(57)【要約】  本開示は、ＰＫＣアイソフォーム制御因子を使用して炎症性疾患および障害を治療するための方法、組成物およびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において炎症性疾患または障害を治療する方法であって、前記被験体にＰＫＣの阻害因子を投与する工程を含み、それにより前記被験体における前記炎症性疾患または障害を治療する方法。
【請求項２】
前記阻害因子は、ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、Ｎ−末端修飾、Ｃ−末端修飾またはそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化またはＮ−パルミトイル化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、非経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、皮下または静脈内投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、局所、経口、粘膜、直腸、肺、鼻腔、または耳投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、約０．１〜約１０，０００μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、約０．１〜約１，０００μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、約１．０〜約５０μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、毎日、毎週、隔週または毎月投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性疾患または障害は、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病、喘息、炎症性肺障害、炎症性肝障害、炎症性糸球体障害、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、シェーグレン（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ）症候群、角結膜炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、潰瘍性大腸炎、関節、皮膚、もしくは筋肉の炎症性疾患、急性もしくは慢性特発性炎症性関節炎、筋炎、脱髄疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、間質性腎炎および慢性活動性肝炎からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
被験体における炎症性疾患または障害を治療するためのキットであって：
ａ）ＰＫＣの阻害因子、および
ｂ）前記被験体に前記ＰＫＣ阻害因子を投与するための取扱説明書を含むキット。
【請求項１５】
前記阻害因子は、ポリペプチドである、請求項１８に記載のキット。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、Ｎ−末端修飾、Ｃ−末端修飾またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化またはＮ−パルミトイル化されている、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記ポリペプチドは、非経口、皮下、静脈内、局所、経口、粘膜、直腸、肺、鼻腔、または耳投与される、請求項１５に記載のキット。
【請求項２０】
前記取扱説明書は、前記ポリペプチドが約０．１〜約１０，０００μｇ／ｋｇの用量で投与されることを規定する、請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記取扱説明書は、前記ポリペプチドが毎日、毎週、隔週または毎月投与されることを規定する、請求項１５に記載のキット。
【請求項２２】
炎症性疾患または障害を治療するための医薬品の製造におけるＰＫＣ阻害因子の使用。
【請求項２３】
前記阻害因子は、ポリペプチドである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ポリペプチドは、Ｎ−末端修飾、Ｃ−末端修飾、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記ポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化またはＮ−パルミトイル化されている、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
前記ポリペプチドは、非経口投与される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
前記ポリペプチドは、皮下または静脈内投与される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは、局所、経口、粘膜、直腸、肺、鼻腔、または耳投与される、請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
前記ポリペプチドは、約０．１〜約１０，０００μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２３に記載の使用。
【請求項３１】
前記ポリペプチドは、約０．１〜約１，０００μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２３に記載の使用。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、約１．０〜約５０μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２３に記載の使用。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、毎日、毎週、隔週または毎月投与される、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に疾患を治療する方法、より詳細には炎症性疾患および障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症の開始は炎症反応とともに始まり、好中球、顆粒球、単球、マクロファージ、ならびにその他の免疫調節細胞の活性化をもたらす。これは、炎症性サイトカインおよびメディエーター、例えばインターロイキン類、ＴＮＦα、およびプロスタグランジン類を包含する局所性または全身性炎症カスケードを生じさせる可能性がある。この複雑な炎症媒介性カスケードは、あらゆる種類の反応、例えば細胞走化性および内皮損傷を誘発し、先天性および適応免疫系からの追加の細胞の動員をもたらす。
【０００３】
皮膚は、身体内部と環境との重要な境界として機能し、潜在的に有害な病原菌との接触を妨害する。抗原／病原菌が侵入した症例では、炎症反応が抗原を排除するために誘導されることが多い。この反応は、主としてＴ細胞、多核白血球、およびマクロファージからなる皮膚浸潤をもたらす。
【０００４】
炎症反応は、必ずしも外部からの刺激と関連していない場合、または非有害性環境物質によって引き起こされる場合（アレルギーの場合）がある。どちらの場合も、前炎症性サイトカインの過剰発現は、適正に制御されないと、一般に局所性および全身性炎症の特徴である炎症、ならびに様々な炎症性疾患および障害を引き起こす。炎症には、様々な障害、例えば湿疹および皮膚炎が結び付いており、例えばアトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、異汗性湿疹、貨幣状湿疹、うっ血性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、乾癬、掻痒症、多発性硬化症、皮膚炎症、瘢痕性類天疱瘡、強皮症、化膿性汗腺炎、中毒性表皮剥離症、座瘡、骨炎、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、壊疽性膿皮症、およびベーチェット症候群（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が包含される。
【０００５】
当然のことながら、前炎症性サイトカインの過剰産生は、多数の炎症性および自己免疫疾患に関係すると見なされてきた。例えば、サイトカイン類、例えばＴｈ１７細胞の生存および増殖を刺激するＴＮＦαおよびインターロイキン（ＩＬ）−２３の分泌は乾癬と高度に関連しているが、一方、ＩＬ−６がその前炎症性サイトカインとしての一般的役割に加えてＴｈ１７発生のために必要とされる。ＩＬ−１２およびＩＰ−１０のような他のサイトカイン類は開始因子であり、乾癬およびその他の自己免疫疾患に典型的であるＴｈ１経路に関与している。好酸球の産生を増加させるサイトカインであるインターロイキン５（ＩＬ−５）は、喘息において過剰発現し、結果としてアレルギー性炎症の特徴である、喘息性気管支粘膜における好酸球の蓄積を生じさせる。インターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、炎症性腸疾患および喘息において見いだされる平滑筋の高収縮性の公知のメディエーターである。さらに、以下で詳細に考察するように、炎症性サイトカインは、例えば、乾癬、多発性硬化症、関節炎、虚血、敗血性ショック、および臓器移植拒否反応に関係することが証明されている。
【０００６】
同様に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、顆粒球およびマクロファージ系統集団の成熟の制御因子であり、多数の炎症性および自己免疫疾患における重要な因子であると関係付けられてきた。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ分泌を阻害する抗体は、自己免疫疾患を改善することが証明されている。
【０００７】
そこで、前炎症性サイトカインの分泌を減少させる、および／または免疫制御因子を調節する治療薬の開発は、一般に局所性および全身性炎症、ならびに本明細書で考察する炎症性および／または自己免疫疾患の宿主を改善することに有益となる。複数の一連の証拠は、ＰＫＣアイソフォームの修飾因子がこれらの結果を達成する際に有用であることを指摘している。
【０００８】
数件のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１７細胞の関与ならびに皮膚関連細胞、例えばケラチン生成細胞、樹状細胞およびＴヘルパー細胞によるサイトカイン類、例えばインターロイキン類およびＴＮＦαの分泌が乾癬および他の自己免疫炎症性疾患の病原に関与する炎症反応の発生における重要な要素であることを証明している。本明細書で使用するｉｎ  ｖｉｖｏ（「生体内」を意味するラテン語）は生きている生体全体を用いる実験であり、部分的もしくは死んでいる生体、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（「ガラス内」、例えば、試験管もしくはペトリ皿内）制御環境とは対照的である。Ｔｈ１７細胞の生存および増殖を刺激するサイトカイン類、例えばＴＮＦαおよびインターロイキン（ＩＬ）−２３の分泌もまた、これらの疾患にとって重要な主要サイトカイン制御因子として役立つ（非特許文献１）。真皮内のＴｈ１７細胞は、順にＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２２の分泌を誘導する。ＩＬ−２２は、特に、ケラチン生成細胞の過剰増殖を引き出し、乾癬における炎症反応を増強する（非特許文献１）。
【０００９】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーは、リン酸のＡＴＰからタンパク質のセリンおよびトレオニン残基への共有転移を触媒する１群のリン脂質依存性酵素を表している。このファミリーは、現在、カルシウムイオンおよびその他の因子によるそれらの活性化に基づいて３つの別個のカテゴリーに属する少なくとも１２の個別アイソフォームから構成されると考えられている。ＰＫＣファミリーは、通常、従来型、新型および非典型ＰＫＣの３つのサブグループ（図１）に分けられる少なくとも１０のメンバーからなる。特異的補因子要求、組織分布、および細胞区分化は、各アイソフォームに対する機能差および特異的シグナル伝達カスケードの調整を示唆している。そこで、特異的刺激は、それらの因子によって調節されるアイソフォーム特異的ＰＫＣシグナル伝達による特異的反応：例えば特定の生物学的状況における発現、局在化、および／またはリン酸化状態をもたらし得る。ＰＫＣアイソフォームは、様々な細胞外シグナルによって活性化され、そして順に、受容体、酵素、細胞骨格タンパク質、および転写因子を包含する細胞タンパク質の活性を修飾する。したがって、ＰＫＣファミリーは、細胞増殖、分化、生存および死の調節を包含する細胞シグナルプロセシングにおいて中心的役割を果たす。
【００１０】
皮膚内で高度に豊富であるＰＫＣαは、表皮内で主要な従来型のＣａ２＋反応性ＰＫＣアイソフォームであり、それは、最初はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるケラチン生成細胞中で検出された唯一のｃＰＫＣであった（非特許文献２、非特許文献３）。このため、ＰＫＣαは、Ｃａ２＋誘導性分化における重要な因子であると提案されていた（非特許文献４、非特許文献２）。表皮内に、および主として基底層直上に限定すると（非特許文献５）、ＰＫＣαは細胞周期離脱に関与しており、主としてケラチン細胞骨格および接着斑細胞−細胞接着と関連付けられている（非特許文献６、非特許文献７）。従来型ＰＫＣ活性化因子であるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）に曝露させると有棘マーカーが抑制されたので、ＰＫＣαは、ＴＰＡ活性化の結果として有棘状から顆粒状分化への変化にとって大きな役割を果たすと考えられた（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。実際に、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＰＫＣα活性またはその合成のブロッキングは、顆粒マーカーを無効にし、Ｋ１およびＫ１０のような有棘状マーカーを蘇生させると思われた。同様に、優性ネガティブＰＫＣαの実施は、（後期）有棘状マーカーであるインボルクリンを再生すると思われた（非特許文献１２）。したがって、皮膚癌における不完全な分化（非特許文献１３、非特許文献１４）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腫瘍細胞においても観察される上昇したＰＫＣα活性と相関する（非特許文献２、非特許文献１５）。しかし、正常ヒトケラチン生成細胞中のＰＫＣαの過剰発現は、それらの分化パターンを変化させるとは思われなかった（非特許文献１２）。遊走中のβ１−インテグリンの細胞内輸送および膜動員にＰＫＣαが及ぼす影響（非特許文献１６）は、創傷再上皮化および腫瘍細胞浸潤の両方を明確に促進することができる。
【００１１】
トランスジェニックマウスにおけるＰＫＣαの過剰発現は、著しい炎症反応、増加した表皮肥厚および好中球浸潤と相関する浮腫、多発性微小膿瘍、ならびに炎症性サイトカイン類およびケモカイン類、例えばＴＮＦα、ＭＩＰ−２、ＣＯＸ−２もしくはマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）の顕著な増加を誘導すると思われてきた。これらの結果は、表皮炎症反応にＰＫＣαを関係付けている（非特許文献１７）。ＴＰＡ（ＰＫＣα活性因子）を用いた治療は、明らかに表皮過形成、表皮内炎症、および広範なアポトーシスを誘発した（非特許文献１８、非特許文献６）。さらに、ＰＫＣアイソエンザイム選択的ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスにおける近年のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、免疫系における個別ＰＫＣの際だった別個の機能を有すると思われる。これらの遺伝分析は、生化学的試験と一緒に、ＰＫＣ調節シグナル伝達経路が免疫反応の多数の態様において重要な役割を果たすことを示すと思われる。例えば、ＰＫＣファミリーのメンバーは、Ｔ細胞シグナル伝達経路において極めて重要であると思われる。特に、ＰＫＣαのアイソタイプは、リンパ球特異的ｉｎ  ｖｉｖｏエフェクターの性質を決定すると思われる。ＰＫＣαは、さらにマクロファージ活性化に関与すると考察されており、明白に肥満細胞シグナル伝達に関与することが証明された（非特許文献１９）。このため、ＰＫＣアイソタイプは、適応免疫において有効な薬物標的である。
【００１２】
炎症性疾患の１つの例は、乾癬である。感染発生をもたらす基本病変に関する２つの主要な仮説が存在する。第１の仮説は、乾癬が主として皮膚細胞の過剰成長および再生の障害であると見なしている。第２の仮説は、乾癬を皮膚細胞の過剰再生が免疫系によって生成される因子に続発性である免疫媒介性障害であると見なしている。したがって、乾癬に対する大多数の薬物は、皮膚細胞の過剰増殖状態、または乾癬斑として存在する皮膚炎症反応のいずれかである疾患の１つの成分を標的としている。
【００１３】
近年のデータは、どちらの経路も皮膚細胞と免疫学的環境（環境、周囲、位置および／または状況を網羅する）とのクロストークを通して疾患の病理学の基礎をなすという概念を支持している。従来型の全ゲノム連鎖解析は、乾癬感受性１〜９（ＰＳＯＲＳ１〜ＰＳＯＲＳ９）遺伝子座と命名された乾癬を発生する傾向と関連する様々な染色体上の９つの場所（遺伝子座）を同定した。これらの場所では、数個の遺伝子が特性付けられ、表皮細胞内で発現するタンパク質、例えば表皮の顆粒層および角化層内で発現し、乾癬においてはアップレギュレートされるコルネオデスモシンをコードすることが見いだされた。他方では、他の乾癬関連遺伝子は、インターロイキン−１２Ｂを発現する染色体５ｑ上で例えば１Ｌ−１２Ｂのように特性付けられた免疫系の調節に関与するタンパク質をコードする（非特許文献２０）。
【００１４】
炎症性疾患のまた別の例は、多発性硬化症（ＭＳ）である。ＭＳは、一般に青少年に影響を及ぼす脳および脊髄に影響を及ぼす可能性があるＣＮＳの慢性的かつ予測不能な炎症性疾患である（非特許文献２１）。ＭＳは、現在は青少年の最も一般的な神経系疾患であると言われており、通常、２０〜４０歳で始まり、男性に比較して女性においてほぼ２倍の確率で発生する傾向がある。
【００１５】
ＭＳでは、神経細胞を取り囲んで保護する物質である髄鞘、および／またはその産生能力が損傷され、これは「脱髄」と呼ばれている。この損傷は、脳と身体との間のメッセージを緩徐化または遮断する作用を有し、ＭＳとともに観察される症状をもたらす。脳および／または脊髄内に散在する領域内の脱髄および瘢痕もしくはその他の病変は、この疾患に特徴的であると考えられている（非特許文献２２）。これらの病変は、神経伝導を変化させ、ＣＮＳにおける脱髄性プラークの場所に伴って変化する廃疾神経学的欠損を誘導すると思われる。（非特許文献２４）。その臨床徴候および症状は様々で、それが影響するＣＮＳの部分に依存し、運動、感覚、自律神経および認知障害が含まれる可能性がある。（非特許文献２３）。
【００１６】
ＭＳの一部の一般的症状には以下が含まれる：１）極度の疲労の感覚、２）平衡歩行および協調運動障害、３）視覚的問題−複視および失明、４）手足における麻痺および刺痛、５）軽度および重度両方の疼痛、筋力低下、６）筋肉の硬直および痙攣、７）気分変動−抑うつおよび不安、８）記憶および集中力の欠如、会話障害（非特許文献２４）。
【００１７】
進行性身体障害は、特に２５年間見通しが包含される場合、ＭＳを有する大多数の患者の宿命である。ＭＳ患者の半数は、疾患発症の１５年間以内には歩行に杖を必要とするようになる。ＭＳは、若年および中年成人における神経性身体障害の主要原因であり、過去１０年間までは、公知の有益な治療を有していなかった。ＭＳは非特異的な臨床所見のために診断を下すのが困難であるが、このことがＭＲＩスキャン、誘発電位、および脳脊髄液（ＣＳＦ）試験からなる幾つかの技術的進歩を包含する高度に構造化された診断基準の開発をもたらした。診断基準は、一般には様々な時点に発生するが、他の病因、例えば感染、血管障害、または自己免疫障害によって説明されない中心体白質内の散在性病変の一般的原理に依存している。
【００１８】
ＭＳは、それによって未知の薬剤がＴ細胞媒介性炎症性発作を引き起こし、ＣＮＳ（中枢神経系）組織の脱髄を誘発する自己免疫疾患であると広く考察されている（非特許文献２５）。ミエリンを標的とする自己免疫反応についての証拠は強力であるが、決定的ではない。例えば、リンパ球またはミエリン食作用の非存在下では、早期多発性硬化症病変におけるマイクログリア細胞活性化による原発性オリゴデンドロサイトアポトーシスの開示がある（非特許文献２６）。
【００１９】
ＭＳは、特徴的に４つの疾患パターン：再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、進行再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）、および二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を有すると報告されている。ＲＲＭＳを備える患者の推定５０％は１０年以内にＳＰＭＳを発生し、ＲＲＭＳの９０％までは最後にはＳＰＭＳを発生することになる。疾患の各パターンは、軽度、中等度または重度として現れることがある。ＲＲＭＳを患うヒトは、悪化する神経機能の明確な発作を提示する。これらの発作には、その間疾患進行が発生しない部分または完全回復期（緩解期）が続く（約８５％の人々は、最初はＲＲＭＳであると診断される）。ＰＰＭＳは、最初から緩徐に悪化する神経機能を特徴とし、顕著な再発または緩解を伴わない（約１０％のヒトはＰＰＭＳと診断される）。ＳＰＭＳでは、ＲＲＭＳの原初期に続いて、多くの人はこの疾患がより確実に悪化する二次進行型疾患経過をたどる（ＲＲＭＳを備えるヒトの約５０％が１０年間以内にこの疾患のこの形態を発生する）。ＰＲＭＳでは、ヒトは最初から確実に、しかし途中で悪化する神経機能の明白な発作を伴って悪化する疾患症状を経験し、他方ではこの疾患は緩解を伴わずに進行すると思われる（５％）（非特許文献２６）。
【００２０】
現時点ではＭＳに対する治療薬はないが、疾患活性および疾患進行の低下を試みる幾つかの治療薬を利用できる。合衆国では、４つのクラスの６種の薬物がＭＳの治療のために承認されている。ＦＤＡ承認の疾患治療薬には、以下のインターフェロンクラス、ＩＦＮ−β−１ａ（ＲＥＢＩＦ（登録商標）およびＡＶＯＮＥＸ（登録商標））およびＩＦＮ−β−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標））、酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標））、ポリペプチド、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、細胞毒性薬、が包含される。コルチコステロイド剤、メソトレキセート、シクロホスファミド、アザチオプリン、および静脈内（ＩＶ）イムノグロブリンを包含する様々な成功度を示す他の薬物が使用されてきた。現在承認されている治療薬の利点は、ＭＳにおける、相当小さな再発率、そして身体障害の予防である。
【００２１】
ＲＥＢＩＦ（登録商標）（インターフェロンβ１ａ）は、ヒトの身体において見いだされるものと同一のインターフェロンβを産生するバイオ技術プロセスによって製造された医薬品である。ＲＥＢＩＦ（登録商標）は、週３回皮下投与すると報告されている（ＲＥＢＩＦ（登録商標）についてのＦＤＡ承認医療用医薬品情報から）。
【００２２】
ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）（インターフェロンβ１ａ）は、ヒトの身体において見いだされるものと同一のインターフェロンβを産生するバイオ技術プロセスによって製造された医薬品である。ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）は、週１回筋肉内注射として投与すると報告されている（ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）についてのＦＤＡ承認医療用医薬品情報から）。
【００２３】
ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）（インターフェロンβ１ｂ）は、ヒトの身体において見いだされるものと同一のインターフェロンβを産生するバイオ技術プロセスによって製造された医薬品である。ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）は、１日おきに皮下注射すると報告されている（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）についてのＦＤＡ承認医療用医薬品情報から）。
【００２４】
ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）（酢酸グラチラマー）は、ミエリン塩基性タンパク質を刺激する合成タンパク質である。完全には理解されていない機序を通して、この薬物はミエリンデコイとして作用することによりミエリン損傷性Ｔ細胞をブロックすると思われる。ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）は、１日１回皮下注射すると報告されている（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）についてのＦＤＡ承認医療用医薬品情報から）。
【００２５】
ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ）は、実験室で生成されたモノクローナル抗体である。ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）は、潜在的損傷免疫細胞が血流から「血液脳関門」を越えて脳および脊髄内に移動するのを阻止するように設計されている。ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）は、４週に１回、点滴静脈によって投与すると報告されている（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）についてのＦＤＡ承認医療用医薬品情報から）。
【００２６】
ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）（ミトキサントロン）は、抗悪性腫瘍薬と呼ばれる医薬品の一般群に属する。ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）は、所定の形態の癌を治療するために使用されてきた。ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）は、ＭＳ治療において、ミエリン鞘上での発作をもたらすと推定されているＴ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの活性を抑制することによって作用すると報告されている（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）についてのＦＤＡ承認医療用医薬品情報から）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｆｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｒｅｐ．  ９：４６１−７
【非特許文献２】Ｄｌｕｇｏｓｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ４６：３０４
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１９：２７９−２８７
【非特許文献４】Ｄｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ６：１４９−１５７
【非特許文献５】Ｄｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３６：１１４１−１１４６
【非特許文献６】Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９３：６３５−６４３
【非特許文献７】Ｔｉｂｕｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１９：１２８２−１２８９
【非特許文献８】Ｄｌｕｇｏｓｚ  ａｎｄ  Ｙｕｓｐａ（１９９３）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２０：２１７−２２５
【非特許文献９】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１１：７６２−７６６
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９９：５６５−５７１
【非特許文献１１】Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０１：７１９−７２６
【非特許文献１２】Ｄｅｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１７０３２−１７０４０
【非特許文献１３】Ｔｅｎｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３：４８０３−４８１０
【非特許文献１４】Ｔｏｍａｋｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００：２９８−３０７
【非特許文献１５】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９５：２４９−２５９
【非特許文献１６】Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：３９０９−３９２３
【非特許文献１７】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍａｒｔ（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１２：３４９７−３５０６
【非特許文献１８】Ｃａｔａｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：２７０３−２７１３
【非特許文献１９】Ｃａｔａｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：１６８６−１６９２
【非特許文献２０】Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：４９６−５０９
【非特許文献２１】Ｈａｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２０４：２０８−３１
【非特許文献２２】Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ５９４−６０４
【非特許文献２３】Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：９３８−５２
【非特許文献２４】Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（全国多発性硬化症協会）ウェブサイト
【非特許文献２５】Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１：１６１３−１６１５
【非特許文献２６】Ｍａｎｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｒａｉｎ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
炎症性疾患と闘うための既存の治療法は、概して病因の複数の成分を標的とする多成分アプローチを提供することはできていない。例えば、自己免疫疾患のための多数の治療法は、炎症を阻止するために、細胞増殖を阻止すること、または免疫反応を抑制することのいずれかによる疾患の単一成分を標的とする工程を包含する。結果として、ＰＣＫアイソフォーム活性を標的として調節することによる、炎症性疾患の病因の複数の成分を標的とする効果的治療薬を提供するという強い必要性が存在する。特異的ＰＫＣアイソフォームを選択的に阻害または活性化することのできる特異的に標的化された治療薬が不可欠であり、そのような治療薬は、例えば局所投与された場合、副作用を低レベルに維持しながら、炎症性疾患の病因の複数の成分を標的とする治療アプローチを提供することになる。そこで、前炎症性サイトカインの分泌を減少させる、および／またはＰＫＣアイソフォームの調節によって免疫制御因子を調節する治療薬の開発は、局所性および全身性炎症、ならびに本明細書で考察する炎症性および／または自己免疫疾患の宿主の改善に有益となる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、炎症性疾患および障害の治療であって、被験体にＰＫＣの制御因子、例えばＰＫＣεもしくはＰＫＣηの阻害因子またはＰＫＣδの活性化剤を投与する工程による治療に関する。
【００３０】
したがって１つの態様では、本開示は、被験体において炎症性疾患または障害を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣの阻害因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における炎症性疾患または障害を治療する。典型的な実施形態では、阻害因子は、ＰＫＣα、ＰＫＣεまたはＰＫＣηを選択的に阻害するポリペプチド、例えば配列番号１〜２９のポリペプチドである。
【００３１】
また別の態様では、本開示は、被験体において炎症性疾患または障害を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣδの活性化因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における炎症性疾患または障害を治療する。様々な実施形態では、活性化因子は、ＰＫＣδを選択的に活性化するポリペプチド、例えば配列番号３０〜３７のポリペプチドである。
【００３２】
また別の態様では、本開示は、被験体において掻痒症を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣの阻害因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における掻痒症を治療する。様々な実施形態において、阻害因子は、ＰＫＣα、ＰＫＣεまたはＰＫＣηの阻害因子である。典型的な実施形態では、阻害因子は、ＰＫＣα、ＰＫＣεまたはＰＫＣηを選択的に阻害するポリペプチド、例えば配列番号１〜２９のポリペプチドである。
【００３３】
また別の態様では、本開示は、被験体において掻痒症を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣδの活性化因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における掻痒症を治療する。様々な実施形態では、活性化因子は、ＰＫＣδを選択的に活性化するポリペプチド、例えば配列番号３０〜３７のポリペプチドである。
【００３４】
また別の態様では、本開示は、被験体において多発性硬化症を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣα、ＰＫＣη、ＰＫＣε、またはＰＫＣεの阻害因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における多発性硬化症を治療する。典型的な実施形態では、阻害因子は、ＰＫＣαまたはＰＫＣηを選択的に阻害するポリペプチド、例えば配列番号１〜１３および２６〜２９のポリペプチドである。
【００３５】
様々な態様において、本開示は、本開示の方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態では、本キットは、ＰＫＣの阻害因子、例えばＰＫＣα、ＰＫＣεもしくはＰＫＣηの阻害因子、またはＰＫＣδの活性化因子、ならびに該阻害因子または活性化因子を投与するための取扱説明書を包含する。
【００３６】
また別の態様では、本開示は、配列番号３の単離ポリペプチド、または、その生理学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供し、ここで該ポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化されている。典型的な実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１２である。
【００３７】
本開示は、配列番号３のポリペプチド、または、その生理学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供し、ここで該ポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化され、そして薬学的に許容される溶媒（vehicle）を包含する医薬組成物をさらに提供する。
【００３８】
また別の態様では、本開示は、配列番号４のアミノ酸配列を包含する単離ポリペプチド、または、その生理学的に許容される塩を提供する。典型的な実施形態では、該単離ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１３のポリペプチドである。
【００３９】
本開示は、配列番号４のアミノ酸配列を包含する単離ポリペプチド、または、その生理学的に許容される塩を包含する医薬組成物をさらに提供する。
【００４０】
また別の態様では、本開示は、配列番号３０〜３３から選択される単離ポリペプチド、または、その生理学的に許容される塩を提供する。典型的な実施形態では、該単離ポリペプチドは、配列番号３４〜３７のポリペプチドである。
【００４１】
本開示は、配列番号３０〜３３のアミノ酸配列を包含する単離ポリペプチド、または、その生理学的に許容される塩を包含する医薬組成物をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、ＰＫＣファミリーのアイソフォームの様々なメンバーを描出している図的表示である。
【図２】図２は、乾癬に特徴的なケラチン生成細胞構造統合性を調節するＰＫＣαの阻害を描出している一連の図的表示である。皮膚組織は、パラフィン包埋して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）一般組織学的染色、または基底層に対するケラチン１４（Ｋ１４）、有棘層に対するケラチン１（Ｋ１）、ケラチン生成細胞遊走に対するケラチン６（Ｋ６）およびケラチン生成細胞増殖に対するＰＣＮＡを包含する様々な皮膚層に対する別個のマーカーについて染色した。結果は、ＰＫＣα阻害後の皮膚特性の正常化を証明している（左欄はＷＴ、右欄はＰＫＣαノックアウトである）。
【図３】図３は、ＩＭＱを用いた処置後のコントロールに比較した、様々なノックアウトマウスにおける落屑の重症度を比較しているヒストグラムである。
【図４】図４は、ＩＭＱを用いた処置後のコントロールに比較した、様々なノックアウトマウスにおける落屑を示している一連の図的表示である。
【図５】図５は、フィラグリン（Ｆｉｌ）、ロリクリン（Ｌｏｒ）およびケラチン１（Ｋ１）の発現を示す一連の図的表示である。
【図６】図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのケラチン生成細胞増殖を評価している一連の図的およびグラフ表示である。上方は、ＰＣＮＡの発現を示す図的表示である。下方は、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＰＣＮＡ陽性細胞およびコントロールのパーセンテージを比較しているヒストグラムである。
【図７】図７は、フィラグリン（Ｆｉｌ）、ロリクリン（Ｌｏｒ）、ケラチン１（Ｋ１）、ＰＣＮＡおよびケラチン１４（Ｋ１４）の発現を示す一連の図的表示である。
【図８】図８は、様々なペプチドＰＫＣα阻害因子に対するケラチン生成細胞内でのタンパク質発現データの概要を示しているグラフ表示である。
【図９】図９は、ＨＯ／０２／１０を用いて処置された皮膚サンプルおよびコントロールの破裂圧を比較しているヒストグラムである。
【図１０】図１０は、創傷の４および９日後にＢ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける皮膚創傷にＨＯ／０２／１０が及ぼす抗炎症作用を比較しているヒストグラムである。
【図１１】ＨＯ／０２／１０を用いて処置された脾細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図１２】図１２は、皮膚の血管内の基底ケラチン生成細胞および内皮細胞内でのＩＣＡＭ発現を示している一連の図的表示である。
【図１３】図１３は、皮膚の血管内の基底ケラチン生成細胞および内皮細胞内でのＩＣＡＭ発現を示している一連の図的表示である。
【図１４】図１４は、創縁部での陽性ＩＣＡＭ−１染色を示すマウスのパーセントを比較しているヒストグラムである。
【図１５】図１５は、Ｉｂａ−１陽性染色細胞の１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ケラチン生成細胞内でのＭＡＣ−２発現を示している一連の図的表示であり、ＭＡＣ−２発現を示している一連の染色を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ケラチン生成細胞内でのＭＡＣ−２発現を示している一連のグラフ表示であり、左から、コントロール、１、１０および１００μｇ（マイクログラム）／mlのＰＫＣα阻害因子を用いてＭＡＣ−２陽性染色された細胞の１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌を比較している。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、Ｇ−ＣＳＦの分泌を比較している。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、ＭＩＰ−２の分泌を比較している。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、ＫＣの分泌を比較している。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化マクロファージにおけるサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ、およびＭＩＰ−２の分泌を比較している。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化マクロファージにおけるサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、ＩＬ−１α（ヒストグラム対の左のバー）およびＴＮＦα（ヒストグラム対の右のバー）の分泌を比較している。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＨＯ／０２／１０を用いて処置されたＬＰＳ活性化マクロファージにおけるサイトカイン分泌を比較している一連のヒストグラムであり、ＩＬ１β（ヒストグラム対の左のバー）およびＩＬ１２（ヒストグラム対の右のバー）の分泌を比較している。
【図１９】図１９は、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図２０】図２０は、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＩＬ−１αの分泌を比較している。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＩＬ−６の分泌を比較している。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、Ｇ−ＣＳＦの分泌を比較している。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＧＭ−ＣＳＦの分泌を比較している。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＭＩＰ−２の分泌を比較している。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＩＰ−１０の分泌を比較している。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＩＬ−１αの分泌を比較している。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＩＬ−６の分泌を比較している。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＴＮＦαの分泌を比較している。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＩＰ−１０の分泌を比較している。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、Ｇ−ＣＳＦの分泌を比較している。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＧＭ−ＣＳＦの分泌を比較している。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＫＣの分泌を比較している。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムであり、ＭＩＰ−２の分泌を比較している。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＨＯ／０２／１０を用いた処置後の炎症段階中の真皮および表皮へのＴ細胞浸潤のダウンレギュレーションを示している一連の表示であり、抗ＣＤ３抗体を使用した一連の染色を示している図である。
【図２８Ｂ】図２８ＢＨＯ／０２／１０を用いた処置後の炎症段階中の真皮および表皮へのＴ細胞浸潤のダウンレギュレーションを示している一連の表示であり、ＣＤ３陽性染色細胞の１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。
【図２９】図２９は、様々な細胞タイプにおいてペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１を使用した処置が及ぼす作用の概要を提示しているグラフ表示である。
【図３０】図３０は、乾癬関連経路においてＨＯ／０２／１０が及ぼす全体的作用のスキーマを示しているグラフ表示である。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＨＯ／０２／１０を用いた処置後の炎症段階中の真皮および表皮への好中球浸潤のダウンレギュレーションを示している一連の表示であり、好中球特異的抗体を使用した染色である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＨＯ／０２／１０を用いた処置後の炎症段階中の真皮および表皮への好中球浸潤のダウンレギュレーションを示している一連の表示であり、好中球特異的陽性染色細胞の１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。
【図３２】図３２は、Ｓｅｒ１７６／１８０抗体を用いて染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥの図的表示である。
【図３３】図３３は、治療の時間経過にわたるＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）スコアを示しているグラフ表示である。
【図３４】図３４は、治療の時間経過にわたるＥＡＥスコアを示しているグラフ表示である。
【図３５】図３５は、治療の時間経過にわたるＥＡＥスコアを示しているグラフ表示である。
【図３６】図３６は、治療の時間経過にわたるＥＡＥスコアを示しているグラフ表示である。
【図３７】図３７は、治療の時間経過にわたるＥＡＥスコアを示しているグラフ表示である。
【図３８】図３８は、掻痒症へＭＰＤＹ−１が及ぼす作用を評価するために皮刺試験（プリックテスト）モデルで使用されるヒスタミンの作用機序の図的表示である。
【図３９】図３９は、ヒスタミンが注射され、ＭＰＤＹ−１を用いて、または用いずに処置された被験体の前腕を示している図的表示である。
【図４０】図４０は、ヒスタミンが注射され、ＭＰＤＹ−１を用いて、または用いずに処置された被験体の前腕を示している図的表示である。
【図４１】図４１は、ヒスタミンが注射され、ＭＰＤＹ−１を用いて、または用いずに処置された被験体の前腕を示している図的表示である。
【図４２】図４２は、ヒスタミンが注射され、ＭＰＤＹ−１を用いて、または用いずに処置された被験体の前腕を示している図的表示である。
【図４３】図４３は、ＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１およびＰＫＣδ活性化因子ＤＡＰ−１（配列番号３４）についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫学的試験で収集されたデータの表である（全データは表示されていない）。
【図４４】図４４は、ＴＮＦαおよび阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌のＰＫＣδ活性化因子ＤＡＰ−１（配列番号３４）についての結果を表にまとめた概要である。
【図４５】図４５は、ＬＰＳまたはＴＮＦαおよび様々なＰＫＣε阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内のサイトカイン分泌の比較を示しているヒストグラムである。
【図４６】図４６は、ＬＰＳまたはＴＮＦαおよび様々なＰＫＣε阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内のサイトカイン分泌の比較を示しているヒストグラムである。
【図４７】図４７は、ＬＰＳまたはＴＮＦαおよび様々なＰＫＣε阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内のサイトカイン分泌の比較を示しているヒストグラムである。
【図４８】図４８は、ＬＰＳまたはＴＮＦαおよび様々なＰＫＣε阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内のサイトカイン分泌の比較を示しているヒストグラムである。
【図４９】図４９は、ＬＰＳまたはＴＮＦαおよび阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌の様々なＰＫＣε阻害因子についての結果を表にまとめた概要である。
【図５０】図５０は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５１】図５１は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５２】図５２は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５３】図５３は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５４】図５４は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５５】図５５は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５６】図５６は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５７】図５７は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５８】図５８は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、およびＰＰＤＹ（配列番号１０）を包含するペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図５９】図５９は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６０】図６０は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６１】図６１は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６２】図６２は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＡＷＯＴ−１（配列番号７）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６３】図６３は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６４】図６４は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６５】図６５は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６６】図６６は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６７】図６７は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６８】図６８は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図６９】図６９は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７０】図７０は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７１】図７１は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７２】図７２は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７３】図７３は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７４】図７４は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７５】図７５は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７６】図７６は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７７】図７７は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７８】図７８は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）、およびＡＩＰ−２（配列番号８）を用いて処置されたＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図７９】図７９は、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）およびＰＤＹ−１（配列番号１３）を用いて処置されたＬＰＳ活性化ケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を比較しているヒストグラムである。
【図８０】図８０は、ＬＰＳ、ＴＮＦαまたはＩＬ−１７Ａおよび阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌の様々なＰＫＣα阻害因子についての結果を表にまとめた概要である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本開示は、ＰＫＣアイソフォームの修飾因子を炎症性疾患および障害のための効果的治療薬として投与できるという独創性に富む発見に基づいている。皮膚細胞の主要細胞プロセス、ならびに免疫系の多数の成分におけるＰＫＣアイソフォームの関与は、ＰＫＣアイソフォームが炎症性病理状態を治療するための潜在的標的であることを特徴付けている。本明細書に提示したデータは、ＰＫＣファミリーのアイソフォームが炎症および炎症性疾患と関連する皮膚細胞および免疫細胞内での活性化プロセスを調節することを証明している。
【００４４】
本開示は、本明細書に記載した特定の組成物、方法、および実験条件には限定されず、そのような方法および条件は変動する可能性があることを理解すべきである。さらにまた、本明細書で使用する専門用語は特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定することは意図しておらず、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の記載においてのみ限定されることもまた理解すべきである。
【００４５】
本開示による方法の原理および操作は、図面および添付の説明を参照することでより明確に理解することができる。
【００４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「１つの」および「その」は、状況が明白に他のことを指示しない限り、複数の言及を包含する。そこで、例えば、「該方法」との言及は、本開示を読むなどすると当業者には明白になる、１つ以上の方法および／または本明細書に記載したタイプの工程を包含する。
【００４７】
他に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載した方法と類似する、または同等の任意の方法および材料は本開示の実践または試験において使用できるが、以下では一部の好ましい方法および材料を記載する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「被験体」は、哺乳動物被験体を意味する。そこで、他の哺乳動物における任意の動物の治療が想定されている。そのような動物には、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類およびヒトが包含されるがそれらに限定されない。そこで、本開示の方法は、獣医学的用途における使用ならびにヒト使用のために企図されている。
【００４９】
本明細書の被験体の「処置」は、治療的処置および予防的もしくは防止的手段を意味する。処置を必要とする被験体には、すでに炎症性疾患または障害を備える被験体ならびにそれが防止されなければならない被験体が包含される。そこで、該被験体は、炎症性疾患または障害を有すると診断されている、または炎症性疾患もしくは障害に罹りやすい、または感受性である可能性がある。
【００５０】
本明細書で使用する「炎症性疾患または障害」は、ＰＫＣファミリーのアイソフォーム調節と関連する病因を有する任意の疾患および障害を包含することが意図されている。そのような疾患には、掻痒症、皮膚炎症、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病、喘息、炎症性肺障害、炎症性肝障害、炎症性糸球体障害、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、シェーグレン（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ）症候群、角結膜炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、潰瘍性大腸炎、関節、皮膚、もしくは筋肉の炎症性疾患、急性もしくは慢性特発性炎症性関節炎、筋炎、脱髄疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、間質性腎炎および慢性活動性肝炎が包含されるがそれらに限定されない。
【００５１】
炎症性疾患または障害の「症状」は、該被験体が経験した、または炎症性疾患もしくは障害の指標となる任意の病的徴候または構造、機能、もしくは感覚における正常からの逸脱である。
【００５２】
文言「有効量」は、ＰＫＣアイソフォームの阻害因子もしくは活性化因子、例えば配列番号１〜３７のポリペプチドの炎症性疾患または障害を予防する、緩和する、または治療するために有効である量を意味する。そのような有効量は、一般には炎症性疾患または障害の徴候、症状および／またはその他の指標における改善を生じさせる。例えば、皮膚炎症では、有効量は腫脹および／または炎症の減少および／または発赤の除去を生じさせる。掻痒症に対しては、有効量は発赤および／または掻痒の除去を生じさせることができる。ＭＳに対しては、有効量は、再発率の低下、身体障害の防止、脳ＭＲＩ病変の数および／または容積の減少、２５フィート歩行時間の改善、無進行期間の延長などを生じさせることができる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「ＰＫＣアイソフォーム」は、全てのＰＫＣアイソフォームを含み、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣη、ＰＫＣζ、ＰＫＣγ、ＰＫＣθ、およびＰＫＣλを包含する。
【００５４】
文言「ＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を調節する」は、ＰＫＣアイソフォームの増加または減少した発現および／または活性に関する。発現の増加は、ＰＫＣアイソフォームの産生増加をもたらす。
【００５５】
用語「活性化因子」は、本明細書ではＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を増強する分子を記載するために使用される。用語「阻害因子」は、本明細書ではＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を阻害する分子を記載するために使用される。特に、リン酸基転移領域、偽基質ドメイン、ホルボールエステル結合配列、およびリン酸化部位は、アイソエンザイム特異的ＰＫＣ活性の調節のための標的となることがある。
【００５６】
ＰＫＣアイソフォームの「偽基質領域」もしくは自己阻害ドメインは、本明細書では、本質的にリン酸化可能な残基を備えていないキナーゼのための基質のコンセンサス配列であると規定されている。偽基質ドメインは調節領域に基づいており、認識部位を阻害してリン酸化を防止する基質認識モチーフに酷似している。そこで、ＰＫＣアイソフォームの阻害性ペプチド、例えば本開示のポリペプチドは、セリン（Ｓ）またはチロシン（Ｔ）のリン酸化可能な残基をアラニン（Ａ）で置換することによって得られる。ＰＫＣδは、ＰＫＣδの保存ドメイン２であるＣ２ドメイン上でのこのアイソフォームの活性化を可能にする追加の結合部位を有することが公知である唯一のＰＫＣアイソフォームである。
【００５７】
ＰＫＣは、ケラチン生成細胞の増殖、遊走および分化を媒介する主要シグナル伝達経路である。多数のＰＫＣアイソフォームは、皮膚組織中で発現することが公知であり、それらの発現／活性は、細胞増殖および／または細胞遊走および／または細胞分化において役割を果たすと思われる。しかし、炎症性疾患の治療を達成するためのそれらの発現および活性の特異的調節は以前は未知であったが、本開示において証明されている。
【００５８】
総体的に、本明細書に提示した結果は、様々なＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を調節することが炎症および炎症性疾患の治療において効果的であることを実証している。
【００５９】
そこで、１つの態様では、本開示は、被験体において炎症性疾患または障害を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣの阻害因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における炎症性疾患または障害を治療する。典型的な実施形態では、阻害因子は、ＰＫＣα、ＰＫＣεまたはＰＫＣηを選択的に阻害するポリペプチド、例えば配列番号１〜２９のポリペプチドである。
【００６０】
実施例において開示するように、ＰＫＣアイソフォーム阻害因子の投与は、多種多様性のある皮膚細胞タイプ（皮膚細胞だけではない。つまり、マクロファージは、他の組織において見いだされ、活性である）における前炎症性サイトカイン、ケモカインおよびＴｈ１サイトカインの分泌を減少させることが証明されている。さらに、ＰＫＣアイソフォームの投与は、活性化因子、例えばケラチン生成細胞および内皮細胞上のＩＣＡＭ−１およびマクロファージ上のｍａｃ−２の発現を減少させる。さらに、ＰＫＣα阻害因子は、皮膚炎症の治療において、および乾癬の炎症性皮膚モデルにおける炎症症状を軽減するために有効であることが見いだされている。実施例でさらに考察するように、ＰＣＫアイソフォームの阻害因子の作用機序は、炎症性疾患または障害のための効果的療法としてのそれらの使用に関係することが解明されてきた。例えば、ＰＣＫアイソフォームのペプチド阻害因子は、例えば、図３０に要約したように、炎症性プロセスの様々な工程において様々な細胞タイプの動員および活性化へ特異的に影響を及ぼすことによって：１）最終分化を減少させることにより表皮分化マーカーの発現を正常化する、２）異常過剰増殖を軽減する、３）皮膚構造を調節し、皮膚強度を増強する、および／または４）炎症をダウンレギュレートすることが証明されてきた。
【００６１】
さらに実施例において開示するように、ＰＫＣδの活性化因子は、多種多様性のある皮膚細胞タイプにおいて前炎症性サイトカインの分泌を減少させることもまた証明されている。そこで、また別の態様では、本開示は、被験体において炎症性疾患または障害を治療する方法であって、該被験体にＰＫＣδの活性化因子を投与し、それにより該被験体において該炎症性疾患または障害を治療する方法を提供する。様々な実施形態では、活性化因子は、ＰＫＣδを選択的に活性化するポリペプチド、例えば配列番号３０〜３７のポリペプチドである。
【００６２】
さらに、実施例において開示するように、ＰＫＣα阻害因子およびＰＫＣη阻害因子の投与は、ＭＳの症状を軽減することが見いだされてきた。したがって、また別の態様では、本開示は、被験体において多発性硬化症を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣαまたはＰＫＣηの阻害因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における多発性硬化症を治療する。
【００６３】
さらに、ＰＫＣアイソフォーム阻害因子の投与は、掻痒症の治療において有効であることが見いだされている。したがって、また別の態様では、本開示は、被験体において掻痒症を治療する方法を提供する。本方法は、被験体にＰＫＣの阻害因子を投与する工程を包含し、それにより該被験体における掻痒症を治療する。
【００６４】
実施例および図面は、ＰＫＣδの活性化因子が、主要な前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの分泌を阻害する能力を示すデータを提示している。類似のデータは、ＰＫＣα、ＰＫＣεおよびＰＫＣηを包含する様々なＰＫＣアイソフォーム阻害因子について示されている。実施例において示したように、本開示のＰＫＣ阻害因子および活性化因子を包含する製剤は、主要前炎症性サイトカインの分泌を阻害することが証明されてきた。乾癬に関しては、特定の理論に連関しなくても、前炎症性物質のレベルを減少させると、隣接血管内の内皮細胞の活性化、したがって好中球、マクロファージおよびＴ細胞の乾癬斑への動員を防止すると考えられている。さらに、ＴＨ１およびＴＨ１７細胞は、炎症を強化する、またはケラチン生成細胞過剰増殖を各々駆動すると思われる特異的サイトカインの分泌によって、乾癬の病因に関与することが証明された。上述した前炎症性サイトカインは、これらのＴＨ１７細胞の発生（Ｍａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３１−２３４；Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３５−２３８）およびＴＨ１細胞活性に不可欠であると思われる。ＰＫＣ阻害因子および活性化因子によるそれらの分泌の減少は、炎症性障害および掻痒症の効果的治療におけるそれらの使用を関係付けている。
【００６５】
様々な実施形態では、ＰＫＣアイソフォームの阻害因子は、ＰＫＣの偽基質領域の阻害因子であり、ポリペプチドであるが、ＰＫＣアイソフォームの活性化因子もまたポリペプチドである。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、本明細書では、隣接残基のαアミノ基とカルボキシ基とのペプチド結合によって１つを他の残基に結合させた直鎖系列のアミノ酸残基を指定するために互換的に使用される。
【００６６】
様々な実施形態では、使用可能なペプチドＰＫＣ活性化因子および阻害因子の例には、制限なく、表１に記載の配列番号１〜５、１４〜１９、２６、２７および３０〜３３のペプチドまたはそれらの生理学的に許容される塩、ならびに特定の修飾もしくは末端保護基を有すると示されている表１の配列番号６〜１３、２０〜２５、２８、２９、３４〜３７のペプチドが包含される。
【００６７】
【表１−１】
2013516500.tif 000002
【表１−２】
2013516500.tif 000003
【００６８】
様々な実施形態では、ペプチドＰＫＣ阻害因子または活性化因子は、典型的には６〜１２アミノ酸を含有するが、長さがもっと長くても短くてもよい。様々な実施形態では、ペプチドＰＫＣ阻害因子または活性化因子は長さが６〜４５、６〜４０、６〜３５、６〜３０、６〜２５、６〜２０、６〜１５、または６〜１０個のアミノ酸の範囲に及んでよい。一実施形態では、該ペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を包含する。
【００６９】
様々な実施形態では、ペプチドＰＫＣ阻害因子または活性化因子は、好ましくはＣ１２−Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４アシル（ミリストイル）またはＣ１６アシル（パルミトイル）に由来するアシル基によってＮ−アセチル化されてよい。
【００７０】
一般に、ペプチドＰＫＣα阻害因子には、共通モチーフ配列Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号１）が包含される。または、また別の実施形態では、ＰＫＣα阻害因子には、共通モチーフ配列Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号５）が包含される。
【００７１】
ペプチドＰＫＣ阻害因子および活性化因子は正確な配列またはモチーフ配列によって規定できるが、当業者であれば、類似の配列を有するペプチドは類似機能を有する可能性があることを理解できる。このため、実質的に同一の配列を有する、または実質的に表１に記載のＰＫＣ阻害因子または活性化因子と全く同一もしくは類似する配列を有するペプチドは、含まれることが意図されている。本明細書で使用する用語「実質的に同一の配列」には、配列番号１〜３７によって規定された配列と少なくとも６０＋％（６０％以上を意味する）、好ましくは７０＋％、より好ましくは８０＋％、および最も好ましくは９０＋％、９５＋％、または９８＋％配列同一性を有する配列を包含する、およびＰＫＣアイソフォーム活性を阻害または活性化するペプチドが包含される。
【００７２】
２つのポリペプチドが実質的に同一であるというまた別の指摘は、１つのポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。そこで、ポリペプチドは、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ相違する場合、典型的には第２ポリペプチドと実質的に同一である。
【００７３】
用語「保存的置換」は、タンパク質またはペプチドに関連して分子の活性（例えば、抗菌活性）を実質的には変化させないアミノ酸置換を示すために使用される。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸と類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備える別のアミノ酸との置換を包含する。以下の６つの群は、各々相互に対して典型的な保存的置換であるアミノ酸を含有する、１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、ならびに６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）。
【００７４】
用語「アミノ酸」は、極めて広い意味では、天然型アミノ酸ならびにアミノ酸アナログを包含する非天然型アミノ酸を包含するために使用される。この広い定義を考慮すると、当業者であれば、本明細書でのアミノ酸に関する言及には、例えば、天然型のタンパク生成（Ｌ）−アミノ酸、（Ｄ）−アミノ酸、化学修飾アミノ酸、例えばアミノ酸アナログ、天然型の非タンパク生成アミノ酸、例えばノルロイシン、および当分野においてアミノ酸に特徴的である公知の特性を有する化学合成化合物が包含されることが公知である。本明細書で使用する用語「タンパク生成（proteogenic）」は、アミノ酸を代謝経路を通して細胞内のタンパク質内に組み込めることを示している。
【００７５】
２つのポリペプチド配列の状況における用語「同一」または「同一性率」（％）は、配列比較アルゴリズムを使用して、もしくは視覚的検定によって測定した場合、比較して最大対応についてアラインメントされると同一である、または規定パーセンテージの同一であるアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列に関する。
【００７６】
２つのポリペプチド配列の状況における文言「実質的に同一」は、配列比較アルゴリズムを使用して、もしくは視覚的検査によって測定した場合、最大一致で、比較及びアラインメントされると、少なくとも６０＋％、好ましくは８０＋％、最も好ましくは９０〜９５＋％のアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列に関する。
【００７７】
当分野において一般に公知であるように、比較のための最適な配列アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（（１９８１）Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２：４８２）の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４）の類似性検索方法によって、視覚的検定によるこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実行、またはその他の効果的方法によって実施することができる。
【００７８】
ペプチドＰＫＣ阻害因子または活性化因子は、修飾アミノ酸配列または非天然型末端修飾を有する可能性がある。ペプチド配列への修飾には、例えば、そのような修飾によって生成されたペプチドがＰＫＣα阻害因子活性を保持することを前提に、アミノ酸の付加、欠失または置換を包含することができる。さらに、ペプチドは、遊離末端もしくはアミノ保護（例えば、Ｎ−保護）および／またはカルボキシ保護（例えば、Ｃ−保護）末端を備える形態で存在してよい。保護基には、（ａ）ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニルおよび４−メトキシベンジルオキシカルボニルを包含する芳香族ウレタン型保護基、（ｂ）ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニルおよびメチルスルホニルエトキシカルボニルを包含する脂肪族ウレタン型保護基、（ｃ）アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニルおよびイソボルニルオキシカルボニルを包含するシクロアルキルウレタン型保護基、（ｄ）アシル保護基またはスルホニル保護基が包含される。追加の保護基には、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニルおよび１−カンファースルホニルが包含される。
【００７９】
様々な実施形態では、ペプチドＰＫＣアイソフォーム阻害因子および活性化因子は、被験体を治療するために局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、静脈内、および／または病巣内投与を包含する任意の適切な手段によって投与することができる。しかし、典型的な実施形態では、ペプチドは局所投与のため、例えば液剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、泡スプレーなどの形態で調製される。
【００８０】
本開示によって使用されるＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子の治療用製剤は、例えば、所望の純度を有するＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤および／または安定剤とともに混合する工程によって調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度で受容者に非毒性であり、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸類、アスコルビン酸およびメチオニンを包含する抗酸化物質、保存料（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン類、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくはイムノグロビン類、親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン、単糖類、二糖類、およびその他のグルコース、マンノース、もしくはデキストリン類を包含する炭水化物、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール、塩形成対イオン、例えばナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、および／または非イオン性界面活性化因子、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含することができる。
【００８１】
典型的な実施形態では、ＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子は、クリーム剤に調製される。ＰＫＣアイソフォームの阻害因子および活性化因子は、皮膚炎症および他の炎症性障害の局所治療のために理想的であるが、それはＰＫＣ酵素の活性を特異的に標的とすることができるからである。特異的ＰＫＣ酵素の阻害または活性化は、他のＰＫＣアイソフォームに影響を及ぼさずに低濃度でＰＫＣアイソフォームを選択的に調節する能力によって達成される。
【００８２】
局所投与の代表的な製剤は、ペプチドＭＰＤＹ−１（配列番号６）が局所投与のためのクリーム剤として調製される実施例４に開示されている。しかし、当業者であれば、本製剤は、クリーム剤の本質的特性、例えば粘度、安定性、非毒性などを保持しながら変更を加えられることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、本製剤を本開示のペプチドＰＫＣ阻害因子または活性化因子のいずれかのための溶媒として使用可能なことを認識するであろう。
【００８３】
また別の実施形態では、１つの製造品、例えば本開示の治療方法を実施するために有用な材料を含有するキットが提供される。様々な実施形態では、本キットは、ＰＫＣアイソフォーム活性化因子または阻害因子、つまり本明細書に開示したペプチドＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子、および該被験体に該活性化因子または阻害因子を投与するための取扱説明書を包含する。
【００８４】
用語「取扱説明書」または「添付文書」は、適応、用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と結合すべき他の治療用製品および／またはそのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含有する、治療用製品の商業包装内に慣習的に包含される取扱説明書を意味するために使用される。
【００８５】
本明細書で開示するＰＫＣαの阻害因子は、特定投与経路のために調製することができる。したがって、本キットは、適切な容器、例えばチューブ、ボトル、バイアル、シリンジなどの中に含有されるＰＫＣαの阻害因子を包含する製剤を包含することができる。容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成されてよい。容器は、炎症性疾患を治療するために有効である組成物を保持または含有し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。製剤中の少なくとも１つの成分は、ＰＫＣアイソフォームの阻害因子または活性化因子である。ラベルまたは添付文書は、ＰＫＣアイソフォームの阻害因子または活性化因子を包含する製剤を提供するために投与量および投与間隔に関する特別の手引きを用いて、本組成物が炎症性疾患を患う患者において治療するために使用されることを示している。本製造品は、商業的観点および利用者の観点から望ましい、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを包含する他の材料をさらに包含することができる。
【００８６】
当然ながら、治療を必要とする任意の特定被験体のための特定用量レベルおよび投与頻度は変動してよく、使用されるＰＫＣアイソフォームの阻害因子または活性化因子の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与様式および時刻、特定状態の重症度、および療法を受ける宿主に依存することになる。しかし一般に、用量は、特異的ＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子の公知の投与方法に典型的な用量に近似する。当業者であれば、最適用量、投与方法および反復頻度を容易に決定することができる。正確な処方および用量は、患者の状態に照らして個々の医師が選択することができる（Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，  Ｃｈ．１  ｐ．１（１９７５））。
【００８７】
そこで、治療対象の状態の重症度および反応性に依存して、投与は単回、または治癒するまで、または障害の減少が達成されるまで治療過程が数日間から数週間持続する反復投与であってよい。
【００８８】
ＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子がペプチドである様々な実施形態では、該ペプチドは組成物中で０．００１〜１００μｇ／mlの濃度で提供される。例えば、濃度は、０．００１〜１００、０．０１〜５０、０．０１〜１０、０．０１〜１、および０．０１〜０．５μｇ／mlであってよい。
【００８９】
１つの投与プロトコールでは、本方法は、ペプチドＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子を該被験体へ局所的に、例えばクリーム剤として投与する工程を含んでいる。ペプチドは、約１μｇ／ml〜約１，０００μｇ／ml、１μｇ／ml〜約５００μｇ／ml、１μｇ／ml〜約１００μｇ／ml、１μｇ／ml〜約１０μｇ／ml、または１０μｇ／ml〜約１００μｇ／mlの濃度で局所投与される。ペプチドは、その状態が治療されるまで少なくとも１日１回投与される。
【００９０】
また別の投与プロトコールでは、本方法は、ペプチドＰＫＣアイソフォーム阻害因子または活性化因子を該被験体へ非経口、皮下または静脈内投与する工程を含んでいる。ペプチドは、約１μｇ／ml〜約１，０００μｇ／ml、１μｇ／ml〜約５００μｇ／ml、１μｇ／ml〜約１００μｇ／ml、１μｇ／ml〜約１０μｇ／ml、または１０μｇ／ml〜約１００μｇ／mlの濃度で投与される。ペプチドは、その状態が治療されるまで少なくとも１日１回、週１回、２週に１回、または月１回投与される。
【００９１】
以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに具体的に示すために提供するが、範囲を限定することは意図されていない。これらの実施例は使用可能な実施例の典型ではあるが、あるいはまた当業者には公知の他の手順、方法、または技術を使用することができる。
【実施例１】
【００９２】
ＰＫＣαの阻害は炎症性皮膚障害である乾癬に特徴的なケラチン生成細胞構造統合性（structure integrity）を調節する
ＰＫＣαの阻害は、乾癬に特徴的なケラチン生成細胞構造統合性を調節することが証明された。皮膚組織をパラフィン包埋し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）一般組織学的染色のため、または基底層に対するケラチン１４（Ｋ１４）、有棘層に対するケラチン１（Ｋ１）、ケラチン生成細胞遊走に対するケラチン６（Ｋ６）およびケラチン生成細胞増殖に対するＰＣＮＡを包含する様々な皮膚層に対する別のマーカーについて染色した。結果は、ＰＫＣα阻害後の皮膚特性の正常化を証明している（図２）。
【実施例２】
【００９３】
乾癬モデルによる炎症のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ治療を評価するためのモデル
これまで極めて多数の動物モデルが乾癬を試験するために使用されてきたが、これらのモデルはいずれも、過剰な皮膚産生、新規血管の形成、および重度免疫機能障害を特徴とするヒト疾患病理を適正に模倣するために十分ではなかった。一般に、乾癬の有用なモデルであると見なすには、モデルは、乾癬との一部の組織病理学的特徴を共有し、類似の病因および／または疾患機序を示し、そしてこの疾患を治療するための治療薬に同様に応答しなければならない。既存モデルは、表皮肥厚、表皮分化の変化、脈管新生の増加、および白血球／Ｔ細胞浸潤を包含する幾つかの特徴を示す。しかし、特に既存のマウスモデルの中では、既存薬物および療法に応答するマウスは多くない。したがって、既存モデルを使用して、以下の実施例において利用された乾癬治療を評価するための新規のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルが開発されてきた。
【００９４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
開発されたモデルは、細胞系および皮膚由来細胞ならびに免疫細胞の一次培養物を使用し、ＳＴＡＴ３およびＰＫＣα媒介性シグナル伝達経路を過剰発現させて不活性化するための構築体およびツールを利用する細胞培養試験を包含していた。皮膚細胞の増殖、遊走、分化、炎症およびシグナル伝達を試験するための膨大な一連の技術が利用され、乾癬の発生機序を試験し、乾癬におけるＰＫＣαの阻害の治療作用を試験するのに有用であることが証明された。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏモデル
ＰＫＣα過剰発現およびノックアウトマウスモデルを使用した。Ｋ５−ＰＫＣαトランスジェニックマウスを使用したケラチン生成細胞内でのＰＫＣαの過剰発現は、例えば膿疱性乾癬などの状態を模倣する重度の表皮内好中球浸潤および表皮の破壊を示すことが証明された。トランスジェニックマウスのＰＫＣαおよびＤＮ形態の両方が確立され、これは、皮下投与によってｉｎ  ｖｉｖｏで試験された。さらに、皮膚構造および機能にＰＫＣα不活性化が及ぼす作用を試験するために、ＰＫＣαノックアウトマウスを使用した。
【００９６】
ＳＴＡＴ３を過剰発現するマウスモデルを使用した。中でも、乾癬、ヒト乾癬に対する類似性に関するリードマウスモデルは、Ｓｔａｔ３が表皮ケラチン生成細胞内で過剰発現するトランスジェニックマウスである。これらのマウスは、乾癬状の表皮での棘細胞増殖を発生し、真皮内では主としてＣＤ４＋であり、表皮内ではＣＤ８＋である皮膚リンパ球浸潤を有するが、これらは全てヒトにおける乾癬に類似する特徴である。
【００９７】
皮膚炎症および過形成のためのモデルとしての創傷。創傷状況における皮膚病変内の炎症を検出して定量的に評価するために、様々な皮膚区画における皮膚炎症応答を追跡し、この応答に影響を及ぼす薬剤の同定を可能にするスクリーニング方法が開発された。
【００９８】
ｅｘ  ｖｉｖｏモデル
ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）上での乾癬性皮膚の移植。ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）上での乾癬性皮膚移植の技術は、ｅｘ  ｖｉｖｏ治療用途を試験する目的で開発された。この技術は皮膚腫瘍試験および血管新生実験において一般に使用されるが、これを乾癬試験のために採用して使用した。この最初のアプローチは、ヒト乾癬性皮膚への新規薬物の直接的な投与を可能にするため、そこで感染を治療するための新規薬物のより臨床的に意義のある試験を作り出す。移植後、乾癬性ヒト皮膚を利用して様々な製剤における様々な治療の有効性およびタイミングを確定し、形態学的、組織学的および生化学的分析を使用して分析する。
【実施例３】
【００９９】
ＰＫＣαノックアウトマウスにおける瘢痕形成の軽減
ＰＫＣαノックアウトマウスモデルを開発し、皮膚構造および機能にＰＫＣα不活性化の作用が及ぼす作用を試験するために利用した。図３および４に示したように、落屑の軽減がＰＣＫαノックアウトマウスにおいて観察された。図３は、平均落屑重症度が、コントロールと比較してＰＣＫαノックアウトマウスにおいて５０％超減少したことを示しているヒストグラムであり、ＰＫＣαの阻害が乾癬治療の重要な要件であることを証明している。これは、相違するマウスにおける落屑を比較している一連の図である図４においても証明されている。
【実施例４】
【０１００】
局所的ＰＫＣα阻害因子製剤
局所的ＰＫＣα阻害因子製剤を開発し、乾癬の治療における有効性について評価した。ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）をクリーム剤に調製し（本明細書では、ＨＯ／０２／１０と称する）、その成分は表２に示した。
【０１０１】
【表２】
2013516500.tif 000004
【実施例５】
【０１０２】
ＰＫＣα阻害因子がｉｎ  ｖｉｔｒｏ表皮分化に及ぼす作用
実施例４の製剤（ＨＯ／０２／１０）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで表皮分化を制御するために決定した。基底ケラチン生成細胞は、分化してＫ１／Ｋ１０ケラチンを特徴とする有棘層、ロリクリン／フィラグリンを特徴とする顆粒層および角層を形成する。ロリクリンおよびフィラグリン線維の発現および取込みの欠損には、乾癬を包含する様々な免疫学的皮膚疾患が関連している。そこで、ＨＯ／０２／１０が皮膚分化および増殖に及ぼす作用を評価した。図５および６に示したように、ＨＯ／０２／１０は、皮膚増殖（ＰＣＮＡ）（図６）を正常化し、ロリクリンおよびフィラグリンの発現を減少させることによって皮膚分化を調節したが、その間、有棘層は影響を受けないままであった（図５）。乾癬性皮膚ケラチン生成細胞は急速に分化して顆粒細胞および主として大量の角膜細胞（鱗屑）を生成するが、有棘層は薄化するので、ＨＯ／０２／１０は、皮膚特性を正常表現型に向けて修正することによって乾癬性皮膚を正常化するように機能した。
【０１０３】
図５は、ＨＯ／０２／１０がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの表皮顆粒分化を制御することを図示している。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するケラチン生成細胞は、ケラチン生成細胞分化を誘導するためにＣａ２＋を含有する培地中でインキュベートした。次に細胞をＨＯ／０２／１０（１μｇ／ml）の存在下でインキュベートした。細胞を採取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上でランし、抗フィラグリン（Ｆｉｌ）、抗ロリクリン（Ｌｏｒ）および抗ケラチン１（Ｋ１）抗体を使用してイムノブロッティングした。
【０１０４】
図６は、ＨＯ／０２／１０がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのケラチン生成細胞増殖を減少させたことを図示している。２日齢Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の一次マウスケラチン生成細胞は、０．０５ｍＭ  Ｃａ２＋ＭＥＭ培地中で完全コンフルエンスに達するまで５日間増殖させた。ＨＯ／０２／１０処置（１０−６Ｍおよび１０−５Ｍ）は、分化誘導の６時間前に適用した。細胞を採取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上でランし、抗ＰＣＮＡ抗体を使用して免疫ブロッティングした。結果は、図６の上図に示した。８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌａｃｋマウスは、表皮リモデリングおよび分化を誘導するために、上背領域内での全層創傷形成を受けさせた。創傷形成後、マウスは１日１回７日間ＨＯ／０２／１０（範囲：４０〜４，０００ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した。終了時点に、マウスを安楽死させ、上背皮膚サンプルを４％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン包埋し、スライド標本作製した。皮膚サンプルを次にＰＣＮＡ抗体を利用して免疫組織学的染色にかけた（ｎ＝１８）。結果は、図６の下図に示した。
【０１０５】
図７および８は、ＭＰＤＹ−１（配列番号６）を利用したケラチン生成細胞内の追加の発現データならびにＰＫＣα阻害因子ＡＩＰ−１（配列番号９）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＷＯＴ−１（配列番号７）およびＰＰＤＹ−１（配列番号１０）についてのデータを示している。図７は、様々なペプチドＰＫＣα阻害因子を用いて処置されたケラチン生成細胞内での抗ＰＣＮＡ、抗フィラグリン（Ｆｉｌ）、抗ロリクリン（Ｌｏｒ）、抗ケラチン１（Ｋ１）および抗ケラチン１４（Ｋ１４）抗体を利用した免疫組織学的染色を示している。図８は、様々なペプチドＰＫＣα阻害因子に対するケラチン生成細胞内での発現データの概要を示している。
【０１０６】
皮膚の強度および弾性を試験するために、破裂チャンバを使用して、皮膚サンプルを破裂（皮膚弾性および耐久性の測定可能な指標）させるために必要とする圧力を測定した。図９における結果は、ＨＯ／０２／１０処置皮膚が皮膚強度を増強したことを証明した。そこで、ＰＫＣαの阻害は、皮膚の統合性を増強して乾癬病変の破裂を防止することが証明されたため、乾癬性皮膚にとって有益な可能性がある。
【０１０７】
図９は、ＨＯ／０２／１０が皮膚強度を劇的に強化したことを証明している。マウス皮膚を１４日間ＨＯ／０２／１０を用いて処置し、続いて破裂圧分析にかけた。破裂チャンバデバイスは、一端は閉鎖して、制御弁および圧力計によって高圧ＣＯ２容器に接続した固定容積の金属製シリンダーから構成された。チャンバの他方の端部では、試験対象の皮膚組織を載荷して適所に保持するために、調節可能なフレームを据え付けた。ガスを徐々にチャンバ内に流入させ、内部の圧力は、試験対象組織の破裂が発生するまで持続的に監視した。
【実施例６】
【０１０８】
ＰＫＣアイソフォーム阻害因子および活性化因子が皮膚炎症に及ぼす作用
創傷状況における皮膚病変内の炎症を検出して定量的に評価するために、様々な皮膚区画における皮膚炎症応答を追跡し、この応答に影響を及ぼす薬剤を（予備スクリーニングとして）同定することを可能にする方法が開発された。炎症応答は、以下の３つの状態の内２つが明白であった場合に重度と見なした。（１）膿瘍形成、（２）過度の白血球増加症（固定視野×２００内で＞１００細胞）、（３）血管内の＞２０％のＷＢＣ含量が固定視野×２００内で示されている、血管内での高ＷＢＣ／ＲＢＣ比。免疫学的応答の作用的特性は、特異的免疫学的細胞の浸潤および活性化を同定するためのマーカーを利用して試験する。そのようなマーカーについての例は、ＩＣＡＭ−１（マーカー活性化基底細胞および内皮細胞として）、ＭＡＣ−２（活性化マクロファージのためのマーカーとして）およびＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）である。この定量的方法を使用すると、数種の動物モデルにおける異なる細胞タイプおよびプロセスにおける無傷皮膚および皮膚病変内でのＨＯ／０２／１０およびその他のペプチドＰＣＫα阻害因子が及ぼす強力な抗炎症性作用を証明することが可能であった。
【０１０９】
下記の代表的な結果は、創傷の４および９日後にＢ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける皮膚創傷にＨＯ／０２／１０が及ぼす抗炎症作用を証明している（図１０）。図１０は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける炎症にＨＯ／０２／１０が及ぼす用量反応を示している。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚は、１日１回、ＨＯ／０２／１０（４μｇ／ｋｇ／日）または（４０μｇ／ｋｇ／日）の投与によって処置した（６マウス／群）。処置は局所的に投与した。生検標本は、創傷の４および９日後に採取した。組織は、組織学および免疫組織化学によって炎症を評価するために安楽死させた動物から切除した。
【０１１０】
ＨＯ／０２／１０は、ＬＰＳ活性化脾細胞からの前炎症性サイトカイン分泌を減少させることもまた証明された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一般的抗炎症作用を評価するために、マウス由来一次脾細胞を免疫学的モデルとして利用した。脾細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来し、赤血球を溶解し、細胞は９６ウエルプレート内で５００，０００／ウエルでインキュベートした。ＬＰＳを加え（ＩＬ−１およびＴＮＦα試験のために１μｇ／ml、およびＩＬ−６試験のために０．２ｎｇ／ml）、そして細胞をＭＰＤＹ−１（１μｇ／ml）またはＰＢＳで処置した。陰性コントロールサンプルにはＬＰＳを加えなかった。培地を２日後に収集し、分泌されたサイトカインの量はＥＬＩＳＡを使用して定量した。
【０１１１】
図１１、ならびに図１７〜２７、４３および５０は、ＨＯ／０２／１０が、主要な全炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１およびＩＬ−６の活性化ケラチン生成細胞からの分泌を劇的に減少させる能力を証明している。詳細には、ＩＬ−６が乾癬の病因に関与するＴＨ１７細胞の発達に必須であることが証明され、ＩＬ−１およびＴＮＦαについては増強作用が証明された。ＴＮＦαおよびＩＬ−６は、乾癬療法にとって公知の標的である。図１１は、１μｇ／mlのＨＯ／０２／１０の作用を証明している。
【０１１２】
ＨＯ／０２／１０は、ｉｎ  ｖｉｖｏで基底ケラチン生成細胞および内皮細胞の免疫学的活性化を阻害することもまた証明された。ＩＣＡＭは、炎症性病変内への白血球浸潤を許容する接着分子である。詳細には、皮内で、基底ケラチン生成細胞が免疫学的活性化されるとＩＣＡＭ−１を発現し、これは乾癬の特徴の１つである好中球およびＣＤ８−Ｔ細胞の表皮内への浸潤を増強する可能性がある。そこで、ＨＯ／０２／１０が皮膚内でのＩＣＡＭ発現に及ぼす作用をｉｎ  ｖｉｖｏでの創傷炎症性状況において免疫組織化学によって試験した。
【０１１３】
皮膚炎症において活性化されたケラチン生成細胞および内皮細胞のダウンレギュレーション（ＩＣＡＭ−１染色）が観察された。２ｃｍの縦切開をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの上背部で実施した。創傷後、このマウスの皮膚に無菌パッドを縫合した。動物は、毎日、ＨＯ／０２／１０を用いて処置した（ｎ＝１２）。創傷の５日後、炎症期がそのピークに達した時点で、マウスを犠牲にし、皮膚組織をパラフィン包埋し、抗ＩＣＡＭ−１抗体を利用して免疫組織化学的染色を実施した。
【０１１４】
図１２に示したように、ＨＯ／０２／１０は、皮膚の血管内の基底ケラチン生成細胞および内皮細胞上でのＩＣＡＭ発現を劇的に減少させる。この作用は、用量依存性であることが証明され、最大作用は１０μｇ／mlで証明された。
【０１１５】
図１３は、皮膚炎症における活性化されたケラチン生成細胞および内皮細胞のダウンレギュレーション（ＩＣＡＭ−１染色）を示す追加の染色を示している。上述したように、２ｃｍの縦切開をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの上背部で実施した。創傷後、このマウスの皮膚に無菌パッドを縫合した。動物は、毎日回ＭＰＤＹ−１を用いて処置した（ｎ＝６）。創傷の５日後、炎症期がそのピークに達した時点で、マウスを犠牲にし、皮膚組織をパラフィン包埋し、抗ＩＣＡＭ−１抗体を利用して免疫組織化学的染色を実施した。
【０１１６】
図１４は、両創縁部で陽性ＩＣＡＭ−１染色を示すマウスのパーセントを比較しているヒストグラムである。
【０１１７】
ＭＰＤＹ−１がマクロファージ浸潤に及ぼす作用もまたＩｂａ−１染色によって証明された。Ｉｂａ−１は、マクロファージのための一般的マーカーである。図１５は、Ｉｂａ−１陽性染色細胞の１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。上述したように、２ｃｍの縦切開をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの上背部で実施した。創傷後、このマウスの皮膚に無菌パッドを縫合した。動物は、毎日ＭＰＤＹ−１を用いて処置した（ｎ＝６）。創傷の５日後、炎症期がそのピークに達した時点で、マウスを犠牲にし、皮膚組織をパラフィン包埋し、抗Ｉｂａ−１抗体を利用して免疫組織化学的染色を実施した。ＭＰＤＹ−１がマクロファージ浸潤に及ぼす用量依存性作用が観察された。
【０１１８】
ＭＰＤＹ−１がマクロファージ活性化に及ぼす作用もまたＭＡＣ−２染色によって証明された。ＭＡＣ−２は、活性化されたマクロファージのための特異的マーカーである。図１６は、一連のＭＡＣ−２染色および陽性ＭＡＣ−２染色を示している１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。上述したように２ｃｍの縦切開を実施した。動物は、毎日、ＤＰＢＳ−／−（コントロール）または規定濃度のＭＰＤＹ−１を用いて処置した（ｎ＝６）。５日後に、免疫組織化学的染色は、抗ＭＡＣ−２抗体を利用して実施した。バー１μｍ。（＊ｐ（コントロール対ＭＰＤＹ−１  １０μｇ）＝０．００２８）。マクロファージの活性化は、ＭＰＤＹ−１処置後、有意に阻害された。
【０１１９】
ＭＰＤＹ−１はさらに、図３２に示したように、用量依存様式によりケラチン生成細胞内でＴＮＦα誘導性ＩＫＫ活性化を有意に減少させることも証明された。マウス一次ケラチン生成細胞は、低Ｃａ＋２ＭＥＭ中で完全コンフルエンスまで４日間増殖させた。細胞は、ＴＮＦα誘導に先行して、図に記載したように１時間にわたり指定濃度のＭＰＤＹ−１を用いて前処置した。ＭＰＤＹ−１前処置後、細胞は１５分間ＴＮＦα  ３５ｎｇ／mlとともにインキュベートした。反応は、氷温ｄＰＢＳ−／−を添加することにより停止させ、ケラチン生成細胞は、ＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズした。サンプルは、リン−ＩＫＫａ／ｂ（Ｓｅｒ１７６／１８０抗体）を利用して、ＳＤＳ  ＰＡＧＥウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）分析にかけた。ＭＰＤＹ−１を用いた前処置はケラチン生成細胞内のＴＮＦα誘導性ＩＫＫ活性化を用量依存様式で有意に減少させたが、この時、最低ＭＰＤＹ−１濃度（０．１ｍｇ／ml）は最強の阻害を示し、したがってＮＦｋＢ活性化を抑制した。
【０１２０】
上記で考察したように、ＨＯ／０２／１０はさらに活性化されたケラチン生成細胞およびマクロファージからのサイトカイン分泌を減少させることも証明された。近年、免疫成分および皮膚成分の両方が乾癬の病因の基礎にある周期へ同等に寄与することが見いだされた。常在皮膚細胞および免疫学的細胞（常在細胞および浸潤細胞の両方）は、細胞−細胞相互作用およびサイトカイン分泌によって炎症性乾癬プロセスにおいて相互作用する。そこで、ＨＯ／０２／１０がケラチン生成細胞および免疫細胞、例えばマクロファージおよび樹状細胞両方からの前炎症性、化学走化性および免疫学的経路関連サイトカインの分泌へ及ぼす直接作用を試験した。図１７および１８に示した結果は、ＨＯ／０２／１０がケラチン生成細胞およびマクロファージからの免疫関連サイトカイン類、例えばＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−２およびＫＣの分泌をダウンレギュレートすることを証明している。
【０１２１】
図１７の結果は、ケラチン生成細胞内のサイトカイン分泌にＨＯ／０２／１０が及ぼす作用を示している。ケラチン生成細胞は、新生仔Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来した。細胞は、２４ウエルプレート内で５日間インキュベートした。細胞は、次にＤＰＢＳ−／−、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ml）、またはＨＯ／０２／１０（１μｇ／ml）＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ml）を用いて処置した。分泌されたサイトカインを含有する培地を４８時間後に収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを使用して分析した。
【０１２２】
図１８の結果は、マクロファージ内のサイトカイン分泌をＨＯ／０２／１０がダウンレギュレートすることを示している。骨髄細胞は、Ｂ６マウスに由来した。細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ml）の存在下で６日間インキュベートし、次にＤＰＢＳ−／−、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ml）またはＨＯ／０２／１０＋ＬＰＳ（各々、１μｇ／mlおよび１００ｎｇ／ml）を用いて処置した。
【０１２３】
その他のペプチドＰＫＣα阻害因子は、さらに活性化されたケラチン生成細胞およびマクロファージからのサイトカイン分泌を減少させることも証明された。図１９〜２３は、ペプチド阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＭＰＤＹ−１ｓｈ（配列番号１２）およびＰＤＹ−１（配列番号１３）は、ＬＰＳおよびＴＮＦα活性化ケラチン生成細胞からのサイトカイン分泌を減少させることを示している。図２４〜２７は、ペプチド阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＭＰＤＹ−１ｓｈ（配列番号１２）およびＰＤＹ−１（配列番号１３）は、ＩＬ−１７Ａ活性化ケラチン生成細胞からのサイトカイン分泌を減少させることを示している。
【０１２４】
表３は、ＨＯ／０２／１０についてのサイトカインの役割および起源に関する結果を要約している。
【０１２５】
【表３】
2013516500.tif 000005
【０１２６】
様々なその他のＰＫＣα阻害因子は、さらに活性化されたケラチン生成細胞におけるサイトカイン分泌を減少させることも証明された。それらの作用を決定するために、ケラチン生成細胞を、新生仔ＢＡＬＢ／Ｃマウス皮膚に由来した。細胞は、２４ウエルプレート内で５日間インキュベートした。細胞は次に、コントロールとしてのＰＢＳ−／−とともにインキュベートした、またはＬＰＳ、ＴＮＦα、もしくはＩＬ−１７によって刺激した。ＰＫＣα阻害因子は指示どおりに加えた。分泌されたサイトカインを含有する培地を４８時間後に収集し、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。図５０は、サイトカイン分泌の表にまとめた概要である。ＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）、ＡＩＰ−２（配列番号８）、ＡＩＰ−１（配列番号９）、ＡＷＯＴ（配列番号７）およびＰＰＤＹ−１（配列番号１０）は、全てケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌の減少に効果的であることが証明された。
【０１２７】
ＨＯ／０２／１０もまた、皮膚へのＴ細胞浸潤を軽減することが証明された。ＨＯ／０２／１０がＴ細胞浸潤に及ぼす作用は、抗ＣＤ３特異的染色を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【０１２８】
図２８から明らかなように、ＨＯ／０２／１０は、炎症期中に真皮および表皮へのＴ細胞浸潤をダウンレギュレートした。詳細には、ＨＯ／０２／１０は、同様に乾癬斑に特徴的な更なる抗炎症特性を示す表皮内へのＴ細胞浸潤を阻害した。上述したように２ｃｍの縦切開を実施した。動物は、毎日ＨＯ／０２／１０を用いて処置した（ｎ＝１２）。９日後、免疫組織化学的染色は、抗ＣＤ３抗体を利用して実施した。図２８Ｂは、ＣＤ３に対して陽性染色された１視野当たりの細胞数を比較しているヒストグラムである。この作用は、１μｇ／mlおよび１０μｇ／mlの濃度で統計的有意であったが、１μｇ／mlの処置は１０μｇ／mlより強度の作用を証明している。
【０１２９】
ＨＯ／０２／１０もまた、皮膚への好中球浸潤を軽減することが証明された（図３１）。ＨＯ／０２／１０が好中球浸潤に及ぼす作用は、好中球特異的染色を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。上述したように２ｃｍの縦切開を実施した。動物は、毎日、ＤＰＢＳ−／−（コントロール）または規定濃度のＰＫＣαを用いて処置した（ｎ＝６）。５日後、マウスを犠牲にし、皮膚組織をパラフィン中に包埋し、好中球に対する免疫組織化学的染色を実施した。用量依存性傾向が観察されたが、結果は統計的有意ではなかった。
【０１３０】
ＰＫＣδ活性化因子もまたケラチン生成細胞および脾細胞に及ぼす抗炎症作用を有することが証明された。ケラチン生成細胞は、新生仔ＢＡＬＢ／Ｃマウス皮膚に由来した。細胞は、２４ウエルプレート内で５日間インキュベートした。細胞は次に、コントロールとしてのＰＢＳ−／−とともにインキュベートした、またはＬＰＳもしくはＴＮＦαによって刺激した。ＰＫＣδ阻害因子ＤＡＰ−１（配列番号３４）を加えた。分泌されたサイトカインを含有する培地を４８時間後に収集し、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。図４３は、ＬＰＳを用いて刺激したケラチン生成細胞内でのサイトカイン分泌を示している表による概要である。図４４は、ＴＮＦαを用いて刺激した脾細胞内でのサイトカイン分泌を示している表による概要である。ＤＡＰ−１は、ケラチン生成細胞および脾細胞の両方で炎症性サイトカインの分泌を有意に減少させることが証明された。
【０１３１】
ＰＫＣε阻害因子もまた、ケラチン生成細胞に抗炎症作用を有することが証明された。ケラチン生成細胞は、新生仔ＢＡＬＢ／Ｃマウス皮膚に由来した。細胞は、２４ウエルプレート内で５日間インキュベートした。細胞は次に、コントロールとしてのＰＢＳ−／−とともにインキュベートした、またはＬＰＳもしくはＴＮＦαによって刺激した。ＰＫＣε阻害因子ＥＰＩＰ−１（配列番号２０）、ＥＰＩＰ−２（配列番号２１）、またはＥＰＩＰ−４（配列番号２３）を加えた。分泌されたサイトカインを含有する培地を４８時間後に収集し、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。図４５〜４８は特異的サイトカインの分泌についての結果を示しており、図４９は様々なＰＫＣε阻害因子についてのサイトカイン分泌の表による概要である。ＰＫＣε阻害因子の幾つかは、ケラチン生成細胞における炎症性サイトカインの分泌を有意に減少させることが証明された。
【０１３２】
要約すると、炎症および炎症性疾患のための効果的療法としてのそれらの使用に関係しているＰＫＣアイソフォーム阻害因子および活性化因子の作用機序を決定した。そのようなペプチドは、炎症性プロセスの様々な工程において様々な細胞タイプ動員および活性化に示差的に影響を及ぼすことによって、１）末端分化を減少させることにより表皮分化マーカーの発現を正常化する、２）異常過剰増殖を軽減する、３）皮膚構造を調節し、皮膚強度を増強する、および／または４）炎症をダウンレギュレートすることが証明された。
【０１３３】
図３０は、本開示のＰＫＣアイソフォーム阻害因子および活性化因子が皮膚炎症および乾癬関連経路に及ぼす全体的作用を示すスキームを図示している。このスキームは、阻害因子および活性化因子が皮膚内の様々な細胞タイプおよび炎症段階に及ぼす阻害作用を要約している。ＰＫＣアイソフォーム阻害因子および活性化因子は、常在皮膚免疫細胞による前炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦα）の分泌を阻害する。したがって、内皮細胞およびケラチン生成細胞活性化における減少が達成され、結果、ＩＣＡＭ−１発現の有意な減少、ケモカイン分泌および好中球、マクロファージ、およびＴ細胞を包含する炎症部位への白血球浸潤の減少が生じる。どちらも乾癬における主要経路であるＴｈ１およびＴｈ１７経路の発達および進行に関与するサイトカインもまた、ダウンレギュレートされた。
【実施例７】
【０１３４】
ＰＫＣαおよびＰＫＣη阻害因子を用いた多発性硬化症の治療
多発性硬化症の動物モデル：ＣＮＳ組織は容易にはサンプリングされないため、疾患機序に関する情報を獲得するために、多数のモデルが開発され、文献において一般に使用されている。これらのモデルには、報告によれば、ＭＳの臨床状態および病理を模倣するミエリン突然変異体、化学的に誘導された病変、ウイルスおよび自己免疫モデルが包含される（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＡＣＮＲ  ６（６）：１０−１２）。モデルの中でも、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、報告によればＭＳのために最も一般的に使用されるモデルである（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＡＣＮＲ  ６（６）：１０−１２）。
【０１３５】
多発性硬化症の自己免疫モデル：実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、明らかにＭＳ疾患および進行のモデルとして最も注目を受けており、ＭＳのための治療戦略を試験する際にルーチン的に使用されている（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＡＣＮＲ  ６（６）：１０−１２）。
【０１３６】
この疾患モデルはＭＳの多数の臨床的および組織学的特徴を示し、報告によればＣＮＳにおいて自然に、または人工的のいずれかで発現する抗原への自己免疫の誘導によって誘発される（Ｌａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＩＳＢＮ  ０−３８７−２５５１７−６；およびＯｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｄｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  ９８：７７−８９）。ミエリン抗原への感作後、動物は、四肢麻痺を典型とする疾患を発生すると思われる。これには、血液脳関門機能障害、結果として神経伝達障害を生じさせるＣＮＳおよび伝導ブロック内への単核球浸潤が関連している。
【０１３７】
ＥＡＥは、感受性および臨床経過が免疫抗原および調査対象の動物の血統／種に依存して変動すると思われる多遺伝子性である。小さなミエリンタンパク質であるＭＯＧは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて慢性麻痺性ＥＡＥを誘導すると思われる。ＥＡＥは、単一モデルではなく、ＭＳと類似する程度の様々な病理を提示する多数のモデルである（Ｌａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＩＳＢＮ  ０−３８７−２５５１７−６）。
【０１３８】
数種のＰＫＣ阻害因子がＥＡＥマウスの発達および臨床状態に及ぼす作用を試験するために、以下の実験プロトコールを利用する様々な試験を実施した。詳細には、ペプチドＰＫＣα阻害因子ＭＰＤＹ−１（配列番号６）およびペプチドＰＫＣη阻害因子ＭＰＥ−１（配列番号２８）を評価した。
【０１３９】
試験には、雌性８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。群の総数は７であった（ｎ＝７／群）。動物の総数は４９匹であった。麻酔後、マウスをＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡにより免疫した。マウスは、３００μｇの結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔ）Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）を補給した２００μｇのＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡを用いて側腹部への皮下（ｓ．ｃ．）注射により免疫した。百日咳毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ：ＰＴＸ）は、免疫時および４８時間後に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。追加免疫の必要性は、合成ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた予備キャリブレーション実験（マウス２０匹）に基づいて決定した（処置実験に先行してキャリブレーション手順として実施した）。
【０１４０】
処置は、以下の通りに投与した。免疫当日に開始し、マウスは週３回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（２００μl／注射）によって処置した。
【０１４１】
臨床観察およびスコア判定は、４９日間の観察期間、６日間／週で実施した。体重は、免疫前およびその後は週２回測定した。有効ＥＡＥは、以下の表４に示したようにマウスの定量可能な臨床所見に依存して０〜６のスケール上でスコア付けした。
【０１４２】
【表４】
2013516500.tif 000006
【０１４３】
マウス群は、表５に示したように処置した。
【０１４４】
【表５】
2013516500.tif 000007
【０１４５】
結果は、図３３〜３７に提示し、要約した。
【０１４６】
図３３から明らかなように、ＭＰＤＹ−１  ０．１ｍｇ／ｋｇを用いて処置されたマウスは、コントロール群より２日後、実験の第１３日目に疾病の徴候を示し始めた。ＭＰＤＹ−１  ０．１ｍｇ／ｋｇ群のマウスは、ほとんどの実験期間中にコントロール群のマウスと比較して低いスコアを示した。さらにＭＰＤＹ−１  ０．１ｍｇ／ｋｇ群およびＭＰＥ−１  ０．１ｍｇ／ｋｇ群のマウスは実験期間中に１匹も死ななかったが（スコア６）、他の全群では時間の経過に伴ってマウスが死んだ（コントロール群−最初のマウスは実験第３４日目に死亡し、もう１匹は第３５日目に死んだ）。全マウスの死亡の要約は、以下の表６に提示した。
【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
特定時点での図３３〜３７から引き出されたスコアの概要は、表７に示した。
【０１４９】
【表７】
2013516500.tif 000009
【０１５０】
処置の第４群および第６群は、実験の第４９日目までの無死亡数を包含する、疾患の臨床症状の発生への耐性を示している。０．１μｇ／ml（第４群）の濃度でのＭＰＤＹ−１およびＭＰＥ処置はＥＡＥの重症度を低下させ、コントロール動物における疾患の後期に観察された致死性ＥＡＥからマウスを保護したので、そこで実験終了時（第４２日目）での平均群スコア（１．９３のＭＰＤＹ−１、２．００のＭＰＥ−１）の平均コントロール群スコア（２．８６）より下方への低下を生じさせた。０．１μｇ／mlの濃度でのＭＰＤＹ−１処置は、コントロール群と比較してＥＡＥ比較の発生の臨床状態の２日間の遅延を誘導した。このため、ＭＰＤＹ−１およびＭＰＥは、ＭＳの治療のための効果的薬剤であると証明されたと思われた。
【実施例８】
【０１５１】
掻痒症治療のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
図３８に示したように、掻痒症を評価するためにヒスタミンを利用する皮刺試験モデルを開発した。個々の被験体の前腕に、ヒスタミン溶液およびプラセボを注射した。実施例４の製剤は、様々な濃度でＭＰＤＹ−１とともに局所的に適用し、図３９〜４２に示したように掻痒症を時間の経過に伴って評価した。
【０１５２】
この試験は、可能性のあるアレルゲンを含有する溶液の液滴を皮膚上に配置し、一連の引っ掻き傷または針穿刺により溶液の皮内進入を可能にする。抽出液は、細針（例えば、２６Ｇディスポーザブル針）を使用して皮膚の外層（表皮）内に進入させる。この試験は非有痛性であり、一般には針は皮膚の表面を引っ掻くだけであるので、出血を伴うことがない。皮膚が赤く盛り上がった痒い領域（膨疹と呼ばれる）を発生した場合、これはそのアレルゲンに対するアレルギー反応の結果である。これは陽性反応と呼ばれている。抽出物の液滴は細針（例えば、Ｎｏ．２６のディスポーザブル針）を通して導入する。この試験は不快感を引き起こさず、生じさせる外傷は極めて小さいので、コントロールおよび陰性試験は、たとえ示しても穿刺部位しか示さない。
【０１５３】
２６Ｇ針を利用してヒスタミンストック液（Ｈｉｓｔａｔｒｏｌ陽性コントロールヒスタミン、１ｍｇ／ml、コード番号ＨＩＳＴ１４９９９Ｖ、Ｔｒｕｐｈａｒｍ社）を導入した。本試験は、二重盲験無作為化試験において健常志願者を対象に実施した。製剤は、前腕に適用された。３カ所の処置領域を選択し、マーキングした（肘から手首までの前腕の表面を近位、中部および遠位３分の１に横に分割した）、これらの領域を下記の処置前に穿刺した。
【０１５４】
１つの領域は、二重盲験法により活性製剤で１０分間処置し、Ａとマーキングした。
【０１５５】
１つの領域は、二重盲験法によりプラセボで１０分間処置し、Ｃとマーキングした。
【０１５６】
カラー写真は、０（Ｔ０）、１０、２０、３０分後の時点に撮影した。
【０１５７】
掻痒症のアンケートには、処置の５および１５分後に被験体に回答してもらった。
【０１５８】
１つの試験では、３人の被験体を表８および９に示した処置で試験した。
【０１５９】
【表８】
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【０１６０】
【表９】
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【０１６１】
被験体に掻痒感覚記入様式を提供し、様々な時間間隔で感じた掻痒レベルを０（反応なし）〜４（制御不能な掻痒症）で示すように求めた。結果は、下記の表１０に示した。
【０１６２】
【表１０】
2013516500.tif 000012
【０１６３】
さらに、図３９〜４２で明白なように、ＭＰＤＹ−１の投与は、コントロールと経時的に比較して、発赤、炎症および掻痒を有意に軽減した。
【０１６４】
本開示の課題を上記の実施例を参照して記載してきたが、変更態様および変形態様が本開示の真意および範囲内に含まれることを理解されたい。したがって、本開示は以下の特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【実施例９】
【０１６５】
インスリンおよびＰＫＣα阻害因子を組み合わせると、インスリン単独処置によって誘発される有害な副作用を回避する。
【０１６６】
創傷は、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背部に切開によって作製し、７日間にわたり１日１回ビヒクル（ＰＢＳ）コントロールまたは１μＭインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社、米国）もしくは１μＭインスリンと１μＭの配列番号６のＰＫＣα阻害因子との混合物のいずれかで処置した。創傷の７日後、全マウスを犠牲にし、処置した創傷を表皮の増殖能力（増殖性細胞核抗原−ＰＣＮＡ）、血管新生、炎症、表皮細胞および創傷間隙でのリモデリングプロセスについて組織学的に分析した。
【０１６７】
表１１に示したように、インスリン単独処置は、ＰＢＳコントロールと比較して、創傷領域内の異常な血管新生の発生率の実質的増加を誘発した（各々、６０％および２５％）。創傷治癒プロセスは急速に増殖する表皮細胞を包含するので、そのような増加した血管新生は正常顆粒組織の形成を遅延させることによる創閉鎖欠陥のリスクを増加させる可能性もある。他方、インスリンが配列番号６のＰＫＣα阻害因子と結合された場合、処置された創傷領域内で異常な血管新生は観察されなかった。
【０１６８】
【表１１】
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【０１６９】
さらにインスリン単独処置は、増加した炎症、表皮細胞の過形成、表皮細胞の有棘層の遅延性分化および瘢痕形成の増加を生じさせた。インスリン単独処置の結果として生じた有害な副作用は、ＰＫＣα阻害因子がインスリンと組み合わされた場合、全く観察されなかった。
【実施例１０】
【０１７０】
ＰＫＣα阻害因子は創傷炎症を減少させる。
【０１７１】
創傷における後期および重度の炎症反応は治癒プロセスを抑制する可能性があるため、そこでそのような炎症の発生の予防は創傷治癒プロセスを促進できる。そこで、ＰＫＣα阻害因子ＨＯ／０２およびインスリンが創傷炎症に及す作用を下記の実験において試験した。
【０１７２】
創傷はＣ５７ＢＬマウスの背部上で切開によって作製し、７日間にわたり毎日、（ｉ）ＰＢＳ、コントロール、（ｉｉ）１μＭの配列番号６のＰＫＣα阻害因子、（ｉｉｉ）１μＭのインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社、米国）、または（ｉｖ）１μＭ  ＰＫＣα阻害因子と１μＭインスリンとの混合物を用いて処置した。創傷の７日後、全マウスを犠牲にし、処置した創傷を顕微鏡下で炎症について観察した。創傷領域で観察された、結果として生じた重度炎症の発生率は、表１２に要約した。
【０１７３】
図１２に示したように、創傷へのＰＫＣα阻害因子の投与は、コントロールと比較して、重度創傷炎症発生率の実質的な（３３．３％の）減少を引き起こした。インスリン単独は、実験条件下で抗炎症作用を有していなかった。
【０１７４】
【表１２】
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【０１７５】
これらの結果は、ＰＫＣα阻害因子を療法に使用すると、創傷の重度炎症を制御できることを示している。配列番号６のＰＫＣα阻害因子が炎症を減少させる実証済みの能力は、表皮閉鎖、皮膚閉鎖および表皮細胞の空間分化を促進する能力と結合すると、創傷治癒のために潜在的に最も効果的な治療薬となる。
【実施例１１】
【０１７６】
ＳＴＺ−誘導性糖尿病マウスの創傷治癒におけるＰＫＣａ阻害因子ＨＯ／０２と組み合わせたインスリンの有効性
全層皮膚切開（２０ｍｍ）は、麻酔をかけて、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）注射（１７５ｍｇ／ｋｇ（体重））糖尿病性、クエン酸緩衝液緩衝液注射（６マウス／群）非糖尿病性、および未注射（６マウス／群）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの上背部上で実施した。定期的血糖モニタリングは、ＳＴＺ注射後の尾静脈からの血糖値を測定することによって実施した。４５０ｍｇ／ｄＬ超の血糖レベルを示すマウスだけを試験に取り入れた。切開後、ＳＴＺ誘導性糖尿病性創傷は、毎日ＰＢＳ（７／６マウス／群）、インスリン（０．１単位／ml）（６マウス／群）、配列番号６のＰＫＣａ阻害因子（１μｇ／ml）（７／５マウス／群）またはインスリン＋配列番号６のＮ−ミリストイル化ＰＫＣα阻害因子を含有する製剤（本明細書ではＨＯ／０３／０３と命名した）（７／６マウス／群）の外科的包帯材への直接的適用によって処置した。生検標本は、創傷の９日後に採取した。創傷は、組織学および免疫組織化学検査によって創傷−治癒パラメータを評価するために安楽死させた動物から切除した。
【０１７７】
創傷は、ケラチン１４染色によって表皮閉鎖について評価した。創傷は、完全表皮染色が創傷間隙を越えて観察された場合に閉鎖したと見なした。Ｈ＆Ｅ染色を利用して固定視野×１００の倍率で両方の皮膚の縁を視認できた場合に皮膚収縮と見なした。上皮分化は、ケラチン１染色によって評価した。全創傷間隙を越えて陽性染色を示した創傷は、分化している（Ｋ１陽性である）と見なした。
【０１７８】
表１３に示したように、ＳＴＺ誘導性糖尿病性動物は、創傷治癒欠陥であった。糖尿病性処置、未処置および非糖尿病性マウスにおける重要な創傷治癒パラメータの比較は、製剤ＨＯ／０３／０３処置群が相乗的治癒作用を示すことを解明した。相乗作用は、表皮閉鎖（７１％対１７％（糖尿病性コントロール、ｐ＜０．０５）、表皮分化（２８％対０％）および皮膚収縮（３３％対０％）を包含する全ての臨床的治癒段階において明白であった。
【０１７９】
皮下組織の組織化を、両方の創縁部の皮下組織の存在（または非存在）によって評価した。顆粒組織形成は、創傷床における線維芽細胞およびコラーゲン線維の存在によって評価した。創傷は、顆粒組織の連続相が創傷間隙内に存在した場合に顆粒組織形成に対して陽性であると見なした。さらに、本発明者らは、糖尿病性創傷の重度炎症を特徴付ける３種の特異的組織学的パラメータを規定した。（ｉ）創傷領域での膿瘍形成、（ｉｉ）過度の白血球増加症（固定視野内で＞１００細胞（×２００））、および（ｉｉｉ）固定視野内で示された血管内での高い白血球（ＷＢＣ）／赤血球（ＲＢＣ）比（×２００）。創傷間隙にこれらのパラメータ中少なくとも２つが存在する場合、創傷は重度に炎症していると見なされる。
【０１８０】
【表１３】
2013516500.tif 000015
【０１８１】
結果は、各群における創傷のパーセントとして提示した。
【０１８２】
【表１４】
2013516500.tif 000016
【０１８３】
結果は、各群における創傷のパーセントとして提示した。
【０１８４】
表１４に示したように、糖尿病性動物は、他の創傷治癒パラメータにおける障害、例えば創縁部での皮下組織の組織化、炎症および顆粒組織形成を示した。糖尿病関連の治癒パラメータ障害は、創傷間隙縁での皮下組織の組織化（４３％対２５％）および顆粒組織形成（８６％対４２％）によって証明されるように、製剤ＨＯ／０３／０３を用いた処置によって補正された。ＨＯ／０３／０３を用いた処置は、創傷間隙における炎症反応（２８％対６７％）を減少させた。製剤単独（インスリンまたは配列番号６のペプチド）の治癒有効性は、部分的治癒作用しか示さなかった。
【０１８５】
上記に要約した結果は、製剤ＨＯ／０３／０３が多数の治癒パラメータにおける糖尿病関連治癒障害の克服に相乗作用を示すことを証明している。
【実施例１２】
【０１８６】
ブタ皮膚モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの創傷治癒におけるＰＫＣα阻害因子ＨＯ／０２と組み合わせたインスリンの有効性
数件の創傷治癒試験は、創傷治癒プロセスならびに製剤ＨＯ／０３／０３の治癒作用についてさらに理解するためにブタモデル系で実施した。
【０１８７】
全層（full tickness）の３５〜４０ｍｍの皮膚切開は、麻酔した雌性ブタ（５カ月齢、６０〜７０ｋｇ）の背部上で実施した。１０カ所の対称的切開を背骨から等間隔で背部領域の両側で実施した（計２０創傷）。創傷は毎日、１日２回、１mlのＰＢＳ（１０例／群）またはインスリン０．１単位および配列番号６のＮ−ミリストイル化ＰＫＣα阻害因子１μｇ／ml（１０例／群）を含有する製剤（本明細書ではＨＯ／０３／０３と称した）の創傷領域への直接投与によって処置した。創傷は犠牲にした動物から創傷７および２２日後に切除し、形態学的、組織学的および免疫組織化学的評価を実施した。
【０１８８】
表１５に示したように、製剤ＨＯ／０３／０３を用いた処置は、治癒の早期に表皮の移動および顆粒組織の形成に影響を及ぼすことによって創傷治癒を促進する。さらに、これらの創傷は大きく、環境病原菌からの感染（動物は無菌状態には維持されない）に曝される可能性があるが、ＨＯ／０３／０３は創傷間隙での炎症反応の軽減を促進し、したがって、創傷治癒を促進する。
【０１８９】
【表１５】
2013516500.tif 000017
【０１９０】
【表１６】
2013516500.tif 000018
として提示した。
【０１９１】
進行した治癒段階を試験すると、ＨＯ／０３／０３処置創傷は、加速された治癒をさらに示す。表１６に示したように、表皮閉鎖では差は認められなかったが、皮膚収縮および表皮分化は処置した創傷において有意に高かった。これらの創傷が同一動物上で実施され、このため処置が顕著な治癒作用に寄与したことを強調することは重要である。
【０１９２】
上記に要約した結果から、製剤ＨＯ／０３／０３が、創傷治癒段階の早期ならびに後期における治癒パラメータに影響を及ぼして、ブタ皮膚モデルにおける加速された治癒を促進することは容易に理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
2013516500.tif 000036
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
2013516500.tif 000040
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
2013516500.tif 000043
【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013516500.tif 000114