(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つの微生物を同定して、タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する潜在的耐性および毒性因子の特性を決定することを含む、試料から少なくとも一つの微生物を特徴づける方法であって、前記少なくとも一つの微生物についてタイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性、および毒性因子の特性を決定することが、タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性および毒性因子の前記特性のマーカーとして、タンパク質、ペプチドおよび／または代謝産物を使用する質量分析によって実施することを特徴とする、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの微生物を同定すること、及びタイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する潜在的耐性および毒性因子の特性を決定することを含む、試料から少なくとも一つの微生物を特徴づける方法であって、前記少なくとも一つの微生物についてタイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性、および毒性因子の特性を決定することが、タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性および毒性因子の前記特性のマーカーとして、タンパク質、ペプチドおよび／または代謝産物を使用する質量分析によって実施することを特徴とする、方法。
【請求項２】
タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する潜在的耐性および毒性因子の特性について実施する質量分析がＭＳ／ＭＳ型のスペクトロメトリーであることを特徴とする、請求項１に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項３】
ＭＳ／ＭＳスペクトロメトリーがＭＲＭであることを特徴とする、請求項２に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項４】
タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性および毒性因子の特性の決定を、同じ質量分析装置で実施することを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項５】
タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性および毒性因子の特性の決定を同時に行うということを特徴とする、請求項４に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項６】
前記少なくとも一つの微生物を同定することも質量分析によって行うことを特徴とする請求項１から５の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの微生物を同定するための質量分析がＭＳ型、ＭＳ／ＭＳ型又はＭＳ／ＭＳ型のスペクトロメトリが後に続くＭＳ型のスペクトロメトリであることを特徴とする、請求項６に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの微生物の同定を確認する更なる工程を含んでなり、該確認工程は質量分析により実施することを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項９】
確認工程の質量分析がＭＳ／ＭＳ型の質量分析であることを特徴とする、請求項８に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１０】
確認工程の質量分析がＭＲＭであることを特徴とする、請求項９に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１１】
タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性および毒性因子の前記特性のマーカーが前記少なくとも一つの微生物のタンパク質であることを特徴とする、請求項１から１０の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１２】
前記微生物のタンパク質がペプチドに消化されることを特徴とする、請求項１１に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１３】
消化が酵素によって行われることを特徴とする、請求項１２に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１４】
酵素がトリプシンであることを特徴とする請求項１３に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１５】
前記少なくとも一つの微生物が細菌であり、抗菌物質が抗生物質であることを特徴とする、請求項１から１４の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１６】
細菌が黄色ブドウ球菌であることを特徴とする、請求項１５に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１７】
タイピング特性を決定することは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４２、４４または４５に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項１６に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１８】
少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的耐性の特性を決定することが配列番号１０から１７に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項１９】
毒性を決定することが配列番号１９、２０、２１、２３または２４に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項１６から１８の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２０】
同定することが配列番号２６、２７、２９、３０、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４２、４４および４５に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項１６から１９の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２１】
細菌が大腸菌であることを特徴とする、請求項１５に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２２】
タイピング特性を決定することが配列番号４６から８７に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２１に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２３】
少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的耐性の特性を決定することが配列番号８５、８６および８７に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２１又は２２に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２４】
毒性を決定することが配列番号６２から６６に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２１から２３の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２５】
同定することが配列番号４６から６１に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２１から２４の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２６】
前記少なくとも一つの微生物が酵母であり、抗菌物質が抗真菌薬であることを特徴とする、請求項１から１４の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２７】
酵母がカンジダ・アルビカンスであることを特徴とする請求項２６に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２８】
タイピング特性を決定することが配列番号８８から１２５及び１７７に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２７に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項２９】
少なくとも一つの抗真菌薬に対する潜在的耐性の特性を決定することが配列番号１１７から１２２及び１７７に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２７又は２８に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項３０】
毒性を決定することが配列番号１２３から１２５に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２７から２９の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項３１】
同定することが配列番号８８から１１６に記載の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用することを特徴とする、請求項２７から３０の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項３２】
代謝産物がエルゴステロールであることを特徴とする、請求項１から３１の何れか一項に記載の少なくとも一つの微生物を特徴づける方法。
【請求項３３】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４２、４４から１２５および１７７に記載の配列を有するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は質量分析を使用して試料から微生物を特徴づけることに関する。
【０００２】
パスツールによる微生物の発見以来、微生物は、顕微鏡分析と生化学分析によって研究されてきた。これらの従来法は大抵、長く面倒であり、分析の代替法が間もなく求められた。したがって、質量分析による細菌の解析は、１９７５年という早い時期にJ. Anhalt and C. Fenselauによって始まった。
【０００３】
これらの初期研究の後に、質量分析（ＧＣ−ＭＳ）と組合わせたガスクロマトグラフィーによる微生物細胞壁脂肪酸の研究が続いた（文献２）。この方法は、脂肪酸メチルエステルについてのＦＡＭＥの名で普及した。現在、それは分類学研究の参照方法となっている。しかしながら、その使用は、鹸化、加水分解及び誘導による試料の処理を習得した特定の実験技術者に限られたままである。
【０００４】
１９９６年のM. Claydonの仕事（文献３）及びT. Krishnamurthy and P. Ross（文献４）の仕事は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight)型の質量分析により、さまざまな細菌種を同定できることを示した。分析は、マススペクトルの獲得と専門ソフトウェアによる解釈を組合わせている。それは極めて単純であり、数分で実施することができる。しかしながら、それは医療診断実験室にごく最近広がるようになったばかりである（文献５）。その臨床使用は、現在、細菌及び酵母の種の同定に限られている。それは、タイピングのためにも、抗菌物質への耐性を同定するためにも、また毒性を分析するためにも使われない。
【０００５】
しかしながら、微生物の特徴づけは、臨床分野及び産業分野の両方において基本となる。したがって、例えば、抗生物質のような抗菌物質に対する耐性の同定及び毒性因子の検出は、患者の最適な治療を確実にするための不可欠な要素である。同様に、タイピングは、疫学的研究及び院内疾患と戦うために重要である。
【０００６】
質量分析の他の方法は、特定のタンデム型質量分析において、これらの要求を満たすために提案された。例えば、四重極−ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）によるβ−ラクタマーゼの同定に関するC. Fenselau et al.の仕事（文献６）、三連四重極によるブドウ球菌エンテロトキシンＣ２（病原性因子ＳＥＣ２）の検出に関するD. Ding et al.（文献７）の仕事、又は他にＱ−ＴＯＦによるクロストリジウム属のタイピングに関するR. Everley et al.の仕事（文献８）を挙げることができる。
【０００７】
しかしながら、これらの研究結果は、ルーチンの臨床用途には適用できない。それらは、高い能力のスタッフを必要する調査計測器で得られた。大抵１試料につき１時間以上の解析時間は、微生物の試験実験室の作業負荷と適合しない。最後に、さまざまなチームによって得られたデータは、特定の問題には答えるが、全ての臨床要求に同時には応答しない。
【０００８】
近年、S. Hofstadler et al.は、全ての臨床要求を満たす方法を提案した（文献９）。彼らは、ＰＣＲによる微生物ゲノムの増幅とエレクトロスプレー−ＴＯＦ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）によるＰＣＲ産物の検出を組合わせている。この方法は、現在、完全自動化されている（文献１０）。しかしながら、分子生物学に固有の欠陥（すなわちプローブのコスト、抽出収率等）を有するＰＣＲ増幅を必要とする。
【０００９】
これに関連して、本発明の目的は微生物を特徴づける方法、すなわち少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性と毒性因子のタイピングの特性を同定して決定する方法を提案することであり、それは従来法の欠点を解決することを可能にし、すなわち各々の種に特異的な試薬を使用しない、特に分子生物学方法と比較して安価で、１時間未満の短い時間で結果を与え、高い能力のあるスタッフを必要とせず、臨床でルーチンに使用することができる方法を提供する。さらにまた、微生物を特徴づける方法の全体は、同じ質量分析法により有利に実施することができ、それによって微生物の試験実験室の機器類を単純化する。
【００１０】
このために、本発明は試料から少なくとも一つの微生物を特徴づける新規な方法であって、それは前記少なくとも一つの微生物を同定すること、及びタイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する潜在的な耐性及び毒性因子の特性を決定することを含み、前記少なくとも一つの微生物について、タイピング、少なくとも一つの抗菌物質及び病原性因子に対する耐性の特性の測定が、タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性及び病原性因子の前記特性のマーカーとして、タンパク質、ペプチドおよび／または代謝産物を使用する質量分析により実施することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
従って、本発明の方法は、微生物を特徴づけるための特性のうちの少なくとも３つが、特徴付けされる微生物を代表するタンパク質、ペプチド又は代謝産物をマーカーとして使用する質量分析技術によって行われる。
【００１２】
本発明の方法によって特徴づけることができる微生物は、産業及び臨床で遭遇する全ての病原性又は非病原性の微生物である。それらは、細菌、ウイルス、原生動物または酵母であってもよい。
「タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する耐性及び毒性因子の特性のマーカー」なる表現は、前記特性の特徴である、タンパク質又は代謝起源の分子を意味する。
「微生物をタイピングする」なる表現は、同じ種の範囲内でいくつかの菌株の区別を意味することを目的とする。タイピングは疫学的価値を有しており、臨床医は、患者から単離された菌株が、他の患者から又は環境から単離した他の菌株と明らかに同一で、同じ源に由来するかどうかを知ることができる。したがって、これは食中毒時又は院内での感染源を明らかにすることを可能にする。細菌の特性をタイピングするためのマーカーの非限定的な例として、特有の突然変異、例えば大腸菌のａｄｋ、ｆｕｍＣ、ｇｙｒＢ、ｉｃｄ、ｍｄｈ、ｐｕｒＡ及びｒｅｃＡ遺伝子の転写産物、及び黄色ブドウ球菌のａｒｃ、ａｒｏＥ、ｇｌｐＦ、ｇｍｋ、ｐｔａ、ｔｐｉ及びｙｑｉＬ遺伝子の転写生成物を有するペプチドを挙げることができる。原生動物の特性をタイピングするマーカーの非限定的な例として、赤痢アメーバとエントアメーバ・ディスパーのキチナーゼ遺伝子の産物を挙げることができる。ウイルスの特性をタイピングするマーカーの非限定的な例として、ヒト免疫不全ウイルスのポリメラーゼ遺伝子の産物を挙げることができる。最後に、酵母の特性をタイピングするマーカーの非限定的な例として、カンジダ・アルビカンスのａａｔ１ａ、ａｃｃ１、ａｄｐ１、ｍｐｉｂ、ｓｙａ１、ｖｐｓ１３及びｚｗｆ１ｂ遺伝子断片の転写産物を挙げることができる。
【００１３】
「少なくとも一つの抗菌物質への耐性を測定する」なる表現は、抗菌物質により破壊されることへの微生物の感受性を決定することを意味する。したがって、微生物が細菌である場合には細菌が耐性を発現する抗菌物質は抗生物質であり、原生動物である場合に抗菌物質は駆虫剤であり、ウイルスである場合に抗菌物質は抗ウイルス剤であり、酵母である場合に抗菌物質は抗真菌薬である。耐性機構に関与するタンパク質は、系統と種によって異なる。細菌で有用である少なくとも一つの抗生物質に対する耐性のマーカーの非限定的な例として、メチシリンに耐性を与える黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の転写産物を挙げることができ、菌株がメチシリン耐性（ＭＲＳＡ菌株）であるか、メチシリン感受性（ＭＳＳＡ菌株）であるかを示すことができる。大腸菌菌株がペニシリンに対して耐性化しているが、抗生物質の他の種類（例えばセファロスポリン又はカルバペネム）に感受性であるかどうかについて示すことを可能にするＴＥＭ−２タンパク質を挙げることができる。別のマーカーは、カルバペネムに耐性を与えるＫＰＣ（肺炎桿菌カルバペネマーゼ）という酵素である。黄色ブドウ球菌についての耐性マーカーの別の例は、２００９年ＡＳＭＳ会議で提出されたポスター「黄色ブドウ球菌の抗生物質の耐性に対するメタボロミクスに基づくアプローチ」として、E. Alexander et al.が記載したように、バンコマイシンに対する耐性の代謝プロフィール代表例である。原生動物で使用する少なくとも一つの駆虫剤に対する耐性のマーカーの非限定的な例として、鉄含有スーパーオキシドジスムターゼ（Ｆｅ−ＳＯＤ）とペルオキシレドキシンを挙げることができ、その増大された発現はメトロニダゾールに耐性を与える。ウイルスで使用する少なくとも一つの抗ウイルス剤に対する耐性のマーカーの非限定的な例として、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素酵素の突然変異を挙げることができ、逆転写酵素ヌクレオシド・インヒビターに対し減少した感受性を与える。最後に、酵母で有用である少なくとも一つの抗真菌薬に対する耐性のマーカーの非限定的な例として、カンジダ・アルビカンス１，３−ｂ−Ｄ−グルカン合成酵素の突然変異を挙げることができ、それはエキノカンジンに対し減少した感受性を与える。別の例では、フルコナゾールに対する特定の耐性では、カンジダ・アルビカンスのアゾール抗真菌薬への耐性を挙げることができる。フルコナゾールの標的は、エルゴステロール（菌類の壁の主要な成分）の合成に関与する酵素のラノステロール・デメチラーゼである。フルコナゾールに対する耐性は、ラノステロール・デメチラーゼをコードするｅｒｇ１１遺伝子の点突然変異の出現と関係している場合がある。
本出願人によって示されるように、耐性特異的なマーカーがタイピングマーカーとして使用できる可能性があることに注意する必要がある。
【００１４】
「微生物の毒性を決定する」なる表現は、微生物の病原性、有害性及び狂暴な性質を評価することを意味することを目的とする。細菌の毒性マーカーの非限定的な例として、ＰＶＬ（パントン-バレンタイン型ロイコシジン）、黄色ブドウ球菌に存在する２つの相乗的構成成分を有する細胞融解毒素（ＬｕｋＦｅｔ  ＬｕｋＳ）を挙げることができ、それは皮膚疾患、広範囲の蜂巣炎、骨髄炎及び壊死性肺炎を引き起こす最も強毒の毒素の１つであり、ウイルス重複感染に関係している。他の例は、肺炎連鎖球菌（気道感染症、髄膜炎及び菌血の原因となる種）に存在する自己消化酵素と肺炎球菌溶血素、更にはクロストリジウム・ディフィシール（腸の共生菌）の毒素ＡとＢであって、腸の上皮の透過性の変性を生じる毒素（毒素Ａ）又は上皮細胞を直接攻撃する毒素（毒素Ｂ）又は時間とともに腸の輸送と腸管吸収を減少させ下痢を引き起こす毒素（毒素ＡとＢの合わせた作用）を含む。また、例えば大腸菌に存在する志賀毒素Ｓｔｘ１とＳｔｘ２を挙げることができる。これらの２つの細胞毒素は、腸出血大腸菌の重大な毒性因子であると考えられる。それらは、潰瘍性大腸炎または容血性尿毒症症候群のような合併症の原因となる。原生動物の毒性マーカーの非限定的な例として、赤痢アメーバ（赤痢と肝臓膿瘍の原因となる種）に存在する抗酸化剤（Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ２、ペルオキシレドキシン、スーパーオキシドジスムターゼ）を挙げることができる。ウイルスの毒性マーカーの非限定的な例として、ヒト免疫不全ウイルス１型（ヒトでより病原性の強い種類）のＮｅｆタンパク質変異体を挙げることができる。最後に、酵母の毒性マーカーの非限定的な例として、カンジダ・アルビカンス（表在性カンジダ症、さらに敗血症及び播種性カンジダ症の原因となる種）のリパーゼ８を挙げることができる。
本出願人によって示されるように、毒性特異的なマーカーが、更にタイピング・マーカーとして使用することができることに注目されたい。
【００１５】
本発明の方法は細菌を特徴づけるために実施することができ、前記抗菌物質はそのとき抗生物質であり、本発明の実施態様を構成する。かくして、例えば、本発明の方法に従って特徴づけることができる細菌に関して、以下を挙げることができる：
−耐性及びタイピング・マーカーとしてＴＥＭ２を、更には毒性及びタイピング・マーカーとして志賀毒素、ＯｍｐＡを使用する大腸菌、
−耐性とタイピングについてＶａｎＡとＶａｎＢを、更には毒性とタイピングについてＥＳＰ（エンテロコッカス表面タンパク質）を使用する大便連鎖球菌、
−タイピングのために免疫グロブリンＧ−結合タンパク質Ａ（別名タンパク質Ａ）として知られるタンパク質を、耐性またはさらにタイピングのためにＰＢＰ２ａタンパク質として知られるタンパク質を、更には毒性のために又はタイピングのためにさえＰＶＬタンパク質として知られるタンパク質を使用する黄色ブドウ球菌。
【００１６】
本発明の方法に従って特徴づけることができる他の微生物について、以下を挙げることができる：
−耐性及びタイピング・マーカーとして１，３−ｂ−Ｄ−グルカンシンターゼ酵素または他にラノステロール・デメチラーゼ酵素を、更には毒性とタイピング・マーカーとしてのリパーゼ８使用するカンジダ・アルビカンス。
【００１７】
本発明の方法が実施されてもよい試料は、標的微生物を含む可能性がある任意の試料である。試料は、生物起源、すなわち動物、植物、ヒト起源であってもよい。それは、それから、生体液（例えば、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、器質性分泌）の標本、組織標本または単離細胞に対応してもよい。微生物を特徴づけるためのマーカーが試験された標本において利用可能な限り、この標本がそのまま使われてもよいし、あるいは解析の前に、公知の方法に従って、濃縮、抽出、濃度、精製および／または培養型の調製を受けてもよい。
【００１８】
試料は産業起源であってもよく、網羅的なリストではないが、空気の標本、水の標本、表面、目的物または製品から取られた標本または食物起源の生成物である。食物起源の試料の中で、非網羅的に、乳製品（ヨーグルト、チーズ）の、肉の、魚の、卵の、果物の、野菜の、水のまたは飲料（牛乳、果汁、ソーダ、その他）の試料を挙げることができる。また、食物起源のこれらの試料はソース又は調製された料理由来であってもよい。最後に、食物試料は、動物飼料（例えば特に動物の餌）に由来するものであってもよい。
【００１９】
微生物を特徴づけるためのマーカーがタンパク質起源のものである場合、質量分析による検出の上流で、分析される試料は、試料に存在する全てのタンパク質からペプチドを作成し、これらのタンパク質をペプチドに断片化するために、例えばタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）により、あるいは化学試薬の作用を介して、前処理されることが好ましい。実際、タンパク質は、物理化学的処理によって、生物学的処理によって、又は２つの処理の組合せによって切断されてもよい。使用することができる処理の中で、水酸基、特にＨ２Ｏ２による処理を挙げることができる。水酸基により処理によってペプチド結合の切断が生じて、それがタンパク質の任意のペプチド結合にランダムに起こる。水酸基の濃度は、作成された切断の数を調整し、従って、得られたペプチド断片の長さを調製する。更に他の化学処理が使われてもよく、例えば、メチオニル残基のカルボキシル基のレベルで特異的にペプチド結合を壊すブロモシアン（ＣＮＢｒ）による処理である。トリフルオロ酢酸中のタンパク質溶液を１０００°Ｃで加熱することによって、アスパラギン酸残基で部分的な酸分解を実施することができる。
【００２０】
それにもかかわらず酵素消化によるタンパク質の処理は、物理化学的治療と比較して好まれており、それはより広範囲にタンパク質の構造を保存し、制御により容易であるためである。「酵素消化」なる用語は、適切な反応条件下で一つ以上の酵素の単独の作用又は組合わせた作用を意味することを目的とする。タンパク質分解（プロテアーゼと呼ばれている）を実施する酵素は、特異的な部位でタンパク質を切断する。各々のプロテアーゼは、それが常に同じ切断を行うアミノ酸の配列を一般に認識する。特定のプロテアーゼは単一アミノ酸またはそれらの切断が実施される間の２つのアミノ酸配列を認識し、他のプロテアーゼはより長い配列だけを認識する。これらのプロテアーゼは、エンドプロテアーゼまたはエキソプロテアーゼであってもよい。既知のプロテアーゼの中で、ＷＯ２００５／０９８０７１にて説明したように、以下を挙げることができる：
−特異的酵素、例えばＡｒｇとＬｙｓ残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を分割するトリプシン、リジンの−ＣＯ基のペプチド結合を切断するエンドリシン、芳香族残基（Ｐｈｅ、ＴｙｒとＴｒｐ）のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を加水分解するキモトリプシン、芳香族残基（Ｐｈｅ、ＴｙｒとＴｒｐ）のＮＨ２基のレベルで切断するペプシン、Ｇｌｕ残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を切断する黄色ブドウ球菌のＶ８菌株のＶ８プロテアーゼ；
−非特異的酵素、例えば、疎水性アミノ酸（Ｘａａ−Ｌｅｕ、Ｘａａ−Ｉｌｅ、Ｘａａ−Ｐｈｅ）のＮＨ２基のペプチド結合を加水分解するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ細菌に起源するサーモライシン、事実上全ての結合を加水分解して制御された反応条件（酵素濃度と反応時間）の下でタンパク質をオリゴペプチドに変換できる細菌性プロテアーゼであるサブチリシンとプロナーゼ。
【００２１】
複数のプロテアーゼは、それらの作用方法が互換性を持つ場合、同時に使われてもよいか、またはそれらは連続して使われてもよい。本発明に関連して、試料の消化は、好ましくはプロテアーゼ酵素（例えばトリプシン）の作用を介して実施される。
化学試薬またはプロテアーゼを用いたペプチド類の生成は、溶液中の単純反応によって得られてもよい。それは、また、電子レンジ（文献１１）、又は圧力下（文献１２）、又は代わりに超音波装置によって実施されてもよい（文献１３）。後者３つの場合において、プロトコルは非常により迅速なものとなる。
したがって得られるペプチドの中で、タンパク質に特異的なペプチドは、プロテオタイプ・ペプチドと呼ばれている。質量分析によって検定されるのは、これらである。
【００２２】
本発明の一実施態様によれば、特徴づけマーカーは、特徴づけられる微生物のタンパク質である。特に、前記タンパク質は、好ましくは酵素によって、より好ましくは、トリプシンを有するペプチドによって消化される。
また、同様にタンパク質起源の特徴づけマーカーを含んでいる試料は精製目的のために前もって処理されてもよい。マーカーがタンパク質起源である場合、この精製前処理は上記の通りにペプチドを作成する工程の前か後に実施されてもよい。
【００２３】
試料精製前処理は当業者に広く知られており、特に遠心、濾過、泳動またはクロマトグラフィー技術を実施する場合がある。これらの分離技術は単独で使用されても、または多次元的分離を得るために他と組合わせられてもよい。例えば、多次元的クロマトグラフィーが、T. Fortin et al.（文献１４）又はH. Keshishian et al.（文献１５）に記載されるように、逆相クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを組合わせることによって使われてもよい。これらの刊行物において、クロマトグラフィー媒体は、カラムまたはカートリッジ（固相抽出）中にある場合がある。
【００２４】
プロテオタイプ・ペプチドの電気泳動的又はクロマトグラフィ分画（一次元又は多次元的クロマトグラフィーでの保持時間）は各ペプチドに特徴的であり、従ってこれらの技術の実施は分析されるプロテオタイプ・ペプチドの選択を可能にする。生成されたペプチドの上記分画は、質量分析によってその後のアッセイの特異性を増大することを可能にする。  
【００２５】
泳動またはクロマトグラフィー技術の代替法は、ペプチド分画のために、Ｎ−グリコペプチドを特異的に精製することにある（（文献１６）と特許出願ＷＯ２００８／０６６６２９）。それにもかかわらず、上記の精製は、Ｎ−グリコシル化タイプの翻訳後修飾を受けていたペプチドの定量を可能にするだけである。しかしながら、全てのタンパク質がグリコシル化されるというわけではなく、従ってその使用は制限される。
【００２６】
本発明の方法で実施される質量分析は、様々な種類の分子を分析して検出するための強力な道具として、当業者に広く知られている。通常、イオン化されてもよい任意の種類の分子は、質量分析計を使用してその分子量の関数として検出されてもよい。検出される分子の性質に従い、タンパク質または代謝起源の中で、特定の質量分析技術が、より適している場合がある。それにもかかわらず、検出のために使用される質量分析方法が何であれ、後者は分子イオンと言われるイオンへの標的分子のイオン化工程（この場合は特徴づけマーカーのイオン化工程）及び、それらの重量の関数として得られた分子イオンの分離工程を含む。
【００２７】
従って、全ての質量分析計は、
ｉ）分析される試料に存在するマーカーをイオン化するため、すなわちこれらのマーカーに正の又は負の電荷を与えるための、イオン源；
ｉｉ）質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、イオン化マーカーまたは分子イオンを分離するための質量分析器；
ｉｉｉ）以下に詳述されるように、分子イオンによって直接的に又は分子イオンからの産生されるイオンの何れかによって産生されるシグナルを測定するための検出器を含む。
【００２８】
質量分析を実施するために必要なイオン化工程は、当業者に知られている任意の方法で実施されてもよい。イオン源は、アッセイされる分子をイオン化とガス状態に導くことを可能にする。イオン源は、陽イオンを研究するための正のモード、または陰イオンを研究するための負のモードのいずれかで使用してもよい。複数種類の源が存在しており、所望の結果と分析される分子に応じて使われる。特に以下を挙げることができる：
−電子イオン化（ＥＩ）、化学イオン化（ＣＩ）及び脱着化学イオン化（ＤＣＩ）、
−高速原子衝撃（ＦＡＢ）、準安定性原子衝撃（ＭＡＢ）またはイオン衝撃（ＳＩＭ、ＬＳＩＭＳ）、
−誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、
−大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）と大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、
−エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）、
−マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面拡張レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）またはシリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯ）、
−準安定性種との相互作用によるイオン化−脱着（ＤＡＲＴ）。
【００２９】
特に、イオン化は、以下の通りに実施されてもよい：標的分子を含む試料はイオン源に導入され、ここで分子はガス状態でイオン化されて、したがって当初の分子に対応する分子イオンに変換される。エレクトロスプレー型のイオン源（エレクトロスプレー・イオン化のためのＥＳＩ）は分子をイオン化することを可能にし、それと同時に液体状態からガス状態まで通過させる。従って得られた分子イオンは液体状態に存在する分子に対応し、正のモードで、１、２、更には３つ又はそれ以上の追加的なプロトンは、１、２、更には３つ又はそれ以上の電荷を有する。例えば、標的分子がタンパク質である場合、正のモードで操作されたエレクトロスプレー型の源によって、標的タンパク質の分画後に得られたプロテオタイプなペプチドのイオン化は、１、２、更には３つ又はそれ以上の追加的なプロトンを有するガス状態のポリペプチド・イオンに結果としてなり、従ってそれは１、２、更には３つ又はそれ以上の電荷を有しており、液体状態からガス状態への変化を可能にする（文献１７）。得られた標的分子またはプロテオタイプなペプチドが逆相液体クロマトグラフィによって前もって分離される場合、このタイプの源は特に適切である。それにもかかわらず、試料に存在する分子のイオン化の収率は、濃度と存在するさまざまな種の性質に従って変化しうる。この現象は、当業者に知られているマトリックス効果に結果としてなる。
【００３０】
ＭＡＬＤＩイオン源は、固体状態の試料から分子をイオン化することを可能にする。
それらの質量／荷電比（ｍ／ｚ）の関数として、イオン化マーカーを分離する工程が実施される質量分析器は、当業者に知られている任意の質量分析器である。低解像度アナライザーは、四重極（Ｑ）、３Ｄイオントラップ（ＩＴ）または線形イオントラップ（ＬＩＴ）型、またはイオントラップと呼ばれるものを挙げることができ、検体の正確な質量を測定するために特に電気セクターと組合わせた磁気セクター高解像度アナライザー、飛行時間型（ＴＯＦ）を挙げることができる。
【００３１】
それらのｍ／ｚ比率によって分子イオンの分離は単回（一回の質量分析またはＭＳ）で実施されてもよく、でなければ、複数の連続したＭＳ分離が実施されうる。２回の連続したＭＳ分離が実施される場合、分析はＭＳ／ＭＳまたはＭＳ２と呼ばれる。３回の連続したＭＳ分離が実施される場合、分析はＭＳ／ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ３と呼ばれ、さらに一般的にいえば、ｎ回の連続したＭＳ分離が実施される場合、分析はＭＳｎと呼ばれている。
【００３２】
いくつかの連続した分離を実施する技術の中で、単一の標的分子の検出またはアッセイの場合にＳＲＭ法（選択反応監視）方法、あるいは複数の標的分子の検出またはアッセイの場合ＭＲＭ法（多重反応監視）は、特にＭＳ２分離の使用である。同様に、ＭＲＭ３方法は、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳによる分離の特定の使用である。次に、標的とされた質量分析が使われる。
一回のＭＳ方法での検出の場合、得られた分子イオンの質量／荷電比であり、検出される標的分子と相関している。
【００３３】
ＭＳ／ＭＳ方法の検出の場合、本質的に２つの工程が加えられ、ＭＳアッセイと比較される：
ｉ）第１世代断片イオンと呼ばれるイオンを生じるために、前駆体イオンと呼ばれる分子イオンを断片化すること、及び
ｉｉ）第１世代断片イオンと呼ばれるイオンをそれらの質量（ｍ／ｚ）２、前駆体イオンの比率（ｍ／ｚ）に対応する比率（ｍ／ｚ）１に従って分離すること。
従って、得られた第１世代断片イオンの質量／荷電比は、検出される標的分子と相関している。
【００３４】
「第１世代断片イオン」なる用語は、断片化工程のあとに前駆体イオンから生じたイオンであって、前駆体イオンとは異なる質量電荷比ｍ／ｚのイオンを意味する。
対（ｍ／ｚ）１と（ｍ／ｚ）２は遷移と名付けられ、検出される特徴的イオンの代表例である。
標的分子と相関させるために検出される特性イオンの選択は、標準方法に従って当業者によってなされる。それらの選択は、有利には、再現性と信頼性に関して、可能な限り感度が高く、可能な限り特異的であり、できる限り確固なアッセイに結果としてなる。プロテオタイプなペプチド（ｍ／ｚ）１の及び第一世代断片（ｍ／ｚ）２の選択のために開発された方法では、選択は反応の強度に本質的に基づく。更に詳しくは、V. Fusaro et al.（文献１８）を参照されたい。  アプライドバイオシステムまたは他にＭＲＭａｉｄの市販ソフト（ＭＩＤＡＳソフトウェアとＭＲＭパイロット）は、全てのありうる遷移の対を予測するために当業者によって使われてもよい。また、科学界で記載されている全てのペプチドＭＲＭ遷移をコンパイルするために、F. Desiere et al.（文献２０）によって構築された、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓと呼ばれているデータベースを使用してもよい。このＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓデータベースは、インターネットで自由に入手できる。非タンパク分子の場合に、例えばアプライドバイオシステム社（アメリカ合衆国）のＣｌｉｑｕｉｄソフトウェアによってアクセスできるデータベースを使用することが可能である。
【００３５】
プロテオタイプなペプチド、（ｍ／ｚ）１と（ｍ／ｚ）２を選択するための代替物アプローチは、他の研究の時に得られたＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルを使用することにある。これらの研究は、例えば、発見の段階とプロテオミック解析によるバイオマーカの同定の段階であってもよい。このアプローチは、ユーザ会議の間、Thermo Scientificによって提唱された（文献１９）。それは、ＳＩＥＶＥソフトウェア（Thermo Scientific）によって実験的に同定されたペプチドから候補遷移のリストを作成することが可能である。（ｍ／ｚ）１と（ｍ／ｚ）２イオンの選択の特定の基準については、J. Mead et al.（文献１９）により詳述されている。
・内部切断部位、すなわち内部リジンまたはアルギニンを有するペプチドは、リジンまたはアルギニンの後にプロリンが続かない限り、回避されるべきである。
・アスパラギンまたはグルタミンを有するペプチドは、それらが脱アミノ化されうるので、回避されるべきである。
・Ｎ末端グルタミンまたはグルタミン酸を有するペプチドは、それらが自発的に環化しうるので、回避されるべきである。
・メチオニンを有するペプチドは、それらが酸化されうるので、回避されるべきである。
・システインを有するペプチドは、それらがチオール基の変性、還元及びブロッキングのありうる工程の間に、再生産不可能に修飾されうるので、回避されるべきである。
・プロリンを有するペプチドは、それらが単一の非常に優勢なピークを有するＭＳ／ＭＳの強度の断片を通常産生するので、有利であると考えられる。しかしながら、単一の非常に支配的な断片は、複雑な混合物の遷移の同一性を確認することを可能にしない。実際、複数の特徴的断片が同時に存在する場合だけ、所望の前駆体イオンが実際に検出されることを確認することができる。
・Ｃ末端に隣接しているか（位置ｎ−１）か、またはＣ末端と関連する第二位置（位置ｎ−２）にプロリンを有するペプチドは、この場合、第一世代断片ペプチドのサイズが、十分な特異性を有するにはあまりにも小さいと通常は考えられるので回避される。
・前駆体より大きい質量を有する断片の選択は、特異性を促進するために好まれる。この場合、それは、二重電荷された前駆体イオンを選択して、前駆体（すなわち単一荷電された第一世代の断片イオン）より大きい質量を有する最も強い第一世代の断片イオンを選択する必要がある。
【００３６】
選択された前駆体イオンの断片化は、三連四重極型（文献２１）又はイオントラップ型（文献２２）、あるいはイオンを分離することを可能にする飛行時間（ＴＯＦ）型（文献２３）のモデルのような断片化セルで実施される。断片化は、従来どおり、電場においてアルゴンまたは窒素のような不活性ガスとの衝突によって、強度の光源、電子との衝突またはラジカル種を用いた光励起法または光解離によって、例えば飛行時間型の管での電位差の適用によって、または他のいかなる活性化方法によって実施される。電場の特性は、強度と断片化の性質を条件づける。したがって、不活性ガスの存在下でかけられる電場は、例えば四重極では、イオンに供給される衝突エネルギーを条件づける。この衝突エネルギーは、分析される遷移の感受性を増大するために、当業者によって最適化される。例えば、衝突エネルギーは、アプライドバイオシステム社（フォスター市、米国）のＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００の質量分析計では、ｑ２で５と１８０ｅ−Ｖの範囲で変化することが可能である。同様に、当業者によって、衝突ステップの期間と（例えばイオントラップの範囲内の）励起エネルギーは、最も感度が高いアッセイを作るために、最適化される。例えば、アプライドバイオシステム社のＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００の質量分析計では、Ｑ３では、この時間（励起時間と呼ばれている）は０．０１０から５０ｍｓの範囲で、励起エネルギーは０から１の範囲（任意単位）で変化させることが可能である。
【００３７】
最後に、イオンが選択した特徴あるイオンの検出は従来どおりに、特に検出器及び処理システムにより実施される。検出器はイオンを収集して、電気シグナルを産生して、その強度は収集されるイオン量によって決まる。次に得られた信号は増幅され、そのためコンピュータによって処理されてもよい。データ処理コンピュータ・アセンブリは、質量スペクトルに検出器が受ける情報を変換することを可能にする。
【００３８】
ＳＲＭ法あるいはＭＲＭ法の原理は、特異的に前駆体イオンを選択し、それを断片化し、次に特異的にその断片イオンの１つを選択することである。上記の適用のために、三連四重極型または三重四極−イオントラップ・ハイブリッドの装置が、通常使われる。
【００３９】
ＭＳ２法で使用する三重四極装置（Ｑ１ｑ２Ｑ３）の場合、標的タンパク質を分析するか又は検出するために、第一の四重極（Ｑ１）は分子イオンをろ過することを可能にし、分子イオンは分析されるタンパク質のプロテオタイプ・ペプチドに対応しており、それらの質量電荷比（ｍ／ｚ）に従って前の消化工程の間に得られる。求められているプロテオタイプ・ペプチドの質量／荷電比（（ｍ／ｚ）１と呼ばれる比率）を有するペプチドだけが第二の四重極（ｑ２）に送られて、続く断片化のための前駆体イオンの役割を演ずる。ｑ２分析器は、質量／荷電比（ｍ／ｚ）１のペプチドを第一世代の断片イオンに断片化することが可能である。断片化は、通常、前駆体ペプチドを不活化ガス（たとえばｑ２では窒素またはアルゴン）と衝突させることによって得られる。第一世代の断片イオンは第三の四重極（Ｑ３）に送られ、それは（ｍ／ｚ）２と呼ばれる特異的な質量電荷比に従って第一世代の断片イオンをろ過する。求められるプロテオタイプ・ペプチドの特徴的な断片の質量／荷電比（ｍ／ｚ）２を有する第一世代の断片イオンだけが、検出又は更には定量されるために検出器に送られる。
【００４０】
このオペレーティング・モードは、一つは前駆体イオンの選択について、一つは第一世代の断片イオンの選択について、二重選択性を有する。従って、ＳＲＭ法またはＭＲＭ法の質量分析は、定量のために有利である。
本発明の方法で実施される質量分析がタンデム型質量分析（ＭＳ２、ＭＳ３、ＭＳ４またはＭＳ５）である場合、複数の質量分析器は一緒に組合せられうる。例えば、第一の分析器はイオンを分離し、衝突セルはイオンを断片化することを可能にし、第二の分析器は断片イオンを分離する。
複数の分析器（例えばイオントラップまたはＦＴ−ＩＣＲ）は一つで複数の分析器を構成し、イオンを断片化し、直接断片を分析することができる。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、以下の特性の一つ以上を含む：
−質量分析（タイピング、少なくとも一つの抗菌物質に対する潜在的な耐性と病原性因子の特性のために実施される）はＭＳ／ＭＳ型のスペクトロメトリであり、検出又は定量される分子に特異的な断片を生み出して、次に高い特異性を有するアッセイ方法を提供するという効果がある；
−ＭＳ／ＭＳスペクトロメトリはＭＲＭであり、それは数十ミリ秒の質量分析計の分析循環時間を使用することが有利であり、多数の異なる分子のマルチプレックスな方法で、高い感受性によって検出又は定量することが可能である。
−タイピング、抗菌物質に対する耐性と毒性因子の特性の決定は、同じ質量分析装置で、好ましくは同時に、実施され、分析時間と計測器のコストを減じることに効果がある；更に、これは結果の処理と記録を促進する。
【００４２】
タイピング、抗菌物質に対する耐性と病原性因子の特性を決定することに加えて、試験される試料に存在する微生物を同定することが好ましい。
微生物を同定する方法は、例えば、P. R. Murray el al.(Manual of Clinical Microbiology, 2007, 9th edition)、特にVol. I, Section III, chapters 15及び16（細菌及び酵母）、Vol. II, Section VI, chapter 82（ウイルス）及びVol. II, Section X, chapter 135 （原生動物）に記載のとおり、当業者にとって広く公知である。従来の同定方法の例として、バイテック２同定カード（ビオメリュー）を用いて、又はある遺伝子の存在を調べること及びその配列を調べることに基づいた同定基準を用いた分子生物技術を使用した生物プロフィールを決定することを挙げることができる。
【００４３】
同定は、同定が行われる試料から直接に実施されてもよく、あるいは当業者に公知の方法により、Murray et al.,(Manual of Clinical Microbiology, 2007, 9th edition) Vol. I, Section III, chapter 14, 特にVol. I, Section IV, chapter 21（細菌）、 Vol. II, Section VI, chapter 81（ウイルス）、Vol. II, Section VIII, chapter 117（酵母）、及びVol. II, Section X, chapter 134（原生動物）に記載のとおり、求められる微生物の種に従って構成される最適培養条件によって培養することができる試料に含まれる微生物から直接に実施されてもよい。
【００４４】
従って、通常は、生化学の方法によって標本中の細菌を同定する場合に、まず第１に、例えば寒天への接種後に純粋培養で得ることが必要である。分子生物学（ＰＣＲ）は、特定の場合に、分析される試料に直接実施される。
微生物を培養する代わりに、後者は、活性表面の試料において、直接捕獲により濃縮されてもよい。上記の方法は、Ｆｅ３Ｏ４／ＴｉＯ２−活性化表面を有する磁気ビーズによってさまざまな細菌種を捕えたW.-J. Chen et al.（文献１１）等に記載されいる。他の手段による捕獲も可能であり、それは、例えばレクチン（文献２４）、抗体（文献２５）又はバンコマイシン（文献２６）による。従って、捕獲は微生物を濃縮し、培養工程を減らすか又は除くことさえ可能にする。これは、相当な時間節減に結果としてなる。
【００４５】
更に、同定は既に記載されている技術に従って、質量分析によって実施することができ、好ましくはＭＳによって、ＭＳ／ＭＳによって、あるいはＭＳ／ＭＳ型のスペクトロメトリに続くＭＳによって実施されてもよく、それは本発明の実施態様を構成する。更に、この場合、試料は、前もって培養工程（例えば寒天上の接種する）を受けてもよい。
ＭＳによる同定法の使用は、数分間、実施することができ、ただ一つの分析器を有する質量分析計、すなわちＭＳ／ＭＳで使用する直列型の質量分析計より複雑でない計測器を必要とするので有利である。
また、ＭＳ／ＭＳ型のスペクトロメトリが続くＭＳによる同定法の使用も有利である。ＭＳで観察されるイオンの同一性を確実にすることができ、それは分析の特異性を増大する。
ＭＲＭ型のＭＳ／ＭＳによる同定法の使用は、ＭＳ次にＭＳ／ＭＳの従来のアプローチよりも、より感度が高く、より単純であることが有利である。この方法は、ＭＳスペクトルの獲得とＭＳ／ＭＳスペクトルの獲得との間の情報を処理するために有効なソフトウェアも、ＭＳとＭＳ／ＭＳスペクトルのための機械パラメータの調節における任意の変更も何れも必要としない。  
【００４６】
ＭＳによる同定法は、S. Vaidyanathan（文献２７）あるいはR. Everley et al.（文献８）に記載されているように、粗試料上のエレクトロスプレー・ソースにより実施されてもよい。従って、ｍ／ｚの多様な範囲は微生物の同定を可能にする。S. Vaidyanathan et al.は、２００から２０００Ｔｈのウインドウを使用しており、R. Everley et al.は、６２０から２４５０Ｔｈのウインドウを使用している。更に、質量スペクトルは、タンパク質のチャージ状態から独立にタンパク質の質量にアクセスするためにデコンボリューション処理されてもよい。従って、R. Everley et al.は、ほぼ５０００から５００００Ｄａの質量を利用した。あるいは、Claydon et al.（文献３）及びT. Krishnamurthy and P. Ross（文献４）に記載のように、ＭＳによる同定法はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実施されてもよい。分析は、マススペクトルの獲得と専門ソフトウェアによる解釈の組合せである。それは極めて単純であり、数分間で実施できる。この同定法は、医療診断実験室に現在、拡がっている（文献２８）。  
【００４７】
試料に存在する細菌のタンパク質によるＭＳ次にＭＳ／ＭＳによる細菌の同定は、多くのチームにより広く実施されている。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａのペプチドームを研究したN. Manes et al.（文献２９）の最近の研究、又はタンパク質の消化後の細菌のプロテオームを研究したR. Nandakumar et al.（文献３０）又はL. Hernychova et al.（文献３１）の研究を挙げることができる。
【００４８】
従来法は
ｉ）ＭＳスペクトルを得ること、
ｉｉ）続いて、強い信号を有するＭＳスペクトルで観察される各前駆体イオンを選択すること、
ｉｉｉ）続いて、各前駆体イオンを断片化し、そのＭＳ／ＭＳスペクトルを得ること、
ｉｖ）観察されるＭＳ／ＭＳスペクトルに対応する確率が高いペプチドを同定するために、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ロンドン、英国）又はＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）のようなソフトウェアを介して、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＮＣＢＩのようなタンパク質データベースを調査することを含む。種の特徴を示すタンパク質またはペプチドが同定された場合、この方法は微生物の同定に結果としてなる。
【００４９】
さらに別の実施態様によれば、前記少なくとも一の微生物の同定は従来の同定法によって実施され、本発明の方法は、前記少なくとも一つの微生物の同定を確認する追加の工程を含み、確認工程は、微生物の同定のために既に記載されている技術に従って、質量分析によって実行される。
ある特定の実施態様によれば、確認工程の質量分析は、ＭＳ／ＭＳ型、好ましくはＭＲＭの質量分析である。
質量分析の使用の利点の１つは、分子の定量化に特に有用であることであり、本発明の場合は、タイピングの特性のマーカーであり、少なくとも一つの抗菌物質に耐性である。これを行うため、検出された電流の強さが使われ、それは標的分子の量と比例している。従って、測定される電流の強さは、存在する標的分子の量を決定するための定量的測定値として役立ててもよく、国際単位系の（ＳＩ）のｍｏｌ／ｍ３又はｋｇ／ｍ３型、又はこれらの単位の倍数または約数によって、又はＳＩ単位の通常の関数（その倍数又は約数を含む）によって表示されることを特徴とする。非限定的な例として、ｎｇ／ｍｌ又はｆｍｏｌ／ｌのような単位は、定量的測定を特徴づける単位である。
【００５０】
それにもかかわらず、校正は、検出されたイオンによって誘導される電流の強度に対応する、測定されたピークの領域を、分析される標的分子の量と相関させるために必要である。このために、本発明に関連して、質量分析において従来使用されている校正が実施されてもよい。T. Fortin et al.（文献１４）に記載のように、ＭＲＭアッセイは従来は、外部標準を使用するか、又は好ましくは内部標準を使用して校正される。標的分子がプロテオタイプなペプチドであるとき、関心のあるタンパク質を分析することが可能であり、標的プロテオタイプなペプチドの、従って関心のあるタンパク質の量と定量的測定値の間の相関は、分析される量が分かっている標準信号に比例する測定された信号を校正することによって得られる。校正は、校正曲線によって実施されてもよく、例えば多様な濃度（外部校正）での標準プロテオタイプなペプチドの連続注射によって得られるか、または好ましくは、重いペプチドを使用する内部校正によって内部標準として得られ、例えば以下に詳述するＡＱＵＡ、ＱｃｏｎＣＡＴまたはＰＳＡＱ法に従う。「重いペプチド」なる用語は、プロテオタイプなペプチドに対応するペプチドを意味するが、１又は複数の炭素１２（１２Ｃ）原子は炭素１３（１３Ｃ）と置き換えられ、および／または１又は複数の窒素１４（１４Ｎ）原子は窒素１５（１５Ｎ）と置き換えられる。
【００５１】
また、内部標準（ＡＱＵＡ）としての重いペプチドの使用は特許出願ＵＳ２００４／０２２９２８３において提案された。原理は、通常の天然同位体より重い同位体を含むアミノ酸で、人工的にプロテオタイプなペプチドを合成することである。上記のアミノ酸は、例えば、いくつかの炭素１２（１２Ｃ）原子を炭素１３（１３Ｃ）と置き換えることにより、またはいくつかの窒素１４（１４Ｎ）原子は窒素１５（１５Ｎ）と置き換えることにより得られる。従って、人工ペプチド（ＡＱＵＡ）は、天然ペプチドと（より高い質量を除いて）厳密に同じ物理化学的特性を有する。それは、通常は、所与の濃度で、質量分析によるアッセイの上流で、例えば興味がある試料のタンパク質の切断を導く処理と処理工程後に得られるペプチドの分画との間に、試料に加えられるその結果、ペプチドの分画の間、ＡＱＵＡペプチドは、アッセイされる天然ペプチドによって共精製される。従って、アッセイの場合に、２つのペプチドは同時に質量分析計に注入される。次に、それらはソースにおいて同じイオン化収率を経験する。天然ペプチドと濃度が分かっているＡＱＵＡペプチドのピーク領域の比較は、天然ペプチドの濃度を計算することができ、従ってアッセイされるタンパク質の濃度に戻ることができる。ＡＱＵＡ技術の変形は、ＱｃｏｎＣａｔという名前の下でJ.-M. Pratt et al.（文献３２）により提唱されている。更に、この変異体は特許出願ＷＯ２００６／１２８４９２に記載されている。それは、さまざまなＡＱＵＡペプチドを連結すること、及び重い組換えタンパク質の形態で人工ポリペプチドを産生することから成る。組換えタンパク質は、重同位体を含むアミノ酸によって合成される。この方法で、低いコストで複数のタンパク質の同時アッセイを調整するための標準を得ることか可能である。ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、タンパク質の切断を導く処理の上流で、タンパク質分画、変性、減少、そしてタンパク質のチオール基のブロッキング工程がある場合にはこれらの前に、最初から加えられる。従って、ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、天然タンパク質と同じタンパク質の切断を導く処理のサイクルを受けるので、それによりタンパク質の切断を導く処理工程からの収率を考慮に入れることを可能にする。これは、天然タンパク質の処理が、特に消化によって完了しないかもしれないという理由である。この場合、ＡＱＵＡ標準の使用は、過小評価された天然タンパク質の量に結果としてなる。従って、絶対アッセイのために、タンパク質の切断を導く処理からの収率を考慮に入れることは重要である場合がある。しかしながら、V. Brun et al.（文献３３）は、ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、天然タンパク質の処理（特に消化による）からの収率を必ずしも再現せず、これはＱｃｏｎＣＡＴタンパク質の異なる三次元立体構造によることは疑いないことを示した。
【００５２】
従って、V. Brun et al.（文献３３）は、特許出願ＷＯ２００８／１４５７６３に記載されているＰＳＡＱと呼ばれている方法を使用することを提案した。この場合、天然タンパク質と同じ配列を有するが、重いアミノ酸によって合成された内部標準は組換えタンパク質である。合成は、重いアミノ酸によりエクスビボで実施される。この標準は、天然タンパク質（より高い質量を除いて）と厳密に同じ物理化学的特性を有する。前記工程がある場合に、それはタンパク質分画工程の前に、最初から加えられる。従って、タンパク質分画工程の間、それは天然タンパク質によって共精製される。それは、処理、特に消化によって、天然タンパク質と同じ収率を呈する。ペプチド分画工程が実施される場合、切断後に得られた重いペプチドも、天然ペプチドによって共精製される。従って、２つのペプチドは同時に質量分析計に注入されて、それにより量的にアッセイされる。従って、それらは、ソースにおいて同じイオン化収率を経験する。アッセイ方法の全工程を考慮すると共に、天然ペプチドと対照標準ペプチドのピーク領域のＰＳＡＱ法での比較は、アッセイされるタンパク質の濃度を計算することを可能にする。
【００５３】
質量分析によるアッセイ、特にＭＲＭまたはＭＳアッセイで使用されるこれら全ての技術、すなわちＡＱＵＡ、ＱｃｏｎＣＡＴ、又はＰＳＡＱ、又は他の任意のキャリブレーション技術は、本発明に関して、キャリブレーションを実施するために実装される場合がある。
【００５４】
好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、黄色ブドウ球菌の特徴づけを可能にする。
特に、黄色ブドウ球菌の特徴づけは、以下のように、少なくとも一つのペプチドを使用する。
１．タイピングについて
以下の配列を有するタンパク質Ａに属する少なくとも１つのペプチド、配列番号１：
MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
好ましくは、以下に定義する配列番号２、３、４、５、６、７及び８の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000002
【００５５】
２．少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的耐性について
以下の配列を有するＰＢＰ２ａタンパク質に属している少なくとも一つのペプチド、配列番号９：
KIKIVPLILIVVVVGFGIYFYASKDKEINNTIDAIEDKNFKQVYKDSSYISKSDNGEVEMTERPIKIYNSLGVKDINIQDRKIKKVSKNKKRVDAQYKIKTNYGNIDRNVQFNFVKEDGMWKLDWDHSVIIPGMQKDQSIHIENLKSERGKILDRNNVELANTGTAYEIGIVPKNVSKKDYKAIAKELSISEDYIKQQMDQNWVQDDTFVPLKTVKKMDEYLSDFAKKFHLTTNETESRNYPLEKATSHLLGYVGPINSEELKQKEYKGYKDDAVIGKKGLEKLYDKKLQHEDGYRVTIVDDNSNTIAHTLIEKKKKDGKDIQLTIDAKVQKSIYNNMKNDYGSGTAIHPQTGELLALVSTPSYDVYPFMYGMSNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTAMIGLNNKTLDDKTSYKIDGKGWQKDKSWGGYNVTRYEVVNGNIDLKQAIESSDNIFFARVALELGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPFYNAQISNKNLDNEILLADSGYGQGEILINPVQILSIYSALENNGNINAPHLLKDTKNKVWKKNIISKENINLLTDGMQQVVNKTHKEDIYRSYANLIGKSGTAELKMKQGETGRQIGWFISYDKDNPNMMMAINVKDVQDKGMASYNAKISGKVYDELYENGNKKYDIDE
好ましくは、以下に定義する配列番号１０から１７の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000003
【００５６】
３．毒性について：
ＰＶＬタンパク質、サブユニットＬｕｋＳおよびＬｕｋＦ（以下の配列番号１８および２２の配列をそれぞれ有する）に属している少なくとも一つのペプチド
配列番号１８：
MIFMVKKRLLAATLSLGIITPIATSFHESKADNNIENIGDGAEVVKRTEDTSSDKWGVTQNIQVDFVKDKKYNKDALILKMQGFINSKTTYYNYKNTDHIKAMRWPFQYNIGLKTNDPNVDLINYLPKNKIDSVNVSQTLGYNIGGNFNSGPSTGGNGSFNYSKTISYNQQNYISEVERQNSKSVQWGIKANSFITSLGKMSGHDPNLFVGYKPYSQNPRDYFVPDNELPPLVHSGFNPSFIATVSHEKGSGDTSEFEITYGRNMDVTHATRRTTHYGNSYLEGSRIHNAFVNRNYTVKYEVNWKTHEIKVKGHN
配列番号２２：
MKKIVKSSVVTSIALLLLSNTVDAAQHITPVSEKKVDDKITLYKTTATSDSDKLKISQILTFNFIKDKSYDKDTLILKAAGNIYSGYTKPNPKDTISSQFYWGSKYNISINSDSNDSVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTVGYSYGGDINISNGLSGGGNGSKSFSETINYKQESYRTSLDKRTNFKKIGWDVEAHKIMNNGWGPYGRDSYHSTYGNEMFLGSRQSNLNAGQNFLEYHKMPVLSRGNFNPEFIGVLSRKQNAAKKSKITVTYQREMDRYTNFWNQLHWIGNNYKDENRATHTSIYEVDWENHTVKLIDTQSKEKNPMS
【００５７】
好ましくは、以下に定義する配列番号１９、２０、２１、２３及び２４の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000004
【００５８】
４．同定について：
５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０（ＲＬ３０）、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３３１（ＲＬ３３１）、ブドウ球菌分泌抗原ｓｓａＡ２（ＳＳＡＡ２）、ＵＰＦ０３３７タンパク質ＳＡ０７７２（Ｙ７７２）、二官能性自己消化酵素（ＡＴＬ）、伸長因子Ｔｕ（ＥＦＴＵ）、推定トランスグリコシラーゼｉｓａＡ（ＩＳＡＡ）およびＵＰＦ０４５７タンパク質ＳＡ１９７５．１（Ｙ１９７Ａ）に属しており、配列番号２５、２８、３１、３３、３６、３９、４１および４３の配列をそれぞれ有している少なくとも一つのペプチド：
配列番号２５：
MAKLQITLTRSVIGRPETQRKTVEALGLKKTNSSVVVEDNPAIRGQINKVKHLVTVEEK
配列番号２８：
MRVNVTLACTECGDRNYITTKNKRNNPERVEMKKFCSRENKQTLHRETK
配列番号３１：
MKKIATATIATAGFATIAIASGNQAHASEQDNYGYNPNDPTSYSYTYTIDAQGNYHYTWKGNWHPSQLNQDNGYYSYYYYNGYNNYNNYNNGYSYNNYSRYNNYSNNNQSYNYNNYNSYNTNSYRTGGLGASYSTSSNNVQVTTTMAPSSNGRSISSGYTSGRNLYTSGQCTYYVFDRVGGKIGSTWGNASNWANAAARAGYTVNNTPKAGAIMQTTQGAYGHVAYVESVNSNGSVRVSEMNYGYGPGVVTSRTISASQAAGYNFIH
配列番号３３：
MADESKFEQAKGNVKETVGNVTDNKNLENEGKEDKASGKAKEFVENAKEKATDFIDKVKGNKGE
配列番号３６：
MAKKFNYKLPSMVALTLVGSAVTAHQVQAAETTQDQTTNKNVLDSNKVKATTEQAKAEVKNPTQNISGTQVYQDPAIVQPKTANNKTGNAQVSQKVDTAQVNGDTRANQSATTNNTQPVAKSTSTTAPKTNTNVTNAGYSLVDDEDDNSEHQINPELIKSAAKPAALETQYKAAAPKAKTEATPKVTTFSASAQPRSVAATPKTSLPKYKPQVNSSINDYIRKNNLKAPKIEEDYTSYFPKYAYRNGVGRPEGIVVHDTANDRSTINGEISYMKNNYQNAFVHAFVDGDRIIETAPTDYLSWGVGAVGNPRFINVEIVHTHDYASFARSMNNYADYAATQLQYYGLKPDSAEYDGNGTVWTHYAVSKYLGGTDHADPHGYLRSHNYSYDQLYDLINEKYLIKMGKVAPWGTQFTTTPTTPSKPTTPSKPSTGKLTVAANNGVAQIKPTNSGLYTTVYDKTGKATNEVQKTFAVSKTATLGNQKFYLVQDYNSGNKFGWVKEGDVVYNTAKSPVNVNQSYSIKSGTKLYTVPWGTSKQVAGSVSGSGNQTFKASKQQQIDKSIYLYGSVNGKSGWVSKAYLVDTAKPTPTPIPKPSTPTTNNKLTVSSLNGVAQINAKNNGLFTTVYDKTGKPTKEVQKTFAVTKEASLGGNKFYLVKDYNSPTLIGWVKQGDVIYNNAKSPVNVMQTYTVKPGTKLYSVPWGTYKQEAGAVSGTGNQTFKATKQQQIDKSIYLFGTVNGKSGWVSKAYLAVPAAPKKAVAQPKTAVKAYTVTKPQTTQTVSKIAQVKPNNTGIRASVYEKTAKNGAKYADRTFYVTKERAHGNETYVLLNNTSHNIPLGWFNVKDLNVQNLGKEVKTTQKYTVNKSNNGLSMVPWGTKNQVILTGNNIAQGTFNATKQVSVGKDVYLYGTINNRTGWVNAKDLTAPTAVKPTTSAAKDYNYTYVIKNGNGYYYVTPNSDTAKYSLKAFNEQPFAVVKEQVINGQTWYYGKLSNGKLAWIKSTDLAKELIKYNQTGMTLNQVAQIQAGLQYKPQVQRVPGKWTDANFNDVKHAMDTKRLAQDPALKYQFLRLDQPQNISIDKINQFLKGKGVLENQGAAFNKAAQMYGINEVYLISHALLETGNGTSQLAKGADVVNNKVVTNSNTKYHNVFGIAAYDNDPLREGIKYAKQAGWDTVSKAIVGGAKFIGNSYVKAGQNTLYKMRWNPAHPGTHQYATDVDWANINAKIIKGYYDKIGEVGKYFDIPQYK
配列番号３９：
MAKEKFDRSKEHANIGTIGHVDHGKTTLTAAIATVLAKNGDSVAQSYDMIDNAPEEKERGITINTSHIEYQTDKRHYAHVDCPGHADYVKNMITGAAQMDGGILVVSAADGPMPQTREHILLSRNVGVPALVVFLNKVDMVDDEELLELVEMEVRDLLSEYDFPGDDVPVIAGSALKALEGDAQYEEKILELMEAVDTYIPTPERDSDKPFMMPVEDVFSITGRGTVATGRVERGQIKVGEEVEIIGLHDTSKTTVTGVEMFRKLLDYAEAGDNIGALLRGVAREDVQRGQVLAAPGSITPHTEFKAEVYVLSKDEGGRHTPFFSNYRPQFYFRTTDVTGVVHLPEGTEMVMPGDNVEMTVELIAPIAIEDGTRFSIREGGRTVGSGVVTEIIK
配列番号４１：
MKKTIMASSLAVALGVTGYAAGTGHQAHAAEVNVDQAHLVDLAHNHQDQLNAAPIKDGAYDIHFVKDGFQYNFTSNGTTWSWSYEAANGQTAGFSNVAGADYTTSYNQGSNVQSVSYNAQSSNSNVEAVSAPTYHNYSTSTTSSSVRLSNGNTAGATGSSAAQIMAQRTGVSASTWAAIIARESNGQVNAYNPSGASGLFQTMPGWGPTNTVDQQINAAVKAYKAQGLGAWGF
配列番号４３：
MAMTVKKDNNEVRIQWRVADIKIPTSEIKNITQDQDIHAVPKLDSKDVSRIGSTFGKTNRVIIDTEDHEYIIYTQNDQKVYNELTK
【００５９】
好ましくは、以下に定義する配列番号２６、２７、２９、３０、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４２、４４及び４５の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000005
前述のように、タイピングのために、本発明の方法は、更に、少なくとも一つの抗生物質または毒性に対する潜在的耐性を決定するために役立つ、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４２、４４および４５の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用できることに注目されたい。
当然ながら「少なくとも一つのペプチド」なる用語は、検出することが求められるマーカーを代表する、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ又はそれ以上のペプチドを意味することを目的とする。好ましくは、特徴につき、少なくとも２つ、または更に少なくとも３つ、または少なくとも４つのペプチドが使われる。
【００６０】
他の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は大腸菌の特徴づけを可能にする。
特に、大腸菌の特徴づけは、以下の通りに少なくとも一つのペプチドを使用する。
１．タイピングについて：
アスパラギン酸アンモニアリアーゼ・タンパク質（ＡＳＰＡ）、ＡＴＰシンターゼαサブユニット（ＡＴＰＡ）、１０ｋＤａのシャペロニン（ＣＨ１０）、６０ｋＤａのシャペロニン（ＣＨ６０）、ＤＮＡ結合性タンパク質ＨＵ−β（ＤＢＨＢ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＤＣＥＢ）、コハク酸デヒドロゲナーゼ・プラビンタンパク質サブユニット（ＤＨＳＡ）、飢餓の間のＤＮＡ保護タンパク質（ＤＰＳ）、ＤＮＡ結合性タンパク質Ｈ−ＮＳ（ＨＮＳ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼシンターゼ（ＰＵＲ７）、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ４（ＲＬ４）、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１（ＲＳ１）、ＵＰＦ００７６タンパク質ｙｊｇＦ（ＹＪＧＦ）に属している少なくとも一つのペプチド（それぞれ、以下の配列番号１３８から１５２の配列を有する）：
配列番号１３８
MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ
配列番号１３９
MQLNSTEISELIKQRIAQFNVVSEAHNEGTIVSVSDGVIRIHGLADCMQGEMISLPGNRYAIALNLERDSVGAVVMGPYADLAEGMKVKCTGRILEVPVGRGLLGRVVNTLGAPIDGKGPLDHDGFSAVEAIAPGVIERQSVDQPVQTGYKAVDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTALAIDAIINQRDSGIKCIYVAIGQKASTISNVVRKLEEHGALANTIVVVATASESAALQYLAPYAGCAMGEYFRDRGEDALIIYDDLSKQAVAYRQISLLLRRPPGREAFPGDVFYLHSRLLERAARVNAEYVEAFTKGEVKGKTGSLTALPIIETQAGDVSAFVPTNVISITDGQIFLETNLFNAGIRPAVNPGISVSRVGGAAQTKIMKKLSGGIRTALAQYRELAAFSQFASDLDDATRKQLDHGQKVTELLKQKQYAPMSVAQQSLVLFAAERGYLADVELSKIGSFEAALLAYVDRDHAPLMQEINQTGGYNDEIEGKLKGILDSFKATQSW
配列番号１４０
MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA
配列番号１４１
MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNVVLDKSFGAPTITKDGVSVAREIELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQVGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVEDGTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADKKISNIREMLPVLEAVAKAGKPLLIIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTVISEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDREKLQERVAKLAGGVAVIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALIRVASKLADLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQIVLNCGEEPSVVANTVKGGDGNYGYNAATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAADLGAAGGMGGMGGMGGMM
配列番号１４２
MNKSQLIDKIAAGADISKAAAGRALDAIIASVTESLKEGDDVALVGFGTFAVKERAARTGRNPQTGKEITIAAAKVPSFRAGKALKDAVN
配列番号１４３
MDKKQVTDLRSELLDSRFGAKSISTIAESKRFPLHEMRDDVAFQIINDELYLDGNARQNLATFCQTWDDENVHKLMDLSINKNWIDKEEYPQSAAIDLRCVNMVADLWHAPAPKNGQAVGTNTIGSSEACMLGGMAMKWRWRKRMEAAGKPTDKPNLVCGPVQICWHKFARYWDVELREIPMRPGQLFMDPKRMIEACDENTIGVVPTFGVTYTGNYEFPQPLHDALDKFQADTGIDIDMHIDAASGGFLAPFVAPDIVWDFRLPRVKSISASGHKFGLAPLGCGWVIWRDEEALPQELVFNVDYLGGQIGTFAINFSRPAGQVIAQYYEFLRLGREGYTKVQNASYQVAAYLADEIAKLGPYEFICTGRPDEGIPAVCFKLKDGEDPGYTLYDLSERLRLRGWQVPAFTLGGEATDIVVMRIMCRRGFEMDFAELLLEDYKASLKYLSDHPKLQGIAQQNSFKHT
配列番号１４４
MKLPVREFDAVVIGAGGAGMRAALQISQSGQTCALLSKVFPTRSHTVSAQGGITVALGNTHEDNWEWHMYDTVKGSDYIGDQDAIEYMCKTGPEAILELEHMGLPFSRLDDGRIYQRPFGGQSKNFGGEQAARTAAAADRTGHALLHTLYQQNLKNHTTIFSEWYALDLVKNQDGAVVGCTALCIETGEVVYFKARATVLATGGAGRIYQSTTNAHINTGDGVGMAIRAGVPVQDMEMWQFHPTGIAGAGVLVTEGCRGEGGYLLNKHGERFMERYAPNAKDLAGRDVVARSIMIEIREGRGCDGPWGPHAKLKLDHLGKEVLESRLPGILELSRTFAHVDPVKEPIPVIPTCHYMMGGIPTKVTGQALTVNEKGEDVVVPGLFAVGEIACVSVHGANRLGGNSLLDLVVFGRAAGLHLQESIAEQGALRDASESDVEASLDRLNRWNNNRNGEDPVAIRKALQECMQHNFSVFREGDAMAKGLEQLKVIRERLKNARLDDTSSEFNTQRVECLELDNLMETAYATAVSANFRTESRGAHSRFDFPDRDDENWLCHSLYLPESESMTRRSVNMEPKLRPAFPPKIRTY
配列番号１４５
MSTAKLVKSKATNLLYTRNDVSDSEKKATVELLNRQVIQFIDLSLITKQAHWNMRGANFIAVHEMLDGFRTALIDHLDTMAERAVQLGGVALGTTQVINSKTPLKSYPLDIHNVQDHLKELADRYAIVANDVRKAIGEAKDDDTADILTAASRDLDKFLWFIESNIE
配列番号１４６
MSEALKILNNIRTLRAQARECTLETLEEMLEKLEVVVNERREEESAAAAEVEERTRKLQQYREMLIADGIDPNELLNSLAAVKSGTKAKRAQRPAKYSYVDENGETKTWTGQGRTPAVIKKAMDEQGKSLDDFLIKQ
配列番号１４７
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDATPALEGANVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAAEVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGVSFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAYVEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEKNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
配列番号１４８
MSVIKMTDLDLAGKRVFIRADLNVPVKDGKVTSDARIRASLPTIELALKQGAKVMVTSHLGRPTEGEYNEEFSLLPVVNYLKDKLSNPVRLVKDYLDGVDVAEGELVVLENVRFNKGEKKDDETLSKKYAALCDVFVMDAFGTAHRAQASTHGIGKFADVACAGPLLAAELDALGKALKEPARPMVAIVGGSKVSTKLTVLDSLSKIADQLIVGGGIANTFIAAQGHDVGKSLYEADLVDEAKRLLSTCNIPVPSDVRVATEFSETAPATLKSVNDVKADEQILDIGDASAQELAEILKNAKTILWNGPVGVFEFPNFRKGTEIVANAIADSEAFSIAGGGDTLAAIDLFGIADKISYISTGGGAFLEFVEGKVLPAVAMLEERAKK
配列番号１４９
MQKQAELYRGKAKTVYSTENPDLLVLEFRNDTSAGDGARIEQFDRKGMVNNKFNYFIMSKLAEAGIPTQMERLLSDTECLVKKLDMVPVECVVRNRAAGSLVKRLGIEEGIELNPPLFDLFLKNDAMHDPMVNESYCETFGWVSKENLARMKELTYKANDVLKKLFDDAGLILVDFKLEFGLYKGEVVLGDEFSPDGSRLWDKETLEKMDKDRFRQSLGGLIEAYEAVARRLGVQLD
配列番号１５０
MELVLKDAQSALTVSETTFGRDFNEALVHQVVVAYAAGARQGTRAQKTRAEVTGSGKKPWRQKGTGRARSGSIKSPIWRSGGVTFAARPQDHSQKVNKKMYRGALKSILSELVRQDRLIVVEKFSVEAPKTKLLAQKLKDMALEDVLIITGELDENLFLAARNLHKVDVRDATGIDPVSLIAFDKVVMTADAVKQVEEMLA
配列番号１５１
MTESFAQLFEESLKEIETRPGSIVRGVVVAIDKDVVLVDAGLKSESAIPAEQFKNAQGELEIQVGDEVDVALDAVEDGFGETLLSREKAKRHEAWITLEKAYEDAETVTGVINGKVKGGFTVELNGIRAFLPGSLVDVRPVRDTLHLEGKELEFKVIKLDQKRNNVVVSRRAVIESENSAERDQLLENLQEGMEVKGIVKNLTDYGAFVDLGGVDGLLHITDMAWKRVKHPSEIVNVGDEITVKVLKFDRERTRVSLGLKQLGEDPWVAIAKRYPEGTKLTGRVTNLTDYGCFVEIEEGVEGLVHVSEMDWTNKNIHPSKVVNVGDVVEVMVLDIDEERRRISLGLKQCKANPWQQFAETHNKGDRVEGKIKSITDFGIFIGLDGGIDGLVHLSDISWNVAGEEAVREYKKGDEIAAVVLQVDAERERISLGVKQLAEDPFNNWVALNKKGAIVTGKVTAVDAKGATVELADGVEGYLRASEASRDRVEDATLVLSVGDEVEAKFTGVDRKNRAISLSVRAKDEADEKDAIATVNKQEDANFSNNAMAEAFKAAKGE
配列番号１５２
MSKTIATENAPAAIGPYVQGVDLGNMIITSGQIPVNPKTGEVPADVAAQARQSLDNVKAIVEAAGLKVGDIVKTTVFVKDLNDFATVNATYEAFFTEHNATFPARSCVEVARLPKDVKIEIEAIAVRR
【００６１】
好ましくは、以下に定義する配列番号６７から８４の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000006
2013508675.tif 000007
【００６２】
２．少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的耐性について
配列番号１２６の配列を有するＴＥＭ−２  β−ラクタマーゼタンパク質（ＴＥＭ−２）に属する少なくとも一つのペプチド：
配列番号１２６：
HPETLVKVKDAEDKLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGVGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW
好ましくは、以下に定義する配列番号６２から６６の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000008
【００６３】
３．毒性について
配列番号１５３及び１５４の配列をそれぞれ有する志賀毒素１サブユニットＡタンパク質（ＳＴＸ１Ａ）、志賀毒素２サブユニットＡタンパク質（ＳＴＸ２Ａ）又は両方に属している少なくとも一つのペプチド
配列番号１５３  
MKIIIFRVLTFFFVIFSVNVVAKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
配列番号１５４  
MKCILFKWVLCLLLGFSSVSHSREFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALVEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVRAVNEDSQPECQITGDRPVIKINNTLWESNTAAAFLNRKSQFLYTTGK
【００６４】
好ましくは、以下に定義する配列番号８５、８６及び８７の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000009
【００６５】
４．同定について
アコニット酸ヒドラターゼ２（ＡＣＯＮ２）、Ｌ−アスパラギナーゼ２（ＡＳＰＧ２）、３−オキソアシル−［アシルキャリアータンパク質］合成酵素１（ＦＡＢＢ）、グルタミン結合性ペリプラズマタンパク質（ＧＬＮＨ）、モリブデン酸結合性ペリプラズマタンパク質（ＭＯＤＡ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＤＰ２）のジヒドロ・リポイルリシン残基アセチルトランスフェラーゼ構成成分、外膜タンパク質Ｃ（ＯＭＰＣ）、蟻酸アセチルトランスフェラーゼ１（ＰＦＬＢ）、スクシニル−ＣｏＡリガーゼ［ＡＤＰ−形成］サブユニットα（ＳＵＣＤ）、トランスケトラーゼ１（ＴＫＴ１）、ＵＰＦ０３８１タンパク質ｙｆｃＺ（ＹＦＣＺ）、特徴づけされていないタンパク質ｙｇａＵ（ＹＧＡＵ）に属している少なくとも一つのペプチド（それぞれ、以下の配列番号１２７から１３５、１７６、１３６および１３７の配列を有する）：
配列番号１２７
MLEEYRKHVAERAAEGIAPKPLDANQMAALVELLKNPPAGEEEFLLDLLTNRVPPGVDEAAYVKAGFLAAIAKGEAKSPLLTPEKAIELLGTMQGGYNIHPLIDALDDAKLAPIAAKALSHTLLMFDNFYDVEEKAKAGNEYAKQVMQSWADAEWFLNRPALAEKLTVTVFKVTGETNTDDLSPAPDAWSRPDIPLHALAMLKNAREGIEPDQPGVVGPIKQIEALQQKGFPLAYVGDVVGTGSSRKSATNSVLWFMGDDIPHVPNKRGGGLCLGGKIAPIFFNTMEDAGALPIEVDVSNLNMGDVIDVYPYKGEVRNHETGELLATFELKTDVLIDEVRAGGRIPLIIGRGLTTKAREALGLPHSDVFRQAKDVAESDRGFSLAQKMVGRACGVKGIRPGAYCEPKMTSVGSQDTTGPMTRDELKDLACLGFSADLVMQSFCHTAAYPKPVDVNTHHTLPDFIMNRGGVSLRPGDGVIHSWLNRMLLPDTVGTGGDSHTRFPIGISFPAGSGLVAFAAATGVMPLDMPESVLVRFKGKMQPGITLRDLVHAIPLYAIKQGLLTVEKKGKKNIFSGRILEIEGLPDLKVEQAFELTDASAERSAAGCTIKLNKEPIIEYLNSNIVLLKWMIAEGYGDRRTLERRIQGMEKWLANPELLEADADAEYAAVIDIDLADIKEPILCAPNDPDDARPLSAVQGEKIDEVFIGSCMTNIGHFRAAGKLLDAHKGQLPTRLWVAPPTRMDAAQLTEEGYYSVFGKSGARIEIPGCSLCMGNQARVADGATVVSTSTRNFPNRLGTGANVFLASAELAAVAALIGKLPTPEEYQTYVAQVDKTAVDTYRYLNFNQLSQYTEKADGVIFQTAV
配列番号１２８
MEFFKKTALAALVMGFSGAALALPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVVNIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKTDGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNAVVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDVTKTNTTDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPKVGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDGIVSAGVGNGNLYKSVFDTLATAAKTGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFVASGTLNPQKARVLLQLALTQTKDPQQIQQIFNQY
配列番号１２９
MKRAVITGLGIVSSIGNNQQEVLASLREGRSGITFSQELKDSGMRSHVWGNVKLDTTGLIDRKVVRFMSDASIYAFLSMEQAIADAGLSPEAYQNNPRVGLIAGSGGGSPRFQVFGADAMRGPRGLKAVGPYVVTKAMASGVSACLATPFKIHGVNYSISSACATSAHCIGNAVEQIQLGKQDIVFAGGGEELCWEMACEFDAMGALSTKYNDTPEKASRTYDAHRDGFVIAGGGGMVVVEELEHALARGAHIYAEIVGYGATSDGADMVAPSGEGAVRCMKMAMHGVDTPIDYLNSHGTSTPVGDVKELAAIREVFGDKSPAISATKAMTGHSLGAAGVQEAIYSLLMLEHGFIAPSINIEELDEQAAGLNIVTETTDRELTTVMSNSFGFGGTNATLVMRKLKD
配列番号１３０
MKSVLKVSLAALTLAFAVSSHAADKKLVVATDTAFVPFEFKQGDKYVGFDVDLWAAIAKELKLDYELKPMDFSGIIPALQTKNVDLALAGITITDERKKAIDFSDGYYKSGLLVMVKANNNDVKSVKDLDGKVVAVKSGTGSVDYAKANIKTKDLRQFPNIDNAYMELGTNRADAVLHDTPNILYFIKTAGNGQFKAVGDSLEAQQYGIAFPKGSDELRDKVNGALKTLRENGTYNEIYKKWFGTEPK
配列番号１３１
MARKWLNLFAGAALSFAVAGNALADEGKITVFAAASLTNAMQDIATQFKKEKGVDVVSSFASSSTLARQIEAGAPADLFISADQKWMDYAVDKKAIDTATRQTLLGNSLVVVAPKASVQKDFTIDSKTNWTSLLNGGRLAVGDPEHVPAGIYAKEALQKLGAWDTLSPKLAPAEDVRGALALVERNEAPLGIVYGSDAVASKGVKVVATFPEDSHKKVEYPVAVVEGHNNATVKAFYDYLKGPQAAEIFKRYGFTIK
配列番号１３２
MAIEIKVPDIGADEVEITEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPSPQAGIVKEIKVSVGDKTQTGALIMIFDSADGAADAAPAQAEEKKEAAPAAAPAAAAAKDVNVPDIGSDEVEVTEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGTVKEIKVNVGDKVSTGSLIMVFEVAGEAGAAAPAAKQEAAPAAAPAPAAGVKEVNVPDIGGDEVEVTEVMVKVGDKVAAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKELKVNVGDKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKAEGKSEFAENDAYVHATPLIRRLAREFGVNLAKVKGTGRKGRILREDVQAYVKEAIKRAEAAPAATGGGIPGMLPWPKVDFSKFGEIEEVELGRIQKISGANLSRNWVMIPHVTHFDKTDITELEAFRKQQNEEAAKRKLDVKITPVVFIMKAVAAALEQMPRFNSSLSEDGQRLTLKKYINIGVAVDTPNGLVVPVFKDVNKKGIIELSRELMTISKKARDGKLTAGEMQGGCFTISSIGGLGTTHFAPIVNAPEVAILGVSKSAMEPVWNGKEFVPRLMLPISLSFDHRVIDGADGARFITIINNTLSDIRRLVM
配列番号１３３
MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEVYNKDGNKLDLYGKVDGLHYFSDDKSVDGDQTYMRLGFKGETQVTDQLTGYGQWEYQIQGNSAENENNSWTRVAFAGLKFQDVGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQGKNGSVSGEGMTNNGREALRQNGDGVGGSITYDYEGFGIGAAVSSSKRTDDQNSPLYIGNGDRAETYTGGLKYDANNIYLAAQYTQTYNATRVGSLGWANKAQNFEAVAQYQFDFGLRPSLAYLQSKGKNLGVINGRNYDDEDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF
配列番号１３４
MSELNEKLATAWEGFTKGDWQNEVNVRDFIQKNYTPYEGDESFLAGATEATTTLWDKVMEGVKLENRTHAPVDFDTAVASTITSHDAGYINKQLEKIVGLQTEAPLKRALIPFGGIKMIEGSCKAYNRELDPMIKKIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRVALYGIDYLMKDKLAQFTSLQADLENGVNLEQTIRLREEIAEQHRALGQMKEMAAKYGYDISGPATNAQEAIQWTYFGYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDVYIERDLKAGKITEQEAQEMVDHLVMKLRMVRFLRTPEYDELFSGDPIWATESIGGMGLDGRTLVTKNSFRFLNTLYTMGPSPEPNMTILWSEKLPLNFKKFAAKVSIDTSSLQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMIVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGVDEKLKMQVGPKSEPIKGDVLNYDEVMERMDHFMDWLAKQYITALNIIHYMHDKYSYEASLMALHDRDVIRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRDEDGLAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKIQKLHTYRDAIPTQSVLTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEVRKTNLAGLMDGYFHHEASIEGGQHLNVNVMNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM
配列番号１３５
MSILIDKNTKVICQGFTGSQGTFHSEQAIAYGTKMVGGVTPGKGGTTHLGLPVFNTVREAVAATGATASVIYVPAPFCKDSILEAIDAGIKLIITITEGIPTLDMLTVKVKLDEAGVRMIGPNCPGVITPGECKIGIQPGHIHKPGKVGIVSRSGTLTYEAVKQTTDYGFGQSTCVGIGGDPIPGSNFIDILEMFEKDPQTEAIVMIGEIGGSAEEEAAAYIKEHVTKPVVGYIAGVTAPKGKRMGHAGAIIAGGKGTADEKFAALEAAGVKTVRSLADIGEALKTVLK
配列番号１７６
MSSRKELANAIRALSMDAVQKAKSGHPGAPMGMADIAEVLWRDFLKHNPQNPSWADRDRFVLSNGHGSMLIYSLLHLTGYDLPMEELKNFRQLHSKTPGHPEVGYTAGVETTTGPLGQGIANAVGMAIAEKTLAAQFNRPGHDIVDHYTYAFMGDGCMMEGISHEVCSLAGTLKLGKLIAFYDDNGISIDGHVEGWFTDDTAMRFEAYGWHVIRDIDGHDAASIKRAVEEARAVTDKPSLLMCKTIIGFGSPNKAGTHDSHGAPLGDAEIALTREQLGWKYAPFEIPSEIYAQWDAKEAGQAKESAWNEKFAAYAKAYPQEAAEFTRRMKGEMPSDFDAKAKEFIAKLQANPAKIASRKASQNAIEAFGPLLPEFLGGSADLAPSNLTLWSGSKAINEDAAGNYIHYGVREFGMTAIANGISLHGGFLPYTSTFLMFVEYARNAVRMAALMKQRQVMVYTHDSIGLGEDGPTHQPVEQVASLRVTPNMSTWRPCDQVESAVAWKYGVERQDGPTALILSRQNLAQQERTEEQLANIARGGYVLKDCAGQPELIFIATGSEVELAVAAYEKLTAEGVKARVVSMPSTDAFDKQDAAYRESVLPKAVTARVAVEAGIADYWYKYVGLNGAIVGMTTFGESAPAELLFEEFGFTVDNVVAKAKELL
配列番号１３６
MSKCSADETPVCCCMDVGTIMDNSDCTASYSRVFANRAEAEQTLAALTEKARSVESEPCKITPTFTEESDGVRLDIDFTFACEAEMLIFQLGLR
配列番号１３７
MGLFNFVKDAGEKLWDAVTGQHDKDDQAKKVQEHLNKTGIPDADKVNIQIADGKATVTGDGLSQEAKEKILVAVGNISGIASVDDQVKTATPATASQFYTVKSGDTLSAISKQVYGNANLYNKIFEANKPMLKSPDKIYPGQVLRIPEE
【００６６】
好ましくは、以下に定義する配列番号４６から６１の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000010
2013508675.tif 000011
前述のように、タイピングのために、本発明の方法は、更に、少なくとも一つの抗生物質または毒性に対する潜在的耐性を決定するために役立つ、配列番号４６から６６及び８５から８７の配列を有する少なくとも一つのペプチドを使用できることに注目されたい。
【００６７】
他の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、カンジダ・アルビカンスの特徴づけを可能にする。
特に、カンジダ・アルビカンスの特徴づけは、以下の通りに少なくとも一つのペプチドを使用する。
１．  タイピングについて：
配列番号１５５から１７５の配列をそれぞれ有する、アルコールデヒドロゲナーゼ１タンパク質（ＡＤＨ１）、フルクトース−２リン酸アルドラーゼ・タンパク質（ＡＬＦ）、ラノステロール１４−αデメチラーゼ・タンパク質（ＣＰ５１）、Ｆ−ボックス・タンパク質ＣＯＳ１１１（ＣＳ１１１）、伸長因子１−β（ＥＦ１Ｂ）、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３Ｐ）、熱ショックタンパク質ＳＳＡ１（ＨＳＰ７１）、熱ショックタンパク質ＳＳＢ１（ＨＳＰ７５）、ピルビン酸キナーゼ（ＫＰＹＫ）、リパーゼ８（ＬＩＰ８）、多タンパク質−ブリッジング因子１（ＭＢＦ１）、核輸送因子２（ＮＴＦ２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ペプチジル−プロリル・シス‐トランスイソメラーゼ（ＰＰＩＡ）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＬ１３）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＬ２８）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＬ３６）、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２２（ＲＳ２２）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩＳ）に属している少なくとも一つのペプチド：
配列番号１５５
MSEQIPKTQKAVVFDTNGGQLVYKDYPVPTPKPNELLIHVKYSGVCHTDLHARKGDWPLATKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKIGDFAGIKWLNGSCMSCEFCQQGAEPNCGEADLSGYTHDGSFEQYATADAVQAAKIPAGTDLANVAPILCAGVTVYKALKTADLAAGQWVAISGAGGGLGSLAVQYARAMGLRVVAIDGGDEKGEFVKSLGAEAYVDFTKDKDIVEAVKKATDGGPHGAINVSVSEKAIDQSVEYVRPLGKVVLVGLPAHAKVTAPVFDAVVKSIEIKGSYVGNRKDTAEAIDFFSRGLIKCPIKIVGLSDLPEVFKLMEEGKILGRYVLDTSK
配列番号１５６
MAPPAVLSKSGVIYGKDVKDLFDYAQEKGFAIPAINVTSSSTVVAALEAARDNKAPIILQTSQGGAAYFAGKGVDNKDQAASIAGSIAAAHYIRAIAPTYGIPVVLHTDHCAKKLLPWFDGMLKADEEFFAKTGTPLFSSHMLDLSEETDDENIATCAKYFERMAKMGQWLEMEIGITGGEEDGVNNEHVEKDALYTSPETVFAVYESLHKISPNFSIAAAFGNVHGVYKPGNVQLRPEILGDHQVYAKKQIGTDAKHPLYLVFHGGSGSTQEEFNTAIKNGVVKVNLDTDCQYAYLTGIRDYVTNKIEYLKAPVGNPEGADKPNKKYFDPRVWVREGEKTMSKRIAEALDIFHTKGQL
配列番号１５７
MAIVETVIDGINYFLSLSVTQQISILLGVPFVYNLVWQYLYSLRKDRAPLVFYWIPWFGSAASYGQQPYEFFESCRQKYGDVFSFMLLGKIMTVYLGPKGHEFVFNAKLSDVSAEDAYKHLTTPVFGKGVIYDCPNSRLMEQKKFAKFALTTDSFKRYVPKIREEILNYFVTDESFKLKEKTHGVANVMKTQPEITIFTASRSLFGDEMRRIFDRSFAQLYSDLDKGFTPINFVFPNLPLPHYWRRDAAQKKISATYMKEIKSRRERGDIDPNRDLIDSLLIHSTYKDGVKMTDQEIANLLIGILMGGQHTSASTSAWFLLHLGEKPHLQDVIYQEVVELLKEKGGDLNDLTYEDLQKLPSVNNTIKETLRMHMPLHSIFRKVTNPLRIPETNYIVPKGHYVLVSPGYAHTSERYFDNPEDFDPTRWDTAAAKANSVSFNSSDEVDYGFGKVSKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAYVQLGTILTTFVYNLRWTIDGYKVPDPDYSSMVVLPTEPAEIIWEKRETCMF
配列番号１５８
MLKTDSLDFHSYLPPYRSLINPNARYDYRTHSLIPLTQNDLNLLRIAFQKKKEAPPSAFKMKYKSLLSDVSRTISMRLSNSNLLSSSSANNNNVLLSPPPSSSSTLSTPCGNILNRAGTTSSNISKINNLSQNQTQNQLPLFPAELHIKNLPVEILDYIFYLVDDNLDYKSCMYTCKLFYFLAKPYYYENLVFTSTYRFAQFVTYLRVNSEVGQYVQSIDLSGIKPGYDEDEQEEGQEENAENGEEENGGGARDPQYLLGEIADNPHHERVDQFPRGKILAGWRDWKFKNNPLYTIHPSPSLTKIASNSQFSNVSSKSSRSTSSKSSSSTTKKFVKPFRYFKSRKRKMSYSGTTKLERKSPRLEQLQLDQYSSNWNKRVNSHPLINKFLLHYSTSKDLPIGYILHMINLCPNIVSLNLGNLSLSTDYEISRSTIHKYQNFDLINNYPKDLIYKVDNIMRLNDVDDVYSIDGSILRFGNINSGSSGSNWERNGSSSNNRILFKSNQSIASTASSVYSVTTFSKPIRKYNSLLPPLPQTVADISYLNKGDGKVYLSDLNLKEINSAYLKKINEDEILSAIINVHGKRLIEYDTSLYQIPKPLNVDIAGTLKYINLSSMIWLNRKLIEKFLTRLLTKKSPELDMYGICYTDEFFDSDEQESDDDYEDSDDEEQRQCPIIYKQNLVIDFTDSGMYKSLPWAKRIDLNSFEGCQLANKIINNDLMTPQEQALRRERRRRGAIAANYLA
配列番号１５９
MSFSDFSKVESIKSLNEFLADKSYIDGTTATQADVTVYKAFQKEFPQFTRWFNHIASFTEEFEDLPAGKAPAASGSAAAAAEEEDDEDVDLFGSDDEVDEEAEKLKQQRLAEYAAKKAAKGPKPAAKSIVTLDVKPWDDETDLDELLTNVKAIEMEGLTWGAHQWIPVGFGIKKLQINLVVEDALVSLDDLQAAVEEDEDHVQSTDIAAMQKL
配列番号１６０
MSYATKIHARYVYDSRGNPTVEVDFTTDKGLFRSIVPSGASTGVHEALELRDGDKSKWLGKGVLKAVANVNDIIAPALIKAKIDVVDQAKIDEFLLSLDGTPNKSKLGANAILGVSLAAANAAAAAQGIPLYKHIANISNAKKGKFVLPVPFQNVLNGGSHAGGALAFQEFMIAPTGVSTFSEALRIGSEVYHNLKSLTKKKYGQSAGNVGDEGGVAPDIKTPKEALDLIMDAIDKAGYKGKVGIAMDVASSEFYKDGKYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQLISEYPIVSIEDPFAEDDWDAWVHFFERVGDKIQIVGDDLTVTNPTRIKTAIEKKAANALLLKVNQIGTLTESIQAANDSYAAGWGVMVSHRSGETEDTFIADLSVGLRSGQIKTGAPARSERLAKLNQILRIEEELGSEAIYAGKDFQKASQL
配列番号１６１
MAIKIGINGFGRIGRLVLRVALGRKDIEVVAVNDPFIAPDYAAYMFKYDSTHGRYKGEVTASGDDLVIDGHKIKVFQERDPANIPWGKSGVDYVIESTGVFTKVEGAQKHIDAGAKKVIITAPSADAPMFVVGVNEDKYTPDLKIISNASCTTNCLAPLAKVVNDTFGIEEGLMTTVHSITATQKTVDGPSHKDWRGGRTASGNIIPSSTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMSLRLPTTDVSVVDLTVRLKKAASYEEIAPAIKKASEGPLKGVLGYTEDAVVSTDFLGSSYSSIFDEKAGILLSPTFVKLISWYDNEYGYSTKVVDLLEHVA
配列番号１６２
MSKAVGIDLGTTYSCVAHFANDRVEIIANDQGNRTTPSFVAFTDTERLIGDAAKNQAAMNPANTVFDAKRLIGRKFDDPEVINDAKHFPFKVIDKAGKPVIQVEYKGETKTFSPEEISSMVLTKMKEIAEGYLGSTVKDAVVTVPAYFNDSQRQATKDAGTIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKGSRGEHNVLIFDLGGGTFDVSLLAIDEGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNFFIQEFKRKNKKDISTNQRALRRLRTACERAKRTLSSSAQTSIEIDSLYEGIDFYTSITRARFEELCADLFRSTLDPVGKVLADAKIDKSQVEEIVLVGGSTRIPKIQKLVSDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAILTGDTSSKTQDILLLDVAPLSLGIETAGGIMTKLIPRNSTIPTKKSETFSTYADNQPGVLIQVFEGERAKTKDNNLLGKFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSALEKGTGKTQKITITNDKGRLSKEEIDKMVSEAEKFKEEDEKEAARVQAKNQLESYAYSLKNTINDGEMKDKIGADDKEKLTKAIDETISWLDASQAASTEEYEDKRKELESVANPIISGAYGAAGGAPGGAGGFPGAGGFPGGAPGAGGPGGATGGESSGPTVEEVD
配列番号１６３
MADGVFQGAIGIDLGTTYSCVATYDSAVEIIANEQGNRVTPSFVAFTSEERLIGDAAKNQAALNPKNTVFDAKRLIGRAFDDESVQKDIKSWPFKVVESNGQPLIEVEYLDETKTFSPQEISSMVLTKMKEIAEAKIGKKVEKAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGAIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLGAGKSEKERHVLIFDLGGGTFDVSLLNITGGVFTVKATAGDTHLGGQDFDTNLLEHFKKEFQKKTGNDISSDARALRRLRTACERAKRSLSSGTQTTVEIDSLFDGEDFSANITRARFEDINSALFKSTLEPVEQVLEDAKISKSQVDEVVLVGGSTRIPKVQKLLSDFFDGKQLEKSINPDEAVAYGAAVQGAILTGQSTNDDTKDLLLLDVIPLSLGVAMQGNVLAPVVPRNTTVPTIKRRTFTTVADHQTTVQFPVYQGERVNCSENTLLGEFDLKNIPPMQAGEPVLEAIFEVDANGILKVTAVEKSTGRSANITISNSIGRLSTEEIEKMISDAEKFKSSDDAFAKRHEQKQKLEAYVASVESTVTDPVLSAKLKKSAKDKIEAALSDALQTLEIEESSADDYRKAELALKRAVTKGMATR
配列番号１６４
FTIPPNHEMIFTTDDAYKTKCDDKVMIIDYKNITKVIAPGKIIYVDDGVLSFEVISVDDQQTLKVRSLNAGMISSHKTANDVLELRVLSTSG
配列番号１６５
MLFLLFLLITPIYAGLIFPTKPSSDPFYNPPKGFEKAAVGDILQSRETPKSITGRFAPLKIQNSWQLLVRSEDSFGNPNAIVTTVIEPVNADPSKIASYQVFEDAAKADCAPSYALQFGSDLTTFVTQAEMYLMAPLLDQGYYVVSPDYEGPKSTFTIGKQSGQAVLNSIRATLKSSKITNIKEDAKVVMWGYSGGSLASGWAAALQPSYAPELSSSLLGAALGGFVTNITATAQAADGTVFAGIVANALGGVANEYPEFKSILQSDTDKKSVFDEFDSHCLADGVIDYINTSFLTGDNKIFKTGWDILKSPTIAKIVEDNGLVYQKQLVPKIPIFVYHGSIDQIVPIVNVKKTYQNWCEGGISSLEFAEDGTNGHLTETVVGAPAALTWIIDRFNGKQTVSGCQHDKRLSNFQYPNISSSILKYFKVALDTMMSNGLGSDIQKDKITPDDLRKFLLGGW
配列番号１６６
MSSDWDSVTIIGQKARVGGGGPRENVAKTSSQLNAARRAGLVVGTEKKYGTANTKSNPEGQRLTKLDATDDVVAVKKVDVSVGKAIQQARQEKKLTQKELATKVNEKPNVINDYEAGRAIPNQQLLAKLERALGVKLRGKNIGEPLFAKKK
配列番号１６７
MSVDFNAVATEFCNFYYNQFDSDRSQLGNLYRNESMLTFETSQLQGARDIVEKLASLPFQKVAHRISTLDAQPASANGDILVMVTGELLIDEEQNAQRYSQVFHLIPDNGSYYVFNDIFRLNYS
配列番号１６８
MSLSNKLSVKDLDVAGKRVFIRVDFNVPLDGKTITNNQRIVAALPTIKYVEEHKPKYIVLASHLGRPNGERNDKYSLAPVATELEKLLGQKVTFLNDCVGPEVTKAVENAKDGEIFLLENLRYHIEEEGSSKDKDGKKVKADPEAVKKFRQELTSLADVYINDAFGTAHRAHSSMVGLEVPQRAAGFLMSKELEYFAKALENPERPFLAILGGAKVSDKIQLIDNLLDKVDMLIVGGGMAFTFKKILNKMPIGDSLFDEAGAKNVEHLVEKAKKNNVELILPVDFVTADKFDKDAKTSSATDAEGIPDNWMGLDCGPKSVELFQQAVAKAKTIVWNGPPGVFEFEKFANGTKSLLDAAVKSAENGNIVIIGGGDTATVAKKYGVVEKLSHVSTGGGASLELLEGKDLPGVVALSNKN
配列番号１６９
MSTVYFDVSADGQKLGKITFKLYDDVVPKTAENFRALCTGEKGFGYKGSIFHRVIPQFMLQGGDFTNFNGTGGKSIYGTKFADENFVKRHDRPGLLSMANAGPNTNGSQFFITTVPCPWLDGKHVVFGEVTDGLDIVKKIESFGSGSGATSKKIVIEESGQL
配列番号１７０
MAISKNLPLLNNHFRKHWQERVRVHFDQAGKKASRRQSRLRKAAKIAPRPIDALRPVVRAPTVKYNRKVRAGRGFTLAELKAVGIAPKYARTIGISVDHRRQNKSQETFDANVARLQEYKSKLVIFDKKTKASEVASFEQVDVSATFPVEQPAPESGLRAVEVPEQTAYRTLRLARNEKKYKGIREKRAKEKAEAEAEKAKK
配列番号１７１
EKKDEYLSKSSASAAPVIDTLAHGYGKVLGKGRLPEVPVIVKARFVSKLAEEKSESLVVLSN
配列番号１７２
MAKSGIAAGVNKGRKTTAKEVAPKISYRKGASSQRTVFVRSIVKEVAGLAPYERRLIELIRNAGEKRAKKLAKKRLGTHKRALRKVEEMTQVIAESRRH
配列番号１７３
MKYLAAYLLLVQGGNTSPSASDITALLESVGVEAEESRLQALLKDLEGKDLQELIAEGNTKLASVPSGGAAAGGASASTGAAAGGAAEAEEEKEEEAKEESDDDMGFGLFD
配列番号１７４
MTRTSVLADALNAINNAEKTGKRQVLIRPSSKVIIKFLTVMQKHGYIGEFEYIDDHRSGKIVVQLNGRLNKCGVIQPRFNVKINDIERWTDNLLPARQFGYVILTTSAGIMDHEEARRKHVSGKILGFVY
配列番号１７５
MARQFFVGGNFKANGTKQQITSIIDNLNKADLPKDVEVVICPPALYLGLAVEQNKQPTVAIGAQNVFDKSCGAFTGETCASQILDVGASWTLTGHSERRTIIKESDEFIAEKTKFALDTGVKVILCIGETLEERKGGVTLDVCARQLDAVSKIVSDWSNIVVAYEPVWAIGTGLAATPEDAEETHKGIRAHLAKSIGAEQAEKTRILYGGSVNGKNAKDFKDKANVDGFLVGGASLKPEFVDIIKSRL
【００６８】
好ましくは、以下に定義する配列番号８８から１２５の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチドである。
2013508675.tif 000012
2013508675.tif 000013
2013508675.tif 000014
【００６９】
２．少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的耐性について
ラノステロール１４−αデメチラーゼ・タンパク質（ＣＰ５１）に属しており、配列番号１５７を有する少なくとも一つのペプチドであって、上記の通り、好ましくは、配列番号１１７から１２２の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチド。
【００７０】
３．毒性について：
リパーゼ８タンパク質（ＬＩＰ８）に属しており、配列番号１６３を有する少なくとも一つのペプチドであって、上記の通り、好ましくは、配列番号１２３から１２５の配列を有するペプチドから選択される前記ペプチド。
【００７１】
４．同定について：
配列番号１５５、１５６、１５８から１６４、及び１６６から１７５の配列をそれぞれ有する、アルコールデヒドロゲナーゼ１タンパク質（ＡＤＨ１）、フルクトース−２リン酸アルドラーゼ・タンパク質（ＡＬＦ）、Ｆ−ボックス・タンパク質ＣＯＳ１１１（ＣＳ１１１）、伸長因子１−β（ＥＦ１Ｂ）、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３Ｐ）、熱ショックタンパク質ＳＳＡ１（ＨＳＰ７１）、熱ショックタンパク質ＳＳＢ１（ＨＳＰ７５）、ピルビン酸キナーゼ（ＫＰＹＫ）、多タンパク質−ブリッジング因子１（ＭＢＦ１）、核輸送因子２（ＮＴＦ２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ペプチジル−プロリル・シス‐トランスイソメラーゼ（ＰＰＩＡ）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＬ１３）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＬ２８）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＬ３６）、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２２（ＲＳ２２）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩＳ）に属する少なくとも一つのペプチド。
配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４２、４４から１２５および１７７の配列を有する、本発明の目的に有用なペプチドは新規であり、本発明の別の対象を構成する。
本発明の方法およびその効果は、本発明の方法の実施のさまざまな非限定的な例に関連する本願記載の残りから現れる。
【実施例】
【００７２】
実施例１：生化学分析結果による試料からの微生物の同定
１．培養培地上における試料の培養
最適な培養培地および最適な培養条件は、微生物の種によって異なる。デフォルトでは、試料は、さまざまな培地上に接種される：
・ヒツジ血液を含むコロンビア寒天（ビオメリュー、ｒｅｆ４３０４１）、３５℃で１８から２４時間、嫌気的条件あり又はなし；
・ＴＳＡ寒天（ビオメリュー、ｒｅｆ４３０１１）、３７℃で１８から２４時間。
２．微生物の同定
同定は、以下の通りに行う：
１．単離されたコロニーを選択する。
２．無菌状態を観察すると共に、透明プラスチック（ポリスチレン）試験管に３．０ｍｌの無菌の食塩水溶液（０．４５−０．５０％のＮａＣｌ含有、ｐＨ４．５から７．０）を移す。
３．無菌綿棒または無菌綿球を使用して、工程２で調節した食塩溶液の管へ十分な数の同一コロニーを移し、調整されたバイテック２デンシチェックにより０．５０から０．６３マクファーランドに、細菌懸濁液を調製する。
４．バイテック２カセット上に細菌懸濁液の管及びバイテック２同定カードを配置する。
５．バイテック２計測器へカセットを装着する。
６．充填、シーリング、インキュベートおよび読出し操作は、自動である。
７．生化学分析結果が得られる。
８．バイテック２システムによる同定は、既知の菌株の生化学分析結果との比較により行われる。
【００７３】
実施例２：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる試料からの微生物の同定
同定は、以下の通りに行う：
１．実施例１によって得られた微生物のコロニーの一部を１μｌループを使用して移し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量分析のための金属板へ均一に付着させる。
２．１μｌのマトリックスにより付着物をカバーする。使用するマトリックスは、有機溶媒（５０％のアセトニトリルおよび２．５％のトリフルオロ酢酸）のＨＣＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）飽和溶液である。
３．大気温度で乾燥する。
４．質量分析計にプレートを導入する。
５．質量スペクトルを得る。
６．知識ベースに含まれるスペクトルと、得られたスペクトルを比較する。
７．得られたピークと、知識ベースのものとの比較により微生物を同定する。
【００７４】
実施例３：ＥＳＩ−ＭＳによる試料からの微生物の同定
同定は、以下の通りに行う：
１．  実施例１により得られた微生物コロニーを試料採取し、１００μｌの脱塩水に懸濁する。
２．  ３０００ｇで５分間、遠心する。
３．  上澄みを除去する。
４．  １００μｌの脱塩水に再懸濁する。
５．  ３０００ｇで５分間、遠心する。
６．  上澄みを除去する。
７．  アセトニトリル、脱塩水および蟻酸（５０／５０／０．１％）の混合物の１００μｌに再懸濁する。
８．  ０．４５μｍ孔径を有するフィルタでろ過する。
９．  シングルＭＳモードの質量分析計に注入する。
１０．  質量スペクトルを得る。
１１．  知識ベースに含まれるスペクトルと、得られたスペクトルを比較する。
１２．  参照スペクトルを参照することで微生物を同定する。
【００７５】
実施例４：微生物から消化されたタンパク質を得ること
従来通り、以下のプロトコルは１１工程で行う：
１．  実施例１によって得られた微生物のコロニーから試料採取し、６Ｍのグアニジン塩酸溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）の１０から１００μｌに懸濁する。
２．  ５ｍＭの最終濃度を得るためにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を追加する。
３．  ９５℃のウォーターバスで２０分間、還元する。
４．  外界温度まで管を冷却する。
５．  １２．５ｍＭの最終濃度を得るためにヨードアセトアミドを加える。
６．  外界温度及び暗所で４０分間、アルキル化する。
７．  １Ｍのグアニジン塩酸の最終濃度１Ｍを得るために５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液（ｐＨ＝８．０）により６倍に希釈する。
８．  １μｇのトリプシンを加える。
９．  一晩６時間、３７℃で消化する。
１０．  反応を止めるためにｐＨ４未満までギ酸を加える。
１１．  １０００００ｇで、３０分間、超遠心する。  
【００７６】
実施例５：黄色ブドウ球菌（S.aureus）試料の特徴づけ：
実施例１から３に記載した方法の何れか一つにより試料の１又は複数の種を決めた後に、下にリストする種を分析する。
黄色ブドウ球菌の１３菌株は、それらの同定を確認し、その特徴を決めるために分析する。
ＩＤ２      ＩＤ３
ＩＤ４      ＩＤ２ａ
ＩＤ３ａ    ＩＤ４ａ
ＡＳＴ７    ＡＳＴ８
ＡＳＴ１３  ＡＳＴ１４
ＶＩＲ５    ＶＩＲ６
ＶＩＲ７
分析の同じ方法は、ネガティブコントロールとして役立てるために、黄色ブドウ球菌種に属しない種に適用する：
・大腸菌
ＩＤ７  ＡＳＴ２
・肺炎球菌
ＶＩＲ２１
・クロストリジウム・ディフィシール
ＶＩＲ２６
【００７７】
各試料は実施例４によって処理し、次に  消化されたタンパク質の５μｌ量は、以下の条件に従って注入して、分析する：
・アジレント・テクノロジー社（マッシー、フランス）のアジレント１１００シリーズクロマトグラフィ・システム。
・ウォーターズ・シンメトリーＣ１８カラム、内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒径３．５μｍ。
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸  
・溶媒Ｂ：ＡＣＮ  ＋０．１％ギ酸
・以下の表１に定めるＨＰＬＣ勾配：
表１
2013508675.tif 000015
【００７８】
・クロマトグラフィーカラムの出力の溶出液は、アプライドバイオシステム社のＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計（フォレストシティ、米国）のイオン源に直接注入する。
・微生物のタンパク質の消化から生じたペプチドはＭＲＭモードの質量分析によって分析する。表２に示すペプチドだけが検出される。このため、表２に示す第一世代の断片が検出される。各々の遷移、すなわち第一世代の断片に関連する各ペプチドが対応することができる用途は、文字Ｉ、Ｔ、Ｒ、及びＶで、表２の臨床関心の欄に特定する。Ｉは微生物の同定の確認、Ｔはタイピング、Ｒは少なくとも一つの抗生物質への耐性、及びＶは毒性因子の検出を示す。
表２
2013508675.tif 000016
2013508675.tif 000017
2013508675.tif 000018
【００７９】
前駆体ペプチドの荷電状態、保持時間及び遷移、すなわちＱ１の（ｍ／ｚ）１及びＱ３の（ｍ／ｚ）２の比率を、表３に示す。更に、前駆体イオンを分解するために使用する衝突エネルギーは表３に示す。
表３
2013508675.tif 000019
2013508675.tif 000020
2013508675.tif 000021
・使用する他の機械パラメータは以下である：
スキャン型：ＭＲＭ
極性：正
イオン源：ターボＶＴＭ（アプライドバイオシステム）
Ｑ１設定：ユニットレゾルーションによるフィルタリング
Ｑ３設定：ユニットレゾルーションによるフィルタリング
スキャン間の休止：５．００ミリ秒
スキャンスピード：１０Ｄａ／ｓ
カーテン・ガス：５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
ソース温度：５００．００°Ｃ
霧化ガス：５０．００ｐｓｉ
燃料ガス：４０．００ｐｓｉ
動的充填：作動
クラスター分離電位（ＤＰ）： １００．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位（ＥＰ）：６．００Ｖ
衝突セル出口電位（ＣＸＰ）：１１Ｖ
総サイクル時間：１．６秒
【００８０】
各遷移について及び研究される各微生物について得られた領域が測定された。１０００（任意単位）以上の領域を有する全ての遷移は陽性であるとみなして、表４Ａおよび４Ｂに「１」と示されている。１０００未満の領域を有する全ての遷移は陰性であるとみなして、表４Ａおよび４Ｂに「０」と示されている。信号ピークが観察されない場合に、遷移は陰性として記載した。
陽性の遷移番号は、次に用途Ｉ、ＲおよびＶについてまとめて、表５に報告した：
表４Ａ
2013508675.tif 000022
2013508675.tif 000023
2013508675.tif 000024
表４Ｂ
2013508675.tif 000025
2013508675.tif 000026
2013508675.tif 000027
表５
2013508675.tif 000028
【００８１】
全ての黄色ブドウ球菌試料は、Ｉカテゴリーで１２以上の陽性遷移を示す。従って、全てのこれらの試料は、実際に、黄色ブドウ球菌種（Ｓ．アウレウス種）に属することが確認される。
一方では、試料ＩＤ７、ＡＳＴ２、ＶＩＲ２１およびＶＩＲ２６はＩカテゴリーで２つ未満の陽性の遷移を示し、従ってこれらの試料が黄色ブドウ球菌種（Ｓ．アウレウス種）に属しないことが確認される。
黄色ブドウ球菌のＩＤ２、ＩＤ４、ＩＤ２ａ、ＩＤ４ａ、ＡＳＴ１３およびＡＳＴ１４菌株は、Ｒカテゴリーについて８つ以上の陽性の遷移を示し、従ってペニシリン結合性タンパク質（ＰＢＰ２ａ）を発現し、これはグループＭペニシリン（例えばメチシリン）に対する耐性の機構と同義である。
一方で、黄色ブドウ球菌のＩＤ３、ＩＤ３ａ、ＡＳＴ７、ＡＳＴ８、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６およびＶＩＲ７菌株は、Ｖカテゴリーについて３つの陽性の遷移を示し、従ってＰＢＰ２ａを発現しない。従って、これらの菌株は、グループＭペニシリンのような抗生物質に感受性である。
黄色ブドウ球菌種に属しないＩＤ７、ＡＳＴ２、ＶＩＲ２１およびＶＩＲ２６菌株はＲカテゴリーについて３つ未満の遷移を示し、従ってそれらはＰＢＰ２ａを発現せず、それによって方法の特異性が確認される。
黄色ブドウ球菌のＶＩＲ５およびＶＩＲ７試料はＶカテゴリーで９つ以上の陽性の遷移を示し、従って、パントン−バレンタイン型ロイコシジン（ＰＶＬ）タンパク質を発現する。
一方で、黄色ブドウ球菌のＩＤ２、ＩＤ３、ＩＤ４、ＩＤ２ａ、ＩＤ３ａ、ＩＤ４ａ、ＡＳＴ７、ＡＳＴ８、ＡＳＴ１３、ＡＳＴ１４およびＶＩＲ６菌株は３つ未満の陽性の遷移を示し、従ってＰＶＬを発現しない。従って、これらの菌株はＰＶＬに関連した毒性特性を有しない。
黄色ブドウ球菌種（Ｓ．アウレウス種）に属しないＩＤ７、ＡＳＴ２、ＶＩＲ２１およびＶＩＲ２６菌株もＶカテゴリーについて３つ未満の遷移を示し、従ってＰＶＬを発現せず、それにより方法の特異性が確認される。
【００８２】
タイピングについて、各々の菌株のＴ−カテゴリー遷移は、参照遷移とみなした他の菌株の遷移と比較される。実際には、２つの菌株間の遷移が同じカテゴリー（陽性又は陰性）に分類されるときに値０が割り当てられ、２つの菌株間の遷移が異なるカテゴリー（陽性の遷移および陰性の遷移）に分類されるときに値１が割り当てられる。スコアを決めるために、値を各菌株ペアのＴ−カテゴリー遷移についてまとめる。スコアは表６に示す。
表６
2013508675.tif 000029
４以下のスコアを有する菌株は同じタイプであり、厳密に４より上のスコア有する菌株は異なるタイプである。従って、ＩＤ２とＩＤ２ａ、ＩＤ３とＩＤ３ａ、ＩＤ４とＩＤ４ａ、並びにＡＳＴ７とＡＳＴ８菌株は、同じタイプである。残りの菌株ペアの全ては、異なるタイプである。ＩＤ７、ＡＳＴ２、ＶＩＲ２１およびＶＩＲ２６菌株（これらは黄色ブドウ球菌ではない）の間で、及び黄色ブドウ球菌である他の菌株の全てで得られる合計は高いことに注目されたい。これらの結果は、方法の特異性を確認する。
ＩＤ７、ＡＳＴ２、ＶＩＲ２１およびＶＩＲ２６菌株は当然ながら同じタイプでない；それらは異なる種であり、これは不合理である。従って、これらの菌株は互いに比較することができず、値は表６に報告していない。
極めて有利には、例えばＤ２とＶＲ７との間の２５より高いスコアは、菌株間の大きな相違を反映する。ＩＤ２およびＡＳＴ１４との間のような１５から２５のスコアは中程度の相違を反映し、ＩＤ２とＩＤ４ａとの間のような５から１５のスコアは弱い相違を反映する。  
従って、このように行う方法は、（感染の共通の源を同定することにとって重要である）２つの菌株が同じタイプであるかどうか立証するだけでなくて、（疫学的研究にとって極めて重要である）２つの菌株の近さを推定することも可能にする。
この実施例は、非常に有利には、本発明が、黄色ブドウ球菌のような種のアイデンティティを確認することが１時間未満（非常に短い）の時間内で可能であり、同じ分析の範囲内で同時に、タイピングおよび少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的抵抗性の特性を決定し、毒性因子の存在を決めることができることを示す。これらの特性は同じ計測器で決められ、それは分析および結果の報告を非常に容易にする。最後に、細菌の特徴づけは細菌タンパク質を使用して決められ、それは生きていて生存可能な微生物の存在を反映し、死んだ細菌の存在によって歪められうる細菌ＤＮＡを使用した特徴づけとは異なる。
【００８３】
実施例６：脱塩化工程を有する微生物の消化プロトコル
従来法どおり、以下のプロトコルは１７工程で行う。
工程１から１０：実施例４と同じ。
１１．試料体積は、水／０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸により１ｍｌにする。
１２．ウォーターズ・オアシスＨＬＢカラムは１ｍｌのメタノール、次に１ｍｌのＨ２Ｏ／０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸）で平衡化する。
１３．試料をロードし、試料は重力で注がれる。
１４．１ｍｌのＨ２Ｏ／０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸で洗浄する。
１５．８０％メタノールおよび２０％の水／０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸の混合物の１ｍｌにより溶出する。
１６．溶出液は、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０蒸発器によって、およそ１００μｌの体積を得るために、２時間蒸発させる（サーモエレクトロン社、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）。
１７．次に、溶出液は、十分量（ＱＳ）２５０μｌで、水／０．５％（ｖ／ｖ）の蟻酸溶液にとる。
【００８４】
実施例７：大腸菌試料の特徴づけ：
実施例１から３に記載した方法の何れかに従って試料の１又は複数の種を決めた後に、下に挙げた種が分析される。
１５の大腸菌菌株はそれらの同定を確認し、それらの特徴を決めるために分析する：
ＡＳＴ１      ＡＳＴ２
ＡＳＴ３      ＡＳＴ４
ＡＳＴ５      ＶＩＲ４１
ＶＩＲ４２    ＶＩＲ４３
ＶＩＲ４４    ＶＩＲ４５
ＩＤ６        ＩＤ７
ＩＤ８        ＩＤ９
ＩＤ１０
分析の同じ方法は、ネガティブコントロールとして使用するために大腸菌種に属していない種に適用する：
・黄色ブドウ球菌
ＶＩＲ１０
・肺炎球菌
ＶＩＲ１９
・クロストリジウム・ディフィシール
ＶＩＲ２８
各試料は実施例６に従って処理し、次に消化したタンパク質の体積５μｌは以下の条件に従って注入して、分析する：
・アジレント・テクノロジー社（マッシー、フランス）のアジレント１１００シリーズクロマトグラフィーシステム。
・ウォーターズ・シンメトリーＣ１８カラム、内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒径３．５μｍ。
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸  
・溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸
・以下の表７に定められるＨＰＬＣ勾配
表７
2013508675.tif 000030
・クロマトグラフィーカラムの出力の溶出液は、アプライドバイオシステム社のＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計（フォレストシティ、米国）のイオン源に、直接注入する。
【００８５】
・微生物のタンパク質の消化から生じたペプチドはＭＲＭモードの質量分析を使用して分析する。表８に示すペプチドだけを検出する。このため、表８に示す第一世代の断片を検出する。各々の遷移、すなわち第一世代の断片に関連する各ペプチドが対応することができる用途を、文字Ｉ、Ｔ、Ｒ、及びＶで、表８の臨床関心の欄に特定する。Ｉは微生物の同定の確認、Ｔはタイピング、Ｒは少なくとも一つの抗生物質への耐性、及びＶは毒性因子の検出を示す。 
表８
2013508675.tif 000031
2013508675.tif 000032
2013508675.tif 000033
2013508675.tif 000034
【００８６】
前駆体ペプチドの荷電状態、保持時間及び遷移、すなわちＱ１の（ｍ／ｚ）１及びＱ３の（ｍ／ｚ）２の比率を、表９に示す。更に、前駆体イオンを分解するために使用する衝突エネルギーは表９に示す。
表９
2013508675.tif 000035
2013508675.tif 000036
2013508675.tif 000037
2013508675.tif 000038
【００８７】
・使用する他の機械パラメータは、以下のとおりである：
スキャン型：ＭＲＭ
予定されたＭＲＭ：イエス
極性：正
イオン源：ターボＶＴＭ（アプライドバイオシステム）
Ｑ１設定：ユニットレゾルーションによるフィルタリング
Ｑ３設定：ユニットレゾルーションによるフィルタリング
スキャン間の休止：５．００ミリ秒
スキャンスピード：１０Ｄａ／ｓ
カーテン・ガス：５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
ソース温度：５５０．００°Ｃ
霧化ガス：５０．００ｐｓｉ
燃料ガス：４０．００ｐｓｉ
動的充填：作動
クラスター分離の電位（ＤＰ）：１００．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位（ＥＰ）：９．００Ｖ
衝突セル出口電位（ＣＸＰ）：３５Ｖ
総サイクル時間：１．２秒
検出ウィンドウ：８０秒
【００８８】
各遷移について及び研究される各微生物について得られた領域を測定した。２５００（任意単位）以上の領域を有する全ての遷移は陽性であるとみなして、表１０Ａおよび１０Ｂに「１」と示す。２５００未満の領域を有する全ての遷移は陰性であるとみなして、表１０Ａおよび１０Ｂに０と示す。
信号ピークが観察されない場合に、遷移は陰性として記載した。陽性の遷移番号は、次に用途Ｉ、ＲおよびＶについてまとめて、表１１に報告した：
表１０Ａ
2013508675.tif 000039
2013508675.tif 000040
2013508675.tif 000041
2013508675.tif 000042
表１０Ｂ
2013508675.tif 000043
2013508675.tif 000044
2013508675.tif 000045
2013508675.tif 000046
表１１
2013508675.tif 000047
【００８９】
全ての大腸菌試料は、Ｉカテゴリーで４４以上の陽性遷移を示す。従って、全てのこれらの試料は、実際に大腸菌種に属することが確認される。
一方では、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１９およびＶＩＲ２８試料はＩカテゴリーで３つ未満の陽性遷移を示し、従って、これらの試料は大腸菌種に属しないことが確認される。
大腸菌のＡＳＴ２、ＡＳＴ３、ＡＳＴ４およびＡＳＴ５菌株がＲカテゴリーで１４以上の陽性遷移を示し、従って、プラスミド媒介性ペニシリナーゼＴＥＭ−２を発現し、これはペニシリンに対する耐性の機構と同義である。
大腸菌のＡＳＴ１、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５、ＩＤ６、ＩＤ７、ＩＤ８、ＩＤ９およびＩＤ１０菌株がＲカテゴリーで７未満の陽性遷移を示し、従って、プラスミド媒介性ペニシリナーゼＴＥＭ−２を発現しない。従って、これらの菌株は、ペニシリン、特にアミノペニシリンまたはＡペニシリン（アンピシリン）、カルボキシペニシリンまたはＣペニシリン（チカルシリン）およびウレイドペニシリンまたはペニシリンＵ（ピペラシリン）に感受性である。
大腸菌種に属しないＶＩＲ１０、ＶＩＲ１９およびＶＩＲ２８菌株はＲカテゴリーで２未満の遷移を示し、従ってＴＥＭ−２を発現せず、それにより方法の特異性が確認される。
大腸菌のＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３およびＶＩＲ４４試料はＶカテゴリーで４つの陽性遷移を示し、従ってシガトキシン  １または２（ＳＴＸ１またはＳＴＸ２）毒素を発現する。より詳しくは、ＶＩＲ４１については遷移１１８から１２５は陽性であり、従ってＶＩＲ４１はシガトキシン１およびシガトキシン２を同時に発現する。ＶＩＲ４２およびＶＩＲ４４は遷移１２１から１２５について陽性であり、従って、それらはシガトキシン２を発現する。遷移１２３および１２４を示すＶＩＲ４５の場合も同様である。遷移１１８から１２２を示すＶＩＲ４３はシガトキシン２を発現する。一方で、大腸菌のＡＳＴ１、ＡＳＴ２、ＡＳＴ３、ＡＳＴ４、ＡＳＴ５、ＶＩＲ４５、ＩＤ６、ＩＤ７、ＩＤ８、ＩＤ９およびＩＤ１０菌株が３未満の陽性遷移を示し、従って、それらはシガトキシンを発現しない。従って、これらの菌株はシガトキシンに関連した毒性の特性を有しない。
大腸菌種に属さないＶＩＲ１０、ＶＩＲ１９およびＶＩＲ２８菌株はＶカテゴリーで３未満の遷移を示し、従って、それらはｓｔｘ１またはｓｔｘ２を発現せず、それにより方法の特異性が確認される。
【００９０】
タイピングのために、各菌株のＴ−カテゴリー遷移は、参照菌株とみなした他の菌株の遷移と比較した。実際には、２つの菌株間の遷移が同じカテゴリー（陽性又は陰性）に分類されるときに値０が割り当てられ、２つの菌株間の遷移が異なるカテゴリー（陽性の遷移および陰性の遷移）に分類されるときに値１が割り当てられる。スコアを決めるために、値は各菌株ペアのＴ−カテゴリー遷移についてまとめる。スコアは表１２に与える：
表１２
2013508675.tif 000048
【００９１】
４以下のスコアを有する菌株は同じタイプであり、厳密に４より上のスコア有する菌株は異なるタイプである。
従って、ＡＳＴ２、ＡＳＴ３、ＡＳＴ４およびＡＳＴ５菌株は、同じタイプである。ＡＳＴ１とＩＤ６菌株について、ＩＤ７、ＩＤ８、ＩＤ９およびＩＤ１０菌株について、それぞれ同様である。残りの菌株ベアの全ては、異なるタイプである。
ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１９およびＶＩＲ２８菌株（これらは黄色ブドウ球菌ではない）の間で、及び黄色ブドウ球菌である他の菌株の全てで得られる合計は高いことに注目されたい。これらの結果は方法の特異性を確認する。
ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１９およびＶＩＲ２８菌株は、異なる種である。従って、これらの菌株は互いに比較することができず、値は表１２に報告していない。
極めて有利には、例えばＡＳＴ４とＶＩＲ４１との間の２０より高いスコアは、菌株間の大きな相違を反映する。
ＩＤ７とＶＩＲ４２との間のような１２から２０のスコアは中程度の相違を反映し、ＩＤ１０とＡＳＴ１との間のような４から１２のスコアは弱い相違を反映する。
従って、このように行う方法は、（感染の共通の源を同定することにとって重要である）２つの菌株が同じタイプであるかどうか立証するだけでなくて、（疫学的研究にとって極めて重要である）２つの菌株の近さを推定することも可能にする。
この実施例は、非常に有利には、本発明が、黄色ブドウ球菌のような種のアイデンティティを確認することが１時間未満（非常に短い）の時間内で可能であり、同じ分析の範囲内で同時に、タイピングおよび少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的抵抗性の特性を決定し、毒性因子の存在を決めることができることを示す。
これらの特性は同じ計測器で決められ、それは分析および結果の報告を非常に容易にする。最後に、細菌の特徴づけは細菌タンパク質を使用して決められ、それは生きていて生存可能な微生物の存在を反映し、死んだ細菌の存在によって歪められうる細菌ＤＮＡを使用した特徴づけとは異なる。
【００９２】
実施例８：メタノールの存在下における微生物の消化のプロトコル
従来どおり、以下のプロトコルは１７工程で実施される：
１．実施例１に従って得られた微生物コロニーから試料採取し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝８．０）の４００μｌに再懸濁する。
２．メタノール６００μｌを加える。
工程３から７：実施例４の工程２から６と同じ。
工程８から１７：実施例６の工程８から１７と同じ。
【００９３】
実施例９：カンジダ・アルビカンス試料の特徴づけ：
実施例１から３に記載されている方法の何れかにより試料の１又は複数の種を決めた後に、以下に挙げた種を分析する。
１７のカンジダ・アルビカンス菌株は、それらの同定を確認して、それらの特徴づけを決めるために、分析する：
ＡＴＦ１   ＡＴＦ２
ＡＴＦ３   ＡＴＦ４
ＡＴＦ５   ＡＴＦ６
ＡＴＦ７   ＶＩＲ３１
ＶＩＲ３２   ＶＩＲ３３
ＶＩＲ３４   ＶＩＲ３５
ＶＩＲ３６   ＶＩＲ３７
ＶＩＲ３８   ＶＩＲ３９
ＣＡ１６
ネガティブコントロールとして使用するために、分析の同じ方法はカンジダ・アルビカンス種に属していない種に適用する。
・大腸菌
ＶＩＲ４３ 
・黄色ブドウ球菌
ＶＩＲ５ 
・フェシウム菌  
ＡＳＴ−ＶＡＮ８
各試料は実施例８に従って処理して、次に消化されたタンパク質の体積５μｌは注入して、実施例７と同じ条件に従って分析する。
【００９４】
・微生物のタンパク質の消化から生じたペプチドは、ＭＲＭ法の質量分析計を使用して分析する。表１３に示すペプチドだけを検出する。このために、表１３に記載の第一世代の断片を検出する。各々の遷移、すなわち第一世代の断片に関連する各ペプチドが対応することができる用途を、表１４の臨床関心の欄に、文字Ｉ、Ｔ、Ｒ、及びＶで特定する。Ｉは微生物の同定の確認、Ｔはタイピング、Ｒは少なくとも一つの抗生物質への耐性、及びＶは毒性因子の検出を示す。
表１３
2013508675.tif 000049
2013508675.tif 000050
2013508675.tif 000051
2013508675.tif 000052
【００９５】
前駆体ペプチドの荷電状態、その保持時間および遷移、すなわちＱ１の（ｍ／ｚ）１とＱ３の（ｍ／ｚ）２の比率は、表１４に示す（ｍ／ｚ）。更に、前駆体イオンを分解するために使用する衝突エネルギーを表１４に示す。
表１４
2013508675.tif 000053
2013508675.tif 000054
2013508675.tif 000055
2013508675.tif 000056
【００９６】
使用する他の機械パラメータは実施例７と同じである。各遷移について及び研究される各微生物について得られた領域を測定した。２０００（任意単位）以上の領域を有する全ての遷移は陽性であるとみなして、表１５Ａおよび１５Ｂに「１」と示す。２０００未満の領域を有する全ての遷移は陰性であるとみなして、表１５Ａおよび１５Ｂに０と示す。信号ピークが観察されない場合に、遷移は陰性として記載した。
表１５Ａ
2013508675.tif 000057
2013508675.tif 000058
2013508675.tif 000059
2013508675.tif 000060
表１５Ｂ
2013508675.tif 000061
2013508675.tif 000062
2013508675.tif 000063
2013508675.tif 000064
【００９７】
次に、陽性遷移番号は、Ｉ、ＲおよびＶアプリケーションについてまとめて表１６に報告する：
表１６
2013508675.tif 000065
2013508675.tif 000066
全てのカンジダ・アルビカンス試料は、Ｉカテゴリーで６０以上の陽性遷移を示す。従って、全てのこれらの試料は、実際に、カンジダ・アルビカンス種に属することが確認される。
一方では、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ５およびＡＳＴ−ＶＡＮ８試料はＩカテゴリーで１３未満の陽性遷移を示し、従ってこれらの試料はカンジダ・アルビカンス種に属しないことが確認される。
遷移８４および８５の観察結果は、突然変異ペプチドの存在を示しており、ＡＴＦ６およびＡＴＦ７菌株の耐性を反映する。
遷移８６および８７の観察結果は、突然変異ペプチドの存在を示しており、ＡＴＦ２およびＡＴＦ３菌株の耐性を反映する。
遷移９６の観察結果は、突然変異ペプチドの存在を示しており、ＡＴＦ５菌株の耐性を反映する。
遷移９９および１００の観察結果は、突然変異したペプチドの存在を示しており、ＡＴＦ７菌株の耐性を反映する。
遷移８８および８９の観察結果は、天然ペプチドの存在を示しており、ＡＴＦ４菌株の感受性を反映する。
遷移９３および９４の観察結果は、天然ペプチドの存在を示しており、ＡＴＦ１およびＴＦ４菌株の感受性を反映する。
【００９８】
Ｉ遷移の全ての領域は、合計ＳＩを与えるために合計する。Ｖ遷移の全ての領域は、合計ＳＶを与えるために合計する。次にＳＶ／ＳＩ比率を算出して、増倍係数ＭＦによって倍加する。得られた結果を表１７に示す。
表１７
2013508675.tif 000067
ＶＩＲ３１およびＶＩＲ３２菌株（９×１０４より大きい（ＳＶ／ＳＩ）比率×ＭＦ超過を有する）はリパーゼ８を過剰発現し、従って、これらの菌株は毒性である。全ての他の菌株は、９×１０４より小さい比率を有しており、それらはリパーゼ８を過剰発現しないので、毒性でない。興味深いことに、（ＳＶ／ＳＩ）比率×ＭＦは、ＶＩＲ３１菌株がＶＩＲ３２菌株より高いので、ＶＩＲ３１菌株はＶＩＲ３２菌株より毒性が強いと特徴づけられる。
【００９９】
タイピングについて、各菌株のＴカテゴリー遷移は、参照菌株と考えられる他の菌株の遷移と比較される。実際には、２つの菌株間の遷移が同じカテゴリー（陽性又は陰性）に分類されるときに値０が割り当てられ、２つの菌株間の遷移が異なるカテゴリー（陽性の遷移および陰性の遷移）に分類されるときに値１が割り当てられる。値は、スコアを決めるために、各菌株ペアの全てのＴ−カテゴリー遷移を合計する。スコアを表１８に与える：
表１８
2013508675.tif 000068
２未満のスコアを有する菌株は同じタイプであり、厳密に２以上のスコアを有する菌株は異なるタイプである。
このように、ＡＴＦ１とＡＴＦ２、ＶＩＲ３５とＶＩＲ３６、およびＶＩＲ３７とＶＩＲ３８菌株は、それぞれ同じタイプである。全ての他の菌株のペアは、異なるタイプである。黄色ブドウ球菌でないＶＩＲ４３、ＶＩＲ５およびＡＳＴ−ＶＡＮ８菌株の間で得られた高い合計、および黄色ブドウ球菌である全ての他の菌株に注目されたい。これらの結果は方法の特異性を確認する。
ＶＩＲ４３、ＶＩＲ５およびＡＳＴ−ＶＡＮ８菌株は異なる種である。従って、これらの菌株は互いに比較することができず、値は表１８に報告しない。
極めて有利には、例えばＡＴＦ１とＶＩＲ３９間の２０を超えるスコアは、菌株間の大きな相違を反映する。ＣＡ１６とＡＴＦ１との間のように、１４から２０のスコアは中程度の相違を反映し、ＡＴＦ１とＡＴＦ７との間のように４から１４のスコアは弱い相違を反映する。
従って、本方法は、（感染の共通の源を同定することにとって重要である）２つの菌株が同じタイプであるかどうか立証するだけでなくて、（疫学的研究にとって極めて重要である）２つの菌株の近さを推定することも可能にする。
この実施例は、非常に有利には、本発明が、カンジダ・アルビカンスのような種のアイデンティティを確認することが（非常に短い）１時間未満の時間内で可能であり、同じ分析の範囲内で同時に、タイピングおよび少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的抵抗性の特性を決定し、毒性因子の存在を決めることができることを示す。
さらに、本発明は定量的アッセイを可能にし、少なくとも一つの抗生物質または毒性に対する耐性の特性がタンパク質の発現の又は代謝産物のレベルに連結されるときに、それは特に有利である。これは、本実施例では、リパーゼ８を定量的に分析することにより例示するものである。これらの特性は同じ計測器で決められ、それは分析および結果の報告を非常に容易にする。
最後に、酵母の特徴づけは菌類タンパク質を使用して決められ、それは生きていて生存可能な微生物の存在を反映し、死んだ細菌の存在によって歪められうる菌類ＤＮＡを使用した特徴づけとは異なる。
【０１００】
実施例１０：少なくとも一つの代謝産物の分析に適している、メタノールの存在下における微生物の消化のプロトコル
従来どおり、以下のプロトコルは１９工程で実施する：
１．実施例１に従って得られた、５つの微生物のコロニーを試料採取し、６Ｍのグアニジン塩酸塩、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ＝８．０）の１００μｌに懸濁する。
２．１５０００ｇで５分間、遠心する。
３．ペレットは、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝８．０）の４００μｌにとる。
４．６００μｌのメタノールを加える。
工程５から９：実施例４の工程２から６と同じ。
工程１０から１９：実施例４の工程８から１７と同じ。
【０１０１】
実施例１１：タンパク質及び代謝産物の同時解析によるカンジダ・アルビカンス試料の特徴づけ：
実施例１から３に記載した方法の何れかによって試料の１又は複数の種を決めた後に、下に挙げた種を分析する。
カンジダ・アルビカンスの５つの菌株は、その同定を確認し、特徴を決めるために分析する：
ＡＴＦ１   ＡＴＦ２
ＡＴＦ３   ＡＴＦ４
ＡＴＦ６
各試料を実施例１０に従って処理し、消化されたタンパク質の体積２０μｌを注入して、実施例７と同じ条件で分析する。
表１３および１４は、一点以外は同一である。遷移番号１０９を方法に加える。それは、臨床関心ＩおよびＲの分子、エルゴステロールに対応する。
前駆体の荷電状態は１であり、保持時間は３６．３分であり、Ｑ１でフィルターをかけられたｍ／ｚは３７９．４であり、Ｑ３でフィルターをかけられたｍ／ｚは６９．２であり、衝突エネルギーは４７である。
下記の点を除いて、大量のパラメータは実施例７のものと同じである：
カーテン・ガス：２５．００ｐｓｉ
ソース温度：４５０．００°Ｃ
燃料ガス： ５０．００ｐｓｉ
Ｑ０（ＥＰ）前の入力電位：４．００Ｖ
遷移１０９について、パラメータは異なる：
クラスター分離の電位（ＤＰ）：２００．００Ｖ
Ｑ０（ＥＰ）前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突セル出口電位（ＣＸＰ）：８Ｖ
【０１０２】
全ての遷移１から１０８は、実施例９と同じの方法で分析する。
Ｉ遷移の全ての領域は、合計ＳＩを与えるために合計する。遷移１０９の領域はＡ１０９と呼ばれる。次にＡ１０９／ＳＩ比率を計算して、増倍係数ＭＦによって倍加する。得られた結果を表１９に与える。
表１９
2013508675.tif 000069
ＡＴＦ２、ＡＴＦ３およびＡＴＦ６菌株（２×１０３より大きい（Ａ１０９／ＳＩ）比率×ＭＦ超過を有する）はエルゴステロールを過剰発現し、従って、これらの菌株は耐性である。
全ての他の菌株は、２×１０３より小さい比率を有しており、それらはエルゴステロールを過剰発現しないので、耐性でない。
この実施例は、非常に有利には、本発明が、（非常に短い）１時間未満の時間内で、同じ分析の範囲内で同時に、タンパク質、ペプチド又は代謝産物のようなさまざまな化合物を量的に分析できることを示す。
タンパク質の分析よりも更に有利には、このタンパク質の作用から生じる代謝産物を定量的に分析することは、機能するたんぱく質の存在、及びより広くは機能する合成経路の存在を特徴づけることである。このように、エルゴステロールの定量化は、この場合、機能的で強い活性をするラノステロール・デメチラーゼの存在に関連づけられるフルコナゾールに対する耐性の機構の存在を決めることを可能にする。
【０１０３】
実施例１２：尿試料に存在する微生物の特徴づけ：
実施例１から３に記載されている方法の何れかにより、試料の１又は複数の種を決めた後に、大腸菌によって汚染された５つの尿試料（尿１から５）を分析する。
更に、汚染されていない第６の尿（尿６）は、ネガティブコントロールとして使用するために分析する。
以下のプロトコルは、２９工程で実施する（工程５から１２は任意であり、結果を有意には変えずに省略することができる）。
１．  ２０００ｇで３０秒間の５ｍｌの汚染された尿を遠心する。
２．  上澄みを回収する。
３．  １５０００ｇで５分間、遠心する。
４．  上澄みを除去する。
５．  再懸濁によって３ｍｌの蒸留水によりペレットを洗浄する。
６．  １５０００ｇで５分間、遠心する。
７．  上澄みを除去する。
８．  ペレットを１／１０に希釈された溶媒と接触させる。
９．  −２０℃で１時間置く。 
１０．  １５０００ｇで５分間、遠心する。
１１．  上澄みを除去する。
１２．  ペレットを１／１０に希釈された溶媒と接触させる。
１３．  −２０℃で１時間置く。 
１４．  １５０００ｇで５分間、遠心する。
１５．  上澄みを除去する。
１２．  ６Ｍのグアニジン塩酸塩、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ＝８．０）の１０〜１００μｌにペレットを懸濁する。
１３．  工程１４から１８：実施例４の工程２から６と同じ。
１９．  工程１９から２８：実施例６の工程８から１７と同じ。
２９．  実施例７に記載されているプロトコルに従って、クロマトグラフィー・システムおよび質量分析計に酸性化された溶出液を１００μｌ注入する。
【０１０４】
各遷移について及び研究された各微生物について得られた領域を測定した。尿試料の細菌負荷は試料ごとに非常に異なるので、陽性遷移を表すために実施例７で使用する閾値を、ここで使うことができない。それは存在する細菌の量に合わせなければならない。前の実施例において、コロニーからの試料採取は微生物の相当量に結果としてなった。これは本実施例には当てはまらない。このように、細菌の量は、全てのＩ遷移の領域を合計することによって推定される。Ｉ遷移の領域の合計を表２０に報告する。
表２０
2013508675.tif 000070
このように、試料４は、試料３（それ自体は実施例１及び５より高い細菌負荷を有する）より高い細菌負荷を含んでなり、それらは試料２より高い負荷を有する。試料１と５は類似の細菌負荷を有する。試料６は大腸菌を含まず、ゼロ負荷を示し、それによって技術の特異性を示す。
【０１０５】
従って、各遷移の領域は、全Ｉ遷移の領域によって、それを分けることによって標準化される。比率が０．０００１５（非次元の比率）以上である全ての遷移は、陽性であるとみなして、表２１の「１」と示す。比率が０．０００１５未満である全ての遷移は陰性とみなして、表２１に０と示す。信号ピークが観察されないときに、遷移は陰性と記載する。
表２１
2013508675.tif 000071
2013508675.tif 000072
2013508675.tif 000073
2013508675.tif 000074
【０１０６】
次に、陽性遷移番号を、Ｉ、ＲおよびＶアプリケーションについてまとめて、表２２に報告する。
表２２
2013508675.tif 000075
同様に、試料の濃縮を考慮して、遷移陽性閾値は修正されなければならなかったので、菌株を特徴づけるために必要なペプチドの数は細菌の完全な濃縮に合わせなければならない。実施例７で弱く検出されたいくつかのペプチドは、細菌の量が１つ未満のコロニーであるときは、検出限界よりも下にある場合がある。  
尿１から５は、Ｉカテゴリーで３０以上の陽性遷移を示す。従って、これらの全ての試料が大腸菌種により汚染されるにつれて、全てのこれらの試料は確認される。
一方では、尿６は、Ｉカテゴリーの陽性遷移を示さない。従って、それは大腸菌種によって汚染されていないことが確認される。
尿１、２、３および５はＲカテゴリーについて、少なくとも５つの陽性遷移を示しており、従って、それらはプラスミド媒介性ペニシリナーゼＴＥＭ−２を発現し、それはペニシリン、特にアミノペニシリンまたはＡペニシリン（アンピシリン）、カルボキシペニシリンまたはＣペニシリン（チカルシリン）およびウレイドペニシリンまたはペニシリンＵ（ピペラシリン）に対する耐性機構を有することと同義である。
一方では、尿４および６はＲカテゴリーで陽性遷移を示さず、従ってそれらはプラスミド媒介性ペニシリナーゼＴＥＭ−２を発現しない。従って、これらの菌株はペニシリンに感受性である。
【０１０７】
アンピシリン、チカルシリンおよびピペラシリンに対する耐性は、出願人によって販売されるバイテック（登録商標）２自動装置及びＡＳＴ  ＥＸＮ及びＡＳＴ−Ｎ１０３カードによって確認された。バイテック（登録商標）２自動装置での確認は、６から８時間かかり、それは本発明でかかる時間よりも遅い。
尿１から６は、Ｖカテゴリーで１より上の陽性遷移を示していない。従って、これらの尿はシガトキシン・タイプの毒素によって汚染されていない。
タイピングについて、各菌株のＴ−カテゴリー遷移は、参照菌株とみなした他の菌株の遷移と比較される。実際には、２つの菌株間の遷移が同じカテゴリー（陽性又は陰性）に分類されるときに値０が割り当てられ、２つの菌株間の遷移が異なるカテゴリー（陽性の遷移および陰性の遷移）に分類されるときに値１が割り当てられる。値は、スコアを決めるために、各菌株ペアの全てについてＴ−カテゴリー遷移について合計される。スコアを表２３に与える：
表２３
2013508675.tif 000076
４以下のスコアを有する尿はなかった。従って、尿１から５を汚染している菌株は、異なるタイプである。これらの尿試料は、地方の診断研究所において集められ、そこでは感染症がしばしば異なる環境で生じる。これらの条件下では、尿感染症が同じ菌株に関連づけられることを観察することはまれである。
この実施例は、非常に有利には、大腸菌のような種のアイデンティティを一次試料から直接に確認して、同じ分析の範囲内で同時に、タイピングおよび少なくとも一つの抗生物質に対する潜在的耐性の特性を決定することができることを示す。
【０１０８】
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2013508675.tif 000079
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