(57)【要約】  本発明は、一般に液滴を生成するシステムおよび方法に関連する。上記液滴は、例えば、ライブラリとして使用するために様々なスピーシーズを含んでいてもよい。いくつかの場合では、フローフォーカシング技術のような技術を使用して、少なくとも1つの液滴が複数の液滴を生成するために使用される。一実施形態では、様々なスピーシーズを含む複数の液滴は、分割され、様々なスピーシーズを液滴中に含む液滴の集合体を生成しうる。特定の実施形態では、液滴の集合体は、すべてそこに同じスピーシーズを含む液滴の様々な部分母集団を含んでいてもよい。液滴のそのような集合体は、いくつかの場合では、ライブラリとして使用されてもよく、あるいは、他の目的に使用されてもよい。
2013508156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の液滴を生成する方法であって、
第２の流体によって実質的に囲まれている第１の流体を有する少なくとも１つの液滴を供給し、
上記少なくとも１つの液滴をマイクロ流体チャネルに通して複数の分割液滴を生成することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
上記第１の流体と上記第２の流体とは、実質的に混合可能でないことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
上記複数の分割液滴は、上記第２の流体によって実質的に囲まれていることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
それぞれが上記第２の流体によって実質的に囲まれた複数の液滴を供給し、
上記マイクロ流体チャネルを通過する液滴のそれぞれが分割されて、２以上の分割液滴を生成するように、上記液滴の少なくともいくつかを上記マイクロ流体チャネルに通すことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
それぞれが上記第２の流体によって実質的に囲まれた複数の液滴を供給し、
上記マイクロ流体チャネルを通過する液滴のそれぞれが分割されて、略同じ数の分割液滴を生成するように、上記液滴の少なくともいくつかを上記マイクロ流体チャネルに通すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、
上記マイクロ流体チャネルを通るそれぞれの液滴について、
上記それぞれの液滴から生成された２以上の分割液滴は、上記分割液滴の約５％以内が、生成された全ての上記分割液滴の平均直径の約１０％よりも大きい直径を有するような直径の分布を有することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、
上記複数の分割液滴は、上記液滴の約５％以内が上記液滴の平均直径の約１０％よりも大きい直径を有するような直径の分布を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、
上記複数の液滴は、少なくとも４つの区別可能なスピーシーズを含み、上記液滴の約５％以内が上記少なくとも４つの区別可能なスピーシーズのうちの２以上を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、
上記少なくとも４つの区別可能なスピーシーズは、少なくとも４つの区別可能な核酸を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、
上記少なくとも４つの区別可能なスピーシーズは、少なくとも４つの区別可能な同定要素を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法において、
上記少なくとも４つの区別可能なスピーシーズは、少なくとも４つの区別可能なタンパク質を有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
上記少なくとも１つの液滴は、約５００ミクロンより大きい平均直径を有し、上記複数の分割液滴は、約５００ミクロンより小さい平均直径を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも約１０の分割液滴は、少なくとも１つの第１の液滴から生成されていることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも約５０の分割液滴は、少なくとも１つの第１の液滴から生成されていることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、
複数の第２の分割液滴の平均直径は、約１０００ミクロンより小さく、上記液滴は、実質的に単分散であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも１つの第１のスピーシーズを有する第１の液滴と、
上記第１のスピーシーズから区別可能な少なくとも１つの第２のスピーシーズを有する第２の液滴と
を供給することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、
複数の分割液滴を有するエマルションを生成し、
各分割液滴は、上記第１の液滴の一部または上記第２の液滴の一部を有し、
上記エマルション中の上記分割液滴の平均直径は、約１０００ミクロンより小さいことを特徴とする方法。
【請求項１８】
複数の液滴を含む流体を備え、上記複数の液滴の少なくともいくつかは、区別可能な組成物を有し、
上記流体内に含まれる上記複数の液滴を使用して分割液滴を生成できるフローフォーカシングデバイスを備え、
生成された分割液滴は、上記液滴の約５％以内が上記液滴の平均直径の約１０％よりも大きい直径を有するような直径の分布を有することを特徴とする製品。
【請求項１９】
請求項１８に記載の製品において、
上記流体は、少なくとも５つの区別可能な液滴を含むことを特徴とする製品。
【請求項２０】
請求項１８に記載の製品において、
少なくとも１０の分割液滴は、各液滴から生成されることを特徴とする製品。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、ウェイツらによって「液滴生成技術」という発明の名称で２００９年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２５５，２３９号の利益を主張する。この米国仮特許出願は、参照によって本出願に組み込まれている。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、米国国立科学財団によって授与されたＤＭＲ−０８２０４８４の下、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明について一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、一般的に、液滴を生成するためのシステムおよび方法に関する。上記液滴は、例えばライブラリとして使用するための様々なスピーシーズ（species）を含んでいてもよい。
【０００４】
多くのマイクロ流体プロセスの１つのコンポーネントは、複数の単分散液滴である。従来技術により複数の液滴を生成するために、ブルートフォース(brute force)アプローチが一般に使用される。例えば、いくつかのプロセスでは、試薬のそれぞれの所望の組み合わせは、単一の単分散液滴メーカを使用して、それぞれ乳化されるに違いない。そして、すべての乳化は、単一のエマルションライブラリ（emulsion library）を生成するためにプール(pool)される。これは、小さなライブラリでさえ、長く、退屈で、高価なプロセスだろう。さらに、各要素の連続した手動の乳化のために、液滴の大きさについて高い均一性を維持するのは非常に難しいだろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一般的に、液滴を生成するシステムおよび方法に関する。上記液滴は、例えばライブラリの生成のための様々なスピーシーズを含んでいてもよい。本発明の内容は、いくつかの場合では、相互関係があった生成物、特有問題の代替解決案、および／または、１以上のシステムおよび／または製品の複数の異なる用途を含む。
【０００６】
１つの局面では、本発明は、方法に向けられる。一実施形態では、複数の液滴を生成する方法は、第２の流体によって実質的に囲まれている第１の流体を有する少なくとも１つの液滴を供給することと、上記少なくとも１つの液滴をマイクロ流体チャネルに通して複数の分割液滴を生成することとを含む。
【０００７】
別の局面では、本発明は製品に向けられる。一実施形態では、上記製品は、複数の液滴を含む流体を備え、液滴の少なくともいくつかは、区別可能な組成物を有している。また、上記製品は、上記流体内に含まれた複数の液滴を使用して分割液滴を生成できるフローフォーカシング（flow-focusing）デバイスを備え、生成された分割液滴は、上記液滴の約５％以内が上記液滴の平均直径の約１０％よりも大きい直径を有するような直径の分布を有する。
【０００８】
本発明の他の利点および新たな特徴は、添付図面と共に考慮されたとき、発明の様々な非限定的な実施例についての以下の詳細な説明から明白になるだろう。本明細書および参照によって組み込まれた文書が、対立するおよび／または一貫しない開示を含んでいるとき、本明細書がコントロールするものとする。参照によって組み込まれた２以上の文書が、互いに関して対立するおよび／または一貫しない開示を含んでいるとき、その後の有効なデータを有する文書がコントロールするものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明の非限定的な実施形態は、概要であって一定の比率で描かれるように意図されていない添付の図面に関する一例によって記載される。上記図では、それぞれ、説明された同一か、ほとんど同一のコンポーネントが、単一の数で通例表わされている。明確さの目的のために、すべての図の中で、すべてのコンポーネントに符号が付されているとは限らず、また、本発明の各実施形態のすべてのコンポーネントは、当業者が本発明を理解するのに図示が必要ではないところで示されていない。
【００１０】
【図１】本発明の非限定的な実施形態に係る液滴の集合体の組成物を示す図である。
【図２】本発明の別の実施形態に係る実質的に区別不能な液滴の２つのグループを有する液滴の集合体のイメージを示す図である。
【図３Ａ】本発明のさらに別の実施形態に係る、実質的に区別不能な液滴の２つのグループを有する大きな多分散液滴の集合体のイメージを示す図である。
【図３Ｂ】本発明の非限定的な実施形態に係る、マイクロ流体フィルタのイメージを示す図である。
【図４Ａ】本発明の非限定的な実施形態に係る、複数の液滴の緑色および赤色チャネルイメージをそれぞれ示す図である。
【図４Ｂ】本発明の非限定的な実施形態に係る、複数の液滴の緑色および赤色チャネルイメージをそれぞれ示す図である。
【図５Ａ】図４Ａ−４Ｂにそれぞれ示す緑色および赤色チャネルイメージの強度ヒストグラムを示す図である。
【図５Ｂ】図４Ａ−４Ｂにそれぞれ示す緑色および赤色チャネルイメージの強度ヒストグラムを示す図である。
【図５Ｃ】図５Ａからの緑色強度対図５Ｂからの赤色強度のプロットを示す図である。
【図６Ａ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を示す図である。
【図６Ｂ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を示す図である。
【図６Ｃ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を示す図である。
【図６Ｄ】マイクロ流体フィルタ中に存在する可能性があるポスト形状の非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ａ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｂ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｃ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｄ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｅ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｆ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｇ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図７Ｈ】マイクロ流体フィルタの非限定的な実施例を説明する図である。
【図８】膜乳化の非限定的な実施例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、一般的に、液滴を生成するためのシステムおよび方法に関する。上記液滴は、例えばライブラリ(library)として使用するための様々なスピーシーズを含んでいてもよい。いくつかの場合では、少なくとも１つの液滴は、フローフォーカシング技術のような技術を使用して、複数の液滴を作成するために使用される。一実施形態では、様々なスピーシーズを含む複数の液滴は、分割されて、様々なスピーシーズを液滴中に含む液滴の集合体（collection）を生成しうる。液滴の集合体は、特定の実施形態によれば、全てがその中に同じスピーシーズのものを含む液滴の様々な部分母集団を含んでいてもよい。液滴のそのような集合体は、いくつかの場合ではライブラリとして使用されてもよく、あるいは他の目的に使用されてもよい。
【００１２】
１つの局面では、本発明は、複数の液滴を生成するために技術を提供する。少なくともいくつかの液滴は、核酸プローブまたはセルのように、少なくとも１つのスピーシーズを液滴中に含んでいてもよい。一実施形態において、第２の流体に実質的に囲まれている第１の流体を有する少なくとも１つの液滴が供給される。いくつかの場合では、第１の流体と第２の流体とは、実質的に混合しない。例えば、液滴は、水を基剤とする液体を含んでいてもよいし、油を基剤とする液体によって実質的に囲まれていてもよい。他の構成は、以下に詳述する。上記液滴は、複数の液滴に分割されてもよい。例えば、以下に述べるように、上記液滴をマイクロ流体チャネルに通すことにより、およびフローフォーカシング技術または他の技術を使用することにより、上記液滴がより小さな複数の液滴を生成する。これは、複数の流入液滴のために繰り返されてもよいし、いくつかの場合では、いくつかの液滴あるいはすべての液滴が様々なスピーシーズを含んでいてもよい。特定の例では、そのように生成された液滴が一緒に集められて、例えばエマルションを生成してもよい。様々なスピーシーズを含む異なる液滴が使用されれば、もたらされた集合体は、複数のグループの液滴を有してもよい。各グループ内の上記液滴は、実質的に区別不能であるが、液滴の各グループは、例えば液滴の各グループ内に含まれる異なるスピーシーズにより、液滴の他のグループと区別可能である。いくつかの場合では、そのような集合体が様々なスピーシーズを含む液滴のライブラリを生成するのに使用されてもよい。
【００１３】
実質的に区別不能な液滴の複数のグループを含むエマルションの生成に向けられた非限定的な実施例が、図1に示される。図１では、６つの区別可能な流体(例えば６つの区別可能なスピーシーズを含んでいる流体)が与えられ、各流体は、コンテナ１６のうちの１つに収容される。(そのような６つの流体およびコンテナは、実施例のような方法のみによりここで供給される。以下に述べるように、コンテナまたは流体の他の数は、本発明の他の実施例の中で使用されうる)。例えば、異なる組成物、および／または同じ組成物だが流体中に異なるスピーシーズが含まれるもの、および／または同じスピーシーズだが異なる濃度のものを有するとして、上記流体は区別可能であってもよい。例えば、コンテナ１６１は、第１の流体、およびこの第１の流体に含まれる第１のスピーシーズを含んでいてもよい。一方、コンテナ１６２は、第１の流体、およびこの第１の流体に含まれる第２のスピーシーズを含んでいてもよい。あるいは、コンテナ１６２は、第１のスピーシーズまたは異なるスピーシーズを含む第２の流体を含んでいてもよい。あるいは、コンテナ１６２は、コンテナ１６１と異なる濃度で、第１の流体および第１のスピーシーズを含んでいるなどでもよい。上記コンテナは、任意の適切な技術(例えば自動ピペットで移す技術、ロボットなどのような自動技術)も使用して、満たされてもよい。あるいは、上記流体は、コンテナ１６あるいはアプローチの任意の適切な組み合わせに、手動で加えられてもよい。
【００１４】
その後、コンテナ１６内の流体は、コンテナ１６からの流体と実質的に混合しない運搬流体２４で満たされた共通コンテナ４に注がれる。コンテナ１６からの流体は、共通コンテナ４に任意の適切な順番、例えば、連続して、同時に、などで加えられてもよい。したがって、共通コンテナ４は、この例において、様々なコンテナ１６からの流体を含む複数の液滴を含む。いくつかの場合では、共通コンテナ４内の液滴がエマルションを生成してもよい。注目すべきは、いくつかの実施形態では、以下に述べられるように、エマルション２は、この実施例では共通コンテナ４への流体の追加によって生成されるが、他の方法がエマルション２を生成するために使用されてもよい。
【００１５】
さらに、図１に示される実施例を参照して、共通コンテナ４からの液滴１２は、その後、チャネル１８を通り抜け、複数の液滴１４は、液滴メーカ１０を使用して、液滴１２から生成される。そのような液滴メーカの例は、以下で詳述される。図１に示すように、液滴メーカ１０は、チャネル１８とそれぞれ交差するチャネル２０および２２を含む。チャネル２０および２２は、それぞれ外部の流体を含む。チャネル１８内の流体のまわりの外部の流体のフロー１０は、流体を複数の液滴１４を生成するために分割させる。しかしながら、液滴メーカ１０は、本明細書では、ほんの一例として示される。つまり、本発明の他の実施例では、異なるチャネルを含む他の液滴メーカ構成を使用できる。いくつかの実例では、液滴１４は、実質的に単分散か、あるいはそうでなければ、平均直径または平均体積の狭い範囲を有していてもよい。その後、液滴１４は、集合体チャンバー８に流れ込む。
【００１６】
その後、これは、集合体チャンバー４内の他の液滴を使用して繰り返されうる。例えば、第１の液滴３０は、分割されて、第１の複数の分割液滴を生成してもよいし、第２の液滴３２は、分割されて、第２の複数の分割液滴を生成してもよい。異なる複数の液滴からの液滴は、お互いに区別可能かもしれないが、複数の分割されたそれぞれの液滴中のそれぞれの液滴は、実質的に区別不能かもしれない。分割後の液滴はすべて、図１に示されるように、液滴６（例えばエマルション)の集合体を生成するために任意に混合されて、集合体チャンバー８内に集められてもよい。いくつかの場合では、液滴６の集合体が、それぞれが複数の液滴内に含まれるスピーシーズのライブラリを明確にしてもよい。また、液滴６の集合体は核酸、セルなどの分析に使用されてもよい。
【００１７】
上記のように、分割の前の液滴のグループ(および／または第１の複数の分割液滴および第２の複数の分割液滴)は、例えば、液滴および／または液滴を生成する流体内に含まれるスピーシーズの組成物および／または濃度に基づいて、いくつかの方法で区別されてもよい。例えば、第１の液滴は、第１の流体から構成されて、第１のスピーシーズを含んでいてもよい。また、第２の液滴は、同じ第１の流体を含み、第１のスピーシーズおよび第２のスピーシーズがお互いに関して区別可能な第２のスピーシーズを含んでいてもよい。あるいは、第２の液滴は、第１のスピーシーズを、第１の液滴等と実質的に異なる濃度で含んでいてもよい。本発明の液滴内に組み込まれうるスピーシーズの非限定的な例は、核酸(例えばｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＤＮＡなど)、タンパク質、ペプチド、酵素、ナノ粒子、量子ドット、香料、タンパク質、指示薬、染料、蛍光試料、化学薬品、細胞、粒子、製剤粒子、薬品、後述する強化のための前駆体スピーシーズなどを含むが、これらに限定されない。スピーシーズは、液滴を含む流体および／または実質的に液滴を取り巻く流体中に実質的に可溶または可溶ではない。
【００１８】
いくつかの場合では、第１の液滴および第２の液滴（例えば、液滴および／または分割の前の第１の液滴および第２の液滴から生成された、第１の分割液滴および第２の分割液滴）は、同じ組成物を実質的に有していてもよい。本明細書で使用されているように、「実質的に同じ組成物」は、例えば、同じ濃度で同じ組成物(例えば、流体、ポリマー、ゲルなど)を本質的に有する少なくとも２つの液滴のことをいい、実質的に区別不能なスピーシーズの組成物および／または濃度を有する液滴内に含まれる任意のスピーシーズも含む。上記液滴は、同一のまたは異なる直径を有していてもよい。いくつかの場合では、実質的に同じ組成物を有している２つの液滴は、液滴の平均的な組成物に対して、約０．５％以内、約１％以内、約２％以内、約３％以内、約４％以内、約５％以内、約１０％以内、約２０％以内等の異なる組成物を有していてもよい。
【００１９】
いくつかの場合では、液滴は、１以上のタイプのスピーシーズを含んでいてもよい。例えば、液滴は、少なくとも約２つのタイプ、少なくとも約３つのタイプ、少なくとも約４つのタイプ、少なくとも約５つのタイプ、少なくとも約６つのタイプ、少なくとも約８つのタイプ、少なくとも約１０のタイプ、少なくとも約１５のタイプ、少なくとも約２０のタイプ等のスピーシーズを含んでいてもよい。液滴内に含まれる各タイプのスピーシーズの総数は、必ず等しい、あるいは等しくないかもしれない。例えば、いくつかの場合では、２つのタイプのスピーシーズが液滴内に含まれているとき、上記液滴内に含まれる略等しい数の第１のタイプのスピーシーズおよび第２のタイプのスピーシーズがあってもよい。他の場合では、第１のタイプのスピーシーズは、第２のタイプのスピーシーズよりも多量、または少量存在してもよい。例えば、１つのスピーシーズの別のスピーシーズに対する比率は、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：１０、約１：２０、約１：１００等であってもよい。液滴の各グループにおける各タイプのスピーシーズの数は、等しい、あるいは等しくない。例えば、グループの第１の液滴は、第１のタイプのスピーシーズのうちの１つ、および第２のタイプのスピーシーズのうちの１つを含んでいてもよい。また、上記グループの第２の液滴は、１以上の第１のタイプのスピーシーズおよび１以上の第２のタイプのスピーシーズを含んでいてもよい。いくつかの場合では、複数の液滴が少なくとも４つの区別可能なスピーシーズを含むように、上記液滴の約１％以内、約２％以内、約３％以内、約５％以内、約１０％以内などが、少なくとも４つの区別可能なスピーシーズのうちの２スピーシーズ以上を液滴に含むように、上記液滴は生成されてもよい。本明細書に記載されているように、上記区別可能なスピーシーズは、４つの区別可能な核酸、同定要素あるいはタンパク質だろう。いくつかの場合では、液滴は、一種類以上のタイプのスピーシーズを含んでいてもよい。例えば、液滴は、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００等の数の単一のスピーシーズを有していてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、液滴の集合体が、少なくとも約２、少なくとも約４、少なくとも約１０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約６４、少なくとも約１２８、少なくとも約１０２４、少なくとも約４０９６、あるいは少なくとも約１０，０００以上の区別可能な液滴のグループを有し、この液滴の各グループは、１つ以上の区別不能な液滴を含んでいる。各グループにおける液滴の数は、ほぼ等しい、あるいは、等しくない。
【００２１】
上記液滴（例えば分割前後）は、多分散、単分散、または実質的に単分散（例えば、均一な直径分布を有する）であってもよい。複数の液滴は、実施例において実質的には単分散である。この実施例では、液滴の約１０％以内，約５％以内，約４％以内，約３％以内，約２％以内，約１％以内あるいはそれ以下は、全ての液滴の平均直径の約２０％，約３０％，約５０％，約７５％，約８０％，約９０％，約９５％，約９９％、またはそれ以上より大きい、または小さい直径となるような直径分布を有する。本明細書で使用されるように、液滴の母集団の「平均直径」は、上記液滴の直径の算術平均である。当業者は、例えばレーザー光散乱あるいは他の既知の技術を使用して、液滴の母集団の平均直径を決定することができる。いくつかの実施形態では、分割後の複数の液滴は、実質的に単分散、あるいは、分割前の液滴が多分散であるのに対して単分散である。理論によって拘束されるつもりはないが、本発明の或る実施例における技術の１つの利点は、分割後の液滴の実質的に単分散の集合体が、多分散の複数の液滴から生成されてもよいということである。いくつかの場合では、分割後の液滴から生成される液滴の数が多ければ多いほど、上記液滴が多分散である実施例においてさえ、分割後の全液滴が実質的に単分散になる可能性が大きくなる。
【００２２】
当業者は、本出願により、液滴などから生成される、分割液滴の所望の直径および／または数のような要因によって、液滴の適切なサイズを決定することができるだろう。いくつかの場合では、分割前の液滴は、約５００マイクロメートルよりも大きい、約７５０マイクロメートルよりも大きい、約１ミリメートルよりも大きい、約１．５ミリメートルよりも大きい、約２ミリメートルよりも大きい、約３ミリメートルよりも大きい、約５ミリメートルよりも大きい、またはそれよりも大きい平均直径を有し、また、複数の分割液滴は、約１０００マイクロメートル未満、約７５０マイクロメートル未満、約５００マイクロメートル未満、約４００マイクロメートル未満、約３００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、あるいはそれよりも小さい平均直径を有している。いくつかの実施例では、少なくとも約５，少なくとも約１０，少なくとも約２０，少なくとも約２５，少なくとも約５０，少なくとも約７５，少なくとも約１００，あるいはそれ以上の分割液滴が、液滴から生成される。いくつかの場合では、約５と約１００との間で、約１０と約１００との間で、約１０と約５０との間で、あるいは約５０と約１００との間等で、液滴が単一の液滴を分割することにより生成される。
【００２３】
複数の液滴（例えば分割前）は、任意の適切な技術を使用して生成されてもよい。例えば、液滴は、個々の液滴を生成するために液体を振るか混ぜるかすることにより、個々の液滴を含むサスペンションまたはエマルションを生成すること、または、ピペット技術、あるいは針等によって液滴を生成することにより、生成されてもよい。液滴の生成についての他の非限定的な例は、「流体分散のための方法および装置」という発明の名称で、ストーンらによって２００４年１２月２８日に出願された米国特許出願第１１／０２４，２２８号に開示され、２００５年８月１１日に発行された米国特許出願公開公報第２００５／０１７２４７６号に記載されたもの；「流体のスピーシーズの生成および制御」という発明の名称で、リンクらによって２００５年１０月７日に出願された米国特許出願第１１／２４６，９１１号に開示され、２００６年７月２７日に発行された米国特許出願公開公報第２００６／０１６３３８５号に記載されたもの；「流体のスピーシーズの電子制御」という発明の名称で、リンクらによって２００６年２月２３日に出願された米国特許出願第１１／３６０，８４５号に開示され、２００７年１月４日に発行された米国特許出願公開公報第２００７／０００３４４２号に記載されたもの；あるいは、「流体のスピーシーズの操作のための方法および装置」という発明の名称で、２００８年６月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７９４１号に開示され、２００９年１月８日に発行された国際特許公開公報第ＷＯ２００９／００５６８０号に記載されたものが、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれている。
【００２４】
上記のように、いくつかの場合では、複数の分割液滴が、液滴メーカに関連したマイクロ流体チャネルを通過することにより、液滴から生成されてもよい。いくつかの実施形態では、複数の液滴が、マイクロ流体チャネルへの入り口を有するか、あるいはマイクロ流体チャネルと流体連通している貯留部に供給されてもよい。第１の流体を有するとともに実質的に運搬流体によって囲まれる液滴は、マイクロ流体チャネルに入ってもよい。液滴が、マイクロ流体チャネルよりも直径に関して十分に大きい実施例では、上記液滴は、例えばマイクロ流体チャネル内の液体の流れを生成するために圧縮されてもよい。複数の液滴は、上記液滴メーカによって、マイクロ流体チャネル内の流入流体（例えば流体の流れとして）から生成されてもよい。これは、液滴メーカに入る流体が本質的に連続的であるシステムにおけるのと同様のプロセスであってもよい。したがって、第１の複数の液滴は、第１の液滴（例えば、流体の流れとしてマイクロ流体チャネル内に存在する)から生成されてもよい。その後、第２の液滴は、マイクロ流体チャネルに入ってもよく、また、このプロセスは繰り返されてもよい。それによって、第２の液滴から第２の複数の液滴を生成し、第２の複数の液滴は、第１の複数の液滴から区別可能であってもよい。これは、液滴の任意の数で繰り返されてもよく、この液滴は、他の液滴から区別可能、あるいは区別不能であってもよい。
【００２５】
いくつかの場合では、分割液滴の生成が並列処理されてもよい。例えば、複数の液滴を有する１以上の貯留部は、液滴メーカを有する１以上のマイクロ流体チャネルに関連していてもよく、それによって、一度に１以上の液滴から、分割液滴を生成することができる。いくつかの場合では、貯留部は、それぞれ、１，２，３，４，５，１０，２０あるいはそれ以上のマイクロ流体チャネルおよび／または液滴メーカに関連していてもよい。そのようなシステムの１つの例は、「マイクロ流体デバイスのスケールアップ」という発明の名称でＭ．ロマノフスキーらによって２００９年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／１６０，１８４号に開示されており、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００２６】
当業者は、マイクロ流体チャネル内の流体の流れから（例えば液滴から）液滴を生成することに適した他のシステムおよび方法に気づくだろう。例えば、実施形態の１セットでは、流体の液滴は、個々の液滴を生成するために流体を導入することができる態様で、チャネル寸法を変更することにより、チャネル内の運搬流体によって囲まれている流体から生成されうる。例えば、上記チャネルは、流れの方向に対して拡大するチャネルであってもよく、例えば、上記流体は、チャネル壁に付着せず、その代わりに個々の液滴を生成する。また、上記チャネルは、流れの方向に対して狭くするチャネルであってもよく、例えば、上記流体は、個々の液滴内に合体させられるチャネルであってもよい。他の実施形態では、内部障害物も液滴の生成をさせるために使用されてもよい。例えば、バッフル（baffles）、リッジ(ridges)、ポスト(posts)などは、上記流体が流体液滴内に合体するような態様で、運搬流体の流れを妨げるために使用されてもよい。マイクロ流体システムと共に使用される他の液滴メーカは、当業者に知られており、Ｔ字状ジャンクション液滴メーカ、ミクロの毛状の液滴メーカ（例えば、共同流れ、あるいはフローフォーカス）、あるいは３次元の液滴メーカなどを含むが、これらに限られない。
【００２７】
いくつかの場合では、複数の液滴は、ミリ，マイクロ，ナノ流体システムを含むが、これらに非限定的な乳化システム、例えば均質化、膜乳化、シェアセル乳化（shear cell emulsification）、流体乳化などを使用して、生成されてもよい。すなわち、複数の液滴は、デバイスおよび／またはマイクロ流体以外の技術を使用して分割されてもよい。当業者は、そのようなシステムに精通しているだろう。
【００２８】
いくつかの場合では、複数の液滴が膜乳化を使用して分割されてもよい。膜乳化は、当業者に知られ、膜（例えば、複数の気孔を有する）によってエマルションが生成されるようになっている第１の流体の通過を一般に含む。実質的に混合できない第２の流体は、膜プレートの外面（例えば、第１の流体が上記膜を出る表面）を通って流出され、図８に示されるように、第１の流体を有する複数の液滴を生成する（例えば、液滴は、膜表面を通る連続相によって分離される）。一般に、第１の流体の流れは、圧力によってコントロールされる。膜乳化が本発明と共に使用される実施形態では、複数の液滴を含む流体は、上記膜を通過してもよい。その後、各液滴は、膜の外面を通過する連続相のフローによって、複数のより小さな液滴に分割される。
【００２９】
別の実施形態のセットでは、電荷は、運搬流体によって囲まれている流体について作成されてもよい。それは、上記流体を運搬流体内の個々の液滴に分離させてもよい。したがって、一連の個々の充電および／または運搬流体内の電気的な誘導液滴として存在しうる。適切な技術を使用して、例えば電場（ＡＣ、ＤＣなどでもよい）内に上記流体を位置させることによって、および／または上記流体が電荷を有するようにさせる反応、例えば、化学反応、イオン反応、光触媒反応等を生じさせることによって、運搬流体内の流体に電荷が生成されてもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態の中では、電場は、電場発生器、つまり上記流体に適用可能な電場を生成できるデバイスまたはシステムから生成される。上記電場発生器は、ＡＣ場、ＤＣ場（つまり時間に関して一定のもの）、パルス電場などを発生させてもよい。上記電場発生器は、チャネルまたはマイクロ流体チャネルの中に含まれる流体の中で電場を生成するように構築および配置されてもよい。上記電場発生器は、いくつかの実施形態によって、チャネルまたはマイクロ流体チャネルを含む流体システムに統合されてもよく、またはこのシステムから分離されてもよい。本明細書で使用される場合、「統合」とは、互いに対して統合されているコンポーネントの一部が、そのコンポーネントの少なくとも１つを切断または破壊しなければ、上記コンポーネントが手動で分離できないように結合されることを意味する。
【００３１】
適切な電場（ＡＣ、ＤＣなどでもよい）を生じるための技術は、当業者に公知である。例えば、一実施形態では、電場は、電極の対を横切って電圧をかけることによって生じ、これらの電極は、電場の少なくとも一部が上記流体と相互作用するように、上記流体システム内（例えば、上記チャネルを画定する基質内）に配置もしくは埋め込まれてもよく、および／または上記流体に近接して配置されてもよい。上記電極は、当業者に公知である任意の適切な電極材料から構築することができ、この材料には、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、錫、カドミウム、ニッケル、インジウムスズ酸化物（「ＩＴＯ」）など、またこれらの合成物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、透明か、実質的に透明な電極を使用できる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、上記デバイス内に含まれる流体から、例えば、本明細書に記載されているように、複数の液滴を生成する分割に先立って、マイクロ流体チャネル内に含まれる液滴から、少なくとも任意の望まれない粒子状物質の一部を取り除くことを助ける１以上のフィルタを有していてもよい。粒子状物質(例えば、ダスト、粒子、汚れ、残骸、セル残留物、タンパク質凝集体、リポソーム、コロイド粒子、不溶性物質、その他未確認の微粒子など)の除去は、重要かもしれない。なぜなら、マイクロ流体デバイスが比較的狭いチャネルを含むかもしれないし、上記粒子状物質がチャネルを詰まらせたり、閉鎖したりするかもしれないからである。上記粒子状物質は、上記チャネルより大きい、および／または、上記チャネルを通る粒子状物質の輸送が、少なくとも多少妨げられるような形状を有していてもよい。例えば、上記粒子状物質は、チャネルの側面上で「妨げる」あるいはこする部分を有する非均一あるいは非球状の形状を有し、上記粒子状物質のまわりの流体の流れを少なくとも部分的に妨害する形状を有している。いくつかの場合では、複数の粒子状物質は、上記チャネル内のフローの少なくともいくつかの妨げをともに引き起こしてもよい。例えば、上記粒子状物質は、流体の流れを妨げるために上記チャネル内にともに集合してもよい。
【００３３】
一般に、本発明の一局面によれば、マイクロ流体フィルタは、複数のポストを有する。いくつかの実施形態では、上記ポストは、チャネル内に配置されてもよい。上記ポストは、流体が上記ポストのまわりを流れるのを許容する一方、任意の望まれない粒子状物質も、ろ過してよい。例えば、図６Ａに示すように、マイクロ流体チャネル５０は、マイクロ流体チャネルの壁５２の間に配置された複数のポスト５６を有する。矢印６０によって示されるように、流体が残りのギャップの間を流れることができる一方、粒子状物質５８は、ポスト５６によって捕捉される。(任意に、上記流体は、本明細書に記載されたもののような液滴を含んでもよい。)その後、上記流体は、液滴メーカに入り、および／または、そうでなければマイクロ流体デバイス内で使用されてもよい。
【００３４】
いくつかの局面では、図６Ａに記載されたフィルタは、液滴（図６Ａに図示しない)を含む流体から粒子状物質をろ過するために使用されてもよい。例えば、上記液滴は、上記ポスト間を通過する一方、５８のような粒子状物質は、フィルタ内で詰まって、フィルタを通って通過することが妨げられる。特に注目すべきは、図６Ａ中の粒子状物質５８のようないくつかの粒子状物質がたとえ存在しても、例えば、図６Ａ中の矢印６０によって識別されるように、流体が流れるフィルタを通るいくつかの通過物が存在する限り、上記フィルタは、流体を通過させ、さらなる粒子をろ過することに対して依然として有効であるということである。
【００３５】
しかしながら、いくつかの実施形態では、液滴を含む流体をろ過するために使用される図６Ａに記載されているようなフィルタは、上記液滴が上記フィルタを通過するとき、大きな液滴を複数の小さな液滴へ分割させてもよい。いくつかの場合では、小さな液滴が多分散であってもよい。例えば、上記液滴は、この液滴がポスト５４の間を通過するとき、様々な態様で変形され、または破壊されてもよい。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、図６Ｂを参照して示される。この実施形態では、チャネル６２は、複数のポスト６４を有するフィルタ６１を含む。上記フィルタおよびポストは、この実施形態では、チャネル６２に関して対称的に配置されなくてもよい。代わりに、この実施形態では、上記ポストがチャネルの一方に実質的に位置するように、上記フィルタが配置される。したがって、例えば、ポストの少なくとも５０％、少なくとも７０％、あるいは少なくとも９０％は、上記チャネルの他方側に対して上記チャネルの一方側に位置している。図６Ａ中に示されるように、いくつかの実施形態では、上記チャネルは、上記ポストを収容するために上記フィルタの周りで広くなってもよい。しかしながら、ポストがチャネルの一方に本質的に置かれる或る配置では、上記チャネルは、非対称の態様で広くなり、つまり、上記チャネルは、上記チャネルの他方側に対して上記チャネルの一方側でより広くなる。フィルタからの出口は、フィルタへの入口に対して実質的に同一直線上に位置することも注目されるべきである。しかしながら、他の実施形態では、上記出口は、上記フィルタの中心、あるいは他方側に位置してもよい。そして／または、上記出口は、上記入口と同じ方向ではない方向に位置してもよい。上記フィルタの形状は、四角形、三角形、長方形、円形等を含む、しかし、これらに非限定的な任意の適切な形状であってもよい。フィルタの形状および構成の非限定的な実施例は、図７Ａ−７Ｈに示される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、フィルタは、複数のポストおよび上記ポスト間の複数のギャップを有する。このフィルタでは、各ギャップは、上記フィルタの入口からフィルタの出口への異なる経路長を有する。したがって、任意の理論によって拘束されずに、フィルタの入口からフィルタの出口へのギャップの間を通過する他の経路に対し、各ギャップの間を流れる流体は、異なる流体抵抗を有すると信じられている。そのような配置の結果によって、上記流体が最小の流体比率を有するギャップを通って主に流れる。上記粒子状物質が上記フィルタに入るとき、上記粒子状物質は、このギャップにつかまり、また、上記流体の流れは、流体の流れの最小の抵抗の次の利用可能な経路になる次のギャップの周りに迂回されるだろう。驚いたことに、そのような配置は、さらに上記チャネル内の流体の液滴を正常に維持する間、粒子状物質が除去されることを許容してもよい。そのような配置は、チャネル内の一連のポストを単に生成することにより、予測されたり、期待されたりしなかっただろう。
【００３８】
従って、実施形態の１つのセットは、入口と出口との間の複数の異なる経路長を有するフィルタに、一般に向けられている。いくつかの場合では、そのような異なる経路長は、複数のポストおよびこれらのポストの間の複数のギャップを使用して生成されてもよい。上記のように、上記流体の入口および出口は、上記フィルタの片面に位置してもよい。例えば、図６Ｂの実施例に示されるように、流体６２は、ポスト６４を含むフィルタ６１を通って流れる。上記流体の大半は、最小の流体抵抗を有するギャップ６６を通って流れる。図６Ｃに示されるように、ギャップ６６は、粒子状物質７２で実質的に閉鎖されるようになるとき、上記流体の大半は、ギャップ７４、つまり、次に最小の流体抵抗を有するギャップを通って流れるだろう。一例のフィルタのイメージは、図３Ｂにも示される。
【００３９】
上記フィルタの出口の大きさ、あるいは上記流体が上記フィルタを出てから流れるチャネルの距離の大きさの約２０％，約３０％，約４０％，約５０％，約６０％，約７０％，約８０％あるいは約９０％であるように、上記ポスト間のギャップの大きさが選択されてもよい。上記大きさは、上記フィルタ中の分離した隣接するポスト間の最小距離として決定されてもよい。いくつかの場合では、ポスト間のギャップの大きさは、上記チャネルの幅の約５０％である。上記ポストは、任意の適切な大きさ、形状、および／または数であり、上記フィルタ内の任意の適切な位置に配置されてもよい。形状の非限定的な例は、図６Ｄに記載され、長方形、正方形、円形、楕円形、台形、涙滴形（例えば正方形と円弧状の底縁の両方を備えたもの)および三角形を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポストの長さは、ポストの幅より実質的に大きくてもよく、あるいは、ポストの幅は、ポストの長さより実質的に大きくてもよい。例えば、上記ポストの長さあるいは幅は、それぞれ、上記ポストの幅あるいは長さの約２倍，約３倍，約４倍，約５倍，約１０倍，約１５倍，約２０倍またはそれ以上であってもよい。いくつかの場合では、上記ポストの長さが上記ポストの幅より実質的に大きいとき、２つのポスト間のギャップは、チャネルを形成してもよい。上記フィルタ内の上記ポストは、同じ大きさ、形状および／または配置でもよいし、そうでなくてもよい。例えば、いくつかの場合では、上記ポストの実質的にすべてが、同じ大きさ、形状および配置を有していてもよいし、その一方で、他の場合では、上記ポストは様々な大きさ、形状および／または配置を有していてもよい。
【００４０】
上記フィルタは、約５，約６，約７，約８，約９，約１０，約１１，約１２，約１５，約２０，あるいはそれ以上のポストを有していてもよい。上記ポストの幅は、上記ポスト間のギャップの大きさとほぼ同じ大きさ、約１．５倍，約２倍，約３倍，約４倍，約５倍，約７倍あるいは約１０倍の大きさであってもよい。上記ポストは、例えば図６Ｂに示されるような直線的配置、および／または、ポストの複数列配置(矩形状、ジグザグ状など)、あるいはポストのランダム配置を含む他の配置がなされてもよい。いくつかの場合では、上記ポストは、チャネルの任意の適切な表面(例えば、チャネルの底、上面および／または壁)に関連していてもよい。いくつかの場合では、上記ポストは、３次元配置がなされていてもよい。いくつかの場合では、マイクロ流体チャネルの高さが変わってもよく、および／または、ポストの高さが変わってもよい。ポストのラインが存在するとき、それらは、上記フィルタの入口および出口に対して約９０°あるいは９０°以外の角度で配置されてもよい。いくつかの場合では、流体内に存在する粒子状物質の少なくとも約５０％，約６０％，約７０％，約８０％，約９０％，約９５％，約９８％あるいはそれ以上が、上記フィルタによって上記流体から除去されてもよい。
【００４１】
上記フィルタは、本明細書に記載されたような液滴メーカに関連して記載されているが、上記フィルタは、そのような適用だけに制限されないことが理解されるに違いない。他のマイクロ流体の適用におけるフィルタの使用が粒子状物質の除去が望まれるあらゆる適用(液滴がチャネル内の流体内に存在するかどうか)を含めて検討される。そのような適用の限定しない例は、マイクロ流体適用(例えば「ラボオンチップ（lab-on-a-chip）」の適用)，クロマトグラフィー適用(例えばＨＰＬＣ、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除（size exclusion）クロマトグラフィーなどのような液体クロマトグラフィー)，半導体生産技術，飲用水適用，インクジェット印刷の適用，酵素の分析，ＤＮＡ分析などを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、上記フィルタに先立つマイクロ流体チャネルの高さは、急速に減少してもよい(例えば、上記チャネルの高さの急激な短縮)。これにより、少なくともダストの一部あるいは他の粒子状物質が、減少した高さを有するトンネルに入る前に安定する。
【００４３】
いくつかの場合では、１以上のチャネルが上記フィルタと交差してもよい。上記チャネルは、上記ポストに先立つ、隣接する、あるいは続く位置で上記フィルタと交差してもよい。いくつかの場合では、上記チャネルは、１セット以上のポスト間に位置してもよい。上記フィルタとのチャネルの関連は、上記フィルタに入る流体からの連続相の追加あるいは抽出を許容してもよい。いくつかの場合では、上記チャネルは、上記フィルタに入る上記流体中に存在する連続相と異なる連続相を導入するために使用されてもよい。いくつかの場合では、上記チャネルは、コンデンサチャネルであってもよい。ここでコンデンサチャネルは、行き止まりのチャネルである。コンデンサチャネルは、液滴メーカ中の圧力を等しくするのを援助し、および／または、高度に単分散した複数の液滴を生成することを援助してもよい。
【００４４】
いくつかの場合では、コンポーネントが、泡を縮小することを援助するためにフィルタ(あるいはマイクロ流体システムの他の部分)に関連していてもよい。上記「泡」という用語は、その技術の属する分野における通常の意味が与えられる。上記フィルタあるいはマイクロ流体システム(例えば液滴メーカ)の他の部分における泡の存在は、流体の流れを妨げ、および／または他の障害をもたらす(例えば、上記液滴メーカで生成された液滴の多分散性を増加させる)だろう。いくつかの場合では、上記泡は、ウェッティングパッチ（wetting patch）、電場および／または界面活性剤(例えば、１以上の流体中に存在する)を使用して、減少され、あるいは除去されてもよい。
【００４５】
本明細書に記載されているような構成および方法は、様々な適用、例えば、飲食物、健康および化粧品、絵の具およびコーティング、薬およびドラッグデリバリーのような分野と関係のある技術の中で使用されうる。液滴またはエマルションは、例えば、化学反応のコントロール、あるいは例えば進化技術に向けられたインビトロ転写および翻訳といった特定の場合における反応槽としても役立ちうる。さらに、本発明の液滴は、付加反応コンポーネント、例えば、触媒、酵素、抑制剤などを含んでもよい。いくつかの実施形態では、スピーシーズを含む、複数の分割液滴が、被分析物を決定するのに役立ってもよい。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「決定」という用語は、一般的には、例えば、定量的、または定性的な標的分析物分子の分析あるいは測定、あるいは標的分析物分子の存在の有無の検知のことをいう。また、「決定」は、例えば、定量的に、または質的に、あるいは相互作用の存在の有無の検知による、少なくとも１つのスピーシーズと１つの標的分析物分子との間の相互作用の分析または測定のことをいってもよい。実施例の技術は、赤外線、吸収、蛍光、ＵＶ／可視、ＦＴＩＲ(「フーリエ変換赤外分光」)、またはラマンなどのスペクトル測定；重量測定技術；偏光解析法；圧電測定；免疫測定；電気化学的測定；光学密度測定などの光学測定；偏光分析法；屈折分析；または濁度測定を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
いくつかの場合では、組成物と方法が標的核酸の配列に役立ってもよい。例えば、標的分析物分子は、核酸でもよい。また、複数の分割液滴内に含まれるスピーシーズは、例えば以下の国際特許出願で開示されたような技術を使用して、上記核酸のシーケンスが決定されるように、核酸プローブのライブラリから選択されてもよい。上記国際特許出願は、「核酸配列用のシステムおよび方法」という発明の名称でウィーツらによって２００８年１２月１９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３９１２号、あるいは、「液滴および関連スピーシーズのライブラリの生成」という発明の名称でウィーツらによって２００８年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０９８，６７４号である。これらは、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示された技術は、複数のグループの液滴を有するエマルションの生成のために使用されてもよく、液滴のそれぞれ異なるグループは、区別可能な核酸プローブを有している。例えば、スピーシーズが核酸プローブを区別するために使用される場合、分割液滴の各グループは、１以上の追加のスピーシーズを有してもよい。いくつかの場合では、液滴のライブラリは、例えば核酸のシークエンシングのために使用されてもよい。例えば、少なくともいくつかの液滴の集合体は、標的核酸を有する液滴と融合され、複数の融合された液滴を生成してもよい。複数の融合された液滴は、当業者に知られている技術（例えば、シークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーション（sequencing by hybridization）技術)を使用して、核酸のシーケンスを決定するように分析されてもよい。
【００４９】
一実施形態では、複数の区別可能な同定要素は、複数の分割液滴、あるいは核酸プローブ、あるいは他の適切なサンプルを区別するために使用される。本明細書で使用されるように、「同定要素」は、いくつかの態様で、例えば、この同定要素が液滴内に含まれるときに区別されるように決定されうるコンポーネントを含むスピーシーズである。例えば、蛍光性の粒子が使用されるとき、例えば、少なくとも５つの区別可能粒子、少なくとも約１０の区別可能粒子、少なくとも約２０の区別可能粒子、少なくとも約３０の区別可能粒子、少なくとも約４０の区別可能粒子、少なくとも約５０の区別可能粒子、少なくとも約７５の区別可能粒子、あるいは少なくとも約１００以上の区別可能粒子を有する１セットの区別可能粒子が最初に決定される。そのようなセットの非限定的な実施例は、Luminex（登録商標）法から利用可能である。区別可能な同定要素は、複数のグループ(例えば２、３、４、５、６あるいは７以上)に分割されてもよい。ここで、各グループは、少なくとも２つの区別可能な同定要素のセットを含んでいる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明の液滴は、前駆体物質を有し、この前駆体物質は、相変化、例えば、固体化した液滴または流動化した液滴を生成することができる。例えば、液滴は、ゲル前駆体、および／または、ゲルおよび／またはポリマーを有する固体化した液滴を生成するように固体化されうるポリマー前駆体を含んでいてもよい。したがって、上記方法およびプロセスは、いくつかの場合では、複数のグループの粒子(他のグループの粒子から区別可能な各グループの粒子)を含む粒子の集合体を生成するために使用することができる。いくつかの場合では、固体化された液滴は、ゲルまたはポリマー内に流体を含んでいてもよい。液滴は、いずれかの適切な技術を使用して、相変化をさせてもよい。例えば、固体化された液滴は、環境の変化にさらされることにより流体化された液滴を生成してもよい。液滴は、液滴のまわりの環境の変化、例えば、温度の変化、ｐＨレベルの変化、イオン強度の変化、電磁放射(例えば紫外線)の被爆、化学薬品(例えばポリマー中の架橋剤を開裂する化学薬品)の追加などによって流体化または固体化されてもよい。
【００５１】
本発明の様々な局面の理解に役立つ様々な定義が与えられる。以下は、これらの定義が組み込まれた、より完全に本発明を記載するさらなる開示である。
【００５２】
一実施形態では、キットは、上記組成物の１以上を含有して、提供されてもよい。「キット」は、本明細書で使用されるように、本発明の組成物の、および／または、例えば上記のような本発明に関連する他の組成物の１つ以上を含むパッケージまたはアッセンブリを通例定義する。上記キットの各組成物は、液体形式（例えば溶液）、固体形式(例えば硬化した液滴の乾燥粉末または集合体)などで提供されてもよい。いくつかの場合では、本発明のキットは、説明書が本発明の組成物と関連していることを当業者が認識するような態様で、本発明の組成物と関連して提供される任意の形式の説明書を含み得る。例えば、上記説明書は、組成物および／または上記キットに関連する他の組成物の使用、組み換え、混合、希釈、保存、投与、構築、貯蔵、包装、および／または調製のための説明書を含んでもよい。上記説明書は、任意の態様で提供されるこのような説明を含有する好適な媒体、たとえば記載または印刷、言葉、音声(例えば、電話)、デジタル、光学、視覚(例えばビデオテープ、ＤＶＤなど)、あるいは電子通信(インターネットあるいはウェブ・ベースのコミュニケーションを含む)として、当業者によって認識可能な任意のフォームで与えられてもよい。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「液滴」は、第２の流体によって完全に囲まれる第１の流体の分離された部分である。液滴は、必ずしも球状ではないが、例えば、外的環境に依存して、同様に他の形を仮定してもよいことが注目される。非球状の液滴における液滴の直径は、非球状の液滴と同じ体積を有する完全に数学的な球体の直径である。上記のように、上記液滴は、任意の適切な技術を使用して生成されてもよい。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「流体」は、その通常の意味が与えられる、つまり液体またはガスである。流体は、定義された形状を維持できず、流体が入れられるコンテナを満たす観測可能な時間枠の間、流れるだろう。したがって、上記流体は、流れを許容するあらゆる適切な粘性を有していてもよい。２以上の流体が存在するとき、各流体は、当業者によって、本質的に任意の流体（液体、ガスなど）から独立して選択されてもよい。
【００５５】
本発明の特定の実施形態は、複数の液滴を作成する。いくつかの実施形態では、複数の液滴が第１の流体から生成され、第２の流体によって実質的に囲まれてもよい。本明細書で使用されるように、上記流体だけを通して上記液滴のまわりで閉ループが描かれるとき、液滴は流体によって「囲まれる」。上記流体だけを通す閉ループは、方向にかかわらず上記液滴のまわりで描かれる場合、液滴は「完全に囲まれる」。上記流体だけを通す上記ループが、上記方向に基づく上記液滴の周りに描かれうるとき、液滴は、「実質的に囲まれる」（例えば、いくつかの場合では、上記液滴の周りのループは、第２の流体、あるいは第２の液滴等を含む上記流体のほとんどを含む。）。
【００５６】
すべての実施形態ではないが、ほとんどの実施形態では、上記液滴とこの液滴を含む上記流体とは実質的に混合しない。しかしながら、いくつかの場合では、混合してもよい。いくつかの場合では、親水性の液体が、疎水性の液体の中で懸濁されてもよく、疎水性の液体は、親水性の液体の中で懸濁されてもよく、気泡は、液体などの中で懸濁されてもよい。通例、疎水性の液体および親水性の液体は、互いに対して実質的に混合せず、親水性の液体は、疎水性の液体よりも水に対するより大きな親和性を有する。親水性の液体の例は、セルまたは生体媒質、エタノール、食塩水などの水および水を有する他の水溶液を含むが、これらに限定されない。疎水性の液体の例は、炭化水素、シリコーン油、フルオロカーボン油、有機溶媒などのような油を含むが、これらに限られない。いくつかの場合では、２つの流体は、流体の流れの生成についての時間枠の中で実質的に混合しないように選択されうる。当業者は、本発明の技術を実行するために、接触角測定などを使用して、実質的に混合する、または、実質的に混合しない適切な流体を選択することができる。
【００５７】
すべての実施形態ではないが、いくつかの実施形態では、本明細書でより多く述べられたように、上記複数の液滴は、マイクロ流体技術を使用して生成されてもよい。本明細書で使用されるように、「マイクロ流体」は、横断面寸法が１ｍｍ未満であるとともに、最大の横断面寸法に対する長さの比率が少なくとも約３：１である、少なくとも１つの流体チャネルを含むデバイス、装置またはシステムに言及する。本明細書で使用されるように、「マイクロ流体チャネル」は、これらの基準を満たすチャネルである。チャネルの「横断面寸法」は、流体の流れの方向に対して直交して測定される。いくつかの実施形態では、上記流体チャネルは、単一コンポーネントによって一部が形成されてもよい(例えば、エッチングされた基質あるいは成型されたユニット)。もちろん、大きなチャネル，チューブ，チャンバー，貯留部などは、大量に流体を格納し、かつ本発明のコンポーネントに流体を送るために使用されうる。実施形態の１セットでは、本発明の実施形態を含むチャネルの最大の横断面寸法は、１ｍｍ未満、５００ミクロン未満、２００ミクロン未満、１００ミクロン未満、５０ミクロン未満あるいは２５ミクロン未満である。いくつかの場合では、流体が製品または基質を自由に流れることができるように、チャネルの寸法が選択されてもよい。チャネルの寸法は、例えば、チャネルの流体のある容積測定または線形流量を許容するために選択されてもよい。もちろん、チャネルの数およびチャネルの形状は、当業者に既知の任意の方法によって変えることができる。いくつかの場合では、１以上のチャネルまたは毛細管が使用されてもよい。例えば、２以上のチャネルが、お互いの内側に位置し、互いに隣接して位置し、互いに交差して位置するなどして、２以上のチャネルが使用されてもよい。
【００５８】
本明細書で使用されるように、「チャネル」は、少なくとも部分的に流体の上記流れに向かわせる製品(基質)上、あるいはその製品(基質)内での特徴を意味する。上記チャネルは、任意の断面形状(円形，楕円形，三角形，不規則，正方形，あるいは長方形など)を有しうるし、カバーされるか、あるいはカバーされないようにすることができる。上記チャネルが完全にカバーされる実施形態では、チャネルの少なくとも一部分は、完全に囲まれる横断面を有しうる。あるいは、全チャネルは、その全長に沿って、その入口と出口を除いて、完全に閉じられてもよい。チャネルは、また、少なくとも約３：１、少なくとも約５：１、あるいは少なくとも約１０：１あるいはそれ以上の縦横比（平均横断面寸法に対する長さ）を有していてもよい。開いたチャネルは、液体輸送、例えば構造特性(長方形の刻み付け)および／または物理的あるいは化学的特性(疎水性対親水性)に対する制御を促進する特徴、あるいは流体上の力(例えばコンテイニングフォース（containing force)）を作用させることができる他の特徴を一般的に含む。上記チャネル内の流体は、部分的に、あるいは完全に上記チャネルを満たしてもよい。開いたチャネルが使用されるいくつかの場合では、上記流体は、例えば表面張力(つまり凹型か凸型のメニスカス)を使用して、上記チャネル内に保持されてもよい。
【００５９】
本発明で使用されるマイクロ流体システムの非限定的な実施例は、以下の特許出願の公開公報に開示されている。すなわち、「流体のスピーシーズの生成および制御」という発明の名称で２００５年１０月７日に出願された米国特許出願第１１／２４６，９１１号であって、２００６年７月２７日に発行された米国特許出願公報第２００６／０１６３３８５号；「流体分散のための方法および装置」という発明の名称で２００４年１２月２８日にファイルされた米国特許出願第１１／０２４，２２８号であって、２００５年８月１１日に発行された米国特許出願公報第２００５／０１７２４７６号；「流体のスピーシーズの電子制御」という発明の名称で２００６年２月２３日に出願された米国特許出願第１１／３６０，８４５号であって、２００７年１月４日に発行された米国特許出願公報第２００７／０００３４２号；「複数のエマルションを生成する方法および装置」という発明の名称で２００６年３月３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００７７７２号であって、２００６年９月１４日に発行された国際公開公報第ＷＯ２００６／０９６５７１号；「粒子を生成するシステムおよび方法」という発明の名称で２００６年３月３日に出願された米国特許出願第１１／３６８，２６３号であって、２００７年３月８日に発行された米国特許出願公報第２００７／００５４１１９号；「複数のエマルションおよび生成のための技術」という発明の名称で２００８年３月２８日に出願された米国特許出願第１２／０５８，６２８号であって、２００９年１月８日に発行された米国特許出願公報第２００９／００１２１８７号；そして、「コロイド粒子のような粒子中にカプセル化された流体の液滴を生成するためのシステムおよび方法」という発明の名称で２００６年１月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１９３８号であって、２００６年７月２７日に発行された国際公開公報第ＷＯ２００６／０７８８４１号である。これらの出願は、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、作成されるマイクロ流体システムは、液滴を操作するために使用されてもよい。例えば、いくつかの場合では、複数の液滴がスクリーンされる（screened）か、ソートされて（sorted）もよい。例えば、複数の液滴がスピーシーズを含む液滴のためにスクリーンされるかソートされてもよい。また、いくつかの場合では、上記液滴は、特有の数あるいは範囲の興味のあるスピーシーズのエンティティを含む液滴のためにスクリーンされるかソートされてもよい。液滴をスクリーンするおよび／またはソートするためのシステムおよび方法は、例えば上記したような以下の公報で、当業者に公知である。上記公報は、「流体のスピーシーズの電子制御」という発明の名称で、リンクらによって２００６年２月２３日に出願された米国特許出願第１１／３６０，８４５号に開示され、２００７年１月４日に発行された米国特許出願公開公報２００７／０００３４４２号である。これらの公報は、参照によって本明細書に組み込まれている。限定しない例として、デバイス(あるいはデバイスの一部)に第１の電場を適用する(あるいは除去する)ことによって、液滴が第１の領域あるいはチャネルに向けられてもよく; デバイス(あるいはデバイスの一部)に第２の電場を適用する(あるいは除去する)ことによって、液滴が第２の領域あるいはチャネルに向けられてもよく；デバイス(あるいはデバイスの一部)に第３の電場を適用することによって、上記液滴が第３の領域あるいはチャネルに向けられてもよいなど、上記電場は、例えば、強度、方向、周波数、デュレーション(duration)など、どこか異なっていてもよい。
【００６１】
別の局面では、液滴は、さらに分離され、または２以上の液滴に分割されてもよい。液滴を分離するための方法、システム、および技術は、例えば以下の特許出願で、当業者に公知である。上記特許出願は、２００４年４月９日にリンクらによって出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３号；２００３年８月２７日にリンクらによって出願された米国仮特許出願第６０／４９８，０９１号；２００３年６月３０日にストーンらによって出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２０５４２号であって、２００４年１月８日に国際公開公報第ＷＯ２００４／００２６２７号に記載されたものである。これらの特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれている。例えば、分割液滴は、適用された電場を使用して、分割されうる。上記電場は、ＡＣ場、ＤＣ場などでもよい。
【００６２】
いくつかの場合では、第１の液滴（例えば分割液滴)は、第２の液滴と融合され、あるいは合体されてもよい。例えば、１組の実施形態では、界面活性剤の組成物、表面張力、液滴直径、存在あるいは欠如などにより、２以上の液滴が通常融合し、結合できない場合、２以上の液滴（例えば、流体の不連続の流れから発生して)を１の液滴に融合させるか結合させることができるようなシステムおよび方法が供給される。他の実施形態では、液滴は流体の流れと融合されてもよい。例えば、チャネル内の流体の流れは、同じチャネルの１以上の液滴と融合されてもよい。特定のマイクロ流体システムでは、上記液滴の表面張力は、液滴の大きさに対して、いくつかの場合では、液滴の融合あるいは結合が生じるのを防いでもよい。当業者に知られている方法、システム、および／または技術、例えば以下の特許出願に開示されているものを使用して、２以上の液滴が融合あるいは結合されてもよい。上記特許出願は、「流体分散のための方法および装置」という発明の名称で、ストーンらによって２００４年１２月２８日に出願された米国特許出願第１１／０２４，２２８号であり、２００５年８月１１日に発行された米国特許出願公開公報２００５／０１７２４７６号に記載されたもの；「流体のスピーシーズの生成および制御」という発明の名称で、リンクらによって２００５年１０月７日に出願された米国特許出願第１１／２４６，９１１号であり、２００６年７月２７日に発行された米国特許出願公開公報２００６／０１６３３８５号に記載されたもの；「複数のエマルションを生成する方法および装置」という発明の名称で、ウェイツらによって２００７年８月２９日に出願された米国特許出願第１１／８８５，３０６号に開示され、２００９年３月２１日に発行された米国特許出願公開公報２００９／０１３１５４３号に記載されたもの；「流体のスピーシーズの電子制御」という発明の名称で、リンクらによって２００６年２月２３日に出願された米国特許出願第１１／３６０，８４５号に開示され、２００７年１月４日に発行された米国特許出願公開公報２００７／０００３４４２号に記載されたものである。これらの特許出願は、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれている。いくつかの場合では、第２の流体は、分割液滴内に注入されてもよい。これは、例えば、「流体注入」という発明の名称で、ウェイツらによって２００９年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２２０，８４７号に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００６３】
本発明の特定の局面によれば、様々な材料および方法は、本発明のシステムおよびデバイスの上記コンポーネントのうちのいずれかを形成するために使用できる。いくつかの場合では、上記選択された様々な材料は、様々な方法に向けられる。例えば、本発明の様々なコンポーネントは、固形物から形成することができる。この固形物において、上記チャネルは、マイクロマシニング（micromachining）、スピン・コーティング（spin coating）および化学蒸着のような膜蒸着プロセス、レーザーファブリケーション（laser fabrication）、フォトリソグラフィー技術（photolithographic techniques）、湿式化学プロセスおよびプラズマプロセスを含むエッチング法などにより、形成されうる。例えば、サイエンティフィックアメリカン、２４８：４４−５５、１９８３年(エーンジェルら)を参照のこと。一実施形態では、少なくとも流体システムの一部は、シリコーンチップ中のエッチングフィーチャー（etching features）によってシリコーンから形成される。本発明の様々な流体システムおよびデバイスのシリコーンからの正確で効率的な組立てについての技術は、知られている。他の実施形態では、本発明のシステムおよびデバイスの様々なコンポーネントは、ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）のようなエラストマーポリマー（elastomeric polymer）、ポリテトラフルオロエチレン（「ＰＴＦＥ」あるいはテフロン(登録商標))などから形成されうる。
【００６４】
異なるコンポーネントは、異なる材料で作られうる。例えば、底壁および側壁を含むベース部は、シリコーンまたはＰＤＭＳのような不透明な材料から作られ、トップ部は、流体プロセスの観察および／または制御のため、ガラスあるいは透明なポリマーのような透明な、あるいは少なくとも部分的に透明な材料から作られうる。コンポーネントは、所望の化学機能性を内部のチャネル壁に接触する流体にさらすために覆うことができる。基礎の支持材料は、正確で所望の機能性を有しない。例えば、内部のチャネル壁が別の材料で覆われて、上記のようにコンポーネントが作られうる。本発明のシステムおよびデバイスの様々なコンポーネントを作るために使用される材料、例えば流体チャネルの内部の壁を覆うために使用される材料は、上記流体システムを流れる流体によって悪影響を与えない、または影響されない材料、例えば上記デバイス内で使用される流体の存在下で化学的に不活性な材料の中から望ましいように選択されてもよい。
【００６５】
本発明の種々のコンポーネントは、ポリマー性および／または柔軟性および／またはエラストマー性の材料から形成され、硬化可能な流体で便利に形成され得、成型（例えば、レプリカ成型、注入成型、キャスト成型など）を介する形成を容易にする。硬化可能な流体は、流体ネットワークにおける、およびこれを伴う使用のために意図される流体を含み、および／またはそれを輸送することが可能である固体に、固化するように誘導可能であるかまたはそれに自発的に固化する、本質的に任意の流体であり得る。一実施形態では、硬化可能な流体は、ポリマー液体または液体ポリマー前駆体（すなわち、「プレポリマー」）を含む。適切なポリマー液体には、例えば、熱可塑性ポリマー、熱硬化性ポリマー、またはそれらの融点より上に加熱したかかるポリマーの混合物を含めることができる。別の例として、適切なポリマー液体は、適切な溶媒中に１種以上のポリマーの溶液を含んでもよく、この溶液は、例えば、蒸発による溶媒の除去の際に、固体ポリマー材料を形成する。例えば、融解状態から、または溶媒蒸発によって固化することができるかかるポリマー材料は当業者に周知である。その多くがエラストマー性である種々のポリマー材料もまた、型マスターの一方または両方がエラストマー材料から構成される実施形態のために、型または型マスターを形成するために適切である。かかるポリマーの例の非限定的なリストには、シリコーンポリマー、エポキシポリマー、およびアクリル酸ポリマーの一般的クラスのポリマーが含まれる。エポキシポリマーは、一般的にエポキシ基、１，２−エポキサイド、またはオキシランと呼ばれる３員環状エーテル基の存在によって特徴付けられる。例えば、ビスフェノールＡのジグリシジルエーテルは、芳香族アミン、トリアジン、および脂環式バックボーンに基づく化合物に加えて、使用することができる。別の例には、周知のＮｏｖｏｌａｃポリマーが挙げられる。本発明に従う使用のために適切なシリコーンエラストマーの非限定的な例には、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシランなどのようなクロロシランを含む前駆体から形成されるものが含まれる。
【００６６】
シリコーンポリマー、例えば、シリコーンエラストマー、ポリジメチルシロキサンが好ましい。ＰＤＭＳポリマーの非限定的な例には、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩによって商標シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）、および特に、
シルガード１８２、シルガード１８４、およびシルガード１８６で販売されているものが含まれる。ＰＤＭＳを含むシリコーンポリマーには、本発明のマイクロ流体構造の形成を単純化するいくつかの有益な特性を有する。例えば、かかる材料は安価であり、容易に利用可能であり、そして熱を用いる硬化を介してプレポリマー液体から固化することができる。例えば、ＰＤＭＳは、通例、例えば、約６５℃〜約７５℃の温度に、例えば、約１時間の曝露時間で、プレポリマー液体を曝露することによって硬化可能である。また、ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーは、エラストマー性でありえ、従って、本発明の特定の実施形態において必要である、比較的高いアスペクト比を有する非常に小さな特徴を形成するために有用であり得る。柔軟な（例えば、エラストマー性）成型またはマスターは、この点において有利であり得る。
【００６７】
ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーから本発明のマイクロ流体構造などの構造を形成する１つの利点は、例えば、空気プラズマなどの酸素含有プラズマへの曝露によってかかるポリマーを酸化させる能力であり、その結果、酸化された構造は、それらの表面において、他の酸化されたシリコーンポリマー表面に、または種々の他のポリマー材料および非ポリマー材料の酸化された表面に架橋可能である化学基を含む。従って、コンポーネントは、別々の接着剤または他のシール手段の必要性なしで、他のシリコーンポリマー表面、または酸化されたシリコーンポリマー表面と反応性である他の基材の表面に、形成可能であり、次いで酸化可能であり、そして本質的に不可逆的にシール可能である。多くの場合では、シーリングは、シールを形成するために補助的な圧力を適用する必要性なく、単に酸化シリコーンを別の表面に接触させることによって、達成することができる。すなわち、あらかじめ酸化したシリコーン表面が、適切な接合表面に対する接触接着剤として働く。具体的には、それ自体に対して不可逆的にシール可能であることに加えて、酸化ＰＤＭＳなどの酸化シリコーンもまた、それ自体以外の一連の酸化材料に不可逆的にシールすることができ、この材料には、例えば、ＰＤＭＳ表面へと同様の様式で（例えば、酸素含有プラズマへの曝露を介して）酸化されている、ガラス、ケイ素、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス状炭素、およびエポキシポリマーが含まれる。本発明の状況において有用である酸化方法およびシーリング方法は、全体の成型技術と同様に、当該分野において、例えば、参照により援用される、「Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌ
ｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ」という標題の論文、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７０：４７４−４８０，１９９８（ダフィら）において記載されている。
【００６８】
酸化シリコーンポリマーからの本発明のマイクロ流体構造（例えば、内部の、流動接触表面）を形成することに対する別の利点は、これらの表面が、典型的なエラストマーポリマーの表面（ここでは親水性の内部表面が所望される）よりもはるかに親水性であり得ることである。従って、かかる親水性チャネル表面は、典型的な、酸化されていないエラストマーポリマーまたは他の疎水性材料から構成される構造よりも、水溶液でより容易に満たし、かつ濡らすことができる。
【００６９】
一実施形態において、底壁は、１以上の側壁もしくは上面壁、または他のコンポーネントとは異なる材料から形成される。例えば、底壁の内部表面は、シリコンウェハもしくはマイクロチップの表面、または他の基材を含み得る。他のコンポーネントは、上記のように、かかる代替的な基材にシールすることができる。異なる材料の基材（底壁）にシリコンポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）を含むコンポーネントをシールすることが所望される場合、上記基材は、酸化シリコーンポリマーが不可逆的にシール可能である材料群（例えば、ガラス、ケイ素、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、エポキシポリマー、およびガラス状カーボンの酸化されている表面）から選択されてもよい。代わりに、当業者には明らかであるように、別個の接着剤、熱結合、溶剤結合、超音波溶接などの使用を含むがこれらに限定されない、他のシーリング技術を使用できる。
【００７０】
ウェイツらによって「液滴生成技術」という発明の名称で２００９年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２５５，２３９号は、そっくりそのまま参照によって本出願に組み込まれている。
【００７１】
以下の実施例は、本発明の或る特定の実施の形態の或る特定の態様を説明しようとするものであり、本発明の技術的範囲の全体を例示するものではない。
【００７２】
実施例１
以下の実施例は、１つの非限定的な実施形態による、複数の液滴の生成について記載する。特に、この実施例は、大きいエマルションライブラリを生成する制御され、拡張可能な方法を示す。この方法は、自動化され、ユーザによる介入をほとんど必要としない。また、並列処理され、ライブラリの迅速な作成を許容する。
【００７３】
この実施例では、上記方法は、図１に示すように３つのステップを有する。さらに、ライブラリは、特にこの実施例のために６つの識別可能な流体（あるいは６つの識別可能なスピーシーズを含む流体）を含む液滴を有する。ライブラリを生成するための異なる流体は、図１に示すように、個別のコンテナ１６に入れられる；これは、自動化されたピペット操作技術，ロボット，あるいは他の適切な技術を使用して行うことができる。
【００７４】
その後、各コンテナの溶液は、コンテナ１６から、６つの識別可能な流体と実質的に混合しない運搬流体２４で満たされた共通コンテナ４へ進む。このプロセスは、共通コンテナ４内で区別不能な液滴の６つのグループを生成する。ここで、上記グループ自体は、識別可能だが、各グループ内では、液滴の組成物は区別不能である。この例では、複数の液滴２が、この実施形態において、大きく、かつ多分散（そして必ずしもマイクロ流体液滴でない）であるように生成され、かつ、ほんの数分間で生成される。異なる液滴が実質的に混合することなく、液滴が共通のコンテナ４内に一緒に溜められることを可能にして、液滴間の流体の変換がなくてもよい。さらに、液滴が大きくなるように生成されるので、いくつかの場合では、標準の並列ピペッター(pipetters)、あるいは他の一般的に知られた技術を使用して、大量の液滴が、並列で、ほんの数秒間で生成されうる。
【００７５】
少なくとも複数の液滴２の一部は、液滴メーカ１０（例えばチャネル２０および２２を含む）に結合したマイクロ流体チャネル１８に一度に１つの液滴ずつ流れ込んでもよい。例えば、液滴１２は、マイクロ流体チャネル１８に入り、複数の分割液滴１４は、液滴１２からの流体の流れとして生成され、上記液滴メーカ１０を通過する。このプロセスは、任意の数の液滴（例えば液滴３０および３２）で繰り返されてもよいし、それによって、実質的に区別不能な実質的に単分散の複数の液滴６を生成する。分割前の液滴は、大きい、および／または多分散であってもよく、したがって、プラグ（例えば、流体の流れ）としてマイクロ流体チャネルを通って上記液滴メーカへ向けて流れてもよい。
【００７６】
液滴メーカ１０は、上記液滴を分割して、実質的に区別不能な複数の実質的に単分散の液滴を生成してもよい。したがって、様々な液滴は、各々が実質的に単分散および／または区別不能な複数の液滴を生成するために、上記液滴メーカを通ってもよい。これにより、分割液滴の複数のグループ（例えば、実質的に区別不能な組成物を有する、例えば、同じスピーシーズを運搬する液滴の分割によって生成された各グループ）を含む集合体６を生成する。いくつかの実施形態では、液滴メーカによって生成された分割液滴は、実質的に単分散で（例えば１％以内で）生成されてもよい。いくつかの場合では、実質的に単分散の液滴を生成するために、最初の複数の液滴が、分割液滴の所望の大きさより、はるかに大きくてもよい（例えば、少なくとも約５倍）。
【００７７】
さらに、この方法は、いくつかの場合では拡張可能である。分割前の複数の液滴は、標準の並列ピペッター、あるいは他の一般的に知られた技術を使用して、高度に並列化された態様で生成することができる。これは、ロボットを用いて、さらに速く遂行することができる。複数の液滴から分割液滴の生成も、例えば、一連のマイクロ流体液滴メーカあるいは分岐チャネルなどの中に複数の液滴を通すことにより並列化されうる。
【００７８】
実施例２
この実施例は、２つの液滴のグループの集合体を示し、各グループは、組成物によって区別できるが、各グループ自体の液滴は、組成的に区別不能である。
【００７９】
この限定しない実施例において、２つの水溶液が準備され、一方は、５ｍＭのブロモフェノール・ブルーを有する溶液を含み、他方が蒸留水を有する溶液を含む。上記溶液は、界面活性剤を有するＨＦＥ−７５００において予め乳化された。プレ−エマルション滴（pre-emulsion droplet）は、ＰＥ／５管材に取り付けられた幅広の針を有する注射器に充填された。より具体的には、プレ−エマルション滴を充填するため、管材は、大型クリップで圧着され、ピストンが注射器から取り除かれる。上記プレ−エマルションは、上記注射器の後部へ注ぎ込まれ、ピストンが再挿入されて、針が上を向くように、注射器が反対向きにされる。上記大型クリップは取り除かれ、注射器中のどのような空気も押し出される。ここまで、注射器は、澄んだ（例えば、水を有する）または青い（例えば、ブロモフェノール・ブルーを含む溶液を有する）液滴の集合体を含んでいた。上記液滴は、およそ２ｍｍの平均直径を有していた。その後、上記注射器は、注射器ポンプの上に置かれた。この注射器ポンプは、上記プレ−エマルションをマイクロ流体フローフォーカス液滴メーカに送り込み、追加の油が加えられた。上記プレ−エマルションおよび上記油の流量は、それぞれ７００ｕＬ／ｈｒおよび１１００ｕＬ／ｈｒであった。このプロセスは、個々の大きな液滴から複数の分割液滴を生成した。次に、分割液滴は、ＦＣ４０フルオロカーボン油を１ｍＬ入れた３ｍＬの注射器内に集められた。分割液滴は、上記注射器内に点滴注入され、トップまで上昇するクリームを生成した。大きな液滴の全てが分割液滴に分割された後、上記集合体注射器は、約３０秒間回転され、上記コンテナ内の分割液滴を均一に分配した。その後、分割液滴の小標本は、スライド・ガラス上に置かれ、明視野顕微鏡で撮像された（図２）。この画像では、液滴の２つの個体群、すなわち、澄んだ水を有する液滴と染料を有する液滴とがはっきり見える。上記液滴は、すべて、平均してほぼ同じ直径を有する。
【００８０】
実施例３
この実施例は、複数の液滴のグループを有する集合体を示し、各グループは、組成物によって区別できるが、各グループ自体の液滴は、組成的に区別不能である。
【００８１】
この実施例では、あらかじめ溶液を乳化するため、各溶液は、それぞれ、キャリアオイル（ＨＦＥ−７５００フルオロカーボン油）および界面活性剤（ペルフルオロ・ジ−ブロック・テイル（perfluorinated di-block tail）に付けられた親水性のＰＥＧヘッドグループ（head group）を有するＥ０６６５）で満たされたバイアル（vial）へピペットで移された。上記油へ溶液をピペットで移すプロセスは、界面活性剤により、合体に対して安定した大きな液滴を生成する。このプロセスは、各溶液から生成された液滴の区別可能なグループを有する大きな多分散の液滴の集合体を生成した。大きな液滴の集合体から、より小さな液滴（例えば分割液滴）の単分散の集合体を生成するために、大きな液滴は、マイクロ流体液滴メーカを使用して、さらに乳化された。そうするために、液滴メーカ・ノズルの横断面寸法が２５×２５ｕｍ（マイクロメートル）であるフローフォーカス液滴メーカが使用された。上記液滴メーカは、ソフトリソグラフィー（soft lithography）を使用して、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）の中で作り上げられる。フルオロカーボン油にデバイス表面を湿らせさせ、かつ水溶液をカプセルに入れさせるために、上記チャネルは、それらを疎水性にするために化学処理された。上記チャネルは、アクアペル（Aquapel）で満たされるとともに３０秒間その状態が維持されて、その後、超過したアクアペルを取り除くためにチャネルを通って空気が流された。それから、上記デバイスは、使用される前の５分間、６５℃にセットされたオーブン・セット内で加熱された。
【００８２】
大きな液滴の体積は、マイクロ流体液滴メーカの体積よりもはるかに大きかった。その結果、上記液滴メーカを流れたとき、大きな液滴は、流体の長く連続した流れ、つまり、プラグを生成した。上記流体の長いプラグは、実施例２に記載された方法と似た方法を使用して、単分散の複数の分割液滴を生成した。いくつかの場合では、理論によって拘束されずに、分割液滴が適度に多分散した集合体は、上記プラグの有限のサイズにより発生してもよい。例えば、プラグの端部で、所望の大きさに分割液滴を生成するのに十分な流体がなくてもよい。しかしながら、大きな液滴の体積が、分割液滴の少なくとも約５倍以上（例えば１００倍）の大きさである例では、生成された分割液滴は、単分散、あるいは実質的には単分散でありうる。例えば、約２ｍｍの直径を有する大きな液滴については、生成された分割液滴が約２０ｕｍの直径を有しているとき、大きな液滴は、分割液滴より約１００万倍大きく、したがって、そのような結果は多分散性にほとんど寄与しない。
【００８３】
複数の分割液滴は、ＦＣ４０フルオロカーボン油を有する集合体チャンバーへ集められ、したがって全ての分割液滴を一緒に集める。この例では、ＦＣ４０油の存在は、液滴の表面張力を増加させ、液滴をより固くするとともにせん断に対して強くし、また、連続相の中への溶質の分割を減らして、カプセル化を促進した。分割液滴がすべて集められた後、上記集合体チャンバーは、チャンバー内の液滴を均等に分配するために、約３０秒間軽く回転された。
【００８４】
いくつかの場合では、大きな液滴の生成のために使用される油および界面活性剤の合成物は、結合に対して液滴が安定するように選択されることを保証するのが重要かもしれない。この実施例では、図３Ａに示すように、ＰＥＧ−ペルフルオロ−ジブロック（diblock）界面活性剤を有するＨＦＥ−７５００の使用は、大きな液滴の非常に安定した集合体を生成することがわかった。この図３Ａは、蒸留水（透明）およびブロモフェノール・ブルーに染められた（濃い藍色）液滴から成る、パックされたプレ−エマルション（pre-emulsion）のイメージを示している。しかしながら、当然のことながら、液滴の安定した集合体は、様々な他のフルオロカーボン、炭化水素、シリコーン油および界面活性剤で作られうる。さらに、異なる油が異なる比重をしばしば有するので、プレ−エマルションに使用される上記油および界面活性剤は、マイクロ乳化ステップに使用されるものと同じである必要はない。これは、望まれない相が遠心分離で分離されることを許容する。これは、油と界面活性剤の選択に関して上記方法を非常に柔軟にする。
【００８５】
いくつかの場合では、液滴が上記マイクロ流体液滴メーカに入るちょうど前に、大きな液滴の集合体から望まれない微粒子を取り除くことがさらに重要である。これは、上記マイクロ流体液滴メーカが狭いチャネルを含み、フィルタの欠如が上記デバイスの詰まりにつながるかもしれないからである。典型的なマイクロ流体フィルタは、ずらりと並んだポストを備え、これらのポストは、ポストの間に狭いギャップを有する。；このポストは、望まれない粒子をろ過しつつも、流体がまわりに流れることを許容し、上記液滴メーカへ流す。そのようなフィルタは、液滴が上記フィルタを通過するとき、大きな液滴を小さな多分散の液滴に分割するだろう。その後、小さな多分散の液滴は、上記マイクロ流体液滴メーカに入り、分割液滴の多分散のライブラリが形成されることとなる。大きな液滴が上記フィルタによって分割されるのを回避するために、大きな液滴が分割されるのを防ぐ一方で、任意の粒子も取り除く専用のフィルタが生成された。このフィルタは、ポスト間に、液滴メーカへの異なる経路の長さを有し、したがって、異なる流体抵抗を有するギャップを備えている。上記フィルタのイメージは、図３Ｂに示される。より具体的には、図の最も左側のギャップは、最短経路長および最小の流体抵抗を有する。一方、図の最も右側のギャップは、最長経路長および最大の流体抵抗を有する。結果として、大きな液滴が上記フィルタに入るとき、それは最初のギャップのみを通って流れて、連続的なプラグのままである。粒子がフィルタに入ると、この粒子は上記最初のギャップに捕まって、最小の流体抵抗である次の経路になる次のギャップに流れを迂回させる。このフィルタは、大きな液滴をそのままにしておく一方、粒子を取り除くことができる。
【００８６】
この方法の有効性およびこの方法により、大きな液滴の集合体から生成される複数の分割液滴の生成が容易になされることのデモンストレーションとして、８つの異なる組成物を有する液滴の集合体が生成された。異なる組成物を生成するために、異なる濃度の２つの蛍光染料（緑色色素（fluorocien）および赤色色素（Alexafluor 680（登録商標）））から成る水溶液が使用された。８つの異なる液滴タイプは、２つの異なる濃度の緑色色素および４つの濃度の赤色色素を有していた。上記溶液は、上記のような大きな液滴内に形成され、その後、大きな液滴は、上記のような複数の分割液滴（平均直径３５ｕｍ）に分割された。生成された分割液滴は、ＦＣ４０を含む注射器内に集められ、液滴を均等に分配するために３０秒間回転し、次に２分間クリーム状になることを許容され、２分を超えると、より軽い水の液滴が注射器の上部へ浮かび、一方で、より重いフルオロカーボン油は沈む。その後、ぎっしり詰まった分割液滴は、幅１０００ｕｍ、高さ２５ｕｍのマイクロ流体チャネルに再注入された。平均液滴直径が上記チャネルの高さを超過したので、上記分割液滴は、単分子層として流れ、各液滴が個々に撮像されることを許容する。
【００８７】
上記液滴中の蛍光染料を励起するため、ダブルバンド励起フィルタ（double band excitation filter）とダイクロックイミラー（dichroic mirror）とを備えた落射蛍光顕微鏡(epi-fluorescence microscope)が使用された。；上記光学コンポーネントは、波長４８０＋／−１０ｎｍおよび６６０＋／−１０ｎｍ（それぞれ、緑色色素および赤色色素の励起バンド）をサンプル内へ反射させ、一方で、上記サンプルから発せられた光が通過出来るようにしている。発せられた光は、逆方向における対象によって捕らえられ、２台のＣＣＤカメラによって撮像された。上記カメラに達する前に、上記光は、緑色光を反射するとともに赤色光を通すハイパスのダイクロイックミラー（５６０ｎｍ）にぶつかった。上記緑色光は、１台のカメラに到達する前に５４０＋／−１０ｎｍの吸収フィルタを通過するとともに、上記赤色光は、第２のカメラに到達する前に６９０＋／−１０ｎｍの吸収フィルタを通過した。カメラおよびこの光学セットアップ（optical setup）で、上記分割液滴中の緑色および赤色の蛍光は、同時に撮像された。図４Ａおよび図４Ｂは、上記分割液滴の緑色および赤色のチャネルイメージ（channel images）をそれぞれ示している。
【００８８】
液滴の強度を測定するために、画像解析技術が、上記液滴の特定にまず使用され、次に、上記緑色および赤色の両者のイメージ中の各液滴の強度を測定する。緑色および赤色の強度値は、各液滴用にデータ・ファイルに格納された。上記緑色および赤色のチャネル用の強度ヒストグラムは、図５Ａおよび図５Ｂ中にそれぞれ示される。デザインされたように、各染料の異なる濃度に対応して、緑色のチャネルは、２つのピークを示し、赤色のチャネルは、４つのピークを有する。８つの組み合わせが上記液滴用の光学ラベルとして使用されうることを実証するために、図５Ｃ中の各液滴について、緑色の強度は、赤色の強度に対比してプロットされた。８つの異なる領域へ分けられたポイントの各々は、ユニークなカラーコードに相当する。
【００８９】
本発明の複数の実施形態を本明細書で記載および例証したが、当業者は、機能を実施するためのおよび／または本明細書に記載した結果および／または利点の１つ以上を得るための、多種多様の他の手段および／または構造を想定するであろうし、このような変更形態または修飾形態は、それぞれ本発明の範囲内であると見なされる。さらに一般的には、本明細書中で説明したすべてのパラメータ、寸法、物質、および構成は例を示すためのものであり、実際のパラメータ、寸法、物質および構成が本発明の教示を使用する特定の用途に依存することは当業者には自明であろう。単なる慣用的な実験操作を用いて、当業者は本明細書中に説明した本発明の特定の実施形態に等価な多くのものを認識し、あるいは確かめることができよう。したがって、これまでに説明した実施形態は、例を示すためにだけ提示したものであり、本発明は添付の請求項および請求項への等価物の範囲内で、具体的に説明したものおよび／または請求項に記載したものとは異なった方法で実施されることがあることが理解される。本発明は本明細書中で説明した個々の機能、システム、物質および／または方法を目的とする。さらに、そのような機能、システム、製品、物質および／または方法の二つの以上の任意の組み合せは、そのような機能、システム、製品、物質および／または方法が相互に矛盾しないなら、本発明の範囲に含まれる。
【００９０】
本明細書にて使用するようなすべての定義は、本開示の目的のためだけである。これらの定義は、この開示に関連する、または関連しないにかかわらず、同一出願人による他の特許および／または特許出願に、必ずしも帰属させるべきではない。本明細書にて定義され使用されるすべての定義は、辞書による定義、言及によって本明細書に組み込まれた文献における定義、および／または定義された用語の通常の意味に優先することを理解すべきである。
【００９１】
また、明らかにそれとは反対に指摘されない限り、ここに請求する１以上の行為を含む方法について、上記方法における行為の順序が、必ずしも上記方法の行為についての記載の順序に限定されないことも理解されるべきである。
【００９２】
特許請求の範囲、ならびに本明細書では、「を備える、有する、含む（comprising）」、「を含む、有する（including）」、「を運搬する（carrying）」、「を有する（having）」、「を包含する（involving）」、「を保持する（holding）」などのようなすべての移行句は開放形すなわち、含むが限定されない、を意味すると理解される。米国特許庁特許審査基準の２１１１．０３節に示されているように、移行句のうち「からなる（consisting of）」および「基本的にからなる（consisting essentially of）」だけを、それぞれ閉鎖形または半閉鎖形の移行句とする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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