(57)【要約】  心筋細胞損傷の臨床状態を診断するための、心筋細胞損傷のリスクを評価するためのまたは心筋細胞損傷の結果としての成果を予測するためのアッセイが開示される。イムノアッセイ方法およびキットは、試験試料中の複数の心筋細胞抗原を判定すること、および単一のアッセイ結果において複数の判定を組み合わせることによって、心筋細胞損傷の評価を提供する。
2013513108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心筋細胞損傷を試験試料から検出するためのイムノアッセイであって：
ａ）心筋細胞損傷が疑われる対象からの試験試料をｎ個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上の少なくともｎ個のエピトープに結合するｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）に接触させて、ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）（式中、ｎは１から１０の整数であり；ｎ´は２から１０の整数である。）を形成するステップ；
ｂ）ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体を含む前記化合物を、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上のｎ´´個のエピトープに結合するｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）に接触させて、ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数であり、抗体ＡおよびＢは、心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合する。）を形成するステップ；
ｃ）測定可能集合体の光学的、電気的、または状態変化シグナルを測定するステップ；ならびに
ｄ）ステップ（ｃ）の測定値が所定のレベルを超えるか否かを判定することによって心筋細胞損傷を検出するステップ；
を含むイムノアッセイ。
【請求項２】
請求項１に記載のイムノアッセイであって、前記心筋細胞抗原ａｎ´が、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ，ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｈＢＮＰ（ｌ−３２）を含む。）、心脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）から成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項３】
請求項１に記載のイムノアッセイであって、ｎ´＝２であり、前記心筋細胞抗原ａｎ´が、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ））であるイムノアッセイ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ａ＾n_an´、抗体Ｂ＾n´´_an´、または抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n´´_an´が、ヒト化抗体を含むイムノアッセイ。
【請求項５】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ｂ＾n´´_an´が、抗ヒトＩｇＧ抗体を含むイムノアッセイ。
【請求項６】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ｂ＾n´´_an´が、検出可能な標識に結合され、該検出可能な標識が、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンであるイムノアッセイ。
【請求項７】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記光学シグナルが、化学発光、蛍光、リン光、電気化学発光、紫外線吸収、可視吸収、赤外線吸収、屈折、表面プラズモン共鳴における心筋細胞抗原ａｎ´濃度依存性変化として測定されるイムノアッセイ。
【請求項８】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記電気シグナルが、電流、抵抗、電位、質量対電荷比、またはイオンカウントにおける心筋細胞抗原ａｎ´濃度依存性変化として測定されるイムノアッセイ。
【請求項９】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記状態変化シグナルが、サイズ、溶解度、質量または共鳴における心筋細胞抗原ａｎ´濃度依存性変化として測定されるイムノアッセイ。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ａ＾n_an´が、固相に固定されているイムノアッセイ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のイムノアッセイであって、前記固相が、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップから成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のイムノアッセイであって、前記試験試料が、全血、血清、または血漿であるイムノアッセイ。
【請求項１３】
対象における前記心筋細胞損傷を試験試料から検出するためのイムノアッセイであって：
ａ）心筋細胞損傷が疑われる対象からの試験試料を、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上の少なくともｎ個のエピトープに結合するｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）に接触させて、ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）（式中、ｎは１から１０の整数であり；ｎ´は２から１０の整数である。）を形成するステップ；
ｂ）ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体を含む前記化合物をｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上のｎ´´個のエピトープに結合するｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）に接触させて、ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数であり、抗体ＡおよびＢは、心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合し、ここで抗体Ｂは、少なくとも１つのアクリジニウム化合物を含む検出可能な標識で標識されている。）形成するステップ；
ｃ）過酸化水素源をステップ（ｂ）の混合物に発生させるまたは提供するステップ；
ｄ）ステップ（ｃ）の混合物に塩基性溶液を添加して光シグナルを発生させるステップ；
ｅ）ステップ（ｄ）によって発生したまたはステップ（ｄ）において放出された光シグナルを測定するステップ；および
ｆ）ステップ（ｅ）の測定値が所定のレベルを超えるか否かを判定することによって心筋細胞損傷を検出するステップ；
を含むイムノアッセイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のイムノアッセイであって、前記心筋細胞抗原ａｎ´が、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｈＢＮＰ（１−３２）を含む。）、心脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）から成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載のイムノアッセイであって、ｎ´＝２であり、前記心筋細胞抗原（ａｎ´）が、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）であるイムノアッセイ。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ａ＾n_an´、抗体Ｂ＾n´´_an´、または抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n´´_an´が、ヒト化抗体を含むイムノアッセイ。
【請求項１７】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ｂ＾n´´_an´が、抗ヒトＩｇＧ抗体を含むイムノアッセイ。
【請求項１８】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ａ＾n_an´が、固相に固定されているイムノアッセイ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のイムノアッセイであって、前記固相が磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップから成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項２０】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記試験試料が、全血、血清または血漿であるイムノアッセイ。
【請求項２１】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記アクリジニウム化合物が、式Ｉによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミド：
【化１】
2013513108.tif 000027
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され、ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。）
であるイムノアッセイ。
【請求項２２】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記アクリジニウム化合物が、式ＩＩによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステル：
【化２】
2013513108.tif 000028
（式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルであり；ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。）
であるイムノアッセイ。
【請求項２３】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ａ＾n_an´が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および親和性成熟抗体から成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項２４】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記抗体Ｂ＾n´´_an´が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および親和性成熟抗体から成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項２５】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記過酸化水素が、緩衝液または過酸化水素を含有する溶液を添加することによって提供されるイムノアッセイ。
【請求項２６】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、過酸化水素発生酵素を試験試料に添加することによって発生させることができるイムノアッセイ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のイムノアッセイであって、前記過酸化水素発生酵素が、（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパノアートオキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニレートオキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデラートオキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチネートデヒドロゲナーゼ、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリールアルコールオキシダーゼ、アリールアルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメート（Ｄ−アスパルテート）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシラートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタネートオキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−グルノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコラートオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチル−リジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、オキサラートオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プレトシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−ホスフェートシンターゼ、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノンシンターゼ、ピルベートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、サルファイトオキシダーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、ウレートオキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼおよびこれの組合せから成る群から選択されるイムノアッセイ。
【請求項２８】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、前記塩基性溶液が、少なくとも約１０のｐＨを有する溶液であるイムノアッセイ。
【請求項２９】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、ステップ（ｅ）の測定値が所定のレベルを超えるか否かを判定することによって心筋細胞損傷を検出するステップｆ）が、各心臓抗原ａの標準曲線の使用または各心臓抗原ａの参照標準への比較のどちらかによって、ステップ（ｅ）の光シグナルの量を試験試料中の心臓抗原ａおよびｂの量に関連付けることを含むイムノアッセイ。
【請求項３０】
請求項２９に記載のイムノアッセイであって、各心臓抗原ａｎ´の参照標準への比較を備え、各参照標準が抗イディオタイプ抗体を含むイムノアッセイ。
【請求項３１】
請求項２９に記載のイムノアッセイであって、各心臓抗原ａｎ´の参照標準への比較を備え、各参照標準が誘導体化心筋細胞抗原を含むイムノアッセイ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のイムノアッセイであって、前記誘導体化心筋細胞抗原が、ポリエチレングリコールによって誘導体化された前記心筋細胞抗原を含むイムノアッセイ。
【請求項３３】
請求項１３または１４に記載のイムノアッセイであって、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適合させたイムノアッセイ。
【請求項３４】
試験試料から心筋細胞損傷を検出するためのキットであって：
ａ）ｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）であって、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上の少なくともｎ個のエピトープに結合してｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎは１から１０の整数であり；およびｎ´は２から１０の整数である。）を形成する抗体（Ａ＾n_an´）；
ｂ）ｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）であって、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上のｎ´´個のエピトープに結合して、ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数であり、ならびに抗体ＡおよびＢは心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合する。）を形成する抗体（Ｂ＾n´´_an´）；および
ｃ）試験試料中の心筋細胞抗原（ａｎ´）の全量が所定を超えるか否かを判定するための説明書；
を含むキット。
【請求項３５】
請求項３４に記載のキットであって、前記心筋細胞抗原ａｎ´が、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドから成る群から選択され、前記第１の心臓特異性抗原および前記第２の心臓特異性抗原が異なる抗原であるキット。
【請求項３６】
請求項３４に記載のキットであって、ｎ´＝２であり、前記心筋細胞抗原（ａｎ´）が、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）であるイムノアッセイ。
【請求項３７】
請求項３４または３５に記載のキットであって、固相をさらに含み、前記抗体Ａ＾n_an´が、該固相に結合されているキット。
【請求項３８】
請求項３７に記載のキットであって、前記固相が、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップから成る群から選択されるキット。
【請求項３９】
抗体Ｂ＾n´´_an´に結合された検出可能な標識をさらに含む請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項４０】
請求項３９に記載のキットであって、前記検出可能な標識が、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンであるキット。
【請求項４１】
前記検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
請求項４１に記載のキットであって、前記アクリジニウム化合物が、式Ｉによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミド：
【化３】
2013513108.tif 000029
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され、ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。）
であるキット。
【請求項４３】
請求項４１に記載のキットであって、前記アクリジニウム化合物が、式ＩＩによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステル：
【化４】
2013513108.tif 000030
（式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルであり；ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。）
であるキット。
【請求項４４】
塩基性溶液をさらに含む、請求項４２または４３に記載のキット。
【請求項４５】
請求項４４に記載のキットであって、前記塩基性溶液が、少なくとも約１０のｐＨを有する溶液であるキット。
【請求項４６】
過酸化水素源をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
請求項４６に記載のキットであって、過酸化水素源が、緩衝液または過酸化水素を含有する溶液を含むキット。
【請求項４８】
請求項４７に記載のキットであって、前記過酸化水素源が、過酸化水素発生酵素を含むキット。
【請求項４９】
請求項４８に記載のキットであって、前記過酸化水素発生酵素が（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパノアートオキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニレートオキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデラートオキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチネートデヒドロゲナーゼ、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリールアルコールオキシダーゼ、アリールアルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメート（Ｄ−アスパルテート）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシラートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタネートオキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−グルノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコラートオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチル−リジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、オキサラートオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プレトシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−ホスフェートシンターゼ、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノンシンターゼ、ピルベートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、サルファイトオキシダーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、ウレートオキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼおよびこれの組合せから成る群から選択されるキット。
【請求項５０】
請求項３４または３５に記載のキットであって、前記検出抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体を含むキット。
【請求項５１】
少なくとも１つの心筋細胞抗原参照標準をさらに含む、請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項５２】
請求項５１に記載のキットであって、前記少なくとも１つの心筋細胞抗原参照標準が、抗イディオタイプ抗体を含むキット。
【請求項５３】
請求項５１に記載のキットであって、前記少なくとも１つの心筋細胞抗原参照標準が、誘導体化心筋細胞抗原を含むキット。
【請求項５４】
請求項５３に記載のキットであって、前記誘導体化心筋細胞抗原が、ポリエチレングリコールによって誘導体化された心筋細胞抗原を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、対象中の心筋細胞損傷を診断するアッセイおよびキットに、ならびに特に試験試料中の他の物質の存在による干渉の可能性も回避する、試験試料中の複数の心筋細胞抗原の存在を検出するための方法およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイ技法は、最近数十年にわたって公知であり、現在は生体試料中の標的検体を検出するために多種多様の診断目的で、医療において普通に使用されている。イムノアッセイは、標的検体である抗体の、抗体に対応する抗原への高度に特異的な結合を利用する。通例、抗体または抗原のどちらかの定量は、放射性標識または蛍光標識などのある形の標識によって達成される。サンドイッチイムノアッセイは、試料中の標的検体を（固体支持体に結合されていることが多い）抗体部位に結合すること、結合標識抗体を捕捉検体に結合すること、および次に結合した標識抗体の量を測定することを含み、標識抗体は検体が試料中に存在しない限り結合しないので、標識は標的検体の濃度に比例するシグナルを産生する。
【０００３】
臨床症状を診断するために現在利用可能なアッセイの中で、心筋細胞損傷から生じるリスクを評価し、または生じる成果を予測するのは、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｈＢＮＰ（１−３２）を含む。）、心脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の濃度を決定するアッセイである。通例、このようなアッセイは、患者からの試験試料に対して順次行われるイムノアッセイのパネルとして実施され、各検体の試験はこのため、各アッセイ結果のために時間、試料および試薬の体積の増加をさらに必要とする。検体の完全パネルのアッセイは、単一のベンダーからの単一のアッセイプラットフォームでは、または単一の検出技術によってさえ利用できないことが多く、このことによって患者の臨床状態の評価の複雑さが増大する。さらに個別におよび連続して行うとき、パネル中の任意の単一の検体の結果は信頼性がないかもしれない、つまり誤っているかもしれないし誤っていないかもしれない。個別のアッセイ結果の、たとえ誤っているとしても、どれが誤っているかを決定することは、困難であるかまたは実際的でない可能性があり、このため潜在的に矛盾する結果、従って矛盾する診断、リスクの評価または成果の予測がもたらされる。
【０００４】
２つの関連する抗原、心筋トロポニンＴおよび心筋トロポニンＩが例証的である。心筋トロポニンＩアッセイは、複数のベンダーからただちに商業的に入手できるが、心筋トロポニンＴアッセイは単一のベンダーＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに限定されており、このことは代替手段が利用できないことを意味する。さらにどちらのアッセイも、偽陽性および偽陰性結果の複数の報告によれば、精度の面で限界がある。（例えばＰ．Ｒ．Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．３２  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，１２５８−６１，（２００５）；Ｒ．Ｉ．Ｋｎｏｂｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２；１２６：６０６−９；Ａ．Ｎ．Ｍａｋａｒｙｕｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００７；３０：９２−４を参照のこと）。さらに理論ではどちらの心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＴも心筋細胞損傷に関連付けられているが、患者試料中の心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＴの判定のためのイムノアッセイは、時間の約１０％と相関できない。この不一致は、異なるアッセイ間の抗体配置の相違、他の生化学的な相違または分析によるものであり得る。
【０００５】
さらに循環抗原のためのこのようなイムノアッセイは、試験試料中に存在し得る他の物質、例えばヘテロ親和性内因性抗体および自己抗体からの干渉を受けやすいことが公知である。このような干渉は通例、問題のある試料を同定するための第２のアッセイを行うことによって対処されるが、このことは時間と費用がかかる。自己抗体の問題に対処するための別の手法は、自己抗体と反応する検体エピトープとは異なる特異性エピトープに結合する検体特異性抗体を選ぶことである。この一般的な手法に従って、自己抗体からの干渉を回避するために、２、３および４もの検体特異性抗体の数千の異なる組合せの使用を調査することに努力が注がれてきた。しかしこの努力は多くは成功していない。複合体タンパク質検体に対する自己抗体は特定の試料内でポリクローナルであるらしく、異なる個体からの試料の間ではなおさらに多様であり得ることが今や明らかである。多様なポリクローナル自己抗体からの干渉は、わずか２５％またはなお低い検体タンパク質配列が検体特異性抗体に結合するという観察結果を説明し得て、このことは次に、この手法の使用により成功がないことを説明し得る。
【０００６】
このため少なくとも上述の理由で、心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＴどちらか単独の、標準アッセイを使用する初期の試験は、ＭＩの発生にもかかわらず陰性であり得る、即ち偽陰性結果を提供し得る。心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＴについて利用可能なアッセイはＭＩの診断の適時性を改善しているが、これにもかかわらずＭＩ症状を有する多くの患者は、提示後数時間まで陽性と診断されない。その結果、処置の遅延や延期が重篤な結果をもたらす可能性がある。
【０００７】
心筋細胞損傷の検出を改善するこのような検出の適時性を含む新たなイムノアッセイ方法へのおよびまた試験試料中に存在し得るヘテロ親和性内因性抗体および自己抗体による干渉を補償する方法へのならびに特に検体検出を再設計せずにこのような結果を達成し、または抗体を捕捉するこのような方法への要求が当分野に存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐ．Ｒ．Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．３２  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，１２５８−６１，（２００５）
【非特許文献２】Ｒ．Ｉ．Ｋｎｏｂｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２；１２６：６０６−９
【非特許文献３】Ａ．Ｎ．Ｍａｋａｒｙｕｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００７；３０：９２−４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１態様において、本開示は対象における心筋細胞損傷を試験試料から検出するためのイムノアッセイを提供し、該イムノアッセイは：
ａ）心筋細胞損傷が疑われる対象からの試験試料を、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上の少なくともｎ個のエピトープに結合するｎ個の抗体［画像では
2013513108.tif 000003
は、Ａ＾n_an´で表現します。］（Ａ＾n_an´）に接触させて、ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）（式中、ｎは１から１０の整数であり；ｎ´は２から１０の整数である。）を形成するステップ；
ｂ）ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体を含む前記化合物を、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上のｎ´´個のエピトープに結合するｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）に接触させて、ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数であり、抗体ＡおよびＢは、心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合する。）を形成するステップ；
ｃ）測定可能集合体の光学的、電気的、または状態変化シグナルを測定するステップ；ならびに
ｄ）ステップ（ｃ）の測定値が所定のレベルを超えるか否かを判定することによって心筋細胞損傷を検出するステップ；
を含む。
【００１０】
心筋細胞抗原（ａｎ´）は、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｈＢＮＰ（１−３２）を含む。）、心脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）から成る群から選択することができる。イムノアッセイの例示的な実施形態において、ｎ´＝２であり、心筋細胞抗原（ａｎ´）は例えば、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ））である。抗体Ａ＾n_an´、抗体Ｂ＾n´´_an´、または抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n´´_an´はヒト化抗体を含むことができる。
【００１１】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ｂ＾n´´_an´は共有結合または非共有結合を通じて検出可能な標識、例えば酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンに結合することができる。光学シグナルは、化学発光、蛍光、リン光、電気化学発光、紫外線吸収、可視吸収、赤外線吸収、屈折、表面プラズモン共鳴における抗原（ａｎ´）濃度依存性変化として測定することができる。電気シグナルは、電流、抵抗、電位、質量対電荷比、またはイオンカウントにおける抗原（ａｎ´）濃度依存性変化として測定することができる。状態変化シグナルは、サイズ、溶解度、質量、または共鳴における抗原（ａｎ´）濃度依存性変化として測定することができる。
【００１２】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ｂ＾n´´_an´は抗ヒトＩｇＧ抗体と複合したヒト化抗体を含むことができ、前記抗ヒトＩｇＧ抗体は検出可能な標識にコンジュゲートされ、検出可能な標識は酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンである。
【００１３】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ａ＾n_an´を固相に固定することができる。固相は、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップから成る群から選択することができる。
【００１４】
別の態様において、本開示は対象における心筋細胞損傷を試験試料から検出するためのイムノアッセイを提供し、該イムノアッセイは：
ａ）心筋細胞損傷が疑われる対象からの試験試料を、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上の少なくともｎ個のエピトープに結合するｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）に接触させて、ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）（式中、ｎは１から１０の整数であり；ｎ´は２から１０の整数である。）を形成するステップ；
ｂ）ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体を含む前記化合物を、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上のｎ´´個のエピトープに結合するｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）に接触させて、ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数であり、抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n´´_an´は、心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合し、ここで抗体Ｂ＾n´´_an´は、少なくとも１つのアクリジニウム化合物を含む検出可能な標識で標識されている。）を形成するステップ；
ｃ）過酸化水素源をステップ（ｂ）の混合物に発生または提供するステップ；
ｄ）ステップ（ｃ）の混合物に塩基性溶液を添加して光シグナルを発生させるステップ；
ｅ）ステップ（ｄ）によって発生したまたはステップ（ｄ）において放出された光シグナルを測定するステップ；および
ｆ）ステップ（ｅ）の測定値が所定のレベルを超えるか否かを判定することによって心筋細胞損傷を検出するステップ；
を含む。
【００１５】
上のイムノアッセイにおいて、心筋細胞抗原（ａｎ´）は心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｈＢＮＰ（１−３２）を含む。）、心脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）から成る群から選択することができる。イムノアッセイの例示的な実施形態において、ｎ´＝２であり、心筋細胞抗原（ａｎ´）は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）である。抗体Ａ＾n_an´、抗体Ｂ＾n´´_an´、または抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n´´_an´はヒト化抗体を含むことができる。
【００１６】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ｂ＾n´´_an´は共有結合または非共有結合を通じて検出可能な標識、例えば酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、またはビオチンに結合することができる。光学シグナルは、化学発光、蛍光、リン光、電気化学発光、紫外線吸収、可視吸収、赤外線吸収、屈折、表面プラズモン共鳴における抗原（ａｎ´）濃度依存性変化として測定することができる。電気シグナルは、電流、抵抗、電位、質量対電荷比、またはイオンカウントにおける抗原（ａｎ´）濃度依存性変化として測定することができる。状態変化シグナルは、サイズ、溶解度、質量、または共鳴における抗原（ａｎ´）濃度依存性変化として測定することができる。
【００１７】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ｂ＾n´´_an´は抗ヒトＩｇＧ抗体と複合したヒト化抗体を含むことができ、前記抗ヒトＩｇＧ抗体は検出可能な標識にコンジュゲートされ、検出可能な標識は酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンである。
【００１８】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ａ＾n_an´を固相に固定することができる。固相は、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップから成る群から選択することができる。
【００１９】
上のイムノアッセイにおいて、アクリジニウム化合物は、式Ｉによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドであることができ：
【００２０】
【化１】
2013513108.tif 000004
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され、ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【００２１】
または上のイムノアッセイにおいて、アクリジニウム化合物は、式ＩＩによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルであることができ：
【００２２】
【化２】
2013513108.tif 000005
式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルであり；ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【００２３】
上のイムノアッセイにおいて、抗体Ａ＾n_an´は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および親和性成熟抗体から成る群から選択することができる。抗体Ｂ＾n´´_an´は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および親和性成熟抗体から成る群から選択することができる。
【００２４】
上のイムノアッセイにおいて、過酸化水素は、緩衝液または過酸化水素を含有する溶液を添加することによって提供することができる。過酸化水素は、例えば過酸化水素発生酵素を試験試料に添加することによって発生させることができる。過酸化水素発生酵素は：（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパノアートオキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニレートオキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデラートオキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチネートデヒドロゲナーゼ、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリールアルコールオキシダーゼ、アリールアルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメート（Ｄ−アスパルテート）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシラートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタネートオキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−グルノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコラートオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチル−リジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、オキサラートオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プレトシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−ホスフェートシンターゼ、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノンシンターゼ、ピルベートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、サルファイトオキシダーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、ウレートオキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼおよびこれの組合せから成る群から選択することができる。
【００２５】
上のイムノアッセイにおいて、塩基性溶液は少なくとも約１０のｐＨを有する溶液であることができる。
【００２６】
上のイムノアッセイにおいて、ステップ（ｅ）の測定値が所定のレベルを超えるか否かを判定することによって心筋細胞損傷を検出するステップｆ）は、各心筋細胞抗原ａｎ´の標準曲線の使用または各心筋細胞抗原ａｎ´の参照標準への比較のどちらかによって、ステップ（ｅ）の光シグナルの量を試験試料中の心筋細胞抗原ａｎ´の量に関連付けることを含む。各心筋細胞抗原ａｎ´の参照標準は、抗イディオタイプ抗体を含むことができる。参照標準は、誘導体化心筋細胞抗原、例えばポリエチレングリコールによって誘導体化された心筋細胞抗原を含むことができる。
【００２７】
上のイムノアッセイのいずれも、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適合させることができる。
【００２８】
上のイムノアッセイのいずれにおいても、試験試料は全血、血清、または血漿であることができる。
【００２９】
別の態様において、本開示は試験試料から心筋細胞損傷を検出するためのキットを提供し、該キットは：ｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）であって、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上の少なくともｎ個のエピトープに結合して、ｎ´個の（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）（式中、ｎは１から１０の整数であり；およびｎ´は２から１０の整数である。）を形成するｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）；ならびにｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）であって、ｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）上のｎ´´個のエピトープに結合して、ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）（式中、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ならびにｎ´は２から１０の整数であり、ならびに抗体ＡおよびＢは、心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合する。）を形成するｎ´´個の抗体（Ｂ＾n´´_an´）、ならびに試験試料中の心臓抗原（ａｎ´）の全量が所定のレベルを超えるか否かを判定するための説明書を含む。キットにおいて、心筋細胞抗原（ａｎ´）は、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドから成る群から選択することができ、第１の心臓特異性抗原および第２の心臓特異性抗原は異なる抗原である。キットの例示的な実施形態において、ｎ´＝２であり、心筋細胞抗原（ａｎ´）は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）である。
【００３０】
上のキットは固相をさらに含み得て、抗体Ａ＾n_an´は固相に結合されている。固相は、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップから成る群から選択することができる。
【００３１】
上のキットは、抗体Ｂ＾n´´_an´が共有結合または非共有結合を通じて結合されている、検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンであることができる。
【００３２】
キットのある実施形態において、検出可能な標識はアクリジニウム化合物であることができる。アクリジニウム化合物は、式Ｉによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドであることができ：
【００３３】
【化３】
2013513108.tif 000006
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され、ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【００３４】
または上のキットにおいて、アクリジニウム化合物は、式ＩＩによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルであることができ：
【００３５】
【化４】
2013513108.tif 000007
式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルであり；ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【００３６】
キットは、塩基性溶液、例えば少なくとも約１０のｐＨを有する溶液をさらに含み得る。キットは過酸化水素源をさらに含み得る。過酸化水素源は、緩衝液または過酸化水素を含有する溶液を含むことができる。過酸化水素源は、過酸化水素発生酵素を含むことができる。過酸化水素発生酵素は：（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパノアートオキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニレートオキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデラートオキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチネートデヒドロゲナーゼ、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリールアルコールオキシダーゼ、アリールアルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメート（Ｄ−アスパルテート）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシラートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタネートオキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−グルノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコラートオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチル−リジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、オキサラートオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プレトシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−ホスフェートシンターゼ、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノンシンターゼ、ピルベートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、サルファイトオキシダーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、ウレートオキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼおよびこれの組合せから成る群から選択することができる。
【００３７】
上のキットにおいて、抗体Ａ＾n_an´、抗体Ｂ＾n´´_an´、または抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n´´_an´はヒト化抗体を含むことができる。キットの例示的な実施形態において、抗体Ｂ＾n´´_an´は抗ヒトＩｇＧ抗体を含む。
【００３８】
上のキットは、１つ以上の心臓抗原の参照標準をさらに含み得る。心臓抗原の参照標準は、抗イディオタイプ抗体を含むことができる。各心臓抗原の参照標準は、誘導体化心臓抗原、ポリエチレングリコールによって誘導体化された心臓抗原を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】検出および捕捉抗体の異なる組合せの用量応答のグラフである。
【図２】ヒト心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）のアミノ酸配列である。
【図３】ｃＴｎＴ自己抗体エピトープの頻度プロットである。
【図４】マウス抗心筋トロポニンＴ  Ｍ８０２０２０７のエピトープマップである。
【図５】マウス抗心筋トロポニンＴ  １Ｃ１１のエピトープマップである。
【図６】ヒト心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）のアミノ酸配列である。
【図７】ヒト心筋トロポニンＩ自己抗体に見出される反応性心筋トロポニンＩエピトープの頻度を示す。
【図８】モノクローナル１９Ｃ７のエピトープマップである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、試験試料から対象における心筋細胞損傷を検出するための改良アッセイを提供する。アッセイは、心筋細胞損傷に関連する臨床状態を診断するために、リスクを評価するために、または成果を予測するために有用である。開示したイムノアッセイ方法およびキットにより、心筋細胞損傷を心筋細胞死の程度までも診断することができる。さらにイムノアッセイ方法およびキットは、対象からの試験試料に基づく心筋細胞損傷を検出するためにとりわけ有用であり、該試験試料は、心臓損傷インジケータの判定を、特にこのような判定が単一のアッセイ結果として報告される場合に干渉し得る他の物質も含有し得る。対照的に、本明細書で開示する方法およびキットは、心筋細胞損傷の少なくとも２つの異なるインジケータからの結果を組み合わせて、シグナルを単一の結果として報告することによって心筋細胞損傷のアッセイを強化する新たな手法を提供するものであり、この場合のインジケータは心筋細胞抗原である。異なる心筋細胞抗原の判定からの結果は、連続的または同時に行うことができる。
【００４１】
このため本開示は、心筋細胞損傷の単一インジケータに基づく方法、例えば心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）単独の、または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）単独の判定に依存する方法よりも分析および臨床感受性が向上した方法およびキットを提供する。従って、本発明で開示された方法およびキットは、ＭＩのより信頼性の高い診断、リスク層別化および予後を提供する。方法およびキットは、心臓病状、例えばうっ血性心不全、急性冠不全症候群、心筋梗塞、心筋炎などにおよび腎臓病、腎臓傷害などにも罹患している患者の診断およびケアに有用である。
【００４２】
該方法は一部は、特異性を改善するための１を超える捕捉相抗体および１を超える検出抗体の使用に基づいている。本アッセイの手法は、検体特異性検出抗体または捕捉抗体を再設計することなく、他の物質、例えばヘテロ親和性内因性抗体および試験試料中に存在し得る自己抗体の存在も補償して、問題のある試料を同定するための第２のアッセイの必要を回避する。さらに該方法は、ヘテロ親和性抗体の干渉を克服するためのヒト化免疫試薬の使用を提供する。抗ヒトＩｇＧ検出抗体の使用は内因性自己抗体を補正し、ヒト化免疫試薬と併せて使用されるときには、「万能」シグナル発生物質を提供する。誘導体化心筋細胞抗原もアッセイ標準化に好適な参照標準として記載されている。
【００４３】
Ａ．定義
本節および本明細書の開示全体で使用するような節の見出しは、限定するものではない。
【００４４】
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書の数値範囲の列挙では、同じ程度の精度を有するこの間に介在する各数は、明示的に検討される。例えば範囲６から９では、数７および８が６および９に加えて検討され、範囲６．０から７．０では、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に検討される。
【００４５】
ａ）アシル（および他の化学構造基の定義）
本明細書で使用する場合、「アシル」という用語は、Ｒａが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである−Ｃ（Ｏ）Ｒａ基を指す。アシルの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、ホルミル、アセチル、シクロヘキシルカルボニル、シクロヘキシルメチルカルボニル、ベンゾイル、ベンジルカルボニルなどを含む。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は２から１０個の炭素を含有し、２個の水素の除去により形成された少なくとも１個の炭素間２重結合を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルケニルの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニルおよび３−デセニルを含む。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は１から１０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルを含む。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「アルキル基（ｒａｄｉｃａｌ）」という用語は、直鎖または分枝鎖炭化水素に由来する一般式ＣｎＨ２ｎ＋１の一連の１価基のいずれかを意味する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を通じて親分子基部分に付加された、本明細書で定義するようなアルキル基を意味する。アルコキシの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシおよびヘキシルオキシを含む。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「アルキニル」という用語は２から１０個の炭素原子を含有し、少なくとも１個の炭素間３重結合を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。アルキニルの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニルおよび１−ブチニルを含む。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「アミド」という用語は、カルボニル基（ここで「カルボニル基」という用語は−Ｃ（Ｏ）−基を指す。）を通じて親分子基部分に結合されたアミノ基を指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「アミノ」という用語は、ＲｂおよびＲｃが独立して、水素、アルキルおよびアルキルカルボニルから成る群から選択される−ＮＲｂＲｃを意味する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「アラルキル」という用語は、本明細書に定義するように、アルキル基を通じて親分子基部分に付加されたアリール基を意味する。アリールアルキルの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピルおよび２−ナフタ−２−イルエチルを含む。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、フェニル基、または縮合環の１個以上がフェニル基である２環式もしくは３環式縮合環系を意味する。２環式縮合環系は、シクロアルケニル基、シクロアルキル基、または別のフェニル基に縮合されたフェニル基によって例示される。３環式縮合環系は、本明細書で定義するようなシクロアルケニル基、シクロアルキル基または別のフェニル基に縮合された２環式縮合環系によって例示される。アリールの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、アントラセニル、アズレニル、フレオニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニルおよびテトラヒドロナフチルを含む。本開示のアリール基は、アルコキシ、アルキル、カルボキシル、ハロおよびヒドロキシルから成る群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基によって場合により置換することができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「カルボキシ」または「カルボキシル」という用語は、−ＣＯ２Ｈまたは−ＣＯ２を指す。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「カルボキシアルキル」という用語は、ｎが１から１０である、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈまたは−（ＣＨ２）ｎＣＯ２−基を指す。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「シアノ」という用語は−ＣＮ基を意味する。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「シクロアルケニル」という用語は、３から１０個の炭素原子および１から３個の環を有する非芳香族環式または２環式環系を指し、ここで各５員環は１個の２重結合を有し、各６員環は１または２個の２重結合を有し、各７および８員環は１から３個の２重結合を有し、ならびに各９から１０員環は１から４個の２重結合を有する。シクロアルケニル基の代表的な例は、シクロヘキセニル、オクタヒドロナフタレニル、ノルボルニレニルなどを含む。シクロアルケニル基は、アルコキシ、アルキル、カルボキシル、ハロおよびヒドロキシルから成る群から独立して選択される１、２、３、４または５個の置換基によって場合により置換することができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、１から１２個の炭素原子を有する飽和単環式、２環式、または３環式炭化水素環系を指す。シクロアルキル基の代表的な例は、シクロプロピル、シクロペンチル、ビシクロ［３．１．１］ヘプチル、アダマンチルなどを含む。本開示のシクロアルキル基は、アルコキシ、アルキル、カルボキシル、ハロおよびヒドロキシルから成る群から独立して選択される１、２、３、４または５個の置換基によって場合により置換することができる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「シクロアルキルアルキル」という用語は、Ｒｄがアルキレン基であり、Ｒｅがシクロアルキル基である−ＲｄＲｅ基を意味する。シクロアルキルアルキル基の代表的な例は、シクロヘキシルメチルなどである。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「ハロゲン」という用語は、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−Ｆを意味する；「ハライド」という用語は、一方の部分がハロゲン原子であり、他方の部分がハロゲンよりも電気陰性が低い元素または基（ｒａｄｉｃａｌ）、例えばアルキル基（ｒａｄｉｃａｌ）である、２元化合物を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨ基を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ニトロ」という用語は−ＮＯ２基を意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「オキソアルキル」という用語は、Ｒａが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルであり、ｎが１から１０である−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒａを指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「フェニルアルキル」という用語は、フェニル基によって置換されているアルキル基を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「スルホ」という用語は−ＳＯ３Ｈ基を意味する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「スルホアルキル」という用語は、ｎが１から１０である、−（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈまたは−（ＣＨ２）ｎＳＯ３−基を指す。
【００６８】
ｂ）アニオン
本明細書で使用する場合、「アニオン」という用語は、無機酸または有機酸、例えばこれに限定されるわけではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、マンデル酸、フマル酸、乳酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ホスフェート、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸およびフルオロスルホン酸ならびにこれのいずれかの組合せのアニオンを指す。
【００６９】
ｃ）抗体
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１個以上のポリペプチドから成るタンパク質を指し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびこれのフラグメント、ならびに免疫グロブリン遺伝子配列から作られた分子を包含する。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのどちらかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これは次に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。ここに示すように、表記形式「Ａ＾n_an´」は抗原ｎ´上のエピトープｎに結合する抗体を示すものである。例えばＡ＾1_a1は抗原ａ１上の１個のエピトープに結合する抗体であり得て、抗原ａ１は心筋トロポニンＩであり、Ａ＾1_a2は抗原ａ２上の１個のエピトープに結合する抗体であり得て、抗原ａ２は心筋トロポニンＴである。
【００７０】
ｄ）過酸化水素発生酵素
本明細書で使用する場合、「過酸化水素発生酵素」という用語は、反応生成物として分子式Ｈ２Ｏ２を有する化学化合物、即ち過酸化水素を産生することができる酵素を指す。過酸化水素発生酵素の非制限的な例を下の表Ａ−１に挙げる。
【００７１】
【表１】
2013513108.tif 000008
2013513108.tif 000009
2013513108.tif 000010
【００７２】
ｅ）自己抗体
本明細書で使用する場合、「自己抗体」という句は、抗体が産生された対象において内因的に産生された、検体に結合する抗体を指す。
【００７３】
ｆ）ｎ´個（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体
本明細書で使用する場合、「ｎ´個（ｎ−抗体：抗原）免疫複合体」は、ｎ個の抗体Ａおよびｎ´個の心筋細胞抗原の組合せを指し、該抗体および抗原は、各抗体の少なくとも１つの抗原結合部位とｎ´個の心筋細胞抗原ａｎ´それぞれの少なくとも１つのエピトープとの間の特異性非共有相互作用によって結合され、ｎは１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数である。ここに示すように、表記形式（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´  ）は、２個以上の抗体：抗原免疫複合体を示すものである。例えば（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a1）（ａ１）は第１の抗体：抗原免疫複合体であり、Ａ＾1_a1は抗原ａ１上の１個のエピトープに結合する第１の抗体であり、場合によりＡ＾2_a1は抗原ａ１上の第２のエピトープに結合する第２の抗体であり、抗原ａ１のｎ番目のエピトープに結合するｎ番目のｎ抗体であるＡ＾n_a1まで同様であり、抗原ａ１は心筋トロポニンＩである；および（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２）は第２の抗体：抗原免疫複合体であり、Ａ＾1_a2は抗原ａ２上の１個のエピトープに結合する第１の抗体であり、場合によりＡ＾2_a2は抗原ａ２上の第２のエピトープに結合する第２の抗体であり、抗原ａ２上のｎ番目のエピトープに結合するｎ番目の抗体であるＡ＾n_a2まで同様であり、抗原ａ２は心筋トロポニンＴである。
【００７４】
ｇ）ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体
本明細書で使用する場合、「ｎ´個の（（ｎ＋ｎ´´）抗体：抗原）測定可能集合体」という用語は、ｎ´個の（ｎ＋ｎ´´）測定可能な抗体：抗原免疫複合体を形成するための、ｎ個の抗体Ａ、ｎ´´個の抗体Ｂおよびｎ´個の心筋細胞抗原の組合せを指し、ｎおよびｎ´´は独立して、１から１０の整数であり、ｎ´は２から１０の整数であり、抗体ＡおよびＢは心筋細胞抗原の（ｎ＋ｎ´´）個の異なるエピトープに結合する。抗体および心筋細胞抗原の組合せは、検出および定量することができる光学、電気、または状態変化シグナルを産生し、このため組合せは「測定可能」である。ここに示すように、表記形式（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）は、２個以上の抗体：抗原測定可能集合体を示すものである。例えば（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１）は、第１の測定可能集合体であり、式中、Ａ＾1_a1は抗原ａ１上の１個のエピトープに結合する第１の抗体であり、および場合によりＡ＾2_a1は抗原ａ１上の第２のエピトープに結合する第２の抗体であり、抗原ａ１上のｎ番目のエピトープに結合するｎ番目の抗体であるＡ＾n_a1まで同様であり、ならびにＢ＾1_a1は抗原ａ１上の１個のエピトープに結合する第１の抗体であり、および場合によりＢ＾2_a1は抗原ａ１上の第２のエピトープに結合する第２の抗体であり、抗原ａ１上のｎ番目のエピトープに結合するｎ番目の抗体であるＢ＾n_a1まで同様であり、抗原ａ１は心筋トロポニンＩである；ならびに（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２）は第２の測定可能集合体であり、式中、Ａ＾1_a2は抗原ａ２上の１個のエピトープに結合する第１の抗体であり、場合によりＡ＾2_a2は抗原ａ２上の第２のエピトープに結合する第２の抗体であり、抗原ａ２上のｎ番目のエピトープに結合するｎ番目の抗体であるＡ＾n_a2まで同様であり、ならびにＢ＾1_a2は抗原ａ２上の１個のエピトープに結合する第１の抗体であり、場合によりＢ＾2_a2は抗原ａ２上の第２のエピトープに結合する第２の抗体であり、抗原ａ２上のｎ番目のエピトープに結合するｎ番目の抗体であるＢ＾n_a2まで同様であり、抗原ａ２は心筋トロポニンＴである。
【００７５】
ｈ）検出可能な標識
本明細書で使用する場合、「検出可能な標識」という用語は、基部分に結合された１個または複数の分子の状況の変化の光学、電気または他の物理的指標を介して測定可能信号を発生するいずれの基部分も指す。このような物理的インジケータは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁的、放射化学的および化学的手段、例えばこれに限定されるわけではないが、蛍光、化学蛍光、化学発光、などを包含する。好ましい検出可能な標識は、アクリジニウム化合物、例えば本明細書の下のＢ節で述べるような式Ｉによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシミド、および本明細書の下のＢ節でまた述べるような式ＩＩによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルを含む。
【００７６】
ｉ）対象
本明細書で使用する場合、「対象」および「患者」という用語は、対象がいかなる形態であれ治療を過去または現在受けているかどうかにかかわらず、互換的に使用される。本明細書で使用する場合、「１つまたは複数の対象」という用語は、これに限定されるわけではないが、哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長動物（例えばサル、例えばカニクイザル、チンパンジーなど）およびヒト）を含むいずれの脊椎動物も指す。好ましくは、対象はヒトである。
【００７７】
ｊ）試験試料
本明細書で使用する場合、「試験試料」という用語は概して、興味のある検体について試験され、および／または興味のある検体を含有することが疑われ、興味のある１つまたは複数の検体に対する自己抗体も含み得る生体材料を指す。生体材料は、いずれの生体源からも由来し得るが、好ましくは心筋細胞抗原を含有していると思われる生体液である。生体材料の例は、これに限定されるわけではないが、便、全血、血清、血漿、赤血球、血小板、間質液、唾液、眼内レンズ液、脳脊髄液、汗、尿、腹水、粘液、鼻汁、痰、滑液、腹膜水、膣液、月経、羊水、精液、汚物などを含む。試験試料は、生体源から得たまま直接または試料の特徴を調節するための前処置の後に使用され得る。例えばこのような前処置は、血液から血漿の調製、粘液の希釈などを含み得る。前処置の方法は、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害構成要素の不活性化、試薬の添加、溶解なども含み得る。前処置のこのような方法が試験試料に関して用いられる場合、このような前処置方法は、未処置試験試料（例えば即ちいずれのこのような前処置方法も受けていない試験試料）中の濃度に比例する濃度で試験試料中に残存するようになっている。
【００７８】
Ｂ．試験試料中の心筋細胞抗原を検出するためのイムノアッセイ
本開示は、心筋細胞抗原の免疫検出を妨害し得る他の物質を含有し得る試験試料での使用のために特に有用な試験試料中の心筋細胞抗原を検出するためのイムノアッセイに関する。このような物質は、例えばヘテロ親和性内因性抗体、および心筋細胞抗原に対する自己抗体を含む。本開示のイムノアッセイは、対象から試験試料を得ること、および次に、試料中に存在し得るいずれのこのような物質の存在も補償しながら、免疫検出を使用して心筋細胞抗原の存在を検出することを包含する。このことは一部は、ｎ´個の抗体：抗原免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）を形成するためのｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）に結合するｎ個の抗体（Ａ＾n_an´）およびｎ´個の抗体：抗原免疫複合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）の測定可能集合体を形成するためのｎ´個の心筋細胞抗原（ａｎ´）に結合するｎ´´個の抗体（Ｂ＾n_an´´）を提供することによって達成され、式中、各心筋細胞抗原ａｎ´は独立して少なくとも２個のエピトープを備え、抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n_an´´は抗原ａｎ´上のｎ個の異なるエピトープに結合し、ｎは１から１０の整数である。言い換えれば、ｎ個の抗体Ａ＾n_an´はそれぞれ心筋細胞抗原ａｎ上の少なくとも１個のエピトープに結合して、ｎ個の抗体Ｂｎはそれぞれ、ｎ個の抗体Ａ＾n_an´ｂのいずれかが結合するエピトープのいずれとも異なる心筋細胞抗原ａｎ上の少なくとも１個のエピトープに結合する。抗体Ｂ＾n_an´は例えば、検出可能な標識で標識された「検出抗体」であることができる。抗体は、固体支持体であることができる固相上に提供することができ、固体支持体上に例えば抗体Ａ＾n_an´またはＢ＾n_an´が固定される。
【００７９】
イムノアッセイ方法
本開示のイムノアッセイ方法は、多種多様の形式のいずれでも行うことができる。イムノアッセイの総説は、これの全体が参照により本明細書に組み入れられている、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＶＯＬＵＭＥ  ３７：ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｓａｉ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、およびＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ７ＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．（１９９１）で入手できる。代表的な異種サンドイッチイムノアッセイは（固体支持体としての）固相を用い、この上に抗原である興味のある検体上の少なくとも１個のエピトープと反応性の第１の（捕捉）抗体が結合される。第２の（検出）抗体も、抗原である興味のある検体上の少なくとも１個のエピトープと反応性である。第２の抗体は、検出抗体が捕捉検体に結合した後に測定されるシグナルを提供する検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。検体を含有する試験試料が第１の抗体と接触するとき、第１の抗体は興味のある検体を捕捉する。興味のある検体を第２の抗体に接触させると、第１の抗体、興味のある検体および第２の抗体から成る免疫検出複合体の形成がもたらされ、該複合体は固相に結合される。第２の（検出）抗体によって発生したシグナルは、免疫検出複合体の形成速度（ｋ１）対免疫検出複合体の解離速度（ｋ２）によって決定されるような、興味のある検体の濃度に比例する。ヘテロ親和性内因性抗体および任意の自己抗体は、存在する場合興味のある検体上でこれらが結合する正確な箇所について予測不可能であり、第１のおよび／または第２の抗体の結合を、このように得られたシグナルを実質的に妨害することが可能である。
【００８０】
公知のイムノアッセイとは対照的に、本開示のイムノアッセイは、心筋細胞抗原である、興味のある少なくとも２つの検体の免疫検出結果を組み合わせることに基づいている。心筋細胞抗原ａは、抗原のインビボレベルの上昇と心筋細胞損傷との間に関連が確立されている任意の抗原であることができる。公知のこのような抗原は例えば、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、クレアチンホスホキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｈＢＮＰ（１−３２）を含む。）、心脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む。イムノアッセイの例示的な実施形態において、２つの心筋細胞抗原が使用され、これは例えばトロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）である。
【００８１】
また代表的なイムノアッセイ形式と対照的に、および本明細書の別の箇所に記載するように、本開示の例示的な実施形態によるイムノアッセイは、多重抗体Ａ＾n_an´および多重抗体Ｂ＾n_an´を用い、各抗体Ａ＾n_an´は、抗体Ｂ＾n_an´が結合するエピトープのいずれとも異なる心筋細胞抗原ａｎ´上の少なくとも１個のエピトープに結合する。多重抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n_an´の使用により（Ａ＾n_an´およびＢ＾n_an´は、いずれかの心筋細胞抗原ａｎ´上の同じエピトープに対する結合特異性の欠如によって区別される。）、検出の特異性が改善され、シグナルの品質が、ゆえに心筋細胞損傷に関するこれの精度が改善され、任意のヘテロ親和性内因性抗体および／または自己抗体の存在の存在による非特異性結合からのシグナル中のノイズも減少される。抗体Ｂ＾n_an´によって発生したシグナルは、ｎ´個の心筋細胞抗原ａｎ´の合せた濃度になお比例しているが、新たな免疫検出複合体の解離速度に対する新たな免疫検出複合体：（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）の形成速度によって決定される。このため１個を超える抗体Ａ＾n_an´および１個を超える抗体Ｂ＾n_an´の使用により、特異性結合から各心筋細胞抗原ａｎ´へのシグナルを上昇させることによって、イムノアッセイの精度が改善される。該方法はヒト化免疫試薬の使用も提供し、これにより試験試料中に存在し得るヘテロ親和性抗体からのいずれの干渉も克服される。さらに抗ヒトＩｇＧ抗体は、各心筋細胞抗原ａｎ´に対する内因性自己抗体を修正するために抗体Ｂ＾n_an´に使用することができる。さらにヒト化免疫試薬と併せて使用すると、抗ヒトＩｇＧは「万能」シグナル発生物質を提供する。誘導体化心筋細胞抗原、例えば誘導体化心筋トロポニンＩまたは誘導体化心筋トロポニンＴを使用して、アッセイ標準化に好適な可溶性試薬を提供することができる。例えば心筋細胞抗原は、ポリエチレングリコールによって好適に誘導体化することができる。
【００８２】
このため一実施形態により、少なくとも２個の心筋細胞抗原心筋細胞抗原ａｎ´の存在を検出するための本開示のイムノアッセイは、固相を用いることができる異種アッセイであり、固相は固体支持体であることができる。イムノアッセイは例えば１個以上の抗体（Ａ＾1_a1），（Ａ＾2_a1），…（Ａ＾n_an´）を固相に固定することによって行うことができ、ここで各抗体Ａ＾n_an´は、心筋細胞抗原ａｎ´上の少なくとも１つのエピトープと反応性である外因性抗体である。各抗体Ａ＾n_an´のａｎ´への特異性結合に十分な条件下で、心筋細胞抗原（ａ１），（ａ２），…（ａｎ´）を含有することが疑われ、他の干渉物質を含有し得るまたは含有し得ない試験試料は抗体（Ａ＾1_a1），（Ａ＾2_a1），…（Ａ＾n_an´）と接触して、このため免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）を形成する。免疫複合体（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1）（ａ１），（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2）（ａ２），…（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´）（ａｎ´）は抗体（Ｂ＾1_a1），（Ｂ＾2_a1），…（Ｂ＾n_an´）と接触して、ｎ´個の抗体：抗原免疫複合体の測定可能集合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）を形成し、ここで各心筋細胞抗原ａｎ´は独立して少なくとも２個のエピトープを備え、抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n_an´は抗原ａｎ´上のｎ個の異なるエピトープに結合し、ｎ´は２から１０の整数である。本ステップは、試験試料中に存在する心筋細胞抗原ａｎ´のいずれかへの抗体Ｂ＾n_an´の特異性結合に十分な条件下で行われる。
【００８３】
「測定可能集合体」とは、物理的検出および／または定量に感受性であるシグナルを発生する分子の配置を意味する。例えばある実施形態において、抗体Ｂ＾n_an´は検出可能な標識によって標識され得る。検出手法に応じて、集合体の光学的、電気的、または状態変化シグナルを測定する。さらに抗ヒトＩｇＧ抗体を抗体の検出に使用することができ、これにより心筋細胞抗原ａｎ´に対する内因性自己抗体が修正される。
【００８４】
イムノアッセイは例証目的で一連のステップを含めて上に記載されているが、試験試料は抗体Ａおよび検出抗体Ｂと同時にまたは順次、任意の順序で接触され得る。
【００８５】
本開示によるサンドイッチイムノアッセイの１つの形式において、検出することは、ｎ´個の抗体：抗原免疫複合体（（Ａ＾1_a1）（Ａ＾2_a1）…（Ａ＾n_a1））（（Ｂ＾1_a1）（Ｂ＾2_a1）…（Ｂ＾n_a1））（ａ１），（（Ａ＾1_a2）（Ａ＾2_a2）…（Ａ＾n_a2））（（Ｂ＾1_a2）（Ｂ＾2_a2）…（Ｂ＾n_a2））（ａ２），…（（Ａ＾1_an´）（Ａ＾2_an´）…（Ａ＾n_an´））（（Ｂ＾1_an´´）（Ｂ＾2_an´´）…（Ｂ＾n_an´´））（ａｎ´）である固相固定免疫検出複合体からシグナルを検出することを含む。一実施形態において、免疫検出複合体は通例洗浄によって固相から分離され、結合標識からのシグナルが検出される。本開示によるサンドイッチイムノアッセイの別の形式において、免疫検出複合体は固相固定複合体として残存し、次に検出される。
【００８６】
抗体
本開示によるイムノアッセイにおいて、各抗体Ａ＾n_an´は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、親和性成熟抗体または抗体フラグメントであることができる。同様に各抗体Ｂ＾n_an´は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、親和性成熟抗体または抗体フラグメントであることができる。
【００８７】
モノクローナル抗体は検体／抗原に対して高度に特異性であるが、ポリクローナル抗体は好ましくは、可能な限り多くの検体／抗原を固定するために抗体Ａ＾n_an´として使用することができる。検体／抗原に対して本質的により高い結合特異性を有するモノクローナル抗体は次に、各抗体Ｂ＾n_an´に使用され得る。いずれにせよ抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n_an´は各心筋細胞抗原ａｎ´上の重複していないエピトープを認識し、例示的な実施形態においては、それぞれ他方の結合に干渉せずに、各心筋細胞抗原上の異なるエピトープに同時に結合することができる。
【００８８】
ポリクローナル抗体は、免疫原を好適な非ヒト哺乳動物（例えばマウスまたはウサギ）に注射（例えば皮下または筋肉内注射）することによって産生される。概して、免疫原は標的抗原に対して比較的高い親和性を有する抗体の高い力価の産生を誘発すべきである。
【００８９】
所望ならば、心筋細胞抗原は、当分野で周知であるコンジュゲーション技法によって担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。普通に使用される担体は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドを含む。次にコンジュゲートは、動物を免疫化するために使用される。
【００９０】
次に、動物から採取された血液試料より抗体が得られる。ポリクローナル抗体を産生するために使用する技法は、文献に広範囲にわたって記載されている（例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  Ｗｉｔｈ  Ｓｍａｌｌ  Ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ」，Ｌａｎｇｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９８１）を参照のこと）。動物によって産生されたポリクローナル抗体は、標的抗原が結合されているマトリックスへの結合およびこれからの溶離によってさらに精製することができる。当業者には、ポリクローナルならびにモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための、免疫学分野で一般的な各種の技法が公知となる（例えばＣｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｕｎｉｔ  ９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと）。
【００９１】
多くの用途でモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が好ましい。ハイブリドーマ分泌ｍＡｂの産生に使用される一般的な方法は周知である（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５）。簡潔には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載されるように、該技法は、黒色腫、奇形癌または子宮頸癌、神経膠腫または肺癌のいずれかを有する別々の癌患者５名の局所流入リンパ節からリンパ球を単離すること（試料を外科標本より得た場合）、細胞をプールすること、および細胞をＳＨＦＰ−１と融合することを伴う。ハイブリドーマを癌株化細胞に結合した抗体の産生についてスクリーニングした。ｍＡｂ間の特異性の確認は、興味のあるｍＡｂの素反応パターンを決定するための日常的なスクリーニング技法（例えば酵素結合免疫吸着測定法、即ち「ＥＬＩＳＡ」）を使用して達成することができる。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、ファージ提示技術を使用して産生／選択することができる抗原結合抗体フラグメント、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖまたはその他）を含む。細菌に感染するウイルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面上で抗体フラグメントを発現する能力によって、例えば１０１０個を超える非結合クローンのライブラリから単一の結合抗体フラグメントを単離することが可能となる。ファージ表面上で抗体フラグメントを発現するために（ファージ提示）、抗体フラグメント遺伝子をファージ表面タンパク質をコードする遺伝子（例えばｐＩＩＩ）中に挿入すると、抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合タンパク質がファージ表面に提示される（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。
【００９３】
ファージ表面上の抗体フラグメントは機能性であるために、ファージ担持抗原結合抗体フラグメントを非結合ファージから抗原親和性クロマトグラフィーによって分離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４）。抗体フラグメントの親和性に応じて、１回の親和性選択で２０倍から１，０００，０００倍の濃縮係数が得られる。しかし細菌に溶離ファージを感染させることにより、さらにファージを増大させて、もう１回選択させることができる。このようにして１回で１０００倍の濃縮を、２回の選択で１，０００，０００倍にすることができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４）。このため濃縮が低いときでも（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）、複数回の親和性選択によって、希少なファージの単離がもたらされる。抗原でのファージ抗体ライブラリの選択は濃縮を生じるため、わずか３から４回の選択の後に、大半のクローンは抗原を結合する。このため抗原への結合を分析するために、比較的少数の（数百の）クローンのみが必要である。
【００９４】
ヒト抗体は、事前の免疫化なしに、ファージ上での非常に大きく多様なＶ遺伝子レパートリーを提示することによって産生することができる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）。一実施形態において、ヒト末梢血リンパ球に存在する天然ＶＨおよびＶＬレパートリーは、免疫化されていないドナーからＰＣＲによって単離される。Ｖ遺伝子レパートリーはＰＣＲを使用してランダムに共にスプライスされてｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを生成することができ、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーをファージベクター中にクローニングして３０００万個のファージ抗体のライブラリを生成することができる（Ｉｄ．）。単一の「未変性」ファージ抗体ライブラリから、結合抗体フラグメントが、ハプテン、ポリサッカライドおよびタンパク質を含む１７を超える異なる抗原に対して単離されている（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：７７９−７８３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−６２８）。抗体はヒトチログロブリン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子およびＣＥＡを含む自己タンパク質に対して産生された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．１２：７２５−７３４）。抗体フラグメントは選択に使用される抗原に対して高度に特異性であり、１ｎＭから１００ｎＭの範囲の親和性を有する（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）。より大きいファージ抗体ライブラリは、より大きい割合の抗原に対してより高い結合親和性を含むより多くの抗体の単離を生じる。
【００９５】
当業者がただちに認識するように、抗体は幾つかの商業サービス（例えばＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎａｗａ，Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃなど）のいずれかによって調製することができる。
【００９６】
固相
固相は抗体、例えば各抗体Ａ＾n_an´もしくは各抗体Ｂ＾n_an´、または各抗体Ａ＾n_an´および各抗体Ｂ＾n_an´を結合するのに十分な表面親和性を有する任意の好適な材料であることができる。例示的な実施形態において、各Ａ＾n_an´は固相に結合されている。固相は幾つかの形、例えば磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップのいずれかを取ることができる。有用な固相材料は：天然ポリマー系炭水化物およびこれの合成修飾、架橋または置換誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、とりわけ硝酸およびカルボン酸によるセルロースエステル、混合セルロースエステルおよびセルロースエーテル；窒素を含有する天然ポリマー、例えば架橋または修飾ゼラチンを含むタンパク質および誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えばラテックスおよびゴム；合成ポリマー、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびこれの部分加水分解誘導体を含むビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、重縮合体のコポリマーおよびターポリマー、例えばポリエステル、ポリアミドおよび他のポリマー、例えばポリウレタンまたはポリエポキシド；無機材料、例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含む、アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩、アルカリおよびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩；ならびに酸化アルミニウムまたはケイ素または水和物、例えば粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラス（これらの材料は上のポリマー材料と共にフィルタとして使用され得る。）；および上のクラスの混合物またはコポリマー、例えば既存の天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始することによって得たグラフトコポリマーを含む。これらの材料はすべて好適な形状、例えばフィルム、シーツ、管、微粒子、もしくはプレートで使用され得るか、またはこれらは適切な不活性担体、例えば紙、ガラス、プラスチックフィルム、布などにコーティング、結合もしくはラミネートされ得る。ニトロセルロースは、モノクローナル抗体を含む多種多様の試薬に対して優れた吸収および吸着品質を有する。ナイロンも同様の特徴を所有し、また好適である。
【００９７】
または固相は、微小粒子を構成することができる。本開示で有用な微小粒子は、当業者が任意の好適な種類の微粒子材料から選択することができ、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、または同様の材料で構成されるものを含む。さらに微小粒子は、磁場内での微小粒子の操作を容易にするために、磁性または常磁性微小粒子であることができる。例示的な実施形態において、微小粒子はカルボキシラート化磁性微小粒子である。
【００９８】
微小粒子は、可溶性試薬および試験試料の混合物中に懸濁させることができるか、または支持体材料によって保持および固定することができる。後者の場合では、支持体材料の上または中の微小粒子は、支持体材料内の他の位置に実質的に移動することはできない。または微小粒子は、可溶性試薬および試験試料の混合物中の懸濁物から沈降または遠心分離によって分離することができる。微小粒子が磁性または常磁性であるとき、微小粒子は可溶性試薬および試験試料混合物中の懸濁物から磁場によって分離することができる。
【００９９】
本開示の方法は、固相が微小粒子を含む自動化および半自動化システムを含む、微小粒子技術を利用するシステムでの使用に適合させることができる。このようなシステムは、公開されたＥＰＯ  Ａｐｐ．Ｎｏｓ．ＥＰ０４２５６３３およびＥＰ０４２４６３４にそれぞれ相当する係属中のＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．４２５，６５１およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０８９，４２４ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，００６，３０９に記載されたものを含む。
【０１００】
特定の実施形態において、固相は１個以上の電極を含む。例えば抗体Ａ＾n_an´は、例えば電極に直接または間接的に付着させることができる。一実施形態において、例えば抗体Ａ＾n_an´は磁性または常磁性微小粒子に付着させることができ、微小粒子は次に磁石を使用して電極表面付近に配置される。１個以上の電極が固相として作用するシステムは、検出が電気化学相互作用に基づく場合に有用である。この種の例示的なシステムは、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，８８７，７１４（２００５年５月３日発行）に記載される。電気化学検出に関する基本的な方法は、さらに下で記載されている。
【０１０１】
抗体Ａ＾n_an´またはＢ＾n_an´は、抗体が疎水性力によって保持される吸着により固相に付着させることができる。または固相の表面は、抗体を支持体に共有結合させる化学的方法によって活性化することができる。
【０１０２】
固相の固有の電荷を変化または上昇させるために、帯電物質を固相上に直接コーティングすることができる。ＥＰ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０３２６１００に相当するＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．１５０，２７８、およびＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．３７５，０２９（ＥＰ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０４０６４７３）に記載された、固定可能な反応複合体を負に帯電したポリマーによって固定するためのイオン捕捉手順を本開示に従って用いて、高速溶液相免疫化学反応に影響を及ぼすことができる。このような手順では、固定可能な免疫複合体は、負に帯電したポリアニオン／免疫複合体と先に処理された正に帯電したマトリックスとの間のイオン性相互作用によって反応混合物の残りから分離されて、ＥＰＯ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０２７３，１１５に相当するＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．９２１，９７９に記載されているような、例えば化学発光システムを含む幾つかのシグナル発生システムのいずれかを使用することによって検出される。
【０１０３】
固相がケイ素またはガラスである場合、表面は概して、各抗体Ａ＾n_an´またはＢ＾n_an´を付着させる前に活性化させる必要がある。活性化シラン化合物、例えばトリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手可能である。）、トリエトキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、および（３−メルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を使用して反応性基、例えばアミノ−、ビニルおよびチオールをそれぞれ導入することができる。このような活性化表面を使用して抗体に直接結合することができるか（アミノまたはチオールの場合）、または活性化表面をリンカー、例えばグルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ  ９スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎマレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４ヨードアセチル］アミノベンゾアート）およびＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［１マレイミドフェニル］ブチラート）とさらに反応させて、表面から抗体を分離することができる。ビニル基を酸化して共有結合のための手段を提供することができる。ビニル基は、特異性抗体の複数の結合点を供給することができる各種のポリマー、例えばポリアクリル酸の重合のためのアンカーとしても使用することができる。アミノ基は、各種の分子量の酸化デキストランと反応して、異なるサイズおよび能力の親水性リンカーを提供することができる。酸化可能なデキストランの例は、デキストランＴ−４０（分子量４０，０００ダルトン）、デキストランＴ−１１０（分子量１１０，０００ダルトン）、デキストランＴ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、デキストランＴ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）（このすべてはＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．より入手可能である。）またはＦｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルトン；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手可能である。）。さらに高分子電解質相互作用を使用して、参照によりこのそれぞれが本明細書に組み入れられている１９８８年１月２９日に提出されたＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．１５０，２７８および１９８９年７月７日に提出されたＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．３７５，０２９に記載されている技法および化学作用を用いて、特異性抗体を固相に固定することができる。
【０１０４】
固相の選出に影響を及ぼす他の考慮事項は、標識された実態の非特異性結合を最小化する能力および用いた標識系との適合性を含む。例えば蛍光標識と共に使用される固相は、シグナル検出を可能にするために十分に低いバックグラウンド蛍光を有するべきである。
【０１０５】
特異性抗体の結合後、固体支持体の表面は材料、例えば血清、タンパク質または他の遮断薬によってさらに処置されて、非特異性結合が最小化され得る。
【０１０６】
一般的な検出システム
上で考察したように、本開示によるイムノアッセイは、それぞれが抗体心筋細胞抗原ａｎ´に特異性である１個以上の抗体Ｂ＾n_an´を用いる。ある実施形態において、各抗体Ｂ＾n_an´は検出可能な標識に結合される。
【０１０７】
本開示の検出抗体での使用に好適な検出可能な標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能である基部分を有する任意の化合物または組成物を含む。このような標識は例えば、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンを含む。このため例えば光学シグナルを用いるイムノアッセイにおいて、光学シグナルは、化学発光、蛍光、リン光、電気化学発光、紫外線吸収、可視吸収、赤外線吸収、屈折、表面プラズモン共鳴における検体濃度依存性変化として測定される。電気シグナルを用いるイムノアッセイにおいて、電流、抵抗、電位、質量対電荷比またはイオンカウントにおける検体濃度依存性変化として測定される。状態変化シグナルを用いるイムノアッセイにおいて、状態変化シグナルは、サイズ、溶解度、質量または共鳴における検体濃度依存性変化として測定される。
【０１０８】
本開示による有用な標識は、磁性ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光染料（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質）など（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，ＵＳＡを参照のこと）、化学発光化合物、例えばアクリジニウム（例えばアクリジニウム−９−カルボキサミド）、フェナントリジニウム、ジオキセタン、ルミノールなど、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、触媒、例えば酵素（例えばＥＬＩＳＡで普通に使用される、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼおよびその他）および比色標識、例えばコロイド金（例えば４０−８０ｎｍ直径サイズ範囲の金粒子は、緑色光を高い効率で散乱させる。）または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズを含む。このような標識の使用を教示する特許は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１４９；および４，３６６，２４１を含む。
【０１０９】
標識は生体試料との接触の前、間または後に各抗体Ｂ＾n_an´に結合することができる。標識は共有または非共有相互作用によって抗体と結合することができる。いわゆる「直接標識」は、アッセイでの使用前に検出抗体に直接結合されるまたは検出抗体中に組み入れられる検出可能な標識である。直接標識は、当業者に周知の幾つかの手段のいずれかによって抗体Ｂ＾n_an´に結合し、または抗体Ｂ＾n_an´中に組み入れることができる。
【０１１０】
対照的に、いわゆる「間接標識」は通例、アッセイの間のある時点で各抗体Ｂ＾n_an´に結合する。間接標識はしばしば、使用前に検出剤に結合されるまたは検出剤中に組み入れられる基部分に結合する。このため例えば各抗体Ｂ＾n_an´は、アッセイでの使用前にビオチン化することができる。アッセイの間に、アビジン・コンジュゲート・フルオロフォアはビオチン担持検出剤を結合して、容易に検出される標識を提供することができる。
【０１１１】
間接標識の別の例において、免疫グロブリン定常領域を特異的に結合することができるポリペプチド、例えばポリペプチドＡまたはポリペプチドＧは、検出抗体の標識として使用することもできる。これらのポリペプチドは、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成物質である。これらは多種多様の種による免疫グロブリン定常領域との強い非免疫原性反応性を呈する（概してＫｒｏｎｖａｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１１：１４０１−１４０６、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２を参照）。このようなポリペプチドはこのため標識してアッセイ混合物に添加することができ、アッセイ混合物ではこれらは各抗体Ａ＾n_an´およびＢ＾n_an´に自己抗体と同様に結合し、すべてを標識して、試料中に存在する検体および自己抗体に起因する複合シグナルを提供する。
【０１１２】
本開示で有用な幾つかの標識は、検出可能なシグナルを産生するために追加の試薬の使用を必要とし得る。ＥＬＩＳＡでは例えば、酵素標識（例えばベータ−ガラクトシダーゼ）は、検出可能なシグナルを産生するための基質（例えばＸ−ｇａｌ）の添加を必要とする。アクリジニウム化合物を直接標識として使用するイムノアッセイでは、塩基性溶液および過酸化水素源が添加される。
【０１１３】
検出システム−例示的な形式
化学発光イムノアッセイ：例示的な実施形態において、化学発光化合物を、各抗体Ｂ＾n_an´にコンジュゲートされた直接標識として上記の方法で使用する。化学発光化合物は例えばアクリジニウム化合物であることができる。アクリジニウム化合物が検出可能な標識として使用されるとき、次に上記の方法は、試験試料を抗体Ａおよび抗体Ｂ＾n_an´と接触させることから生じる混合物に対して過酸化水素源を発生または提供すること、ならびに少なくとも１つの塩基性溶液を混合物に添加して光シグナルを発生することをさらに含み得る。混合物によって発生または放出された光シグナルを次に測定して、試験試料中の心筋細胞抗原ａｎ´を検出する。
【０１１４】
過酸化水素源は、緩衝溶液もしくは過酸化水素を含有する溶液または試験試料に添加されるときに過酸化水素を発生する酵素であり得る。塩基性溶液はトリガ溶液として作用して、少なくとも１つの塩基性溶液および検出可能な標識が添加される順序は重要ではない。該方法で使用される塩基性溶液は、少なくとも１つの塩基を含有し、１０以上の、好ましくは１２以上のｐＨを有する溶液である。塩基性溶液の例は、これに限定されるわけではないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび重炭酸カルシウムを含む。試験試料に添加される塩基性溶液の量は、アッセイで使用される塩基性溶液の濃度によって変わる。使用した塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者は本明細書に記載する方法で使用される塩基性溶液の量を容易に決定することができる。
【０１１５】
本開示によるおよびアクリジニウム化合物を検出可能な標識として使用する化学発光イムノアッセイにおいて、好ましくは、アクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボキサミドである。特にアクリジニウム−９−カルボキサミドは、式Ｉによる構造を有する：
【０１１６】
【化５】
2013513108.tif 000011
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され、ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；
ならびにさらに式中、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルのいずれかが１個以上のヘテロ原子を含有し得て；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【０１１７】
アクリジニウム９−カルボキサミドを調製する方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，６，１０７−１４；（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．，Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｐａｎ，Ｙ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３，５６３６−５６３９（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．；Ｓｈｒｅｄｅｒ，Ｋ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５５，１０８９９−１０９１４（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．；Ｐａｎ，Ｙ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ，１，７７９−７８１（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．；Ｆｉｓｈｐａｕｇｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｐａｎ，Ｙ．；Ｓｈｒｅｄｅｒ，Ｋ．；Ｙｕ，Ｚ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１１，７１４−７２４（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．７７−１０５（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．；Ｐａｎ，Ｙ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，５，３７７９−３７８２（２００３）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，４６８，６４６、５，５４３，５２４および５，７８３，６９９に記載されている（調製方法に関する文献の教示について、文献の全体が参照により本明細書にそれぞれ組み入れられている。）。
【０１１８】
またはアクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルであることができ；アクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルは、式ＩＩによる構造を有することができ：
【０１１９】
【化６】
2013513108.tif 000012
式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルであり；ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに
場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【０１２０】
本開示で使用することができる、上の式ＩＩを有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルの例は、これに限定されるわけではないが、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホナート（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能である。）。アクリジニウム９−カルボキシラートアリールエステルを調製する方法は、ＭｃＣａｐｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ，４，１１１１−２１（１９６５）；Ｒａｚａｖｉ，Ｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，１５：２４５−２４９（２０００）；Ｒａｚａｖｉ，Ｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，１５：２３９−２４４（２０００）；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２４１，０７０に記載されている（調製方法に関する文献の教示について、文献の全体が参照により本明細書にそれぞれ組み入れられている。）。
【０１２１】
少なくとも１つのアクリジニウム化合物に加えて、インジケータ溶液は少なくとも１つの界面活性剤も含有することができる。水に溶解したときに水の表面張力を低下させて、有機化合物の溶解度を上昇させる、いずれの界面活性剤も本発明で使用することができる。使用できる界面活性剤の例は、１つ以上の非イオン性またはイオン性界面活性剤（例えばアニオン性、カチオン性または両性イオン界面活性剤）である。使用できる非イオン性界面活性剤の例は、これに限定されるわけではないが、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイン２０）、ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル（ノニデットＰ１０）、デシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、シクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デカノイルスクロース、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド、ジギトニン、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ポリオキシエチレン（１０）ドデシルエーテル（ゲナポールＣ−１００）、イソトリデカノールポリグリコールエーテル（ゲナポールＸ−８０）、イソトリデカノールポリグリコールエーテル（ゲナポールＸ−１００）、ヘプタン−１，２，３−トリオール、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドおよびこれの組合せを含む。使用できるイオン性界面活性剤の例は、コール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、コール酸、デヒドロコール酸、ドクサートナトリウム、ドクサートナトリウム塩、グリコール酸水和物、グリコデオキシコール酸１水和物、グリコリトコール酸エチルエステル、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、リチウムドデシルサルフェート、カルシウムプロピオナート、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、ナトリウム１−ブタンスルホナート、ナトリウムケノデオキシコレート、ナトリウムコレート水和物、ナトリウム１−デカンスルホナート、ナトリウム１−デカンスルホナート、ナトリウムデオキシコレート、ナトリウムデオキシコレート１水和物、ナトリウムドデシルベンゼンスルホナート、ナトリウムドデシルサルフェート、ナトリウムグリコデオキシコレート、ナトリウムグルココレート水和物、ナトリウム１−ヘプタンスルホナート、ナトリウムヘキサンスルホナート、ナトリウム１−ノナンスルホナート、ナトリウムオクチルサルフェート、ナトリウムペンタンスルホナート、ナトリウム１−プロパンスルホナート水和物、ナトリウムタウロデオキシコレート水和物、ナトリウムタウロヒオデオキシコレート水和物、ナトリウムタウロウルソデオキシコレート、タウロコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸３−サルフェートジナトリウム塩、トリトン（登録商標）Ｘ−２００、トリトン（登録商標）ＱＳ−１５、トリトン（登録商標）Ｑ��−４４、トリトン（登録商標）ＸＱＳ−２０、トリズマ（登録商標）ドデシルサルフェート、ウルソデオキシコール酸、アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、アンプロリウムヒドロクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムヒドロキシド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、塩素ｐ−トルエンスルホナート塩、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド、グリニャール試薬、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド１水和物、ヘキサデシルピリジニウムクロリド１水和物、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホナート、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホナート、ハイアミン（登録商標）１６２２、メチルベンゼトニウムクロリド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、オキシフェノニウムブロミド、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロー−１，３−ジアミノプロパン、テトラヘプチルアンモニウムブロミド、テトラキス（デシル）アンモニウムブロミド、トンゾニウムブロミドおよびルビカット（商標）ＦＣ３７０、ルビカット（商標）ＨＭ５５２、ルビカット（商標）ＨＯＬＤ、ルビカット（商標）ＭＳ３７０、ルビカット（商標）ＰＱ１１ＰＮおよびこれの組合せ（すべてＡｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手可能である。）を含む。
【０１２２】
場合により試験試料は、少なくとも１つの塩基性溶液、過酸化水素源および検出可能な標識のいずれか１つ以上の添加の前に処置され得る。このような処置は、希釈、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび消化を含み得る。このような処置は、本明細書で先に考察したような、試験試料が受け入れ得るまたは対象となり得る任意の前処置に加えられ得るか、または該前処置とは別であり得る。加えて、処置方法が試験試料に使用される場合、このような処置方法は、心筋細胞抗原が未処置試験試料（例えば即ち、いずれのこのような処置方法も受けていない試験試料）中の濃度に比例する濃度で試験試料中に残存するようになっている。
【０１２３】
本明細書で先に簡単に言及したように、混合物を形成するために試験試料、少なくとも１つの塩基性溶液、過酸化水素源および検出可能な標識を添加する時間および順序は重大ではない。さらに少なくとも１つの塩基性溶液、過酸化水素源および検出可能な標識によって形成された混合物は場合により、ある期間にわたってインキュベートすることができる。例えば混合物は、約１秒から約６０分の期間にわたってインキュベートすることができる。特に混合物は、約１秒から約１８分の期間にわたってインキュベートすることができる。
【０１２４】
各抗体Ｂ＾n_an´に使用される検出可能な標識は、好適な標準曲線または参照標準が各抗原ａｎ´について得られるという条件で同じであることができ、各抗原の結果の混同を回避するために、各抗体からのシグナルが個別に測定されて、各抗原の校正された測定抗原量が決定され、次にそれぞれの他の抗原ａｎ´の測定抗原量と組み合わされる。各抗体Ｂ＾n_an´に異なる検出可能な標識が使用され得て、選択された標識化合物に応じてシグナルが相互からただちに区別できる場合には、抗原ａｎ´を超えるシグナルの同時測定が可能となる。例えば異なる発光スペクトルを有する異なる蛍光標識が使用され得る。
【０１２５】
検出可能な化学発光標識を使用するとき、少なくとも１つの塩基性溶液、過酸化水素源および検出可能な標識の試験試料への添加の後に、検出可能なシグナル、即ち化学発光シグナルが発生する。混合物によって発生したシグナルは、一定期間にわたって検出される。好ましくは、混合物が形成されて、同時にシグナルが検出される。検出の期間は、約０．０１から約３６０秒の、さらに好ましくは約０．１から約３０秒のおよび最も好ましくは約０．５から約５秒の範囲に及び得る。発生した化学発光シグナルは、当業者に公知の所定の技法を使用して検出することができる。
【０１２６】
このため本開示による化学発光イムノアッセイにより、検出可能な化学発光標識を使用して試験試料に添加すると、塩基性溶液および検出可能な標識の添加後に発生した化学発光シグナルは、試験試料中の各心筋細胞抗原ａｎ´の存在を示し、該シグナルを検出することができる。試験試料中の各心筋細胞抗原心筋細胞抗原ａｎの量または濃度は、発生したシグナルの強度に基づいて定量することができる。特に各心筋細胞抗原ａｎ´では、試験試料に含有される心筋細胞抗原ａｎ´の量は、発生したシグナルの量に比例する。特に、存在する心筋細胞抗原ａｎ´の量は、発生した光の量を心筋細胞抗原ａｎ´の標準曲線と比較することに基づいて、または心筋細胞抗原ａｎ´に特異性の参照標準への比較によって定量することができる。このような参照標準はそれぞれ、例えば抗イディオタイプ抗体を含み得る。各参照標準は、例えば誘導体化心筋細胞抗原、例えばポリエチレングリコールによって誘導体化された心筋細胞抗原を含み得る。例えば心筋トロポニンＩに好適な参照標準は、誘導体化心筋トロポニンＩ、例えばポリエチレングリコールによって誘導体化された心筋トロポニンＩである。同様に、心筋トロポニンＴに好適な参照標準は、誘導体化心筋トロポニンＴ、例えばポリエチレングリコールによって誘導体化された心筋トロポニンＴである。本明細書の他の箇所に記載したような他の心筋細胞抗原も、イムノアッセイに選択された心筋細胞抗原に基づいて適切な参照標準を得るためにただちに誘導体化されることが理解される。各心筋細胞抗原の好適な標準曲線は、公知の濃度の心筋細胞抗原の段階希釈液、または溶液を使用して、質量分析法、重量測定、または当分野で公知の他の方法によって生成することができる。
【０１２７】
蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）：例示的な実施形態において、蛍光標識は本発明による蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）で用いられる。概して、蛍光偏光技法は、蛍光標識が特徴的な波長の平面偏光によって励起されたときに、所与の媒体中の標識の偏光に反比例する入射光に対して偏光度を保持する別の特徴的な波長の光（即ち蛍光）を放出するという原理に基づく。この特性の結果として、回転が拘束された標識、例えば別の溶液構成要素に比較的低い回転率で結合した標識は、溶液中で遊離しているときよりも比較的大きい放出光の偏光度を保持する。
【０１２８】
本技法は、例えば所与の平面で放出された光の強度の変化が検出できるように、蛍光標識された実体の結合がサイズの十分に異なる複合体を形成するように試薬を選択することによって、本発明によるイムノアッセイで用いることができる。例えば標識された心筋トロポニン抗体が捕捉抗体および／または心筋トロポニンと反応性の自己抗体によって捕捉された１個以上の心筋トロポニン抗原によって結合されているとき、得られた複合体は遊離した標識心筋トロポニン抗体と比較して十分に大きく、これの回転は十分に制約されているため、結合は容易に検出される。
【０１２９】
ＦＰＩＡで有用なフルオロフォアは、フルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセインなど、好ましくは５および６−アミノメチルフルオレセイン、５および６−アミノフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセイン、ならびに同様の蛍光誘導体を含む。蛍光偏光アッセイを行うことができる市販の自動化機器の例：ＩＭｘシステム、ＴＤｘシステムおよびＴＤｘＦＬｘシステム（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．から入手可能である。）を含む。
【０１３０】
走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）：イムノアッセイへの走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用も、本開示のイムノアッセイ方法が容易に適合できる技術である。ＳＰＭにおいて、特に原子間力顕微鏡法において、捕捉抗体は、結合自己抗体を結合できることに加えて、走査に好適な表面を有する好適な固相に付着される。抗体Ａ＾n_an´は例えば、プラスチックまたは金属表面に吸着させることができる。または抗体Ａｎは、当業者に公知の方法により、例えば誘導体化プラスチック、金属、ケイ素またはガラスに共有結合させることができる。抗体Ａ＾n_an´の結合後に、試験試料を固相と接触させて、走査型プローブ顕微鏡を使用して固相付着複合体を検出および定量する。ＳＰＭの使用により、イムノアッセイシステムに用いられる標識の必要がなくなる。このようなシステムは、参照により本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．６６２，１４７に記載されている。
【０１３１】
微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）：本開示によるイムノアッセイは、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）を使用して行うこともできる。ＭＥＭＳは、機械要素、光学要素および流体要素を電子機器と組み合わせるシリコン上に組み込まれた微視的構造であり、興味のある検体を好都合に検出できるようにする。本開示での使用に好適な例示的なＭＥＭＳデバイスは、Ｐｒｏｔｉｖｅｒｉｓのマルチカンチレバーアレイである。本アレイは、特別に設計されたシリコンマイクロカンチレバーの化学機械的作動およびその後のマルチカンチレバーの偏向の光学的検出に基づいている。片側を結合パートナーによってコーティングしたとき、マイクロカンチレバーは相補的分子を含有する溶液に曝露されると湾曲する。この湾曲は、結合事象による表面エネルギーの変化によって引き起こされる。湾曲（偏向）度の光学検出によって、マイクロカンチレバーに結合した相補的分子の量を測定することができる。
【０１３２】
電気化学検出システム：他の実施形態において、本開示によるイムノアッセイは電気化学検出を使用して行われ、この技法は当業者に周知である。このような電気化学検出は、電流を測定および記録するデバイスに接続された１個以上の電極を用いることが多い。このような技法は幾つかの市販のデバイス、例えば携帯型電気化学検出器具および独立型アッセイ特異性試薬カートリッジを含むＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）システムで実現することができる。例えば本発明において、塩基性トリガ溶液を独立型ヘモグロビン試薬カートリッジ内に含有することができ、試験試料の添加時に試験試料中のヘモグロビンの量に比例する電流が、少なくとも１個の電極にて発生する。電気化学検出の基本的な手順は、例えばＨｅｉｎｅｍａｎおよび共同研究者らによって記載されている。これは１次抗体（Ａｂ、ラット抗マウスＩｇＧ）の固定と、続いての抗原（Ａｇ、マウスＩｇＧ）、酵素標識（ＡＰ−Ａｂ、抗ラットマウスＩｇＧおよびアルカリ性ホスファターゼ）にコンジュゲートされた２次抗体およびｐ−アミノフェニルホスフェート（ＰＡＰＰ）を含有する一連の溶液への曝露を必要とした。ＡＰはＰＡＰＰをｐ−アミノフェノール（ＰＡＰＲ、「Ｒ」は、還元形をキノンイミンである酸化形のＰＡＰＯと区別するためのものである。）に変換し、この変換は最適活性を呈するｐＨ９．０にて酸素および水の還元に干渉しない電位にて電気化学的に可逆性である。ＰＡＰＲはフェノールとは違って電極汚損を引き起こさず、フェノールの前駆体のフェニルホスフェートは酵素基質として使用されることが多い。ＰＡＰＲは空気および光酸化を受けるが、これらは小規模および短い時間枠で容易に防止される。２０μｌから３６０μＬの範囲に及ぶＰＡＰＰ量を使用する微小電気化学イムノアッセイで達成されたＰＡＰＲのピコモル検出限界およびＩｇＧのフェムトグラム検出限界は、先に報告されている。電気化学検出を用いるキャピラリーイムノアッセイでは、これまでに報告された最低検出限界は、７０μＬの量、および３０分または２５分のアッセイ時間を使用して、マウスＩｇＧ  ３０００分子である。
【０１３３】
本開示による電気化学検出を用いる例示的な実施形態において、心筋細胞抗原と反応性である抗体Ａ＾n_an´を固相である電極の表面上に固定することができる。次に電極を例えばヒトからの試験試料と接触させる。試料中のいずれの検体も抗体Ａｎに結合して、第１の固相付着複合体を形成する。自己抗体も電極表面に結合して、これにより電極の表面上に固定されるようになる。捕捉抗体Ａ＾n_an´によって結合されていない試験試料中の検体は、検体と反応性である固定化自己抗体に結合して、第２の固相付着複合体を形成する。これらの固相付着複合体を、また検体特異性であり、検出可能な標識を有する抗体Ｂ＾n_an´と接触させる。Ａ＾n_an´−ａｎ´−Ｂ＾n_an´に加えて自己抗体−ａｎ´−Ｂ＾n_an´複合体を含む免疫検出複合体の形成により、検出可能な標識のシグナルが発生して、次にこのシグナルが検出される。
【０１３４】
各種の電気化学検出システムは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，０４５，３６４（２００６年５月１６日発行；参照により本明細書に組み入れられている。）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，０４５，３１０（２００６年５月１６日発行；参照により本明細書に組み入れられている。）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，８８７，７１４（２００５年５月３日発行；参照により本明細書に組み入れられている。）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６８２，６４８（２００４年１月２７日発行；参照により本明細書に組み入れられている。）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６７０，１１５（２００３年１２月３０日発行；参照により本明細書に組み入れられている。）に記載されている。
【０１３５】
Ｃ．キット
本開示は、心筋細胞抗原の免疫検出に干渉する他の物質も含有し得る試験試料を、心筋細胞抗原の存在についてアッセイするためのキットも提供する。本開示によるキットは、１個以上の本開示によるイムノアッセイを実施するのに有用な１つ以上の試薬を含む。キットは概して、試薬を１つ以上の別個の組成物として、または場合により試薬の適合性が許す場合には混和物として保持する１個以上の容器を含むパッケージを含む。試験キットは、使用者の観点から所望であり得る他の材料、例えば緩衝液、希釈剤、標準および／または試料の処理、洗浄、もしくはアッセイのその他のステップの実行に有用なその他の材料も含むことができる。
【０１３６】
ある実施形態において、試験キットはヒト化モノクローナル抗体または抗体を含み、各ヒト化モノクローナル抗体は選択された心筋細胞抗原に対して特異性である。本構成要素は、本発明によるイムノアッセイで正の対照として使用することができる。所望ならば、本構成要素を試験キットに複数の濃度で含ませて、試験試料中で検出されたシグナルを比較できる標準曲線の作成を容易にすることができる。または標準曲線は、キットで提供された単一のヒト化モノクローナル抗体溶液の希釈物を調製することによって作成することができる。
【０１３７】
本開示によるキットは、心筋細胞抗原ａｎ´上の少なくとも１個のエピトープにそれぞれ結合している１つ以上の抗体Ａ＾n_an´およびＡ＾n_an´が結合するいずれのエピトープとも異なる心筋細胞抗原ａｎ上の少なくとも１個のエピトープにそれぞれ結合している１つ以上の検出抗体Ｂ＾n_an´、ならびに各心筋細胞抗原ａｎ´を検出または定量するための説明書を含むことができる。ある実施形態において、本開示による試験キットは、抗体Ａ＾n_an´および／または抗体Ｂ＾n_an´が結合されている固相を含み得る。固相は、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップであり得る。
【０１３８】
本開示による試験キットは例えば、抗体Ａ＾n_an´および抗体Ｂ＾n_an´のような、それぞれ心筋細胞抗原ａｎ´に対する１つ以上の非ヒトモノクローナル抗体を含むことができる。キットは、各抗体Ｂ＾n_an´にコンジュゲートすることができる、またはコンジュゲートしている１つ以上の検出可能な標識も含み得る。ある実施形態において、試験キットは酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンであり得る少なくとも１つの直接標識を含む。幾つかの実施形態において、直接標識はアクリジニウム化合物、例えば式Ｉによるアクリジニウム−９−カルボキサミドであり：
【０１３９】
【化７】
2013513108.tif 000013
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され、ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【０１４０】
またはアクリジニウム化合物は、式ＩＩによる構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシラートアリールエステルであることができ：
【０１４１】
【化８】
2013513108.tif 000014
式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルであり；ならびに
式中、Ｒ３からＲ１５はそれぞれ独立して：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハライド、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から選択され；ならびに場合により、存在する場合、ＸΘはアニオンである。
【０１４２】
本開示によるおよびアクリジニウム化合物を含む試験キットは、塩基性溶液も含むことができる。例えば塩基性溶液は、少なくとも約１０のｐＨを有する溶液であることができる。
【０１４３】
ある実施形態において、本開示による試験キットは、過酸化水素源、例えば緩衝溶液、過酸化水素を含有する溶液、または過酸化水素発生酵素をさらに含む。例えば試験キットは、（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパノアートオキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニレートオキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデラートオキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチネートデヒドロゲナーゼ、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリールアルコールオキシダーゼ、アリールアルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメートオキシダーゼ、Ｄ−グルタメート（Ｄ−アスパルテート）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシラートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタネートオキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコラートオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチル−リジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、オキサラートオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プレトシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−ホスフェートシンターゼ、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノンシンターゼ、ピルベートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシンＢオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、サルファイトオキシダーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、ウレートオキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼおよびこれの組合せから選択される過酸化水素発生酵素のある量を含み得る。
【０１４４】
本開示による試験キットは好ましくは、本発明のイムノアッセイの１つ以上を行うための説明書を含む。本開示のキットに含まれる説明書は、梱包材料に付着させることができるか、または添付文書として含めることができる。説明書は通例、記載または印刷された材料であるが、これらはこれに限定されない。このような説明書を格納して、これらをエンドユーザに伝えることができるいずれの媒体も、本開示によって考慮される。このような媒体は、これに限定されるわけではないが、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）などを含む。本明細書で使用する場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１４５】
Ｄ．本開示の方法の適合
本開示は例えば、ＴｎＩ、ＣＫＭＢおよびＢＮＰを含む複数の心臓マーカーのサンドイッチイムノアッセイを行う、共有の市販Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイシステムに適用できる。免疫センサおよび単回使用試験デバイスでのこれの操作方法は、共有のＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＵＳ２００３０１７０８８１、ＵＳ２００４００１８５７７、ＵＳ２００５００５４０７８およびＵＳ２００６０１６０１６４に記載され、このそれぞれは参照により本明細書に組み入れられている。電気化学および他の種類の免疫センサの製造に関する追加の背景は、参照によりまた組み入れられている、共有のＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０６３，０８１に見出される。
【実施例】
【０１４６】
限定するものではなく、一例として、本発明の実施例をここに示すものとする。
［実施例１］
検出抗体コンジュゲート
一般コンジュゲーション手順：検出抗体をコンジュゲーション緩衝液（１００ｍＭナトリウムホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解させて、１−１０ｍｇ／ｍＬ（６．２５−６２．５μＭ）の濃度を得た。アクリジニウム、９−［［［４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジンイル）オキシ］−４−オキソブチル］［（４−メチルフェニル）スルホニル］アミノ］カルボニル］−１０−（３−スルホプロピル）−、分子内塩、２（Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｐａｎ，Ｙ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６３，５６３６−５６３９）標識試薬を、下の式２に示すようにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で１−５０ｍＭの濃度にて調製した：
【０１４７】
【化９】
2013513108.tif 000015
選択した抗体を１−３５倍のモル過剰のアクリジニウム標識試薬によって、周囲温度で暗所にて３−１４時間処置した。この後、アクリジニウム−９−カルボキサミド−抗体コンジュゲート溶液を周囲温度にて２０時間にわたって１０キロダルトン分子量カットオフ膜を使用して、３倍の体積（１０００×コンジュゲート溶液体積）の、０．１％  ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）を含有する１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）から成る透析緩衝液で透析した。
【０１４８】
アクリジニウム−９−カルボキサミド−抗体コンジュゲートを２８０／３６９ｎｍのＵＶ吸光度によって分析して、式に従って計算した、アクリジニウム−９−カルボキサミド標識のタンパク質に対する取込比（ＩＲ）を決定した：
ＩＲ＝Ａ３６９／３６９／（［Ａ２８０−（Ａ３６９／４．１）］／２８０）
式中：
Ａ２８０およびＡ３６９は、コンジュゲートのＵＶ−可視スペクトルから得た吸光度値であり；
４．１は、アクリジニウム−９−カルボキサミド標識のおよそのＡ３６９／Ａ２８０比であり；
２８０は、２８０ｎｍにおける抗体の消衰係数であり（即ちＩｇＧ  ｍＡｂでは、２８０＝２１０，０００Ｍ−１ｃｍ−１）；
ならびに
３６９は、３６９ｎｍにおけるアクリジニウム−９−カルボキサミド標識の消衰係数である。
【０１４９】
プールされた画分の平均取込比は、使用したアクリジニウム−９−カルボキサミド標識試薬の０．４−０．８×モル過剰の範囲に及ぶことができる。
【０１５０】
ａ）エピトープｃＴｎＴ６０−７０にマップされたマウス抗心筋トロポニンＴ  ７Ｇ７（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｏ，ＭＥ；カタログ番号Ｈ８６４２９Ｍ）をＰＢＳで透析して、０．３５ｍｇ／ｍＬの溶液濃度を得た。コンジュゲーションの後、計算したＩＲは３．１であった。
【０１５１】
ｂ）エピトープｃＴｎＴ６１−７０にマップされたマウス抗心筋トロポニンＴ  ７Ｆ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄ  Ｉｎｔｎｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ、カタログ番号１０Ｒ−Ｔ１２７Ｃ）をＰＢＳで透析して、０．４６９ｍｇ／ｍＬの溶液濃度を得た。コンジュゲーションの後、計算したＩＲは２．８であった。
【０１５２】
ｃ）エピトープｃＴｎＴ９５−１８１にマップされたマウス抗心筋トロポニンＴ  １Ｃ１１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄ  Ｉｎｔｎｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ、カタログ番号１０Ｒ−Ｔ１２７Ｄ）をＰＢＳで透析して、０．４６９ｍｇ／ｍＬの溶液濃度を得た。コンジュゲーションの後、計算したＩＲは２．８であった。
【０１５３】
ｄ）エピトープｃＴｎＴ  ｃＴｎＴ７３−８７にマップされたマウス抗心筋トロポニンＴ  Ｍ８０２０２０７（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄ  Ｉｎｔｎｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ、カタログ番号１０Ｒ−Ｔ８５Ｄ）をＰＢＳで透析して、０．４１３ｍｇ／ｍＬの溶液濃度を得た。コンジュゲーションの後、計算したＩＲは４．１であった。
【０１５４】
ｅ）エピトープｃＴｎＩ４１−４９にマップしたマウス抗心筋トロポニンＩ  １９Ｃ７（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ，カタログ番号４Ｔ２１）。コンジュゲーションの後、計算したＩＲは２．２であった。
【０１５５】
［実施例２］
磁性微小粒子上の捕捉抗体
カルボキシ常磁性微小粒子（５％固体、公称直径５ミクロン、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ、２ｍＬ、ｐＨ６．２、５０ｍＭ）中で１％固体濃度まで希釈し、次にＭＥＳ緩衝液（３×２ｍＬ）で洗浄して、最後にＭＥＳ（２ｍＬ）に再懸濁させた。粒子を１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（１１ｍｇ／水１．１２９ｍＬの２０μＬ）と２０分間混合することによって活性化させ、次に洗浄して（ＭＥＳ、２ｍＬ）、ＭＥＳ（２ｍＬ）に再懸濁させた。マウス抗心筋トロポニンＴ  １Ｃ１１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄ  Ｉｎｔｎｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ、カタログ番号１０Ｒ−Ｔ１２７Ｄ）を懸濁液に６０μｇ／ｍＬにて添加した。６０分間混合した後、抗原コート粒子を磁気的に封鎖して、抗原溶液をＰＢＳ中１％  ＢＳＡ（２ｍＬ）から成る遮断溶液に代えた。３０分間混合した後、粒子をＰＢＳ中１％  ＢＳＡ（３×２ｍＬ）で洗浄して、最後にＰＢＳ中１％  ＢＳＡ（２ｍＬ）に再懸濁させて、１％固体の最終濃度に調整した。
【０１５６】
微小粒子を以下のマウス抗心筋トロポニンＴ抗体を用いて同様に調製した：７Ｇ７（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｏ，ＭＥ；カタログ番号Ｈ８６４２９Ｍ）；７Ｆ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄ  Ｉｎｔｎｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ、カタログ番号１０Ｒ−Ｔ１２７Ｃ）；およびＭ８０２０２０７（「Ｍ８０」，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄ  Ｉｎｔｎｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ、カタログ番号１０Ｒ−Ｔ８５Ｄ）。
【０１５７】
微小粒子は同様に、以下のマウス抗心筋トロポニンＩ抗体：エピトープｃＴｎＩ８６−９２にマップされた８Ｅ１０（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ、カタログ番号４Ｔ２１；カタログ番号４Ｔ２１）およびＭＯ６（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ、カタログ番号Ｄ２４４０Ｍ４０６−ＭＡ）の混合物を用いて同様に調製した。
【０１５８】
［実施例３］
捕捉抗体および検出抗体の組合せに対する化学発光イムノアッセイ心筋トロポニンＴ用量応答
実施例２で調製した各捕捉抗体微小粒子の作用懸濁液は、原懸濁液をスクロース（１３．６％）および抗菌剤を含有するＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．６）で０．０５％固体まで希釈することによって調製した。各検出抗体コンジュゲートの作用溶液は、原液を１０ｎｇ／ｍＬまで希釈することによって調製した。心筋トロポニンＴ（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号Ｊ３４５１０３５９）標準溶液は、０、０．２５、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍＬで調製した。
【０１５９】
アッセイは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ｉ２０００機器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で行った。簡潔には、心筋トロポニンＴ標準溶液（１０μＬ）をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレインキュベーション希釈剤（５０μＬ）および捕捉抗体微小粒子（５０μＬ）で希釈して、機器の反応容器内でインキュベートした。インキュベーションの後、微小粒子を磁気的に封鎖して、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液で洗浄した。検出抗体溶液（５０μＬ）を添加して、懸濁液をインキュベートし、次に微小粒子を再度洗浄した。過酸化水素を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガ溶液およびナトリウムヒドロキシドを含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガ溶液を次に順次添加して、化学発光シグナル（相対光ユニット、ＲＬＵ）を記録した。
【０１６０】
捕捉抗体および検出抗体の組合せの用量−応答曲線を表１に、およびグラフで図１に示す。
【０１６１】
【表２】
2013513108.tif 000016
【０１６２】
［実施例４］
自己抗体の心筋トロポニンＴへのエピトープマッピング
抗体を図２に示すようなｃＴｎＴアミノ酸配列全体（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ４５３７９（ＴＮ  Ｔ２＿ＨＵＭＡＮ）、開始剤メチオニン除去、２９７ａａ、配列番号９６）、各ペプチド長、１５ａａ；オーバーラップ、１２ａａ；ＰＥＰｓｃｒｅｅｎ（登録商標），Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を含むビオチン化ペプチドライブラリ（表２）に対して、ストレプトアビジン・コート・マイクロプレート（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）、ストレプトアビジン；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上でスクリーニングした。
【０１６３】
このためペプチド（１００μＬ、１２００ｐｍｏｌ／ｍＬ）をマイクロプレート上に整列させた；該マイクロプレートを次に密封して、周囲温度にて１時間インキュベート／混合した。次にマイクロプレートをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液で洗浄して、吸引乾固した。試料（５００μＬ）をＡｘｓｙｍトロポニンプレインキュベーション希釈剤９．５ｍＬで希釈して、次にペプチドライブラリを用いてマイクロプレートに整列させた（１００μＬ／ウェル）。プレートを次に密封して、３７℃にてインキュベートし、２８ｒｐｍにて２時間混合した。後にプレートをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液で洗浄して、マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）上での化学発光検出を使用して、各ペプチドに対する応答を決定した。マウス抗ヒトＩｇＧアクリジニウム標識コンジュゲート溶液（１００μＬ）を各試験ウェルに添加した。コンジュゲートをすべての試験試料に添加した後、次にマイクロプレートを密封して、２８ｒｐｍのオービタルシェーカー上に置き、３７℃にて１時間インキュベートした。次にコンジュゲート溶液を除去して、マイクロプレートのウェルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ希釈剤（３×３００μＬ）で洗浄した。マイクロプレートを３７℃で平衡させた機器に装填した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配した。プレトリガ溶液を添加した後、プレートを７２秒間振とうした。次にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配して、化学発光シグナルを２秒間記録した。図３は、ヒト心筋トロポニンＴ自己抗体中で見出された反応性心筋トロポニンＴエピトープの頻度を示す。
【０１６４】
【表３】
2013513108.tif 000017
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2013513108.tif 000019
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【０１６５】
［実施例５］
モノクローナル抗体の心筋トロポニンＴへのエピトープマッピング
実施例１からのマウス抗心筋トロポニンＴ  Ｍ８０２０２０７アクリジニウム−９−カルボキシアミドコンジュゲートをビオチン化ペプチドライブラリ（表２、実施例４）に対してスクリーニングした。コンジュゲートを１００ｎｇ／ｍＬまで希釈して、次にコンジュゲート溶液（１００μＬ）各試験ウェルに添加した。コンジュゲートを添加した後、次にマイクロプレートを密封して、２８ｒｐｍのオービタルシェーカー上に置いて、３７℃にて１時間インキュベートした。次にコンジュゲート溶液を除去して、マイクロプレートのウェルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ希釈剤（３×３００μＬ）で洗浄した。マイクロプレートを３７℃で平衡させた機器に装填した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配した。プレトリガ溶液を添加した後、プレートを７２秒間振とうした。次にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配して、化学発光シグナルを２秒間記録した。図４に示すように、１次応答はｃＴｎＴ７３−８７に相当するペプチド２５に対してであった。
【０１６６】
実施例１からのマウス抗心筋トロポニンＴ  １Ｃ１１をビオチン化ペプチドライブラリ（表２、実施例４）に対してスクリーニングした。抗体を１００ｎｇ／ｍＬまで希釈して、次に１００μＬを各試験ウェルに添加した。プレートを次に密封して、３７℃にてインキュベートし、２８ｒｐｍにて２時間混合した。後にプレートをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液で洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧアクリジニウム標識コンジュゲート溶液（１００μＬ）を各試験ウェルに添加した。コンジュゲートをすべての試験試料に添加した後、次にマイクロプレートを密封して、２８ｒｐｍのオービタルシェーカーに置き、３７℃にて１時間インキュベートした。次にコンジュゲート溶液を除去して、マイクロプレートのウェルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ希釈剤（３×３００μＬ）で洗浄した。マイクロプレートを３７℃で平衡させた機器に装填した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配した。プレトリガ溶液を添加した後、プレートを７２秒間振とうした。次にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配して、化学発光シグナルを２秒間記録した。図５に示すように、１次エピトープ応答はｃＴｎＴ１８１−１９５に相当するペプチド６１に対してであった。
【０１６７】
［実施例６］
心筋トロポニンＴの標準曲線
実施例２からのマウス抗心筋トロポニンＴ  Ｍ８０２０２０７コート微小粒子を０．３％固体まで希釈した。実施例１からのマウス抗心筋トロポニンＴ  ７Ｇ７アクリジニウム−９−カルボキシアミドコンジュゲートを３０ｎｇ／ｍＬまで希釈した。標準溶液をヒト心筋トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ、カタログ番号８Ｔ６２）から作製して、ｃＴｎＴ濃度：０、７．０、１３．０、４０．０および２６９．０ｐＭを得た。ｈｃＴｎＩＴＣを陰性のヒト血漿中にスパイクすることによって３つの試験試料を調製して、０、７．０および４０ｐＭの公称ｃＴｎＴ濃度を得た。
【０１６８】
標準溶液およびヒト血漿試料は、実施例３のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ｉ２０００で分析した。ポイント間校正曲線をプロットした（ＲＬＵ対ｃＴｎＴ濃度）。結果を表３に挙げる。
【０１６９】
【表４】
2013513108.tif 000021
【０１７０】
［実施例７］
自己抗体の心筋トロポニンＩへのエピトープマッピング
抗体を図６に示すようなｃＴｎＩアミノ酸配列全体（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＰＩ  ９４２９−１（ＴＮＮＩ３＿ＨＵＭＡＮ）、開始剤メチオニン除去、２０９  ａａ、配列番号９７）ペプチド長、１５ａａ；オーバーラップ、１２ａａ；ＰＥＰｓｃｒｅｅｎ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を含むペプチドライブラリ（表４）に対して、ストレプトアビジン・コート・マイクロプレート（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）、ストレプトアビジン；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上でスクリーニングした。このためペプチド（１００μＬ、１２００ｐｍｏｌ／ｍＬ）をマイクロプレート上に整列させた；該マイクロプレートを次に密封して、周囲温度にて１時間にわたってインキュベート／混合した。次にマイクロプレートをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液で洗浄して、吸引乾固した。試料（５００μＬ）をＡｘｓｙｍトロポニンプレインキュベーション希釈剤９．５ｍＬで希釈して、次にペプチドライブラリを用いてマイクロプレートに整列させた（１００μＬ／ウェル）。プレートを次に密封して、３７℃にてインキュベートし、２８ｒｐｍにて２時間混合した。後にプレートをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液で洗浄して、マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）上での化学発光検出を使用して、各ペプチドに対する応答を決定した。マウス抗ヒトＩｇＧアクリジニウム標識コンジュゲート溶液（１００μＬ）を各試験ウェルに添加した。コンジュゲートをすべての試験試料に添加した後、次にマイクロプレートを密封して、２８ｒｐｍのオービタルシェーカー上に置いて、３７℃にて１時間インキュベートした。次にコンジュゲート溶液を除去して、マイクロプレートのウェルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ希釈剤（３×３００μＬ）で洗浄した。マイクロプレートを３７℃で平衡させた機器に装填した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）プレトリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配した。プレトリガ溶液を添加した後、プレートを７２秒間振とうした。次にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配して、化学発光シグナルを２秒間記録した。図７は、ヒト心筋トロポニンＩ自己抗体に見出される反応性心筋トロポニンＩエピトープの頻度を示す。
【０１７１】
【表５】
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2013513108.tif 000023
2013513108.tif 000024
【０１７２】
［実施例８］
モノクローナル抗体の心筋トロポニンＩへのエピトープマッピング
実施例１からのマウス抗心筋トロポニンＩ  １９Ｃ７アクリジニウム−９−カルボキシアミドコンジュゲートをビオチン化ペプチドライブラリ（実施例７）に対してスクリーニングした。コンジュゲートを１００ｎｇ／ｍＬまで希釈して、次にコンジュゲート溶液（１００μＬ）各試験ウェルに添加した。コンジュゲートを添加した後、次にマイクロプレートを密封して、２８ｒｐｍのオービタルシェーカー上に置いて、３７℃にて１時間インキュベートした。次にコンジュゲート溶液を除去して、マイクロプレートのウェルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ希釈剤（３×３００μＬ）で洗浄した。マイクロプレートを３７℃で平衡させた機器に装填した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配した。プレトリガ溶液を添加した後、プレートを７２秒間振とうした。次にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガ溶液（１００μＬ）を各ウェルに分配して、化学発光シグナルを２秒間記録した。図８に示すように、１次応答は、ベンダーからのエピトープ割当てを含むｃＴｎＩ３７−５７に相当するペプチド１３−１５に対してであった。（配列番号１１０、１１１および１１２）。
【０１７３】
［実施例９］
心筋トロポニンＩアッセイの標準曲線
実施例２からのマウス抗心筋トロポニンＩ  ８Ｅ１０／ＭＯ６コート微小粒子を０．３％固体まで希釈した。実施例１からのマウス抗心筋トロポニンＩ  １９Ｃ７アクリジニウム−９−カルボキシアミドコンジュゲートを３０ｎｇ／ｍＬまで希釈した。標準溶液をヒト心筋トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ、カタログ番号８Ｔ６２）から作製して、ｃＴｎＩ濃度：０、１０．０、２１．０、６３．０および４１９．０ｐＭを得た。ｈｃＴｎＩＴＣを陰性のヒト血漿中にスパイクすることによって３つの試験試料を調製して、０、１０．０および６３ｐＭの公称ｃＴｎＩ濃度を得た。標準溶液およびヒト血漿試料は、実施例３のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ｉ２０００で分析した。ポイント間校正曲線をプロットした（ＲＬＵ対ｃＴｎＩ濃度）。結果を表５に挙げる。
【０１７４】
【表６】
2013513108.tif 000025
【０１７５】
［実施例１０］
心筋トロポニンアッセイの標準曲線
実施例２からのマウス抗心筋トロポニンＩ  ８Ｅ１０／ＭＯ６コート微小粒子およびマウス抗心筋トロポニンＴ  Ｍ８０２０２０７コート微小粒子を１：１で０．３％固体懸濁物となるまで希釈した。実施例１からのマウス抗心筋トロポニンＩ  １９Ｃ７アクリジニウム−９−カルボキシアミドコンジュゲートおよびマウス抗心筋トロポニンＴ  ７Ｇ７アクリジニウム−９−カルボキシアミドコンジュゲートを１：１で３０ｎｇ／ｍＬの溶液となるまで希釈した。標準溶液をヒト心筋トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ、カタログ番号８Ｔ６２）から作製して、ｃＴｎ濃度：０、１７．０、３４．０、１０３．０および６８７．０ｐＭを得た。ｈｃＴｎＩＴＣを陰性のヒト血漿中にスパイクすることによって３つの試験試料を調製して、０、１７．０および１０３ｐＭの公称ｃＴｎ濃度を得た。標準溶液およびヒト血漿試料は、実施例３のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ｉ２０００で分析した。ポイント間校正曲線をプロットした（ＲＬＵ対ｃＴｎ濃度）。結果を表６に挙げる。
【０１７６】
【表７】
2013513108.tif 000026
【０１７７】
当業者は、本開示に記載したイムノアッセイが目的を遂行し、言及された目標および利点を達成するのに適していることを、イムノアッセイに本来備わっているものと同様にただちに認識するであろう。本明細書に記載する分子複合体および方法、手順、処置、分子、特異性化合物は好ましい実施形態を現在表し、例示的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書で開示された本開示に様々な代替および修正が行われ得ることが当業者には明らかとなる。
【０１７８】
明細書で言及したすべての特許および刊行物は、本開示が関わる当業者の水準を示す。すべての特許および刊行物は、個別の刊行物がそれぞれ具体的および個別に参照により組み入れられていることが示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられている。
【０１７９】
本明細書に例として記載した本開示は、本明細書で具体的に開示されていないいずれかの１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定の非存在下で好適に実施され得る。このため，例えば各例において、「含む」、「から本質的に成る」および「から成る」という用語のいずれも他の２つの用語のどちらかと置き換えられ得る。用いられた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用において、提示および説明された特徴のいずれかの均等物またはこれの一部を除外する意図はないが、請求された本開示の範囲内での各種の修正が可能であることが認識される。このため本開示は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書で開示した概念の修正および変更が当業者によって用いられ得ること、およびこのような修正および変更が添付請求項によって定義されるような本発明の範囲内であることが理解されるべきである。
【０１８０】
上記の説明が本発明の範囲を限定するのではなく、例証するものであることが理解されるはずである。本発明の他の態様、利点および修正は、下で述べる請求項の所期の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2013513108.tif 000036
【図７】
2013513108.tif 000037
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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