３７Ｅ、Ｖ３７Ｇ、Ｖ３７Ｈ、Ｖ３７Ｉ、Ｖ３７Ｌ、Ｖ３７Ｋ、Ｖ３７Ｍ、Ｖ３７Ｆ、Ｖ３７Ｐ、Ｖ３７Ｓ、Ｖ３７Ｔ、Ｖ３７Ｗ、Ｖ３７Ｙ、Ａ３９Ｎ、Ａ３９Ｒ、Ａ３９Ｄ、Ａ３９Ｃ、Ａ３９Ｑ、Ａ３９Ｅ、Ａ３９Ｇ、Ａ３９Ｈ、Ａ３９Ｉ、Ａ３９Ｌ、Ａ３９Ｋ、Ａ３９Ｍ、Ａ３９Ｆ、Ａ３９Ｐ、Ａ３９Ｓ、Ａ３９Ｔ、Ａ３９Ｗ、Ａ３９Ｙ、Ａ３９Ｖ、Ｎ４０Ａ、Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｄ、Ｎ４０Ｃ、Ｎ４０Ｑ、Ｎ４０Ｅ、Ｎ４０Ｇ、Ｎ４０Ｈ、Ｎ４０Ｉ、Ｎ４０Ｌ、Ｎ４０Ｋ、Ｎ４０Ｍ、Ｎ４０Ｆ、Ｎ４０Ｐ、Ｎ４０Ｓ、Ｎ４０Ｔ、Ｎ４０Ｗ、Ｎ４０Ｙ、Ｎ４０Ｖ、Ｇ４１Ａ、Ｇ４１Ｒ、Ｇ４１Ｎ、Ｇ４１Ｄ、Ｇ４１Ｃ、Ｇ４１Ｑ、Ｇ４１Ｅ、Ｇ４１Ｈ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｌ、Ｇ４１Ｋ、Ｇ４１Ｍ、Ｇ４１Ｆ、Ｇ４１Ｐ、Ｇ４１Ｓ、Ｇ４１Ｔ、Ｇ４１Ｗ、Ｇ４１Ｙ、Ｇ４１Ｖ、Ｑ４２Ａ、Ｑ４２Ｒ、Ｑ４２Ｎ、Ｑ４２Ｄ、Ｑ４２Ｃ、Ｑ４２Ｅ、Ｑ４２Ｇ、Ｑ４２Ｈ、Ｑ４２Ｉ、Ｑ４２Ｌ、Ｑ４２Ｋ、Ｑ４２Ｍ、Ｑ４２Ｆ、Ｑ４２Ｐ、Ｑ４２Ｓ、Ｑ４２Ｔ、Ｑ４２Ｗ、Ｑ４２Ｙ、Ｑ４２Ｖ、Ｔ４３Ａ、Ｔ４３Ｒ、Ｔ４３Ｎ、Ｔ４３Ｄ、Ｔ４３Ｃ、Ｔ４３Ｑ、Ｔ４３Ｅ、Ｔ４３Ｇ、Ｔ４３Ｈ、Ｔ４３Ｉ、Ｔ４３Ｌ、Ｔ４３Ｋ、Ｔ４３Ｍ、Ｔ４３Ｆ、Ｔ４３Ｐ、Ｔ４３Ｓ、Ｔ４３Ｗ、Ｔ４３Ｙ、Ｔ４３Ｖ、Ｐ４４Ａ、Ｐ４４Ｒ、Ｐ４４Ｎ、Ｐ４４Ｄ、Ｐ４４Ｃ、Ｐ４４Ｑ、Ｐ４４Ｅ、Ｐ４４Ｇ、Ｐ４４Ｈ、Ｐ４４Ｉ、Ｐ４４Ｌ、Ｐ４４Ｋ、Ｐ４４Ｍ、Ｐ４４Ｆ、Ｐ４４Ｓ、Ｐ４４Ｔ、Ｐ４４Ｗ、Ｐ４４Ｙ、Ｐ４４Ｖ、Ｄ６６Ａ、Ｄ６６Ｒ、Ｄ６６Ｎ、Ｄ６６Ｃ、Ｄ６６Ｑ、Ｄ６６Ｅ、Ｄ６６Ｇ、Ｄ６６Ｈ、Ｄ６６Ｉ、Ｄ６６Ｌ、Ｄ６６Ｋ、Ｄ６６Ｍ、Ｄ６６Ｆ、Ｄ６６Ｐ、Ｄ６６Ｓ、Ｄ６６Ｔ、Ｄ６６Ｗ、Ｄ６６Ｙ、Ｄ６６Ｖ、Ｋ６８Ａ、Ｋ６８Ｒ、Ｋ６８Ｎ、Ｋ６８Ｄ、Ｋ６８Ｃ、Ｋ６８Ｑ、Ｋ６８Ｅ、Ｋ６８Ｇ、Ｋ６８Ｈ、Ｋ６８Ｉ、Ｋ６８Ｌ、Ｋ６８Ｍ、Ｋ６８Ｆ、Ｋ６８Ｐ、Ｋ６８Ｓ、Ｋ６８Ｔ、Ｋ６８Ｗ、Ｋ６８Ｙ、Ｋ６８Ｖ、Ｙ７０Ａ、Ｙ７０Ｒ、Ｙ７０Ｎ、Ｙ７０Ｄ、Ｙ７０Ｃ、Ｙ７０Ｑ、Ｙ７０Ｅ、Ｙ７０Ｇ、Ｙ７０Ｈ、Ｙ７０Ｉ、Ｙ７０Ｌ、Ｙ７０Ｋ、Ｙ７０Ｍ、Ｙ７０Ｆ、Ｙ７０Ｐ、Ｙ７０Ｓ、Ｙ７０Ｔ、Ｙ７０Ｗ、Ｙ７０Ｖ、Ｙ７２Ａ、Ｙ７２Ｒ、Ｙ７２Ｎ、Ｙ７２Ｄ、Ｙ７２Ｃ、Ｙ７２Ｑ、Ｙ７２Ｅ、Ｙ７２Ｇ、Ｙ７２Ｈ、Ｙ７２Ｉ、Ｙ７２Ｌ、Ｙ７２Ｋ、Ｙ７２Ｍ、Ｙ７２Ｆ、Ｙ７２Ｐ、Ｙ７２Ｓ、Ｙ７２Ｔ、Ｙ７２Ｗ、Ｙ７２Ｖ、Ｎ７５Ａ、Ｎ７５Ｒ、Ｎ７５Ｄ、Ｎ７５Ｃ、Ｎ７５Ｑ、Ｎ７５Ｅ、Ｎ７５Ｇ、Ｎ７５Ｈ、Ｎ７５Ｉ、Ｎ７５Ｌ、Ｎ７５Ｋ、Ｎ７５Ｍ、Ｎ７５Ｆ、Ｎ７５Ｐ、Ｎ７５Ｓ、Ｎ７５Ｔ、Ｎ７５Ｗ、Ｎ７５Ｙ、Ｎ７５Ｖ、Ｄ７６Ａ、Ｄ７６Ｒ、Ｄ７６Ｎ、Ｄ７６Ｃ、Ｄ７６Ｑ、Ｄ７６Ｅ、Ｄ７６Ｇ、Ｄ７６Ｈ、Ｄ７６Ｉ、Ｄ７６Ｌ、Ｄ７６Ｋ、Ｄ７６Ｍ、Ｄ７６Ｆ、Ｄ７６Ｐ、Ｄ７６Ｓ、Ｄ７６Ｔ、Ｄ７６Ｗ、Ｄ７６Ｙ、Ｄ７６Ｖ、Ｎ７７Ａ、Ｎ７７Ｒ、Ｎ７７Ｄ、Ｎ７７Ｃ、Ｎ７７Ｑ、Ｎ７７Ｅ、Ｎ７７Ｇ、Ｎ７７Ｈ、Ｎ７７Ｉ、Ｎ７７Ｌ、Ｎ７７Ｋ、Ｎ７７Ｍ、Ｎ７７Ｆ、Ｎ７７Ｐ、Ｎ７７Ｓ、Ｎ７７Ｔ、Ｎ７７Ｗ、Ｎ７７Ｙ、Ｎ７７Ｖ、Ａ７８Ｒ、Ａ７８Ｎ、Ａ７８Ｄ、Ａ７８Ｃ、Ａ７８Ｑ、Ａ７８Ｅ、Ａ７８Ｇ、Ａ７８Ｈ、Ａ７８Ｉ、Ａ７８Ｌ、Ａ７８Ｋ、Ａ７８Ｍ、Ａ７８Ｆ、Ａ７８Ｐ、Ａ７８Ｓ、Ａ７８Ｔ、Ａ７８Ｗ、Ａ７８Ｙ、Ａ７８Ｖ、Ｒ７９Ａ、Ｒ７９Ｎ、Ｒ７９Ｄ、Ｒ７９Ｃ、Ｒ７９Ｑ、Ｒ７９Ｅ、Ｒ７９Ｇ、Ｒ７９Ｈ、Ｒ７９Ｉ、Ｒ７９Ｌ、Ｒ７９Ｋ、Ｒ７９Ｍ、Ｒ７９Ｆ、Ｒ７９Ｐ、Ｒ７９Ｓ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ７９Ｗ、Ｒ７９Ｙ、Ｒ７９Ｖ、Ｓ８０Ａ、Ｓ８０Ｒ、Ｓ８０Ｎ、Ｓ８０Ｄ、Ｓ８０Ｃ、Ｓ８０Ｑ、Ｓ８０Ｅ、Ｓ８０Ｇ、Ｓ８０Ｈ、Ｓ８０Ｉ、Ｓ８０Ｌ、Ｓ８０Ｋ、Ｓ８０Ｍ、Ｓ８０Ｆ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ｔ、Ｓ８０Ｗ、Ｓ８０Ｙ、Ｓ８０Ｖ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８１Ｒ、Ｓ８１Ｎ、Ｓ８１Ｄ、Ｓ８１Ｃ、Ｓ８１Ｑ、Ｓ８１Ｅ、Ｓ８１Ｇ、Ｓ８１Ｈ、Ｓ８１Ｉ、Ｓ８１Ｌ、Ｓ８１Ｋ、Ｓ８１Ｍ、Ｓ８１Ｆ、Ｓ８１Ｐ、Ｓ８１Ｔ、Ｓ８１Ｗ、Ｓ８１Ｙ及びＳ８１Ｖ。
【０１３０】
クレードル分子は、更に、特定のターゲットに対する親和性を有するか否かを選択することができる第２のＦｎＩＩＩドメインを含むことができる。第２のＦｎＩＩＩドメインは、更なるアミノ酸のバリエーションないしは多様化を含むことができるし、含まなくても良い。他の視点において、クレードル分子は、更に、ＦｎＩＩＩポリペプチドのターゲット分子に対する結合親和性を増強する非ＦｎＩＩＩポリペプチドを含むことができる。非ＦｎＩＩＩポリペプチドは、クレードル分子の他のターゲット分子（例えば、半減期延長剤（ＨＳＡ）など）に対する結合親和性を増強するないしは増加させる更なるバリエーションないしは多様化を含むことができる。非ＦｎＩＩＩポリペプチドは、ホスホ−チロシン結合（例えば、ＳＨ２、ＰＴＢ）、ホスホ−セリン結合（例えば、ＵＩＭ、ＧＡＴ、ＣＵＥ、ＢＴＢ／ＰＯＺ、ＶＨＳ、ＵＢＡ、ＲＩＮＧ、ＨＥＣＴ、ＷＷ、１４−３−３、ポロ−ボックス）、ホスホ−スレオニン結合（例えば、ＦＨＡ、ＷＷ、ポロ−ボックス）、プロリン−リッチ領域結合（例えば、ＥＶＨ１、ＳＨ３、ＧＹＦ）、アセチル化リシン結合（例えば、ブロモ）、メチル化リシン結合（例えば、クロモ、ＰＨＤ）、アポトーシス（例えば、ＢＩＲ、ＴＲＡＦ、ＤＥＤ、Ｄｅａｔｈ、ＣＡＲＤ、ＢＨ）、細胞骨格調節（例えば、ＡＤＦ、ＧＥＬ、ＤＨ、ＣＨ、ＦＨ２）又は他の細胞の機能（例えば、ＥＨ、ＣＣ、ＶＨＬ、ＴＵＤＯＲ、ＰＵＦ  Ｒｅｐｅａｔ、ＰＡＳ、ＭＨ１、ＬＲＲ１  ＩＱ、ＨＥＡＴ、ＧＲＩＰ、ＴＵＢＢＹ、ＳＮＡＲＥ、ＴＰＲ、ＴＩＲ、ＳＴＡＲＴ、ＳＯＣＳボックス、ＳＡＭ、ＲＧＳ、ＰＤＺ、ＰＢ１、ＬＩＭ、Ｆ−ＢＯＸ、ＥＮＴＨ、ＥＦ−Ｈａｎｄ、ＳＨＡＤＯＷ、ＡＲＭ、ＡＮＫ）に関与するドメインを含むことができるが、それらに限定されない。
【０１３１】
多重特異性ＦｎＩＩＩドメインクレードル分子
他の視点において、本発明は、一分子に連結される（例えば、遺伝学的に又は化学的に）２つ以上の個々のクレードル分子を含む多重特異性クレードル分子を提供する。多重特異性クレードル分子は、ターゲットに結合する少なくとも１つのβ鎖を使用する少なくとも１つのクレードル分子を含む。
【０１３２】
１つの実施形態において、多重特異性クレードル分子は数珠繋ぎに連結される２つ以上の個々のクレードル分子を含み、個々のクレードル分子はそれぞれ特定のターゲットに結合する。そのようなターゲット（複数）は、同一の分子又は異なる分子に（多重特異性クレードル分子に対する結合によって異なる分子が隣り合う（ないし、並置する：juxtaposed）ように存在することができる。ターゲット（複数）は、多重特異性クレードル分子が、抗体に類似する様式で、ターゲット分子をクラスタ化するように同一のものであることもできる。ターゲット分子の異なる領域に対して独立して結合することが可能な多重特異性クレードル分子の２つの結合サイトをもって同一の（１つの）ターゲット分子に結合することによっても、親和性は増加する。
【０１３３】
多重特異性クレードル分子には、いくつかの個々のクレードル分子を、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを上回る個々のクレードル分子を組み込むことができる。
【０１３４】
多重特異性クレードル分子は、本発明の分野において認識されている方法を使用して生成することができる。例えば、多重特異性クレードル分子が単一のポリペプチドとして発現されるように、クレードル分子を遺伝子学的に連結することができる。この連結は直接的なものであっても良いし、又は、追加のアミノ酸「リンカー」配列によってもたらすこともできる。適切な方法及びリンカーは、例えば、米国特許公開２００６０２８６６０３号及び国際公開ＷＯ０４０４１８６２Ａ２号に記載されているが、これらに限定されない。ポリペプチドリンカーの例は、ＧＳリンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７１）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４７２）など、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号４７３）、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号４７４）、及びそれらの多量体を含むが、それらに限定されない。
【０１３５】
リンカー配列を使用して生成される多重特異性クレードル分子は、ターゲット分子（複数）に対する結合の改善された立体的障害を有するので、２つ以上の個々のクレードル分子を一分子に連結することに用いる短いリンカー配列を実現することができる。より短いリンカー配列は、免疫原性の応答が生じ難く、そして、切断され難い。
【０１３６】
あるいは、多重特異性クレードル分子は、本発明の分野において知られた方法を使用して個々のクレードル分子を化学的にコンジュゲートすることによって調製することができる。種々のカップリング剤又はクロスリンキング剤は、共有結合性のコンジュゲーションのために使用することができる。クロスリンキング剤の例は、例えば、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−サクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセタート（ＳＡＴＡ）、５、５´−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、及びスルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:8648を参照）を含む。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83,及びGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されたものを含む。好ましいコンジュゲート剤はＳＡＴＡ及びｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能である。ＦｎＩＩＩドメイン変異の特定位置にシステイン残基を導入して、ＤＰＤＰＢ又はＤＴＭＥ（Pierceから入手可能である）などのスルフヒドリルに対する試薬でクロスリンクさせることができ、２つの個々のクレードル分子を一分子になるよう連結して多重特異性クレードル分子を形成させることができる。
【０１３７】
ＦｎＩＩＩクレードル分子にＣＤＲを取り付ける方法
１つの視点において、本発明は、野生型ＦｎＩＩＩドメインとの比較において改変されたＦｎＩＩＩクレードル分子が、抗体又はＴ細胞受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の全部又は一部分を含むことを特徴とする。
【０１３８】
抗体、Ｔ細胞受容体の可変領域又はそれらの抗原結合フラグメントのＣＤＲ領域は、グラフティングに適する。ＣＤＲは、任意の動物（げっ歯類、霊長類、ラクダ類又はサメ類を含むがそれらに限定されない）の抗体又はＴ細胞受容体のレパートリーから取得することができる。１つの実施形態において、ＣＤＲは、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３から取得される。更に特別の実施形態において、単一ドメイン抗体（ナノボディなど）のＣＤＲ１、２又は３は、ＦｎＩＩＩドメインのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ又はＦＧループのいずれかにグラフトされ、それによってクレードル分子に本来の（オリジナル）ナノボディのターゲット結合特異性が提供される。１つの実施形態において、ＣＤＲは重鎖ＣＤＲ３である。１つの実施形態において、ＣＤＲは、ＦＧループにグラフトされる。ラクダ抗体及び抗体フラグメントの（遺伝子）操作したライブラリは商業的に（例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから）入手可能である。抗体レパートリーは、１つ以上の抗原で免疫誘導（チャレンジ）した動物から、又は抗原で免疫誘導されていない無処置の動物から由来することができる。追加的に又は代わりに、インビトロ又はインビボのライブラリスクリーニング方法（インビトロポリソーム又はリボソームディスプレイ、ファージ ディスプレイあるいは酵母ディスプレイ技術を含むがそれらに限定されない）において生成される抗体、又はその抗原結合フラグメントからＣＤＲを取得することができる。これは、インビトロ又はインビボのライブラリスクリーニング方法によっては本来的には生成されないが、その後の突然変異誘導又はインビトロ又はインビボのスクリーニング方法を使用する１回以上の親和性成熟ステップによって生成される抗体を含む。そのようなインビトロ又はインビボのライブラリスクリーニング方法又は親和性熟成方法の例は、例えば、米国特許７，１９５，８８０号；６，９５１，７２５号；７，０７８，１９７号；７，０２２，４７９号；５，９２２，５４５号；５，８３０，７２１号；５，６０５，７９３号；５，８３０，６５０号；６，１９４，５５０号；６，６９９，６５８号；７，０６３，９４３号；５，８６６，３４４号及び国際公開公報ＷＯ０６０２３１４４号に記載されている。
【０１３９】
抗体ＣＤＲの同定方法は、本発明の分野において良く知られている（see Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983); Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; MacCallum et al., (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745を参照）。特定の抗体をコードする核酸は、単離してシーケンス処理することができる。そしてコードされるタンパク質を確立された抗体配列名に関して点検することによってＣＤＲ配列を推論することもできる。高度可変領域又はＣＤＲｓをＦｎＩＩＩにグラフトする方法は、例えば、遺伝子操作、新規（de novo）の核酸合成又はＰＣＲベース遺伝子アッセンブリを含む（例えば、米国特許５，２２５，５３９号参照）。
【０１４０】
上記の技術によって、高度可変領域又はＣＤＲの選択及びプレゼンテーションに関して適切なループ（例えば、ＦＧループ）を同定することができる。しかしながら、更なる手法（ないし手段：metrics）を、ＦｎＩＩＩドメイン及びドナー抗体の構造モデリングに基づいて高度可変領域のフィット及びプレゼンテーションを更に改善するために採用することができる。
【０１４１】
１つの視点において、ＦｎＩＩＩドメインの何れかのβ鎖における特定のアミノ酸残基に突然変異を導入して、ＣＤＲループが抗原に対する結合を保持するか、又は改善する立体構造を有するようにすることができる。この手法は、構造上モデリングとアライメントの組み合わせを使用して、異種性の抗体フレームワークにＣＤＲを取り付ける方法に類似の仕方で実行することができる。１つの実施形態において、Queen et al.（米国特許６，１８０，３７０号；５，６９３，７６２号；５，６９３，７６１号；５，５８５，０８９号；７，０２２，５００号）によって実行された方法に類似の仕方で、ＣＤＲに隣接するＦｎＩＩＩドメイン残基に突然変異が導入される。他の実施形態において、ＣＤＲ残基の１ファンデルワールス半径内のＦｎＩＩＩドメイン残基に、Winter et al.（米国特許６，５４８，６４０号；６，９８２，３２１号参照）に類似の仕方で突然変異が導入される。他の実施形態において、Carter et al.又はAdair et al.（米国特許６，４０７，２１３号；６，６３９，０５５号；５，８５９，２０５号；６，６３２，９２７号）によって実行された方法と類似の仕方で、ＣＤＲ残基に隣接していないが、ＦｎＩＩＩドメイン及びドナー抗体の構造上モデリングに基づいてＣＤＲ残基の立体構造を改変することが予測され、ＦｎＩＩＩドメイン残基に突然変異が導入される。
【０１４２】
ＩＶ．ＦｎＩＩＩクレードルライブラリ
高親和性で、かつ、特異的に他のタンパク質と相互作用することができる新規の結合タンパク質を生成する能力はバイオテクノロジー、医学及び分子生物学において重要である。そのようにデザインされた結合タンパク質は、多くの応用で使用することができる。それらはターゲットタンパク質を結合し、検出と可視化のために関心のあるタンパク質をラベルするために、複雑な混合物からターゲットタンパク質を精製するために、又は、機能部位をブロッキングすることによってターゲットを機能的に撹乱する（perturb）ために使用することができる。
【０１４３】
組み合わせ方法は新規の結合タンパク質の生産のための有効なプラットフォームである。これらの方法では、タンパク質変異体の大きなライブラリは、タンパク質スキャフォールドでの接触面（contiguous surface）へ大量の配列多様性、及び、時として構造多様性を導入することによって作製される。組み合わせアプローチにおける中心的なアイデアは、形状と化学的特性において異なる候補結合表面の十分に多様なレパートリーを作成することである。その後、関心のあるターゲットを結合することができる変異体は、様々な選択方法を使用して単離することができる。
【０１４４】
強力であるが、組み合わせシステムの重要な制限は、それらの限定されたサンプリング・キャパシティー（sampling capacity）である。例えば、ファージディスプレイライブラリは、一般に、およそ１０１０メンバーに制限されている。タンパク質スキャフォールドの１５ケの位置からなる小さな結合表面を考えれば、１５のすべての位置が２０のすべてのアミノ酸に変えられる場合、これは２０１５又は３×１０１９の理論的な配列の組み合わせないしシーケンス・コンビネーションを与える。したがって、可能な結合部位配置の非常に低い割合だけが、ライブラリで実際にサンプリングされ得る。与えられたターゲットに適している結合表面の発見が既にまれな事象（イベント）となるので、組み合わせ方法のサンプリング制限は、機能的な結合タンパク質の隔離（ないし単離）を困難で、かつ、ありそうもないタスクにさせる。
【０１４５】
いくつかの戦略は組み合わせ的ライブラリにおけるサンプリング問題と格闘するために調査されている。最も広く使用されたアプローチは、いわゆる親和性成熟戦略と単純なライブラリ選択を結び付けることである。通常、これらの戦略は、サンプリング・キャパシティーを有効に増加させるために、選別過程の間に様々な段階でタンパク質集団ないしポピュレーションへの追加的な配列の多様性の導入を含む。そのようなアプローチにおける目的は、前段階でサンプリングされた（under-sampled）ライブラリから該当のもの（hit）を最初にリカバー（ないし回収）し、次に、増加した親和性のためのこれらのクローンを徐々に最適化する点突発変異を導入することである。これらのアプローチは、様々なシステムにおいて成功裡に使用されている。しかしながら、ほとんどの場合、導入された突然変異は、それらの位置とアミノ酸のタイプの点から無作為ないしランダムである。したがって、この戦略は有効であると証明されているが、生産的な突然変異を蓄積する可能性は非常に低い。その結果、最初に該当したものがリカバーされた後、そのような方法は、しばしば親和性成熟のための数回の追加的な選択を必要とし、効果的なバインダー（binders）が必ずしも生産されるとは限らない。
【０１４６】
組み合わせ方法におけるサンプリング問題と格闘するための別のタイプの戦略は、関心のあるターゲットタイプに結合するのに役立つであろうものに対して、結合部位ライブラリの配列及び構造特性に焦点をあてる（集中させる）ことを含んでいる。これらの戦略は結合分子が存在する構造情報(第一級と第三級の両方)に基づく。このアプローチは、ペプチドターゲットとされ、かつ小分子ハプテン（付着体）ターゲットとされたライブラリの合成を備えた合成抗体で調査されている（Cobaugh, et al., J. Mol. Biol. (2008) 378:622-633; Persson, et al., J. Mol. Biol. (2006) 357:607-620）。これらの実施例の各々では、ペプチド又は小分子結合抗体で頻繁に観察される抗体相補性決定領域(CDR)の長さが選ばれた。これらの構造上の特徴は、抗体結合部位であらかじめコード化され、次で、配列多様性は、関心のあるターゲットタイプを認識する抗体で頻繁に観察されたアミノ酸タイプを使用して、この文脈（前後関係：context）に導入される。このように、証明された有用な構造は、同様の特性を備えた別の分子を認識するために、単に、「再プログラムされ」る。
【０１４７】
ここで議論されるいくつかの実施形態において、ＦｎＩＩＩドメインは、タンパク質結合領域の組み合わせ的ライブラリを生成するための基礎ないし土台として使用される。
【０１４８】
ひとつには抗体を生産するのが困難で、高価になり得るので、特定のリガンドを結合する人工抗体スキャフォールドは、従来の技術を使用して生成された抗体の正当な代替になりつつある。抗体の制限は、免疫グロブリン様の折り畳み（folds）又は他のタンパク質トポロジーに基づいた代替の結合タンパク質の開発に拍車をかけている。これらの非抗体スキャフォールドは、タンパク質の他の部分の多数の置換に対して耐性である、構造上安定したフレームワークコアを有する一般的な性質を共有する。
【０１４９】
本発明は、β鎖（複数）の表面が露出された残基を伴うＦｎＩＩＩドメインのCD及びFGループを使用する、ＦｎＩＩＩクレードル分子のライブラリを提供する。ここに「クレードルライブラリ」と呼ばれる、提案されたライブラリは、従来の既に示されたトップ及びボトム側ライブラリの結合に利用可能な表面積（表面領域）を増加させるであろう。更に、ループFG及びCDは、自然に生じるフィブロネクチンにおいて可変性が高く、構成とループの長さの両方に制限なしで無作為化ないしランダム化することができる。これは、以前に示された従来のライブラリにおける制限のうちのいくつかを克服するべき、不安定な分子を生成せずに、非常に多様なライブラリを可能にするであろう。さらに、表面の露出したβシート残基（複数）もターゲットタンパク質に対する結合が利用可能な、大きなクレードル（受け台ないし枠台）様表面を生成するために無作為化されるであろう。
【０１５０】
人工的な多様性を作成することによって、例えば、新しい治療を得る高生産性（ハイスループット）な方法を使用して、それらを容易にスクリーニングできるようにライブラリサイズは制御できる。トップ及びボトム側ループ領域を伴うＦｎＩＩＩクレードルライブラリと、βシートの表面の露出した残基は、FACS、ファージパンニング（phage panning）、又は、選択的リガンド保持による肯定的な物理的クローン選択を使用し、スクリーニングできる。これらの生体外スクリーンは、抗体ハイブリドーマライブラリ及び上澄みスクリーニングの生成に特有の標準的で退屈な方法論を回避する。
【０１５１】
更に、ボトムとトップのループ領域（複数）(それぞれ、CDとFG)と、βシート（複数）の表面の露出した残基を備えたＦｎＩＩＩクレードルライブラリは、生体外多様性技術によって作成されるターゲット結合ループにおける構成アミノ酸として任意のターゲットを認識する可能性がある。これは、多様性サイズを制御するライブラリ及び自己抗原を認識する潜在的な可能性の著しい利点をもたらす。さらにまた、ボトムとトップのループ領域(CDとFG)とβシートの表面の露出した残基を伴うＦｎＩＩＩクレードルライブラリは、他の所望のターゲットに対する追加的なフィブロネクチン結合領域を発見するために増殖（propagated）でき、また再スクリーニングできる。
【０１５２】
組み合わせ的ライブラリは、化学合成、又は、多くの化学の「ビルディングブロック（building blocks）」を組み合わせることによる生物学的合成のいずれかによって生成された種々の合成物のコレクションである。例えば、ポリペプチド（例えば、突然変異タンパク質又は変異体）ライブラリのような線形の組み合わせの化学的ライブラリは、所定の化合物の長さにおいてあらゆる可能な方法で、アミノ酸と呼ばれる1セットの化学的ビルディングブロック（複数）を組み合わせることにより形成される。何百万もの合成物は、化学的ビルディングブロックのそのような組み合わせの混合によって合成することができる。例えば、100の交換可能な化学的ビルディングブロックの系統的な組み合わせの混合が、1億の四量体の化合物又は100億の五量体の化合物の理論的な合成に帰着することをある評論者が観察した（Gallop, et al., J.Med. Chem. (1994) 37:1233-1250）。
【０１５３】
発明の実施形態（複数）は、ＦｎＩＩＩドメインの組み合わせ的ライブラリに向けられる。いくつかの実施形態では、ライブラリのポリペプチドは、ＦｎＩＩＩドメインのβ鎖の1つ以上にアミノ酸配列の変異を含んでいる。いくつかの実施形態で、ライブラリは、ＦｎＩＩＩドメインの1つ以上のループにアミノ酸配列の変異を含んでいる。いくつかの実施形態では、ライブラリは、ＦｎＩＩＩドメインのループ及びβ鎖の両方における変異を含んでいる。ライブラリは、（i）指定されたアプローチと（ii）任意のアプローチを使用して生成することができ、それらの両者は実施例において説明される。
【０１５４】
ユニバーサル突然変異誘導クレードルライブラリ
本発明は、選択結合活性又は選択酵素活性を有する1つ以上のポリペプチドの存在に関するスクリーニングにおいて有用なＦｎＩＩＩドメインポリペプチドの突然変異誘導クレードルライブラリに関連する。ライブラリポリペプチドは、（ａ）選択された天然のＦｎＩＩＩ領域ポリペプチドあるいはポリペプチド（複数）の野生型アミノ酸配列を有する領域A、AB、B、BC、C、CD、D、E、EF、F、FG、及びG、（ｂ）1つ以上の選択された長さを有するβ鎖Ｃ及びβ鎖Ｆ、並びにループ領域CD及びFGを含んでいる。選択された長さの少なくとも1つの選択されたβ鎖又はループ領域は、各β鎖又はループ位置で、保存的コンセンサスアミノ酸又は選択半保存的コンセンサスアミノ酸を、また、（コンセンサスアミノ酸が少なくとも50%の選択閾値頻度以下の発生頻度を有する場合）、単一の共通ターゲットアミノ酸及び任意の共生成アミノ酸（co-produced amino acids）(コドンの縮退の結果として所定の位置でコード配列によって生成されたアミノ酸)をコードする、コード配列のライブラリによってコード化された配列のライブラリを含む。
【０１５５】
与えられたループ／鎖の長さの与えられたループ／鎖内のライブラリを構築する際に、可変性プロファイル（variability profile）は固定及び「可変」位置（「variable」 positions、つまりターゲットアミノ酸が導入することができる位置）の配列を規定するために使用される。固定位置の数は、各位置（position）でのコンセンサスアミノ酸の選択閾値頻度に依存するであろう。
【０１５６】
一旦β鎖及びループ配列が選択されると、識別された配列をすべてコードするコード配列オリゴヌクレオチドのライブラリは、示されるような既存のコンセンサスアミノ酸を保存するのに有効なだけでなく選択されたターゲットアミノ酸及び縮退コドンによってコード化された任意の他の共同生成アミノ酸をコードする、コドン置換を作成して、構築される。
【０１５７】
β鎖とループのためのコード配列のライブラリは、ポリペプチドライブラリのためのコード配列のライブラリを構築するためにフレームワーク配列に加えられる。ポリペプチドのライブラリは、リボソーム・ディスプレイ・ライブラリ、ポリソーム・ディスプレイ・ライブラリ、ファージ・ディスプレイ・ライブラリ、細菌発現ライブラリ又はイースト・ディスプレイ・ライブラリを含む、発現ライブラリ・フォーマットによってコード化できる。
【０１５８】
ライブラリは、所望の結合親和力を有するポリペプチドを識別する方法において使用されることができ、この方法で、天然−変異の組み合わせ的ライブラリは、所望の結合親和力を有するＦｎＩＩＩドメインを選択するためにスクリーニングされる。同じ方法論は、βシート及びトップとボトムのループ領域の任意の組み合わせを使用して、ＦｎＩＩＩライブラリを生成するために用いることができる。
【０１５９】
天然−変異の組み合わせクレードルライブラリ
選択結合活性又は選択酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在のためのスクリーニングに有用なＦｎＩＩＩポリペプチドの天然−変異の組み合わせクレードルライブラリがさらに提供される。クレードルライブラリ・ポリペプチドは、（a）選択された天然のＦｎＩＩＩポリペプチド又はポリペプチド（複数）の野生型アミノ酸配列を有する、領域A、AB、B、BC、C、CD、D、DE、E、EF、F、FG及びＧ、ならびに、（ｂ）選択された長さを有するβ鎖Ｃ及びβ鎖Ｆ及びループ領域ＣＤとＦＧを含む。少なくとも1つの選択されたβ鎖又は選択された長さのループ領域は、各ループ位置で、保存又は選択半保存的コンセンサスアミノ酸を、また、（コンセンサスアミノ酸が少なくとも５０％の選択閾値頻度以下の発生頻度を有する場合）、他の天然−変異アミノ酸(半保存アミノ酸及び可変アミノ酸（その出現率がその位置での選択最小閾値出現率より上である）を含む)を、又はそれらの化学的に同等なものをコードする、コード配列のライブラリによって発現される天然−変異の組み合わせ配列のライブラリを含む。
【０１６０】
与えられたループ／シート及びループ／シートの長さのための天然−変異の組み合わせクレードルライブラリを構築する際に、可変性プロファイルは固定及び「可変」位置（つまりターゲットアミノ酸が導入することができる位置）の配列を規定するために使用される。クレードルライブラリにおいて、固定位置の数は、各位置でのコンセンサスアミノ酸の選択閾値頻度に依存するであろう。例えば、選択頻度閾値が約６０％で設定される場合、保存又は半保存された残基及び天然−変異置換は、これらの位置でなされないであろう。反対に、閾値頻度が１００％で設定される場合、１００％の頻度により単一のアミノ酸がループ位置で置換されないであろうことを認識して、全ての位置が可変（変異）対象になることが考慮され得る。そして、1つの非常に優性なアミノ酸があった位置（例えば、９０％の頻度で）は、低頻度の変異体（variant(s)）が、優性なアミノ酸と化学的に相違した場合のみ置換されうるであろう。
【０１６１】
与えられたループ／シート及びループ／シートの長さのためのアミノ酸プロファイルから、どの位置が固定して保持されるか、また、どれ（どの位置）が変異を許容するかを知ることで、個々の可変位置でのアミノ酸置換は選択することができる。一般に、選択された変異の数(共生成アミノ酸を含む)は、ループ／シートでの可変置換位置の数及び置換されたループ／シート位置当たりの変異の平均数に依存するであろう。当然のことながら、天然−変異の置換が単一のループのみへ導入される場合、1つの位置当たりさらに多くの変異を許容できる。
【０１６２】
各位置に選択される特定の天然−変異アミノ酸は、最も高い頻度を有するアミノ酸を一般に含んでいるであろう、一方、共生成アミノ酸の数は制限され、そして、二次的に、各部位で、化学的多様性を保存する。一旦、天然−変異ループ／シート配列が選択されると、識別された天然−変異配列をすべてコードするコード配列オリゴヌクレオチドのライブラリが、既存のコンセンサスアミノ酸を保存し、かつ、縮退コドンによってコード化された変異を含む、選択された変異アミノ酸をコードするのに有効なコドン置換を行って、構築される。
【０１６３】
天然−変異ループ／シートのためのコード配列のライブラリは、天然−変異ポリペプチドライブラリのためのコード配列のライブラリを構築するためにフレームワーク配列に加えられる。いくつかの実施形態では、コーディングライブラリは、1ペアのAB/CD、AB/EF、CD/EF又はCD/FGループのためのコード配列を含み、ここで、ペアの各ループは１つの選択された長さを有する。別の実施形態で、コーディングライブラリは、すべての5つのループ、AB、BC、CD、EF及びFGの任意の組み合わせのためのコード配列を含む。また別の実施形態では、コーディングライブラリは、C及びFシートのためのコード配列を含む。さらに別の実施形態では、コーディングライブラリは、すべてのβシートの任意の組み合わせのためのコード配列を含む。
【０１６４】
Ｎ＋/−ライブラリ
さらに、本発明の方法は、「N+/-ライブラリ」と呼ばれる、他のライブラリも提供する。これらのN+/-ライブラリは、ボトムループ、AB、CD及びEF、トップループ、BC、DE、FG、又はトップ及びボトムループの任意の組み合わせ、並びに、β鎖（例えば、C及び／（又はF）の任意の組み合わせに変異を伴って構築される。「N+/-ライブラリ」について、Nは、特定の位置での最も優性なアミノ酸であり、アミノ酸の上流又は下流は、それぞれ、＋Ｎ又は−Ｎで表される。例えば、ＦｎＩＩＩの3D構造において、N+3はNの上流の3つ目の位置のアミノ酸であり、一方、N-3はNの下流の3つ目の位置のアミノ酸である。同様に、N+2及びN+1は、Nの上流のそれぞれ2つ目及び1つ目の位置のアミノ酸であり、その一方で、N-2及びN-1はNの下流のそれぞれ2つ目及び1つ目のアミノ酸である。最も主要に存在するアミノ酸からそれほど存在しないアミノ酸までNを改変することによって、その改変の影響は、Nから離れた1つ目、2つ目又は3つ目の位置のアミノ酸の存在で評価することができる。そのようなライブラリを設計する際に、固定N位置を取り巻くアミノ酸の頻度及び存在量が決定される。これらの違いはＦｎＩＩＩクレードルライブラリを生成するために使用することができる。
【０１６５】
説明の目的だけのために、CD/5ループのコンセンサス配列は、主要なアミノ酸であるGと共に、ループ位置1、2、3、4及び5がSGGEW（配列番号２７８）である。N+/-理論を用いると、Ｇは優勢アミノ酸(N)であるので、ループ位置3においてGを固定する場合、ループ位置1(N-2)、ループ位置2(N-1)、ループ位置4(N+1)及びループ位置5(N+2)のGの構造及び微細な環境効果が決定される。位置Nの固定Gの状態における各位置N-2、N-1、N+1、N+2のアミノ酸頻度が計算される。その後、ループ位置3でのGがSに改変される場合、位置N-2、N-1、N+1、N+2(つまり、ループ位置1、2及び4、5)に対するSの影響が決定されるなどなど。結局、可能な組み合わせが計算され、得られた情報は、この位置Nの特定のアミノ酸の状態の前もって定義したループ領域内の与えられた位置Nのアミノ酸分布(N-2、N-1、N、N+1、N+2)である。その後、この情報はライブラリを生成するために使用することができる。
【０１６６】
別の例では、シートCのコンセンサス配列は、シートCのシート位置1、2、3、4、5、6、7、8及び9でそれぞれGYIVEYREK（配列番号２７９）である。N+/-理論を用いると、Ｙは優勢アミノ酸(N)であるので、位置2のYが固定されて保持される場合、その後、位置1(N-1)でのG、位置3(N+1)でのＩ、位置4(N+2)でのV、位置5(N+3)でのE、位置6(N+4)でのY、位置7(N+5)でのR、位置8(N+6)でのE及び位置9(N+7)でのKの構造及び局所的な微細環境効果が決定される。さらに、位置2でのYがVに改変される場合、次いで、位置N-1、N+1、N+2、N+3、N+4、N+5、N+6及びN+7(つまり、シート位置1、3、4、5、6、7、8及び9)に対するこの改変の影響が決定される。
【０１６７】
クレードルライブラリのＦｎＩＩＩクレードル分子は、配列番号４６８−４７０に規定される配列で表わすことができる。クレードル残基は太字で示され、Ｘはβ鎖のためのアミノ酸置換を表わし、Ｙはループの長さの範囲を添字としたループのためのアミノ酸置換を表わす。天然のアミノ酸若しくは改変されたアミノ酸又は他の分子を含む任意の置換も考慮される。いくつかの実施形態では、自然の残基以外の19のアミノ酸のいずれも、クレードル残基に対し置換できる。置換は、制限されないが、タンパク質の全体としての電荷、極性又は疎水性の効果がほとんどないか、あるいはまったくない保存的置換を含んでよい。置換はさらに、1つ以上のアミノ酸の挿入及び削除を含んでよい。ＦｎＩＩＩクレードル分子は、アミノ酸位置の1つ以上でアラニン置換を含むことができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、FGループは約1-10の長さの残基であってよい。いくつかの実施形態では、FGループは約5つあるいは6つの長さの残基であってよい。いくつかの実施形態では、FGループは5つの長さの残基であってよい。いくつかの実施形態では、FGループの位置3及び／又は5はGly残基である。いくつかの実施形態では、FGループの位置1は、Ala、Gly、Ser、Asn又はAsp残基であり、FGループの位置2は、Ala、Lys、Gly、Val又はGln残基であり、FGループの位置3は、Gly、Leu、Val、Arg又はTyr残基であり、FGループの位置4は、Glu、Leu、Asp、Tyr又はPro残基であり、また、FGループの位置5は、Gly、Ser、Thr、Asn又はHis残基である。いくつかの実施形態では、FGループは6アミノ酸長であってよい。いくつかの実施形態では、FGループの位置1はGly残基であり、FGループの位置2はLeu、Val又はIle残基であり、FGループの位置3は荷電又は極性残基であり、FGループの位置4はPro残基であり、FGループの位置5はGly残基であり、また、FGループの位置6は極性残基である。いくつかの実施形態では、FGループの位置1は、Gly、Glu、Asp、Ser又はAla残基であり、FGループの位置2は、Ala、Gly、Tyr、Val又はAsn残基であり、FGループの位置3は、Gly、Gln、Lys、Arg又はGlu残基であり、FGループの位置4は、Arg、Glu、Val、Ile又はLeu残基であり、FGループの位置5はSer、Gly、Val、Thr又はLeu残基であり、またFGループの位置6は、Glu、Gly、Lys、Ser又はPro残基である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、CDループは約3-11残基長（残基の長さ）であってよい。いくつかの実施形態では、CDループは約4-9残基長であってよい。いくつかの実施形態では、CDループは4残基長であってよい。いくつかの実施形態では、CDループの位置1は、Asp、Gly、Glu、Ser又はAsn残基であり、CDループの位置2は、Gly、Ala、Asp、Asn又はGlu残基であり、CDループの位置3は、Gln、Glu、Arg、Gly又はThr残基であり、CDループの位置4は、Pro、Thr、Glu、Ser又はGln残基である。いくつかの実施形態では、CDループは5アミノ酸長（アミノ酸の長さ）であってよい。いくつかの実施形態では、CDループの位置1は、Ser、Asp、Gly、Glu又はThr残基であり、CDループの位置2は、Gly、Ser、Arg、Glu又はThr残基であり、CDループの位置3は、Gly、Glu、Arg、Lys又はThr残基であり、CDループの位置4は、Glu、Trp、Ala、Ser又はThr残基であり、CDループの位置5は、Trp、Pro、Leu、Val又はThr残基である。いくつかの実施形態では、CDループは6アミノ酸長であってよい。いくつかの実施形態では、CDループの位置1は、Gly、Asn、Asp、Glu又はLys/Ser残基であり、CDループの位置2は、Gly、Ser、Lys、Thr又はAla残基であり、CDループの位置3は、Glu、Pro、Asp、Thr又はAsn残基であり、CDループの位置4は、Gly、Glu、Leu、Arg又はSer残基であり、CDループの位置5は、Trp、Glu、Asp、Pro又はArg残基であり、また、CDループの位置6は、Glu、Val、Thr、Pro又はAla残基である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、β鎖Cは約6-14残基長であってよい。いくつかの実施形態では、β鎖Cは約8-11残基長であってよい。いくつかの実施形態では、β鎖Cは9残基長であってよい。いくつかの実施形態では、β鎖Cの位置2、4及び6は、疎水性残基である。いくつかの実施形態では、β鎖Cの位置1、3、5及び7-9は、野生型配列に対して改変される。いくつかの実施形態では、β鎖Cの位置1は、Ala、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys及びArgから構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、β鎖Cの位置3は疎水性残基である。いくつかの実施形態では、β鎖Cの位置3は、Ile、Val、Arg、Leu、Thr、Glu、Lys、Ser、Gln及びHisから構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、β鎖Cの位置5及び7-9は、Ala、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys及びArgから構成される群から選択される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、β鎖Fは約8-13残基長であってよい。いくつかの実施形態では、β鎖Fは約9-11残基長であってよい。いくつかの実施形態では、β鎖Fは10残基長であってよい。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置1、3、5及び10は、野生型配列に対して改変される。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置1、3、5及び10は、Ala、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys、Argから構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置2、4及び6は、疎水性残基である。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置7は疎水性残基である。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置7は、Arg、Tyr、Ala、Thr及びValから構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置8は、Ala、Gly、Ser、Val及びProから構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、β鎖Fの位置9は、Val、Leu、Glu、Arg及びIleから構成される群から選択される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸３０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って（との組み合わせとして）、配列番号１のアミノ酸３１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸３３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸３５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸３７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸３８に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸３９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４４に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸４９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸５０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸６７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸６９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７６に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７８に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸７９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８１、［８２、］８３、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８４に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８６に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３０、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１のアミノ酸８６に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸３３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸３５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸３７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸３９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４４に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４６に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸４８に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸７０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸７２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸７４に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸７６に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、８０、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸７９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８１、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸８０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８２、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸８１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８３、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸８２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８４及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸８３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３及び／又は８５に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸８４に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３及び／又は８４に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号９７のアミノ酸８５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸３１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸３１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸３３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸３５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸３７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸３９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸４０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸４１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸４２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸４３に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸４４に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸６６に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸６８に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７２に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７６、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７５に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７７、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７６に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７８、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７７に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７９、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７８に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸７９に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９及び／又は８１に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸８０に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、クレードルライブラリは、アミノ酸３１、３３、３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６６、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、７９及び／又は８０に対応する一つ以上の残基を伴って、配列番号１２９のアミノ酸８１に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０２５０】
Ｖ．コンピュータ支援型ＦｎＩＩＩクレードルライブラリの構築
本発明によれば、例えば、バイオインフォマティクス及び／又は構造解析を介して取得される配列情報に基づいて、ＦｎＩＩＩドメイン変異体のクレードルライブラリを作成する方法がさらに提供される。本発明のフィブロネクチンライブラリを構築する第１ステップは、ある所定の基準を満たす配列を選択することである。PFAM、ProSite及び同様のデータベースから、ＦｎＩＩＩドメインを含む配列を探索した（図１）。これらの電子データベースは、発現するフィブロネクチン及びフィブロネクチン様タンパク質配列のカタログを含み、それらのＦｎＩＩＩドメイン及び同様の配列について、(例えば、BLAST探索アルゴリズムを使用して)照会（探索）することができる。その後、ＦｎＩＩＩドメイン配列は、ドメインサブクラス、配列の相同性又は起源生物種（originating organism(s)）のような所定の基準に従ってグループ分けすることができる。
【０２５１】
本発明の基準に基づいたＦｎＩＩＩドメインの選択は、ループサイズ及び導入される最初のアミノ酸配列の多様性の両方を指示する。バイオインフォマティクスに導かれた設計によって、ループ領域は多数のＦｎＩＩＩドメインへの挿入に対して柔軟である。特定のターゲットとされたループ置換によって、全体的なスキャフォールドの安定性が最大限にされると同時に、非免疫原性の置換が最小化される。加えて、異系統で容易に全体的な多様性をスクリーニングできるように、ライブラリはサイズが適合できる。さらに、設計されたループの代表的な多様性は、多くの所定のターゲットをまだ結合できる。さらには、ループの系統的設計は、なお、リカバーされた結合クローンの以降の親和性成熟させる。
【０２５２】
その後、ＦｎＩＩＩドメイン配列が明らかにされ、次いで、介在するβ鎖及びループ領域及び構成アミノ酸が識別ないし特定される。その後、これは、既存のループ及びβ鎖の長さ、各ループの長さ及びβ鎖の長さについてアミノ酸プロファイルを決定し、したがって、これらのフレームワーク内に提供（ないし適合）することができる物理的なサイズ及びアミノ酸多様性を決定する。一旦ループとβ鎖が同定されると、各ループ及びβ鎖内の配列はアライメント（整列）され、また、次に、アライメントした配列は、ループの長さ及びβ鎖の長さに従って、グループ分けされる。シートA−Gにおけるβ鎖の長さの分布、並びに、AB、BC、CD、EF及びFGループにおけるループの長さが同定（識別）された(例えば、図４を参照)。この情報を使用して、最も一般的（common）なβ鎖の長さ及びループサイズが選択される。いくつかの実施形態では、選択されたループの長さは、CD/4、CD/5、CD/6、FG/5及びFG/6であり、また、選択されたβ鎖の長さは、β鎖Cについて９つの残基及びβ鎖Fについて１０個の残基である。
【０２５３】
各β鎖について、一つは、比較的な構造及び配列解析の両方に基づいて、好ましいループ受容体サイトを決定できる。例えば、一つは、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０、ＦｎＩＩＩ１４又は他の既知のＦｎＩＩＩドメインのいずれかの間の全体のループ及びβ鎖のスキャフォールドの構造的なオーバーレイ比較（overlay comparison）を使用することができる。正確なループ位置を同定する際に、上記のステップは、機能的リガンド結合特異性に帰結し得ない、必要な多様性ループの突然変異を極めて最小にする。
【０２５４】
一旦ループの長さが選択されると、部位特異的アミノ酸頻度解析は、1セットの天然ＦｎＩＩＩドメインにおいて、出現頻度を決定するために各ループ位置で実行される。この方法は、頻度解析、及び既存のループ配列の対応する可変性プロファイル(VP)の生成を含んでもよい（実施例６を参照）。加えて、シートC及びFの外側に面するアミノ酸が解析され、1セットの天然ＦｎＩＩＩドメインにおいて、出現頻度を決定する（図７Ｂ）。β鎖Cのアミノ酸１、３、５、７-９及びβ鎖Fのアミノ酸１、３、５、７及び１０は、クレードルライブラリでの使用を意図する。高い頻度（例えば>50%）の位置（positions）は、保存又は固定されたと考えられる。適度に高い頻度、あるいは「半保存された（semi-conserved）」アミノ酸、あるいは(２又は３が組み合わされて、>40%の構成を占める場合)は、他の位置で「野生型」として選択される。その後、これらの野生型アミノ酸は、突然変異生成、例えば、ウォークスルー突然変異生成を使用して、系統的に改変され、クレードルライブラリを生成する。「可変」位置とは、典型的には、いずれのアミノ酸も表されたセットの20%超を占めないところである。
【０２５５】
ＦｎＩＩＩドメインデータベースの可変プロファイル解析は、3つのカテゴリーに入るループ/β鎖・アミノ酸残基位置の識別を可能にし、それらは、例えば、１)保存されるべき、又は「固定されるべき」位置、２）半保存されるべき位置、及び／又は、３）多様性生成に適している可変位置の識別を可能にする。可変プロファイル解析が実行され、また、限界頻度は全体的なループ／シートの多様性を指定するのに使用される、最も望ましい配列を識別するために使用される。
【０２５６】
保存的（保存された）配列、又は、選択（選択された）半保存的配列（典型的に、半保存残基で最も頻繁なアミノ酸)は、ループ配列の「野生型」あるいは「コンセンサス」残基と考えられる。この「コンセンサス」あるいは「頻度」アプローチ（手法）は、特定の位置で最も頻繁に生じる、選択性が高い圧力下で、それら特定のアミノ酸を識別する。
【０２５７】
従って、多様性を残存するアミノ酸位置(これらの位置で存在するべき、あるアミノ酸に対する識別された優先傾向を考慮して)に導入して、これらの残基位置は典型的に固定される。アミノ酸突然変異が導入される発生頻度のための閾値は、４０％にすぎないか、好ましくは、５０％から１００％までも選択されたレベル間で変化できる。１００％の閾値頻度では、アミノ酸の突然変異生成は、ループの全位置で導入することができ、また、自然の変異体アミノ酸におけるただ一つの制限は、変異体の総数と化学的等価物が利用可能であるか否かになるであろう。
【０２５８】
前述のループ及びβ鎖のいずれかにおいて多様性を設計する場合、改変ないし修飾アミノ酸残基（例えば、ほとんどのポリペプチドで使用される、従来の２０のアミノ酸以外の残基、例えば、ホモシステイン）は、所望のときループに組み入れることができる。これは、改変アミノ酸残基が望まれる場合、典型的には、ポリヌクレオチドへ終止コドンを導入する、当該技術分野で認識された技術を使用して実行される。その後、その技術は、ポリペプチドに組み入れられるべく(例えば、終止コドンアンバー（amber）、オパール（opal）、あるいはオーカー（ochre）のいわゆるサプレッサｔＲＮＡ)改変アミノ酸に結合された改変ｔＲＮＡを提供する（例えば、Koehrer, et al., PNAS (2001) 98:14310-14315を参照）。
【０２５９】
本発明のＦｎＩＩＩドメインクレードルライブラリとそれらの構築は、改善されたＦｎＩＩＩドメインクレードル分子を生成する可能性が増加するように、配列及び構造情報を利用して行われる。構造分子置換モデリング情報も、定義されたβ鎖及びループ領域へ導入される、アミノ酸多様性の選択を導くために使用することができる。またさらに、本発明のＦｎＩＩＩドメインクレードル分子で得られた実際の結果は、反復する手法で生成されスクリーニングされる、後のＦｎＩＩＩドメインクレードル分子の選択（又は排除）、例えば、親和性成熟を導くことができる。
【０２６０】
ここに、下記のステップを含むターゲットに特異的なタンパク質結合ドメインを選択するための方法がさらに提供される：（ａ）配列番号１の少なくともアミノ酸位置３１、３３、４７、４９、７１、７３及び／又は７５に相当する、アミノ酸置換を有する、複数のＦｎＩＩＩドメインポリペプチドを含むクレードルライブラリの一以上の要素の、ターゲット特異的な結合を検出すること、及び（ｂ）ターゲットに特異的に結合するタンパク質結合ドメインを選択することと、。いくつかの実施形態では、該方法は、ここに記載した複数のＦｎＩＩＩドメインポリペプチドの変異体（例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸位置３１、３３、４７、４９、７１、73及び／又は７５に相当する、アミノ酸置換を有する、ＦｎＩＩＩドメイン）の第一調製をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、特定の特性を表すようにして識別されるポリペプチドが分離されてよい。いくつかの実施形態では、該方法は、選択されたタンパク質結合ドメインの配列の核酸及び／又はアミノ酸を決定することをさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、選択されたタンパク質結合ドメインは合成又は発現されることができる。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、コンピュータによる（in silico）モデリングは、劣った又は所望でない構造及び／又は機能を有するものと予期される任意のＦｎＩＩＩクレードル分子の生成を除去するために使用される。このように、合成されるＦｎＩＩＩクレードル分子の数は急激に縮小でき、それによって後のスクリーニング検査での信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ比）を高めることができる。また別の特定の実施形態で、コンピュータでのモデリングは、任意の適切な出所からの、例えば、遺伝子及びタンパク質配列及び三次元データベースからの、並びに／又は既に試験されたＦｎＩＩＩクレードル分子に起因する、付加的なモデリング情報で連続的に更新され、その結果、そのコンピュータによる（in silico）データベースは、その予測性能がより正確になる（図１）。
【０２６２】
さらに別の実施形態で、コンピュータによるデータベースは、解析結果、例えば、以前に試験されたＦｎＩＩＩクレードル分子の結合親和力／親和性が供給され、また解析基準（複数）に基づいて、応答するもの又は応答しないもの（例えば、良好に結合する又はそれほど良好に結合しない、ＦｎＩＩＩクレードル分子）として、ＦｎＩＩＩクレードル分子を分類する。このように、本発明の親和性成熟は、特定の配列及び構造情報と一連の機能的反応を関連付け、試験される将来のＦｎＩＩＩクレードル分子の合成を導くためにそのような情報を使用することができる。方法は、例えば、Biacore（登録商標）アッセイを用いて、ターゲットリガンドに対する特異的な結合親和力についてＦｎＩＩＩクレードル分子をスクリーニングすることが特に適切である。
【０２６３】
従って、例えば、コンピュータによるモデリングによって、所定領域でのある残基が所望の機能に参加しないであろうことが知られている場合、ループ領域又はβ鎖内の隣接していない残基の突然変異生成は望ましくなり得る。定義された領域間の等位構造及び空間的相互関係（例えば、ＦｎＩＩＩクレードル分子の定義された領域での機能的アミノ酸残基と、例えば、導入された多様性）は、考慮できモデル化することができる。そのようなモデル化基準は、例えば、アミノ酸残基の側基の化学、原子距離、結晶学的データなどを含む。従って、合成されるＦｎＩＩＩクレードル分子の数は、知的に最小化することができる。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、上記のステップの1つ以上はコンピュータ支援型である。特定の実施形態では、コンピュータ支援型ステップは、例えば、NCBI、Genbank、PFAM及びProSiteデータベースの検索、並びに、任意で、PDB構造データベースに対する結果の相互参照を含み、それによって、所望のループ多様性を設計するために、本発明のある基準が決定され使用される（図１）。本方法も、装置（例えば、コンピュータで駆動される装置）によって、一部分あるいは全体が実行されるように適応可能である。例えば、データベース検索フィブロネクチンドメイン配列選択、多様性設計、オリゴヌクレオチド合成、先に列記したもののPCRを介したアセンブリ、ならびに、与えられたターゲットを結合する候補ＦｎＩＩＩクレードル分子の発現及び選択は、インターレースした装置によって、部分的にあるいは完全に行なうことができる。さらに、一部分あるいは全体の方法を実行するための指示は、指示を行なうための電子機器で使用するために適した媒体に与えることができる。要するに、本発明の方法は、ソフトウェア（例えば、コンピュータ読取可能指示）ならびにハードウェア（例えば、コンピュータ、ロボット、及びチップ)を含む高生産性アプローチに適応可能である。
【０２６５】
フィブロネクチン及びＦｎＩＩＩ配列の分類、識別及び解析に関するさらなる詳細は入手できる、例えば、PFAM.アライメント（整列）したヌクレオチド及びアミノ酸配列をスクリーニングするためのプログラム、Johnson,G., Methods Mol. Biol. (1995) 51:1-15；及びWu, et al., 「Clustering of highly homologous sequences to reduce the size of large protein databases.」 Bioinformatics (2001) 17:282-283；サンガー研究所(pfam.sanger.ac.uk)でのPFAMデータベースを含むデータベース及び探索及び解析プログラム；the ExPASy PROSITE database (expasv.ch/prosite/)；SBASE web (hydra.icgeb.trieste.it/sbase/)；BLAST（ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/のWorld Wide Webに位置する)；CD-HIT (bioinformatics.ljcrf.edu/cd-hi/)；EMBOSS (hqmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/)；PHYLIP (evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)；及び FASTA (fasta.bioch.virginia.edu)である。
【０２６６】
バイオインフォマティック（bioinformatic）な解析は、記述的な目的のためのＦｎＩＩＩドメイン遺伝子に注目するが、他のＦｎドメイン及び他のスキャフォールド（スキャフォールド）タンパク質のための遺伝子が同様に評価されることは理解されるであろう。
【０２６７】
ＶＩ．ＦｎＩＩＩクレードルライブラリの合成
ポリペプチドのクレードルライブラリは、リボソーム・ディスプレイライブラリ、ポリソーム・ディスプレイライブラリ、ファージ・ディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリあるいはイースト・ディスプレイライブラリのフォーマットを有する、発現ライブラリによってコード化することができる。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｎＩＩＩクレードルライブラリは、ポリペプチドの定義された領域をコード化し、所定のアミノ酸のための1つのコドンを有する、個々のオリゴヌクレオチドの合成によりスクリーニングするために生成される。これは、オリゴヌクレオチド内の各コドン位置で、組み合わせることにより遂行され、野生型のポリペプチドの合成に必要なコドン又は所定のアミノ酸のコドンのいずれも、ルックスルー（look-through）突然変異生成(LTM)（例えば、米国特許公開第２００５/０１３６４２８号を参照）と呼ばれる。
【０２６９】
いくつかの実施形態で、多数のアミノ酸位置での多様性が必要な場合、ウォークスルー突然変異生成(WTM)は使用することができる（例えば、米国特許第６,６４９,３４０号；５,８３０,６５０号；及び５,７９８,２０８号；並びに米国特許公開第２００５/０１３６４２８号参照）。別の実施形態では、多様性は、AB、BC、CD、EF及びFGループのループの長さ、ループの各位置でのアミノ酸の位置分布及びループの各位置で上位7つのアミノ酸の存在度（量）に関する情報を提供することにより、DNA2.0及びGeneartのような販売者ないし販売会社から利用可能な方法を使用して作成することができる。
【０２７０】
ライブラリの生成のためのオリゴヌクレオチドの混合物は、DNA合成のための既知の方法によって容易に合成することができる。好ましい方法は、固相ベータ・シアノエチルホスホアミダイト化学（例えば、米国特許第４,７２５,６７７号参照)の使用を含む。便宜上、DNA自動合成のための機器は、ヌクレオチドの指定された試薬容器を含んで使用することができる。ポリヌクレオチドも、例えば、定義された領域を表わしているポリヌクレオチドの大きな遺伝子コンテキストないし配列（gene context）への導入又はアセンブリを促進する、制限部位あるいはプライマーハイブリダイゼーション部位を含むように合成されてよい。
【０２７１】
合成されたポリヌクレオチドは、標準的な遺伝子工学技術を使用して、より大きな遺伝子コンテキスト（例えば、一つのスキャフォールドドメイン）に挿入することができる。例えば、ポリヌクレオチドは制限酵素用のフランキング認識部位を含むために作成することができる（例えば、米国特許第４,８８８,２８６号参照）。認識部位は、自然に存在するか、領域をコードするDNAに近い遺伝子に導入される、認識部位に相当するように設計できる。二本鎖の形状に転換した後、ポリヌクレオチドは標準的な技術によって遺伝子又は遺伝子ベクターへライゲーションされる。適切なベクター（例えば、ファージ・ベクター、プラスミドを含む）によって、遺伝子はフィブロネクチン結合ドメイン分子の発現に適している、無細胞抽出液、ファージ、原核細胞又は真核細胞へ導入することができる。
【０２７２】
部分的にオーバーラップするポリヌクレオチドが遺伝子アセンブリにおいて使用される場合、1セットの縮重したヌクレオチドも、ポリヌクレオチドのうちの1つの代わりに直接的に組込むことができる。適切な相補鎖はポリメラーゼによる酵素的な伸長によって別の鎖から部分的に相補的なポリヌクレオチドの伸長反応の間に合成される。多様性を有するように、遺伝子の1つ以上のドメイン又は定義された領域が多様性をもつよう突然変異されるか、又は、工学的に改変される際、合成の段階における縮重したポリヌクレオチドの組み込みもクローニングを簡素化する。
【０２７３】
別のアプローチでは、フィブロネクチン結合ドメインは単一鎖プラスミドに存在する。例えば、遺伝子は、ヘルパーファージの使用により単一鎖分子の伝播（propagation）を可能にする、複製の線状ファージ起源を備えた、ファージ・ベクターあるいはベクターへとクローニングできる。単一鎖のテンプレートは所望の変異を表わす1セットの縮重したポリヌクレオチドでアニールでき、また、伸長及びライゲーションでき、これによって、適切なホスト（宿主）へ導入することができる分子の集合に各アナログ鎖を組み込む（例えば、Sayers,J.R., et al., Nucleic Acids Res. (1988) 16:791-802参照）。複数のドメインが突然変異生成に選択される場合、このアプローチは多数のクローニング・ステップを回避することができる。
【０２７４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法も、遺伝子にポリヌクレオチドを組み入れるために用いることができ、例えば、β鎖・フレームワーク領域へループ多様性を組入れるために用いることができる。例えば、ポリヌクレオチドはそれ自体が伸長のためのプライマーとして使用することができる。このアプローチでは、定義された領域（又は、その部分）に対応する変異原性カセットをコードするポリヌクレオチドは、互いに少なくとも一部分相補的であり、ポリメラーゼを使用して（例えば、ＰＣＲ増幅を使用して）、大きな遺伝子カセット（例えば、フィブロネクチン結合ドメイン）を形成するために伸長することができる。
【０２７５】
ライブラリのサイズは、ループ／シートの長さ、及び突然変異生成方法を使用して発現される必要のある配列多様性の量に依存して変化するであろう。例えば、ライブラリは、１０１５、１０１４、１０１３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９、１０８、１０７及び１０６未満のフィブロネクチン結合ドメインを含むように設計される。
【０２７６】
上記の記述は、対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変することによって、フィブロネクチン結合ドメインの多様性を表わすことに集中された。しかしながら、本発明の範囲が、タンパク質化学を使用して、所望のポリペプチド領域の直接的な合成によってここに示されたフィブロネクチン結合ドメインの多様性を表わす方法も包含するものと理解される。このアプローチを実行する際に、ポリヌクレオチド中間物の使用を除外できるという点を除いて、結果となるポリペプチドは本発明の特徴も組み込む。
【０２７７】
上記に記述されたライブラリについて、ポリヌクレオチド及び／又は対応するポリペプチドの形態でも、当該技術分野の技術を使用して、ライブラリはマイクロチップ、好ましくはアレイ型マイクロチップのような固体支持に付けられてもよいことが理解される。
【０２７８】
この発明の方法は、親和性成熟により、候補フィブロネクチン結合ドメイン領域分子を改変するのに特に有用である。改変はループへ、及び／又はフィブロネクチン結合ドメインのβ鎖・フレームワーク（コンスタント）領域へ導入することができる。ベータシート及びループ領域の改変は、より良好なリガンド結合特性、また所望であれば、触媒特性を備えた、フィブロネクチン結合ドメインを生産することができる。β鎖・フレームワーク領域の修飾・改変（modification）は、例えば、商業的な生産、生物学的利用性、及びリガンドのための親和性に特に有用である、例えば、可溶性又は安定性のような化学物理的性質の改良に結びつくことができる。典型的には、突然変異生成は、フィブロネクチン結合ドメイン（つまり、３つのループ領域から構成することができる、リガンド結合活性に関与する構造）のループ領域をターゲットとするであろう。好ましい実施形態では、ターゲットリガンドに対する結合分子の親和力／親和性を増加させるために、識別された候補の結合分子は、親和性成熟状態にある。１つの実施形態では、少なくとも１つのループ及び少なくとも1つのベータシートに対する修飾・改変は、ターゲット分子との結合に利用可能な増加した表面積を備えたＦｎＩＩＩクレードル分子を生産する。１つの実施形態では、少なくとも1つのトップループ、少なくとも1つの底ループ及び少なくとも1つのベータシートに対する修飾・改変は、ターゲット分子との結合に利用可能な増加した表面積を備えたＦｎＩＩＩクレードル分子を生産する。1つの実施形態では、FG及びCDループ、並びに、C及び／又はFベータシートに対する修飾・改変は、ターゲット分子との結合に利用可能な増加した表面積を備えたＦｎＩＩＩクレードル分子を生産する。1つの実施形態では、少なくとも１つのループ及び少なくとも1つのベータシートに対する修飾・改変は、異なるターゲット分子と結合することができるＦｎＩＩＩクレードル分子を生産する。
【０２７９】
一般に、本発明の実施は、他に指定がない限り、当該技術の範囲内にあり、また文献で説明される、化学、分子生物学、組換えDNA技術、PCR技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、発現システム（例えば、無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソーム・ディスプレイ及びProfusion（登録商標））、並びに、任意の必要な細胞培養の従来技術を採用する。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；DNA Cloning, Vols.1 and 2, (D.N.Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, Ed. 1984)；PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor)；Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ Press (1999)；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al., Academic Press (1990)；PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John Wiley & Son Ltd (1996)；The PCR Technique: RT-PCR, Siebert, Ed., Eaton Pub. Co. (1998)；Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel, et al., John Wiley & Sons (1992)；Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki,A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display: A Laboratory Manual, C.Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001)；Antibody Phage Display, P.O'Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border, et al., 「Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries,」 Nature Biotechnology (1997) 15:553-557; Border, et al., 「Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability,」 Methods Enzymol. (2000) 328:430-444; Pluckthun, et al.によるリボソーム・ディスプレイが記載の米国特許第６,３４８,３１５号及びSzostak, et al.によるProfusion（登録商標）が記載の米国特許第６,２５８,５５８号；６,２６１,８０４号及び６,２１４,５５３号、並びに細菌ぺリプラズマ発現（bacterial periplasmic expression）が記載の米国特許公開第２００４/００５８４０３Ａ１を参照されたい。
【０２８０】
ＶＩＩ．発現及びスクリーニングシステム
上記の技術又は他の適切な技術のうちの任意の技術によって生成されたポリヌクレオチドのライブラリは、所望の構造及び／又は活性を有するＦｎＩＩＩクレードル分子を識別するために発現しスクリーニングすることができる。ＦｎＩＩＩクレードル分子の発現は、無細胞抽出液（例えば、リボソーム・ディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核細胞又は真核細胞（例えば、イースト・ディスプレイ）を使用して行なうことができる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは無細胞抽出液で発現することができるテンプレートとして役立つように遺伝子工学的に改変される。例えば、米国特許第５,３２４,６３７号、５,４９２,８１７号及び５,６６５,５６３号に記載のベクター及び抽出液を使用することができ、また、多数のものが市販で入手可能である。ポリヌクレオチド（つまり、遺伝子型）をポリペプチド（つまり、表現型）に結合するためのリボソーム・ディスプレイ及び他の無細胞技術、例えば、Profusion（登録商標）（例えば、米国特許第６,３４８,３１５号、６,２６１,８０４号、６,２５８,５５８号及び６,２１４,５５３号参照)を使用することができる。
【０２８２】
代替として、本発明のポリヌクレオチドは、Pluckthun, Meth. Enzymol. (1989) 178:476-515; and Skerra, et al. Biotechnology (1991) 9:273-278などに記載される従来の大腸菌発現システムで発現できる。Better及びHorwitz Meth. Enzymol. (1989) 178:476によって記載されるように、変異タンパク質は、培地及び／又は細菌の細胞質中の分泌物において発現することができる。いくつかの実施形態では、ＦｎＩＩＩクレードル分子は、ompA、phoAあるいはpelBシグナル配列のようなシグナル配列をコードする配列の３´末端へ付けられる（Lei, et al., J.Bacteriol. (1987) 169:4379）。これらの遺伝子融合はジシストロニック（dicistronic）構造にアセンブリされ、その結果、それらは単一のベクターから発現でき、そして、それらが再び折りたたまれ、活性型でリカバーすることができる、大腸菌のペリプラズム空間へ分泌できる（Skerra, et al., Biotechnology (1991) 9:273-278）。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、ＦｎＩＩＩクレードル分子配列は、例えば、米国特許公開第２００４/００７２７４０Ａ１、２００３/０１０００２３Ａ１及び２００３/００３６０９２Ａ１に記載のような分泌シグナル及び脂質化部分（lipidation moiety）を使用して、原核生物（例えば、大腸菌）の膜表面上で発現される。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６,４２３,５３８号、６,３３１,３９１号及び６,３００,０６５号に記載のような、例えば、イースト・ディスプレイを使用して、酵母のような真核細胞で発現することができる。このアプローチでは、ライブラリのＦｎＩＩＩクレードル分子は、酵母の表面に発現されて表示される、ポリペプチドに融合される。
【０２８５】
本発明のＦｎＩＩＩクレードル分子の発現のための高等真核細胞も使用でき、それらは、例えば、哺乳類細胞（例えば、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ/０細胞）、ハイブリドーマ細胞、又は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。典型的には、哺乳類細胞で発現される場合のＦｎＩＩＩクレードル分子は、培地へ発現されるか、又はそのような細胞の表面に発現されるように設計される。ＦｎＩＩＩクレードル分子は、例えば、単一の個々のドメインとして、又は、同一のドメイン若しくは異なるＦｎＩＩＩ可変ドメイン型（ＦｎＩＩＩ０３-ＦｎＩＩＩ１０：ホモダイマー；ＦｎＩＩＩ１０-ＦｎＩＩＩ０８：ヘテロダイマー；ＦｎＩＩＩ１０-ＦｎＩＩＩ１０n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ０７-ＦｎＩＩＩ０７n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ１４-ＦｎＩＩＩ１４n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ０７-ＦｎＩＩＩ１０n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ１０-ＦｎＩＩＩ１４n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ０７-ＦｎＩＩＩ１４n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ０７-ＦｎＩＩＩ１０-ＦｎＩＩＩ１４n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；ＦｎＩＩＩ０８-ＦｎＩＩＩ０９-ＦｎＩＩＩ１０n、［nは1-20からの整数又は野生型若しくは可変ＦｎＩＩＩドメインである］；など）から構成できる、二量体、三量体を含む多重結合の鎖として生成することができる。
【０２８６】
発現されたＦｎＩＩＩクレードル分子（又は直接的な合成によって生成されたＦｎＩＩＩクレードル分子）のスクリーニングは、適切な手段によって行うことができる。例えば、結合活性は、標準免疫測定及び／又はアフィニティー・クロマトグラフィーによって評価することができる。触媒機能、例えば、タンパク質分解機能のための本発明のＦｎＩＩＩクレードル分子のスクリーニングは、例えば、米国特許第５,７９８,２０８号に記載のような標準ヘモグロビン・プラークアッセイを使用して達成できる。候補ＦｎＩＩＩクレードル分子が治療ターゲットを結合する活性の決定は、与えられたターゲット若しくはリガンドに対するＦｎＩＩＩクレードル分子の結合率を測定する、例えば、Biacore（登録商標）機器、又はここに記載の方法を使用してインビトロでアッセイできる。生体内解析は、多くの動物モデルのうちの任意のモデルを使用し、次に、続いてヒトにおいて適切に試験されて実施することができる。
【０２８７】
ＦｎＩＩＩクレードルライブラリは、実施例に記載されるような標準的な技法を用いて、受容細菌／酵母宿主にトランスフェクションないし導入される。酵母は、各細胞表面に表示されている各ＦｎＩＩＩ融合タンパク質の１０３-１０５のコピーを備え、１０７までのライブラリ・サイズを容易に受け入れることができる。酵母菌は、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類（FACS）又は磁気ビーズを使用して、容易にスクリーニングされ分離される。酵母の酵母真核生物の分泌システム及びグリコシル化経路もＦｎＩＩＩ型分子が細胞表面にＮ及びＯリンクの糖で表示されることを可能にする。イースト・ディスプレイの詳細は、実施例で概説される。
【０２８８】
別の実施形態では、イースト・ディスプレイ・システムは、細胞表面上にタンパク質を表示するために凝集素イースト凝着受容体を利用する。関心のあるタンパク質、この場合、ＦｎＩＩＩライブラリは、Ａｇａ２タンパク質を伴う融合パートナーとして発現される。
【０２８９】
これらの融合タンパク質は細胞から分泌され、酵母菌壁に付される、Ａｇａ１タンパク質にリンクされた二硫化物になる（Invitrogen, pYD1 Yeast Display product literature参照）。プラスミド精製(Qiagen)によって大腸菌宿主から調製されたプラスミド(例えば、pYD1)は、制限酵素、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化され、子牛の腸のアルカリフォスファターゼで末端が脱リン酸される。pYD1及びCR産物ライブラリのライゲーション、大腸菌（DH5α）形質転換及びLBアンピシリン(50mg/ml)プレート上の選択は、酵母菌宿主へのエレクトロポレーション前にライブラリを増幅するために標準的な分子生物学のプロトコルを使用して行なわれた。
【０２９０】
参照野生型ＦｎＩＩＩドメインと比較して、ターゲットリガンド（例えば、TNF、VEGF、VEGF-Rなど）に対する実質的に高い親和性を有する発現されたＦｎＩＩＩライブラリ変異体を選択するための方法は、下記のように達成できる。
【０２９１】
候補テストリガンド（例えば、TNF、VEGF、VEGF-Rなど）は、蛍光ラベルされる（上記のように、直接的か、又はビオチン−ストレプトアビジン結合による間接的のいずれか）。ラベルされた抗原を効率的に結合するライブラリ・クローンは、その後、FACSの使用によって富化される。次いで、酵母菌のこの集団ないし群は再成長され、より高い特異性及び親和性でターゲットを認識するクローンの小さな部分集団を分離するために高レベルのストリンジェンシーを使用して、選択の後の段階に付される。例えば、迅速な識別及び確認のためのＦＩＴＣラベル抗Ｍｙｃ−ｔａｇＦｎＩＩＩ結合ドメイン分子及びＦＡＣＳ解析を使用して、ライブラリは容易に高生産性フォーマットに補正ないし修正できる。さらに、発現レベルのモニター及び／又は結合親和性測定の標準化に利用することができるカルボキシル末端タグが含まれる。
【０２９２】
Ａｇａ２-ＦｎＩＩＩ融合タンパク質の表示を確認するために、培地からの酵母菌（40μl中、8×105細胞）のアリコートは、2300rpmで5分間遠心分離機にかけられる。上澄みは吸引され、また、細胞ペレットは200μlの氷冷PBS/BSAバッファー(PBS/BSA 0.5%w/v)で洗浄される。細胞は再度ペレットにされ、また、上澄みは、ビオチン化TNFα(200 nM)を含む100μlのバッファーで再懸濁する前に取り除かれる。細胞は、TNFαを結合するために２０℃で４５分間置かれ、その後、氷上の30分間のストレプトアビジン-FITC(2mg/L)での付加及び培養前にPBS/BSAバッファーで2度洗浄された。バッファーでの別の洗浄段階（round）は、PBS/BSAでの400μlの最終再懸濁の前に行なわれた。その後、細胞は、メーカーの指示通り、CellQuestソフトウェアを使用するFACScanTM (ベクトン・ディキンソン)で解析された。
【０２９３】
TNFαに対するライブラリを生成するために、酵母表示TNF-αフィブロネクチン結合ドメインライブラリの動態選択は、ビオチン化TNF-αリガンドでの細胞の初期ラベル、その後の非ビオチン化TNF-αリガンドの多過剰が存在する状態での時間依存性の追跡を含む。遅い解離動態のクローンは、追跡期間の後ストレプトアビジン-PEラベルにより識別することができ、高速FACSソーターを使用して分類ないし選別できる。Ａｇａ２-ＦｎＩＩＩ誘導の後、細胞は、飽和濃度(400nM)での２５℃、３時間攪拌下にビオチン化TNFαと培養される。細胞の洗浄後、２５℃で未ラベルTNFα(1μM)を使用して、40時間冷温追跡される。次いで、細胞はPBS/BSAバッファーで2度洗浄され、ラベルは、氷上で30分間にわたってストレプトアビジンPE(2mg/ml)抗HIS-FITC(25 nM)で行われ、洗浄され、そして、再懸濁され、次に、FACS・ARIAソーターで解析される。
【０２９４】
ライブラリ・スクリーニングは特定のリガンド又はターゲットに結合するＦｎＩＩＩ変異体を選択するために実施できる。組み合わせスクリーニングは、特定の突然変異生成(「合理的設計」)アプローチで実現可能でない、多くの変異体を容易に生成、かつ、スクリーニングすることができる。ＦｎＩＩＩでの様々なアミノ酸位置における異なるアミノ酸変異体は、縮重したヌクレオチド配列を使用して生成できる。所望の結合能を備えるＦｎＩＩＩ変異体は、生体外で、選択、リカバーかつ増幅することができる。選択されたクローンのアミノ酸配列は、選択されたＦｎＩＩＩをコードする核酸をシークエンシングすることにより容易に識別することができる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、特定のＦｎＩＩＩクレードル分子は、ここに議論された置換の前におけるポリペプチドの親和性より少なくとも2倍大きいターゲットに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、他のＦｎＩＩＩクレードル分子と比較して、親和性は少なくとも、又は、高くても、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍及び１００倍の増加を示す。
【０２９６】
ターゲット分子に対して所望の結合親和性を有するクレードルポリペプチドを識別するここに開示された方法を使用して、選択されるクレードルポリペプチドが、さらにここに提供される。いくつかの実施形態では、クレードルポリペプチドは、配列番号４-７８、８０-８５、８７-９６、９８、９９、１０１-１２８、１３０-１４１、１４３、１４５-１４７、１４９-１５９、１６１-１９９、２４０-２７７から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【０２９７】
ＦｎＩＩＩライブラリの機能のための解析及びスクリーニング
ＦｎＩＩＩライブラリは機能的活性を有するＦｎＩＩＩタンパク質についてスクリーニングするためにも使用できる。タンパク質の研究は、あるアミノ酸がそれらの構造及び機能において重大な（crucial）役割を果たすことを明らかにした。例えば、アミノ酸の個別（discrete）の数だけが酵素の機能的な事象に関与するように思われる。上記の技術又は他の適切な技術のうちのいずれかの技術によって生成されるタンパク質ライブラリは、所望の構造若しくは活性の変異を識別するためにスクリーニングできる。
【０２９８】
野生型タンパク質と生成された変異体の特性を比較することによって、個々のアミノ酸、又は、結合及び／若しくは機能的活性を与えるアミノ酸ドメインを識別することは可能である。通常、研究された領域は、結合ドメインのようなタンパク質の機能ドメインになるであろう。例えば、領域は、ＦｎＩＩＩドメインのAB、BC、CD、DE、EF及びFGループ結合領域又はβシートになり得る。スクリーニングは、任意の適切な手段によって行うことができる。例えば、活性は基質変換に適切なアッセイによって確認することができ、また、結合活性は標準免疫測定及び／又はアフィニティー・クロマトグラフィーによって評価できる。
【０２９９】
側鎖の化学的性質から、天然アミノ酸の選択された数だけが触媒作用に優勢に関与するように思える。これらのアミノ酸は、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysのような極性及び中性アミノ酸の群、荷電アミノ酸の群、Asp及びGlu、Lys及びArg、及び特にアミノ酸Hisに属する。典型的な極性及び中性の側鎖は、Cys、Ser、Thr、Asn、Gln及びTyrの側鎖である。Glyもこの群の境界上のメンバーであると考えられる。Ser及びThrは、水素結合の形成に重要な役割を果たす。Thrはβ炭素で追加的な非対称を有し、したがって、立体異性体のうちの1つだけが使用される。酸アミドGln及びAsnは、さらに、水素結合、水素供与体として機能するアミド基及び受容体として機能するカルボニル基を形成することができる。Glnは、Asnより、1つ多くのCH2基を有し、それは、極性基をより柔軟にし、主鎖とのその相互作用を縮小する。Tyrは、高いpH値で解離できる、非常に極性が高い水酸基（フェノール性のOH）を有する。Tyrは、荷電側鎖のような挙動をし、その水素結合はかなり強い。
【０３００】
ヒスチジン（His）には、6.0のpK値を備えた複素環の芳香族側鎖がある。生理学的なpH範囲では、溶液から水素イオンを取り上げた後、そのイミダゾール環は非荷電又は荷電のいずれにもできる。これらの２つの状態が容易に利用可能であるので、Hisは化学反応を触媒するために最適である。Hisは酵素の活性中心の大部分に見られる。
【０３０１】
Asp及びGluは、生理的pHで負に荷電される。それらの短い側鎖のために、Aspのカルボキシル基は主鎖に関してかなり強固である。これは、多くの触媒部位中のカルボキシル基がGluによってではなくAspによって提供される理由かもしれない。荷電した酸は、一般的に、タンパク質の表面で見出される。
【０３０２】
したがって、ＦｎＩＩＩタンパク質ドメインのいくつかの異なる領域又はループは同時に突然変異を起こすことができる。これは、タンパク質の折り重なることに機能部位又は結合部位を構築するように関連される領域などの構造的に関連する領域のアミノ酸置換の評価を可能にする。この方法は、改変された結合部位又は完全に新しい結合部位を作成する方法を提供する。ターゲットリガンドの結合をもたらすように遺伝子工学的に改変できる、ＦｎＩＩＩの2つのループ領域及び2つのβシートは、この結合部位での結合機能に寄与するために解析するべく、CD及びFGループ若しくはC及びFシート内に、同時に突然変異を起こすことができるか、又は、別々に突然変異を起こすことができる。したがって、タンパク質のリガンド結合領域への追加の「機能的に重要な」アミノ酸の導入は、同じターゲットリガンドに対する新たな改善された結合活性となり得る。
【０３０３】
従って、新しいＦｎＩＩＩクレードル分子は、この発明の方法によって適切な領域だけを変異させることにより、既存のＦｎＩＩＩポリペプチドの天然の「スキャフォールド」に設けることができる。自然に発生するＦｎＩＩＩｓの分離と比較して、この発明の方法は新たに改善された結合タンパク質の設計に適する。
【０３０４】
ＶＩＩ．キット
キットも、本発明のいくつかの実施形態で作成されるか又は使用されるものとして検討される。例えば、本発明のポリペプチド又は核酸は、キットにあるいはキットの中に提供されるライブラリに含むことができる。キットは密封容器に含むことができる。容器ないしコンテナの制限しない例は、マイクロプレート、ボトル、金属チューブ、ラミネート・チューブ、プラスチック・チューブ、ディスペンサー、加圧容器、障壁容器（コンテナ）、パッケージ、コンパートメント、又は、分散液あるいは組成物、あるいは所望のボトル、ディスペンサーあるいはパッケージが保持される、注入若しくは風成型プラスチック容器のような他のタイプの容器（コンテナ）を含む。容器（コンテナ）他の例は、グラス又はプラスチックバイアル若しくはボトルを含む。キット及び／又は容器は、その表面にしるしを含むことができる。しるしは、例えば、言葉（単語）、語句、略語、絵あるいはシンボルになり得る。
【０３０５】
容器は、本発明の所定量の組成物を分布するか又は含むことができる。組成物は、液体、流体又は半固体として分布することができる。キットは、キット及び／又は組成物を使用するための指示書も含むことができる。指示書は、組成物を使用し、且つ、維持する方法の説明を含むことができる。
【０３０６】
ＶＩＩＩ．実施例
下記の実施例は、本発明を説明するために提示されるが、本発明を制限するものではない。
【０３０７】
実施例１
ファージディスプレイライブラリ及び選択
ＦｎＩＩＩ１０遺伝子の鋳型が構築された（Koide,A., et al., J Mol Biol (1998) 284:1141-1151）。ライブラリは、多様化される位置にポリセリン配列を含んでいる「シェイブされた（shaved）」鋳型を使用して作成することができる（Koide, et al., supra, 2007 and Wojcik, et al., supra, 2010）。DsbA（Steiner, et al., Nat. Biotechnol. (2006) 24:823-831）のシグナル配列をコードする合成ＤＮＡフラグメントは、鋳型用遺伝子に融合され、また、融合遺伝子は、ファージディスプレイ・ベクターpAS38（Koide, A., et al., supra, 1998）へクローニングされた。ファージディスプレイの組み合わせ的ライブラリは、ＦｎＩＩＩ１０遺伝子へアミノ酸変異体用コドンを導入することにより構築された。ライブラリ構築の手順は以前に記載されている（Koide,A., and Koide,S., Methods Mol. Biol. (2007) 352:95-109）。
【０３０８】
ファージミド粒子は、0.2mM IPTG及びヘルパーファージ（LoConte, et al., J.Mol. Biol. (1999) 285:2177-2198; Fellouse, et al., J. Mol. Biol. (2005) 348:1153-1162）の存在する状態で、ファージミド・ライブラリでトランスフェクトされたXL1-Blue細胞を成長させることによって調製できる。ファージミド・ライブラリ選択は、以下のように行なうことができる。第一段階ないし期間（round）において、EZリンク・スルホ-NHS-SSビオチン(Sulfosuccinimidyl 2(biotinamido)-エチル-1,3-dithiopropionate; Pierce)で改変されたターゲットタンパク質（0.5μM）は、0.5%のTween20を含有するTBS(50mMトリスHClバッファー、pH 7.5、150mM NaCl) (TBST)で十分な量のストレプトアビジン結合の磁気ビーズ(Streptavidin MagneSphere（登録商標） Pramagnetic Particles; Promega, Z5481/2)と混合された。このターゲット溶液に、0.5%のBSAを加えた1mlのTBST中で懸濁された1012-13のファージミドが加えられ、そして、その溶液は混合され、室温で１５分間培養される。ビーズをTBSTで2度洗浄した後に、結合したファージミドを含有するビーズ懸濁液は、新鮮な大腸菌培養に添加される。以前に記載されたように（Fellouse, et al., supra, 2005）、ファージミドは増幅された。第二段階では、ファージミドは0.5%のBSAを加えたTBST中のターゲット（0.1μＭ）と培養され、次に、ストレプトアビジン結合の磁気ビーズによって捕獲された。ターゲットタンパク質に結合されたファージミドは、100mM DTTのTBST溶液を含むビオチン化試薬内でリンカーを開裂することにより、ビーズから溶出された。上述のように、ファージミドは洗浄されて回収される。増幅後、第三段階の選択が、0.02μＭのターゲットを使用して行なわれる。ファージディスプレイは、結合要素を生成するための確立している技術で、Kontermann&Dubel (ed.), In:Antibody Engineering: Miniantibodies, 637-647, Springer-Verlag, (2001)及びWO92/01047のような多くの出版物に詳細に述べられている。それら各々は、その全体が参照によってここに組込まれる。
【０３０９】
実施例２
酵母表面ディスプレイ
酵母表面の実験は、Boder,E.T., and Wittrup,K.D., Methods Enzymol. (2000) 328:430-444にわずかな改変を加えることにより実施される。抗ＦＬＡＧ抗体（Sigma）と交差反応するために、酵母ディスプレイベクターの発現タグ、ｐＹＤ１（Invitrogen）は取り除かれた。３回の選択後のファージミド・ライブラリのクレードル分子のための遺伝子はＰＣＲを使用して増幅され、EcoRIとXhoIで切断された改変ｐＹＤ１と混合され、酵母ＥＢＹ１００細胞はこの混合物と形質転換される。形質転換された酵母細胞は、３０℃のＳＤ−ＣＣＡ培地で二日間成長され、次いで、３０℃のＳＧ−ＣＣＡ培地で細胞を２４時間成長することによってモノボディ（monobody）発現が誘発される。
【０３１０】
モノボディを表示する酵母細胞の選別（ソート）は下記のように実施される。酵母細胞はビオチン化されたターゲット（50nm）及びマウス抗Ｖ５抗体（Sigma）で培養され、次いで、洗浄後、抗マウス抗体−ＦＩＴＣ複合体（Sigma）及びNeutrAvidin（登録商標）−PE複合体（Invitrogen）で培養される。染色された細胞は、ＦＩＴＣ及びＰＥ強度に基づいて選別される。典型的には、上位約１％のＰＥ強度及び上位１０％のＦＩＴＣ強度を表す細胞が回収される。
【０３１１】
ＦＡＣＳ選別後、個々のクローンが解析される。概算のＫｄ値は、ＦＡＣＳ解析による滴定曲線から決定される（Boder and Wittrup, supra, 2000）。アミノ酸配列はＤＮＡ配列から推論される。
【０３１２】
モノボディとターゲットの相互作用に対する大腸菌溶解物の影響は、ＯＤ６００が５０の細胞懸濁液から調製された大腸菌溶解物の存否における結合を比較することによって試験される。
【０３１３】
実施例３
タンパク質発現及び精製
核酸をコードする任意のターゲットは、適切な発現ベクターにクローニングされる。一つの実施例において、モノボディの遺伝子は、Ｈｉｓ６tagがＨｉｓ１０tagと置き換わっている、ｐＨＦＴ1（Huang, et al., supra, 2006）の誘導体である、発現ベクターｐＨＦＴ２にクローニングされる。タンパク質発現及び精製は、前に記載されたように実施することができる（Huang, et al., supra, 2006）。
【０３１４】
ＦｎＩＩＩポリペプチド又はターゲット分子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターは発現のための大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入され、ポリペプチドを得る。本発明で使用されるポリペプチドは、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載の方法又は同様の方法を使用して、宿主細胞にそれをコードするＤＮＡを発現することによって生成できる。組換えベクターは、適切な発現ベクターのプロモーターの下流にｃＤＮＡを挿入することによって生成される。次いで、ベクターは発現ベクターに適切な宿主細胞に導入される。関心のある遺伝子を発現することができるかぎり、宿主細胞は細菌（例えば、大腸菌）、動物細胞などを含む、任意の細胞であってよい。発現ベクターは、使用される宿主細胞又はポリペプチドをコードするDNAを転写することができるような位置で、適切なプロモーターを含む染色体へ統合することができるベクターで、自律的に複製することができる。
【０３１５】
実施例４
リボソーム・ディスプレイ
リボソーム・ディスプレイは、無細胞生体外結合転写/翻訳系を利用して、タンパク質ライブラリを生成する。ＦｎＩＩＩライブラリ遺伝子は、mRNAの末端に到達する際に、リボソームを開放させず停止させる末端の終止コドンを有しないカッパ光免疫グロブリン遺伝子の上流に挿入される。さらに、カッパドメインスペーサーは、ＦｎＩＩＩ結合ドメインがその同系統のリガンドを認識するためによりよいアクセシビリティを有するように、リボソーム複合体から物理的にＦｎＩＩＩタンパク質を引き離す役割を供する。mRNAライブラリは、S30大腸菌リボソーム抽出調製液（Roche）又はウサギ網状溶解物（Promega）のいずれかへ導入される。いずれの場合も、発生期のmRNAの５´末端はリボソームに結合し、翻訳を受ける。翻訳中に、リガンド結合タンパク質は、高分子複合体でそのmRNA前駆体と共にリボソームに非共有結合で付加されて維持される。
【０３１６】
次いで、機能ＦｎＩＩＩタンパク質は、磁気ビーズ又はマイクロタイターウェル表面のいずれかに付加される特定のリガンドに結合することができる。富化プロセスにおいて、特定のＦｎＩＩＩバインダーが溶出される前に、非特異性の変異体が洗浄される。結合したmRNAは、カッパ遺伝子の5´ＦｎＩＩＩ及び3´部分に特異的なプライマーを用いるRT-PCRによってそれぞれ検出される。その後、増幅された二本鎖ｃＤＮＡは、配列解析とタンパク質生成のため発現ベクターへクローニングされる。
【０３１７】
原核生物の翻訳反応において、反応ミックスないし混合物は、110mlの全容積中、0.2Mグルタミン酸カリウム、6.9mMの酢酸マグネシウム、90mg/mlのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(Fluka)、50mMのトリス酢酸塩(pH 7.5)、0.35 mMの各アミノ酸、2mM ATP、0.5mM GTP、1mM cAMP、30mMアセチルリン酸、0.5mg/mlの大腸菌ｔＲＮＡ、20mg/mlのフォリニン酸、1.5%のPEG 8000、40mlのS30大腸菌抽出液及び10mgのmRNAを含む。翻訳は、３７℃で７分間行なうことができ、その後に氷冷選択バッファー(50mMトリス酢酸塩(pH 7.5)、150mM NaCl、50mM酢酸マグネシウム、0.1%Tween20、2.5mg/mlのヘパリン)の５倍希釈によって、リボソーム複合体は安定させることができる。
【０３１８】
ターゲットリガンドのための親和性選択
安定したリボソーム複合体は、ビオチン化ハプテン（50nM蛍光ビオチン（Sigma））又は抗体（100nMのIL-13ビオチン化（Peprotech））と適切に４℃で１〜２時間培養でき、続いて、ストレプトアビジンで皮膜されたＭ２８０磁気ビーズ（Dynal）で捕獲できる。次いで、ビーズは洗浄されて、非特異的に結合したリボソーム複合体が取り除かれる。原核生物の選択において、氷冷選択バッファーでの洗浄を５回行うことができる。真核生物の選択において、０．１％ＢＳＡと５ｍＭ酢酸マグネシウムを含有するＰＢＳでの洗浄が３回行われ、続いて、ＰＢＳだけで一度洗浄される。次いで、真核生物の複合体は、３７℃で２５分間にわたって、40mM Tris-HCl、6mM MgCl2、10mM  NaCl、10mM CaCl2での10U DNAse Iで培養でき、続いて、さらなる洗浄がＰＢＳ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１％Tween20で３回される。
【０３１９】
選択されたリボソーム複合体からｍＲＮＡの回収
特定の破砕ステップなしのｍＲＮＡ回収の解析において、磁気ビーズに結合したリボソーム複合体は、逆転写反応へと、直接的に処理できる。リボソーム複合体破砕による原核生物の選択からのｍＲＮＡの回収について、選択された複合体は、４℃で１０分間にわたって、ＥＢ２０［50 mM トリス酢酸塩 (pH 7.5)、150mM NaCl、20mM EDTA, 10 mg/ml Saccharomyces cerevisae RNA］で培養できる。真核生物の選択からのｍＲＮＡの回収における２０ｍＭのＥＤＴＡの効率を評価するために、リボソーム複合体は、４℃で１０分間にわたって、［ＰＢＳ２０（PBS、20 mM EDTA、10 mg/ml S. cerevisae RNA）］で培養できる。ｍＲＮＡは市販のキット（High Pure RNA Isolation Kit、Roche）を用いて精製できる。原核生物のサンプルにおいて、キットのDNAse Iによる消化のオプションが行われたが、しなしながら、DNAse Iによる消化は選択後の洗浄中に行われるたので、このステップは真核生物のサンプルには必要ない。逆転写は、４ｍｌの精製されたＲＮＡ又は４ｍｌの固定されて選択されたリボソーム複合体（つまり、ビーズ懸濁液）で実行できる。
【０３２０】
原核生物のサンプルにおいて、反応物は50mM Tris-HCl (pH 8.3)、75mM KCl、3mMMgCl2、10mMDTT、1.25プライマー、0.5mM PCR核酸ミックス (Amersham Pharmacia)、1U  RNAsin (Promega) 及び 5U SuperScript II (Invitrogen)を含み、５０℃で３０分間の培養が行われた。真核細胞のサンプルにおいて、反応物は50mM Tris-HCl (pH 8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mMスペルミン、10mM DTT、1.25mM RTプライマー、0.5 mM PCR核酸ミックス、1 U RNasin 及び 5 U AMV逆転写酵素(Promega)を含み、４８℃で４５分間の培養が行われた。
【０３２１】
選択結果のＰＣＲ
完全長の構成物の増幅を可視化するために、エンドポイントＰＣＲが実行できる。各逆転写反応の５ｍｌサンプルは、0.25mM PCR核酸ミックス、0.25mM フォワードプライマー(T7B若しくはT7KOZが、それぞれ、原核生物及び／又は真核生物の実験に対して) 及び 0.25mM RTプライマーを含む20mM Tris-HCl (pH 8.4)、50mM KCl、1mM MgCl2、 5% DMSO溶液中の2.5ＵのＴａｑポリメラーゼ（ロシュ）で増幅できる。サーマルサイクルは９４℃で３分間、次いで、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間を３０サイクル、そして、最終ステップを７２℃で５分間行う。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイド染色したアガロースゲルでの電気泳動によって可視化された。次いで、分離したＰＣＲ産物は、溶解性のタンパク質生成のための細菌のｐＢＡＤ発現ベクターへサブクローニングできる。
【０３２２】
細菌の発現及び生成
コンピテント大腸菌宿主細胞は、取扱説明書（インビトロジェンＰＢＡＤ発現システム）の通りに調製される。簡潔に述べれば、４０μｌのＬＭＧ１９４コンピテント細胞及び０．５μｌのｐＢＡＤＦｎＩＩＩ構成物（ほぼ１μｇＤＮＡ）は、共に氷上で１５分間培養でき、この後、１分間の４２℃ヒートショックが適用された。次いで、細胞は、ＬＢ−Ａｍｐプレートにプレーティングし３７℃でオーバーナイト成長する前に、ＳＯＣ培地において３７℃で１０分間にわたって回収される。ＦｎＩＩＩ生成のための最適なL-アラビノース誘導濃度を初期段階で決定するために、小規模の液体培養において、翌日、単一コロニーが取られる。ＯＤ６００＝０．５に到達した後の各クローンの複製物は、室温でオーバーナイト成長した後に、L-アラビノースの連続（1:10）滴定（0.2%から終濃度0.00002%へ）で誘起されて試験することができる。試験培養（１ｍｌ）は収集されてペレットにされ、また、100μｌ 1×BBSバッファー（10mM、160mM NaCl、200mMホウ酸、pH=8.0）が、１時間（３７℃）にわたるリゾチーム溶液50μlの添加前に細胞を再懸濁するために添加される。リゾチーム消化からの細胞上清は遠心分離の後に収集でき、また、MgSO4は終濃度40mMまで添加することができる。この溶液は、PBSの予め平衡に保たれたNi-NTAカラムに適用することができる。Ｈｉｓタグ結合のＦｎＩＩＩサンプルは、PBSバッファーで２度洗浄され、それに対し溶出が250mMイミダゾールの追加で達成できる。可溶性のＦｎＩＩＩ発現の純度は、SDS-PAGEによって検査できる。
【０３２３】
実施例５
ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４ドメインで例証されたＦｎＩＩＩドメインに基づいたクレードルライブラリの設計
この実施例では、フィブロネクチン結合ドメインライブラリ配列のために外側に向かって面するループ間の3つのβ鎖と共に、ユニバーサルCD及びFGループ配列は、バイオインフォマティクス及び本発明の基準を使用して、識別され選択される。このプロセスの一般化された概略図は、図１に示される。
【０３２４】
配列
7th FnIII domain (FnIII07)−FINC_HUMAN(1173-1265):
PLSPPTNLHLEANpDTGVLTVSWERSTTPDI TGYRITTTPTNGQQGNSLEEVVHADQSSCTFDN LSPGLEYNvsVYTvKDDKESVpISDTllP （配列番号 9 7 )
【０３２５】
10th FnIII domain (FnIII10) −FINC_HUMAN(1447-1542):
VSDVPRDLEVVAATpTSLLI SWDAPAVTVRYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATI SGLKP GVDYTITVYAVTGRGDsPASSKpISINYRTEI （配列番号 2 8 0 )
【０３２６】
14th FnIII domain (FnIII14) −FINC_HUMAN(1813-1901):
NVSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSYTITGLQPG TDYKIYLYTLNDNARSSpWIDAST （配列番号 1 2 9 )
【０３２７】
アライメント（整列）
以下は、ＦｎＩＩＩリピート７、１０、１４（それぞれ、配列番号９７、２８０、１２９）の配列アライメントである。構造上保存された疎水性コア残基は、太字で示される。
2013539362.tif 000003
【０３２８】
クレードルの定義
クレードルと見なされるフィブロネクチンの部分は、外側へ面するループ間の3つのβ鎖のアミノ酸と共に、ループＣＤとＦＧである（図２及び３）。クレードル残基は、以下に示す配列（それぞれ、配列番号９７、２８０、１２９）において太字で強調される。
2013539362.tif 000004
【０３２９】
クレードルループの分布
フィブロネクチンファミリーのアライメント、ＰＦ０００４１.fullは、ストックホルムのＰＦＡＭからダウンロードされた（1.0フォーマット（format）はインターネット（World Wide Web）上、pfam.sanger.ac.uk/family/PF00041#tabview=2に位置する）。FGループはPF00041.fullで切り取られ、米国特許公開２００９/０１７６５４Ａ１からのデータが代わりに使用された。FGループは配列TGRGDSPASSKPIを含むよう定義され、かつ、末端のT及びＩはクレードルのFGループの一部として定義されない。その結果、米国特許公開２００９/０１７６５４Ａ１からのFGループにおける分布データは、当該分布での各ループ長から２つ分を差し引くことにより修正される。
【０３３０】
ＢＣループは、保存されたＷの前のアミノ酸、及び、保存されたＹまで（Ｙは含まず）の配列１であるＤＥループの米国特許公開２００９/０１７６５４Ａ１での定義に基づいたPF00041.fullにおいて計算された。ＢＣループはPF00041.fullの１２５−２４８カラムに対応する。BCループは抽出され、かつ、ギャップが除去された。各ループの長さが決定された。また、ループ長の範囲は１−２６であることが分かった。ループの長さの分布が決定された。
【０３３１】
その結果はBC_Loop.txtとして取得され、エクセル（登録商標）にフォーマットされて、BC_Loop.xlsxとして保存され、図４Ａで示された表及びグラフとなる。下記は、クレードルループ／シートを有するＦｎＩＩＩ１０(配列番号２８０)の配列であり、クレードルループ／シートは太字で示される。
2013539362.tif 000005
【０３３２】
CDループの前に位置するシートはβ1（さらにシートCとも称する）と指定され、そして、配列YYRITYGET（配列番号２８０の残基31-39）を含んだ。CDループは配列GGNSPV（配列番号２８０の残基40-45)であった。CDループに直接後続のシートはβ2（さらにシートDとも称する)であり、そして、配列QEFTV（配列番号２８０の残基46-50)を含んだ。FGループの前に位置するシートはβ3（さらにシートFとも称する）であり、そして、配列DYTITVYAVT（配列番号２８０の残基67-76）を含んだ。FGループは配列GRGDSPASSKP（配列番号２８０の残基77-87）であった。β1は236−271カラムに対応した。CDループは271−317カラムであった。β2は318−323カラムであった。β3は400−415カラムであった。
【０３３３】
各シート又はループの分布は、適切なカラムを使用して、BCループと同じパイソン（Python）・コードで計算された。長さの分布は、シート、β1−β3にはフィブロネクチン分子内のシートの構造の機能ないし役割（duties）と良好に相関する長さの保存が高度にあることを示した（図4A及び4C）。クレードルのCD及びFGループは、ループ長のワイドアレイ（分布）の承認を示す（図4B及び4D）。
【０３３４】
クレードルのβシートの配列保存
β1長の９、β2長の４4及びβ3長の１０のアミノ酸配列は、配列保存のために解析された。
【０３３５】
同じコードがβ2及びβ3の分布を計算するために使用された。位置1、3、5、7及び9はクレードルライブラリの設計に関心ある位置であり、図５Ａで示されるような適度に低い配列保存を示した。位置２は、ベータ・サンドイッチの反対側のシートからのトリプトファンを介して重要なパック機能（packing roles）がある、高度に保存されたチロシンであると知られている（図５Ａ）。位置４及び６は、構造中のベータ・サンドイッチのパック機能をさらに有し、高い配列保存を示す（図５Ａ）。位置２及び４は、クレードルライブラリにおける関心の位置であり、低い保存を示した（図５Ｃ）。全体的にβ2は、β1又はβ3ほど高度に保存されない（図５Ｂ）。β1のように、β3の奇数位置はライブラリで使用されることが意図され、低度から適度な保存を示し、また構造上の支持機能を有する位置でさえ高い配列保存を示す。
【０３３６】
保存はＦｎＩＩＩ７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４にマッピングされ、β1−β3の図及びボール/スティック状の図が、図６に示され、保存に依存して着色して示される（白＝高度保存、灰色＝適度な保存、黒＝低度の保存）。
【０３３７】
結合表面の領域（面積）
クレードルライブラリがトップ又はボトム側のライブラリに提供する注目すべき利点は、図６に示されるようにフィブロネクチンにおける結合表面の表面積の増加である。フィブロネクチンライブラリを結合するトップ側は、BC、DE及びFGループから構成される。ボトム側ライブラリはAB、CD及びEFループである。クレードルは3つのβ鎖と共にCDとFGのループである。
【０３３８】
下記のアライメント（それぞれ配列番号９７、２８０、１２９）は、トップ側の残基を太字で示す。
2013539362.tif 000006
【０３３９】
下記のアライメント（それぞれ配列番号９７、２８０、１２９）は、ボトム側の残基を太字で示す。
2013539362.tif 000007
【０３４０】
下記のアライメント（それぞれ配列番号９７、２８０、１２９）は、クレードル（cradle）残基を太字で示す。
2013539362.tif 000008
【０３４１】
解析の概要
下記の表１（図２Ｂも）は、クレードルがトップ側ループ又はボトム側ループのおよそ２倍の結合表面を提供し、ライブラリ設計のために意図された残基がトップ側又はボトム側ライブラリよりも少ない保存を有することを示す。
表１  ループの表面面積
2013539362.tif 000009
【０３４２】
さらに、フィブロネクチン分子中のループのうち、CDとFGのループだけには許容されたループ長における大きな変異がある。長さの変異は、これらのループが、位置2のロイシンの>95%の配列保存と共に、ＦｎＩＩＩ１０配列GLKPGV（配列番号２８０の残基６１−６６）で定義される、ループ長6の>90%の保存を有するEFループのようなトップ又はボトム側ループより多くの変異を許容するであろうことを示し得る。クレードルは最大のベータシートの3つのβ鎖を含むが、それはトップループ又はボトムループよりも、改変するためのより多くのアミノ酸残基を提示する。下記のアライメントは、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４（それぞれ配列番号９７、２８０、１２９）のための配列を示し、ここにトップループはイタリック体であり、ボトム側ループは下線で強調され、また、クレードル残基は太字である。ライブラリ設計を受る可能性のある残基だけが示される。
2013539362.tif 000010
【０３４３】
ループ長の変異が適用されない場合、トップ側、ボトム側及びクレードルは、使用することができる１９−２３、１２−１４及び１９−２４残基をそれぞれ含む。トップ及びボトム側は、その長さが積極的に変異することができる1つだけのループを含んでおり、一方、クレードルはそれらを両方とも含む。
【０３４４】
実施例６
多様な哺乳類のＦｎＩＩＩドメインアライメントの作成
プロファイルは、ヒトのフィブロネクチン・タンパク質、ユニプロット（uniprot）FINC_HUMAN又はP02751で見出されるＦｎＩＩＩドメインを使用して作成された。
【０３４５】
下記のリストはプロファイルメンバーを示す。
2013539362.tif 000011
【０３４６】
各プロファイルメンバーのファスタ（fasta）配列はユニプロトエントリー（Uniprot entry）に由来した。配列はClustal X 2.0.11でアライン（整列）した。ＦｎＩＩＩ１０、RCSB entry 1fnaの結晶構造は、二次構造を強調し、かつ後の解析のためのアライメントの領域を定義するために使用された。フィブロネクチン上のシートはA−Gと表示され、タンパク質のN末端からC末端に向って命名された。
【０３４７】
ループはどのシート間に（ループが）あったかに従って（命名）ラベルされた。例：ループＣＤはシートＣとシートＤとの間にあった。
【０３４８】
アライメントプロファイル
下記のアライメント（FnIII_template.aln）（それぞれ配列番号１００、９７、１２９、２８１−２９２）は、プロファイル１としてClustal Xにロードされた。
CLUSTAL 2.0.11マルチプル配列アライメント（multiple sequence alignment）
2013539362.tif 000012
【０３４９】
哺乳類フィブロネクチン配列
ＦｎＩＩＩドメインアライメントはPFAMから得られ、PF00041.fullとして保存された。PFAMからのアライメントは、FGループ及びシートG全体のC末端部で断たれた。そのアライメントはストックホルム1.0フォーマットであった。
【０３５０】
ファイルfn3.inは1985のユニークな哺乳類配列を含んでおり、プロファイル２としてClustal Xにロードされた。プロファイル２中の配列はすべてプロファイル１にアライメントされた。アウトライアー（外れないし異常なもの）は削除され、プロファイル２中の配列はすべてプロファイル１にアライメントされた。プロファイル２のための最終アライメントは1750の配列を含んだ、fn3_final.alnであった。
【０３５１】
各タンパク質が1行のラインを持つように、ファイルfn3_final.alnは再フォーマットされ、ＦｎＩＩＩ１０のC末端を過ぎたアミノ酸はすべてトリム（trim）され、また、ヘッダーがトップに加えられた。ファイルはfibronectins.alnとして保存され、さらなる解析のための基礎アライメントであった。
【０３５２】
アミノ酸分布
2010年7月15日現在のSWISS_PROTリリースはｆａｓｔａフォーマットでダウンロードされた。リリースは総計182,829,264のアミノ酸の非余剰の配列518,415を含んだ。SWISS_PROTリリースでのアミノ酸分布はランダム発生の参照として計算された。
表２  アミノ酸分布の表
2013539362.tif 000013
【０３５３】
哺乳類ＦｎＩＩＩドメインモチーフ
下記に哺乳類ＦｎＩＩＩドメインモチーフを示す。キー：Ｈ＝親水性、Ｐ＝極性、Ｂ＝塩基性、Ａ＝酸性、Ｃ＝荷電、Ｘ＝選択なし、シートは太字で示され、特定のアミノ酸は下線で強調される。添字は、％表示がないものは長さの変異を示し、％表示のものは出現率を示す。
2013539362.tif 000014
【０３５４】
クレードルライブラリの記述
クレードルライブラリは、元来、ループＣＤ及びＦＧを伴うシートＣ、Ｄ及びＦとして定義されていた。シートＤは、フィブロネクチン分子の外部にあり、結合残基に著しく寄与しそうもない。クレードルライブラリの定義は、ループCD及びFGを伴うシートC及びF、並びにその様々な組合せないしコンビネーションであるように正確化される。
【０３５５】
ヒトフィブロネクチン配列（それぞれ配列番号２９２、２８８、２８９、２８３、２８４、２９１、９７、２８１、２８５、１００、２９０、２８７、２８２、１２９及び２８６）にマッピングされたクレードルライブラリを下記に示す。クレードルライブラリは太字で示す。
2013539362.tif 000015
【０３５６】
トップ側ライブラリはループBC、DE及びFGであり、ボトムライブラリはループAB、CD及びEFである。ABループには67.4%の確率でトレオニン又はセリンである位置１を備えた3アミノ酸長の制約がある。BCループは、28.8%超保存された個々の長さのないループ長の多大な変異を容認する。しかしながら、BCループは、すべてのBC長に>92%で保存され、フィブロネクチンを適切に折り畳むために必要な位置１で重要なトリプトファン残基を含む。さらに、BCループの位置４は>33%の保存のプロリンであり、また、N-１位置は疎水性残基である。
【０３５７】
CDループは、5つのアミノ酸を中央とした長さのポアソン分布を有する。CDループで最も豊富なアミノ酸は、位置２及びN-2のグリシンであり、位置５がある場合、30%の確率で、それはトリプトファンである。DEループには4アミノ酸長の制約がある。EFループには高度の配列保存を備えた6アミノ酸長の制約がある。
位置１：４４．２％保存のグリシン
位置２：９７．８％保存のロイシン、バリン又はイソロイシン
位置３：荷電又は極性アミノ酸
位置４：５７．５％保存のプロリン
位置５：４４．４％保存のグリシン
位置６：極性アミノ酸である傾向がある
【０３５８】
FGループの長さは、>43%の確率でグリシンを有する位置３及び５を伴い、５（３２．６％）又は６（６２．１％）のいずれかである。残りの位置は、所定のアミノ酸のために<22%の保存を有する。
【０３５９】
トップ側ライブラリは、DEループの長さの制約及びBCループ中の保存されたアミノ酸により制限される。ボトム側ライブラリは、ABループに対する3アミノ酸長の制約及びEFループの全体にわたる高度の保存によって制限される。
【０３６０】
フィブロネクチンの疎水性パッキング（hydrophobic packing）に最も占めるアミノ酸は、BCループ位置１（W）、シートC位置２（Y/F）、EFループ位置２（L）及びシートF位置２（Y）である。トップ及びボトム側両方のライブラリは、有効な変異を妨害し得る、重要なパッキング残基を有するループを含む。クレードルライブラリ・ループは構造上必要なアミノ酸を含んでいない。さらに、クレードルライブラリは、結合表面を拡張するためにシートC及びFの外側に向かうアミノ酸を利用する。
【０３６１】
クレードルライブラリβ鎖Ｃ及びＦは、フィブロネクチン分子で最長の２つであり、また外部に向かって面するアミノ酸への改変が行なわれる場合にタンパク質を安定させる反平行のβシートを形成するように広範囲に相互作用する。シートCのアミノ酸１、３、５、７−９及びシートFのアミノ酸１、３、５、７、１０はクレードルライブラリ（図７Ａ）での使用を意図する。
【０３６２】
シートC及びFの残基は、単純化されたアミノ酸タイプ・スキームを使用して解析された。ここで、A/G/P/S/Tは小さく、柔軟であると考慮され、D/E/N/Q/H/K/Rは極性／荷電であると考慮され、F/Y/W/I/L/V/Ｍは疎水性であると考慮され、またCは二硫化物であると考慮される。
【０３６３】
図７Ｂは、シートC長さ9(SF=アミノ酸A/G/P/S/T; CP=D/E/N/Q/H/K/R; H=F/Y/W/I/L/V/Ｍ; C=C)の単純化されたポジショナルディストリビューションないし位置分布（positional distribution）を示す。位置２、４及び６は、疎水性アミノ酸に対する明らかな優位性を示し、フィブロネクチンのコア（中心）に向かって内側に指向している。位置３は、疎水性アミノ酸に対して優位であったが、その優位性は強度でなく、溶媒に向かって外側に指向する。シートC、長さ９、位置３の保存による上位１０のアミノ酸は次のとおりであった：
2013539362.tif 000016
【０３６４】
位置１、５、７、８及び９は、わずかな柔軟さ又は荷電／極性アミノ酸に対する明らかな優位性を示し、溶媒に向かって外側に指向していた。
【０３６５】
図７Ｂは、シートF長さ10の単純化されたポジショナルディストリビューションを示す。位置２、４及び６は、疎水性アミノ酸に対する明らかな優位性を示し、フィブロネクチンのコアに向かって内側に指向していた。位置７は、疎水性アミノ酸に対して優位であったが、その優位性は強度でなく、溶媒に向かって外側に指向する。シートＦ、長さ１０、位置７の保存による上位５のアミノ酸は次のとおりであった：
2013539362.tif 000017
【０３６６】
位置１、３、５及び１０は、わずかな柔軟さ又は荷電／極性アミノ酸に対する明らかな優位性を示し、溶媒に向かって外側に指向していた。位置９は、疎水性アミノ酸に対して優位であった。シートＦ、長さ１０、位置９の保存による上位５のアミノ酸は次のとおりであった：
2013539362.tif 000018
【０３６７】
位置８は、80%の保存でアラニン又はグリシンを備えた高度に保存されたアラニン残基を含んだ。シートＦ、長さ１０、位置８の保存による上位５のアミノ酸は次のとおりであった：
2013539362.tif 000019
【０３６８】
結合表面の比較
下記にＦｎＩＩＩ０７ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４（それぞれ配列番号９７、１００及び１２９）におけるクレードルライブラリを示す。
2013539362.tif 000020
【０３６９】
下記にＦｎＩＩＩ０７ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４（それぞれ配列番号９７、１００及び１２９）におけるトップ側ライブラリを示す。
2013539362.tif 000021
【０３７０】
下記にＦｎＩＩＩ０７ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４（それぞれ配列番号９７、１００及び１２９）におけるボトム側ライブラリを示す。
2013539362.tif 000022
表３  各ライブラリの結合表面
2013539362.tif 000023
表４  トップ側ライブラリに対する各ライブラリの結合表面
2013539362.tif 000024
【０３７１】
クレードルライブラリの要約
ＦｎＩＩＩドメインのβ鎖Ｃ、β鎖Ｆ、ループＣＤ及びループＦＧから構成されるクレードルライブラリは、指向性ループに基づいたトップ及びボトム側ライブラリよりも良好な安定性及び利用可能な結合表面を提示する。
【０３７２】
抗原を結合すると知られているCDR-H3ドメインにおける分布と比較して、図８は、残基及びアミノ酸変化のアミノ酸分布を示す。図９Ｃは、ＸとＹで示したクレードル残基に望まれる偏った（biased）アミノ酸分布を示す。
【０３７３】
図９Ｄ-９Ｆは、ＦｎＩＩＩ０７ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４の配列におけるクレードルライブラリ定義のマッピングを示す。図９Ｄ：ＦｎＩＩＩ０７ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４のクレードル残基のアライメント。βシートは黒色背景上の白字の残基として示され、また、ループは黒字で示される。クレードル残基は、βシートのアミノ酸分布を表すＸと、添字として与えられるループ長の範囲の、ループのアミノ酸分布を表わすＹを伴って、太字で示される。図９Ｅ：ＦｎＩＩＩ０７ＦｎＩＩＩ１０及びＦｎＩＩＩ１４のβシートＣ及びＦ並びにループＣＤ及びＦＧのクレードル残基を例示するアライメント。βシートは黒色背景上の白字の残基として示され、また、ループは太字で示されたクレードル残基を伴い黒字で示される。図９Ｆ：ＦｎＩＩＩ構造要素残基範囲及びＦｎＩＩＩクレードル残基範囲が示される。
【０３７４】
［実施例７］
リゾチーム、Ｆｃ及びヒト血清アルブミン（HSA）に結合するクレードル分子
本実施例は、計算されたデザインライブラリを使用して、ターゲット分子に結合するクレードル分子を生じさせる原理についての証拠を実証する。上記のアプローチを使用して、クレードルバインダは、３つのターゲット（リゾチーム、ヒトＦｃ、及びＨＳＡ）に対して、ＦｎＩＩＩ０７、ＦｎＩＩＩ１０、及びＦｎＩＩＩ１４を使用して、創作された。
【０３７５】
ＦｎＩＩＩ０７は、リゾチームを見出す（hit）（各配列番号：９７−９９）：
2013539362.tif 000025
【０３７６】
ＦｎＩＩＩ１０は、リゾチームを見出す（各配列番号：１００−１２８）：
2013539362.tif 000026
【０３７７】
ＦｎＩＩＩ１４は、リゾチームを見出す（各配列番号：１２９−１４１）：
2013539362.tif 000027
【０３７８】
ＦｎＩＩＩ０７は、ヒトＦｃを見出す（各配列番号：１４２−１４３）：
2013539362.tif 000028
【０３７９】
ＦｎＩＩＩ１０は、ヒトＦｃを見出す（各配列番号：１４４−１４７）：
2013539362.tif 000029
【０３８０】
ＦｎＩＩＩ１４は、ヒトＦｃを見出す（各配列番号：１４８−１５９）：
2013539362.tif 000030
【０３８１】
ＦｎＩＩＩ０７は、ＨＳＡを見出す（各配列番号：１６０−１９９）：
2013539362.tif 000031
2013539362.tif 000032
【０３８２】
ＦｎＩＩＩ１０は、ＨＳＡを見出す（各配列番号：２００−２３８）：
2013539362.tif 000033
2013539362.tif 000034
【０３８３】
ＦｎＩＩＩ１４は、ＨＳＡを見出す（各配列番号：２３９−２７７）：
2013539362.tif 000035
2013539362.tif 000036
2013539362.tif 000037
【０３８４】
［実施例８］
構造からガイドされる（guided）デザインを使用した、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）に関する原理についての証拠
発明者は、本願に記載の方法を実証するための非制限的なモデルとしてＳＵＭＯを使用した。以下の記載は、発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、如何なる態様においても本願発明を制限することを意味しない。当業者は、言及された目的を実施するために、本発明に固有の、これらの目的、目標及び有利な点に、本願発明が良く適合していること理解するだろう。ＳＵＭＯは、原理を証明する目的のための一般的な実施形態を示すために使用され、発明の範囲を制限することを意図しない。記載された方法及び組成物は、膨大な（plethora）ターゲット分子について使用することができ、単にＳＵＭＯにのみに制限されない。特許請求の範囲により規定されるような、本発明の趣旨（spirit）に包含されるその改変及び他の使用は、当業者に想起されるであろう。
【０３８５】
ＳＵＭＯ（複数）は、ユビキチンに構造的に類似し、翻訳後に、他のタンパク質にコンジュゲートし、その結果、様々な機能的な調節をもたらす。ヒトにおいては、４つのＳＵＭＯアイソフォーム（SUMO1-4）がある（Gareau and Lima, Nature Rev. (2010) 11:861-871）。ＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２は、４１％の配列同一性（７２％の類似性：similarity）を共有するが、機能的に異なっている（図１０Ｂ、ボトム）（Saitoh and Hinchey, J. Biolog. Chem. (2000) 275:6252-6258; Vertegaal, et al., Mol. Cell Proteomics (2006) 5:2298-2310）。ＳＵＭＯ２及びＳＵＭＯ３（これらは、まとめてＳＵＭＯ２／３と称される）は、９７％の配列同一性を共有し、機能的に同一であると推測される（Gareau and Lima, supra, 2010; Johnson, Annual Rev. Biochem. (2004) 73:355-382）。ＳＵＭＯ４の翻訳後修飾としての関連は、明確でない（Bohren, et al., Protein Express. Purif. (2007) 54:289-294; Owerbach, et al., Biochemical Biophysical Res. Comm. (2005) 337:517-520）。したがって、ＳＵＭＯ生物学における多くの研究は、ＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３に焦点を当ててなされている。ＳＵＭＯ化（SUMOylation）は、ＤＮＡ修復、転写、核輸送及び染色体ダイナミックス（chromosome dynamics）を含む様々な細胞プロセスを制御する重要な役割を担っている（Gareau and Lima, supra, 2010; Johnson, supra, 2004）。ＳＵＭＯ化がタンパク質の機能を変化させる主要な機構は、ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（SIM）として知られる短いペプチドモチーフを含む他のタンパク質とのＳＵＭＯの媒介による相互作用［以下、ＳＵＭＯ媒介相互作用と呼ぶ］を介したものであると思われる（Johnson, supra, 2004; Kerscher, EMBO Repts. (2007) 8:550-555; Song, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101:14373-14378）。
【０３８６】
ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用の僅かな阻害剤の存在は、ＳＵＭＯ生物学を詳細に解析する能力を限定し、本願に記載された方法と組成物の有効性を実証するための理想的なモデル系を提供する。その様な阻害剤の唯一報告された例において、ＳＩＭ含有線状ペプチドは、ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用を阻害するために使用され、非相同的末端結合（NHEJ）によるＤＮＡ修復に協調することにおける重要性を立証した（Li, et al., Oncogene (2010) 29:3509-3518）。このペプチドは、がん細胞を放射線及び化学治療誘導ＤＮＡ損傷に対して敏感にさせ、ＳＵＭＯ／ＳＩＭ阻害剤に関する治療の可能性を示す。これらの知見は、ＳＵＭＯ／ＳＩＭ阻害剤の有用性を明確に立証するが、ペプチド阻害剤は２つの深刻な欠点に悩まされている。第１には、ペプチドは、ＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３に等しく良く結合し、各アイソフォームの役割を区別することを不可能にすることである。第２には、ペプチドは、ＳＵＭＯについて低い親和性（Ｋｄ〜５μＭ）を有することである（Song, et al., supra, 2004）。その結果、高濃度のペプチドが阻害のために要求される。多くの天然のＳＩＭペプチドは、同様に低い親和性を示し、個々のＳＵＭＯアイソフォームを約１０倍以下の［差で］区別する（Kerscher, supra, 2007; Chang, et al., J. Biological Chem. (2010) 285:5266-5273; Hecker, et al., J. Biol. Chem. (2006) 281:16117-16127; Sekiyama, et al., J. Biological Chem. (2008) 283:35966-35975; Zhu, et al., J. Biological Chem. (2008) 283:29405-29415）。個々のＳＵＭＯアイソフォームのＳＩＭ相互作用を選択的に阻害することができる、より親和性の高い薬剤は、各アイソフォームの機能をより良く定義するための強力な道具となり得るであろうし、より有力な治療法となる可能性がある。しかしながら、ＳＩＭ結合部位がＳＵＭＯアイソフォームの間で高度に保存されているので、そのような高選択的な阻害剤の開発は、骨の折れる挑戦である（図１６Ａ及び１０Ｂ、ボトム）（Chupreta, et al., Molec. Cell. Biol. (2005) 25:4272-4282）。ＳＵＭＯの特定のアイソフォーム間を区別するＳＵＭＯ／ＳＩＭ阻害剤又は親和性薬剤（affinity agent）の開発は、本願に記載された方法及び組成物を使用して、その様な親和性薬剤をデザインし、製造する能力を実証するためのモデル系として使用することができる。
【０３８７】
ＦｎＩＩＩクレードルライブラリ
ループ位置に加えて、ＦｎＩＩＩスキャフォールドのベータ鎖領域にある位置が多様化されているライブラリが、デザインされ、そして構築されている。ＢＬ１ライブラリにおいては、ＣＤループ（４１−４５残基）の位置が多様化されたが、他方、ＢＬ２ライブラリにおいて、その位置が多様化されていないという点で異なる２つの異なったライブラリが本願に記載されている。ライブラリは、以下の、刊行されている手法（Wojcik, et al., supra, 2010）及び本願に記載される手法のファージディスプレイ形式（format）で構築された。ＢＬ１及びＢＬ２ライブラリは、それぞれ６×１０１０及び１×１０１０の固有（unique）の配列を含むと評価された。
【０３８８】
ライブラリからのクレードル分子の選択は、以前に記載されたように行なった（Koide, A., et al., 2009）。ポリヒスチジンタグ化タンパク質の形の以下のターゲットを使用した：ヒトＳＵＭＯ１、ヒトユビキチン、ヒトＡｂｌ  ＳＨ２ドメイン、ヒトＳＦＭＢＴ２ドメイン、ヒトＳＣＭＨ１ドメイン、及び緑色蛍光タンパク質。多くのターゲットについて、多数のクローンを単離した。代表例の結合データを、図１５（Ａ−Ｃ）に表す。モノボディクローンのアミノ酸配列が、表６において与えられる。
表５  クレードルライブラリに使用されたアミノ酸多様性
2013539362.tif 000038
野生型の残基は、括弧内に表す
表６  クレードルライブラリから生じたクレードル分子のアミノ酸配列
配列は、その結合ターゲットにしたがってグループ分けされている。「ｘ」は、ライブラリにおいて、多様化された位置を示す。ＣＤループ及びＦＧループの長さは、ＢＬ１及びＢＬ２ライブラリにおいて変化したため、これらのライブラリに表される「ｘ」の数は、ガイダンスのためにのみ表し、これらは、実際の残基の数を正確に反映しない。
2013539362.tif 000039
2013539362.tif 000040
2013539362.tif 000041
2013539362.tif 000042
【０３８９】
構造からガイドされるライブラリデザイン
多くのタンパク質は、構造的に保存された巨大なファミリーのメンバーである。高度に関連するタンパク質ファミリーの個々のメンバーにおける機能部位を特異的にターゲットとすることができる結合タンパク質は、これらの分子の固有の機能を研究するための道具として有用である。その様なファミリーのタンパク質は、大抵、保存された構造的な特徴に加え、高度なレベルの配列の類似性を示し、個々のファミリーのメンバーを効果的に区別する結合タンパク質を作り出すことを困難にする。ファミリーメンバー間で特に高度に保存された機能部位をターゲットにする場合に、この問題は、さらに顕著になる（pronounce）。すなわち、これらの要因によって、そのような薬剤の製造は、挑戦的なものとなる。
【０３９０】
近年の研究において、酵母の小ユビキチン様修飾因子タンパク質（yeast small ubiquitin-like modifier protein: ySUMO）に結合するＦｎＩＩＩドメイン変異体（ySMB-1）の構造が決定されている。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（SIMs）として知られる短いペプチドモチーフと相互作用するために通常使用される機能部位で、ｙＳＭＢ−１は、ｙＳＵＭＯに結合した（図１０Ａ）。ＳＩＭ結合部位は、ＳＵＭＯファミリータンパク質間でもっとも保存されている表面を構成する（図１０Ｂ）（Hecker, et al., J. Biol. Chem. (2006) 281:16117-16127）。この高レベルな保存性にも拘わらず、ｙＳＭＢ−１は、ｙＳＵＭＯを、深く関連する２つのヒトホモログであるｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２から効果的に区別することが示された。
【０３９１】
ＳＵＭＯファミリータンパク質のＳＩＭ結合部位に結合する、特異的かつ高親和性クレードル分子は、ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用の阻害剤として使用することができる可能性がある。異なったＳＵＭＯタンパク質におけるこれらの相互作用の役割は良く解明されていないため、そのようなクレードル分子は、ＳＵＭＯ生物学の研究において、有用な道具であり得るであろう。しかしながら、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−２に交差反応する単一のｈＳＵＭＯ−１結合クローンを除いては、ＦｎＩＩＩドメインのループが多様化されている組み合わせ的ライブラリ（combinatorial libraries）において、ｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２に対するＦｎＩＩＩドメイン変異体は、同定されていなかった。これらの困難性は、これらのターゲットに対するＦｎＩＩＩドメイン変異体を得るために、代替のアプローチが求められていることを示唆する。ｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体であるｙＳＭＢ−１のアーキテクチャ（architecture）を基に、構造からガイドされるライブラリ（structure-guided library）を作成することにより、ｈＳＵＭＯ−１のＳＩＭ結合部位に結合するクレードル分子が生成された。この戦略の背景にあるアイディアは、ｙＳＭＢ−１の有用な結合モード、及びＳＩＭ結合部位の認識を維持するが、クレードル分子結合表面における十分な（sufficient）変換を、他のＳＵＭＯタンパク質の予見されるエピトープにおける配列の相違に適応させることである。
【０３９２】
ヒトＳＵＭＯ（ｈＳＵＭＯｓ）と約４５％の配列同一性（約６７％の類似性）を有するＳＵＭＯの酵母ホモログ（ySUMO）並びに個々のヒトＳＵＭＯアイソフォームを特異的にターゲットとするクレードル分子が単離された（図１０Ｂ、ボトム及び、図１６Ａ）。中間のｎＭ  Ｋｄ値を有するｙＳＵＭＯに対する多くのクレードル分子が、成功裏に単離された（図１６Ｃ、Ｄ及び図１９）。
【０３９３】
クレードルライブラリのデザインをさらに改良するために、ｙＳＵＭＯに結合するｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体の結晶構造が決定され、ｙＳＵＭＯをターゲットするための構造的な基礎が明らかにされた。この構造的な情報にガイドされ、ｈＳＵＭＯ１に対するアイソフォーム特異的クレードル分子を生じる「ＳＵＭＯターゲット（SUMO-Targeted）」クレードルライブラリが開発された。〜１００ｎＭのＫｄ値でヒトＳＵＭＯ１のＳＩＭ結合部位に結合するが、ＳＵＭＯ２には、４００倍（以上）もより弱く結合するクレードル分子が、このライブラリから得られた。機能的な研究により、これらのクレードル分子が、ｈＳＵＭＯ１／ＳＩＭ相互作用及びｈＳＵＭＯ１コンジュゲーションの高度に選択的な阻害剤であることも実証された。
【０３９４】
ＳＵＭＯターゲットファージディスプレイライブラリの、構造によりガイドされるデザイン 
ライブラリデザインをガイドするために、ｙＳＵＭＯにおけるｙＳＭＢ−１エピトープの残基を、ｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２において同等の残基と比較した。次に、これらのエピトープ位置のそれぞれの位置と接した、又は近接したｙＳＭＢ−１パラトープ残基を、同定した（図１１Ａ、１１Ｂ）。ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ構造において、改変された（engineered）ＦＧループ及び多様化されていないＦｎＩＩＩスキャフォールドの部分を使用して、ｙＳＭＢ−１は結合表面を形成する。ＳＵＭＯターゲットライブラリにおいて、これらの表面のどちらも多様化されている（図１１Ｃ）。ＳＵＭＯターゲットライブラリは、３つのＳＵＭＯターゲットのうちいずれかの効果的な相補性を許容し得る、野生型ｙＳＭＢ−１残基及び他のアミノ酸型を含む各ｙＳＭＢ−１パラトープ位置にアミノ酸多様性を導入することによってデザインされた（図１１Ｂ）。例えば、極性アミノ酸及び相補的な電荷を有するアミノ酸が、１以上のＳＵＭＯアイソフォームにおいて、荷電した残基と接触すると期待される位置に含まれ、疎水性アミノ酸（複数）が、疎水性の表面と接触すると期待される位置（複数）に含まれ、そして、小さいアミノ酸残基が、ＳＵＭＯタンパク質などのいくつかにおいて、より大きな側鎖と立体的な衝突をし得る位置に含まれた。
【０３９５】
ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ結晶構造において、ｙＳＵＭＯと接触せず、如何なる類似のインターフェイスへ直接関与が可能であるとは思われなかった唯一のＳ７７を除いて、ＦＧループの全ての残基を変化させた。Ｙ７６を、Ｄ、Ｈ、Ｎ及びＹに変化させた。なぜなら、［この位置は、］ｙＳＭＢ−１インターフェイスにおいて、ｙＳＵＭＯと直接的に接触しなかったが、この位置は、全てのＳＵＭＯにおいて、保存されたＲ５５と相互作用する能力があると推測されたからである（図１１Ａ）。ｙＳＭＢ−１のロイシン８１は、全てのＳＵＭＯアイソフォームにわたって保存されているｙＳＵＭＯ表面のポケットに埋められており、対応する「アンカー」であるロイシン又はバリンは、その構造を有する全てのＳＩＭ／ＳＵＭＯにおいて保存されている。結果として、アミノ酸の多様性は、この位置において、Ｆ、Ｌ、Ｉ及びＶに制限された。ＦｎＩＩＩスキャフォールドのＥ４７及びＳ８６は、ｙＳＭＢ−１インターフェイスにおいて極く最小の接触を作り出し、変化しなかった。スキャフォールドのＰ８７は、ｙＳＭＢ−１インターフェイスにおいて、十分な接触を作り出さなかったが、これは、折り返し構造の摂動を避けるために常に固定（held constant）されており、これは、おそらくＦＧループの全体的な位置決めの改変を誘導する。ＳＵＭＯターゲットライブラリにおいて、エンコードされた配列の総数は、１．６×１０１１であり、製造されたファージライブラリの実寸法（実数）は、２．０×１０９であった。
【０３９６】
再プログラムされたＳＵＭＯ結合クレードル分子の選択
上で記載した、ＳＵＭＯターゲットライブラリを使用して、ｈＳＵＭＯ−１、ｈＳＵＭＯ−２及びｙＳＵＭＯに対して４回（four rounds）の選択を行なった。ターゲットの非存在下でリカバーされた数により除算された、ターゲットの存在下においてリカバーされたファージの数として、富化割合（enrichment ratios）が定義され、そして、（その割合は）概して、ソートされた（sorted）ファージ集団における機能的なバインダの数及び親和性レベルを反映する。４回の選択の後、良好に改良された割合が、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１の両方に関して観察された（それぞれ〜２０及び５０）。それぞれのターゲットについての３２の無作為のクローンを、ファージＥＬＩＳＡを使用して、結合活性について解析し、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１のケースでは、１００％のクローンが、結合に関して陽性である結果であった。
【０３９７】
５の無作為のｙＳＵＭＯクローン及び１０の無作為のｈＳＵＭＯ−１クローンは、可溶性タンパク質として発現され、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介して結合活性が評価された。ファージＥＬＩＳＡの結果と一致して、全てのクローンに、結合シグナルが生じた。ｙＳＵＭＯについて、Ｋｄは、３９ｎＭから３．３μＭの範囲と評価された。同様に、ｈＳＵＭＯ−１について、Ｋｄは、１４５ｎＭから３．６μＭの範囲と評価された（図１２Ｂ）。したがって、ＳＵＭＯターゲットライブラリは、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１の両方に対する機能的なクレードル分子の生成に成功し、当該ライブラリは、これら両方のターゲットに対して同様の挙動を示した。
【０３９８】
ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１結合クレードル分子の配列プロファイル
シーケンシングは、ＳＰＲを試験された１０のｈＳＵＭＯ−１クレードル分子の全てが、ＦｎＩＩＩスキャフォールド中の位置３３に、野生型残基から離れた（野生型残基と異なる）変異を含んでおり、そして、１つを除いた全てのクローンが、位置３１に変異を含んでいたことを明らかにした。位置７３においては、野生型であるチロシンが、〜５０％の確率でリカバーされた。全てのｈＳＵＭＯ−１モノボディのＦＧループ配列は、ｙＳＭＢ−１への明確な類似性を有しており、目論見どおり、ｙＳＭＢ−１結合モードが、これらのモノボディにおいて維持されたことを示唆する。
【０３９９】
興味深いことに、位置７３においてＹからＦへの変異を含んだ１つのクローンを除く、ＳＰＲがテストされた全てのｙＳＵＭＯクローンにおいて、野生型スキャフォールド残基がリカバーされた（図１２Ａ、１２Ｂ）。ｙＳＵＭＯクレードル分子のＦＧループ配列はまた、ｙＳＭＢ−１への類似性を有するが、これらは、ｈＳＵＭＯ−１モノボディのＦＧループ配列と比較して、幾分か、より多様化（divergent）していた。
【０４００】
ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１結合クレードル分子の配列特性をさらに調査するために、ｈＳＵＭＯ−１についての３４の追加のクローン及び、ｙＳＵＭＯについての３５の追加のクローンの配列を決定した。これらのクローンの全ては、ファージＥＬＩＳＡによってターゲットへの結合が陽性であった。ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１クレードル分子の両方に関する全体の配列プロファイルは、ｙＳＭＢ−１配列に及び相互に極めて関連することを表し、デザインに関して、このライブラリ由来のクレードル分子は、これら両ターゲットへのｙＳＭＢ−１様結合モードを維持していることを示唆する（図１２Ａ、１２Ｃ）。しかしながら、ｙＳＵＭＯ結合クレードル分子とｈＳＵＭＯ−１結合クレードル分子との間で、はっきりとした違いが、ベータ鎖残基において見られた。４０のｙＳＵＭＯ結合クローン中、３９のクローンが位置３１及び３３において野生型残基を含んでいた。４４のｈＳＵＭＯ−１結合クローン中、ひとつのクローンも位置３３において野生型であるアルギニンを含んでおらず、その大部分は、位置３１において、野生型であるチロシンを含んでいなかった。両ターゲットに対するクレードル分子は、位置７３においてチロシンに向う傾向を表す。ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子における野生型ベータ鎖残基からの強い逸脱（departure）は、ＦｎＩＩＩベータ鎖における変異が、ｙＳＭＢ−１様結合モードを使用してｈＳＵＭＯ−１に結合するのに必要であることを示唆する。したがって、ベータ鎖残基における修飾によって、ターゲットに対するクレードル分子又はクレードルライブラリの選択性及び／又は親和性を高めることができる。
【０４０１】
ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子における位置３３の主要なアミノ酸は、アラニン及びグルタミン酸であり、野生型であるアルギニンと比べて電荷の欠失及び逆転を表す（図１２Ｃ）。モデル化されたｙＳＭＢ−１／ｈＳＵＭＯ−１構造において、ＦｎＩＩＩスキャフォールドの野生型アルギニン残基は、ｈＳＵＭＯ−１のＫ２３との潜在的な（potential）立体的及び静電気的な衝突を示す（図１３）。この衝突は、ｈＳＵＭＯ−１結合クレードル分子における観察された変異によって解決されるかもしれない。ＦｎＩＩＩベータ鎖の位置３１における野生型チロシンを上回る、ヒスチジンへの強力な優先性（preference）についての解釈は、モデル化された構造からは明確でない。
【０４０２】
ベータ鎖残基と対照的に、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１に対してリカバーされたクレードル分子のＦＧループ配列は、多くの位置（７５、７６、７８、８０、８１及び８４）において、類似のアミノ酸優先性を示す。この類似性は、ｙＳＵＭＯとｈＳＵＭＯ−１との間で保存されたこれらの位置と主に接触するＦＧループ残基と一致する（図１１Ａ）。興味深いことに、位置８０及び８１において、ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子は、ｙＳＵＭＯクレードル分子よりもより明確な優先性（more pronounced preference）を表し、ｈＳＵＭＯ−１インターフェイスにおいて、これらの位置で、より強力な選択圧があることを示唆する。また、位置７９において、ｈＳＵＭＯ−１に対するクレードル分子は、アスパラギン酸塩［sic,アスパラギン酸］への十分な優先性を有する（図１２Ｃ）。
【０４０３】
ｙＳＭＢ−１／ｈＳＵＭＯ−１複合体のモデル化された構造を基に、ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子の位置７９及び８０（のアミノ酸）は、ｈＳＵＭＯ−１の２つのリシン残基に近接するだろうと考えられ、これらのひとつは、ｙＳＵＭＯにおいて（その代わり）アルギニンである（図１２Ａ）。ｙＳＭＢ−１において、Ｙ７９は、ｙＳＵＭＯのＲ４７と積層（重なり形成）相互作用（stacking interation）を形成する（図１１Ａ）。ｈＳＵＭＯ−１における位置４７のリジン残基は、アスパラギン酸塩［sic,アスパラギン酸］によりよく適合し得る。ｈＳＵＭＯ−１のこの領域における塩基性残基は、通常、ＳＩＭ（複数）における保存された酸性ストレッチ（acidic stretch）と相互作用し、ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子における「ＤＤ」モチーフは、よりＳＩＭ様配列の方向へのシフト（ないし移行：shift）をマークする。興味深いことに、これらの２つの酸性残基は、ｙＳＵＭＯクレードル分子においては、強力に保存されておらず、結合に関するこれら接触への依存が、それほど強力ではないのであろうことを示唆する。ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子は、ＳＩＭインターフェイスにおける「アンカー」位置において、ロイシンに比べてイソロイシンへの著しい優先性を示す。ｈＳＵＭＯ−１において、ＳＩＭ結合表面における核（core）残基の同一性に関して、Ｉ３９（ｙＳＵＭＯ）は、バリンに切り詰め（変換）されている（truncated）（図１２Ａ）。この変異は、結果として、「アンカー」位置において、より深いポケットをもたらし（Chupreta, et al., supra. (2005)）、ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子におけるより嵩張った側鎖への強力な優先性を説明し得る。
【０４０４】
いくつかの相違点にも拘わらず、全体として、ＦＧループ配列の優先性は、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１に対するクレードル分子において類似しており、類似のＦＧループ配列が両ターゲットへの結合を効果的に媒介することができることを示唆する。この類似性の極端な（extreme）例において、クレードル分子の１つの対（クレードル分子のひとつはｙＳＵＭＯに対してのものであり、もう一つはｈＳＵＭＯ−１に対してのものである）は、位置８４における一つのアミノ酸のみによって異なるＦＧループ配列を有する。ｙＳＵＭＯクレードル分子は、この位置にアラニンを含む一方、ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子は、セリンを含んでいた（図１４Ａ）。多くのｈＳＵＭＯ−１バインダにおいて、この位置にアラニンが生じるので（図１２Ｃ）、ｙＳＵＭＯクレードル分子におけるアラニン変異は、ｈＳＵＭＯ−１への結合活性を十分に変化させる可能性は極めて低い。興味深いことに、これら２つのクレードル分子におけるベータ鎖残基は異なっており、この場合、ベータ鎖残基が単独で、これらのクレードル分子がどちらのターゲットに結合するかを決定し得ることを示唆する。
【０４０５】
ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１へのこれら２つのクローンの結合は、ファージＥＬＩＳＡにより評価された。ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子は、ｈＳＵＭＯ−１及びｙＳＵＭＯの両方に結合した。しかし、予想通りに、野生型ＦｎＩＩＩスキャフォールド残基を含むｙＳＵＭＯクレードル分子は、ｙＳＵＭＯのみにしか結合しなかった（図１４Ｂ）。これらの結果は、有効に同一なＦＧループは、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１の両方を認識するのに使用できることを表すが、ＦｎＩＩＩスキャフォールドにおける変異が、ｈＳＵＭＯ−１への結合に必要である。これらの結果はまた、クレードル分子における特異性に関するベータ鎖ベース機構を支持する明確な証拠を提供する。
【０４０６】
選択されたクレードル分子の特異性
ＳＵＭＯターゲットライブラリは、ｙＳＵＭＯへのクレードル分子の結合モードを基にしてデザインされたので、ｙＳＵＭＯ結合活性は、リカバーされたｈＳＵＭＯ−１クレードル分子において維持され得る可能性は高い。これを調査するために、ファージＥＬＩＳＡを使用して、ｈＳＵＭＯ−１クレードル分子のｙＳＵＭＯへの結合を評価し、ｈＳＵＭＯ−２との交差反応も試験した。どのｈＳＵＭＯ−１クレードル分子もｈＳＵＭＯ−２への結合を表さなかった、しかしながら、およそ５０％のｈＳＵＭＯ−１のクレードル分子は、ｙＳＵＭＯへの十分な結合を表した（図１４Ｃ）。興味深いことに、配列解析では、ｈＳＵＭＯ−１特異的なクレードル分子と交差反応するクレードル分子のアミノ酸優位性において明白な違いは明らかにされなかった（図１４Ｄ）。これらの結果は、異なるクレードル分子における特異性は異なった起源であること及び、ｈＳＵＭＯ−１への特異的な結合は、結合インターフェイスにおけるｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ−１のアミノ酸優位性における僅かな相違を利用する複数のそして様々な（varying）変異をおそらく要求するであろうことを示唆する。
【０４０７】
特異的及び非特異的なクレードル分子の類似の配列に関する代わりの説明は、ターゲットタンパク質のＧＳＴ融合体を使用するファージＥＬＩＳＡにおいて、たとえ弱い相互作用でも強力な結合シグナルを生ずることができるというものである。この解析における親和性の低い解像度（low resolution）は、交差反応について偽陽性を生じ得る。交差反応性として分類されたｈＳＵＭＯ−１結合クレードル分子の多くが、実際に特異的であるならば、これは、これらの２つの群の間の配列プロファイルにおける類似性を説明することができるだろう。弱い結合でさえ顕著なシグナルを生じるので、とりわけファージＥＬＩＳＡのデータは、交差反応性に関する偽陰性を生じることはありそうにない。したがって、特異性についてのｈＳＵＭＯ−１クレードル分子の分類は、正確であると思われる。しかしながら、これらのクレードル分子についてのＫｄ測定は、十分にそして定量的に交差反応性を評価するのに必要である。
【０４０８】
種々のＦｎＩＩＩドメイン変異体は、ｙＳＵＭＯのＳＩＭ結合部位を認識し、ｈＳＵＭＯからｙＳＵＭＯを区別する
ＦｎＩＩＩドメイン変異体が、どのようにｙＳＵＭＯを認識するかを理解するために、２つの最も親和性の高いｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体（ｙＳＭＢ−１及びｙＳＭＢ−２）（図１６Ｃ、Ｄ及び図１７）のエピトープが、ＮＭＲ化学シフト摂動を使用してマップされた。これらの可変ループにおける異なったアミノ酸配列にも拘わらず（図１６Ｃ）、類似のエピトープに結合する両ＦｎＩＩＩドメイン変異体は、ＳＩＭ結合部位の中央に位置した（図１６Ｅ）。３３の他のｙＳＵＭＯＦｎＩＩＩドメイン変異体の結合は、ｙＳＭＢ−１により阻害され、これらもＳＩＭ結合部位に結合することを示唆する（図１８）。ｙＳＭＢ−１のように、多くのｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体は、ライブラリ構築における鋳型ベクターの不十分な突然変異に由来して、ＢＣ及びＤＥループにポリセリン配列を有しており、これらのループが、結合に貢献しないことを示唆する（図１６Ｃ及び１７）。さらに、これらのＦｎＩＩＩドメイン変異体の多くは、中央に局在する酸性残基及び近傍の芳香族及び疎水性残基を有する１１残基のＦＧループを有する（図１６Ｃ及び１７）。共に、これらの結果は、基本的に全てのｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体が、類似の相互作用モードを使用して、ＳＩＭ結合部位を認識することを示唆する。
【０４０９】
大部分のｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体は、ファージＥＬＩＳＡ解析においてｈＳＵＭＯ１又はｈＳＵＭＯ２への、無視できる程度のレベルの結合を示した（図１９Ａ）。ＳＩＭ結合部位はｙＳＵＭＯとｈＳＵＭＯタンパク質との間で最も高度に保存された表面であるので（図１６Ａ）、そのような高い選択性は予想外であった。ＳＰＲ測定は、ｙＳＭＢ−１（これは、ＥＬＩＳＡにおいてｙＳＵＭＯに選択的である）が、８２ｎＭ  ＫｄでｙＳＵＭＯに結合し、〜５４μＭ  ＫｄでｈＳＵＭＯ１に結合することを示し、そして、ｈＳＵＭＯ２に検出可能に結合しないことを示し（図２１Ｂ）、親和性において６００倍超でｈＳＵＭＯｓからｙＳＵＭＯを区別する。ｙＳＭＢ−９（これは、ＥＬＩＳＡにおいて非選択的である）は、３つのＳＵＭＯタンパク質の全てに結合した。ｙＳＭＢ−９は、ｙＳＵＭＯ又はｈＳＵＭＯ２のどちらかに対してよりも、高い親和性（６８ｎＭ  Ｋｄ）でｈＳＵＭＯ１に結合したが（図１９Ｂ）、これは、ｈＳＵＭＯ２をたった〜７０倍で区別しており、すなわちｙＳＭＢ−１と比較して１０倍低い選択性である。とりわけ、ｙＳＭＢ−９は、多くの他のｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体のように、ポリセリンＢＣ及びＤＥループを有しておらず、そして、ｙＳＭＢ−9はまた、著しく短いＦＧループを有する（図１６Ｂ及び１７）。競合データは、ｙＳＭＢ−９が、ＳＩＭ結合部位に結合することを示唆していたが（図１７）、その顕著な配列の特徴は、ｙＳＭＢ−９が、多くのｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体と比べて、相互作用の異なったモードを採用することを示唆しており、これはｙＳＭＢ−９のより低い特異性につながる。共に、これらの知見は、多くのｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体の結合モードは、高度に保存されたＳＩＭ結合部位へ結合するにも関わらず、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯｓを区別するのに特に有効であることを実証する。したがって、ｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体に類似するモードにおいてｈＳＵＭＯに結合するＦｎＩＩＩドメイン変異体を生ずることは、ｈＳＵＭＯ（複数）について、より高いアイソフォーム選択性を有するクローンを生ずるだろうことが予測された。
【０４１０】
ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体の結晶構造
ＳＩＭ結合部位のアイソフォーム選択的認識の構造的基礎を理解するために、２．４Åの分解能でｙＳＵＭＯと複合体を形成するｙＳＭＢ−１の結晶構造（表８の構造的な統計）を決定した。ＮＭＲエピトープマッピングデータと一致して、ｙＳＭＢ−１は、ＳＩＭ結合部位に結合した（図２０Ａ及び１６Ｅ）。ＦｎＩＩＩドメイン変異体は、一つの可変ループ（ＦＧループ）及び不変ＦｎＩＩＩベータ鎖由来の残基を使用して、結合表面を形成した（図２０Ａ）。これらのポリセリン配列から推測するに、ｙＳＭＢ−１のＢＣ及びＤＥループは、ｙＳＵＭＯとの直接接触には関与していなかった。
【０４１１】
ｙＳＭＢ−１ＦＧループの７８−８５残基は、残余に貢献する非ループ残基に対して、８４％ものＦｎＩＩＩドメイン変異体結合表面を提供するベータヘアピンを形成する（図２０Ｂ及び図２１Ａ）。このヘアピンの端は、ｙＳＵＭＯと分子間ベータシートを形成するＳＩＭ結合部位の疎水性中央部に沿って、結合（dock）し、ＳＩＭの相互作用モードをしっかりと模倣する（図２０Ｂ、Ｃ）（Kerscher, supra, 2007; Reverter, D., and Lima, C. D., Nature (2005) 435:687-692; Song, et al., J. Biological Chem. (2005) 280:40122-4012）。ＳＩＭｓは、概して、酸性残基のストレッチの側面に位置する疎水性残基のストレッチを含む、例えば、ＲａｎＢＰ２におけるＤＶＬＩＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）及び、ＰＩＡＳｘにおけるＴＬＤＩＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）（Song, et al., supra, 2004; Li, et al., supra, 2010; Minty, et al., J. Biological Chem. (2000) 275, 36316-36323）。ｙＳＭＢ−１において、このモチーフは、ＦＧループ配列ＤＬＹＹＳＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）（残基  ８０−８５）によって模倣される（図１６Ｃ、及び２０Ｂ、Ｃ）。ＦｎＩＩＩドメイン変異体のＤ８０は、ＳＩＭにおいて保存された酸性ストレッチとして、類似の方向におけるＳＩＭ結合部位の「頂点」の基礎部分（「top」 basic portion）とアラインし（Kerscher, supra, 2007; Song, et al., supra, 2005）、Ｔｙｒ残基（複数）は、ＳＩＭにおいて脂肪族残基が常に見られる、疎水性のトラクト（索：tract）を形成する（line）。
【０４１２】
結晶構造は、ｙＳＵＭＯ結合ＦｎＩＩＩドメイン変異体のアイソフォーム選択性に関する構造的基礎及び、ｙＳＵＭＯに対するＦｎＩＩＩドメイン変異体が生ずることの困難性に関する構造的基礎を示唆する。ｙＳＭＢ−１エピトープにおける１６の残基のうちたったの５つのみが、ｙＳＵＭＯとｈＳＵＭＯとの間で低度に保存されている（位置２５、３４、３６、５０及び５４）（図１０Ｂ、ボトム）。これらの残基の内３つ（Ｎ２５、Ｅ３４及びＦ３６）は、ＦｎＩＩＩドメイン変異体により埋められている総ｙＳＵＭＯ表面の２３％（１４７Å２）からなる、高度に埋められているインターフェイスの片側において、クラスタ（cluster）を形成する（図２０Ｂ及び２２Ａ）。ｈＳＵＭＯ１はＮ２５Ｋ及びＦ３６Ｈを含む。ｈＳＵＭＯ２は、Ｅ３４Ｖ及びＦ３６Ｑを含む。したがって、ｙＳＭＢ−１に類似するインターフェイスを形成する如何なるＦｎＩＩＩ変異体も、ｈＳＵＭＯ１又はｈＳＵＭＯ２／３に強固に結合することはありそうにない。とりわけ、このクラスタは、ｙＳＭＢ−１におけるスキャフォールド残基（Ｙ３１、Ｒ３３及びＹ７３）によって、広い部分で接触する（図２０Ｃ及び２２Ａ）。これらのベータ鎖残基は、ライブラリにおいて変化しておらず、立体構造的に（conformationally）剛なベータシートにアンカーされている（anchored）ので、ｈＳＵＭＯｓにおいてクラスタの非保存的な置換を受け入れることはできないであろうし、ｈＳＵＭＯについてのｙＳＭＢ−１様ＦｎＩＩＩドメイン変異体の発生を不可能にする。これらの構造的な拘束は、ｈＳＵＭＯに結合することができる、ＦＧループを有する潜在的にとても多くの数のｙＳＭＢ−１様ＦｎＩＩＩドメイン変異体を排除するだろう。したがって、これらの観察は、ＦｎＩＩＩベータ鎖中の残基が、ｙＳＵＭＯ結合を好む陽性デザインエレメント、及び、ｈＳＵＭＯへの結合を好まない陰性デザインエレメントの両方として機能することを強力に示唆する。
表７  ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体（ＰＢＤ  ＩＤ：３ＱＨＴ）の構造に関する結晶の情報及び精密化統計
2013539362.tif 000043
*括弧内に表される最も高い分解能シェルの値
2013539362.tif 000044
ＨＫＬ反射のｉ観測について
2013539362.tif 000045
§Ｒfreeは、精密化の前に隔離された反射の５％を有するＲである。
表８  ＦｎＩＩＩドメイン変異体ｙＳＭＢ−１及びＳＩＭペプチドのインターフェイス統計
2013539362.tif 000046
＊報告された値は、５のＳＵＭＯ／ＳＩＭ複合体（ＰＤＢ  ＩＤＳ  １ＷＹＷ、１Ｚ５Ｓ、２ＡＳＱ、２ＫＱＳ、及び２ＰＲＱ）の平均である。５つの複合体全てにわたるこれらの値における標準偏差が与えられる。埋められた表面及び、％組成値（% composition values）は、ＰＲＯＴＯＲＰ ｓｅｒｖｅｒを使用して計算した（Reynolds, et al., Bioinformatics (Oxford, England) (2009) 25:413-414）。ＳＣ値は、ＣＣＰ４ｓｕｉｔｅのｓｃ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して計算した（The CCP4 Suite, Acta Cryst (1994) D50:760-763; Lawrence and Colman, J. Molec. Biol. (1993) 234:946-950）。
【０４１３】
ＳＵＭＯターゲットクレードルライブラリの構造ガイドデザイン
ｙＳＭＢ−１の結合モードが、ｈＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用のアイソフォーム特異的クレードル阻害剤をデザインするための鋳型として使用することができるだろうという理論を基に、ｈＳＵＭＯタンパク質へ結合するためのｙＳＭＢ−１の「再プログラム」を目的とするライブラリがデザインされた。３つのＳＵＭＯタンパク質のいずれかに効果的な相補性を許容し得る野生型アミノ酸及び他のアミノ酸型を含む各ｙＳＭＢ−１パラトープ位置でのアミノ酸多様性を導入した（図２２Ａ）（ＳＩ法）。とりわけ、このライブラリは、ｙＳＵＭＯ結合に関与する、以前は不変であったベータ鎖位置における多様性を含んだ。構築されたファージディスプレイライブラリにおける独立したクローンの数は、デザインの理論的なサイズ（１．６×１０１１）を妥当にカバーする２．０×１０９であった。
【０４１４】
ＳＵＭＯターゲットクレードルライブラリ由来のクレードル分子の選択
ｈＳＵＭＯ１、ｈＳＵＭＯ２及びｙＳＵＭＯに対する、4回のライブラリのソートの後、各ターゲットについて３２の無作為に選ばれたクローンが、ファージＥＬＩＳＡを使用して、結合活性について解析された。全てのクローンは、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１の場合における結合に関して陽性であったが、ｈＳＵＭＯ２には１つも結合しなかった。５のｙＳＵＭＯ結合クレードル分子及び１０のｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子が、可溶性タンパク質として発現し、ＳＰＲを使用して評価された。これらの全てが結合シグナルを生じ（図２２Ｂ）、ファージＥＬＩＳＡの結果と一致した。ｙＳＵＭＯに関して、クレードル分子は、以前のナイーブな（naieve）ライブラリ由来のＦｎＩＩＩドメイン変異体のＫｄ値と類似するＫｄ値を示した（３９ｎＭから３．３μＭ）（図１７、２３及び１６Ｃ）。ｈＳＵＭＯ１に関して、Ｋｄ値は、１１８ｎＭから３．６μＭの範囲であった（図２２Ｂ）。したがって、元のライブラリとは違って、ＳＵＭＯターゲットライブラリは、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１の両方に良い親和性を有するクレードル分子を容易く生じさせた。
【０４１５】
ＮＭＲ化学シフト摂動解析により、新しく生じたｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子であるｈＳ１ＭＢ−４が、ＳＩＭ結合部位をターゲットとしたことを確認した（図２２Ｃ）。
ＥＬＩＳＡで試験されたように、１５の他のｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子の結合は、ｈＳ１ＭＢ−４により阻害されており、これらのｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子の全てが、意図した通り、ＳＩＭ結合部位をターゲットにしたことを強く示唆する（図２４）。
【０４１６】
４４のｈＳＵＭＯ−１結合クローン及び４０のｙＳＵＭＯ結合クローンのアミノ酸配列は、両ターゲットに対するクレードル分子が、ｙＳＭＢ−１と高度に類似するＦＧループ配列を含んでいたことを明らかにし（図２２Ｄ）、ｙＳＭＢ−１様結合モードが、これらのクレードル分子において維持されていたこと及び、ｙＳＭＢ−１様ＦＧループ配列は、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１の両方に結合するのに有効であることを示唆する。一方、ベータ鎖残基は、２つのターゲットに対するクレードル分子で明確に異なっていた（図２２Ｄ）。野生型ｙＳＭＢ−１ベータ鎖残基は、ｙＳＵＭＯ結合クレードル分子の間で高度に保存されていたが、ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子においては、野生型アミノ酸は、位置３３において、全くリカバーされておらず、位置３１においてまれにリカバーされたのみであった。これらの結果は、ｙＳＵＭＯ結合クレードル分子におけるアイソフォーム選択性が、クレードルスキャフォールドの非ループ領域により作られる接触から生じるという発明者の見解を強烈に支持する。この機構と一致して、ほぼ同一のＦＧループ配列を有するクレードル分子の対（ｈＳ１ＭＢ−２２及びｙＳＭＢ−ＳＴ６）において、野生型スキャフォールド残基を含むｙＳＭＢ−ＳＴ６は、ｙＳＵＭにのみ結合したが、一方、改変されたスキャフォールド残基を含むｈＳ１ＭＢ−２２は、ｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１の両方に結合したことが観察された（図２２Ａ及び２２Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ｈＳＵＭＯ１への結合を容易にするために、ＦｎＩＩＩドメインにおいて非ループ残基を改変することの重要性を示す。
【０４１７】
ｈＳＵＭＯ１とのｙＳＭＢ−１インターフェイスのモデリングは、ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子における非ループ残基の観察された変異に関する明確な論理的根拠を提供する。ｙＳＵＭＯに対するｈＳＵＭＯ１におけるＮ２５Ｋ及びＦ３６Ｈ置換は、結果として、ＦｎＩＩＩドメインのＹ７３とｙＳＵＭＯにおけるＦ３６との間の、近接した端−面（edge-plane）の芳香族相互作用の喪失と共に、ＦｎＩＩＩドメインのＲ３３とｈＳＵＭＯ１のＫ２５との間の、起こり得る静電気的及び立体的な衝突をもたらす（図２２Ｆ）。とりわけ、ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子の位置３３の最も好まれるアミノ酸型は、Ａｌａ及びＧｌｕであり、これらのどちらかは、Ｋ２５との衝突を回避するはずであり、結合特異性に関するこの分子機構を支持する。
【０４１８】
ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子は、アイソフォーム特異的である
ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子は、ファージＥＬＩＳＡにより評価されるように、ｈＳＵＭＯ１及びｙＳＵＭＯを区別可能なように変化していた（図２５Ａ及び２６Ａ）。
ｙＳＵＭＯに検出可能な結合を示さなかったいくつかのクローンがあり（例えば、ｈＳ１ＭＢ−７、１６及び２３）、ｈＳＵＭＯ１への結合よりも少なくとも１００倍弱くｙＳＵＭＯに結合することを示す（図２５Ａ及び２６Ａ）。ＳＰＲによって測定されるように、ｈＳ１ＭＢ−４のｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１への親和性の違いは、〜２０倍であり、〜１０倍の差を生じたファージＥＬＩＳＡ試験を証明する（図２５Ｂ及び２６Ｂ）。ｙＳＵＭＯを区別する又は区別しないクローンの配列間で異なった特徴は明確でなく（図２６Ｂ）、これは、ｙＳＵＭＯ／ｈＳＵＭＯ１の区別の機構が複雑であることを示唆しており、いくつかの位置が関与しているかも知れず、異なったクローンに渡って変化したかも知れない。ｈＳＵＭＯ２に対するクレードル分子を発生させるという目的の我々のライブラリの失敗（failure）から予期されるように、ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子は、ファージＥＬＩＳＡにおいて、ｈＳＵＭＯ２への検出可能な結合が見られなかった（図２５Ａ及び２６Ａ）、そして、ＳＰＲによって決定されるｈＳＵＭＯ２に対するｈＳ１ＭＢ−４の親和性はとても弱く（Ｋｄ＝４３μＭ；図２５Ｂ）、ｈＳＵＭＯ１とｈＳＵＭＯ２との間の３６０倍の区別［親和性の差］に対応する。まとめると、これらのデータは、ＳＵＭＯターゲットクレードルライブラリは、ｈＳＵＭＯ１に対する高い親和性と高い特異性を有する様々なクレードル分子を生じさせる能力を有することを実証する。
【０４１９】
新しいクレードル分子は、ＳＵＭＯ１／ＳＩＭ相互作用及びＳＵＭＯ１コンジュゲーションを阻害する
ｈＳＵＭＯ１特異的クレードル分子の、ＳＵＭＯ生物学を研究するための道具（tool）としての潜在的な有用性を調べるために、３つの主要な過程（process）：ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用、ＳＵＭＯ化、及び脱ＳＵＭＯ化、におけるこれらの効果を調査した。ｈＳ１ＭＢ−４は、用量依存的な態様で、ＳＵＭＯ１−ＲａｎＧＡＰとＲａｎＢＰ２との間のＳＩＭ媒介相互作用を完全に阻害した（図２７Ａ）（Johnson, supra, 2004; Mahajan, et al., Cell (1997) 88:97-107; Matunis, et al., J. Cell Biol. (1996) 135:1457-1470）、さらに、予期どおりに、これらのクレードル分子がＳＩＭ結合部位に結合することを確認し、それらのＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用の阻害剤としての有効性を実証した。
【０４２０】
ＳＵＭＯ化でのクレードル分子の効果を、次に、ＳＵＭＯｓとＳＵＭＯコンジュゲーションカスケードのＳＵＭＯ  Ｅ１活性化酵素（ＳＡＥ１／ＳＡＥ２）とＥ２コンジュゲーション酵素（Ｕｂｃ９）との間の共有結合複合体のインビトロでの形成を観察することにより調査した（図２７Ｂ）。この解析において、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ３の両方が基質として存在しており、クレードル分子のアイソフォーム特異性の直接的な評価を可能にする。クレードル分子の非存在下、又はｙＳＵＭＯ特異的ｙＳＭＢ−１クレードル分子の存在下において、Ｅ１及びＥ２は、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ３の両方とコンジュゲートした（図２７Ｃ、レーン１及び２）。一方、ｈＳ１ＭＢ−４又はｈＳ１ＭＢ−５のどちらかの存在下において、ｈＳＵＭＯ１のコンジュゲーションは、Ｅ１依存的なステップで阻害されたが、ｈＳＵＭＯ３コンジュゲーションは促進された（図２７Ｃ、レーン３−８）。ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ３は、同一のＥ１活性化酵素に関して競合するので、ｈＳＵＭＯ３コンジュゲーションの促進は、競合剤としてのｈＳＵＭＯ１が効果的に排除され、そして、Ｅ１酵素がｈＳＵＭＯ３により多く利用できたという理由である可能性が高い。ＳＩＭベースペプチド阻害剤は、この過程を阻害しなかったため（Li, et al., supra, 2010）、クレードル分子によるｈＳＵＭＯ１コンジュゲーションの有効な阻害は、注目すべきものであった。
【０４２１】
ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体構造の、Ｅ１／ｈＳＵＭＯ１複合体の結晶構造（Olsen, et al., supra, 2010）との重ね合わせ（superposition）は、ｙＳＭＢ−1と類似した形態において、ｈＳＵＭＯ1に結合するクレードル分子が、Ｅ１の構造的に良く定義されている領域と立体的に衝突する原因とはならないだろうことを示唆する。むしろ、クレードル分子は、ＳＡＥ１サブユニット（残基〜１７５−２０５）における長い不規則なループの軌道に配置されるだろう（図２８）。結果として、クレードル分子とＳＡＥ１ループとの間の立体的な衝突は、クレードル分子／ｈＳＵＭＯ１複合体の、Ｅ１への結合を妨げ、したがって、これはＥ１依存的ステップでのＳＵＭＯ化を阻害することが予想される。ＳＩＭペプチドに基づく以前に報告された阻害剤は、十分に小さく、そのような立体的な障害の原因になる可能性はないと思われ、この（阻害剤）が、ＳＵＭＯ化をなぜ阻害しなかったかを説明する（Li, et al., supra, 2010）。ｈＳ１ＭＢ−４は、ＳＵＭＯ化を阻害することについて、ｈＳ１ＭＢ−５よりも顕著に一層効果的であった（図２７Ｂ）（これらのｈＳＵＭＯ１についてのＫｄ値は、〜2倍異なるのみであり、これらの大きさは、本質的に同一であるが（図２２Ｂ））。この阻害効果の違いは、ｈＳＵＭＯ１に結合したときの２つのクレードル分子の空間的な配置における微妙な変化によって説明が可能であろうし、提案された機構と一致する。
【０４２２】
ｈＳＵＭＯ1  Ｃ末端ジグリシン配列でのＳＥＮＰ1開裂を観察することによるインビトロ解析によると、ｈＳ１ＭＢ−４及びｈＳ１ＭＢ−５のどちらも脱ＳＵＭＯ化に影響しなかった（Tatham and Hay, Methods Mol. Biol. (2009) 497:253-268）（図２９）。ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ構造の、ＳＥＮＰ１に結合するｈＳＵＭＯ１の構造との重ね合わせ（Shen, et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (2006) 13:1069-1077）は、クレードル分子とプロテアーゼとの間に明確な衝突がないことを示唆し、類似の態様でｙＳＭＢ−１に結合するクレードル分子は、ＳＥＮＰ１／ｈＳＵＭＯ１相互作用を阻害することはないだろうことを示唆する。
【０４２３】
材料と方法
「ファージディスプレイライブラリ構築」
ＳＵＭＯターゲットファージディスプレイライブラリを、近年における最適化（Wojcik, et al., supra, 2010）も組み込んだ以前に記載されている方法（Koide, A., et al., supra, 2007）で調製した。ライブラリを、ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループにおけるポリセリン配列を含む「シェイブした（shaved）」鋳型を使用して創作した。アミノ酸多様性を、図１１Ｂ及び高効率Ｋｕｎｋｅｌ遺伝子突然変異によって示されるコドンの縮重を使用して、ＦＧループ及びスキャフォールド位置に導入した。
【０４２４】
「ファージディスプレイ選択」
選択での使用に関して、ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ−１及びｈＳＵＭＯ−２を、Ｎ末端の近傍の単一のシステインを除いてシステイン残基を欠く（ＣからＳへの変異）改変されたＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）変異体へのＣ末端融合体として発現した。これは、遺伝子を、以前に報告されたベクター（Wojcik, et al., supra, 2010）にクローニングすることにより達成した。ｈＳＵＭＯ−１の場合、Ｃ５２Ａ変異が使用され、ｈＳＵＭＯ−２の場合は、Ｃ４７Ｓ変異が使用された。ＧＳＴ融合ターゲットは、ＥＺリンク（link）ビオチンＨＰＤＰ（Pierce）を使用して、酸化還元開裂可能ビオチン部分（モイエティ、moiety）を有する様に修飾した。ファージ増殖に関して、ＬａｃＩ含有プラスミドｐＭＣＳＧ２１が形質転換されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＸＬ２１細胞と称する）を、ＩＰＴＧが添加されるまで、転写静止を維持するために使用した。クレードル分子ディスプレイファージは、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ及びヘルパー（helper）ファージ  Ｋ０７の存在下で、ファージミドライブラリをトランスフェクトしたＸＬ２１細胞を成長させることにより調製した（Koide, A., and Koide, S., supra, 2007; Sidhu, S. S., et al., Methods Enzymol. (2000) 328:333-363）。第一回目のライブラリ選択において、５０ｎＭのビオチン化ＧＳＴターゲットを、十分量のストレプトアビジンコンジュゲート磁石ビーズ（Streptavidin MagneSphere（登録商標）Paramagnetic Particles; Promega, Z5481/2）と共に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファ  ｐＨ７．５  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）（ＴＢＳＴ）中で混合した。ビーズをＴＢＳＴ中、ビオチンの５μＭ溶液でブロックした。このターゲット溶液に、０．５ｍｌ  ＴＢＳＴ＋０．５％  ＢＳＡに１０１１−１２のファージを懸濁したものを加え、この溶液を混合し、室温で15分間インキュベートした。ビーズをＴＢＳＴで２回洗浄した後、結合されたファージを含むビーズ懸濁液を新しいＸＬ２１培地に添加した。ファージを、以前に記載した方法（Sidhu, et al., supra, 2000）で増殖させた。第二回目（の選択）（round）において、ファージを、５００ｎＭの非ビオチン化ＧＳＴ競合剤（competitor）を含有するＴＢＳＴ＋０．５％  ＢＳＡで前インキュベートし、集団からＧＳＴバインダを除去した。ターゲット結合ファージは、次に、１０ｎＭ  ＧＳＴターゲットを担持した（load）ストレプトアビジンコンジュゲート磁石ビーズにより捕獲した。ターゲットタンパク質に結合したファージは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０に１００ｍＭ  ＤＴＴを含有するビオチン化薬剤中でリンカーを開裂させることによりビーズから溶出した。ファージミドを、上に記載したように、洗浄し、リカバーした。増殖の後、第３回、第４回目の選択を、それぞれ１ｎＭ及び０．１ｎＭのターゲットを使用して行なった。
【０４２５】
「タンパク質の発現と精製」
ＧＳＴ融合タンパク質を、遺伝子を以前に記載したベクター（Wojcik, et al., supra, 2010）にクローニングすることにより製造した。他のタンパク質の全ては、遺伝子をｐＨＦＴ２ベクターにクローニングすることにより発現させた。ｐＨＦＴ２は、６−Ｈｉｓの代わりに１０−Ｈｉｓタグを含むｐＨＦＴ１の誘導体である。特に注記しない限り、全てのタンパク質は、Ｓｔｕｄｉｅｒらの方法、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．（2005）  ４１：  ２０７−２３４に従って、ＺＹＰ−５０５２自己誘導培地中で適切なｐＨＦＴ２ベクターを有するＢＬ２１（DE3）細胞を成長させることにより発現させた。タンパク質は、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Thermo）と連結させた、Ｎｉ−セファロースカラム（GE Healthcare）、又は、Ｈｉｓ−Ｍａｇ磁性粒子（Novagen）を使用して精製した。
【０４２６】
「表面プラズモン共鳴」
ターゲット結合から［導かれる］理論的な最大反応（Rmax）が１００−２００ＲＵとなるように、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、上に記載したように精製されたクレードル分子を、Ｈｉｓ−タグを介して、ＮＴＡ表面に固定した。濃度を種々変化させたターゲットタンパク質を、次に，３０μＬ／分の流速で、表面上に流し、結合シグナルを記録した。キネティックトレース（kinetic traces）の適合（あてはめ：fitting）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して行なった。平衡試験に関して、複数のターゲット濃度について平衡結合反応を記録し、単純な１：１飽和結合曲線に適合させた。
【０４２７】
「ファージＥＬＩＳＡ」
ファージ増殖に関して、ＬａｃＩ含有プラスミドｐＭＣＳＧ２１が形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞を使用した（Stols, et al., Protein Express. Purif. (2007) 53:396-403）（以下、「ＸＬ２１」と称する）。クレードル分子ディスプレイファージは、個々のクローンのファージミドをトランスフェクトしたＸＬ２１細胞を、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ及びヘルパーファージ  Ｋ０７の存在下で、成長させることにより調製した（Koide, A., and Koide, S., supra, 2007; Sidhu, et al., supra, 2000）。培地を次に、遠心分離し、ファージ含有上清をＥＬＩＳＡ解析に使用した。全てのインキュベーションは、室温で実施した。ｈＳＵＭＯ１結合クレードル分子の特異性の試験に使用した、ファージタイトレーション（titration）試験（図２６）を除く全ての場合において、９６ウェル  Ｍｉｃｒｏｌｏｎ（ｃ）（Greiner）ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｃｌバッファ（ＴＢＳ）中、適切なターゲットタンパク質のＧＳＴ融合物の２μｇ／ｍＬ溶液で処理するか、又はＧＳＴのみで処理し、1時間インキュベートし、続いて、ＴＢＳ中、０．５％  ＢＳＡで1時間ブロックした。ｈＳＵＭＯ１バインダ特異性試験において、ＴＢＳ中、２μｇ／ｍＬ  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）で被覆し、続いて、０．５％  ＢＳＡでブロックし、そして、ＢＴ−Ｔｒｉｓ  ＮＴＡ化合物と複合体を形成したヒスチジンタグ化ｙＳＵＭＯ、ｈＳＵＭＯ１又はｈＳＵＭＯ２（ヒスチジンタグにビオチン部分（モイエティ）を非共有結合的に連結したものである）（Koide, A., et al., supra, 2007; Reichel, et al., Analytical Chem. (2007) 79:8590-8600）の５０ｎＭ  溶液を添加して、３０分間インキュベートした。エピトープマッピング競合試験において、ＧＳＴターゲットで被覆したウェルは、次に、ＴＢＳ中、１μＭ  ｙＳＭＢ−１又は１μＭ  ｈＳ１ＭＢ−４、又はＴＢＳのみのもの、のいずれかと共に1時間インキュベートした。他の試験においては、このステップは行なわなかった。ウェルをＴＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、５０μＬの、ＴＢＳ＋０．５％  ＢＳＡでのファージ上清の３０％溶液をウェルに加え、３０分間インキュベートした。ファージタイトレーション試験において、この３０％溶液のシリアル５倍段階希釈液もまた試験した。競合試験において、１μＭ  ｙＳＭＢ−１又は１μＭ  ｈＳ１ＭＢ−４が結合混合液に含まれていた。結合したファージを次に、Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢＥＬＩＳＡ比色解析基質（Pierce）に連結した西洋ワサビペルオキシダーゼ（GE Healthcare）にコンジュゲートされた抗Ｍ１３抗体を使用して検出した。５分後に、反応をＨ２ＳＯ４の添加により抑え、ファージ結合を450ｎｍで測定される吸光度によって定量した。
【０４２８】
「ＮＭＲエピトープマッピング」
過剰の非ラベル化クレードル分子の存在下及び非存在下に、ラベルされたｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトラにおける化学シフトを比較することより、ＮＭＲエピトープマッピングを行なった。均一に１５Ｎラベル化されたｙＳＵＭＯ及びｈＳＵＭＯ１を、ｙＳＵＭＯ又はｈＳＵＭＯ１遺伝子を含有するｐＨＦＴ２誘導体を有するＢＬ２１（DE3）細胞を、１５ＮＨ４Ｃｌを唯一の窒素源として有するＭ９倍地中で、培養することにより製造した。ｐＨＦＴ２は、６−Ｈｉｓの代わりに１０−Ｈｉｓタグを有するｐＨＦＴ１（Huang, et al., supra, 2006）誘導体である。Ｃ５２Ａ変異を含むｈＳＵＭＯ１変異体を使用した。タンパク質発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導した。タンパク質は、Ｎｉ−セファロースカラム（GE Healthcare）を使用して精製した。ＴＥＶプロテアーゼでのＮ末端タグ配列の開裂の後、タンパク質を濃縮し、５０ｍＭ  フォスファート、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝６．５に溶解した。１Ｈ、１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトラを、製造者により提供されたパルス配列を使用して、Ｖａｒｉａｎ（Palo Alto, CA）ＩＮＯＶＡ  ６００  ＮＭＲスペクトロメーターで、回収した。全てのｙＳＵＭＯスペクトラを、２０℃で記録した。全てのｈＳＵＭＯ１スペクトラを、１７℃で記録した。ｙＳＵＭＯ共鳴を、Ｓｈｅｎｇらにより以前に報告された割当て（assignment）を使用して割当てた（Sheng and Liao, Protein Sci. (2002) 11:1482-1491）。ｈＳＵＭＯ１共鳴を、Macauley, et al. J. Biological Chem. (2004) 279:49131-49137により以前に報告された割当を使用して割当てた。上記のバッファ中、フリーな［１５Ｎ］−ｙＳＵＭＯ（３８０μＭ）、フリーな［１５Ｎ］−ｈＳＵＭＯ１（２２８μＭ）、ラベルされていないクレードル分子（２００μＭ）と複合体を形成した［１５Ｎ］−ｙＳＵＭＯ（１００μＭ）及び、ラベルされていないクレードル分子（４８４μＭ）と複合体を形成した［１５Ｎ］−ｈＳＵＭＯ１（２４２μＭ）について、スペクトラを収集した。クレードル分子の結合により影響を受ける残基を、フリーなもの［のスペクトラ］とクレードル分子が結合したものスペクトラを比較することにより特定した。アミドの交差ピークを５のカテゴリーに分類した：強力に影響をうけたもの（２つのピーク幅よりも大きいシフト）、適度に影響を受けたもの（１つのピークの幅と２つのピークの幅の間のシフト）、弱く影響を受けたもの（およそ１つのピーク幅のシフト）、影響を受けなかったもの（１つのピーク未満のシフト）、及び排除されたもの（不明瞭でなく割当てが出来なかった共鳴）（Farmer, et al., Nature Struct. Biol. (1996) 3:995-997; Huang, et al., J. Molec. Biol. (1998) 281:61-67）。
【０４２９】
「Ｘ線結晶学」
ｙＳＭＢ−１及びｙＳＵＭＯタンパク質を上に記載されたように発現させ、精製した。ＴＥＶプロテアーゼで、タグ配列を除去した後、２つのタンパク質を、１：１のモル比で混合し、４．９ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に濃縮し、そして、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０に溶解した。複合体の形成及び単分散をゲル濾過により行なった。ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ複合体を１４％  ＰＥＧ８０００、１６％  グリセロールで、１９℃で、ハンギングドロップ蒸気拡散法（hanging drop vapor diffusion method）を使用して結晶化した。８０％  母液及び、凍結保護物質として２０％  グリセロールの混合液で結晶を凍結した。ＡＰＳビームライン２１−ＩＤ−Ｆ（Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory）で回折データを回収した。結晶及びデータ収集情報は、表４に説明する。Ｘ線回析データは、ＨＫＬ２０００で処理し（processed）、スケール化（scaled）した（Otwinowski, Z., and Minor, W., Methods in Enz. (1997) 276:307-326）。ＣＣＰ４（(1994) The CCP4 suite）のプログラム  ＭＯＬＲＥＰで、２つの異なったモデルで、配列検索を使用して、分子置換により、構造を決定した。ｙＳＵＭＯ構造（Ｃ鎖  ＰＤＢ  ＩＤ  Ｃｏｄｅ  ２ＥＫＥの残基１０１３−１０９８）を、可変ループ領域が欠損したＦｎＩＩＩ構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ｃｏｄｅ  １ＦＮＡ）と共に、検索モデルとして使用した（Dickinson, C., D., et al., J. Mol. Biol. (1994) 236:1079-1092; Duda, et al., J. Molec. Biol. (2007) 369:619-630）。リジッドボディリファインメント（Rigid body refinement）は、ＲＥＦＭＡＣ５で行なった（Murshudov, G. N., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr (1997) 53:240-255）。モデル構築及び水分子の検索は、Ｃｏｏｔ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して行なった（Emsley, P., and Cowtan, K., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr (2004) 60:2126-2132）。模擬アニーリングは、ＣＮＳ１．１において行なった（Brunger, A. T., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr (1998) 54:905-921）。ＴＬＳ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／Ｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｓｃｒｅｗ）及びバルク溶媒パラメータ、制限された温度因子及び最終的な位置の精緻化は、ＲＥＦＭＡＣ５で完遂した（Murshudov, et al., supra, 1997）。分子図は、ＰｙＭＯＬを使用して作成した（これは、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｐｙｍｏｌ．ｏｒｇにある）。
【０４３０】
「ＳＵＭＯターゲットクレードルライブラリのデザイン」
ＳＵＭＯターゲットライブラリにおける位置と多様性の選択は以下の論理的根拠で行なった。ＦＧループの全ての残基を、ｙＳＭＢ−１／ｙＳＵＭＯ結晶構造においてｙＳＵＭＯと接触せず、如何なる類似のインターフェイスにも直接に関与することができると思われなかった１つの残基Ｓ７７を除いて改変した。７６番目の位置は、ｙＳＭＢ−１インターフェイスにおいてｙＳＵＭＯと直接的に接触しないが、この位置は、全てのＳＵＭＯにおいて保存されているＲ５５と相互作用し得ると考えられたので（図２２Ａ）、発明者は、Ｙ７６をＤ、Ｈ、Ｎ及びＹに改変した。ｙＳＭＢ−１のロイシン８１は、全てのＳＵＭＯアイソフォームにわたって保存されているｙＳＵＭＯ表面のポケット内に埋められており、対応する「アンカー」であるロイシン［sic,イソロイシン］又はバリンは、全てのＳＩＭ／ＳＵＭＯ複合体の構造に保存されている。結果として、この位置のアミノ酸多様性は、Ｆ、Ｌ、Ｉ及びＶに制限された。Ｅ４７及びＳ８６は、ｙＳＭＢ−１インターフェイスにおいて極最小の接触を作り、これらは変化しなかった。ＦＧループのＰ８７は、ｙＳＭＢ−１インターフェイスにおいて、明瞭な接触を作らなかったが、これは、ターン構造（turn structure）の摂動を避けるために、常に定置（constant）されており、これは、おそらくＦＧループの全体的な位置決めの改変を誘導する。
【０４３１】
「ＳＵＭＯ／ＳＩＭ相互作用におけるクレードル分子の効果」
Ｍｉｃｒｏｌｏｎ（著作権）（Greiner）ＥＬＩＳＡプレートのウェルを２μｇ／ｍＬ  ＧＳＴ−ＲａｎＢＰ２で、１時間室温で被覆した。このＲａｎＢＰ３２のＩＲ１−Ｍ−ＩＲ２コンストラクト（construct）は、以前に記載されている（Tatham, et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (2005) 12:67-74）。複合体を、ｈｉｓタグ化ＳＵＭＯ化ＲａｎＧＡＰ（これはＳＵＭＯ１で修飾されている）と、ビオチン部分（モイエティ）をＨｉｓタグに非共有結合的に取り付けるＢＴ−Ｔｒｉｓ−ＮＴＡ剤との間で前形成した（Koide, A., et al., Protein Eng. Des. Sel. (2009) 22:685-690; Reichel, et al., supra, 2007）。この複合体を、濃度を変えたｈＳ１ＭＢ−４と共に、1時間インキュベートし、そして、混合液を、ＥＬＩＳＡプレートに添加し、３０分間インキュベートした。結合したＳＵＭＯ−ＲａｎＧＡＰは、次に、Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ薬剤（Pierce）に連結したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して、検出した。反応を２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で抑え、４５０ｎｍの吸光度で測定した。
【０４３２】
「ＳＵＭＯ化でのクレードル分子の効果」
ｈＳＵＭＯ１及びＨｉｓ６−ＳＵＭＯ３（24 μM ea.）の混合液は、濃度を種々変えたクレードル分子、ｈＳ１ＭＢ−４又はｈＳ１ＭＢ−５のどちらかと混合し、1時間インキュベートした。Ｅ１（SAE1/2, 1.7 μM）、Ｅ２（Ubc9, 13.7 μM）、及びＡＴＰ（5.5 mM）の混合液を次に添加し、そしてＳＵＭＯ化反応を、３７℃で１０分間、継続させた。反応を次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングダイの添加により抑え、反応混合液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【０４３３】
「脱ＳＵＭＯ化でのクレードル分子の効果」
ＹＦＰ−ｈＳＵＭＯ１−ＥＣＦＰ融合タンパク質（63 μg/mL）を、濃度を変えたクレードル分子ｈＳ１ＭＢ−４、ｈＳ１ＭＢ−５又は、コントロールとしてｙＳＭＢ−１と混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＳＥＮＰ１を次に、３２ｎＭの最終濃度で加え、混合液を１５分間、３７℃でインキュベートした。反応を、反応容器を氷上に置くことで停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファを添加し、次に５分間沸騰させた。反応混合液を次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【０４３４】
［実施例９］
ＦｎＩＩＩベータシートライブラリデザインの代替的表面を使用して構築されたクレードル分子
ＦｎＩＩＩドメインは、２つのベータシートを有しており（図３０Ａ）、１つは、ベータ鎖Ａ、Ｂ及びＥにより構築されており、他方は、ベータ鎖Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧにより構築されている。ターゲット（Ａｂｌ  ＳＨ２ドメイン）と複合形成したクレードル分子の結晶構造は、ＦｎＩＩＩドメインのＣＤＦＧベータシート領域の残基（複数）（これらは、我々のライブラリにおいては多様化していなかった）によって作られる広範囲の相互作用（extensive interaction）を明らかにした（図３０Ｃ）（Wojcik, et al., supra, 2010）。アラニンスキャニング突然変異試験は、結合におけるこれらの残基のエネルギーの重要性を実証した（Wojcik, et al., supra, 2010）。これらのベータシート表面の似たような使用が、酵母小ユビキチン様修飾因子（ySUMO）に結合するクレードル分子においても観察された（Gilbreth, R. N., et al., Proc Natl Acad Sci USA (2011) 108:7751-7756）。これらの観察は、抗体―模倣工学（antibody-mimic engineering）（たとえば、抗体相補性決定領域（CDRs）に相当するループにより特徴付けられる相互作用）に頼った従来のデザインとは異なるターゲット結合表面を構築することは可能であり得ることを示唆する。ＣＤＦＧベータシートの表面は、僅かに凹んでおり、多くの球形巨大分子に見られる凸形表面に相補的な認識表面（recognition surface）を形成するのに適していることを示唆する。
【０４３５】
そのような代わりのＦｎＩＩＩライブラリデザインの有効性、及び、従来のループに注目したＦｎＩＩＩ工学の戦略と比較したそれらの性能はどの程度のものであるかを調査するために、２つの異なったクレードル分子ライブラリが構築された。クレードルライブラリと称される１つめのライブラリは、ＦＧ及びＣＤループにおける残基、並びにベータ鎖Ｃにおける残基（残基３１及び３３）及び［ベータ鎖］Ｄにおける残基（残基４７及び４９）を利用し（図３０Ｅ及び３１Ａ）、上に記載のような凹形結合表面を表現した。ループのみライブラリと称される他のライブラリは、ベータシート領域において多様化された残基を有さない、ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループにおける位置を利用する従来のＦｎＩＩＩライブラリデザインを構成する（図３０Ｄ及び３１Ｂ）。
【０４３６】
以前に記載されたように（Wojcik, et al., supra, 2010）、両ライブラリにおいて、高度にバイアスされた（偏った）アミノ酸の多様性及び、ＦＧループの様々なループ長を使用した。ループのみライブラリにおいて、この多様性をまた、長さを変化させたＢＣループの位置にも使用した。ループのみライブラリにおけるＤＥループは、長さが固定され、位置５２にも含まれるＴｙｒ又はＳｅｒに対してのみＧｌｙで多様化された（図３１Ｂ）。クレードルライブラリにおいて、Ｐｒｏ及びＧｌｙを除くコドン、ＦｎＩＩＩドメインの構造的な整合性（integrity）に悪影響がでる可能性があるアミノ酸を、内部ベータ鎖であるベータ鎖Ｃの位置に使用した。末端の鎖であるベータ鎖Ｄに関して、アミノ酸の小サブセット（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ及びＴｈｒ）を使用した。Ａｌａ及びＴｈｒは、ターゲットの結合を妨げ得る大きな側鎖を避けるように意図され、Ｇｌｕ及びＬｙｓは、分子間ベータシートの形成により媒介される凝集を妨げるための陰性デザイン要素として含有させた（Richardson, J. S., and Richardson, D. C., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:2754-2759）。Ｔｙｒは、タンパク質相互作用インターフェイスの作成に高度に適しているので（Koide, S., and Sidhu, S. S., ACS Chem Biol (2009) 4:325-334）、Ｔｙｒ７３は、常にターゲットとの相互作用に貢献しているであろうという期待から多様化しなかった。それぞれ２．０×１０１０及び１．５×１０１０の独立した配列の推定数を有するファージディスプレイ形式（format）で、両ライブラリを構築した。
【０４３７】
クレードルライブラリ由来の高親和性ＦＮＩＩＩクレードル分子
従来の「ループのみ」ライブラリ（Wojcik, et al., supra, 2010）に対する新しいクレードルライブラリの性能は、３つのターゲット（Ａｂｌ  ＳＨ２、ヒト小ユビキチン様修飾因子１（hSUMO1）、及び緑色蛍光タンパク質（GFP））を使用して比較された。多様化された残基の局在を除いて、これらのライブラリについての分子プラットフォーム（molecular platform）は同一であった。これらのライブラリは、類似した数の独立した配列（複数）を含んでいた。ターゲットとライブラリの各組み合わせに関して、クレードル分子を生じさせるための以下のステップを行なった。第一に、ファージディスプレイ由来のクレードル分子を富化させた。Ｎ末端セグメント及びＣ末端セグメントを次に、Ｅ鎖において結合を有する、与えられたターゲットについて富化させた集団におけるクレードル分子クローンの間で「シャッフル」し、酵母表面ディスプレイ形式における第２世代（second-generation）ライブラリを創作した（Koide, et al., supra, 2007）。遺伝子シャッフリングステップを、最初のファージディスプレイライブラリにおいてサンプルされたものを越えて配列空間を増加させるために組み込んだ。最終的に、酵母表面ディスプレイライブラリを、フロサイトメトリーを使用してソートした。
【０４３８】
クレードルライブラリ及び「ループのみ」ライブラリの両方由来のターゲットの全てに対するＦｎＩＩＩドメイン変異体を発生させた。多くのＦｎＩＩＩドメイン変異体が、酵母ディスプレイ形式で測定され、低いｎＭの範囲にＫｄ値を有する高親和性を示した（図３１Ａ−３１Ｃ）。これらのＫｄ値は、精製されたＦｎＩＩＩドメイン変異体及び表面プラズモン共鳴を使用して決定されたこれらの（Ｋｄ値）と良く一致した（図３１Ｄ）。以前に発生させたＦｎＩＩＩドメイン変異体と同様に、両ライブラリから選択された全てのＦｎＩＩＩドメイン変異体において、ＦＧループの残基は変異しており、これは、ＦｎＩＩＩドメイン変異体のターゲット認識におけるＦＧループ残基の中心的な重要性を示唆する。クレードルライブラリ由来のクレードル分子のいくつかは、野生型のＣＤループ及びＤ鎖を含んでおり、これらの残基は、これらのクレードル分子におけるターゲット認識に関与していないか、又は野生型残基の置換は、親和性の改良をもたらさなかったかのいずれかであることを示唆する。反対に、Ｃ鎖の多様化された位置（複数）は、選択されたクレードル分子の全てにおいて変異しており、異なったターゲットに対するクレードル分子は、異なったアミノ酸配列を示した（図３１Ａ）。ＧＦＰ結合クレードル分子のＣ鎖であるＧＳ♯２が、野生型配列に戻るように変換された場合、変異体は完全にＧＦＰに対する結合を喪失した（図３３）。共に、これらの結果は、クレードルライブラリに由来するクレードル分子のターゲット結合におけるＣ鎖の位置の重要性を支持する。
【０４３９】
２つのライブラリは、異なったターゲットに対して異なった挙動をするように見える。ＧＦＰに関して、クレードルライブラリクローンは、ループのみライブラリ由来の対応物（counterpart）と比較してより高い親和性を有したが、ｈＳＵＭＯ１に関しては、その傾向は反対であった。高親和性ＦｎＩＩＩドメイン変異体は、Ａｂｌ  ＳＨ２に関する両ライブラリから得られた。これらの結果は、両ライブラリが、これらの様々なターゲットに対するＦｎＩＩＩドメイン変異体を生じさせることが可能である一方、２つの異なったライブラリの使用が、より広範囲のターゲットに対する、高度に機能的なＦｎＩＩＩドメイン変異体を発生させる可能性を高めることを示唆する。
【０４４０】
この研究は、ｈＳＵＭＯ１について良い親和性を有する、いくつかのループのみＦｎＩＩＩドメイン変異体を生じさせたが、一方、以前の研究において、ｙＳＭＢ−９と呼ばれるＦｎＩＩＩドメイン変異体が、サブ−μＭ  Ｋｄでリカバーされた唯一のｈＳＵＭＯ１バインダであった（Gilbreth, et al., supra, 2011）。２つの研究の間の１つの注目すべき違いは、本研究においては、ループシャッフリングステップを包含することである。下に表すように、ｙＳＭＢ−９／ｈＳＵＭＯ１結晶構造は、３つの全てのループ由来の残基がｙＳＭＢ−９における結合に重要であり、同様のことが、本研究で単離された高度に相同なクレードル分子にも真実であろうことを強く示唆する。したがって、以前の研究と一致して（Hackel, et al., supra, 2008）、ループシャッフリングは、調査できる配列スペース（sequence space）を拡張し、したがって、高親和性ＦｎＩＩＩドメイン変異体を生ずる可能性を増加させる。
【０４４１】
クレードル分子ターゲット複合体の結晶構造は、ライブラリデザインを裏付けする
ターゲットである、ＡｂｌキナーゼのＳＨ２ドメインと複合体を形成した、ＳＨ１３と称される、クレードルライブラリから単離されたクレードル分子の結晶構造を、１．８３Åの分解能で決定した（図３１Ａ及び３２Ａ；表９）。ＳＨ１３は、ループシャッフリングをしていないファージディスプレイライブラリと酵母ディスプレイスクリーニングから直接に発生させた最初のクレードル分子クローンの範疇であった。その結果、これは、〜４μＭのＫｄ値の低親和性を有する。ＳＨ１３クレードル分子は、以前に決定されたクレードル分子構造からの最小偏差によって証拠付けられてるＦｎＩＩＩスキャフォールド構造を維持していた（ＣαＲＭＳＤ＜０．７Å、変異した残基を除く）（Wojcik, et al., supra, 2010; Gilbreth, et al., supra, 2008）。Ａｂ１  ＳＨ２ドメインの全体の構造は、同様に、以前に公表された、他のクレードル分子と複合体を形成したＡｂ１  ＳＨ２ドメインの結晶構造と良く一致している（ＣαＲＭＳＤ＜０．５Å）（Wojcik, et al., supra, 2010）。ＳＨ２ドメインのホスホＴｙｒ結合ポケットは、結晶化溶液に存在した、スルファートイオンと一致する電子密度を含んでいた。
表９  データ収集及び精密化統計（分子置換）
2013539362.tif 000047
ＡＰＳ、アドバンスフォトンソース（Advanced Photon Source）
＊括弧内に表される最も高い分解能シェルの値
2013539362.tif 000048
ｈｋｌ反射のｉ観測について
2013539362.tif 000049
§Ｒfreeは、精密化の前に隔離された反射の５％を有するＲである。
【０４４２】
クレードルライブラリのデザインに従って、ＳＨ１３クレードル分子は、主にクレードル表面を使用して、ターゲットに結合する（図３２Ａ）。結晶構造において観察される相互作用のモードは、ＮＭＲ化学シフト摂動を使用してマップされた（mapped）エピトープと一致する（図３２Ｂ）。クレードル分子により示される凹形表面は、Ａｂｌ  ＳＨ２ドメインの凸形表面を効果的に補完する（相補的である）。相互作用インターフェイスに埋められた総表面（面積）は、ほぼ２０００Å２であり、ＳＨ１３クレードル分子は、〜１０３０Å２を占め、Ａｂ１  ＳＨ２ドメインは９６０Å２を占めている。とりわけ、〜９０％のインターフェイスにおいて埋められたクレードル分子表面は、ライブラリの発生において多様化された位置の残基によって得られる。同様に、ＳＨ２原子の５Åの中にある、２１のクレードル分子残基のうち１５の［残基］は、クレードルライブラリにおいて多様化された位置にあった。これらの１５残基のうち、１つを除いて、ターゲット認識に直接的に関与する。インターフェイスに対する多様化された位置の広範囲な貢献は、ライブラリデザインが、ターゲットと直接の接触を作ることが可能な位置にアミノ酸多様性を集中させるのに効果的であることを示唆する。これらの特徴はまた、タンパク質相互作用インターフェイスの構築のためのＦｎＩＩＩベータシートの表面の有効性に関して追加的な支持を与える。
【０４４３】
ＳＨ１３により認識されるＡｂ１  ＳＨ２ドメインのエピトープは、以前に報告されたクレードル分子が認識するホスホペプチド結合インターフェイスとは顕著に異なる（Wojcik, et al., supra, 2010）。しかしながら、ＳＨ１３エピトープはまた、ＳＨ２ドメインの既知の機能的に重要な表面である。全長のＡｂｌキナーゼのコンテクスト（context）において、αＡヘリックスの中央にあるこの表面は、キナーゼを不活性のコンホメーション（conformation）に維持することを助けるキナーゼドメインのＣローブとの相互作用を媒介する。ＳＨ１３へのエピトープのおよそ半分（〜４７５Å２）は、αＡヘリックス全体と、このヘリックスにすぐに隣接する残基を含む線状セグメントより得られる（図３２Ｂ）。ＳＨ１３クレードル分子の凹形状パラトープは、このヘリックスにより示される凸形状表面を認識するのに適しているように思える。もっぱらループベース結合表面を有するクレードル分子において典型的に観察される、凸形状パラトープ形状を有するクレードル分子は、この表面を認識することができる可能性は低い。
【０４４４】
２つの異なった型のライブラリから単離されたＦｎＩＩＩドメイン変異体におけるターゲット認識に関する構造的な基礎をより良く比較し、対照させる目的で、ｈＳＵＭＯ１に結合するＦｎＩＩＩドメイン変異体であるｙＳＭＢ−９の結晶構造を、２．１５Åの分解能で決定した（図３２Ｃ；表９）。ｙＳＭＢ−９ＦｎＩＩＩドメイン変異体は、僅かに異なった選択スキームを使用して、同一の「ループのみ」ファージディスプレイライブラリよりリカバーされ（Hogrefe, H. H., et al., Gene (1993) 128:119-126）、この研究においてリカバーされた新しいｈＳＵＭＯ１クレードル分子に対して密接なホモロジーを表す（図３１Ｂ）。したがって、ｙＳＭＢ−９／ｈＳＵＭＯ１複合体の構造は、「ループのみ」ＦｎＩＩＩ変異体がどのように、そのターゲットを認識するかという良い例を提供する。構造は、３つのループ全てを使用する「正面（head-on）」の態様で、ｈＳＵＭＯ１へｙＳＭＢ−９がｈＳＵＭＯ１に結合し、典型的なループベースＦｎＩＩＩライブラリデザインにおいて想定される正確な様態において、隣接する（contiguous）結合表面を形成することを表した（図３２Ｃ）。それぞれ、ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループはそれぞれ、ＦｎＩＩＩドメインのベータシート領域により得られる埋められた表面を含まない、ＦｎＩＩＩ変異体の埋められた総表面の５４％、６％及び４０％を占める。
【０４４５】
ｙＳＭＢ−９  ＦｎＩＩＩ変異体により示される相互作用のモードは、Ａｂｌ  ＳＨ２への結合においてＳＨ１３により使用される「クレードル」表面と著しく対照的であり（図３２Ａ）、酵母ＳＵＭＯ（顕著にｙＳＵＭＯ）結合ＦｎＩＩＩ変異体であるｙＳＭＢ−１において以前に観察されたものとも顕著に異なる（図３２Ｃ及び３２Ｄ）（Gilbreth, et al., supra, 2011）。ＦｎＩＩＩ変異体であるｙＳＭＢ−１においては、ＳＨ１３により示される相互作用の側面及びループモード（side-and-loop mode）に似たものを形成するために、ＦＧループ及び野生型ＦｎＩＩＩスキャフォールドを使用した。興味深いことに、ｙＳＢＭ−１及びｙＳＭＢ−９は、ｈＳＵＭＯ及びｙＳＵＭＯにおいて構造的に同等で、高度に保存されたエピトープにそれぞれ結合する（図３２Ｄ）。したがって、ＦｎＩＩＩ変異体のこの対は、「ループのみ」及び「クレードル」結合モードの両方が、本質的に同一のターゲット表面を成功裏に認識するために使用することができ、さらに、両ライブラリデザイン戦略の有効性を支持することを実証する。さらには、ｙＳＭＢ−９により認識されるエピトープは、形状が平坦であり、一方ループのみ結合表面は、平坦な表面を認識するのに適切でないと思われる凸形状表面を有する傾向があるが、これは、ループのみＦｎＩＩＩ変異体ライブラリを使用して平坦なエピトープに対するバインダを効果的に生じさせることが可能であることを実証する。
【０４４６】
アミノ酸多様化のための位置が、従来のＦｎＩＩＩ変異体ライブラリの［位置］と異なる新しい型のＦｎＩＩＩクレードル分子ライブラリを開発した。新しいクレードルライブラリは、高親和性クレードル分子を生じさせるのに効果的であり、従来の「ループのみ」ライブラリと比較した性能は、異なったターゲット分子によって明確に異なると思われる。さらに、新しいクレードルライブラリ由来のクレードル分子の結晶構造は、凹形状のパラトープを示し（図３２Ａ）、これは、「ループのみ」ライブラリ由来のＦｎＩＩＩ変異体においてしばしば観察される、平坦な又は凸形状のパラトープと明確に異なる（図３２Ｃ）。タンパク質表面の大多数は、形状が、平坦から凸形状に及んでいるので、凹形状パラトープを生じることができる新しいライブラリの能力は、タンパク質―タンパク質相互作用インターフェイスを阻害するためのクレードル分子の使用において重要であろう。ＳＨ１３構造は、ＦｎＩＩＩドメインのベータシート領域における残基が、ターゲット結合の際に、最小のバックボーン（backbone）移動を受けたことを示した。したがって、結合の際に、これらの残基によって被った、小さなエントロピーのペナルティは、高い親和性を達成するのに有利に貢献し得る。共に、これらの結果は、単一のＦｎＩＩＩドメインが、明確に異なったトポグラフィ（distinct topography）を有するエピトープ（複数）を認識することが正確にできる結合表面の様々な型を生じるために使用できることを明確に示す。これは、人工の結合インターフェイスを生じさせるためのＦｎＩＩＩドメインの利用を拡張する。
【０４４７】
ＦｎＩＩＩ及びイムノグロブリン可変ドメインの構造的な比較において、この研究において新しい結合部位を構築するために使用されたＦｎＩＩＩドメインの「ＤＣＦＧ」ベータシートは、重鎖と軽鎖との可変ドメインの間のヘテロ二量化（heterodimerization）を媒介するイムノグロブリン可変ドメインのベータシートに相当する（Amzel, L. M., and Poljak, R. J., Annu Rev Biochem (1979) 48:961-997）。それゆえ、イムノグロブリンドメインは、外来分子の認識のためにではなく、特異的タンパク質―タンパク質相互作用のために、このベータシート表面を利用する。らくだ様の（camelid）単一ドメイン抗体（VHHs）において、相当するベータシートは、従来の可変ドメインに対していくつかの変異を含み、これは、ヘテロ二量体化を妨げる（Desmyter, A., et al., Nat Struct Biol (1996) 3:803-811; Hamers-Casterman, C., et al., Nature (1993) 363:446-448）。今まで報告されている多くのらくだ様ＶＨＨのパラトープは、３つのＣＤＲループで作られ、凸形状のトポグラフィを有しているが（De Genst, et al., Proc Natl Acad Sci USA (2006) 103:4586-4591）、「側面及びループ」モードに相当する結合モードを使用するＶＨＨのまれな例が確認されている（Kirchhofer, A., et al., Nat Struct Mol Biol (2010) 17:133-138）。これらの例は、ＶＨＨスキャフォールドもまた、そのような「側面バインダ」を生じさせるために、ＦｎＩＩＩドメインと同一の態様で使用することができることを示唆する。そのようなＶＨＨ分子の希少性（rarity）は、それらのアミノ酸多様性が天然の免疫系において生じる態様から由来しているもようである。イムノグロブリン配列の多様性の生成の基礎となる遺伝子組み換え機構は、ＣＤＲに焦点を合わせる（Wu, T., T., et al., Proteins: Struct Funct Genet (1993) 16:1-7）。それゆえ、ベータシートの「側面」位置は、天然の免疫レパートリー（repertoire）において広くは多様化されておらず、「側面バインダ」ＶＨＨ分子を発生させる機会を制限する。
【０４４８】
ＦｎＩＩＩ変異体は、それらの構造的類似性から、抗体の近縁の模倣物として見られているが、クレードルライブラリのデザインは、この「抗体模倣物」の考え方から離れること（departure）を示す。クレードル分子−ターゲット複合体の構造的な特徴付けは、クレードル分子―ターゲット相互作用の予期外のモード及び、ターゲット認識のためのベータシート表面の潜在的な有用性を特定するための手段となったことが強調された。天然の資料由来のイムノグロブリンライブラリと異なり、クレードル分子ライブラリは、インビトロ突然変異を使用して生成され、ライブラリにおけるアミノ酸多様化のための配位位置（location）の選択について完全な制御を提供する。この自由性（freedom）は、明確であり、人工的なスキャフォールド系の重要な有利な点である。類似のアプローチが、他のスキャフォールドにおいて結合インターフェイスを構築するために役立つ顕著な（distinct）表面を特定するのに有効であるはずである。このデザイン戦略は、分子認識インターフェイスのデザインの一般的な見識を与える。
【０４４９】
方法と材料
「タンパク質の製造及び修飾」
ターゲットタンパク質（Ａｂｌ  ＳＨ２、ｈＳＵＭＯ１、及びＧＦＰ）及びクレードル分子を、ｐＨＦＴ２ベクターを使用して、Ｈｉｓ１０タグタンパク質として製造し（Koide, et al., supra, 2007）、以前に記載されたように精製した（Gilbreth, et al., supra, 2011, Koide, A., et al., supra, 2009）。この研究で使用されたｈＳＵＭＯ１サンプルは、ダイマー形成を妨げるＣ５２Ａ変異を含んでいた（Tatham, M. H., et al., J Biol Chem (2001) 276:35368-35374）。アイソトープ富化サンプルを、以前に記載されたように調製した（Pham, T-N, and Koide, S., J Biomol NMR (1998) 11:407-414）。ＳＰＲ試験に関して、ターゲットのＨｉｓタグセグメントを、ＴＥＶプロテアーゼを使用して開裂させた。結晶化に関して、Ｈｉｓタグセグメントを、両ターゲット及びクレードル分子から取り除いた。
【０４５０】
酵母ディスプレイに使用したターゲットタンパク質は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Thermo Fisher Scientific）を使用してビオチン化した。典型的に、０．３−０．６ｍｇ／ｍｌのターゲットタンパク質を、６０μＭの薬剤で３０分間インキュベートし、反応を、０．１Ｍの終濃度でＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８）を加えることにより抑えた。過剰のビオチン化薬剤を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｃｌバッファ、ｐＨ  ８に対して透析することにより取り除いた。ビオチン化のレベルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量解析法を使用して、１分子当り〜１となるように決定した。
【０４５１】
「ファージ及び酵母ディスプレイ、ライブラリ構築及び選択」
「ループのみ」のライブラリは既知である（Wojcik, et al., supra, 2010）。クレードルライブラリは、以前に記載されている様に、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異法を使用して構築した（Koide, A., and Koide, S., supra, 2007, Sidhu, et al., supra, 2000）。ファージディスプレイ選択を、以前に記載された方法に従って行なった（Fellouse, F. A., et al. J Mol Biol (2007) 373:924-940, Koide, A., et al., supra, 2009）。Ｈｉｓタグ化ターゲットタンパク質を、等モルの濃度のＢＴｔｒｉｓＮＴＡ、ビオチン部分（モイエティ）を含む高親和性Ｎｉ−ＮＴＡ化合物と共に３０分間インキュベートし、ＢＴｔｒｉｓＮＴＡ／ｈｉｓタグ化タンパク質複合体を形成し、この複合体を、クレードル分子ファージディスプレイライブラリと共にインキュベートした。１、２及び３回目の（選択）（rounds）に使用したターゲット濃度は、それぞれ、Ａｂｌ  ＳＨ２に関しては１００、１００及び５０ｎＭ、ＧＦＰに関しては１００、５０及び５０ｎＭであり、ｈＳＵＭＯ１に関しては，（３回を）通して１００ｎＭであった。ＢＴｔｒｉｓＮＴＡ／ターゲット複合体に結合したクレードル分子ディスプレイファージをストレプトアビジン（ＳＡＶ）被覆磁石ビーズを使用して捕獲した。捕獲したファージを、ターゲットとＢＴｔｒｉｓＮＴＡとの間の連結を破壊する１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で溶出した。リカバーされたファージを、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で増殖させ、クレードル分子―ｐ３融合遺伝子の発現を誘導させた。
【０４５２】
３回のファージディスプレイライブラリ選択の後、選択されたクレードル分子の遺伝子を酵母ディスプレイベクターに移動させ、酵母における相同組み換えを使用して酵母ライブラリを作成した（Swers, J. S., et al., Nucleic Acids Res (2004) 32:e36）。酵母ディスプレイライブラリの構築の間の遺伝子シャッフリング（Gene shuffling）を、以下の通りに組み込んだ。線状化した酵母ディスプレイベクターｐＧａｌＡｇａＣａｍＲ（Koide, A., et al., J Mol Biol (2007) 373:941-953）を、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ消化を使用して調製した。残基１−７４をそれぞれエンコードするクレードル分子遺伝子セグメント及び、残基５４−９４を［エンコードするクレードル分子遺伝子セグメント］を別に、ファージ選択の後に富化したプールからＰＣＲを使用して増殖させた。酵母株ＥＢＹ１００を、次に、３つのＤＮＡフラグメントの混合物を使用して形質転換した。正しく組み換えられたクローンは、Ａｇａ２−クレードル分子−Ｖ５タグの融合遺伝子を含んでいた。形質転換体を、トリプトファン欠損培地で選択し、Ａｇａ２−クレードル分子融合タンパク質を、以前に記載されたように発現させた（Koide, et al., supra, 2007, Boder and Wittrup, supra, 2000）。
【０４５３】
以前に記載されたように、３０ｎＭ  ビオチン化Ａｂｌ−ＳＨ２、１０ｎＭ  ビオチン化ｈＳＵＭＯ１、及び３ｎＭ  ビオチン化ＧＦＰを使用して、酵母ディスプレイライブラリをソートした(Koide, et al., supra, 2007)。表面ディスプレイ（surface-displayed）したクレードル分子を、抗Ｖ５抗体（Sigma）で検出した。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）（ＮＡＶ）−ＰＥ（InvitroGen）又はＳＡＶ−ＰＥ（InvitroGen）及び、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−６４７ニワトリ抗ウサギＩｇＧ（InvitroGen）を、ビオチン化タンパク質及び抗Ｖ５抗体の第２次検出薬剤としてそれぞれ使用した。総計２回（rounds）のライブラリソートを、Ａｂｌ  ＳＨ２及びｈＳＵＭＯ１に関して行い、１回［のソート］をＧＦＰに関して行なった。
【０４５４】
「酵母ディスプレイを使用した親和性測定」
ソートされたライブラリ由来の個々のクローンを、以前に記載されたように、寒天プレート上で単離し、そして液体培地中で成長させた（Koide, et al., supra, 2007, Boder and Wittrup, supra, 2000）。各クローンについて、５万の酵母細胞を、様々な濃度のビオチン化ターゲットと共に、撹拌しながら、３０分間氷上で、ポリプロピレン９６ウェルプレート（Greiner 650201）のウェル中、ＢＳＳバッファ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で、２０μｌの最終容量で、インキュベートした。９６ウェルフィルタープレート（MultiScreenHTS HV, 0.45μm 穴サイズ; Millipore）のウェルを、１００μｌ  ＢＳＳを添加して洗浄し、次に、真空を適用して液体を取り除いた。結合反応液からの細胞懸濁液を９６ウェルフィルタープレートの洗浄したウェルに移動させた。結合溶液を、真空ろ過により取り除いた。ウェル中の酵母細胞を、１００μｌのＢＳＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＢＳＳバッファ）で２回、同じように洗浄した。次に、２０μｌの、ＢＳＳ中１０μｇ／ｍｌ  ＮＡＶ−ＰＥ（InvitroGen）を各ウェルに添加した。３０分間の、撹拌しながらの氷上でのインキュベーションの後、１回、細胞をＢＳＳＴで洗浄した。細胞を３００μｌのＢＳＳに懸濁し、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ６／Ｌフローサイトメーター（Millipore）を使用して解析した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Synergy Software）を使用して１：１の結合モデルに適合（fit）させることによって、ターゲット濃度に対する平均ＰＥ蛍光強度のプロットから、Ｋｄ値を決定した。
【０４５５】
「表面プラズモン共鳴」
すべてのＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで行なった。キネティック試験に関して、製造者より提供されたアミン結合（amine coupling）の以下の方法を使用して、Ａｂｌ  ＳＨ２をＣＭ５チップに固定した。濃度を変化させたクレードル分子を、１００μｌ／分の流速で、表面上に流し、結合シグナルを記録した。５つ１組のデータセットを加工し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２  ｐｒｏｇｒａｍ（BioLogic Software, Campbell, Australia）を使用して、物質移行を含む２分子モデルに適合させた。物質移行の存在を、流速を変化させることにより確認した。平衡試験を、以前に記載されたように行った（Gilbreth, et al., supra, 2011）。２部のデータセットを、Ｓｃｕｒｕｂｂｅｒ２で加工し、飽和曲線を、Ｏｒｉｇｉｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（OriginLab, Northampton, MA）を使用して、１：１結合モデルに適合させた。
【０４５６】
「結晶化及び構造決定」
ＳＨ１３／Ａｂｌ  ＳＨ２ドメイン複合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（GE Lifesciences）で精製した。複合体を、〜１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２Ｍ  マクネシウムクロリド、０．１Ｍ  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ５．５及び２５％  ＰＥＧ  ３３５０で、１９℃で、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化した。ｙＳＭＢ−９及びｈＳＵＭＯ１タンパク質を１：１のモル比で混合し、総タンパク質濃度を〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に溶解させた。複合体を２４％  ＰＥＧ−８０００、０．１Ｍ  イミダゾール、ｐＨ＝８．０で、１９℃で、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して結晶化した。８０％  母液及び凍結保護物質として２０％  グリセロールの混合液で結晶を凍結した。結晶及びデータ収集情報は、表１に示す。
【０４５７】
Ｘ線回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｅａｍｌｉｎｅｓ（Argonne National Laboratory）で収集した。結晶及びデータ収集情報は、補助的な表１に示す。Ｘ線回折データを、ＨＫＬ２０００（Otwinowski, Z., supra, 1997）で加工し、スケール化した。ＳＨ１３／Ａｂｌ  ＳＨ２構造を、ＣＣＰ４ｐｒｏｇｒａｍ  ｓｕｉｔｅでＰｈａｓｅｒを使用する分子置換により決定した（The CCP4 Suite, supra ,1994; Potterton, E., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr (2003) 59:1131-1137）。検索モデルとして、ループ領域を除き、Ａｂｌ  ＳＨ２ドメイン及びＦｎＩＩＩスキャフォールドを使用して、多コピー検索を行なった（それぞれ、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＡＢＬ及びｌＦＮＡ）。模擬アニーリング、エネルギーの最小化、Ｂ−因子の精密化及びマップ構築は、ＣＮＳを使用して行なった（Brunger, A. T., et al., supra, 1998; Brunger, A. T., Nature protocols (2007) 2:2728-2733）。ｙＳＭＢ−９／ｈＳＵＭＯ１構造を、ＣＣＰ４のＭＯＬＲＥＰプログラム（The CCP4 Suite, supra ,1994）で２つの異なったモデルを使用する配列検索を使用する分子置換によって決定した。ｈＳＵＭＯ１構造（Ｂ鎖の残基２０−９２、ＰＢＤ  ＩＤコード  １Ｚ５Ｓ）を、可変ループ領域を欠損させたＦｎＩＩＩ構造（ＰＢＤ  ＩＤコード１ＦＮＡ）と共に、検索モデルとして使用した（Dickinson, et al., supra, 1994; Reverter, D., supra, 2005）。モデル構築及び水分子の検索は、Ｃｏｏｔ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して行なった（Emsley, P., supra, 2004）。ＴＬＳ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／Ｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｓｃｒｅｗ）及びバルク溶媒パラメータ、抑制された温度因子及び最終位置の精密化を、ＲＥＦＭＡＣ５で行った（Murshudov, et al., supra, 1997）。分子グラフィックは、ＰｙＭＯＬを使用して作成した（これは、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｐｙｍｏｌ．ｏｒｇにある）。表面領域（面積）の計算を、ＰＲＯＴＯＲＰタンパク質−タンパク質相互作用サーバーを使用して行なった（Reynolds, et al., supra, 2009）。
【０４５８】
「ＮＭＲ分光法」
以下のスペクトラの一式は、製造者より提供されたパルスシーケンス（1H,15N-HSQC, HNCO, CBCACONH, HNCACB, CCONH, HN(CA)CO）を使用した低温プローブを備えたＶａｒｉａｎ（Palo Alto, CA）ＩＮＯＶＡ  ６００  ＮＭＲ  スペクトロメータを使用して、９０％Ｈ２Ｏ及び１０％Ｄ２Ｏ中で調製した１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０μＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％  アジ化ナトリウム含有１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．４中、均一に１３Ｃ／１５Ｎを富化したＡｂｌ  ＳＨ２ドメイン（〜２００μＭ）について得た。ＮＭＲデータを、ＮＭＲＰｉｐｅ及びＮＭＲＶｉｅｗ  ソフトウェアを使用して処理し、解析した（Delaglio, F., et al., J Biomol NMR (1995) 6:277-293; Johnson, B. A., et al., J Biomol NMR (1994) 4:603-614）。共鳴の割当ては、ＰＩＮＥサーバーを使用して得（Bahrami, A., et al., PLoS Computational Biology (2009) 5:e1000307）そして、ＮＭＲｖｉｅｗでの目視検査によって検証した。エピトープマッピングに関して、ラベルされていないＳＨ１３クレードル分子の１．２５倍のモル［濃度］の超過の存在下及び非存在下における、１Ｈ、１５Ｎ富化Ａｂｌ  ＳＨ２ドメインの１Ｈ、１５Ｎ−ＨＳＱＣのスペクトラ（〜６０μＭ）が記録された。１Ｈ、１５Ｎ−ＨＳＱＣ交差ピークを、以前に記載されたように（Koide, et al., supra, 2007）、ＳＨ１３結合の際の移動の程度について分類した。
【図１】
2013539362.tif 000050
【図２Ａ】
2013539362.tif 000051
【図２Ｂ】
2013539362.tif 000052
【図３Ａ】
2013539362.tif 000053
【図３Ｂ】
2013539362.tif 000054
【図４Ａ】
2013539362.tif 000055
【図４Ｂ】
2013539362.tif 000056
【図４Ｃ】
2013539362.tif 000057
【図４Ｄ】
2013539362.tif 000058
【図５Ａ】
2013539362.tif 000059
【図５Ｂ】
2013539362.tif 000060
【図５Ｃ】
2013539362.tif 000061
【図５Ｄ】
2013539362.tif 000062
【図５Ｅ】
2013539362.tif 000063
【図５Ｆ】
2013539362.tif 000064
【図５Ｇ】
2013539362.tif 000065
【図５Ｈ】
2013539362.tif 000066
【図６Ａ】
2013539362.tif 000067
【図６Ｂ】
2013539362.tif 000068
【図６Ｃ】
2013539362.tif 000069
【図６Ｄ】
2013539362.tif 000070
【図６Ｅ】
2013539362.tif 000071
【図６Ｆ】
2013539362.tif 000072
【図７Ａ】
2013539362.tif 000073
【図７Ｂ】
2013539362.tif 000074
【図８】
2013539362.tif 000075
【図９Ａ】
2013539362.tif 000076
【図９Ｂ】
2013539362.tif 000077
【図９Ｃ】
2013539362.tif 000078
【図９Ｄ】
2013539362.tif 000079
【図９Ｅ】
2013539362.tif 000080
【図９Ｆ】
2013539362.tif 000081
【図１０Ａ】
2013539362.tif 000082
【図１０Ｂ】
2013539362.tif 000083
【図１０Ｃ】
2013539362.tif 000084
【図１１Ａ】
2013539362.tif 000085
【図１１Ｂ】
2013539362.tif 000086
【図１１Ｃ】
2013539362.tif 000087
【図１２Ａ】
2013539362.tif 000088
【図１２Ｂ】
2013539362.tif 000089
【図１２Ｃ】
2013539362.tif 000090
【図１３】
2013539362.tif 000091
【図１４Ａ】
2013539362.tif 000092
【図１４Ｂ】
2013539362.tif 000093
【図１４Ｃ】
2013539362.tif 000094
【図１４Ｄ】
2013539362.tif 000095
【図１５】
2013539362.tif 000096
【図１６Ａ】
2013539362.tif 000097
【図１６Ｂ】
2013539362.tif 000098
【図１６Ｃ】
2013539362.tif 000099
【図１６Ｄ】
2013539362.tif 000100
【図１６Ｅ】
2013539362.tif 000101
【図１７】
2013539362.tif 000102
【図１８】
2013539362.tif 000103
【図１９Ａ】
2013539362.tif 000104
【図１９Ｂ】
2013539362.tif 000105
【図２０Ａ】
2013539362.tif 000106
【図２０Ｂ】
2013539362.tif 000107
【図２０Ｃ】
2013539362.tif 000108
【図２１Ａ】
2013539362.tif 000109
【図２１Ｂ】
2013539362.tif 000110
【図２２Ａ】
2013539362.tif 000111
【図２２Ｂ】
2013539362.tif 000112
【図２２Ｃ】
2013539362.tif 000113
【図２２Ｄ】
2013539362.tif 000114
【図２２Ｅ】
2013539362.tif 000115
【図２２Ｆ】
2013539362.tif 000116
【図２３】
2013539362.tif 000117
【図２４】
2013539362.tif 000118
【図２５Ａ】
2013539362.tif 000119
【図２５Ｂ】
2013539362.tif 000120
【図２６Ａ】
2013539362.tif 000121
【図２６Ｂ】
2013539362.tif 000122
【図２７Ａ】
2013539362.tif 000123
【図２７Ｂ】
2013539362.tif 000124
【図２７Ｃ】
2013539362.tif 000125
【図２８】
2013539362.tif 000126
【図２９Ａ】
2013539362.tif 000127
【図２９Ｂ】
2013539362.tif 000128
【図３０Ａ】
2013539362.tif 000129
【図３０Ｂ】
2013539362.tif 000130
【図３０Ｃ】
2013539362.tif 000131
【図３０Ｄ】
2013539362.tif 000132
【図３０Ｅ】
2013539362.tif 000133
【図３１Ａ】
2013539362.tif 000134
【図３１Ｂ】
2013539362.tif 000135
【図３１Ｃ】
2013539362.tif 000136
【図３１Ｄ】
2013539362.tif 000137
【図３２Ａ】
2013539362.tif 000138
【図３２Ｂ】
2013539362.tif 000139
【図３２Ｃ】
2013539362.tif 000140
【図３２Ｄ】
2013539362.tif 000141
【図３３】
2013539362.tif 000142
【配列表】
2013539362000001.app
【国際調査報告】
2013539362.tif 000143
2013539362.tif 000144
2013539362.tif 000145
2013539362.tif 000146
2013539362.tif 000147
2013539362.tif 000148