(57)【要約】本発明は、抗体のＦａｂ部分に付いている糖中のシアル酸量を調整することにより、抗体の循環半減期を制御する方法に関する。さらに、本発明は、循環半減期が延長された抗体も提供する。本発明者らは、抗体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖鎖中のシアル酸量が、抗体の循環半減期に大きな影響を及ぼすことを見出した。この原理は、抗体、特に、治療的または診断的に有用な抗体の循環半減期を制御し、したがって、これらのバイオアベイラビリティーを制御するのに用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期を制御するための方法であって、
（ａ）循環半減期を延長することについては、
（ａ１）該抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を増大させるステップ、および／あるいは
（ａ２）該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位を除去するステップ、および／あるいは
（ａ３）該抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を減少させるステップ、あるいは
（ｂ）循環半減期を短縮することについては、
（ｂ１）該抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を減少させるステップ、および／あるいは
（ｂ２）該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に１またはそれより多くのグリコシル化部位を導入するステップ、および／あるいは
（ｂ３）該抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を増大させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ１）が、以下の特徴：
（ｉ）前記組成物において、前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも５０％が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むように、シアル酸量を増大させること、
（ｉｉ）前記組成物において、前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖における糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量が、少なくとも０．８となるように、シアル酸量を増大させること、
（ｉｉｉ）前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を増大させる一方で、前記組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの２０％未満、好ましくは１０％未満が、少なくとも１つのシアル酸を含むこと、および
（ｉｖ）シアル酸量を増大させるステップが、前記抗体またはその断片もしくは誘導体を、細胞または細胞系において、該細胞または細胞系が高いシアリル化活性を有する条件下で発現させるステップを包含すること
のうちの１またはそれより多くを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ２）が、以下の特徴：
（ｉ）前記１またはそれより多くのグリコシル化部位を、前記抗体またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸配列を変化させることにより除去すること、
（ｉｉ）除去される少なくとも１つのグリコシル化部位が、前記抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域内または軽鎖可変領域内、好ましくは重鎖可変領域内、より好ましくはそのフレームワーク領域内に存在すること、
（ｉｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体の前記Ｆａｂ部分に存在する全てのグリコシル化部位を除去すること、
（ｉｖ）前記１またはそれより多くのグリコシル化部位の除去が、前記抗体またはその断片もしくは誘導体の抗原結合および／または抗原特異性を有意に低減しないかまたは消失させないこと、ならびに
（ｖ）抗原結合アフィニティーを、２０％を超えて、好ましくは１５％を超えて、１０％を超えて、または５％を超えて低下させることがないこと
のうちの１またはそれより多くを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ３）が、以下の特徴：
（ｉ）前記組成物において、前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むように、フリーのガラクトース単位量を減少させること、および
（ｉｉ）フリーのガラクトース単位量を減少させるステップが、前記抗体またはその断片もしくは誘導体を、細胞または細胞系において、前記細胞または細胞系が高いシアリル化活性を有する条件下で発現させるステップを包含すること
のうちの１またはそれより多くを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ１）が、以下の特徴：
（ｉ）前記組成物において、前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むように、シアル酸量を減少させること、
（ｉｉ）前記組成物において、前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖における糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量が、０．５未満となるように、シアル酸量を減少させること、および
（ｉｉ）シアル酸量を減少させるステップが、前記抗体またはその断片もしくは誘導体を、細胞または細胞系において、該細胞または細胞系が低いシアリル化活性を有するかまたはシアリル化活性を有さない条件下で発現させるステップを包含すること
のうちの１またはそれより多くを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ２）が、以下の特徴：
（ｉ）正確に１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのグリコシル化部位が、前記抗体またはその断片もしくは誘導体の前記Ｆａｂ部分に導入されること、
（ｉｉ）前記１またはそれより多くのグリコシル化部位が、前記抗体またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸配列を変化させることにより導入されること、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのグリコシル化部位が、前記抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域内または軽鎖可変領域内、好ましくは重鎖可変領域内、より好ましくはそのフレームワーク領域内に導入されること、
（ｉｖ）少なくとも１つのグリコシル化部位が重鎖定常領域１または軽鎖定常領域に導入されること、
（ｖ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、前記１またはそれより多くのグリコシル化部位を導入する前に、そのＦａｂ部分にグリコシル化部位を含有しないこと、
（ｖｉ）前記Ｆａｂ部分に導入された前記グリコシル化部位のうちの少なくとも１つが、配列Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有し、この場合、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の、任意のアミノ酸であること、
（ｖｉｉ）前記１もしくはそれより多くの導入されたグリコシル化部位、および／または該グリコシル化部位に付いている糖が、前記抗体またはその断片もしくは誘導体の抗原結合および／または抗原特異性を有意に低減しないかまたは消失させないこと、ならびに
（ｖｉｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記１またはそれより多くの導入されたグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むこと
のうちの１またはそれより多くを含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ３）が、以下の特徴：
（ｉ）前記組成物において、前記Ｆａｂ部分に存在する前記少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも５０％が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むように、フリーのガラクトース単位量を増大させること、および
（ｉｉ）シアル酸量を増大させるステップが、前記抗体またはその断片もしくは誘導体を、細胞または細胞系において、前記細胞または細胞系が低いシアリル化活性を有するか、またはシアリル化活性を有さない条件下で発現させるステップを包含すること
のうちの１またはそれより多くを含む、請求項１、５、および６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体の前記Ｆａｂ部分に存在する前記グリコシル化部位のうちの少なくとも１つが、重鎖可変領域内または軽鎖可変領域内、好ましくは重鎖可変領域内、より好ましくは可変領域のフレームワーク領域内に存在する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも５０％が、前記Ｆａｂ部分においてグリコシル化されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、Ｆｃ部分、好ましくはＣＨ２領域、より好ましくはアミノ酸Ａｓｎ２９７において、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、以下の特徴：
（ｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも５０％が、前記Ｆｃ部分においてグリコシル化されていること、
（ｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％が、フコース残基を保有しないこと、
（ｉｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％が、シアル酸残基を保有しないこと、および
（ｉｖ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも５％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン残基を保有すること
のうちの１またはそれより多くを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、以下の特徴：
（ｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基を保有すること、
（ｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、ヒトグリコシル化パターンを有すること、
（ｉｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まないこと、
（ｉｖ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まないこと、
（ｖ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖中のシアル酸のうちの少なくとも４０％が、２，６結合により連結されていること、
（ｖｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のうちの少なくとも２３％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン（ビスＧｌｃＮＡｃ）残基を保有すること、
（ｖｉｉ）前記抗体が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、またはＩｇＭ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体、より好ましくはＩｇＧ１抗体であること、
（ｖｉｉｉ）前記抗体が、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、霊長動物抗体、またはラクダ抗体であること、および
（ｉｘ）前記抗体が、操作された抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であること
のうちの１またはそれより多くを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体の前記断片または誘導体が、以下の特徴：
（ｉ）該抗体の該断片または誘導体が、該抗体のうちの少なくとも重鎖可変領域を含み、場合によって、該抗体の該断片または誘導体が、該抗体の重鎖定常領域１、および／または該抗体の軽鎖可変領域、および／または該抗体の軽鎖定常領域をさらに含むこと、
（ｉｉ）該抗体の該断片または誘導体が、
（ａ）重鎖および軽鎖の各々のうちの可変領域および第１の定常ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、
（ｂ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片、
（ｃ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片、
（ｄ）抗体の単一のアームの重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片、
（ｅ）単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片、
（ｆ）共有結合的に連結された２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片、
（ｇ）重鎖可変ドメイン、および
（ｈ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との会合が、分子間だけで生じることが可能であり、分子内で生じることは可能でない形で共有結合的に連結された、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域からなる多重抗体
からなる群から選択されること、ならびに
（ｉｉｉ）該抗体の該断片または誘導体が、該抗体と同じ抗原、好ましくは同じエピトープに結合することが可能であること
のうちの１またはそれより多くを有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物において、前記抗体またはその断片もしくは誘導体の前記Ｆａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％が、ビスＧｌｃＮＡｃを保有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、該重鎖可変領域のうちのアミノ酸８５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む、キメラまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、該重鎖可変領域のうちのアミノ酸５４位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む、キメラまたはヒト化抗ＴＡ−Ｍｕｃ１抗体である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物であって、該抗体またはその断片もしくは誘導体が、それらのＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位を含むことを特徴とし、該組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体の該Ｆａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも６５％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有し、かつ／あるいは該抗体またはその断片もしくは誘導体の該Ｆａｂ部分に付いている糖のうちの３５％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を保有することを特徴とする抗体組成物。
【請求項１８】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、請求項２、４、および８から１６のいずれか一項に記載の特徴のうちの１またはそれより多くを有する、請求項１７に記載の抗体組成物。
【請求項１９】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、以下の特徴：
（ｉ）前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも５０％が、前記Ｆａｂ部分においてグリコシル化されていること、
（ｉｉ）前記組成物において、Ｆａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有すること、
（ｉｉｉ）該抗体またはその断片もしくは誘導体が、それらのＦｃ部分において、好ましくはＣＨ２領域において、より好ましくはアミノ酸Ａｓｎ２９７において、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むこと、
（ｉｖ）前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも５０％が、前記Ｆｃ部分においてグリコシル化されていること、
（ｖ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％が、フコース残基を保有しないこと、
（ｖｉ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％が、シアル酸残基を保有しないこと、
（ｖｉｉ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも５％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン残基を保有すること、
（ｖｉｉｉ）前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基を保有すること、
（ｉｘ）該抗体またはその断片もしくは誘導体が、ヒトグリコシル化パターンを有すること、
（ｘ）該抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まないこと、
（ｘｉ）該抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まないこと、
（ｘｉｉ）前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖中のシアル酸のうちの少なくとも４０％が、２，６結合により連結されていること、
（ｘｉｉｉ）前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のうちの少なくとも２３％が、二分枝状のＮ−アセチルグルコサミン（ビスＧｌｃＮＡｃ）残基を保有すること、
（ｘｉｖ）前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％が、ビスＧｌｃＮＡｃを保有すること、
（ｘｉｖ）該抗体が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、またはＩｇＭ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体、より好ましくはＩｇＧ１抗体であること、
（ｘｖ）該抗体が、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、霊長動物抗体、またはラクダ抗体であること、
（ｘｖｉ）該抗体が、操作された抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であること、
（ｘｖｉｉ）該抗体の該断片または誘導体が、該抗体のうちの少なくとも重鎖可変領域を含み、Ｆａｂ部分において前記グリコシル化部位を含むこと、
（ｘｖｉｉｉ）該断片または誘導体が、
（ａ）重鎖および軽鎖の各々の可変領域および第１の定常ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、
（ｂ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片、
（ｃ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片、
（ｄ）抗体の単一のアームの重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片、
（ｅ）単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片、
（ｆ）共有結合的に連結された２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片、
（ｇ）重鎖可変ドメイン、および
（ｈ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との会合が、分子間だけで生じることが可能であり、分子内で生じることは可能でない形で共有結合的に連結された、該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域からなる多重抗体
からなる群から選択されること、
（ｘｉｘ）該断片または誘導体が、該抗体と同じ抗原、好ましくは同じエピトープに結合することが可能であること、ならびに
（ｘｘ）該抗体が、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂなどの抗ＥＧＦＲ抗体、Ｋａｒｏｍａｂなどの抗ＴＦ抗体、Ｐａｎｋｏｍａｂなどの抗Ｍｕｃ１抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂなどの抗ＨＥＲ２抗体、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂなどの抗ＣＤ２０抗体からなる群から選択されること
のうちの１またはそれより多くを有する、請求項１７または１８に記載の抗体組成物。
【請求項２０】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むキメラまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体を含む抗体組成物であって、
（ｉ）該抗体が、Ｋａｂａｔの番号付けによる、該重鎖可変領域のうちのアミノ酸８５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位を含み、該組成物において、該Ｆａｂ部分に存在する該グリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６５％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有し、かつ／もしくは該Ｆａｂ部分に存在する該グリコシル化部位に付いている糖のうちの３５％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を保有すること、または
（ｉｉ）該抗体が、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を含まないこと
を特徴とする抗体組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、以下の特徴：
（ｉ）該抗体が、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位を含むこと、
（ｉｉ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％が、フコース残基を保有しないこと、
（ｉｉｉ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％が、シアル酸残基を保有しないこと、
（ｉｖ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも１０％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン残基を保有すること、
（ｖ）前記組成物において、該抗体に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基を保有すること、
（ｖｉ）該抗体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まないこと、および
（ｖｉｉ）該抗体に付いている糖が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まないこと、
（ｖｉｉｉ）場合によって、前記組成物において、該抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％が、ビスＧｌｃＮＡｃを保有すること
の全てを有する、請求項２０に記載の抗体組成物。
【請求項２２】
配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むキメラまたはヒト化抗Ｍｕｃ１抗体を含む抗体組成物であって、該抗体が、Ｋａｂａｔの番号付けによる、該重鎖可変領域のうちのアミノ酸５４位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位を含み、該組成物において、該Ｆａｂ部分に存在する該グリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６５％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有し、かつ／または該Ｆａｂ部分に存在する該グリコシル化部位に付いている糖のうちの３５％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を保有することを特徴とする抗体組成物。
【請求項２３】
前記抗体が、以下の特徴：
（ｉ）該抗体が、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位を含むこと、
（ｉｉ）場合によって、前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％が、フコース残基を保有しないこと、
（ｉｉｉ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％が、シアル酸残基を保有しないこと、
（ｉｖ）前記組成物において、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも５％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン残基を保有すること、
（ｖ）前記組成物において、該抗体に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基を保有すること、
（ｖｉ）該抗体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まないこと、
（ｖｉｉ）該抗体に付いている糖が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まないこと、
の全てを有する、請求項２２に記載の抗体組成物。
【請求項２４】
医療、好ましくはがんの処置において使用するための、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項２５】
医薬組成物である、請求項１７から２４のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項２６】
ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆをコードする少なくとも１つの対立遺伝子を有する患者におけるがんの処置において使用するための、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項２７】
Ｅｒｂｉｔｕｘによる処置が不成功であった後のがんの処置において使用するための、請求項２０または２１に記載の抗体組成物。
【請求項２８】
腫瘍細胞が、ＥＧＦＲによるシグナル伝達経路における少なくとも１つの活性化変異を含む、がんの処置において使用するための、請求項２０または２１に記載の抗体組成物。
【請求項２９】
前記活性化変異が、構成的に活性なＫ−Ｒａｓ変異体、構成的に活性なＰＩ  ３キナーゼ変異体、またはＲａｆキナーゼの過剰発現を結果としてもたらす、請求項２８に記載の抗体組成物。
【請求項３０】
所望の循環半減期を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物を生成するための方法であって、該抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を宿主細胞において発現させるステップを含み、ここで、請求項１に記載の抗体またはその断片もしくは誘導体の半減期を制御するための方法が、該方法のステップ（ａ１）、ステップ（ａ３）、ステップ（ｂ１）、もしくはステップ（ｂ３）を用いて実施され、かつ／または該宿主細胞が、ステップ（ａ２）もしくは（ｂ２）を用いる請求項１に記載の方法により得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を発現する方法。
【請求項３１】
請求項２から１６のいずれか一項に記載の方法が実施されるかまたは実施された、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体組成物が、請求項２から２５のうちの１またはそれより多くに記載の特徴のうちの１またはそれより多くを有する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体であって、該抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列が、Ｆａｂ部分において少なくとも１つのグリコシル化部位を含む基準抗体に由来し、該抗体またはその断片もしくは誘導体が、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を含まず、該抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体が、該基準抗体より長い循環半減期を有する、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体。
【請求項３４】
以下の特徴：
（ｉ）前記抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体が、前記基準抗体と同じエピトープに結合すること、
（ｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域の３つのＣＤＲ全てのアミノ酸配列が、前記基準抗体に由来すること、
（ｉｉｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ全てのアミノ酸配列が、前記基準抗体に由来すること、
（ｉｖ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域のアミノ酸配列全体、および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列全体が、前記基準抗体に由来すること、
（ｖ）前記抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の抗原結合アフィニティーが、前記基準抗体の抗原結合アフィニティーと同様であるか、またはこれより高いこと、
（ｖｉ）前記抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期が、前記基準抗体の循環半減期より少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％長いこと、
（ｖｉｉ）前記抗原結合アフィニティーが、２０％を超えて、好ましくは１５％を超えて、１０％を超えて、または５％を超えて低下しないこと、
（ｖｉｉｉ）前記基準抗体が、ＣｅｔｕｘｉｍａｂまたはＣｅｔｕｘｉｍａｂと同じエピトープに結合する抗体などの抗ＥＧＦＲ抗体、ＰａｎｋｏｍａｂまたはＰａｎｋｏｍａｂと同じエピトープに結合する抗体などの抗ＭＵＣ１抗体、ＳｏｌａｎｅｚｕｍａｂまたはＳｏｌａｎｅｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体などの抗Ａβ抗体、およびＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂまたはＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体などの抗ＣＤ５２抗体からなる群から選択されること、ならびに
（ｉｘ）前記基準抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位が、好ましくはアミノ酸配列Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有するＮ−グリコシル化部位であり、この場合、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であること
のうちの１またはそれより多くを有する、請求項３３に記載の抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体。
【請求項３５】
前記基準抗体が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸８５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗ＥＧＦＲ抗体であるか、または
前記基準抗体が、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸５４位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗ＴＡ−Ｍｕｃ１抗体であるか、または
前記基準抗体が、
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）場合によって、Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸６０位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗ＣＤ５２抗体であるか、または
前記基準抗体が、
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）場合によって、Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸５５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗Ａβ抗体である、
請求項３３または３４に記載の抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体。
【請求項３６】
（ｉ）前記基準抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位が、重鎖可変領域内または軽鎖可変領域内にあり、そして
（ｉｉ）前記抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、該重鎖可変領域内または軽鎖可変領域内のグリコシル化部位が除去されるように、少なくとも１つのアミノ酸において、該基準抗体の対応するアミノ酸配列とは異なる、
請求項３３から３５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体。
【請求項３７】
延長された循環半減期を有する、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を生成するための方法であって、
（ａ）Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を供給するステップと、
（ｂ）該コードされた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の該Ｆａｂ部分における該グリコシル化部位が除去されるように、変異を該核酸へと導入するステップと
を含む方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法により得ることが可能な核酸。
【請求項３９】
延長された循環半減期を有する、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を生成するための方法であって、
（ａ）Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を供給するステップと、
（ｂ）該コードされた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の該Ｆａｂ部分における該グリコシル化部位が除去されるように、変異を該核酸へと導入するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られる核酸を発現させて、前記Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を含まず、かつ、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体よりも長い循環半減期を有する、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を生成するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法により得ることが可能な抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体。
【請求項４１】
請求項３３から３６のうちの１またはそれより多くに記載の抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物。
【請求項４２】
前記組成物における前記抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体が、Ｆｃ部分において、請求項１１および／または１２に記載のグリコシル化パターンを有する、請求項４１に記載の抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体の分野に関する。特に、高度にシアリル化されたグリカンをそれらのＦａｂ部分に結合させた抗体が提供される。さらに、本発明は、それらのＦａｂシアリル化を介して、抗体の循環半減期を制御する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
今日、抗体は、医療および研究の分野で広く用いられる薬剤である。医療では、抗体が、多くの異なる分野で適用されている。例えば、抗体は、疾患の診断および／もしくは予後診断、または例えば、特定のホルモンの存在もしくは濃度など、特定の体内パラメータの決定を可能とする特定のマーカーを検出するための標識化薬剤として用いられている。
【０００３】
さらに、抗体はまた、がん、心血管疾患、炎症性疾患、黄斑変性、移植片拒絶、多発性硬化症、およびウイルス感染など、多様な疾患の処置および予防における治療剤としても用いられている。これらの療法では、抗体が、受容体分子もしくはメッセンジャー分子を遮断し、これによりそれらの疾患関与性機能を阻害することにより、または患者の免疫系の構成要素を動員および活性化することにより、抗体が独自の治療活性を保有しうる。代替的に、抗体を、治療活性を有する別の薬剤に連結することもできる。特に、がんおよび感染症の治療では、前記さらなる薬剤が細胞殺滅活性を有するが、これらは、例えば、放射性同位元素の場合もあり、細胞毒素の場合もある。別の適用では、抗体を用いて、適切な抗体を患者の循環中に移入させることにより、患者を受動的に免疫化することもできる。
【０００４】
抗体のインビボにおける適用、特に、それらの治療的な使用の重要な側面は、抗体が患者の体内に滞留する時間、すなわち、抗体の循環半減期である。
【０００５】
タンパク質の循環半減期を延長するための多くの手法は、それらを、半減期を延長する他の分子とコンジュゲートするか、またはそれらを、半減期を延長するタンパク質もしくはペプチドに融合することなど、タンパク質の人工的な修飾を伴う。しかし、これらの手法は、ある不利益を伴う。それらは、通常、複雑な生成工程を伴い、それらの生体適合性または医薬としての承認に関して問題が生じることが多い。さらに、これらの修飾は、抗体の生物学的活性、特に、それらの抗原結合特性、ならびに、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）など、それらの下流におけるシグナル伝達に対しても有害であることが多い。
【０００６】
さらに、一部の場合におけるＦＳＨなどの糖タンパク質については、糖タンパク質の糖鎖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈａｉｎ）に付いているシアル酸量が、糖タンパク質のクリアランス速度に影響を及ぼし、したがって、糖タンパク質の循環半減期にも影響を及ぼす。しかし、当技術分野の最新技術によれば、この原理を抗体に帰属させることはできない。第１に、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に付いている糖鎖のシアリル化度が高ければ、抗体の生物学的活性に負の影響が及ぶ。特に、Ｆｃ領域の各Ｆｃ受容体へのアフィニティーが低下するために、抗体のＡＤＣＣが大幅に低下する（例えば、非特許文献１を参照されたい）。さらに、Ｆａｂ領域におけるグリコシル化部位に付いている糖鎖のシアリル化度は、抗体の循環半減期には影響を及ぼさないと考えられ、むしろ、抗原結合に影響を及ぼす（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５を参照されたい）。
【０００７】
他方でまた、循環半減期が短い抗体も、適用によっては重要な場合もある。例えば、放射性造影法を用いる診断目的の場合は、放射性核種にコンジュゲートされた抗体を用いる。造影手順は、比較的短時間で実施することができ、抗体にコンジュゲートされた放射性核種は、ある有害な副作用を及ぼすので、患者の循環からのコンジュゲートの迅速なクリアランスが有利である。
【０００８】
したがって、当技術分野では、抗体、特に、治療的または診断的に有用な抗体の循環半減期を、化学コンジュゲートまたは融合タンパク質を用いることなしに制御すること、特に、延長または短縮することが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃａｌｌｏｎ，  Ｂ．Ｊ．ら（２００６年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４４巻、１５２４〜１５３４頁
【非特許文献２】Ｈｕａｎｇ，  Ｌ．ら（２００６年）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４９巻、１９７〜２０７頁
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｗａｒｄ，  Ｔ．Ａ．ら（２００８年）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、３６巻、４１〜４７頁
【非特許文献４】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，  Ｒ．（２００９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８３巻、２２３〜２３８頁
【非特許文献５】Ｓｏｌａ，  Ｒ．Ｊ．ら（２０１０年）、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２４巻、９〜２１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、抗体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖鎖中のシアル酸量が、抗体の循環半減期に大きな影響を及ぼすことを見出した。この原理は、抗体、特に、治療的または診断的に有用な抗体の循環半減期を制御し、したがって、これらのバイオアベイラビリティーを制御するのに用いることができる。抗体の循環半減期を個別に調整しうることは、例えば、抗体の治療有効性を最適化し、抗体の治療効果および有害な副作用の可能性を考量するのに有利である。さらに、有害な副作用を回避するためには、抗体の循環半減期を低レベルへと調整することも、診断の目的に有利である。
【００１１】
したがって、第一の態様では、本発明が、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期を制御するための方法であって、
（ａ）循環半減期を延長するために、
（ａ１）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）中のシアル酸量を増大させるステップ、および／あるいは
（ａ２）抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位を除去するステップ、および／あるいは
（ａ３）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を減少させるステップ、あるいは
（ｂ）循環半減期を短縮するために、
（ｂ１）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を減少させるステップ、および／あるいは
（ｂ２）抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に１またはそれより多くのグリコシル化部位を導入するステップ、および／あるいは
（ｂ３）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を増大させるステップ
を含む方法を対象とする。
【００１２】
第二の態様では、本発明が、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物であって、抗体またはその断片もしくは誘導体が、それらのＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位を含むことを特徴とし、組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも６５％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有し、かつ／あるいは抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの３５％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を保有することを特徴とする抗体組成物を提供する。さらに本発明は、特異的な抗体組成物、および医療におけるそれらの使用も提供する。
【００１３】
第三の態様では、本発明が、所望の循環半減期を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物を生成する方法であって、宿主細胞において前記抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を発現させるステップを含み、本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の半減期を制御する方法を、前記方法のステップ（ａ１）、ステップ（ａ３）、ステップ（ｂ１）、もしくはステップ（ｂ３）を用いて実施し、かつ／または宿主細胞が、ステップ（ａ２）もしくは（ｂ２）を用いて本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の半減期を制御する方法により得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を発現する方法を提供する。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明により提供される抗体が、免疫系の異なる活性、特に、ＡＤＣＣを誘導する能力をさらに大幅に改善している。これは、抗体のグリコシル化パターンを最適化する結果として、循環半減期の制御のほか、抗体の活性、特に、Ｆｃ受容体への結合およびその活性化の改善をもたらすことにより達成される。したがって、さらなる態様における本発明は、循環半減期が延長され、ＡＤＣＣ活性が改善された抗体を含む抗体組成物のほか、このような抗体を生成する方法も提供する。これらの抗体は、それらのバイオアベイラビリティーならびにそれらの生物学的活性が増大しており、これらのいずれもが治療的有効性の増大に寄与するので、治療的使用に特に適する。したがって、本発明の別の利点は、循環半減期が延長されると同時に生物学的活性も増大した抗体を適用する可能性でもある。循環半減期の延長は、本発明の第一の態様に従う方法により達成することが好ましい。加えて、生物学的活性の増大は、特に、個別のＦｃ受容体に対するより強力な結合から結果として生じる、ＡＤＣＣ活性の増大でもあることが好ましい。このようなＡＤＣＣ活性の増大は、特に、抗体のグリコシル化パターンを最適化することにより、例えば、抗体のＦｃ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフコース残基量を低減することにより達成することができる。
【００１５】
以下の記載および付属の特許請求の範囲により、当業者には、本発明の他の目的、特徴、利点、および態様が明らかとなるであろう。しかし、本出願の好ましい実施形態を示す、以下の記載、付属の特許請求の範囲、および具体例は、例示だけを目的として与えられることを理解されたい。以下を読み取ることにより、当業者には、開示される発明の精神および範囲内にある多様な変更および改変が容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明によりグリコシル化された抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）の、フローサイトメトリーにより解析される異なる細胞系における結合を示す図である。２連の平均値±ＳＤを示す。
【図２】図２は、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂまたはＮＭ−Ｆ９細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂの、ラットにおける薬物動態を示す図である。
【図３】図３は、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂまたはＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂの、カニクイザルにおける薬物動態を示す図である。
【図４】図４は、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させた、Ｆａｂのグリコシル化部位およびＦｃのグリコシル化部位を有するキメラＣｅｔｕｘｉｍａｂ、ならびにＦｃのグリコシル化部位だけを有するヒト化Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの薬物動態を示す図である。
【図５】図５は、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）の、ＥＧＦ受容体に対する阻害活性を示す図である。Ａ：異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂ変異体の存在下における、リガンド結合の阻止によるＥＧＦＲリン酸化の阻害を示す図である。市販のキットを用いて、細胞溶解物における全ＥＧＦＲ量およびリン酸化されたＥＧＦＲ量を決定した。全ＥＧＦＲ中のリン酸化ＥＧＦＲの百分率が示される。２連の平均値±ＳＤが示される。Ｂ：異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂ変異体の存在下におけるＥＧＦＲへのリガンド結合を阻止することによる、Ａ４３１細胞の増殖の阻害を示す図である。６ウェルの平均値±ＳＤが示される。
【図６】図６は、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）ならびにプロテインＧを伴う１８時間にわたるインキュベーション後におけるＡ４３１細胞を用いる、活性カスパーゼ３アポトーシスアッセイを示す図である。２連の測定値のカスパーゼ３陽性細胞（アポトーシス細胞）の百分率の平均値±ＳＤが示される。
【図７】図７は、異なる細胞系において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを用いるＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を示す図である。
【図８】図８は、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂまたはＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを用いる、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖドナーから得られるＰＢＭＣによる標的細胞の溶解を示す図である。
【図９】図９は、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂまたはＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを用いる、ヘテロ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｖドナーから得られるＰＢＭＣによる標的細胞の溶解を示す図である。
【図１０】図１０は、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂまたはＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを用いる、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆドナーから得られるＰＢＭＣによる標的細胞の溶解を示す図である。
【図１１】図１１は、異なるＦｃγＲＩＩＩａアロタイプを伴うドナーのヒト初代ＰＢＭＣによる、ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＡＤＣＣアッセイ（インキュベーション時間：５時間、Ｅ：Ｔ比を８０：１とし、全ての解析を、同じ日に平行して実施する）を示す図である。３連の特異的溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）（抗体を伴わない特異的溶解（バックグラウンド））の平均値および標準偏差が示される。Ａ：本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂを示す図である。Ｂ：ＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを示す図である。
【図１２】図１２は、異なる細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂのＡＤＣＣ活性についての比較を示す図である。異なる濃度において一晩にわたる、ＣＨＯ細胞に由来するＰａｎｋｏｍａｂ（Ｐａｎｋｏｍａｂ  ＣＨＯ）、シアリル化欠損ヒト骨髄細胞に由来するＰａｎｋｏｍａｂ（Ｐａｎｋｏｍａｂ  シアリル化−、シアリル化が低度である）、またはＧＴ−５ｓ細胞に由来するＰａｎｋｏｍａｂ（Ｐａｎｋｏｍａｂ  シアリル化＋、シアリル化が高度である）と共にインキュベーションした後において、Ｅ：Ｔ比を５０：１とする、ＺＲ−７５−１細胞およびヒトＰＢＭＣによるユーロピウム放出アッセイを示す図である。
【図１３】図１３は、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂまたはＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させたＰａｎｋｏｍａｂを用いる、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆドナーから得たＰＢＭＣによる標的細胞の溶解を示す図である。
【図１４】図１４は、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂを用いる、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆドナーまたはホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖドナーから得たＰＢＭＣによる、構成的に活性なＫ−Ｒａｓ変異を含む標的細胞の溶解を示す図である。
【図１５】図１５は、帯電の異なるアイソタイプのプールにおけるシアリル化グリカン量を示す図である。（Ａ）等電点電気泳動から得られたプールにおけるＦｃ部分およびＦａｂ部分のシアリル化を示す図である（プール１：ｐＨが高く、プール２：ｐＨが中程度であり、プール３：ｐＨが低い）。（Ｂ）薬物動態研究に用いられるプールのシアリル化を示す図である（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  Ａ：プール１および２、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｂ：プール３）。Ｓ１とは、グリカンを保有する単一のシアル酸を意味し、Ｓ２とは、ジシアリル化グリカンを意味し、Ｓ＞０とは、Ｓ１とＳ２との和を意味する。
【図１６】図１６は、マウスにおけるＣｅｔｕｘｉｍａｂの循環半減期の薬物動態を示す図である。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  Ａ：シアリル化が低度であり、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｂ：シアリル化が高度である。抗体濃度は、対数スケールによる。
【図１７】図１７は、Ａ４３１ヒト外陰類表皮がん異種移植細胞を保有するヌードマウスにおける、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）の、インビボにおける抗腫瘍活性を示す図である。異種移植されたマウスは、腫瘍が触知可能なサイズに到達したときに、表示の用量レベルで処置した。各記号は、動物８匹の群の平均値およびＳＥＭを表す。＃：腫瘍サイズが危機的なサイズであるために、対照群の動物は、２０日目に屠殺した。
【図１８】図１８は、ＤＵ１４５結腸がん異種移植細胞を保有するヌードマウスにおける、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））のインビボにおける抗腫瘍活性を示す図である。異種移植されたマウスは、腫瘍が触知可能なサイズに到達した後で、表示の用量レベルでＣｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）で処置した。各記号は、動物７〜８匹の群の平均値およびＳＥＭを表す。
【図１９】図１９は、ＺＲ−７５−１細胞を異種移植されたヌードマウスにおける腫瘍成長に対する、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたシアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂの効果を示す図である。８匹の群のマウス、ヌードマウス、用量：０．５ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与。Ｐａｎｋｏｍａｂ  シアリル化＋：シアリル化されたＰａｎｋｏｍａｂ、Ｐａｎｄｏｍａｂ  シアリル化−：シアリル化されていないＰａｎｋｏｍａｂ；ＰＢＳ：緩衝液対照。
【図２０】図２０は、患者から得られたＮＳＣＬＣおよびＣＲＣ起源の異種移植細胞を保有するヌードマウスにおける、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））のインビボにおける抗腫瘍活性を示す図である。異種移植されたヌードマウスは、腫瘍が触知可能なサイズに到達したときに、緩衝液対照または異なる濃度のＣｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）で処置した。各記号は、動物８匹の群の平均値およびＳＥＭを表す。
【図２１−１】図２１は、（Ａ）ＩｇＧ抗体、および（Ｂ）コア構造、および（Ｃ）抗体のＦａｂグリコシル化部位およびＦｃグリコシル化部位に付いている糖鎖の二分枝性（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合体型構造についての概略図を示す図である。（Ａ）では、ＩｇＧ抗体が、例示的なグリコシル化部位において例示的な糖構造を含む。抗体の１つの重鎖のグリコシル化だけを示す。他の重鎖は、概略図には示されていない、対応する糖構造を保有する、対応するグリコシル化部位を含む。（Ｂ）および（Ｃ）では、黒色四角が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、グレーの丸が、マンノース残基（Ｍａｎ）を表し、白色丸が、ガラクトース残基（Ｇａｌ）を表し、グレーの菱形が、シアル酸残基（ＳＡ）を表し、黒色の三角が、フコース残基（Ｆｕｃ）を表し、グレーの四角が、二分枝状の（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ビスＧｌｃＮＡｃ）を表す。二分枝性複合体型の構造では、糖の分枝中のＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、およびＳＡ、ビスＧｌｃＮＡｃ、ならびにＦｕｃを糖構造内に存在させるのは任意選択であるに過ぎず、存在させなくともよい。
【図２１−２】図２１は、（Ａ）ＩｇＧ抗体、および（Ｂ）コア構造、および（Ｃ）抗体のＦａｂグリコシル化部位およびＦｃグリコシル化部位に付いている糖鎖の二分枝性複合体型構造についての概略図を示す図である。（Ａ）では、ＩｇＧ抗体が、例示的なグリコシル化部位において例示的な糖構造を含む。抗体の１つの重鎖のグリコシル化だけを示す。他の重鎖は、概略図には示されていない、対応する糖構造を保有する、対応するグリコシル化部位を含む。（Ｂ）および（Ｃ）では、黒色四角が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、グレーの丸が、マンノース残基（Ｍａｎ）を表し、白色丸が、ガラクトース残基（Ｇａｌ）を表し、グレーの菱形が、シアル酸残基（ＳＡ）を表し、黒色の三角が、フコース残基（Ｆｕｃ）を表し、グレーの四角が、二分枝状のＮ−アセチルグルコサミン残基（ビスＧｌｃＮＡｃ）を表す。二分枝性複合体型の構造では、糖の分枝中のＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、およびＳＡ、ビスＧｌｃＮＡｃ、ならびにＦｕｃを糖構造内に存在させるのは任意選択であるに過ぎず、存在させなくともよい。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書で用いられる通り、以下の表現は一般に、それらが用いられる文脈が他の内容を示す場合を除き、以下に示す意味を有することが好ましいことを意図する。
【００１８】
本明細書で用いられる「含む」という表現は、その字義通りの意味のほかに、また、「本質的に〜からなる」という表現および「〜からなる」という表現も包含し、これらの表現を具体的に指す。したがって、「含む」という表現は、具体的に列挙された要素を「含む」対象物が、さらなる要素を含まない実施形態を指すほか、具体的に列挙された要素を「含む」対象物が、さらなる要素を包含する可能性があり、かつ／またはこれらを実際に包含する実施形態も指す。同様に、「有する」という表現も、「含む」という表現と同様に理解されるべきであるが、また、「本質的に〜からなる」という表現および「〜からなる」という表現も包含し、これらの表現も具体的に指すものとして理解されるべきである。
【００１９】
「抗体」という用語は、特に、ジスルフィド結合により連結された、少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むタンパク質を指す。「抗体」という用語は、天然の抗体のほか、抗体の全ての組換え形態、例えば、原核細胞において発現する抗体、グリコシル化されていない抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体も包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖定常領域は、３つまたは（ＩｇＭ型抗体またはＩｇＥ型抗体の場合は）４つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含み、第１の定常ドメインＣＨ１は、可変領域に隣接し、ヒンジ領域を介して、第２の定常ドメインであるＣＨ２に連結されうる。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインだけからなる。可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する、より保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性領域へとさらに区分することができ、この場合、各可変領域は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、多様な免疫系細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。しかし、本発明による「抗体」という用語はまた、重鎖抗体、すなわち、１またはそれより多くの、特に、２つの重鎖だけからなる抗体、およびナノボディー、すなわち、単一の単量体可変ドメインだけからなる抗体も包含する。
【００２０】
特に、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２など、任意のサブクラスを含めた、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭなど、任意のアイソタイプの抗体でありうる。抗体は、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体であることが好ましく、ＩｇＧ１抗体であることがより好ましい。重鎖定常領域は、γ型重鎖、δ型重鎖、α型重鎖、μ型重鎖、またはε型重鎖など、任意の型の重鎖でありうる。さらに、軽鎖定常領域もまた、κ型軽鎖またはλ型軽鎖など、任意の型の軽鎖でありうる。抗体の軽鎖は、κ鎖であることが好ましい。
【００２１】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸位置を示すのに、本明細書では、Ｋａｂａｔによる番号受けシステム（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号）を用いる。前記システムによれば、重鎖は、３５Ａ、３５Ｂ、５２Ａ〜５２Ｃ、８２Ａ〜８２Ｃ、および１００Ａ〜１００Ｋを含め、０位〜１１３位のアミノ酸位置を含む。Ｋａｂａｔによる番号付けでは、重鎖可変領域のＣＤＲが、３１〜３５Ｂ位（ＣＤＲ１）、５０〜６５位（ＣＤＲ２）、および９５〜１０２位（ＣＤＲ３）に位置する。残りのアミノ酸位置は、フレームワーク領域であるＦＲ１〜ＦＲ４を形成する。軽鎖可変領域は、２７Ａ〜２７Ｆ位、９５Ａ〜９５Ｆ位、および１０６Ａ位を含めた、０〜１０９位を含む。ＣＤＲは、２４〜３４位（ＣＤＲ１）、５０〜５６位（ＣＤＲ２）、および８９〜９７位（ＣＤＲ３）に位置する。抗体の特異的遺伝子の初期形成に応じて、これらの位置のうちの全てが、所与の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に必ずしも存在する必要があるわけではない。本明細書で重鎖可変領域または軽鎖可変領域におけるアミノ酸位置に言及する場合、別段に示さない限り、これらのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔによる番号付けに従う位置を指す。
【００２２】
抗体またはその断片もしくは誘導体の「Ｆａｂ部分」とは、特に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）と、第１の重鎖定常領域および軽鎖定常領域（ＣＨ１およびＣＬ）とを含む抗体の部分を指す。抗体またはその断片もしくは誘導体が、これらの領域の全てを含むわけではない場合は、「Ｆａｂ部分」という用語が、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬという領域のうちで、抗体またはその断片もしくは誘導体に存在する領域だけを指す。「Ｆａｂ部分」とは、パパインで天然抗体を消化することにより得られる、抗体の抗原結合活性を含有する断片に対応する抗体の部分を指すことが好ましい。特に、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分は、抗原結合部位またはその抗原結合能力を包含する。Ｆａｂ部分は、抗体のうちの少なくともＶＨ領域を含むことが好ましい。
【００２３】
抗体またはその断片もしくは誘導体の「Ｆｃ部分」とは、特に、重鎖定常領域２、３、および（適合する場合は）４（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含む抗体の部分を指す。抗体またはその断片もしくは誘導体が、これらの領域の全てを含まない場合は、「Ｆｃ部分」という用語が、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４という領域のうちで、抗体またはその断片もしくは誘導体に存在する領域だけを指す。「Ｆｃ部分」とは、パパインで天然抗体を消化することにより得られる、抗体の抗原結合活性を含有しない断片に対応する抗体の部分を指すことが好ましい。特に、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分は、Ｆｃ受容体に結合することが可能であり、したがって例えば、Ｆｃ受容体結合部位またはＦｃ受容体結合能を含む。さらに、Ｆｃ部分は、ＡＤＣＣを誘導することも可能である。Ｆｃ部分は、抗体のうちの少なくともＣＨ２領域を含むことが好ましい。
【００２４】
Ｆａｂ部分およびＦｃ部分を含めた、ＩｇＧクラスの抗体についての概略図を、図２１Ａにおいて見ることができる。
【００２５】
本発明によれば、「キメラ抗体」という用語が、特に、定常領域がヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列に由来し、少なくとも１つの可変領域、および好ましくは両方の可変領域が、非ヒト抗体、特に、マウス抗体に由来する抗体を指す。
【００２６】
本発明によれば、「ヒト化抗体」という用語は、特に、少なくとも１つのＣＤＲが、非ヒト抗体に由来し、定常領域と、存在する場合は、可変領域のうちの少なくとも１つのフレームワーク領域とが、ヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列に由来する抗体を指す。重鎖可変領域の全てのＣＤＲ、またはより好ましくは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全てのＣＤＲが、非ヒト抗体に由来することが好ましい。さらに、重鎖可変領域の全てのフレームワーク領域、または好ましくは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全てのフレームワーク領域が、ヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列に由来することも好ましい。ＣＤＲは、同じ非ヒト抗体に由来することが好ましい。１つの可変領域のフレームワーク領域のうちの最初の３つまたは全ては、同じヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列に由来するが、重鎖可変領域のフレームワーク領域が、軽鎖可変領域のフレームワーク領域と同じヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列に由来しなくともよい。特に好ましい実施形態では、ヒト化抗体が、同じ抗原、特に、１またはそれより多くのＣＤＲが由来する非ヒト抗体と同じエピトープに結合することが可能である。
【００２７】
非ヒト抗体に由来するヒト化抗体のＣＤＲは、非ヒト抗体のＣＤＲと同一であることが好ましい。さらに、ヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列に由来するヒト化抗体のフレームワーク領域は、ヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列のフレームワーク領域と同一でありうる。別の実施形態では、ヒト化抗体のフレームワーク領域が、それらが由来するヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列のフレームワーク領域と比較して、１またはそれより多くのアミノ酸置換を有しうる。置換されたアミノ酸残基は、ＣＤＲのうちの１またはそれより多くが由来する非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基（特に、Ｋａｂａｔの番号付けによれば同じ位置である、対応するアミノ酸残基）により置換されることが好ましい。特に、ヒト化抗体の可変領域のフレームワーク領域（重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域）は、３０以下のアミノ酸置換、好ましくは２５以下、２０以下、１５以下、１２以下、１０以下、または８以下のアミノ酸置換を含むことが好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態では、ヒト化抗体の重鎖可変領域の全てのフレームワーク領域は、まとめると、それらが由来するヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列の重鎖可変領域のフレームワーク領域と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の相同性または同一性を共有する。さらに、ヒト化抗体の軽鎖可変領域の全てのフレームワーク領域は、まとめると、それらが由来するヒト抗体またはヒト抗体のコンセンサス配列の軽鎖可変領域のフレームワーク領域と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の相同性または同一性を好ましくは共有する。
【００２９】
キメラ抗体またはヒト化抗体の定常領域は、任意のヒト抗体またはヒト化抗体のコンセンサス配列に由来しうる。特に、重鎖定常領域は、γ型重鎖、δ型重鎖、α型重鎖、μ型重鎖、またはε型重鎖など、任意の型の重鎖でありうる。したがって、キメラ抗体またはヒト化抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２など、任意のサブクラスを含めた、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭなど、任意のアイソタイプの抗体でありうる。キメラ抗体またはヒト化抗体は、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体であることが好ましく、ＩｇＧ１抗体であることがより好ましい。さらに、軽鎖定常領域もまた、κ型軽鎖またはλ型軽鎖など、任意の型の軽鎖でありうる。キメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖は、κ鎖であることが好ましい。
【００３０】
標的アミノ酸配列が、その全長にわたり、基準アミノ酸配列の対応する部分と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の相同性または同一性を共有する場合、標的アミノ酸は、基準アミノ酸配列に「由来」する。例えば、ヒト化抗体のフレームワーク領域が、特定のヒト抗体の可変領域に由来する場合、ヒト化抗体のフレームワーク領域のアミノ酸は、その全長にわたり、ヒト抗体の対応するフレームワーク領域と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の相同性または同一性を共有する。「対応する部分」または「対応するフレームワーク領域」とは、例えば、標的抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲＨ１）が、基準抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１に対応することを意味する。同じことは、例えば、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、ＦＲＨ４、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４についても当てはまる。具体的な実施形態では、基準アミノ酸配列に「由来」する標的アミノ酸配列は、その全長にわたり、基準アミノ酸配列の対応する部分と１００％相同であるか、または特に、１００％同一である。
【００３１】
抗体の「断片または誘導体」とは、特に、前記抗体に由来するタンパク質または糖タンパク質であり、この抗体と同じ抗原、特に、同じエピトープに結合することが可能である。したがって、本明細書における抗体の断片または誘導体とは、一般に、機能的な断片または誘導体を指す。抗体の機能的な断片または誘導体は、特に、この抗体と同じ抗原、とりわけ、同じエピトープに結合することが可能である。特に好ましい実施形態では、抗体の断片または誘導体が、重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片またはそれらの誘導体により実施されうることが示されている。抗体の断片または誘導体の例には、（ｉ）重鎖および軽鎖の各々のうちの可変領域および第１の定常ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片と、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片と、（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一のアームの重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片と、（ｖ）単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片と、（ｖｉ）共有結合的に連結された２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片と、（ｖｉｉ）重鎖可変ドメインと、（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との会合が、分子間だけで生じることが可能であり、分子内で生じることは可能でない形で共有結合的に連結された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなる多重抗体とが含まれる。これらの抗体断片および誘導体は、当業者に公知である従来の技法を用いて得られる。
【００３２】
「特異的な結合」とは、抗体などの薬剤が、その薬剤が特異的であるエピトープなどの標的に、別の標的に対する結合と比較してより強力に結合することを意味することが好ましい。薬剤は、その薬剤が、第１の標的に、第２の標的に対する解離定数より小さな解離定数（Ｋｄ）で結合する場合、第１の標的に、第２の標的に対する場合と比較してより強力に結合する。薬剤が特異的に結合する標的に対する解離定数は、この薬剤が特異的には結合しない標的に対する解離定数の２分の１未満、好ましくは５分の１未満、より好ましくは１０分の１未満、なおより好ましくは２０分の１、５０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、または１０００分の１未満であることが好ましい。
【００３３】
「シアル酸」という用語は、特に、ノイラミン酸の任意のＮ置換誘導体またはＯ置換誘導体を指す。シアル酸とは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸および５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸の両方を指すことが好ましく、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸だけを指すことがより好ましい。シアル酸、特に、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、２，３結合または２，６結合を介して、糖タンパク質の糖鎖へと付いていることが好ましい。本明細書で記載される抗体組成物では、２，３結合したシアル酸ならびに２，６結合したシアル酸の両方が存在することが好ましい。
【００３４】
本明細書で言及される「フリーのガラクトース単位」（ｆｒｅｅ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｕｎｉｔ）という用語は、特に、その還元末端を介して糖構造に付いているガラクトース単位であるが、その６位にシアル酸を保有しないガラクトース単位を指す。特に、フリーのガラクトース単位は、その６位に糖単位を保有しない。特定の実施形態では、フリーのガラクトース単位が、その６位にいかなる化学修飾または置換基も保有しない。特に、ガラクトース単位は、その２位、３位、４位、５位、および６位のうちのいずれの１つにおいても、シアル酸、好ましくはサッカリド（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、より好ましくはいかなる化学修飾または置換基も保有しない。この点で、ガラクトース単位の水素およびヒドロキシル残基を、化学修飾または置換基としては考えない。
【００３５】
「グリコシル化部位」という用語は、特に、単糖単位または糖鎖のペプチド鎖への付着を触媒することが可能な酵素により認識されうる任意のアミノ酸配列を指す。グリコシル化部位は、単糖単位または糖鎖が付いているアミノ酸残基を包含することが好ましい。好ましいグリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化部位、特に、結合部位としてアスパラギン残基を含むＮ−グリコシル化部位、およびＯ−グリコシル化部位、特に、付着部位としてセリン残基またはトレオニン残基を含むＯ−グリコシル化部位である。好ましいＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸配列Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒを含み、この場合、Ｘａａは、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である。このアミノ酸配列は、３つの連続アミノ酸配列を指し、この場合、第１のアミノ酸残基は、アスパラギン残基であり、第２のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基、特に、プロリン以外の任意の天然のアミノ酸残基であることが可能であり、第３のアミノ酸残基は、セリンまたはトレオニンである。グリコシル化するとき、糖鎖は、アスパラギン残基に結合する。
【００３６】
本明細書で示される数、特に、特異的なグリコシル化特性の相対量は、好ましくは概数として理解されるべきである。特に、数は、最大で１０％高値および／または低値でありうる、特に、最大で９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％高値および／または低値でありうることが好ましい。
【００３７】
「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の核酸およびリボ核酸ならびにデオキシリボ核酸を包含する。核酸は、天然ならびに合成のヌクレオチドを含む可能性があり、例えば、メチル化、５’キャッピング、および／または３’キャッピングにより天然修飾される場合もあり、合成修飾される場合もある。
【００３８】
本発明によれば、「宿主細胞」という用語が、外因性核酸により形質転換またはトランスフェクトされうる任意の細胞を指す。本発明による「宿主細胞」という用語は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞、酵母細胞、および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、または霊長動物に由来する細胞など、哺乳動物細胞が特に優先される。細胞は、複数の組織型に由来することが可能であり、一次細胞および一次細胞系を含みうる。宿主細胞は、ヒト細胞、特に、不死化ヒト細胞、好ましくは、不死化ヒト骨髄細胞、または不死化ヒト骨髄性白血病細胞など、不死化ヒト血液細胞であることが好ましい。さらに、宿主細胞はまた、不死化ヒト腫瘍細胞でもありうる。核酸は、宿主細胞において、単一コピーの形態で存在する場合もあり、２つ以上のコピーの形態で存在する場合もあり、一実施形態では、宿主細胞内で発現する。
【００３９】
本発明による「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長動物、または別の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはマウスおよびラットなどの齧歯動物などの哺乳動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者が、ヒトである。
【００４０】
本発明による「がん」という用語は、特に、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠芽腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳腫瘍、子宮頸がん、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）がん、頭頸部がん、消化器がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、および肺がん、ならびにこれらの転移を含む。これらの例は、肺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、または上記で記載したがんの種類もしくは腫瘍の転移である。本発明によるがんという用語はまた、がん転移も含む。
【００４１】
「腫瘍」とは、制御異常の細胞増殖、特に、がんにより形成される細胞群または組織群を意味する。腫瘍は、構造的秩序および正常組織との機能的協調性の部分的または完全な欠如を示す場合があり、通常は、良性の場合もあり悪性の場合もある、異質の組織塊を形成する。特に、「腫瘍」という用語は、悪性腫瘍を指す。一実施形態によれば、「腫瘍」という用語または「腫瘍細胞」という用語はまた、非充実性腫瘍、および白血病細胞など、非充実性腫瘍細胞も指す。別の実施形態によれば、「腫瘍」という用語および「腫瘍細胞」という用語には、個別の非充実性腫瘍またはそれらの細胞が包含されない。
【００４２】
「転移」とは、その元の部位から、体内の別の部分へのがん細胞の拡大を意味する。転移の形成は、極めて複雑な過程であり、通常は、がん細胞が原発性腫瘍から離脱し、体内循環へと侵入および定着して、体内の他の場所にある正常組織内で増殖することを伴う。腫瘍細胞が転移する場合、新規の腫瘍を、二次性腫瘍または転移性腫瘍と呼び、その細胞は、通常、元の腫瘍における細胞に類似する。これは、例えば、乳がんが肺へと転移する場合は、二次性腫瘍が、異常な乳腺細胞からなり、異常な肺細胞からなるわけではないことを意味する。よって、肺におけるこの腫瘍は、転移性乳がんと呼ばれ、肺がんとは呼ばれない。
【００４３】
「医薬組成物」という用語は、特に、ヒトまたは動物への投与に適する組成物、すなわち、薬学的に許容可能な成分を含有する組成物を指す。医薬組成物は、緩衝剤、防腐剤、および等張性修飾剤など、担体、希釈剤、または医薬賦形剤と共に、活性化合物またはその塩もしくはプロドラッグを含むことが好ましい。
【００４４】
「抗体組成物」という用語は、特に、抗体またはその断片もしくは誘導体を含む任意の組成物を指す。抗体組成物は、流体組成物の場合もあり、固体組成物の場合もあり、また、乾燥凍結させた抗体組成物または再構成した抗体組成物も包含する。流体組成物、より好ましくは水性組成物を用いることが好ましい。抗体組成物は、水などの溶媒、ｐＨ値を調整するための緩衝液、および場合によって、抗体を安定化させるか、または抗体の分解を防止するためのさらなる薬剤をさらに含むことが好ましい。抗体組成物は、妥当量の抗体、特に、少なくとも１フェムトモル、好ましくは、少なくとも１ピコモル、少なくとも１ナノモル、または少なくとも１マイクロモルの抗体またはその断片もしくは誘導体を含むことが好ましい。しかし、特定の実施形態ではまた、１つの抗体分子またはその断片もしくは誘導体だけを含む抗体組成物も包含される。特異的な抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物は、加えて、さらなる抗体またはその断片もしくは誘導体も含みうる。しかし、特異的な抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物は、特異的な抗体またはその断片もしくは誘導体とは別に、他の抗体または抗体断片もしくは誘導体を含まないことが好ましい。特に、抗体組成物中の抗体のうちの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、最も好ましくは約１００％が、同じ抗原またはエピトープを指向するか、またはこれらに結合する。
【００４５】
本発明による「糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量」とは、特に、糖鎖群のうちの１つの糖鎖中に平均で存在するシアル酸残基数を指す。特に、それは、糖鎖群のうちの糖に付いているシアル酸残基の総数を、前記群中の糖鎖の総数で除した数を指す。糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量が１．０であるとは、糖鎖群において、各糖鎖が、平均で１．０のシアル酸残基を含むことを意味する。この点における「糖鎖」という用語は、抗体のポリペプチド鎖に付いている糖を指すことが好ましい。糖鎖群とは、抗体組成物中に存在する全ての抗体の全ての糖鎖、または抗体組成物中の全ての特定の種類の抗体の全ての糖鎖、または抗体組成物中の全ての（特定の種類の）抗体の特定の部分もしくは特定のグリコシル化部位に存在する全ての糖鎖を指すことが好ましい。
【００４６】
「循環半減期」という用語は、薬剤を、生体の循環、特に、ヒト体内の循環へと投与した後で、この薬剤の投与量のうち、循環内に存在する量が半分だけとなるまでに経過する時間を指すことが好ましい。治療的に有効な薬剤の場合、循環半減期が長いと、薬剤がより長時間にわたり持続する治療効果を及ぼすので、循環半減期が長いことが一般に望ましい。「クリアランス速度」とは、薬剤が、生体の循環、特に、ヒト体内の循環から除去される速度を指すことが好ましい。したがって、クリアランス速度が大きければ、通常、結果として循環半減期が短くなる。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、（先行技術の教示とは対照的に）そのＦａｂ部分にグリコシル化部位を有する抗体のＦａｂ部分に付いている糖鎖中のシアル酸残基量が、前記抗体の循環半減期に対して決定的であり、したがって、前記抗体のバイオアベイラビリティーに対して決定的であるという知見に基づく。特に、Ｆａｂ部分のシアリル化が高度であると、患者の循環内で、抗体の半減期が結果として延長される。同様に、Ｆａｂ部分のシアリル化が低度であると、循環半減期が短縮される。しかしまた、抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位を除去し、これにより、Ｆａｂのグリコシル化を全て解除すると、抗体の循環半減期が、Ｆａｂ部分のシアリル化度が中程度である〜高い抗体の循環半減期と同等になることも判明した。したがって、シアリル化が低度な抗体の循環半減期は、シアル酸量を増大させることにより延長しうるだけでなく、それぞれのグリコシル化部位が存在する場合、その抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位を除去することによってもまた延長することができる。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、Ｆａｂ部分のグリコシル化部位におけるシアル酸含量を調整することが、抗体の抗原結合または抗原特異性に影響を及ぼさないことが多く、さらにまた、そのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性など、抗体の下流における生物学的活性に対しても負の影響を及ぼさないことも見出した。シアル酸含量の変化が、抗原結合に負の影響を及ぼす場合はまた、Ｆａｂ部分におけるグリコシル化部位を除去して、循環半減期を延長することも可能であり、かつ／またはさらなるグリコシル化部位を、Ｆａｂ部分における別の位置に導入し、この新規に導入されたＦａｂのグリコシル化部位のシアル酸含量を、本明細書で教示する通りに調整することもできる。本発明者らにより見出されたさらなる利点は、Ｆａｂ部分のグリコシル化部位におけるシアリル化を増大させながら、同時に、Ｆｃ部分におけるシアリル化は最小限度に保つ可能性である。したがってまた、抗体のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が、Ｆａｂ部分のシアリル化を増大させることにより影響を受けることもない。
【００４８】
抗体の循環半減期を制御する方法
これらの知見に照らして、本発明は、抗体組成物における抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期を制御する方法であって、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分において存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を調整するステップ、および／あるいは１またはそれより多くのグリコシル化部位を、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分において除去または導入するステップを含む方法を提供する。したがってまた、抗体の意図される使用との関連で調整される循環半減期をもたらすことも可能である。これにより、化学修飾（ＰＥＧまたはＨＥＳなど）または融合タンパク質を用いる必要なしに、抗体の循環半減期を調整するための柔軟性がもたらされる。
【００４９】
特に、第一の態様では、本発明が、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期を制御するための方法であって、
（ａ）循環半減期を延長するために、
（ａ１）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を増大させるステップ、および／あるいは
（ａ２）抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位を除去するステップ、および／あるいは
（ａ３）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を減少させるステップ、あるいは
（ｂ）循環半減期を短縮するために、
（ｂ１）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を減少させるステップ、および／あるいは
（ｂ２）抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に１またはそれより多くのグリコシル化部位を導入するステップ、および／あるいは
（ｂ３）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を増大させるステップ
を含む方法を提供する。
【００５０】
したがって、本発明による方法を用いると、抗体のＦａｂ部分に既に存在するかまたは人工的に導入されるグリコシル化部位における、シアリル化度および／またはフリーのガラクトース単位の程度を調整することにより、かつ／あるいはＦａｂ部分におけるグリコシル化部位を除去するかまたはＦａｂ部分にグリコシル化部位を導入することにより、所与の抗体の循環半減期を個別に制御することが可能となる。
【００５１】
抗体の糖鎖中のシアル酸は、糖構造の非還元末端（複数可）においてガラクトース単位に付いている。したがって、シアル酸量を増大させると、フリーのガラクトース単位量もまた結果として減少し、この逆もまた成り立つ。フリーのガラクトース単位量を増大および減少させることは、例えば、それぞれ、シアル酸量を減少または増大させることにより達成することができる。しかし、フリーのガラクトース単位量はまた、フリーのガラクトース単位に、他の残基、例えば、アセチル残基、グルクロン酸、もしくは硫酸を結合させることにより減少させることもでき、かつ／またはフリーのガラクトース単位を糖から除去することによって減少させることもできる。同様に、フリーのガラクトース単位量の増大は、シアル酸量を減少させることによって達成することもでき、かつ／またはさらなるガラクトース単位を、完全にガラクトシル化されているわけではない糖へと結合させることによって達成することもできる。
【００５２】
循環半減期の延長
本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の循環半減期を延長するためには、組成物中に含まれる抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を増大させることができる。
【００５３】
好ましい実施形態では、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも５０％が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むように、シアル酸量を増大させる。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、または最も好ましくは少なくとも７５％が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むことが好ましい。特定の実施形態では、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも２０％が、少なくとも２つのシアル酸残基を含むように、シアル酸量を増大させる。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または最も好ましくは少なくとも４５％が、少なくとも２つのシアル酸残基を含むことが好ましい。
【００５４】
組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の相対量を、少なくとも５百分率ポイント、より好ましくは少なくとも７百分率ポイント、少なくとも１０百分率ポイント、少なくとも１５百分率ポイント、少なくとも２０百分率ポイント、少なくとも２５百分率ポイント、少なくとも３０百分率ポイント、少なくとも３５百分率ポイント、少なくとも４０百分率ポイント、少なくとも４５百分率ポイント、または少なくとも５０百分率ポイント増大させるようにシアル酸量を増大させることが好ましい。組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の相対量は、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている全ての糖のうちの、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の百分率である。例えば、１０百分率ポイントの増大とは、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の相対量の百分率値が、ステップ（ａ１）において１０増大する実施形態、すなわち、ステップ（ａ１）の前では相対量がＸ％であり、ステップ（ａ１）の後では相対量が（Ｘ＋１０）％となる実施形態を指す。
【００５５】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を、少なくとも５百分率ポイント増大させる。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、または最も好ましくは少なくとも７５％が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むことが好ましい。
【００５６】
Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量の増大はまた、少なくとも１つのシアル酸残基を既に含む組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸数を増大させることも包含する。特に、本発明による方法のステップ（ａ１）によるシアル酸量の増大とは、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量の増大を指すことが好ましい。糖鎖１本当たりの前記平均シアル酸残基量は、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．３、または最も好ましくは少なくとも０．５増大させることが好ましい。好ましい実施形態では、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量が、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．０５、または少なくとも１．１となるように、シアル酸量を増大させる。
【００５７】
Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位を、その循環半減期を延長するステップの前に抗体に存在させている場合もあり、これらのグリコシル化部位のうちの１またはそれより多くを、本発明による方法の一部として、抗体のＦａｂ部分へと導入している場合もある。したがって、特定の実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を増大させるステップが、１またはそれより多くのグリコシル化部位を、Ｆａｂ部分へと導入するステップを包含する。これらの新規に導入されたグリコシル化部位は、グリコシル化されると、糖であって、組成物における前記糖のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、または最も好ましくは少なくとも７５％が、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖を保有することが好ましい。抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分へのグリコシル化部位の導入については、以下でより詳細に記載する。
【００５８】
特定の実施形態では、Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を有意に増大させることなしに増大させる。
【００５９】
組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量は、本発明による方法を実施した後で、２０％未満、より好ましくは１５％未満、１０％未満、８％未満、または最も好ましくは７％未満となることが好ましい。特に、抗体のＦｃ部分におけるグリコシル化部位に付いている糖のうちの２０％未満、より好ましくは１５％未満、１０％未満、または８％未満、最も好ましくは７％未満が、１またはそれより多くのシアル酸を含む。
【００６０】
特定の実施形態では、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むように、フリーのガラクトース単位量を減少させる。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、または５％未満が、２つ以上のフリーのガラクトース単位を含むことが好ましい。さらに、組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの９５％未満が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位を含むことが好ましい。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満が、１またはそれより多くのフリーのガラクトース単位を含むことがより好ましい。
【００６１】
組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の相対量を、少なくとも５百分率ポイント、より好ましくは少なくとも７百分率ポイント、少なくとも１０百分率ポイント、少なくとも１５百分率ポイント、少なくとも２０百分率ポイント、少なくとも２５百分率ポイント、少なくとも３０百分率ポイント、少なくとも３５百分率ポイント、少なくとも４０百分率ポイント、少なくとも４５百分率ポイント、または少なくとも５０百分率ポイント減少させるようにフリーのガラクトース単位量を減少させることが好ましい。組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の相対量は、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている全ての糖のうちの、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の百分率である。例えば、１０百分率ポイントの減少とは、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の相対量の百分率値が、ステップ（ａ３）において１０減少する実施形態、すなわち、ステップ（ａ３）の前では相対量がＸ％であり、ステップ（ａ３）の後では相対量が（Ｘ−１０）％となる実施形態を指す。
【００６２】
Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量の減少はまた、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、１より多いフリーのガラクトース単位を含む糖中のフリーのガラクトース単位数を減少させることも包含する。特に、本発明による方法のステップ（ａ３）によるフリーのガラクトース単位量の減少とは、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均フリーのガラクトース単位量の減少を指すことが好ましい。糖鎖１本当たりの前記平均フリーのガラクトース単位量は、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．３、または最も好ましくは少なくとも０．５減少させることが好ましい。好ましい実施形態では、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均フリーのガラクトース単位量が、１．５未満、好ましくは１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、好ましくは０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、または０．５未満となるように、フリーのガラクトース単位量を減少させる。フリーのガラクトース単位量の減少は、シアル酸量を増大させることにより達成することが好ましい。
【００６３】
シアル酸量の増大および／またはフリーのガラクトース単位量の減少は、シアリル化活性が高い細胞または細胞系において抗体またはその断片もしくは誘導体を発現させるステップを包含する、任意の公知の手段により達成することができる。シアリル化度が高い細胞系は、例えば、細胞系の適切な単一クローンを選択することにより得ることもでき、細胞系を遺伝子操作することにより得ることもできる。シアリル化活性が高い細胞系は、特に、抗体を発現させるのに適する細胞系に対する変異誘発によるスクリーニングであって、シアリル化活性の高い細胞クローンを選択するスクリーニングにより得ることができる。さらに、糖タンパク質のシアリル化の一因となる酵素（複数可）の発現は、例えば、内因性酵素（複数可）の発現を誘導するかもしくは増大させることにより、細胞もしくは細胞系において誘導もしくは増強することもでき、かつ／または前記酵素（複数可）のための外因性発現カセット（複数可）を導入することにより、細胞もしくは細胞系において誘導もしくは増強することもできる。適切な酵素は、例えば、シアル酸残基の糖鎖への移動の一因となるシアリルトランスフェラーゼ、シアル酸残基もしくはその前駆体の細胞内の関与性の部分もしくは小器官への輸送を制御する輸送体、またはシアル酸の生合成に関与する酵素である。具体例は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびα２，３−シアリルトランスフェラーゼなどのシアリルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアル酸輸送体などの輸送体、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼなどのエピメラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−Ｐ−シンセターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−Ｐ−ホスファターゼ、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼなどのキナーゼである。さらに、シアリル化度を結果として高める、発現時の培養条件も用いることができる。当技術分野では、適切な方法が公知であり、例えば、ＷＯ２００５／０８０５８５において記載されている。代替的に、または加えて、インビトロにおけるシアリル化、特に、シアリルトランスフェラーゼおよび適切な基質を用いる酵素的シアリル化、または適切な化学試薬を用いる化学的シアリル化も用いることができる。シアリル化度を高めることが可能な例示的な細胞系は、ブダペスト条約の要請により受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０７８の下、２０１０年７月２８日に、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）により、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に寄託されたＧＴ−５ｓ細胞、またはこの細胞に由来する細胞系、もしくはこの細胞系と相同な細胞系である。ＧＴ−５ｓ細胞とは、Ｋ５６２細胞に由来する細胞系であり、そのシアリル化活性の高さのために選択されている。Ｋ５６２細胞とは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに存在するヒト骨髄性白血���細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）である。ＧＴ−５ｓ細胞およびこれに由来する細胞系は、Ｋ５６２細胞に適する周知の条件下で培養および維持することができる。
【００６４】
ＧＴ−５ｓ細胞に由来する細胞系は、例えば、場合によって、それらの変異率を増強するために、ＧＴ−５ｓ細胞を処置した後で、ＧＴ−５ｓ細胞の培養物に由来する単一クローンまたは細胞群を無作為的または特異的に選択することにより得ることもでき、ＧＴ−５ｓ細胞系を遺伝子改変することにより得ることもできる。選択されたクローンまたは細胞群は、上記で記載した通りにさらに処置することもでき、かつ／またはさらなる選択ラウンドを実施することもできる。特に、ＧＴ−５ｓ細胞と相同的な細胞系は、不死化ヒト骨髄細胞系である。ＧＴ−５ｓ細胞に由来するかまたはこれと相同的な細胞系は、ＧＴ−５ｓ細胞から得られる抗体と類似のグリコシル化パターンを有する抗体をもたらすことが可能であることが好ましい。ＧＴ−５ｓ細胞に由来するかまたはこれと相同的な細胞系を介して生成する抗体は、本明細書で記載されるグリコシル化特徴のうちの１またはそれより多くを有する、特に、シアリル化度が高く、好ましくはＦａｂ部分におけるシアリル化度が高いことが好ましい。好ましい実施形態では、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するかまたはこれと相同的な細胞系が、本明細書で記載される通り、フコシル化度が低く、特に、Ｆｃ部分におけるフコシル化度が低い抗体をもたらすことがさらに可能である。ＧＴ−５ｓ細胞に由来するかまたはこれと相同的な細胞系を介して生成する抗体の、類似のグリコシル化パターンは、ビスＧｌｃＮＡｃを保有する糖量百分率、シアリル化された糖量百分率、フリーのガラクトース残基を保有する糖量百分率、２，６連結されたシアル酸量百分率、およびフコースを保有する糖量百分率からなる群から選択されるグリコシル化特性のうちの、特に、１またはそれより多く、好ましくは全てにおいて、ＧＴ−５ｓ細胞から得られる抗体のグリコシル化パターンと、２０％以下、より好ましくは１５％以下、１０％以下、または５％以下異なることが好ましい。特に好ましい実施形態では、類似のグリコシル化特性が、フコースを保有する糖量百分率を包含しない。
【００６５】
ＧＴ−５ｓ細胞系、ならびにこれに由来する細胞系、およびこれと相同な細胞系は、特に、抗体との関連で、極めて安定的で相同的なタンパク質生成をもたらすので、特に有利である。これらの細胞系は、極めて良好なバッチ間の安定性を有する、すなわち、異なる生成操作から得られる場合、または異なるスケールおよび／もしくは異なる培養手順で生成される場合に、生成するタンパク質およびそれらのグリコシル化パターンが類似する。
【００６６】
抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位を除去することによって、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸含量の増大および／またはフリーのガラクトース単位含量の減少のほか、抗体またはその断片もしくは誘導体の循環半減期の延長もまたもたらすことができる。前記グリコシル化部位（複数可）を除去することにより、シアリル化度が低く、かつ／またはフリーのガラクトース単位の存在度が高い、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における糖の存在が防止される。これらのシアリル化の低度な糖は、患者の循環からの抗体のクリアランス速度を高める一因となるので、抗体のＦａｂ部分における各グリコシル化部位（複数可）を除去すれば、その循環半減期が延長される。
【００６７】
好ましい実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を遺伝子操作することにより、グリコシル化部位の除去を行う。特に、抗体またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸配列を変化させることによりグリコシル化部位を除去する。グリコシル化部位における少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加、または欠失を達成するように、グリコシル化部位のアミノ酸をコードするコドンのうちの１またはそれより多くを変異させることが好ましい。特に、糖鎖が付いているアミノ酸を欠失させるか、または好ましくは、糖アクセプターとして機能することが可能でないアミノ酸で置換する。代替的にまたは加えてまた、変化させたアミノ酸配列が、酵素的グリコシル化の認識部位として機能しないように、グリコシル化部位のうちの別のアミノ酸を置換するかまたは欠失させることもでき、１またはそれより多くのさらなるアミノ酸をグリコシル化部位に付加することもできる。
【００６８】
Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位が除去される抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｆａｂ部分におけるただ１つのグリコシル化部位、少なくとも２つのグリコシル化部位、または少なくとも３つのグリコシル化部位など、Ｆａｂ部分における任意の数のグリコシル化部位を有することが可能である。本発明による方法では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における全てのグリコシル化部位を除去しなくともよい。しかし、循環半減期を最大限に延長するためには、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する全てのグリコシル化部位を除去することが好ましい。
【００６９】
循環半減期の短縮
本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の循環半減期を短縮するためには、組成物中に存在する抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を減少させることができる。
【００７０】
好ましい実施形態では、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むように、シアル酸量を減少させる。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、１またはそれより多くのシアル酸残基を含むことが好ましい。一実施形態によれば、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの約０％が、少なくとも１つのシアル酸残基を含むように、シアル酸量を減少させる。特定の実施形態では、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの３０％未満が、少なくとも２つのシアル酸残基を含むように、シアル酸残基を減少させる。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満、より好ましくは約０％が、２つ以上のシアル酸残基を含むことが好ましい。
【００７１】
組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の相対量を、少なくとも５百分率ポイント、より好ましくは少なくとも７百分率ポイント、少なくとも１０百分率ポイント、少なくとも１５百分率ポイント、少なくとも２０百分率ポイント、少なくとも２５百分率ポイント、少なくとも３０百分率ポイント、少なくとも３５百分率ポイント、少なくとも４０百分率ポイント、少なくとも４５百分率ポイント、または少なくとも５０百分率ポイント減少させるようにシアル酸量を減少させることが好ましい。組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の相対量は、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている全ての糖のうちの、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の百分率である。例えば、１０百分率ポイントの減少とは、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのシアル酸残基を含む糖の相対量の百分率値が、ステップ（ｂ１）において１０減少する実施形態、すなわち、ステップ（ｂ１）の前では相対量がＸ％であり、ステップ（ｂ１）の後では相対量が（Ｘ−１０）％となる実施形態を指す。
【００７２】
Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量の減少はまた、１以上のシアル酸残基を含む組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸数を減少させることも包含する。特に、本発明による方法のステップ（ｂ１）によるシアル酸量の減少とは、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量の減少を指すことが好ましい。糖鎖１本当たりの前記平均シアル酸残基量は、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．３、または最も好ましくは少なくとも０．５減少させることが好ましい。好ましい実施形態では、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量が、０．８未満、好ましくは０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満または０．０５未満となるように、シアル酸量を減少させる。
【００７３】
特定の実施形態では、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも５０％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むように、フリーのガラクトース単位量を増大させる。組成物では、Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９８％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むことが好ましい。
【００７４】
組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の相対量を、少なくとも５百分率ポイント、より好ましくは少なくとも７百分率ポイント、少なくとも１０百分率ポイント、少なくとも１５百分率ポイント、少なくとも２０百分率ポイント、少なくとも２５百分率ポイント、少なくとも３０百分率ポイント、少なくとも３５百分率ポイント、少なくとも４０百分率ポイント、少なくとも４５百分率ポイント、または少なくとも５０百分率ポイント増大させるようにフリーのガラクトース単位量を増大させることが好ましい。組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の相対量は、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている全ての糖のうちの、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の百分率である。例えば、１０百分率ポイントの増大とは、組成物における、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖の相対量の百分率値が、ステップ（ｂ３）において１０増大する実施形態、すなわち、ステップ（ｂ３）の前では相対量がＸ％であり、ステップ（ｂ３）の後では相対量が（Ｘ＋１０）％となる実施形態を指す。
【００７５】
Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量の増大はまた、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖であって、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位を既に含む糖中のフリーのガラクトース単位数を増大させることも包含する。特に、本発明による方法のステップ（ｂ３）によるフリーのガラクトース単位量の増大とは、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均フリーのガラクトース単位量の増大を指すことが好ましい。糖鎖１本当たりの前記平均フリーのガラクトース単位量は、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．３、または最も好ましくは少なくとも０．５増大させることが好ましい。好ましい実施形態では、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中の糖鎖１本当たりの平均フリーのガラクトース単位量が、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９または少なくとも１．９５となるように、フリーのガラクトース単位量を増大させる。
【００７６】
Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位を、その循環半減期を延長するステップの前に抗体に存在させている場合もあり、これらのグリコシル化部位のうちの１またはそれより多くを、本発明による方法の一部として、抗体のＦａｂ部分へと導入している場合もある。したがって、特定の実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のフリーのガラクトース単位量を増大させるステップが、１またはそれより多くのグリコシル化部位を、Ｆａｂ部分へと導入するステップを包含する。これらの新規に導入されたグリコシル化部位は、グリコシル化されると、糖であって、組成物における前記糖のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９８％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖を保有することが好ましい。抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分へのグリコシル化部位の導入については、以下でより詳細に記載する。
【００７７】
シアル酸量の減少および／またはフリーのガラクトース単位量の増大は、シアリル化活性が低いか、またはシアリル化活性を有さない細胞または細胞系において抗体またはその断片もしくは誘導体を発現させるステップを包含する、任意の公知の手段により達成することができる。シアリル化度が低いかまたは見られない細胞系は、例えば、細胞系の適切な単一クローンを選択することにより得ることもでき、細胞系を遺伝子操作すること、例えば、１またはそれより多くの変異を細胞系のゲノム内に導入することにより得ることもでき、細胞系のシアリル化経路に関与する１またはそれより多くの遺伝子に対するノックアウトもしくはノックダウンまたはＲＮＡ干渉により得ることもできる。シアリル化経路に関与する適切な遺伝子は、例えば、シアル酸残基の糖鎖への移動の一因となるシアリルトランスフェラーゼ、シアル酸残基もしくはその前駆体の細胞内の関与性の部分もしくは小器官への輸送を制御する輸送体、またはシアル酸の生合成に関与する酵素をコードする。具体例は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびα２，３−シアリルトランスフェラーゼなどのシアリルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアル酸輸送体などの輸送体、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼなどのエピメラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−Ｐ−シンセターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−Ｐ−ホスファターゼ、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼなどのキナーゼである。さらに、シアリル化度を結果として低める、発現時の培養条件も用いることができる。代替的に、または加えて、インビトロにおける脱シアリル化、特に、シアリラーゼを用いる酵素的脱シアリル化、または適切な化学試薬を用いる化学的脱シアリル化も用いることができる。具体的に調整されたシアル酸含量、特に、低含量のシアル酸を有する糖タンパク質をもたらすのに適する細胞系および方法は、例えば、ＷＯ２００５／０８０５８５において記載されている。
【００７８】
抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に１またはそれより多くのグリコシル化部位を導入することによって、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸含量の減少および／またはフリーのガラクトース単位含量の増大のほか、抗体またはその断片もしくは誘導体の循環半減期の短縮もまたもたらすことができる。前記グリコシル化部位（複数可）を導入することにより、抗体またはその断片もしくは誘導体におけるシアリル化度が低い糖の存在を増大させることができる。これらの新規に導入されたグリコシル化部位は、グリコシル化されると、糖であって、組成物における前記糖のうちの５０％未満、より好ましくは４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、または最も好ましくは５％未満が、１またはそれより多くのシアル酸残基を含む糖を保有することが好ましい。同様に、これらの新規に導入されたグリコシル化部位は、グリコシル化されると、糖であって、組成物における前記糖のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９８％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖を保有することも好ましい。それぞれの低量のシアリル化をどのようにして達成しうるかは、上記に記載されている。
【００７９】
少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、または少なくとも３つのグリコシル化部位を、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に導入することが好ましい。特定の実施形態では、１つ、２つ、または３つのグリコシル化部位を導入する。グリコシル化部位（複数可）は、当技術分野において公知である任意の手段により導入することができる。抗体またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を遺伝子操作することにより、グリコシル化部位の導入を行うことが好ましい。特に、抗体またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸配列を変化させることによりグリコシル化部位を導入する。コードされたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように、抗体のコドンのうちの１またはそれより多くを変異させることが好ましい。グリコシル化部位の導入は、１またはそれより多くのさらなるコドンを付加する結果として、１またはそれより多くのさらなるアミノ酸をもたらすことにより達成することもでき、１またはそれより多くのヌクレオチドを置換する結果として、１またはそれより多くのアミノ酸の置換をもたらすことにより達成することもでき、かつ／または１またはそれより多くのコドンを欠失させる結果として、１またはそれより多くのアミノ酸の欠失をもたらすことにより達成することもできる。特に、グリコシル化部位（複数可）は、抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域、好ましくは重鎖可変領域に導入する。グリコシル化部位は、可変領域のフレームワーク領域に導入することがより好ましい。しかし、グリコシル化部位はまた、Ｆａｂ部分の定常領域、特に、重鎖定常領域１に導入することもできる。
【００８０】
１またはそれより多くのグリコシル化部位を、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に導入する場合、抗体またはその断片もしくは誘導体は、そのＦａｂ部分において、元はグリコシル化部位を含有しないことが好ましい。しかし、特定の実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体が、１またはそれより多くのグリコシル化部位を、そのＦａｂ部分において既に含み、本発明による方法を介して、１またはそれより多くのさらなるグリコシル化部位を導入する。これらの新規に導入されたグリコシル化部位（複数可）は、糖であって、組成物における前記糖のうちの５０％未満、より好ましくは４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、または最も好ましくは５％未満が、１またはそれより多くのシアル酸残基を含む糖を保有することが好ましい。特に、組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する全てのグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満、より好ましくは４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、または最も好ましくは５％未満が、１またはそれより多くのシアル酸残基を含むことが好ましい。同様に、これらの新規に導入されたグリコシル化部位は、グリコシル化されると、糖であって、組成物における前記糖のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９８％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含む糖を保有することも好ましい。特に、組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する全てのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９８％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むことが好ましい。それぞれの低量のシアリル化をどのようにして達成しうるかは、上記に記載されている。
【００８１】
Ｆａｂにおけるグリコシル化部位
抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在するか、またはこのＦａｂ部分に導入されるかもしくはこのＦａｂ部分から除去される、１またはそれより多くのグリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化部位および／またはＯ−グリコシル化部位であり、好ましくはＮ−グリコシル化部位であり、より好ましくは、アミノ酸配列Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有し、この場合、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である、Ｎ−グリコシル化部位である。グリコシル化部位は、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分のいずれに位置させることもできる。しかし、グリコシル化部位は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域、好ましくは重鎖可変領域に位置させることが好ましい。特に、グリコシル化部位は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ、好ましくはフレームワーク領域に存在させることができる。しかし、１またはそれより多くのグリコシル化部位はまた、Ｆａｂ部分の定常領域、特に、重鎖定常領域１に位置させることもできる。
【００８２】
Ｆａｂ部分におけるグリコシル化部位の導入および除去は、Ｆａｂ部分のアミノ酸配列を変化させることにより、特に、１またはそれより多くのアミノ酸残基の付加、置換、および／または欠失により達成することができる。これは、アミノ酸またはそれらの断片もしくは誘導体をコードする核酸を遺伝子操作することにより、特に、核酸配列の変異誘発により行いうることが好ましい。グリコシル化部位を除去または導入するのに適する方法は、上記で説明されている。
【００８３】
抗体またはその断片もしくは誘導体が、２つ以上の重鎖可変領域を含む実施形態では、重鎖可変領域に存在するグリコシル化部位が、抗体またはその断片もしくは誘導体の全ての重鎖可変領域に存在することが好ましい。抗体またはその断片もしくは誘導体が、２つ以上の重鎖定常領域、特に、２つ以上のＣＨ１領域を含む実施形態では、重鎖定常領域１に存在するグリコシル化部位が、抗体またはその断片もしくは誘導体の全ての重鎖定常領域１に存在することが好ましい。抗体またはその断片もしくは誘導体が、２つ以上の軽鎖可変領域を含む実施形態では、軽鎖可変領域に存在するグリコシル化部位が、抗体またはその断片もしくは誘導体の全ての軽鎖可変領域に存在することが好ましい。抗体またはその断片もしくは誘導体が、２つ以上の軽鎖定常領域を含む実施形態では、軽鎖定常領域に存在するグリコシル化部位が、抗体またはその断片もしくは誘導体の全ての軽鎖定常領域に存在することが好ましい。
【００８４】
ヒト血清から単離される抗体のうちの約３０％は、Ｆａｂ部分内にグリコシル化部位を有する。抗ＥＧＦＲ抗体、特にＣｅｔｕｘｉｍａｂについて述べると、これらの抗体のＦａｂ部分における１つのグリコシル化部位は、重鎖可変領域のフレームワーク領域３に位置することが好ましく、より好ましくはＫａｂａｔの番号付けによるアミノ酸の８５位に位置する。抗Ｍｕｃ１抗体、特にＰａｎｋｏｍａｂについて述べると、これらの抗体のＦａｂ部分における１つのグリコシル化部位は、重鎖可変領域のＣＤＲ２に位置することが好ましく、より好ましくはＫａｂａｔの番号付けによるアミノ酸の５４位に位置する。
【００８５】
少なくとも１つのグリコシル化部位が、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する場合、組成物中の少なくとも１つの抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｆａｂ部分においてグリコシル化されている。組成物中の抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最も好ましくは約１００％が、Ｆａｂ部分においてグリコシル化されていることが好ましい。さらに、組成物中の抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最も好ましくは約１００％が、本明細書で記載されるＦａｂ部分における特定のグリコシル化部位、好ましくはＦａｂ部分における全てのグリコシル化部位においてグリコシル化されていることが好ましい。また、例えば、精製工程後または精製工程中における、例えば、濃縮法によっても、それぞれにグリコシル化の高度な抗体を得ることができる。
【００８６】
好ましい実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位の導入または除去が、抗体またはその断片もしくは誘導体の抗原結合および／または抗原特異性を阻害しない。Ｆａｂ部分に１もしくは複数のグリコシル化部位を導入するかまたはＦａｂ部分における１もしくは複数のグリコシル化部位を除去することによって、抗原結合および／または抗原特異性が有意には低減されないことが好ましい。同様にまた、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量の増加または減少も、抗原結合および／または抗原特異性を阻害しないことが好ましく、抗原結合および／または抗原特異性を有意には低減しないことがより好ましい。特に、本発明による方法を実施した後では、循環半減期を延長または短縮した抗体またはその断片もしくは誘導体の、その特異的抗原に対する結合アフィニティーが、その循環半減期を制御する前における抗体またはその断片もしくは誘導体の結合アフィニティーの少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。
【００８７】
しかし、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における特定のグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量の増加または減少が、抗原結合または抗原特異性に負の影響を及ぼすかまたは負の影響を及ぼす危険性にある場合は、前記グリコシル化部位を抗体から除去することもでき、かつ／または１もしくは複数の他のグリコシル化部位を、Ｆａｂ部分の、抗原結合および／もしくは抗原特異性に影響を及ぼさないかもしくはこれに及ぼす影響がより低度である位置に導入することもできる。次いで、循環半減期を所望の通りに制御するために、新規に導入されたグリコシル化部位（複数可）に付いている糖のシアル酸含量を増大させることもでき、減少させることもできる。前記新規に導入されたグリコシル化部位（複数可）は、Ｆａｂ部分の可変領域のフレームワーク領域、または、より好ましくは、重鎖定常領域１および／もしくは軽鎖定常領域など、Ｆａｂ部分の定常領域に位置させることが好ましい。
【００８８】
抗体またはその断片もしくは誘導体
本発明による方法において用いられる抗体は、天然抗体、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、操作抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を含め、任意の抗体でありうる。それは、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、霊長動物抗体、またはラクダ抗体でありうる。抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であることが好ましい。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２など、任意のサブクラスを含めた、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭなど、任意のクラスの抗体でありうる。抗体は、ＩｇＧ抗体であることが好ましく、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体であることがより好ましく、ＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。
【００８９】
例えば、抗体は、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂなどの抗ＥＧＦＲ抗体、Ｋａｒｏｍａｂなどの抗ＴＦ抗体、Ｐａｎｋｏｍａｂなどの抗Ｍｕｃ１抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂなどの抗ＨＥＲ２抗体、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂなどの抗ＣＤ２０抗体、Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂなどの抗Ａβ抗体、Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂなどの抗ＣＤ５２抗体、およびこれらのキメラ形またはヒト化形からなる群から選択することができる。
【００９０】
好ましい抗ＥＧＦＲ抗体は、ＷＯ９６／４０２１０（特に、抗体２２５のヒト化形およびキメラ形について記載する）およびマウス抗体２２５について記載するＵＳ４，９４３，５３３において記載されており、かつ／または配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１またはそれより多くを含む。特に、抗体は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸８５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含むキメラまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体でありうる。
【００９１】
前記抗体は、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂおよび／または抗体２２５と同じ抗原、特に、これと同じエピトープに結合しうることが好ましい。
【００９２】
好ましい抗Ｍｕｃ１抗体は、参照により本明細書に組み込まれる特許出願であるＷＯ０４／０６５４２３およびＥＰ０９００９９４２．５において記載されており、かつ／または配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１またはそれより多くを含む。特に、抗体は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸５４位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む、キメラまたはヒト化抗ＴＡ−Ｍｕｃ１抗体でありうる。
【００９３】
前記抗体は、Ｐａｎｋｏｍａｂと同じ抗原、特に、これと同じエピトープに結合しうることが好ましい。特に、キメラ抗体またはヒト化抗ＴＡ−Ｍｕｃ１抗体は、アミノ酸配列ＰＤＴＲ（配列番号１３）、またはより好ましくはＰＤＴＲＰ（配列番号１４）を含むエピトープに特異的に結合することが可能である。このエピトープへの結合は、グリコシル化依存性であることが好ましく、この場合、特に、糖部分が配列ＰＤＴＲまたはＰＤＴＲＰのそれぞれのトレオニン残基に付いていると、結合が増大する。エピトープを、トレオニン残基において、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリルα２−６  Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴｎ）、ガラクトースβ１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）、およびガラクトース  β１−３（シアリルα２−６）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴＦ）からなる群から選択される糖部分でグリコシル化する、好ましくはＴｎまたはＴＦでグリコシル化すると、結合が増大することが好ましい。糖部分は、α−Ｏ−グリコシド結合により、トレオニン残基に結合していることが好ましい。一部の実施形態では、特に、上記で言及した特定の糖部分によりグリコシル化される場合は、結合のグリコシル化依存性が、エピトープが採用する特定の立体構造に起因する。この場合、抗体は、必ずしも糖部分に結合しなくともよく、エピトープのペプチド部分の結合しさえすればよく、この場合、この結合のアフィニティーは、エピトープの立体構造に依存する。エピトープは、ムチンタンパク質であるＭｕｃ１の細胞外タンデム反復配列に含まれることが好ましい。特に、本発明による抗体は、腫瘍関連ムチンエピトープ、特に、エピトープＴＡ−Ｍｕｃ１など、腫瘍関連Ｍｕｃ１エピトープに結合することが可能である（Ｋａｒｓｔｅｎ，  Ｕ．ら（２００４年）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４巻、６８１〜６９２頁、およびＤａｎｉｅｌｃｚｙｋ，  Ａ．ら（２００６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５５巻、１３３７〜１３４７頁を参照されたい）。腫瘍関連ムチン１エピトープであるＴＡ−Ｍｕｃ１とは、腫瘍細胞において存在するが、正常細胞においては存在せず、かつ／または腫瘍細胞に存在する場合に限り宿主の循環中の抗体により接近可能であるが、正常細胞に存在する場合は接近可能でない、Ｍｕｃ１のエピトープを指す。
【００９４】
好ましい抗ＣＤ５２抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１またはそれより多くを含む。特に、抗体は、
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる重鎖可変領域のうちのアミノ酸６０位のＦａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位のＦｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗ＣＤ５２抗体でありうる。
【００９５】
前記抗体は、Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂと同じ抗原、特に、これと同じエピトープに結合しうることが好ましい。
【００９６】
好ましい抗Ａβ抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１またはそれより多くを含む。特に、抗体は、
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸５５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗Ａβ抗体でありうる。
【００９７】
前記抗体は、Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂと同じ抗原、特に、これと同じエピトープに結合しうることが好ましい。
【００９８】
Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に加え、抗体はまた、Ｆｃ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位も含みうる。抗体は、Ｆｃ部分の天然のグリコシル化部位を含むことが好ましい。例えば、抗体は、ＣＨ２領域内、特に、ＩｇＧ抗体の場合にはＡｓｎ２９７にグリコシル化部位を含みうる。これらの実施形態では、組成物における少なくとも１つの抗体またはその断片もしくは誘導体が、Ｆｃ部分においてグリコシル化されていることが好ましい。組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最も好ましくは約１００％が、Ｆｃ部分においてグリコシル化されていることが好ましい。
【００９９】
抗体の断片または誘導体は、抗体のうちの少なくとも重鎖可変領域を含むことが好ましい。それは、抗体の重鎖定常領域１、および／または抗体の軽鎖可変領域、および／または抗体の軽鎖定常領域もさらに含むことが好ましい。好ましい実施形態では、抗体の断片または誘導体が、抗体のＦａｂ部分全体を含む。
【０１００】
特に、抗体の断片または誘導体は、
（ｉ）重鎖および軽鎖の各々のうちの可変領域および第１の定常ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、
（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片、
（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片、
（ｉｖ）抗体の単一のアームの重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片、
（ｖ）単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片、
（ｖｉ）共有結合的に連結された２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片、
（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン、および
（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との会合が、分子間だけで生じることが可能であり、分子内で生じることは可能でない形で共有結合的に連結された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなる多重抗体と
からなる群から選択される。
【０１０１】
断片または誘導体は、抗体と同じ抗原、好ましくは抗体と同じエピトープに結合しうることが好ましい。
【０１０２】
グリコシル化パターン
好ましい実施形態では、その循環半減期が本発明による方法を介して制御され、それが本発明による抗体組成物中に含まれる、抗体またはその断片もしくは誘導体が、この抗体またはその断片もしくは誘導体に特定の所望の特性をもたらす、さらなるグリコシル化特徴を有する。
【０１０３】
抗体またはその断片もしくは誘導体における糖は、複合体型の糖であることが好ましい。特に、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分および／またはＦｃ部分に付いている糖のうちの、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、および最も好ましくは約１００％が、図２１Ｂ（図中、黒色の四角は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、グレーの丸は、マンノース残基（Ｍａｎ）を表す）に示されるコア構造を有する。前記コア構造を有する糖は、図２１Ｃ（図中、黒色の四角は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、グレーの丸は、マンノース残基（Ｍａｎ）を表し、白色の丸は、ガラクトース残基（Ｇａｌ）を表し、グレーの菱形は、シアル酸残基（ＳＡ）を表し、黒色の三角は、フコース残基（Ｆｕｃ）を表し、グレーの四角は、二分枝状のＮ−アセチルグルコサミン残基（ビスＧｌｃＮＡｃ）を表し、この場合、糖の分枝中のＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、およびＳＡ、ビスＧｌｃＮＡｃ、ならびにＦｕｃを糖構造内に存在させるのは任意選択であるに過ぎず、存在させなくともよい）に示される構造を有する二分枝性複合体型糖などの複合体型糖であることがより好ましい。特に、任意選択の残基は、本明細書に記載される量で存在させる。
【０１０４】
特に、抗体組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のうちの少なくとも５０％が、少なくとも１つのガラクトース残基を保有する。組成物における前記糖のうちの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％は、少なくとも１つのガラクトース残基を保有することがより好ましい。好ましい実施形態では、抗体組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基を保有する。組成物における前記糖のうちの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％は、少なくとも１つのガラクトース残基を保有することがより好ましい。このガラクトース残基は、場合によって、シアル酸残基をさらに保有する、特に、糖鎖のうちの１またはそれより多くの分枝の末端に位置する、特に、Ｎ−アセチルグルコサミン残基に付いている、末端のガラクトース残基であることが好ましい。この点における「末端の」という用語は、糖鎖におけるガラクトース残基の位置、特に、糖鎖の分枝のうちの１つにおけるその位置だけを指す。この用語は、ガラクトース残基が、糖鎖の非還元末端に最後に残る単糖単位であることを必ずしも意味しない。特に、末端のガラクトース単位は、シアル酸残基をさらに保有しうる。
【０１０５】
好ましい実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体が、ヒトグリコシル化パターンまたはヒト様グリコシル化パターンを有する。特に、抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まないことが好ましい。これらの糖は、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌを含まないことが好ましい。抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖はまた、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まないことも好ましい。さらに、組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のシアル酸のうちの少なくとも２５％が、２，６結合により連結されていることも好ましい。組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のシアル酸のうちの少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも６８％が、２，６結合により連結されていることがより好ましい。
【０１０６】
天然のヒトグリコシル化に類似するグリコシル化パターンを用いることにより、抗体またはその断片もしくは誘導体の投与により引き起こされる有害な副作用を軽減する。特に、Ｇａｌｉｌｉエピトープ、ＮｅｕＧｃ、または高量の２，３結合されたシアル酸などの糖構造は、患者の免疫系による免疫反応を引き起こしうるので、回避すべきである。例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、ヒト様グリコシル化パターンを有するキメラ抗体、または好ましくはヒト化抗体を用いることにより回避することができる。特に、Ｇａｌｉｌｉエピトープは、重度の知覚過敏反応を多数引き起こすことが公知である。特に、マウスＳＰ２／０細胞において発現させたキメラ抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）は、ＧａｌｉｌｉエピトープおよびＮｅｕＧｃを保有する糖を含み、したがって、ヒト患者において抗体に対する免疫反応を誘導する。本発明に従う方法により得られる抗体、特に、キメラＣｅｔｕｘｉｍａｂ抗体もしくはヒト化Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ抗体、または本発明による方法を介して得られるＣｅｔｕｘｉｍａｂと同じエピトープを有し、本発明による抗体組成物中に含まれうる抗体などのＥＧＦＲ抗体は、これらの不利な糖構造を含まない。
【０１０７】
さらに、本発明による組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２３％、少なくとも２５％、少なくとも２７％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン（ビスＧｌｃＮＡｃ）残基を保有する。特に、組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、なおまたは少なくとも７０％が、ビスＧｌｃＮＡｃを保有する。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明による組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に結合した糖のうちの５０％以下、好ましくは４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１３％以下、または１０％以下が、フコース残基を保有する。さらなる実施形態では、本発明による組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に結合した糖のうちの好ましくは少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％が、フコース残基を保有する。
【０１０９】
生物学的活性の増強
本発明の好ましい実施形態では、循環半減期を延長した抗体は、生物学的活性も加えて増強されている。この点における抗体の生物学的活性には、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣが含まれる。生物学的活性の増強は、主に、グリコシル化パターンの最適化、特に、抗体のＦｃ部分におけるグリコシル化パターンの最適化により達成される。例えば、ＩｇＧ型の抗体のＡＤＣＣ活性は、抗体の、そのＦｃ部分によるＦｃγ受容体、特に、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合により媒介される。ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージにおいて発現し、抗体により活性化されると、サイトカインおよび細胞傷害性顆粒の放出を誘導し、この結果として、抗体が結合した標的細胞のアポトーシスをもたらす。抗体のＦｃγ受容体に対する結合アフィニティーは、抗体のＦｃ部分におけるグリコシル化部位に付いている糖による影響を受ける。したがって、抗体のＦｃ部分におけるグリコシル化パターンを最適化すると、結果として、ＦｃγＲＩＩＩａへのより強力な結合がもたらされ、このため、ＡＤＣＣ活性の増強がもたらされる。
【０１１０】
抗体の治療有効性（それらの循環半減期に加えた）は、多くの場合、抗体が結合した標的細胞に対する細胞傷害性効果、特に、ＡＤＣＣの誘導に依存する。したがって、抗体のＡＤＣＣ活性を増大させると、その治療価値が高まる。例えば、患者に同量の抗体を投与しても、それらのＡＤＣＣ活性について最適化した抗体を用いる場合は、はるかに大きな治療的利益が達成される。さらに、同じ治療効果を達成するには、はるかに少量のこのような抗体を投与すればよい。本明細書で論じる通り、抗体の循環半減期を延長することによってもまた、治療効果の増強が結果としてもたらされる。したがって、循環半減期の延長および生物学的活性の増大という両方の特徴を組み合わせることにより、治療用抗体の利点が大きくなる。
【０１１１】
しかし、両方の特性ともに、抗体のグリコシル化パターンを制御することにより最適化することが好ましい。特に、抗体のＦａｂ部分においてシアリル化度を高くすると、それらの循環半減期が延長されるのに対し、抗体のＦｃ部分におけるフコシル化度を低くすると、それらのＡＤＣＣ活性が増大する。さらに、Ｆｃ部分におけるシアリル化度を高くすると、ＡＤＣＣ活性が干渉されうる。両方の特徴を１つの抗体組成物中に組み合わせ、これにより、Ｆａｂ部分におけるグリコシル化パターンを循環半減期の延長について最適化し、Ｆｃ部分におけるグリコシル化パターンを生物学的活性の増大について最適化した抗体をもたらすことは、本発明の達成である。
【０１１２】
特に、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に付いている糖中のフコース量の減少、二分枝状のＧｌｃＮＡｃ量の増大、および／またはシアル酸量の減少は、抗体のＦｃγＲＩＩＩａに対するアフィニティーおよび／またはそのＡＤＣＣ活性を増大させることが判明している。
【０１１３】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体が、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に付いている糖中のフコース量が少ない。代替的に、またはこのフコース量が少ないことに加えて、抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｆｃ部分に付いている糖中の二分枝状のＧｌｃＮＡｃ量が多い場合もあり、かつ／またはシアル酸量が少ない場合もあることが好ましい。抗体のＦｃ部分におけるこのようなグリコシル化パターンは、結果として、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす。
【０１１４】
好ましい実施形態では、本発明による組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％が、フコース残基を保有しない。抗体のＦｃ部分のグリコシル化部位におけるフコース含量を少なくすることは、特に、抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を高めるために重要である。とりわけ、ＩｇＧ抗体の場合、Ｆｃのグリコシル化部位におけるフコース量が多いと、抗体のＦｃγ受容体、特に、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージにより発現され、ＡＤＣＣを媒介する、ＦｃγＲＩＩＩａへのアフィニティーが低減される。さらにまた、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分におけるグリコシル化部位に付いている糖中のフコース量が少ないと、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの異なる多形変異体（ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ）に対する抗体の結合アフィニティーの差違も減少する。したがって、Ｆｃ部分に付いている糖中のフコース量、特に、上記で記載したフコース量が少ないＩｇＧ抗体は、Ｆｃ部分におけるフコース含量が多い同じ抗体を投与した場合には治療効果をもたらさない量の抗体を投与することにより、患者を処置するのに用いることができる。さらに、これらの低フコース抗体を用いると、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ患者、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ患者、およびヘテロ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｖ患者など、ＦｃγＲＩＩＩａの異なる多形変異体を有する患者を、同量の抗体で処置し、投与された同量の抗体に対して同様の応答をもたらすことができる。特に、それらのＦｃ部分におけるフコース含量が多い抗体を結合させると、とりわけ、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆに対するアフィニティーが低下する。したがって、前記低フコース抗体を用いると、抗体療法の患者対象範囲が広がる。これはまた、本発明による各抗体組成物を用いる例でも裏付けられる。
【０１１５】
さらに、本発明による組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、または少なくとも２２％が、ビスＧｌｃＮＡｃ残基を保有する。抗体、特に、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分におけるビスＧｌｃＮＡｃ量を多くすると、抗体のＡＤＣＣを結果として増大させることができる。
【０１１６】
さらに、本発明による組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％が、シアル酸残基を保有しない。さらに、本発明による組成物では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％が、２つ以上のシアル酸残基を保有しない。抗体のＦｃ部分におけるシアリル化度を高めると、Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩａへの結合に対して負の影響を及ぼす可能性があり、したがって、抗体のＡＤＣＣに対して負の影響を及ぼす可能性がある。これらの抗体組成物を生成するのに用いられる細胞および細胞系は、Ｆａｂ部分におけるシアリル化度が高く、Ｆｃ部分におけるシアリル化度が低い抗体をもたらしうることが好ましい。適切な細胞系の例は、細胞系ＧＴ−５ｓであり、これに由来する細胞および細胞系、またはこれと相同的な細胞および細胞系である。
【０１１７】
抗体組成物
第二の態様では、本発明が、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物であって、抗体またはその断片もしくは誘導体が、それらのＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位を含むことを特徴とし、組成物において、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも６５％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有し、かつ／あるいは抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの３５％未満が、少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を保有することを特徴とする抗体組成物を提供する。抗体組成物の好ましい特徴、および、特に、好ましいグリコシル化パターンは、グリコシル化パターンと共に上記で記載されており、下記でも記載される。
【０１１８】
本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および最も好ましくは約１００％が、同じ抗原、好ましくは同じエピトープを認識し、これに結合し、かつ／またはこれに特異的であることが好ましい。
【０１１９】
抗体組成物は、本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の循環半減期を制御する方法であって、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量を増大させる方法により得ることが可能であるか、または実際に得られることが好ましい。
【０１２０】
特に、本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、本発明による循環半減期を制御する方法に関して上記で記載した特徴のうちの１またはそれより多くを有することが好ましい。特に、本発明による循環半減期を制御する方法と共に記載された、抗体またはその断片もしくは誘導体を含む組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体それぞれの特徴、および、特に、グリコシル化パターン、Ｆａｂにおけるグリコシル化部位の特徴、ならびに上記で説明したグリコシル化パターンの特徴はまた、本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体にも適用することができる。
【０１２１】
好ましい実施形態では、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有する。特に、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖における糖鎖１本当たりの平均シアル酸残基量は、少なくとも０．６５、好ましくは少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．０５、または少なくとも１．１である。さらに、組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に付いている糖のうちの、好ましくは３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、または５％未満が、２つ以上のフリーのガラクトース単位を保有する。特に、組成物における、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖における糖鎖１本当たりの平均フリーのガラクトース単位量は、１．２未満、好ましくは１．１未満、１．０未満、０．９未満、０．８５未満、０．８未満、０．７５未満、または０．７未満である。
【０１２２】
組成物における少なくとも１つの抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｆａｂ部分においてグリコシル化されていることが好ましい。組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％は、Ｆａｂ部分においてグリコシル化されていることがより好ましい。さらに、組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または最も好ましくは少なくとも９０％が、本明細書で記載されるＦａｂ部分の特定のグリコシル化部位において、好ましくはＦａｂ部分に存在する全てのグリコシル化部位においてグリコシル化されている。抗体またはその断片もしくは誘導体は、例えば、精製工程後または精製工程中における各グリコシル化パターンに応じて濃縮することもできる。
【０１２３】
抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、それらのＦｃ部分において少なくとも１つのグリコシル化部位をさらに含むことが好ましい。このグリコシル化部位は、糖によりグリコシル化されていることが好ましく、この場合、組成物中の糖であって、フコース残基を保有する糖の量は、５０％未満、より好ましくは４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、好ましくは１０％未満、および最も好ましくは５％未満であることが好ましい。さらに、組成物では、Ｆｃ部分に付いている糖であって、１またはそれより多くのシアル酸残基を保有する糖の量が、５０％未満、より好ましくは４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、および最も好ましくは７％未満、または５％未満であることが好ましい。
【０１２４】
組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、以下の表に列挙されるグリコシル化パターンを有することが好ましい。
【０１２５】
【表９】
2013535970.tif 000002
【０１２６】
組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｆａｂのグリコシル化パターンについての１つの実施形態（実施形態１〜１５）と、Ｆｃのグリコシル化パターンについての１つの実施形態（実施形態１６〜２９）との組合せ、例えば、実施形態１と１６との組合せ、実施形態６と１９との組合せ、実施形態１０と２３との組合せ、実施形態１５と２６との組合せ、実施形態１と２７との組合せ、実施形態４と２８との組合せ、ならびに実施形態１４と２９との組合せを有することが好ましい。
【０１２７】
好ましい実施形態では、抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体が、Ｇａｌｉｌｉエピトープおよび／またはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含む糖を保有しない。
【０１２８】
本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、適切な細胞系、特に、ヒト細胞系、好ましくは、ヒト血液細胞系、特に、ヒト骨髄細胞系またはヒト骨髄性白血病細胞系など、不死化ヒト細胞系における発現を介して得ることができる。本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、ＧＴ−５ｓ細胞系（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０７８）、または上記で規定したこれに由来する細胞もしくは細胞系、またはこれと相同な細胞もしくは細胞系、特に、単一クローン選択により、または細胞系の操作により、例えば、遺伝子ノックアウトにより、低フコシル化について選択される細胞系など、フコシル化活性が低いかまたは見られない細胞系における発現を介して得られる。特に、フコシル化活性が低いかまたは見られない細胞系では、フコースの生合成経路、および／またはフコースの輸送系、および／またはフコシル化酵素において１またはそれより多くの欠損が存在しうる。その活性が低いかまたは見られない標的酵素は、ＦＵＴ８遺伝子によりコードされるα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ、およびＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼからなる群から選択することが好ましい。欠損は、活性が低いかまたは見られないタンパク質の発現を結果としてもたらす場合もあり、遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する場合もある。さらに、低フコース含量はまた、ＲＮＡ干渉など、細胞の遺伝子構造を変化させない生物学的方法によっても達成することができる。
【０１２９】
さらに本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むキメラまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体を含む抗体組成物であって、
（ｉ）抗体が、Ｋａｂａｔの番号付けによる重鎖可変領域のうちのアミノ酸８５位のＦａｂ部分に存在するグリコシル化部位を含み、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する前記グリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有すること、または
（ｉｉ）抗体が、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を含まないこと
を特徴とする抗体組成物を提供する。
【０１３０】
上記で説明した通り、各抗体組成物は、それぞれのグリコシル化パターンを有さない抗体組成物と比較して、半減期の改善を示す。好ましくは、キメラまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位を含み、組成物では、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、フコース残基を保有しない。さらに、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、シアル酸残基を保有しない。さらに、一実施形態によれば、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも１０％が、二分枝状のＮアセチルグルコサミン残基を保有し、抗体に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基（このガラクトース残基は、特に、場合によって、シアル酸残基をさらに保有する糖鎖の１またはそれより多くの分枝の末端に位置する、特に、Ｎ−アセチルグルコサミン残基に付いている、末端ガラクトース残基であることが好ましい）を保有し、抗体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まず、抗体に付いている糖が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まない。さらに、一実施形態によれば、Ｆａｂ部分に付いている糖のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは少なくとも７０％が、二分枝状Ｎ−アセチルグルコサミン残基を保有する。一実施形態によれば、抗体に付いている糖のうちの少なくとも２５％または少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％が、シアル酸を含む。一実施形態によれば、各抗体組成物が、上記で説明した特徴の全てを、好ましい特徴として組み合わせる。抗体は、ＩｇＧ抗体であることが好ましい。一実施形態によれば、各グリコシル化抗体の機能的な断片または誘導体を含む抗体組成物が提供される。
【０１３１】
さらに、本発明はまた、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むキメラまたはヒト化抗Ｍｕｃ１抗体を含む抗体組成物であって、抗体が、Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸５４位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位を含み、組成物において、Ｆａｂ部分に存在する前記グリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％が、少なくとも１つの末端シアル酸残基を保有することを特徴とする抗体組成物を提供する。上記で説明した通り、各抗体組成物は、それぞれのグリコシル化パターンを有さない抗体組成物と比較して、半減期の改善を示す。
【０１３２】
好ましくは、キメラまたはヒト化抗Ｍｕｃ１抗体は、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位を含み、組成物では、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％が、フコース残基を保有せず、かつ／または、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％が、シアル酸残基を保有しない。さらに、一実施形態によれば、Ｆｃ部分に付いている糖のうちの少なくとも５％が、二分枝状Ｎアセチルグルコサミン残基を保有し、抗体に付いている糖のうちの少なくとも７０％が、少なくとも１つのガラクトース残基（このガラクトース残基は、特に、場合によって、シアル酸残基をさらに保有する糖鎖の１またはそれより多くの分枝の末端に位置する、特に、Ｎ−アセチルグルコサミン残基に付いている、末端ガラクトース残基であることが好ましい）を保有し、抗体に付いている糖が、構造Ｇａｌα（１→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃを有するＧａｌｉｌｉエピトープを含まず、抗体に付いている糖が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）残基を含まない。一実施形態によれば、各抗体組成物が、上記で説明した特徴の全てを、好ましい特徴として組み合わせる。抗体は、ＩｇＧ抗体であることが好ましい。一実施形態によれば、各グリコシル化抗体の機能的な断片または誘導体を含む抗体組成物が提供される。
【０１３３】
さらなる態様では、本発明が、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体であって、抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列が、Ｆａｂ部分において少なくとも１つのグリコシル化部位を含む基準抗体に由来し、抗体またはその断片もしくは誘導体が、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を含まず、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期が、基準抗体より長い、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を提供する。
【０１３４】
上記で論じた通り、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分のグリコシル化部位（複数可）を除去すると、Ｆａｂ部分にグリコシル化部位を含む基準抗体と比較して、循環半減期の延長を結果としてもたらす。循環半減期の延長は、少なくとも１つの種において見ることができ、霊長動物、好ましくはヒトにおいて見られることが好ましい。本発明による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、基準抗体と同じエピトープに結合することが好ましい。
【０１３５】
抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域の３つＣＤＲ全てのアミノ酸配列は、基準抗体に由来することが好ましい。さらに、抗体またはその断片もしくは誘導体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ全てのアミノ酸配列も、基準抗体に由来することが好ましい。好ましい実施形態では、基準抗体に由来するＣＤＲのアミノ酸配列は、基準抗体の対応するＣＤＲのアミノ酸配列と同一である。
【０１３６】
好ましい実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域のアミノ酸配列の全体、および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列の全体が、基準抗体に由来する。特定の実施形態では、基準抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位が、基準抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に存在し、本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体が、基準抗体に由来する重鎖可変領域または軽鎖可変領域において、少なくとも１つのアミノ酸の変異であって、前記グリコシル化部位を除去する変異を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体のアミノ酸配列の全体が、基準抗体に由来するが、この場合、アミノ酸配列の全体は、Ｆａｂ断片においてグリコシル化部位を含まない。
【０１３７】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の抗原結合アフィニティーは、基準抗体の抗原結合アフィニティーと同様であるかまたはこれより大きいことが好ましい。抗原結合アフィニティーは、２０％を超えて低下しないか、好ましくは１５％を超えて低下しないか、１０％を超えて低下しないか、または５％を超えて低下しないことが好ましい。さらに、一実施形態によれば、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期は、基準抗体の循環半減期より少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％長い。上記で論じた通り、循環半減期の延長は、少なくとも１つの種、好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒトにおいて観察される。
【０１３８】
基準抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体、特に、上記で記載した抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、ＣｅｔｕｘｉｍａｂまたはＣｅｔｕｘｉｍａｂと同じエピトープに結合する抗体、抗ＭＵＣ１抗体、特に、上記で記載した抗ＭＵＣ１抗体、例えば、ＰａｎｋｏｍａｂまたはＰａｎｋｏｍａｂと同じエピトープに結合する抗体、ＳｏｌａｎｅｚｕｍａｂまたはＳｏｌａｎｅｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体などの抗Ａβ抗体、およびＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂまたはＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体などの抗ＣＤ５２抗体からなる群から選択されることが好ましい。
【０１３９】
好ましい抗ＥＧＦＲ抗体、および好ましい抗ＭＵＣ１抗体、ならびにこれらのＣＤＲ配列は、上記に記載されている。ここでもまた当てはまる上記の開示が参照される。これらの抗体は、基準抗体として用いられることが好ましい。上記で論じた通り、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、それぞれの抗体のうちの少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは全てのＣＤＲを含むことが好ましい。
【０１４０】
好ましい抗ＣＤ５２抗体はまた、上記で説明されており、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１またはそれより多くを含む。特に、抗体は、
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸６０位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗ＣＤ５２抗体でありうる。
【０１４１】
前記抗体は、Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂと同じ抗原、特に、これと同じエピトープに結合しうることが好ましい。
【０１４２】
好ましい抗Ａβ抗体はまた、上記で説明されており、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１またはそれより多くを含む。特に、抗体は、
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）場合によって、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付けによる、重鎖可変領域のうちのアミノ酸５５位の、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位と、
（ｉｖ）場合によって、重鎖定常領域２のうちのアミノ酸２９７位の、Ｆｃ部分に存在するグリコシル化部位と
を含む抗Ａβ抗体でありうる。
【０１４３】
前記抗体は、Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂと同じ抗原、特に、これと同じエピトープに結合しうることが好ましい。
【０１４４】
例示的な基準抗体はまた、以下の表にも列挙される。
【０１４５】
【表１０】
2013535970.tif 000003
【０１４６】
Ｆａｂのグリコシル化部位に関して上記で記載されている詳細については、上記の開示が参照される。基準抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位は、特に、アミノ酸配列Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有し、この場合、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である、Ｎ−グリコシル化部位であることが好ましい。
【０１４７】
好ましい実施形態では、基準抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり、本発明のこの態様による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域におけるグリコシル化部位が除去されるように、少なくとも１つのアミノ酸において、基準抗体の対応するアミノ酸配列とは異なる。
【０１４８】
基準抗体におけるグリコシル化部位は、当技術分野において公知である任意の方法により除去することができ、特に、アミノ酸配列を変化させることにより除去することができる。これもまた上記で記載されている任意選択肢については、上記の開示が参照される。基準抗体のアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸を付加すること、置換すること、および／または欠失させることにより、グリコシル化部位を除去することが好ましい。特に、糖鎖のアクセプターとして機能するグリコシル化部位のアミノ酸を、糖鎖のアクセプターとしては機能することが可能でない別のアミノ酸により欠失させるかもしくは置換し、かつ／または抗体のグリコシル化の一因となる酵素、特に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの認識配列を、この酵素が、アミノ酸配列を認識することができず、このため、糖鎖を抗体のポリペプチド鎖へと移送することができなくなるように変化させる。特に、Ｎ−グリコシル化部位を除去するには、グリコシル化部位Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒであって、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸残基である、グリコシル化部位のアミノ酸配列を、（ｉ）Ａｓｎを欠失させるか、もしくは他の任意のアミノ酸に置換し、（ｉｉ）ＳｅｒまたはＴｈｒを欠失させるか、もしくはＳｅｒおよびＴｈｒ以外の任意のアミノ酸で置換し、（ｉｉｉ）Ｘａａを欠失させるか、もしくはＰｒｏで置換し、かつ／または（ｉｖ）ＡｓｎとＳｅｒ／Ｔｈｒとの間にさらなるアミノ酸を導入するように変化させる。
【０１４９】
さらに、本発明は、上記で記載した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物であって、対応する基準抗体と比較して、Ｆａｂ部分にグリコシル化部位を含まない抗体組成物を提供する。抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の詳細については上記の開示が参照される。この態様による抗体組成物は、上記で記載した抗体組成物に関して本明細書で開示される特徴のうちのいずれかを有しうる。特に、組成物における抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、上記で規定および記載したＦｃ部分においてグリコシル化パターンを有しうる。
【０１５０】
本発明はさらに、循環半減期を延長した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を生成する方法であって、
（ａ）Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体（基準抗体）をコードする核酸を供給するステップと、
（ｂ）コードされた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位が除去されるように、変異を核酸へと導入するステップと
を含む方法を提供する。
【０１５１】
これにより、元の抗体（本明細書ではまた、基準抗体とも称する）と同じエピトープに結合するが、循環半減期を延長した、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体が得られる。上記で論じた通り、循環半減期の延長は、少なくとも１つの種、好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒトにおいて観察されることが好ましい。適切な基準抗体および好ましい基準抗体に関して上記で記載されている詳細については、上記の開示が参照される。得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の抗原結合アフィニティーは、基準抗体の抗原結合アフィニティーと同様であるかまたはこれより大きいことが好ましい。抗原結合アフィニティーは、２０％を超えて低下しないか、好ましくは１５％を超えて低下しないか、１０％を超えて低下しないか、または５％を超えて低下しないことが好ましい。さらに、一実施形態によれば、得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期は、基準抗体の循環半減期より少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％長い。上記で論じた通り、循環半減期の延長は、少なくとも１つの種、好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒトにおいて観察される。Ｆａｂ部分のグリコシル化部位を除去するのに適する、上記で記載されている方法については、それぞれの開示が参照される。
【０１５２】
本発明はまた、循環半減期を延長した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を生成する方法であって、
（ａ）Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体（基準抗体）をコードする核酸を供給するステップと、
（ｂ）コードされた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位が除去されるように、変異を核酸へと導入するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた核酸を宿主細胞において発現させて、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を含まず、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期が、Ｆａｂ部分においてグリコシル化部位を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体より長い、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をもたらすステップと
を含む方法を提供する。
【０１５３】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、例えば、宿主細胞を含む培養培地から得ることができる。抗体を発現させるのに適する宿主細胞は、先行技術において公知であり、上記でもまた記載されている。抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、精製されることが好ましい。基準抗体、およびＦａｂ断片においてグリコシル化部位を含まない、得られた変異抗体に関して上記で記載されている詳細については、上記の開示が参照される。
【０１５４】
さらに、本発明は、循環半減期を延長した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を生成する方法により得られる核酸、および循環半減期を延長した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を生成する方法により得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体も提供する。
【０１５５】
さらなる態様では、本発明が、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体であって、抗体またはその断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列が基準抗体に由来し、抗体またはその断片もしくは誘導体が、Ｆａｂ部分における少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位であって、基準抗体には存在しないグリコシル化部位を含む、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を提供する。特定の実施形態では、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期が、基準抗体より短い。これらの実施形態では、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるシアリル化度が低く、かつ／またはフリーのガラクトース単位の存在度が高いこと、特に、循環半減期を短縮した抗体またはその断片もしくは誘導体、すなわち、本発明による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期を制御するための方法のステップ（ｂ１）または（ｂ３）の後に得られる抗体またはその断片もしくは誘導体に関して、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量および／またはフリーのガラクトース単位量が上記の通りであることが好ましい。ここでもまた当てはまる上記の開示が参照される。
【０１５６】
上記で論じた通り、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分にグリコシル化部位（複数可）を付加すると、Ｆａｂ部分にそれぞれのグリコシル化部位を含まない基準抗体と比較して、循環半減期の短縮を結果としてもたらすことができる。循環半減期の短縮は、少なくとも１つの種において見ることができ、霊長動物、好ましくはヒトにおいて見られることが好ましい。本発明による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、基準抗体と同じエピトープに結合することが好ましい。
【０１５７】
基準抗体は、Ｆａｂ部分において、グリコシル化部位を含まないことが好ましい。
【０１５８】
抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域の３つＣＤＲ全てのアミノ酸配列は、基準抗体に由来することが好ましい。さらに、抗体またはその断片もしくは誘導体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ全てのアミノ酸配列も、基準抗体に由来することが好ましい。好ましい実施形態では、基準抗体に由来するＣＤＲのアミノ酸配列は、基準抗体の対応するＣＤＲのアミノ酸配列と同一である。
【０１５９】
好ましい実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体の重鎖可変領域のアミノ酸配列の全体、および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列の全体が、基準抗体に由来する。特定の実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位が、基準抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に存在し、本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体が、基準抗体に由来する重鎖可変領域または軽鎖可変領域において、少なくとも１つのアミノ酸の変異であって、前記グリコシル化部位（複数可）を導入する変異を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体のアミノ酸配列の全体が、基準抗体に由来するが、この場合、アミノ酸配列の全体は、Ｆａｂ断片において少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含む。
【０１６０】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の抗原結合アフィニティーは、基準抗体の抗原結合アフィニティーと同様であるかまたはこれより大きいことが好ましい。抗原結合アフィニティーは、２０％を超えて低下しないか、好ましくは１５％を超えて低下しないか、１０％を超えて低下しないか、または５％を超えて低下しないことが好ましい。さらに、一実施形態によれば、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期は、基準抗体の循環半減期より少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％短い。上記で論じた通り、循環半減期の短縮は、少なくとも１つの種、好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒトにおいて観察される。
【０１６１】
Ｆａｂのグリコシル化部位に関して上記で記載されている詳細については、上記の開示が参照される。抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分における１またはそれより多くのさらなるグリコシル化部位は、特に、アミノ酸配列Ａｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有し、この場合、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である、Ｎ−グリコシル化部位であることが好ましい。
【０１６２】
好ましい実施形態では、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるさらなるグリコシル化部位（複数可）のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てが、重鎖可変領域または軽鎖可変領域、好ましくは重鎖可変領域に存在し、本発明のこの態様による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、重鎖可変領域または軽鎖可変領域に少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位が導入されるように、少なくとも１つのアミノ酸において、基準抗体の対応するアミノ酸配列とは異なる。さらなる実施形態では、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるさらなるグリコシル化部位のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てが、重鎖定常領域または軽鎖定常領域、好ましくは重鎖定常領域に存在し、本発明のこの態様による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域のアミノ酸配列が、重鎖定常領域または軽鎖定常領域に少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位が導入されるように、少なくとも１つのアミノ酸において、基準抗体の対応するアミノ酸配列とは異なる。
【０１６３】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体におけるグリコシル化部位は、当技術分野において公知である任意の方法により導入することができ、特に、アミノ酸配列を変化させることにより導入することができる。これもまた上記で記載されている任意選択肢については、上記の開示が参照される。基準抗体のアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸を付加すること、置換すること、および／または欠失させることにより、グリコシル化部位を導入することが好ましい。特に、アミノ酸を、糖鎖のアクセプターとして機能するアミノ酸を含み、かつ／または抗体のグリコシル化の一因となる酵素、特に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの認識配列を含む、機能的なグリコシル部位を形成するように変化させる。特に、Ｎ−グリコシル化部位を導入するには、基準抗体のアミノ酸配列を、アミノ酸の配列モチーフＡｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒであって、Ｘａａが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸残基であるモチーフを有するグリコシル化部位が、本発明による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体に存在するように変化させる。
【０１６４】
さらに、本発明は、上記で記載した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物であって、対応する基準抗体と比較して、Ｆａｂ部分に少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含む抗体組成物を提供する。抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の詳細については、上記の開示が参照される。この態様による抗体組成物は、上記で記載した抗体組成物に関して本明細書で開示される特徴のうちのいずれかを有しうる。特に、組成物における抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、上記で規定および記載したＦｃ部分および／またはＦａｂ部分においてグリコシル化パターンを有しうる。
【０１６５】
特定の実施形態では、抗体組成物における抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期が、基準抗体より短い。これらの実施形態では、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分におけるシアリル化度が低く、かつ／またはフリーのガラクトース単位の存在度が高く、特に、循環半減期を短縮した抗体またはその断片もしくは誘導体、すなわち、本発明による抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期を制御する方法のステップ（ｂ１）または（ｂ３）の後に得られる抗体またはその断片もしくは誘導体に関して上記で記載した、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖中のシアル酸量および／またはフリーのガラクトース単位量を有する。ここでもまた当てはまる上記の開示が参照される。特に、組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの５０％未満が、少なくとも１つのシアル酸残基を含む。組成物では、Ｆａｂ部分に存在する１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または約０％が、１またはそれより多くのシアル酸残基を含むことが好ましい。さらに、組成物では、Ｆａｂ部分に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも５０％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むことが好ましい。組成物では、Ｆａｂ部分における１またはそれより多くのグリコシル化部位に付いている糖のうちの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９８％が、少なくとも１つのフリーのガラクトース単位、好ましくは少なくとも２つのフリーのガラクトース単位を含むことが好ましい。
【０１６６】
本発明は、循環半減期を短縮した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を生成する方法であって、
（ａ）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体（基準抗体）をコードする核酸を供給するステップと、
（ｂ）コードされた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位が導入されるように、変異を核酸へと導入するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【０１６７】
これにより、元の抗体（本明細書ではまた、基準抗体とも称する）と同じエピトープに結合するが、循環半減期を短縮した、抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体が得られる。上記で論じた通り、循環半減期の短縮は、少なくとも１つの種、好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒトにおいて観察されることが好ましい。適切な基準抗体および好ましい基準抗体、ならびに抗体またはその断片もしくは誘導体の適切なグリコシル化特徴に関して上記で記載されている詳細については、上記の開示が参照される。得られた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の抗原結合アフィニティーは、基準抗体の抗原結合アフィニティーと同様であるかまたはこれより大きいことが好ましい。抗原結合アフィニティーは、２０％を超えて低下しないか、好ましくは１５％を超えて低下しないか、１０％を超えて低下しないか、または５％を超えて低下しないことが好ましい。さらに、一実施形態によれば、得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体の循環半減期は、基準抗体の循環半減期より少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％短い。上記で論じた通り、循環半減期の短縮は、少なくとも１つの種、好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒトにおいて観察される。Ｆａｂ部分にグリコシル化部位を導入するのに適する、上記で記載されている方法については、それぞれの開示が参照される。
【０１６８】
本発明はまた、循環半減期を短縮した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を生成する方法であって、
（ａ）抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体（基準抗体）をコードする核酸を供給するステップと、
（ｂ）コードされた抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体のＦａｂ部分に少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位が導入されるように、変異を核酸へと導入するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られる核酸を宿主細胞において発現させて、Ｆａｂ部分において少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を有し、Ｆａｂ部分において前記少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を有さない抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体より循環半減期が短い抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をもたらすステップと
を含む方法も提供する。
【０１６９】
抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、例えば、宿主細胞を含む培養培地から得ることができる。抗体を発現させるのに適する宿主細胞は、先行技術において公知であり、上記でもまた記載されている。具体的な好ましい宿主細胞は、シアリル化活性が低いかまたはこれが見られない。抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体は、精製されることが好ましい。基準抗体、およびＦａｂ部分において少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含む、得られた変異抗体に関して上記で記載されている詳細については、上記の開示が参照される。
【０１７０】
さらに、本発明は、循環半減期を短縮した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体をコードする核酸を生成する方法により得られる核酸、および循環半減期を短縮した抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を生成する方法により得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体も提供する。
【０１７１】
抗体および抗体組成物の医療における使用
上記で記載された抗体および抗体組成物、ならびに、特に、上記で記載された抗ＥＧＦＲ抗体組成物および抗Ｍｕｃ１抗体組成物は、グリコシル化パターンが最適化されており、これにより、半減期が延長され、ＡＤＣＣ活性が増大し、ヒト免疫系との適合性が増大しているので、特に有利である。特に、キメラまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明による抗体組成物における抗ＥＧＦＲ抗体は、マウスＳＰ２／０細胞において発現させた抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）より循環半減期が長く、ＡＤＣＣ活性が大きい。さらに、特に、Ｇａｌｉｌｉ構造が存在しないため、有害な副作用が軽減されている。このように有利な特徴を組み合わせることにより、有効な処置に必要な抗体用量を低減することがさらに可能となり、これによりまた、有害な副作用の危険性を軽減することも可能となる。さらに、グリコシル化パターンを最適化することにより患者スペクトルが拡張され、これにより、Ｆ／ＦアロタイプおよびＦ／Ｖアロタイプの患者を含め、全てのＦｃγＩＩＩ受容体型の患者の処置が可能となる。したがって、本発明は、治療プロファイルが改善された抗体組成物、および、特に、治療プロファイルが改善された抗ＥＧＦＲ抗体組成物を提供する。
【０１７２】
本発明による抗体組成物は、医療、特に、疾患、特に、がんの処置、予防、診断、予後診断、および／またはモニタリングにおいて用いることができる。したがって、抗体組成物は、医薬組成物であることが好ましい。がんは、任意のがん、特に、上記で記載されたがんでありうる。
【０１７３】
好ましい実施形態では、抗体組成物が、本明細書で記載される抗ＥＧＦＲ抗体を含み、がん、特に、ＥＧＦＲを発現するがんの処置、予防、診断、予後診断、および／またはモニタリングにおいて用いられる。この実施形態では、がんが、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺がん、腎細胞がん、乳癌、およびトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択されることが好ましい。抗ＥＧＦＲ抗体を含む抗体組成物は、別の薬剤、特に本明細書で記載される化学療法剤、例えば、イリノテカンと共に、かつ／または放射線療法と組み合わせて用いることができる。さらに、抗体組成物は、イリノテカン療法、白金ベースの療法、または放射線療法など、先行の抗がん療法の後で用いることもできる。
【０１７４】
さらに好ましい実施形態では、抗体組成物が、本明細書で記載される抗ＭＵＣ１抗体を含み、がん、特に、ＭＵＣ１、特に、腫瘍抗原であるＴＡ−ＭＵＣ１を発現するがんの処置、予防、診断、予後診断、および／またはモニタリングにおいて用いられる。この実施形態では、がんが、卵巣がん、乳がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、消化器がん、腎臓がん、および尿路上皮がんからなる群から選択されることが好ましい。抗ＭＵＣ１抗体を含む抗体組成物は、別の薬剤、特に本明細書で記載される化学療法剤と共に、かつ／または放射線療法と組み合わせて用いることができる。さらに、抗体組成物は、化学療法または放射線療法など、先行の抗がん療法の後で用いることもできる。
【０１７５】
本発明による抗体組成物、特に、組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体のＦｃ部分に結合した糖のうちの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％がフコース残基を含まない抗体組成物は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆをコードする少なくとも１つの対立遺伝子を有する患者におけるがんを処置するのに用いることができる。Ｆｃのグリコシル化部位におけるフコース含量が少ないために、特に、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆをコードする少なくとも１つの対立遺伝子を有する患者における抗体のＡＤＣＣ活性が増大し、とりわけ、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ遺伝子についてホモ接合性である患者における抗体のＡＤＣＣ活性と同様となる。この有利な特徴を、本明細書で記載される通り、Ｆａｂ部分におけるシアル酸量を増大させることにより、またはＦａｂ部分における１つのグリコシル化部位、または好ましくは全てのグリコシル化部位を除去することにより達成される半減期の改善と組み合わせると、臨床プロファイルが改善された抗体がもたらされる。
【０１７６】
例えば、がん患者の処置には、腫瘍細胞の縮小、悪性細胞の根絶、転移の防止、播種性がん、特に、播種性腫瘍細胞もしくは転移性がん、特に、循環中の播種性細胞またはアポトーシス回避もしくは浸潤下にある播種性細胞が、退縮、減少、部分死滅、もしくは完全死滅した患者における再発の防止、生存の延長、ならびに／あるいは腫瘍およびがんそれぞれの進行までの時間の延長が含まれる可能性があり、かつ／またはがんの処置によりこれらが結果としてもたらされうる。がんの処置、診断、または予防において使用される、本発明による抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、フリーのの抗体または断片もしくは誘導体の形態の場合もあり、さらなる物質、例えば、放射性核種もしくは細胞傷害性薬剤など、治療的に活性な薬剤、または放射性核種もしくは蛍光マーカーなどのマーカーに連結することもできる。さらに、抗体組成物は、化学療法剤など、１またはそれより多くの治療的に活性なさらなる薬剤も含みうる。さらなる薬剤は、細胞傷害性薬剤または放射性核種、特に、シスプラチンなどのアルキル化剤、抗代謝剤、植物アルカロイドおよびテルペノイド、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキソールなどのタキサン、イリノテカンおよびトポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、またはドキソルビシンなどの抗新生物剤であることが好ましい。疾患の診断、予後診断、および／またはモニタリングに用いる場合は、本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体を、検出可能なシグナルをもたらすことが可能な標識化剤に連結することが好ましい。特に、前記標識化剤は、放射性核種、フルオロフォア、または酵素でありうる。
【０１７７】
ＡＤＣＣ活性を増大させた抗ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明による抗体組成物に関しては、前記臨床プロファイルの改善が、抗体組成物により処置されうる患者群の拡大もまた包含する。抗ＥＧＦＲ抗体、特に、ＷＯ９６／４０２１０またはＵＳ４，９４３，５３３において開示される抗ＥＧＦＲ抗体を用いるがん患者の一般的な処置は、この抗体が、受容体のリガンド結合部位に結合し、これを遮断することにより、ＥＧＦＲの細胞内シグナル伝達を阻害する能力に基づく。ＥＧＦＲによる下流のシグナル伝達経路は、結果として細胞増殖をもたらすので、ＥＧＦＲによるシグナル伝達を遮断すると、細胞増殖が抑制され、このため、腫瘍成長も抑制される。しかし、この作用方式は、前記シグナル伝達経路がＥＧＦＲの活性化状態に関わりなく構成的に活性化される腫瘍細胞については作用しない。これは、例えば、シグナル伝達経路の１またはそれより多くのメンバーが構成的に活性となる変異、特に、構成的に活性となるＫ−Ｒａｓ変異体の場合に生じうる。さらに、この作用方式はまた、ＥＧＦＲシグナル伝達経路には依存せずに増殖する腫瘍細胞に対しても作用しない。
【０１７８】
一般的に用いられる抗ＥＧＦＲ抗体とは対照的に、循環半減期を改善し、かつ／またはＡＤＣＣ活性を増大させた抗ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明による抗体組成物は、ＥＧＦＲを発現する任意の腫瘍細胞、特に、ＥＧＦＲの発現が正常組織と比較して増大する腫瘍細胞など、ＥＧＦＲの発現率が高い腫瘍細胞を死滅させることが可能である。したがって、本発明による前記抗体組成物は、標的腫瘍細胞の増殖を阻害するだけでなく、標的腫瘍細胞を死滅させ、抗ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化状態に関わりなく、腫瘍細胞に対して有効であるという利点を有する。特に、これらの抗ＥＧＦＲ抗体の治療活性は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の下流における要素、とりわけ、構成的に活性なＫ−Ｒａｓ変異体の活性に対する非依存性がより大きい。したがって、上記で記載した、ＡＤＣＣ活性を増大させた抗ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明による抗体組成物を用いると、処置可能な患者群が、ＥＧＦＲに対するリガンドの結合を遮断することによっては処置することができない腫瘍またはがん細胞を有する患者へと拡張される。特に、これには、構成的に活性なＫ−Ｒａｓ変異体、構成的に活性なＰＩ  ３キナーゼ変異体、またはＲａｆキナーゼの過剰発現など、ＥＧＦＲシグナル伝達経路における活性化変異または過剰発現を含む腫瘍またはがん細胞が含まれる。各Ｋ−Ｒａｓ変異体の例は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｄ、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｃ、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｓ、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ａ、およびＫ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｒなど、アミノ酸番号１２に変異を有するＫ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１３ＤおよびＫ−Ｒａｓ  Ｇ１３Ｒなど、アミノ酸番号１３に変異を有するＫ−Ｒａｓ、ならびにＫ−Ｒａｓ  Ｑ６１Ｈ、  Ｋ−Ｒａｓ  Ｑ６１Ｋ、およびＫ−Ｒａｓ  Ｑ６１Ｌなど、アミノ酸番号６１に変異を有するＫ−Ｒａｓである。各ＰＩ  ３キナーゼ変異体には、特に、クラスＩのＰＩ  ３キナーゼ触媒サブユニットｐ１１０αにおいて活性化変異を有するＰＩ  ３キナーゼが含まれる。さらにまた、腫瘍細胞がＥＧＦＲを発現する限りにおいて、腫瘍がＥＧＦＲシグナル伝達経路の異常により引き起こされるわけではない患者も、この抗体組成物により処置することができる。抗ＥＧＦＲ抗体を含む、本発明による抗体組成物は、結腸直腸がんまたは頭頸部がん、特に転移性結腸直腸がんまたは転移性頭頸部がんの処置において用いることが好ましい。抗ＥＧＦＲ抗体は、上記で説明した抗ＥＧＦＲ抗体であることが好ましい。
【０１７９】
医薬組成物は、所望の処方物に応じて、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を調合するのに一般的に用いられる媒体として規定される、薬学的に許容可能な非毒性の希釈剤による担体を包含しうる。希釈剤は、混合物の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝処理水、生理食塩液、ＰＢＳ、リンゲル液、デキストロース液、およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または処方物は、他の担体、追加投与剤、または非毒性で治療剤以外である、非免疫原性の安定化剤、賦形剤なども包含しうる。組成物はまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、保湿剤、および洗浄剤など、生理学的条件を近似するためのさらなる物質も包含しうる。
【０１８０】
組成物はまた、例えば、抗酸化剤など、各種の安定化剤のうちのいずれかも包含しうる。医薬組成物がポリペプチドを包含する場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボにおける安定性を増強するか、または他の形でその薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を延長し、その毒性を軽減し、可溶性または取込みを増強する）多様な周知の化合物と複合体化させることができる。このような修飾剤または複合体化剤の例には、硫酸、グルコン酸、クエン酸、およびリン酸が含まれる。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボにおける属性を増強する分子と複合体化させることもできる。このような分子には、例えば、糖、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が含まれる。
【０１８１】
各種の投与に適する処方物に関するさらなる指針は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、１７版（１９８５年）において見出すことができる。薬物送達のための方法についての簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照されたい。
【０１８２】
本明細書で記載される医薬組成物は、各種の異なる方法で投与することができる。例には、薬学的に許容される担体を含有する組成物を、経口法、鼻腔内法、直腸内法、局所法、腹腔内法、静脈内法、筋肉内法、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）法、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）法、経皮法、髄腔内法、および頭蓋内法を介して投与する方法が含まれる。
【０１８３】
抗体組成物を生成する方法
さらなる態様では、本発明が、所望の循環半減期を有する抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を含む抗体組成物を生成する方法であって、宿主細胞において抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を発現させるステップを含み、本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の半減期を制御する方法を、前記方法のステップ（ａ１）、ステップ（ａ３）、ステップ（ｂ１）、もしくはステップ（ｂ３）を用いて実施し、かつ／または宿主細胞が、ステップ（ａ２）もしくは（ｂ２）を用いて本発明による抗体またはその断片もしくは誘導体の半減期を制御する方法により得られる抗体またはその機能的な断片もしくは誘導体を発現する方法を提供する。
【０１８４】
宿主細胞を培養培地中で培養し、前記培養培地中で抗体組成物を蓄積し、抗体組成物を細胞培養培地から回収することが好ましい。
【０１８５】
抗体組成物における抗体またはその断片もしくは誘導体は、本明細書で記載される特徴のうちの任意の１またはそれより多くを有しうる。さらに、抗体またはその断片もしくは誘導体は、抗体またはその断片もしくは誘導体の半減期を制御するのに所望され、かつ／または必要なグリコシル化特徴をもたらすことが可能な細胞系において発現させることが好ましい。特に、本明細書で開示される細胞および細胞系は、抗体またはその断片もしくは誘導体を発現させるのに用いることができる。ヒト細胞またはヒト細胞系、特に、ヒト血液細胞系、好ましくは、ヒト骨髄細胞系またはヒト骨髄性白血病細胞系など、不死化ヒト細胞系を用いることが好ましい。
【０１８６】
循環半減期を延長した抗体を含む抗体組成物を生成するには、抗体を、シアリル化活性が高い細胞系において発現させることが好ましい。このような細胞系の例は、好ましくは上記で規定した通り、ヒト細胞系ＧＴ−５ｓ、またはこれに由来する細胞系もしくはこれと相同な細胞系である。循環半減期を延長し、ＡＤＣＣ活性を増大させた抗体を含む抗体組成物は、抗体を、シアリル化活性が高く、フコシル化活性が低い細胞または細胞系において発現させることにより得ることができる。例えば、上記で説明した細胞系など、フコシル化活性を低下させたＧＴ−５ｓ細胞に由来する細胞系を用いることができる。
【０１８７】
本明細書で示される見出し文は、本明細書を全体として参照することによりもたらされうる、本発明の多様な態様または実施形態を限定するものではない。
【０１８８】
特定のグリコシル化特性について本明細書で示される百分率値は、特に、組成物中の全ての糖のうちで、表示される百分率が、記載される特性を有することを意味する。百分率値が、糖のうちの特定の群、例えば、組成物中の抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位に付いている糖だけを指す場合、示される百分率が記載される特性を有する組成物中の抗体のＦａｂ部分におけるグリコシル化部位に付いている全ての糖を意味する。このようなグリコシル化特性は、例えば、組成物中の抗体をそれらのＦａｂ部分およびＦｃ部分へと切断し、Ｆａｂ部分をＦｃ部分から分離し、糖を、分離されたＦａｂ部分およびＦｃ部分から切断し、糖の構造および／または特性を決定する（Ｆａｂ部分における糖およびＦｃ部分における糖について個別に）ことにより、決定することができる。構造および特性を決定するのに適する測定法は、例えば、ＨＰＬＣ法および質量分析である。
【実施例】
【０１８９】
（実施例１）
糖鎖プロファイリング
抗ＥＧＦＲ抗体
ヒト不死化血液細胞系であるＧＴ−５ｓ（Ｆｕｃ＋）に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させた抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ、またはマウス細胞系であるＳＰ２／０において発現させた抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）のグリコシル化パターンをより詳細に特徴づけるため、糖鎖プロファイリング研究を実施した。ヒト／マウスキメラＩｇＧ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂは、重鎖可変領域のフレームワーク領域３において１つのＮ−グリコシル化部位を含み、重鎖定常領域２において１つのＮ−グリコシル化部位を含む。
【０１９０】
抗体をパパインで切断した結果として、１つのＦｃ断片と、２つのＦａｂ断片がもたらされた。断片の分離は、Ｆｃ断片には結合するが、Ｆａｂ断片には結合しない、プロテインＡによる固相におけるアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施した。Ｆｃ部分をＦａｂ部分から分離した後で、各断片のＮ−グリカンを、糖鎖プロファイリングに適用した。
【０１９１】
糖鎖プロファイリングでは、完全なＮ−グリカンをタンパク質のコアから放出させ、Ｎ−グリカンの還元末端を、蛍光マーカーで標識化した。標識化したＮ−グリカンの精製試料は、ＨＰＬＣにより分離した。
【０１９２】
Ｎ−グリカン構造の相対モル存在量を計算するには、蛍光定量検出に基づくピーク面積を用いた。両方の抗体について推定されるデータを、表１にまとめる。値は、対象の種類の単糖（例えば、フコース）を含有するＮ−グリカンの相対モル含量を表す。
【０１９３】
【表１】
2013535970.tif 000004
【０１９４】
糖鎖プロファイリングは、マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ抗体と比較して、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ抗体のＦｃグリコシル化部位における平均フコース含量がはるかに少なく、Ｆａｂグリコシル化部位における平均シアル酸含量がはるかに多く、Ｆｃ部分における平均ビスＧｌｃＮＡｃ含量がはるかに多いほか、Ｆａｂ部分のグリコシル化がはるかに高度であることを示す。さらに、ＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ抗体だけが、ヒトにおける有害な副作用の一因となるＧａｌｉｌｉエピトープを含む。
【０１９５】
さらに、異なる２つのＣｅｔｕｘｉｍａｂ調製物中のＮｅｕＧｃおよびＮｅｕＡｃの相対量も決定した。免疫原性である５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）から識別することができる。
【０１９６】
解析のために、シアル酸を、タンパク質から放出させた。フリーのシアル酸をフルオロフォアで標識化し、蛍光定量検出を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。標識化したＮｅｕＡｃと、ＮｅｕＧｃとは、ＲＰ−ＨＰＬＣにおける貯留時間が異なる。これらの化合物を同定するために、市販の基準物質を用いた。
【０１９７】
表２に結果をまとめる。ＳＰ２／０により発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂでは、いずれのシアル酸も同定されたが、５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（９６％）が、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４％）に対してはるかに卓越した。これに対し、ヒトＧＴ−５ｓに由来するＦｕｃ−細胞系において発現させた、本発明によるＣｅｔｕｘｉｍａｂについては、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸だけが検出可能であった。
【０１９８】
【表２】
2013535970.tif 000005
【０１９９】
以下の実験では、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ、またはＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを、グリコシル化パターンを改善した、特にＦａｂ部分におけるシアリル化度が高く、Ｆｃ部分における二分枝状ＧｌｃＮＡｃ量が多く、場合によって、Ｆｃ部分におけるフコース量が少ない、本発明による抗体の例として用いた。ＳＰ２／０により発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）は、はるかに低いＦａｂ部分のシアリル化度を示すので、陰性対照として用いた。
【０２００】
抗ＭＵＣ１抗体
同様の糖鎖プロファイリングを、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＴＡ−Ｍｕｃ−１抗体であるＰａｎｋｏｍａｂ、およびＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させたＰａｎｋｏｍａｂについても実施した。重鎖可変領域のＣＤＲ２にＮ−グリコシル化部位を有し、重鎖定常領域２にもＮ−グリコシル化部位を有する、ＩｇＧ抗体のヒト化形であるＰａｎｋｏｍａｂ（ｈＰＭ）を用いた。
【０２０１】
【表３】
2013535970.tif 000006
【０２０２】
ＧＴ−５ｓ細胞系に由来するＦｕｃ−細胞系は、同様に高度なシアリル化パターンおよびガラクトシル化パターンを有する一方で、フコース量は顕著に減少したＰａｎｋｏｍａｂ抗体を産生する。Ｆｕｃ−細胞系により発現させたＰａｎｋｏｍａｂ抗体の全体における平均フコシル化糖量が少ないことは、Ｆｃ部分のフコースを保有するグリコシル化部位の平均量もまた少ないことを示す。ＧＴ−５ｓ細胞から得られたヒト化Ｐａｎｋｏｍａｂについて実施された糖鎖解析では、二分枝状ＧｌｃＮＡｃ残基量が決定されなかった。
【０２０３】
改善された検出手順および解析手順を用いて、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させた抗体であるＰａｎｋｏｍａｂについて、さらなる糖鎖解析を実施した。以下の結果が得られた。
【０２０４】
【表４】
2013535970.tif 000007
【０２０５】
（実施例２）
抗原結合研究
抗原ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレート上に固定化された市販抗原のＥＧＦＲにより、抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂについて特異的な抗原ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）を開発した。コーティングされたウェルは、ＰＢＳ中２％のＢＳＡでブロッキングして、抗体の非特異的な結合を防止した。１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈した抗ＥＧＦＲ抗体を、固定化された抗原へとインキュベートして結合させ、酵素で標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体により検出した。酵素であるＰＯＤにより、基質であるＴＭＢを色素へと転換し、これを、希硫酸による酸性化の後に、４５０ｎｍにおける測光法により定量した。
【０２０６】
マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｍｅｒｃｋ））を、１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の較正に用いた。本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂを含む試料を、４〜８ｎｇ／ｍｌへと希釈し、検量線と比較した（二次方程式による近似法）。異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂプローブによる結果は、ＥＬＩＳＡにおけるいずれの抗体の結合も同等であることを示す。
【０２０７】
反応速度およびアフィニティー（表面プラズモン共鳴）
センサーチップであるＣＭ５を、アミン結合を介して、市販されるＥＧＦＲの細胞外ドメインにより共有結合的にコーティングした。マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、シアリル化度が低い）と、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂの２つの調製物とを、リガンド密度を異にしてコーティングした２つのフローセル上を同時に流動させた結果、それぞれ、約２５ＲＵおよび１００ＲＵのＲｍａｘが得られた。抗ＥＧＦＲ抗体を、広範な濃度（２ｎＭ〜１μＭ）にわたり注入して、結合反応速度を計算した。抗体は２つの結合部位を有するので、二価評価モデルを用いた。結果を表５に示す。Ｂｉａｃｏｒｅ製のシミュレーションソフトウェアであるＢＩＡＳｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ２．１において示されうる通り、会合定数ｋａ１および解離定数ｋｄ１が、関与性の定数である。したがって、これらの２つの定数を用いて、アフィニティー定数であるＫＤを計算した。コーティングが極めて低度であるフローセルおよびコーティングがやや高度なフローセルによる全ての実験結果をまとめると、いずれのＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形についてのＫＤも同等であるが、本発明によるＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形のＫＤが、なおわずかに良好であった（ＫＤ値が低ければ、より強力な抗原結合が示される）。
【０２０８】
【表５】
2013535970.tif 000008
【０２０９】
フローサイトメトリーにおける腫瘍細胞への結合
フローサイトメトリーにより複数のＥＧＲ受容体陽性細胞系を解析して、本発明によりグリコシル化された抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂの結合特性と、シアリル化度が低いＣｅｔｕｘｉｍａｂ（マウスＳＰ２／０細胞において発現させた）の結合特性とを探索し、比較した。略述すると、標的細胞を採取し、濃度の異なる抗ＥＧＦＲ抗体と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、暗所、４℃で、Ｃｙ３をコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。細胞を再度洗浄し、フローサイトメーターであるＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により解析した。生細胞を、それらの散乱特性に基づいてゲーティングし、ＦＡＣＳＤｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて陽性細胞の百分率を計算した。
【０２１０】
本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂと、マウスＳＰ０／２細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂとは、図１において示す通りに調べた全ての腫瘍細胞系において、同等の結合特徴を示す。
【０２１１】
スキャッチャード解析
２つの因子：腫瘍細胞における抗体のアフィニティーおよび結合部位数が、抗体の治療的適切性に特に重要である。
【０２１２】
受容体−リガンド間結合のアフィニティーは、それらの相互作用の強度について記載する。抗原−抗体間相互作用の場合、相互作用は、フリーの抗体／抗原と、形成される抗体−抗原複合体との化学平衡により定義される。この平衡はまた、会合速度と解離速度との比率でもあり、例えば、水素結合力、静電相互作用力、疎水性相互作用力、およびファンデルワールス力などの異なるパラメータにより影響される。スキャッチャード解析は、リガンド−受容体間結合のアフィニティー定数を計算するのに一般的に用いられる。スキャッチャードの式は、
【０２１３】
【数１】
2013535970.tif 000009
【０２１４】
［式中、ｒは、結合可能な結合部位の全体に対する結合したリガンドの濃度比であり、ｃは、フリーのリガンドの濃度であり、ｎは、タンパク質分子１つ当たりの結合部位数である］により与えられる。
【０２１５】
一価の相互作用を仮定して、ｒ／ｃをｒと対比させるこのデータをプロットすると、傾きを−Ｋａとし、Ｙ切片をｎＫａとする、直線のスキャッチャードプロットが得られる。細胞結合研究（この場合、細胞とは、抗原を指す）の場合、細胞１個当たりの結合抗体数は、Ｘ切片から計算することができる。
【０２１６】
細胞結合研究では、本発明によりグリコシル化された抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ、およびマウスＳＰ２／０において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂの、腫瘍細胞系に対する結合を、放射性標識した抗体を用いて評価した。抗体を、ｐ−ＳＣＮ−ベンジル−ＤＴＰＡによりキレート化し、担体を含まない１１１Ｉｎで放射性標識した。解離定数および抗体結合部位は、スキャッチャードプロット解析により推定した。
【０２１７】
結合実験は、同等の条件下にある両方の抗体により実施した。ヒト腫瘍細胞系であるＡ４３１細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、およびＤＵ１４５細胞を用いて、両方の抗体の結合特性を探索し、比較した。実験では、細胞のアリコート（バイアル１つ当たりに同等数の細胞）を、量を増大させた、１１１Ｉｎで放射性標識した異なる抗体調製物と共にインキュベートして平衡化させ、その後、結合しなかった抗体から分離させた。細胞に結合した抗体の量は、放射性の測定により決定し、上記の通りにデータを評価した。
【０２１８】
スキャッチャードプロット解析による結果として、同等のアフィニティーおよび結合部位数が推定された。表６に細胞結合実験の結果をまとめる。
【０２１９】
【表６】
2013535970.tif 000010
【０２２０】
値（ＬＳ１７４Ｔ、ＤＵ１４５の）は、少なくとも２つの個別の実験セットの平均を表す。細胞１個当たりの結合部位数とは、細胞１個当たりの結合抗体分子数を指すものであり、細胞表面における受容体の結合位置の数を指すものではない。
【０２２１】
結果は、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））、およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）の、腫瘍細胞に対するアフィニティーおよび結合部位数が同等であることを示す。
【０２２２】
抗ＭＵＣ１抗体であるＰａｎｋｏｍａｂについても、同様のスキャッチャード解析を実施した。各々をプロテインＡによるクロマトグラフィーを介して精製した、ＣＨＯ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂ、およびＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂについて、類似の実験を実施した。ヒト腫瘍細胞系であるＺＲ−７５−１を用いて、異なる細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂ抗体（全て、特異性が同じであるＩｇＧ１抗体）の結合特性を探索し、比較した。
【０２２３】
実験では、細胞のアリコート（バイアル１つ当たりに同等数の細胞）を、量を増大させた異なる抗体調製物（１１１Ｉｎで放射性標識したＰａｎｋｏｍａｂを定量に用いた）と共にインキュベートして平衡化させ、その後、結合しなかった抗体から分離させた。細胞に結合した抗体の量は、放射能の測定により決定し、上記の通りにデータを評価した。表７に結果をまとめる。結果として、グリコシル化の異なるＰａｎｋｏｍａｂ変化形について、同等の結合が測定された。
【０２２４】
【表７】
2013535970.tif 000011
【０２２５】
まとめ
結論として述べると、上記の実験は、本発明による抗体のグリコシル化パターンの改善、特に、抗体のＦａｂ部分におけるシアリル化度の増大が、その抗原結合特性に負の影響を及ぼさないことを裏付ける。
【０２２６】
（実施例３）
グリコシル化の異なる抗体の循環半減期
グリコシル化の異なる抗体の循環半減期を調べるため、薬物動態アッセイを実施した。
【０２２７】
このアッセイでは、プロテインＡで精製した抗ＴＡ−Ｍｕｃ１抗体であるＰａｎｋｏｍａｂ  １５μｇをラットに注射し、特定の時点においてラットの血清中の抗体量を決定した。ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂを、ヒト不死化血液細胞系であるＮＭ−Ｆ９（例えば、ＷＯ２００５／０１７１３０Ａにおいて開示されているＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６：Ｆｕｃ＋、シアル酸−）において発現させたＰａｎｋｏｍａｂと比較した。図２に結果を示す。
【０２２８】
見ることができる通り、Ｆａｂ部分におけるシアリル化度が高い抗体（ＧＴ−５ｓ細胞による）は、シアリル化度が低い抗体（ＮＭ−Ｆ９細胞による）より、循環半減期がはるかに長い。
【０２２９】
さらなる薬物動態アッセイでは、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させた抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ、およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂを、インビボのカニクイザルアッセイにおいて調べた。図３に結果を示す。ここでもまた、Ｆａｂ部分におけるシアリル化度が高い抗体（ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系による）は、シアリル化度が低い抗体（ＳＰ２／０細胞による）より、循環半減期がはるかに長いことが裏付けられる。
【０２３０】
【表８】
2013535970.tif 000012
【０２３１】
したがって、Ｆａｂ部分のグリコシル化部位におけるシアル酸量を増大させることにより、循環半減期は大幅に延長された。
【０２３２】
第３の薬物動態アッセイでは、Ｆａｂ部分にグリコシル化部位を有し、Ｆｃ部分にもグリコシル化部位を有するヒト／マウスキメラＩｇＧ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂの循環半減期を、Ｆａｂ部分におけるグリコシル化部位が除去され、Ｆｃ部分におけるグリコシル化部位だけを含む、この抗体のヒト化形の循環半減期と比較する。いずれの抗体も、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞系において発現させた。
【０２３３】
マウス１匹当たり１０μｇずつの抗体をマウスに注射し、表示時間後において回収された抗体の相対量を検出した。試験は、３連で行った。図４に結果を示す。Ｆａｂ部分のグリコシル化部位を有さないヒト化抗体が、そのＦａｂ部分のグリコシル化部位に付いているシアリル化度の高い糖を含むキメラ抗体と比較して、循環半減期が同一であることが裏付けられる。これはまた、本明細書で教示される通り、Ｆａｂ部分のグリコシル化部位を除去すると、結果として半減期が延長されることも裏付ける。
【０２３４】
結論として述べると、上記の実験は、シアル酸含量が少ないＦａｂ部分のグリコシル化部位を有する抗体の循環半減期を、Ｆａｂ部分に付いている糖中のシアル酸量を増大させることにより延長することもでき、Ｆａｂ部分に存在するグリコシル化部位を除去することにより延長することもできることを示す。
【０２３５】
（実施例４）
グリコシル化が異なる抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦ受容体の阻害
天然リガンド（例えば、ＥＧＦまたはＴＮＦアルファ）によりＥＧＦＲを活性化すると、受容体の二量体化、細胞内キナーゼドメインの刺激およびリン酸化がもたらされる。核内で誘導されるシグナル伝達カスケードは、これにより細胞増殖を活性化させる。抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂの１つの作用機構は、ＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインのＥＧＦにより誘導されるリン酸化の防止であり、これにより、核におけるシグナル伝達が途絶する。これらは、結果として、ＥＧＦＲ陽性細胞系がＥＧＦにより誘導されて増殖することを阻害する。
【０２３６】
ＥＧＦＲリン酸化の阻害
グリコシル化の異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂ抗体の、ＥＧＦＲリン酸化に対する効果を解析するために、ＥＧＦＲリン酸化アッセイを実施した。略述すると、Ａ４３１細胞（外陰のヒト類表皮がん細胞系）またはＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒト結腸上皮がん細胞）を、２４時間にわたる血清枯渇によりＥＧＦ飢餓させた。細胞を、異なる濃度の異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）と共に、４時間にわたりインキュベートし、０．１μｇ／ｍｌのＥＧＦにより１５分間にわたり刺激した。細胞の溶解物を調製し、全ＥＧＦＲおよびリン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）の含量を、同じウェル内でＥＧＦＲとリン酸化されたＥＧＦＲとを同時に検出しうる市販のｐ−ＥＧＦＲ／全ＥＧＦＲキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）を製造元のプロトコールに従って用いて決定した。ｐ−ＥＧＦＲ／全ＥＧＦＲキットでは、プレートを、ウェルの１つのスポットでは、リン酸化ＥＧＦＲに特異的な抗体（Ｔｙｒ１１７３）であらかじめコーティングし、同じウェルの別のスポットでは、リン酸化ＥＧＦＲおよび非リン酸化ＥＧＦＲ（全ＥＧＦＲ）を認識する抗体であらかじめコーティングする。ブロッキングおよび洗浄の後、プレートを、溶解物と共にインキュベートし、プレートを洗浄し、結合したＥＧＦＲを、Ｓｕｌｆｏタグで標識した二次抗体により検出した。ＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ６０００（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）により、各スポットについて、電気化学発光を個別に測定した。ｐＥＧＦＲスポットにおけるシグナルの百分率を、全ＥＧＦＲスポット（同じウェルの）におけるシグナルと比較して計算した。
【０２３７】
図５Ａは、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）の非存在下および存在下における、ＥＧＦＲ陽性細胞系であるＡ４３１細胞のＥＧＦによる刺激後におけるＥＧＦＲリン酸化を測定するアッセイの結果を示す。リン酸化ＥＧＦＲの百分率の濃度依存的な低下が決定された。１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのＣｅｔｕｘｉｍａｂでは、見出されたリン酸化ＥＧＦＲの量が、抗体とのインキュベーションを伴わずに見出されたリン酸化ＥＧＦＲの量の３分の１に過ぎなかった。ＥＧＦＲリン酸化の低減は、いずれのＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形についても同等であった。ＥＧＦＲ陽性細胞系であるＬＳ１７４Ｔを用いても、同様の結果が得られた。結果として、本発明によりグリコシル化パターンが改善されたＣｅｔｕｉｍａｂは、用いられた条件下において、市販のＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）と同じレベルで、細胞内のキナーゼドメインのＥＧＦＲリン酸化を阻害する。
【０２３８】
増殖の阻害
ＥＧＦ受容体の細胞外ドメインにＣｅｔｕｘｉｍａｂが結合すると、結果として、リガンド結合が阻害され、これにより、腫瘍細胞のＥＧＦ依存的な増殖が低減される。グリコシル化の異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形についてこの作用機構を解析するため、Ａ４３１細胞（外陰のヒト類表皮がん細胞系）の増殖を、異なる濃度（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）の、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ、およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｍｅｒｃｋ））によるＭＴＴアッセイにおいて測定した。ＭＴＴアッセイとは、生細胞のミトコンドリアにおけるデヒドロゲナーゼによる、可溶性で黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、チアゾリルブルー）の切断に基づく非放射性アッセイである。これは、紫色のホルマザンの形成を結果としてもたらし、これは、５７０ｎｍにおけるＥＬＩＳＡリーダーにより測定することができる。吸収シグナルは、培養物中の生細胞についての直接的な測定である。
【０２３９】
陽性対照としてはタキソールを添加することにより増殖を完全に阻害し、陰性対照としてはｈＩｇＧまたは培地単独を用いた。略述すると、Ａ４３１細胞を、９６ウェルの平底プレートにおいて４日間にわたり増殖させた。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ変化形および対照物質を添加し、プレートを、加湿したＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、さらに３〜５日間にわたりインキュベートした。上清を完全に除去し、ＭＴＴを添加した。細胞を、ＭＴＴと共に、加湿したＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２時間にわたりインキュベートした。上清を除去し、溶解緩衝液を含有するＨＣｌおよび２−プロパノールを用いて、暗所において、室温で１時間にわたり細胞を溶解させた。プレートリーダーであるＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ）により、５７０ｎｍ／６３０ｎｍにおける吸収を測定した。
【０２４０】
図５Ｂは、同じ実験内の異なるプレートにおける、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））、およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）により実施した実験の結果を示す。各プレートに対照を添加し、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）については暗色で示し、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０については明色で示す。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂとのインキュベーション後、培地対照（緑色で示される）およびｈＩｇＧ１対照（グレーで示される）と比較して少ない生細胞が観察された。培地対照とｈＩｇＧ１対照とは、同じ増殖を示した。陽性対照であるタキソールは、結果として、最大の増殖阻害をもたらした。本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ、およびマウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂは、Ａ４３１細胞において、濃度依存的な増殖の阻害を誘導した。増殖の阻害は、いずれのＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形においても同等であった。
【０２４１】
結論として述べると、本発明による抗体のグリコシル化パターンの改善は、抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂの受容体阻害活性に負の影響を及ぼさない。
【０２４２】
（実施例５）
グリコシル化の異なる抗体によるアポトーシスおよび標的細胞溶解の誘導
アポトーシスの誘導
アポトーシスの誘導は、抗体が、抗腫瘍活性を媒介しうるさらなる機構である。単量体抗体によるアポトーシスの直接的な誘導がしばしば無効であるのに対し、抗ヒト免疫グロブリンまたはプロテインＧによる抗体の架橋形成は、この作用機構を喚起する。インビボでは、抗体の架橋形成が、Ｆｃ受容体保有細胞により誘導されうる。
【０２４３】
この潜在的な作用方式を研究するため、本発明者らは、腫瘍細胞系であるＬＳ１７４ＴおよびＡ４３１におけるプロテインＧによる架橋形成後における、グリコシル化の異なるＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形によるアポトーシスの誘導を解析した。アポトーシスの誘導についてのマーカーとして、本発明者らは、ＢＤ  ＰＥ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、カスパーゼ３の活性化について解析した。システインプロテアーゼであるカスパーゼ３は、アポトーシスの初期段階で活性化される重要なプロテアーゼである。カスパーゼ３は、アポトーシスを受けつつある細胞においてプロセシングされる、３２ｋＤａの不活性のプロ酵素として合成される。プロセシングされた形態は、会合して活性カスパーゼを形成する２つのサブユニット（１７ｋＤａのサブユニットおよび１２ｋＤａのサブユニット）からなる。活性のカスパーゼ３は、細胞質および核内の他のカスパーゼならびに標的をタンパク質分解的に切断および活性化し、これにより、アポトーシスを促進する。ＢＤ  ＰＥ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、カスパーゼ３の不活性のプロ酵素形態を認識しない、カスパーゼ３の活性形態に特異的な抗体を用いて、アポトーシス細胞を染色する。
【０２４４】
略述すると、腫瘍細胞系を、無血清（Ａ４３１細胞）培地または血清低減（１％、ＬＳ１７４Ｔ細胞）培地中で、アッセイ前の２４時間にわたり培養した。細胞を４８ウェルプレートへと播種し、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。異なる濃度のＣｅｔｕｘｉｍａｂ変化形または陰性対照としてのｈＩｇＧ１および最終濃度を２μｇ／ｍｌとするプロテインＧを添加した。ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で４〜４８時間にわたり、プレートをインキュベートした。細胞を採取し、透過処理し、固定し、製造元のプロトコールに従い、活性カスパーゼ３について染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターによるフローサイトメトリーを介して、活性カスパーゼ３陽性（アポトーシス性）細胞を解析した。
【０２４５】
プロテインＧによる架橋形成後、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ変化形は、Ａ４３１細胞およびＬＳ１７４Ｔ細胞において、濃度依存的なアポトーシスを強力に誘導した。例として述べると、図６は、Ａ４３１細胞を用いる活性カスパーゼ３アポトーシスの結果を示す。アポトーシスの誘導は、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））と、マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）との間で同等であった。
【０２４６】
ＡＤＣＣアッセイ
抗体の異なるグリコシル化パターンのＡＤＣＣに対する影響を決定するため、ユーロピウム放出アッセイを実施した。
【０２４７】
第１のアッセイでは、異なる細胞系により発現させた、抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂを用いて、標的細胞の異なる溶解を調べた。特に、マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が低度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が高度である）、齧歯動物ＣＨＯ細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が低度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が高度である）、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が高度である）、およびＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が低度である）を用いるヒトＰＢＭＣによるＬＳ１７４Ｔ細胞の溶解を調べた。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は５０：１とし、インキュベーション時間は４時間とした。図７に結果を示す。
【０２４８】
このアッセイにより裏付けられる通り、抗体のＦａｂ部分におけるシアル酸量は、そのＡＤＣＣ活性に影響を及ぼさない。しかし、Ｆｃ部分におけるフコシル化度を低くすると、ＡＤＣＣ活性が増大する。
【０２４９】
第２のアッセイでは、マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が低度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が高度である）またはＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が低度である）を用いる、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆについてホモ接合性である（Ｆ／Ｆ）か、もしくはＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖについてホモ接合性である（Ｖ／Ｖ）か、またはＦｃγＲＩＩＩａについてヘテロ接合性である（Ｆ／Ｖ）異なるドナーから得られた初代ヒトＰＢＭＣによるＬＳ１７４Ｔ細胞の溶解を決定した。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は８０：１とし、インキュベーション時間は５時間とした。図８〜１０に結果を示す。
【０２５０】
同じ日において、異なるドナーのＰＢＭＣにより実施されたさらなる実験（図１１）では、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））が、全ての異なるドナー型について同様のＡＤＣＣ活性を示すことが裏付けられる。これとは対照的に、マウスＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）を介する特異的な溶解は、ＶＶドナーにおいて、ＦＦドナーと比較して顕著な細胞傷害作用の増大を示した。
【０２５１】
見ることができる通り、Ｆｃ部分におけるフコシル化度が低く、Ｆａｂ部分におけるシアリル化度が高い抗体（Ｆｕｃ−細胞による）は、Ｆｃ部分におけるフコシル化度が高く、全てのドナーに対してＦａｂ部分におけるシアリル化度が低い抗体（ＳＰ２／０細胞による）よりはるかに大きなＡＤＣＣ活性を示す。さらに、低フコース／高シアル酸抗体のＡＤＣＣ活性はまた、異なるドナーの各々についても同等であるのに対し、高フコース／低シアル酸抗体は、Ｖ／Ｖドナーに対して大きなＡＤＣＣ活性を示す。
【０２５２】
第３のアッセイでは、抗ＭＵＣ−１抗体であるＰａｎｋｏｍａｂのシアリル化度が高いことの、そのＡＤＣＣ活性に対する影響を解析した。抗体依存性細胞傷害作用についての比較アッセイでは、ヒト骨髄細胞系において生成した、Ｐａｎｋｏｍａｂのシアリル化を本質的に欠くグリコシル化の効果、およびＧＴ−５ｓ細胞において生成したＰａｎｋｏｍａｂ（シアリル化が高度である）のグリコシル化の効果、ならびにＣＨＯ細胞において生成されたＰａｎｋｏｍａｂのグリコシル化の効果を解析した。全ての物質は、プロテインＡカラム上のクロマトグラフィーにより精製した。
【０２５３】
非シアリル化細胞および高シアリル化細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂが、ＺＲ−７５−１腫瘍細胞に対して同等の特異的溶解を示すのに対し、ＣＨＯ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂは、大幅に低度の溶解を示す。シアリル化が低度なＰａｎｋｏｍａｂのＡＤＣＣ活性と、シアリル化が高度なＰａｎｋｏｍａｂのＡＤＣＣ活性とは、同等である（図１２を参照されたい）。
【０２５４】
したがって、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂの完全なヒトグリコシル化は、ＣＨＯ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂの約５倍のＡＤＣＣ活性を伴う抗体の生成を結果としてもたらす。
【０２５５】
さらに、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させた抗ＴＡ−Ｍｕｃ１抗体であるＰａｎｋｏｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が高度である）またはＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が低度である）を用いる、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆについてホモ接合性である（Ｆ／Ｆ）ドナーから得られた初代ヒトＰＢＭＣによるＺＲ−７５−１細胞の溶解を決定した。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は１００：１とし、インキュベーション時間は６時間とした。図１３に結果を示す。
【０２５６】
見ることができる通り、Ｆｃ部分におけるフコシル化度が高く、Ｆａｂ部分におけるシアリル化度が高い抗体（ＧＴ−５ｓ細胞による）は、妥当な程度に大きなＡＤＣＣ活性を示す。しかし、Ｆｃ部分におけるフコース含量が少ない抗体（Ｆｕｃ−細胞による）では、ＡＤＣＣ活性がなお増大する。
【０２５７】
このＡＤＣＣ活性の増大を、本発明の教示による半減期の改善と組み合わせることにより、臨床プロファイルが改善された抗体が提供される。
【０２５８】
（実施例６）
構成的に活性なＫ−Ｒａｓ変異を有する標的細胞の、本発明による抗ＥＧＦＲ抗体による溶解
本発明によりグリコシル化パターンを最適化した抗ＥＧＦＲ抗体が、ＡＤＣＣを介して、構成的に活性なＫ−Ｒａｓ変異を有する標的細胞の溶解を誘導する能力を裏付けるため、ユーロピウム放出アッセイを実施した。
【０２５９】
このアッセイでは、ヒト肺がん上皮細胞系であるＡ５４９細胞を標的細胞として用いた。これらの細胞におけるＫ−Ｒａｓ遺伝子は、Ｇｌｙ−１２−Ｓｅｒ変異を有する構成的に活性なＫ−Ｒａｓタンパク質をもたらす、コドン１２における変異を含む。エフェクター細胞としては、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆについてホモ接合性である（Ｆ／Ｆ）か、またはＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖについてホモ接合性である（Ｖ／Ｖ）異なるドナーから得られた初代ヒトＰＢＭＣを用いた。ＡＤＣＣを介する標的細胞の溶解は、本発明によりグリコシル化された抗ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が低度である）により誘導した。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は８０：１とし、インキュベーション時間は５時間とした。図１４に結果を示す。
【０２６０】
このアッセイにより裏付けられる通り、グリコシル化パターンが改善された、特に、Ｆａｂ部分におけるシアリル化が高度であり、Ｆｃ部分におけるフコシル化が低度である、本発明による抗ＥＧＦＲ抗体は、構成的に活性なＥＧＦＲシグナル伝達経路を含む、すなわち、ＥＧＦＲのリガンド結合を遮断することによっては処置することができない標的がん細胞に対してもなお、ＡＤＣＣを介する標的細胞の溶解を誘導することが可能である。
【０２６１】
（実施例７）
グリコシル化の異なる抗体変異体の循環半減期
ＩｇＧ抗体のシアリル化に対する半減期の依存性を調べるため、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを、ＧＴ−５ｓ細胞に由来するＦｕｃ−細胞において発現させ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））、電荷の異なるアイソタイプに由来する調製物を生成した。マウスにおける薬物動態研究を実施した。
【０２６２】
プロテインＡで精製したＩｇＧ抗体を、陰イオン交換装置により等電点電気泳動（ＣＦ）処理し、それらのｐＩの差違に従って分離し、画分化し、プーリングした。異なるｐＨ値で溶出するこれらの調製物の糖鎖プロファイリングは、異なるグリコシル化パターンを示した。加えて、実施例１で記載したＦａｂ／Ｆｃ特異的な糖鎖プロファイリングを記録したところ、抗体のＦｃ部分にはジシアリル化されたグリカンが基本的に存在しないので、シアリル化が高度なグリカンを濃縮するには、主にＦａｂのグリコシル化だけが関与性であることが示される（図１５Ａを参照されたい）。しかし、Ｓ＞０の増大はまた、負に帯電したプールのＦｃグリカンにおいても達成された。
【０２６３】
薬物動態アッセイでは、２つの異なる試料：（Ａ）プール１とプール２との混合物（ＣＦが高値〜中程度値のｐＨ範囲にある）と、（Ｂ）プール３（ＣＦが低値のｐＨ範囲にある）とを比較した。マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体を注射し、特定の時点で血清試料を採取した。試料を、それらの抗体含量について、ｈＩｇＧ力価についてのＥＬＩＳＡにより解析および評価した。この研究では、全シアリル化度を２８％とする調製物（Ａ）と、４９％とする調製物（Ｂ）とを比較した（図１５Ｂを参照されたい）。
【０２６４】
図１６が示す通り、調製物Ａの循環半減期（Ｔ１／２＝１６１．９時間）は、シアリル化が高度な調製物Ｂの循環半減期（Ｔ１／２＝１９９．５時間）より著明に短い。Ｆａｂ部分におけるシアリル化が低度である調製物、とりわけ、Ｆａｂ部分におけるＳ２が少ない調製物は、血清から迅速にクリアランスされた。
【０２６５】
（実施例８）
グリコシル化の異なる抗体の抗腫瘍活性
Ａ４３１細胞による異種移植モデルにおける抗ＥＧＦＲ抗体
グリコシル化の異なる抗体を比較するために、Ａ４３１外陰類表皮がん細胞を用いて、マウス異種移植モデルを準備した。この細胞系は、ＥＧＦＲタンパク質を高度に発現する。
【０２６６】
本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））およびＳＰ２／０細胞において発現させたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０）を、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（１群当たりＮ＝８（雌））の投与レベルで、毎週２回ずつ３週間にわたり静脈内投与した。適用体積は、いずれの抗体処方物についても、体重１ｇ当たり１０μｌとした。注射溶液における濃度の調整は、ＰＢＳによる希釈を介して行った。
【０２６７】
処置された動物の平均相対腫瘍体積を図１７に示す。いずれの抗体も、ＰＢＳで処置された動物と比較して、腫瘍の成長を用量依存的に阻害する（ｐ＜０．００１）。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０で処置された群の結果は、公表されたデータ（Ｆｉｃｈｔｎｅｒら、２００８年、Ｓｔｅｉｎｅｒら、２００７年、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９５年）と一致する。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）で処置された群における相対腫瘍体積と、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０で処置された群における相対腫瘍体積との間では、いずれの投与群においても有意差が見出されなかった。マウスでは、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）のＡＤＣＣ活性の増大の利点が大きくないので、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）およびＣｅｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰ２／０で同等の有効性が予測される。
【０２６８】
全ての動物は、予定された研究が終了するまで生存した。動物の体重には著明な変化が観察されなかったことから、処置された動物では大きな毒性が発生しなかったことが示される。
【０２６９】
ＤＵ１４５細胞による異種移植モデルにおける抗ＥＧＦＲ抗体
加えて、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）のインビボにおける有効性を、ＤＵ１４５ヒト前立腺がん異種移植細胞を保有する無胸腺ヌードマウスにおいて研究した。ＤＵ１４５細胞系は、ＥＧＦＲ陽性であり、ＤＵ１４５細胞による異種移植モデルは、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）による処置に対して感受性であることが報告されている。
【０２７０】
予備研究により、毎週２回５０ｍｇ／ｋｇずつのＣｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）を３週間にわたり投与した結果、対照群と比較して強力な抗腫瘍効果がもたらされたことが示されている。その後、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある５つの異なる用量レベルを包含する体積範囲発見研究を実施した。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）（１群当たりＮ＝７〜８（雄））を、毎週２回ずつ４週間にわたり静脈内投与した。注射溶液中の濃度の調整は、処方物緩衝液による希釈を介して行った。適用体積は、体重１ｇ当たり１０μｌで一定に保った。処置された動物で研究期間中に死亡した動物は見られなかった。動物の体重には著明な変化が観察されなかったことから、大きな毒性が発生しなかったことが示される。
【０２７１】
動物の平均相対腫瘍体積を図１８に示す。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）は、媒体で処置された動物と比較して、ＤＵ１４５細胞における腫瘍の成長を強力かつ用量依存的に阻害した（ｐ＜０．００１）。０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルが、腫瘍成長の阻害に有効であることが示された。高用量は、低用量と比較して、より迅速でより顕著な効果を結果としてもたらした。
【０２７２】
ＺＲ−７５−１細胞による異種移植モデルにおける抗ＭＵＣ１抗体
さらなる研究では、異なる細胞系における発現により得られる、シアリル化度の異なるＰａｎｋｏｍａｂの抗腫瘍有効性について探索した。両方の抗体の治療的可能性を、ＺＲ−７５−１細胞による異種移植ヌードマウスにおいて探索した。ＺＲ−７５−１腫瘍細胞を皮下注射し、約０．１ｃｍ３の平均サイズまで成長させた。ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたシアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂ（Ｐａｎｋｏｍａｂ  シアリル化＋）、またはシアリル化欠損ヒト骨髄腫瘍細胞系において発現させた非シアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂ（Ｐａｎｋｏｍａｂ  シアリル化−）を、毎週２回ずつ４週間にわたりマウス８匹の群に静脈内投与した。各マウスに０．５ｍｇ／ｋｇずつの用量を適用し、ＰＢＳを対照として用いた。体重および腫瘍成長をモニタリングした。結果として、０．５ｍｇ／ｋｇという低用量のシアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂが、腫瘍成長を阻害するのに高度に有効であるのに対し、非シアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂは有意に有効ではなかった。図１９は、相対腫瘍体積に基づく結果を示す。全ての結果は、平均±平均の標準誤差として表した。処置期間および抗体濃度の影響を調べるために、相対腫瘍体積についての二元配置ＡＮＯＶＡを実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ５．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）。ｐ値を０．０５とするボンフェローニによる事後検定を用いて、群の対間における差違の統計学的有意性を評価した。
【０２７３】
まとめると、低用量の、ＧＴ−５ｓ細胞において発現させたシアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、ＺＲ−７５−１細胞による異種移植ヌードマウスにおいて有効な腫瘍成長の阻害をもたらした（ｐ＜０．００１）。非シアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂと比較したシアリル化Ｐａｎｋｏｍａｂの高度な有効性は、循環からのシアリル化抗体のクリアランスが緩徐であること、したがって、バイオアベイラビリティーが長期にわたることによりもたらされると考えられる。
【０２７４】
（実施例９）
異なる患者に由来する腫瘍に対する抗腫瘍活性
この研究では、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））のインビボにおける有効性を、ヒト患者のＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）およびＣＲＣ（結腸直腸がん）に由来する異種移植がん細胞を保有する免疫不全マウスにおいて評価した。患者に由来する腫瘍細胞の異種移植モデルは、腫瘍細胞系より元の組織への類似性がなおより大きく、したがって、臨床的関与性が大きいと考えられる。腫瘍モデルは、免疫組織化学により評価された、それらの陽性のＥＧＦＲ発現状態によるほか、それらのＫ−Ｒａｓ遺伝子の変異状態によっても選択した。ＮＳＣＬＣ  ＃７４６６モデルおよびＣＲＣ  ＃８３９７モデルのいずれも、高度なＥＧＦＲ発現を示すが、ＮＳＣＬＣ  ＃７４６６モデルが、野生型のＫ−Ｒａｓ遺伝子を含むのに対し、ＣＲＣ  ＃８３９７モデルは、発がん性で常に活性な、Ｋ−Ｒａｓ遺伝子のＧ１２Ｄ変異体を保有する。
【０２７５】
Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）（１群当たりＮ＝８（雄））を、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの投与レベルで、毎週２回ずつ３週間にわたり静脈内投与した。注射溶液中の濃度の調整は、処方物緩衝液による希釈を介して行った。適用体積は、体重１ｇ当たり１０μｌで一定に保った。動物の平均相対腫瘍体積を図２０に示す。示される通り、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）は、ヒト患者に由来する腫瘍の成長を、それらのＫ−Ｒａｓ遺伝子の変異状態に依存しないで有効に阻害する。
【０２７６】
Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明）により処置された群で研究終了前の早期に死亡した動物は見られなかった。動物の体重には著明な変化が観察されなかったことから、大きな毒性が発生しなかったことが示される。
【０２７７】
（実施例１０）
毒性学的研究
カニクイザルにおける４週間にわたる反復投与毒性研究およびカニクイザルにおける２週間にわたる用量範囲発見研究を実施した。これらの毒性研究に基づくと、本発明によりグリコシル化されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（発明））の安全性プロファイルにより、モノクローナル抗体による候補薬物の忍容性が十分であり、したがって、選択された患者集団の処置も安全であることの十分な重みのある証拠がもたらされる。ヒトにおける抗ＥＧＦＲ抗体の使用を押しとどめる、異常であるかまたは警告的な毒性の指標は観察されなかった。
【０２７８】
マウスの場合とは対照的に、カニクイザルは、インビトロおよびインビボにおいて、コア構造が脱フコシル化されたヒトＩｇＧ１によるＡＤＣＣ活性の増大を示し、これは、ヒト被験系におけるそれぞれのＡＤＣＣ活性の増大と同等であることが示された。したがって、市販のＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）と比較した、グリコールを最適化したＣｅｔｕｘｉｍａｂのＡＤＣＣ介在性傷害作用増大の理論的可能性があるとすれば、それがカニクイザルモデルで示されたと結論することができる。
【０２７９】
抗ＭＵＣ１抗体であるＰａｎｋｏｍａｂによるさらなる毒性研究を、ドイツ国内のガイドラインおよび国際的ガイドライン（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌａｗ  ２００２、ＯＥＣＤ  １９９７、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｒｌｉａｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ２００４）に従うＧＬＰ条件下で、Ａｕｒｉｇｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨにおいて、Ｗｉｓｔａｒラットにより実施した。この研究は、雌ラットに静脈内投与されたＧＴ−５ｓ細胞において発現させたＰａｎｋｏｍａｂについての用量範囲発見研究、ならびに１４日間にわたる回復期間を後続させる、雄ラットおよび雌ラットにおける４週間にわたる静脈内反復投与による毒性研究を包含した。用量範囲発見研究の結果、および２８日間にわたる反復投与毒性研究の生体における観察は、化合物に関連する作用を示さない。
【０２８０】
結果は、本発明による抗体、すなわち、本明細書で記載されるグリコシル化パターンの改善を示す抗体の毒性学的プロファイルが、毒性の増大を示さず、グリコシル化パターンを改善していない最新型の抗体と同等であることの十分な証拠をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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