(57)【要約】  サンプル調製及び検体検出のためのシステムは、流体チャネル、導波路、及び捕捉スポットを備えたカートリッジを含む。システムはさらに、力場発生装置、画像化システム、並びに検体を潜在的に含むサンプル、標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ力場に応答する第一の種類の粒子、及び標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ信号を生成することができる第二の種類の粒子を含む液体を含む。サンプルが標的検体を含む場合、標的検体と結合部分との特異的な結合相互作用は、標的検体を介して第一及び第二の種類の粒子を連結させ、捕捉スポットで多重粒子複合体を形成する。力場は、第二の種類の粒子からの検出される信号が、サンプル中の標的検体の指標となるように、粒子及び多重粒子複合体の操作を可能にする。
2013503352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル調製及び検体検出のためのシステムであって、ここでシステムは以下：
カートリッジ、ここでカートリッジは以下：
液体チャンネル、
導波路、及び
導波路上で、且つ流体チャネル内に配置された捕捉スポット、を含み；
力場生成装置；
画像化システム；及び
液体、ここで液体は以下：
標的検体を潜在的に含むサンプル、
第一の種類の粒子、ここで第一の種類の粒子は、標的検体に特異的である結合部分を含み、且つ力場に応答する、及び
第二の種類の粒子、ここで第二の種類の粒子は、標的検体に特異的である結合部分を含み、且つ信号を生成することが可能である、を含む、
を含む、システムであって、
ここで、サンプルが標的検体を含む場合、標的検体と、第一及び第二の種類の粒子上結合部分との特異的な結合相互作用は、少なくとも一つの第一の種類の粒子、及び少なくとも一つの第二の種類の粒子に、標的検体を介して連結させ、多重粒子複合体を形成し、
ここで、液体が捕捉スポットに接触した場合、多重粒子複合体は、一つ又は複数の捕捉スポットで捕捉されることができ、
ここで、第二の種類の粒子により生成され、且つ画像化システムで捕捉された信号が、サンプル中の標的検体の存在の指標となるように、力場が、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体の少なくとも一つの操作を可能にする、システム。
【請求項２】
前記第一の種類の粒子が、磁性粒子であり、ここで力場発生装置が磁石である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記磁性粒子が磁性成分を含むポリスチレンマイクロスフェアである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記多重粒子複合体が、指向性の信号増幅を示す、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記第二の種類の粒子が、発光粒子である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記流体チャネルの少なくとも一部を照射するように、励起エネルギーを供給するための励起源をさらに含み、且つここで、励起エネルギーがそれに入射された場合、第二の種類の粒子が、蛍光信号を生成するために設定される蛍光粒子である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記導波路が平面導波路であって、且つ励起エネルギーが平面導波路を介して全内部反射により、少なくとも一部において、流体チャネルの一部に向けられる、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記導波路が平面導波路である、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記カートリッジが、導波路上、且つ流体チャネル内に配置された複数の捕捉スポットを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記画像化システムが、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）、及び相補型金属酸化物半導体（「ＣＭＯＳ」）センサからなる群から選択される画像センサを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
サンプル処理及び検体検出のための方法であって、以下：
サンプルを提供すること、標的検体を潜在的に含むサンプル；
第一の種類の粒子を提供すること、標的検体に特異的な結合部分を含む第一の種類の粒子、力場に応答する第一の種類の粒子；
第二の種類の粒子を提供すること、標的検体に特異的な結合部分をまた含む第二の種類の粒子、信号を生成することのできる第二の種類の粒子；
標的検体の存在下で、第一の種類の粒子の一つ、及び第二の種類の粒子の一つが標的検体を介して連結して多重粒子複合体を形成するように、標的検体と第一及び第二の種類の粒子上の結合部分の間の特異的な結合相互作用を許容する条件下で、サンプルと第一及び第二の種類の粒子とを接触させること；
力場を用いて、第一及び第二の種類の粒子並びに多重粒子複合体の少なくとも一つを操作すること；並びに
多重粒子複合体に感受性であり、第一及び第二の種類の粒子の個別の一つには反応しない方法で、多重粒子複合体を検出すること、ここでそのように検出される多重粒子複合体は、標的検体の指標である、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記操作することが、第一及び第二の種類の粒子、並びに多重粒子複合体の少なくとも一部に磁場を適用することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記操作することが、第二の種類の粒子から、第一の種類の粒子及び多重粒子複合体を分離することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二の種類の粒子を提供することが、第二の種類の粒子として発光分子が用いられることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発光分子を用いることが、第二の種類の粒子として蛍光分子を用いることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多重粒子複合体を検出することは、以下：
第二の種類の粒子が標的検体と連結し、多重粒子複合体の一部を形成するように、励起エネルギーで多重粒子複合体の少なくとも一部を照射すること、及び
そのように照射された第二の種類の粒子により生成された信号を感知すること、
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記の多重粒子複合体の少なくとも一部を照射することは、ボリュームに隣接して配置された、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが照射されるように、ボリューム内の励起エネルギーを含むこと、及びガイドすることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記の第一及び第二の種類の粒子並びに多重粒子複合体の少なくとも一つを操作することは、第一の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが照射されるように、第二の種類の粒子を移動させてボリュームから離すことを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の力場を適用することは、標的検体に連結していない第二の種類の粒子をサンプルから取り除く一方で、多重粒子複合体を保持するように、サンプルを力場に曝すことを含む方法であって、以下：
サンプル中でそのように保持される多重粒子複合体において連結する第二の種類の粒子が検出可能な信号を生成するように、サンプルに励起エネルギーを供給すること、
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記多重粒子複合体が指向性の信号増幅を示し、且つ前記多重粒子複合体を検出することが、指向性の信号増幅に反応する方法で検出可能な信号を感知することを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
この発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約ＡＩ０６５３５７の下に、政府支援で成された。政府はこの発明において所定の権利を有する。
【０００２】
優先権及び関連出願
この出願は、２００９年８月３１日に出願された米国仮特許出願番号６１／２３８，３７６の利益を主張する。この出願番号６１／２３８，３７６の詳細は、その全体において、及び全ての目的のために、参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
体液（例えば、血液、尿、鼻洗浄液）を含む生物学的サンプル、環境的サンプル、及びバイオプロセスサンプルにおける標的検体を測定するための方法は、いくつかの特異的検出アッセイが後に続く、生物学的サンプル調製の組み合わせがしばしば要求される。検体、例えば生物学的サンプルにおけるタンパク質、核酸、及び細胞は、典型的に、複合的な液体又は固体環境中の低濃度成分である。
【０００４】
核酸、例えばリボ核酸（「ＲＮＡ」）及びデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）は、生物学的アッセイにおいて、特に有用な標的検体である。例えば、インフルエンザウイルス検出について、標的検体は、鼻スワブ中の低濃度のウイルス粒子内に含まれるＲＮＡから成り得る。生物学的サンプルを調製するために、例えば、標的ＲＮＡが分解酵素から保護される一方で、試料は、スワブから放出され、鼻粘膜マトリックスは壊され、ウイルス粒子はオープンになるに違いない。同様の処理ステップは、体液又は組織を含む他の生物学的マトリックス、環境的サンプル、法医学的サンプルなどにおける核酸標的検体に要求される。適切なサンプル調製を実施後、多くの進歩した核酸検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、核酸配列ベース増幅（「ＮＡＳＢＡ」）、転写仲介増幅（「ＴＭＡ」）、ループ仲介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）、又は他の酵素的増幅技術などの方法を経た標的検体の増幅を要求する。これらの方法の全ては、標的マトリクスにおける混入物に対する様々な感度を有し、従って、慎重なサンプル調製が要求される。最終的に、増幅は、典型的に、増幅産物を測定するために、信号変換のいくつかの種類と結合される。
【０００５】
他の有用な標的検体は、ペプチド、抗原、抗体、及び他のタンパク質を含む。しばしばこれらの標的は、残屑、様々な細胞種類、及び標的検体よりも何桁も大きい濃度であり得るタンパク質のバックグラウンドを含む複合体マトリックスにおいて、非常に低濃度である（例えば、１ミリリットルの血液あたり、ピコグラムの抗原濃度）。ペプチド又はタンパク質標的の検出のための一般的な手法は、標的を選択的に固定する、及び検出するための標的検体に対して特異的な親和性を有する抗体を用いる、サンドイッチイムノアッセイのバリエーションである。イムノアッセイにおける信号変換は、しばしば、いくつかの信号変換手段、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）において色変化をもたらすために使用される酵素、蛍光イムノアッセイ（「ＦＩＡ」）に用いられる蛍光標識、化学発光、及び放射性標識で標識された抗体に基づく。粒子凝集アッセイ及びイムノクロマトグラフィーアッセイは、可視的な信号を生じる粒子集合に基づくイムノアッセイの例である。組織学、蛍光顕微鏡検査法、及びフローサイトメトリー適用では、細胞集団の分析はまた、典型的に、標識された検体特異的抗体が、標的検体を比色分析的に又は蛍光的に標識するために用いられる免疫染色ステップを要求する。磁性粒子はまた、磁気的信号変換のための標識として用いられ得る。
【０００６】
全細胞（例えば、哺乳動物、植物、又は細菌）及びウイルス粒子は、標的検体の別の分類を定義する。さらに、標的検体細胞又は粒子は、しばしば、複合的サンプル環境において低濃度で発見される。例えば、血中の臨床的に意義のある細菌濃度は、１ミリリットルあたり、１〜１０コロニー形成単位である。多数の複合的なサンプル調製及び標識は、典型的に、細胞標的の検出が要求される。
【０００７】
マイクロスフェア、ビーズ、及びナノ粒子を含む機能化された粒子は、多数の生物学的アッセイ用途に用いられている。いくつかの手法は、下記で強調される。
【０００８】
粒子に基づくサンプル調製：機能化された磁性粒子及びビーズは、生物学的なサンプル洗浄、濃縮、及び分離に関連して用いられる。磁性粒子は、大きさ、担体マトリックス（例えば、ポリマー、シリカ）、デザイン（例えば、コア‐シェル、埋め込まれた酸化鉄ナノ粒子）、及び表面化学の範囲において、市販されている。磁性粒子は、高額又は複雑な設備を要求することなく、サンプル操作を可能にする。非磁性粒子はまた、生物学的サンプル調製に使用される。一つの例は、選択的に核酸と結合するカオトロピックバッファの存在におけるシリカ粒子の使用である。
【０００９】
粒子に基づく検出：粒子は、生物学的アッセイにおける検出又は信号変換を提供するために用いられ得る。典型的な方法は、ラテックス凝集アッセイ、イムノクロマトグラフィーアッセイ、光散乱アッセイ、及び蛍光粒子アッセイを含む。標的検体の存在が機能化されたラテックス粒子の凝集（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）又は凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）を引き起こす、凝集アッセイは、単純で、視覚的に読み取る（ｖｉｓｕａｌｌｙ−ｒｅａｄ）アッセイである。特異的な結合基（例えば、抗体）を有する粒子は、多孔質体を通して移動し、標的検体の存在下で、特異的な結合基が固定されている多孔質体においてライン又はスポットの上に蓄積する、側方流動アッセイ及び他のイムノクロマトグラフィー法はまた、典型的に視覚的に読み取るアッセイである。多数の粒子種（例えば、着色されたラテックス、金、及びセレンコロイド）は、イムノクロマトグラフィーアッセイに用いられる。ラテックス凝集及びイムノクロマトグラフィー手法の主な不都合な点は、限られた感度及び限られた多重化能力である。視覚的な読み取りはまた、これらの技術を定性的及び主観的にする。
【００１０】
検体検出を目的とする別の粒子に基づく手法は、生物学的アッセイにおいて、信号変換を提供する蛍光標識粒子の使用である。蛍光色素及び他の発色団、例えばランタノイドキレートを含むポリマー及びガラス粒子は、市販されており（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、さらなる機能化を実施するための表面反応基と共に供給される。蛍光粒子は、平面導波路に基づく検出に関連して用いられ、様々な蛍光標識粒子の多重化された測定に基づく多重検体検出方法は、実証される（Ｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌらにより、ＷＡＶＥＧＵＩＤＥ  ＷＩＴＨ  ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＬＥＮＳの表題の下に、２００９年１１月１２日に出願された米国特許出願、出願番号１２／６１７，５３５を参照のこと、それは、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる）。光散乱粒子はまた、平面同波路表面で結合した光散乱粒子を含む検体検出に用いられる。
【００１１】
場支援（ｆｉｅｌｄ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）粒子アッセイ：大量輸送は、固体表面で行われる実際の不均一アッセイにおいて重大な制限を示す。この制限は、特に、対流混合が制限される低容量液体システムにおいて重要である。大量輸送制限を克服するための提案された方法は、核酸、タンパク質、及び全細胞の濃縮及び検出のための電気泳動的手法、及び磁性粒子標識を使用する方法を含む。
【００１２】
二重粒子手法：いくつかの二重粒子手法、例えば、標的検体の存在下で、ラテックス粒子対は形成され、近接に基づくドナー‐アクセプター酸素チャネリング機構を介して信号の生成を可能にする手法は記述されている。加えて、核酸配列の検出のためのシステムは記述されており、それは標的特異的なオリゴヌクレオチド配列を含む磁性粒子、及び標的特異的オリゴヌクレオチド配列をまた含む色素‐カプセル化リポソームを使用する。粒子‐リポソームの組み合わせは、特異的なＲＮＡ標的のためのセンサとして用いられる。「バイオバーコード」アッセイとして集合的に呼ばれる一連の手法では、バーコード配列分子の多数のコピーは、検体の存在下で生成される。あるいは、自己較正アッセイは、粒子複合体及び二重波長検出を利用する。
【００１３】
様々な有用な粒子に基づく分離及び精製方法は、それに続く検出アッセイのための生物学的サンプルを処理することに使用できる。粒子に基づくシステムは、信号変換の方法を提供し、様々な生物学的アッセイ形式における検出モードとして役割を果たし得る。これらの手法の多くは、しかしながら、典型的に、多数の利用者又は機械介入を伴う、複数のサンプル調製及び検体検出ステップが要求される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
概要
一つの実施形態では、サンプル調製及び検体検出のためのシステムは、開示される。システムは、カートリッジを含み、そのカートリッジは、流体チャネル、導波路、及び導波路上且つ流体チャネル内に配置される捕捉スポットを含む。システムは、さらに、力場発生装置、画像化システム、及び流体を含む。流体は、標的検体を潜在的に含むサンプルを含む。流体はさらに、標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ力場に応答する第一の種類の粒子、及び標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ信号を生成することができる第二種類の粒子を含む。サンプルが標的検体を含む場合、第一及び第二の種類の粒子上の標的検体と結合部分の間の特異的な結合相互作用は、少なくとも一つの第一種類の粒子及び少なくとも一つの第二の種類の粒子を、標的検体を介して連結させ、多重粒子複合体を形成する。その上、流体は、捕捉スポットと接触させられた場合、多重粒子複合体は、一つ又は複数の捕捉スポットで捕捉され得る。なおさらには、第二の種類の粒子により生成され、画像化システムで捕捉された信号が、サンプル内で標的検体の存在の指標となるように、力場は、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体の少なくとも一つの操作を可能にする。
【００１５】
さらなる実施形態はで、第一の種類の粒子は磁性粒子であり、力場発生器は磁石である。例えば、磁性粒子は、磁性成分を含むポリスチレンマイクロスフェアである。
【００１６】
なおさらなる実施形態では、多重粒子複合体は、方向性のある信号増幅を示す。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、第二の種類の粒子は、発光粒子である。
【００１８】
さらなる実施形態では、システムはまた、流体チャネルの少なくとも一部を照射するために、励起エネルギーを提供するように励起源を含む。第二の種類の粒子は、励起エネルギーがその表面に入射する場合、蛍光信号を生成するために構成される蛍光粒子である。
【００１９】
なおさらなる実施形態では、励起エネルギーが、平面導波路を通じて全内部反射による少なくとも一部の流体チャンネルの一部に向けられるように、導波路は平面導波路である。
【００２０】
なおさらなる実施形態では、カートリッジは、導波路上、且つ流体チャネル内に配置された多数の捕捉スポットを含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、画像化システムは、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）、及び相補型金属酸化物半導体（「ＣＭＯＳ」）センサからなる群から選択される画像センサを含む。
【００２２】
別の実施形態では、サンプル処理及び標的検出のための方法は開示される。方法は、標的検体を潜在的に含むサンプルを提供することを含む。本方法はまた、標的検体に特異的な結合部分及び力場に反応的であることを含む、第一の種類の粒子を提供することを含む。本方法は、標的検体に特異的な結合部分及び信号を生成し得ることをまた含む、第二の種類の粒子を提供することをさらに含む。本方法は、標的検体の存在下で、第一の種類の粒子の一つ及び第二の種類の粒子の一つが、標的検体を介して連結し、多重粒子複合体を形成するように、標的検体と第一及び第二の種類の粒子上の結合部分の特異的な結合相互作用を許容する条件下で、サンプルと、第一及び第二の種類の粒子とを接触させることさらに含む。本方法はさらに、少なくとも一つの第一及び第二の種類の粒子及び多重粒子複合体を、力場を用いて操作することを含む。最終的には、本方法は、多重粒子複合体に感受性であり、第一及び第二の種類の粒子の個別の一つには感受性でない方法で、多重粒子複合体を検出することを含み、ここでそのように検出される多重粒子複合体は、標的検体の指標である。
【００２３】
さらなる実施形態では、少なくとも一つの第一及び第二の種類の粒子及び多重粒子複合体を操作することは、少なくとも一部の第一及び第二の種類の粒子及び多重粒子複合体に磁場を適用することを含む。なおさらなる実施形態では、操作することは、第一の種類の粒子及び多重粒子複合体を第二の種類の粒子から分離することを含む。
【００２４】
なおさらなる実施形態では、第二の種類の粒子は、発光分子又はイオンを含んでもよい。なおさらなる実施形態では、第二の種類の粒子は、励起エネルギーに曝露された場合、信号を生成する。さらに、別の実施形態では、照射することは、ボリュームに隣接して配置された第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが、照射されるように、ボリューム内で励起エネルギーを含むこと及びガイドすることを含む。なおさらには、操作することは、第一の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが照射されるように、ボリュームから第二の種類の粒子を移動させることを含む。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、操作することは、標的検体と連結していない第二の種類の粒子をサンプルから取り除く一方で、多重粒子複合体を保持するように、力場にサンプルを曝露することを含む。方法は、サンプル中でそのように保持された多重粒子複合体において連結した第二の種類の粒子が検出可能な信号を生成するように、サンプルに励起エネルギーを提供することをさらに含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、多重粒子複合体は指向性の信号増幅を示し、多重粒子複合体を検出することは、指向性の信号増幅に感受的である方法において検出可能な信号を感知することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、核酸、タンパク質、及び細胞標的について、多重粒子複合体形成の典型的な概略図を表す。
【図２】図２は、核酸、タンパク質、及び細胞標的について、多重粒子複合体形成の典型的な概略図を表す。
【００２８】
【図３】図３は、一つの実施形態に従って、サンプル洗浄、多重粒子複合体形成、及び検体検出の典型的な概略図を提供する。
【図４】図４は、一つの実施形態に従って、サンプル洗浄、多重粒子複合体形成、及び検体検出の典型的な概略図を提供する。
【図５】図５は、一つの実施形態に従って、サンプル洗浄、多重粒子複合体形成、及び検体検出の典型的な概略図を提供する。
【図６】図６は、一つの実施形態に従って、サンプル洗浄、多重粒子複合体形成、及び検体検出の典型的な概略図を提供する。
【００２９】
【図７】図７は、一つの実施形態に従って、別の洗浄ステップがない、多重粒子複合体形成、及び検出の典型的な概略図を提供する。
【図８】図８は、一つの実施形態に従って、別の洗浄ステップがない、多重粒子複合体形成、及び検出の典型的な概略図を提供する。
【図９】図９は、一つの実施形態に従って、別の洗浄ステップがない、多重粒子複合体形成、及び検出の典型的な概略図を提供する。
【００３０】
【図１０】図１０は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１１】図１１は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１２】図１２は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１３】図１３は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１４】図１４は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１５】図１５は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１６】図１６は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【図１７】図１７は、捕捉スポットのアレイを含む表面を横切って粒子複合体を移動させるために、磁場を用いる流体カートリッジ及び装置を用いるための方法の典型的な概略図を提供する。
【００３１】
【図１８】図１８は、粒子複合体についての可能な表面ハイブリダイゼーションモードを示す典型的な概略図を提供する。
【図１９】図１９は、粒子複合体についての可能な表面ハイブリダイゼーションモードを示す典型的な概略図を提供する。
【００３２】
【図２０】図２０は、一つの実施形態に従って、画像化表面から非特異的な結合粒子を取り除くための磁気的洗浄プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【図２１】図２１は、一つの実施形態に従って、画像化表面から非特異的な結合粒子を取り除くための磁気的洗浄プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【図２２】図２２は、一つの実施形態に従って、画像化表面から非特異的な結合粒子を取り除くための磁気的洗浄プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【図２３】図２３は、一つの実施形態に従って、画像化表面から非特異的な結合粒子を取り除くための磁気的洗浄プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【図２４】図２４は、一つの実施形態に従って、画像化表面から非特異的な結合粒子を取り除くための磁気的洗浄プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【００３３】
【図２５】図２５は、一つの実施形態に従って、磁気的サンプル分離プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【図２６】図２６は、一つの実施形態に従って、磁気的サンプル分離プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【図２７】図２７は、一つの実施形態に従って、磁気的サンプル分離プロセスを示す典型的な概略図を提供する。
【００３４】
【図２８】図２８は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図２９】図２９は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３０】図３０は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３１】図３１は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３２】図３２は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３３】図３３は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３４】図３４は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３５】図３５は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３６】図３６は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【図３７】図３７は、多重粒子複合体内の粒子の組み合わせにより得られる蛍光信号増幅及び光収集効果の指向性を示す典型的な概略図を与える。
【００３５】
【図３８】図３８は、ＤＮＡ標的検出実験（実施例Ｉ）の代表的な結果を提供する。
【００３６】
【図３９】図３９は、一つの実施形態に従って、サンプル処理及び検体検出システムについての典型的な概略図を提供する。
【００３７】
【図４０】図４０は、実施例Ｖに記述される多重化した粒子実験の典型的な結果を提供する。
【００３８】
【図４１】図４１は、実施例ＶＩに記述されるタンパク質検出実験の典型的な結果を提供する。
【００３９】
【図４２】図４２は、実施例ＶＩＩに記述されるように、粒子複合体のアライメントから得られる蛍光信号増幅を表す代表的な実験結果を提供する。
【００４０】
【図４３】図４３は、実施例ＩＸに記述されるＲＮＡ検出実験の典型的な結果を提供する。
【００４１】
【図４４】図４４は、実施例Ｘに記述されるＲＮＡ検出実験の典型的な結果を提供する。
【図４５】図４５は、実施例Ｘに記述されるＲＮＡ検出実験の典型的な結果を提供する。
【００４２】
【図４６】図４６は、実施例ＸＩに記述されるＨＩＶｐ２４抗原検出実験の典型的な結果を提供する。
【図４７】図４７は、実施例ＸＩに記述されるＨＩＶｐ２４抗原検出実験の典型的な結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
説明の明確性の目的のために、図中の特定の要素は縮小されてはならないことが言及される。
【００４４】
詳細な説明
本明細書で記述される実施形態は、生物学的アッセイのための、単純化され、統合されたサンプル調製及び検出システムの必要性に取り組む。典型的な実施形態は、サンプル調製及び検体検出が、複合的で、時間のかかる、又は自動化の集約的な方法でそれぞれ分離して行われる、現在の技術分野における主な制約に取り組む。わずかな、あったとしても少しの、すでに記述された手法は、首尾よく合わせられ、一回に統合された方法における、サンプル調製及び検出を有する。本明細書で記述された手法は、生物学的アッセイのための、単純化され、統合されたサンプル調製及び検出システムの著しい必要性に取り組む。
【００４５】
検体の例は、核酸、タンパク質、及び複雑な環境下の細胞、例えば生物学的サンプルを含む。例えば、標的検体は、タンパク質又はペプチド標的であってもよく、粒子は、特異的な結合基、例えば抗体、Ｆａｂフラグメント、又はアプタマーで機能化されてもよい。少なくとも二つの異種の粒子種類の複合体は、標的検体の統合された精製、濃縮、及び検出に用いられ得る。例えば、標的検体が、磁場反応性粒子、例えば磁性粒子、と信号生成粒子、例えば蛍光粒子との連結を形成した場合、多重粒子複合体は形成し得る。すなわち、多重粒子複合体は効率的にサンドイッチアッセイとして作用する。
【００４６】
用語「粒子」及び「ビーズ」とは、本明細書で区別せずに用いられ、直径約０．０１〜２０マイクロメーターの大きさに及ぶ様々な組成物のいくつかの粒子を意味する。粒子は、有機材料、例えば、ラテックス、ポリスチレン、アガロース、及び脂質を含むがこれに限定されない。粒子は、多くの場合球状（例えば、ラテックスマイクロスフェア）である一方で、本明細書で開示される粒子は、球状であることは要求されない。粒子はまた、無機材料、例えば、シリカ、及び他のシリカ系ガラス組成物、酸化鉄を含む酸化物、セラミックス、及び半導体を含むがこれに限定されない。粒子はまた、複合構造、例えばコアシェル粒子（例えば、有機ポリマーシェルを含む金属又は金属酸化物コア）、及びその中に金属酸化物サブ粒子を組み込んだポリマーでもよい。
【００４７】
図１は、一つの実施形態に従って、標的検体を介した第一の種類の粒子と第二の種類の別の粒子の連結による、多重粒子複合体の形成の図を示す。複合体１００は、核酸鎖としてここで示される標的検体１１０を含む。標的検体１１０は、第一の末端配列１１２及び第二の末端配列１１４を含む。第一の種類の粒子１２０は、標的検体１１０の第一の末端配列１１２と相補的である、第一のプローブ１２５（例えば、「捕捉プローブ」）で機能化されている。第一の種類の粒子１２０は、例えば、標的検体１１０の第一の末端配列１１２と相補的な捕捉配列で機能化された、磁場反応性粒子、例えば磁性粒子でもよい。特定の例として、第一のプローブ１２５は、５０ヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ捕捉配列でもよい。場反応性粒子は、外力の場、例えば磁場、電場、及び、重力又は沈降場であるがこれに限定されない、に反応する任意の粒子でもよい。
【００４８】
続けて図１に言及すると、第二の種類の粒子１３０は、第二のプローブ（「検出プローブ」）１３５で機能化されており、それは、標的検体１１０の第二の末端配列１１４に相補的である。例えば、第二の種類の粒子１３０は、信号粒子、例えば、第二の末端配列１１４に相補的なＤＮＡ配列で機能化された蛍光粒子でもよい。信号粒子（又は信号生成粒子）は、検出可能な信号を生成する任意の粒子、例えば適切な照射源で励起された場合、光を発する発光粒子でもよい。検出可能な信号の例は、発光、蛍光、リン光、化学発光、光散乱、及び磁場を含むが、これに限定されない。複合体１００は、それぞれ第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０の特徴の組み合わせを示す。例えば、第一の種類の粒子１２０が磁性粒子であり、第二の種類の粒子１３０が蛍光粒子である場合、その後複合体１００は、磁場の適用により操作され得、また適切な励起エネルギー、例えばレーザー又は発光ダイオード（「ＬＥＤ」）からの光の適用により蛍光信号を生成することが誘導される。
【００４９】
様々な実施形態では、標的検体１１０は、それぞれ異なる機能性を有する少なくとも二つの異種の粒子との間のブリッジを形成する。一つの粒子の種類（例えば、第一の種類の粒子１２０）は、力場に反応的（すなわち、場反応性粒子）でもよく、適切な力場の適用で、これらの粒子の分離、精製、及び／又は濃縮を可能にする。例えば、場反応性粒子は、常磁性粒子でもよく、それは、永久磁石又は電磁石からの磁場に反応的である。場反応性粒子はまた、他の磁性粒子種を含んでもよい。場反応性粒子としての使用に適したさらなるの種類の粒子は、沈降粒子、例えば、自然の重力場において又は遠心分離を通じて、沈殿を許容する液体密度と比較して十分な密度を有する粒子、及び電気泳動移動性を有する粒子（すなわち、適用された電場に反応的な粒子）でもよい。
【００５０】
さらに、第二の種類の粒子１３０は、例えば、蛍光分子で含浸されたラテックス又はガラス粒子、発光粒子（例えば、ランタニドキレートで含浸された粒子）、光散乱粒子、共鳴光散乱粒子、ナノ粒子、及び／又は磁性粒子でもよい。第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０の双方は、それを生物学的アッセイに適応させた結合部分での機能化を要求し得る。粒子機能化プロトコールは、当該技術分野で確立されており、磁性粒子及び蛍光粒子機能付与のためのキットは、市販されている。
【００５１】
図２は、実施形態に従って、多重粒子複合体の形成の別の手法の図を示す。この場合では、第一の種類の粒子及び第二の種類の粒子は、標的検体が抗原、例えば、タンパク質、細菌、又は細胞である標的検体を介して連結する。複合体２００は、標的検体２１０を含む。標的検体２１０は、第一のエピトープ領域２１２、及び第二のエピトープ領域２１４を含む。第一の種類の粒子２２０は、第一の特異的結合リガンド２２５、例えば、標的検体２１０の第一のエピトープ領域２１２に特異的な親和性を有するために選択された抗体で機能化される。第一の種類の粒子２２０は、さらに、場反応性粒子、例えば磁性粒子でもよい。第二の種類の粒子２３０は、標的検体２１０の第二のエピトープ領域２１４に特異的な親和性を有するために選択された、第二の特異的結合リガンド２３５で同様に機能化される。第二の種類の粒子２３０は、例えば、信号粒子、例えば適切な励起エネルギーの適用により蛍光信号を精製する蛍光粒子でもよい。
【００５２】
一つの実施形態では、核酸標的は、標的核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブで機能化された磁性粒子、及び標的配列の異なる部分に相補的なオリゴヌクレオチドプローブで機能化された蛍光粒子を用いて、迅速に濃縮され、検出される。単純な洗浄ステップは、磁気的洗浄を用いて行われ得、磁石は、その後、粒子複合体が定量される検出表面に粒子対を移動させるために用いられる。図３〜６は、そのようなサンプル調製及び多重粒子複合体形成及び検出のための典型的なプロセスを説明する一連の図である。
【００５３】
まず、図１と併せて図３に関しては、バッファ３０２は、容器３０４内に閉じ込められている。サンプル、例えば血液、血清、又は標的検体１１０を含む他の生物学的見本は、バッファ３０２に添加される。バッファ３０２は、例えば、溶解バッファ、又は機能化された粒子を含む安定化バッファでもよい。図３で示される典型的なプロセスでは、バッファ３０２は、先述のようにそれぞれ機能化された第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０を含む。例えば、図１及び３に示されるように、第一の種類の粒子は、特異的な目的の標的検体の第一の末端配列１１２と結合するために好適な捕捉プローブ１２５で機能化された磁性粒子でもよい。また、第二の種類の粒子１３０は、標的検体１１０の第二の末端配列１１４と結合するために好適な検出プローブ１３５で機能化された蛍光粒子でもよい。
【００５４】
図４に関しては、ハイブリダイゼーションは多重粒子複合体１００の形成を導く。多重粒子複合体１００のそれぞれは、標的検体１００の第一の末端配列１１２に結合する第一の種類の粒子１２０の捕捉プローブ１２５、及び標的検体１１０の第二の末端配列１１４に結合する第二の種類の粒子１３０の検出プローブ１３５により形成される。バッファ３０２中に残っている、結合していない第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０のそれぞれは、その後、図５に示されるように、一回又は複数回の「洗浄」ステップにより取り除かれる。第一の種類の粒子１２０の磁気的性質を生かして、非磁性である未結合の第二の種類の粒子１３０は、バッファ３０２中に懸濁されて残る一方で、磁性粒子複合体１００及び未結合の第一の種類の粒子１２０は、磁石５１０の方に引っ張られるように、磁石５１０は、容器３０４の近くに運ばれる。一連の液体交換（すなわち、「洗浄」）ステップにより、実質的に全ての未結合の第二の種類の粒子１３０は、容器３０４から取り除かれ得る。それらは、図６で説明される検出のステップにおいて検出可能な信号を生成しないので、未結合の第一の種類の粒子１２０は、洗浄ステップにより取り除かれる必要がないことは、指摘され得る。
【００５５】
洗浄ステップに続いて、磁石５１０は取り除かれ、残った多重粒子複合体１００及び、未結合の第一の種類の粒子１２０は、図６で示されるように、容器３０４の底に沈殿する。あるいは、多重粒子複合体１００、及び未結合の第一の種類の粒子１２０は、容器３０４の底に磁気的に濃縮され得る。多重粒子複合体１００内で標的検体１１０と結合した第二の種類の粒子１３０は、適切な励起エネルギーで励起され（示されない）、第二の種類の粒子から得られる信号は、画像化システム６１０により検出される。
【００５６】
「洗浄」ステップのない、サンプル調製及び検体検出の代わりの方法は、図７〜９に示される。この実施形態では、多重粒子複合体、及び未結合の第一の種類及び第二の種類の粒子を含む全ての粒子は、容器３０４の底に存在し、多重粒子複合体にのみ反応的である検出方法は、標的検体検出に用いられる。図３と同様である図７に示されるように、容器３０４内のバッファ３０２は、多数の標的検体１１０、第一の種類の粒子１２０、及び第二の種類の粒子１３０を含む。図８に示されるように（図４と同様である）、標的検体１１０は、多数の多重粒子複合体１００を形成するように、第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０のそれぞれと一緒に連結する。図３〜６に関して記述される方法と対照的に、この代わりの方法は、図５に示される洗浄ステップを取り除く。その後、図９に示されるように、多重粒子複合体１００の存在にのみ感受的な検出方法は、標的検体の存在を検出するために用いられる。そのような検出方法の例は、下記の実施例ＶＩＩに記述される。
【００５７】
図３〜９に示されるプロセスは、流体チャネルと磁気的配置、例えば、任意で活性化及び不活性化され得る、移動可能な一組の磁石又は複数の磁石（例えば、電磁石）を組み合わせたプロセスを用いることにより、標的検体及び／又は多重粒子複合体の空間的移動に作用するように構成され得る。統合されたサンプル調製及び検体検出に適したそのような空間的移動プロセスの例は、図１０〜１７に図解される。
【００５８】
図１０は、基板１０１２、上部の構成部分１０１４、及び流体チャネル１０２０を特徴付けるガスケット１０１６から形成されるカートリッジ１０１０を含むシステム１０００を示す。あるいは、基板１０１２及び上部の構成部分１０１４の組み合わせのみが、流体チャネル１０２０の輪郭を示すように、基板１０１２及び／又は上部の構成部分１０１４は、ガスケット１０１６の代わりに、完全に形成された側壁（示されない）を含む。流体チャネル１０２０は、液体が入口１０３０を通って導入され、その後出口１０４０を通って取り除かれ得るように、入口１０３０及び出口１０４０を含む。捕捉スポットのアレイ（図１０でＡ１〜Ａ４で示される）は、基板１０１２上にプリントされる。捕捉スポットは、固定化された生体分子、例えば、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、多糖、又は核酸を含み得る。接触プリンディング、インクジェットプリンティング、圧電的プリンティング、及び電磁弁ジェットプリンティングを含む、プリントされたアレイを調製する様々な方法は利用できる。Ｍ０〜Ｍ８は、空間的移動プロセスに使用のための磁石の配置についての様々な位置を示す。固定された磁石は、アッセイの間、異なる位置に移動され得、又は電磁石は、これらの位置で移動する磁場を作るために、オン・オフで切り替わるように構成され得る。画像化システム１０５０は、光源１０６５からの励起１０６０により捕捉スポットＡ１〜Ａ４で生成された光学的な信号の画像を捕捉するために用いられる。
【００５９】
一つの実施形態では、図１１に関して、チャネル１０２０は、バッファ１０２５で前もって充填される。サンプルは、その後、導入され入口１０３０において導入される。サンプルは、標的検体１１０、第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０、及びそれと共に第一及び第二の種類の粒子１２０及び１３０と連結する標的検体１１０の組み合わせにより形成された多重粒子複合体１００の組み合わせを含む。
【００６０】
図１２に関して、位置Ｍ０で固定された磁石又は電磁石は活性化され、その後、さらなる量のバッファ１０２５が入口１０３０に添加される。さらなるバッファは、第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００が捕捉スポットのアレイから上流に保持される一方で、未結合の第二の種類の粒子は、出口１４０に排出されるように、流体チャネル１０２０を介した流れを引き起こす。
【００６１】
図１３に示されるように、捕捉スポットＡ１の真下の位置Ｍ１に位置する第二の電磁石は、残った第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００が、捕捉スポットＡ１上に移動するように、その後活性化される。あるいは、固定された磁石は、位置Ｍ０から捕捉スポットＡ１の真下の位置Ｍ１に移動され得、一定時間（例えば、５秒）活性化される。磁石は、第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００を、スポットＡ１で固定化された捕捉分子と自由に相互作用させることために、その後不活性化される。捕捉スポットへの捕捉分子固定化及び結合のモードは、下記の図１８及び１９の記述に記載される。特異的な結合イベントが生じた場合（例えば、抗原‐抗体、タンパク質‐タンパク質、核酸ハイブリダイゼーション）、その後、第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００はスポットＡ１で結合する。
【００６２】
一定時間（例えば、２０秒）後、電磁石は捕捉スポットＡ２の真下で活性化され、又は、あるいは、図１３で示される磁石は、位置Ｍ１から、捕捉スポットＡ２の真下の位置Ｍ２に移動され得、その後、図１４に示されるように、所定の時間（例えば、５秒）、活性化される。それ故、捕捉スポットＡ１と結合しなかった第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００は、捕捉スポットＡ２に向けて移動する。図１４に示される実施例では、スポットＡ１との特異的結合は生じず、及び全ての第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００は、捕捉スポットＡ２に磁気的に移動される。一度Ｍ２における磁石が不活性化される、又は取り除かれると、未結合の第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００は、一定時間（例えば、２０秒）、捕捉スポットＡ２に固定化された捕捉分子と自由に相互作用することが許容される。プロセスは、その後、図１５及び１６に示されるように、捕捉スポットＡ３及びＡ４のそれぞれに相当する磁石の位置Ｍ３及びＭ４についてそれぞれ繰り返される。この実施例では、生じる捕捉スポットＡ２での特異的結合、及び粒子複合体は、連続的な磁気的移動ステップの間、スポットＡ２で保持された。最終的には、任意の残った第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００は、位置Ｍ５に磁石を移動すること又は活性化することにより、捕捉アレイから取り除かれた。
【００６３】
図１０〜１７に図解される方法では、流体チャネル及び磁石の配置の組み合わせは、一回容量内のサンプル調製及び検体検出の性能を許容する。すなわち、図１１に示されるように、最初に添加したサンプルは、チャネル１０２０に導入される前に、未結合の第二の種類の粒子を含んでもよい。例えば、図３〜６に図解されるサンプル調製方法は、チャネル１０２０へのサンプル導入の前に別に行われ得る一方で、図１０の流体チャネル及び磁石配置は、任意で別のサンプル調製をさせる。そのような単純化は、全般的なアッセイプロトコールの複雑性を減少させるのに特に望ましい。
【００６４】
図１０〜１７に示される実施形態では、位置Ｍ６及びＭ８における磁石は、チャネルを通じた磁石の移動速度を変更するために、適用される磁場の指向性を調整するために、さらに構成され得る。例えば、任意で、位置Ｍ６における、固定された磁石又は電磁石は、図１２に示されるように、チャネル１０２０を通して第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１０の流動性及び捕捉を助けるために、位置Ｍ０における磁石と同時に活性化され得る。同様に、位置Ｍ８で固定された磁石又は電磁石はまた、図１７に示されるように、出口１０４０に向けて、未結合の第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００の流動を助けるために、同時に活性化される。
【００６５】
図１８及び１９は、捕捉スポットへの捕捉分子固定化及び結合の異なるモード説明する概略図が示される。多重粒子複合体１００の特異的結合は、第一の種類の粒子１２０上の第一のプローブ１２５を介して（図１８）、又は第二の種類の粒子１３０（上の第二のプローブ１３５を介して図１９）生じるように設計され得る。説明の目的のために、図１８及び１９は、それぞれの粒子種類上のオリゴヌクレオチドプローブを伴う核酸標的を想定する。
【００６６】
図１０と併せて図１８に関して、基板１０１２上の捕捉スポットＡ１は、第一の種類の粒子１２０上に固定されたオリゴヌクレオチド（すなわち、第一のプローブ１２５）の配列に相補的な、第一の末端配列１１２を有する、第一の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ１９１０を含む。捕捉スポットＡ２は、第一のプローブ１２５又は第二のプローブ１３５のどちらにも相補的でない別の配列を有する、第二の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ１９２０を含む。図１０〜１７に記述されるようなアッセイの間、多重粒子複合体１００は、第一のプローブ１２５で機能化された第一の種類の粒子１２０と結合しないように、第一のプローブ１２５を介して捕捉スポットＡ１と特異的に結合する。捕捉スポットＡ２は、この例において非相補的な配列を有する第二の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ１９２０のみを含むので、いずれの種類の粒子もスポットＡ２に結合しない。
【００６７】
図１９は、多重粒子複合体１００が第二の種類の粒子１３０を介して結合する、代替の構造を示す。この例では、捕捉スポットＡ２’が、第二の種類の粒子１３０上に固定化された第二の末端配列１３５に相補的である、第二の末端配列１１４を含む第二の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ２０２０を含む一方で、捕捉スポットＡ１’は、非相補的な配列を含む第一の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ２０１０を含む。図１０〜１７に記述されるようなアッセイの間、多重粒子複合体１００、及び未結合の第二の種類の粒子１３０は、第二のプローブ１３５を介して捕捉スポットＡ２’と特異的に結合する。第一のプローブ１２５とも第二のプローブ１３５とも相補的でない配列のみを含む、第一の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ２０１０として、いずれの種類の粒子もスポットＡ１’に結合しない。未結合（すなわち、遊離の）の第二の種類の粒子１３０が、流体チャネル１０２０に導入される前にサンプルから取り除かれると仮定すれば、図２０に示されるように、第二の種類の粒子を介して特異的な結合を行う利点は、多重粒子複合体のみが、捕捉スポット上に固定化されることである。図３〜６は、未結合の第二の種類の粒子が、図１９に示されるように、捕捉配置で使用のためのサンプルから除かれ得る、サンプル調製方法を記述した。
【００６８】
もっとも、図１８及び１９は、オリゴヌクレオチドプローブを介した特異的な結合を説明し、図１８及び１９で示される構想は、特異的に結合する分子、例えばペプチド、タンパク質、抗体、アプタマーなどと共に、タンパク質、又は細胞内標的に容易に適用され得ることは、認識される。
【００６９】
さらに図１０〜１７に関して、図１１〜１７に示されるステップ後、カートリッジ１０１０は、その後、光源１０６５からの励起１０６０で照射され得る。結果として、一つ又は複数の捕捉スポットＡ１〜Ａ４上で捕捉された多重粒子複合体１００の中で連結した第二の種類の粒子１３０は、標的検体検出のための画像化システム１０５０により捕捉され得る励起１０６０に反応して信号を生成する。
【００７０】
任意で、図２０及び２１に示されるように、洗浄磁石１９１０は、「磁気的洗浄」ステップを提供するために用いられ得る。例えば、図２０に示されるように、第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００は、図１１〜１７に図解されるように、段階的な方法でスポットからスポットへと移動されるよりもむしろ、粒子が一つ又は複数の捕捉スポットＡ１〜Ａ４に同時に定まるように、流体チャネル１０２０を介して分散され得る。特異的結合プロセスの少なくとも一つは、図１８及び１９に図解されるように、特定の粒子が一つ又は複数の捕捉スポットＡ１〜Ａ４上に捕捉されるように、行われ得る。捕捉スポットＡ１〜Ａ４の一つに特異的に結合しなかった未結合の第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００が、捕捉スポットＡ１〜Ａ４に近接した画像化ゾーンから取り除かれるように、洗浄磁石１９１０は、その後、一定時間（例えば、１分）、位置Ｍ７で活性化される。例えば、光源１０６５により与えられる、得られた励起１０６０、基板１０１２の配置、及び画像化システム１０５０の設定について、画像化ゾーンは、その上に捕捉スポットＡ１〜Ａ４が配置される基板１０１２の表面からチャネル１０１２にマイクロメーター未満に広がる領域として定義される（例えば、基板１０１２を介して照射の全内部反射モードにおける、基板１０１２を超えるエバネッセント波伝搬の範囲）。未結合の第一の種類の粒子１２０の画像化ゾーンからの除去は、望ましくない粒子が、磁力によって画像化ゾーンから取り除かれる「磁気的洗浄」として、本質的に機能する。磁場の強度は、捕捉スポットに特異的に結合する粒子が、位置Ｍ７から磁場の適用によって取り除かれないように、調整され得る。４つのスポットＡ１〜Ａ４が図１０〜１７及び図２０〜２１に示される一方で、より少ない、又はより多い捕捉スポットは、目的の特定の生体分子に応じて用いられてもよい。
【００７１】
図１８に示される磁気的洗浄ステップのさらなる詳細は、図２２〜２４で説明される。図２２〜２４に示される状況は、サンプル中のいずれの粒子も、捕捉スポットＡ２に結合しない一方で、第一の種類の粒子１２０は、捕捉スポットＡ１に特異的に結合する点で、図１８に示されるそれと同等である。上からの磁力の適用上（例えば、図２１に示されるように、位置Ｍ７における磁石から）、未結合の粒子及び多重粒子複合体は、図２３に示されるように、基板１０１２の表面から取り除かれる。磁場強度が特異的に結合した粒子を取り除くために十分でない場合、磁気的洗浄ステップは、大変低い非特異的粒子バックグラウンド結合を有する捕捉スポット上で、特異的に結合した粒子をもたらす（図２４）。
【００７２】
別の実施形態では、粒子複合体、例えば図１及び２に示されるそれらは、単純な機械的移動を用いて遊離の蛍光粒子から分離され得る。図２５〜２７は、典型的な手法を説明する。標的検体を含むサンプルが、機能化された第一の種類の粒子１２０及び機能化された第二の種類の粒子１３０を含む溶液に導入される場合、図２５に示されるように（図２５は、先に記述された図４及び８と同様である）、多重粒子複合体１００は形成された。特定の場合では、遊離の機能化された第二の種類の粒子１３０（例えば、遊離の蛍光粒子）を多重粒子複合体１００から物理的に分離することが、必要である。この分離は、液体チャンバー２６２０を集合的に定義付ける基板２６１２、上部構成要素２６１４、及びガスケット２６１６から形成される、カートリッジ２６１０を用いることにより行われ得る。液体チャンバー２６２０は、バッファ２６２５で満たされる。多重粒子複合体１００、第一の種類の粒子１２０、及び第二の種類の粒子１３０は、図２６に示されるように、液体チャンバー２６２０に導入される。薄いチャネル装置（例えば、チャネルの高さ＜０．２ミリメートル）について、対流的混合が最小限になり、粒子の塊が一般的に入口の近くに残る。場反応性粒子（例えば、第一の種類の粒子１２０及び多重粒子複合体１００）が、磁石２６５０に対して引っ張られるように、磁石２６５０は、磁力を発揮する。磁石２６５０の移動（又電磁石のは活性化）は、図２７に示されるように、多重粒子複合体１００及び第一の種類の粒子１２０を所望の位置まで移動させるために、その後用いられ得る。このプロセスは、混同する遊離の第一の種類の粒子１２０の物理的分離を提供する。所望の位置における多重粒子複合体１００は、その後、適切な検出方法、例えば蛍光画像化により、分析され得る。
【００７３】
別の実施形態では、高い屈折率の粒子は、図２８〜３７に示されるように、増幅された光学的な検出信号を作るために用いられ得る。例えば、高い屈折率の粒子−蛍光粒子複合体を伴う指向性の発光信号増幅は、得ることができる。磁性粒子は、高い屈折率の球面レンズとして作用し得、それは、発光粒子に向けて、発光放射を効率的に集束させることに役立つ。あるいは、磁性粒子球面レンズは、発光粒子から放射された光信号を回収し、集束させ得る。
【００７４】
図２８〜３２は、矢印により表される照射場２８１０について、多重粒子複合体１００の様々な配向性を示す。第一の種類の粒子１２０は、レンズ効果を提供するように物質の組み合わせかれ形成され得、従って、それを通して伝えられる照射場２８１０の一部を集束させる。例えば、第一の種類の粒子は、磁性成分、例えばマグネタイト（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）で含浸された、又はコートされたポリスチレンコア粒子でもよい。従って、照射に応じて検出信号を生成することを設定し得る、第二の種類の粒子１３０上の照射場２８１０の入射の量は、第一の種類の粒子１２０に対する第二の種類の粒子の配向性に依存する。例えば、図２８〜３０に示されるように、第二の種類の粒子１３０が照射場２８１０内で第一の種類の粒子１２０の「上流」にある場合、従って、第二の種類の粒子１３０は、それが多重粒子複合体１００の部分でないように照射される。しかしながら、第二の種類の粒子１３０が、図２８〜３０に示される場合においてよりもより少ない照射を受けるように、多重粒子複合体１００の配向性は、第一の種類の粒子１２０が、第二の種類の粒子１３０から離れて照射場２８１０を集束するように、なり得る（図３１を参照のこと）。あるいは、図３２に示されるように、第二の種類の粒子１３０が、多重粒子複合体１００の他の配向性においてよりもより激しく照射されるように、第二の種類の粒子１３０は、照射場２８１０が第一の粒子１２０により集束される領域内にあり得る。
【００７５】
加えて、図３３〜３７に示されるように、第二の種類の粒子１３０により生成された信号はまた、第一の種類の粒子１２０により与えられるレンズ効果により、影響を受け得る。それ故、第二の種類の粒子１３０により生成された信号３３１０（矢印により示される）の同じ量について、観測器３３２０に達する信号３３１０の量は、多重粒子複合体１００の配向性に依存する。例えば、図３３に示されるように、第一の種類の粒子１２０が、第二の種類の粒子１３０と観測器３３２０の間で、信号３３１０の進路において直行的である場合、第一の種類の粒子１２０は、観測器３３２０に達する信号３３１０の量を増大するように、信号３３１０を屈折させ得る。あるいは、第一の種類の粒子１２０が、観測器３３２０から離れて信号３３１０を屈させるように、多重粒子複合体は、配向され得、従って、観測器３３２０に達する信号３３１０の量は減少する（図３４〜３７を参照のこと）。集束及び光収集効果は、下記の実施例ＶＩＩに実験的に説明される。
【００７６】
集束及び光収集効果の双方は、多重粒子複合体検出の感度を著しく向上させるために、検出システムに用いられ得る。検出器（例えば、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラ）に対して適切に配向している場合、測定される発光信号は、単離され多発光粒子からの信号に対して、著しく増幅され得る。例えば、多重粒子複合体は、溶液中で、回転することが許容され得る。照射源及び検出器に対する多重粒子複合体の配向性に応じて、この回転効果は、発光粒子における照射強度入射を著しく変化させ得る。同様に、発光の間、磁性粒子球体レンズは、粒子複合体の配向性に連結した方向に、光を集束する又は向かわせる役割を果たし得る。
【００７７】
図２８〜３７に図解される信号増幅効果の高い指向性特性のために、回転する多重粒子複合体は、画像化検出器、例えばＣＭＯＳ又はＣＣＤカメラを用いて可視化される場合、フラッシュするように見える。遊離の蛍光粒子（すなわち、多重粒子複合体において、磁性粒子と連結しない蛍光粒子）は、そのようなフラッシュ効果を示さず、代わりに定常状態の蛍光発光を示す。多重粒子複合体において磁性粒子と結合した場合、フラッシングする粒子は（それらの「明るい」方向に捕捉される場合）、遊離の蛍光粒子よりも物理的に大きく、より強く見える蛍光発光を示す。さらに、粒子対は、放出された光検出を増加させるために、検出器に対して意図的に方向付けられ得る。粒子対は、例えば磁場及び流体力を用いて方向付けられ得る。
【００７８】
この局所的な粒子レンズ効果は、高い屈折率の粒子の使用により、著しく増幅されることは指摘され得る。一つの実施形態では、磁性ポリマーマイクロスフェアは、非磁性ポリマーマイクロスフェアよりも高い効果的な屈折率を示す。例えば、マイクロスフェア内の磁性鉄の組み込みは、マイクロスフェアの効果的な屈折率を増加させ得、従って、強力な集束効果を生じる。この実施形態に記述される粒子の径範囲について、磁性ポリマーマイクロスフェアは、同じ直径の非磁性ポリマーマイクロスフェアと比較して、著しい信号増幅を与える。この信号増幅効果は、下記に述べる実施例ＶＩＩＩで実験的に実証される。
【００７９】
本技術の典型的な実施形態の実施のいくつかの例は、本明細書で開示される。これらの記述的実施例は、限定することなく、説明することを意図する。本明細書で述べられる特定の量及び化学物質は、当業者により理解されるように、代表的なものに過ぎない。
【実施例】
【００８０】
実施例Ｉ：迅速で特異的なＤＮＡ標的濃縮及び検出
本技術のこの実施例は、オリゴヌクレオチドサンドイッチアッセイ及び二つの粒子捕捉及び検出フォーマットを用いた標的ＤＮＡの検出を説明する。磁性粒子は、ＤＮＡ標的の部分に特異的な５０ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡ捕捉配列（「捕捉プローブ」）で機能化された。「検出プローブ」は、捕捉配列に隣接したＤＮＡ標的の部分に特異的な５０ヌクレオチドビオチン化ＤＮＡ配列であった。ＤＮＡ標的の存在下で、捕捉及び検出プローブは、標的の隣接した部分に特異的にハイブリダイズし、サンドイッチを形成する。粒子複合体は、ビオチン化検出プローブと結合する、アビジン機能化蛍光粒子を添加することにより形成される。核酸プローブ配列は、表１に提供され、実験的詳細は、ここで提供される。一つの例では、標的検体／粒子複合体は、周囲の重力により受動的な沈殿により検出表面に運ばれ得る。別の手法では、標的検体／粒子複合体は、遠心分離による能動的な沈殿により検出表面に運ばれ得る。別の手法では、標的検体／粒子複合体は、二次元表面の下から磁力を適用し、磁石、従って粒子複合体を分析的領域に移動させることにより、二次元表面に沿って分析的領域に移動され得る。
【００８１】
磁性粒子機能化。磁性粒子は、下記のプロトコールを用いて、アミン機能化したＤＮＡプローブでコートされた。１００マイクロリットルの１マイクロメーター直径の磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）ＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液は、１．７ｍｌマイクロ遠心チューブに移された。チューブは、チューブの側壁にビーズを濃縮するために、磁気的分離装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ）中に置かれた。液体は取り除かれ、粒子は水に再懸濁された。この洗浄ステップは、水で繰り返され、その後、粒子は２００マイクロリットルの０．１Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸、Ｆｌｕｋａ）、ｐＨ５．２に懸濁された。１００マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍｌ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）、及び１００マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍｌ  スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）は、磁性粒子溶液に添加された。溶液は、回転することにより３０分間混合された。チューブは、その後、磁気的分離装置中に置かれ、液体は取り除かれた。粒子はその後、０．１Ｍリン酸バッファ、ｐＨ８．０中の５００マイクロモーラーのアミン修飾捕捉プローブ（表１参照のこと）の１００マイクロリットルの溶液に懸濁された。溶液は、回転装置上で、室温で、３時間混合された。チューブは、その後、磁気的分離装置中に置かれ、液体は取り除かれた。粒子はその後、それぞれのステップについて磁気的分離装置を用いて、１Ｘ  ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で、３回洗浄された。粒子は、その後、１Ｘ  ＰＢＳ、０．３モーラー塩化ナトリウム（ＮａＣＩ）、２０マイクログラム／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００マイクログラム／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む、ビーズバッファ（「ＢＢ」）に再懸濁された。この時点における粒子の濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。機能化された粒子は、４℃で保存された。
【００８２】
蛍光粒子機能化。蛍光粒子（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ，０．３９マイクロメーター、２％ｗｔ／ｖｏｌ）は、４℃で４時間、０．２モーラーのリン酸ナトリウム中、１００マイクロリットルの０．２ｍｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む１００マイクロリットルの粒子ストック溶液と、混合することにより、機能化された。２００マイクロリットルのＢＢは添加された。溶液は、０．１マイクロメーター精密濾過遠心チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移され、６０００ｒｐｍで８分間遠心分離された（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｃｃｕｓｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏ１７遠心分離機）。粒子は、ビーズバッファに再懸濁され、濾過ステップは、２回繰りかえされた（すなわち、全部で３回の洗浄）。粒子はその後、ビーズバッファに再懸濁され、０．１％ｗ／ｖの濃度で、４℃で保管された。
【００８３】
標的ＤＮＡ捕捉。標的ＤＮＡは、捕捉プローブ修飾された磁性粒子上で捕捉された。ビオチン化検出プローブは、ハイブリダイゼーションの最中に添加された。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコートされた蛍光粒子は、完全なサンドイッチを完了するために、ハイブリダイゼーション後に添加された。
【００８４】
合成標的ＤＮＡ  Ｃ０５  ｄ１００ｔａｒ（ＩＤＴ、表１、実施例Ｉ）は、インフルエンザＨ１Ｎ１ゲノムの一部に由来する。捕捉オリゴヌクレオチド（すなわち、捕捉プローブ）は、標的ＤＮＡの５’末端に相補的であり、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ，Ｉｎｃ．）により、Ｃ６−アミン３’修飾（表１中の捕捉プローブｃ０５  ５ｐｃｏｍｐ  ５０）を伴って、合成された。ビオチン化検出オリゴヌクレオチド（検出プローブ）は、標的ＤＮＡの３’末端に相補的であり、５’Ｃ６−アミン誘導体として（表１中の検出プローブｃ０５  ３ｐｃｏｍｐ５０）、ＩＤＴ，Ｉｎｃ．により合成された。ビオチンは、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）との反応によりこの配列に結合した。
【００８５】
アッセイプロトコール。標的ＤＮＡの希釈物は、２ナノモーラーのビオチン化検出プローブを含む、ハイブリダイゼーションバッファ（「ＨＢ」）である（３Ｘ  ＳＳＰＥ（生理食塩水−リン酸ナトリウム−エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」））バッファ０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」））、１００マイクログラム／ｍｌ  ＢＳＡ、及び２０マイクログラム／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（「ｈｓＤＮＡ」））中で２Ｅ６捕捉プローブ修飾された磁性粒子と混合され、５５℃で１１００ｒｐｍで２時間、回転するヒートブロック上で混合され、粒子／捕捉プローブ／標的／検出プローブ複合体の形成を許容した。
【００８６】
粒子複合体は、その後、下記のように、永久磁石及び液体交換を用いて洗浄された。上清は、取り除かれ、粒子は、３Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（１Ｘ）に再懸濁された。これは、続いてＰＢＳＨＴ（１Ｘ  ＰＢＳ、５００ミリモーラーＮａＣＩ、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌ  ｈｓＤＮＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄（上清交換）された。粒子は、その後、１００マイクロリットルのＰＢＳＨＴで懸濁され、２Ｅ８  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−蛍光粒子が添加された。溶液は、室温で１５分間、回転装置上で混合され、ビオチン−ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ結合を許容した。磁性−蛍光粒子複合体はこのステップで形成され、標的ＤＮＡは粒子間で連結を形成した。
【００８７】
粒子複合体は、磁気的単離によりＰＢＳＨＴにより３回洗浄され、１００マイクロリットルのＰＢＳＨＴ中の最後の再懸濁を含む上清は除去された。それぞれの反応の全体の容量は、３８４ウェルプレートの別々のウェルに移され、棒磁石は、粒子複合体をウェルの底表面に引き寄せるために用いられた。この洗浄手順は、残った蛍光粒子のみが、標的との相互作用を介して磁性粒子と複合体化するそれらとなるように、未結合の蛍光粒子を取り除く。
【００８８】
粒子複合体は、２０Ｘ対物レンズ、及びＣｙ５フィルターを備えた落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１）上で画像化することにより定量化される。画像における粒子複合体は、オープンソースソフトウェアＩｍａｇｅＪにおいて開発された粒子計測ツールを用いて自動的に計測される。結果は、図３８に表され、約１フェムトモーラー標的で検出限界を有する、得られた滴定曲線が示される。
【００８９】
本実施例では、１マイクロメーターの直径の磁性粒子が、典型的な実証に用いられた。あるいは、０．０１〜２０マイクロメーターの範囲の直径の磁性粒子が用いられてもよい。あるいは、０．２〜１０マイクロメーターの範囲の直径の磁性粒子が用いられてもよい。あるいは、０．３〜６マイクロメーターの範囲の直径の磁性粒子が用いられてもよい。磁性粒子径分布は、単分散でもよいことはまた、指摘される。あるいは、磁性粒子径の範囲は、同時に用いられてもよい。非球形磁性粒子が用いられてでもよいことはまた、指摘される。
【００９０】
本実施例では、市販の単分散のポリマーシェル超常磁性粒子が、典型的な実証として用いられた。代替の磁性粒子の種類は、この発明に用いられてもよい。代替の磁性粒子マトリックス物質は、ラテックス、ポリスチレン、アガロース、及び他のポリマー、シリカ及びシリカ系ガラス組成物、酸化鉄を含む酸化物、及びセラミックスを含む。磁性粒子はまた、複合構造、例えばコア‐シェル粒子（例えば、有機ポリマーシェルを供えた金属又は金属酸化物コア）、及び金属酸化物サブ粒子が組み込まれたポリマーでもよい。
【００９１】
本実施例では、磁性粒子機能化は、典型的な実証として、ＥＤＣ−ＮＨＳエステル化学構造を有するアミン修飾オリゴヌクレオチドを用いて行われた。あるいは、アミン反応性結合化学反応は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリール化試薬、イミドエステル、カルボジイミド、及び無水物（ａｎｙｈｙｄｒｉｄｅ）に基づくそれらを含む。アミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、チオール修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のチオール修飾反応性結合化学反応は、ハロアセチル及びアルキルハロゲン化物誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化試薬、及びチオール−ジスルフィド交換試薬に基づくそれらを含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、カルボン酸修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のカルボン酸修飾反応性結合化学反応は、ジアゾアルカン及びジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール、及びカルボジイミドを含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、ヒドロキシル修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のヒドロキシル反応性結合化学反応は、エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート、アルキルハロゲン、イソシアネート、又は酸化化学を含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、アルデヒド修飾又はケトン修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のアルデヒド反応性又はケトン反応性結合化学反応は、ヒドラジン誘導体、シッフ塩基形成、還元的アミノ化、及びマンニッヒ縮合を含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、光反応性オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替の光反応性結合化学反応は、アリールアジド及びハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、及びジアジリン誘導体を含む。
【００９２】
本実施例では、０．３９マイクロメーター直径の蛍光粒子は、典型的な実証として用いられた。あるいは、０．０１〜２０マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられてもよい。あるいは、０．２〜１０マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられてもよい。あるいは、０．３〜６マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられてもよい。蛍光粒子径分布は、単分散であってもよいことはまた、指摘される。あるいは、蛍光粒子径の範囲は、同時に用いられてもよい。非球状の蛍光粒子が用いられてもよいことはまた、指摘される。
【００９３】
本実施例に用いられるＤａｒｋ  Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ）蛍光粒子製品は、６４０／６６０ｎｍにおいて中心となる励起／発光波長を有する。代替の蛍光色素は、スペクトルの青色の部分（励起３６０〜４２０ｎｍ、及び発光４２０〜４８０ｎｍ）；スペクトルの緑色の部分（励起４５０〜５００ｎｍ、及び発光５００〜５４０ｎｍ）；又はスペクトルの赤色の部分（励起５４０〜５９０ｎｍ、及び発光５９０〜６４０ｎｍ）；で用いられてもよい。別の代替の蛍光色素は、発光波長＞７００ｎｍのスペクトラム、例えばＬｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の製品を用いて、赤外の部分で用いられてもよい。本実施例に用いられる蛍光粒子は、有機色素蛍光分子に基づいてもよい。代替の発光分子は、用いられてもよく、ランタニド、例えば放射体に基づくユウロピウム、エルビウム、及びテルビウム、並びに放射体に基づく半導体、例えば量子ドットを含んでもよい。
【００９４】
本実施例では、検出プローブは、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ蛍光粒子と後に結合するビオチン化オリゴヌクレオチドであった。あるいは、この実施例における蛍光粒子は、ストレプトアビジン、又はアビジンで修飾されてもよい。あるいは、この実施例における蛍光粒子は、アッセイの前に、検出オリゴヌクレオチドと直接に結合してもよい。代替の蛍光粒子機能化化学物質は、磁性粒子機能化について上述したそれらと同様である。
【００９５】
本実施例におけるＤＮＡ標的は、典型的な実証として用いられる合成１００ヌクレオチド配列であった。あるいは、ＤＮＡ標的は、最短で３０ヌクレオチド長を有する任意のＤＮＡ分子でもよい。あるいは、ＤＮＡ標的は、３０〜５０００ヌクレオチド長であってもよい。
【００９６】
この実施例に用いられる捕捉及び検出プローブ長は、６個の炭素リンカーを有する５０のヌクレオチド長であった。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブは、１０〜１００のヌクレオチド長でもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブは、２０〜７０のヌクレオチド長でもよい。
【００９７】
本実施例におけるハイブリダイゼーション反応は、典型的な実証として、５５℃で、１１００ｒｐｍで回転するヒートブロックを用いて行われた。あるいは、ハイブリダイゼーション反応は、機械的混合（回転）することなく行われてもよい。あるいは、ハイブリダイゼーション反応は、４〜６５℃の温度範囲で行われてもよい。あるいは、ハイブリダイゼーション反応は、２５〜５５℃の温度範囲で行われてもよい。
【００９８】
実施例ＩＩ：検出表面に対する磁気的濃縮を用いた迅速で特異的なＲＮＡ標的検出
実施例ＩＩは、合成ＲＮＡ標的（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、配列：ＰｒＰ  １０１３−２７−１、表１）が、２０ナノモーラーの検出プローブと共に、１００ピコモーラーで用いられることを除いて、実施例Ｉの方法を用いてＲＮＡ標的の検出を実証した。
【００９９】
フルサンドイッチ検出のために用いられる磁性粒子は、上述のように、ＤＮＡプローブ（ＩＤＴ、表１、実施例ＩＩ、捕捉プローブ：ＰｒＰ  １０１３−２７−５）と共有的に連結した。対照磁性粒子は、標的ＲＮＡの５’末端に相補的なＤＮＡプローブ（表１、実施例ＩＩ  対照プローブ：ＮＡ−Ｈ１Ｎ１−６  ３ｐ３０）で装填された。ビオチン化検出プローブはまた、標的ＲＮＡの５’末端に相補的であるので、標的は、捕捉プローブ粒子とハイブリダイズするが、信号を生成しない。標的の５’末端に相補的である検出プローブは、３’末端上にビオチン及びｄＴ−１０スペーサーを含んで（表１、実施例ＩＩ  検出プローブ：ＮＡ−ＨｌＮｌ−６  ３ｐ３０ビオチン）、ＩＤＴから購入された。
【０１００】
４つの異なる条件の全てはこの実験で試験された：１）特異的捕捉プローブ及びＲＮＡ標的（ポジティブサンプル）；２）非特異的なハイブリダイゼーションを見つけるための、ミスマッチ捕捉プローブ及びＲＮＡ標的；３）特異的捕捉プローブ及びＲＮＡ標的なし；及び４）ミスマッチ捕捉プローブ及びＲＮＡ標的なし。最後の二つの条件は、非特異的な粒子−粒子相互作用を評価する。
【０１０１】
アッセイプロトコールは、実施例Ｉ記述される通りであった。それぞれの粒子懸濁液は、マイクロプレートウェルに移され、上述のように倒立蛍光顕微鏡で画像化された。１００ピコモーラーＲＮＡ標的、及び相補的な捕捉及び検出プローブを含むウェルは、実質的な蛍光ビーズカウントを検知した一方で、ゼロＤＮＡ又はミスマッチプローブを含むウェルにおいては、信号は観察されなかった。
【０１０２】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１０３】
実施例ＩＩＩ：磁気的濃縮、特異的なマイクロアレイ表面捕捉、及び磁気的洗浄を用いた、迅速で特異的なＤＮＡ標的検出
実施例ＩＩＩは、迅速なハイブリダイゼーションに続く、マイクロアレイ表面上の捕捉スポットのアレイとの選択的な表面結合を実証する。この実験は、実施例Ｉにおいてと同様のＤＮＡ標的配列、捕捉プローブ、磁性粒子、及びビオチン化プローブが用いられた。
【０１０４】
４つのアミン機能化プローブは、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ非接触マイクロアレイヤーロボットを用いて、カスタム−活性化アッセイ装置基板上にスポットされた。この実施例については、装置基板は、積分光組みレンズを備えた、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）平面導波路、約７０ｍｍ  ｘ２５ｍｍ  ｘ１ｍｍであった。カスタム活性化は、ＣＯＰ導波路上に酸素プラズマ処理を最初に行うことによりされ、続いて、エポキシ基で活性化されたアミン反応性表面を形成するために、（３−グリシドキシプロピル）トリエトキシシランでシラン化がされた。代替の装置基板は、ガラス、セラミックス、又はポリマー、例えばポリスチレン又はアクリルから作れられた透明な平面構成物を含む。代替のシラン化試薬は、アミノプロピルシラン、アルデヒドシラン、ビニルシラン、ビニルスルホンシラン、アクリレートシラン、メタクリレートシラン、メルカプトシラン、ヒドロキシルシラン、カルボキシシラン、アジドシランを含む。あるいは、表面活性化は、活性末端基を含むポリエチレングリコールポリマーを含む、表面上のポリマー化、又はポリマーグラフト化を介してであり得る。
【０１０５】
アレイは、３Ｘ４のアレイのために、それぞれのプローブの３スポットでプリントされた。４つの表面捕捉プローブのうちの一つは、磁性粒子上に固定化されたプローブと相補的である。他の３つの表面捕捉プローブは、非相補的なミスマッチである。全ての表面捕捉プローブは、３’−アミンリンカー及びｄＴ−９スペーサーを含んで、ＩＤＴから購入され、表１、実施例ＩＩＩに記述される。
【０１０６】
３つのサンプルは、１ミリリットルのＨＢ、上述のように捕捉プローブで装填された１Ｅ７磁性粒子、及び５ナノモーラーのビオチン化検出プローブを含む１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに調製された。標的ＤＮＡは、２００フェムトモーラー及び２０フェムトモーラーの濃度を与えるように添加された。３つ目のサンプルチューブは標的ＤＮＡを含まなかった（ゼロ対照）。
【０１０７】
サンプルは、１２００ｒｐｍで、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上で、５５℃で１時間混合された。粒子は、その後、ＨＢで１回、ＢＢで２回リンスされた。粒子は、その後、９０マイクロリットルのＢＢに懸濁された。１０マイクロリットルのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ修飾蛍光粒子は、サンプルあたり５Ｅ８蛍光粒子の濃度について添加された。サンプルは、回転装置（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｌａｂｑｕａｋｅ）上で、１５分転倒して回転され、磁気的分離装置を用いてＢＢで２回リンスされ、約４マイクロリットルのＢＢに懸濁された。
【０１０８】
アッセイを実施するために、図１０〜１７に図解されるのと同様のカートリッジアッセンブリが用いられた。特に、プラスチックマイクロアレイ基板は、加圧反応性接着ガスケットでプラスチック液体上部構成部品に組み立てられ、アレイの上部の流体チャネルを定義付けた。チャネルは１００マイクロリットルのＢＢで前もって充填された。２マイクロリットルのサンプルは、流動チャネルの入口に添加された。電磁石は、マイクロアレイの約２ｍｍ上流の位置に置かれ（例えば、位置Ｍ０）、磁石への出力は、１２Ｖに調整され、２００マイクロリットルのＢＢが入口に添加された。磁性粒子がマイクロアレイの上流で磁石の位置に濃縮された一方で、ＢＢの添加はチャネルを介して流れを引き起こした（図１２に示されるように）。電磁は、その後オフにされ、スポットの第一の列の直下の位置に移動された（Ｃ０５−ＴＲ１ＳＣ特異的スポット；図１０及び１３に示されるように位置Ｍ１）。磁石は、６Ｖ  ＤＣ（２アンペア電力供給）の出力で、約５秒間、電源が入れられた。粒子はスポットの第一列を超えて移動し、及び磁石はその後、オフにされた。２０秒後、磁石はスポットの第二列の下に置かれ（Ｃ１８−ＴＲ１ＳＣ；図１０及び１４に示される位置Ｍ２）、５秒間、電源が入れられた（６Ｖ）。粒子がスポットのそれぞれの列を超えて置かれるまで、この手順は、繰り返された。スライドはその後、前の実験においてのように、蛍光顕微鏡で画像化された。
【０１０９】
最初の画像化後、棒形状の磁石は、マイクロアレイの上（例えば、図２１に示されるように位置Ｍ７に）に１分間置かれた。磁力のこの適用は、図２０〜２４に関して先述のように、「磁気的洗浄」として機能する。すなわち、アレイスポットに特異的に結合しない磁性粒子は、チャネルを通って移動し、画像化ゾーンの外に出て、従って非特異的に吸着された粒子を磁気的に洗浄する。磁場の強度は、磁場の適用のために、特異的に結合した粒子が取り除かれないように、調整され得る。カートリッジは、画像化システムを用いて画像化され、その後、サンプルあたりのそれぞれの捕捉スポットにおける粒子対は、画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を用いて数えられた。得られる画像分析は、同種の特異的なアレイスポット上での特異的な信号、及びミスマッチスポット上での極めて少ない信号を得た。
【０１１０】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１１１】
実施例ＩＶ：導波路に基づく蛍光検出を用いた迅速で特異的なＲＮＡ標的検出
この実施例では、特異的粒子複合体検出は、平面導波路に基づく検出システムに関連して実証される。この実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例ＩＩに記載されるものと同様であった。３つのサンプルが実施された：１）１０ピコモーラー標的サンプル；２）１００フェムトモーラー標的サンプル；３）ゼロ標的対照。他の実験のように、顕微鏡上でマイクロタイタープレートウェルの底部において画像化する場合、ゼロ標的対照は、ごくわずかの粒子対を有する。１０ピコモーラー標的サンプルは、その後、マイクロアレイ上で粒子対の捕捉を試験するために用いられた。マイクロアレイは、表１、実施例ＩＶに記載されるように、３つの異なる捕捉プローブを含んだ。
【０１１２】
スライドは、図３９に概略的にしめされる装置を用いる導波路照射を用いて画像化された。図３９に示されるように、サンプル調製及び検出システム３９００は、カートリッジアセンブリ３９１０を含み、それは、屈折ボリューム３９１５、上部の構成部分３９１４、及び流体チャネル３９２０を定義するガスケット３９１６と共に、平面導波路３９１２を含む。流体チャネル３９２０は、入口３９３０、及び出口３９４０を含む。システム３９００はさらに、画像化システム３９５０を含み、それは例えば、一つ又は複数の屈折要素、回折要素、反射要素、フィルター、及びセンサを順に含み得る。システム３９００はまた、励起源３９６５により供給される励起エネルギー３９６０（矢印により表される）を含む。励起源３９６５は、例えば、レーザー、ＬＥＤ、又は他の好適な励起エネルギー源でもよい。図３９に示されるように、捕捉スポット３９７０のアレイは、標的検体（又は標的検体を含む多重粒子複合体３９８０）が一つ又は複数の捕捉スポット３９７０で捕捉され得るように、流体チャネル３９２０内に平面導波路３９１２の表面に取り付けられた。実験では、粒子複合体は、特異的なＮＡ−Ｈ１Ｎ１−６  ３ｐ３０  ＣＯＭＰ−ＮＨ２スポット上でのみ検出された。
【０１１３】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉ及びＩＩＩについて、本実施例に適用可能である。
【０１１４】
実施例Ｖ：特異的マイクロアレイ捕捉を用いた、多重化された迅速で特異的なＤＮＡ標的検出
別の実施形態では、粒子対の混合物は、多数の様々な標的検体を含むサンプルに添加された。標的検体／粒子複合体は、実施例ＩＶに記述されるように、様々な粒子プローブに特異的な捕捉スポットのアレイを含む流体チャンバーに添加された。捕捉スポット上で測定される信号は、原溶液中の標的検体の存在及び量を示す。
【０１１５】
この実施例は、標的検体との関連において機能化された粒子の混合物の使用を実証する。粒子の混合物は、４つの可能性のある核酸標的（表１、実施例Ｖを参照のこと）についてプローブを用いて調製された。それぞれの可能性のある標的について、混合物は、特異的な捕捉プローブ及びビオチン化検出プローブを有する磁性粒子を含む。それぞれの磁性粒子の種類は、２Ｅ＋０６粒子／ｍｌの濃度であり、それぞれのビオチン化プローブは、１０ナノモーラー濃度であった。従って、混合物中において合計で８つの異なるプローブ配列のために、４つの磁性ビーズ捕捉配列種類、及び４つのビオチン化検出配列種類が存在した。
【０１１６】
基板は、磁性粒子上のプローブに相補的な配列を有数するマイクロアレイをプリントすることにより調製された（図１８に示される表１；捕捉配置に提供される配列）。
【０１１７】
アッセイは、１００フェムトモーラーの濃度で４つの可能性のある標的の一つ（配列Ｃ０５）を添加することにより行われた。アッセイステップ及び、マイクロアレイは、実施例ＩＩＩにおいてと同様であった。処理された基板は、蛍光顕微鏡を用いて画像化され、粒子複合体は、画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を用いて数えられた。代表的な結果は、図４１に提供される。結果は、信号が、正確な相補的なスポットにおいて強いことを示す。ミスマッチスポットは、スポットのないバックグラウンドに対して最小限の信号を示す。
【０１１８】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉ及びＩＩＩについて、本実施例に適用可能である。
【０１１９】
実施例ＶＩ：粒子複合的手法を用いたタンパク質標的の検出
この実施例は、システムがタンパク質標的を検出するために用いられ得ることを実証する。この実施例では、標的は、抗体である。２００マイクロリットルのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、１．７ｍｌマイクロ遠心チューブにおいて磁気的分離を用いて、１００ミリモーラーのｐＨ７．２のリン酸でリンスされ、その後、２００マイクロリットルのｐＨ７．２のリン酸バッファに懸濁された。２０マイクロリットルの１ｍｇ／ｍｌのビオチン化ロバ抗ウサギＩｇＧは、粒子に添加され、それは、サーモミキサー上で、９００ｒｐｍ、室温で１時間混合された。粒子は、その後、磁気的分離を用いてＰＢＴ（１Ｘ  ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回リンスされた。
【０１２０】
１００マイクロリットルの蛍光粒子（Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉ．，ＦＲ３０４０ＰＡ，０．３９μｍ  Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ，２％ｗ／ｖ）は、２０μｌの１：５の割合でのオボアルブミン（ＯＶＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ：５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）の混合物で装填された。ＯＶＡ／ＢＳＡ溶液は、粒子に添加され、混合物は４℃で一晩インキュベートされ、その後、ＰＢＴで、０．１マイクロメーターのスピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）によって、４回リンスされた。それぞれのリンスについて、４００マイクロリットルのＰＢＴバッファが添加され、フィルターチューブは、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。濾液は棄てられ、別の４００マイクロリットルのＰＢＴバッファが粒子を含む上部のチャンバーに添加された。粒子はその後、２００マイクロリットルのＰＢＴに懸濁され、１％ｗ／ｖ懸濁液を得た。
【０１２１】
このアッセイについての検体は、ウサギ抗アルブミンＩｇＧであった。１２８、３２、８、２、０．５、及び０ｐｇ／ｍｌの標的溶液を作るために、ウサギ抗オボアルブミンの１：４の段階希釈は、ＢＢで調製された。
【０１２２】
アッセイステップ。１マイクロリットルの磁性粒子（１０ｍｇ／ｍｌストック）は、１．７ｍｌマイクロ遠心チューブ中の８００マイクロリットルのサンプルにそれぞれ添加された。サンプルは、室温で１時間混合された（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  ｌａｂｑｕａｋｅ）。粒子は、その後磁気的分離により分離され、上清は取り除かれた。１００マイクロリットルのＢＢは添加され、１０マイクロリットルのオボアルブミン修飾された蛍光粒子１：１０希釈物は添加され、反応物は回転装置上で１５分間混合された。２００マイクロリットルのＢＢは添加され、チューブは磁気的分離装置に置かれ、９９％の上清は取り除かれた。２００マイクロリットルのＢＢは、その後添加され、サンプルは、９６ウェルプレートに移された。ハンドヘルド磁石は、ウェルの底部上の磁性粒子、及び磁性粒子−蛍光粒子対を濃縮するために用いられた。サンプルウェルは、その後蛍光顕微鏡で画像化された。代表的な結果は、図４１に提供される。この予備的実験は、約１０ピコグラム／ｍｌ抗体標的の検出限界を示す。
【０１２３】
本実施例では、１マイクロメーターの直径の磁性粒子が、典型的な実証に用いられた。あるいは、０．０１〜２０マイクロメーターの直径範囲の磁性粒子が用いられ得る。あるいは、０．２〜１０マイクロメーターの直径範囲の磁性粒子が用いられ得る。あるいは、０．３〜６マイクロメーターの直径範囲の磁性粒子が用いられ得る。磁性粒子径分布は、単分散でもよいことはまた、指摘される。あるいは、磁性粒子径の範囲は、同時に用いられ得る。非球形磁性粒子が用いられ得ることはまた、指摘される。
【０１２４】
本実施例では、商業的に入手可能な単分散のポリマーシェル超常磁性粒子は、典型的な実証として用いられた。代替の磁性粒子の種類は、この発明に用いられてもよい。代替の磁性粒子マトリックス物質は、ラテックス、ポリスチレン、アガロース、及び他のポリマー、シリカ及びシリカ系ガラス組成物、酸化鉄を含む酸化物、及びセラミックスを含む。磁性粒子はまた、複合構造、例えばコア‐シェル粒子（例えば、有機ポリマーシェルを供えた金属又は金属酸化物コア）、及び金属酸化物サブ粒子が組み込まれたポリマーであってもよい。
【０１２５】
本実施例では、磁性粒子は、ビオチン化抗体の固定化を提供するためにストレプトアビジンで機能化された。ビオチン−ストレプトアビジン結合のいくつかの代替は、タンパク質−粒子結合に用いられ得る。あるいは、アミン反応性結合化学反応は、スクシンイミドエステルに基づくそれら、例えば、ＮＨＳ、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリール化試薬、イミドエステル、カルボジイミド、及び無水物（ａｎｙｈｙｄｒｉｄｅ）を含む。用いられ得る代替のチオール反応性結合化学反応は、ハロアセチル及びアルキルハロゲン化物誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化試薬、及びチオール−ジスルフィド交換試薬に基づくそれらを含む。用いられ得る代替のカルボキシレート反応性結合化学反応は、ジアゾアルカン及びジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール、及びカルボジイミドを含む。用いられ得る代替のヒドロキシル反応性結合化学反応は、エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート、アルキルハロゲン、イソシアネート、又は酸化化学を含む。用いられ得る代替のアルデヒド反応性又はケトン反応性結合化学反応は、ヒドラジン誘導体、シッフ塩基形成、還元的アミノ化、及びマンニッヒ縮合を含む。用いられ得る代替の光反応性結合化学反応は、アリールアジド及びハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、及びジアジリン誘導体を含む。
【０１２６】
本実施例では、０．３９マイクロメーター直径の蛍光粒子は、典型的な実証として用いられる。あるいは、０．０１〜２０マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられ得る。あるいは、０．２〜１０マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられ得る。あるいは、０．３〜６マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられ得る。蛍光粒子径分布は、単分散でもよいことはまた、指摘される。あるいは、蛍光粒子径の範囲は、同時に用いられ得る。非球状の蛍光粒子が用いられ得ることはまた、指摘される。
【０１２７】
本実施例に用いられるＤａｒｋ  Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ）蛍光粒子製品は、６４０／６６０ｎｍにおいて中心となる励起／発光波長を有する。代替の蛍光色素は、スペクトルの青色の部分（励起３６０〜４２０ｎｍ、及び発光４２０〜４８０ｎｍ）；スペクトルの緑色の部分（励起４５０〜５００ｎｍ、及び発光５００〜５４０ｎｍ）；及びスペクトルの赤色の部分（励起５４０〜５９０ｎｍ、及び発光５９０〜６４０ｎｍ）；で用いられ得る。別の代替の蛍光色素は、励起波長（発光＞７００ｎｍ）、例えばＬｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の製品を用いて、スペクトラムの赤外の部分で用いられてもよい。本実施例に用いられる蛍光粒子は、有機色素蛍光分子に基づく。代替の発光分子は、用いられ得、ランタニド、例えば放射体に基づくユウロピウム、エルビウム、及びテルビウム、並びに放射体に基づく半導体、例えば量子ドットを含む。
【０１２８】
本実施例では、蛍光粒子は、粒子とのタンパク質の物理的吸着を介して修飾された。あるいは、タンパク質は、上述のように磁性粒子のために記述される結合化学を介して蛍光粒子と共有結合され得る。
【０１２９】
実施例ＶＩＩ：粒子複合体の増幅された蛍光効果の実証
この実験は、粒子複合体との関連で、蛍光粒子信号の指向性増幅を実証する。実験は、大きい直径の粒子が、よりよい顕微鏡観察及び遅いブラウン運動を可能にするために用いられることを除いて、実施例ＩＩに記述されるのと同様である。磁性粒子は、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ製の５．９マイクロメーター直径の粒子であった。蛍光粒子は、先の実施例に記述されるように、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで標識された、０．３９マイクロメーター直径の、Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ粒子であった。
【０１３０】
１ナノモーラーＲＮＡ標的は、先述の磁性粒子−ビオチン化検出プローブサンドイッチで捕捉された。粒子複合体は、３回リンスされ、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ蛍光ビーズとインキュベートされ、実施例ＩＩに記述されるように、顕微鏡上で画像化する前に、リンスされた。粒子動作を促進するために、ハンドヘルド永久磁石は、画像化されるウェルの近くでゆっくりと前後に振られた。これは、フラッシング効果を導くウェルに回転動作を与えた。
【０１３１】
顕微鏡ビデオ捕捉（Ｒｅｔｉｇａ冷却ＣＣＤカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１蛍光顕微鏡）は、回転する間、１秒あたり約７フレームのフレーム速度で行われた。遊離の蛍光粒子、及び磁性粒子と連結した蛍光粒子の双方を含むビデオ視野は、その後、選択された。個別の画像フレーム内で、画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）は、回転動作を経た一つの遊離の蛍光粒子、及び一つの磁性粒子と連結した粒子について、積分強度（すなわち、蛍光粒子面積に亘る個別の画素強度の合計）を計算するために用いられた。１３の連続するフレームは、この方法で分析された。時間に対する得た積分強度のプロットは、図４２に提供される。連結した粒子は、蛍光粒子−磁性粒子対のように非常に大きい強度を示し、検出器に対して様々な方向に回転することが観察された（例えば、図２８〜３７に示されるように）。積分強度の大きな増加に続いて、強度が減少し、その後、長時間に亘り、別の増加、及び最終的には減少が続く。対照的に、遊離の蛍光粒子は、予測されたように、長時間に亘り、比較的一定の蛍光強度を示す。それは、どのように閾値化分析が遊離の蛍光粒子と磁性−蛍光粒子複合体とを区別するために用いられ得るのか、容易に想像し得る。
【０１３２】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１３３】
実施例ＶＩＩＩ：高い屈折率の粒子の利点の実証
実施例ＶＩＩに記述される粒子は、遊離の蛍光粒子、磁性粒子−蛍光粒子複合体、及び非磁性粒子−蛍光粒子複合体の蛍光強度を比較するための同様の実験に用いられた。後者の場合について、６マイクロメーター直径のポリマーマイクロスフェアは、実施例ＩＩにおける磁性マイクロスフェアについて記述されるように捕捉プローブで機能化された。ＲＮＡ標的アッセイは、実施例ＩＩですでに述べられたように行われた。多重粒子複合体は、予測されたように、ゼロ標的対照において観察されなかった。多重粒子複合体は、１ピコモーラー及び１０ピコモーラーの双方の標的ウェルにおいて観察された。増幅された蛍光効果の証拠は、方向付けられた粒子複合体及び遊離の蛍光粒子について蛍光信号を定量的に測定することにより提示される。画像は、Ｒｅｔｉｇａ冷却ＣＣＤカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１蛍光顕微鏡上で回収された。所定のカメラ感度及び露出について、遊離の蛍光粒子は、約６００相対蛍光単位（「ＲＦＵ」）の蛍光信号を示し、粒子投影面積（Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析）に亘る平均画素強度として報告した。対照的に、磁性粒子−蛍光粒子複合体がそれらの「最も明るい」配置に方向付けられた場合、信号強度は１２ビットカメラを飽和する。方向付けられた粒子複合体蛍光は、それ故、遊離の蛍光同等物よりも少なくとも７倍超の強度である。対照的に、非−磁性粒子−蛍光粒子複合体は、どの方向においても蛍光を示さなかった。
【０１３４】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１３５】
実施例ＩＸ：インビトロで転写されたＲＮＡの検出
この実施例では、インビトロ反応から転写される１０５６塩基のＲＮＡ分子の直接検出が実証される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの隣に位置するインフルエンザＡのマトリックス遺伝子由来の配列を含むプラスミドは、それが１０５６塩基のＲＮＡ（ＩｎｆＡ−Ｍ−１０５６）の転写のための鋳型になるように、構築された。ＲＮＡ転写は、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて合成され、ＵＶ−可視分光法により定量化された。検出実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例ＩＩに記述されるそれらと同様である。一連の反応における１０、３．３、１．１、０．３７、０．１２、及び０フェムトモーラー標的分子の試験溶液を作るために、ストックＩｎｆＡ−Ｍ−１０５６  ＲＮＡの段階希釈物は、作られた。上記のゼロ標的の信号は、最も低い濃度で測定され、図４３に示されるように、サブフェムトモーラー濃度までの大きいＲＮＡ分子の直接検出を実証する。
【０１３６】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１３７】
実施例Ｘ：ウイルス細胞培養上清からの特異的なＲＮＡの検出
この実施例では、ウイルス細胞培養上清からの特異的ＲＮＡ標的配列の直接検出が実証される。細胞培養は、インフルエンザＡの１０株で調製され、全ＲＮＡは、標準的な方法により回収された。検出実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例ＩＩに記述されるそれらと同様である。マトリックス遺伝子に相当する特異的な配列ＲＮＡの定量は、実施例ＩＸに記述されるように、参照標準としてＩＶＴ−ＲＮＡ  ＩｎｆＡ−Ｍ−１０５６を用いたＲＴ−ＰＣＲ定量アッセイにより測定された。１０の上清について、１５マイクロリットルの一定分量の０．２マイクロリットルは試験され、全てはゼロ標的対照を上回る信号ウェルを記録した。図４４は、２４２７〜２４３２と番号付けされた臨床的インフルエンザサンプル由来の１０のウイルス上清について、粒子複合体の数（すなわち、カウント）を示す。ゼロ標的対照サンプルは、プロット上に「ｃｎｔｌ」として示される。定量データに基づいて、反応あたりの標的分子の数は、３．８Ｅ６〜１Ｅ７、又は１２．６〜３３フェムトモーラーに及んだ。カウントは、１００〜１０００内に存在し、過剰な感度の桁を表した。段階希釈は、一つのサンプルで行われ（図４５を参照のこと）、２．４Ｅ５分子、又は〜１００アトモーラーの標的濃度まで、ゼロ標的対照を上回る測定可能なカウントを示した。
【０１３８】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１３９】
実施例ＸＩ：改良された磁気的分離を備えたＨＩＶ  ｐ２４抗原の高感度検出
この実施例は、完全に形成された二つのビーズ複合体を単離するために、磁気的分離装置を用いた、抗体サンドイッチ型におけるウイルスタンパク質抗原の高感度検出を実証する。ＨＩＶ  ｐ２４タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ＮＨＳ／ＥＤＣ結合化学により磁性ビーズに共有結合的に機能化された。手短に言えば、２．５Ｅ８のＣＯＯＨ−磁性ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）は、等量の０．１モーラーＭＥＳバッファ中１０ｍｇ／ｍｌスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＮＨＳ；Ｐｉｅｒｃｅ）、及び１０ｍｇ／ｍｌ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；Ａｌｄｒｉｃｈ）で、２５℃で３０分間混合することにより活性化され、続いてリンスされ、１Ｘ  ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）に再懸濁された。２０マイクログラムのモノクローナルマウス抗ｐ２４抗体は、添加され、２５℃で１時間混合された。１００マイクログラムのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）は、添加され、３０分間混合され、続いて１００マイクロリットルのＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで３回、磁気的にリンスされた。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）は、実施例Ｉに記述されるように、蛍光ビーズに吸着された（ＮＡ−Ｆｌビーズ）。第二の抗ＨＩＶ  ｐ２４モノクローナル抗体は、スルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた化学的機能化によりビオチン化された。ｐ２４抗原（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）の段階希釈物は、０．５マイクログラムの１Ｘ  ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ２０＋９０％ウシ胎仔血清（ＰＴＳ）中ビオチン化抗ｐ２４抗体と共に、１Ｅ７の抗ｐ２４抗体磁性ビーズの混合物に添加され、回転されながら、２５℃で、２５分間インキュベートされた。サンプルは、磁気的分離により、ＢＢ中で３回洗浄され、１８マイクロリットルの０．２％ＮＡ−Ｆｌビーズは、添加され、続いて２５℃で１０分間インキュベートされた。
【０１４０】
フローセルは、独自の導波路基板を用いて構成された。未結合の蛍光ビースが磁性ゾーンを通って、離れる一方で、ビーズ／標的混合物の導入が、磁石の上でフローセル中の実質的に全ての多重粒子複合体（すなわち、連結した磁性ビーズ、標的検体、及び蛍光ビーズの組み合わせにより形成された複合体）及び磁性ビーズの固定化を引き起こすように、フローセルは、磁石アライメントの上の第一の位置に置かれた。その後、フローセルは、図２５〜２７に概念的に図解されるように、実質的に全ての多重粒子複合体及び磁性ビーズがフローセルの床面から画像化ゾーンに移動されるように、フローセルの流体チャネルにおける液体流動の方向に対して直角の方向において磁石配列に対して移動させた。磁気的移動による多重粒子複合体の移動は、残存する遊離の蛍光ビーズから実質的に全てのビーズ複合体を分離する。
【０１４１】
フローセルは、磁石配置の第一の位置に置かれ、それぞれのｐ２４検出混合物は、フローセル装置の入口に移された。フローセルは、第二ポジションに〜１ｍｍ／秒で移動され、残存する多重粒子複合体は、蛍光顕微鏡で画像化され、先述の実施例（図４６を参照のこと）に記述されるように、カスタムＩｍａｇｅＪマクロにより数えられた。その後、完全に形成された複合体の蛍光ビーズは、カスタムダイオードレーザー／カメラリーダー装置上で導波路照射により画像化され、積分された蛍光信号が記録された（図４７参照のこと）。ビーズカウントモードでは、最も低い標的濃度における信号は、ゼロ標的対照信号を優に上回った。低い全体の信号をもたらす積分モードを用いて、従って、バックグラウンドを上回る３つの標準偏差を上回る最初のデータポイントは、１ミリリットル当たり４．４ピコグラムであった。
【０１４２】
上述のバリエーションはまた、実施例Ｉについて、本実施例に適用可能である。
【０１４３】
変更は、その範囲から離れることなく、上記の方法及びシステムにおいてなされてもよい。上述の記述に含まれる、又は添付の図面に示される内容は、趣旨を限定することなく、説明として解釈されるべきであることは、従って、指摘されるべきである。添付の特許請求の範囲は、本明細書に記述される遺伝的及び特定の特徴、並びに本方法及びシステムの範囲の記述を網羅することを意図し、それは、言語の問題のように、それらの間に収まると言える。
【０１４４】
先述の実施形態のそれぞれは、特定のそれぞれの方向性を有する様々な構成要素を用いて説明されるにもかかわらず、本開示で記述されるようなシステムは、様々な位置及び相互の方向性に位置する様々な構成要素を伴って様々な特定の配置を引き受け得、本開示の趣旨及び範囲内になお残存し得ることは理解されるべきである。さらに、好適な同等物は、様々な構成要素と置き換えて又は加えて用いられてもよく、そのような置換又は追加の構成要素の機能及び使用は、当業者によく知られており、それ故本開示の範囲内であるとみなされる。従って、本実施例は、限定するものではなく、説明として解釈され、本開示は、本明細書で与えられる詳細に限定されることはないが、添付の特許請求の範囲内で変更されてもよい。
【０１４５】
【表１】
2013503352.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013503352.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
2013503352000001.app
【国際調査報告】
2013503352.tif 000050