(57)【要約】  直接的または間接的に病原体の抗原に特異的に結合するリガンドと、ただし、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインではなく、ＲＩＮＧドメインおよび／またはＴＲＩＭ２１発現の誘導因子とを含む化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）直接的または間接的に病原体の抗原に特異的に結合するリガンドと、ただし、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインではなく、
（ｂ）ＲＩＮＧドメインおよび／またはＴＲＩＭ２１発現の誘導因子と
を含む化合物。
【請求項２】
前記リガンドが、前記抗原に直接的に結合し、かつ、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、ペプチドおよび／または核酸アプタマー、ならびに構造化ポリペプチドリガンドからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、改変ＴＣＲおよびそれらの多価的な組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記免疫グロブリン分子がＶＨドメインおよびＶＬドメインの少なくとも一つを含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記抗原がウイルスに特異的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記リガンドが、前記抗原に間接的に結合し、かつ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗免疫グロブリンペプチドおよび抗免疫グロブリン抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＲＩＮＧドメインがＥ３リガーゼ活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＲＩＮＧドメインがＴＲＩＭポリペプチドに由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
前記ＴＲＩＭポリペプチドがＴＲＩＭ５α、ＴＲＩＭ１９、ＴＲＩＭ２１およびＴＲＩＭ２８からなる群から選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
二つ以上のＲＩＮＧドメインを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＴＲＩＭポリペプチドＢボックスドメインおよび／またはＴＲＩＭポリペプチドコイルドコイルドメインをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記Ｂ３０．２ドメインが、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの少なくとも一つにより置換されているＴＲＩＭポリペプチドを含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ＴＲＩＭ２１発現の誘導因子が、インターフェロンまたはインターフェロン誘導因子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記インターフェロン誘導因子が、ウイルスまたは細菌性抗原、ポリアニオン、ＴＬＲアゴニストおよび小分子インターフェロン誘導因子からなる群から選択される、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記インターフェロンまたはインターフェロン誘導因子が不安定なリンカーによって化合物に結合している、請求項１３または１４に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む、病原性感染を治療する方法。
【請求項１７】
病原性感染を治療するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
対象において感染を治療する方法であって、前記対象に、前記感染を引き起こす病原体の抗原に対して特異的な抗体と、前記抗体に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドとを同時投与することを含む方法。
【請求項１９】
感染の治療のための、対象において前記感染を引き起こす病原体の抗原に対して特異的な抗体と、前記抗体に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドとの使用。
【請求項２０】
感染に罹患している対象において前記感染を治療する方法であって、前記対象に、病原体の抗原に間接的に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドを含む治療有効量のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項２１】
対象における感染性疾患の治療のための、病原体の抗原に間接的に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドを含むポリペプチドの使用。
【請求項２２】
前記リガンドが、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメイン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗免疫グロブリンペプチドおよび抗免疫グロブリン抗体からなる群から選択される、請求項１８もしくは２０に記載の方法または請求項１９もしくは２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、ＴＲＩＭポリペプチドのコイルドコイルドメインおよび／またはＴＲＩＭポリペプチドのＢボックスドメインをさらに含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２４】
前記ポリペプチドがヒトＴＲＩＭ２１である、請求項２３に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体に対して特異的なリガンドとＲＩＮＧドメインとのコンジュゲートである化合物に関する。一実施形態では、ＲＩＮＧドメインはＴＲＩＭ２１などのＴＲＩＭポリペプチドに由来する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスおよびその宿主は何百万年もの間共進化し、これにより先天性の応答および適応性の応答に伝統的に分けられる複雑な免疫システムが生じた１。先天性免疫は、病原体関連分子パターンまたはＰＡＭＰを認識する、生殖細胞系にコードされた受容体およびエフェクター機構を含む２。先天性免疫の利点は、速くて包括的であることであるが、ウイルスは、先天性免疫を抑制することまたはその分子パターンを変化させることによって、認識を回避することに長けている。これとは対照的に、適応免疫は、感染宿主を「治癒させる」こと、およびさらなる感染から防御することができる。先天性免疫のＰＡＭＰ受容体とは異なり、適応免疫は、抗体などのタンパク質を用いて病原体を標的にする。抗体は、個体の生涯を通じて進化し、進化していく病原体を標的にし続けることができるという点で、人体において独特である３。適応免疫の弱点は、最大効力に達するのに１〜２週間かかり得るということである。さらに、過去１００年間の抗体免疫の定説は、抗体は細胞外防御のみをもたらすというものである１。一度ウイルスが細胞のサイトゾルに侵入すると、抗体は、その感染を防ぐことができないと考えられている。
【０００３】
細胞内抗体が開発されてきている。例えば、Ｍｏｕｔｅｌ  Ｓ、Ｐｅｒｅｚ  Ｆ．、Ｍｅｄ  Ｓｃｉ（Ｐａｒｉｓ）．２００９  Ｄｅｃ；２５（１２）：１１７３〜６；Ｓｔｏｃｋｓ  Ｍ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；９（４）：３５９〜６５を参照されたい。しかし、細胞内抗体またはイントラボディを使用した結果が混合している。一般に、細胞内抗体を開発する試みは、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体フラグメントならびにＶＨＨ抗体およびｄＡｂなどの単一ドメイン抗体に集中している。
【０００４】
抗体および免疫血清は、病原性感染の治療に長い間使用されている。例えば、１８９０年代には、ウマ抗血清が破傷風およびジフテリアを治療するために使用されていた。しかし、抗血清はヒトの免疫システムによって異質と見なされ、これは、特に反復投与において、抗血清に対する抗体産生反応を示す。２０世紀のほとんどの間、動物抗体の有害作用のせいで、疾患から回復したドナー由来のヒト抗血清の使用が、典型的には呼吸器感染およびＢ型肝炎感染の予防目的で促された。毒性問題が原因で抗体療法の人気が低下した後、ヒト化抗体およびヒト抗体によってそのような懸念が取り除かれ、そうした治療手段に戻る結果になった。Ｃａｓａｄｅｖａｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２、６９５〜７０３（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００４）を総説として参照されたい。抗体療法を用いて標的にしてきた疾患には、炭疽病、百日咳、破傷風、ボツリヌス中毒、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症、エンテロウイルス消化管感染症、ａ群連鎖球菌感染症、壊死性筋膜炎、Ｂ型肝炎、麻疹、結核、髄膜炎、再生不良性貧血、狂犬病、ＲＳＶ感染症、肺炎、帯状疱疹、ＶＺＶによる水疱および肺炎、ならびに天然痘が含まれる。しかし、こうした進展にもかかわらず、抗体療法は高用量の抗体を必要とし、予期できない結果をもたらすため、他の適切な療法が使用できない場合にだけ検討される。
【０００５】
病原体に対する抗体の効力は、補体の作用を仲介するのに関与する、抗体のＦｃ部分に少なくとも部分的には依存していると理解されている。したがって、小型で、かつ、製造費が低いという利点が抗体フラグメントにあるにもかかわらず、抗体フラグメントは抗ウイルス療法に対して一般に提案されていない。
【０００６】
ウイルス性疾患の主な療法はワクチン接種のままであり、それは予防手段である。樹状細胞などの抗原提示細胞によってプロセッシングを受けたウイルス性抗原は、免疫システムに提示され、無感作Ｔ細胞をメモリーＴ細胞およびエフェクターＴ細胞へ分化するように誘導すると考えられている。メモリーＴ細胞は、二次感染に対するより攻撃的で即時型の免疫反応に関与しており、これによってワクチン接種の利点がもたらされる。総説に関しては、Ｋａｅｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２巻、Ａｐｒｉｌ  ２００２、２５１を参照されたい。
【０００７】
感染性疾患の療法に対する免疫に基づく別の手段は、インターフェロンを含めたサイトカインの使用である。インターフェロンは、がんおよび多発性硬化症ならびにウイルス感染症の治療のために最初に提案された。インターフェロンは、１９９８年以来、Ｃ型肝炎治療に認可されている。さらに、特に東ヨーロッパにおいて、低用量の経口または鼻腔内インターフェロンが風邪およびインフルエンザの治療に投与されている。しかし、抗ウイルス効果が認められ得る用量よりも使用用量が低いと考えられるため、その作用機構は知られていない。Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００９  Ａｐｒ；９０（第４部）：８７４〜８２は、アデノウイルス送達性ＶＥＥＶワクチンのアジュバントとしてインターフェロンを使用した。彼らはこのウイルスに対する防御が低下することを認めたが、ウイルスベクターに対する免疫反応の増加も認めた。
【０００８】
最近、本発明者らは、そのＰＲＹＳＰＲＹドメインを介して抗体分子の不変領域に結合することができる、ＴＲＩＭ２１と呼ばれる細胞内のサイトゾルタンパク質を述べた４。本発明者らは、この活性は構造的、熱力学的および動力学的に哺乳動物全体にわたって保存されていることを見出した５。ＴＲＩＭ２１の機能に関する仮説が提唱されており、その仮説には、アポトーシスへの関与およびＢ細胞で作られるアンフォールドされたＩｇＧをプロテアソームに導く役割が含まれる。
【発明の概要】
【０００９】
抗体は細胞外タンパク質であり、（細胞内に存在するがサイトゾルには存在しないＦｃＲｎを除く）全ての既知の哺乳類ＩｇＧ受容体も細胞外タンパク質である。したがって、本発明者らには、ＴＲＩＭ２１が普遍的に保存された細胞内タンパク質であるはずであり、それにもかかわらず親和性が高く特異性が高いＩｇＧ受容体であるはずであるということは矛盾していると思われた。本発明者らは、抗体免疫に関する現時点での理解はおそらく不十分であり、ＴＲＩＭ２１によって仲介され、細胞内で生じる「未発見」の免疫システムが存在すると仮定した。本明細書で提供するデータは、この未発見の免疫システムの存在、および二つの無関係なウイルス、すなわちｄｓＤＮＡアデノウイルスおよびｓｓＲＮＡコクサッキーウイルスによる感染の阻止におけるその働きを示す。
【００１０】
したがって、本発明の第一の態様では、
（ａ）直接的または間接的に病原体の抗原に特異的に結合するリガンドと、ただし、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインではなく、
（ｂ）ＲＩＮＧドメインおよび／またはＴＲＩＭ２１発現の誘導因子と
を含む化合物が提供される。
【００１１】
本発明者らは、ＴＲＩＭ２１は、免疫グロブリンに対する高親和性リガンドであることを示した。ＴＲＩＭ２１のＲＩＮＧドメインはＥ３リガーゼであり、これはユビキチン化され、結合した抗原と共に免疫グロブリンをプロテアソームに導く。
【００１２】
本発明によると、ＴＲＩＭポリペプチドのＲＩＮＧドメインなど、少なくともＲＩＮＧドメインは抗原に対するリガンドに結合することができる。そのようなリガンドは、好ましくは直接的に抗原に結合し、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含むことができる。しかし、ペプチド、ペプチドおよび核酸に基づくアプタマー、天然起源のリガンド、受容体およびそれらの結合フラグメントを含めた他のリガンドを用いてもよい。
【００１３】
別の実施形態では、リガンドは間接的に抗原に結合する。例えば、リガンドは、免疫グロブリンのＦｃ部分など、免疫グロブリンに非特異的に結合することができる。そのような一実施形態では、リガンドはＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインではない。例示的なリガンドには、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、例えば免疫グロブリンのＦｃ領域を認識するペプチドなどのペプチド、抗Ｆｃ抗体およびそれらのフラグメントなどが含まれる。この場合、標的特異性は、病原体の抗原に対して特異的な抗体または抗体フラグメントによって提供される。この抗体は、本発明の化合物と同時投与されてもよく、または天然起源でもよい。
【００１４】
本発明において、用語「リガンド」は、結合対のどちらか一方を指すのに使用される。
【００１５】
リガンドが免疫グロブリンである場合、リガンドは任意の免疫グロブリン分子、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、ＴＣＲおよびそれらの多価的な組み合わせからなる群から選択される免疫グロブリン分子でもよい。多価抗体には、例えば、二価の抗体および抗体フラグメント、二重特異性の抗体および抗体フラグメント、それらの三価バージョンならびにダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などの専売の形態が含まれる。ｄＡｂおよびＶＨＨ抗体などの単一ドメイン抗体は、組み合わせて多価および／または多特異性分子を形成するのに特に適する。
【００１６】
リガンドが抗体の場合は、抗体分子は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインまたはそれらの同等物のうちの少なくとも一つを含む。
【００１７】
一実施形態では、ＴＲＩＭポリペプチドは、ＴＲＩＭ５α、ＴＲＩＭ１９、ＴＲＩＭ２１およびＴＲＩＭ２８からなる群から選択される。その抗体結合特性によるとＴＲＩＭ２１が好ましいが、ポリペプチドまたはそのドメインが抗原そのものまたは抗原に対して特異的なリガンドに結合しているならば、抗体結合能力はもはや必要とされない。そのような場合には、ＴＲＩＭ２１以外のＴＲＩＭポリペプチド由来のＲＩＮＧドメインを同じ趣旨で使用することができる。好都合には、Ｂボックスドメインまたはコイルドコイルドメインなどの別のドメインを加えることができる。コイルドコイルドメインはＴＲＩＭ２１の二量体化に関与する。
【００１８】
好ましくは、本発明による化合物に関しては、ＲＩＮＧドメインは二コピー以上で存在する。ＴＲＩＭ２１の二量体化は、そのコイルドコイルドメインを介して起こり、Ｅ３介在性ユビキチン連結を介するプロテアソームへのタンパク質のターゲティングを補助する。
【００１９】
一実施形態では、本発明の化合物は、ＰＲＹＳＰＲＹ（Ｂ３０．２）ドメインが抗原または抗原特異的リガンドに交換されている、実質的にインタクトなＴＲＩＭポリペプチドを含む。例えばこのドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのうちの少なくとも一つを含む抗体に交換することができる。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、ＴＲＩＭドメインの代わりにまたはＴＲＩＭドメインに加えて、ＴＲＩＭ発現の誘導因子を含む。ＴＲＩＭ２１発現は、インターフェロンによって上方制御されているため、ＴＲＩＭ発現の誘導因子は、好都合には、インターフェロンまたはインターフェロン誘導因子である。細菌多糖類およびポリＩ：Ｃなどのヌクレオシド類似体を含めた、様々なインターフェロン誘導因子が当技術分野で知られている。
【００２１】
インターフェロン誘導因子は、細胞内または細胞表面で作用することができる。インターフェロン誘導因子が細胞表面で作用する場合は、対象に投与される化合物の少なくとも一部が細胞表面に留まり、インターフェロン誘導因子受容体に結合する。好適な実施形態では、インターフェロン誘導因子は、不安定な連結、例えば生理的条件下で半減期が限られた連結によって化合物に結合することができる。例えば、半減期は、リガンドが病原体およびインターフェロン受容体を導くのに十分であるが、著しく長くはないであろう。
【００２２】
第二の態様では、本発明の第一の態様による化合物を対象に投与することを含む、病原性感染を治療する方法が提供される。
【００２３】
同様に、対象において免疫反応を誘導するための、本発明の第一の態様による化合物の使用が提供される。
【００２４】
第三の態様では、本発明は、対象において感染を治療する方法であって、対象に、前記感染を引き起こす病原体の抗原に対して特異的な抗体と、前記抗体に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドとを対象に同時投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
同様に、感染の治療のための、対象に前記感染を引き起こす病原体の抗原に対して特異的な抗体ならびに前記抗体に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドの使用が提供される。
【００２６】
本発明者らは、ウイルス特異的抗体および野生型または改変したＴＲＩＭ２１で細胞を処理することによって、内在性のＴＲＩＭ２１がノックダウンされている細胞においてでさえウイルス感染力が阻害されることを示した。したがって、ＴＲＩＭ２１の同時投与を用いて、感染性疾患の治療に使用される抗ウイルス療法を増強することができる。
【００２７】
第四の態様では、感染に罹患している対象においてそのような感染を治療する方法であって、対象に、病原体の抗原に間接的に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含む治療有効量のポリペプチドを対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２８】
同様に、対象における感染性疾患の治療のための、病原体の抗原に間接的に結合するリガンドおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドの使用が提供される。
【００２９】
好ましくは、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインおよびＲＩＮＧドメインを含むポリペプチドは、ＴＲＩＭ２１由来などのＴＲＩＭポリペプチドのさらなるドメインを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、コイルドコイルドメインおよび／またはＢボックスドメインを含む。一実施形態では、ポリペプチドはＴＲＩＭ２１、好ましくはヒトＴＲＩＭ２１である。
【００３０】
ＴＲＩＭ２１が抗感染特性を有することはこれまで提唱されていない。しかし、本明細書で示すように、ＴＲＩＭ２１は、ＩｇＧおよびＩｇＭのＦｃ受容体に非常に高い親和性で結合し、抗体に加えて任意の結合した抗原をプロテアソームに導く。したがって、外来性のＴＲＩＭ２１は、病原体に応答する内在性の抗体の効果を高める。
【００３１】
本発明者らの結果は、抗体が感染細胞のサイトゾル内部でウイルス中和を仲介する、未発見の細胞内免疫システムが存在することを明らかにする。この細胞内システムは、適応性免疫または先天性免疫のいずれかだけに伝統的に付随する特徴を兼ね備える。病原体のターゲティングは適応免疫によってもたらされ、一方、中和は細胞内受容体（ＴＲＩＭ２１）および先天性の分解経路によって抗体の形としてもたらされる。ＴＲＩＭ２１は他の抗体エフェクター機構と異なり、全身性であり、免疫監視機構に基づく。ＴＲＩＭ２１はプロフェッショナル免疫細胞に限らず、たいていの細胞で発現しており、このことは、どの感染事象も中和の機会であることを意味する。宿主細胞内に免疫を封じ込めることは、ウイルスの伝播を抑制することにとって極めて重要である可能性がある。最後に、ＴＲＩＭ２１はＩｇＭとＩｇＧの両方を利用する。このことは、ＴＲＩＭ２１は感染の初期段階中の先天性免疫と適応免疫の両方と一緒に作用して、長期の防御をもたらすことを示唆する。
【００３２】
ＴＲＩＭ２１は、過去１００年間にわたる多くの抗体中和実験の一因となっている可能性がある。実際、本発明者らが、ＴＲＩＭ２１はアデノウイルスの強力な抗体中和を仲介すると認めるように、他のウイルスの抗体中和が、侵入を阻止することによって引き起こされるのか、またはＴＲＩＭ２１依存的であるのかを再評価することは重要であろう。このことは、効果的なワクチンはＴＲＩＭ２１免疫を刺激する必要があり得るため、ワクチン設計において考慮すべき重要なことである可能性がある。本発明者らは、他のウイルスの抗体中和にＴＲＩＭ２１が関与することについての良い予測因子は、インターフェロンと抗体との間の相乗関係であろうことを提案する。実際、単純ヘルペスウイルス８、エンテロウイルス７０８およびシンドビスウイルス９に関して、インターフェロンと抗体との間の未解明の相乗作用が報告されている。常法的な組織培養で使用される子ウシ血清が潜在的な交差反応特異性の可能性のある抗体レパートリーを含むため、ＴＲＩＭ２１はまた、抗体を添加しない実験におけるウイルス中和の一因となる可能性もある。
【００３３】
ＴＲＩＭ２１／抗体の細胞内免疫反応の存在は、ウイルス感染におけるいくつかの未解明な観察を解明する助けとなる可能性がある。ウイルスを標的細胞にあらかじめ付着させておく場合でさえ、ポリオウイルス１０と呼吸系発疹ウイルス１１の両方の抗体中和が起こることが報告されている。また、ポリオウイルス１２およびアデノウイルス１３の中和を仲介するのには単一のＩｇＧで十分であり、ライノウイルス１４に関しては、わずか５〜６のＩｇＧ分子だけが必要とされることも観察されている。最後に、インタクトな抗体は、それがタンパク質分解されたフラグメントよりもはるかに、二価の抗原結合を維持するＦａｂ２よりずっと、有効であるという報告が数多くある。例えば、Ｆａｂ２フラグメントは、黄熱病ウイルス１５、ＨＳＶ１６およびインフルエンザ１７の中和において、インタクトなＩｇＧよりも有効でないことが示されており、このことは、効率的な中和に対するＦｃドメインのエフェクター機能を示唆する。ＴＲＩＭ２１介在性分解によって、これら全ての現象が説明可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＴＲＩＭ２１が細胞内抗体中和を仲介することを示す図である。（Ａ）アデノウイルスが感染したＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡画像。抗体であらかじめ被覆され、二次のＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５４６（赤）で感染後に検出したアデノウイルスを細胞内部に見ることができる。内在性のＴＲＩＭ２１局在を緑で示し、ＤＡＰＩ染色した核を青で示す。これらのチャネルのマージは、抗体で被覆されたビリオンに対するＴＲＩＭ２１の局在を示す。画像はＺ投影であり、スケールバーは１０μｍおよびズームボックスでは２μｍである。（Ｂ）ＩＦＮα、ＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡ（ＫＤ）、ｓｉＲＮＡコントロール（ＨｅＬａ）またはＩＦＮα＆ＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡ（ＩＦＮα  ＫＤ）で処理した細胞を、異なるポリクローナル抗体濃度において、ＧＦＰアデノウイルスで感染させた。ＧＦＰ陽性細胞の割合を測定して感染レベルを決定し、各条件について、抗体なしのレベルに標準化した。アデノウイルス感染は、最高レベルのＴＲＩＭ２１を発現する細胞において２ｌｏｇ減少する。（Ｃ）各条件におけるＴＲＩＭ２１タンパク質レベルのウエスタンブロット。（Ｄ）濃度を増大させるヒト血清ＩｇＧの存在下における、コクサッキーウイルスによる処理細胞の感染。ＩＦＮαおよび抗体は、相乗的に作用してウイルスを中和する。この効果は、ＴＲＩＭ２１を特異的にノックダウンすることによって反転する。
【図２Ａ−２Ｆ】ＴＲＩＭ２１が細胞型および抗体と無関係に感染を中和することを示す図である。（Ａ）ＴＲＩＭ２１の中和は、抗体存在下、ｓｉＲＮＡの配列またはｓｉＲＮＡであるかｓｈＲＮＡであるかとは無関係に、ノックダウンによって反転する。（Ｂ）ＴＲＩＭ２１は三つの異なる細胞系においてアデノウイルス感染を中和する。中和はＩＦＮαによって増強され、ノックダウン（ＫＤ）によって反転する。（Ｃ）ＴＲＩＭ２１は、異なるポリクローナルまたは抗ヘキソンモノクローナルＩｇＧを用いる場合、アデノウイルス感染を中和する。（Ｄ）侵入中和は、ＴＲＩＭ２１介在性中和に比べてごくわずかである。抗体依存的なＴＲＩＭ２１のウイルス中和は、Ｆｃドメインの存在が必要である。Ｆａｂ２フラグメントは二価であり、侵入中和に対してインタクトなＩｇＧと同じ能力を有するが、それにもかかわらずＦａｂ２フラグメントは、感染に限られた影響しか及ぼさない。このことは、ＩｇＧ中和を反転させる、ＴＲＩＭ２１のノックダウンによって確かめられる。（Ｅ）ＴＲＩＭ２１は血清ＩｇＭと結合する。ＩｇＭのＴＲＩＭ２１への結合を蛍光異方性の変化として測定し、標準的な二次式（材料＆方法）に適合させ、１６．８μＭ±１．５μＭの親和性を得た。（Ｆ）血清ＩｇＭ抗体はまた、ＴＲＩＭ２１に使用されてウイルスを中和することができる。ＴＲＩＭ２１のノックダウン（ＫＤ）はこの効果を反転させ、ＩＦＮαはそれを増大させる。全てのパネルのエラーバーは、３回の実験から計算した。
【図２Ｇ】ＴＲＩＭ２１が細胞型および抗体と無関係に感染を中和することを示す図である。（Ｇ）ＩｇＡ抗体は、さらにＴＲＩＭ２１に使用されてウイルスを中和することができる。ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＲＩＭ２１）を用いるＴＲＩＭ２１のノックダウンはこの効果を反転させ、ＩＦＮαはそれを増大させる。コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉコントロール）は無影響である。
【図３】ＴＲＩＭ２１の中和機構を示す図である。（Ａ）ＴＲＩＭ２１（黒）、ＩｇＧ（薄灰色）およびＩｇＧとの複合体中のＴＲＩＭ２１（暗灰色）のＳＥＣ  ＭＡＬＳクロマトグラム。連続トレースはＲＩシグナル（左側の軸）を表し、タンパク質濃度の指標である。短い横線は、各サンプリング間隔（１秒）での各ピーク内の計算質量（右側の軸）を表す。分析によって、ＴＲＩＭ２１は１０７ｋＤａの質量を有する二量体であり、ＩｇＧは１５４ｋＤａの質量を有し、ＴＲＩＭ２１：ＩｇＧ複合体は遊離ＩｇＧおよび約２８０ｋＤａの質量を有する１：１複合体に対応するピークをもたらすことが示される。（Ｂ＆Ｃ）完全長ＴＲＩＭ２１（左側）およびΔＲＩＮＧ−ΔボックスＴＲＩＭ２１（右側）を用いる定常状態のＩｇＧの蛍光滴定。滴定を標準的な二次式（材料＆方法）に適合して、０．６±０．１ｎＭという完全長ＴＲＩＭ２１の抗体に対する親和性（Ｂ）およびΔＲＩＮＧ−ΔボックスＴＲＩＭ２１については０．９±０．２ｎＭの親和性（Ｃ）を得た。（Ｄ）ＴＲＩＭ２１中和は、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２によって反転させられるが、オートファジー阻害剤３−ＭＡによっては反転させられない。エラーバーは３回の実験から計算した。（Ｅ）ＭＧ１３２の濃度とＴＲＩＭ２１中和の反転との間の直接相関。ＭＧ１３２は、抗体の存在下でのみ中和を反転する。（Ｆ）プロテアソーム分解、ＴＲＩＭ２１および抗体は、ウイルス中和の同一経路において必要因子である。例えば、ＴＲＩＭ２１のノックダウンは、ＭＧ１３２の性向を取り除く。
【図４】ＴＲＩＭ２１のＥ３ユビキチンリガーゼ機能はウイルス中和に必須であることを示す図である。（Ａ）組換え完全長ＴＲＩＭ２１はウイルスを中和するが、ＲＩＮＧおよびＢボックスドメインを欠くＴＲＩＭ２１は中和しない。（Ｂ）ＴＲＩＭ２１は活性なＥ３リガーゼであるが、ＲＩＮＧおよびＢボックスドメインの欠損は、自己ユビキチン化を妨げる。（Ｃ）ＴＲＩＭ２１は、ヘキソンまたはその結合抗体を感染中に直接的にユビキチン化しない（Ｄ）抗体で被覆されたアデノウイルスに感染したＨｅＬａ細胞を示す共焦点顕微鏡Ｚ投影。ビリオンと共局在したＴＲＩＭ２１は、ユビキチンに対して陽性である。（Ｅ）感染後１〜６時間目のヘキソン、抗体およびＴＲＩＭ２１タンパク質レベルのウエスタンブロット。アデノウイルスのヘキソンタンパク質および抗体は、ＴＲＩＭ２１依存的様式で迅速に分解される。ＭＧ１３２の添加は、部分的に分解をレスキューする。分解は、細胞のＴＲＩＭ２１プールに有意な影響を及ぼさない。
【図５】抗体で被覆された細胞内のビーズはＴＲＩＭ２１を動員し、ユビキチン化されることを示す図である。ストレプトアビジン結合ラテックスビーズを抗ストレプトアビジン抗体で被覆し、細胞にトランスフェクトした。細胞内のビーズはＴＲＩＭ２１によって認識され、ユビキチンと共局在する。スケールバーは、１０μｍおよびズームボックスでは５μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
別途記載のない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等ないかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。そうした使用に適する方法、装置および材料をこれから記載する。本発明と組み合わせて使用する可能性のある、刊行物で報告されている方法論、試薬およびツールを記載および開示する目的で、本明細書で引用される全ての刊行物はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
特に指示がない限り、本発明の実施は、当業者に知られている化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。そのような手法は、文献で十分に説明される。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｌ．Ｅ．およびＧｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．編（２００１）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．編（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編（１９９９）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら編（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．およびＧｒａｈａｍ，Ａ．編（１９９７）ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇを参照されたい。
【００３７】
本発明において、投与は、投与される試薬、化合物または遺伝子構築物に応じて、細胞培養の標準的な手法によって行われる。例えば、細胞培養培地への添加によって、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入による細胞への導入によって、または他の手段によって投与することができる。本発明の方法が試験系としてヒト以外の哺乳動物を用いる場合は、哺乳動物は、トランスジェニックでもよく、内在性の細胞で必要な試薬を発現してもよい。
【００３８】
本発明において、抗原は、リガンドに認識され得、病原体に対して特異的なエピトープを有する分子である。典型的には、抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体の抗原決定基であり、抗体などのリガンドによる結合を生理的条件下で受ける。好ましい抗原は、既知の中和抗体または病原体に対して特異的なワクチンによって標的にされるエピトープを含む。
【００３９】
病原体は、対象に感染することができる生物、例えば細菌もしくは原生動物またはウイルスなどの任意の異物でもよい。好都合には、病原体はウイルスである。ウイルスはエンベロープ型でもよく、非エンベロープ型でもよい。一実施形態では、病原体は非エンベロープウイルスである。
【００４０】
直接的に抗原に結合するリガンドは、生理的条件下で特異的に抗原に結合することができるリガンドである。本明細書で使用する場合、用語「リガンド」は、特異的結合対のどちらか一方の部分を指すことができる。例えば、それは、抗体−抗原対の抗体または抗原を指すことができる。抗体は好ましいリガンドであり、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、改変ＴＣＲおよびそれらの多価的な組み合わせを含む、当技術分野で知られているような完全な抗体でもよく、または抗体フラグメントでもよい。リガンドは、代替の非免疫グロブリンスキャフォールドに基づく結合分子、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、非ペプチド骨格を基礎とするポリペプチドループを含む構造化ポリペプチド、天然の受容体またはそれらのドメインでもよい。
【００４１】
間接的に抗原に結合するリガンドは、第二のリガンドを介して抗原に結合するリガンドである。例えば、それは、抗体に結合するリガンドである。このリガンドは、抗体の結合特異性に無関係な方式で抗体に結合する。例えば、このリガンドはＦｃ領域と結合することができる。一実施形態では、このリガンドは、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメイン、抗免疫グロブリン抗体および特異的に抗体を認識する、例えばＦｃ領域中のペプチドを含む群から選択される。
【００４２】
ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインは、ＰＲＹおよびＳＰＲＹ領域からなり、それぞれ、配列番号１に記載のヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列の２８６〜３３７および３３９〜４６５に位置する。
【００４３】
ＲＩＮＧドメインは、配列番号１に記載のヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列のアミノ酸１５から５８間の、ヒトＴＲＩＭ２１のドメインである。
【００４４】
Ｂボックスドメインは、配列番号１に記載のヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列のアミノ酸９１から１２８間の、ヒトＴＲＩＭ２１のドメインである。
【００４５】
コイルドコイルドメインは、配列番号１に記載のヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列のアミノ酸１２８から２３８間の、ヒトＴＲＩＭ２１のドメインである。
【００４６】
用語「免疫グロブリン」は、二つのβシートおよび通常保存されたジスルフィド結合を含む、抗体分子の免疫グロブリンフォールド特性を保持するポリペプチドファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫システムにおける広範な役割（例えば抗体、Ｔ細胞受容体分子など）、細胞接着への関与（例えばＩＣＡＭ分子）および細胞内情報伝達（例えばＰＤＧＦ受容体などの受容体分子）を含めた、インビボにおける細胞性および非細胞性の相互作用の多くの局面に関与している。本発明は、結合ドメインを有する全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用することができる。好ましくは、本発明は抗体に関する。
【００４７】
生理的条件下で、抗原のターゲティングが結果として病原体の実質的に排他的なターゲティングになる場合は、抗原は病原体に特異的である。
【００４８】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインならびにＴ細胞受容体のαおよびβ鎖などの他のタンパク質中の同等物は、抗原結合特異性の決定に関与する。ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬｄＡｂのように独立に抗原に結合することができる。ＶＨおよびＶＬドメインへの言及には、合成であろうと天然起源であろうと、ＶＨおよびＶＬドメインの改変バージョンが含まれる。例えば、天然起源のＶＨ変異体には、ラクダ科動物のＶＨＨドメインおよび軟骨魚類の重鎖免疫グロブリンのＩｇＮＡＲが含まれる。
【００４９】
ＴＲＩＭポリペプチドは、タンパク質のトリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）モチーフ（ＴＲＩＭ）ファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ＴＲＩＭ２１（Ｒｏ５２）を含めた７０メンバーをヒトゲノム中に含む。ＴＲＩＭタンパク質は、細胞の増殖、分化、発達、癌化およびアポトーシスを含めた多様な細胞プロセスに関与している。ＴＲＩＭタンパク質はマルチドメインであり、そのように呼ばれる理由は、その保存されたＮ末端のＲＢＣＣドメイン、すなわちＥ３ユビキチンリガーゼ活性をコードするＲＩＮＧフィンガー、オリゴマー化を仲介するＢボックスおよびコイルドコイルドメインのためである。Ｃ末端のＰＲＹＳＰＲＹまたはＢ３０．２ドメインは、ターゲティングモジュールとして働くことにより、異なるＴＲＩＭポリペプチドの機能を通常決定する。Ｎｉｓｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３、７９９〜８０８（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００５）を参照されたい。ＲＩＮＧドメインは、二つの亜鉛原子を配位するシステインおよびヒスチジン残基の規則的な配置によって定義され、多種多様なタンパク質に見出される。ＲＩＮＧドメインは、Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（９〜３９）−Ｃ−Ｘ（１〜３）−Ｈ−Ｘ（２〜３）−（Ｎ／Ｃ／Ｈ）−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（４〜４８）Ｃ−Ｘ２−Ｃの構造を特徴とし、ＴＲＩＭポリペプチド中のＢボックスドメインに会合している。Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｊａｎ  ２７；１０（２）：Ｒ８４〜７を参照されたい。
【００５０】
ドメインは、そのタンパク質の残りの部分に関係なく三次構造を保持する、フォールドされたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性に関与し、多くの場合、残りのタンパク質の機能および／またはドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に加える、移動するまたは移転することができる。ＴＲＩＭポリペプチドのＲＩＮＧ、Ｂボックス、コイルドコイルおよびＰＲＹＳＰＲＹドメインは、それらの例である。抗体可変ドメインとは、抗体可変ドメインに特有の配列を含むフォールドされたポリペプチドドメインを意味する。したがって、それには、完全な抗体可変ドメインおよび改変可変ドメインが含まれ、例えば、それらの一つまたは複数のループが、抗体可変ドメインの特性がない配列またはＮ末端もしくはＣ末端伸長部が切り捨てられた、もしくはそれを含む抗体可変ドメイン、ならびに完全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも部分的には保持するフォールドされた可変ドメインフラグメントによって交換されている。
【００５１】
ＴＲＩＭ発現の誘導因子は、所望のＴＲＩＭポリペプチドの細胞内レベルを増大させる薬剤である。好ましくは、ポリペプチドはＴＲＩＭ２１である。Ｉ型インターフェロンはＴＲＩＭ２１発現の誘導因子である。
【００５２】
本明細書で言及する場合、同時投与は、同時に目的の部位で有効であるような、二種の薬剤の同時、同時分離または連続投与である。したがって抗体およびＴＲＩＭ２１ポリペプチドの同時投与においては、二種の薬剤は、細胞によって内在化される前に抗体がＴＲＩＭ２１ポリペプチドに結合するように投与される必要がある。したがって、抗体およびＴＲＩＭ２１ポリペプチドは投与前に混合することができ、またはそれらが同時に血液循環中に存在するように分離投与することができる。
【００５３】
抗体は、病原体が細胞に感染する前に病原体を標的にする。本明細書において、本発明者らは、これらの抗体は、感染の際に病原体に結合したままであり、全ての細胞内に存在する細胞内免疫反応を導くことを示す。本発明者らは、各細胞は細胞質のＩｇＧ受容体、すなわちＴＲＩＭ２１を有し、それは人体の他のどんなＩｇＧ受容体よりも高い親和性で抗体に結合することを実証する。これによって、ＴＲＩＭ２１が細胞内の抗体結合ウイルスを迅速に動員し、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を介するプロテアソームにおける分解の標的にすることが可能になる。生理的抗体濃度では、ＴＲＩＭ２１はウイルス感染を完全に中和する。こうした発見によって、新奇な広域性免疫システムが示され、抗体に仲介される防御は細胞膜で終わるのではなく、細胞内で継続して感染に対する最後のとりでとなることが明らかにされる。
【００５４】
ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインは抗体結合に関与し、この意味でＴＲＩＭ２１は、ＴＲＩＭポリペプチドファミリーにおいて独特であるように思われる。しかし、プロテアソームターゲティングに関与するＴＲＩＭドメイン、すなわちＲＩＮＧドメインはＴＲＩＭ２１に特異的ではなく、むしろＴＲＩＭファミリーを含めたタンパク質に一般的に見られる。
【００５５】
細胞におけるＴＲＩＭ２１発現の誘導は、インターフェロンに依存しており、これはウイルス機構による遅延および干渉を受ける。したがって本発明は、病原体が細胞によって内在化される場合、病原体に結合したリガンドが直ぐに病原体をプロテアソームに導き分解するような、ＲＩＮＧドメインに融合した抗原特異的リガンドを提供する。これによって、病原体感染から細胞が自力で回復することが実際上可能になる。
【００５６】
１．リガンド
生理的条件下で病原体結合抗原に結合することができ、細胞による内在化が可能な任意のリガンドが本発明における使用に適する。自然免疫システムは、病原体に対するリガンドとして抗体を使用し、抗体または抗体フラグメントは、本発明における使用に理想的である。他の可能性のあるものには、他の受容体由来の結合ドメインならびに加工された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ペプチドおよび核酸が含まれる。
【００５７】
１ａ．抗体
抗原または病原体特異的抗体、抗原または病原体結合抗体および抗原または病原体に対して特異的な抗体に対する本明細書の言及は同一範囲に含まれ、病原体に存在する抗原に特異的な様式で結合し、血液循環または組織中に存在する他の分子と実質的に交差反応しない、抗体または抗体に由来する結合フラグメントを指す。
【００５８】
本明細書で使用する「抗体」には、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化、単鎖、二重特異性のＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントが含まれる。そのようなフラグメントには、所望の抗原に対するその結合活性を保持する全抗体フラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ｖ）またはＶＨ抗体フラグメントならびに抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質および他の合成タンパク質が含まれる。さらに、より詳細に以下に記載するように、それらの抗体およびフラグメントはヒト抗体でもよくヒト化抗体でもよい。
【００５９】
抗体およびフラグメントは、抗体変異体およびそれらのフラグメントも包含する。変異体には、抗原特異的抗体またはそのフラグメントと同じまたは実質的に同じ親和性および特異性のエピトープ結合を有する、一種または複数のアミノ酸配列の置換、欠損、および／または付加を含むペプチドならびにポリペプチドが含まれる。
【００６０】
アミノ酸残基の欠損、挿入または置換は、サイレント変化を引き起こし、機能的に等価な物質となる可能性がある。残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様の親水性値を持つ非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【００６１】
例えば以下の表に従って、保存的置換を行うことができる。第二カラムの同じブロック内のアミノ酸および好ましくは第三カラムの同じラインにあるアミノ酸は、互いに置換することができる。
【表１】
2013535462.tif 000002
【００６２】
相同的置換（本明細書では、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の両方とも既存のアミノ酸残基を代替の残基と入れ替えることを意味するのに使用される）、すなわち、塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性などの同等置換が起こる可能性がある。非相同的置換、すなわち、あるクラスの残基から別のものへ、またはオルニチン（以後本明細書ではＺと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後本明細書ではＢと称する）、ノルロイシンオルニチン（以後本明細書ではＯと称する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の含有物を代わりに含む置換も起こる可能性がある。
【００６３】
したがって、変異体には、抗原特異的抗体およびそれらのフラグメントへの一種または複数のアミノ酸配列の置換、欠損および/または付加を含むペプチドならびにポリペプチドが含まれてよく、この場合、そのような置換、欠損および/または付加がエピトープ結合の親和性および特異性を実質的に変化させない。抗体またはそのフラグメントの変異体は、天然起源の軽鎖および/または重鎖のアミノ酸配列中に変化を有してもよく、または組換えＤＮＡ技術を用いて天然配列をインビトロにおいて改変することによって導入される。天然起源の変異体には、外来抗原に応答した抗体産生中に、対応する生殖細胞のヌクレオチド配列においてインビボで発生する、「体細胞」変異体が含まれる。
【００６４】
抗体および結合フラグメントの変異体は、突然変異誘発の手法によって調製することもできる。例えば、アミノ酸変化は、抗体コード領域全体にわたってランダムに導入することができ、得られた変異体は、標的抗原に対する結合親和性または別の特性でスクリーニングすることができる。あるいは、アミノ酸変化は、軽鎖および／もしくは重鎖のＣＤＲ中ならびに／またはフレームワーク領域中などの抗体の選択された領域に導入することができ、得られた抗体は、標的抗原に対する結合またはいくつかの他の活性でスクリーニングすることができる。アミノ酸変化は、所定のＣＤＲ内の単一アミノ酸の差異から多数のアミノ酸置換までの、ＣＤＲ中の一種または複数のアミノ酸置換を包含する。アミノ酸挿入によって作製されて、ＣＤＲの大きさが増大した変異体も包含される。
【００６５】
抗原結合抗体およびそのフラグメントは、ヒト化抗体またはヒトの改変抗体でもよい。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」またはその抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来の抗原結合部位の一部ならびにヒト抗体のフレームワーク領域および／または定常領域の一部を含む組換えポリペプチドである。ヒトの改変抗体または抗体フラグメントは、ヒトにおいて、改変抗体の検知可能などんな免疫原性も低減または排除するために、特異的な位置でアミノ酸を改変（例えば欠損、挿入または置換）することによって改変された、非ヒト（例えばマウス）抗体である。
【００６６】
ヒト化抗体には、キメラ抗体およびＣＤＲグラフト化抗体が含まれる。キメラ抗体は、ヒトの定常領域に連結された非ヒト抗体の可変領域を含む抗体である。したがって、キメラ抗体では、可変領域は主に非ヒトであり、定常領域はヒトである。キメラ抗体およびその作製方法は、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８４１〜６８５５（１９８４）に記載されている。それらは、マウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が低い可能性があるが、キメラ抗体の投与は、抗体の非ヒト部分に対するヒト免疫反応（ＨＡＭＡ）と関連付けられてきた。
【００６７】
ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒト「レシピエント」抗体由来のフレームワーク領域に連結された、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲを含む抗体である。ヒト化抗体を作製するのに使用することができる方法はまた、例えば、ＵＳ５，７２１，３６７および６，１８０，３７７に記載されている。
【００６８】
「ベニア化（Ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体」は、その免疫原性を低減またはその機能を増強するために、特定の溶媒露出アミノ酸残基を交換するように改変された非ヒトまたはヒト化（例えば、キメラまたはＣＤＲグラフト化抗体）抗体である。キメラ抗体のべニア化（Ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）は、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域中の溶媒露出残基を特定すること、およびそれらの少なくとも一つをヒトフレームワーク領域の対応する表面残基と置換することを含むことができる。ベニア化は、任意の適切な改変技術によって達成することができる。
【００６９】
抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体およびそれらの調製方法に関するさらなる詳細は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１に見出すことができる。
【００７０】
ヒト化またはヒト改変抗体の例は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体である。抗体は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）のものまたはアイソタイプでよく、カッパまたはラムダ軽鎖を含むことができる。例えば、ヒト抗体は、ＩｇＧ重鎖またはアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の少なくとも一つなどの定義されたフラグメントを含むことができる。さらなる例として、抗体またはそのフラグメントは、ＩｇＧ１重鎖およびカッパまたはラムダ軽鎖を含むことができる。
【００７１】
抗原特異的抗体およびそのフラグメントはヒト抗体でもよく、例えば、抗原と結合し、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン核酸配列の天然起源の体細胞変異体でもよい核酸配列にコードされる抗体ならびにそれらのフラグメント、合成変異体、誘導体および融合体などである。そのような抗体は、哺乳動物の染色体中において天然免疫グロブリンがヒトＶ遺伝子に交換されている（トランスジェニックマウスなどの）トランスジェニック哺乳動物の使用を介するなど、当技術分野で知られている任意の方法によって産生することができる。
【００７２】
国際公開第９８／２４８９３号および国際公開第９１／００９０６号に記載のように、所望の抗原を標的にするためのヒト抗体は、内在性の免疫グロブリン産生がなく、ヒト免疫グロブリン座を含むように改変されたトランスジェニック動物を用いて産生することもできる。
【００７３】
ヒト抗体は、抗体を提示したライブラリーのインビトロスクリーニングを介して作出することもできる（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２７：３８１）。様々な抗体を含むファージディスプレイライブラリーが述べられてきており、容易に調製することができる。ライブラリーは、ヒトのＦａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントなどの、適切な標的に対してスクリーニング可能な、多様なヒト抗体配列を含むことができる。ファージディスプレイライブラリーは、所望の抗原に選択的結合が可能な薬剤を特定するためにスクリーニング可能な、抗体以外のペプチドまたはタンパク質を含むことができる。
【００７４】
ファージディスプレイ方法は、糸状バクテリオファージの表面上に抗体レパートリーを提示すること、およびそれに続いて、選択した抗原への抗体の結合によってファージを選抜することを介して、免疫選択を模倣する。その一つの方法が国際公開第９９／１０４９４号に記載されている。抗原特異的抗体は、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを用いて調製した組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーの、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。そのようなライブラリーの調製およびスクリーニングの方法論は、当技術分野で既知である。ファージディスプレイライブラリーを作出するための市販品として入手可能なキットが存在する。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域など、インタクトな完全長抗体の一部分を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；二重特異性、三重特異性および多特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ））などの多特異性抗体フラグメント；結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）；キレート組換え抗体；トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）；イントラボディ；ナノボディ；小モジュラー免疫薬剤（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、ＶＨＨ含有抗体；ならびに抗体フラグメントから形成される任意の他のポリペプチドが挙げられる。
【００７６】
抗原結合抗体およびフラグメントは、所望の抗原に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を包含する。ｓｃＦｖは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に作動可能に連結させた抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここでは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、一緒にまたは独立して抗原に結合する結合部位を形成する。ｓｃＦｖは、アミノ末端にＶＨ領域を、カルボキシ末端にＶＬ領域を含むことができる。あるいは、ｓｃＦｖは、アミノ末端にＶＬ領域を、カルボキシ末端にＶＨ領域を含むことができる。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子にコードされるが、組換え方法を用いて、それらがＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖとして知られる）として作られることを可能にする合成リンカーによって、それらを結合することができる。ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にポリペプチドリンカーを場合によりさらに含むことができる。
【００７７】
抗原結合抗体およびそのフラグメントは、イムノアドヘシンも包含する。一つまたは複数のＣＤＲを共有結合的にまたは非共有結合的のいずれかで分子中に組み入れ、これをイムノアドヘシンにすることができる。イムノアドヘシンは、より大きなポリペプチド鎖の一部として一以上のＣＤＲを組み入れることができ、一以上のＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結することができ、または一以上のＣＤＲを非共有結合的に組み入れることができる。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが特異的に所望の抗原に結合するのを可能にする。
【００７８】
抗原結合抗体およびそのフラグメントは、（タンパク質性または炭水化物性スキャフォールドなどの）有機性または分子性スキャフォールド上に構築された一つまたは複数の抗原結合部分を含む抗体模倣物も包含する。通常タンパク質スキャフォールドと称される、比較的明確な三次元構造を有するタンパク質は、抗体模倣物の設計のための試薬として使用することができる。これらのスキャフォールドは、典型的には、特異的またはランダムな配列変異を受け入れやすい一つまたは複数の領域を含み、そうした配列ランダム化は、所望の産物を選抜することができるタンパク質ライブラリーを作製するために行われることが多い。例えば、抗体模倣物は、ループそれぞれに挿入され、親抗体に結合するリガンドに対して選択的結合活性を示す、親抗体とは異なるＣＤＲを含む二つ以上の溶媒露出ループを有するスキャフォールドを含有する免疫グロブリン様ドメインを持つキメラの非免疫グロブリン結合ポリペプチドを含むことができる。非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドは、新規な結合特性を有するタンパク質を得るために提唱された。
【００７９】
抗原特異的抗体またはそれらの抗体フラグメントは、典型的には、例えば約１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、または約２５ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約３ｐＭ以下約１ｐＭ以下、約０．７５ｐＭ以下、または約０．５ｐＭ以下の抗原に対する平衡結合解離定数（ＫＤ）を有するなど、（例えばＢＩＡｃｏｒｅで決定されるような）高い親和性で所望の抗原に結合する。
【００８０】
１ｂ  ペプチドリガンド
ペプチドアプタマーなどのペプチドは、スクリーニング手法によってペプチドライブラリーから選抜することができる。実際には、短鎖核酸配列を真核細胞で発現するのに適した任意のベクターシステムを用いて、ペプチドライブラリーを発現させることができる。好ましい実施形態では、高力価のレトロウイルスパッケージングシステムを用いて、ペプチドアプタマーライブラリーを作製することができる。マウスまたはヒトの細胞に感染する高力価のレトロウイルスを産生するのに使用可能な、様々なベクターならびに広宿主性および狭宿主性のパッケージング細胞系が存在する。これらの送達および発現システムは、任意の哺乳類細胞型を効率的に感染するのに容易に適合させることができ、これらを用いて、一つの実験で数千万の細胞を感染することができる。少数の、例えば５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるが、好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、および最も好ましくは２０未満のアミノ酸残基のランダムな組み合わせをコードする核酸配列を含むアプタマーライブラリーを、遊離体（ｆｒｅｅ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）として、または所定のスクリーンの標的に依存して、（例えばペプチドアプタマーの発現能、細胞内または細胞内局在、安定性、分泌能、単離能（ｉｓｏｌａｔａｂｌｉｔｉｙ）または検出能の促進のために特異的タンパク質スキャフォールドとして働くことができるタンパク質などの異種タンパク質への融合物として、レトロウイルス感染細胞で発現させることができる。例えば、７アミノ酸から構成される場合のランダムペプチドアプタマーライブラリーは、重要および特異的な構造情報を表すのに十分であり、１０７以上の可能な組み合わせが試験可能な細胞数の範囲内である、多数の分子をコードする。
【００８１】
好ましくは、アプタマーは標的抗原の配列情報を用いて作出される。
【００８２】
アプタマーの特定において、例えば、アプタマーライブラリーのメンバーを発現する遺伝子構築物で細胞集団を感染させ、アプタマーの抗原結合能を、例えばＢＩＡｃｏｒｅプラットフォームで評価する。一ラウンド目のスクリーニングで選抜したアプタマーのコード配列をＰＣＲで増幅し、再クローニングして、無感作細胞に再導入することができる。次に、最初のプール内の個々のアプタマーを確認するために、同じまたは異なるシステムを用いる選抜を繰り返すことができる。後の選抜ラウンドで特定した細胞内のアプタマーコード配列は、繰り返して増幅およびサブクローニングすることができ、次に、活性アプタマーの配列は、標準的な手法を用いて、ＤＮＡシークエンシングにより決定することができる。
【００８３】
１ｃ  構造化ポリペプチド
合成分子構造に結合するポリペプチドは、当技術分野で既知である（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．およびＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、１９８５；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、トリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用し、合成スキャフォールド上に多数のペプチドループを迅速かつ定量的に環化して、タンパク質表面を構造的に模倣した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。候補薬物化合物の作出方法であって、前記化合物が、例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンのような分子スキャフォールドにシステイン含有ポリペプチドを連結することによって作出される方法は、国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に開示されている。
【００８４】
国際公開第２００４／０７７０６２号は、候補薬物化合物の選択方法を開示している。特にこの文献は、第一および第二の反応基を含む様々なスキャフォールド分子、ならびに前記スキャフォールドを別の分子に接触させて、カップリング反応においてスキャフォールドと別の分子の間に少なくとも二つの連結を形成することを開示している。
【００８５】
国際公開第２００６／０７８１６１号は、結合化合物、免疫原性化合物およびペプチド模倣物を開示している。この文献は、既存のタンパク質から得られるペプチドの様々なコレクションの人工合成を開示している。次に、こうしたペプチドを、コンビナトリアルライブラリーを作製するために導入された、いくつかのアミノ酸変化を有する定常合成ペプチドと結合させる。様々なアミノ酸変化を特徴とする別々のペプチドに化学的連結を介してこの多様性を導入することによって、所望の結合活性を発見する機会が増大する。この文献の図７は、様々なループペプチド構築物の合成の概略図を示す。
【００８６】
国際公開第２００９０９８４５０号には、合成分子構造に結合するペプチドを選抜するための、ファージディスプレイなどの生物学的選抜手法の使用が記載されている。この手段では、構造的に制約されたペプチド（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）がファージ表面上に提示されるように、ペプチドをファージ上に発現し、次に、適切な条件下で分子スキャフォールドと反応させる。
【００８７】
そのような構造化ペプチドは、任意の所望の抗原に結合するように設計することができ、抗原リガンド複合体を細胞内部のプロテアソームに導くためにＲＩＮＧドメインに連結することができる。
【００８８】
１ｄ  間接的リガンド
間接的リガンドは、特異的に抗原を認識する第二のリガンドを介して抗原に結合する。例えば、第二のリガンドは抗原に対して特異的な抗体である。免疫グロブリンに対して特異的であるが、標的免疫グロブリンの結合特異性に依存していない形で免疫グロブリンに結合する、上記の第１ａ〜１ｃ節に記載したリガンドを調製することができる。例えば、抗Ｆｃ抗体、ペプチドおよび構造化ペプチドは、調製することができる。プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬなどの抗体結合ペプチドは使用することができる。
【００８９】
２．ＲＩＮＧドメイン
トリパータイトモチーフ（ＴＲＩＭ）タンパク質は、ＲＩＮＧフィンガードメイン、一つまたは二つのＢボックスドメイン、コイルドコイルドメインおよび可変的なＣ末端を特徴とする保存されたドメイン構造（ＲＢＣＣとして知られる）に基づく、タンパク質ファミリーを構成する。
【００９０】
ＴＲＩＭタンパク質は、分化、アポトーシスおよび免疫を含めた様々な細胞機能に関係する。いくつかのＴＲＩＭタンパク質は、抗ウイルス活性を提示することが発見されており、または先天性免疫に関わる過程に関与していることが知られている。Ｃａｒｔｈａｇｅｎａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２００９）４、３：ｅ４８９４によって言及されたように、ＴＲＩＭ５ａは、霊長類細胞において、Ｎ−ＭＬＶおよびＨＩＶ−１を含めた多様なレトロウイルスの種特異的な侵入後制限に関与し、一方ＴＲＩＭ１／ＭＩＤ２はまた、Ｎ−ＭＬＶ感染に特異的に作用する抗レトロウイルス活性を提示する。Ｓｔａｆ５０としても知られるＴＲＩＭ２２は、ＨＩＶ−１複製を阻害することが示されているが、どのステップで阻止が起こるかはまだ不明である。ＴＲＩＭ２８は、マウス胚細胞においてＭＬＶのＬＴＲ駆動性転写を制限する。さらに、ＴＲＩＭ１９／ＰＭＬによって、広範囲のＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスが阻害されることが報告されている。今までに行われた最も大規模なスクリーンによって、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ３１およびＴＲＩＭ６２を含めたいくつかのＴＲＩＭタンパク質は、ＭＬＶまたはＨＩＶ−１の複製の様々な段階を妨げることができることが示された。最後に、ＴＲＩＭ２５は、そのＥ３ユビキチンリガーゼ活性を介して、ＲＩＧＩ介在性抗ウイルス活性を制御することが示された。
【００９１】
本明細書に記載のＴＲＩＭ２１のＲＩＮＧフィンガーは、結合した抗体／抗原複合体のプロテアソームへの誘導に関与する。これは、ＲＩＮＧドメインのＥ３ユビキチンリガーゼ活性によるものである。したがって、好都合には、本発明で使用するＲＩＮＧドメインはＥ３リガーゼ活性を有する。
【００９２】
ＲＩＮＧドメインの異種性のＴＲＩＭドメインとの交換、すなわちＩＭタンパク質間においてそれらを交換することは当技術分野で既知である。Ｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００６）６１９８〜６２０６を参照されたい。
【００９３】
ＲＩＮＧドメインは、Ｆｒｅｅｍｏｎｔら、Ｃｅｌｌ．１９９１  Ｆｅｂ  ８；６４（３）：４８３〜４によって説明されている。このドメインは、Ｅ３リガーゼとして機能すると考えられている。Ｍｅｒｏｎｉ＆Ｒｏｕｘ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２７、１１：１１４７〜１１５７（２００５）を参照されたい。ＲＩＮＧドメインは、ＲＩＮＧフィンガー（Ｒｅａｌｌｙ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅ）ドメインスーパーファミリー、すなわち二つの亜鉛原子が結合する、４０から６０残基のＺｎフィンガーの特殊型のメンバーであり、「交差ブレース（ｃｒｏｓｓ−ｂｒａｃｅ）」モチーフＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（９〜３９）−Ｃ−Ｘ（１〜３）−Ｈ−Ｘ（２〜３）−（Ｎ／Ｃ／Ｈ）−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（４〜４８）Ｃ−Ｘ２−Ｃによって定義される。ファミリー内に二つの変異型、すなわちＣ３ＨＣ４型とＣ３Ｈ２Ｃ３型（ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガー）があり、それらは異なるシステイン／ヒスチジンパターンを有する。
【００９４】
好ましいＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭタンパク質由来であり、ＴＲＩＭタンパク質の一部でもよい。一実施形態では、本発明は、その特異性を与えるＢ３０．２ドメインが抗原特異的結合ドメインと交換されたＴＲＩＭポリペプチドを提供する。少なくともＰＲＹＳＰＲＹ（Ｂ３０．２）ドメインは交換され、ＲＩＮＧドメインのＥ３リガーゼ機能が保存される限り、他のドメインは交換されてもよいし取り除かれてもよい。
【００９５】
３．ＴＲＩＭ発現の誘導
ＴＲＩＭポリペプチドのＲＩＮＧドメインを所望の抗原に連結する代わりに、またはそれに加えて、細胞内の内在性のＴＲＩＭ２１の発現を刺激することが可能である。ＴＲＩＭ２１は高い親和性で抗体に結合し、抗体および任意の結合抗原をプロテアソームに導く。
【００９６】
ＴＲＩＭ２１は抗体のＦｃ部分に結合するため、ＴＲＩＭ発現の誘導因子にリガンドを結合させることによって内在性のＴＲＩＭ２１発現が刺激される場合は、リガンドは、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインに対する結合部位を含む。好ましくは、それは抗体Ｆｃ領域を含み、一実施形態ではそれは抗体である。例えば、抗体はＩｇＧまたはＩｇＭ抗体でもよい。
【００９７】
ＴＲＩＭ２１の発現はインターフェロンで誘導される。したがって、一実施形態では、ＴＲＩＭ発現の誘導因子はインターフェロンまたはインターフェロン誘導因子である。
【００９８】
インターフェロンは、好ましくはＩ型インターフェロン、例えば、αインターフェロンまたはβインターフェロンである。
【００９９】
インターフェロンは、いくつかの治療適用において当技術分野で知られているが、特にＨＢＶおよびＨＣＶの療法で知られている。ペグインターフェロン（ペグ化されたインターフェロン）およびアルブフェロン（ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）（ＨＳＡに結合させたインターフェロン）などのインターフェロン誘導体は、ヌクレオチド類似体などの抗ウイルス剤と同時投与される。
【０１００】
インターフェロン誘導因子は、当技術分野で既知である。一般に、多くのワクチンアジュバントはインターフェロン誘導因子として働く。これらには、ウイルス性抗原、ＬＰＳなどの細菌性抗原、ポリＩ：Ｃ（例えばＡｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標））などの合成ポリマーを含めた、ワクチンアジュバントとして働くことが長年知られている物質が含まれる。ごく最近、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストがインターフェロンの有効な誘導因子であることが示された。例えば、いくつかのインターフェロン誘導因子は、米国特許出願公開第２０１０１２０７９９号、米国特許出願公開第２０１００４８５２０号、米国特許出願公開第２０１００１８１３４号、米国特許出願公開第２０１００１８１３２号、米国特許出願公開第２０１００１８１３１号、米国特許出願公開第２０１００１８１３０号、米国特許出願公開第２０１０００３２８０号から既知である。さらに、例えばＭｕｓｍｕｃａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．、２００９、４９（７）、１７７７〜１７８６ページに記載の小分子インターフェロン誘導因子が開発中である。
【０１０１】
４．抗体コンジュゲート
薬物または他の小分子医薬品を抗体フラグメントに結合させる方法は周知である。様々なペプチド結合化学が当技術分野で確立されており、それらには、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノ安息香酸；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノ安息香酸；４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−［α］−（２−ピリジルジチオ）トルエン；スルホスクシンイミジル−６−［［α］−メチル−［α］−（ピリジルジチオール）−トルアミド］ヘキサノアート；Ｎ−スクシンイミジル−３−（−２−ピリジルジチオ）−プロプリオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）；スクシンイミジル−６−［３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロプリオンアミド（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｍｉｄｏ）］ヘキサノアート；スルホスクシンイミジル−６−［３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノアート；３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインなどの二官能性の化学的リンカーが含まれる。さらなる二官能性の架橋分子が、米国特許第５，３４９，０６６号、第５，６１８，５２８号、第４，５６９，７８９号、第４，９５２，３９４号および第５，１３７，８７７号ならびにＣｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ  Ｃｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３、１１、６７７〜６９２ページ、２００８に開示されている。
【０１０２】
ＲＩＮＧドメインおよび抗体を含めたポリペプチドリガンドは、一つの（または両方の）ポリペプチドに官能基または反応基を介して結合させることができる。これらは、ポリペプチドポリマー中に見出される特定のアミノ酸の側鎖から典型的には形成される。そのような反応基は、システイン側鎖、リジン側鎖またはＮ末端アミン基もしくは任意の他の適切な反応基でよい。
【０１０３】
反応基は、結合することになるリガンドに対して共有結合を形成することができる。官能基は、官能基を形成する天然または非天然のいずれかのアミノ酸内の特定の原子群である。
【０１０４】
天然アミノ酸の適切な官能基は、システインのチオール基、リジンのアミノ基、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジニウム基、チロシンのフェノール基またはセリンの水酸基である。非天然アミノ酸は、アジド、ケト−カルボニル、アルキン、ビニルまたはハロゲン化アリール基を含めた、広範囲の官能基を提供することができる。ポリペプチド末端のアミノ基およびカルボキシル基も、所望のリガンドに対して共有結合を形成する官能基としての役目をすることができる。
【０１０５】
チオール介在性結合に代わるものを使用して、共有結合相互作用を介してポリペプチドにリガンドを結合することができる。こうした方法は、相補的官能基を有する組み合わせ低分子中で必要な化学官能基を持つ非天然アミノ酸を有するポリペプチドを生成することによって、または分子が選抜／単離フェーズ後に作製される予定の場合は、化学的にまたは組換えで合成されたポリペプチド中に非天然アミノ酸を組み込むことによって、チオール介在性の方法の代わりに（またはそれと組み合わせて）使用することができる。
【０１０６】
ファージ上のペプチドおよびタンパク質に組み込まれた非天然アミノ酸は、１）ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびそれらの誘導体と特異的に反応することができる（パラまたはメタアセチル−フェニルアラニンに見られるような）ケトン官能基（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｅｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｚｈａｎｇ  Ｚ、Ｂｒｏｃｋ  Ａ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｊａｎ  ７；１００（１）：５６〜６１；Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｏｃｔ  １５；１６（２０）：５３５６〜９．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｋｅｔｏｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｚｅｎｇ  Ｈ、Ｘｉｅ  Ｊ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ）、２）銅触媒性「クリックケミストリー」または歪み促進（３＋２）環状付加を介してアルキンと反応して、対応するトリアゾールを形成することができる（ｐ−アジド−フェニルアラニンに見られるような）アジド（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｃｈｉｎ  ＪＷ、Ｓａｎｔｏｒｏ  ＳＷ、Ｍａｒｔｉｎ  ＡＢ、Ｋｉｎｇ  ＤＳ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００２  Ａｕｇ  ７；１２４（３１）：９０２６〜７；Ａｄｄｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｄｅｉｔｅｒｓ  Ａ、Ｃｒｏｐｐ  ＴＡ、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ  Ｍ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＣ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００３  Ｏｃｔ  １；１２５（３９）：１１７８２〜３）、またはシュタウディンガーライゲーションを介してアリールホスフィンと反応して、対応するアミドを形成することができるアジド（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐ−ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ．Ｔｓａｏ  ＭＬ、Ｔｉａｎ  Ｆ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００５Ｄｅｃ；６（１２）：２１４７〜９）、４）アジドと反応して、対応するトリアゾールを形成することができるアルキン（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｄｅｉｔｅｒｓ  Ａ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００５  Ｍａｒ  １；１５（５）：１５２１〜４）、５）一つより多くの適切に間隔のあいた水酸基を含む化合物と特異的に反応することができるまたはハロゲン化化合物とパラジウム介在性カップリングを受けることができるボロン酸（ボロナート）（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００８；４７（４３）：８２２０〜３．Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｏｒｏｎａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ．、Ｂｒｕｓｔａｄ  Ｅ、Ｂｕｓｈｅｙ  ＭＬ、Ｌｅｅ  ＪＷ、Ｇｒｏｆｆ  Ｄ、Ｌｉｕ  Ｗ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ）、６）特異的に金属イオンを配位させることができる、ビピリジルを有するものを含めた金属キレート化アミノ酸（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００７；４６（４８）：９２３９〜４２．Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ，ｍｅｔａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ．Ｘｉｅ  Ｊ、Ｌｉｕ  Ｗ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ）を含むことができる。
【０１０７】
非天然アミノ酸は、１）コドンに対応して非天然アミノ酸の組み込みを導く直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびｔＲＮＡ、２）非天然アミノ酸を組み込む部位に選択されたコドンを含むように改変されたファージＤＮＡまたはファージミドプラスミド（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  Ｎｏｖ  １８；１０５（４６）：１７６８８〜９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｌｉｕ  ＣＣ、Ｍａｃｋ  ＡＶ、Ｔｓａｏ  ＭＬ、Ｍｉｌｌｓ  ＪＨ、Ｌｅｅ  ＨＳ、Ｃｈｏｅ  Ｈ、Ｆａｒｚａｎ  Ｍ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ、Ｓｍｉｄｅｒ  ＶＶ；Ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．Ｔｉａｎ  Ｆ、Ｔｓａｏ  ＭＬ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００４  Ｄｅｃ  １５；１２６（４９）：１５９６２〜３）を含むプラスミドまたはプラスミドの組み合わせでＥ．ｃｏｌｉを形質転換することによって、タンパク質およびペプチド中に組み込むことができる。直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびｔＲＮＡは、Ｍｅｔｈａｎｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｃｈｉｉのチロシル対または合成酵素（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｃｈｉｎ  ＪＷ、Ｍａｒｔｉｎ  ＡＢ、Ｋｉｎｇ  ＤＳ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２  Ａｕｇ  ２０；９９（１７）：１１０２０〜４）およびピロリシンを自然に組み込むｔＲＮＡ対（Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅ  Ｎ（ｅｐｓｉｌｏｎ）−（ｏ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｔ、Ｉｓｈｉｉ  Ｒ、Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｒ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ、Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋ、Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｎｏｖ  ２４；１５（１１）：１１８７〜９７；Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｎ（ｅｐｓｉｌｏｎ）−ａｃｅｔｙｌｌｙｓｉｎｅ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｈ、Ｐｅａｋ−Ｃｈｅｗ  ＳＹ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ａｐｒ；４（４）：２３２〜４．Ｅｐｕｂ２００８Ｆｅｂ１７）に由来してもよい。組み込みのためのコドンはアンバーコドン（ＵＡＧ）、別の終止コドン（ＵＧＡまたはＵＡＡ）でもよく、あるいは４塩基コドンでもよい。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびｔＲＮＡは、ｐＢＫ系ベクター、ｐＳＵＰ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｒｙｕ  Ｙ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６  Ａｐｒ；３（４）：２６３〜５）ベクターおよびｐＤＵＬＥベクター（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５  Ｍａｙ；２（５）：３７７〜８４．Ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ  ＩＳ、Ｔｏｒｏｎｅｙ  Ｒ、Ｈａｚｅｎ  ＪＬ、Ｍｅｈｌ  ＲＡ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ）を含む既存のベクターから産生することができる。使用するＥ．ｃｏｌｉ株は、（一般にｔｒａオペロンを介して）Ｆ’線毛を発現するものである。アンバーサプレッションを用いる場合は、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、それ自体の活性アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含まないものである。アミノ酸は、好ましくは最終濃度が１ｍＭ以上で増殖培地に添加することになる。アミノ酸組み込みの効率は、直交リボソーム結合部位を有する発現構築物を用いて、リボ−Ｘを有する遺伝子を翻訳させることによって高めることができる（Ｅｖｏｌｖｅｄ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｗａｎｇ  Ｋ、Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｈ、Ｐｅａｋ−Ｃｈｅｗ  ＳＹ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｊｕｌ；２５（７）：７７０〜７）。これによって、リガンドに対する多数の結合部位をもたらす非天然アミノ酸の効率的な多重部位組み込みが可能になり得る。
【０１０８】
上記のような方法は、抗体および非ペプチドリガンドを含めた他のリガンドにＲＩＮＧドメインを結合させるのに有用である。そのような方法はまた、小分子インターフェロン誘導因子およびＴＲＩＭ２１発現の他の誘導因子を結合させるのにも有用である。
【０１０９】
薬物および他の化合物に抗体を結合させる手法はまた、Ｃａｒｔｅｒ＆Ｓｅｎｔｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ  ２００８−第１４巻−第３号−１５４〜１６９ページ；ＤｕｃｒｙおよびＳｔｕｍｐ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０１０、２１（１）、５〜１３ページに記載されている。
【０１１０】
あるいは、二重特異性抗体を用いてもよい。例えば、二重特異性ドメイン抗体は当技術分野で既知であり、所望の抗原およびＲＩＮＧドメインまたはＲＩＮＧドメイン含有ポリペプチドの両方をターゲティングするのに有用である。
【０１１１】
血清中の抗体コンジュゲートの半減期はいくつかの要因に依存するが、小さな抗体フラグメントほど血液循環からすばやく除去される傾向にある。したがって、より小さな構築物、例えばドメイン抗体およびＲＩＮＧドメインを含む構築物は、好都合には、血清半減期を増大させるポリペプチドに連結される。例えば、それらはＨＳＡに連結することができる。好ましくは、ＨＳＡへの結合は不安定なものであり、例えば、その結合は、細胞に結合した時に構築物がＨＳＡから遊離され、ＨＳＡなしで内在化されるような限られた半減期を有する。有用な手段は、リガンドもまたＨＳＡに結合し、血液循環中でそれを維持するように、多特異性リガンド構築物を使用することである。ＨＳＡに対するリガンドの親和性は、リガンドが細胞によって適切に内在化され得るように適合させることができる。 
【０１１２】
５．ＴＲＩＭ２１と抗体の同時投与
治療用抗体は、当技術分野で周知である。ＴＲＩＭ２１は、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のＦｃ部分に結合し、対象へのそれらの同時投与は、細胞が病原体を破壊するのを促進するのに有効である。
【０１１３】
表１は、病原性感染の治療に使用可能な既存の抗体薬物を示す。ＴＲＩＭ２１の同時投与は、そのような薬物を伴った治療に適応される。
【０１１４】
抗体薬物と同時投与されるポリペプチドは、好ましくはＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインおよびＥ３リガーゼとして働くことができるＲＩＮＧドメインを含む。しかし、抗体の標的特異性に無関係な様式で免疫グロブリンに結合するプロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬまたは抗Ｆｃペプチドなどの、他の免疫グロブリン特異的リガンドを用いてもよい。
【０１１５】
好ましくは、ポリペプチドはまた、コイルドコイルドメインおよび／またはＢボックスドメインも含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは実質的に完全なＴＲＩＭ２１ポリペプチドである。
【０１１６】
ＴＲＩＭ２１は、好ましくは配列番号１に記載のヒトＴＲＩＭ２１である。Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３３（３）、２７３〜２８４（２０１０）を参照されたい。
【０１１７】
本発明は、少なくとも抗体結合およびＥ３リガーゼ機能を保存する、ＴＩＭ２１の改変誘導体を包含する。例えば本発明は、必要とされる機能が十分に維持される限り、ＴＲＩＭ２１のアミノ酸配列内に置換、付加または欠損を包含する。ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性（相同性）を有し得る。
【０１１８】
本発明のポリペプチドの変異は、その特定のドメインを標的にすることができる。配列同一性の高レベルな保存は、例えばＰＲＹＳＰＲＹドメインにおいて要求される。このドメインは、ポリペプチドによる抗体結合に関与する。低レベルな同一性は、例えばＲＩＮＧドメインにおいて一般に要求される。ＲＩＮＧドメインは、ゲノム中に広く存在し、保存されたＥ３リガーゼ機能を有する。好都合には、コンセンサス配列Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（９〜３９）−Ｃ−Ｘ（１〜３）−Ｈ−Ｘ（２〜３）−（Ｎ／Ｃ／Ｈ）−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（４〜４８）Ｃ−Ｘ２−Ｃを保持する。
【表２Ａ】
2013535462.tif 000003
【表２Ｂ】
2013535462.tif 000004
【表２Ｃ】
2013535462.tif 000005
【表２Ｄ】
2013535462.tif 000006
【表２Ｅ】
2013535462.tif 000007
【表２Ｆ】
2013535462.tif 000008
【表２Ｇ】
2013535462.tif 000009
【表２Ｈ】
2013535462.tif 000010
【表２Ｉ】
2013535462.tif 000011
【表２Ｊ】
2013535462.tif 000012
【０１１９】
６．化合物の投与
一般に、本発明による化合物は、薬理学的に適切な担体と共に、精製された形で利用されることになる。典型的には、こうした担体には、水性もしくはアルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれ、いずれも生理的食塩水および／または緩衝化媒体を含む。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液中で維持するために必要な場合は、適切な生理学的に許容可能な補助剤をカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸などの増粘剤から選択することができる。
【０１２０】
静脈内用ビヒクルには、リンガーデキストロースに基づくものなど、流体および栄養補充物ならびに電解質補充物が含まれる。防腐剤および他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなども存在してよい（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版）。
【０１２１】
本発明の化合物は、分離投与組成物として、または他の薬剤と併用して使用することができる。これらには、さらなる抗体、抗体フラグメントおよびコンジュゲートならびにシルコスポリン（ｃｙｌｃｏｓｐｏｒｉｎｅ）、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチナムおよび免疫毒素などの様々な免疫療法薬を含めることができる。医薬組成物には、本発明の選択された抗体、受容体またはそれらの結合タンパク質と併用する、様々な細胞障害性薬物または他の薬剤の「カクテル」、または異なる標的リガンドを用いて選抜されたポリペプチドなど、本発明による選択された異なる特異性を有するポリペプチドの組み合わせを含めることができ、これらを投与前にプールするか否かは問わない。
【０１２２】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に通常知られているいかなるものであってもよい。免疫療法（それに限定はされない）を含めた療法のために、本発明の選択された抗体、受容体またはそれらの結合タンパク質を、標準的な手法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路経由を含めた任意の適切な方法でよく、または適宜、カテーテルを用いる直接注入によってもよい。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌ならびに臨床医が考慮すべき他のパラメーターによって決まる。
【０１２３】
本発明の化合物は凍結乾燥して保存することができ、使用前に適切な担体中で再構成することができる。この手法は有効であることが示されており、技術分野で既知の凍結乾燥および再構成法を用いることができる。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の活性の損失をもたらす恐れがあり、使用レベルを上方に調整して補正する必要があり得ることを当業者なら理解するであろう。
【０１２４】
予防および／または治療処置のために、本発明のペプチドリガンドを含む組成物またはそのカクテルを投与することができる。特定の治療適用において、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅またはいくつかの測定可能な他のパラメーターを達成するのに十分な量を「治療有効量」と定義する。こうした投与量を達成するのに必要な量は、疾患の重症度および患者自身の免疫システムの全体的な状態によって決まることになるが、一般に、体重キログラムあたり、選択されたペプチドリガンドは０．００５から５．０ｍｇの範囲であり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／投薬の用量がより一般的に用いられる。予防的適用のために、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含む組成物はまた、同様のまたはやや少ない投薬量で投与することができる。
【０１２５】
本発明による化合物を含む組成物を予防的および治療的環境において利用して、哺乳動物における選択した標的細胞集団の変質、不活化、死滅または除去に役立てることができる。さらに、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはインビトロで選択的に用いて、不均一な細胞集合体から標的細胞集団を死滅、枯渇または別な形で有効に除去することができる。哺乳動物の血液を選択されたペプチドリガンドと体外で混合し、これによって、血液から望ましくない細胞を死滅または別の形で除去し、標準的な手法に従って哺乳動物に戻すことができる。
【０１２６】
本発明を以下の例でさらに説明する。
【０１２７】
［材料＆方法］
＜細胞株＞
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＴＥ６７１、ＱＴ３５およびＨＴ１０８０を、１０％ウシ胎仔血清ならびに１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、湿潤なインキュベーターにおいて３７℃で維持した。２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を無血清のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、旋回振盪機において５０ｒｐｍ、３７℃で生育させた。必要に応じて、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）で細胞を選抜した。
【０１２８】
＜ウイルス産生＞
コクサッキーウイルスを以前の記述１８に改変を加えて産生した。ウイルスポリペプチドのＮ末端にｅＧＦＰ配列および切断配列を有するｐＨ３株をコードするプラスミドｅＧＦＰ−ＣＶＢ３を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を使用し、製造業者の指示に従って、１０ｃｍシャーレのＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間後に細胞をシャーレから機械的に取り出し、３回凍結融解してビリオンを放出させ、上清を１，０００ｇで清澄化してから、０．４５μｍで濾過した。ウイルスのストックをＨｅＬａ細胞中で４８時間増大させ、上記のように凍結融解および濾過を行うことによりウイルス粒子を回収した。必要になるまでアリコートを−８０℃で凍結した。力価は、典型的には１０６から１０７ＩＵ／ｍｌの範囲であった。アデノウイルスＡｄ５−ＧＦＰ１９をトランス相補性細胞系２９３Ｆ中で７２時間生育させてから、３回凍結融解を行ってウイルス粒子を放出させ、０．４５μｍで濾過した。２回の超遠心分離によって、塩化セシウムのグラジエント上にバンド化するウイルスストックを精製し、ＰＢＳ／１０％グリセロール中で透析して、必要になるまで−８０℃で凍結した。精製したウイルスの力価は、典型的には、１０８から１０９ＩＵ／ｍｌであった。
【０１２９】
＜安定的なノックダウンおよび過剰発現細胞系の作出＞
ヒトＴＲＩＭ２１ＤＮＡを、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限酵素フラグメントとしてｐＤＯＮＡＩ（Ｔａｋａｒａ、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、Ｆｒａｎｃｅ）にクローニングして、ｐＤＯＮ−Ｔ２１を作出した。ヒトＴＲＩＭ２１配列ＧＣＡＧＣＡＣＧＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡに対する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡをコードするＤＮＡをｐＳＩＲＥＮ  Ｒｅｔｒｏ−Ｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングして、ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＴ２１を作製した。ルシフェラーゼを標的とするコントロールｓｈＲＮＡは、ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＬｕｃにコードされていた。レトロウイルスの形質導入粒子は、各５μｇのＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドｐＣＭＶｉおよびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＭＤＧ２０と一緒に、５μｇのｐＤＯＮ−Ｔ２１、ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＴ２１、空のｐＤＯＮＡＩまたはｐＳＩＲＥＮ−Ｌｕｃを４×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして作製した。７２時間後に上清を回収し、０．４５μｍで濾過し、これを用いてＨｅＬａ細胞を形質導入した。安定的な形質導入細胞をＧ４１８（ｐＤＯＮ−Ｔ２１、ｐＤＯＮＡＩ）またはピューロマイシン（ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＴ２１、ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＬｕｃ）で選抜した。ＴＲＩＭ２１タンパク質のレベルをウエスタンブロット法（ｓｃ−２５３５１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で測定した。
【０１３０】
＜一過的なｓｉＲＮＡノックダウン＞
６ウェルプレートのウェルあたり１×１０５細胞で細胞を蒔き、一晩接着させた。各１５０ｐｍｏｌの低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドＴ２１ｓｉＲＮＡ１（ＵＣＡＵＵＧＵＣＡＡＧＣＧＵＧＣＵＧＣ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）およびＴ２１ｓｉＲＮＡ２（ＵＧＧＣＡＵＧＧＡＧＧＣＡＣＣＵＧＡＡＧＧＵＧＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または３００ｐｍｏｌのコントロールオリゴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞にトランスフェクトした。３時間後に細胞を洗浄し、７２時間インキュベートしてから感染させた。必要な場合は、１０００ＵのＩＦＮ−α（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を、ノックダウンしてから４８時間後に添加した。
【０１３１】
＜ウイルス中和アッセイ＞
Ａｄ５−ＧＦＰおよびｅＧＦＰ−ＣＶＢ３の両感染に関しては、標的ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレート中の２ｍｌの完全ＤＭＥＭ中にウェルあたり１×１０５細胞で感染前日に播種した。必要な場合は、１０００ＵのＩＦＮ−αと共に細胞をインキュベートした。５×１０４感染単位（ＩＵ）のＡｄＶ５−ＧＦＰを、１０μｌ容積中で抗体と共に３０分間室温でインキュベートしてから細胞に添加した。細胞を４８時間インキュベートしてから、洗浄し、トリプシン処理し、４％パラホルムアルデヒド中に固定した。コクサッキーウイルスに関しては、２×１０４ＩＵを２００μｌのインキュベーション中で抗体と共に３０分間室温でインキュベートした。感染させてから８時間後に感染細胞を固定して、感染が広がるのを防止した。両ウイルスに関して、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＧＦＰ陽性細胞を計数した。
【０１３２】
ＶＮＡにおいて使用される抗体は、ヒト血清ＩｇＧとＩｇＭとをプールしたもの（０９０７０７および０９０７１３、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ、ＵＳＡ）、精製された９Ｃ１２抗アデノウイルス５ヘキソンマウスＩｇＧ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、ＩＡ、ＵＳＡから入手したハイブリドーマ）、ヤギ抗アデノウイルスポリクローナル抗体（０１５１−９００４、Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫおよびＡＢ１０５６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、ＵＫ）である。
【０１３３】
＜免疫蛍光法＞
２．５×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレート中のカバーガラス上に播種し、一晩接着させた。細胞を感染前にＤＭＥＭで２回洗浄した。５×１０４ＩＵのＡｄＶ５−ＧＦＰをポリクローナルまたはモノクローナルの抗ヘキソンアデノウイルス抗体と共に（例えば、２３０μｌのＤＭＥＭを添加する前に、５００ｎｇのマウスモノクローナルＩｇＧと２０μｌ容積中で室温で３０分間）インキュベートした。細胞を２５０μｌのこの混合物で３７℃３０分間感染させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳで透過処理し、ＰＢＳ−ＢＳＡ（５％ウシ血清アルブミン、０．１％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ）で１時間ブロッキングした。ＴＲＩＭ２１に対する免疫染色をウサギ５０ｋＤａ  Ｒｏ／ＳＳＡ一次抗体２０９６０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、ユビキチンに対する免疫染色をヤギ一次６０８５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、ＰＢＳ−ＢＳＡで１：２００に希釈して実施した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２００希釈で用いて一次抗体を検出した。ストレプトアビジンで被覆された０．２５μｍのラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ウサギ抗ストレプトアビジンポリクローナル血清Ｓ６３９０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション３時間後に細胞をＰＢＳ洗浄し、上記のように固定した。ＴＲＩＭ２１に対する免疫染色を組換えＴＲＩＭ２１ＲＢＣＣに対してマウスで産生した免疫血清を用いて、結合ユビキチンに対する免疫染色を上記のように、両方ともＰＢＳ−ＢＳＡで１：２００に希釈して実施した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５００希釈で用いて一次抗体を検出した。共焦点画像を、ＬＳＭ７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＺｅｉｓｓ６３Ｘレンズを用いて撮影した。
【０１３４】
＜Ｆａｔｅ−ｏｆ−ｃａｐｓｉｄアッセイ＞
ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレート中の２ｍｌのＤＭＥＭ中にウェルあたり２×１０５細胞で蒔いて、一晩放置して接着させた。一部のウェルを８μＭのＭＧ１３２（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）で４時間処理した。未処理の細胞は、処理の間、等量のＤＭＳＯにさらした。４×１０７ＩＵのＡｄ５−ＧＦＰを６μｇの９Ｃ１２モノクローナル抗体と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次に１ｍｌ完全培地中の細胞上に添加した。感染物を３７℃で１時間インキュベートしてから、感染混合物を除去し、ＤＭＥＭに交換した。細胞を最初の感染後の指示された時点で回収して、還元剤を含む１００μｌの１×ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で煮沸した。ウイルスをヤギ抗ヘキソンＡｄ５（１：１０００、ＡＢ１０５６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２０５６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で検出した。抗体をロバ抗マウスＩｇＧ（１：５００、ＡＰ１９２Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびプロテインＡ−ＨＲＰ（１：２０００、６１０４３８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。ＴＲＩＭ２１ＲＢＣＣ免疫血清（１：２０００）およびマウス抗体に対するゲル上での交差反応を避けるためのプロテインＡ  ＨＲＰを用いて、ＴＲＩＭ２１を検出した。
【０１３５】
＜免疫ブロット＞
６ウェルプレートの単一ウェルから細胞を掻き取り、再懸濁し、還元剤を含む１００μｌの１×ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で９８℃で５分間加熱した。等容積を４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲルにロードして、１×ＭＯＰＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で電気泳動した。タンパク質をＰｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ）に転写し、指示された抗体で免疫ブロットした。全てにおいて、ブロットは、５％ミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで抗体とインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で可視化した。再検出のために、ウェスタンを１×Ｒｅ−Ｂｌｏｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で製造業者の指示通りにストリッピングした。ローディングコントロールブロットは、ウサギポリクローナルβ−アクチン（１：１０００、＃４９６７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を用いて行った。
【０１３６】
＜蛍光滴定＞
完全長およびΔＲＩＮＧボックス組換えＴＲＩＭ２１をＭＢＰ融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉで発現させ、アミロース樹脂およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ｔｅｖプロテアーゼ切断を介してＭＢＰタグを取り除き、切断されたＴＲＩＭ２１を２０ｍＭのトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中で透析した。定常状態の蛍光滴定実験は、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を使用し、励起が２９６ｎｍおよび放出が３３５ｎｍ、スリット幅が１５ｎｍおよびＰＭＴ電圧が８５０で、２０℃で行った。ＩｇＧの滴定における内在性のＴＲＩＭ２１トリプトファン蛍光のクエンチングを５秒の平均化時間で測定した。各滴定は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、二次式Ｆ＝ＦＴＲ＋ｆ’（（−（Ｉ０−ＴＲ０＋Ｋｄ）±（（（Ｉ０−ＴＲ０＋Ｋｄ）２）＋（４ＫｄＴＲ０））１/２））／２（式中、Ｆは観察された蛍光、ＦＴＲはモルＴＲＩＭ２１蛍光、ｆ’は蛍光のモル変化、（ＴＲ０）は総ＴＲＩＭ２１濃度、（Ｉ０）は総抗体濃度およびＫｄは解離定数である）に適合させた。
【０１３７】
＜蛍光異方性＞
ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインを以前の記述４、５のように発現および精製した。タンパク質をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８  ５−ＳＤＰエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、２００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭトリスｐＨ８で透析した。異方性実験は、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を用いて、励起が４８８ｎｍおよび放出が５３０ｎｍ、スリット幅が１０ｎｍおよびＰＭＴ電圧が６００で行った。ＩｇＭ（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ、ＵＳＡ）を５０ｎＭのＰＲＹＳＰＲＹ中に滴定し、偏光蛍光を５秒かけて平均した。解離定数（Ｋｄ）は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、異方性の変化を上記の二次式に適合させて決定した。
【０１３８】
＜ＳＥＣ  ＭＡＬＳ＞
ＳＥＣ  ＭＡＬＳは、Ｗｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸオンライン屈折率検出器に連結された、Ｗｙａｔｔ  Ｈｅｌｅｏｓ  ＩＩ１８角度光散乱器を用いて実施した。試料を上述のように調製し、０．５ｍｌ／ｍｉｎで流すＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００分析用ゲル濾過カラムで分離してから、標準的なＳＥＣ  ＭＡＬＳ型の光散乱および屈折率検出器を通過させた。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに対する０．１８６ΔＲＩに基づく屈折率から決定し、観察された散乱強度と組み合わせて、Ｗｙａｔｔ’ｓ  ＡＳＴＲＡ分析ソフトウェアを用いて絶対分子量を計算した。ＴＲＩＭ２１の主要な種類は、ピークの指定された領域にわたって平均化された、１０７ｋＤａの質量を有する。単量体ＴＲＩＭ２１の推定質量は５４ｋＤａであり、溶液中でＴＲＩＭ２１を二量体にするが、以前に報告されているように、三量体にはしない。ＩｇＧのＳＥＣ  ＭＡＬＳによって、わずかな（１０％未満）レベルの二量体質量３２５ｋＤａを伴って、期待される質量である１５４ｋＤａが示され、これはＩｇＧに典型的なものである。ＴＲＩＭ２１−ＩｇＧ複合体は多数のピークとして分離され、これは、先のような質量および溶出容積ならびに質量約２８０ｋＤａを持つピークを有する過剰なＩｇＧに対応する。２８０ｋＤａのピークは、ＴＲＩＭ２１：ＩｇＧの１：１複合体と矛盾がなく、ここでは各タンパク質がホモ二量体である。
【０１３９】
＜外来性のＴＲＩＭ２１を使用する補体中和アッセイ＞
ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレート中の２ｍｌの完全ＤＭＥＭ中に、１ウェルあたり１×１０５細胞で感染前日に播種した。５×１０４ＩＵのＡｄＶ５−ＧＦＰを４μｇのヤギ抗アデノウイルスポリクローナル抗体（ＡＢ１０５６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、ＵＫ）と共に１５分間インキュベートしてから、２００μｇの適切な組換えＴＲＩＭ２１タンパク質を添加して、１００μｌの総容積で、さらに１５分室温でインキュベーションした。細胞上の培地をこの混合物と交換し、完全なＤＭＥＭで１ｍｌにした。細胞を湿潤なインキュベーター中で３７℃で４８時間インキュベートし、次にウイルス中和アッセイと同様に処理した（上記を参照されたい）。
【０１４０】
＜インビトロユビキチン化アッセイ＞
インビトロアッセイを大部分は以前の記述２１のように行った。反応は、示されている通り、２ｍＭのＡＴＰ、３００ｎｇのＨｉｓ−Ｕｂａ１、３００ｎｇのＨｉｓ−ＵｂｃＨ５ｃ、１μｇのユビキチン（Ｓｉｇｍａ）および５０ｎｇのＭＢＰ−ＴＲＩＭ２１またはＭＢＰ−ＴＲＩＭ２１ΔＲｉｎｇボックスを添加した１×ユビキチン化バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ）中で行った。ヒトＵｂａ１およびＵｂｃＨ５ｃを細菌で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、以前の記述２１のように精製した。抗体アデノウイルス混合物を１５０ｎｇのヤギポリクローナル抗ヘキソン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）につき５×１０４ＩＵのＡｄＶ５−ＧＦＰで３０分間インキュベーションして作製し、ここでは、１μｌの混合液が３．６×１０４ＩＵおよび１０６ｎｇの抗体を含む。示されている通り、量を増大させて反応混合液に添加した。Ａｄ５または抗ヘキソン抗体のどちらか一方だけを有するコントロールは、それぞれ、１．２５×１０５ＩＵおよび１５０ｎｇの抗体を含んでいた。反応混合液を３７℃で１時間インキュベートし、次にＬＤＳサンプルバッファーを添加し、９８℃まで５分間加熱して終了させた。示されている通り、試料をゲルで流し、ＴＲＩＭ２１（１：５００、ｓｃ−２５３５１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ａｄ５ヘキソン（ロバ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ  １：５０００  ｓｃ−２０５６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはユビキチン（１：１０００、ＦＫ−２、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対してウエスタンブロットを行った。
【実施例１】
【０１４１】
＜抗体を内在化する＞
抗体はウイルス感染中にサイトゾルに通常入らないと考えられている。これを試験するために、本発明者らは、アデノウイルス（呼吸器疾患を起こすモデルヒトウイルス）を抗体とプレインキュベーションし、培養ＨｅＬａ細胞にビリオンを添加した。アデノウイルスは非エンベロープウイルスであり、細胞感染前にそのカプシドが血清抗体に自然に露出されているという理由で、アデノウイルスを選択した。感染３０分後に、細胞を固定し、蛍光性抗ＩｇＧ抗体を添加して、抗体で被覆されたビリオンを検出した。  １Ａから分かるように、抗体で被覆されたビリオンは首尾よく細胞に感染した。同様の結果が、ポリクローナル抗ヘキソン抗体およびヒト血清ＩｇＧを用いて得られた。アデノウイルスは、ＣＡＲ受容体に結合しエンドサイトーシスされることによって細胞に侵入する。本発明者らは、抗体添加はこのプロセスを妨げず、抗体は、侵入後ウイルスに結合したままであることを見出した。
【実施例２】
【０１４２】
＜ＴＲＩＭ２１は細胞内ウイルス中和を仲介する＞
抗体で被覆されたウイルスがサイトゾルのＴＲＩＭ２１に到達できるかどうかを検討するために、本発明者らはＴＲＩＭ２１に対して共染色した。図１Ａに示すように、ＴＲＩＭ２１は、抗体で被覆されたウイルス粒子に効率的に動員された。
【０１４３】
次に、本発明者らは、アデノウイルス感染レベルを定量化することにより、ＴＲＩＭ２１動員のビリオンに対する効果を試験した。本発明者らは、感染効率をフローサイトメトリー分析によって決定できるようにするために、ＧＦＰ遺伝子を保有するウイルスを使用した。コントロールｓｉＲＮＡ、ＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡ、インターフェロンα（ＩＦＮα）またはＩＦＮαおよびＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡで前処理したＨｅＬａ細胞で、標準的なウイルス中和アッセイを行った（図１Ｂ）。これらの異なる条件間の毒性および変化しやすい細胞死を考慮するために、本発明者らは抗体添加に起因する感染の低下を測定した。抗体が存在しない場合は、アデノウイルスは約５０％の細胞に感染した。感染細胞の割合は、４００ｎｇ／μｌ抗体では、感染は５０倍超低下するように、抗体濃度が高まるに従って迅速に低下した（図１Ｂ）。しかし、ＴＲＩＭ２１が枯渇した細胞では、４００ｎｇ／μｌ抗体の添加は、感染にわずかな影響しか与えなかった（約３倍）。
【０１４４】
免疫反応中に、ＩＦＮαは抗ウイルス遺伝子の転写を活性化する。本発明者らは、ＴＲＩＭ２１はＩＦＮα制御性であり、あまり高くないレベルの内在性ＴＲＩＭ２１タンパク質がＩＦＮαによって大きく増加することを見出した（図１Ｃ）。この結果に合致して、４００ｎｇ／μｌ抗体において感染が２３０倍超減少したように、ＩＦＮαで細胞をプレインキュベーションすることによって抗体中和効果が増大する。ＩＦＮαは多面的効果を有するが、抗体を加えない場合、本発明者らは、アデノウイルス感染に対してほとんど影響がないことを観察した。ＩＦＮα／抗体中和相乗作用がＴＲＩＭ２１依存的であることを示すために、本発明者らはＩＦＮαによって上方制御されているＴＲＩＭ２１レベルを特異的に枯渇させ、これによって、９５％超感染力が回復した（図１Ｂ）。全ての実験において、ウイルス感染の抗体中和はＴＲＩＭ２１レベルと直接的に相関した（図１Ｃ）。例えば、最も多いＴＲＩＭ２１を発現する細胞は、最も少ない発現のものよりもアデノウイルス感染に対しておよそ２桁違いに抵抗性である。
【実施例３】
【０１４５】
＜条件のバリエーション＞
ＴＲＩＭ２１／抗体の細胞内中和がアデノウイルス特異的ではないことを実証するために、本発明者らは、コクサッキーウイルスＢ３感染へのその効果を試験した。コクサッキーウイルスＢ３は、ポリオウイルスと同じ属のピコルナウイルスであり、無菌性髄膜炎の主因である。ＧＦＰレポーター遺伝子を有する自己複製型株を用いて、ＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡおよびＩＦＮαの組み合わせで前処理したＨｅＬａ細胞を上述の通りに感染させた。感染時間を１６時間未満に制限して、感染が広がるのを防止した。ＴＲＩＭ２１の内在性レベルは、有効な阻止を仲介するには不十分であった（ＴＲＩＭ２１の枯渇の際は感染が２倍増加した）が、ＩＦＮαで処理すると、１５μｇ／ｍｌ抗体の存在下でほぼ完全に感染を阻止した（図１Ｄ）。ＩＦＮα処理細胞におけるＴＲＩＭ２１の枯渇によって、未処理の細胞レベルまで感染レベルが回復し、このことは、この処理がＴＲＩＭ２１依存的効果であることを示す。
【０１４６】
本発明者らは異なるｓｉＲＮＡ配列、細胞型および抗体型の効果を試験することによって、この表現型の頑健性を確認した。図２Ａで分かるように、異なる標的配列を有する異なるＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡは、ＴＲＩＭ２１レベルをノックダウンすることによってアデノウイルス感染の抗体中和を反転させた。次に、本発明者らは、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０およびＴＥ６７１を含めた細胞系の範囲を試験した。いずれの場合もｓｉＲＮＡ２の配列に基づいたｓｈＲＮＡベクターを用いてＴＲＩＭ２１の安定的なノックダウン系統を確立した。全ての細胞において、ＴＲＩＭ２１はアデノウイルスの抗体中和を仲介した（図２Ｂ）。最後に、本発明者らは、二つの異なる抗Ａｄ５ポリクローナル抗体（Ａｂｄ  ＳｅｒｏｔｅｃおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗Ａｄ５ヘキソンモノクローナル（９Ｃ１２）のアデノウイルス中和への効果を試験した。どの場合においても、アデノウイルスの中和は、ＴＲＩＭ２１の上方制御によって増強されＴＲＩＭ２１ＫＤによって反転された（図２Ｃ）。
【０１４７】
受容体結合を阻止し、細胞侵入を阻止することによって、抗体はウイルスを中和すると一般に考えられている。しかし、本発明者が観察した抗体アデノウイルスの中和の９０％超は、ＴＲＩＭ２１によって仲介される（例えば、２００ｎｇ／μｌ抗体では、ＨｅＬａコントロールにおいて０．２７％の感染細胞が存在し、これに対してＴＲＩＭ２１が枯渇した細胞では１０％であった）。これら二つの機構のどちらがポリクローナル応答で優勢であるか試験するために、本発明者らは、プールされたヒト血清ＩｇＧでアデノウイルスの中和を調べた。本発明者らは中和の性向（ａｆｆｅｃｔ）の大部分（試験した濃度範囲内で）がＴＲＩＭ２１によって仲介されることを見出した（図２Ｄ）。ＴＲＩＭ２１は、Ｆｃドメインを介してＩｇＧに結合する。したがって、Ｆｃを欠く抗体フラグメントは、もはやウイルスを有効に中和することができないであろう。一次ウイルス中和源はＴＲＩＭ２１であって受容体阻止ではないかを確認するために、本発明者らは血清ＩｇＧをペプシンで処理した。ＩｇＧのペプシン切断によって、Ｆｃが取り除かれＦａｂ２フラグメントが作出され、これはまだ二価であり抗原を架橋結合させることができる。さらに、Ｆａｂ２フラグメントは、ＩｇＧと同じ親和性で抗原を結合させる。本発明者らは、Ｆａｂ２フラグメントは、もはやアデノウイルス感染を有効に中和することができないことを見出した（図２Ｄ）。さらに、Ｆａｂ２を使用した場合は、ＩＦＮα処理またはＴＲＩＭ２１ＫＤは、もはやアデノウイルス感染に影響を及ぼさなかった。
【実施例４】
【０１４８】
＜ＩｇＭおよびＩｇＡとの相互作用＞
前述の例は、抗体が細胞内ウイルス中和を仲介するためには、抗体がＦｃフラグメントを含む必要があり、ＴＲＩＭ２１が存在する必要があることを実証した。
【０１４９】
先天性免疫が重要である感染の初期段階中は、ＩｇＧ抗体よりもむしろＩｇＭが抗体レパートリーで優勢である。本発明者らは、ＴＲＩＭ２１がＩｇＭと相互作用するかどうか、もしそうであればＩｇＭのウイルス中和におけるＴＲＩＭ２１の重要性を試験した。ＴＲＩＭ２１：ＩｇＭ結合を調べるために、本発明者らは、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹドメインをＡｌｅｘａ４８８フルオロフォアで標識し、ＩｇＭの滴定でその蛍光異方性を測定した（図２Ｅ）。得られた滴定曲線を適合させ（材料＆方法）、１６．８μＭ±１．５μＭの親和性（ＫＤ）を得た。ＩｇＭに対するＴＲＩＭ２１のインビボでの親和性は著しく高い可能性があるが、これは完全長ＴＲＩＭ２１が多量体のためである。ナノモルの親和性でＩｇＭに結合する補体Ｃ１ｑは、単量体として測定した場合は、親和性は検知不可能である６。
【０１５０】
次に本発明者らは、アデノウイルス感染への血清ＩｇＭの効果を試験した。本発明者らは、プールされたヒト血清ＩｇＭおよびＴＲＩＭ２１が相乗的に作用してアデノウイルス感染を中和することを見出した（図２Ｆ）。さらにＩｇＧと同様に、ＩｇＭによるウイルス中和はＴＲＩＭ２１を必要とする。このことは、ＴＲＩＭ２１は先天性免疫と一緒に働き、液性免疫反応の初期段階において防御性であることを示唆する。
【０１５１】
ＩｇＡについては同じ効果が見られた（図２Ｇ）。ＩｇＡは粘膜における主要なアイソタイプであるため重要であり、ＩｇＡはウイルスとの接触の第一ポイントであることが多い。血清分泌型ＩｇＡを使用する感染実験によって、ＴＲＩＭ２１はＩｇＡを用いてウイルスを中和することができることが示される。抗ＴＲＩＭ２１ｓｉＲＮＡはウイルス中和を妨げるが、一方ＩＦＮ−αはその効果を高める。
【実施例５】
【０１５２】
＜ＴＲＩＭ２１免疫機構＞
先の例は、ＴＲＩＭ２１によって仲介される細胞内免疫反応およびウイルス感染を阻止することができる抗体が存在することを実証する。次に、本発明者らは、この細胞内中和を起こす機構を試験した。本発明者らは三種の方法でこの機構を調べた。第一に、本発明者らはＴＲＩＭ２１が抗体を標的にする方法および相互作用の熱力学を決定した。第二に、本発明者らは、ターゲティングの後にどんな事象が中和に必要とされるかを試験した。第三に、本発明者らはウイルスが中和される方法を求めた。
【０１５３】
ＴＲＩＭ２１は、ＲＩＮＧ、Ｂボックス、コイルドコイルおよびＰＲＹＳＰＲＹドメインからなるマルチドメインタンパク質である。本発明者らは、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および蛍光滴定分光法を用いて、ＩｇＧ結合におけるこれらのドメインの役割を試験した。ＭＡＬＳデータの分析により、以前の報告７のように、組換え完全長ＴＲＩＭ２１は、安定的な二量体を形成し、三量体は形成しないことが明らかになる（図３Ａ）。さらに、ＩｇＧと混合した場合は、ＴＲＩＭ２１は、一つの抗体および一つのＴＲＩＭ２１からなる化学量論的複合体を形成する（図３Ａ）。ＲＩＮＧドメイン単独の欠損は組換えタンパク質を不安定化させたが、ＲＩＮＧおよびＢボックス両方の欠損はＴＲＩＭ２１安定性またはその二量体化能に影響を与えなかった（データ非表示）。蛍光滴定分光法は、完全長ＴＲＩＭ２１およびΔＲＩＮＧボックスは１ｎＭ未満という同様の解離定数（ＫＤ）でＩｇＧに結合することを明らかにした（図３Ｂ＆Ｃ）。単量体のＰＲＹＳＰＲＹドメインは約１５０ｎＭの親和性で結合する４、５ため、これはコイルドコイルドメインがＴＲＩＭ２１の二量体化および両方のＩｇＧ重鎖の同時会合に必要であることを示す。ＩｇＧに対するＴＲＩＭ２１のｎＭ以下の親和性によって、ＴＲＩＭ２１は人体で親和性が最も高い抗体受容体となる。ＴＲＩＭ２１がウイルスを有効に標的にする方法は、そのような高親和性の相互作用の進化によって説明がつく。
【０１５４】
次に、本発明者らは、ＴＲＩＭ２１が動員された後にウイルスに起こること、およびＲＩＮＧおよびＢボックスドメインの役割を調べた。ＲＩＮＧドメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を提示することが多いため、本発明者らは、ＴＲＩＭ２１が、結合したウイルスをユビキチン化を介する分解の標的にする可能性を仮定した。細胞は、ユビキチン化された物質の二つの分解経路、すなわちプロテアソームおよびオートファジーを有する。ウイルスのＴＲＩＭ２１中和におけるこれらの経路の役割を探るために、本発明者らは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）および３−メチルアデニン（３−ＭＡ、オートファジー阻害剤）の存在下でウイルス感染実験を実施した。オートファジー阻害剤は、感染力に影響を及ぼさなかったが、ＭＧ１３２は、ＴＲＩＭ２１の感染力中和を有意に反転した（図３Ｄ）。滴定実験は、ＭＧ１３２の増加レベルと中和の低減との間に直接的な相関関係を示した（図３Ｅ）。ＭＧ１３２が中和を反転させる能力は、抗体およびＴＲＩＭ２１の存在に依存した。さらに、ＭＧ１３２の添加は、ＴＲＩＭ２１が枯渇した細胞の感染を回復できず、このことは、ＴＲＩＭ２１およびプロテアソームの機能が中和経路の必須な要素であることを示す（図３Ｆ）。
【０１５５】
ウイルスをプロテアソームの標的にするのにユビキチン化が必須であるか決定するために、本発明者らは、完全長ＴＲＩＭ２１およびΔＲＩＮＧボックス組換えタンパク質の感染中和能力を試験した。本発明者らは、抗体で被覆されたビリオンと共にタンパク質をインキュベートし、ＴＲＩＭ２１が枯渇した細胞にウイルスを感染させた。図４Ａで分かるように、ＲＩＮＧおよびＢボックスドメインの欠損は、ＴＲＩＭ２１のウイルス中和を妨げた。本発明者らはＴＲＩＭ２１過剰発現細胞でこれらの実験を繰り返すことを試みたが、これは機能欠損をもたらした。機能欠損は、部分的にインターフェロンで反転することができ、このことは、過剰発現は、不活性タンパク質を作り出すというよりもむしろ必須補助因子を漸増する（ｔｉｔｒａｔｅｓ）ことを示す（データ非表示）。本発明者らが組換えタンパク質を用いて観察した中和がユビキチンリガーゼ活性と相関するか確認するために、本発明者らは、完全長およびΔＲＩＮＧボックスタンパク質の自己ユビキチン化能を比較した。ＲＩＮＧおよびＢボックスドメインの欠損はＩｇＧ結合に影響しないが、ユビキチン化を無効にする（図４Ｂ）。したがって、ＴＲＩＭ２１のユビキチン化活性およびプロテアソーム機能の両方がウイルス中和に必要である。ユビキチン化されるのは細胞内のＴＲＩＭ２１結合ウイルスの粒子であることを実証するために、本発明者らは共焦点顕微鏡で感染細胞を調べ、ユビキチンを染色した。図４Ｃで分かるように、ＴＲＩＭ２１と共局在するビリオンは、ユビキチンに対して陽性でもある。
【０１５６】
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、自己ユビキチン化することが知られている一方、プロテアソームターゲティングにとって重要であると考えられている、ユビキチンの基質への移送体である。しかし、自己ユビキチン化を介するプロテアソームターゲティングによって、ＴＲＩＭ２１が任意のウイルスを中和し、ユビキチン結合を免れる突然変異ウイルスの進化を妨げることが可能になると思われる。この機構に合致して、本発明者らのインビトロでのユビキチン化アッセイにおいて、本発明者らは、ＴＲＩＭ２１はユビキチン鎖をそれ自体に効率的に形成することを見出した一方、ＩｇＧまたはウイルスのいずれのユビキチン化も検知不可能であることを見出した（図４Ｄ）。これは、ＴＲＩＭ２１が抗体と結合するように進化した極めて高い親和性と相関する。ＴＲＩＭ２１が通常の酵素的ターンオーバーを介して抗体またはウイルスにユビキチンを移してしているならば、高い親和性は非常に非効率的なＫＭとして解釈されるであろう。
【０１５７】
ＴＲＩＭ２１介在性のプロテアソームへのターゲティングの後にウイルスに起こっていることを決定するために、本発明者らはｆａｔｅ−ｏｆ−ｃａｐｓｉｄ経時変化実験を行った。本発明者らは、感染ＨｅＬａ細胞中のヘキソンタンパク質（ウイルスのカプシド）レベルとＴＲＩＭ２１が枯渇した細胞中のそのレベルとを比較した。感染後２時間まで、ＴＲＩＭ２１枯渇細胞と比べてＨｅＬａ中のヘキソンは顕著に低かった（図４Ｅ）。このことは、ＴＲＩＭ２１はウイルスの分解を仲介すること、およびそれは迅速なプロセスであることの両方を示す。ＭＧ１３２の添加はヘキソンレベルの低下を防ぎ、このことは、ウイルスはプロテアソーム依存的様式で物理的に分解されていることを裏付ける。ＴＲＩＭ２１によるプロテアソームターゲティングは、ウイルスが抗体結合性になる必要があることから、本発明者らは感染細胞中の抗体レベルも調べた。本発明者らは、ウイルスの破壊は、抗体の消失（ｄｉｓｐｏｓａｌ）と類似することを見出した（図４Ｅ）。それとは対照的に、本発明者らは、ＭＧ１３２はＴＲＩＭ２１レベルにほとんど影響をおよばさないことを確かめ、このことは細胞性ＴＲＩＭ２１の総プールのほんの一部が分解されるまたはＴＲＩＭ２１が再利用されることを示す（図４Ｅ）。
【０１５８】
抗体ターゲティングとＴＲＩＭ２１の自己ユビキチン化との組み合わせは、中和には、ウイルスの直接相互作用は必要とされないこと意味する。このことは、ＴＲＩＭ２１介在性免疫がたいていの細胞内病原体に対して広く有効であるはずであることを意味する。このことを試験するために、本発明者らは、抗ストレプトアビジン抗体で被覆されたストレプトアビジンラテックスビーズを細胞にトランスフェクトした。ＴＲＩＭ２１は、抗体結合ビーズに効果的に動員された（図５）。さらに、ＴＲＩＭ２１結合ビーズは、ユビキチンに対して陽性である。したがって、ＴＲＩＭ２１は、結合またはユビキチン化に関していずれの直接的な病原体相互作用も必要とせず、広域性病原体に対して有効であるはずであり、逃れにくいはずである。
【実施例６】
【０１５９】
＜細胞培養における活性＞
胚線維芽細胞を野生型またはＴＲＩＭ２１ＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２２）のいずれかから調製し、９Ｃ１２、すなわちモノクローナル抗ヘキソン抗体（ＤＳＨＢ、Ｉｏｗａから入手可能）の存在下で、ＧＦＰ−アデノウイルスを攻撃感染した。ヘキソンはアデノウイルスの主要な外被タンパク質である。９Ｃ１２は、野生型マウス由来細胞の感染を強力に阻止したが、ノックアウトマウス由来の細胞の感染を阻止することにはほとんど影響を及ぼさなかった。飽和濃度の抗体存在下でさえ、ノックアウト由来のほとんど全ての細胞が感染した。図６を参照されたい。このことは、ＴＲＩＭ２１非存在下では強力な中和抗体が非中和性になるため、ＴＲＩＭ２１はウイルス感染に対して非常に強力な防御をもたらすことおよびＴＲＩＭ２１は抗体の中和能力にとって重要であることを示す。
【実施例７】
【０１６０】
＜野生型およびノックアウトマウスにおける活性＞
＜ウイルス調製＞
３Ｔ３マウス線維芽細胞の細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入したマウスアデノウイルス１型（ＭＡＶ−１）参考株で感染させた。４日後の感染細胞および上清を回収した。凍結融解サイクルを３回繰り返してウイルスを細胞から放出させた。細胞上清とペレットを有さない細胞可溶化物とを一緒にプールし、ＭＡＶ−１粒子を平衡遠心法によって連続ＣｓＣｌグラジエント中で２回精製した。１．８×１０１３ｐｆｕ／ｍｌに相当するＡ２６０値を測定することによってウイルスを定量した。ウイルス感染力を終末点希釈アッセイによって測定し、ＲｅｅｄおよびＭｕｎｃｈの方法によって計算した５０％組織培養感染量値（ＴＣＩＤ５０）は、８．４×１０８／ｍｌまたは５．８×１０８ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１６１】
＜実験的感染＞
ＬＤ５０を決定するために、１００μｌのＰＢＳ中のＭＡＶ−１の１０倍段階希釈用量を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（投与毎に４匹の動物）することによって、６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスを感染させ、罹患および死亡を一日二回まで観察した。４×１０５ｐｆｕでの野生型マウス感染は、７５％の死亡率であった（図８）。したがって、Ｃ５７ＢＬ／６野生型およびＴＲＩＭ２１ノックアウトマウスにおける全てのさらなる実験について、本発明者らは無症状の４×１０４ｐｆｕ用量のＭＡＶ−１を選択した。
【０１６２】
＜ウイルスの力価＞
感染に対する免疫へのＴＲＩＭ２１の関与を試験するために、本発明者らは６匹のＷＴおよび６匹のＫＯ無感作マウスを４×１０４ｐｆｕ用量のＭＡＶ−１で攻撃感染した。マウスが中程度の症状を超えない限り、感染後９日目にマウスを殺処分した。殺処分した動物から脾臓および脳を回収し、両方のウイルスおよびゲノムＤＮＡを調製した。特異的ヘキソンプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにゲノムＤＮＡを用いてウイルスレベルを定量した。ウイルスをＴＣＩＤ５０によって力価測定し、各動物のウイルス血症を決定した。ＴＲＩＭ２１が一次免疫反応（ＩｇＭ）を増強する能力が生存および／またはウイルス血症の原則決定要因となるように、実験を計画した。
【０１６３】
防御免疫（ＩｇＧ）におけるＴＲＩＭ２１の役割を決定するために、ウイルスに対する中和抗体を有するＭＡＶ−１で攻撃感染したマウスを対象として実験を実施した。したがって、マウスを無症状用量のＭＡＶ−１で攻撃感染し、９日後に臨床用量のウイルスで再度攻撃感染した。
【０１６４】
両実験において、ＭＡＶ−１感染の結果として、ＴＲＩＭ２１ＫＯマウスがウイルス負荷の増加および／または死亡を示すことが観察された。本発明者らは、マウスにおいて抗体治療の抗ウイルス効果を仲介することにとって、ＴＲＩＭ２１の存在が重要であると結論し、このことは、アデノウイルス感染に対して有効であることが知られている（１６）。
【実施例８】
【０１６５】
＜抗体−ＴＲＩＭ２１融合体＞
本発明者らは、モノクローナル抗ヘキソンマウス抗体（９Ｃ１２）を試験し、この抗体がアデノウイルス感染に対して強力な中和活性を有することを見出した（実施例６を参照されたい）。９Ｃ１２ハイブリドーマ細胞からｃＤＮＡを調製し、以下のプライマーを用いて軽鎖および重鎖をＰＣＲで増幅した。
【０１６６】
＜軽鎖＞
ｐＢｕｄＣＥ４．１のＣＭＶプロモーター中のκ鎖：
順方向:
VL1S  acgtGTCGACccaccATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA T
VL2S  acgtGTCGACccaccATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AG
VL3S  acgtGTCGACccaccATG GAG WCA CAK WCT CAG GTC TTT RTA
VL4S  acgtGTCGACccaccATG KCC CCW RCT CAG YTY CTK GT
VL5S  acgtGTCGACccaccATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG
逆方向
CLX catgtctagaCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC
順方向
VH1N  aataGCGGCCGCcaccATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT
VH2N  aataGCGGCCGCcaccATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT
VH3N  aataGCGGCCGCcaccATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT
VH4N  aataGCGGCCGCcaccATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG
逆方向
CHKpn  catgGGTACCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAG
【０１６７】
＜重鎖＞
ｐＢｕｄＣＥ４．１（図７）のＥＦ−１ａプロモーター中の重鎖γ１：
順方向
VH1N  aataGCGGCCGCcaccATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT
VH2N  aataGCGGCCGCcaccATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT
VH3N  aataGCGGCCGCcaccATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT
VH4N  aataGCGGCCGCcaccATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG
逆方向
CHKpn  catgGGTACCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAG
ここでは：ｒ＝ａ、ｇ；ｙ＝ｃ、ｔ；ｍ＝ａ、ｃ；ｋ＝ｇ、ｔ；ｓ＝ｃ、ｇ；ｗ＝ａ、ｔ；ｖ＝ａ、ｃ、ｇ；ｎ＝ａ、ｃ、ｇ、ｔである。
【０１６８】
次に、増幅したＤＮＡを配列決定し、以下の軽鎖および重鎖配列を得た。
重鎖：配列番号１３
軽鎖：配列番号１４
【０１６９】
次に、対応するアミノ酸配列を、ｐＢｕｄＣＥ４．１（図７）で発現させるためのコドン最適化ＤＮＡ配列に逆翻訳した。各鎖は、抗体タンパク質の分泌を確実にするＮ末端分泌シグナルを付加してクローン化した。
【０１７０】
最適化配列は以下の通りである。
【０１７１】
重鎖：配列番号１５
軽鎖：配列番号１６
【０１７２】
次に、得られた組換え９Ｃ１２発現ベクターを起点として用いて、重鎖のＣ末端（ＣＨ３末端）が短いリンカーを介してＴＲＩＭ２１の先頭に結合するように融合タンパク質をクローン化した。三種の変異体を完全長ＴＲＩＭ２１、ＲＩＮＧ、Ｂボックスおよびコイルドコイルドメイン、またはＲＩＮＧおよびＢボックスのいずれかの融合体の代表としてクローン化した。一形態において、得られた融合配列は、
９Ｃ１２−完全ＴＲＩＭ２１融合体：配列番号１７
９Ｃ１２−ＲＢＣＣ融合体：配列番号１８
９Ｃ１２−ＲＢ融合体：配列番号１９
である。
【０１７３】
いずれの場合にも、これらの重鎖融合体は、多鎖発現ベクターｐＢｕｄの未改変軽鎖と共に発現させる（図７を参照されたい）。これらの構築物の発現は、懸濁細胞系２９３Ｆなどの細胞系で行うことができる。抗体は培地へ分泌される。培地から抗体を精製するために、上清をプロテインＡアフィニティー樹脂にアプライし、次に低ｐＨバッファーで溶出した。溶出後、精製タンパク質を生理食塩水バッファーに戻した。精製タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥでアッセイした。
【０１７４】
次に、以下の実験を用いて、キメラのタンパク質の有効性を試験した。ＧＦＰアデノウイルスを様々な濃度のキメラタンパク質とプレインキュベーションする。約０．５のＭＯＩをもたらすように設計されたウイルスの力価で、アデノウイルス−キメラ混合物を培養細胞に添加する。感染細胞を約２４時間インキュベートして、ＦＡＣＳ分析によって、ＧＦＰ陽性細胞数を数えることによって感染効率を決定する。有効性を試験するのに使用可能な細胞系には、２９３、ＨｅＬａおよびＭＥＦなどのアデノウイルス許容細胞系が含まれる。さらにキメラの有効性を実証するために、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡによって内在性のＴＲＩＭ２１を枯渇させた条件下またはＴＲＩＭ２１が遺伝的にノックアウトされた細胞で、これらの実験を行うことができる。
【実施例９】
【０１７５】
上記の例は、ウイルス結合活性およびＴＲＩＭ２１の機能が単一ポリペプチド中に一体となった分子に関する。この単一ポリペプチドが機能的になるために別のポリペプチド鎖（例えば軽鎖）を必要とする場合は、これは、ウイルスとのインキュベーション前に、通常発現中に含まれている必要がある。次の例では、本発明者らは、内在性のＴＲＩＭ２１タンパク質非存在下で抗体に結合することができ、ＴＲＩＭ２１活性を有する分子を説明する。したがって、ウイルス結合とＴＲＩＭ２１機能との両方を備える単一分子を有することの代わりに、これら二つの活性は、二つの別々の分子、すなわち（抗体に例示されるような）病原体に結合する能力を有する第一のもの、および第一のものに結合し、病原体を中和させる能力を持つ（ＴＲＩＭ２１に例示されるような）第二のものに分離する。本発明者らは、すでに先に、外来的にＴＲＩＭ２１を添加することを述べており、これが抗ウイルス活性を有することを示した。この例によって、プロテインＡ（ｐＡ）の抗体結合ドメインのＴＲＩＭ２１の触媒ドメインに対する融合体が説明される。三つの例は、ＲＩＮＧ、Ｂボックスおよびコイルドコイルドメイン、ＲＩＮＧおよびＢボックスドメインまたはＲＩＮＧドメインのいずれかを用いて示される。さらなる例は、プロテインＡドメインがＣ末端に見出される改変である。さらなる構築物が予想され、それらはｐＡが別の抗体結合ドメイン（例えばプロテインＧ、選択されたペプチドリガンド）と交換されたものおよび／または触媒ドメインが（例えば別のＴＲＩＭタンパク質のものと）交換されユビキチンプロテアソーム動員を維持するものである。
【０１７６】
ｐＡ−ＲＢＣＣ配列番号２０
ｐＡ−ＲＢ：配列番号２１
ｐＡ−Ｒ：配列番号２２
ＲＢＣＣ−Ｐａ：配列番号２３
【０１７７】
これらの配列をアフィニティータグを有する細菌性発現構築物中にクローニングすることで、効率的な精製（ＨｉｓおよびＭＢＰタグ）を可能にした。タンパク質を２５℃で一晩発現させ、細胞を溶解し、タンパク質をアフィニティー樹脂、続いてゲル濾過によって精製した。タンパク質を様々な濃度で抗ウイルス抗体（例えば９ｃ１２）とインキュベートし、この混合物をウイルス（例えばＧＦＰアデノウイルス）に加えてから、約０．５のＭＯＩで培養細胞を感染させることで、抗ウイルス効果を試験した。許容細胞系を使用する必要がある（例えばアデノウイルスについては、ＨｅＬａ、２９３、ＭＥＦ）。次に、感染効率をＦＡＣＳによって、ＧＦＰ陽性細胞数を数えることによって決定する。
【０１７８】
［参考文献］
【表３Ａ】
2013535462.tif 000013
【表３Ｂ】
2013535462.tif 000014
【表３Ｃ】
2013535462.tif 000015
【図１】
2013535462.tif 000016
【図２Ａ−２Ｆ】
2013535462.tif 000017
【図２Ｇ】
2013535462.tif 000018
【図３】
2013535462.tif 000019
【図４】
2013535462.tif 000020
【図５】
2013535462.tif 000021
【図６】
2013535462.tif 000022
【図７】
2013535462.tif 000023
【図８】
2013535462.tif 000024
【配列表】
2013535462000001.xml
【国際調査報告】
2013535462.tif 000032
2013535462.tif 000033
2013535462.tif 000034
2013535462.tif 000035