(57)【要約】  本発明は、胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方法および組成物を提供する。特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の大きなパネルが同定された。一定のこれらＤＭＲは、成人女性の血液ＤＮＡにおいては低メチル化され、胎児ＤＮＡにおいては高メチル化されているが、その他は、成人女性の血液ＤＮＡにおいては高メチル化され、胎児ＤＮＡにおいては低メチル化されている。さらに、成人女性ＤＮＡにおいて低メチル化され、胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されているＤＭＲは、妊娠中の母体血液試料に存在する胎児ＤＮＡの胎児異数性を正確に予測した。本発明の方法において、高メチル化ＤＮＡは、好ましくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により、低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される。2013517789.tif 000317
2013517789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体血液の試料を使用した胎児異数性の出生前診断の方法であって、
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定する工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を前記複数のＤＭＲの標準参照高メチル化値と比較する工程；および
ｄ）前記比較に基づき、胎児異数性を診断する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
母体血液試料が母体の末梢血試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高メチル化ＤＮＡが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、該高メチル化ＤＮＡが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
高メチル化ＤＮＡがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）により増幅される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されたリストから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも３個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも５個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも８個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも１０個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されるリストから選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高メチル化ＤＮＡ試料における複数のＤＭＲレベルが、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、複数のＤＭＲのレベルが未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体においても決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２１トリソミー診断のための複数のＤＭＲが２１番染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数のＤＭＲが、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択された染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
母体の末梢血試料を使用した２１トリソミーの出生前診断の方法であって、
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体末梢血の試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）レベルを決定する工程であって、
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含み、および
複数のＤＭＲレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を２１番染色体上の前記複数のＤＭＲの標準正常参照高メチル化値と比較する工程；ならびに
ｄ）前記比較に基づき２１トリソミーを診断する工程
を含む、前記方法。
【請求項２１】
高メチル化ＤＮＡが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、高メチル化ＤＮＡが増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
高メチル化ＤＮＡがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）により増幅される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、複数のＤＭＲレベルが未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体においても決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が、正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ２１トリソミーの診断が下される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
胎児異数性の診断に利用するのに適し、関心対象の染色体上にある特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する方法であって、
ａ）以下：
（ｉ）正常の成人女性の末梢血ＤＮＡ試料（ＰＢ試料）；および
（ｉｉ）正常な胎盤ＤＮＡ試料（ＰＬ試料）
を提供する工程；
ｂ）以下：
（ｉ）分離されたＰＢ試料；および
（ｉｉｉ）分離されたＰＬ試料
を得るために、ａ）の各試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程；
ｃ）ｂ）の分離された各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程；および
ｄ）分離されたＰＢ試料では低メチル化され、かつ分離されたＰＬ試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する、工程
を含む、前記方法。
【請求項２８】
ＰＬ試料が二つの異なる試料、すなわち、第１トリメスターＰＬ試料および第３トリメスターＰＬ試料を含み、前記工程ｄ）が、第１トリメスターの分離ＰＬ試料および第３トリメスターの分離ＰＬ試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
関心対象の染色体が２１番染色体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
関心対象の染色体が、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
異数性がトリソミーまたはモノソミーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
以下を含む２１トリソミーの出生前診断キット：
ａ）２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定するための、１種または複数種の核酸組成物；および
ｂ）２１トリソミーの出生前診断のための核酸組成物の利用ガイド。
【請求項３３】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されたリストから選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
染色体２１上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４３）、および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
核酸組成物が、
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、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３８】
血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段が、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させる抗体を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
高メチル化ＤＮＡを増幅する手段をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
高メチル化ＤＮＡを増幅する手段が、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を行うためのオリゴヌクレオチドリンカーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
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、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種の単離オリゴヌクレオチドプライマーを含む、核酸組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
出生前診断は現在、従来の細胞遺伝学的解析（核型分類等）またはＤＮＡ解析（ＱＦ−ＰＣＲ等）を使って行われているが、これらは、羊水穿刺、絨毛採取または臍帯穿刺により採取する胎児の遺伝物質を必要とする。しかし、これらは侵襲性手順であり、胎児喪失という重大なリスクと関連する（絨毛採取および羊水穿刺の０．５〜１％）（Ｈｕｌｔeｎ，Ｍ．Ａ．ら（２００３）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ１２６：２７９−２９７（非特許文献１））。有効な出生前診断検査の必要性は、特に、２１トリソミー症候群としても知られているダウン症候群の場合は緊急性を擁する。ダウン症候群は精神遅滞の最多発な形式と考えられており、世界の全人口の７００人に１人の割合で発生する。しかし、現在の出生前検査に伴うリスクのため、出生前診断は高リスク妊娠（全妊娠の６〜８％）にのみ行われており、母体の漿液スクリーニングおよび胎児の超音波検査法に基づき評価されている。よって、非侵襲性診断と一般に称されている、胎児を危険にさらさない診断手順の開発が緊急に必要とされている。
【０００２】
胎児のフリーＤＮＡ（ｆｆＤＮＡ）は、妊娠中の母体循環で発見されており（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．ら（１９９７）Ｌａｎｃｅｔ３５０：４８５−４８７（非特許文献２））、非侵襲性出生前診断開発に向けた代替的アプローチとして注目を浴びてきた。ｆｆＤＮＡは、母体血漿から胎児の性別および胎児のＲｈＤ状態を診断するためにすでに問題なく活用されている（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．ら（１９９８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１７３４−１７３８（非特許文献３）；Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｗ．ら（２００５）Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０６：８４１−８４４（非特許文献４））。しかしながら、大量の母体ＤＮＡの中の限られた量のｆｆＤＮＡ（３〜６％）による直接解析は、胎児異数性の非侵襲性検査の開発にとっては大きな課題である。
【０００３】
当分野における最近の進歩により、ｆｆＤＮＡの物理的および分子的特性を、母体の循環ＤＮＡから区別するために、または胎児のＤＮＡを濃縮する手段として使用できることが示された（Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．ら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：８８−９２（非特許文献５）；Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．ら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：３５−４１（非特許文献６））。例えば、胎児のＤＮＡは通常，循環の母体ＤＮＡよりも長さが短いため、胎児のＤＮＡを濃縮するために、血漿ＤＮＡのサイズ分画が行われてきた（Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．ら（２００４）、ｓｕｐｒａ）。さらに、母体血漿中のｆｆＤＮＡは胎盤由来であるという根拠に基づき、母体の末梢（全体）血液と胎盤ＤＮＡとの間のエピジェネティックな差分が、胎児由来の母体血漿中の低メチル化遺伝子配列（ｍａｓｐｉｎ／ＳＥＲＰＩＮＢ５）の検知のために使われてきた（Ｍａｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４１：２８９−２９２（非特許文献７）；Ｆｉｏｒｉ，Ｅ．ら（２００４）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９：７２３−７２４（非特許文献８）；Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１４７５３−１４７５８（非特許文献９））。その後、３番染色体上のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子並びに２１番染色体上のマーカーを含む、胎児特異的エピジェネティック分子マーカーが少数ではあるが新たに加えられ、詳細が記された（Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：９４１−９５０（非特許文献１０）；Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ１５：２２７−２３５（非特許文献１１）；Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５４：５００−５１１（非特許文献１２））。
【０００４】
これらの研究は、胎児ＤＮＡ（絨毛採取により採取する胎盤ＤＮＡ）と母体末梢血ＤＮＡのエピジェネティック差分が、非侵襲性出生前診断用の胎児分子マーカーとなる可能性のあることを示しているが、現時点においては、限られた数の遺伝子領域のみが同定され、または検査されている。多くの研究が、単一の遺伝子プロモーター領域に注目している（Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００５）ｓｕｐｒａ；Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）、ｓｕｐｒａ）。一方、２１番染色体上のＣｐＧアイランドを研究しているものある（Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）ｓｕｐｒａ；Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００８）ｓｕｐｒａ）が、これらの研究は、染色体の小断片のみを対象としている（Ｆａｚｚａｒｉ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：４４６−４５５（非特許文献１３））。
【０００５】
非侵襲性出生前診断にｆｆＤＮＡを用いて開発された現在の方法は、数的制限を受ける。現在研究中のある方法は、低メチル化された母体ＤＮＡを取り除き、よってｆｆＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）分析を直接行うことができるようにする、メチル化感受性制限酵素の使用が含まれている（Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）、ｓｕｐｒａ）。しかし、メチル化感受性制限酵素により認識できるよう制限部位を含むために求められる特異的メチル化ＤＮＡ領域に対する要件により、検査に適した領域の数は制限される。現在研究中の別の方法では、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの間の異なるメチル化を区別できるよう、亜硫酸水素ナトリウム変換の利用が含まれる。この方式では、亜硫酸水素ナトリウム変換の後に、メチル化特異的ＰＣＲかまたはメチル化感受性一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長および／または亜硫酸水素シークエンシングのいずれかを行う（Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００５）ｓｕｐｒａ；Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）ｓｕｐｒａ；Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００８）ｓｕｐｒａ）。しかし、この方式には主に２つの問題がある。第一に、亜硫酸水素変換後のメチル化状態を正確に解析できるかどうかは、非メチル化シトシンがウラシルに完全に変換したかどうかによるが、この状態になるのは稀である。第二に、亜硫酸水素処理後に得られたＤＮＡの分解（Ｇｒｕｎａｕ，Ｃ．ら（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ６５−５（非特許文献１４）に記載）は、検査および極端に微量の胎児ＤＮＡの定量をさらに複雑にする。
【０００６】
最近の別の方式は、スループットショットガンシークエンシング法を用いて、妊婦の血漿由来無細胞ＤＮＡを直接配列することである（Ｆａｎ，Ｈ．Ｃ．ら（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：１６２６６−７１；Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．ら（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０５：２０４５８−６３）。しかし、この方式は技術的に要求が高く、高コストでもあるため、大部分の診断研究所においては実用は極めて困難である。
【０００７】
従って、胎児喪失のリスクを削減し、単に高リスク妊娠のみならず、全ての妊娠のスクリーニングを可能とするため、胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方式および方法が別途必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｕｌｔeｎ，Ｍ．Ａ．ら（２００３）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ１２６：２７９−２９７
【非特許文献２】Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．ら（１９９７）Ｌａｎｃｅｔ３５０：４８５−４８７
【非特許文献３】Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．ら（１９９８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１７３４−１７３８
【非特許文献４】Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｗ．ら（２００５）Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０６：８４１−８４４
【非特許文献５】Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．ら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：８８−９２
【非特許文献６】Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．ら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：３５−４１
【非特許文献７】Ｍａｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４１：２８９−２９２
【非特許文献８】Ｆｉｏｒｉ，Ｅ．ら（２００４）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９：７２３−７２４
【非特許文献９】Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１４７５３−１４７５８
【非特許文献１０】Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：９４１−９５０
【非特許文献１１】Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ら（２００７）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ１５：２２７−２３５
【非特許文献１２】Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５４：５００−５１１
【非特許文献１３】Ｆａｚｚａｒｉ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：４４６−４５５
【非特許文献１４】Ｇｒｕｎａｕ，Ｃ．ら（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ６５−５
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ｆｆＤＮＡの検知に基づく、非侵襲性出生前診断の新たな方式を提供する。検査対象の各染色体（１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体）上の多数の（２０００超）特異的メチル化領域（ＤＭＲ）は、女性の末梢血と胎児のＤＮＡ（胎盤ＤＮＡ）で特異的にメチル化されるが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）と高解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析を組み合わせたシステムを利用してすでに同定されており、それにより高スループット方式で全染色体のＤＮＡメチル化パターン同定が可能となる。さらに、胎児ＤＮＡで高メチル化され、女性の末梢血で低メチル化されているこれらＤＭＲのサブセットの代表的な例を用いて、２１トリソミーを正確に予測した。その手法は、一般には妊娠期間の第１トリメスターの母体血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離し、その後、高メチル化ＤＮＡ試料中の複数のＤＭＲのレベルを決定することに基づく。よって、開示されたＤＭＲおよび胎児異数性診断方法の有効性が示された。
【００１０】
従って、１つの態様においては、本発明は、母体の血液試料を用いる、胎児異数性の出生前診断の方法に関連する。当該方法は、以下の工程を含む：
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化ＤＮＡおよび低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定する工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、前記複数のＤＭＲの標準参照高メチル化値（例えば、妊娠月齢が符合する正常な母体の参照高メチル化値）と比較する工程；および
ｄ）前記比較に基づく胎児異数性の診断を行う工程。
【００１１】
好ましい実施形態では、母体の血液試料は、母体の末梢血試料である。高メチル化ＤＮＡは、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により、低メチル化ＤＮＡから物理的に分離されることが好ましい。高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離した後、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）等により高メチル化ＤＮＡを増幅することが好ましい。
【００１２】
複数のＤＭＲは、添付Ａ〜Ｅに示されるリストから選択されることが好ましい。様々な実施形態において、複数のＤＭＲのレベルは、例えば添付のＡ〜Ｅに示されるリストから選択し、少なくとも３個のＤＭＲ、少なくとも５個のＤＭＲ、少なくとも８個のＤＭＲ、少なくとも１０個のＤＭＲまたは少なくとも１２個のＤＭＲで決定される。さらに、コントロール領域（例えば、２つのコントロール領域）を使用することも可能である。高メチル化ＤＮＡ試料中の複数のＤＭＲのレベルは、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定されることが好ましい。
【００１３】
１つの実施形態では、複数のＤＭＲのレベルは、ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体において決定される。
【００１４】
好ましくは、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、例えば、正常な胎児を妊娠している女性由来の母体ＤＮＡにより定められる標準参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が、標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される。
【００１５】
好ましい実施形態では、２１トリソミーの診断には、複数のＤＭＲが２１番染色体上に存在する。２１番染色体上の複数のＤＭＲは、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域、５個またはそれ以上の領域、あるいは８個またはそれ以上の領域を含む。２１トリソミー診断に使用される２１番染色体上の好ましいＤＭＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６、３７、３８、３９、４０、４２、４３および４４である。他の実施形態において、複数のＤＭＲは、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される染色体上にある。
【００１６】
別の態様では、本発明は、母体の末梢血試料を使って２１トリソミーの出生前診断を行う方法に関する。当該方法には、以下が含まれる:
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体の末梢血試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定する工程であって、
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含み、および
複数のＤＭＲのレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、２１番染色体上の前記複数のＤＭＲの、標準正常参照高メチル化値と比較する工程；および
ｄ）前記比較に基づき２１トリソミーを診断する工程。
２１トリソミー診断に使用される２１番染色体上の好ましいＤＭＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６、３７、３８、３９、４０、４２、４３および４４である。高メチル化ＤＮＡは、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離されることが好ましい。高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）等により高メチル化ＤＮＡを増幅することが好ましい。
【００１７】
１つの実施形態では、複数のＤＭＲのレベルはまた、ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体で決定される。
【００１８】
別の実施形態では、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値は、正常な母体の血液試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡの高メチル化値が、標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、２１トリソミーの診断が下される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、胎児の異数性診断の利用に適する、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する方法に関する。当該方法には以下が含まれる。
ａ）以下：
（ｉ）正常な成人女性の末梢血ＤＮＡ試料（ＰＢ試料）、および
（ｉｉ）正常な胎盤ＤＮＡ試料（ＰＬ試料）
を提供する工程；
ｂ）以下：
（ｉ）分離したＰＢ試料、および
（ｉｉｉ）分離したＰＬ試料
を得るために、ａ）の各試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程；
ｃ）ｂ）の各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程；および
ｄ）分離されたＰＢ試料では低メチル化され、分離されたＰＬ試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する、工程。
【００２０】
１つの実施形態では、ＰＬ試料は２つの異なる試料、すなわち、妊娠第１トリメスターＰＬ試料および妊娠第３トリメスターＰＬ試料を含み、前記工程ｄ）においてさらに、第１トリメスターの分離ＰＬ試料および第３トリメスターの分離ＰＬ試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択することが含まれる。好ましい実施形態では、関心対象の染色体は２１番染色体である。その他の実施形態では、関心対象の染色体は、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される。好ましい実施形態では、異数性はトリソミーである。別の実施形態では、異数性はモノソミーである。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、２１トリソミーの出生前診断のキットに関する。当該キットは以下を含む。
a)   ２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定するための、１種または複数種の核酸組成物；および
b)   ２１トリソミーの出生前診断のための核酸組成物のための利用ガイド。
【００２２】
２１番染色体上の複数のＤＭＲは、添付Ａに示されるリストから選択されるのが好ましい。さらに好ましいのは、２１番染色体上の複数のＤＭＲは、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上、５個またはそれ以上、あるいは８個またはそれ以上の領域を含む。２１トリソミーの診断に利用される２１番染色体上の好ましいＤＭＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６、３７、３８、３９、４０、４２、４３および４４である。
【００２３】
キットの好ましい実施形態では、核酸組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ１〜２４、およびそれらの組み合わせから成る群から選択された、１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。別の実施形態では、キットにはさらに、コントロール領域検知のためのオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、２種またはそれ以上）が含まれる。別の実施形態では、キットにはさらに、血液試料中で、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段が含まれる。好ましくは、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段には、メチル化ＤＮＡを免疫沈降する抗体が含まれる。別の実施形態では、キットにはさらに、高メチル化ＤＮＡを増幅する手段が含まれ得る。好ましい実施形態では、高メチル化ＤＮＡを増幅する手段には、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を行うためのオリゴヌクレオチドリンカーおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜２４、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種の単離オリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】オリゴヌクレオチドアレイにより評価されたＣＨＲ２１（Ａ）領域のＤＮＡメチル化濃縮を示した図である。本図は、第３トリメスターの胎盤、末梢（全体）血液、末梢（全体）血液の個々のメチル化状態、第１トリメスターおよび第３トリメスター胎盤ＤＮＡ試料の間のメチル化差分を示している。
【図２】末梢血、第１トリメスターおよび第３トリメスター胎盤ＤＮＡ試料を使用し、オリゴヌクレオチドアレイおよびリアルタイム定量ＰＣＲにより、ＣＨＲ２１（Ａ）のＤＮＡメチル化濃縮を比較した図である。Ｙ軸は、末梢血ＤＮＡ試料と比較した胎盤の相対的濃縮倍率を示しており、Ｘ軸は、ｂｐの染色体位置を示している。灰色の線は、２１番染色体の特定領域を覆うオリゴヌクレオチドを表し、黒い線は、リアルタイム定量ＰＣＲを実施した際のＰＣＲ産物（ＣＨＲ２１（Ａ１）およびＣＨＲ２１（Ａ２））を表している。点線は、第１トリメスター胎盤から得た結果を表し、実線は、第３トリメスター胎盤から得た結果を示している。
【図３】メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）およびインプットした複製ＤＮＡ試料のリアルタイム定量ＰＣＲによるＣＨＲ２１（Ｂ４）ＤＮＡメチル化濃縮を示す棒グラフである。棒グラフの白抜き棒は、末梢（全体）血液試料であり、灰色棒は第１トリメスター胎盤ＤＮＡ試料、黒色棒は第３トリメスター胎盤ＤＮＡ試料を示している。ＷＢは全体（末梢）血液で、ＰＬは胎盤のことである。
【図４】リアルタイム定量ＰＣＲを用いたＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）のＤＮＡメチル化濃縮を示す棒グラフである。棒グラフの棒は、末梢（全体）血液と比較したインプットＤＮＡであり、黒色棒は末梢（全体）血液と比較した免疫沈降ＤＮＡであり、１ＰＬおよび２ＰＬは、第３トリメスターの胎盤、３ＰＬは第１トリメスターの胎盤である。ＷＢは全体（末梢）血液で、Ｐは胎盤である。
【図５】特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の同定方法を示したフローチャート図である。
【図６】２１トリソミーの非侵襲性出生前診断（ＮＩＤ２１）の開発および検証の方法論を示すフローチャート図である。
【図７】２１番染色体に位置する胎児特異的ＤＮＡメチル化領域の相対量により、母体の末梢血解析を通じて２１トリソミーを非侵襲性に検知するためのＤＮＡメチル化比率戦略を示す略図である。
【図８】ＤＮＡメチル化比率決定のための解析手法の略図である。
【図９】正常なケースおよび２１トリソミーケースにおける４つの特異的メチル化領域、すなわち、ＥＰ１、ＥＰ４、ＥＰ７およびＥＰ１０から得られた結果の箱髭図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、胎児ＤＮＡでは高メチル化、母体ＤＮＡでは低メチル化を示す、特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の大きなパネルを発明者が同定したことに、少なくとも部分的に基づいている。もっとさらに、本発明は、化学的に変性させることなく、または酵素的に高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡ試料を消化することなく、２つのＤＮＡ群を物理的に分離することにより、高メチル化胎児ＤＮＡを低メチル化母体ＤＮＡから精製することができ、よって高メチル化胎児ＤＮＡが濃縮した試料となることを、本発明者が示したことに基づき、少なくとも部分的に基づいている。もっとさらに、本発明者は、本明細書で開示されるＤＭＲの代表的実施例を用いて、母体の末梢血試料のパネルで、２１トリソミーを正確に診断し、よって、同定されたＤＭＲと開示された胎児異数性の診断法の有効性を提示した。
【００２７】
本開示の様々な態様については、以下のサブセクションにさらに詳細が記述される。
【００２８】
Ｉ．胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方法
１つの態様では、本発明は、母体の血液試料を用いて、胎児異数性の出生前診断を行う方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる。
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体の血試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離し；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定し；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、前記複数のＤＭＲの標準参照高メチル化値（例えば、後述する、標準正常参照高メチル化値）と比較し；および
ｄ）前記比較に基づき胎児異数性を診断する。
【００２９】
母体の血液試料
母体の血液試料は、針および注射器を用いる等の標準的技法により得られる。好ましい実施形態では、母体の血液試料は母体の末梢血試料である。代わりに、母体の血液試料は、母体の血漿試料等の末梢血の切片部分であり得る。いったん血液試料が得られると、標準的技法を用いて試料からＤＮＡ全体を抽出することができる。標準的技法の非限定的例の１つが、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社）である。一般には、ＤＮＡ全体はその後断片化し、好ましくは、約３００ｂｐ〜８００ｂｐの大きさに断片化する。例えば、ＤＮＡ全体は高周波により分解され得る。
【００３０】
高メチル化ＤＮＡの低メチル化ＤＮＡからの分離
本方法において、高メチル化ＤＮＡは、高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される。この物理的分離は、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により行われることが好ましく、この技法は当業者の間ですでに詳細が記されている（例えば、Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．ら（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：８５３−８６２；およびＲａｋｙａｎ，ら（２００８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１８：１５１８−１５２９を参照のこと）。これらは共に、本明細書に引用により明示的に含まれるものとする。
【００３１】
ＭｅＤｉＰ技法では、インプットＤＮＡは変性し、５−メチルシトシンに対抗する抗体でインキュベートされ、その後、メチル化されたＤＮＡは免疫沈降により単離される。例えば、免疫沈降を達成するためには、抗５−メチルシトシン抗体を固相担体（例えば、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｂｅａｄｓ、巨視的なアガロースビーズまたは常磁性ビーズ）と結合させ、メチル化されたＤＮＡが溶液中から沈殿するようにし得る（直接免疫沈殿）。代わりに、抗５−メチルシトシン抗体（例えば、抗体の一定領域）を認識し、固相担体と結合し、よってメチル化ＤＮＡを溶液から沈殿させる（直接免疫沈殿）という、第二の抗体または試薬を使用することもできる。直接または間接免疫沈殿にとって、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン系等、試料内の成分を物理的に分離する方法として、当業者の間で知られているその他の方式を使用することもできる。例えば、抗５−メチルシトシン抗体をビオチンと結合させ、その後、固相担体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを使い、メチル化ＤＮＡを溶液から沈殿させることもできる。免疫沈殿を生じさせる方法として当業者の間で知られているその他の様々な方法も、本発明に適していることは、通常の当業者には明らかであろう。よって、本明細書で使用する「メチル化されたＤＮＡの免疫沈殿」すなわち「ＭｅＤｉＰ」という用語は、高メチル化ＤＮＡと低メチル化ＤＮＡの間を区別する抗体を、母体の血液試料のＤＮＡと接触させ、その後、高メチル化ＤＮＡ（すなわち、抗体と特異的に結合するＤＮＡ）を溶液から沈殿させる、任意のおよび全ての方式を包含するよう意図されている。
【００３２】
高メチル化ＤＮＡを母体の血液試料由来の低メチル化ＤＮＡから物理的に分離させる点において、試料のＤＮＡは化学的に変性もされず、酵素的に消化されることもない。本明細書で使用する「化学的変性」という用語は、ＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウム変換等、高メチル化ＤＮＡと低メチル化ＤＮＡを区別する非抗体化学物質と反応させることを意味するよう意図されている。よって、即時方法において、母体の血液試料由来のＤＮＡは、亜硫酸水素ナトリウム変換を受けず、または、高メチル化ＤＮＡと低メチル化ＤＮＡを区別するその他類似の（非抗体の）いかなる化学反応にもさらされない。さらに、本明細書で使用する「酵素的に消化する」という用語は、ＤＮＡを、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素と反応させ、よって高メチル化ＤＮＡを除去するという意味であるよう意図している。よって、即時方法において、母体の血液試料由来のＤＮＡは、高メチル化ＤＮＡと低メチル化ＤＮＡを区別するために、メチル化感受性制限酵素で処理されることはない。
【００３３】
しかし、母体の末梢血試料由来ＤＮＡの断片化（通常、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから分離する前に行われる）は、通常は超音波せん断によるが、制限酵素によるＤＮＡ消化によっても成し遂げられる。しかしながら、断片化を達成するためのそのような一般的なＤＮＡ消化は、メチル化感受性制限酵素では行われない。よって、母体の血液試料由来のＤＮＡが「酵素的に消化」しないようにする要件として、母体の血液試料ＤＮＡの全般的断片化（すなわち、サイズ縮減）を達成するために、非メチル化感受性制限酵素の利用を排除すること意図しない。
【００３４】
ＤＮＡ増幅
診断法では、通常は、母体の血液試料における高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離した後に、高メチル化ＤＮＡを増幅する。本明細書で使用する「増幅」という用語は、ＤＮＡのコピーが追加され、よって、ＤＮＡのコピー数が増加するという意味であることを意図している。ＤＮＡのコピーは、通常は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて達成される。高メチル化ＤＮＡ増幅の好ましい方法は、当業者によりすでに詳述されている、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）である（例えば、Ｒｅｎ，Ｂ．ら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２：２３０６−２３０９；およびＯｂｅｒｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７６：３１５−３３４を参照のこと；双方の内容は、本明細書に引用により明示的に含まれるものとする）。ＬＭ−ＰＣＲでは、平滑末端ライゲーションを通じてリンカー末端が試料のＤＮＡ断片に連結し、その後、リンカー末端のヌクレオチド配列を認識したオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲで使用され、よって、リンカーが連結したＤＮＡ断片が増幅される。よって、即時診断方法の好ましい実施形態では、母体の血液試料由来のＤＮＡが断片化した後（例えば、約３００〜８００ｂｐの断片になる）、および高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される前に（例えば、ＭｅＤｉＰにより）、リンカーアームは、平滑末端ライゲーションにより断片化されたＤＮＡに連結する。その後、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離した後、回収した高メチル化ＤＮＡに対し、ＤＮＡにすでに連結しているリンカー末端を認識したヌクレオチドプライマーを使ってＰＣＲ処理を行う。これにより、高メチル化ＤＮＡ試料が増幅される。
【００３５】
特異的メチル化領域（ＤＭＲ）
本発明の診断法として、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）が使われる。本明細書で使用する「特異的メチル化領域」または「ＤＭＲ」という用語は、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの間で特異的にメチル化された染色体ＤＮＡの領域を指していることを意図しており、本発明の目的から、好ましい選択ＤＭＲは、胎児ＤＮＡでは高メチル化され、母体では低メチル化されている領域である。すなわち、これらの領域（選択されたＤＭＲ）では、母体ＤＮＡに比べて、胎児ＤＮＡメチル化の度合いが高い（すなわち、数が多い）。
【００３６】
理論的には、関心対象の染色体に上記の特徴を有する任意のＤＭＲは、即時診断法に用いることができる。特に、当該ＤＭＲを同定する方法については、以下および実施例（実施例１および２を参照のこと）において詳細を記述する。さらに、１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹの各染色体のＤＭＲの大きなパネル（約２０００）は、様々な診断での利用に適しているが、ここに同定された。当該ＤＭＲは、添付Ａ〜Ｅのリストに示されており、２１番、１３番、１８番、ＸおよびＹ染色体それぞれに選択したＤＭＲを提供している。
【００３７】
本明細書で使用する「複数のＤＭＲ」という用語は、２個またはそれ以上のＤＭＲを意味するよう意図している。好ましい実施形態では、複数のＤＭＲは、２１番、１３番、１８番、ＸまたはＹ染色体それぞれについて、添付Ａ〜Ｅに示されているリストから選択される。様々な実施形態では、複数のＤＭＲのレベルは、少なくとも２つのＤＭＲ、少なくとも３個のＤＭＲ、少なくとも４個のＤＭＲ、少なくとも５個のＤＭＲ、少なくとも６個のＤＭＲ、少なくとも７個のＤＭＲ、少なくとも８個のＤＭＲ、少なくとも９個のＤＭＲ、少なくとも１０個のＤＭＲ、少なくとも１１個のＤＭＲまたは少なくとも１２個のＤＭＲについて決定される。繰り返しになるが、複数のＤＭＲは、添付Ａ〜Ｅに示されるリストから選択されるのが最も好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態では、複数のＤＭＲは、２１トリソミーの診断用に２１番染色体上に存在する。特に好ましい実施形態では、２１番染色体上の複数のＤＭＲは、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される２個またはそれ以上の領域、３個またはそれ以上の領域、４個またはそれ以上の領域、５個またはそれ以上の領域、６個またはそれ以上の領域、７個またはそれ以上の領域、８個またはそれ以上の領域、９個またはそれ以上の領域、１０個またはそれ以上の領域、１１個またはそれ以上の領域、あるいは１２個の領域が含まれる。これら領域の用語法に関して、「塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４」（等）という用語は、２１番染色体上の特異的メチル化領域の最初と最後の塩基のペアのことである。よって、代表的なＤＭＲとして２１番染色体の「塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４」の場合、このＤＭＲには、塩基対が３９２７９８５６で始まり、３９２８０００４で終わる（よって、この領域は１４８の塩基対から成る）２１番染色体上の領域が含まれる。先に列記したＤＭＲを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーについては、実施例３および表７にさらに詳述し、またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜２４に示されている。先に列記したＤＭＲのヌクレオチド配列は、表８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３３〜４４に示されている。
【００３９】
実施例３に詳細を記載するが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ３３〜４４に示されている１２個のＤＭＲのうち８個のサブセットがすでに選択されており、２１トリソミー胎児を妊娠した女性の妊娠期間中に母体から採取する血液試料で２１トリソミーを正確に診断するのに十分であることが確認されている。本発明の２１トリソミー診断法で使用される、２１番染色体上の８個の好ましいＤＭＲは、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）から成る。
【００４０】
様々なその他の実施形態において、複数のＤＭＲは、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される染色体上に存在し、これら任意の染色体の異数性診断を可能にする。
【００４１】
コントロールＤＭＲもまた、本発明の診断法で用いることができる。例えば、高メチル化状態であるとして知られているもう一つのＤＭＲを、高メチル化のコントロールとして診断法に含めることもできる。好ましいコントロールメチル化領域にはＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２５および２６に示されている。また、好ましいコントロールメチル化領域には、ＣＨＲ１３（ＨＹＰ２）も含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２７および２８に示されている。さらに、ＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）の増幅したＰＣＲ産物のヌクレオチド配列は、表８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されている。さらに、または代わって、高メチル化状態であるとして知られているもう一つのＤＭＲを、高メチル化コントロールとして診断方法に含めることもできる。好ましい低メチル化コントロール領域にはＣＨＲ２２（Ｕ１）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２９および３０に示されている。また、好ましい低メチル化コントロール領域にはＣＨＲ２２（Ｕ２）が含まれ、そのプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３１および３２に示されている。さらに、ＣＨＲ２２（Ｕ１）の増幅されたＰＣＲ産物のヌクレオチド配列は、表８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に示されている。コントロールＤＭＲおよびそのプライマーについては、実施例１でさらに議論し、表６、７および８でさらに記述する。
【００４２】
添付Ａ〜Ｅに示される任意のＤＭＲの実際のヌクレオチド配列は、当業者に周知のその他の情報と共に、本明細書で提供される情報から容易に取得できる。より具体的には、添付Ａ〜Ｅに示されている各ＤＭＲは、先に述べた通り、２１番染色体の「塩基３９２７９８５６−３９２８０００４」等、特定の染色体の塩基対の始まりと終わりにより定められる。ヒトの２１番、１３番、１８番、ＸおよびＹ染色体のそれぞれの完全なヌクレオチド配列は、すでに決定しており、当業者の間で公に利用可能である。例えば、これら５つの各染色体の完全なヌクレオチド配列は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ、  Ｂｕｉｌｄ  ３６  （ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）から取得できる。さらに、前記染色体上に伸びるＤＮＡの実際のヌクレオチド配列を得るため、５つの染色体それぞれの特定のＤＭＲそれぞれの塩基対の始点および終点を具体的にＧｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒにインプットすることもできる。さらに、その後、標準的な分子生物学的手法を用いて、ＤＭＲのヌクレオチド配列に基づき、ＤＭＲを検知および／または増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。従って、本明細書で提供される、添付Ａ〜ＥのＤＭＲそれぞれの塩基対始点および終点の情報を元に、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒから取得可能な染色体配列等、当業者の間で周知のその他の染色体配列を用いて、普通の当業者であれば本情報から容易に取得できる、これらＤＭＲのヌクレオチド配列と共に、添付Ａ〜Ｅに示されるＤＭＲそれぞれの完全なヌクレオチド配列を、よってここに、本明細書に引用により明示的に含むものとする。
【００４３】
ＤＭＲのレベルの決定
即時診断法において、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離し、好ましくは、回収した高メチル化ＤＮＡを増幅した後、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルが高メチル化ＤＮＡ試料において決定され、よって、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が得られる。
【００４４】
本明細書で使用されている「複数のＤＭＲのレベルが決定される」という表現は、ＤＭＲの量、または大きさ、あるいはコピーの数が決定されることを意味するよう意図されている。この塩基は、胎児異数性を有する胎児において、正常の胎児と比較して、異数性の結果ＤＭＲの量が多い（すなわち、コピーの数が大きい）。好ましい実施形態では、高メチル化ＤＮＡにおける複数のＤＭＲのレベルは、当業者の間で確立した技法である、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される。リアルタイムＱＰＣＲの代表的な、非制限条件については、実施例において記載される。
【００４５】
ある実施形態において、複数のＤＭＲのレベルはまた、ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体において決定される（例えば、リアルタイムＱＰＣＲ）。本明細書で使用される「未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体」という用語は、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離するための処理がまだなされていない母体の血液から取得されるＤＮＡ試料のことを指すよう意図されている。
【００４６】
複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルは、高メチル化ＤＮＡ試料において決定され、よって、高メチル化ＤＮＡ試料の「高メチル化値」が得られる。本明細書で使用されている「高メチル化値」という用語は、試料中ＤＭＲレベルの任意の数量的表現を包含するよう意図されている。例えば、リアルタイムＱＰＣＲから取得した生データは、高メチル化ＤＮＡ試料中の複数のＤＭＲそれぞれのレベルを表示する、１つまたは複数の数値を取得するために、様々なコントロールおよび統計的分析に基づいて正規化される。試料に応用可能な、コントロールおよび統計的分析の代表的な非制限的実施例については、実施例３において詳細が記載される。しかし、実施例においてデータを評価するために使用される特定の統計検査は代表的な実施形態であり、実施例および図により提供されているガイダンスに基づけば、代替的統計手法も本発明に応用可能であることは、普通の当業者により理解されるであろう。
【００４７】
標準参照値との比較
いったん、母体の末梢血に存在する高メチル化された胎児ＤＮＡの高メチル化値（「検査ＤＮＡ」とも称される）が決定すると、この値を検査ＤＮＡで調べた同じ複数のＤＭＲの標準参照高メチル化値と比較し、これに基づき胎児異数性の診断（または、当該胎児異数性の非存在）が行われる。
【００４８】
通常は、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、正常な胎児の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が正常な胎児の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される。すなわち、母胎の末梢血に存在する正常な胎児のＤＮＡ（すなわち、胎児異数性の存在しない胎児のＤＮＡ）から取得されたデータに基づき、「正常な」高メチル化値が設定され、検査ＤＮＡの高メチル化値が「正常な」値よりも高い時、検査試料に対する胎児異数性の診断が下される。最も好ましいのは、標準正常参照高メチル化値が、「検査ＤＮＡ」と比べて妊娠期間が同じである（例えば、検査ＤＮＡが少なくとも妊娠期間３ヵ月の胎児であれば、標準正常参照高メチル化値は、妊娠期間３ヵ月の正常な胎児を妊娠した女性の母体末梢血を用いて決定される）正常な胎児（すなわち、胎児異数性を有しない胎児）を妊娠した女性から採取された母胎末梢血液試料を用いて決定されることである。例えば、標準正常参照高メチル化値を１と設定することもでき、その場合、検査ＤＮＡの高メチル化値が１より大きければ、胎児の異常を示し、高メチル化値が１またはそれ以下であれば、胎児の正常を示す。
【００４９】
さらに、または代わって、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を胎児異数性の胎児の標準正常参照高メチル化値と比較することもでき、検査ＤＮＡ試料の高メチル化値が、胎児異数性の胎児の標準正常参照高メチル化値と比較して、胎児異数性の診断を行うことができる。すなわち、母体末梢血に存在する胎児異数性の胎児ＤＮＡ（すなわち、胎児異数性を有する胎児由来のＤＮＡ）から取得されたデータに基づき、標準化参照「異常」または「胎児異数性」高メチル化値を設定し、検査ＤＮＡ高メチル化値が、「異常」または「胎児異数性」値と同程度（類似、または同じ範囲）である時、胎児異数性の診断が下される。
【００５０】
正常な胎児の標準正常参照高メチル化値を確立するために、正常な胎児を妊娠した健康な妊婦のグループが選ばれた。これらの女性の妊娠期間は類似しており、子癇前症状、胎児染色体異数性、および早期陣痛等のスクリーニング条件に適した妊娠期間内にある。同様に、標準参照値は、健康な非妊婦のグループからの試料を使って確立することができる。選択された妊婦の健康状態および当該女性たちが妊娠している胎児は、女性の血圧監視、陣痛開始の記録および、ＣＶＳ並びに羊水穿刺を用いて胎児の遺伝子解析を行う等、十分に確立され、通常使用されている方法により確認されるが、これらに限定されるわけではない。さらに、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦として選ばれたグループは、正常な胎児の標準正常参照高メチル化値が統計的に正確となるよう、相当のサイズでなければならない。好ましくは、選択されたグループは、少なくとも１０名の女性を含む。
【００５１】
正常な胎児の標準正常参照高メチル化値を確立するために、正常な胎児を妊娠しているこれら妊婦由来の母体血液試料に、上記の診断法（ａ）および（ｂ）と同じ工程、すなわち、高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、（高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく）高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程を施し、その後、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料中の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定する。
【００５２】
同様に、「異常な」胎児の標準化参照高メチル化値は、上記の、「正常な」胎児の標準化参照高メチル化値を確立するための手法と同じ手法を使って確立することができる。但し、「異常な」参照値を確立するために使われる母体の血液試料は、従来の侵襲性診断法を用いて胎児異数性を有する胎児を妊娠していると診断された妊婦から採取される。
【００５３】
適切な統計解析手法について詳細を記載した実施例、特に実施例３は、ＤＮＡ試料から取得したデータの解析に用いられ得る。例えば、実施例に詳細を記載するように、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検査およびステップワイズモデル解析を用いた統計解析を行うことができる。しかし、実施例においてデータの評価を行うために用いられる特定の統計検査は、代表的な統計手法であり、実施例および図において提供されるガイダンスに基づき、代替的統計手法を本発明に応用することも可能であることは、普通の当業者であれば理解されるであろう。
【００５４】
ＩＩ．２１トリソミーの非侵襲性出生前診断検査
別の態様では、本発明は、２１トリソミー（本明細書では「ＮＩＤ２１検査」とも称される）の非侵襲性出生前診断検査を提供する。実施例３において詳細を記述するが、ＮＩＤ２１検査は、実施例１および２の記載に従って同定されたＤＭＲを使って開発し、有効化した。検査の開発において、正常２０および異常２０（すなわち、２１トリソミーを有する胎児を妊娠したことが判明した妊婦）から成る４０の事例から採取した母体の血液試料を使って、（本明細書に開示の）２１番染色体上の１２個のＤＭＲを調べた。結果の統計解析（実施例３において詳細を記述）により、最も情報量が豊富な染色体領域が明らかにされ、正常および異常事例全ての診断において１００％感受性および正確性に到達するのに、（当初試験した全部で１２個のＤＭＲのうち）８個の特定ＤＭＲのみで十分であった。
【００５５】
従って、別の態様においては、本発明は、母体末梢血の試料を使って、２１トリソミーの出生前診断を行う方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる：
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体末梢血試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離し；
ｂ）高メチル化ＤＮＡの高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定し、
ここで、２１番染色体上の複数のＤＭＲは、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含み、
ここで、複数のＤＭＲのレベルは、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定され；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、２１番染色体上の前記複数のＤＭＲの標準正常参照高メチル化値と比較し；および
ｄ）当該比較に基づき２１トリソミーを診断する。
【００５６】
好ましい実施形態では、２１番染色体上の複数のＤＭＲは、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４)のヌクレオチド配列を有する８領域から成る。
【００５７】
好ましくは、高メチル化ＤＮＡは、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）（上記セクションＩにおいて詳細を記述）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する。好ましくは、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離した後、例えばライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）（上記セクションＩにおいて詳細を記述）により、高メチル化ＤＮＡを増幅する。２１番染色体の上記ＤＭＲを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーについては、実施例３および図７においてさらに記述し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜２４に示す。
【００５８】
さらに、コントロールＤＭＲも診断法に利用することができる、例えば、高メチル化であるとして知られているもう一つのＤＭＲを、高メチル化のコントロールとして診断法に含めることができる。好ましい高メチル化コントロール領域にはＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２５および２６に示されている（および、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されている）。また、好ましいコントロール高メチルか領域にはＣＨＲ１３（ＨＹＰ２）も含まれ、そのプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２７および２８に示されている。さらに、または代わって、高メチル化状態であるとして知られているもう一つのＤＭＲを、高メチル化コントロールとして診断法に含むことができる。好ましい低メチル化コントロール領域にはＣＨＲ２２（Ｕ１）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２９および３０に示されている（および、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に示されている）。並びに、好ましい低メチル化コントロール領域にはＣＨＲ２２（Ｕ２）も含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３１および３２に示されている。よって、コントロールＤＭＲおよびプライマーについては実施例１においてさらに論じ、表６で詳述する。
【００５９】
１つの実施形態では、複数のＤＭＲのレベルは、ＬＭ−ＰＣＲ効率（上記セクションＩにおいて詳細を記述）のコントロールとして、未処理の母体血液ＤＮＡ試料の全体においても決定される。
【００６０】
好ましくは、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、正常な胎児の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が正常な胎児の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、２１トリソミーの診断が下される。すなわち、母体末梢血に存在する正常な胎児ＤＮＡ（すなわち、胎児異数性を有しない胎児のＤＮＡ）（先に詳細を記載）から取得したデータに基づき、２１番染色体上の複数のＤＭＲの「正常な」高メチル化値を設定することができ、検査ＤＮＡの高メチル化値が「正常」値よりも高ければ、２１トリソミーの診断を下すことができる。例えば、実施例３において記述するように、１２個のＤＭＲそれぞれに「正常な」高メチル化値を計算し、これに基づき、検査試料の２１トリソミー診断を正確に行うに十分であるとして、好ましいＤＭＲを８つ選択した。
【００６１】
さらに、または代わって、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を、２１トリソミー胎児の標準参照高メチル化値と比較し、ＤＮＡ試料の高メチル化値が、２１トリソミー胎児の標準参照高メチル化値と比較して高ければ、２１トリソミーの診断を下すことができる。
すなわち、２１トリソミー胎児ＤＮＡ（すなわち、２１トリソミーを有する胎児のＤＮＡ）から取得されたデータに基づき、２１番染色体上の複数のＤＭＲの「異常な」高メチル化値を設定することができ、検査ＤＮＡの高メチル化値が「異常」値と同程度（類似、または同じ範囲）であれば、２１トリソミーの診断を下すことができる。
【００６２】
ＩＩＩ．特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の同定法
別の態様では、本発明は、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離することに基づき、胎児ＤＮＡの高メチル化された、および母体ＤＮＡの低メチル化された、特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の同定法を提供する。実施例１および２において記載されるように、本明細書に記載の手法は、胎児ＤＮＡにおいて、成人女性の末梢血ＤＮＡと比較して高メチル化レベルを呈する、２１番、１３番、１８番、ＸおよびＹ染色体上の特異的メチル化領域（高メチル化）の大きなパネルを同定するために、染色体全体に適用された。されに、これら同じ手法が、これら同じ染色体上の追加ＤＭＲを同定するために、およびその他の染色体上の新たなＤＭＲを同定するために、適用され得る。
【００６３】
従って、別の態様では、本発明は、胎児異数性の診断に利用するのに適している、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる：
ａ）以下を提供すること
（ｉ）正常な成人女性の末梢血ＤＮＡ試料（ＰＢ試料）；および
（ｉｉ）正常な胎盤ＤＮＡ試料（ＰＬ試料）；
ｂ）a）の各サンプルにおいて、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離し、
（ｉ）分離したＰＢ試料；および
（ｉｉｉ）分離したＰＬ試料；
を得；および
ｃ）ｂ）の分離した試料それぞれにおいて、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定し；および
ｄ）分離したＰＢ試料では低メチル化され、分離したＰＬ試料では高メチル化されている領域を選択し、よって、本明細書に記載の診断法で利用するのに適している、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する。
【００６４】
１つの実施形態では、ＰＬ試料には、２つの異なる試料、すなわち、第１トリメスターＰＬ試料および第３トリメスターＰＬ試料が含まれ、ここで、前記工程ｄ）においてさらに、第１トリメスターの分離ＰＬ試料および第３トリメスターの分離ＰＬ試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択することが含まれる。
【００６５】
好ましい実施形態では、関心対象の染色体は２１番染色体である。その他の様々な実施形態では、関心対象の染色体は、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される。好ましくは、異数性はトリソミーである。
【００６６】
本明細書で使用されている「正常な成人女性」とは、染色体異数性を有しない女性のことである。本明細書で使用されている「正常な胎盤ＤＮＡ」とは、染色体異数性を有しない胎児の胎盤由来のＤＮＡのことである。
【００６７】
先にセクションＩで記載した通り、各試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから分離する。この分離は、セクションＩに記載の通り、「分離した」試料を得るために、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により達成されることが好ましい。本明細書で使用されている「分離されたＰＢ試料」および分離されたＰＬ試料」という用語は、低メチル化ＤＮＡから分離された高メチル化ＤＮＡを含有すると推定されるオリジナル末梢血試料またはオリジナル胎盤ＤＮＡ試料の一部のことである。例えば、ＭｅＤｉＰが分離に使用される時、「分離された」試料とは、免疫沈降した末梢血ＤＮＡ試料または胎盤ＤＮＡ試料の断片のことである。
【００６８】
好ましくは、分離後、分離されたＰＢ試料および分離されたＰＬ試料のＤＮＡを、好ましくはＬＭ−ＰＣＲで増幅する。よって、本実施形態では、リンカー末端は分離前にＤＮＡと平滑末端ライゲーションされ、それから、分離した後に、先にセクションＩに記載の通り、リンカー末端が認識するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、分離されたＤＮＡ試料にＰＣＲ法を実施する。
【００６９】
関心対象の染色体上の複数領域レベルは、先のセクションＩに記載の通り、分離された試料において、好ましくはリアルタイムＱＰＣＲにより、決定される。また、上記の通り、複数領域の高メチル化値を決定するために、コントロールおよび統計解析を生データに応用することもできる。最後に、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定するために、正常な成人女性由来の分離された末梢血（ＰＢ）試料では低メチル化され、正常な胎児由来の分離された胎盤（ＰＬ）試料では高メチル化されている領域を選択する。
【００７０】
ＩＶ．本発明のキット
別の態様において、本発明では、本発明の診断法で利用され得るキットをも提供する。当該キットには、通常は、少なくとも１つの試薬およびキットの使用ガイドが含まれる。好ましい実施形態では、本発明は、２１トリソミーの出生前診断のキットを提供する。当該キットには、以下が含まれる。
ａ）２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）レベルを決定するための、１種または複数種の核酸組成物；および
ｂ）２１トリソミーの非侵襲性出生前診断のための核酸組成物の使用ガイド。
【００７１】
２１番染色体上の複数のＤＭＲは、例えば、添付Ａのリストに示される２１番染色体ＤＭＲから選択され得る。好ましくは、２１番染色体の複数のＤＭＲは、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの領域を含む。別の実施形態では、２１番染色体上の複数のＤＭＲには、上に挙げた、２個またはそれ以上、３個またはそれ以上、４個またはそれ以上、５個またはそれ以上、６個またはそれ以上、７個またはそれ以上、８個またはそれ以上、９個またはそれ以上、あるいは１０個またはそれ以上の領域が含まれる。好ましい実施形態では、２１番染色体の複数のＤＭＲには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６、３７、３８、３９、４０、４２、４３および４４を有する８個の領域から成る。上に列記された１２個のＤＭＲを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例３および表７においてさらに詳細に記載され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜２４に示されている。
【００７２】
従って、キットの好ましい実施形態では、核酸組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜２４、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。さらに、高メチル化コントロール領域または低メチル化コントロール領域を増幅するための１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーもキットに含めることができる。例えば、好ましい高メチル化コントロール領域にはＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２５および２６に示されている（および、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示されている）。また、好ましい高メチル化コントロール領域にはＣＨＲ１３（ＨＹＰ２）も含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２７および２８に示されている。好ましい低メチル化コントロール領域にはＣＨＲ２２（Ｕ１）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２９および３０に示されている（および、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に示されている）。また、好ましい低メチル化コントロール領域にはＣＨＲ２２（Ｕ２）が含まれ、そのプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３１および３２に示されている。よって、コントロールＤＭＲおよびプライマーについては、実施例１でさらに論じ、表６で詳述する。
【００７３】
別の実施形態では、キットにはさらに、血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段が含まれる。高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する好ましい手段には、５−メチルシトシンに特異的に結合する抗体等、メチル化ＤＮＡを免疫沈降する抗体が含まれる。別の実施形態では、キットにはさらに、高メチル化ＤＮＡを増幅する手段が含まれる。高メチル化ＤＮＡを増幅するのに好ましい手段には、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を惹起する、オリゴヌクレオチドリンカーおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。
【００７４】
Ｖ．核酸組成物  
別の実施形態では、本発明では、本発明の方法およびキットで使用され得る核酸組成物を提供する。これら核酸組成物は、ＤＭＲを検知するのに有効である。例えば、好ましい実施形態では、核酸組成物には、添付Ａに示されるリストから選択された、１個または複数のＤＭＲ等、本発明の１個または複数のＤＭＲを増幅するのに有効である１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。オリゴヌクレオチドプライマーは「単離されている」、すなわち、異なる（望ましくない）特異性を有しないその他のプライマーから精製されている、または分離されていることが好ましい。さらに、「単離された」オリゴヌクレオチドプライマーは、染色体ＤＮＡまたはその他自然または天然由来の核酸等、自然または天然に存在する場所にプライマー配列を並べることができる、その他の核酸から精製され、または分離される。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明は、ＤＭＲのＥＰ１〜ＥＰ１２（表７）を増幅するために、
2013517789.tif 000003
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸組成物を提供する。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、高メチル化コントロール領域または低メチル化コントロール領域を増幅するために、
2013517789.tif 000004
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸組成物を提供する。
【実施例】
【００７７】
VI.実施例
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものと解釈するべきではない。すべての参照、添付、遺伝子バンクエントリー、本願で引用されている特許および公開特許出願は、その全体を、本明細書に引用により明示的に含めるものとする。
【００７８】
実施例１：胎盤血液および末梢血液の間の特異的ＤＮＡメチル化の部位同定
本実施例では、高スループット方式でＤＮＡメチル化パターンの全染色体同定を可能とするよう、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）と高解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析を組み合わせたシステムを利用して、１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）が同定された。
【００７９】
本実施例に記載の実験はまた、Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ，  Ｅ．Ａ．ら（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７４：１６０９−１６１８に記載されており、その内容全体を、補足的データおよび資料として本明細書に引用により明示的に含めるものとする。
【００８０】
材料および方法  
ヒトの試料
本研究で使用された試料は、ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｕｒｏｐｅ）Ｌｔｄ（Ｏｘｏｎ、イギリス）より取得された。これらの試料は、元々はＢｉｏｃｈａｉｎ社（Ｈａｙｗａｒｄ、カリフォルニア）から取得されたものであるが、組織内倫理審査委員会（ＩＲＢ）承認のプロトコルによる同意を得た。
【００８１】
本研究では、全部で５人の女性の正常な末梢血液試料および５つの正常な胎盤ＤＮＡ試料が使われた。胎盤ＤＮＡ試料のうち３つは妊娠第１トリメスターから採取され、そのうち１つは女の胎児から、２つは男の胎児から採取された。残り２つの胎盤ＤＮＡ試料は妊娠第３トリメスターから採取され、１つは女の胎児から、もう一つは男の胎児から得られた。
【００８２】
ＬＭ−ＰＣＲ増幅と組み合わせたＭｅＤｉＰアッセイ
ＭｅＤｉＰアッセイ（Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．ら（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：８５３−８６２）に続いて、Ｒｅｎ、Ｂ．ら（２０００）（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２：２３０６−２３０９）およびＯｂｅｒｌｅｙ、Ｍ．Ｊ．ら（２００５）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７６：３１５−３３４）に記載の通りに、だが修正を加えて、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を行った。手短には、全体で１００μｌの量のうち２．５μｇのＤＮＡを、まず、Ｖｉｒｓｏｎｉｃ３００超音波発生装置（Ｖｉｒｔｉｓ；Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ニューヨーク）を使って超音波により約３００ｂｐ〜１０００ｂｐの断片に分断した。最終量が最大１２０μｌとなるように、１ＸＮＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、イギリス）、１０ＸＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、イギリス）、１００ｍＭのｄＮＴＰミックス、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ／μｌ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、イギリス）および蒸留水と組み合わせた後、ＤＮＡ断片を平滑末端にした。１２℃で２０分間インキュベートした後、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ＴＭ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ；Ｇｌａｓｇｏｗ、スコットランド）を用いて、製造者のプロトコルに従って反応のクリーンアップを行った。しかし、最後の溶出ステップは、ＱｉＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、イギリス）により提供される３０μｌのＥＢバッファで行った。クリーンアップされた試料は、その後、先にＲｅｎ，Ｂら（２０００）ｓｕｐｒａ、Ｏｂｅｒｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）ｓｕｐｒａにより記載されたように、４０μｌのアニールしたリンカー（５０μＭ）（ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓ；Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、イギリス）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１０Ｘバッファ（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、６μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）および蒸留水と混合し、最終量が最大１０１μｌとなるようにした。その後、試料を一晩、１６℃でインキュベートし、アダプターがライゲーションするようにした。上記のＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ＴＭ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ；Ｇｌａｓｇｏｗ、スコットランド）を用いて試料を精製した。その後、溶出された試料を、１００ｍＭのｄＮＴＰミックス、１ｘＰＣＲ  Ｇｏｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、および５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼと合わせた。その後、７０℃で１０分間インキュベートし、ＤＮＡオーバーハングを充填し、上記のＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ＴＭ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ；Ｇｌａｓｇｏｗ、スコットランド）を用いて試料を精製した。５０ｎｇのＤＮＡを取り除き、遺伝子コントロールＤＮＡとして利用するために保有した。反応を適宜スケールダウンした後に、先に記述されているように（Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．ら（��００５）ｓｕｐｒａ）、残りのライゲーションしたＤＮＡ試料（７００ｎｇ〜１．２μｇ）をＭｅＤｉＰ処理した。その後、免疫沈降したＤＮＡを、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ＴＭ（７００μｌのライゲーションバッファを使用して）を用いて、製造者の指示書に従ってクリーンアップした。
【００８３】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、フランス）を用いて、１０ｎｇの各インプットおよび免疫沈降したＤＮＡ断片を使って、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を行った。適用した温度循環条件は、９５℃で２分間であり、（９４℃で３０秒間および６８℃で３分間）を２０サイクル、および６８℃で１０分間であった。ＰＣＲ増幅の後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、イギリス）を用いて反応を精製し、予め５０℃に温めた５０μｌの蒸留水で溶出した。
【００８４】
アレイハイブリダイゼーション
インプットおよび女性の末梢血ＤＮＡ由来の免疫沈降ＤＮＡ断片、妊娠第３トリメスター中の胎盤ＤＮＡ試料および妊娠第１トリメスターＤＮＡ胎盤試料（胎盤試料は共に男の胎児から採取された）を、ハイブリダイゼーションのためにＲｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｉｎｃ（Ｒｅｙｋｊｓｖｉｋ、アイスランド）に送った。使用されたアレイプラットフォームは、１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体に特化された解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析法であり、プローブ間隔の中央値は、１３番染色体で２２５ｂｐ、１８番染色体で１７０ｂｐ、２１番染色体で７０ｂｐ、Ｘ染色体で３４０ｂｐおよびＹ染色体で２０ｂｐであった。
【００８５】
手短には、インプット遺伝子コントロールＤＮＡおよび各試料の免疫沈降ＤＮＡは、蛍光性染料（Ｃｙ３、Ｃｙ５）で特異的にラベル化し、その後オリゴヌクレオチドアレイで共ハイブリダイズさせた。
【００８６】
生データに関しては、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ａｓ／ａｅ／）で、アクセション番号Ｅ−ＴＡＢＭ−５０７を指定してアクセス可能である。
【００８７】
タイリングオリゴヌクレオチドアレイのデータ解析
胎盤と末梢血との間のメチル化の相対的差分を計算するために、末梢血ＤＮＡから得られたオリゴヌクレオチドアレイ正規化ｌｏｇ２比値（免疫沈降物対インプット断片）を、Ｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使って、胎盤ＤＮＡから採取したｌｏｇ２比値（免疫沈降物対インプット断片）から差し引いた。正の差分は胎盤ＤＮＡにおける相対的高メチル化を表し、負の差分は、相対的低メチル化を表す。その後、差し引いたｌｏｇ２比率データの一般的な特徴の形式（ＧＦＦ）ファイルを作成し、その結果を、ＳｉｇｎａｌＭａｐ  ｖｉｅｗｅｒ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｒｅｙｋｊｓｖｉｋ、アイスランド）を使って、遺伝子、ＣｐＧアイランドおよび１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体全てのＣＧ内容と共に閲覧した。遺伝子データは、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒ、（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ３６）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ．）からダウンロードし、ＣｐＧアイランドとＣＧ内容は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ３６）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ．）からダウンロードした。末梢血と胎盤の間の重要な特異的メチル化の豊富な領域を自動的に選択するために、先に、Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＮＶ）コーリング（Ｐｒｉｃｅ，Ｔ．Ｓ．ら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３４５５−３４６４）に用いられてきたＡｒｒａｙ−ＣＧＨ（ＳＷ−ＡＲＲＡＹ）に適合させたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎダイナミックプログラミングアルゴリズムを応用した。本アルゴリズムは、末梢血ＤＮＡと比較して胎盤ＤＮＡではメチル化濃縮またはメチル化枯渇のいずれかを示す連続的オリゴヌクレオチド類の「セグメント」または「アイランド」を同定するのに用いられた。各オリゴヌクレオチドアレイデータを染色体アームにより分析した。０．２と１との間のＳＷ−ＡＲＲＡＹの閾値（ｔ0）は、同じメチル化状態を有し、異なる閾値（ｔ0）で得られたスコアのうち最も高いスコアを示す、少なくとも２つの連続的オリゴヌクレオチドの同定に基づき、相対的にスコアの高いセグメントまたは「アイランド」をコーリングするのに最適な値を同定するために検査された。ＳＷ−ＡＲＲＡＹにより同定された特異的メチル化領域と、遺伝子の位置、プロモーター領域（各遺伝子の５'末端の２ｋｂ上流までさかのぼる領域として定義した）およびＣｐＧアイランドとの間を直接比較が行われた。
【００８８】
上記の分析により、非侵襲性出生前診断のためのコピー数（すなわち、例えば、２１トリソミーの同定用）の定量的アッセイ前の濃縮方法としてＭｅＤｉＰを利用するための、特異的メチル化遺伝子領域が同定されるが、選択された標的が胎児において高メチル化されたことも重要である。よって、ＭｅＤｉＰは、母体の低メチル化ＤＮＡを枯渇させ、胎児の高メチル化ＤＮＡアッセイが行えるようにするために使われるであろう。よって、免疫沈降対インプットの比率が胎盤では正であり、末梢血試料（胎盤の高メチル化）では負である全領域を同定した。他者が調べたその他のアッセイシステムについて、胎盤におけるＤＮＡの高メチル化が求められ、そのため、免疫沈降対インプットの比率が、胎盤において負であり、末梢血試料において正である全領域も記録した。これを達成するために、末梢血ＤＮＡから採取されたオリゴヌクレオチド正規化ｌｏｇ２比値（免疫沈降物対インプット断片）を、比率の印が異なる場合にのみ胎盤ＤＮＡから得られたｌｏｇ２比値（免疫沈降物対インプット断片）から差し引いた。胎盤の中の最も特異的に高メチル化されている少数の領域（２１番染色体上には８領域、および、１８番染色体＋ＳＥＲＰＩＮＢ５プロモーター領域には１領域）が、１．０より大きい任意の異なるカットオフ比率（連続的プローブのうち少なくとも１つがｌｏｇ２比値＞１を示す）を用いてさらなる検証およびアッセイ開発を行うために、このデータから選択された。
【００８９】
リアルタイム定量ＰＣＲによるタイリングオリゴヌクレオチドアレイデータの確認
２１番染色体および１８番染色体上の選択された領域のメチル化濃縮は、リアルタイム定量ＰＣＲで確認された。この目的のために、５人の女性の末梢血ＤＮＡ試料、および、妊娠第１トリメスターおよび妊娠第３トリメスターの胎盤のＤＮＡ試料５人分を使用した。関心対象の領域に特異なプライマーを、ｐｒｉｍｅｒ３のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／．）を使って設計した。プライマー設計は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光融解曲線解析で推奨されているように、長さ８０〜１５０ｂｐの産物を生じるよう最適化された。さらに、全プライマーのＴｍは、６０℃で閉じるよう選択された。プライマー配列とＰＣＲ産物配列双方の一意性に関しては、Ｂｌａｔを使ってヒト参照配列上にこれらをマッピングすることにより確認された。プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、イギリス）より購入した。
【００９０】
免疫沈降したメチル化ＤＮＡまたはインプット遺伝子ＤＮＡのいずれかを２０ｎｇを有し、最終量を２５μｌとして、それぞれの定量ＰＣＲを行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ；Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）およびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が使用された。最初に、正常な遺伝子ＤＮＡを使って一連の希釈を検査した後（１５０〜９００ｎM）、各プライマーにとって最適な濃度が選択された。それぞれ選択された濃度ついて、１：２の連続希釈（２００ｎｇ削減して３．１２５ｎｇへ）で検量線を計算し、最終的に３倍で試料反応を行った。増幅プログラムは、５０℃で２分間と９５℃で１０分間から成り、その後、９５℃で１５秒間の変性を４０サイクル、および、６０℃で１分間のアニーリング／伸張を行った。増幅後に、反応混合物を６０℃〜９５℃で、０．２℃／秒の割合で加熱することにより、融解曲線解析を行った。増幅反応では常に、アガロースゲル電気泳動による非特異産物のチェックが行われる。ＭｅＤｉＰアッセイの後、標的の配列の濃縮を評価するために、検査ＤＮＡ（免疫沈降またはインプットＤＮＡ）（ＣＴtｅｓｔ）と、インプットゲノムＤＮＡに対する免疫沈降ＤＮＡ中の未処理の正常ゲノム遺伝子ＤＮＡ(CTcontrol) (ΔCT = CTcontrol - CTtest)との間で計算されたサイクル差分(ΔCT)の比率を計算した。加えて、末梢血と比較して胎盤試料のメチル化濃縮を評価するために、胎盤の免疫沈降ＤＮＡ対末梢血免疫沈降ＤＮＡの比率を計算した。さらに、本実施例のヌクレオチドアレイの結果により判明した、末梢血ＤＮＡ試料と胎盤ＤＮＡ試料で同様のメチル化状態を示すコントロール領域を、ＭｅＤｉＰまたはＰＣＲ増幅バイアスの可能性を検査する度に、使用した。個人間または技術的複写実験間における、メチル化濃縮の変動性および再現性の中央値は、検査対象の異なる試料の全比値、または、特定の領域の技術的複製の全比値の平均値（ＩＰ／ＩＮＰＵＴの平均）を計算することにより得られた。その後、各検査の再現性評価のために各比値を平均比値で除算し、パーセンテージ（ＩＰｉ／ＩＮＰＵＴｉ）／中央値（ＩＰｉ／ＩＮＰＵＴｉ、ＩＰｉｉ／ＩＮＰＵＴｉｉ、...）＝Ｒｉで表した。（ＩＰｉ：「ｉ番目」試料の免疫沈降ＤＮＡ、ＩＮＰＵＴｉ：「ｉ番目」試料のインプットＤＮＡ、ＲＩ：「ｉ番目」試料の再現性）。再現性の中央値は、異なる再現性値全ての中央値を計算して得た（Ｒｉ、Ｒｉｉｓ．．．）。最後に、変動性は、以下の公式を使って計算した：（１−Ｒｉ）ｘ１００＝Ｖｉおよび変動性の中央値：中央値（Ｖｉ、Ｖｉｉ、...）。（Ｖｉ＝「ｉ番目」試料の変動性）。
【００９１】
結果
特異的メチル化マーカー候補の選択
当初、胎盤ＤＮＡと末梢血ＤＮＡの比率差（相対的メチル化）を計算するために、胎盤ＤＮＡ試料および末梢血ＤＮＡ試料双方の１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体のオリゴヌクレオチドアレイ正規化ｌｏｇ２比値が使われた。本発明では、末梢血と胎盤との間で特異的メチル化領域を同定するためにＳＷ−ＡＲＲＡＹを使用した。領域の同定に最適なＳＷ−ＡＲＲＡＹ閾値は、全染色体に対し０．９であることが分かった。第１トリメスターおよび第３トリメスターにおいて、末梢血ＤＮＡと比較してＳＷ−ＡＲＲＡＹ分析により同定された特異的メチル化領域については、２１番、１３番、１８番、ＸおよびＹ染色体のそれぞれに関して、添付Ａ〜Ｅに示されている。本発明では、高メチル化であると同定した領域の数は、以下の表１に概要を示すように、検査対象となった５つの染色体全てにおいて低メチル化の領域数とほぼ同じであった。さらに、特異的メチル化領域の合計数は、表１に概要を示すように、第１トリメスターおよび第３トリメスターの胎盤に匹敵する。同定された遺伝子座、添付Ａ〜Ｅに示されるように、遺伝子の位置、プロモーター領域並びにＣｐＧアイランドの位置と直接相関関係にある。
【００９２】
（表１）１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体における、末梢血ＤＮＡ試料との比較した胎盤の特異的メチル化領域
2013517789.tif 000005
【００９３】
同定された領域の１７．５〜４３．６％は遺伝子内に位置し、それらのメチル化状態は、表２に示すように、染色体により並びにトリメスターにより異なっていた。１３番染色体およびＹ染色体に関しては、特異的メチル化領域（遺伝子内に存在）は、第１トリメスターの胎盤の大部分は、第１トリメスターでは低メチル化状態であるが、その大部分は、第３トリメスターで高メチル化された。表２に概要が示されているように、２１番染色体およびＸ染色体では、大部分の領域は第１トリメスターおよび第３トリメスター双方とも低メチル化状態であったが、１８番染色体では、高メチル化と低メチル化の領域数は等しかった。
【００９４】
（表２）１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体の遺伝子内に位置する特異的メチル化領域
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【００９５】
さらに、以下の表３Ａに概要が示されているように、同定された領域（ゲノムおよび非ゲノム領域）のわずかなパーセンテージ（１．６〜１１．０％）は、ＣｐＧアイランドと重複していた。特異的メチル化領域と同定されたＣｐＧアイランドの大部分は、遺伝子内に（各遺伝子の最大５'末端２ｋｂ上流領域と同定された、適切なプロモーター部位を含む）位置し、これらの相当数（最大６５．５％）は、プロモーター領域内に特異的に位置していた。各染色体における、および第１トリメスター並びに第３トリメスターにおけるこれら領域のメチル化状態については、以下の表３Ｂに示されている。
【００９６】
（表３Ａ）１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体における、ＣｐＧアイランドと重複するメチル化領域の数
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【００９７】
（表３Ｂ）１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体の特異的メチル化領域に位置するゲノム、非ゲノムおよびプロモーターＣｐＧアイランドのメチル化状態
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【００９８】
タイリングオリゴヌクレオチドアレイ結果の検証
アレイ解析を検証するために、まず、リアルタイム定量ＰＣＲによる従来の調査領域のメチル化状態を分析した。本発明では、ＳＥＲＰＩＮＢ５プロモーター領域は、胎盤では低メチル化状態、末梢血では高メチル化状態であったが、これは、Ｃｈｉｍ，  Ｓ．Ｓ．ら（２００５）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１：１４７５３−１４７５８）の研究と一致している。さらに、抗画像アレイ解析により同定されたメチル化を検証するために、ＳＥＲＰＩＮＢ５プロモーター領域を含む追加の９領域（Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら（２００５）ｓｕｐｒａ）について、リアルタイム定量ＰＣＲで解析した。各領域を対象とするため、様々なプライマーが設計された。各プライマーは、使用前に検査し、各プライマーに最適な濃度を決定した。
【００９９】
一つの実施例として、２１番染色体（図１）に位置する領域のオリゴヌクレオチドアレイの結果を、図２に示すリアルタイム定量ＰＣＲ結果と比較することができる。オリゴヌクレオチドアレイ混成で使用したのと同じ末梢血および胎盤ＤＮＡ試料を、ＰＣＲ検証のためにも使用した。両方法において、末梢血と比較した胎盤のメチル化濃縮が報告されている。さらに、オリゴヌクレオチドアレイおよびリアルタイム定量ＰＣＲ双方とも、第３トリメスター胎盤ＤＮＡ試料と比較して、第１トリメスター胎盤ＤＮＡ試料におけるメチル化濃縮の度合いが低いことを示している。しかしながら、第１トリメスターで観察されたメチル化濃縮は、末梢血ＤＮＡ試料から得られたメチル化濃縮に比べて高かった。本発明者は、アレイ解析と定量ＰＣＲの間で、９つの全領域並びにＳＥＲＰＩＮＢ５プロモーター領域の特異的メチル化に一致が見られることを発見した。しかし、リアルタイム定量ＰＣＲを使って得られた相対的濃縮倍率は、オリゴヌクレオチドアレイ解析により得られた濃縮より一般的に大きいことが分かった。
【０１００】
ＭｅＤｉＰ−ＬＭＰＣＲ効率の評価
ＭｅＤｉＰ手順による実験的再現性を単一の胎盤ＤＮＡ試料の技術的複製を行うことにより評価し、２１番染色体上の２個の領域のメチル化状態をリアルタイム定量ＰＣＲにより評価した。再現性の中央値は、９８．６２％および９５．８４％であった。
【０１０１】
異なる個体の選択された領域のメチル化状態を評価する
個体間のメチル化状態の正常な変動性を評価するために、本発明者は、前記の９つの選択された領域のリアルタイム定量ＰＣＲアッセイを、５つの異なる末梢血および３つの異なる第１トリメスター胎盤に応用した。第３トリメスター胎盤のうち２つのメチル化状態は、選択された領域の４つのみで検査した。妊娠第１トリメスター期間が、非侵襲性出生前診断の開発に最も適しているため、第１トリメスター胎盤を好んで使用した本研究においては、第３トリメスター胎盤の個体間変動性のさらなる調査は必要なかった。ＣＨＲ２１（Ｂ４）の結果は図３に示した。表４に概要が示されているように、５つの末梢血試料全てが、個体間でＤＮＡメチル化濃縮の変動性を有する５つの胎盤ＤＮＡと比較して低メチル化であることが分かった。第３トリメスター胎盤と比較して、第１トリメスター胎盤ではメチル化濃縮が少なく、オリゴヌクレオチドアレイの結果を確認した（図３参照）。より低い変動性レベルが、同じ妊娠月齢の異なる胎盤間で観察された。
【０１０２】
（表４）同じ組織（末梢血（ＰＢ）または胎盤（ＰＬ））から採取された異なる試料間のメチル化変動性パーセンテージ、および１８番染色体並びに２１番染色体に位置する複数領域用に計算された妊娠月齢（胎盤）
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【０１０３】
リアルタイム定量ＰＣＲによるこの時点までの検査領域の大部分では、妊娠月齢の異なる胎盤ＤＮＡ試料間のメチル化変動性が示された（表４を参照）。しかし、全ての領域でこの効果が表れたわけではなかった。一つの実施例では、表４に示すように、１８番染色体（ＣＨＲ１８（Ａ））上に位置する領域である。第１トリメスター胎盤と第３トリメスター胎盤のメチル化レベルの違いは、この領域に関してはわずかであることが分かった。さらに、第１トリメスター胎盤と第３トリメスター胎盤との間でＤＮＡメチル化状態が逆である領域、並びに特異的メチル化を示す領域を同定した。その例を以下の表５に示す。
【０１０４】
（表５）第１トリメスター胎盤ＤＮＡと第３トリメスター胎盤ＤＮＡではメチル化状態が逆である、または、末梢血ＤＮＡと比べて特定の胎児月齢において特異的にメチル化されていることが判明した領域の例
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【０１０５】
特異的メチル化コントロール領域
全実験におけるＭｅＤｉＰ効率を評価するために、本発明者は、コントロールとして用いるためのアレイ実験から特異的メチル化が同程度であった、２つの高メチル化領域と２つの低メチル化領域を選択した。これらのコントロール領域を検知するために使われたプライマーについては、以下の表６に概要を示した。その中で、ＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）プライマーおよびＣＨＲ１３（ＨＹＰ２）プライマーは、高メチル化コントロール領域を検知し、ＣＨＲ２２（Ｕ１）およびＣＨＲ２２（Ｕ２）は低メチル化コントロール領域を検知する。
【０１０６】
（表６）リアルタイム定量ＰＣＲにより異なる試料のＭｅＤｉＰ効率を評価するために使用されるコントロールプライマー
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【０１０７】
これら領域のメチル化状態は、末梢血および胎盤の複数の試料においてリアルタイム定量ＰＣＲにより評価した。１３番染色体の領域の結果については、末梢血ＤＮＡおよび胎盤ＤＮＡの双方とも高メチル化であると予想されていたが、図４に示した。同じＤＮＡ試料が、全コントロールプライマーの検査に使用された。個体間のメチル化濃縮の再現性の中央値は、ＣＨＲ１３（ＨＹＰ１）では９８．４8％、ＣＨＲ１３（ＨＹＰ２）では９６．０２％、ＣＨＲ２２（Ｕ１）では９８．７１％、およびＣＨＲ２２（Ｕ２）では９９．７５％であった。
【０１０８】
実施例２：特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の同定に関する追加の記載
本実験では、特異的メチル化領域（ＤＭＲ）がどのように同定されたか、また、これらＤＭＲのうち、母体ＤＮＡでは低メチル化であり、胎児ＤＮＡでは高メチル化である特異的メチル化領域がどのように優先的に選択されたか、これらに関する追加の詳細な説明を提供する。本方法のフローチャート図は、図５に示されている。当該図では、１３番染色体、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体全体のＤＭＲ同定に向けたＭｅＤｉＰ  ＬＭ−ＰＣＲおよびオリゴーアレイハイブリダイゼーション手順の適用を示している。
【０１０９】
試料
１人の正常な成人女性の末梢血（ＰＢ）由来のＤＮＡ試料、１つの正常な第１トリメスター胎盤（ＰＬ１）および１つの正常な第３トリメスター胎盤（ＰＬ３）が非血縁同士の個人から採取された。試料は、元々は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ社（Ｈａｙｗａｒｄ、カリフォルニア）で採取されたものだが、ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ヨーロッパ）Ｌｔｄ（Ｏｘｏｎ、イギリス）を通じて供給された。これら試料に対する同意書は、組織内倫理審査委員会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコルに従って取得された。
【０１１０】
ＤＭＲの同定
最初に、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）およびライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を、１人の正常な成人女性の末梢血（ＰＢ）由来のＤＮＡ試料、１つの正常な第１トリメスター胎盤（ＰＬ１）および１つの正常な第３トリメスター胎盤（ＰＬ３）に適用された。さらに詳細には、ＭｅＤｉＰアッセイ（Ｗｅｂｅｒ、Ｍ．ら（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：８５３−８６２に詳細が記載されている）に続き、ＬＭ−ＰＣＲ（Ｒｅｎ，Ｂ．ら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２：２３０６−２３０９；Ｏｂｅｒｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７６：３１５−３３４に詳細が記載されている）を行った。当該方法論に関しては、先の記述に（Ｒａｋｙａｎ、Ｋ．Ｖ．ら（２００８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：１５１８−１５２９）に微修正を加えた方法を行った。図５に、当該手順のフローチャート図が提供されている。
【０１１１】
ＤＮＡ断片化およびリンカーのアニール
手短に、総量１００μｌ中のＤＮＡ試料２．５μｇを、ＶｉｒＳｏｎｉｃ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ６００超音波発生装置（Ｖｉｒｔｉｓ；Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ニューヨーク）（図１）を使って超音波により約３００ｂｐ〜１０００ｂｐの大きさにせん断した。
【０１１２】
試料のＤＮＡ断片は、１ＸＮＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、イギリス）、１０ＸＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、イギリス）、１００ｍＭのｄＮＴＰミックス、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ／μｌ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；  Ｉｐｓｗｉｃｈ、イギリス）および蒸留水と合わせ、最終量を最大１２０μｌにした後、平滑末端にした（図５）。１２℃で２０分間インキュベートした後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、イギリス）を使い、製造者のプロトコルに従って反応をクリーンアップした。しかし、最終溶出ステップでは、３０μｌのＥＢバッファで行った。クリーンアップされた試料はその後、以前の記載（Ｒｅｎ，Ｂ．ら（２００２）、ｓｕｐｒａ；Ｏｂｅｒｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）、ｓｕｐｒａ）に従って生成された４０μｌのアニールされたリンカー（５０μＭ）（ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓ；Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、イギリス）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０Ｘバッファ（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、６μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、および蒸留水と混ぜ合わせ、最終量を最大１０１μｌにした。試料はその後、１６℃で一晩インキュベートし、アダプターがライゲーションするようにした（図５）。上記のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使って試料を精製した。溶出試料は、その後、１００ｍＭのｄＮＴＰミックス、１ｘＰＣＲ  Ｇｏｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、および５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼと配合された。これらの試料を７０℃で１０分間インキュベートし、ＤＮＡオーバーハングを充填し、上記のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使って精製した（図５）。
【０１１３】
インプットおよびＭｅＤｉＰＤＮＡ単離
各試料から合計５０ｎｇのライゲーションしたＤＮＡを取り除き、インプットゲノムコントロールＤＮＡとして保有した（図５）。反応を適宜スケールダウンした（Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．ら（２００５）ｓｕｐｒａ）後に、残りのライゲーションしたＤＮＡ試料（８００ｎｇ−１．２μｇ）を、先に記載した通りにＭｅＤｉＰ処理した。その後、免疫沈降したＤＮＡを、前記ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使って、製造者のプロトコルに従って精製した（図５）。
【０１１４】
ＬＭ−ＰＣＲ
ライゲーション仲介ＰＣＲ増幅（ＬＭ−ＰＣＲ）反応は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノムＬＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、フランス）を用いて、各インプットおよびＩＰＤＮＡ断片１０ｎｇとの間で行われた（図５）。適用した温度循環条件は、９４℃で１分間、（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で２分間）を２０サイクル、および７２℃で５分間であった。ＰＣＲ増幅後、前記ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使って精製し、予め５０℃に温めた５０μｌの蒸留水で溶出した（図５）。
【０１１５】
１３番、１８番、２１番、Ｘ、Ｙ染色体に特化したオリゴ−アレイとの共ハイブリダイゼーションおよびデータ解析
各試料のインプットおよびＩＰＤＮＡを、１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体専用のオリゴアレイと共ハイブリダイズさせた。第１トリメスター胎盤および第３トリメスター胎盤双方の関心対象の染色体（１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体）全体のＤＭＲを明らかにするために、ＰＢ比値をＰＬ１比値およびＰＬ３比値から差し引いた。さらに、末梢血ＤＮＡと比較して胎盤ＤＮＡの主要な特異的メチル化を有する領域を自動的に選択するために、Ａｒｒａｙ−ＣＧＨ  （ＳＷ−ＡＲＲＡＹ）に適合させたダイナミックプログラミングアルゴリズムを用いて応用した（図５）。
【０１１６】
先に同定されたＤＭＲを解析し、検証するために、いくつかの実験が行われた。これらの実験には、複数のＤＮＡ試料に対しリアルタイム定量ＰＣＲを行うことにより、これら多数のＤＭＲのメチル化状態を確認することが含まれる。異なる妊娠月齢の胎盤間の任意の特異的メチル化を同定するために、第１トリメスター胎盤と第３トリメスター胎盤との間から得られた結果比較した。さらに、個体間および技術的複製物間におけるメチル化レベルの変動性および再現性の評価を行った（実施例１）。
【０１１７】
実施例３：２１トリソミーの非侵襲性診断検査の開発および検証
本実施例において、実施例１および２に記載の方法に従って同定されたＤＭＲが、２１トリソミー（本明細書ではＮＩＤ２１と称する）の非侵襲性診断の開発および検証に使用された。当該方法論のフローチャート図は、図６に示されている。当該図には、ＮＩＤ２１検査の開発及び検証に向けて、正常なケース２０件および２１トリソミーのケース２０件を使用した実験手順が示されている。
【０１１８】
２１トリソミーの非侵襲性診断検査開発のためのＤＭＲの選択
女性の末梢血試料および胎盤ＤＮＡ試料（実施例１および２）との間で同定されたＤＭＲをさらに掘り下げて調査し、２１番染色体上に位置する１２個の領域を選択した。ＮＩＤ２１検査開発のために選択された領域と共に、１３番染色体および２２番染色体上に追加された２つの領域が、それぞれ高メチル化コントロールおよび低メチル化コントロールとして使用された。１２個の領域の選択基準は、まず、末梢血ＤＮＡ試料および胎盤ＤＮＡ試料における領域のメチル化状態に基づいていた。さらに具体的には、胎盤の選択領域では高メチル化状態を示し、末梢血の選択領域では低メチル化状態を示さなければならない。第二に、選択領域には、メチル化状態の組織特異性を確実にするために、第１トリメスター胎盤と第３トリメスター胎盤との間に共通なメチル化状態を有しなければならない。最後に、これら領域で観察された特異的なメチル化のレベルは、高バックグラウンドな低メチル化ＤＮＡの中に存在する微量の高メチル化ＤＮＡ試料を検査する時に効率的にメチル化状態を区別するよう、対数目盛で「１」の値より上でなければならない。
【０１１９】
上記の評価に基づき、選択されたＤＭＲ、またはそれらの一部を、ＮＩＤ２１検査のＤＭＲとして使用することができる。しかし、ＮＩＤ２１検査に用いられ得るとして添付Ａ〜Ｅに示したリストのその他のＤＭＲも、本明細書に記載の評価と同様の評価を示し得る。さらに、ＤＭＲの評価および選択は、１３番、１８番、ＸおよびＹ染色体の異数性のＮＩＰＤのために同様または異なる方法で使用することもできる。
【０１２０】
試料
ＮＩＤ２１検査の開発目的のために、本発明では、正常な胎児を妊娠している女性由来の２０の母体末梢血試料と、ダウン症候群（２１トリソミー）胎児（Ｔ２１胎児）を妊娠している女性由来の２０の母体末梢血を用いた。母体末梢血ＤＮＡ試料はすべて、キプロスおよびギリシャの協力を通じて、Ｃｙｐｒｕｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにおいて、妊娠第１トリメスターから採取した。Ｃｙｐｒｕｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された同意書が、参加者の各試料採取のために回収された。
【０１２１】
ＮＩＤ２１検査の開発および検証
ＭｅＤｉＰおよびＬＭ−ＰＣＲ準備
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、イギリス）を用いて、全試料からＤＮＡを抽出した。正常な胎児を妊娠している女性由来の２０の母体末梢血試料およびＴ２１胎児を妊娠している女性由来の２０の末梢血試料から単離されたＤＮＡに対し、ＤＮＡ断片化、リンカーアニーリング、ＭｅＤｉＰおよびＬＭ−ＰＣＲ処理を施し、その結果、図６に示すように、インプットおよびＩＰ  ＤＮＡ断片を生じさせた。上記の方法論は、実施例１および２に記載されている。
【０１２２】
リアルタイムｑＰＣＲおよびデータ評価
４０の母体末梢血試料全てにおいて、予め選択された２１番染色体上の１２個のＤＭＲおよび１３番染色体並びに２２番染色体の２つのコントロール領域に関するインプットおよびＩＰ断片全てにリアルタイムｑＰＣＲを適用した（図６）。最初に、関心対象の領域に特異的なプライマーを、プライマー３ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／．）を使って設計した。リアルタイムｑＰＣＲに使用されたプライマーを表７に示す。
【０１２３】
（表７）２１番染色体の検査領域および１３番染色体と２２番染色体のコントロール領域用に設計されたプライマー
2013517789.tif 000012
【０１２４】
プライマー設計には、最適なＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光融解曲線解析に推奨されているように、長さ８０〜１５０ｂｐの産物を生じるよう最適化された。さらに、全プライマーのＴｍは、６０℃で閉じるよう選択された。表７に記載のプライマーにより増幅された１２個のＤＭＲ（ＥＰ１〜ＥＰ１２）のヌクレオチド配列は、２個のコントロール領域（ＨＹＰ１１３およびＵ１２２）のヌクレオチド配列と共に、以下の表８に示す。
【０１２５】
（表８）２１番染色体上の検査領域のヌクレオチド配列および１３番染色体と２２番染色体上のコントロール領域のヌクレオチド配列
2013517789.tif 000013
2013517789.tif 000014
【０１２６】
双方のプライマー配列およびＰＣＲ産物配列の独自性は、Ｂｌａｔを使って、これらをヒト参照配列上にマッピングすることにより確認した。プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、イギリス）より購入した。各リアルタイムｑＰＣＲ反応は、インプットまたはＩＰＤＮＡのいずれか２０ｎｇを含む最終量２５μｌで行われた。本発明では、ＳＹＢＲ  ＰＣＲマスターミックス（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ；Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）およびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。当初は、各プライマーの最適濃度は、正常なゲノムＤＮＡ（図７）を使用した一連の希釈検査（１５０〜９００ｎＭ）の後に選択した。選択した各プライマーの濃度について、１：２の連続希釈（２００ｎｇ削減して３．１２５ｎｇへ）で検量線を計算し、最終的に３回試料反応を行った。増幅プログラムは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、次いで、９５℃、１５秒間の変性と６０℃、１分のアニーリング／伸長とのサイクルを４０回行うことから成っていた。増幅後、反応混合物を６０℃〜９５℃へ、0.2℃／秒の速度で加熱することにより融解曲線分析を行った。上記のリアルタイムｑＰＣＲにより、全てのインプットおよびＩＰ断片（図６）ＣＴ値が得られた。
【０１２７】
取得されたＣＴ値に一連の正規化ステップを施した。最初は、三重リアルタイムｑＰＣＲ反応の平均ＣＴ値を、インプットおよびＩＰ試料それぞれに計算した。よって、ＭｅＤｉＰおよびＬＭ−ＰＣＲを適用中に行われたＰＣＲ反応の効率は、以下の数式を使って正規化された。
ΔCTPB-Normal = CTPB-Normal-Input - CTPB-Normal-IP
ΔCTPB-T21 = CTPB-T21-Input - CTPB-T21-IP
但し、式中ＰＢ＝末梢血であり、Ｔ２１＝２１トリソミーである。
【０１２８】
上記の正規化は、全ての試料に対し、および、全ての選択されたＤＭＲとコントロールに対し別々に行われた。
【０１２９】
その後、さらなる正規化のために、以下の数式によりリアルタイム定量ＰＣＲプライマーの効率が行われた。
Norm ΔCT valuePB-Normal= E ΔCTPB-Normal
Norm ΔCT value PB-T21 = E ΔCT PB-T21
但し、式中E= 10 [-1/slope]  = プライマーの効率
Norm= 正規化
正規化値は、各「検査試料」の各コントロール領域のメチル化濃縮に対応するコントロールプライマーから得た。
【０１３０】
ＰＣＲ反応の正規化、およびリアルタイムｑＰＣＲプライマーの効率に基づく正規化に続いて、以下の数式を使って、選択されたＤＭＲそれぞれに、別々に、NormΔCTPB-Normalの中央値が計算された。
Median Norm ΔCTPB-Normal = Median (Norm ΔCTPB-Normal-1、 Norm ΔCTPB-Normal-2、 ... Norm ΔCTPB-Normal-n)
Median Norm ΔCTPB-Normalの計算には、検査対象の各ＤＭＲにおける各試料の比値を決定することが求められる。この比値は、以下の数式により決定される。
Ratio ValueSample; DMR = Norm ΔCTPB-Sample (Normal or T21) / Median (Norm ΔCTPB-Normal)
正常なケースから得られた比値は、正常なケースと異常なケースを区別する度合いを評価するために、検査対象の各ＤＭＲの２１トリソミーから得られた比値と比較した。しかし、上記データの統計解析は、正常なケースと異常なケースを区別する統計的有意性を正確に決定するために重要である。
【０１３１】
統計解析
正常なケースと２１トリソミーのケースを区別するにあたり、１２個のＤＭＲそれぞれの統計的有意性を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  Ｔｅｓｔを使って評価した。本検査は、２つの独立した観察セット（本発明においては、正常試料および２１トリソミー試料を有するセット）が、同じ分布由来であるかどうかを評価するための、ノンパラメトリック検査である。その後、１２個の各ＤＭＲにつきｐ値が報告された。ｐ値が＜０．０５であれば有意とした。
【０１３２】
上記の結果のデータ評価に加えて、検査対象のＤＭＲ全てにつき、正常なケースおよび２１トリソミーのケースの比値が、正常なケースと２１トリソミーのケースを再評価するために使われた。
【０１３３】
最初に、正常なケースと２１トリソミーのケースを区別するにあたり、１２個の各領域の有意性を評価した。最後に、２１トリソミーの全ケースおよび正常な全ケースの比値の中央値が、各ＤＭＲにつき別々に計算された。使用された数式は、以下の通りである。
Median ratio valuesPB-Normal = Median (ratio valuePB-Normal-1、 ratio valuePB-Normal-2、 ... ratio valuePB-Normal-n)
Median ratio valuesPB-T21 = Median (ratio valuePB- T21 -1、 ratio valuePB- T21 -2、 ... ratio valuePB- T21 -n)
その後、以下の数式に示すように、２１トリソミーのケースの比値の中央値を、正常なケースの比値の中央値で除算した。
Median Ratio ValueDMR = Median ratio valuesPB-T21 / Median ratio valuesPB-Normal 
ＤＭＲより得た比値の中央値は、降順に並べ、正常なケースと２１トリソミーのケースの間の分離の度合いを示した。その後、（ノンパラメトリックの）中央値検査を行った。本検査は、２群が同じ中央値を有するかどうかを決定するためのカイ二乗検査である。その後、１２個の各ＤＭＲのｐ値が報告された。ｐ値が＜０．０５であれば有意とした。さらに、フィッシャーの多重検定が適用された。本検査では、様々なＤＭＲのｐ値をまとめ、正常なケースと２１トリソミーのケースを区別する統計的有意性について全般的評価を行った。
【０１３４】
本解析の最終目的は、新しいケースの結果を正確に解釈し、正常ケースまたは２１トリソミーケースとして正確に分類できるようにすることであった。これを達成するために、コンピュータプログラムＳＰＳＳｖ１６．０を使って行う「判別分析（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＤＡ）」と呼ばれる解析を行った。ＤＡは、各ケースの観察された特性に基づき、群の構成員の予測モデルを構築するために使われるテクニックである。すなわち、ＤＡにおいて、（通常は連続的）予測変数のセットから、群の構成員を予測することが期待される。
【０１３５】
ＤＡは、群の構成員が周知であるケースのサンプルから関数を導き出す。その後、予測変数の測定値を有するがどの群の構成員かは分からない新しいケースに適用され得る。２群のＤ値ができるだけ異なるよう「線形判別方程式」を組み立てる。「線形判別方程式」は以下の通りである。
Ｄｉ＝ａ＋ｂ１Ｘ１＋ｂ２Ｘ２＋・・・＋ｂＰＸＰ， （１）
ａ＝定数、ｂ＝非標準化係数、Ｘｐ＝ratio valueSample; DMR
【０１３６】
さらに詳細に、「ａ」および「ｂ」は、周知のサンプルのセットを使って計算した値であり、方程式の組み立てに使われる。各「ｂ」値は、１つのＤＭＲに固有であり、よって、新しいケースを分類するたびに、特定のＤＭＲの「Ｘ」値を、先に計算した同じＤＭＲの「ｂ」値と乗算する。本研究において、正常なケースおよび２１トリソミーのケース（正常なケース２０件、２１トリソミーのケース２０件）が同じ数であったため、Ｄが正の値（Ｄ＞０）であれば、新しいケースは異常（２１トリソミーのケース）であり、負の値（Ｄ＜０）であれば、新しいケースは正常であるとみなすよう、方程式を組み立てた。
【０１３７】
正常または２１トリソミーとしてケースを分類する別の方法として、いわゆる「フィッシャーの分類関数係数」を適用した。それぞれのケースにつき、各群のＤ関数を計算し、対応するＤ関数の値が最も高い群に分類される。本研究において、２つの群（１つは正常なケース、もう１つは２１トリソミーのケース）が作られ、よって、（１）のような２つの関数が組み立てられた。Ｄ１は第１群（正常なケース）の関数を有し、Ｄ２は第２群（２１トリソミーのケース）の係数を有する。新しいケース（Ｘ１，...，Ｘｐ）の分類のために、２つの関数が評価された。Ｄ１＞Ｄ２であれば、対象は第１群（正常なケース）に分類され、そうでなければ第２群（２１トリソミー）に分類される。
【０１３８】
本研究の目的のため、様々なタイプのＤＡの中から、統計基準によりエントリの順番が決定する段階的判別解析を使用した。本実施例では、最も経済的な選択テクニック、すなわち、Ｗｉｌｋｓ  ｌａｍｂｄａ基準を用いた段階的ＤＡに集中した。段階的重回帰と同様に、エントリ基準および除外基準（Ｆ基準またはｐ基準）を設定することもできる。正確に分類する能力を有する判別関数を導き出す判別解析の能力は、分散（等分分散性）の正規性、線形性、均一性、予測値の独立性、多重共線性、および外れ値の影響が満たされている時に向上する。
【０１３９】
本研究では、上記の通り、本研究のデータを評価するために特定の統計検査を用いたが、代替的統計手法を利用しても、同じ結論に至る可能性がある。
【０１４０】
本研究では、２１トリソミー胎児を妊娠した女性の妊娠期間中に、母体末梢血試料を検査して２１トリソミーを正確に同定するには、表８（ＥＰ１〜ＥＰ１２）に記載のヌクレオチド配列を有する１２個のＤＭＲを使って、それらのＤＭＲのうち８領域のみから成るサブセット、すなわち、ＥＰ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、ＥＰ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、ＥＰ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、ＥＰ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ＥＰ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ＥＰ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ＥＰ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）およびＥＰ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）から成るサブセットで十分であることが判明した。
【０１４１】
実施例４：２１トリソミーの非侵襲性診断検査の追加説明および検証
本実施例では、実施例３に記載の２１トリソミーの非侵襲性診断検査について、さらに詳細に記述する。さらに、この胎児特異的メチル化比率方式を用いて、４６の正常な妊娠および３４の２１トリソミー妊娠を１００％正確に診断することが示された。
【０１４２】
本実施例で使用された試料
ここで行う診断戦略の目的のために、当初、周知の核型を有する４０の母体末梢血試料（正常な妊娠から２０、２１トリソミー妊娠から２０）を用いた。これら４０の末梢血試料は、妊娠月齢１１．１〜１４．４週の間から採取された。さらに、対象のアイデンティティおよび核型結果が、本検査を実行する試験者に分からないようにするために、４０の追加試料が無作為に使用された。
【０１４３】
使用された８０の試料は、キプロスおよびＭｉｔｅｒａ病院，アテネ，ギリシャの協力を通じて、Ｃｙｐｒｕｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにおいて、妊娠第１トリメスターから採取した。これらの試料は、ＥＤＴＡチューブで回収され、使用時まで−８０℃で、回収から最大６時間保管された。Ｃｙｐｒｕｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された同意書が、参加者の各試料採取のために回収された。
【０１４４】
４０の試料を６つの群に分けて検査した（３つの正常なケースおよび３つの２１トリソミーのケース）。本実験に参加した３つの正常な試料の中央値を、特定の実験の２１トリソミー試料とのみ比較した。
【０１４５】
２１トリソミーの非侵襲性出生前検知のためのＤＭＲの選択
本発明者が先に同定したＤＭＲについては、実施例１に記載されているが、それをさらに深く調べていくと、さらなる研究対象として、２１番染色体上に位置する１２個のＤＭＲの選択という点に導かれた。１２個のＤＭＲは、３つの基準に基づき選択された。第一に、１２個のＤＭＲは、胎児特異的ＤＭＲメチル化濃縮を達成し、よって母体循環におけるｆｆＤＮＡ量を増加させるために、胎盤においては高メチル化状態、末梢血においては低メチル化状態を示さなければならない。第二に、１２個のＤＭＲは、メチル化状態の組織特異性を確実にするために、第１トリメスター胎盤と第３トリメスター胎盤との間に共通なメチル化状態を有しなければならない。最後に、これらＤＭＲで観察された特異的なメチル化のレベルが、当該領域に含まれるオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つにおいて、対数目盛で「１」の値より大きくなければならない。１２個のＤＭＲと共に、１３番染色体（ＨＹＰ１１３）および２２番染色体（Ｕ１２２）上に位置する２つの追加領域は、実施例３に記載の通り、それぞれ、高メチル化コントロールおよび低メチル化コントロールとして使用された。
【０１４６】
胎児特異的ＤＮＡメチル化比率方式の開発および検証
ＭｅＤｉＰおよびリアルタイムＱＰＣＲの応用
ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；  Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、  イギリス）を用いて、各試料から１ｍｌずつ抽出した。８０の試料から単離されたＤＮＡに対し、実施例１〜３に記載の通り、メチル化部位の免疫沈降の処理を行った。簡潔に、２．５μｇのＤＮＡを、約３００ｂｐ〜１０００ｂｐの大きさの断片に超音波によりせん断した。ＤＮＡ断片を平滑末端として、リンカーを作られた両端に追加した。各試料から合計５０ｎｇのライゲーションしたＤＮＡを取り除き、インプットゲノムコントロールＤＮＡとして保有した。残りのライゲーションしたＤＮＡ試料（８００ｎｇ〜１．２μｇ）には、実施例１〜３に記載の通り、ＭｅＤｉＰ処理を施した。最後に、ＤＮＡの量を増加させるために、インプットおよびＩＰＤＮＡ断片をそれぞれ１０ｎｇずつ用いて、ライゲーション仲介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）反応を行った。
【０１４７】
その後、リアルタイムＱＰＣＲを、２１番染色体上および二つのコントロール領域上の選択されたＤＭＲのインプットおよびＩＰＤＮＡ断片全てに適用した。使用されたプライマー設計、最適化および循環条件の手順については、実施例１〜３に記載の通りであった。２１番染色体上の検査領域および１３番染色体および２２番染色体上のコントロール領域のために使用されたプライマーは、実施例３の表７に記載されている。
【０１４８】
統計解析法
１２個の選択されたＤＭＲの区別の度合いを評価するために、既知の核型を有する４０の試料を使用した。これを達成するために、１２個の各ＤＭＲに関して、２０の正常なケースの胎児特異的メチル化比値を２０の２１トリソミーケースの比値と比較した。生データを正規化するために、上記のリアルタイムｑＰＣＲにより、インプットおよびＩＰ断片すべてにＣＴ値を得た。取得されたＣＴ値に一連の正規化ステップを施した。最初は、三重リアルタイムｑＰＣＲ反応の平均ＣＴ値を、インプットおよびＩＰ試料それぞれのために計算した。その後、ＭｅＤｉＰおよびＬＭ−ＰＣＲ適用中のＰＣＲ反応の効率を、以下の数式を使って正規化した。
ΔCTPB Normal = CTPB Normal Input - CTPB Normal IP
ΔCTPB T21 = CTPB T21 Input - CTPB T21 IP
式中、
ＰＢ＝末梢血
Ｔ２１＝２１トリソミー
ＩＰ＝免疫沈降
である。
上記正規化は、全ての試料に対し、また、選択されたＤＭＲおよびコントロールのすべてに対し別々に行った。
【０１４９】
その後、以下の公式によるさらなる正規化のために、リアルタイムｑＰＣＲのプライマー効率を使用した
Norm ΔCT valuePB Normal= E ΔCTPB Normal
Norm ΔCT value PB T21 = E ΔCT PB T21
式中、
E= 10 [-1/slope]  = プライマーの効率、
Norm= 正規化
である。
【０１５０】
コントロールプライマーから得た正規化値は、検査された各試料の各コントロール領域のメチル化濃縮に対応する。
【０１５１】
ＰＣＲ反応の正規化およびリアルタイムｑＰＣＲのプライマー効率に基づく正規化の後、以下の数式を使って、選択された各ＤＭＲのために、別々に、NormΔCTPB Normalの中央を計算した。
Median Norm ΔCTPB Normal = Median (Norm ΔCTPB Normal-1、 Norm ΔCTPB Normal-2、 ... Norm ΔCTPB Normal-n)
検査対象の各ＤＭＲにおける各試料の胎児特異的メチル化比値を決定するために、Median Norm ΔCTPB Normalの計算が必要であった。本比値は、以下の数式を用いて決定した。
Ratio ValueSample; DMR = Norm ΔCTPB Sample (Normal or T21) / Median (Norm ΔCTPB Normal)
【０１５２】
理論的には、正常なケースの比値は、２１番染色体の場合、１および１．５でなければならない。しかし、観察された比率は通常、メチル化レベルの個体間変動性（実施例１に記載）並びに母体ＤＮＡバックグラウンドの存在のため、正常なケースの値よりも小さく、２１トリソミーケースの値よりも大きい。
【０１５３】
各ＤＭＲの統計的有意性を正確に決定するためには、さらなる統計解析が必須であった。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検査を用いて、統計評価を行った。本検査は、２つの独立した観察セットが同じ分布由来であるかどうかを評価するためのノンパラメトリック検査である。
【０１５４】
本解析の最終目的は、ケースの結果を正確に解釈し、正常または２１トリソミーとして正確に分類することであった。これを達成するために、「判別分析（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｙｓ  （ＤＡ）」と呼ばれる解析を行った。ＤＡは、群の構成員が既知であるケースのサンプルから関数を導き出す。その後、予測変数の測定値を有するがどの群の構成員かは分からない新しいケースに適用され得る。２群のＤＡ関数ができるだけ異なるように「線形判別方程式」を組み立てる。本研究の目的のために、異なるタイプのＤＡのうち、統計基準がエントリの順番を決定する段階的判別分析を用いた。本実施例では、最も経済的な技法、すなわちＷｉｌｋｓ  ｌａｍｂｄａ基準を用いた段階的ＤＡに集中した。ＤＭＲが最終モデル含まれるには、多くの基準が満たされる必要がある（Ｆ基準）。ＤＭＲの最終モデルへのエントリには、ＤＭＲのＦの最大有意性計算し、ＤＭＲの最終モデルからの除外には、Ｆの最小有意性を計算することにより基準が設定された。
【０１５５】
予測方程式が完成したら、無作為試験を行い、さらに結果を検証した。４０の無作為試料を使って、８個の選択されたＤＭＲのメチル化濃縮を検査した。各試料から得られた比値を予測方程式にあてはめ、それらの状態を（正常かまたは２１トリソミーか）を判断した。
【０１５６】
ＭｅＤｉＰ効率の評価
ＭｅＤｉＰ方法論の効率を評価するために、上記の８０の母体末梢血試料を使って、既知の高メチル化（ＨＹＰ１１３）領域および低メチル化（Ｕ１２２）領域を検査した。試料Ｐ１〜Ｐ４０は、予測方程式を作るために使用された既知の核型を有する試料であり、一方、試料Ｐ４１〜Ｐ８０は、無作為試験に参加した試料である。試料Ｐ１〜２０およびＰ４１〜Ｐ６６は、正常な胎児を妊娠した女性から採取した試料であり、一方、Ｐ２１〜Ｐ４０およびＰ６７〜Ｐ８０は、２１トリソミーを有する胎児を妊娠した女性から採取した試料である。
【０１５７】
試料Ｐ１〜２０およびＰ４１〜６６（「正常な」試料）に関して、ＨＹＰ１１３コントロール領域のメチル化濃縮値は、３．６６〜８．６８の範囲（中央値＝５．２７）であり、試料Ｐ２１〜Ｐ４０およびＰ６７〜Ｐ８０（「２１トリソミー」試料）に関して、ＨＹＰ１１３コントロール領域のメチル化濃縮値は、３．１５〜１２．３２の範囲（中央値＝４．６８）であった。試料Ｐ１〜２０およびＰ４１〜６６（「正常」試料）に関して、Ｕ１２２コントロール領域のメチル化濃縮値は、０．００〜０．１５（中央値＝０．０３）であり、試料Ｐ２１〜Ｐ４０およびＰ６７〜Ｐ８０（「２１トリソミー」試料）に関して、Ｕ１２２コントロール領域のメチル化濃縮値は、０．００〜０．５１（中央値＝０．０４）であった。よって、ＨＹＰ１１３コントロール領域を試験すると高メチル化濃縮が観察されたが、これは、正常および２１トリソミーの両ケースにおいて、３．１５倍率変化またはそれ以上の値を有するメチル化状態であることを示している。一方、Ｕ１２２コントロール領域を検査すると、正常および２１トリソミーの両ケースにおいて予想通り、０．５１倍率変化またはそれ以下の低メチル化状態が示された。
【０１５８】
胎児特異的ＤＮＡメチル化比率方式の効率
本明細書で記載されているように、４０の既知の核型試料を用いて（正常が２０、２１トリソミーが２０）、正常および２１トリソミーケースのＤＮＡメチル化比率を決定するための方式を開発した。
【０１５９】
本明細書で使用された胎児特異的メチル化比率方式は、図７にその略図を示した。その中で、正常なケースを２１トリソミーのケースから区別する能力は、正常なケースと２１トリソミーのケースから得られた比値を、２１番染色体に位置する胎児特異的メチル化領域を使って比較することにより達成される。２１トリソミーを有する胎児は、正常な胎児と比べて、胎児特異的メチル化領域の余分なコピーを有している。ＤＮＡメチル化濃縮の完成後、胎児ＤＮＡの量が母体循環で増加する。しかし、２１トリソミーを有する胎児ではでは、領域に余分なコピーがあるため、正常なケースと比べて胎児特異的領域の量がより増加する。よって、正常な試験試料を有する正常なコントロールケースの母体末梢血比率は、２１トリソミーケースと比較して、正常なコントロールケースの比値から逸脱する。
【０１６０】
正常なケースおよび２１トリソミーケースにおけるＤＮＡメチル化比率を決定するための分析方式について、図８にその略図が示されている。いったん胎児特異的メチル化領域のメチル化濃縮が完成すれば、正常なケースおよび２１トリソミーケースにおける胎児ＤＮＡの量の相対的定量化を行うために、リアルタイムＱＰＣＲを胎児特異的メチル化領域に適用する。ＤＮＡメチル化比率を得るために、正常なケースから得られた正規化（正規）ＣＴ値を、正常なコントロールケースの正規中央値で除算した。同じ手順が、２１トリソミーケースにも行われた。正常なケースの予測比値は１またはそれ以下であり、２１トリソミーのケースでは、１またはそれ以上である。
【０１６１】
判別／予測方程式の作成に参加した、既知の核型を有する４０の試料から得られた、１２個の選択されたＤＭＲ（ＥＰ１〜ＥＰ１２）の比値については、以下の表９に概要を示した。
【０１６２】
（表９）周知の核型を有する４０の各試料由来の選択された１２個の各ＤＭＲのために取得された胎児特異的メチル化比値の概要
2013517789.tif 000015
【０１６３】
表９に示すように、正常なケースの比率中央値は、１．００またはそれより小さいのに対し、２１トリソミーの比率中央値は、ＥＰ８（広範な高メチル化比値を示した）およびＥＰ１１を除いて、１．００またはそれより大きい。
【０１６４】
図９は、正常なケースおよび２１トリソミーケースにおける４個のＤＭＲ、すなわち、ＥＰ１、ＥＰ４、ＥＰ７およびＥＰ１０から得られた結果の箱髭図を示している。この箱髭図は５数要約を示している。すなわち、最小値および最大値、第３四分位点（Ｑ３）および第１四分位点（Ｑ１）、および中央値である。中央値は、箱の内側の線によって定められる。箱の長さは四分位間の範囲を表す（ＩＱＲ＝Ｑ３−Ｑ１）。箱のいずれかの端より３ＩＱＲより大きい値は極端外れ値として、アステリスク（＊）を付ける。箱のいずれかの端より１．５ＩＱＲを超えるが、３ＩＱＲ未満の値は、軽度外れ値として丸印（０）を付ける。
【０１６５】
統計解析
胎児特異的メチル化比値をさらに評価するために、本研究において、正常なケースを２１トリソミーケースから区別するにあたり、１２個の各ＤＭＲの統計的有意性を明らかにする、詳細な単変量統計解析を行うことが必須であった。これを達成するために、ｐ値について各ＤＭＲの有意性を評価するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  Ｔｅｓｔを使用した。各ＤＭＲに対し両側検定により得られたｐ値を、以下の表１０に示す。
【０１６６】
（表１０）ｐ値計算により評価された各ＤＭＲの統計的有意性
2013517789.tif 000016
【０１６７】
ＥＰ１、ＥＰ４、ＥＰ７およびＥＰ１０（ｐ＜０．００１）等、正常なケースを２１トリソミーケースと効率的に区別するＤＭＲは、２１トリソミーケース由来の値と比べて、正常なケース由来の値の範囲を明確に区別している。２１トリソミーケース由来の値（それぞれの値＝１．７４、１．７９．２．１７および２．０３）と比較した正常なケースの値（値＝１．００）の中央値との差分によっても、特異的ＤＭＲに関してＤＭＲの統計的有意性を評価できる。一方、ＥＰ８およびＥＰ１１等、統計的に有意でない（ｐ＞０．０５）ＤＭＲにおいて、正常なケースおよび２１トリソミーケースから得られた中央値は、１．００に近似している、例えば、ＥＰ１１においては、中央値は、正常なケースにおいて１．００、２１トリソミーケースにおいて０．９４である。
【０１６８】
単一のＤＭＲでは、正常妊娠であるかまたは２１トリソミー妊娠であるか確信をもって正確に診断できないかもしれないが、複数のＤＭＲを組み合わせることで、これを達成できるかもしれないと仮説を立てた。この仮説を検証するために、複数のＤＭＲのサブセットまたは全体から理想的な組み合わせを作り出す統計ツールを使用した。「判別分析（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＡ）」と称されるアプリケーションにより、正常妊娠または２１トリソミー妊娠を正確に決定する統計手法が得られるとの結論に至った。
【０１６９】
方法のセクションにおいて論じたように、方程式の組み立てに最も適切なＤＭＲを選択するために、続いて段階的選択手順を踏んだ。４０のケースに判別分析（ＤＡ）を行った結果、１２個のうち８個のＤＭＲが予測方程式の最終モデルとなり、取り除かれるものはなかった。よって、段階的分析は８ステップから成り、それぞれに新たに予測変数が選択された。予測変数は、Ｗｉｌｋ'ｓ  Ｌａｍｂｄａ統計に従って、以下の順番で選択された。すなわち、ＥＰ４（０．６４６）、ＥＰ１２（０．４５６）、ＥＰ６（０．３４０）、ＥＰ５（０．２５１）、ＥＰ７（０．２１０）、ＥＰ１１（０．１５９）、ＥＰ１０  （０．１３３）、およびＥＰ８（０．１２２）である。ＤＭＲのＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ９は、最終モデルから除外された。
【０１７０】
ＤＭＲの選択が終わると、各ＤＭＲの判別関数係数が計算された、値は、ケースを分類するのに用いられ得る予測方程式を組み立てるために使われた。以下の表１１は、ＤＡ関数で８つの選択された各ＤＭＲの推定係数を示している。
【０１７１】
（表１１）判別関数係数
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【０１７２】
本予測方程式における係数の解釈は単純である。例えば、ＥＰ５で１単位増加すると、予測方程式値が１．１８８単位増加する（表１１）。その結果、予測方程式は以下の通りとなる。
D = - 6.331 + 0.959 XEP4 + 1.188 XEP5 + 0.424 XEP6 + 0.621 XEP7 + 0.028 XEP8 + 0.387 XEP10 - 0.683 XEP11 + 0.897 XEP12
式中、XEPi = ratio valueSample; EPi 、  i= 1、...12 
である。
【０１７３】
正常ケースおよび２１トリソミーケースの分類
予測値、または「Ｄ値」がカットポイントを超えるケースは、「２１トリソミー」と分類し、カットポイントを下回ると評価したケースは、「正常」と評価する。ケースで構成される２群のサイズは等しく、カットポイントは「０」とする。よって、Ｄ＞０の場合ケースは「２１トリソミー」と分類され、そうでなければ「正常」と分類される。明らかに正常な妊娠から採取した試料は全て、Ｄ値が負であったが、明らかに２１トリソミー妊娠から採取した試料は全てＤ値が正であった。正常であるかそれとも２１トリソミーであるかかが明らかな４０のケースのＤ値の範囲並びに中央値は、以下の表１２に示されている。
【０１７４】
（表１２）予測方程式を使った場合の、核型が判明している４０の試料から得られた予測値
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【０１７５】
オリジナルの検証方法によりＤＡ関数の診断係数を統計的に評価したところ、正常なケースおよび２１トリソミーケース全てを完全に分類したことが判明した。これらの結果は、方法論の特異度１００％および感度１００％に相当する。
【０１７６】
ケースを正確に分類する診断ルールが目的であるため、結果的に得られた判別関数の能力向上のために、すべての仮説を確認しなければならない。ＤＡ関数では、直線性の仮説は対となる予測因子間の関係にのみ適用される。非直線性では関係性の検知能が低減するため、研究者は通常、ある予測因子が常に他の予測因子と非直線的関係にあると明確に分かっている時にのみ注目する。本分析においては、そのような可能性を示す証拠は存在しない。
【０１７７】
予測因子の多変量正規性を仮定しても、関与する全ての予測因子に対する検査は容易に行えた。歪度および尖度の適切な信頼区間は、少なくとも部分的に（−１、１）の範囲を対象とする。これは、正規分布の変数の範囲である。外れ値に関しては、一般的に、各ケースとケースが属する群の重心との間のマハラノビス距離が評価されてきた。有意な偏差の報告はなく、いかなる影響も観察されていない。依存変数により定義された群の均一な共分散マトリックスの仮説のみが、判別分析の分類段階に影響を与え、Ｂｏｘ'ｓ  Ｍ  ｔｅｓｔで評価される。本分析の場合がそうであるように、データに重要な外れ値が含まれないならば、判別関数分析は、分散均一性の仮説が満たされない時でもロバストである。１つの予測因子が、１つまたは複数の他の予測因子と強い相関関係にある場合、独立変数に対する当該因子の関係が誤って解釈される傾向にあるため、多重共線性が発生する。その結果、独立変数の説明に対する可能な一意の貢献が、他の予測因子に対する強い関係性のために最小化することとなる。独立変数の許容値が０．１０より小さい場合、多重共線性が示唆される。結果として得られるＤＡ関数の独立変数全てに対する許容値は、０．１０より大きい。多重共線性は、本判別分析においては問題とはならない。
【０１７８】
提案するＤＡ関数の適正を評価するために、本発明者は、ＤＡ関数で説明される独立変数において、分散の部分を示す関連固有値を取得した。値が大きければ大きいほど、関数は強くなる。さらに、標準係数を評価し、その平方根が、ＤＡの予測因子で半別された独立変数の変量パーセントを表す。これらの値は、重要な関数は幾つあるかを決定するために使われる。本明細書では、判別関数はわずか１つであるため、ここでは問題とはならない。但し、固有値が１よりも大きいため、それは７．２０７となり、その正準相関は非常に高く９３．７％である。最後に、固有値の有意性に対する適切なＷｉｌｋｓ'  Ｌａｍｂｄａ  ｔｅｓｔを実施し、統計的に有意であることが判明した（Ｗｉｌｋｓ'Ｌａｍｂｄａ＝１．２２２、ｐ値＝０．００）。
【０１７９】
正常ケースおよび２１トリソミーケースの無作為試験
方法の特異度および感度は、４０のサンプルから成る無作為試験により再評価された。本無作為試験は、予測方程式を構成する８個のＤＭＲのメチル化状態を評価することにより行われた。試料の状態（正常または２１トリソミー）を判断するＤ値を明らかにするために、本無作為試験で４０のサンプルの８ＤＭＲから得られた比値を予測方程式に当てはめた。合計２６のケースのＤ値は負であり、１４のケースのＤ値は正であった。従って、表１３にまとめるように、予測方程式によると２６のケースは正常であり、１４のケースは２１トリソミーである。
【０１８０】
（表１３）予測方程式を用いて、無作為試験に参加した４０の試料から得られた予測値
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【０１８１】
上記結果は、試料の核型と相互参照した後に確認し、先に予測した通り、ＮＩＰＤアプローチの１００％特異度および１００％感度を示した。
【０１８２】
興味深いことに、本研究の結果は、ＲＮＡ−ＳＮＰ戦略（それぞれ９０％および９６．５％）（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．ら（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：２１８−２２３）を用いた従来の研究と比較して、高い診断感度および特異度を示した。ＲＮＡ−ＳＮＰ研究には、１２〜２０週の範囲にあるわずか１０の２１トリソミーケースしか含まれておらず、その２１トリソミーケースのうちの１つは正しく分類されていなかった。本研究では、既知の核型を有する合計４０のサンプル（２０は正常で、２０は２１トリソミー）、並びに４０の無作為サンプル（２６が正常で、１４が２１トリソミー）が正確に分類され、１００％感度および１００％特異度をもたらした。全てのサンプルは、具体的に、妊娠第１トリメスターの月例（１１．１〜１４．４）から採取された。さらに、本戦略の診断感度および特異度は、現在利用されている、後頚部浮腫およびバイオマーカーを含む第１トリメスターのスクリーニングプロトコル（Ｗａｌｄ，Ｎ．Ｊ．ら（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：４６１−４６７；Ｗｅｉｓｚ、Ｂ．およびＲｏｄｅｃｋ，Ｃ．Ｈ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ１２：５１３−５１８）と比較して、有意に大きいことが判明した。
【０１８３】
高コストで診断ラボへのアクセスが容易ではない次世代配列テクノロジーの応用等、新たに開発された方法と比較して、本研究にはさらに利点のあることが観察された。本方式では、ＭｅＤｉＰおよびリアルタイムＱＰＣＲ方法を活用し、当該方法は、大型かつ高額なインフラを必要としないため、基礎的な診断を行うラボであればどこでもアクセス可能であり、技術的に容易であり、またコストも安価である。
【０１８４】
さらに、ＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム変換では、最大９６％のＤＮＡが分解する可能性があり（Ｇｒｕｎａｕ，Ｃ．ら（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ６５−Ｅ６５）、限られた量のｆｆＤＮＡの定量化をさらに複雑にすることもあり得るが、本方式では、現在利用されているこのような方法論に比べて改良されている。さらに、本診断方式は、従来の研究（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．ら（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：２１８−２２３；Ｔｓｕｉ，Ｎ．Ｂ．ら（２００９）Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２９：１０３１−１０３７；Ｔｓｕｉ，Ｎ．Ｂ．ら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５１：２３５８−２３６２；Ｔｓｕｉ，Ｎ．Ｂ．およびＬｏ、Ｙ．Ｍ．（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４４：２７５−２８９；Ｔｏｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５６：９０−９８）と対照的に、胎児の性別または情報的多型部位（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｉｔｅｓ）の存在による影響を受けない。本技術は広く利用される得るため、非常に重要である。
【０１８５】
本明細書に記載の本アプローチは、２１トリソミーのＮＩＰＤへの道を開き、全ての診断ラボで日常的に利用され、全ての妊娠に応用可能となる可能性がある。係る非侵襲性アプローチは、現在行われている侵襲性のために正常な妊娠において流産するリスクを回避する。
【０１８６】
配列の概要
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【０１８７】
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中1頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中５頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中６頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中７頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中８頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中９頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中１０頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中１２頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中１３頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中１４頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中１５頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中１９頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２０頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２１頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２２頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２３頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２４頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２５頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２６頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２７頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２８頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中２９頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３０頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３１頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３２頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３３頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３４頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３５頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３６頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３７頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３８頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ａ：２１番染色体
３９頁中３９頁目
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＊染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中５頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中６頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中７頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中８頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中９頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１０頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１１頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１２頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１３頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
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添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１６頁目
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添付Ｂ：１３番染色体
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中１８頁目
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添付Ｂ：１３番染色体
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
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４９頁中２１頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２２頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２３頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２４頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２５頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２６頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２７頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２８頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中２９頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３０頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３１頁目
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染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３２頁目
2013517789.tif 000094
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３３頁目
2013517789.tif 000095
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３４頁目
2013517789.tif 000096
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３５頁目
2013517789.tif 000097
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３６頁目
2013517789.tif 000098
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３７頁目
2013517789.tif 000099
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３８頁目
2013517789.tif 000100
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中３９頁目
2013517789.tif 000101
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４０頁目
2013517789.tif 000102
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４１頁目
2013517789.tif 000103
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４２頁目
2013517789.tif 000104
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４３頁目
2013517789.tif 000105
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４４頁目
2013517789.tif 000106
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４５頁目
2013517789.tif 000107
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４６頁目
2013517789.tif 000108
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４７頁目
2013517789.tif 000109
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４８頁目
2013517789.tif 000110
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｂ：１３番染色体
４９頁中４９頁目
2013517789.tif 000111
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１頁目
2013517789.tif 000112
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２頁目
2013517789.tif 000113
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３頁目
2013517789.tif 000114
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４頁目
2013517789.tif 000115
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５頁目
2013517789.tif 000116
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６頁目
2013517789.tif 000117
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中７頁目
2013517789.tif 000118
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中８頁目
2013517789.tif 000119
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中９頁目
2013517789.tif 000120
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１０頁目
2013517789.tif 000121
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１１頁目
2013517789.tif 000122
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１２頁目
2013517789.tif 000123
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１３頁目
2013517789.tif 000124
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１４頁目
2013517789.tif 000125
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１５頁目
2013517789.tif 000126
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１６頁目
2013517789.tif 000127
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１７頁目
2013517789.tif 000128
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１８頁目
2013517789.tif 000129
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中１９頁目
2013517789.tif 000130
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２０頁目
2013517789.tif 000131
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２１頁目
2013517789.tif 000132
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２２頁目
2013517789.tif 000133
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２３頁目
2013517789.tif 000134
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２４頁目
2013517789.tif 000135
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２５頁目
2013517789.tif 000136
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２６頁目
2013517789.tif 000137
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２７頁目
2013517789.tif 000138
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２８頁目
2013517789.tif 000139
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中２９頁目
2013517789.tif 000140
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３０頁目
2013517789.tif 000141
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３１頁目
2013517789.tif 000142
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３２頁目
2013517789.tif 000143
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３３頁目
2013517789.tif 000144
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３４頁目
2013517789.tif 000145
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３５頁目
2013517789.tif 000146
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３６頁目
2013517789.tif 000147
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３７頁目
2013517789.tif 000148
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３８頁目
2013517789.tif 000149
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中３９頁目
2013517789.tif 000150
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４０頁目
2013517789.tif 000151
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４１頁目
2013517789.tif 000152
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４２頁目
2013517789.tif 000153
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４３頁目
2013517789.tif 000154
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４４頁目
2013517789.tif 000155
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４５頁目
2013517789.tif 000156
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４６頁目
2013517789.tif 000157
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４７頁目
2013517789.tif 000158
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４８頁目
2013517789.tif 000159
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中４９頁目
2013517789.tif 000160
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５０頁目
2013517789.tif 000161
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５１頁目
2013517789.tif 000162
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５２頁目
2013517789.tif 000163
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５３頁目
2013517789.tif 000164
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５４頁目
2013517789.tif 000165
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５５頁目
2013517789.tif 000166
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５６頁目
2013517789.tif 000167
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５７頁目
2013517789.tif 000168
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５８頁目
2013517789.tif 000169
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中５９頁目
2013517789.tif 000170
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６０頁目
2013517789.tif 000171
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６１頁目
2013517789.tif 000172
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６２頁目
2013517789.tif 000173
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６３頁目
2013517789.tif 000174
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６４頁目
2013517789.tif 000175
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６５頁目
2013517789.tif 000176
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６６頁目
2013517789.tif 000177
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６７頁目
2013517789.tif 000178
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６８頁目
2013517789.tif 000179
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中６９頁目
2013517789.tif 000180
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中７０頁目
2013517789.tif 000181
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中７１頁目
2013517789.tif 000182
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｃ：１８番染色体
７２頁中７２頁目
2013517789.tif 000183
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１頁目
2013517789.tif 000184
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２頁目
2013517789.tif 000185
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３頁目
2013517789.tif 000186
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４頁目
2013517789.tif 000187
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５頁目
2013517789.tif 000188
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６頁目
2013517789.tif 000189
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中７頁目
2013517789.tif 000190
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中８頁目
2013517789.tif 000191
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中９頁目
2013517789.tif 000192
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１０頁目
2013517789.tif 000193
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１１頁目
2013517789.tif 000194
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１２頁目
2013517789.tif 000195
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１３頁目
2013517789.tif 000196
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１４頁目
2013517789.tif 000197
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１５頁目
2013517789.tif 000198
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１６頁目
2013517789.tif 000199
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１７頁目
2013517789.tif 000200
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１８頁目
2013517789.tif 000201
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中１９頁目
2013517789.tif 000202
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２０頁目
2013517789.tif 000203
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２１頁目
2013517789.tif 000204
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２２頁目
2013517789.tif 000205
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２３頁目
2013517789.tif 000206
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２４頁目
2013517789.tif 000207
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２５頁目
2013517789.tif 000208
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２６頁目
2013517789.tif 000209
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２７頁目
2013517789.tif 000210
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２８目
2013517789.tif 000211
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中２９目
2013517789.tif 000212
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３０目
2013517789.tif 000213
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３１頁目
2013517789.tif 000214
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３２頁目
2013517789.tif 000215
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３３頁目
2013517789.tif 000216
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３４頁目
2013517789.tif 000217
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３５頁目
2013517789.tif 000218
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３６頁目
2013517789.tif 000219
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３７頁目
2013517789.tif 000220
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３８頁目
2013517789.tif 000221
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中３９頁目
2013517789.tif 000222
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４０頁目
2013517789.tif 000223
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４１頁目
2013517789.tif 000224
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４２頁目
2013517789.tif 000225
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４３頁目
2013517789.tif 000226
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４４頁目
2013517789.tif 000227
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４５頁目
2013517789.tif 000228
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４６頁目
2013517789.tif 000229
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４７頁目
2013517789.tif 000230
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４８頁目
2013517789.tif 000231
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中４９頁目
2013517789.tif 000232
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５０頁目
2013517789.tif 000233
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５１頁目
2013517789.tif 000234
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５２頁目
2013517789.tif 000235
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５３頁目
2013517789.tif 000236
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５４頁目
2013517789.tif 000237
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５５頁目
2013517789.tif 000238
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５６頁目
2013517789.tif 000239
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５７頁目
2013517789.tif 000240
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５８頁目
2013517789.tif 000241
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中５９頁目
2013517789.tif 000242
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６０目
2013517789.tif 000243
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６１頁目
2013517789.tif 000244
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６２頁目
2013517789.tif 000245
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６３頁目
2013517789.tif 000246
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６４頁目
2013517789.tif 000247
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６５頁目
2013517789.tif 000248
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６６頁目
2013517789.tif 000249
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６７頁目
2013517789.tif 000250
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６８頁目
2013517789.tif 000251
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中６９頁目
2013517789.tif 000252
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中７０頁目
2013517789.tif 000253
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中７１頁目
2013517789.tif 000254
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中７２頁目
2013517789.tif 000255
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｄ：Ｘ染色体
７３頁中７３頁目
2013517789.tif 000256
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１頁目
2013517789.tif 000257
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２頁目
2013517789.tif 000258
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３頁目
2013517789.tif 000259
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４頁目
2013517789.tif 000260
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５頁目
2013517789.tif 000261
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中６頁目
2013517789.tif 000262
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中７頁目
2013517789.tif 000263
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中８頁目
2013517789.tif 000264
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中９頁目
2013517789.tif 000265
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１０頁目
2013517789.tif 000266
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１１頁目
2013517789.tif 000267
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１２頁目
2013517789.tif 000268
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１３頁目
2013517789.tif 000269
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１４頁目
2013517789.tif 000270
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１５頁目
2013517789.tif 000271
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１６頁目
2013517789.tif 000272
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１７頁目
2013517789.tif 000273
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１８頁目
2013517789.tif 000274
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中１９頁目
2013517789.tif 000275
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２０頁目
2013517789.tif 000276
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２１頁目
2013517789.tif 000277
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２２頁目
2013517789.tif 000278
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２３頁目
2013517789.tif 000279
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２４頁目
2013517789.tif 000280
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２５頁目
2013517789.tif 000281
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２６頁目
2013517789.tif 000282
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２７頁目
2013517789.tif 000283
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２８頁目
2013517789.tif 000284
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中２９頁目
2013517789.tif 000285
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３０頁目
2013517789.tif 000286
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３１頁目
2013517789.tif 000287
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３２頁目
2013517789.tif 000288
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３３頁目
2013517789.tif 000289
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３４頁目
2013517789.tif 000290
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３５頁目
2013517789.tif 000291
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３６頁目
2013517789.tif 000292
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３７頁目
2013517789.tif 000293
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３８頁目
2013517789.tif 000294
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中３９頁目
2013517789.tif 000295
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４０頁目
2013517789.tif 000296
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４１頁目
2013517789.tif 000297
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４２頁目
2013517789.tif 000298
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４３頁目
2013517789.tif 000299
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４４頁目
2013517789.tif 000300
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４５頁目
2013517789.tif 000301
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４６頁目
2013517789.tif 000302
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４７頁目
2013517789.tif 000303
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４８頁目
2013517789.tif 000304
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中４９頁目
2013517789.tif 000305
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５０頁目
2013517789.tif 000306
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５１頁目
2013517789.tif 000307
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５２頁目
2013517789.tif 000308
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５３頁目
2013517789.tif 000309
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５４頁目
2013517789.tif 000310
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５５頁目
2013517789.tif 000311
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５６頁目
2013517789.tif 000312
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５７頁目
2013517789.tif 000313
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
添付Ｅ：Ｙ染色体
５８頁中５８頁目
2013517789.tif 000314
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/）ビルド３６から得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年10月25日(2012.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013517789000001.app
【国際調査報告】
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2013517789.tif 000328
2013517789.tif 000329
2013517789.tif 000330
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