(57)【要約】本発明は、同じ固定生物学的サンプルからの、ＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離および／または精製のためのプロセス、本発明によるプロセスによって単離された核酸の定量化および分析、固定サンプルからのＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離および／または精製のためのキット、ならびに疾患の診断、予後、治療に関する決定、および／または治療のモニタリングのためのこのキットの使用に関する。溶解した画分を未溶解画分から分離した後、その画分を望ましいように別々に処理し得る。例えば、ＲＮＡを未溶解画分から単離し得、そしてＤＮＡを未溶解画分から単離し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋によって固定された同じ生物学的サンプルからの、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の並行単離および／または並行精製のためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
ａ）少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を用いた、該サンプルのタンパク質含有成分の部分的なタンパク質分解と同時に、該サンプルを水性緩衝溶液中に部分的に溶解して、溶解画分（画分Ａ）および未溶解残渣（ペレット；画分Ｂ）を得る工程；
ｂ）該溶解画分を、該未溶解残渣から分離する工程、
を含み、
ここで、該溶解画分における核酸の全量に基づいて、該溶解画分は主にＲＮＡを含み、そして該未溶解残渣における核酸の全量に基づいて、該未溶解残渣は主にＤＮＡを含み、
そして、主にＲＮＡを含む該画分の、主にＤＮＡを含む該画分からの分離は、有機溶媒による１つまたは両方の型の核酸の沈殿も抽出も、１つまたは両方の型の核酸の固体マトリックスへの選択的結合のいずれも必要としない、プロセス。
【請求項２】
前記水性緩衝溶液は、少なくとも１つの緩衝物質、および／または、好ましくは少なくとも１つの界面活性剤を含み、
該緩衝物質は、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｐｉｐｅｓ、Ｍｏｐｓ、およびアルカリ金属酢酸塩／酢酸を含む群から好ましくは選択され、
該界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ポリエチレングリコールフェニルエーテル、またはこれらの混合物、特に好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム、４０のエトキシ化度を有するポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル、および／または９〜１０のエトキシ化度を有するポリエチレングリコール（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテルを含む群から好ましくは選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記水性緩衝溶液は、以下：
・錯体形成剤、好ましくはエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸ナトリウム、またはこれらの混合物、
・好ましくは０．１から１０Ｍの濃度の、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、過塩素酸塩、ＮａＩ、ＫＩおよび尿素を含む群から好ましくは選択される、カオトロピック剤、
・ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、チオ硫酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、またはこれらの混合物を含む群から好ましくは選択される、還元剤、および
・無機塩、好ましくはアルカリ金属ハロゲン化物、特に好ましくはＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌ、好ましくはアルカリ土類金属ハロゲン化物、特に好ましくはＣａＣｌ２、またはＭｇＣｌ２、好ましくはアンモニウム塩、特に好ましくは塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウム、好ましくは硫酸リチウム、またはこれらの混合物
を含む群から選択される、少なくとも１つの物質をさらに含み、そして
該水性緩衝溶液は、６から９の範囲のｐＨ、好ましくは６．５から８．５の範囲のｐＨ、特に好ましくは６．８から７．５の範囲のｐＨを好ましくはさらに有する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記タンパク質分解活性化合物は、プロテアーゼおよび非酵素的タンパク質分解活性化合物、好ましくはプロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、および臭化シアン、またはこれらの混合物、特にプロテイナーゼＫを含む群から選択され、前記水溶液中の該タンパク質分解活性化合物の総濃度は、該水溶液の全重量に基づいて、好ましくは０．００１重量％から５重量％、特に好ましくは０．０１重量％〜２．５重量％、そして特に０．０５重量％〜０．２重量％の範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
前記水性緩衝溶液中の前記サンプルの前記部分的溶解は、好ましくは１８℃から８０℃の温度、特に５０℃から６５℃の温度で、そして好ましくは３０秒から５日の期間、特に好ましくは１分から５時間の期間、より好ましくは５分から９０分の期間、そして特に１０分から３０分の期間、該水性緩衝溶液中の該サンプルのインキュベーションにより生じる、請求項１〜４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
架橋により固定された前記生物学的サンプルは、パラフィン包埋サンプル、好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋サンプル（ＦＦＰＥサンプル）である、請求項１〜５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７】
前記プロセスは、工程（ａ）による前記部分的溶解の前に、好ましくは前記サンプルを疎水性有機溶媒に接触させることによって、特に好ましくは、Ｃ１〜Ｃ５アルコールの添加を必要に応じて伴って、６個より多く１７個未満の炭素原子の鎖長の非極性の脂肪族もしくは芳香族炭化水素またはこれらの混合物を使用して；特に１〜２５容量％のメタノールの添加を必要に応じて伴って、キシレン、ヘプタン、および鉱物油を含む群から選択される炭化水素または炭化水素混合物を使用して、前記パラフィンを選択的に除去するための工程（ｉ）を含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
工程（ｉ）による前記パラフィンの除去の後、および工程（ａ）による前記水性緩衝溶液における前記サンプルの前記部分的溶解の前に、以下の工程：
（ｉｉ）好ましくは、該サンプルを、連続的に水含有量を増加させた水性Ｃ１〜Ｃ５アルコール溶液で繰り返し洗浄することによって、該サンプルを再水和する工程、
（ｉｉｉ）該サンプルを乾燥する工程、および／または
（ｉｖ）該サンプルをホモジナイズする工程
のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
得られた前記未溶解残渣からの前記ＤＮＡの続いて起こる放出のために、該未溶解残渣は、同時酵素プロテアーゼ消化による溶解に供される、請求項１〜８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
請求項１による工程（ｂ）に続いて、前記溶解画分Ａから得られる前記ＲＮＡおよび／またはペレットＢから得られる前記ＤＮＡを、好ましくは沈殿、核酸結合材料への結合、電気泳動、および／またはクロマトグラフィーによって、別々に精製するためのさらなる工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
主にＤＮＡを含む前記未溶解画分は、分離後に廃棄される、請求項１〜１０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
主にＲＮＡを含む前記溶解画分からの該ＲＮＡの単離の前に、ＤＮａｓｅ消化が、該画分に対して行われる、請求項１〜１１の一つ以上に記載のプロセス。
【請求項１３】
増幅技術、特にＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムＤＮＡ全体の増幅（全ゲノム増幅）、ゲル電気泳動、ブロッティング技術、特にサザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析、制限酵素断片長多型解析（ＲＦＬＰ分析）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）、ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ配列決定およびＲＮＡ配列決定を含む配列決定、一塩基多型分析（ＳＮＰ分析）、突然変異分析、エピジェネティック分析、特にメチル化パターンの分析、またはそれらの組み合わせを含む群から好ましくは選択される、単離かつ／または精製された核酸の検出のための工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
（１）タンパク質分解活性化合物、好ましくは請求項４に記載のタンパク質分解活性化合物、（２）少なくとも１つの緩衝物質、好ましくは請求項２に記載の緩衝物質、および（３）少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは請求項２に記載の界面活性剤の１つ、ならびに好ましくは（４）工程（ａ）による不完全なタンパク質分解を行うための指示、を少なくとも含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のプロセスを行うためのキット。
【請求項１５】
（５）少なくとも１つの核酸結合材料、およびまた必要に応じて（６）核酸精製のためのバッファー、好ましくは結合および／または溶出バッファーをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
生物学的サンプル中に存在する核酸の分析および／または定量化のための、請求項１４または１５に記載のキットの使用。
【請求項１７】
ヒトの身体外または動物の身体外のサンプルを用いた、疾患の診断、予後、治療に関する決定、および／または治療のモニタリングのための、請求項１４または１５に記載のキットの使用。
【請求項１８】
架橋によって固定された同じ生物学的サンプルから、溶解画分中のＲＮＡ、および未溶解画分中のＤＮＡを得るためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
ａ）少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を用いた、該サンプルのタンパク質含有成分の部分的なタンパク質分解と同時に、該サンプルを水性緩衝溶液中に部分的に溶解して、溶解画分（画分Ａ）および未溶解残渣（ペレット；画分Ｂ）を得る工程；
ｂ）該溶解画分を、該未溶解残渣から分離する工程、
を含み、
ここで、該溶解画分における核酸の全量に基づいて、該溶解画分は主にＲＮＡを含み、そして該未溶解残渣における核酸の全量に基づいて、該未溶解残渣は主にＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１９】
主にＲＮＡを含む前記画分の、主にＤＮＡを含む前記画分からの分離は、有機溶媒による１つまたは両方の型の核酸の沈殿も抽出も、１つまたは両方の型の核酸の固体マトリックスへの選択的結合のいずれも必要としない、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記画分の分離後、前記ＲＮＡは、主にＲＮＡを含む前記溶解画分から単離され、そして／またはＤＮＡは、主にＤＮＡを含む前記未溶解画分から単離される、請求項１８または１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
主にＤＮＡを含む前記未溶解画分は、分離後に廃棄される、請求項１８〜２０のうちの一つ以上に記載のプロセス。
【請求項２２】
請求項１〜１３のうちの一つ以上で規定される工程および／または特徴のうちの一つ以上を含む、請求項１８〜２１のうちの一つ以上に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同じ固定生物学的サンプルからの、ＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離および／または並行精製のためのプロセス、本発明によるプロセスによって単離された核酸の定量化および分析、固定サンプルからのＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離および／または精製のためのキット、ならびに疾患の診断、予後、治療に関する決定、および／または治療のモニタリングのための、このキットの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
もし、例えば組織断片または単離細胞のような生物学的材料を、生きた生物から除去した場合、その細胞は、短期間で死ぬ。非常に迅速に、死んだ細胞は、まず自己融解／発酵によって、そして次いで細菌によって分解され、もとの細胞および組織構造は破壊される。従って、もし細胞または組織断片を、組織学的調査のために生物から除去するなら、分解を防止するために、取った生物学的サンプルを固定することが推奨される。理想的には、固定は、サンプルの構造を、実質的に変化させないで、その組織学的評価を可能にする。さらに固定は、サンプルの長期保存および記録保管を可能にする。これらの理由のために、多くの形態学的調査は、固定した材料に基づいてのみ可能である。
【０００３】
通常、例えば酸、アルコール、ケトン、またはアルデヒド、特にグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような、タンパク質沈殿またはタンパク質架橋化合物を用いて、固定を達成する。ここで、ホルムアルデヒド（「ホルマリン」と呼ばれる水溶液の形態で使用される）による固定に続く、固定サンプルのパラフィンへの包埋は、細胞および組織構造が特に良好に保存されるので、特に病理学において非常に重要である。本明細書の以下で、この方式で固定した材料を、「ホルマリン固定、パラフィン包埋材料」または「ＦＦＰＥ材料」と呼ぶ。
【０００４】
しかし、特にホルマリンによるサンプルの固定は、ホルムアルデヒドの架橋効果のために、タンパク質だけでなく、サンプル中に存在する核酸を含む様々な他の生体分子も、お互いに共有結合し、そして結果として、そのようなサンプルからの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の単離は、非常に困難であるという欠点を有する。しかし、分子レベルにおける多くの研究に関して、核酸の単離は非常に重要である。
【０００５】
そのような固定サンプルから核酸を単離する１つの方法が、特許文献１において記載されている。そこに記載された方法は、生物学的サンプルにおいて固定によって形成された架橋を切断し、そして１つの型の核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを単離することを可能にし、続いて例えばＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ分析を行い得る。
【０００６】
例えば腫瘍障害の診断または予後に関する分子病理学の分野において、ＤＮＡに基づく分析、およびＲＮＡに基づく分析の両方が使用される。同じ固定サンプル、例えば腫瘍サンプルについてＤＮＡおよびＲＮＡに基づく分析の両方を可能にするために、例えば生検からの組織切片のような１つのサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの並行単離を可能にするプロセスが必要である。まず、通常非常に少量のサンプル材料しか入手可能でなく、複数の別個の精製のためには不十分であるので、そのような単一のサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの並行単離は、非常に望ましい。２番目に、サンプル材料の組成は、一般的に不均一である；例えば健康な細胞のマトリックス中には非常に少数の腫瘍細胞しか存在しない。この場合、異なる細胞のお互いに対する比が、それぞれの部分的なサンプルにおいて同じであることを保証することは不可能であるので、サンプルを分けることは望ましくない。単一の、分割していないサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの並行単離のみが、研究する全ての被検体が同じ比で存在し、そして同じ組成のサンプル由来であることを保証する。
【０００７】
特許文献１において記載されたプロセスは、固定の間に導入された架橋を切断することによって、両方の型の核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを等しく放出する。従ってこのプロセスは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、または両方の核酸の混合物の単離のみを可能にする；しかし、それは別の画分におけるＤＮＡおよびＲＮＡの並行単離を可能にしない。２つの型の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を分離するために、特許文献１は、単離後に、精製の間に同時に放出された２つの型の核酸の１つの、選択的沈殿または選択的吸着を示唆する。あるいは、それぞれの不必要な型の核酸を酵素的に分解することが可能である。
【０００８】
選択的吸着による、サンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの並行精製の１つの方法が公知であり、そして例えば市販で入手可能なＡｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行い得る。ここで、そのサンプルを最初に、いかなるアルコールも含まないカオトロープを含む溶解バッファーで溶解し、そして溶解産物中に存在するＤＮＡはシリカマトリックスに結合し、一方これも溶解産物に存在するＲＮＡは結合しないで溶液中に残る。残った溶解産物にアルコールを加えた後、ＲＮＡはさらなるシリカマトリックスに結合し得る。このプロセスは、非固定サンプルに関してよく作用する。しかし、ここでＤＮＡは最初のシリカマトリックスに定量的に結合せず、多くの量が残った溶解産物に残り、そしてＲＮＡと共に精製されるので、それは依然としてホルマリン固定サンプルに最適に適用できないことが見出された。従って、このプロセスは、ＲＮＡおよびＤＮＡの別々の精製を可能にしない。
【０００９】
特許文献２は、ＦＦＰＥサンプルを含む生物学的サンプルから、ＤＮＡおよびＲＮＡを同時抽出するための方法を記載する。そのＦＦＰＥサンプルを脱パラフィン化し、そしてカオトロピック剤、イオン性界面活性剤、およびタンパク質分解酵素を含む溶解バッファーを用いて消化する。ＲＮＡおよびＤＮＡを放出するために、少なくとも５時間、好ましくは１０時間サンプルを消化し、フェノール−クロロホルムを加え、そして相を分離する。水相は主にＲＮＡを含み、有機相は主にＤＮＡを含む。次いでアルコール沈殿を用いて、ＲＮＡを水相から回収し得る。ＤＮＡを有機相から回収する。この方法は、特に、上記核酸を有機相および水相から別々に単離する前に、ＤＮＡからＲＮＡを分離し得るために、フェノールを用いて放出された核酸を抽出する必要があるという欠点を有する。
【００１０】
同様のプロトコールが、Ｏ’Ｓｈｅａら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ＣＤＲ３  ｓｉｚｅ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ｗａｘ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９７；５０：８１１−８１４において記載されている。
【００１１】
ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、またはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを、ＦＦＰＥサンプルから単離するための、市販で入手可能なキットが同様に公知である。ＦＦＰＥ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｈｏｒｏｌｄ、Ｃａｎａｄａ）は、１つの溶出液中で、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物の単離を可能にする。ここで、ＤＮＡのみ、またはＲＮＡのみのいずれかを得るために、特に長いプロテアーゼＫ消化およびＲＮＡｓｅ処理を行ってＤＮＡを単離し得る、または短いプロテアーゼＫ消化およびＤＮＡｓｅ処理を行ってＲＮＡを単離し得る。しかし、このキットは、同じサンプルから、両方の型の核酸の、同時であるが別々の精製を可能にしない。
【００１２】
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＦｏｒｍａＰｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）も、１つの溶出液におけるＲＮＡおよびＤＮＡの混合物の単離、またはＤＮＡｓｅ消化後のＲＮＡの単離を可能にするが、ＤＮＡおよびＤＮＡの同時であるが別々の単離を可能にしない。
【００１３】
対応するヌクレアーゼ消化によって、または適当な加熱インキュベーションによって、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを得るためのオプションも、Ａｍｂｉｏｎ  Ｒｅｃｏｖｅｒ  ＡＩＩ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）およびＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）によって提供される。しかし、これらの市販で入手可能なキットはいずれも、同じ固定サンプルからＤＮＡおよびＲＮＡ両方を別々に精製することを可能にしない。
【００１４】
さらに、特許文献２は、同じサンプルから、両方の型の核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）を同時に抽出するためのプロセスを記載し、それはまたとりわけ固定サンプルであり得る。このプロセスは、サンプルの溶解および芳香族アルコールを用いた酵素不活性化の後、適当な抽出プロセスによる２つの型の核酸の分離を含む。しかし、このプロセスで得られた２つの相（ＲＮＡを含む水相、およびＤＮＡを含む有機相）から、次いでさらなる精製および／または単離の前に、適当な沈殿剤の添加によって、核酸を沈殿させなければならない。まず、これはそのプロセスを時間のかかるものにし、そして２番目に、沈殿のために、物質の損失のリスクおよび／または核酸に沈殿剤が混入するリスクが存在する。
【００１５】
よって、架橋によって固定された同じサンプルから、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を別々に精製することを可能にするプロセスを提供することが本発明の目的であり、ＤＮＡのＲＮＡからの分離は、有機溶媒も、核酸を結合するための固体マトリックスも必要としない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００７／０６８７６４号
【特許文献２】国際公開第２００５／０７５６４２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、とりわけ少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を用いた、架橋によって固定された生物学的サンプルが有するタンパク質を含む成分の部分的なタンパク質分解は、ＲＮＡをサンプルの溶解画分へ選択的に放出することを可能にし、一方ＤＮＡは主に上記サンプルの未溶解残渣に残るという発見に基づく。サンプルの上記部分的消化は、別々の画分を得ることを可能にし、ここで溶解画分は主にＲＮＡを含み、そして未溶解残渣は主にＤＮＡを含む。主にＲＮＡを含む溶解画分を、主にＤＮＡを含む未溶解残渣から、例えば遠心分離プロセスを用いて容易に分離し得る。
【００１８】
溶解した画分を未溶解画分から分離した後、その画分を望ましいように別々に処理し得る。例えば、ＲＮＡを未溶解画分から単離し得、そしてＤＮＡを未溶解画分から単離し得る。個々の画分から核酸を単離する前に、主にＲＮＡを含む溶解画分を、主にＤＮＡを含む未溶解画分から分離することは、同じ架橋サンプルから良好な収率でＲＮＡおよびＤＮＡを効率的に単離することを可能にする。１つの画分からのみ核酸を単離し、そして他の画分を廃棄することも、本発明の範囲内である。例えば、ＲＮＡの単離が関心の的であるなら、ＤＮＡを含む未溶解画分を、分離後に廃棄し得る。
【００１９】
本出願の他の目的、特徴、利点および局面は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、本出願の好ましい実施態様を示すが、例示としてのみ提供されることが理解されるべきである。開示された本発明の意図および範囲内の様々な変化および改変は、以下を読むことから当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、それぞれＴＡＥ−アガロースゲル（ＤＮＡ）およびホルムアルデヒド−アガロースゲル（ＲＮＡ）における、エチジウムブロミドによる染色後の、本発明によるプロセスによって上清およびペレットからそれぞれ単離されたＲＮＡおよびＤＮＡの分離を示す（実施例１）。サイズ比較のために、サイズマーカーＬａｍｂｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を、レーンＭにアプライした。
【図２】図２は、タンパク質分解活性化合物の反応時間の関数として、画分Ａ（上清）および画分Ｂ（ペレット）から単離された核酸の全収量を示す（実施例３）。
【図３】図３は、タンパク質分解活性化合物の反応時間の関数としての、ＴＡＥ−アガロースゲルにおける、画分Ｂ中のＲＮＡ含有量の分析の結果を示す（実施例３）。
【図４】図４は、ｃｔ値の変化としての、定量的リアルタイムＰＣＲによる、画分Ｂから得られたＤＮＡの増幅に対する、タンパク質分解活性化合物の反応時間の影響を示す（実施例３）。
【図５】図５は、市販で入手可能なキットを用いて行ったプロセスにおける収量と比較して、ＵＶ分光法によって決定された、本発明によるプロセスを用いて、各場合において示される期間保存された様々な型の組織から単離し得るＤＮＡの収量を示す。（実施例５）。
【図６】図６は、ＴＡＥ−アガロースゲルにおける、実施例５によって得られたＤＮＡの分析を示す。サイズ比較のために、サイズマーカーＬａｍｂｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を、レーンＭにアプライした。
【図７】図７は、リアルタイムＰＣＲ分析による、実施例５によって得られたＤＮＡの分析を示す。
【図８】図８は、単離したＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析を示す。１−５：実施例１において記載された前処理バッファー１−５を用いて、ＤＮＡｓｅにより前処理したサンプル。ｏｃ：ＤＮＡｓｅ前処理なしであるが、先行技術において通常であるように、オンカラムＤＮＡｓｅ処理したサンプル。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
上記で議論したように、架橋によって固定された同じサンプルからＤＮＡおよびＲＮＡの両方を別々に精製することを可能にするプロセスを提供することが、本発明の１つの目的であり、ＤＮＡのＲＮＡからの分離は、有機溶媒も、核酸を結合するための固体マトリックスも必要としない。
【００２２】
この目的を、架橋によって固定された同じ生物学的サンプルからの、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の並行単離および／または精製のためのプロセスによって達成し、それは以下の工程：
ａ）少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を用いた、サンプルが有するタンパク質を含む成分の部分的なタンパク質分解と同時に、水性緩衝溶液中においてサンプルを部分的に溶解して、溶解画分（画分Ａ）および未溶解残渣（ペレット；画分Ｂ）を得る工程；
ｂ）溶解画分を、未溶解残渣から分離する工程、
を含み、
ここで、溶解画分における核酸の全量に基づいて、その溶解画分は主にＲＮＡを含み、そして未溶解残渣における核酸の全量に基づいて、その未溶解残渣は主にＤＮＡを含み、
そしてここで、主にＲＮＡを含む画分の、主にＤＮＡを含む画分からの分離は、有機溶媒による１つまたは両方の型の核酸の沈殿も抽出も、１つまたは両方の型の核酸の固体マトリックスに対する選択的結合も必要としない。
【００２３】
本発明によるプロセスの目的のために、並行単離および／または精製は、２つの型の核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの単離および／または精製が、お互いに空間的に離れて起こる、１つは主にＲＮＡを含み、そして他方は主にＤＮＡを含む、その２つの画分ＡおよびＢの処理が、同時に、または異なる時点で起こり得る、単離および／または精製を意味すると理解される。
【００２４】
本発明の目的のために、架橋によって固定された同じ生物学的サンプルは、工程（ａ）において部分的溶解を受けるサンプル全体を意味すると理解される。
【００２５】
本発明の目的のために、「部分的溶解」および「部分的タンパク質分解」または「部分的消化」という用語はそれぞれ、下記でより詳細に説明するように、サンプルまたはサンプルの個々の成分の部分的溶解、およびサンプルが有するタンパク質を含む成分の部分的分解を意味すると理解される。
【００２６】
本発明の目的のために、もし画分が主に１つの型の核酸を含むと呼ばれる場合、それは、この画分における核酸の全量（すなわち、２つの型の核酸の合計）に基づいて、５０重量％超のこの型の核酸を含む。１つの実施態様によって、主に１つの型の核酸を含む上記画分は、この画分における核酸の全量に基づいて、少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％のこの型の核酸を含む。
【００２７】
本発明によるプロセスは、別々の画分における、同じ固定サンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの並行単離、および高感度で、定性的、および／または定量的方法による、それらの引き続く分析を可能にし、ここで例えば直径数ｍｍの中空の針による臨床生検の顕微鏡的に分析可能な切片から得られるような、少量のサンプルでさえも、サンプル材料として適当である。本発明によるプロセスにおいて、市販で入手可能なＡｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と対照的に、ＤＮＡを含む、およびＲＮＡを含む画分への分離は、核酸の実際の精製の前に実施する。固定した生物学的サンプルから、本発明によるプロセスは、主にＲＮＡを含む溶解画分および主にＤＮＡを含む未溶解画分という２つの画分を生じる。さらなる工程において、これらの画分を、それぞれの核酸のさらなる抽出および／または精製のために利用し得る。部分的消化およびＲＮＡのＤＮＡからの、主にＲＮＡを含む溶解画分および主にＤＮＡを含む未溶解画分への引き続く分離はまた、本発明による方法を、ＤＮＡをＲＮＡから分離するためにフェノール／クロロホルム抽出に基づく先行技術の方法から差別化する。それぞれのフェノール／クロロホルムに基づく方法において、ＤＮＡおよびＲＮＡはどちらも溶解産物に放出され、そして従って、両方とも溶解画分に存在する。フェノール−クロロホルム抽出および相分離の後、ＲＮＡは水相に溶解し、そしてＤＮＡは有機相に溶解した形態で存在する。従って、先行技術の分離原理は、本発明によるプロセスと根本的に異なる。本発明によるプロセスはＲＮＡをＤＮＡから分離するためのフェノール／クロロホルム抽出を必要とせず、とりわけ架橋したサンプルの部分的消化に依拠してＤＮＡを主に未溶解画分に維持する一方、ＲＮＡを溶解画分に放出する。
【００２８】
最初の工程において、ＦＦＰＥサンプルを、好ましくはプロテアーゼ処理にかける。驚くべきことに、この最初のプロテアーゼ処理において、プロテアーゼを用いることによるタンパク質のこのタンパク質分解（酵素的「消化」）の条件を調整する最適化によって、サンプルからＤＮＡではなく、ＲＮＡのみを選択的に放出することが可能であることが見出された。適当な分離プロセス、例えば遠心分離を用いて、サンプルの本発明による不完全な「消化」後に、ＤＮＡを含む依然として未溶解の画分を、ＲＮＡを含む上清から分離することが可能である。
【００２９】
ここで、２つの画分の溶解画分（Ａ）および未溶解画分（Ｂ）への分離を、例えばろ過、沈降、デカンテーション、遠心分離等のような、液体および固体成分を分離するために適当であるとして当業者に公知のあらゆる方法を用いて行い得る。本明細書の以下で、この工程で得られる未溶解残渣はまた、ペレットと呼ばれ、ここで本発明の目的のために、この用語は、明確に遠心分離によってサンプルの液体成分から分離した未溶解残渣に限定されず、他の手段によって分離した未溶解残渣、例えばろ過の後にフィルターに残った固体物質も含む。
【００３０】
未溶解画分をペレットにすることは、２つの画分の容易なおよび効率的な分離を可能にするので、有用である。
【００３１】
ＲＮＡを単離するために、ＲＮＡを含む上清を、現在の技術水準から公知である習慣的なプロセスによって、例えば特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたプロセスによって処理し得、そのプロセスは残った架橋を除去するための求核試薬を含む溶液中における加熱インキュベーションを含み、ここでＲＮＡを次いで、例えばＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、例えばシリカマトリックスに結合させることによって単離し得る。
【００３２】
ＤＮＡおよび不完全に消化されたサンプルが有する他の未溶解成分を含む未溶解画分を、ＤＮＡを単離するために使用する。ここで、そのペレットは依然として本質的に固定サンプルの性質を有するので、ＤＮＡを固定サンプルから単離するための適当な、またはそのために習慣的な現在の技術水準によるあらゆる方法を用いることが可能である。特に、先行する不完全なプロテアーゼ消化は、サンプルから相当量のＤＮＡを除去しなかった、および／または相当量のＤＮＡ架橋物を除去しなかった。このために、別のまたはさらなる酵素プロテアーゼ消化を有利に行ってサンプルを完全に溶解し、続いて例えばＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたような求核試薬を含む溶液中で加熱インキュベーションする。この方式において放出されたＤＮＡを、次いであらゆる適当な方法の助けによって、例えばＱＩＡａｍｐ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、例えばシリカマトリックスへの結合によって、さらに精製し得る。
【００３３】
この方式において、両方の型の核酸を、１つの工程で単一のサンプルから前もって分画し、そして次いでお互いに別々に単離し、そしてさらなる分析方法のために使用可能にする。
【００３４】
本発明の目的のために、核酸という用語は、当業者に公知の全ての核酸、例えば天然または合成核酸、およびサンプルに人工的に導入された核酸、１本鎖および２本鎖核酸、直鎖、分枝、または環状核酸、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、またはリボザイム、ＤＮＡ、特にゲノムまたは色素体ＤＮＡ、または細胞小器官のＤＮＡ、および感染由来の核酸も含む。
【００３５】
適当な生物学的サンプルは、例えば、血液、精子、脳脊髄液、唾液、痰または尿などの細胞含有体液、白血球画分、バフィーコート、糞便、表面生検材料、吸引物、皮膚断片、生物全体、例えば剖検材料、生検材料、細針吸引物、または組織切片の形態の後生動物、好ましくは昆虫および哺乳類の、特にヒトの臓器および組織、例えば接着または懸濁した細胞培養物の形態の単離細胞、植物、植物の一部、植物組織または植物細胞、細菌、ウイルス、酵母および真菌のような、固定に適当な全ての生物学的サンプルである。
【００３６】
本発明によるプロセスの最初の工程ａ）において、固定サンプルを、好ましくはタンパク質分解活性化合物の活性を可能にする水溶液と接触させ、そしてまた１つまたはそれより多いタンパク質分解活性化合物とも接触させる。
【００３７】
本発明の目的のために、タンパク質分解活性化合物は、全てのタンパク質切断化合物、好ましくはプロテアーゼおよび熱安定性プロテアーゼ、特に好ましくはプロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、およびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、特にプロテイナーゼＫのようなタンパク質分解活性酵素、およびまた臭化シアンのような、タンパク質を切断するために適当な非酵素的物質、またはこれらの物質の混合物である。
【００３８】
水溶液中のタンパク質分解活性化合物の濃度は、一般的にそのタンパク質分解活性化合物の性質、およびその生物学的サンプルの性質および量に依存し、そしてその濃度は簡単な日常的な実験を用いて当業者が決定し得る。水溶液中のプロテアーゼ酵素の濃度は、それぞれの場合において水溶液の全重量に基づいて、好ましくは０．００１重量％から５重量、特に好ましくは０．０１重量％〜２．５重量％、そして特に０．０５重量％〜０．２重量％の範囲である。ここで、ある特定のサンプルのために使用するタンパク質分解活性化合物の量または濃度は、そのタンパク質分解活性化合物の性質、および当業者が精通している幾つかのもの、ｐＨ、補助因子、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間などの、選択した反応条件に依存する。そのタンパク質分解活性化合物の適当な量または濃度を、日常的な実験によって、簡単な方式で決定し得る。さらに、本発明によるプロセスにおいて、いかなる場合でも、タンパク質分解活性化合物の量または濃度を特に調整することは決定的ではなく、それは核酸の収量またはその完全性に悪い影響を与えることなく、ある特定のバンド幅で変動し得ることが見出された（実施例２）。
【００３９】
その水溶液は、好ましくは、例えばカオトロピック剤、および／または好ましくは界面活性剤のような、生物学的組織の分解および／または細胞の溶解を促進するさらなる物質を含む。
【００４０】
本発明によるプロセスにおいて使用するために適当な界面活性剤は、当業者に公知であり、そして細胞を溶解するために適当な全ての界面活性剤である；ここで陰イオン性または非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００４１】
好ましい界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｗｅｅｎまたはＮＰ−４０の商品名で入手可能な界面活性剤などのポリエチレングリコールフェニルエーテル、またはこれらの混合物を含む群から選択される化合物であり、好ましい界面活性剤は、ＳＤＳ、ＮＰ−４０、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（９から１０のエトキシ化度を有するポリエチレングリコール（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル）である。生物学的サンプルに存在する細胞の溶解を補助するために使用される界面活性剤の量は、その生物学的サンプルの性質および量に依存し、そして簡単な日常的な実験を用いて当業者が決定し得る。
【００４２】
その水溶液はさらに、好ましくは緩衝溶液であり、そのｐＨは、溶液中に存在する少なくとも１つの緩衝物質によって、６から９、好ましくは６．５から８．５、および特に好ましくは６．８から７．５の範囲に安定化される。よって、その水性緩衝溶液は好ましくは、好ましくはＴｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｐｉｐｅｓ、Ｍｏｐｓ、アルカリ金属酢酸塩／酢酸等を含む群から選択される、少なくとも１つの緩衝物質、および／または好ましくは、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ポリエチレングリコールフェニルエーテル、またはこれらの混合物、特に好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ−ｔｙｐｅ  ＮＰ−４０の商品名で入手可能な、４０のエトキシ化度を有するポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル、および／または９〜１０のエトキシ化度を有するポリエチレングリコール（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテルを含む群から選択される、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００４３】
その水溶液はさらに、溶解を補助する、核酸を分解要素（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ）に対して保護する、および／または水溶液を安定化する、さらなる成分、例えば錯体形成剤（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｅｒ）、還元剤、または他の緩衝物質を含み得、ここで当業者は溶解バッファーのための可能性のある添加物の性質および量に精通している、またはそれらを簡単な日常的な実験によって決定し得る。好ましい実施態様において、その水性緩衝溶液はさらに、以下のものを含む群から選択される、少なくとも１つの物質を含む：
・錯体形成剤、好ましくはエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸ナトリウム、またはこれらの混合物、
・好ましくは０．１から１０Ｍの濃度の、好ましくは塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、過塩素酸塩、ＮａＩ、ＫＩおよび尿素を含む群から選択される、カオトロピック剤、
・好ましくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、チオ硫酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、またはこれらの混合物を含む群から選択される、還元剤、および
・無機塩、好ましくは例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物、例えばＣａＣｌ２、またはＭｇＣｌ２のようなアルカリ土類金属ハロゲン化物、例えば塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硫酸リチウム、またはこれらの混合物。
【００４４】
１つの実施態様によって、その水性緩衝溶液は、界面活性剤、好ましくはＳＤＳのような非イオン性界面活性剤、および好ましくは緩衝剤、好ましくはＴＲＩＳを含む。その水性緩衝溶液はまた、ＥＤＴＡのようなキレート剤を含み得る。
【００４５】
本発明によるプロセスのプロセス工程ａ）において、架橋によって固定された生物学的サンプルを、少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を含む水溶液と接触させ、そして適当な温度でインキュベートする。ここで、その温度は一般的に、使用されるタンパク質分解活性化合物の性質に依存する。酵素の場合、その酵素が活性であることを可能にする温度を選択しなければならない。一般的に、低すぎる温度は酵素活性を不活性な段階まで抑制し、一方高過ぎる温度は、変性によって酵素を不活性化し得る。問題の酵素によって許容される温度範囲または最適な反応温度は、それぞれの酵素に依存して変動し、そして当業者に公知である、または簡単な日常的な実験によって決定し得る。例えばプロテイナーゼＫを用いる場合、その反応を約９５℃まで、好ましくは１８℃および８０℃の間、特に好ましくは５０および６５℃の間の温度で行い得る。
【００４６】
既に記載したように、驚くべきことに、タンパク質分解活性化合物、好ましくはプロテアーゼを用いた、固定サンプルにおけるタンパク質のタンパク質分解「消化」の条件の調整を最適化することによって、サンプルから、ＤＮＡではなく、ＲＮＡのみを選択的に除去することが可能であることが見出された。サンプルの本発明によるこの不完全な（部分的な）消化の後、ＤＮＡを含む、依然として未溶解の画分を、ＲＮＡを含む溶解した上清から分離し得る。所定のタンパク質分解活性化合物に関して、ＲＮＡおよびＤＮＡへの分離の質は、その濃度およびインキュベーション温度、および特にインキュベーション時間に依存する。もしそのタンパク質分解活性化合物を、非常に短時間のみ反応させたら、ＤＮＡだけでなく、ＲＮＡもサンプルから不十分にしか離れず、そして従って可溶性画分において全体で低い収量の核酸しか得られない。対照的に、もしそのタンパク質分解活性化合物を長く反応させすぎると、その結果は、ＲＮＡの（ほとんど）完全な溶解であるが、より多くのＤＮＡもペレットから遊離する。しかし、そのタンパク質分解活性化合物の反応時間を適切に調整することによって、可溶性画分中のＲＮＡおよび未溶解画分中のＤＮＡの間を実質的に分離する、サンプルの部分的な（不完全な）溶解を達成することが可能であり、それは実際の精製の前の、２つの型の核酸の「予備分画」である。
【００４７】
ここで、最適な反応時間は、まずそのタンパク質分解活性化合物、その水溶液中の濃度、およびインキュベーション温度に依存する。２番目に、その生物学的サンプルの量および厚さ、および他のサンプル特異的なパラメーター、例えば固定の型および期間が、そのタンパク質分解活性化合物の最適な反応時間に影響を有する。
【００４８】
ホルマリンで固定したサンプルを、特にそのサンプルをパラフィンに包埋した後に使用することが好ましい。比較的大きい組織塊に関して、サンプルの量の多さおよび厚さのために、より小さいサンプルと比較して、タンパク質分解活性化合物を含むより多い容量の溶液、およびまた有利に、より高い濃度のタンパク質分解活性化合物、およびより長い反応時間を使用する。適当な切断装置、例えばミクロトームを使用して、固定サンプルから組織切片を調製し、ここで、光学顕微鏡で調査するための厚さは、一般的に約５μｍから２０μｍである。さらに、パラフィン包埋サンプルをまた、他の方法を用いて、例えば中空針で穴をあけることによって、またはレーザーキャプチャー法によって、より小さいサンプル断片に分割し得る。より小さい組織断片は、より少量のタンパク質分解活性化合物およびより短い反応時間を必要とする。ここで特に切片の厚さが、組織とタンパク質分解活性化合物の完全な接触に関する制限因子であるので、決定的である。従って、好ましくは５μｍから５０μｍの厚さを有する組織切片、またはもし適当なら、より大きなサンプルを分割またはホモジナイズすることによって得られる、より小さい組織断片を用いることが好ましい。
【００４９】
固定時間、すなわち固定剤が生物学的サンプルに対して作用する時間は、生物学的サンプルにおいて生体分子の共有結合的架橋の程度に影響を与え、架橋の程度は、固定時間が長くなるほど増加する。短時間しか固定されなかったサンプルにおいては、従って少ない程度の生体分子の架橋しか存在せず、それは、個々の生体分子のより容易なおよびより迅速な溶解を可能にする。対照的に、長時間固定されたサンプルは、高い程度の架橋を有し、それは、特により大きな生体分子の溶解を遅延させ得る。よって、強く固定された（過固定）サンプルに関して、タンパク質分解活性化合物のより長い反応時間を有することが有用であり得る。ここで、最適な固定時間は、組織片のサイズに依存するので、「短時間固定された」および「長時間固定された」という用語は、相対的に理解される。組織におけるホルマリンの拡散速度は、最初約１ｍｍ／時間（ｈ）であり、その速度は、組織深度が増加すると減少する。従って、約５ｍｍの厚さの組織片に関して、ホルマリンがサンプルに完全に浸透するために約８時間が必要である（固定時間）。実際、約１２〜２４時間の固定時間が通例である；非常に小さなサンプルは、はるかにより短い固定時間を必要とし、そして１２時間の固定時間で既に過剰固定である。
【００５０】
従って、最適な反応時間は、固定および固定時間、生物学的サンプルの性質、量および厚さのような、サンプル特異的なパラメーターに依存し、そして個々のサンプルそれぞれに関して最適に調整し得る。驚くべきことに、それにも関わらず、多くの可能性のあるサンプルパラメーター、すなわち多くの異なる個々のサンプルに関して、ＤＮＡおよびＲＮＡの未溶解および溶解画分への分離を可能にするように、その条件を調整することも可能である。ここで、その反応時間は、３０秒および数日の間、好ましくは１分および５時間の間、そして特に好ましくは５分および９０分の間、そしてより好ましくは１０分および３０分の間であり得る。６００ｍＡＵ／ｍｌより大きい活性の、１０μｌから４０μｌのプロテイナーゼＫ溶液を、１０μｍから２０μｍの厚さのＦＦＰＥ組織切片に関して、５６℃のインキュベーション温度、および約１５分から９０分の反応時間で使用する場合、本発明の目的のために、サンプルの部分的溶解に関して非常に良い結果が得られる、すなわち、ＲＮＡは（ほとんど）完全に未溶解画分から溶解し、そして溶解画分に移動し、一方ＤＮＡは依然として（ほとんど）完全に未溶解画分に存在する（実施例２および３）。
【００５１】
１つの実施態様によって、工程ａ）は、界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を含む水性緩衝溶液中でのサンプルの部分的溶解と同時に、タンパク質分解活性酵素、好ましくはプロテイナーゼＫのようなプロテアーゼを用いた、サンプルが有するタンパク質を含む成分の部分的なタンパク質分解を含み、ここでその反応を、１８℃および８０℃の間、好ましくは５０℃から６５℃の間の温度で、１０分から５時間の間、好ましくは１０から９０分の間、より好ましくは１０分から３０分の間の反応時間で行う。この実施態様は、ＲＮＡの溶解画分への放出において迅速および有効であるという利点を有する。
【００５２】
ここで、生物学的サンプルの固定を、当業者に公知のあらゆる固定剤によって、特に酸、アルコール、ケトン、または特にグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような、他の有機物質によって行い得、ここで、ホルムアルデヒドで固定した生物学的サンプルが特に好ましい。本発明によるプロセスの特に好ましい実施態様によって、ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋生物学的サンプル（ＦＦＰＥサンプル）を使用する。
【００５３】
もしパラフィンに包埋した生物学的サンプルを使用するなら、そのパラフィンを好ましくは最初に、少なくとも部分的に、好ましくは完全に、サンプルから除去する。脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）は、水性媒体中でサンプルを効率的に溶解するために、生物学的サンプルを包埋するために使用したパラフィンを選択的に除去するように働く。一般的に、パラフィンは核酸の溶解および分画の間、および核酸のさらなる精製および分析の間の両方に干渉し得る。好ましくは前もって行う脱パラフィン化は、プロテアーゼ処理後に本発明によるプロセスにおいて得られるペレットの質、特に固体性に、そして従って核酸の分離および得られる収量に顕著な影響を有し得る。
【００５４】
生物学的サンプルからのパラフィンの除去を、原則として当業者に公知の、生物学的サンプルの脱パラフィン化のためのあらゆるプロセスによって行い得る。好ましくは、その脱パラフィン化を、最初にサンプルを疎水性有機溶媒に接触させることによって行う。ここで、生物学的サンプルおよび有機溶媒の混合物を、パラフィンのサンプルからの効率的な溶解を保証するために、例えば実験室振とう機で振とうすること、マグネティックスターラー等を使用することによって、撹拌しながら混合することが有利であり得る。有利に、そのサンプルを続いて遠心分離して、有機溶媒に溶解したパラフィンを、ペレット、すなわち生物学的サンプルから分離する。もし必要なら、生物学的サンプルからパラフィンを溶解する工程を、１回、２回、３回、または１０回まで繰り返し得る。その脱パラフィン化を、例えば特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたように、好ましくは疎水性有機溶媒、好ましくは芳香族炭化水素、特にキシレン中でインキュベーションし、続いてエタノール中でサンプルを再水和することによって行い得る。例えばアルカン類、好ましくは６＜ｎ＜１７である、一般式ＣｎＨ２ｎ＋２の、室温で液体であるアルカン類またはこれらの混合物、特に好ましくはヘプタンのような、他の有機溶媒も、もし適当ならＣ１〜Ｃ５アルコール類、すなわちメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノール、好ましくはメタノールを添加して、脱パラフィン化のために使用し得る。もし直鎖、すなわち未分枝のアルカンを使用するなら、６個またはそれより少ない炭素原子の鎖長のアルカンのいくつかは、毒性であると分類されており、室温でガス状であって、かつ／またはあまりにも揮発性であり、１７個およびそれより多い炭素原子の鎖長のアルカンは、室温で固体であるので、ｎは好ましくは６より多く１７未満である。もし適当なら、アルケン類、芳香族化合物等のような他の化合物が室温で液体であり、そして例えば鉱物油のようなパラフィンを溶解する限り、それらとのアルカンの混合物を使用することもさらに可能である。６個より多く１７個未満の炭素原子の鎖長を有するアルカン類中で、特に好ましくはヘプタン中でインキュベートすることによる脱パラフィン化は、本発明に従うプロセスによる可溶性および不溶性画分ＡおよびＢの引き続く分離のために特に有利であることが見出された。Ｃ１〜Ｃ５アルコール、好ましくはメタノールの、容量で１〜２５％、好ましくは容量で５〜１０％の量での、疎水性有機溶媒への添加は、不溶性残渣の沈殿を促進し、従って可溶性および不溶性画分の分離をより容易に、そしてより効率的になし得る。好ましい実施態様においては、それゆえそのプロセスは、工程（ａ）による部分的な溶解の前に、もし適当ならＣ１〜Ｃ５アルコール、好ましくはメタノールの、容量で１〜２５％、好ましくは容量で５〜１０％の量での添加を伴って、好ましくはサンプルを疎水性有機溶媒に接触させることによる、特に好ましくは６個より多く１７個未満の炭素原子の鎖長の非極性脂肪族または芳香族炭化水素；特にキシレン、ヘプタン、および鉱物油を含む群から選択される炭化水素を用いた、パラフィンの選択的除去のための工程（ｉ）を含む。１つの実施態様によって、脱パラフィン化を、アルカン、好ましくはヘプタン、およびアルコール、好ましくはメタノールとのインキュベーションによって達成する。適当な有機溶媒によるパラフィンの溶解に加えて、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８（１９９５）７６８−７７３頁において、Ｂａｎｅｒｊｅｅらによって記載されたような、パラフィンの融解のような他のプロセスも、脱パラフィン化のプロセスとして適当である。
【００５５】
パラフィンの除去後、生物学的サンプルを再水和することが好ましい場合があり、この再水和を、好ましくはアルコール濃度を次第に減少させた水性アルコール溶液（下降アルコール系列（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｅｒｉｅｓ））で段階的に洗浄することによって行い、Ｃ１からＣ５アルコールが好ましく、そしてメタノール、エタノールおよびイソプロパノールが特に好ましい。もし使用する脱パラフィン化試薬がキシレンであるなら、そのサンプルを、さらなる処理の前に、通常この方式で再水和する。引き続く核酸単離のためのこの再水和の必要性は、関連する文献において議論されている。もし使用する脱パラフィン化試薬が直鎖脂肪族アルカンであるなら、サンプルの再水和は必要ない。しかし、単一の適当な試薬、例えば市販で入手可能な製品、ＢｉｏＧＥｎｅｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡからのＥＺ−ＤＥＷＡＸ（登録商標）で脱パラフィン化および再水和を行うことも可能である。
【００５６】
好ましくは、そのサンプルは、脱パラフィン化および再水和の後、最初に、例えば空気への曝露または乾燥オーブンでのインキュベーションによって乾燥する。さらに、必要に応じて脱パラフィン化および再水和した生物学的サンプルを、好ましくは部分的な溶解の前にホモジナイズすることができ、それは特に比較的大きな組織サンプルの場合に有用である。対照的に、２０μｍの厚さまでの組織切片は、一般的にサンプルのホモジナイゼーションを必要としない。このホモジナイゼーションを、生物学的サンプルを細かく砕くための、当業者に公知のあらゆる装置、特に機械的破砕装置、例えばミル、ローター−ステーターホモジナイザー、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーまたは細いカニューレの補助を有する高圧細胞消化を用いて、または超音波ホモジナイザーによって行い得る。
【００５７】
従って、好ましい実施態様において、そのプロセスは、工程（ｉ）によるパラフィンの除去の後、および工程（ａ）による水性緩衝溶液におけるサンプルの部分的溶解の前に、好ましくは少なくとも以下の工程の１つを含む：
（ｉｉ）好ましくは、サンプルを、連続的に水含有量を増加させた水性Ｃ１〜Ｃ５アルコール溶液で繰り返し洗浄することによる、サンプルを再水和する工程、
（ｉｉｉ）サンプルを乾燥する工程および／または
（ｉｖ）サンプルをホモジナイズする工程。
【００５８】
脱パラフィン化する、そして脱パラフィン化サンプルを作り上げるそれぞれの方法の工程も、先行技術において周知であり、そして従って、ここでさらなる説明を必要としない。
【００５９】
１つの実施態様によって、架橋によって固定したサンプルを、脱パラフィン化の後にペレットの形態で得る。好ましくは、部分的溶解工程ａ）を行うために、水性緩衝溶液を、上記ペレットに加える。さらなる実施態様によって、脱パラフィン化化学物質を含む脱パラフィンされたサンプル（それぞれ脱パラフィン化溶液（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｓａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））を、工程ａ）において使用するための水性緩衝溶液と混合し、それによって水相を形成し、その水相に対し、工程ａ）において少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を用いて、上記サンプルが有するタンパク質を含む成分の部分的タンパク質分解を行なうことで、含まれるＲＮＡを選択的に溶解画分に放出させ、一方含まれるＤＮＡは主に未溶解画分に留まる。ここで、そのタンパク質分解活性化合物、好ましくはタンパク質分解酵素を、その水相に加えることができ、一方脱パラフィン化のために用いた溶液は依然として、水性緩衝溶液を添加したことにより形成された水相の上に存在する。もし、これの代替の分離工程ｂ）を、例えば部分的に消化した架橋サンプルを遠心分離することによって（例えば上記および下記を参照のこと）、行うなら、主にＤＮＡを含む未溶解画分は水相中でペレットを形成する。溶解画分を未溶解画分から分離するために、水相を、例えばピペットを使用することによって、例えば脱パラフィン化溶液によって回収し、他方では、未溶解の、主にＤＮＡを含むペレットを残す。あるいは、脱パラフィン化溶液を、水性緩衝溶液の添加後に得られた水相から分離し、その後、タンパク質分解活性化合物を加え、そして未溶解画分を溶解画分から分離し得る。
【００６０】
本発明によるプロセスの工程ｂ）において、出発材料に存在する異なる型の核酸、すなわちＲＮＡおよびＤＮＡを、次いで、主にＲＮＡを含む溶解画分（Ａ）、および主にＤＮＡを含む未溶解画分（Ｂ）に分離する。溶解および未溶解成分を含むサンプル全体を、少なくとも２つの画分に分離することも可能であり、次いで、それから様々な生体分子を単離または精製する、またはその中の様々な生体分子を次いで検出または分析し得る；しかし、そのサンプルを、本発明によるプロセスの工程ａ）の後に、好ましくは少なくとも１つの溶解画分（Ａ）、および少なくとも１つの未溶解画分（Ｂ）に分離する。２つの画分を分離する利点は、それぞれの収率を減少させる、またはサンプルが有する様々な細胞型の不均一な分布をもたらす、もとの生物学的サンプルを分離する如何なる必要もなく、これらの２つの画分から、それぞれの場合別々に実質的に１つの型の核酸を単離し得ることである。
【００６１】
この方式で得られた画分に対し、次いで別々に核酸の精製を行い得る。１つの画分からのみ核酸を単離し、そして他の画分を廃棄することも、本発明の範囲内である（例えば実施例６および７を参照のこと）。核酸の単離のための、サンプル（複数可）のさらなる処理の間に、そのサンプル（複数可）を、好ましくはタンパク質分解活性化合物の存在下で、５０℃〜１００℃、好ましくは５５℃から９５℃、特に好ましくは６０℃から９０℃、および特に６５℃から８５℃の範囲の温度に加熱する。
【００６２】
未溶解成分の、水溶液からの分離は、特にもしそのタンパク質分解活性化合物が高い温度、すなわち室温より上の温度で活性であるなら、好ましくはタンパク質分解活性化合物の反応時間後に混合物を冷却することによって補助される。冷却を、好ましくはそのサンプルをプロテアーゼ消化の温度より下の温度で、好ましくは室温で、特に４℃で、または例えば−２０℃または−８０℃のようなさらにより低い温度でインキュベートすることによって行い、ここで、水溶液全体が凍結するのを避けるために、これらの温度で冷却するのは短時間である。従って、冷却を好ましくは１５℃またはそれより低い、１０℃またはそれより低い、４℃またはそれより低い温度で、または例えば−２０℃または−８０℃のような、さらにより低い温度で行う。冷却を、分離工程の前および／または分離工程の間に行い得る。冷却は、未溶解画分の分離、特にペレット化がより効率的であるという利点を有する。これは、ＦＦＰＥサンプルは通常未溶解成分を含み、特にＤＮＡは大量の固体成分ではなくタンパク質に架橋しているので、特に有利である。上記未溶解成分は、通常ペレット化するのが困難である。冷却は、未溶解成分のペレット化を補助し、そして従って分離をより効率的にする。従って、冷却は、個々の画分の分離が改善されるため、主にＤＮＡを含む未溶解画分が、より多くのＤＮＡを含むこと、そしてそれゆえ、ＲＮＡを含む溶解画分では、ＤＮＡの混入がより少なくなることがもたらされる。少しの細胞材料しか含まない架橋サンプルを処理する場合に、これは特に有用である。
【００６３】
１つの実施態様によって、分離により、主にＤＮＡを含む未溶解画分を、小型のペレットの形態で得ることになる。これにより、主にＤＮＡを含むペレットを、主にＲＮＡを含む溶解画分から容易に分離することが可能となる。
【００６４】
３番目の工程において、この方式で得られたその溶解画分（Ａ）および未溶解画分（Ｂ）を、お互い別々に使用して、存在する生体分子、好ましくは核酸（複数可）を精製し得る。ここで、溶解画分（Ａ）を、好ましくはＲＮＡを単離するために使用し、そして未溶解画分（Ｂ）を、好ましくはＤＮＡを単離するために使用する。１つの画分からのみ核酸を単離し、そして他の画分を廃棄することも、本発明の範囲内である（例えば実施例６および７を参照のこと）。
【００６５】
ここで、溶解画分（Ａ）を、核酸単離のための適当なプロセスにおいて、さらなる溶解無しに、直接使用し得る。しかし、例えばタンパク質分解活性化合物、好ましくはプロテアーゼによるさらなる溶解を、必要に応じて水溶液中で行い得る。適当なプロセスは、当業者に公知である、核酸、特にＲＮＡを単離するための全てのプロセスおよび方法である。特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４、ＷＯ２００８／０２１４１９、ＷＯ２００５／０１２５２３、またはＷＯ２００５／０５４４６６において記載されたような、固定サンプル材料から核酸を単離するためのプロセス、または別に、市販のキットＲＮｅａｓｙＦＦＰＥおよびｍｉＲＮｅａｓｙＦＦＰＥ（どちらもＱＩＡＧＥＮから）の補助によって行われるプロセスが適当である。後者の場合、シリカ膜へのカオトロープが媒介する結合によって核酸を精製する前に、画分Ａを少なくとも１つの加熱工程にかける。ＲＮＡのさらなる抽出および精製を、好ましくは特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたプロセスの補助によって行い得る。もし特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたようなプロセスを、溶解画分からの核酸の単離のために使用するなら、そのサンプルを、求核試薬の存在下で加熱する。これを、少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物および現在溶解した核酸を含む水溶液中で行い得、ここで特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたプロセスのために必要な求核試薬を、本発明によるプロセスの工程ａ）（タンパク質分解活性化合物の作用）の後に、その水溶液に加え得る、またはさらには工程ａ）に従ってサンプルに加える前に、求核試薬がその水溶液に存在し得る。画分の分離を、特許出願ＷＯ２００７／０６８７６４において記載されたようなサンプルの加熱の後に、または好ましくは、さらなる加熱の前の、タンパク質分解活性化合物を作用させた後に直接行い得る。
【００６６】
適当な求核試薬は、電子をルイス酸の空の軌道に、または複数の空の軌道に移し得る、全てのルイス塩基である。これらのルイス塩基の中で、陰性の電荷を有する、陰性に分極している、または少なくとも１つの自由電子対を有する、少なくとも１つの官能基を有する試薬が特に好ましい。
【００６７】
陰性の電荷を有する官能基を含む化合物は、例えばアルカリ金属アルコキシドまたはアルカリ土類金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属ハロゲン化物またはアルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ金属シアン化物またはアルカリ土類金属シアン化物等であり、それらに制限されない。
【００６８】
陰性に分極した少なくとも１つの官能基を有する試薬は、特にお互いに共有結合した２つの原子を含み、そしてそのＡｌｆｒｅｄおよびＲｏｃｈｏｗによる電気陰性度が、少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．５、そしてより好ましくは少なくとも１．０異なる、少なくとも１つの官能基を有する試薬である。
【００６９】
しかし、本発明によって、１つまたは２つ、特に好ましくは１つの自由電子対（複数可）を有する、少なくとも１つの官能基を有する求核試薬が、特に好ましく、そして今度はこれらの化合物の中で、少なくとも１つの１級アミノ基、２級アミノ基、または構造Ｉの３級アミノ基を有するものが最も好ましい
【００７０】
【化１】
2013520187.tif 000002
ここで、Ｒ１はＣ１からＣ２０炭化水素基、特に好ましくはＣ２からＣ１５炭化水素基、そしてより好ましくはＣ２からＣ１０炭化水素基、少なくとも１つのヘテロ原子を有するＣ１からＣ２０炭化水素基、少なくとも１つのヘテロ原子を有するＣ２からＣ１５炭化水素基、そしてより好ましくは少なくとも１つのヘテロ原子を有するＣ２からＣ１０炭化水素基、または必要に応じてヘテロ原子で置換された芳香環系である、
Ｒ２は、Ｃ１からＣ２０アルキル基、特に好ましくはＣ１からＣ１０アルキル基、そしてより好ましくはＣ１からＣ２アルキル基、特にメチル基またはエチル基、Ｃ１からＣ２０ヒドロキシアルキル基、特に好ましくはＣ１からＣ１０ヒドロキシアルキル基、そしてより好ましくはＣ１からＣ２ヒドロキシアルキル基、または水素原子であり、水素原子が最も好ましい、および
Ｒ３は、Ｃ１からＣ２０アルキル基、特に好ましくはＣ１からＣ１０アルキル基、そしてより好ましくはＣ１からＣ２アルキル基、特にメチル基またはエチル基、Ｃ１からＣ２０ヒドロキシアルキル基、特に好ましくはＣ１からＣ１０ヒドロキシアルキル基、そしてより好ましくはＣ１からＣ２ヒドロキシアルキル基、または水素原子であり、水素原子が最も好ましい。
【００７１】
本発明によって、上記で示した構造Ｉの官能基を有する求核試薬が特に好ましく、それは特に少なくとも１つの構造Ｉの官能基を有し、構造ＩのうちででラジカルＲ２およびＲ３のうち少なくとも１つ、最も好ましくは両方のラジカルＲ２およびＲ３が、水素原子である。それに加えて、少なくとも１つの構造Ｉの官能基を有する求核試薬が特に好ましく、ここで構造Ｉの窒素原子は、ラジカルＲ１、Ｒ２およびＲ３のｓｐ３混成原子に共有結合しているのみである。特に、ラジカルＲ１、Ｒ２およびＲ３はどれも、それぞれラジカルＲ１、Ｒ２およびＲ３を超えて窒素原子の自由電子対を非局在化する（ｄｅｌｏｃａｌｉｓｉｎｇ）ことはできない。従って、特に好ましくは、ラジカルＲ１、Ｒ２およびＲ３はどれも、例えば構造ＩＩを有さない。
【００７２】
【化２】
2013520187.tif 000003
本発明によって、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、イソブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ヘキサメチレンテトラミン、２−エチルヘキシルアミン、２−アミノ−１，３−プロパンジオール、ヘキシルアミン、シクロヘキシルアミン、１，２−ジメトキシプロパンアミン、１−アミノペンタン、２−メチルオキシプロピルアミン、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アミノカルボン酸、特にグリシンまたはヒスチジン、またはアミノグアニジンを含む群から選択される、少なくとも１つの構造Ｉの官能基を有する求核試薬が特に好ましく、ここで最後に述べたものは、可能であるが、好ましくはない。これらの中で、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、アミノ−１，３−プロパンジオールおよびトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタンが最も好ましい。少なくとも１つの構造Ｉの官能基を有する、好ましい求核試薬は、さらにアニリン、トルイジン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、キシリジン、キシレンジアミン、ナフタレンジアミン、トルエンジアミン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジフェニルジアミン、フェニレンジアミン、２，４’−メチレンジアニリン、４，４’−メチレンジアニリン、スルホニルジアニリン、およびジメチルベンジルアミンを含む群から選択される、芳香族アミンである。
【００７３】
その求核試薬が少なくとも１つの構造Ｉの１級アミノ基を有する、本発明によるプロセスの特定の実施態様によって、その求核試薬は、Ｃ１からＣ６アルキルアミン、Ｃ１からＣ６アルキルジアミン、Ｃ１からＣ６アルキルトリアミン、Ｃ１からＣ１５アミノアルコール（ａｍｉｎｏａｌｋｏｈｏｌ）、Ｃ１からＣ１５アミノジオール、またはＣ１からＣ１５アミノカルボン酸である。
【００７４】
本発明によるプロセスの別の特定の実施態様によって、その求核試薬は、窒素原子を含むヘテロ環状化合物であり、そしてピロール、ピリジン、キノリン、インドール、アザシクロペンタン、アザシクロヘキサン、モルホリン、ピペリジン、イミダゾ−ルまたはこれらの化合物の誘導体を含む群から選択され、ここでこれらの化合物の誘導体は、好ましくは水素原子の代わりに、上記で述べた化合物の、１つまたはそれより多い炭素原子、または窒素原子に結合した、Ｃ１からＣ３アルキル基、特に好ましくはメチルまたはエチル基を有する化合物を意味すると理解される。
【００７５】
上記で述べた求核試薬の中で、水溶性であるもの、特に２５℃の温度、およびｐＨ７において、水中で少なくとも１ｇ／ｌ、特に好ましくは少なくとも１０ｇ／ｌ、そしてより好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌの溶解度を有するものが好ましい。
【００７６】
使用する水溶液中での求核試薬の濃度は、好ましくは０．１から１００００ｍｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１から５０００ｍｍｏｌ／ｌ、さらにより好ましくは５から２５００ｍｍｏｌ／ｌ、および最も好ましくは２０から１０００ｍｍｏｌ／ｌの範囲である。本発明によるプロセスの特に有用な実施態様によって、水溶液中の求核試薬の濃度は、２０ｍｍｏｌ／ｌ超、特に好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ超、そして最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ超である。
【００７７】
１つの実施態様によって、好ましくはタンパク質分解酵素である、タンパク質分解活性化合物による消化を行った後、サンプル中の架橋は、好ましくは少なくとも７０℃、より好ましくは少なくとも７５℃、最も好ましくは少なくとも８０℃、または少なくとも９０℃の温度まで、少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、最も好ましくは少なくとも１５分の期間加熱することによって、少なくとも部分的に逆行する（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）。少なくとも１５分間８０℃に加熱することが、分解したサンプルのＲＮＡを含む溶解画分において架橋を逆行させるために特に好ましい。少なくとも３０分から数時間まで、好ましくは少なくとも１．５、または少なくとも２時間、少なくとも８５℃、好ましくは少なくとも９０℃に加熱することが、ＤＮＡにおいて架橋を逆行させるために好ましい。上記で述べたように、求核試薬の存在下で加熱を行う。適当なインキュベーション時間も、引用された先行技術において記載される。架橋を逆行させるためのこのさらなる加熱工程を、主にＲＮＡを含む溶解画分を、主にＤＮＡを含む未溶解画分から分離する前または後に行い得る。この加熱工程は、さらなるＤＮＡが未溶解画分から放出されることをもたらし得るので、特に続いて未溶解画分からＤＮＡを単離することも意図するなら、画分を分離した後に上記加熱工程を行うことが好ましい。さらに放出されたＤＮＡは、例えばＤＮａｓｅ消化を行うことによって分解され得るので、ＲＮＡを単離することのみを意図するなら、上記加熱工程を、画分を分離する前にも行い得る。小さいＲＮＡ分子も保存する、ＤＮａｓｅ消化を行うための好ましい実施態様を、下記で詳細に説明する。
【００７８】
１つの実施態様によって、ＤＮａｓｅ消化を、分離した、主にＲＮＡを含む溶解画分に対して行う。架橋サンプルに含まれる主な量のＤＮＡを含む未溶解画分を分離することにより、既に上記サンプルに含まれるＤＮＡの主な部分が除去される。従って、部分的な消化および画分の分離の後に得られる、主にＲＮＡを含む溶解画分は、既にＤＮＡが枯渇している。工程ａ）において部分的消化の間に放出されたかもしれない、残りの量のＤＮＡを、ＲＮＡを含む溶解画分に対して、ＤＮａｓｅ消化を行うことによって効率的に分解し得る。ＲＮＡをＤＮａｓｅ消化サンプルから単離することにより、ほとんどまたは全くＤＮＡの混入のない、純粋なＲＮＡが提供される。
【００７９】
従って、１つの実施態様によって、ＤＮａｓｅを、分離した主にＲＮＡを含む溶解画分に加える。ＤＮａｓｅ消化を、ＲＮＡを単離する前に効率的に行い得ることは、非常に驚くべきことであった。これは、通常の先行技術の方法ではＲＮＡを精製するときＲＮＡを単離してからＤＮａｓｅ消化を行っているように、ＤＮａｓｅが、効率的には機能しないことが予測されたからである。さらに、例えば通常のオンカラムのＤＮａｓｅ処理と比較して、特に小さいＲＮＡの量が、本発明によるプロセスを用いる場合に増加するので、ＲＮＡを単離する前にＤＮａｓｅ消化を行うことはまた、かなりの利点を有する。それぞれのＤＮａｓｅ消化を、実施例６および７で行う。好ましくは、そのＤＮａｓｅ消化を、上記で記載したように加熱によって架橋を逆行させた後に行う。
【００８０】
「ＤＮａｓｅ」という用語は、ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合の加水分解切断を触媒するあらゆる酵素を指す。多種多様なデオキシリボヌクレアーゼが公知であり、それらはその基質特異性、化学的メカニズム、および生物学的機能が異なる。「ＤＮａｓｅ」という用語は、エキソデオキシリボヌクレアーゼおよびエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。特に、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩを使用し得る。ＤＮａｓｅＩが好ましい。
【００８１】
ＤＮａｓｅ消化を、ＤＮＡの効率的な分解を可能にするために、ＤＮａｓｅが活性である条件下で行う。ＤＮａｓｅ消化の効率を、例えば分解サンプルに加えるＤＮａｓｅの量によって、およびさらに、特にＭｇイオンおよびＣａイオンのような、ＤＮａｓｅの活性を促進する添加物を加えることによって、調整し得る。さらに、工程ａ）において部分的消化を達成するために使用する条件に依存して、分離した、主にＲＮＡを含む溶解画分に対して、ＤＮａｓｅ消化が高い効率で作用することを保証するために、中間の処理工程が有用であり得る。例えば、ＤＮａｓｅ消化に干渉し得る成分を、ＤＮａｓｅ消化を阻害しない濃度まで除去または希釈し得る。ＤＮａｓｅ消化を、ＤＮａｓｅが活性である濃度のＭｇイオンおよびＣａイオンの存在下で行う。例えば、ＤＮａｓｅ消化を行うために、ＭｇイオンおよびＣａイオンを、例えばＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の形態で、分解サンプルに加えて、ＤＮａｓｅ消化混合物において適当な濃度を確立し得る。ＭｇイオンおよびＣａイオンの適当な濃度は、サンプル、および特に分解工程ａ）において使用する溶解条件に依存する。例えば、もしＣａイオンおよびＭｇイオンが、工程ａ）における消化の間に既に提供され、そして従って、分解サンプルに存在するなら、より少ない量のＭｇイオンおよびＣａイオンをＤＮａｓｅ消化のために加えなければならない、またはＭｇおよびＣａの添加はさらに必要でない。もし、例えばＥＤＴＡのようなキレート剤を、工程ａ）の間に使用するなら、ＤＮａｓｅ消化の間により高い濃度のＭｇイオンおよびＣａイオンを使用することが賢明である。１つの実施態様によって、そのＭｇイオンおよびＣａイオンは、好ましくはＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の形態で、少なくともそれぞれ０．２ｍＭ、少なくともそれぞれ２ｍＭ、少なくともそれぞれ５ｍＭ、少なくともそれぞれ７．５ｍＭ、および好ましくは少なくともそれぞれ１０ｍＭから成る群から選択される濃度で、反応組成物中で提供される。さらに、そのＣａイオンおよびＭｇイオンを、０．２ｍＭから１Ｍ、２ｍＭから１００ｍＭ、１０ｍＭから５０ｍＭ、および１０ｍＭから２５ｍＭから成る群から選択される、各イオンの濃度範囲で提供し得る。ＤＮａｓｅ、分解サンプルおよび必要に応じて、ＤＮａｓｅ消化を促進するさらなる添加物を含むＤＮａｓｅ消化反応組成物を、適当な時間インキュベートして、ＤＮＡが分解されることを可能にする。好ましくは、そのインキュベーションは、少なくとも５分、少なくとも好ましくは１０分、または少なくとも１５分間行う。適当な範囲は、１分から６時間、５分から１２０分、１０分から６０分、および１５分から３０分を含む。随意選択のＤＮａｓｅ消化を行った後、ＲＮＡをサンプルから単離し得る。本明細書中で議論するように、基本的にあらゆるＲＮＡ単離方法を使用し得る。
【００８２】
１つの実施態様によって、そのＲＮＡを、溶解した、必要に応じてＤＮａｓｅ処理した画分から、適当な添加物を加えることによって適当な結合条件を確立すること、および核酸結合固相にＲＮＡを結合することによって、単離する。１つの実施態様によって、ＲＮＡの単離は、少なくとも以下の工程を含む：
ｉ）少なくとも１つのアルコールおよび／または少なくとも１つのカオトロピック剤、および必要に応じてさらなる添加物を加えて、結合混合物を形成する工程、およびその結合混合物を、核酸結合固相と接触させて、ＲＮＡを上記固相に結合させる工程；
ｉｉ）必要に応じてＲＮＡが固相に結合している間にＲＮＡを洗浄する工程；および
ｉｉｉ）必要に応じてその固相からＲＮＡを溶出する工程。
【００８３】
核酸結合固相として、核酸を結合し得るあらゆる材料を使用し得、そして従って適当な条件下で核酸を結合し得る、様々な材料を含む。本発明と関連して使用し得る代表的な固相は、シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、およびホウケイ酸塩を含むがこれに限らない、シリカおよびケイ質固相を含む化合物、ニトロセルロース；ジアゾ化紙；ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイトとも呼ばれる）；ナイロン、金属酸化物；ジルコニア；アルミナ；ポリマー支持体、ジエチルアミノエチル−およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体、疎水性クロマトグラフィー樹脂（フェニルまたはオクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅのような）等を含むがこれに限らない。固相という用語は、その形態またはデザインに関していかなる制限も意味することを意図しない。従って、固相という用語は、膜、フィルター、シート、粒子、磁気粒子、ビーズ、ゲル、粉末、繊維等を含むがこれに限らない、多孔性または非多孔性、透過性または不透過性の、適当な材料を包含する。１つの実施態様によって、その固相の表面は、改変されていない、そして例えば官能基によって改変されていない。好ましい実施態様によって、その核酸結合固相は、カラムに含まれる。本明細書中で使用される「カラム」という用語は、特に少なくとも２つの開口部を有する容器を説明する。それによって、溶液および／またはサンプルが、上記カラムを通過し得る。「カラム」という用語は、特に容器の形に関していかなる制限も意味せず、それは例えば円形または角であり得、および好ましくは円柱状であり得る。しかし、特に多層カラムを使用する場合、他の形も使用し得る。そのカラムは、核酸結合固相を含む。上記カラムに含まれる上記固相は、カラムにアプライした場合に溶液、それぞれサンプルの通過を可能にする。これは、もし例えば遠心力をカラムにかけたら、溶液および／またはサンプルは、遠心力の方向にカラムを通過し得ることを意味する。上記で議論したように、それぞれのカラムに基づく核酸単離手順を用いる場合、そのサンプルは、例えば遠心分離または減圧によって補助されて、カラムを通過し、そして核酸は、上記通過の間に、含まれる核酸固相に結合する。そのカラムを、単一の形式で、または多層の形式で使用し得る。マルチウェルプレートと同様の形式を有し、そして膜のような核酸結合固相を含む、そのような多層カラムは、先行技術において周知である。好ましくは、そのカラムはスピンカラムである。カラムに含まれる核酸結合固相として、通常カラムに基づく核酸単離手順で利用される、あらゆる固相を使用し得る。好ましくは、核酸結合膜、および従って核酸を結合し得る膜を使用する。適当な膜は、親水性膜、疎水性膜、およびイオン交換によって核酸を結合する膜を含むが、これに限らない。例は、シリカ膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、改変セルロース膜（例えばアセチル−またはヒドロキシ−）のようなセルロース膜、紙膜、特に改変紙を含むがこれに限らない。好ましくは、その膜は多孔性である。さらに、シリカを含む、またはシリカから成る膜を使用することが好ましい。カラムに含まれる、さらなる通常の核酸結合固相は、シリカ粒子のような、核酸結合粒子の充填、または核酸結合材料（例えばシリカゲル）の層である。例えば、そのシリカ粒子を、不活性なフィルターまたは膜上に層として配置し、それによって核酸結合固相を形成し得る。
【００８４】
サンプルの未溶解成分を消化し、そして生体分子の残った架橋を切断するために、もし適当なら、未溶解成分を含む画分（Ｂ）に、好ましくはさらなる処理を行う。実質的に依然として未溶解画分（Ｂ）にある、溶解可能な核酸、主にＤＮＡを、このさらなる処理工程によって単離し得る。固定組織から核酸を溶解するために公知のあらゆるプロセス、例えばＷＯ２００７／０６８７６４、ＷＯ２００８／０２１４１９、ＷＯ２００５／０１２５２３、またはＷＯ２００５／０５４４６６において記載されたようなプロセスが適当である、または他に市販で入手可能なキット、例えばＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）の補助によって行い得る方法が、核酸、特にＤＮＡを、未溶解画分（Ｂ）から単離するために適当である。後者の場合、画分Ｂの未溶解成分に、タンパク質分解剤、例えばプロテアーゼによる、少なくとも１つのさらなる処理、および加熱工程を行う。そのプロテアーゼ処理は、効率的な溶解、および従って溶解可能な核酸の放出を行う。未溶解画分Ｂは、完全な固定サンプルと比較して、特により容易に溶解可能でない成分しか含まないので、さらなる最適化、例えばさらなるプロテアーゼ工程および加熱工程の延長が有用であり得、そして著しく改善した収量および引き続く（下流の）分析における結果をもたらす。
【００８５】
従って、１つの実施態様によって、ＤＮＡを、画分の分離後に、未溶解の主にＤＮＡを含む画分から得る。ＤＮＡを未溶解画分から得ることは、１つの実施態様によって以下の工程を含む：
ｉ）上記未溶解画分に、同時酵素プロテアーゼ消化による溶解を行うことによって、ＤＮＡを、未溶解の、主にＤＮＡを含む画分から放出する工程であって、ここで好ましくは、溶解の間に少なくとも１つの界面活性剤、および必要に応じてさらなる添加物を使用し、そしてここで、その酵素消化を、好ましくは加熱によって補助する（適当な条件を上記で（ａｂｉｖｅ）述べる）工程；
ｉｉ）架橋を少なくとも部分的に逆行させるために、主にＤＮＡを含む画分を、好ましくは工程ｉ）の後に、好ましくはサンプルを加熱することによって、少なくとも７０℃、より好ましくは少なくとも８０℃、最も好ましくは少なくとも８５℃、より好ましくは少なくとも９０℃の温度まで、求核試薬の存在下で加熱する工程、および
ｉｉｉ）架橋を逆行させた後に、好ましくは適当な添加物を加えることによって結合条件を確立すること、およびＤＮＡを核酸結合固相に結合させることによって、ＤＮＡを単離する工程。好ましくは、カオトロピック剤および界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤およびアルコールを、結合条件を確立するために加える。適当なＤＮＡ単離手順はまた、先行技術において周知である。
【００８６】
従って、好ましくは、本発明によるプロセスは、工程ｂ）に続いて、画分Ａから得られるＲＮＡおよび／またはペレットＢから得られるＤＮＡを、好ましくは沈殿、核酸の適当な結合材料への結合、電気泳動、および／またはクロマトグラフィーまたはその組み合わせによって、別々に精製するためのさらなる工程を含む。
【００８７】
さらに、そのプロセスは、好ましくは、単離および／または精製した核酸の分析／検出のための工程を含む。
【００８８】
当業者に公知である全ての分析方法、例えばＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムＤＮＡ全体の増幅（全ゲノム増幅）のような増幅技術、ゲル電気泳動、ブロッティング技術、特にサザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析、制限酵素断片長多型解析（ＲＦＬＰ分析）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））、ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ配列決定およびＲＮＡ配列決定を含む配列決定、一塩基多型分析（ＳＮＰ分析）、突然変異分析、エピジェネティック分析、特にメチル化パターンの分析、またはその組み合わせを、本発明によるプロセスによって単離した核酸を分析するために使用し得る。
【００８９】
上記の開示から明らかになるように、本発明はまた、以下の工程を含む、溶解画分中のＲＮＡおよび未溶解画分中のＤＮＡを、架橋によって固定した同じ生物学的サンプルから得るためのプロセスを提供する：
ａ）少なくとも１つのタンパク質分解活性化合物を使用した、サンプルが有するタンパク質を含む成分の部分的なタンパク質分解と同時に、水性緩衝溶液中でサンプルを部分的に溶解して、溶解画分（画分Ａ）および未溶解残渣（ペレット、画分Ｂ）を得る工程、
ｂ）溶解画分を未溶解画分から分離する工程、
ここで、溶解画分における核酸の全量に基づいて、その溶解画分は主にＲＮＡを含み、そして未溶解残渣における核酸の全量に基づいて、その未溶解残渣は主にＤＮＡを含む。
【００９０】
１つの実施態様によって、主にＲＮＡを含む画分を、主にＤＮＡを含む画分から分離することは、沈殿も、１つまたは両方の型の核酸の有機溶媒による抽出も、１つまたは両方の型の核酸の固体マトリックスへ選択的結合も必要としない。１つの実施態様によって、画分の分離後、ＲＮＡを、主にＲＮＡを含む溶解画分から単離し、および／またはＤＮＡを、主にＤＮＡを含む未溶解画分から単離する。もし、例えばＲＮＡの単離のみを意図するなら、主にＤＮＡを含む未溶解画分を、分離後に廃棄し得る。
【００９１】
適当なおよび好ましい実施態様、ならびに本発明による部分的消化および分離工程に関連する利点、ならびに引き続く核酸単離の適当なおよび好ましい実施態様を、同じ架橋サンプルからのＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離および／または精製のプロセスに関して、上記で詳細に議論した。それは上記の開示に参照され、それもここで適用する。
【００９２】
本発明はさらに、少なくとも（１）タンパク質分解活性化合物、好ましくは上記で述べたタンパク質分解活性化合物の１つ、（２）少なくとも１つの緩衝物質、好ましくは上記で述べた緩衝物質の１つ、および（３）少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは上記で述べた界面活性剤の１つ、およびまた好ましくは（４）工程（ａ）による不完全なタンパク質分解を行うための指示を含む、本発明によるプロセスを行うためのキットを含む。
【００９３】
特に好ましい実施態様において、本発明によるキットは、さらに（５）少なくとも１つの核酸結合材料、およびまた必要に応じて（６）核酸単離のためのバッファー、好ましくは結合および／または溶出バッファーを含む。
【００９４】
核酸結合材料（５）として使用するために適当なのは、ＤＮＡまたはＲＮＡの吸着に関して当業者に公知である全ての材料であり、セルロースに基づく材料、特にカルボキシ官能基（ｆｕｎｋｔｉｏｎａｌ）セルロース材料、またはジエチルアミノエチルセルロース、アガロース、シリカ、ガラス、石英、ゼオライト、または金属酸化物のようなミネラルキャリア、またはイオン交換体材料でコーティングしたキャリアが特に好ましい。記載した材料は、例えば膜、または磁気粒子または非磁気粒子の形態で存在し得る。その核酸結合材料は、好ましくは組み立て式カラムのカラム材料として、または別に懸濁物としてキットに含まれる。材料の型は、分析する核酸の化学的構造に決定的に依存し、当業者は、それぞれの意図する適用、すなわちＲＮＡまたはＤＮＡの分析に関して、各場合において適当な吸着材料に精通している。
【００９５】
溶出バッファー（６）として、本発明によるキットは、当業者に公知であり、そして核酸の核酸結合材料からの溶出に習慣的に使用されるあらゆるバッファーを含み得る。その溶出バッファーは、好ましくは水性塩溶液、特に例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物、例えばＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２のようなアルカリ土類金属ハロゲン化物、例えば塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、またはこれらの塩の少なくとも２つの混合物を含む水溶液であり、ここでその溶出バッファーは、必要に応じてまた、例えばアルカリ金属酢酸塩／酢酸に基づくバッファーシステム、またはトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタンに基づくバッファーシステムを含み得る。もしそのキットを、固定組織からＲＮＡを単離するために使用するなら、そして使用するマトリックスがシリカ膜であるなら、溶出バッファーとして水、特にＲＮａｓｅを含まない水を使用することが特に好ましい。
【００９６】
結合バッファー（６）として、本発明によるキットは、当業者に公知であり、そして核酸を核酸結合材料に結合させるために習慣的に使用されるあらゆるバッファーを含み得、ここでその結合バッファーは、使用するそれぞれの核酸結合材料とマッチしていなければならない。もし使用する核酸結合材料がシリカマトリックスであるなら、その結合バッファーは、好ましくはカオトロピック剤、および必要に応じてＣ１〜Ｃ５アルコールをさらに含む。
【００９７】
本発明によるキットを、生物学的サンプルに存在する核酸、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡの両方を分析および／または定量化するために使用し得る。
【００９８】
この理由のために、本発明によるキットをさらに、ヒトまたは動物の体の外のサンプルの、疾患の診断、予後、治療に関する決定、および／または治療のモニタリングのために使用し得る。
【実施例】
【００９９】
実施例１：本発明のプロセスによるＲＮＡおよびＤＮＡの分離
使用するサンプルは、包埋の後約４ヵ月間室温で保存されていたラット肝臓由来の、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプル（ＦＦＰＥサンプル）であった。ミクロトームの補助によって、約２０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルから調製した。各場合において、反応あたり１つの切片を使用した。処理したサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの引き続く単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐ  ＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１００】
脱パラフィン化のために、その組織をまず１ｍｌのキシレン中で１０分間インキュベートした。サンプルの遠心分離によるペレット化、および上清の除去後、このキシレンによるこの処理を、後２回繰り返した。続いて各場合においてサンプルを無水エタノールで２回、続いて水性エタノール溶液で処理して（まず９６％エタノール、および次いで７０％エタノール）、そして３７℃で１０分間乾燥した。
【０１０１】
この方式で得られた脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、および０．２％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）（ｐＨ７）を含む１５０μｌの水溶液で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。得られた混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１５分間インキュベートした。溶解画分（Ａ）を、未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルを遠心分離し、そして上清（画分Ａ）を、未溶解成分（画分Ｂ）を含むペレットから除去した。
【０１０２】
２つの画分における、核酸の型、ＲＮＡおよびＤＮＡの分布を決定するために、上清およびペレット由来のＲＮＡを、各場合４つのサンプル（サンプル１〜４）から単離し、そしてさらなる４つのサンプル（サンプル５〜８）から、上清およびペレット由来のＤＮＡを単離した。
【０１０３】
サンプル１〜４の上清（画分Ａ）（サンプル１ａから４ａ）からＲＮＡを単離するために、その上清を８０℃で１５分間インキュベートした。ＤＮＡ結合のための条件に調整するために、３２０μｌのカオトロピックバッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＢＣバッファーを加えた。その混合物を、例えばＱＩＡＧＥＮからのｇＤＮＡ除去カラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによってその膜を通過させた。混合物の組成は、ＤＮＡのシリカ膜への選択的結合を引き起こすので、ＲＮＡは、カラムの溶出液にある。ＲＮＡのための結合条件に調整するために、この溶出液を、エタノールと混合し、そして次いでもう１度、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによってその膜を通過させた。次いでそのシリカ膜を、各場合において５００μｌのアルコールを含む洗浄バッファーＲＷ２（ＱＩＡＧＥＮ）で２回洗浄した。その膜を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって乾燥し、そして１分のインキュベーション後、ＲＮＡを３０μｌの水によって溶出した。
【０１０４】
ＲＮＡをサンプル１〜４のペレット（画分Ｂ）（サンプル１ｂから４ｂ）から単離するために、そのペレットを、界面活性剤および求核試薬を含む、ＱＩＡＧＥＮからのＰＫＤバッファー１５０μｌ、および１０μｌのＱＩＡＧＥＮからのプロテイナーゼＫと混合した。５６℃で１５分間インキュベートし、そして次いで８０℃で１５分間インキュベートした後、その溶解産物を、カオトロープを含む結合バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＢＣバッファーで処理し、そしてその混合物を、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１００００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって、膜を通過させた。上記で記載したように、そのシリカ膜を、洗浄バッファーＲＷ２で２回洗浄し、そしてＲＮＡを溶出した。
【０１０５】
ＤＮＡをサンプル５〜８の上清（画分Ａ）（サンプル５ａから８ａ）から単離するために、その上清を、界面活性剤を含む溶解バッファーＡＴＬ（ＱＩＡＧＥＮ）で、１８０μｌの全容量にし、そして２０μｌのＱＩＡＧＥＮからのプロテイナーゼＫを加えた。そのサンプルを、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１時間インキュベートし、そして次いで９０℃で１時間加熱した。存在するあらゆるＲＮＡを分解するために、インキュベーション後に、４μｌのＲＮＡｓｅＡ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）をサンプルに混合した。ＤＮＡをさらに精製するために、そのサンプルを、各場合で２００μｌのカオトロピックバッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＡＬバッファー、およびエタノールと混合した。その混合物を、例えばＱＩＡＧＥＮからのＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１００００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって膜を通過させた。次いでそのシリカ膜を、５００μｌのグアニジン塩を含む洗浄バッファーＡＷ１で、そして次いで５００μｌのＱＩＡＧＥＮからのアルコールを含む洗浄バッファーＡＷ２で洗浄した。その膜を、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離することによって乾燥し、そして１分間のインキュベーション後、ＤＮＡを３０μｌのＤＮＡ溶出バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのバッファーＡＴＥと遠心分離することによって溶出した。
【０１０６】
ＤＮＡを、サンプル５〜８のペレット（画分Ｂ）（サンプル５ｂから８ｂ）から単離するために、そのペレットを、例えば１８０μｌのＱＩＡＧＥＮからの界面活性剤を含むバッファーＡＴＬのような、習慣的なＤＮＡ溶解バッファーで処理した。ペレットは、前の処理によって溶解されなかった成分のみを含むので、２０μｌのＱＩＡＧＥＮからのプロテイナーゼＫによるさらなる溶解を、これらの未溶解成分も溶解するように行った。５６℃で１時間、および続いて９０℃で１時間インキュベートした後、その溶解産物を、カオトロープを含む結合バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＡＬバッファーおよびまたエタノールで処理した。その混合物を、例えばＱＩＡＧＥＮからのＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１００００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって、膜を通過させた。上記で記載したように、そのシリカ膜を、バッファーＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、その膜を乾燥し、そしてＤＮＡを溶出した。
【０１０７】
２つの画分、上清（Ａ）およびペレット（Ｂ）からこの方式で単離した核酸の分布を決定するために、両方の画分の核酸を、適当な方法を用いて定量化した。ＤＮＡおよびＲＮＡの収率および純度の決定を、サンプルの吸収を２６０／２８０ｎｍで測定することによる吸光度（ＯＤ）によって行った。各場合の収率を、全収量のパーセントで示した。ここで全収量は、上清およびペレットにおける１つの型の核酸の収量の合計である。表１は、４回の決定の平均値を示す。
【０１０８】
【表１】
2013520187.tif 000004
さらなる分析のために、各場合において、それぞれの画分から単離した核酸１０μｌを、ＤＮＡの場合はＴＡＥアガロースゲル（Ｔｒｉｓ酢酸塩／ＥＤＴＡ）上で、ＲＮＡの場合はホルムアルデヒド／アガロースゲル上で、習慣的な方法によって分離し、そしてエチジウムブロミドで染色した。その結果を図１に示す。
【０１０９】
その結果は、本発明によるプロセスを適用した場合、引き続く精製の前に核酸の明らかな分離／分画が存在することを示す。ＲＮＡは主に上清に存在し、一方ＤＮＡは主にペレット画分に存在する。
【０１１０】
実施例２：使用したタンパク質分解活性化合物の量の影響
この実験のために使用したサンプルは、包埋の後約７ヵ月間室温で保存されていたラット肝臓由来の、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプル（ＦＦＰＥサンプル）であった。ミクロトームの補助によって、約１０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルから調製した。各場合において反応あたり２つの切片を使用した。処理したサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの引き続く単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１１１】
脱パラフィン化のために、その組織をまずそれぞれ１ｍｌのヘプタン中で１０分間インキュベートした。５０μｌのメタノールを加え、そして混合した後、そのサンプルを遠心分離し、上清を除去し、そして残渣を室温で５分間風乾した。
【０１１２】
この方式で得た脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳを含む１５０μｌの水溶液（ｐＨ７）で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として、１０μｌ、２０μｌ、または４０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。この混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１５分間インキュベートした。溶解画分（Ａ）を、未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルをまず氷上で５分間冷却し、そして次いで４℃で遠心分離した。ＲＮＡのさらなる単離のために、その上清を除去し、そしてペレットを廃棄した。
【０１１３】
その上清を、続いて８０℃で１５分間インキュベートした。結合条件に調整するために、３２０μｌのカオトロピックバッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＢＣバッファーを次いで加え、そして得た混合物をエタノールと混合し、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって膜を通過させた。次いで５００μｌのアルコールを含む洗浄バッファーＲＷ２を通過させることによって、そのシリカ膜を２回洗浄した。その膜を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって乾燥した。次いでＲＮＡを、１分間インキュベートした後、３０μｌの水を加えることによって遠心分離によって溶出した。
【０１１４】
この方式で単離したＲＮＡを分析するために、２６０ｎｍにおける吸収を測定することによって、その収量を決定した。その結果を表２に示す。
【０１１５】
ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、そしてＲＩＮ値の形式で示した、ここで１０のＲＩＮ値は、完全にインタクトなＲＮＡを示し、そして０のＲＩＮ値は、完全に分解されたＲＮＡを示す。その結果を同様に表２に示す。
【０１１６】
本発明によるプロセスにおける核酸の単離に対するだけでなく、増幅による引き続く分析に対しても、異なる量のタンパク質分解活性化合物の影響を調査するために、そのＲＮＡを、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この目的のために、その単離されたＲＮＡを、各場合２回の決定で、ｍａｄＨ７転写物のアンプリコンを検出するために使用した。その溶出液をそれぞれ、水で１：１０の比で希釈した。各場合において、５μｌのこれらの希釈溶液を、リアルタイム−ＰＣＲのために使用した。製造会社の指示によって、例えばＱＩＡＧＥＮからのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキットのような、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために適当なマスターミックスによって、２５μｌの全容量で、増幅をおこなった。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からの、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような、適当なリアルタイム増幅装置において、増幅をおこなった。測定したｃｔ値を用いて、平均値を決定し、それを表２に示す。
【０１１７】
【表２】
2013520187.tif 000005
その結果は、使用したプロテイナーゼＫの全ての量が、同等の収量、同等のＲＮＡ完全性、および同等のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果をもたらしたことを示す。本発明によるプロセスにおけるタンパク質分解活性化合物の量は、従って広い範囲で変更することができる。
【０１１８】
実施例３：タンパク質分解活性化合物の反応時間
この実験のために使用したサンプルは、包埋後約５ヵ月間室温で保存されていたラット肝臓由来の、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプル（ＦＦＰＥサンプル）であった。ミクロトームの補助によって、約２０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルから調製した。各場合において、反応あたり１つの切片を使用した。処理したサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの引き続く単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１１９】
切片の脱パラフィン化、再水和、および乾燥を、実施例１に記載したように行った。この方式で得た脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳを含む１５０μｌの水溶液（ｐＨ７）で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として、１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。この混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で３時間インキュベートした。溶解画分（Ａ）を、未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルを遠心分離し、そしてその上清（画分Ａ）を、未溶解成分（画分Ｂ）を含むペレットから除去した。実施例１に記載したように、ＲＮＡを上清（画分Ａ）から単離し、そしてＤＮＡをペレット（画分Ｂ）から単離した。
【０１２０】
この方式で単離した核酸を分析するために、２６０ｎｍにおける吸収を測定することによって、その収量を決定した。その結果を図２に示す。プロテイナーゼの反応時間を増加させると、より長いプロテイナーゼ作用によって、より多くの核酸がペレットから溶解するので、核酸の収量はペレットにおいて減少し、そしてそれに対応して上清において増加する。
【０１２１】
しかし、核酸のこの全体分布は、画分におけるＤＮＡおよびＲＮＡ含有量についての情報は提供しない。従って、各場合において、ＤＮＡを含む画分（Ｂ）の溶出液１０μｌを、ＴＡＥ−アガロースゲルで分析した。その結果を図３に示す。
【０１２２】
５分のみのプロテイナーゼＫ反応時間後には、ＲＮＡの大部分は依然として未溶解画分、すなわちペレットに留まっていることが明らかである。プロテイナーゼ反応時間を増加させると、この量が減少し、そして反応時間１５分から先は、未溶解画分は少量のＲＮＡしか含まないか、またはＲＮＡは実質的にもはや検出されない。対照的に、ＤＮＡはかなりより長く（少なくとも９０分間）、未溶解画分Ｂに留まる。従って、タンパク質分解活性化合物の反応時間を最適化することによって、２つの画分における核酸の型の分布を調整することが可能である。
【０１２３】
核酸の単離に対するだけでなく、増幅による分析にも対する、本発明によるプロセスにおけるタンパク質分解活性化合物の反応時間の長さの影響を調査するために、そのＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。この目的のために、各場合において、等容量の単離ＤＮＡ溶出液を、各場合２回の決定で、ｐｒｎｐ遺伝子のアンプリコンを検出するために使用した。例えばＱＩＡＧＥＮからのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＰＣＲキットのような、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに適当なマスターミックスを用いて、製造会社の指示に従って、２５μｌの全量で増幅を行った。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からの、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような、適当なリアルタイム増幅装置において、増幅をおこなった。ｃｔ値から決定した平均値を、図４に示す。
【０１２４】
その結果は、反応時間が増加すると、ｃｔ値が増加することを示し、それは溶出液中のＤＮＡの量が減少したためである。反応時間を増加させると、ＲＮＡだけでなくＤＮＡも徐々に上清へ移るが、ここでＲＮＡは、ＤＮＡよりも著しくより迅速に、上清に溶解および移動する（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）。ゲルは、１５分の反応時間後でも、ＲＮＡは既に実質的に完全にペレットから溶解し、そして上清に移動していることを示すが、未溶解画分ＢのＤＮＡの量は、ゲルおよびリアルタイムＰＣＲによると、９０分超後にのみ有意に減少する。
【０１２５】
実施例４：本発明によるプロセスにおける、異なる水溶液の使用
この実験のために使用したサンプルは、包埋後約７ヵ月間室温で保存されていたラット肝臓由来の、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプル（ＦＦＰＥサンプル）であった。ミクロトームの補助によって、約２０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルから調製した。各場合において、反応あたり１つの切片を使用した。処理したサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの引き続く単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１２６】
切片の脱パラフィン化、再水和、および乾燥を、実施例２に記載したように行った。この方式で得た脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳを含む１５０μｌの水溶液１（ｐＨ７）、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ  ＮＰ４０、および５００ｍＭのＮａＣｌを含む水溶液２（ｐＨ７．４）、または５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、３％のＳＤＳおよび１０ｍＭのＮａＣｌを含む水溶液３（ｐＨ８．２）で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として、１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。その混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１５分間インキュベートした。溶解画分（Ａ）を、未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルをまず氷上で５分間冷却し、そして次いで４℃で遠心分離した。ＤＮＡを、実施例１で記載したようにペレット（画分Ｂ）から単離し、そのペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、および５００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７．４）中に溶解した。その収量を、２６０ｎｍにおける吸収を測定することによって決定した。その結果を表３に示す。
【０１２７】
【表３】
2013520187.tif 000006
使用した３つの水溶液は全て、高い収量のＤＮＡを与え、一定の変動がサンプルの不均一性によって生じた。本実施例は、多数の異なる水溶液を、本発明によるプロセスのために使用し得、その成分および濃度の両方を変動させることが可能であることを示す。従って、使用する水溶液を、使用するタンパク質分解活性化合物に適合させることが可能である。
【０１２８】
実施例５：本発明によるプロセスの補助による、異なる型の組織からのＤＮＡの単離
使用したサンプルは、室温で異なる期間保存されていた、ラット由来のＦＦＰＥサンプルであった：腎臓（保存期間約１３ヶ月）、肝臓（保存期間約６ヶ月）、脾臓（保存期間約１９ヶ月）、心臓（保存期間約１３ヶ月）、および肺（保存期間約６ヶ月）。ミクロトームの補助によって、約２０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルそれぞれから調製した。各場合において、反応あたり１つの切片を使用した。本発明による方法の補助による、処理したサンプルからの引き続く核酸の単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１２９】
本発明によるプロセスの補助によるＤＮＡの単離を、ＦＦＰＥサンプルからのＤＮＡの精製のために特に確立されたプロセスと比較するために、各場合において同じサンプルの切片を、製造会社（ＱＩＡＧＥＮ）の指示による、ＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットによるＤＮＡ単離のために、およびコントロールサンプルとして使用した。
【０１３０】
切片の脱パラフィン化、再水和、および乾燥を、実施例２に記載したように行った。この方式で得た脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳを含む１５０μｌの水溶液（ｐＨ７）で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として、１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。その混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１５分間インキュベートした。溶解画分（Ａ）を、未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルをまず氷上で５分間冷却し、そして次いで遠心分離した。ＤＮＡを、９０℃で２時間インキュベートして、実施例１で記載したようにペレット（画分Ｂ）から単離した。
【０１３１】
得られたＤＮＡの分析のために、その収量を、２６０ｎｍにおける吸収を測定することによって決定した。２組の決定の平均値および標準偏差を図５に示す。本発明によるプロセスの補助によって、ＤＮＡを全てのサンプルから単離し得、全ての場合の収量は、コントロールプロセスで得られた収量を超えた。
【０１３２】
さらに、各場合において、１０μｌのＤＮＡ溶出液を、ＴＡＥ−アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロミドで染色した。その結果を図６に示す。全ての場合において、本発明による方法の補助によって単離されたＤＮＡは、コントロール方法で単離されたＤＮＡと、およそ同じ分子サイズ分布を示した。
【０１３３】
本発明によるプロセスによって単離されたＤＮＡの増幅分析に対する適合性を調査するために、この方式で得られたＤＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて使用した。等容量の単離ＤＮＡ溶出液を、ｐｍｐ遺伝子の４６５塩基対のアンプリコンを検出するために、２組の決定において使用した。
【０１３４】
ＦＦＰＥサンプルにおいて、そのＤＮＡは、原則として断片化形態で存在し、単離し得るＤＮＡ断片の断片化の程度および従ってスペクトルは、特に固定および包埋の性質に依存するが、またサンプルの種類およびサンプルの保存にも依存する。さらに、核酸の単離後に残るＤＮＡの架橋の程度が、増幅、および特にアンプリコンの可能性のあるサイズを制限する。これにも関わらず効率的な増幅を保証するためには、原則として小さいアンプリコンが好ましい。ここで使用した４６５ｂｐというアンプリコンサイズは、ＦＦＰＥサンプルに関しては非常に大きく、そしてそれを本発明によるプロセスによって単離されたＤＮＡの質および適合性を試験するために選択した。
【０１３５】
増幅を、例えば、ＱＩＡＧＥＮからのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＰＣＲキットのような、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに適当なマスターミックスを用いて、製造会社の指示に従って、２５μｌの全容量で行った。増幅を、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からの、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような、適当なリアルタイム増幅装置において、増幅をおこなった。測定したｃｔ値を用いて、本発明によって単離されたＤＮＡの平均値および標準偏差を決定し、それを図７に示す。
【０１３６】
全ての場合において、ｃｔ値は、コントロールＤＮＡのものと同等であるか、またはさらにより低く、そのことはより良い増幅能力（ａｍｐｌｉｆｉａｂｉｌｉｔｙ）および／またはより高い収量を確実にする。
【０１３７】
全体として、その結果は、本発明によるプロセスにより、ＦＦＰＥサンプルからのＤＮＡの単離が可能となること、収量、質、断片サイズ、および増幅分析への適合性に関し、ＦＦＰＥサンプルからのＤＮＡの特異的単離について、先行技術から公知のプロセスによって単離したＤＮＡと少なくとも同じ、またはより良好であるということを示す。
【０１３８】
実施例６：本発明によるプロセスによる、異なる型の組織からのＲＮＡの単離
この実験のために使用したサンプルは、異なる期間室温で保存されていた、ラット由来のＦＦＰＥサンプルであった：腎臓（保存期間約５ヶ月）、肝臓（保存期間約２４ヶ月）、心臓（保存期間約２４ヶ月）、および肺（保存期間約２４ヶ月）。ミクロトームの補助によって、約２０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルから調製した。各場合において、反応あたり１つの切片を使用した。本発明のプロセスの補助による、ＦＦＰＥ切片からの引き続く核酸の単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１３９】
本発明によるプロセスの補助によるＲＮＡの単離を、ＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡの精製のために特に確立されたプロセスと比較するために、同じサンプルの切片を、製造会社（ＱＩＡＧＥＮ）の指示による、ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥキットによるＲＮＡの単離のために、およびコントロールサンプルとして使用した。
【０１４０】
切片の脱パラフィン化、再水和、および乾燥を、実施例２に記載したように行った。この方式で得た脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳを含む１５０μｌの水溶液（ｐＨ７）で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として、１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。この混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１５分間インキュベートした。溶解画分（Ａ）を、未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルをまず氷上で５分間冷却し、そして次いで遠心分離した。ＲＮＡのさらなる単離のために、その上清（画分Ａ）を除去し、そしてペレットを廃棄した。
【０１４１】
その上清を続いて８０℃で１５分間インキュベートした。そのサンプルを室温で５分間冷却し、その後２０μｌの従来のＤＮＡｓｅバッファー（例えば０．４６ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１１４ｍＭのＮａＣｌ、１１４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１４ｍＭのＣａＣｌ２を含む）、１５μｌの脱イオン水、および５μｌのＱＩＡＧＥＮからのＤＮＡｓｅＩ溶液を加え、そしてその混合物を室温で１５分間インキュベートした。４００μｌのカオトロピックバッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＬＴバッファーを次いで加え、その混合物をエタノールと混合し、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって膜を通過させた。５００μｌのアルコールを含む洗浄バッファーＲＷ２（ＱＩＡＧＥＮ）で、そのシリカ膜を２回洗浄した。その膜を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって乾燥し、そしてＲＮＡを、１分間インキュベートした後、３０μｌの水を加えることによって遠心分離によって溶出した。
【０１４２】
この方式で単離したＲＮＡを分析するために、２６０ｎｍにおける吸収を測定することによってその収量を決定した。２組の決定の平均値を、表４に示す。
【０１４３】
【表４】
2013520187.tif 000007
本発明によるプロセスの補助によって、ＲＮＡを全てのサンプルから単離することが可能であり、ここで、全ての場合において、本発明によるプロセスによって得られた収量は、コントロールのものと同等、またはそれより高かった。
【０１４４】
本発明によるプロセスによって単離されたＲＮＡの、増幅分析のための適合性を調査するために、そのＲＮＡを、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用した。等容量の単離ＲＮＡ溶出液を、各場合においてｍａｄＨ７転写産物およびｃ−ｊｕｎ転写産物のアンプリコンを検出するために、２組の決定において使用した。増幅を、例えば、ＱＩＡＧＥＮからのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキットのような、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに適当なマスターミックスを用いて、製造会社の指示に従って、２５μｌの全容量で行った。増幅を、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からの、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような、適当なリアルタイム増幅装置において行った。それに加えて、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１６（ｍｉＲ１６）を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、製造会社（ＱＩＡＧＥＮ）の指示に従って、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＰＣＲシステムを用いて、ＲＮＡ溶出液において検出した。測定したｃｔ値から得た平均値を、表５に示す。
【０１４５】
【表５】
2013520187.tif 000008
全ての場合において、本発明によって処理したサンプルの測定したｃｔ値は、コントロールサンプルのものと同等であるか、またはさらにより低く、そのことはよりよい増幅能力またはより多いＲＮＡ量によるものである。
【０１４６】
実施例７：効率的なｍｉＲＮＡ精製のためのＤＮＡｓｅ処理
この実験のために、異なる期間室温で保存していたラット由来のＦＦＰＥサンプルを使用した：脳（保存期間約５ヶ月）および心臓（保存期間約１８ヶ月）。ミクロトームの補助によって、約２０μｍの厚さの切片を、これらのサンプルから調製した。各場合において、反応あたり１つの切片を使用した。本発明のプロセスの補助による、ＦＦＰＥ切片からの引き続く核酸の単離のために、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットおよびＱＩＡａｍｐＦＦＰＥキットの構成成分を使用した。
【０１４７】
本発明によるプロセスの補助によるｍｉＲＮＡの単離を、ＦＦＰＥサンプルからのｍｉＲＮＡの精製のために特に確立されたプロセスと比較するために、同じサンプルの切片を、製造会社（ＱＩＡＧＥＮ）の指示による、ｍｉＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥキットによるｍｉＲＮＡの単離のために、およびコントロールサンプルとして使用した。
【０１４８】
この方式で得た脱パラフィン化サンプルペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のＳＤＳを含む１５０μｌの水溶液（ｐＨ７）で処理し、そしてタンパク質分解活性化合物として、１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（＞６００ｍＡＵ／ｍｌ）と混合した。この混合物を、１４００ｒｐｍで振とうしながら、５６℃で１５分間インキュベートした。主にＲＮＡを含む溶解画分（Ａ）を、主にＤＮＡを含む未溶解画分（Ｂ）から分離するために、そのサンプルをまず氷上で３分間冷却し、そして次いで遠心分離した。ｍｉＲＮＡを含むＲＮＡのさらなる単離のために、上清（画分Ａ）を除去し、そしてＤＮＡを含むペレットを廃棄した。
【０１４９】
続いて上清を８０℃で１５分間インキュベートして、架橋を逆行させた。そのサンプルを室温で５分間冷却し、その後ＤＮａｓｅ活性を促進するための異なるバッファー（前処理バッファー１〜５、下記を参照のこと）を２０μｌ、１５μｌの水、および５μｌのＱＩＡＧＥＮからのＤＮＡｓｅＩ溶液を加えた。この実験のために以下のバッファーを使用した：
前処理バッファー１：０．４６ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１１４ｍＭのＮａＣｌ、１１４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１４ｍＭのＣａＣｌ２
前処理バッファー２：０．４６ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１１４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１４ｍＭのＣａＣｌ２
前処理バッファー３：４６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１１．４ｍＭのＮａＣｌ、１１．４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１．４ｍＭのＣａＣｌ２
前処理バッファー４：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＣａＣｌ２
前処理バッファー５：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＣａＣｌ２
その混合物を、室温で１５分間インキュベートした。次いでＤＮａｓｅ消化サンプルから、マイクロＲＮＡのような小さいＲＮＡを含むＲＮＡを単離するために、４００μｌのカオトロピックバッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＬＴバッファーを加え、その混合物を１４００μｌの９６〜１００％エタノールと混合し、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって膜を通過させた。５００μｌのアルコールを含む洗浄バッファーＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ）で、そのシリカ膜を２回洗浄した。その膜を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって乾燥し、そしてＲＮＡを、１分間インキュベートした後、３０μｌの水を加えることによって遠心分離によって溶出した。
【０１５０】
比較のために、ＤＮＡｓｅ前処理をしないが、ＲＮＡの膜への結合の後に通常のオンカラムＤＮＡｓｅ処理を行う、小さいＲＮＡを含むＲＮＡの精製のために、同じサンプルを使用した。脱パラフィン化およびプロテイナーゼＫ消化を、上記で記載したように行った。その後、３２０μｌのカオトロピックバッファー、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＬＴバッファーを次いで加え、その混合物を１１２０μｌの９６〜１００％エタノールと混合し、例えばＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに存在するシリカ膜にアプライし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって膜を通過させた。バッファーＲＷＴ（ＱＩＡＧＥＮ）のような、カオトロピック試薬およびエタノールを含む３５０μｌの洗浄バッファーで、そのシリカ膜を洗浄した。１０μｌのＤＮａｓｅ１および適当なＤＮＡｓｅバッファー（例えばバッファーＲＤＤ（ＱＩＡＧＥＮ））を含む８０μｌの混合物を、次いでその膜にアプライし、そして室温で１５分間インキュベートした。その後、その膜を再びバッファーＲＷＴで洗浄し、そして５００μｌのアルコールを含む洗浄バッファーＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ）で２回洗浄した。その膜を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって乾燥し、そしてＲＮＡを、１分間インキュベートした後、３０μｌの水を加えることによって遠心分離によって溶出した。
【０１５１】
この方式で単離したＲＮＡを分析するために、代表的な脳のＲＮＡを、ＲＮＡ分子をサイズに依存して分離する、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。図８は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ測定の結果を示す。ＦＦＰＥサンプル由来のＲＮＡは常に、部分的に分解されており、そして分解の程度は、サンプルの固定、包埋および保存、およびＲＮＡの抽出方法のような複数の因子に依存する。従って、ＲＮＡのゲル様の視覚化は、全ての場合において、部分的に分解したＲＮＡを示す（図８を参照のこと）。２８ＳｒＲＮＡは明らかでなく、そして１８ＳｒＲＮＡは弱く現れるのみである。それに加えて、多数のＲＮＡ断片が、２８ｓｒＲＮＡのバンドのサイズから低分子量まで生じる。通常のオンカラムＤＮＡｓｅ処理は、ｍｉＲＮＡを含む最も小さいＲＮＡ集団の、非常に低い収量をもたらす（矢印を参照のこと）。対照的に、本発明によるカラムに添加する前のＤＮＡｓｅ前処理は、非常に低分子量のＲＮＡの多量の単離を可能にする。
【０１５２】
特にｍｉＲＮＡの精製の効率を決定するために、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、製造会社（ＱＩＡＧＥＮ）の指示に従って、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、精製ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡの検出および定量に関して分析した。測定したｃｔ値から得られる平均値を、表１に示す。
【０１５３】
【表６】
2013520187.tif 000009
全ての場合において、測定したｃｔ値は、ＤＮＡｓｅ前処理をしたサンプルにおいてより低く、一方オンカラムＤＮＡｓｅ処理は、有意により高いｃｔ値を与える。より低いｃｔ値は、より多量のｍｉＲＮＡを示し、ｃｔ値の１の差異は、検出されたｍｉＲＮＡの約２倍の量を示す。従って、ＲＮＡを単離する前のＤＮＡｓｅ前処理は、従来技術によるオンカラムＤＮａｓｅ消化に対して、ｍｉＲＮＡ精製効率を有意に増強する。
【０１５４】
全体として、その結果は、本発明によるプロセスにより、ＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡの単離が可能となること、収量、質、断片サイズおよび増幅分析への適合性に関し、先行技術から公知の単離プロセスによって単離したＲＮＡと、少なくとも同程度に良好であり、かつＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡの単離に特異的であることを示す。
【図１】
2013520187.tif 000010
【図２】
2013520187.tif 000011
【図３】
2013520187.tif 000012
【図４】
2013520187.tif 000013
【図５】
2013520187.tif 000014
【図７】
2013520187.tif 000015
【図８】
2013520187.tif 000016
【図６】
2013520187.tif 000017
【国際調査報告】
2013520187.tif 000018
2013520187.tif 000019
2013520187.tif 000020