(57)【要約】  本発明は、強力な遺伝子治療剤であるｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と標的特異的層状無機水酸化物とのナノハイブリッド、その製造方法及び前記ナノハイブリッドを含有する腫瘍治療用の医薬組成物に関する。本発明に係るナノハイブリッドは、腫瘍マーカーと特異的に結合できる標的志向性多官能基リガンドが結合された層状無機水酸化物とナノハイブリッドをなしており、ｓｉＲＮＡの生体内安定性が腫瘍特異的伝達効率を向上させて比較的低濃度の投与量でｓｉＲＮＡの腫瘍治療活性を示すことから、汎用的な標的特異的腫瘍の治療に広く活用することができる。
2013504337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表される標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド：
［一般式１］
［Ｍ（II）１−ｘＭ（III）ｘ（ＯＨ）２］Ｘ＋［Ｓ］［Ｔ］
（式中、Ｍ（II）は二価金属カチオンを表し、Ｍ（III）は三価金属カチオンを表し、ｘは０．１〜０．５の数であり、ＳはｓｉＲＮＡであり、前記Ｔは腫瘍標的志向性多官能基リガンドである）。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡは、サバイビン遺伝子から由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１〜９からなる群から選ばれるいずれか一種の塩基配列で表されることを特徴とする請求項１に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項４】
前記二価金属カチオンはＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋及びＺｎ２＋からなる群から選ばれ、前記三価金属カチオンはＡｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｉｎ３＋、Ｖ３＋及びＴｉ３＋からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項５】
前記腫瘍標的志向性多官能基リガンドは、抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、セレクチン、放射線同位元素で標識された生体物質及び腫瘍レセプタからなる群から選ばれるいずれか一種と特異的に結合できることを特徴とする請求項１に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項６】
前記腫瘍レセプタは、リガンド、抗原、受容体及びこれらをコードする核酸からなる群から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項７】
前記腫瘍レセプタは、シナプトタグミンＩのＣ２、アネキシンＶ、インテグリン、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、ソマトスタチン、血管作動性腸管ペプチド、ガン胎児性抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、前立腺特異抗原及び葉酸受容体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項８】
前記腫瘍レセプタと特異的に結合できる腫瘍標的志向性多官能基リガンドは、ホスファチジルセリン、ＶＥＧＦＲ、インテグリン受容体、Ｔｉｅ２受容体、ソマトスタチン受容体、血管作動性腸管ペプチド受容体、ハーセプチン、リツキサン及び葉酸からなる群から選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項７に記載の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド及び薬学的に許容可能な担体を含有する腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１０】
前記担体は、イオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質、緩衝物質、水、塩、電解質、コロイド状シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコール及び羊毛脂からなる群から選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１１】
賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、界面活性剤、甘味剤、保存剤、潤滑剤、着香剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤及びこれらの混合物からなる群から選ばれる添加剤をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１２】
剤形は、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤及びシロップ剤からなる群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１３】
剤形は、液剤、懸濁液剤型または乳濁液剤型の注射剤であることを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１４】
静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、口腔、心臓内、骨髄内、硬膜内、経皮、腸管、皮下、舌下または局部投与用に剤形化させることを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１５】
単位投与量または多投与量の単位製剤に剤形化された請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１６】
治療対象の体重ｋｇ当たりに０．０５〜０．１μｇのｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１７】
前記腫瘍は、口腔ガンまたは肺ガンであることを特徴とする請求項９に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１８】
下記のステップを含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造方法：
（ａ）二価金属塩と三価金属塩を含有する水溶液に塩基水溶液を滴加して、沈殿した層状無機水酸化物を製造するステップと、（ｂ）ｓｉＲＮＡ含有溶液をステップ（ａ）において製造された層状無機水酸化物が分散された溶液と混合し、そして攪拌してｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを調製するステップと、（ｃ）前記ハイブリッドに腫瘍標的志向性多官能基リガンドを結合させて標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造するステップ。
【請求項１９】
前記ステップ（ａ）における層状無機水酸化物は、下記の一般式２で表されることを特徴とする請求項１８に記載の方法：
［一般式２］
［Ｍ（II）１−ｘＭ（III）ｘ（ＯＨ）２］Ｘ＋［Ａｎ−］Ｘ／ｎ・ｙＨ２Ｏ
（式中、Ｍ（II）は二価金属カチオンを表し、
Ｍ（III）は三価金属カチオンを表し、
Ａはアニオン化学種であって、ｎはアニオンの電荷数であり、
ｘは０．１〜０．５の数であり、そして、
ｙは０を超える正数である）。
【請求項２０】
前記二価金属カチオンはＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋及びＺｎ２＋からなる群から選ばれ、前記三価金属カチオンはＡｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｉｎ３＋、Ｖ３＋及びＴｉ３＋からなる群から選ばれ、前記アニオンはＣＯ３２−、ＮＯ３−、Ｃｌ−、ＯＨ−、Ｏ２−及びＳＯ４２−からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
下記のステップを含む、請求項９に記載のｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを含有する腫瘍治療用医薬組成物の製造方法：
（ａ）二価金属塩と三価金属塩を含有する水溶液に塩基水溶液を滴加して、沈殿された層状無機水酸化物を製造するステップと、（ｂ）ｓｉＲＮＡ含有溶液をステップ（ａ）において製造された層状無機水酸化物が分散された溶液と混合し、そして攪拌してｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを調製するステップと、（ｃ）前記ハイブリッドに腫瘍マーカー特異的な多官能基リガンドを結合させて標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造するステップと、（ｄ）前記ナノハイブリッドに薬学的に許容可能な担体を添加して製剤化させるステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強力な遺伝子治療剤であるｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と標的特異的層状無機水酸化物とのナノハイブリッド、その製造方法及び前記ノハイブリッドを含有する腫瘍治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療における安全且つ効率よい遺伝子伝達技術への研究は長年に亘ってなされてきており、種々の遺伝子伝達体と伝達技術が開発されてきている。アデノウィルス、レトロウィルスなどウィルスを用いた遺伝子伝達技術と、リポソームとカチオン性脂質、そしてカチオン性高分子などを用いた非ウィルス性ベクター（nonviral vector）を用いた遺伝子伝達技術が開発されてきている。しかしながら、これまでウィルスそのものを遺伝子治療剤の伝達体として用いる方法は、伝達された遺伝子が宿主の染色体に取り込まれて宿主遺伝子の正常機能に異常を誘導したり、または発ガン遺伝子を活性化させないと保証することができない。また、ウィルス遺伝子が少量でも発現し続けている場合、自己免疫症を引き起こしたり、ウィルス伝達体から変形された形のウィルス感染が引き起こされる場合に、効率よい防御免疫を引き起こせないこともある。このため、ウィルスを用いる方法の代わりに、リポソームに遺伝子を融合させる方法や、カチオンを有する脂質や高分子を用いる方法、無機ナノ粒子を用いる方法などがこれらのそれぞれの欠点を改良する方向で研究されている。これらの非ウィルス性ベクターは、ウィルス性ベクターよりはその効率性の面で大幅に劣っているものの、生体内安定性と経済性を考慮したとき、副作用が少なく、しかも、生産コストが安価になるというメリットがある。なお、現在、遺伝子伝達システム（gene delivery system）において最も重要に取り上げられているアプローチ法は、標的特異的伝達性（target specific delivery）に関する部分である。遺伝子を生体内に直接的に投与すれば、生体内の全ての臓器及び細胞が同じく遺伝子の攻撃を受けることにより、正常細胞及び正常組織が損傷されるため、選択的な遺伝子伝達及び治療方法のための技術開発が重要である。
【０００３】
一方、近年、ｓｉＲＮＡは、動物細胞において特定の遺伝子の発現を阻害するのに卓越した効果を示すことが判明し、遺伝子治療剤として脚光を浴びている物質であって、これらの高い活性と精度よい遺伝子選択性によって、この２０年間研究されて現在治療剤として活用中のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を代替できる治療剤として期待されている。ｓｉＲＮＡは、約１９個から約２３個のヌクレオチドからなる短い二重螺旋のＲＮＡ鎖であり、これらと塩基配列が相補的な治療をしようとする遺伝子のｍＲＮＡを標的として、遺伝子の発現を抑制する。しかしながら、ｓｉＲＮＡは安定性が低く、生体内で短時間内に分解されてしまうため、その治療効率が急激に下がり、高価なｓｉＲＮＡの投与量を高めなければならない。また、ｓｉＲＮＡのアニオン性によって同じ陰電荷を帯びる細胞膜を透過することが困難である結果、細胞内への伝達性に劣るという問題点がある（Celia M. &Henry, Chemical and Engineering News December, 22, 32-36, 2003）。また、たとえｓｉＲＮＡが二本鎖から構成されているとはいえ、ＲＮＡを構成するリボース糖の結合は、ＤＮＡを構成するジオキシリボース糖の結合に比べて、極めて不安定であるため、ほとんどが生体内において半減期が３０分以内で、速やかに分解されてしまう。最近は、ｓｉＲＮＡに種々の官能基を導入してこれらを分解酵素から保護して安定性を向上させるための試みがなされているが（Frank Czauderna et al., Nucleic Acids Research 31, 2705-2716, 2003参照）、現在のところ、ｓｉＲＮＡの安定性確保及び効率よい細胞膜透過性のための技術は、未だ開発段階に留まっているといえる。また、ｓｉＲＮＡの治療効果を得るために、これらの血液内における不安定性を考慮して、単に高濃度のｓｉＲＮＡのみを打ち込み続ける方法を使用しているが、その効率が低いということが知られており、経済的な側面でも、遺伝子治療剤としてｓｉＲＮＡを用いるためには、これらの細胞内伝達が容易である新規な非ウィルス性伝達体の製造技術の開発が必然的に求められるといえる。大韓民国登録特許第１０−０８８３４７１号によれば、ｓｉＲＮＡと親水性高分子とを共有結合により連結したハイブリッド接合体及び前記接合体とカチオン性化合物からなる高分子電解質複合体ミセルを用いて、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を向上させることにより、細胞内に治療用ｓｉＲＮＡを効率よく伝達することができ、且つ、比較的に低濃度の投与量でｓｉＲＮＡの活性を示すということが報告されている。
【０００４】
しかしながら、ｓｉＲＮＡの安定性を向上させ、且つ、標的特異的遺伝子治療剤を開発するための非ウィルス性層状無機水酸化物を用いた腫瘍治療用の医薬組成物は、未だ報告されていない。このため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いる標的特異的遺伝子治療剤を開発するために鋭意努力した結果、ｓｉＲＮＡを腫瘍特異的な多官能基リガンドが結合された層状無機水酸化物とナノハイブリッド化させて効率よく腫瘍を治療することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【発明の要約】
【０００５】
本発明の目的は、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡを層状無機水酸化物にカプセル化させ、腫瘍マーカーと特異的に結合できる標的志向性多官能基リガンドが結合されたナノハイブリッド及びその製造方法を提供するところにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド及び薬学的に許容可能な担体を含有する腫瘍治療用の医薬組成物を提供するところにある。
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は、下記一般式１で表されるｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを提供する：
［一般式１］
［Ｍ（II）１−ｘＭ（III）ｘ（ＯＨ）２］Ｘ＋［Ｓ］［Ｔ］
（式中、Ｍ（II）は二価金属カチオンを表し、Ｍ（III）は三価金属カチオンを表し、ｘは０．１〜０．５の数であり、ＳはｓｉＲＮＡであり、Ｔは腫瘍標的志向性多官能基リガンドである）。
【０００８】
また、本発明は、（ａ）二価金属塩と三価金属塩を含有する水溶液に塩基水溶液を滴加して、沈殿された層状無機水酸化物を製造するステップと、（ｂ）ｓｉＲＮＡ含有溶液を、ステップ（ａ）において製造された層状無機水酸化物が分散された溶液と混合し、そして攪拌して、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを調製するステップと、（ｃ）前記ハイブリッドに腫瘍標的志向性多官能基リガンドを結合させて、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造するステップと、を含む標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、前記ナノハイブリッドを含有する腫瘍治療用の医薬組成物及びその製造方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造する反応の模式図である。
【図２】標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドのＸ線回折図である。（（ａ）：ＮＯ３−層状無機水酸化物、（ｂ）：ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物、（ｃ）：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物）
【図３】標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの透過電子顕微鏡像である。
【図４】ｓｉＲＮＡと標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの血液内安定性を評価するために、血清タンパク質が存在する環境下でのｓｉＲＮＡの経時分解度を示す電気泳動像である。（（ａ）：純粋なｓｉＲＮＡ、（ｂ）：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物）
【図５】標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドが腫瘍細胞内においてサバイビンの発現を抑制する度合いをｍＲＮＡレベルで示すグラフである。（（ａ）：比較群、（ｂ）：ＮＯ３−層状無機水酸化物、（ｃ）ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物、（ｄ）：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物、葉酸含有培地、（ｅ）：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物、葉酸を含有しない培地）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１３】
本発明は、標的特異的を有するｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドに関するものである。
【００１４】
本明細書において用いられた用語「ナノハイブリッド（nanohybrid）」は、ｓｉＲＮＡが層状無機水酸化物と分子間引力（intermolecular interaction）によって結合されることを意味する。前記分子間引力の種類（例えば、静電気的引力、疎水性引力、水素結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、ファンデルワールス結合、イオン結合など）は、特に制限がないため、種々に選択可能である。また、前記「ナノハイブリッド」という用語は、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの上に標的志向性多官能基リガンドが分子間引力によって結合されている形態も含まれるということが理解さるべきである。
【００１５】
一観点において、本発明は、下記一般式１で表されるｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドに関する：
［一般式１］
［Ｍ（II）１−ｘＭ（III）ｘ（ＯＨ）２］Ｘ＋［Ｓ］［Ｔ］
（式中、Ｍ（II）は二価金属カチオンを表し、Ｍ（III）は三価金属カチオンを表し、ｘは０．１〜０．５の数であり、ＳはｓｉＲＮＡであり、Ｔは腫瘍標的志向性多官能基リガンドである）。
【００１６】
本発明において、ｓｉＲＮＡのヌクレオチド長が長い、例えば、分子量３０，０００レベルでは、標的特異的層状金属水酸化物と結合された場合であっても、二本鎖のｓｉＲＮＡオリゴマーがこれらの遺伝子の阻害作用に関与する生体内酵素複合体であるＲＮＡ−誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と安定的に結合することができるが、普通の１９個のヌクレオチドである１０，０００レベルのｓｉＲＮＡの場合、遺伝子阻害作用を助長する細胞内酵素複合体と結合するときに、標的志向性多官能基リガンドによって構造的な安定性が低下する虞があるため、生体内においてまたは細胞内においてこれらの結合体が分解可能な結合を導入することが有利である。このため、前記ｓｉＲＮＡのオリゴ鎖は、分子量１０，０００〜３０，０００の範囲内で選択されることが好ましい。ｓｉＲＮＡオリゴ鎖が前記範囲の分子量を有する場合、１９〜３０個、好ましくは、１９〜２３個のヌクレオチドを含むこととなる。このとき、前記ｓｉＲＮＡは、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｆ、ｃ−ｓｒｃ、ｂｃｌ−２またはＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、またはサバイビン由来のｓｉＲＮＡを用いることが好ましいが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００１７】
また、前記ｓｉＲＮＡの導入に際し、細胞質内に過量存在するグルタチオン（glutathione）によって細胞内において分解されるジスルフィド結合、細胞内に流入した後に酸性を帯びる環境下で効果的に分解可能な酸分解性結合、細胞内に流入した後に細胞内において効果的に分解可能なエステル結合、若しくはアンヒドリド結合、又は特定の細胞の周りに存在する酵素によって細胞内に流入する直前に分解可能な酵素分解性結合などを導入することが好ましい。
【００１８】
ガン（cancer）は、一般に、能動的で且つ自発的な細胞の死である細胞の自殺（apoptosis）の速度が下がり、細胞周期が変わることと関連しているため、細胞周期を抑制したり、あるいは、細胞の自殺を修復させる方法は、新たな腫瘍の治療方法として取り上げられている。細胞の自殺が抑制される腫瘍においては、細胞自殺抑制タンパク質（ＩＡＰｓ；inhibitors of apoptosis）が発現すると知られており、前記ＩＡＰｓは細胞の自殺を誘導するタンパク質分解酵素（caspase）の活性を直接的に抑制したり、関連する転写因子であるＮＦ−ｋＢの活性を調節する方式によってその作用を示すことが知られている。最近の研究によれば、ＩＡＰｓの一つであるサバイビン（survivin）タンパク質が腫瘍と関連していることが判明された。サバイビンは、これまでテストされたほとんどの新生腫瘍や形質変異された細胞株において共通して発現するタンパク質であり、持続的な変異（mutation）が起こる腫瘍でも一定のレベルで発現することが知られており、抗ガン治療において重要なターゲットになり得ると予測されている（参照：Ambrosini G, et al., Nat. Med., 3(8):917-921, 1997）。
【００１９】
サバイビンをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡと結合して、前記ｍＲＮＡを不活性化させ得るｓｉＲＮＡを直接的に腫瘍細胞に導入させて、腫瘍細胞内においてサバイビンの発現を抑制したり、あるいは、サバイビンの活性を阻害することによりガン細胞を効果的に治療する方法が注目を集めている（大韓民国登録特許第１０−０８４８６６５号）。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、サバイビンをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡと結合することができ、細胞内におけるサバイビンの発現を抑制する。
【００２０】
本発明のｓｉＲＮＡの好適な実施形態としては、ほとんどの腫瘍から共通して発現するサバイビンの発現を抑制し得るサバイビンをコードするｍＲＮＡと相補結合できるｓｉＲＮＡであってもよい。
【００２１】
具体的に、前記サバイビンをコードするｍＲＮＡと相補結合できるｓｉＲＮＡは、下記表１に示す塩基配列であってもよい。
【００２２】
【表１】
2013504337.tif 000003
【００２３】
また、前記ｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンスの末端基は、他の官能基に置換されてもよい。例えば、官能基の例としての３’のヒドロキシ基は、アミン基、スルフィドリル基、またはフォスフェート基などに置換されてもよい。本発明に係るｓｉＲＮＡは、その末端部に腫瘍細胞選択的なリガンドがさらに設けられていてもよい。前記リガンドとしては、好ましくは、細胞特異的な抗体、細胞選択的なペプチド、細胞成長因子、葉酸、ガラクトース、マンノース、ＲＧＤ、トランスフェリンなどが使用可能である。これらのリガンドは、ジスルフィド結合、アミド結合、エステル結合などの結合を通じて前記ｓｉＲＮＡの末端基に導入できる。
【００２４】
本発明において、前記層状無機水酸化物は結晶構造が層状であり、アニオン交換能（anion exchange capacity）を有している。これは、層状無機水酸化物の水酸化物層が陽電荷を帯びているため、これを補償するためにアニオンが層間に存在し、この層間アニオンは、他のアニオン化学種に置換可能であるためである。前記層状無機水酸化物は、下記一般式２で表されることを特徴としてもよい：
［一般式２］
［Ｍ（II）１−ｘＭ（III）ｘ（ＯＨ）２］Ｘ＋［Ａｎ−］Ｘ／ｎ・ｙＨ２Ｏ
（式中、Ｍ（II）は二価金属カチオンを表し、Ｍ（III）は三価金属カチオンを表し、Ａはアニオン化学種であって、ｎはアニオンの電荷数であり、ｘは０．１〜０．５の数であり、ｙは０を超える正数である）。
【００２５】
本発明において、前記二価金属カチオンはＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋及びＺｎ２＋からなる群から選ばれ、前記三価金属カチオンはＡｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｉｎ３＋、Ｖ３＋及びＴｉ３＋からなる群から選ばれ、前記アニオンはＣＯ３２−、ＮＯ３−、Ｃｌ−、ＯＨ−、Ｏ２−及びＳＯ４２−からなる群から選ばれることを特徴としてもよい。前記二価金属カチオンと三価金属カチオンとの割合を２：１、３：１及び４：１などに調節して層電荷が調節されたような層状無機水酸化物を形成することができる。前記二価金属カチオン、三価金属カチオン及び前記アニオンは、前記種類に限定されるものではなく、当該技術分野において層状無機水酸化物として公知のものをいずれも含むことができる。
【００２６】
本発明において、前記「腫瘍標的志向性多官能基リガンド」は、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドにさらに結合されて標的特異的を与える腫瘍特異的な結合成分を意味する。かような腫瘍特異的結合成分の例としては、抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン（hapten）、アビジン（avidin）、ストレプトアビジン（streptavidin）、ニュートラアビジン（neutravidin）、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン（lectin）、セレクチン（selectin）、放射性同位元素で標識されたバイオ物質、及び腫瘍マーカーと特異的に結合できるバイオ物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
ここで、前記標的志向性多官能基リガンドは、（ｉ）付着領域、（ｉｉ）架橋結合領域及び（ｉｉｉ）活性成分領域を含む物質を意味する。以下、前記多官能基リガンドをより具体的に説明する。
【００２８】
前記「付着領域」は、層状無機水酸化物に表面改質されて付着し得る官能基（functional group）を含むスペーサー若しくは標的志向性多官能基リガンドの一部、好ましくは、末端を意味する。このため、付着領域は、層状無機水酸化物の表面との親和性が高い官能基を含むことが好ましく、層状無機水酸化物をなす物質に応じて種々に選択可能である。付着領域は、例えば、アミノシラン、エポキシシラン、ビニルシラン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈまたは−ＯＨを含んでいてもよい。
【００２９】
前記「架橋結合領域」は、表面改質された層状無機水酸化物に近づく多官能基リガンドの一部と架橋結合可能な官能基を含む「付着領域の末端」と「標的志向性多官能基リガンドの末端」を意味する。「架橋結合」とは、多官能基リガンドが近くに位置している表面改質された層状無機水酸化物の付着領域の末端と分子間引力によって結合されることを意味する。前記分子間引力の種類（例えば、疎水性引力、水素結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、ファンデルワールス結合、イオン結合など）には、特に制限がないため、架橋結合可能な官能基は、目的とする分子間引力の種類によって様々に選択可能である。架橋結合領域は、例えば、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＲ４＋Ｘ−、−エポキシ（epoxy）、−エチレン（ethylene）、−アセチレン（acetylene）−スルホナート（sulfonate）、−ニトレート（nitrate）、またはホスホナート（phosphonate）を官能基として含むことができる。前記架橋結合領域の官能基は、付着領域の末端と活性成分末端の種類及びこの化学式による。
【００３０】
また、前記分子間結合は、非分解性結合または分解性結合のいずれであっても構わない。このとき、非分解性結合としては、アミド結合（amide bond）またはフォスフェート結合（phosphate bond）が挙げられ、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンヒドリド（anhydride）結合、生分解性結合、または酵素分解性結合などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されることはない。
【００３１】
前記「活性成分領域」は、付着領域と架橋結合可能な官能基を含む腫瘍特異的な結合成分若しくは標的志向性多官能基リガンドの一部、好ましくは、前記付着領域と反対側に位置している末端を意味する。
【００３２】
ここで、前記腫瘍特異的結合成分は、抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン、アビジンストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、セレクチン、放射性同位元素で標識された成分、腫瘍マーカーと特異的に結合できる物質を含むが、これらに制限されるものではない。前記腫瘍特異的な結合成分リガンドとしては、好ましくは、細胞特異的抗体、細胞選択的ペプチド、細胞成長因子、葉酸、ガラクトース、マンノース、ＲＧＤ、トランスフェリンなどが使用可能である。前記活性成分としては、腫瘍特異的に結合できるリガンドまたは抗体が好適に挙げられる。前記リガンドとしては、好ましくは、細胞特異的抗体、細胞選択的ペプチド、細胞成長因子、葉酸、ガラクトース、マンノース、ＲＧＤ、トランスフェリンなどが使用可能である。
【００３３】
本発明は、前記標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドに腫瘍特異的に結合して治療できる物質を結合させてナノハイブリッドを提供する。すなわち、本発明における「標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド」は、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドが付着領域、架橋結合領域及び活性成分領域を含む標的志向性多官能基リガンドに囲まれているが、前記活性成分領域には、腫瘍マーカーと特異的に結合できる物質が結合されているナノハイブリッドを意味する。
【００３４】
本発明の好適な実施形態においては、前記標的特異的ナノハイブリッドを構成する標的志向性多官能基リガンドとして、腫瘍細胞において過発現する葉酸受容体に選択的に感応しつつカルボキシル末端を有している葉酸を用いている。すなわち、付着領域はアミノシランのシラン部分であり、架橋結合領域はアミノシランのアミン末端部分と葉酸のカルボキシル末端とが反応して結合されたペプチド領域であり、活性成分領域は葉酸受容体に感応する領域である。
【００３５】
葉酸（folic acid（ＦＡ））は、細胞内において遺伝子を産生する機構である葉酸サイクル（folate cycle）において重要な役割を果たす栄養分であり、特に、細胞分化に重要な役割を果たすことが知られている。一般に、ガン細胞は、高速な細胞分化のために多量の葉酸（あるいは、ホレート）を必要とし、このために、細胞膜に葉酸受容体（folate receptor）を過発現して大量の葉酸を摂取しようとする傾向にある。特に、ＫＢ細胞などの一部の乳房ガン細胞においては、正常細胞に比べて葉酸受容体が過発現しており、葉酸はこれらのガン細胞を認識する一種のリガンド（ligand）の役割を果たす。ガン細胞を認識するリガンドとしては、葉酸などの化学物質の他にも、抗体（antibody）、アプタマー（aptamer）などが挙げられるが、免疫副作用がなく、比較的に安価に接近できるという点で、葉酸はリガンドとしてのメリットが大きい。このため、最近のいくつかの研究では、葉酸をリガンドとして用いて、薬物伝達体のガン細胞親和力を高めようとする努力が行われている。特に、リポソームなどの薬物伝達体の表面にリガンドを付着しようとする研究（Gabizon, A. et al., Adv. Drug Delivery Rev. (2004) 56:1177-1192）と、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（polyethyelenglycol-disterarolyl phosphatidylethanolamine）などの高分子型薬物伝達体の末端にリガンドを付着して担持されたＤＮＡの感染効率を高めようとする研究（Hattori, Y. et al., J. Contorlled Rel., (2004) 97:173-183）、あるいは、ｐＮＩＰＡＭ（poly (Nisopropylacrylamide)）などのハイドロゲル状の薬物伝達体に葉酸を付着して細胞標的化しようとする研究（Nayak, S. et al., J. Am. Chem. Soc., (2004) 126:10258-10259）などがその代表例である。
【００３６】
本発明のナノハイブリッドは、腫瘍と関わる様々な疾病、例えば、胃ガン、肺ガン、乳房ガン、卵巣ガン、肝ガン、気管支ガン、鼻咽頭ガン、喉頭ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、結腸ガン及び子宮頸部ガンを治療する遺伝子治療剤として使用可能である。
【００３７】
上記の腫瘍疾患細胞においては、正常細胞ではほとんどまたは全く生産されない特定の物質を発現及び／又は分泌するが、これらを一般に「腫瘍マーカー（tumor marker）」と命名する。このような腫瘍マーカーと特異的に結合できる物質をｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物に結合させてなるナノハイブリッドは、腫瘍の治療に有効である。当業界においては、種々の腫瘍マーカーだけではなく、これらと特異的に結合できる物質が公知である。前記リガンドとしては、好ましくは、細胞特異的抗体、細胞選択的ペプチド、細胞成長因子、葉酸、ガラクトース、マンノース、ＲＧＤ、トランスフェリンなどが使用可能である。
【００３８】
本発明において、前記腫瘍マーカーは、作用機序によって、リガンド、抗原、受容体、これらをコードする核酸に分類される。
【００３９】
腫瘍マーカーが「リガンド」である場合には、前記リガンドと特異的に結合できる物質を本発明に係るナノハイブリッドの標的志向性多官能基リガンド成分として導入することができるが、前記リガンドと特異的に結合できる受容体または抗体であることが好適である。本発明において利用可能なリガンド及びこれと特異的に結合できる受容体の例としては、シナプトタグミンのＣ２（synaptotagminのＣ２）とホスファチジルセリン、アネキシンＶ（annexin V）とホスファチジルセリン、インテグリン（integrin）とこの受容体、ＶＥＧＦとこの受容体、アンジオポエチン（angiopoietin）とＴｉｅ２受容体、ソマトスタチン（somatostatin）とこの受容体、血管作動性腸管ペプチド（vasointestinal peptide）とこの受容体などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００４０】
腫瘍マーカーが「抗原」である場合、前記抗原と特異的に結合できる物質を本発明に係るナノハイブリッドの標的特異的活性成分として導入することができるが、前記抗原と特異的に結合できる抗体であることが好適である。本発明において利用可能な抗原及びこれと特異的に結合できる抗体の例としては、ガン胎児性抗原（carcinoembryonic antigen；大腸ガンマーカー抗原）とハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原（HER2/neu antigen；乳房ガンマーカー抗原）とハーセプチン、前立腺特異抗原（prostate-specific membrane antigen；前立腺ガンマーカー抗原）とリツキサン（ＩＤＣＥ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）などが挙げられる。
【００４１】
腫瘍マーカーが「受容体」の代表例としては、卵巣ガン細胞において発現する葉酸受容体が挙げられる。前記受容体と特異的に結合できる物質（葉酸受容体の場合には葉酸）が、本発明に係るナノハイブリッドの標的志向性多官能基リガンドとして導入可能であるが、前記受容体と特異的に結合できる物質としては、リガンドまたは抗体が挙げられ、好ましくは、抗体である。
【００４２】
ここで、抗体は、特定の対象とのみ選択的で且つ安定的に結合する性質を有しており、抗体のＦｃ領域にあるリシンの−ＮＨ２、システインの−ＳＨ、アスパラギン酸及びグルタミン酸の−ＣＯＯＨは、ナノハイブリッドの標的特異的活性成分領域官能基と結合するのに有用であるためである。このような抗体は、商業的に入手可能であるか、あるいは、当業界における公知の方法に従って製造することができる。一般に、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、馬または羊）を適量の抗原で１回以上免疫化させる。所定の時間後に、力価が適正レベルに至ったとき、哺乳動物の血清から回収する。回収した抗体は、所望の場合、公知の工程を用いて精製し、使用時まで冷凍緩衝された溶液に貯蔵することができる。このような方法の詳細は、当業界によく知られている。
【００４３】
一方、前記「核酸」は、上述のリガンド、抗原、受容体またはその一部をコードするＲＮＡ及びＤＮＡを含む。核酸は、当業界において知られているように、相補的な配列間に塩基対（base pair）を形成するという特徴を有しているため、特定の塩基配列を有する核酸は、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を用いて検出することができる。前記酵素、リガンド、抗原、受容体をコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸を、本発明に係るナノハイブリッドの標的特異的活性成分として用いることができる。
【００４４】
また、核酸は、５’−及び３’−末端に、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＯＨなどの官能基があるため、活性成分の官能基と結合するのに有用である。このような核酸は、当業界における公知の標準方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成器（例えば、バイオサーチ、アプライドバイオシステムなどから購入可能なもの）を用いて合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、文献（Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209）に記述されている方法によって合成することができる。メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、調節されたガラス重合体支持体を用いて製造することができる（Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448）。
【００４５】
本発明において、前記ナノハイブリッドの粒度が、１０〜３５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは、５０〜２００ｎｍである。これは、標的特異的ナノハイブリッドが多官能基リガンドの受容体、すなわち、腫瘍マーカーに選択的に感応した後、効果的に細胞に内包化されるようにし、且つ、今後生体内への投与時に、毛細血管が閉塞することなく、細胞に物理的な衝撃が加わらないようにするためである。標的特異的ナノハイブリッドが小さ過ぎて５０ｎｍに至らない場合には、細胞に大量流入して物理的な衝撃を与えることもできる。
【００４６】
本発明において、前記標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド中のｓｉＲＮＡの含量は、１〜５０重量％であることを特徴としてもよい。
【００４７】
他の観点において、本発明は、（ａ）二価金属塩と三価金属塩を含有する水溶液に塩基水溶液を滴加して、沈殿された層状無機水酸化物を製造するステップと、（ｂ）ｓｉＲＮＡ含有溶液を、ステップ（ａ）において製造された層状無機水酸化物が分散された溶液と混合し、そして攪拌して、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを調製するステップと、（ｃ）前記ハイブリッドに腫瘍標的志向性多官能基リガンドを結合させて、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造するステップと、を含む標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造方法に関する。
【００４８】
さらに、本発明は、前記ステップ（ｃ）後に、（ｄ）前記ナノハイブリッドに、１種以上の薬学的に許容可能な担体を添加して製剤化させるステップを含む前記ナノハイブリッドを含有する腫瘍治療用の医薬組成物の製造方法に関する。
【００４９】
本発明において、前記ステップ（ａ）の層状無機水酸化物は、下記一般式２で表されるが、共沈方法によって容易に製造することができる。
［一般式２］
［Ｍ（II）１−ｘＭ（III）ｘ（ＯＨ）２］Ｘ＋［Ａｎ−］Ｘ／ｎ・ｙＨ２Ｏ
（式中、Ｍ（II）は二価金属カチオンを表し、Ｍ（III）は三価金属カチオンを表し、Ａはアニオン化学種であって、ｎはアニオンの電荷数であり、ｘは０．１〜０．５の数であり、そしてｙは０を超える正数である）。
【００５０】
式中、Ｍ（III）は、これに相当する三価のカチオンが選択的に存在してもよく、全く存在しなくてもよい。一般式２のようにＭ（II）イオンとＭ（III）イオンとが共存する場合には、過量のＭ（III）イオンが層状構造の生成を妨げる虞があるため、Ｍ（III）イオンが全体の金属イオンに対して５０モル％以下で存在することが好ましい。
【００５１】
前記二価金属カチオンと三価金属カチオンとの割合を２：１、３：１及び４：１などに調節して、層電荷が調節されたような層状無機水酸化物を形成することができる。
【００５２】
前記二価金属塩としては、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋またはＺｎ２＋などをカチオンとし、ＮＯ３−、Ｃｌ−、ＯＨ−、Ｏ２−、ＳＯ４２−、ＣＯ３２−またはスクシネートなどをアニオンとする塩化合物が使用可能であるが、これに限定されるものではない。前記三価金属塩としては、Ａｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｉｎ３＋、Ｖ３＋またはＴｉ３＋などをカチオンとし、ＮＯ３−、Ｃｌ−、ＯＨ−、Ｏ２−、ＳＯ４２−、ＣＯ３２−またはスクシネートなどをアニオンとする塩化合物が利用可能であるが、これらに限定されることはない。Ｍｇ金属塩の場合、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４またはこれらの水和物が使用可能であり、Ａｌの金属塩の場合には、Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌ（ＮＯ３）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３またはこれらの水和物などが使用可能である。前記二価金属カチオン、三価金属カチオン及び前記アニオンは、上記の種類に限定されるものではなく、当該技術分野において層状無機水酸化物として公知のものをいずれも含むことができる。共沈反応は、塩基を加えて沈殿を誘導することができる。好適な塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムまたはアンモニアが使用可能である。反応溶液のｐＨは５〜１２、好ましくは、６〜１０であり、反応温度は０℃〜１００℃、好ましくは、１５℃〜３０℃である。反応時間は１０分以上であることが好ましい。なお、反応中には、窒素または不活性ガスを連続して投入して反応させることが好ましい。
【００５３】
前記層状無機水酸化物は、製造過程において、ｉ）反応液の温度、ｉｉ）反応液の濃度、ｉｉｉ）金属カチオン間の混合比、ｉｖ）洗浄水の温度、ｖ）乾燥温度などの合成要因から種々の粒度と形状を示すことができる。
【００５４】
本発明において、前記ステップ（ｂ）において、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造過程は、層状無機水酸化物の製造と同時にｓｉＲＮＡ含有溶液をともに共沈することにより、ナノハイブリッドを形成する共沈法（co-precipitation method）、層状無機水酸化物を形成した後、ｓｉＲＮＡ含有溶液を混合し、そして攪拌して、イオン交換によって層状無機水酸化物の層間に導入してナノハイブリッドを形成するイオン交換法（ion-exchange method）、製造した層状無機水酸化物をか焼した後、ｓｉＲＮＡ含有溶液を加えて再構成することによりナノハイブリッドを形成するか焼−再構成法（calcination-reconstruction method）または製造した層状無機水酸化物を枚葉シート状に剥離化させた後、ｓｉＲＮＡ含有溶液を加えて組換えすることによりナノハイブリッドを形成する剥離化−組換え法（exfoliation-reassembling method）などがある。
【００５５】
前記共沈法による本発明に係るナノハイブリッドの製造方法は、ｓｉＲＮＡ及び二価／三価金属塩の溶液を製造するステップ及び前記溶液に塩基を加えてｐＨを６〜１０に滴定して沈殿物を得るステップを含む。
【００５６】
前記イオン交換法による本発明に係るナノハイブリッドの製造方法は、二価／三価金属塩の溶液を製造するステップと、前記二価／三価金属塩の溶液に塩基を加えて、ｐＨを６〜１０に滴定して層状無機水酸化物沈殿物を形成するステップ、及び前記形成された沈殿物にｓｉＲＮＡ含有溶液を加えて、前記沈殿物の層間に存在するアニオンとのイオン交換によって前記沈殿物の層間にｓｉＲＮＡを導入するステップを含む。
【００５７】
前記か焼−再構成法による本発明に係るナノハイブリッドの製造方法は、二価／三価金属塩の溶液を製造するステップと、前記二価／三価金属塩の溶液に塩基を加えて、ｐＨを６〜１０に滴定して層状無機水酸化物沈殿物を形成するステップと、前記形成された沈殿物の層間アニオンを除去するために、２５０℃〜５００℃以内の温度下で１時間以上熱処理、好ましくは、４００℃で約４時間熱処理してか焼するステップ及びｓｉＲＮＡ含有溶液に前記か焼された沈殿物を加えて攪拌して再構成するステップを含む。
【００５８】
前記剥離化−組換え法による本発明に係るナノハイブリッドの製造方法は、二価／三価金属塩の溶液を製造するステップと、前記二価／三価金属塩の溶液に塩基を加えて、ｐＨを６〜１０に滴定して層状無機水酸化物沈殿物を形成するステップと、前記形成された沈殿物の層間アニオンを長い炭素鎖のアニオン性イオンに置換したり、あるいは、特定の溶媒を用いて層状無機水酸化物を枚葉の単一層シートに剥離化、好ましくは、ホルムアミド溶液に０．０５重量％で分散し、且つ、２日間攪拌して剥離化させるステップ及びｓｉＲＮＡ含有溶液を前記剥離化されたコロイド溶液に加え、攪拌して組換えするステップを含む。
【００５９】
前記製造方法において、二価／三価金属塩溶液、塩基溶液またはｓｉＲＮＡ含有溶液を製造するための溶媒は、前記反応に関与せず、前記ｓｉＲＮＡ及び金属塩を両方とも溶解可能な溶媒であれば、特に制限はなく、例えば、蒸留水、エタノール、蒸留水及びエタノールの混合溶媒が使用可能である。
【００６０】
前記製造方法において、層状無機水酸化物とｓｉＲＮＡとの間の反応は、特に制限されるものではなく、通常、常温下で、好ましくは、ｓｉＲＮＡ変性温度以下で、概ね１０分〜７日間反応することによって行うことができる。反応に求められる前記各反応物の添加比は、特に限定されるものではなく、ｓｉＲＮＡ：層状無機水酸化物＝１０：９０〜９０：１０のモル比（％）にて添加可能であり、これにより、ｓｉＲＮＡの層状無機水酸化物の導入率を調節することができる。
【００６１】
また、ｓｉＲＮＡが腫瘍細胞内に伝達された後、層状無機水酸化物から分解された金属カチオンの存在下では、二本鎖ｓｉＲＮＡのリン酸基と金属カチオンとの相互作用によって不溶性の形でｓｉＲＮＡの活性に否定的な影響を与える虞がある（Duguid J et al., Biophys. J. 65:1916-1928, 1993）。二価／三価金属カチオンと強くキレート結合を形成するＥＤＴＡ（Ethylene diaminetetra acetic acid）を、前記ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造するステップ（ｂ）において、ｓｉＲＮＡとともに添加してナノハイブリッドを形成して腫瘍の治療に用いると、細胞内に流入した後、弱酸性の条件下で層状金属水酸化物の分解産物である金属カチオンとの相互作用を減らすことにより、ｓｉＲＮＡの活性を増大させることを補助することができる。
【００６２】
本発明は、他の観点より、前記標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを有効成分として含有する腫瘍治療用の医薬組成物に関する。
【００６３】
本発明において、前記医薬組成物は、通常用いられる薬学的に許容可能な担体またはビヒクルを含んでいてもよい。
【００６４】
本発明において、前記腫瘍は、これらに制限されるものではないが、乳房ガン、肺ガン、口腔ガン、膵臓ガン、結腸ガン、前立腺ガン、卵巣ガンなどであってもよく、例えば、実施の形態に開示する口腔ガンまたは肺ガンであってもよい。
【００６５】
本発明の腫瘍治療用の医薬組成物に使用可能な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるものではないが、イオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、複数のリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンサルフェート、リン酸水素ニナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、コロイド状シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコール及び羊毛脂などが挙げられる。本発明の腫瘍治療用の医薬組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでいてもよい。
【００６６】
本発明のナノハイブリッド含有医薬組成物は、臨床投与のために公知の技術を用いて好適な剤形に製剤化させることができる。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤または食用担体と混合するか、あるいは、硬質または軟質ゼラチンカプセルに密封されるか、あるいは、製剤に打錠して投与することができる。経口投与用の場合、活性化合物は、賦形剤と混合されて摂取型錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリクシール、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形で使用可能である。なお、注射用、非経口投与用などの各種の剤形は、当該技術分野における公知の技法または通常の技法に従い製造することができる。
【００６７】
本発明のナノハイブリッド含有腫瘍治療用の医薬組成物は、投与のために、前記有効成分の他にさらに薬学的に許容可能な担体を１種以上含めて製造することができる。薬学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立できる必要があり、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化させることができる。さらには、当分野の適正な方法によって、または、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法を用いて、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化させることができる。
【００６８】
本発明に係るナノハイブリッド含有腫瘍治療用の医薬組成物は、医学分野において通常用いられる経路を介して投与可能であり、非経口投与であることが好ましく、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与経路を介して投与することができる。
【００６９】
一実施の形態として、本発明に係るナノハイブリッド含有腫瘍治療用の医薬組成物は、非経口投与のための水溶性溶液にすることができる。好ましくは、ハンクス溶液（Hank’s solution）、リンガー溶液（Ringer’s solution）または物理的に緩衝された塩水などの緩衝溶液を用いることができる。水溶性注入（injection）懸濁液は、ソジウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストリンなど懸濁液の粘度を増大できる基質を添加することができる。
【００７０】
本発明において、前記剤形は、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤及びシロップ剤からなる群から選ばれることを特徴としてもよく、前記剤形が注射剤である場合には、液剤、懸濁液剤または乳濁液剤であってもよい。
【００７１】
本発明の好適なナノハイブリッド含有腫瘍治療用の医薬組成物は、滅菌注射用の水性または油性懸濁液であって、滅菌注射用製剤の形であってもよい。このような懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、ツイーン８０）及び懸濁化剤を用いて、この分野における公知の技術によって剤形化させることができる。また、滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤であってもよく、溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１,３−ブタンジオール中の溶液）であってもよい。使用可能なビヒクル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、通常、滅菌不揮発性オイルが溶媒または懸濁化媒質として用いられる。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドをはじめとして、刺激性の低い不揮発性オイルは、いずれも使用可能である。
【００７２】
あるいは、注射用または注入用の最終製剤の他にも、凍結乾燥物または殺菌散剤として存在し、投与の直前に溶媒、例えば、水と混合して注射用または注入用の最終製剤を製造できる投与の形態であってもよい。
【００７３】
本発明のナノハイブリッド含有腫瘍治療用の医薬組成物の投与形態は、通常の患者の症状と疾病の深刻度に基づいて、この技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な剤形に製剤化させることができ、単位投与量または多投与量の容器、例えば、密封されたアンプル及び瓶などとして提供されることもできる。
【００７４】
本発明のナノハイブリッド含有医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などに応じてその範囲が多岐に渡り、この技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。
【００７５】
本発明において、サバイビンをコードする遺伝子と相補結合できるｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与方法または予防目的に応じて、体重１ｋｇ当たりにｓｉＲＮＡを基準として０．０５〜０．１μｇを非経口投与することができる。特異症状を示す患者への投与容量レベルは、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法などに応じて当業者が投与量を変化させることもできる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
《実施例１：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造》
１−１．ＮＯ３−層状無機水酸化物の製造
Ｍｇ（ＮＯ３）２・Ｈ２Ｏ（０．２Ｍ）及びＡｌ（ＮＯ３）３・Ｈ２Ｏ（０．１Ｍ）を炭酸イオン（ＣＯ３２−）が除去された蒸留水に溶解させ、ＮａＯＨ水溶液（１Ｍ）でｐＨ９〜１０値に滴定して沈殿により形成された層状無機水酸化物結晶体を得た。層状無機水酸化物結晶体を１００℃で１６時間攪拌し、洗浄過程を経て未反応塩を除去した後、凍結乾燥してＮＯ３−層状無機水酸化物を得た。
【００７７】
１−２．ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造
前記１−１において得られた層状無機水酸化物を蒸留水に再分散させ、この分散溶液にサバイビンをコードする遺伝子と相補結合できるｓｉＲＮＡ（バイオニア、韓国、配列番号１）を蒸留水に溶解した溶液を添加し（ｓｉＲＮＡ：層状無機水酸化物＝３：１重量比）、３７℃で２日間攪拌した後、洗浄過程を経て未反応ｓｉＲＮＡを除去した後、ｓｉＲＮＡが層状無機水酸化物の層間に挿入されたナノハイブリッドを得た。前記ナノハイブリッドの製造過程は、空気中の二酸化炭素による炭酸イオン（ＣＯ３２−）の生成を防ぐために窒素雰囲気下で行われた。
【００７８】
１−３．標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの製造
葉酸多官能基リガンドが活性成分として結合された標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを製造するために、まず、前記１−２において製造されたｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物を用いて、アミノシランが付着したｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを合成した。ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物をエタノールに再分散させ、乾燥して表面水を蒸発させた後、アミノプロピルシランが溶解されているトルエン溶液に添加して６０℃で６時間攪拌し、洗浄してアミノシランが付着領域に結合されたｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを得た。前記アミノシランが結合されたｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを再分散させた水溶液、反応触媒剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）、トリエチルアミン（ＥＴ３Ｎ）がそれぞれ溶解されている水溶液、葉酸がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された溶液を用意した。ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド分散液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド水溶液とＮ−ヒドロキシサクシンイミド水溶液を添加し、葉酸溶液を添加した後、トリエチルアミン水溶液を用いてｐＨを９に滴定した。反応物は、３８℃で５時間攪拌し、ジメチルスルホキシドと蒸留水で洗浄した後に凍結乾燥することにより、葉酸多官能基リガンドが結合された標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを得た。
【００７９】
上記の標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの表面反応は、１次的に付着領域である、層状無機水酸化物のＭ（金属）−ＯＨ結合がＭ−Ｏ−Ｓｉ−アミンで表面改質され、２次的に架橋結合領域において末端のアミンと葉酸のカルボキシル基とが反応してＭ−Ｏ−Ｓｉ−ペプチド−葉酸が形成され、活性成分領域は葉酸受容体に感応する末端領域である。
【００８０】
前記実施例１に従い製造したナノハイブリッドの結晶構造を確認するために、Ｘ線回折（Ｒｉｇａｋｕ、Ｄ／Ｍａｘ２２００）分析を行った。その結果、図２に示すように、層状無機水酸化物の層間間隔は約７．９Åであり、硝酸アニオンが挿入されている典型的な層状構造であることを確認し、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物の層間間隔は約２５Åであり、硝酸アニオンがｓｉＲＮＡとイオン交換され、ｓｉＲＮＡが水酸化層と平行な構造に層間に挿入されつつ約２０Å膨張され、その結果、２次元構造を有するｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドが得られるということが分かった。標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物もまた、多官能基リガンド結合反応後にも層間間隔を維持することより、ｓｉＲＮＡ層間に挿入されているような標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドが製造されたことが分かる。
【００８１】
前記実施例１に従い製造した標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの形状及び粒度を確認するために、透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＪＥＭ−２１００Ｆ）分析を行った。その結果、図３に示すように、前記標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドは、平均１００±２０ｎｍサイズの六角形状のナノ粒子に製造されていることが分かった。
【００８２】
《実験例１：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの血清内安定性の分析》
前記実施例１に従い製造した標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドの血清内安定性を調べてみた。
【００８３】
ｓｉＲＮＡを基準とし、濃度１０μｇを安定性反応液（ｒａｔ血清１０％を含む、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）９０μＬに加え、３７℃で放置した。所定の時間（０、０．５、１、２、４、６、８、１０、１２及び２４時間）が経過したタイミングで、１２μＬずつを分注して、−７０℃に直ちに凍結させて保管し、保管されたそれぞれの時間別の試料２．５μＬをトリス−アセテート（ＴＡＥ）バッファーでゲル電気泳動（１％アガロスゲル）して、血清内でｓｉＲＮＡが維持されるかどうかを確認した。比較群として、純粋ｓｉＲＮＡを用いた。
【００８４】
その結果、図４に示すように、純粋ｓｉＲＮＡは、血清を含む反応液で８時間培養すれば、ほとんど完全に分解された（図４（ａ））。これに対し、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドは、同じ条件下でヌクレアーゼによって媒介されるｓｉＲＮＡ分解が２４時間経過後にも全く検出されなかった（図４（ｂ））。このような血清内における持続的なｓｉＲＮＡの安定化は、層状無機水酸化物に層間挿入されているｓｉＲＮＡが層状無機水酸化物のカチオン性層電荷とｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基が強い静電気的な引力によって結合されてヌクレアーゼがナノハイブリッドの内部中心部に近づくことを構造的に遮るために得られることと認められる。
【００８５】
《実施例２：標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドのＩｎ−Ｖｉｔｒｏ効能試験》
２−１．腫瘍細胞株培養及び細胞株におけるサバイビンの発現抑制
腫瘍細胞株であるヒト口腔ガン細胞株（ＫＢ、韓国細胞株銀行）は、葉酸受容体が過発現される細胞への最大発現を誘導するために葉酸なし培養液で最小２週以上３７℃、ＣＯ２の条件下で培養後に使用した。ＫＢ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）にそれぞれ１ｘ１０５／２ｍＬで分注して３７℃、ＣＯ２培養器で培養した後、実施例１に従い製造したｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドをｓｉＲＮＡを基準として１００ｎＭの濃度にて細胞に処理して３７℃、ＣＯ２培養器で培養した。６時間経過後、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地に交換した後、２４時間３７℃、ＣＯ２培養器でサバイビンの発現を抑制するためにさらに培養した。
【００８６】
比較群としては、何の処理もしなかった細胞、対照群としては、ＮＯ３−層状無機水酸化物、実験群としては、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを処理した細胞を用いた。また、対照群として、標的特異的リガンドである葉酸による腫瘍特異的細胞内在化を確認するために、含葉酸（１ｍｇ／ｍＬ）培養液を２４時間培養した後に、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを処理した細胞を用いた。
【００８７】
本発明に係る標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドは、腫瘍マーカーである葉酸受容体が過発現された腫瘍細胞で受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞内に透過され（receptor-mediated endocytosis）、腫瘍マーカーが発現しない腫瘍細胞では、ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド若しくは標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドが両方ともクラスリン媒介エンドサイトーシス（clathrin-mediated endocytosis）というメカニズムによって細胞内在化して腫瘍治療効果を示すことと認められる。また、標的志向性多官能基リガンドが付着したナノハイブリッドを用いた場合に、多量のナノハイブリッドが腫瘍選択的に細胞内に流入することが分かる。この結果は、標的特異的層状無機水酸化物が腫瘍細胞特異的ｓｉＲＮＡ伝達媒介体としての役割を果たすということを示唆する。
【００８８】
２−２．ＲＴ−ＰＣＲによるサバイビンｍＲＮＡの定量分析
腫瘍細胞抑制が実際に細胞内サバイビンｍＲＮＡの量の減少に起因するかどうかを確認するために、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全体ＲＮＡ中のサバイビンｍＲＮＡの濃度をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）分析によって、下記の方法により定量した。
【００８９】
すなわち、各試料の全体ＲＮＡ１μｇをｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８（５００ｎｇ／μＬ）１μＬ及びｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）２μＬと混合し、７０℃で１０分間反応させた後、氷で５分間冷却させ、逆転写酵素（reverse superscript（２００Ｕ／μＬ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１０Ｘ反応緩衝液２μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤（inhibitor）０．５μＬ及び適量の滅菌水を混合して、全体体積を２０μＬにした後、４２℃で１５分間反応させ、９５℃で５分間、４℃で５分間反応させてそれぞれのｃＤＮＡを得た。その後、それぞれのｃＤＮＡ１μＬ、ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）の２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μＬ、サバイビン及びＧＡＰＤＨに特異的なそれぞれの順方向プライマー（１０ｐＭ）０．４μＬ及び逆方向プライマー（１０ｐＭ）０．４μＬを混合した後、ＲＴ−ＰＣＲを行った（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を４０回繰り返し行う）。このとき、用いられた順方向（forwarding）プライマーと逆方向（reverse）プライマーの配列は、下記の通りである：
サバイビン特異的順方向プライマー: 5'-CCTTCACATCTGTCACGTTCTCC-3' (配列番号10)
サバイビン特異的逆方向プライマー: 5'-ATCATCTTACGCCAGACTTCAGC-3' (配列番号11)
ＧＡＰＤＨ特異的順方向プライマー: 5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (配列番号12)
ＧＡＰＤＨ特異的逆方向プライマー: 5'-ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3' (配列番号13)
【００９０】
ＰＣＲが終了した後、ｃＤＮＡ標準曲線を用いて、それぞれの得られたサバイビンＰＣＲ産物の量及びＧＡＰＤＨ ＰＣＲ産物の量を測定し、サバイビンの測定値をＧＡＰＤＨの測定値で除算してサバイビン相対的発現量を算出し、これよりサバイビンｍＲＮＡの発現減少率を比較した。
【００９１】
その結果を図５に示し、ＫＢ細胞でｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを処理した場合には４０％のサバイビン発現減少を行い、標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドを処理した場合には６０％のサバイビン発現減少を行った。
【００９２】
これにより、本発明のｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッド及び標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドは、サバイビンのｍＲＮＡレベルを減少させるだけではなく、サバイビンの発現減少による腫瘍細胞の増殖抑制を直接的に誘発することができるということが確認された。
【００９３】
本発明に係る標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドは、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を増加させ、腫瘍マーカーと特異的に結合できる標的志向性多官能基リガンドは腫瘍特異的伝達効率を向上させて比較的に低い濃度の投与量でｓｉＲＮＡの腫瘍治療活性を示して、様々な疾病腫瘍治療の効率性及び正確性を向上させる組成物として使用可能であるということが確認され、新規なｓｉＲＮＡ伝達システムであり、生命工学のための基礎研究と医学産業上極めて有用な発明であることが確認された。
【００９４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
以上述べたように、本発明に係る標的特異的ｓｉＲＮＡ−層状無機水酸化物ナノハイブリッドは、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を増加させ、腫瘍マーカーと特異的に結合できる標的志向性多官能基リガンドは腫瘍特異的伝達効率を向上させて比較的に低い濃度の投与量でｓｉＲＮＡの腫瘍治療活性を示して、様々な疾病腫瘍治療の効率性及び正確性を向上させる組成物として使用できるだけではなく、新規なｓｉＲＮＡ伝達システムであって、生命工学のための基礎研究と医学産業上極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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