(57)【要約】  本開示は、血液癌、例えば、リンパ腫、白血病または骨髄腫の予防および治療において有用な、少なくとも１種のアジュバントを含むワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）リンパ腫または白血病に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原、
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原と連結したＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントまたはそのＣＤ４０結合性断片；ならびに
ｉｉｉ）連結したイディオタイプ抗原およびＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのＣＤ４０結合性断片アジュバントに対する免疫応答を増強する第２のアジュバント
を含むワクチン。
【請求項２】
前記第２のアジュバントが、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃおよびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記アジュバントが、ポリＩ：Ｃである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記アジュバントが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）および／またはモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ］などの細菌細胞壁誘導体である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記アジュバントが、ＭＰＬである、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記イディオタイプ抗原が、前記イディオタイプ抗原のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ）２’断片を含む、またはそれからなる、請求項１から６までのいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】
ｉ）リンパ腫または白血病に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原と連結したＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントまたはそのＣＤ４０結合性断片；ならびに
ｉｉｉ）リンパ腫または白血病の治療において使用するための、連結したイディオタイプ抗原およびＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのＣＤ４０結合性断片アジュバントに対する免疫応答を増強する第２のアジュバント
を含むワクチン。
【請求項９】
前記リンパ腫または白血病が、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞リンパ腫が、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、骨髄腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症など）、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、ＭＡＬＴリンパ腫とも称される節外周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記リンパ腫が、免疫不全関連リンパ腫である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記免疫不全関連リンパ腫がＨＩＶ関連である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記免疫不全関連リンパ腫が移植関連である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記免疫不全関連リンパ腫が、メトトレキサート治療の結果である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
ｉ）骨髄腫に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原と連結したＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントまたはそのＣＤ４０結合性断片；ならびに
ｉｉｉ）骨髄腫の治療において使用するための、連結したイディオタイプ抗原およびＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのＣＤ４０結合性断片アジュバントに対する免疫応答を増強する第２のアジュバント
を含むワクチン。
【請求項１６】
リンパ腫の予防法または治療に適したワクチンを製造する方法であって、
ｉ）リンパ腫または白血病を有する、またはそれにかかりやすい対象からイディオタイプ抗原を単離するステップ；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原をＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのＣＤ４０結合性断片アジュバントと連結して複合体を形成し、場合によって、連結した複合体を単離するステップ；および
ｉｉｉ）少なくとも１種の追加的なアジュバントを伴った、連結した抗原／アジュバント複合体の調製物を形成するステップ
を含む方法。
【請求項１７】
リンパ腫の予防法または治療に適したワクチンを製造する方法であって、
ｉ）リンパ腫の細胞を含む単離された生体試料を用意するステップ；
ｉｉ）ＣＤ４０モノクローナル抗体を産生する単離されたハイブリドーマ細胞を用意するステップ；
ｉｉｉ）リンパ腫の細胞と前記ハイブリドーマ細胞系との融合を促進してハイブリッド細胞を形成するのに適した調製物を形成するステップ；
ｉｖ）前記ハイブリッド細胞を、１つの免疫グロブリンがＣＤ４０に対して特異的であり、第２の免疫グロブリンがリンパ腫または白血病のイディオタイプである少なくとも２つの免疫グロブリンを含むモノクローナル抗体についてスクリーニングするステップ；および
ｖ）連結した抗原／アジュバント複合体と、少なくとも１種の追加的なアジュバントとの調製物を形成するステップ
を含む方法。
【請求項１８】
前記第２のアジュバントが、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃおよびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントが、ポリＩ：Ｃである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アジュバントが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）および／またはモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ］などの細菌細胞壁誘導体である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
ｉ）リンパ腫に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；および
ｉｉ）リンパ腫の治療において使用するための、イディオタイプ抗原に対する免疫応答を増強するアジュバント
を含むワクチン。
【請求項２３】
前記アジュバントが、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃおよびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記アジュバントがポリＩ：Ｃである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記アジュバントが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）および／またはモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ］などの細菌細胞壁誘導体である、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記アジュバントがＭＰＬである、請求項２６に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、リンパ腫、白血病または骨髄腫などの血液癌の予防および治療において有用なワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、１つまたは複数の細胞集団が制御されずに増殖することによって正常な生物学的機能が妨げられる異常な病態である。増殖性変化は、通常、あまり組織化されていない状態への後戻りを含めた、細胞の性質の他の変化を伴う。癌細胞は、一般には「形質転換された」と称される。形質転換された細胞は、一般に、以下の性質のいくつかを示す：球状の形態、胎児性抗原の発現、成長因子非依存性、接触阻止の欠如、足場非依存性、および高密度になるまで成長すること。癌細胞は、腫瘍を形成し、「原発性」または「二次性」腫瘍と称される。原発性腫瘍により、元の形質転換された細胞が発生する器官において癌細胞が成長する。二次性腫瘍は、癌細胞が原発性腫瘍から逃れ、別の器官において二次性腫瘍を確立することから生じる。このプロセスは、転移と称され、このプロセスは、例えば、肝細胞癌または肺癌の場合と同様に、攻撃的であり得る。
【０００３】
リンパ腫は、リンパ球で起こり、リンパ節において固形腫瘍を形成する癌である。リンパ腫とは、多数のリンパ球を起源とする癌を分類する用語である。例えば、Ｂ細胞腫瘍、例えば、慢性リンパ球白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、バーキットリンパ腫など；Ｔ細胞腫瘍、例えば、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、ＮＫ細胞白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病など。さらに、リンパ腫としては、細分することができる古典的ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。上記に加えて、免疫不全に関連するリンパ腫、例えば、ＨＩＶ感染に関連するリンパ腫、移植後のリンパ腫およびメトトレキサート治療に関連するリンパ腫が蔓延している。これらの後者のリンパ腫は、ワクチン接種が実行可能な療法ではないので、特定の難しさがある。リンパ腫の治療は、一般には、化学療法および放射線療法であり、これは、特定のリンパ腫および病期に応じて有効な治療であり得る。免疫不全の対象を保護するワクチンを提供することが望ましい。現在のところ、このクラスの癌に対する、ワクチン接種するための検証された有効な手段はない。
【０００４】
抗体の、その抗原に対する結合特異性を決定する抗体の領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、「超可変領域」または「イディオタイプ」とも称される。抗体の抗原結合領域は、ランダムに引き出されたアミノ酸配列で構成されているので、これらはＢ細胞の１つのクローンまたは少数クローンに対して独特である。したがって、これらの独特のペプチド配列は、それ自体が抗原性であり、組み合わさって抗体分子の独特のイディオタイプを構成する。抗原は、いくつものエピトープで構成されているので、同様に、イディオタイプもいくつもの「イディオトープ」で構成されている。特定のイディオタイプの精製した免疫グロブリンを用いて免疫化することにより、そのイディオタイプに対する抗体応答を生成することができる。
【０００５】
免疫グロブリンに対する免疫応答を誘導することを目的として、免疫グロブリンをワクチン抗原として使用する２つのシステムがある。どちらのシステムでも、免疫応答を惹起するために、抗体の超可変領域またはイディオタイプを使用する。どちらの場合でも、抗体のイディオタイプを使用して抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）応答を生成する。第１の場合では、抗体のイディオタイプは、免疫エフェクター応答の実際の標的である。例えば、Ｂ細胞リンパ腫および白血病は、一般に、Ｂ細胞の単一のクローンから生じ、したがって、それらの細胞表面上に、腫瘍に独特の、またはほぼ独特の免疫グロブリンを発現し得る。この免疫グロブリンイディオタイプに対する免疫応答の生成は、ワクチン接種の所望の効果であり、これは、腫瘍細胞のクリアランスに役立ち得る。生成される抗イディオタイプ応答は、抗体媒介性応答とＴ細胞媒介性応答の両方からなり得る。したがって、免疫グロブリンイディオタイプは、腫瘍に特異的な抗原の最も良い例の１つであり得る。第２のシステムでは、何らかの理由で精製することが難しいか、直接投与すると免疫原性が低い腫瘍抗原または病原体もしくは別の供給源由来の抗原であり得る抗原と交差反応する応答を生成させるために、いわゆる「内部イメージ抗イディオタイプ抗体」を使用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の抗イディオタイプワクチンを含めた、イディオタイプに基づくワクチンが当技術分野で公知である。しかし、これらのワクチンには問題が伴う。第１に、リンパ腫の患者に対して、イディオタイプはその個体の腫瘍に対して独特であると思われるので、ワクチンを個別に作製しなければならず、また、多くの場合、所望のイディオタイプを分泌するハイブリドーマを作製するステップ、免疫グロブリンを精製するステップ、および、次いでＫＬＨなどのタンパク質担体とコンジュゲートするステップを伴うワクチンの製剤化には数ヶ月かかり得る。第２に、ヒト免疫グロブリンは本質的にヒトにおける免疫原性が低く、したがって、イディオタイプに対する免疫応答を増大させるために担体とコンジュゲートさせても、抗Ｉｄ抗体応答が弱い傾向がある（実際、コンジュゲートに対する応答の大部分は、免疫原性の高い担体タンパク質を対象とする）。第３に、マウスおよびヒトの両方において、イディオタイプタンパク質に対するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＴＬ応答の両方が、治療反応を媒介することにおいて重要であり得、ＫＬＨなどの担体とコンジュゲートすることはＣＴＬ応答を生成するための最も効率的な手段ではないことが示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、リンパ腫の予防的な治療および治療的な治療のためのワクチンおよび治療レジメンに関する。
【０００８】
本発明の態様によると、
ｉ）リンパ腫に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原と連結したＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバント、またはそのＣＤ４０結合性断片；ならびに
ｉｉｉ）連結したイディオタイプ抗原およびＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントに対する免疫応答を増強する第２のアジュバント
を含むワクチンが提供される。
【０００９】
ＣＤ４０モノクローナル抗体が当技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９／００７４７１［その内容全体、特に前記抗体の可変領域のアミノ酸配列が参照により組み込まれる］には、本発明による、図１２に開示されている配列で表されるワクチンにおいて使用するのに適したヒト化抗ヒトＣＤ４０およびキメラ抗ヒトＣＤ４０が開示されている。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、前記第２のアジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００１１】
本発明の別の代替的な実施形態では、前記アジュバントは、ＴＬＲアゴニスト、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリイノシン・ポリシチジン酸［ポリＩ：Ｃ］およびそれらの誘導体などである。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ポリＩ：Ｃである。
【００１３】
ポリＩ：Ｃは、Ｂ細胞および樹状細胞によって発現されるＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ３に結合するアジュバントである。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、細菌細胞壁誘導体、例えば、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）および／またはモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ］などである。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ＭＰＬである。
【００１６】
アジュバントは、免疫細胞の活性を調節することによって抗原に対する特異的な免疫応答を増大させる物質または手順である。アジュバントの例としては、単に例として、同時刺激分子に対するアゴニスト抗体、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、リポソーム、ミョウバン、ＱＳ２１が挙げられる。したがって、アジュバントは免疫調節物質である。担体は、第２の分子に結合すると、それに対する免疫応答を増大させる免疫原性分子である。担体という用語は、以下のように解釈される。担体は、第２の分子に結合すると、それに対する免疫応答を増大させる免疫原性分子である。一部の抗原は、本来免疫原性ではないにもかかわらず、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイドなどの外来タンパク質分子と結びつくと抗体応答を生成することができ得る。そのような抗原は、Ｂ細胞エピトープを含有するが、Ｔ細胞エピトープは含有しない。そのようなコンジュゲートのタンパク質部分（「担体」タンパク質）により、ヘルパーＴ細胞を刺激するＴ細胞エピトープが提供され、今度は、それによって抗原に特異的なＢ細胞が刺激されて血漿細胞に分化し、抗原に対する抗体を産生する。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞などの他の免疫細胞も刺激し、担体は、細胞に媒介される免疫ならびに抗体の生成において類似の役割を果たし得る。Ｔ細胞エピトープを欠く特定の抗原、例えば、反復Ｂ細胞エピトープを有するポリマーなど（例えば、細菌性多糖類）は、本来、限られた程度に免疫原性である。これらは、Ｔに依存しない抗原として公知である。そのような抗原は、はるかに強力な抗体応答を引き出す状況の下で、破傷風トキソイドなどの担体と結びつけることが有益である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、前記イディオタイプ抗原は、前記イディオタイプ免疫グロブリンのＦａｂ断片またはＦ（ａｂ）２’Ｆｄ断片を含む、またはそれからなる。
【００１８】
イディオタイプ抗原は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域、すなわち（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’、Ｆｄ断片内にあってよい、またはそれどころか、重鎖可変領域および軽鎖可変領域と別の抗体の定常領域との間のキメラであってよい。
【００１９】
本発明の態様によると、
ｉ）リンパ腫に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原と連結したＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントまたはそのＣＤ４０結合性断片；および
ｉｉｉ）リンパ腫の治療において使用するための、連結したイディオタイプ抗原とＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントに対する免疫応答を増強する第２のアジュバント
を含むワクチンが提供される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、前記リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、前記Ｂ細胞リンパ腫は、慢性リンパ球白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、骨髄腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症など）、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、ＭＡＬＴリンパ腫とも称される節外周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病からなる群から選択される。
【００２２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫である。
【００２３】
本発明の代替の好ましい実施形態では、前記リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫である。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記リンパ腫は、免疫不全関連リンパ腫である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、前記免疫不全関連リンパ腫は、ＨＩＶ関連である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、前記免疫不全関連リンパ腫は、移植関連である。
【００２７】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記免疫不全関連リンパ腫は、メトトレキサート治療の結果である。
【００２８】
本発明の別の態様によると、
ｉ）骨髄腫に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原と連結したＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバント、またはそのＣＤ４０結合性断片；ならびに
ｉｉｉ）骨髄腫の治療において使用するための、連結したイディオタイプ抗原およびＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのＣＤ４０結合性断片アジュバントに対する免疫応答を増強する第２のアジュバント
を含むワクチンが提供される。
【００２９】
本発明のワクチンまたはワクチンを含む医薬組成物を投与する場合、それらは、薬学的に許容される調製物で投与する。そのような調製物は、常套的に、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性の担体、補足的な免疫増強剤、および場合によって、本発明のワクチンとは別に、または、組み合わせが適合する場合、組み合わせた調製物で投与することができる化学療法剤などの他の治療剤を含有してよい。本発明のワクチンは、注射を含めた任意の従来の経路によって、またはある期間にわたる段階的な注入によって投与することができる。投与は、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または経皮的であってよい。
【００３０】
本発明の組成物は、有効量で投与する。「有効量」は、単独で、または別の用量と一緒に、所望の免疫学的応答を生じさせる組成物の量である。リンパ腫を治療する場合では、所望の応答は、疾患の進行を阻害することである。これは、単に疾患の進行を一時的に遅くすることを含んでよいが、疾患の進行を恒久的に停止することを含むことがより好ましい。これは、常套的な方法によってモニターすることができる。
【００３１】
前述の方法において使用するワクチンは、好ましくは、滅菌されており、所望の応答を生じさせるための有効量を患者に投与するのに適した重量または体積の単位で含有する。応答は、例えば、腫瘍の退縮、疾患の症状の減少、アポトーシスの調節などを決定することによって測定することができる。
【００３２】
ワクチンを投与するための、投与量、注射のスケジュール、注射する部位、投与形式（例えば、腫瘍内）などが前述のものと異なる他のプロトコールは当業者に公知になる。例えば、ヒト以外の哺乳動物への、試験目的または獣医学的な治療目的での組成物の投与は、上記と実質的に同じ条件下で行う。対象は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、好ましくはヒトであり、非ヒト霊長類、雌ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類を含む。
【００３３】
本発明の別の態様によると、リンパ腫の予防法または治療に適したワクチンを製造する方法であって、
ｉ）リンパ腫を有する、またはそれにかかりやすい対象からイディオタイプ抗原を単離するステップ；
ｉｉ）前記イディオタイプ抗原をＣＤ４０モノクローナル抗体アジュバントまたはそのＣＤ４０結合性断片と連結して複合体を形成し、場合によって、連結した複合体を単離するステップ；および
ｉｉｉ）少なくとも１種の追加的なアジュバントを伴った、連結した抗原／アジュバント複合体の調製物を形成するステップ
を含む方法が提供される。
【００３４】
本発明の別の態様によると、リンパ腫の予防法または治療に適したワクチンを製造する方法であって、
ｉ）リンパ腫の細胞を含む単離された生体試料を用意するステップ；
ｉｉ）ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのＣＤ４０結合性断片を産生する単離されたハイブリドーマ細胞を用意するステップ；
ｉｉｉ）リンパ腫の細胞と前記ハイブリドーマ細胞系との融合を促進してハイブリッド細胞を形成するのに適した調製物を形成するステップ；
ｉｖ）前記ハイブリッド細胞を、１つの免疫グロブリンまたは部分がＣＤ４０に対して特異的であり、第２の免疫グロブリンまたは部分がリンパ腫のイディオタイプである少なくとも２つの免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を含むモノクローナル抗体についてスクリーニングするステップ；および
ｖ）連結した抗原／アジュバント複合体と、少なくとも１種の追加的なアジュバントとの調製物を形成するステップ
を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明の好ましい方法では、前記第２のアジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００３６】
本発明の別の代替の方法では、前記アジュバントは、ＴＬＲアゴニスト、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃおよびそれらの誘導体などである。
【００３７】
本発明の好ましい方法では、前記アジュバントは、ポリＩ：Ｃである。
【００３８】
本発明の好ましい方法では、前記アジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）および／またはモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ］などの細菌細胞壁誘導体である。
【００３９】
本発明の好ましい方法では、前記アジュバントは、ＭＰＬである。
【００４０】
本発明の態様によると、
ｉ）リンパ腫に罹患している患者から単離されたイディオタイプ抗原；および
ｉｉ）リンパ腫の治療において使用するための、イディオタイプ抗原に対する免疫応答を増強するアジュバント
を含むワクチンが提供される。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００４２】
本発明の別の代替の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃおよびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ポリＩ：Ｃである。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）および／またはモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ］などの細菌細胞壁誘導体である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、前記アジュバントは、ＭＰＬである。
【００４６】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という単語、およびその単語の変形、例えば、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加物、構成成分、整数またはステップを排除することを意図しない（そして、排除しない）。
【００４７】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、単数形は、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、複数形を包含する。具体的には、不定冠詞が使用されている場合、本明細書は、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数だけでなく複数も意図していると理解されるべきである。
【００４８】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と併せて記載されている特徴、整数、特性、化合物、化学的部分または化学基は、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または実施例に、それに適合しない場合を除き、適用可能であると理解されるべきである。
【００４９】
ここで、本発明の実施形態を、単に例として、以下の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ワクチンを２ヶ月隔てて２回投薬した後の、マウス（群当たりｎ＝５）におけるＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ］および６０日目における生存［Ｂ］を示すグラフである。
【図２】２回目のワクチン接種の１４日後、腫瘍の攻撃前のＩｇＧ抗Ａ２０抗体の応答を示すグラフである。
【図３】２回目のワクチン接種の１４日後、腫瘍の攻撃前のＩｇＧ抗Ａ２０抗体の応答を示すグラフである。
【図４】単回のワクチン接種の１４日後、腫瘍の攻撃前のＩｇＧ抗Ａ２０抗体の応答を示すグラフである。
【図５】ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートワクチンのＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２ａアイソタイプを単回投薬した後の、マウス（群当たりｎ＝５）におけるＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ］および６０日目における生存［Ｂ］を示すグラフである。
【図６】ワクチンを２週間隔てて２回投薬した後のマウス（群当たりｎ＝５）におけるＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ］および６０日目における生存［Ｂ］を示すグラフである。
【図７】ワクチンをＭＰＬと一緒に、またはＭＰＬなしで、２週間隔てて２回投薬した後のマウス（群当たりｎ＝５）におけるＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ］および６０日目における生存［Ｂ］を示すグラフである［免疫試験５ａ］。
【図８】ワクチンを、ポリＩ：Ｃと一緒に、またはポリＩ：Ｃとなしで、２週間隔てて２回投薬した後のマウス（群当たりｎ＝１０）におけるＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ］および生存曲線［Ｂ］を示すグラフである［免疫試験５ｂ］。
【図９】ワクチンをＧＭ−ＣＳＦと一緒に、２回投薬した後の、マウス（群当たりｎ＝１０）におけるＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ、Ｃ］および生存曲線［Ｂ、Ｄ］を示すグラフである［免疫試験６および１０］。
【図１０】ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートまたはＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲートの用量レベルを増加させた後の、マウス（群当たりｎ＝１０）のＡ２０リンパ腫について、腫瘍の成長［Ａ、Ｃ］および生存曲線［Ｂ、Ｄ］を示すグラフである［免疫試験７および９］。
【図１１】ＡＤＸ４０リンパ腫ワクチンの作用様式の潜在性を例示しているグラフである。
【図１２】図１２ａ：ヒトＣＤ４０に結合するＣＤ４０モノクローナル抗体の可変性の重鎖のヌクレオチド配列を示す図である。  図１２ｂ：ヒトＣＤ４０に結合するＣＤ４０モノクローナル抗体のアミノ酸配列を示す図である。  図１２ｃ：ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と融合したＣＤ４０可変領域を含むキメラ抗体を示す図である。  図１２ｄ：ヒトＣＤ４０に結合するＣＤ４０モノクローナル抗体の可変性の軽鎖のヌクレオチド配列を示す図である。  図１２ｅ：ヒトＣＤ４０に結合するＣＤ４０モノクローナル抗体の可変性の軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。  図１２ｆ：図１２ｅで言及された全長の可変性の軽鎖を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
材料および方法
コンジュゲートするためのイディオタイプタンパク質の作製
リンパ腫ワクチンまたは白血病ワクチンに組み入れるための腫瘍イディオタイプタンパク質は、２つの一般の方法のうちの１つによって得ることができる。どちらの場合でも、腫瘍細胞は、まず生検によって得られる。
【００５２】
第１の方法は、腫瘍細胞をヒト／マウスヘテロハイブリドーマまたは骨髄腫株などの同様の不死化細胞株と融合して、別のハイブリドーマを作製し、次いでそれを、腫瘍イディオタイプタンパク質の分泌に基づいて選択する、ハイブリドーマレスキューである。次いで、選択されたハイブリドーマを組織培養物中、通常バイオリアクター内で成長させて上清を得、それからイディオタイプタンパク質を精製する１２３。
【００５３】
第２の方法は、組換えＩｄの作製である。この方法では、Ｉｄを含有し腫瘍に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方のｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲなどの標準の分子生物学的方法によってクローニングする。次いで、クローニングされた配列の両方を、共有されている免疫グロブリン定常領域の配列を含有するプラスミドに挿入し、最終的に、完全なプラスミドを細菌、哺乳動物の細胞、昆虫細胞、酵母細胞またはタバコ植物体などの種々の生きている宿主に形質導入する。その後、Ｉｄタンパク質を培養物の上清またはトランスフェクトされた細胞から精製する４。
【００５４】
コンジュゲートの調製
Ａ２０イディオタイプタンパク質（Ａ２０）を、ＰＥＧ融合によって調製したＡ２０リンパ腫の細胞とＰ３Ｘ６３骨髄腫細胞との間のレスキューハイブリドーマのバイオリアクターの上清から、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ａ２０イディオタイプタンパク質をまず、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）と反応させて、マレイミド活性化Ａ２０を作製した。その間に、マウスのＩｇＧ１抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはＩｇＧ２ａ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（どちらもＡＤＸ４０；ＩｇＧ１変異体およびＩｇＧ２ａ変異体）をＳ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＡＴＡ）で処理して、保護されたスルフヒドリル基を導入した。その後、抗体をヒドロキシルアミンで脱アセチル化することにより、遊離のスルフヒドリル基を生成させ、それをＡ２０のマレイミド基と反応させて安定なコンジュゲートを形成した。アイソタイプを適合させた対照抗体を、同様にＡ２０とコンジュゲートした。
【００５５】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット法によって架橋を確認した。
【００５６】
マウスの免疫化および攻撃
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、免疫原を１回または２回、腹腔内注射し、その後、最後の免疫化の少なくとも２週間後に、Ａ２０リンパ腫の細胞１０５個を用いて皮下に攻撃した。腫瘍の成長を、直径１５ｍｍになるまでモニターし、その時点でマウスを選別した。生存曲線は、腫瘍が１５ｍｍの閾値に到達したマウスに生存しているマウスがいないことを示している。６０日目における生存は、目に見える腫瘍が出現していないマウスの百分率を表す。
【００５７】
対照ワクチン接種には、アイソタイプを適合させた対照コンジュゲート、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートしたＡ２０、単独のＡ２０抗原、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含めた。
【００５８】
体液性免疫応答
Ａ２０のＦａｂ断片に対するＩｇＧを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、ラット抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して測定した。
【実施例１】
【００５９】
２回のワクチン接種の効果（免疫試験１）
ＡＤＸ４０  ＩｇＧ１変異体を用いて２ヶ月隔ててワクチン接種し、２回目のワクチン接種の２０日後に攻撃したマウス（群当たり５匹）の腫瘍の体積および生存データが、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示されている。
【００６０】
ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲート群における腫瘍の増生は、アイソタイプ対照、ＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲートまたは単独のＡ２０を用いてワクチン接種した動物よりも有意に低く（ダンの検定後補正（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を用いたクラスカル・ワリス検定による、ｐ＜０．０１）、また、同様にＰＢＳ群よりも有意に低くかった（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートで免疫化した群の６０日目の生存は、アイソタイプ対照で免疫化した群よりも有意に良かった（ｐ＝０．０４８、フィッシャーの正確確率検定）が、ＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲート、単独のＡ２０抗原、またはＰＢＳを与えた動物よりも生存が高かったにもかかわらず、これは統計的有意性に達しなかった。
【００６２】
図２は、２回目のワクチン接種の１４日後に誘導された抗Ａ２０抗体応答を示している。アイソタイプ対照コンジュゲートは、抗体誘導の点で免疫原性が高かったが、これは、腫瘍の成長の減少または生存の改善に転換されなかった。ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートおよびＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲートに対する抗体応答も観察されたが、アイソタイプ対照に対するよりもレベルが低く、これは、腫瘍の増生の阻止が、抗体応答に部分的にしか反映されないことを示している。
【実施例２】
【００６３】
１回のワクチン接種の効果（免疫試験２）
ＡＤＸ４０  ＩｇＧ１変異体コンジュゲートを用いて一度ワクチン接種し、１４日後に攻撃したマウス（群当たり１０匹）の腫瘍の体積および生存データが図３Ａ〜Ｃに示されている。
【００６４】
ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲート群における腫瘍の増生は、どちらの対照群よりも有意に低く、遅かった（ＰＢＳ、ｐ＜０．０５；対照コンジュゲート、ｐ＜０．００１；ダンの後補正（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を用いたクラスカル・ワリス検定）。しかし、ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲート処置群における６０日目における生存は、初期の時点ではコンジュゲート群において生存が良かったが、ＰＢＳ対照群よりも、有意に良くなかった。
【００６５】
コンジュゲートを用いた単回の免疫化により、ＡＤＸ４０−Ａ２０処置群において対照の動物よりもわずかに強力な抗体応答がもたらされた（図４）。
【実施例３】
【００６６】
ＩｇＧ１ＡＤＸ４０アイソタイプとＩｇＧ２ａ  ＡＤＸ４０アイソタイプの比較（免疫試験３）
それぞれ攻撃の１４日前に単回のワクチン接種として与えたＡＤＸ４０  ＩｇＧ１変異体およびＡＤＸ４０  ＩｇＧ２ａ変異体の腫瘍の増生および６０日目における生存データの比較が、それぞれ図５Ａおよび５Ｂに示されている。
【００６７】
ＡＤＸ４０コンジュゲート変異体の両方で、ＰＢＳ対照群と比較して初期の腫瘍の成長の遅延および６０日目における生存の増加の傾向があったが、ＡＤＸ４０変異体または対照のいずれとの間にも腫瘍の増生または６０日目における生存に統計的有意差はなかった（クラスカル・ワリス検定およびカイ二乗検定）。
【実施例４】
【００６８】
組み合わせアジュバントの評価（免疫試験４）
アジュバントであるＭＰＬまたはポリＩ：ＣをＡＤＸ４０  ＩｇＧ１変異体−Ａ２０コンジュゲートワクチンと組み合わせることの効果を、マウス（群当たり５匹）に、２週間隔てて２回ワクチン接種し、２週間後に攻撃する攻撃試験において探究した。腫瘍の増生および生存データがそれぞれ図６Ａおよび６Ｂに示されている。
【００６９】
コンジュゲートの１回の投薬または２回の投薬のいずれでも、ＰＢＳ群またはＫＬＨコンジュゲート群のいずれに対しても腫瘍の成長に有意差は導かれなかった。ＡＤＸ４０プラスＭＰＬにより、ＫＬＨコンジュゲートと比較して（ｐ＜０．０１）およびＰＢＳと比較して（ｐ＜０．０５）腫瘍の成長が有意に遅くなった。ＡＤＸ４０プラスポリＩ：Ｃにより、ＰＢＳ群およびＫＬＨ群の両方と比較して腫瘍の成長が有意に遅くなった（ｐ＜０．０１）。全ての比較は、ダンの後検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を用いたクラスカル・ワリス検定によった。
【００７０】
単独のＡＤＸ４０を１回または２回与えることによって、６０日目における生存は、ＫＬＨ群またはＰＢＳ群と比較して有意に改善されなかった。
【実施例５】
【００７１】
ＭＰＬを用いた実験（免疫試験５ａ）およびポリＩ：Ｃを用いた実験（免疫試験５ｂ）を、マウスのより大きな群（群当たり１０匹）を用いて繰り返し、そのデータがそれぞれ図７および８に示されている。
【００７２】
ＡＤＸ４０−Ａ２０＋ＭＰＬで免疫化したマウスは、腫瘍の成長が、ＫＬＨ−Ａ２０＋ＭＰＬで免疫化したマウスと比較して有意に遅くなった（Ｐ＜０．０１、クラスカル・ワリス検定）。ＭＰＬとＡＤＸ４０の相加効果の明らかな傾向があったが、これはこの時に統計的に有意ではなかった。
【００７３】
しかし、ＭＰＬとは異なり、第２の攻撃ではポリＩ：ＣはＡＤＸ４０−Ａ２０抗腫瘍の効力を有意に増さなかったが、ＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲートと組み合わせると、アジュバントのアジュバント効果の傾向があった。
【実施例６】
【００７４】
「臨床的な」レジメンを用いた比較（免疫試験６および１０ａ）
ＡＤＸ４０とコンジュゲートしたＡ２０Ａの効果を、臨床的なイディオタイプリンパ腫ワクチン（すなわち、ＫＬＨとコンジュゲートし、ＧＭ−ＣＳＦでアジュバントしたイディオタイプ抗原）と一緒に使用するレジメンと類似したレジメンと比較するために、マウス１０匹の群に、ＡＤＸ４０−Ａ２０、ＡＤＸ４０＋ＧＭ−ＣＳＦおよびＫＬＨ−Ａ２０＋ＧＭ−ＣＳＦを２回注射した（１４日間隔てて）。ＧＭ−ＣＳＦをマウス１匹当たり５５ｎｇの用量で、ワクチン接種日から開始して４日連続で皮下に与えた（すなわち、臨床的なレジメンと同様）。腫瘍の体積および生存データがそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに示されている。
【００７５】
ＡＤＸ４０コンジュゲート＋ＧＭ−ＣＳＦ群（２１日目まで）およびＡＤＸ４０コンジュゲート群（３１日目まで）では、腫瘍の成長が有意に遅延し、これは、ＡＤＸ４０コンジュゲートが「臨床的な」ワクチン類似体よりも優れていることを示している。
【００７６】
ＡＤＸ４０コンジュゲートおよびＡＤＸ４０コンジュゲート＋ＧＭ−ＣＳＦは、対照ＰＢＳ群に対して有意な生存優位性を有した（それぞれｐ＝０．００１およびｐ＜０．０３。対照ＰＢＳ群の生存期間中央値は１７日間であった。これは、ＫＬＨコンジュゲート＋ＧＭ−ＣＳＦでは１９．５日間まで増加し、ＡＤＸ４０コンジュゲート＋ＧＭ−ＣＳＦおよびＡＤＸ４０コンジュゲートでは、それぞれ２４日および３１日に増加した。免疫試験１０ａからのデータ（図９Ｃおよび９Ｄ）は、これらの知見を裏付けている。
【実施例７】
【００７７】
確認実験のためのコンジュゲートの用量を最適化するために、マウス１０匹の群に、１０μｇ、２０μｇまたは５０μｇのＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートまたはＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲートを与えた。腫瘍の体積および生存データが図１０に示されている。
【００７８】
最低用量（１０μｇ）のＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートおよび中間の用量（２０μｇ）のＫＬＨ−Ａ２０コンジュゲートが最も有効であることが見いだされた。次いで、もっと低い用量範囲のＡＤＸ４０を用いてさらなる実験を実施し、１０、５μｇのコンジュゲートおよび２．５μｇのコンジュゲートを１回または２回投薬した、５μｇのＡＤＸ４０コンジュゲートが、１回だけであろうと、２回であろうと、最も有効な用量であると思われた（図１０）。コンジュゲートを２回投薬すると、用量に関係なく、予想通り、１回の投薬よりも良い転帰が生じた。最終的に、異なるマウスイディオタイプタンパク質とのＡＤＸ４０の対照コンジュゲートによっては保護が誘導されず、これは、ＡＤＸ４０ワクチンによって誘導される保護の特異性を示している。
【実施例８】
【００７９】
腫瘍を皮下移植した３日後（最初の実験）または３日後および１１日後（第２の実験）に、ＡＤＸ４０−Ａ２０コンジュゲートまたはＫＬＨ−Ａ２０＋ＧＭ−ＣＳＦを与えるという２つの治療的なワクチン接種試験を行った。どのワクチンレジメンも、対照と比較して腫瘍の増生または生存に対する有意な効果を有さなかった（データは示していない）。これらのデータは、臨床的な設定ではイディオタイプワクチン接種は、化学療法後に寛解の状態にある、疾患の残留が最小限である患者に一般に使用されるので、驚くべきものではない。
【実施例９】
【００８０】
種々の攻撃実験からの生存データのメタ分析が表１に示されている。ＡＤＸ４０−Ａ２０を与えたマウスは、ＫＬＨ−Ａ２０を与えたマウスと比較して生存が有意に改善された（それぞれ２６％、２．８％；ｐ＝０．００７）。さらに、ＡＤＸ４０−２０を与えたマウスの６０日目の生存は、ＫＬＨ−Ａ２０プラスＧＭ−ＣＳＦの現行の臨床的なレジメンを与えたマウスと同様であった（２５％）が、注射は８回ではなく２回であった。最後に、ＡＤＸ４０−Ａ２０プラスＭＰＬを与えた動物の生存が他の群を有意に超えたので、追加的なアジュバントをＡＤＸ４０コンジュゲートと組み合わせると相乗効果が見られるとことを示す証拠がある。
【実施例１０】
【００８１】
実施例１０は、潜在的な作用様式を例示している。マウスを、ＡＤＸ４０−Ａ２０＋ＭＰＬで免疫化し、攻撃の直前に、ＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞のいずれか、またはその両方を枯渇させた。ＣＤ４細胞単独の枯渇では、腫瘍の成長または生存率に対する明白な影響はなかった。ＣＤ８Ｔ細胞の枯渇により、防御が減少し、これは、ＡＤＸ４０＋ＭＰＬ保護を媒介することにおけるＣＤ８Ｔ細胞の可能性のある役割を示している。ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞両方の枯渇により、防御のさらなる減少がみられた；図１１。
（参考文献）
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２．Rodriguez-Calvillo M, Inoges S, Lopez-Diaz de Cerio A, Zabalegui N, Villanueva H, Bendandi M. Variations in "rescuability" of immunoglobulin molecules from different forms of human lymphoma: implications for anti-idiotype vaccine development. Crit Rev Oncol Hematol. 2004;52:1 -7. 
３．Kwak LW, Campbell MJ, Czerwinski DK, Hart S, Miller RA, Levy R. Induction of immune responses in patients with B-cell lymphoma against the surface-immunoglobulin idiotype expressed by their tumors. N Engl J Med. 1992;327:1209- 1215. 
４．Park HJ, Neelapu SS. Developing idiotype vaccines for lymphoma: from preclinical studies to phase III clinical trials. Br J Haematol. 2008;142:179-191 . 
【図１】
2013520482.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ｉ】
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【図９ｉｉ】
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【図１０ｉ】
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【図１０ｉｉ】
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【図１０ｉｉｉ】
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【図１１】
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【図１２ｉ】
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【図１２ｉｉ】
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【配列表】
2013520482000001.app
【国際調査報告】
2013520482.tif 000018
2013520482.tif 000019
2013520482.tif 000020