(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）のピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩（式中のｎ、ｍおよびＲはそれぞれ明細書中に定めたいずれかの意味を有する）；それらの製造方法、それらを含有する医薬組成物、および骨関連の障害または状態の処置に使用するための医薬の製造におけるそれらの使用に関する。2013517321.tif 000046【選択図】なし
2013517321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2013517321.tif 000045
［式中：
ｎは、２または３であり；
ｍは、２または３であり；
Ｒは、メチルまたはエチルである］
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項２】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドまたはその医薬的に許容できる塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を、医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤーと共に含む、医薬組成物。
【請求項７】
療法に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項８】
ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ−３酵素の阻害に対して感受性である骨関連の障害または状態の治療または予防に使用するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩の使用。
【請求項９】
ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ−３酵素の阻害に対して感受性である骨関連の障害または状態の予防または治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１０】
ＧＳＫ−３酵素の阻害に対して感受性である骨関連の障害または状態を伴うヒトなどの温血動物を治療または予防するための方法であって、その動物に有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法。
【請求項１１】
ヒトなどの温血動物において骨形成を促進するのに使用するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩の使用。
【請求項１２】
ヒトなどの温血動物において骨形成を促進するのに使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１３】
ヒトなどの温血動物において骨形成を促進するための方法であって、その動物に有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法。
【請求項１４】
ヒトなどの温血動物において、癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病における骨病変の処置に使用するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩の使用。
【請求項１５】
ヒトなどの温血動物において、癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病における骨病変の処置に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１６】
ヒトなどの温血動物において、癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患、ならびにページェット病における骨病変を処置するための方法であって、その動物に有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法。
【請求項１７】
癌が多発性骨髄腫である、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１８】
癌が多発性骨髄腫である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成活性をもち、したがってヒトまたは動物の身体を処置する方法に有用である、特定の新規なピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩に関する。本発明はまた、それらのピラジン誘導体の製造方法、それらのピラジン誘導体を含有する医薬組成物、および療法、たとえばヒトなどの温血動物における骨関連の障害または状態の予防または治療に使用するための医薬の製造におけるそれらのピラジン誘導体の使用に関する。
【０００２】
本発明は特に、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害薬であるピラジン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＧＳＫ３は、別個の遺伝子によりコードされるけれども触媒ドメイン内において高度に相同性である２つのイソ形（αおよびβ）から構成される、セリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ＧＳＫ３は、中枢および末梢神経系に高度に発現する。ＧＳＫ３は、細胞の重要な機能、構造、遺伝子発現、運動性および生存性に関与する多数の異なるシグナル伝達経路を調節する多機能性キナーゼである(Jope et al Neurochem Res. 2007, 32, 577-595)。ＧＳＫ３は、タウ、β−カテニン、グリコーゲンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよび伸長開始因子２ｂ（ｅＩＦ２ｂ）を含めた数種類の基質をリン酸化する。インスリンおよび成長因子はプロテインキナーゼＢを活性化し、これがＧＳＫ３をセリン９残基においてリン酸化してそれを不活性化する(Kannoji et al, Expert Opin. Ther. Targets 2008, 12, 1443-1455)。
【０００４】
ＧＳＫ３は構成性活性キナーゼであり、これは現在ではＷｎｔ／β−カテニン、ノッチおよびＰＩ３Ｋおよびヘッジホッグシグナル伝達経路を含めた経路を調節すると認識されており、骨形成、軟骨形成および脂肪形成を含めたプロセスを調節する役割をもつ(Kulkarni et al., J Cell Biochem, 2007, 102, 1504-1518)。ＧＳＫ３のイソ形のひとつであるＧＳＫ３βは、インビトロおよびインビボの両方で骨形成を調節することが証明された。ＧＳＫ３を阻害するとβ−カテニンのリン酸化が阻止されて、β−カテニンの安定化、蓄積、および細胞質から核へのトランスロケーションが生じる。このプロセスは、骨形成に関与する特異的遺伝子の転写因子の活性化および転写、たとえば初期骨芽細胞分化のマーカーであるアルカリホスファターゼのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の誘導をもたらすと考えられている(Bain et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 301: 84-91)。ネズミ間葉幹細胞においてＧＳＫ３を阻害すると、インビトロで骨芽細胞分化および骨形成のマーカーが誘導される(Kulkarni et al., JBMR, 2006, 6, 910-920)。ＧＳＫ３βの阻害は、インビトロでグルココルチコイド誘導による骨芽細胞培養物の生存および分化の抑制に対して保護する(ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞, Wang et al. Life Sciences, 2009, 85, 685-692)。ヘテロ接合ＧＳＫ３β欠損マウスは骨形成の増大を示した(Kugimiya F et al., PLoS One, 2007, 2(9), e837, 1-9)。さらに、特定のＧＳＫ３阻害薬は、卵巣摘出した骨損失動物モデルにおいて骨質量を増加させ、骨強度を改善し(Kulkarni et al., JBMR, 2006, 21, 910-920)、動物においてグルココルチコイド誘導による骨損失を減弱させる(Wang et al. Life Sciences, 2009, 85, 685-692)ことが証明された。さらに、ＧＳＫ３の阻害は、５Ｔ２ＭＭ骨髄腫モデルにおける骨髄腫誘発による骨形成抑制および骨溶解性疾患の発症を阻止する(Abdul et al., Bone, 2009, 44 (suppl.1), S53 Abstract 103)。
【０００５】
遺伝学的研究により、ヒトの骨質量とＷｎｔシグナル伝達の関連性が確立された(Gong et al., Am. J. Hum. Genet 1996, 59, 146-51: Little et al., N. Engl. J. Med., 2002, 347, 943-4)。それ以来、マウスにおけるＷｎｔシグナル伝達の遺伝学的および薬理学的操作により、骨形成調節におけるこの経路の中心的役割が確認された。Ｗｎｔにより活性化される経路のうち、幹細胞の更新、前骨芽細胞複製の刺激、骨芽細胞形成の誘導、ならびに骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスの阻害を含めた多数の機序によって骨質量を増加させるのは、カノニカル（すなわち、Ｗｎｔ／β−カテニン）経路によるシグナル伝達である。したがって、ＧＳＫ３阻害薬によるＷｎｔ経路のシグナル伝達の増強は、骨関連障害、または新たな増強された骨形成の必要性を伴う他の状態、たとえば骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の処置に利用できるであろう。
【０００６】
これらの知見は、ＧＳＫ３酵素の薬理学的阻害薬が、種々の形の骨関連の障害または状態、たとえば骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患、ならびにページェット病の処置のために療法的価値があるはずであることを示唆する。
【０００７】
骨関連の障害または状態のほかに、他の疾患においてＧＳＫ３酵素が役割をもつという証拠がある。ＧＳＫ３阻害薬は、アルツハイマー病、認知症、およびタウパシー、急性神経変性性疾患、双極性障害、統合失調症、糖尿病、脱毛症、炎症性疾患、癌、緑内障、ならびに再生医療において有益な効果をもつ可能性がある。したがって、ＧＳＫ３酵素の阻害は、骨関連の障害または状態のほかに広範な疾患の予防および治療において価値があると期待される。
【０００８】
今回、本発明の化合物、すなわちピラジン誘導体が有効な骨形成活性をもち、骨関連の障害または状態の予防または治療に有用であることが、予想外に見出された。本発明において開示する化合物が単一の生物学的プロセスに対する作用のみによって薬理学的活性をもつと指摘するのを望むわけではないが、これらの化合物はＧＳＫ３酵素の阻害によって骨形成効果をもたらすと考えられる。
【０００９】
他の薬物の共投与によってある薬物の血漿濃度が変化すると毒性または有効性低下などの重大な問題が起きる可能性があることは周知である。肝酵素の阻害または誘導特性をもつ他の物質の共投与によってある薬物の代謝に変化が引き起こされれば、しばしば薬物−薬物相互作用と呼ばれるこの現象が起きる可能性がある。シトクロムＰ４５０は主要な肝異物代謝酵素であり、ＣＹＰ（シトクロムＰ４５０）３Ａ４イソ形がヒトの肝臓において最も重要な酵素のひとつであると一般に考えられている；大部分の酸化された薬物はこの酵素によって生体内変換されているからである。したがって、著しい程度のそのような肝酵素阻害または誘導特性をもつ医薬を用いるのは望ましくない。本発明の化合物を処置に使用できる疾患において、これは特に重要である。たとえば、骨病変を生じる癌に用いる抗癌薬はしばしば、骨関連の障害または状態の予防または治療に使用するための化合物と共投与する必要があろう。多数の抗癌薬が狭い療法ウインドウをもち（すなわち有効量と有毒量の境界が小さい）、したがって、毒性または有効性低下を避けるためにはそのような薬物の血漿濃度を慎重に制御することがきわめて重要である。多発性骨髄腫の一次処置として使用されるそのような抗癌薬の一例はプロテアソーム阻害薬ボルテゾミブ(bortezomib) (Velcadeとして知られる）であり、これはきわめて狭い療法境界をもつ。この薬物はＣＹＰ３Ａ４によって著しく代謝されるので、この酵素を誘導または阻害する可能性のあるいずれかの化合物の共投与を受ける患者は緊密にモニターすることが要求される(参照：Highlights of Prescribing Information for Velcade: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021602s015lbl.pdf)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jope et al Neurochem Res. 2007, 32, 577-595
【非特許文献２】Kannoji et al, Expert Opin. Ther. Targets 2008, 12, 1443-1455
【非特許文献３】Kulkarni et al., J Cell Biochem, 2007, 102, 1504-1518
【非特許文献４】Bain et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 301: 84-91
【非特許文献５】Kulkarni et al., JBMR, 2006, 6, 910-920
【非特許文献６】Wang et al. Life Sciences, 2009, 85, 685-692
【非特許文献７】Kugimiya F et al., PLoS One, 2007, 2(9), e837, 1-9
【非特許文献８】Kulkarni et al., JBMR, 2006, 21, 910-920
【非特許文献９】Abdul et al., Bone, 2009, 44 (suppl.1), S53 Abstract 103
【非特許文献１０】Gong et al., Am. J. Hum. Genet 1996, 59, 146-51
【非特許文献１１】Little et al., N. Engl. J. Med., 2002, 347, 943-4
【非特許文献１２】Highlights of Prescribing Information for Velcade: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021602s015lbl.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、骨関連の障害または状態の予防または治療に使用するための新規化合物であってＣＹＰ３Ａ４などの肝酵素に対して低い活性を示す化合物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の特定の化合物、すなわち３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩が予想外にＣＹＰ３Ａ４に対してそのような低い活性をもつことが今回見出された。３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩のさらに他の有利な特性は、それが心臓Ｎａ＋チャンネルｈＮａｖ１．５に対して強力な阻害活性を示さないことである。
【００１３】
さらに、本発明のある化合物は、他の特定のキナーゼと比較してＧＳＫ３に対して有用な選択性をも示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】２４時間のヒト脂肪組織由来幹細胞培養後の３００ｎＭの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩に応答した無機質化骨節のアリザリンレッドＳ染色を示すイメージをビヒクル（０．２％  ＤＭＳＯ）と比較したもの。実験を三重に実施した。
【図１Ｂ】３００ｎＭの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩が骨無機質化に及ぼす影響；セチルピリジニウムクロリド抽出を用いてアリザリンレッドＳ染色を定量した。データを５５０ｎｍにおける平均吸光度として示し、一元ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を用いて分析した：ｎ＝９；＊＊＊，  Ｐ＜０．００１。
【図２】３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩をラットに７日間経口投与した後の血清Ｐ１ＮＰレベル。（結果を平均±  ｓｅｍとして表示し、＊ｐ＜０．０５の場合は化合物処理とビヒクル対照グループの間に統計的に有意差がみられた）。
【図３】３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩をラットに７日間経口投与した後の血清ＴＲＡｃＰ−５ｂレベル。（結果を平均±  ｓｅｍとして表示し、＊ｐ＜０．０５の場合は化合物処理とビヒクル対照グループの間に統計的に有意差がみられた）。
【図４】形態Ｂの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドのＸ−線粉末回折パターン。
【図５】形態Ｂの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドのＤＳＣサーモグラム。
【図６ａ】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートのＸ−線粉末回折パターン。
【図６ｂ】形態Ｃの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートのＸ−線粉末回折パターン。
【図７ａ】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートのＤＳＣサーモグラム
【図７ｂ】形態Ｃの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートのＤＳＣサーモグラム。
【図８】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートのＸ−線粉末回折パターン。
【図９】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートのＤＳＣサーモグラム。
【図１０】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレートのＸ−線粉末回折パターン。
【図１１】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレートのＤＳＣサーモグラム。
【図１２】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレートのＸ−線粉末回折パターン。
【図１３】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレートのＤＳＣサーモグラム。
【図１４】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエートのＸ−線粉末回折パターン。
【図１５】形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエートのＤＳＣサーモグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の１観点によれば、式Ｉの化合物：
【００１６】
【化１】
2013517321.tif 000003
【００１７】
［式中：
ｎは、２または３であり；
ｍは、２または３であり；
Ｒは、メチルまたはエチルである］
またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【００１８】
本発明の他の観点によれば、式Ｉのピラジン誘導体、すなわち３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド：
【００１９】
【化２】
2013517321.tif 000004
【００２０】
またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
前記に定めた式Ｉの化合物は互変異性の現象を示す場合があることを理解すべきである。本発明はそれの定義にＧＳＫ３酵素阻害活性をもつそのようないずれかの互変異性形態または異なる互変異性形態の混合物を含み、式の記載に用いるかまたは実施例に挙げたいずれかの互変異性形態に限定されるべきではないことを理解すべきである。一般にそのような互変異性形態のいずれかひとつだけを後記の実施例中に挙げるか、あるいは以下のいずれか関連する式の記載に示す。
【００２１】
式Ｉの化合物の適切な医薬的に許容できる塩は、たとえば式Ｉの化合物の酸付加塩、たとえば無機酸または有機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸またはクエン酸との酸付加塩である。式Ｉの化合物の他の適切な医薬的に許容できる塩は、たとえば式Ｉの化合物の投与後にヒトまたは動物の体内で形成される塩である。
【００２２】
式Ｉの化合物の特定の医薬的に許容できる塩は、式Ｉの化合物と塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、エタンスルホン酸、ＤＬ−マンデル酸または安息香酸から選択される酸との酸付加塩である。
【００２３】
本発明の１観点によれば、式Ｉの化合物の特定の医薬的に許容できる塩は、式Ｉの化合物と塩酸との酸付加塩である。
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物の特定の医薬的に許容できる塩は、式Ｉの化合物とベンゼンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸との酸付加塩である。
【００２４】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物の特定の医薬的に許容できる塩は、式Ｉの化合物とベンゼンスルホン酸との酸付加塩である。
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物の特定の医薬的に許容できる塩は、式Ｉの化合物とｐ−トルエンスルホン酸との酸付加塩である。
【００２５】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物の特定の医薬的に許容できる塩は、式Ｉの化合物とエタンスルホン酸、ＤＬ−マンデル酸または安息香酸から選択される酸との酸付加塩である。
【００２６】
さらに式Ｉの化合物の適切な医薬的に許容できる溶媒和物も本発明の観点を形成することを理解すべきである。適切な医薬的に許容できる溶媒和物は、たとえば水和物、たとえば半水和物、１水和物、２水和物もしくは３水和物、または別の量の水和物である。
【００２７】
さらに、ある式Ｉの化合物は多型性を示す場合がある。本発明は、その形態がグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性の阻害に有用な特性をもついずれかの多型またはその混合物を包含することを理解すべきであり、ある多型がグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性を阻害する効力を後記に述べる標準試験により判定する方法は当技術分野で周知である。
【００２８】
結晶性物質をＸ線粉末回折（以下、ＸＲＰＤ）分析、示差走査熱量測定（以下、ＤＳＣ）、熱重量分析（以下、ＴＧＡ）、拡散反射赤外フーリエ変換（ＤＲＩＦＴ）分光法、近赤外（ＮＩＲ）分光法、液相および／または固相核磁気共鳴分光法などの常法を用いて分析できることは一般に知られている。そのような結晶性物質の含水率は、カールフィッシャー分析により測定できる。
【００２９】
一例として、実施例２の化合物について具体的な結晶形態を同定した。
したがって、本発明の他の観点は、形態Ｂの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドである。
【００３０】
以下のＸＲＰＤデータはすべて実施例のセクションの導入部の節（ｖｉｉｉ）の記載に従って測定された。
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド結晶形態であって、２θ＝３．５°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３１】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝１７．６°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３２】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝３．５°および１７．６°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３３】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝３．５、７．０、９．５、１０．４、１２．４、１３．８、１４．１、１５．９、１７．６、２１．０°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３４】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、図４に示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３５】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝３．５°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３６】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝１７．６°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３７】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂ結晶形態のの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝３．５°および１７．６°に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３８】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、２θ＝３．５、７．０、９．５、１０．４、１２．４、１３．８、１４．１、１５．９、１７．６、２１．０°に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００３９】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドであって、図４に示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４０】
他の例として、実施例３の化合物は多型性を示し、２つの結晶形態が同定された。
したがって、本発明の他の観点は、形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートである。
【００４１】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、ほぼ２θ＝８．４°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４２】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、ほぼ２θ＝１４．５°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４３】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、ほぼ２θ＝８．４°および１４．５°に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４４】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、ほぼ２θ＝７．５、８．４、１１．０、１４．５、１５．７、１８．５、２０．２、２２．０、２２．２、２３．０°に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４５】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、図６ａに示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４６】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝８．４°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４７】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１４．５°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４８】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝８．４°および１４．５°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００４９】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝７．５、８．４、１１．０、１４．５、１５．７、１８．５、２０．２、２２．０、２２．２、２３．０°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５０】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝８．４°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５１】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１４．５°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５２】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝８．４°および１４．５°に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５３】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝７．５、８．４、１１．０、１４．５、１５．７、１８．５、２０．２、２２．０、２２．２、２３．０°に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５４】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、図６ａに示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５５】
したがって、本発明の他の観点は、形態Ｃの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドである。
【００５６】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、ほぼ２θ＝１１．２°、１４．７°および１５．８°に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５７】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、ほぼ２θ＝１１．２、１２．６、１４．７、１５．５、１５．８、１６．８、２０．４、２１．１、２２．５、２６．５°に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５８】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、図６ｂに示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００５９】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１１．２°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６０】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１４．７°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６１】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１５．８°±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６２】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１１．２°、１４．７°および１５．８°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６３】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、２θ＝１１．２、１２．６、１４．７、１５．５、１５．８、１６．８、２０．４、２１．１、２２．５、２６．５°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６４】
本発明の他の観点によれば、形態Ｃの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートであって、図６ｂに示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６５】
さらに他の例として、実施例４．１の化合物について具体的な結晶形態を同定した。
したがって、本発明の他の観点は、形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートである。
【００６６】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、ほぼ２θ＝８．０°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６７】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、ほぼ２θ＝２３．０°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６８】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、ほぼ２θ＝８．０°および２３．０°に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００６９】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、ほぼ２θ＝８．０、１１．７、１４．８、２０．０、２０．９、２１．５、２２．２、２３．０、２７．５、２８．０°に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７０】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、図８に示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７１】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝８．０±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７２】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝２３．０±０．１°の２θに少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７３】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝８．０°および２３．０°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７４】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝８．０、１０．５、１１．７、１２．４、１４．８、１６．０、１７．０、１８．１、２０．０、２０．９、２１．５、２２．２、２３．０、２７．５、２８．０°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７５】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝８．０°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７６】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝２３．０°に少なくとも１つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７７】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝８．０°および２３．０°に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７８】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、２θ＝８．０、１０．５、１１．７、１２．４、１４．８、１６．０、１７．０、１８．１、２０．０、２０．９、２１．５、２２．２、２３．０、２７．５、２８．０°に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００７９】
本発明の他の観点によれば、形態Ｂの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレートであって、図８に示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８０】
具体的な結晶形態を同定したさらに他の化合物の例は、実施例４．２〜４．４の化合物である。
したがって、本発明の他の観点は、形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレートである。
【００８１】
したがって、本発明の他の観点は、形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレートである。
【００８２】
したがって、本発明の他の観点は、形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエートである。
【００８３】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレートであって、２θ＝５．２°および１２．７°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８４】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレートであって、２θ＝５．２、１０．４、１２．７、１５．０、１６．９、１７．３、１９．１、１９．６、２０．０、２３．５°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８５】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレートであって、図１０に示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８６】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレートであって、２θ＝２．７°および７．８°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８７】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレートであって、２θ＝２．７、５．２、７．８、９．６、１０．５、１２．３、１３．１、１５．７、１８．４°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８８】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレートであって、図１２に示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００８９】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエートであって、２θ＝５．３°および９．２°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に少なくとも２つの特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００９０】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエートであって、２θ＝５．３、６．２、９．２、９．８、１１．９、１６．６、１７．８、１８．１、１９．５、２４．６°（これらの数値は±０．１°の２θであってもよい）に特異的ピークをもつＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００９１】
本発明の他の観点によれば、形態Ａの結晶形態の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエートであって、図１４に示すＸ線粉末回折パターンを有するものが提供される。
【００９２】
Ｘ線粉末回折パターンが機器毎または試料毎にわずかに異なる可能性があることは理解されるであろう；したがって引用した数値を絶対とみなすべきではない。
測定条件（たとえば、使用する装置または機器）に応じて１以上の測定誤差をもつＸ線粉末回折パターンが得られる可能性があることも知られている。特に、測定条件に応じてＸ線粉末回折パターンの強度が変動する可能性があることが一般に知られている。したがって、前記の本発明の結晶形態は、別に記載しない限り、図４、６ａ、６ｂ、８、１０、１２および１４に示すＸ線粉末回折パターンと同一のＸ線粉末回折パターンを提供する結晶に限定されず、これらの図に示すものと実質的に同じＸ線粉末回折パターンをもつ結晶はいずれも本発明の範囲に含まれることを理解すべきである。Ｘ線粉末回折の分野の専門家はＸ線粉末回折パターンの実質的同一性を判断することができる。
【００９３】
Ｘ線粉末回折の分野の専門家は、ピークの相対強度が、たとえば試料の分析に影響を及ぼす可能性がある３０ミクロンを超えるサイズおよび単一ではないアスペクト比の結晶粒によって影響を受ける可能性があることを認識しているであろう。当業者は反射の位置が回折計において試料が存在する厳密な高さおよび回折計のゼロ目盛定めによって影響を受ける可能性があることも認識しているであろう。試料の表面平坦度もわずかな影響をもつ可能性がある。したがって、提示した回折パターンデータを絶対的な数値と解釈すべきではない(参照：Jenkins, R および Snyder, R.L.‘Introduction to X-Ray Powder Diffractometry’John Wiley および Sons 1996; Bunn, C.W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; Klug, H. P. および Alexander, L. E. (1974), X-Ray Diffraction Procedures)。
【００９４】
一般に、Ｘ線粉末回折図の回折角の測定誤差は約±０．１°の２θであり、Ｘ線粉末回折データを考察する際にはその程度の測定誤差を考慮に入れるべきである。さらに、実験条件および試料の調製（好ましい配向）に応じて強度が変動する可能性があることを理解すべきである。
【００９５】
さらに式Ｉの化合物の適切な医薬的に許容できるプロドラッグも本発明の観点を形成することを理解すべきである。したがって、本発明の化合物をプロドラッグ、すなわちヒトまたは動物の体内で分解して本発明の化合物を放出する化合物の形で投与することができる。プロドラッグは、本発明の化合物の物理的特性および／または薬物動態特性を変化させるために使用できる。プロドラッグは、特性改変基を結合させることができる適切な基または置換基を本発明の化合物が含む場合に形成できる。プロドラッグの例には、式Ｉの化合物中のアミノ基において形成できるインビボ開裂性アミド誘導体が含まれる。
【００９６】
したがって、本発明には、有機合成により利用可能になった場合の、およびヒトまたは動物の体内でそのプロドラッグの開裂により利用可能になった場合の、前記に定めた式Ｉの化合物が含まれる。したがって、本発明には、有機合成手段で製造される式Ｉの化合物が含まれ、またヒトまたは動物の体内で前駆化合物の代謝により生成する化合物も含まれる；すなわち、式Ｉの化合物は合成により製造された化合物または代謝により生成した化合物であってもよい。
【００９７】
式Ｉの化合物の適切な医薬的に許容できるプロドラッグは、望ましくない薬理活性なしにかつ過度の毒性なしにヒトまたは動物の身体に投与するのに適切であるという妥当な医学的判断に基づくものである。
【００９８】
前記に定めた式Ｉの化合物の適切な医薬的に許容できるプロドラッグが１以上の不斉炭素原子のため光学活性またはラセミ形態で存在する場合がある限り、本発明はそれの定義にそのような光学活性形態またはラセミ形態を含むことを理解すべきである。光学活性形態の合成は当技術分野で周知の標準的な有機化学により、たとえば光学活性である出発物質からの合成により、またはラセミ形態の分割により実施できる。
【００９９】
種々の形態のプロドラッグが、たとえば下記の文献に記載されている。
a)  Methods in Enzymology, Vol. 42, p. 309-396, edited by K. Widder, et al. (Academic Press, 1985)
b)  Design of Pro-drugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985)
c)  A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5 “Design and Application of Pro-drugs”, by H. Bundgaard p. 113-191 (1991)
d)  H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992)
e)  H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988);
f)  N. Kakeya, et al., Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984)
g)  T. Higuchi and V. Stella, “Pro-Drugs as Novel Delivery Systems”, A.C.S. Symposium Series, Volume 14
h)  E. Roche (editor), “Bioreversible Carriers in Drug Design”, Pergamon Press, 1987
アミノ基をもつ式Ｉの化合物の適切な医薬的に許容できるプロドラッグは、たとえばそのインビボ開裂性アミド誘導体である。アミノ基からの適切な医薬的に許容できるアミドには、たとえば（１−１０Ｃ）アルカノイル基、たとえばアセチル、ベンゾイル、フェニルアセチル、ならびに置換されたベンゾイルおよびフェニルアセチル基が含まれる。フェニルアセチルおよびベンゾイル基上の環置換基の例には、アミノメチル、Ｎ−アルキルアミノメチル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノメチル、モルホリノメチル、ピペラジン−１−イルメチル、および４−（１−４Ｃ）アルキルピペラジン−１−イルメチルが含まれる。
【０１００】
式Ｉの化合物のインビボ効果は、一部は式Ｉの化合物の投与後にヒトまたは動物の体内で形成された１以上の代謝産物により発揮される可能性がある。前記のように、式Ｉの化合物のインビボ効果は、前駆化合物（プロドラッグ）の代謝により発揮される可能性もある。
【０１０１】
本発明の具体的化合物は実施例のそれぞれおよびその医薬的に許容できる塩（単数または複数）であり、それらはそれぞれ独立した他の観点の本発明を提供する。
本発明の他の観点によれば、本明細書に開示する実施例のいずれかに従って得ることができる式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０１０２】
本発明の他の特徴は、本明細書に定めるいずれかの範囲であり、ただし特定の実施例、たとえば実施例１、２、３ａ、３ｂ、４．１などは個々にディスクレームされる。
本発明の他の特徴は、本明細書に定めるいずれかの範囲であり、ただし特定の１実施例、たとえば実施例１、２、３ａ、３ｂ、４．１などは個々にディスクレームされる。
【０１０３】
本発明の特定の新規化合物には、たとえば式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が含まれ、それらにおいてｎ、ｍおよびＲは前記または以下の節（ａ）〜（ｈ）に定めたいずれかの意味を有する。
【０１０４】
（ａ）ｎは２である；
（ｂ）ｎは３である；
（ｃ）ｍは２である；
（ｄ）ｍは３である；
（ｅ）ｎは３であり、かつｍは３である；
（ｆ）ｎは３であり、かつｍは２である；
（ｇ）ｎは２であり、かつｍは３である；または
（ｈ）Ｒはメチルである。
【０１０５】
特定の群の本発明の化合物は、前記式Ｉのピラジン誘導体
［式中：
ｎは、２または３であり；
ｍは、３であり；
Ｒは、メチルまたはエチル、好都合にはメチルである］
またはその医薬的に許容できる塩である。
【０１０６】
特定の群の本発明の化合物は、前記式Ｉのピラジン誘導体
［式中：
ｎは、３であり；
ｍは、２または３であり；
Ｒは、メチルまたはエチル、好都合にはメチルである］
またはその医薬的に許容できる塩である。
【０１０７】
特定の本発明の化合物は、下記のいずれかから選択される式Ｉのピラジン誘導体：−
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；
３−アミノ−６−（４−｛２−［（２−メトキシエチル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；
３−アミノ−６−（４−｛２−［（３−メトキシプロピル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；および
３−アミノ−６−（４−｛３−［（２−メトキシエチル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；
またはその医薬的に許容できる塩である。
【０１０８】
本発明のさらに他の観点によれば、本発明の化合物は、下記のいずれかから選択される式Ｉのピラジン誘導体：−
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；
３−アミノ−６−（４−｛２−［（３−メトキシプロピル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；および
３−アミノ−６−（４−｛３−［（２−メトキシエチル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド；
またはその医薬的に許容できる塩である。
【０１０９】
本発明の他の観点は、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩の製造方法を提供する。適切な方法を下記の代表的な変法により説明する；その際、別に記載しない限り、ｎ、ｍおよびＲは前記に定めたいずれかの意味をもつ。必要な出発物質は有機化学の標準法により得ることができる。そのような出発物質の製造を、下記の代表的な変法と併せて後記の実施例に記載する。あるいは、必要な出発物質は示したものと類似の方法により得ることができ、それらは有機化学の当業者が容易になしうる範囲のものである。
【０１１０】
適切な変法には、たとえば下記のものが含まれる。
（ａ）式ＩＩの化合物：
【０１１１】
【化３】
2013517321.tif 000005
【０１１２】
またはその反応性誘導体［式中、ｍは２または３であり、Ｘは適切な脱離基、たとえばハロゲン（たとえば、ブロモ、フルオロ、クロロまたはヨード）、またはスルホネート基、たとえばメタンスルホネートもしくはトリフルオロメタンスルホネートを表わす］（その際、存在するいずれかの置換基を必要ならば保護する）と式ＩＩＩのアミン化合物：
【０１１３】
【化４】
2013517321.tif 000006
【０１１４】
［式中、ｍは２または３であり、Ｒは、メチルまたはエチル、好都合にはメチルである］をアミン置換反応させ、その後、存在するいずれかの保護基を除去する。
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリルの存在下で、適切な塩基、たとえば炭酸アルカリ金属塩（たとえば、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム）または炭酸アルカリ土類金属塩（たとえば、炭酸カルシウム）、金属水酸化物（たとえば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）の存在下に、たとえば０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には８０〜９０℃の温度範囲で実施される。
【０１１５】
式ＩＩの化合物は、その反応性誘導体を含めて、たとえば式ＩＶの化合物：
【０１１６】
【化５】
2013517321.tif 000007
【０１１７】
（式中、ｍは２または３である）を、適切な活性化試薬、たとえば塩化メタンスルホニル、塩化トルエンスルホニル、塩化チオニルまたは塩化オキサリルと反応させることにより製造できる。この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフランまたはジクロロメタン中で、無機塩基、たとえば炭酸ナトリウムもしくは炭酸カリウム、または有機塩基、たとえばトリエチルアミンもしくはジイソプロピルエチルアミンを用いて、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には周囲温度で実施できる。
【０１１８】
式ＩＶの化合物は、たとえば式Ｖの化合物：
【０１１９】
【化６】
2013517321.tif 000008
【０１２０】
（式中、ｍは２または３であり、ＰＧは保護基、たとえばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルまたはテトラヒドロピランを表わす）を、適切な酸、たとえば硫酸と反応させることにより製造できる。
【０１２１】
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばメタノール、テトラヒドロフランまたはジオキサン中で、無機酸、たとえば塩酸もしくは臭化水素酸、または有機酸、たとえばトリフルオロ酢酸を用いて、たとえば０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には２０〜８０℃の温度範囲で実施できる。
【０１２２】
式Ｖの化合物は、たとえば式ＶＩの化合物：
【０１２３】
【化７】
2013517321.tif 000009
【０１２４】
［式中、Ｙは適切な脱離基、たとえばハロゲン（たとえば、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨード）、またはトリフルオロメタンスルホネートを表わす］を式ＶＩＩの化合物：
【０１２５】
【化８】
2013517321.tif 000010
【０１２６】
（式中、ｍは２または３であり、Ｚは適切な脱離基、たとえばハロゲン（たとえば、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨード）、またはトリフルオロメタンスルホネートを表わし、ＰＧは保護基、たとえばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルまたはテトラヒドロピランを表わす）と金属触媒カップリング反応させることにより製造できる。
【０１２７】
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはジオキサン中で、適切な配位子を含むＰｄ触媒、たとえばＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２またはＰｄ（ＰＰｈ３）３の存在下で、適切な配位子を含むジボラン、たとえばビス（ピナコラト）ジボロンまたはビス（カテコラト）ジボロンの存在下に、塩、たとえば酢酸カリウムまたは酢酸ナトリウムの存在下で、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には８０〜９０℃の温度範囲で実施できる。
【０１２８】
あるいは、式ＩＶの化合物は、たとえば式ＶＩの化合物を式ＶＩＩＩの化合物：
【０１２９】
【化９】
2013517321.tif 000011
【０１３０】
（式中、ｍは２または３であり、Ｗはボロン酸またはボロン酸エステル、たとえばボロン酸ピナコールまたはボロン酸カテコールを表わす）と反応させることにより製造できる。
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはジオキサン中で、適切な配位子を含むＰｄ触媒、たとえばＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２またはＰｄ（ＰＰｈ３）３の存在下で、塩、たとえば酢酸カリウムまたは酢酸ナトリウムの存在下に、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には７０〜９０℃の温度範囲で実施できる。
【０１３１】
式ＩＶの化合物は、上記のものと逆のカップリング法により製造することもでき、その際、式ＶＩの化合物がＹ基の代わりにＷ基（これは上記のボロン酸またはボロン酸エステル、たとえばボロン酸ピナコールまたはボロン酸カテコールである）をもち、式ＶＩＩＩの化合物がＷ基の代わりに存在するＹ基（適切な脱離基、たとえば前記のハロゲン（たとえば、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨード）、またはトリフルオロメタンスルホネートである）をもつ。この反応に適切な条件は前記のものである。
【０１３２】
式ＶＩＩＩの化合は、たとえば式ＩＸの化合物：
【０１３３】
【化１０】
2013517321.tif 000012
【０１３４】
（式中、ｍは２または３であり、Ｚは適切な脱離基、たとえばハロゲンまたはトリフルオロメタンスルホネートを表わす）を適切なジボラン錯体、たとえばビス（ピナコラト）ジボロンまたはビス（カテコラト）ジボロンで処理することにより製造できる。この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルまたはジオキサン中で、ＰＣｙ３またはＰＰｈ３などの配位子を含むＰｄ−Ｃｌ２またはＰｄ（ＯＡｃ）２などのＰｄ触媒の存在下で、塩、たとえば酢酸カリウムまたは酢酸ナトリウムの存在下に、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には７０〜９０℃の温度範囲で実施できる。
【０１３５】
式ＶＩＩの化合は、たとえば式ＩＸの化合物：
【０１３６】
【化１１】
2013517321.tif 000013
【０１３７】
（式中、ｍは２または３であり、Ｚは適切な脱離基、たとえばハロゲンまたはトリフルオロメタンスルホネートを表わす）を適切な保護剤、たとえばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドで処理することにより製造できる。この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフランまたはジクロロメタンの存在下で、無機塩基、たとえば炭酸ナトリウムもしくは炭酸カリウム、または有機塩基、たとえばトリエチルアミンもしくはジイソプロピルエチルアミンを用いて、適切な触媒、たとえば４−ジメチルアミノピリジンの存在下に、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には周囲温度で実施される。
【０１３８】
あるいは、上記の反応はジヒドロピランを用いて有機溶媒、たとえばＴＨＦ中で、または溶媒が存在しない場合は触媒、たとえば硫酸またはＨＣｌを用いて、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には還流温度で実施できる。
【０１３９】
式ＶＩＩＩ、ＶＩおよびＩＸの化合物は常法により得ることができ、または市販されており、文献中に既知であり、あるいはそれらは当技術分野で既知の標準法の使用または適合により製造できる；
（ｂ）式Ｘの化合物：
【０１４０】
【化１２】
2013517321.tif 000014
【０１４１】
［式中、ｎは２または３であり、ｍは２または３であり、Ｒはメチルまたはエチルであり、ＰＧ２は適切な保護基、たとえばアルコキシカルボニル（たとえば、ｔ−ブトキシカルボニルまたはイソプロポキシカルボニル）を表わす］と、適切な酸、たとえばＨＣｌまたはトリフルオロ酢酸の反応。
【０１４２】
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばＥｔＯＡｃ、メタノール、２−メチルテトラヒドロフランもしくはテトラヒドロフラン、または無機溶媒、たとえば水中で、無機酸、たとえば塩酸もしくは臭化水素酸、または有機酸、たとえばトリフルオロ酢酸を用いて、たとえば０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には２０〜８０℃の温度範囲で実施できる。
【０１４３】
式Ｘの化合物は、たとえば式ＸＩの化合物：
【０１４４】
【化１３】
2013517321.tif 000015
【０１４５】
［式中、ｎは２または３であり、ｍは２または３であり、Ｒはメチルまたはエチルであり、ＰＧ２は適切な保護基、たとえばアルコキシカルボニル（たとえば、ｔ−ブトキシカルボニルまたはイソプロポキシカルボニル）を表わし、Ｗはボロン酸またはボロン酸エステル、たとえばボロン酸ピナコールまたはボロン酸カテコールを表わす］を、式ＶＩの化合物と金属触媒カップリング反応させることにより製造できる。
【０１４６】
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジオキサンまたは１−ブタノール中で、適切な配位子を含むＰｄ触媒、たとえばＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２もしくはＰｄ（ＰＰｈ３）３、またはテトラクロロパラジウム酸ナトリウムおよび硫酸３−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスホニウム）プロパンの混合物の存在下で、塩、たとえば酢酸カリウム、酢酸ナトリウムまたは三塩基性リン酸カリウムＮ−水和物の存在下に、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には７０〜９０℃の温度範囲で実施できる。
【０１４７】
式ＸＩの化合物は、たとえば式ＸＩＩの化合物：
【０１４８】
【化１４】
2013517321.tif 000016
【０１４９】
［式中、ｎは２または３であり、ｍは２または３であり、Ｒはメチルまたはエチルであり、ＰＧ２は適切な保護基、たとえばアルコキシカルボニル（たとえば、ｔ−ブトキシカルボニルまたはイソプロポキシカルボニル）を表わし、Ｚは適切な脱離基、たとえばハロゲンまたはトリフルオロメタンスルホネートを表わす］を、適切なジボラン錯体、たとえばビス（ピナコラト）ジボロンまたはビス（カテコラト）ジボロンと反応させることにより製造できる。この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルまたはジオキサン中で、ＰＣｙ３またはＰＰｈ３などの配位子を含むＰｄ−Ｃｌ２またはＰｄ（ＯＡｃ）２などのＰｄ触媒の存在下で、塩、たとえば酢酸カリウムまたは酢酸ナトリウムの存在下に、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には７０〜９０℃の温度範囲で実施できる。
【０１５０】
式ＸＩＩの化合物は、たとえば式ＸＩＩＩの化合物：
【０１５１】
【化１５】
2013517321.tif 000017
【０１５２】
（式中、ｎは２または３であり、ｍは２または３であり、Ｚは適切な脱離基、たとえばハロゲンまたはトリフルオロメタンスルホネートを表わす）を、適切な保護剤、たとえば二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルと反応させることにより製造できる。この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばメタノール、テトラヒドロフランまたはジオキサン中で、無機酸、たとえば塩酸もしくは臭化水素酸、または有機酸、たとえばトリフルオロ酢酸を用いて、たとえば０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には２０〜８０℃の温度範囲で実施できる。
【０１５３】
式ＸＩＩＩの化合物は、たとえば式ＸＩＶの化合物：
【０１５４】
【化１６】
2013517321.tif 000018
【０１５５】
またはその反応性誘導体［式中、ｍは２または３であり、Ｘは適切な脱離基、たとえばハロゲン（たとえば、ブロモ、フルオロ、クロロまたはヨード）、またはスルホネート基、たとえばメタンスルホネートもしくはトリフルオロメタンスルホネートを表わし、Ｚは適切な脱離基、たとえばハロゲンまたはトリフルオロメタンスルホネートを表わす］を、適切な保護剤、たとえば二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルと、式ＩＩＩのアミン化合物と反応させることにより製造できる。
【０１５６】
この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリルの存在下で、適切な塩基、たとえば炭酸アルカリ金属塩（たとえば、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム）または炭酸アルカリ土類金属塩（たとえば、炭酸カルシウム）、金属水酸化物（たとえば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）の存在下に、たとえば０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には８０〜９０℃の温度範囲で実施できる。
【０１５７】
式ＸＩＶの化合物は、は、たとえば式ＩＸの化合物を、適切な活性化試薬、たとえば塩化メタンスルホニル、塩化トルエンスルホニル、塩化チオニルまたは塩化オキサリルと反応させることにより製造できる。この反応は、好都合には有機溶媒、たとえばテトラヒドロフランまたはジクロロメタン中で、無機塩基、たとえば炭酸ナトリウムもしくは炭酸カリウム、または有機塩基、たとえばトリエチルアミンもしくはジイソプロピルエチルアミンを用いて、０から１５０℃までの範囲の温度、好都合には周囲温度で実施できる。
【０１５８】
式Ｉのピラジン誘導体の医薬的に許容できる塩、たとえば酸付加塩が必要な場合、それはたとえばそのピラジン誘導体と適切な酸の反応により得ることができる。
式Ｉのピラジン誘導体の医薬的に許容できるプロドラッグが必要な場合、それは常法を用いて得ることができる。たとえば、式Ｉのピラジン誘導体のインビボ開裂性アミドは、たとえばアミノ基を含む式Ｉの化合物と医薬的に許容できるカルボン酸の反応により得ることができる。
【０１５９】
本発明の化合物中のある環置換基は、前記プロセスの前または直後に標準的な芳香族置換反応により導入するか、あるいは一般的な官能基修飾により生成することができ、したがって本発明の方法の観点に含まれることも、有機化学の分野の専門家により認識されるであろう。そのような反応および修飾には、たとえば芳香族置換反応による置換基導入、置換基の還元、置換基のアルキル化、置換反応アシル化、置換基のアミド化、および置換基の酸化が含まれる。そのような方法のための試薬および反応条件は化学技術分野で周知である。芳香族置換反応の具体例には、たとえばハロゲン化アシルおよびルイス酸（たとえば、三塩化アルミニウム）をフリーデル−クラフツ条件下で用いるアシル基導入；ハロゲン化アルキルおよびルイス酸（たとえば、三塩化アルミニウム）をフリーデル−クラフツ条件下で用いるアルキル基導入；ならびにハロゲノ基の導入が含まれる。
【０１６０】
前記に述べた反応のうちあるものにおいて化合物中のいずれかの感受性基を保護するのが必要または望ましい場合があることも認識されるであろう。保護が必要または望ましい例、および保護に適した方法は、当業者に既知である。一般的な保護基を標準法に従って使用できる(説明については、T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991を参照)。したがって、反応体がアミノ、カルボキシまたはヒドロキシなどの基を含む場合、本明細書中に述べるある反応においてその基を保護することが望ましい可能性がある。
【０１６１】
アミノまたはアルキルアミノ基に適切な保護基は、たとえばアシル基、たとえばアルカノイル基、たとえばアセチル、アルコキシカルボニル基、たとえばメトキシカルボニル、エトキシカルボニルもしくはｔ−ブトキシカルボニル基、アリールメトキシカルボニル基、たとえばベンジルオキシカルボニル、またはアロイル基、たとえばベンゾイルである。前記の保護基についての脱保護条件は、選択する保護基に応じて必然的に異なる。たとえば、アシル基、たとえばアルカノイル基もしくはアルコキシカルボニル基またはアロイル基は、たとえば適切な塩基、たとえばアルカリ金属水酸化物、たとえば水酸化リチウムまたは水酸化ナトリウムで加水分解することにより除去できる。あるいは、アシル基、たとえばｔ−ブトキシカルボニル基は、適切な酸、たとえば塩酸、硫酸もしくはリン酸またはリン酸トリフルオロ酢酸で処理することにより除去でき、アリールメトキシカルボニル基、たとえばベンジルオキシカルボニル基は、たとえばカーボン上パラジウムなどの触媒上での水素化により、またはルイス酸、たとえばホウ素トリス（トリフルオロアセテート）で処理することにより除去できる。第一級アミノ基に適切な別の保護基は、たとえばフタロイル基であり、これはアルキルアミン、たとえばジメチルアミノプロピルアミンで、またはヒドラジンで処理することにより除去できる。
【０１６２】
保護基は、合成中のいずれか好都合な段階で、当技術分野で周知の一般法を用いて除去できる。
本明細書中に定めるある中間体は新規であり、これらは本発明の他の特徴として提供される。たとえば、式ＩＩおよびＶ（前記に定めたもの）は、本発明の化合物の製造に際して中間体として使用できる。
【０１６３】
さらに、下記の化合物は本発明の化合物の製造に際して中間体として使用できる
３−アミノ−６−（４−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）プロピル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）−ピラジン−２−カルボキサミド；および
３−（４−（５−アミノ−６−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ピラジン−２−イル）フェニル）プロピルメタンスルホネート。
【０１６４】
生物学的アッセイ
下記のアッセイ法を用いて本発明化合物の効果を測定することができる：
（ａ）インビトロＧＳＫβキナーゼアッセイ
この生化学的アッセイは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を基礎とする結合酵素方式を用いて、被験化合物が組換えＧＳＫ３βセリン／トレオニンキナーゼによる基質のリン酸化を阻害する能力を測定した(Kleman-Leyer, K. et al. Drug Disc. Devel. 2003, 6:81-2)。このアッセイに用いた基質はZ’-LYTE(商標)ser/Thr 9ペプチドであり、ＦＲＥＴアッセイキットはInvitrogen (Paisley, UK,カタログ番号PV3324)から入手された。Ｎ−末端Ｈｉｓ６−タグ付き組換えヒトＧＳＫ３β（Ｈ３５０Ｌ変異を伴う）はバキュロウイルスにおいてＳｆ２１昆虫細胞中で発現し、精製され、Millipore (Billerica, Massachusetts, USA,カタログ番号14-306 Human)から入手された。
【０１６５】
被験化合物を１０ｍＭ原液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製し、必要に応じてＤＭＳＯ中に希釈した。化合物希釈液の部分量（２．５μｌ）をOptiplate-F PerkinElmer 384ウェルプレート(Massachusetts, USA,カタログ番号6007270)のウェルに添加した。最大酵素活性に相当する最大信号を発生した対照ウェルは、Invitrogen (Paisley, UK,カタログ番号PV3326)から入手した１００％リン酸化ペプチドを用いて作成された。１００％リン酸化ペプチド（１．３３×キナーゼ緩衝液中１００μＭ）５μｌ部分をすべての最大対照ウェルに添加した。１．３３×キナーゼ緩衝液中の４％  ＤＭＳＯ溶液（ｖ／ｖ）２．５μｌを最大対照ウェルに添加した。１００％酵素阻害に相当する最小信号を発生した対照ウェルは、４％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含有する１．３３×キナーゼ緩衝液中の４０μＭスタウロスポリン(Staurosporine)２．５μｌの添加により作成された。ＧＳＫ３β（１００ｎｇ／μｌ）酵素およびリン酸化されていない基質(Z-LYTE(商標)ser/Thr 9ペプチド，１００μＭ）の１．３３×キナーゼ緩衝液中における混合物５μｌを、最大対照ウェル以外の各ウェルに添加し、アッセイプレートを２７０ｇで１分間遠心した。用いた１．３３×キナーゼ緩衝液はInvitrogen (Paisley, UK,カタログ番号PV3189)から入手され、６７ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．３ｍＭのＥＧＴＡ、０．０１％のＢＲＩＪ−３５を含有していた。次いでキナーゼ緩衝液中のアデノシン三リン酸（２８μＭ）をウェル当たり２．５μｌ添加し、２７０ｇで１分間遠心し、次いでアッセイプレートを室温で１時間振とうした。５８μｌの顕色試薬Ａ(Invitrogen, Paisley, UK,カタログ番号PV3297)を２１４２μｌの顕色試薬Ｂ(Invitrogen, Paisley, UK,カタログ番号P3127)に添加することにより、占有顕色液を調製した。次いで５μｌのInvitrogen占有顕色液を各ウェルに添加し、２７０ｇで１分間遠心し、次いで室温で１時間振とうした。ウェル当たり５μｌの停止試薬(Invitrogen, Paisley, UKカタログ番号P3094)の添加により反応を停止し、２７０ｇで１分間遠心し、次いで室温で５分間振とうした。
【０１６６】
４００ｎＭでのレーザー光線励起から生じる発生信号をPerkin Elmer Envision分光光度計(Perkin Elmer, Massachusetts, USA)により読み取った。Z’-LYTE(商標)生化学的アッセイは、ＦＲＥＴを基礎とする結合酵素方式を用い、リン酸化されたペプチドとリン酸化されていないペプチドのタンパク質分解性開裂に対する感受性の差に基づく。４００ｎｍでドナー蛍光体を励起した後のアクセプター発光に対するドナー発光の比（発光比）を計算する比率法(ratiometric method)により、次式に示すように反応進行が定量される：
発光比＝クマリン発光（４４５ｎｍ）÷フルオレセイン発光（５２０ｎｍ）
それぞれの被験化合物濃度、１００％  ＤＭＳＯ対照ウェルおよび１００％阻害対照ウェルについての平均データ値を用いて、濃度応答曲線を作成し、これから化合物処理によるキナーゼ活性の阻害率を計算し、力価（ＩＣ５０）値を計算した。ＩＣ５０値はヒトＧＳＫ３βキナーゼ活性を５０％阻害した被験化合物濃度である。このアッセイにおける最終ＡＴＰ濃度は７μＭであった。
【０１６７】
（ｂ）細胞β−カテニン安定化アッセイ
このアッセイは、被験化合物がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の核においてβ−カテニン安定化を促進する能力を測定するためのイメージングを基礎とする方法を用いる。β−カテニン安定化はＧＳＫ３β阻害の指標である。
【０１６８】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウスクローン８線維芽細胞系(American Type Culture Collection (ATCC, USA;カタログ番号CRL 226)を３７℃、５％  ＣＯ２で、１０％  （ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ, Invitrogen, Paisley; UK;カタログ番号10270)および２ｍＭＬ−グルタミン(Invitrogen, Paisley, UK;カタログ番号25030024)を含有する基礎イーグル培地（ＢＭＥ, Invitrogen; Paisley, UK;カタログ番号41010)においてルーティンに維持した。アッセイのために、細胞を培養フラスコから‘Accutase’ (Innovative Cell Technologies Inc., San Diego, USA;カタログ番号AT104)で標準組織培養法により剥離し、５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＢＭＥからなるアッセイ培地に再懸濁して、５５，５５５細胞／ｍｌにした。次いで９０μｌのこの溶液を透明底９６ウェル組織培養プレート(Perkin Elmer Viewplate;カタログ番号6005182)の各ウェルにMultidrop Combi Dispenser (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK)を用いて接種して、５，０００細胞／ウェルにした。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２で一夜インキュベートして、細胞をウェルに付着させた。
【０１６９】
被験化合物を１０ｍＭ原液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）(Sigma-Aldrich; Poole, UK,カタログ番号49442-9)中に調製し、ＤＭＳＯ中に系列希釈した。Multidrop Combiを用いて２４５μｌの予熱したアッセイ培地を９６ウェルにプレート(Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK;カタログ番号50823925)に分配した後、５μｌの系列希釈した化合物をこの中間プレートに添加した。混合した後、各化合物濃度のもの１０μｌを細胞プレートに添加した。ＤＭＳＯ原液からの総希釈係数は５００倍であった。対照細胞にはＤＭＳＯ（最終濃度０．２％  ｖ／ｖ）または１０μＭの陽性対照化合物を投与した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１７０】
化合物処理の後、１００μｌの８％  ｗ／ｖパラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich, Poole, UK;カタログ番号P6148)をアッセイプレートウェルに直接添加することにより細胞を固定した。細胞を固定剤と共に周囲温度で３０分間インキュベートした後、１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ, Sigma-Aldrich;カタログ番号D8537)で３回洗浄した。次いで細胞を遮断液（ＰＢＳ；１．１％  ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ, Sigma-Aldrich, Poole, UK;カタログ番号A7906)および０．２％  ｖ／ｖのTriton X-100 (Sigma-Aldrich, Poole, UK;カタログ番号X100)を含有)中で１回洗浄し、室温で１時間インキュベートした。遮断液を除去した後、抗β−カテニン抗体(BD Biosciences;カタログ番号610154)を１．２５μｇ／ｍｌの濃度で遮断液中に希釈したもの３０μｌを細胞に添加し、４℃で１６時間インキュベートした。次いで細胞を１００μｌの遮断液中で２回洗浄し、周囲温度で１時間インキュベートした。細胞を次いで４０μｌの二次抗体溶液に入れた：ＡＦ６４７ロバ抗マウス抗体(Invitrogen, Paisley, UK;カタログ番号A31571)およびHoechst 33342 (Invitrogen, Paisley, UK;カタログ番号H1399)核対比染色染料をそれぞれ４μｇ／ｍｌおよび１μＭの濃度で遮断液中に希釈したものからなる。二次染色液とのインキュベーションは室温で２時間であった。細胞を次いで１００μｌのＰＢＳ中で３回洗浄した後、プレートをシールしてイメージ取得できる状態にした。蛍光イメージを取得し、Incell Analyser 3000 (GE Healthcare, USA)を用いて定量した。Hoechst核染色を、励起波長３６５ｎｍならびに中密度フィルター設定１および４５０−６５発光フィルターで視覚化した。β−カテニン局在を、６３３ｎｍのレーザー波長、中密度フィルター１および発光フィルター６９５−５５ｎｍで取得した。十分な細胞計数ができるように、ウェル当たり４つのイメージを取得した。イメージデータをNuclear Trafficking Analysis Module, TRF2により分析した。各ウェルからのデータを同一アッセイプレート上の陰性および陽性対照の中央値に対して正規化し、効果パーセントを陽性対照に対する割合として表示した。総細胞数が実験バッチ中央値の５０％未満に低下したウェルからのデータを分析から除外した。濃度応答曲線を下記の形のHill方程式に当てはめた(Neubig et al., 2003, Pharmacol Rev. 2003; 55:597-606)：
ｙ＝Ａ＋（（Ｂ−Ａ）÷（１＋（（Ｃ÷ｘ）＾Ｄ）））
式中、ｘ＝化合物濃度（Ｍ）およびｙ＝効果％。また式中、Ａ＝濃度効果曲線の基底、Ｂ＝漸近曲線（asymptote curve）、Ｃ＝曲線の中間点、Ｄ＝傾き。
各被験化合物についてのデータを、最大効果の半分を生じた化合物濃度（ＥＣ５０）および最大効果パーセントとして報告した。
【０１７１】
式Ｉの化合物の薬理学的特性は、上記試験（ａ）および（ｂ）のうち１以上で下記の濃度または用量において立証できる：
試験（ａ）：−ヒトＧＳＫ３β酵素に対するＩＣ５０、たとえば１０ｎＭ〜１μＭの範囲；
試験（ｂ）：−ネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞における細胞β−カテニン蓄積に対するＥＣ５０、たとえば５０ｎＭ〜５μＭの範囲。
【０１７２】
たとえば、実施例１に開示するピラジン化合物は、試験（ａ）でヒトＧＳＫ３β酵素に対するＩＣ５０  約３５ｎＭの活性；試験（ｂ）でネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞の核における細胞β−カテニン蓄積に対するＥＣ５０  約２４２ｎＭの活性をもつ。
【０１７３】
実施例５に開示するピラジン化合物は、試験（ａ）でヒトＧＳＫ３β酵素に対するＩＣ５０  約２１ｎＭの活性；試験（ｂ）でネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞の核における細胞β−カテニン蓄積に対するＥＣ５０  約９０２ｎＭの活性をもつ。
【０１７４】
実施例６に開示するピラジン化合物は、試験（ａ）でヒトＧＳＫ３β酵素に対するＩＣ５０  約４８ｎＭの活性；試験（ｂ）でネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞の核における細胞β−カテニン蓄積に対するＥＣ５０  約９０２ｎＭの活性をもつ。
【０１７５】
実施例７に開示するピラジン化合物は、試験（ａ）でヒトＧＳＫ３β酵素に対するＩＣ５０  約８０ｎＭの活性；試験（ｂ）でネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞の核における細胞β−カテニン蓄積に対するＥＣ５０  約３８９０ｎＭの活性をもつ。
【０１７６】
好都合には、本発明の特定の化合物は上記試験（ａ）および（ｂ）で下記の濃度または用量の活性をもつ：−
試験（ａ）：−ヒトＧＳＫ３β酵素に対する平均ＩＣ５０、たとえば５ｎＭ〜４０ｎＭの範囲；
試験（ｂ）：−ネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞における細胞β−カテニン蓄積に対する平均ＥＣ５０、たとえば５０ｎＭ〜３００ｎＭの範囲。
【０１７７】
たとえば、実施例１に開示するピラジン化合物は、試験（ａ）でヒトＧＳＫ３β酵素に対するＩＣ５０  約３５ｎＭの活性；試験（ｂ）でネズミＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞の核における細胞β−カテニン蓄積に対するＥＣ５０  約２４２ｎＭの活性をもつ。
【０１７８】
ｃ）インビトロでの骨形成分化、および無機質化の評価
材料および方法
インビトロ骨形成のために、ヒト脂肪組織由来の幹細胞（ｈＡＤＳＣ）(Invitrogen, UK;カタログ番号R7788-115)を１２ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、フェノールレッドを含まない基礎培地ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ; Sigma-Aldrich, UK;カタログ番号D1145)に５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ, Gibco, UK;カタログ番号10270)および２ｍＭのGlutaMax(登録商標)(Gibco;カタログ番号35050)を補充したもので培養した。一夜のインキュベーション後、基礎培地を交換し、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩（１００％  ＤＭＳＯに溶解し、細胞培養培地中に希釈して０．２％  ＤＭＳＯの最終濃度にしたもの）を添加した。骨形成陽性対照ウェルでは、基礎培地を分化培地に交換した；フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに、５％のＦＢＳ、２ｍＭのGlutaMax(登録商標)、５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸(Sigma-Aldrich; Catalogue no. A8960)、５ｍＭのβ−グリセロリン酸(Calbiochem, UK;カタログ番号35675)、および１０ｎＭのデキサメタゾン(dexamethasone)(Sigma-Aldrich;カタログ番号D4902)を補充したもの。培養物を３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートし、培地および化合物を３〜４日毎に２４時間のタイムコースにわたって交換した。
【０１７９】
無機質化した骨節(bone nodule)の形成をこのタイムコース中、アリザリンレッドＳ染色により評価した。タイムコース中の多数時点で細胞を４％パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich;カタログ番号P6148)で２０分間固定し、続いて塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）(Sigma-Aldrich;カタログ番号D8537)で３回洗浄した後、４０ｍＭのアリザリンレッドＳ(Sigma-Aldrich;カタログ番号A5533)（ｐＨ４．２）で室温において２０分間染色した。染色に際してプレートをロッキングプラットホーム（５０ｒｐｍ）に乗せた。染色した後、細胞をＰＢＳで３回、水で３回洗浄した。細胞をLeica M165FC立体顕微鏡および付属のLeica Application Suiteイメージングソフトウェア(Leica Microsystems, UK)でイメージングした。
【０１８０】
骨節からセチルピリジニウムクロリドを用いてアリザリンレッドＳ染料を抽出することにより、無機質化の量を定量した；先の記載(Gregory et al., Analytical Biochemistry, 2004, 329: 77-84; Hwang et al., Stem Cells and Development 17: 963-970, 2008)に従った。要約すると、１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４(Sigma-Aldrich;カタログ番号342483)（ｐＨ７．０）中の１０％のセチルピリジニウムクロリド(Sigma-Aldrich;カタログ番号C0732)からなるセチルピリジニウムクロリド緩衝液１ｍｌを各ウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートすることにより、骨節からアリザリンレッドＳ染料を抽出した。インキュベーション後、２００μｌ部分を９６ウェルフォーマットへ移し、５５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレート分光光度計(SpectraMax Plus, Molecular Devices, USA)で測定した。データを５５０ｎｍにおける平均吸光度±平均標準誤差（ＳＥＭ）として表示した。一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてＴｕｋｅｙの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ試験を用いて、グループ間の差を統計的有意性について調べた。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１８１】
図１Ａ：２４時間の細胞培養後の３００ｎＭの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩に応答した無機質化骨節のアリザリンレッドＳ染色を示すイメージをビヒクルと比較したもの。実験を三重に実施した。
【０１８２】
図１Ｂ：３００ｎＭの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩が骨無機質化に及ぼす影響；セチルピリジニウムクロリド抽出を用いてアリザリンレッドＳ染色を定量。データを５５０ｎｍにおける平均吸光度として示し、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてＴｕｋｅｙの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ試験を用いて分析した：ｎ＝９；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【０１８３】
図１Ａおよび１Ｂは、２４時間の細胞培養後、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩が、ビヒクル対照と比較して増加したアリザリンレッドＳ染色により示されるように前駆細胞コミットメント（方向づけ）および骨芽細胞分化を有意に誘導したことを示す。
【０１８４】
ｄ）ラットにおける骨形成増加
化合物の投与、採血および剖検
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩を、０．５％のＨＰＭＣ（（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース; カタログ番号H7509, Sigma, Poole, UK)および0.1% Tween 80 (v/v) (カタログ番号P8074, Sigma, Poole UK)を含有する水中に配合した。１２〜１６週令（２３０〜３４０ｇ）の雌Sprague Dawleyラット(Charles River CRL:CDラット, Deal, Margate, UK)に、化合物またはビヒクルを５ｍＬ／ｋｇ容量で直線スチール（７５ｍｍ，１６ゲージ）経口胃管給餌針(Vet-Tech Solutions Ltd, Congleton, UK)投与により、毎日午前７〜１０時に投与した。化合物またはビヒクルを種々の用量（２．５、５、１５または５０ｍｇ／ｋｇ／日の遊離塩基量を含む；３、６、１８および５９ｍｇ／ｋｇの三塩酸塩に相当）で１日１回、７〜１４日間投与した。ある試験では、ベースライン血清骨バイオマーカーを測定するために、処理前に一夜絶食後に血清試料を採取した。血液を尾静脈からサンプリングし、血液を血清ゲル採血チューブ(Microvette 500 Z-gel,カタログ番号20.1344, Sarstedt, Leicester, UK)に添加し、チューブを１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心することにより血清を調製した。血清試料をバイオマーカー分析前に−８０℃に保存した。最終処理投与量の２４時間後に、一夜絶食させた動物を過剰量のペントバルビトン(pentobarbitone)麻酔薬（３ｍＬ／ｋｇの２００ｍｇ／ｍＬEuthatal, Merial Animal Health Ltd, Harlow, UK)の腹腔内注射により終止した後、剖検を実施した。化合物またはビヒクル処理後に、骨バイオマーカー分析用の最終血清試料を得るために、剖検に際して血液を下行大動脈から採取した。血液を無菌２．５ｍＬ注射器内へ２５ゲージ×５／８  ＴＷ針により採取し、２本の０．５ｍＬ血清ゲル採血チューブ(Microvette 500 Z-gel,カタログ番号20.1344, Sarstedt, Leicester, UK)中へデカントし、遠心し、分析前に−８０℃に保存した。大腿骨および腰椎を組織病理学的処理および骨形成評価のために摘出した。左大腿骨および第４または第５腰椎を組織病理学的検査用に処理した。骨の迅速脱灰のために（ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の調製のために）、大腿骨を１０％中性緩衝化ホルマリン(カタログ番号PRC/R/4, Pioneer Chemicals, Colchester, UK)中で１０日間固定し、続いて水中１０％ギ酸(カタログ番号F/1850/PB17, Fisher Scientific, Loughborough, UK)中で５日間、この脱灰液を毎日交換しながら脱灰した。免疫組織化学的検査が必要な場合、骨を１０％中性緩衝化ホルマリン中で１０日間固定し、続いて１２％  ＥＤＴＡ（ジアミノエチレン四酢酸）プラス４％中性緩衝化ホルマリン(カタログ番号PRC/R/132, Pioneer Chemicals, Colchester, UK)で５０℃において７週間、この液を毎週交換しながら脱灰した。脱灰後、大腿骨を流出水道水中で２時間洗浄し、標準的な一夜自動プロセシング計画で、一連のアルコール、エチルアルコールおよびキシレン溶液を用いて処理した後、最終ワックス包埋した。４μｍ厚さの切片をミクロトームで切り取り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織病理学的評価を実施した。
【０１８５】
骨形成の評価
下記の手法を用いて化合物がＧＳＫ３阻害および骨同化に及ぼす影響を評価することができる。
【０１８６】
ａ）組織病理学的検査
ラット大腿骨切片における組織病理学的変化を光学顕微鏡により評価し、骨形成を骨梁骨および皮質骨の変化により評価した。
【０１８７】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩を５ｍｇ／ｋｇで７または１４日間経口投与した後、関連ビヒクル対照グループと比較して大腿骨の形態に差が示されなかった。
【０１８８】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩を７日間経口投与した後、１５および５０ｍｇ／ｋｇの経口投与は、骨幹の軟骨下領域および皮質骨の両方において類骨および骨の増加に用量関連の変化を伴っていた。さらに、両用量とも骨芽細胞肥大の証拠を伴っていた（骨芽細胞活性化の指標）。さらに、５０ｍｇ／ｋｇの用量では海綿骨区画内に骨増加の証拠があった。この用量は、海綿骨区画内の未熟（芽）骨芽細胞数の増加および骨髄細胞充実性の増大によって認められる骨髄細胞の動員および分化の組織学的証拠も伴っていた。
【０１８９】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩を１４日間経口投与した後、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩の組織学的効果は７日間投与後にみられたものと質的に類似していたが、全般的にさらに顕著であり、化合物に対する、より大きな骨髄応答の証拠を伴っていた。詳細には、１５ｍｇ／ｋｇ用量の３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩は、軟骨下領域および皮質骨領域の両方において骨形成の証拠を示した。両所見とも骨芽細胞肥大を伴っていた。骨形成の判定は、１０匹中２匹の動物の軟骨下領域における局所骨質量の所見によってさらに強化された。５０ｍｇ／ｋｇのグループでは、前記に指摘したものに加えて骨形成を示唆する、より広範な骨変化があった：軟骨下領域の類骨増加および石灰化線成帯(tide mark zonation)；海綿骨区画の類骨増加および骨髄細胞充実性の顕著な変化、詳細には、形態学的に骨芽細胞拡張と一致する芽細胞集団の拡張。
【０１９０】
合わせると、これらのデータは３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩がインビボで骨形成を誘発するという概念に形態学的支持を与える。
【０１９１】
ｂ）骨密度測定
Norland Stratec XCT Research SA+装置をStratecソフトウェア、バージョン6.0 (Norland Stratec Medizintechnik, Birkenfeld, Germany)と共に用いる末梢定量コンピューター断層撮影(peripheral quantitative computed tomography)ｐＱＣＴ(Jaemsae et al. Bone, 1998, 23, 155-61, Tuukkanen et al. J Bone Mineral. Res. 2000, 15, 1905-11)を用いて、骨無機質密度を測定した。ｐＱＣＴ測定はエクスビボでそれぞれの右大腿骨についてボクセルサイズ０．０７×０．０７×０．５ｍｍ３で実施された。骨幹端測定については、ＣＴ走査の部位は大腿骨の遠位末端、すなわち遠位関節表面から全骨長の２５％の位置であった。全骨の容量無機質密度（骨幹端全骨無機質密度、metaphysis total bone mineral density−ＢＭＤ)をｍｇ／ｃｍ３として測定した。
【０１９２】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩の経口投与は、１日１回、連続１４日間、１５ｍｇ／ｋｇで雌ＣＲＬ：ＣＤラットに経口投与すると、右大腿骨骨幹端全ＢＭＤをビヒクル処理ラットと比較して６．６％増加させた。３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩で処理したラットからの大腿骨の全ＢＭＤは８１４．４１±１５ｍｇ／ｃｍ３であり、ビヒクルは７６４．２３±１６ｍｇ／ｃｍ３であった（平均±ＳＥＭ）。これらの結果は、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩の経口投与が骨形成を刺激することを指摘する。
【０１９３】
骨バイオマーカー評価
骨バイオマーカーを、ラット血清バイオマーカー定量に特異的な、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）についての酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）アッセイキット、および破骨細胞由来の酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ型（ＴＲＡｃＰ−５ｂ）についての免疫固定酵素活性アッセイキットにより測定した。アッセイキットをImmunodiagnostic Systems Ltd (IDS Ltd, Boldon, UK)から購入し、製造業者の指示に従って用いて、血清中のＩ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ−製品コードAC-33F1）および破骨細胞由来の酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ型（ＴＲＡｃＰ−５ｂ−製品コードSB-TR102)のレベルを測定した。
【０１９４】
Ｐ１ＮＰアッセイ
用いたＰ１ＮＰアッセイは、ラット血清中のＰ１ＮＰがプレート固定した抗体の結合に対してビオチン標識Ｐ１ＮＰタンパク質と競合する競合免疫アッセイであった。ポリクローナルウサギ抗Ｐ１ＮＰでプレコートした状態で供給された９６ウェルのアッセイプレートを、プレート振とう機上、７００ｒｐｍで振とうしながら室温で１時間、５０μＬの製造業者供給された標準品、または５μＬの血清と４５μＬの供給されたアッセイ試料希釈剤、プラス５０μＬの供給された溶液Ｐ１ＮＰビオチン溶液（ビオチン標識Ｐ１ＮＰタンパク質を含有）と共にインキュベートした。アッセイプレートの各ウェルを３００μＬの供給された洗浄用緩衝液で３回、手動洗浄し、洗浄用緩衝液を十分に除去し、１５０μＬの供給された酵素コンジュゲート（西洋わさびペルオキシダーゼに結合したアビジンを含有）を室温で３０分間インキュベートした。アッセイプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、１５０μＬの供給されたＴＭＢ溶液（テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素の水性配合物を含有）を室温で３０分間インキュベートした後、５０μＬの供給された０．５Ｍ  ＨＣｌを添加して反応を停止した。全ウェルの吸光度を４５０ｎｍで、６５０ｎｍの吸光度を基準として、Molecular Devices Spectromax-Plus分光光度計により測定した。血清試料中のＰ１ＮＰの濃度をｎｇ／ｍＬで、標準曲線に対する標準回帰分析により決定した。
【０１９５】
ＴＲＡｃＰ−５ｂアッセイ
ＴＲＡｃＰ−５ｂアッセイを、ポリクローナル抗マウスＩｇＧでプレコートした状態で供給された９６ウェルのアッセイプレートにおいて実施した。各ウェルを１００μＬの抗ラットＴＲＡｃＰ−５ｂ抗体と共に、プレート振とう機上、９５０ｒｐｍで振とうしながら室温で６０分間インキュベートした。アッセイプレートの各ウェルを、３００μＬの供給された洗浄用緩衝液で４回、自動式１２００μＬマルチチャンネルピペットにより手動洗浄した。洗浄用緩衝液を払い落し、１００μＬの供給された標準品、または２５μＬの血清試料と７５μＬの０．９％  ＮａＣｌ溶液(Fresenius Kabi Ltd, Runcorn, UK, 製品コード2295121E)を、５０μＬの供給された放出試薬と共に１時間、室温で振とうしながらインキュベートした。アッセイプレートの各ウェルを、３００μＬの供給された洗浄用緩衝液で５回、手動洗浄した。洗浄用緩衝液を十分に除去し、１００μＬの供給された新たに調製したｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）基質溶液を３７℃で１時間インキュベートした後、２５μＬの０．３２Ｍ  ＮａＯＨを添加して反応を停止した。全ウェルの吸光度を４０５ｎｍで、Molecular Devices Spectromax-Plus分光光度計により測定した。血清試料中のＴＲＡｃＰ−５ｂの濃度をＵ／Ｌで、標準曲線に対する標準回帰分析により決定した。
【０１９６】
図２は、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩をラットに７日間経口投与した後の血清Ｐ１ＮＰレベルを示す。
【０１９７】
図３は、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩をラットに７日間経口投与した後の血清ＴＲＡｃＰ−５ｂレベルを示す。
【０１９８】
図２および図３に示すデータは、１日１回、連続７日間、雌ＣＲＬ：ＣＤラットに経口投与した３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩が血清Ｐ１ＮＰレベル（骨形成のマーカー）の上昇および血清ＴＲＡｃＰ−５ｂレベル（骨再吸収のマーカー）の低下を生じたことを立証する。これらの結果は、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩の経口投与が骨形成を促進することを指摘する。
【０１９９】
以下のアッセイを用いて、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩がＣＹＰ３Ａ４を阻害する能力を組換えヒト酵素において測定した。
【０２００】
アッセイ
特定の化合物が膜のＣＹＰ３Ａ４を阻害する能力を、ミダゾラム(midazolam)から１’−ヒドロキシミダゾラムへの酸化の阻害により測定した。ミダゾラムを用いると、ＣＹＰ３Ａ４は１’−ヒドロキシミダゾラムの形成を触媒し、これをＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより測定した。ＣＹＰ３Ａ４を阻害すると、１’−ヒドロキシミダゾラムの産生速度が対照と比較して低下した。自動プラットホームを用いる自動化アッセイ（完全ＩＣ５０）を用いて、プレート当たり最高１３の化合物およびＣＹＰ３Ａ４の標準阻害薬としてのケトコナゾール(ketoconazole)を試験した。
【０２０１】
インキュベーション
下記のものを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，３７℃で）中でインキュベーションを実施した：ＤＭＳＯ（１％）、ミダゾラム（２．５μＭ）、フェナセチン(phenacetin)（２５．７μＭ）、ジクロフェナク(diclofenac)（１．８μＭ）、Ｓ−メフェニトイン(S-mephenytoin)（３０．５μＭ）、ブフラロール(bufuralol)（８．８μＭ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）、大腸菌(E. coli)発現した３Ａ４膜（５ｐｍｏｌ／ｍｌ）、１Ａ２膜（２５ｐｍｏｌ／ｍｌ）、２Ｃ９膜（５ｐｍｏｌ／ｍｌ）、２Ｃ１９膜（２．５ｐｍｏｌ／ｍｌ）、２Ｄ６膜（５ｐｍｏｌ／ｍｌ）、ならびに被験阻害薬ケトコナゾール、α−ナフトフラボン(α-napthoflavone)、スルファフェナゾール(sulphaphenazole)、トラニルシプロミン(tranylcypromine)およびキニジン(quinidine)。フェナセチンおよびジクロフェナクはSigma-Aldrich (Poole, dorset, UK)から購入された。Ｓ−メフェニトイン、ブフラロール（塩酸塩）およびミダゾラム（塩酸塩）はUltrafine Chemicals (Manchester, UK)から購入された。組換え発現したＣＹＰ酵素はCypex (Dundee, UK)から購入された。
【０２０２】
アッセイをロボット式サンプルプロセッサーで実施した。インキュベーションをマイクロタイタープレート中で実施した。アッセイをＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）により開始し、試薬を混合し、プレートをプレインキュベートした。次いでプレートをホテルインキュベーター(hotel incubator)で１０分間インキュベートした。ＭｅＯＨ（１：１  ｖｏｌ／ｖｏｌ）の添加により反応を停止した。試料を遠心し、清浄なプレートへ移し、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより分析した；これは、Applied Biosystems - Sciex API4000質量分析計をAgilent HP1100 ２成分溶媒送達ポンプおよびCTC HTS-PAL自動サンプラーと共に用いて実施された。移動相はメタノール、および改質剤としてギ酸（０．１％）を含む水からなっていた。用いたカラムはPhenomenex Max RP ５０×２ｍｍ（４μｍの粒度）であった。勾配系を用いた：３％有機移動相０．２５分間から出発して、１．７５分で１００％有機移動相に上昇。総実験時間は２．５分間、流速は０．６ｍｌ／分。１０μＬをカラムに注入した）。生成物（１’−ヒドロキシミダゾラム）の形成をモニターした。
【０２０３】
阻害薬濃度
被験化合物の推奨濃度は５０、１５、５、１．５、０．５、０．１５μＭであった。これらの濃度を得るためには、ＤＭＳＯ中における被験阻害薬の５ｍＭ原液が必要であった。ケトコナゾールを標準阻害薬として用い、０．０９〜０．０００３μＭでインキュベートした。
【０２０４】
データ分析
各反応についてＭＳ／ＭＳ面積単位を測定することにより反応率を計算した。疑似Ｈｉｌｌプロットを用い、自動化スプレッドシートを利用してデータを直線化することにより、データ分析を実施した。
【０２０５】
ＣＹＰ３Ａ４の阻害度を計算し、ＩＣ５０値として表示した。ＩＣ５０値は、５０％のＣＹＰ３Ａ４活性を阻害した被験化合物濃度である。前記アッセイにおける３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩の推定ＩＣ５０値は＞５０μＭであり、これはその化合物がＣＹＰ３Ａ４に対して無視できる程度の活性をもつことを指摘する。
【０２０６】
下記のアッセイを用いて、心臓Ｎａ＋チャンネル、ｈＮａｖ１．５に対する３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩の活性を測定した。
【０２０７】
細胞の培養および調製
使用したｈＮａｖ１．５を発現するチャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯ）細胞は先に記載されている(Persson, F. et al, (2005), Journal of Cardiovascular Electrophysiology, 16, 329-341)。これらの細胞を、３７℃、加湿環境（５％  ＣＯ２）で、Glutamax（商標）、１０％のウシ胎仔血清および１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８(すべてInvitrogen)を含有するF-12 Ham培地において、半集密状態にまで増殖させた。使用前に、単層を、予熱した（３７℃）３ｍｌ部分のVersene 1:5000 (Invitrogen)で洗浄した。この溶液を吸引した後、フラスコを３７℃でさらに３ｍｌのVersene 1:5000と共に６分間インキュベートした。次いで軽く叩くことによりフラスコの底から細胞を剥離し、カルシウム（０．９ｍＭ）およびマグネシウム（０．５ｍＭ）を含有するダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；Invitrogen)１０ｍｌを次いでフラスコに添加し、１５ｍｌの遠心管中へ吸引した後、遠心した（５０ｇ，４分間）。得られた上清を廃棄し、ペレットを３ｍｌのＰＢＳに穏やかに再懸濁した。０．５ｍｌ部分の細胞懸濁液を取り出し、生存細胞数（トリパンブルー排除に基づく）を自動化細胞計数機(Cedex; Innovatis)で測定し、これにより細胞再懸濁液の容量をＰＢＳで調整して目的とする最終濃度にした。IonWorks Quattro実験について、用いた最終細胞濃度は１，０００，０００細胞／ｍｌであった。
【０２０８】
IonWorksについての電気生理学
IonWorks HTデバイスの原理および操作は、Schroeder et al. (Schroeder, et al (2003), Ionworks HT: a new high-throughput electrophysiology measurement platform. Journal of Biomolecular Screening, 8, 50-64.2003)により記載されている。要約すると、この手法は３８４ウェルプレート(PatchPlate)において、２つの隔離された流体チャンバーを分離する小さな孔に細胞を配置してそこに保持するために吸引を用いることにより、各ウェルにおいて記録を試みることに基づく。シーリングが行なわれた時点で、PatchPlateの下側の溶液をアンホテリシン(amphotericin)Ｂを含有するものに交換する。これは各ウェルの孔を覆っている細胞膜のパッチを透過性にし、実際に単一細胞からの穿孔された全細胞パッチクランプ記録を行なうのが可能になる。IonWorks Quattroデバイスは同じ手法を採用し、ただし、ウェル当たり最高６４個の細胞から記録を行なう。下記の組成（ｍＭ）をもつＰＢＳ(Invitrogen)を細胞外液として用いた：１３８  ＮａＣｌ、２．７  ＫＣｌ、０．９  ＣａＣｌ２、０．５  ＭｇＣｌ２、１．５  ＫＨ２ＰＯ４、および８．１  Ｎａ２ＨＰＯ４。“内部”溶液（シール形成過程で使用）組成（ｍＭ）は下記のとおりであった：グルコン酸カリウム１００、ＫＣｌ  ４０、ＭｇＣｌ２  ３．２、ＥＧＴＡ  ３およびＨＥＰＥＳ  ５（すべてSigma-Aldrich；ｐＨ７．２５〜７．３０，１０Ｍ  ＫＯＨを使用）。抗生物質を含有する溶液の組成（ｍＭ）は下記のとおりであった：ＫＣｌ  １４０、ＥＧＴＡ  １、ＭｇＣｌ２  １およびＨＥＰＥＳ  ２０（ｐＨ７．２５〜７．３０，１０Ｍ  ＫＯＨを使用）プラス１００μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ(Sigma-Aldrich)。１０の８点濃度−効果曲線を構築できるように、各化合物プレートを１２列にレイアウトした；プレート上の残り２列は、アッセイベースラインを決定するためのビヒクル（最終濃度０．３３％のＤＭＳＯ）、および１００％阻害レベルを決定するための過最大遮断濃度のフレカイニド(flecainide)（最終濃度３１６μＭ）が占めた。それぞれの被験化合物とのインキュベーションの前および約３．５分後にｈＮａｖ１．５電流を測定した。この方法で、非累積濃度−効果曲線を作成することができ、その際、許容基準の獲得は十分な割合のウェルにおいて達成された（後記を参照）。すべての記録を室温で行なった。
【０２０９】
化合物投与前および投与後のｈＮａｖ１．５電流を下記からなる単一電圧トレインにより誘起した：１５秒間の−９０ｍＶでの保持、１６０ミリ秒間の−１００ｍＶへの移行（漏れ電流の推定値を得るために）、１００ミリ秒間の元の−９０ｍＶへの移行、続いて５０ミリ秒の−９０ｍＶ保持電位から０ｍＶへの一連の８パルスを３Ｈｚで付与（刺激周波数３Ｈｚを選択したのは、それがヒトにみられる正常上限の心拍数、すなわち毎分１８０回に類似するからである）。化合物投与の前と後の電圧パルス間で膜電位のクランピングはなかった。電圧パルスプロトコルの開始時に−１００ｍＶへの移行に際して誘起された推定電流値に基づいて、電流の漏れを差し引いた。電流信号を２．５ｋＨｚでサンプリングした。
【０２１０】
IonWorks(商標)ソフトウェアにより０ｍＶへの脱分極パルスの終了までの平均電流（ベースライン電流）を求め、これをピーク内向き電流から差し引くことによって、漏れ電流差引きトレースから走査前および走査後ｈＮａｖ１．５電流振幅を決定した。各ウェルにおいて誘起された電流についての許容基準は下記のとおりであった：走査前シール抵抗＞３０ＭΩ（Quattro）、走査前Ｎａ＋電流振幅，−１５０ｐＡより負；走査後シール抵抗＞３０ＭΩ（Quattro）。各ウェルおよび各８試験パルスについて走査後ｈＮａｖ１．５電流をそれぞれの走査前ｈＮａｖ１．５電流で割ることにより、ｈＮａｖ１．５電流の阻害度を評価した。
【０２１１】
ＩＣ５０値は５０％のｈＮａｖ１．５活性を阻害した被験化合物濃度である。３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩のＩＣ５０は２１．２μＭであり、これはその化合物が心臓Ｎａ＋チャンネルｈＮａｖ１．５に対して有効な阻害活性を示さないことを指摘する。
【０２１２】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートを同様にインビボでのラット遺伝毒性微小核試験で試験した。この試験の目的は、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートの２回の経口投与がラット骨髄の微小核形成幼若赤血球(micronucleated immature erythrocytes)（ＭＩＥ）の頻度を高めるかどうかを調べることであった。
【０２１３】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートを、投与時に約１０週令であった雄Wistar Hanラット７匹のグループに投与した。グループに０、２５、１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの遊離塩基相当量（０、５９．５、２９７および５９５ｕｍｏｌ／ｋｇ）を２４時間間隔で２回投与し、２回目の投与後２４時間目に骨髄分析のためにサンプリングした。対照ラットにはビヒクル、すなわちリン酸緩衝化生理食塩水中０．５％  ｗ／ｖのヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび０．１％  ｗ／ｖのpolysorbate 80を投与した。最高用量は最大耐量であった。
【０２１４】
２回目の投与後２４時間目に動物をと殺し、骨髄塗抹標本を調製し、固定し、アクリジンオレンジで染色した。各動物について２０００個の幼若赤血球（ＩＥ）を微小核形成細胞（ＭＩＥ）の発生につき採点し、１０００個の細胞においてＩＥ−対−成熟赤血球（Ｅ）の比を決定した。品質管理措置として用いるために、先の試験において２０ｍｇ／ｋｇ（７２ｕｍｏｌ／ｋｇ）のシクロホスファミドで処理したラットの骨髄からの６枚のスライドを、染色およびコーディングの前の処理動物からのスライドと共に含めた。
【０２１５】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートの２回の経口投与後に、ＭＩＥの発生率にビヒクル対照を上回る生物学的または統計的に有意の上昇はなかった。ＩＥ：Ｅ比は処理グループとビヒクル対照グループで類似していた。予想どおり、予めシクロホスファミドを投与したラットからのスライドにおけるＭＩＥの発生率はビヒクル対照値と比較して有意に上昇していた。
【０２１６】
結論として、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートは、最高２５０ｍｇ／ｋｇの遊離塩基相当量（５９５ｕｍｏｌ／ｋｇ）を２回の経口投与として投与した場合、雄Wistar Hanラットの骨髄において微小核形成幼若赤血球の発生率を上昇させなかった。
【０２１７】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩は他の望ましい特性、たとえば薬物動態特性および高い水溶性（ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に約１１２８ｍｇ／ｍｌの平均溶解度測定値，ｎ＝４）を示すことも見出された。
【０２１８】
本発明の他の観点によれば、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤーと共に含む医薬組成物が提供される。
【０２１９】
本発明の組成物は、経口用（たとえば、錠剤、トローチ剤、硬もしくは軟カプセル剤、水性もしくは油性の懸濁液剤、乳剤、分散性の散剤もしくは顆粒剤、シロップ剤、またはエリキシル剤）、局所用（たとえば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、または水性もしくは油性の液剤もしくは懸濁液剤）、吸入による投与用（たとえば、微粒子状散剤または液体エアゾール剤）、吹入れによる投与用（たとえば、微粒子状散剤）、または非経口投与用（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与のための無菌の水性または油性の液剤または懸濁液剤）に適した剤形、または直腸投与用の坐剤としてであってもよい。
【０２２０】
本発明の組成物は、骨組織の処置に適した器具またはインプラントと併せて用いることもできる。
本発明の組成物は、常法により、当技術分野で周知の一般的な医薬賦形剤を用いて常法により得ることができる。例として、経口用組成物はたとえば１種類以上の着色剤、甘味剤、着香剤および／または保存剤を含有することができる。
【０２２１】
１種類以上の賦形剤と組み合わせて単一剤形を製造するための有効成分の量は、処置されるホストおよび個々の投与経路に応じて必然的に異なるであろう。たとえば、ヒトに経口投与するための配合物は、一般にたとえば１ｍｇから１ｇまでの有効薬剤（より適切には１から２５０ｍｇまで、たとえば１から１００ｍｇまで）を、適切かつ好都合な量の賦形剤と配合されて含有するであろう；賦形剤の量は全組成物の約５から約９８重量％まで変動してもよい。
【０２２２】
治療または予防の目的のための式Ｉの化合物の投与量は、疾病状態の性質および重症度、動物または患者の年齢および性別、ならびに投与経路に従い、周知の医薬原理に従って、当然異なるであろう。
【０２２３】
式Ｉの化合物を治療または予防の目的で使用する際、それは一般に たとえば１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の１日量が得られるように、必要であれば分割量で、投与されるであろう。一般に、非経口経路を採用する場合はより低い用量が投与されるであろう。例として、静脈内投与には、たとえば１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量が一般に用いられるであろう。同様に、吸入による投与には、たとえば１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量が用いられるであろう。しかし、経口投与、特に錠剤の形態での投与が好ましい。一般に、単位剤形は約１０ｍｇ〜０．５ｇの本発明化合物を含有するであろう。
【０２２４】
前記のように、本発明において定める式Ｉの化合物はグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）の阻害に好適であることが見出された。したがって、本発明の化合物はグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性に関連する状態の予防および／または治療に有用であると期待される；すなわち、これらの化合物は、そのような予防および／または治療を必要とするヒトを含めた哺乳動物においてＧＳＫ３の阻害効果を生じるために使用できる。
【０２２５】
前記のように、ＧＳＫ３酵素の阻害薬は、種々の形の骨関連障害または状態、たとえば骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の予防および／または治療のために療法的価値があるはずである。
【０２２６】
本発明の観点によれば、ヒトなどの温血動物において医薬として使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
本発明の観点によれば、ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ３に関連する状態の予防および／または治療に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２２７】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ３に関連する状態を予防および／または治療するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２２８】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ３に関連する状態の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２２９】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物においてＧＳＫ３に関連する状態を予防および／または治療するための方法であって、その動物に有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２３０】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物において骨損失の予防に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物における骨損失の予防における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２３１】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨損失作用の予防に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２３２】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨損失を予防するための方法であって、その動物に有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２３３】
本発明の観点によれば、ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ３酵素の阻害に感受性である骨関連の障害または状態の予防および／または治療に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２３４】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物においてＧＳＫ３酵素の阻害に感受性である骨関連の障害または状態の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２３５】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ＧＳＫ３酵素の阻害に感受性である骨関連の障害または状態を予防および／または治療するための方法であって、ヒトなどの温血動物に有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２３６】
本発明の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌における骨病変、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の予防および／または治療に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２３７】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌における骨病変、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２３８】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌における骨病変、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２３９】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）、傷害もしくは外科処置の結果としての骨折の修復、骨損失をもたらす慢性炎症性疾患、たとえばリウマチ性関節炎、骨病変を生じる癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌における骨病変、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病を予防および／または治療するための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２４０】
前記に定めた式Ｉのピラジン化合物は原発性および続発性の骨粗鬆症に使用でき、その際、原発性骨粗鬆症には閉経後骨粗鬆症、ならびに男女両方における老年性骨粗鬆症が含まれ、続発性骨粗鬆症にはコルチゾン誘発性骨粗鬆症が含まれ、また他のいずれかのタイプの誘発型続発性骨粗鬆症が骨粗鬆症という用語に含まれる。式Ｉのピラジン化合物は、種々の配合計画で、これらの状態を処置するために局所または全身に投与できる。
【０２４１】
したがって、本発明の他の特徴では、ヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）の処置に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２４２】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）の処置に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２４３】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）の処置に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２４４】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨粗鬆症（遺伝性、医原性、または老化／ホルモンバランス異常により発症するもの）を処置するための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのクロメノン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２４５】
骨形成および／または骨無機質密度の促進および増大により、前記に定めた式Ｉの化合物は、哺乳動物における骨折発生の低下、骨折率の低下、および／または骨折治癒速度の増大、海面骨形成および／または新規骨形成の増強に適したものになる。新規骨形成を促進および増強するための使用は、外科処置に関係するものであってもよい。本発明は外科処置中に使用でき、その際、担当の外科医が本発明を適切な配合物中において、骨欠損部付近および／または体腔に局所配置する。骨はたとえば破損していてもよく、その際、本明細書および特許請求の範囲に記載する本発明の使用は開放骨折修復中に骨折部またはその付近においてなされるであろう。ある場合には骨片が失われていてもよく（たとえば、腫瘍摘出後または重大な災害）、その際、本明細書および特許請求の範囲に記載する本発明の使用は骨構築外科処置部位の付近においてなされるであろう。
【０２４６】
したがって、本発明の他の特徴では、ヒトなどの温血動物において骨形成を促進するのに使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２４７】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨形成を促進するのに使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２４８】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨形成を促進するのに使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２４９】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨形成を促進するための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２５０】
本発明の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨無機質密度を増大させるのに使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２５１】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨無機質密度を増大させるのに使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２５２】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨無機質密度を増大させるのに使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２５３】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨無機質密度を増大させるための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２５４】
本発明の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨折の発生を低下させ、および／または骨折治癒速度を増大させ、および／または治癒した骨折部の強度を増大させるのに使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２５５】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨折の発生を低下させ、および／または骨折治癒速度を増大させ、および／または治癒した骨折部の強度を増大させるのに使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２５６】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において骨折の発生を低下させ、および／または骨折治癒速度を増大させ、および／または治癒した骨折部の強度を増大させるのに使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２５７】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨折の発生を低下させ、および／または骨折治癒速度を増大させ、および／または治癒した骨折部の強度を増大させるための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２５８】
本発明の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病における骨病変の予防および／または治療に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２５９】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病における骨病変の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２６０】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病における骨病変の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２６１】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患、ならびにページェット病における骨病変を予防および／または治療するための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２６２】
本発明の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において多発性骨髄腫における骨病変の予防および／または治療に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２６３】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、ヒトなどの温血動物において多発性骨髄腫における骨病変の予防および／または治療に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２６４】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において多発性骨髄腫における骨病変を予防および／または治療するための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２６５】
本発明の他の特徴によれば、癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の結果としての骨病変を伴うヒトなどの温血動物において骨格関連事象の予防に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２６６】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の結果としての骨病変を伴うヒトなどの温血動物において骨格関連事象の予防に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２６７】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、癌、たとえば乳癌、前立腺癌および肺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、癌誘発性骨疾患、医原性骨疾患、良性骨疾患ならびにページェット病の結果としての骨病変を伴う、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において、骨格関連事象を予防するための方法であって、有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２６８】
骨関連の障害または状態のほかに、ＧＳＫ３酵素は他の疾患において役割をもつという証拠がある。したがって、ＧＳＫ３酵素の阻害薬は骨関連の障害または状態のほかに広範な疾患の予防および治療に際して価値があると期待される。たとえばＧＳＫ３酵素の阻害薬は癌の処置に際して価値があると期待される。実際に、特定の式Ｉのピラジン誘導体、すなわち３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩は、癌において役割をもつ他のキナーゼ、たとえばＰＩＭ３、ＣＨＫ２（チェックポイントキナーゼ２）およびＤＹＲＫ１ａ(Dual Specificity Tyrosine Phosphorylated and Regulated Kinase（二重特異性チロシンリン酸化型および調節型キナーゼ）１ａ）に対して阻害活性を示すことも見出された。
【０２６９】
したがって、式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩は、充実性腫瘍を含めた種々の形態の癌疾患、たとえば癌腫および白血病およびリンパ性悪性疾患の処置のために療法的価値があるはずである。特に、式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌および細気管支肺胞上皮癌を含む）および前立腺癌、ならびに胆管、骨、膀胱、頭頚部、腎臓、肝臓、胃腸組織、食道、卵巣、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮、子宮頚および外陰部の癌、ならびに白血病（ＡＬＬおよびＣＭＬを含む）、多発性骨髄腫およびリンパ腫の処置のために、療法的価値があるはずである。
【０２７０】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物において癌の処置に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物において癌の処置に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２７１】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において癌を処置するための方法であって、その動物に有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２７２】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物において乳癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌および細気管支肺胞上皮癌を含む）および前立腺癌から選択される癌の処置に使用するための、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２７３】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物において乳癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌および細気管支肺胞上皮癌を含む）および前立腺癌から選択される癌の処置に使用するための医薬の製造における、前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩の使用が提供される。
【０２７４】
本発明のこの観点の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において乳癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌および細気管支肺胞上皮癌を含む）および前立腺癌から選択される癌を処置するための方法であって、その動物に有効量の前記に定めた式Ｉのピラジン誘導体またはその医薬的に許容できる塩を投与することを含む方法が提供される。
【０２７５】
本明細書の概念において、用語“療法”または“処置”は、それに反する具体的指示がない限り、“予防”も含む。用語“療法的”および“療法的に”は、これに従って解釈すべきである。
【０２７６】
本明細書の概念において、用語“障害”は、それに反する具体的指示がない限り、“状態”も含む。
前記に述べたように、式Ｉの化合物のインビボ効果は、一部は式Ｉの化合物の投与後にヒトまたは動物の体内で形成された１以上の代謝産物により発揮される可能性がある。
【０２７７】
前記に定めた抗骨損失処置を唯一の療法として適用してもよく、あるいは本発明の化合物のほかに一般的な外科処置または放射線療法または化学療法を伴ってもよい。そのような化学療法には下記のカテゴリーの抗腫瘍薬のうち１以上を含めることができる：−
（ｉ）癌医療に用いられる他の抗増殖／抗新生物薬およびその組合わせ、たとえばアルキル化剤（たとえば、シスプラチン(cis-platin)、オキサリプラチン(oxaliplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ナイトロジェンマスタード(nitrogen mustard)、メルファラン(melphalan)、クロラムブシル(chlorambucil)、ブスルファン(busulphan)、テモゾラミド(temozolamide)およびニトロソ尿素類）；代謝拮抗薬（たとえば、ゲムシタビン(gemcitabine)、ならびに葉酸代謝拮抗薬、たとえばフルオロピリミジン類、たとえば５−フルオロウラシルおよびテガフル(tegafur)、ラルチトレキセド(raltitrexed)、メトトレキセート(methotrexate)、シトシンアラビノシド(cytosine arabinoside)、およびヒドロキシ尿素)；抗腫瘍性抗生物質（たとえばアントラサイクリン類、たとえばアドリアマイシン(adriamycin)、ブレオマイシン(bleomycin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ダウノルビシン(daunomycin)、エピルビシン(epirubicin)、イダルビシン(idarubicin)、マイトマイシン−Ｃ(mitomycin-C)、ダクチノマイシン(dactinomycin) およびミトラマイシン(mithramycin))；細胞分裂抑制薬（たとえば、ツルニチニチソウアルカロイド、たとえばビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンデシン(vindesine)およびビノレルビン(vinorelbine)、ならびにタキソイド類、たとえばタキソール(taxol)およびタキソテール(taxotere)、ならびにポロキナーゼ阻害薬)；およびトポイソメラーゼ阻害薬（たとえば、エピポドフィロトキシン類、たとえばエトポシド(etoposide)およびテニポシド(teniposide)、アムサクリン(amsacrine)、トポテカン(topotecan)およびカンプトテシン(camptothecin))；
（ｉｉ）細胞増殖抑制薬、たとえば抗エストロゲン薬（たとえば、タモキシフェン(tamoxifen)、フルベストラント(fulvestrant)、トレミフェン(toremifene)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)およびヨードキシフェン(iodoxyfene))、抗アンドロゲン薬（たとえば、ビカルタミド(bicalutamide)、フルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)および酢酸シプロテロン(cyproterone acetate))、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（たとえば、ゴセレリン(goserelin)、ロイプロリン(leuprorelin)およびブセレリン(buserelin)）、プロゲストーゲン類（たとえば、酢酸メゲストロール(megestrol acetate))、アロマターゼ阻害薬（たとえば、アナストロゾール(anastrozole)、レトロゾール(letrozole)、ボラゾール(vorazole)およびエキセメスタン(exemestane))、ならびに５α−レダクターゼの阻害薬、たとえばフィナステリド(finasteride)；
（ｉｉｉ）抗浸潤薬［たとえば、ｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害薬、たとえば４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン(AZD0530；国際特許出願WO 01/94341)、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド(ダサチニブ(dasatinib)、BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661)およびボスチニブ(bosutinib) (SKI-606)、ならびにメタロプロテイナーゼ阻害薬、たとえばマリマスタット(marimastat)、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能の阻害薬、またはヘパラナーゼに対する抗体]；
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害薬：たとえば、そのような阻害薬には下記のものが含まれる：増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体（たとえば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツヅマブ(trastuzumab) [Herceptin(商標)]、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ(panitumumab)、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ(cetuximab) [Erbitux, C225]、ならびにStern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29により示されたいずれかの増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体)；そのような阻害薬にはチロシンキナーゼ阻害薬、たとえば上皮増殖因子ファミリーの阻害薬も含まれる（たとえば、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼの阻害薬、たとえばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ(gefitinib), ZD1839)、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン(エルロチニブ(erlotinib), OSI-774)および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン(CI 1033)、ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害薬、たとえばラパチニブ(lapatinib))；肝細胞増殖因子ファミリーの阻害薬；インスリン増殖因子ファミリーの阻害薬；血小板由来増殖因子ファミリーの阻害薬、たとえばイマチニブ(imatinib)および／またはニロチニブ(nilotinib) (AMN107)；セリン／トレオニンキナーゼの阻害薬（たとえば、Ｒａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害薬、たとえばファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、たとえばソラフェニブ(sorafenib) (BAY 43-9006)、ティピファルニブ(tipifarnib) (R115777)およびロナファルニブ(lonafarnib) (SCH66336))、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼによる細胞シグナル伝達の阻害薬、ｃ−ｋｉｔ阻害薬、ａｂｌキナーゼ阻害薬、ＰＩ３キナーゼ阻害薬、Ｐｌｔ３キナーゼ阻害薬、ＣＳＦ−１Ｒキナーゼ阻害薬、ＩＧＦ受容体（インスリン様増殖因子）キナーゼ阻害薬；オーロラキナーゼ阻害薬（たとえば、AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528およびAX39459)ならびにサイクリン依存性キナーゼ阻害薬、たとえばＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害薬；
（ｖ）抗血管新生薬、たとえば血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの［たとえば、抗−血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ(bevacizumab) (Avastin(商標))、および、たとえばＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬、たとえばバンデタニブ(vandetanib) (ZD6474)、バタラニブ(vatalanib) (PTK787)、スニチニブ(sunitinib) (SU11248)、アキシチニブ(axitinib) (AG-013736)、パゾパニブ(pazopanib) (GW 786034)および４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン(AZD2171; WO 00/47212の例240)、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856およびWO 98/13354に開示される化合物、ならびに他の機序により作動する化合物（たとえば、リロミド(linomide)、インテグリンαｖβ３機能の阻害薬、およびアンギオスタチン(angiostatin))]；
（ｖｉ）血管損傷薬、たとえばコンブレタスタチンＡ４(Combretastatin A4)、ならびに国際特許出願WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669,WO 01/92224, WO 02/04434およびWO 02/08213に開示される化合物；
（ｖｉｉ）エンドセリン受容体アンタゴニスト、たとえばジボテンタン(zibotentan) (ZD4054)またはアトラセンタン(atrasentan)；
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法薬、たとえば前記の標的に向けたもの、たとえばISIS 2503、および抗ｒａｓアンチセンス；
（ｉｘ）プロテオソーム阻害薬、たとえばVelcade(ボルテゾミブ(bortezomib))；
（ｘ）下記を含む遺伝子療法：たとえば、異常な遺伝子、たとえば異常なｐ５３または異常なＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２を交換する方法、ＧＤＥＰＴ(gene-directed enzyme pro-drug therapy；遺伝子指向型酵素プロドラッグ療法)方法、たとえばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロレダクターゼ酵素を用いる方法、および化学療法または放射線療法に対する患者の耐容性を高める方法、たとえば多剤耐性遺伝子療法；ならびに
（ｘｉ）下記を含む免疫療法、たとえば、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのエクスビボ法およびインビボ法、たとえばサイトカイン、たとえばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子のトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを低下させる方法、トランスフェクションした免疫細胞、たとえばサイトカイントランスフェクションした樹状細胞を用いる方法、サイトカイントランスフェクションした腫瘍細胞系を用いる方法、ならびに抗イディオタイプ抗体を用いる方法。
【０２７８】
本発明のこの観点によれば、骨関連の障害または状態の処置に使用するのに適した組合せであって、前記に定めた式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩および前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げた抗腫瘍薬のいずれか１つを含む組合わせが提供される。
【０２７９】
したがって、本発明の他の観点において、前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせた式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【０２８０】
本明細書中で用語“組合わせ”を用いる場合、これは同時、個別または逐次投与を表わすことを理解すべきである。本発明の１観点において、“組合わせ”は同時投与を表わす。本発明の他の観点において、“組合わせ”は個別投与を表わす。本発明のさらに他の観点において、“組合せ”は逐次投与を表わす。投与が逐次または個別である場合、第２成分の投与の遅れは組合せの有益な効果を失うほどであってはならない。
【０２８１】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせたものを、医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤーと共に含む、医薬組成物が提供される。
【０２８２】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせたものを、医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤーと共に含む、骨関連の障害または状態の処置に使用するための医薬組成物が提供される。
【０２８３】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物において骨関連の障害または状態の処置に使用するための医薬の製造における、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせたものの使用が提供される。
【０２８４】
本発明の他の特徴によれば、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨関連の障害または状態を処置するための方法であって、その動物に有効量の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。
【０２８５】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩を前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせたものを含むキットが提供される。
【０２８６】
本発明の他の観点によれば、下記のものを含むキットが提供される：
ａ）第１単位剤形の、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩；
ｂ）第２単位剤形の、前記の（ｉ）〜（ｘｉ）に挙げたものから選択される抗腫瘍薬；ならびに
ｃ）第１および第２剤形を収容するための容器手段。
【０２８７】
前記に定めた抗骨損失処置を唯一の療法として適用してもよく、あるいは本発明の化合物のほかに他の薬理活性剤（単数または複数）、たとえばビスホスホネート類、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ(selective estrogen receptor modulator；選択的エストロゲン受容体調節薬)、ＲＡＮＫＬ(receptor activator of nuclear factor kB ligand；核因子ｋＢリガンドの受容体活性化剤)アンタゴニスト、カルシトニン類、およびエストゲン促進薬(oestogenic promoting agent)、たとえば副甲状腺ホルモンまたは組換えもしくは合成による副甲状腺ホルモンとの組合わせを伴ってもよい。ビスホスホネート類の例には、アレンドロネート(alendronate)、クロドロネート(clodronate)、イバンドロネート(ibandronate)、パミドロネート(pamidronate)、エチドロネート(etidronate)、リセドロネート(risedronate)、チルドロネート(tiludronate)、およびゾレドロン酸(zoledronic acid)が含まれる。ＳＥＲＭＳの例には、ラロキシフェン(raloxifene)およびジヒドロラロキシフェン(dihydroraloxifene)が含まれる。ＲＡＮＫＬアンタゴニストの例はデノスマブ(denosumab)である。カルシトニン類には、ヒトおよびサケのカルシトニン類が含まれる。
【０２８８】
本発明のこの観点によれば、骨関連の障害または状態の処置に使用するのに適した組合わせであって、前記に定めた式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩、ならびにビスホスホネート、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト、カルシトニン、およびエストゲン促進薬から選択される薬理活性剤を含む組合わせが提供される。
【０２８９】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩をビスホスホネート、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト、カルシトニン、およびエストゲン促進薬から選択される薬理活性剤と組み合わせたものを、医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤーと共に含む、医薬組成物が提供される。
【０２９０】
本発明の他の観点によれば、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩をビスホスホネート、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト、カルシトニン、およびエストゲン促進薬から選択される薬理活性剤と組み合わせたものを、医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤーと共に含む、骨関連の障害または状態の処置に使用するための医薬組成物が提供される。
【０２９１】
本発明の他の観点によれば、ヒトなどの温血動物の骨関連の障害または状態の処置における、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩をビスホスホネート、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト、カルシトニン、およびエストゲン促進薬から選択される薬理活性剤と組み合わせたものの使用が提供される。
【０２９２】
したがって、本発明のさらに他の特徴では、そのような処置を必要とするヒトなどの温血動物において骨関連の障害または状態を処置するための方法であって、その動物に有効量の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容できる塩をビスホスホネート、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト、カルシトニン、およびエストゲン促進薬から選択される薬理活性剤と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。
【０２９３】
式Ｉの化合物は主に温血動物（ヒトを含む）に使用するための療法薬として価値があるが、それらはＧＳＫ−３の作用を阻害する必要がある場合には常に同様に有用である。たとえば、それらは新規な生物学的試験法の開発および新規な薬理活性剤の探査に際して薬理学的標準品として有用である。
【実施例】
【０２９４】
以下、本発明を下記の実施例において説明する。本発明においては、一般に以下のとおりである。
（ｉ）別に記載しない限り、操作は周囲温度で、すなわち１７〜２５℃の範囲で、不活性ガス、たとえば窒素の雰囲気下に実施された;
（ｉｉ）蒸発は回転式蒸発により実施され、仕上げ処理は残留固体を濾過により分離した後に実施された；
（ｉｉｉ）フラッシュクロマトグラフィー精製は自動化combiflash companion (TELEDYNE, ISCO, USA)で、Agela technologiesから入手したプレパックAgela順相Si60シリカカートリッジを用いて実施された；
（ｉｖ）分取クロマトグラフィーは、ZMDまたはZQ ESCi質量分析計およびLuna逆相カラム(C-18,５ミクロンのシリカ，直径５０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，流速８０ｍｌ／分）を備えたSHIMADZU機器(LC-8A)で、極性が低下する水（０．１％  ＴＦＡを含有）およびアセトニトリルの混合物を溶離剤として用いて実施され、あるいはＲＰＨＰＬＣ（逆相分取高速液体クロマトグラフィー）で、Waters Symmetry C8、XterraまたはPhenomenex Geminiカラムを用い、アセトニトリル、および適切な場合には緩衝剤としての水性酢酸アンモニウム、アンモニア、ギ酸またはトリフルオロ酢酸のいずれかを用いて実施された；
（ｖ）収率を提示した場合、それらは必ずしも達成可能な最大ではない；
（ｖｉ）一般に、式Ｉの目的生成物の構造を核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により確認した；ＮＭＲ化学シフト値はデルタ目盛で測定された［プロトン核磁気共鳴スペクトルはVarianまたはBruker Avance 400 (400 MHz)機器を用いて測定された；別に明記しない限り、測定は周囲温度で行なわれた；下記の略号を用いた：ｓ，一重線；ｄ，二重線；ｔ，三重線；ｑ，四重線；ｍ，多重線；ｄｄ，二重線の二重線；ｄｄｄ，二重線の二重線の二重線；ｄｔ，三重線の二重線；ｂｓ，幅広い信号；
（ｖｉｉ）一般に、式Ｉの目的生成物を液体クロマトグラフィーを伴う質量分析（ＬＣＭＳ）によっても特性解明した；ＬＣＭＳは、SHIMADZU 2010EV質量分析計を備えたSHIMADZU 20 ABを用いて、Xtimate 3um C-18カラム（２．１×３０ｍｍ）またはShim-pack XR-ODS C-18カラム（３．０×３０ｍｍ）で、下記のいずれかにより実施された：（ａ）流速１．２ｍｌ／分、溶媒系１０％Ａ＋９０％Ｂ〜８０％Ａ＋２０％Ｂを３分間にわたって用い、その際、Ａ＝アセトニトリル中０．０１８７５％  ＴＦＡ、Ｂ＝Ｈ２Ｏ中０．０３７５％  ＴＦＡ）、または（ｂ）流速１．０ｍｌ／分、溶媒系９０％Ａ＋１０％Ｂ〜１０％Ａ＋８０％Ｂを２分間にわたって用い、その際、Ａ＝水中０．０５％ギ酸、Ｂ＝ＡＣＮ中０．０５％ギ酸；
（ｘｉｉｉ）Ｘ線粉末回折スペクトルは、結晶質材料の試料をシリコン単結晶（ＳＳＣ）ウェハー試料ホルダーに乗せ、試料を広げて薄層にすることにより測定された(P’Analytical Cubix Analytical Instrumentを使用)。試料を毎分３０回転で遠心し（計数統計値を改善するために）、４５ｋＶおよび４０ｍＡで１．５４１８オングストロームの波長で操作される銅ロングファインフォーカス管(copper long-fine focus tube)により発生するＸ線を照射した。照準Ｘ線源を、Ｖ２０に設定した自動可変拡散スリットに通し、反射した放射線を５．８９ｍｍの散乱防止スリットおよび９．５５ｍｍの検出スリットを通して方向づけた。試料を０．０２°の２θ増分当たり１００秒間（連続走査モード）、２°から４０°の２θにわたってθ−θモードで照射した。機器はPosition sensitive detector (Lynxeye)であった。管理およびデータ取得は、X’Pert industryソフトウェアにより操作されるDell Optiplex 686 Windows XP Workstationによった。Ｘ線粉末回折の専門家は、ピークの相対強度が、たとえば試料の分析に影響を及ぼす可能性がある３０ミクロンを超えるサイズおよび単一ではないアスペクト比の結晶粒によって影響を受ける可能性があることを認識しているであろう。当業者は反射の位置が回折計において試料が存在する厳密な高さおよび回折計のゼロ目盛定めによって影響を受ける可能性があることも認識しているであろう。試料の表面平坦度もわずかな影響をもつ可能性がある。したがって、提示した回折パターンデータを絶対的な数値と解釈すべきではない；
（ｉｘ）示差走査熱量測定はTA Instruments Q2000 DSC機器を用いて実施された。一般に、蓋付きTZeroアルミニウム皿に入れた５ｍｇ未満の材料を温度範囲０℃〜３００℃にわたって毎分１０℃の一定の加熱速度で加熱した。パージガス窒素を用いた−流速毎分５０ｍｌ。一般に、転移温度値における約±１℃の測定誤差は粒子および試料サイズにより導入される温度遅れによるものとみることができる；ならびに
（ｘ）下記の略号を用いた：−
Ｂｏｃ２Ｏ    二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル
Ｂｒ２    臭素
ＣＤＣｌ３    ジューテリウム化クロロホルム
ＤＣＭ    ジクロロメタン
ＤＭＡＰ    ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ    Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ    ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ    酢酸エチル
ＨＡＴＵ    Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＣｌ    塩化水素
ＨＦ    フッ化水素
ＩＰＡ    イソプロピルアルコール
ＫＯＡｃ    酢酸カリウム
Ｋ２ＣＯ３    炭酸カリウム
ＬｉＡｌＨ４    水素化アルミニウムリチウム
ＭｅＣＮ    アセトニトリル
ＭｅＯＤ    ジューテロ−メタノール
ＭｇＳＯ４    硫酸マグネシウム
ＭｓＣｌ    塩化メタンスルホニル
ＭＴＢＥ    メチル  ｔｅｒｔ−ブチルエーテル
Ｎａ２ＣＯ３    炭酸ナトリウム
ＮａＯＨ    水酸化ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４    硫酸ナトリウム
ＮＭＰ    １−メチル−２−ピロリドン
Ｎ２    窒素ガス
ＰＣｙ３    トリシクロヘキシルホスフィン
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２    ジクロロ［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）
Ｐｄ−Ｃｌ２    ジクロロパラジウム（ＩＩ）
ＰＥ    石油エーテル
ＴＢＳＣｌ    ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド
ＴＨＦ    テトラヒドロフラン
ＴＥＡ    トリエチルアミン
ＴＬＣ    薄層クロマトグラフィー
実施例１
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩
【０２９５】
【化１７】
2013517321.tif 000019
【０２９６】
表題化合物を下記のスキームに従って製造した：
【０２９７】
【化１８】
2013517321.tif 000020
【０２９８】
（ｉ）３−（４−ブロモフェニル）プロパン−１−オール：
３−（４−ブロモフェニル）−プロピオン酸（９．１６ｇ，４０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中における溶液に、０℃でＬｉＡｌＨ４（１．４ｇ，３６ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加した。添加が終了した時点で、反応混合物を還流下でさらに５時間、加熱および撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、２Ｎ−ＨＣｌ（５０ｍＬ）を滴加した。反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、水（×３）で洗浄した。有機抽出液を合わせて無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、これにより副題化合物（ｉ）が油として得られた（８ｇ）；
1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.40 (d, 2H), 7.08 (d, 2H), 3.66 (t, 2H), 2.66 (t, 2H), 1.89-1.82 (m, 2H)。
【０２９９】
（ｉｉ）（３−（４−ブロモフェニル）プロポキシ）（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラン：
工程（ｉ）の生成物（３２．２５ｇ，０．１５ｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（４００ｍＬ）中における溶液に、トリエチルアミン（４５ｇ，０．４５ｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（９１５ｍｇ，７．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＳＣｌ（３３ｇ，０．２１５ｍｏｌ）を順に添加した。得られた溶液を一夜撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（×３）で洗浄した。有機層を合わせて無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによりＰＥを用いて精製して、副題化合物（ｉｉ）を淡褐色の油として得た（４０ｇ）；
1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.34 (d, 2H), 7.02 (d, 2H), 3.56 (t, 2H), 2.58 (t, 2H), 1.77-1.73 (m, 2H), 0.86 (s, 9H), 0.00 (s, 6H);
HPLC保持時間= 1.017分。
【０３００】
（ｉｉｉ）３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸メチル：
３−アミノピラジン−２−カルボン酸メチルエステル（２００ｇ，１．３ｍｏｌ，3B Scientific Corporation）をＡｃＯＨ（１Ｌ）に溶解した。この溶液を５０℃に加温し、Ｂｒ２（３１２ｇ，１．９ｍｏｌ）を滴加した。添加が終了した時点で、混合物を５０℃でさらに３時間撹拌した。反応混合物を徐々に氷−水（４Ｌ）に注入した。沈殿を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、副題化合物（ｉｉｉ）を褐色の油として得た（３００ｇ）；
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (s, 1H), 3.97 (s, 3H);
HPLC保持時間= 1.016分。
【０３０１】
（ｉｖ）３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸：
工程（ｉｉｉ）の生成物（２００ｇ，０．８６ｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５００ｍＬ）中における溶液に、５Ｎ−ＮａＯＨ（５００ｍＬ）を徐々に添加した。得られた混合物を５０℃で３時間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、水（３００ｍＬ）を反応混合物に添加した。溶液を６Ｎ−ＨＣｌでｐＨ３の酸性にした。溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、水で洗浄した。有機抽出液を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固して、副題化合物（ｉｖ）を黄褐色固体として得た（１８０ｇ）；
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.30 (s, 1H);
HPLC保持時間= 0.850分。
【０３０２】
（ｖ）３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
工程（ｉｖ）の生成物（１００ｇ，０．４５ｍｏｌ）のＤＭＦ（３５０ｍＬ）中における溶液に、ＴＥＡ（１２９ｍＬ，０．９１ｍｏｌ）および３−アミノピリジン（４２．３ｇ，０．４５ｍｏｌ）を添加した。ＨＡＴＵ（１７４ｇ，０．４５ｍｏｌ）を溶液に少量ずつ添加した。この懸濁液を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、副題化合物（ｖ）を黄色固体として得た（１０５ｇ）；
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.50 (s, 1H), 8.81 (d, 1H), 8.40 (dd, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.23-8.20 (m, 1H), 7.33 (dd, 1H). LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 294および296 (計算値= 294および296) (MultiMode+), HPLC保持時間= 0.478分。
【０３０３】
（ｖｉ）３−アミノ−６−（４−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）プロピル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）−ピラジン−２−カルボキサミド：
工程（ｉｉ）の生成物（９．８４ｇ，３０ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１１．４ｇ，４５ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（９ｇ，９０ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１ｇ，１．５ｍｍｏｌ）のジオキサン（２００ｍＬ）中における混合物を撹拌し、Ｎ２（×３）で脱ガスした。混合物を８０℃でＮ２雰囲気下に３時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却した。水（２５ｍＬ）およびＮａ２ＣＯ３（１０ｇ，９０ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。混合物を１０分間撹拌した後、工程（ｖ）の生成物（７．９ｇ，２７ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．５ｇ，０．７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液をＮ２（×３）で再び脱ガスした。反応混合物を９０℃でＮ２雰囲気下にさらに１０時間撹拌した。Ｎａ２ＳＯ４を添加し、濾過し、濾液を真空中で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによりＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝５：１−３：１を溶離剤として用いて精製して、副題化合物（ｖｉ）を黄色固体として得た（７．８ｇ）；
1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 9.90 (s, 1H), 8.73 (d, 1H), 8.62 (s, 1 H), 8.34 (d, 1H), 8.21 (d, 1H), 7.74 (d, 2H), 7.28 (d, 2H), 7.28 (m, 1H), 3.6 (t, 2H), 2.68 (t, 2H), 1.83-1.79 (m, 2H), 0.86 (s, 9H), 0.00 (s, 6H); LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 464 (計算値= 464) (MultiMode+), HPLC保持時間= 1.233分。
【０３０４】
（ｖｉｉ）３−アミノ−６−（４−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド：
工程（ｖｉ）の生成物（１４．５ｇ，３１．３ｍｍｏｌ）をプラスチック容器に入れ、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）を添加した。ＨＦ（３０ｍＬ）を慎重に溶液に添加し、溶液を室温で３時間撹拌した。混合物を６００ｍＬの水に注入し、５Ｎ−ＮａＯＨを添加して溶液をｐＨ＝１０〜１１の塩基性にした。溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、水（×３）で洗浄した。ＥｔＯＡｃ抽出液を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、これにより副題化合物（ｖｉｉ）が黄色固体として得られた（１０ｇ）；
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.94 (d, 1 H), 8.87（s, 1H）, 8.31 (dd, 1H), 8.18-8.16 (m, 1H), 8.10 (d, 2H), 7.60 (brs, 2H), 7.38 (dd, 1H), 7.28 (d, 2H), 3.39 (q, 2H ), 2.61 (t, 2H), 1.75-1.65 (m, 2H); LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 350 (計算値= 350) (MultiMode+), HPLC保持時間= 0.858分。
【０３０５】
（ｖｉｉｉ）３−（４−（５−アミノ−６−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ピラジン−２−イル）フェニル）プロピル  メタンスルホネート：
ジクロロメタン（２００ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（２ｇ，１７．１６ｍｍｏｌ）を、工程（ｖｉｉ）の生成物（４ｇ，１１．４６ｍｍｏｌ）に添加した。得られた溶液を０℃に冷却し、ＭｓＣｌ（２ｇ，１７．１６ｍｍｏｌ）を滴加した。添加が終了した時点で、得られた溶液を０℃で１０分間、そして室温で２時間、撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（×３）で洗浄した。有機抽出液を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、これにより副題化合物（ｖｉｉｉ）が黄褐色固体として得られた（４．５ｇ）；
1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 9.94 (s, 1 H), 8.81 (d,1H), 8.70 (s, 1H), 8.41 (d, 1H), 8.30 (d, 1H), 7.84 (d, 2H), 7.34 (d, 2H), 7.34 (m, 1H), 4.27 (t, 2H), 3.03 (s, 3H), 2.84 (t, 2H), 2.17-2.10 (m, 2H);
LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 428 (計算値= 428) (MultiMode+), HPLC保持時間= 0.933分。
【０３０６】
（ｉｘ）３−アミノ−６−（４−（３−（３−メトキシプロピルアミノ）プロピル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）−ピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩：
工程（ｖｉｉｉ）の生成物（４．２５ｇ，１０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．７６ｇ，２０ｍｍｏｌ）および３−メトキシプロピルアミン（１．７８ｇ，２０ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１００ｍＬ）中における混合物を、９０℃でＮ２雰囲気下に一夜撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を真空中で濃縮し、分取ＨＰＬＣにより精製した。目的化合物を含有する画分を蒸発させて溶媒（アセトニトリルおよび水）の体積を１Ｌから５０ｍｌに減らし、０．５Ｍ−水性ＨＣｌ（２０ｍＬ）を添加した。得られた黄色溶液を次いで凍結乾燥すると、これにより表題化合物が三塩酸塩として得られた（黄色固体，２．７ｇ）；
1H-NMR(400 MHz, MeOD) δ 9.63 (d, 1H), 8.95 (d, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.64 (d,1H), 8.12-8.09 (m, 1H), 8.10 (d, 2H), 7.42 (d, 2H), 3.51 (t, 2H), 3.34 (s, 3H), 3.13 (t, 2H), 3.05 (t, 2H), 2.78 (t, 2H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.98-1.90 (m, 2H);
LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 421 (計算値= 421) (MultiMode+), HPLC保持時間= 0.815分。
【０３０７】
実施例２
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−カルボキサミド
【０３０８】
【化１９】
2013517321.tif 000021
【０３０９】
表題化合物を下記のスキームに従って製造した：
【０３１０】
【化２０】
2013517321.tif 000022
【０３１１】
（ｉ）３−（４−ブロモフェニル）プロピル  メタンスルホネート：
３−（４−ブロモフェニル）プロパン−１−オール（５００ｇ，２．３０ｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（３１２ｇ，２．４０ｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（４Ｌ）中における０〜５℃の撹拌溶液に、メタンスルホニルクロリド（２８０ｇ，２．４０ｍｏｌ）を徐々に滴加した。添加した後、反応混合物を０〜５℃で１時間撹拌した。反応混合物をブライン（１Ｌ）で２回洗浄した。有機相を真空中で濃縮して、副題化合物（ｉ）（６６７ｇ）を得た。HPLC保持時間= 1.353 分。
【０３１２】
（ｉｉ）３−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−（３−メトキシプロピル）プロパン−１−アミン：
工程（ｉ）の生成物（２７２ｇ，０．９３ｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２５６ｇ，１．８６ｍｏｌ）、メトキシプロピルアミン（１９９ｇ，２．２２ｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１．５Ｌ）中における混合物を、８０〜９０℃でＮ２雰囲気下に１６時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を濃縮してＭｅＣＮを除去した。ＭＴＢＥ（１Ｌ）およびＨ２Ｏ（１Ｌ）を得られた混合物に装入し、水性１Ｎ−ＨＣｌ（１Ｌ）で洗浄した。水相を集め、水性２．５Ｎ−ＮａＯＨによりｐＨ＝９〜１０の塩基性にすると、溶液状の副題化合物（ｉｉ）が得られ、これをそのまま次の工程に用いた；
LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 286および288 (計算値= 286および288) (MultiMode+), HPLC保持時間= 0.935 分。
【０３１３】
（ｉｉｉ）Ｎ−［３−（４−ブロモフェニル）プロピル］−Ｎ−（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
最後の工程から得られた、工程（ｉｉ）の生成物（０．９３ｍｏｌ）のＮａＯＨ水溶液中における撹拌した反応混合物に、ＴＨＦ（１Ｌ）を送入し、Ｂｏｃ２Ｏ（２２２ｇ，１．０１ｍｏｌ）を混合物に１０℃で滴加した。添加した後、混合物を１０℃で１時間撹拌し、ＭＴＢＥ（１Ｌ×２）で抽出した。有機相を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１〜５：１）により精製して、３００ｇの副題化合物（ｉｉｉ）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H) 3.35 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.22 (s, 4H), 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.76-1.84 (m, 4H), 1.43 (s, 9H). LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 386および388 (計算値= 386および388) (MultiMode+)。
【０３１４】
（ｉｖ）Ｎ−（３−メトキシプロピル）−Ｎ−｛３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］プロピル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
工程（ｉｉｉ）の生成物（２３０ｇ，０．６０ｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（２２７ｇ，０．８９ｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（１７５ｇ，１．７９ｍｏｌ）、Ｐｄ−Ｃｌ２（３．２０ｇ，１８ｍｍｏｌ）、ＰＣｙ３（１０ｇ，３８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（４Ｌ）中における混合物を撹拌し、Ｎ２で３回脱ガスした。反応混合物を８０℃でＮ２下に１６時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮してＭｅＣＮを除去した。ＭＴＢＥ（３Ｌ）を装入し、有機相をＨ２Ｏ（８００ｍＬ×３）で洗浄し、濃縮すると、副題化合物（ｉｖ）が油として得られ（２５０ｇ）、これをそのまま次の工程に用いた。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.29 (s, 3H), 3.22 (s, 4H), 2.60 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.75-1.88 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.32；
HPLC保持時間= 1.793 分。
【０３１５】
（ｖ）Ｎ−［３−｛４−［５−アミノ−６−（３−ピリジルカルバモイル）ピラジン−２−イル］フェニル｝プロピル］−Ｎ−（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
工程（ｉｖ）の生成物（２５０ｇ，０．５８ｍｏｌ）、３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（２２０ｇ，０．７５ｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（１８３ｇ，１．７３ｍｏｌ）およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２５．３０ｇ，３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３Ｌ）中における混合物を撹拌し、Ｎ２で３回脱ガスした。混合物を７０〜８０℃でＮ２下に２４時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮してＤＭＦを除去した。ＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）およびＨ２Ｏ（８００ｍＬ）を装入し、１０〜２５℃で１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、有機相を真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１−１：３）により精製した。粗生成物をＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨから再結晶し、濾過し、黄色固体をＥｔＯＡにより洗浄し、減圧下で乾燥させた。副題化合物（ｖ）が得られた（淡黄色固体，１６０ｇ）；
LCMS (ESI) m/z [M+H]+ = 521 (計算値= 521) (MultiMode+), HPLC保持時間= 1.366 分。
【０３１６】
（ｖｉ）３−アミノ−６−（４−（３−（３−メトキシプロピルアミノ）プロピル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）−ピラジン−２−カルボキサミド：
工程（ｖ）の生成物（３００ｇ，０．５８ｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ中４Ｎ−ＨＣｌ（３Ｌ）中における混合物を、３時間撹拌した。懸濁液を濾過すると黄色固体が得られた。この固体をＨ２Ｏ（１．２Ｌ）に溶解した。２Ｎ−ＮａＯＨをこの溶液に滴加して、ｐＨ＝１１の塩基性にした。混合物をＴＨＦおよびＥｔＯＡｃの混合物（５Ｌ×２，１：１）で抽出し、有機相を水性１０％−ＮａＣｌで洗浄し、真空中で濃縮した。副題化合物（ｖｉ）が得られた（淡黄色固体，２１０ｇ）；
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.57 (s, 1H), 8.99 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.89 (s,1H), 8.35 (dd, J = 1.2 Hz, J = 4.8 Hz, 1H), 8.23-8.20 (m, 1H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.67 (s, 2H), 7.40 (dd, J = 4.8 Hz, J = 4.8 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.18 (s, 3H), 2.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.47 (dd, J = 7.2 Hz, J = 14 Hz, 4H), 1.73-1.65 (m, 2H),. 1.62-1.56 (m, 2H)。
【０３１７】
前記に従って製造した３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド形態Ｂは結晶性であるとＸＲＰＤ（図４を参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた:
【０３１８】
【表１】
2013517321.tif 000023
【０３１９】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド形態ＢのＤＳＣ分析（図５）も加熱速度１０℃／分で実施し、４７℃での開始および６０℃でのピークを伴う初期吸熱事象、続いて１１３℃での開始および１１６℃でのピークを伴う後続の相転移を示した。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド形態Ｂが約１１３℃での融解開始および約１１６℃でのピークを伴う高融点固体であることを示す。
【０３２０】
実施例３ａ
形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート
５００．６ｍｇの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド（実施例２で製造したもの）および１８９．０９ｍｇのベンゼンスルホン酸をガラスバイアル中へ正確に秤量し、１５ｍＬのＩＰＡを添加して懸濁液を調製した。この懸濁液を室温で２日間振とうし続け、次いで濾過し、室温で乾燥させて、黄色粉末を得た。
【０３２１】
前記に従って製造した形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートは結晶性であるとＸＲＰＤ（図６ａを参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた：
【０３２２】
【表２】
2013517321.tif 000024
【０３２３】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート形態ＡのＤＳＣ分析も加熱速度１０℃／分で実施し、８９℃での開始および９９℃でのピークを伴う初期吸熱事象、続いて１６４℃での開始および１６７．０℃でのピークを伴う融解を示した（図７ａ）。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート形態Ａが約１６４℃での融解開始および約１６７℃でのピークを伴う高融点固体であることを示す。
【０３２４】
実施例３ｂ
形態Ｃの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート
【０３２５】
【化２１】
2013517321.tif 000025
【０３２６】
３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミドの合成
段階１：３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸メチル
【０３２７】
【化２２】
2013517321.tif 000026
【０３２８】
３−アミノピラジン−２−カルボン酸メチルエステル（１ｋｇ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１．１６２ｋｇ  およびアセトニトリル（８Ｌ）を反応器に装入した。混合物を室温で１０分間撹拌し、７５〜８０℃に加熱し、わずかに還流する条件下に２〜３時間保持した。混合物を２５℃に冷却し、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。得られた暗色固体をジクロロメタン（２０Ｌ）に再溶解し、活性炭（１００ｇ）を装入した。得られた懸濁液を２５℃で３０〜６０分間撹拌した後、濾過して不溶性物質を除去した。次いで濾液を飽和Ｎａ２ＳＯ３水溶液（３×５Ｌ）および水（５Ｌ）で洗浄した。相分離した後、有機層を集めた。ジクロロメタンをロータリーエバポレーターで除去すると、３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸メチルが褐色固体として得られ、これをさらに精製せずに次の工程に用いた（湿潤生成物１０９０ｇ）。
【０３２９】
段階２：３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸
【０３３０】
【化２３】
2013517321.tif 000027
【０３３１】
３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸メチル（１．４Ｋｇ）、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液（５．６Ｌ）およびメタノール（８．４Ｌ）を反応器に装入した。得られた懸濁液を５０℃に３時間、激しく撹拌しながら加温した。混合物を反応終了について分析した。混合物を２５℃に冷却し、固体を濾過により集めた。フィルターケーキを水（１Ｌ）で洗浄した。得られた固体を水（５Ｌ）に懸濁し、６Ｎ  ＨＣｌ溶液の添加によりこの懸濁液のｐＨ値を３に調整した。この酸性溶液を２５℃で４８時間、激しく撹拌した。この期間にｐＨ値を検査し、ｐＨ値が＞３であればさらに酸を装入した。懸濁液を濾過して黄褐色固体を集め、これを４０℃のオーブンでＮ２流下に乾燥させた。粗製の副題物質を次の工程に用いた。
【０３３２】
段階３：３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
【０３３３】
【化２４】
2013517321.tif 000028
【０３３４】
３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸（１．０７ｋｇ）、３−アミノピリジン（４６０ｇ）、トリエチルアミン（６８０ｍｌ）およびＤＭＦ（６．４Ｌ）を反応器に装入した。混合物を−５〜０℃に冷却し、１５分間撹拌した。窒素流下で、ＨＡＴＵ（１．８ｋｇ）を多数部分に分けて、温度を１０℃より低く維持しながら徐々に添加した。添加すると濃厚な黄色の沈殿が生成した。添加後、混合物を２０〜２５℃で１時間撹拌した。反応を完了について分析した（３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸＝０％）。水（１３Ｌ）を激しい撹拌下で添加した。黄色懸濁液を２５℃で３０分間撹拌した。懸濁液を濾過し、フィルターケーキを反応器に再装入した。水（１３Ｌ）を装入した。この黄色懸濁液を５０℃に加温し、この温度で２時間撹拌した。懸濁液を濾過し、フィルターケーキを水で洗浄した。湿潤生成物（３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド）を５５℃のオーブンで窒素流下に乾燥させた（１．１４Ｋｇ）；
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 7.39 (dd, 1H); 7.74 (br.s., 2H); 8.18 (ddd, 1H); 8.33 (dd, 1H); 8.43 (s, 1H); 8.96 (d,1H); 10.51 (s,1H)。
【０３３５】
（３−メトキシプロピル）｛３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］プロピル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
段階１：３−（４−ブロモフェニル）プロパン−１−オール
【０３３６】
【化２５】
2013517321.tif 000029
【０３３７】
水素化ホウ素ナトリウム（１１９．１２ｇ）およびＴＨＦ（５Ｌ）を反応器１に装入し、温度を−２０℃に調整した。３−（ブロモフェニル）プロピオン酸（１ｋｇ）を反応器２にＴＨＦ（３Ｌ）と共に装入し、すべての固体が溶解するまで２５℃で撹拌した。反応器２中のこの溶液を、反応器１へ、反応器１の内容物を＜０℃に維持しながら移した。ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（９９１．４ｇ）を徐々に反応器１に、反応器１の内容物を−２０〜−１０℃に維持しながら添加した。添加後、混合物を−２０〜−１０℃で１時間撹拌した。反応を完了について分析した（３−（ブロモフェニル）プロピオン酸＜２．５％）。水（２Ｌ）を徐々に反応器１に添加して、反応（ガスの発生）を停止した。ＭＴＢＥ（５Ｌ）を反応器１に装入し、相を分離させた。上層を集め、下層をＭＴＢＥ（５Ｌ）で洗浄した。上層を集め、前段階からの層と合わせた。１Ｎ  ＮａＯＨ溶液の添加により有機層のｐＨ値を８〜９に調整した。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（２Ｌ）で洗浄し、上層を集めた。有機層を蒸発させると無色の油になった。
【０３３８】
段階２：３−（４−ブロモフェニル）プロピル  メタンスルホネート
【０３３９】
【化２６】
2013517321.tif 000030
【０３４０】
３−（４−ブロモフェニル）プロパン−１−オール（３３５ｇ）およびジクロロメタン（２．５Ｌ）を反応器１に装入した。反応器１を−１０〜０℃に調整した。トリエチルアミン（２０５ｇ）を反応器１に装入した。メタンスルホニルクロリド（２７２．７ｇ）を反応器１に、内容物を＜０℃に維持しながら滴加した。反応器１を−５〜５℃で１時間撹拌し、次いで反応の完了について分析した。有機層を水（１Ｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１Ｌ）で洗浄した。有機層を蒸発乾固して、３−（４−ブロモフェニル）プロピル  メタンスルホネートを得た（４１８ｇ）。
【０３４１】
段階３：３−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−（３−メトキシプロピル）プロパン−１−アミン
【０３４２】
【化２７】
2013517321.tif 000031
【０３４３】
３−（４−ブロモフェニル）プロピル  メタンスルホネート（４１８ｇ）およびアセトニトリル（２Ｌ）を反応器１に装入した。３−メトキシプロピルアミン（３０５ｇ）および炭酸カリウム（３９４ｇ）を反応器１に添加し、混合物を８０〜９０℃に４〜１６時間加温した。混合物を完了について分析した（３−（４−ブロモフェニル）プロピル  メタンスルホネート＜０．５％）。反応物を２５℃に冷却し、この懸濁液を濾過して白色固体を除去した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。ロータリーエバポレーターからの粗生成物、ＭＴＢＥ（２Ｌ）および水（１．５Ｌ）を反応器２に装入した。相の分離後、有機層を集め、ｐＨ＝４〜５になるまで１Ｎ  ＨＣｌ（２Ｌ）で洗浄した。相の分離後、水相を２．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液によりｐＨ＝９〜１０の塩基性にし、得られた水溶液をさらに処理せずに次の工程に用いた。
【０３４４】
段階４：［３−（４−ブロモフェニル）プロピル］（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【０３４５】
【化２８】
2013517321.tif 000032
【０３４６】
水（１．５Ｌ）およびＴＨＦ（５００ｍｌ）中の３−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−（３−メトキシプロピル）プロパン−１−アミン（５００ｇ）を反応器に装入した。トリエチルアミン（１７６．８ｇ）を反応器に１０℃で装入した。Ｂｏｃ２Ｏ（４７５．５ｇ）を反応器１中の混合物に１０℃で滴加し、混合物を１０℃で１時間撹拌した。混合物を反応の完了について分析した。混合物をＭＴＢＥ（３×１Ｌ）で抽出した。有機層を合わせて蒸発させると粗生成物が油として得られた。粗生成物をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：０−２０：１−１０：１）により精製した。［３−（４−ブロモフェニル）プロピル］（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルがわずかに黄色の油として得られた（３２７．０ｇ）。
【０３４７】
段階５：（３−メトキシプロピル）｛３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］プロピル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【０３４８】
【化２９】
2013517321.tif 000033
【０３４９】
［３−（４−ブロモフェニル）プロピル］（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５００ｇ）およびアセトニトリル（４．３Ｌ）を反応器１に、ビス（ピナコラト）ジボロン（３９４．４ｇ）、酢酸カリウム（１９０．５ｇ）、ＰＣｙ３（２３．２ｇ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（８．７ｇ）と共に装入した。容器を窒素で３回、揺動パージした。混合物を８５〜９０℃に１６時間加温し、次いで反応の完了について分析した（［３−（４−ブロモフェニル）プロピル］（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル＜０．５％）。混合物を２５℃に冷却し、濾過し、濾液を濃縮してＭｅＣＮを除去した。ＭＴＢＥ（３Ｌ）を装入し、ＭＴＢＥ層を水（３×１．５Ｌ）で洗浄した。ＭＴＢＥ層を濃縮すると粗生成物が得られた。この粗生成物をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：０−４０：１−１０：１）により精製した。（３−メトキシプロピル）｛３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］プロピル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルがわずかに黄色の油として得られた（４９０．０ｇ）；
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.27 (s, 12H); 1.35 (m, 9H); 1.65 (m, 2H); 1.74 (m, 2H); 2.54 (t, 2H); 3.10 (m, 1H); 3.15 (m, 1H); 3.18 (s, 3H); 3.26 (t, 2H); 7.19 (d, 2H); 7.58 (d, 2H)。
【０３５０】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートの合成
段階１：（（３−｛４−［５−アミノ−６−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ピラジン−２−イル］フェニル｝プロピル）（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【０３５１】
【化３０】
2013517321.tif 000034
【０３５２】
反応器に、３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（１５８０ｇ）、（３−メトキシプロピル）｛３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］プロピル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２７７８ｇ）、１−ブタノール（２３．７Ｌ）、三塩基性リン酸カリウム  Ｎ−水和物（２７４０ｇ）および水（１．５８Ｌ）を装入した。内容物を窒素下に周囲温度（２１℃）で撹拌した。第２反応器内で、３−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスホニウム）プロパンスルホネート（ＤＴＢＰＰＳ）（８３．０４ｇ）；テトラクロロパラジウム酸ナトリウム（４５．５２ｇ）および水（１．５８Ｌ）の溶液を調製した。この触媒／配位子溶液を反応物に注入した；反応を不活性化し、８０℃まで加熱した。反応物を８０℃で２時間撹拌した。このバッチを６０℃に冷却し、水（２２．１Ｌ）を添加した。内容物を６０℃の水で洗浄した。有機層および境界層を、１−ブタノール（３．９５Ｌ）で調製したパーライト（５００ｇ）により濾過した。有機液体を容器に再装入し、６０℃の水（１１．１Ｌ）で洗浄した。有機液体を６０℃の１０％ｗ／ｖ  水性塩化ナトリウム（１１．２Ｌ）で洗浄した。有機液体を６０℃まで加熱し、真空下で蒸留して約１０の相対体積にした。このバッチを２０℃に冷却し、窒素下で１６時間撹拌した。内容物を濾過し、１−ブタノール（４Ｌ×２）で洗浄した。黄色のらさらした固体を取り出し、４０℃の真空オーブン内で一夜乾燥させた（（３−｛４−［５−アミノ−６−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ピラジン−２−イル］フェニル｝プロピル）（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２４２８ｇ））；
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.37 (s, 9 H) 1.62 - 1.72 (m, 2 H) 1.73 - 1.87 (m, 2 H) 2.59 (t, J=7.65 Hz, 2 H) 3.12 - 3.21 (m, 4 H) 3.19 (s, 3 H) 3.28 (t, J=6.25 Hz, 2 H) 7.31 (d, J=8.10 Hz, 2 H) 7.42 (dd, J=8.41, 4.74 Hz, 1 H) 7.62 (br. s., 2 H) 8.13 (d, J=8.10 Hz, 2 H) 8.21 (ddd, J=8.40, 2.60, 1.40 Hz, 1 H) 8.35 (dd, J=4.70, 1.40 Hz, 1 H) 8.90 (s, 1 H) 8.98 (d, J=2.59 Hz, 1 H) 10.54 (s, 1 H)。
【０３５３】
段階２：３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド
【０３５４】
【化３１】
2013517321.tif 000035
【０３５５】
（３−｛４−［５−アミノ−６−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ピラジン−２−イル］フェニル｝プロピル）（３−メトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１ｋｇ）および水（８Ｌ）を反応器に添加し、撹拌し、７０℃まで加熱した。３６％塩酸（６０６ｍｌ）を、ガス発生の速度を制御しながら徐々に添加した。内容物を７０℃で４５分間撹拌した。水酸化ナトリウム（３２５ｍｌ）の添加によりｐＨを３〜４に調整した。内容物を５０℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（５Ｌ）を添加した。次いで４８％水酸化ナトリウム液（１７０ｍｌ）の添加によりｐＨをｐＨ１１〜１２に調整した。次いで内容物を４０℃に冷却した。このバッチを沈降させ、２層を分離した。水層を２−メチルテトラヒドロフラン（２．５Ｌ）で洗浄した。有機層を合わせて１０％  ｗ／ｖ  塩化ナトリウム水溶液の溶液で洗浄した。有機層を蒸留して３．７５Ｌの留出物を除去した。残留液を５０℃に加熱し、メチル−ｔ−ブチルエーテル（４Ｌ）を添加した。液体を４時間かけて１０℃に冷却し、次いで濾過により単離した。固体をメチル−ｔ−ブチルエーテル（２Ｌ×２）で洗浄し、５０℃の真空オーブンで乾燥させた。３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド（７２１ｇ）；
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.77 - 1.87 (m, 2 H) 1.88 - 2.01 (m, 2 H) 2.72 (t, J=7.65 Hz, 2 H) 2.89 - 3.03 (m, 4 H) 3.23 (s, 3 H) 3.39 (t, J=5.98 Hz, 2 H) 7.35 (d, J=8.30 Hz, 2 H) 7.68 (br. s., 2 H) 7.68 (dd, J=8.62, 5.17 Hz, 1 H) 8.18 (d, J=8.30 Hz, 2 H) 8.41 - 8.52 (m, 2 H) 8.57 (br. s., 2 H) 8.94 (s, 1 H) 9.16 (d, J=2.15 Hz, 1 H) 10.77 (s, 1 H)。
【０３５６】
段階３：３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート
【０３５７】
【化３２】
2013517321.tif 000036
【０３５８】
反応器に、３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド（７００ｇ）およびエタノール（４．９Ｌ）を装入した。内容物を６０℃まで加熱すると溶液が得られた。反応器にベンゼンスルホン酸（２５８ｇ）、続いてエタノール（２．１Ｌ）および水（７０ｍｌ）を装入した。内容物を６０℃まで加熱した。完了した溶液を次いで５１℃に冷却し、形態Ａの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート（０．３５ｇ，実施例３ａに従って製造したもの）を播種した。結晶化が確立した時点で内容物を５１℃に２時間保持し、次いで４時間かけて４０℃まで徐冷し、４０℃に４時間保持し、次いで４時間かけてさらに１０℃に冷却した。内容物を１０℃に１２時間保持し、次いで濾過し、エタノール（７００ｍｌ×２）で洗浄した。固体３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート形態Ｃを４０℃の真空オーブンで乾燥させた（８１０ｇ）；
1H-NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.78 - 1.86 (m, 2 H) 1.92 (quin, J=7.70 Hz, 2 H) 2.70 (t, J=7.70 Hz, 2 H) 2.89 - 2.99 (m, 4 H) 3.22 (s, 3 H) 3.37 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 7.28 - 7.35 (m, 5 H) 7.47 (dd, J=8.25, 4.73 Hz, 1 H) 7.62 (br. s., 2 H) 7.62 (dd, J=7.92, 1.54 Hz, 2 H) 8.16 (d, J=8.36 Hz, 2 H) 8.27 (ddd, J=8.30, 2.40, 1.30 Hz, 1 H) 8.34 (br. s., 2 H) 8.38 (dd, J=4.70, 1.32 Hz, 1 H) 8.91 (s, 1 H) 9.01 (d, J=2.42 Hz, 1 H) 10.57 (s, 1 H)。
【０３５９】
上記に従って製造した形態Ｃの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレートは結晶性であるとＸＲＰＤ（図６ｂを参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた:
【０３６０】
【表３】
2013517321.tif 000037
【０３６１】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート形態ＣのＤＳＣ分析も加熱速度１０℃／分で実施し、９８℃での開始および９９℃でのピークを伴う固体−固体転移、続いて１６５℃での開始および１７０℃でのピークを伴う後続の相転移を示した（図７ｂ）。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベシレート形態Ｃが約１６５℃での融解開始および約１７０℃でのピークを伴う高融点固体であることを示す。
【０３６２】
実施例４．１〜４．４
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドの特定の塩
実施例４．１
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレート
実施例４．２
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレート
実施例４．３
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレート
実施例４．４
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエート
モノ−ベンゾエート形態Ａ、モノ−ＤＬ−マンデレート形態Ａ、およびモノ−トシレート形態Ａは、約５００ｍｇの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド形態Ｂを１モル当量の適宜な対イオンと共に１０ｍＬのＩＰＡ中で反応させることにより製造された。反応を室温で実施し、混合物を５日間撹拌した後、濾過により単離した。
【０３６３】
ジ−エシレート形態Ａは、約５００ｍｇの３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド形態Ｂを２モル当量の対イオンと共に１０ｍＬのＩＰＡ中で反応させることにより製造された。反応を室温で実施し、混合物を５日間撹拌した後、濾過により単離した。
【０３６４】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレート形態Ａは結晶性であるとＸＲＰＤ（図８を参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた:
【０３６５】
【表４】
2013517321.tif 000038
【０３６６】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレート形態ＡのＤＳＣ分析も加熱速度１０℃／分で実施し（図９）、１６８℃での開始および１７１℃でのピークを伴う融解を示した。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−トシレート形態Ａが約１６８℃での融解開始および約１７１℃でのピークを伴う高融点固体であることを示す。
【０３６７】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレート形態Ａは結晶性であるとＸＲＰＤ（図１０を参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた:
【０３６８】
【表５】
2013517321.tif 000039
【０３６９】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレート形態ＡのＤＳＣ分析も加熱速度１０℃／分で実施し（図１１）、１７９℃での開始および１８１℃でのピークを伴う融解を示した。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  ジ−エシレート形態Ａが約１７９℃での融解開始および約１８１℃でのピークを伴う高融点固体であることを示す。
【０３７０】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレート形態Ａは結晶性であるとＸＲＰＤ（図１２を参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた:
【０３７１】
【表６】
2013517321.tif 000040
【０３７２】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレート形態ＡのＤＳＣ分析も加熱速度１０℃／分で実施し、１４０℃での開始および１４４℃でのピークを伴う、融解に対応すると考えられる初期吸熱事象を示した。これに続いて約１４６℃での開始および約１４９℃でのピークを伴う発熱（再結晶化）事象、続いて約１５３℃での開始および約１５６℃でのピークを伴う最終融解事象が起きた。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ＤＬ−マンデレート形態Ａが最初の約１４０℃での融解開始および約１４４℃でのピークを伴う融解−再結晶化−融解シーケンスの転移を行なうことを示す。
【０３７３】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエート形態Ａは結晶性であるとＸＲＰＤ（図１４を参照）により判定され、下記のＸ線粉末回折ピークをもっていた:
【０３７４】
【表７】
2013517321.tif 000041
【０３７５】
３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエート形態ＡのＤＳＣ分析も加熱速度１０℃／分で実施し（図１５）、１４１℃での開始および１４３℃でのピークを伴う融解を示した。したがって、ＤＳＣ分析は３−アミノ−６−（４−｛３−［（３−メトキシプロピル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド  モノ−ベンゾエート形態Ａが約１４１℃での融解開始および１４３℃でのピークを伴う高融点固体であることを示す。
【０３７６】
実施例５
３−アミノ−６−（４−｛３−［（２−メトキシエチル）アミノ］プロピル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩
【０３７７】
【化３３】
2013517321.tif 000042
【０３７８】
表題化合物を実施例１に記載したものと同様な方法を用い、ただし工程（ｉｘ）で２−メトキシエチルアミンを３−メトキシプロピルアミンの代わりに用いて製造した；
1H NMR (400 MHz ,CD3OD) δ 9.65 (s, 1H), 8.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.64 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.12 (m, 3H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.66(m, 2H), 3.48 (s, 3H), 3.23 (m, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.11 (m, 2H)；
LCMS:保持時間= 0.761分。
【０３７９】
実施例６
３−アミノ−６−（４−｛２−［（３−メトキシプロピル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド
【０３８０】
【化３４】
2013517321.tif 000043
【０３８１】
表題化合物を下記の方法に従って製造した:
（ｉ）（４−ブロモフェニルエトキシ）（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラン
２−（４−ブロモフェニル）エタノール（５ｇ，２５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中における溶液に、トリエチルアミン（７．５ｇ，７５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３００ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（７．５ｇ，５０ｍｍｏｌ）を順に添加した。得られた淡褐色溶液を室温で一夜撹拌した。反応混合物をジクロロメタンおよび水で３回抽出した。有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物を、ＰＥを溶離剤としてカラムクロマトグラフィー処理して、副題化合物を褐色の油として得た（７．１ｇ）；
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.41 (dd, J = 6.4, 2.0 Hz, 2H), 7.10 (dd, J = 6.4, 2.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)。
【０３８２】
（ｉｉ）３−アミノ−６−（４−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）エチル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
工程（ｉ）の生成物（６．９ｇ，２７．１ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（６．６ｇ，６７．８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．８２ｇ，１．１３ｍｍｏｌ）のジオキサン（１５０ｍＬ）中における混合物を脱ガスし、Ｎ２を３回戻し充填した。混合物を９０℃でＮ２下に一夜撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、実施例１の工程（ｖ）の生成物（６．６ｇ，２２．６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．５ｇ，０．７ｍｍｏｌ）、水（５０ｍＬ）およびＮａ２ＣＯ３（７．２ｇ，６７．８ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。得られた溶液をＮ２で３回脱ガスし、９０℃でＮ２下にさらに７時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで３回抽出しし、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムによりＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝５：１→３：１を溶離剤として用いて精製して、副題化合物を黄色固体として得た（４．１ｇ）；
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.95 (s, 1H), 8.79 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.68 (s, 1 H), 8.41 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.39-7.30 (m, 3H), 3.84 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)。
【０３８３】
（ｉｉｉ）３−アミノ−６−（４−（２−ヒドロキシエチル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
工程（ｉｉ）の生成物（４．１ｇ，９．１３ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（４．８ｇ，１８．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中における溶液を、室温で一夜撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、残留物をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄した。有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、副題化合物を得た（２．５ｇ）；
LCMS保持時間= 0.801分。
【０３８４】
（ｉｖ）４−（５−アミノ−６−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ピラジン−２−イル）フェネチル  メタンスルホネート
工程（ｉｉｉ）の生成物（２．５ｇ，７．５ｍｍｏｌ，１．０当量）およびＴＥＡ（２．３ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン中における溶液に、ＭｓＣｌ（１．７ｇ，１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をカラムにより精製して、副題化合物を得た（１．９ｇ）；
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.87 (s, 1 H), 8.76 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.36 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.38-7.24 (m, 3H), 4.42 (t, J = 6.8 Hz, 2H ), 3.08 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.87 (s, 3H)。
【０３８５】
（ｖ）３−アミノ−６−（４−｛２−［（３−メトキシプロピル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド
工程（ｉｖ）の生成物（２５０ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２５０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）、３−メトキシプロピルアミン（８２ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２０ｍＬ，Ａｌｄｒｉｃｈ，ＨＰＬＣ用）中における混合物を、９０℃でＮ２雰囲気下に一夜撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を真空中で濃縮し、残留物を精製のために分取ＨＰＬＣ処理し、溶離剤を濃縮し、１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を残留物に添加してｐＨ＝８〜９に調整した。混合物をＤＣＭで３回抽出した。抽出液を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、これにより表題化合物が得られた（黄色固体，１５８ｍｇ）；
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.89 (s, 1H), 8.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.35 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.40-7.27 (m, 3H), 3.37 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.90-2.77 (m, 4H), 2.69 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.76-1.62 (m, 2H)；
LCMS:保持時間= 0.741分。
【０３８６】
実施例７
３−アミノ−６−（４−｛２−［（２−メトキシエチル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミド三塩酸塩
【０３８７】
【化３５】
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【０３８８】
３−アミノ−６−（４−｛２−［（２−メトキシエチル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドを、実施例６に記載したものと同様な方法を用い、ただし工程（ｖ）で２−メトキシエチルアミンを３−メトキシプロピルアミンの代わりに用いて製造した。ＭｅＣＮを３−アミノ−６−（４−｛２−［（２−メトキシエチル）アミノ］エチル｝フェニル）−Ｎ−ピリジン−３−イルピラジン−２−カルボキサミドに添加し、０．５Ｍ−水性ＨＣｌ（２０ｍＬ）も添加した。得られた黄色溶液を次いで凍結乾燥すると、これにより表題化合物が三塩酸塩として得られた；
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 9.66 (s, 1H), 8.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.65 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.17-8.12 (m, 3H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.35-3.28 (m, 4H), 3.13-3.08 (m, 2H)；
LCMS:保持時間= 0.720分。
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１Ａ】
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【国際調査報告】
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