(57)【要約】【課題】ヒアルロンナンを含有する組成物を、１つの個体における前記組成物を必要としている部位に投与することを含む血管新生を促進する方法を提供する。【解決手段】本発明は、ヒアルロン酸、特に高分子量のヒアルロナンが、効率的に血管新生の促進、並びにこれによる創傷治癒の促進を行うものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生の促進に有効の濃度を有すると共に、１２ｋＤａ以上の分子量を有するヒアルロンナンを含有する組成物を、１つの個体における前記組成物を必要としている部位に投与することを含む血管新生を促進する方法。
【請求項２】
前記ヒアルロンナンの分子量は５０ｋＤａないし２，０００ｋＤａである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロンナンの分子量は２００ｋＤａないし１，５００ｋＤａである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒアルロンナンの分子量は７００ｋＤａないし１，５００ｋＤａである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒアルロンナンの濃度は０．０２ないし５０ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒアルロンナンの濃度は２ないし２０ｍｇ／ｍｌである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、１つの創傷の近傍の部位に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記創傷は、虚血、心筋梗塞、糖尿病、眼外傷、潰瘍、または慢性創傷によるものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は、筋肉内注射を介して投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物は、さらにコラーゲン、ゼラチン、成長因子、またはその組み合わせを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、成長因子を含有しないと共に、細胞をも含有しないものである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、さらにコラーゲンを有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
０．０２ないし５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有するヒアルロンナンを含有する組成物を、１つの個体における前記組成物を必要としている部位に投与することを含む血管新生を促進する方法。
【請求項１４】
前記ヒアルロンナンの濃度は２ないし２０ｍｇ／ｍｌである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物は、１つの創傷の近傍の部位に投与される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記創傷は、虚血、心筋梗塞、糖尿病、眼外傷、潰瘍、または慢性創傷によるものである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、筋肉内注射を介して投与される請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は、さらにコラーゲン、ゼラチン、成長因子、またはその組み合わせを有する請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は、成長因子を含有しないと共に、細胞をも含有しないものである請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は、さらにコラーゲンを有する請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に血管新生の促進のためのヒアルロナンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、非特許文献１、２に記載されるように、多種の動物組織（例えば、皮膚、軟骨、硝子体液）または微生物細胞外カプセル由来の、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはヒアルロン酸塩（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ）としても知られる、陰イオン性、非硫酸化グリコサミノグリカンである。自然環境において、ヒアルロナンはヒアルロナン合成酵素により合成されると共に、５ないし２０，０００ｋＤａの分子量を有する。
【０００３】
ヒアルロナンは、医療上における多様の利用を有する。自然起源のポリマーとして、ヒアルロナンは、生体組織工学において生物材料の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）の製造に用いられる。さらに、ヒアルロナンは、骨関節炎患者に投薬され、関節液の粘稠性の向上に寄与するので、間接の潤滑及び痛みの軽減に繋がる。また、ヒアルロナンの生物材料商品は、眼部手術の潤滑剤として利用されるものをも含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ  Ｌａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６２（４）：  ３２１−３２６，  ２００５
【非特許文献２】Ｉｃｈｉｋａ  Ａｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５（３）：  ８０５−８１０，  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記の従来のヒアルロナンの利用には、血管新生の促進のためのヒアルロナンの使用がなかった。
【０００６】
そこで、出願されたのが本発明であって、血管新生の促進のためのヒアルロナンの使用を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願の請求項１の発明は、血管新生の促進に有効の濃度を有すると共に、１２ｋＤａ以上の分子量を有するヒアルロンナンを含有する組成物を、１つの個体における前記組成物を必要としている部位に投与することを含む血管新生を促進する方法、を提供する。
【０００８】
本願の請求項２の発明は、前記ヒアルロンナンの分子量は５０ｋＤａないし２，０００ｋＤａである請求項１に記載の方法、を提供する。
【０００９】
本願の請求項３の発明は、前記ヒアルロンナンの分子量は２００ｋＤａないし１，５００ｋＤａである請求項２に記載の方法、を提供する。
【００１０】
本願の請求項４の発明は、前記ヒアルロンナンの分子量は７００ｋＤａないし１，５００ｋＤａである請求項３に記載の方法、を提供する。
【００１１】
本願の請求項５の発明は、前記ヒアルロンナンの濃度は０．０２ないし５０ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の方法、を提供する。
【００１２】
本願の請求項６の発明は、前記ヒアルロンナンの濃度は２ないし２０ｍｇ／ｍｌである請求項５に記載の方法、を提供する。
【００１３】
本願の請求項７の発明は、前記組成物は、１つの創傷の近傍の部位に投与される請求項１に記載の方法、を提供する。
【００１４】
本願の請求項８の発明は、前記創傷は、虚血、心筋梗塞、糖尿病、眼外傷、潰瘍、または慢性創傷によるものである請求項７に記載の方法、を提供する。
【００１５】
本願の請求項９の発明は、前記組成物は、筋肉内注射を介して投与される請求項１に記載の方法、を提供する。
【００１６】
本願の請求項１０の発明は、前記組成物は、さらにコラーゲン、ゼラチン、成長因子、またはその組み合わせを有する請求項１に記載の方法、を提供する。
【００１７】
本願の請求項１１の発明は、前記組成物は、成長因子を含有しないと共に、細胞をも含有しないものである請求項１に記載の方法、を提供する。
【００１８】
本願の請求項１２の発明は、前記組成物は、さらにコラーゲンを有する請求項１１に記載の方法、を提供する。
【００１９】
本願の請求項１３の発明は、０．０２ないし５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有するヒアルロンナンを含有する組成物を、１つの個体における前記組成物を必要としている部位に投与することを含む血管新生を促進する方法、を提供する。
【００２０】
本願の請求項１４の発明は、前記ヒアルロンナンの濃度は２ないし２０ｍｇ／ｍｌである請求項１３に記載の方法、を提供する。
【００２１】
本願の請求項１５の発明は、前記組成物は、１つの創傷の近傍の部位に投与される請求項１３に記載の方法、を提供する。
【００２２】
本願の請求項１６の発明は、前記創傷は、虚血、心筋梗塞、糖尿病、眼外傷、潰瘍、または慢性創傷によるものである請求項１５に記載の方法、を提供する。
【００２３】
本願の請求項１７の発明は、前記組成物は、筋肉内注射を介して投与される請求項１２に記載の方法、を提供する。
【００２４】
本願の請求項１８の発明は、前記組成物は、さらにコラーゲン、ゼラチン、成長因子、またはその組み合わせを有する請求項１３に記載の方法、を提供する。
【００２５】
本願の請求項１９の発明は、前記組成物は、成長因子を含有しないと共に、細胞をも含有しないものである請求項１３に記載の方法、を提供する。
【００２６】
本願の請求項２０の発明は、前記組成物は、さらにコラーゲンを有する請求項１９に記載の方法、を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、ヒアルロン酸、特に高分子量のヒアルロナンが、効率的に血管新生の促進、並びにこれによる創傷治癒の促進を行うことができると言った予想し得ない発見に基づいたものである。
【００２８】
したがって、本発明は、血管新生を促進するために、局部血管新生を刺激するに足りる有効濃度（例えば、０．０２ないし５０ｍｇ／ｍＬまたは２ないし２０ｍｇ／ｍＬ）でヒアルロナンを有する組成物（例えば、少なくとも１２ｋＤａの分子量を有する長連鎖ヒアルロナン）を、個体における該組成物を必要としている部位に、投与し使用する方法を提供するものである。
好ましくは、この方法で使用されるヒアルロナンは、５０ｋＤａないし２，０００ｋＤａの分子量（例えば、７０ｋＤａないし１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａないし１，５００ｋＤａ、５００ｋＤａないし１，５００ｋＤａ、または７００ｋＤａないし１，５００ｋＤａ）を有する。前記個体は、例えば虚血、心筋梗塞、糖尿病、眼外傷、潰瘍、または慢性創傷などによる創傷を有する人類患者出会っても構わない。血管新生を促進するために、前記ヒアルロナンを有する組成物は、例えば、筋肉内注射などを介して、創傷またはその近傍の部位に、局部血管新生を刺激ために、創傷治癒の促進を行えるように投与される。
１つの実施例において、前記ヒアルロナンを有する組成物は、成長因子も、細胞も有しないものである。
他の実施例において、前記ヒアルロナンを有する組成物は、成長因子、細胞、及びその組み合わせを有するものである。前記ヒアルロナンを有する組成物は、さらにコラーゲンまたはゼラチンを有しても構わない。
【００２９】
また、本発明の範囲は、血管新生を促進するために、または同目的の医薬組成物の製造のために使用されるヒアルロナンを含める。
【００３０】
本発明の実施例の詳細は、以下の発明の説明に記載される。本発明の他の特徴及び効果は、以下の実施例及び係る従属項により明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に説明するのは、ヒアルロナンを単独に使用し、または１つ以上の他の治療剤（例えば、コラーゲン、ゼラチン、成長因子、及び幹細胞）と併用することにより、創傷の近傍における血管新生を促進する方法である。
【００３２】
用語「ヒアルロナン」は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＤ−グルクロン酸による繰り返し二糖単位を含む自然起源のグリコサミノグリカン重合体、及びその誘導体を意味する。化学式「（Ｃ14Ｈ21ＮＯ11）n」を有する自然起源のグリコサミノグリカンは、従来の方法で獲得しても構わない。
１つの実施例において、例えば連鎖球菌の莢膜、鶏のとさか．軟骨、滑膜関節液、臍帯、皮膚組織および眼球の硝子体液などの自然の起源から、従来の方法で獲得しても構わない（Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ  Ｌａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６２（４）：  ３２１−３２６，  ２００５及びＩｃｈｉｋａ  Ａｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５（３）：  ８０５−８１０，  ２００９参照）。
他の実施例において、遺伝子改変微生物からヒアルロナンを合成しても構わない。典型的にいえば、このように獲得されたヒアルロナンは、即ち、異なる長さの連鎖及び異なる分子量を有する分子を含む異質性のものである。
一定の範囲以内の分子量を有するヒアルロナン分子は、分子量カットオフのフィルターまたはゲル濾過により得ることができる。また、例えばＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，  ＬＬＣ  ａｎｄ  Ｈｙａｌｕｒｏｎ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｉｎｇなどの業者からヒアルロナンを購入しても構わない。
【００３３】
自然起源のヒアルロナンの誘導体は、ヒアルロナンエステル、アジピン酸ジヒドラジドで改質のヒアルロナン、ヒアルロナンアミド製品、架橋結合されたヒアルロン酸、コハク酸のヘミエステルまたはコハク酸の重金属塩によるヒアルロン酸エステル、一部または全部ヒアルロン酸エステル、硫酸化のヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化のヒアルロン酸、及びアミドまたはジアミン改質のヒアルロナンを含むものの、それに限定されるものでない。
これらは、官能基（例えばカルボン酸基、ヒドロキシル基、還元末端、Ｎ−アセチル基）を化学的に改質することにより獲得することができる。カルボン酸基は、エステル化、カルボジイミドおよびビスヒドラジドで媒介される反応で改質することができる。ヒドロキシル基の改質は、硫酸化、エステル化、イソ尿素結合、臭化シアン活性化、および過よう素酸酸化を含むものの、それに限定されるものでない。還元末端は、還元的アミノ化により改質することができる。
また、リン脂質、染料（例えば発蛍光団または発色団）、またはアフィニティーマトリックスに好適な試薬に結合しても良い。自然起源のヒアルロナンの誘導体は、架橋剤（例えば、ビスエポキシド、ジビニルスルホン、ビスカルボジイミド、小型の同型の両作用性リンカー（ｓｍａｌｌ  ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋｅｒ）、ホルムアルデヒド、シクロヘキシルイソシアニド、及びリシンエチルエステル、金属カチオン、ヒドラジド、またはそれらの混合物）を用いる架橋結合により、または内部エステル化、光架橋結合、または表面プラスマ処理により獲得することができる。
【００３４】
上述したヒアルロナンと、医薬的に許容出来るキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）とを混合することにより、医薬組成物を形成させることができる。前記医薬的に許容出来るキャリアは、製剤処方の有効成分と交換性を有する（好ましくは、それを安定化させることができる）と共に、この医薬組成物を受ける個体に無害なものである。
例えば、ヒアルロナンと特定の可溶性の合成物を形成させるシクロデキストリンなどの溶解補助剤、または１つのもしくは複数の溶解補助剤は、ヒアルロナンを運搬するための付形剤として使用され得る。他のキャリアの例は、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、及びＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ＃１０を含む。
【００３５】
前記ヒアルロナンを有する医薬組成物は、さらにコラーゲンまたは（ボイリングなどの手段により変性されたコラーゲン由来の）ゼラチンを有しても構わない。
【００３６】
自然起源のコラーゲンまたはその機能的な変異体の何れかも前記組成物の製造に用いることができる。現在、少なくとも２０種類の遺伝学的に異なるコラーゲンが発見されていた。コラーゲンは、例えば人類及び動物の皮膚、腱、靭帯、及び骨などのコラーゲンを豊富に含有する組織から、簡単に単離及び精製することができる。コラーゲンを単離及び精製する方法は、周知技術である。米国特許ＵＳ  ５，５１２，２９１、米国特許出願公開公報２００４０１３８６９５、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ８２，  ｐｐ．  ３３−６４，  １９８２」、「Ｏｎｅｓｏｎ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ．  Ａｍ．  Ｌｅａｔｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ａｓｓｏｃ．  Ｖｏｌ．  ＬＸＶ，  ｐｐ．  ４４０−４５０，  １９７０」、米国特許ＵＳ  ６，０９０，９９６。
コラーゲンは、例えば「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア）」による組換技術により製造し、または多数の供給者（例えば、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ（南サンフランシスコ、カリフォルニア））から購入することができる。
一例を以下に記載する。牛の深屈筋の腱から脂肪、筋膜を除去し、水で洗浄し、冷凍してから、ミートスライサで０．５ｍｍの薄片にする。好適の量の前記腱の薄片に対して、まず室温で５０ｍｌの水を用い、２４時間の抽出を行う。水溶性の部分が捨てられ、前記腱の薄片はさらに酸性溶液（例えば０．２Ｎの塩酸）を用い、好適な温度（例えば、室温）で好適な時間（例えば１２−２４時間）の抽出を行う。前記塩酸は捨てられ、水で前記腱の薄片から残留の酸性溶液をすすぎ落とす。
洗浄された前記腱の薄片は、さらにアルカリ性溶液（例えば０．７５ＭのＮａＯＨ）を用い、好適な温度（例えば、室温）で好適な時間（例えば１２−２４時間）の抽出を行う。前記アルカリ性溶液を捨ててから、前記腱の薄片は酸性溶液（例えば０．１ＮのＮａＯＨ）でｐＨ値が４−７（例えば、５）になるまで中和され、さらに、繰り返される水での洗浄により、残留のアルカリ性溶液を前記腱の薄片から除去する。この腱の薄片はアルコール（例えばイソプロパノール）により、室温で、脂肪を取り除く処理を十分な時間（例えば１６時間）で行う。
抽出溶媒は除去され、前記腱の薄片に対して、さらにアルコール（例えばイソプロパノール）を用い、室温で、好適な時間（例えば１２−２４時間）の抽出を行うことにより、コラーゲンを含有する溶液を作る。
前記溶液は、清潔なフードで乾燥することができる。これにより、得られたコラーゲンの粉末は、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンまたはペプシン）が存在する酸性溶液（例えば０．５Ｍまたは０．２５Ｍの酢酸）に分散され、セ氏４度で好適な時間で培養される。この混合物は、１００メッシュのステンレス鋼製フィルターで濾過され、そして可溶化されたコラーゲンを５％の塩化ナトリウム溶液で沈殿させることができる。この沈殿されたコラーゲンは、前記酸性溶液に再溶解されることができるので、得られた溶液を１００メッシュのステンレス鋼製フィルターで濾過することにより、不溶性の粒子を排除することができる。このコラーゲン溶液は、さらに蒸留水で透析され、酸を除去する。
【００３７】
あるいは、またはそのうえ、上述したヒアルロナンを有する組成物は、さらに細胞成長、血管新生、創傷治癒を促進する生物活性物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、少糖類、多糖類、または小分子）を有する。
１つの実施例において、前記生物活性物質は、例えば表皮成長因子、繊維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、結合組織成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、セロトニン、及びフォンヴィレブランド因子、形質転換成長因子、ケラチノサイト成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、グリア細胞由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮単球活性化ペプチド、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子などの成長因子である。
他の実施例において、前記生物活性物質は、ＩＬ−２、乳房発現ケモカイン（例えば、ＢＲＡＫ）、腎臓発現ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１４）を含むものの、それに限定されていないサイトカインまたはケモカインである。なお、前記生物活性物質は、例えばデキサメタゾン、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸、プロリン、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、及びウシ血清アルブミン、並びにＴＧＦ−  β３などの細胞分化因子であっても構わない。
好適な実施例において、前記分化因子は、間葉系幹細胞の軟骨形成を促進する化合物（米国特許第５，９０８，７８４号に開示されているものを参照）、骨形成を促進する化合物（例えば、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールリン酸）、脂肪生成を促進する化合物（例えば、インスリン、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシン）、心筋分化を促進する化合物（例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４）、内皮細胞分化を促進する化合物（例えば、ＥＢＭ−２、デキサメタゾン、およびＶＥＧＦ）、平滑筋細胞の分化を促進する化合物（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、神経誘導を促進する化合物（例えば、ｂＦＧＦを、ＥＧＦ、およびＢ２７サプリメント、ＤＭＳＯ、ブチル化ヒドロキシアニソール、フォルス、バルプロ酸、塩化カリウム、Ｋ２５２ａ、とＮ２サプリメント）、及び内胚葉系譜分化を促進する化合物（例えば、デキサメタゾン、ＨＧＦ、およびＦＧＦ−４）である。前記生物活性物質は、漢方薬またはその有効成分であっても良い。
【００３８】
局所血管新生を促進するために、上述した医薬組成物の何れかを、関心領域にまたはその近傍における１つまたは複数の部位に対して、例えば筋肉内注射または植え込みリザーバを介して投与することができる。前記関心領域は、虚血、心筋梗塞、糖尿病、眼外傷、潰瘍、または慢性創傷などによる創傷。前記創傷の治癒は、普通、血管新生を必要としている。
前記血管新生は即ち新しい血管の形成であり、関心領域における血流の変化を計測することにより、新しい血管の形成を測定することができる。前記組成物におけるヒアルロナンの濃度は、０．０２ｍｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２ｍｇ／ｍｌないし２０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌないし１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌないし１０ｍｇ／ｍｌ）であるが、前記組成物におけるヒアルロナンの分子量により変化する。
【００３９】
滅菌注射用組成物（例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液）は、当該技術分野における周知技術により、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、トゥイーン８０など）および懸濁剤を用い、製造することができる。
前記滅菌注射用製剤は、非経口的に許容出来る無毒の希釈剤または溶剤による無菌注射用水性または油性懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオールによる溶液）であっても良い。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶剤には、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。
さらに、無菌の不揮発性油は、従来、溶剤または懸濁媒（例えば、合成モノ−またはジグリセリド）として用いられる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸（例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化された形態（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎｓ）などの、天然の薬学的に許容される油）は、注射剤の調製に有用である。
これらの油溶液または懸濁液は、長連鎖アルコール希釈剤または分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤を有しても構わない。例えば、トゥイーンまたはスパンまたは他の類似の乳化剤または医薬的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般的に用いられるバイオアベイラビリティ増強剤も、製剤化を目的として使用することができる。
【００４０】
さらに詳述しなくても、当業者は、上述した説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。
以下の具体的な実施例は、即ち、単なる例示であり、いかなる方法でも本明細書が開示した他の部分を限定するものではないと解されるべきである。本明細書に引用された全ての刊行物は、参考として援用される。
【実施例１】
【００４１】
実施例１は、糖尿病マウスにおいて、虚血肢の血管新生を促進し、虚血肢の回復の改善におけるヒアルロナンの効果に関する。
【００４２】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｎａｒｌの（６−８週齢）雄マウスを、国立研究所の実験動物センター（ＮＬＡＣ、台南、台湾）から取得した。実験に供する糖尿病を、５日間、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を毎日腹腔内注射（５０  ｍｇ／ｋｇ体重）することによって、前記マウスにおいて誘発させた。ＳＴＺ注射一週間後、マウスにおいて著しい低インスリン血症、重度の高血糖（血清グルコース＞３００ｍｇ／ｄｌ）が発症する。
【００４３】
後肢虚血は、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ４１：３１２−３２０  （２００５）  ａｎｄ  Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ５０：１４１２−１４２２  （２００９）に記載された方法に従い、ＳＴＺ−未処理の（正常）とＳＴＺ処理をされた（糖尿病）マウス両方において誘導された。
マウスは、短時間２％のイソフルランを用いて麻酔された。ケトプロフェンは鎮痛剤として使用された。その左大腿動脈および関連血管枝が分離され、結紮された。各マウスの左大腿動脈は鼠径靱帯から伏在動脈と膝窩動脈への分岐部が切除された。切除後、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，  ＬＬＣから得た分子量の異なる（即ち、１２  ｋＤ、７８０  ｋＤ、１５００  ｋＤ、および２０００  ｋＤａ）ヒアルロン酸を、種々の濃度（即ち、０．５  ｍｇ／ｍｌ、２  ｍｇ／ｍｌ、５  ｍｇ／ｍｌ、および１０  ｍｇ／ｍｌ）で筋肉内注射を介して左後肢に注入した。
【００４４】
局所血管新生を示す各マウスの後肢の血流は、以下のように測定した。レーザードップラー血流画像化装置（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、デボン、イギリス）が両側の後肢の皮膚血流量を計測するために使用された。マウスは、１．５％のイソフルランで麻酔され、その後肢の毛皮が脱毛クリームで除去された。
この研究は、周囲の光や温度の影響を最小限に抑えるために、暖かく（３７°Ｃ）暗い部屋で行った。虚血性後肢から得られた血流のレベルは、非虚血性後肢から得たものに対して正規化した。その結果を下記表１に示す：
【００４５】
【表１】
2013539761.tif 000002
＊「ＲＯＩ」は関心領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を意味する。この表に示されているＲＯＩ％の値は、次のように計算された：（虚血性後肢における関心領域の血流レベル）／（非虚血後肢の関心領域の血流レベル）％。
【００４６】
表１に示すように、表に示した分子量のいずれかを有するヒアルロンナンは、非虚血性後肢の血流と比べて、糖尿病マウスの後肢虚血流を促進した。この結果は、ヒアルロンナンが虚血性後肢の血管新生を改善したことを示す。
【００４７】
虚血が誘発された２週間後及び４週間後、形態学的および機能的な後肢の両方の変化をを評価するために、下記のスケール表に従う身体検査が実施された：
【００４８】
【表２】
2013539761.tif 000003
【００４９】
ヒアルロンナンで処理されたマウスに対する回復スコアは粗観測により測定されたものである。
【００５０】
下記表３に示すように、ヒアルロナンは虚血性後肢の回復の促進に有効であった。
【００５１】
【表３】
2013539761.tif 000004
【００５２】
上記全部の研究において、対側後肢は、各マウスにおける内部コントロールとされた。
【実施例２】
【００５３】
実施例２は、ヒアルロンナンおよびコラーゲンにおける、糖尿病マウスの虚血性後肢の血管新生の促進および虚血性後肢の回復の改善に対する効果に関する。
【００５４】
ＳＴＺ処理の糖尿病マウスの後肢に、上述した実施例１の方法に従い、虚血が誘発された。ヒアルロンナン（１０  ｍｇ／ｍｌで、表４および５に示すように、異なる分子量を有する）およびコラーゲン（１０  ｍｇ／ｍｌ）を両方含有する１００  ｕｌの組成物が虚血性後肢に筋肉内注射を介して注入された。処理されたマウスにおける血流および形態学的／機能的変化を、同様に上記実施例１に記載した手順に従って、様々な時点で調べた。下記の表４および５に示すように、ヒアルロンナンおよびコラーゲンの組み合わせも虚血性後肢の血流および負傷肢の形態学／機能的な回復を促進した。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
【表５】
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【００５７】
表５において、虚血を誘発させた後２および４週間、後肢における形態学的および機能的な変化を評価するために、表２に示されたスケールに従い、身体検査が実施された。ヒアルロンナンで処理されたマウスに対する回復スコアは、粗観測により測定されたものである。
【００５８】
（他の実施形態）
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴は、同一、同等、又は類似の目的を果たす代わりの特徴によって置き換えることができる。従って、特に明記しない限り、開示された各特徴は等価または類似の特徴の一般的な一連の一例に過ぎない。
【００５９】
上記の説明から、当業者であれば容易に本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および種々の用途および条件に適合させるために、本発明の修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内のものである。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、ヒアルロン酸、特に高分子量のヒアルロナンが、効率的に血管新生の促進、並びにこれによる創傷治癒の促進を行うことができる。