(57)【要約】抗血管形成アデノウイルスベクターおよびその治療的使用が提供される。より具体的には、これに限定されるわけではないが、Ad5-PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターによる、患者の固形腫瘍の治療のための臨床プロトコルが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を該対象に投与する工程を含み、該ベクターが、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該治療的有効量が少なくとも1×108ウイルス粒子である、方法。
【請求項２】
前記治療的有効量が少なくとも約1×109〜約1×1016ウイルス粒子である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記治療的有効量が少なくとも約3×1012ウイルス粒子である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記fasキメラ導入遺伝子が、SEQ ID NO:2に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記fasキメラ導入遺伝子が、SEQ ID NO:3に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記fasキメラ導入遺伝子が、SEQ ID NO:4に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:8に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:7に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:13に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:12に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:5に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記非複製型アデノウイルスベクターがアデノウイルス5型ベクターである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記アデノウイルスベクターがSEQ ID NO:9または10に示される核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記固形腫瘍が癌である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記固形腫瘍が原発腫瘍である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
前記固形腫瘍が転移性腫瘍である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記アデノウイルスベクターが全身投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクターが、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、注入、経口投与、直腸投与、経鼻投与、および吸入からなる群より選択される経路によって全身投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも2回の別個の全身投与で前記アデノウイルスベクターを投与する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
投与後少なくとも約4日目に前記対象の血中に前記アデノウイルスが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
血清抗アデノウイルス抗体の量が前記投与後に増加し、かつ投与後少なくとも約21日目に前記対象の血中に前記アデノウイルスが検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を該対象に投与する工程を含み、該アデノウイルスベクターがSEQ ID NO:9または10に示される核酸配列を含む、方法。
【請求項２６】
前記治療的有効量が少なくとも約1×108〜約1×1016ウイルス粒子である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記治療的有効量が少なくとも約3×1012ウイルス粒子である、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子である、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
前記固形腫瘍が癌である、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
前記固形腫瘍が転移性腫瘍である、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
前記固形腫瘍が原発腫瘍である、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
前記アデノウイルスベクターが全身投与される、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターが、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、注入、経口投与、直腸投与、経鼻投与、および吸入からなる群より選択される経路によって全身投与される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
1回目の投与および少なくとも2回目の追加投与で前記アデノウイルスベクターを投与する工程を含む、請求項25記載の方法であって、1回目の投与が、前記対象において抗Ad5抗体を誘導するのに十分であり、かつ1回目の投与と少なくとも2回目の投与の間の時間が、該対象における抗Ad5抗体形成のために十分である、方法。
【請求項３６】
投与後少なくとも約4日目に対象の血中でアデノウイルスが検出される、請求項25記載の方法。
【請求項３７】
血清抗アデノウイルス抗体の量が前記投与後に増加し、かつ投与後少なくとも約21日目に前記対象の血中でアデノウイルスが検出される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を、少なくとも2回の別個の投与で該対象に投与する工程を含み、該投与が、該対象において該アデノウイルスベクターに対する抗体の用量依存性の増加を誘導しない、方法。
【請求項３９】
前記治療的有効量が少なくとも約1×108〜約1×1016ウイルス粒子である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子である、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
前記治療的有効量が少なくとも約3×1012ウイルス粒子である、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子である、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
前記fasキメラ導入遺伝子が、SEQ ID NO:2に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４４】
前記fasキメラ導入遺伝子が、SEQ ID NO:3に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４５】
前記fasキメラ導入遺伝子が、SEQ ID NO:4に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４６】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４７】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:8に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４８】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:7に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４９】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:13に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５０】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:12に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５１】
前記マウスプレプロエンドセリンプロモーターが、SEQ ID NO:5に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項５２】
前記非複製型アデノウイルスベクターがアデノウイルス5型ベクターである、請求項38記載の方法。
【請求項５３】
前記アデノウイルス5型ベクターがSEQ ID NO:9または10に示される核酸配列を含む、請求項38記載の方法。
【請求項５４】
前記固形腫瘍が癌である、請求項38記載の方法。
【請求項５５】
前記固形腫瘍が原発腫瘍である、請求項38記載の方法。
【請求項５６】
前記固形腫瘍が転移性腫瘍である、請求項38記載の方法。
【請求項５７】
前記アデノウイルスベクターが全身投与される、請求項38記載の方法。
【請求項５８】
前記ベクターが、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、注入、経口投与、直腸投与、経鼻投与、および吸入からなる群より選択される経路によって全身投与される、請求項38記載の方法。
【請求項５９】
投与後少なくとも約4日目に前記対象の血中に前記アデノウイルスが検出される、請求項38記載の方法。
【請求項６０】
血清抗アデノウイルス抗体の量が前記投与後に増加し、かつ投与後少なくとも約21日目に前記対象の血中でアデノウイルスが検出される、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1×1012ウイルス粒子の単回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項６２】
前記固形腫瘍が癌性腫瘍である、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記固形腫瘍が原発腫瘍である、請求項61記載の方法。
【請求項６４】
前記固形腫瘍が転移性腫瘍である、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
前記投与量のアデノウイルスベクターの投与が、前記腫瘍の血管形成を阻害する、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
前記投与量のアデノウイルスベクターの投与が、前記腫瘍の成長を阻害する、請求項61記載の方法。
【請求項６７】
投与後少なくとも約4日目に前記対象の血中に前記アデノウイルスが検出される、請求項61記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、治療前の抗アデノウイルス抗体レベルと比較して上昇した血清抗アデノウイルス抗体を有し、かつ、投与後少なくとも約21日目に該対象の血中に前記アデノウイルスが検出される、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
その必要がある対象において甲状腺癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1×1013ウイルス粒子の単回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項７０】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
その必要がある対象において神経内分泌癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1×1013ウイルス粒子の単回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項７２】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子である、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターのウイルス粒子の単位投薬量と、アデノウイルスの投与についての説明とを含む、その必要がある対象において固形腫瘍を治療するためのキットであって、該非複製型アデノウイルスベクターが静脈内投与用に製剤化されている、キット。
【請求項７４】
前記単位投薬量が約3×1012ウイルス粒子を含む、請求項73記載のキット。
【請求項７５】
前記単位投薬量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子を含む、請求項73記載のキット。
【請求項７６】
アデノウイルスベクターを含む治療用組成物を対象に投与する方法であって、治療的有効量の該組成物を、少なくとも2回、該対象に投与する工程を含み、該投与が、該対象において該アデノウイルスベクターに対する抗アデノウイルス抗体の用量依存性の増加を誘導しない、方法。
【請求項７７】
前記治療的有効量が少なくとも約1×108〜約1×1016ウイルス粒子である、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子である、請求項76記載の方法。
【請求項７９】
前記治療的有効量が少なくとも約3×1012ウイルス粒子である、請求項76記載の方法。
【請求項８０】
前記治療的有効量が少なくとも約1×1013ウイルス粒子である、請求項76記載の方法。
【請求項８１】
投与後少なくとも約4日目に前記対象の血中に前記アデノウイルスが検出される、請求項76記載の方法。
【請求項８２】
血清抗アデノウイルス抗体の量が投与後に増加し、かつ投与後少なくとも約21日目に前記対象の血中でアデノウイルスが検出される、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
前記対象が、前記非複製型アデノウイルスベクターの前記ウイルス粒子による治療に加えて、化学療法剤をさらに投与されている、請求項1〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
前記化学療法剤が前記ウイルス粒子による治療の前に投与される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
前記化学療法剤が前記ウイルス粒子による治療と同時に投与される、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
前記化学療法剤が前記ウイルス粒子による治療の後に投与される、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
前記化学療法剤がスニチニブである、請求項83記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、そのいくつかの態様において、抗血管形成アデノウイルスベクターおよびその治療的使用に関し、より具体的には、これに限定されるわけではないが、Ad5-PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターによる、患者における固形腫瘍の治療のための臨床プロトコルに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、既存の近隣の血管からの出芽による新血管の形成の過程である。この過程は、いくつかの病理の共通の主要な特色である。それらには、過度の血管形成が病理の一部分であって、従って、治療の標的となる疾患、最も重要なものとしては、癌が含まれる。血管形成が腫瘍において発生し、その成長、侵襲、および転移性増殖を可能にする。1971年、Folkmanが、腫瘍の成長および転移が血管形成依存性であることを提唱し、血管形成の阻害が腫瘍成長を阻止するための戦略となり得ることを示唆した。
【０００３】
細胞表面分子から、転写因子、増殖因子まで、いくつかの分子が血管形成に関与している。低酸素は、新血管新生をもたらし、血管内皮増殖因子（VEGF）およびその受容体、アンジオポエチンファミリーのメンバー、塩基性繊維芽細胞増殖因子、ならびにエンドセリン-1（ET-1）を含む、いくつかの血管形成促進性サイトカインの放出を誘導する、重要な環境因子である。これらの因子は、内皮細胞の活性化、増殖、および遊走の制御を通して、血管形成の誘導を媒介する。
【０００４】
内在性の血管形成阻害剤の組換え型が、癌の治療のために試験されたが、これらの組換え阻害剤の慢性送達には、薬物動態学的欠点、生物工学的欠点、および経済的欠点の可能性があるため、科学者は他のアプローチを開発するようになった。抗VEGFモノクローナル抗体ベバシズマブの開発は、抗血管形成性のターゲティングが、化学療法の補足的な治療モダリティとなることを確証した。第二世代の多重標的チロシンキナーゼ阻害剤を含む、いくつかの低分子阻害剤も、癌のための抗血管形成剤としての見込みを示している。
【０００５】
組換え阻害剤、抗体、および低分子の慢性送達には欠点があり、これらの薬物が単独治療として投与された時に出現する活性は限られているため、抗血管形成遺伝子治療が開発されるようになった。遺伝子治療は、遺伝性および後天性のヒト疾患を治療するための新生モダリティである。しかしながら、発現の継続時間、免疫応答の誘導、ベクターの細胞障害性、および組織特異性を含む、多数の障壁によって、遺伝子治療の開発の成功は妨げられている。
【０００６】
抗癌遺伝子治療のため、腫瘍指向性遺伝子治療または全身性遺伝子治療という二つの一般的な戦略が提案されている。全身治療による、癌細胞またはその環境への遺伝子治療生成物のターゲティングは十分に成功しておらず、相当の抗薬物免疫または抗ベクター免疫の危険があるため、全身投与の利点にも関わらず、大多数の治療は、腫瘍自体へ投与されている。患者の体内で発現された組換えの抗原またはエピトープに対して免疫を誘導するよう設計された「アデノウイルスワクチン」が試みられたが、主として期待外れの結果を与えている。従って、治療用組換えアデノウイルスベクターの全身反復投与に対する病理学的な宿主免疫応答を回避するため、免疫抑制、ベクター抗原に対する経口寛容化、およびベクターの遺伝学的修飾を含む、精巧な、危険の可能性のある、高コストの戦略が、提唱されている（Bangari et al,Current Gene Therapy 2006;6:215-226（非特許文献1）を参照のこと）。
【０００７】
米国特許第5,747,340号（特許文献1）は、血管形成細胞に対して選択性を示すマウス内皮細胞特異的プロモーターの使用、およびその治療的適用を教示している。
【０００８】
国際出願WO/2008/132729（特許文献2）は、開発された、修飾型マウスプレプロエンドセリンプロモーター（PPE-1-3X）とfasキメラ導入遺伝子［Fasおよびヒト腫瘍壊死因子（TNF）受容体］とを含有している、非複製型アデノウイルスベクター（Ad5、E1欠失）を開示している。修飾型マウスプロモーター（PPE-1-3X）は、血管形成性の血管にfasキメラ導入遺伝子の発現を制限し、これらの血管の指向的なアポトーシスをもたらすことができる。
【０００９】
PPE-1-3Xプロモーターによる内皮特異的遺伝子治療は、ウイルスの宿主との相互作用（例えば、トランスフェクション）の特異性は増加させないが、修飾型プロモーターを内因的に認識する組織、即ち、血管形成性の内皮細胞に、導入遺伝子の発現を制限する。キメラ受容体は、TNFαとの結合によってFas経路を誘発することができ、それは、肝臓のような非腫瘍正常組織に高発現しているFas/Fasリガンド機序を使用するより、非腫瘍性組織において低毒性である。さらに、TNFαは、腫瘍の微小環境に豊富に存在し、腫瘍およびその周囲における導入遺伝子活性の特異性を増すことが見出された。
【００１０】
予備的研究は、B16黒色腫およびルイス肺癌マウスモデルにおいて、PPE-1-3X-fasキメラの単回全身注射が、腫瘍を保持する器官に制限された導入遺伝子発現をもたらし、腫瘍成長遅延、転移性腫瘍腫瘤における血管の壊死、および腫瘍量の低下を引き起こすことを示した。
【００１１】
しかしながら、臨床的な状況における治療的な量の組換え抗血管形成アデノウイルスベクターの投与のための有効な手法は、未だ、欠如している。従って、本明細書に記載されたような現行の方法の短所のない、癌のような新血管新生に関連した状態の抗血管形成アデノウイルス治療のための、臨床的に実行可能なプロトコルのパラメーターを定義することが、大いに必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第5,747,340号
【特許文献２】国際出願WO/2008/132729
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Bangari et al,Current Gene Therapy 2006;6:215-226
【発明の概要】
【００１４】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を該対象に投与する工程を含み、該治療的有効量が少なくとも1×108ウイルス粒子である方法が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を該対象に投与する工程を含み、該アデノウイルスベクターがSEQ ID NO:9または10に示される核酸配列を含む、方法が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を、少なくとも2回の別個の投与で該対象に投与する工程を含み、1回目の投与と少なくとも2回目の投与の間の時間が、対象における抗Ad5抗体形成のために十分である、方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1×1013ウイルス粒子の単回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、その必要がある対象において甲状腺癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1×1012ウイルス粒子の単回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、その必要がある対象において神経内分泌癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1×1013ウイルス粒子の単回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの態様によると、前記投与量のアデノウイルスベクターの投与は、腫瘍の血管形成を阻害する。
【００２１】
本発明のいくつかの態様によると、前記投与量のアデノウイルスの投与は、腫瘍の成長を阻害する。
【００２２】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、アデノウイルスベクターを含む治療用組成物の治療的有効量を対象に投与する方法であって、該組成物を、少なくとも2回、該対象に投与する工程を含み、該投与が、該対象において該アデノウイルスベクターに対する抗アデノウイルス抗体の用量依存性の増加を誘導しない、方法が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、静脈内投与用に製剤化された、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターのウイルス粒子の単位投薬量と、アデノウイルスの投与についての説明とを含む、その必要がある対象において固形腫瘍を治療するためのキットが提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの態様によると、単位投薬量は、約3×1012ウイルス粒子、少なくとも約1×108〜約1×1016ウイルス粒子、少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子、任意で、少なくとも約3×1012ウイルス粒子を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの態様によると、fasキメラ導入遺伝子は、SEQ ID NO:3に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２６】
本発明のさらに他の態様によると、fasキメラ導入遺伝子は、SEQ ID NO:2に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２７】
本発明のさらに他の態様によると、fasキメラ導入遺伝子は、SEQ ID NO:4に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
本発明のいくつかの態様によると、マウスプレプロエンドセリンプロモーターは、SEQ ID NO:6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの態様によると、マウスプレプロエンドセリンプロモーターは、SEQ ID NO:7に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
本発明のさらに他の態様によると、マウスプレプロエンドセリンプロモーターは、SEQ ID NO:8に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明のさらに他の態様によると、マウスプレプロエンドセリンプロモーターは、SEQ ID NO:5に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３２】
本発明のさらに他の態様によると、マウスプレプロエンドセリンプロモーターは、SEQ ID NO:12に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの態様によると、マウスプレプロエンドセリンプロモーターは、SEQ ID NO:13に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３４】
本発明のいくつかの態様によると、非複製型アデノウイルスベクターはアデノウイルス5型ベクターである。
【００３５】
本発明のさらに他の態様によると、アデノウイルス5型ベクターは、SEQ ID NO:9または10に示される核酸配列を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの態様によると、固形腫瘍は癌性腫瘍である。
【００３７】
本発明のさらに他の態様によると、固形腫瘍は原発腫瘍である。
【００３８】
本発明のさらに他の態様によると、固形腫瘍は転移性腫瘍である。
【００３９】
いくつかの態様によると、固形腫瘍は甲状腺腫瘍である。
【００４０】
いくつかの態様によると、固形腫瘍は神経内分泌腫瘍である。
【００４１】
いくつかの態様によると、前記投与量のアデノウイルスベクターの投与は、腫瘍の血管形成を阻害する。
【００４２】
いくつかの態様によると、前記投与量のアデノウイルスベクターの投与は、腫瘍の成長を阻害する。
【００４３】
いくつかの態様によると、アデノウイルスは、投与後少なくとも約4日目に対象の血中に検出される。
【００４４】
いくつかの態様によると、投与後に血清抗アデノウイルス抗体の量が増加し、かつ投与後少なくとも約21日目に対象の血中でアデノウイルスが検出される。
【００４５】
本発明のいくつかの態様によると、アデノウイルスベクターは全身投与される。
【００４６】
本発明のさらに他の態様によると、ベクターは、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、注入、経口投与、直腸投与、経鼻投与、および吸入からなる群より選択される経路によって全身投与される。
【００４７】
本発明のさらに他の態様によると、アデノウイルスベクターの投与は、少なくとも2回の別個の全身投与で行われる。
【００４８】
本発明のいくつかの態様によると、アデノウイルスベクターの投与は、1回目の投与および少なくとも2回目の追加投与で行われ、1回目の投与は対象において抗Ad5抗体を誘導するのに十分であり、かつ1回目の投与と少なくとも2回目の投与の間の時間は、対象における抗Ad5抗体形成のために十分である。
【００４９】
本発明のいくつかの態様によると、対象は、非複製型アデノウイルスベクターのウイルス粒子による治療に加えて、化学療法剤もさらに投与されている。
【００５０】
本発明のいくつかの態様によると、化学療法剤は、ウイルス粒子による治療の前に、ウイルス粒子による治療と同時に、またはウイルス粒子による治療の後に投与される。
【００５１】
本発明のいくつかの態様によると、化学療法剤はスニチニブである。
【００５２】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および／または科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の態様の実施または試行において使用され得るが、例示的な方法および／または材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む本特許明細書が適用されるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、必ずしも限定的なものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明のいくつかの態様が、添付の図面および画像を参照しながら、単なる例として、本明細書に記載される。ここで、図面および画像を詳細に具体的に参照することにより、示された具体例が、例であって、本発明の態様の例示的な考察のみを目的とすることが強調される。この点に関して、図面と共に説明を参照することにより、本発明の態様が如何にして実施され得るかが、当業者には明白になるであろう。
【図１】図1A〜1Dは、ルイス肺癌モデルにおけるAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの全身投与による転移性疾患の阻害を例示する、写真を含むグラフである。図1A〜1Cは、対照（生理食塩水）およびAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターにより処理されたマウスの例示的な肺の写真である。切除された肺の肉眼的な形態学および重量の両方に反映されるような、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターによる、強力な用量依存性の転移発達の阻害に留意されたい（図1C）。
【図２】Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの投与後28日目における疾患進行の関数としての、コホート6（3×1012vp）の患者の血清中の中和抗Ad5抗体の処理前力価を示すヒストグラムである。進行（progressive disease）（青）と安定（stable disease）（赤）と抗体力価（Y軸）との間の相関の欠如に留意されたい。
【図３】図3Aおよび3Bは、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの投与後56日目における疾患進行の関数としての、患者の血清中の中和抗Ad5抗体の処理前力価を示すヒストグラムである。図3Aはコホート6についての値を表す。図3Bはコホート6および7についての値を表す。進行（青）と安定（赤）と中和抗体のベースライン力価との間の相関の欠如に留意されたい。
【図４】気管の部分閉塞（赤矢印）を引き起こしている傍気管転移を証明している、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの単回用量（3×1012ウイルス粒子）を投与された進行甲状腺乳頭癌を有する対象のベースライン（投与前）頚部CTスキャンである。
【図５】中央の液化（青矢印）を含む転移性病変の退縮（赤矢印）を証明している、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの投与後6ヵ月目の、図4に記載されたのと同一の対象の追跡頚部CTである。
【図６Ａ】進行神経内分泌癌を有する対象におけるAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与後の転移性病変の退縮を例示している腹部CTスキャンである。図6Aは、投与後21日目の肝臓内の転移性病変（円）を示す腹部CTスキャンである。
【図６Ｂ】進行神経内分泌癌を有する対象におけるAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与後の転移性病変の退縮を例示している腹部CTスキャンである。図6Bは、投与後50日目の肝臓内の病変の有意な退縮（円）を示す腹部CTスキャンである。
【図６Ｃ】進行神経内分泌癌を有する対象におけるAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与後の転移性病変の退縮を例示している腹部CTスキャンである。図6Cは、投与後112日目の肝臓内の病変のさらに大きな退縮（円）を示す腹部CTスキャンである。
【図７Ａ】図6Aに記載されたAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与後の転移性病変の退縮を例示している腹部CTスキャンである。異なる方向からの同一病変を示している、図6Aと同一の系列、同一の対象からのCTスキャン（異なるレベルでのCTスライス）である。
【図７Ｂ】図6Bに記載されたAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与後の転移性病変の退縮を例示している腹部CTスキャンである。異なる方向からの同一病変を示している、図6Bと同一の系列、同一の対象からのCTスキャン（異なるレベルでのCTスライス）である。
【図７Ｃ】図6Cに記載されたAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与後の転移性病変の退縮を例示している腹部CTスキャンである。異なる方向からの同一病変を示している、図6Cと同一の系列、同一の対象からのCTスキャン（異なるレベルでのCTスライス）である。
【図８】0日目、28日目、および56日目に測定され、0日目に観察されたスコアに対するRECISTスコアの変化率として表された、コホート1〜5の個々の患者の疾患応答を例示するグラフである。RECISTスコアのより大きな増加は、典型的には、進行を示す（実線＝安定、点線＝進行）。
【図９】0日目、28日目、および56日目に測定され、0日目に観察されたスコアに対するRECISTスコアの変化率として表された、コホート6および7の個々の患者の疾患応答を例示するグラフである。RECISTスコアのより大きな増加は、典型的には、進行を示す（実線＝安定、点線＝進行）。コホート6および7におけるRECISTスコアの比較的少ない変化の傾向に留意されたい。
【図１０】図10Aおよび10Bは、2人の甲状腺癌患者における疾患進行に対するAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクター（3×1012ウイルス粒子）の単回投与の効果を示す時系列である（本明細書中の実施例IIを参照のこと）。図10Aは、ほぼ2年の間隔で、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターを2回投与し、その期間の大部分において、無進行のままであった、難治性転移性甲状腺乳頭癌を有する患者の生存を図示する。図10Bは、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの単回用量を投与した後、120日目にモニタリングされた時、安定であり、無進行であった、甲状腺髄様癌を有する患者の無進行生存を示す。SD＝安定。PD＝進行。PR＝部分的応答。
【図１１】コホート1〜7（コホート1＝菱形◆；コホート2＝四角形■；コホート3＝三角形▲；コホート4＝「×」；コホート5＝星印；コホート6＝丸形●；コホート7＝縦線｜）におけるAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスの単回投与に対する体液性免疫応答を例示するグラフである。0日目（投与）、ならびに注入後7日目、14日目、21日目、および28日目に、（実施例IIに詳述されるように）個々の患者の抗アデノウイルス5型IgGレベルがアッセイされた。いくつかのコホート（例えば、1、3、4）では早くも7日目に免疫応答がプラトーに達し、他（例えば、コホート2、5、6、7）では比較的遅かったことに留意されたい。
【図１２Ａ】静脈内投与後のAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの薬物動態を示す。図12Aは、投与から注入後56日目までの血中のAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの薬物動態を図示するグラフである。1010（◆、黒実線）、3×1010（■、黒点線）、1011（▲、黒破線）、3×1011（×、灰色実線）、1012（■、灰色点線）、および3×1012（●、灰色破線）Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルス粒子を投与された患者の全血試料が、アデノウイルス5型DNAについて、示された時点で、RT-PCRによって分析された。56日目までにアデノウイルスレベルは少なくとも2桁低下するか、または検出不可能となった。
【図１２Ｂ】静脈内投与後のAd5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターの薬物動態を示す。図12Bは、ウイルスベクター注入の終了時に採取された全血における、RT-PCRによって分析されたアデノウイルス粒子の平均レベルを表す。
【図１３】図13Aおよび13Bは、転移性ルイス肺癌モデルに対する、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターとスニチニブとの組み合わせの効果を例示する。誘導肺転移を有するマウスに、示された投与量で、Ad5-PPE-1-3X fasキメラアデノウイルスベクターもしくは経口スニチニブのいずれか、または2種の治療の組み合わせを投与した。対照マウスには、空（偽）ウイルスビヒクルを投与した。原発腫瘍除去後22日目の腫瘍重量（g）（腫瘍量）によって肺転移が評価された。図13Aは、図13Bの値のヒストグラムである。80mg/kgスニチニブおよび109 Ad5-PPE-1-3X fasキメラウイルス粒子における、組み合わせ治療の増強された効果に留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および／または科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の態様の実施または試行において使用され得るが、例示的な方法および／または材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む本特許明細書が適用されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものに過ぎず、必ずしも限定的なものではない。
【００５５】
発明の具体的な態様の説明
本発明は、そのいくつかの態様において、抗血管形成アデノウイルスベクターおよびその治療的使用に関し、より具体的には、これに限定されるわけではないが、Ad5-PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターによる、患者における固形腫瘍の治療のための臨床プロトコルに関する。
【００５６】
本発明の少なくとも一つの態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明において示されるかまたは実施例によって例示される詳細に、その適用が必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の態様も可能であるか、または様々な方式で実行もしくは実施され得る。
【００５７】
血管形成は、新生物性の過剰増殖性の成長の発達のために必要とされる。癌のような新血管新生に関連した状態における抗血管形成治療のための遺伝子治療が調査されているが、インビトロ実験および動物モデルにおける有望な結果にも関わらず、臨床的な状況においては抗血管形成遺伝子治療はほとんど成功していない。それは、移入された遺伝子の発現の継続時間、宿主免疫応答の誘導、ベクターの細胞障害性、および発現の組織特異性を含む障壁のためである可能性が高い。
【００５８】
本発明者らは、多様な癌およびその他の過剰増殖性新血管依存性疾患の治療のため、例えば、固形腫瘍のために使用され得る、血管形成性内皮特異的修飾型マウスプレプロエンドセリンプロモーターの転写制御下で細胞障害性fasキメラエフェクター配列を含む治療用組換えアデノウイルスベクターの投与のための臨床的に安全で有効な手法を開発した。
【００５９】
従って、本発明の一つの局面によると、その必要がある対象において固形腫瘍を治療する方法であって、マウスプレプロエンドセリンプロモーターに転写的に連結されたfasキメラ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターの治療的有効量を該対象に投与し、それにより、固形腫瘍を治療する工程を含み、該治療的有効量が少なくとも1×108ウイルス粒子である方法が提供される。
【００６０】
本明細書において使用されるように、「癌」、「悪性疾患」、「固形腫瘍」、または「過剰増殖性障害」という語句は、同義的な用語として使用され、調節されない異常な細胞増殖、影響を受けた細胞が局所的にまたは血流およびリンパ系を通して身体の他の部分へ蔓延する（即ち、転移する）能力、ならびに多数の特徴的な構造的特色および／または分子的特色を特徴とする、多数の疾患のうちのいずれかをさす。「癌性の」または「悪性細胞」または「固形腫瘍細胞」とは、特定の構造的特性を有し、分化を欠き、侵襲能および転移能を有する細胞として理解される。「癌」とは、癌腫および肉腫を含む、哺乳動物に見出される全ての型の癌または新生物または悪性腫瘍をさす。例は、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、脳の癌、頭頸部癌、髄芽腫、骨癌、肝臓癌、結腸癌、尿生殖器癌、膀胱癌、泌尿器癌、腎臓癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頚癌、前立腺癌、黒色腫、中皮腫、肉腫である（DeVita,et al.,(eds.),2001,Cancer Principles and Practice of Oncology,6th.Ed.,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,Pa.を参照のこと；この参照は、参照により全ての目的のためその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００６１】
「癌に関連した」とは、対象の細胞における核酸およびその発現もしくはその欠如、またはタンパク質およびそのレベルもしくは活性もしくはその欠如と、悪性疾患の発症との関係をさす。例えば、癌は、正常健康細胞においては発現されないかまたはより低レベルに発現される特定の遺伝子の発現に関連している場合がある。反対に、癌関連遺伝子は、悪性細胞（もしくは形質転換を受けている細胞）においては発現されないか、または悪性細胞においては正常健康細胞において発現されるより低レベルに発現されるものであり得る。
【００６２】
「過剰増殖性疾患」とは、細胞が正常組織の成長より急速に増殖する任意の疾患または障害をさす。従って、過剰増殖細胞とは、正常細胞より急速に増殖している細胞である。
【００６３】
「新血管新生」および「血管形成」とは、新血管の成長をさす。病理学的な血管形成または新血管新生とは、自己制御されない内皮および内皮周囲の細胞増殖を含む、不均衡な新血管の成長をさす。「血管形成性疾患」とは、調節されない血管形成の状態、例えば、癌、眼新血管新生、関節炎、糖尿病、皮膚病、慢性関節リウマチ、乾癬、および滑膜炎のような慢性炎症性疾患である。
【００６４】
「進行癌」とは、もはや原発腫瘍部位に局在していない癌、またはAmerican Joint Committee on Cancer（AJCC）によるステージIIIもしくはIVである癌を意味する。
【００６５】
「耐容性が高い」とは、治療の結果として発生し、治療決定に影響を与えるであろう、健康状態の有害な変化が存在しないことをさす。
【００６６】
「転移性」とは、免疫不全マウスの乳房脂肪パッドおよび／または循環系への注射により、免疫不全マウスの肺、肝臓、骨、または脳において二次性の腫瘍病変を確立することができる腫瘍細胞、例えば、ヒト固形腫瘍または甲状腺悪性疾患をさす。
【００６７】
「固形腫瘍」には、肉腫、黒色腫、癌腫、またはその他の固形腫瘍癌が含まれるが、これらに限定されない。「肉腫」とは、胚性結合組織のような物質から構成され、一般に、繊維性のまたは均質な物質に埋め込まれた密に充填された細胞から構成される。肉腫には、軟骨肉腫、繊維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー（Abemethy）肉腫、脂肪肉腫（adipose sarcoma）、脂肪肉腫（liposarcoma）、胞状軟部肉種、エナメル芽細胞性肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、繊維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、B細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫、傍骨肉腫、網状赤血球性肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および末梢血管拡張性肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
「黒色腫」とは、皮膚およびその他の器官のメラノサイト系から発生する腫瘍をさす。黒色腫には、例えば、末端部黒子黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、S91黒色腫、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫が含まれる。
【００６９】
「癌腫」とは、周辺組織に浸潤し、転移を生じる傾向を有する、上皮細胞から構成された悪性新成長をさす。例示的な癌腫には、例えば、小葉（acinar）癌、小葉（acinous）癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌（carcinoma adenomatosum）、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌（basal cell carcinoma）、基底細胞癌（carcinoma basocellulare）、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、気管支肺胞癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、大脳様（cerebriform）癌、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面疱癌、体（corpus）癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱癌、円柱細胞癌、腺管癌、硬膜癌（carcinoma durum）、胎生期癌、脳様癌、類表皮癌、アデノイド上皮癌（carcinoma epitheliale adenoides）、外向発育癌、潰瘍癌、繊維性癌腫、ゼラチン様（gelatiniform）癌、コロイド腺癌、巨細胞癌（giant cell carcinoma）、巨細胞癌（carcinoma gigantocellulare）、腺癌（glandular carcinoma）、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血性（hematoid）癌、肝細胞癌、ハースル細胞癌、硝子様（hyaline）癌、副腎様（hypemephroid）癌、幼児型胎児性癌、上皮内癌（carcinoma in situ）、表皮内癌、上皮内癌、クロムペッヒャー（Krompecher's）癌、クルチツキー（Kulchitzky）細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（lenticular carcinoma）、レンズ状癌（carcinoma lenticulare）、脂肪腫性癌、リンパ上皮癌、髄様癌（carcinoma medullare）、髄様癌（medullary carcinoma）、黒色癌、髄様癌（carcinoma molle）、粘液性癌（mucinous carcinoma）、粘液性癌（carcinoma muciparum）、粘液細胞癌、粘液性類表皮癌、粘液癌（carcinoma mucosum）、粘液癌（mucous carcinoma）、粘液腫性癌（carcinoma myxomatodes）、鼻咽喉癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨（osteoid）癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄様癌（pultaceous carcinoma）、腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌（carcinoma sarcomatodes）、シュナイダー（schneiderian）癌、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌（carcinoma simplex）、小細胞癌、ソラノイド（solanoid）癌、回転楕円状（spheroidal）細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌（squamous carcinoma）、扁平上皮癌（squamous cell carcinoma）、ストリング（string）癌、毛細管拡張性癌（carcinoma telangiectaticum）、毛細管拡張性癌（carcinoma telangiectodes）、移行上皮癌、結節癌（carcinoma tuberosum）、結節癌（tuberous carcinoma）、ゆうぜい癌、および絨毛癌が含まれる。
【００７０】
追加の癌には、例えば、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、神経芽腫、神経内分泌癌、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌が含まれる。
【００７１】
本発明者らは、転移性甲状腺乳頭癌に罹患した患者において、Ad5-PPE-1-3X-fas-cアデノウイルスベクターの全身投与が、腫瘍重量の低下および不変の延長と相関していることを示した（以下の実施例IIならびに図4および5を参照のこと）。従って、本発明のいくつかの態様の一つの局面によると、その必要がある対象において甲状腺癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1013ウイルス粒子の単回または複数回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法が提供される。甲状腺癌における疾患進行は、腫瘍の重量および密度のエックス線分析（例えば、RECIST基準）、甲状腺ホルモンおよび甲状腺関連ホルモンのレベル、チログロブリンレベルの測定等を含むが、これらに限定されない方法によって、査定またはモニタリングされ得る。
【００７２】
本発明者らは、転移性神経内分泌癌に罹患した患者において、Ad5-PPE-1-3X-fas-cアデノウイルスベクターの全身投与が、転移性肝病変の低下および不変の延長と相関していることを示した（以下の実施例IIならびに図6A〜6C、7A〜7Cを参照のこと）。従って、本発明のいくつかの態様の一つの局面によると、その必要がある対象において神経内分泌癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1013ウイルス粒子の単回または複数回静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法が提供される。神経内分泌癌における疾患進行の査定またはモニタリングの方法には、腫瘍の重量および密度のエックス線分析（例えば、RECIST基準）、肝酵素レベル（腫瘍が肝臓転移である場合）の測定等が含まれる。
【００７３】
添付の特許請求の範囲に記載される本発明の方法は、その他の癌の治療においても有効であることが示された。従って、本発明のいくつかの態様のさらなる局面によると、その必要がある対象において卵巣癌、非小細胞肺癌、および／または腎細胞癌を治療する方法であって、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターを3×1012または1013ウイルス粒子の単回または複数回の静脈内投与量で該対象に投与する工程を含む、方法が提供される。これらの癌における疾患進行の査定またはモニタリングの方法には、腫瘍の重量および密度のエックス線分析（例えば、RECIST基準）、臓器機能の測定（例えば、腎細胞癌においては腎機能）、特異的なバイオマーカー、内分泌機能の測定等が含まれる。
【００７４】
治療されることが企図される対象には、哺乳動物、例えば、ヒトが含まれる。一つの態様によると、対象は、固形腫瘍に対する治療（例えば、放射線治療および／または化学療法）を過去に受けたことがあり、悪性腫瘍が再発したものである。もう一つの態様によると、対象は、悪性腫瘍に対する治療を過去に受けたことがないものである。
【００７５】
「ウイルスベクター」という語句は、宿主に核酸分子を移入することができる、複製能を有するウイルス粒子または複製欠損ウイルス粒子をさす。
【００７６】
本発明者らは、複製欠陥ベクター、および複製欠陥ベクターを産生するパッケージング細胞の使用を企図する。そのようなベクターの例は、アデノウイルスベクター、AAVベクター、およびレトロウイルスベクター、ならびにShir et al,Cellular and Molecular Neurobiology,Vol.21,No.6,December 2001（これの内容は、参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されたその他のベクターである。
【００７７】
「ウイルス」という用語は、タンパク質合成またはエネルギー発生の機序を有しない絶対細胞内寄生体をさす。ウイルスゲノムは、脂質膜のタンパク質のコーティングされた構造により含有されたRNAまたはDNAであり得る。本発明の実施において有用なウイルスの例には、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコビルナウイルス科が含まれる。組換えウイルスという用語には、キメラ（または多量体）ウイルス、即ち、複数のウイルス亜型からの補足的なコーディング配列を使用して構築されたベクターが含まれる（例えば、Feng,et al.Nature Biotechnology 15:866-870を参照のこと）。「アデノウイルス」という用語は、「アデノウイルスベクター」という用語と同義であり、アデノウイルス属のウイルスをさす。アデノウイルス科という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルのアデノウイルス亜属を含むが、これらに限定されない、マストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを集合的にさす。特に、ヒトアデノウイルスには、A〜F亜属およびそれらの個々の血清型が含まれ、個々の血清型およびA〜F亜属には、ヒトアデノウイルス1型、2型、3型、4型、4a型、5型、6型、7型、8型、9型、10型、11型（Ad11AおよびAd11P）、12型、13型、14型、15型、16型、17型、18型、19型、19a型、20型、21型、22型、23型、24型、25型、26型、27型、28型、29型、30型、31型、32型、33型、34型、34a型、35型、35p型、36型、37型、38型、39型、40型、41型、42型、43型、44型、45型、46型、47型、48型、ならびに91型が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ウシアデノウイルスという用語には、ウシアデノウイルス1型、2型、3型、4型、7型、および10型が含まれるが、これらに限定されない。イヌアデノウイルスという用語には、イヌ1型（CLL株、Glaxo株、RI261株、Utrect株、Toronto 26-61株）および2型が含まれるが、これらに限定されない。ウマアデノウイルスという用語には、ウマ1型および2型が含まれるが、これらに限定されない。ブタアデノウイルスという用語には、ブタ3型および4型が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一つの態様において、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型2型または5型に由来する。本発明の目的のため、アデノウイルスベクターは、標的細胞における複製能を有していてもよいし、または複製欠損であってもよい。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされる遺伝子が、細胞および／または環境に特異的なプロモーターに機能的に連結されている、条件的に複製するアデノウイルスまたは選択的に複製するアデノウイルスである。選択的に複製するアデノウイルスまたは条件的に複製するウイルスベクターの例は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第7,691,370号を参照のこと）。一つの態様において、アデノウイルスベクターは、E1遺伝子がプレプロエンドセリンプロモーターPPE-1（PPE-1、SEQ ID NO:13）の転写制御下にある、条件的に複製するアデノウイルスである。もう一つの態様において、アデノウイルスベクターは、E1遺伝子が修飾型プレプロエンドセリンプロモーターPPE-1-3X（PPE-1-3X、SEQ ID NO:12）の転写制御下にある、条件的に複製するアデノウイルス���たは選択的に複製するアデノウイルスである。いくつかの態様において、本発明において使用するのに適しているアデノウイルスベクターには、ヘキソンタンパク質構造を有する全てのアデノウイルス血清型が含まれる。治療的使用に適しているウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、AAV、ヘルペスウイルスベクター等が含まれる。例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第7,732,129号または第6,649,158号に詳細に記載されるように、ウイルスベクターの操作および作製は、当技術分野において周知である。具体的な態様において、アデノウイルスは、C型アデノウイルス（Ad5、Ad2）、B型アデノウイルス（Ad3、Ad16、Ad21、Ad35、Ad50）、E型アデノウイルス（Ad4）、またはF型アデノウイルス（Ad41）である。
【００７８】
本明細書において使用されるように、アデノウイルスベクターという語句は、ウイルス粒子内の核酸分子のうち、ウイルスベクターとして機能するのに必要な配列が、アデノウイルスゲノムに基づくベクターをさす。
【００７９】
一つの態様によると、アデノウイルスベクターは、非複製型血清型5型（Ad5）アデノウイルスベクターである。
【００８０】
もう一つの態様によると、アデノウイルスベクターは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:11に示される配列を含む。
【００８１】
本発明が、癌細胞において繁殖し、その後、最初に感染した細胞を溶解によって死滅させる腫瘍退縮性ウイルスの使用も企図することが認識されるであろう。そのようなウイルスは近隣の細胞への感染に進み、そのようにして、そのサイクルを繰り返す。腫瘍退縮性ウイルスの企図される例には、単純ヘルペスウイルス、条件的複製型Ad（CRAd）、およびレオウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
CRAdベクターの開発のための二つの主要な戦略は、ウイルス複製を標的細胞に制限し、正常組織においては複製しないよう、初期1（E1）遺伝子を遺伝子操作することに主として焦点を当てて開発されている。Ad524のような遺伝子補完型（1型）CRAdは、腫瘍細胞においては補完されるが、正常細胞においては補完されない、最初期（E1A）または初期（E1B）アデノウイルス領域における変異を有する。トランス補完型（2型）CRAdにおいて、ウイルス複製は、腫瘍／組織特異的プロモーターを介して制御される。
【００８３】
レオウイルスは、複製のために腫瘍細胞の活性化されたRasシグナリング経路を必要とする、天然に存在する腫瘍退縮性ウイルスである。Ras経路は、受容体チロシンキナーゼによる上流シグナリングを介して、大多数の悪性腫瘍において活性化されている。
【００８４】
前述のように、本発明のこの局面のウイルスベクターは、血管形成性内皮特異的修飾型マウスプレプロエンドセリンプロモーターの転写制御下で細胞障害性fasキメラエフェクター配列を含む。
【００８５】
典型的には、そのようなウイルスベクターは、遺伝子組み換えテクノロジーを使用して構築される（即ち、組換えウイルスベクター）。
【００８６】
Fasキメラ（Fas-c）ポリペプチドは、TNFR1の細胞外領域（SEQ ID NO:2）と、Fasの膜貫通領域および細胞内領域（SEQ ID NO:3）とから構築された、2腫の「デスレセプター」の以前に記載された融合体である［Boldin MP et al.J Biol Chem(1995)270(14):7795-8；これの内容は参照によって本明細書に組み入れられる]。
【００８７】
一つの態様によると、Fas-cは、SEQ ID NO:4に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。
【００８８】
本発明は、固形腫瘍の治療のための、その他の細胞障害性ポリペプチドに機能的に連結された内皮／内皮周囲細胞特異的プロモーターを含むウイルス構築物（例えば、アデノウイルス構築物）の使用も企図することが認識されるであろう。
【００８９】
そのようなポリペプチドには、p53およびegr-1-TNF-αのような自殺ポリペプチド、ガンシクロビル／チミジンキナーゼおよび5-フルオロシトシン／シトシンデアミナーゼのような薬物感受性治療（drug susceptibility therapy）のための細胞障害性プロドラッグ／酵素、ならびに5E1Aのような抗転移性ポリペプチドが含まれるが、これらに限定さない。
【００９０】
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用されるように、構成性または誘導可能な様式で、機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の細胞における転写を指図するDNA配列をさす。プロモーターには、連結されたプロモーターからの転写を刺激するエンハンサーエレメントも含まれ得る。
【００９１】
プレプロエンドセリンプロモーターとは、本明細書において使用されるように、哺乳動物起源のプレプロエンドセリン-1（PPE-1）プロモーターをさす。一つの態様において、プレプロエンドセリン1プロモーターは、マウスプレプロエンドセリン1プロモーター（PPE-1、SEQ ID NO:13）およびその修飾型である。その他の内皮特異的プロモーター、例えば、TIE-1プロモーター、TIE-2プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォン・ヴィルブランドプロモーター、KDR/flk-1プロモーター、FLT-1プロモーター、Egr-1プロモーター、ICAM-1プロモーター、VCAM-1プロモーター、PECAM-1プロモーター、および大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ACLP）プロモーターも、本発明において使用され得ることが認識されるであろう。
【００９２】
一つの態様によると、プロモーターは、内皮細胞特異的な転写活性を付与するエンハンサーエレメントの少なくとも1コピーを含む。一つの態様によると、エンハンサーエレメントは、（SEQ ID NO:6に示される）マウスPPE-1プロモーターの-364bp〜-320bpの位置に天然に見出される。一つの態様において、プロモーターは、上記エンハンサーエレメントを少なくとも2個、より好ましくは3個、含む。具体的な態様によると、プロモーターは、プロモーターDNAの一方の鎖に上記エンハンサーエレメントのうちの2個を含み、プロモーターDNAの相補鎖に上記エンハンサーエレメントのうちの1個を含む。
【００９３】
さらにもう一つの態様において、プロモーターは、任意で、他のエンハンサーエレメントと組み合わせて、SEQ ID NO:8に示される修飾型エンハンサーエレメントを含む。従って、この態様によると、プロモーターはSEQ ID NO:7に示される配列を含む。
【００９４】
もう一つの態様によると、プロモーターは、例えば、SEQ ID NO:5に示される配列を含む、少なくとも1個の低酸素応答エレメントをさらに含む。
【００９５】
本発明に関して使用され得る例示的なプロモーターには、SEQ ID NO:12に示される配列が含まれる。この配列は、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7（これ自体は、SEQ ID NO:8の1コピーの両側にSEQ ID NO:6の2コピーを含む）を含む。
【００９６】
本発明のこの局面の特定の態様によると、ウイルスベクターは、SEQ ID NO:9または10に示される配列からなる。
【００９７】
SEQ ID NO:9または10に示されるAd5-PPE-1-3X-fas-c配列は、核酸座標894〜1036に位置するSEQ ID NO:7のアンチセンスコピーである配列、ヌクレオチド座標951〜997に位置するSEQ ID NO:8の単一アンチセンスコピーである配列；ヌクレオチド座標907〜950に位置するSEQ ID NO:6の第1アンチセンスコピーである配列；ヌクレオチド座標993〜1036に位置するSEQ ID NO:6の第2アンチセンスコピーである配列；ならびに823〜866位のセンス方向のSEQ ID NO:6の第3コピーを含む。
【００９８】
本発明のいくつかの態様において、ウイルスベクターは、内皮特異的プロモーターの転写活性を増強するかまたは阻害することができる追加のポリヌクレオチド配列を含む。本発明のいくつかの態様の一局面によると、追加のポリヌクレオチド配列は、プレプロエンドセリン（PPE-1）プロモーターのエレメントXの少なくとも6ヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。ここで、エレメントXはSEQ ID NO:6に示される野生型配列を有し、少なくとも6個のヌクレオチドは、SEQ ID NO:6に由来する少なくとも2個の連続配列を含み、少なくとも2個の連続配列は、各々、少なくとも3個のヌクレオチドを含み、少なくとも3個のヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、
（i）SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチド；
（ii）SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチド；
（iii）SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチド；
（iv）SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6配列の少なくとも1個のヌクレオチド；
（v）SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1個のヌクレオチド；
（vi）SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列の少なくとも1個のヌクレオチド；および
（v）SEQ ID NO:21に（CTTTT）示された野生型M3配列の少なくとも1個のヌクレオチド：
からなる群より選択される、SEQ ID NO:6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の隣りに位置しており；少なくとも1個のヌクレオチド位置は、少なくとも1個のヌクレオチド置換、少なくとも1個のヌクレオチド欠失、および／または少なくとも1個のヌクレオチド挿入により、SEQ ID NO:6と比較して変異している。ただし、単離されたポリヌクレオチドが、PPE-1プロモーターに組み込まれ、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼコーディング配列）の上流に置かれた時、SEQ ID NO:6が、PPE-1プロモーターに同様に組み込まれ、レポーター遺伝子コーディング配列の上流に置かれた場合と比較して、レポーター遺伝子の発現レベルがアップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるよう、少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異は、SEQ ID NO:6の21〜24位におけるヌクレオチドGGTAおよび／またはSEQ ID NO:6の29〜32位におけるヌクレオチドCATGをもたらさない。
【００９９】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、生物のゲノムまたは完全染色体配列に、天然には存在しない。
【０１００】
本明細書において使用されるように、「天然に存在する」という語句は、人工的な修飾なしに自然界に見出されることをさす。
【０１０１】
上記のように、エレメントXの少なくとも6個のヌクレオチドは、SEQ ID NO:6に由来する少なくとも2個の連続配列を含む。
【０１０２】
本明細書において使用されるように、「SEQ ID NO:6に由来する連続配列」という語句は、ヌクレオチドが、それらが由来するSEQ ID NO:6の核酸配列と同一の順序で出現する核酸配列（ポリヌクレオチド）をさす。ヌクレオチドの順序は、先行するヌクレオチドの3'-OHと、後続のヌクレオチドの5'-リン酸との間で形成された化学結合（ホスホジエステル結合）によって決定されることに注意するべきである。
【０１０３】
本発明のいくつかの態様によると、少なくとも2個の連続配列は、各々、SEQ ID NO:6の少なくとも3ヌクレオチド、例えば、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、 31ヌクレオチド、32ヌクレオチド、33ヌクレオチド、34ヌクレオチド、35ヌクレオチド、36ヌクレオチド、37ヌクレオチド、38ヌクレオチド、39ヌクレオチド、40ヌクレオチド、41ヌクレオチドを含む。
【０１０４】
前記のように、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:6に由来する少なくとも2個の連続配列を含む。本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:6に由来する2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14の連続配列を含む。
【０１０５】
本明細書において使用されるように、ヌクレオチド配列に関して「野生型」という語句は、SEQ ID NO:6に出現する核酸配列をさす。例には、野生型M4配列（SEQ ID NO:15）、野生型M5配列（SEQ ID NO:16）、野生型M8（SEQ ID NO:19）、野生型M6配列（SEQ ID NO:17）、野生型M7配列（SEQ ID NO:18）、野生型M1（SEQ ID NO:20）、および野生型M3配列（SEQ ID NO:21）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明のいくつかの態様によると、変異は、SEQ ID NO:6に関するヌクレオチド位置における少なくとも1個のヌクレオチドの挿入である。本発明のいくつかの態様によると、挿入は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチド、例えば、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約55、少なくとも約60、少なくとも約65、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約100、少なくとも約200、少なくとも約300、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。
【０１０７】
変異によって挿入される配列は、任意の起源（例えば、種、組織、または細胞型）に由来してよく、エレメントXの配列の起源に限定されないことに注意するべきである。
【０１０８】
本発明のいくつかの態様によると、変異は、上記の変異の型、即ち、置換、挿入、および欠失の任意の組み合わせである。例えば、SEQ ID NO:6の1個のヌクレオチド位置が置換変異を受け、SEQ ID NO:6のもう1個のヌクレオチド位置が欠失または挿入を受けてもよい。さらに、または、あるいは、SEQ ID NO:6の1個のヌクレオチド位置が欠失変異を受け、SEQ ID NO:6のもう1個のヌクレオチド位置が置換または挿入を受けてもよい。さらに、または、あるいは、SEQ ID NO:6の1個のヌクレオチド位置が挿入変異を受け、SEQ ID NO:6のもう1個のヌクレオチド位置が置換または欠失を受けてもよい。その他の様々な組み合わせも可能であることに注意するべきである。
【０１０９】
本発明の具体的な態様によると、本発明の単離されたポリヌクレオチドの変異は、SEQ ID NO:6の21〜24位におけるヌクレオチドGGTAおよび／またはSEQ ID NO:6の29〜32位におけるヌクレオチドCATGをもたらさない。
【０１１０】
本明細書において使用されるように、「PPE-1プロモーターに組み込まれた」という語句は、PPE-1プロモーター配列内に共有結合で接合したヌクレオチド配列（単離されたポリヌクレオチド）をさす。
【０１１１】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、以下のものからなる群より選択される核酸配列の少なくとも1コピーをさらに含む：
（i）SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列、
（ii）SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列、
（iii）SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列、
（iv）SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6配列、
（v）SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列；
（vi）SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列、および
（vii）SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列。
【０１１２】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、任意の公知の（または未知の）プロモーター配列の内部（内側）、下流、または上流に組み込まれ、それにより、プロモーターの転写促進活性を調節する（例えば、増加させる、減少させる、組織特異性を改変する、誘導性または構成性の発現を改変する）。
【０１１３】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、機能的に連結された異種ポリヌクレオチドの内皮細胞における発現を増加させるためのものである。そのようなポリヌクレオチドは、エレメントX由来の追加の配列の存在下もしくは非存在下で、かつ／またはエレメントX由来の他の変異型配列の存在下で、M4および／またはM5の野生型配列を含み得る。
【０１１４】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1コピーを含む。
【０１１５】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０１１６】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０１１７】
本発明のいくつかの態様によると、SEQ ID NO:6と比較して変異している少なくとも1個のヌクレオチド位置は、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドである。そのような単離されたポリヌクレオチドは、野生型M6配列（SEQ ID NO:17）および／または野生型M7配列（SEQ ID NO:18）をさらに含んでいてもよいことに注意するべきである。
【０１１８】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:55〜62に提供される。
【０１１９】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:63〜66に提供される。
【０１２０】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:67〜70に提供される。
【０１２１】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列の少なくとも1コピーをさらに含む。
【０１２２】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:71〜105に提供される。
【０１２３】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:106〜136に提供される。
【０１２４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:137〜152に提供される。
【０１２５】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、機能的に連結された異種ポリヌクレオチドの内皮細胞における発現を低下させる。そのようなポリヌクレオチドは、エレメントX由来の追加の配列の存在下もしくは非存在下で、かつ／またはエレメントX由来の他の変異型配列の存在下で、M4および／またはM5の変異を含み得る。
【０１２６】
本発明のいくつかの態様によると、SEQ ID NO:6と比較して変異している少なくとも1個のヌクレオチド位置は、SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドである。
【０１２７】
SEQ ID NO:46（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:153〜162に提供される。
【０１２８】
本発明のいくつかの態様によると、SEQ ID NO:6と比較して変異している少なくとも1個のヌクレオチド位置は、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドである。
【０１２９】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:163〜171に提供される。
【０１３０】
本発明のいくつかの態様によると、SEQ ID NO:6と比較して変異している少なくとも1個のヌクレオチド位置は、SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチド、およびSEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドである。
【０１３１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:172〜180に提供される。
【０１３２】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、機能的に連結された異種ポリヌクレオチドの、内皮細胞以外の細胞における発現を増加させるためのものである。そのようなポリヌクレオチドは、エレメントX由来の追加の配列の存在下もしくは非存在下で、かつ／またはエレメントX由来の他の変異型配列の存在下で、M4および／またはM5の変異、ならびにM6および／またはM7の野生型配列を含み得る。
【０１３３】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、M4（SEQ ID NO:15）および／またはM5（SEQ ID NO:16）の変異、ならびにSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピーおよび／またはSEQ ID NO:18に示される野生型M7の少なくとも1コピーを含む。
【０１３４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:181〜182に提供される。
【０１３５】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:183〜189に提供される。
【０１３６】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:190〜191に提供される。
【０１３７】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーをさらに含む。
【０１３８】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:192〜195に提供される。
【０１３９】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:196〜198に提供される。
【０１４０】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:199〜202に提供される。
【０１４１】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーをさらに含む。
【０１４２】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:203〜205に提供される。
【０１４３】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:206〜207に提供される。
【０１４４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:208〜209に提供される。
【０１４５】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、機能的に連結された異種ポリヌクレオチドの細胞における発現を低下させる。そのようなポリヌクレオチドは、エレメントX由来の追加の配列の存在下もしくは非存在下で、かつ／またはエレメントX由来の他の変異型配列の存在下で、M4、M5、 M6、および／またはM7の変異を含み得る。
【０１４６】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M4（SEQ ID NO:15）および／または野生型M5（SEQ ID NO:47）ならびにSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個の変異を含む。
【０１４７】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:210〜213に提供される。
【０１４８】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:214〜222に提供される。
【０１４９】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:223〜231に提供される。
【０１５０】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個の変異をさらに含む。
【０１５１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:232〜236に提供される。
【０１５２】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:237〜240に提供される。
【０１５３】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:241〜248に提供される。
【０１５４】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個の変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個の変異をさらに含む。
【０１５５】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:249〜258に提供される。
【０１５６】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:259〜264に提供される。
【０１５７】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:265〜270に提供される。
【０１５８】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、エレメントX（SEQ ID NO:6）に由来する追加の野生型または変異型の配列と共に、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む。
【０１５９】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:271〜279に提供される。
【０１６０】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:280〜287に提供される。
【０１６１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:288〜291に提供される。
【０１６２】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:294〜298に提供される。
【０１６３】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:299〜301に提供される。
【０１６４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:302〜303に提供される。
【０１６５】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:304〜308に提供される。
【０１６６】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:309〜311に提供される。
【０１６７】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:312〜315に提供される。
【０１６８】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:316に提供される。
【０１６９】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:317に提供される。
【０１７０】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:318に提供される。
【０１７１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:319〜327に提供される。
【０１７２】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:328〜333に提供される。
【０１７３】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:334〜337に提供される。
【０１７４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:338〜344に提供される。
【０１７５】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:345〜348に提供される。
【０１７６】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:349〜354に提供される。
【０１７７】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:355〜361に提供される。
【０１７８】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:362〜365に提供される。
【０１７９】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:366〜369に提供される。
【０１８０】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、エレメントX（SEQ ID NO:6）に由来する追加の野生型または変異型の配列と共に、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む。
【０１８１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:378〜384に提供される。
【０１８２】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:628〜634に提供される。
【０１８３】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:370〜377に提供される。
【０１８４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:385〜390に提供される。
【０１８５】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:391〜396に提供される。
【０１８６】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:397〜401に提供される。
【０１８７】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:402〜409に提供される。
【０１８８】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:410〜417に提供される。
【０１８９】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:418〜423に提供される。
【０１９０】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:424〜425に提供される。
【０１９１】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:538〜540に提供される。
【０１９２】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:426に提供される。
【０１９３】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:427〜435に提供される。
【０１９４】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:436〜444に提供される。
【０１９５】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:445〜451に提供される。
【０１９６】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:452〜458に提供される。
【０１９７】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:459〜465に提供される。
【０１９８】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:466に提供される。
【０１９９】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:467〜471に提供される。
【０２００】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:472〜477に提供される。
【０２０１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:478〜483に提供される。
【０２０２】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、エレメントX（SEQ ID NO:6）に由来する追加の野生型または変異型の配列と共に、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーおよびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーをさらに含む。
【０２０３】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:484〜495に提供される。
【０２０４】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:496〜507に提供される。
【０２０５】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:508〜515に提供される。
【０２０６】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:516〜519に提供される。
【０２０７】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:520〜523に提供される。
【０２０８】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:524〜525に提供される。
【０２０９】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:526〜529に提供される。
【０２１０】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:530〜533に提供される。
【０２１１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:534〜535に提供される。
【０２１２】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:536〜537に提供される。
【０２１３】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:538〜539に提供される。
【０２１４】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:540に提供される。
【０２１５】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:541〜547に提供される。
【０２１６】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:548〜554に提供される。
【０２１７】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:555〜559に提供される。
【０２１８】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:560〜566に提供される。
【０２１９】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:567〜573に提供される。
【０２２０】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:574〜578に提供される。
【０２２１】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:579〜583に提供される。
【０２２２】
SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:584〜588に提供される。
【０２２３】
SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7の少なくとも1個のヌクレオチド位置の変異、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:589〜592に提供される。
【０２２４】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M6（SEQ ID NO:17）および／または野生型M7（SEQ ID NO:50）の少なくとも1個の変異と共に、野生型M3配列（SEQ ID NO:21）の少なくとも1コピーおよび野生型M8配列（SEQ ID NO:19）の少なくとも1コピーを含む。
【０２２５】
野生型M6配列（SEQ ID NO:17）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、および／または野生型M7（SEQ ID NO:18）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異と共に、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーおよびSEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:593〜600に提供される。
【０２２６】
本発明者らは、組織特異的エンハンサー（例えば、野生型M4および／もしくは野生型M5）、ならびに／または誘導型エンハンサー（例えば、発達関連エンハンサーもしくはストレス関連エンハンサー）に加えて、野生型M8配列（SEQ ID NO:19）および／または野生型M3（SEQ ID NO:21）配列を含む、単離されたポリヌクレオチドは、非標的細胞においては、または非誘導条件下では、発現を抑制することにより、より特異的な調節効果を発揮すると予想されると考えた。
【０２２７】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーおよび内皮特異的エンハンサー配列を含む。
【０２２８】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーおよびSEQ ID NO:15に示される野生型M4配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２２９】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピーおよびSEQ ID NO:16に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３０】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:15に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:16に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３１】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーおよび内皮特異的エンハンサー配列を含む。
【０２３２】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーおよびSEQ ID NO:15に示される野生型M4配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３３】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピーおよびSEQ ID NO:16に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３４】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:15に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:16に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３５】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、および内皮特異的エンハンサー配列を含む。
【０２３６】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:15に示される野生型M4配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３７】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:16に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３８】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:15に示される野生型M4配列の少なくとも1コピー、およびSEQ ID NO:16に示される野生型M5配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２３９】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列の少なくとも1コピー、SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列の少なくとも1コピー、ならびに野生型M6（SEQ ID NO:17）および／または野生型M7配列（SEQ ID NO:18）のような少なくとも1個のエンハンサーエレメントを含む。
【０２４０】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M8配列（SEQ ID NO:19）の少なくとも1コピー、野生型M7（SEQ ID NO:18）および／または野生型M9配列（SEQ ID NO:14、CTGGA）の少なくとも1コピーのような追加の隣接配列と共に、野生型M8の少なくとも1コピーを含み；かつ／または単離されたポリヌクレオチドは、M9（SEQ ID NO:22）と共に、またはM9なしに、野生型M8の少なくとも1コピーおよびM7の少なくとも1個の変異を含む。そのようなポリヌクレオチドは、非特異的リプレッサーとして使用され得る。
【０２４１】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、機能的に連結された異種ポリヌクレオチドの細胞／組織における発現を増加させるためのものである。
【０２４２】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6配列の少なくとも1コピーおよび／またはSEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列の少なくとも1コピーを含む。
【０２４３】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M6（SEQ ID NO:17）の少なくとも1コピーおよび野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む。
【０２４４】
野生型M6（SEQ ID NO:17）の少なくとも1コピーおよび野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:23〜26に提供される。
【０２４５】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M7（SEQ ID NO:18）の少なくとも1コピーおよび野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む。
【０２４６】
野生型M7（SEQ ID NO:18）の少なくとも1コピーおよび野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:27〜28に提供される。
【０２４７】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M6（SEQ ID NO:17）の少なくとも1コピー、野生型M7（SEQ ID NO:18）の少なくとも1コピー、および野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む。
【０２４８】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M1（SEQ ID NO:20）の少なくとも1コピーおよび野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む。
【０２４９】
野生型M1（SEQ ID NO:20）の少なくとも1コピーおよび野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:43〜54および601〜632に提供される。
【０２５０】
本発明のいくつかの態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、野生型M1（SEQ ID NO:20）の少なくとも1コピー、野生型M6（SEQ ID NO:17）の少なくとも1コピー、および／または野生型M7（SEQ ID NO:18）の少なくとも1コピー、ならびに野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異を含む。
【０２５１】
野生型M8（SEQ ID NO:19）の少なくとも1個のヌクレオチドの変異、ならびに野生型M1（SEQ ID NO:20）、野生型M6（SEQ ID NO:17）、および／または野生型M7（SEQ ID NO:18）の少なくとも1コピーを含む、単離されたポリヌクレオチドの非限定的な例は、SEQ ID NO:29〜42に提供される。
【０２５２】
本発明のいくつかの態様に従って使用され得る、調節性の単離されたポリヌクレオチドの追加の例は、以下の実施例セクションに提供される（SEQ ID NO:633〜644）。
【０２５３】
本発明のいくつかの態様の一局面によると、SEQ ID NO:13に示されるプレプロエンドセリン（PPE-1）プロモーターを含む第1のポリヌクレオチドと、以下のものからなる群より選択される核酸配列の少なくとも1コピーを含む第2のポリヌクレオチドとを含む核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される：
（i）SEQ ID NO:15（CATTC）に示される野生型M4配列、
（ii）SEQ ID NO:16（CAATG）に示される野生型M5配列、
（iii）SEQ ID NO:19（GCTTC）に示される野生型M8配列、
（iv）SEQ ID NO:17（GGGTG）に示される野生型M6配列、
（v）SEQ ID NO:18（ACTTT）に示される野生型M7配列；
（vi）SEQ ID NO:20（GTACT）に示される野生型M1配列、および
（vii）SEQ ID NO:21（CTTTT）に示される野生型M3配列；
ただし、第2のポリヌクレオチドはSEQ ID NO:6（エレメントX）ではなく、かつ単離されたポリヌクレオチドはSEQ ID NO:12（PPE-1-3X）ではない。
【０２５４】
本発明のいくつかの態様によると、野生型M4、M5、M8、M6、M7、および／またはM1配列の各々は、SEQ ID NO:13に示されるPPE-1プロモーターに対して頭-尾（5'→3'）方向に置かれる。
【０２５５】
本発明のいくつかの態様によると、野生型M4、M5、M8、M6、M7、および／またはM1配列の各々は、SEQ ID NO:13に示されるPPE-1プロモーターに対して尾-頭（3'→5'）方向に置かれる。
【０２５６】
本発明のいくつかの態様によると、野生型M4、M5、M8、M6、M7、および／もしくはM1配列は、他の野生型M4、M5、M8、M6、M7、および／もしくはM1配列に対して、かつ／またはSEQ ID NO:13の方向に対して、様々な方向（頭-尾もしくは尾-頭）および／または配列順序で置かれる。
【０２５７】
そのようなウイルスベクターの構築は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),in Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)、Chang et al.,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)、Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995)、Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)、およびGilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]に記載されたもののような公知の分子生物学技術を使用して達成され得る。
【０２５８】
SEQ ID NO:9のウイルスベクターの構築は、国際出願WO/2008/132729に記載されており、その内容は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２５９】
本明細書において使用されるように、「投与」という用語は、任意の有効な経路によって、抗血管形成ウイルス組成物のような剤を、対象に提供するかまたは与えることをさす。
【０２６０】
本発明のこの局面のウイルスベクターは、そのまま投与されてもよいし、または生理学的に許容される担体も含む薬学的組成物の一部分として投与されてもよい。薬学的組成物の目的は、有効成分の生物への投与を容易にすることである。
【０２６１】
本明細書において使用されるように、「薬学的組成物」とは、生理学的に適当な担体および賦形剤のようなその他の化学成分を含む、本明細書に記載された有効成分のうちの一つまたは複数の調製物をさす。薬学的組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
【０２６２】
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果を担う本発明のウイルスベクターをさす。
【０２６３】
以後、交換可能に使用され得る「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して有意な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しない担体または希釈剤をさす。佐剤は、これらの語句に含まれる。
【０２６４】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質をさす。賦形剤の例には、非限定的に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。
【０２６５】
薬物の製剤化および投与のための技術は、参照によって本明細書に組み入れられる「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Co.,Easton,PA）最新版に見出され得る。
【０２６６】
適当な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に、経鼻送達、腸管送達、または筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、および髄内注射を含む非経口送達が含まれ、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、心臓内注射、例えば、右心室もしくは左心室への注射、総頸動脈への注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、または眼球内注射、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路、および吸入経路も含まれ得る。脊髄液へのウイルスベクターの注射も、投与モードとして使用され得る。
【０２６７】
ウイルスベクターまたはその組成物は、入院状況においてもまたは外来状況においても投与され得る。一つの特定の態様において、ウイルスベクターまたはその組成物は、注射または静脈点滴で投与される。
【０２６８】
本発明は、免疫応答を回避するか、抑制するか、または操作し、理想的には、持続的な発現および導入遺伝子生成物に対する免疫寛容をもたらすためのウイルスベクターの操作も企図する。そのような方法は、例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Nayak et al.,Gene Therapy(12 November 2009)に記載されている。
【０２６９】
あるいは、例えば、患者の組織または腫瘤への薬学的組成物の直接注射、さらに直接的には、腫瘍細胞自体への注射を介して、全身的にではなく局所的に薬学的組成物を投与することも可能である。
【０２７０】
本発明の薬学的組成物は、当技術分野において周知の過程、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成、粉砕、乳化、封入、閉じ込め、または凍結乾燥の過程によって製造され得る。
【０２７１】
従って、本発明に従い使用するための薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む一つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化され得る。適切な製剤は、選ばれた投与経路に依存する。
【０２７２】
注射の場合、薬学的組成物の有効成分は、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理学的塩緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液で、水性溶液へと製剤化され得る。経粘膜投与の場合、浸透すべき関門にとって適切な浸透剤が、製剤において使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に公知である。
【０２７３】
頬投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
【０２７４】
鼻吸入による投与の場合、本発明に従い使用するための有効成分は、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素の使用により、加圧されたパックまたは噴霧器からエアロゾルスプレー提示の形態で便利に送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量単位は、一定量を送達する弁を準備することにより、決定され得る。ディスペンサーにおいて使用するためのカプセルおよびカートリッジ、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、乳糖またはデンプンのような適当な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化され得る。
【０２７５】
本明細書に記載された薬学的組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による、非経口投与のために製剤化され得る。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルにおいて提示されてもよいし、または多用量容器において提示されてもよく、任意で、保存剤が添加され得る。組成物は、油性もしくは水性のビヒクルによる懸濁物、溶液、またはエマルションであり得、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤のような製剤化用の剤を含有していてもよい。
【０２７６】
非経口投与用の薬学的組成物には、水溶性の形態の活性調製物の水性溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物が、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されてもよい。適当な親油性の溶媒またはビヒクルには、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射用懸濁物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁物の粘性を増加させる物質を含有していてもよい。任意で、懸濁物は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするため、適当な安定剤、または有効成分の溶解度を増加させる剤を含有していてもよい。
【０２７７】
あるいは、有効成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば、無菌の発熱性物質を含まない水性溶液により再生させるため、粉末形態であってもよい。
【０２７８】
本発明の薬学的組成物は、例えば、カカオ脂またはその他のグリセリドのような従来の坐剤用基剤を使用して、坐剤または停留浣腸のような直腸用組成物へと製剤化されてもよい。
【０２７９】
本発明に関して使用するために適当な薬学的組成物には、意図された目的を達成するのに有効な量で有効成分が含有されている組成物が含まれる。より具体的には、治療的有効量とは、障害（例えば、甲状腺癌、神経内分泌癌）の症状を防止するか、軽減するか、もしくは寛解させるか、または治療されている対象の生存を延長するために有効な有効成分（即ち、ウイルス粒子）の量を意味する。
【０２８０】
治療的有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明のアデノウイルスベクターの投与の治療的効果は、臨床像、生化学的パラメーター、放射線学的評価等を含む、多様な基準に従って査定され得る。いくつかの態様において、効果は、以下の例示的なパラメーターのうちの一つまたは複数に従って評価される：
体内分布：例えば、血液試料中および尿試料中のウイルスDNAのレベル、血中のfas-c導入遺伝子（mRNA）の発現；
抗体：例えば、血清中の全抗Ad-5 Ig、IgG、および中和抗Ad5抗体のレベル；
血管形成バイオマーカー：例えば、血中のフォン・ヴィルブランド因子、TNFα、VEGFR1、およびVEGFR2のレベル；
サイトカインレベル：例えば、末梢血サイトカインレベル（例えば、IL-6、IL-8、表6を参照のこと）；
腫瘍応答：腫瘍寸法を、CT（もしくはMRI）スキャンまたはその他のX線手段で測定することができる。次いで、腫瘍応答を、RECIST（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）のような一般に認められている基準に従って評価することができる。
【０２８１】
基準は、投与後の任意の時点で評価され得、投与前の値と比較されてもよい。一つの態様において、評価基準は、アデノウイルスベクターの投与前に査定され、次いで、投与後、4±1日目、7±1日目、14±1日目、28±2日目、56±3日目、112±4日目、約3ヶ月目、約4ヶ月目、約5ヶ月目、約6ヶ月目、約1年目、またはそれ以降に査定され得る。いくつかの態様において、評価基準は、投与後、7±1日目、14±1日目、28±2日目、56±3日目、112±4日目、約3ヶ月目、約6ヶ月目、約9ヵ月目、約1年目、その後は、2年目、3年目、4年目、またはそれ以降まで、約3ヵ月毎に査定され得る。
【０２８２】
投与の安全性または投与レジメンの決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。安全性は、臨床像、組織および器官の病理、異常な生命徴候の存在（例えば、発熱、疲労、悪寒、頻脈、高血圧、便秘等）、血液学的値（例えば、ヘモグロビン、ヘマトクリット、RCV等）、化学、または尿検査異常（アルカリホスファターゼ、ALT、AST、ビリルビン等のような酵素の上昇）、ならびにECG、EEG等を含むが、これらに限定されない、多様な基準に従って査定され得る。
【０２８３】
本明細書において使用されるように、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をさす。「抗体」という用語には、完全分子のみならず、マクロファージに結合することができる、Fab、F(ab')2、およびFvのような、その機能性断片も含まれる。これらの機能性の抗体断片は、以下のように定義される：（1）抗体分子の一価の抗原結合断片を含有している断片、Fabは、完全な軽鎖および重鎖の一部分を与える、酵素パパインによる完全抗体の消化により作製され得る；（2）完全な軽鎖および重鎖の一部分を与えるため、ペプシンにより完全抗体を処理し、続いて、還元することにより入手され得る抗体分子の断片、Fab'；各抗体分子につき2個のFab'断片が入手される；（3）酵素ペプシンにより完全抗体を処理し、その後、還元しないことにより入手され得る抗体の断片、(Fab')2；F(ab')2は、2個のジスルフィド結合によって接続された2個のFab'断片の二量体である；（4）2本の鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有している、遺伝子操作された断片として定義されるFv；ならびに（5）遺伝学的に融合させられた単鎖分子として、適当なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有している、遺伝子操作された分子、単鎖抗体（「SCA」）。
【０２８４】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を作製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988を参照のこと）。
【０２８５】
本明細書において使用されるように、「抗原」という用語は、哺乳動物に注射されるかまたは吸収される組成物を含む、哺乳動物における抗体の生成またはT細胞応答を刺激することができる物質をさす。抗原は、異種免疫原によって誘導されたものを含む、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する。「抗原」という用語には、全ての関連する抗原性エピトープが含まれる。一例において、抗原は癌抗原である。標的抗原とは、例えば、腫瘍退縮のような治療効果を達成するため、免疫応答が望まれる抗原である。
【０２８６】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療的有効量または用量は、インビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定され得る。例えば、用量は、所望の濃度または力価を達成するため、動物モデルにおいて公式化され得る。そのような情報が、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０２８７】
治療的有効量の有効成分は、単位用量へ製剤化され得る。本明細書において使用されるように、「単位用量」とは、個々にまたは集合的に抗癌効果のような所望の効果を生ずるよう計算された活性材料の予定された量を含有している、物理的に不連続の単位をさす。単回の単位用量または複数回の単位用量が、抗癌治療効果のような所望の効果を提供するために使用され得る。いくつかの態様において、単位投薬量は、1×108〜約1×1016ウイルス粒子、少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子、任意で、約1×1011、約3×1011、約5×1011、約1×1012、約3×1012、約5×1012、約1×1013、約3×1013、またはそれ以上のウイルス粒子である。
【０２８８】
本明細書に記載された有効成分の毒性および治療効果は、インビトロで、細胞培養物で、または実験動物で、標準的な薬学的手法によって決定され得る。これらのインビトロアッセイ、細胞培養アッセイ、および動物研究から入手されたデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を公式化するために使用され得る。投薬量は、利用される剤形および利用される投与経路に依って変動し得る。正確な製剤、投与経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選ばれ得る（例えば、Fingl,et al.,1975,in "The Pharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1 p.1を参照のこと）。
【０２８９】
投薬量および間隔は、生物学的効果を誘導するかまたは抑制するのに十分な有効成分のレベル（最小有効濃度、MEC）を提供するため、個々に調整され得る。MECは、各調製物について変動するであろうが、インビトロデータから推定され得る。MECを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴および投与経路に依るであろう。検出アッセイが、血漿濃度を決定するために使用され得る。
【０２９０】
治療すべき状態の重度および応答性に依って、投与は、単回投与であってもよいし、または複数回投与であってもよく、治療の課程は、数日〜数週間、または治癒が達成されるかもしくは疾患状態の縮小が達成されるまで、継続される。
【０２９１】
投与される組成物の量は、当然、治療される対象、罹患の重度、投与の様式、処方する医師の判断等に依存するであろう。
【０２９２】
一つの態様によると、約103〜約1016ウイルス粒子が、対象に投与される。
【０２９３】
もう一つの態様によると、約105〜約1013ウイルス粒子が、対象に投与される。
【０２９４】
一つの態様によると、約107〜約1012ウイルス粒子が、対象に投与される。
【０２９５】
一つの態様によると、約1×1012〜約5×1012ウイルス粒子が、対象に投与される。
【０２９６】
さらにもう一つの態様によると、約1×109〜約1×1016ウイルス粒子、少なくとも約1×1011〜約1×1013ウイルス粒子が、対象に投与される。
【０２９７】
さらにもう一つの態様によると、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10の1×1012〜1×1013ウイルス粒子が、対象に静脈内投与される。
【０２９８】
さらにもう一つの態様によると、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10の1×1012〜1×1013ウイルス粒子が、少なくとも2回、対象に静脈内投与される。さらにもう一つの態様によると、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10の1×1012〜1×1013ウイルス粒子が、少なくとも3回またはそれ以上、対象に静脈内投与される。特定の態様において、少なくとも2回の投与は、少なくとも約1日、少なくとも約3日、少なくとも約5日、少なくとも約7日、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約6ヶ月、少なくとも約9ヶ月、少なくとも約1年、少なくとも約1.25年、少なくとも約1.5年、少なくとも約1.75年、少なくとも約2年、少なくとも約2.5年、少なくとも約3年、またはそれ以上の間隔で行われる。
【０２９９】
本発明の組成物は、望まれる場合、有効成分を含有している一つまたは複数の単位剤形を含有していてもよいFDA認可キットのようなパックまたはディスペンサー装置で提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックのような、金属またはプラスチックのフォイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与についての説明が添付され得る。パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態で、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的な投与の、機関による承認を反映する、容器に関連した通知に適合していてもよい。そのような通知は、例えば、処方薬についてのU.S.Food and Drug Administrationによって認可された表示、または認可された製品インサートであり得る。適合性の薬学的担体で製剤化された本発明の調製物を含む組成物は、さらに上に詳述されたように、調製され、適切な容器に置かれ、適応症の治療についての表示を付され得る。
【０３００】
従って、本発明のいくつかの態様のいくつかの局面によると、静脈内投与用に製剤化された、SEQ ID NO:9または10に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む非複製型アデノウイルスベクターのウイルス粒子の単位投薬量と、アデノウイルスの投与についての説明とを含む、その必要がある対象において固形腫瘍を治療するためのキットが提供される。
【０３０１】
アデノウイルスベクターは、他の治療と組み合わせて使用されてもよい。例えば、操作された抗体または低分子ペプチドによりベクターを処理することによって、EC細胞へのアデノウイルスベクターの取り込みを増強することができる。そのような「アデノボディ（adenobody）」処理は、細胞上のEGF受容体にアデノウイルス構築物を差し向けるために有効であることが示された（Watkins et al 1997,Gene Therapy 4:1004-1012）。さらに、Nicklinらは、ファージディスプレイを介して単離された低分子ペプチドが、培養物中で、内皮細胞におけるベクターの特異性および効率を増加させ、肝細胞における発現を減少させることを示した（Nicklin et al 2000,Circulation 102:231-237）。最近の研究において、FGFによって再ターゲティングされたアデノウイルスベクターは、マウスにおけるtkの毒性を低下させた（Printz et al 2000,Human Gene Therapy 11:191-204）。
【０３０２】
低線量放射線は、主としてG2/M期に、DNA鎖の破損、細胞膜傷害を引き起こし、傍観者効果を増強することが示されており、従って、組み合わせ投与された時に、他の細胞障害治療および抗新生物治療を強化し得る。低線量放射線は、微小血管内皮細胞のアポトーシス系を特異的に標的とすることが証明されているため、血管内皮細胞は、そのような組み合わせ治療または補助治療に特に適している可能性がある（Kolesnick et al.,Oncogene 2003;22:5897-906）。アンジオスタチンは、低線量放射線の治療効果を強化することが示されている（Gorski et al.Can Res 1998;58:5686-89）。しかしながら、照射は血管形成促進性の「組織修復因子」を増加させることも示されているため（Itasaka et al.,Am Assoc Cane Res,2003;abstract 115）、放射線の効果は未だ十分には理解されていない。同様に、ある種の化学療法剤は、特定の細胞障害経路およびアポトーシス経路を活性化することが示されている［ドキソルビシン、シスプラチン、およびマイトマイシンCは、FADD/MORT-1経路における、Fas受容体、FADD、およびその他のアポトーシス促進性シグナルの蓄積を誘導する（Micheau et al.,BBRC 1999 256:603-07）］。
【０３０３】
例えば、国際出願WO/2008/132729は、内皮細胞（BAEC）における、ドキソルビシンおよびAdPPE-1(3x)-Fas-cキメラ構築物の組み合わせの投与を教示している。従って、本発明のウイルスベクターおよびそれを含む薬学的組成物は、固形腫瘍を治療するため、単独で、またはそのような障害のための一つもしくは複数の他の確立されたもしくは試験的な治療レジメンと組み合わせて、使用され得る。本発明のウイルスベクターと組み合わせるのに適当な固形腫瘍の治療のための治療レジメンには、化学療法、放射線療法、光線療法および光線力学療法、手術、栄養療法、切除療法、放射線療法と化学療法との組み合わせ、近接照射療法、陽子線療法、免疫療法、細胞療法、ならびに光子線手術療法が含まれるが、これらに限定されない。本発明のベクターは、細胞による核酸構築物の取り込み、細胞における核酸構築物によるキメラポリペプチドの発現、発現されたキメラポリペプチドの活性、または疾患の任意の局面に対する治療の効果を改善することができる追加の成分と共に投与され得る。癌治療のため組換え抗血管形成アデノウイルスベクターを使用するためのプロトコルは、当技術分野において公知である。アデノウイルスに基づく抗血管形成遺伝子治療の多くの臨床試験が現在実施されており、それらは、主に、小細胞肺癌のためのアデノウイルス-p53ワクチンおよび化学療法（NCT0049218）、小細胞肺癌のためのアデノウイルス-自殺遺伝子および化学療法（NCT00964756）、頭頸部癌のためのアデノウイルス-エンドスタチン構築物および化学療法（NCT00634595）、悪性黒色腫のためのアデノウイルス-自殺遺伝子および化学療法（NCT00005057）、ならびに肝細胞癌のためのアデノウイルス-tk構築物および化学療法（NCT00844623）のように、他の癌治療と組み合わせられた組換え抗血管形成アデノウイルスを含み、腫瘍内に投与されている。
【０３０４】
本発明の化合物と共に投与され得る抗癌薬には、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール（Acodazole）塩酸塩；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン（Ambomycin）；アメタントロン（Ametantrone）酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Asperlin）；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン（Azotomycin）；バチマスタット；ベンゾデパ（Benzodepa）；ビカルタミド；ビサントレン（Bisantrene）塩酸塩；メシル酸ビスナフィド（Bisnafide Dimesylate）；ベバシズマブ、ビセレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン（Cactinomycin）；カルステロン（Calusterone）；カラセミド（Caracemide）；カルベチマー（Carbetimer）；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン（Carzelesin）；セデフィンゴール（Cedefingol）；クロラムブシル；シロレマイシン（Cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール（Crisnatol）；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン（Dexormaplatin）；デザグアニン（Dezaguanine）；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン（Diaziquone）；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン（Droloxifene）；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（Duazomycin）；エダトレキサート；エフロールニチン塩酸塩；エルサミトルシン（Elsamitrucin）；エンロプラチン（Enloplatin）；エンプロメート（Enpromate）；エピプロピジン（Epipropidine）；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール（Erbulozole）；エソルビシン（Esorubicin）塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（Etoprine）；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン（Fazarabine）；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン（Flurocitabine）；フォスキドン（Fosquidone）；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン（Ilmofosine）；インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-Ia；インターフェロンγ-Ib；イプロプラチン（Iproplatin）；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；リュープロリド酢酸塩；リアロゾール（Liarozole）塩酸塩；ロメトレキソール（Lometrexol）ナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン（Losoxantrone）塩酸塩；マソプロコール；マイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン（Metoprine）；メツレデパ（Meturedepa）；ミチンドミド（Mitindomide）；マイトカルシン（Mitocarcin）；マイトクロミン（Mitocromin）；マイトギリン（Mitogillin）；マイトマルシン（Mitomalcin）；マイトマイシン；マイトスペル（Mitosper）；ミトタン；ミトキサン��ロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン（Ormaplatin）；オキシスラン（Oxisuran）；パゾチニブ（pazotinib）；パクリタクセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン（Peliomycin）；ペンタムスチン（Pentamustine）；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド（Perfosfamide）；ピポブロマン；ピポスルファン（Piposulfan）；ピロキサントロン（Piroxantrone）塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン（Plomestane）；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン（Pyrazofurin）；リボプリン（Riboprine）；ログレチミド（Rogletimide）；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン（Simtrazene）；ソラフィニブ（Sorafinib）；スパルフォセート（Sparfosate）ナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム（Spirogermanium）塩酸塩；スピロムスチン（Spiromustine）；スピロプラチン（Spiroplatin）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（Sulofenur）；スニチニブ；タリソマイシン（Talisomycin）；タキソール；テコガラン（Tecogalan）ナトリウム；テガフール；テロキサントロン（Teloxantrone）塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（Teroxirone）；テストラクトン；チアミプリン（Thiamiprine）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン（Trestolone）酢酸塩；リン酸トリシリビン（Triciribine）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール（Tubulozole）塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ（Uredepa）；バプレオチド（Vapreotide）；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン（Vinepidine）硫酸塩；ビングリシネート（Vinglycinate）硫酸塩；ビンロイロシン（Vinleurosine）硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン（Vinrosidine）硫酸塩；ビンゾリジン（Vinzolidine）硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン（Zeniplatin）；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が含まれるが、これらに限定されない。追加の抗新生物剤には、GoodmanおよびGilmanの「The Pharmacological Basis of Therapeutics」（Eighth Edition,1990,McGraw-Hill,Inc.(Health Professions Division)）のチャプター52、Antineoplastic Agents(Paul Calabresi and Bruce A.Chabner)およびその序論、1202-1263に開示されたものが含まれる。
【０３０５】
本発明者らは、ルイス肺癌腫モデルにおいて、化学療法薬スニチニブ（Sutent）と組み合わせた本発明のウイルスベクター（例えば、Ad5PPE-1-3X fasキメラ）の単回投与が、転移性癌に対する化学療法治療の効果またはウイルスベクターの効果を改善し得ることを示した（下記実施例VIを参照のこと）。従って、いくつかの態様において、本発明のウイルスベクターは、スニチニブ（Sutent）のような化学療法薬のうちの一つまたは複数と組み合わせて投与される。
【０３０６】
化学療法剤は、本発明のウイルスベクターと共に、本発明のウイルスベクターによる治療の前に、または本発明のウイルスベクターによる治療の後に、投与され得る。特定の態様において、化学療法剤は、本発明のウイルスベクターによる治療の開始の少なくとも約1日前、少なくとも約3日前、少なくとも約5日前、少なくとも約7日前、少なくとも約2週間前、少なくとも約3週間前、少なくとも約4週間前、少なくとも約2ヶ月前、少なくとも約6ヶ月前、少なくとも約9ヶ月前、少なくとも約1年前に投与される。もう一つの特定の態様において、化学療法剤は、本発明のウイルスベクターによる治療の開始の少なくとも約1日後、少なくとも約3日後、少なくとも約5日後、少なくとも約7日後、少なくとも約2週間後、少なくとも約3週間後、少なくとも約4週間後、少なくとも約2ヶ月後、少なくとも約6ヶ月後、少なくとも約9ヶ月後、少なくとも約1年後に投与される。もう一つの特定の態様において、化学療法剤は、本発明のウイルスベクターによる治療の間に、または本発明のウイルスベクターによる治療の開始と並行して投与される。
【０３０７】
本発明のウイルスベクターは、アデノウイルスにより媒介される一過性発現における導入遺伝子の発現を増強する剤と共に投与されてもよい。例えば、国際出願WO/2008/132729は、AdPPE-1(3x)-Fas-cキメラ構築物の投与前の副腎皮質ステロイド（例えば、デキサメタゾンおよび／もしくはN-アセチルシステイン（NAC）の投与、またはボセンタンのようなエンドセリン阻害剤との同時治療を教示している。
【０３０８】
さらに、本発明のウイルスベクターは、反復投与を可能にするため、例えば、デオキシスパガリン（DSG）またはシクロホスファミド（例えば、Smith et al.,Gene Ther.1996 Jun;3(6):496-502を参照のこと）のような、一過性の免疫抑制をもたらす剤と共に投与されてもよい。 
【０３０９】
集団の大多数が、様々なアデノウイルス抗原に繰り返し曝され感作されているため、特に、患者の抗アデノウイルス免疫応答に関する、薬物の安全性および効果に関係する理由のため、アデノウイルスに基づく遺伝子治療プロトコルは、一般的に、単回投与に限定されている。本発明者らは、驚くべきことに、本発明のアデノウイルスの投与後の患者の血清中の抗アデノウイルス抗体のレベルと、投与されたアデノウイルスの用量との間に、相関を見出さなかった。患者における抗Ad5中和抗体、IgG、および全抗Ad5抗体を含む抗体力価の評価（実施例IIならびに図2および3A〜3Bを参照のこと）は、中和抗アデノウイルス抗体のベースラインレベルには、投与後の疾患進行に対する効果がないことを明らかにした。Ad5-PPE-1-3X-fas-cアデノウイルスベクターの投与の前後の、患者の血清中の全抗アデノウイルスAd5抗体力価および特異的抗Ad5 IgGの評価は、アデノウイルスベクター投与後に抗体力価が増加することを明らかにしたが、投与された用量との相関は示さなかった（下記実施例IIの表4を参照のこと）。このことは、本明細書に記載されるアデノウイルスの反復投与が、宿主におけるアデノウイルスの臨床的利用可能性を限定する免疫応答をもたらさない可能性を示唆した。さらに、構築物の初回注射の前に高レベルの中和抗Ad5抗体および全抗Ad5抗体が検出された対象ですら、Ad5-PPE-1-3X-fasキメラの投与が、疾患進行を低下させるために有効であることが見出された（図2および3を参照のこと）。さらに、投与後の血中および尿中のAd5-PPE-1-3X-fas-cレベル（体内分布）のアッセイは、上昇した全抗Ad5抗体レベルまたはIgG抗Ad5抗体レベルの存在下ですら、投与後28日目に高レベルの本発明のアデノウイルス構築物を明らかにした（下記実施例IIの表4および7を参照のこと、特に、対象2、9、および10を参照のこと）。例えば、ある対象［036］においては、抗Ad5抗体力価の大きな増加倍率（×3125）にも関わらず、アデノウイルスベクター投与から28日も後に、転移性病変部からの吸引液の中に、高レベルの導入遺伝子発現が検出された（下記実施例IIの表4および9を参照のこと）。
【０３１０】
従って、いくつかの態様において、該用量の本発明のアデノウイルスベクターの投与は、腫瘍の成長を阻害する。その他の態様において、アデノウイルスベクターの投与は、腫瘍の血管形成を阻害する。
【０３１１】
従って、本発明のアデノウイルスベクターは、用量依存性の抗ウイルス性抗体応答を引き起こすことなく、抗体形成のために十分な間隔で、1回、少なくとも2回、3回、またはそれ以上の回数、投与され得る。そのような間隔は、典型的には、21〜28日であるが、1日もしくは2日と少なくてもよいし、または7日、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、もしくはそれ以上と多くてもよい。従って、本発明のいくつかの態様のもう一つの局面によると、アデノウイルスベクターを含む治療用組成物の治療的有効量をその必要がある対象へ投与する方法であって、該対象へ該組成物を少なくとも2回投与する工程を含み、該投与が、該対象における該アデノウイルスベクターに対する抗体の用量依存性の増加を誘導しない、方法が提供される。本発明の一つの態様のもう一つの局面によると、1回目の投与と少なくとも2回目の投与の間の時間は、抗Ad5抗体形成のために十分である。
【０３１２】
さらにもう一つの態様において、血清抗Ad5抗体の上昇したレベルを有する対象に投与された時にも、本発明のアデノウイルスベクターは有効である。いくつかの特定の態様において、抗Ad5抗体レベルは、対象の投与前のベースライン抗Ad5レベルと比較して上昇する。さらに他の態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、対象の投与前のベースライン抗Ad5レベルと比較して上昇した抗Ad5抗体レベルを有する対象の血中に、投与後4日目、投与後7日目、投与後15日目、投与後21日目、投与後28日目、投与後37日目、投与後56日目、または投与後112日目、またはそれ以降に検出される。そのような抗Ad5抗体は、中和抗体、全抗Ad5抗体、または抗Ad5 IgGのような特定の抗Ad5抗体亜型であり得る。
【０３１３】
従って、いくつかの態様において、アデノウイルスは、投与後少なくとも約4日目に対象の血中に検出される。他の態様において、血清抗アデノウイルス抗体の量は投与後に増加し、かつ投与後少なくとも約21日目に対象の血中でアデノウイルスが検出される
【０３１４】
この出願から特許成立までの期間に、多くの関連する化学療法剤が開発されるであろうことが予想され、化学療法剤という用語の範囲は、そのような新たな技術を全て演繹的に含むものとする。
【０３１５】
本明細書において使用されるように、「約」という用語は、±10％をさす。
【０３１６】
「を含む（comprises）」、「を含む（comprising）」、「を含む（includes）」、「を含む（including）」、「を有する」という用語、およびそれらの活用形は、「を含むが、これらに限定されない」を意味する。
【０３１７】
「からなる」という用語は、「を含み、これらに限定される」を意味する。
【０３１８】
「から本質的になる」という用語は、追加の成分、工程、および／または部分が、添付の特許請求の範囲に記載された組成物、方法、または構造の基本的な新規の特徴を実質的に改変しない限り、組成物、方法、または構造が、追加の成分、工程、および／または部分を含んでいてもよいことを意味する。
【０３１９】
本明細書において使用されるように、単数形「ある（a）」、「一つの（an）」、および「その（the）」には、状況が明白にそうでないことを指示しない限り、複数の言及が含まれる。例えば、「化合物」または「少なくとも一つの化合物」という用語には、それらの混合物を含む、複数の化合物が含まれ得る。
【０３２０】
本願の全体にわたって、本発明の様々な態様は、範囲の形式で提示されてもよい。範囲の形式での説明は、便利および簡潔のためのものに過ぎず、本発明の範囲に対する順応性のない限定として解釈されるべきでないことを理解するべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等のような部分範囲、およびその範囲内の個々の数、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは範囲の広さに関わらず当てはまる。
【０３２１】
本明細書において数的な範囲が示される場合は常に、それは、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むものとする。第1の示された数と第2の示された数と「の間の範囲」、および第1の示された数「から」第2の示された数「までの範囲」という語句は、本明細書において交換可能に使用され、第1の示された数および第2の示された数、ならびにその間にある全ての分数および整数を含むものとする。
【０３２２】
本明細書において使用されるように、「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学、および医学の分野の実務者に公知の様式、手段、技術、および手法、または公知の様式、手段、技術、および手法から容易に開発される様式、手段、技術、および手法を含むが、これらに限定されない、与えられた課題を達成するための様式、手段、技術、および手法をさす。
【０３２３】
本明細書において使用されるように、「治療」という用語には、状態の進行を抑止するか、実質的に阻害するか、遅延させるか、もしくは逆転させること、状態の臨床的もしくは審美的な症状を実質的に寛解させること、または状態の臨床的もしくは審美的な症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０３２４】
明瞭化のため、別々の態様に関して記載された本発明のある種の特色が、単一の態様において組み合わせられて提供されてもよいことが認識される。反対に、簡潔のため、単一の態様に関して記載された本発明の様々な特色が、別々に、または任意の適当な部分的組み合わせで、または本発明の他の記載された態様において適当に、提供されてもよい。様々な態様に関して記載されたある種の特色は、それらの要素がないと態様が無効となる場合を除き、それらの態様の本質的な特色とは見なされない。
【０３２５】
上記に概説され添付の特許請求の範囲に記載される本発明の様々な態様および局面は、以下の実施例において実験的に支持される。
【実施例】
【０３２６】
ここからは以下の実施例を参照する。これらは、上記の説明と共に、本発明のいくつかの態様を非限定的な様式で解説するものである。
【０３２７】
全体として、本明細書で使用する用語体系および本発明において利用する検査室手順は、分子学、生化学、微生物学および組み換えDNA技術を含んでいる。そのような技術は、文献により十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);米国特許第4,666,828号;同第4,683,202号;同第4,801,531号;同第5,192,659号および同第5,272,057号に示される方法論; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); Freshneyによる"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique", Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980);利用できる免疫アッセイは特許および科学文献に広く記載されている、例えば、米国特許第3,791,932号;同第3,839,153号;同第3,850,752号;同第3,850,578号;同第3,853,987号;同第3,867,517号;同第3,879,262号;同第3,901,654号;同第3,935,074号;同第3,984,533号;同第3,996,345号;同第4,034,074号;同第4,098,876号;同第4,879,219号;同第5,011,771号および同第5,281,521号を参照のこと; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照のこと; これらはすべて、その全体が示されているものとして、参照により本明細書に組み入れられる。その他の一般的な参考文献も本明細書を通して提供される。それらに記載されている手順は当技術分野で周知であると理解しているが、読み手の利便性を考慮して提供する。それらに含まれる情報はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３２８】
実施例I
ルイス肺癌モデルにおけるAd5PPE-1-3X-fasキメラの効果
固形腫瘍の治療のためのAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスの有効用量範囲を評価するため、転移性腫瘍をマウスルイス肺癌モデルにおいて誘導し、様々な用量のAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルス（SEQ ID NO:10）を全身投与した。
【０３２９】
材料および実験方法
ウイルスベクターの構築およびクローニング：
このベクターは、アデノウイルス5型のゲノムの大部分を含み、かつ組み換えが可能なようにアダプタープラスミドに対して部分的相同性を有する骨格を用いて構築した。
【０３３０】
E1初期転写ユニットを骨格プラスミドから除去し、さらにpWE25およびAmp耐性選択マーカー部位を除去することによって改変した。
【０３３１】
Ad5、CMVプロモーター、MCSおよびSV40ポリAの配列を含むアダプタープラスミドを、CMVプロモーターの除去により改変し、PPE-1プロモーターおよびFas-cフラグメントを制限消化により挿入した。
【０３３２】
改変PPE-1プロモーター（PPE-1-3X、SEQ ID NO:12）およびFas-キメラ導入遺伝子（Fas-c、SEQ ID NO:4）をアデノウイルスベクターの構築に利用した。PPE-1-(3X)-Fas-cエレメント（2115bp）を、PPE-1-(3X)-lucエレメントから構築した。このエレメントは、1.4kbのマウスプレプロエンドセリンPPE-1-(3X)プロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、SV40ポリA部位およびマウスET-1遺伝子の第1イントロンを含み、Harats et al（Harats D. et al., JCI, 1995）により使用されたpEL8プラスミド（8848bp）から得たものである。PPE-3-LucカセットをBam HI制限酵素を用いてpEL8プラスミドから抜き出した。ルシフェラーゼ遺伝子をFas-c遺伝子［ヒトTNF-R1（腫瘍壊死因子受容体1、SEQ ID NO:2）の細胞外および膜内ドメインならびにFas（p55）細胞内ドメイン（SEQ ID NO:3）で構成される（Boldin et al., JBC, 1995）]で置換し、PPE-1-3x-Fas-cカセットを得た。
【０３３３】
PPE-1(3X)-Fas-cプラスミド  -  このカセットをさらに制限消化により骨格プラスミドに導入し、PPE-1(3X)-Fas-cプラスミドを得た。
【０３３４】
アダプター-PPE-1(3X)-Fas-cプラスミド  -  PPE-1-3X-Fas-cエレメントを第1世代コンストラクトのPPE-1-3x-Fas-cプラスミドから抜き出し、5'および3'末端にそれぞれSnaB1およびEcoR1制限部位を導入する指定のPCRプライマーを用いて増幅した。これらの部位を使用して、SnaB1およびEcoR1で消化したアダプタープラスミドにPPE-Fas-cフラグメントをクローニングし、宿主細胞（例えば、PER.C6細胞）のトランスフェクションに使用するアダプター-PPE-1-3X-Fas-cを得た。
【０３３５】
ルイス肺癌モデル
新しく採取したD122ルイス肺癌（LLC）細胞（マウスあたり5×105個）を、C57BL/6マウス（3月齢）に、足裏への皮下注射により投与した。原発腫瘍は、約14日で足部に出現した。腫瘍が少なくとも7mm径に達したらマウスを麻酔し、肢部の末端領域を切断した。肢部切断から5日後、マウスを以下のグループの一つに無作為割付けした。
2013516454.tif 000002
ビヒクル=PBS、10%グリセロール
【０３３６】
ウイルスはマウスの尾部に静脈内注射した。マウスは、5匹の対照（ビヒクル注射）マウスが死亡した際（ウイルス／対照投与からおよそ24日後）に屠殺した。処置後に原発腫瘍が再出現したマウスは研究から除外した。屠殺の際、動物の肺を肺機能試験のために摘出し、洗浄および秤量し、そして血液を回収した。
【０３３７】
ヘマトキシリン-エオシン染色または抗PECAM1（抗CD31）染色による組織学分析のために、肝臓および腫瘍組織を切り刻み、それぞれ、4%ホルムアルデヒドまたはOCT化合物中で凍結させた。腫瘍重量差をマン・ホイットニーのU検定を用いて評価した。
【０３３８】
この研究の目的は、Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスの用量依存的効果を評価することおよびその最小有効用量を算定することであった。
【０３３９】
結果
臨床的に有意な用量（106〜1011 vp/マウス）のAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスは非特異的全身効果を生じない
計画的屠殺の前に全グループの死亡率を観察したところ、用量反応傾向（dose response trend）はみられなかった。生存マウスの臨床兆候はいかなる異常も示さなかった。マウスの体重に関して、用量反応傾向は観察されなかった。
【０３４０】
全グループにおける腎機能に関して、最低用量コホートで投与後5日目に尿酸増加が観察されたことを除いて統計学的有意差は観察されなかった。処置対非処置マウスのSGOPおよびSGPTレベルに関して、統計学的有意差は観察されなかった。
【０３４１】
剖検による巨視的試験（脳、肝臓、心臓、脾臓、生殖腺、腎臓、小腸、肺）は、肺で転移物が発見されたことを除いていかなる異常も示さなかった。臓器重量に関して、アデノウイルス処置マウスで非処置マウスと比較して重量増加（用量依存的でない）が観察された心臓および脾臓を除いて、グループ（肝臓、脾臓、小腸、心臓、腎臓、肺および脳）間で統計学的差異は見出されなかった。
【０３４２】
（肺、肝臓および心臓に対する）微視的観察は、108〜1011 vp/マウスによる処置後の肝臓における軽度から中等度の炎症および再生変化（regenerative change）を示した。
【０３４３】
Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルス（108〜1011 vp/マウス）は転移性腫瘍の成長を抑制する
図1A〜1Cは、本研究終了時の処置および対照グループの典型的な肺を示している。ビヒクル処置マウスにおいて、肺内で大きな転移物が見られた（図1A）。これらの転移物は、Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルス処置マウスでは、用量依存的な様式で減少し（図1B〜1C）、その最高用量（1011 vp/マウス）コホートにおいて最も強い効果が示され（図1C）、肺の大部分が正常であるかまたは小さな転移物しか有さないことが観察された。この効果は、力価の低いウイルス（107 vp/マウスおよび106 vp/マウス）では、観察不可能レベルまで低下した。Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスの保護的抗腫瘍効果は、低ウイルス価では観察不可能レベルまで縮小するものの対照マウスと比較して有意に減少したAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルス処置マウスの肺の重量の差により確認された（図1D）。
【０３４４】
このように、臨床的に有意な量のAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスの単回全身注射は、ルイス肺癌モデルにおける腫瘍量（tumor burden）の用量依存的な減少にきわめて効果的であった。1011 vp/マウスは、腫瘍量を70%減少させた。最低用量（106 vp/マウス〜107 vp/マウス）では、処置の効果が観察されなかった。
【０３４５】
実施例II
臨床設定下でのAd5PPE-1-3X-fasキメラの投与
臨床設定下でのAD5PPE-1-3X-fas-キメラの投与の安全性および効果を決定するために、原発固形腫瘍および転移性固形腫瘍を有し、様々な用量のAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターを静脈内注入された対象において、毒性、副作用、抗体価、生体内分布、疾患進行および疾患再発ならびに生存性等の結果をモニターした。
【０３４６】
材料および実験方法
対象集団：
進行および／または転移性固形臓器癌を有し、18歳以上であり、標準的な治療または暫定措置に他の選択肢をもたない対象を登録する。
【０３４７】
対象の処置グループへの参加基準は：
1.対象が少なくとも18歳である；
2.転移性または切除困難であり、かつ標準的な治療または暫定措置がないかまたはこれ以上有効でない悪性腫瘍が組織学的に確認されている；
3.カルノフスキーパフォーマンスステータスが≧70%；
4.十分な血液学的プロフィール：ANC>1500/μl、ヘモグロビン≧10g/dl、血小板>100,000/μl、および正常範囲内のINR；
5.十分な腎機能（CCT>60mL/分/1.73m2）；
6.十分な肝機能：（ALTおよびAST<2.5×ULN）ならびに正常範囲内の総ビリルビン
である。
【０３４８】
対象の処置グループからの除外基準は：
1.近時の心臓事象（12ヶ月以内）または活動性の心臓／血管系疾患；
2.近時の手術（4週間以内）；
3.増殖性網膜症；
4.肝疾患；
5.CNS転移；
6.近時の抗血管新生療法（6週間以内）；
7.続行中／近時（4週間以内）の免疫抑制療法；
8.近時の化学／放射線療法または調査薬（4週間以内）；
9.コントロール不良の共存疾患
である。
【０３４９】
組成物：Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラ
Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラ（SEQ ID NO:10）は、血管破壊性の遺伝子治療剤であり、改変マウスプレプロエンドセリンプロモーター（PPE-1-3X、SEQ ID NO:12）およびfas-キメラ導入遺伝子［Fasおよびヒト腫瘍壊死因子（TNF）受容体］（SEQ ID NO:4）を含む非複製性アデノウイルスベクター（Ad5、E1欠失、SEQ ID NO:1）からなる。これは、単回使用バイアルに滅菌ベクター溶液として処方され、凍結状態（-65℃以下）で供給される。各バイアルは、特定ウイルス価のベクター溶液0.5mLを含む。
【０３５０】
用量
用量の拡張は、以下のようにコホート単位で行う。
2013516454.tif 000003
【０３５１】
最初の6コホートの各3名の対象への投与後に用量制限的な毒性が観察されなかったため、9名の追加の対象を、プロトコルに従いおよびInstitutional Review Boardsの承認後に、コホート6に登録した。27名の対象（コホート1〜5の各々に3名［計15名の対象］およびコホート6に12名）を処置した。用量制限的な毒性が観察されなかったので、6名のさらなる患者をコホート7に登録した。計33名の対象を処置した。最高用量（コホート7）の投与直後に、NCIグレード3の発熱が1例観察された。
【０３５２】
Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラは静脈内注入により投与する。同じ薬物量および生理食塩水量を各コホートの各対象に使用し、各対象に同量の薬物を注入した。注入時間は、コホート1〜5で3〜5分間、コホート6で15分間、コホート7で50分間であった。これらの数値は概ね、本研究で提供された薬剤マニュアルに示されている指示を反映している。
【０３５３】
対象の評価基準
生体内分布：血液および尿試料を、ウイルスDNA（血液および尿中）ならびに導入遺伝子発現（血液中のメッセンジャーRNA）のレベルの評価のために、投与前、注入終了時（血液試料のみ）、3時間目、6時間目ならびに4（±1）、7（±1）、14（±1）、28（±2）日目および56（±3）日目に回収した。検出可能なウイルスDNAを含む試料のみ、導入遺伝子発現について試験した。
【０３５４】
抗体：血清試料を、総抗Ad-5 Ig、IgGおよび中和抗Ad5抗体レベルの分析のために投与前に、ならびに総抗Ad-5 Ig、IgG抗Ad5抗体レベルの分析のために28日目および56日目に、回収した。
【０３５５】
Ad-5-IgGアッセイ：血清試料を希釈し、ELISAによりアデノウイルス特異的免疫グロブリンG（IgG）について分析した。ELISAのために、96ウェル平底・高結合性Immulon-IVプレートを、4℃で一晩、50ulのAd5抗原（Upenn Vector Core）含有pH 9.5炭酸塩バッファー（コーティングバッファー）（5×10^8粒子／ウェル）によりコーティングし、PBS/0.05% Tween中で2回洗浄し、24℃で1時間、PBS/1% HSA中でブロックし、その後、PBS/0.05 Tween中で2回洗浄した。適当に希釈した（3倍）試料を抗原コートプレートに添加し、室温で4時間インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tweenで3回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg（1:5000希釈、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）と共に室温で1時間インキュベートした。プレートを上記のようにして3回洗浄し、TMB基質（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を30分間かけて100ul/ウェルとなるよう添加した。反応は、100ulの2N H2SO4を添加することにより停止し、450nmにおける光学密度をVersaMAX可変マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）において読み取った。力価は、0.5最大ODを達成する希釈である。
【０３５６】
中和抗Ad5抗体アッセイ：インビトロでHela細胞（ATCC）のアデノウイルス感染をブロックする血清の能力を、レポーターとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するアデノウイルス（Upenn Vector Core）を用いて分析した。様々な希釈率の試験血清および、対照／標準としての、AB血清プール（Sigma）を、レポーターウイルスのmoiが1000となるよう37℃で1時間プレインキュベートし、これを90%コンフルエントの細胞培養物に添加した。細胞を16時間インキュベートし、GFPの発現をVictor2（Wallace/PerkinElmer）を用いる蛍光イメージングによりおよび視覚的に定量した。血清の中和価は、1000MOIで最大蛍光の50%を示す血清の希釈率の逆数として計算した。
【０３５７】
血管新生バイオマーカー：フォンヴィレブランド因子レベルおよびTNFαレベルの評価のために、血液試料を、投与前ならびにその後の以下の来院時、投与後4±1、7±1、14±1、28±2日目および56±3日目に回収した。
【０３５８】
サイトカインレベル：コホート6の患者の末梢血サイトカイン（以下の表6参照）レベルを、ベースライン時ならびにAd5-PPE-1-3X-fas-キメラ投与後の以下の時点、投与後6時間目、4日目、7日目、14日目、28日目および56日目に測定した。
【０３５９】
腫瘍反応：腫瘍反応に対して薬物処置がもたらし得る効果を、固形腫瘍における反応の評価基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumor; RECIST）の基準にしたがいスクリーニング時ならびに投与後4および8週目に、またはRECIST基準にしたがいスクリーニング時、ベースライン1/0日目ならびに投与後7±1日目、4週目（28±2日目）および8週目（56±3日目）に、CT（またはMRI）スキャンで腫瘍の寸法を測定することにより評価した。
【０３６０】
RECIST基準：
標的病変の評価
完全奏功（Complete Response; CR）：全ての標的病変の消失。
部分奏功（Partial Response; PR）：標的病変のLDの和が、ベースラインのLD和を参照として、少なくとも30%減少。
安定性疾患（Stable Disease; SD）: 処置開始以降の最小のLD和を参照として、PRと判定するには縮小が十分でなく、PDと判定するには増大が十分でない。
進行性疾患（Progressive Disease; PD）：標的病変のLDの和が、処置開始以降または1つもしくは複数の新規の病変の出現以降に記録された最小のLD和を参照として、少なくとも20%増大。
【０３６１】
非標的病変の評価
完全奏功（CR）：すべての非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化。
不完全奏功／安定性疾患（SD）：1つもしくは複数の非標的病変の残存または／および腫瘍マーカーレベルが正常上限値以上で維持。
進行性疾患（PD）：1つもしくは複数の新規の病変の出現および／または既存の非標的病変の明らかな進行。
【０３６２】
最良総合効果（best overall response）の評価
最良総合効果は、処置開始から疾患の進行／再発までに記録された最良の効果である（PDの参照として処置開始以降に記録された最小の測定値を採用する）。一般に、患者の最良効果の認定は、測定値の基準（measurement criteria）および確定の基準（confirmation criteria）の両方の到達による。
【０３６３】
その時点で疾患進行の客観的証拠なく処置の中止が必要となる健康状態の全体悪化があった患者は、「症候性悪化（symptomatic deterioration）」ありと分類されるべきである。処置の中止後であっても進行の実体を明らかにする努力がなされるべきである。
【０３６４】
いくつかの状況下では、残存疾患と正常組織を識別するのが困難な場合がある。完全奏功の評価がこの決定に依存する場合、残存病変を調査（細針吸引／生検）することで完全奏功状態を確認することが推奨される。
【０３６５】
結果：
患者の最終結果
ここに患者の最終結果を要約する：6つのコホートの26名の対象は、2007年11月〜2009年8月の間に登録され、2010年12月までに計33名の対象が登録された。コホート1〜4の各3名の対象については、2名の対象は死亡により、8名は当人都合の脱落により、そして2名は別の処置プロトコルの継続のため、研究を途中で中止した。死亡した2名のうち、患者1番は重篤な副作用と報告され、一方、患者9番は投与から88日後に死亡したため、本プロトコルの定義により、SAEと報告されなかった。コホート5では、1名の対象が本研究を完遂し（56日目まで）、1名は56日目以前に離脱し、1名は疾患の進行による「その他の」離脱と認定された。5名のコホート6患者は本研究を完遂し、5名は疾患進行により離脱し（2名は脳転移を患った）、そして1名は研究処置を受けてからおよそ2ヶ月後に死亡した。4名のコホート7患者は本研究を完遂し；2名は疾患進行により離脱した。
【０３６６】
33名の初期登録患者のうち、31名は28日目の来院に参加し、19名は56日目の来院に参加した。フォローアップのために2〜3ヶ月ごとに、その後はモニタリングのために投与後最大3年間またはそれ以上の期間、対象と連絡をとった。
【０３６７】
患者集団のプロフィール
集団統計（Demographics）
集団統計およびベースライン特性を以下の表1に要約する。全体として、対象の54%が男性、46%が女性であった。登録対象のうち5名（4名はヒスパニック系および1名はアジア系）を除く全員がカフカス系であった。登録対象の平均年齢は58.5歳であり、最年少は35.1歳、最年長は74.1歳であった。エントリー時の平均カルノフスキースコアは85.4であり；最低エントリー時スコアは70（プロトコル参加基準により許可される最小値）、最大は100であった。
【０３６８】
（表１）集団統計／ベースライン特性の要約
2013516454.tif 000004
【０３６９】
病歴
ここに病歴を要約する：平均年齢58.5歳の患者集団において予想された通り、全対象がベースライン時に別の医学的状態を有していた。最も共通する医学的状態（少なくとも3名の対象に存在する医学的状態と定義される）は：高血圧（13名の対象）；倦怠（10名の対象）；便秘（6名の対象）；下痢および貧血（各々5名の対象）；悪心、GERD、高コレステロール血症、高脂血症、季節性アレルギーおよび胆嚢摘出（各々4名の対象）；腹痛、咳、甲状腺機能低下、腰痛および肺炎（各々3名の対象）、であった。
【０３７０】
一次診断
ベースライン時の腫瘍タイプの頻度を以下の表2に要約する。最も高頻度の腫瘍タイプは、結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、肉腫およびカルチノイド／神経内分泌であった。1名の対象ずつ以下の腫瘍タイプを有していた：膀胱移行細胞癌、食道下部癌、メルケル細胞癌、肺小細胞癌、腎細胞癌、胃腸間質腫瘍、精巣性索腫瘍および甲状腺乳頭癌。
【０３７１】
（表２）一次腫瘍診断（コホート1〜7）
2013516454.tif 000005
【０３７２】
化学療法経験
ここに、化学療法経験を、化学療法の数および頻度により要約する：本試験に登録された対象は全員、複数の剤を用いる化学療法経験を有しており、平均化学療法経験数（mean previous chemotherapy lines）は3.7（1〜8の範囲）であった。最も高頻度で利用されていた薬物は：5-FU（10.9%）、ベバシズマブ（10.9%）、カペシタビン（8.6%）、ロイコボリン（8.0%）、イリノテカン（8.0%）、セツキシマブ（5.2%）、オキサリプラチン（4.6%）、テモゾロミド（3.4%）、シスプラチン（3.4%）、フォルフォックス（3.4%）、スニチニブ（2.9%）、ダカルバジン（2.3%）およびドセタキセル（2.3%）であった。大多数の対象（16/26、61.5%）は、少なくとも一回、過去に抗血管新生剤を投与された：ベバシズマブ（12名の患者）、スニチニブ（4名の患者）およびソラフェニブ（2名の患者）。これらの化学療法剤の使用は、この患者集団において見られる腫瘍のタイプを反映している。
【０３７３】
その他の抗腫瘍インターベンション
基本的に全対象が、腫瘍に対する手術経験を有していた。ここに、化学療法を除く手術およびその他の抗腫瘍インターベンションの詳細を要約する：腫瘍関連外科処置の平均経験数は>2/対象であり、数名の対象は4回の外科処置を受けていた。また、対象のうち12名は放射線療法経験を有していた。放射線療法のコースは、対象13番を除いてすべて、研究処置の少なくとも8ヶ月前に行われていたが、同対象については、放射線療法の最終コースが約4.5ヶ月前に行われた。本プロトコルは、登録前の少なくとも4週間の間に放射線療法が行われていないことを必要とするものであった。
【０３７４】
ベースライン時の腫瘍の評価
全対象に対して腫瘍標的病変のCT評価を行い、その後の処置後比較のために、ベースライン時の腫瘍サイズを測定した。これらの測定において、各標的病変の最長径を利用した。
【０３７５】
患者集団の要約
この研究に登録された対象の大多数はカフカス系であり、性の分布はほぼ等しく、平均年齢は58.5歳であった。平均エントリーカルノフスキースコアは85.4であり、全対象が同時並行の医学的状態を有していた。最も高頻度の腫瘍タイプは結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、肉腫およびカルチノイド／神経内分泌であった。本試験に登録された対象は全員、癌関連の手術および複数の剤を用いる化学療法の経験があり、その最も共通するものは5-FU、ベバシズマブ、カペシタビン、ロイコボリン、イリノテカン、セツキシマブ、オキサリプラチン、テモゾロミド、シスプラチン、フォロフォックス、スニチニブ、ダカルバジンおよびドセタキセルであり；多くは、抗血管新生療法および放射線療法の経験も有していた。
【０３７６】
安全性の評価
有害事象
有害事象の発生および頻度を以下の表3に要約する：全体として、少なくとも4名（15.4%）の対象が体験した事象には：発熱（50%）；倦怠（46.2%）；aPTT延長（38.5%）；悪寒、低ナトリウム血症およびヘモグロビン減少（各々26.9%）；便秘（23.1%）；悪心、嘔吐、食欲不振および呼吸困難（dyspoena）（各々19.2%）；リンパ球減少症、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ増加、高血糖症、筋肉痛および多汗（各々15.4%）、が含まれた。発熱および悪寒は、高用量（コホート4〜6）でのみ起こった。コホート6では、11名のうち9名の対象が発熱を体験し、11名のうち6名は悪寒も有した。コホート7では、1名の対象がグレード3の発熱を体験した。全患者において、発熱および悪寒は、研究処置の日（注入後）に発生し、これは一時的なものであり、24時間以内に解消した。
【０３７７】
（表３）最も高頻度の有害事象（コホート1〜6）
2013516454.tif 000006
【０３７８】
高用量グループで発生した発熱事象の大多数（14名中11名）および悪寒事象の大多数（8名中7名）は、もしかしたら（possibly）、おそらく（probably）または間違いなく（definitely）、研究薬に関連すると判断された。研究薬に間違いなく関連すると判断されたその他の事象は、悪心の2事象、貧血、嘔吐、倦怠、多汗、食欲不振および頭痛の各1事象、のみであった。これらの事象の中に、NCIグレード3またはそれ以上に分類されるものはなかった。したがって、用量制限的な毒性は起こらなかった。その他の有害事象の大多数は、研究薬と無関係また関連する可能性が低いと判断された。
【０３７９】
最も共通する有害事象のうち、倦怠は、9/12名の対象で無関係、1名の対象で関連する可能性が低い、と判断され；aPTT延長は、7/10名の対象で無関係と判断され；ヘモグロビン減少は7名の対象全員で無関係と判断され；そして便秘は全員で無関係と判断された。ただし：現地調査員は、現地のaPTT検査室試験は感度が高く（そのためループス性抗凝固因子のスクリーニングに使用されている）；実際、すべてのaPTT亢進有害事象は、そのクリニックの患者で発生したものである、との見解を示した。
【０３８０】
以下のグレード3またはそれ以上の有害事象が報告された：すべて、調査薬と無関係かまたは関連する可能性が低いと判断された：対象001番（コホート1）：グレード3の疾患進行；対象007番（コホート3）：グレード3の低ナトリウム血症および高カリウム血症；対象008番（コホート3）：グレード3のヘモグロビン減少；対象009番（コホート3）：グレード3の倦怠；対象013番（コホート4）：グレード3の低カリウム血症、低ナトリウム血症、低塩素血症および倦怠；対象025番（コホート6）：グレード4の自殺念慮；対象027番（コホート6）:グレード3の脱力感；対象033番（コホート6）：グレード4の腹痛およびグレード3の高血糖症；対象035番（コホート6）：グレード3の総ビリルビン増加、AST増加、ALT増加およびアルカリホスファターゼ増加；ならびに対象036番（コホート6）：グレード3の低ナトリウム血症。対象1番における疾患進行は重篤な有害事象であったが；その他の事象はすべて重篤ではなかった。グレード3の低ナトリウム血症を他のグレード3の代謝性事象を伴いまたは伴わずに生じた対象（007番、013番および036番）は全員、胃腸悪性腫瘍を有していた。
【０３８１】
重篤な有害事象
本研究薬による処置に関連する重篤な有害事象（SAE）は報告されなかった。
【０３８２】
検査室試験：
血液学および凝固
以下の試験では、いずれのコホートにおいても処置後の平均変化に有意な傾向が見られなかった：好塩基球数、好酸球数、リンパ球数、ヘマトクリット、ヘモグロビン、好中球数、血小板数、RBCおよびPT。各コホートにおいて処置後のaPTT増加の傾向が観察されたが、大多数の平均値は正常範囲内で維持されていた。白血球数（WBC）の平均および中央値は、コホート3〜6において、投与当日から4日目にかけて減少する傾向があったが、個々の値は、コホート6の2名の対象を除く全対象において正常範囲内で維持され：（1）対象26番では、投与当日の低いWBC（3700K/μL）が4日目には2700K/μLまで減少したが、その後、研究の残りの日数の間に少なくとも4000K/μLまで増加し、（2）対象32番では、投与当日の正常なWBC 6.3K/μLが4日目には4.5K/μLまで減少し、その後4.3〜6.0K/μLの間で変化した。
【０３８３】
臨床的に有意な知見であると判断された血液学試験の値には、以下が含まれる：
対象8番（コホート3）では、投与当日のヘマトクリット32.3%およびヘモグロビン10.6g/dLが、時間と共に徐々に減少し、28日目には、それぞれ、25.5%および7.9g/dLとなった。この対象の血小板数は、投与当日に443,000K/μLであり、28日目には516,000K/μLに増加した。
対象14番（コホート4）では、スクリーニング時のヘマトクリットが34.2%およびヘモグロビンが10.8g/dLであり；これらの値は、時間と共に徐々に減少し、14日目には、それぞれ、26.4%および8.3g/dLとなった。この対象のaPTTはスクリーニング時に33.1秒、4日目に34.4秒であり、その後、7日目には49.6秒および14日目には53.6秒に増加した。
対象33番（コホート6）では、ヘマトクリットがスクリーニング時に38.3%および投与当日に33.1%ならびにヘモグロビンがスクリーニング時に12.3g/dLおよび投与当日に10.9g/dLであり；両方とも研究期間の間安定していた。この対象の血小板数は、投与当日に116,000K/μLであり、4日目に89,000K/μLに減少したが、その後、28日目には129,000K/μLに増加した。PTTは、投与当日には31秒で正常であったが、14日目および28日目には、それぞれ、44.5および48.2秒に増加した。
【０３８４】
全コホートの投与当日から28日目までの血液学および凝固に関する検査値の推移を要約すると：この推移は、値が処置後28日目に正常範囲以下または以上に推移する傾向を示唆するものではなかった。特に、ヘマトクリットおよびヘモグロビンの両方に関して、値が正常範囲以下に推移する傾向は観察されなかった。
【０３８５】
化学
血清化学試験の要約：以下の試験では、いずれのコホートにおいても処置後の変化中央値に有意な傾向は見られなかった：ALT、AST、アルブミン、アルカリホスファターゼ、カルシウム、クレアチニン、グルコース、カリウム、ナトリウム、ビリルビン、総タンパク質およびBUN。以下のレベルの中央値は、1名の対象で高いレベルが観察されたために上昇した：28日目のコホート6におけるALTおよびAST、これは、対象35番におけるそれぞれのレベル406U/Lおよび232U/Lに起因する；28日目のコホート6における総ビリルビン、これは、対象35番におけるレベル7.4に起因する。以下の対象における非常に高いアルカリホスファターゼレベルにより、彼らの各コホートの平均レベルが上昇した：対象4番（コホート2）、24番（コホート5）ならびに22、26、30、35および36番（すべてコホート6）。
【０３８６】
化学的試験：対象4番および22番では、投与当日の試験でALTおよびASTが増加していたが、その後に減少／正常化した。コホート6の対象35番では、28日目に高レベルのALTおよびAST：それぞれ406U/Lおよび232U/Lを示したが、これらのレベルは56日目までに正常化した。この対象（35番）は、疾患進行による胆管障害のために入院し、かつ28日目に非常に高レベルの総ビリルビン7.4mg/dLおよびアルカリホスファターゼ1176U/Lを示した。それ以外では、すべてのALTおよびASTの増加は、正常値上限の<3Xであり、散発的な傾向であった。35番以外の対象で、研究参加中に異常な総ビリルビンレベルを示した者はいなかった。投与当日の高いアルカリホスファターゼは共通であり、これは腫瘍および／または転移性疾患に起因するものと考えられるが、この検査室試験で有意な漸進的増加を示したのは、2名の対象のみであった（4番はスクリーニング時に383U/L、投与当日に493U/L、28日目に609U/Lのレベルを示し、36番は投与当日に163U/L、28日目に377U/Lのレベルを示した）。その他の化学的試験については、いずれの対象も臨床的に有意な処置後レベルを示さなかった。
【０３８７】
全コホートの投与当日から28日目までの血清化学値の推移を要約すると：5/15名の対象は投与当日に正常レベルを示し、28日目に低レベルの血清ナトリウムを示した。しかし、ナトリウムレベルは断続的に異常を示すにとどまり、通常は正常値をわずかに下回るのみであり、臨床的に有意ではなかった。推移表は、値が処置後28日目に正常範囲以下または以上に推移するその他の傾向を示唆しなかった。
【０３８８】
尿検査
尿検査における異常の頻度は、投与当日（89.5%）およびスクリーニング時（76.0%）で高かったが、投与後の来院時に観察される傾向はなかった。データの精査により、尿検査では臨床的に有意な異常は発生しなかったが、数名の対象では尿中タンパク質が少量であり、コホート6の対象30番では28日目に2+のタンパク尿であったことが示された。
【０３８９】
アデノウイルス5に対する抗体
対象由来の血清試料をアデノウイルス5に対する抗体について試験した（総量およびIgG）:投与前および投与後の間のIgG抗体の力価の増加を表4および図11に要約する。投与後試料は、3名を除くすべての対象において28または56日目に回収し；これらの3名については28日目の試料が入手できなかったためそれよりも早い段階で投与後試料を試験した。すべての投与後IgG抗体価は少なくとも7倍増加し；33名の対象のうちの8名ではIgG抗体が投与前の力価の少なくとも100倍増加した。アデノウイルス5に対する投与後総抗体価はすべて、少なくとも5倍増加し；26名の対象のうちの10名では総抗体が投与前の力価の少なくとも625倍増加した。増加倍率（総抗体価およびIgG抗体価）と用量レベルの間に相関性はなかった（P>0.05；ピアソン・スピアマン相関検定）。コホート7の対象において56日目に回収されたデータと28日目との比較は、IgGレベルの減少傾向を示した（以下の表4参照）。
【０３９０】
（表４）IgG抗体価および総抗体価における抗アデノウイルス5の増加の要約
2013516454.tif 000007
【０３９１】
全対象を、ベースライン時の彼らの中和アデノウイルス5抗体のレベルに関しても評価した（表5）。結果は、対象の35%が非常に高いベースラインレベル（>210）および41%が低レベル（≦18）の中和抗体を有していたことを示している。
【０３９２】
（表５）ベースライン時の抗アデノウイルス5中和抗体価の要約
2013516454.tif 000008
【０３９３】
ベースライン時の中和抗Ad5抗体の存在と28日目（図2）または56日目（図3A、3B、表5）の疾患進行の間に相関性を見出すことはできなかった（ピアソンの積率相関；P>0.050；スピアマンの順位相関；P>0.050）。
【０３９４】
コホート6の末梢血におけるサイトカインレベル
末梢血サイトカインレベルを、コホート6の患者において、ベースライン時ならびにAD5-PPE-1-3X-FAS-キメラの投与後の以下の時点：注入後6時間目、4日目、7日目、14日目、28日目および56日目、に測定した。結果を以下の表6に要約する。
【０３９５】
（表６）コホート6の平均末梢血サイトカインレベルの要約
2013516454.tif 000009
【０３９６】
平均IL-6レベルの有意な増加は、注入後6時間目に起こり；このレベルは4日目にベースラインに戻った。4日目〜14日目の間をピークとするTNFRIIレベルの小さな増加が確認された。他の測定されたサイトカインでは大きな上昇は起こらなかった。
【０３９７】
生命兆候
収縮期BP、拡張期BPおよび呼吸数に関しては有意な処置後傾向は観察されず、かつ、臨床的に有意な異常を示した対象はいなかった。
【０３９８】
有意な体温上昇（>38摂氏度）が、5名の対象：コホート5の1名の対象20番（38.3摂氏度）ならびにコホート6の4名の対象26番（39.1摂氏度）、27番（39.7摂氏度）、32番（39.8摂氏度）および36番（39摂氏度）において、注入後6時間目に起こった。各人とも、体温は4日目前または4日目に（この日は注入後6時間目の記録の後の最初の体温記録日であった）正常化した。平均心拍数は、コホート6において、投与後6時間目に101.2拍／分に増加した。これは、このコホートの発熱を体験した対象における速い心拍数に起因するものであった（107〜140拍／分の心拍数）。ここに体重を要約する：フォローアップ時の平均体重の減少（スクリーニング時に75.0kg、56日目に75.0kg、フォローアップ時に63.5kg）を除いて大きな体重変化は起こらなかった。
【０３９９】
身体検査
スクリーニング時および56日目の対象ごとの身体検査のデータから、検査での処置関連または臨床的に有意な変化は確認されなかった。
【０４００】
ECG
ここにスクリーニング時のECGパラメータを要約する：スクリーニング時に、15名の対象が正常なECGを示し、11名が異常を示したが、これは臨床的に有意ではないと判断された。当初のプロトコルは、フォローアップECGを56日目のフォローアップ来院時に行うよう指定していた。大多数の対象は56日目よりも前に研究から離脱したため、コホート1〜5では対象7番のみがフォローアップECGを受け、これは、臨床的に有意でないと判断されるECG変化を示した。
【０４０１】
プロトコルは、事後的に、28日目の来院時にフォローアップECGを得るよう修正された。コホート6では、4名のフォローアップECGを得：2名が正常であり、2名が、スクリーニング時のECGから大きく変化しない、小さな、臨床的に有意でない知見を示した。
【０４０２】
Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラの生体内分布
手違いにより、コホート5および6［3]）の数名の対象から全血試料が得られなかった。12名のコホート6患者のうちの11名について尿試料を試験し、番号の若いコホートの12名の別の患者について血中レベルを試験した。
【０４０３】
アデノウイルスの存在についての尿試料の分析
尿から検出されたアデノウイルスベクターDNAの最大レベルを表7に要約する。
【０４０４】
（表７）尿中のアデノウイルスベクターの最大レベル（コホート1〜6）
2013516454.tif 000010
VP - ウイルス粒子；BLQ<20コピー；BLD<1.4コピー
【０４０５】
アデノウイルスベクターの存在についての全血試料の分析
コホート1〜6の全血中でのRT-PCRにより検出されたアデノウイルスベクターDNAの平均レベルを図12Aに経時的に要約する。以下の表8は、コホート1〜6の中央値を示している。アデノウイルスベクターの注入前は、試験した患者のいずれも、アデノウイルス遺伝子の増幅を示さなかった（検出可能レベル以下）。全血中で見出されるアデノウイルスベクターDNAの平均最大レベルの用量依存的な増加は、データから明らかである。注入終了時、全患者が、投与された用量と正相関する1.9×103から5.5×107コピー／μg gDNAの範囲の個々の血液ウイルスレベルを示した。
【０４０６】
コホート6の患者（図12A、グレーの点線）では、アデノウイルスの平均レベルが、2.1×105〜5.5×107（注入終了時）の範囲から1.1×104〜2.6×105コピー／μg gDNA（注入後3時間目、図12B参照）の範囲に減少した。アデノウイルスレベルは、注入後6時間減少を続け、その後、最終時点まで減少した。56日目に、アデノウイルスDNAレベルはすべて、少なくとも2log倍減少したかまたは検出不可能となった。
【０４０７】
（表８）全血におけるアデノウイルスベクターの存在：中央値
2013516454.tif 000011
【０４０８】
全血におけるfas-キメラ導入遺伝子の発現レベルの分析
試験した21名の対象のいずれも、全血中に検出可能レベルの導入遺伝子cDNA（RT-PCRにより決定、血中mRNAレベルを表す）を有さなかった。しかし、1名の患者01-036（食道癌）において、皮下転移物由来の試料を試験し、検出可能レベルのアデノウイルス導入遺伝子の発現を、処置後4日目（1.4×105コピー／μg RNA）および28日目（3.9×105コピー／μg RNA）の吸引で見出し（表9）、標的腫瘍組織における導入遺伝子発現の特異性の直接的証拠を得た。
【０４０９】
（表９）患者01-036の腫瘍からの吸引（コピー／μg RNA）
2013516454.tif 000012
【０４１０】
安全性の結果の要約
この研究では、Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラによる有意な安全性問題の兆候は観察されなかった。その最大治療用量（MTD）は、試験した最高用量（コホート7）で投与直後に見られたNCIグレード3の発熱という用量制限的な毒性を考慮して、単位用量あたり103ウイルス粒子と決定した。異常な検査室結果以外で、最も高頻度の有害事象は、発熱、倦怠、悪寒および便秘であった。発熱および悪寒の大多数は高用量グループで起こり、多くは研究薬物に関連すると判断された。血液学値が正常範囲外に推移する傾向は観察されなかったが、数名の対象では研究処置後にヘモグロビンおよびヘマトクリット値が低下した。本研究を通して、臨床的に有意な処置後の化学的または尿検査上の異常は、胆管障害を有する対象において癌の進行により生じた顕著に上昇したアルカリホスファターゼならびにALT、ASTおよび総ビリルビンの上昇を除けば、起こらなかった。臨床的に有意な生命兆候の処置後変化は、1名のコホート5対象および4名のコホート6対象において注入後6時間で発熱があったこと；発熱したコホート6対象が心拍数増加も示し、その結果注入後6時間目のコホート6の心拍数の平均が増加したことを除けば、観察されなかった。身体検査またはECGでは処置に関連する変化は観察されなかった。
【０４１１】
全対象が投与前抗アデノウイルス5抗体（総量およびIgG）を有し、総抗体価は処置後に少なくとも5倍増加した。図11は、ベースライン時、7日目、14日目および28日目に測定したコホート1〜6の各々における抗アデノウイルス5抗体を示しており、これは、ベースライン抗体価レベルに患者間でばらつきが観察されるものの、抗アデノウイルス5抗体が注入後7日目〜14日目の間でプラトーに達する傾向を示している。抗アデノウイルス5抗体のレベル（総量およびIgG）は、投与後に増加する傾向があり、28日目にピークに達し、そして56日目まで減少する傾向があった（図11）。全体として、増加倍率は、IgG力価よりも総抗アデノウイルス5力価において高かったが、抗アデノウイルス5抗体の増加倍率と投薬レベルの間で相関性は見出されなかった。対象の34.6%では、ベースライン時にアデノウイルス5に対する中和抗体が非常に高レベルで測定され、23.1%は中程度の高レベル、そして42.3%は低レベルを示した。しかし、ベースライン時の中和抗体価と臨床反応（安定性疾患により測定される）の間で相関性を見出すことはできなかった。平均IL6血中レベルの有意な増加はAd5-PPE-1-3X-fas-キメラの投与後6時間で起こり；このレベルは4日目にベースラインに復帰した。他の測定されたサイトカイン（Il-8、VEGF、FGFおよびTNF-α）では大きな上昇は起こらなかった。
【０４１２】
尿中に検出可能なレベルのアデノウイルス5を有していた大多数の対象において、その存在は一時的なものであり、そのレベルはAd5-PPE-1-3X-fas-キメラの静脈内（IV）注入後最初の24時間内でのみ検出可能であった。Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラアデノウイルスベクターは、IV注入の直後の全血中に高コピー数で存在した。この全血中のアデノウイルスベクターレベルはその後、時間と共に減少した。全血中にベクターが存在した試料を、Fas-キメラ導入遺伝子の発現について試験した（導入遺伝子mRNAのRT-PCR）。試験した21名の対象のいずれも、全血中で検出可能レベルの導入遺伝子cDNAを示さなかった（cDNAはRT-PCR反応産物であり、血中mRNAレベルを表すものである）。
【０４１３】
予備的効果評価
疾患進行または再発
疾患進行は、RECIST基準に基づき、臨床的悪化および放射線学的成長により評価した。コホート1〜5では、56日目に、3/14名の患者が安定性疾患を示した。コホート6では、56日目に（n=12）、1名がPR、4名がSD（「安定性疾患」）、そして7名が進行性疾患を示した。このように、56日目に、5/12名（42%）が安定性疾患またはそれより良好を示した。コホート7では、56日目に、6名中4名の対象（67%）が安定性疾患を示した。コホート1〜6では、28日目に、21/26名（80.8%）の対象が悪化していないと判断され、1名が悪化しており（5.6%）、そして4名がこのエンドポイントに関して観察されなかった。コホート1〜6の8名の対象のみについて56日目の来院時に観察を行い、彼ら全員が悪化に関して陰性であった。
【０４１４】
疾患進行は、放射線学的成長（RECIST採点基準に定義される標的病変の最長径の和の%成長により測定）の頻度によっても評価した。新しい病変が存在せずかつ標的病変の最長径和に成長がないまたはその成長が20%以下のいずれかの場合、その対象は、その来院時に、放射線学的安定性疾患であると判断された。
【０４１５】
3×1012ウイルス粒子のAd5-PPE-1-3X-fas-キメラの複数回注入後の難治性転移性甲状腺乳頭癌の減少
これらの患者の中に、放射性ヨードに抵抗性の転移性甲状腺乳頭癌を有する69歳のヒスパニック系女性対象026が加えられ、2009年3月16日にコホート6において投与された。ベースラインCTスキャンは、首に気道を圧迫する病変塊を示した（図4、矢印）。28日目のスキャンは、安定性疾患を示し、処置後6ヶ月目（図5、矢印）および12ヶ月目のフォローアップスキャンは、この塊の長径が30%超減少したことおよび気道に対する圧迫がなくなったことを示し、放射線透過性低下域（radiographic lucency）は中心部の壊死を示唆した（図5、青色の矢印）。さらに、この患者ではサイログロブリンレベルが減少し；そのベースライン時のレベルは426ng/mLであり10月後は326ng/mLに減少した（正常レベル<55mg/mL）。
【０４１６】
2回目の投与は1回目の投与から1年半後に投与され、患者は注入後120日目で進行性なし（progression free）であった。2回目の投与時のサイログロブリンレベルは281ng/mLであり、これは注入後28日目に477ng/mLに上昇し、そして56日目に382ng/mLに低下した。処置期間を通して、用量制限的な毒性、重度の副作用またはサイトカインストームは観察されなかった（図10A）。
【０４１７】
甲状腺髄様癌病変を有する別の患者では、3×1012ウイルス粒子のAd5-PPE-1-3X-fas-キメラの投与により甲状腺癌バイオマーカーであるカルシトニンのレベルが劇的に低下した；レベルは投与前に極めて高く（14,331pg/ml、正常=<10pg/ml）、注入後56日目に増加した（16,324pg/ml）が、注入後120日目に顕著な減少を示した（6600pg/ml）。処置後120日目においてこの患者は依然として進行性なしであった（図10B）。
【０４１８】
進行神経内分泌癌の転移性病変は、3×1012ウイルス粒子のAd5-PPE-1-3X-fas-キメラの単回注入後に減少した。
【０４１９】
進行神経内分泌癌を有するコホート6の別の登録患者は、2009年3月16日にコホート6において投与された。21日目のCTスキャンは、いくつかの肝転移を示した（図6Aおよび7A、赤色のマル）。投与後50日目（図6Bおよび7B、赤色のマル）および112日目（図6Cおよび7C、赤色のマル）のフォローアップCTスキャンは、これらの転移性病変の一つが継続的に退行していたことを示した。RECIST基準にしたがい、この患者は「安定性疾患」と採点され、その後4ヶ月間「安定性疾患」の分類を維持した。
【０４２０】
効果の要約
この、進行または転移性固形臓器癌を有する患者を用いる単回注入研究は、小規模ではあるものの、その効果データから一定の傾向を見出すことができる。
【０４２１】
56日目の評価において、14名のコホート1〜5の患者のうち3名が放射線学的安定性疾患（SD）を示し；12名のコホート6患者のうち5名が56日目に安定性疾患を示し、（12名のコホート6患者のうちの）1名の（甲状腺乳頭癌）患者が56日目にほぼ部分奏功を示し、これはその後に部分奏功（PR）となった。
【０４２２】
5名のコホート7患者のうち5名は、「安定性疾患」（SD）の分類を維持した。RECISTスコアのパーセント変化を0、28および56日目でプロットし、安定性および進行性疾患の評価と相関させると、コホート1〜5の14名のうちの3名（21%）が56日目で安定であったことが分かる（図8）。しかし、コホート6および7（図9）では、17名の患者のうちの9名が56日目に安定であった。
【０４２３】
この、臨床設定下でのAd5PPE-1-3X-fas-キメラ（SEQ ID NO:9）の単回IV注入による投与の安全性および効果を評価する非盲検の用量範囲探索試験において、3名の進行または転移性癌を有する対象を最初の5つの先行する用量コホートの各々に登録し、12名の対象を第6のコホートに登録した。まとめて言うと、データは、Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラが、全身投与に関して、利用した用量のいずれにおいても安全性に関するシグナルまたは用量制限的な毒性（DLT）が観察されなかったことから、試験したすべての用量において安全である、ということを示している。2つの重篤な有害事象が報告されたが、これらは癌の進行に関連するものであり、研究処置とは無関係であった。Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラを2つの最高用量のうちの一方で投与された数名の対象は、研究処置を受けた直後に一時的な発熱および悪寒を引き起こしたが、これはアデノウイルスベクターの投与後に共通して起こる事象である。検査室試験において臨床的に有意な異常がまれに見られたが、これらはAd5-PPE-1-3X-fas-キメラ処置に無関係であると判断された。
【０４２４】
最大耐量（MTD）は、試験した最高用量を投与されたコホート（コホート7）で観察された1例の用量制限的な毒性（NCIグレード3の発熱）を考慮して、単位用量あたり1013ウイルス粒子と決定した。複数タイプの進行、難治性癌を有する患者間の小規模の単回注入研究ではあるが、Ad5-PPE-1-3X-fas-キメラ注入の効果の証拠には、3×1012ウイルス粒子のAd5-PPE-1-3X-fas-キメラを投与された患者（コホート6）の中に放射線学的安定性疾患および1例の長期的な部分奏功を示す患者がいたことが含まれる（表10）。
【０４２５】
（表１０）単回用量のAd5PPE-1-3X-Fas-キメラに対する疾患反応：56日目における適応ごとのパーセント安定性疾患（コホート6および7）
2013516454.tif 000013
【０４２６】
1名の食道癌患者において、処置後4日目および28日目の吸引により皮下転移物を採取し、検出可能レベルのAd5-PPE-1-3X-fasキメラ導入遺伝子の発現を見出した。
【０４２７】
実施例III
臨床設定下での甲状腺癌に対するAd5PPE-1-3X-fasキメラ投与の効果
臨床設定下での甲状腺癌に対するAD5PPE-1-3X-fas-キメラ投与の効果を決定するため、Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターの静脈内注入を受けた甲状腺癌腫瘍対象において、毒性、副作用、抗体価、生体内分布、疾患進行および疾患再発ならびに生存等の結果をモニターした。
【０４２８】
材料および実験方法
適応：
進行性および放射性ヨード難治性の進行分化甲状腺癌（DTC）（乳頭、濾胞、ヒュルトレ細胞）の癌患者。
【０４２９】
安全目標：
進行甲状腺癌患者におけるAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターの単回全身用量の安全性を評価すること。
【０４３０】
効果および薬力学目標：
1.  進行DTC患者の処置に対する反応を、固形腫瘍における反応の評価基準（RECIST基準）を用いる測定可能な疾患により評価すること；
2.  Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターの薬物動態および薬力学プロフィールを評価すること；
3.  Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクター処置に応じた候補バイオマーカーの変化の評価；
4.  処置前腫瘍の遺伝的変化がAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクター処置に対する反応に及ぼす影響を、保管している腫瘍資料を用いて探索すること。
【０４３１】
効果のエンドポイント：
1.  第1効果エンドポイントは、研究薬に対する目的の反応を達成した患者の比率である（RECIST基準にしたがう）。
2.  第2エンドポイントは、処置に応じたサイログロブリンレベルの変化を含む（抗サイログロブリン抗体陰性患者のみ）。
【０４３２】
研究設計：
2つの患者グループ（並行実施）における前向き、非盲検、単回用量研究：
グループA - 放射性ヨード処置を受けたにもかかわらず進行性甲状腺癌疾患を有しており、標的化抗血管新生療法（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤または抗VEGFモノクローナル抗体）は未使用の12名の評価可能な患者の処置。対象はまた、その他の癌化学療法処置を受けている場合がある。
グループB - 放射性ヨードおよび少なくとも一つの抗血管新生療法による処置経験があるにもかかわらず進行性甲状腺癌を有している12名の評価可能な患者の処置。対象はまた、その他の癌化学療法処置を受けている場合がある。
【０４３３】
処置計画および研究期間：
Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターを、3×1012 vp（ウイルス粒子）の単回静脈内注入により投与する。注入後の効果のフォローアップ期間は、疾患進行が起こるまでとする。処置後の安全性および効果の評価のための来院は、12週目または疾患進行まで（いずれか遅い方）の4週ごととする。その後、ステージ再評価を、研究参加後少なくとも1年間または進行があるまで（早い方）2ヶ月ごとに行う。指標とする病変の正式なステージ再決定は8週ごとに行う。
【０４３４】
集団規模：
この研究のグループAおよびBに、各12名の評価可能な対象、計24名の評価可能な対象を登録する。評価可能な対象とは、研究期間を通じて選択された評価基準を適用できる対象のことである。本試験は、2段階サイモン（Simon）統計モデルに基づき設計されている。最初の12名の患者において少なくとも1つの反応が観察された場合、そのグループからさらに24名の患者を登録する（グループあたり計37名の患者または総計74名まで）。
【０４３５】
参加基準：
1.  患者≧18歳；
2.  組織学的または細胞学的に進行DTC（乳頭、濾胞、ヒュルトレ細胞）が確認されている；
3.  放射性ヨード治療に対する感受性の不存在；
4.  抗血管新生剤による処置経験なし（グループAの患者のみ）；
5.  従来技術では≧20mmまたはスパイラルCTスキャンでは≧10mmの、少なくとも一つの寸法（最長径が記録されるべき）を正確に測定することができる少なくとも一つの病変と定義される、測定可能な疾患（注：身体検査によってのみ測定可能な疾患は不適格であり、指標となる病変の評価にはCTおよび／またはMRIが必要となる）；
6.  期待余命>3ヶ月；
7.  ECOGパフォーマンスステータス（PS）が0、1または2；カルノフスキーパフォーマンスステータスが≧60%；
8.  i.  適当な場合、適切な腫瘍マーカーの漸進的増加；および
ii.  継続的に行う適当な画像診断（例えばCTスキャン）において客観的に測定される疾患の明らかな進行
によって評価される、スクリーニングの来院の前の6ヶ月の期間における腫瘍進行の客観的証拠。腫瘍の進行が不明確な場合、本研究の主任調査員を決定の補助として使用することができる；
9.  患者が、末梢白血球数>3000細胞/mcL、絶対好中球数>1500細胞/μl、ヘモグロビン≧10g/dl、血小板>100,000/μlおよび国際標準化比（International Normalized Ratio; INR）<1.2x正常上限（Upper Limit of Normal; ULN）により示される、正常／許容可能な血液学的プロフィールを有すること；
10.  患者が、十分な腎機能、すなわち、正常上限の<1.5倍の血清クレアチニン；ならびにALTおよびAST<2.5x正常上限および正常上限以下の総ビリルビンにより定義される十分な肝機能を有すること；
11.  男性および出産能力のある女性は、本試験コースを通じて、標準的な避妊法を利用しなければならない；
12.  書面によるインフォームドコンセント書類を理解する能力およびそれに署名する意志；
13.  研究要件を満たす意志。
【０４３６】
除外基準：
1.  妊娠または授乳中の女性；
2.  疾患が身体検査によってのみ測定可能であること；
3.  以下のいずれかの存在；
・ベースラインの来院の<4週間前の放射線療法または化学療法；
・骨髄の≧25%に対する放射線療法；
・ベースラインの来院の<4週間前の大きな手術；
・同時におよび／または先行してオクトレオチド療法が行われること、ただしこの療法において腫瘍の進行が確認される場合；
・同時におよび／または先行してビスホスホネート療法が行われること；
4.  登録前4週間以内の任意のその他の継続的調査薬；
5.  過去12ヶ月以内に、心筋梗塞、心不整脈、不安定狭心症の判定、心血管形成術またはステント留置術を含む急性心臓事象を経験した患者；
6.  QTcの延長（QTc間隔≧500ミリ秒と定義される）またはその他の有意なECGの異常（例えば、心室期外収縮の頻出、継続的な心筋虚血の証拠）；
7.  患者が、心筋または末梢のいずれかの活動性血管性疾患を有すること；
8.  患者が、増殖性および／または血管性網膜症を有すること；
9.  患者が、腫瘍転移に関連する疾患以外の既知の活動性肝疾患（アルコール性、薬物／毒物誘導性、遺伝性または自己免疫性）を有すること；
10.  患者が、既知のCNS転移性疾患を有すること（例外：処置したCNS転移物が最終的な治療投与から>6ヶ月後の放射線学的試験により安定であることが示された患者は、適性があるものとする）；
11.  以下のウイルスの一つに対して陽性であることが確認された患者：HIV、HBVまたはHCV；
12.  以下の状態のいずれか；
・  重篤または非治癒性の創傷、潰瘍または骨折；
・  登録から28日以内の腹瘻、胃腸穿孔、活動性憩室炎、腹腔内膿瘍または胃腸管出血の病歴；
・  登録から6ヶ月以内の任意の脳血管障害（CVA）の病歴；
・  治療用ワルファリンを現在使用中（注：低分子量ヘパリンおよび予防用低用量ワルファリン［国際標準化比（INR）<1.2x正常上限（ULN）]は許容される）；
・  血友病、播種性血管内凝固（DIC）または潜在的に患者を易出血性にする任意のその他の凝固異常を有する患者を含む、出血性疾患の病歴；
・  コントロール不十分な鬱病もしくは不安症、または近時（6ヶ月前以内）の自殺念慮；
13.  グルココルチコイドまたはシクロスポリンの使用を含む免疫抑制処置に対する継続的な必要性が存在する患者、または登録前の最後の4週間以内に任意のそのような薬物の長期的使用の履歴がある患者；
14.  継続中もしく活性な感染または研究要件の順守を制限し得る精神病／社会的状況を含むがこれらに限定されないコントロール不良の併発性疾患。
【０４３７】
処方、投薬量、および投与：
Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターは、滅菌ベクター溶液として処方する。この溶液を、単回使用バイアルにより、凍結状態（-65℃以下）で供給する。各バイアルは特定ウイルス価のベクター溶液0.5mlを含む。希釈および取り扱い中は、このベクター溶液を解凍し、氷上で維持する。
【０４３８】
Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターは、単回静脈内注入により投与し、最大用量は1×1012〜1×1013ウイルス粒子（vp）である。注入前に、注射用溶液を室温にする。バイアルを生物学的に安全なキャビネット内で開封し、通常の注入用生理食塩水で1:4希釈する（注射ごとに）。希釈したAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクターの単回注入は1ml/分の速度で行う。複数分の用量は既定の最小間隔をあけて投与する。
【０４３９】
安全性の評価：
1.  有害事象を継続的に記録する。これらの事象は、解消するまでまたは研究終了までのいずれか早い方まで追跡する。
2.  生命兆候をスクリーニング時、投与前、投与30分後、60分後、4時間後および6時間後ならびに全患者来院時に記録する。
3.  身体検査を各々の研究来院時にあわせて行う。
4.  安全性に関する検査室評価（生命兆候、血液の血液学および化学、尿検査）を、スクリーニング時、投与前、および、4±1日目以降疾患進行または12週目のいずれか遅い方までの全患者来院時に実施する。
5.  疾患進行または12週目（いずれか遅い方）以降は、研究登録から1年後まで2ヶ月ごとに、安全性に関するフォローアップのために各患者と電話で接触する。
【０４４０】
生体内分布：
アデノウイルスベクターDNAおよびfas導入遺伝子のレベルの評価のための血液および尿試料を、アデノウイルスベクターDNA用に注入後の複数時点で回収する。
【０４４１】
効果の評価：腫瘍反応
腫瘍反応に対するAd5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスベクター処置の効果は、スクリーニング時およびその後の疾患進行までの来院時にRECIST基準（上記参照）にしたがい腫瘍を測定することによって評価する。腫瘍ボリュームの変化を、放射線学的研究に基づき評価分析する。
【０４４２】
生化学および検査室アッセイ：
抗体：アデノウイルス（総免疫グロブリン、総IgGおよびAd-5中和Ab）およびfas-キメラ導入遺伝子に対する抗体レベルの分析のために、血清試料を、投与前および1週目以降の全患者来院時に回収する。
【０４４３】
腫瘍マーカー：TSH、抗サイログロブリン抗体およびサイログロブリンを、すべてのフォローアップ評価にあわせて試験する。
【０４４４】
腫瘍測定：指標となる病変に対する生物学的効果の評価（CT、MRI）。
【０４４５】
統計学的評価：
患者を彼らの甲状腺癌の処置経験に基づき2つの対象グループ：グループA、DTC放射性ヨード抵抗性および抗血管新生剤未使用；グループB、DTC放射性ヨード抵抗性で抗血管新生剤によっても進行あり、に分ける。これら2つのグループを、独立して、効果および毒性のエンドポイントに関して評価する。
【０４４６】
各グループにおける患者の動員は2段階で行う：
第1段階：12名の患者を研究に投入する。各グループ12名の対象とする。臨床反応が観察されない場合、その療法はこの患者集団において有効ではないと判断し、研究を終了する。少なくとも1つの反応が観察される場合、本研究グループを第2段階に移行する。
第2段階：さらに25名の評価可能な患者を各グループの研究に投入する。37名の評価可能な患者全員を反応について評価し、3またはそれより少ない反応が観察される場合、その療法はこの患者集団において十分に有効でないと判断する。4またはそれより多くの反応が観察される場合、これは成功が期待できる十分な証拠と判断し、この処置を、その後の研究においてこの患者集団でさらに試験することを推奨する。
【０４４７】
毒性に遭遇するかまたは本研究がその中間分析で中止されない限り、この研究に各グループ37名の適格な対象および評価可能な患者を動員する。不適格性、中断、大きな処置上の違反もしくはその他の理由または早期の離脱もしくは脱落を考慮して、各グループにさらに4名の患者を登録する。したがって41名の患者がこの研究の各グループに登録される。計82名の対象となる。
【０４４８】
評価は、以下の表10のスケジュールにしたがい行う。
【０４４９】
（表１０）評価スケジュール
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【０４５０】
注記
1.  出産能力のある女性については、スクリーニング時および12週目に、血清妊娠試験を使用して妊娠について試験する。
2.  生命兆候（血圧、体温および心拍数）は、スクリーニング時、投与前、投与30および60分後ならびに投与6時間後、ならびにその後の全患者来院時に記録する。
3.  血液学は、全血球計算および白血球百分率数（differential）、PTならびにPTTフィブリノゲンを含む。
4.  化学は、電解質（ナトリウム、カリウム、カルシウム）、クレアチニン；ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ALTおよびAST；総タンパク質およびアルブミンを含む。
5.  一般的な尿検査。
6.  アデノウイルスおよび導入遺伝子に対する血清抗体のレベルのために血液試料を回収する。
7.  生体内分布の決定（ウイルスDNAおよび導入遺伝子のレベル）のために血液および尿試料を回収する。詳細についてはプロトコル参照。
8.  指標となる病変の評価（CT、MRI等）を、疾患進行までの各来院時に行う。
9.  疾患進行までの各来院時にTSH、抗サイログロブリン抗体およびサイログロブリンが試験されるべきである。
10.  20、28、36、44および52週目の来院は、その来院前に疾患進行が起こっていない場合にのみ実施する。
11.  電話による接触は、12週目または疾患進行以降（どちらか遅い方）2ヶ月ごとに、研究登録後1年経過まで実施する。
【０４５１】
サイログロブリンは、投与後13ヶ月または進行のいずれか早い方まで2ヶ月ごとに試験する。
【０４５２】
実施例IV
Ad5PPE-1-3X-fasキメラアデノウイルスと化学療法の併用の効果
癌における腫瘍サイズに対するAd5PPE-1-3X-fasキメラと化学療法の併用治療腫瘍崩壊効果を評価するため、転移の速いルイス肺癌モデルへのAd5PPE-1-3X-fasキメラの全身投与および化学療法の同時実施を選択した。
【０４５３】
ルイス肺癌モデルは、生じた転移性癌に対する処置の効果を観察する方法を提供する。
【０４５４】
スニチニブ（Sutent）はチロシンキナーゼを標的とし、VEGFの作用を阻害することで抗血管新生効果を生じ、これは特に、間質性腫瘍および進行腎細胞癌に使用される。
【０４５５】
肺転移物を有するマウスにおけるAd5PPE-1-3X-fasキメラの単回全身投与および経口用スニチニブの抗転移効果
8週齢のC57BL/6オスマウス（各グループ13〜19匹）の左足裏に5 X 105 LLC細胞を接種した。原発腫瘍が7mmに達したら直ちに全身麻酔下で足を切断した。（足切断から）2日後、Ad5PPE-1-3X-fasキメラ（109または1011ウイルス粒子）の単回静脈内注射を尾静脈を通じて実施した。このベクターを投与した後、1日1回40または80mg/kgの経口用スニチニブの1日単位レジメンを、1〜5、8〜13および16〜17日目に実施した。マウスの屠殺を、原発腫瘍の除去後22日目に設定した。マウスの健康状態を観察および体重測定により毎日モニターした。結果（腫瘍量）は、グラム数で表す腫瘍の大きさに関する（腫瘍量として公知である）。
【０４５６】
図13Aおよび13Bは、併用療法を受けた2つの転移性マウスのグループの結果を、各々の処置様式を単独で用いた場合との比較で詳細に示している。この処置の用量効果は、40mg/kgスニチニブを投与されたマウスと80mg/kgスニチニブを投与されたマウスの腫瘍量の比較、および109のAd5PPE-1-3X-fas-cを投与されたマウスと1011のAd5PPE-1-3X-fas-cを投与されたマウスの腫瘍量の比較において見出すことができ、2つの処置様式の併用の結果は対照グループとすべての処置グループの間の統計学的有意差（P<0.05）を明らかにし、対照グループにおける平均腫瘍量はその他の各グループよりも有意に大きかった。高ウイルス用量（1011ウイルス粒子）および低用量併用処置（109ウイルス粒子および80mg/kgスニチニブ）が、腫瘍量の減少に最も効果的であることが見出され、その腫瘍量は、109ウイルス粒子および40mg/kgスニチニブのいずれかのグループの腫瘍量よりも統計学的に低かった。これらの併用グループはまた、その他の実験グループと比較して、小さい変動性および全体的に低いスコアを示した。この結果は、全身投与したAdPPE-1-3X-fas-キメラ＋経口用スニチニブの併用処置が転移性疾患に対して有効であることを示している。
【０４５７】
まとめると、これらの結果は、Ad5PPE-1-3X fas-cが、現在利用されている臨床化学療法プロトコルと併用した場合、それらの治療効果を高め、かつ用量および処置頻度を減らすことができる可能性があることを示している。
【０４５８】
本発明は、その特定の態様と関連づけて説明されてきたが、多くの変更、修正および派生が当業者に明らかとなるであろうことは明白である。したがって、そのような変更、修正および派生はすべて、添付の特許請求の範囲の精神および広義の範囲に包含されるものとして網羅されることが意図される。
【０４５９】
本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、各々個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられることが示されているのと同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、本願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明に関する先行技術として利用できることの承認であるとみなされるべきではない。各セクションで見出しが使用されている場合、それらは必須の限定であるとみなされるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2013516454.tif 000029
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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