(57)【要約】  本発明は、不活化水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、並びに前記不活化ＶＺＶを含む組成物及びワクチンを提供し、ここでＶＺＶの感染力は検出限界以下であり並びに不活化ＶＺＶは患者に投与された時にＶＺＶに対し免疫応答を誘導する。本明細書記載の組成物の実施態様において、ＶＺＶはガンマ線照射により不活化される。また本発明は不活化ＶＺＶワクチンの調製方法も提供し、前記方法は約５ｋＧｙから約５０ｋＧｙのガンマ線照射を使用してＶＺＶを含む試料をガンマ線照射することを含む。また本明細書の発明によって、ＨＺ又はＶＺＶの再活性化に関連する他の疾病の治療若しくは免疫化の方法も提供され、前記方法は治療上有効量の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチン又は医薬組成物を患者に投与することを含み、ここでＶＺＶはガンマ線照射によって不活化される。【選択図】図１
2013535488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化された水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）であって、前記ＶＺＶの感染性が検出限界以下であり並びに前記不活化ＶＺＶが患者に投与されたときにＶＺＶに対する免疫応答を誘発する前記ウイルス。
【請求項２】
治療上有効量の請求項１記載のＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
不活化ＶＺＶの感染性が０．０４０プラーク形成単位（ＰＦＵ‘ｓ）／ｍＬ以下である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
不活化ＶＺＶの感染性が０．０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ‘ｓ）／ｍＬ以下である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
不活化ＶＺＶの感染性が０．００２プラーク形成単位（ＰＦＵ‘ｓ）／ｍＬ以下である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＶＺＶ株が岡株又は岡株の派生株である任意の請求項２〜５記載の医薬組成物。
【請求項７】
組成物が凍結乾燥されている請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＶＺＶがガンマ線照射によって不活化されている請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物によって誘発される免疫応答が同量の不活化されていないＶＺＶを含む対照試料によって誘発される免疫応答と著しく異ならない請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
不活化ＶＺＶによって誘発される免疫応答が対照試料によって誘発される免疫応答と２５％以下だけ異なる請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＶＺＶの感染性が水痘帯状疱疹プラークアッセイによって定量される請求項２〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
約５から５０ｋＧｙのガンマ線を使用してＶＺＶを含む試料にガンマ線照射することを含む、不活化水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を調製する方法。
【請求項１３】
ガンマ線が試料を６０Ｃｏ線に暴露することによってガンマ線を試料に供給する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＶＺＶが岡株又は岡株の派生株である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
試料が照射される前に凍結乾燥される請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
使用されるガンマ線照射線量が約２５ｋＧｙ以下である請求項１４又は請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ワクチンが液体バルク製剤であり、使用されるガンマ線照射量が約５ｋＧｙから１２．５ｋＧｙである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
使用されるガンマ線照射量が約１０ｋＧｙから約２５ｋＧｙである請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法によって産生される又は得られる不活化ＶＺＶ。
【請求項２０】
治療上有効量の請求項１９記載の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
【請求項２１】
対象における帯状疱疹の治療のための方法であって、前記方法が、治療上有効量の不活化水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで前記ＶＺＶがガンマ線照射により不活化されている前記方法。
【請求項２２】
医薬組成物の投与経路が皮下又は筋肉内である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
対象が５０歳以上である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
対象が免疫不全状態である請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
対象が、血液系腫瘍罹患、免疫抑制療法受容、同種造血幹細胞被移植、臓器被移植、ＨＩＶ感染、及び自己免疫疾患罹患から成る群から選択される少なくとも１容態を有する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
当該方法が、予め決められた時間を終過させて、１又は複数用量の当該医薬組成物を対象に投与することをさらに含む請求項２２又は２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は帯状疱疹の予防及び治療のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は不活化水痘帯状疱疹ウイルスワクチン（ＶＺＶ）を含むワクチン組成物及び前記組成物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）による一次感染は通常、子供及び青少年において水痘を引き起こす。水痘の臨床症状は一般的に医療行為を施さなくても短期間で解決するが、ＶＺＶは感染後多年にわたって感覚神経に潜伏することができる。潜伏ＶＺＶの再活性化及び複製は、しばしば数十年後に、一般的には単一の皮膚分節に限定される有痛性の発疹であるｓｈｉｎｇｌｅｓ（帯状疱疹）として知られている帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ（ＨＺ））と結果としてなり得る。当該ＶＺＶ再活性化は、高齢者又は免疫不全者に発生する細胞媒介性免疫の低下と関連する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （２００９）  ２００：  １０６８−７７）。何人かの患者においては、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）と呼ばれる合併症であるＨＺに伴う疼痛は、ＨＺ発疹が治癒した後数カ月又は数カ年さえも持続する可能性がある。
【０００３】
弱毒化生ワクチン（ＺＯＳＴＡＶＡＸ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）が、高齢患者における帯状疱疹の予防に現在利用可能である（米国特許第６，２１４，３５４号及び第５，９９７，８８０号）。本ワクチンは免疫適格性患者個体群におけるＨＺの有害な影響を顕著に減少させた（Ｏｘｍａｎ，ＭＮ，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．（２０１０）５１（２）：１９７−２１３；Ｓａｎｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｄｒｕｇｓ  Ａｇｉｎｇ（２０１０）２７（２）：１５９−７６；Ｏｘｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００５）３５２：２２７１−８３）。しかしながら、弱毒化生ワクチンは免疫不全患者には適していないかもしれない。
【０００４】
血液系腫瘍罹患患者、免疫抑制療法を受けている患者、同種造血幹細胞移植（ＨＣＴ）又は臓器移植（ＳＯＴ）を受けた患者、ＨＩＶ感染患者、及び自己免疫疾患患者を含む免疫不全個体は、一般の個体群と比較してＨＺの発生率がより高い。さらにこれらの患者個体群は、重篤で生命を危うくする合併症（Ｇｏｕｒｉｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｍ  Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ４：１０８−１１５，Ｒａｇｏｚｚｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）６１：３１０−３１６、Ｗｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  １１８：１４１６．ｅ９−１４１６．ｅ１８，Ｄｗｏｒｋｉｎ  ＆  Ｓｃｈｍａｄｅｒ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３６：８７７−８８２，Ｇｅｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ａｃｑｕｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ  Ｓｙｎｄｒ  ４０：１６９−１７４，Ｍａｔｔｉｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：９７６−９８０，Ｄｗｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６０：１２７４−１２８３））、例えば髄膜脳炎（Ｔａｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２６：７９５−７９６）、横断性脊髄炎、視力障害（Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２３：１３１７−１３２０）、間質性肺炎（Ｗａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ４：１９１−１９４）、肝炎（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５：８０５−８０７；Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ７：４８９−４９１）、細菌重複感染、皮膚瘢痕及び傷跡（Ｓｃｈｕｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｂｌｏｏｄ  ７４：１４２４−１４２７）等の発症に関して非常に危険な状態にある。免疫不全個体におけるＨＺに関連する罹患率及び死亡率の危険性が高いにも関わらず、この個体群はＨＺに対するＺＯＳＴＡＶＡＸ（登録商標）等の弱毒化生ワクチンによる接種に適していない。従ってＨＺを予防する又はＨＺ若しくは伴う合併症の重症度若しくは持続期間を減少するために、免疫不全患者個体群において安全で効果的であろうワクチンに対する重要な必要性が存在する。
【０００５】
免疫不全患者に関する安全性の懸念が、ウイルス病原体に対する非複製ワクチン、例えばサブユニットワクチン、ウイルス様粒子ワクチン及び不活化ホールワクチン等の使用の調査へと研究者を導いた。多数の認可された不活化ワクチンは、Ａ型肝炎予防ワクチン、ポリオワクチン、及び日本脳炎ワクチンを含み、ホルマリンを使用して不活化されたウイルスを含んでいる。ＨＺに対しては、免疫不全対象にとってより安全なワクチンは、ＶＺＶの熱不活化によって又はサブユニットワクチンの使用によって開発されるだろうと示唆されていた（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｉ．，（２００８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  １９７（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ２３７−Ｓ２４１）。Ｒｅｄｍａｎら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅｅａｓｅｓ（１９９７）  １７６：５７８−８５）は、５０℃での加熱によって不活化され、感染性ウイルス含量が１．２ｐｆｕ／０．５ｍＬ以下となった不活化ＶＺＶワクチンを記載している。このレベルの非感染性は、免疫不全患者に投与するための製品にとって好ましくないであろう。また米国特許第６，２１４，３５４号及び第５，９９７，８８０号も不活化ＶＺＶワクチン使用の可能性に言及し、当該製品の実施例および熱処理ワクチンの試験を開示している。
【０００６】
免疫不全患者において安全で効果的な、すなわち残存感染性はないが非不活化試料の免疫原性と抗原性を保持しているＶＺＶ試料を結果として生じるような、ＶＺＶを不活化する方法が開発されれば医学的に重要な必要性を満たすことだろう。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書において、ＶＺＶ試料がガンマ線照射により不活化されることが可能で、その結果試料中のＶＺＶの感染性が検出限界以下のレベルとなることを示した。しかしながら、本明細書記載の方法による不活化に関しては、不活化されなかったＶＺＶ試料と比較して免疫原性及び／又は抗原性における著しい低下並びにＶＺＶの著しい構造変化が認められない。
【０００８】
１態様において本発明は、不活化水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を提供し、ここでＶＺＶの感染性は検出限界以下であり並びに不活化ＶＺＶは患者に投与されたときにＶＺＶに対する免疫応答を誘導する。また治療上有効量の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物／ワクチンも提供される。本発明の組成物は液体か凍結状態、例えば凍結乾燥のいずれかである。本明細書記載の組成物のいくつかの実施態様において、ＶＺＶはガンマ線照射により不活化される。
【０００９】
他の態様において本発明は、不活化ＶＺＶワクチンを調製する方法を提供し、当該方法は約５ｋＧｙから約５０ｋＧｙのガンマ線を使用してＶＺＶを含む試料をガンマ線照射することを含んでいる。好ましい実施態様において、ガンマ線源は６０Ｃｏであるが、当該技術分野において周知の他の同位体もこの点において有用でありえよう。本明細書に開示される調製方法のいくつかの実施態様において、試料は照射の前に凍結乾燥される。他の実施態様において、先に凍結乾燥されることなく、液体バルクがガンマ線に暴露される。
【００１０】
また本発明は、ＨＺ若しくはＶＺＶの再活性化に関連する他の疾病の治療又は免疫化の方法も提供し、当該方法は治療上有効量の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチン又は医薬組成物を対象に投与することを含んでおり、ここでＶＺＶはガンマ線照射によって不活化されている。本明細書記載の治療方法のいくつかの実施態様において、組成物／ワクチンの投与経路は皮下又は筋肉内である。本発明の本態様の具体的な実施態様において、患者は５０歳以上及び／又は免疫不全者である。
【００１１】
明細書を通して及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈にそうではないと明白に示されていない限り複数のものを含むものとする。
【００１２】
明細書を通して及び添付の請求項で使用される場合、以下の定義及び略語が適用される。
【００１３】
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、治療上の処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）すなわち病気を防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置（ｍｅａｓｕｒｅ）の双方をいう。治療を必要とする個体には、病気に罹り易い人々又は病気を予防しようとする人々と同様に既に病気に罹った人々が含まれる。本発明の不活化ＶＺＶによる患者の治療には、以下の１又は複数が含まれる。患者におけるＶＺＶに対する免疫応答を誘導／増強すること。水痘に感染した又はＶＺＶ生ワクチンを接種した患者におけるＶＺＶ再活性化の可能性を防止し、改善し、抑制し、又は減少させること。ＨＺ及び／又はＰＨＮ等のＶＺＶの再活性化に関連する他の疾病若しくは合併症の発症の可能性を防止し又は減少させること。ＨＺ及び／又はＰＨＮ等のＶＺＶの再活性化に関連する他の疾病若しくは合併症の重症度又は持続期間を減少させること。
【００１４】
用語「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、所期の効果を生むために十分なワクチン組成物を意味し、限定するものではないが当該効果には以下が含まれる。患者におけるＶＺＶに対する免疫応答を誘導／増強すること、水痘に感染した又はＶＺＶ生ワクチンの接種を受けた患者におけるＶＺＶの再活性化を防止し、改善し、抑制し、又は減少させること、ＨＺ及び／又はＰＨＮを予防すること、Ｚ及び／又はＰＨＮの重症度又は持続期間を減少させること。当業者であればこのレベルが変動しうることを認識している。
【００１５】
用語「免疫応答」とは、細胞媒介性（Ｔ細胞）免疫応答及び／又は抗体（Ｂ細胞）応答をいう。
【００１６】
用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、本明細書記載の不活化ＶＺＶワクチン、又は医薬組成物を受容する予定の、免疫適格性固体及び免疫不全個体の双方を含む任意のヒトをいう。本明細書に定義する場合、「患者」には、自然感染かワクチン接種のいずれかによって既にＶＺＶに感染した人々が含まれる。
【００１７】
用語「バルク（ｂｕｌｋ）」とは、１用量のワクチン以上を含む液体製剤又は液体組成物をいう。
【００１８】
用語「検出限界以下のレベル（ｕｎｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｌｅｖｅｌｓ）」とは、個々のワクチン製剤又は組成物の感染性に関して、製剤又は組成物が試料１ｍＬ当たり０．０５０以下の感染単位すなわちプラーク形成単位（「ＰＦＵ‘ｓ」）の感染性ＶＺＶウイルスを含むことを意味し、好ましくは０．０４０ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．０３０ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．０２０ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．０１５ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．０１０ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．００９ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、又は０．００８ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、より好ましくは０．００７ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．００６ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．００５ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．００４ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、０．００３ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、さらに好ましくは０．００２ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下、又は０．００１ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下の感染性ＶＺＶウイルスを含むことを意味する。個々の試料のＰＦＵ’ｓは、例えば実施例１に記載され、さらにＫｒａｈらにより記載された（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９０）  ２７：３１９−２６）アッセイ等の水痘帯状疱疹プラークアッセイ法を使用して定量することができる。また試料の感染性は、実施例１に記載の通り免疫染色法によって確認することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はγ線照射された凍結乾燥ＶＺＶの不活化動力学を示す（ｌｏｇ  ＰＦＵ／ｍｌ対放射線量、実施例４を参照）。ＶＺＶ入りのバイアルを６０Ｃｏ  Ｇａｍｍａｃｅｌｌ（登録商標）照射器を使用して異なるレベルの６０Ｃｏ線で照射した。照射線量（Ｇｙ）当たりの各バイアルの残存ＰＦＵ／ｍＬは、ＭＲＣ−５細胞の水痘帯状疱疹プラークアッセイを使用して定量した。計測したデータポイント（実際に計測したデータ）は黒色のひし形（「計測値」）として示し、アッセイによって測定された最大データは灰色のひし形（「数値以下（＜＝Ｖａｌｕｅ）」）によって示す。
【図２】図２はγ線照射されたＶＺＶバルクの不活化動力学を示す（照射時間に対するｌｏｇ  ｐｆｕ／ｍＬ力価、実施例４を参照）。ＶＺＶバルクを照射するために異なるレベルの６０Ｃｏ線を使用した。照射バルクの残存感染性は、ＭＲＣ−５細胞を使用して水痘帯状疱疹プラークアッセイ法で分析した。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（実施例５参照）によって測定した、異なる条件下でＶＺＶを不活化した後のＶＺＶ応答（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）を示す。データは６名のドナーのＰＢＭＣ試料（図Ａ〜Ｆ）に対する、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品及び２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品について示す。また上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料及び紫外線処理により不活化したＶＺＶの１ロット（ＶＺＶロット番号９６．０７）に対するＶＺＶ応答も示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（実施例５参照）によって測定した、異なる条件下でＶＺＶを不活化した後のＶＺＶ応答（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）を示す。データは６名のドナーのＰＢＭＣ試料（図Ａ〜Ｆ）に対する、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品及び２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品について示す。また上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料及び紫外線処理により不活化したＶＺＶの１ロット（ＶＺＶロット番号９６．０７）に対するＶＺＶ応答も示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（実施例５参照）によって測定した、異なる条件下でＶＺＶを不活化した後のＶＺＶ応答（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）を示す。データは６名のドナーのＰＢＭＣ試料（図Ａ〜Ｆ）に対する、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品及び２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品について示す。また上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料及び紫外線処理により不活化したＶＺＶの１ロット（ＶＺＶロット番号９６．０７）に対するＶＺＶ応答も示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（実施例５参照）によって測定した、異なる条件下でＶＺＶを不活化した後のＶＺＶ応答（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）を示す。データは６名のドナーのＰＢＭＣ試料（図Ａ〜Ｆ）に対する、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品及び２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品について示す。また上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料及び紫外線処理により不活化したＶＺＶの１ロット（ＶＺＶロット番号９６．０７）に対するＶＺＶ応答も示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（実施例５参照）によって測定した、異なる条件下でＶＺＶを不活化した後のＶＺＶ応答（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）を示す。データは６名のドナーのＰＢＭＣ試料（図Ａ〜Ｆ）に対する、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品及び２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品について示す。また上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料及び紫外線処理により不活化したＶＺＶの１ロット（ＶＺＶロット番号９６．０７）に対するＶＺＶ応答も示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｆは、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（実施例５参照）によって測定した、異なる条件下でＶＺＶを不活化した後のＶＺＶ応答（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）を示す。データは６名のドナーのＰＢＭＣ試料（図Ａ〜Ｆ）に対する、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品及び２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品について示す。また上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料及び紫外線処理により不活化したＶＺＶの１ロット（ＶＺＶロット番号９６．０７）に対するＶＺＶ応答も示す。
【図４】図４Ａ〜４ＣはクライオＥＭで評価したＶＺＶウイルス粒子の画像を示す（実施例６参照）。未処理（図４Ａ）、２５ｋＧｙで照射（図４Ｂ）及び５０ｋＧｙで照射（図４Ｃ）した凍結乾燥試料を示す。
【図５】図５は、種々の不活化法（実施例８参照）を使用して作製した一組の不活化ＶＺＶ調製品に対するＶＺＶ力価（ＩｇＧ応答）をＶＺＶのＥＬＩＳＡアッセイで評価したマウス免疫原性研究の結果を示す。幾何平均力価と共に各マウスに対する調整ＶＺＶ力価（ＶＺＶ力価マイナスＭＲＣ−５力価）を示す。また熱処理凍結乾燥群の２匹のマウスからの異常値と考えられた結果も示す。
【図６】図６は、実施例９記載の通り熱処理ＶＺＶワクチン（Ｎ＝６５）又はガンマ線照射ＶＺＶワクチン（Ｎ＝６３）のいずれかを受容したヒトワクチンのレシピエント間の時点ごとのＶＺＶのｇｐＥＬＩＳＡ抗体応答の統計解析を示す。
【図７】図７は、実施例１０記載の通りガンマ線照射ＶＺＶワクチンＢ（１６〜２５ｋＧｙ、Ｎ＝６４）又はガンマ線照射ワクチンＣ（２５〜５０ｋＧｙ、Ｎ＝６５）のいずれかを受容したヒトワクチンのレシピエント間の時点ごとのＶＺＶのｇｐＥＬＩＳＡ抗体応答の統計解析を示す。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
バルク又は凍結乾燥ＶＺＶ試料は、試料中のＶＺＶの感染性が検出限界以下のレベル（例えば、本明細書記載の不活化ＶＺＶ試料の感染性は０．００１ＰＦＵｓ／ｍＬ以下であった）となるようにガンマ線照射により不活化することができることが、本明細書に示されている。本明細書記載の方法によって産生された不活化ＶＺＶは、本発明の治療／免疫化の方法で使用するための医薬組成物又はワクチンを生産するために、薬学的に許容可能な担体と製剤化することが可能である。本明細書記載の方法による不活化に関する、不活化されなかったＶＺＶ試料と比較して、免疫原性及び／又は抗原性における著しい低下並びにＶＺＶの著しい構造変化は認められない。従って、本発明の医薬組成物を患者に投与するならば、本組成物によって誘発される免疫応答は、不活化されなかった同量のＶＺＶを含む対照試料によって誘発される免疫応答と著しく異ならない。本明細書で使用する場合、非不活化対照試料と「著しく異ならない」不活化試料によって誘発された免疫応答は、約５０％以下、より好ましくは約４０％以下、約３０％以下、さらに好ましくは約２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は５％以下だけ対照試料と異なっている。
【００２１】
不活化試料及び対照試料によって誘発される免疫応答は、適切な動物モデル又はヒト個体群における臨床試験において、例えば以下のパラメータの１又は複数を測定することによって求めることができよう。（１）ＶＺＶ特異的応答細胞数（Ｃａｌａｎｄｒａら、ＷＯ  ９４／００２５９６に記載）、（２）抗ＶＺＶ細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、又はＶＺＶ特異的ＣＤ８＋細胞、（３）抗ＶＺＶヘルパーＴ細胞、又はＶＺＶ特異的ＣＤ４＋細胞、（４）抗ＶＺＶ特的抗体レベル、又は（５）インターフェロン、又はインターロイキン等のリンホカインレベル。
【００２２】
免疫応答の測定に有用な技術は当該技術分野で周知であり、限定されるものではないが、Ｔ細胞応答アッセイ、力価試験、ＶＺＶのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイを含んでいる。
【００２３】
本発明の及び本明細書記載の方法によって作製されたワクチン／医薬組成物によって誘発された免疫応答の充足性並びに不活化ワクチンの効力を定量するためには、ヒトボランティア／対象の臨床試験における臨床成績を評価することが、例えば、ＨＺの持続期間又は重症度の減少、及び／又は個体におけるＰＨＮ持続期間の帯状疱疹発症後一月未満の期間までの減少、統計的レベルでの患者個体群における帯状疱疹の発症率の一般個体群に見出される発症率又は同様に危険な状態にある個体若しくは免疫不全個体の発生率の低下、を評価することが有用でありえよう。
【００２４】
上記の通り本発明は、同時に非不活化ＶＺＶと同様の抗原性及び免疫原性をなお保持しながら、ＶＺＶ調製品が検出限界以下のレベルに不活化され得ることを示している。それ故に本発明の一態様は、ＶＺＶの感染性が検出限界以下であり並びに不活化ＶＺＶが患者に投与されたときにＶＺＶに対し免疫応答を誘導するような不活化ＶＺＶを提供する。
【００２５】
当業者であれば、治療上有効量のＶＺＶとして使用するための適切な量のＶＺＶ抗原を容易に決めることができる。当該量は使用目的、又は具体的な患者個体群等の他の要因によって変動するであろう。本明細書記載の方法及び組成物のいくつかの実施態様において、ＶＺＶの量は約１から約１０ＶＺＶ抗原単位／用量である。ここで１ＶＺＶ抗原単位はおよそ１μｇのＶＺＶ精製タンパク質と等価である。特定の実施態様において、組成物中のＶＺＶ抗原量は、約２と約８ＶＺＶ抗原単位／用量の間又は約３と約６ＶＺＶ抗原単位／用量の間である。抗原量は、適切な抗原アッセイ法、例えば本明細書の実施例２記載の競合ＥＬＩＳＡ法により定量することができる。当業者であれば試料中の抗原量を測定するために他の適切なアッセイ法を決めることができる。
【００２６】
また本明細書では、治療上有効量の上記の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の組成物に有用な薬学的に許容可能な担体には、使用される投薬量と濃度において患者に無毒である任意の適合性のある薬剤、例えば水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール、緩衝液、等、及びその混合物が含まれる。また担体には、追加の成分、例えば安定剤、可溶化剤、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、又はＣａＣｌ２等の浸透圧調整剤、界面活性剤、及びその混合物が含まれてもよい。
【００２７】
また本発明は、１用量を超える不活化ＶＺＶ、組成物を含むバイアルへの注射器挿入の際の偶発性の微生物汚染を防止する抗菌性保存料、及び薬学的に許容可能な担体を含有する多用量組成物も提供する。当該多用量組成物は、一人の患者に対し予定の時間が過ぎた後１回よりも多く又は一人より多い患者に提供することができる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施態様において、組成物は１用量より多い不活化ＶＺＶを含有する液体バルクである。他の実施態様において、組成物は凍結乾燥品されている。凍結乾燥法は当該技術分野で周知である。また本発明によって、注射用滅菌水又は注射用静菌水等の適切な希釈剤により元に戻される凍結乾燥製剤ももたらされる。
【００２９】
ガンマ線照射は通常、医療用途へ使用する装置や設備を滅菌するために使用される。またそれは、任意の生物学的製剤、例えば血液製剤及び抗体製剤中の任意の潜在病原体を滅菌するためにも使用される。これらの使用に対して、微生物はその機能を保持するような顧慮はされずに不活化される。ガンマ線照射によるウイルス不活化を記載する文献源は限られている。
【００３０】
Ｒｏｓｅｎら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．  ５２：７９５−８０４（１９８７））は、６０Ｃｏ線処理後の単純疱疹ウイルスのインタクトなウイルス粒子のプラーク形成能の生残性及び精製ゲノムのＤＮＡ分子に対する損傷を評価した。当該研究は、照射後のウイルスの抗原性又は免疫原性を評価しなかった。Ｅｌｌｉｏｔｔら（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．  １６：  ７０４−７０８  （１９８２））による他の研究は、６０Ｃｏ線を使用してラッサ、マールブルグ、及びエボラウイルスの不活化を評価した。不活化の線形動力学がラッサ、マールブルグ、及びエボラウイルスについて観察され、ウイルスの不活化が６０Ｃｏ線を使用したガンマ線照射によって達成された。Ｅｌｌｉｏｔｔらは、液体状態よりも凍結状態のウイルスの不活化のためにより大量の放射線量が要求されることを観察した。Ｒｏｓｅｎらと同様、この研究もガンマ線照射後のウイルスの抗原性又は免疫原性を検討し損なった。Ａｌｓｈａｒｉｆｉら（ＷＯ  ２０１０／０１２０４５）は、ワクチンとしての使用のために、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルスを不活化するためのガンマ線照射の使用を記載している。
【００３１】
本明細書記載の本発明においてガンマ線照射が、同時に非不活化対照の抗原性、免疫原性及び構造特性を保持しながら、ＶＺＶウイルス調製品の感染性を検出限界以下のレベルに減少させることができることが示されている。従って本発明
の好ましい実施態様においてＶＺＶは、６０Ｃｏ、１３７Ｃｅｓｉｕｍ（セシウム１３７）、９９Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ（テクネチウム９９）又は９９ｍＴＣ（テクネチウム９９ｍ）等の適切な同位体への暴露によってＶＺＶへ搬送され得るガンマ線照射によって不活化される。より好ましい実施態様において、ガンマ線は６０Ｃｏ線への暴露によってＶＺＶに搬送される。
【００３２】
ＶＺＶを不活化するために有用なガンマ線照射量は、約５から約５０キログレイ（ｋＧｙ）のガンマ線照射である。１グレイ（Ｇｙ）は吸収線量の基本単位であり、１グレイは１ジュール／キログラム（１００ラド）の吸収線量に等しい。当業者であれば、試料に暴露される放射線量及び所要時間は、照射の所期の吸収線量（線量＝フルエンスｘ時間）に達するように変動されるべきことを理解するであろう。また当業者であれば、試料の一部、例えば放射線源に最も近い部分を過剰暴露することなく適切な照射線量が試料全体に搬送されるように、試料が格納されている容器のサイズに応じて試料が暴露される照射線量を変動することができるであろう。
【００３３】
本明細書記載の本発明の方法及び組成物のいくつかの実施態様において、ＶＺＶを不活化するために使用されるガンマ線照射量は約２５ｋＧｙ以下である。他の実施態様において、ガンマ線照射量は、約５ｋＧｙないし約４０ｋＧｙ、約５ｋＧｙないし約３５ｋＧｙ、約５ｋＧｙないし約３０ｋＧｙ、約５ｋＧｙないし約２５ｋＧｙ、約５ｋＧｙないし約２０ｋＧｙ、約５ｋＧｙないし約１０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙないし約５０ｋＧｙ、１０ｋＧｙないし約４０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙないし約３５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙないし約３０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙないし約２５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙないし約２０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙないし約５０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙないし約４０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙないし約３５ｋＧｙ、約１５ｋＧｙないし約３０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙないし約２５ｋＧｙ、約１５ｋＧｙないし約２０ｋＧｙの範囲である。
【００３４】
また本発明は、上記の医薬組成物及び前記組成物の生産方法も提供し、ここで当該組成物は液体バルクであり、ＶＺＶを不活化するために使用するガンマ線照射量は約５ｋＧｙから約１０ｋＧｙ又は約５ｋＧｙから約１２．５ｋＧｙである。他の特定の実施態様において、組成物はガンマ線照射の前に凍結乾燥されるが、当該実施態様において、ガンマ線照射量は約５ｋＧｙから約２５ｋＧｙ又は約１５ｋＧｙから約２５ｋＧｙである。
【００３５】
ガンマ線により不活化されたＶＺＶについて不活化の線形動力学が観察されたことを本明細書で示しているが、そのことは不活化のモデル化、すなわち不活化ＶＺＶを含む試料中の残存感染性レベルの確実な推定を可能にする上で、非常に有用である。当該不活化の動力学は熱処理不活化ＶＺＶについては観察されなかった。Ｇｒｉｅｂら（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（２００２）  ３０：２０７−２１６及びＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００５）  ２６：２０３３−２０４２）は、ガンマ線照射によるウイルスの不活化について２の特異的機構を記載したが、それはＶＺＶについて観察された不活化の線形動力学を支持する。第一の機構は「標的中への光子蒸着エネルギーの直接の結果」である。この直接のエネルギー移動は「分子からの外殻電子の転位及び共有結合の切断」という結果になる。第二の「間接的な」機構は、典型的には放射線照射の水分子及び酸素との相互作用によって生成されたフリーラジカル及び活性酸素種への化学攻撃の結果である。本明細書記載の組成物及び方法の特定の実施態様において、ＶＺＶはガンマ線照射による不活化の前に凍結乾燥される。従って、水が凍結乾燥行程で除去されるので水分子との相互作用は起こりそうもない。
【００３６】
Ｒｅｄｍａｎら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９７）  １７６：５７８−８５）は、５０℃への加熱によって不活化され、感染性ウイルス含量が１．２ｐｆｕ／０．５ｍＬ以下となった不活化ＶＺＶワクチンを記載している。Ｒｅｄｍａｎ及び共同研究者によって記載された熱処理ワクチンは、自家骨髄移植又は抹消血幹細胞注入又は他の骨髄移植を受ける予定の患者２４名間のＶＺＶ再活性化に関連する疾患の重症度を減少させることを示した。このレベルの感染性は免疫不全である患者の全てにとって適当でない。さらに熱処理を使用するＶＺＶの不活化方法は、低レベルの感染性を達成するために長時間を要し、非効率的であり対費用効果が良くない。
【００３７】
その為本発明は、不活化ＶＺＶ及び前記不活化ＶＺＶを含む医薬組成物／ワクチンを提供し、ここで当該ＶＺＶの感染性は検出限界以下のレベル、すなわち０．０５０ＰＦＵ‘ｓ／ｍＬ以下であり、前記不活化ＶＺＶ組成物は、ＨＺ若しくはＶＺＶ再活性化に関連する疾病の治療及び／又は予防のために以前に開示されたワクチンよりもより安全であり、より効率的な製造工程に適している。本発明の不活化ＶＺＶは、不活性化後も非不活化ＶＺＶ対照の構造物理的特性、免疫原性及び抗原性を保持する。いくつかの実施態様において感染性は、０．０４０ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、０．０３０ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、又は０．０２０ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下である。また本発明は、感染単位数が０．０１５ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、０．０１０ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、０．００９ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、又は０．００８ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下である実施態様も提供する。他の実施態様においてＶＺＶの感染性は、０．００７ＰＦＵｓ／ｍＬ以下、０．００６ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、０．００５ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下、０．００４ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下又は０．００３ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下である。さらに他の実施態様において感染性は、０．００２ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下又は０．００１ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ以下である。
【００３８】
本明細書で提供する組成物及び方法のいくつかの実施態様において、試料の感染性（ＰＦＵ）は、実施例１に記載されＫｒａｈら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９０）  ２７：３１９−２６）にさらに記載されたアッセイ等の水痘帯状疱疹プラークアッセイ法を使用して定量される。当業者であれば、また他の方法もＶＺＶ試料又は組成物の感染性を定量するために有用であり水痘帯状疱疹プラークアッセイ法に代えて使用されることを理解するだろう。
本明細書記載の組成物及び方法には、野生型の水痘帯状疱疹ウイルス株、又は米国特許第３，９８５，６１５号に記載され、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手することができる（寄託番号ＶＲ−７９５ＴＭ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）岡株等の弱毒化ウイルス株を含む任意のＶＺＶ株を使用することができる。岡株は元は水痘に自然感染した健康な少年から得られ、ヒト肺細胞の胚細胞で継代培養された。それはモルモットの胚細胞の細胞培養液及びヒト二倍体胚線維芽細胞の細胞培養液（例えば、ＭＲＣ−５細胞）で増殖するように馴化された。本明細書記載の組成物及び方法の好ましい実施態様において、ＶＺＶは岡株又は岡／メルクＶＺＶ株等の岡株の派生株である。本明細書で使用する場合「岡株の派生株」とは、例えば弱毒化生ワクチンとして有用であるようにウイルス株を十分に弱毒化するために、岡株を適切な細胞型中で継代培養をさらに継続する過程によって得られるウイルス株である。本明細書記載の方法及び組成物において、岡株若しくはその派生株等の生又は弱毒化ＶＺＶは、患者への投与の前にガンマ線照射により不活化される。
【００３９】
また本明細書では、約５から約５０ｋＧｙのガンマ線照射を使用して、ＶＺＶを含む試料をガンマ線照射することを含む不活化ＶＺＶを調製する方法も提供する。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、ガンマ線照射は試料を６０Ｃｏ線に暴露することによって試料に提供される。本発明のこの態様の特定の実施態様において、ガンマ線照射量は上述の通りである。
【００４０】
また本発明は、本明細書記載の方法によって産生される又は得られる不活化ＶＺＶも提供する。さらに、本明細書記載の方法によって産生される治療上有効量の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチンが提供される。
【００４１】
また本発明は、一態様において、患者における帯状疱疹及び／又は帯状疱疹後神経痛等のＶＺＶの再活性化に関連する他の疾病若しくは合併症についての治療、予防、免疫化、又は可能性の減少のための方法も提供し、当該方法は不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含む、治療上有効量のワクチン又は医薬組成物を患者に投与することを含み、ここでＶＺＶはガンマ線照射により不活化されている。ＶＺＶ再活性化は細胞媒介性免疫の低下と関連するので本明細書の治療方法は、自然感染又はワクチン接種によって以前に水痘に暴露されたが、加齢及び／又は免疫系機能障害の結果としてその免疫応答が低下してしまった患者において、細胞媒介性免疫応答を追加免疫するために有用である。
【００４２】
上記の治療／免疫化の方法において、不活化ＶＺＶを含む医薬組成物は、限定されるものではないが、皮下注射、皮内導入、皮膚圧入、又は静脈内送達、筋肉内送達若しくは吸入送達等の他の投与方法を含む、任意の適切な経路によって患者に投与することができよう。本明細書記載の方法の好ましい実施態様において、投与方法は皮下又は筋肉内である。
【００４３】
上記の方法及び組成物は、ＨＺ及び／又はＰＨＮの予防、又は免疫能正常患者及び免疫不全患者個体群におけるその重症度若しくは持続期間の低下に有用であり、これらの患者個体群には、限定するものではないが、健康な患者及び同種造血幹細胞移植（ＨＣＴ）又は臓器移植（ＳＯＴ）受容免疫不全患者、ＨＩＶ感染患者、自己免疫疾患患者、血液癌に罹患した個体；広い範囲の悪性固形腫瘍にわたる化学療法受容個体；リウマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、クローン病、乾癬、及び多発性硬化症を含む広い範囲の病態にわたる免疫抑制療法の長期受容患者が含まれる。本明細書記載の方法のいくつかの実施態様において、不活化ＶＺＶワクチンは、疾病、例えば上記の疾病又は疾病の治療（例えば、血液系腫瘍、悪性固形腫瘍又は化学療法、自己免疫疾患）のためにＨＺに対し非常に危険な状態にある患者に投与される。
【００４４】
上記の任意の方法及び組成物のいくつかの実施態様において、患者は５０歳以上であり、健康又は免疫不全であってよい。他の実施態様において、患者は５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、又は７５歳以上である。他の実施態様において、患者は約５０から約５５歳、約５５から約６０歳、約６０から約６５歳、又は約６５から７０歳である。
【００４５】
本明細書記載の方法のさらなる実施態様において、ワクチン又は医薬組成物は、他の通常施される「標準治療」の療法；又は標的患者個体用の他のワクチンと同時に投与され、当該ワクチンには、例えば、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３（ＰＮ２３，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）等の肺炎球菌ワクチン、ＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ（登録商標）ＨＢ又はＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）等のＢ型肝炎ワクチン（ＨＢＶ）及びインフルエンザワクチン等が含まれる。
本明細書で提供される治療／予防方法の特定の実施態様において、当該方法には予定された所要時間が適切に経過することを可能にすること及び医薬組成物の１又は複数の追加用量を患者に投与することがさらに含まれる。前記の実施態様において、時間が適切に経過した後に１の追加用量が患者に投与されてよく、代わりに時間が適切に経過した後に２、３又は４の追加用量が各々投与されてよい。代表的な実施態様において、経時的に適切な間隔を置いた投与計画の一環として３又は４用量が患者に投与される。当業者であれば投与間の時間が患者個体群、ワクチンの投与量及び／又は患者の投薬遵守に依存して変動し得ることを理解するであろう。代表的な実施態様において、患者への各用量の投与の間に、約３週、約１月、約６週、約２月、又は約３月以上の期間が過ぎることが許される。１の特定の実施態様においてワクチンは、当該移植前、例えば移植前の３週、１月又は２月等に移植を受ける予定の患者に投与され、それから追加の１又は複数の用量が移植後の適切な時期、例えば移植後３週、１月又は２月等に、予定された各用量間の時間の経過を経て患者に与えられる。
【００４６】
本明細書記載の全刊行物は、本発明に関連して使用され得る方法論及び材料を記載し開示する目的のために参照され援用される。本明細書のいかなるものも、本発明が先願発明を理由として当該開示より日時が前である資格を与えられないことを認めるものと解されてはならない。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様は付随的な図面と関連して記載されているが、本発明がこれらと寸分違わない実施態様に限定されないこと、及び添付の請求項で定義した通りの本発明の範囲又は意図から逸脱することなく当業者によってその中で種々の変更及び改変が果たされ得ることを了解されたい。
【００４８】
以下の実施例は本発明を説明するが限定するものではない。
材料及び方法
【実施例１】
【００４９】
水痘帯状疱疹プラークアッセイ
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）調製品の感染性力価は、Ｋｒａｈら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９０）  ２７：３１９−３２６）によって記載された液体オーバーレイ法を使用して測定した。アッセイは以下の通り実施した。ＭＲＣ−５（ヒト二倍体胚線維芽細胞）を、乳糖１００ｍｇ／Ｌ、ネオマイシン５０μｇ／ｍＬ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＢＭＥ（イーグル基礎培地ハンクス液）５ｍＬ容中６００、０００細胞にて６０ｍｍの組織培養プレートに播種し、それから５％±１％ＣＯ２の湿った雰囲気下、３５±１℃でインキュベートした。２４〜５６時間インキュベートした後に、細胞は５０〜８０％の培養密度に達し、プラークアッセイに使用した。細胞増殖培地を吸引で除去し、ＰＧＳ安定剤（ショ糖及び加水分解ゼラチンを含むＰＢＳ）等の適切な希釈剤で希釈したＶＺＶ溶液の一定分量１００μＬで細胞を感染させた。
【００５０】
ウイルスは、５％±１％ＣＯ２の湿った雰囲気下、３５±１℃で１時間以上吸着させた。次に培養液は、５ｍＬ容の維持培地（加熱不活化ウシ胎児血清２％、ネオマイシン５０μｇ／ｍＬ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含む最小必須培地・アール塩（ＭＥＭ））でオーバーレイし、プラーク形成のために５％±１％ＣＯ２の湿った雰囲気下、３５±１℃で６〜７日間のインキュベーションに戻した。次に培地はプレートから吸引し、プラークを０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブルーＲ−２５０・エタノール溶液（１％酢酸を含む）による細胞染色によって可視化した。プラーク数は、３〜５枚のレプリカプレートの平均であり、プラーク形成単位／ｍＬ（ＰＦＵ／ｍＬ）を与えるために希釈係数（試験ウイルスの相当する希釈度の逆数）及び接種容量補正係数（１０、０．１ｍＬから１ｍＬに調整するため）によって乗じた。
【００５１】
不活化試料に対する偽陽性のＰＦＵ結果がないことを保証する必要が不可欠であることを考慮して（ここで偶発性の単層のひっかきのために又は細胞凝集隗の存在のために、プラークアッセイに使用した細胞単層中にプラーク様のスポットが現れるかもしれない）、１の免疫染色法を開発しそれからプラークとして計数された増殖巣が実際にＶＺＶ感染した細胞の増殖巣（ＶＺＶプラーク）であることを確認するために適用した。手短に言えば、標準プラークアッセイにおけるクマシーブルーによる染色の後に、目に見えるプラークを有する培養液を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで希釈したポリクローナル抗ＶＺＶ血清と共に３５℃で１時間インキュベートした。結合していない抗体を除去するために細胞を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより洗浄し、結合した抗体は、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体及びペルオキシダーゼと反応して沈殿を生じるペルオキシダーゼ基質（ジアミノベンジジン溶液）を使用して検出した。褐色の沈殿がＶＺＶを含有する増殖巣の周りに生じ、クマシーブルー染色を使用して観察された増殖巣以外にいかなる追加のプラークも検出されなかった。従って、本免疫染色法は、抗ＶＺＶ一次血清、ペルオキシダーゼ結合抗一次種抗体及びペルオキシダーゼ基質の組み合せを使用して、不活化試料中の疑わしいプラークが実際に残存する感染性ＶＺＶを表しているかどうか確認する方法を提供する。
【実施例２】
【００５２】
ＶＺＶ抗原の競合ＥＬＩＳＡ及びＶＺＶ抗原の直接結合（吸着）（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）ＥＬＩＳＡアッセイ
ＶＺＶ抗原を特性化し及び定量化するために、２の抗原アッセイフォーマットを使用した。ＶＺＶ市販品中のＶＺＶ抗原を推定するために使用される試験法を模倣し、ＶＺＶ抗原を検出するために単一のポリクローナル血清を利用する、１の競合ＥＬＩＳＡを選抜研究に使用した。ガンマ線照射又は他の不活化処理の後のＶＺＶ抗原の反応性の特性評価をさらに提供するために、１の直接結合ＥＬＩＳＡを開発し使用し、ここで試験試料はＥＬＩＳＡのマイクロタイタープレートに直接吸着し、次にモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用して検出した。
ＶＺＶ抗原定量のための競合ＥＬＩＳＡ
手短に言えば本アッセイは、一定量のポリクローナル抗ＶＺＶ血清と試験試料由来のＶＺＶ抗原とを溶液中のインキュベーションによって実施した。残存する遊離抗体（抗原非結合）は、ＥＬＩＳＡのマイクロタイタープレートに固相化されたＶＺＶ標準抗原に結合させた。プレートに結合可能な抗体量は、試験試料中の抗原量に逆比例する。プレートに結合する抗体は、酵素結合抗ヒト抗体と、分光測定で定量される着色産物を提供する適切な基質との反応によって定量した。
【００５３】
試験方法には次の段階が含まれた：（１）ＥＬＩＳＡプレートをＶＺＶ感染又は非感染のＭＲＣ−５細胞由来の糖タンパク質（ｇｐｓ）により被覆し、プレートへの非特異的な抗体の吸着を減らすために１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでその上から被覆した。（２）試験ＶＺＶ抗原をポリプロピレンのマイクロチューブ中のＰＧＳ安定剤で希釈した。抗原力価が既知のＶＺＶ抗原調製品を対照として含めた。試料は、２．６から０．９抗原単位／ｍＬの範囲の抗原濃度を含むように、典型的には１：１．２５倍系列希釈により希釈した。試験試料中の抗原測定用の標準曲線を作製するために、ＶＺＶ標準品の希釈系列を使用した。（３）２の倍数の所期の最終希釈まで、ヒト抗ＶＺＶ血清をＰＧＳ安定剤で希釈した。（４）３００μＬ容の希釈した抗原をポリプロピレンのマイクロチューブに分注し、３００μＬの希釈抗ＶＺＶ血清と混合し、３３〜３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。抗ＶＺＶ血清に希釈剤を加えてもの（抗原不含）を対照として使用した。（５）各血清−抗原混合液（及び対照）由来の一定分量１００μＬを、ＶＺＶｇｐを被覆した２のレプリカウェル及びＭＲＣ−５ｇｐを被覆した２のウェルに添加した。（６）プレートは、プレート上に固相化されたｇｐ抗原に遊離抗体（溶液中の試験抗原と複合化していない）を結合させるために、３５〜３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。（７）結合していない抗体を洗浄によって除去し、結合したヒト抗体を検出するためにアルカリフォスファターゼヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体複合体溶液をウェルに分注した。（８）３５〜３７℃、１５〜３０分間のインキュベーション後、非結合複合体を洗浄により除去した。結合複合体を基質ｐ−ニトロフェニルリン酸と３５〜３７℃、１０〜１５分間のインキュベーションによって検出した。（９）発色（４０５ｎｍでのＯＤ）は、３ＭのＮａＯＨ５０μＬの添加による基質反応停止後にマイクロプレート分光光度計を使用して定量した。
【００５４】
試験の計算及びその解釈には以下の段階が含まれた：（１）ＶＺＶ及びＭＲＣ−５ｇｐ被覆レプリカウェルに対するそれぞれの繰り返しのＯＤ値を平均した。経験からＭＲＣ−５のＯＤは、異なる試料及び希釈の間で矛盾しないことが知られていた。そこで、試験したセット全部に対するＭＲＣ−５ｇｐのＯＤ値を典型的に平均し、一次抗体（抗ＶＺＶ血清）の非特異的結合を較正するために使用した。ＶＺＶに特異的な値（ΔＯＤ）を与えるために、それぞれのＶＺＶｇｐの平均ＯＤからＭＲＶ−５ｇｐの平均ＯＤを差し引いた。（２）抗原量測定用標準曲線の作製：既知の抗原濃度（ＶＺＶ抗原単位／ｍＬ）に対して標準曲線のΔＯＤ値をプロットした。データを適切なグラフィックプログラムに入力し、曲線の直線部を確認し、この線形曲線に対する「直線当てはめ式」（ｙ＝ａ＋ｂｘ）を得た。（３）試験試料の抗原量の計算：ａ及びｂに対する値は直線当てはめ式によって与えられ、ｙ（ΔＯＤ）は既知であるので、次に単位／ｍＬ抗原を表す未知の値ｘを計算することができ、元の（未希釈の）試験試料の抗原濃度を得るために試料の希釈度によって修正することができた。報告した抗原濃度は、標準曲線の直線部内でΔＯＤ値を提供する最小希釈試料により得られたものである。
ＶＺＶ抗原の直接吸着ＥＬＩＳＡ
手短に言えば本アッセイは、抗原を固相化するための９６ウェルマイクロタイタープレート中での試験試料由来のＶＺＶ抗原の希釈液のインキュベーションを実施し、引き続いてモノクローナル又はポリクローナル抗ＶＺＶ抗体と結合した抗原の検出を行った。結合した抗ＶＺＶ抗体は、酵素結合抗指標種抗体と分光光度的に定量される着色産物を与える適切な基質との反応によって定量した。次に試料の希釈度に対するＯＤの滴定曲線を比較した（滴定曲線間の希釈系列の差異（「曲線シフト」）として定量）。
【００５５】
試験方法には以下の段階が含まれた：（１）高結合ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳの２倍系列希釈で１：２０から１：２５６０まで希釈した抗原（ワクチン）２００μＬで被覆した。プレートに蓋をして２〜８℃で一晩保管した。（２）段階（１）の液体を注ぎ出して、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回すすいだ。最後のすすぎ液を除去して希釈した抗体（１００μｌ／ウェル）を添加した。プレートを３５℃で１時間インキュベートした。（３）段階（２）の液体を注ぎ出して、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回すすいだ。最後のすすぎ液を除去して希釈した複合体（１００μｌ／ウェル）を添加した。プレートを３５℃で１時間インキュベートした。（４）段階（３）の液体を注ぎ出して、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回すすいだ。最後のすすぎ液を除去して基質（無希釈）を添加した。次にプレートを３５℃で３０分間インキュベートした。（５）ＮａＯＨで反応を停止した。（６）４０５ｎｍでプレートを読み取って光学密度（ＯＤ）を定量した。
本試験に使用した抗体は以下の通りであった：ＥＰＰ（流行性肺炎ブタ）血清及びｇＥ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ｃａｔａｌｏｇ＃ｍａｂ８６１２）、ｇＢ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ｃａｔａｌｏｇ＃Ｃ０５１０２Ｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、及びｇＨ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ｃａｔ＃Ｃ０５１０４Ｍ及びＶｉｒｕｓｙｓ  ｃａｔ＃ＶＡ０３３−１００，Ｖｉｒｕｓｙｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｔａｎｅｙｔｏｗｎ，ＭＤ）に対する精製モノクロール抗体。使用した複合体は、抗ヒトＩｇＧ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＨＩ０３０５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又はヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃３１３２２，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のいずれかであった。アルカリフォスファターゼｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸）（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃ｐ７９８８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｃｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍＬを基質として使用した。
【実施例３】
【００５６】
ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
手短に言えば、１から０．１２５までのＶＺＶ抗原単位／ｍＬの試験抗原の系列希釈液を６名のドナー由来のＰＢＭＣと共に二つ組ウェル中でインキュベートした。インキュベーション後、ＶＺＶ抗原に応答する細胞をそのインターフェロンガンマ産生能によって同定した。インターフェロンガンマ産生は、マイクロタイタープレート上に被覆したマウス抗インターフェロンガンマ、及び同等の酵素抗マウスＩｇＧ二次抗体複合体及び基質を使用し、インターフェロンガンマ産生細胞のまわりに沈殿した物質（「スポット」）の検知に導いて検出した。スポット形成細胞（ＳＦＣ：インターフェロンガンマ分泌を示すスポットを形成する細胞）の数を自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダーで定量し、結果を１０６ＰＢＭＣ当たりのＳＦＣとして表した。
結果
【実施例４】
【００５７】
ガンマ線照射ＶＺＶの不活化動力学
発明者らは以前、免疫不全患者用ワクチンとして使用するために、凍結乾燥したワクチンを不活化する一方法として熱処理を検討したが、当該方法はウイルス調製品の残存感染性という結果になることを見出した（以下を参照）。当該残存感染性は、「不活化」ワクチンの最適の特性ではないと考えられた。凍結乾燥ワクチンと比較して液体バルクワクチンの不活化がより広範囲に行われたが、バルクワクチンの熱処理は最適の製造工程を提供しないと判定された。そこで、熱処理よりもより広範な感染性の不活化（より好ましい安全特性をもたらす）方法と確認され得るか否かを見るために、６０Ｃｏ線ガンマ線照射を使用する水痘帯状疱疹ウイルス凍結乾燥ワクチン（岡／メルク）に対する代わりの不活化方法が研究された。当該評価の目標は、第一に６０Ｃｏ線照射によってより広範な感染性の不活化が達成され得るか否かを特定することであり、第二にガンマ線照射後に達せられる抗原特性が熱処理物質のそれと異なるかいなか及び臨床応用研究に許容可能か否かを特定することであった。ＶＺＶ入りのバイアルを〜１、２、３、４、５、６、７、８ｋＧｙ（２００７）又は０．４５、１．３５、及び２．７ｋＧｙで照射した。照射は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ（登録商標）６０Ｃｏ線照射器（Ｂｅｓｔ  Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ  Ｌｔｄ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｔｔａｗａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して実施した。
【００５８】
照射線量（Ｇｙ）当たりの各バイアルの残存ＰＦＵ／ｍＬは、ＭＲＣ−５細胞における水痘帯状疱疹プラークアッセイを使用して定量した。照射線量に対してｌｏｇ  ＰＦＵ／ｍＬをプロットしたところ、データポイントは不活化の線形回帰を示した（図１）。動力学的検討後に発明者らは、不活化範囲に関する拡張した確証を可能とするために（より大きな総容積を検討することによって）、６０Ｃｏ線により１２ｋＧｙに照射した１００ｍＬの不活化ＶＺＶワクチン（凍結乾燥品の不活化）を試験した。試料１００ｍＬにプラークは検出されなかった。
【００５９】
ＶＺＶバルクを照射するためにさらに６０Ｃｏ線を使用した。バルクを解凍して、０．５、１、２、３、４、５、６ｋＧｙでの照射のためにＰＥＴＧボトルに分取した（図２）。残存感染性に関しＭＲＣ−５細胞を使用する水痘帯状疱疹プラークアッセイで照射バルクを分析した。照射バルク（６ｋＧｙ）の試料１００ｍＬにプラークは検出されなかった。照射時間に対してｌｏｇ  ｐｆｕ／ｍＬ力価をプロットすることによって線形の不活化動力学が観察された。
【実施例５】
【００６０】
ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる免疫原性評価
異なる不活化方法の免疫原性に関する影響を評価するために、実施例３記載の通り６名のドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料を使用して、ＶＺＶのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。本研究は、ＶＺＶが異なる条件下で不活化された後にＩＦＮ‐γ応答が減少するか否かを判定するために行った。２のガンマ線照射ＶＺＶバルク調製品と共に、５の熱処理ＶＺＶバルク調製品を試験した。熱処理ＶＺＶ調製品は、以下の条件下で処理された試料から成った：（１）４０℃、２４時間、（２）４５℃、３．５時間、（３）４５℃、４．５時間、（４）５６℃、３０分間、及び（５）５６℃、９０分間。ガンマ線照射試料は、５．９２ｋＧｙで３又は４時間、ガンマ線照射したＶＺＶバルクから成った。また比較のために、不活化試料を作製するために上で使用したのと同じバルク調製品由来の生（未処理）のＶＺＶ試料も試験した。
【００６１】
また紫外線処理によって不活化したＶＺＶのロットも、ＰＨＡ（陽性対照）及び培地（陰性対照）と共にアッセイ行程の対照としてと同様にＥＬＩＳＰＯＴの抗原（ＶＺＶロット番号９６．０７）として含めた。全ての抗原は、１：４０から１：３２０にわたる２倍系列希釈で評価した。１アッセイ行程は、ＶＺＶ応答レベルの範囲を代表するように選択された６名のＰＭＢＣ試料を試験して実施した。
【００６２】
ＶＺＶスポット数（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）の結果を図３Ａ〜Ｆに示す。試験したドナーの間で未処理の抗原調製品と比較して不活化した抗原調製品に対する、ＶＺＶ応答における差異を示唆する証拠は認められなかった。また、個々の希釈レベルでの調製（処理）と応答の間の顕著な相互作用に関する証拠も認められなかった。生ＶＺＶ調製品と比較して、元のＶＺＶロット番号９６．０７を含む８の不活化ＶＺＶ調製品に対するＥＬＩＳＯＴ数の差異は、生ＶＺＶ調製品の１．１５倍低いもの（５６℃、９０分間）から１．１４倍高いもの（４０℃、２４時間；ロット番号９６．０７）まで変動する。生ＶＺＶ調製品と比較して８の不活化ＶＺＶ調製品のいずれも、試験したドナーで統計的に有意差のある低いＥＬＩＳＰＯＴ数を得るものはなかった。
【００６３】
従って、ヒトＥＬＩＳＰＯＴ試験は、異なる方法（バルクの４０℃、４５℃、５６℃熱処理又はガンマ線照射）によって不活化されたＶＺＶ調製品に関し、ドナーパネル由来のＰＢＭＣを使用する応答において顕著な差異を示さなかった。
【実施例６】
【００６４】
不活化ＶＺＶワクチンの電子顕微鏡分析
熱処理及びガンマ線照射バルク及び凍結乾燥ワクチンのＥＭ分析は、不活化ＶＺＶ調製品への不活化の影響の追加の特性化を提供するために実施した。選択した分析方法は、ＥＭ分析の間ウイルスのインテグリティを最良に保つために、ガラス状氷中でのクライオ透過電子顕微鏡法であった。クライオＴＥＭは、ＮａｎｏＩｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって実施した。
【００６５】
不活化ＶＺＶＣ試料は、粒子のインテグリティ／外観への不活化の影響を評価するためにｐＥＭ分析用に調製した。凍結乾燥試料は、滅菌水７００μＬで再水和して、画像撮影の前にそれ以上希釈しなかった。試料は、４００メッシュ銅グリッド上の２．０ｘ０．５μｍＣ−Ｆｌａｔ穴開カーボンフィルム（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）上に支持されたガラス状氷の薄膜中に保持した。グリッドは、使用直前にＳｏｌａｒｕｓプラズマ洗浄装置の中で洗浄した（１０秒間、２５％Ｏ２、７５％Ａｒ）。全ての試料は、ＦＥＩのＶｉｔｒｏｂｏｔ（登録商標）（４℃、ＲＨ９５％）を使用して、試料懸濁液の１滴（〜３μＬ）をプラズマ洗浄したグリッドへ載せ、ろ紙でブロッティングして、液体エタン中で即時ガラス化処理することによって調製した。グリッドは、画像撮影のために電子顕微鏡に移すまで液体窒素下に貯蔵した。電子顕微鏡法は、ＦＥＩのＴｅｃｎａｉ（登録商標）Ｔ１２電子顕微鏡（ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）を使用し、ＦＥＩのＥａｇｌｅ（登録商標）４Ｋｘ４Ｋ  ＣＣＤカメラ（ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を装備して１２０ＫｅＶで作動して実施した。各グリッドの画像は、検体の全体的な分布を評価するために複数のスケールで撮影した。低倍率で画像撮影のための標的領域を確認した後に、１対の高倍率画像を撮影した。
【００６６】
試料は、ＮａｎｏＩｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（倍率２１Ｋ〜５２Ｋ）を使用して評価した。未処理凍結乾燥ＶＺＶ、５６℃、７７日間の熱処理凍結乾燥ＶＺＶ、及び６０Ｃｏ線源を使用して２５又は５０ｋＧｙで照射した凍結乾燥ＶＺＶを比較した。
【００６７】
クライオＥＭの結果は、電子密度の減少（おそらくウイルスＤＮＡの分解を反映している）を伴う高ガンマ線照射量での潜在的な粒子効果を示すが、凍結乾燥試料に対する総体的な粒子及びタンパク質の外観への著しい効果は示さない。しかしながら、凍結乾燥不活化試料が電子密度の減少を示したので、凍結乾燥はこれらの変化から保護するのかもしれないが、粒子は高線量において無傷のままであった。（図４参照）
【実施例７】
【００６８】
抗原反応性の定量
ＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡアッセイは、熱若しくはガンマ線照射不活化バルク試料又はガンマ線照射凍結乾燥ＶＺＶの抗原（Ａｇ）含量を定量するために、検出抗体としてヒトポリクローナル血清及びＶＺＶのｇＢ、ｇＨ、ｇＥに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して実施した。ガンマ線照射バルク又は凍結乾燥試料は抗原反応性において変化を示さなかった。しかし５６℃、９０分間で熱処理した試料は、ポリクローナル抗体、ｇＥ及びｇＨモノクローナル抗体との抗原反応性において変化を示した。
【００６９】
最終滅菌のための暴露限度として５０ｋＧｙの使用を支持するために、ＶＺＶバルク試料を２５ｋＧｙ及び５０ｋＧｙでさらにガンマ線照射した。これらの試料は、ポリクローナル抗ＶＺＶ血清及びｇｐＥ、ｇＢ、及びｇＨのｍＡｂに対し直接抗原結合（吸着）ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
【００７０】
凍結乾燥ＶＺＶワクチンの滅菌条件（２５〜５０ｋＧｙ）でのガンマ線照射は、ポリクローナル血清又はｇＥ若しくはｇＢのモノクローナル抗体とのＥＬＩＳＡの抗原反応性に検出可能な悪影響を及ぼさなかった。ｇＨのｍＡｂを使用した結果は、高いバックグラウンド染色のために確定的でなかった。当該モノクローナル抗体（ｇＥ又はｇＢに対する抗体ではなく）に伴うバックグランド信号の増加は、また他のＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の使用の際にも観察された。
【実施例８】
【００７１】
マウス免疫原性
マウス免疫原性研究は、不活化のための種々の方法を使用して作製した一組の不活化ＶＺＶ（ｉＶＺＶ）調製品を評価するために実施した。当該研究から作製された血清試料は、異なる不活化ＶＺＶ製剤によって作製されたＶＺＶに対する抗体の相対力価を定量するために、ＶＺＶのＥＬＩＳＡアッセイで評価した。異なる２のＶＺＶバルク調製品を作製し評価した。（１）ＶＺＶバルク、熱処理５６℃、９０分間、及び（２）ＶＺＶバルク、ガンマ線照射５、９２４．７グレイ（Ｇｙ）、３時間。また異なる２のＶＺＶ凍結乾燥ワクチン調製品も作製し評価した。（１）ＶＺＶ凍結乾燥ワクチン、熱処理５６℃、５０日間、及び（２）ＶＺＶ凍結乾燥ワクチン、ガンマ線照射２５、０００Ｇｙ。生（未処理）ＶＺＶバルク及び生（未処理）ＶＺＶ凍結乾燥ワクチンを、ｉＶＺＶバルク調製品との比較のために評価した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群ｎ＝１６）を４．５ＶＺＶ抗原単位（Ｕ）／マウス（９Ｕ／ｍＬ）により、０、１４及び２９日目に腹腔内で（ｉ．ｐ．）免疫した。瀉血（血清）を−１（前−瀉血）及び１３、２８及び４３日目に採取した。２８日の血清（投与２の１４日）は、ＩｇＧ応答に関してＶＺＶのＥＬＩＳＡで評価した。
【００７２】
調整ＶＺＶ力価（ＶＺＶ力価マイナスＭＲＣ−５力価）を図５に示す。ＭＲＣ−５及びＶＺＶに対する力価の足きり値（ｔｉｔｅｒ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）を決定するために、２８日からの相当する群に関して前瀉血の血清を試験した。ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、ＵＶ処理ＶＺＶ又はＭＲＣ−５抽出液で被覆し、次にマウス血清中のＶＺＶに特異的な抗体の相対量を定量するために試験マウス血清の希釈液とインキュベートした。
【００７３】
結果は熱処理バルクのＩｇＧ力価が未処理バルクと比較して、平均して５．５７倍低く（９５％ＣＩ（信頼区間）＝（３．４５、８．９９））並びにガンマ線照射バルクのＩｇＧ力価が平均して２．４３倍低かった（９５％ＣＩ＝（１．５１、３．９３））ことを示す。熱処理凍結乾燥力価は、未処理凍結乾燥ウイルスよりも平均して１．３８倍低く（９５％ＣＩ＝（１．００、１．９０））並びにガンマ線照射凍結乾燥力価は平均して１．６６倍低かった（９５％ＣＩ＝（１．２２、２．２６））。ガンマ線照射バルクの抗体力価は、熱処理バルクによる免疫化後に得られた力価よりも平均して２．２９倍高かった（９５％ＣＩ＝（１．５４、３．４１））。ガンマ線照射凍結乾燥ウイルスの抗体力価は、熱処理凍結乾燥調製品による免疫化後に得られた力価よりも平均して１．２０倍低かった（９５％ＣＩ＝（０．８９、１．６１））。全体のデータは、本モデルにおいて免疫原性へ最小の影響しか有さないゆえに、凍結乾燥ウイルスのガンマ線照射を支持している。
【００７４】
結果は抗体（ＩｇＧ）応答が未処理バルクと比較して、不活化調製品の２用量による免疫化後にマウスにおいて減少したことを示している。
【実施例９】
【００７５】
５０〜５９歳の健康な患者への不活化ＶＺＶワクチン投与
ワクチンの安全性、耐容性、及び免疫原性を評価するために計画された、ランダム化された、二重盲検の、２部構成の、多施設治験において、ガンマ線照射ＶＺＶワクチンを５０ないし５９歳の健康な成人に投与した。本治験の目的は、ガンマ線照射又は熱処理方法によって不活化されたワクチンロットの安全性、耐容性、及び免疫原性を研究することであった。
【００７６】
１６ないし２５ｋＧｙで不活化されたガンマ線照射ＶＺＶワクチン「Ａ」（ｎ＝６５）、熱処理ＶＺＶワクチン（ｎ＝６３）、又はプラセボ（ｎ＝３３）のいずれかを４用量の投与計画で投与するために、総計１６１名の５０ないし５９歳の健康な個体を２：２：１にランダム化した。各用量を約３０日の間隔で投与した。熱処理ワクチン及びガンマ線放射ワクチン「Ａ」は、別個のバルクロット由来であったが同一の抗原濃度を標的にすることによって制御した。
【００７７】
第一の仮説は、１６ないし２５ｋＧｙレベルで不活化されたガンマ線照射ＶＺＶワクチン（Ａ）が、投与４の２８日後にｇｐＥＬＩＳＡによって測定されたときに、許容可能なＶＺＶ特異的免疫応答を誘発するだろうということだった。第二の仮説は、熱処理ＶＺＶワクチンが、投与４の２８日後にｇｐＥＬＩＳＡによって測定されたときに、許容可能なＶＺＶ特異的免疫応答を誘発するだろうということだった。成功の統計的基準は、熱処理ＶＺＶワクチンのレシピエントにおける幾何平均上昇倍数（ＧＭＦＲ、抗体変化比）に関する両側９５％信頼区間の下限が＞１．０であることに相当する。本研究におけるワクチンのレシピエント間の免疫原性の結果を図６に提供する。
結果は、第一及び第二の仮説の試験に関する成功基準が満たされたこと、すなわちガンマ線照射ＶＺＶワクチンＡ及び熱処理ＶＺＶワクチンが健康な個体に投与されたときに免疫原性であったことを示している。双方のワクチン群は、プラセボ群と同様の安全性プロファイルを有していた。
【実施例１０】
【００７８】
５０ないし５９歳の健康なボランティアへの異なるガンマ線照射レベルで不活化したＶＺＶワクチンロットの投与
第二の研究は、より広範囲なガンマ線照射により不活化されたワクチンロットに関する臨床データを提供するために実施した。本研究において、１６ないし２５ｋＧｙで照射されたガンマ線照射ＶＺＶワクチン「Ｂ」（ｎ＝６４）、又は２５ないし５０ｋＧｙで照射されたガンマ線照射ＶＺＶワクチン「Ｃ」（ｎ＝６５）のいずれかを、各用量を約３０日の間隔で投与する４用量の投与計画に従って投与するために、総計１２９名の５０ないし５９歳の健康な個体を１：１にランダム化した。本研究で利用したワクチンロットＢ＆Ｃは、同一のＶＺＶ抗原含量を有する同一のバルクロット及び同一の充填／製剤に由来するが、異なるガンマ線照射レベルで不活化した。
【００７９】
本研究の第一の仮説は、２５ないし５０ｋＧｙレベルで不活化されたガンマ線照射ＶＺＶワクチン（Ｃ）が、投与４の２８日後にｇｐＥＬＩＳＡによって測定されたときに許容可能なＶＺＶ特異的免疫反応を誘発するだろうということであった。第二の仮説は、１６ないし２５ｋＧｙレベルで不活化され同時に２５ないし５０ｋＧｙで不活化されたワクチンと抗原含量を一致されたガンマ線照射ＶＺＶワクチン（Ｂ）が、投与４の２８日後にｇｐＥＬＩＳＡによって測定されたときに許容可能なＶＺＶ特異的免疫応答を誘発するだろうということであった。各仮説の成功の統計的基準は、ガンマ線照射ワクチンのレシピエントにおけるＧＭＦＲに関する両側９５％信頼区間の下限が＞１．０であることに相当する。本研究におけるワクチンのレシピエント間の免疫原性の結果を図７に提供する。
本研究の結果は、主要な仮説の試験に関する成功基準が満たされたこと、すなわちガンマ線照射ＶＺＶワクチンＢ（ガンマ線照射１６〜２５ｋＧｙ）及びガンマ線照射ＶＺＶワクチンＣ（ガンマ線照射２５〜５０ｋＧｙ）が健康な個体に投与されたときに免疫原性であったことを示している。ワクチン群の双方とも同様の安全性プロファイルを有していた。
【００８０】
また本研究の結果は、ベースラインの幾何平均力価（ＧＭＴ）の不均衡（群ＢのベースラインのＧＭＴが〜３１３であり群ＣのベースラインのＧＭＴが〜４２９であった）が存在したことも示す。上昇倍数の差異は著しくなかったとはいえ、ベースライン力価の差異が試験中に観察された上昇倍数の差異を説明するかもしれない。さらに分析データは、ガンマ線照射量が高いほど（＞２５ｋＧｙ）結果として抗原の分解が高くなることを示している。
【図１】
2013535488.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月28日(2013.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化された水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）であって、前記ＶＺＶの感染性が検出限界以下であり並びに前記不活化ＶＺＶが患者に投与されたときにＶＺＶに対する免疫応答を誘発する前記ウイルス。
【請求項２】
治療上有効量の請求項１記載のＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
不活化ＶＺＶの感染性が０．０４０プラーク形成単位（ＰＦＵ‘ｓ）／ｍＬ以下である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
不活化ＶＺＶの感染性が０．０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ‘ｓ）／ｍＬ以下である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
不活化ＶＺＶの感染性が０．００２プラーク形成単位（ＰＦＵ‘ｓ）／ｍＬ以下である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＶＺＶ株が岡株又は岡株の派生株である任意の請求項２〜５記載の医薬組成物。
【請求項７】
組成物が凍結乾燥されている請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＶＺＶがガンマ線照射によって不活化されている請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物によって誘発される免疫応答が同量の不活化されていないＶＺＶを含む対照試料によって誘発される免疫応答と著しく異ならない請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
不活化ＶＺＶによって誘発される免疫応答が対照試料によって誘発される免疫応答と２５％以下異なる請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＶＺＶの感染性が水痘帯状疱疹プラークアッセイによって定量される請求項２〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
約５から５０ｋＧｙのガンマ線を使用してＶＺＶを含む試料にガンマ線照射することを含む、不活化水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を調製する方法。
【請求項１３】
試料を６０Ｃｏ線に暴露することによってガンマ線を試料に供給する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＶＺＶが岡株又は岡株の派生株である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
試料が照射される前に凍結乾燥される請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
使用されるガンマ線照射線量が約２５ｋＧｙ以下である請求項１４又は請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ワクチンが液体バルク製剤であり、使用されるガンマ線照射量が約５ｋＧｙから１２．５ｋＧｙである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
使用されるガンマ線照射量が約１０ｋＧｙから約２５ｋＧｙである請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法によって産生される又は得られる不活化ＶＺＶ。
【請求項２０】
治療上有効量の請求項１９記載の不活化ＶＺＶ及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
【請求項２１】
対象における帯状疱疹の治療のための医薬の製造における不活化水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の使用であって、前記ＶＺＶがガンマ線照射により不活化されている前記使用。
【請求項２２】
医薬の投与経路が皮下又は筋肉内である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
対象が５０歳以上である請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
対象が免疫不全状態である請求項２２又は２３記載の使用。
【請求項２５】
対象が、血液系腫瘍罹患、免疫抑制療法受容、同種造血幹細胞被移植、臓器被移植、ＨＩＶ感染、及び自己免疫疾患罹患から成る群から選択される少なくとも１容態を有する請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
当該方法が、予め決められた時間を終過させて、１又は複数用量の当該医薬を対象に投与することをさらに含む請求項２２又は２３記載の使用。
【国際調査報告】
2013535488.tif 000015