(57)【要約】代謝物プロファイリング方法を用いて特定されたバイオマーカーの多様性のパネルの存在を検出する、高い程度の感度および特異性を有する再発乳癌のためのモニタリング試験が提供される。この試験は、現在利用可能なモニタリング診断試験よりも約１年早く、乳癌の再発を検出できる。核磁気共鳴（ＮＭＲ）および２次元クロマトグラフィガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣ×ＧＣ−ＭＳ）の組み合わせを用いて、バイオマーカーのパネルを特定して、血清サンプルの代謝物プロファイルを生成する。ＮＭＲおよびＧＣ×ＧＣ−ＭＳデータを、多変量統計学的方法によって分析して、乳癌の再発のある患者由来のサンプルと、無病生存患者由来のサンプルとの間で特定された代謝物のシグナルを比較する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における乳癌の再発の指標である複数の所定の代謝物バイオマーカーのパネルを検出するための方法であって、
前記対象から体液のサンプルを得る工程と、
前記サンプルを分析して、前記パネルにおける代謝物バイオマーカーの各々の存在および量を決定する工程とを包含し、
前記パネル中の前記代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、対象における乳癌の再発の指標である、方法。
【請求項２】
前記体液が、血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の代謝物バイオマーカーの前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、２−ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、３−メチル−２−ヒドロキシ−２−ペンテン酸、ドデカン酸、１，２，３，トリヒドロキシプロパン、β−アラニン、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも７つの化合物からなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、
請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記パネルが、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、
請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる、
請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記パネル中の代謝物バイオマーカーが、
乳癌の状態が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、
前記サンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、前記サンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、
前記サンプルを質量分析測定に供することによって前記サンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、
前記核磁気共鳴測定の結果および前記質量分析測定の結果を分析して、前記サンプル内に含まれる１つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、
前記スペクトルを多変量統計分析に供して、前記サンプル内に含まれる少なくとも１つ以上の代謝物種を特定する工程と、
どの代謝物種が乳癌の状態と相関するかを決定する工程とによって決定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物対象において二次的な腫瘍細胞増殖を検出する方法であって、
前記対象から体液のサンプルを得る工程と、
前記サンプルを分析して、所定のバイオマーカーのパネルにおいて各々の代謝物バイオマーカーの存在および量を決定する工程とを包含し、
前記パネル中の前記代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、哺乳動物対象における二次的な腫瘍細胞増殖の指標である、方法。
【請求項１０】
体液が血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数の代謝物バイオマーカーの前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、２−ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、３−メチル−２−ヒドロキシ−２−ペンテン酸、ドデカン酸、１，２，３，トリヒドロキシプロパン、β−アラニン、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも７つの化合物からなる、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記パネルが、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記パネルが、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリ
ンおよびチロシンからなる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記パネル中の代謝物バイオマーカーが、
乳癌の状態が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、
前記サンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、前記サンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、
前記サンプルを質量分析測定に供することによって前記サンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、
前記核磁気共鳴測定の結果および質量分析測定の結果を分析して、前記サンプル内に含まれる１つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、
前記スペクトルを多変量統計分析に供して、前記サンプル内に含まれる少なくとも１つ以上の代謝物種を特定する工程と、
どの代謝物種が二次的な腫瘍細胞増殖と相関するかを決定する工程とによって決定される、
請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
生体サンプル内の乳癌の再発の状態を検出するための方法であって、
前記サンプルを、核磁気共鳴分析と質量分析とを組み合わせた分析に供することによって前記サンプル内の１つ以上の代謝物種を測定する工程であって、前記分析によって前記サンプル内に含まれる１つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、
前記個々のスペクトルピークを統計学的パターン認識分析に供して、前記サンプル内に含まれる少なくとも１つ以上の代謝物種を特定する工程と、
前記１つ以上の代謝物種の測定値と乳癌の状態とを関連付ける工程とを包含する、方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の代謝物種が、２−メチル、３−ヒドロキシブタン酸；３−ヒドロキシ酪酸塩；コリン；ギ酸塩；ヒスチジン；グルタミン酸；Ｎ−アセチル−グリシン；ノナン二酸；プロリン；トレオニン；チロシン；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、体液を含む、
請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記体液が血清である、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記質量分析が、二次元ガスクロマトグラフィとカップリングした質量分析を含む、
請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
２−メチル、３−ヒドロキシブタン酸；３−ヒドロキシ酪酸塩；コリン；ギ酸塩；ヒスチジン；グルタミン酸；Ｎ−アセチル−グリシン；ノナン二酸；プロリン；トレオニン；チロシン；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの代謝物種またはその一部を含む、
乳癌を検出するためのバイオマーカー。
【請求項２３】
２−メチル、３−ヒドロキシブタン酸；３−ヒドロキシ酪酸塩；コリン；ギ酸塩；ヒス
チジン；グルタミン酸；Ｎ−アセチル−グリシン；ノナン二酸；プロリン；トレオニン；チロシン；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、１つ以上の代謝物種またはその一部を含む、
複数のバイオマーカーからなるパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、主に、乳癌再発の早期検出のために有効な代謝物種のパネル（ｐａｎｅｌ）を含む低分子バイオマーカーに関するとともに、生体サンプル内におけるバイオマーカーの上記パネルをガスクロマトグラフィ−質量分析と核磁気共鳴分析とを組み合わせたプロセスを用いて特定するための方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、依然として世界中の女性の主な死亡原因である。乳癌は、米国では女性の２番目に主要な死亡原因であって、２０１０年には、１９０，０００例近くの新規な症例と４０，０００例の死亡とが予想された。乳癌患者の生存率は、診断スクリーニング法の改善により過去２０〜３０年間にわたって改善しているが、乳癌は最初の処置の２〜１５年後のいずれかで再発する場合が多く、同側または反対側の乳房において局所的に、または遠隔再発（転移）として生じ得る。３，０００例近くの乳癌患者での近年の研究によって、アジュバント処置の完了後５年および１０年の再発率は、それぞれ１１パーセント（％）および２０％であることが示された。ステージ、グレードおよびホルモン受容体のステータスのような多数の要因が、再発と関連することが示される。腫瘍のステージが高いほど、再発する傾向が高い場合が多い。例えば、近年の研究では、ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩの腫瘍における５年後の再発はそれぞれ７％、１１％および１３％と報告されている。さらに、リンパ節浸潤およびエストロゲン受容体がないことなどの条件は、高い再発率および短い無病生存期間の要因である。局所再発乳癌の早期検出が生存率を有意に改善し得ることが研究によって示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
再発乳癌の慣用的な調査のための一般的な方法としては、定期的なマンモグラフィ検査、自己診断または医師の行う理学的検査および血液試験が挙げられる。このような試験の能力は不十分であり、調査のための広範な検討でも有効性は証明されていない。多くの場合、マンモグラフィは、小さい局所再発を見逃すか、または偽陽性をもたらし、その結果、感度および特異性が低く、不必要な生検につながる。より鋭敏かつ早期の検出方法への必要性が満たされていないという観点から、ここ１０年程度、再発乳癌検出および疾患進行のモニタリングのための多数の新規なアプローチの開発が、血液に基づく腫瘍マーカーまたは遺伝的プロファイルを用いて行われた。インビトロの診断（「ＩＶＤ」）マーカーとしては、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、癌抗原（「ＣＡ」）１５−３、ＣＡ２７．２９、組織ポリペプチド抗原（「ＴＰＡ」）、および組織ポリペプチド特異的抗原（「ＴＰＳ」）が挙げられる。このような分子マーカーは、有望であると考えられる。なぜなら、これらのマーカーに基づく診断の結果が、臨床家の専門知識および経験と無関係であり、組織病理学のような従来の病理学的試験と通常関連するサンプリングエラーを可能性としては回避するためである。しかし、現在のところ、これらのマーカーは、望ましい感度および特異性がなく、再発から遅れて応答する場合が多く、代替的なアプローチの必要性が強調される。
【０００４】
患者の相対生存におけるほぼ５０％までの改善が、臨床的な無症候期に再発を検出することによって達成可能である、これは、二次的な腫瘍細胞増殖の指標であるバイオマーカーに基づく信頼できる試験の必要性を示している。しかし、癌胎児性抗原および癌抗原のような循環中の腫瘍マーカーに基づく市販の非侵襲性の試験の能力は、早期検出を改善するために有意な価値であるにはあまりに低い。この理由は、これらのマーカーのレベルが、乳癌とは関係のない多数の他の悪性および非悪性の条件で上昇するからである。このよ
うな限界を考慮して、アメリカ臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔｓ）のガイドラインは、これらのマーカーの使用を、多数の他の検査および検討と組み合わせて、能動的な治療の間の転移性疾患を有する患者のモニタリングにのみ推奨している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
代謝物プロファイリング（またはメタボロミクス（代謝学））は、血液および尿のようなサンプルの代謝物プロファイルの全体的分析または標的化分析に由来する低分子のパネルに基づいて疾患を検出し得る。代謝物プロファイリングでは、生体サンプル中に存在する数百の低分子（約１，０００Ｄａ未満）の定量分析のため、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法および質量分析法（ＭＳ）のような高解像度の分析方法が用いられる。代謝物プロファイルの複雑性のため、多変量の統計学的方法がデータ分析のために広く用いられる。わずかな刺激に対してさえ代謝物プロファイルが高感度であることにより、リアルタイムでの種々の生体変動（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）の早期の発現を検出する手段を得ることができる。
【０００６】
代謝物プロファイリング方法を用いて特定した多様なバイオマーカーのパネルの存在を検出する、感度および特異性の程度が高い、再発乳癌のためのモニタリング試験を提供する。この試験は、現在利用可能なモニタリング診断試験よりも約１年早く、乳癌の再発を検出し得る。バイオマーカーのパネルは、血清サンプルの代謝物プロファイルを作成するために、核磁気共鳴（ＮＭＲ）と２次元のガスクロマトグラフィクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ×ＧＣ−ＭＳ）との組み合わせを用いて特定される。乳癌を再発した患者由来のサンプルと、疾患の所見のない患者由来のサンプルとの間で、特定された代謝物シグナルを比較すべく、ＮＭＲおよびＧＣ×ＧＣ−ＭＳのデータを多変量統計法により分析する。
【０００７】
好ましい実施形態では、対象における乳癌の再発の指標である複数の所定の代謝物バイオマーカーのパネルを検出するための方法が開示されており、この方法は、この対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを分析して、このパネルにおける代謝物バイオマーカーの各々の存在および量を決定する工程とを包含し、このパネルのこの代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、対象における乳癌の再発の指標である。典型的には、上記体液は、血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である。好ましくはこの体液とは、血清である。
【０００８】
好ましい実施形態では、複数の代謝物バイオマーカーの上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、２−ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、３−メチル−２−ヒドロキシ−２−ペンテン酸、ドデカン酸、１，２，３，トリヒドロキシプロパン、β−アラニン、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも７つの化合物からなる。
【０００９】
別の好ましい実施形態では、上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシ
ン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる。
【００１０】
さらに好ましい実施形態では、上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。別の好ましい実施形態では、上記パネルは、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。さらに別の好ましい実施形態では、上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる。
【００１１】
好ましい実施形態では、上記パネル中の代謝物バイオマーカーは、乳癌の状態が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、このサンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、このサンプルを質量分析測定に供することによってこのサンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、この核磁気共鳴測定の結果および質量分析測定の結果を分析して、このサンプル内に含まれる１つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを作成する工程と、このスペクトルを多変量統計分析に供して、このサンプル内に含まれる少なくとも１つ以上の代謝物種を特定する工程と、どの代謝物種が所定の乳癌の状態と相関するかを決定する工程とによって決定される。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、哺乳動物対象において二次的な腫瘍細胞増殖を検出する方法が開示されており、この方法は、対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを分析して、所定のバイオマーカーのパネルにおいて各々の代謝物バイオマーカーの存在および量を決定する工程とを包含し、このパネル中のこの代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、哺乳動物対象における二次的な腫瘍細胞増殖の指標である。典型的には、上記体液は、血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である。好ましくはこの体液は血清である。
【００１３】
好ましい実施形態では、複数の代謝物バイオマーカーの上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、２−ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、３−メチル−２−ヒドロキシ−２−ペンテン酸、ドデカン酸、１，２，３，トリヒドロキシプロパン、β−アラニン、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも７つの化合物からなる。別の好ましい実施形態では、上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる。
【００１４】
さらに好ましい実施形態では、上記パネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。別の好ましい実施形態では、このパネルは、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。さらに別の好ましい実施形態では、このパネルは、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸
塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる。
【００１５】
好ましい実施形態では、上記パネル中の代謝物バイオマーカーは、二次的な腫瘍細胞増殖が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、このサンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、このサンプルを質量分析測定に供することによってこのサンプル中の１つ以上の代謝物種を測定する工程と、この核磁気共鳴測定の結果および質量分析測定の結果を分析して、このサンプル内に含まれる１つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、このスペクトルを多変量統計分析に供して、このサンプル内に含まれる少なくとも１つ以上の代謝物種を特定する工程と、どの代謝物種が二次的な腫瘍細胞増殖と相関するかを決定する工程とによって決定される。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、生体サンプル内の乳癌の再発の状態を検出するための方法が開示されており、この方法は、核磁気共鳴分析と質量分析とを組み合わせた分析にサンプルを供することによってこのサンプル内の１つ以上の代謝物種を測定する工程であって、この分析によってこのサンプル内に含まれる１つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、この個々のスペクトルピークを統計学的パターン認識分析に供して、このサンプル内に含まれる少なくとも１つ以上の代謝物種を特定する工程と、この１つ以上の代謝物種の測定値と乳癌の状態とを関連付ける工程とを包含する。好ましくは、上記１つ以上の代謝物種は、２−メチル、３−ヒドロキシブタン酸；３−ヒドロキシ酪酸塩；コリン；ギ酸塩；ヒスチジン；グルタミン酸；Ｎ−アセチル−グリシン；ノナン二酸；プロリン；トレオニン；チロシン；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。典型的には、上記サンプルは、体液、好ましくは血清を含む。典型的には、上記質量分析は、二次元クロマトグラフィガスクロマトグラフィとカップリングした質量分析を含む。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、乳癌を検出するためのバイオマーカーのパネルであって、このパネルは、２−メチル、３−ヒドロキシブタン酸；３−ヒドロキシ酪酸塩；コリン；ギ酸塩；ヒスチジン；グルタミン酸；Ｎ−アセチル−グリシン；ノナン二酸；プロリン；トレオニン；チロシン；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの代謝物種またはその一部を含んでいるパネルを提供する。
【００１８】
本発明の教示の上述の態様およびそれらを達成する方式は、さらに明白になり、その教示は、添付の図面と組み合わせて行われる以下の実施形態の説明を参照すればさらに理解される。ここでは対応する参照符号は、いくつかの図面を通して対応する部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】バイオマーカー選択、モデル開発およびバリデーション（検証）の方法の一実施形態を示すフローチャート。このサンプルは、診断の時点および診断後に近いＮＥＤサンプル（ｎ＝１４１）および再発サンプル（ｎ＝４９）からなるトレーニングセット、ならびに診断前の再発サンプルからなるサンプルのテストセットに分割された。トレーニングセットのサンプルは、患者の５つの交差検証群に分けられた。５分割の交差検証を用いたバイオマーカー選択にはロジスティック回帰を用いた。モデル構築は、リーブ・ワン・アウト・インターナル（ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｏｕｔ  ｉｎｔｅｒｎａｌ）交差検証による、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）モデリングを用いた。バリデーションは、診断前サンプルで行った。
【図１Ｂ】バイオマーカー選択、モデル開発およびバリデーションの別の実施形態を示すフローチャート。サンプルを、トレーニングセット（ｎ＝１４０、６６の再発サンプルおよび７４のＮＥＤサンプル）と、テストセット（ｎ＝１１７サンプル、５０の再発サンプルおよび５０のＮＥＤサンプル）とに無作為に分けた。可変性の選択を、ロジスティック回帰を用いて行い、予測モデルを、ＮＭＲ研究で特定された７つのバイオマーカー、およびＧＣ研究で特定された４つのバイオマーカーに基づいて構築した。
【図２Ａ】典型的な５００ＭＨｚの一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図２Ｂ】再発後の乳癌患者由来の二次元ＧＣ×ＧＣ／ＴＯＦ−ＭＳ総イオン電流（ＴＩＣ）等高線プロットスペクトル（溶媒なし）。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＭＳバイオマーカーのためのバリデーション手順を示す。図３Ａは、三次元ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦ総イオン流れ（ＴＩＣ）表面プロットクロマトグラム。
【図３Ｂ】典型的な一次元ＴＩＣ  ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦクロマトグラム。
【図３Ｃ】ｍ／ｚが４３２の選択されたイオンピークについてのクロマトグラムに基づき選択された代謝物（グルタミン酸）を示す図。
【図３Ｄ】ＮＥＤ患者由来のグルタミン酸の質量スペクトル。
【図３Ｅ】再発乳癌を有する患者由来のグルタミン酸の質量スペクトル。
【図３Ｆ】その代謝物の市販のサンプルについてのグルタミン酸の質量スペクトル。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｋは、７つのＮＭＲマーカーおよび４つのＧＣ×ＧＣ／ＭＳマーカーに関し、全てのサンプルについての、再発後（ｐｏｓｔ）患者に加えて再発中（ｗｉｔｈｉｎ）患者（「再発（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）」）（再発後患者＋再発中患者）対ＮＥＤ患者の間の識別を相対ピーク積分として表して図示する箱髭図を示す。箱の真ん中部分の水平線は、平均に相当するが、箱の底と頂部の境界は、それぞれ２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルに相当する。下側および上側のひげは、それぞれ最小値および最大値に相当するが、白抜き丸印は異常値である。ｙ軸は、方法のセクションで記載したとおり相対ピーク積分を示す。図４Ａは、ギ酸塩のＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｂ】ヒスチジンのＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｃ】プロリンのＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｄ】コリンのＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｅ】チロシンのＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｆ】３−ヒドロキシ酪酸塩のＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｇ】乳酸塩のＮＭＲデータに基づく図。
【図４Ｈ】グルタミン酸塩のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図４Ｉ】Ｎ−アセチル−グリシンのＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図４Ｊ】３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図４Ｋ】ノナン二酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｒは、追加のマーカーに関し、全てのサンプルについての、再発後患者に加えて再発中患者（「再発」）（再発後患者＋再発中患者）対ＮＥＤ患者の間の識別を相対ピーク積分として表して図示する箱髭図を示す。箱の真ん中部分の水平線は、平均に相当するが、箱の底と頂部の境界は、それぞれ２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルに相当する。下側および上側のひげは、それぞれ最小値および最大値に相当するが、白抜き丸印は異常値である。ｙ軸は、方法のセクションで記載したとおり相対ピーク積分を示す。図５Ａは、アルギニンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｂ】ドデカン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ｃ】アラニンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｄ】アラニンのＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ｅ】フェニルアラニンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｆ】フェニルアラニンのＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ｇ】アスパラギン酸のＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｈ】グルタミン酸塩のＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｉ】トレオニンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｊ】バリンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｋ】アセト酢酸塩のＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｌ】リシンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｍ】クレアチニンのＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｎ】イソ酪酸塩のＮＭＲデータに基づく図。
【図５Ｏ】ヘキサデカン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ｐ】９，１２−オクタデカジエン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ｑ】ペンタデカン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図５Ｒ】酢酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく図。
【図６Ａ】再発後および再発中（＝「再発」）サンプル由来のデータ対ＮＥＤサンプル由来のデータを用いて、図１Ａに図示され、下に記載されるＰＬＳ−ＤＡモデルから作成したＲＯＣ曲線、ならびに同じサンプルに対するＣＡ２７．２９の能力を示す図。
【図６Ｂ】２つのサンプル分類についての箱髭図を示し、モデル予測スコアを用いることによってＮＥＤ患者由来のサンプルと再発サンプルとの識別を示す図。
【図６Ｃ】図１Ｂに図示される第二の統計的アプローチに基づくテストサンプルセットを用いることによってＰＬＳ−ＤＡ予測モデルから作成したＲＯＣ曲線を示す図。
【図６Ｄ】２つのサンプル分類についての箱髭図を示し、テストセット由来の予測スコアを用いることによってＮＥＤ患者由来のサンプルと再発サンプルとの識別を示す図。
【図７Ａ】カットオフ閾値４８を用い、１１のバイオマーカーモデルを用いて正確に特定した再発患者の割合（ＢＣＲプロファイル１、黒塗りの四角）を、ＣＡ２７．２９試験を用いて正確に特定した再発患者の割合（黒塗り三角）と比較して、全ての再発患者についての時間の関数として示す図。
【図７Ｂ】カットオフ閾値４８を用い、１１のバイオマーカーモデルを用いて正確に特定したＮＥＤ患者の割合（黒塗りの四角）を、ＣＡ２７．２９試験を用いて正確に特定したＮＥＤ患者の割合（黒塗り三角）と比較して、時間の関数として示す図。
【図７Ｃ】カットオフ閾値５４を用い、１１のバイオマーカーモデルを用いて正確に特定した再発患者の割合（黒塗りの四角）を、ＣＡ２７．２９試験を用いて正確に特定した再発患者の割合（黒塗り三角）と比較して、全ての再発患者についての時間の関数として示す図。
【図７Ｄ】カットオフ閾値５４を用い、１１のバイオマーカーモデルを用いて正確に特定したＮＥＤ患者の割合（黒塗りの四角）を、ＣＡ２７．２９試験を用いて正確に特定したＮＥＤ患者の割合（黒塗り三角）と比較して、時間の関数として示す図。
【図８Ａ】１１のバイオマーカーモデル（ＢＣＲプロファイル１）およびカットオフ閾値４８を用いて、再発として正確に特定された再発患者の割合を、エストロゲン受容体（ＥＲ）ステータス（図８Ａ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）ステータス（図８Ｂ）に基づき時間の関数として示す図。ＥＲマイナスのステータスは、黒塗り三角によって示され、ＥＲプラスのステータスは、黒塗りの四角によって示される。
【図８Ｂ】１１のバイオマーカーモデル（ＢＣＲプロファイル１）およびカットオフ閾値４８を用いて、再発として正確に特定された再発患者の割合を、エストロゲン受容体（ＥＲ）ステータス（図８Ａ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）ステータス（図８Ｂ）に基づき時間の関数として示す図。ＰＲマイナスのステータスは、黒塗り三角によって示され、ＰＲプラスのステータスは、黒塗りの四角によって示される。
【図９Ａ】図１Ｂに図示された統計学的アプローチを用いて、トレーニングセット（図９Ａ）を用いて予測モデルから作成したＲＯＣ曲線。
【図９Ｂ】図１Ｂに図示された統計学的アプローチを用いて、テストセットを用いて予測モデルから作成したＲＯＣ曲線。
【図９Ｃ】２つのサンプル分類についての箱髭図であり、トレーニングセット由来の予測スコアを用いてＮＥＤサンプルと再発サンプルとの間の識別を示す図。
【図９Ｄ】２つのサンプル分類についての箱髭図であり、テストセット由来の予測スコアを用いてＮＥＤサンプルと再発サンプルとの間の識別を示す図。
【図１０】癌の再発のある乳癌患者と疾患の所見のない（無病生存）患者（ＮＥＤ）との間で有意な統計的相違を示した代謝物についての変更された代謝経路をまとめる図。実線で囲って示される代謝物は、再発患者で下方制御されたが、破線で囲って示される代謝物は、上方制御された。代謝物プロファイルで用いられる１１の代謝物に加えて、表２、および図４ならびに図５由来の多数の他の関連の代謝物もまた図１０に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１つの好ましい実施形態では、代謝物プロファイリング方法を用いて開発された再発乳癌についてのモニタリング試験が開示される。核磁気共鳴（ＮＭＲ）および二次元のガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ×ＧＣ−ＭＳ）方法の組み合わせを用いて、本発明者らは、以前に診断され、外科的に処置された５６例の乳癌患者由来の２５７例のレトロスペクティブな（過去に遡っての）連続的な（経時的な）血清サンプルの代謝物プロファイルを分析した。１１６例の連続サンプルは、再発乳癌の２０例の患者由来であって、１４１例のサンプルは、６年までのサンプル収集の間に臨床上疾患の所見のない（無病生存の）３６例の患者由来であった。ＮＭＲおよびＧＣ×ＧＣ−ＭＳデータを、再発サンプルと、無病生存のサンプルとの間で特定された代謝物のシグナルを比較するために多変量統計法によって分析し、１セットの４０個のバイオマーカーを得た（下の表２）。１１個の代謝物マーカー（ＮＭＲから７つ、およびＧＣ×ＧＣ−ＭＳから４つ）のサブセットを、全ての患者サンプルの分析から、ロジスティック回帰および５分割交差検証を用いることによって選択した。リーブ・ワン・アウト交差検証によってこれらのマーカーを用いて構築された部分最小二乗判別分析モデルによって、８６％という感度および８４％という特異性が得られた（受信者動作特性曲線下面積＝０．８８）。驚くべきことに、５５％の患者について、再発することが、臨床上の再発の診断の１年以上（平均で１３カ月）前に正確に予想され得、このことは、現在の乳癌−モニタリングアッセイＣＡ２７．２９を上回る大きな改善である。
【００２１】
下に記載される本発明の開示の実施形態は、網羅的でもなく、以下の詳細な説明に開示される正確な形態に対してその開示を限定するものでもない。むしろ、この実施態様は、当業者が、本発明の開示の原理および実施を評価し理解し得るように選択され記載される。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解される意味を有する。
本明細書において用いる場合、「代謝物」とは、以下のような、エネルギーを生み出して用いる体内の全ての物理的および化学的なプロセス、例えば、食物および栄養の消化、尿および便を通じた廃棄物の排出、呼吸、血液循環および温度調節の間に生成されるかまたは用いられる任意の物質を意味する。「代謝前駆体」という用語は、代謝物が生成される由来の化合物を指す。「代謝産物」という用語は、代謝経路の一部である任意の物質（例えば、代謝物、代謝前駆体）を指す。
【００２３】
本明細書において用いる場合、「生体サンプル」とは、対象から得られたサンプルを指す。好ましい実施形態では、生体サンプルは、限定はしないが、血液、血漿、血清、汗、唾液（喀痰を含む）、尿などからなる生体液（「体液」）の群から選択され得る。本明細書において用いる場合、「血清」とは、フィブリン塊および血球の除去後に得られた血液の体液部分を指し、循環血液中の血漿とは区別される。本明細書において用いる場合、「血漿」とは、凝集後に得られ、血清とは識別される、血液の非細胞部分の液体を指す。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「対象」とは、任意の温血動物、特に、例としては、限定するものではないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭内動物、例えば、イヌおよびネコ；実験動物、例としては、げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどのような分類の多数の哺乳動物を指す。この用語は、特定の年齢または
性別を指すのではなく、従って、雄性または雌性にかかわらず、成体および新生の対象を包含する。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「検出する」とは、サンプル中の物質（単数または複数）の有無を特定する工程と、サンプル中の物質（単数または複数）の量を定量する工程と、および／または物質の種類を特定する工程とを包含する方法を指す。「検出する」とは、同様に、対象における乳癌組織または乳癌再発の有無を特定する工程を包含する方法を指す。
【００２６】
「質量分析計」とは、気相イオンの質量対電荷比に変換され得るパラメータを測定する気相イオン分光計を指す。質量分析計は一般には、イオン源および質量分析器を備える。質量分析計の例は、飛行時間、磁場型、四重極フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクタ分析器およびそれらのハイブリッドである。「質量分析法」とは、気相イオンを検出するための質量分析計の使用を指す。
【００２７】
「包含する、含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに属するとみなされる広範な意味を有するものとし、「包含する、含む、備える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。
【００２８】
本発明は、記載される装置の特定の構成要素または記載される方法の工程段階に限定されず、そのようなものとして装置および方法が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書に用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定されると解釈されるべきではないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「不定冠詞／１つの、ある（ａ）、（ａｎ）」および「定冠詞／この、その（ｔｈｅ）」とは、その文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を包含する。
【００２９】
本開示は、乳癌の早期の再発を検出するのに有効であるとして選択された、選択されたバイオマーカーのパネルに基づくモニタリング試験を提供する。この試験は、高い程度の臨床感度および臨床特異性を有し、現在のモニタリング診断よりもかなり早期の時点で乳癌再発を検出できる。この試験は、核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）および質量分析法（「ＭＳ」）技術の組み合わせを利用する生体サンプル分類法に基づく。さらに具体的には、本発明の技術は、ＮＭＲと二次元のガスクロマトグラフィ−質量分析法（「ＧＣ×ＧＣ−ＭＳ」）との組み合わせを利用して、患者の血清サンプルで見い出される１セットの代謝物種を含む低分子バイオマーカーを特定する。これらの特定されたバイオマーカーのパネルは、再発のサンプルと、無病生存のサンプルとの間で特定された代謝シグナルを比較することによって早期のステージで再発乳癌を検出するのに有効であることが見い出され、現在利用可能な診断試験または臨床診断よりも１年早く再発の指標が得られる。
【００３０】
代謝物プロファイリングは、生体サンプル中に存在する数百の低分子（約１０００ダルトン未満）の定量分析のためのハイスループットの分析方法、例えば、核磁気共鳴分光法および質量分光法を利用する。代謝物プロファイルの複雑性のため、データ分析のために多変量統計法が広範に用いられる。わずかな刺激に対しても高感度である代謝物プロファイルは、リアルタイムで種々の生体変動の早期の発現を検出する手段を提供することができる。
【００３１】
本発明の研究では、代謝物プロファイリング方法を用いて、再発乳癌に対して感受性であるとともに血清サンプル中で検出される代謝物を決定および選択した。ＮＭＲおよび二次元のガスクロマトグラフィ分解ＭＳ（「２Ｄ  ＧＣ−ＭＳ」）方法の組み合わせを利用
して、１セットの２５７のレトロスペクティブ連続血清サンプルに基づく早期乳癌再発検出のためのモデルを構築して実証（バリデート）した。本モデルのために選択された誘導された代謝物バイオマーカーの能力は、現在用いられている分子マーカーＣＡ２７．２９の能力と比較して極めて好ましく匹敵した。このことは、代謝物プロファイリング方法が、処置された乳癌患者の追跡調査のための鋭敏な試験を保証することが示している。具体的には、６０％を超える再発性患者が、臨床的な診断による再発の検出の１０カ月より前に特定され得る。結果の試験によって、再発乳癌の早期の検出のための鋭敏かつ特異的なモデルが得られる。
【００３２】
この代謝物プロファイルは、ＮＭＲおよびＭＳ方法のプラットフォームを用いて開発されたが、当業者は、これらの特定のバイオマーカーが、適切な感度の別の方法、例えば、ＨＰＬＣ、イムノアッセイ、酵素的アッセイ、または臨床化学方法によって検出され得ることを認識するであろう。
【００３３】
本発明の一実施形態では、サンプルは、長期間にわたって個体から収集され得る。個体から経時的に多数のサンプルを得ることは、早期検出の結果を検証ため、および／または例えば、病理学の結果としてマーカーパターンにおける変化を特定するために用いられうる。
【００３４】
本発明の一実施形態では、サンプルは、追加の調製および／または分離の手順なしで分析される。本発明の別の実施形態では、サンプルの調製および／または分離は、限定はしないが、収集されたサンプルの種類および／または検索された代謝産物の種類次第で、任意の以下の手順を包含し得る：多量のポリペプチド（例えば、アルブミンおよびトランスフェリン）の除去；防腐剤および検量体の追加、サンプルの脱塩；サンプル物質の濃縮；タンパク質消化；ならびに画分収集。本発明のさらに別の実施形態では、サンプル調製技術は、情報の多い代謝産物を濃縮して、情報が少ないかまたは全くないポリペプチドまたは他の物質（血清に極めて豊富であるかまたは天然であるものなど）を除去する。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、サンプル調製は、マニフォールドまたは調製／分離装置で行われる。このような調製／分離装置は、例えば、マイクロフルイディクス（微小流体）装置、例えば、カセットであってもよい。本発明のさらに別の実施形態では、調製／分離装置は、検出装置と直接または間接的に連結する。このような調製／分離装置は、例えば、フルイディクス（流体）装置であってもよい。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、所望されないポリペプチド（例えば、多量の、情報にならない、または検出できないポリペプチド）の除去は、高親和性の試薬、高分子量フィルター、カラム精製、超遠心および／または電気透析を用いて達成され得る。高親和性試薬としては、特定のｐＨ、イオン値または界面活性剤の強度を有する豊富なポリペプチドまたは試薬に選択的に結合する、抗体が挙げられる。高分子量フィルターとしては、サイズおよび分子量に基づいて分子を分離する膜が挙げられる。このようなフィルターはさらに、逆浸透、ナノフィルトレーション（ナノ濾過）、限外濾過およびマイクロフィルトレーション（精密濾過）を使用してもよい。
【００３７】
限外濾過は、所望されないポリペプチドを除去するための別の方法を構成する。限外濾過では、粒子の沈殿（またはその欠失）を光学系でモニターしながら約６０，０００回転／分（ｒｐｍ）でサンプルを遠心する。最後に、電気透析は、電位勾配の影響下でイオン透過性膜を通じて１つの溶液から別の溶液にイオンが移送される電気膜処理である。電気透析に用いられる膜は、正の電荷または負の電荷を有するイオン、および反対の電荷の拒絶イオンを選択的に輸送する能力を有するので、電気透析は、電解質の濃縮、除去または分離に有用である。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、マニフォールドまたはマイクロフルイディクス装置は、電気透析を行って、高分子量ポリペプチドまたは望ましくないポリペプチドを除去する。電気透析を最初に用いて、ほぼ３５３０ｋＤより低い分子のみが第二のチャンバへ通過することを可能にしてもよい。極めて低い分子量カットオフ（ほぼ５００Ｄ）を有する第二の膜によって、より小さい分子が第二のチャンバを出ることが可能になる。
【００３９】
サンプルの調製の際、目的の代謝産物は、本発明の別の実施形態で分離され得る。分離は、調製物と同じ位置で、または別の位置で行われ得る。本発明の一実施形態では、分離は、分離が生じる同じマイクロフルイディクス装置で、ただし、装置上の異なる位置で生じる。サンプルは、電場を含む、種々の手段を用いて最初のマニフォールド位置からマイクロフルイディクス装置へ移動され得る。本発明の別の実施形態では、サンプルは、逆相ビーズおよび有機溶媒溶出、例えば、５０％メタノールを用いて、マイクロフルイディクス装置へのそれらの移動の間に濃縮される。これによって、分子は、マイクロフルイディクス装置の分離装置上のチャネルまたはウェル中に溶出される。
【００４０】
クロマトグラフィは、複数の物質の一部を分離するための別の方法を構成する。クロマトグラフィは、種々の物質の種々の吸収および溶出に基づく。液体クロマトグラフィ（ＬＣ）は、例えば、非移動層を移動する液体担体の使用を包含する。従来のＬＣカラムは、ほぼ４．６ｍｍの内径、およびほぼ１ｍｌ／分の流速を有する。マイクロ−ＬＣ（Ｍｉｃｒｏ−ＬＣ）は、ほぼ１．０ｍｍの内径およびほぼ４０μｌ／分の流速を有する。キャピラリーＬＣは、ほぼ３００ｉｍの内径およびほぼ５μｌ／分の流速を有するキャピラリーを利用する。ナノ−ＬＣは、５０μｍ−１ｍｍの内径および２００ｎｌ／分の流速で利用可能である。ＨＰＬＣに比較したナノ−ＬＣの感度はほぼ３７００倍である。本発明の追加の実施形態に適切な他の種類のクロマトグラフィとしては、限定はしないが、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、およびガスクロマトグラフィ（ＧＣ）が挙げられる。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、サンプルは、キャピラリー電気泳動分離を用いて分離される。これは、分子を、所定のｐＨ（または疎水性）でのそれらの電気泳動の移動度に基づいて分離する。本発明の別の実施形態では、サンプルの調製および分離は、マイクロフルイディクス技術を用いて組み合わされる。マイクロフルイディクス装置は、マイクロチャネル構造を用いた異なる位置間において分析物および溶出物などの種々の試薬を含む液体を輸送し得る装置である。
【００４２】
適切な検出方法とは、少なくとも５０μＭの体液サンプル中の分析物の検出のための感度を有する方法である。特定の実施形態では、この検出方法の感度は、少なくとも１μＭである。他の実施形態では、検出方法の感度は、少なくとも１ｎＭである。
【００４３】
本発明の一実施形態では、サンプルは、事前の調製および／または分離なしに検出装置に直接送達され得る。本発明の別の実施形態では、一旦調製および／または分離されれば、代謝産物は、検出装置に送達され、この検出装置がサンプル中の代謝産物を検出する。本発明の別の実施形態では、溶出液または溶液中の代謝産物は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって検出装置に送達される。本発明のさらに別の実施形態では、ナノスプレーイオン化（ＮＳＩ）が用いられる。ナノスプレーイオン化は、ＥＳＩの小型版であり、極めて限られた容積のサンプル液を用いて低い検出限界を提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、分離された代謝産物は、マイクロフルイディック装置に組み込まれたエレクトロスプレーイオン化エミッター（統合型ＥＳＩマイクロフルイディック装置）につながるチャネルに直接供される。このような統合型のＥＳＩマイクロフルイ
ディック装置は、検出に最適な流速および複雑度でサンプルを検出装置に提供し得る。さらに、マイクロフルイディック装置は、最適のサンプル捕獲のために検出装置と配置されてもよい。
【００４５】
適切な検出装置とは、限定するものではないが、ＩＲ（赤外線分光法）、ＮＭＲ（核磁気共鳴）を含み、バリエーション、例えば、相関分光法（ＣＯＳｙ）、核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）、およびローテーティングフレーム核オーバーハウザー効果分光法（ＲＯＥＳＹ：ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、およびフーリエ変換、２−Ｄ  ＰＡＧＥ技術、ウエスタンブロット技術、トリプシンマッピング、インビトロ生物学的アッセイ、免疫学的分析、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分析法）、ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、およびＭＳ（質量分析法）を含む、代謝産物の存在および／またはレベルを検出できる任意の装置または実験方法であり得る。
【００４６】
ＮＭＲ分光法の適用に依拠する分析のために、分光法は、一次元、二次元もしくは多次元のＮＭＲ分光法として、または他のＮＭＲ分光検査技術によって、とりわけクロマトグラフィ法とも組み合わされて（例えば、ＬＣ−ＮＭＲ）行われてもよい。該当の代謝産物の決定に加えて、１Ｈ−ＮＭＲ分光法は、同じ検討の試行でさらに代謝産物を決定する可能性をもたらす。１つの検討の試行で複数の代謝産物の評価を組み合わせることが、いわゆる「パターン認識」のために使用され得る。一般に、単一の代謝物濃度の単独の決定と比較して、選択された代謝物、すなわち、特定されたバイオマーカーのパネルのプロファイルに基づく評価および結論の強さは改善される。
【００４７】
免疫学的分析のため、例えば、免疫学的試薬（例えば、抗体）の使用は一般には、他の化学的および／または免疫学的試薬と組み合わせて、反応を誘導するか、または反応産物をもたらし、これが次に目的の代謝産物（単数または複数）の群全体、サブグループまたは亜種の検出および測定を可能にする。高い選択性でかつ高感度（１０〜１０００ｐｇ、または０．０２〜２ピコモル）という適切な免疫学的検出方法（例えば、バルド  Ｂ．Ａ．ら（Ｂａｌｄｏ，Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、Ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ＰＡＦ，Ｌｉｐｉｄｓ  ２６（１２）巻：１１３６〜１１３９ページ）は、体液サンプル中の０．５〜２１ｎｇ／ｍｌの分析物を検出し得る（コーニー  Ｓ．Ｊ．ら（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  ＰＡＦ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓａｌｉｖａ），Ｌｉｐｉｄｓ  ２６（１２）巻：１１４０〜１１４３ページ）。
【００４８】
本発明の一実施形態では、質量分析法は、所定のサンプル中に存在する代謝産物を検出することに依拠する。本発明の別の実施形態は、ＥＳＩ−ＭＳ検出装置である。このようなＥＳＩ−ＭＳは、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析システムを利用し得る。四重極質量分析法、イオントラップ質量分析法、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）が同様に、本発明の追加の実施形態において考慮される。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、検出装置は、分離／調製装置またはマイクロフルイディック装置（サンプル中の代謝産物の全てではないが多くの急速なアッセイを可能にする）と連結する。分析のための連続サンプル流を可能にし、検出プロセス（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ）を通じて高感度をもたらす質量分析計が利用され得る。本発明の別の実施形態では、質量分析計は、１つ以上のエレクトロスプレー、２つ以上のエレクトロスプレー、３つ以上のエレクトロスプレー、または４つ以上のエレクトロスプレーと連結する。このようなエレクトロスプレーは、単一または複数のマイクロフルイディクスの装置に由来し得る。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、利用される検出システムによって、検出装置中に導入されたほとんど、または全ての代謝産物の捕獲および測定が可能になる。本発明の別の実施形態では、検出システムによって、代謝産物の規定の組み合わせ（「プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）」、「パネル（ｐａｎｅｌ）」、「アンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）、または「複合、コンポジット（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）」）における変化の検出が可能になる。
【００５１】
実施例
本実施例では、ＮＭＲおよび２Ｄ  ＧＣ×ＧＣ−ＭＳの方法の組み合わせを用いて、以前に診断され、外科的に処置された５６例の乳癌患者由来の２５７例のレトロスペクティブな連続血清サンプルの代謝物プロファイルを分析した。１１６例の連続血清サンプルは再発乳癌の２０例の患者由来であり、１４１例の血清サンプルは、サンプル収集期間の間に臨床的に無病生存の３６例の患者由来であった。ＮＭＲおよびＧＣ×ＧＣ−ＭＳのデータを、多変量統計法によって分析して、再発サンプルと無病生存のサンプルとの間で特定された代謝物シグナルを比較した。１１の代謝物マーカー（７つはＮＭＲからで、４つはＧＣ×ＧＣ−ＭＳから）を、５分割交差検証を用いるロジスティック回帰モデルによって全ての患者サンプルの分析から選択した。リーブ・ワン・アウト交差検証によってこれらのマーカーを用いて構築されたＰＬＳ−ＤＡモデルによって、８６％という感度および８４％という特異性が得られた（ＡＵＲＯＣ＞０．８５）。驚くべきことに、６０％を超える患者が、臨床上の再発の診断の１０カ月（平均で）前に、再発することが正確に予想され得、このことは、現在の乳癌モニタリングアッセイＣＡ２７．２９を上回る大きな改善を示す。本発明者らが知っている限りでは、これは、代謝物プロファイルに基づいて再発乳癌の早期検出のための予測モデルを開発して予備検証した最初の研究である。詳細には、２つの進歩した分析的方法（ＮＭＲおよびＭＳ）の組み合わせによって、再発乳癌の早期の検出のための強力なアプローチが得られる。
【００５２】
サンプル収集
２５７例の血清サンプル（５６例の乳癌患者由来の各々４００マイクロリットル（μｌ）以下）を、ＭＤアンダーソン癌センター（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）（米国テキサス州ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）所在）から入手した。これらの保存血清サンプルは、１９９７年から２００３年の間に、ＭＤアンダーソン癌センター（米国テキサス州ヒューストン所在）に登録された乳癌患者である女性ボランティア（年齢４０歳〜７５歳）から１患者あたり平均で５連続の時間経過サンプルを収集したものである。乳癌再発に関してＭＤアンダーソンの腫瘍学者による追跡調査は、ＣＡ  ２７．２９、ＣＥＡ、および／またはＣＡ１２５  ＩＶＤの結果、患者の症状、最初の乳癌のステージ、ホルモン受容体およびリンパ節の状態（ステータス）を含む要因の組み合わせに基づいた。５６例の患者のうち、乳癌は２０例で、局所でまたは遠位臓器で再発し、残りの３６例は、サンプリング期間も、以後２年間も再発無病生存（ＮＥＤ）であった。
【００５３】
再発の乳癌患者から全部で１１６例の血清サンプルを得たが、これは、臨床上再発と診断されるより３カ月早く（再発前（Ｐｒｅ））収集した６７例のサンプルと、再発の±３カ月内に収集された（再発中）１８例のサンプルと、再発が診断された後３カ月より遅くに（再発後）収集された３１例のサンプルとから構成された。残りの１４１例のサンプルは、患者がそのサンプル収集期間をこえて少なくとも２年間にわたってＮＥＤのままである症例である。ほぼすべてのサンプルを収集の時点でＣＡ２７．２９値について評価し、その結果比較に用いることができた。研究のサンプルは、収集からそれをパーデュー大学の評価研究室に移すまでドライアイス上で、−８０℃で維持し、研究室で再度、研究終了まで−８０℃で凍結保存した。血清サンプルおよび添付の臨床データは、本研究に移る前には適切に特定されていなかった。表１では、癌患者の臨床パラメータおよび個体群統計学的特性をまとめる。
【００５４】
【表１】
2013522652.tif 000002
【００５５】
１Ｈ  ＮＭＲ分光法
解凍後、２００マイクロリットル（「μＬ」）の血清を、３３０μＬのＤ２Ｏおよび５μＬのアジ化ナトリウム（１２．３ｎｍｏｌ）と混合した。サンプル溶液を、６０秒間ボルテックスして、１分あたり８０００回転（ＲＰＭ）で５分間遠心分離した。その後、５３０μＬのアリコートを、ＮＭＲ測定のために、標準の５ミリメートル（ｍｍ）のＮＭＲチューブに移した。６０μＬの０．０１２％の３−（トリメチルシリル）プロピオン−（２，２，３，３−ｄ４）酸ナトリウム塩（「ＴＳＰ」）溶液をＤ２Ｏ中に含有する外側キャピラリーチューブ（ガラスステム同軸インサート、ＯＤ２ｍｍ）を、化学シフト周波数標準（δ＝０．００ｐｐｍ）として、およびロッキング目的のために用いた。全てのＮＭＲ実験は、２５℃で、ブルカーＤＲＸ５００メガヘルツ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００
Ｍｅｇａｈｅｒｔｚ）（「ＭＨｚ」）分光計（低温プローブを装備した）および三軸磁場勾配で行った。２つの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、各々のサンプル、標準ＩＤ  ＮＯＥＳＹ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）およびＣＰＭＧ（Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ）パルスシーケンス（水前期飽和と対にした）について測定した。各々のスペクトルについては、３２のトランジエントを３２ｋデータポイントおよび６０００Ｈｚのスペクトル幅を用いて収集した。０．３Ｈｚのライン広幅化に対応する指数関数重み関数を、フーリエ変換適用
前に自由誘導減衰（ＦＩＤ）に適用した。各々のピークを積分し、次いで水および尿のピークを排除して総ＮＭＲスペクトル強度（総合計）の値を用いて正規化した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＸＷＩＮＮＭＲソフトウェアバージョン３．５を用いる位相整合およびベースライン補正の後、処理したデータを、さらなる分析のためにＡＳＣＩＩフォーマットに保存した。
【００５６】
ＧＣ×ＧＣ−ＭＳ
タンパク質の沈殿は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で２００μＬの血清と４００μＬのメタノールとを混合することによって各々のサンプルについて行った。この混合物を短時間ボルテックスし、次いで−２０℃で３０分間保持した。１４，０００ＲＰＭで１０分間、冷たく保ちながらサンプルを遠心分離した。上層（上清）を、さらに使用するために別のエッペンドルフチューブに移した。クロロホルム（２００μＬ）をタンパク質ペレットと混合して、１４，０００ＲＰＭでさらに１０分間遠心分離した。遠心分離後、アリコート（試料の一部）を移して、前の工程由来のメタノール上清溶液と合わせた。得られた混合物を凍結乾燥して、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ  ＡＥＳ２０１０）を用いて５時間、溶媒を除去した。次いで、各々の乾燥したサンプルを、５０μＬの無水ピリジンに溶解して、短時間のボルテックスの後に、約２０分間、超音波処理した。この溶液の２０μＬを、２０μＬの誘導体化試薬ＭＴＢＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、トリフルオロアセトアミド）（レジス社（Ｒｅｇｉｓ）、米国イリノイ州モートングローブ（Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ）所在）と混合した。この混合物に対する、活性なｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を含有するこの誘導体化剤の添加によって、生体サンプル中に存在する代謝物のヒドロキシル、アミンまたはカルボン酸のような官能基は活性化される。次いで、このサンプルを、反応に影響するように６０℃で１時間インキュベートした。誘導体化後、溶液の内容物を、分析のためにガラスＧＣ（オートサンプラー）バイアルに移した。
【００５７】
二次元のＧＣ×ＧＣ−ＭＳ分析を、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ（登録商標））飛行時間質量分析計と組み合わされたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）  ６８９０ガスクロマトグラフ（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在）から構成されるＰｅｇａｓｕｓ  ４Ｄシステム（レコ社（ＬＥＣＯ）、米国ミシガン州セントジョセフ（Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ）所在）を用いて行った。第一の次元のクロマトグラフィ分離を、ＤＢ−５キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍの内径、０．２５μｍのフィルム厚）で行った。第一のカラムの末端で、溶出されたサンプルを４秒間クリオトラッピング（ｃｒｙｏｔｒａｐｐｉｎｇ）することによって凍結し、次いで急速に加熱して、第二の次元のクロマトグラフィカラム（ＤＢ−１７、１ｍ×０．１ｍｍ内径、０．１０μｍフィルム厚）に送った。第一のカラム温度の勾配は、０．２分の保持時間で５０℃で開始され、次いでこれは１０℃／分の速度で３００℃まで増大され、この温度が５分間保持された。第二のカラム温度の勾配は、対応する第一のカラム温度の勾配よりも２０℃高く、同じ速度および保持時間とした。第二の次元の分離時間は、４秒間に設定した。高純度ヘリウムを搬送ガスとして、１．０ｍＬ／分の流速で用いた。入口および移動ラインのための温度は、２８０℃に設定し、イオン源は、２００℃に設定した。検出およびフィラメントバイアス電圧は、それぞれ１６００Ｖおよび−７０Ｖに設定した。
【００５８】
５０〜６００ｍ／ｚにおよぶ質量スペクトルを、５０Ｈｚの比率で収集した。ＬＥＣＯ
ＣｈｒｏｍａＴＯＦソフトウェア（バージョン４．１０）を、自動ピーク検出および質量スペクトル解析のために用いた。ＮＩＳＴ  ＭＳデータベース（ＮＩＳＴ  ＭＳ  Ｓｅａｒｃｈ  ２．０、ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ；ＮＩＳＴ  ２００２）を、データ処理およびピークマッチングのために用いた。全ての特定された化合物の質量スペクトルを、ＮＩＳＴデータベース（ＮＩＳＴ  ＭＳ  
Ｓｅａｒｃｈ  ２．０、ＮＩＳＴ  ＥＰＡ／ＮＩＨ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ；ＮＩＳＴ  ２００２）における標準の質量スペクトルと比較した。さらに、特定されたバイオマーカー候補物を、購入されて、同一の実験条件下で行われた真正の市販のサンプルの質量スペクトルおよび保持時間から確認した。
【００５９】
代謝物の特定および選択
各々のサンプル由来のＮＭＲスペクトルを、０ｐｐｍで３−（トリメチルシリル）プロピオン−（２，２，３，３−ｄ４）（「ＴＳＰ」）酸ナトリウム塩シグナルを参照して整列させた。０．５〜９．０ｐｐｍの範囲内のスペクトル領域を、残留の水ピークおよび尿のシグナルを含んだ４．５〜６．０ｐｐｍの領域を排除した後に分析した。早期の乳癌検出で研究において最初に特定された、バイオマーカーに対応する２２のスペクトルの領域を、さらなる分析のためのバイオマーカー候補物として選択した。選択された領域における各々の代謝物の統計学的有意性を、トレーニングセットにおいてスチューデントのｔ検定を用いてＰ値を算出することによって決定した。代謝物のプールをさらに増強するため、再発サンプルとＮＥＤサンプルとの間のピークの強度における最も高い相違に基づき１８個の追加の代謝物を標的化ＭＳ分析のために特定した（表２）。ソフトウェアプログラムを内部開発し、これらの代謝物シグナルをＧＣ×ＧＣ−ＭＳデータセットから抽出した。このプログラムは、ｍ／ｚの入力値および保持時間範囲に基づいて、代謝物のスペクトルを、ＬＥＣＯ  Ｃｈｒｏｍａ  ＴＯＦソフトウェアパッケージ（ｖ１．６１）で利用可能な標準的なＮＩＳＴライブラリー由来の特徴的な実験的質量スペクトルにマッチングした後、各々の代謝物についてのクロマトグラフィピークを積分する。
【００６０】
本発明の方法を用いて特定されるバイオマーカーの完全なセットは、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、２−ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、３−メチル−２−ヒドロキシ−２−ペンテン酸、ドデカン酸、１，２，３，トリヒドロキシプロパン、β−アラニン、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる（表２）。
【００６１】
さらなる分析を、図４Ａ〜図４Ｋおよび図５Ａ〜図５Ｒの箱髭図に図示されるように、バイオマーカーのサブセットで行った。このバイオマーカーのサブセットは、３−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、酢酸、Ｎ−アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる。
【００６２】
バイオマーカーのさらなるサブセットまたはパネルが、予測モデルの開発およびモデルのバリデーションのために選択され、これは、代謝物、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。
【００６３】
【表２】
2013522652.tif 000003
【００６４】
あるいは、８つのバイオマーカーのサブセットまたはパネルが選択され、これは、代謝物である、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。
【００６５】
他の実施形態では、７つのバイオマーカーのサブセットまたはパネルが選択され、これは、３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる。
【００６６】
予測モデルの開発およびバリデーション
予測モデルを開発するための最も高いスコアを有する代謝物を選択するために、ＮＥＤ群、再発後群、および再発中群由来のサンプルを用いた。再発前のサンプルは、臨床診断前での正確な疾患状態の決定におけるあいまい性を回避するために省いた。再発後および再発中対ＮＥＤのサンプルを５つの交差検証（ＣＶ）群に分けた。２２のＮＭＲおよび１８のＧＣ×ＧＣ／ＭＳ検出代謝物シグナルのロジスティック回帰モデルを用いる多変量分析を、４つのＣＶ群に適用して、得られたモデルを用いて、５番目のＣＶ群の分類の構成要素を予測した。ロジスティック回帰手順の出力は、マーカーのランク付けされたセットである。誤分類のエラー率が最も低く、かつ予測力が最も高いモデルをもたらしたＮＭＲおよびＧＣのマーカーの最も好ましい組み合わせ確保されるとともに、全てのサンプルを用いる最終予測モデルを構築するために使用された。
【００６７】
図１Ａは、一実施形態にかかり、バイオマーカー選択、モデル開発およびバリデーションの方法１００を示すフローチャートである。全部で２５７例の血清サンプル（再発患者由来の１１６サンプル、ＮＥＤ患者由来の１４１サンプルが提供される）（１１０）。サンプルを、診断時点付近および診断後、ＮＥＤ（ｎ＝１４１）および再発サンプル（ｎ＝４９）からなるトレーニングセット（１１２）、ならびに再発診断前のサンプルからなるサンプルのテストセット（１１４）に分割した。サンプルのトレーニングセットを、患者の５交差検証群に分けた（１３０および１３２）。ロジスティック回帰を、５分割の交差検証を用いてバイオマーカー選択のために用いた。モデル構築は、リーブ・ワン・アウト・インターナル交差検証による、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）モデリングを用いた（１４０）。バリデーションは、診断前サンプル（１１４）に対してモデル（１５０）を提供すること、リーブ・ワン・ペイシェント・アウト交差検証を用いる予測を提供すること（１６０）、および予測スコアを得ること（１７０）によって行った。
【００６８】
図１Ｂは、バイオマーカー選択、モデル開発、およびバリデーションの別の実施形態を示すフローチャートである（２００）。全部で２５７例の血清サンプル（再発患者由来の１１６サンプル、ＮＥＤ患者由来の１４１サンプルが提供される）（１１０）。サンプルを、無作為にトレーニングセット（ｎ＝１４０、６６例の再発サンプルおよび７４例のＮＥＤサンプル）（２１２）、ならびにテストセット（ｎ＝１１７サンプル、５０例の再発サンプルおよび５０例のＮＥＤサンプル）（２１４）に分割した。変数選択は、ロジスティック回帰を用いて行い（２３０）、予測モデルは、ＮＭＲ研究で特定した７つのバイオマーカーおよびＧＣ研究で特定した４つのバイオマーカーに基づいて構築した（２４０）。バリデーションは、テストセット（２１４）に対してモデル（２５０）を提供すること、分類予測を提供すること（２６０）、および予測スコアを得ること（２７０）によって行った。
【００６９】
それらの能力に基づいて、１１の代謝物マーカー（ＮＭＲ由来の７つおよびＧＣ×ＧＣ−ＭＳ由来の４つ）を、モデル構築のために選択した。これらのマーカーについてのＮＭＲおよびＭＳデータを、ＰＬＳ−ＤＡモデリングのためのＰＬＳツールボックス（エイゲンベクトル・リサーチ社（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ）、バージョン４．０）をインストールしたＭａｔｌａｂソフトウェア（マスワークス社（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）、米国マサチューセッツ州所在）中にインポートした。リーブ・ワン・アウト交差検証を選択して、潜在的変数（ＬＶ）の数を、交差検証の平均二乗根誤差（ＲＭＳＥＣＶ）に応じて選択した。Ｒ統計パッケージ（バージョン２．８．０）を用いて、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。モデルの感度、特異性および受信者操作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を算出して比較した。
【００７０】
これらのマーカーの能力をまた、再発の臨床的診断の前後、サンプル収集の時点に基づいて評価した（再発後対ＮＥＤ、再発中対ＮＥＤ、および再発前対ＮＥＤ）。各々のサン
プルの分類の構成要素を、決定して、患者の状態と比較した。ＲＯＣ曲線を作成して、ＡＵＲＯＣ、感度、および特異性を算出した。モデル由来のスコアを、スケーリングして、０〜１００の範囲を得て、再発状況についてのカットオフ値を、感度と特異性との間の賢明な選択によって決定した。乳癌の初期ステージ、ＥＲ／ＰＲステータスおよび再発部位を参照したモデルの能力もまた評価した。
【００７１】
最終的に、ＮＭＲおよびＭＳ代謝物マーカーの能力もまた、サンプルを無作為に２つの部分、トレーニングセット（１４１サンプル）およびテストセット（１１６サンプル）に分けることによって試験し、図１Ｂに図示されるように分析した。２２のＮＭＲおよび１８のＧＣ×ＧＣ／ＭＳで検出した代謝物の多変量ロジスティック回帰を、トレーニングデータセットに適用して、変数選択を最適化した。１０分割交差検証を、この手順の間に用いた。導出されたモデルを、次いで、サンプルの「テストセット」に対して検証した。「テストセット」のサンプルは全て、変数選択およびモデル構築に用いたのとは異なる患者からのものであった。
【００７２】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルおよびＧＣ×ＧＣ／ＭＳスペクトルの分析
ＣＰＭＧ配列を用いて得られた乳癌血清サンプルのＮＭＲスペクトルは、高分子由来のシグナルを欠き、糖、アミノ酸およびカルボン酸を含む多数の低分子についてのシグナルを明らかに示した。再発後患者由来の代表的なＮＭＲスペクトルを、図２Ａに示す。個々の代謝物を、サンプル条件におけるわずかな相違から生じるわずかなシフトを考慮して、ＮＭＲデータベースを用いて特定した。本研究では、本発明者らは、乳癌の以前の研究においてＮＭＲによって検出された２２の代謝物に集中した。高感度のＭＳにより、各々のＧＣ×ＧＣ−ＭＳスペクトルは、ほぼ３００という代謝物についてのピークを示し、これはＮＩＳＴデータベースにおける公知の代謝物との類似性によって特定された。図２Ｂは、図２Ａに示されるのと同じ再発乳癌患者についての典型的なＧＣ×ＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。ＮＭＲによって検出される代謝物のパネルを増強するため、再発サンプルとＮＥＤサンプルとの間のピーク強度における相違に基づいてＧＣ×ＧＣ−ＭＳデータの分析において１８の追加の代謝物を標的した。ＧＣ×ＧＣ−ＭＳスペクトルにおける代謝物の特定は、実験の質量スペクトルと、ＮＩＳＴデータベースにおけるスペクトルとの比較に基づき、割り当てはさらに、真正の市販のサンプルのＧＣ×ＧＣ−ＭＳスペクトルと比較することによって確認した。グルタミン酸についてのこのバリデーション手順の例は、図３Ａ〜３Ｆに図示しており、このように特定された２２のＮＭＲおよび１８のＧＣ−ＭＳ代謝物のリストは、上の表２に含まれる。
【００７３】
バイオマーカーの選択およびバリデーション
最初のデータ分析は、２２のＮＭＲおよび１８のＭＳ代謝物の能力を試験すること、およびこれらのデータから最も高いランクを有するマーカーを選択して、診断の正確性を最大化することに集中した。変数選択プロトコールを利用し、およびロジスティック回帰分析から、１１個の代謝物（７つは、ＮＭＲで特定し、４つはＭＳによって特定）のサブセットを、それらの最も高いランク付けおよび予測正確性に基づいて選択して、バイオマーカーの試験パネルを形成した。下の表３は、１１個のバイオマーカーのリスト、およびそれらのＰ値を、再発前対ＮＥＤ、および再発中および再発後（＝「再発」）対ＮＥＤの比較について全てのサンプルを用いて示す。一般には、再発中および再発後（＝「再発」）対ＮＥＤ比較についてのこれらのマーカーの個々のＰ値は、極めて低いが、ロジスティック回帰によって高度にランク付けされたにもかかわらず４つの例外があった。これらの４例のうち２つでは、特定された代謝物は、再発中対ＮＥＤ、または再発後対ＮＥＤのいずれかについて（ただし両方ではない）低いＰ値を示した。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
その後の分析は、上記の表３に列挙された１１のＮＭＲ／ＭＳバイオマーカーに基づいた。乳癌の再発の分類における代謝物マーカーの能力を、個々におよび集合的に試験した。個々のバイオマーカーの箱髭図を、図４Ａ〜図４Ｋ、および図５Ａ〜図５Ｒに示す。
【００７６】
図４Ａ〜図４Ｋは、７つのＮＭＲおよび４つのＧＣ×ＧＣ／ＭＳマーカーに関し、全てのサンプルについて、再発後患者に加えて再発中患者（「再発」）対ＮＥＤ患者の間の識別を相対ピーク積分として表して図示する箱髭図を示す。箱の真ん中部分の水平線は、平均に相当するが、箱の底と頂部の境界は、それぞれ２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルに相当する。下側および上側のひげは、それぞれ最小値および最大値に相当するが、白抜き丸印は異常値である。ｙ軸は、方法のセクションで記載したとおり相対ピーク積分を示す。図４Ａは、ギ酸塩のＮＭＲデータに基づく。図４Ｂは、ヒスチジンのＮＭＲデータに基づく。図４Ｃは、プロリンのＮＭＲデータに基づく。図４Ｄは、コリンのＮＭＲデータに基づく。図４Ｅは、チロシンのＮＭＲデータに基づく。図４Ｆは、３−ヒドロキシ酪酸塩のＮＭＲデータに基づく。図４Ｇは、乳酸塩のＮＭＲデータに基づく。図４Ｈは、グルタミン酸塩のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図４Ｉは、Ｎ−アセチル−グリシンのＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図４Ｊは、３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図４Ｋは、ノナン二酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。
【００７７】
図５Ａ〜図５Ｒは、追加のマーカーについて、全てのサンプルについて、再発後患者に加えて再発中患者（「再発」）対ＮＥＤ患者の間の識別を相対ピーク積分として表して図示する箱髭図を示す。箱の真ん中部分の水平線は、平均に相当するが、箱の底と頂部の境界は、それぞれ２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルに相当する。下側および上側のひげは、それぞれ最小値および最大値に相当するが、白抜き丸印は異常値である。ｙ軸は、方法のセクションで記載したとおり相対ピーク積分を示す。図５Ａは、アルギニンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｂは、ドデカン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図５Ｃは、アラニンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｄは、アラニンのＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図５Ｅは、フェニルアラニンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｆは、フェニルアラニンのＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図５Ｇは、アスパラギン酸のＧＣ×ＧＣ／
ＭＳデータに基づく。図５Ｈは、グルタミン酸塩のＮＭＲデータに基づく。図５Ｉは、トレオニンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｊは、バリンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｋは、アセト酢酸塩のＮＭＲデータに基づく。図５Ｌは、リシンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｍは、クレアチニンのＮＭＲデータに基づく。図５Ｎは、イソ酪酸塩のＮＭＲデータに基づく。図５Ｏは、ヘキサデカン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図５Ｐは、９，１２−オクタデカジエン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図５Ｑは、ペンタデカン酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。図５Ｒは、酢酸のＧＣ×ＧＣ／ＭＳデータに基づく。
【００７８】
図６Ａは、再発後および再発中（＝「再発」）サンプル由来のデータ対ＮＥＤサンプル由来のデータを用いて、図１Ａに図示され、下に記載されるＰＬＳ−ＤＡモデルから作成したＲＯＣ曲線、ならびに同じサンプルに対するＣＡ２７．２９の能力を示す。図６Ｂは、２つのサンプル分類についての箱髭図を示し、これは、モデル予測スコアを用いることによってＮＥＤ患者由来のサンプルと再発サンプルとの識別を示している。再発後サンプルおよび再発中サンプル対ＮＥＤサンプルを用いるＰＬＳ−ＤＡ分析由来の予測モデルについてのＲＯＣ曲線は極めて良好で、０．８８というＡＵＲＯＣ、８６％の感度、および８４％という特異性を、選択されたカットオフ値で有する（図６Ａ）。再発乳癌とＮＥＤとの間のモデルの識別力のさらなる比較を、全ての再発後サンプルおよび再発中サンプル対ＮＥＤサンプルについてのモデルのスコアを用いて示した図６Ｂの箱髭図で示す。
【００７９】
図６Ｃは、図１Ｂに図示される第二の統計的アプローチに基づくテストサンプルセットを用いることによってＰＬＳ−ＤＡ予測モデルから作成したＲＯＣ曲線を示す。図６Ｄは、２つのサンプル分類についての箱髭図を示し、これは、テストセット由来の予測スコアを用いることによってＮＥＤ患者由来のサンプルと再発サンプルとの識別を示している。同じ１１個のバイオマーカーが、ノナン二酸（これは全体の１３番目にランク付けされた）を除いて、ロジスティック回帰によってトップにランク付けされた。しかし、これは、整合性および比較の目的のためにこの第二の分析における１１マーカーのモデルの一部として含まれた。図６Ｃに示されるとおり、サンプルのテストセットは、０．８４というＡＵＲＯＣを生じ、ここで感度は７８％で、特異性は８５％であった。このようにして得られたテストセットのＲＯＣプロットはまた、第一の統計的分析によって得られたものに匹敵した（図６Ａ）。さらに、再発乳癌およびＮＥＤの両方についての平均スコア（図６Ｄ）は、図６Ｂに示されるスコアと十分匹敵した。再発スコアとＮＥＤスコアとの間の相違は、トレーニングセット（Ｐ＝１．４０×１０−５）およびテストセット（Ｐ＝２．２５×１０−４）の両方について統計的に非常に高かった。この第二の統計分析の結果によって、サンプルのデータセットおよび本発明者らの統計的分析から導かれる代謝物プロファイルが完全に一貫しているという証拠が得られる。
【００８０】
代謝物プロファイリングの結果と同じサンプルについて得られたＣＡ２７．２９データとの比較を下の表４に示しており、これによって、インビトロの診断（「ＩＶＤ」）試験で現在利用可能なＣＡ２７．２９を超える本発明の好ましい実施形態によって提供される感度の大きい改善が示される。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
引き続き、乳癌再発の早期検出のためのモデルの予測力を評価した。再発性乳癌患者由来の全てのサンプルを、各々の患者について診断の時点（ｔ＝０）に関してグループ化した。互いに５カ月内のサンプルをグループとし、月の平均値を各々のグループ（群）に割り当てた。月数および印は、臨床診断の前（すなわち、負の時間）または後（正の時間）でサンプルを収集した時間の平均に相当する。再発が正確に診断された患者の割合を、モデルを用いて算出した。図７Ａには、血液サンプル収集時間の関数として患者の割合のプロットが示される。比較のため、サンプル収集の時点で得られた、従来の癌抗原マーカーＣＡ２７．２９についての結果もまた図７Ａに示す。ここでは、３７．７Ｕ／ｍＬというＣＡ２７．２９についての推奨されるカットオフ値を、同じセットのサンプルについて、臨床感度および臨床特異性の算出のために用いた。図に示されるとおり、ＢＣＲバイオマーカープロファイル１およびＣＡ２７．２９の両方について、正確に診断された患者数は、後の時点では増大する。しかし、臨床診断の時点では、ＢＣＲバイオマーカープロファイル１に基づく本発明者らのモデルは、再発性患者の７５％を検出したが、ＣＡ２７．２９のマーカーでは、わずか１６％しか検出しない。さらに、再発患者のうち５５％が、臨床的に診断される約１３カ月前に、ＢＣＲバイオマーカープロファイル１を用いて特定された。これに対し、ＣＡ２７．２９で特定されたのは約５％であった。ＮＥＤ患者についての結果の同様の比較では、サンプル収集の期間にわたって患者のほぼ９０％が真の陰性であると正確に診断されたことが示されるとともに、代謝物プロファイリングモデルの能力は、ＣＡ２７．２９の能力に匹敵したことが示される（図６）。しかし、時間とともに特異性はある程度低下した
閾値を５４まで増大させることにより、特異性は約９４％まで増大すると同時に、感度は６８％に低下した。９８％特異性についての閾値は６５であって、９４％についての閾値は４１であった。図７Ａは、カットオフ閾値４８を用い、１１マーカーモデル（黒塗り四角）を用いて正確に特定された再発患者の割合を、ＣＡ２７．２９試験（黒塗り三角）を用いて正確に特定された再発患者の割合と比較して、全ての再発患者についての時間の関数として示す。図７Ｂは、カットオフ閾値４８を用い、１１マーカーモデル（黒塗り四角）を用いて正確に特定されたＮＥＤ患者の割合を、ＣＡ２７．２９試験（黒塗り三角）を用いて正確に特定されたＮＥＤ患者の割合と比較して、時間の関数として示す。図７Ｃは、カットオフ閾値５４を用い、１１マーカーモデル（黒塗り四角）を用いて正確に特定された再発患者の割合を、ＣＡ２７．２９試験（黒塗り三角）を用いて正確に特定された再発患者の割合と比較して、全ての再発患者についての時間の関数として示す。図７Ｄは、カットオフ閾値５４を用い、１１マーカーモデル（黒塗り四角）を用いて正確に特定されたＮＥＤ患者の割合を、ＣＡ２７．２９試験（黒塗り三角）を用いて正確に特定されたＮＥＤ患者の割合と比較して、時間の関数として示す。
【００８３】
別にまた、最初の診断での癌のステージ、再発の種類、エストロゲン（ＥＲ、図８Ａ）およびプロゲステロン（ＰＲ、図８Ｂ）の受容体ステータスに基づき、再発乳癌患者につ
いてこのモデルを試験した。図８Ａおよび図８Ｂは、同じ１１のバイオマーカーモデルおよびカットオフ閾値４８を用いて、再発と正確に特定された再発患者の割合を、患者のエストロゲン受容体（ＥＲ）ステータス（図８Ａ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）ステータス（図８Ｂ）に基づき時間の関数として示す。図８Ａでは、ＥＲマイナスのステータスを黒塗りの三角によって示し、ＥＲプラスのステータスを黒塗りの四角によって示す。図８Ｂでは、ＰＲマイナスのステータスを黒塗りの三角によって示し、ＰＲプラスのステータスを黒塗りの四角です。特に、この結果は、ＥＲ陽性患者とＥＲ陰性患者との間、ＰＲ陽性患者とＰＲ陰性患者との間における著しい相違を示す。一方で、ＥＲ陽性患者およびＰＲ陽性患者についてのモデルは、全てのサンプルが一緒に試験された場合、ＥＲ陰性患者およびＰＲ陰性患者の４０％近くが臨床的な診断の早くも２８カ月に検出されたことに匹敵した。しかし、その後において検出されたＥＲ陰性およびＰＲ陰性患者の割合は、ＥＲおよびＰＲ陽性の患者と比較して１０％〜２０％低かった。
【００８４】
予測モデルに基づく追加の分析は、トレーニングサンプルセットを用いた変数選択に由来し（図１Ｂ）、独立したサンプルセット（テストセット）由来のサンプルの分類の構成要素の予測もまた良好な能力をもたらした。図９Ａ〜図９Ｄは、図１Ｂで図示される統計的なアプローチを用いるトレーニングセット（図９Ａ）およびテストセット（図９Ｂ）を用いた予測モデルから作成したＲＯＣ曲線を示す。２つのサンプル分類についての箱髭図は、トレーニングセット（図９Ｃ）およびテストセット（図９Ｄ）に由来する予測スコアを用いて、ＮＥＤサンプルと再発サンプルとの間の識別を示している。
【００８５】
図９Ｂに示されるとおり、サンプルのテストセットでは、０．８４というＡＵＲＯＣを生じ、感度は７８％で、特異性は８５％であった。テストセットのＲＯＣプロットは、トレーニングセットのプロットに匹敵した（図９Ａ）。再発乳癌およびＮＥＤの両方についての平均スコアでさえ、トレーニングセット由来のスコアに十分匹敵した（図９Ｃおよび９Ｄ）。
【００８６】
図１０は、再発した乳癌患者と無病生存の患者との間の有意な統計的相違を示した代謝物についての変化した代謝経路のまとめである。実線で囲って示された代謝物は、再発患者では下方制御されたが、破線で囲って示された代謝物は、上方制御された。代謝物プロファイルで用いられる１１の代謝物に加えて、表２由来の多数の他の関連の代謝物を図１０に示す。
【００８７】
本研究は、乳癌再発の早期検出のための代謝学に基づく方法の実施形態を図示する。本検討は、分析的技術、ＮＭＲおよびＭＳの組み合わせ、ならびに乳癌の再発に対して感受性である代謝物の群を特定するための進歩した統計学を利用する。本発明者らは、有意に改善された感度および特異性でもって、無病生存から再発を識別する新規な方法を示した。この予測モデルを用いて、患者の６０％近くにおける再発が、従来の方法に基づいて再発が診断されるより１０〜１８カ月ほど早く検出された。
【００８８】
代謝物レベルにおける変動は、最初の分析で用いた全ての４０の代謝物について検出されたが（表２、上記）、最も高いランク付けおよび異なるカットオフレベルに基づいて選択された少数の代謝物を含むいくつかの群は改善されたモデルを提供した。特に、１１の代謝物のパネル（ＮＭＲ由来の７つおよびＧＣ由来の４つ；表３、上記）は、ＮＥＤから再発を識別することに大きく貢献した。さらに、これらの１１の代謝物由来の予測モデルは、単一の分析方法、すなわちＮＭＲまたはＭＳ由来の個々の代謝物、または代謝物の群を用いて誘導されたモデルに比べた場合、感度および特異性の両方に関して有意に優れていた。再発の早期検出に関して（図７Ａ〜図７Ｄ）、１１の代謝物のパネルに基づくモデルは、腫瘍マーカーＣＡ２７．２９を含む、患者に用いられた診断方法を上回って機能し、単一のマーカーに基づく現在利用可能な試験と比較して再発のための早期の検出および
処置の選択肢について有意な改善をもたらし得る。
【００８９】
代謝物がさらに少ないパネルでの他のモデルを評価すれば、これらの実施形態も、有用な結果をもたらし得るであろうことが示される。代謝物である、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、３−ヒドロキシ−２−メチル−ブタン酸、Ｎ−アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる８つのバイオマーカーパネル（ＮＭＲによって検出される４つの代謝物、およびＧＣ×ＧＣ−ＭＳによって検出される４つの代謝物）のＡＵＲＯＣは、０．８６であったが、代謝物である３−ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、およびチロシンからなる７つのバイオマーカーパネル（ＮＭＲ単独によって検出される７つの代謝物を用いる）は、０．８０というＡＵＲＯＣを有した。これらの結果によって、乳癌の再発を検出するために有用なパネル内の個々のバイオマーカーは、表２の他の化合物によって欠失または置換される場合があり、乳癌の再発を検出するための有用性はやはり保持していることが示される。
【００９０】
１１個の選択されたバイオマーカーのパネルの実施形態は、アミノ酸代謝（ヒスチジン、プロリン、チロシンおよびトレオニン）、リン脂質代謝（コリン）および脂肪酸代謝（ノナン二酸）を含む、乳癌に関連する７つの経路の代謝活性の鋭敏な変化を示す。腫瘍形成の代謝物の局面の多数の検討によって、これらの代謝物の大多数と乳癌との関連が示された。図４に示されるとおり、乳癌の再発は、ギ酸塩（図４Ａ），ヒスチジン（図４Ｂ）、プロリン（図４Ｃ）、コリン（図４Ｄ）ノナン二酸（図４Ｋ）、Ｎ−アセチル−グリシン（図４Ｉ）および３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸（図４Ｊ）を含む多数の代謝物についての平均濃度の低下と関連し、実施例において上で開示されたとおり、それらの低下によって示されるが、一方でチロシン（図４Ｅ）および乳酸塩（図４Ｆ）の平均濃度は増大する。同様に、表２および図５は、以下のアミノ酸代謝の経路における代謝物について乳癌再発と関連した変化を示す。すなわち、アラニン（図５Ｃ、図５Ｄ）、アルギニン（図５Ａ）、クレアチニン（図５Ｍ）、リシン（図５Ｌ）、トレオニン（図５Ｉ）、フェニルアラニン（図５Ｅおよび図５Ｆ）、およびバリン（図５Ｊ）である。
【００９１】
本開示の原理を組み込んでいる例示的な実施形態を上記に開示してきたが、本開示は、開示された実施形態に限定されるものではない。代わりに、本出願は、その一般的原理を用いる開示の任意の変形、用途または適合を包含するものとする。さらに、本出願は、本開示が関連し、添付の特許請求の制限内におさまる、当該分野で公知であるかまたは慣行内の実務である場合、本開示からのこのような逸脱を包含するものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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