(57)【要約】  Ｋ−Ｒａｓのレベルが正常な甲状腺細胞に比べて高いことを特徴とする甲状腺がんを治療する医薬組成物および方法が開示される。この方法は、甲状腺がん患者に、治療有効量のＦＴＳ（ファルネシルチオサリチル酸またはサリラシブ）またはＦＴＳアナログを含む医薬組成物を投与することを伴う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要のある患者における甲状腺がんの治療方法であって、患者に、治療有効量の式
【化１】
2013508450.tif 000003
［式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはアルケニルであり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキルを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す］により表されるＲａｓアンタゴニストを投与するステップを含み、ここで前記甲状腺がんはＫ−Ｒａｓのレベルが高いことにより特徴づけられる、方法。
【請求項２】
前記ＲａｓアンタゴニストがＦＴＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、５−クロロ−ＦＴＳ、５−フルオロ−ＦＴＳ、ＦＴＳ−メチルエステル、ＦＴＳ−アミド、ＦＴＳ−メチルアミド、ＦＴＳ−ジメチルアミド、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるＦＴＳアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与が経口的である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記Ｒａｓアンタゴニストを、錠剤またはカプセル剤である経口剤形で投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記甲状腺がんが乳頭状甲状腺癌である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記甲状腺がんが濾胞性甲状腺癌である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記甲状腺がんが未分化甲状腺癌である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
式
【化２】
2013508450.tif 000004
［式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはアルケニルであり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキルを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す］により表され、必要のある患者において甲状腺がんの治療に使用するための有効量のＲａｓアンタゴニストであって、前記甲状腺がんはＫ−Ｒａｓのレベルが高いことにより特徴づけられる、有効量のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記ＲａｓアンタゴニストがＦＴＳである、請求項９に記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、５−クロロ−ＦＴＳ、５−フルオロ−ＦＴＳ、ＦＴＳ−メチルエステル、ＦＴＳ−アミド、ＦＴＳ−メチルアミド、ＦＴＳ−ジメチルアミド、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるＦＴＳアナログである、請求項９に記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１２】
投与が経口的である、請求項９から１１のいずれかに記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１３】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、錠剤またはカプセル剤である経口剤形で投与される、請求項４に記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１４】
前記甲状腺がんが乳頭状甲状腺癌である、請求項９から１３のいずれかに記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１５】
前記甲状腺がんが濾胞性甲状腺癌である、請求項９から１３のいずれかに記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１６】
前記甲状腺がんが未分化甲状腺癌である、請求項９から１３のいずれかに記載のＲａｓアンタゴニスト。
【請求項１７】
必要のある患者において甲状腺がんを治療するための医薬組成物であって、式
【化３】
2013508450.tif 000005
［式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはアルケニルであり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキルを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す］により表されるＲａｓアンタゴニストを含み、ここで前記甲状腺がんはＫ−Ｒａｓのレベルが高いことにより特徴づけられる、医薬組成物。
【請求項１８】
前記ＲａｓアンタゴニストがＦＴＳである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、５−クロロ−ＦＴＳ、５−フルオロ−ＦＴＳ、ＦＴＳ−メチルエステル、ＦＴＳ−アミド、ＦＴＳ−メチルアミド、ＦＴＳ−ジメチルアミド、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるＦＴＳアナログである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記組成物が経口投与に適するものである、請求項１７から１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記Ｒａｓアンタゴニストが、錠剤またはカプセル剤である経口剤形の形態である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記甲状腺がんが乳頭状甲状腺癌である、請求項１７から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記甲状腺がんが濾胞性甲状腺癌である、請求項１７から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記甲状腺がんが未分化甲状腺癌である、請求項１７から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その開示を引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００９年１０月２６日出願の米国仮特許出願第６１／２５４，８７９号の出願日の権益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
濾胞性甲状腺癌は、最も一般的な内分泌悪性腫瘍である［Ｈｕｎｄａｈｌら、Ｃａｎｃｅｒ  ８３（１２）：２６３８〜４８（１９９８）、Ｐｅｒｋｉｎら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５５（２）：７４〜１０８（２００５）］。甲状腺癌の９５％より多くは、濾胞細胞由来である。濾胞上皮細胞由来である大部分の癌腫は、放射性ヨウ素アブレーションを併用するかまたは併用しない手術によって、効果的に管理することのできる無痛性腫瘍である。しかし、こうした腫瘍のある特定の亜集団は、侵襲性の挙動を示す場合があり、現在は有効な治療形態がない［Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｉ．、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１（９３５６）：５０１〜１１（２００３）、Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３８（５）：２９７〜３０６（１９９８）］。
【０００３】
濾胞性甲状腺癌は、組織学的および臨床的パラメータを基準として高分化型から未分化型に及ぶ幅広い範囲の腫瘍を包含する［Ｒｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１（４）：３８９〜９６（１９９９）、Ｈｕｎｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２７（１２）：１５５９〜６４（２００３）］。高分化甲状腺癌には、乳頭状（ＰＴＣ）および濾胞性（ＦＴＣ）のタイプが含まれる。これらの癌は、一般に予後が良好である。対照的に、未分化型または退形成性の甲状腺癌（ＡＴＣ）は、侵襲性が高く、予後が極めて不良である［Ｃｈｉａｃｃｈｉｏら、Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３３（４）：３４１〜５７（２００８）、Ｓｉｐｏｓら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ９（１５）：２６２７〜３７（２００８）］。ＡＴＣでは、急速に拡大する頚部腫瘤が生じるが、これは、近接した組織を侵し、身体の異なる部分、特に骨中に転移する。現在、未分化甲状腺癌の有効な治療はない。手術、化学療法、および放射線療法は、生存率の向上を図って実施される従来の治療戦略である。手術は、多くの患者で実現可能でなく、手術の実施可能性は、一連の報告にわたって１７〜６５％とまちまちである［Ａｈｕｊａら、Ｊ．ｅ  ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０（３）：３０３〜１０（１９８７）］。ＡＴＣは、性質が侵襲性であり、全身に広がる恐れがあるために、ドキソルビシンを始めとする多くの異なる化学療法計画が試されているが、ドキソルビシンは、良くても２２％の部分寛解率しか示していない。生存は、通常は１年以内と診断される［Ｋｅｂｅｂｅｗら、Ｃａｎｃｅｒ  １０３（７）：１３３０〜５（２００５）］。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第一の態様は、Ｋ−Ｒａｓのレベルが正常な甲状腺細胞に比べて高いことを特徴とする甲状腺がんの患者の治療方法に関する。この方法は、本明細書に記載される式によって共に規定される、治療有効量のファルネシルチオサリチル酸（本明細書においてＦＴＳまたはサリラシブとも称される）またはＦＴＳアナログと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を、患者に投与するものである。これらの方法を実施する際に使用する組成物、ならびにその製造方法も提供される。
【０００５】
本発明者らは、乳頭状甲状腺癌、濾胞性甲状腺癌、および未分化甲状腺癌などの、Ｋ−Ｒａｓレベルが高いことを特徴とする甲状腺がんが、Ｓ−トランス，トランス−ファルネシルチオサリチル酸およびそのアナログなどの種々のＲａｓアンタゴニストで治療できることを発見した。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳが、Ｇａｌ−３タンパク質のレベルが高い甲状腺濾胞細胞の成長を抑制することを示す棒グラフである。図１Ａは、比較的低い血清濃度（５％）の存在下で成長させ、５０、７５および１００μＭのＦＴＳまたは０．１％ＤＭＳＯ（対照）で２４時間処理し、次いでＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みによって細胞増殖を判定した甲状腺癌ＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡ（１５０００細胞／９６ウェルプレート）において、ＦＴＳが細胞増殖を減少させたこと（およびＴＴ細胞ではそうした効果がなかったこと）を示し、データは、ＦＴＳ処理した細胞におけるＢｒｄＵの、対照に対する百分率として示す。図１Ｂは、上述のように成長させて処理し、次いでＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を使用して生細胞の判定を行った、ＦＴＳ処理した甲状腺癌細胞の生存度を示し、データは、ＦＴＳ処理細胞におけるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ蛍光の、対照に対する百分率として示す（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図２】ホモジナイズした後、ホモジネートの分割量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および特異的抗体を用いた免疫ブロット法を使用して、Ｇａｌ−３、Ｒａｓ、Ｒａｓ−ＧＴＰ、Ｒａｓ−ＧＴＰアイソフォーム（Ｎ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓ）、およびＲａｓ下流エフェクターであるホスホＥＲＫのレベルの判定にかけた、甲状腺癌細胞系ＡＲＯ、ＭＲＯ、ＮＰＡおよびＴＴ細胞における活性Ｒａｓ、ＥＲＫ、およびＧａｌ−３のレベルを示す免疫ブロットである。β−チューブリンを添加対照として使用し、免疫ブロットは、ＥＣＬによって可視化した。
【図３】ＦＴＳが、種々の甲状腺がん細胞系においてＲａｓおよびそのシグナルを阻害することを示す棒グラフである。図３Ａは、ＦＴＳが、ＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡ細胞において総Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルを低下させたことを示す。細胞は、図１Ａに記載のとおりに播き、次いで７５μＭのＦＴＳまたはビヒクル対照で４８時間処理し、溶解させて、活性Ｒａｓ．ＧＴＰおよび総Ｒａｓの定量化にかけた後、ｐａｎ  Ｒａｓ  Ａｂを用いた免疫ブロット法に供した。図３Ｂは、比較的少ない血清条件下（０．５％）としたこと以外は図３Ａについて記載したとおりに成長させ、次いで１０μＭのＦＴＳまたはビヒクル対照で２４時間処理した後、溶解させて、次いで活性Ｋ−Ｒａｓ．ＧＴＰおよび総Ｋ−Ｒａｓを定量化し、続いて特異的抗Ｋ−Ｒａｓ抗体を用いた免疫ブロット法に供したＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡ細胞において、ＦＴＳがＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルを低下させたことを示す。図３Ｃは、７５μＭのＦＴＳで４８時間処理し、次いで溶解させて、抗ＥＲＫおよび抗ホスホＥＲＫ  Ａｂを用いた免疫ブロット法にかけたＡＲＯおよびＭＲＯ細胞において、ＦＴＳがホスホＥＲＫのレベルを低下させたことを示す。
【図４Ａ−４Ｄ】ＦＴＳ処理によって、甲状腺癌細胞においてＰ２１およびＴｔｆ−１のレベルが増大することを示す棒グラフである。図４Ａおよび図４Ａ’は、図３Ａに記載のとおりに播き、７５μＭのＦＴＳで処理した後、溶解させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに抗ｐ２１および抗Ｔｔｆ−１または抗チューブリン（対照）抗体を用いた免疫ブロット法に供した甲状腺癌細胞のＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡ細胞において、ＦＴＳが、ｐ２１およびＴｔｆ１を上方制御することをそれぞれ示す。ＦＴＳ処理したＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡ細胞のｐ２１のレベルは、対応する対照より高く（＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）、ＦＴＳ処理したＡＲＯおよびＭＲＯ細胞のＴｔｆ−１のレベルも、対応する対照より高かったが（＊Ｐ≦０．０５）、ＮＰＡおよびＴＴ細胞では大きな差が記録されていない。図４Ｂは、ドミナントネガティブＧＦＰ−Ｒａｓ  １７ＮまたはＧＦＰ（対照）を発現させるベクターをトランスフェクトした後、トランスフェクトから４８時間後に溶解させ、抗Ｔｔｆ−１および抗β−チューブリンＡｂを用いた免疫ブロット法に供した甲状腺癌細胞ＡＲＯおよびＭＲＯにおいて、ドミナントネガティブＲａｓがＴｔｆ１のレベルを増大させることを示す。図４Ｃは、細胞（２×１０５細胞）をガラスカバースリップ上に播き、次いで７５μＭのＦＴＳまたはビヒクル対照で４８時間処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔおよびウサギ抗Ｔｔｆ１  Ａｂに続いて、フルオレセイン標識ヤギ抗ウサギＡｂで標識し、画像処理した対照ＡＲＯ細胞およびＦＴＳ処理した細胞の共焦点蛍光画像の統計的分析を示す。図４Ｄおよび図４Ｄ’は、２×１０５細胞／６ｃｍプレートの密度で播き、１０μＭのＵＯ１２６を加えたおよび加えないＲＰＭＩ／５％ＦＣＳで２４時間成長させた後、溶解させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いで抗Ｔｔｆ−１、抗ｐ２１、および抗β−チューブリンＡｂを用いた免疫ブロット法に供したＡＲＯおよびＭＲＯ細胞において、ＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６が、ｐ２１およびＴｔｆ１を増加させたことをそれぞれ示す。
【図５】ガラスカバースリップ上に播き、０．１％ＤＭＳＯ（対照）または７５μＭのＦＴＳの存在下で７２時間成長させ、次いでマウスｐａｎ抗Ｒａｓ  Ａｂに続いてｃｙ３標識ロバ抗マウスＡｂ、およびラット抗Ｇａｌ−３  Ａｂに続いてフルオレセイン標識ヤギ抗ラットＡｂで標識したＡＲＯ細胞（２×１０５細胞）の細胞膜において、ＦＴＳがＫ−Ｒａｓ−Ｇａｌ−３共局在を妨害することを示す棒グラフである。
【図６Ａ−６Ｃ】ＦＴＳが、ヌードマウスモデルにおいてＡＲＯ細胞腫瘍成長を抑制することを示すグラフである。ＡＲＯ細胞は、ヌードマウスの側腹部に皮下注射し、続いて細胞を埋め込んでから７日後より毎日、経口ＦＴＳ（６０ｍｇ／ｋｇ、１０匹）またはビヒクル対照（１０匹）での処置を始めた。図６Ａは、対照およびＦＴＳ処置マウスにおけるＡＲＯ細胞腫瘍の体積を時間に応じて示す（平均±ＳＥ  ｎ＝１０  ＊Ｐ＜０．０５、対照対ＦＴＳ）。図６Ｂは、対照マウスおよびＦＴＳ処置マウスにおけるＡＲＯ細胞腫瘍の重量を示す。腫瘍重量は、処置２５日目に測定した（平均±ＳＥ、ｎ＝１０、＊＊Ｐ＜０．０１）。図６Ｃは、免疫ブロット法によって評価したＧａｌ−３、Ｒａｓ、ホスホＥＲＫ、およびβ−チューブリンの活性を（Ｇａｌ−３、Ｒａｓ、Ｒａｓ−ＧＴＰ、およびホスホＥＲＫ発現の濃度測定分析の見かけのレベルをβ−チューブリン発現によって正規化したものに関して）示す（平均±ＳＥ、ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５、対照対ＦＴＳ）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
［Ｒａｓアンタゴニスト］
Ｒａｓタンパク質、たとえば、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓは、細胞成長、分化、および生存を制御するシグナル伝達経路を調節する入切スイッチとして働く［Ｒｅｕｔｈｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：１５７〜６５（２０００）］。Ｒａｓタンパク質は、形質膜の内側小葉状部分に固定化され、そこで、受容体チロシンキナーゼなどの細胞表面受容体が活性化されることにより、Ｒａｓ上でグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）がグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）と交換され、不活性Ｒａｓ−ＧＤＰが活性Ｒａｓ−ＧＴＰへと変換される［Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３３３〜７（１９９７）］。これらのシグナルの停止には、Ｒａｓ−ＧＴＰをＲａｓ−ＧＤＰにする加水分解が必要となる［Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３３３〜３３８（１９９７）］。野生型Ｒａｓによる細胞増殖の促進に加えて、Ｒａｓのいくつかの変異型は、そのＧＴＰ加水分解の受けやすさに欠陥があり、したがって構成的活性型である［Ｂａｒｂａｃｉｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７７９〜８２７（１９８７）、Ｂｏｘ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３１：１０５１〜１０５４（１９９５）］。多くのがんタイプで見られるこうした発がん性Ｒａｓタンパク質は、悪性腫瘍の一因となり、したがって指向型治療の好適なターゲットとみなされる［Ｂｏｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：４６８２〜４６８９（１９８９）］。活性Ｒａｓタンパク質は、細胞成長、分化の調節解除、ならびに生存、遊走、および浸潤の増進に寄与する複数のＲａｓエフェクターの活性化を通して発がんを促進する［たとえば、Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３：１１〜２２（２００３）、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：１４７〜５４１（２０００）、およびＭｉｔｉｎ，Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１５：Ｒ５６３〜７４（２００５）を参照のこと］。
【０００８】
Ｒａｓの形質膜との連係は、野生型および変異した構成的活性型の両方において、Ｒａｓ活性にとって非常に重要であることが示されている［Ｂｏｇｕｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３６６：６４３〜６５４（１９９３）、Ｃｏｘら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：１００８〜１０１６（１９９２）、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：１９７〜２０４（１９９６）］。少なくとも２つの構造的要素がこの連係に必要であり、第一は、Ｒａｓのカルボキシ末端にあるファルネシルシステインカルボキシメチルエステルであり、第二の要素は、近傍の上流配列に存在し、異なるＲａｓアイソフォームによって様々である［Ｈａｎｃｏｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：４０３３〜４０３９（１９９１）、Ｈａｎｃｏｃｋら、Ｃｅｌｌ  ５７：１１６７〜１１７７（１９８９）］。正常なＲａｓ活性には、特にファルネシルイソプレノイド部分が必要であり［Ｃｏｘら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：１００８〜１０１６（１９９２）、Ｃｏｘら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６０６〜２６１５（１９９２）］、この部分が特異的な認識単位として働いて、Ｈ−Ｒａｓをガレクチン−１と［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３７１６９〜３７１７５（２００２）、Ｒｏｔｂｌａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６４：３１１２〜３１１８（２００４）］、Ｋ−Ｒａｓをガレクチン−３と結合させ［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３４９２２〜３４９３０（２００４）］、強力な膜連係および強固なシグナル伝達を促進する。
【０００９】
ＦＴＳは、活性のあるＧＴＰ結合型のＨ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびＫ−Ｒａｓタンパク質に、どちらかと言えば特異的に作用するＲａｓ阻害剤として知られている［Ｗｅｉｓｚ，Ｂ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２５７９〜２５８８（１９９９）、Ｇａｎａ−Ｗｅｉｓｚ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：５５５〜６５（２００２）］。より詳細には、ＦＴＳは、形質膜において、特異的な飽和性結合部位への結合を巡ってＲａｓ−ＧＴＰと競合し、その結果、活性Ｒａｓの誤った局在化が生じ、Ｒａｓ分解が促進される［Ｈａｋｌａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（５）：１３０６〜１４（１９９８）］。この競合的阻害により、活性Ｒａｓがその主立った下流エフェクターと相互作用することが妨げられ、活性化型Ｒａｓを収容する形質転換細胞の形質転換された表現型が逆転する。その結果として、Ｒａｓ依存的な細胞成長および形質転換活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、ＦＴＳによって強力に阻害される［Ｗｅｉｓｚ，Ｂ．ら、上記を参照、Ｇａｎａ−Ｗｅｉｓｚ，Ｍ．ら、上記を参照］。
【００１０】
本発明における有用なＲａｓアンタゴニストとして、以下に述べるＦＴＳおよびその構造アナログが挙げられる。
【００１１】
Ｒａｓアンタゴニストは、次式により表される。
【化１】
2013508450.tif 000002
式中、Ｒ１は、ファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、Ｒ２は、ＣＯＯＲ７、ＣＯＮＲ７Ｒ８、またはＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０であり、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはアルケニル（線状および分枝状のアルキルまたはアルケニルを含み、一部の実施形態では、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアルケニルを含む）であり、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルを表し、Ｒ１０は、アルキル（線状および分枝状のアルキルを含み、一部の実施形態では、Ｃ１〜Ｃ４アルキルを表す）を表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ（線状および分枝状のアルキル、アルケニル、またはアルコキシを含み、一部の実施形態では、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アルケニル、またはアルコキシを表す）、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、またはアルキルメルカプトであり、ＸはＳを表す。Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０のいずれかがアルキルを表す実施形態では、アルキルは、メチル基またはエチル基であることが好ましい。
【００１２】
一部の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストは、Ｓ−トランス，トランス−ファルネシルチオサリチル酸またはＦＴＳ（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ２はＣＯＯＲ７であり、Ｒ７は水素である）である。
【００１３】
一部の実施形態では、ＦＴＳアナログは、ハロゲン化されており、たとえば、５−クロロ−ＦＴＳ（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ２はＣＯＯＲ７であり、Ｒ４はクロロであり、Ｒ７は水素である）および５−フルオロ−ＦＴＳ（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ２はＣＯＯＲ７であり、Ｒ４はフルオロであり、Ｒ７は水素である）である。
【００１４】
他の実施形態では、ＦＴＳアナログは、ＦＴＳ−メチルエステル（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＯＲ７を表し、Ｒ７はメチルを表す）、ＦＴＳ−アミド（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＮＲ７Ｒ８を表し、Ｒ７およびＲ８は、両方とも水素を表す）、ＦＴＳ−メチルアミド（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＮＲ７Ｒ８を表し、Ｒ７は水素を表し、Ｒ８はメチルを表す）、およびＦＴＳ−ジメチルアミド（Ｒ１はファルネシルを表し、Ｒ２はＣＯＮＲ７Ｒ８を表し、Ｒ７およびＲ８は、それぞれメチルを表す）である。
【００１５】
さらに他の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストは、Ｓ−プレニルチオサリチル酸アルコキシアルキルまたはＦＴＳ−アルコキシアルキルエステル（Ｒ２はＣＯＯＣＨＲ９ＯＲ１０を表す）である。代表例としては、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ９はＨであり、Ｒ１０はメチルである）、Ｓ−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル（Ｒ１はゲラニルゲラニルであり、Ｒ９はＨであり、Ｒ１０はメチルである）、５−フルオロ−Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ５はフルオロであり、Ｒ９はＨであり、Ｒ１０はメチルである）、およびＳ−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチル（Ｒ１はファルネシルであり、Ｒ９はメチルであり、Ｒ１０はエチルである）が挙げられる。上記の実施形態それぞれにおいて、別段詳細に指摘しない限り、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素を表す。
【００１６】
［組成物および方法］
用語「有効量」、「治療有効量」、または「薬学的有効量」とは、本明細書では、甲状腺がんおよびその関連する徴候の少なくとも１つの症状を回復させ、疾患の程度または重症度を軽減し、疾患の進行を遅らせまたは阻止し、部分的または完全な寛解を実現し、生存を引き延ばすのに十分なＲａｓアンタゴニストの量およびその組合せを指す。任意のがん患者のための適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定することができる。任意の特定の患者の特別な用量レベルは、Ｒａｓアンタゴニストの効力、患者の年齢、体重、および全般的健康状態、がんの重症度などのいくつかの要素に応じて決まる。本発明のＲａｓアンタゴニストの平均日用量は、一般には約２００ｍｇ〜約２０００ｍｇ、一部の実施形態では約４００〜約１６００ｍｇ、他の一部の実施形態では約６００〜約１２００ｍｇ、さらに他の実施形態では約８００ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲である。
【００１７】
用語「投与する」、「投与すること」、「投与」などは、本明細書では、Ｒａｓアンタゴニストの所望の生物学的作用部位への送達を可能にするのに使用することのできる方法を指す。本発明での使用に適する医学的に許容可能な投与技術は、当業界で知られている。たとえば、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、現行版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（現行版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルヴェニア州イーストンを参照のこと。一部の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストを経口投与する。他の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストを非経口投与する（本発明の意図では、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、および注入がこれに含まれる）。局所投与や直腸投与などの他の投与経路が適する場合もある。
【００１８】
用語「薬学的に許容可能な」とは、本明細書では、化合物の生物学的活性または特性を損なわず、比較的非毒性である、担体や希釈剤などの材料を指す。
【００１９】
用語「医薬組成物」とは、本明細書では、任意選択的に薬学的に許容可能な担体と組み合わされた（たとえば、混合された）Ｒａｓアンタゴニストを指す。こうした成分は、非毒性であり、生理学的に不活性であり、Ｒａｓアンタゴニスト（および組成物中に存在する可能性のある他の任意の（１種または複数の）活性薬剤）と不利に相互作用しない。担体は、活性薬剤の製剤および／投与を円滑にする。本発明の医薬組成物は、１種または複数の賦形剤をさらに含有していてもよい。
【００２０】
Ｒａｓアンタゴニストの経口組成物は、（１種または複数）の薬剤を、担体と関連させる（たとえば、混合する）ことにより調製でき、ここで担体の選択は投与方式に基づく。担体は一般に、固体または液体である。場合によっては、組成物は、固体担体と液体担体を含有してもよい。活性物を含有する、経口投与に適する組成物は、錠剤（たとえば、フィルムコート、糖衣、制御放出、または持続放出を含める）、カプセル剤、たとえば、硬ゼラチンカプセル剤（制御放出または持続放出を含める）および軟ゼラチンカプセル剤、粉末および顆粒などの固体剤形にすることが好ましい。しかし、組成物は、他の経口形態、たとえば液体またはゲルでの患者への投与を可能にする、他の担体中に含まれていてもよい。形態にかかわらず、組成物は、所定の量のＲａｓアンタゴニストを含有する個別または組合せの用量に分けられる。
【００２１】
経口剤形は、通常は活性医薬成分の形のＲａｓアンタゴニストを、１種または複数の適切な担体と（任意選択的に１種または複数の他の薬学的に許容可能な賦形剤と共に）混合し、次いで組成物を所望の剤形に製剤することにより、たとえば、組成物を錠剤に圧縮する、または組成物をカプセルもしくは小袋に充填することにより調製できる。典型的な担体および賦形剤として、ラクトース、デンプン、マンニトール、微結晶性セルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、第二リン酸カルシウム、アカシア、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、トウコロコシ油、植物油、およびポリエチレングリコールを含む、増量剤もしくは希釈剤、結合剤、緩衝剤もしくはｐＨ調整剤、崩壊剤（架橋およびスーパー崩壊剤、たとえばクロスカルメロースを含める）、流動促進剤、および／または滑沢剤が挙げられる。糖、セラック、合成ポリマーなどのコーティング剤、ならびに着色剤および保存剤を用いることもできる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（２０００）を参照のこと。
【００２２】
液体形態の組成物としては、たとえば、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル、および加圧組成物が挙げられる。たとえば、（１種または複数の）活性薬剤を、水、有機溶媒（およびその混合物）、および／または薬学的に許容可能な油脂などの薬学的に許容可能な液体担体に溶解または懸濁させることができる。経口投与用の液体担体の例として、水（特に、前述のような添加剤、たとえば、セルロース誘導体を好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液中の懸濁液にしたものを含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、たとえばグリセリンおよび非毒性グリコールを含む）およびその誘導体、ならびに油（たとえば、ヤシ油およびラッカセイ油）が挙げられる。液体組成物は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、着香剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、浸透圧調節剤などの適切な他の医薬賦形剤を含有してもよい。
【００２３】
非経口投与用組成物の調製に適する担体としては、注射用滅菌水、注射用静菌水、塩化ナトリウム注射液（０．４５％、０．９％）、デキストロース注射液（２．５％、５％、１０％）、乳酸加リンゲル注射液などが挙げられる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物、および油中に分散液を調製することもできる。組成物は、等張化剤（たとえば、塩化ナトリウムおよびマンニトール）、抗酸化剤（たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸）、および保存剤（たとえば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびメチルパラベンとプロピルパラベンの組合せ）も含有し得る。
【００２４】
本発明の方法による治療の影響を受けやすい甲状腺がんは、Ｋ−Ｒａｓのレベルが正常な甲状腺細胞に比べて高いことを特徴とし、このことは、甲状腺がん細胞の免疫ブロットを正常な甲状腺細胞と比較して判定することができる。そのようながんとしては、乳頭状甲状腺癌、濾胞性甲状腺癌、および未分化甲状腺癌が挙げられる。
【００２５】
Ｒａｓアンタゴニストを含有する医薬組成物は、キットの形で包装および販売することができる。たとえば、組成物は、錠剤やカプセル剤などの１種または複数の経口剤形の形にすることができる。キットには、本明細書に記載の本発明の方法を実施するための取扱説明書を含めてもよい。
【００２６】
一部の実施形態では、Ｒａｓアンタゴニストは、（単一または分割用量で）毎日経口的に３週間服用させ、続いて１週間の「休止期間」を置き、寛解に到達するまで繰り返すことにより投与される。
【００２７】
Ｒａｓアンタゴニストは、一次治療戦略として（たとえば、がんが転移しているかいないかにかかわらず、新たに診断されたがん患者における初回の治療として）、または二次治療戦略として（たとえば、少なくとも１種の他の薬剤を使用して以前に治療を受けたことがあるが、以前の（１種または複数の）薬剤に反応しなかった、またはそれに対して抵抗性が出てしまい、そのため、はっきりとわかる治療有効性が実現できる前に治療を終了する結果となってしまった可能性もあるがん患者の治療として）、単独で使用してもよいし、または他の治療剤、たとえば、生物学的抗がん剤（たとえば、抗体）、化学療法剤、放射線と共に使用してもよい。
【００２８】
ここで、本発明について、以下の非限定的な実施例において説明する。
【００２９】
［実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験］
−細胞系および試薬−
ヒト濾胞性甲状腺がん細胞系ＡＲＯおよびＭＲＯならびにヒト未分化甲状腺がん細胞系ＮＰＡは、Ｓｏａｒｓｋｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ内分泌学研究所のＺａｋｉ  Ｋｒａｉｅｍ氏から寄贈を受けた。髄様甲状腺癌細胞系ＴＴは、ＡＴＣＣ（カタログ番号：ＣＲＬ−１８０３（商標））から購入した。細胞系はすべて、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で培養した。細胞は、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。
【００３０】
ＦＴＳは、Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（フロリダ州フォートローダーデール）から寄贈を受けた。ＥＣＬキットはＡｍｅｒｓｈａｍ（イリノイ州アーリントンハイツ）から、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ｕ０１２６は、ＡＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州サンディエゴ）のものであった。マウス抗ｐａｎ−Ｒａｓ（Ａｂ−３）、マウス抗Ｎ−Ｒａｓ、およびマウス抗Ｋ−Ｒａｓ抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから、ウサギ抗ｐ２１、ウサギ抗Ｔｔｆ１、およびウサギ抗β−チューブリン抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）から、マウス抗ホスホＥＲＫはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、ウサギ抗ホスホＡｋｔ（ｓｅｒ４７３）およびウサギ抗ＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州ベヴァリー）から入手した。ペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ、ペルオキシダーゼ−ヤギ抗ラットＩｇＧ、およびペルオキシダーゼ−ヤギ抗ウサギＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ペンシルヴェニア州Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）のものであった。
【００３１】
タンパク質バンドは、Ｉｍａｇｅ  ＥＺＱｕａｎｔ−Ｇｅｌソフトウェア（著作権（Ｃ）２００５、ＥＺＱｕａｎｔ  Ｌｔｄ）を用いた濃度測定によって定量化した。
【００３２】
−トランスフェクション−
トランスフェクションアッセイについては、２×１０５個のＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞／ウェルを６ウェルプレートに播いた。後日、Ｌｉｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクションキット（カタログ番号１１６６８−０２７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用し、細胞に、ＧＦＰ−Ｒａｓ１７ＮをコードするプラスミドＤＮＡ（２μｇ）または緑色蛍光タンパク質をコードする対照を有するベクター（２μｇ）をトランスフェクトした。
【００３３】
−細胞生存度−
ＡＲＯ細胞、ＭＲＯ細胞、ＮＰＡ細胞およびＴＴ細胞（９６ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェル）を、５０、７５および１００μＭのＦＴＳまたはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを製造者の説明書に従って使用し（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国オックスフォード）、細胞生存度を推定した。
【００３４】
−細胞増殖アッセイ−
９６ウェルプレートにおいて、ＡＲＯ細胞、ＭＲＯ細胞、ＮＰＡ細胞およびＴＴ細胞を、１．５×１０４細胞／ウェルの密度で５％ＦＣＳ培地に播いた。翌日、細胞を５０、７５または１００μＭのＦＴＳまたはビヒクル（０．１％のＤＭＳＯ）で処理した。ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用し、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みによって増殖を評価した。
【００３５】
−ＭＴＴアッセイ−
生存している細胞のミトコンドリア活性を判定する３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用し、６日後に、細胞増殖を判定した。細胞を０．１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴと共に３７℃で２時間インキュベートし、次いで１００％のＭｅ２ＳＯ４で溶解させた。５７０〜６３０ｎｍで吸光度を読み取ることにより、結果を定量化した。
【００３６】
−ウエスタン免疫ブロット法−
ＡＲＯ細胞、ＭＲＯ細胞、ＮＰＡ細胞（０．４×１０６細胞／１０ｃｍ）、およびＴＴ細胞（０．５×１０６細胞／ｍＬ）を、５％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞を７５μＭのＦＴＳまたはビヒクル（０．１％のＤＭＳＯ）で４８時間処理し、溶解させ、先に詳述されているとおりにＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析にかけた［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４０）：３７１６９〜７５（２００２）］。次いで可溶化液を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけた後、次の抗体（Ａｂ）、すなわち、１：２，５００のｐａｎ−Ｒａｓ  Ａｂ、１：５０の抗Ｋ−Ｒａｓ  Ａｂ、１：１０００の抗β−チューブリンＡｂ、１：１０００の抗Ｇａｌ−３  Ａｂ、１  １：１０，０００の抗ホスホＥＲＫ  Ａｂ、１：２，０００の抗ＥＲＫ  Ａｂ、１：７５０の抗ｐ２１  Ａｂ、１：５００の抗Ｔｔｆ１  Ａｂのうちの１種を用いた免疫ブロット法に供した。次いで免疫ブロットを、１：５，０００のペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：５，０００のペルオキシダーゼ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ、または１：５，０００のペルオキシダーゼ−ヤギ抗ラットＩｇＧに暴露し、強化化学発光（ＥＣＬ）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用してタンパク質バンドを可視化した。
【００３７】
−Ｒａｓ−ＧＴＰアッセイ−
１ｍｇのタンパク質を含有する可溶化液を使用して、従前に記載されているようなグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲＢＤプルダウンアッセイ［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら（２００２）、上記を参照］、続いて上述のようなＲａｓアイソフォーム特異的Ａｂを用いたウエスタン免疫ブロット法により、Ｒａｓ−ＧＴＰを測定した。
【００３８】
−共焦点顕微鏡観察−
２×１０５個のＡＲＯ細胞をガラスカバースリップ上に播き、次いで７５μＭのＦＴＳまたはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）で処理した。７２時間後に細胞を固定し、次いで０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。サンプルを２％ウシ血清アルブミンおよび２００μｇ／ｍｌのヤギガンマグロブリンで３０分間ブロッキングした。細胞を１μｇ／ｍＬの抗Ｔｔｆ−１、Ｇａｌ−３、およびｐａｎ−Ｒａｓ抗体で１時間まで、次いで１：７５０のヤギ抗ウサギフルオレセイン、ヤギ抗ラットフルオレセイン、およびロバ抗マウスｃｙ３抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でそれぞれ標識した。それぞれインキュベートした後、３回十分に洗浄した。染色強度をＭｅｔａ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡で分析した。各細胞の核中のＴｔｆ−１の定量化をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって行った。
【００３９】
−感染およびｓｈＲＮＡ−
Ｔｔｆ−１に対する特異的ｓｈＲＮＡ（クローンＩＤ  Ｖ２ＨＳ＿６１８５０  Ｏｐｅｎ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をコードする６μｇのレトロウイルスベクターを、レトロウイルスエンベロープとＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をそれぞれコードする３μｇのｐＭＤ２Ｇおよび３μｇのｐＣＧＰと共に使用し、ＨＥＫ２９３細胞を一過性に三重トランスフェクトすることにより、ウイルスを生成した。対照として、６μｇの非サイレンシングｓｈＲＮＡ（Ｏｐｅｎ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、従前に記載されているとおりに使用した［Ｓｈａｌｏｍ−Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００８）］。
【００４０】
−結果−
甲状腺癌におけるガレクチン−３の発現は、高レベルのＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰ、およびＦＴＳによる成長抑制と相関する
最初の一連の実験では、Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳが４種の甲状腺癌細胞系、すなわち、ＮＰＡ（乳頭状）、ＭＲＯ（濾胞性）、ＴＴ（髄様）、およびＡＲＯ（未分化）系列の成長に与える効果を調べた。本発明者らは、Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳが細胞増殖に及ぼす影響を、ＢｒｄＵアッセイを使用して調べた。ＦＴＳは、ＴＴ細胞を除く全細胞系で、ＢｒｄＵのＤＮＡへの取り込みを用量依存的に強力に阻害し（図１Ａ）、細胞死を誘発した（細胞生存度試薬ＡｌａｍａｒＢｌｕｅによって示される、図１Ｂ）。ＴＴ細胞では、ＦＴＳは、細胞成長の弱い抑制しか引き起こさなかった。
【００４１】
ＲＢＤプルダウンアッセイおよびｐａｎ  Ｒａｓ抗体を使用して活性Ｒａｓのレベルを測定したとき、本発明者らは、ＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡが比較的高レベルのＲａｓ．ＧＴＰを示し、ＴＴが比較的低レベルのＲａｓ．ＧＴＰを示したことを見出した（図２）。研究中の細胞系はいずれも、Ｒａｓ突然変異がないものである［Ｎａｍｂａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８（９）：４３９３〜７（２００３）、Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８（１１）：５３９９〜４０４（２００３）］。したがって、これらの甲状腺癌で観察された比較的高レベルのＲａｓ．ＧＴＰは、おそらく成長因子受容体によるＲａｓ交換因子の刺激によるものであり［Ｋｏｌｉｂａｂａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３３３（３）：Ｆ２１７〜４８（１９９７）、Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（５）：２９２７〜３５（１９９７）、Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４（２１）：７５６７〜７０（１９８７）］、活性Ｒａｓ．ＧＴＰを安定化するＲａｓシャペロンによるものであると思われる［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（３３）：３４９２２〜３０（２００４）、Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４０）：３７１６９〜７５（２００２）］。
【００４２】
したがって、本発明者らは次に、甲状腺悪性病変に関与することがわかっており［Ｓａｇｇｉｏｒａｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６（１１）：５１５２〜８（２００１）、Ｉｎｏｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  ８５（１１）：２４７５〜８４（１９９９）、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８（１４）：３０１５〜２０（１９９８）、Ｓａｇｇｉｏｒａｔｏら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７（４）：３１１〜７（２００４）］、Ｋ−Ｒａｓ．ＧＴＰの既知のシャペロンである［Ｅｌａｄ−Ｓｆａｄｉａら、Ｊ．Ｂｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（３３）：３４９２２〜３０（２００４）、Ｓｈａｌｏｍ−Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８（１６）：６６０８〜１６（２００８）］、Ｇａｌ−３のレベルを調べた。本発明者らは、ＡＲＯ細胞、ＭＲＯ細胞およびＮＰＡ細胞が、比較的高レベルのＧａｌ−３を発現したが、ＴＴ細胞は、Ｇａｌ−３を全く発現しなかったことを見出した（図２）。興味深いことに、本発明者らは、甲状腺癌細胞系のいずれにおいても有意な量のＨ−Ｒａｓを検出することができなかったが（図示せず）、Ｎ−Ｒａｓタンパク質を検出した（図２）。しかし、Ｎ−Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルは、Ｇａｌ−３のレベルと相関がなかった（図２）。興味深いことに、ＮＰＡ細胞は、最も高いレベルのｐ−ＥＲＫを示した（図２）。このことは、２つの要素、すなわち、ｉ）この細胞が有する慢性的に活性なＲａｓ、および、ｉｉ）この細胞が２つの対立遺伝子に有する活性化Ｂ−Ｒａｆ突然変異、によるものかもしれないと思われる［Ｌｉｕら、Ｔｈｙｒｏｉｄ  １８（８）：８５３〜６４（２００８）、Ｃａｒｔａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）６４（１）：１０５〜９（２００６）］。したがって本発明者らは、主にＡＲＯ（一方の対立遺伝子だけにＢ−Ｒａｆ突然変異）およびＭＲＯ（Ｂ−Ｒａｆ突然変異なし）について研究を続けた［Ｌｉｕら、Ｔｈｙｒｏｉｄ  １８（８）：８５３〜６４（２００８）、Ｃａｒｔａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）６４（１）：１０５〜９（２００６）］。
【００４３】
ＦＴＳは、高いＧａｌ−３を示すＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞においてＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰを下方制御し、ＥＲＫへのＫ−Ｒａｓシグナル伝達に影響を及ぼす
次いで本発明者らは、種々の甲状腺癌細胞系においてＦＴＳがＲａｓ．ＧＴＰのレベルに及ぼす影響を調べた。これら実験の典型的な結果は、ＦＴＳ（４８時間７５μＭ）が、Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルを低下させ、総Ｒａｓに対しては小さい効果しか与えなかったことを示した（図３Ａ）。別の実験では、ＦＴＳがＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルを低下させたことが示された（図３Ｂ）。この後者の実験は、基礎条件下、すなわち血清による刺激効果なしでＦＴＳの影響が判定できるようにするために、血清不足の細胞で実施した。示されるように、Ｋ−Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルは、血清が不足していても、ＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡにおいて比較的高く、ＦＴＳによってＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰが減少した（図３Ｂ）。
【００４４】
次に本発明者らは、ＦＴＳで処理した甲状腺癌細胞におけるＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰレベルの低下がＲａｓシグナル伝達の減少に変換されるかどうかを調べた。したがって本発明者らは、２つの主立ったＲａｓ経路Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫおよびＰＩ３−Ｋ−Ａｋｔのそれぞれの読み出し情報としてのホスホＥＲＫおよびホスホＡｋｔのレベルを調べた。ホスホＡｋｔは、薬物処理なしでも、細胞系のいずれにおいても検出されなかった（図示せず）。したがって、ホスホＡｋｔは、Ｒａｓシグナル伝達の読み出し情報として使用できなかった。とはいえ、上述のように（図２）、本発明者らは、全細胞系においてホスホＥＲＫを検出しており、ＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞で、ＦＴＳによってホスホＥＲＫのレベルが激しく有意に低下したことを観察した（図３Ｃ）。ＦＴＳは、ＮＰＡおよびＴＴ細胞においてホスホＥＲＫを減少させなかった（図３Ｃ）。高いＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰがＦＴＳによって下方制御されたＮＰＡ細胞において、ホスホＥＲＫに対するＦＴＳの効果が比較的小さいことの原因は、おそらくはこうした細胞が両方の対立遺伝子に活性化Ｂ−Ｒａｆ突然変異（Ｖ６００Ｅ）を有すると考えられることにある［Ｃａｒｔａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）６４（１）：１０５〜９（２００６）］。したがって、ＮＰＡ細胞では、活性Ｒａｓとは無関係であるＥＲＫに対するＲａｆシグナルが比較的強い。これは、活性化型変異体Ｂ−Ｒａｆに関してヘテロ接合性であり、１つのｗｔ  Ｂ−Ｒａｆ対立遺伝子を有するＡＲＯ細胞、およびＢ−Ｒａｆ突然変異のないＭＲＯ細胞には当てはまらない［Ｌｉｕら、Ｔｈｙｒｏｉｄ  １８（８）：８５３〜６４（２００８）、Ｃａｒｔａら（２００６））。すなわち、どちらの細胞系においても、Ｋ−Ｒａｓ．ＧＴＰがＦＴＳによって下方制御されたとき、野生型（ｗｔ）Ｂ−ＲａｆのＲａｓ依存的な活性化が阻害される。
【００４５】
ＦＴＳは、細胞周期インヒビターｐ２１および甲状腺転写因子１（Ｔｔｆ−１）を上方制御する
Ｒａｓが活発ながん細胞系を用いた先の研究では、ＣＤＫ２を阻害する細胞周期インヒビターｐ２１が、少なくとも一部、活性Ｒａｓによる負の調節を受けること［Ｈａｌａｓｃｈｅｋ−Ｗｉｅｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６（１１）：１３１９〜２７（２００４）］、およびいくつかのがん細胞系において、ＦＴＳがｐ２１のレベルを増大させたこと［Ｈａｌａｓｃｈｅｋら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（８）：６９３〜７０４（２０００）］が示されている。したがって本発明者らは、研究中の甲状腺細胞系においてＦＴＳがｐ２１レベルに影響を及ぼすかどうかを調べた。本発明者らは、ＦＴＳによって、ＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡでｐ２１のレベルが増大したが、ＴＴ細胞では増大しなかったことを見出した（図４Ａ）。これは、ＡＲＯ、ＭＲＯおよびＮＰＡのみでＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰのレベルが低下し、細胞成長が抑制されたことと正の相関があった（図１Ａおよび図３Ａ）。すなわち、ＦＴＳによって誘発されたｐ２１の増加は、高Ｇａｌ−３の甲状腺細胞における細胞成長抑制の主要な要素であると思われる。
【００４６】
次に本発明者らは、ＦＴＳが、甲状腺癌ではＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路による負の調節を受けるＴｔｆ−１のレベルに影響を及ぼすかどうかを調べた［Ｍｉｓｓｅｒｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０（８）：２７８３〜９３（２０００）］。本発明者らは、ＦＴＳによって、ＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞ではＴｔｆ−１が上方制御されたが、ＮＰＡ細胞およびＴＴ細胞では上方制御されなかったことを見出した（図４Ａ’）。これは改めて、Ｋ−Ｒａｓ．ＧＴＰおよびＲａｓ依存的なＥＲＫ活性化は、他の細胞系よりもＡＲＯおよびＭＲＯにおいてＦＴＳに対する感受性が高いという本発明者らの結果と一致する。ＦＴＳのように、ドミナントネガティブ（ＤＮ）Ｒａｓも、ＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞においてＴｔｆ−１を上方制御した（図４Ｂ）。
【００４７】
すなわち、本発明者らの結果は、ＦＴＳまたはＤＮ−ＲａｓによるＲａｓ阻害は、細胞成長を阻止し、甲状腺細胞における不可欠な因子であることがわかっている分化転写因子Ｔｔｆ−１を増加させることにより、ここで研究している最も悪性の細胞系（ＡＲＯ）の悪性の表現型を少なくとも一部戻すことを示唆している［Ｒｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１（４）：３８９〜９６（１９９９）、Ｍｉｓｓｅｒｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０（８）：２７８３〜９３（２０００）、ＤｅＶｉｔａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９（１）：７６〜８９（２００５）、Ａｋａｇｉら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９（５）：７８１〜８（２００８）］。実際、ＦＴＳ処理したＡＲＯ細胞を顕微鏡で調べたとき、本発明者らは、細胞がより拡散し、密集しなくなっている、その形態の変化を見出した（図示せず）。加えて、本発明者らは、ＦＴＳ処理後のこの細胞において核Ｔｔｆ−１が著しく増加し、まだ解明されていないが、核傍Ｔｔｆ−１が多少増加したことを観察した（図４Ｃ）。ＦＴＳのように、ＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６によっても、ＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞においてｐ２１およびＴｔｆ−１のレベルが著しく増大し（図４Ｄおよび図４Ｄ’）、これらの増大がＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の阻害を介したものであることが示唆される。これらの結果は、ＦＴＳの作用機序にＴｔｆ−１の上方制御が少なくとも一部関与するという見解を支持する。
【００４８】
全体的にみて、上記の結果は、ＡＲＯ細胞およびＭＲＯ細胞においてＧａｌ−３がＫ−Ｒａｓ．ＧＴＰと相互作用した結果として、ｐ２１およびＴｔｆ−１に負の調節をかける、すなわち細胞成長を迅速に抑制して、分化を誘導することが知られているＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードへの強力なシグナルが生じることを示唆した。
【００４９】
ＦＴＳは、ＡＲＯ細胞の細胞膜におけるＫ−Ｒａｓ−Ｇａｌ−３の共局在を妨害する。
本発明者らは次に、ＦＴＳが、細胞膜におけるＫ−ＲａｓとＧａｌ−３の相互作用を妨害するかどうかを調べた。そのために、本発明者らは、一連の細胞の中で最も悪性の細胞、すなわちＡＲＯ細胞を使用し、細胞をＦＴＳ処理の前後にマウス抗ｐａｎ  Ｒａｓ抗体およびラット抗Ｇａｌ−３抗体で染色した。次いで細胞をｃｙ３標識抗マウス抗体（Ｒａｓ標識用）およびフルオレセイン標識抗ラット抗体（Ｇａｌ−３標識用）で染色した（写真は示さず）。これらの実験の典型的な蛍光共焦点画像は、Ｒａｓが主に対照細胞の細胞膜に局在化したこと（図示せず）、およびＦＴＳ処理後、Ｒａｓの主要な分画は、細胞質に誤って局在化したこと（図示せず）を示した。重要な点で、ＡＲＯ細胞中のＧａｌ−３は、細胞質および細胞膜の両方に局在化し（図示せず）、ＦＴＳ処理後、Ｇａｌ−３の大部分は細胞質にあった（図示せず）ことがわかった。ＦＴＳが内因性のＲａｓおよびＧａｌ−３相互作用に及ぼす強力な影響は、薬物処理した細胞の形質膜におけるＧａｌ−３およびＲａｓの共局在の妨害が認められたことにより、はっきりと実証される（図示せず）。結果の統計的分析を図５に示す。重要なことに、これらの結果は、がん細胞におけるＲａｓとＧａｌ−３の相互作用が、２種の結合パートナーの外因的な発現なしに妨害されたことを示している。
【００５０】
［実施例２：動物実験］
次に本発明者らは、ＦＴＳが甲状腺癌の成長をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制し得るかどうかを調べた。このために、本発明者らは、所有する中で最も悪性の細胞系、すなわちＡＲＯ細胞を使用し、雄ヌードマウス側腹部の皮膚の下に、従前に詳述されているとおりに、細胞を埋め込んだ［Ｂａｒｋａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２（１８）：５５３３〜４２（２００６）］。細胞を埋め込んでから７日後、腫瘍の体積は、０．５〜０．６ｃｍ３であった。次いで、マウスを対照群（１０匹のビヒクル処置マウス）とＦＴＳ処置群（１０匹）にランダムに分けた。マウスにＦＴＳ（６０ｍｇ／ｋｇ、毎日）またはビヒクルを２５日間経口的に与え、表示した時期に腫瘍体積を測定した。次いで、腫瘍重量および薬理学を明らかにするために、マウスを屠殺した。結果を図６Ａ〜Ｃに示す。示されるとおり、ＦＴＳによって、腫瘍成長の速度が有意に低下した（ｐ＜０．０５、図６Ａ）。終末点での腫瘍重量も、ＦＴＳ処置群では対照と比べて有意に少なかった（ｐ＝０．０１、図６Ｂ）。図６Ｃに、薬理学の結果を示す。本発明者らは、経口ＦＴＳ処置によって、Ｒａｓ．ＧＴＰ、Ｇａｌ−３、およびｐ−ＥＲＫのレベルが有意に低下したことを見出した。全体としてこれらの実験は、ＦＴＳが、腫瘍においてｉｎ  ｖｉｖｏでそのターゲットに打撃を与え、未分化甲状腺腫瘍の成長を抑制することを示した。
【００５１】
すべての特許刊行物および非特許刊行物は、本発明が属する分野の当業者の技量のレベルを示唆する。これらの刊行物はすべて、個々のそれぞれの刊行物について引用することにより本明細書の一部をなすものとすると明確かつ個別に指摘した場合と同じく、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００５２】
本明細書では本発明について特定の実施形態に関して述べてきたが、それらの実施形態は、単に本発明の原理および応用の具体例に過ぎないことを理解されたい。したがって、その具体例となる実施形態に数多くの変更を加えてもよいこと、ならびに添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、他の計画を考案してもよいことを理解されたい。
【図１】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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