(57)【要約】本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌；ＧＢＳ）の処置および予防のためのタンパク質および組成物を提供する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号４のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号４のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくとも９０％の同一性を有するエピトープを含む、断片などからなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号４のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号４のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくとも９０％の同一性を有するエピトープを含む、断片；
ｉｉｉ）配列番号５に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号８のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｖ）配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号８のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくとも９０％の同一性を有するエピトープを含む、断片
からなるポリペプチド。
【請求項２】
ｉ）配列番号１に由来する断片であって、配列番号４のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号１に対して９０％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する断片であって、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉｉ）配列番号５に由来する断片であって、配列番号８のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｖ）配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する断片であって、配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む配列番号１の断片；またはｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む配列番号５に由来する断片を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列：
Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ
を含むポリペプチドであって、式中、各Ｘは請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドであり；Ｌは任意選択のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり；ｎは１以上の整数である、
ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質および配列番号５のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質のアミノ酸配列に結合する抗体を含む抗体応答を惹起する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号９のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＣＪＢ１１１株）、配列番号１３のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（５１５株）、配列番号１７のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＮＥＭ３１６株）、配列番号２１のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＤＫ２１株）、および配列番号２５のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＣＪＢ１１０株）に結合する抗体を含む抗体応答を惹起する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
糖部分とキャリアタンパク質部分とを含む結合体であって、該キャリアタンパク質部分が請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドを含む、結合体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の結合体または請求項８に記載の核酸を含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の結合体、請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
髄膜炎の処置または予防を含む、ＧＢＳにより引き起こされる疾患および／または感染の処置または予防に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の結合体、請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の結合体、請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物におけるＧＢＳにより引き起こされる疾患および／または感染、好ましくは髄膜炎を処置または予防する方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌；ＧＢＳ）の処置および予防のためのタンパク質および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（または「Ｂ群連鎖球菌」、「ＧＢＳ」と省略される）は、免疫無防備状態の個体および新生児において、重篤な疾患、菌血症および髄膜炎を引き起こす。２つの型の新生児感染が存在する。第１（早発型、通常は誕生の５日以内）は、菌血症および肺炎が認められる。それは、新生児が産道を通過する時に垂直感染する。ＧＢＳは若い女性の約２５％の膣に定着し、定着された母親の経膣分娩により生まれた乳児の約１％が感染する。死亡率は５０〜７０％である。第２は、誕生の１０〜６０日後に起こる髄膜炎である。妊娠女性にＩＩＩ型莢膜をワクチン接種して、乳児を受動免疫した場合、遅発型髄膜炎の発生率は低下するが、完全になくなるわけではない。
【０００３】
「ＧＢＳ」における「Ｂ」とは、希酸において可溶性であり、Ｃ炭水化物と呼ばれる炭水化物の抗原性に基づくＬａｎｃｅｆｉｅｌｄの分類を指す。Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄは、１３の型のＣ炭水化物を同定し、Ａ〜Ｏと命名し、これらは血清学的に区別され得る。ヒトに最も一般的に感染する生物は、Ａ群、Ｂ群、Ｄ群、およびＧ群に見出される。Ｂ群内では、その多糖莢膜の構造に基づいて、株を１０の血清型（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩおよびＸＩ）に分けることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＧＢＳに対するタンパク質に基づくワクチンおよび多糖に基づくワクチンの開発において調査が行われてきたが、現在のところ、市販のＧＢＳワクチンはない。したがって、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染に対する有効なワクチンが依然として必要である。
【０００５】
そのようなワクチンの開発において用いることができるタンパク質および免疫原性組成物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＧＢＳにおける線毛構造は、興味深いワクチン候補であると考えられる。ＧＢＳは、それぞれ、別個の病原性アイランド（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ）、ＰＩ−１、ＰＩ−２ａおよびＰＩ−２ｂによりコードされる３つの線毛変異体を有する［１、２］。それぞれの病原性アイランドは、線毛骨格タンパク質（ＢＰ）；２つの付属タンパク質（ＡＰ１およびＡＰ２）；ならびに線毛の集合に関与する２つのソルターゼタンパク質をコードする５つの遺伝子からなる。
【０００７】
ＧＢＳ株は全て、これらの３つの病原性アイランドのうちの少なくとも１つを担持し、これらの病原性アイランドによりコードされる線毛構造タンパク質（ＢＰ、ＡＰ１およびＡＰ２）の配列は全体的によく保存されている。本明細書ではＧＢＳ６７とも呼ばれる、病原性アイランド２ａ（ＡＰ１−２ａ）によりコードされる付属タンパク質１（ＡＰ１）の配列は、ＧＢＳ株間で変動する。ＧＢＳ６７タンパク質の少なくとも２つのファミリーが存在する。
【０００８】
元の「ＧＢＳ６７」（ＳＡＧ１４０８）配列は、参考文献１４７中で細胞壁表面アンカーファミリータンパク質としてアノテートされている（ＧＩ：２２５３４４３７を参照されたい）。２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号１として記載する。ＧＢＳ株ＣＪＢ１１１、５１５およびＮＥＭ３１６は、２６０３株に由来するＧＢＳ６７配列と同じファミリーに属するＧＢＳ６７配列を発現する。ＣＪＢ１１１、５１５およびＮＥＭ３１６株中に見出される完全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号９、１３および１７として記載する。
【０００９】
ＧＢＳ６７の変異体（ＳＡＩ１５１２）がＨ３６Ｂ株中に存在する。この変異体「ＧＢＳ６７」（ＳＡＧ１４０８）配列は、参考文献３中で細胞壁表面アンカーファミリータンパク質としてアノテートされている（ＧＩ：７７４０５７５１を参照されたい）。Ｈ３６Ｂ株中に見出される完全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号５として記載する。ＧＢＳ株ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０は、Ｈ３６Ｂ株に由来するＧＢＳ６７配列と同じファミリーに属するＧＢＳ６７配列を発現する。ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０株中に見出される完全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号２１および２５として記載する。
【００１０】
本明細書に示されるように、２６０３株および関連する株中に見出される完全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列に対して生じた血清は、Ｈ３６Ｂ株および関連する株中に見出される完全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列を発現するＧＢＳの株に対して活性であり、逆の場合も同じである。よって、完全長ＧＢＳ６７は、２つのファミリーのいずれかに由来するＧＢＳ６７変異体を発現するＧＢＳ株に対する交差防御を提供する。
【００１１】
本発明者らはここで、交差防御の原因となるエピトープを含むＧＢＳの２６０３株とＧＢＳのＨ３６Ｂ株の両方に由来する完全長ＧＢＳ６７配列の断片を同定することに成功した。
【００１２】
交差防御の原因となるエピトープを含む２６０３株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号３として記載する。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の２６０３株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１５に位置する３９８アミノ酸の断片である。
【００１３】
交差防御の原因となるエピトープを含む２６０３株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号４として記載する。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の２６０３株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１６〜８６６に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００１４】
交差防御の原因となるエピトープを含むＨ３６Ｂ株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号７として記載する。配列番号７のアミノ酸配列は、配列番号５に記載のＨ３６Ｂ株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１０に位置する３９３アミノ酸の断片である。
【００１５】
交差防御の原因となるエピトープを含むＨ３６Ｂ株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号８として記載する。配列番号８のアミノ酸配列は、配列番号５に記載のＨ３６Ｂ株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１１〜８６１に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００１６】
対応する断片もまた、ＧＢＳ株２６０３に由来するＧＢＳ６７と同じファミリーに由来するＧＢＳ６７を発現するＧＢＳ株、すなわち、ＧＢＳ株ＣＪＢ１１１、５１５およびＮＥＭ３１６、ならびにＧＢＳ株Ｈ３６Ｂと同じファミリーに由来するＧＢＳ６７を発現するＧＢＳ株、すなわち、ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０において同定された。
【００１７】
交差防御の原因となるエピトープを含むＣＪＢ１１１株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号１１として記載する。配列番号１１のアミノ酸配列は、配列番号９に記載のＣＪＢ１１１株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１５に位置する３９８アミノ酸の断片である。
【００１８】
交差防御の原因となるエピトープを含むＣＪＢ１１１株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号１２として記載する。配列番号１２のアミノ酸配列は、配列番号９に記載のＣＪＢ１１１株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１６〜８６６に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００１９】
交差防御の原因となるエピトープを含む５１５株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号１５として記載する。配列番号１５のアミノ酸配列は、配列番号１３に記載の５１５株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１５に位置する３９８アミノ酸の断片である。
【００２０】
交差防御の原因となるエピトープを含む５１５株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号１６として記載する。配列番号１６のアミノ酸配列は、配列番号１３に記載の５１５株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１６〜８６６に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００２１】
交差防御の原因となるエピトープを含むＮＥＭ３１６株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号１９として記載する。配列番号１９のアミノ酸配列は、配列番号１７に記載のＮＥＭ３１６株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１５に位置する３９８アミノ酸の断片である。
【００２２】
交差防御の原因となるエピトープを含むＮＥＭ３１６株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号２０として記載する。配列番号２０のアミノ酸配列は、配列番号１７に記載のＮＥＭ３１６株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１６〜８６６に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００２３】
交差防御の原因となるエピトープを含むＤＫ２１株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号２３として記載する。配列番号２３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載のＤＫ２１株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１０に位置する３９３アミノ酸の断片である。
【００２４】
交差防御の原因となるエピトープを含むＤＫ２１株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号２４として記載する。配列番号２４のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載のＤＫ２１株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１１〜８６１に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００２５】
交差防御の原因となるエピトープを含むＣＪＢ１１０株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号２７として記載する。配列番号２７のアミノ酸配列は、配列番号２５に記載のＣＪＢ１１０株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸２１８〜６１０に位置する３９３アミノ酸の断片である。
【００２６】
交差防御の原因となるエピトープを含むＣＪＢ１１０株中に見出されるＧＢＳ６７配列の断片を、本明細書では配列番号２８として記載する。配列番号２８のアミノ酸配列は、配列番号２５に記載のＣＪＢ１１０株に由来するＧＢＳ６７配列のアミノ酸６１１〜８６１に位置する２５１アミノ酸の断片である。
【００２７】
（ＧＢＳ６７ポリペプチド）
これらのＧＢＳ６７の断片およびこれらの断片に由来するエピトープは、ＧＢＳを処置または予防するための免疫原性組成物において完全長ＧＢＳ６７の代わりに用いることができる。
【００２８】
（ＧＢＳ６７  ２６０３）
したがって、本発明の一態様によれば、
ｉ）配列番号１に由来する少なくともｔ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号１に対して少なくともａ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｔ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｂ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号１に由来する少なくともｔ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号１に対してａ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｔ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号３および／または配列番号４に対して少なくともｂ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３０】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む配列番号１に由来する少なくともｔ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３１】
（ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ）
本発明の別の態様によれば、
ｉ）配列番号５に由来する少なくともｕ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号５に対して少なくともｃ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｕ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｄ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号５に由来する少なくともｕ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号５に対してｃ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｕ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号７および／または配列番号８に対して少なくともｄ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３３】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む配列番号５に由来する少なくともｕ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３４】
（ＧＢＳ６７  ＣＪＢ１１１）
本発明の別の態様によれば、
ｉ）配列番号９に由来する少なくともｖ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１１および／または配列番号１２のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号９に対して少なくともｅ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｖ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１１および／または配列番号１２のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｆ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００３５】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号９に由来する少なくともｖ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１１および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号９に対してｅ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｖ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１１および／または配列番号１２に対して少なくともｆ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３６】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号１１および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む配列番号９に由来する少なくともｖ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３７】
（ＧＢＳ６７  ５１５）
本発明の別の態様によれば、
ｉ）配列番号１３に由来する少なくともｗ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１５および／または配列番号１６のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号１３に対して少なくともｇ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｗ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１５および／または配列番号１６のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｈ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００３８】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号１３に由来する少なくともｗ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１５および／または配列番号１６のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号１３に対してｇ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｗ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１５および／または配列番号１６に対して少なくともｈ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００３９】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号１５および／または配列番号１６のアミノ酸配列を含む配列番号１３に由来する少なくともｗ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４０】
（ＧＢＳ６７  ＮＥＭ３１６）
本発明の別の態様によれば、
ｉ）配列番号１７に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１９および／または配列番号２０のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号１７に対して少なくともｉ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１９および／または配列番号２０のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｊ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００４１】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号１７に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１９および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号１７に対してｉ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号１９および／または配列番号２０に対して少なくともｊ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４２】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号１９および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む配列番号１７に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４３】
（ＧＢＳ６７  ＤＫ２１）
本発明の別の態様によれば、
ｉ）配列番号２１に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２３および／または配列番号２４のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号２１に対して少なくともｋ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２３および／または配列番号２４のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｌ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００４４】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号２１に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２３および／または配列番号２４のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号２１に対してｋ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２３および／または配列番号２４に対して少なくともｌ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４５】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号２３および／または配列番号２４のアミノ酸配列を含む配列番号２１に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４６】
（ＧＢＳ６７  ＣＪＢ１１０）
本発明の別の態様によれば、
ｉ）配列番号２５に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２７および／または配列番号２８のアミノ酸配列に由来するエピトープを含む、断片；
ｉｉ）配列番号２５に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２７および／または配列番号２８のアミノ酸配列に由来するエピトープに対して少なくともｎ％の同一性を有するエピトープを含む、断片
を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００４７】
本発明のこの態様のポリペプチドは、
ｉ）配列番号２５に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２７および／または配列番号２８のアミノ酸配列を含む、断片；
ｉｉ）配列番号２５に対してｍ％の同一性を有するアミノ酸配列に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片であって、配列番号２７および／または配列番号２８に対して少なくともｎ％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、断片
を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４８】
本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号２７および／または配列番号２８のアミノ酸配列を含む配列番号２５に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片を含むか、またはそれからなってもよい。
【００４９】
「エピトープ」とは、免疫系により認識され、免疫応答を惹起するポリペプチドの一部を意味する。本発明のポリペプチドは、変異体ＧＢＳ６７ペプチドを発現するＧＢＳの株に対して交差防御を誘導することができる。よって、本発明のポリペプチドは、被験体に投与した場合、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（２６０３株）および配列番号５のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（Ｈ３６Ｂ株）に結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。よって、本発明のポリペプチドは、配列番号１または配列番号５に対して生じた抗体への結合に関して、配列番号１と配列番号５の両方と競合できる。
【００５０】
本発明のポリペプチドはまた、典型的には、被験体に投与した場合、配列番号９のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＣＪＢ１１１株）、配列番号１３のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（５１５株）、配列番号１７のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＮＥＭ３１６株）、配列番号２１のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＤＫ２１株）、および配列番号２５のアミノ酸配列を有する野生型ＧＢＳタンパク質（ＣＪＢ１１０株）に結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。よって、本発明のポリペプチドはまた、これらのタンパク質に対して生じた抗体への結合に関して、配列番号９、１３、１７、２１または２５を有するこれらの野生型ＧＢＳタンパク質と競合できる。
【００５１】
抗体は、標準的な免疫化方法を用いて本発明のポリペプチドに対して容易に生成させることができ、これらの抗体が配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の野生型ＧＢＳタンパク質に結合する能力をＥＬＩＳＡアッセイなどの標準的なアッセイを用いて評価できる。
【００５２】
同様に、ポリペプチドが野生型ＧＢＳタンパク質に対して生じた抗体と競合する能力を、ＥＬＩＳＡなどの平衡方法、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）などの運動学的方法（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）およびフローサイトメトリー方法によるなど、当該技術分野で公知の競合アッセイ技術を用いて容易に決定できる。これらの野生型ＧＢＳタンパク質のうちの１つに対する抗体への結合に関して、配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の野生型ＧＢＳタンパク質と競合するポリペプチドは、該ポリペプチドが存在しない場合と比較して、前記抗体への野生型ＧＢＳタンパク質の観察される全結合の減少を引き起こす。典型的には、この結合の減少は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、６０％以上であり、例えば、配列番号１、５、９、１３、１７、２１または２５を有するＧＢＳタンパク質について観察される抗体結合と比較して、本発明のポリペプチドの存在下では７０％以上の結合の減少である。
【００５３】
本発明のポリペプチドが変異体ＧＢＳ６７タンパク質を発現するＧＢＳの株に対する交差防御を誘導する能力を、メスのマウスを前記ポリペプチドで免疫化し、その仔に変異体ＧＢＳ６７タンパク質を発現するＧＢＳ株を抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）する実施例で記載されている母体免疫化モデルなどの動物モデルにおいて確認することもできる。
【００５４】
ａの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｂの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｃの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｄの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｅの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｆの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｇの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｈの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｉの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｊの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｋの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｌの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｍの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。ｎの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上である。典型的には、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍおよびｎは、少なくとも９０、例えば、少なくとも９５である。
【００５５】
ｔの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号１に示される２６０３株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、９０１アミノ酸長である。よって、ｔの値はまた、９０１未満、例えば、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｔの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００５６】
ｕの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号５に示されるＨ３６Ｂ株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、８９６アミノ酸長である。よって、ｕの値はまた、８９６未満、例えば、８６０、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｕの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００５７】
ｖの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号９に示されるＣＪＢ１１１株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、９０１アミノ酸長である。よって、ｖの値はまた、９０１未満、例えば、８６０、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｖの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００５８】
ｗの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号１３に示される５１５株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、９０１アミノ酸長である。よって、ｗの値はまた、９０１未満、例えば、８６０、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｗの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００５９】
ｘの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号１７に示されるＮＥＭ３１６株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、９０１アミノ酸長である。よって、ｘの値はまた、９０１未満、例えば、８６０、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｗの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００６０】
ｙの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号２１に示されるＤＫ２１株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、８９６アミノ酸長である。よって、ｙの値はまた、８９６未満、例えば、８６０、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｙの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００６１】
ｚの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００である。配列番号２５に示されるＣＪＢ１１０株に由来する完全長ＧＢＳ６７配列は、８９６アミノ酸長である。よって、ｚの値はまた、８９６未満、例えば、８６０、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０未満である。ｚの値は、５０〜６００、１００〜４００、１５０〜３００、２２５〜２７５、例えば、１２０〜１５０であってもよい。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の断片と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の保存的なアミノ酸の置き換え、すなわち、あるアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸での置き換えを含んでもよい。これらの保存的なアミノ酸の置き換えは、それぞれ、配列番号３および４、７および８、１１および１２、１５および１６、１９および２０、２３および２４、または２７および２８に対応する配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の領域内に位置してもよい。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることもある。一般的には、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物学的な活性に対して大きな影響を有さない。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の断片と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一アミノ酸欠失を有してもよい。前記ポリペプチドはまた、配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の断片と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、１、２、３、４または５アミノ酸のそれぞれ）を含んでもよい。これらの欠失および挿入は、それぞれ、配列番号３および４、７および８、１１および１２、１５および１６、１９および２０、２３および２４、または２７および２８に対応する配列番号１、５、９、１３、１７、２１および２５の領域内に位置してもよい。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、
（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１または配列番号２５の断片と同一であり（すなわち、１００％同一であり）；
（ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１または配列番号２５の断片との配列同一性を有し；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、離れた位置にあり得るか、または連続的であり得る１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれより多く）の単一のアミノ酸変化（欠失、挿入、置換）を有し；かつ
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１または配列番号２５の断片とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウ（ｐアミノ酸まで伸長するアラインメントについて、ｐ＞ｘの場合、ｐ−ｘ＋１のこのようなウィンドウが存在するように）が、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸（ここで、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され；ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；ｘ・ｙが整数でない場合、最も近い整数まで端数を切り上げる）を有する
アミノ酸配列を含んでもよい。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてギャップ開始ペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５）を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［４］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅツールに簡便に実装されている［５］。
【００６５】
本発明のポリペプチドを、ハイブリッドポリペプチドの形態で提供することができる。ハイブリッドポリペプチドは、さらなるＧＢＳまたは非ＧＢＳポリペプチド配列を含んでもよい。
【００６６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【００６７】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、ハイブリッドポリペプチドまたは核酸を含む免疫原性組成物も提供する。そのような免疫原性組成物は、ＧＢＳと関連する疾患または状態を処置または予防する方法において用いることができる。
【００６８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドを発現する細胞（典型的には、細菌）も提供する。
【００６９】
（ハイブリッドポリペプチド）
本発明のポリペプチドを、単一ポリペプチド鎖として他のポリペプチドと組み合わせて発現させることができる（「ハイブリッド」ポリペプチドまたは「キメラ」）。ハイブリッドポリペプチドは２つの主な利点を提供する：第１に、それ自体では不安定または発現が乏しいことがあるポリペプチドを、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することにより援助することができる；第２に、商業的な製造が単純化される。なぜなら、両方とも抗原的に有用な２つのポリペプチドを生成するために、ほんの１回の発現および精製の使用しか必要としないからである。
【００７０】
ハイブリッドポリペプチドは、他のＧＢＳ抗原および／または他の非ＧＢＳ抗原に由来する配列を含んでもよい。通常、ハイブリッドポリペプチドは、他の線毛サブユニットなどの他のＧＢＳ配列に由来する配列を含む。これらの他のＧＢＳ配列は、ＧＢＳ６７ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にあってよい。異なるハイブリッドポリペプチドを単一処方物中で一緒に混合してもよい。
【００７１】
ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表すことができる。Ｘは上記で論じられた本発明のＧＢＳ６７ポリペプチドである。−Ｘ−部分が、その野生型形態においてリーダーペプチド配列を有する場合、これは、ハイブリッドタンパク質に含めても、またはハイブリッドタンパク質から取り除いてもよい。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のもの以外は欠失され、すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２・・・Ｘｎのリーダーペプチドは取り除かれる。このことは、全てのリーダーペプチドを欠失させ、Ｘ１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として用いることと等しい。
【００７２】
｛−Ｘ−Ｌ−｝の各ｎの場合、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在しても、または存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２である場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであってよい。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、典型的には短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）を含む）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い））が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。有用なリンカーは、ＧＳＧＳ（配列番号２９）、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号３０）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号３１）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成されるので、クローニングおよび操作の助けとなり、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドが典型的なポリグリシンリンカーである。特に最後のＬｎとして用いるための他の適切なリンカーは、Ｌｅｕ−ＧｌｕジペプチドまたはＧｌｙ−Ｓｅｒである。リンカーは通常、構造的可撓性を促進するための少なくとも１のグリシン残基を含み、例えば、−Ｌ−部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いグリシン残基を含んでもよい。そのようなグリシンは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチド配列、またはより長いオリゴ−Ｇｌｙ配列、すなわち、Ｇｌｙｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）において少なくとも２の連続するグリシンを含むように配置できる。
【００７３】
−Ａ−は、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い））が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠失している場合、−Ａ−は、Ｎ末端メチオニン、例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒを提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）、または単一のＭｅｔ残基であることが好ましい。新生ポリペプチドにおいては、−Ａ−部分はポリペプチドのＮ末端メチオニン（細菌では、ホルミル−メチオニン、ｆＭｅｔ）を提供できる。しかし、本発明の成熟ポリペプチド中の−Ａ−部分がＮ末端メチオニンを必ずしも含まないように、１または複数のアミノ酸を新生−Ａ−部分のＮ末端から切断することができる。
【００７４】
−Ｂ−は、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を指示する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多い）を含む）、またはタンパク質安定性を増進する配列が挙げられる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡの１４ｋＤａ断片、ビオチン化ペプチド、マルトース結合タンパク質、エンテロキナーゼフラグなどの他の適切なＣ末端アミノ酸配列は当業者には明らかであろう。
【００７５】
−Ａ−配列、−Ｂ−配列および−Ｌ−配列は、ヒトポリペプチド配列と共通する１０またはそれより多い連続するアミノ酸を有する配列を含まないのが好ましい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、−Ｌ−部分は、非ＧＢＳ６７抗原を含む。いくつかの実施形態において、−Ａ−部分は、非ＧＢＳ６７抗原を含み、いくつかの実施形態において、−Ｂ−部分は、非ＧＢＳ６７抗原を含む。
【００７７】
（ポリペプチド）
本発明で用いるポリペプチドは、多くの方法で、例えば、化学的合成により（全部または一部）、プロテアーゼを用いてより長いポリペプチドを消化することにより、ＲＮＡからの翻訳により、細胞培養物からの精製（例えば、組換え発現から）により、生物自体から（例えば、細菌培養後、または患者から直接）などで調製できる。４０未満のアミノ酸長のペプチドの生成のための好ましい方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成を含む［６、７］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［８］化学に基づく方法などの、固相ペプチド合成が特に好ましい。酵素的合成［９］を部分的または全体に用いることもできる。化学的合成の代用として、生物学的合成を用いてもよく、例えば、ポリペプチドを翻訳により生成できる。これをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実行できる。生物学的方法は、一般的には、Ｌ−アミノ酸に基づくポリペプチドの生成に限られるが、翻訳機構（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子）の操作を用いて、Ｄ−アミノ酸（またはヨードチロシンもしくはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなどの他の非天然アミノ酸）の導入を可能にすることができる［１０］。しかし、Ｄ−アミノ酸を含有させる場合、化学的合成を用いるのが好ましい。ポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端に共有結合改変を有してもよい。
【００７８】
ポリペプチドは、種々の形態をとることができる（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ）、非ミリストイル化、モノマー状、マルチマー状、粒子状、変性など）。
【００７９】
ポリペプチドは、精製または実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然に存在するポリペプチドを含まない）形態、特に、他の肺炎球菌ポリペプチドまたは宿主細胞ポリペプチドを実質的に含まない形態で提供されることが好ましく、一般的に、少なくとも約５０％純粋（重量）、通常少なくとも約９０％純粋であり、すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは、約１０％未満（例えば、５％またはそれより少ない）が、他の発現されるポリペプチドで構成される。
【００８０】
ポリペプチドを固体支持体に付着させることができる。ポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含んでもよい。
【００８１】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってよく、これは、改変アミノ酸を含んでよく、これは、非アミノ酸により中断されてよい。この用語は、天然で改変されたか、または介在、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化などの任意の他の操作もしくは改変により改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当該技術分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドも、定義内に含まれる。ポリペプチドは、単一鎖または会合した鎖として存在することができる。ポリペプチドは、天然または非天然にグリコシル化することができる（すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチド中に見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
【００８２】
本発明は、ポリペプチド発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本発明のポリペプチドを生成するプロセスを提供する。ポリペプチドの発現はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにおいて起こってもよいが、本発明は通常、発現のための異種宿主を用いる。異種宿主は原核生物（例えば細菌）または真核生物であってよい。これは、通常はＥ．ｃｏｌｉであろうが、他の適切な宿主として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【００８３】
本発明はまた、ポリペプチドの一部または全部を化学的手段により合成する、本発明のポリペプチドを生成するプロセスも提供する。
【００８４】
本発明はまた、本発明の２以上のポリペプチドを含む組成物も提供する。
【００８５】
（核酸）
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【００８６】
例えば、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７または配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００８７】
本発明はまた、そのようなヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。そのような核酸は、同じアミノ酸をコードするように代替コドンを用いるものを含む。特に、核酸は、特定の微生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のために最適化された代替コドンを含有してもよい。
【００８８】
本発明はまた、これらの核酸にハイブリダイズできる核酸も提供する。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該技術分野において広く公知であり、公開されている。関連する条件の例は（ストリンジェンシーを増加させる順に）、２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度（ここで、ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である）および他の緩衝液系を用いるそれらの等価物；０％、２５％、５０％および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１、２回以上の洗浄ステップ；１、２または１５分の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液を含む。ハイブリダイゼーション技術およびそれらの最適化は、当該技術分野で周知である［例えば、参考文献１１および２２２などを参照されたい］。
【００８９】
本発明は、これらの配列に相補的な配列を含む核酸を含む（例えば、アンチセンスもしくはプローブ（ｐｒｏｂｉｎｇ）のため、またはプライマーとして用いるため）。
【００９０】
本発明による核酸は、種々の形態をとることができる（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識された形態など）。本発明の核酸は、環状または分岐状であってよいが、一般的には直鎖状である。そうでないと明記しない限り、またはそうでないことが要求されない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖の形態と、二本鎖の形態を構成する２つの相補的一本鎖の形態のそれぞれとの両方を利用し得る。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸と同様に、一般的に一本鎖である。
【００９１】
本発明の核酸は、精製または実質的に精製された形態、すなわち、他の核酸を実質的に含まない形態（例えば、天然に存在する核酸を含まない）、特に、他のＧＢＳの核酸または宿主細胞の核酸を実質的に含まない形態で提供されることが好ましく、一般的に、少なくとも約５０％純粋（重量）、通常少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、好ましくは、ＧＢＳの核酸である。
【００９２】
本発明の核酸は、例えば、全体的もしくは部分的に化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いてより長い核酸を消化することによって、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーから、より短い核酸もしくはヌクレオチドを（例えば、リガーゼもしくはポリメラーゼを用いて）連結することによって、などの多くの方法で調製できる。
【００９３】
本発明の核酸を、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルタ、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に付着させることができる。本発明の核酸は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識またはビオチン標識で標識することができる。このことは、検出技術において核酸を用いる場合、例えば、核酸がプライマーであるか、またはプローブとしてである場合は特に有用である。
【００９４】
用語「核酸」は、一般的に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含む任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形態の意味を含む。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。これは、改変骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはホスホロチオエート）または改変塩基を含有するものなどのＤＮＡまたはＲＮＡ類似体も含む。よって、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分岐状核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合、これは、５’キャップを有しても有さなくてもよい。
【００９５】
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１または複数の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であってよい。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増幅（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）および複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞中のヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の生成をもたらすために設計された「ウイルスベクター」または１より多い型のベクターの属性を含む「シャトルベクター」であってよい。好ましいベクターは、プラスミドである。「宿主細胞」は、外来核酸を受容できるか、または受容した個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶然の、または故意の変異および／または変更のために元の親の細胞と完全に同一（形態的に、または全体のＤＮＡ総量において）である必要はない。宿主細胞は、本発明の核酸にｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてトランスフェクトまたは感染した細胞を含む。
【００９６】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」がＤＮＡにおいては「Ｔ」に置き換わることが認識されるであろう。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」は、ＲＮＡにおいては「Ｕ」に置き換わることが認識されるであろう。
【００９７】
核酸に関連して用いる場合の用語「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」または「相補的」とは、ワトソン−クリック塩基対形成を指す。よって、Ｃの相補体はＧであり、Ｇの相補体はＣであり、Ａの相補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体はＡである。Ｉ（プリンであるイノシン）などの塩基を用いて、例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）を相補することも可能である。
【００９８】
本発明の核酸を、例えば、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生成するため；生体試料中の核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして；核酸のさらなるコピーを作製するため；リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するため；一本鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブとして；または３重鎖形成オリゴヌクレオチドとして用いることができる。
【００９９】
本発明は、核酸が、部分的または全体的に化学的手段を用いて合成される、本発明の核酸を生成するプロセスを提供する。
【０１００】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングまたは発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１０１】
（免疫原性組成物）
本発明のポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドは、免疫原性組成物中の活性成分として有用である。そのような免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。これらのワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染を処置する）のいずれかであってよいが、典型的には予防的である。
【０１０２】
組成物は、よって、薬学的に許容され得る。これらは、通常、抗原に加えて成分を含み、例えば、これらは、典型的には、１または複数の薬学的キャリア、および／または賦形剤を含む。このような成分の詳細な考察は、参考文献［２１７］で入手可能である。
【０１０３】
組成物は、一般的に、哺乳動物に水性形態で投与される。しかし、投与の前に、組成物は非水性形態であってよい。例えば、いくつかのワクチンは水性形態で製造され、次いで充填および配布され、同じく水性形態で投与されるが、その他のワクチンは製造中に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。よって、本発明の組成物は、凍結乾燥処方物のように乾燥され得る。
【０１０４】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような防腐剤を含んでよい。しかし、好ましくは、ワクチンは、水銀性物質を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないようにすべきである。水銀を含まないワクチンがより好ましい。防腐剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【０１０５】
張度を制御するために、ナトリウム塩のような生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌで存在してよい。存在し得るその他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【０１０６】
組成物は、一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。
【０１０７】
組成物は、１または複数の緩衝剤を含んでよい。典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤（特に水酸化アルミニウムアジュバントとともに）またはクエン酸塩緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１０８】
組成物のｐＨは、一般的に、５．０〜８．１であり、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５および７．５、または７．０〜７．８である。
【０１０９】
組成物は、好ましくは滅菌されている。組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な尺度）、好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１１０】
組成物は、単回の免疫化のための物質を含んでも、複数回の免疫化（すなわち「複数回用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）のための物質を含んでもよい。複数回用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、防腐剤を含むことが好ましい。複数回用量組成物に防腐剤を含める代わり（またはそれに加えて）に、組成物を、物質を取り出すための無菌アダプタを有する容器中に入れてよい。
【０１１１】
ヒトワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、小児には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与してよい。
【０１１２】
本発明の免疫原性組成物は、１または複数の免疫調節剤も含んでよい。好ましくは、免疫調節剤の１または複数は、１または複数のアジュバントを含む。アジュバントは、以下でさらに論じるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを含んでよい。
【０１１３】
本発明の組成物で使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（Ａ．無機質含有組成物）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切な無機質含有組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩［例えば、参考文献１２の第８章および第９章を参照されたい］、または異なる無機化合物の混合物を含み、これらの化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、吸着されることが好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方されてもよい。
【０１１４】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）により表すことができるオキシ水酸化アルミニウムを、赤外線（ＩＲ）分光法により、特に、１０７０ｃｍ−１での吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いショルダーの存在により、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物と区別することができる［参考文献１２の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、半分の高さでの回折バンドの幅（ＷＨＨ）により反映され、結晶性の乏しい粒子は、より小さい晶子サイズに起因してより大きな線の広がりを示す。ＷＨＨが増加するにつれて表面積が増加し、より高いＷＨＨ値を有するアジュバントはより大きい抗原吸着能を有することが観察された。水酸化アルミニウムアジュバントについて、繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）が典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１であり、すなわちアジュバント自体が生理的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１１５】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、少量の硫酸塩も頻繁に含有しているヒドロキシリン酸アルミニウムである（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度に影響する。ヒドロキシホスフェートは、一般的には、０．３〜１．２のモル比のＰＯ４／Ａｌを有する。ヒドロキシホスフェートを、ヒドロキシル基の存在により厳密なＡｌＰＯ４と区別できる。例えば、３１６４ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）は、ヒドロキシル構造の存在を示唆する［参考文献１２の第９章］。
【０１１６】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的には、０．３〜１．２、好ましくは、０．８〜１．２、より好ましくは、０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、ヒドロキシリン酸塩については特に、一般的に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に粒子状である（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるようなプレート様の形態）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後に、０．５〜２０μｍの範囲（例えば約５〜１０μｍ）である。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７〜１．５ｍｇのタンパク質吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１１７】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動できる。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、一般的に、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【０１１８】
本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えばリン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含有してよいが、このことは常に必要というわけではない。懸濁物は、好ましくは、滅菌されており、発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含んでよい。懸濁物は、塩化ナトリウムも含んでよい。
【０１１９】
一実施形態において、アジュバント成分は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、水酸化アルミニウムよりも多くのリン酸アルミニウムが存在し得、例えば、少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比であってよい。
【０１２０】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大＜０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１２１】
（Ｂ．油性エマルジョン）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切な油性エマルジョン組成物は、ＭＦ５９［参考文献１２の第１０章；参考文献１３も参照されたい］（マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５）のようなスクアレン−水エマルジョンを含む。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も用いてよい。
【０１２２】
種々の適切な水中油型エマルジョンが公知であり、これらは、典型的には、少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤とを含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）であり、生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、通常、直径５μｍ未満であり、有利にはエマルジョンは、サブミクロンの直径を有する油滴を含み、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、フィルタ滅菌に供することができるので好ましい。
【０１２３】
本発明は、動物（例えば魚類）または植物供給源からのもののような油とともに使用され得る。植物油の供給源は、堅果、種子および穀粒を含む。ピーナツ油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま油などを含む。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オート麦、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなどのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製し得る。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝可能であり、よって、本発明の実施において用いてよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当該技術分野において周知である。ほとんどの魚類は、容易に収集し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において用い得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、通常、テルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分岐不飽和テルペノイドを含有する。他の好ましい油は、トコフェロール類（以下を参照のこと）である。スクアレンを含む水中油型エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を用いることができる。
【０１２４】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのようなＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）を含む界面活性剤を用いることができる。エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。上記のように、Ｔｗｅｅｎ  ８０のような洗浄剤は、以下の実施例で見られる熱安定性に寄与し得る。
【０１２５】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のようなオクトキシノールとの組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス−９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【０１２６】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズのその他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【０１２７】
本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、それらに限定されないが、以下のものを含む。
【０１２８】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの容積での組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量の点において、これらの比率は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ８５になる。このアジュバントは、参考文献１７の第１０章および参考文献１８の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［１４〜１６］として公知である。有利には、ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を含む。
【０１２９】
・スクアレン、αトコフェロールおよびポリソルベート８０のエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ８０を有してよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンが得られるので、好ましくは≦１（例えば、０．９０）である。スクアレンとＴｗｅｅｎ８０とは、約５：２の容積比または約１１：５の重量比で存在してよい。あるこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳ中に溶解して２％溶液を得て、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次いで混合物をマイクロフルイダイズすることにより作製できる。得られるエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。
【０１３０】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでよい（下記参照）。エマルジョンは、リン酸緩衝剤を含有してよい。
【０１３１】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびトコフェロール（例えばα−コハク酸トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０の質量比で含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−コハク酸トコフェロール）、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいずれの寄与も含むべきである。エマルジョンは、スクアレンも含んでよい。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでよい（下記参照）。水相は、リン酸緩衝剤を含有してよい。
【０１３２】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中で処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント中で用いられている［１９］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。これは、「ＡＦ」アジュバントでのようにＴｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる［２０］（５％スクアラン、１．２５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１３３】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン界面活性剤（例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または少なくとも９０％の油滴（容積による）が２００ｎｍ未満のサイズである［２１］。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１または複数も含んでよい。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してよい。
【０１３４】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質および０．０５〜５％の非イオン界面活性剤を含むエマルジョン。参考文献２２に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１３５】
・代謝不可能油（例えば軽油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（例えば脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生成される、参考文献２３に記載されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加物を含んでよい。
【０１３６】
・鉱油、非イオン親油性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２４］。
【０１３７】
・鉱油、非イオン親水性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２４］。
【０１３８】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン［２５］。
【０１３９】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には、患者への送達の時点で混合される。エマルジョンを、製造中に、または送達の時点で即席で抗原と混合してもよい。よって、アジュバントおよび抗原は、使用時の最終的な処方のために準備された、パッケージまたは分配されたワクチンにおいて別々に保持され得る。抗原は、一般的に、ワクチンが２つの液体を混合することにより最終的に調製されるように水性の形態にある。混合するための２つの液体の容積比は変動し得る（例えば５：１〜１：５）が、一般的には約１：１である。
【０１４０】
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献１２の第２２章］）
サポニン処方物を、本発明においてアジュバントとして用いてもよい。サポニンは、広範囲の種の植物の樹皮、葉、茎、根および花でさえも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの不均質な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズヴェイル（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート）から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物は、ＱＳ２１のような精製処方物およびＩＳＣＯＭのような脂質処方物を含む。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。
【０１４１】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む、これらの技術を用いた具体的な精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献２６に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールのようなステロールも含んでよい［２７］。
【０１４２】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成できる［参考文献１２の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質も含む。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭで用いることができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１または複数を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献２７〜２９にさらに記載されている。所望により、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠いていてよい［３０］。
【０１４３】
サポニンに基づくアジュバントの開発の概説は、参考文献３１および３２で見出すことができる。
【０１４４】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、本発明においてアジュバントとして用いることもできる。これらの構造は、一般的に、所望によりリン脂質と組み合わされたかもしくはそれとともに処方されたウイルスからの１または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般的に、非病原性で、非複製性であり、一般的に、いずれの天然ウイルスゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換え生成されても、またはウイルス全体から単離されてもよい。ビロソームまたはＶＬＰで用いるために適切なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（例えばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばコアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えばコートタンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＴｙ（例えばレトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質を含む。ＶＬＰは、参考文献３３〜３８においてさらに論じられている。ビロソームは、例えば参考文献３９においてさらに論じられている。
【０１４５】
（Ｅ．細菌または微生物誘導体）
本発明で用いるために適切なアジュバントは、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体のような細菌または微生物誘導体を含む。
【０１４６】
ＬＰＳの非毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」の形態は、参考文献４０に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過されるために十分小さい［４０］。その他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９のようなモノホスホリルリピドＡ模倣物を含む［４１、４２］。
【０１４７】
リピドＡ誘導体は、ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのリピドＡの誘導体を含む。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献４３および４４に記載されている。
【０１４８】
本発明においてアジュバントとして用いるために適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｄ）によりグアノシンと連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有するヌクレオチド配列を含む。２本鎖ＲＮＡおよびパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。
【０１４９】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート改変のようなヌクレオチド改変／類似体を含むことができ、２本鎖または１本鎖であり得る。参考文献４５、４６および４７は、可能性のある類似体置換、例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換えを開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献４８〜５３においてさらに論じられている。
【０１５０】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ［５４］のようにＴＬＲ９に向けられることがある。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答を誘導するために特異的であり得るか、またはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮのようにＢ細胞応答を誘導するためにより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献５５〜５７において論じられている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１５１】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体認識のために５’端が近付くことができるように構築されている。所望により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’端で付着させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してよい。例えば、参考文献５４および５８〜６０を参照されたい。
【０１５２】
免疫刺激オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１ＴＭとして公知である［６１］。よって、本発明で用いられるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（好ましくは複数）のＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと連結されてジヌクレオチドを形成するシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば１５〜４０のヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つ（好ましくは複数）のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むオリゴペプチド（例えば５〜２０のアミノ酸）のようなポリカチオンポリマーとの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号３２）を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオンポリマーは、１１ｍｅｒのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号３３）を含むペプチドであってよい。
【０１５３】
細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして用いてよい。好ましくは、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒化ＡＤＰリボシル化毒素を粘膜アジュバントとして用いることは、参考文献６２に記載され、非経口アジュバントとして用いることは、参考文献６３に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡおよびＢのサブユニットをともに含むホロ毒素の形態にある。好ましくは、Ａサブユニットは解毒化変異を含有し、好ましくは、Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２のような解毒化ＬＴ変異体である。アジュバントとしてＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２を用いることは、参考文献６４〜７１で見出すことができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［７２］。アミノ酸置換についての数字の参照は、好ましくは、参考文献７３（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれている）に示されるＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１５４】
（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切なヒト免疫調節物質は、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７４］など）［７５］、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子のようなサイトカインを含む。好ましい免疫調節物質は、ＩＬ−１２である。
【０１５５】
（Ｇ．生体付着性物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着性物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ））
生体付着性物質および粘膜付着性物質も、本発明においてアジュバントとして用いてよい。適切な生体付着性物質は、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［７６］、またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体のような粘膜付着性物質を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いてよい［７７］。
【０１５６】
（Ｈ．微小粒子）
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いてよい。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に加えて、生分解性で非毒性の物質（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）で形成された微小粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、これらは、所望により、負に荷電された表面（例えばＳＤＳで）または正に荷電された表面（例えばＣＴＡＢのようなカチオン洗浄剤で）を有するように処理される。
【０１５７】
（Ｉ．リポソーム（参考文献１２の第１３および１４章））
アジュバントとして用いるために適切なリポソーム処方物の例は、参考文献７８〜８０に記載されている。
【０１５８】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明で用いるために適切なアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを含む［８１］。このような処方物は、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［８２］、およびオクトキシノールのような少なくとも１つの追加の非イオン界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［８３］を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１５９】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
例えば参考文献８４および８５に、ＰＣＰＰ処方物が記載される。
【０１６０】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切なムラミルペプチドの例は、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む。
【０１６１】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントを使用するための適切なイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献８６および８７にさらに記載された、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族化合物（例えば、「レシキモド３Ｍ」が挙げられる。
【０１６２】
本発明はまた、上記で同定されたアジュバントのうちの１または複数の態様の組み合わせを含んでもよい。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において用いることができる：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［８８］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［８９］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［９０］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［９１］；（６）サブミクロンのエマルジョンになるようにマイクロフルイダイズされたか、またはより大きい粒子サイズのエマルジョンを生じるようにボルテックスされた１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１または複数の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１または複数の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）。
【０１６３】
免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献１２の第７章に開示されている。
【０１６４】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に、小児において有用であり、抗原は、一般的に、これらの塩に吸着される。水中スクアレン型エマルジョンも、特に、高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせは、ＣｐＧおよびａｌｕｍ、またはレシキモドおよびａｌｕｍのようなＴｈ１アジュバントおよびＴｈ２アジュバントの組み合わせを含む。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを用いてよい。
【０１６５】
本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答と体液性免疫応答をともに惹起し得る。
【０１６６】
２つの型のＴ細胞、すなわちＣＤ４およびＣＤ８細胞は、一般的に、細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／または増進するために必要であると考えられている。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現でき、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と一般に呼ばれる。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識でき、またはそれと相互作用できる。
【０１６７】
ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現でき、Ｔヘルパー細胞と一般に呼ばれる。ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した抗原性ペプチドを認識できる。ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用により、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌できる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび免疫応答に参加するその他の細胞を活性化できる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセット、すなわちそれらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型にさらに分けることができる。
【０１６８】
活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増進し（抗原特異的ＣＴＬの生成の増加を含む）、よって、細胞内感染に対する応答において特に価値がある。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βの１または複数を分泌し得る。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することにより局所的炎症反応をもたらし得る。ＴＨ１免疫応答は、ＢおよびＴ細胞の増殖を、ＩＬ−１２を用いて刺激することにより免疫応答を拡大するように作用することもある。ＴＨ１刺激Ｂ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１６９】
活性化ＴＨ２細胞は、抗体生成を増進し、よって、細胞外感染に対する応答において価値がある。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の１または複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび将来の防御のためのメモリーＢ細胞の生成をもたらし得る。
【０１７０】
免疫応答の増進は、ＴＨ１免疫応答の増進およびＴＨ２免疫応答の増進の１または複数を含み得る。
【０１７１】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関連するサイトカインの１もしくは複数（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β）の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの生成の増加の１または複数を含み得る。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増進は、ＩｇＧ２ａ生成の増加を含む。
【０１７２】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを用いて惹起し得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比べて、増加したレベルのＩｇＧ２ａ生成を惹起する。本発明で用いるために適切なＴＨ１アジュバントは、例えばサポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドを含んでよい。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのような免疫刺激オリゴヌクレオチドは、本発明で用いるために好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１７３】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連するサイトカインの１もしくは複数（例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の生成の増加の１または複数を含み得る。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増進は、ＩｇＧ１生成の増加を含む。
【０１７４】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを用いて惹起し得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比べて、増加したレベルのＩｇＧ１生成を惹起する。本発明で用いるために適切なＴＨ２アジュバントは、例えば無機質含有組成物、油性エマルジョンならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体を含む。アルミニウム塩のような無機質含有組成物は、本発明で用いるために好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１７５】
組成物は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含み得る。好ましくは、このような組成物は、増進されたＴＨ１応答および増進されたＴＨ２応答を惹起し、すなわちアジュバントなしでの免疫化と比べて、ＩｇＧ１生成およびＩｇＧ２ａ生成の両方の生成の増加を惹起する。さらにより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一アジュバントを用いる免疫化と比べて（すなわち、ＴＨ１アジュバントのみでの免疫化またはＴＨ２アジュバントのみでの免疫化と比べて）、ＴＨ１免疫応答の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増加を惹起する。
【０１７６】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１応答の増進およびＴＨ２応答の増進の一方または両方をもたらす。
【０１７７】
免疫応答の増進は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、全身免疫応答の増進および粘膜免疫応答の増進の一方または両方をもたらす。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＩｇＡの生成の増加を含む。
【０１７８】
連鎖球菌感染は、体の種々の領域に影響し得、よって、本発明の組成物は、種々の形態で調製してよい。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとしての注射剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）として調製してよい。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するために適切な固体の形態も調製できる（例えば凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）。組成物は、表面投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）用に、例えば軟膏剤、クリームまたは散剤として調製してよい。組成物は、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセル剤として、噴霧剤として、またはシロップ剤（必要に応じて矯味矯臭される）として調製してよい。組成物は、肺投与用に、例えば微細粉末または噴霧剤を用いる吸入器として調製してよい。組成物は、坐剤または膣坐剤として調製してよい。組成物は、鼻、耳または眼の投与用に、例えば滴剤として調製してよい。組成物は、組み合わせた組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってよい。このようなキットは、液体の形態の１または複数の抗原と、凍結乾燥された１または複数の抗原とを含んでよい。
【０１７９】
組成物が使用前に即席で調製され（例えば成分が凍結乾燥された形態である場合）、かつキットである場合、キットは２つのバイアルを含んでも、１つの充填済み（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジと１つのバイアルとを含んでもよく、シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。
【０１８０】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）と、必要に応じて任意のその他の成分とを含む。「免疫学的有効量」により、単回用量または一連のものの一部のいずれかとしてその量を個体に投与することが、処置または予防のために効果的であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体の状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態についての処置医師の評価、およびその他の関連する要因に依存して変動する。この量は、日常的な試験により決定できる比較的広い範囲内にあると予測される。
【０１８１】
（核酸免疫化）
上記の免疫原性組成物は、ＧＢＳに由来するポリペプチド抗原を含む。しかし、全ての場合において、ポリペプチド（およびハイブリッドポリペプチド）抗原を、これらのポリペプチドをコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）により置き換えて、核酸免疫化に基づく組成物、方法および使用を得ることができる［９２〜９９］。
【０１８２】
免疫原をコードする核酸は、患者に送達された後にインビボにおいて発現し、発現した免疫原が、次いで、免疫系を刺激する。活性成分は、典型的には、（ｉ）プロモーターと、（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した免疫原をコードする配列と、所望により（ｉｉｉ）選択マーカーとを含む核酸ベクターの形態をとる。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製起点と、（ｖ）（ｉｉ）の下流であって（ｉｉ）に作動可能に連結した転写ターミネーターとをさらに含んでよい。一般的に、（ｉ）および（ｖ）は真核生物のものであり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核生物のものである。
【０１８３】
好ましいプロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのウイルスプロモーターである。ベクターは、プロモーターに加えて転写調節配列（例えばエンハンサー）も含んでよく、これは、プロモーターと機能的に相互作用する。好ましいベクターは、前初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含み、より好ましいベクターは、ＣＭＶイントロンＡも含む。プロモーターは、免疫原をコードする下流配列に作動可能に連結して、免疫原をコードする配列の発現がプロモーターの制御下になるようにする。
【０１８４】
マーカーを用いる場合、これは、好ましくは、微生物宿主内（例えば原核生物内、細菌内、酵母内）で機能する。マーカーは、好ましくは、原核生物選択マーカー（例えば原核生物プロモーターの制御下で転写される）である。簡便のために、典型的なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。
【０１８５】
ベクターは、好ましくは、プラスミドのような自己複製エピソームまたは染色体外ベクターである。
【０１８６】
ベクターは、好ましくは、複製起点を含む。複製起点は、原核生物内で活性であるが、真核生物内で活性でないことが好ましい。
【０１８７】
よって、好ましいベクターは、ベクターの選択のための原核生物マーカーと、原核生物の複製起点と、免疫原をコードする配列の転写を駆動する真核生物のプロモーターとを含む。ベクターは、よって、（ａ）ポリペプチドを発現することなく原核生物宿主において増幅されて選択されるが、（ｂ）増幅されることなく真核生物宿主において発現される。この構成は、核酸免疫化ベクターについて理想的である。
【０１８８】
ベクターは、コード配列の下流に真核生物の転写ターミネーター配列を含んでよい。これは、転写レベルを増進できる。コード配列がそれ自体のものを有さない場合、ベクターは、好ましくは、ポリアデニル化配列を含む。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンに由来する。
【０１８９】
ベクターは、マルチクローニング部位を含んでよい。
【０１９０】
免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターは、第２真核生物コード配列を含んでよい。ベクターは、上記の第２配列の上流にＩＲＥＳも含むことにより、免疫原と同じ転写産物からの第２真核生物ポリペプチドの翻訳を許容することもできる。代わりに、免疫原コード配列が、ＩＲＥＳの下流にあってよい。
【０１９１】
ベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば２つの５’プリンと２つの３’ピリミジンとに挟まれた、グアノシンの前にシトシンを共通して有する非メチル化ＤＮＡ配列を含んでよい。これらの非メチル化形態において、これらのＤＮＡモチーフは、いくつかの型の免疫細胞の強力な刺激物質であることが証明されている。
【０１９２】
ベクターは、標的化様式で送達してよい。受容体媒介ＤＮＡ送達技術が、例えば参考文献１００〜１０５に記載されている。核酸を含有する治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲のＤＮＡで投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲を、遺伝子治療プロトコール中に用いることもできる。作用の方法（例えばコードされる遺伝子産物のレベルを増進または阻害するための）ならびに形質転換および発現の効力のような因子は、最終的な効力のために要求される投与量に影響する、考慮すべき事項である。組織のより大きい領域にわたってより高い発現が所望される場合、より多い量のベクター、または逐次的投与プロトコールにおいて再投与される同じ量、または様々な近接もしくは近い組織部分への数回の投与が、正の治療転帰をもたらすために要求され得る。全ての場合において、臨床試験における日常的な実験が、最適な治療効果の特定の範囲を決定する。
【０１９３】
ベクターは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達できる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルスの起源のものであり得る（一般的に、参考文献１０６〜１０９を参照されたい）。
【０１９４】
所望の核酸の送達および所望の細胞における発現のためのウイルスに基づくベクターは、当該技術分野において周知である。例示的なウイルスに基づくビヒクルは、それらに限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば参考文献１１０〜１２０）、アルファウイルスに基づくベクター（例えばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ
ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）；これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも用いてよい）、ポックスウイルスベクター（例えばワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、改変ワクシニアＡｎｋａｒａなど）、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む（例えば参考文献１２１〜１２６を参照されたい）。不活化（ｋｉｌｌｅｄ）アデノウイルスと連結されたＤＮＡ［１２７］の投与も用いることができる。
【０１９５】
それらに限定されないが、不活化アデノウイルスのみに連結されたかまたは連結されていないポリカチオン凝縮ＤＮＡ［例えば１２７］、リガンド連結ＤＮＡ［１２８］、真核細胞送達ビヒクル細胞［例えば参考文献１２９〜１３３］および核電荷中和または細胞膜との融合を含む非ウイルス送達ビヒクルおよび方法も用いることができる。裸のＤＮＡも用いることができる。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、参考文献１３４および１３５に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用できるリポソーム（例えばイムノリポソーム）は、参考文献１３６〜１４０に記載されている。さらなるアプローチは、参考文献１４１および１４２に記載されている。
【０１９６】
用いるために適切なさらなる非ウイルス送達は、参考文献１４２に記載されているアプローチのような機械的送達系を含む。さらに、コード配列およびその発現の生成物は、光重合されたヒドロゲル物質の堆積または電離放射線の使用により送達できる［例えば参考文献１４３および１４４］。コード配列を送達するために用いることができる遺伝子送達のためのその他の従来の方法は、例えば、手持ち式遺伝子移入粒子銃（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ）の使用［１４５］または移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用［１４３および１４４］を含む。
【０１９７】
ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）｝微小粒子を用いるＤＮＡの送達は、例えば微小粒子への吸着による特に好ましい方法であり、これらの微小粒子は、所望により、負に荷電された表面（例えばＳＤＳで処理される）または正に荷電された表面（例えばＣＴＡＢのようなカチオン洗浄剤で処理される）を有するように処理される。
【０１９８】
（処置方法、およびワクチンの投与）
本発明はまた、上記のポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、核酸または免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を高めるための方法も提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、好ましくは、抗体および／または細胞媒介性免疫を含む。前記方法は、追加免疫応答（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を高めることができる。
【０１９９】
本発明はまた、例えば、哺乳動物における免疫応答を高めることにおいて用いるための医薬品として使用するための上記のポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、核酸または免疫原性組成物も提供する。
【０２００】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を高めるための医薬品の製造における、上記のポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、核酸または免疫原性組成物の使用も提供する。
【０２０１】
これらの使用および方法により哺乳動物において免疫応答を高めることにより、哺乳動物を、ＧＢＳにより引き起こされる疾患および／または感染、例えば、髄膜炎に対して防御することができる。
【０２０２】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物が予め充填された送達デバイスも提供する。
【０２０３】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ヒトは、好ましくは、１０代の若者または成人である。
【０２０４】
治療的処置の効力を確認する１つの方法は、本発明の組成物の投与後のＧＢＳ感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の効力を確認する１つの方法は、標準的な試験において免疫化後の血清を試験することを含む；例えば、防御効力を示す細菌をオプソニン化する能力を用いて、オプソニン食菌殺傷アッセイ（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（ＯＰＫＡ）において血清を試験することができる。予防的処置の効力を確認するための別の方法は、ＧＢＳ感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスにおける免疫化後抗原投与を含む。１つのそのようなモデルは、参考文献１４６に記載されている。本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、患者の血清または粘膜分泌物をイムノブロットおよび／またはマイクロアレイによりスクリーニングするためにポリペプチドを組換え発現させることである。ポリペプチドと患者試料との間の陽性反応は、患者が、問題のポリペプチドに対する免疫応答を開始したことを示す。この方法を用いて、免疫優性抗原および／または抗原内のエピトープを同定することもできる。
【０２０５】
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間質腔へ）、または直腸、経口（例えば、錠剤、噴霧剤）、膣、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与など、粘膜を介して達成できる。
【０２０６】
本発明を用いて、全身および／または粘膜免疫を惹起する、好ましくは、増進された全身および／または粘膜免疫を惹起することができる。
【０２０７】
好ましくは、増進された全身および／または粘膜免疫は、増進されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答に反映される。好ましくは、増進された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの生成の増加を含む。
【０２０８】
投薬は、単回用量計画または複数回用量計画によるものであってよい。複数回用量は、初回免疫化計画および／または追加免疫化計画で用いることができる。複数回用量計画において、種々の用量を、同じか、または異なる経路により与えてもよく、例えば、非経口による初回免疫（ｐｒｉｍｅ）と粘膜による追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）、粘膜による初回免疫と非経口による追加免疫などである。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間隔てて投与される（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。
【０２０９】
本発明に従って調製されるワクチンを用いて、小児および成人の両方を処置することができる。よって、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってよい。ワクチンを受ける好ましい患者は、青年（例えば、１３〜２０歳）、妊娠女性、および高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）である。しかし、ワクチンは、これらの群にのみ適するのではなく、集団においてより一般的に用いることができる。
【０２１０】
本発明により製造されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ医療相談または訪問中に）、例えば、風疹ワクチン、水痘ワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、インフルエンザウイルスワクチン（汎流行性インフルエンザウイルスワクチンを含む）などと実質的に同時に患者に投与してもよい。
【０２１１】
また、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特に、インフルエンザウイルスに対して活性である抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、医療専門家への同じ医療相談または訪問中に）患者に投与してもよい。これらの抗ウイルス剤（ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ）としては、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても公知の（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）である。
【０２１２】
（組み合わせ）
ＧＢＳ６７ポリペプチド断片に加えて、組成物は、（ｉ）ＧＢＳタンパク質、特に、ＧＢＳ６７以外のＧＢＳタンパク質に対する抗体応答を惹起する１または複数のさらなるポリペプチド；（ｉｉ）ＧＢＳに由来する莢膜糖；および／または（ｉｉｉ）非ＧＢＳ生物上のエピトープを認識する抗体応答を惹起する１または複数の免疫原を含んでもよい。
【０２１３】
（さらなるポリペプチド抗原との組み合わせ）
上記のＧＢＳ６７ポリペプチド断片を、（１）（ＧＢＳ８０）抗原；（２）ＧＢＳ５９抗原；（３）ＧＢＳ１５２３抗原；（４）ＧＢＳ１０４抗原；（５）ＧＢＳ１５２４抗原；（６）ＧＢＳ３抗原；（７）ＳＡＮ１４８５抗原；（８）ＧＢＳ１４７抗原；（９）ＧＢＳ３２８抗原；および／または（１０）ＧＢＳ８４抗原からなる群より選択される１または複数（すなわち、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種全部）のポリペプチド抗原と組み合わせることができる。
【０２１４】
これらのさらなる抗原を、別のポリペプチドとして追加することができる。代替として、これらをハイブリッド、例えば、ＧＢＳ８０−ＧＢＳ１５２３ハイブリッドとして追加することができる。さらなる代替として、これらをＧＢＳ６７ポリペプチド断片に融合して、ハイブリッドポリペプチドを提供することができる。
【０２１５】
これらの組み合わせはいずれも、典型的には、キャリアタンパク質（複数可）と結合体化する１または複数のＧＢＳ莢膜糖（複数可）を含んでもよい。そのような糖および結合体化に関するさらなる情報を、以下に提供する。
【０２１６】
（ＧＢＳ８０）
元の「ＧＢＳ８０」（ＳＡＧ０６４５）配列は、参考文献１４７中で細胞壁表面アンカーファミリータンパク質としてアノテートされている（ＧＩ：２２５３３６６０を参照されたい）。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ８０のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号３４として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ８０ポリペプチドは、（ａ）配列番号３４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号３４の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ８０タンパク質は、配列番号３４の変異体を含む。
【０２１７】
（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３４に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号３４のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号３４のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号３４の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２１８】
野生型ＧＢＳ８０は、配列番号３４のアミノ酸１〜３７にＮ末端リーダーまたはシグナル配列領域を含む。ＧＢＳ８０のリーダーまたはシグナル配列領域に由来する１または複数のアミノ酸を除去することができる（例えば、配列番号３５）。野生型配列はまた、配列番号３４のアミノ酸５２６〜５４３にＣ末端膜貫通領域も含む。膜貫通領域および／または細胞質領域に由来する１または複数のアミノ酸を除去することができる（例えば、配列番号３６）。野生型ＧＢＳ８０は、配列番号３４のアミノ酸５２１〜５２５に細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含む。いくつかの組換え宿主細胞系においては、このモチーフを除去して、宿主細胞からの組換えＧＢＳ８０ポリペプチドの分泌を容易にすることが有用であり得る。よって、膜貫通および／または細胞質領域ならびに細胞壁アンカーモチーフをＧＢＳ８０から除去することができる（例えば、配列番号３７）。あるいは、いくつかの組換え宿主細胞系においては、細胞壁アンカーモチーフを用いて、組換え発現されたポリペプチドを細胞壁に係留することが有用であり得る。発現されたポリペプチドの細胞外ドメインを精製の間に切断するか、または組換えポリペプチドを最終組成物中で不活化された宿主細胞もしくは細胞膜に付着したままにすることができる（例えば、配列番号３８）。野生型ＧＢＳ８０の特に免疫原性である断片は、ポリペプチドのＮ末端に向かって位置し、それは配列番号３９である。
【０２１９】
（ＧＢＳ５９）
ＧＢＳ５９は、病原性アイランド２ａ（ＢＰ−２ａ）によりコードされる線毛骨格タンパク質である。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ５９のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号４０として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ５９ポリペプチドは、（ａ）配列番号４０に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４０の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ５９タンパク質は、配列番号４０の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４０に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４０のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号４０のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号４０の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２０】
ＧＢＳ５９の変異体は、Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０株に存在する。参照目的で、Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＣＪＢ１１０およびＤＫ２１株に見出される完全長ＧＢＳ５９のアミノ酸配列を、配列番号４１、４２、４３、４４、および４５として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ５９ポリペプチドは、（ａ）配列番号４１、４２、４３、４４、もしくは４５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４１、４２、４３、４４、もしくは４５の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４１、４２、４３、４４、もしくは４５のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号４１、４２、４３、４４、もしくは４５のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号４１、４２、４３、４４、もしくは４５の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２１】
（ＧＢＳ１５２３）
元の「ＧＢＳ１５２３」（ＳＡＮ１５１８；ＳｐｂＩ）配列は、参考文献３中で細胞壁表面アンカーファミリータンパク質としてアノテートされている（ＧＩ：７７４０８６５１を参照されたい）。参照目的で、ＣＯＨ１株中に見出される完全長ＧＢＳ１５２３のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号４６として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ１５２３ポリペプチドは、（ａ）配列番号４６に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４６の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ１５２３タンパク質は、配列番号４６の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４６に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４６のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号４６のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号４６の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２２】
野生型ＧＢＳ１５２３は、配列番号４６のアミノ酸１〜２９にＮ末端リーダーまたはシグナル配列領域を含み、これは、断片中で除去することができる（例えば、配列番号４７）。野生型配列は、配列番号４６のアミノ酸４６８〜４７２に細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフ（ＬＰＳＴＧ）を含む。いくつかの組換え宿主細胞系においては、このモチーフを除去して、細胞からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのが好ましい。あるいは、細胞壁アンカーモチーフを用いて、組換え発現されたポリペプチドを細胞壁に係留するのが好ましい。発現されたポリペプチドの細胞外ドメインを、精製の間に切断するか、または組換えポリペプチドを、最終組成物中で不活化された宿主細胞もしくは細胞膜に付着したままにすることができる。保存されたグルタミン酸残基を含有するＥボックスも、配列番号４６のアミノ酸４１９〜４２９に同定されており、残基４２３に保存されたグルタミン酸を有する。Ｅボックスモチーフは、オリゴマー線毛様構造の形成にとって重要であってよく、したがってＧＢＳ１５２３の有用な断片は保存されたグルタミン酸残基を含んでもよい。ＣＡＡからＡＡＡへのコードヌクレオチド配列中のコドンの変異の結果として、配列番号４６の位置４１のグルタミン（Ｑ）がリジン（Ｋ）に置換されたＧＢＳ１５２３の変異体が同定された。この置換は、ＧＢＳ１５２３配列およびＧＢＳ１５２３断片（例えば、配列番号４８）中に存在してもよい。
【０２２３】
組成物がＧＢＳ８０とＧＢＳ１５２３の両方を含む場合、ハイブリッドポリペプチドを用いることができる。ＧＢＳ８０−ＧＢＳ１５２３ハイブリッドの例は、参考文献１４８に見出され、配列番号４９〜５２のポリペプチドを含む。
【０２２４】
（ＧＢＳ１０４）
元の「ＧＢＳ１０４」（ＳＡＧ０６４９）配列は、参考文献１４７中で「細胞壁表面アンカーファミリータンパク質」としてアノテートされている（ＧＩ：２２５３３６６４を参照されたい）。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ１０４のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号５３として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ８０ポリペプチドは、（ａ）配列番号５３に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号５３の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ１０４タンパク質は、配列番号５３の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４０に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号５３のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号５３のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号５３の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２５】
（ＧＢＳ１５２４）
参照目的で、ＣＯＨ１株中に見出される完全長ＧＢＳ１５２４（ＳＡＮ１５１９）のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号５４として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ１５２４ポリペプチドは、（ａ）配列番号５４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号５４の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ１５２４タンパク質は、配列番号５４の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５４に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号５４のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号５４のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号５４の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２６】
（ＧＢＳ３）
元の「ＧＢＳ３」（ＳＡＧ２６０３；ＢｉｂＡ）配列は、参考文献１４７中に「病原性タンパク質」としてアノテートされている（ＧＩ：２２５３５１０９を参照されたい）。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ３のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号５５として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ３ポリペプチドは、（ａ）配列番号５５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号５５の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ３タンパク質は、配列番号５５の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３５に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号５５のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号５５のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号５５の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２７】
野生型ＧＢＳ３は、配列番号５５のアミノ酸１〜３６にＮ末端リーダーまたはシグナル配列領域を含み、これは、断片中で除去することができる（例えば、配列番号５６３）。ＧＢＳ３はまた、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフ（ＬＰＸＴＧ）、膜貫通領域および細胞質ドメインも含む（参考文献１４９を参照されたい）。リーダーまたはシグナル配列領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、および細胞壁アンカーモチーフを全てＧＢＳ３から除去して、以下に記載のコイルドコイルセグメントおよびプロリンリッチセグメントを含む断片を残すことができる（配列番号５７）。ＧＢＳ３の代替的な断片は、シグナル配列領域およびコイルドコイルセグメント（配列番号５８）；コイルドコイルセグメント（配列番号５９）；またはシグナル配列領域、コイルドコイルセグメント、およびプロリンリッチセグメント（配列番号６０）を含んでもよい。
【０２２８】
ＧＢＳ３の変異体は、５１５株（ＳＡＬ２１１８）、ＣＪＢ１１１株（ＳＡＭ１９７４）およびＣＯＨ１株（ＳＡＮ２２０７）に存在する。５１５株、ＣＪＢ１１１株およびＣＯＨ１株における完全長ＧＢＳ３の参照アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３として本明細書に記載する。よって、本発明で用いるためのＧＢＳ３ポリペプチドは、（ａ）配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号６３に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号６３の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ３タンパク質は、配列番号６１、配列番号６２または配列番号６３の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６１、配列番号６２または配列番号６３に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号６３のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号６３のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号６３の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２２９】
本発明は、上記で詳細に論じられた２６０３株に由来するＧＢＳ３の断片と類似する（例えば、Ｎ末端リーダーもしくはシグナル配列領域を欠失するか；コイルドコイルおよびプロリンリッチセグメントを含むか；シグナル配列領域およびコイルドコイルセグメントを含むか；コイルドコイルセグメントを含むか；またはシグナル配列領域、コイルドコイルセグメント、およびプロリンリッチセグメントを含む）５１５株、ＣＪＢ１１１株およびＣＯＨ１株に由来するＧＢＳ３の断片の使用を含む。
【０２３０】
（ＳＡＮ１４８５）
元の「ＳＡＮ１４８５」配列は、参考文献３中で「細胞壁表面アンカーファミリータンパク質」としてアノテートされている（ＧＩ：７７４０８２３３を参照されたい）。参照目的で、ＣＯＨ１株中に見出される完全長ＳＡＮ１４８５のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号６４として記載する。本発明で用いるための好ましいＳＡＮ１４８５ポリペプチドは、（ａ）配列番号６４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号６４の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳＡＮ１４８５タンパク質は、配列番号６４の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６４に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号６４のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号６４のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号６４の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２３１】
（ＧＢＳ１４７）
元の「ＧＢＳ１４７」（ＳＡＧ０４１６）配列は、参考文献１４７中で「推定プロテアーゼ」としてアノテートされている（ＧＩ：ＧＩ：２２５３３４３５を参照されたい）。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ１４７のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号６５として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ１４７ポリペプチドは、（ａ）配列番号６５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号６５の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ１４７タンパク質は、配列番号６５の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６５に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号６５のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号６５のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号６５の少なくとも１つのエピトープを保持している。
【０２３２】
（ＧＢＳ３２８）
元の「ＧＢＳ３２８」（ＳＡＧ１３３３）配列は、参考文献１４７中で「５’−ヌクレオチダーゼファミリータンパク質」としてアノテートされている（ＧＩ：２２５３４３５９を参照されたい）。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ３２８のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号６６として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ３２８ポリペプチドは、（ａ）配列番号６６に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号６６の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ３２８タンパク質は、配列番号６６の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６６に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号６６のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号６６のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号６６の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２３３】
（ＧＢＳ８４）
元の「ＧＢＳ８４」（ＳＡＧ０９０７）配列は、参考文献１４７中で「推定リポタンパク質」としてアノテートされている（ＧＩ：２２５３３９２９を参照されたい）。参照目的で、２６０３株中に見出される完全長ＧＢＳ８４のアミノ酸配列を、本明細書では配列番号６７として記載する。本発明で用いるための好ましいＧＢＳ８４ポリペプチドは、（ａ）配列番号６７に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号６７の少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＢＳ８４タンパク質は、配列番号６７の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６７に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号６７のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／または配列番号６７のＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失しているが、配列番号６７の少なくとも１つのエピトープを保持している。他の断片は１または複数のタンパク質ドメインが取り除かれている。
【０２３４】
（ＧＢＳ糖との組み合わせ）
ＧＢＳ６７ポリペプチド断片を、典型的には、キャリアタンパク質（複数可）と結合体化する１または複数のＧＢＳ莢膜糖（複数可）と組み合わせることができる。よって、本発明は、
（１）上記で論じられたＧＢＳ６７ポリペプチド断片；および
（２）１または複数のＧＢＳ莢膜糖、
の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。
【０２３５】
この組み合わせの成分（２）で用いられる糖は、理想的には、糖部分およびキャリアタンパク質部分を含む結合体として存在する。結合体中のキャリア部分は、単一のＧＢＳ６７ポリペプチド断片、ハイブリッドＧＢＳ６７ポリペプチド、非ＧＢＳ６７  ＧＢＳポリペプチド、または非ＧＢＳポリペプチドであってよい。
【０２３６】
糖は、ＧＢＳの莢膜糖に由来するものである。糖は、細菌からの糖の精製の間に生じるサイズを有する多糖であってよく、またはそれはそのような多糖の断片化により達成されるオリゴ糖であってもよい。
【０２３７】
組成物は、以下の連鎖球菌血清型：Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩのうちの１または複数に由来する莢膜糖を含んでもよい。組成物は、複数の血清型、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの血清型を含んでもよい。血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶのうちの１または複数に由来する糖を含むのが有用である。これらの５つの血清型の各々の莢膜糖は、（ａ）全ての場合に２→３でガラクトース残基に連結された、末端Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基（一般的には、シアル酸と呼ばれる）；および（ｂ）トリサッカリドコア内のＮ−アセチル−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。
【０２３８】
本発明に従って用いられる糖は、その天然形態にあるか、または改変されたものであってもよい。例えば、糖は、天然の莢膜糖よりも短いものであるか、または化学的に改変されたものであってもよい。例えば、糖は、脱−Ｏ−アセチル化（部分的もしくは完全に）、脱−Ｎ−アセチル化（部分的もしくは完全に）またはＮ−プロピオン酸化（Ｎ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的もしくは完全に）されたものなどであってよい。脱アセチル化は、結合体化の前、結合体化中または結合体化の後に起こってよいが、好ましくは、結合体化の前に起こる。特定の糖に応じて、脱アセチル化は免疫原性に影響することもあり、または影響しないこともある。種々の血清型におけるＧＢＳ糖上でのＯ−アセチル化の妥当性は参考文献１５０で論じられており、いくつかの実施形態においては、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化は、例えば、保護／脱保護、再アセチル化などにより、結合体化の前、結合体化中および結合体化の後に保持される。しかし、典型的には本発明で用いられるＧＢＳ糖は、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化を実質的に有さない。脱アセチル化などの効果を、日常的なアッセイにより評価することができる。別の可能性のある改変は、側鎖末端シアル酸などの、糖からのシアル酸残基の除去である［１５１］。特に、血清型Ｖの莢膜糖を本発明で用いる場合、それを参考文献［１５１］に記載のような脱シアル化により改変できる。脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖ莢膜糖は、参考文献［１５１］に記載のように、弱酸性条件下で（例えば、８０℃の０．１Ｍ硫酸で６０分）精製されたＧＢＳ血清型Ｖ莢膜糖を処理することにより、またはノイラミニダーゼでの処理により調製できる。別の例では、例えば、弱酸中での加水分解、加熱、サイジングクロマトグラフィーなどにより、完全長多糖を脱重合させて、本発明で用いるためのより短い断片を得ることができる。鎖の長さは、ウサギにおけるＧＢＳ糖の免疫原性に影響すると報告されている［１５２］。特に、血清型ＩＩおよび／またはＩＩＩ莢膜糖を本発明で用いる場合、それを参考文献１５３に記載のように脱重合させることができる。この文書は、還元末端２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基を有する抗原性断片への軽度の脱アミノ的切断によるＩＩ型およびＩＩＩ型莢膜糖の部分的脱重合を記載する。
【０２３９】
莢膜糖は、参考文献１５４などの本明細書に記載の参考文献に記載のような公知の技術により精製できる。典型的なプロセスは、塩基抽出、遠心分離、濾過、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびさらなる限外濾過を含む。代替として、参考文献１５５に記載の精製プロセスを用いることができる。このプロセスは、塩基抽出、エタノール／ＣａＣｌ２処理、ＣＴＡＢ沈降、および再可溶化を含む。
【０２４０】
本発明は、天然の供給源から精製された糖に限定されないが、全体的または部分的合成などの他の方法により糖を取得することができる。糖は、典型的にはキャリアタンパク質と結合体化する。一般的には、キャリアへの糖の共有結合性の結合体化は、それが糖をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換し、よって、免疫記憶のための初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）を可能にするため、糖の免疫原性を増進する。
【０２４１】
ＧＢＳ糖の結合体化は、広く報告されている（例えば、参考文献１５６〜１６３を参照されたい）。ＧＢＳ糖結合体化に関する典型的な従来技術プロセスは、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはＣＲＭ１９７などのキャリアタンパク質への精製された糖の還元的アミノ化を含む［１５７］。還元的アミノ化は、キャリア中のアミノ酸の側鎖上のアミン基および糖中のアルデヒド基を含む。ＧＢＳ莢膜糖は、その天然形態中にアルデヒド基を含まないため、これは典型的には、糖のシアル酸残基の一部の酸化（例えば、過ヨウ素酸塩での酸化）による結合体化の前に生成される［１５７、１６４］。この様式で調製された結合体ワクチンは、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶのそれぞれについて、ヒトにおいて安全かつ免疫原性であることが示された［１６５］。
【０２４２】
好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリア毒素もしくは破傷風毒素、またはそのトキソイドまたは変異体などの細菌毒素である。これらは、結合体ワクチン中で一般的に用いられる。結合体中のキャリアタンパク質は、（１）のＧＢＳ５９抗原のうちの１つであってもよいし、またはそうでなくてもよい。それがＧＢＳ５９抗原でない場合、その代わりに異なるＧＢＳ抗原であってもよい。しかし、いくつかの実施形態においては、キャリアはＧＢＳ抗原ではなく、例えば、細菌毒素またはトキソイドであってよい。
【０２４３】
典型的なキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドもしくは破傷風トキソイドまたはその変異体である。毒素またはトキソイドの断片、例えば、破傷風トキソイドの断片Ｃを用いることもできる［１６６］。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体［１６７〜１６９］は、本発明で特に有用である。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体［１７０］、合成ペプチド［１７１、１７２］、熱ショックタンパク質［１７３、１７４］、百日咳タンパク質［１７５、１７６］、サイトカイン［１７７］、リンホカイン［１８７］、ホルモン［１８７］、成長因子、種々の病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１７８］（Ｎ１９［１７９］など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来Ｄタンパク質［１８０〜１８２］、鉄取込みタンパク質［１８３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来毒素ＡまたはＢ［１８４］、組換えＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）［１８５］などが挙げられる。
【０２４４】
組成物が１より多い結合体を含む場合、各結合体は同じキャリアタンパク質または異なるキャリアタンパク質を用いてもよい。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、単一の結合体は複数の血清型に由来する糖を担持してもよい［１８６］。しかし、通常、各結合体は単一の血清型に由来する糖を含む。
【０２４６】
結合体は、過剰のキャリア（ｗ／ｗ）または過剰の糖（ｗ／ｗ）を有してよい。いくつかの実施形態において、結合体は、それぞれを等しい重量で含んでよい。例えば、１：５〜５：１の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、特に、１：５〜２：１の比を有する結合体を用いることができる。
【０２４７】
キャリア分子は、キャリアに、直接またはリンカーを介して共有結合的に結合体化してよい。タンパク質への直接の連結は、例えば、参考文献１８７および１８８に記載されるように、例えば、糖とキャリアとの間の還元的アミノ化により達成してよい。糖は、まず、例えば、酸化により活性化する必要があることがある。リンカー基を介する連結は、任意の公知の手順、例えば、参考文献１８９および１９０に記載される手順を用いて作製してよい。好ましい型の連結は、遊離の−ＮＨ２基（例えば、アミノ化によりグルカンに導入される）とアジピン酸とのカップリング（例えば、ジイミド活性化を用いる）と、次いで得られた糖−アジピン酸中間体へのタンパク質のカップリングにより形成し得る、アジピン酸リンカーである［１９１、１９２］。別の好ましい型の連結は、糖ＣＤＩの遊離のヒドロキシル基の反応［１９３、１９４］と、その後のタンパク質との反応によりカルバメート連結を形成することにより形成され得るカルボニルリンカーである。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［１９５］、ニトロフェニル−エチルアミン［１９６］、ハロアシルハロゲン化物［１９７］、グリコシド連結（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）［１９８］、６−アミノカプロン酸［１９９］、ＡＤＨ［２００］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［２０１］などが挙げられる。カルボジイミド縮合を用いることもできる［２０２］。
【０２４８】
（非ＧＢＳ抗原との組み合わせ）
ＧＢＳ６７断片を非ＧＢＳ抗原と組み合わせて用いることができる。よって、本発明は、
（１）上記で論じられたＧＢＳ６７ポリペプチド断片；ならびに
（２）ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；１または複数の百日咳抗原；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；不活化ポリオウイルス抗原；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ由来莢膜糖抗原の結合体；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｙ由来莢膜糖抗原の結合体；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｗ１３５由来莢膜糖抗原の結合体；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ由来莢膜糖抗原の結合体；１または複数のインフルエンザ抗原；および１または複数のヒトパピローマウイルス抗原からなる群より選択される１または複数の抗原
の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。
【０２４９】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅに由来するジフテリア毒素を処理（例えば、ホルムアルデヒドを用いる）することにより、ジフテリアトキソイドを取得できる。ジフテリアトキソイドは、例えば、参考文献２０３の第１３章により詳細に開示される。
【０２５０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉに由来する破傷風毒素を処理（例えば、ホルムアルデヒドを用いる）することにより、破傷風トキソイドを取得できる。破傷風トキソイドは、参考文献２０３の第２７章により詳細に開示される。
【０２５１】
ワクチンにおける百日咳抗原は、細胞性（全細胞、Ｐｗ）または無細胞性（Ｐａ）のいずれかである。本発明は、どちらの種類の百日咳抗原も用いることができる。細胞性百日咳抗原の調製は文書で十分に立証されており（例えば、参考文献２０３の第２１章を参照されたい）、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフェーズＩ培養物の熱不活化により取得することができる。無細胞性百日咳抗原（複数可）は、天然の細菌から精製されたか、または組換え宿主中での発現後に精製された、特定の精製されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原を含む。１より多い無細胞性抗原を用いるのが通常であり、したがって組成物は、１、２または３の以下の周知かつよく特徴付けられたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原を含んでもよい：（１）解毒された百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「ＰＴ」）；（２）線維状赤血球凝集素（「ＦＨＡ」）：（３）ペルタクチン（「６９ｋＤａ外膜タンパク質」としても公知）。ＦＨＡおよびペルタクチンは、ホルムアルデヒドで処理した後、本発明に従って用いることができる。ＰＴをホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドでの処理により解毒することができるが、この化学的解毒手順の代替として、それは酵素活性を変異誘発により低下させたＰＴ変異体であってもよい［２０４］。用いることができるさらなる無細胞性百日咳抗原としては、線毛（例えば、凝集原２および３）が挙げられる。
【０２５２】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、Ｂ型肝炎ウイルスのキャプシドの主要成分である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母中での組換え発現により、それを都合良く生成できる。
【０２５３】
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）抗原は、細胞培養物上で増殖させた後、不活化された（例えば、ホルムアルデヒドを用いる）ウイルスから調製される。ポリオは、参考文献２０３の第２４章で説明されるように、３つの型のポリオウイルスのうちの１つにより引き起こされ得るため、組成物は３つのポリオウイルス抗原：１型ポリオウイルス（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、２型ポリオウイルス（例えば、ＭＥＦ−１株）、および３型ポリオウイルス（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）を含んでもよい。
【０２５４】
組成物が成分（２）中のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたは無細胞性百日咳抗原のうちの１つを含む場合、それは通常はそれらの３つ全部を含む、すなわち、成分（２）はＤ−Ｔ−Ｐａの組み合わせを含む。
【０２５５】
組成物が成分（２）中のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたは細胞性百日咳抗原のうちの１つを含む場合、それは通常はそれらの３つ全部を含む、すなわち、成分（２）はＤ−Ｔ−Ｐｗの組み合わせを含む。
【０２５６】
ヒトパピローマウイルス抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造を形成するように集合することができるＬ１キャプシドタンパク質を含む。ＶＬＰは酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａなどのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞、もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞）中でのＬ１の組換え発現により生成することができる。酵母細胞については、プラスミドベクターがＬ１遺伝子（複数可）を担持できる；昆虫細胞については、バキュロウイルスベクターがＬ１遺伝子（複数可）を担持できる。より好ましくは、組成物はＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１  ＶＬＰを含む。この二価組み合わせは、高度に有効であることが示されている［２０５］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株に由来するＬ１  ＶＬＰを含有させて、四価組み合わせを得ることも可能である。
【０２５７】
インフルエンザ抗原は、現在のインフルエンザウイルスワクチンの形態にあってもよい。種々の形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能である（例えば、参考文献［２０３］の第１７および１８章を参照されたい）。一般的には、ワクチンは生ウイルス、不活化ウイルス、組換え血球凝集素またはビロソームに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製表面抗原に基づいてもよい。本発明のワクチン中の抗原は、生ウイルスまたは、より好ましくは、不活化ウイルスの形態をとってもよい。ワクチンは、例えば、三価ワクチン（例えば、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株に由来する血球凝集素を含む）であってもよい。他の実施形態においては、ワクチンは一価ワクチン（例えば、Ａ／Ｈ１Ｎ１株またはＡ／Ｈ５Ｎ１株に由来する血球凝集素を含む）である。ワクチンはアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）（例えば、水中油型エマルジョンを用いる）されているか、またはアジュバント添加されていなくてもよい。
【０２５８】
ヒトパピローマウイルス抗原は、組換えＨＰＶ外被タンパク質、典型的には、ＨＰＶ１６型および１８型、ならびにまた必要に応じて、ＨＰＶ６型および１１型から構築された中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態にある。
【０２５９】
（抗体）
ＧＢＳ抗原に対する抗体は、受動免疫のために用いることができる［２０６］。よって、本発明は、同時投与、別個の投与または逐次的な投与のための抗体の組み合わせを提供し、ここで、この組み合わせが、（ａ）上記で定義された第１のアミノ酸配列を認識する抗体；（ｂ）上記で定義された第２のアミノ酸配列を認識する抗体；および／または（ｃ）上記で定義された第３のアミノ酸配列を認識する抗体；のうちの少なくとも２つを含む。
【０２６０】
本発明は、治療におけるこのような抗体の組み合わせの使用も提供する。本発明は、医薬品の製造におけるこのような抗体の組み合わせの使用も提供する。本発明は、有効量のこのような組み合わせを哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物を処置するための方法も提供する。免疫原性組成物について上で述べたように、これらの方法および使用は、ＧＢＳ感染に対して哺乳動物を防御することを可能にする。
【０２６１】
「抗体」との用語は、インタクトな免疫グロブリン分子、および抗原と結合できるその断片を含む。これらは、ハイブリッド（キメラ）抗体分子［２０７、２０８］；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片ならびにＦｖ分子；非共有結合ヘテロダイマー［２０９、２１０］；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［２１１］；ダイマーおよびトリマー抗体断片構築物；ミニボディ［２１２、２１３］；ヒト化抗体分子［２１４〜２１６］；ならびにこのような分子から得られる任意の機能的断片、ならびにファージディスプレイのような慣用的ではないプロセスにより得られる抗体を含む。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当該技術分野において周知である。ヒト化または完全ヒト抗体が好ましい。
【０２６２】
（全般）
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術分野の範囲内である化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば参考文献２１７〜２２４などを参照されたい。
【０２６３】
「ＧＩ」番号付けを上記で用いている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」は、そのデータベースに配列が加えられた場合に、ＮＣＢＩにより処理されるそれぞれの記録された配列に連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、記録された配列のアクセッション番号に対して類似性はない。配列がアップデートされたとき（例えば修正のため、またはさらなるアノテーションもしくは情報を加えるため）に、新しいＧＩ番号が与えられる。よって、与えられたＧＩ番号に付随する配列は、決して変更されない。
【０２６４】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであってよい。このようなエピトープは、経験的に同定できる（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［２２５、２２６］または類似の方法を用いて）か、またはこれは予想できる（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）［２２７］、マトリックスに基づくアプローチ［２２８］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［２２９］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２３０、２３１］、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）［２３２］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２３３、２３４］、ＡＤＥＰＴ［２３５］、Ｔｓｉｔｅｓ［２３６］、親水性［２３７］、抗原インデックス［２３８］または参考文献２３９〜２４３に開示される方法などを用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位により認識され、それと結合する抗原の部分であり、これらは、「抗原決定基」と呼ぶこともできる。
【０２６５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または何か追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【０２６６】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除しない、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないものであってよい。必要に応じて、用語「実質的に」を本発明の定義から取り除いてもよい。
【０２６７】
数値ｘに関する「約」との用語は、任意選択であり、例えばｘ±１０％を意味する。
【０２６８】
具体的に記述しない限り、２以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、任意の特定の順序の混合を必要としない。よって、成分を任意の順序で混合してもよい。３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いに混合した後、その組み合わせを第３の成分などと組み合わせてもよい。
【０２６９】
抗体は、一般的には、その標的に対して特異的となる。よって、それらは、ウシ血清アルブミンなどの無関係の対照タンパク質に対するより、標的に対する高い親和性を有する。
【０２７０】
２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、アラインメントさせたときに、アミノ酸のそのパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献２４４の７．７．１８節に記載されるものを用いて決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップ開始ペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスでのアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献２４５に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１−１】図１は、２６０３（ＳＡＧ１４０８）とＨ３７Ｂ（ＳＡＩ１５１２）に由来するＧＢＳ６７のアラインメントであり、断片１（Ｆｒ１）、断片２（Ｆｒ２）および断片３（Ｆｒ３）の位置を示す。
【図１−２】図１は、２６０３（ＳＡＧ１４０８）とＨ３７Ｂ（ＳＡＩ１５１２）に由来するＧＢＳ６７のアラインメントであり、断片１（Ｆｒ１）、断片２（Ｆｒ２）および断片３（Ｆｒ３）の位置を示す。
【図２】図２は、２６０３（図２Ａ）およびＨ３６Ｂ（図２Ｂ）に由来する断片１（Ｆｒ１）、断片２（Ｆｒ２）および断片３（Ｆｒ３）の精製を示す。
【図３Ａ】図３は、ＧＢＳ６７  ２６０３（図３Ａ）およびＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ（図３Ｂ）に対して生じたポリクローナル抗体が、ウェスタンブロット分析において、断片２（Ｆｒ２）または断片１（Ｆｒ１）ではなく、両変異体に由来する断片３（Ｆｒ３）を認識することを示す。
【図３Ｂ】図３は、ＧＢＳ６７  ２６０３（図３Ａ）およびＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ（図３Ｂ）に対して生じたポリクローナル抗体が、ウェスタンブロット分析において、断片２（Ｆｒ２）または断片１（Ｆｒ１）ではなく、両変異体に由来する断片３（Ｆｒ３）を認識することを示す。
【図４】図４は、２６０３に由来する断片１に対する抗体のみが、ウェスタンブロット分析において２６０３変異体に由来する組換え断片１（１  ２６０３）および２６０３変異体に由来する完全長ＧＢＳ６７（ＦＬ  ２６０３）を認識することを示す。Ｈ３６Ｂに由来する完全長ＧＢＳ６７（ＦＬ  Ｈ３６Ｂ）、Ｈ３６Ｂに由来する断片１、断片２および断片３、ならびに２６０３に由来する断片２および断片３は認識されない。
【図５Ａ】図５Ａは、２６０３に由来する断片２に対する抗体が、ウェスタンブロット分析において、２６０３変異体に由来する組換え断片２（２  ２６０３）およびＨ３６Ｂ変異体に由来する断片２（２  ２６０３）、ならびに２６０３変異体に由来する完全長ＧＢＳ６７（ＦＬ  ２６０３）を認識することを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２６０３に由来する断片３に対する抗体が、ウェスタンブロット分析において、２６０３変異体に由来する組換え断片３（３  ２６０３）およびＨ３６Ｂ変異体に由来する断片３（３  ２６０３）、ならびに２６０３変異体に由来する完全長ＧＢＳ６７（ＦＬ  ２６０３）およびＨ３６Ｂに由来する完全長ＧＢＳ６７（ＦＬ  Ｈ３６Ｂ）を認識することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０２７２】
（ＧＢＳ６７変異体は交差防御性である）
１つはＧＢＳ株２６０３において、そして１つはＧＢＳ株Ｈ３６Ｂにおいて、ＧＢＳ６７の２つの対立遺伝子変異体（ＡＰ１−２ａ）が同定されている。ＧＢＳ株２６０３で同定されたＧＢＳ６７株が優勢であり、ＧＢＳ株の８７％に存在する変異体である。
【０２７３】
これらの２つのＧＢＳ６７変異体のいずれも、他のＧＢＳ６７変異体を発現するＧＢＳ株に対する交差防御を付与することができる。例えば、以下の表１に示されるように、２６０３株に由来するＧＢＳ６７（ＡＰ１−２ａ）で免疫化したメスのマウスの仔は、ＧＢＳ６７の２６０３変異体またはＨ３６Ｂ変異体のいずれかを発現するＧＢＳ株での抗原投与に対して保護される。
【０２７４】
【表１】
2013520487.tif 000002
【０２７５】
交差防御の原因となるＧＢＳ６７変異体の部分を同定するために調査を行った。
【０２７６】
（ＧＢＳ６７の３つの断片の同定）
ＡＰ１−２ａ（ＧＢＳ６７）の結晶構造は利用可能ではない。２６０３およびＨ３６Ｂに由来するＧＢＳ６７変異体の二次構造のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、ＧＢＳ６７の交差防御活性の原因となり得る３つの推定保存断片が同定された（表２を参照されたい）。
【０２７７】
【表２】
2013520487.tif 000003
【０２７８】
３つの断片の位置を示すＧＢＳ６７変異体のアラインメントを図１に示す。
【０２７９】
これらの６つの断片をクローニングし、ＨＫ１００株およびＢＬ２１（ＤＥ３）株中でＨｉｓタグ付タンパク質として発現させた。全部の断片が過剰発現され、可溶性であった。得られた断片の収量を以下の表３に示し、図２はゲル上で単離された精製断片を示す。
【０２８０】
【表３】
2013520487.tif 000004
【０２８１】
（ＧＢＳ６７断片の交差防御活性の評価）
２６０３  ＧＢＳ６７変異体およびＨ３６Ｂ  ＧＢＳ６７変異体に対して生じたポリクローナル抗体は、ウェスタンブロット分析において両変異体に由来する断片３を認識することができたが（図３）、これは断片３が交差防御を誘導する原因となるエピトープを含むことを示唆する。
【０２８２】
その後のウェスタンブロット分析において、２６０３  ＧＢＳ６７変異体の断片１に対して生じた抗体のみが、２６０３  ＧＢＳ６７に由来する組換え断片１および２６０３に由来する完全長ＧＢＳ６７を認識した（図４）。これらの抗体は、Ｈ３６Ｂ  ＧＢＳ６７変異体に由来する断片１もＨ３６Ｂに由来する完全長ＧＢＳ６７も認識しなかった。対照的に、２６０３  ＧＢＳ６７に由来する断片２に対して生じた抗体は、Ｈ３６Ｂ  ＧＢＳ６７および完全長Ｈ３６Ｂ  ＧＢＳ６７に由来する断片２を認識し（図５Ａ）、２６０３  ＧＢＳ６７に由来する断片３に対して生じた抗体は、Ｈ３６Ｂ  ＧＢＳ６７に由来する断片３および完全長Ｈ３６  ＧＢＳ６７を認識した（図５Ｂ）。
【０２８３】
ＦＡＣＳ分析は、ＧＢＳ６７の断片２と断片３との両方がＧＢＳ細菌の表面上に高度に曝露されることを示している（以下の表４を参照されたい）。
【０２８４】
【表４】
2013520487.tif 000005
【０２８５】
次いで、断片１、断片２および断片３が交差防御を誘導する能力を母体免疫化モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。メスのマウスをＧＢＳ６７  ２６０３に由来する断片１、断片２もしくは断片３、２６０３もしくはＨ３６Ｂに由来する完全長ＧＢＳ６７、またはＰＢＳで免疫化した。次いで、仔にＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ変異体を発現する５４０１  ＧＢＳ株を抗原投与した。その結果を以下の表５に示す。
【０２８６】
【表５】
2013520487.tif 000006
【０２８７】
これらの結果は、ＧＢＳ６７  ２６０３変異体の断片３が、ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ変異体を発現する５４０１  ＧＢＳ株に対して、完全長ＧＢＳ６７  ２６０３または完全長ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂと同じ交差防御を付与することができることを示している。
【０２８８】
ＧＢＳ６７  ２６０３の断片１、断片２および断片３がＧＢＳ６７  ２６０３変異体を発現する５１５  ＧＢＳ株による抗原投与に対して防御を誘導する能力を、仔を５４０１  ＧＢＳ株の代わりに５１５  ＧＢＳ株で抗原投与する点以外は上記の実験を反復することにより確認した。その結果を以下の表６に示す。
【０２８９】
【表６】
2013520487.tif 000007
【０２９０】
さらなる実験において、メスのマウスを、ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂに由来する断片１、断片２もしくは断片３、Ｈ３６Ｂに由来する完全長ＧＢＳ６７、またはＰＢＳで免疫化した。仔を、ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ変異体を発現する５４０１  ＧＢＳ株で抗原投与した。その結果を以下の表７に示す。
【０２９１】
【表７】
2013520487.tif 000008
【０２９２】
したがって、ＧＢＳ６７  ２６０３の断片２および断片３ならびにこれらの断片内のエピトープを、完全長ＧＢＳ６７  ２６０３または完全長ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂの代わりに免疫原性組成物中で用いることができる。同様に、ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂの断片２および断片３ならびにこれらの断片内のエピトープを、完全長ＧＢＳ６７  ２６０３または完全長ＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂの代わりに免疫原性組成物中で用いることができる。
【０２９３】
（材料および方法）
（バイオインフォマティクス）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ株２６０３  Ｖ／Ｒ（Ｖ）およびＨ３６Ｂ（Ｉｂ）の完全なゲノム配列は、受託番号ＡＥ００９９４８およびＡＡＪＳ００００００００の下で入手可能である。ペアワイズ配列アラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより得られたものである。
【０２９４】
推定構造を同定するために、本発明者らはＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴデータベースに接続されたＰｆａｍプログラムを用いた。二次構造の予測を、ＰｓｉＰｒｅｄ（タンパク質構造予測サーバー；ＵＣＬ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｇｒｏｕｐ）ソフトウェアを用いて実施した。
【０２９５】
（細菌株および増殖条件）
本研究で用いたＧＢＳ株は、２６０３  Ｖ／Ｒ（血清型Ｖ）、５１５（Ｉａ）、Ｈ３６Ｂ（血清型Ｉｂ）および５４０１（ＩＩ）であった。細菌をＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＨＢ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または５％ヒツジ血液を補給したトリプチケースソイ寒天培地中、３７℃で増殖させた。
【０２９６】
（組換えタンパク質および抗血清のクローニング、発現、精製）
ＧＢＳ６７  ２６０３対立遺伝子変異体およびＧＢＳ６７  Ｈ３６Ｂ対立遺伝子変異体の単一の断片（断片１、断片２および断片３）をコードする配列をクローニングするためのＤＮＡの供給源として、ＧＢＳ株２６０３およびＧＢＳ株Ｈ３６Ｂを用いた。製造業者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いるグラム陽性細菌のための標準的なプロトコールにより、ゲノムＤＮＡを単離した。各ドメインに対応する遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＫ１００株（２４６）においてＰＩＰＥクローニング法によりＳｐｅｅｄＥＴベクターまたはｐＥＴ１５−ＴＥＶベクター（Ｎ末端６×ＨＩＳタグ）中にクローニングした。用いたオリゴを表６に列挙する。ｐＥＴ１５−ＴＥＶ中の得られた構築物を、配列決定のために確認した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換した。組換えタンパク質発現のために、ｐＥＴクローンについては１ｍＭ  ＩＰＴＧで、またはＳｐｅｅｄＥＴクローンについては０．２％アラビノースで誘導した後、培養物を２５℃で５ｈ維持した。全ての組換えタンパク質をアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。簡単に述べると、細胞を遠心分離により収穫し、ＰＢＳ中の１０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅおよびＣＯＭＰＬＥＴＥインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する「溶解緩衝液」中に溶解した。溶解物を遠心分離により清澄化し、１０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ中で予め平衡化させたＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（Ａｒｍｅｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えた。２０ｍＭおよび５０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いる２回の洗浄ステップの後、２５０ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液を用いてタンパク質溶出を行った。純粋な画分のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて見積もった。
【０２９７】
各タンパク質に特異的な抗血清を、以前に記載のように［２４７］精製組換えタンパク質でＣＤ１マウスを免疫化することにより生成させた。プールされた血清中のタンパク質特異的免疫応答（総Ｉｇ）をＥＬＩＳＡによりモニターした。
【０２９８】
２６０３対立遺伝子変異体およびＨ３６Ｂ対立遺伝子変異体に対応する完全長組換えＧＢＳ６７タンパク質（それぞれ、ＴＩＧＲアノテーションＳＡＧ＿１４０８およびＳＡＩ＿１５１２）を、以前に報告されたように［２、２４７］生成させた。
【０２９９】
（イムノブロッティング）
１０ｎｇの各精製タンパク質を、４〜１２％のＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分離し、ｉＢｌｏｔ（商標）Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１０％スキムミルクを含有する１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および１．８ｍｍ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．３）中、室温で１ｈブロッキングした後、膜を、１：５００に希釈した一次抗体と共に室温（ＲＴ）で１ｈインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で３回洗浄した後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（Ｄａｋｏ）と共に１ｈインキュベートした。陽性のバンドをＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて可視化した。
【０３００】
（ＥＬＩＳＡ）
ウェルあたり１００ｎｇの精製組換え抗原を用いることにより、抗原特異的抗体応答をＥＬＩＳＡによって検出した。基準線計算プログラムを用いることによって、試験血清試料の応答曲線と、参照血清試料の応答曲線とを比較することにより、ＩｇＧ抗体力価を算出した。参照血清試料は、精製組換え抗原で免疫化したマウスから得られた血清試料のプールであり、１５０，０００ＥＵ／ｍＬの任意力価を割り当てた。
【０３０１】
（ＦＡＣＳ）
精製組換えタンパク質に対して生じたマウス血清を、フローサイトメトリーにより全細菌に対して分析して、単一のドメインの表面曝露を評価した。対数期の細菌細胞を、０．０８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒドの存在下で固定し、３７℃で１ｈインキュベートした。次いで、固定された細菌をＰＢＳで１回洗浄し、Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、２５℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を、希釈緩衝液（ＰＢＳ、２０％Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、０．１％ＢＳＡ）中で１：２００に希釈された免疫前血清または免疫血清中、４℃で１ｈインキュベートした。細胞をＰＢＳ−０１％ＢＳＡ中で洗浄し、Ｒ−フィコエリスリン結合体化Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｉｎｃ．）の１：１００希釈液と共に４℃でさらに１ｈインキュベートした。洗浄後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いるＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて分析した。免疫血清と免疫前血清で染色された細胞間の蛍光の差異としてデータを表す。
【０３０２】
（マウス能動母体免疫化モデル）
ＧＢＳ感染の母体免疫化／新生仔抗原投与モデルを用いて、以前に記載されたように［２４７］、マウスにおける生成されたタンパク質の防御効力を検証した。簡単に述べると、ＣＤ−１メスマウス（６〜８週齢）を１日目（ＣＦＡにおいて）、２１および３５日目（ＩＦＡ）に、ＰＢＳまたは２０ｍｇの組換えタンパク質のいずれかで免疫化した後、最後の免疫化の３日後に繁殖させた。誕生の４８ｈ以内に、９０％の死亡率を引き起こすと算出された用量の種々のＧＢＳ株を仔に腹腔内注射した。仔の生存を抗原投与後２日間モニターした。Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定を用いて統計分析を行った。全ての動物試験を、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ  ｄｉ  Ｓａｎｉｔａ（Ｉｔａｌｙ）の指針に従って実施した。
【０３０３】
【表８】
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【０３０４】
【化１】
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【０３０５】
【化２】
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【０３０６】
【化３】
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【０３０７】
【化４】
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【０３０８】
【化５】
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【０３０９】
【化６】
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【０３１０】
【化７】
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【０３１１】
【化８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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