(57)【要約】  本発明は、個体がパーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているかどうかを特定する方法に関する。特に、本発明は、個体が、ＰＤに罹患しているか否かを疾患の発症前段階で特定するための方法、又はＰＤを他の神経学的疾患から鑑別するための方法に関する。本発明の方法は、個体から採取された脳脊髄液サンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマー量を測定することを含む。本発明は、また、任意によりＣＳＦサンプル中の総α−シヌクレイン量を測定すること、総α−シヌクレイン量に対するα−シヌクレインオリゴマー量の比を計算すること、及びそれによって個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することを含む。本発明の方法は、ＰＤの動物モデル及びヒトのＰＤ患者の両方において、薬剤の効果を測定するための臨床試験に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体がパーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているか否かを特定する方法であって、個体から採取された脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマー量を測定し、それによって個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することを含む、方法。
【請求項２】
個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することが、サンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマー量が、非ＰＤ個体から採取されたサンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマーの量と比べて増加しているか否かを判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマー量が、非ＰＤ個体から採取されたサンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマーの量と比べて少なくとも２倍増加している場合に、個体がＰＤに罹患していると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＳＦサンプル中の総α−シヌクレイン量を測定すること、
【数１】
2013504766.tif 000004
比を計算すること及びそれによって個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することが、当該比が、非ＰＤ個体から採取されたサンプル中の比と比べて増加しているか否かを判定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
当該比が、非ＰＤ個体から採取されたサンプル中の比と比べて少なくとも３倍増加している場合に、個体がＰＤに罹患していると判定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することが、当該比が、パーセンテージで表現された場合、少なくとも６％であるか否かを判定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記方法がＰＤとＰＤではない他の神経学的疾患とを鑑別するためのものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
個体が、ＰＤ又はＰＤではない他の神経学的疾患を発症するリスクがあると疑われている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
個体がＰＤか、又はＰＤではない他の神経学的疾患の家族歴を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体が（ａ）ＰＤの診断に関連するいずれの臨床症状も有しないか、又は該症状と診断されていない、或いは（ｂ）ＰＤのいずれか１つの非運動症状を有するか、又は該症状と診断されている、或いは（ｃ）ＰＤではない他の神経学的疾患に関連する１以上の症状を有するか、又は該症状と診断されている、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
個体がホーエン−ヤールのグレード２又はそれ未満に分類される者である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＳＦサンプル中のα−シヌクレインオリゴマーを検出するための方法であって：
−  ＣＳＦサンプルを、固相上に固定された、第一のα−シヌクレイン結合試薬とインキュベートすること
−  固定されておらず、且つ、第一の試薬と同一か又は重複するα―シヌクレイン上の部位に結合する第二のα−シヌクレイン結合試薬を用いて、結合したα−シヌクレインを検出すること
を含む方法。
【請求項１４】
α−シヌクレイン結合試薬がα−シヌクレイン特異的モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＳＦサンプル中のα−シヌクレインオリゴマーを検出するための方法であって：
−  ＣＳＦサンプルを、アミロイドオリゴマーに特異的であるが、α―シヌクレインには特異的に結合しない、固相上に固定された第一の試薬とインキュベートすること
−  固定されておらず、且つα−シヌクレインタンパク質に特異的に結合するα−シヌクレイン結合試薬を用いて、結合したα−シヌクレインオリゴマーを検出すること
を含む方法。
【請求項１６】
個体におけるＰＤの症状の発症を遅延又は予防する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定すること；及び
（ｉｉ）（ｉ）においてＰＤに罹患していると特定された個体に対して、治療有効量の、α−ｓｙｎの凝集及び／又は毒性を直接的又は間接的に阻害する薬剤、α−ｓｙｎタンパク質の発現を低下させる薬剤、α−ｓｙｎ凝集体の分解を直接的又は間接的に亢進又は刺激する薬剤、又は神経保護薬を投与すること
を含む方法。
【請求項１７】
神経保護薬が抗アポトーシス剤、抗酸化剤、抗グルタミン酸剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、アデノシン拮抗薬、ドーパミン作動薬、ミトコンドリア安定化薬又は栄養素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
神経保護薬がラサギリン、セレギリン、ロピニロール、プラミペキソール、ニコチン、ミノサイクリン、クレアチン、カフェイン、又はコエンザイムＱ１０である、請求項１５、１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
個体がＰＤに罹患しているか否かを判定するための方法に使用するための試験キットであって、ＣＳＦサンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマーを検出するための手段を含む、キット。
【請求項２０】
ＣＳＦサンプル中の総α−シヌクレイン量の測定のための手段を更に含む、請求項１９のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、個体がパーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているか否かを特定する方法に関する。特に、本発明は、個体がＰＤに罹患しているか否かを疾患の発症前段階において特定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性疾患である。ＰＤの最も初期の臨床的特徴は、典型的にレトロスペクティブに特定され、且つＰＤに特異的ではない。これらの症状は、典型的には、便秘、鬱病、嗅覚障害、及び睡眠障害等の非運動症状である。
【０００３】
より一般的に認識されているＰＤの症状は、ブラジキネジア、筋肉振戦、強剛及び平衡障害等の運動症状である。これらの症状は当該疾患においてかなり後、既に脳への重大な損傷が生じる時まで現れない。確かに、中脳中の黒質ニューロンの少なくとも７０％は、このタイプの症状の出現に先立って失われるはずである。それでも、運動症状の最初の兆候はかすかなものであり得、数ヶ月間又は数年間にわたって気付かれないこともあり得る。
【０００４】
生存中、ＰＤの正確な臨床診断は相当困難であり、症例中のほんの約８５％が正しいにすぎない。結果として、有効な病態修飾療法の発見が妨げられる。ＰＤの診断について現在得られる最も進展した方法は、放射性核種を用いるイメージングに基づいている。これらの方法は費用がかかり、またそれらが、根底にある病的過程をどれほど厳密に反映しているかはいまだ議論の余地がある。
【０００５】
現在のところ、個体がＰＤに罹患しているか否かを確実に判定できる試験は無い。特に、ＰＤの初期（発症前）段階の間、脳への過剰な障害が生じてしまう前に、個体が当該疾患に罹患しているか否かを判定できる試験は無い。
【０００６】
従って、生体に用いることができる、ＰＤの確実な検査の開発については、長年にわたるニーズがある。ＰＤの初期（発症前）段階の間に、個体が当該疾患に罹患しているか否かを判定できる試験については、とりわけニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要旨
ＰＤの家族性症例における、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）をコードする遺伝子中の突然変異の発見により、特発性ＰＤの病因におけるα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）タンパク質の重要な役割が初めて示唆された。より最近には、遺伝学的研究により、ＳＮＣＡにおける稀な３重化のイベントが、レビー小体型の変化を伴う認知症の特徴をも示す、若くして発症する重篤型の家族型ＰＤと関連し得ることも明らかとなった。更に重複突然変異によって、家族型ＰＤの、遅発性の特発性ＰＤによりよく似る表現型が惹起される。これらの研究を総合すると、野生型α−ｓｙｎの発現上昇によってＰＤ発症のリスクが高まること、またα−ｓｙｎのタンパク質レベルが、パーキンソン病表現型の進行度及び重篤度の重要な決定要因であるかもしれないことが示される。
【０００８】
人口データによっても、ＳＮＣＡ遺伝子座における一般的な遺伝的変異性が散発性ＰＤのリスクファクターであることが証明される。更に、末期ＰＤを最もよく特徴付ける神経病理学的病変（レビー小体（ＬＢ））は、主として繊維状α−ｓｙｎの沈着で構成される。しかしながら、α−ｓｙｎは主に神経細胞で発現し、細胞質の、且つ脂質小胞に結合したタンパク質として存在すると一般に考えられており、診断マーカーとしてそれを使用することを妨げる傾向にあった。
【０００９】
α−ｓｙｎは実際に、通常神経細胞により放出されヒトの脳脊髄液（ＣＳＦ）及び末梢血血漿に存在するが、ＰＤに罹患している患者から採取したＣＳＦ中のα−ｓｙｎレベルは、年齢をマッチさせたコントロールのものと比較して減少していることがわかったことが最近示された。
【００１０】
成熟アミロイド原繊維よりもむしろ、神経変性疾患に関連するアミロイド生成性タンパク質の可溶性オリゴマーが、神経細胞死を惹起する病原性種であることを示唆する証拠がある。最近、ＰＤ及びレビー小体を有する認知症（ＤＬＢ）の死亡患者の脳ホモジェネート中では、正常な脳由来のホモジェネートと比べて、可溶性のα−ｓｙｎオリゴマーが上昇していることが示された。更に、ＣＳＦにおける結果とは対照的に、血漿中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーレベルは、ＰＤ患者において、コントロールと比較して上昇していることが最近わかった。注目すべきは、ＰＤ患者から得られる血漿中のα−ｓｙｎオリゴマーレベルには非常にばらつきがあり、コントロール由来サンプル中のものとかなり重なっていたことである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そうではあったが、本発明者は、生存するＰＤ患者と、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及びアルツハイマー病（ＡＤ）の患者並びにコントロールの正常被験者を含む、年齢をマッチさせた被験者とから採取したＣＳＦ中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーレベルを比較した。同一サンプル中の全体的なα−ｓｙｎタンパク質レベルを測定するために、総α−ｓｙｎのレベルも測定した。本発明者は、可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量及び当該オリゴマー量と総α−ｓｙｎ量との比が、生存するＰＤ患者由来ＣＳＦサンプル中では、年齢をマッチさせた正常のコントロール由来のＣＳＦサンプルと比較して有意に増加したことを見出した。本発明者は、可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量が、ＰＤ患者由来ＣＳＦサンプル中では、年齢をマッチさせた他の神経学的疾患の患者由来のＣＳＦサンプルと比較して有意に増加することも見出した。
【００１２】
即ち、本発明は：
個体がパーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているか否かを特定する方法であって、個体から採取された脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量を測定し、それによって個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することを含む、方法を提供する。典型的には、当該方法は、パーキンソン病をＰＳＰ又はＡＤ等の他の神経学的疾患から鑑別することを含んでいてもよい。当該方法においては、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することは、サンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーの量又はレベルが、非ＰＤ個体から採取されたサンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーの量又はレベルと比べて増加しているか否かを判定することを含んでいてもよい。例えば、サンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量は、非ＰＤ個体から採取されたサンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量と比べて少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍だけ増加し得る。
【００１３】
１つの実施形態においては、当該方法はＣＳＦサンプル中の総α−シヌクレイン量を測定すること、
【００１４】
【数１】
2013504766.tif 000002
【００１５】
比を計算すること及びそれによって個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することを更に含む。
【００１６】
当該方法においては、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することは、総α−ｓｙｎ量に対するα−ｓｙｎオリゴマー量の比が、正常の個体から採取されたサンプル中の比と比べて増加しているか否かを判定することを含んでいてもよい。例えば、当該比は、非ＰＤ個体から採取されたサンプルにおける比と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍又は少なくとも３倍だけ増加し得る。
【００１７】
或いは、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定することは、当該比が、パーセンテージで表現された場合、少なくとも５％であるか否か、好ましくは少なくとも６％であるか否か、より好ましくは少なくとも７％であるか否かを判定することを含んでいてもよい。
【００１８】
本発明の方法においては、被験体の個体は、ＰＤ発症のリスク或いはＰＳＰ又はＡＤ等の他の神経学的疾患のリスクがあると疑われていてもよい。当該個体はＰＤの家族歴を有していてもよい。当該個体は、ＰＤ或いはＰＳＰ又はＡＤ等の他の神経学的疾患の診断に関連する任意の臨床症状を有していても（又はそれと診断されていても）、より典型的には、いなくてもよい。当該個体は、いずれか１つのＰＤの非運動症状を有していても（又はそれと診断されていても）、いなくてもよい。当該個体は、典型的にはホーエン−ヤールのグレード２又はそれ未満に分類されていてもよい。
【００１９】
本発明は、また、ＣＳＦサンプル中のα−ｓｙｎオリゴマーを検出するための方法であって：
−  ＣＳＦサンプルを、固相上に固定されている第一のα−ｓｙｎ結合試薬とインキュベートすること
−  固定されておらず、且つ第一の試薬と同一か又は重複するα―シヌクレイン上の部位に結合する第二のα−ｓｙｎ結合試薬を用いて、結合したα−シヌクレインを検出すること
を含む方法も提供する。
【００２０】
本発明は、また、ＣＳＦサンプル中のα−ｓｙｎオリゴマーを検出するための方法であって：
−  ＣＳＦサンプルを、アミロイドオリゴマーに特異的であるが、α―シヌクレインには特異的に結合しない、固相上に固定されている第一の試薬とインキュベートすること
−  固定されておらず、且つα−シヌクレインタンパク質に特異的に結合するα−シヌクレイン結合試薬を用いて、結合したアミロイドオリゴマーを検出すること
を含む方法を提供する。
【００２１】
この実施形態においては、当該第一の試薬は、典型的にはアミロイドオリゴマーのα−シヌクレインではないコンポーネントに特異的に結合する。例えば、当該第一の試薬はβ−アミロイドタンパク質、ハンチントンタンパク質又はアミリンタンパク質に特異的に結合し得る。
【００２２】
当該方法において、α−ｓｙｎ結合試薬は、α−ｓｙｎに特異的なモノクローナル抗体、任意には標識された抗体であってもよい。
【００２３】
本発明は、また、個体においてＰＤ症状の発症を遅延させるか、又は予防する方法であって；
（ｉ）本発明による方法を用いて、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定すること；及び
（ｉｉ）（ｉ）においてＰＤに罹患していると特定された個体に、治療有効量の、α−ｓｙｎの凝集及び／又は毒性を直接的又は間接的に阻害する薬剤、α−ｓｙｎタンパク質の発現を低下させる薬剤、α−ｓｙｎ凝集体の分解を直接的又は間接的に亢進又は刺激する薬剤、或いは神経保護薬を投与すること
を含む方法も提供する。
【００２４】
当該方法においては、神経保護薬は抗アポトーシス剤、抗酸化剤、抗グルタミン酸剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、アデノシン拮抗薬、ドーパミン作動薬、ミトコンドリア安定化薬又は栄養素であり得る。
【００２５】
神経保護薬はラサギリン、セレギリン、ロピニロール、プラミペキソール、ニコチン、ミノサイクリン、クレアチン、カフェイン、又はコエンザイムＱ１０であり得る。
【００２６】
本発明は、また、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定するための方法に使用するための試験キットであって、ＣＳＦサンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーを検出するための手段を含む、キットも提供する。
【００２７】
当該キットは、ＣＳＦサンプル中の総α−ｓｙｎ量の測定のための手段を更に含んでいてもよい。
【００２８】
本発明の方法又は試験キットは、ＰＤのモデル動物及びヒトのＰＤ患者の両方において、薬剤効果を測定するための臨床試験に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図面の要旨
【図１】図１は、ＰＤ患者（黒丸）由来及びコントロール（白丸）由来のＣＳＦ中の総α−シヌクレインレベル（Ａ）、α−ｓｙｎオリゴマーレベル（Ｂ；ＲＬＵ＝相対発光単位）及び総α−ｓｙｎに対するα−ｓｙｎオリゴマーの比（Ｃ；オリゴマー／総量  比、％）についての個々の値を示す。それぞれのバーは平均値を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）における点線は、受信者操作特性曲線（図２参照）により特定された、最も確実な感度及び特異度が得られる、それぞれのカットオフ値を示す。
【図２】図２。ある範囲のカットオフ値にわたる、ＰＤのコントロールからの鑑別における、ＣＳＦα−ｓｙｎオリゴマーレベル（白四角）及びＣＳＦ中の総α−ｓｙｎに対するα−ｓｙｎオリゴマーの比（白丸）についての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線、矢頭は最も適切な感度及び特異度をもたらすカットオフ値を示す。
【図３】図３は、ＰＤ（ｎ＝２５）、ＰＳＰ（進行性核上麻痺；ｎ＝１８）、ＡＤ（アルツハイマー病；ｎ＝３５）に罹患した患者及び正常なコントロールの被験者（ｎ＝４３）を含む第二被験者群由来のＣＳＦ中のα−ｓｙｎオリゴマーレベルの個々の値を示す。それぞれのバーは平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は被験体がＰＤに罹患しているか否かを特定する方法に関する。従って、本発明は各被験体におけるＰＤの検出に関する。典型的には、当該個体は哺乳動物である。典型的には、当該哺乳動物はヒト或いはウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ又はネコ等の家畜哺乳動物である。当該個体は、好ましくはヒトである。当該個体は最大３０歳、最大４０歳、最大５０歳、最大６０歳又は最大７０歳であり得る。当該個体の年齢は３０〜４０歳、３０〜５０歳、３０〜６０歳又は３０〜７０歳であり得る。当該個体の年齢は４０〜５０歳、４０〜６０歳又は４０〜７０歳であり得る。当該個体の年齢は５０〜６０歳又は５０〜７０歳であり得る。
【００３１】
個体はＰＤに関連する臨床症状を示していなくてもよく、また個体は以下の１以上の症状を示していてもよい：
【００３２】
一次的運動症状
ＰＤの診断に関しては、現在の臨床診療では、典型的に少なくとも１つの一次的運動症状の存在が必要である。一次的運動症状は：
（ｉ）静止時振戦：パーキンソン病の人の約７０％は軽度の振戦に見舞われるが、これは多くの場合、特定可能な最初の症状である。振戦は、典型的には身体の片方の手又は足のいずれかに、或いは頻度は低いものの、顎又は顔に生じる。振戦は、「脈動」又は揺動運動として出現する。パーキンソン病の振戦は、通常、人の筋肉が弛緩したときに出現し、したがって「静止時振戦」と呼ばれる。典型的には、身体の罹患部が動作していないときに震えが生じ、そして人が行動を始めるとその震えは弱まる。当該振戦は多くの場合、疾患の進行につれて身体の他方の側へと広がるが、依然、生じた元の側で最も顕著である。
（ｉｉ）ブラジキネジア（動作緩慢）：患者は著しく緩慢な動作を示す。動作緩慢に加えて、ブラジキネジアの人はまた、典型的に動作が不完全で、動作開始が困難で、且つ継続中の動作の急停止が困難でもある。ブラジキネジアに罹患している人々は、小刻みに引きずって歩くことがある（加速歩行）。ブラジキネジア及び強剛は顔面の筋肉に起こり得、人の顔の表情の幅を減少させ、「仮面のような」風貌を生じる。
（ｉｉｉ）強剛：筋緊張亢進とも呼ばれ、筋肉の硬化又は柔軟性が無いことを意味する。強剛においては、罹患した手足が緊張し筋肉が常にこわばって弛緩せず、時に運動の範囲が減少する。例えば、強剛を有している人は、筋肉が硬すぎるので、歩行時に腕を振ることができない場合がある。強剛は疼痛及び筋痙攣を惹起し得る。
（ｉｖ）姿勢の不安定：（平衡障害及び協調障害）ＰＤに罹患している被験体は多くの場合、起立時に不安定感に見舞われるか、又は平衡障害及び協調障害になる。これらの症状により、ブラジキネジア等の他の症状と相まって転倒の危険性が増加する。平衡障害の被験体は、曲がること又は運動を突然にすることが困難であり得る。当該被験体は、歩行開始の困難を覚える「フリーズ」の時間に見舞われ得る。動作緩慢及び動作不完全は会話及び嚥下にも影響し得る。
【００３３】
二次的運動症状
ＰＤの被験体すべてが二次的運動症状に見舞われるわけではない。しかしながら典型的には、大抵の被験体は以下：
−前かがみの姿勢、前傾になる傾向
−筋失調症
−疲労
−細かい動きの器用さ及び運動協調の障害
−粗大運動協調障害
−運動欠乏（腕振り低下）
−静座不能
−筋肉の制御の欠如により惹起される声のか細さ又は不明瞭な発語等の会話障害
−顔面の表情喪失、又は「仮面」
−小字症（小さく、判読できない筆跡）
−嚥下困難
−性機能不全
−流涎
の１以上を示す。
【００３４】
非運動症状
多くの非運動症状がＰＤと関連している。しかしながら、これらの症状はＰＤに特異的ではなく、典型的に、レトロスペクティブにＰＤを示すものとして特定されるにすぎない。即ち、被験体が見舞われる非運動症状は、典型的には、一次的及び二次的運動症状の存在が特定された後になって初めて、ＰＤを示すものとして認識される。それでも、ＰＤ患者は、典型的には以下：
−疼痛
−認知症又は精神錯乱
−睡眠障害（例、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ））
−嗅覚障害
−便秘
−皮膚障害
−鬱病
−恐怖症又は不安症
−記憶障害及び思考力の減退
−泌尿器系障害
−疲労及び疼痛
−精力喪失
−脅迫行動（例、賭博）
−筋痙攣
の１以上を示す。
【００３５】
検査個体は、典型的には、ＰＤの一次的運動症状のいずれにも罹患していないか、又はそのいずれとも診断されていない。好ましくは、当該個体はまた、ＰＤの二次的運動症状のいずれにも罹患していないか、又はそのいずれとも診断されていない。
【００３６】
個体は、ＰＤの１以上の非運動症状又は二次的運動症状の存在のために、ＰＤ発症のリスクがあると疑われていてもよい。
【００３７】
当該個体は、ホーエン−ヤールの尺度に従って分類されていても、されていなくてもよい。ホーエン−ヤールの尺度は、パーキンソン病の症状がどれだけ進行しているのかを記述するための、一般的に用いられるシステムである。当該尺度は、０〜５のステージを当てて、身体障害の相対的レベルを表示する：
−  ステージ１：身体の片側のみにおける症状。
−  ステージ２：身体の両側における症状。平衡障害は無し。
−  ステージ３：平衡障害。軽度から中度の疾患。身体的には自立。
−  ステージ４：重篤な身体障害、しかし依然として無介助で歩行又は起立可能。
−  ステージ５：無介助では車椅子又は寝たきり。
分類した場合、ホーエン−ヤールの尺度では、当該個体は典型的にはグレード２又はそれ未満である。
【００３８】
個体は、英国パーキンソン病協会脳バンクの基準に従って、ＰＤと診断されていてもよいし、されていなくてもよい。これらの基準は：
ステップ１：パーキンソン症候群の診断
−  ブラジキネジア
−  以下の少なくとも１つ
−  筋強剛
−  ４〜６ヘルツの静止時振戦
−  一次視覚野、前庭、小脳、又は固有受容器の機能不全によって惹起されない不安定姿勢
ステップ２：パーキンソン病をパーキンソニズムの原因としては排除する傾向がある特徴の同定
−  パーキンソン病の病徴の段階的進行を伴う、度重なる脳卒中歴
−  度重なる頭部外傷歴
−  確定脳炎歴
−  注視発症
−  症状発症時の神経弛緩薬治療
−  １人より多い罹患親族
−  持続的寛解
−  ３年後の厳密な片側性病徴
−  核上性注視麻痺
−  小脳徴候
−  重症の早期自律神経障害
−  記憶障害、言語障害、及び習慣障害を伴う重症の早期認知症
−  バビンスキー徴候
−  画像検査における脳腫瘍又は交通性水頭症の存在
−  吸収不良の非存在下、レボドパ大量投与への陰性反応
−  ＭＰＴＰ（１−メチル  ４−フェニル  １，２，３，６−テトラヒドロピリジン）への曝露
ステップ３：パーキンソン病診断を支持する特徴の同定（パーキンソン病の確定診断にはステップ１を伴って、３つ以上が必要である）：
−  片側性の発症
−  静止時振戦の存在
−  進行性疾患
−  発症側を最も侵襲する持続性の非対称性
−  レボドパに対する良好な応答（７０−１００％）
−  重篤なレボドパ誘導性舞踏病
−  ５年間以上のレボドパ応答
−  １０年間以上の臨床経過
【００３９】
当該個体は、ＰＳＰ又はＡＤ等の他の神経学的疾患に罹患している又はそれを発症するリスクがあると疑われていても、いなくてもよい。当該個体はそのような疾患か、又はそのような疾患に関連する１以上の症状と診断されていても、されていなくてもよい。
【００４０】
個体は、ＰＤへの罹患のしやすさを増大させる１以上の要因の存在のために、ＰＤを発症するリスクがあると疑われていてもよい。
【００４１】
例えば、当該個体はＰＤの家族歴を有していてもよい。大規模な疫学的研究により、親兄弟等、罹患した一親等血縁者がいる人々は、一般の集団と比較してパーキンソン病発症リスクが２〜３倍増大することが証明されている。
【００４２】
当該個体はＰＤに関連する遺伝子又は遺伝子座において突然変異又は多型を有していてもよい。例えば、当該個体は以下の遺伝子又は遺伝子座：
ＰＡＲＫ１（α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）をコードする遺伝子）、ＰＡＲＫ２（ユビキチン−タンパク質リガーゼと推定されるパーキン（ＰＲＫＮ２）をコードする遺伝子）、ＰＡＲＫ３、ＰＡＲＫ４、ＰＡＲＫ５（ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１をコードする遺伝子）、ＰＡＲＫ６（推定上のプロテインキナーゼ（ＰＩＮＫ１）をコードする遺伝子）、ＰＡＲＫ７（ＤＪ−１をコードする遺伝子）、又はＰＡＲＫ８（ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）をコードする遺伝子）
の１以上において突然変異又は多型を有していてもよい。
【００４３】
当該個体は、以下の産物：ドーパミンレセプター２、ドーパミンレセプター４、ドーパミントランスポーター、モノアミンオキシダーゼＡ、モノアミンオキシダーゼＢ、カテコール−ｏ−メチル−トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２解毒酵素、アポリポプロテインＥ、グルタチオントランスフェラーゼ解毒酵素Ｔ１、グルタチオントランスフェラーゼ解毒酵素Ｍ１、グルタチオントランスフェラーゼ解毒酵素、又はグルタチオントランスフェラーゼ解毒酵素Ｚ１をコードする遺伝子の１以上；並びに／或いはミトコンドリアｔＲＮＡ  Ｇｌｕ遺伝子及び／又はミトコンドリア複合体１遺伝子において突然変異又は多型を有していてもよい。好ましくは、当該個体はモノアミンオキシダーゼＢ、及び／又はＮ−アセチルトランスフェラーゼ２解毒酵素、及び／又はグルタチオントランスフェラーゼ解毒酵素Ｔ１をコードする遺伝子、並びに／或いはミトコンドリアｔＲＮＡ  Ｇｌｕ遺伝子において突然変異又は多型を有する。
【００４４】
環境リスク要因もまた存在し得る。これまでに、疫学的研究により農村生活、井戸水、除草剤使用及び殺虫剤への曝露が、ＰＤに関係し得る要因として同定された。また、ＭＰＴＰ（１−メチル  ４−フェニル  １，２，３，６−テトラヒドロピリジン）が注射された場合に、パーキンソニズムを惹起し得る。ＭＰＴＰの化学構造は、広く使用されている除草剤のパラコートに類似し、殺虫剤のロテノン、及び他のいくつかの物質に似た方法で細胞を損傷する。
【００４５】
本発明は、個体から採取した脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量を測定することを含む。本発明によれば、ベースラインレベルと比較して可溶性α−ｓｙｎオリゴマーレベルが増大することは、個体がＰＤに罹患していることを示す。ベースラインレベルは、典型的には非ＰＤ個体由来のＣＳＦサンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量である。非ＰＤ個体は、典型的には、神経学的に正常な、年齢をマッチさせた個体（本明細書中「正常の個体」として言及される）である。或いは、非ＰＤ個体は、ＰＤではない他の神経学的疾患に関連する１以上の症状と診断された、年齢をマッチさせた患者であってもよい。例えば、非ＰＤ個体はＰＳＰ又はＡＤの１以上の症状と診断されていてもよい。
【００４６】
本発明者は、ＰＤ患者由来サンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーの量又はレベルは、非ＰＤ個体由来サンプル中の量又はレベルよりも、典型的には少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍高いことを示した。
【００４７】
本発明はまた、サンプル中の総α−ｓｙｎ量の測定、及びサンプル中の総α−ｓｙｎ量に対する可溶性α−ｓｙｎオリゴマー量の比の評価を含んでいてもよい。
【００４８】
本発明によれば、オリゴマー／総α−ｓｙｎ比の増大により、個体がＰＤに罹患していることが示される。例えば、本発明者は、あるサンプルについてのオリゴマー／総α−ｓｙｎ比が、パーセンテージで表示された場合、少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％、より好ましくは少なくとも７％のレベルにより、個体がＰＤに罹患していることが示されることを示した。
【００４９】
また本発明によれば、ベースライン比と比較して、オリゴマー／総α−ｓｙｎ比が増大することにより、個体がＰＤに罹患していることが示される。ベースライン比は、典型的には非ＰＤ個体由来サンプル中のオリゴマー／総α−ｓｙｎ比である。非ＰＤ個体は、典型的には、神経学的に正常な、年齢をマッチさせた個体（本明細書中「正常の個体」として言及される）である。或いは、非ＰＤ個体は、ＰＤではない他の神経学的疾患に関連する１以上の症状と診断された、年齢をマッチさせた患者であってもよい。例えば、非ＰＤ個体はＰＳＰ又はＡＤの１以上の症状と診断されていてもよい。ＰＤに関連するオリゴマー／総α−ｓｙｎ比の増大は、ベースライン比と比べて、典型的には少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍又は３倍である。
【００５０】
本発明は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、個体から取得した脳脊髄液サンプルに対して実施される。サンプルは、典型的には、アッセイされる前に、例えば遠心分離により処理されてもよい。サンプルはまた、アッセイ前には、好ましくは−７０℃以下で、保存されていてもよい。
【００５１】
可溶性α−ｓｙｎオリゴマーレベルをアッセイするためには、当該技術分野で公知の、標準的な方法が用いられ得る。これらの方法は、典型的には可溶性α−ｓｙｎオリゴマー検出のための薬剤を用いることを含む。当該薬剤は、典型的には可溶性α−ｓｙｎオリゴマーに特異的に結合する。当該薬剤は、可溶性α−ｓｙｎオリゴマーに特異的な抗体であってもよい。特異的によって、当該薬剤又は抗体は、可溶性α−ｓｙｎオリゴマーに、他の任意の分子、特に他の任意のタンパク質に有意に交差反応することなく結合することが理解されるであろう。例えば、可溶性α−ｓｙｎオリゴマーに特異的な薬剤又は抗体は、モノマーのα−ｓｙｎには有意な交差反応性を示さない。交差反応性は任意の好適な方法により評価され得る。
【００５２】
それに代えて、本発明者は可溶性α−ｓｙｎオリゴマーの検出、特にＣＳＦサンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーの検出について新規な方法を開発した。当該方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ法に基づく。ＥＬＩＳＡは、試薬の分離が必要な、異成分から成る固相アッセイである。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では２つの薬剤：捕捉剤及び検出剤、が必要である。第一の薬剤は標的に特異的に結合し、且つ固相支持体に結合している（固定されている）。第二の薬剤は標識が結合しており、典型的には酵素コンジュゲートである。酵素のための基質は、標的−薬剤複合体、つまりサンプル中の標的の量を定量するために用いられる。ＥＬＩＳＡ反応のための固相支持体は、好ましくはウェルを含む。当該薬剤は、典型的には抗体である。
【００５３】
本発明者によって開発されたアッセイは、典型的には、特異的な抗α−ｓｙｎモノクローナル抗体を捕捉剤として用いる。しかしながら、従来のＥＬＩＳＡとは異なり、本発明のアッセイにおける検出剤は、捕捉剤と同一又は重複するα−ｓｙｎ上の部位に結合する。例えば、当該剤が抗体である場合、検出剤は、典型的には捕捉剤と同一のエピトープを認識する抗体である。当該捕捉剤は、タンパク質上で利用できる唯一の結合部位を塞ぐので、モノマーのα−ｓｙｎは、本発明のアッセイにおいてシグナルを生じ得ない。しかしながら、α−ｓｙｎのオリゴマー形態の場合は、複数の結合部位が利用可能であり、捕捉剤及び検出剤の両方による結合を可能にする。捕捉剤及び検出剤は同一の抗原認識部位を有していてもよい。好ましい実施形態においては、検出剤はビオチン化抗体である。次いで、アビジン結合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素により検出が達成され、適切な検出可能な基質、好ましくは化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｎｅｓｃｅｎｔ）基質とのインキュベーションによりモニターされる。即ち、当該アッセイの「読み出し」は発光のレベルであり、典型的には相対発光単位で示される。
【００５４】
総α−ｓｙｎレベルは任意の従来法を用いて測定される。これらの方法は、典型的には全形態のα−ｓｙｎの検出のための薬剤を用いることを含む。当該薬剤は、典型的には、全形態のα−ｓｙｎオリゴマーに特異的に結合する。当該薬剤はα−ｓｙｎに特異的な抗体であってもよい。従来のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイが好ましい方法である。即ち、捕捉抗体及び検出抗体が異なっている方法である。理想的には、総α−ｓｙｎレベルを測定するための方法用の「読み出し」の態様が、可溶性α−ｓｙｎオリゴマーレベルを測定するための方法用のものと同一であるべきである。これにより、オリゴマー／総α−ｓｙｎ比の算出が促進される。
【００５５】
本発明の更なる実施形態においては、ＣＳＦサンプル中のα−ｓｙｎオリゴマーを検出するための代替法が提供されるが、それは当該オリゴマー中に存在し得る異なるタンパク質成分の存在を利用するものである。典型的には、α−ｓｙｎオリゴマーは、例えばβ−アミロイドタンパク質、ハンチントンタンパク質又はアミリンタンパク質を含んでいてもよい。複数の異なるタンパク質を含むオリゴマーは、典型的には、一般的な用語「アミロイドオリゴマー」として言及され得る。従って本発明の方法では、ＣＳＦサンプルを、アミロイドオリゴマーには特異的であるがα−シヌクレインには特異的に結合しない、固相上に固定された第一の試薬とインキュベートしてもよい。次いで、上記方法にあるとおり、固定されておらず、且つα−シヌクレインタンパク質に特異的に結合するα−シヌクレイン結合試薬を用いてオリゴマーの検出が達成される。
【００５６】
本発明の任意の方法において用いられる抗体は、所望のタンパク質、例えば、所望の形態のα−ｓｙｎに結合できる全長抗体又はその断片のいずれかであり得る。当該抗体はモノクローナルであってもよい。そのような全長抗体は、典型的には、当該技術分野で公知の任意の好適な方法により製造される抗体である。例えば、ポリクローナル抗体は、哺乳動物、典型的にはウサギ又はマウスを、好適な条件下α−ｓｙｎで免疫し、抗体分子を当該哺乳動物の例えば血清から単離することにより得ることができる。モノクローナル抗体はハイブリドーマ又は組換え法により得られてもよい。
【００５７】
典型的には、当該抗体は哺乳動物の抗体であり、霊長類、ヒト、げっ歯類（例、マウス又はラット）、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ又はラクダの抗体等である。当該抗体はラクダ科動物の抗体又はサメの抗体であってもよい。当該抗体はナノボディーであってもよい。当該抗体は任意のクラス又はアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＭであり得るが、好ましくはＩｇＧである。本発明において用いられ得る全長抗体の断片は、抗原結合部位（例、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ）２断片）を含む。１つの実施形態においては、当該抗体は、異なる天然抗体由来の配列を含むキメラ抗体、例えばヒト化抗体である。
【００５８】
本発明は、サンプル中の可溶性α−ｓｙｎオリゴマーレベルを測定し、それによって個体がＰＤに罹患しているか否かを判定するための手段を含む診断用キットを更に提供する。当該キットは、典型的には、α−ｓｙｎに特異的に結合する１以上の抗体を含有する。例えば、当該キットはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト化抗体又はヒト化抗体を含んでいてもよい。当該抗体はインタクトなイムノグロブリン分子或いはその、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片等の断片であってもよい。１より多くの抗体が存在する場合、当該抗体は、本発明者により開発されたアッセイにより、それらが可溶性α−ｓｙｎオリゴマーを検出するが、モノマーを検出しないために用いられ得るように、オーバーラップする抗原決定基を有することが好ましい。
【００５９】
当該キットは、サンプル中の総α−ｓｙｎの測定のための手段を更に含んでもよい。
【００６０】
当該キットは、上記方法の任意の実施形態の実施を可能にする、他の１以上の試薬又は機器を、更に含んでいてもよい。そのような試薬又は機器としては、以下：好適な緩衝液（水溶液）、サンプルからα−ｓｙｎを単離するための手段、個体からサンプルを取得するための手段（ニードルを含む管又は機器等）又は定量的反応が行われ得る、ウェルを含む支持体、のうちの１以上が挙げられる。当該キットは、任意により、本発明の方法における当該キットの使用を可能にする指示書、又は当該方法がどの個体に対して実施され得るかに関する細目を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明はまた、個体におけるＰＤ症状の発症を遅延させるか、又は予防する方法も提供する。当該方法は：（ｉ）本発明の方法を用いて、個体がＰＤに罹患しているか否かを判定すること；及び（ｉｉ）（ｉ）においてＰＤに罹患していると特定された個体に、治療有効量の、α−ｓｙｎの凝集及び／又は毒性を直接的又は間接的に阻害する薬剤、α−ｓｙｎタンパク質の発現を低下させる薬剤、α−ｓｙｎ凝集体の分解を直接的又は間接的に亢進又は刺激する薬剤、或いは神経保護薬を投与することを含む。当該神経保護薬は、典型的には抗アポトーシス剤、抗酸化剤、抗グルタミン酸剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、アデノシン拮抗薬、ドーパミン作動薬、ミトコンドリア安定化薬又は栄養素である。例えば、当該神経保護薬はラサギリン、セレギリン、ロピニロール、プラミペキソール、ニコチン、ミノサイクリン、クレアチン、カフェイン、又はコエンザイムＱ１０であり得る。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例により本発明を説明する：
実施例１
被験者及び方法
被験者
本研究はヘルシンキ宣言に従い、且つ大学倫理委員会（京都府立医科大学、京都、日本）により承認された。被験者はすべて、書面による同意書を提出し、本研究に参加した。臨床的に確定した（英国パーキンソン病協会脳バンクの基準に従って診断された）３２名のＰＤ患者（男性１８名及び女性１４名、年齢４３〜８３［平均±標準偏差、６７．３±９．４］歳、臨床上の詳細については表１を参照）が本研究に登録された。
【００６３】
３２名のＰＤ患者のうち３名は、運動症状発症から１年以上後に発症した認知症に罹患しており、そのことによって、レビー小体を伴う認知症ではなく、認知症を伴うＰＤと診断された。年齢をマッチさせたコントロール被験者（男性１８名及び女性１０名、年齢２９〜８６［平均±標準偏差、６４．０±１３．９］歳）は、診断過程の一環として腰椎穿刺を経た、神経学的に正常な個体（ｎ＝１５）、及び、脳橋のラクナ梗塞（ｎ＝１）、癲癇（ｎ＝２）、脊髄症（ｎ＝１）、末梢神経障害（ｎ＝６）、及び筋疾患（ｎ＝２）の患者を含む様々な神経学的疾患を伴うコントロール（ｎ＝１３）から構成された。年齢をマッチさせた２８名のコントロール患者は皆認知症には罹患していなかった。ＰＤの患者及びコントロールの被験者から新鮮なＣＳＦサンプルが回収され、一定分量に分割され、次いで我々のＥＬＩＳＡシステムによるイムノアッセイ用に用いられるまで−８０℃で保存した。
【００６４】
ＣＳＦ中の総α−シヌクレインについてのイムノアッセイ
α−ｓｙｎをＣＳＦサンプルから直接測定するためにアッセイの感度を改善するための多少の改良を行ったサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＣＳＦサンプル中の総α−ｓｙｎを測定した。抗ヒトα−ｓｙｎモノクローナル抗体２１１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を捕捉用に用い、抗ヒトα−ｓｙｎポリクローナル抗体ＦＬ−１４０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をリンクした化学発光アッセイによる抗原検出用に用いた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ，ＮＵＮＣ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの２１１（１００μｌ／ウェル）と共に４℃で１晩インキュベートしてコーティングした。２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（２．５％ゼラチン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））と共に２時間インキュベートした後、次いで１００μｌのＣＳＦサンプルを各ウェルに加え、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１００μｌ／ウェルのＦＬ−１４０抗体（０．２μｇ／ｍｌ）と反応させ、続いて１００μｌ／ウェル（１：１０，０００希釈）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とインキュベートすることにより、捕捉されたα−ｓｙｎタンパク質を検出した。結合ＨＲＰ活性を、増強された化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いて、化学発光反応（１００μｌ／ウェル）によりアッセイした。マイクロプレートルミノメータ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ｔｏｋｙｏ）により、相対光単位での化学発光を３９５ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡアッセイ用の標準曲線は、ＰＢＳ中の異なるタンパク質濃度の組換えヒトα−ｓｙｎ溶液１００μｌ／ウェルを用いて実施した。全てのサンプル及び標準品は、同ロットの標準品で同日に、３連で実行した。ＣＳＦ中総α−ｓｙｎの相対濃度の推定は、各標準曲線に従って算出した。アッセイ内及びアッセイ間の精度は＜９％であった。
【００６５】
ビオチン化抗体の調製
スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）（２００μｇ）をＰＢＳ中でビオチン化すべき抗体（２００μｇ／ｍｌで１ｍｌ）と反応させ、次いで氷上に２時間静置した。混合物をＢｉｏ−Ｓｐｉｎ−６カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＫ）で脱塩し、結合していない過剰なビオチンを除去した。ビオチン化抗体は使用するまで４℃で保存した。
【００６６】
α−ｓｙｎオリゴマーを測定するためのＥＬＩＳＡ
３８４ウェルのＥＬＩＳＡプレートを２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｕ．Ｋ．）、ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの非ビオチン化２１１マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）（５０μｌ／ウェル）と共に４℃で１晩インキュベートすることによりコーティングした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）で４回洗浄し、１００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（２．５％ゼラチン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）と共に３７℃、２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、試験するＣＳＦサンプル５０μｌを各ウェルに加え、プレートを更に３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化２１１  ５０μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中（１：１００００に）希釈した５０μｌ／ウェルのＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｕ．Ｋ．）と３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、最後に、プレートを５０μｌ／ウェルの増強された化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とインキュベートし、それから化学発光を、Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０（Ｗａｌｌａｃ）マイクロプレートリーダーにより相対光単位で直ちに測定した。
【００６７】
すべてのＥＬＩＳＡアッセイについて、サンプルは継続して氷上に維持され、且つアッセイは、最初の凍結後１度だけ融解した後のサンプルの一定分量に対して行った。
【００６８】
統計学的解析
ＰＤ群とコントロール群との間の差については、当該群をマン−ホイットニーのＵ検定を用いて比較した。有意水準はＰ＜０．０５に設定した。相関解析はピアソンの単純相関により行った。ＰＤ群とコントロール群との鑑別において、ＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーレベル及びＣＳＦ中のオリゴマー／総α−ｓｙｎ比の最も適切なカットオフ値を決定するために、受信者操作特性（ＲＯＣ）を解析した。解析はすべてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０，ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【００６９】
結果
本研究においては、総α−ｓｙｎレベルについて、３２名のＰＤ患者及び２８名のコントロール被験者を調査した。二群間において、年齢、性別比に有意な差異は観察されなかった。図１Ａに示すとおり、ＣＳＦ中の総α−ｓｙｎ濃度の比較は、ＰＤ群とコントロール群との間で個体シグナルにおけるかなりのオーバーラップを示す。それにもかかわらず、当該結果により、ＰＤ患者におけるＣＳＦの平均総α−ｓｙｎ濃度（平均±ＳＥＭ＝２０．９８±０．７６ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝３２）は、コントロール（２４．４０±１．１７、ｎ＝２８）と比較すると低いことが証明された（ｐ＝０．０４１７、マン−ホイットニーのＵ検定）。
【００７０】
次に、同一被験者に由来する同一ＣＳＦアリコートにおいてＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーレベルを測定した。この測定には、モノマー形態のα−ｓｙｎを検出することなく、可溶性α−ｓｙｎオリゴマーのみを測定できるＥＬＩＳＡシステムを用いた。各ＰＤ患者及びコントロール群についての、ＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーレベルの散布図を図１Ｂに示す。当該図では、α−ｓｙｎオリゴマーレベルは化学発光シグナルの強度（相対発光単位／秒（ＲＬＵ／秒））で示す。ＰＤ群におけるＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーレベル（平均±ＳＥＭ＝１９，７９１±２，４５８、ｎ＝３２）は、年齢をマッチさせたコントロール被験者のレベル（９，５６９±１０３７、ｎ＝２８）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１、マン−ホイットニーのＵ検定）。各被験者由来ＣＳＦの総α−ｓｙｎの測定値及びＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーの測定値はＲＬＵ／秒で得られたので、これらにより、各患者ＣＳＦ中の総α−ｓｙｎに対するα−ｓｙｎオリゴマーの比（オリゴマー／総量比、％）の算出が可能になる。興味深いことに、ＰＤ群におけるＣＳＦ中の当該比（平均±ＳＥＭ＝１２．９２±１．０８、ｎ＝３２）は、コントロール群（４．５８±０．５２、ｎ＝２８）における比と比較して有意に高かった（ｐ＜０．０００１，マン−ホイットニーのＵ検定）（図１Ｃ）。男性と女性のＰＤ患者間、及び認知症患者と認知症でない患者間の当該比には、有意差は無かった（データ示さず）。しかも、ＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーレベルは、被験者の年齢（ｒ＝０．０６、ｐ＝０．７３）、ホーエン−ヤールのグレード（ｒ＝−０．１２、ｐ＝０．５１）、罹病期間（ｒ＝０．０１、ｐ＝０．９５）とは何らの相関がなかった。オリゴマー／総α−ｓｙｎ比も、被験者の年齢（ｒ＝−０．１７、ｐ＝０．３４）、ホーエン−ヤールのグレード（ｒ＝−０．１４、ｐ＝０．４４）、罹病期間（ｒ＝−０．０２、ｐ＝０．８９）とは何らの相関がなかった。興味深いことに、α−ｓｙｎオリゴマーレベル及びオリゴマー／総α−ｓｙｎ比は、コントロール群と比較して、軽度のＰＤ患者（ホーエン−ヤールのグレード１及び２、ｎ＝８、オリゴマーレベルについてｐ＝０．００４６、及び比についてｐ＝０．０００２）及び初期のＰＤ患者（発症後２４ヶ月以内、ｎ＝１２、オリゴマーレベルについてｐ＝０．０００２、及び比についてｐ＜０．０００１）においてなお一層高かった。
【００７１】
図２は、ＰＤのコントロールからの鑑別において、ＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマー及びＣＳＦのα−ｓｙｎ比（オリゴマー／総量；％）についてのＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線により、ＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーについては９，９５０ＲＬＵ／秒、またオリゴマー／総量については６．１６５％のカットオフ値により、ＰＤがコントロール群から最も確実に鑑別されることが証明された。ＣＳＦのα−ｓｙｎオリゴマーについてのカットオフレベル９，９５０ＲＬＵ／秒により、０．８５９の曲線下面積（ＡＵＣ）で、７５．０％（信頼区間９５％、５５．１〜８９．３％）の感度、及び８７．５％（信頼区間９５％、７１．０〜９６．５％）の特異度がもたらされた。一方、オリゴマー／総量比についてのカットオフレベル６．１６５％では、０．９４８のＡＵＣで８９．３％（信頼区間９５％、７１．８〜９７．７％）の感度及び９０．６％（信頼区間９５％、７５．０〜９８．０％）の特異度がもたらされた。
【００７２】
これらの結果により、ＣＳＦ中の総α−ｓｙｎ及びオリゴマー形態のα−ｓｙｎの定量は、ＰＤ患者の診断の手段としてだけでなく、神経保護治療のよい候補である、高リスク個体の発症前スクリーニングの手段としても、有用性が高いことが証明される。
【００７３】
【表１】
2013504766.tif 000003
【００７４】
実施例２
より大規模な横断的研究により、ＰＤと臨床診断された患者（ｎ＝２５、年齢４３〜８３［平均±標準偏差、６８．６±１０．４］歳）、アルツハイマー病（ＡＤ）と臨床診断された患者（ｎ＝３５、年齢５８〜８３［平均±標準偏差、７４．１±５．６］歳）及び進行性核上麻痺（ＰＳＰ）と臨床診断された患者（ｎ＝１８、年齢５１〜７８［平均±標準偏差、６９．４±８．１］歳）、並びにコントロールの被験者（ｎ＝４３、年齢３５〜８８［平均±標準偏差、６４．９±１２．５］歳）を含む別群の１２１名の被験者由来ＣＳＦサンプルを調べた。ＡＤの患者は、ＡＤについてのＤＳＭＩＶ基準及び「推定されるＡＤ」の臨床診断についてのＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準を満たしていた（ＭｃＫｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９８４；３４  ｐ９３９−９４４）。ＰＳＰの患者は、臨床的に確定的か、又は臨床的に推定されるＰＳＰについてのＮＩＮＤＳ−ＳＰＳＰ診断基準を満たしていた（Ｌｉｔｙａｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ  ２００３；１８  ｐ４６７−４８６）。
【００７５】
上記のとおりのＥＬＩＳＡにより、ＣＳＦサンプルをα−ｓｙｎレベルに関して解析した。第一群と同様に、ＰＤの症例（ｎ＝２５）において、ＰＳＰの被験者（ｎ＝１８；ｐ＜０．０５、ダネット（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定）、ＡＤの被験者（ｎ＝３５；ｐ＜０．００１）及びコントロールの被験者（ｎ＝４３；ｐ＜０．０５）と比較して有意に高いレベルのＣＳＦα−ｓｙｎオリゴマーが観察された（図３）。このことは、第一群についての結果を確認し、また、ＣＳＦ中のα−ｓｙｎがＰＤを他の神経学的疾患から鑑別するのに有用であることをも示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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