(57)【要約】  本発明は、水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約１０００万細胞／ｍＬでありかつ細胞生存率が少なくとも約９０％である細胞懸濁液を作製するための方法を提供する。これらの方法は、孔径が０．１ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）を用いて水性培地の容量を減少させる工程を含み、その工程中、膜間差圧（ＴＭＰ）は約３ｐｓｉ未満で維持されかつ剪断速度は約４０００秒−１未満で維持される。本発明はまた、治療用組成物に用いる哺乳類細胞を大規模製造するための全プロセス、および容易に入手可能な使い捨て用品およびポンプを使用して、そのプロセスを実施するための規模拡張可能な完全使い捨てのシステムも提供する。【選択図】  図１
2013517771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約５００万細胞／ｍＬでありかつ細胞生存率が少なくとも約７０％である細胞懸濁液を作製するための方法であって、孔径が０．１ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）を用いて該培地の容量を減少させる工程を含み、該工程中、膜間差圧（ＴＭＰ）が約３ｐｓｉ未満で維持されかつ剪断速度が約４０００秒−１未満で維持される、上記方法。
【請求項２】
細胞生存率が少なくとも約８０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞生存率が少なくとも約９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
剪断速度が約３０００秒−１未満で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＭＰが約１ｐｓｉ未満で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＴＦＦの孔径が約０．６５ミクロンである、請求項１に記載の方法。。
【請求項７】
ＴＦＦが、少なくとも約０．５ｆｔ２の濾過表面積を有する中空糸フィルターである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルターを通る流束が少なくとも約５０Ｌ／ｍ２ｈである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記フィルターを通る流束が少なくとも約３００Ｌ／ｍ２ｈである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞懸濁液中の細胞の回収率が前記水性培地中の細胞の少なくとも約８０％であり、この際、該回収率が開始時細胞数と最終細胞数の割合として決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞懸濁液が約１０００万〜約７５００万生細胞／ｍＬの間で含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞懸濁液が約１０００万〜約２億の間で生細胞を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記懸濁液中の細胞の生存率が約９０％〜約１００％の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＦＦを用いて、前記細胞懸濁液の容量の少なくとも約４倍に等しい水性洗浄培地の容量で前記懸濁液の細胞を洗浄するダイアフィルトレーション工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞懸濁液中の望ましくない可溶性成分の残留レベルが前記水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約１０００倍低下する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記残留レベルが前記細胞懸濁液の約１ｐｐｍ未満に低下する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
センサーを用いて生細胞濃度を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
センサーを用いて総細胞生存率を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記センサーからシグナルを検出することをさらに含み、ＴＦＦ中のサンプリングが排除される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
処理段階を決定するために前記シグナルを処理することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記処理が、評価処理するためにフィードバックを提供することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記シグナルがアンプセンサーを通ってヒューマンマシンインターフェースに送られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記シグナルを可変細胞密度（ＶＣＤ）データに変換することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
最適の最終細胞密度および／または濃縮係数を決定するために前記ＶＣＤデータを解析することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
治療用組成物に用いる細胞を製造する方法であって、
大規模細胞培養を用いて細胞を増殖させる工程；
水性培地中の細胞を回収する工程、
該水性培地中の細胞の容量を減少させ、請求項１１に記載の方法においてＴＦＦを用いて該細胞を洗浄する工程、
得られた細胞懸濁液を凍結防止培地中で処方し、細胞生存率の長期維持に好適な条件下で該処方細胞を凍結し保存する工程を含み、
該凍結処方細胞が次のパラメーター：少なくとも約８０％の融解時細胞生存率；約５００万細胞／ｍＬより高い生細胞密度；および処方細胞中の望ましくない可溶性成分の残留レベルが約１ｐｐｍ未満のレベルに低下している、を示す、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法によって作製された、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、監督官庁の要件、例えば、装置、生物製剤および薬物の現行適正製造基準(current good manufacturing practice)（ｃＧＭＰ）規定などに従う体細胞療法用製品を製造するための方法および装置に関する。より特には、本発明は、タンジェンシャルフローフィルトレーション（「ＴＦＦ」）を用いて生存哺乳類細胞、特に治療製品に用いられる生存哺乳類細胞を無菌で濃縮し洗浄するためのプロセスおよび装置(apparati)に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＤＡは、細胞療法を、ex vivoで操作または改変された、自己細胞、同種異系細胞または異種細胞の投与によるヒトにおける疾患または損傷の予防、治療、治癒または緩和と定義する。細胞療法の目的は、再生医療の目的と重複し、損傷組織または器官を修復し、置換しまたは回復させることである。
【０００３】
ヒトドナーから得られた細胞のex vivo増殖は、例えば、自己細胞療法および同種細胞療法に利用可能な幹細胞および前駆細胞の数を増やすために用いられている。例えば、多能性間葉間質細胞（ＭＳＣ）は、免疫調節、造血および組織再生におけるそれらの可能性を調査するために、非常に多くの臨床試験において現在利用されている。ＭＳＣは低頻度であることから移植可能な数を達成するためには細胞増加を必要とする。
【０００４】
いずれの細胞療法における課題も安全かつ高品質の細胞生産を保証することである。特に、現行適正製造基準(current Good Manufacturing Practice)（ｃＧＭＰ）グレードの条件下での細胞処理は、そのような高度な細胞療法の進歩にとって必須である。同種療法では、ＧＭＰ適合に関するプロセスおよび製品の試験および認証の経済的な側面が、細胞製造、すなわち、最大バッチサイズおよび最小バッチ運転の強く有望な製造における重要なコスト要因である。
【０００５】
そのため、臨床規模拡大のための治療用細胞製造は、細胞収集から培養後処理まで完全に自動化された閉鎖系プロセスで行われることが最適であろう。そのような閉鎖系プロセスは、微生物汚染および機械的ストレスまたは生理的ストレスによる生存率低下の危険性を最小限に抑え、保存に好適でかつ臨床環境での使用に対応できる形での細胞療法用製品のｃＧＭＰに適合した製造を促進すると思われる。そのような閉鎖系プロセスについていくつかのシステムが自己細胞療法用製品の比較的小規模での製造のために開発されている（例えば、Hampson et al.による米国特許出願公開番号第２００８／０１７５８２５号を参照のこと）が、そのようなシステムは様々な理由で、例えば、同種異系製品で期待されるように、大量調製のために規模拡張することは容易ではない。
【０００６】
タンパク質、例えば、バイオセラピューティックなどを製造するための哺乳類細胞の使用に関する大規模自動化閉鎖系プロセスは、十分に確立されている。しかしながら、大部分そのようなプロセスは、タンパク質産物を回収し、細胞内産物の放出に至るまで細胞を破壊する場合には意図的に、または高速遠心分離などの苛酷な方法により分泌産物から細胞を分離する場合には付随的に、細胞死に至る条件下で細胞を廃棄するように設計される。対照的に、増殖後の治療用細胞の処理は、典型的に、細胞回収、容量減少、洗浄、処方、保存容器充填および、多くの場合には製品細胞の低温保存を必要とし、全て、細胞生存率、生物学的機能性、最終的には、臨床効力を維持する条件下で行われる。
【０００７】
加えて、治療用細胞は、タンパク質生産に用いられる細胞を取り扱うための公知プロセスでは生き残れないかもしれない。これは、後者の細胞が、典型的には、培養による大規模複製中に、例えば、細胞療法に用いられる前駆細胞または幹細胞によって示されるよりも機械的剪断力および生理的ストレスに対する低感受性で選択を受けたかもしれない高度に操作された細胞株であるためである。よって、効力を保持するために、治療用細胞は、典型的には、ヒト組織からの単離時に表示された最初の親表現型を維持するように最小限に培養される；それゆえ、治療用細胞は、一般的に、選択を受けずまたは下流の処理を容易にするように遺伝子操作を受けない。
【０００８】
細胞培養プロセスを規模拡張するために技術が開発されると、下流の処理に必要な技術はすぐに圧倒された。具体的に言えば、現行技術を用いた多量（例えば、１０〜１００リットル）の治療用細胞懸濁液の容量減少および洗浄は、時間がかかり、規模拡張できない。現行技術、例えば、開放遠心分離などは、数十〜数百個の特有の処理容器を使用して５〜２０名の高度な訓練を受けた技術者によって４〜８時間を要することがあり、そのため、操作が増え、汚染の危険性が高まる。細胞療法の分野の大部分では小規模血液処理装置を利用し、この小規模血液処理装置は１回の操作当たり約１０リットルより多くに規模拡張することができない。このように、処理時間および労力ならびに製造コストが治療用細胞の容量減少および洗浄において解決すべき主要な制約であり、プロセスおよび得られる細胞製品の重大な品質パラメーターを維持しながら、５〜１０リットルの範囲から数百リットルまで規模拡張することかできるプロセス装置にはさらなる利益がある。そのような重大な品質パラメーターとしては以下が挙げられる：治療処方物に十分な細胞懸濁密度（例えば、ほとんどの場合には１０００万細胞／ｍＬより高く、場合によっては少なくとも３０００万〜７０００万細胞）：機能性および安全性を維持するための最終細胞製品の高生存率（例えば、９０％より高い）：高価値細胞の損失を最小限に抑えるための細胞の高収率（例えば、開始時細胞の９０％より高い）；ならびに規制目的での回収試薬（例えば、トリプシンまたは他の酵素）および培地成分（例えば、血清成分、活性増殖因子など）の残留レベルの許容レベルへの低下。
【０００９】
よって、生細胞が高収率でかつ細胞の治療的使用に有害な培養成分または処理成分が低残留レベルでの、細胞懸濁液の効率的な容量減少および洗浄のためのプロセスを含む、細胞収集から培養後処理までの、治療用細胞を製造するための改良されたプロセス、特に、自動化された閉鎖系での製造を促進するそのようなプロセスが必要である。
【００１０】
１９９１年１０月１日にArathoon et al.に対して発行された「懸濁培養を用い培地から有害成分を除去して、組換えＣＨＯ細胞において生物活性プラスミノーゲン活性化因子を生産するためのプロセス(Process for Producing Biologically Active Plasminogen Activator in Recombinant CHO Cells Using Suspension Culture and Removing Detrimental Components from Medium)」に関する米国特許第５，０５３，３３４号（「‘３３４号特許」）には、懸濁培養による生物活性のあるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法が提供されることが開示されており、この方法では、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が培養され、クロスフローフィルトレーションによって回収および生物活性に有害な特定成分が無細胞濾液として除去される。‘３３４号特許には、開示プロセスがウシ胎児血清（２％ｖ／ｖ）を含む培地中、集団密度約１００万細胞／ｍＬのＣＨＯ細胞懸濁液を用いて例示されている。「実施例」参照。ＣＨＯ細胞は培地交換が行われた後に無血清生産培地中に約９０時間再懸濁された。培地交換は、０．１ミクロン孔および濾過面積４．１５ｆｔ２の中空糸タンジェンシャルフローフィルターを用いて行われ、１分間当たり約２１１ｍＬの速度で濾液が除去され、それによって培養容量がおよそ５．２リットルに減少された。この時点で新しい滅菌無血清培地が培養容器に１分間当たり約２１１ｍＬの速度で供給され、このようにして常に古い培地が希釈除去されながら保持液容量が維持された。独立した１０Ｌステンレス鋼発酵槽に入った新しい無血清培地にアリコートの細胞懸濁液が加えられたときに計算上約１９０，０００倍（または０．０００１容量％未満）の血清濃度の低下がもたらされるように、５５リットルの新しい無血清培地が前記システムを通じて供給された。１０Ｌの新鮮培地に加えるアリコートのサイズ（それゆえ、関連希釈係数）は開示されておらず；定量的細胞生存率は報告されていなかった。
【００１１】
１９９３年１０月２６日にvan Reisに対して発行された、「タンジェンシャルフローフィルトレーションプロセスおよび装置(Tangential Flow Filtration Process and Apparatus)」に関する米国特許第５，２５６，２９４号（「‘２９４号特許」）には、対象となる種を、それらを含有する混合物から分離するためのプロセスおよび装置(apparati)が開示されており、それはその混合物をタンジェンシャルフローフィルトレーションに付すことを含み、その際、濾過膜は、好ましくは、約１０ミクロンまでのサイズを有する種を保持する孔径を有し、流束は転移点での流束の約５％から１００％までに及ぶレベルで維持される。
【００１２】
Trinh, L. and Shiloach, J.、“Recovery of insect cells using hollow fiber microfiltration,” Biotechnol Bioeng. 48(4): 401-405 (1995)には、懸濁状態での真核細胞増殖のための培地分離および細胞収集のための方法が開示されている。その方法は、中空糸構成のオープンチャネル配置を用いるタンジェンシャルフローマイクロフィルトレーションに基づいている。要約書を参照のこと。ポリスルホン中空糸の最良の結果（最大処理流束）は、内径０．７５ｍｍ、０．４５ミクロン孔径の繊維および剪断速度１４０００ｓ−１の細胞懸濁液流量（繊維１本当たり０．０３２Ｌ／分）を用いて報告された。著者らは、流束５００Ｌ／ｍ２ｈは、表面積／細胞比を０．０５ｍ２／細胞１０Ｌ（濃度２．５×１０６細胞／ｍＬ）に維持することによって得ることができることを報告している。４０リットルの感染昆虫細胞は、細胞生存率に影響を及ぼすことなく２０分間以内に１０倍濃縮されることとなった。
【００１３】
２０００年５月２０日にCuster et al.に対して発行された、「細胞懸濁液からの薬剤の除去(Removal of Agent From Cell Suspension)」に関する米国特許第６，０６８，７７５号（「‘７７５号特許」）には、半透膜を用いた細胞懸濁液からの薬剤（例えば、ＤＭＳＯ）の除去方法が開示されている。その発明の１つの態様では、それらの細胞は、薬剤の除去後に体液をバイオプロセスで作るために用いられる。細胞懸濁液の容量減少については開示されていない。
【００１４】
２００３年８月１９日にSchickに対して発行された、「タンジェンシャルフローフィルトレーションにおける濾過収率を高めるための方法および装置(Method and Apparatus for Enhancing Filtration Yields in Tangential Flow Filtration)」に関する米国特許第６，６０７，６６９号（「‘６６９号特許」）には、収率を高めるとされている制御特性を強化した形で液体の濾過を進めるためのシステムが開示されている。要約書を参照のこと。そのシステムおよび方法は、実質的に一定の膜間差圧を維持するために使用され得る。所望される場合に、その一定の膜間差圧は、有益な成分の損傷または損失の危険性を最小限に抑えながら、特定の液体を濾過し、濃縮しまたは収集するための収率の増大にとりわけよく適している。加えて、一定の供給速度またはポンプ出力が維持され得る。‘６６９号特許には、その発明の１つの目的が、収集成分の収率を高める一定の圧力モードでの液体の強制濾過のための改良された装置および方法を提供することであることがさらに開示されている。
【００１５】
’６６９号特許のシステムの使用は、細胞外タンパク質（ＩｇＧ）を細胞懸濁液から分離するためのＴＦＦプロセスによって例示されている。実施例１を参照のこと。より特には、３００万細胞／ｍＬのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞懸濁液５００リットルが濃縮され、濾過ユニットは０．４５ミクロン孔および表面積０．６ｍ２の膜を備え、一定の膜間差圧（ＴＭＰ）５．０ｐｓｉが用いられた。無細胞培地は透過物として収集され、保持液に細胞懸濁液が含まれた。細胞懸濁液は濾過が進行するにつれて徐々に濃縮されるとされた。細胞懸濁液の容量は３．５時間の処理期間をかけて２．０リットルに至るまで、２５０倍減少され、３．５時間での平均システム流束（透過物体積流量）はＴＭＰ  ５ｐｓｉで２３７リットル／時間−ｍ２であった。６６９号特許には、「細胞懸濁液の濃縮は細胞生存率に影響を及ぼすことなく行われ、このことは次の処置における細胞利用の成功によって確認された」ことが報告されている。しかしながら、細胞の収率または生存率の定量化についてのデータは報告されていない。
【００１６】
ＴＦＦはまた、単球（例えば、米国特許出願公開番号第２００５／０１７３３１５号を参照のこと）または血液もしくは骨髄由来のＣＤ３４＋幹細胞（米国特許出願公開番号第２００５／０１８９２９７号）のサイズに基づく分離にも使用されている。これらのプロセスでは、大きな孔径（例えば、１〜１０ミクロンが特許請求されている）のＴＦＦ膜が使用され、その際、未処理材料（血液または骨髄）がそのフィルターに通され、対象となる細胞は保持液中で割合が増加される（骨髄から４．２％ＣＤ３４＋細胞は１８％に、血液では３２％単球は７１％に増加される）。これらの細胞に基づくプロセスではＴＦＦを用いて様々なサイズの細胞が分離されるが、細胞に基づく製品の重大な品質パラメーター、例えば、分離された細胞の生存率、最終細胞懸濁液の総生存率、またはこれらの分離された細胞の生物学的機能性などは開示されていない。さらに、最初の細胞の割合に関してこれらのプロセスの収率は論じられておらず、開示されているプロセスは小規模処理にのみ適用できるが、数十〜数百リットルの細胞懸濁液の処理は教示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許出願公開番号第２００８／０１７５８２５号
【特許文献２】米国特許第５，０５３，３３４号
【特許文献３】米国特許第５，２５６，２９４号
【特許文献４】米国特許第６，０６８，７７５号
【特許文献５】米国特許第６，６０７，６６９号
【特許文献６】米国特許出願公開番号第２００５／０１７３３１５号
【特許文献７】米国特許出願公開番号第２００５／０１８９２９７号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Trinh, L. and Shiloach, J.,“Recovery of insect cells using hollow fiber microfiltration,” Biotechnol Bioeng. 48(4): 401-405 (1995)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、タンジェンシャルフローフィルトレーション（「ＴＦＦ」、クロスフローフィルトレーション（「ＣＦＦ」）としても知られている）を用いて生存哺乳類細胞を無菌で濃縮し洗浄するためのプロセスおよび装置(apparati)を提供する。本発明は、治療製品に用いられる生存哺乳類細胞に、例えば、低温保存用または対象への投与用の処方のためのそのような細胞の懸濁液の容量減少および洗浄などに特に有用である。
【００２０】
特に、本発明は、開始時細胞の少なくとも９０％収率および最終細胞製品の少なくとも９０％生存率で少なくとも約５００万細胞／ｍＬの、医薬処方物に好適な細胞組成を作出するための、数十または数百リットルの回収された哺乳類細胞の容量減少および洗浄が見込まれるＴＦＦの高収率プロセスを提供する。このプロセスからの医薬組成物は、治療的使用に有害な成分（例えば、血清成分、トリプシンまたは他の酵素などの回収試薬）の残留レベルが開始時レベルと比べて少なくとも約１０００〜１００００倍低下しており、例えば、治療的使用に用いる特定の生物学的製剤では、血清についての要件どおりに１ｐｐｍより低い最終レベルへの低下が可能となる（連邦規則集第２１編第６１０．１５（ｂ）項）。このプロセスは、例えば、シングルユース用装置において剪断速度を最小にし、流束（容量／表面積×時間、例えば、Ｌ／ｍ２ｈまたは本明細書では「ＬＭＨ」）を最大にする工程、および処理時間を最小限に抑える工程を用いて実行に至った−これらは全てヒト投与に好適な高品質の細胞懸濁液に寄与している。そのプロセスは、フィルター孔径に依存し、フィルターの種類（中空糸対フラットシート）、フィルター材料およびバッファー処方とは比較的無関係である。他のプロセス変形も使用され、１〜３時間の処理時間内に５００万〜６０００万細胞／ｍＬの範囲に及ぶ細胞懸濁液を得るように最適化されている。操作変形は記載されており、操作変形では非常に速い処理時間（透過物流束最大化）および非常に高い細胞濃度（例えば、３０００万細胞／ｍＬより高い濃度）を得るために利用することができる。
【００２１】
よって、本発明の１つの態様は、水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約５００万細胞／ｍＬでありかつ細胞生存率が少なくとも約８０％である細胞懸濁液を作製するための方法を提供する。この方法は、孔径が０．１ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）を用いて該培地の容量を減少させる工程を含む。この工程中、望ましい膜透過流束を維持するために、膜間差圧（ＴＭＰ）はタンパク質溶液のＴＦＦ処理についての先行技術条件と比べて比較的低く維持される。例えば、ＴＭＰは約５ｐｓｉ未満で、好ましくは約３ｐｓｉ未満で、より好ましくは１ｐｓｉ未満で維持される。本発明のこの処理工程中、細胞生存率を維持するために、剪断速度もまた、タンパク質溶液についての先行技術条件と比べて比較的低く、例えば、約４０００秒−１未満で、好ましくは約３０００秒−１未満で、より好ましくは約２０００秒−１未満で維持される。
【００２２】
本発明のこの方法では、望ましい膜透過流束を得るために、ＴＦＦの孔径が少なくとも約０．１ミクロンであり、好ましくは０．１ミクロンより大きく、より好ましくは約０．６５ミクロンであることが一般的に有利である。この方法でのＴＦＦは、所望の処理容量に好適な任意の構成、例えば、当技術分野で一般的に公知の中空糸構成またはシート構成などのものであってよい。本発明により約１０Ｌ〜約１００Ｌの細胞を処理するために、ＴＦＦは、表面積が約０．５ｆｔ２の中空糸フィルターであることが好ましい。本発明によるＴＦＦ面積の１平方フィート当たりに処理される細胞の数は、少なくとも７．５億細胞ほど少ない場合も、少なくとも約１８０億細胞ほど多い場合もあるが、その際、細胞品質および膜透過流束などの所望の操作パラメーターは維持される。
【００２３】
驚くべきことに、本発明方法の比較的低い剪断(sheer)パラメーターおよびＴＭＰパラメーターによりフィルターの「目詰まり」にはならず、それよりも、非常に望ましい膜透過流束、例えば、少なくとも約５０Ｌ／ｍ２ｈ、好ましくは少なくとも約１００Ｌ／ｍ２ｈ、より好ましくは少なくとも約２００Ｌ／ｍ２ｈ、より好ましくは少なくとも約３００〜約６００Ｌ／ｍ２ｈなどをもたらす。そのような流束は、約１０Ｌ〜約１００Ｌの細胞バッチ容量、あるいは少なくとも約１０００Ｌまでのより大きなバッチでの処理時間を、従来の遠心分離法と比べて大幅に短縮し、それによって生存率を含む高い細胞品質を維持する。
【００２４】
さらに、本発明の上記ＴＦＦプロセスパラメーターは、驚くべきことに、得られる細胞懸濁液において優れた細胞回収率、例えば、水性培地中の開始時細胞の、少なくとも約８０％〜約８５％、好ましくは少なくとも約９０％〜約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％〜１００％を提供する。細胞の種類および用途に応じて、得られる細胞懸濁液は、少なくとも約５００万生細胞／ｍＬ、１０００万生細胞／ｍＬ、２５００万生細胞／ｍＬ、５０００万生細胞／ｍＬまたは少なくとも約７５００万生細胞／ｍＬを含有し得、場合によっては約１億細胞／ｍＬを超える密度も可能である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明方法は、ＴＦＦを用いて、得られた懸濁液中の細胞を、該細胞懸濁液の容量の少なくとも約２〜４倍、好ましくは少なくとも約４〜６倍、より好ましくは少なくとも約８〜１０倍に等しい水性洗浄培地の容量で洗浄するダイアフィルトレーション工程をさらに含む。本発明のダイアフィルトレーション工程は、前記細胞懸濁液中の望ましくない可溶性成分の残留レベルを、細胞を含有する最初の水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約３００倍、好ましくは約１０００倍、より好ましくは約３０００倍低下させ得る。実際には、例えば、この工程は、例えば、治療的使用に用いる特定の生物学的製剤では、要件どおりに、血清タンパク質（例えば、ＢＳＡまたはＨＳＡ）などの培養培地成分の残留レベル、または回収試薬、例えば、トリプシンなどの残留レベルを、最終細胞懸濁液の約１ｐｐｍ未満に低下させることができる（連邦規則集第２１編第６１０．１５（ｂ）項）。
【００２６】
もう１つの態様では、本発明は、治療用組成物に用いる哺乳類細胞を製造するための全プロセスを提供する。この方法は次の工程を含む：任意の公知の大規模細胞培養方法論、例えば、１０段もしくは４０段の容器（「セルファクトリー」）、または「波動」揺動バッグまたは攪拌槽型バイオリアクターを用いて細胞を増殖させる工程；水性培地中の細胞を回収する工程；および該水性培地中の細胞の容量を減少させ、フラットシートまたは中空糸のＴＦＦ構成で本発明のＴＦＦ方法を用いて該細胞を洗浄する工程。本発明のプロセスは、当技術分野で公知の低温保存技術（例えば、凍結防止剤としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を必要とする）を用いて、得られた細胞懸濁液を凍結防止培地中で処方し、細胞生存率の長期維持に好適な条件下で、該処方細胞を凍結し保存することをさらに含む。凍結防止処方物中の細胞は、そのような目的で知られている任意の従来容器、例えば、プラスチックバッグまたはガラスバイアルなどで凍結し保存し得、短期間の場合には少なくとも約−８０℃の温度で保存し得、または長期保存の場合には、液体窒素の気相もしくは液相中で保存し得る。
【００２７】
本発明のこの製造プロセスは、次のパラメーター：少なくとも約８０％；９０％または９５％の融解時細胞生存率；約１００万細胞／ｍＬ、３００万細胞／ｍＬまたは６００万細胞／ｍＬより高い生細胞濃度；および望ましくないタンパク質成分の残留レベルが最初の水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約１０００倍、約１ｐｐｍ未満のレベルに低下している、を示す凍結処方細胞を生産する。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、本発明の細胞処理方法における、例えば、中空糸フィルター（ＨＦＦ）を用いる、完全に閉鎖された完全使い捨ての規模拡張可能なタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）システムに関する。このＴＦＦシステムは、高い細胞生存率および機能性を維持しながら、大容量バッチを３時間未満で処理する（液体培地から細胞を分離し、清浄化し、回収し、収集する）ことができる。このシステムでは、ＨＦＦは、システム組立に３箇所の迅速接続と（バッチサイズに応じた）プラスチックチューブの無菌接合のみ必要であるように取り付けられている無菌クイックコネクターを有する。下記の図１は、チューブ、使い捨てのセンサー（図１のＰ１、Ｐ２およびＰ３）および処理貯槽（図１のバッグ番号１）ならびに使い捨てのフィルター（全て市販されている）を備えた、完全に閉鎖された完全使い捨ての、本発明の例示的なＴＦＦシステムを示している。本発明のＴＦＦシステムはまた、中空糸フィルターの代わりにフラットシートフィルターも使用し得る。そのようなシステムに好適な蠕動ポンプも市販されている。
【００２９】
いくつかの例示的な実施形態のこれらの態様および他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考えれば、よりよく認識され理解されるであろう。しかしながら、以下の説明は、好ましい実施形態およびそれらの非常に多くの具体的な詳細を示しながら、例示として記載しているが限定するものではないことは理解すべきである。実施形態の範囲内でその精神から逸脱することなく多くの変更および修飾を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、哺乳類細胞を濃縮し洗浄するために本発明の方法において用いられる例示的なタンジェンシャルフローフィルトレーションシステムの概略図を示している。
【図２】図２は、本発明のプロセスにおける細胞生存率および回収率に対する剪断速度の影響を例示している。
【図３Ａ】図３は、本発明のプロセスにおける細胞生存率および回収率に対する膜間差圧（ＴＭＰ）の影響を例示している。パネルＡ．生存率。パネルＢ．回収率。パネルＣ．複数回の実験についての細胞回収率および生存率に対するＴＭＰの傾向曲線。
【図３Ｂ】図３は、本発明のプロセスにおける細胞生存率および回収率に対する膜間差圧（ＴＭＰ）の影響を例示している。パネルＡ．生存率。パネルＢ．回収率。パネルＣ．複数回の実験についての細胞回収率および生存率に対するＴＭＰの傾向曲線。
【図３Ｃ】図３は、本発明のプロセスにおける細胞生存率および回収率に対する膜間差圧（ＴＭＰ）の影響を例示している。パネルＡ．生存率。パネルＢ．回収率。パネルＣ．複数回の実験についての細胞回収率および生存率に対するＴＭＰの傾向曲線。
【図４】図４は、本発明のプロセスにおける流束および細胞生存率および回収率に対するフィルター孔径の影響を例示している。
【図５】図５は、本発明のプロセスによる細胞濃縮を例示している。
【図６】図６は、本発明のプロセスによる、望ましくない成分の除去を例示している。
【図７】図７は、本発明による処理後の細胞品質（生存率）を例示している。
【図８】図８は、本発明のプロセスにより処理された細胞の機能性（増殖）を例示している。
【図９】図９は、本発明のプロセスの大規模運転（２５Ｌの回収細胞）中の流束およびＴＭＰを例示している。
【図１０】図１０は、本発明のプロセスの大規模運転（２５Ｌの回収細胞）中の生存率および細胞回収率を例示している。
【図１１】図１１は、本発明のプロセスによる細胞濃縮におけるフラットシートフィルターの使用を例示しており、細胞濃縮中の時間の関数として生存率および総細胞密度（ＴＣＤ）を示している。
【図１２】図１２は、図１１のフラットシートフィルターの場合と同様の条件下での本発明のプロセスによる細胞濃縮における中空糸フィルターの使用を例示している。
【図１３】図１３は、図１２の場合と同様の条件下での本発明のプロセスによるＣＨＯ細胞濃縮の使用を例示しており、細胞濃縮中の時間の関数として生存率および総細胞密度（ＴＣＤ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、特にヒト細胞療法用製品の調製のための、生存哺乳類細胞の濃縮および洗浄のための改良された方法、ならびに関連装置およびシステムを提供する。
【００３２】
本発明は、水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約５００万細胞／ｍＬでありかつ細胞生存率が少なくとも約７０％である細胞懸濁液を作製するためのシステムおよび方法に関し、その方法は、孔径が０．１ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）を用いて該培地の容量を減少させる工程を含み、該工程中、膜間差圧（ＴＭＰ）が約３ｐｓｉ未満で維持されかつ剪断速度が約４０００秒−１未満で維持される。
【００３３】
本方法を用いた細胞生存率は、少なくとも約７０％であり、８０％、９０％またはそれより高いこともある。
【００３４】
前記方法の剪断速度は約３０００秒−１未満で維持されかつＴＭＰは約１ｐｓｉ未満で維持される。ＴＦＦの孔径は約０．６５ミクロンであり、ＴＦＦは濾過表面積が少なくとも約０．５ｆｔ２の中空糸フィルターである。
【００３５】
前記方法のフィルターを通る流束は少なくとも約５０Ｌ／ｍ２ｈであり、少なくとも約３００Ｌ／ｍ２ｈであることもある。
【００３６】
細胞懸濁液中の細胞の回収率が水性培地中の細胞の少なくとも約７０％である場合、その回収率は開始時細胞数と最終細胞数の割合として決定される。本方法では、細胞懸濁液は約１０００万〜約７５００万生細胞／ｍＬの間または約１０００万生細胞〜約２億生細胞／ｍＬの間で含有する。加えて、懸濁液中の細胞の生存率は少なくとも約７０％であり、典型的には少なくとも８０％、または９０％以上である。
【００３７】
もう１つの実施形態では、前記方法は、ＴＦＦを用いて、細胞懸濁液の容量の少なくとも約４倍に等しい水性洗浄培地の容量で懸濁液中の細胞を洗浄するダイアフィルトレーション工程を含む。細胞懸濁液中の望ましくない可溶性成分の残留レベルは、水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約１０００倍低下し、細胞懸濁液の約１ｐｐｍ未満に低下させることができる。
【００３８】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、前記方法は(the comprising)センサーを用いて生細胞濃度を測定することを含む。その方法は、ＴＦＦ処理を制御し、そのプロセス中の特定の工程が終わり別のプロセス工程が始まる（例えば、濃縮を終え、ダイアフィルトレーションを始める）時期を特定し、確認サンプリングの必要性をなくすためにフィードバック機構を提供し、それによって細胞処理中の汚染の危険性を防ぐ。よって、その方法は、センサーから「リアルタイム」シグナルを検出すること（この際、ＴＦＦ中のサンプリングが排除される）、処理段階を決定するために該シグナルを処理すること、生細胞の目標密度に達した時にＴＦＦプロセス工程を終えるためにフィードバックを提供することを含む。前記方法において用いられるセンサーによって測定されたシグナルは、アンプセンサーを通ってヒューマンマシンインターフェースに送られ、そのシグナルは生細胞密度（ＶＣＤ）データに変換することができる。前記方法は(the further comprising)、最適の最終細胞密度および／または濃縮係数を決定するために前記ＶＣＤデータを解析することをさらに含む。このＶＣＤデータはまた、プロセス決定することができるもう１つの重大な品質パラメーターである総細胞生存率（ＴＣＶ）を計算するために総細胞密度（ＴＣＤ）センサーと組み合わすこともできる。
【００３９】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、治療用組成物に用いる細胞を製造する方法が提供され、その方法は、大規模細胞培養を用いて細胞を増殖させる工程；水性培地中の細胞を回収する工程、該水性培地中の細胞の容量を減少させ、本明細書に開示するようにＴＦＦを用いて該細胞を洗浄する工程、得られた細胞懸濁液を凍結防止培地中で処方し、細胞生存率の長期維持に好適な条件下で該処方細胞を凍結し保存する工程を含み、該凍結処方細胞は次のパラメーター：少なくとも約８０％の融解時細胞生存率；約５００万細胞／ｍＬより高い生細胞密度；および処方細胞中の望ましくない可溶性成分の残留レベルが約１ｐｐｍ未満のレベルに低下している、を示す。
【００４０】
本発明のもう１つの実施形態は、本明細書に開示する方法を実施するための、セルファクトリー、バイオリアクター、タンクを含んでなる装置(apparati)を備えたシステムを含む。
【００４１】
適当な期間の培養物から回収された細胞の大バッチ（例えば、３時間未満で約１０〜約１００Ｌ）の処理についての課題に対処するために、本発明者らは、例えば、中空糸フィルター（ＨＦＦ）を用いる、完全に閉鎖された、完全使い捨ての規模拡張可能なタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）システムを開発した。このＴＦＦシステムは、高い細胞生存率および機能性を維持しながら、大容量バッチを３時間未満で処理する（液体培地から細胞を分離し、清浄化し、回収し、収集する）ことができる。このシステムでは、ＨＦＦは、システム組立に３箇所の迅速接続と（バッチサイズに応じた）プラスチックチューブの無菌接合のみ必要であるように取り付けられている無菌クイックコネクターを有する。
【００４２】
下の図１は、完全に閉鎖された完全使い捨ての、本発明の例示的なＴＦＦシステムを示している。チューブ、使い捨てのセンサー（図１のＰ１、Ｐ２およびＰ３）および処理貯槽（図１のバッグ番号１）は、注文組立し、ガンマ線によって滅菌した。使い捨てのフィルターは、GE社から供給されたものであり（ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ、ＲＴＰＣＦＰ−１−Ｅ−４ＭおよびＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−５）、無菌で組立を行った。この構成または類似した構成で複数回のＴＦＦ運転を完了した。加えて、実現可能性の研究によって、本発明のＴＦＦシステムはまた、中空糸フィルターの代わりにフラットシートフィルターも使用し得ることも示された。
【００４３】
本発明の典型的なＴＦＦプロセスは２段階：容量減少およびダイアフィルトレーションで構成される。容量減少工程の間に、図１に示した処理バッグ内で所望の細胞濃度に達するまでバルク容量（細胞培養培地）がフィルターの透過物側から濾去される。容量減少段階に続くダイアフィルトレーション段階では、濃縮された細胞が液体、例えば、バッファーなどで洗浄され、ヒト投与には望まれないまたは許容されない細胞培養培地成分または回収培地成分が除去される。また、ダイアフィルトレーション後にさらなる容量減少を行って、治療製品の処方のために所望の細胞密度に到達させることもできる。
【００４４】
本発明のもう１つの実施形態では、図１３に示されるように、本明細書に開示する閉鎖された完全使い捨てのＴＦＦシステムは、中空糸フィルターおよび生細胞密度（ＶＣＤ）流水式センサーおよび検出（ＦＴセンサー）をさらに導入している。ＶＣＤ  ＦＴセンサーは、別のラインで接続し得ることが好ましい（Ｓ１）。使い捨てのＶＣＤセンサーの使用によってＴＦＦ中の製品サンプリングがなくなり、その結果、リスクが最小限に抑えられ、製品品質および安全性が向上する。ＶＣＤ  ＦＴセンサーからのシグナルはヒューマンマシンインターフェース、例えば、FOGALE-SEMICONのヒューマンマシンインターフェースを用いて送ることができる。このようにして、ＶＣＤデータを用いて、ＴＦＦ操作中に最適の細胞密度および／または濃縮係数を決定することができる。
【００４５】
膜濾過プロセスは、一般的に、膜の孔径に応じて、逆浸透、限外濾過およびマイクロフィルトレーションのカテゴリーに入る。例えば、’２９４号特許、前掲を参照のこと。通常、限外濾過では分子量がおよそ１〜１０００ｋＤａの間の溶質の保持に値する膜を使用し、逆浸透では塩および他の低分子量溶質を保持する能力がある膜を使用し、マイクロフィルトレーション、またはマイクロポーラス濾過では、コロイドおよび微生物を保持するために典型的に使用される０．１〜１０μｍ（ミクロン）孔径範囲の膜を使用する。同上。ＴＦＦでは、供給流を膜の面に対して接線方向に高速で再循環させ、逆拡散の物質移動係数を増加させる。フィルター膜に対して平行な方向に流れる液体は、連続的にフィルター表面を清浄するように働き、濾過できない溶質による目詰まりを防ぐ。同上。ＴＦＦでは、膜間差圧（ＴＭＰ）と呼ばれる圧力差勾配を膜の長さ方向に適用して、液体および濾過可能な溶質をフィルター通過させる。流束は、経験的に決定することができる特定の最小値より高いＴＭＰには依存しない。同上。最大流束を達成するために、限外濾過システムは、典型的には、この最小値以上の出口圧力で運転される。そのため、ＴＭＰは変動するが流束は膜の長さ方向に一定である。
【００４６】
驚くべきことに、本発明のＴＦＦプロセスの比較的低い剪断(sheer)パラメーターおよびＴＭＰパラメーターによりフィルターの「目詰まり」にはならず、それよりも、非常に望ましい膜透過流束、例えば、少なくとも約１００Ｌ／ｍ２ｈ、好ましくは少なくとも約２００Ｌ／ｍ２ｈ、より好ましくは少なくとも約３００Ｌ／ｍ２ｈなどをもたらす。そのような流束は、約１０Ｌ〜約１００Ｌの細胞バッチ容量、あるいは約１０００Ｌまでのより大きなバッチでの処理時間を、従来の遠心分離法と比べて大幅に短縮し、それによって生存率を含む高い細胞品質を維持する。さらに、本発明の上記ＴＦＦプロセスパラメーターは、驚くべきことに、得られる細胞懸濁液において優れた細胞回収率、例えば、水性培地中の開始時細胞の、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％または９９％を提供する。細胞の種類および用途に応じて、得られる細胞懸濁液は、少なくとも約３００万生細胞／ｍＬ、６００万生細胞／ｍＬ、あるいは少なくとも約１０００万生細胞／ｍＬを含有し得る。
【００４７】
本明細書に記載する方法および応用に対する他の好適な修飾および改変は明らかであり、そのような修飾および改変は本発明またはそのあらゆる実施形態の範囲からも逸脱することなく行うことができることは当業者には明白である。本発明は次の実施例を参照することによってより明確に理解され、それらの実施例は本明細書において例示のためだけに示し、本発明を限定するのもではない。
【実施例】
【００４８】
次の実施例におけるこのＴＦＦ手法の開発段階で、初代ヒト細胞（典型的には、成体間葉系幹細胞またはヒト皮膚繊維芽細胞）を「セルファクトリー」（ＣｏｒｎｉｎｇまたはＮｕｎｃ（登録商標））で培養し、複数のバッグ(Lonza)に回収した。実験開始前に、回収した細胞のバッグを、プラスチックチューブの無菌接合または他の無菌接続によって処理バッグ（図１のバッグ番号１）に接続し、図１に示す供給ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）を用いて細胞懸濁液を処理バッグに移した。処理バッグには細胞懸濁液がバッグ容量の半分〜２／３まで充填した。再循環ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ−３２３ＥまたはＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｋｒｏｓｆｌｏｗ）（図１に示すとおりである）をゆっくり始動させ、目的とする速度まで上げた。次いで、透過ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）（図１に示すとおりである）をゆっくり始動させ、目的とする速度に上げた。供給ポンプおよび透過ポンプを同じサイズのチューブ（３／１６インチまたは１／４インチＩＤ）を用いて同じ速度で運転して、本プロセスの容量減少工程中、処理バッグ内で一定の液体容量を維持した。再循環ポンプには、１／４インチまたは３／８インチＩＤのチューブを典型的に用い、一定の速度で運転して望ましい入口流量を得た。細胞懸濁液サンプルを定期的に収集して、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ(New Brunswick Scientific)または他の細胞計数技術を用いて細胞密度および生存率を測定した。
【００４９】
典型的には、バルク容量を（所望の細胞濃度に応じて）約１００〜８００ｍＬの範囲内に減少させたら、バッファーバッグを処理バッグに接続することによってダイアフィルトレーションを開始させた。ダイアフィルトレーションバッファーの８〜１０容量の同等物で細胞を洗浄して、残留する培養成分および回収成分の減少を達成させた。次いで、処理バッグ内の容量を上記のように濾過によってさらに減少させて、処方のために所望の細胞濃度を達成してもよい。所望の細胞濃度を達成したら、全てのポンプを停止させ、フィルターおよびチューブの細胞懸濁液を重力によって処理バッグ中に排出した。細胞計数のために処理バッグの最終サンプルを得、低温保存のために細胞懸濁液を処方し、バイアルに充填した。
【００５０】
回収した細胞懸濁液１０〜１００Ｌでの細胞療法プロセスの重大な品質パラメーターには：細胞を１０００万細胞／ｍＬより高く濃縮する際の少なくとも９０％の細胞生存率および高い細胞機能性の維持；少なくとも約８５％の全体細胞回収率（（入細胞−出細胞）／入細胞として定義される）の取得；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの培養培地残留物の１ｕｇ／ｍＬ未満への低下（例えば、連邦規則集第２１編第６１０．１５項を参照のこと）；および細胞死を制限する細胞処理時間、例えば、約３時間未満の維持、が含まれる。
【００５１】
実施例１．剪断速度の影響
高剪断速度は、フィルターの汚れを最小限に抑えるのに役立ち（フィルター材料への細胞の吸着を防ぎ）、そうすることによって流束を最大にし、処理時間を最小限に抑えるため、ＴＦＦプロセスでは一般的である。この一連の実験の目的は、最終細胞懸濁液の重大な品質パラメーターを維持しながら剪断速度を最適化することであった。ＴＦＦプロセス性能および製品品質に対する剪断速度の影響を調査するために、上記の典型的なＴＦＦ手順に従って小規模（３〜５Ｌ）実験を行った。剪断速度は、＝〜（式中、ｒは剪断速度（単位＝秒−１）であり、ｑは繊維ルーメンを通るフィルター入口流量（単位＝ｍ３／秒）であり、Ｒは繊維半径（単位  ｍ）である）として計算した。明記したフィルターおよびチューブを含む任意の装置では、フィルター入口流量（すなわち、図１の供給ポンプの流量）によって剪断速度を制御した。２〜３のセルファクトリー（４０段  Ｎｕｎｃ）からおよそ２０億〜３０億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、０．５ｆｔ２サイズのフィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ）を用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は２．５×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲に及び、典型的なＴＦＦプロセスに従って容量を６２±９分間濃縮した。中空糸フィルターで処理を行い、場合によっては（過大な剪断速度）ダイアフィルトレーションを行わなかった。表１のデータは、高剪断速度が細胞生存率に悪影響を及ぼしたことを示している。
【表１】
2013517771.tif 000003
【００５２】
数回の実験に関する剪断速度の傾向解析によって最終濃縮細胞製品の生存率に対する剪断力の影響を示し（図２）、この場合、「生存率の低下」は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒアッセイによって測定されるＴＦＦ前およびＴＦＦ後の細胞生存率の差異として定義される。
【００５３】
結論：この一連の研究によって、最終細胞生存率が本プロセスの液体剪断速度に依存し、その剪断速度は約３０００秒−１より低く維持されることが好ましいはずであることが示される。
【００５４】
実施例２．細胞懸濁液の品質パラメーターに対するＴＭＰの影響
膜間差圧（ＴＭＰ）はＴＦＦの重大な処理変数である。透過制御のないプロセス（例えば、上記の’６６９号特許の場合など）の間、ＴＭＰは透過流の主な推進力であり、流束を制御する。よって、高ＴＭＰは高流束および低処理時間に至らせる。そのため、我々は、明記した装置を用いて処理した細胞の品質パラメーターに対するＴＭＰの影響を判定することに着手した。本実験では、セルファクトリー（４０段  Ｎｕｎｃ）からおよそ２９億のヒト皮膚繊維芽細胞（ｈＤＦ）を回収し、０．５ｆｔ２サイズの中空糸フィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ）を用いて３５００〜３９００秒−１の比較的高剪断速度で処理した。この高剪断速度は、細胞生存率を最大にしながらフィルターの汚れを最小限に抑えるために選択した。ＴＭＰは、ＴＭＰ＝Ｐ  ２  Ｐ２  Ｐ３（式中、Ｐ１はフィルター入口圧力であり、Ｐ２はフィルター出口圧力であり、Ｐ３は透過圧力である）として計算した。所定の装置では、図１に示す再循環ポンプおよび透過ポンプのポンプ流量の制御を通じてＰ１、Ｐ２および／またはＰ３を変えることによってＴＭＰを制御した。実験開始時の細胞濃度は４．２×１０５細胞／ｍＬであり、上記の典型的なプロセスに本質的に従って細胞を濃縮した。図３ａおよび図３ｂは、ＴＦＦプロセス性能および製品品質に対する中度のＴＭＰレベル（５〜１０ｐｓｉ）の影響を示している。
【００５５】
処理中、ＴＭＰはフィルターの目詰まりから５ｐｓｉを超えるまでに上昇したため、生存率および細胞回収率の両方に影響を及ぼした。容量減少工程中に細胞生存率は９０％より低く低下し（ダイアフィルトレーションを行う他の実験によって、処理が続く場合には生存率が８０％未満に低下し得ることが立証されている）、これは処理中の剪断速度によるものであった可能性がある。しかしながら、高膜間差圧から処理中にほぼ９０％の細胞が消失したことが重要であり、この高膜間差圧によってフィルターの汚れが進み、流束がほぼゼロに減少した。
【００５６】
結論：本実験中に細胞生存率は９０％より低く低下し（容量減少工程だけの間、プロセス性能の不良からダイアフィルトレーションを行うことができなかった）、細胞製品のかなりの部分（８８％）が消失した。さらに、＞１０Ｍ／ｍＬの処方用細胞懸濁液の取得は、フィルターの汚れおよび細胞回収率の不良から達成できなかった（終濃度はたった０．５Ｍ細胞／ｍＬであった）。従って、本実験によって、５ｐｓｉより高いＴＭＰが細胞生存率、最終細胞濃度および細胞回収率に悪影響を及ぼすことが示される。これは、治療用細胞製品の品質特性を維持するために処理時間（流束による）と他の処理パラメーターとのバランスをとることの重要性の基礎となる。
【００５７】
さらなる研究によって、許容される（少なくとも９０％）回収率が約１ｐｓｉ以下のＴＭＰを用いて得られるのに対し、約１ｐｓｉより高く５ｐｓｉまでのＴＭＰは細胞回収率に対して中度の影響を及ぼし、５ｐｓｉを超えるＴＭＰは細胞回収率に対して重大な悪影響を及ぼすことが示された。図３ｃは、複数回のＴＦＦ実験のＴＭＰ（運転中の平均）、細胞回収率および細胞生存率についての傾向チャートである。
【００５８】
実施例３．流束に対する孔径の影響
ＴＦＦプロセス性能および製品品質に対するフィルター孔径の影響を調査するために、小規模（３〜５Ｌ）実験を行った。セルファクトリー（４０段  Ｎｕｎｃ）からおよそ３０億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、０．６５ミクロン孔（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ）または０．１ミクロン孔（ＲＴＰＣＦＰ−１−Ｅ−４Ｍ）の０．５ｆｔ２サイズの中空糸フィルターを用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、４×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに本質的に従って濃縮した。下記の表２は、試験したフィルター孔径の範囲および対応する製品品質パラメーターおよびプロセス性能パラメーターを示している。
【表２】
2013517771.tif 000004
【００５９】
０．１ミクロン孔フィルターを用いた実験は透過流量（流束）の不良から完了することができなかった。そのため、細胞回収率および処理時間のデータは適用しない（「Ｎ／Ａ＊」）
図４は、ＴＦＦプロセス性能に対するフィルター孔径の影響を調査するために行った実験の流束およびＴＭＰを示している。
【００６０】
結論：この一連の研究によって、０．６５ミクロンから０．１ミクロンへの孔径の減少はフィルターの汚れにつながり、流束は減少し、ＴＭＰは上昇し、これは最終的には最終細胞製品の重大な品質パラメーターに対して悪影響を及ぼし、多くの場合には製品欠陥（生存率＜８０％）に至ることが示される。
【００６１】
実施例４．高流束の影響
ＴＦＦプロセス性能および製品品質に対する高流束の影響を調査するために、小規模（３〜５Ｌ）実験を行った。セルファクトリー（４０段  Ｎｕｎｃ）からおよそ３０億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、０．５ｆｔ２サイズの中空糸フィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ）を用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、２．５×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに本質的に従って濃縮した。流束は、再循環速度を維持しながら透過流量を増加させることによって制御した。下記の表３は、達成した流束の範囲および対応する製品品質パラメーターを示している。流束は、１５０〜３５０ＬＭＨの範囲に及び、剪断速度は、２０００〜３０００秒−１の範囲に及んだ。
【表３】
2013517771.tif 000005
【００６２】
結論：この一連の研究によって、流束（単位  ＬＭＨ）は、剪断速度およびＴＭＰを最小限に抑え、少なくとも９０％の細胞生存率および少なくとも９０％の細胞回収率を維持しながら透過流量の制御を用いて１５０〜３５０ＬＭＨの範囲で達成することができることが示される。大容量の場合にはこの高流束により処理時間の最小化が見込まれ、この最小化は製品品質に対して全体的な良い影響を及ぼす。
【００６３】
実施例５．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の大規模バイオプロセス
上記の典型的な手順および図１のＴＦＦシステムを用い、複数のＮｕｎｃまたはＣｏｒｎｉｎｇの４０段の培養容器を用いてヒト間葉系幹細胞（Lonza社BioscienceのＭＳＣ）を増殖させ、２〜４×１０５細胞／ｍＬ〜４×１０７細胞／ｍＬまでの回収濃度から濃縮し、その際、約９５％の細胞生存率を維持し、本プロセスから本質的に全ての細胞を回収した。図５を参照のこと。濃縮および８〜１０ダイアフィルトレーション容量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有生理食塩水を用いたダイアフィルトレーションの後、濃縮した細胞の最終ＢＳＡ残留レベルは１００ｎｇ／ｍＬ未満に低下していた（図６）。次いで、規模拡張可能なシングルユース用システムを用いてそれらの細胞をさらに処理した。容量減少および洗浄後に、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒを用いてｈＭＳＣを計数して、濃度および生存率を確認し、ＴＦＦ処理収率を確認し、さらに処方の指針とした。約８〜１２Ｍ細胞／ｍＬでＰｒｏＦｒｅｅｚｅ（商標）(Lonza)中７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終溶液を得るために細胞を処方した。処方されたｈＭＳＣを、Ｆｌｅｘｉｃｏｎ（登録商標）ポンプおよび処方バッグに接続されたシングルユース用チューブセットを用いて２０ｍＬバイアルに分注した。バイアルは、大量に（大規模凍結をシミュレーションするために約２００のバイアル）速度制御付きフリーザーで凍結し、気相液体窒素に入れて７〜１４日間保存した。最終容器中で、融解時、細胞生存率（図７）および生細胞回収率は９０％をはるかに超えて維持された。ＴＦＦプロセスが処理細胞の全体的健康および生存率に対して何らかの影響を及ぼしたかどうかを評価するために、処理細胞および未処理細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり３０，０００細胞で播種し、Ｖｉａｌｉｇｈｔ（登録商標）(Lonza)細胞代謝・生存率アッセイを用いて２４時間生存率および細胞機能性をモニタリングした。重要なことには、ＴＦＦプロセスは大規模（４０段）培養プラットフォームから回収された細胞に対してほとんど〜全く影響を及ぼしていなかった（図８）。
【００６４】
この一連の研究によって、増殖させ大規模培養容器に回収した臨床的に関連のある細胞（すなわち、ヒトＭＳＣ）を本発明のＴＦＦプロセスを用いてうまく濃縮し洗浄することができ、残留タンパク質が除去されるのと同時に、低温保存後でも生存率および最終細胞製品の収率などの重大な品質パラメーターが維持されることが示される。これらの細胞は、未処理細胞と比べて、培養下で生物学的機能性を維持し、高濃度で低温保存することができ、処理後に優れた回収率を示す。要約すれば、これらのデータは、ＴＦＦが大規模細胞療法製造のための容量減少および洗浄についての信頼性のある方法であることを示している。
【００６５】
実施例６．大規模（２５Ｌ）処理運転
大規模（２５Ｌ）でＴＦＦプロセス性能および製品品質を評価するために、本実験を行った。本実験では、複数の振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））からおよそ１８０億のＣＨＯ細胞を回収し、１．７ｆｔ２サイズの中空糸フィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−５）を用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、２．５×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに従って、表４に示すＴＭＰパラメーターおよび流束パラメーターを用いて濃縮し、表４には、製品品質パラメーターおよびプロセス性能パラメーターも示している。
【表４】
2013517771.tif 000006
【００６６】
図９は、大規模（２５Ｌ）でのＴＦＦプロセス性能および製品品質を評価するために行った実験の流束およびＴＭＰを示している。
【００６７】
図１０は、大規模（２５Ｌ）でのＴＦＦプロセス性能および製品品質を評価するために行った実験の細胞生存率および回収率を示している。
【００６８】
結論：この研究によって、最終細胞製品の重大な品質パラメーターを維持しながらの、本プロセスの商業規模への規模拡張性が示される。
【００６９】
実施例７．中空糸フィルター型および平面フィルター型の比較
細胞処理へのフラットシートフィルター使用の実現可能性を調査するために、小規模実験を行った。これらの実験では、８〜１２の１０段のセルファクトリーまたは１〜３の４０段のセルファクトリーからおよそ１０億〜３０億の間葉系幹細胞またはヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、中空糸フィルター（０．５ｆｔ２または１ｆｔ２サイズのフィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ））またはSartorius社およびPall社製の０．１〜０．６５ｐｍのフラットシートフィルターのいずれかを用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、４．５×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲に及んだ。実施例１のプロセスに本質的に従って細胞を濃縮した。
【００７０】
図１１はフラットシート運転の例を示し、図１２は中空糸フィルター運転の例を示している。
【００７１】
結論：この一連の研究によって、ＴＦＦプラットフォームの種類、すなわち、中空糸またはフラットシートが、本システムの重大な品質パラメーターに実質的に影響を与えず、そして、ＴＦＦプラットフォームに関係なく、本発明によって細胞生存率および細胞回収率を達成することができることが示される。
【００７２】
実施例８．最終細胞濃度
ＴＦＦプロセスを用いての高細胞濃度達成の実現可能性を調査するために、小規模（３〜５Ｌ）実験を行った。４〜５のセルファクトリー（４０段  Ｎｕｎｃ）からおよそ５０億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、０．５ｆｔ２サイズの中空糸フィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ）を用いて処理した。第２の実験では、複数の振盪フラスコからおよそ１００億のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を回収し、全く同じ０．５ｆｔ２サイズの中空糸フィルターを用いて処理した。実験開始時の細胞密度は、約４×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに本質的に従って細胞を濃縮した。図１３は、ＣＨＯ実験の過程において達成された総細胞密度（ＴＣＤ）を時間の関数として示し、表５には、両実験についての達成された最終ＴＣＤおよび対応する製品品質パラメーターを示している。
【表５】
2013517771.tif 000007
【００７３】
結論：この一連の研究によって、細胞生存率および回収率を維持しながら、少なくとも、５０００万／ｍＬより高い密度に細胞を濃縮し得ることが示される。他の類似実験では、本発明の方法によって１億細胞／ｍＬを超えるＴＣＤが達成されている。
【００７４】
実施例９．フィルター充填容量
これらの研究では、１〜２のセルファクトリー（４０段  Ｎｕｎｃ）からｈＭＳＣ細胞を、複数の振盪フラスコからＣＨＯ細胞を回収した。０．５ｆｔ２中空糸フィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ）を用いてｈＭＳＣ細胞を処理し、１．７ｆｔ２中空糸フィルター（GE社製ＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−５）を用いてＣＨＯ細胞を処理した。実験開始時の細胞濃度は、２．５×１０５〜５．６×１０５細胞／ｍＬの範囲に及び、実施例１のプロセスに従って濃縮した。
【００７５】
下記の表６には、フィルターの面積当たりの処理細胞の範囲および対応する製品品質パラメーターを示している。
【表６】
2013517771.tif 000008
【００７６】
結論：この一連の研究によって、許容される細胞生存率および回収率を維持しながら、１４億細胞／ｆｔ２ほど低くも、８６億細胞／ｆｔ２ほど高くもフィルターに充填し得ることが示される。加えて、理論的には、フィルター充填量は少なくとも７．５億細胞／ｆｔ２ほど少なくてもよく、その際には、許容されるプロセス性能パラメーターが維持される。
【００７７】
本発明の実施形態を記載してきたが、それらの実施形態は本発明の原理の応用の一部の例示であることは理解されるであろう。当業者ならば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく非常に多くの修飾を行うことができる。
【００７８】
実施例１０．ＦＴセンサーを備えたＴＦＦシステム
図１３は、Lonza社で設計された、中空糸フィルターおよび生細胞密度（ＶＣＤ）流水式センサー／検出器（ＦＴセンサー）を備えた、完全に閉鎖された完全使い捨てのＴＦＦシステムを示している。チューブ、使い捨てのセンサー（図１３のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＳ１）（ＶＣＤセンサーを含む）および処理貯槽（図１のバッグ番号１）は、注文組立し、ガンマ線によって滅菌した。使い捨てのＶＣＤセンサーの使用によってＴＦＦ中の製品サンプリングがなくなり、その結果、リスクが最小限に抑えられ、製品品質および安全性が向上する。使い捨てのフィルターは、GE社から供給されたものであり（ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−４Ｍ、ＲＴＰＣＦＰ−１−Ｅ−４ＭおよびＰＮ：ＲＴＰＣＦＰ−６−Ｄ−５）、無菌で組立を行った。この構成または非常に類似した構成で複数回のＴＦＦ運転を完了した。加えて、ＴＦＦシステムは、中空糸フィルターの代わりにフラットシートフィルターも使用し得る。フラットシートフィルターを用いて実現可能性の研究を行った。典型的なＴＦＦプロセスは２工程−容量減少およびダイアフィルトレーション、で構成される。容量減少工程の間に、図１３に示した処理バッグ内で所望の細胞濃度に達するまでバルク容量（細胞培養培地）がフィルターの透過物側から濾去される。容量減少工程の後にダイアフィルトレーション工程が続く。ダイアフィルトレーションの間に、濃縮された細胞がバッファーで洗浄され、不純物が除去される。
【００７９】
典型的なＴＦＦ実験では、初代ヒト細胞（ほとんどの場合、間葉系幹細胞またはヒト皮膚繊維芽細胞）をセルファクトリー（ＣｏｒｎｉｎｇまたはＮｕｎｃ（登録商標））で培養し、複数のバッグ(Lonza)に回収する。ＴＦＦ実験開始前に、回収した細胞のバッグを、無菌接合または他の無菌接続によって処理バッグ（図１３のバッグ番号１）に接続し、図１３に示す供給ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）を用いて細胞懸濁液をそのバッグに移す。ＶＣＤ  ＦＴセンサーからのシグナルはアンプケーブルを通ってFogale社製のヒューマンマシンインターフェース（ＨＭＩ）に送られる。そのシグナルはＶＣＤ基準に変換され、ＨＭＩに表示される。このＶＣＤデータを用いて、ＴＦＦ操作中に最適の最終細胞密度および／または濃縮係数が決定される。処理バッグには細胞懸濁液がバッグ容量の半分〜２／３まで充填される。再循環ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ−３２３ＥまたはＳｐｅｃｔｒｕｍ  ＫｒｏｓＦｌｏｗ）（図１に示すとおりである）をゆっくり始動させ、目的とする速度まで上げる。次いで、透過ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）（図１３に示すとおりである）をゆっくり始動させ、目的とする速度に上げる。供給ポンプおよび透過ポンプを同じサイズのチューブ（３／１６インチ、１／４インチまたは３／８インチＩＤ）を用いて同じ速度で運転して、本プロセスの容量減少工程中、処理バッグ内で一定の液体容量を維持する。再循環ポンプには、１／４インチまたは３／８インチＩＤのチューブを典型的に用い、一定の速度で運転して望ましい入口流量を得る。細胞懸濁液サンプルを定期的に収集して、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＮＣ）(New Brunswick Scientific)または他の細胞計数技術を用いて細胞密度および生存率を測定し得る。典型的には、一度、バルク容量をＶＣＤ  ＦＴセンサーからのＶＣＤデータに基づいて１００〜８００ｍＬの範囲内に減少させたら、バッファーバッグを処理バッグに接続することによってダイアフィルトレーション工程を開始させる。ダイアフィルトレーションバッファーの８〜１０容量の同等物で細胞を洗浄して、残留する培養試薬および回収試薬の減少を達成させる。処理バッグ内の容量をさらに減少させて、処方のためにＶＣＤ  ＦＴセンサーからのＶＣＤデータに基づいて所望の細胞濃度を達成してもよい。一度、所望の細胞濃度が達成されたら、全てのポンプを停止させる。フィルターおよびチューブの細胞懸濁液を重力によって処理バッグ中に排出する。細胞計数のために処理バッグの最終サンプルを得、低温保存のために細胞懸濁液を処方し、バイアルに充填する。
【００８０】
細胞療法プロセスの重大な品質パラメーターでは、細胞を５Ｍ細胞／ｍＬより高く濃縮しながら細胞生存率＞９０％を維持しなければならず、細胞機能性も維持しなければならない。
【００８１】
この一連の構造によって、間葉系幹細胞は２〜４×１０５から．３ｘ１０７細胞／ｍＬまで濃縮することができ、ＶＣＤセンサーシグナル（誘電率）がＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによる方法を用いて測定されるＶＣＤの増加と相関することが示される（図１３）。重要なことには、このプロセスは完全使い捨てのシングルユース用構成で行い得る。
【００８２】
いくつかの具体的な実施形態についての前述の説明は、他者が、現在の知識を適用することによって、包括的概念から逸脱することなくそのような具体的な実施形態を様々な用途に向けて容易に修飾しまたは改変することができる十分な情報を提供しており、それゆえ、そのような改変および修飾は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内に包含されるべきであり、そうであることが意図されている。本明細書において使用した表現または用語は、説明を目的としており、限定するものではないことを理解されたい。図面および説明では、例示的な実施形態を開示しており、特有語を使用したが、それらは、特に断りのない限り、一般的かつ記述的な意味でのみ使用しており、限定するものではなく、それゆえ、特許請求の範囲の範囲はそのように限定されない。さらに、本明細書において論じた方法の特定の工程は別の順序で並べることができ、または工程を組み合わせることもできることは当業者ならば分かるであろう。よって、添付の特許請求の範囲は本明細書に開示した特定の実施形態に限定されないことが意図される。
【００８３】
本明細書に引用した出願および特許の各々、ならびに出願および特許の各々において引用された各文書または参照文献（各発行済み特許の審査中のものを包含する；「出願引用文献」）、およびこれらの出願および特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張するＰＣＴおよび外国出願または特許の各々、および出願引用文献の各々において引用されたまたは参照された文書の各々は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。より一般には、文書または参照文献は、本明細書末尾の参照文献リスト；または本明細書自体のいずれか；において引用されており、そして、これらの文書または参照文献の各々（「本明細書引用参照文献」）、ならびに本明細書引用参照文献の各々において引用された各文書または参照文献（製造業者の仕様書、使用説明書などのいずれもを包含する）は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【図１】
2013517771.tif 000009
【図２】
2013517771.tif 000010
【図３Ａ】
2013517771.tif 000011
【図３Ｂ】
2013517771.tif 000012
【図３Ｃ】
2013517771.tif 000013
【図４】
2013517771.tif 000014
【図５】
2013517771.tif 000015
【図６】
2013517771.tif 000016
【図７】
2013517771.tif 000017
【図８】
2013517771.tif 000018
【図９】
2013517771.tif 000019
【図１０】
2013517771.tif 000020
【図１１】
2013517771.tif 000021
【図１２】
2013517771.tif 000022
【図１３】
2013517771.tif 000023
【国際調査報告】
2013517771.tif 000024
2013517771.tif 000025
2013517771.tif 000026