(57)【要約】本発明は、安定化した多層状小胞で構成された送達システム、さらにその組成物、合成方法、及び使用方法を提供する。安定化した多層状小胞は、予防、治療及び／又は診断薬を含むことができる。【選択図】      図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞。
【請求項２】
前記小胞は、機能化脂質を含む、請求項１に記載の多層状脂質小胞。
【請求項３】
前記小胞は、ホスホコリンを含む、請求項１又は２に記載の多層状脂質小胞。
【請求項４】
前記小胞は、ホスホグリセロールを含む、請求項１、２又は３に記載の多層状脂質小胞。
【請求項５】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項２、３又は４に記載の多層状脂質小胞。
【請求項６】
前記小胞は、作用物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項７】
前記作用物質は、予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項８】
前記作用物質は、抗原である、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項９】
前記作用物質は、アジュバントである、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１０】
前記作用物質は、タンパク質である、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１１】
前記作用物質は、前記小胞内に封入されている、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１２】
前記作用物質は、前記脂質二重層間に封入されている、請求項６又は１１に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１３】
前記小胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１４】
前記小胞は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１５】
前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項１４に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記多層状脂質小胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記多層状脂質小胞及び凍結乾燥に適した賦活剤を含む組成物。
【請求項１８】
前記凍結乾燥に適した賦活剤は、ショ糖を含む、請求項１７に記載の前記多層状脂質小胞を含む組成物。
【請求項１９】
機能化脂質を含むリポソームを二価陽イオンに接触させて融合リポソームを形成することと、
前記融合リポソームを架橋剤に接触させて、脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞を形成することと、
を含む方法。
【請求項２０】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソームは、ホスホコリンを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポソームは、ホスホグリセロールを含む、請求項１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リポソームは、マレイミド機能化脂質、ホスホコリン及びホスホグリセロールを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記機能化脂質は、機能化ホスホエタノールアミンである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記架橋剤は、ジチオール架橋剤である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記架橋剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
脂質二重層間に架橋を有する前記多層状脂質小胞の表面に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記二価陽イオンは、Ｃａ２＋である、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記二価陽イオンは、Ｍｇ２＋である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触することは、水性緩衝液中で実行される、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記リポソームは、作用物質を含む、請求項１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記作用物質は、予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記リポソームは、４０：１０：５０のモル比のＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質を使用して調製される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ジチオール架橋剤とマレイミド機能化脂質とのモル比は、１：２である、請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞を形成するために、機能化脂質を含む多層状脂質小胞を架橋剤に接触させることを含む方法。
【請求項３７】
架橋した脂質二重層を有し、有効量の作用物質を含む多層状脂質小胞を対象に投与すること、
を含む方法。
【請求項３８】
前記多層状脂質小胞は、生分解性脂質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記多層状脂質小胞は、リン脂質を含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記多層状脂質小胞は、ホスホコリン、ホスホグリセロール、及び／又はホスホエタノールアミンを含む、請求項３７、３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記多層状脂質小胞は、機能化脂質を含む、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記作用物質は、予防薬である、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記作用物質は、治療薬である、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記作用物質は、抗原である、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記作用物質は、アジュバントである、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記多層状脂質小胞は、複数の作用物質を含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記多層状脂質小胞は、２つの作用物質を含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記多層状脂質小胞は、抗原及びアジュバントを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記多層状脂質小胞は、その外表面上でＰＥＧと結合する、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
架橋した脂質二重層を有し、作用物質含む多層状脂質小胞を、in vitroで細胞に接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項により、２０１０年３月１９日出願の「MICRO- AND NANOPARTICLES WITH SELF-ASSEMBLED LIPID COATINGS FOR SURFACE DISPLAY OF DRUGS SUCH AS VACCINE ANTIGENS AND ADJUVANTS」と題した米国仮特許出願第６１／３１５，４８５号、及び２０１０年３月３１日出願の「INTERBILAYER CROSSLINKED MULTILAMELLAR VESICLES」と題した米国仮特許出願第６１／３１９，７０９号の利益を主張し、両出願とも参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
（連邦政府後援の研究）
本発明は、米国国立衛生研究所からの助成金第ＣＡ１４０４７６号及び国防省からの助成金第Ｗ９１１ＮＦ−０７−Ｄ−０００４号による政府の支援を受けて実行された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
リポソームは低分子化合物の送達媒体として広く使用されてきたが、多くの高分子薬物をリポソーム内に高レベルに封入することは困難なままであり、多くの製剤においては、有用な薬物送達の動態を維持するにはリポソームからの漏出が速すぎる。微粒子及びナノ粒子による薬物送達はタンパク質及び低分子薬物を封入することができるが、これも通常は粒子の質量当たりの封入薬物総質量が非常に小さく、通常は粒子１ｍｇ当たり約１０μｇ程度の薬物である。また、ポリマー粒子の合成に使用される有機溶媒、及びこれらの粒子内の疎水性／酸性環境は、治療の破壊につながることがある。（Zhu他のNat. Biotechnol（2000 18:52-57）参照。）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、装填容量が向上し、高レベルの疎水性作用物質と疎水性作用物質との両方を同時に封入する能力があり、放出プロファイルが延長された新規性及び進歩性を有する薬物送達システムを提供する。これらの送達システムの幾つかの態様は、架橋した脂質二重層を有する多層状脂質小胞（本明細書では二層間架橋多層状小胞またはＩＣＭＶと呼ぶ）を含む。
【０００５】
実施例で示すように、本発明の小胞は予想外の向上した封入効率（例えば幾つかの場合では、単純なリポソームより１００倍効率的である）を示し、封入された（又は他の方法で閉じ込められた）作用物質を、血清存在下でゆっくりと持続性のある動態によって放出することができ、in vivoでの持続性の送達媒体として非常に望ましいものである。また、本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明の小胞は水性環境内で合成することができ、それにより、様々な先行技術の方法において一般的な、有機溶媒及び／又は酸性環境の使用を含む過酷な条件が回避される。その結果、これらの合成方法は、このような先行技術の方法を使用すると通常は構造的及び／又は機能的に損なわれるようなものを含め、様々な作用物質によってより適切なものになる。したがって、その結果得られる小胞は有機溶媒を含まず、専ら生分解性脂質などの脂質と、当該脂質内に封入された又は当該脂質を通って封入される任意の作用物質とで構成することができる。
【０００６】
本発明は部分的に、本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明の上記及びその他の驚くべき予想外の特徴に基づく。したがって本発明は、これらの安定化した小胞、これらの小胞を含む組成物、これらの小胞の作成方法、及びその使用方法を提供する。
【０００７】
したがって１つの態様では、本発明は脂質の二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞、又は脂質の二重層間に架橋を有する複数又は集団の多層状脂質小胞を提供する。複数とは１〜１０３、１〜１０４、１〜１０５、１〜１０６、１〜１０７、１〜１０８、又は１〜１０９とすることができるが、これらに限定されない。小胞の様々な態様について以下で説明するが、これらの態様は他に明記しない限り、複数又は集団の小胞に等しく当てはまることを理解されたい。本発明の小胞は、単なる外部（又は最外）二重層の又は二重層表面の成分間の架橋ではなく、内部隣接（又は並置）二重層の成分間の結合を含む。
【０００８】
幾つかの実施形態では、小胞は機能化した脂質を含む。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。機能化脂質はホスホエタノールアミンとすることができるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞は機能化され、好ましくは直接機能化された脂質二重層成分を含む。幾つかの実施形態では、小胞はホスホコリンを含み、これはＤＯＰＣなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞はホスホグリセロールを含み、これはＤＯＰＧなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞はＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及び機能化脂質を含み、これは機能化ホスホエタノールアミンなどであるが、これに限定されない。機能化脂質はマレイミド含有とすることができる。幾つかの実施形態では、小胞はＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ、及びマレイミド機能化脂質を含む。機能化脂質は、ＭＰＢなどであるが、これに限定されないマレイミド機能化ホスホエタノールアミンとすることができる。幾つかの実施形態では、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：機能化脂質のモル比は４０：１０：５０である。幾つかの実施形態では、小胞はＤＯＰＣ及びＭＰＢを含むことができる。幾つかの実施形態では、小胞はＤＯＰＣ、ＤＯＴＡＰ及びＭＰＢを含むことができる。幾つかの実施形態では、ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：機能化脂質のモル比は４０：１０：５０である。幾つかの実施形態では、機能化脂質は少なくとも２５％の分子パーセンテージで存在する。
【０００９】
幾つかの実施形態では、小胞は１つ又は複数の作用物質を含むある作用物質を含む。本明細書では、１つ又は複数の作用物質は相互に異なる１つ又は複数の作用物質を意味する。幾つかの実施形態では、作用物質は予防薬、治療薬、又は診断薬である。幾つかの実施形態では、作用物質は抗原である。幾つかの実施形態では作用物質は全タンパク質抗原を含むタンパク質抗原である。幾つかの実施形態では、作用物質はアジュバントである。アジュバントはＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９アゴニストなどのＴＬＲアゴニストとすることができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞は抗原と、ＴＬＲ４及びＴＬＲ７アゴニストなどの少なくとも２つのアジュバントとを含む。幾つかの実施形態では、作用物質はタンパク質である。
【００１０】
幾つかの実施形態では、小胞は脂質（又は粒子）１ｍｇ当たり３００μｇを超える作用物質、又は脂質（又は粒子）１ｍｇ当たり４００μｇを超える作用物質を含む。幾つかの実施形態では、小胞は脂質（又は粒子）１ｍｇ当たり３００〜４００μｇの作用物質を含む。幾つかの実施形態では、小胞は脂質（又は粒子）１ｍｇ当たり３２５μｇの作用物質、又は脂質（又は粒子）１ｍｇ当たり４０７μｇの作用物質を含む。関連する実施形態では、作用物質はタンパク質抗原とすることができる。
【００１１】
幾つかの実施形態では、作用物質は小胞内に封入される。幾つかの実施形態では、作用物質は小胞の核内に存在する。幾つかの実施形態では、作用物質は脂質二重層間に存在する。
【００１２】
幾つかの実施形態では、小胞は核内にある作用物質を、脂質二重層間に別の作用物質を含む。幾つかの実施形態では、核内の作用物質はタンパク質抗原などの抗原とすることができ、脂質二重層間の作用物質はＭＰＬＡなどであるが、これに限定されないアジュバントとすることができる。幾つかの実施形態では、ある抗原が核内にあり、２つのアジュバントが内部脂質二重層間にある。２つのアジュバントは、幾つかの実施形態ではＭＰＬＡ及びＲ−８４８である。
【００１３】
幾つかの実施形態では、小胞は核内にある作用物質を、外部二重層内に別の作用物質を含む。幾つかの実施形態では、核内の作用物質はタンパク質抗原などの抗原とすることができ、外部二重層内の作用物質はＭＰＬＡなどであるが、これに限定されないアジュバントとすることができる。幾つかの実施形態では、ある抗原が核内にあり、２つのアジュバントが外部二重層内にある。幾つかの実施形態では、ある抗原が核内にあり、１つ又は複数のアジュバントが内部二重層間、及び／又は外部二重層表面上にある。２つのアジュバントは、幾つかの実施形態ではＭＰＬＡ及びＲ−８４８である。
【００１４】
幾つかの実施形態では、小胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合する。幾つかの実施形態では、小胞はＰＥＧと表面結合することができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は上記の多層状脂質小胞（又は小胞集団）のいずれか、及び製薬上許容可能なキャリアを含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は上記の多層状脂質小胞（又は小胞集団）のいずれか、及び凍結乾燥に適した賦形剤を含む。幾つかの実施形態では、凍結乾燥に適した賦形剤はショ糖を含む。小胞は単独型として使用することもできるし、本明細書で説明する作用物質のいずれかを含む他の作用物質と組み合わせることもできる。幾つかの実施形態では、小胞は細胞と一緒に投与されず、例えば対象に投与する前に、細胞に結合させる（又は他の方法での物理的付着させる）こともない。しかし、小胞は体内の特定の細胞又は部位を標的とするために標的リガンドと結合することができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は融合リポソームを形成するために機能化脂質を含むリポソームを多価（例えば二価）陽イオンと接触させることと、脂質二重層間に架橋を有する、上記の小胞のいずれかを含む多層状脂質小胞を形成するために、融合リポソームを架橋剤と接触させることとを含む方法を提供する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。幾つかの実施形態では、機能化脂質は機能化ホスホエタノールアミンである。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化ホスホエタノールアミンである。幾つかの実施形態では、リポソームはホスホコリンを含み、これはＤＯＰＣなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、リポソームはホスホグリセロールを含み、これはＤＯＰＧなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、リポソームはマレイミド機能化脂質、ホスホコリン及びホスホグリセロールを含む。幾つかの実施形態では、リポソームはＤＯＰＣなどであるが、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質（ＭＰＢなど）を４０：１０：５０のモル比で含む。幾つかの実施形態では、リポソームはＤＯＰＣ及びＭＰＢなどのマレイミド機能化脂質を含む。幾つかの実施形態では、リポソームはＤＯＰＣ、ＤＯＴＡＰ及びマレイミド機能化脂質（ＭＰＢなど）を任意選択で４０：１０：５０のモル比で含む。
【００１９】
幾つかの実施形態では、リンカーは膜透過性リンカーである。幾つかの実施形態では、架橋剤はジチオール架橋剤である。幾つかの実施形態では、架橋剤はジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。幾つかの実施形態では、ジチオール架橋剤とマレイミド機能化脂質のモル比は１：２である。
【００２０】
幾つかの実施形態では、この方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞の表面と結合させることをさらに含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、多価陽イオンは二価陽イオンであり、これはＣａ２＋又はＭｇ２＋などであるが、これらに限定されない。これらは単独で、又は組み合わせて使用することができる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、接触は水性緩衝液内で生じる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、リポソームは作用物質を含む。幾つかの実施形態では、作用物質は予防薬、治療薬、又は診断薬である。
【００２４】
別の態様では、本発明は脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞を形成するために、機能化脂質などの機能化脂質二層成分を含む多層状脂質小胞を架橋剤に接触させることを含む方法を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は架橋脂質二重層を有し、有効量の作用物質を含む多層状脂質小胞を対象に投与することを含む方法を提供する。架橋脂質二重層を有する多層状脂質小胞は、架橋脂質二重層を有する上記の多層状脂質小胞のいずれか、又は本明細書で説明するもののいずれかとすることができる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞は生分解性脂質を含む。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞はリン脂質を含む。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞はホスホコリン、ホスホグリセロール、及び／又はホスホエタノールアミンを含む。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞は機能化脂質を含む。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。幾つかの実施形態では、マレイミド機能化脂質はマレイミド機能化ホスホエタノールアミンである。
【００２７】
幾つかの実施形態では、作用物質は予防薬である。幾つかの実施形態では、作用物質は治療薬である。幾つかの実施形態では、作用物質は抗原である。幾つかの実施形態では、作用物質はアジュバントである。幾つかの実施形態では、小胞は２つ以上の作用物質を含む。幾つかの実施形態では、小胞はある抗原及びあるアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、小胞はある抗原及び２つのアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、小胞はあるタンパク質抗原及びあるＴＬＲ４アゴニスト及びあるＴＬＲ７アゴニストを含む。幾つかの実施形態では、タンパク質抗原などの抗原が小胞の核内に存在し、（１つ又は複数の）アジュバントが小胞の内部二重層間に存在する。
【００２８】
幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞はその外面上でＰＥＧと結合する。
【００２９】
幾つかの実施形態では、対象は癌を発症しているか、又はその危険がある。幾つかの実施形態では、対象は感染症を発症しているか、又はその危険がある。幾つかの実施形態では、アレルギー又は喘息を発症しているか、又はその危険がある、又は喘息発作を経験しているか、又はそれを経験する危険がある。
【００３０】
幾つかの実施形態では、有効量は対象内の免疫応答を刺激する量である。免疫応答は体液性応答、又は細胞性応答であってもよい、又は体液性応答と細胞性応答の組合せであってもよい。細胞性応答はＣＤ８Ｔ細胞の刺激を含むことがある。
【００３１】
別の態様では、本発明は架橋脂質二重層を有し、抗原を含む多層状脂質小胞を投与することにより、それを要する対象の免疫応答を刺激することを含む方法を提供し、抗原の有効量が対象に投与される。架橋脂質二重層を有する多層状脂質小胞は、上記のこのような小胞のいずれか、又は本明細書で説明するもののいずれかでよい。小胞は、１つ又は複数のアジュバントをさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、小胞はその核にタンパク質抗原などの抗原を、その脂質二重層間にアジュバントを含む。タンパク質抗原は全タンパク質抗原でよい。アジュバントは、ＭＰＬＡなどのＴＬＲ４アゴニスト及びＲ−８４８などのＴＬＲ７アゴニストでよいが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞は脂質１ｍｇ当たり３００〜４００μｇの抗原を含む。幾つかの実施形態では、小胞は１回のみ投与される（すなわち、初回抗原投与量で十分である）。幾つかの実施形態では、小胞は複数回（例えば初回抗原投与量及び追加抗原投与量）投与される。幾つかの実施形態では、抗原は細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、又はマイコバクテリア抗原である。幾つかの実施形態では、抗原は癌抗原である。幾つかの実施形態では、免疫応答は相乗的免疫応答である。
【００３２】
別の態様では、本発明は架橋脂質二重層を有し、作用物質を含む多層状脂質小胞を細胞、又は細胞集団にin vitroで接触させることを含む方法を提供する。細胞又は細胞集団は、樹状細胞又は他の抗原提示細胞とすることができる。架橋脂質二重層を有する多層状脂質小胞は、架橋脂質二重層を有する上記の多層状脂質小胞のいずれか、又は本明細書で説明するもののいずれかとすることができる。
【００３３】
上記の概念と、以下でさらに詳細に検討する追加の概念との組合せはすべて（このような概念が相互に矛盾しない限り）、本明細書で開示する本発明の主題の一部であると想定されることを認識されたい。特に、本開示の最後にある特許請求の範囲の主題の組合せはすべて、本明細書で開示する本発明の主題の一部であると想定される。本明細書で明示的に採用され、参照により組み込まれた開示のいずれかにも現れることがある用語は、本明細書で開示する特定の概念と最も矛盾しない意味に合致することも認識されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】二層間架橋した多層状小胞（ＩＣＭＶ）の合成の概略図である。二価陽イオンが媒介する融合は多層状小胞の形成につながり、その隣接する二重層はＤＴＴで架橋されている。その結果のＩＣＭＶは、ＰＥＧ−チオールとの反応でＰＥＧ化されている。
【図１Ｂ】多層状小胞内の２つの脂質頭部を一緒に結合させることによって形成されたＩＣＭＶの図である。
【図２Ａ−１】ＩＣＭＶの合成である。（Ａ）ＩＣＭＶ合成の概略図及び極低温電子顕微鏡画像。（ｉ）乾燥した脂質被膜から陰イオンのマレイミド機能化リポソームが調製され、（ｉｉ）リポソームの融合及びＭＬＶの形成を誘導するために二価陽イオンが添加され、（ｉｉｉ）膜浸透性ジチオールが添加され、これが小胞壁内で並置された脂質二重層上のマレイミド脂質を架橋し、（ｉｖ）その結果の脂質粒子がチオール末端ＰＥＧでＰＥＧ化される。合成の各ステップの低温ＥＭ画像は、（ｉ）初期リポソーム、（ｉｉ）ＭＬＶ、及び（ｉｉｉ）脂質壁が厚いＩＣＭＶを示す。縮尺バー＝１００ｎｍである。（ｉｉｉ）の右手側の画像は、ＩＣＭＶ壁の拡大像を示し、積み重ねられた二重層は、高電子密度の条線として解像され、縮尺バー＝２０ｎｍである。（Ｂ）動的光散乱法により測定されたＩＣＭＶ粒子サイズのヒストグラム。（Ｃ、Ｄ）低温ＥＭ画像からのＩＣＭＶ特性のヒストグラムは、（Ｃ）粒子当たりの脂質二重層の数、及び（Ｄ）粒子の半径と脂質壁の厚さとの比率を示す（ｎ＝１６５個の粒子を分析した）。
【図２Ａ−２】同上。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図３Ａ】（Ａ）動的光散乱法により測定した粒子直径のヒストグラムである。（Ｂ）ＩＣＭＶ粒子の低温ＥＭ画像である。
【図３Ｂ】同上。
【図４Ａ】ＩＣＭＶからのタンパク質の封入及び放出を示す。（Ａ）ＩＣＭＶ合成の各ステップで収集した脂質小胞内の球状タンパク質ＳＩＶ−ｇａｇ、ＦＬＴ−３Ｌ、又はＯＶＡの封入効率。（Ｂ、Ｃ）ＩＣＭＶ対脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）又はＰＬＧＡナノ粒子の（Ｂ）ＯＶＡ封入効率、及び（Ｃ）粒子質量当たりの全タンパク質装填量の比較。（Ｄ）１０％血清のＲＰＭＩ媒質中で３７℃で培養し、３０日間にわたってin vitroで測定した単純なリポソーム、ＭＬＶ、又はＩＣＭＶ（すべて基本的な脂質組成は４：５：１のＤＯＰＣ：ＭＰＢ：ＤＯＰＧ）からのＯＶＡ放出の動態。比較のために、コレステロール及びＰＥＧ−脂質で安定化させたリポソーム（３８：５７：５のＤＯＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＯＰＥ）の放出動態も示す。（Ｅ）エンドリソソーム環境の様々な態様をシミュレートする緩衝剤中で、ＩＣＭＶからのＯＶＡの放出を測定した。緩衝剤とは、ＰＢＳ中に１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）がある還元緩衝剤、ｐＨ５．０の５０ｍＭのクエン酸ナトリウムである酸性緩衝剤、ＰＢＳに５００ｎｇ／ｍＬのリパーゼＡがあるリパーゼ含有緩衝剤である。データは、少なくとも３つの実験の平均値±標準誤差を表し、ｎ＝３である。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【図５Ａ】従来のリポソーム、脂質コーティングしたＰＬＧＡ粒子、及びＩＣＭＶに封入されたＯＶＡの比較であり、（Ａ）粒子内に封入されたＯＶＡの画分、及び（Ｂ）粒子総質量当たりの封入ＯＶＡの量を示す。
【図５Ｂ】同上。
【図６Ａ】１０％血清を含む（Ａ）ＰＢＳ及び（Ｂ）ＲＰＭＩ媒質中で、音波処理したリポソーム、Ｍｇ２＋によって融合したＭＬＶ、及びＭｇ２＋及びＤＴＴによって形成されたＩＣＭＶから放出されたＯＶＡを示す。
【図６Ｂ】同上。
【図７Ａ】ＴＬＲアゴニストＭＰＬＡを補足したＩＣＭＶによる免疫応答のin vitroシミュレーションを示す。（Ａ）０．１μｇ／ｍＬのＭＰＬＡが存在する、又は存在しない状態で、０．７μｇ／ｍＬの可溶性ＯＶＡ、ＩＣＭＶに装填した等価用量のＯＶＡ、又は無関係のタンパク質（三日熱マラリアタンパク質、ＶＭＰ）を装填したＩＣＭＶでの１８時間培養後の脾臓樹状細胞（ＤＣ）上の細胞表面共刺激マーカＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現のフローサイトメトリ分析。（Ｂ）脾臓ＤＣを１０μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＯＶＡ257-264）、５．０μｇ／ｍＬの可溶性ＯＶＡ、ＩＣＭＶに装填した等価用量のＯＶＡ、又は０．０５μｇ／ｍＬのＭＰＬＡが存在する、又は存在しない状態で、ＶＭＰ装填ＩＣＭＶで１８時間培養し、Ｈ−２Ｋbで錯体化したＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する２５−Ｄ１．１６で染色した細胞のフローサイトメトリ分析によって、ＯＶＡの交差提示の程度を評価した。（Ｃ）５−（６）−二酢酸カルボキシフルオレスセインスクシンイミジルジエステル（ＣＦＳＥ）標識付きＯＶＡ特異的な未処理ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、０．１μｇ／ｍＬのＭＰＬと混合した０．７μｇ／ｍＬの可溶性ＯＶＡ、又は等価用量のＯＶＡを装填してＭＰＬＡと混合したＩＣＭＶを適用した同系脾臓ＤＣと同時培養した。無関係の抗原ＶＭＰを装填した抗原又はＩＣＭＶがない空のＩＣＭＶを、負の対照として含めた。ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＦＳＥ希釈度のフローサイトメトリ分析で３日目に評価した。ＣＦＳＥ蛍光のヒストグラムで示す。各ヒストグラムのゲートは各サンプル中の分割細胞のパーセンテージを示す。データは、少なくとも３つの実験の平均値±標準誤差を表し、ｎ＝３〜４である。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８Ａ】ＭＰＬＡ及び／又はＲ−８４８を取り込んだＩＣＭＶに応答した（Ａ）ＤＣの熟成及び（Ｂ）活性化を示す。
【図８Ｂ】同上。
【図９Ａ】ＩＣＭＶ対可溶性抗原又は非架橋小胞に封入した抗原でのin vivo免疫処置を示す。可溶性、リポソーム、ＭＬＶ、又はＩＣＭＶ製剤で送達され、それぞれが０．１μｇのＭＰＬＡを混合した１０μｇのＯＶＡを１回皮下注射（ｓ．ｃ．）して、ａ、ｂ、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを免疫処置した。（Ａ）蛍光ＯＶＡペプチド−ＭＨＣ四量体で免疫処置した７日後に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリ分析によって、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを解明した。（Ｂ）ＯＶＡ特異的ＩｇＧに対して免疫処置した２１日後に、免疫処置したマウスの血清をＥＬＩＳＡで分析した。（Ｃ、Ｄ）Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、可溶性、リポソーム、又はＩＣＭＶ製剤として０．１μｇのＭＰＬＡと混合した１０μｇの蛍光体結合ＯＶＡを注射し、ＯＶＡを内部移行した排出鼠径リンパ節（ｄＬＮ）細胞を２日目に評価した。（Ｃ）ＯＶＡ取り込みがポジティブのＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）、マクロファージ（Ｆ４／８０＋）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋）、及び形質球様ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋）のパーセンテージ、及び（Ｄ）ＯＶＡ＋集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。（Ｅ、Ｆ）Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、可溶性、リポソーム、又はＩＣＭＶ製剤として０．１μｇのＭＰＬＡと混合した１０μｇのＯＶＡを注射し、２日後にフローサイトメトリで排出鼠径ＬＮを分析し、ＤＣの活性化及び抗原の交差提示を評価した。（Ｅ）重ね合わせたヒストグラムは、ＤＣ中の共刺激マーカ（ＣＤ４０及びＣＤ８６）及びＭＨＣ−ＩＩ発現を示す。（Ｆ）左側のパネルは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｋb＋錯体で染色した鼠径ＬＮのＤＣの重ね合わせたヒストグラムを示し、平均ＭＦＩレベルを右側のパネルに示す。データは、２〜３の独立した実験の平均値±標準誤差を表し、ｎ＝３〜４であった。*、ｐ＜０．０５及び**、ｐ＜０．０１で、一方向ＡＮＯＶＡとその後のTukeyのＨＳＤで分析した
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図９Ｅ】同上。
【図９Ｆ】同上。
【図１０Ａ】（Ａ）ＣＤ８に対する抗体、及びＯＶＡ誘導ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬで錯体化したペプチドＭＨＣ四量体で染色した細胞をフローサイトメトリ分析で評価した、追加免疫から７日後の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。（Ｂ）ＥＬＩＳＡでの免疫処置から２１日目に測定した抗ＯＶＡ抗体のタイタ。
【図１０Ｂ】同上。
【図１１Ａ】水性核中の抗原保有ＩＣＭＶ、及び小胞壁に埋め込まれたＭＰＬＡは、強力な抗原及びＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を誘導する。（Ａ）ワクチン群の略図：ＭＰＬＡと混合した可溶性ＯＶＡ（ＭＰＬＡ）、外面のみにＭＰＬＡがあるＯＶＡ装填ＩＣＭＶ（外部ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶ）、又は脂質多重層全体にＭＰＬＡがあるＯＶＡ装填ＩＣＭＶ（内部ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶ）。（Ｂ〜Ｇ）基部にＭＰＬＡ、外部ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶ、又は内部ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶとして製剤化された１０μｇのＯＶＡ及び０．１μｇ又は１．０μｇのＭＰＬＡを皮下注射して、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを０、２１、及び３５日目に免疫処置した。（Ｂ）血清中の合計ＯＶＡ特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析。（Ｃ）１０μｇのＯＶＡ及び０．１μｇのＭＰＬＡによるワクチン接種に対する四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリ分析で経時評価した末梢血中のＯＶＡ特異的Ｔ細胞の出現率。比較のために、可溶性ＯＶＡ及び１μｇのＭＰＬＡによるワクチン接種に対する応答も示す。４１日目の個々のマウスからの代表的なフローサイトメトリ散乱プロット、及びマウス群からの四量体＋の平均値対時間を示す。（Ｄ）４１日目の末梢血からの四量体＋細胞をＣＤ４４／ＤＣ６２Ｌで染色することによる末梢血のＴ細胞エフェクタ／エフェクタ記憶／中枢記憶表現型の分析。個々のマウスからの代表的サイトメトリのプロット、及びＣＤ８＋Ｔ細胞中の四量体＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞の平均パーセンテージを示す。（Ｅ）４９日目にＰＢＭＣの生体外再刺激後に、in vitroでＯＶＡペプチドにより細胞内ＩＦＮ−γを染色して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を検定した。個々のマウスからのＩＮＦ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリのヒストグラム、及び群の平均結果を示す。データは、ｎ＝３で実施した２つの独立した実験の平均値±標準誤差を示す。可溶性ＯＶＡ＋ＭＰＬＡと比較してｃ、*、ｐ＜０．０５、及び外部ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶと比較して＃、ｐ＜０．０５。（Ｄ、Ｅ）*、ｐ＜０．０５及び**、ｐ＜０．０１で、双方向ＡＮＯＶＡとその後のTukeyのＨＳＤで分析した。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１１Ｅ】同上。
【図１２Ａ】「クリック」化学を使用した代替二重層間架橋反応を示す。（Ａ）ＤＯＰＥ及びアルキン前駆物質からアルキン頭部脂質が合成された。（Ｂ）アルキン末端脂質でリポソームが形成され、Ｍｇ２＋によってＭＬＶを形成するように誘導された。その後に、示されたようにジアジド及び触媒でアルキン保有ＭＬＶを培養すると、ＩＣＭＶが成功裏に形成され、低速遠心分離条件で粒子回収後に測定し、粒子収量は８３％であった。
【図１２Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、特に作用物質の送達に使用するために、安定化多層状脂質小胞を提供する。組み換えタンパク質に基づく先行技術のワクチンは、生ワクチン（例えばウイルス性）ベクターに伴う毒性及び抗ウイルス免疫を回避したが、その免疫原生は不十分であり、特にＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８Ｔ）応答に対して不十分である。サブユニットワクチンを強化するために、合成粒子保有抗原及びアジュバント分子が開発されているが、概してこれらの材料は、前臨床動物モードで生ワクチンに匹敵するＣＤ８Ｔ応答を誘発していない。これらの先行技術の組成物及び方法と対照的に、本発明は、多層状小胞内で隣接する脂質二重層の頭部を架橋することによって形成される二重層間架橋多層状小胞（ＩＣＭＶ）などの安定化多層状小胞を提供する。これらの小胞は細胞外条件で、特に小胞核内にタンパク質抗原を、小胞壁内に脂質系免疫促進分子を安定して取り込むが、エンドリソソームリパーゼの存在下で急速放出を呈した。抗原を単独で、又はアジュバントの存在下で送達するために使用する場合、本発明の小胞は極めて強力なワクチン（例えば全タンパク質ワクチン）を形成し、最強のワクチンベクターに匹敵する内因性Ｔ細胞及び抗体応答を誘導する。
【００３６】
小胞は、その脂質二重層を内部結合（例えば架橋）することによって安定化する。これらの小胞の安定化した性質により、単純なリポソーム又は脂質でコーティングしたナノ粒子又は微粒子と比較して、大量の作用物質を取り込み、このような作用物質をさらに長期間にわたって保持することができる。特に血清の存在下では、その徐放性動態により、緩慢で一定の徐放が望ましく、細胞外環境では遅い放出が望ましいが、細胞内では即放性が望ましい作用物質のin vivo送達に有用となる。本発明は、このような小胞を、本明細書でさらに詳細に説明するような予防薬、治療薬、及び／又は診断薬などの多数かつ様々な作用物質とともに使用することを想定している。したがって、本発明は上述した小胞を含む組成物、その合成方法、及びその使用方法を提供する。
【００３７】
安定化多層状脂質小胞（ＭＬＶ）
本発明は、隣接する（又は並置した）脂質二重層を相互に結合することによって安定化したＭＬＶを提供する。本明細書では、多層状小胞は、２つ以上の同心状に配置構成された脂質二重層で構成されたシェルを有するナノ又はマイクロスフェアである。本明細書では、隣接又は並置脂質二重層（又は脂質二重層表面）は、相互に非常に近接しているが、それ以外は別個であり、通常は物理的に分離している二重層又は表面を意味する。この用語は通常、単一の二重層における２つの単層の関係を意味しない。
【００３８】
本明細書では、「結合」は、任意の物理化学的手段によって相互に安定して接着した２つの実体を意味する。共有結合又は非共有結合を含め、当業者に知られている任意の結合を使用することができるが、共有結合が好ましい。本明細書で説明する幾つかの重要な実施形態では、ＭＬＶの隣接（又は並置）脂質二重層間の共有結合は、脂質二重層の架橋剤及び機能化成分を使用することによって達成される。しかし、本発明は、共有結合などの結合が他の方法で実行できることを想定している。一例として、本発明は、相補的反応性基が隣接する二重層表面の成分上にあり、架橋剤がなくても、二重層表面間の結合が、これらの基を相互に反応させることによって実行される方法を想定している。適切な相補的反応性基が当技術分野で知られており、本明細書で説明されている。
【００３９】
小胞の内部は通常は水性環境であり、予防薬、治療薬又は診断薬などの作用物質を含むことができるが、これらに限定されない。場合によっては、小胞は固体ポリマー核（例えば合成ポリマー核）などの固体核を含まない。代わりに以上で検討したように、関係する作用物質を含む流体核を有することがある。核は、場合によっては重合してヒドロゲル核になるモノマを含むことができる。小胞は、本明細書ではナノ粒子又は微粒子などの粒子と呼ぶこともできるが、このようなナノ粒子又は微粒子は、本発明の安定化ＭＬＶ及び二重層間架橋多層状脂質小胞（ＩＣＭＶ）の属性を有することを理解されたい。
【００４０】
小胞は、図１Ａ、図１Ｂ及び図２Ａに示すように、その核にボイド容量を有することができる、及び／又はその核内に、及び／又は隣接（又は並置）脂質二重層間に１つ又は複数の作用物質を含むことができる。作用物質は通常、合成プロセス中に脂質溶液に含まれ、この方法で合成中に小胞に（例えば封入によって）取り込まれる。小胞が形成されるにつれ、親油性分子も脂質二重層内に直接取り込むことができる、又は小胞形成中に、親油性尾部を脂質二重層に固定することができる。小胞は、有機溶媒などの刺激性溶媒がない状態で生成することができ、その結果、有機溶媒などに影響されやすい作用物質などの多種多様な作用物質を封入可能にすることができる。
【００４１】
小胞中の作用物質の量は変化可能であり、作用物質の性質によって解明することができる。実施例で実際に示すように、脂質１ｍｇ当たり３００〜４００μｇのタンパク質作用物質を本発明の小胞に取り込むことができる。幾つかの実施形態では、小胞は脂質１ｍｇ当たり約１００μｇの作用物質、又は約１５０μｇの作用物質、又は約２００μｇの作用物質、又は約２５０μｇの作用物質、又は約３００μｇの作用物質、又は約３２５μｇの作用物質、又は約３５０μｇの作用物質、又は約３７５μｇの作用物質、又は約４００μｇの作用物質、又は約４１０μｇの作用物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、作用物質はタンパク質抗原などのタンパク質とすることができる。
【００４２】
本発明の小胞は、貯留プロファイルで特徴付けることもできる。幾つかの実施形態では、小胞は、血清含有媒体（例えば１０％血清）内に配置し、３７℃に維持すると、１週間当たり約２５％の速度で作用物質を放出する。幾つかの実施形態では、小胞は、これらの条件で第一週には作用物質の約２５％を、約３０日後には最大約９０％を放出する。幾つかの実施形態では、小胞は、４℃で（ＰＢＳなどの）緩衝剤中に３０日保管されている場合、作用物質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を維持している。
【００４３】
各小胞内の脂質二重層の数は変化することがあり、通常は少なくとも２個から約５０個、又は少なくとも２個から約２５個、又は少なくとも２個から約１５個、又は少なくとも２個から約１０個、又は少なくとも２個から約５個である。
【００４４】
小胞の直径は変化することがある。場合によっては、小胞の直径は約１００から約５００ｎｍの範囲であり、約１２５から約３００ｎｍ、約１５０から約３００ｎｍ、約１７５から約２７５ｎｍの範囲を含む。場合によっては、直径は約１５０から約２５０ｎｍの範囲である。実施例で説明するように調製されるＩＣＭＶの直径プロファイルが、図２Ｂ及び図３Ａに示されている。小胞のいかなる調製時にも、小胞の直径、脂質二重層の数、装填される作用物質などに関して小胞間に不均質性があることが理解される。このような分布が実施例に示されている。
【００４５】
本明細書では、本発明の小胞はリポソームとも呼ぶことができる（例えば安定化多層状リポソーム、又は以下で検討するように二重層間架橋多層状リポソーム）。したがって、「小胞」という用語を使用する場合、それは小胞の発生源又は起源を示唆するものではない。本発明の小胞は、以下でさらに詳細に検討するように、合成小胞である（すなわち、in vitroで生成される）。
【００４６】
小胞は、隔離培養することができる、すなわち、それが合成される環境から全体が、又は一部が物理的に分離される。一例として、作用物質（すなわち、その「カーゴ」又は「ペイロード」）を含む小胞は、作用物質がない小胞（すなわち、空の小胞）から全部を、又は一部を分離することができ、それ故に「隔離培養小胞」と呼ぶことができる。分離は、重量（又は質量）、密度（浮遊密度を含む）、サイズ、色など（例えば小胞のカーゴがエネルギ放射によって検出可能な場合）に基づいて実行することができる。実施例で説明するように、遠心分離を使用して、脂質組成が同一で架橋二重層を有さない単純なリポソーム又はＭＬＶから本発明の小胞を分離することができる。ペレットである本発明の小胞をこれらの他の粒子タイプから分離するには、約１４，０００ｇで約４分間の遠心分離で十分である。
【００４７】
二重層間架橋多層状脂質小胞
本発明の安定化ＭＬＶの一例は、二重層間架橋多層状（脂質）小胞（ＩＣＭＶ）である。上述した安定化ＭＬＶと同様に、ＩＣＭＶは本明細書で説明するように相互に結合して同心状に配置構成された２つ以上の脂質二重層で構成されたシェルを有するナノ又はマイクロスフェアである。ＩＣＭＶなどの安定化多層状小胞内にある脂質二重層の数は、約２〜３０と変化することができるが、２〜１５の範囲がさらに一般的である。したがって様々な実施形態では、層の数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上とすることができる。ＩＣＭＶの１つの例示的合成に由来する二重層の頻度分布が、図２Ｃに示してある。二重層は通常、細胞膜と同様の方法で配置構成された親水性頭部及び疎水性尾部を有する資質で構成される（すなわち、親水性頭部が通常は水性環境に曝露し、疎水性尾部が二重層に埋め込まれる）。
【００４８】
ＩＣＭＶはその脂質二重層間の架橋によって安定化し、したがって「二重層間架橋」ＭＬＶと呼ばれる。本明細書では、これは小胞のシェル内の少なくとも２つの脂質層が相互に架橋される、という意味である。架橋二重層は通常、相互に並置又は隣接する二重層である。シェル内の脂質二重層の大部分又は全部は、シェル内でそれと並置した脂質二重層に架橋することができる。脂質二重層の間には１つ又は複数の架橋があってよい。通常、脂質二重層間には無数の架橋がある。このような架橋の配置構成及び位置決めはランダムであるか、非ランダムとすることができる。架橋の程度（したがってその結果となる小胞の安定性）は、小胞の作成に使用される機能化脂質（又は他の脂質二重層の成分）の割合、及び架橋条件（例えば架橋剤による小胞培養の時間）によって解明される。他の要素及びパラメータがすべて等しければ、小胞内の機能化脂質（又は他の脂質二重層の成分）の割合が高いほど、形成される架橋が多くなることが理解される。同様に、条件が架橋にとって好ましいほど、達成される架橋の程度が大きくなる。
【００４９】
合成方法
例示的合成方法は以下の通りである。すなわち、脂質及び任意選択で他の二重層の成分を化合して、同質の混合物を形成する。これは、脂質を乾燥させて脂質被膜を形成する乾燥ステップにより実行することができる。次に、脂質を水性溶媒と化合させる（例えば再水和する）。水性溶媒は、約７のｐＨなど、約６から約８の範囲のｐＨを有することができる。小胞の融合に融和性がある緩衝剤を、通常は低濃度の塩とともに使用する。実施例で使用する溶媒は、ｐＨ７．０の１０ｍＭのビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）である。緩衝剤の性質は、表１Ａに示すように培養の長さに影響を与えることができる。例えば、それ以外がすべて等しければ、ＰＢＳなどの緩衝剤は、ＢＴＰなどの緩衝剤と比較して長い培養時間を必要とすることがある。緩衝剤がＰＢＳである場合は、培養時間は約６〜２４時間、又は８〜１６時間、又は１０〜１２時間とすることができる。緩衝剤がＢＴＰである場合は、培養時間は１〜４時間、又は１〜２時間など、これより短くすることができる。したがって、十分な培養時間も使用すれば、様々な水性緩衝液を使用することができる。このステップは、小胞に取り込まれる作用物質の存在も含むことがある。その結果のリポソームは、次に多層状小胞に融合させるために、１つ又は複数の二価陽イオンで培養される。適切な二価陽イオンはＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、又はＳｒ２＋を含む。多価又はポリマー陽イオンも小胞融合に使用することができる。小胞融合は、陽イオン小胞を二価以上の陰イオンと混合することによっても達成することができ、その一例が、陽イオンリポソームとＤＮＡオリゴヌクレオチド又はＤＮＡプラズマとの融合である。これは、音波処理、渦形成などの攪拌により実行することができる。ある作用物質の存在下でリポソームを作成する場合、ＭＬＶはその核内に、又は同心状に配置構成された脂質二重層の間に、その作用物質を含むことになる。本発明は、様々な作用物質を保有するリポソームを融合して、このような作用物質を含むＭＬＶを形成することを想定する。
【００５０】
その結果であるＭＬＶは、次に架橋剤で、好ましくは膜浸透性架橋剤で培養される。本明細書で述べるように、架橋剤の性質は、相互に結合されている反応基の性質に応じて変化する。実施例で実際に示すように、ＤＴＴ又は（１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルチオ）−プロピオンアミド］ブタン）などのジチオール含有架橋剤を使用して、マレイミド機能化脂質（又は他の機能化脂質二重層の成分）で構成されたＭＬＶを架橋するか、図１２に示すように、ジアジド架橋剤を使用し、「クリック」ケミストリによりアルキン頭部を架橋することができる。これらの様々な培養はすべて、約６から約８、又は約６．５から約７．５の範囲、又は約７のｐＨの水性条件で実行する。架橋ステップは、室温（例えば２０〜２５℃）で、又は例えば最高３７℃、又はそれ以上などの高温で実行することができる。
【００５１】
その結果の架橋小胞は、次に（例えば遠心分離又は他のペレット化手段によって）収集し、洗浄して、チオール−ＰＥＧで培養することによってその最外面又は外面をＰＥＧ化することができる（例えば本明細書では、小胞を「表面ＰＥＧ化した」、又はＰＥＧに「表面結合した」と言うことができる）。ＰＥＧは任意のサイズにすることができ、それは０．１〜１０ｋＤａ、０．５〜５ｋＤａ、又は１〜３ｋＤａを含むが、これらに限定されない。実施例では、チオールで機能化した２ｋＤａのＰＥＧを使用する。培養期間は約１０分から２時間の範囲とすることができるが、温度、濃度などの他の条件に応じて、これより短い、又は長くてもよい。ＰＥＧ化ステップは室温（例えば２０〜２５℃）で、又は例えば最高３７℃、又はそれ以上などの高温で実行することができる。実施例の例示的合成方法では、３０分の培養期間を使用する。次に小胞を（例えば遠心分離又は他のペレット化手段によって）収集し、水又は他の水性緩衝液で洗浄することができる。
【００５２】
小胞は、ＰＢＳなどであるが、これに限定されない緩衝溶液に入れて４℃で保存するか、適切な凍結保存剤に入れて凍結乾燥し、次に−２０℃で保存することができる。適切な凍結保存剤は、ショ糖を含むもの（例えば１〜５％のショ糖、及び好ましくは約３％のショ糖溶液）を含む。
【００５３】
架橋は、１つの二重層中の反応基を隣接する二重層中の相補的反応基と結合することによって達成することもできる。例えば、スクシンイミジルエステル機能化脂質（Ａ）の頭部及び第一アミン含有（Ｂ）頭部を含有する融合小胞は、隣接する二重層のＡ脂質とＢ脂質を現場で反応させることによって、架橋することができる。当業者によく知られている様々な他の相補的機能化脂質を、同様の方法で使用することができる。
【００５４】
機能化脂質（又は脂質二重層の他の機能化成分）と架橋剤とのモル比は、条件に応じて変更することができる。場合によっては、約１から約５の範囲にすることができる。幾つかの実施形態では、２というモル比で十分である（すなわち、機能化脂質（又は成分）と架橋剤とのモル比が２：１である）。実施例では、２：１のモル比のマレイミド機能化脂質とＤＴＴを使用して、小胞の脂質二重層を架橋する合成方法について説明する。培養時間は１時間から２４時間、２〜１８時間、２〜１２時間、又は２〜６時間の範囲とすることができる。場合によっては、これは約２時間とすることができる。別の場合では、一晩（例えば約１２時間）とすることができる。
【００５５】
小胞中の機能化脂質の分子％は、１％から１００％、又は場合によっては約１０％から約６０％、又は場合によっては約２５％から約５５％の範囲とすることができる。場合によっては、小胞中の機能化脂質の分子％は通常、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、さらに好ましくは少なくとも２０％、及びさらに好ましくは少なくとも２５％である。表１Ａ及び表１Ｂは、機能化脂質がない状態では小胞が形成されないことを示す。
【００５６】
逆に、非機能化脂質が分子％として約０％から９９％存在することができる。さらに典型的には、非機能化脂質は分子％として約４０％〜７５％又は４０％から６０％存在することができる。
【００５７】
１つの重要な実施形態では、小胞はＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化ＤＳＰＥを使用して合成される。これらの脂質の相互の比率は変更することができる。表１Ａ及び表１Ｂは、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：マレイミド機能化脂質の比率の変更が小胞の収量に及ぼす影響を示す。ＤＯＰＣの分子％は１〜５０％の範囲とすることができ、ＤＯＰＧの分子％は１〜５０％の範囲とすることができ、マレイミド機能化脂質の分子％は１〜８０％の範囲とすることができる。本発明の幾つかの実施形態は、４０：１０：５０というＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：マレイミド機能化脂質の比率を有する小胞を提供する。幾つかの実施形態は、６０：１５：２５というＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：マレイミド機能化脂質の比率を有する小胞を提供する。幾つかの実施形態は、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質で構成された小胞を提供する。
【００５８】
脂質
小胞は１つ又は複数の脂質で構成される。集合的に球形の二重層（すなわち、小胞）を形成する限り、脂質のタイプ、数及び比率は変更することができる。脂質は、自然発生する発生源から隔離培養することができる、又は自然発生する発生源とは別に合成することができる。
【００５９】
脂質の少なくとも１つ（又は幾つか）は、両親媒性脂質であり、これは親水性部分と疎水性部分（通常は親水性頭部と疎水性尾部）を有すると定義される。疎水性部分は通常、疎水相（例えば二重層内）を指向し、疎水性部分は通常、水性相（例えば二重層の外側、及び場合によっては隣接する並置二重層の表面間）を指向する。親水性部分は炭水化物、燐酸塩、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシ及び他の同様の基のような極性基又は荷電基を含むことができる。疎水性部分は無極基を含むことができ、これは長鎖飽和及び非飽和脂肪族炭水化物基、及び１つ又は複数の芳香族、脂環又は複素基で置換された基を含むが、これらに限定されない。両親媒性化合物の例はリン脂質及びスフィンゴ脂質を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
通常、脂質はリン脂質である。リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンなどを含むが、これらに限定されない。コレステロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピンなどの他の脂質膜成分を使用できることを理解されたい。
【００６１】
脂質は、陰イオン及び中性リン脂質などの陰イオン及び中性（双性及び極性を含む）脂質でよい。中性脂質は、選択されたｐＨにて無電荷又は中性双性形で存在する。生理学的ｐＨにて、このような脂質は例えばジレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールを含む。双性脂質の例はジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）を含むが、これらに限定されない。陰イオン脂質は、生理学的ｐＨで負に荷電された脂質である。これらの脂質はホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他の陰イオン変更基を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
陰イオン及び中性脂質は、本明細書では集合的に非陽イオン脂質と呼ぶ。このような脂質はリンを含むことができるが、これらに限定されない。非陽イオン脂質の例はレシチン、リソレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、燐酸ジセチル、及びコレステロールを含む。
【００６３】
追加の非亜燐酸含有脂質はステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン−硫酸ラウリル、アルキル−硫酸アリルポリエチルオキシル酸化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウムなど、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、及びセレブロシドを含む。場合によっては、リソホスファチジルコリン及びリソホスファチジルエタノールなどの脂質を使用することができる。非陽イオン脂質はＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、及びリン脂質又はセラミドと結合するポリエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｃｅｒと呼ぶ）などのポリエチレングリコール系ポリマーも含む。
【００６４】
場合によっては、蛍光体などの検出可能なラベルで変更した形体などの、変更形の脂質を使用することができる。場合によっては、脂質は信号（例えば蛍光信号）を放射する脂質類似体である。その例は、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−ヨウ化テトラメチルインドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）及び１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン（ＤｉＤ）を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
脂質は、封入された作用物質をin vivo及び／又はin vitroで放出できるために、生分解性であることが好ましい。生分解性脂質は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジオレオイル−ホスホコリン、ＤＯＰＣ）、陰イオン１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ジオレオイル−ホスホグリセロール、ＤＯＰＧ）、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ジステアロイル−ホスホエタノールアミン、ＤＳＰＥ）を含むが、これらに限定されない。コレステロールなどの非脂質膜成分も取り込むことができる。
【００６６】
機能化脂質又は二重層成分
脂質二重層の少なくとも１つの成分は、機能化しなければならない（又は反応性でなければならない）。本明細書では、機能化成分は、多層状小胞の隣接する二重層の架橋に使用することができる反応基を含む成分である。二重層成分は、反応基を含むように変更することができる。
【００６７】
小胞の合成に使用される脂質の１つ又は複数は、機能化脂質とすることができる。本明細書では、機能化脂質は、多層状小胞の隣接する二重層の架橋に使用することができる反応基を有する脂質である。幾つかの実施形態では、反応基は、このような機能化脂質の間（従って小胞内の脂質二重層の間）に架橋を形成するために架橋剤（又は他の部分）と反応する基である。反応基は、架橋剤との接触、及び隣接する並置二重層内にある別の脂質との架橋を可能にする脂質上のいずれかの位置に位置特定することができる。幾つかの実施形態では、これは例えばリン脂質などの脂質の頭部にある。反応基の一例はマレイミド基である。マレイミド基は、ジチオールトレイトール（ＤＴＴ）などであるが、これに限定されないジチオール架橋剤の存在下で相互に架橋することができる。機能化脂質の一例は、本明細書でＭＰＢと呼ぶ１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミドである。実施例では、本発明の小胞の合成にこの機能化脂質を使用することを実際に示す。機能化脂質の別の例は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）２０００］（マレイミド−ＰＥＧ２ｋ−ＰＥとも呼ばれる）である。機能化脂質の別の例はジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）である。
【００６８】
本発明は、他の機能化脂質、他の機能化脂質二重層成分、他の反応基、及び他の架橋剤の使用も想定していることを理解されたい。マレイミド基以外に、反応基の他の例は他のチオール反応基、第一及び第二アミンなどのアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アルキン基礎、アジド基、カルボニル、ハロアセチル（例えばヨードアセチル）基、イミドエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルフヒドリル基、ピリジルジスルフィド基などを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
機能化及び非機能化脂質はAvanti Polar Lipids（アラバマ州Alabaster）などの幾つかの販売元から入手可能である。
【００７０】
本発明は、多重層小胞内の隣接する二重層を相互に結合する様々な方法を想定していることを理解されたい。場合によっては、隣接する二重層の結合を実行するために架橋剤を使用する。しかし、本発明はこれらに限定されない。
【００７１】
一例として、小胞はクリックケミストリを使用して形成することができる。例示的合成方法は、以下のようなアルキン変性脂質及びアルキン−アジド化学現象を使用する。アルキン変性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ、７４４  ｍｇ、１ｍｍｏｌ）などの脂質を５ｍＬのＣＤＣｌ３中でプロピオル酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１６７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２０２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）と混合することによって作成された。反応はＮＭＲでモニタした。反応は、室温で３時間後に終了した。有機溶液を５ｍＬの５％のＮａ2ＣＯ3、１％のＨＣｌ及び鹸水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、蒸発させた後、アルキン変性ＤＯＰＥを計量した。１：１のＤＯＰＣとアルキン−ＤＯＰＥを有する１．２６μｍｏｌの脂質被膜を準備し、水和化させて、音波処理し、上述したように１０ｍＭのＭｇ２＋と融合するように誘導した。アルキン機能か脂質を有するＭＬＶを、２．５ｍＭのＣｕＳＯ4、銅線、及び１．５ｍＭの１，１４−ジアジド−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカンで２４時間、室温で培養した。遠心分離で3回洗浄した後、粒子収量を測定した。
【００７２】
架橋剤
架橋剤は、相互に結合している脂質二重層内の反応基の性質に応じて、同質二官能価値架橋剤又は異質二官能価架橋剤とすることができる。本明細書では「架橋剤」と「架橋作用物質」という用語は区別なく使用される。同質二官能価架橋剤は２つの同一の反応基を有する。異種二官能価架橋剤は２つの異なる反応基を有する。
【００７３】
１つの場合、隣接する二重層は、同じ官能化脂質（又は他の二重層成分）及び架橋剤（同質二官能価架橋剤）を使用して、相互に架橋される。別の場合では、隣接する二重層は、異なる機能化脂質（又は他の二重層成分）及び架橋剤（異質二官能価架橋剤）を使用して、相互に架橋される。
【００７４】
様々な市販の架橋剤が以下の基のうち１つ又は複数に対して反応性である。すなわち、マレイミド基、第一アミン基、第二アミン基、メルカプト基、カルボキシル基、カルボニル基、及び炭化水素である。アミン特異的な架橋剤の例には、ビス（スルホスクシンイミド）スベリン酸、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、アジピン酸ジメチル２ＨＣｌ、ジメチルピメルイミド酸２ＨＣｌ、ジメチルスベルイミド酸２ＨＣｌ、及びエチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシネート］］がある。スルフィドリル基に対して反応性の架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン、１−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン、及びＮ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミドを含む。炭水化物と優先的に反応する架橋剤は、アジドベンゾイルヒドラジンを含む。カルボキシル基と優先的に反応する架橋剤は４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミンを含む。マレイミド反応基を架橋するために、ジチオールトレイトール（ＤＴＴ）、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）などのジチオール架橋剤、及び場合によっては（ＰＥＧ）−ＳＨ２などのチオール含有ポリマーを使用することができる。ＤＴＴの構造は下式の通りである。
【化１】
2013522362.tif 000003
ＤＰＤＰＢの構造は下式の通りである。
【化２】
2013522362.tif 000004
【００７５】
アルキンに反応する架橋剤は１，１４−ジアジド−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカンなどのジアジド、及び「クリック」ケミストリと適合性の他の基を含む。
【００７６】
アミン及びスルフィドリルと反応する異質二官能価架橋剤はＮ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン酸、スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド］ヘキサン酸、及びスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸を含む。カルボキシル基及びアミン基と反応する異質二官能価架橋剤は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−塩酸カルボジイミドを含む。炭化水素及びスルフィドリルと反応する異質二官能価架橋剤は、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジド２ＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド２  ＨＣｌ、及び３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジドを含む。他の架橋剤にはビス−（β−４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド及びグルタルアルデヒドがある。
【００７７】
架橋剤は、ＭＬＶの１つ又は複数の二重層を通って拡散し、隣接する様々な層を架橋できるように、膜透過性（又は脂質可溶性）であることも好ましい。任意の弱い極性／無荷電の二官能価又は異質二官能価低分子化合物を、効果的な膜透過性架橋剤とすることができ、このような分子がマレイミド、スクシンイミジルエステル、アジド、チオールなどであるが、これらに限定されない反応基を含む場合は、特にそうである。膜透過性架橋剤の例には、ＤＴＴ及び１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
ＰＥＧ化
ＩＣＭＶはさらに変性させることができる。実施例で説明するように、ＩＣＭＶはその表面でプロピレングリコール（ＰＥＧ）と結合することができる。ＳＴＥＡＬＴＨリポソームなどの様々な作用物質の半減期を延長するために、臨床でＰＥＧ化が使用される。ＰＥＧ化は、安定化ＭＬＶの表面上の機能化脂質を相補的な機能化ＰＥＧと反応させることによって遂行することができる。脂質は、ＩＣＭＶ合成の前にはＰＥＧと結合しないことが好ましく、むしろＰＥＧは合成後にＩＣＭＶの外面と結合する、又は「挿入後」プロセスによって粒子の外膜層にＰＥＧ−脂質結合が導入される。
【００７９】
ＩＣＭＶのＰＥＧ化に使用される反応基は、二重層の架橋に使用されるものと同じでよく、その場合は、追加の機能化脂質（又は他の機能化成分）が不必要である。一例として、ＩＣＭＶがマレイミド機能化脂質を含む場合、機能化ＰＥＧはチオール−ＰＥＧとすることができる。あるいは、小胞の安定化に使用される反応基は、ＰＥＧを外面と結合させる反応基と異なってよい。小胞の脂質二重層内にある機能化脂質（又は成分）の反応基の性質に応じて、他の変性タイプのＰＥＧを使用できることが、当業者には認識される。適切な反応基には、第一アミン及び第二アミンなどのアミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基、カルボニル、マレイミド基、ハロアセチル（例えばヨードアセチル）基、イミドエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及びピリジルジスルフィド基が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
表２は、合成直後及び７日後にＰＢＳ中でＰＥＧ化がＩＣＭＶの直径に及ぼす影響を示す。合成直後、ＰＥＧ化されたＩＣＭＶは非ＰＥＧ化ＩＣＭＶよりわずかに大きい直径を有する（例えば１つの実験では、ＰＥＧ化したＩＣＭＶは２７２±３９ｎｍに対して、非ＰＥＧ化では２３４±４５ｎｍであった）。
【００８１】
特に（例えば動的光散乱により）サイズ及び表面電荷、（例えば層状性検定により）外面上の脂質の画分、（例えばＦＡＣＳにより）自身内又は自身を通して取り込まれる作用物質の量などを解明するために、結果となる安定化小胞で様々な試験を実行することができる。小胞で実行できる他の検査には、共焦点顕微鏡検査及び低温トンネル電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）が含まれる。
【００８２】
下表は、安定化小胞で実施した様々な試験の結果を提供する。
【表１】
2013522362.tif 000005
【表２】
2013522362.tif 000006
【表３】
2013522362.tif 000007
【００８３】
作用物質
本発明は本発明のＩＣＭＶなどの安定化脂質小胞を使用して、in vivo又はin vitroで領域、組織又は細胞に作用物質を、場合によっては徐放などで送達することを想定している。本明細書では、作用物質とは（予防又は治療上の利益を含むが、これらに限定されない）利益を対照に提供するために使用することができる、又はin vivoで診断及び／又は検出（例えば撮像）に使用することができる、又はin vitroの用途に使用される任意の原子又は分子又は化合物である。
【００８４】
いかなる作用物質も、組成物（例えばＩＣＭＶなどの安定化ＭＬＶ、及びその医薬品組成物などの組成物）、及び本発明の方法を使用して送達することができるが、ただしこれは本明細書で提供されるＩＣＭＶなどの安定化ＭＬＶの中（その全体）に封入するか、他の方法でそれで輸送できる場合に限る。例えば、作用物質はこれらの小胞の合成に、及び任意選択で保存プロセスに耐えられなければならない。小胞は、例えば凍結乾燥形で、好ましくはショ糖系賦形剤を使用して合成し、保存することができる。作用物質は、合成中に小胞に組み込まれた場合、このような保存手順及び保存時間中に安定していなければならない。
【００８５】
作用物質はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、低分子化合物（例えば有機又は無機の化学物質）薬物、ウイルス様粒子、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、炭化水素、及びその類似体、誘導体、混合物、融合体、化合物又は結合体とすることができるが、これらに限定されない。作用物質は、代謝され、したがってin vivoでその活性（及び／又は安定）形態へと変換するプロドラッグとすることができる。
【００８６】
作用物質は天然に産出するか、天然以外で産出するものでよい。天然に産出する作用物質は、小胞が投与される先の対象によって合成することができるものを含む。天然以外で産出するのは、産出元が植物、動物、微生物、又は他の生物のいずれでも、普通は天然に存在しないものである。
【００８７】
作用物質の１つのクラスは、（単鎖又は多連鎖）タンパク質及びペプチドなどのペプチド系作用物質である。その例には抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、酵素、補助因子、受容体、リガンド、転写因子及び他の制御因子、（以下で検討するような）幾つかの抗原、サイトカイン、ケモカインなどが含まれる。これらのペプチド系作用物質は天然に産出することも、しないこともあるが、例えば遺伝子工学による細胞を使用することにより、対象内で合成することができる。
【００８８】
本発明の小胞を使用して送達することができる作用物質の別のクラスには、ペプチド系ではない作用物質が含まれる。その例には、天然産ではない化合物、又は哺乳類（及び特にヒト）の細胞によって天然に合成されない化合物が含まれる。
【００８９】
治療又は診断目的で現在使用されている様々な作用物質は、本発明により送達することができ、それには撮像剤、免疫賦活剤及び免疫阻害剤などの免疫調節剤、抗原、アジュバント、サイトカイン、ケムトカイン、抗ガン剤、抗感染症剤、核酸、抗体又はそのフラグメント、サイトカイン抗体融合タンパク質などの融合タンパク質、Ｆｃ−融合タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
撮像剤。本明細書では、撮像剤とは、直接又は間接的に信号を発し、それによりin vivoで検出を可能にする作用物質である。造影剤及び放射性作用物質などの撮像剤は、核医学スキャン及び磁気共鳴映像（ＭＲＩ）などの医用撮像技術を使用して検出することができる。磁気共鳴映像（ＭＲＩ）用の撮像剤にはＧｄ（ＤＯＴＡ）、酸化鉄又は金のナノ粒子が含まれ、核医学用撮像剤には201Ｔ１、ガンマ放出放射性核種９９ｍＴｃが含まれ、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）用の撮像剤には陽電子放射同位体、（１８）Ｆ−フッ化デオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フッ素、銅−６４、ガドアミド、及び２０３Ｐｂ及び１１ＩｎなどのＰｂ（ＩＩ）の放射性同位体が含まれ、in vivo蛍光撮像用撮像剤は蛍光染料又は染料結合なの粒子などである。他の実施形態では、送達される作用物質が撮像剤と結合、融合、混合、又は化合する。
【００９１】
免疫刺激剤。本明細書では、免疫刺激剤とは単独であろうと、別の作用物質との組合せであろうと、投与される先の対象の免疫応答を刺激する（先在する免疫応答の強化を含む）作用物質である。その例には、抗原、アジュバント（例えばイミキモド及びレジキモドなどのＴＬＲリガンド、イミダゾキノリン、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）又は他のリポ多糖類誘導体、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、フラゲリン、ムラミルジペプチド）、インターロイキンを含むサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（又はこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／変異形）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３−リガンドなど）、免疫賦活抗体（例えば抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、又はこれらの分子の一本鎖／抗体フラグメント）などが含まれる。
【００９２】
抗原。抗原は癌抗原、自己又は自己免疫抗原、微生物抗原、アレルゲン、又は環境抗原とすることができるが、これらに限定されない。抗原はペプチド、脂質、又は自然界の炭化水素とすることができるが、これらに限定されない。
【００９３】
癌抗原。癌抗原は癌細胞によって優先的に発現する（すなわち、癌細胞以外よりも癌細胞内に高レベルで発現する）抗原であり、場合によっては癌細胞によってのみ発現する。癌抗原は、癌細胞内又は癌細胞の表面上に発現することがある。抗原はＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、サイクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、及びＣＤ２０とすることができる。癌抗原はＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５からなる群から選択することができる。癌抗原はＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９からなる群から選択することができる。癌抗原はＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣ族、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Pmel117、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様多発結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネクシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄ族、１ｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ−コード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、ＣＤ２０、及びｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択することができる。
【００９４】
微生物抗原。微生物抗原は、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫及びマイコバクテリア種などであるが、これらに限定されない微生物種に由来する抗原である。したがって、微生物抗原には細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、及びマイコバクテリア抗原を含まれる。細菌、ウイルス、真菌、寄生虫及びマイコバクテリア種の例が本明細書に提供されている。微生物抗原は、微生物種の一部であるか、微生物全体であることがある。
【００９５】
アレルゲン。アレルゲンは対象内にアレルギー又は喘息反応を誘発することがある作用物質である。アレルゲンには花粉、昆虫の毒液、動物のふけ粉、菌類胞子及び薬物（例えばペニシリン）が含まれるが、これらに限定されない。自然の動物及び植物アレルゲンの例には、以下の属に特異的なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、イヌ属（イエイヌ）、ヒョウダニ属（例えばコナヒョウダニ）、ネコ属（イエネコ）、ブタクサ属（Ambrosia artemiisfolia）、ドクムギ属（例えばホソムギ又はイタリアンライグラス）、スギ属（スギ）、アルテルナリア属（葉上生息菌）、ハンノキ、アルヌス属（Alnus gultinoasa）、カバノキ属（Betula verrucosa）、カシ属（Quercus alba）、オリーブ属（Olea auropa）、ヨモギ属（Artemisia vulgaris）、オオバコ属（例えばPlantago lanceolata）、ヒカゲミズ属（例えばParietaria officinalis又はParietaria judaica）、チャバネゴキブリ属（例えばチャバネゴキブリ）、ミツバチ属（例えばApis multiflorum）、イトスギ属（例えばCupressus sempervirens、Cupressus arizonica及びCupressus macrocarpa）、ビャクシン属（例えばJuniperus sabinoides、エンビツビャクシン、トショウ及びJuniperus ashei）、Thuya（例えばThuya orientalis）、ヒノキ属（例えばヒノキ）、ゴキブリ属（例えばワモンゴキブリ）、カモジグサ属（例えばシバムギ）、ライムギ属（例えばライムギ）、コムギ属（例えばコムギ）、カモガヤ属（例えばオーチャードグラス）、ウシノケグサ属（例えばFestuca elatior）、イチゴツナギ属（例えばケンタッキーブルーグラス又はPoa compressa）、カラスムギ（例えばエンバク）、シラゲガヤ属（例えばHolcus lanatus）、Anthoxanthum（例えばハルガヤ）、カラスムギ（例えばArrhenatherum elatius）、ヌカボ属（例えばAgrostis alba）、アワガエリ属（例えばオオアワガエリ）、クサヨシ属（例えばリードカナリーグラス）、スズメノヒエ属（例えばバヒアグラス）、モロコシ属（例えばSorghum halepensis）、及びスズメノチャヒキ属（例えばBromus inurmis）である。
【００９６】
アジュバント。アジュバントは明礬（例えば水酸化アンモニウム、燐酸アンモニウム）、ＱＳ２１などのキラヤ木の樹皮から精製したサポニン（ＨＰＬＣ分別で２１番目のピークに溶出する糖脂質；Antigenics Inc.、マサチューセッツ州ウスター）、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー、米国ウイルス研究所）、Ｆｌｔ３リガンド、リーシュマニア延長因子（精製したリーシュマニアタンパク質、Corixa Corporation、ワシントン州シアトル）、ＩＳＣＯＭＳ（混合サポニン、脂質を含有し、抗原を保持することができるポアがあるウイルスサイズの粒子を形成する免疫賦活性錯体、CSL、オーストラリア、メルボルン）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＳＢ−ＡＳ４（明礬及びＭＰＬを含有するSmithKline Beechamのアジュバントシステム＃４、SBB、ベルギー）、ＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロック共重合体（ポリオキシエチレンの鎖が隣接する疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖を含む）及びMontanide IMS（例えばIMS 1312、可溶性免疫賦活剤と化合した水性ナノ粒子、Seppic）とすることができるが、これらに限定されない。
【００９７】
アジュバントはＴＬＲリガンドとすることができる。ＴＬＲ３を通して作用するアジュバントは二重鎖ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。ＴＬＲ４を通して作用するアジュバントには、モノホスホリル脂質Ａなどのリポ多糖類(MPLA、Ribi ImmunoChem Research, Inc.、モンタナ州ハミルトン）及びムラミルジペプチド（MDP、Ribi）及びスレオニル−ムラミルジペプチド（t-MDP、Ribi）の誘導体と、ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連するグルコサミン二糖類、OM Pharma SA、スイス、Meyrin）とが含まれるが、これらに限定されない。ＴＬＲ５を通して作用するアジュバントには、フラジェリンが含まれるが、これらに限定されない。ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８を通して作用するアジュバントには直鎖ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、イミダゾキノリンアミンなどの低分子量合成化合物（例えばイミキモド（Ｒ−８３７）、レジキモド（Ｒ−８４８））が含まれる。ＴＬＲ９を通して作用するアジュバントにはウイルス又は細菌起源のＤＮＡ、又はＣｐＧ  ＯＤＮなどの合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が含まれる。別のアジュバントのクラスには、ホスホロチオエート型ヌクレオチド類似体などのホスホロチオエートを含む分子、及び核酸を含むホスホロチオエートバックボーン結合がある。
【００９８】
免疫阻害剤。本明細書では、免疫阻害剤とは単独で、又は別の作用物質との組合せで、投与される先の対象の免疫応答を阻害する作用物質である。その例にはステロイド、レチノイン酸、デキサメタゾン、シクロフォスファミド、抗ＣＤ３抗体又は抗体フラグメント、及び他の免疫抑制剤が含まれる。
【００９９】
抗ガン剤。本明細書では、抗ガン剤とは、癌の発生又は進行を少なくとも部分的に阻害する作用物質であり、短期間でも癌に関連する症状を全体的又は部分的に阻害することを含む。幾つかの抗ガン剤は、ＤＮＡ損傷作用物質と分類することができ、それにはトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポサイド、ランプトテシン(ramptothecin)、トポテカン、テニポシド、ミトキサントロン）、ＤＮＡアルキル化剤（例えばシスプラチン、メクロレタミン、シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル(chorambucil)、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン）、ＤＮＡ鎖切断誘発剤（例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ）、微小管阻害剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、代謝拮抗薬（例えばシタラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、フロクシウリジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、又はエピポドフィロトキシンが含まれる。
【０１００】
抗ガン剤の例にはアシビシン、アクラルビシン、塩酸アコラゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン(Ambomycin)、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビセレシン、硫酸ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチメール(Carbetimer)、カルボプラチン（プラチナを含む製剤）、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン（プラチナを含む製剤）、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デクソールマプラチン(Dexormaplatin)、デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロールニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン、エルブロゾール、エルロチニブ（タルセバ）、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクシウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、フォストリエシン、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、メシル酸イマチニブ(GLEEVAC)、インタフェロンアルファ−２ａ、インタフェロンアルファ−２ｂ、インタフェロンアルファ−ｎ１、インタフェロンアルファ−ｎ３、インタフェロンベータ−Ｉａ、インタフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン、ランレオチド、レナリドマイド（レブリミド、レビミド）、レトロゾール、リュープロリド、リアロゾール、ロメトレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン(Mitocarcin)、ミトクロミン、ミトギリン(Mitogillin)、ミトマルシン(Mitomalcin)、ミトマイシン、ミトスパー(Mitosper)、ミトタン、ミトキサントロン、マイコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン(Ormaplatin)、オキシスラン、パクリタクセル、ペメトレキセド（アリムタ）、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン(Peliomycin)、ペンタムスチン、ペントモン(Pentomone)、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピリトレキシムイソチオネート、ピロキサントロン(Piroxantrone)、プリカマイシン、プロメスタン、ポリフィマー、ポリフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、セムスチン、シムトラ��ン、シトグルシド、スパルホサート、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、タムスロシン、タキソール、タキソテール、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロミド（テモダール）、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、サリドマイド（サロミド）及びその誘導体、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラバザミン、トポテカン、トレミフェン、トレストロン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビングリシナート、ビンレウロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
抗ガン剤は酵素阻害剤でよいが、これはチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、又はＥＧＦＲ阻害剤を含むが、これらに限定されない。チロシンキナーゼ阻害剤はゲニステイン（４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン）、チルホスチン２５（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）、メチレン］−プロパンジニトリル、ハービマイシンＡ、ダイゼイン（４’，７−ジヒドロキシイソフラボン）、ＡＧ−１２６、ｔ−１−（３’−カルボキシ−４’−ヒドロキシフェニル）−２−（２”，５”−ジヒドロキシ−フェニル）エタン、又はＨＤＢＡ（２−ヒドロキシ５−（２，５−ジヒドロキシベンジルアミノ）−２−ヒドロキシ安息香酸とすることができるが、これらに限定されない。ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８、又はｐ１９でよいが、これらに限定されない。ＭＰＡキナーゼ阻害剤はＫＹ１２４２０  （Ｃ２３Ｈ２４Ｏ８）、ＣＮＩ−１４９３、ＰＤ９８０５９、又は４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾールでよいが、これらに限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ(イレッサ)、ＷＨＩ−Ｐ９７（キナゾリン誘導体）、ＬＦＭ−Ａ１２  （レフルノミド代謝産物類似体）、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＺＤ−６４７４（ZACTIMA）、ＡＥＥ７８８、及びＡＧ１４５８でよいが、これらに限定されない。
【０１０２】
抗ガン剤はＶＥＧＦ阻害剤とすることができ、これはベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルセンティス）、ペガプタニブ（マクジェン）、ソラフェニブ、スニチニブ（スーテント）バタラニブ、ＺＤ−６４７４（ZACTIMA）、アネコルタブ（RETAANE）、乳酸スクアラミン、及びセマフォリンを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
抗ガン剤は抗体又は抗体フラグメントとすることができ、これはベバシズマブ（アバスチン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、アレムツズマブ（キャンパス、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病に対して指示される）、ゲムツズマブ（マイロターグ、hP67.6、抗ＣＤ３３、急性骨髄性白血病などの白血病に対して指示される）、リツキシマブ（リツキサン）、トシツモマブ（ベキサール、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性疾患に対して指示される）、ＭＤＸ−２１０（ＨＥＲ−２／neu癌遺伝子タンパク質生成物と免疫グロブリンＧタイプＩＦｃ受容体（ＩｇＧ）との両方に同時に結合する二重特異性抗体）（ＦｃガンマＲＩ））、オレゴボマブ（OVAREX、卵巣癌に対して指示される）、エドレコロマブ（PANOREX）、ダクリズマブ（ゼナパックス）、パリビズマブ（シナジス、ＲＳＶ感染などの呼吸性状態に対して指示される）、イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン、非ホジキンリンパ腫に対して指示される）、セツキシマブ（アービタックス）、ＭＤＸ−４４７、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２２０（抗ＴＡＧ−７２）、ＩＯＲ−Ｃ５、ＩＯＲ−Ｔ６（抗ＣＤ１）、ＩＯＲ  ＥＧＦ／Ｒ３、セロゴバブ(celogovab)（ONCOSCINT OV103）、エプラツズマブ（LYMPHOCIDE）、ペムツモマブ(pemtumomab)（THERAGYN）、及びグリオマブＨ(Gliomab-H)（脳腫瘍、メラノーマに対して指示される）を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
血球分化剤。この作用物質は、造血始原細胞の１つ又は複数の系統への分化を刺激する作用物質とすることができる。その例にはＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、エリスロポイエチン、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ１１Ａなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
血球自己再生剤。この作用物質は、増血始原細胞の自己複製を刺激する作用物質とすることができる。その例にはKitリガンド、ＧＳＫ３−ベータ阻害剤、Ｗｎｔ５ＡならびにＳＬＦ、ノッチ１活性剤、Ｌｎｋ阻害剤、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びＰＧＥ２を含むＰＧＥ２経路を刺激する作用物質、ＰＧＩ２、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、１６，１６−ジメチルＰＥＧ２のＰＧＥ受容体アゴニスト、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２，９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、ブタプロスト、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＥＧ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、ＢＩＯ、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、バプタＡＭ(Bapta-AM)、フェンジリン、ニカルジピン、ニフェジピン、ピモジド、ストロファンチジン、ラナトシド、Ｌ−Ａｒｇ、ニトロプルシドナトリウム、バナジン酸ナトリウム、ブラジキニン、メベベリン、フルドロキシコルチド、アテノロール、ピンドロール、ガボキサドール、キヌレン酸、ヒドララジン、チアベンダゾール、ビククリン、ベサミコール、ペルボシド、イミプラミン、クロルプロパミド、１，５−ペンタメチレンテトラゾール、４−アミノピリジン、ジアゾキシド、ベンフォチアミン、１２−メトキシドデセノン酸、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ガラミン、ＩＡＡ９４、クロロトリアニセン、及びその誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
抗感染症剤。この作用物質は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗真菌剤、及び抗マイコバクテリア剤を含むが、これらに限定されない抗感染症剤とすることができる。
【０１０７】
抗菌剤はβ−ラクタム抗生物質、ペニシリン（天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン）、セファロスポリン（第一世代、第二世代、及び第三世代セファロスポリン）、他のβ−ラクタム（イミペネム、モノバクタムなど）、β−ラクタマーゼ阻害剤、バンコマイシン、アミノグリコシド及びスペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、スルホンアミド及びトリメトプリム、又はキノリンとすることができるが、これらに限定されない。
【０１０８】
他の抗菌剤にはアセダプソン、アセトスルフォンナトリウム、アラメシン(Alamecin)、アレキシジン、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アミサイクリン、アミフロキサシン、メシル酸アミフロキサシン、アミカシン、硫酸アミカシン、アミノサリチル酸、アミノサリチル酸ナトリウム、アモキシシリン、アンホマイシン、アンピシリン、アンピシリンナトリウム、アパルシリンナトリウム、アプラマイシン、アスパルトシン、硫酸アストロマイシン、アビラマイシン、アボパルシン(Avoparcin)、アジスロマイシン、アズロシリン、アズロシリンナトリウム、塩酸バカンピシリン、バシトラシン、バシトラシンメチレンジサリチレート、バシトラシン亜鉛、バンベルマイシン、ベンソイルパスカルシウム、ベリスロマイシン、硫酸ベタマイシン、ビアペネム、ビニラマイシン(Biniramycin)、塩酸ビフェネミン、ビスピリチオンマグスルフェックス(Bispyrithione Magsulfex)、ブチカシン、硫酸ブチロシン、硫酸カプレオマイシン、カルバドックス、カルベニシリン二ナトリウム、カルベニシリンインダニルナトリウム、カルベニシリンフェニルナトリウム、カルベニシリンカリウム、カルモナムナトリウム、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファマンドールナフテート、セファマンドールナトリウム、セファパロール、セファトリジン、セファザフルナトリウム、セファゾリン、セファゾリンナトリウム、セフブペラゾン、セフジニル、セフェピム、塩酸セフェピム、セフェテコール、セフィキシム、塩酸セフメノキシム、セフメタゾール、セフメタゾールナトリウム、セフォニシド一ナトリウム、セフォニシドナトリウム、セホペラゾンナトリウム、セフォラニド、セフォタキシムナトリウム、セフォテタン、セフォテタン二ナトリウム、塩酸セフォチアム、セフォキシチン、セフォキシチンナトリウム、セフピミゾール、セフピミゾールナトリウム、セフピラミド、セフピラミドナトリウム、硫酸セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシムナトリウム、セフトリアキソンナトリウム、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフロキシムピボキセチル、セフロキシムナトリウム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、塩酸セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、塩酸セトサイクリン、セトフェニコール、クロラムフェニコール、パルミチン酸クロラムフェニコール、パントテン酸クロラムフェニコール錯体、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、クロロヘキシジンホスファニラート(Phosphanilate)、クロロキシレノール、重硫酸クロロテトラサイクリン、塩酸クロロテトラサイクリン、シノキサシン、シプロフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、シロレマイシン(Cirolemycin)、クラリスロマイシン、塩酸クリナフロキサシン、クリンダマイシン、塩酸クリンダマイシン、塩酸クリンダマイシンパルミテート、燐酸クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリンベンザチンクロキサシリンナトリウム、クロキシキン、コリスチンメタナトリウム、硫酸コリスチン、クーママイシン、クーママイシンナトリウム、シクラシリン、シクロセリン、ダルホプリスチン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメサイクリン、デノフンギン(Denofungin)、ジアベリジン、ジクロキサシリン、ジクロキサシリンナトリウム、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、ジピリチオン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンカルシウム、ドキシサイクリンフォスファテックス(Fosfatex)、ドキシサイクリン塩酸塩、ドロキサシンナトリウム、エノキサシン、エピシリン、塩酸エピテトラサイクリン(Epitetracycline)、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート(Acistrate)、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンエチルコハク酸、エリスロマイシングルセプト酸、エリスロマイシンラクトビオン酸、エリスロマイシンプロピオン酸、エリスロマイシンステアリン酸、塩酸エタンブトール、エチオナミド、フレロキサシン、フロキサシリン、フルダラニン、フルメキン、ホスホマイシン、ホスホマイシントロメタミン、フモキシシリン、塩化フラゾリウム(Furazolium)、酒石酸フラゾリウム(Furazolium)、フシジン酸ナトリウム、フシジン酸、硫酸ゲンタマイシン、グロキシモナム(Gloximonam)、グラミシジン、ハロプロジン、ヘタシリン、ヘタシリンカリウム、ヘキセジン、イバフロキサシン、イミペネム、イソコナゾール、イセパマイシン、イソニアジド、ジョサマイシン、硫酸カナマイシン、キタサマイシン、レボフラルタドン、レボプロピルシリンカリウム、レキシスロマイシン、リンコマイシン、塩酸リンコマイシン、ロメフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、メシル酸ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マフェニド、メクロサイクリン、スルホサリチル酸メクロサイクリン、リン酸メガロマイシンカリウム、メキドックス(Mequidox)、メロペネム、メタサイクリン、塩酸メタサイクリン、メテナミン、ヒブル酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メチシリンナトリウム、メチオプリム(Metioprim)、塩酸メトロニダゾール、リン酸メトロニダゾール、メズロシリン、メズロシリンナトリウム、ミノサイクリン、塩酸ミノサイクリン、塩酸ミリンカーマイシン、モネンシン、モネンシンナトリウム、ナフシリンナトリウム、ナリジクス酸ナトリウム、ナリジクス酸、ナタマイシン、ネブラマイシン、パルミチン酸ネオマイシン、硫酸ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、硫酸ネチルマイシン、ノイトラマイシン、ニフラデン、ニフルアルデゾン、ニフラテル、ニフラトロン、ニフルダジル、ニフルイミド(Nifurimide)、ニフルピリノール、ニフルキナゾール(Nifurquinazol)、ニフルチアゾール、ニトロサイクリン、ニトロフラントイン、ニトロミド、ノルフロキサシン、ノボビオシンナトリウム、オフロキサシン、オルメトプリム、オキサシリンナトリウム、オキシモナム、オキシモナムナトリウム、オキソリニン酸、オキシテトラサイクリン、オキシテトラサイクリンカルシウム、塩酸オキシテトラサイクリン、パルジマイシン(Paldimycin)、パラクロロフェノール、パウロマイシン(Paulomycin)、ペフロキサシン、メシル酸ペフロキサシン、ペナメシリン、ペニシリンＧベンザチン、ペニシリンＧカリウム、ペニシリンＧプロカイン、ペニシリンＧナトリウム、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、���ニシリンＶハイドラバミン、ペニシリンＶカリウム、ペンチジドンナトリウム、アミノサリチル酸フェニル、ピペラシリンナトリウム、ピルベニシリンナトリウム、ピリジシリンナトリウム、塩酸ピルリマイシン、塩酸ピバンピシリン、パモ酸ピバンピシリン、ピバンピシリンプロベナート(Probenate)、硫酸ポリミキシンＢ、ポルフィロマイシン、プロピカシン、プラジナミド、亜鉛ピリチオン、酢酸キンデカミン、キヌプリスチン、ラセフェニコール、ラモプラニン、ラニマイシン、レロマイシン、レプロマイシン、リファブチン、リファメタン、リファメキシル、リファミド、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロリテトラサイクリン、硝酸ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、酪酸ロサラマイシン、プロピオン酸ロサラマイシン、燐酸ロサラマイシンナトリウム、ステアリン酸ロサラマイシン、ロソクサシン、ロキサルソン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン、サンフェトリネムナトリウム(Sanfetrinem Sodium)、サルモキシシリン、サルピシリン、スコパフンギン、シソマイシン、硫酸シソマイシン、スパルフロキサシン、塩酸スペクチノマイシン、スピラマイシン、塩酸スタリマイシン、ステフィマイシン、硫酸ストレプトマイシン、ストレプトニコジド(Streptonicozid)、スルファベンズ、スルファベンズアミド、スルファセタミド、スルファセタミドナトリウム、スルファシチン、スルファジアジン、スルファジアジンナトリウム、スルファドキシンスルファレン、スルファメラジン、スルファメータ、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファモキソール、スルファニル酸亜鉛、スルファニトラン、スルファサラジン、スルファソミゾール、スルファチアゾール、スルファザメト、スルフィソキサゾール、スルフィソキサゾールアセチル、スルフィソキサゾールジオールアミン、スルフォミキシン(Sulfomyxin)、スロペネム、スルタミシリン、スンシリンナトリウム、塩酸タランピシリン、テイコプラニン、塩酸テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、塩酸テトラサイクリン、リン酸テトラサイクリン錯体、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チフェンシリンカリウム、チカルシリンクレシルナトリウム、チカルシリン二ナトリウム、チカルシリン一ナトリウム、チクラトン、塩化チオドニウム(Tiodonium Chloride)、トブラマイシン、硫酸トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、硫酸トリメトプリム、トリスルファピリミジン(Trisulfapyrimidines)、トロレアンドマイシン、硫化トロスペクトマイシン、チロスリシン、バンコマイシン、塩酸バンコマイシン、バージニアマイシン、又はゾルバマイシンであるが、これらに限定されない。抗マイコバクテリア剤にはミアンビトール(Myambutol)（塩酸エタンブトール）、ダプソン（４，４’−ジアミノジフェニルスルホン）、ぺーサ(Paser)顆粒（アミノサリチル酸素顆粒）、プリフチン(Priftin)（リファペンチン）、ピラジナミド、イソニアジド、リファビン、（リファンピン）、リファジンＩＶ、リファマート(Rifamate)（リファンピン及びイソニアジド）、リファタール（リファンピン、イソニアジド、及びピラジンアミド）、硫酸ストレプトマイシン又はトレカトル−ＳＣ(Trecator-SC)���エチオナミド）があるが、これらに限定されない。
【０１０９】
抗ウイルス剤にはアマンチジン及びリマンタジン、リビバリン、アシクロビル、ビダラビン、トリフルオロチミジン、ガンシクロビル、ジドブジン、レチノビル、及びインタフェロンがあるが、これらに限定されない。
【０１１０】
抗ウイルス剤にはさらにアセマンナン(Acemannan)、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデホビル、アロブジン、アルビルセプトスドトックス(Alvircept Sudotox)、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、メシル酸アテビルジン、アブリジン、シドホビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、メシル酸デラビルジン、デシスコロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン(Fiacitabine)、フィアルウリジン、ホサリラート、フォスカーネットナトリウム、ホスホネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、メシル酸サキナビル、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、燐酸ビダラビン、燐酸ビダラビンナトリウム、ビロキシム(Viroxime)、ザルシタビン、ジドブジン、ジンビロキシム又はインテグラーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
抗真菌剤にはイミダゾール及びトリアゾール、ポリエンマクロリド抗生物質、グリセオフルビン、アンフォテリシンＢ、及びフルシトシンがあるが、これらに限定されない。抗寄生虫剤には重金属、抗マラリアキノリン、葉酸拮抗剤、ニトロイミダゾール、ベンズイミダゾール、アバーメクチン、プラキシカンテル(praxiquantel)、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、フェノール類（例えばビチオノール、ニコロサミド）、合成アルカロイド（例えばデヒドロエメチン）、ピペラジン（例えばジエチルカルバマジン）、アセトアニリド（例えばジロキサニドフロナート）、ハロゲン化キノリン（例えばヨードキノール（ジヨードヒドロキシキン））、ニトロフラン（例えばニフルチモックス）、ジアミジン（例えばペンタミジン）、テトラヒドロピリミジン（例えばパモ酸ピランテル）、又は硫酸化ナフチルアミン（例えばスラミン）が含まれる。他の抗感染症剤には塩酸ジフロキサシン、ラウリル臭化イソキノリン、モキサラクタム二ナトリウム、オルニダゾール、ペンチソミシン、塩酸サラフロキサシン、ＨＩＶ及び他のレトロウイルスのプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ及び他のレトロウイルスのインテグラーゼ阻害剤、セファクロール（セクロル）、アシクロビル（ゾビラックス）、ノルフロキサシン、（Noroxin）、セフォキシチン（メホキシン）、セフロキシムアキセチル（セフチン）、シプロフロキサシン（シプロ）、塩酸アミナクリン、塩化ベンゼトニウム、ビチオノレートナトリウム、ブロムクロレノン、過酸化尿素、塩化セタルコニウム、塩化セチルピリジニウム、塩酸クロルヘキシジン、クリオキノール、臭化ドミフェン、フェンチクロール、塩化フルダゾニウム、塩基性フクシン、フラゾリドン、ゲンチアナ紫、ハルキノール、ヘキサクロロフェン、過酸化水素、イクタモール、イミデシルヨウ素、ヨウ素、イソプロピルアルコール、酢酸マフェナイド、メラレインナトリウム、塩化メルクフェノール(Mercufenol)、塩化水銀（ＩＩ）アミド、塩化メチルベンゼトニウム、ニトロフラゾン、ニトロメルソール、塩酸オクテニジン、オキシクロロセン、オキシクロロセンナトリウム、樟脳処理したパラクロロフェノール、過マンガン酸カリウム、ポビドンヨード、塩化セパゾニウム、硝酸銀、スルファジアジン銀、シムクロセン、チメルホネートナトリウム、チメロサール、又はトロクロセンカリウムがあるが、これらに限定されない。
【０１１２】
核酸剤。本発明により対象に送達することができる核酸には天然又は天然以外で産出するＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡなど）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）オリゴヌクレオチド、三重らせん体形成分子、ＵＳ６１９４３８８号（免疫賦活ＣｐＧ核酸に関するその教示は、参照により本明細書に組み込むものとする）に記載されているような免疫賦活核酸、遺伝子発現の調節に使用される小型干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、遺伝子発現の調節に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、遺伝子又は遺伝子フラグメント、制御配列、及びその類似体、誘導体、及び組合せが含まれる。これらの核酸は、例えば標的組織及び／又は細胞への結合及び／又は摂取を促進するために、巧妙に投与するか、錯化して別の実体にすることができる。
【０１１３】
抗炎症剤。抗炎症剤は、炎症を軽減又は解消する作用物質である。それにはアルクロフェナック、二プロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、クロピラック、プロピオン酸クロチカソン、酢酸コルメタソン、コルトドキソン、デフラザコルト、デソニド、デソキシメタソン、二プロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、二酢酸ジフロラゾン、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン(Endrysone)、エンリモマブ(Enlimomab)、エノリカム(Enolicam)ナトリウム、エピリゾール、エトドラック、エトフェナマート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラック、フェンドサル(Fendosal)、フェンピパロン(Fenpipalone)、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコート、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカソン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタソール、酢酸ハロプレドン、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパク、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロルノキシカム、ロテプレドノールエタボナート、メクロフェノキセートナトリウム、メクロフェナム酸、二ブチル酸メクロリゾン、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、メチルプレドニゾロンスェプタナート、モルニフルマート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラリニン、多硫酸ペントサンナトリウム、グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナザート(Prednazate)、プリフェロン(Prifelone)、プロドール酸、プロクアゾン、プロキサゾール、酢酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレックス(Salcolex)、サルナセジン(Salnacedin)、サルサレート、サリチル酸、塩化サンギナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダック、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナック、ピバル酸チオコルト��ル、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、糖質コルチコイド、ゾメピラックナトリウムが含まれる。１つの好ましい抗炎症剤はアスピリンである。
【０１１４】
他の作用物質。作用物質にはアドレナリン作用薬、副腎皮質ステロイド、副腎皮質抑制剤、嫌酒薬、アルドステロン拮抗薬、アンモニア解毒薬、アミノ酸、筋萎縮性側索硬化症作用薬、アナボリックステロイド、興奮薬、鎮痛薬、アンドロゲン、麻酔薬、食欲抑制薬、食欲抑制薬、下垂体前葉活性剤、下垂体前葉抑制剤、駆虫薬、ニキビ止め薬、抗アドレナリン作用薬、抗アレルギー薬、抗アメーバ薬、抗アンドロゲン物質、抗貧血剤、抗狭心症薬、抗不安薬、抗関節炎薬、β−アドレナリンアゴニスト、メチルキサンチン、マスト細胞安定剤、抗コリン作用薬、糖質コルチコイドなどの副腎皮質ステロイドなどの抗喘息薬、抗アテローム硬化症剤、抗胆石症剤、胆石形成防止剤(anticholelithogenic)、抗コリン作用薬、抗凝血剤、抗コクシジウム薬、抗痙攣薬、抗鬱剤、抗糖尿病剤、止瀉薬、抗利尿薬、抗運動障害剤、制吐剤、抗てんかん薬、抗エストロゲン剤、抗線維素溶解薬、抗緑内障薬、抗出血剤、抗ヒスタミン薬、抗高脂血症剤、抗高リポタンパク血症剤、抗高血圧薬、抗低血圧薬、抗感染薬、抗炎症剤、抗角質化剤、抗偏頭痛薬、抗有糸分裂薬、抗真菌薬、制嘔吐剤、抗好中球減少症剤、抗強迫観念剤、抗酸化剤、抗パーキンソン病薬、抗蠕動剤、肺胞嚢防止剤(antipneumocystic)、抗前立腺肥大剤、抗原虫薬、止痒剤、抗疥癬剤、抗精神病薬、抗リウマチ薬、抗住血吸虫薬、抗脂漏薬、抗分泌薬、鎮痙薬、抗血栓薬、鎮咳薬、抗潰瘍薬、抗尿結石剤、食欲抑制剤、血糖値調整剤、骨吸収阻害剤、気管支拡張薬、炭酸脱水酵素阻害薬、心抑制薬、心臓保護薬、強心剤、心血管剤、脳虚血剤、胆汁分泌促進薬、コリン作動薬、コリン作動アゴニスト、コリンエステラーゼ不活性剤、抗コクシジウム剤、認知補助剤、認知改善薬、結膜炎薬、造影剤、鎮静剤、診断補助剤、利尿剤、ドーパミン作動薬、外部奇生生物撲滅薬、吐剤、酵素阻害剤、エストロゲン、エストロゲン受容体アゴニスト、線維素溶解薬、蛍光剤、酸素遊離基スカベンジャ、胃酸抑制剤、胃腸運動作用因子、老人病薬、糖質コルチコイド、性腺刺激成分、発毛刺激剤、止血剤、植物活性剤、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ホルモン、低コレステロール血症、低血糖症、抗高脂血症薬、低血圧、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤、不能症治療補助剤、炎症性腸疾患薬、角質溶解薬、ＬＨＲＨアゴニスト、肝臓病薬、黄体融解素、記憶補助剤、精神状態昂進剤(mental performance enhancer)、ミネラル、気分調節薬、粘液溶解薬、粘膜保護剤、多発性硬化症薬、散瞳薬、鼻粘膜充血除去薬、神経弛緩薬、神経筋遮断薬、神経保護薬、ＮＭＤＡ拮抗薬、非ホルモンステロール誘導体、栄養素、子宮収縮薬、パジェット病薬、プラスミノゲン活性化因子、血小板活性化因子拮抗薬、血小板凝集阻害剤、脳卒中後及び頭部外傷後の作用物質、プロゲスチン、プロスタグランジン、前立腺肥大阻害剤、プロシロトロピン(prothyrotropin)、向精神剤、放射性作用物質、弛緩薬、鼻炎薬、殺疥癬虫薬、硬化剤、鎮痛剤、催眠鎮静薬、選択的アデノシンＡｌ拮抗薬、金属イオン封鎖剤、セロトニン拮抗薬、セロトニン阻害剤、セロトニン受容体拮抗薬、ステロイド、興奮薬、抑制剤、甲状腺ホルモン、抗甲状腺薬、甲状腺擬態、精神安定剤、不安定狭心症薬、尿酸排泄薬、血管収縮薬、血管拡張剤、傷薬、創���治癒薬、又はキサンチン酸化酵素阻害薬があるが、これらに限定されない。
【０１１５】
対象
本発明は、本明細書で想定されるような作用物質の送達による恩恵を受けそうな事実上いかなる対象のタイプにも実践することができる。本発明の幾つかの実施形態では、ヒト対象が好ましい対象である。対象には家のペット（例えばイヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなど）、家畜又は農場の動物（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ及び他の家禽類）、サラブレッドなどのウマ、研究室の動物（例えばマウス、ラット、ラビットなど）のような動物も含まれる。対象には魚及び他の水生種も含まれる。
【０１１６】
作用物質が投与される対象は正常な対象でもよい。あるいは、１つ又は複数の特定の作用物質の送達により診断できる、又はその恩恵を受けることができる症状がある、又はその症状が発生する危険があるものとすることができる。
【０１１７】
このような症状には癌（例えば固形腫瘍癌又は白血病などの非固形癌）、感染症（体内の特定の領域又は組織に局在する感染症など）、自己免疫異常、アレルギー又はアレルギー症状、喘息、移植の拒否反応などが含まれる。
【０１１８】
本発明に包含される様々な症状を診断する試験は当技術分野で知られており、普通の医師も精通している。これらの研究室の試験には顕微鏡分析、培養依存の試験（培養菌など）、及び核酸検出試験が含まれるが、これらに限定されない。それには湿式マウント、染色で向上させた顕微鏡検査、免疫顕微鏡検査（例えばＦＩＳＨ）、ハイブリダイゼーション顕微鏡検査、粒子凝集、酵素結合免疫吸着検定法、尿スクリーニングテストなどが含まれる。医師は通常、以上で列挙した研究室の試験を実行する以外に、完全な病歴も受け取り、完全な理学的検査を実行する。
【０１１９】
癌を有する対象とは、検出可能な癌細胞を有する対象である。癌発生の危険がある対象とは、癌を発生する蓋然性が通常より高い対象である。これらの対象には、例えば癌発生の可能性が高くなることに関係すると実証されている遺伝的異常を有する対象、癌の家族性素因を有する対象、タバコ、アスベスト、又は他の化学的毒素など癌を引き起こす作用物質（すなわち、発癌物質）に曝露した対象、及び以前に癌の治療を受け、見かけの寛解状態にある対象が含まれる。
【０１２０】
感染を有する対象とは、熱、寒気、筋肉痛、羞明、咽頭炎、急性リンパ節炎、脾腫、消化管の不調、白血球増加又は白血球減少を含むが、これらに限定されない症状を呈する対象、及び／又は体内で感染症の病原体又は副産物を検出することができる対象である。
【０１２１】
感染症発生の危険がある対象とは、感染症の病原体に曝露する危険がある対象である。このような対象には、このような病原体が存在することが知られている区域、及びこのような感染症が一般的である区域に居住する対象が含まれる。これらの対象には、注射針を共有する、無防備な性交渉をする、感染した対象サンプルに日常的に接触する（例えば医師）などの危険性が高い行為に関わる対象、腹部手術を含むがこれらに限定されない手術を受けた人なども含まれる。
【０１２２】
対象は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染又はマイコバクテリア感染などの感染を有する、又はその発生の危険があることがある。これらの実施形態では、小胞は抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、又は抗マイコバクテリア剤などの抗菌剤を含むことができ、細胞キャリア（例えばＴ細胞）は、感染に対する免疫応答の刺激、又は場合によっては感染の治療に有用な別の作用物質を生成するために、遺伝子工学で処理することができる。
【０１２３】
癌
本発明は、例えば固形腫瘍癌などの癌を有する、又はそれを発生する危険がある対象に対して、本発明の小胞を使用して作用物質を投与することを想定している。作用物質は、化学療法剤、抗体系治療剤、ホルモン系治療剤、酵素阻害剤などの抗ガン剤とすることができる、及び／又は抗原（例えば癌抗原）及び／又はアジュバントなどの免疫賦活剤とすることができる、及び／又は診断薬（例えば造影剤）、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかとすることができる。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び／又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。
【０１２４】
癌は単純癌、肉腫又は黒色腫となることがある。単純癌には基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、中枢神経癌、大腸直腸癌、腎臓又は腎細胞癌、喉頭癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ；腺癌、巨（燕麦）細胞癌、及び扁平上皮癌など）、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌及び扁平上皮癌など）、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、直腸癌、呼吸器の癌、及び泌尿系の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
肉腫は、稀な間葉性新生物で骨（骨肉腫）及び軟組織（線維肉腫）に生じる。肉腫には脂肪肉腫（粘液性脂肪肉腫及び多態性脂肪肉腫など）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性シュワン細胞腫、神経線維肉腫、又は神経原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング腫（ユーイング骨肉腫、骨格外（すなわち、骨以外の）ユーイング肉腫、及び原始神経外胚葉腫瘍など）、滑膜肉腫、血管肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、類腱腫（進行性線維腫症とも呼ばれる）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管外皮細胞腫、悪性間葉組織腫瘍、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、癒着性小細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（ＧＩ間質肉腫としても知られる）、及び軟骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
黒色腫は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍である。黒色腫の例には悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、及び末端性ほくろ性黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。癌は固形腫瘍リンパ腫となることがある。その例にはホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫が含まれる。
【０１２７】
癌には骨癌、脳腫瘍、乳癌、結腸大腸癌、結合組織癌消化系の癌、子宮内膜癌、食道癌、目の癌、頭部及び首の癌、胃ガン、上皮内新生物、黒色腫神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、網膜芽腫、又は横紋筋肉腫があるが、これらに限定されない。
【０１２８】
感染症
本発明は、例えば細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、又はマイコバクテリア感染症を有する、又はそれを発生する危険がある対象に対して、本発明の小胞を使用して作用物質を投与することを想定している。作用物質には抗感染薬（抗菌剤、抗ウイルス剤、抗近々剤、抗寄生虫剤、及び抗マイコバクテリア剤など）、抗原（例えば最近抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、及びマイコバクテリア抗原などの微生物抗原）などの免疫賦活剤、及び／又はアジュバント、診断薬（例えば造影剤）、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び／又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。
【０１２９】
細菌感染症には大腸菌感染症、ブドウ球菌感染症、連鎖菌感染症、緑膿菌感染症、クロストリジウム‐ディフィシレ感染症、レジオネラ感染症、肺炎球菌感染症、ヘモフィルス感染症、クレブシエラ感染症、エンテロバクタ感染症、シトロバクタ感染症、ナイセリア感染症、赤痢菌感染症、サルモネラ菌感染症、リステリア感染症、パスツレラ感染症、連鎖桿菌感染症、スピリルム感染症、トレポネーマ感染症、放射菌感染症、ボレリア感染症、コリネバクテリウム感染症、ノカルジア感染症、ガードネレラ感染症、カンピロバクタ感染症、スピロヘータ感染症、プロテウス感染症、バクテリオイド感染症、ピロリ菌感染、又は炭疽菌感染があるが、これらに限定されない。
【０１３０】
マイコバクテリア感染症には、それぞれ結核菌及び癩菌を原因とする結核又はハンセン病があるが、これらに限定されない。
【０１３１】
ウイルス感染症には単純疱疹ウイルス１型感染症、単純疱疹ウイルス２型感染症、サイトメガロウイルス感染症、Ａ型肝炎ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ＥＢウイルス感染症、ロタウイルス感染症、アデノウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、インフルエンザＡ型ウイルス感染症、Ｈ１Ｎ１（ブタインフルエンザ）感染症、ＲＳウイルス感染症、水痘‐帯状疱疹ウイルス感染症、天然痘感染症、サル痘ウイルス感染症、ＳＡＲＳ感染症、又はトリインフルエンザ感染症があるが、これらに限定されない。
【０１３２】
真菌感染症にはカンジダ症、白癬、ヒストプラズマ症、分芽菌症、パラコクシジオイドミコーシス、クリプトコッカス、アスペルギルス症、色素酵母菌症、菌腫感染症、偽アレシェリアシス、又は癜風感染症があるが、これらに限定されない。
【０１３３】
寄生虫感染症にはアメーバ症、トリパノソーマ‐クルージ感染症、肝蛭症、リーシュマニア症、プラズマ原虫感染症、糸状虫症、肺吸虫症、トリパノソーマ‐ブルーセイ感染症、ニューモシスティス感染症、膣トリコモナス感染症、条虫感染症、模様条虫感染症、エキノコックス感染症、住血吸虫感染症、神経嚢虫、アメリカ鉤虫感染症、又はヒト鞭虫があるが、これらに限定されない。
【０１３４】
アレルギー及び喘息
本発明は、アレルギー又は喘息を有する、又はそれを発生する危険がある対象に作用物質を投与することを想定している。作用物質にはアレルゲン、Ｔｈ１応答を刺激する作用物質などの免疫賦活剤、Ｔｈ２応答を阻害する作用物質などの面積阻害剤又は免疫抑制剤、抗炎症剤、ロイコトリエン拮抗薬、ＩＬ−４突然変異タンパク質、可溶性ＩＬ−４受容体、抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−４拮抗剤、抗ＩＬ−５抗体、可溶性ＩＬ−１３受容体−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＩＬ−９抗体、ＣＣＲ３拮抗剤、ＣＣＲ５拮抗剤、ＶＬＡ−４阻害剤、及び他のＩｇＥの下方制御因子、例えば制限なしで抗ＩｇＥ、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−ガンマなどのＴｈ１サイトカインなどのサイトカイン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイドを含むステロイドがあるが、これらに限定されない、及び／又は診断薬（例えば造影剤）、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び／又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。
【０１３５】
アレルギーはアレルゲンに対する獲得過敏症である。アレルギー症状には湿疹、アレルギー性鼻炎又は鼻感冒、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹（発疹）、及び食物アレルギー、及び他のアトピ症状が含まれるが、これらに限定されない。アレルギーは通常、無害のアレルゲンに対してＩｇＥ抗体が発生することによって引き起こされる。喘息は気管系の障害であり、炎症、気道狭窄、及び吸入剤に対する気道の反応増大を特徴とする。喘息はアトピ又はアレルギー症状を伴うことが多いが、これに限らない。
【０１３６】
自己免疫疾患
本発明は、自己免疫疾患又は異常を有する、又はそれを発生する危険がある対象に作用物質を投与することを想定している。作用物質にはＴｈ１応答を阻害するものを含む免疫阻害剤又は免疫抑制剤、Ｔｈ２応答を刺激する免疫賦活剤、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０などのサイトカイン、後援商材がある、及び／又は診断薬（例えば造影剤）、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び／又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。
【０１３７】
自己免疫疾患とは、対象自身の抗体が宿主組織に反応するか、免疫エフェクタＴ細胞が内因性の自己ペプチドに対して自己反応し、組織の破壊を引き起こすという疾患の種類である。したがって、免疫応答は自己抗原と呼ばれる対象自身の抗原に対して展開される。自己免疫疾患は通常、Ｔｈ１バイアスがあると見なされる。その結果、Ｔｈ２免疫応答又はＴｈ２様サイトカインの導入が遊離になることがある。
【０１３８】
自己免疫疾患にはリウマチ様動脈炎、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体での硬皮症、混合性結合組織病、多発筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば半月形糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インシュリン抵抗性、及び自己免疫性真性糖尿病があるが、これらに限定されない。
【０１３９】
移植療法
本発明は、細胞又は器官を移植した対象に作用物質を投与することを想定している。作用物質には免疫阻害剤又は免疫抑制剤、抗炎症剤がある、及び／又は診断薬（例えば造影剤）、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び／又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。
【０１４０】
本明細書で提供する組成物及び方法は、移植療法後に免疫応答を調製するために使用することもできる。移植の成功は、身体の免疫系による移植組織の拒絶によって制限されることが多い。その結果、被移植者は通常、移植組織が生き延びられるために長期間にわたって免疫抑制される。本発明は、移植の拒絶を最小化するために移植部位に免疫調節剤、特に免疫阻害剤を投与することを想定している。したがって、本発明は移植を予定した対象、移植を受けている対象、又は移植した対象への投与を想定している。
【０１４１】
上記のリストは包括的ではなく、例示である。当業者には、本発明の方法を使用した予防及び治療に適した各症状タイプの他の例が明らかになる。
【０１４２】
有効な量、療法、製剤
作用物質は安定化したＭＬＶの形態で有効量を投与される。有効量とは、医学的に望ましい結果を提供するのに十分な作用物質の用量である。有効量は、所望のアウトカム、治療又は予防する特定の状態、治療中の対象の年齢及び身体的状態、症状の重症度、治療期間、併用療法の（がある場合はその）性質、特定の投与経路などの要因に応じて、医師の知識及び専門技術内で変化する。通常は、最大容量、すなわち、健全な医学的判断により安全な最高用量を使用することが好ましい。
【０１４３】
例えば対象が腫瘍を有している場合、有効量は、（例えば腫瘍の撮像によって解明されるような）腫瘍の体積又は負荷を減少させる量とすることができる。有効量は、血液又は他の体液又は組織中の癌細胞の存在及び／又は頻度によって評価することもできる。腫瘍が組織又は器官の正常な機能に影響を及ぼす場合は、組織又は器官の正常な機能を測定することによって、有効量を評価することができる。
【０１４４】
場合によっては、有効量とは１つ又は複数、好ましくは全部の症状を軽減又は解消するのに必要な量である。例えば、アレルギーを有する、又は喘息の発作を経験している対象では、作用物質の有効量は、アレルギー又は喘息発作に伴う症状を軽減又は解消する量とすることができる。これにはくしゃみ、蕁麻疹、鼻閉、及び呼吸困難が含まれることがある。同様に、感染症を有する対象では、作用物質の有効量は、感染症に伴う症状を軽減又は解消する量とすることができる。それには発熱及び倦怠感が含まれることがある。作用物質が診断薬である場合、有効量は、身体の関係領域又は細胞の視覚化を可能にする量とすることができる。作用物質が抗原である場合、有効量は抗原に対する免疫応答を引き起こし、抗原の由来となる病原体に対して好ましくは短期間の、さらに好ましくは長期間の保護を提供する量とすることができる。場合によっては、本発明は作用物質を１回投与することを想定し、場合によっては、本発明は作用物質を複数回投与することを想定することが理解される。一例として、抗原を初回投与量及び追加投与量で投与することができるが、場合によっては、本発明は追加投与量が必要ない十分な抗原を、及び任意選択でアジュバントを送達する。
【０１４５】
本発明は製薬組成物を提供する。製薬組成物は、好ましくは薬学的に許容可能なキャリアに入れた本発明の小胞、及び好ましくは作用物質を含む無菌組成物である。「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、ヒト及び本発明が想定する他の対象への投与に適した１つ又は複数の融和性の固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。
【０１４６】
「キャリア」という用語は、投与を容易にするために小胞及び好ましくは作用物質と化合することができる天然又は合成の有機又は無機成分を指す。製薬組成物の成分は、所望の薬学的効率を実質的に損なうような相互作用を排除する方法で混合される。
【０１４７】
適切な緩衝剤には、酢酸と塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）、クエン酸と塩（１〜３％Ｗ／Ｖ）、ホウ酸と塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）、及び燐酸と塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）が含まれる。適切な保存剤には塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）、及びパラオキシ安息香酸エステル類（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）が含まれる。
【０１４８】
本明細書で他に言明していない限り、様々な投与経路が使用可能である。選択される特定のモードが、選択される特定の活性作用物質、治療される特定の症状、及び治療効力のために必要な容量によって決定されることは言うまでもない。概して、提供される方法は、医学的に許容可能な任意の投与モード、すなわち、臨床的に許容不能な副作用を引き起こさずに、有効レベルの所望の応答を生成する任意のモードを使用して実践することができる。１つの投与モードは非経口経路である。「非経口」という用語には、皮下注射、静脈注射、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射又は輸注技術が含まれる。他の投与モードには口腔、粘膜、直腸、膣、舌下、鼻腔内、気管内、吸入、眼球、経皮などが含まれる。
【０１４９】
経口投与の場合、化合物は、当技術分野でよく知られている薬学的に許容可能なキャリアに小胞を組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。このようなキャリアにより、治療すべき対象が経口摂取するために錠剤、丸薬、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、被膜、懸濁液などとして製剤化することができる。適切な賦活剤には、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含む糖などの充填剤と、例えばコーンスターチ、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製とがある。任意選択で、経口製剤は、内部の酸性状態を中和するために塩水又は緩衝剤中で製剤化するか、キャリアが全くない状態で投与することもできる。
【０１５０】
経口で使用可能な医薬製剤には、ゼラチンで作成されたプッシュフィット式カプセル、さらにゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作成した密封ソフトカプセルが含まれる。プッシュフィット式カプセルには、水溶液、緩衝溶液、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に浮遊させた小胞を含めることができる。また、安定剤を添加することができる。経口投与するための製剤化はすべて、このような投与に適した用量でなければならない。
【０１５１】
口腔内投与の場合、組成物は従来の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態をとることができる。
【０１５２】
吸入による投与の場合、組成物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切な気体などの適切な噴射剤を使用することにより、加圧したパック又はネブライザからエアロゾル噴霧提示の形態で送達できるので都合がよい。加圧したエアロゾルの場合、用量単位は、計量した量を送達するために弁を設けることによって決定することができる。
【０１５３】
本発明の組成物を全身に送達することが望ましい場合、例えば大量瞬時投与又は連続注輸などの注入により非経口投与するように製剤化することができる。注入するための製剤化は単位用量の形態で、例えばアンプル又は複数用量の容器に入れて提示することができる。非経口の医薬製剤には、処方成分の水溶液が含まれる。注入用水性懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を上げる物質が含まれる。あるいは、小胞の懸濁液は、油性懸濁液として調製することができる。適切な脂肪親和性溶媒又は小胞には、ごま油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。
【０１５４】
あるいは小胞は、使用前に例えば発熱性物質がない無菌の水などの適切な小胞と一緒の構成にするために、粉末形態又は凍結乾燥形態とすることができる。
【０１５５】
小胞は、座剤又は滞留性浣腸剤のように、例えばココアバター又は他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含有するなど、直腸又は膣の組成で製剤化することもできる。
【０１５６】
in vitroの使用
本発明は、細胞成長因子などを含むが、これらに限定されない１つ又は複数の作用物質の安定的な発生源を必要とする、又はそれを有する方が都合がよくなる細胞培養又は組織工学などのin vitroの用途もさらに想定している。
【０１５７】
キット
本発明は、本発明の小胞を含むキットをさらに想定している。小胞は、１つ又は複数の関係する作用物質を含むことができる。キットには、小胞に取り込まれる１つ又は複数の関係する作用物質をさらに含めることができる。キットには小胞の使用指示などの書類も含めることができる。小胞は好ましくはショ糖を含有した賦活剤とともに、緩衝剤に入れて、又は凍結乾燥形態で提供することができる。
【０１５８】
本発明は、本発明の小胞を合成するために必要な様々な物質、試薬及び触媒を含むキットも想定している。このようなキットには、例えば本明細書で説明するような脂質、機能化脂質などの脂質二重層の機能化成分、膜透過性架橋剤などの１つ又は複数の架橋剤、二価陽イオンなどの多価陽イオンなどを含めることができる。これらのキットには、小胞を合成する指示などの書類も含めることができる。キットには関係する作用物質も含めることができる。
【０１５９】
本発明について、以下の実施例でさらに例証するが、これは決してさらなる限定とは解釈されない。本出願を通して引用される全参照先（参照文献、発行済み特許、公開特許出願、及び共願特許出願を含む）の内容はすべて、参照により明示的に本明細書に組み込むものとする。
【０１６０】
（実施例）
実施例１
先行技術の方法の限界に対応するために、多層状小胞（ＭＬＶ）内の隣接する脂質層の頭部を接続する架橋を形成することによって安定化させた脂質粒子の合成を構想した。二価陽イオンはリポソームの融合を誘発してＭＬＶにすることが知られている。（Duzgunes他のJ Membrane Biol.（1981;59:115-125）を参照されたい。）マレイミドで機能化した脂質（例えばＭＰＢ）を小胞に導入し、ヂチオール架橋剤を使用してＭＰＢの層を架橋することによって、このプロセスを変更した（例えば図１Ａに示す合成略図）。その結果となる二層間架橋の多層状脂質小胞（ＩＣＭＶ）はタンパク質の封入効率が大幅に向上したこと（単純なリポソームに対して１００倍、図５）、粒子の質量当たりのタンパク質装填量が大幅に向上したこと（単純なリポソームに対して２０倍、図５）、及び低速の徐放動態（図６）で、血清の存在下にて取り込んだカーゴの持続的貯留が大幅に向上したことなど、魅力的な特徴を呈した。合成は、全体が脆弱なタンパク質カーゴの取り込みに親和的な水性緩衝液中で実行され、生分解性脂質のみで構成される粒子を生成する。この新種の粒子を生物医学的に応用するための試験台として、抗原及びアジュバントの送達小胞としてのＩＣＭＶを検査した。特に、モデル抗原としてオバルブミン（ＯＶＡ）を使用し、ワクチン用途のためにin vivoでトール様受容体アゴニスト（ＴＬＲａ）の同時送達を検査した。
【０１６１】
材料及び方法
脂質（４０：１０：５０のモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：マレイミド機能化脂質）を乾燥して脂質被膜を形成し、カーゴ分子の存在下でｐＨ７．０の１０ｍＭのビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）中で１時間再水和した。図１Ａに示すように、その結果のリポソームを音波処理し、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋などの二価陽イオンを添加することによって融合するように誘導した。その結果のＭＬＶをＤＴＴ（マレイミド：ＤＴＴの比率２：１）で培養し、マレイミド機能化脂質の並置する層を結合させて、架橋ＩＣＭＶを形成した。その結果の構造を遠心分離して洗浄し、次に２ｋＤａのＰＥＧ−チオールで培養してＰＥＧ化した。最終生成物を遠心分離し、脱イオン水で３回洗浄した。粒子のサイズ及び表面の電荷は、９０＋粒子サイズの分析器（Brookhaven Instruments）を使用して動的光散乱法（ＤＬＳ）にて割り出した。粒子サイズは、共焦点顕微鏡検査及び低温ＴＥＭで分析した。粒子の外面に露出した脂質の画分を定量化するために、上述したような層状性検定を実施した（Girard他のBiophysical journal（2004;87:419-429）を参照）。封入化を研究するために、alexa-fluor 500で変性したオバルブミン（ＯＶＡ）を使用して、ＰＥＧ化リポソーム、（Bershteyn他のSoft Matter（2008;4:1787-1791）にて上述されているような）脂質コーティングしたＰＬＧＡ粒子、及びＩＣＭＶに封入された量を測定した。幾つかの検定では、アレキサフルオル、５５５で変性したＣＩＶ−Ｇａｇ及びＦＬＴ−３リガンドを使用した。これらの粒子からのＯＶＡの放出は、１００ｋＤａのＭＷ分画で透析膜内で実施した。
【０１６２】
in vitro樹状細胞（ＤＣ）活性化研究のために、それぞれモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）及びＲ−８４８、ＴＬＲ４及びＴＬＲ７アゴニストと組み合わせたＯＶＡを封入したＩＣＭＶで、骨髄由来又は脾臓のＤＣを培養した。細胞を染色し、フローサイトメトリで分析して、ＤＣ活性化及び粒子内部移行の程度を検査した。培地は、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によりＩＬ１２ｐ７０の発現を分析した。ワクチンキャリアとしてのＩＣＭＶのin vivo機能を分析するために、Ｃ５７ＢＩ／６マウスの群の脇腹に大量瞬時投与で、又はＩＣＭＶ中で（ＴＬＲアゴニストがある状態、又はない状態で）送達される７０μｇのＯＶＡを皮下注射して免疫処置し、２１日後に追加処理した。免疫処置により誘発されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞及びインタフェロンガンマ生成Ｔ細胞の頻度を、末梢血単核細胞のフローサイトメトリ分析により解明した。抗ＯＶＡタイタを、免疫処置したマウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析により解明した。動物は、米国国立衛生研究所、州、及び地方のガイドラインに従って世話をした。
【０１６３】
結果及び検討
ＭＬＶの従来の形成プロトコルを変更して、安定したＩＣＭＶを合成した（図１Ａ）。最初に、タンパク質又は薬物カーゴ溶液の存在下で音波処理し、脂質被膜を再水和することによって、最大５０ｍｏｌ％のＭＰＢを含有するリポソームを形成した。その結果となるリポソームに二価陽イオンを添加して、その融合を誘発し、以上で報告したようにＭＬＶを形成した。（Duzgunes他のJ Membrane Biol.（1981;59:115-125）を参照）。次に膜透過性試薬としてＤＴＴを投入し、ＭＬＶ内で並置する脂質膜のマレイミド頭部間に共有架橋を形成した（図１Ｂ）。表１Ａ及び表１Ｂに示すように、４０％を超える有意の収量で安定したＩＣＭＶを形成するために、二価陽イオンとＤＴＴの両方が必要であった。Ｍｇ２＋又はＤＴＴのみで形成したＭＬＶでは、１０Ｋ×ｇで遠心分離した脂質粒子が有意な量で生成されなかった。２０ｍＭの塩化ナトリウムが存在すると、粒子の形成を妨害した。何故なら、一価陽イオンは、二価陽イオンが媒介する小胞の融合を阻止することが知られているからである（Duzgunes他のJ Membrane Biol.（1981 ;59:1 15-125）を参照）。有意な収量の粒子を達成するには、少なくとも２５ｍｏｌ％以上のＭＰＢが必要であったので、その後は４０：１０：５０のモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＢの脂質組成物で作業することにした。
【０１６４】
その結果のＩＣＭＶは２５０±４０ｎｍの典型的な平均直径を有し、多分散性指数は約０．０８であった（図３Ａ）。粒子の低温ＥＭ画像により、単一の脂質二重層よりも厚い高電子密度バンクで構成された多層状構造であることが判明し、このことは脂質膜をまたいで結合した脂質の多層であることを示唆した（図３Ｂ）。粒子の外面に表示された脂質の画分を、層状性検定で測定した。音波処理したリポソームは外面に３７±２．３％の脂質を有する一方、その値はＭｇ2＋及びＤＴＴでリポソームを変性した後に形成したＩＣＭＶ中で１９±１．０％へと低下し、そのことは、それが多層状構造であることを示唆した。表面に表示されたＭＰＢをＰＥＴ−チオール（２ｋＤａのＭＷ）と反応させることによって、ＩＣＭＶをＰＥＧ化した。ＰＥＧ化はＩＣＭＶの直径を２７２±４０ｎｍへと増大させ、ＰＢＳ中で７日間保存された粒子は、元のサイズを維持していた（表２及び表示のない幾つかのデータ）。ＩＣＭＶは、賦形剤として３％ショ糖を添加した状態で、凍結乾燥に適合した。何故なら、凍結乾燥後に緩衝溶液中に再浮遊した粒子は、全体的な形態及びサイズの特徴を維持していたからである（表２）。
【０１６５】
リポソーム及びＰＬＧＡ粒子は、タンパク質を送達する小胞に広く使用されてきたので、これらの小胞に封入されたタンパク質をＩＣＭＶと比較した。図５に示すように、ＩＣＭＶは、従来のＰＥＧ化したステルスリポソーム及び脂質でコーティングしたＰＬＧＡ粒子と比較して優れたＯＶＡ封入効率（それぞれ１０８倍及び４倍の増加）を呈した。同様に粒子総質量当たりの封入ＯＶＡの量は、ＩＣＭＶ中でそれぞれ２１倍及び１０倍増加した。次に、合成の過程でＩＣＭＶに封入された様々なタンパク質の量を検査した（図４Ａ）。ＳＩＶ−ｇａｇ、ＦＬＴ−３リガンド、及び封入ＯＶＡの量は、音波処理したリポソームから、Ｍｇ２＋が媒介した融合により形成されたＭＬＶ、Ｍｇ２＋及びＤＴＴによって形成されたＩＣＭＶへと漸進的に増加する。特に、最初に装填されたＯＶＡの７０％を超える量が、脂質１ｍｇ当たり４０７．５±１８．７μｇのＯＶＡで、ＩＣＭＶに封入された。ＯＶＡをモデルタンパク質と使用して、これらの小胞から放出されるカーゴを比較した（図６）。ＯＶＡはＩＣＭＶからは低速で連続的に放出され、血清を含む媒質中のリポソーム及びＭＬＶからはバースト放出された。
【０１６６】
モデルワクチン抗原としてＯＶＡを使用して、ワクチン送達のプラットフォームとしてのＩＣＭＶを検査した。ＩＣＭＶにＯＶＡ及びトール様受容体アゴニスト、ＭＰＬＡ（ＴＬＲ４リガンド）及び／又はレジキモド（ＴＬＲ７／８リガンド）を装填した。in vitroでＯＶＡを装填したＩＣＭＶで培養した樹状細胞（ＤＣ）は粒子を貪食した。ＯＶＡ装填ＩＣＭＶのみではin vitroでＤＣが活性化しなかったが、ＴＬＲアゴニスト（ＴＬＲａ）を担持する粒子は共刺激分子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＭＨＣ  ＩＩ）の上方制御、及びin vitroでのＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０の分泌を刺激し、ＴＬＲ４及びＴＬＲ７アゴニストの両方を担持する粒子がＤＣの相乗活性化を促進した（図８）。
【０１６７】
ワクチン接種のためにＯＶＡとの組合せでＴＬＲａを同時送達する粒子の効力をin vivoで試験するために、ＯＶＡ装填ＩＣＭＶでＣ５７Ｂ１／６マウスに免疫処置し、同等の用量の可溶性ＯＶＡと比較した。興味深いことに、ＯＶＡの大量瞬時投与と比較して、ＯＶＡ装填ＩＣＭＶは抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張を１７倍増大させ、追加投与後に全ＣＤ８＋Ｔ細胞中で約７％に到達した（図１０）。これらのＯＶＡ装填粒子は、機能が匹敵するインタフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を生成するＯＶＡ特異的Ｔ細胞の最高頻度も誘発する。しかし、ＯＶＡに対する抗体応答は、最大タイタのためにＴＬＲａの存在を必要とし、ＯＶＡを装填してＴＬＲ４及びＴＬＲ７アゴニストと同時封入したＩＣＭＶは、同じ用量の可溶性ＯＶＡ／ＴＬＲａと比較して１０倍高い抗ＯＶＡ抗体のタイタを誘発したことは注目に値する（図１０Ｂ）。
【０１６８】
臨床関連の病原体からの抗原に対してＩＣＭＶが誘発することができる免疫応答の理解の手始めとして、感染因子からの抗原での免疫処置を試験した。抗原が封入され、その二重層内にＭＰＬＡも取り込まれた様々な用量のＩＣＭＶを使用して、マウスを免疫処置した。初期及び追加療法の後、３４日目から血清中で検出すると、抗原に対して強力な抗体タイタが生成され、可溶性抗原及びＭＰＬＡによって送達された同等用量によって誘発された抗体タイタははるかに弱かった（データは表示せず）。これらの結果は、ＩＣＭＶが免疫処置のための抗原送達の効果的な小胞であることを示唆している。
【０１６９】
本研究では、魅力的な特徴を呈する新規の多層状脂質粒子を開発した。すなわち、有機溶媒を使用せずに、ＩＣＭＶ中のタンパク質封入が大幅に向上する。これらの粒子は、コロイドの安定性を呈し、脂質系粒子は十分に生分解性である。ワクチン送達のプラットフォームとしてのＩＣＭＶの融通性が実証された。これらの研究は、ＩＣＭＶが様々なin vivoの薬剤送達用途に広く有用であるに違いないことを示唆している。
【０１７０】
実施例２
以下の実施例は、実施例１で説明した実験及び結果の幾つかをさらに包括的に説明し、報告する。
【０１７１】
現在認可されているワクチンアジュバント（例えば水酸化アルミニウム及び水中油型乳剤ＭＦ５９）は、細胞免疫を刺激説に、主に体液性免疫応答を誘発することによって免疫を促進する1,2。ＨＩＶ、マラリア、及びＣ型肝炎などの細胞内病原体又は癌に対するワクチンには、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８Ｔ）応答が必要になることがあるので、協奏的体液及び細胞免疫応答を促進する技術に対する関心が高い3,4。そのために、複製組み換えウイルスなどの工学した生ワクチンベクターが開発されており5−7、これはネズミのモデルで機能性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の堅調な抗体応答及び大膨張を誘発することができる。しかし、生ベクター及び抗ベクター免疫に対する安全性の懸念が、生ベクターワクチンの設計を複雑化することがある7。既存のベクター特異的免疫応答は、臨床検査で生ベクター系ワクチンの免疫原生を低下させており8、初期免疫処置後に生ベクターに対する免疫応答が上昇するので、同じベクターを使用した追加免疫処置に問題を生じることがある7。
【０１７２】
対照的に、規定された抗原を送達する非生体の合成ワクチンは、抗ベクター免疫性を回避するために合理的に設計することができる9。このような「サブユニット」ワクチンは、標的病原体の構造に通常存在し、選択された１つ又は幾つかの組み換え型タンパク質又は多糖類から構成される。しかし、サブユニットワクチンは、交差提示（クラスＩのＭＨＣ分子上で未処理のＣＤ８＋Ｔ細胞に対して提示するための免疫細胞による細胞外抗原の摂取及び処理）の効率が低いので、誘発されるＣＤ８Ｔ応答が少ない、又はない10。交差提示を促進するために、タンパク質抗原を装填した合成粒子及び規定された免疫促進分子を使用し11-17、還元主義者の方法で、病原体により感染中に免疫系に提供されるキューを模倣した。リポソームは、毒性及び免疫原生が低く、臨床用で安全性の実績があり、調製が容易で、商業規模での製造しやすさが実証されているので18,19、この用途には特に魅力的な材料である。単層、多層、又は重合小胞の形態の脂質小胞が、ワクチン送達材料として試験されており、多少の成功を収めている19-23。脂質小胞中に取り込まれた抗原がin vivoで交差提示され19,24,25、リポソームタンパク質ワクチンが小動物のモデルで保護Ｔ細胞媒介の抗菌性及び抗腫瘍性免疫応答を誘発することが示されている23,26,27。しかし、ＨＩＶ及び癌などの疾患では、ウイルス／腫瘍を抑制するために（体液性免疫と協調した）極めて強力なＴ細胞性応答が必要であると現在考えられており、したがってさらに強力なＴ細胞ワクチンが未だに探求されている3,4。
【０１７３】
ワクチン送達における脂質小胞の効力に影響する潜在的要因は、血清成分の存在下で安定性が限定される。高温で処理するか、予備成形した小胞膜を通した拡散によって装填することができるリポソームカーゴの場合、特にコレステロール及び／又はＰＥＧ化と組み合わせた場合、高Ｔm脂質を使用することによって小胞の安定性を向上させることができる28。単層及び多層小胞は、二重層の表面で反応性頭部を重合するか29、リン脂質アシル尾部の反応基を重合するか20,29、膜の疎水性内部に吸着した疎水性モノマを重合すること30によっても安定化されている。これらの各アプローチに共通しているのは、二重層の面で成分を重合するという概念である。しかし、ワクチン抗原に適合する穏やかな状態で実行することができる重合の化学作用を発見することは難問である20。
【０１７４】
ここで、新種の脂質薬物キャリアについて説明する。すなわち、小胞壁内で密に積み重ねられた隣接二重層の並置面にわたって脂質頭部を結合する短い共有架橋で、多層状小胞を安定化させることによって形成される二層間架橋多層状小胞（ＩＣＭＶ）である。ＩＣＭＶは高レベルのタンパク質を封入して、確実に保持し、同じ脂質組成の単純なリポソーム又は多層状小胞（ＭＬＶ）と比較すると、血清に（３０日間）曝露した場合、非常に低速で取り込んでいたカーゴを放出した。しかし、これらの小胞は、細胞内の区画内に通常高レベルで見られるリポソームの存在下で急速に劣化した31。この新規の小胞構造を使用し、高レベルのモデルタンパク質抗原（オバルブミン、ＯＶＡ）及び脂質様免疫刺激リガンド（モノホスホリル脂質Ａ、ＭＰＬＡ）を同時に取り込んで、マウスで免疫処置研究を実施し、ＩＣＭＶは強健な抗体タイタを、単純なリポソームの約１０００倍、及び同一の脂質組成のＭＬＶの約１０倍多く誘発することを発見した。ベクター未経験の個体に投与される単回投与にのみ有効であることが多い生ベクターとは異なり7、これらの合成小胞は、繰り返し投与した後に体液性及びＣＤ８＋Ｔ細胞性応答の着実な増加を引き起こし、抗原特異性Ｔ細胞は、初回及び２回の追加免疫処置の後、血中の総ＣＤ８＋Ｔ細胞のほぼ３０％というピークまで膨張した。したがってこれらの新しい材料は、体液性免疫及び細胞免疫の両方を生成するために安全かつ非常に効果的であるサブユニットワクチンへの扉を開く。
【０１７５】
材料及び方法
ＩＣＭＶの合成。クロロホルム中の１．２６μモルの脂質（典型的な脂質組成：ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）：ＤＯＰＧ（１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロールｌ））：ＭＰＢ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド）＝４：１：５モル比、全脂質はAvanti Polar Lipids（アラバマ州アラバスタ）による）をガラスのバイアルに計量分配し、真空中で有機溶媒を一晩蒸発させ、乾燥した脂質薄膜を調製した。脂質被膜は、カーゴタンパク質とともにｐＨ７．０で１０ｍＭのビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）内で１時間、１０分毎に厳密に渦形成して再水和し、次に氷上にて３０分間隔で５分間、６ワットと３ワットの交互の電力サイクルで音波処理した（Misonix Microson XLプローブチップ超音波処理器、Farmingdale、ニューヨーク）。この第一ステップで形成されたリポソームは、最終濃度が１０ｍＭのＭｇ２＋及びＣａ２＋などの二価陽イオンを添加することによって融合を誘導した。その結果のＭＬＶを、１．５ｍＭのＤＴＴ（マレイミド：ＤＴＴのモル比が２：１）で１時間、３７℃で培養し、マレイミド機能化脂質の対抗する二重層を結合させて架橋ＩＣＭＶを形成し、その結果の小胞を１４，０００×ｇで４分間遠心分離し、脱イオン水で２回洗浄して回収した。ＰＥＧ化のために粒子を、マレイミド基に対してＰＥＧ−ＳＨが１．５倍余計にある２ｋＤａのＰＥＧ−チオール（Laysan Bio、アラバマ州Arab）で１時間、３７℃で培養した。その結果の粒子を遠心分離し、脱イオン水で３回洗浄した。最終生成物は、ＰＢＳ中で４℃で保存するか、凍結防止剤として３％のショ糖が存在する状態で凍結乾燥し、−２０℃で保存した。幾つかの検定では、Optima超遠心分離機（Beckman Coulter）を使用して６時間、１１５ｋｇで超遠心分離して架橋する前に、単純なリポソーム又はＭｇ融合ＭＬＶを収穫した。
【０１７６】
in vitroのタンパク質装填及び薬物放出。封入研究では、取り込んだタンパク質の量を直接的に蛍光定量するために、オバルブミン（OVA、Worthington、ニュージャージー州レークウッド）、ＳＩＶ−ｇａｇ（Advanced Bioscience Laboratories、メリーランド州ケンジントン）、及びＦＬＴ−３Ｌ（Peprotech、ニュージャージー州ロッキーヒル）をアレキサフルオル５５５（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）でラベリングした。ＯＶＡも、上述したようにＤＲＶ及びＰＬＧＡナノ粒子に封入した43,44。幾つかの実験では、ＩＣＭＶに無関連の抗原コントロール49（Walter Reed Army Institute of ResearchのDr. Anjali Yadavaにより提供）として組み換え型の三日熱タンパク質（ＶＭＰ）を装填した。１ｍｇのＯＶＡを１．５ｍＭのＴＣＥＰで１時間、室温で培養し、その後に１．５ｍＭのエチルマレイミド（Pierce、イリノイ州ロックフォード）で１時間、３７℃で培養することによって、キャップ構造のチオールＯＶＡを調製した。チオール保護の程度は、エルマン検定50で評価して＞９５％であった。アレキサフルオル５５５でラベリングしたＯＶＡの脂質小胞からの放出は、１００ｋＤａのＭＷ分画の透析膜を使用して、３７℃の１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ媒質中で定量化した。蛍光を定量化するために、一定間隔で放出媒質を取り出し、薬物放出のモニタを継続するために等量の新鮮な媒質と交換した。時間経過の最後に残った残留ＯＶＡは、１％のTriton X-100処理した小胞の脂質抽出で解明し、蛍光分光法で放出したタンパク質を測定した。５００ｎｍ／ｍｌのホスホリパーゼＡ（Sigma、ミズーリ州セントルイス）を補給したハンクス緩衝塩水で、ＯＶＡ放出検定も実施した。封入されたカーゴ分子の安定性を検査するために、ＩＣＭＶに封入された単クローンラットのＩｇＧを、１％のTriton X-100処理で回収し、銀染色した非還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Pierce）。
【０１７７】
ＩＣＭＶでのワクチン接種研究。Ｃ５７ＢＩ／６マウスの群（Jackson Laboratories）の尾に指示された用量の（ＴＬＲアゴニストＭＰＬＡがある、又はない）ＯＶＡを皮下注射して免疫処置した。免疫処置によって誘発されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及びその表現型の頻度は、（生／死細胞を区別するための）ＤＡＰＩ、抗ＣＤ８アルファ、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６２Ｌ、及びＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ−２ＫbペプチドＭＨＣ四量体（Becton Dickinson）で染色した後、選択された時点でＰＢＭＣのフローサイメトリ分析によって解明した。感作されたＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を評価するために、ＰＢＭＣを１μＭのＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ及びGolgiPlug（Becton Dickinson）で６時間、生体外刺激し、固定して、透過化処理し、抗ＩＦＮガンマ及びＣＤ８アルファで染色して、フローサイメトリで分析した。４５０ｎｍのＯＤ値が０．５である血清の希釈剤と定義された抗ＯＶＡのＩｇＧタイタを、免疫処置したマウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析で解明した。動物は、米国国立衛生研究所、州、及び地方のガイドラインに従って世話をした。
【０１７８】
統計分析。統計分析はJmp 5.1（SAS Institute Inc.、ノースカロライナ州ケアリ）で実施した。データセットは、分散の一方向又は双方向分析（ANOVA）を使用し、その後に多重比較のためにTukeyのＨＳＤ試験で分析した。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意と見なされた。値はすべて平均値±標準誤差で報告されている。
【０１７９】
結果
予備成形されたＭＬＶ内の隣接する並置二重層の機能化脂質頭部の間に共有架橋を導入して、ＩＣＭＶを形成した（図２Ａ）。典型的な分析では、ＤＯＰＣ、陰イオンＤＯＰＧ、及び陰イオンマレイミド頭部脂質ＭＰＢを４：１：５のモル比で含有する乾燥リン脂質被膜を水和して音波処理し、単純リポソームを形成した（ステップ（ｉ））。二価陽イオン（例えばＭｇ２＋）をリポソームに添加して、以前に報告32されているように小胞の融合及びＭＬＶの形成を誘導した（ステップ（ｉｉ））。ＭＬＶ中で隣接する二重層間に架橋を導入するために、次にジチオールトレイトール（ＤＴＴ）を小胞懸濁液に添加して、膜透過性架橋剤として作用し、小胞の層間に形成された陽イオン塩橋によって近接した並置膜のマレイミド頭部間に共有結合を形成した（ステップ（ｉｉｉ））。ＰＥＧ化は、脂質小胞の血清安定性及び血液循環半減期を上げるために周知の方略である18。したがって最終ステップとして、小胞を洗浄し、粒子の外面に露出した残留マレイミド基にチオール末端ＰＥＧでキャップをした（ステップ（ｉｖ））。
【０１８０】
粒子の直径／多分散性は、これらの粒子を内部移行できる細胞タイプを決定し33、小胞壁を含む二重層の数は、小胞の安定性、及び血清の存在下でカーゴを保持／徐放する能力に影響すると予想される。これらの特性を評価し、ＩＣＭＶの形成プロセスをよりよく理解するために、合成の各ステップで生成物を特徴付けた。音波処理（ステップ（ｉ））によって形成された初期のリポソームは、約１９０ｎｍの流体力学的径を有し、サイズは、Ｍｇ２＋が媒介した小胞融合（ステップ（ｉｉ））、及びその後の二重層のＤＴＴ「ステープリング」（ステップ（ｉｉｉ））の後、約２４０ｎｍまで増加した（表２）。その結果のＩＣＭＶは、（一般的な脂質小胞又はポリマーナノ粒子の薬剤12,21と比較して）単一モードで比較的狭いサイズ分布を示し、架橋ステップ中に動的光散乱法（ＤＬＳ）又は低温電子顕微鏡検査法で粒子のバルク凝集の証拠はなかった（図２Ａ、図２Ｂ及び表２）。チオール末端ＰＥＧをＤＴＴで処理した小胞に添加すると、ＭＬＶの表面上に残っていた検出可能なマレイミド基が反応停止し、粒子の径を大幅に変化させずに、ＩＣＭＶの約２ｍｏｌ％の表面露出脂質上にＰＥＧ鎖を導入した（表２及び表示のないデータ）。４℃で、又はＰＢＳ中で３７℃で保存したＰＥＧ化ＩＣＭＶは、７日間安定したままであり、賦活剤として添加された３％ショ糖での凍結乾燥に適していたが34、このことは、長期保存状態への適合性を協調した（表２及び表示のないデータ）。最初のリポソーム、Ｍｇ２＋融合ＭＬＶ、及び最終的なＩＣＭＶを低温電子顕微鏡検査で撮像すると（図２Ａ）、ＤＴＴで架橋すると、密に積み重なって、約４〜５ｎｍの高電子密度条痕として解像された二重層から構成される厚い多層状壁を有する小胞の形成につながることが判明した。粒子当たりの二重層の中央値は４．４（四分位数間範囲［ＩＱＲ］３．３〜６．９）であり、粒子半径中央値と脂質壁の厚さとの比率は３．８（ＩＱＲ、２．４〜６．８）であった（図２Ｃ、図２Ｄ）。興味深いことに、ＩＣＭＶの大部分は同心状の二重層から構成される小胞壁を有していたが、不完全な脂質外層の形態で表面欠陥があるＩＣＭＶのわずかな例も見られた（データは表示せず）。陽イオンで媒介した融合及びＤＴＴ架橋の後に電子顕微鏡での撮像で観察された小胞の層状性増大と矛盾せず、小胞の外面に露出した脂質の画分は、バルク染料反応停止層状性検定35で測定し、合成のステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で減少した（表２）。ＤＴＴ処理後にマレイミド脂質間が架橋された化学的証拠は、ＩＣＭＶの薄層クロマトグラフィ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定で判明した（データは表示せず）。重要なことは、粒子サイズと個々の層状性分布が両方とも単モードであり、粒子の機能的特性（例えばタンパク質の放出）を歪曲するような汚染性の単層小胞は３％未満で、大きい凝集はなかったことである。ＩＣＭＶは、単核細胞及び樹状細胞によって貪食されるに違いないサイズ36、及び従来の単層又は多層状リポソームと比較してタンパク質の取り込みを安定化させる架橋多層状壁構造を有している。
【０１８１】
安定した小胞を形成するために必要な条件の分析により、ＩＣＭＶ形成のメカニズムに対する見通しが得られた。二層間架橋の後、ＩＣＭＶは１４，０００×ｇで４分間の遠心分離（「低速条件」）で収集することができたが、同等の脂質成分の単純リポソーム又はＭＬＶは、ペレット化のために超遠心分離が必要であった。架橋した小胞の収量の代理測定として低速遠心分離によって収集した粒子の質量を使用すると、ＩＣＭＶの形成には二価陽イオンで媒介した融合（Ｍｇ２＋又はＣａ２＋の図２Ａのステップ（ｉｉ））及びＤＴＴ処理（ステップ（ｉｉｉ））の両方が必要であることが判明した（表１Ａ、表１Ｂ）。Ｍｇ２＋又はＤＴＴのみで処理した先駆物質小胞は、マレイミド基に対して分子が１０倍余分でも、有意な収量の粒子を生成しなかった（表１Ａ、表１Ｂ）。また、ＩＣＭＶの形成には少なくとも２５ｍｏｌ％のＭＰＢが必要であり（表１Ａ、表１Ｂ）、ＩＣＭＶの有意な収量のために必要な高レベルの反応性頭部は、二層内（同じ二重層の頭部間）の架橋形成と二層間架橋形成との競合を反映することがある。ＤＴＴは、使用した条件では、別の膜透過性ジチオールであるＤＰＤＰＢで置換することができたが、２ｋＤａのＰＥＧ−ジチオールでは置換できなかった。ＩＣＭＶは、ＤＯＰＣ及びＭＰＢ脂質のみを使用して、又はＤＯＰＧの代わりに陽イオンＤＯＴＡＰを使用して形成することもできた（データは表示せず）。ＩＣＭＶを形成する代替方法として、マレイミド−ジチオールの架橋を生体直交型クリックケミストリに交換することができ、小胞形成のためにアルキン末端脂質を、架橋のためにジアジドを採用した37,38（図１２及び表示のないデータ）。したがって、安定化した小胞を形成するための二層間架橋は、他の脂質／架橋剤のケミストリにも適合可能な一般的方略である。高い合成安定性及びコロイドの安定性に基づき、タンパク質／ワクチン送達小胞として、さらなる試験のために４：１：５のモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＢの脂質組成を有するＰＥＧ化したＩＣＭＶに焦点を絞ることにした。
【０１８２】
タンパク質送達のためのＩＣＭＶの安定性を試験するために、幾つかの球状タンパク質、すなわち、ＳＩＶ−ｇａｇ、ＨＩＶワクチン抗体、ＦＬＴ−３Ｌ、治療用サイトカイン、及びモデルワクチン抗原であるオバルブミン（ＯＶＡ）の取り込みを検査した。タンパク質封入は、合成のステップ（ｉ）のタンパク質溶液で、乾燥した脂質を再水和することによって達成された（図２Ａ）。封入タンパク質の量は、ＩＣＭＶ調製の各ステップで増加し（図４Ａ）、このことはステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｉｉ）の両方で小胞融合として生じる追加のタンパク質取り込みを反映していることがある。ＩＣＭＶへのタンパク質取り込みは、カーゴタンパク質上のチオールがマレイミド機能化脂質小胞と結合することによって媒介されなかった。何故なら、タンパク質上の全チオール基をブロックするためにＴＣＥＰで事前還元され、エチル−マレイミドで処理されたＯＶＡが、変性していないタンパク質と同様のレベルでＩＣＭＶに封入されているからである（キャップをしたチオールＯＶＡ対未変性ＯＶＡでは７６．１±６．３％対８３．３±８．４％；ｐ＝０．１７）。モデルタンパク質カーゴ中の二硫化物結合は、小胞形成プロセス中にＤＴＴ架橋剤によって減少せず、ＩＣＭＶの封入はタンパク質凝集を引き起こさないことも確認された（データは表示せず）。ＩＣＭＶによって達成されたタンパク質装填の効率及び品質を、薬物送達小胞の最も一般的なタイプのうち２つと直接比較するために39-41、リポソーム、ＰＬＧＡナノ粒子、及びＩＣＭＶ内のＯＶＡの封入を比較した。すなわち、ホスホコリン、ＰＥＧ脂質、及びコレステロールで構成された安定した脂質組成のモデルを使用して42、リポソームの最も効率的な水性取り込みアプローチの１つとしてＤＲＶを形成し43、二重乳化溶媒蒸発プロセスを使用してＯＶＡを装填したＰＬＧＡ粒子を調製した44。ＩＣＭＶは、ＤＲＶ又はＰＬＧＡと比較して、優れた封入効率（約７５％）を停止（それぞれ２倍及び４倍の増加；図４Ｂ）、粒子の総質量当たりの封入ＯＶＡの量（粒子１ｍｇ当たり約３２５μｇのＯＶＡ）は、ＤＲＶ又はＰＬＧＡ粒子と比較して、ＩＣＭＶはそれぞれ１．８倍及び９倍の増加であった（図４Ｃ）。したがって、ＩＣＭＶは様々な球状タンパク質を封入するのに効果的であり、少なくともモデル抗原ＯＶＡの場合、ＩＣＭＶを装填したタンパク質は一般的な代替タンパク質キャリアより効率的であるように見えた。
【０１８３】
次に、血清の存在下でタンパク質貯留が増加する間に、二層間架橋によって脂質小胞の生分解性の保持が可能になったかを解明した。脂質組成がすべて同じであるＰＥＧ化リポソーム、Ｍｇ２＋融合ＭＬＶ、又はＩＣＭＶにＯＶＡを装填し、１０％のウシ胎児血清を含有する媒体中で３７℃にてタンパク質放出の動態を定量化した。単層状リポソームは、取り込んだＯＶＡの全ペイロードを約２日以内に素早く放出したが、多層状Ｍｇ２＋融合ＭＬＶは、同じ期間に取り込んだカーゴの約５０％を放出した（図４Ｄ）。しかし、ＩＣＭＶは大幅に向上したタンパク質の貯留を示し、１週間でカーゴのわずか約２５％しか放出せず、３０日後には約９０％であった（図４Ｄ）。注目に値するのは、ＩＣＭＶが、コレステロールを含むことによって安定化した単層リポソームより、タンパク質の放出も非常に遅かったことである（図４Ｄ）。架橋小胞は、ＰＢＳ中で４℃にて３０日間保存された場合、取り込んだタンパク質の約９５％も貯留していた（図４Ｅ）。細胞内区画をモデル化した状態でも、ＩＣＭＶからのタンパク質放出を検査し、還元又は酸性条件で３７℃にて１日間培養された小胞は、取り込んだＯＶＡの＞９５％を保持していたが、ホスホリパーゼＡでの培養では、ＯＶＡの＞９０％が放出され、小胞が急速に劣化した（図４Ｅ）。したがって、ＩＣＭＶは血清の存在下で従来のリポソーム製剤よりも高い安定性を呈したが、細胞内リポソーム内区画の中に存在する構造の存在下で急速に分解し31、細胞による内部移行後にカーゴの細胞内放出を引き起こすメカニズムを提供した。細胞による内部移行の前に、in vivoで投与すると小胞内で多少のタンパク質分解が生じ得るが、このような分解プロセスが最小であるべきワクチン送達での免疫処置から最初の数日で45、抗原の重大な摂取及び処理が生じる。
【０１８４】
ＩＣＭＶの独特の構造は、封入されたタンパク質抗原を細胞外環境に効率的に貯留するが、エンドソーム内／リソソーム内では急速に放出し、ワクチン応答を向上させることになるとの仮説をたてた。ワクチンＩＣＭＶを生成するために、モデル抗原ＯＶＡを搬送する小胞（ＯＶＡ−ＩＣＭＶ）を調製し、これらの小胞を分子アジュバントモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）と混合した。ＭＰＬＡは、樹状細胞、Ｂ細胞、及び先天性免疫細胞によって発現し、ワクチン応答を増幅させる可能性があるトール様受容体（ＴＬＲ）４のＦＤＡ認可のアゴニストである1,46。抗原を装填してＭＰＬＡと混合したＩＣＭＶは、ＭＰＬＡがないＩＣＭＶを適用した樹状細胞（ＤＣ）と比較して、in vitroで脾臓及び骨髄ＤＣ上の共刺激分子の上方制御を促進した（図７Ａ及び表示のないデータ）。ＩＣＭＶを適用したＤＣはＯＶＡから誘導されたペプチドを交差提示し、その効率は、ＭＨＣクラスＩＨ−２Ｋb分子で錯化したＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＯＶＡ２５７−２６４）を認識する２５−Ｄ１．１６ｍＡｂでＤＣを染色することによって解明した状態で、（添加ＭＰＬＡがある、又はない）可溶性ＯＶＡを適用したものと比較して非常に向上している（ｐ＜０．００１、無関係の抗原［三日熱タンパク質、ＶＭＰ］を装填した可溶性ＯＶＡ又はＩＣＭＶと比較、図７Ｂ）。ＯＶＡ−ＩＣＭＶ＋ＭＰＬＡで培養した脾臓ＤＣは、カルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）希釈検定で評価して、in vitroでＯＶＡ特異的な未処理のＯＴ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞の堅調な増殖を引き起こした。対照的に、ＤＣに同等の用量の可溶性ＯＶＡ及びＭＰＬＡ、空のＩＣＭＶ、又はＶＭＰ−ＩＣＭＶを適用した場合は、弱いＴ細胞性応答が検出され、これはＩＣＭＶによって誘発されたＴ細胞性応答の特異性を示す（図７Ｃ）。これらの結果は、ＭＰＬＡを添加すると、ＩＣＭＶ又は可溶性ＯＶＡによる同等のＤＣ活性が可能になるが、粒子状抗原の送達で予想されるように、ＩＣＭＶは抗原の交差提示の増大を引き起こすことを示唆する。
【０１８５】
小胞構造がin vivoの免疫応答に対する小胞構造の影響を解明するために、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、ＰＥＧ化した単層リポソーム、ＭＬＶ、又はＩＣＭＶの形態で等価用量のＯＶＡ、ＭＰＬＡ、及び脂質（それぞれ１０μｇ、０．１μｇ、及び１４２μｇ）をワクチン接種した。免疫処置の７日後に、フローサイメトリで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＯＶＡペプチド−ＭＨＣ四量体＋（抗原特異的）ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を分析することによって、内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞性応答の強度を評価し、可溶性ＯＶＡ＜リポソーム＜Ｍｇ２＋融合ＭＬＶ＜ＩＣＭＶの順序でＴ細胞性応答が増大する傾向があることが判明した（図９Ａ）。免疫処置後３週間で、Ｍｇ２＋融合ＭＬＶは、可溶性ＯＶＡ又は単層リポソームと比較して、動物の血清中に約１００倍多いＯＶＡ特異的ＩｇＧタイタを誘発した。しかし、ＩＣＭＶの免疫処置により生じた体液性応答は非常に強力になり、可溶性ＯＶＡ（ｐ＜０．０１）及び非架橋ＭＬＶの免疫処置（ｐ＜０．０５）よりもそれぞれ約１００倍及び約１０倍強力である（図９Ｂ）。したがって、ＩＣＭＶの安定化した構造は、Ｔ細胞性応答と抗体応答の両方を促進した。他の製剤と比較して、ＩＣＭＶによる免疫処置に対するＴ細胞及び抗体応答の強化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原送達の改善、ＤＣの活性化増強、（in vitroで見られる）抗原交差提示の増強、又はこれらの要因の組合せに帰すことができた。これらの可能性を区別するために、可溶性、リポソーム、又はＩＣＭＶ製剤としてＭＰＬＡと混合した蛍光体結合ＯＶＡでマウスを免疫処置し、ＯＶＡを内在化した流入領域鼠径リンパ節細胞を２日目に評価した。ＩＣＭＶによって送達されるＯＶＡは、流入領域リンパ節（ｄＬＮ）中のＤＣ、マクロファージ、及び形質球様細胞（ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋）ＤＣの合計中に容易に検出されたが、可溶性及びリポソーム製剤は、背景上に蛍光をほとんど示さなかった（ｐ＜０．０１、図９Ｃ、図９Ｄ）。ラベリングしていないＯＶＡでこの分析を繰り返すと、ＯＶＡ−ＩＣＭＶをＭＰＬＡとともに投与した場合、可溶性又はリポソームＯＶＡ＋ＭＰＬＡと比較して、ｄＬＮ内のＤＣ中で共刺激マーカ及びＭＨＣ−ＩＩの発現にマイナな増強を引き起こすことが判明した（図９Ｅ及び表示のないデータ）。しかし、ＯＶＡペプチド提示を検出するために２５−Ｄ１．１６抗体を使用すると、ＩＣＭＶ免疫処置後にｄＬＮ内のＤＣ上にＯＶＡペプチド−ＭＨＣ錯体が容易に検出されたが、可溶性ＯＶＡ又はリポソームＯＶＡを注入しても、２５−Ｄ１．１６と自己ペプチドＭＨＣ錯体とで予想される背景交差反応性47よりも強力な染色はなかった（図９Ｆ）。全体として、これらの結果は、ＩＣＭＶの架橋多層状構造内に取り込まれた抗原の貯留が改善されると、ＡＰＣへの抗原送達が向上し、その後に交差提示が向上することを示唆する。
【０１８６】
ＩＣＭＶの多層状構造により、（水性核内の）タンパク質抗原ばかりでなく（小胞壁内の）親油性分子も封鎖する機会が与えられる。したがって、ＩＣＭＶの壁全体にＭＰＬＡを埋め込むと、小胞内の抗原とともにＭＰＬＡの貯留を改良することにより、in vivoの免疫応答に影響するか否かを試験した。ＴＬＲアゴニストは、合成の第一ステップでＭＰＬＡを他の脂質と同時溶解することにより（ｉｎｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶ）、小胞層全体に組み込まれており、挿入後のアプローチ（ｅｘｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶ）により、小胞表面のみに組み込まれた同量のＭＰＬＡを担持するＩＣＭＶとこれらの小胞を比較した（図１１Ａ及び表示のないデータ）。マウスは、ＩＣＭＶ中の、又は可溶性形態のＯＶＡ（１０μｇ）及びＭＰＬＡ（０．１μｇ又は１．０μｇ）を皮下注射して免疫処置し、２１日目及び３５日目に同じ製剤で追加処置した。図１１Ｂに示すように、低用量のＭＰＬＡを使用して免疫処置すると、２回の追加処置後でも可溶性ＯＶＡに対する抗体応答はほとんど検出不可能であったが、int-MPLAとext-MPLAは両方とも５６日目には強力な抗ＯＶＡ血清ＩｇＧタイタを誘発した。可溶性ＯＶＡに対するＩｇＧ応答は、１０倍多いＭＰＬＡを使用して獲得することができたが、１．０μｇのＭＰＬＡを使用したｉｎｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶは、可溶性タンパク質より高いタイタを誘発した（５６日目に３倍）。他方で、これらの免疫処置研究を通して、ＩＣＭＶの脂質成分に対する有意なレベルの抗体は観察されなかった。
【０１８７】
ＩＣＭＶの多重層にＭＰＬＡを埋め込むと、ワクチン接種に対するＣＤ８＋Ｔ細胞性応答にさらに顕著な影響を与えた。０．１μｇのＭＰＬＡと混合した可溶性ＯＶＡが誘発する抗原特異的Ｔ細胞の膨張は、ＰＢＭＣの四量体染色によって評価して、ほとんど検出不可能であった。ｅｘｔ−Ｍｐｌａ  ＩＣＭＶ送達は、ｄ４１による四量体＋Ｔ細胞集団の２．５倍の増加につながった（図１１Ｃ、ｐ＜０．０５）。１０倍多くのＭＰＬＡを添加すると、可溶性ＯＶＡの免疫処置は、追加処置後にｅｘｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶと同等のＴ細胞性応答に最終的に到達することができた。対照的に、ｉｎｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶで免疫処置すると、劇的に強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞性応答を誘発し、これは追加処置ごとに膨張し続け、４１日目にはＣＤ８＋Ｔ細胞集団中の四量体＋Ｔ細胞が２８％のピークに到達した（ｅｘｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶの５倍（ｐ＜０．０５）、及び可溶性ＯＶＡ＋ＭＰＬＡの１４倍（ｐ＜０．０１）、図１１Ｃ）。注目に値するのは、病原体及び腫瘍に対する長期間の保護を提供することが知られている中枢記憶Ｔ細胞の表現型48である四量体＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞の頻度を、ｉｎｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶが全体的に有意に上昇させたことである（ｐ＜０．０１、図１１Ｄ）。int-MPLA ICMVによって誘発された抗原特異的Ｔ細胞は、最終追加処理後に１カ月後でも生き残り、ＣＤ８＋Ｔ細胞中に四量体＋Ｔ細胞が約１１％あった（それぞれｅｘｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶ及び可溶性ＯＶＡ＋ＭＰＬＡの３倍及び８倍、両方ともｐ＜０．０５、図１１Ｃ）。これらの免疫処置によって膨張したＴ細胞の機能性を試験するために、４９日目に生体外で再評価した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が末梢血からインタフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を生成する能力を評価した。ｉｎｔ−ＭＰＬＡ  ＩＣＭＶで免疫処置したマウスは、ext-MPLA ICMV又は可溶性ＯＶＡの免疫処置を受けたマウスよりもＩＦＮ−γコンピテントＴ細胞のレベルがはるかに高かった（ｐ＜０．０５、図１１Ｅ）。出願人の知る限りでは、抗原特異的Ｔ細胞の膨張程度、記憶細胞の残存、及びＩＦＮ−γ機能性に関して、これはタンパク質ワクチンに関してこれまで報告された最強の内因性Ｔ細胞性応答の１つであり、組み換え型ウイルスなどの強力な生ベクターに匹敵する5,6。注目に値するのは、これが「均質な」追加処置、同じ粒子製剤で繰り返した免疫処置、病原体による送達ベクター自身に対して生じる免疫応答により多くの生ベクターでは使用することができない方略により達成されることである。
【０１８８】
これらの研究は、架橋した多層状脂質小胞に基づくミクロン以下の粒子試薬の新しいクラスの合成を実証し、これは生物医学的用途にとって幾つかの魅力的な形体を組み合わせており、粒子の合成はタンパク質カーゴを有機溶媒に曝露させる必要がなく、粒子の脂質基剤によって代謝性副産物へと本質的に生分解性になり、リン脂質シェルによって親油性及び親水性カーゴ両方の分子捕捉が可能になり、タンパク質は粒子の質量当たり非常に高レベルで封入され、粒子からのタンパク質放出は非常に長期間にわたって持続させることができる。これらの結果は、ＩＣＭＶが生体高分子の送達に、及び特にワクチン適用にとって非常に効果的な媒体になり得ることを示唆する。合成粒子ワクチンを使用して、このような強力な複合Ｔ細胞及び抗体応答を達成できる能力により、感染症及び癌の状況でワクチン接種の新しい可能性をもたらすことができた。
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【０１８９】
同等物
本明細書では本発明の幾つかの実施形態について説明し、図示してきたが、本明細書で説明した機能を実行する、及び／又は結果及び／又は１つ又は複数の利点を獲得するために、当業者には様々な他の手段及び／又は構造が容易に構想され、このような変形及び／又は解像はそれぞれ、本明細書で説明する本発明の実施形態の範囲に入るものとする。さらに一般的には、本明細書で述べたすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成は例示の意味であり、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成は、本発明の教示が使用される特定の１つ又は複数の用途に依存することが、当業者には容易に認識される。当業者には、日常の実験の範囲内で、本明細書で述べた特定の本発明の実施形態に対して多くの同等物が認識されるか、それを確認することができる。したがって、上記の実施形態は例示としてのみ提示されており、特許請求の範囲及びその同等物の範囲内で、本発明の実施形態は特に説明及び特許請求の範囲にあるもの以外で実践できることを理解されたい。本開示にある本発明の実施形態は、本明細書で述べた個々の各形体、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を指向する。また、２つ以上のこのような形体、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組合せは、このような形体、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない限り、本開示にある本発明の範囲に含まれる。
【０１９０】
本明細書で定義し、使用したすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれた文書の定義、及び／又は定義された用語の通常の意味を規制すると理解されたい。
【０１９１】
本明細書で開示されたすべての参照文献、特許及び特許出願は、それぞれの言及先である主題が参照により組み込むものとし、それは場合によっては文書全体を包含することがある。
【０１９２】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞の「ある」は、明らかに矛盾して示されていない限り、「少なくとも１つ」の意味であると理解されたい。
【０１９３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する「及び／又は」という語句は、このように結合される要素、すなわち、幾つかのケースでは接続的に提示され、他のケースでは離接的に提示される要素の「いずれか又は両方」という意味であることを理解されたい。「及び／又は」とともに列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ又は複数」であると想定されたい。他の要素は、「及び／又は」という語句によって特に識別された要素以外に、特に識別されたこれらの要素に関係あるか、無関係であるかに関わらず、任意選択で提示することができる。したがって、非制限的な例として、「Ａ及び／又はＢ」と言う場合、「含む」などの開放型の言語と結合して使用されると、１つの実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指すことができる。
【０１９４】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する「又は」は、以上で定義したような「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「又は」又は「及び／又は」は包括的であると解釈されたい。すなわち、幾つかの要素又は要素のリストのうち少なくとも１つを含むが、複数も、さらに任意選択でリストにない追加の品目も含む。対照的に、「のうち１つのみで」又は「のまさに１つで」などの明瞭に指示される用語のみ、又は特許請求の範囲で使用された場合に「からなる」は、幾つかの要素又は要素のリストのうちまさに１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用する「又は」という用語は、「いずれか」、「のうち１つ」、「の１つのみ」、又は「のまさに１つ」などの排他性の用語で提示される場合、排他的代替物（すなわち、「一方又は他方であるが、両方ではない」）を示すと解釈されたい。「基本的に〜からなる」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野で使用されている通常の意味を有するものとする。
【０１９５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用され、１つ又は複数の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストにある任意の１つ又は複数の要素から選択された少なくとも１つを意味するが、リスト内に特に列挙された各要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストにある要素の任意の組合せを排除しないことを理解されたい。この定義により、「少なくとも１つ」という語句が言及する要素のリストで特に識別された要素以外に、特に識別されたこれらの要素に関係しても、無関係でも、要素を任意選択で提示可能にすることができる。したがって非限定的な例として、「Ａ及びＢのうち少なくとも１つ」（又は同等に「Ａ又はＢのうち少なくとも１つ、又は同等に「Ａ及び／又はＢのうち少なくとも１つ」」）は、１つの実施形態では少なくとも１つ、任意選択でＢがない状態で複数、Ａなど（及び任意選択でＢ以外の要素など）を、別の実施形態では少なくとも１つ、任意選択でＡがない状態で複数、Ｂ（及び任意選択でＡ以外の要素など）を、さらに別の実施形態では少なくとも１つ、任意選択で複数、Ａ、及び少なくとも１つ、任意選択で複数、Ｂなど（及び任意選択で他の要素など）等々を指すことができる。
【０１９６】
矛盾することが明示されていない限り、特許請求の範囲にあり複数のステップ又は行為を含む方法のいずれでも、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が言及されている順序に必ずしも限定されないことを理解されたい。
【０１９７】
特許請求の範囲、さらに上記の明細書でも、「含む」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「構成される」などの前後を接続する語句は、開放型である、すなわち、含むが限定されないという意味であることを理解されたい。「からなる」及び「基本的に〜からなる」という前後を接続する語句のみが、米国特許商標庁の特許審査手続便覧（ＭＰＥＰ）のセクション２１１１．０３で規定されているように、それぞれ閉鎖型又は半閉鎖型の前後を接続する語句である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月5日(2012.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重層間に共有結合による架橋を有する多層状脂質小胞。
【請求項２】
前記小胞は、機能化脂質を含む、請求項１に記載の多層状脂質小胞。
【請求項３】
前記小胞は、ホスホコリンを含む、請求項１又は２に記載の多層状脂質小胞。
【請求項４】
前記小胞は、ホスホグリセロールを含む、請求項１、２又は３に記載の多層状脂質小胞。
【請求項５】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項２、３又は４に記載の多層状脂質小胞。
【請求項６】
前記小胞は、作用物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項７】
前記作用物質は、予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項８】
前記作用物質は、抗原である、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項９】
前記作用物質は、アジュバントである、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１０】
前記作用物質は、タンパク質である、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１１】
前記作用物質は、前記小胞内に封入されている、請求項６に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１２】
前記作用物質は、前記脂質二重層間に封入されている、請求項６又は１１に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１３】
前記小胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１４】
前記小胞は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１５】
前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項１４に記載の多層状脂質小胞。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記多層状脂質小胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記多層状脂質小胞及び凍結乾燥に適した賦活剤を含む組成物。
【請求項１８】
前記凍結乾燥に適した賦活剤は、ショ糖を含む、請求項１７に記載の前記多層状脂質小胞を含む組成物。
【請求項１９】
機能化脂質を含むリポソームを二価陽イオンに接触させて融合リポソームを形成することと、
前記融合リポソームを架橋剤に接触させて、脂質二重層間に共有結合による架橋を有する多層状脂質小胞を形成することと、
を含む方法。
【請求項２０】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソームは、ホスホコリンを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポソームは、ホスホグリセロールを含む、請求項１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リポソームは、マレイミド機能化脂質、ホスホコリン及びホスホグリセロールを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記機能化脂質は、機能化ホスホエタノールアミンである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記架橋剤は、ジチオール架橋剤である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記架橋剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
脂質二重層間に共有結合による架橋を有する前記多層状脂質小胞の表面に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記二価陽イオンは、Ｃａ２＋である、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記二価陽イオンは、Ｍｇ２＋である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触することは、水性緩衝液中で実行される、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記リポソームは、作用物質を含む、請求項１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記作用物質は、予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記リポソームは、４０：１０：５０のモル比のＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質を使用して調製される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ジチオール架橋剤とマレイミド機能化脂質とのモル比は、１：２である、請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
脂質二重層間に共有結合による架橋を有する多層状脂質小胞を形成するために、機能化脂質を含む多層状脂質小胞を架橋剤に接触させることを含む方法。
【請求項３７】
共有結合により架橋した脂質二重層を有し、有効量の作用物質を含む多層状脂質小胞を対象に投与すること、
を含む方法。
【請求項３８】
前記多層状脂質小胞は、生分解性脂質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記多層状脂質小胞は、リン脂質を含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記多層状脂質小胞は、ホスホコリン、ホスホグリセロール、及び／又はホスホエタノールアミンを含む、請求項３７、３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記多層状脂質小胞は、機能化脂質を含む、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記作用物質は、予防薬である、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記作用物質は、治療薬である、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記作用物質は、抗原である、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記作用物質は、アジュバントである、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記多層状脂質小胞は、複数の作用物質を含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記多層状脂質小胞は、２つの作用物質を含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記多層状脂質小胞は、抗原及びアジュバントを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記多層状脂質小胞は、その外表面上でＰＥＧと結合する、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
共有結合により架橋した脂質二重層を有し、作用物質含む多層状脂質小胞を、in vitroで細胞に接触させることを含む方法。
【国際調査報告】
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