(57)【要約】本発明は、創薬に有用な新しい細胞ベースのセンサーに関し、該センサーは、プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株の調節性分泌顆粒貯蔵レポーターポリペプチドとして、プロテアーゼによってトランスフェクトされた分泌顆粒のプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株を含み、該センサーは、調節性分泌顆粒のエキソサイトーシスのモジュレーターとして内因性分子または異種分子のいずれかを有し、このような前記顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、少なくとも、他のプロテアーゼによるｐＨ低下およびタンパク質分解などの、顆粒内に既に存在する状態に対する高耐性；エキソサイトーシス後の酵素活性；高度に特異的な開裂配列；非刺激のまたは基礎的な条件下での非常に低レベルの分泌；および、ハイスループットのロバストおよび高感度な検出のための細胞培養生存度、および、顆粒エキソサイトーシスとの適合性のある培地における高い信号対バックグラウンド活性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ベースのセンサーであって、
前記細胞ベースのセンサーは、
（ａ）分泌顆粒のプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する造血細胞株、
（ｂ）細胞株の分泌顆粒に貯蔵される、（ａ）の造血細胞株にトランスフェクトされたプロテアーゼレポーター、
（ｃ）（ａ）の細胞株の分泌顆粒の調節性エキソサイトーシスの内因性モジュレーターまたはトランスフェクトした異種モジュレーター、
（ｄ）分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの検出のための特異的な気質を含む、細胞ベースのセンサー。
【請求項２】
分泌顆粒のプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、マスト細胞、赤血球、巨核球、血小板、および、樹状細胞を含む骨髄細胞株からなる群から選択された、あるいは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および、ＮＫ細胞を含むリンパ細胞株からなる群から選択された、造血細胞またはその後代である、請求項１に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項３】
細胞は、ラットの好塩基球性白血病細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３、マウスの骨髄造血細胞株３２Ｄ、ナチュラルキラー細胞株ヒトＮＫ９２細胞株、ナチュラルキラー細胞株ヒトＹＴ細胞株、および、マウスマスト細胞マウスＭＣ／９細胞株からなる群から選択される、請求項１または２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項４】
エキソサイトーシスモジュレーターは、活性化または抑制されると、カルシウムによって誘発されるエキソサイトーシスを次々に調節または調整する細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、リン脂質、および、ＡＴＰのレベルの変化を誘発する、ペプチドである、請求項１乃至３に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項５】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターは、内因性の表面受容体またはトランスフェクトされた異種表面受容体である、請求項１乃至４に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項６】
表面受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＩＴＡＭモチーフを有する受容体、ＩＴＩＭモチーフを有する受容体、および、タンパク質チロシンキナーゼ受容体からなる群から選択される、請求項５に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項７】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターは、（ａ）リガンド結合ドメインを含む細胞外受容体と、（ｂ）細胞外領域でのリガンド結合によって誘発された受容体のオリゴマー形成後の細胞内カルシウムの増加のためのＩＴＡＭ配列を含む、Ｆｃ受容体の少なくとも膜貫通および細胞内領域とを含む、キメラ受容体である、請求項１乃至６に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項８】
細胞株へと安定的にトランスフェクトされ、分泌顆粒中に貯蔵される、プロテアーゼレポーターは、タンパク質分解と、造血細胞の顆粒内部の低ｐＨの環境に対する耐性を有するポリペプチドである、請求項１乃至７に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項９】
細胞株に安定的にトランスフェクトされた分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、セリンプロテアーゼである、請求項８に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１０】
セリンプロテアーゼは、アスパラギン酸後の開裂を伴うＡｓｐ−ａｓｅ様活性を含む酵素、フェニルアラニン、トリプトファン、および、チロシン後の開裂を伴うキマーゼ様活性を含む酵素、リジンまたはアルギニン後の開裂を伴うトリプターゼ様活性を含む酵素、あるいは、バリン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、または、システイン後の開裂を伴うエラスターゼ様活性を含む酵素を含む、造血細胞の顆粒で自然に貯蔵されるセリンプロテアーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１１】
セリンプロテアーゼは、ヒトグランザイムＡ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、および、Ｍ、マウスグランザイムＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｌ、および、Ｎ、ウシグランザイムＢ、チンパンジーグランザイムＢ、モノデルフィスのグランザイムＢ、および、ウマグランザイムＢからなる群から選択されるグランザイムである、請求項８乃至１０に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１２】
セリンプロテアーゼは、ヒトキマーゼ、ヒトカテプシンＧ、ヒト好中球エラスターゼ、および、ヒトプロテイナーゼ３から選択される、請求項８乃至１０に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１３】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、ヒト、ラット、チンパンジー、および／または、ウマ種からのグランザイムＢであり、レポーターエキソサイトーシスの検出のために用いられる基質は、イソロイシンまたはバリンから選択されたアミノ酸をＰ４に、グルタミン酸、メチオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、アスパラギン酸、トレオニン、トリプトファン、チロシン、または、バリンから選択されたアミノ酸をＰ３に、プロリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン酸、アラニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、グルタミン酸、グリシン、または、ヒスチジンから選択されたアミノ酸をＰ２に、アスパラギン酸をＰ１に含む、請求項１乃至１２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１４】
基質は、バリン、セリン、グリシン、チロシン、および、フェニルアラニンから選択される非荷電アミノ酸をＰ’で、および、セリン、アラニン、グリシン、チロシン、ロイシン、または、グルタミン酸から選択されたアミノ酸をＰ２’に含む、請求項１３に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１５】
基質は、配列ロイシンをＰ４に、グルタミン酸をＰ３に、プロリンまたはトレオニンをＰ２に、アスパラギン酸をＰ１に、セリンをＰ１’に、および、グリシンまたはロイシンをＰ２’に含む、請求項１３または１４に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１６】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、ヒト、ラット、および／または、マウス種のグランザイムＡであり、レポーターエキソサイトーシスの検出に用いられる基質は、イソロイシン、バリン、または、グリシンから選択されたアミノ酸をＰ４に、アラニン、グリシン、セリン、フェニルアラニン、または、チロシンから選択されたアミノ酸をＰ３に、アスパラギンまたはフェニルアラニンから選択されたアミノ酸をＰ２に、アルギニンまたはリジンをＰ１に、リジンおよびメチオニンの脂肪族側鎖などの長い直線状の疎水性アミノ酸、または、アラニンのような非分岐疎水性アミノ酸またはセリンのような極性残基をＰ１’に、および、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、および、チロシンから選択されたアミノ酸をＰ２’に含む、請求項１乃至１２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１７】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、ヒトキマーゼであり、レポーターエキソサイトーシスの検出に用いられる基質は、グリシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、プロリン、グルタミン、または、ロイシンから選択されたアミノ酸をＰ４に、アラニン、バリン、ロイシン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、または、グルタミン酸から選択されたアミノ酸をＰ３に、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、トレオニン、プロリン、ロイシン、アラニン、または、バリンから選択されたアミノ酸をＰ２に、チロシンまたはフェニルアラニンをＰ１に、セリンまたはグリシンをＰ１’に、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、または、グリシンから選択されたアミノ酸をＰ２’に、および、バリン、ロイシン、アラニン、または、グリシンから選択されたアミノ酸をＰ３’に含む、請求項１乃至１２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１８】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、ヒト、ラット、および、マウス種のプロテイナーゼ３であり、レポーターエキソサイトーシスの検出に用いられる基質は、バリンおよびアラニンのような小さな脂肪族残基を含むアミノ酸をＰ４に、アラニンおよびバリンのような小さな脂肪族残基を含むアミノ酸をＰ３に、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、および、リジンから選択された荷電アミノ酸をＰ２に、システイン、ノルバリン、バリン、アラニン、および、メチオニンから選択されたアミノ酸をＰ１に、アルギニンおよびリジンから選択された正荷電アミノ酸、あるいは、アラニンまたはバリンのような小さな脂肪族残基を含むアミノ酸をＰ１’に、および、アスパラギン酸、グルタミン酸、または、グルタミンから選択されたアミノ酸をＰ２’に含む、請求項１乃至１２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項１９】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、ヒト、ラット、および、マウス種の好中球エラスターゼであり、レポーターエキソサイトーシスの検出に用いられる基質は、プロリンを、あるいは、バリンおよびアラニンのような小さな脂肪族残基を含むアミノ酸をＰ４に、アラニンおよびバリンのような小さな脂肪族残基を含むアミノ酸を、あるいは、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択された負荷電アミノ酸をＰ３に、アラニン、および、バリンのような小さな脂肪族残基を含むアミノ酸を、または、アスパラギン酸、および、グルタミン酸から選択された負荷電アミノ酸をＰ２に、イソロイシン、ノルバリン、バリン、アラニン、および、メチオニンから選択された疎水性または極性アミノ酸をＰ１に、疎水性、極性、および、負荷電アミノ酸をＰ１’に、および、疎水性または負荷電アミノ酸をＰ２’に含む、請求項１乃至１２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のセンサーを得るための方法であって、
前記方法は、
適切なプロモーターの制御下で、請求項８乃至１９の分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターを分類するベクターによって、請求項４乃至６の調節性分泌顆粒エキソサイトーシスの内因性モジュレーターを有する請求項２または３の造血細胞株を変形する工程を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１乃至１９のセンサーを得るための方法であって、
前記方法は、
適切なプロモーターの制御下で、請求項４乃至７の調節性分泌顆粒エキソサイトーシスの発現のためのベクターによって、および、適切なプロモーターの制御下で、請求項８乃至１９の分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターを分類するベクターによって、請求項２または３の造血細胞株を変形する工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項４乃至７の調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターを分類するためのベクターは、細胞の表面での受容体発現に有用なシグナルペプチドと、陽性細胞の表面検出および／または分離のためのタグとを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの直感的な発現のためのプロモーターは、ヒトまたはマウスの伸張因子１−アルファプロモーター（ｈＥＦ１α、配列番号：１）、ヒトからのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫプロモーター）、マウスおよびラット種からのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター（配列番号：２）、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウィルス５’−ＬＴＲプロモーター（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーター）からの５’ＬＴＲ（配列番号３）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの発現に有用なプロモーターは、誘導性プロモーターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クミン酸誘導性プロモーター、および、プロゲステロン誘導性プロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの発現のためのベクターは、表面の過剰発現のためのグリコシル化配列を含む、請求項２１乃至２５に記載の方法。
【請求項２７】
グリコシル化配列は、配列番号４を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの構成的発現のためのベクターは、Ｐ−ＭｏＭＬＶ−５’ＬＴＲ−ＳＰ−ｃｍｙｃ−ｔａｇ−ＶＧＳ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ（配列番号５）である、請求項２１乃至２７に記載の方法。
【請求項２９】
分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターを分類するためのベクターは、自然に発生する配列、または、造血細胞株での高発現のためのコドン最適化配列のいずれかを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項３０】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの発現のためのプロモーターは、強力なタンパク質発現プロモーターに対する培地からなる群から選択される、請求項２０乃至２９に記載の方法。
【請求項３１】
プロモーターは、ｈＣＭＶおよびＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター（配列番号１０）、ＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター（配列番号３）、伸張因子１−αプロモーター（配列番号１）、ＲＳＶプロモーター（配列番号２）のキメラプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、および、チミジンキナーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
顆粒貯蔵レポーターは、誘導性プロモーターの制御下で発現する、請求項２０乃至２９に記載の方法。
【請求項３３】
誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クミン酸誘導性プロモーター、および、プロゲステロン誘導性プロモーターからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１つがエキソサイトーシスモジュレーターとして機能し、もう１つがエキソサイトーシスモジュレーターの特異リガンドとして機能する、少なくとも２つの分枝間での相互作用を試験する方法であって、
前記方法は、
ａ）細胞の生存、エキソサイトーシス、および、分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの酵素活性に適合する培地で、請求項１乃至１９の細胞ベースのセンサーをインキュベートする工程、
ｂ）エキソサイトーシスモジュレーターの特異的なリガンドを追加する工程、
ｃ）顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの特異的な基質を追加する工程、
ｄ）放出されたレポーターの特異的な基質によって、（顆粒から細胞外培地へと放出された）放出されたレポーターポリペプチドの酵素活性を検出する工程、を含む、方法。
【請求項３５】
相互作用の試験は、単一または多重アッセイで行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの酵素活性は、比色分析、蛍光、ＦＲＥＴ、時間分解ＦＲＥＴ、または、発光基質からなる群から選択される細胞非透過性基質を用いて、測定される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
顆粒分泌プロテアーゼの検出は、ペプチド修飾したルシフェリン基質を用いた発光測定によって行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
蛍光基質は、ローダミン１１０（Ｒ１１０）のアミノ基の各々に共役結合した特異的なペプチドからなるローダミン１１０ベースのプロテアーゼ基質であり、酵素的開裂後、非蛍光性のビスアミド基質は、２段階の工程で、最初に蛍光モノアミドに、その後、さらに強い蛍光Ｒ１１０に変えられる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
顆粒分泌プロテアーゼの検出は、ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）にＣ−末端結合したプロテアーゼ特異的ペプチド基質を用いる、４０５ｎｍでの比色分析検出によって、７−アミド−４−メチルクマリンＣ−末端結合したプロテアーゼ特異的ペプチド基質を用いる、３８０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光波長とによる蛍光によって、または、７−アミド−トリフルオロメチルクマリンにＣ−末端結合したプロテアーゼ特異的ペプチド基質を用いる、４００ｎｍでの励起と５０５ｎｍでの発光とによる蛍光によって行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの活性の検出は、信号増幅のための酵素カスケードの生成を含み、レポーター分泌プロテアーゼの活性は、分泌されたプロテアーゼによって活性化されたチモーゲンによって検出される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４１】
ヒト、ラット、チンパンジー、または、ウマのグランザイムＢの検出に用いられるチモーゲンは、配列番号１１で列挙される変異型ヒトプロ−カスパーゼ３である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターによって活性化されたチモーゲンの酵素活性は、比色分析、蛍光、ＦＲＥＴ、時間分解ＦＲＥＴ、または、発光基質からなる群から選択される細胞非透過性基質を用いて測定される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
チモーゲンは、分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターによって活性化されない限り、酵素活性を欠いた、環状に変更した酵素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
一対の２つの分子が結合するタンパク質を測定するための、請求項１乃至１９の細胞ベースのセンサーの使用であって、
測定されるタンパク質に結合する分子の１つは、特異的な免疫グロブリンＧ、特異的な免疫グロブリンＥ、または、特異的な免疫グロブリンＡであり、測定されるタンパク質に結合するもう１つの分子は、結合後に測定されるタンパク質のオリゴマー形成を誘発する、細胞ベースのセンサーの使用。
【請求項４５】
創薬において分子間の相互作用を試験するための、または、薬物の診断および検出のためのタンパク質などの分子を、あるいは、食品産業におけるサンプル、環境サンプル、および、製薬産業における、あるいは、ＩｇＥアレルゲン相互作用を試験するための分子を、抗アレルギー化合物を試験するための分子を、および／または、アレルゲンを検出するための分子を定量化するための、請求項４４に記載の、請求項１乃至１９の細胞ベースのセンサーの使用。
【請求項４６】
１つのみの細胞ベースのセンサーは１つの反応容器に含まれ、１つのみの顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、特異的なリガンドのエキソサイトーシスモジュレーターとの反応後に検出される、単一のアッセイにおける請求項１乃至１９の細胞ベースのセンサーの使用。
【請求項４７】
少なくとも２つの異なる細胞ベースのセンサーは、異なる一対のエキソサイトーシスモジュレーター−顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターを各々が含む単一の反応容器内に含まれ、少なくとも２つの異なる顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、各々が異なるエキソサイトーシスモジュレーターを含む少なくとも２つの異なる特異的なリガンドの反応後に、検出される、多重アッセイにおける請求項１乃至１９の細胞ベースのセンサーの使用。
【請求項４８】
化合物がエキソサイトーシスを調整するかどうかを試験するために、請求項１乃至１９の細胞ベースのセンサーを含むキット。
【請求項４９】
分泌された異種プロテアーゼレポーターの検出のために少なくとも１つの特異的な基質を含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
細胞ベースのセンサーは、測定される分析物のためのエキソサイトーシスモジュレーターとしてＩｇＥ、ＩｇＧ、または、ＩｇＡ受容体と、ＩｇＥ、ＩｇＧ、または、ＩｇＡに結合された分析物のオリゴマー形成を誘発するために第２の分子とを含む、請求項４８または４９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬、診断、および検体の決定に有用な新しい細胞ベースのセンサーに関し、該センサーは、プロフェッショナルな（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）調節性エキソサイトーシスを有する細胞株の調節性分泌顆粒に貯蔵されたレポーターポリペプチドとして、プロテアーゼによってトランスフェクトされた分泌顆粒のプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株を含み、および該センサーは、調節性分泌顆粒のエキソサイトーシスのモジュレーターとして内因性分子または異種分子のいずれかを有し、このような前記顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターは、少なくとも、他のプロテアーゼによるｐＨ低下およびタンパク質分解などの、顆粒内に既に存在する状態に対する高耐性；エキソサイトーシス後の酵素活性；高度に特異的な開裂配列；非刺激の又は基礎的な条件下での非常に低レベルの分泌；およびハイスループットのロバストおよび高感度な検出のための細胞培養生存度および脱顆粒との適合性のある培地における高度な信号対バックグラウンド（ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）活動を有する。
【０００２】
細胞ベースのセンサーがエキソサイトーシスモジュレーターの特定のリガンドによってインキュベートされるとき、レポーターポリペプチドは顆粒から細胞外培地に放出され、このように放出されたレポーターポリペプチドの酵素活性は、特定の基質によって検出される。本発明はまた、同じ反応容器において、各々が異なる１対のエキソサイトーシスモジュレーター−顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターである、少なくとも２つの細胞株を混合することによって、および各々の顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの高度に特異的な基質によってエキソサイトーシスを検出することによって、多重アッセイの開発を可能にする。
【０００３】
このような高感度の細胞ベースのセンサーは、１つがエキソサイトーシスモジュレーターとして作用し、もう１つはエキソサイトーシスモジュレーターの特定のリガンドとして作用する、少なくとも２つの分子間の相互作用を試験するのに有用である。そのようなセンサーの使用の例は次のとおりである：創薬における分子間の相互作用を試験し、薬物の診断および検出のためのタンパク質などの分子、またはいくつかのサンプルにおける、例えば、食品産業、環境サンプルおよび製薬産業における分子を定量化する。
【背景技術】
【０００４】
新しい療法を発見するプロセスは、伝統的に、以下の工程を含む：患者または適切なモデル系における、（１）薬物標的の同定、（２）標的の確認、（３）標的の活性に影響を与える化合物のためのスクリーニング、（４）毒性に関する鉛化合物の試験、（５）副作用に関する鉛化合物の試験、および（６）鉛化合物の代謝および安定性の検査。
【０００５】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、創薬プロセスの初期段階の１つである。それは、今後の検査に対する最も有望な候補を選択するための１日当たりの何十万もの化学化合物の試験を可能にする。化合物は治療標的に対抗して試験される。現代のマススクリーニングの最近の開発は、ゲノミクスによって確認された増え続ける数の標的に、およびコンビナトリアルケミストリーの方法を使用して合成された化合物のライブラリの拡張に大いに影響を受ける。
【０００６】
例えば、原形質膜は、レセプトローム（ｒｅｃｅｐｔｏｒｏｍｅ）と呼ばれる、１０００以上の異なるタンパク質を含む、２０を超える異なるファミリーの受容体に対する宿主の役割を果たす。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーは、単一の最も大きな片のレセプトロームを表すが、レセプトロームはまた、トール様受容体、インテグリン受容体、低密度リポタンパク質受容体、タンパク質チロシンキナーゼ受容体およびホスファターゼ、サイトカイン受容体、および受容体として機能するいくつかのイオンチャネルさえも含む。
【０００７】
「薬物受容体」の概念として始まった、細胞外受容体と細胞表面受容体との間の相互作用の治療上の利用は、２０世紀の生物医科学において重大な思想および洞察の１つであると考えられる。標的同定、スクリーニング技術および標的確認の継続的な進歩のために、レセプトロームベースの創薬の試みが、恐らくこれから何十年間も生産的であろう。驚くことではないが、ほとんどの専門家は、レセプトロームが新薬の開発につながるようなゲノムにおいて最も大きな部分を占め、ＧＰＣＲが変わらずその先頭に立っていると結論付ける。
【０００８】
大量スクリーニングのための第１の技術の１つは、対象の受容体を選択的に標的とする高度に特異的な活性放射リガンドの使用に依存する競合放射リガンド結合アッセイである。競合放射リガンド結合アッセイは、典型的に実行されるように、特定の分子標的に関する薬物親和性の信頼できる推定を提供するが、（アゴニスト、アンタゴニストまたは部分アゴニストのいずれかとしての）有効性に関連する情報を与えない。伝統的に、薬理学者は、リガンド親和性および受容体特異性を測定するための及び、生理学的関連性をＧＰＣＲを原因とするための、競合放射リガンド結合に依存してきた。競合放射リガンドスクリーンは、似通った−ＨＴＳ技術（ｎｅａｒ  −ＨＴＳ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）に適用可能であり、なぜなら、それらは、一連の受容体に対して焦点を当てた化学的ライブラリの効果的なスクリーニングのために非常に貴重であると証明されてきた、９６＋ウェルのプレートにおいて実行することができるからである。競合放射リガンド結合アッセイはまた、化学構造を薬物の副作用と関連付けるのに有用である。
【０００９】
たとえ放射リガンドスクリーンが、異なる細胞の発現系にわたって一貫していても、それらには代替技術についての研究を促したいくつかの欠点がある。例えば、放射リガンドアッセイは、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストの間で区別はしない。しかし、より重要なことに、放射リガンドアッセイは、リガンド結合の下流に生じる反応を検出せず、このようなものは、オーファン受容体を脱オーファン化するのに適していない。なぜなら、定義によると、これらのｏＧＰＣＲは未知のリガンドを有するからである。さらに、放射リガンド結合アッセイは、典型的に、内因性の受容体部位（オルソステリック部位）へのリガンド結合を検出するのに向けられており、それ故、アロステリック部位と呼ばれる、内因性の部位とは異なる部位で効果を発揮する小分子モジュレーターを検出しないかもしれない。
【００１０】
放射リガンド結合アッセイとは対照的に、機能アッセイは、リガンドが、例えばＧＰＣＲにおいて、シグナル伝達をどのように調節するかを明らかにする情報が豊富なリガンド特性をもたらす。このような機能アッセイは、受容体に特異的なシグナル伝達経路の結果として生成される、二次メッセンジャーの検出に依存する。このような方法の１つは、シグナルとしてカルシウム感受性フルオロフォアによって測定されるカルシウムの細胞内上昇を使用するが、一方で、他の方法は、受容体の活性化または阻害を測定するために、ルシフェラーゼのようなレポーターに結合されたカルシウムまたはｃＡＭＰ感受性のプロモーターを使用する。カルシウムの細胞内上昇は、カルシウムを結合する細胞内の色素としてその蛍光を増加させるカルシウム感受性の色素によって、またはセレンテラジン誘導体が加えられるときに発光シグナルを生成するエクオリンと呼ばれるカルシウム感受性タンパク質によって測定される。しかし、両方のカルシウムアッセイには以下の欠点がある：（１）それらはインバースアゴニストのためのスクリーニングに使用することはできない；（２）リガンド付加およびカルシウム上昇との間の短時間の間隔は、同時のリガンド付加およびカルシウム測定のための非常に特殊な装備を必要とする；および（３）シグナルは増幅されない。ＳＰＡ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ＨＴＲＦ ｃＡＭＰ（Ｃｉｓｂｉｏ）およびＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（商標）（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）などの、細胞または膜ベースのｃＡＭＰ蓄積を測定する多くの技術がある。レポーター遺伝子ベースのスクリーニング技術は、二次メッセンジャーの増加が、レポーター分子、例えばルシフェラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ＳＥＡＰ、およびベータ−ガラクトシダーゼの発現を誘発する、細胞ベースのアッセイである。
【００１１】
理想的なスクリーニング技術は、単純で、非放射性で、高度で、信号対雑音比を有し、均質で、最小の試薬付加を有し、およびロボットの自動化を促進するマイクロタイタープレートフォーマットに適用可能であるべきである。別の考察は、近位または遠位のシグナル伝達工程を測定するかどうかである。標的活性に近位の事象の測定は、偽陽性の発生を減少させる；しかしながら、シグナル増幅のために、信号対雑音比は高まり、シグナル伝達カスケードを下げかねない。カルシウムまたはｃＡＭＰ感受性のプロモーターのような二次メッセンジャーに結合されたレポーター分子の使用の別の欠点は、これらのアッセイが、高度なバックグラウンドを有する通常弱いプロモーターである誘導可能なプロモーターに依存し、レポーターが、溶菌液において又は分泌された生成物としてのいずれかでの転写と翻訳の後に測定される必要があることである。レポーター分子がリガンド−タンパク質の相互作用後、細胞外の培地に急速に分泌される方法の使用は、創薬スクリーニングにおいて望ましく、なぜなら、これによって、細胞内レポーターを放出する溶菌工程を除くことができるからである。また、特定のフルオロフォアによる細胞内カルシウムの測定のような方法の使用は、転写および新しいタンパク質合成の必要性を排除し、そのため、アッセイ時間を減少させる。アッセイ時間のこの減少は、均質な３４５６ナノプレートスクリーニングのような方法において非常に重要であり、そこで、反応体積は非常に少ないため、試薬蒸発が特に関連付けられるようになる。また、スクリーニングのためのナノプレートの使用は、非常に少量のレポーター分子または二次メッセンジャーを定量化するための非常に高感度な方法を必要とし、そのため、任意にシグナル増幅カスケードと結合され得るレポーター分子が所望される。しかし、バックグラウンドはまた、シグナル増幅カスケードにおいて増幅されるため（特にシグナル増幅カスケードにおける第１工程によるバックグラウンド）、可能な限り低いシグナルバックグラウンドを有する高度に特異的なレポーター分子が必要とされる。最終的に、ナノプレートの各ウェルへの１つまたは２つの試薬付加を用いる方法が、創薬プロセスにおいて好ましい。したがって、所望のスクリーニング技術は、次のものの組合せであるべきである：（１）高感度なレポーターベースの方法；（２）低い偽陽性率の二次メッセンジャー方法；（３）転写のない短いアッセイ時間の二次メッセンジャー方法；（４）安定したシグナルのタンパク質レポーターベースの方法；（５）均質方法のアッセイ生成物の最小試薬の付加または分離；（６）高度な信号対雑音比を有するロバストなシグナル；（７）高度な信号対雑音比を保ちながらアッセイ体積を減少させるための増幅可能なシグナル、および（８）大多数のヒトの新薬の開発につながるようなゲノムに使用され得る、普遍的な読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）
【００１２】
予め形成されたレポーターの調節性エキソサイトーシスを有する細胞は、上記の条件のいくつかを満たし得、そのため、このような細胞ベースのセンサーは、創薬および化合物の特徴付けにおいて高い有用性を有し得る。内因性のベータヘキソサミニダーゼは、顆粒消失のための最も広く使用されるリソソームレポーターであるが、このタンパク質は、低い感受性レポーターであると考えられる。例えば、Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３＿１９９９．６３−７５）は、前骨髄球性のＨＬ−６０細胞が、酵素学的に測定された細胞放出の酵素としてベータ−ヘキソサミニダーゼと一緒に細胞外液を集めるための遠心分離に代わるろ過を使用する、９６ウェルのマイクロプレートの方法を始めるために分化され利用された方法を発展させた。この方法は、分泌を誘発するために分化される必要のある非プロフェッショナル細胞を使用し、ベータ−ヘキソサミニダーゼレポーターおよび化学誘引物質受容体の両方は、内因性であり、そのため、発現が少なく、すべての上記の組み合わせの要因は、結果として、スクリーニングのために１ウェル当たり少なくとも２５０，０００個の細胞を必要とする方法をもたらす。したがって、著者は、これらの方法の主な利点が、細胞外液を集めるための遠心分離に代わるろ過の使用であると主張する。
【００１３】
別のアッセイにおいて、Ｎａａｌ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ． Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２００４  Ｎｏｖ  １； ２０（４）：７９１−６． Ｎａａｌ  ｅｔ  ａｌは、単一工程における内因性のベータ−ヘキソサミニダーゼの細胞外環境への放出に基づいた環境的毒性評価および創薬に関する化学的ライブラリをスクリーニングするためのバイオセンサーとしてのＲＢＬ−２Ｈ３マスト細胞の使用を可能にするために、直接的な顆粒消失アッセイを発展させてきた。著者は、ハプテン−ＩｇＥ相互作用を検出するための及び顆粒消失のために重要なｓｙｋチロシンキナーゼ活性の薬理学的インヒビターをスクリーニングするためのこのような方法の使用を期待する。これらの著者はまた、レポーターとして内因性のベータ−ヘキソサミニダーゼを使用し、ハプテン−ＩｇＥ相互作用を検出するための及び顆粒消失に関係するチロシンキナーゼの薬理学的インヒビターのスクリーニングのための方法を使用するだけである。さらに、この方法において、接着細胞のみが使用され、そのため、アッセイ前の１６〜２４時間の細胞培養の間に貯蔵された基礎的なベータ−ヘキソサミニダーゼ活性および細胞培地において使用されるウシ血清に通常は存在するベータ−ヘキソサミニダーゼ活性の両方が原因で、バックグラウンドを排除するために、各ウェルの洗浄工程が必要とされる。個々のウェルの洗浄工程はスループットを限定し、コストを増加させ、および自動分注ロボットによってＨＴＳ環境において行われるとき、アッセイのバックグラウンドに対するシグナルは、ベータ−ヘキソサミニダーゼ活性を含むウェル中の残留量が原因で減少される。最終的に、ベータヘキソサミニダーゼ酵素がプロフェショナルな調節性エキソサイトーシスとともに最も造血性である細胞株によって発現されるため、この酵素は、多重アッセイではなく、単一アッセイの開発のみを可能にする。
【００１４】
第３の方法において、Ｇｒａｍｉｎｓｋｉ，  ＧＦ  ｅｔ  ａｌ  （Ｇｒａｍｉｎｓｋｉ  ＧＦ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９３）  ，２６８，  ８，  ５９５７−５９６４を参照）は、リガンド−受容体相互作用の検査および大量薬物スクリーニングに使用される機能アッセイを介してＰＫＡまたはＰＬＣを活性化する受容体に対する化学薬品の効果を迅速に評価するために、プロテインキナーゼＡまたはプロテインキナーゼＣを活性化する受容体によって媒介されたカエルのメラノフォア（ｆｒｏｇ  ｍｅｌａｎｏｐｈｏｒｅｓ）において色素拡散を使用してきた。この方法の主な欠点は、受容体リガンド相互作用の機能評価のために非哺乳類由来の細胞を使用すること、および蛍光または化学発光の方法と比較されると、比色検出が低感度であるということである。
【００１５】
リソソームの標的パートナーと、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質との間の融合タンパク質の細胞内の移動および分泌を研究するために他の方法が開発されてきた。第１の方法において、Ｅｌ  Ｍｅｓｋｉｎｉ，  Ｒ  ｅｔ  ａｌ  （Ｅｌ  Ｍｅｓｋｉｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２００１  ，  １４２−２，  ８６４−８７３を参照）は、刺激された放出を経たＬＤＣＶ内のＧＦＰ蓄積をもたらす、ＡｔＴ−２０細胞、ＰＣ−１２細胞、および主要な下垂体細胞においてキメラタンパク質のルーチング（ｒｏｕｔｉｎｇ）を調査するために、ＧＦＰとのプレプロニューロペプチドＹの融合を使用してきた。２００２年に、Ｒａｊｏｔｔｅ（ＷＯ２００４／０１６２１２）は、顆粒消失を検出および定量化するためにＲＭＣＰをＧＦＰに融合することによって技術を発展させてきたと主張したが、この方法は、細胞によって放出されたＧＦＰの感受性が低いことから、移動を測定するためにのみ有用であるが、定量化には有用ではない。
【００１６】
他の研究者は、ＧＰＣＲをＲＢＬ−２Ｈ３のようなプロフェショナルな分泌細胞へとトランスフェクトしてきたが、内因性のベータ−ヘキソサミニダーゼは常に、顆粒消失を測定するのに使用されるレポーターであって、接着細胞のみがアッセイに使用され、そのため、さらなる洗浄工程がバックグラウンドを排除するために必要とされることでスループットを損ない、この酵素によって単一アッセイの開発が可能になるだけである。また、ＧＰＣＲのような表面受容体のＲＢＬ−２Ｈ３などの造血細胞への発現に使用されるプロモーターおよび条件は、一貫した結果を見出すために慎重に最適化される必要がある。例えば、アデノシン３受容体は、単独で顆粒を消失しないが、準最適な量のＩｇＥ−アレルゲンによって誘発された顆粒消失を強めるＧＰＣＲと考えられる。したがって、現在の最先端技術は、ＨＴＳに使用するのに適した顆粒消失に基づくロバストで高感度なセンサーを発展させる方法を教示していない。
【００１７】
本発明に至るまで、創薬に有用な造血細胞ベースのセンサーを発展させるための又は診断のための分子を検出するための分泌リソソームに貯蔵されたレポーターとしての、グランザイムＡ、Ｂ、ヒトキマーゼ、プロテイナーゼ３または好中球エラスターゼのような高度に特異的なセリンプロテアーゼの使用に関する報告はなかった。現在の最先端技術は、比較的多数の細胞である、少なくとも５０，０００の細胞からのこの酵素の活性を測定することによって、レポーターとして内因性のベータ−ヘキソサミニダーゼを利用するか（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３：１４４５−１４５０，  １９７９；  ａｎｄ  Ｄｒａｇｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １  １３：３２８９−３２９８，  ２０００を参照）、または分泌リソソームの運動を追跡するためにＧＦＰに融合されるリソソーム酵素が、実時間でモニタリングされる。
【００１８】
本発明は、コストを下げるために、ハイスループットスクリーニングに対して適用可能である最小の工程を有し、少ない数の細胞からの分泌された酵素の検出のためのレポーター酵素の感受性基質を使用する、（高速力学の（ａ  ｆａｓｔ  ｋｉｎｅｔｉｃ））、ロバストな検出のための高度な信号対バックグラウンドを有する、少なくとも２つの分子間の相互作用を試験するのに有用なプロテアーゼレポーターの顆粒消失に基づいた高感度の造血細胞ベースのセンサーを記載する。この細胞ベースのセンサーは、単一又は多重のいずれかで使用され得る。多重アッセイは、単一アッセイ以上のいくつかの利点、例えば：スループットの増加、およびデータ品質、またはあらゆるアッセイが内的統制として同じウェルで行った他のアッセイを有するため改善されたデータ品質さえ損なうことのない、コスト低減を有している。
【００１９】
＜発明の目的＞
＜定義＞
トランスデューサーは、シグナルを１つの形態から別の形態に変換する任意の装置として定義される。例えば、本発明の細胞ベースのバイオセンサーは、細胞表面でのリガンドを対受容体の相互作用を、以前に細胞の内部で貯蔵されたレポーターポリペプチドの分泌に変換し、そのため、レポーターの酵素活性の測定は、リガンド−受容体相互作用に関係する。
【００２０】
センサーは一種のトランスデューサーである。生物学的シグナルを変換するセンサーはバイオセンサーと呼ばれる。有機体はすべて、機械的なセンサーの機能に類似した機能を有する生物学的センサーを含む。これらのほとんどは、次のものに感受性のある特殊化した細胞である：光、動作、温度、磁場、重力、湿気、振動、圧力、電場、音、および外的環境の他の物理的態様；伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）、有機体の動作、および付属肢の位置（固有受容）などの、内部環境の物理的態様；毒素、栄養素、およびフェロモンを含む、大量の環境的分子；グルコース濃度、酸素濃度、またはオスモル濃度などの、内部の代謝環境の多くの態様；およびホルモン、神経伝達物質、およびサイトカインなどの、様々な内部の信号分子。生物学的感受性のある成分を使用することによって生物学的センサーを模倣する人工センサーは、バイオセンサーと呼ばれる。
【００２１】
調節性エキソサイトーシスは、特殊化した細胞が、神経伝達物質、ホルモン、酵素、ペプチドまたは低分子量物質（例えばカテコールアミン、グルタミン酸など）を分泌するプロセスである。エキソサイトーシス中に、細胞の活性化は、積荷を含有する小胞（ｃａｒｇｏ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の細胞表面膜（原形質膜）への送達につながる一連の細胞内の事象を生じさせ、最終的に、これらの小胞のサブセットの原形質膜の特殊化した領域と融合する。細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、しばしば、エキソサイトーシスのための引き金となる一方で、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、リン脂質、およびＡＴＰを含む他の細胞内のシグナルもまた、Ｃａ２＋によって引き起こされるエキソサイトーシスを調節または調整する。
【００２２】
分泌顆粒または分泌小胞または分泌リソソームは、選択された分泌物のための貯蔵プールとして機能する特殊化した細胞内オルガネラである。分泌顆粒は、刺激またはモジュレーターによって細胞の周囲に向かって移動し、それらの膜は細胞膜と融合し、それらの内容物の負荷（ｃｏｎｔｅｎｔ  ｌｏａｄ）が放出される。ほとんどの細胞タイプにおいて、分泌顆粒は完全に新しい種類のオルガネラを表わすように見えるが、様々な造血細胞および特定の他の細胞タイプの顆粒は、リソソームといくつかの特性を共有する。
【００２３】
造血細胞は、骨髄幹細胞に由来する細胞であり、脊髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板およびいくつかの樹状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、いくつかの樹状細胞）の両方を含む血球型をすべて含む。
【００２４】
調節性エキソサイトーシスを有する細胞株：本明細書で使用されるように、用語「調節性エキソサイトーシスを有する細胞」、「プロフェショナルな分泌細胞株」、および「プロフェショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株」は、交換可能に使用され得る。本発明の方法に関して、重要な細胞株は、プロフェショナルな調節性エキソサイトーシスを有する造血細胞株である。これらの用語はすべて、任意の又は全ての続く世代である、それらの後代を含む。すべての後代が故意の又は故意でない変異によって同一とはかぎらないことが理解される。細胞ベースのセンサーのための調節性エキソサイトーシスを有する有用な細胞株は、アゴニストリガンド結合後のＧＰＣＲなどの、細胞表面受容体のようなエキソサイトーシスのモジュレーターによって培地に放出される顆粒貯蔵レポーターを発現するように一般に操作される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）宿主細胞である。
【００２５】
レポーターポリペプチドまたはレポーターは：研究者が、細胞培養、動物または植物における対象の別の遺伝子に付ける遺伝子である。特定の遺伝子は、それらを発現する有機体にそれらが与える特性が容易に同定され測定されるため、またはそれらが選択可能なマーカーであるため、レポーターとして選ばれる。レポーター遺伝子は、対象の遺伝子が、細胞または有機体の個体群によって吸収されたか、またはそれらにおいて発現されたかを決定するために一般に使用される。レポーター遺伝子は、本明細書において、特定の造血細胞のようなプロフェショナルな分泌細胞株の分泌顆粒の内部で貯蔵されたポリペプチドであり、刺激またはエキソサイトーシスのモジュレーターによって細胞外の培地へ放出される。
【００２６】
プロテアーゼ：タンパク質は、ビルディングブロックとしてアミノ酸から作られ、ここで、アミド結合は、１つのアミノ酸のＣＯＯＨと次のアミノ酸のＮＨ２との間で形成され、ペプチド結合を形成する。用語、プロテアーゼは、ペプチダーゼと同義語であり、これはペプチド結合ヒドロラーゼを意味し、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含む。それ故、中性ｐＨおよび周囲温度でペプチド結合の加水分解を触媒する能力は、プロテアーゼを特徴付け、ここで、様々な触媒機構は、様々なその他の関連していないタンパク質の骨組に位置付けられる。現在、６種類のプロテアーゼがある：セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、プラスメプシン）、メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼ。ペプチド結合を開裂するのに使用される機構は、システインおよびトレオニン（ペプチダーゼ）または水分子（アスパラギン酸およびメタロペプチダーゼ及びグルタミン酸ペプチダーゼ）の求核を有するアミノ酸残基を作ることを含み、その結果、これはペプチドカルボニル基を攻撃することができる。求核分子を作るための１つの方法は、触媒性のトライアドによるものであり、ここで、ヒスチジン残基は、求核分子としてセリン、システインまたはトレオニンを活性化するために使用される。すべてのプロテアーゼ中の基質結合部位は、加水分解前に基質の適切な配列を確実なものにし、転移状態の安定化を通して触媒の促進を助けるかなり多くのアミノ酸残基からなる。結合部位は、多くのサブ部位に分けられ、その各々は、複数の相互作用によって基質の単一のアミノ酸残基を確実なものにする。特異的な側鎖との相互作用に加えて、ペプチドバックボーンの結合もまた、触媒において重要な役割を果たす。プロテアーゼの特異性は、触媒の残基に隣接し、酵素にペプチドまたはタンパク質の基質に対して特異的に優先順位を与えるサブ部位の文脈においてしばしば研究されている。プロテアーゼ特異性の分析について、ＢｅｒｇｅｒおよびＳｃｈｅｃｈｔｅｒ（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  Ｉ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （１９６８）  ３２：  ８９８−９０２を参照）の命名法が使用される。この命名法によると、プロテアーゼ反応部位中に存在するアミノ酸は、Ｓ４、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、ＳＶ、Ｓ２’、Ｓ３’と呼ばれ、これらは、配列Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’を有する基質中に存在するアミノ酸に相当し、ここで、Ｐ１−Ｐ１’ペプチド結合が開裂される。例えば、パパインシステインプロテアーゼファミリーは、Ｓ３からＳ１’まではっきり定義された部位を有し、いくつかの個別のプロテアーゼは、より拡大された特異性を有する。例えば、グランザイムＢペプチド、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅは、Ｐ４としてＩｌｅ、Ｐ３としてＧｌｕ、Ｐ２としてＰｒｏおよびＰ１としてＡｓｐを有する。いくつかのプロテアーゼに関して、開裂されたペプチド結合後のアミノ酸残基、すなわちＰｎ’もまた特異性に寄与する。例えば、マウスグランザイムＢは、基質の効果的な開裂のためのＰ２’���置でグリシンの必要条件を有する。また、ヒトグランザイムＢの好適な拡大された基質は、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ρ２’−Ρ３’−Ρ４’）である。
【００２７】
酵素として、プロテアーゼは、それらの基質親和性、反応の触媒速度およびそれらの基質特異性または触媒有効性によって速度論的に特徴付けられ得る。ＭｉｃｈａｅｌｉｓおよびＭｅｎｔｅｎの方程式は、単純な１の部位の反応に関する反応の速度および特異性を記載する。ＭｉｃｈａｅｌｉｓおよびＭｅｎｔｅｎは、基質Ｓの生成物Ｐへの転換のプロセスを、以下に示されるような２つの工程に分けた：
【００２８】
【化１】
2013535195.tif 000002
【００２９】
第１の反応工程は、基質の酵素（触媒）への結合を記載し、定数Ｋｍは、生成物形成が基質の解離プロセスと比較して非常にゆっくりしている条件下で平衡の解離定数に相当する。Ｋｍは、半分の最大反応速度Ｖｍａｘ／２での基質濃度と等しい。この場合、Ｋｍは、解離定数にとても近く、したがって、酵素に対する基質の親和性を記載する。より複雑な反応について、定数は、酵素に結合されるすべての基質の解離平衡を反映する。第２の反応工程は、触媒速度または生成物形成の速度を記載し、代謝回転数、Ｋｃａｔとして呼ばれる。代謝回転速度は、１つの単位時間につき１つの活性部位当たりの生成物Ｐの最大数として定義される。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式は、飽和条件下、すなわち、基質Ｓの濃度が酵素濃度よりはるかに大きいときにのみ有効である。プロテアーゼの別の重要な特性は、それらの基質特異性である。速度Ｋｃａｔ／Ｋｍは、酵素−基質の対の触媒有効性の基準を定義する。それは、遊離酵素および遊離基質の特性および反応を指す。それ故、酵素の特異性は、競合する基質のための酵素または単一の基質のための競合する酵素の特異性の基準である。プロテアーゼは、それらの開裂配列が標的基質の内部である場合のエンドペプチダーゼ、またはそれらが開裂のためのアミノ末端またはカルボキシ末端の基を必要とする場合のエキソペプチダーゼとして分類される。したがって、エキソペプチダーゼは、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼに分類される。
【００３０】
いくつかの造血細胞の顆粒は、グランザイムのようなプロテアーゼ、マスト細胞プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテイナーゼ３、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−９のようなメタロプロテアーゼ、カテプシンＡおよびＧのようなセリンプロテアーゼカテプシンおよびシステインカテプシンを自然に貯蔵する。グランザイムおよびマスト細胞プロテアーゼは、広範囲に文書化された（ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ）セリンプロテアーゼに対するそれらの高度のアミノ酸配列の同一性；合成セリンプロテアーゼ基質を開裂するそれらの能力、および典型的なセリンプロテアーゼインヒビターによるそれらの阻害のために、セリンプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリーに属する（例えばＳｍｉｔｈ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９９６，  ６０：  ５５５−５６２を参照）。グランザイムおよびマスト細胞プロテアーゼの酵素活性は、トリプターゼ様（アルギニンまたはリジンの後の開裂）、Ａｓｐ酵素様（アスパラギン酸後の開裂）、キマーゼ様（フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンの後の開裂）、エラスターゼ様（バリン、アラニン、イソロイシン、メチオニンまたはロイシンの後の開裂）として分類されてきた。
【００３１】
カテプシンは、球状のプロテアーゼの種類であり、細胞内のペプチドヒドロラーゼとして最初に記載されるが、いくつかのカテプシンはまた、細胞外の機能を有する。カテプシンＢ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｏ、Ｓ、Ｖ、ＷおよびＸは、パパインファミリーのシステインプロテアーゼであり、最大で最もよく知られている種類のカテプシンを表わす。それらは、主として、リソソームの酸性環境における末端の非特異的な大量のタンパク質分解を媒介する細胞内のプロテアーゼとして機能する（例えばＴｕｒｋ  Ｖ，  Ｔｕｒｋ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔｕｒｋ  Ｄ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００１；２０：４６２９−３３を参照）。カテプシンＡおよびＧは、両方ともセリンプロテアーゼであるが、カテプシンＧが、エンドペプチダーゼである一方で、カテプシンＡは、カルボキシペプチダーゼである。カテプシンＤおよびＥは、アスパラギン酸プロテアーゼである。カテプシンは、不活性のプロ酵素として合成され、成熟したおよび活性な酵素になるように処理される。
【００３２】
グランザイム：グランザイムは、それらの基質特異性において異なる構造上関連するセリンプロテアーゼである。それらは、ＣＤ８陽性のＴリンパ球およびナチュラルキラー細胞などの、細胞毒性リンパ球においてだけでなく、精巣においても自然に発現される。現在まで、次の５つの異なるグランザイムが、ヒトにおいて記載されてきた：グランザイムＡ、Ｂ、Ｈ、ＫおよびＭ（例えばＧｒｏｓｓｍａｎ，  ＷＪ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２００３）  １５，  ５４４−５５２を参照）。
マウスにおいて、これらのグランザイムの４つの明確なオルソログ（Ａ、Ｂ、ＫおよびＭ）が発見され得、グランザイムＣは、グランザイムＨの最もあり得るマウスのオルソログのようである。マウスのゲノムは、いくつかの追加のグランザイム（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＬおよびＮ）をコード化し、それらのうちＤ、Ｅ、ＦおよびＧは、それに細胞毒性リンパ球によって発現され；Ｌは偽遺伝子として現れ、Ｎは精巣において発現される。
【００３３】
調節性エキソサイトーシスのモジュレーターは、調節性エキソサイトーシスのプロセスに関係する下流にある、１つまたはそれ以上のシグナル伝達経路を変更することができる化合物、分子、または組成物を指す。活性のこの変更は、阻害（すなわち、化合物、分子または組成物は、エキソサイトーシスの「インヒビター」である）の他に、刺激、誘発または増強（すなわち、化合物、分子または組成物は、エキソサイトーシスの「刺激物」、「誘導体」または「エンハンサー」である）も包含する。これらのモジュレーターは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の及び／又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のアッセイを使用して確認される。これらのアッセイにおいて、対照は、サンプル間の比較を可能にするために使用される。
【００３４】
創薬は、それによって薬物が発見される及び／又は設計されるプロセスである。本明細書で使用されるように、創薬は、親和性、副作用、バイオアベイラビリティに関する薬物の識別および修飾だけでなく、再プロファイリングとしても知られるプロセスである、新しい治療指標において予め市場へ出された薬物の効果を試験することも含む。
【００３５】
遺伝子は、遺伝の基本となる物理的および機能的な単位である。生化学的な用語で、遺伝子は、異なる機能性生成物（すなわちタンパク質またはＲＮＡ分子）をコード化する特定の染色体上の特定の位置にあるヌクレオチドの順序付けされた配列である。本明細書で使用されるように、遺伝子は、コード配列から作られるだけでなく、コード配列（例えばプロモーター、エンハンサー）およびイントロンの転写の制御に関係する隣接するＤＮＡ領域を含むことができる。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡの上に存在する配列は、５’の非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’の非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムの形態の両方を包含する。遺伝子のゲノムの形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列により遮断されたコード領域を含む。イントロンは、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へ転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーなどの調節性の要素を含み得る。イントロンは、核または一次転写物から取り除かれるか又は「切り出され（ｓｐｌｉｃｅｄ  ｏｕｔ）」；それ故、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に、発生期のポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を明白にするように機能する。
【００３６】
「安定して導入された」あるいは「安定して形質転換された」あるいは「安定して形質導入された」あるいは「安定してトランスフェクトされた」あるいは「安定して電気穿孔された」は、それらのゲノムへ統合された所望の外来性ＤＮＡを有する細胞の一部分を指す。使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術によって、細胞の一部分だけが、外来性ＤＮＡをそれらのゲノムへ統合し得る。これらの成分を確認し選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）をコード化する遺伝子は、対象の遺伝子と共に宿主細胞へと一般に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびピューロマイシンなどの、薬物に対する耐性を与えるものを含む。選択可能なマーカーをコード化する核酸は、検知可能な翻訳産物をコード化するベクターと同じベクター上で宿主細胞へ導入され得るか、または別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸によって安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって確認され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、その一方でそれ以外の細胞は死ぬ）。
【００３７】
表面受容体は、細胞の表面に生じ、細胞外の環境と相互作用し、特異的なプロモーターの転写を最終的に調整し、結果的に特定遺伝子の転写をもたらす方法で細胞内の環境に関する情報を送信するかまたは変換する分子を指す。表面受容体の例は、チロシンキナーゼ受容体、イオンチャンネル受容体、サイトカイン受容体、走化性因子ペプチド受容体などの、ケモカイン受容体またはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ニューロペプチド受容体、光受容体、神経伝達物質受容体、またはポリペプチドホルモン受容体である。
【００３８】
７つの膜貫通性の受容体、７ＴＭ受容体、ヘプタヘリカル受容体としても知られる、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、およびＧタンパク質連結型受容体（ＧＰＬＲ）は、細胞外のＮ末端および細胞質のＣ末端を有する７つの膜貫通ドメインによって特徴付けられる膜貫通性受容体の大きなタンパク質ファミリーである。ＧＰＣＲへのリガンド結合は、小さなＧタンパク質共役、シグナル伝達経路の開始、および最終的に細胞反応につながる構造変化を促進する。これらの受容体を結合し活性化するリガンドは、感光性の化合物、芳香、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質を含み、ペプチドに対する小分子から大きなタンパク質まで大きさが異なる。Ｇタンパク質共役受容体は、イースト、植物、および特に動物を含む、より高度な真核細胞においてのみ見られる。Ｇタンパク質共役受容体は、多くの疾患に関係するが、すべての現代の医薬品の約半分の標的でもある。
【００３９】
ＧＰＣＲは、類似した分子機構を介して作用する。細胞外の刺激によるＧＰＣＲの活性化は、受容体の構造変化を引き起こし、これは、結果的に、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）の中間結合および活性化をもたらす。Ｇタンパク質は、本来ヘテロトリマーであり、異なる遺伝子によってコード化された、アルファ（α）、ベータ（β）、およびガンマ（γ）のサブユニットからなる。アルファサブユニットは、ＧＤＰとＧＴＰの結合の原因である。リガンドのＧＰＣＲへの結合は、結果的に、ＧＤＰ結合した形態からＧＴＰ結合した形態へとアルファ（α）サブユニットを転位し、βγダイマーからのα-ＧＴＰの解離を介するヘテロトリマーの活性化につながる。α-ＧＴＰおよびβγダイマーの両方は、二次メッセンジャー分子（例えば、カルシウム、ｃＡＭＰなど）の生成を介して細胞内部にシグナルを送信する様々な作用因子の活性を調節する。少なくとも１７のＧアルファ（Ｇα）遺伝子があり、Ｇタンパク質のメンバーは、Ｇαｉ／ｏ、Ｇαｑ／１１、ＧαｓおよびＧα１２／１３と称された、４つの主類へとグループ化され得る（例えばＰｒｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＡＭおよびＨａｍｍ  ＨＥ．  Ｓｃｉ． ＳＴＫＥ  ２００４，  ｒｅ３  ａｎｄ  Ｃａｂｒｅｒａ−Ｖｅｒａ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ． Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．  ２００３  Ｄｅｃ； ２４（６）：７６５−８１．を参照）。本明細書で使用されるように、ＧＰＣＲは、Ｇαｉ／ｏ、Ｇαｑ／１１、ＧαｓおよびＧα１２／１３のいずれかに結合された受容体を含む。
【００４０】
内因性の酵素のチロシンキナーゼ活性（ＲＴＫ）を有する受容体は、多くのポリペプチド成長因子、サイトカインおよびホルモンに関する高親和性の細胞表面受容体である。ヒトゲノムにおいて確認される９０の特有のチロシンキナーゼ遺伝子のうち、５８の遺伝子は、受容体チロシンキナーゼタンパク質をコード化する。ほとんどのＲＴＫは、単一サブユニットの受容体であるが、いくつか、例えばインシュリン受容体は、多重結合の複合体として存在する。各モノマーは、単一の膜貫通ドメイン、細胞外のＮ末端領域および細胞内のＣ末端領域を有する。細胞外のＮ末端領域は、細胞外のリガンドに結合する非常に大きなタンパク質ドメイン（例えば特定の成長因子）からなる。細胞内のＣ末端領域は、調節性ドメイン、および特異的にチロシンアミノ酸をリン酸化する、これらの受容体のキナーゼ活性の原因であるドメインからなる。
【００４１】
キメラ受容体は、１つの受容体の部分を別の受容体の部分と組み合わせた人工受容体、タンパク質フラグメント、タグおよびそれらの任意の組み合わせに基づいており、これは、それらの全体のドメインおよび部分の両方を含む。一般に、キメラタンパク質または「融合タンパク質」は、少なくとも別のペプチド配列または別のポリペプチドに融合する所望のタンパク質産物の少なくとも１つの部分を含むポリペプチドである。
【００４２】
ＩＴＡＭベアリング受容体：免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）は、免疫系の特定の細胞表面タンパク質の細胞質尾部において２度繰り返される４つのアミノ酸の保存配列である。モチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含み、これは記号ＹｘｘＬで表される。これらの記号の２つは、典型的に、分子の尾部において７〜１２の間のアミノ酸によって分離される（ＹｘｘＬＸ（７−１２）ＹｘｘＬ）。ＩＴＡＭは、免疫細胞のような特定の造血細胞におけるシグナル伝達に重要である。したがって、それらは、Ｔ細胞受容体の複合体のＣＤ３鎖およびゼータ鎖、Ｂ細胞受容体の複合体のＣＤ７９アルファ鎖およびＣＤ７９ベータ鎖、および特定のＦｃ受容体などの、重要な細胞シグナル伝達分子の尾部において見られる。これらのモチーフ内のチロシン残基は、受容体分子のそれらのリガンドとの相互作用後にリン酸化され、細胞内ストアからのカルシウムの放出に関係する他のタンパク質との相互作用のための部位を形成する。１つの受容体の細胞外のリガンド結合ドメインおよび少なくともＩＴＡＭベアリング受容体の膜貫通性および細胞内の領域を含む、特定のキメラ受容体が発達され得る。このようなキメラ受容体は、架橋結合後、細胞内ストアからカルシウムの放出を誘発する。
【００４３】
アンタゴニストまたは受容体インヒビターは、タンパク質の少なくとも１つの生物活性をダウンレギュレートする薬剤を指す。最も広い意味で使用されるアンタゴニストは、特異的なタグの生物学的活性を、部分的にまたは完全に、遮断、阻害、または中和する任意の分子を含む。アンタゴニストはまた、遺伝子の発現をダウンレギュレートする、または存在する発現されるタンパク質の量を減らす化合物であり得る。それらは、タンパク質の１つの生物活性を、競合的に、非競合的に、及び／又はアロステリック的に阻害することができる。
【００４４】
アゴニストまたは受容体活性化因子は、タンパク質の生物活性を模倣、誘発、またはアップレギュレートする（例えば、強める又は補足する又は増強する）薬剤を指す。アゴニストは、野生型のタンパク質または野生型のタンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体であり得る。アゴニストはまた、遺伝子の発現をアップレギュレートする又はタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる化合物であり得る。アゴニストはまた、ポリペプチドと別の分子、例えば、標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増加させる化合物であり得る。
【００４５】
細胞外のシグナルは、シグナルと、直接または間接的に相互作用する細胞表面タンパク質を介して、細胞内で変換される環境における分子または変化を含む。細胞外のシグナルまたはエフェクター分子は、細胞表面タンパク質の活性をいくつかの方法で特別に変更する、任意の化合物または物質を含む。このようなシグナルの例は、限定されないが、アセチルコリンなどの分子、細胞表面に結合する成長因子およびホルモン、及び／又は細胞内受容体およびイオンチャネルを含み、このような受容体およびチャネルの活性を調整する。この用語はまた、細胞受容体の活性を調整し、それによって細胞内の機能に影響を与える、まだ確認されていない物質を含む。このような細胞外のシグナルは、特異的な細胞表面受容体の活性を調整することよって特異的疾患を処置するために使用され得る潜在的な薬理作用のある薬剤である。
【００４６】
オーファン受容体は、特異的な生理リガンドが記載されていない受容体に与えられる呼称である。
【００４７】
シグナル伝達は、細胞の環境から細胞膜を通る化学シグナルの処理であり、リン酸化、イオンチャンネルの活性化、グアニンヌクレオチド結合タンパク質の中間物を介するエフェクター酵素の活性化、イノシトールフォスフェートの形成、アデニリルシクラーゼの活性化、及び／又は転写因子の直接的な活性化（または阻害）などの、いくつかの機構の１つまたはそれ以上を介して生じ得る。
【００４８】
ベクターまたはプラスミドベクターまたはプラスミド：用語「ベクター」は、核酸配列が、複製することができる細胞への導入のために挿入され得る担体核酸分子に言及するために使用される。核酸配列は、「外因性」であり得、これは、ベクターが導入されている細胞に対して異質であること、該配列が細胞内ではあるが通常見られない宿主細胞の核酸内の位置での配列と相同性があることを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。当業者は、標準の組換え型の技術によってベクターを構築するのに必要なものを十分備えているだろう（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｔ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９６）を参照し、それら両方は引用によって本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、転写することができるＲＮＡをコード化する核酸を含む任意のタイプの遺伝的構成物を指す。いくつかの場合において、その後、ＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産出においては翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主細胞中の操作可能に結合したコード配列の転写および起こり得る翻訳に必要な核酸配列を指す、様々な「制御配列」を含むことができる。転写および翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他の機能も果たし、下記に記載されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００５０】
プロモーター：「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、核酸配列の特異的な転写を開始するために、調節性タンパク質および分子が結合し得る、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの遺伝要素を含み得る。句「動作可能に位置した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ）」「動作可能に結合した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」「制御下」および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列に関連した、正確な機能的な位置及び／又は配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御することを意味する。
【００５１】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のために開始部位の位置を決めるように機能する配列を含む。この最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチド転換酵素遺伝子のためのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーターなどの、ＴＡＴＡボックスを欠く幾つかのプロモーターにおいて、開始部位自体に重なる分離した要素は、開始の場所を固定する助けとなる。付加的なプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の上流の領域３０  １  １０  ｂｐに位置するが、多くのプロモーターは、同様に開始部位の下流の機能要素を含むと示されてきた。「プロモーターの制御下」でのコード配列をもたらすために、当業者は、転写の読枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の転写開始部位の５’の終結部分（５’ｅｎｄ）を、選択されたプロモーターの下流（すなわち、３’）に位置付ける。「上流の」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コード化されたＲＮＡの発現を促進する。
【００５２】
プロモーター要素間のスペーシングはしばしば柔軟であり、そのため、要素が互いに対して逆さまになるか又は移動するときに、プロモーター機能が保存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター要素間のスペーシングは、活性が低下し始める前に、別々に５０ｂｐまで増加され得る。プロモーターに依存して、個々の要素は、転写を活性化するために協力してまたは独立してかのいずれかで機能することができるようである。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関係するシス作用の調節配列を指す、「エンハンサー」と併用して使用され得るか又は使用され得ない。
【００５３】
プロモーターは、コード化するセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’の非コード配列を分離することによって得られ得るように、核酸分子に自然に関係するプロモーターであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸分子に自然に関係するエンハンサーであり得る。あるいは、特定の利点は、その自然環境における核酸分子に通常は関係していないプロモーターを指す、組換え型または異種のプロモーターの制御下で、コード化する核酸セグメントを位置付けすることにより得られるだろう。組換え型または異種のエンハンサーは、その自然環境における核酸分子に通常は関係しないエンハンサーも指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、およびあらゆる他のウイルス、または原核細胞または真核細胞から分離したプロモーターまたはエンハンサー、および「自然発生でない」、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素を含む、プロモーターまたはエンハンサー、及び／又は発現を変更する変異を含み得る。プロモーターは、異種または内因性であり得る。
【００５４】
ポリＡシグナルまたは終結シグナル：本発明のベクターまたは構成物は、一般に、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写物の特異的な終結に関係するＤＮＡ配列を含む。したがって、特定の実施形態において、ＲＮＡ転写物の産出を終了する終結シグナルが熟考される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するのにインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で必要とされ得る。
【００５５】
真核細胞系において、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位をさらすように新しい転写物の部位特異的な開裂を可能にする特異的ＤＮＡ配列をも含み得る。これは、特殊化した内因性のポリメラーゼにシグナルを送り、転写物の３’の終結部分に約２００にわたるアデノシン残基（ｐｏｌｙＡ）を加えるようにさせる。このｐｏｌｙＡの尾部によって修飾されるＲＮＡ分子は、より安定して現れ、より効率的に翻訳される。したがって、真核細胞に関係する他の実施形態において、そのターミネーターがＲＮＡの開裂のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがさらに好ましい。ターミネーター及び／又はポリアデニル化部位の要素は、メッセージレベルを高め、カセットから他の配列への読み取りを最小限にする役割を果たすことができる。
【００５６】
シグナルペプチドまたはシグナル配列：シグナルペプチドは、タンパク質の翻訳後輸送を指示する、短い（３−６０のアミノ酸長）ペプチド鎖である。シグナルペプチドはまた、標的シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド、または局在化シグナルと呼ばれ得る。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、（サイトゾルで合成される）タンパク質を、核、ミトコンドリア基質、小胞体、クロロプラスト、アポプラストおよびペルオキシソームなどの、特定のオルガネラに向ける。タンパク質が輸送された後、いくつかのシグナルペプチドは、シグナルペプチターゼによってタンパク質から開裂される。
【００５７】
チモーゲンまたはプロ酵素：チモーゲン（またはプロ酵素）は、不活性の酵素前駆体である。チモーゲンは、活性酵素になるために、生化学的な変化（活性部位を明らかにする、または活性部位を明らかにするために構造を変更する加水分解反応など）を必要とする。生化学的な変化は、通常、前駆体酵素の特異的部分がそれを活性化するために開裂されるリソソームにおいて生じる。活性化で放出されるアミノ酸鎖は、活性化ペプチドと呼ばれる。
【００５８】
チモーゲン性（Ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）：チモーゲン性またはチモーゲン性の指標は、処理された酵素の活性の、例えばプロテアーゼによる、任意の所与の基質上のチモーゲンの活性に対する比率である。それはチモーゲンがどれくらい効果的に抑制されるかの基準であり、大きい数はチモーゲンの重要でない活性に相当する。例えば、カスパーゼ−３が、約１０，０００のチモーゲン性の指標を有する一方で、カスパーゼ−８は１００、カスパーゼ−９は１０、および組織プラスミノーゲン活性化因子は２乃至１０のチモーゲン性の指標を有する（例えばＳｔｅｎｎｉｃｋｅ  ＨＲおよびＳａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  （１９９９）  ６，  １０５４  −１０５９を参照）。
【００５９】
環状に変更したタンパク質（Ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：タンパク質のＮ末端およびＣ末端が、例えば分子生物学的技術によってタンパク質構造中の別の位置に人為的に移動されると、タンパク質は環状に変更される。タンパク質配列が、Ｎ末端からＣ末端まで読み取られ、ＡＢＣＤＥＦＧＨによって表わされると、環状に変更した分子は、ＤＥＦＧＨＡＢＣであり得る。したがって、環状変更は、正常な終点が共有結合され、新しい終点がタンパク質バックボーンを他のどこかで折ることによって導入されるときに、巨大分子の異性化の形態を表わす。本発明の方法に有用な環状に変更した酵素は、環状変更が、プロテアーゼ開裂によって活性酵素に変換され得る酵素活性が欠けている高度なチモーゲン性の指標によってプロ酵素またはチモーゲンを作り出す酵素のみである。
【００６０】
ペプチドタグ：ペプチドタグは、タンパク質に対する特異抗体が、利用可能でないか又はタンパク質精製のためでないときに、例えば抗体によってタンパク質を検出するために使用され得る短いペプチドである。細胞表面の検出および分離に使用され得る既知のペプチドタグの例は、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグおよびＦＬＡＧ ｓｕｐ．（商標）タグである。一般に、特異的結合タンパク質に利用可能な任意のペプチドタグは、このような特異的結合タンパク質が、フルオロフォアによって又は例えば表面の分離のためのビーズによって直接的または間接的にのいずれかで標識化される場合に、表面の検出及び／又は分離に使用され得る。
【００６１】
増幅カスケード：結合された酵素の増幅カスケードは、定量化される最初のシグナルの大きさを増幅する方法を表わす。これらのカスケードは、多酵素系の固有の増殖性特性へと基礎付けられ、すなわち、反応のうちの１つの生成物は、続く酵素反応のための触媒または補助因子でなければならない。プロテアーゼ増幅カスケードの最たる例は、血液凝固カスケードであり、ここで、第１のプロテアーゼは、チモーゲンを活性化し、活性プロテアーゼを生成し、この第２のプロテアーゼも、チモーゲンを活性化し、第２の活性プロテアーゼを生成することで、初期のシグナルが１０００倍まで増幅されるカスケードを作り出す。
【００６２】
酵素の基礎活性またはチモーゲンの基礎活性：チモーゲンの基礎活性は、チモーゲン活性化プロテアーゼが加えられていない、限定培地、例えば、刺激されていない条件下の細胞培養およびチモーゲンが欠けている同じ培地中のおよび酵素活性と適合性がある細胞培養上清または培地における酵素活性の比率として定義される。
【００６３】
基礎分泌：基礎分泌は、細胞エキソサイトーシスのモジュレーターが欠如している細胞によって分泌されたタンパク質の相対量を指す。ほとんどすべての分泌細胞のタイプにおいて、基礎分泌のレベルが検出され得る。基礎分泌が、顆粒へ貯蔵されるタンパク質の放出から、または分泌顆粒とは別に分類される新しい合成タンパク質の一部分から結果的に生じるかどうかは知られていない（例えばＢｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  （２００３）  ８３：  ５８１−６３２を参照）。例えば、ラットの耳下腺腺房細胞において、いくつかの分泌タンパク質は、基礎放出の原因となる構成的分泌小胞に達するために、それらの生物発生中に分泌顆粒とは別に分類される（例えばＡｒｖａｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｃａｓｔｌｅ  Ｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９９８），  ３３２：５９３−６１０を参照）。耳下腺腺房細胞は、正確な構成的分泌を介していくつかのアミラーゼを放出し、一方で、それらはまた、アミラーゼおよび他の分泌タンパク質（耳下腺の分泌タンパク質、ＰＳＰなど）を従来の分泌顆粒へとパッケージ化し、該顆粒は、エキソサイトーシスモジュレーターに反応してエキソサイトーシスを経る。エキソサイトーシスの調節された態様に対する構成的分泌または基礎分泌の間の関連性の別の例は、乳房上皮細胞によって実証される（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ  ａｎｄ  Ｄｕｎｃａｎ  ＪＳ．  Ｊ  Ｍａｍｍ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，  （１９９８）  ３：  ２７５−２８６を参照）。これらの細胞は、大部分は明らかに構成性のルートによって、牛乳タンパク質、カゼインを含む豊富な量の乳成分を分泌するが、合成したカゼインの約３分の１は、貯蔵された細胞内のプールに残存し、インタクト細胞のＣａ２＋の上昇に応じて放出され得る。
【００６４】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子は、遺伝子などの核酸配列をＤＮＡ分子配列に動作可能に結合させることによって生成されたＤＮＡ分子を指す。したがって、組換えＤＮＡ分子は、自然には通常一緒に見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、雑種ＤＮＡ分子である。しばしば、自然には通常一緒に見られないポリペプチドのための、少なくともプロモーターおよびＤＮＡコード配列を含む、組換えＤＮＡの導入は、真核細胞に導入される際に「異種である」と言われている。このような異種または組換えＤＮＡによって生成されたタンパク質はまた、「異種である」と言われている。異種の核酸配列を発現する文脈において、「宿主細胞」は、ベクターを複製する及び／又はベクターによってコード化された異種遺伝子を発現することができる、原核細胞または真核細胞を指す。宿主細胞が、核酸分子によって「トランスフェクトされる」または「形質転換される」とき、それらは「操作された」または「組換え型の」細胞または宿主細胞、例えば、ベクターなどの外因性の核酸配列が導入された細胞として言及される。それ故、組換え型の細胞は、組換え的に導入された核酸を含まない、自然発生の細胞と見分けられる。宿主細胞の例は、限定されないが、ＦまたはＦ ｓｕｐ’因子（例えば、ＤＨ５アルファＦまたはＤＨ５アルファＦ ｓｕｐ’）を含む大腸菌株またはＦまたはＦ ｓｕｐ’因子（例えばＤＨ１０Ｂ）を欠く大腸菌株を含む。宿主は、ベクターの複製またはベクターへクローン化されたポリペプチドの発現を可能にする場合に適合性があると言われている。
【００６５】
プライマーは、本明細書で使用されるように、精製された制限消化産物（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔ）におけるように自然に生じようが、または合成的に生成されようとも、オリゴヌクレオチドを指し、該オリゴヌクレオチド核酸鎖に相補的なプライマー伸長の生成物の合成が誘発される条件下（すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、および適切な温度およびｐＨ）に置かれたときに核酸合成の開始の点として作用することができる。
【００６６】
ＰＣＲは、ＤＮＡの領域を酵素学的に増幅させる合成酵素連鎖反応法を指す。この指数関数的な増幅の手順は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、それぞれ、サーマス・アクアチクスまたはサーマス・フラバスから分離されたＴａｑまたはＴｆｌのＤＮＡポリメラーゼ酵素）などの、ＤＮＡを重合する薬剤によって、変性、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびプライマー伸長の繰り返されたサイクルに基づく。
【００６７】
ポリリンカーまたは多回クローニングサイト（ＭＣＳ）またはポリクローニングは、核酸配列の挿入及び／又は除去に利用される、核酸構成物上の制限酵素部位のクラスターを指す。
【００６８】
制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素またはエンドヌクレアーゼは、その各々が特定のヌクレオチド配列で又はそのヌクレオチド配列の近くで二本鎖ＤＮＡを開裂する、酵素（例えば細菌）を指す。例は、限定されないが、Ａｖａｉｌ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｈｉｎｄｉ、Ｎｃｏｌ、Ｓｍａｌ、およびＲｓａｌを含む。
【００６９】
選択成長培地は、１つまたはそれ以上の選択的薬剤、例えば、抗生物質で補足された細胞を成長させるために使用される成長培地を指す。
【００７０】
選択可能なマーカーまたは選択可能なマーカー配列または選択可能なマーカー遺伝子は、他の場合には有害な環境になるであろう場所で成長または残存する能力を与える活性をコード化または提供する遺伝子または他のＤＮＡフラグメントを指す。例えば、選択可能なマーカーは、選択的なマーカー発現される細胞上に抗生物質または薬物に対する耐性を与え得る。複製開始点（Ｏｒｉ）も、プラスミドベクターの繁殖を可能にする選択可能なマーカーとして使用され得る。選択可能なマーカー領域は、ベクター配列に関して、特定のベクター成分上で存在する選択可能なマーカー配列をすべて含むベクター成分の部分を指す。言い換えれば、存在する選択可能なマーカー配列の終結部分は、選択可能なマーカー領域を定義する。例えば、特定のベクター成分に１つの選択可能なマーカー配列を有するだけであれば、選択可能なマーカー領域は、選択可能なマーカー配列の最初および選択可能なマーカー配列の終結部分によって定義されるだろう。特定のベクター成分が、例えば、２つの選択可能なマーカー配列を有する場合、選択可能なマーカー領域は、第１の選択可能なマーカー配列の開始部分と第２の選択可能なマーカー配列の終結部分の間の核酸配列である。
【００７１】
挿入配列およびベクターに関して使用されるときのクローン化またはクローニングは、宿主において複製可能なベクターへの挿入配列の連結反応を意味する。挿入配列、ベクター、および宿主細胞に関して使用されるときの用語「クローン化すること」は、所与の挿入配列の複写を作ることを一般に指す。この点に関して、ＤＮＡ断片（例えば、挿入配列）をクローン化するために、当業者は、その後宿主（通常は細菌）に入れられ得るベクター（例えば、プラスミド）にそれを挿入し、その結果、プラスミドおよび挿入物は宿主とともに複製する。個々の細菌は、培養液上の単一のコロニーとして目に見えるまで成長させられ、コロニーは選ばれ、液体培養中で成長させられ、および「クローン化した」ＤＮＡを含むプラスミドは、ＤＮＡの何百万もの複写があるであろう時点で、細菌から再度分離される。用語「クローン」はまた、クローン化したＤＮＡを運ぶ細菌、またはクローン化したＤＮＡ自体のいずれかを指すことができる。
【００７２】
本明細書で使用されるような形質転換またはトランスフェクションは、外来性ＤＮＡの細胞（例えば原核細胞または真核細胞）への導入を指す。形質転換は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、ポリブレン媒介性のトランスフェクション、電気穿孔、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含む、当該技術分野に既知の様々な手段によって達成され得る。特に、真核細胞へのトランスフェクションは、適切な抗生物質が、ＤＮＡの染色体への安定した統合を生む細胞の選択のために細胞培地へ含まれていないときに一過性になり得る。安定した選択のためのプラスミドベクターは、抗生物質によって選択されるべき細胞へ発現される選択可能なマーカーを有さなければならない。一過性のトランスフェクションは、本発明の方法に使用され得るが、好ましい細胞は、抗生物質の選択によって安定して作られた細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】顆粒貯蔵レポーターとしてのセリンプロテアーゼ、脱顆粒を調整する細胞表面受容体としてのＩｇＥ受容体、及び検出のため分泌された顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターにより開裂されるＦＲＥＴベースの基質を使用する、本発明の一般的な概念の図である。高親和性受容体結合ＩｇＥに結合する、多重結合の抗原（例えばアレルゲン）による細胞の処置は、顆粒貯蔵プロテアーゼの放出を誘発し、前記プロテアーゼは基質を開裂し、蛍光の最終生産物を生成する。分泌されたレポーター酵素のこの特異的な基質を使用すると、リガンド対受容体の相互作用（ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）が測定され得る。
【図２】顆粒貯蔵レポーターとしてのセリンプロテアーゼ、脱顆粒を調整する細胞表面受容体としてのＧＰＣＲ、及び検出のため分泌された顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターにより開裂されるＦＲＥＴベースの基質を使用する、本発明の一般的な概念の図である。ＧＰＣＲのアゴニストによる細胞の処置は、顆粒貯蔵プロテアーゼの放出を誘発し、前記プロテアーゼは基質を開裂し、蛍光の最終生産物を生成し、及び前記プロテアーゼはチモーゲンを開裂し、活性酵素を生成する。分泌されたレポーター酵素の特異的な基質を使用すると、リガンド対レセプターの相互作用（ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）が測定され得る。
【図３】本発明の代表的なプラスミドベクターの一般的な構造である。ヒグロマイシン耐性を有するプラスミドベクターのマップは、キメラｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’−ＬＴＲの強力な構成的プロモーター（Ａ）又はテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｂ）の制御下で、グランザイムＢを安定して発現するために使用される。ネオマイシン耐性を有するプラスミドベクターのマップは、ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲのプロモーター（Ｃ）の制御下、又はテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｄ）の制御下で、マウス免疫グロブリンカッパ鎖のシグナルペプチド、抗ｃｍｙｃ単クローン抗体による表面の検出のためのｃ−ｍｙｃタグ、及び過剰発現のためのウイルス性のＧＰＣＲグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ）配列を使用して、ＧＰＣＲなど機能的な表面受容体を発現するために使用される。
【図４】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株が、ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲのプロモーターの制御下で、分泌顆粒に貯蔵されたヒトグランザイムＢ及びＮ末端ｃ−ｍｙｃによりタグ付けされたヒトムスカリンＩＩ型受容体（ＣＨＲＭ２）の両方で安定してトランスフェクトされ、効果的な表面の発現のためのシグナルペプチド及びウイルスのグリコシル化配列を含む、アッセイの実施例である。（１）カルバコール（ＣＨＲＭ２のアゴニスト）による処理は、４８５ｎｍの励起及び５３５ｎｍの発光を使用して、５’ＦＡＭ−ＳＧＩＥＰＤＳＧＶ−ＴＡＭＲＡ、ＦＲＥＴベースのグランザイムＢ基質（４）で検出される、分泌されたグランザイムＢ（３）の顆粒放出を誘発する、細胞内カルシウム濃度（２）の増加を誘発する。５３５ｎｍの蛍光の増加は、グランザイムＢが放出した量に比例する。分泌されたレポーターは、直接検出され、又は、分泌されたレポーターのより敏感な検出用のヒトプロカスパーゼ−３のようなプロ酵素によって増幅されるシグナルにより検出され得る。
【図５】本発明に記載の方法で作られた二重のアッセイの図である。２つの異なる細胞株（Ａ）及び（Ｂ）は、同じ反応容器中で混合される。細胞株Ａは、ＧＰＣＲ１（エキソサイトーシスモジュレーター）と顆粒貯蔵プロテアーゼレポーター１の組み合わせを発現する。ＧＰＣＲ１は、アゴニストとしてリガンド１を有し、一方でプロテアーゼレポーター１は、波長１にて読みとられる基質１（例えば、ＦＲＥＴベースの基質）を開裂する。細胞株Ｂは、ＧＰＣＲ２（エキソサイトーシスモジュレーター）と顆粒貯蔵プロテアーゼレポーター２の組み合わせを発現する。ＧＰＣＲ２は、アゴニストとしてリガンド２を有し、一方でプロテアーゼレポーター２は、波長２にて読みとられる基質２（例えば、ＦＲＥＴベースの基質）を開裂する。ＧＰＣＲ１とＧＰＣＲ２のリガンド１及びリガンド２の混合物による、細胞Ａ及びＢの混合物の処理は、顆粒貯蔵プロテアーゼ１と２の放出を誘発し、及び、波長１並びに２の蛍光の増加は測定され得る。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、創薬、診断、および検体の決定に有用な新しい細胞ベースのセンサーに関し、該センサーは、プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株の調節性分泌顆粒に貯蔵されたレポーターポリペプチドとして、プロテアーゼによってトランスフェクトされた分泌顆粒のプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株を含み、および該センサーは、調節性分泌顆粒のエキソサイトーシスのモジュレーターとして内因性分子または異種分子のいずれかを有し、このような前記顆粒で貯蔵されたプロテアーゼレポーターは、少なくとも、他のプロテアーゼによるｐＨ低下およびタンパク質分解などの、顆粒内に既に存在する状態に対する高耐性；エキソサイトーシス後の酵素活性；高度に特異的な開裂配列；非刺激の又は基礎的な条件下での非常に低レベルの分泌；およびハイスループットのロバストおよび高感度な検出のための細胞培養生存度および脱顆粒との適合性のある培地における高度な信号対バックグラウンド活動を有する。
【００７５】
細胞ベースのセンサーがエキソサイトーシスモジュレーターの特定のリガンドによってインキュベートされるとき、レポーターポリペプチドは顆粒から細胞外培地に放出され、このように放出されたレポーターポリペプチドの酵素活性は、特定の基質によって検出される。本発明はまた、同じ反応容器において、各々が異なる１対のエキソサイトーシスモジュレーター−顆粒で貯蔵されたプロテアーゼレポーターである、少なくとも２つの細胞株を混合することによって、および各々の顆粒で貯蔵したプロテアーゼレポーターの高度に特異的な基質によってエキソサイトーシスを検出することによって、多重アッセイの開発を可能にする。
【００７６】
本発明の細胞ベースのセンサーは、従って：プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する造血細胞株；適切なプロモーターの制御下で、前記造血細胞株及び前記顆粒に貯蔵したレポーターへとトランスフェクトされた、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーター；エキソサイトーシスモジュレーター（例えば、分泌された顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの検出のため、適切なプロモーター及び特定の基質の制御下にあるＧＰＣＲのような表面受容体）を含む。
【００７７】
このような高感度の細胞ベースのセンサーは、１つがエキソサイトーシスモジュレーターとして作用し、もう１つはエキソサイトーシスモジュレーターの特定のリガンドとして作用する、少なくとも２つの分子間の相互作用を試験するのに有用である。そのようなセンサーの使用の例は次のとおりである：創薬における分子間の相互作用を試験し、薬物の診断および検出のためのタンパク質などの分子、またはいくつかのサンプルにおける、例えば、食品産業、環境サンプルおよび製薬産業における分子を定量化する。
【００７８】
本発明のセンサーは敏感であり、故に、現在利用可能なセンサーよりも低い量の細胞を使用し、反応は、誘導性のプロモーターに基づいたセンサーよりも速く、溶解は、レポーターの放出に必要とされず、シグナルは、エンドポイントモード又は動力学モードのいずれかで測定することができ、全ての試薬は、混合され、その後読み取られ、洗浄又は停止工程は必要とされず、故にスループットが増加し、高度の信号対バックグラウンドは、ロバストなアッセイのために得られ、及びシグナル増幅でさえ、更により敏感な検出のために可能である。本発明のセンサーはまた、各々が異なる１対のエキソサイトーシスモジュレーター−顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターである、少なくとも２つの細胞株を同じ反応容器において混合することによって、及び各々の顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの高度に特異的な基質によりエキソサイトーシスを検出することによって、多重アッセイの開発を可能にする。前記多重アッセイは、１つのアッセイ当たりのコストを下げ、各アッセイが内部制御として同じウェルにおいて作られたアッセイを有するため、シグナルの質を改善する。
【００７９】
本発明は、プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシス、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーター、エキソサイトーシスモジュレーター、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーター及びエキソサイトーシスモジュレーターのためのプロモーター及び条件、並びに検出システムを有する細胞のセンサーの各構成要素の関連する特性の記載によって最良に理解される。
【００８０】
〈Ｂ．１．本発明の方法のための有用な細胞〉
本発明は、創薬、診断、および検体の決定に有用な新しい細胞ベースのセンサーに関し、該センサーは、プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株の調節性分泌顆粒に貯蔵されたレポーターポリペプチドとして、プロテアーゼによってトランスフェクトされた分泌顆粒のプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する細胞株を含み、および該センサーは、調節性分泌顆粒のエキソサイトーシスのモジュレーターとして内因性分子または異種分子のいずれかを有し、このような前記顆粒で貯蔵されたプロテアーゼレポーターは、少なくとも、他のプロテアーゼによるｐＨ低下およびタンパク質分解などの、顆粒内に既に存在する状態に対する高耐性；エキソサイトーシス後の酵素活性；高度に特異的な開裂配列；非刺激の又は基礎的な条件下での非常に低レベルの分泌；およびハイスループットのロバストおよび高感度な検出のための細胞培養生存度および脱顆粒との適合性のある培地における高度な信号対バックグラウンド活動を有する。
【００８１】
分泌顆粒及びそれらの調節性のエキソサイトーシスは、当該技術分において周知であり、特定の実験的な利点、又はそれらの重大な生理学的又は病態生理学的な関心のいずれかのため、モデルシステムとして選択された少数の細胞型において最も広範囲に研究された（例えば、Ｂｕｒｇｏｙｎｅ，  ＲＤ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，  Ａ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．  ８３，  Ｎｏ．  ２，  Ａｐｒｉｌ  ２００３，  ｐｐ．  ５８１−６３２を参照）。おそらく最も研究された細胞型は、副腎のクロム親和性細胞（及びその腫瘍相当物、ＰＣ１２細胞株）、膵臓のベータ細胞及びマスト細胞のような造血細胞、血小板及び好中球であるが、分泌顆粒エキソサイトーシスはまた、ペプチド及び他のホルモンの分泌のための多くの異なる神経内分泌細胞型及び内分泌細胞型において、並びに、消化酵素の分泌のための外分泌細胞に生じる。更に、繊維芽細胞様細胞株（ＣＨＯ細胞）などの非プロフェッショナルな分泌細胞株においてさえ、エキソサイトーシスのためのＣａ２＋調節性の経路が存在し、及びこの恐らく全ての細胞型は、調節性のエキソサイトーシスの経路を有し、すなわち、従来のリソソームは、エキソサイトーシスを受けるためにＣａ２＋によって引き起こされ得ることが、実証された。しかし、分泌のリソソームは、別のクラスの調節性の分泌オルガネラであり、このエキソサイトーシスの能力は、従来のリソソームからそれらを明白に示す。従来のリソソームはまた、原形質膜に融合し、刺激後にそれらの可溶性の内容物を放出し得るが（１）、繊維芽細胞と上皮細胞などの細胞からのリソソーム酵素のＣａ２＋により引き起こされた分泌の程度は、１０−２０％だけの傾向がある（２）。それに比べて、リソソームマーカーの８０％までが、分泌のリソソームを有する細胞からの生理学的な要因（本明細書では、プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する細胞と称する）上で放出される。したがって、本発明の方法のための好ましい細胞は、プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する細胞を含む群から選択される。プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する細胞の最も多様な群の１つは、好中球、好塩基球、好酸球、細胞毒性Ｔリンパ球等のＴ細胞、及び、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のような造血細胞を含むものである。すべての上記の細胞の正常機能の中心部は、グランザイム、マスト細胞プロテアーゼ、カテプシン、及び、グリコシダーゼのような他の加水分解酵素などのプロテアーゼのような、莫大な量の貯蔵された構成要素の調節性のエキソサイトーシスである。したがって、プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する造血細胞は、本発明の方法のための、非常に関連した細胞である。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、細胞は、グリコシダーゼ及びメラニンのような様々なヒドロラーゼ、ヒスタミン、及びセロトニンを含む、それらの通常のリソソームの内容物に加えて、グランザイム、カテプシン、マスト細胞プロテアーゼ、好中球のエラスターゼ及びプロテイナーゼ３のようなセリンプロテアーゼなどの特殊化した構成要素を貯蔵するためにそれらの分泌リソソームを使用する、細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、マスト細胞、及び好塩基球などの細胞から選択された、プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する造血細胞株の群から選択される。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、好ましい細胞は、ＲＢＬ−２Ｈ３、ラット好塩基球性白血病細胞株、マウス３２Ｄ細胞株、マウス骨髄の造血細胞、ヒトＮＫ９２細胞株、ナチュラルキラー細胞株及びヒトＹＴ細胞株、ナチュラルキラー細胞株及びマウスＭＣ／９細胞株、マウスマスト細胞から選択される。本発明の方法に特に好ましい細胞株は、ＲＢＬ−２Ｈ３であり、このことは、この細胞株が、非常に低い構成的な分泌レベル、及び高度な信号対バックグラウンドを有するセンサーを与える、グランザイムのような本発明の好ましいレポーターの、高度に誘発された分泌を有するためである。
【００８４】
〈Ｂ．２．エキソサイトーシスモジュレーター〉
本発明はまた、エキソサイトーシスモジュレーターを含む。本発明の１つの実施形態において、エキソサイトーシスモジュレーターは、細胞内カルシウムのレベルの変化を誘発する化合物又はポリペプチドから選択される。本発明の別の実施形態において、エキソサイトーシスモジュレーターは、カルシウムにより引き起こされたエキソサイトーシスを次々に調節又は調整する、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、リン脂質、又はＡＴＰのレベルの変化を誘発する、化合物又はポリペプチドから選択される。
【００８５】
１つの重要なクラスのエキソサイトーシスモジュレーターは、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、内在性のチロシンキナーゼ活性を有する受容体、関連するチロシンキナーゼ活性を有する受容体及び内因性又は異種のＦｃガンマのようなＩＴＡＭモチーフを有する受容体、並びにイプシロン受容体又は抗原認識に通常は関係するＩＴＩＭモチーフを有する受容体を含む表面受容体であり、多くの造血細胞受容体の中に存在する。
【００８６】
したがって、本発明の実施形態において、エキソサイトーシスモジュレーターは、調節性のエキソサイトーシスを有する細胞の顆粒の内部で貯蔵されるレポーターの細胞外放出をリガンド結合時に引き起こす、表面受容体であり得る。前記エキソサイトーシスモジュレーターは、Ｆｃ受容体イプシロンＩとしても知られる高親和性ＩｇＥ受容体のような内因性のエキソサイトーシスモジュレーター、又は、ＧＰＣＲ又はＦｃガンマ受容体或いはＦｃイプシロンＩ受容体のような、トランスフェクトされた相同性又は異種のエキソサイトーシスモジュレーターのいずれかであり得る。本発明の別の実施形態において、エキソサイトーシスモジュレーターは、リガンド結合時に、別の受容体へのリガンド結合によって誘発された受容体のエキソサイトーシスを阻害する、表面受容体であり得る。さらなる実施形態において、エキソサイトーシスモジュレーターは、リガンド結合のための細胞外領域及びシグナル変換のための細胞内の領域を有するキメラ受容体、例えば、ＩＬ−２結合領域を含むインターロイキン２受容体の細胞外領域と、シグナル変換に必要とされるＩＴＡＭ配列及び他の配列を含むラットＦｃイプシロン受容体Ｉの少なくとも膜貫通性及び細胞内の領域との間にある、キメラ受容体を含み得る。
【００８７】
１つの実施形態において、細胞表面受容体は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、内在性又は関連するチロシンキナーゼ活性を有する受容体、及び特定のリガンド結合時に顆粒貯蔵受容体のエキソサイトーシスを引き起こすＩＴＡＭ含有受容体から選択される。
【００８８】
ＧＰＣＲは、それらが４つの主な型へと変換するシグナルに従って分類される：Ｇアルファ−ｉ／ｏ、Ｇアルファ−ｑ／１１、Ｇアルファ−Ｓ及びＧアルファ−１２／１３。結合される受容体。アルファ−ｓ結合ＧＰＣＲが、細胞の内部の環状ＡＭＰを増加させる一方で、アルファ−ｉ／ｏ結合ＧＰＣＲは、細胞の内部の環状ＡＭＰの増加を遮断する。アルファ−ｑ結合ＧＰＣＲは、細胞内カルシウムを増加し、アルファ−１２／１３は、細胞基質の小さなＧＴＰａｓｅ、Ｒｈｏの活性化をもたらす。しかし、造血細胞が、アルファ−ｓ、アルファ−１２／１３及びアルファ−ｉ／ｏ結合ＧＰＣＲを細胞内カルシウムの増加に結び付ける、乱雑なアルファ−１５／１６鎖を有し、本発明はこの事実から利益を得ることは、当該技術分野において周知である。
【００８９】
本発明の１つの実施形態において、顆粒からのレポーターエキソサイトーシスに使用することができるＧＰＣＲは、アルファ−ｑ／１１、又はアルファ−１２／１３或いはアルファ−ｉ／ｏ又はアルファ−ｓ結合ＧＰＣＲから選択され得る。本発明の方法においてエキソサイトーシスモジュレーターとして選択されたＧＰＣＲは、全長の受容体、又はＣ末端尾が部分的又は完全に除去された場合の受容体のいずれかであり得る。
【００９０】
リガンド結合時に、幾つかのＧＰＣＲがベータ−ヘキソサミニダーゼの放出を誘発することは知られているが、当該技術分野によると、このことは、単に特定のＧＰＣＲの特性であるように思われる。例えば、アデノシン３受容体は、単独で顆粒減少を誘発しないが、ＩｇＥと抗原の最適以下の投与量によって誘発された顆粒減少を強めると、報告された。顆粒消失は、主として、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞などのマスト細胞及び好塩基球において内生的に発現される、ケモカイン受容体及び特定のアルファ−ｉ結合ＧＰＣＲにおいて実証された。また、脱顆粒は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において過剰発現される、ムスカリンのＩ型及びＩＩＩ型のアセチルコリン受容体、両方のアルファ−ｑ結合ＧＰＣＲにおいて実証された。しかし、顆粒減少につながる経路に関して議論がある。例えば、Ｂａｒｌｉｃらは、Ｃ末端エンド（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）を欠くＩＬ８ＲＡ（ＣＸＣ１Ｒ）アルファ−ｉ結合ＧＰＣＲが、ＲＢＬ−２Ｈ３において脱顆粒することができず、インターロイキン−８の相互作用の後にアレスチンをリン酸化及び結合するセリン残基に対する脱顆粒のそのような損失にも起因した。他の研究者は、Ｃ末端開裂型のＩＬ８ＲＡ（ＣＸＣ１Ｒ）が、おそらくリガンド結合後のより低い速度の内在化のため、脱顆粒において天然の受容体よりも更に効果的であるという証拠を提供するこのような結果を疑問視した。上記の結果はすべて、レポーターとしてベータヘキソサミニダーゼ、及びＣＭＶプロモーター（ＲＢＬ−２Ｈ３のような細胞におけるほとんどのＧＰＣＲのための非常に弱いプロモーター）を使用し、ＲＢＬ−２Ｈ３のような造血細胞において部分的に静まった（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）。
【００９１】
実験中、本発明の方法に記載されるものなど適切なベクターへとクローン化した時、ヒトアデノシン３受容体（ＡＤＯＲＡ３）は、非常に強力なエキソサイトーシスモジュレーターであり、ほとんどのＧＰＣＲに関するＲＢＬ２Ｈ３のような細胞において極端に低く、ｈＣＭＶプロモーター制御下で発現される特定のＧＰＣＲに関する細胞において経時的に鎮静化される、ＧＰＣＲで主として基づいた、ｈＣＭＶプロモーター制御下で発現されるＧＰＣＲに主に基づいた当該技術分野で疑問視されることを、我々は見出した。また、以前のベクターは、ＧＰＣＲの表面の発現を支援するために任意の配列を使用しなかった。上記の違いはすべて、我々のセンサーを高感度なものにし、故に創薬において有用となる。
【００９２】
有用な細胞ベースのセンサーに対する別の重要な考慮は、リガンドによって調節される標的の発現レベルである。例えば、表面受容体のような標的は、１つの細胞当たり１０００未満の分子から、１つの細胞当たり５０００００を超える分子までの量の細胞表面上で発現され、したがって、標的分子の発現レベルにおいて、１０００倍までの変更がある。ＧＰＣＲ（表面レセプタの種類）は、一般に低レベルで発現され、ほんの約１０％のＧＰＣＲがＮ末端エンドでシグナルペプチドを有し、一方で、大部分は、恐らく表面の発現のための特定のシャペロンによって援助される、細胞膜に対する転位のためのシグナルとして第１膜貫通ドメインを使用する。一般的に、標的のより高度な発現レベルは、センサーのより高感度をもたらし、故に、タンパク質標的（特に表面受容体）の過剰発現のための状態の研究が、所望される。
【００９３】
本発明はまた、本発明の方法に有用な細胞の表面でのＧタンパク質結合受容体の発現に有用な、プロモーター及び配列を含む。１つの実施形態において、構成的なＧＰＣＲ発現に適切なプロモーターは、ヒト又はマウスの伸長因子１−アルファプロモーター（配列番号：１）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（配列番号：６）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（配列番号：２）及びモロニーマウス白血病ウイルスプロモーターＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ（配列番号：３）からの５’ＬＴＲを含む群から選択され得る。前記プロモーターは、本発明の方法で使用される造血細胞において経時的に静められない。本発明の１つの実施形態において、ＧＰＣＲの表面の発現に適切なプロモーターは、誘導可能なプロモーターである。さらなる実施形態において、細胞表面上でのＧＰＣＲ発現のための誘導可能なプロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クミン酸誘導性プロモーター、及びプロゲステロン誘導性プロモーターを含む群から選択され得る。
【００９４】
別の実施形態において、ＧＰＣＲは、表面の過剰発現のためのシグナルペプチド、及び表面の検出及び／又は例えばフローサイトメトリー又は磁気ビーズによる陽性細胞の分離のためのタグを含み得る。例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｈら（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  （２００３）  ６４：５７０−５７７を参照）は、ＣＢ１のＮ末端のシグナルペプチドの追加又は長いＮ−尾の短縮は、カンナビノイドリガンドに結合する受容体に影響を与えずに、受容体の安定性及び細胞表面発現を大幅に増強する。
【００９５】
別の実施形態において、ＧＰＣＲ発現に役立つベクターは、表面の過剰発現のためのグリコシル化配列を含み得る。前記グリコシル化配列は、タグと、天然のＧＰＣＲ配列の第１のアミノ酸との間に挿入されるべきである。更なる好ましい実施形態において、グリコシル化配列は、配列番号：４を含むウイルス性のＧＰＣＲから選択される天然のグリコシル化配列である。構成的なＧＰＣＲ発現のための有用なベクターの１つの例は、造血細胞において静められないプロモーター、膜をわたる転位を援助するシグナルペプチド、表面上でＧＰＣＲを有する細胞の選択のためのタグ、膜の発現を改善するためのグリコシル化シグナル、及びメッセンジャーＲＮＡを安定させるポリアデニル化配列を含む、Ｐ−ＭｏＭＬＶ−５’ＬＴＲ−ＳＰ−ｃｍｙｃ−タグ−ＶＧＳ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ（配列番号：５）である。配列番号：５のベクター中のＰ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーターの配列が、テトラサイクリンにより誘導可能なプロモーターと交換される場合、その後、誘導可能なＧＰＣＲ発現に適切なベクターが得られる。本発明は、最初に、ＧＰＣＲのＮ末端エンドでのグリコシル化シグナル（特に、ウイルス性のＧＰＣＲに由来するグリコシル化シグナル）の追加が、細胞表面受容体の発現を改善することを実証する。
【００９６】
〈Ｂ．３．顆粒貯蔵レポーター〉
顆粒分泌のための最も広く使用されるレポーターは、内因性のベータ−ヘキソサミニダーゼであるが、このタンパク質は、低度の信号対バックグラウンド比率を有する低感度のレポーターであると伝統的に考えられてきた。加えて、このグリコシダーゼは、例えば、プロテアーゼのようなシグナル増幅カスケードに結合できず、当該カスケードは、初期の信号増幅のためのタンパク質分解性のカスケードに結合することができ、シグナルが、基質としてチモーゲン（血液凝固をもたらす）を有する酵素のカスケードによって数倍に増幅される、血液凝固カスケードに類似し得る。更に、ベータ−ヘキソサミニダーゼが、プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する大半の造血細胞の顆粒に通常は存在するため、このタンパク質では、多重アッセイの開発はできない。したがって、脱顆粒の高感度の測定の開発のための、他の顆粒貯蔵レポーターの研究が、保証される。
【００９７】
構成的な経路と調節性の経路の間の可溶性タンパク質の選別は、明らかに複雑であり、発現のレベルにかかわらず、貯蔵顆粒への可溶性タンパク質のルーチングにおいて、細胞型特異性に関する実質的な証拠がある。例えば、アミラーゼは、外分泌の膵細胞における正常な顆粒成分であり、外分泌の膵細胞株へトランスフェクトされた時に顆粒へと輸送されるが、トランスフェクトされた内分泌の細胞株において構成的に分泌される（例えば、Ｅｌ  Ｍｅｓｋｉｎｉ，  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  （２００１） Ｖｏｌ．  １４２，  Ｎｏ．  ２  ８６４−８７３を参照）。細胞型特異性は、様々な内分泌及び神経細胞の細胞株におけるルーチングを研究するために、ＰＯＭＣ分子のアミノ末端の部分を使用して、矛盾した結果のうちのいくつかについて説明し得る（例えば、Ｔａｒｎ  ＷＷＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （１９９３），  ６２：２９４−３０６；Ｒｏｙ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ （１９９１），  ８２：２３７−ＩＩ５０、及びＣｏｏｌ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９５）  ２７０：８７２３−８７２９を参照）。同じ構成物が主要な内分泌及び神経細胞の細胞において全く異なって扱われ得るように、タンパク質選別の細胞特異性は、細胞株を越えて初代培養まで及ぶ。故に、当業者にとって、調節性のエキソサイトーシスを有する造血細胞と異なる他の細胞は、本発明の方法において使用され得るが、他の細胞型の選択は、選択された細胞株の分泌顆粒において高濃度で貯蔵される特異的なレポーターと、及び低レベルの基礎分泌と並行して行われる必要がある。
【００９８】
分泌顆粒、特に造血性由来の細胞の分泌顆粒に蓄積される、本発明の方法に役立つレポーターの１つの重要な特性は、厳しい環境に対する耐性であり、このレポーターの大半が、顆粒の内部で抵抗する。造血細胞の分泌顆粒は、リソソーム、非常に酸性のｐＨの、カテプシン、トリプターゼ及びキマーゼなどの莫大な加水分解酵素の内部で貯蔵するオルガネラに関連し、この環境は、オルガネラなどに自然に貯蔵されないタンパク質に理想的ではなく、故に、プロテアーゼ又はｐＨの不安定なレポーターは、恐らく、分泌顆粒の内部で分解し、前記不安定なレポータータンパク質の感受性を下げる。例えば、プロテアーゼは、活性化されたマスト細胞からエキソサイトーシスを受けた（ｅｘｏｃｙｔｏｓｅｄ）主要なタンパク質成分である（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８：１６９−１８３，  １９９８を参照）。トリプターゼ、キマーゼ、及びカルボキシペプチダーゼは、マスト細胞の分泌顆粒貯蔵プロテアーゼの３つの主要なファミリーである。したがって、本発明の好ましいレポーターは、本発明の造血細胞の顆粒の内部でのタンパク質分解及びｐＨ低下に対する高い耐性を有するポリペプチドである。リソソーム酵素及び造血性のセリンプロテアーゼと、分泌性のリソソームにおける様々な抗生物質タンパク質との共存は、共同貯蔵が分解なしで可能であることを示すが、分泌顆粒へと人為的に向けられたあらゆるポリペプチドが、この厳しい環境に抵抗するとは限らない。例えば、Ｋａｕｒ  ＪとＣｕｔｌｅｒ  ＤＦ（Ｋａｕｒ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｃｕｔｌｅｒ  ＤＦ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２００２）  Ｖｏｌ.  ２７７，  Ｉｓｓｕｅ  １２，  １０４９８−１０５０５を参照）は、キメラＨＲＰ−Ｐセレクションが、分泌の及び従来のリソソームに標的とされ得るが、７０％までの標的とされたタンパク質が、タンパク分解性に分解されたことを見出した。
【００９９】
本発明の方法において使用される造血細胞の分泌顆粒は、非常に酸性であるｐＨ環境にて、カテプシン、トリプターゼ、及びキマーゼなどの莫大なヒドロラーゼの内部に貯蔵するオルガネラであるリソソームを有する特性を共有し、故に、本発明の方法のための有用なレポーターは、適切な造血細胞の顆粒の内部の環境に耐性のあるポリペプチドであるに違いない。
【０１００】
本発明の１つの実施形態において、有用なレポーターは、タンパク質分解及び低ｐＨなどの適切な造血細胞の顆粒の内部の環境に耐性のあるポリペプチドから選択される。本発明の更なる実施形態において、貯蔵されたプロテアーゼレポーターは、アスパラギン酸の後の開裂によるＡｓｐ−ａｓｅ様活性を有する酵素、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンの後の開裂によるキマーゼ様活性を有する酵素、リジン又はアルギニンの後の開裂によるトリプターゼ様活性を有する酵素、及び、バリン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、又はシステインの後の開裂によるエラスターゼ様活性を有する酵素を含む、造血細胞の粒子に自然に貯蔵されるセリンプロテアーゼの群から選択される。また更なる実施形態において、好ましいセリンプロテアーゼは、グランザイム、カテプシンＧ、好中球エラスターゼ、及びプロテイナーゼ３、並びにキマーゼのようなマスト細胞プロテアーゼを含む群から選択される、エンドペプチダーゼ活性を有する酵素である。
【０１０１】
造血細胞の顆粒はまた、システインプロテアーゼのパパインファミリーに属するカテプシンを貯蔵する。カテプシンは、細胞内ペプチドヒドロラーゼとして最初に記載される、球状プロテアーゼのクラスであるが、様々なカテプシンはまた、細胞外の機能を有する。カテプシンＢ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｏ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、及びＸは、パパインファミリーのシステインプロテアーゼであり、カテプシンの最も大きな且つ周知のクラスを表す。それらは主に、リソソームの酸性の環境において、末端の非特異的なバルクタンパク質分解を媒介する、細胞内プロテアーゼとして機能する（例えば、Ｔｕｒｋ  Ｖ，  Ｔｕｒｋ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔｕｒｋ  Ｄ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００１  ；２０：４６２９−３３を参照）。カテプシンＡとＧは、両方ともセリンプロテアーゼであるが、カテプシンＧはエンドペプチダーゼである一方で、カテプシンＡはカルボキシペプチダーゼである。カテプシンＤとＥは、アスパラギン酸プロテアーゼである。カテプシンは、不活性の酵素前駆体として合成され、成熟した活性の酵素となるように処理される。リソソームの酸性の環境における細胞内プロテアーゼとしてのシステインカテプシンの機能のため、それらの最適なｐＨは、およそ５乃至５，５であり、細胞培養生存率及び本発明の方法におけるエキソサイトーシスに必要とされる生理学的なｐＨにて、それらの触媒的な効果は最適ではない。この理由のため、セリンプロテアーゼは、システインカテプシンと比較して、本発明の方法における顆粒貯蔵に一般に好ましいレポーターの中にある。メタロプロテアーゼを含む他の分解プロテアーゼが、顆粒に貯蔵され、好中球（例えば、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）及びＭＭＰ−９（９２ｋＤａ  ゼラチナーゼ））などの造血細胞から放出されることも、当該技術分野において既知である（例えば、Ｏｗｅｎ  ＣＡ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＥＪ．  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９９）  ６５，  １３７−１５０を参照）。しかし、造血細胞のセリンプロテアーゼは、本発明の方法において好ましい細胞から放出される、タンパク質分解性活性に最も大きく寄与し、故に、セリンプロテアーゼは、メタロプロテアーゼ及びシステインカテプシンより好ましい。タンパク質分解性活性に対するこのより優れた寄与は、顆粒にも貯蔵される他のプロテアーゼより中性のｐＨでの、セリンプロテアーゼのより大きな顆粒濃度と、セリンプロテアーゼのより大きな触媒的活性の両方の結果である。
【０１０２】
本発明の１つの実施形態において、レポーターのためのＤＮＡコード化は、チモーゲンタンパク質又は活性酵素を作るためにトランスフェクトされ得る。チモーゲンとして合成される顆粒レポーターは、それらが活性化される分泌顆粒に対して標的とされ、一方で活性酵素は、それらが活性化される必要のない分泌顆粒に対して標的とされる。例えば、グランザイムは、活性酵素を作るため、Ｎ末端活性化ジペプチドでの開裂によるカテプシンＣによって活性化されるチモーゲンである。構成的な活性グランザイムＢは、正確に標的とされ、粒子の内部に貯蔵され、故に、本発明の方法に有用であるが、前記構造的な活性グランザイムＢは、チモーゲンとして合成されるグランザイムＢよりも高度な基礎活性を有し、故に、センサーの信号対バックグラウンドを低下する。他の研究者は、活性合成中のＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンにおいて、重要な量のグランザイムは構造的に選択され、３分の１までのグランザイムＡとＢは、グランザイムＡ、グランザイム活性、及び分泌されたグランザイムＢの免疫ブロットにより示されるように、構造的な分泌径路を介してＣＴＬから直接分泌され得、ここで、３分の１のタンパク質は、シグナルを標的とする粒子を得ることができないことを実証した（Ｉｓａａｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；  ２５（４）：１０７１−９を参照）。溶解性タンパク質の構造的な分泌は、ＣＨＸとブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の両方によって遮断され得る。ＢＦＡが、認識された標的の方向性の死滅（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）に影響を及ぼす一方で、ＢＦＡは、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）死滅を抑止し、バイスタンダー死滅が、非粒子の経路を介して送達される、新しく合成された溶解性タンパク質から生じることを示す。従って、構造的な活性レポーターの代わりに顆粒の内部で活性化される必要のあるチモーゲンの使用は、基礎の活性を減少し、より高度な信号対バックグラウンド比率を有する細胞株は、本発明の方法に有用な、よりロバストなセンサーのために生成される。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法に有用なレポーターは、有用な細胞株における高度な発現のため、自然に生じる配列又はコドンにより最適化されたレポーターのいずれかであり得る。例えば、ウマのグランザイムＢのコドンにより最適化された配列は、配列番号：９として示される。
【０１０４】
〈Ｂ．４．レポーター発現のためのプロモーター〉
本発明はまた、レポーターの発現に適切なプロモーターを含む。本発明の顆粒貯蔵レポーターの発現に有用なプロモーターは、造血細胞におけるタンパク質発現に適切なプロモーター、特に、高度のタンパク質発現に対する培地に適切なプロモーターである。中間のタンパク質発現を有するプロモーターは、１００万のＲＢＬ−２Ｈ３につき１０ｎｇより多くの顆粒貯蔵グランザイムＢを生成し、一方で特異的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって定量化される。適切なプロモーターの別の関連性のある特性は、タンパク質発現が培養中に安定していなければならないことである。特定の異種のプロモーターは、特に造血細胞における培養中に下方制御され。この処理は、「プロモーターの鎮静化」と呼ばれる。本発明の方法に好ましいプロモーターは、故に、鎮静化できないプロモーターである。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態において、レポーター発現のためのプロモーターは、ｈＣＭＶと配列番号：１０のＭｏＭＬＶ−５’−ＬＴＲプロモーターのキメラプロモーター、ＭｏＭＬＶ−５’−ＬＴＲプロモーター（配列番号：３）、伸長因子１−アルファプロモーター（配列番号：１）、ＲＳＶプロモーター（配列番号：２）、及びチミジンキナーゼプロモーター（配列番号：７）を含む群から選択される。ヒトサイトメガロウイルス性プロモーターなどの他のプロモーター、真核細胞のトランスフェクションに広く使用される最も強力なプロモーターの１つはまた適切であるが、本発明の造血細胞において、ＭｏＭＬＶのキメラｈＣＭＶ−５’ＬＴＲの制御下で、グランザイムＢを有するベクターよりも少なくとも１２５倍低いグランザイムＢをもたらし、故にセンサーの感度を低下させる。従って、レポーターとしてグランザイムＢを使用するベクターは、本発明の方法に関するレポーター発現に適切なプロモーターを選択するためのプロモーター評価に役立つ。一般的に、本発明の方法におけるレポーター発現に好ましいプロモーターは、より多くのレポーターが作られるプロモーターであり、即ち、より強力なプロモーターは、より弱いプロモーターよりも好ましい。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、好ましいプロモーターは、継代培養中の細胞により静められないものである。プロモーターの鎮静化は、プロモーターの有用性を制限し、我々は、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターが、本発明の少なくとも１つの好ましい細胞株、即ち、ＲＢＬ−２Ｈ３において、部分的に静められることを発見した。しかし、ＭｏＭＬＶの５’−ＬＴＲに融合されるｈＣＭＶからも構成されるキメラプロモーターは、６カ月より多い期間の連続培養において静められない。プロモーター鎮静化は、実験的に測定されなければならず、当業者にとって、ベクター（例えば、その中で、ヒトグランザイムＢは、試験されるべき、且つ哺乳動物の細胞株における安定した選択のための抗生物質耐性を有するプロモーターの制御下で発現される）は、新しいプロモーターのクローン化、静められない強力なプロモーターを数か月選択することによって培養され得る安定した細胞株を選択することに有用であり、故に、本発明の方法に役立つ。
【０１０７】
本発明の１つの実施形態において、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの発現のためのプロモーターは、誘導型プロモーターである。更なる実施形態において、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの発現のための誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クミン酸誘導性プロモーター、及びプロゲステロン誘導性プロモーターを含む群から選択される。
【０１０８】
〈Ｂ．５．検出の技術及び基質〉
本発明の方法に有用であるべき、レポーターの分泌顆粒の内部の環境に対する耐性、高レベルの発現、低い基礎分泌及び高度に誘発された分泌に加え、本発明の敏感な検出方法のための調節性のエキソサイトーシスに関するレポーターの他の重要な特性は、分泌されたレポーターを測定するために使用される検出技術の一種と、検出に使用される特異的な基質のための前記レポーターの触媒的効果である。高感度な検出技術と、特異的な基質のための高度な触媒的効果を有するレポーターの両方は、本発明の方法に有益である。
【０１０９】
本発明の方法に有用なレポーターは、タンパク質分解性の活性を有する酵素であり、故に、タンパク質分解性の活性の検出技術は、本発明に重要なものである。本発明の１つの実施形態において、分泌された顆粒貯蔵レポーターの酵素活性を測定するために使用される方法は、比色法、蛍光方法、ＦＲＥＴ、時間分解されたＦＲＥＴ又は発光方法から選択される。
【０１１０】
前記方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ヒトグランザイムＢ活性は、４０５ｎｍの比色法により、ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）にＣ末端で結合されるペプチドＩＥＰＤの使用によって検出され得、７−アミド−４−メチルクマリンにＣ末端で結合される同じペプチドは、３８０ｎｍの励起と、４８０ｎｍの発光波長を有する蛍光により検出され得、７−アミド−トリフルオロメチルクマリンにＣ末端で結合される同じペプチドは、４００ｎｍの励起と、５０５ｎｍの発光波長を有する蛍光により検出され得る。
【０１１１】
特に、本発明の方法に対して関連性のあるものは、高度に感受性のある蛍光又は発光のプロテアーゼ基質（例えば、ＦＲＥＴベースのプロテアーゼ基質、発光ベースのプロテアーゼ基質、及びローダミン−１１０ベースの蛍光基質）である。
【０１１２】
本発明の別の実施形態において、グランザイムＡ、Ｂ、キマーゼ、プロテイナーゼ３又は好中球エラスターゼのような有用なレポーターの酵素活性を測定するために使用される方法は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転写（ＦＲＥＴ）方法又は時間分解されたＦＲＥＴ方法から選択される。Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転写又はＦＲＥＴは、ＦＲＥＴの対として機能し得る２つのフルオロフォア間の近接を検出する技術である。例えば、「ドナー」と呼ばれる１つのフルオロフォアのフルオレッセンス発光スペクトルが、「アクセプター」と呼ばれる他のフルオロフォアの励起スペクトルに重複する場合、２つの分子は、ＦＲＥＴの対として機能し得る。（典型的に１００オングストローム以下で）互いに近接すると、ドナーフルオロフォアの励起は、アクセプターフルオロフォアへの非放射性のエネルギー送達に通じ、アクセプターからのフルオレッセンス発光の増加、及びドナーからのフルオレッセンス発光の減少をもたらす。ＦＲＥＴパートナーが分離されると、ＦＲＥＴは排除される。ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬフルオロフォア−クエンチャーの対は、ＦＲＥＴの適用に関して最も共通して使用するもののうちの１つであり、ＥＤＡＮＳ（励起波長３４１ｎｍ、及び発光波長４７１ｎｍ）の発光スペクトルと、ＤＡＢＣＹＬ（最大吸光度波長４５３ｎｍ）の吸光度スペクトルとの間の優れたスペクトルの重複に起因する。ＤＡＢＣＹＬによるＥＤＡＮＳの蛍光のクエンチングは、従って非常に効果的であり、蛍光において４０倍までの増強が、ＤＡＢＣＹＬ／ＥＤＡＮＳで標識化されたペプチドのタンパク質分解の後に観察された。例えば、配列ＳＧＩＥＰＤＳＧＶを有するペプチドは、Ｎ末端での「ドナー」フルオロフォアとしてのＥＤＡＮＳ、及び「アクセプター」又はクエンチャーとしてのＣ末端でのＤＡＢＣＹＬにより、標識化され得る。この無傷のペプチド基質が酵素活性の測定に使用されるとき、ＥＤＡＮＳの蛍光はＤＡＢＣＹＬによってクエンチされる。例えば、ヒトグランザイムＢによるＦＲＥＴペプチドの開裂に際して、ＥＤＡＮＳの蛍光は回復され、励起／発光＝３４０ｎｍ／４７０ｎｍで継続的に監視することができる。ＥＤＡＮＳ蛍光の増加は、グランザイムＢ活性に関連づけられる。５’−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ  ＦＲＥＴの対はまた、プロテアーゼ基質の標識化に広く使用され、ＤＡＢＣＹＬＪＥＤＡＮＳベースのペプチドより敏感であり、５−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡベースのＦＲＥＴ基質は、そのより長い発光波長のため、試験化合物の自己蛍光により妨害されにくい。また、本発明の方法に役立ち得る多くのＦＲＥＴの対がある。例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、ＢＨＱｓｕｐ．（商標）又はブラックホールクエンチャーとして販売されている非常に効果的なクエンチャーを開発し、一方でＡｎａｓｐｅｃは、ＱＸＬｓｕｐ．（商標）クエンチャー及びＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＱＳＹｓｕｐ（登録商標）クエンチャーを開発した。クエンチャー−フルオロフォアの対が効果的であるため、フルオロフォアの発光蛍光スペクトルは、クエンチャーの吸光度スペクトルにより重複されなければならない。本発明の方法に役立つＦＲＥＴの対の別の関連する特性は���検出のための励起と発光の波長である。励起と発光のための長い波長を有するＦＲＥＴの対は、細胞の構成要素、及び創薬の中で使用される化合物からの妨害を受けにくく、故に、本発明の方法に好ましい。ＦＲＥＴベースのプロテアーゼアッセイに役立つ、そのように称されるＮＩＲ色素は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｐｈａｍ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  （２００４）；  １５  １４０３−  １４０７を参照）、本発明は、特定のプロテアーゼによる開裂の後の蛍光の信号対バックグラウンド比率を有する新しいＮＩＲ色素（例えば、Ｐｅｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｄｙｅ  ｆｏｒ  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓｓａｙｓ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｅｐｕｂ  Ｆｅｂ２５，  （２００９）を参照）を含むプロテアーゼ活性の敏感で特定の検出のために発展した新技術から、利益を得る。例えば、ＦＲＥＴを使用するグランザイムＢの検出に適切な基質は、５’−ＦＡＭ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＴＡＭＲＡである。
【０１１３】
時間分解されたＦＲＥＴ又はＴＲ−ＦＲＥＴは、テルビウムのものなどのランタニドキレートがドナー種として使用される、ＦＲＥＴの変化である。テルビウムキレートは、標準の有機のフルオロフォアより桁違いに長い蛍光の寿命を有するので、そのような妨害が完全に衰退した後、ＴＲ−ＦＲＥＴは測定され得る。ドナー強度に対する受容体強度の放射測定の読み出しにより結合されたこれは、ＨＴＳアッセイのための有用な読み出しを提供する。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態において、顆粒分泌プロテアーゼによるペプチド開裂は、時間分解された蛍光測定法により検出される。例えば、ペプチドは、１つの端部での蛍光のランタニドキレート、及びもう１つの端部でのランタニドキレートのクエンチャーと結合され得る。プロテアーゼによる開裂の後、ランタニドキレート及びクエンチャーは、基質が開裂されるとともに分離される。本発明の方法のための時間分解されたＦＲＥＴ技術の１つの関連する特性は、蛍光発光が励起から遅れ得ることであり、故に、創薬プロセスで使用される化合物の自己蛍光が回避される。例えば、分泌されたグランザイムＢの検出に有用な基質は、Ｌａｎｔｈａｎ−ＩＥＰＤＳＧ−Ｑｕｅｎｃｈであり、ここで、Ｌａｎｔｈａｎは、ランタニドのキレート（例えば、ユウロピウムキレート）であり、Ｑｕｅｎｃｈは、ランタニド蛍光（例えば、ＱＳＹｓｕｐ．（登録商標）７）の適切なクエンチャーである。
【０１１５】
１つの好ましい実施形態において、分泌されたプロテアーゼの敏感な検出に使用される方法は、細胞及び創薬において使用される化合物からの最小の妨害を有する非常に効果的なＦＲＥＴの対（例えば、５’−ＦＡＭ及びＴＡＭＲＡ  ＦＲＥＴの対、近赤外線ＦＲＥＴの対、及びランタニドキレートベースの時間分解されたＦＲＥＴ方法）から選択される。
【０１１６】
本発明のまた別の実施形態において、顆粒分泌プロテアーゼは、ＡＴＰとルシフェラーゼの両方を含んでいる適切な緩衝液において、ペプチドにより修飾されたルシフェリン基質（例えば、Ｇｅｉｇｅｒ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍｉｓｋａ  Ｗ，  ＵＳＰＴＯ  ５０３５９９９を参照）により測定される。例えば、分泌されたグランザイムＢの測定に適切なペプチドは、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−アミドルシフェリン（ＩＥＰＤ−アミノルシフェリン）であり、ここで、アスパラギン酸のカルボン酸は、ＩＥＰＤ−アミドルシフェリンが分泌されたヒトグランザイムＢにより最初に開裂されない限り、ルシフェラーゼにより開裂されないアミドルシフェリンを生成するために、６−アミノルシフェリンに結合する。このグランザイムＢ基質を使用して、顆粒貯蔵エキソサイトーシスは、ルミネッセンスに結合され、故に、細胞、及び創薬に使用される化合物の両方の自己蛍光は、アッセイの読み出しによる妨害を引き起こさない。
【０１１７】
ローダミン１１０ベースのプロテアーゼ基質は、ペプチドがローダミン１１０（Ｒ１１０）のアミノ基の各々に共有結合的に結合される、フルオロフォアのビスアミド誘導体であり（例えば、Ｍａｎｇｅｌ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ  ＵＳＰＴＯ  ４５５７８６２を参照）、それにより、可視可能な吸収と色素の蛍光を抑える。酵素の開裂の後、非蛍光のビスアミド基質は、二段階のプロセスで、最初に蛍光のモノアミドへと、その後さらにより蛍光のＲ１１０へと変換される。Ｒ１１０開裂の産物は、フルオレセインのものに類似するスペクトル特性と、より大きな消衰係数を有し、故に、標準のフルオレセインフィルター装置の下での容易な使用と、優れた信号対バックグラウンド比率を提供する。本発明の１つの実施形態において、タンパク質分解の検出用のプロテアーゼ基質は、ローダミン１１０により修飾されたペプチドである。
【０１１８】
別の実施形態において、レポーター検出に有用な好ましい基質は、細胞を含む混合物におけるレポーター検出に適している細胞不浸透性の基質である。
【０１１９】
本発明の別の実施形態において、分泌されたプロテアーゼの好ましい検出は、シグナル増幅のための酵素のカスケードを含む。シグナル増幅を可能にするプロテアーゼカスケードは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｒｉｓ，  Ｃ．  ＵＳＰＴＯ  ４，４６３，０９０を参照）。プロテアーゼ増幅カスケードの最良の実施例は、第１のプロテアーゼが、活性化されたプロテアーゼを生成するためにチモーゲンを活性化し、この第２のプロテアーゼも、第２の活性プロテアーゼを生成するためにチモーゲンを活性化し、それにより、最初のシグナルが１０００倍まで増幅されるカスケードを作り出す、血液凝固カスケードである。非常に低い基礎活性を有する酵素前駆体は、高度の信号対バックグラウンド比率でのシグナル増幅に必要とされる。例えば、天然のカスパーゼ８チモーゲンは、十分に処理された酵素の１％の活性、大半のプロテアーゼチモーゲンと比較して非常に大きな活性を有し（Ｍｕｚｉｏ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９８）  ２７３：  ２９２６−２９３０を参照）、故に、天然のカスパーゼ−８は、グランザイムＢのような分泌されたレポーターの敏感な検出のための高度なバックグラウンドを有する。代わりに、ヒトプロカスパーゼ−３は、ヒト、ラット、ウマ又はチンパンジーのグランザイムＢのいずれかによって効果的に開裂及び活性化され、未開裂のチモーゲンよりも約１００００倍活性な成熟したカスパーゼ−３を生成し、故に、顆粒を分泌したプロテアーゼの検出に非常に有用である。高度のチモーゲン性の指標は、本発明の方法における分泌されたレポーターの検出に役立つプロテアーゼに特に好ましい特性である。高度のチモーゲン性の指標に加えて、本発明の方法に好ましいチモーゲンは、活性化の後の高度な触媒の効率及び酵素の低い基礎活性を有する酵素から選択される。それらの特性を有するチモーゲンは、本発明における脱顆粒の敏感な検出のために選択される必要がある。
【０１２０】
チモーゲンの基礎活性は、チモーゲン性の指標に関連づけられるが、本明細書には、本発明の方法に関連するいくつかの違いがある。最初に、同じチモーゲン性の指標を有する２つの酵素は、異なる基礎活性を有することができるが、より高い基礎活性を有する酵素はまた、より高い触媒の効率を有する酵素である。本発明の方法に好ましいものは、できるだけ高いチモーゲン性の指標、及びできるだけ低い基礎酵素活性を有する酵素である。２つ目に、基礎活性は、チモーゲン性に関連づけられるだけではなく、これは、プロカスパーゼ−３のような特定の酵素が、高濃度で存在する時に容易に自己活性化され得るためである。例えば、プロカスパーゼ−３のチモーゲン性の指標は、約１００００であり、故に非常に高いものであるが、酵素が高濃度で貯蔵されると、酵素は自己活性化し、基礎活性は非常に高いものとなり得る。３つ目に、本発明の方法に関連する基礎活性は、調節性のエキソサイトーシスのモジュレーターの欠如下での細胞の細胞培養の上清において存在し、トランスフェクトされた顆粒貯蔵レポーターによって生成されるだけではない。例えば、グランザイムＡは、プロテアーゼのトリプターゼ−ファミリーに属するセリンプロテアーゼである。前記トリプターゼ−ファミリーは、アルギニン又はリジンのアミノ酸の後の開裂配列により特徴付けられる。ヒトグランザイムＡは、Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１にてＩＧＤＲ又はＶＡＮＲを含む最適な開裂配列を有し（例えば、Ｍａｈｒｕｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｃｒａｉｋ  ＣＳ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２００５），  １２，  ５６７−５７７を参照）、故に本発明の方法に潜在的に役立つが、トリプターゼの活性は、トランスフェクトされていないＲＢＬ−２Ｈ３細胞の刺激を受けていない細胞培養の上清に既に存在し、前記ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は非常に高いため、イオノマイシンのような分泌モジュレーターにより刺激されたヒトグランザイムＡにより安定してトランスフェクトされたＲＢＬ−２Ｈ３細胞と、イオノマイシンにより刺激された又は刺激されていないトランスフェクトされていない細胞との間に違いは無い。しかし、細胞培養の上清が取り除かれ、細胞が血清遊離緩衝液（例えば、修飾されたＨＢＳＳ）により洗浄されると、基礎のトリプターゼ活性は、ヒトグランザイムＡが本発明の方法に有用なレポーターとなるレベルにまで低下される。
【０１２１】
Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎらは、プロテアーゼ定量化に有用な人工の増幅カスケードを発展させ（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （１９９７）  ３２３，  ６０３−６０９  ａｎｄ  Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ  ＪＨ，  ＵＳＰＴＯ，  ８，１１５，２５２を参照）、ここで、ｐｒｏ−ウロキナーゼが、定量化されるプロテアーゼによって開裂可能な認識部位を含むように修飾される。他のものは、プロテアーゼ活性の測定としてプロカスパーゼ−３のような開裂部位にて修飾される異なるプロテアーゼを使用した。例えば、Ｌｉ  Ｙら（Ｌｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （２００１）  Ｖｏｌ．  １８，  Ｎｏ  １  ，  １−１０を参照）は、活性なカスパーゼ−３の周知の効果として２９３Ｔ細胞におけるアポトーシスを誘発する、ベータセクレターゼ開裂部位を含んでいる修飾されたプロカスパーゼ−３を発展させ、彼らは、修飾されたプロカスパーゼ−３により誘発されたアポトーシスが、ベータセクレターゼに対するベータセクレターゼ認識配列の感受性に相互に関連付けられ、プロテアーゼの競合するもの（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒｓ）が、修飾されたカスパーゼ−３により誘発される細胞死を予防することまでも実証した。別の実施例において、Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ  ＡＭら（Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  （１９９９），  Ｖｏｌ  ５，  Ｎｏ．  １  ：２９−３３を参照）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質分解開裂部位を、内因性のものに置換するプロカスパーゼ−３を設計した。一旦細胞の内部で、この設計されたプロカスパーゼ−３が、非感染細胞（しかし、ＨＩＶ感染細胞）において不活性のままであれば、このプロカスパーゼ−３は、ＨＩＶプロテアーゼによって活性型へと処理されるようになり、感染細胞のアポトーシスをもたらす。プロテアーゼカスケードの上記の例はすべて、本発明の方法に関連するが、本発明の方法に好ましいチモーゲンは、天然のプロカスパーゼ−３に基づいた天然の増幅カスケードに基づく。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−８のような様々なカスパーゼは、グランザイムＢの天然の基質であり、我々は、分泌されたグランザイムＢの定量化のための、速くて敏感な方法を発展させるために、カスパーゼ−３のこの特性を使用した。
【０１２２】
本発明の１つの特定の実施形態において、ヒト、ラット、チンパンジー又はウマのグランザイムＢのために使用された好ましいチモーゲンは、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０３２９９１に従って、位置２９のセリンから位置２７７のヒスチジンまでのアミノ酸を含む、修飾されないヒトプロカスパーゼ−３である。
【０１２３】
別の実施形態において、分泌されたヒトグランザイムＢ、ラットグランザイムＢ、チンパンジーグランザイムＢ、又はウマグランザイムＢの検出に役立つヒトプロカスパーゼ−３は、ヒト、ラット、チンパンジー又はウマのグランザイムＢによるより効果的な開裂のため、プロリンに突然変異された位置１７４のトレオニンを有する、突然変異した変異体である。またさらなる実施形態において、ヒトプロカスパーゼ−３は、少なくとも位置１７６のセリンをバリン又はロイシンに変更することにより、自己活性化を減少させるために更に修飾される。１つの実施形態において、ヒトグランザイムＢによる改善された開裂を有するヒトプロカスパーゼ−３は、トレオニンの代わりに位置１７４のプロリン、バリンに突然変異される位置１７６のセリン、ロイシンに突然変異される位置１７７のグリシン、メチオニンに突然変異される位置１７８のバリン、及びグルタミン酸に突然変異される位置１７９のアスパラギン酸を有する。アミノ酸Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’―Ρ２’―Ρ３’−Ρ４’を含む配列ＩＥＰＤＶＬＭＥを有する前記プロカスパーゼ−３は、ヒトグランザイムＢの開裂には最適であり、グランザイムＢの欠如下で非常に低い自己活性化を有するが、ヒトグランザイムＢによって開裂された時、完全な活性を有する。非常に減少された自己活性化を有する前記突然変異されたヒトプロカスパーゼ−３は、配列番号：１１として表に記載される。
【０１２４】
マウスグランザイムＢのテトラペプチド特異性が、ヒトグランザイムＢと著しく異なることが知られている。ヒト及びマウスのグランザイムＢは、各グランザイムＢに関する異種のプロカスパーゼ３よりも効果的である、種に特異的なプロカスパーゼ−３を開裂する。ＩＥＴＤ（位置１７５でのイソロイシン−グルタミン酸−トレオニン−アスパラギン酸）を含むＰ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１の配列にある、マウスグランザイムＢによる、ヒトプロカスパーゼ−３の開裂は、ヒトプロテアーゼよりも効果は約６倍少ないが、両方のカスパーゼは、同一のＩＥＴＤ開裂配列を有し、故に、種に特異的なプロカスパーゼ−３の使用は、本発明の方法の分泌されたグランザイムＢの検出に好ましい。
【０１２５】
本発明の１つの実施形態において、有用な活性化されたチモーゲンの酵素活性を測定するために使用される方法は、比色法、蛍光方法、ＦＲＥＴ、時間分解されたＦＲＥＴ又はルミネセンス方法から選択される。
【０１２６】
活性なカスパーゼ３の検出に役立つ基質の例は、５’−ＦＡＭ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＴＡＭＲＡ、ＦＲＥＴ基質；Ｌａｎｔｈａｎ−ＣＤＥＶＤＫ−Ｑｕｅｎｃｈであり、ここで、Ｌａｎｔｈａｎは、ランタニドのキレート（例えば、ユウロピウムキレート）であり、Ｑｕｅｎｃｈは、時間分解された蛍光測定法用のランタニド蛍光（例えば、ＱＳＹｓｕｐ．（登録商標）７）の適切なクエンチャー；蛍光のためのＤＥＶＤ−ＡＭＣ及び、ＤＥＶＤ−ＡＦＣ並びにルミネッセンス発光検出用のＤＥＶＤ−アミノルシフェリンである。
【０１２７】
別の好ましい実施形態において、カスパーゼ−３のような活性化されたチモーゲンの基質は、細胞内の基質の加水分解のため、バックグラウンドを減少させるための細胞不浸透性の基質である。別の実施形態において、活性なカスパーゼ−３の好ましい細胞不浸透性の基質は、Ｃ末端で結合された７−アミド−４−メチルクマリン、ローダミン１１０又はアミノルシフェリンに結合される、或いはＦＲＥＴ又は時間分解されたＦＲＥＴのいずれかのためのフルオロフォアを有する１つの端部、及び特定のフルオロフォアの蛍光の適切なクエンチャーを有するもう１つの端部に結合される、配列ＤＥＶＤのペプチドである。
【０１２８】
本発明の別の実施形態において、分泌されたプロテアーゼの活性は、前記分泌されたプロテアーゼによって活性化されたチモーゲンによって検出することができ、ここで、前記チモーゲンは、特定のプロテアーゼによって活性化されない限り、酵素活性が欠けている環状に変更された酵素である。環状変更は、酵素のアミノとカルボキシの終端が連結され、新しいアミノ及びカルボキシの終端が分子のあらゆる場所で引き起こされるプロセスである。本発明の方法に有用な環状に変更された酵素は、環状変更によって低い基礎活性を有するチモーゲンに変換される酵素であり、活性は、プロテアーゼ開裂によって貯蔵される。環状に変更されたチモーゲンは、当該技術分野において周知である。Ｐｌａｉｎｋｕｍ  Ｐら（Ｐｌａｉｎｋｕｍ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ｆｅｂ；  １０（２）：  １１５−９．を参照）は、リボヌクレアーゼＡのＮとＣの終端の連結によって、活性部位が、ｐｌａｓｍｅｐｓｉｎ  ＩＩ、熱帯熱マラリア原虫からの非常に特異的なプロテアーゼによって認識されたアミノ酸配列順序により遮断されることを、最初に実証した。彼らは、環状変更によって新しいＮ及びＣの終端を作り、ｐｌａｓｍｅｐｓｉｎ  ＩＩの存在下で、リボヌクレアーゼチモーゲンは、およそ１０００倍の触媒活性を得て、高度な立体構造の安定性を維持した。他の研究者は、プロテアーゼによって活性化することができる、新しいチモーゲンを作るためにＮとＣの終端の環状変更を適用した（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２７３，  Ｉｓｓｕｅ ２３，  ｐｐ．  ５４５７−５４６５，  ２００６  ａｎｄ  Ｊｕｃｏｖｉｃ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２００８  ２１  （１０）：６３１−６３８を参照）。
【０１２９】
本発明の別の実施形態において、分泌されたプロテアーゼの定量化に有用な、適切なチモーゲンは、高度の信号対バックグラウンド比率に関して低い基礎活性を有する酵素から選択され、故に、分泌されたプロテアーゼによる活性化の後、よりロバストなアッセイ及び高度の触媒効果を有する酵素から選択される。例えば、修飾されたｐｒｏ−エンテロキナーゼは、非常に高い基礎活性、即ち、ヒトグランザイムＢの敏感な検出のためのその用途を妨げる、低いチモーゲン性の指標を有する。
【０１３０】
本発明の別の実施形態において、分泌されたプロテアーゼの定量化に好ましいチモーゲンは、反応緩衝液がエキソサイトーシスに使用された培地と適合することができる酵素から選択される。
【０１３１】
検出技術のいずれかに基づいた敏感なレポーター検出のために、非常に高い効果により開裂される特異的なプロテアーゼ基質が必要である。開裂配列の周囲のアミノ酸残留物は、任意の特定の基質のためのプロテアーゼレポーターの触媒効率の主要な決定因子である。
【０１３２】
１つの実施形態において、トリプターゼ様の活性を有する、有用な顆粒貯蔵レポーターは、グランザイムＡ及びグランザイムＫを含む群から選択される。別の実施形態において、Ａｓｐ−ａｓｅ様の活性を有する、有用な顆粒貯蔵レポーターは、グランザイムＢである。別の実施形態において、キマーゼ様の活性を有する、有用な顆粒貯蔵レポーターは、グランザイムＨ、キマーゼ及びカテプシンＧを含む群から選択される。またさらなる実施形態において、エラスターゼ様の活性を有する、有用な顆粒に貯蔵されたレポーターは、グランザイムＭ、好中球のエラスターゼ及びプロテイナーゼ３を含む群から選択される。
【０１３３】
１つの実施形態において、有用な顆粒貯蔵レポーターは、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウシ、モノデルフィス、ヒツジ、及びヤギのセリンエンドペプチダーゼの群から選択される。
【０１３４】
本発明の１つの特定の実施形態において、グランザイムＢプロテアーゼが、アスパラギン酸の後の開裂のための絶対的な必要条件を有する既知の唯一のセリンプロテアーゼであるため、異種のレポーターは、ヒト、ラット、チンパンジー、及びウマの種からのグランザイムＢを含むセリンプロテアーゼの群から選択される。
【０１３５】
本発明の１つの実施形態において、センサーのレポーターとして使用される、ヒト、ラット、チンパンジー、及びウマの種のグランザイムＢに好ましい基質は、Ｐ４でイソロイシン又はバリンから選択されるアミノ酸；Ｐ３でグルタミン酸、メチオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、アスパラギン酸、スレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンから選択されるアミノ酸；Ｐ２でプロリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン酸、アラニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、グルタミン酸、グリシン、又はヒスチジンから選択されるアミノ酸；及びＰ１でスパラギン酸を含む。
【０１３６】
本発明の別の実施形態において、ヒト、ラット、チンパンジー、及びウマの種のグランザイムＢに更に好ましく拡張された基質は、Ｐ１’でバリン、セリン、チロシン、及びフェニルアラニンから選択された負荷されていないアミノ酸、並びに、Ｐ２’でセリン、アラニン、グリシン、チロシン、ロイシン、又はグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含む。
【０１３７】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ヒト、ラット、チンパンジー、及びウマの種のグランザイムＢに更に好ましい基質は、Ｐ４でイソロイシン配列、Ｐ３でグルタミン酸、Ｐ２でプロリン又はスレオニン、及びＰ１でアスパラギン酸を含む。更に好ましい基質はまた、Ｐ１’でセリン、及びＰ２’でグリシン又はロイシンを含む。
【０１３８】
本発明の別の実施形態において、センサーのレポーターとして使用される、ヒト、ラット、又はマウスのグランザイムＡのための基質は、Ｐ４でイソロイシン、バリン、又はグリシンから選択されるアミノ酸；Ｐ３でアラニン、グリシン、セリン、フェニルアラニン、又はチロシンから選択されるアミノ酸；Ｐ２でアスパラギン又はフェニルアラニンから選択されるアミノ酸；及びＰ１でアルギニン又はリジンを含む。
【０１３９】
本発明の別の実施形態において、ヒト、ラット、又はマウスのグランザイムＡに更に好ましく拡張された基質は、Ｐ１’でリジン又はメチオニンの脂肪族の側鎖、或いは、アラニン又はセリンのような極性の残留物のような分岐していない疎水性アミノ酸などの長い線形の疎水性アミノ酸；及びＰ２’でバリン、ロイシン、フェニルアラニン、及びチロシンから選択されるアミノ酸を含む。
【０１４０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ヒトグランザイムＡの更に好ましい基質は、Ｐ４でバリン又はイソロイシン、Ｐ３でアラニン、グリシン又はセリン、Ｐ２でアスパラギン又はアスパラギン酸、及び、Ｐ１でアルギニンを含む。更に好ましい基質はまた、Ｐ１’でのセリン又はメチオニン、Ｐ２’でバリン、ロイシン又はフェニルアラニンを含む。本発明の方法の別の好ましい実施形態において、マウスグランザイムＡの更に好ましい基質は、Ｐ４でグリシン又はバリン、Ｐ３でチロシン又はフェニルアラニン、Ｐ２でフェニルアラニン又はアスパラギン、及び、Ｐ１でアルギニンを含む。マウスグランザイムＡの更に好ましい基質はまた、Ｐ１’でセリン又はメチオニン、Ｐ２’でロイシン又はフェニルアラニンを含む。
【０１４１】
本発明の１つの実施形態において、センサーのレポーターとして使用される、ヒトキマーゼの基質は、Ｐ４でグリシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、プロリン、グルタミン、又はロイシンから選択されるアミノ酸；Ｐ３でアラニン、バリン、ロイシン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、又はグルタミン酸から選択されるアミノ酸；Ｐ２でアスパラギン、セリン、アスパラギン酸、スレオニン、プロリン、ロイシン、アラニン、又はバリンから選択されるアミノ酸；及びＰ１でチロシン又はフェニルアラニンを含む。
【０１４２】
本発明の別の実施形態において、ヒトキマーゼの更に好ましく拡張された基質は、Ｐ１’
でセリン又はグリシン；Ｐ２’でアスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、又はグリシンから選択されるアミノ酸；及びＰ３’でバリン、ロイシン、アラニン又はグリシンから選択されるアミノ酸を含む。
【０１４３】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ヒトキマーゼの更に好ましい基質は、Ｐ３でヒスチジン、グルタミン酸又はスレオニン；Ｐ２でプロリン又はスレオニン；及びＰ１でフェニルアラニン又はチロシンを含む。更に好ましい基質はまた、Ｐ１’でセリン、及び、Ｐ２’でアスパラギン酸、グルタミン酸、又はアラニンを含む。
【０１４４】
本発明の１つの実施形態において、センサーのレポーターとして使用される、ヒト、ラット、及びマウスの種のプロテアーゼ３の基質は、Ｐ４でバリン及びアラニンのような小さな脂肪族の残基を有するアミノ酸；Ｐ３でバリン及びアラニンのような小さな脂肪族の残基を有するアミノ酸；Ｐ２でアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、及びリジンから選択される負荷されたアミノ酸；及びＰ１でシステイン、ノルバリン、バリン、アラニン、及びメチオニンから選択されるアミノ酸を含む。
【０１４５】
本発明の別の実施形態において、ヒト、ラット、及びマウスのプロテアーゼ３の更に好ましく拡張された基質は、Ｐ１’でアルギニン及びリジンから選択された正に負荷されたアミノ酸、又はバリン及びアラニンのような小さな脂肪族の残基を有するアミノ酸；及びＰ２’でアスパラギン酸、グルタミン酸、又はグルタミンから選択されるアミノ酸を含む。
【０１４６】
本発明の方法の別の実施形態において、ヒトプロテイナーゼ３の更に好ましい基質は、Ｐ４でバリン又はアラニン；Ｐ３でバリン又はアラニン；Ｐ２でアスパラギン酸；及びＰ１でシステイン、バリン又はノルバリンを含む。更に好ましい基質はまた、Ｐ１’でアラニン又はリジン、Ｐ２’でアスパラギン酸、及びＰ３’でアルギニンを含む。
【０１４７】
本発明の１つの実施形態において、センサーのレポーターとして使用される、ヒト、ラット、及びマウスの種の好中球エラスターゼの基質は、Ｐ４でバリン及びアラニンのような小さな脂肪族の残基を有するプロリン又はアミノ酸；Ｐ３でバリン及びアラニンのような小さな脂肪族の残基を有するアミノ酸、又は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択される負に負荷されたアミノ酸；Ｐ２でアラニン及びバリンのような小さな脂肪族の残基を有するアミノ酸、又は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択される負に負荷されたアミノ酸；及びＰ１でイソロイシン、ノルバリン、バリン、アラニン及びメチオニンから選択される疎水性又は極性のアミノ酸を含む。
【０１４８】
本発明の別の実施形態において、ヒト、ラット、又はマウスの好中球エラスターゼの更に好ましい基質は、Ｐ１’で疎水性、極性、又は負に負荷されたアミノ酸、及びＰ２’で疎水性又は負に負荷されたアミノ酸を含む。
【０１４９】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ヒト好中球エラスターゼの更に好ましい基質は、Ｐ４でプロリン又はバリン或いはアラニン；Ｐ３でグルタミン酸又はバリン或いはアラニン；Ｐ２でグルタミン酸；及びＰ１でイソロイシン、バリン又はノルバリンを含む。更に好ましい基質はまた、Ｐ１’でメチオニン、Ｐ２’でアルギニン又はアスパラギン酸、及びＰ３でのアルギニンを含む。
【０１５０】
本発明のセンサーの１つの関連する特徴は、異なる細胞ベースのセンサーが、各反応容器での多重アッセイを作るために、同じ反応容器内で組み合され得ることである。同じ反応容器において組み合わせるために、各細胞ベースのセンサーは、特異的なエキソサイトーシスモジュレーターと、特異的な顆粒貯蔵レポーターの独特な組み合わせを作らなければならない。加えて、放出された時、前記顆粒貯蔵レポーターは、他の基質又は他の放出されたレポーターによる最小の妨害を有する、或いはそれをおそらく有さない、特異的な基質により検出されなければならない。
【０１５１】
本発明の１つの実施形態において、少なくとも２つの細胞ベースのセンサーは、それぞれ、１つのエキソサイトーシスモジュレーターと１つの顆粒貯蔵レポーターの独特の特異的な組み合わせを作り、多重反応を作るために同じ反応容器において混合され得る。
【０１５２】
さらなる実施形態において、２、３、４、５又は６の異なる細胞ベースのセンサーは、すべての顆粒貯蔵レポーターの細胞生存率、脱顆粒及び酵素活性に適合する培地における同じ反応において混合される。１つの特定の実施形態において、細胞の生存率、脱粒及び酵素活性に適合する１つの培地は、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ＝７．４；１３０ｍＭ  ＮａＣＩ  ５．６５ｍＭ  ＫＣｌ；１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．１パーセントのグルコース、及び０．１パーセントのウシ血清アルブミンである。
【０１５３】
１つの好ましい実施形態において、混合されたレポーターの酵素活性の検出に使用される方法は、ＦＲＥＴ、又は時間分解されたＦＲＥＴから選択される。
【０１５４】
例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、ＢＨＱｓｕｐ．（商標）又はブラックホールクエンチャーとして販売された非常に効果的なクエンチャーを開発し、一方でＡｎａｓｐｅｃは、ＱＸＬｓｕｐ．（商標）クエンチャー及びＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＱＳＹｓｕｐ（登録商標）クエンチャーを開発した。効果的であるべきクエンチャー−フルオロフォアの対のため、フルオロフォアの発光蛍光スペクトルは、クエンチャーの吸光度スペクトルに重複しなければならない。フルオロフォア−クエンチャーの様々な対は、その蛍光発光スペクトルが重複されない又は最小限に重複されるフルオロフォアを組み合わせることにより、多重の反応を発展させるために混合され得る。
【０１５５】
別の実施形態において、異なるレポーター酵素の活性は、蛍光と発光の方法の組み合わせによって検出される。
【０１５６】
〈Ｃ．本発明の細胞ベースのセンサーの適用〉
本発明の細胞ベースのセンサーは、一般的に、少なくとも２つの分子（一方はエキソサイトーシスモジュレーターとして作用し、もう一方はエキソサイトーシスモジュレーターの特異的なリガンドとして作用する）の間の相互作用を検査するのに役立つ。例えば、創薬において、何千又は何百万もの小分子は、標的の活性を修飾する小分子を見つけるために、前記標的に対して検査される。特定の実施例において、化合物は、Ｇタンパク質共役受容体（非常に新薬の開発につながるような種類のレセプター）のアゴニスト又はアンタゴニストのためスクリーンされる。しかし、同じセンサーは、脱顆粒を調整する化合物の検出及び定量化、例えば、様々なサンプル（例えば、食品産業、環境サンプル、及び診断におけるもの）における薬物の乱用において適用される。創薬における分子間の相互作用を試験し、薬物の診断および検出のためのタンパク質などの分子、またはいくつかのサンプルにおける、例えば、食品産業、環境サンプルおよび製薬産業における分子を定量化する。センサーの使用は、細胞表面受容体又は表面受容体の小さなモジュレーターに限定的ではない。例えば、１つの分子が、特異的な免疫グロブリンＥであり、測定されるべきタンパク質と結合する他の分子は、測定されるべきタンパク質のオリゴマー化を誘発する場合、測定されるべきタンパク質と結合する１組の２つの分子により、早い、特異的な、及び敏感な検出は、本発明のセンサーの使用により実行され、測定されるべきタンパク質と結合する。上記のセンサーの他の使用は、抗アレルギーの化合物の検査のために、及びアレルゲンの検出のために行われる。
【０１５７】
〈Ｄ．化合物がエキソサイトーシスを調整するかを試験するためのキット〉
本発明はまた、化合物がエキソサイトーシスを調整するか試験するためのキットを含む。前記キットは、少なくとも以下のものを含む：適切なプロモーターの制御下で少なくとも異種のプロテアーゼレポーターによりトランスフェクトされたプロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する造血細胞、及び、分泌された異種のプロテアーゼレポーターの検出のための特異的な基質。加えて、プロフェッショナルな調節性のエキソサイトーシスを有する造血細胞株は、ＧＰＣＲ、異種のＦｃガンマＩ受容体又は異種のＦｃイプシロンＩ受容体のような適切なプロモーターの制御下にある異種のエキソサイトーシスモジュレーター、又は、使用され得る内因性のＦｃイプシロンレセプターＩ（ＩｇＥレセプター）のような内因性のエキソサイトーシスモジュレーターによりトランスフェクトされ得る。エキソサイトーシスモジュレーターとしてＩｇＥ受容体を使用するキットは、測定されるべき分析物に特異的なＩｇＥ、及び、ＩｇＥに結合する分析物のオリゴマー化を誘発するための第２の分子を含み得る。
【０１５８】
（実施例）
本発明は以下の実施例に関連してここで記載される。これらの実施例は、説明目的に過ぎず、本発明は、これらの実施例に限定的なものとしては決して解釈されてはならないが、本明細書で提供される教示の結果として明白になる、任意のおよび全ての変形を包含すると解釈されるべきである。しかし、本発明の特定の実施形態は、記載目的のために本明細書で記載されているが、詳細の多くの変形が、添付された請求項に記載される本発明から逸脱することなく作られてもよいことは、当業者に明らかである。
【０１５９】
以下の表は、実施例で使用される顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの要約を示す。
【０１６０】
【表１】
2013535195.tif 000003
【０１６１】
以下の表は、実施例で使用される細胞株の概略を記載する。
【０１６２】
【表２】
2013535195.tif 000004
【０１６３】
以下の表は、実施例で使用されるエキソサイトーシスモジュレーターの概略を記載する。
【０１６４】
【表３】
2013535195.tif 000005
【０１６５】
以下の表は、実施例で使用されるすべてのプライマーを列挙している。
【０１６６】
【表４−１】
2013535195.tif 000006
【０１６７】
【表４−２】
2013535195.tif 000007
【０１６８】
【表４−３】
2013535195.tif 000008
【０１６９】
【表４−４】
2013535195.tif 000009
【０１７０】
【表４−５】
2013535195.tif 000010
【０１７１】
【表４−６】
2013535195.tif 000011
【０１７２】
（実施例１：本発明の方法のための有用な細胞株の選択）
複数の細胞株は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（米国のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ドイツのＱｉａｇｅｎ）で一過性にトランスフェクトされるか、あるいは、ヒトグランザイムＢがヒトＣＭＶプロモーター（配列番号：８）の制御下にあるベクターである、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ−ｈグランザイム  Ｂベクターを含むｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて一過性にエレクトロポレートした。このベクターは、グランザイムのような顆粒レポーターのプロフェッショナルな顆粒エキソサイトーシスによる細胞の選択に用いられた。４８時間後、細胞培養培地を代え、刺激をせずに１時間培養した後の基礎レベルは、顆粒エキソサイトーシスの誘導体として、１時間、１０μＭでイオノマイシンにより処理された細胞と比較して評価された。培地に分泌されるグランザイムＢの量は、１００，０００、５０，０００、２５，０００、および、１２，５００の細胞から同等の上清を用いてタンパク質の総量を定量化するために、ヒトグランザイムＢ（オランダのＵｃｙｔｅｃｈ）に特異的な両方のサンドイッチＥＬＩＳＡによって評価された。グランザイムＢ活性は、ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ＝７，４の２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ；１３０ｍＭ  ＮａＣｌ  ５．６５ｍＭ  ＫＣｌ；１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．１％のグルコースを含有する、ハンクス平衡食塩緩衝液（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ）中の、１リットル当たり４００マイクロモルの１２５マイクロリットルの特定の基質と、５０，００００細胞からの１２５マイクロリットルの上清を用いて、９６ウェルマイクロプレート内で、ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光光度計において分泌された酵素の活性を測定するために、３６０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光を用いて、グランザイムＢの蛍光基質ＩＥＰＤ−ＡＭＣ（米国のＳｉｇｍａ）の加水分解によって測定された。マイクロプレートは、読み取り装置で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に、動態学的に読み取りを行った。Ａ４３１、ＰＣ１２、ＨＥＫ２９３、および、ＣＨＯ−Ｋ１のような非増血性（ｎｏｎ-ｈｅｍｏｐｏｙｅｔｉ）細胞へとトランスフェクトされたグランザイムＢは、細胞がイオノマイシンで処理されると、顆粒貯蔵も分泌もされず、ジャーカットとＰ８１５はプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含まない造血細胞であり、酵素活性を含まないグランザイムＢを構造的に分泌し、および、ＲＢＬ−２Ｈ３、および、３２Ｄのようなプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含む造血細胞はグランザイムＢを生成し、酵素の大部分は顆粒へと貯蔵され、イオノマイシン処理によって分泌され、および、分泌された酵素が活性である。したがって、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターのプロフェッショナルな顆粒エキソサイトーシスを含む造血細胞は、本発明のバイオセンサーの開発に適している。
【０１７３】
（実施例２．一過性のトランスフェクションを使用する、本発明の方法におけるレポーター発現に有用なプロモーターの選択）
ベクターは、以下のプロモーター：Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＬＶ５’ＬＴＲ、配列番号：３）、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、および、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターのキメラプロモーター、および、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲ、配列番号：１０）の制御下で、ヒトグランザイムＢの発現のために開発された。各々のベクターは、標準条件下で、ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたエレクトロポーションによって、ＲＢＬ−２Ｈ３へとトランスフェクトされ、４８時間後、細胞を数え、９６ウェルマイクロプレート内で１ウェル当たり１００，０００個の細胞の密度で、実験の前夜に播種した。翌日、細胞をＢＳＳ緩衝液で洗浄し、３０マイクロリットルの全容積中１０μＭのイオノマイシンによる１時間の処理のために処理する。上清は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（オランダのＵｃｙｔｅｃｈ）によってグランザイムＢについてアッセイした。ＥＬＩＳＡのバックグラウンドは０．２であり、陽性であると考えられる希釈のカットオフは、任意に０．３とした。０．３の信号を生成するために必要とされる細胞の最小の数が、各々の試験したプロモーターについて測定された。
【０１７４】
【表５】
2013535195.tif 000012
【０１７５】
エレクトロポーションによる一過性のトランスフェクションは、レポーター発現のためのプロモーターの潜在能力の序列が、ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲ＞ＭｏＬＶ５’−ＬＴＲ＞ｈＣＭＶ＞ｈＰＧＫであることを示す。したがって、エレクトロポーションによる一過性のトランスフェクションは、すべての試験したプロモーターがレポーター発現に適していることを示唆している。高レベルのレポーター発現が必要とされる場合、プロモーターは、ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーター、ＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター、または、ｈＣＭＶプロモーターから選択され得るが、低レベルのレポーター発現が必要とされる場合、プロモーターは、ｈＰＧＫプロモーターまたはｈＣＭＶプロモーターから選択され得る。
【０１７６】
（実施例３．ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲキメラプロモーター、ＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター、および、ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのヒトグランザイムＢを発現する安定した細胞株の開発）
ベクターは、ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲキメラプロモーター、ＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター、または、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で、ヒトグランザイムＢの安定した発現のために開発された。ヒグロマイシン耐性カセットは、細胞の安定個体群の選択のためのベクター骨格に含まれた。ベクターは、したがって、グランザイムＢを発現する安定した細胞のフローサイトメトリーおよび／または選択のために、同じプロモーターの制御下で、ヒトグランザイムＢの下流でクローン化されたＩＲＥＳ−ＮＧＦＲ（配列番号：１２）のカセットも含んでいた。ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、各々のベクターを個別にＲＢＬ−２Ｈ３にエレクトロポレートし、４８時間後、１５００μｇ／ｍＬのヒグロマイシンを選択培地に加えた。約２週間の選択の後、細胞はＦＩＴＣに結合したＮＧＦＲに対する抗体を用いて、フローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。陽性の個体群は、抗−ＮＧＦＲ−ＭＡＣＳ  ｓｕｐ．Ｒ（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＭＡＣＳによって磁気的に分離された。選別された個体群は、選別効率をチェックするために、フローサイトメトリーによって再度分析された。細胞は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（オランダのＵｃｙｔｅｃｈ）によるヒトグランザイムＢの分泌の定量を決めるための実験の前夜に、１ウェル当たり１００，０００個の細胞で９６ウェルマイクロプレート中にその後播種された。翌日、細胞はＨＢＳＳ緩衝液で洗浄され、顆粒エキソサイトーシスの誘導体として１０μＭのイオノマイシンを含有するＨＢＳＳ３０μＬ中で、摂氏３７度で６０分間インキュベートされた。ＥＬＩＳＡのバックグラウンドは０．２であり、陽性であると考えられる希釈のカットオフは、任意に０．３とした。０．３の信号を生成するために必要とされる最小の数の細胞が、各々の試験したプロモーターについて測定された。
【０１７７】
その結果は、以下の通りであった。
【０１７８】
【表６】
2013535195.tif 000013
【０１７９】
上記の結果は、ｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲキメラプロモーターからの発現がＭｏＭＬＶ−５’ＬＴＲプロモーターおよびｈＣＭＶプロモーターよりも高いが、すべての試験したプロモーターは、顆粒貯蔵レポーターの発現に適していることを確認した。グランザイムＢの発現のための、および、高感度ＥＬＩＳＡのためのｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲキメラプロモーターとともに細胞を用いると、５０未満の細胞からのグランザイムＢ分泌が容易に検出され得るが、ＭｏＭＬＶ−５’ＬＴＲプロモーターをグランザイムＢの発現に使用すると、約７５の細胞を検出し得る。
【０１８０】
（実施例４．本発明の方法のための有用なレポーターの選択）
ベクターは、ｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーターの制御下で、ヒトグランザイムＡ、Ｍ、Ｈ、および、Ｋと、ヒト好中球エラスターゼ、ヒトキマーゼ、ヒトカテプシンＧ、および、ヒトプロテイナーゼ３を発現するように開発され、ならびに、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、上記プラスミドとともに、および、対照としてヒトグランザイムＢプラスミドとともに、ならびに、ＦＩＴＣ（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に結合した抗ｈＮＧＦＲモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによってトランスフェクションの割合を決定するための表面タグとして、細胞質を開裂した（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃａｌｌｙ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｈＮＧＦＲ受容体とともに、ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＧｅｎｔｅｌｂｉｏ）を用いたエレクトロポーションによって個々にトランスフェクトされた。４８時間後、細胞をピペット操作で採取し、ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄し、数を数えた。２００マイクロリットルのＨＢＳＳ緩衝液中の６５０，０００の細胞を、１時間、１０μＭイオノマイシンによって懸濁液中で処理し、５分間、４００ｇの遠心分離の後、上清を、特定の蛍光基質を用いて活性について分析した。ＨＢＳＳ緩衝液のみによってインキュベートされた細胞の対照が含まれていた。蛍光基質は、７−アミド−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）に対して結合した特定のテトラペプチドであり、カスタム・ペプチド・サプライヤー（ｃｕｓｔｏｍｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｐｐｌｉｅｒ）によってカスタム合成された。特定の基質は以下の通りであった：グランザイムＡについてＶＡＮＲ−ＡＭＣ；グランザイムＭについてＫＶＰＬ−ＡＭＣ；グランザイムＨについてＰＴＳＹ−ＡＭＣ；グランザイムＫについてＹＲＦＫ−ＡＭＣ；ヒト好中球のエラスターゼについてＰＥＥＩ−ＡＭＣ；ヒトキマーゼについてＰＴＳＹ−ＡＭＣ；ヒトカテプシンＧについてＰＴＳＹ−ＡＭＣ；ヒトプロテイナーゼ３についてＶＡＤＣ−ＡＭＣ、および、ヒトグランザイムＢについてＩＥＰＤ−ＡＭＣ。発されたＡＭＣは、ＨＢＳＳ緩衝液中１リットル当たり４００マイクロモルでの１２５マイクロリットルの特定の基質と１２５マイクロリットルの上清とを用いて、９６ウェルマイクロプレート内で、ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光光度計における３６０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光によって測定された。マイクロプレートは、読み取り装置上で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に動態学的に読み取られた。開裂したｈＮＧＦＲタグと抗−ｈＮＧＦＲ−ＦＩＴＣ抗体を用いて測定された一過性のエレクトロポーションの割合は、約６０パーセントだった。酵素はすべて活性であり、したがって本発明の方法には適切であったが、トリプターゼ様の酵素（アルギニンのリジンの後に開裂を有するグランザイムＡおよびＫ）のなかで、グランザイムＡはグランザイムＫよりも高い活性を有し、キマーゼ様の酵素（チロシンまたはフェニルアラニンの後に開裂を有する、ヒトグランザイムＨ、ヒトキマーゼ、および、ヒトカテプシンＧ）のなかで、ヒトキマーゼが最も高い活性を有し、エラスターゼ様の酵素（大量の疎水性アミノ酸またはシステインの後に開裂を有��る、ヒトグランザイムＭ、ヒト好中球エラスターゼ、および、ヒトプロテイナーゼ３）のなかで、好中球エラスターゼとプロテイナーゼ３がヒトグランザイムＭよりも高い等価活性を有していた。したがって、トリプターゼ様の酵素、キマーゼ様の酵素、エラスターゼ様の酵素、または、ａｓｐ−ａｓｅ様の酵素は、本発明の方法で使用されてもよい。
【０１８１】
（実施例５．ｈＣ  Ｖ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーターの制御下で、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ヒトキマーゼ、および、ヒトプロテイナーゼ３を発現する安定した細胞株の開発）
トリプターゼ様の酵素、キマーゼ様の酵素、エラスターゼ様の酵素、または、ａｓｐ−ａｓｅ様の酵素のいずれかが本発明の方法に有用であるため、さらなる例として、ヒトグランザイムＡ（トリプターゼ様の酵素）、ヒトグランザイムＢ（Ａｓｐ−ａｓｅ様の酵素）、ヒトキマーゼ（キマーゼ様の酵素）、および、ヒトプロテイナーゼ３（エラスターゼ様の酵素）を選択した。ベクターは、ｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲキメラプロモーターの制御下で、ヒトグランザイムＡ、ヒトグランザイムＢ、ヒトキマーゼ、および、ヒトプロテイナーゼ３の安定した発現のために開発された。ヒグロマイシン耐性カセットは、細胞の安定した個体群の選択のために、ベクター骨格に含まれていた。ベクターは、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの下流で、したがって、ヒトグランザイムＡまたはヒトグランザイムＢ、あるいは、ヒトキマーゼまたはヒトプロテイナーゼ３のいずれかを発現する安定した細胞のＭＡＣＳによる、フローサイトメトリーおよび／または選択のためのｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーターの制御下で、クローン化されたＩＲＥＳ−ＮＧＦＲカセットを同様に含む。ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて各々のベクターを個々にＲＢＬ−２Ｈ３にエレクトロポレートし、４８時間後、１５００μｇ／ｍＬのヒグロマイシンを選択培地に加えた。約２週間の選択後、細胞は、ＦＩＴＣに結合したＮＧＦＲに対する抗体を用いたフローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。陽性の個体群は、抗−ＮＧＦＲ−ＭＡＣＳ  ｓｕｐ．Ｒ（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたＭＡＣＳによって磁気的に分離された。選別された個体群は、選別効率をチェックするために、フローサイトメトリーによって再度分析された。ＮＧＦＲ陽性細胞の割合は、常に６５パーセント以上であった。細胞は、実験の前夜、８００マイクロリットルの完全な細胞培養培地で１ウェル当たり６５０，０００個の細胞で２４ウェルマイクロプレート中に播種された。翌日、細胞はＨＢＳＳ緩衝液で洗浄され、ＨＢＳＳ２００μＬ中で、摂氏３７度で１時間、１０μＭイオノマイシンによって処理され、５分間にわたる４００ｇの遠心分離後、上清は特定の蛍光基質を用いて活性について分析された。ＨＢＳＳ緩衝液のみによってインキュベートされた細胞の対照が含まれていた。蛍光基質は以下の通りであった。グランザイムＡについてのＶＡＮＲ−ＡＭＣ；ヒト好中球のエラスターゼについてのＰＥＥＩ−ＡＭＣ；ヒトキマーゼについてのＰＴＳＹ−ＡＭＣ；ヒトプロテイナーゼ３についてのＶＡＤＣ−ＡＭＣ、および、ヒトグランザイムＢについてのＩＥＰＤ−ＡＭＣ。発されたＡＭＣは、ＨＢＳＳ緩衝液中１リットル当たり４００マイクロモルでの１２５マイクロリットルの特定の基質と１２５マイクロリットルの上清とを用いて、９６ウェルマイクロプレート内で、ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光光度計における３６０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光によって測定された。マイクロプレートは読み取り装置上で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に動態学��に読み取られる。ＨＢＳＳ緩衝液中にのみ基質を含む対照ウェルは、イオノマイシンで処理された細胞と、ＨＢＳＳ緩衝液のみによって処理された細胞の両方の細胞に対する、基質の自己蛍光を引く（ｓｕｂｓｔｒａｃｔ）ために含まれていた。ＨＢＳＳ緩衝液中のペプチド基質の自己蛍光は約３０００であったが、その一方で、摂氏３７度で６０分間ＨＢＳＳ緩衝液のみで処理した細胞の蛍光光度は約５０００であり、すなわち、エキソサイトーシスモジュレーターの不在下での基礎発光は、約２０００であった。対照的に、ヒトグランザイムＡおよびＢのイオノマイシンに誘発された発光の蛍光は、１００，０００個の細胞と同等の上清を用いると、１０のバックグラウンドに対する信号について約２０，０００であり、ヒトキマーゼのイオノマイシンに誘発された発光の蛍光は、１００，０００個の細胞と同等の上清を用いると、１５のバックグラウンドに対する信号について約３０，０００であり、および、ヒトプロテイナーゼ３のイオノマイシンに誘発された発光の蛍光は、１００，０００個の細胞と同等の上清を用いると、６のバックグラウンドに対する信号について約１２，０００であった。したがって、トリプターゼ様の酵素、キマーゼ様の酵素、エラスターゼ様の酵素、または、ａｓｐ−ａｓｅ様の酵素は、プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを用いて、造血細胞の顆粒に安定して発現可能であり、そのような顆粒貯蔵プロテアーゼは、特定のＡＭＣに結合されたペプチド基質を用いて、優れた信号対バックグラウンド比率を含むセンサーを生成するために、エキソサイトーシスモジュレーターによって放たれる。したがって、それらの酵素型はすべて本発明の方法に役立つ。
【０１８２】
（実施例６．異なる種類からの、顆粒を貯蔵した有用なプロテアーゼレポーターの選択）
この実験は、ヒトとは異なる他の種類からの顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターが本発明の方法に使用され得るか否かを試験するために考案された。例として、異なる種類からグランザイムＢを選択した。ベクターは、ヒト、ラット、ウマ、および、チンパンジーのグランザイムＢの発現のために開発され、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、安定したトランスフェクションのためのハイグロマイシン耐性を有するｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ−グランザイムＢ−ＩＲＥＳ−ＮＧＦＲのキメラプロモーターを含むプラスミドにより個々にトランスフェクトされた。ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて各々のベクターをＲＢＬ−２Ｈ３にエレクトロポレートし、４８時間後、１５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンを選択培地に加えた。約２週間の選択の後、細胞は、ＦＩＴＣに結合したＮＧＦＲに対する抗体を用いてフローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。陽性の個体群は、抗−ＮＧＦＲ−ＭＡＣＳ  ｓｕｐ．Ｒ（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＭＡＣＳによって磁気的に分離された。選別された個体群は、選別効率をチェックするためにフローサイトメトリーによって再度分析された。ＮＧＦＲ陽性細胞の割合は常に６５パーセント以上だった。細胞は、実験の前夜に、１００マイクロリットルの培地で、１ウェル当たり１００，０００個の細胞での９６ウェルマイクロプレートにおいて播種された。翌日、細胞は、ＢＳＳ緩衝液で洗浄され、ＨＢＳＳ緩衝液１０５μＬ中で、摂氏３７度で１時間、１０μＭイオノマイシンによって処理され、５分間にわたる４００ｇの遠心分離後、上清は特定の蛍光基質を用いて活性について分析された。ＨＢＳＳ緩衝液のみによってインキュベートされた細胞の対照が含まれていた。蛍光基質はすべての試験されたグランザイムＢについてＩＥＰＤ−ＡＭＣであった。発されたＡＭＣは、ＨＢＳＳ緩衝液中１リットル当たり３４５マイクロモルでの１４５マイクロリットルの特定の基質と１０５マイクロリットルの上清とを用いて、９６ウェルマイクロプレート内で、ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光光度計における３６０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光によって測定された。マイクロプレートは読み取り装置上で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に動態学的に読み取られた。ＨＢＳＳ緩衝液中にのみ基質を含む対照ウェルは、イオノマイシンによって処理された細胞とＨＢＳＳ緩衝液のみによって処理された細胞の両方に対する基質の自己蛍光を引くために含まれた。
【０１８３】
【表７】
2013535195.tif 000014
【０１８４】
上記の結果は、異なる種類からのグランザイムＢが本発明の方法に使用されてもよいことを実証する。したがって、本発明の方法に役立つ顆粒貯蔵された有用なプロテアーゼは、ヒト起源からの酵素に限定されず、他の多くの種類からの酵素が、ヒト起源の酵素と等しいかより大きな効率で使用されてもよい。
【０１８５】
（実施例７．本発明の方法においてエキソサイトーシスモジュレーターとして使用されるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の表面発現に適したプロモーター）
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、３５０以上の異なる受容体と現在認可されている薬物の約３０パーセントを含む、細胞表面受容体の主要なクラスである。同様に、複数のＧＰＣＲは、アゴニストリガンド結合後に細胞内カルシウム上昇を誘発し、したがって、ＧＰＣＲは、本発明の方法にとって非常に重要なエキソサイトーシスモジュレーターである。しかし、特定の細胞の表面上、例えば、プロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含む造血細胞の表面上でのＧＰＣＲの異種発現は、困難である。ＧＰＣＲの９０パーセント以上はシグナルペプチドを有しておらず、多くのＧＰＣＲについては、表面の検出に適切な抗体がない。したがって、本実施例は、モデルＧＰＣＲの表面の発現に対するシグナルペプチド追加の効果と、任意のタグ付けされたＧＰＣＲのフローサイトメトリーによる表面検出のための、アミノ末端ペプチドタグの追加の効果を試験するように考案された。フローサイトメトリーによる表面検出のためにＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能な抗体があるため、ヒトインターロイキン−８受容体が、モデルＧＰＣＲとして選択された。ベクターは、以下のプロモーターの制御下でヒトインターロイキン−８受容体（ｈＩＬ８Ｒ）の発現のために開発された：Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、配列番号：３）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、および、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α、配列番号：１）のためのプロモーター。２つのベクター変形体は各々のプロモーターのために開発された。１つのベクター変形は、ｃ−ｍｙｃタグが後に続くマウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）と、位置１にメチオニンを含まない完全なＧＰＣＲとを含み、もう１つのベクター変形はメチオニン１で始まり、したがって、シグナルペプチドとｃ−ｍｙｃタグを含まない。すべてのベクターは、安定した真核細胞の選択のためにネオマイシン耐性遺伝子を有していた。ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて各々のベクターをＲＢＬ−２Ｈ３にエレクトロポレートし、４８時間後、５００μｇ／ｍＬのネオマイシンを選択培地に加えた。約２週間の選択の後に、細胞は、ＦＩＴＣ（米国のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの抗−ｈＩＬ８Ｒ−ＦＩＴＣ、クローン５Ａ１２、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５９３９）に結合されたヒトインターロイキン−８受容体に対する抗体を有するフローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、および、抗−ｃｍｙｃタグを含むベクターのための抗−ｃｍｙｃタグ抗体（米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０）によって、分析された。すべてのプロモーターは、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の細胞表面上でのヒトインターロイキン−８受容体の発現に有用であり、したがって、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫプロモーター）からの発現が、ｈＥＦ１アルファプロモーター（ｈＥＦ１アルファプロモーター）またはＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲプロモーター（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーター���のいずれかからの発現よりも少ないにもかかわらず、全てのプロモーターは本発明の方法に有用である。タグ付けしたＧＰＣＲとタグ付けしていないＧＰＣＲの発現レベルに違いがなかったため、普遍的なタグとシグナルペプチドは、本発明の方法に有用なＧＰＣＲの表面の検出を可能にする。
【０１８６】
（実施例８．本発明の方法においてエキソサイトーシスモジュレーターとして使用されるＧＰＣＲのプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含む造血細胞の表面発現に関する、プロモーター、シグナルペプチド、および、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ）配列の組み合わせの影響）
ベクターは、以下のプロモーターの制御下でプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを有する造血細胞のＧＰＣＲの安定した発現のために開発された：Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、配列番号：３）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、および、ヒト伸長因子１アルファプロモーター（ｈＥＦ１アルファ、配列番号：１）。すべてのベクターは、安定した真核細胞と、ｃ−ｍｙｃタグが後に続くマウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）と、位置１にメチオニンを含まない完全なＧＰＣＲとを選択するためのネオマイシン耐性遺伝子を有していた。ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて各々のベクターをＲＢＬ−２Ｈ３にエレクトロポレートし、４８時間後に、５００μｇ／ｍＬのネオマイシンを選択培地に加えた。約２週間の選択の後、細胞は、表面発現のために、抗ｃｍｙｃタグ抗体（米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０）を用いたフローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。表面発現に基づいて、ＧＰＣＲは、３つのカテゴリー：プロトタイプとしてヒトインターロイキン８受容体を用いて試験されたすべてのプロモーターで陽性だったＧＰＣＲ；プロトタイプとしてヒトブラジキニン型Ｂ１受容体を用いて試験されたプロモーターの少なくとも１つで陽性だった（Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲプロモーターでのみ陽性だった）ＧＰＣＲ；プロトタイプとしてヒトＨＴＲ１Ｂ受容体を用いて試験されたすべてのプロモーターで陰性だったＧＰＣＲへと分類された。したがって、新しいベクターは、ＲＢＬ−２Ｈ３のような造血細胞へと発現されるのが難しい受容体のプロトタイプとして、ヒトＨＴＲ１  Ｂ受容体を用いて開発された。ベクターは、以下のプロモーターの制御下でプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含むＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるヒトＨＴＲ１  Ｂの安定した発現のために開発された：Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、配列番号：３）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、および、ヒト伸長因子１アルファプロモーター（ｈＥＦ１アルファ、配列番号：１）。すべてのベクターは、安定した真核細胞と、ｃ−ｍｙｃタグが後に続くマウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）と、ウイルスＧＰＣＲに由来するグリコシル化配列（ＶＧＳ、配列番号：４）と、位置１でメチオニンを含まない完全なヒトＨＴＲ１  Ｂを選択するためのネオマイシン耐性遺伝子を有していた。そのようなグリコシル化配列は、表面発現のための限定的な工程が、グリコシル化などのタンパク質の翻訳後修飾によって調節される内質の網状構造からの輸出であるかどうかを試験するために含まれていた。ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて各々のベクターをＲＢＬ−２Ｈ３にエレクトロポレートし、４８時間後、５００μｇ／ｍＬのネオマイシンを選択培地に加えた。約２週間の選択の後、���胞は、表面発現のために、抗ｃｍｙｃタグ抗体（米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０）を用いて、フローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。結果は、同じ抗ｃｍｙｃタグ抗体によってインキュベートされたトランスフェクトしていないＲＢＬ−２Ｈ３細胞から値を引いた後の陽性細胞の割合として表された。２パーセント未満の割合はそのようなものとして示され、ＭＡＣＳによる上記の陽性細胞の分離が成功しなかったため（データには示していない）、陰性と考えられた。陽性細胞については、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、陽性細胞の表面上での表面受容体密度のマーカーとしてみなされた。結果を以下の表に示した。
【０１８７】
【表８】
2013535195.tif 000015
【０１８８】
したがって、ＨＴＲ１  Ｂについて、表面発現を増加させるためにベクター中にグリコシル化配列を含めると、すべての試験したプロモーターで陽性であった。興味深いことに、ＨＴＲ１  Ｂの発現に関して試験された新しいプロモーターについて、グリコシル化配列を含めることで、陽性細胞の割合は改善されなかったが、陽性細胞のＭＦＩは２．８倍増加した。ベクターがＶＧＳとｈＥＦ１アルファプロモーターまたはＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーターのいずれかとを含む、新しいＧＰＣＲのために開発された際、ＶＧＳを含む安定的にトランスフェクトされたベクターは、そのＶＧＳの陰性の対応物と常に等しいかまたはそれよりも優れていた。これまでに試験された上記のようなＧＰＣＲは、ＢＤＫＲＢ１、ＡＧＴＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＲＭ  ４、ＡＶＰＲ２、ＤＲＤ１、ＤＲＤ２、ＥＤＮＲＢ、ＴＡＣＲ３、ＡＤＯＲＡ３、ＨＴＲ１  Ｂ、ＣＨＲＭ２、ＩＬ８ＲＡ、ＮＰＹ１  Ｒ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＤＲＡＢ２、ＣＣＫＢＲ、ＳＳＴＲ２、ＭＣ１  Ｒ、ＢＢ２ＲおよびＣＨＨＲ１（データでは示されず）を含んでいた。同様の結果は、３２ＤとＰ８１５の細胞のような他の造血細胞でも正確で、ＲＢＬ−２Ｈ３におけるＨＴＲ１  Ｂについて示された結果は、複数の造血細胞株中のすべての試験したＧＰＣＲの表面発現に対するグリコシル化配列の影響を表している。したがって、上記の結果は、ＧＰＣＲに対するグリコシル化配列の追加が表面発現を改善し、つまり、本発明の方法に有用であることを示している。
【０１８９】
（実施例９．顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターと、本発明の方法で有用なエキソサイトーシスモジュレーターとしてのＧＰＣＲとの両方を安定的に発現する細胞の開発。細胞表面で発現したＧＰＣＲに対するエキソサイトーシスモジュレーター（アゴニスト）のリガンド結合後の、顆粒貯蔵されたレポーターの調節性エキソサイトーシス）
有用な細胞、レポーター、レポーターのためのプロモーター、および、本発明の方法のためのエキソサイトーシスモジュレーターとして使用されたＧＰＣＲの表面発現のためのベクターを選択した後に、すべての構成要素の組み合わせが本実施例で作られた。ヒトグランザイムＢはレポーターとして選択され、ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーターはレポーター発現のためのプロモーターとして選択され、ＲＢＬ−２Ｈ３はプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含む造血細胞として選択され、複数のＧＰＣＲはエキソサイトーシスモジュレーターの発現のためのプロモーターとしてＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、配列番号：３）の制御下でエキソサイトーシスモジュレーターとして選択された。エキソサイトーシスモジュレーターの発現のためのすべてのベクターは、安定した真核細胞、ｃ−ｍｙｃタグが後に続くマウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）、ウイルスＧＰＣＲに由来するグリコシル化配列（ＶＧＳ、配列番号：４）、および、位置１にメチオニンを含まない完全なヒトＧＰＣＲを選択するためのネオマイシン耐性遺伝子を有していた。グランザイムＢの発現のためのベクターは、安定したトランスフェクションのためのヒグロマイシン耐性を有するｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲ−グランザイムＢ−ＩＲＥＳ−ＮＧＦＲのキメラプロモーターを有していた。ＧＰＣＲのためのベクターが最初にエレクトロポレートされ、細胞は約２週間、５００μｇ／ｍＬのネオマイシンにより選定され、細胞は、表面発現のために、抗ｃｍｙｃタグ抗体（米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０）を用いたフローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。陽性細胞は、ビオチン（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とストレプトアビジン−ＭＡＣＳ（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に共役した抗ｃｍｙｃモノクローナル抗体を用いて、磁気分離によって分離された。成長後、細胞の陽性画分は、抗ｃｍｙｃタグ抗体を用いたフローサイトメトリーによって再度分析された。陽性細胞は、ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（韓国のＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ヒトグランザイムＢを発現させるためのベクターによって個々にエレクトロポレートされ、４８時間後、１５００μｇ／ｍＬのヒグロマイシンと５００μｇ／ｍＬのネオマイシンが選択培地に加えられた。約２週間の選択の後、細胞は、ＦＩＴＣに結合したＮＧＦＲに対する抗体を用いたフローサイトメトリー（米国のＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析された。陽性の個体群は、抗−ＮＧＦＲ−ＭＡＣＳ  ｓｕｐ．Ｒ（ドイツのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたＭＡＣＳによって磁気的に分離された。選別された個体群は、抗ｃｍｙｃタグ抗体と抗ＮＧＦＲ抗体を用いた双方のＧＰＣＲの発現をチェックするために、および、グランザイムＢ発現をチェックするために、フローサイトメトリーによって再度分析された。ＧＰＣＲの発現は、陽性分画として分離された細胞の７０％以上で検出され、��方で、グランザイムＢは細胞の６５パーセント以上で陽性であった。含まれたＧＰＣＲは以下の通りであった：アルファｉ結合したＧＰＣＲとしてＳＳＴＲ２およびＣＨＲＭ２；アルファ−ｑ結合したＧＰＣＲとしてＡＧＴＲ１およびブラジキニン型Ｂ１受容体（ＢＤＫＲＢ１）、および、アルファ−ｓ結合したＧＰＣＲとしてＡＶＰＲ２。上記のＧＰＣＲのリガンドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から購入し、特に明記されない限り、ＨＢＳＳ緩衝液中１０μＭの最終濃度で用いられた（セグリチド（ｓｅｇｌｉｔｉｄｅ）（ＳＳＴＲ２のための）；カルバコール（ＣＨＲＭ２のための）；アンギオテンシン（ＡＧＴＲ１のための）；カリニン（ｋａｌｌｉｎｉｎ）（ブラジキニン型Ｂ１のための）、および、アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰＲ２のための））。細胞は、実験の前夜、１００μＬの完全な細胞培養培地で９６ウェルマイクロプレートの１ウェル当たり１００，０００個の細胞に播種された。翌日、細胞は、ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄され、６０分間、摂氏３７度で、ＨＢＳＳ緩衝液３０μＬ中で１０μＭの各々のＧＰＣＲでリガンド（アゴニスト）によってインキュベートされ、５分間の４００ｇの遠心分離の後、上清は、ヒトグランザイムＢ（オランダのＵｃｙｔｅｃｈ）に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって、ヒトグランザイムＢタンパク質について分析された。対照は基礎発光のためにＨＢＳＳのみによって処理された細胞に含まれていた。ＥＬＩＳＡのバックグラウンドは０．２であった。陽性のＥＬＩＳＡのための最大希釈係数は、以下のデータを用いて、グランザイムＢ定量化のための細胞の最小数を計算するために使用された：１００，０００個の細胞が播種され、エキソサイトーシスは３０μＬでＥＬＩＳＡプレートで行われ、１００μＬの上清がウェルごとに負荷された。例えば、リガンド（アゴニスト）処理された細胞の上清の３０μＬがＥＬＩＳＡプレートのウェルごとに用いられ、その量が１００μＬに達すると、上記ＧＰＣＲのためのそのようなアッセイの感受性は１００，０００の細胞である。なぜなら、その量が３０μＬから１００μＬに達すると、１００，０００の細胞は、３０μＬで割られ、１００μＬを掛け、ＥＬＩＳＡプレートのウェルごとに用いられ、３．３３の希釈係数によって割られるからである。わずかな量の細胞しか必要としないのが、優れたアッセイである。結果は以下のとおりであった：
【０１９０】
【表９】
2013535195.tif 000016
【０１９１】
上記の結果は、エキソサイトーシスモジュレーターとしてＧＰＣＲを有する顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターのプロフェッショナルな調節性エキソサイトーシスを含む造血細胞が、リガンドとエキソサイトーシスモジュレーターの間の相互作用を試験するための超高感度なセンサーであり得るということを実証する。
【０１９２】
（実施例１０．感受性が非常に高い基質を用いる、分泌された顆粒プロテアーゼの直接的な検出）
実施例９の実験は、顆粒貯蔵されたタンパク質のエキソサイトーシスに基づいたセンサーが超高感度であり得る（１００未満の細胞から分泌された酵素は、ＥＬＩＳＡによって容易に検出されることもある）が、酵素活性を検出するための実施例６の実験では、信号対バックグラウンド比１０には１００，０００個の細胞が必要であったことを実証している。したがって、均質なアッセイにおけるアッセイ感度を限定した原因は、顆粒貯蔵プロテアーゼとＡＭＣ結合されたペプチドとの組み合わせであった。開裂部位の両側のアミノ酸が開裂の特異性と効率の両方の一次決定子であることが、最先端の技術では知られている。したがって、分泌されたプロテアーゼからの酵素活性の検出の感度を高めるために、開裂部位の両側のアミノ酸を有するペプチド基質が合成されてもよい。代替策として、チモーゲンを有するプロテアーゼ増幅カスケードは信号増幅に使用されてもよい。本実施例で、ＦＲＥＴに基づいた基質は、発されたＡＭＣの蛍光に対するＦＲＥＴである異なる検出技術と、開裂部位の両側のアミノ酸の存在によるさらに優れた開裂配列とのいずれかが、顆粒発光されたプロテアーゼの酵素活性の検出を改善させるかどうかを試験するために、特注設計された。ヒトグランザイムＢはモデル酵素として使用された。分泌されたヒトグランザイムＢの検出のための基質は、２００μＭの最終濃度で使用され、４００ｎｍでの励起後に５０５ｎｍで読み取られたＩＥＰＤ−ＡＭＣと、ペプチド・サプライヤーによってカスタム合成されたＦＡＭ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＴＡＭＲＡ  （ＦＡＭ−ＳＩＥＰＤＳＧＳ−ＴＡＭＲＡ）であった。ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ標識されたペプチドの開裂は、４８５ｎｍでの励起と５３５ｎｍでの発光と、１μＭの最終濃度での標識されたペプチドを用いて、蛍光によって検出された。各々の基質について、５０，０００、２５，０００、１２，５００、６，２５０、３，１２５、１，５６０、７８０、および、３９０の細胞のエキソサイトーシスを分析した。細胞は、実験の前夜、１ウェル当たり完全な細胞培養培地１００μＬを用いて、９６のウェルプレートにおいて、上記の密度で播種された。実験の日、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄し、ＨＢＳＳ緩衝液中に１０μＭ最終濃度のイオノマイシンを加え、摂氏３７度で６０分間インキュベートすることによって、エキソサイトーシスを始めた。ＨＢＳＳ緩衝液のみで処理された細胞の対照は、基礎発光の決定のために含まれていた。各々の基質の各々の細胞密度の５つのレプリカが播種された。細胞からの上清は５分間４００ｇで遠心分離され、９６のウェルプレートにおいて蛍光決定のために用いられた。発されたＡＭＣは、９６のウェルマイクロプレート中のＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光計で３６０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光によって測定され、その一方で、発されたＦＡＭは、同じ読み取り装置で４８５ｎｍでの励起と５３５ｎｍでの発光によって測定された。マイクロプレートは、読み取り装置上で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に動態学的に読み取られた。ＨＢＳＳ緩衝液中にのみ基質を含む対照ウェルは、イオノマイシンによって処理された細胞と、ＢＳＳ緩衝液のみによって処理された細胞の両方に対する基質の自己蛍光を引くために含まれていた。約２の任意の信号対バックグラウンド比が感度として選択された。結果は以下のとおりであった。ＩＥＰＤ−ＡＭＣに関して、感度は、２のバッググラウンドに対する信号をもたらした２５，０００個の細胞であり、一方で、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡについては、７８０個の細胞が３のバックグラウンドに対する信号をもたらしたため、ペプチド感受性は３９０〜７８０個の間の細胞であり、一方で、３９０の細胞が、２の任意限界よりも小さなバックグラウンドに対する信号をもたらした。７８０個の細胞について感度を選択すると、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡペプチドは、ＩＥＰＤ−ＡＭＣペプチドよりも３０倍以上グランザイムＢの検出の感度が高かった。したがって、この実施例は、ＦＲＥＴペプチドのような非常に高感度なプロテアーゼ基質の選択が本発明の方法に役立つことを示している。
【０１９３】
（実施例１１．増幅カスケードのためのチモーゲンの開発）
最後の実施例は、顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターが発された際に、非常に高感度な基質が該プロテアーゼレポーターの高感度な検出に役立つことを実証しており、したがって、この実施例は、高感度な信号の増幅の別の方法がタンパク質分解カスケードを用いることを実証することを目指したものである。モデルとして、ヒトグランザイムＢを選択した。ヒトグランザイムＢで活性化したチモーゲンは、ヒトの天然無修飾カスパーゼ−３（ｈｕＣａｓｐ３）から、および、１７２から１７９までのアミノ酸が、ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐから、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕまで変化した、すなわち、１７４のトレオニンがプロリンに変異した、変異ヒトプロカスパーゼ−３（ｍｕｔ−ｈｕＣａｓｐ３）から、開発された。なぜなら、ＩＥＰＤはＩＥＴＤよりも優れたグランザイムＢ基質であるからであり、１７６のセリンはバリンに変異しており、１７７のグリシンはロイシンに変異しており、１７８のバリンはメチオニンに変異しており、１７９のアスパラギン酸は、ヒトグランザイムＢによって開裂効率を改善するために、かつ、プロカスパーゼ−３の自己活性化を減らすために、グルタミン酸に変異している。２９のセリンから１９２のアスパラギン酸までのアミノ酸を含むヒトのプロ−カスパーゼ−３の双方の変形からのｃＤＮＡは、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ４３ａ＋ベクターへとクローン化された。シークエンシング後、発現ベクターは、タンパク質発現のために、ＢＬ２１  ＤＥ３ｐＬｙｓ大腸菌菌株に形質転換された。各々のタンパク質は、精製のために、Ｃ末端終端部のポリヒスチジンタグとともにクローン化された。ヒトの天然プロカスパーゼ−３（ｈｕＣａｓｐ３）は自己活性化を防ぐために３０分だけ誘発されたが、その一方で、変異したプロカスパーゼ−３（ｍｕｔ−ｈｕＣａｓｐ３）は３０分と２時間の双方の間、誘発された。ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質は、３６０ｎｍでの励起と４６０ｎｍでの発光を含む活性カスパーゼ−３の検出に使用された。６０分間１０μＭイオノマイシンで処理されたヒトグランザイムＢを安定的にトランスフェクトした１５，０００のＲＢＬ−２Ｈ３と同等の上清が、チモーゲンの活性化に使用された。ＩＥＰＤ−ＡＭＣを用いて測定した際の上記の上清のヒトグランザイムＢ活性は、２５，０００個の細胞と同等な上清を用いた摂氏３７度で６０分間のインキュベーション後に、２．６のバックグラウンドに対する信号をもたらした。ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質の蛍光のバックグラウンドは２７７５であり、グランザイムＢで処理したカスパーゼ−３と、対照として用いられた非グランザイムＢで処理したカスパーゼ−３（カスパーゼ−３のみ）の両方から引かれ、すべてのサンプルが三通り試験された。結果は以下のとおりであった。
【０１９４】
【表１０】
2013535195.tif 000017
【０１９５】
上記の結果は、ヒトのプロカスパーゼ−３が、顆粒で分泌されたグランザイムＢの検出に有用であり、１５，０００個の細胞と同等の上清を用いて、バックグラウンドに対する信号として、基質ＩＥＰＤ−ＡＭＣによる分泌グランザイムＢの直接検出よりも約１．７倍以上感度が高く、プロ−カスパーゼ−３の場合は、２５，０００個の細胞と同等の上清を用いたヒトグランザイムＢの直接検出の場合と同じ感度であることを実証している。蛍光がほぼ同じ（４５４７２対４３５４８）であるため、プロカスパーゼ−３の変異がヒトグランザイムＢによる開裂を改善しない一方で、変異したプロカスパーゼ−３の基礎的な自己活性化はヒトの天然プロカスパーゼ−３よりも２７倍低かった。変異したヒトプロカスパーゼ−３の信号対バックグラウンド比は、７７、すなわち、天然のヒトプロカスパーゼ−３のそれよりも約２７倍高かった。５，０００個の細胞と同等の上清と３８４のウェルプレートを用いて、バックグラウンドに対する信号は２０を超え、したがって、変異したヒトプロカスパーゼ−３は、本発明の方法に有用な均質な細胞に基づいたセンサーの開発を可能にする。加えて、ヒト変異プロカスパーゼ−３は、約１０ｍｇ／Ｌの大腸菌培養物（自己活性化を防ぐために、３０分間だけ発現した天然のプロカスパーゼ−３の約１０倍のタンパク質）へと発現可能であり、最適な反応条件下で３７°Ｃ、１２０分間のインキュベーション後ですら基礎的な活性を有しておらず、自己活性化を伴わずに摂氏−２０度で少なくとも６か月間貯蔵され得る。したがって、高いチモーゲン性（ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）指標と低い基礎活性は、感度の改善と、本発明の細胞ベースのセンサーの利益になる高い信号対バックグラウンド比率との双方に役立つ。
【０１９６】
（実施例１２．アッセイ条件の最適化：エキソサイトーシス時間）
実験は、エキソサイトーシス時間、アッセイに必要とされる多くの工程、および、懸濁液中での細胞の使用などのアッセイ条件を最適化するために考案された。ＧＰＣＲとヒトグランザイムＢの両方を発現する実施例９で展開された細胞は、エキソサイトーシス時間の最適化のために本実施例で使用された。含まれるＧＰＣＲは、ＣＨＲＭ２（アルファｉ結合されたＧＰＣＲ）とブラジキニン型Ｂ１受容体（アルファ−ｑ結合されたＧＰＣＲ）であった。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）からのカルバコールとカリニンは、それぞれ、ＣＨＲＭ２とブラジキニン型Ｂ１受容体のためのリガンドとして用いられ、ＨＢＳＳ緩衝液中１０μＭの最終濃度で用いられた。細胞は、実験の前夜、１００μＬの完全な細胞培養培地において９６ウェルマイクロプレートの１ウェル当たり２０，０００個の細胞で播種された。翌日、細胞はＨＢＳＳ緩衝液で洗浄され、５、１５、３０または６０分間、摂氏３７度で３０μＬのＨＢＳＳ緩衝液中各々１０μＭのＧＰＣＲでリガンド（アゴニスト）を用いてインキュベートされ、５分間の４００ｇでの遠心分離の後、上清は、ヒトグランザイムＢ基質として１μＭの最終濃度でＦＡＭ−ＳＩＥＰＤＳＧＳ−ＴＡＭＲＡを用いて、ヒトグランザイムＢ活性について分析された。発されたＦＡＭは、９６ウェルマイクロプレート中のＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光計で４８５ｎｍでの励起と５３５ｎｍでの発光によって測定された。マイクロプレートは、読み取り装置上で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に動態学的に読み取られた。ＨＢＳＳ緩衝液中にのみ基質を含む対照ウェルは、リガンドによって処理された細胞と、ＨＢＳＳ緩衝液のみによって処理された細胞とに対する基質の自己蛍光を引くために含まれた。ブラジキニン型Ｂ１受容体とＣＨＲＭ２の双方に関して、エキソサイトーシスは５分で最大の９０％以上であり、培地が５−１５分後に取られると、信号対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は約２０−２２であり、培地が３０分後に取られると、Ｓ／Ｂは約１５−１７であり、培地が６０分後に取られると、Ｓ／Ｂは約８−１０である。信号対バックグラウンドは、最初の５〜１５分後の特定の信号の増加よりも急激な基礎発光の増加によって、エキソサイトーシス時間が長いほど低い。したがって、だいたい５分未満から少なくとも６０分までの任意のエキソサイトーシス時間は、本発明の方法に使用されてもよいが、エキソサイトーシス時間が長いほど信号対バックグラウンドが低いセンサーが形成され、エキソサイトーシスは、５分後にはほぼ完全であり、信号対バックグラウンドはロバストなセンサーに優れている。本実施例は、エキソサイトーシス時間が短いことから、スループットを増やすために、細胞非透過性のレポーター基質を、混合および読みとりアッセイ（ｍｉｘ  ａｎｄ  ｒｅａｄ  ａｓｓａｙ）と混合することができることを示唆している。
【０１９７】
（実施例１３．アッセイ条件の最適化：アッセイに必要とされる工程の数）
この実験は、どれだけ多くの工程が細胞ベースのセンサーを用いるアッセイに必要とされるか、とりわけ、洗浄工程がアッセイの前に必要とされるかどうかを試験するために考案された。ＲＢＬ−２Ｈ３が接着細胞株であるため、細胞培養培地の吸引の少なくとも１つの工程は必要である。すべての細胞培養培地が吸引される場合、細胞は乾燥していなければならず、とりわけ、エキソサイトーシスを試験するための化合物の吸引と追加の間に時間間隔がある場合、細胞は最終的に死滅しなければならない。このため、すべての細胞培養培地が吸引されない場合、追加の処理が含まれた。しかし、すべての細胞培養培地が吸引されるとは限らないとき、一晩培養した後に細胞によって分泌されたレポーターのいくつかは基礎エキソサイトーシスに寄与する。実施例１２からの細胞を発現するＣＨＲＭ２およびグランザイムＢがこの実験で用いられたが、細胞は、２０μＬの培地で、黒壁を有する３８４ウェルプレートの１ウェル当たり５，０００個の細胞で実験の１６時間前に播種された。実験前に３つの処理が行われた。（１）洗浄せずに２０μＬの培地をすべて廃棄すること、（２）１５μＬの細胞培養培地だけを廃棄すること、および、（３）１５μＬの細胞培養培地を廃棄して、０．１％のＢＳＡを含有する７５μＬのハンクス平衡食塩緩衝液を用いて細胞を洗浄すること、および、７５μＬの洗浄緩衝液の吸引を行うこと。エキソサイトーシスは、１０μＭの最終濃度のカルバコール（ＣＨＲＭ２受容体アゴニスト）を含有するＨＢＳＳ中で行われた。基礎エキソサイトーシスについては、カルバコールを含まないＨＢＳＳが含まれていた。基礎的な、かつ、アゴニストによって誘発された分泌のためのウェルは、同じウェル中のエキソサイトーシスと活性の両方を決定するためのヒトグランザイムＢ基質として、１μＭ最終濃度のＦＡＭ−ＳＩＥＰＤＳＧＳ−ＴＡＭＲＡを含んだ。プレートは、蛍光読み取り装置上で３７℃でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に動態学的に読み取られた。結果は以下のとおりであった。（ａ）すべての培地がウェルから吸引されるとき、カルバコールを含まないウェル中の基礎エキソサイトーシスに対応するグランザイムＢ活性が低く、バックグラウンドに対する信号が３０分後に１８から２０であるため、細胞を洗浄する工程を加える必要はない。（ｂ）１５μＬの細胞培養培地だけがウェルから吸引される場合、基礎活性は３０分後にバックグラウンドに対する信号を８−１０まで減少させ、１５μＬの細胞培養培地だけがウェルから吸引され、７５μＬのＨＢＳＳによる洗浄工程が含まれるとき、すべての細胞培養培地が吸引されれば、バックグラウンドに対する信号は該処置と同様である。したがって、すべての細胞培養培地が吸引されると、その後、洗浄工程は必要とされず、実験の前の１つの工程が必要とされる（細胞培養培地の廃棄）。もし細胞培養培地の一部が吸引されると、洗浄工程が必要となり、実験前には２つの工程が必要となる（細胞培養培地の廃棄と、洗浄緩衝液の追加廃棄を含む洗浄工程）。したがって、優れたセンターは、細胞培養培地のすべての吸引、または、一定量の吸引と追加洗浄工程の追加のいずれかによって開発され得る。
【０１９８】
（実施例１４．１ウェル当たり１以上の反応を測定するためのセンサーの開発）
この実施例は、本発明のセンサーが、多重反応を測定するために、すなわち、同じ反応容器中で１以上の反応を測定するために、使用されてもよいことを実証すべく考案された。多重反応の原則は図５に例証されている。ＲＢＬ２Ｈ３細胞は、エキソサイトーシスモジュレーターとしてＧＰＣＲと、実施例９に記載されているような顆粒貯蔵されたレポーターとしてのグランザイムとの一対で、安定的にトランスフェクトされた。含まれる組み合わせは以下の通りであった：ｈｌＬ８受容体（ｈＩＬ８ＲＡ）、および、ヒトグランザイムＡ（センサーＡ）、および、ＣＨＲＭ２、および、実施例１２の細胞を発現するグランザイムＢ（センサーＢ）。カルバコールがＣＨＲＭ２アゴニストとして使用された一方で、ヒトＩＬ８はｈＩＬ８Ｒのアゴニストとして使用された。グランザイムＡＦＲＥＴベースの基質はＦＡＭ−ＥＶＡＮＲＳＶＳＥＫ−ＴＡＭＲＡであり、一方で、グランザイムＢＦＲＥＴベースの基質はＦＡＭ−ＳＩＥＰＤＳＧＳ−ＴＡＭＲＡであった。両方の基質がフルオロフォア（ＦＡＭ）とクエンチャー（ＴＡＭＲＡ）の同じ対を使用するため、４８５ｎｍでの励起の後の５３５ｎｍでの特異的な検出のために、反応容器に１つの基質だけを加えることができる。第１の実験では、ＩＬ８処理後にセンサーＡによって分泌されたヒトグランザイムＡの最大酵素活性が、カルバコール処理（データには示されず）後にセンサーＢによって分泌されたグランザイムＢ活性の約４０パーセントであり、したがって、センサーＡの１２，５００個の細胞がセンサーＢの５０００個の細胞と混合したことが分かった。各々のウェルは三通り試験された。センサー、アゴニスト、および、基質は、黒壁を巡らせた３８４ウェルマイクロプレートで全量２０μＬのＨＢＳＳ中で混合され、マイクロプレートはＢＭＧ−Ｌａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光計で摂氏３７度でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に読み取られた。摂氏３７度での３０分のインキュベーション後のバックグラウンドに対する信号が以下の表でまとめられる。条件１はセンサーＡについての１のバックグラウンドに対する信号として選択され、アッセイ中の細胞の総数の差によって異なる基礎発光があるため、条件６はセンサーＢについての１のバックグラウンドに対する信号として選択された。条件５および１０は、各々のチャネルで優れた信号対バックグラウンド比率を有する多重のバイオセンサーを形成するために、１以上のセンサーが同じ反応で組み合わされてもよいということを示している。したがって、結果は、顆粒発されたレポーターが互いに干渉しないという条件で多重アッセイを形成するために、少なくとも２つのセンサーが同じ反応容器中で混合されてもよいということを実証している。この実施例は、同様に、異なる最大活性を有するセンサーが、各々のチャネルで同等の信号を備えたセンサーを生産するために異なる大きさで混合され得るということを実証している。
【０１９９】
【表１１】
2013535195.tif 000018
【０２００】
（実施例１５．チロシンキナーゼ表面受容体に有用なセンサーの開発）
ＥＧＦＲ表面受容体は、表面の検出および／または分離のために、シグナルペプチドおよびｃ−ｍｙｃタグを備えたｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーターの制御下で、タンパク質を発現するように修飾されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターへとクローン化された。上記のようなＥＧＦ受容体は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞へと安定的にトランスフェクトされ、そのような細胞はｈＣＭＶ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーターの制御下でヒトグランザイムＢ（エキソサイトーシスレポーター）で安定的にトランスフェクトされた。懸濁液中の細胞は、総量２０μＬ中の３８４ウェルプレートの１ウェル当たり５，０００個の細胞で使用された。基礎的かつアゴニストによって誘発された分泌のためのウェルは、同じウェル中のエキソサイトーシスと活性の双方を決定するためのヒトグランザイムＢ基質として、１μＭの最終濃度でＦＡＭ−ＳＩＥＰＤＳＧＳ−ＴＡＭＲＡを含んだ。受容体のアゴニストは表皮増殖因子（ＥＧＦ）で、１０μＭの最終濃度で使用された。プレートは、蛍光読み取り装置で３７℃でインキュベートされ、０、１５、３０、４５および６０分後に読み取られた。結果は以下のとおりであった。非ＥＧＦによって処理された細胞と比較すると、ＥＧＦ処理は、ヒトグランザイムＢの強力な特異的発光を誘発した。バックグラウンドに対する信号は４５分後で１５であった。上記の結果は、チロシンキナーゼ受容体が本発明の方法でエキソサイトーシスモジュレーターとして使用され得ること、したがって、本発明のセンサーがチロシンキナーゼ受容体とそのリガンドの間の相互作用を試験するために適用されてもよいことを実証している。
【０２０１】
（実施例１６．ＩｇＥアレルゲン相互作用を試験するためのセンサーの使用）
本実施例は、図１に示されるように、新規な抗アレルギー化合物を探すために広く用いられるマスト細胞の顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターを試験するためのセンサーの使用について記載する。ＲＢＬ２Ｈ３は、実施例３に記載されているように、ｈＣＭＶ−ＭｏＬＶ５’ＬＴＲのキメラプロモーターの制御下で、ヒトグランザイムＢで安定的にトランスフェクトされた。トリニトロフェニル・ハプテンに対するマウスＩｇＥモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣから購入したＩｇＥＬｂ４ハイブリドーマから精製された（ＴＩＢ−１４１）。ＴＮＰ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃから購入され、標準のプロトコルを用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合した。結合は、ＴＮＰの吸光係数として１０ｍｍの光通路長当たり１５４００ユニット／ｍｏｌを用いて、３４８ｎｍでのＴＮＰ吸光度を測定することによって、ｐＨ  ７．０で測定された。ＴＮＰ−ＢＳＡ結合におけるＢＳＡに対するＴＮＰのモル比は、ＢＳＡの分子量を６００００と仮定して計算された。センサー細胞は、６ウェルプレートで４８時間、接着細胞として培養され、その後、ＨＢＳＳで洗浄され、ピペットで取る（ｐｉｐｐｅｔｉｎｇ）ことによって採取された。５０，００００個の細胞が摂氏３７度で６０分間、ＨＢＳＳ中１μｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ  ＩｇＥで標識付けされ、１０ｍＬのＨＢＳＳで洗浄され、遠心分離機にかけられ、ペレットは１ｍＬのＨＢＳＳ中で再懸濁された。黒壁が張り巡らされた３８４のウェルプレート内で、ＨＢＳＳ中１０μＬのＴＮＰ−ＢＳＡの連続希釈が加えられ、各々、１μＭの最終濃度でＦＲＥＴベースのグランザイムＢ基質ＦＡＭ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＴＡＭＲＡ（ＦＡＭ−ＳＩＥＰＤＳＧＳ−ＴＡＭＲＡ）を含み、その開裂は、４８５ｎｍでの励起と５３５ｎｍでの発光を用いて、蛍光によって検出された。試験されたＴＮＰ−ＢＳＡの希釈は、以下の通りであった：１μｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、および、１ｆｇ／ｍＬ。各々のウェルには、１０μＬ（５０００個の細胞）の抗ＴＮＰ  ＩｇＥ標識された細胞が加えられ、プレートは、ＢＭＧ−Ｌａｂｔｅｃｈマイクロプレート蛍光計で摂氏３７度でインキュベートされた。マイクロプレートは、０、１５、３０、４５および６０分後に読み取られた。以下の対照が含まれていた：（１）抗ＴＮＰ  ＩｇＥ標識された細胞とグランザイムＢ基質を含むが、ＴＮＰ−ＢＳＡを含まないウェル、（２）非標識された細胞とグランザイムＢ基質と１μｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＢＳＡを含むウェル、（３）グランザイムＢ基質と１μｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＢＳＡを含むが、細胞を含まないウェル。各々のウェルは、三通り含まれていた。摂氏３７度で３０分のインキュベーション後の結果が以下の表でまとめられている。
【０２０２】
【表１２】
2013535195.tif 000019
【０２０３】
上記の結果は、信号が１ｆｇ／ｍＬにまでさえ達する（ｓａｔｕｒａｔｅ）るため、本発明の方法で開発されたセンサーは、この実施例で使用されるＴＮＰ−ＢＳＡモデルアレルゲンのようなアレルゲンの検出に非常に感度が高いことを示している。さらにＴＮＰを希釈することによって、ＴＮＰ−ＢＳＡの検出限界が０．１ａｇ／ｍＬであり、すなわち、おそらく、このセンサーを現在までに開発されたもっとも感度が高いセンサーとする、１０ｓｕｐ−１９ｇ／ｍＬであることがわかった（図には示されず）。したがって、本発明のセンサーは、アレルゲンの検出と、新規な抗アレルギー化合物を探すために広く用いられるマスト細胞顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの試験の両方に使用されてもよい。
【図１】
2013535195.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月26日(2013.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ベースのセンサーであって、
前記細胞ベースのセンサーは、
（ａ）分泌顆粒の調節性エキソサイトーシスを有する造血細胞株、
（ｂ）細胞株の分泌顆粒に貯蔵される（ａ）の造血細胞株にトランスフェクトされたプロテアーゼレポーターとしてのグランザイムＢ、
（ｃ）（ａ）の細胞株の分泌顆粒の調節性エキソサイトーシスのモジュレーターとして用いられるトランスフェクトされた異種表面受容体、
（ｄ）分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの検出のための特異的な気質、または、前記分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターを免疫学的に検出するための手段を含む、細胞ベースのセンサー。
【請求項２】
分泌顆粒の調節性エキソサイトーシスを有する細胞株は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、マスト細胞、赤血球、巨核球、血小板、および、樹状細胞を含む骨髄細胞株からなる群から選択された、あるいは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および、ＮＫ細胞を含むリンパ細胞株からなる群から選択された、造血細胞および／またはその後代である、請求項１に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項３】
細胞は、ラットの好塩基球性白血病細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３、マウスの骨髄造血細胞株３２Ｄ、ナチュラルキラー細胞株ヒトＮＫ９２細胞株、ナチュラルキラー細胞株ヒトＹＴ細胞株、および、マウスマスト細胞マウスＭＣ／９細胞株からなる群から選択される、請求項１または２に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項４】
エキソサイトーシスモジュレーターとして用いられる表面受容体は、活性化または抑制されると、カルシウムによって誘発されるエキソサイトーシスを順に調節または調整する細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、リン脂質、または、ＡＴＰのレベルの変化を誘発する、ペプチドである、請求項１乃至３に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項５】
表面受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項１に記載の細胞ベースのセンサー。
【請求項６】
請求項１乃至５のセンサーを得るための方法であって、
前記方法は、
適切なプロモーターの制御下で、調節性分泌顆粒エキソサイトーシスの異種モジュレーターとして用いられる表面受容体の発現のためのベクターで、および、適切なプロモーターの制御下で、分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターとしてグランザイムＢを分類するベクターで、造血細胞株を変形する工程を含む、方法。
【請求項７】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの発現のためのプロモーターは、誘導性プロモーターから、あるいは、ヒトまたはマウスの伸張因子１−アルファプロモーター（ｈＥＦ１α、配列番号１）、ヒトからのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫ）、マウスおよびラット種からのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター（配列番号２）、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウィルス５’−ＬＴＲプロモーター  ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲからの５’ＬＴＲ（配列番号３）からなる構成的な強力なプロモーターの群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
調節性分泌顆粒エキソサイトーシスのモジュレーターの発現のためのベクターは、配列番号４を含む表面の過剰発現のための配列を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの発現のためのプロモーターは、ｈＣＭＶおよびＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター（配列番号１０）、ＭｏＬＶ５’ＬＴＲプロモーター（配列番号３）、伸張因子１−αプロモーター（配列番号１）、ＲＳＶプロモーター（配列番号２）のキメラプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、および、チミジンキナーゼプロモーターからなる群から選択される、誘導性のまたは中程度から強度のタンパク質発現プロモーターのいずれかからなる群から選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
１つがエキソサイトーシスモジュレーターとして機能し、もう１つがエキソサイトーシスモジュレーターの特異リガンドとして機能する、少なくとも２つの分子の間の相互作用を試験する方法であって、
前記方法は、
ａ）分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの細胞生存度、エキソサイトーシス、および、酵素活性に適合する培地で、請求項１乃至５の細胞ベースのセンサーをインキュベートする工程、
ｂ）エキソサイトーシスモジュレーターの特異的なリガンドを追加する工程、および、
ｃ）放出されたレポーターの特異的な基質によって、または、放出されたレポーターを免疫学的に検出するための手段によって、放出されたレポーターポリペプチドを検出する工程、を含む、方法。
【請求項１１】
分泌顆粒貯蔵プロテアーゼレポーターの酵素活性は、比色分析、蛍光、ＦＲＥＴ、時間分解ＦＲＥＴ、または、発光基質からなる群から選択される細胞非透過性基質を用いて測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
創薬において分子間の相互作用を試験するための、あるいは、診断および薬物の検出のためにタンパク質などの分子を、または、食品産業におけるサンプル、環境サンプル、および、製薬産業における分子を定量化するための、請求項１乃至５の細胞ベースのセンサーの使用。
【請求項１３】
化合物がエキソサイトーシスを調整するかどうかを試験するための、請求項１乃至５の細胞ベースのセンサーを含むキット。
【国際調査報告】
2013535195.tif 000050
2013535195.tif 000051