(57)【要約】  本発明は、ヘリコバクター・ピロリの検出及び／又はクラリスロマイシンに対するヘリコバクター・ピロリの反応解析のための４つのペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブに関する。これらプローブは、分子生物学的手法、すなわち蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に基づき、臨床分離株や生検を含む数種の試料のヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン感受性診断に用いられる。  その構造に固有の物理的及び化学的特性によって、これらプローブは、より早くそしてより鋭敏にハイブリダイゼーションできる。  本発明の第２の特徴として、ここに記載した１又は数種のプローブを使用できるキット、及び検出と定量の工程の開発に関する。このキットの目的は、臨床試料中のヘリコバクター・ピロリとクラリスロマイシンに対する反応性を同定することである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−４と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、
ヘリコバクター・ピロリ菌株の存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出するＰＮＡプローブ。
【請求項２】
請求項１記載のＰＮＡプローブであって、
ｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、又はヘリコバクター・ピロリの相補的ｒＲＮＡ配列中の標的配列を検出できることを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項３】
請求項１記載のＰＮＡプローブであって、
配列番号１−３と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、
クラリスロマイシン抵抗性を検出できることを特徴とするプローブ。
【請求項４】
請求項１記載のＰＮＡプローブであって、
配列番号４と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、
クラリスロマイシン感受性を検出できることを特徴とするプローブ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のＰＮＡプローブであって、
少なくとも１つの検出可能画分に結合することを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項６】
請求項５記載のＰＮＡプローブであって、
前記プローブの検出可能画分の種類は、共役複合体、分岐した検出システム、発色団、蛍光団、放射性同位体、酵素、ハプテン、又は発光化合物の群から選択されることを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項７】
請求項６に記載のＰＮＡプローブであって、
前記蛍光団は、Ａｌｅｘａシリーズの蛍光団、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ、シアニン、５−（ａｎｄ−６）Ｃａｒｂｏｘｙ−２´，７´−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，５−ＲＯＸ（５−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）の少なくとも１つであることを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のプローブの少なくとも１つを含み、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリ菌株の存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出するキット。
【請求項９】
請求項８記載のキットであって、
１つの固定液、１つのハイブリダイゼーション溶液、及び１つの洗浄液の少なくとも１つを含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のキットであって、
前記固定液は、パラフォルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、２−８％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラフォルムアルデヒド、及び２５−７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールを含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項９記載のキットであって、
ハイブリダイゼーション溶液はフォルムアミドを含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出する方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項記載の少なくとも１つのＰＮＡプローブの使用を含み、
下記の工程を含む方法。
ａ．ＰＮＡプローブを前記試料に接触させる工程、
ｂ．ＰＮＡプローブと前記試料中に存在する微生物の標的配列とのハイブリダイゼーションを行う工程、
ｃ．前記試料の前記検出と測定の指標としてハイブリダイゼーションを検出する工程。
【請求項１３】
請求項１０記載の方法であって、
前記生物学的試料は血液、大気、食物、水、生検、又は胃生検に由来することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法であって、
前記ハイブリダイゼーションが蛍光によって生じることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項記載のＰＮＡプローブの使用であって、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出のための方法に適用されるプローブの使用。
【請求項１６】
請求項８〜１１のいずれか１項記載のキットの使用であって、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとそのクラリスロマイシンに対する反応性の検出に適用されるためのキットの使用。
【請求項１７】
請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法の使用であって、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出に適用される方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床に関連する微生物の検出工程と抗生物質抵抗性に関する。４つのペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，  ＰＮＡ）プローブが、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ）及び／又はクラリスロマイシンの存在に対し反応性（抵抗性／感受性）を有する菌株を検出するために開発された。
【０００２】
本発明の他の側面は、これらプローブの適用、及び生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン抵抗性の検出のためのキットの検出工程、そして臨床適用である。
【背景技術】
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリは、ヒト胃粘膜に定着する病原性細菌であり、慢性胃炎、消化性潰瘍、萎縮性胃炎、及び胃がんのような胃の感染症に関連する。
【０００４】
ヘリコバクター・ピロリ感染の診断は、胃生検（内視鏡検査）のような侵襲的方法、あるいは尿素呼気検査、血清学的検査、便中抗原検査のような非侵襲的方法に基づいて行うことができる。後者は、より費用がかからず、患者により便利であるため、臨床業務において、より頻繁に用いられている。
【０００５】
最も一般的に用いられている検査／キットはヘリコバクター・ピロリの酵素、ウレアーゼを特異的に検出できる（特許文献１、２）。しかしながら、侵襲的方法は、標準的方法が検出感度／特異性に欠けるために、より詳細な診断に好んで用いられる。
【０００６】
実際に、内視鏡バイオプシーとともに、Ｅ−テストや寒天希釈法のような培養に基づく検査、あるいは、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づく分子的方法によって、ヘリコバクター・ピロリ陽性に関するより信頼性のある情報を得ることができる。しかしながら、前者は選好性があり、時間がかかり、後者は、擬陽性あるいは擬陰性につながり得るＤＮＡコンタミネーションの可能性を避けるために格別の注意を必要とする。
【０００７】
最近になって、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，  ＰＮＡ）プローブが開発され、細菌検出に最適化されてきた。ＰＮＡ分子はＤＮＡ擬態物であり、負に帯電する糖リン酸骨格構造が、（２−アミノエチル）グリシン単位の反復により形成されるアキラルかつ電気的に中性な構造に置換されている。
【０００８】
ＰＮＡ分子は、ペントースを欠いているが、ＰＮＡと相補的なＤＮＡ配列間でワトソン−クリックの法則に従った水素結合による特異的なハイブリダイゼーションが生じ得る。
【０００９】
ＰＮＡの電気的に中性な性質は、従来用いられていた典型的なＤＮＡプローブに比べ、ＰＮＡと標的配列（ｒＲＮＡや二重鎖ＤＮＡ）間のより強固なハイブリダイゼーションの原因となる。その高親和性のために、ＰＮＡプローブは、ヌクレオチド配列が比較的短い（８〜１７ヌクレオチド）。ＤＮＡプローブは、弱い安定性と低い融解温度（Ｔｍ）のために、通常少なくとも１８ヌクレオチドであって、付加的な固定及び酵素や他の薬剤を用いた膜透過工程を必要とする。
【００１０】
ＰＮＡプローブは、顕微鏡やフローサイトメトリ、蛍光色素が付加されたときは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術（ＦＩＳＨ）によって検出される。
【００１１】
従来の培養方法と比較して、この技術は、臨床検体においてより早い結果を、また、改良された有効性、感受性及び特異性をもたらす。それは、幅広い応用を提示し、ヒト、環境、食物中の微生物の検出のような異なる微生物学分野に適用し得る。
【００１２】
すでに考案され、公開／特許された、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）以外のブドウ球菌種、ヒトパピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属のような臨床の微生物の検出のためのプローブのいくつかの用例が、この技術の増加する関心を示している。
【００１３】
ヘリコバクター・ピロリを特異的に検出するＰＮＡプローブはすでに入手可能である（Ａｚｅｖｅｄｏ  Ｎ．Ｆ．ら、２００３）。さらに、別のプローブの特許が請求されている（特許文献３、４）。後者は非常に高い特異性と感受性を示し、使用されている標準的方法（Ｇｕｉｍａｒaｅｓ  Ｎ．  ら、２００７）を上回っている。ヘリコバクター・ピロリの検出は重要であるが、上述のプローブを用いるのみでは検出できない、ヘリコバクター・ピロリの抗生物質抵抗性を検出することが望まれている。
【００１４】
実際に、最も一般的に用いられるヘリコバクター・ピロリの根絶処置は、７日から１４日間のプロトンポンプ阻害剤と２種の抗生物質（例えば、クラリスロマイシン、メトロジナゾール（ｍｅｔｒｏｄｉｎａｚｏｌｅ）、アモキシシリン）からなる三剤療法である。この治療は、抗生物質の過剰の使用量やそれらによる副作用によって、患者に不快感を与える。
【００１５】
さらに、この治療の成功は、これらのケースで卓越して用いられている抗生物質であるクラリスロマイシンへのヘリコバクター・ピロリの抵抗性の増加によって妨げられている。現在は、クラリスロマイシン抵抗性は、培養を用いる方法やＰＣＲによって検出される。しかし、これらの方法は、ヘリコバクター・ピロリの検出と同様に上述のとおり限界がある。したがって、迅速で信頼性があり実際的な方法がないために、ヘリコバクター・ピロリの各株のクラリスロマイシン抵抗性は、通常治療開始後、又はその効果がなかったことが証明された後に得られる。
【００１６】
本発明は、抵抗性株の同定において、信頼性があり、実際的で、強固な適用法を説明し、患者の適切な治療方法の選択、不快、危険、処置時間、及び費用の軽減のために重要な貢献を提示する。
【００１７】
ＦＩＳＨ技術は、ヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン抵抗性を検出する代替方法である、実際に、ヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン抵抗性を検出するＤＮＡプローブに関するいくつかの研究がある（Ｔｒｅｂｅｓｉｕｓ  ら、  ２０００）。クラリスロマイシン抵抗性は、ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡのペプチド転移酵素領域のドメインＶの点突然変異と関連性がある。研究で言及されている最も頻度の高い点突然変異は、Ａ２１４３Ｇであり、Ａ２１４２ＧとＡ２１４２Ｃが続いている。一つの研究では、２、３の国のデータが集められ、これら３つの点突然変異が、８４％のクラリスロマイシン抵抗性と関連していることを示すことが計算された（Ｍｅｇｒａｕｄ，  ２００４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０００６８５６号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０９２０５３１号明細書
【特許文献３】国際公開第２００８／１５５７４２号
【特許文献４】ポルトガル特許出願公開１０３７６７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の検出（同定／定量）及び／又はそのクラリスロマイシンに対する反応性（抵抗性／感受性）のためのペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ又はＰＮＡプローブセットについて述べる。そのようなプローブは、微生物の２３Ｓ  ｒＲＮＡ又は前述のｒＲＮＡに一致するゲノム配列を認識し得る。
【００２０】
ＰＮＡプローブは、その構造に特有の物理化学的特性を有し、ＦＩＳＨに基づく方法に適用したときには、ＤＮＡプローブに比べ、より迅速で、強固で、そして特異的な解析ができる。この要因は、ヘリコバクター・ピロリの抵抗性、感受性株間の相違が１塩基であり得ることから、非常に重要である。
【００２１】
本発明によって解決される課題の１つは、ヘリコバクター・ピロリ、及び／又はクラリスロマイシン反応性（感受性／抵抗性）の検出／定量である。生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在を検出する信頼性のある迅速な方法を提供し、迅速で安全な最も良い処置を決定するために、クラリスロマイシンに対する反応性を定量し、決定する方法を提供する。本発明の他の側面は、これらプローブを蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＦＩＳＨ））に適用することに基づく、迅速かつ簡便な方法によって、生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン抵抗性を検出可能とするキットの開発に関する。プローブは、複合的に、又は個別に用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、配列番号１−４と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むヘリコバクター・ピロリの存在を同定／測定する、又はクラリスロマイシンに対するヘリコバクター・ピロリの反応性を検出する、又は、ヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出するＰＮＡプローブのセットに関する。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様として、ここで説明するＰＮＡプローブは、ヘリコバクター・ピロリのｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、又はｒＲＮＡの相補的な配列中の標的配列を検出する。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＰＮＡプローブは以下の配列を含む：
―ヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン抵抗性を検出する、配列番号１−３と少なくとも８６％の構造的に相同するヌクレオチド配列の少なくとも１つ；
―ヘリコバクター・ピロリとそのクラリスロマイシン感受性を検出する、配列番号１−４と少なくとも８６％の構造的に相同するヌクレオチド配列の少なくとも１つ。
【００２５】
本発明のより好ましい実施態様において、配列は少なくとも一種の検出可能画分と結合される。用いる検出可能画分の種類として、以下の群から１つを選択することができる：共役複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、分岐した検出システム（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、発色団、蛍光団、放射性同位体、酵素、ハプテン、又は発光化合物等。
【００２６】
本発明のさらにより好ましい実施態様としては、蛍光団は少なくとも以下の１つであり得る：Ａｌｅｘａシリーズの蛍光団、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  シリーズ、シアニン、５−（ａｎｄ−６）Ｃａｒｂｏｘｙ−２´，７´−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，５−ＲＯＸ（５−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）等。
【００２７】
本発明において、先に記載した少なくとも１つのプローブを含む、生物学的試料中でのヘリコバクター・ピロリの検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン反応性の検出のためのキットもまた対象となる。
【００２８】
本発明のより好ましい実施態様としては、キットは以下の溶液の少なくとも１つを備えてもよい：固定液、ハイブリダイゼーション溶液、及び洗浄液。
【００２９】
本発明の他のより好ましい実施態様としては、固定液はパラフォルムアルデヒドとエタノール、すなわち、２−８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラフォルムアルデヒドと２５−７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールを含むことができ、及び／又はハイブリダイゼーション溶液はフォルムアミドを含んで良い。
【００３０】
本発明のさらなる対象は、前記ＰＮＡプローブを少なくとも１つ用い、生物学的試料中でのヘリコバクター・ピロリの検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンの反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン反応性の検出方法であり、下記の工程を含む：
―ＰＮＡプローブを生物学的試料に接触させる；
―ＰＮＡプローブと、生物学的試料中の微生物の標的配列とのハイブリダイゼーション；
―生物学的試料中の検出と定量の指標として、ハイブリダイゼーションの検出。
【００３１】
生物学的試料は、血液、大気、食物、水、生検試料等から由来し得る。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様は、ハイブリダイゼーションは蛍光によって、行い得る。
【００３３】
本発明のさらなる対象は、生物学的試料中でのヘリコバクター・ピロリの検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン反応性の検出について、前記ＰＮＡプローブ、前記キット及び方法の使用である。
【００３４】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出及び定量するための、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出及び定量するための、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性（抵抗性及び感受性）を検出及び定量するためのＰＮＡプローブ、試薬、方法及びキットを含む。ＰＮＡプローブの最高の特異性（ＤＮＡプローブと比較して）は１又は２ヌクレオチド異なる関連するヌクレオチド配列をよりよく識別し得る。本発明において、この側面は、ヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン感受性と抵抗性菌株の違いがまさに１塩基であることから、特に重要である。
【００３５】
本発明に記載されているＰＮＡプローブは、ｒＲＮＡ、ｒＲＮＡに相当するゲノム配列（ｒＤＮＡ）又はその相補的配列を検出することができ、標的種を特異的に検出し、さらに抗生物質への反応性を決定することさえ可能とする。
【００３６】
本発明のプローブは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、試料中のヘリコバクター・ピロリの解析のために使用される。
【００３７】
本発明に記載されているＰＮＡプローブのヌクレオチド配列は、以下の配列と少なくとも８６％構造的に相同する群から選択される：
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号１）；
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号２）；
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号３）；  
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号４）。
【００３８】
新しいＰＮＡ−ＦＩＳＨプローブの開発は、これまでのところ経験的に行われている。特にこのケースでは、プローブへの適用が望ましい多数の塩基が、まず、テストされた。
【００３９】
プローブのヌクレオチドが数少ないと、ハイブリダイゼーションが生じるための自由エネルギーが十分ではないけれども、多数のヌクレオチドは標的に対し、高親和性を有することができ、非常に高温で作用する。このケースでは、最良の結果は１２〜１８ヌクレオチドで達成された。
【００４０】
さらに、突然変異を検出するための最良の配列が選択された。注目されている突然変異がプローブ配列の中央にある場合には、これらプローブが突然変異をより正確に識別し得るかを検証された。しかしながら、あるヌクレオチドの右又は左への移転は、プローブの良い成果にほとんど影響しない。
【００４１】
プローブのハイブリダイゼーションの成功は、固定／膜透過処理、及び洗浄工程と同様、ハイブリダイゼーションの条件に依存するため、各事例において、実験的に最良のＦＩＳＨの条件が調べられた。まず、先行技術（特許文献３、４）で言及されているヘリコバクター・ピロリの検出のため条件を考慮した。同じ微生物を標的としているので、固定／膜透過処理は先に記載されているのと同様、すなわち、４％パラフィルムアルデヒド及び５０％エタノールで実施され得ることが予測された。したがって、主として調べられるパラメータは、温度、フォルムアミド濃度、及びハイブリダイゼーションと洗浄の時間であった。なぜならば、これら条件は従来のプローブに特徴的であって、この新しいプローブセットにはあてはめることができないからである。
【００４２】
どのパラメータがＰＮＡ−ＦＩＳＨ法に悪影響を与えるかを知らずに、これらパラメータを同時に最適化する必要があるために、この手法は複雑で、多大な時間を必要とする。他の著者らによって公表されている研究報告に述べられているいくつかのプローブでの低親和性は、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法には使用できない。このケースでは、最良の時間、温度、フォルムアミド濃度は、６０分のハイブリダイゼーション、５５℃、５０％フォルムアミド、又は７０℃、３０％フォルムアミドで３０分の洗浄工程であると特定された。温度とフォルムアミド濃度は相関があるという事実から、中間のフォルムアミド濃度でのハイブリダイゼーション温度は５５−７０℃の間であろうということに言及することは重要である。
【００４３】
成功したハイブリダイゼーションの後には、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリ、又はリアルタイムＰＣＲによって、その存在／非存在、濃度及び特定の微生物の抗生物質への感受性に関する特徴を評価することができる。
【００４４】
本件において、安定なプローブ／標的複合体の存在を検出／同定し得るＰＮＡプローブ画分を考慮することもまた重要である。この検出可能画分は、以下の群から１つ選択される：共役複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、分岐した検出システム（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、発色団、蛍光団、放射性同位体、酵素、ハプテン、又は発光化合物。
【００４５】
複数の異なるプローブは、ヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン抵抗性株を検出するために、同じ検出群（例えば、蛍光団）に結合することができ、一方で、他の任意のプローブを異なる検出分子に結合させ、例えば、クラリスロマイシン感受性株を同定できる。
【００４６】
また、本発明の範囲に基づいて、検出可能画分を有さないブロッキングプローブを所望の配列以外とのＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションを減少、又は除去するために用い得る。
【００４７】
本発明に記載された方法は、試料を前記１つあるいは複数のＰＮＡプローブと接触させることを含む。その方法にしたがって、試料中の微生物は、適切なハイブリダイゼーション条件に基づくＰＮＡ配列と標的配列のハイブリダイゼーションに相関するクラリスロマイシン特性（すなわち、感受性又は抵抗性）が検出され、同定され、又は測定される。それゆえに、解析は、信頼性のある判定を伴う唯一の検査に基づいている。これに対して、現在、微生物の解析に用いられている従来法は、複数の表現型特性に基づく、いくつかの検査を含む。
【００４８】
さらに、本発明の対象は判定、すなわち、試料中のヘリコバクター・ピロリの存在を検出、同定、又は測定、及び／又はクラリスロマイシン反応性（感受性／抵抗性）の判定を実施するために適したキットである。キットは、１又は複数のＰＮＡプローブと他の選択された試薬、又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションテストを実施するために必要とされる化合物を含む。    
【００４９】
より好ましい実施態様において、ヘリコバクター・ピロリの検出、同定、又は測定を実施するために適したキットは、固定、ハイブリダイゼーション、及び洗浄液を含む。
【００５０】
方法は、患者試料から得られた検査結果及びクラリスロマイシンに対し抵抗性／感受性であるヘリコバクター・ピロリの同定にしたがって、より適切な処置を導く診断、治療上の疾病の補助的手段となる。
【００５１】
ＰＮＡプローブは、直接スライド上の試料に適用できる。なぜならば、プローブの適用は、試薬又はハイブリダイゼーション前の細胞膜の膜透過処理のための酵素を必要としないからである。しかしながら、ハイブリダイゼーションにおいてしばしば要求される２，３の化合物は必要とされる。したがって、通常プローブは、よりユーザーフレンドリーなキットに含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
Ｉ−定義
ａ）ここで用いる「ヌクレオチド」の語は、核酸、それによって生じる核酸に特異的に結合するポリマーに関する技術を使用する者によって一般的に知られている自然及び人工的分子を含む；
ｂ）「ヌクレオチド配列」の語を用いるときには、サブユニットを含むポリマー断片、この場合はヌクレオチド断片（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、と同一のものを指す；
ｃ）「標的配列」の語は、検査によって検出されることが意図されているヘリコバクター・ピロリのヌクレオチド配列であって、ヌクレオチドプローブの部分がハイブリダイズするように設計されている配列を指す；
ｄ）「ＰＮＡプローブ」の語は、ヌクレオチド配列を有し、特異的に関心対象の微生物の標的配列とハイブリダイズするＰＮＡのサブユニットのポリマーを指す。ＰＮＡ分子は、負に帯電した糖リン酸骨格構造が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位の反復によって形成されるアキラル及び電気的に中性な構造によって置換されている、ＤＮＡ擬態物である；
ｅ）「検出可能画分」という語を用いるときは、プローブに結合し得る分子であり、これによってプローブが機器又は方法によって検出可能であることを意味する；
ｆ）本発明で、「クラリスロマイシンに対する抵抗性」の語は、クラリスロマイシンの抵抗性と感受性に関連する特定の遺伝子と突然変異に基づく微生物のクラリスロマイシンに対する感受性の解析と相関する；
ｇ）「試料」の語は、微生物、又は検出のための標的配列を含み得る、いかなる生物学的試料をも意味する。好ましくは、生物学的試料は、液体（例えば、食物、水、血液、尿等）、又は、組織試料（例えば、胃生検を含む生検試料）である。
【００５３】
ＩＩ説明
ＰＮＡプローブの概念：
本発明のＰＮＡプローブは、ヘリコバクター・ピロリの標的配列として、クラリスロマイシン抵抗性に関する突然変異の原因となる領域を備える。したがって、様々なデータベースの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列のアラインメントを行った。アデニンヌクレオチドがシトシン又はグアニンに置換されている２１４２位の点突然変異、あるいは２１４３位のアデニンがグアニンに置換されている３つの点突然変異（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）が、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のドメインＶにコードされるペプチジルトランスフェラーゼ領域に位置していた。これらの突然変異はこの微生物でのクラリスロマイシン抵抗性の機構に関連している。付加的なプローブは、上述と同じ標的位置に、いかなる点突然変異も含まずに設計され、クラリスロマイシン感受性株を検出することができる。
【００５４】
本発明のＰＮＡプローブは、１５ヌクレオチド配列を含む。これらの基準に従って、配列は、少なくとも８６％、以下の配列に相同な配列を選択した。
【００５５】
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号１）；
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号２）；
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号３）；
５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  −３’  （配列番号４）。
【００５６】
これらプローブは、ヘリコバクター・ピロリ、又はこれらの抵抗性について記載されているが、この場合のみに特異的であることを要さない。
【００５７】
他に、本発明ではプローブヌクレオチド配列の変異体もまた考慮している。そのような変異体は欠失、挿入等を含み得る。結果として、述べたように、プローブヌクレオチド配列は、少なくとも８６％前記配列と相同である。
【００５８】
ＰＮＡプローブの検出可能画分：
以下の実施例に限ることなく、ＰＮＡプローブの検出可能画分は、デキストラン、発色団、蛍光団、放射性同位体、酵素、ハプテン、化学発光化合物等に結合した様々な種類の分子を含むことができる。
【００５９】
例えば、蛍光団の種類として好ましく用いられるのは（これに限られないが）：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ、シアニン、５−（ａｎｄ−６）Ｃａｒｂｏｘｙ−２´，７´−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，５−ＲＯＸ（５−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）である。
【００６０】
方法：
本発明では、ヘリコバクター・ピロリの決定及びそのクラリスロマイシン抵抗性の決定方法を開示する。用いられるＰＮＡプローブは、配列番号１−４と構造的に少なくとも８６％相同なヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む。
【００６１】
方法は、本明細書に記載した１又はそれ以上のＰＮＡプローブを備える試料と細菌の標的配列を適切なハイブリダイゼーション条件、又は適切なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション条件で（実施例１参照）接触させることを意図する。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、又はＰＮＡ−ＦＩＳＨ）、又はリアルタイムＰＣＲは、ヘリコバクター・ピロリ解析の検査様式である。
【００６２】
したがって、方法は、以下の工程に分けることができる：試料調整、細胞固定、ハイブリダイゼーション、洗浄、及び結果の可視化（実施例１参照）。本方法は付着、又は懸濁させた細胞で実施し得る。
【００６３】
ハイブリダイゼーション条件：
ＰＮＡプローブハイブリダイゼーションの標的配列に対するストリンジェンシーを課す、又は調節する、いくつかの要因がある。これらには、用いられるフォルムアミド（又は他の変性剤）の割合、塩濃度及び結果的にイオン強度、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨ等を含む。ハイブリダイゼーションの最適条件を決定するために、異なる要因を固定して、各要因を所望の判別程度が達成されるまで変えていくことが必要である。
【００６４】
試料中の他の標的ではない配列と近似している標的配列では、ハイブリダイゼーションに影響を与える様々な要因を決定するために、より厳密なストリンジェンシーの程度が必要とされた。本発明では、非標的配列は標的配列と１つのヌクレオチドが異なるのみであり（なぜならば、抵抗性は感受性株と抵抗性株の間の１ヌクレオチドの変化と相関しているからである）、ＰＮＡプローブと非標的配列の非特異的ハイブリダイゼーションを避けるための増加した識別レベルが必要である。ヘリコバクター・ピロリ感受性株とハイブリダイズする本発明のプローブは、クラリスロマイシン抵抗性を検出することができる残りの３つのプローブとともに用いることができる。しかしながら、プローブは、ハイブリダイゼーション条件を最適化するとともに、１ヌクレオチドが異なるのみの非標的配列に対する残りのプローブとの非特異的結合を競合を通して消滅させるために、任意に、プロッキングプローブのように検出可能画分なしで用いることができる（実施例２に概説）。
【００６５】
１つのブロッキングプローブは、ＰＮＡプローブと同一の配列間、検出可能画分を備えたＰＮＡプローブの非標的間で形成されるよりも、熱力学的に安定な複合体を形成すると一般に受け入れられており、後者の結合を回避し、擬陽性の可能性を排除する。
【００６６】
試料調整：
解析される試料は、生検、血液、水、食物等から得られる。生検では、試料は３〜５μｍに薄切し、スライド上に載置する。水、大気及び血液試料のような懸濁液中のヘリコバクター・ピロリの場合には、黒色ポリカーボネート膜、又は同等のものを通してろ過する。ろ過後、膜をスライドに載置する。食物試料では、試料を水又は滅菌済み緩衝液中に浸漬後、超音波処理、又はストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）パドルブレンダーで再調整し、食物材料からヘリコバクター・ピロリを抽出する必要がある。ヘリコバクター・ピロリが懸濁液中に存在する時点で、適用される技術は水、大気、又は血液の場合と同様である。代わりに、ヘリコバクター・ピロリ懸濁液試料は、直接ハイブリダイゼーション工程に送られ得る。
【００６７】
キット：
本発明はまた、ヘリコバクター・ピロリ及びそのクラリスロマイシン抵抗性を検査するキットに関する。
【００６８】
このキットに用いられるＰＮＡプローブは、その特性及び方法に関し、ここですでに述べられている。
【００６９】
本発明のキットは、少なくとも１つの配列番号１−４と少なくとも８６％構造的に相同なヌクレオチド配列、及び他の試薬、又は検査を実施するために選択された組成物を含む。
【００７０】
本発明のＰＮＡプローブ、その特性、方法及びキットは、関心対象の生物の細胞の中に存在する、あるいは存在しない核酸配列の解析に適している。そのため、本発明は、生物の解析、抽出されたあるいは関心対象の生物から由来した核酸の解析の両方に用いることができ、本発明における標的配列の起源は限定されないことを意味する。
【００７１】
実施例
実施例１：ヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシン感受性及び抵抗性株の検出。
【００７２】
【表１】
2013504319.tif 000002
【００７３】
細菌株：
ＰＣＲによって確認されたクラリスロマイシン抵抗性のいくつかの単離菌株が使用された。参照菌株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ  （ＡＴＣＣ）から得た。各株の培養液は１滴、８ｍｍ−ウェル  スライドに点着され、５５℃で乾燥された。
【００７４】
固定：
ハイブリダイゼーション中の２３Ｓ  ｒＲＮＡの喪失を防ぐために、試料は４％パラフォルムアルデヒド（ｗｔ／ｖｏｌ）及び５０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液に、各１０分間暴露した。
【００７５】
ハイブリダイゼーション：
この工程で、１０％  （ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸、１０ｍＭ  塩化カルシウム、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）フォルムアミド、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ピロリン酸ナトリウム、０．２％  （ｗｔ／ｖｏｌ）ポリビニルピロリドン、０．２％  （ｗｔ／ｖｏｌ）ＦＩＣＯＬＬ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、０．１％  （ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ及び２００ｎＭのＰＮＡプローブを含む、１滴のハイブリダイゼーション溶液が試料に滴下された。試料はプローブが展開しているのを確認し、カバーグラスで覆われ、６０分間インキュベートされた。この間に、プローブは細胞膜を透過し、２３Ｓ  ｒＲＮＡ相補的配列に結合できる。カバーグラスと試料周囲の湿った紙はハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防ぐために不可欠である。
【００７６】
洗浄：
ハイブリダイゼーション後、カバーグラスは除かれ、スライドは予め温められた５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ、１５ｍＭ  塩化ナトリウム、及び１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐＨ  １０）からなる洗浄液に浸漬される。洗浄工程は３０分間ハイブリダイゼーションと同じ温度で実施される。
【００７７】
結果：
結果は、プローブ中の蛍光色素シグナル分子に適したフィルターを備えた蛍光顕微鏡観察（すなわち、プローブに結合した蛍光色素の蛍光波長を含む）によって得られた。標的配列が存在しないときには、いかなるシグナルも検出されなかった。
【００７８】
【表２】
2013504319.tif 000003
【００７９】
フィルター４８８は蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８による蛍光、これはクラリスロマイシン抵抗性を示す、を捕捉する。フィルター５９４は蛍光色素５９４による蛍光、これはクラリスロマイシン感受性を示す、を捕捉する。
【００８０】
実施例２：予め同定されているヘリコバクター・ピロリ菌株のクラリスロマイシン抵抗性の検出。
【００８１】
本実施例は、例えば、ヘリコバクター・ピロリを検出可能なＰＮＡプローブを言及している特許文献３や特許文献４の文献の方法を用いて、ヘリコバクター・ピロリが同定された時点で、本発明によって、ヘリコバクター・ピロリとして同定された菌株が、クラリスロマイシン抵抗性、又は感受性であるか評価できることを説明することを目的としている。
【００８２】
【表３】
2013504319.tif 000004
【００８３】
ヘリコバクター・ピロリが、従来法により同定された後、菌株の感受性を調べることができる。表３に記載されているプローブを用いて、ヘリコバクター・ピロリの菌株（すでに記載されているプローブを用いて同定された）のクラリスロマイシン抵抗性が検査された。
【００８４】
上述したヘリコバクター・ピロリを検出する特許文献３の方法とは異なる、前記実施例と同様のハイブリダイゼーション方法を用いた。しかしながら、同一の検査でヘリコバクター・ピロリの同定及び抵抗性を決定し、本発明のプローブとともに、上述のプローブを使用するためにいくつかの変更がなされた。
【００８５】
結果：
結果は、プローブ中の蛍光色素シグナル分子に適したフィルターを備えた蛍光顕微鏡観察によって得られた。
【００８６】
【表４】
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【配列表】
2013504319000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月29日(2012.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−４と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、
ヘリコバクター・ピロリ菌株の存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出するＰＮＡプローブ。
【請求項２】
請求項１記載のＰＮＡプローブであって、
ｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、又はヘリコバクター・ピロリの相補的ｒＲＮＡ配列中の標的配列を検出できることを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項３】
請求項１記載のＰＮＡプローブであって、
配列番号１−３と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、
クラリスロマイシン抵抗性を検出できることを特徴とするプローブ。
【請求項４】
請求項１記載のＰＮＡプローブであって、
配列番号４と少なくとも８６％構造的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、
クラリスロマイシン感受性を検出できることを特徴とするプローブ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のＰＮＡプローブであって、
少なくとも１つの検出可能画分に結合することを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項６】
請求項５記載のＰＮＡプローブであって、
前記プローブの検出可能画分の種類は、共役複合体、分岐した検出システム、発色団、蛍光団、放射性同位体、酵素、ハプテン、又は発光化合物の群から選択されることを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項７】
請求項６に記載のＰＮＡプローブであって、
前記蛍光団は、Ａｌｅｘａシリーズの蛍光団、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ、シアニン、５−（ａｎｄ−６）Ｃａｒｂｏｘｙ−２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，５−ＲＯＸ（５−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）の少なくとも１つであることを特徴とするＰＮＡプローブ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のプローブの少なくとも１つを含み、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリ菌株の存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出するキット。
【請求項９】
請求項８記載のキットであって、
１つの固定液、１つのハイブリダイゼーション溶液、及び１つの洗浄液の少なくとも１つを含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項９記載のキットであって、
前記固定液は、パラフォルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、２−８％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラフォルムアルデヒド、及び２５−７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールを含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項９記載のキットであって、
ハイブリダイゼーション溶液はフォルムアミドを含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性を検出する方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項記載の少なくとも１つのＰＮＡプローブの使用、又は請求項８〜１１のいずれか１項記載のキットの使用を含み、
下記の工程を含む方法。
ａ．ＰＮＡプローブを前記試料に接触させる工程、
ｂ．ＰＮＡプローブと前記試料中に存在する微生物の標的配列とのハイブリダイゼーションを行う工程、
ｃ．前記試料中の前記検出と測定の指標としてハイブリダイゼーションを検出する工程。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、
前記生物学的試料は血液、大気、食物、水、生検、又は胃生検に由来することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法であって、
前記ハイブリダイゼーションが蛍光によって生じることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項記載のＰＮＡプローブの使用であって、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出のための方法に適用されるプローブの使用。
【請求項１６】
請求項８〜１１のいずれか１項記載のキットの使用であって、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとそのクラリスロマイシンに対する反応性の検出に適用されるためのキットの使用。
【請求項１７】
請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法の使用であって、
生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリの存在の検出、又はヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出、又はヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ピロリのクラリスロマイシンに対する反応性の検出に適用される方法。
【国際調査報告】
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2013504319.tif 000007
2013504319.tif 000008
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