(57)【要約】【課題】  大腸菌から髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群の組み換えリポタンパク質Ａｇ４７３を調製及び精製する方法を提供する。【解決手段】  本発明の方法は、界面活性剤の存在下で大腸菌の細胞膜を破壊する工程と、シラン改質シリカ樹脂を含む混合相クロマトグラフィの工程と、アニオン交換クロマトグラフィの工程と、カチオン交換クロマトグラフィの工程と、限外濾過の工程とを含む。本方法は、髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群のワクチンの大規模生産に使用することができる。シラン改質シリカ固定相樹脂の調製方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌細胞から組み換えリポタンパク質を調製する方法であって、
髄膜炎菌（ＮＭ）のＡｇ４７３タンパク質を発現する大腸菌細胞の細胞膜を界面活性剤の存在下で破壊して、細胞膜画分を生成する破壊工程と、
前記細胞膜画分を濾過して、濾液を生成する濾過工程と、
混合相クロマトグラフィ、カチオン性膜クロマトグラフィ、及びアニオン性膜クロマトグラフィを任意の順序で含む精製処理により前記濾液を精製して、試料を得る精製工程と、
前記試料を透析濾過膜で透析濾過して、調製物を生成する透析濾過工程と、
前記調製物から前記界面活性剤を除去して、精製Ａｇ４７３タンパク質を得る除去工程と、を含む、リポタンパク質の調製方法。
【請求項２】
前記リポタンパク質は、１０ｋＤａを超える分子量及び４．５未満の等電点（ｐｉ）を有する請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項３】
前記界面活性剤は、０．０５〜１％の範囲の濃度を有する請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項４】
前記界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、オクチル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ及びサルコシンからなる群より選択される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項５】
前記濾過工程は、０．２２μｍの孔径のフィルター膜の透過により実施される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項６】
前記カチオン性膜クロマトグラフィは、ＰＡＬＬ社の０．８μｍのＭｕｓｔａｎｇＳ膜で実施される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項７】
前記アニオン性膜クロマトグラフィは、ＰＡＬＬ社の０．２２μｍのＭｕｓｔａｎｇＥ膜で実施される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項８】
前記精製工程は、
シランにより改質され、かつ酢酸により活性化されたシリカ樹脂からなる混合相クロマトグラフィに、前記濾液を通して第１溶出液を得る工程（ｉ）と、
前記第１溶出液をカチオン性膜クロマトグラフィに付して、第２溶出液を得る工程（ｉｉ）と、
前記第２溶出液をアニオン性膜クロマトグラフィに付して、前記試料を得る工程（ｉｉｉ）と、により実施される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項９】
前記工程（ｉ）の前記混合相クロマトグラフィは、０．２５〜１Ｍの範囲のＮａＣｌを含有する溶媒を前記樹脂より溶出することを含む請求項８に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉ）の前記シリカ樹脂は、シランに対するシリカ樹脂の比が乾燥重量に基づく計算で２．０〜３．５のシラン改質反応により得られる請求項８に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１１】
前記工程（ｉｉ）は、３．０〜４．０の範囲のｐＨ値を有するリン酸塩緩衝液系で実施される請求項８に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１２】
前記工程（ｉｉ）のカチオン性膜クロマトグラフィに適用される前記第１溶出液は、酢酸を含有する溶液の添加により２．５〜５．０の範囲のｐＨ値になるまで予め酸性化したものである請求項８に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１３】
前記工程（ｉｉｉ）は、５を超えるｐＨ値を有する酢酸／リン酸塩緩衝液系で実施される請求項８に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１４】
前記工程（ｉｉｉ）のアニオン性膜クロマトグラフィに適用される前記第２溶出液は、ＮａＯＨの溶液の添加により５．０〜７．５の範囲のｐＨ値になるまで予め塩基性化したものである請求項８に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１５】
前記透析濾過膜は、１０ｋＤの孔径を有する請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１６】
前記除去工程は、４０〜６０％のアセトニトリルを含有する第１溶媒を適用することによって界面活性剤を洗い出す工程と、６０〜９０％のアセトニトリルを含有する第２溶媒を適用することによってタンパク質を回収する工程と、を用いる逆相クロマトグラフィにより実施される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１７】
前記逆相クロマトグラフィは、ＧＥ社のＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣ樹脂で実施される、請求項１１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１８】
前記除去工程は、
４０％のアセトニトリルを含有する第１溶媒で洗浄して、残留界面活性剤を除去する工程と、
８０％のアセトニトリルを含有する第２溶媒で溶出して、ｒＡｇ４７３タンパク質を回収する工程と、を含む逆相クロマトグラフィにより実施される請求項１に記載のリポタンパク質の調製方法。
【請求項１９】
シリカ樹脂及びシランを、当該シランに対する当該シリカ樹脂の比が乾燥重量に基づく計算で２．０〜３．５となる条件の下、溶媒中で混合する工程と、
前記シリカ樹脂及び前記シランが互いに反応してシラン改質シリカ樹脂を形成するように、前記混合物をインキュベートする混合工程と、
前記溶媒を除去して乾燥されたシラン改質シリカ樹脂を得る除去工程と、を含む処理により調製されるシラン改質シリカ樹脂。
【請求項２０】
前記処理は、前記除去工程の後に、
酢酸溶液で洗浄することにより前記シラン改質シリカ樹脂を活性化する工程と、
前記酢酸溶液を除去する工程と、
緩衝液により前記活性化シラン改質シリカ樹脂を洗浄する工程と、を更に含む請求項１９に記載のシラン改質シリカ樹脂。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群分離株のサブユニットワクチンの調製方法に関し、特に、大腸菌発現システムからの髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群の組み換えＡｇ４７３リポタンパク質（ｒＡｇ４７３）の大規模生産及び精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在まで、細菌性髄膜炎は、依然として全世界の健康に対する重大な危機であり、全世界で毎年およそ１７０，０００人の死亡の原因であり、多くの神経損傷の症例が特に幼児及び若者において生じている。髄膜炎菌（ＮＭ）は、伝染病を生じうる細菌の１つであり、ヘモフィルスインフルエンザｂ型及び肺炎レンサ球菌のワクチン導入後、ヒト髄膜炎の主要な病原体となっている。ＮＭ血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５に対する伝統的な多糖系ワクチンは、１９７０年以降入手可能となった。しかし、Ｂ群のワクチンを開発する同様の手法には、Ｂ群細菌の多糖類とヒト脳の糖タンパク質との潜在的な交差免疫反応という問題がある。地域的な大流行に対して、幾つかのタンパク質系Ｂ群ワクチンが世界中に存在するが、これらのワクチン候補に使用される外膜タンパク質の発現が非常に多様であるので、そのようなワクチンの適用範囲は限定されている。
【０００３】
徹底的にスクリーニングをした後、１つのリポタンパク質Ａｇ４７３が、検査済みのＢ群分離株の表面に発見された。組み換えリポタンパク質Ａｇ４７３は、動物モデルにおいて効力を誘発することができる潜在的なワクチン候補であることが示された。Ａｇ４７３遺伝子をカナマイシンの選択下で発現ベクターにクローニングして、高発現クローンを確立することによって、ワクチン開発のための大腸菌によるｒＡｇ４７３の大量生産及びその使用は達成された（例えば、台湾特許第Ｉ２８０２４７号明細書、米国特許第７３５７９３２号明細書、米国特許第２００８０１１８５３５号明細書及び欧州特許１６１２２１８号明細書を参照すること）。ｒＡｇ４７３が脂質化され、細菌の外膜に固着するので、ＬＰＳ汚染は、伝統的な精製方法では安全性の面で極めて重大な問題だった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】台湾特許第Ｉ２８０２４７号明細書
【特許文献２】米国特許第７３５７９３２号明細書
【特許文献３】米国特許第２００８０１１８５３５号明細書
【特許文献４】欧州特許１６１２２１８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、組み換えｒＡｇ４７３の産生において、ＬＰＳを除去することができるクロマトグラフィ技術を提供することを目的とする。
本発明は、組み換えｒＡｇ４７３リポタンパク質を、改良したクロマトグラフィ及び限外濾過技術を使用して、ＬＰＳ汚染物を有することなく精製する技術に基づいている。具体的には、大腸菌から髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群の組み換えリポタンパク質Ａｇ４７３を調製及び精製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの態様は、大腸菌細胞から、１０ｋＤａを越える分子量及び４．５未満の等電点（ｐｉ）を有するリポタンパク質等の組み換えリポタンパク質を調製する方法を特徴とする。本方法は次の５つの工程を含む。
（１）界面活性剤の存在下で、髄膜炎菌（ＮＭ）のＡｇ４７３タンパク質を発現する大腸菌細胞の細胞膜を破壊して、細胞膜画分を生成する破壊工程。
（２）細胞膜画分を例えば０．２２μｍの孔径のフィルター膜に透過させることにより濾過して、濾液を生成する濾過工程。
（３）濾液を精製処理により精製して、試料を得る精製工程（精製処理には、任意の順序で、混合相クロマトグラフィ、カチオン性膜クロマトグラフィ及びアニオン性膜クロマトグラフィが含まれる）。
（４）試料を透析濾過膜（例えば、１０ｋＤの孔径を有する）で透析濾過して、調製物を生成する透析濾過工程。
（５）界面活性剤を例えば逆相クロマトグラフィにより調製物から除去して、精製されたＡｇ４７３タンパク質を得る除去工程。
逆相クロマトグラフィには、ＧＥ社のＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣ樹脂等の樹脂を使用することができる。脂質化ｒＡｇ４７３が含まれた樹脂を、４０〜６０％（例えば、４０％）のアセトニトリルを含有する第１溶媒で洗浄して、残留界面活性剤を除去し、次に６０〜９０％（例えば、８０％）のアセトニトリルを含有する第２溶媒で溶出して、タンパク質を回収することができる。
【０００７】
破壊工程（１）に使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、オクチル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（登録商標）及びＴｗｅｅｎ２０）、双性イオン性界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯ）又はイオン性界面活性剤（ＳＤＳ及びサルコシン）である。濃度は、０．０１〜２％、例えば０．０５〜１％及び０．１〜０．５％の範囲を有してもよい。
【０００８】
精製工程（３）の精製処理は、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を含んでよい。
シランにより改質され、かつ酢酸により活性化されたシリカ樹脂からなる混合相クロマトグラフィ樹脂に濾液を通して第１溶出液を得る工程（ｉ）。
第１溶出液をカチオン性膜クロマトグラフィに付して、第２溶出液を得る工程（ｉｉ）。
第２溶出液をアニオン性膜クロマトグラフィに付して、試料を得る工程（ｉｉｉ）。
【０００９】
シリカ樹脂は、シランに対するシリカ樹脂の比が、乾燥重量に基づく計算で２．０〜３．５（例えば、２．５〜３）のシラン改質反応により得ることができる。
混合相クロマトグラフィには、ＮａＣｌを０．２５〜１Ｍ（例えば、０．５〜０．７５Ｍ）の範囲で含有する溶媒で樹脂を溶出する工程を含んでよい。
【００１０】
カチオン性膜クロマトグラフィに適用される第１溶出液を、酢酸を含有する溶液の添加により予め酸性化して、２．５〜５．０の範囲のｐＨ値を得ることができる。
アニオン性膜クロマトグラフィに適用される第２溶出液を、ＮａＯＨを含有する溶液の添加により予め塩基性化して、５．０〜７．５の範囲のｐＨ値を得ることができる。
カチオン性膜クロマトグラフィは、ＰＡＬＬ社の０．８μｍのＭｕｓｔａｎｇＳ膜で実施することができる。
アニオン性膜クロマトグラフィは、ＰＡＬＬ社の０．２２μｍのＭｕｓｔａｎｇＥ膜で実施することができる。
【００１１】
工程（ｉｉ）は、３．０〜４．０の範囲のｐＨ値を有するリン酸塩緩衝液系で実施することができる。
工程（ｉｉｉ）は、５を超えるｐＨ値を有する酢酸／リン酸塩緩衝液で実施することができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、シリカ樹脂及びシランを溶媒中で混合する工程（シランに対するシリカ樹脂の比は乾燥重量に基づく計算で２．０〜３．５である）と、シリカ樹脂及びシランが互いに反応してシラン改質シリカ樹脂を形成するように、混合物をインキュベートする工程と、溶媒を除去して乾燥シラン改質シリカ樹脂を得る工程と、を含む処理によって調製されるシラン改質シリカ樹脂を特徴とする。
溶媒は、アルコール、例えばエタノール及びメタノールであってもよい。インキュベーションの持続時間は、混合しながら、一般的に１１〜１６時間、例えば１０〜１４時間であり、その後、混合なしで１〜２時間である。インキュベーションの後、シラン改質シリカ樹脂を新たな溶媒で数回洗浄して、残りのシランを除去することができる。
【００１３】
上記に記載された処理は、酢酸溶液（例えば、０．１〜１％酢酸）で洗浄することによるシラン改質シリカ樹脂の活性化、酢酸溶液の除去、及び緩衝液による活性化されたシラン改質シリカ樹脂の洗浄を更に含んでもよい。
【００１４】
本発明の１つ以上の実施態様の詳細が、添付図面及び下記の記載により説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本記載及び図面から、並びに請求項から明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】組み換えＡｇ４７３リポタンパク質（ｒＡｇ４７３）を精製する例示的な５工程処理のフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群分離株のサブユニットワクチンの調製に関し、特に、大腸菌発現システムからの髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群の組み換えＡｇ４７３リポタンパク質（ｒＡｇ４７３）の大規模生産及び精製に関する。
【００１７】
一つの態様において、本発明は、大規模大腸菌発現システムから髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群の組み換えリポタンパク質Ａｇ４７３を精製することを特徴とする方法である。当該方法は、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む。
（ａ）細胞膜からｒＡｇ４７３リポタンパク質のみを抽出するのに十分であり、全細胞構造を破壊しない（すなわち、細胞の他の成分、例えば細胞壁、細胞質及びゲノムが破壊されず、実質的に無傷である）特定の濃度の界面活性剤を使用して、リポタンパク質を過剰発現する大腸菌の上澄みを清澄化する工程。
（ｂ）良好に精製することができる改質剤（シラン）の特定比から作成されたシリカ樹脂においてｒＡｇ４７３リポタンパク質抽出物を混合相クロマトグラフィ処理する工程であって、酢酸による活性化処理と、０．２５Ｍを越える濃度でＮａＣｌ塩を添加することによる標的タンパク質の溶出と、を含むことを特徴とする工程。
（ｃ）不純物を選択的に結合するために、酢酸を上述の系に添加して抽出物を酸性化することを特徴とするカチオン性膜クロマトグラフィの工程。
（ｄ）ＮａＯＨの溶液を酢酸／リン酸塩緩衝液系に添加することにより５を超えるｐＨ値に調整したアニオン性膜クロマトグラフィの工程であって、ＬＰＳ汚染物を除去するための工程。
（ｅ）１０〜１００ｋＤの範囲の異なるＭＷカットオフ値の孔径を有する膜を使用する透析濾過の工程。
（ｆ）（任意選択で）残留界面活性剤を除去する逆相クロマトグラフィの工程。
【００１８】
本発明の一実施態様において、清澄化工程に使用される界面活性剤は、０．０５〜１％の濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。別の実施態様において、混合相クロマトグラフィ処理は、活性化されたシリカゲル及び０．２５〜１ＭＮａＣｌ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液を溶出液として使用して実施される。
【００１９】
更に、本発明は、髄膜炎菌（ＮＭ）Ｂ群のサブユニットワクチンの大規模生産方法を提供する。本方法は、以下の工程を含む。
ｒＡｇ４７３リポタンパク質の発現を誘導するために、動物成分無含有培地を使用したバイオリアクターにおいて大腸菌宿主細胞（例えば、Ｃ４１（ＤＥ３））を発酵する工程。
１％の濃度の界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して、細胞膜からｒＡｇ４７３リポタンパク質を抽出する工程；酢酸により予め活性化されたシラン改質シリカ樹脂においてｒＡｇ４７３リポタンパク質抽出物を混合相クロマトグラフィ処理する工程。
０．５Ｎを超える濃度でＮａＣｌを添加することによりタンパク質を溶出させる工程。
ｐＨ値が３．０〜４．０の範囲である酢酸／リン酸塩緩衝液系によるカチオン性膜（例えば、ＰＡＬＬ社の０．８ｍｍのＭｕｓｔａｎｇＳ）クロマトグラフィの工程。
５を超えるｐＨ値の緩衝液系によるアニオン性膜（例えば、ＰＡＬＬ社の０．２２ｍｍのＭｕｓｔａｎｇＥ）クロマトグラフィの工程。
１０ｋＤａの孔径の膜を使用して透析濾過する工程。
４０〜６０％のアセトニトリルを含有する溶媒を使用して残留界面活性剤を除去し、６０〜９０％のアセトニトリルを含有する別の溶媒を使用して精製ｒＡｇ４７３タンパク質を溶出する逆相クロマトグラフィの工程。
【００２０】
下記の特定の実施例は、説明としてのみ解釈され、本開示の残りの部分に対して、多少なりとも限定的に解釈されるべきではない。更に詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用されている全ての出版物は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。更に、下記に提案されている任意の機構の工程は、特許請求された発明の範囲を多少なりとも限定しない。
【００２１】
＜実施例１＞：ｒＡｇ４７３リポタンパク質の精製のためのシリカ樹脂の調製
７５〜２００μｍのサイズ分布を有する医薬品等級のシリカ、ＰｈａｒｍＰｒｅｐ（登録商標）６０ＣＣ（ＭｅｒｃｋＧａＡ、ドイツ、カタログ番号１．０９３７３．１０００）を、対応する量のシラン（ジエチルアミノプロピルトリメトキシシラン、ＣＡＳ登録番号４１０５１−８０−３）で改質した。エタノールにおける一般的な無水反応を、シランに対するシリカの比が乾燥重量で計算して２．５を超える条件下で実施した。この反応は、１０リットルのエタノール（９５％）中２５０ｇのシリカ粒子、及び、密度がおよそ０．９３４ｇ／ｍｌである１００ｍｌのシランを用いて実施した。得られた混合物を、室温（ＲＴ）で１２時間インキュベートし、次に、新たなエタノールに代え、撹拌しながら更に１２時間保持した。この処理を２回繰り返した後、改質シリカをオートクレーブ内で１２０ｋｇｆ／ｃｍ2及び２ｋｇｆ／ｃｍ2で２０分間乾燥させた。
【００２２】
試験規模では、上記に記載された改質シリカゲル０．０５ｇをＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ、カタログ番号ＵＦＣ３０ＨＶ）に詰め、４００μｌの蒸留水で洗浄し、１２，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離した。流液を廃棄し、洗浄及び遠心分離工程を１回繰り返した。次に、シリカゲルを２００μｌの１％酢酸で洗浄し、１２，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離し、流液を廃棄した。その後、シリカゲルを４００μｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡にし、１２，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離し、流液を廃棄した。前処理（平衡化）工程を２回繰り返した。大規模（１，０００ｇ以上）では、シリカゲルを、ポンプ系を備えたクロマトグラフカラム、ＡｘｉＣｈｒｏｍ（登録商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＵＳＡ）に引き込んで、緩衝液の交換を実施した。
【００２３】
＜実施例２＞：大腸菌宿主細胞において過剰発現したｒＡｇ４７３の精製
動物成分無含有培地を使用し、プラスミドｐＥＴ９ａにおけるＡｇ４７３遺伝子を形質転換された大腸菌Ｃ４３（ＤＥ３）の５リットル規模発酵を実施して、前臨床研究用のワクチンとしてｒＡｇ４７３を産生した。このリポタンパク質は、１０５アミノ酸残基と、Ｎ末端アミノ酸としてのＮ−アシル−Ｓ−ジアシルグリセリル−Ｃｙｓとから構成される。その配列は、以下の通りである。
ＣＳＱＥＡＫＱＥＶＫＥＡＶＱＡＶＥＳＤＶＫＤＴＡＡＳＡＡＥＳＡＡＳＡＶＥＥＡＫＤＱＶＫＤＡＡＡＤＡＫＡＳＡＥＥＡＶＴＥＡＫＥＡＶＴＥＡＫＥＡＶＴＥＡＫＥＡＶＴＥＡＡＤＴＬＮＫＡＡＤＡＴＱＥＡＡＤＭＫＤＡＡＫ
【００２４】
発酵は、酵母抽出物を補充したＭ９規定培地で実施した。培養細菌を５Ｌ発酵槽においてＯＤ６００が８になるまで増殖させた。標的タンパク質の発現をラクトースにより誘導した（最終濃度は１％であった）。細胞を採取し、界面活性剤で細胞膜を破壊した後、上澄みを、５，０００ｒｐｍ、４°Ｃ、１０分間の遠心分離により得て、孔径０．２２μｍの膜で濾過し、以下の５工程の精製処理に付した。５工程のうち、工程（２）、（３）及び（４）は任意の順序で実施することができる。
【００２５】
５工程の精製処理を図１に示した。より詳細には、本処理は、以下の５工程を含んでいる。
（１）特定の濃度（例えば、好ましくは１％）の界面活性剤（この実験ではＴｒｉｔｏｎＸ−１０００）で大腸菌細胞膜を破壊して、ｒＡｇ４７３リポタンパク質を抽出し、膜による精密濾過で抽出物を清澄化する工程。
（２）溶出溶媒として０．５ＭＮａＣｌ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用し、上記の実施例１で述べられた方法で調製したシリカ樹脂を用いた、ｒＡｇ４７３リポタンパク質抽出物の混合相クロマトグラフィ工程。
（３）１％酢酸／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１×ＰＢＳ緩衝液で前処理したＰＡＬＬ社の０．８ｍｍのＭｕｓｔａｎｇＳ膜を使用したアニオン性膜クロマトグラフィ工程。
（４）ｐＨ７．４の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１×ＰＢＳ緩衝液で前処理したＰＡＬＬ社の０．２２μｍのＭｕｓｔａｎｇＥ膜を使用したアニオン性膜クロマトグラフィ工程。
（５）１０ｋＤａの膜孔径を有する濃縮膜による透析濾過の工程。
【００２６】
各工程の後の精製画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果は、工程（２）がｒＡｇ４７３リポタンパク質を有意に精製し、工程（３）〜（５）がそれを均質になるまで更に精製したことを示す。シリカゲルクロマトグラフィの溶出物における内毒素の含有量は、１，０００，０００ＥＵ／ｍｌ超から２００，０００ＥＵ／ｍｌ未満まで減少したことが見出され、大部分の内毒素がシリカゲルクロマトグラフィにより除去されたことが示唆された。
【００２７】
＜実施例３＞：精製ｒＡｇ４７３リポタンパク質の免疫原性の評価
精製ｒＡｇ４７３リポタンパク質の免疫原の特性をin vivoで評価するため、アッセイを実施して、多様な用量（０、５、１０、３０及び５０μｇ／ｍｌ）の精製ｒＡｇ４７３リポタンパク質で免疫化したマウスにおけるＡｇ４７３特異抗体反応の大きさを分析した。より詳細には、８〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５）を、最初に、ＰＢＳ中に処方された（またはＡＬＰＯ4アジュバントと共に処方された）０、５、１０、３０もしくは５０μｇ／ｍｌの精製ｒＡｇ４７３を用いて、皮下で免疫化した。同じ処方及び量の抗原を使用して、初回免疫の１４日後にマウスの皮下に追加免疫した。免疫血清を、追加免疫の２、３、４及び６週間後、尾静脈の出血により収集した。抗Ａｇ４７３抗体価をＥＬＩＳＡで決定した。簡潔には、マイクロタイタープレートをウエル１つあたり５０μｌのｒＡｇ４７３溶液（２ｇ／ｍＬ）で被覆した。結合ＩｇＧを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃで検出した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジンの添加により色を発生させ、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。吸光度０．２以上となった血清希釈を終点力価として定義した。
【００２８】
ＰＢＳ中の精製ｒＡｇ４７３リポタンパク質（またはＡＬＰＯ4アジュバントと共に処方されたｒＡｇ４７３リポタンパク質）により免疫化されたマウスは、ＰＢＳ又はＡＬＰＯ4アジュバントのみで免疫化された動物（０μｇ／ｍｌのｒＡｇ４７３の群）と比較したとき、検出可能なレベルの抗Ａｇ４７３ＩｇＧ抗体反応を誘発した。また、ＡＬＰＯ4アジュバントと共に処方された精製ｒＡｇ４７３リポタンパク質により免疫化されたマウスは、ＰＢＳ中の精製ｒＡｇ４７３リポタンパク質により免疫化されたマウスと比較して、はるかに高い力価の抗Ａｇ４７３抗体を生成した。
【００２９】
＜他の実施態様＞
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されているそれぞれの特徴を、同じ、同等又は同様の目的を果たす代替的特徴に代えることができる。したがって、特に明確に記述のない限り、開示されているそれぞれの特徴は、同等又は同様の特徴の一般的な一連の例にすぎない。
【００３０】
本発明の多数の実施態様が記載されているが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく多様な変更を行えることが理解される。したがって、他の実施態様も特許請求の範囲内である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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