(57)【要約】  本発明は、シトシン類似体、シトシン類似体の調製方法、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１阻害剤、ＤＮＡメチル化の阻害方法、正常なＤＮＡメチル化からの逸脱と関連する疾患の治療における類似体の使用を提供する。より正確には、本発明は、様々なシトシン誘導体、並びにモノ−及び多−１，４，５，及び６−置換シトシンの調製方法に関する。一般に、本解決法は、ＤＮＡメチル化レベル障害と関連する疾患の予防及び治療において使用し得るＤＮＡメチル化の効果的なモジュレーターを提供することに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトシンの１，４，５，及び６−置換誘導体又は５，６−ジヒドロシトシンからなる、シトシンの類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグの調製方法であって、前記類似体を、化学式
【化１】
2013522289.tif 000023
又は
【化２】
2013522289.tif 000024
（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｒ3、Ｒ4、２’−デオキシリボシルであり、Ｒ4は、アルキル又はアリールであり、Ｘは、Ｎ又はＣであり、ここで、式Ｉの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5は置換基ではなく、式Ｉ及び／もしくはＩＩの類似体中のＸがＣであるか、又は式ＩＩの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5とＲ6は、独立に、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ基、アルコキシル、アリールオキシル、アミノアルキル、アミノアリール、チオ基、スルホニル、スルフィニル、又はハロゲンである）によって記載することができることを特徴とし、ここで、シトシン及び４〜６当量の分量の芳香族アルデヒド又はアルキルアルデヒドを無水メタノール又はエタノールに添加し、得られたイミンを還元するために、ＮａＢＨ4又はＢＨ3×ＴＭＳを、アルデヒドに対して少なくとも１．１当量の量で混合物に導入し、その後、還元剤を塩酸で中和し、前記混合物を蒸発させ、水に注ぎ入れ、酢酸エチル又はブタノールで抽出して、酢酸エチル又はブタノール中のアルコールと修飾シトシンの混合物を得；次に、分離した有機層を蒸発乾固させて、純粋な生成物を得るか、又は無機酸の水溶液で抽出し、使用される酸によって、シトシン塩酸塩もしくは他の修飾シトシン塩の水溶液を得、この場合、得られる塩はアルコールを含まず；その後、前記溶液を水酸化物又は他のヒドロキシル基供与体で中和し、酢酸エチル又はブタノールで再び抽出し；有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得、その後、これをフリーズドライに供する、方法。
【請求項２】
芳香族アルデヒドを用いる場合、マグネシウムを、シトシンに対して少なくとも４当量の量で無水メタノール又はエタノールに添加し、マグネシウム粉末が完全に溶解するまで加熱し；次に、少なくとも２ｍｍｏｌのシトシンを添加し、次いで、シトシンに対して４〜６当量、最低でも４当量の芳香族アルデヒドを添加し；次に、反応混合物を、４５〜６５℃の範囲の温度に、少なくとも３時間置き、その後、還元剤、好ましくはＮａＢＨ4を、アルデヒドに対して少なくとも１当量の量で冷却した混合物に添加し；その後、前記混合物を室温で少なくとも１５分間保持し、次いで、無機酸溶液を添加し；次に、前記混合物を蒸発させ、水を再び添加し、前記混合物を酢酸エチルで抽出して、生成物を単離し；前記生成物及び芳香族アルコールを含有する分離した有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得るか、又は無機酸の水溶液で抽出して、使用される酸によって、修飾シトシン塩酸塩又は他の修飾シトシン塩の水溶液を得、この場合、得られる塩はアルコールを含まず；その後、前記溶液を水酸化物又は他のヒドロキシル基供与体で中和し、酢酸エチルで再び抽出し；有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記芳香族アルデヒドは、フルフリルアルデヒド又はベンジルアルデヒドであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
精製後の合成収率は少なくとも５０％であり、かつ前記アルデヒドに依存することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
アルキルアルデヒドを用いる場合、３〜５当量の酢酸、少なくとも０．７５当量のシトシン、及び少なくとも３当量のアルデヒドを無水メタノール、ｎ−プロパノール、又はエタノールに添加し、混合物全体を少なくとも２時間沸騰させ；得られたイミンを、水又はメタノール及びヘキサンによる抽出で単離し、この場合、前記アルデヒドはヘキサンへと移動し、イミンは、残りの未反応基質とともに、水又はメタノール中に残り；次に、水層をブタノール又は酢酸エチルで抽出して、前記水層からイミンを単離し、溶媒を蒸発させ、得られる生成物をフリーズドライに供することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
最終生成物が還元イミンである場合、反応混合物を蒸発させ、塩化メチレンとＢＨ3×ＳＭｅ2のテトラヒドロフラン溶液とを添加し；反応を室温で少なくとも９時間実施し、還元が終了したとき、反応混合物を無機酸の水溶液で少なくとも１０時間処理し；その後、前記反応混合物を蒸発させ、水及び酢酸エチルもしくはブタノールで抽出して、純粋な生成物を得るか、又は無機酸の水溶液で抽出して、修飾シトシン塩酸塩の水溶液を得；次に、修飾シトシン塩酸塩の水溶液を中和した後、前記溶液を酢酸エチル又はブタノールで抽出し；有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得、その後、これをフリーズドライに供することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
シトシンの誘導体及びプロピオン酸アルデヒド又はアセチルアルデヒドの場合、生成物を、好ましくは、水／アセトン逆相クロマトグラフィーカラムで精製することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
シトシンの１，４，５，及び６−置換誘導体又は５，６−ジヒドロシトシンからなる、シトシンの類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグであって、前記類似体を、化学式
【化３】
2013522289.tif 000025
又は
【化４】
2013522289.tif 000026
（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｒ3、Ｒ4、２’−デオキシリボシルであり、Ｒ4は、アルキル又はアリールであり、Ｘは、Ｎ又はＣであり、ここで、式Ｉの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5は置換基ではなく、式Ｉ及び／もしくはＩＩの類似体中のＸがＣであるか、又は式ＩＩの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5とＲ6は、独立に、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ基、アルコキシル、アリールオキシル、アミノアルキル、アミノアリール、チオ基、スルホニル、スルフィニル、又はハロゲンである）によって記載することができることを特徴とする、シトシンの類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグ。
【請求項９】
前記生理的に許容し得る塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩であることを特徴とする、請求項８に記載の類似体。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグからなることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１の阻害剤。
【請求項１１】
ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼの競合的阻害剤（４−Ｎ−プロピリデンシトシンを除く）であり、かつＳｓｓＩ酵素の活性部位を遮断することを特徴とする、請求項１０に記載の阻害剤。
【請求項１２】
細胞内でのＤＮＡメチル化の活性が阻害されるように、細胞と、請求項８又は９に記載の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグとを接触させることからなる、細胞内でＤＮＡメチル化を阻害する方法。
【請求項１３】
細胞内でのＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性が阻害されるように、細胞と、請求項８又は９に記載の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグとを接触させることからなる、細胞内でＤＮＡメチル化を阻害する方法。
【請求項１４】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）の分解によって阻害されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
接触段階は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）の活性の少なくとも５０％が阻害されるように、細胞と、生物学的有効用量の請求項８又は９に記載の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグとを接触させることを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
細胞内のＤＮＡメチル化を阻害するための、ＤＮＡメチル化障害、特に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１活性の異常と関連する疾患の治療における請求項８又は９に記載の類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグの使用。
【請求項１７】
ＤＮＡメチル化障害と関連する疾患は、癌疾患を含む群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトシン類似体、シトシン類似体の調製方法、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１阻害剤、ＤＮＡメチル化の阻害方法、正常なＤＮＡメチル化からの逸脱と関連する疾患の治療における類似体の使用を提供する。より正確には、本発明は、様々なシトシン誘導体、並びにモノ−及び多−１，４，５，及び６−置換シトシンの調製方法に関する。一般に、本解決法は、ＤＮＡメチル化レベル障害と関連する疾患の予防及び治療において使用し得るＤＮＡメチル化の効果的なモジュレーターを提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現及びゲノム安定性は、エピジェネティックな機構で制御されている。この機構の要素のうちの１つは、特定の生物に特異的であり、胚形成期に決定され、かつ全生涯を通じて変わらないメチル化パターンである。連続的な細胞分裂におけるこのパターンの正確な再現は、生物の適切な発生及び機能の条件である。メチル化レベルの増減に存する、メチル化パターンのバリエーション（エピ突然変異）は、多くの癌において記載されている。エピ突然変異の可逆性のために、それらは癌の治療における魅力的な治療標的となっている。なぜなら、遺伝子突然変異とは対照的に、エピ突然変異は、連続的な細胞分裂の後に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）によって積極的に維持されなければならないからである。メチル化阻害剤は、即時の細胞死をもたらすのではなく、メチル化によってサイレンシングされていた遺伝子のそれらによる増殖及び活性化を刺激する。しかしながら、脱メチル化によるアポトーシス促進性遺伝子及び細胞周期調節因子の再活性化は、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす。
【０００３】
ゲノムＤＮＡメチル化パターンのバリエーション、及びこの現象と発癌との相関の解析は、癌の治療及び診断に対する新規のアプローチの開発につながっている。
【０００４】
哺乳動物細胞では、独立にコードされた４つのメチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチル化に関与する：ＤＮＭＴ１（複製過程でのメチル化パターンを再現する）、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、及びＤＮＭＴ３Ｌ（胚発生の初期段階におけるデノボのメチル化に関与する）。
【０００５】
メチルトランスフェラーゼ阻害剤は３つのクラスに分けることができる：第一のクラスは、５−アザシチジン、ゼブラリン、２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）、及び５−フルオロ−２’−デオキシシチジン（５−Ｆ−ｄＣ）などの反応基質（シトシン）類似体からなり、これは、ＲＮＡ又はＤＮＡ鎖へのその取込みのために、極めて毒性が高い。別のクラスは、５−アザ−ｄＣを含む短いオリゴヌクレオチドからなり、これは、ＤＮＭＴ１に共有結合し、それにより、その活性を阻止することができる。第三のクラスは、非ヌクレオシド化合物：ＲＧ−１０８、ヒドララジン、プサマプリン（ｐｓａｍｍａｐｌｉｎ）、ＥＧＣＧ及びその誘導体、４−アニリンキノリン、クルクマス（ｃｕｒｃｕｍａｓ）からなる。しかしながら、これらの化合物の有用性は、不十分な特異性又は低いバイオアベイラビリティによって限定されている。
【０００６】
特許出願ＵＳ２００９００９９１０６  Ａ１（公開日２００９／０４／１６）には、キノリンの誘導体、特に、４−アニリンキノリンの誘導体が記載されている。これらの化合物は、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）の選択的阻害による、例えば、Ｃ−５位でのシトシンメチル化の効果的な阻害のための、ＤＮＡメチル化の調節に用いることができる。本解決法は、ＤＮＡメチル化の調節のための多くの４−アニリンキノリン誘導体の合成方法を提示する。本解決法は、癌及び血液疾患の治療におけるこれらの化合物の開発及び送達方法も提供する。
【０００７】
特許出願ＷＯ２００９０６７０３５（公開日２００９−０５−２８）には、４−フルフリルシトシン及び／又はその誘導体の調製方法、老化防止組成物（複数）及び老化防止組成物の製造におけるその使用が記載されている。４−フルフリルシトシン及び／又はその誘導体は一連の生物学的特性を有するので、皮膚のたるみや、つやの喪失を防止し、かつ皮膚の成長速度や全体的な成長能力を大きくは変化させずに、その美的外観を十分に改善する優れた老化防止効果を有する組成物として用いることができる。可能な限り高いプロセス効率を同時に得ながら、この化合物を製造する最適な方法が、医薬品及び化粧品産業におけるその有用性を特に強調して提示されている。
【０００８】
エピジェネティックなプロセスの調節に基づく新規の癌治療法の研究における大きな進歩にもかかわらず、ＤＮＡメチル化の効果的でかつ毒性のない小分子阻害剤の探索が続けられている。これまで潜在的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤と記載された化合物は、細胞株研究であまり効果がないことが分かった。そのため、新生物又は造血過形成などの、ＤＮＡメチル化レベル障害と関連する疾患の予防及び治療において使用し得るＤＮＡメチル化の効果的なモジュレーターが必要とされている。
【０００９】
本発明の目的は、癌の治療用の治療剤としての様々なシトシン誘導体、並びにモノ−及び多−１，４，５，及び６−置換シトシンの調製方法、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１阻害剤を得る方法を用意することである。
【００１０】
本発明は、できる限り最も高い合成収率に達しようと努めながら、上記の目的を達成する。
【００１１】
本発明は、シトシンの１，４，５，及び６−置換誘導体又は５，６−ジヒドロシトシンからなる、シトシンの類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグの調製方法であって、該類似体を、化学式
【化１】
2013522289.tif 000002
又は
【化２】
2013522289.tif 000003
（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｒ3、Ｒ4、２’−デオキシリボシルであり、Ｒ4は、アルキル又はアリールであり、Ｘは、Ｎ又はＣであり、ここで、式Ｉの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5は置換基ではなく、式Ｉ及び／もしくはＩＩの類似体中のＸがＣであるか、又は式ＩＩの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5とＲ6は、独立に、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ基、アルコキシル、アリールオキシル、アミノアルキル、アミノアリール、チオ基、スルホニル、スルフィニル、又はハロゲンである）によって記載することができることを特徴とし、ここで、シトシン及び４〜６当量の分量の芳香族アルデヒド又はアルキルアルデヒドを無水メタノール又はエタノールに添加し、得られたイミンを還元するために、ＮａＢＨ4又はＢＨ3×ＴＭＳを、アルデヒドに対して少なくとも１．１当量の量で混合物に導入し、その後、還元剤を塩酸で中和し、この混合物を蒸発させ、水に注ぎ入れ、酢酸エチル又はブタノールで抽出して、酢酸エチル又はブタノール中のアルコールと修飾シトシンの混合物を得；次に、分離した有機層を蒸発乾固させて、純粋な生成物を得るか、又は無機酸の水溶液で抽出し、使用される酸によって、シトシン塩酸塩もしくは他の修飾シトシン塩の水溶液を得、この場合、得られる塩はアルコールを含まず；その後、この溶液を水酸化物又は他のヒドロキシル基供与体で中和し、酢酸エチル又はブタノールで再び抽出し；有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得、その後、これをフリーズドライに供する、方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、芳香族アルデヒドを用いる場合、マグネシウムを、シトシンに対して少なくとも４当量の量で無水メタノール又はエタノールに添加し、マグネシウム粉末が完全に溶解するまで加熱し；次に、少なくとも２ｍｍｏｌのシトシンを添加し、次いで、シトシンに対して４〜６当量、最低でも４当量の芳香族アルデヒドを添加し；次に、反応混合物を、４５〜６５℃の範囲の温度に、少なくとも３時間置き、その後、還元剤、好ましくはＮａＢＨ4を、アルデヒドに対して少なくとも１当量の量で冷却した混合物に添加し；その後、混合物を室温で少なくとも１５分間保持し、次いで、無機酸溶液を添加し；次に、混合物を蒸発させ、水を再び添加し、この混合物を酢酸エチルで抽出して、生成物を単離し；この生成物及び芳香族アルコールを含有する分離した有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得るか、又は無機酸の水溶液で抽出して、使用される酸によって、修飾シトシン塩酸塩又は他の修飾シトシン塩の水溶液を得、この場合、得られる塩はアルコールを含まず；その後、この溶液を水酸化物又は他のヒドロキシル基供与体で中和し、酢酸エチルで再び抽出し；有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得る。
【００１３】
好ましくは、芳香族アルデヒドは、フルフリルアルデヒド又はベンジルアルデヒドである。
【００１４】
好ましくは、精製後の合成収率は少なくとも５０％であり、かつアルデヒドに依存する。
【００１５】
好ましくは、アルキルアルデヒドを用いる場合、３〜５当量の酢酸、少なくとも０．７５当量のシトシン、及び少なくとも３当量のアルデヒドを無水メタノール、ｎ−プロパノール、又はエタノールに添加し、混合物全体を少なくとも２時間沸騰させ；得られたイミンを、水又はメタノール及びヘキサンによる抽出で単離し、この場合、アルデヒドはヘキサンへと移動し、イミンは、残りの未反応基質とともに、水又はメタノール中に残り；次に、水層をブタノール又は酢酸エチルで抽出して、水層からイミンを単離し、溶媒を蒸発させ、得られる生成物をフリーズドライに供する。
【００１６】
好ましくは、最終生成物が還元イミンである場合、反応混合物を蒸発させ、塩化メチレンとＢＨ3×ＳＭｅ2のテトラヒドロフラン溶液とを添加し；反応を室温で少なくとも９時間実施し、還元が終了したとき、反応混合物を無機酸の水溶液で少なくとも１０時間処理し；その後、反応混合物を蒸発させ、水及び酢酸エチルもしくはブタノールで抽出して、純粋な生成物を得るか、又は無機酸の水溶液で抽出して、修飾シトシン塩酸塩の水溶液を得；次に、修飾シトシン塩酸塩の水溶液を中和した後、この溶液を酢酸エチル又はブタノールで抽出し；有機層を蒸発させて、純粋な生成物を得、その後、これをフリーズドライに供する。
【００１７】
好ましくは、シトシンの誘導体及びプロピオン酸アルデヒド又はアセチルアルデヒドの場合、生成物を、好ましくは、水／アセトン逆相クロマトグラフィーカラムで精製する。
【００１８】
本発明の次の主題は、シトシンの１，４，５，及び６−置換誘導体又は５，６−ジヒドロシトシンからなる、シトシンの類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグであって、該類似体を、化学式
【化３】
2013522289.tif 000004
又は
【化４】
2013522289.tif 000005
（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｒ3、Ｒ4、２’−デオキシリボシルであり、Ｒ4は、アルキル又はアリールであり、Ｘは、Ｎ又はＣであり、ここで、式Ｉの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5は置換基ではなく、式Ｉ及び／もしくはＩＩの類似体中のＸがＣであるか、又は式ＩＩの類似体中のＸがＮであるならば、Ｒ5とＲ5は、独立に、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ基、アルコキシル、アリールオキシル、アミノアルキル、アミノアリール、チオ基、スルホニル、スルフィニル、又はハロゲンである）によって記載することができることを特徴とする、シトシンの類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグである。
【００１９】
好ましくは、生理的に許容し得る塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩である。
【００２０】
本発明の次の主題は、該阻害剤が、上で言及したような、前述の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグからなることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１の阻害剤である。
【００２１】
好ましくは、阻害剤は、ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼの競合的阻害剤（４−Ｎ−プロピリデンシトシンを除く）であり、かつＳｓｓＩ酵素の活性部位を遮断する。
【００２２】
本発明の次の主題は、細胞内でのＤＮＡメチル化の活性が阻害されるように、細胞と、上で言及した前述の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグとを接触させることからなる、細胞内でＤＮＡメチル化を阻害する方法である。
【００２３】
好ましくは、細胞内でのＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性が阻害されるように、細胞と、上で言及した前述の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグとを接触させることからなる、細胞内でＤＮＡメチル化を阻害する方法。
【００２４】
好ましくは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）の分解によって阻害される。
【００２５】
好ましくは、接触段階は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）の活性の少なくとも５０％が阻害されるように、細胞と、生物学的有効用量の上で言及した前述の化合物又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグとを接触させることを含む。
【００２６】
本発明の次の主題は、細胞内のＤＮＡメチル化を阻害するための、ＤＮＡメチル化障害、特に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１活性の異常と関連する疾患の治療における、上記の類似体又は生理的に許容し得るその塩もしくはプロドラッグの使用である。
【００２７】
好ましくは、ＤＮＡメチル化障害と関連する疾患は、癌疾患を含む群から選択される。
【００２８】
本発明をより良く理解するために、以下の実施例による解決策を提示する。
【実施例】
【００２９】
使用される溶媒を標準的な方法に従って精製し、乾燥させた。以下の容易に入手できる試薬を反応において用いた：塩化トリメチルシリル−ＴＭＳＣｌ（ＰＯＣｈ，Ｐｏｌａｎｄ）、塩化ｐ−トルエンスルホニル（Ｆｌｕｋａ）、濃アンモニア水（Ｍｅｒｃｋ）、フルフリルアミン（Ｆｌｕｋａ）、フルフリルアルデヒド（Ｆｌｕｋａ）、パラホルムアルデヒド（Ｆｌｕｋａ）、プロピオン酸アルデヒド（Ｆｌｕｋａ）、ピコリン酸アルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ベンズアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐ−メチルベンズアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、５−ヒドロキシメチルフルフリルアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、水素化ホウ素ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ボラン−ジメチルスルフィド錯体（Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水酢酸（ＰＯＣＨ）、９９％酢酸（Ｃｈｅｍｐｕｒ）、トリエチルアミン（Ｃｈｅｍｐｕｒ）。ジクロロメタン／メタノール（８：２）を展開相として用いて、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ254プレート上で薄層クロマトグラフィー分析を行なった。２５４ｎｍでＵＶ吸光度を測定した。粒径０．０６３〜０．２００ｍｍのＭｅｒｃｋシリカゲル６０を充填したクロマトグラフィーカラム上で、逆相クロマトグラフィー分離を行なった。温水／メタノール（９９．９：０．１）を溶離液として用いた。1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ３００ＭＨｚスペクトロメーターで記録し、ＥＳ−ＭＳスペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱスペクトロメーターで記録した。
【００３０】
実施例１
芳香族アルデヒドとの反応（一般的方法）
【化５】
2013522289.tif 000006
マグネシウム（シトシンに対して５当量、１ｍｍｏｌ、３１６ｍｇ）を無水メタノールに添加し、マグネシウム粉末が完全に溶解するまで加熱した。次に、フラスコにシトシン（２．７０３ｍｍｏｌ、３００ｍｇ）及びフルフリルアルデヒド（１６．２１８ｍｍｏｌ、１５５６ｍｇ、１．３４３ｍＬ）又はベンジルアルデヒド（１６．２１８ｍｍｏｌ、１７２１ｍｇ、１．６４８ｍＬ）などの適当な芳香族アルデヒド（シトシンに対して６当量）を投入した。反応フラスコを５５℃の温度の乾燥オーブンに３時間置いた。反応の進行をＴＬＣ（フルフリルアルデヒドの場合は９：１又はベンジルアルデヒドの場合は２０：１のアセトン／水）でモニタリングした。次に、ＮａＢＨ4（アルデヒドに対して１．５当量、２４．３ｍｍｏｌ、９２３ｍｇ）を、冷却した反応混合物に添加した。この混合物を室温で約１５分間保持した。次に、ＨＣｌ水溶液を添加して、還元剤を分解し、反応混合物を中和した。
【００３１】
溶媒を蒸発させ、水を残渣に添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。分離した有機相、すなわち、生成物と、フルフリルアルコール又はベンジルアルコールなどの芳香族（通常、高沸点）アルコールとを含む酢酸エチル層を蒸発乾固させるか、又はＨＣｌ水溶液で抽出して、純粋な修飾シトシン塩酸塩溶液を得、その後、これをＫＯＨ溶液で中和し、酢酸エチルで再び抽出した。この有機層を蒸発乾固させて、乾燥形態の純粋な生成物を得た。精製後の合成プロセスの収率は、（アルデヒドによって）５５〜９５％の範囲であった（表１）。下記は、本発明による実施例のシトシン類似体生成物及びそのパラメータである；シトシン類似体の構造及び特性も表１に示す。
【００３２】
４−Ｎ−フルフリルシトシン
【化６】
2013522289.tif 000007
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ-  ｍ／ｚ  １９０［Ｍ−Ｈ］+、１９１［Ｍ］；ＥＳ+  ｍ／ｚ  １９２［Ｍ＋Ｈ］+、２１４［Ｍ＋Ｋ］+。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；６．３（ｑ，Ｊ＝０．７３Ｈｚ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｈ１，Ｈ−９）；６．４（ｑ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１０）；７．２（ｄ，Ｊ＝７．１，１Ｈ，Ｈ−６），７．６（ｑ，Ｊ＝０．７３Ｈｚ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１１）；７．９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ）；１０．３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
13Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２０．８８；９３．１０；１０７．１６；１１０．４６；１２５．５９；１２９．２７；１４１．８２；１５１．９６；１５６．５５；１６４．２９。
【００３３】
４−Ｎ−ピコリルシトシン
【化７】
2013522289.tif 000008
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ：２０２［Ｍ］；２２５［Ｍ＋Ｎａ］+、２４０［Ｍ＋Ｋ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．８（ｄ，Ｊ＝５．８５９Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．８（ｄ，Ｊ＝７．３２４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；７，３（ｄ，Ｊ＝７．８１３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１０）；７．７（ｄ，Ｊ＝１．４６５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−９）；８，１（ｔ，Ｊ＝５．８５９Ｈｚ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ−７）；８．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１１）；８．５（ｄ，Ｊ＝１．２９７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１２）；１０．３（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ−１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ６０．５９；９３．１５；１２３．４３；１３４．７２；１３５．２１；１４１．９１；１４８．９１；１４８．０８；１４８．８７；１５６．５６；１６４．５０。
【００３４】
４−Ｎ−ベンジルシトシン
【化８】
2013522289.tif 000009
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２０２［Ｍ＋Ｈ］+、２２４［Ｍ＋Ｎａ］+、２４０［Ｍ＋Ｋ］+、４０３［２Ｍ＋Ｈ］+。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．５（ｄ，Ｊ＝５．６５９Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．７（ｄ，Ｊ＝７．０８０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；７．２−７．３（ｍ，６Ｈ，Ｈ−６及びＨＢｚ）；８．０（ｔ，Ｊ＝５．８５９Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−７）；１０．３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ４５．０７；８０．２７；９６．２６；１２８．０７；１２８．２８；１２８．８５；１２９．３１，１２９．５３；１３９．７３；１４２．３３；１６０．６９；１６６．６３。
【００３５】
４−Ｎ−ｐ−メチルベンジルシトシン
【化９】
2013522289.tif 000010
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２１６［Ｍ＋Ｈ］+、２３８［Ｍ＋Ｎａ］+、４３１［２Ｍ＋Ｈ］+。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２．２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；４．５（ｄ，Ｊ＝５．６１５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．６（ｄ，Ｊ＝７．０８０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；７．２（ｄ，Ｊ＝６．８３６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−９，Ｈ−１０）；７．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１１，Ｈ−１２）；８．１（ｔ，Ｊ＝５．８５９Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−４）；１０．２（ｓ，１−Ｈ，ＮＨ−１）。
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２０．６４５；４２．６２３；９３．２０２；１２７．３９７；１２８．８１９；１３５．８６９；１３６．１２３；１４１．１２３；１４１．６１７；１５６．７１９；１６４．４５６。
【００３６】
４−Ｎ−（５−ヒドロキシメチル）フルフリルシトシン
【化１０】
2013522289.tif 000011
ＥＳ−ＭＳ；ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２２２［Ｍ＋Ｈ］+、２４４［Ｍ＋Ｎａ］+。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−１１）；４．４（ｄ，Ｊ＝５．７１４Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．２（Ｊ＝７，６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；５．６（ｄ，Ｊ＝７．０５０Ｈｚ，1Ｈ−Ｈ−５）；６．１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−９，Ｈ−１０）；８．１（ｔ，Ｊ＝５．４６３Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−７）；１０．３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−９）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ３６．３４；５５．６１６；９３．２３；１０７．６０；１０７．７５；１４１．８１；１５１．１８；１５４．１７；１５６．６６；１６４．２９。
【００３７】
実施例２
４−Ｎ−アリール−５−ヒドロキシメチルシトシンの合成
４−Ｎ−アリール−５−ヒドロキシメチルシトシンの合成
【化１１】
2013522289.tif 000012
４−Ｎ−アリールシトシン、例えば、４−Ｎ−フルフリルシトシン（５００ｍｇ、２．６１８ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１８１ｍｇ、６．０２０ｍｍｏｌ、２．３当量）を、トリエチルアミン（３．６ｍＬ、０．０２６ｍｏｌ）の水溶液（１０ｍＬ）が投入されているフラスコに入れた。混合物全体を８時間沸騰させ、その後、６０℃に予熱した乾燥オーブンに２４時間置いた。次に、溶媒を蒸発させ、乾燥残渣にエタノール又は酢酸エチルを添加した；このケースでは、エタノールを用い、生成物の沈殿が生じた。この生成物を濾過した後、濾液を再蒸発させ、沈殿させると（３回）、収率が８８％になった。シリカゲルで被覆したプレートと、溶離液としての（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：Ｅｔ3Ｎ  ８：１：０．５）又は（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：Ｅｔ3Ｎ  ４：１：０．５）を用いて、反応の進行をＴＬＣでモニタリングした；４−Ｎ−フルフリルシトシンの場合、溶離液は、（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：Ｅｔ3Ｎ  ４：１：０．５）であった。
【００３８】
最終生成物をアセチル化された４−Ｎ−アリール−５−ヒドロキシメチルシトシンとしたい場合、４−Ｎ−フルフリル−５−ヒドロキシメチルシトシン（１００ｍｇ、０．４５２４ｍｍｏｌ）などの生成物を、無水ピリジン（０．２２３ｍＬ、２．７１４ｍｍｏｌ、無水酢酸に対して５当量以上）を含むフラスコに入れ、無水酢酸（０．０５１ｍＬ、０．５４２ｍｍｏｌ、基質に対して１．２当量）を添加した。反応を室温で３時間実施した。次に、水（０．５ｍＬ）を反応混合物に添加し、ピリジンを蒸発乾固させた。生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を蒸発乾固させ、生成物をフリーズドライに供した。
【００３９】
４−Ｎ−フルフリル−５−ヒドロキシメチルシトシン
【化１２】
2013522289.tif 000013
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２２２［Ｍ＋Ｈ］+；２４４［Ｍ＋Ｎａ］+；４６５［２Ｍ＋Ｎａ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．１（ｄ，Ｊ＝４．９６１Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−１３）；４．５（ｄ，Ｊ＝５．２７４Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．０（ｔ，Ｊ＝５．１６６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；６．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１２）；６．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１１）；７．２（ｔ，Ｊ＝５．２１４Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−７）；７．３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１０）；１０．３（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ−１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ３６．５７；５７．１２；１０４．８７；１０６．８７；１１０．４４；１４０．０２；１４１．９４；１５２．２６；１５６．３９；１６３．０８。
【００４０】
４−Ｎ−フルフリル−５−アセチルヒドロキシメチルシトシン
【化１３】
2013522289.tif 000014
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２６４［Ｍ＋Ｈ］+；２８６［Ｍ＋Ｎａ］+；５４９［２Ｍ＋Ｎａ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１．９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；４．５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；４．７（ｓ，２Ｈ，Ｈ−１３）；６．２（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１２）；６．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１１）；７．５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１０）；７．６（ｔ，Ｊ＝５．２１４Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−７）；１０．５（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ−１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２０．８６；３６．５７；５７．１２；１０４．８７；１０６．８７；１１０．４４；１４０．０２；１４１．９４；１５２．２６；１５６．３９；１６３．０８。
【００４１】
４−Ｎ−ベンジル−５−ヒドロキシメチルシトシン
【化１４】
2013522289.tif 000015
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２３２［Ｍ＋Ｈ］+；２５４［Ｍ＋Ｎａ］+；４８５［２Ｍ＋Ｎａ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．２（ｄ，Ｊ＝４．９６１Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−１５）；４．５（ｄ，Ｊ＝５．２７４Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．０（ｔ，Ｊ＝５，１６６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；７．２−７．３（ｍ，５Ｈ，Ｂｚ）；７，３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６）；１０．４（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ−１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４５．４８；５７．１４；１０４．９６；１２６．６０；１２６．８２；１２７．０９；１２７．３９；１２８．１７；１３９．５３；１５６．５６；１６３．２２。
【００４２】
４−Ｎ−ベンジル−５−アセチルヒドロキシメチルシトシン
【化１５】
2013522289.tif 000016
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］+；［Ｍ＋Ｎａ］+；［２Ｍ＋Ｎａ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２．０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；４．５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；４．７（ｓ，２Ｈ，Ｈ−１４）；７．２−７．３（ｍ，５Ｈ，Ｂｚ）；７．５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−７）；１０．５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２０．８９；４５．２１；６０．３１；９９．３６；１２６．５４；１２６．８９；１２７．０８；１２７．３７；１２８．１４；１３９．５３；１４３．９０；１５６．１６；１６２．８０；１７０．５２。
【００４３】
実施例３
アルキルアルデヒドとの反応（一般的方法）
４−Ｎ−アルキルシトシン及び４−Ｎ−アルキリデンシトシンの合成
【化１６】
2013522289.tif 000017
酢酸（５当量、１８ｍｍｏｌ、１０８１ｍｇ、１．０３０ｍＬ）、シトシン（１当量、３．６０３ｍｍｏｌ、４００ｍｇ）、及びアルキルアルデヒド（４当量、１４ｍｍｏｌ）、例えば、プロピオン酸アルデヒド（８３６ｍｇ、１．０４８７ｍＬ）を、無水メタノール（１５ｍＬ）に添加した。混合物全体を３時間沸騰させた。反応の進行をＴＬＣ（アルデヒドによって、９：１又は２０：１のアセトン／水）でモニタリングした；このケースでは、溶離液は、９：１のアセトン／水であった。次に、混合物を蒸発乾固させ、逆相クロマトグラフィー（水／アセトン）を行なった。使用されるアルデヒドが、プロピオン酸アルデヒドよりも長い炭素鎖（ｎＣ  ｎ＞４）を有する場合、例えば、ヘキサナールの場合、水又はメタノール及びヘキサンによる抽出によってイミンを精製し、この場合、アルデヒドはヘキサンへと移動し、イミンは、残りの未反応基質とともに、水又はメタノール中に残った。次に、水層をブタノール又は酢酸エチルで抽出して、イミンを単離した。その後、溶媒を蒸発させ、生成物をフリーズドライに供した。
【００４４】
最終生成物を還元イミンとしたい場合、反応混合物を蒸発させ、塩化メチレン（１０ｍＬ）及びＢＨ3・ＳＭｅ2の２Ｍテトラヒドロフラン溶液（２当量、７．２ｍｍｏｌ、３．６ｍＬ）を残渣に添加した。この反応を室温で１２時間行なった。還元反応が終了した後、反応混合物をＨＣｌでさらに１２時間処理し、ボランを分解し、ジメチルスルフィド（（ＣＨ3）2Ｓ）を放出させた。
【００４５】
反応後、混合物を蒸発させ、エチルアルデヒド、又はこのケースのように、プロピオン酸アルデヒドの場合、生成物を逆相クロマトグラフィーカラム（水／アセトン）で精製した。反応で使用されるアルデヒドが原子３個よりも長い炭素鎖を有する場合、例えば、ヘキサナールの場合、混合物を水及び酢酸エチルで抽出して、有機層中に、修飾シトシンとアルコール、例えば、ｎ−ヘキサノールの混合物を得た。次に、分離した有機層を塩酸（又は別の無機酸）の水溶液で抽出して、純粋な、修飾シトシン塩酸塩（又は使用される酸によっては、他の塩）の水溶液を得た。分離した水溶液をＫＯＨ（又は他のヒドロキシル供与体）でそれぞれ中和し、酢酸エチル又はブタノールで再び抽出した；このケースでは、カラムを用いた。有機層を蒸発乾固させ、純粋な生成物をフリーズドライした。下記の及び表１のシトシン類似体は、この反応で得られた。
【００４６】
Ｎ−プロピレンシトシン
【化１７】
2013522289.tif 000018
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  １５２［Ｍ＋Ｈ］+；１８４［Ｍ＋ＭｅＯＨ＋Ｈ］+；２０６［Ｍ＋ＭｅＯＨ＋Ｎａ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ０．８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ−１０）；１．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−９））；５．２（ｑ，ＪA＝１４．８Ｈｚ，ＪB＝６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−８）；５．５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；７．２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７，７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ−７）；１０．５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１３．８６；２２．０２；３４．４７；５４．６０；８０．５１；９２．９１；１４２．５５；１５６．５８；１６５．２４；１７４．６６。
【００４７】
実施例４
Ｎ−グリコシド結合の加水分解による４−Ｎ−フルフリル−５−メチルシトシンの合成
フルフリルアミン（０．１７６ｍＬ、１．９８７ｍｍｏｌ）を４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−５−メチル−２−ピリミジン−１−イル−β−Ｄ−３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’デオキシリボフラノシド（Ｉ）（３８８ｍｇ、１．３２５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１５ｍＬ）溶液に添加した。反応フラスコを閉じて、５０℃の温度で２時間放置した。生成物を濾過すると、肉色の粉末が得られた。アセチル基を外すために、沈殿物をメタノール（１５ｍＬ）及び３２％アンモニア水（１５ｍＬ）を含むフラスコに入れた。混合物全体を１時間沸騰させた。次に、溶媒を減圧下で蒸発させた。乾燥残渣を塩化メチレン（２０ｍＬ）及び水（３×２０ｍＬ）で抽出した。生成物を含む水層を蒸発させて、白い粉末を収率９４％で得た。
【化１８】
2013522289.tif 000019
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ３２２［Ｍ＋Ｈ］+、３６０［Ｍ＋Ｋ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１．８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；１．９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’）；２．０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）；３．５（ｄ，Ｊ＝２，４Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−５’）；３．７（ｑ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；４．２（ｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−８）；５．０（ｍ，１Ｈ，５’−ＯＨ）；５．１（ｍ，１Ｈ，３’−ＯＨ）；６．１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；６，２（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−９）；６．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１０）；７．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１１）；７．８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６）；８．０（ｍ，１Ｈ，ＮＨ）。
【００４８】
４−Ｎ−フルフリル−５−メチル−２’−デオキシシチジン（３９９ｍｇ、１．２４５ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）とメタノール（２ｍＬ）の混合物に溶解させ、そこに、濃塩酸水溶液（０．３１ｍＬ、３．７３６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を約４時間沸騰させ、反応の進行をＴＬＣでモニタリングした。この混合物を１Ｍのメタノール性ＮａＯＨで中和した後、溶媒を蒸発させた。乾燥残渣を水（１０ｍＬ）とメタノール（３×１０ｍＬ）の間に分配し、次に、活性炭（３００ｍｇ）を有機層に添加した。濾過後、濾液を蒸発乾固させて、黄色がかった白い沈殿物を収率７４％で得た。反応の進行を、溶離液Ｂ：Ｒｆ（ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ  ６：４）０．４又はＣ：Ｒｆ（アセトン：水  １５：１）０．７中の、シリカゲルで被覆したＴＬＣプレート上でモニタリングした。
【化１９】
2013522289.tif 000020
ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ+  ｍ／ｚ  ２０６［Ｍ＋Ｈ］+、２３８［Ｍ＋Ｈ＋ＭｅＯＨ］+、２４４［Ｍ＋Ｋ］+。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１．３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；４．６（ｓ，２Ｈ，Ｈ−８）；６．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−９）；６．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１０）；７．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１１）；７．４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６）。
【００４９】
表１に記載された化合物の活性を阻害定数Ｋｉで特徴付けた。Ｋｉ値は、［1Ｈ］−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）をメチル基供与体として用いて、原核生物メチルトランスフェラーゼＳｓｓＩにより、ＤＮＡ（ｐＵＣ１８プラスミド）メチル化でインビトロで決定した。反応混合物は、０．１μｇ（０．５μｇ、１μｇのＤＮＡ）、１Ｕの酵素、及び２μＭの［1Ｈ］−ＳＡＭ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのｐＨ７．９のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含んでいた。メチル化のレベルは、３つの異なる阻害剤濃度でＤＮＡに取り込まれた放射能の測定から決定した（表１）。Ｋｉ値は、［１／Ｖｏ］と阻害剤濃度［Ｉ］との関係からディクソン（Ｄｉｘｏｎ）法で決定した。競合的阻害剤の場合、酵素−基質−阻害剤複合体の阻害定数であるＫｉ値は、［Ｖｏ／Ｓ］（式中、Ｓは基質濃度である）と阻害剤濃度［Ｉ］との関係からコーニッシュ−ボウデン（Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ）法で決定した。
【００５０】
表１に記載された化合物のインビトロ解析は、これらの化合物が、酵素の活性部位に直接結合する、メチルトランスフェラーゼＳｓｓＩの競合的阻害剤であることを示した。これは、その高い毒性の原因である、ＤＮＡ鎖、又はリボヌクレオシドの場合、ＲＮＡ鎖への取込みにその治療活性が依存する、現在治療で用いられているアザヌクレオシド（ビダザ（Ｖｉｄａｚａ）、ダコゲン（Ｄａｃｏｇｅｎ））に優るこれらの化合物の利点である。表１に記載の化合物は、ＨｅＬａ細胞株に対して毒性がない。
【表１】
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【国際調査報告】
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2013522289.tif 000029
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