(57)【要約】  本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの経路、１，４−ブタンジオール（１４−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの経路、１，３−ブタンジオール（１３−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの経路、またはメチルアクリル酸（ＭＡＡ）およびイソプロパノールの経路を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記微生物は、ｎ−プロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯまたはＭＡＡとイソプロパノールとの経路のそれぞれにおける酵素をコードしている外来性の核酸を少なくとも１つ含んでいる。本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを共生成させる方法をさらに提供する。当該方法は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールを共生成する微生物を培養することを包含し得る。当該微生物は、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を、各産物を生成させるために十分な時間にわたって、各産物を生成させるための十分な量において発現している。
2013504326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記ｎ−プロパノール経路は、プロパノール脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノール脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、またはアセト酢酸脱水素酵素を含んでいる、天然に存在しない微生物。
【請求項２】
アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるアセチル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
上記アセチル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸リアーゼ、ピルビン酸蟻酸リアーゼを活性化させる酵素、または蟻酸脱水素酵素を含んでいる、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項３】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、またはメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを含んでいる、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項４】
上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらに含んでいる、請求項３に記載の天然に存在しない微生物
【請求項５】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、スレオニン脱アミノ酵素または２−オキソブタン酸脱水素酵素を含んでいる、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項６】
上記ｎ−プロパノール経路は２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼをさらに含んでいる、請求項５に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項７】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素またはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでいる、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項８】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、乳酸脱水素酵素、乳酸−ＣｏＡ転移酵素、ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素またはアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素を含んでいる、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項９】
ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、
プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；または
プロピオン酸還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびにイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項１０】
アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるアセチル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
外来性の核酸の上記第３の組は、（ａ）ピルビン酸キナーゼ；ならびに（ｂ１）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、または（ｂ２）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素をコードしている、請求項９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１１】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；リンゴ酸脱水素酵素；フマラーゼ；フマル酸還元酵素；スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；ならびにメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードしている、請求項９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１２】
外来性の核酸の第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらにコードしている、請求項１１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１３】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；スレオニン脱アミノ酵素；ならびに２−オキソブタン酸脱水素酵素をコードしている、請求項９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１４】
外来性の核酸の上記第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素またはピルビン酸カルボキシラーゼをさらにコードしている、請求項１３に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１５】
外来性の核酸の上記第２の組は２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼをさらにコードしている、請求項１３に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１６】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
外来性の核酸の上記第３の組は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；マロニル−ＣｏＡ還元酵素；マロン酸セミアルデヒド還元酵素；およびプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしている、請求項９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１７】
プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、
外来性の核酸の第３の組は、乳酸脱水素酵素；乳酸−ＣｏＡ転移酵素；ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；およびアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている、請求項９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１８】
ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素およびリン酸プロピオニル還元酵素；（ｃ）プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；または（ｄ）プロピオン酸還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、（ｅ）ピルビン酸キナーゼ；（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｇ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｈ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｉ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｊ）イソプロパノール脱水素酵をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項１９】
外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらにコードしている、請求項１８に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項２０】
ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；
（ｂ）スレオニン脱アミノ酵素；ならびに
（ｃ）以下の（ｃ１）〜（ｃ５）のいずれか：
（ｃ１）２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼおよびプロパノール脱水素酵素；
（ｃ２）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｃ３）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｃ４）２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または
（ｃ５）２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、（ｄ）ピルビン酸キナーゼ；（ｅ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｆ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｇ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｈ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｉ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項２１】
外来性の核酸の上記第２の組は、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼをさらにコードしている、請求項２０に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項２２】
ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）ピルビン酸キナーゼ；
（ｂ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；
（ｃ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；
（ｄ）マロニル−ＣｏＡ還元酵素；
（ｅ）マロン酸セミアルデヒド還元酵素；
（ｆ）プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；ならびに
（ｇ）以下の（ｇ１）〜（ｇ４）のいずれか：
（ｇ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｇ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｇ３）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または
（ｇ４）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項２３】
ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）乳酸脱水素酵素；
（ｂ）乳酸−ＣｏＡ転移酵素；
（ｃ）ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；
（ｄ）アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素；ならびに
（ｅ）以下の（ｅ１）〜（ｅ４）のいずれか：
（ｅ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｅ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｅ３）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；
（ｅ４）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｇ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｈ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｉ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｊ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項２４】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項２５】
実質的に嫌気性の培養培地に入れられている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項２６】
ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールを生成させるために十分な期間にわたって、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールを生成させる条件において、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物を培養することを包含している、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールを生成させる方法。
【請求項２７】
上記条件は実質的に嫌気性の培養条件を包含している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ｎ−プロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記ｎ−プロパノール経路は、プロパノール脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでいる、天然に存在しない微生物。
【請求項３０】
ｎ−プロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている１組の外来性の核酸を含んでおり、
上記１組の外来性の核酸は、（ａ）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｄ）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項３１】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項２９または３０に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項３２】
実質的に嫌気性の培養培地に入れられている、請求項２９または３０に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項３３】
ｎ−プロパノールを生成させるための十分な期間にわたって、ｎ−プロパノールを生成させるための条件において、請求項２９または３０に記載の天然に存在しない微生物を培養することを包含している、ｎ−プロパノールを生成させる方法。
【請求項３４】
上記条件は実質的に嫌気性の培養条件を包含している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記１，４−ブタンジオール経路は、４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノール脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、またはアセト酢酸デカルボキシラーゼを含んでいる、天然に存在しない微生物。
【請求項３７】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記１，３−ブタンジオール経路は、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシ酪酸還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノール脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、またはアセト酢酸デカルボキシラーゼを含んでいる、天然に存在しない微生物。
【請求項３８】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記メチルアクリル酸経路は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素、メチルマロン酸還元酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、または３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノール脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、またはアセト酢酸デカルボキシラーゼを含んでいる、天然に存在しない微生物。
【請求項３９】
アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つ外来性の核酸を含んでいるアセチル−ＣｏＡ経路をさらに含んでいる天然に存在しない微生物であって、
上記アセチル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、または蟻酸脱水素酵素を含んでいる、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項４０】
スクシニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるスクシニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つ外来性の核酸を含んでいるスクシニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでいる天然に存在しない微生物であって、
上記スクシニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでいる請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項４１】
上記スクシニル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらに含んでいる、請求項４０に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項４２】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４３】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４４】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４５】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、
スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４６】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４７】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４８】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項４９】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５０】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５１】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５２】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５３】
１，４−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５４】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５５】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５６】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５７】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５８】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項５９】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６０】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６１】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６２】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６３】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６４】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６５】
１，３−ブタンジオール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６６】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６７】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６８】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項６９】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７０】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７１】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７２】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７３】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７４】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７５】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素；メチルマロン酸還元酵素；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７６】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素；メチルマロン酸還元酵素；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７７】
メチルアクリル酸経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物であって、
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、
上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、
外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、天然に存在しない微生物。
【請求項７８】
アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるアセチル−ＣｏＡ経路をさらに含んでいる天然に存在しない微生物であって、
外来性の核酸の上記第３の組は、（ａ）ピルビン酸キナーゼ；ならびに（ｂ１）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、または（ｂ２）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素をコードしている、請求項４２〜７７のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項７９】
スクシニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるスクシニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるスクシニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでいる天然に存在しない微生物であって、
外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしている、請求項４２〜７７のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項８０】
外来性の核酸の上記第３の組は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらにコードしている、請求項７９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項８１】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項３６〜３８および４２〜７７のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項８２】
実質的に嫌気性の培養培地に入れられている、請求項３６〜３８および４２〜７７のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項８３】
１，４−ブタンジオールおよびイソプロパノールを生成させるために十分な期間にわたって、１，４−ブタンジオールおよびイソプロパノールを生成させるための条件において、請求項３６および４２〜５３のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物を培養することを包含している、１，４−ブタンジオールおよびイソプロパノールを生成させる方法。
【請求項８４】
上記条件は実質的に嫌気性の培養条件を包含している、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
１，３−ブタンジオールおよびイソプロパノールを生成させるために十分な期間にわたって、１，３−ブタンジオールおよびイソプロパノールを生成させるための条件において、請求項３７および５４〜６５のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物を培養することを包含している、１，３−ブタンジオールおよびイソプロパノールを生成させる方法。
【請求項８７】
上記条件は実質的に嫌気性の培養条件を包含している、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
メチルアクリル酸およびイソプロパノールを生成させるために十分な期間にわたって、メチルアクリル酸およびイソプロパノールを生成させるための条件において、請求項３８および６７〜７７のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物を培養することを包含している、メチルアクリル酸およびイソプロパノールを生成させる方法。
【請求項９０】
上記条件は実質的に嫌気性の培養条件を包含している、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
上記外来性の核酸は、異種の核酸である、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生合成過程に一般的に関し、より詳細には、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生合成能、１，４−ブタンジオールおよびイソプロパノールの生合成能、１，３−ブタンジオールおよびイソプロパノールの生合成能、またはメチルアクリル酸およびイソプロパノールの生合成能を有している生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプロパノール（ＩＰＡ）は、ほとんどの溶媒（水が挙げられる）と混和する可燃性の無色の液体である。ＩＰＡの最大の用途は、溶媒（ＩＰＡおよび水の混合物である“消毒用アルコール”としてのいまだわずかな周知の用途が挙げられる）としてである。溶媒としてのＩＰＡは、多くの日用品（例えば、塗料、ラッカー、シンナー、インク、接着剤、汎用性の洗浄剤、消毒薬、化粧品、洗浄用品、氷結防止剤および医薬品）に見られる。また、低い等級のＩＰＡは潤滑油に使用されている。第２の用途は、イソプロピルアミン、イソプロピルエーテルおよびイソプロピルエステルの生成のための化学的な中間体としてである。イソプロパノールは、脱水されて、２億メートルトンを超える年間の市場を有している重合体の前駆体であるプロピレンを形成し得る潜在性を有している。
【０００３】
現状の世界的なイソプロパノール（ＩＰＡ）の生成能は、約６億ｌｂ／年であり、これは、米国、欧州および日本に集約されている世界的なＩＰＡの引受能力の約７４％に相当する。イソプロパノールは２つの石油化学的手順によって製造されている。第１の過程は、硫酸の触媒作用ありまたはなしの、プロピレンの水和を必要とする。第２に、フェノールおよび酸化プロピレンの製造において形成される副産物であるＩＰＡは、アセトンの水素化を介して製造されている。現在、高価なプロピレンは、低コストな供給原料に対する高い必要性を化学工業の全体にわたって刺激している、コストの上昇および利潤の低下をもたらしている。
【０００４】
ｎ−プロパノールはガソリンの代替物として使用され得る可能性を有している。現在、ｎ−プロパノールは、製薬工業における多目的の溶媒として、表面被覆剤の用途にか、またはインク製剤において使用されている。ｎ−プロパノールは、樹脂およびエステル、プロピルアミンおよびハロゲン化プロピルに代えて、建築用ブロックとして使用されている。また、ｎ−プロパノールは、梱包用途およびおよび食品と接触する用途のために使用されている。２００５年におけるｎ−プロパノールの世界的な製造量は、１４００００メートルトンを超えていた。
【０００５】
ｎ−プロパノールは、プロピオンアルデヒドの触媒作用性の水素化によって製造されている。プロピオンアルデヒド自体は、触媒（例えば、オクタカルボニルコバルトまたはロジウム複合体）の存在下における一酸化炭素および水素を用いたエチレンのヒドロホルミル化によってか、またはオキソ過程を介して製造されている。ｎ−プロパノールは、多くの発酵過程において、少量が天然に形成される。例えば、極めて少量のｎ−プロパノールの微生物による生成は、スレオニン代謝を介したClostridiumの特定の種、およびビール発酵における酵母から検出されている。１−プロパノールを有意な量において糖から生成する微生物の存在は報告されていない。
【０００６】
１，４−ブタンジオール（１４−ＢＤＯ）は、約３億ｌｂ／年の世界的な市場を有している重合体の中間体および工業的な溶媒である。現在、ＢＤＯは、石油化学的な前駆体（主にアセチレン、無水マレイン酸および酸化プロピレン）から製造されている。例えば、アセチレンは、Reppe合成反応において２分子のホルムアルデヒドと反応させられ（Kroschwitz and Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., New York (1999)）、それから触媒作用性の水素化によって１，４−ブタンジオールを形成する。後段において１４−ＢＤＯは、例えばγ−ブチルラクトンへの酸化またはテトラヒドロフランへの水素化によって、さらに変化させられ得る。上記γ−ブチルラクトンはピロリドンおよびＮ−メチルピロリドンにさらに変換され得る。これらの化合物は、重合体の中間体、溶媒および添加物としての種々の用途を有しており、合計して約２億ｌｂ／年の市場を有している。１，３−ブタンジオール（１３−ＢＤＯ）は、食品香味料のための有機溶媒として一般的に使用される４つの炭素のジオールである。また、１３−ＢＤＯは、ポリウレタン樹脂およびポリエステル樹脂にとってのコモノマーとして使用されており、低血糖剤として広く使用されている。光学的に活性な１３−ＢＤＯは、生物学的に活性な化合物、および液晶の合成にとっての有用な出発物質である。１，３−ブタンジオールの実質的な工業的な利用法は、脱水の後に１，３−ブタジエンをもたらすことであり（Ichikawa, J. Mol. Catalysis. 256：106-112 (2006)）、２５億ｌｂ／年の１，３−ブタジエンが、合成のゴム（すなわちタイヤ）、ゴム製品および樹脂の製造に使用されている。１３−ＢＤＯは、アセチレンからその水和を介してこれまで製造されている。生じたアセトアルデヒドは、それから３−ヒドロキシブチルアルデヒドに変換され、３−ヒドロキシブチルアルデヒドは、それから還元されて１，３−ＢＤＯを形成する。ここ数年において、エチレンが、アセチレンに代わるアセトアルデヒドの原料として使用されている。
【０００７】
メチルアクリル酸（ＭＡＡ）は、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）の重要な前駆体であり、ＭＭＡは、そのほとんどがポリアクリレートに変換される、１年に４．５億ポンドを超える世界的な需要を有している化学的な中間体である。メチルアクリレートを合成する従来の過程（すなわちアセトンシアノヒドリン経路）は、アセトンシアノヒドリンへのシアン化水素（ＨＣＮ）およびアセトンの変換を含んでいる。アセトンシアノヒドリンは、それから酸によって補助される水和、およびメタノールを用いたエステル化を受けて、ＭＡＡを生じる。副産物の高コストな処分をともなう（１トンのＭＡＡにつき１．２トンの二硫化アンモニウムが形成される）致命的かつ非常なＨＣＮの取扱いの困難さが、洗浄剤およびより経済的な過程を目的とした多大な研究を活発にさせている。出発物質としてのＭＡＡは、メタノールを用いたエステル化によって容易にＭＡＡに変換され得る。ＭＡＡを有意な量において糖から生成する微生物の存在は報告されていない。
【０００８】
工業的な量のｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを効率的に共生成する微生物および方法は、本明細書に説明されており、関連する利点を有している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供する。一局面において、本明細書に開示されている実施形態は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物に関する。ここで、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸含んでいる。一局面において、ｎ−プロパノール経路は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物を提供する。ここで、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでいる。一局面において、上記第１の組は、ｎ−プロパノール経路の酵素をコードしていおり、当該ｎ−プロパノール経路は、（ａ）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；または（ｄ）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素を含んでいる。他の局面において、上記第２の組は、イソプロパノール経路の酵素をコードしており、当該イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００１１】
他の局面において、本発明は、ｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組、およびイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｈ）：
（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；
（ｂ）リンゴ酸脱水素酵素；
（ｃ）フマラーゼ；
（ｄ）フマル酸還元酵素；
（ｅ）スクシニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；
（ｆ）メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；
（ｇ）メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；ならびに
（ｈ）以下の（ｈ１）〜（ｈ４）のいずれか：
（ｈ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｈ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素およびリン酸プロピオニル還元酵素；
（ｈ３）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｈ４）またはプロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記第２の組は、（ａ）ピルビン酸キナーゼ；（ｂ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、またはピルビン酸蟻酸リアーゼ、ピルビン酸蟻酸リアーゼを活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｃ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｄ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびにイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００１２】
他の局面において、本発明は、ｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組、およびイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記第１の組は、（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；（ｂ）スレオニンデアミナーゼ；ならびに（ｃ）以下の（ｃ１）〜（ｃ５）のいずれか：
（ｃ１）２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼおよびプロパノール脱水素酵素；
（ｃ２）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｃ３）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｃ４）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；または
（ｃ５）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記第２の組は、（ａ）ピルビン酸キナーゼ；（ｂ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、またはピルビン酸蟻酸リアーゼ、ピルビン酸蟻酸リアーゼを活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｃ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｄ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｄ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｅ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００１３】
他の局面において、本発明は、ｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組、およびイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）ピルビン酸キナーゼ；
（ｂ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、またはピルビン酸蟻酸リアーゼ、ピルビン酸蟻酸リアーゼを活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；
（ｃ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；
（ｄ）マロニル−ＣｏＡ還元酵素；
（ｅ）マロン酸セミアルデヒド還元酵素；
（ｆ）プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；ならびに
（ｇ）以下の（ｇ１）〜（ｇ４）のいずれか：
（ｇ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｇ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｇ３）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；または
（ｇ４）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００１４】
他の局面において、本発明は、ｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組、およびイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記第１の組は、（ａ）乳酸脱水素酵素；（ｂ）乳酸−ＣｏＡ転移酵素；（ｃ）ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；（ｄ）アクリリル−ＣｏＡ還元酵素；ならびに（ｅ）以下の（ｅ１）〜（ｅ４）のいずれか：
（ｅ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｅ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｅ３）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；
（ｅ４）またはプロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記第２の組は、ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、またはピルビン酸蟻酸リアーゼ、ピルビン酸蟻酸リアーゼを活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびにイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。一局面において、上記ｎ−プロパノール経路は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでいる。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の組を含んでいる。外来性の核酸の上記組は、（ａ）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；または（ｄ）プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００１７】
さらなる他の局面において、本明細書に開示されている実施形態は、天然に存在しない上記微生物を培養することを包含している、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールを生成させる方法に関する。さらなる他の局面において、本明細書に開示されている実施形態は、天然に存在しない上記微生物を培養することを包含している、ｎ−プロパノールを生成させる方法に関する。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、イソプロパノール経路、ならびに１，４−ブタンジオール（１４−ＢＤＯ）経路、１，３−ブタンジオール（１３−ＢＤＯ）経路またはメチルアクリル酸（ＭＡＡ）経路を有している天然に存在しない微生物を提供する。一局面において、本明細書に開示されている実施形態は、１，４−ブタンジオールおよびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物に関する。上記１，４−ブタンジオール経路は、１，４−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。
【００１９】
一局面において、本明細書に開示されている実施形態は、１，３−ブタンジオールおよびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物に関する。上記１，３−ブタンジオール経路は、１，３−ブタンジオールを生成させるための十分な量において発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。一局面において、本明細書に開示されている実施形態は、メチルアクリル酸およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物に関する。上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。
【００２０】
一実施形態において、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、またはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００２１】
一実施形態において、上記１４−ＢＤＯ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素、または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでいる。
【００２２】
一実施形態において、上記１３−ＢＤＯ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素、または３−ヒドロキシ酪酸還元酵素を含んでいる。
【００２３】
一実施形態において、上記ＭＡＡ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ加水分解酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ加水分解酵素、メチルマロン酸還元酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、または３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素を含んでいる。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでいる。
【００２５】
一実施形態において、本発明は、メチルアクリル酸およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している、天然に存在しない微生物を提供する。
上記メチルアクリル酸経路は、メチルアクリル酸を生成させるための十分な量において発現されるメチルアクリル酸経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでいる。
【００２６】
下流の酵素（すなわち脱水酵素）が省かれる場合、メチルアクリル酸生成とは対照的に、中間体３−ヒドロキシイソ酪酸を経るメチルアクリル酸経路は、３−ヒドロキシイソ酪酸生成に適用され得ることが理解される（図７および８を参照）。この場合、天然に存在しない上記生物は、メチルアクリル酸の代わりに３−ヒドロキシイソ酪酸を生成する。天然に存在しない上記生物は、３−ヒドロキシイソ酪酸およびメチルアクリル酸の混合物を代替的に生成し得る。ＡＴＰおよび産物の最大のモル収量は、メチルアクリル酸または３−ヒドロキシイソ酪酸のいずれが生成されるかにかかわらず不変である。
【００２７】
本発明の微生物によって発現される３−ヒドロキシイソブチル酸は、メチルアクリル酸に必要に応じて化学的に変換され得ることがさらに理解される。例えば、３−ヒドロキシイソブチル酸またはβ−ヒドロキシイソブチル酸は、脱水されて、例えば米国特許第７，１８６，８５６号に記載のようなメチルアクリル酸を形成する。
【００２８】
さらなる他の局面において、本明細書に開示されている実施形態は、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを生成させる方法に関し、当該方法は、天然に存在しない上記微生物を培養することを包含している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】グルコースからのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸、ＰＹＲ  −  ピルビン酸、ＦＯＲ  −  蟻酸、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＯＡＡ  −  オキサロ酢酸、ＭＡＬ  −  リンゴ酸、ＦＵＭ  −  フマル酸、ＳＵＣＣ  −  コハク酸、ＳＵＣＣＯＡ  −  スクシニル−ＣｏＡ、ＭＭＣＯＡ  −  メチルマロニル−ＣｏＡ、ＰＰＣＯＡ  −  プロピオニル−ＣｏＡ、ＰＰＡ  −  プロピオン酸、ＰＰＡＬ  −  プロピオンアルデヒド、ＰＰＰｉ  −  リン酸プロピオニル、ＰＰＯＨ  −  ｎ−プロパノール。
【図２】グルコースからのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸、ＰＹＲ  −  ピルビン酸、ＦＯＲ  −  蟻酸、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＯＡＡ  −  オキサロ酢酸、ＴＨＲ  −  スレオニン、２−ＯＢＵＴ  −  ２−オキソブタン酸、ＰＰＣＯＡ  −  プロピオニル−ＣｏＡ、ＰＰＡ  −  プロピオン酸、ＰＰＡＬ  −  プロピオンアルデヒド、ＰＰＰｉ  −  リン酸プロピオニル、ＰＰＯＨ  −  ｎ−プロパノール。
【図３】グルコースからのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸、ＰＹＲ  −  ピルビン酸、ＦＯＲ  −  蟻酸、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＭＡＬＣＯＡ  −  マロニル−ＣｏＡ、ＭＡＬＡＬ  −  マロン酸セミアルデヒド、３ＨＰ  −  ３−ヒドロキシプロピオン酸、ＰＰＣＯＡ  −  プロピオニル−ＣｏＡ、ＰＰＡ  −  プロピオン酸、ＰＰＡＬ  −  プロピオンアルデヒド、ＰＰＰｉ  −  リン酸プロピオニル、ＰＰＯＨ  −  ｎ−プロパノール。
【図４】グルコースからのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸塩、ＰＹＲ  −  ピルビン酸塩、ＦＯＲ  −  蟻酸塩、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸塩、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＬＡＣ  −  Ｄ−酪酸塩、ＬＡＣＣＯＡ  −  ラクトイル−ＣｏＡ、ＡＣＲＹＬＣＯＡ  −  アクリロイル−ＣｏＡ、ＰＰＣＯＡ  −  プロピオニル−ＣｏＡ、ＰＰＡ  −  プロピオン酸塩、ＰＰＡＬ  −  プロピオンアルデヒド、ＰＰＰｉ  −  リン酸プロピオニル、ＰＰＯＨ  −  ｎ−プロパノール。
【図５】グルコースからの１，４−ＢＤＯおよびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸塩、ＰＹＲ  −  ピルビン酸塩、ＦＯＲ  −  蟻酸塩、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸塩、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＯＡＡ  −  オキサロ酢酸、ＭＡＬ  −  リンゴ酸塩、ＦＵＭ  −  フマル酸塩、ＳＵＣＣ  −  コハク酸塩、ＳＵＣＣＯＡ  −  スクシニル−ＣｏＡ、ＳＵＣＳＡＬ  −  コハク酸セミアルデヒド、４−ＨＢ  −  ４−ヒドロキシ酪酸塩、４−ＨＢＣＯＡ  −  ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、４−ＨＢＡＬＤ  −  ４−ヒドロキシブチルアルデヒド、１４−ＢＤＯ  −  １，４−ブタンジオール、４−ＨＢＰ  −  リン酸４−ヒドロキシブチリル。
【図６】グルコースからの１，３−ＢＤＯおよびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸塩、ＰＹＲ  −  ピルビン酸塩、ＦＯＲ  −  蟻酸塩、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸塩、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＯＡＡ  −  オキサロ酢酸、ＭＡＬ  −  リンゴ酸塩、ＦＵＭ  −  フマル酸塩、ＳＵＣＣ  −  コハク酸塩、ＳＵＣＣＯＡ  −  スクシニル−ＣｏＡ、ＳＵＣＳＡＬ  −  コハク酸セミアルデヒド、３−ＨＢ  −  ３−ヒドロキシ酪酸塩、４−ＨＢ  −  ４−ヒドロキシ酪酸塩、４−ＨＢＣＯＡ  −  ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、ＣＲＴＣＯＡ  −  クロトニル−ＣｏＡ、３−ＨＢＣＯＡ  −  ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ＨＢＡＬＤ  −  ３−ヒドロキシブチルアルデヒド、１３−ＢＤＯ  −  １，３−ブタンジオール。
【図７】グルコースからのメタクリル酸およびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸塩、ＰＹＲ  −  ピルビン酸塩、ＦＯＲ  −  蟻酸塩、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸塩、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＯＡＡ  −  オキサロ酢酸、MACOA  −  methyacrylyl−ＣｏＡ、ＭＡＬ  −  リンゴ酸塩、ＦＵＭ  −  フマル酸塩、ＳＵＣＣ  −  コハク酸塩、ＳＵＣＣＯＡ  −  スクシニル−ＣｏＡ、ＳＵＣＳＡＬ  −  コハク酸セミアルデヒド、４−ＨＢ  −  ４−ヒドロキシ酪酸塩、４−ＨＢＣＯＡ  −  ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ＨＩＢＣＯＡ  −  ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ＨＩＢ  −  ３−ヒドロキシイソ酪酸塩、ＭＡＡ  −  メチルアクリル酸。
【図８】グルコースからのメタクリル酸およびイソプロパノールの共生成のための例示的な経路を示す図である。略語：Ｇｌｃ  −  グルコース、ＰＥＰ  −  ホスホエノールピルビン酸塩、ＰＹＲ  −  ピルビン酸塩、ＦＯＲ  −  蟻酸塩、ＡＣＣＯＡ  −  アセチル−ＣｏＡ、ＡＡＣＯＡ  −  アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＣＡＣ  −  アセト酢酸塩、ＡＣ  −  アセトン、ＰＰＯＨ−２  −  イソプロパノール、ＯＡＡ  −  オキサロ酢酸、ＭＡＬ  −  リンゴ酸塩、ＦＵＭ  −  フマル酸塩、ＳＵＣＣ  −  コハク酸塩、ＳＵＣＣＯＡ  −  スクシニル−ＣｏＡ、ＭＭ  −  メチルマロン酸塩、ＭＭＣＯＡ  −  メチルマロニル−ＣｏＡ、ＭＭＳＡ  −  メチルマロン酸セミアルデヒド、３−ＨＩＢ  −  ３−ヒドロキシイソ酪酸塩、ＭＡＡ  −  メチルアクリル酸。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の実施形態は、３つのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）分子からのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のために酸化還元について平衡化されている図１〜４に例示されているような嫌気性の経路を有している、天然に存在しない微生物を提供する。そのような共生成の方法のいくつかの利点としては、（１）上記共生成は、計１．３３モル／１モルのグルコースにおけるｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの理論上の最大収量をもたらす；（２）共生成のための経路は、酸化還元について完全に平衡化されており、ＡＴＰの正味の正の収量を有している。これは、ＮＡＤの再生成のために曝気を必要とするイソプロパノール経路のみを有している微生物の培養と対照的に、Ｃ３アルコールの完全な嫌気性の生成を容易にしている。
【００３１】
また、本発明の実施形態は、図１〜４に示されるように再生可能な資源からｎ−プロパノールおよびイソプロパノールを共生成し得る、天然に存在しない微生物を提供する。より詳細には、上記微生物は、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡからのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成に利用されるすべて酵素を含んでいる。蟻酸は、蟻酸脱水素酵素によって二酸化炭素に変換され得る。当該蟻酸脱水素酵素は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの合成のために使用され得るさらなる還元当量をもたらす。さらに、還元当量は、上記経路の他の段階（例えばグルコースからのホスホエノールピルビン酸への変換の間における解糖経路、ピルビン酸塩からのアセチル−ＣｏＡへの変換の間におけるピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、または２−オキソブタン酸からプロピオニル−ＣｏＡへの変換の間における２−オキソブタン酸脱水素酵素）から得られ得る。
【００３２】
また、本発明の実施形態は、プロピオニル−ＣｏＡを経てｎ−プロパノールを生成し得る、天然に存在しない微生物を提供する。この変換は、２つの異なる酵素：アルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素によってか、または二機能性のアルデヒド／アルコール脱水素酵素による１つの段階において実施される。代替的に、プロピオニル−ＣｏＡは、リン酸プロピオニルに変換され、それからアシルリン酸還元酵素によってプロピオンアルデヒドに変換され得る。代替的に、プロピオニル−ＣｏＡは、プロピオン酸に変換され、プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素またはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、ならびにプロピオン酸ジナーゼ（dinase）のそれぞれによって、それからリン酸プロピオニルに変換され得る。代替的に、プロピオン酸塩はプロピオン酸還元酵素によってプロピオンアルデヒドに変換され得る。プロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、図１〜４に例示されている。一実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、図１に例示されているようにオキサロ酢酸を経て進行する。オキサロ酢酸は、還元的なＴＣＡサイクル、メチル転位酵素、デカルボキシラーゼ、およびデカルボキシラーゼを介してプロピオニル−ＣｏＡに変換される。エピメラーゼは、メチルマロニル−ＣｏＡの（Ｒ）立体異性体を（Ｓ）立体配置に変換するために必要とされ得る。他の実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、図２に例示されているようにスレオニンを経て進行する。オキサロ酢酸は、高収量を得るために設計された天然のスレオニン経路によってスレオニンに変換される。それからスレオニンは、脱アミノ基化されて２−オキソブタン酸を形成し、続いてプロピオニル−ＣｏＡに変換される。１つの代替法において、２−オキソブタン酸は、デカルボキシラーゼによってプロピオンアルデヒドに変換され、それからプロパノール脱水素酵素によってｎ−プロパノールに還元される。さらなる他の実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は図３に例示されているようにマロニル−ＣｏＡを経て進行する。アセチル−ＣｏＡはカルボキシル化されてマロニル−ＣｏＡを形成する。マロニル−ＣｏＡは、マロン酸セミアルデヒドに還元され、それから３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）に変換される。３ＨＰはプロピオニル−ＣｏＡシンターゼを介してプロピオニル−ＣｏＡに変換される。さらなる他の実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、図４に例示されているように乳酸塩を経て進行する。ピルビン酸は、還元されて乳酸を形成し、それから活性化されてラクトイル−ＣｏＡを形成する。ラクトイル−ＣｏＡは、脱水されてアクリロイル−ＣｏＡを形成し、それから還元されてプロピオニル−ＣｏＡを生成する。
【００３３】
また、本発明の実施形態は、アセチル−ＣｏＡを経てイソプロパノールを生成し得る、天然に存在しない微生物を提供する。イソプロパノールの生成は、（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、（ｃ）アセト酢酸デカルボキシラーゼおよび（ｄ）イソプロパノール脱水素酵素によるアセチル−ＣｏＡの変換を介して、図１〜４に例示されているように実現される。一実施形態において、グルコースからのアセチル−ＣｏＡの生成のための経路は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を介して進行する。グルコースは、上記微生物の天然の解糖経路によってＰＥＰに変換される。ＰＥＰは、ピルビン酸キナーゼによってピルビン酸塩に変換され、それからピルビン酸脱水素酵素またはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素によってアセチル−ＣｏＡに変換される。代替的に、ピルビン酸塩は、ピルビン酸蟻酸脱離酵素によってアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩に変換される。上記蟻酸塩は、それから蟻酸脱水素酵素によって二酸化炭素および水素に変換される。
【００３４】
本発明の実施形態は、化合物１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよびＭＡＡをともなったイソプロパノールの共生成のための代替方法を提供する。イソプロパノールの生成は上述のアセチル−ＣｏＡを経て進行する。単独のこのルートは、酸化還元について平衡化されておらず、したがって高収量のイソプロパノールを得るために曝気を必要とする。本明細書に記載の実施形態は、このルートを利用しており、副産物の１，４−ブタンジオール（１４−ＢＤＯ）、１，３−ブタンジオール（１３−ＢＤＯ）およびメチルアクリル酸（ＭＡＡ）を合成するための経路とこのルートを組合せている。共生成経路は、イソプロパノールがアセトンのみを介して生成される場合に酸素を必要とすることと対照的に、嫌気性条件において酸素還元について平衡化されている。また、共生成は、関連する利点（例えば、１４−ＢＤＯ（２３０℃）、１３−ＢＤＯ（２０３℃）およびＭＡＡ（１６３℃）に対して低いイソプロパノールの沸点（８２℃）のために、他の発酵産物からのイソプロパノールの分離の容易さ）をもたらす。本明細書に記載の微生物を利用する共生成は、グルコースからの理論的な最大収量の炭素の生成をもたらす。
【００３５】
本発明の実施形態は、スクシニル−ＣｏＡまたはいくつかの局面においてコハク酸塩を経て１４−ＢＤＯを生成し得る、天然に存在しない微生物を提供する。１４−ＢＤＯの生成のために、スクシニル−ＣｏＡは、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素によってコハク酸セミアルデヒドに変換される。代替的に、コハク酸塩は、コハク酸還元酵素によってコハク酸セミアルデヒドに変換され得る。それからコハク酸セミアルデヒドは、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によって４−ヒドロキシ酪酸に還元される。そのアシルＣｏＡへの４ＨＢの活性化は、ＣｏＡ転移酵素またはＣｏＡ合成酵素によって触媒される。代替的に、４−ＨＢは、４−ヒドロキシブチリル−リン酸に変換され、それから４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素によって４−ＨＢ−ＣｏＡに変換され得る。４−ＨＢ−ＣｏＡは、それから二機能性のＣｏＡ依存性のアルデヒド／アルコール脱水素酵素によってか、またはアルデヒド脱水素酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性を有している２つの個々の酵素によって、１４−ＢＤＯに変換される。４−ＨＢ−ＣｏＡ中間体を回避するさらなる他の変形例は、カルボン酸還元酵素による４−ＨＢの４−ヒドロキシブチリルアルデヒドへの直接的な還元である。４−ヒドロキシブチリルアルデヒドはそれからアルコール脱水素酵素によって１４−ＢＤＯに還元される。４−ＨＢ−ＣｏＡを経ないさらなる他のルートは、リン酸還元酵素によって４−ヒドロキシブチリル−リン酸を４−ヒドロキシブチルアルデヒドに還元することを伴う。
【００３６】
本発明の実施形態は、スクシニル−ＣｏＡを経て、またはいくつかの局面においてコハク酸塩を経て１３−ＢＤＯを生成し得る、天然に存在しない微生物を提供する。また、１３−ＢＤＯの生成は、上述のように形成された４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを経て進行する。このルートにおいて、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、脱水され、異性化されてクロトニル−ＣｏＡを形成する。上記脱水反応およびビニル異性化（vinylisomerisation）反応は、二機能性の酵素の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素によって触媒される。クロトニル−ＣｏＡは、それから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに水和される。ＣｏＡ部分の除去、および同時の還元によって、３−ヒドロキシブチルアルデヒドが生成される。代替的に、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素によって３−ヒドロキシ酪酸に変換され、それから３−ヒドロキシ酪酸還元酵素によって還元されて３−ヒドロキシブチルアルデヒドを生じる。最終的に３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素による上記アルデヒドの還元によって１３−ＢＤＯが生成される。
【００３７】
本発明の実施形態は、２つの他のルートを介してＭＡＡを生成し得る、天然に存在しない微生物を提供する。第１の経路は、上述のように形成された４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを経て進行する。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、メチル転位酵素によって３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに変換される。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのＣｏＡ部分は、それからＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ水素化酵素またはＣｏＡ合成酵素によって除去される。最終的に、３−ヒドロキシ基の脱水によってＭＡＡが生成される。代替的に、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素によってメタクリリル−ＣｏＡに変換され、それからＣｏＡ部分がＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ水素化酵素またはＣｏＡ合成酵素によって除去されてＭＡＡが生成される。代替的なＭＡＡ生成ルートにおいて、スクシニル−ＣｏＡはメチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素によってメチルマロニル−ＣｏＡに変換される。エピメラーゼは、メチルマロニル−ＣｏＡの（Ｒ）立体異性体を（Ｓ）立体配置に変換するために必要とされ得る。ＣｏＡ依存性のアルデヒド脱水素酵素は、それからメチルマロニル−ＣｏＡをメチルマロン酸セミアルデヒドに変換する。代替的に、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡまたは（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡのＣｏＡ部分は、ＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ水素化酵素またはＣｏＡ合成酵素によって除去されてメチルマロン酸を形成する。メチルマロン酸は、それから還元酵素によってセミアルデヒドに変換される。当該アルデヒドの３−ヒドロキシイソ酪酸への還元、および続く脱水によってＭＡＡが生成される。また、メチルマロニル−ＣｏＡは、アルコール形成ＣｏＡ還元酵素によって３−ヒドロキシイソ酪酸に変換される。
【００３８】
本発明の実施形態は、図５〜８に例示されているようにスクシニル−ＣｏＡの生成のための経路を有している、天然に存在しない微生物を提供する。一実施形態において、スクシニル−ＣｏＡの生成のための経路は、オキサロ酢酸を経て進行する。オキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、ならびにスクシニル−ＣｏＡ転移酵素または代替的にスクシニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでいる還元性のＴＣＡサイクルを介して、スクシニル−ＣｏＡに変換される。
【００３９】
微生物における上記経路の構築は、酵素の組をコードしている遺伝子の適切な組を本明細書に記載される生成宿主にクローニングすること、発酵条件を最適化させること、および発酵後の産物の形成を分析することを含んでいる。ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの生成のための生成宿主を構築するために、１つ以上の外来性のＤＮＡ配列が微生物において発現され得る。さらに、上記微生物は、機能的に破壊されているか、欠失されているか、または過剰発現されている内在性の遺伝子を有し得る。本明細書に開示されている代謝の変更は、再生可能な原料を用いてｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを生成させ得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる、天然に存在しない微生物を提供する。
【００４１】
他の実施形態において、本発明は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる、天然に存在しない微生物を提供する。
【００４２】
さらなる他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを共生成するための方法を提供する。当該方法は、本明細書に記載の微生物を培養することを含んでいる。
【００４３】
本明細書に使用されるとき、“天然に存在しない”という用語は、本発明の微生物に対する言及に用いられる場合、微生物が、言及されている種の天然に存在する株（言及されている種の野生株が挙げられる）に通常には見られない少なくとも１つの遺伝的な改変を有していることを意味している。遺伝的な改変は、例えば代謝系のポリペプチドをコードしている発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸の付加、核酸の欠失および／または微生物の遺伝物質の機能的な他の破壊を包含している。当該修飾としては、例えば言及されている種にとって、異種、同種または両方（異種および同種）のポリペプチドのコード領域およびそれらの機能的な断片が挙げられる。さらなる修飾としては、例えば当該修飾が遺伝子またはオペロンを変化させる非コード制御領域が挙げられる。典型的な代謝系のポリペプチドとしては、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ生合成経路に含まれている酵素またはタンパク質が挙げられる。
【００４４】
代謝の改変は、天然に存在する状態から改変された生化学反応を指す。したがって、天然に存在しない微生物は、代謝系のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの機能的な断片をコードしているに対する遺伝的修飾を有し得る。例示的な代謝の可変は本明細書に開示されている。
【００４５】
本明細書に使用されるとき、“単離された”という用語は、微生物に対する言及において使用されている場合、言及されている微生物が天然に見られるときの少なくとも１つの成分を実質的に失っている生物を意味している。上記用語は、微生物が天然の環境において見られるときの成分のいくつかまたはすべてが除去されている微生物を包含する。また、上記用語は、微生物が天然に存在しない環境に見られるときの成分のいくつかまたはすべてが除去されている微生物を包含する。したがって、単離された微生物は、微生物が天然に見られるときの他の物質、または天然に存在しない環境において増殖されるか、保存されているか、もしくは生存しているときの他の物質から部分的または完全に分離されている。単離された微生物の特定の例としては、部分的に同質の微生物、実質的に同質の微生物、および天然に存在しない培地において培養されている微生物が挙げられる。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、“微生物の（microbial）”、“微生物（microbial organism）”または“微生物（microorganism）”という用語は、古細菌、細菌または真核生物の領域内に包含されている、微細な細胞として存在する任意の生物を意味する。したがって、上記用語は、原核細胞、真核細胞または顕微鏡的な大きさを有している生物を包含することを意図されており、当該用語は、すべての種の細菌、古細菌および真正細菌、ならびに真核の微生物（例えば酵母および真菌）を包含している。また、上記用語は、生化学物質の製造のために培養され得る任意る種の細胞培養物を包含している。
【００４７】
本明細書に使用されるとき、“ｎ−プロパノール”は、分子式がＣ３Ｈ８Ｏの分子式および６０．１ｇ／ｍｏｌの分子量を有している第１級アルコールを意味すると意図される。また、“ｎ−プロパノール”は、当該分野において１−プロパノール、１−プロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、プロパン−１−オール、または単にプロパノールとして知られている。ｎ−プロパノールはイソプロパノールの異性体である。
【００４８】
本明細書に使用されるとき、“イソプロパノール”はＣ３Ｈ８Ｏの分子式および６０．１ｇ／ｍｏｌの分子量を有している第二級アルコールを意味すると意図されており、アルコール炭素は他の２つの炭素と結合している。当該結合はときに（ＣＨ３）２ＣＨＯＨと示される。また、イソプロパノールは、当該分野においてプロパン−２−オール、２−プロパノールまたは略語ＩＰＡとして知られている。
【００４９】
本明細書に使用されるとき、“１，４−ブタンジオール”という用語は、Ｃ４Ｈ１０Ｏ２の化学式および９０．１２ｇ／ｍｏｌの分子量を有している、２つの水酸基をともなうアルカンであるブタンのアルコール誘導体を意味すると意図されている。また、化合物１，４−ブタンジオールは、当該分野において１，４−ＢＤＯとして知られており、ＢＤＯ群の化合物と一般に呼ばれている群の化合物の化学的な中間体または前駆体である。
【００５０】
本明細書に使用されるとき、“１，３−ブタンジオール”という用語は、Ｃ４Ｈ１０Ｏ２の化学式および９０．１２ｇ／ｍｏｌの分子量を有しているブタンジオールの４つの安定した異性体のうちの１つを意味すると意図されている。化合物１，３−ブタンジオールは、当該分野において１３ＢＤＯまたはβ−ブタングリコールとして知られており、ＢＤＯ群の化合物と一般に呼ばれている群の化合物の化学的な中間体または前駆体である。
【００５１】
本明細書に使用されるとき、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２の化学式を有している“メチルアクリル酸”（メタクリル酸およびＩＵＰＡＣ名２−メチル−２−プロペン酸としても知られている）は、メチルアクリル酸塩の酸の形態である。メチルアクリル酸およびメチルアクリル酸塩は、無電荷およびイオン化の形態（それらの任意の塩の形態が挙げられる）のいずれかにある化合物を指すために全体を通して交換可能に使用され得ることが理解される。特定の形態がｐＨに依存することは、当業者によって理解される。同様に、３−ヒドロキシイソ酪酸塩および３−ヒドロキシイソ酪酸は、無電荷およびイオン化の形態（それらの任意の塩の形態が挙げられる）のいずれかにある化合物を指すために全体を通して交換可能に使用され得ることが理解される。
【００５２】
本明細書に使用されるとき、“ＣｏＡ”または“補酵素Ａ”という用語は、存在していることが活性酵素系を形成するために多くの酵素（アポ酵素）の活性にとって必要とされる、有機物の補助因子または補欠分子団（酵素の非タンパク質部分）を意味すると意図されている。補酵素Ａは、特定の縮合酵素において機能し、アセチル基または他のアシル基の転移、脂肪酸の合成および酸化、ピルビン酸塩の酸化、ならびに他のアセチｓル化において作用する。
【００５３】
本明細書に使用されるとき、“実質的に嫌気性”という用語は、培養条件または増殖条件に対する言及において使用される場合に、酸素の量が、液体培地に溶解されている酸素の飽和度の約１０％未満であることを意味すると意図されている。また、上記用語は、約１％未満の酸素の環境を用いて維持されている液体培地または固体培地の密閉された容器を包含すると意図されている。
【００５４】
本明細書に使用されるとき、“外来性の”は、言及されている分子または活性が宿主微生物に導入されていることを意味すると意図されている。上記分子は、例えば、宿主の遺伝物質に対する翻訳領域の核酸の導入（例えば宿主の染色体への組込み）、または非染色体性の遺伝物質（例えばプラスミド）としての導入によって導入され得る。したがって、上記用語は、翻訳領域の核酸の発現に言及して使用される場合に、翻訳領域の核酸を発現可能な形態において微生物に導入することを指す。生合成活性に対する言及において使用される場合、上記用語は宿主の基準生物に導入される活性を指す。発源は、例えば宿主微生物への導入に続いて、言及されている活性を発現させる同種または異種の翻訳領域の核酸であり得る。したがって、“内在性の”という用語は、宿主に存在する言及されている分子または活性を指す。上記用語は、同様に、翻訳領域の核酸の発現に言及して使用される場合に、微生物に含まれている翻訳領域の核酸を指す。“異種の”という用語は、言及されている種以外の発源に由来する分子または活性を指す。一方で、“同種の”という用語は、宿主微生物に由来する分子または活性を指す。したがって、本発明に係る翻訳領域の核酸の外因性の発現は、異種または同種の翻訳領域の核酸のいずれか、または両方を利用し得る。
【００５５】
本発明に係る天然に存在しない微生物は、安定した遺伝的な改変を含み得、当該改変を消失することなく、５世代を超えて培養され得る微生物を指す。安定した遺伝的な改変は、１０世代を超えて持続する変更を一般的に包含しており、特に安定な変更は約２５世代を超えて持続し、より詳細には、安定な遺伝的な変更は５０世代を超える（無制限が挙げられる）。
【００５６】
遺伝的な改変（本明細書に例示されている代謝の変更が挙げられる）が、好適な宿主生物（例えばE. coli）およびそれらの対応する物質代謝反応、または所望の遺伝物質（例えば所望の代謝経路のための遺伝子）にとって好適な発源の生物に関して説明されていることを、当業者は理解する。しかし、種々の生物の完全なゲノム配列決定、およびゲノミクス分野における高度な技術を考慮すれば、当業者は本明細書における記載および示唆を、実質的にすべての他の生物に対して容易に適用し得る。例えば、本明細書に例示されているE. coliの代謝の変更は、言及されている種以外の種に由来する同一または類似の翻訳領域の核酸を組み込むことによって、他の種に対して容易に適用され得る。遺伝的な改変としては、例えば、一般的に種の相同物、特にオルソログ（ortholog）、パラログ（paralog）またはオルソログではない（non-orthorgous）遺伝子の置換が挙げられる。
【００５７】
オルソログは、垂直な由来（vertical descent）によって関連付けられ、異なる生物において同一の機能または実質的に同じ機能を担っている（複数の）遺伝子である。例えば、マウスのエポキシド水素化酵素およびヒトのエポキシド水素化酵素は、エポキシドの水素化における生物学的機能についてオルソログであると考えられ得る。遺伝子は、例えばそれらが同種であるか、または共通の祖先からの進化によって関連付けられていることを示すために十分な程度の配列の類似性を共有している場合に、垂直な由来によって関連付けられる。また、遺伝子は、一次配列が同一視できない程度まで共通の先祖から進化していることを示すために十分な程度の三次元構造を、それらの遺伝子が共有しているが、配列の類似性を必ずしも共有していない場合に、オルソログであると考えられ得る。オルソログの遺伝子は、約２５％〜１００％のアミノ酸配列が同一である配列類似性を有しているタンパク質をコードし得る。また、２５％未満のアミノ酸類似性を共有しているタンパク質をコードしている遺伝子は、三次元構造が類似性を示す場合に、垂直な由来よって生じていると考えられ得る。酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバー（組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラステーゼが挙げられる）は、共通の祖先からの垂直な由来によって生じていると考えられる。
【００５８】
オルソログとしては、例えば進化を通じて、構造または全体の活性において異なっている遺伝子またはそれらの遺伝暗号化された遺伝子産物が挙げられる。例えば、１つの種が２つの機能を示す単一の遺伝子産物をコードしており、当該機能が第２の種において異なる遺伝子に分離されている場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する産物はオルソログとみなされる。生化学的な産物の生成のために、当業者は、導入されるべきか、または破壊されるべき代謝活性を有しているオルソログの遺伝子が、天然に存在しない微生物の構築のために選択されるべきことを理解する。分離可能な活性を示すオルソログの例は、異なる活性が２つ以上の種の間または単一の種における異なる遺伝子に分離されている場合である。特定の例は、２種類のセリンプロテアーゼ活性であるエラステーゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解の、プラスミノーゲン活性化因子およびエラステーゼのような異なる分子への分離である。第２の例は、マイコプラズマの５’−３’エキソヌクレアーゼおよびショウジョウバエのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種に由来するＤＮＡポリメラーゼは、第２の種に由来するエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのいずれか、または両方に対するオルソログとみなされ得、逆の場合も同じである。
【００５９】
対照的に、パラログは、例えば重複に続く進化的な分岐によって関連付けられる相同物であり、類似または共通の（同一ではない）機能を有している。パラログは、例えば同じ種または異なる種に発源を有し得るか、または由来し得る。例えばミクロソームのエポキシド水素化酵素（エポキシド水素化酵素Ｉ）および可溶性のエポキシド水素化酵素（エポキシド水素化酵素ＩＩ）は、共通の祖先から共に進化した当該酵素が、同じ種において異なる機能を有しており、異なる反応を触媒する２つの異なる酵素に相当するので、パラログであると見なされ得る。パラログは、顕著な配列の類似性を互いに有している同じ種に由来するタンパク質であり、タンパク質が相同であるか、または共通の祖先からの共進化を通じて関連付けられていることを示している。パラロガスなタンパク質ファミリーのグループとしては、ＨｉｐＡ相同物、ルシフェラーゼ遺伝子およびペプチダーゼなどが挙げられる。
【００６０】
オルソログではない遺伝子の置換は、異なる種において言及されている遺伝子の機能を代替可能な１つの種に由来するオルソログではない遺伝子である。代替としては、例えば、異なる種における言及されている機能と比較して、発源の種において実質的に同じか、または類似の機能を果たし得ることが挙げられる。一般的に、オルソログではない遺伝子の置換は、言及されている機能をコードしている公知の遺伝子と構造的に関連していることと同一視し得るにもかかわらず、構造的によりわずかに関連付けられているが、機能的に類似の遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物は、本明細書に使用されるときの上記用語の意味の範囲内にある。機能的な類似性は、例えば、代替可能と思われる機能をコードしている遺伝子と比較して、オルソログではない遺伝子産物の活性部位または結合領域における少なくともいくつかの構造的な類似性を必要とする。したがって、オルソログではない遺伝子としては、例えばパラログまたは関連のない遺伝子が挙げられる。
【００６１】
したがって、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの生合成能を有している本発明に係る天然に存在しない微生物を同定すること、または構築することにおいて、当業者は、本明細書における記載および示唆を特定の種に適用することと同時に、代謝の変更の同定が、オルソログの同定および導入もしくは不活性化を包含し得ることを理解する。また、類似または実質的に類似の物質代謝反応を触媒する酵素をコードしている言及されている微生物に、パラログおよび／またはオルソログではない遺伝子の置換が存在する程度まで、当業者は、これらの進化的に関連付けられている遺伝子を利用し得る。
【００６２】
オルソログ、パラログおよびオルソログではない遺伝子の置換は、当業者に公知の方法によって測定され得る。例えば、２つのポリペプチドについての核酸配列またはアミノ酸配列の検査によって、比較される配列間における配列同一性および配列類似性が明らかになる。当該類似性に基づいて、当業者は、タンパク質が共通の祖先からの進化を通じて関連付けられることを示すために当該類似性が十分に高いか否かを決定し得る。当業者に公知のアルゴリズム（例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴおよびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗなど）によって、未加工の配列の類似性または同一性が比較および決定され、加重または得点を割り当てられ得る配列におけるギャップの存在または有意性が決定される。また、上記アルゴリズムは、当該分野において公知であり、ヌクレオチド配列の類似性または同一性の特定に対して同様に適用可能である。関連性を決定するために十分な類似性にとってのパラメータは、統計的な類似性、または任意のポリペプチドにおける類似の一致を見出す見込み、および決定された一致の有意性を計算する公知の方法に基づいて算出される。また、コンピューターによる２つ以上の配列の比較は、必要に応じて、当業者によって視覚的に最適化され得る。関連する遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性（例えば２５％〜１００％の配列同一性）を有していると予測され得る。関連しないタンパク質は、十分な規模のデータベースが調査される場合に、偶然に生じると予測される同一性と実質的に同じ同一性（約５％）を有し得る。５％〜２４％の間の配列は、比較された配列が関連していると結論付けるために十分な相同性を示し得るか、または示し得ない。データセットの規模に示される当該一致の有意性を決定するためのさらなる追加の統計分析は、これらの配列の関連性を決定するに実行され得る。
【００６３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定する例示的なパラメータは、例えば以下に記載のものであり得る。端的には、アミノ酸配列の整列化は、ＢＬＡＳＴＰのバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および以下のパラメータ：：Matrix: 0 BLOSUM62; gap open: 11; gap extension: 1; x_dropoff: 50; expect: 10.0; wordsize: 3; filter: onを用いて行われ得る。核酸配列の整列化は、ＢＬＡＳＴＮのバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および以下のパラメータ：Match: 1; mismatch: -2; gap open: 5; gap extension: 2; x_dropoff: 50; expect: 10.0; wordsize: 11; filter: offを用いて行われ得る。当業者は、比較のストリンジェンシーを上昇させるか、または低下させる（例えば、２つ以上の配列の関連性を決定する）ために、どのような修正が上記パラメータになされ得るかを理解している。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しており、上記ｎ−プロパノール経路は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００６５】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているアセチル−ＣｏＡ経路を有している。上記アセチル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、または蟻酸脱水素酵素を含んでいる。
【００６６】
さらなる実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、またはメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを含んでいる。さらなる局面において、上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素を含んでいる。
【００６７】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、スレオニン脱アミノ酵素、または２−オキソブタン酸脱水素酵素を含んでいる。さらなる局面において、上記ｎ−プロパノール経路は、２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼを含んでいる。
【００６８】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素またはプロピオニル−ＣｏＡシンターゼを含んでいる。
【００６９】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、乳酸脱水素酵素、乳酸−ＣｏＡ転移酵素、ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素、またはアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素を含んでいる。
【００７０】
さらなる他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を有しており、外来性の核酸の上記第１の組は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；またはプロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；またはプロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素、プロパノール脱水素酵素、ならびにプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素またはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；またはプロピオン酸還元酵素、プロパノール脱水素酵素、ならびにプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素またはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を有しており、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびにイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００７１】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているアセチル−ＣｏＡ経路を有している。外来性の核酸の上記第３の組は、ピルビン酸キナーゼ；ならびに（ａ）ピルビン酸脱水素酵素、もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；または（ｂ）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素をコードしている。
【００７２】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；リンゴ酸脱水素酵素；フマラーゼ；フマル酸還元酵素；スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらにコードしている。
【００７３】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；スレオニン脱アミノ酵素；ならびに２−オキソブタン酸脱水素酵素をコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼをさらにコードしている。さらなる他の局面において、外来性の核酸の上記第２の組は、２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼをさらにコードしている。
【００７４】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。外来性の核酸の上記第３の組は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；マロニル−ＣｏＡ還元酵素；マロン酸セミアルデヒド還元酵素；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼをコードしている。
【００７５】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、乳酸脱水素酵素；乳酸−ＣｏＡ転移酵素；ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；およびアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。
【００７６】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素およびリン酸プロピオニル還元酵素；（ｃ）プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；または（ｄ）プロピオン酸還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、（ｅ）ピルビン酸キナーゼ；（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｇ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｈ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｉ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｊ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００７７】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｃ）：（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；（ｂ）スレオニン脱アミノ酵素；ならびに（ｃ）以下の（ｃ１）〜（ｃ５）のいずれか：（ｃ１）２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼおよびプロパノール脱水素酵素；（ｃ２）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ３）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ４）２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｃ５）２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、（ｄ）ピルビン酸キナーゼ；（ｅ）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素、またはピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；（ｆ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｇ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｈ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｉ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらにコードしている。
【００７８】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｇ）：（ａ）ピルビン酸キナーゼ；（ｂ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｃ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；（ｄ）マロニル−ＣｏＡ還元酵素；（ｅ）マロン酸セミアルデヒド還元酵素；（ｆ）プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ；ならびに（ｇ）以下の（ｇ１）〜（ｇ４）のいずれか：（ｇ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｇ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｇ３）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｇ４）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００７９】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｅ）：（ａ）乳酸脱水素酵素；（ｂ）乳酸−ＣｏＡ転移酵素；（ｃ）ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；（ｄ）アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素；ならびに（ｅ）以下の（ｅ１）〜（ｅ４）のいずれか：（ｅ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｅ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｅ３）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；（ｅ４）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｇ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｈ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｉ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｊ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００８０】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。上記ｎ−プロパノール経路は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでいる。
【００８１】
他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている１組の外来性の核酸を含んでおり、上記１組の外来性の核酸は、（ａ）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｄ）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００８２】
また、上述の実施形態のさらなる局面において、ｎ−プロパノール経路を有している天然に存在しない上記微生物は、本明細書に例示されているように、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している。例えば、いくつかの局面において、上記外来性の核酸は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、またはメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードしている。他の局面において、上記外来性の核酸は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをさらにコードしている。さらに、上述の実施形態のさらなる他の局面において、ｎ−プロパノール経路を有している天然に存在しない上記微生物は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を有し得、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ；リンゴ酸脱水素酵素；フマラーゼ；フマル酸還元酵素；スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００８３】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しており、上記１４−ＢＤＯ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素、または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００８４】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しており、上記１３−ＢＤＯ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシ酪酸還元酵素、または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００８５】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しており、上記ＭＡＡ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素、メチルマロン酸還元酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、または３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素を含んでいる。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【００８６】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているアセチル−ＣｏＡ経路を有しており、上記アセチル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、または蟻酸脱水素酵素を含んでいる。
【００８７】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物は、スクシニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるスクシニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているスクシニル−ＣｏＡ経路を有しており、上記スクシニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでいる。さらなる局面において、上記スクシニル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素を含んでいる。
【００８８】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００８９】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９１】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９２】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９３】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９４】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９５】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９６】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９７】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【００９９】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；ならびに４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１００】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０１】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０２】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０３】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０４】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０６】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０７】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０８】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、またはアセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１２】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１４】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１５】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１６】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１７】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１８】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２０】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２１】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素；メチルマロン酸還元酵素；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２２】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素；メチルマロン酸還元酵素；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２３】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２４】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているアセチル−ＣｏＡ経路を有しており、外来性の核酸の上記第３の組は、（ａ）ピルビン酸キナーゼ；ならびに（ｂ１）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、または（ｂ２）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素をコードしている。
【０１２５】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、スクシニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるスクシニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているスクシニル−ＣｏＡ経路を有しており、外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第３の組は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をコードしている。
【０１２６】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２７】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル脱水酵素、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシ酪酸還元酵素、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２８】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素、および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１２９】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を提供する。上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素、メチルマロン酸還元酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしている。上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０１３０】
上述の実施形態のそれぞれのさらなる局面において、上記外来性の核酸は、異種の核酸である。
【０１３１】
上述の実施形態のそれぞれのさらなる局面において、天然に存在しない上記微生物は、実質的に嫌気性の培地に存在する。
【０１３２】
さらなる実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供する。ここで、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸にか、オキサロ酢酸をリンゴ酸塩にか、リンゴ酸塩を蟻酸塩にか、蟻酸塩をコハク酸塩にか、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡにか、スクシニル−ＣｏＡを（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡにか、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡを（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡにか、（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡにか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオンアルデヒドにか、プロピオンアルデヒドをｎ−プロパノールにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオン酸塩にか、プロピオン酸塩をリン酸プロピオニル塩にか、プロピオン酸塩をプロピオンアルデヒドにか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸塩にか、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸にか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンからイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、当該酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図１に示される基質および産物）を変換する。
【０１３３】
さらなる実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸にか、オキサロ酢酸をスレオニンにか、スレオニンを２−オキソブタン酸にか、２−オキソブタン酸をプロピオニル−ＣｏＡにか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオンアルデヒドにか、プロピオンアルデヒドをｎ−プロパノールにか、２−オキソブタン酸をプロピオンアルデヒドにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオン酸塩にか、プロピオン酸塩をリン酸プロピオニル塩にか、プロピオン酸塩をプロピオンアルデヒドにか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸塩にか、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸にか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンをイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、当該酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図２に示されている基質および産物）を変換する。
【０１３４】
さらなる実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸塩にか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡにか、マロニル−ＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドにか、マロン酸セミアルデヒドを３−ヒドロキシプロピオン酸にか、３−ヒドロキシプロピオン酸をプロピオニル−ＣｏＡにか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオンアルデヒドにか、プロピオンアルデヒドをｎ−プロパノールにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオン酸塩にか、プロピオン酸塩をリン酸プロピオニル塩にか、プロピオン酸塩をプロピオンアルデヒドにか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンをイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）基質から産物への変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、上記酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図３に示されている基質および産物）を変換する。
【０１３５】
さらなる実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ピルビン酸塩をＤ−乳酸にか、Ｄ−乳酸をラクトイル−ＣｏＡにか、ラクトイル−ＣｏＡをアクリロイル−ＣｏＡにか、アクリロイル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡにか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオンアルデヒドにか、プロピオンアルデヒドをｎ−プロパノールにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオン酸塩にか、プロピオン酸塩をリン酸プロピオニル塩にか、プロピオン酸塩をプロピオンアルデヒドにか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンをイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、上記酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図４に示されている基質および産物）を変換する。
【０１３６】
さらなる実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオンアルデヒドにか、プロピオンアルデヒドをｎ−プロパノールにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、プロピオニル−ＣｏＡをプロピオン酸塩にか、プロピオン酸塩をリン酸プロピオニル塩にか、またはプロピオン酸塩をプロピオンアルデヒドに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、上記酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノール経路の基質および産物（例えば、図１〜４に示されている基質および産物）を変換する。
【０１３７】
さらなる実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸にか、オキサロ酢酸をリンゴ酸塩にか、リンゴ酸塩を蟻酸塩にか、蟻酸塩をコハク酸塩にか、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡにか、スクシニル−ＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドにか、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシ酪酸にか、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡにか、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを４−ヒドロキシブチルアルデヒドにか、４−ヒドロキシブチルアルデヒドを１４−ＢＤＯにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸塩にか、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸にか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンをイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、上記酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図５に示されている基質および産物）を変換する。
【０１３８】
さらなる実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸にか、オキサロ酢酸をリンゴ酸塩にか、リンゴ酸塩を蟻酸塩にか、蟻酸塩をコハク酸塩にか、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡにか、スクシニル−ＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドにか、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシ酪酸にか、コハク酸塩をコハク酸セミアルデヒドにか、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリルリン酸にか、４−ヒドロキシブチリルリン酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡにか、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトノイルＣｏＡにか、クロトノイルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡにか、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチルアルデヒドにか、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ酪酸にか、３−ヒドロキシ酪酸を３−ヒドロキシブチルアルデヒドにか、３−ヒドロキシブチルアルデヒドを１３−ＢＤＯにか、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを１３−ＢＤＯにか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸塩にか、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸にか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンをイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、上記酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図６に示されている基質および産物）を変換する。
【０１３９】
さらなる実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を提供し、天然に存在しない上記微生物は、基質を産物に変換する酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる。当該酵素またはタンパク質は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸にか、オキサロ酢酸をリンゴ酸塩にか、リンゴ酸塩を蟻酸塩にか、蟻酸塩をコハク酸塩にか、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡにか、スクシニル−ＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドにか、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシ酪酸にか、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡにか、コハク酸塩をコハク酸セミアルデヒドにか、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリルリン酸にか、４−ヒドロキシブチリルリン酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡにか、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにか、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ酪酸にか、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡにか、メタクリリル−ＣｏＡをＭＡＡにか、３−ヒドロキシイソ酪酸をＭＡＡにか、スクシニル−ＣｏＡを（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡにか、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡを（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡにか、（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡをメチルマロン酸セミアルデヒドにか、（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ酪酸にか、メチルマロン酸セミアルデヒドを３−ヒドロキシイソ酪酸にか、プロピオニル−ＣｏＡをリン酸プロピオニル塩にか、リン酸プロピオニル塩をプロピオンアルデヒドにか、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸塩にか、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸にか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡにか、ピルビン酸塩をアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩にか、蟻酸塩をＣＯ２にか、２つのアセチル−ＣｏＡ基質を１つのアセトアセチル−ＣｏＡ産物にか、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸にか、アセト酢酸をアセトンにか、またはアセトンをイソプロパノールに変換する。当業者は、（１）これらが単なる例示であること、および（２）産物への基質の変換に適切な活性が利用可能であり、かつ所望の産物を生成するために好適な、本明細書に開示されている基質−産物の任意の対が、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に決定され得ることを理解する。したがって、本発明は、酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物を提供し、上記酵素またはタンパク質は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール経路の基質および産物（例えば、図７および８に示されている基質および産物）を変換する。
【０１４０】
本明細書において全体的に、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路、またはＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を含んでいる微生物として記載されているが、本発明は、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体を生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素、イソプロパノール経路の酵素、１４−ＢＤＯ経路の酵素、１３−ＢＤＯ経路の酵素および／またはＭＡＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物をさらに提供すると理解される。例えば、本明細書に開示されているように、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路が図１〜８に例示されている。したがって、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを生成するｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路、またはＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を含んでいる微生物に加えて、本発明は、ｎ−プロパノール経路の酵素、イソプロパノール経路の酵素、１４−ＢＤＯ経路の酵素、１３−ＢＤＯ経路の酵素および／またはＭＡＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいる天然に存在しない微生物をさらに提供する。上記微生物は、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体（例えば、アセトン、メチルマロニル−ＣｏＡ、リン酸プロピオニル、２−オキソブタン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ラクトイル−ＣｏＡ、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシブチリルリン酸塩、クロトニル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸セミアルデヒド、または３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ）を生成する。
【０１４１】
実施例に記載されており、図面に例示されているような、本明細書に開示されている経路のいずれか（図１〜８の経路）が、必要に応じて、任意の経路の中間体または産物を生成する天然に存在しない微生物を生成するために利用され得ると理解される。本明細書に開示されているように、中間体を生成する上記微生物は、所望の産物を生成するために、下流の経路の酵素を発現する他の微生物と組合せて使用され得る。しかし、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの中間体を生成する天然に存在しない微生物は、所望の産物として中間体を生成するために利用され得ると理解される。
【０１４２】
本発明は、一般的に物質代謝反応、反応物質もしくはそれらの産物、または特に酵素もしくはタンパク質をコードしている１つ以上の核酸もしくは遺伝子に関して説明されている。当該酵素は、物質代謝反応、反応物質もしくはそれらの産物と関連付けられているか、または当該物質代謝反応、反応物質もしくはそれらの産物を触媒し、当該タンパク質は、物質代謝反応、反応物質もしくはそれらの産物と関連付けられている。また、本明細書に特に断りがない限り、反応に対する言及は、反応物質および反応の産物に対する言及を構成していることを当業者は理解する。また同様に、本明細書に特に断りがない限り、反応物質または産物に対する言及は、反応を指し、上記代謝の構成要素のいずれかに対する言及は、言及されている代謝反応、反応物質もしくはそれらの産物を触媒する酵素、または言及されている代謝反応、反応物質もしくはそれらの産物と関連付けられているタンパク質をコードしている（複数の）遺伝子を指す。また同様に、代謝の生化学、酵素学およびゲノミクスの公知の分野を考慮すれば、遺伝子または翻訳領域の核酸に対する本明細書における言及は、コードされている対応する酵素および当該酵素が触媒する反応もしくは当該反応と関連付けられているタンパク質、ならびに当該反応の反応物質および産物に対する言及を構成している。
【０１４３】
本発明に係る天然に存在しない微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成経路の１つ以上に関与する酵素またはタンパク質をコードしている１つ以上の発現可能な核酸を導入することによって生成され得る。生合成のために選択される宿主微生物に応じて、特定のｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成経路のうちのいくつか、またはすべてにとっての核酸が発現され得る。例えば、選択された宿主が所望の生合成経路にとっての（複数の）酵素またはタンパク質を欠損している場合、欠損している酵素またはタンパク質を発現可能な核酸が、それからの外因性の発現のために宿主に導入される。代替的に、選択された宿主が経路のいくつかの遺伝子について内因性の発現を示すが、経路の他の遺伝子を欠損している場合、したがって、欠損している（複数の）酵素またはタンパク質のための翻訳領域の核酸は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成を達成するために必要とされる。したがって、本発明に係る天然に存在しない微生物は、所望の生合成経路を得るために外来性の酵素またはタンパク質の活性を導入することによって、生成され得るか、または所望の生合成経路は、１つ以上の内在性の酵素またはタンパク質と共に、所望の産物（例えばｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ）を生成する１つ以上の外来性の酵素またはタンパク質の活性を導入することによって、実現され得る。
【０１４４】
選択された宿主微生物のｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ生合成経路の構成要素に応じて、本発明に係る天然に存在しない微生物は、少なくとも１つの外因性に発現されるｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の少なくとも１つをコードしている核酸、ならびにｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成経路の１つ以上にとっての最大ですべての翻訳領域の核酸を含んでいる。例えば、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成は、対応する翻訳領域のる核酸の外因性の発現を介して、経路の酵素またはタンパク質を欠損している宿主において確立され得る。ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路のすべての酵素またはタンパク質を欠損している宿主において、これらの経路のすべて酵素またはタンパク質の発現は、外因的にもたらされ得る。しかし、宿主が少なくとも１つの経路の酵素またはタンパク質を含んでいる場合であっても、経路のすべて酵素またはタンパク質は、発現され得ることが理解される。例えば、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成のための経路におけるすべて酵素またはタンパク質の発現は、外因性にもたらされ得る。当該酵素またはタンパク質は、例えば、図１に例示されているような、（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；（ｂ）リンゴ酸脱水素酵素；（ｃ）フマラーゼ；（ｄ）フマル酸還元酵素；（ｅ）スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；（ｆ）メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；（ｇ）メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；（ｈ）メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；（ｉ）以下の（ｉ１）または（ｉ２）のいずれか：（ｉ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；または（ｉ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素およびリン酸プロピオニル還元酵素；（ｊ）ピルビン酸キナーゼ；（ｋ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｌ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｍ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｎ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびにならびに（ｏ）イソプロパノール脱水素酵素である。
【０１４５】
本明細書における記載および示唆を考慮すれば、発現可能な形態において導入するための翻訳領域の核酸の数が、選択された宿主微生物におけるｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の欠損と少なくとも対応することを当業者は理解する。したがって、本発明に係る天然に存在する微生物は、本明細書に開示されているｎ−プロパノール生合成経路、イソプロパノール生合成経路、１４−ＢＤＯ生合成経路、１３−ＢＤＯ生合成経路および／またはＭＡＡ生合成経路を構成している酵素またはタンパク質をコードしている核酸の、最大ですべて（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）を有し得る。また、いくつかの実施形態において、天然に存在しない微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成を容易にするか、もしくは最適化する他の遺伝的改変、または宿主微生物に他の有用な機能を与える他の遺伝的改変を含み得る。そのような他の機能性としては、例えば、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の前駆体（例えばホスホエノールピルビン酸またはピルビン酸塩）の１つ以上の合成の増強が挙げられる。
【０１４６】
一般的に、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の前駆体を、天然に生成される分子または改変された産物として生成する宿主微生物が選択される。ここで、当該天然に生成される分子または改変された産物は、宿主微生物による所望の前駆体の新規合成または宿主微生物によって天然に生成される前駆体の増強された生成をもたらす。例えば、ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸塩は、宿主生物（例えばE. coli）において天然に生成される。本明細書に開示されているように、宿主生物は、前駆体の生成を増強させるように改変され得る。さらに、所望の前駆体を生成するように改変されている微生物は、宿主生物として使用され得、さらに改変されて、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の酵素またはタンパク質を発現し得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本発明に係る天然に存在しない微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの酵素的な合成能を有している宿主から生成される。特定のこの実施形態において、上記微生物は、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の産物の合成または蓄積を促進して、例えばｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成に向けてｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の反応を促進するために、有用であり得る。例えば、促進された合成または蓄積は、例えばｎ−プロパノールおよび／またはイソプロパノール経路の上述の酵素またはタンパク質の１つ以上をコードしている核酸の過剰発現によって実現され得る。ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ経路の（複数の）酵素および／またはタンパク質の過剰発現は、例えば、内在性の（複数の）遺伝子の外因性の発現、または異種の（複数の）遺伝子の外因性の発現を介して生じ得る。したがって、天然に存在する微生物は、本発明に係る天然に存在しない微生物（例えば、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ生合成経路の酵素、またはタンパク質をコードしている核酸の最大ですべて（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）の過剰発現を介してｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成する）へと、容易にさせられ得る。さらに、天然に存在しない微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ生合成経路における酵素の活性を増強をもたらす、内在性の遺伝子の突然変異生成によって生成され得る。
【０１４８】
特に有用な実施形態において、翻訳領域の核酸の外因性の発現が採用される。外因性の発現は、ユーザによって制御される所望の発現レベルを実現するための宿主および用途に対して、発現および／または制御エレメントを所望の通りに調節する能力をもたらす。しかし、内因性の発現はまた、例えば負の制御エフェクターの除去、または誘導性プロモータもしくは他の制御エレメントと連結されている遺伝子のプロモータの誘導によって、他の実施形態において利用され得る。したがって、天然に存在する誘導性プロモータを有している内在性の遺伝子は、適切な誘導因子の供給によって上方制御され得るか、または内在性の遺伝子の制御領域は、誘導性の制御領域を組み込むために改変され得、それによって所望の時点における内在性の遺伝子の増強された発現の制御を可能にする。同様に、誘導性のプロモータは、天然に存在しない微生物に導入された外来性の遺伝子のための制御因子として組み込まれ得る。
【０１４９】
本発明に係る方法において、１つ以上の外来性の核酸のいずれかは、本発明に係る天然に存在しない微生物を生成するために、微生物に導入され得ることが理解される。上記核酸は、例えば、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの生合成経路を上記微生物に付与するように、導入され得る。代替的に、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成能を付与するために必要な反応のいくつかを触媒する生合成能を有している中間体の微生物を生成するために、翻訳領域の核酸が導入され得る。例えば、ｎ−プロパノール生合成経路およびイソプロパノール生合成経路、１４−ＢＤＯ生合成経路およびイソプロパノール生合成経路、１３−ＢＤＯ生合成経路およびイソプロパノール生合成経路、またはＭＡＡ生合成経路およびイソプロパノール生合成経路を有している天然に存在しない微生物は、所望の酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも２つの外来性の核酸を含み得る。上記酵素またはタンパク質は、例えば、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびイソプロパノール脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼおよびアセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；乳酸脱水素酵素およびアセチル−ＣｏＡチオラーゼ；スクシニル−ＣｏＡ還元酵素および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）；クロトナーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼ；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼおよび４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；またはメチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）およびピルビン酸キナーゼなどの組合せである。したがって、生合成経路の２つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せは、本発明に係る天然に存在しない微生物に含まれ得ることが理解される。同様に、生合成経路の３つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せは、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せが対応する所望の産物を生成する限り、必要に応じて、本発明に係る天然に存在しない微生物に含まれ得ることが理解される。当該任意の組合せは、例えば、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼおよびイソプロパノール脱水素酵素；ピルビン酸キナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼおよび２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびイソプロパノール脱水素酵素；乳酸−ＣｏＡ転移酵素、ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素およびピルビン酸蟻酸脱離酵素；スクシニル−ＣｏＡ脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；クロトナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、フマラーゼおよびイソプロパノール脱水素酵素；またはアセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼおよびメチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）などである。同様に、本明細書に開示されている生合成経路の４つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せは、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せが対応する所望の産物を生成する限り、必要に応じて、本発明に係る天然に存在しない微生物に含まれ得る。当該任意の組合せは、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素；アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、イソプロパノール脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、マロン酸セミアルデヒドおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼ；アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼおよびイソプロパノール脱水素酵素；スクシニル−ＣｏＡ脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素およびイソプロパノール脱水素酵素；コハク酸還元酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素およびピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはアセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素およびヒドロキシイソ酪酸脱水酵素である。
【０１５０】
１つ以上の外来性の核酸が微生物に含まれている場合、当該１つ以上の外来性の核酸は、上述のような言及されている翻訳領域の核酸または生合成活性を指すと理解される。本明細書に開示されているように、２つ以上の外来性の核酸は、個々の核酸分子、ポリシストロン性の核酸分子、またはこれらの組合せにおいて宿主微生物に導入され得、２つ以上の外来性の核酸とみなされ得ることがさらに理解される。例えば、本明細書に開示されているように、微生物は、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードしている２つ以上の外来性の核酸を発現させるために改変され得える。所望の活性をコードしている２つの外来性の核酸が宿主微生物に導入されている場合に、２つの外来性の核酸は、例えば単一のプラスミド、個々のプラスミド上の単一の核酸として導入され得、宿主の染色体上の単一または複数の部位に組み込まれ得、２つの外来性の核酸とみなされ得ることが理解される。同様に、２つ以上の外来性の核酸は、例えば単一のプラスミド、個々のプラスミド上の任意の組合せにおいて宿主微生物に導入され得、宿主の染色体上の単一または複数の部位に組み込まれ得、２つ以上の外来性の核酸（例えば３つの外来性の核酸）とみなされ得ることが理解される。したがって、言及されている外来性の核酸または生合成活性の数は、翻訳領域の核酸または生合成活性の数を指しており、宿主微生物に導入された個々の核酸の数を指していない。
【０１５１】
また、本明細書に開示されているようにｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成に加えて、本発明に係る天然に存在しない微生物および方法は、互いの種々の組合せ、ならびに他のルートによって産物の生合成を実現するための当該分野に公知の他の微生物および方法との種々の組合せにおいて使用され得る。例えばｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成体による使用を除いた、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成するための１つの代替法は、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体をｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡに変換可能な他の微生物の追加を介する。そのような手順の１つとしては、例えば、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体を生成する微生物の発酵が挙げられる。ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路、１３−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路、またはＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路の中間体は、それからｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体をｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡに変換する第２の微生物にとっての基質として使用され得る。ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体は、第２の微生物の他の培養物に対して直接に加えられ得か、またはｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の中間体の生成体の元の培養物は、例えば細胞分離によって、当該微生物が取り除かれ得、それから、中間体を精製する段階なしで最終産物を生成するために発酵ブロスに対する第２の生物の続く追加を利用して、中間体の生成段階なしで最終産物が生成され得る。
【０１５２】
他の実施形態において、本発明に係る天然に存在しない微生物および方法は、例えばｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの生合成を実現するための広範なサブ経路（subpathways）において構築され得る。上述の実施形態において、本発明に係る所望の産物のための生合成経路は、異なる微生物において分離され得、当該異なる微生物は、最終産物を生成するために共培養され得る。そのような生合成手順において、１つの微生物の産物は、最終産物が合成されるまでの第２の微生物にとっての基質である。例えば、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成は、１つの経路の中間体を他の経路の中間体または産物に変換させるための生合成経路を含んでいる微生物を構築することによって達成され得る。代替的に、第１の微生物がプロピオニル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡおよび／またはアセチル−ＣｏＡの中間体を生成し、第２の微生物が当該中間体をｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡに変換する場合、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡは、同じ容器における２つの微生物を用いた共培養または共発酵を介して、生合成によって微生物から生成され得る。
【０１５３】
本明細書における記載および示唆を考慮すれば、当業者は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成させる技術において公知の、他の微生物、サブ経路を有している天然に存在しない他の微生物の共培養、ならびに他の化学的および／または生化学的な手法の組合せをともなう、本発明に係る天然に存在しない微生物および方法にとっての広範な組合せおよび入替えが存在することを理解する。
【０１５４】
ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路の酵素またはタンパク質をコードしている核酸の発源としては、例えば、コードされている遺伝子産物が言及されている反応の触媒能を有している、任意の種が挙げられ得る。そのような種としては、原核生物および真核生物（細菌（古細菌および真正細菌が挙げられる）および真核生物（酵母、植物、昆虫、動物および哺乳類（ヒトが挙げられる）が挙げられる））の両方が挙げられるが、これらに限定されない。そのような発源の例示的な種としては、例えば、Escherichia coli, Acetobacter pasteurians、Acidanus brierleyi、Acinetobacter baylyi Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter sp. Strain M-1、Actinobacillus succinogenes、Anaerobiospirillum succiniciproducens、Anaerostipes caccae DSM 14662、Arabidopsis thaliana、Bacillus cereus ATCC 14579、Bacillus subtilis、Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168、Bos taurus、Bradyrhizobium japonicum USDA110、Caenorhabditis elegans、Campylobacter jejuni、Chlamydomonas reinhardtii、Chloroflexus aurantiacus、Clostridium acetobutylicum、Clostridium acetobutylicum ATCC 824、Clostridium beijerinckii、Clostridium botulinum C str. Eklund、Clostridium kluyveri、Clostridium kluyveri DSM 555、Clostridiumnovyi-NT、Clostridium propionicum、Clostridium saccharobutylicum、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、Corynebacterium glutamicum、Desulfovibrio africanus、Erythrobacter sp. NAP1、Escherichia coli K12、Escherichia coli K12 str. MG1655、Escherichia coli O157:H7、Geobacillus thermoglucosidasius M10EXG、Haemophilus influenza、Helicobacter pylori、Homo sapiens、Klebsiella pneumonia MGH78578、Kluyveromyces lactis、Lactobacillus casei、Lactobacillus plantarum WCFS1、Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Mannheimia succiniciproducens、marine gamma proteobacterium HTCC2080、Mesorhizobium loti、Metallosphaera sedula、Methylobacterium extorquens、Moorella thermoacetica、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium tuberculosis、Oryctolagus cuniculus、Plasmodium ovale、Porphyromonas gingivalis、Propionibacterium acnes、Propionibacterium fredenreichii sp. shermanii、Propionibacterium freudenreichii、Propionigenium modestum、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas putida E23、Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas sp、Pseudomonas stutzeri、Ralstonia eutropha、Ralstonia eutropha H16、Rattus norvegicus、Rhodobacter spaeroides、Rhodoferax ferrireducens DSM 15236、Rhodospirillum rubrum、Roseiflexus castenholzii、Saccharomyces cerevisiae、Salmonella enterica、Salmonella typhimurium、Shigella flexneri、Simmondsia chinensis、Streptococcus mutans、Sulfolobus acidocaldarius、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus tokodaii、Syntrophobacter fumaroxidans、Thermococcus litoralis、Thermotoga maritime、Thermus thermophilus、Trichomonas vaginalis G3、Trypanosoma brucei、Veillonella parvula、Yersinia frederiksenii、Zymomonas mobilis、Bacillus megaterium、butyrate-producing bacterium L2-50、Clostridium aminobutyricum、Geobacillus thermoglucosidasius、Mycobacterium bovis BCG、Nocardia farcinica IFM 10152、Nocardia iowensis (sp. NRRL 5646)、Penicillium chrysogenum、Porphyromonas gingivalis ATCC 33277、Pseudomonas mendocina、Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350、および対応する遺伝子の発源として利用可能な、本明細書に記載の例示的な他の種が挙げられる。しかし、必須のｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成活性をコードしている遺伝子の、利用可能な完全なゲノム配列を用いた近縁種または別種における遺伝子についての同定は、定法であり、当該分野において公知である。利用可能な完全なゲノム配列は、現在、５５０種（３９５の微生物のゲノム、ならびに種々の酵母、菌類、植物および哺乳類のゲノムが挙げられる）を超えており、公開されているデータベース（例えば、ＮＣＢＩ）上において利用可能なこれらの半数を超えている。近縁種または別種における上記遺伝子は、例えば、公知の遺伝子の相同物、オルソログ、パラログおよびオルソログではない遺伝子の置換、ならびに生物間における遺伝的変化の交換が挙げられる。
したがって、特定の生物（例えばE. coli）に関して本明細書に記載されているｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成を可能にする代謝の変化は、他の微生物（原核生物および真核生物などが挙げられる）に対して容易に適用され得る。本明細書における記載および示唆を考慮すれば、当業者は、１つの生物において例示された代謝の変化が他の生物に対して等しく適用され得ることを理解する。
【０１５５】
いくつかの例において、例えば他のｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成経路が別種に存在する場合に、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成を、例えば類似しているが同一ではない物質代謝反応を触媒する別種に由来する（複数の）パラログを外因的に発現させて、言及されている反応を置き換えることによって、宿主の種に生じさせ得る。代謝ネットワークにおける特定の差異が異なる生物間に存在するので、当業者は、異なる生物間における実際の遺伝子の利用法が、異なり得ることを理解する。しかし、本明細書における記載および示唆を考慮すれば、当業者は、本発明の開示事項および方法が、本明細書に例示されている種に対する同種の代謝の変更を用いてすべての微生物に適用されて、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを合成する所定の種を用いて微生物を構築し得ることを理解する。
【０１５６】
宿主微生物は、例えば細菌、酵母、菌類または発酵過程に適用可能な種々の他の微生物から選択され得、天然に存在しない微生物は、細菌、酵母、菌類または発酵過程に適用可能な種々の他の微生物において生成され得る。例示的な細菌としては、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、Rhizobium etli、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Gluconobacter oxydans、Zymomonas mobilis、Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Streptomyces coelicolor、Clostridium acetobutylicum、Pseudomonas fluorescens、およびPseudomonas putidaから選択される種が挙げられる。例示的な酵母または菌類としては、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Aspergillus terreus、Aspergillus niger、およびPichia pastorisから選択される種が挙げられる。E. coliは、遺伝子改変にとって好適な十分に性質決定されている生物であるため、特に有用な宿主生物である。特に有用な他の宿主生物としては、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母が挙げられる。特に有用な他の宿主生物としては、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のために十分な量のプロピオニル−ＣｏＡおよび／またはアセチル−ＣｏＡを天然に生成する微生物が挙げられる。そのような微生物の例としては、Clostrium propionicum、Escherichia coliおよびPropionibacterium freudenreichii subsp. Shermaniiが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成する、天然に存在しない微生物を構築し、当該微生物の発現レベルを試験する方法は、例えば当該分野に公知の組換え法および検出法によって、実施され得る。そのような方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)における記述に見られ得る。
【０１５８】
ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを生成するための経路に関連する外来性の核酸配列は、当該分野に公知の技術を用いて宿主細胞に対して安定または一過性に導入され得る。当該技術としては、例えば、抱合、エレクトロポレーション、化学的な形質転換、形質導入、トランスフェクション、および超音波による形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。E. coliまたは他の原核細胞における外因性の発現のために、真核生物の核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおけるいくつかの核酸配列は、標的シグナル（例えばＮ末端ミトコンドリア標的シグナルまたは他の標的シグナル）をコードし得、当該標的シグナルは、必要に応じて、原核宿主細胞に導入する前に除去され得る。例えば、ミトコンドリアのリーダー配列の除去によって、E. coliにおける増強された発現がもたらされた（Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)）。酵母または他の真核細胞における外因性の発現のために、遺伝子は、リーダー配列を加えずに細胞基質において発現され得るか、または好適な標的配列（例えば宿主細胞にとって好適なミトコンドリア標的シグナルまたは分泌シグナル）を加えることによって、ミトコンドリアまたは他のオルガネラに標的化され得るか、もしくは分泌に対して標的化され得る。したがって、標的配列を除去するか、または標的配列を加えるための核酸配列に対する適切な修飾は、所望の特性を与えるために外来性の核酸配列に組み込まれ得ることが理解される。さらに、遺伝子は、当該分野に公知の技術を用いたコドンの最適化に供されて、タンパク質の最適化された発現を実現し得る。
【０１５９】
（複数の）発現ベクターは、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成経路の１つ以上翻訳領域の核酸、本明細書に例示されているような核酸を含んで構築され得、当該核酸は、宿主生物において機能的な発現制御配列と作動可能に連結されている。本発明に係る宿主微生物における使用に対して適用可能な発現ベクターとしては、例えば、宿主染色体に対する安定した組込みに使用可能なベクターおよび選択配列もしくはマーカーを含んでいる、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、および人工染色体が挙げられる。発現ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および適切な発現制御配列をさらに含み得る。また、選択可能なマーカー遺伝子としては、例えば抗生物質もしくは毒素に対する耐性を与える遺伝子、栄養要求性の欠損を補完する遺伝子、または培地に存在しない必須の栄養素を供給する遺伝子が挙げられ得る。発現制御配列としては、当該分野に公知の構造的なプロモータ、誘導性プロモータ、転写エンハンサー、および転写ターミネーターなどが挙げられる。外来性の翻訳領域の核酸の２つ以上が共発現される場合、両方の核酸は、例えば単一または個々の発現ベクターに挿入され得る。単一のベクターの発現のために、翻訳領域の核酸は、共通する１つの発現制御配列と作動可能に連結され得るか、または異なる発現制御配列（例えば１つの誘導性プロモータおよび１つの構成的プロモータ）と連結され得る。代謝経路または合成経路に関連する外来性の核酸配列による形質転換は、当該分野に公知の方法を用いて確認され得る。そのような方法としては、例えば核酸分析（ノーザンブロットまたはｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅）、遺伝子産物の発現のための免疫ブロッティング、または導入された核酸配列もしくは当該核酸配列に対応する遺伝子産物の発現を試験するために好適な他の分析方法が挙げられる。外来性の核酸は、所望の産物を生成させるための十分な量において発現されることが当業者によって理解され、発現レベルは、当該分野に公知の方法および本明細書に開示されている方法を用いて、十分な発現を得るために最適化され得る。
【０１６０】
定方向進化は、酵素の性質を改良するか、および／または変更させるために、特定の遺伝子に標的化された突然変異の導入に関する有力な手法である。改良されたか、および／または変更された酵素は、多くの酵素（例えば＞１０４）のバリアントの自動化されたスクリーニングを可能にする高速大量処理の高感度なスクリーニングの開発および実施を介して同定され得る。突然変異生成およびスクリーニングは、最適化された性質を有している酵素をもたらすために、一般的に繰返して実施される。また、突然変異生成のための遺伝子の領域の同定に役立ち得るコンピューターアルゴリズムが、開発されており、生成およびスクリーニングを求められている酵素のバリアントの数を大幅に低下させ得る。
【０１６１】
種々の変異体ライブラリの作製において有効な多くの定方向進化技術が開発されており（概説について、Hibbert et al., Biomol. Eng 22:11-19 (2005)；Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press；Otten and Quax. Biomol.Eng 22:1-9 (2005).；およびSen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)を参照すればよい）、当該方法は、多くの酵素の種類にわたる広範な性質の改良に首尾よく適用されている。
【０１６２】
定方向進化技術によって改良されたか、および／または変更された酵素の性質としては、例えば、天然にない基質の変換のための選択性／特異性；強度の高温処理のための温度安定性；低ｐＨまたは高ｐＨの条件下におけるバイオプロセスのためのｐＨ安定性；高力価の産物が実現されるような基質または産物に対する許容性；天然にない基質を含むように結合する基質を拡大させる、結合（Ｋｍ）；産物、基質または重要な中間体による阻害を排除するための；害（Ｋｉ）；所望の変化を実現させるために酵素反応の速度を増加させる、活性（ｋｃａｔ）；タンパク質の収量および経路全体の変化を促進させる、発現レベル；嫌気性条件下における空気感受性酵素の機能のための酸素安定性；ならびに酸素の非存在下における好気性酵素の機能のための嫌気性活性が挙げられる。
【０１６３】
例示的な以下の方法は、特定の酵素の所望の性質を標的化するための突然変異生成および遺伝子の多様化のために開発されている。これらのうちのいずれもが、デカルボキシラーゼ酵素の活性を変更／最適化させるために使用され得る。
【０１６４】
ｅｐＰＣＲ（Pritchard et al., J Theor.Biol 234:497-509 (2005)）は、Ｍｎ２＋イオンの添加、ｄＮＴＰ濃度の偏りまたは他の条件の変動による、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの忠実度の低下によって、任意の点変異を導入する。所定の標的遺伝子に対する突然変異生成を限局するための５段階のクローニング工程は、（１）所定の遺伝子の、エラー易発性のＰＣＲ増幅；（２）制限酵素消化；（３）所望のＤＮＡ断片のゲル精製；（４）ベクターに対する連結；（５）好適な宿主に対するバリアント遺伝子の導入および改良された性能についてのライブラリのスクリーニング。この方法は、によれば、単一の遺伝子における複数の変異を同時に生成し得る、有用な方法であり得る。多くのバリアントがＥｐＰＣＲによって生成されるため、高速大量処理のスクリーニングアッセイまたは選択法（特にロボット工学を用いた）は、好ましい特性を有しているこれらを同定するために有用である。
【０１６５】
エラー易発性のローリングサークル増幅（ｅｐＲＣＡ）（Fujii et al., Nucleic Acids Res 32:e145 (2004)；およびFujii et al., Nat.Protoc. 1:2493-2497 (2006)）は、ｅｐＰＣＲと多くの同一の要素を有している。しかし、ｅｐＲＣＡは、環状プラスミドの全体が鋳型として使用されている点、最後の２ヌクレオチド上におけるエキソヌクレアーゼ耐性のチオリン酸連結を有しているランダムなヘキサマーがプラスミドを増幅するために使用されている点、および続いて形質転換された細胞においてプラスミドがタンデムな繰返しとして再環状化されている点おいてｅｐＰＣＲと異なる。Ｍｎ２＋の濃度の調整によって変異の割合は幾分か変更され得る。この技術は、エラー易発性の一段階の単純な方法を利用して、３〜４の変異／ｋｂｐを有しているプラスミドの全長のコピーを作製している。制限酵素消化または特異的なプライマーを必要としない。さらに、この方法は、キットとして一般的に入手可能である。
【０１６６】
ＤＮＡシャッフリングまたはファミリーシャッフリング（Stemmer, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91:10747-10751 (1994); および Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)）は、ランダムな断片のプールを生成するためにヌクレアーゼ（例えばＤｎａｓｅ  ＩまたはＥｎｄｏ  Ｖ）を用いた２つ以上のバリアント遺伝子の消化に一般的に関する。上記ランダムな断片は、キメラ遺伝子のライブラリを作製するために、ＤＮＡポリメラーゼの存在下におけるアニーリングおよび伸長のサイクルによって再構築される。断片は互いにプライミングし、一方のコピーが他方のコピーとプライミングする場合に組換えが生じる（鋳型乗換え）。この方法は、１ｋｂｐを超えるＤＮＡ配列と共に使用され得る。断片の再構築によって作製された変異を有している組換え体に加えて、この方法は、エラー易発性のＰＣＲと同様の割合を有して伸長段階において点変異を導入する。上記方法は、抗原性を付与し得るランダムかつ有害な中立変異を排除するために使用され得る。
【０１６７】
スタッガードエクステンション（Staggered Extension）（ＳｔＥＰ）（Zhao et al., Nat.Biotechnol 16:258-261 (1998)）は、鋳型のプライミング、これに続く変性および非常に短時間のアニーリング／伸長（５秒ほどの短さ）を有している２段階ＰＣＲの繰返しのサイクル必要とする。伸長している断片は、異なる鋳型とアニーリングし、さらに伸長し、これは全長配列が生成されるまで繰り返される。鋳型乗換えは、生じた断片の大部分が複数の親を有していることを意味する。忠実度の低いポリメラーゼの組合せ（ＴａｑおよびＭｕｔａｚｙｍｅ）は、対照的な変異の方向性のために、エラー易発性を低下させる。
【０１６８】
ランダムプライミング組換え（ＲＰＲ）において、ランダムな配列のプライマーは、鋳型の異なる部分に対して相補的な多くの短いＤＮＡ断片を生成するために使用される（Shao et al., Nucleic Acids Res26:681-683 (1998)）。ｅｐＰＣＲを介した塩基の誤った組込みおよび誤ったプライミングは点変異をもたらす。短いＤＮＡ断片は、相同性に基づいてお互いにプライミングし、組換えられ、繰返しの熱サイクルによって全長へと再構築される。この段階の前における鋳型の除去によって、親組換え体の減少が保証される。この方法は、ほとんどの他の方法と同様に、異なる性質を生じさせるために複数回にわたって繰返して実施され得る。この技術は、配列の偏りを避け、遺伝子の長さに依存せず、処理のために極わずかな親ＤＮＡのみを必要とする。
【０１６９】
ヘテロ二本鎖組換えにおいて、直鎖状のプラスミドＤＮＡが使用されて、ミスマッチ修復によって修復されたヘテロ二本鎖を形成する（Volkov et al, Nucleic Acids Res 27:e18 (1999); および Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463 (2000)）。ミスマッチ修復の段階は、少なくとも幾分か変異誘発性である。ヘテロ二本鎖は、直鎖状のホモ二本鎖より効率的に変化する。この方法は、巨大な遺伝子およびオペロン全体にとって好適である。
【０１７０】
一時的な鋳型に基づくランダムなキメラ誘発（Random Chimeragenesis on Transient Templates）（ＲＡＣＨＩＴＴ）（Coco et al., Nat.Biotechnol 19:354-359 (2001)）は、Ｄｎａｓｅ  Ｉによる断片化およびｓｓＤＮＡのサイズ分画を採用している。相同な断片は、ポリメラーゼの非存在下において相補的なｓｓＤＮＡの骨格とハイブリダイズされる。ハイブリダイズされていない重複する断片の任意の末端はエキソヌクレアーゼによって切り取られる。断片の間にあるギャップは、埋められ、それから上記骨格（増幅を防ぐためにＵが含まれている）にハイブリダイズされた種々の全長鎖のプールをもたらすために結合される。この骨格は、それから破壊され、ＰＣＲ増幅によって種々の鎖と相補的な新しい鎖に置き換えられる。上記方法は単一の親に由来する単一の鎖（骨格）に関連するが、プライミングする断片は他の遺伝子に由来し；親の骨格はこれにしたがわずに選択される。したがって、親断片との再アニーリングは起こらない。重複する断片は、エキソヌクレアーゼを用いて切り取られる。この他の点において、当該方法は、ＤＮＡシャッフリングおよびＳｔＥＰと概念的に類似している。したがって、姉妹（sibling）は存在せず、不活性物はわずかに存在し、シャッフルされていない親は存在しない。この技術は、親遺伝子がわずかに生成されるか、またはまったく生成されず、標準的なＤＮＡシャッフリングに対してさらに多くの交差が生じ得るという利点を有している。
【０１７１】
トランケートされた鋳型に基づく組合せ伸長（Recombined Extension on Truncated templates）（ＲＥＴＴ）は、鋳型のプールとして使用される一方向性のｓｓＤＮＡ断片の存在下において、プライマーから一方向性に伸長した鎖の鋳型乗換えを必要とする（Lee et al., J.Molec.Catalysis 26:119-129 (2003)）。ＤＮＡエンドヌクレアーゼは使用されない。一方向性のｓｓＤＮＡは、ランダムプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼ、またはエキソヌクレアーゼを用いた連続する欠失によって作製される。一方向性のｓｓＤＮＡは、鋳型でしかなく、プライマーではない。ランダムプライミングおよびエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡシャッフリング／ＲＡＣＨＩＴＴの酵素的な切断と同じく、配列の偏りを導入しない。ＲＥＴＴは、ごく短時間の伸長の代わりに通常のＰＣＲ条件を使用するため、ＳｔＥＰより容易に最適化され得る。組換えはＰＣＲの段階の構成要素（直接的なシャッフリングではない）として起こる。また、この方法は、中断がないため、ＳｔＥＰに比べてよりランダムであり得る。
【０１７２】
変性オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（ＤＯＧＳ）において、変性したプライマーは、分子間の組換えを制御するために使用される（Bergquist and Gibbs, Methods Mol.Biol 352:191-204 (2007)；Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72 (2005)；Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)）。；上記方法は、親遺伝子を再生するための他の方法（例えばＤＮＡシャッフリング）の傾向を制御するために使用され得る。この方法は、選択された遺伝子セグメントのランダムな突然変異生成（ｅｐＰＣＲ）と組み合わせられ得る。この方法は、親配列の再生成を阻止するための良好な方法であり得る。エンドヌクレアーゼは必要とされない。作製されたセグメントの投入する濃度を調整することによって、所望の骨格への偏りを生じさせ得る。この方法は、制限酵素消化なしで無関係な親に基づくＤＮＡシャッフリング、およびランダムな突然変異生成の方法の選択を可能にする。
【０１７３】
ハイブリッド酵素の作製用のインクリメンタルトランケーション（Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes）（ＩＴＣＨＹ）は、所定の遺伝子または遺伝子断片の１塩基対欠失を有している組合せライブラリを作製する（Ostermeier et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96:3562-3567 (1999)；および Ostermeier et al., Nat.Biotechnol 17:1205-1209 (1999)）。トランケーションは、２つの異なる遺伝子の部分における反対の方向に導入される。これらは互いに連結され、融合体はクローン化される。この技術は、２つの親遺伝子の間における相同性を必要としない。ＩＴＣＨＹがＤＮＡシャッフリングと組合せられる場合、この系はＳＣＲＡＴＣＨＹと呼ばれる（後述する）。両者の主な利点は、親遺伝子の間における相同性を必要としないことである。例えば、E. coli遺伝子およびヒト遺伝子の機能的な融合体はＩＴＣＨＹを介して作製される。ＩＴＣＨＹライブラリが作製されると、見込みのあるすべての交差が保存される。
【０１７４】
ハイブリッド酵素の作製用のチオ−インクリメンタルトランケーション（Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes）（ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ）は、トランケーションを生成するために使用されることを除いて、ＩＴＣＨＹと同様である（Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)）。ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹは、ＩＴＣＨＹと比べて最適化が容易であり、より良好な再現性および調節機能をもたらす。
【０１７５】
ＳＣＲＡＴＣＨＹは、遺伝子を組み換える２つの方法（ＩＴＣＨＹおよびＤＮＡシャッフリング）を組み合わせている（Lutz et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98:11248-11253 (2001)）。ＳＣＲＡＴＣＨＹは、ＩＴＣＨＹおよびＤＮＡシャッフリングの最良の最も特性を組み合わせている。まず、ＩＴＣＨＹは、ＤＮＡの相同性に依存しない様式において遺伝子断片の融合体の広範な組を作製するために使用される。この人工的な群は、それから交差の数を増加させるためのＤＮＡシャッフリングの段階に供される。コンピューターを利用した予測が、最適化において使用され得る。ＳＣＲＡＴＣＨＹは、配列の同一性が８０％未満である場合に、ＤＮＡシャッフリングと比べてより有効である。
【０１７６】
ランダムドリフト突然変異生成（ＲＮＤＭ）において、ｅｐＰＣＲを介して突然変異が行われ、それからこれらの保持している有用な活性についてスクリーニング／選択がなされる（Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72 (2005)）。それらは、複数の活性な変異体の間、または活性な変異体および所望されるいくつかの他の親の間における融合によって組換え体を生成するためにＤＯＧＳに使用される。中立変異の分離を促進させるために設計されており、その目的は、この活性が元の遺伝子より高いか、または低いか否かを、保持されている触媒活性についてスクリーニングすることである。スクリーニングがバックグラウンドを超える活性を検出可能な場合に、ＲＮＤＭは高速大量アッセイにおいて有用である。ＲＮＤＭは、多様性の生成におけるＤＯＧＳの前段として使用されている。当該技術は、シャッフリングまたは続く他の段階の前における活性に対する要求を改善させる。すなわち、より規模の小さいライブラリから活性におけるより高い／速い改良をもたらすための中立なドリフトライブラリが意図されている。ｅｐＰＣＲを用いることが公開されているが、これは、大規模な他の突然変異生成法に適用され得る。
【０１７７】
配列飽和突然変異生成（ＳｅＳａＭ）は、（１）ホソホチオエートヌクレオチドのランダムな組込み、および開裂を用いてランダムな長さの断片のプールを生成し；（２）このプールを鋳型として用いて、“万能”塩基（例えばイノシン）の存在下において伸長させ；（３）イノシンを含んでいる相補体の複製がランダムな塩基の組込みおよび続く変異生成をもたらす、ランダムな突然変異生成法である（Wong et al., Biotechnol J 3:74-82 (2008)；Wong et al., Nucleic Acids Res 32:e26 (2004)；およびWong et al., Anal.Biochem. 341:187-189 (2005)）。この技術を用いれば、単一の方法を用いて２〜３日以内に、大規模な変異のライブラリを生成可能である。この技術は、ＤＮＡポリメラーゼの変異の偏りに比べて定方向性ではない。この手法における差異は、ｅｐＰＣＲに対する補完的なこの技術（または代替法）をもたらす。
【０１７８】
合成シャッフリングにおいて、重複しているオリゴヌクレオチドは“標的における遺伝的多様性のすべて”をコードするように設計されており、シャッフルされた子孫において非常に高い多様性を許容する（Ness et al., Nat.Biotechnol 20:1251-1255 (2002)）。この技術において、シャッフルされるべき断片を設計し得る。これは、子孫に生じる多様性の向上を補助する。より近縁な配列を用いて観察される割合にほぼ等しい割合において、より遠縁の配列を作製するための配列／コドンの偏りを設計し得る。さらに、当該技術は鋳型遺伝子を物理的に所有している必要がない。
【０１７９】
ヌクレオチドの置換および切出技術（Nucleotide Exchange and Excision Technology）（ＮｅｘＴ）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびそれからピペリジンを用いた処理を後に行うｄＵＴＰ組込みの組合せを利用して、終点ＤＮＡの断片化（endpoint DNA fragmentation）を実施する（Muller et al., Nucleic Acids Res 33:e117 (2005)）。遺伝子は、校正ポリメラーゼをとともにＰＣＲプライマーの内部伸長を用いて再構築される。シャッフリングのためのサイズは、ｄＵＴＰ：：ｄＴＴＰ比の変更によって直接的に制御可能である。これは、ウラシルの組込みおよび切断のための簡易な方法を用いた終点反応である。他のヌクレオチド類似物（例えば８−オキソ−グアニン）が、この方法に使用され得る。さらに、当該技術は、非常に短い断片（８６ｂｐ）を用いて十分に機能し、低いエラーの割合を有している。この技術において使用されるＤＮＡの化学的切断は、シャッフルされていないクローンをごくわずかにしか生じない。
【０１８０】
配列相同性に依存しないタンパク質組換え（Sequence Homology-Independent Protein Recombination）（ＳＨＩＰＲＥＣ）において、リンカーは２つの遠縁／無関係の遺伝子間における促進させるために使用される。ヌクレアーゼ処理を使用して、２つの上記遺伝子の間における種々のキメラを生成させる。これらの融合は、単一の交差ハイブリッドのライブラリを生じる（Sieber et al., Nat.Biotechnol 19:456-460 (2001)）。これは、限られた種類のシャッフリングをもたらし、個々の処理が突然変異生成に必要とされる。さらに、相同性は必要とされないので、この技術は、無関係な２つの親によって遺伝子のそれぞれの変化している一部を有しているキメラのライブラリを生成させ得る。ＳＨＩＰＲＥＣは、哺乳類のＣＰ４５０のＮ末端領域に融合された細菌のＣＰ４５０のヘム結合ドメイン（これはより可溶性の高い酵素において哺乳類の活性を生じた）を用いて試験された。
【０１８１】
Gene Site Saturation Mutagenesis（商標）（ＧＳＳＭ（商標））において、出発物質は、突然変異の所望の部位において変性された２つのプライマーおよび挿入を含んでいるスーパーコイルｄｓＤＮＡのプラスミドであり、当該２つのプライマーは、変異の所望されている部位において縮重している（Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11 (2004)）。所定の変異を有しているプライマーは、ＤＮＡの反対の鎖上の同じ配列にアニーリングする。変異は、一般的にプライマーの中央にあり、正しい配列のそれぞれの側の２０ヌクレオチド以下の正しい配列によってその両端にフランキングされている。プライマーの配列はＮＮＮもしくはＮＮＫ（コード）ならびにＭＮＮ（非コード）である（Ｎ＝４つのすべて、Ｋ＝Ｇ、Ｔ、Ｍ＝Ａ、Ｃ）。伸長後に、ｄａｍ−メチル化されたＤＮＡを消化するためにＤｐｎＩが使用されて、野生型の鋳型を排除する。この技術によって、所定の部位（すなわち１つのコドン）における見込みのあるすべてのアミノ酸置換が調査される。当該技術は、ナンセンスコドンを有していない単一の部位における見込みのあるすべての置換の生成を容易にし、見込みのあるほとんどの対立遺伝子のほぼ等しい発現量をもたらす。この技術は、標的酵素の構造、機序またはドメインの予備知識を必要としない。シャッフリングまたは遺伝子再構築に続いて実施される場合、この技術によって、単一部位の向上する変異の見込みのあるすべての組合せを含んでいる組換え体の種々のライブラリが作製される。技術のこの組合せの有用性は、５０を超える異なる酵素の進化の成功、および所定の酵素における２位以上の性質について証明されている。
【０１８２】
組合せカセット突然変異生成（ＣＣＭ）は、見込みのあるアミノ酸配列の多数の変更を用いて限られた領域を置換するための短いオリゴヌクレオチドカセットの使用に関する（Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991)；および Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)）。この技術を用いて、２または３つの部位における同時の置換が可能である。さらに、上記方法は、限られた範囲の部位における見込みのある配列の非常に多数の変更を検証する。この技術は、ラムダリプレッサーＤＮＡ結合部位の情報内容を調査するために使用されている。
【０１８３】
組合せ多重カセット突然変異生成（ＣＭＣＭ）は、規模のより大きいプログラム：（１）高い変異生成率におけるｅｐＰＣＲの使用、（２）突然変異の多発点および多発領域の同定、（３）タンパク質配列空間の特定された領域までのＣＭＣＭによる伸長の一部として採用されることを除いて、ＣＣＭと実質的に同様である（Reetz, M. T., S. Wilensek, D. Zha, and K. E. Jaeger, 2001, Directed Evolution of an Enantioselective Enzyme through Combinatorial Multiple-Cassette Mutagenesis. Angew.Chem.Int.Ed Engl. 40:3589-3591.）。この方法は、ＣＣＭと同様に、標的領域の全体にわたって見込みのある変更のほとんどすべてを検証し得る。ランダムな変異およびシャッフルされた遺伝子を作製するための方法と共に使用される場合、上記方法は、シャッフルされた種々のタンパク質を生成する優れた手段を提供する。この手法によって、酵素のエナンチオ選択性を５１倍まで上昇させることに成功した。
【０１８４】
突然変異誘発株技術において、条件付ｔｓ変異誘発プラスミドは、選択の間におけるランダムな変異および中立変異の頻度における２０〜４０００倍の増加を可能にし、選択が必要でない場合に有害な変異の蓄積を阻止する。（Selifonova et al., Appl Environ Microbiol 67:3645-3649 (2001)）。この技術は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの変異体サブユニットをコードしている、プラスミド由来のｍｕｔＤ５遺伝子に基づいている。このサブユニットは、内在性のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに結合し、プラスミドを有している任意の株におけるポリメラーゼＩＩＩの校正能力を損なわせる。広範な塩基置換およびフレームシフト変異が起きる。効率的な使用のために、所望の表現型が得られると、変異誘発プラスミドは除去されるべきである。これは、温度感受性の複製起点（プラスミドを４１℃に保存することを意図している）を介して実現される。なお、変異誘発株はかなり以前に調査されている（例えばLow et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)を参照すればよい）。この技術においては、非常に高い同時の変異率が観察されている。条件付の特性は、所望されないバックグラウンドの変異を最小化する。この技術は、変異の生成率の向上およびより迅速な所望の特性の獲得のために適応進化と組み合わせられ得る。
【０１８５】
“ルックスルー”型突然変異生成（ＬＴＭ）は、選択されたアミノ酸の組合せ変異を評価し、最適化する多元的な突然変異生成法である（Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 102:8466-8471 (2005)）。見込みのあるアミノ酸変更のすべてを用いて各部位を飽和させるのではなく、９つからなる組は、アミノ酸のＲ基の種々の化学的性質を網羅するために選択される。部位ごとのより少ない変更によって、複数の部位がこの種類の変異を受ける。数ナノモーラーからピコモーラーの、抗体に対する結合親和性は、この方法を介して８００倍を超えて向上されている。この方法は、ランダムな組合せの数を最小化するための合理的な手法であり、スクリーニングされるクローンの数を大幅に減少させることによって、改良された形質を見出す能力を向上させ得る。これは、特に結合親和性の向上および／または解離の低減のために、抗体製造技術に適用されている。当該技術はスクリーニングまたは選択のいずれかと組み合わせられ得る。
【０１８６】
遺伝子再構築は、一度に複数の遺伝子に適用され得るか、または単一の遺伝子のキメラの大規模なライブラリ（複数の突然変異）の作製に適用され得るＤＮＡシャッフリング法である（Verenium Corporationによって提供されているTunable GeneReassembly（商標）（ＴＧＲ（商標））Technology）。一般的に、この技術は、所望の改良のために示された配列空間を照会するための超高速大量処理のスクリーニングと組み合わせて使用される。この技術は、相同性に依存しない複数の遺伝子の組換えを可能にする。交差の正確な数および位置は、バイオインフォマティクス分析を介して設計された断片を用いてあらかじめ決定され得る。この技術は、親遺伝子の再形成が実質的にない非常に高いレベルの多様性および低いレベルの不活性な遺伝子をもたらす。ＧＳＳＭ（商標）と組み合わせることによって、非常に広範な変異は、改良された活性について試験され得る。当該方法は、ＤＮＡシャッフリングの“混合”および“微調整”を可能にする（例えばコドンの利用法が最適化され得る）。
【０１８７】
インシリコのプロテインデザインオートメーション（In Silico Protein Design Automation）（ＰＤＡ）は、特定の折りたたみ構造を有している構造的に明確なタンパク質の骨格を固定する（anchor）最適化アルゴリズムであって、折りたたみ構造およびタンパク質全体のエネルギー論を安定させ得るアミノ酸置換のための配列空間を探索するアルゴリズムである（Hayes et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99:15926-15931 (2002)）。この技術は、タンパク質のアミノ酸変異に対する構造的な許容度を調べるために構造に基づくインシリコのエントロピー予測を用いる。統計力学が適用されて、各部位における結合の相互作用を算出する。アミノ酸置換に対する構造的な許容度は結合の程度である。最終的に、上記技術は、構造的な特性の完全性を維持し、タンパク質の性質の所望の変更を生じるように設計される。この方法は、非常に多く（１０５０）の見込みのある配列バリアントのふるい分けをコンピューターによって評価し、可能にする。試験するための配列バリアントの選択は、最も好ましい熱力学に基づく予測に関連付けられている。表面上は、安定性および安定性と関連している性質のみが、この技術を用いて効率的に対処され得る。この方法は、いくつかの治療用タンパク質（特に免疫グロブリンの改変）において首尾よく使用されている。インシリコの予測は、非常に多くの潜在的なバリアントの試験を回避させる。既存の三次元構造に基づく予測は、仮定の構造に基づく予測に比べて、より上首尾であると考えられる。この技術は、指数的な数の増加によって、純粋に実験手法を用いてときに不可能な同時に起こる多数の変異の標的化されたスクリーニングを容易に予想し得、可能にする。
【０１８８】
反復飽和突然変異生成（ＩＳＭ）は、（１）酵素の改良のために有望な部位を選択するための構造／機能の知識の利用；（２）Stratagene QuikChange（または他の好適な手段）を用いた選択された部位における飽和突然変異生成；（３）所望の特性についてのスクリーニング／選択；および（４）改良された（複数の）クローンを用いて他の部位からやり直し、繰返し継続させることに関する（Reetz et al., Nat.Protoc. 2:891-903 (2007); and Reetz et al., Angew.Chem.Int.Ed Engl. 45:7745-7751 (2006)）。これは、所定の位置における見込みのある置換のすべてがスクリーニング／選択されることを保証する、実証されている方法論である。
【０１８９】
上述の突然変異生成法は、単独にか、または組合せにおいて使用され得る。さらに、定方向進化法のいずれか１つまたは組合せは、適合性の進化技術と共に使用され得る。
【０１９０】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養する工程を包含しているｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成方法であって、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しており、上記ｎ−プロパノール経路は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成方法を提供する。
【０１９１】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記方法は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているアセチル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、上記アセチル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、または蟻酸脱水素酵素を含んでいる。
【０１９２】
さらなる実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、またはメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを含んでいる。さらなる局面において、上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素を含んでいる。
【０１９３】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、スレオニン脱アミノ酵素、または２−オキソブタン酸脱水素酵素を含んでいる。さらなる局面において、上記ｎ−プロパノール経路は、２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼを含んでいる。
【０１９４】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素またはプロピオニル−ＣｏＡシンターゼを含んでいる。
【０１９５】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、上記プロピオニル−ＣｏＡ経路は、乳酸脱水素酵素、乳酸−ＣｏＡ転移酵素、ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素、またはアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素を含んでいる。
【０１９６】
さらなる他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養する工程を包含しているｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成方法であって、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を有しており、外来性の核酸の上記第１の組は、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；またはプロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；またはプロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素、プロパノール脱水素酵素、ならびにプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素またはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；またはプロピオン酸還元酵素、プロパノール脱水素酵素、ならびにプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素またはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を有しており、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびにイソプロパノール脱水素酵素をコードしている、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成方法を提供する。
【０１９７】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記方法は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているアセチル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、外来性の核酸の上記第３の組は、ピルビン酸キナーゼ；ならびに（１）ピルビン酸脱水素酵素、もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；または（２）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素をコードしている。
【０１９８】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；リンゴ酸脱水素酵素；フマラーゼ；フマル酸還元酵素；スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、またはピルビン酸カルボキシラーゼをさらにコードしている。
【０１９９】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；スレオニン脱アミノ酵素；ならびに２−オキソブタン酸脱水素酵素をコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼをさらにコードしている。さらなる他の局面において、外来性の核酸の上記第２の組は、２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼをさらにコードしている。
【０２００】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、プロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでおり、外来性の核酸の上記第３の組は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；マロニル−ＣｏＡ還元酵素；マロン酸セミアルデヒド還元酵素；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼをコードしている。
【０２０１】
さらなる他の実施形態において、上記方法は、乳酸脱水素酵素；乳酸−ＣｏＡ転移酵素；ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；およびアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を有しているプロピオニル−ＣｏＡ経路を有している微生物を含んでいる。
【０２０２】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養する工程を包含しているｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成方法であって、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素およびリン酸プロピオニル還元酵素；（ｃ）プロピオン酸キナーゼ、リン酸プロピオニル還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；または（ｄ）プロピオン酸還元酵素、プロパノール脱水素酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、（ｅ）ピルビン酸キナーゼ；（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｇ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｈ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｉ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｊ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの生成方法を提供する。
【０２０３】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているｎ−プロパノールとイソプロパノールを生成させるための方法を提供し、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｃ）：（ａ）ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼ；（ｂ）スレオニン脱アミノ酵素；ならびに（ｃ）以下の（ｃ１）〜（ｃ５）のいずれか：（ｃ１）２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼおよびプロパノール脱水素酵素；（ｃ２）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ３）２−オキソブタン酸脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ４）２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｃ５）２−オキソブタン酸脱水素酵素；プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、（ｄ）ピルビン酸キナーゼ；（ｅ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；または、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｆ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｇ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｈ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｉ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の第２の組は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をコードしている。
【０２０４】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているｎ−プロパノールとイソプロパノールを生成させるための方法を提供し、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｇ）：（ａ）ピルビン酸キナーゼ；（ｂ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｃ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；（ｄ）マロニル−ＣｏＡ還元酵素；（ｅ）マロン酸セミアルデヒド還元酵素；（ｆ）プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；ならびに（ｇ）以下の（ｇ１）〜（ｇ４）のいずれか：（ｇ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｇ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｇ３）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｇ４）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２０５】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているｎ−プロパノールとイソプロパノールを生成させるための方法を提供し、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、以下の（ａ）〜（ｅ）：（ａ）乳酸脱水素酵素；（ｂ）乳酸−ＣｏＡ転移酵素；（ｃ）ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素；（ｄ）アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素；ならびに（ｅ）以下の（ｅ１）〜（ｅ４）のいずれか：  （ｅ１）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｅ２）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｅ３）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；（ｅ４）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素；またはピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素；（ｇ）アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；（ｈ）アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；（ｉ）アセト酢酸デカルボキシラーゼ；ならびに（ｊ）イソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２０６】
一実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているｎ−プロパノールを生成させるための方法を提供し、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現される１つのｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記ｎ−プロパノール経路は、プロパノール脱水素酵素、プロピオンアルデヒド脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオン酸キナーゼ、プロピオン酸還元酵素、またはリン酸プロピオニル還元酵素を含んでいる。
【０２０７】
他の実施形態において、本発明は、ｎ−プロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているｎ−プロパノールを生成させるための方法を提供し、上記ｎ−プロパノール経路は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている１組の外来性の核酸を備え、上記１組の外来性の核酸は、（ａ）プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｂ）プロピオニル−ＣｏＡ：リン酸プロパノイル転移酵素、リン酸プロピオニル還元酵素およびプロパノール脱水素酵素；（ｃ）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸キナーゼ；リン酸プロピオニル還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素；または（ｄ）プロピオニル−ＣｏＡ水素化酵素、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素；プロピオン酸還元酵素；およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２０８】
上述の実施形態のさらなる局面において、プロパノールを生成させる方法は、ｎ−プロパノール経路を含み、ここで例示されるようなプロピオニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるプロピオニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸を含んでいるプロピオニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでいる、天然に存在しない微生物を培養することを包含している。例えば、いくつかの局面では、外来性の核酸は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、もしくはメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードしている。他の局面において、その外来性の核酸はさらにメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードしている。それに加えて、上述の実施形態のさらなる他の局面において、プロパノールを生成させる方法は、ｎ−プロパノールを生成させるための十分な量において発現されるｎ−プロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでいるｎ−プロパノール経路を有している天然に存在しない微生物を培養することを含んでおり、このとき、外来性の核酸の第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ；リンゴ酸脱水素酵素；フマラーゼ；フマル酸還元酵素；スクシニル−ＣｏＡ転移酵素もしくはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２０９】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させるための方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記１４−ＢＤＯ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【０２１０】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させるための方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記１４−ＢＤＯ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシ酪酸還元酵素、または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼまたはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【０２１１】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路およびイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させるための方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記ＭＡＡ経路は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素、メチルマロン酸還元酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）または３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素、を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでおり、上記イソプロパノール経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、またはイソプロパノール脱水素酵素を含んでいる。
【０２１２】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物はアセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるアセチル−ＣｏＡ経路を有し、そのアセチル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、または蟻酸脱水素酵素を含んでいる。
【０２１３】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物はスクシニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるスクシニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１つの外来性の核酸を含んでいるスクシニル−ＣｏＡ経路を有し、上記スクシニル−ＣｏＡ経路は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、またはスクシニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでいる。さらなる局面において、スクシニル−ＣｏＡ経路は、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素を含んでいる。
【０２１４】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２１５】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２１６】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２１７】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２１８】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２１９】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２０】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２１】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２２】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２３】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素；および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２４】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２５】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２６】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２７】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２８】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２２９】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３０】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３１】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３２】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３３】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３４】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３５】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；３−ヒドロキシ酪酸還元酵素；および３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３６】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３７】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；クロトナーゼ；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３８】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２３９】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４０】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４１】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４２】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４３】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４４】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素もしくは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４５】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、コハク酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素；３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素；およびメタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４６】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４７】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素；メチルマロン酸還元酵素；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４８】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくはメチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素；メチルマロン酸還元酵素；３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２４９】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素；メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）；および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸デカルボキシラーゼ；およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２５０】
上述の実施形態のさらなる局面において、上記微生物は、アセチル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるアセチル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるアセチル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、外来性の核酸の上記第３の組は、（ａ）ピルビン酸キナーゼ；ならびに（ｂ１）ピルビン酸脱水素酵素もしくはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、または（ｂ２）ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素および蟻酸脱水素酵素をコードしている。
【０２５１】
さらなる他の実施形態において、上記微生物は、スクシニル−ＣｏＡを生成させるための十分な量において発現されるスクシニル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第３の組を含んでいるスクシニル−ＣｏＡ経路をさらに含んでおり、外来性の核酸の上記第３の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素をコードしている。さらなる局面において、外来性の核酸の上記第３の組は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素をさらにコードしている。
【０２５２】
一実施形態において、本発明は、１４−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１４−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１４−ＢＤＯ経路は、１４−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１４−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸還元酵素；４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、および４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２５３】
一実施形態において、本発明は、１３−ＢＤＯ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含している１３−ＢＤＯとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記１３−ＢＤＯ経路は、１３−ＢＤＯを生成させるための十分な量において発現される１３−ＢＤＯ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシ酪酸還元酵素、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２５４】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素、コハク酸還元酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、４−ヒドロキシブチリルリン酸転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転位酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水素化酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ水素化酵素、および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２５５】
一実施形態において、本発明は、ＭＡＡ経路とイソプロパノール経路を有している微生物を包含している天然に存在しない微生物を培養することを包含しているＭＡＡとイソプロパノールを生成させる方法を提供し、上記ＭＡＡ経路は、ＭＡＡを生成させるための十分な量において発現されるＭＡＡ経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第１の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第１の組は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ水素化酵素、メチルマロン酸還元酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）、および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素をコードしており、上記イソプロパノール経路は、イソプロパノールを生成させるための十分な量において発現されるイソプロパノール経路の酵素をコードしている外来性の核酸の第２の組を含んでおり、外来性の核酸の上記第２の組は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素、ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化させる酵素、蟻酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡアセチルチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ水素化酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、およびイソプロパノール脱水素酵素をコードしている。
【０２５６】
上述の実施形態のそれぞれのさらなる局面において、上記外来性の核酸は異種の核酸である。
【０２５７】
上述の実施形態のそれぞれのさらなる局面において、上記条件は実質的に嫌気性の培養条件を包含している。
【０２５８】
ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成を試験するための好適な精製および／または分析は、公知の方法を用いて行われ得る。好適な同型物（例えば３組の培養）は、それぞれの検証されるべき改変されている株のために増殖され得る。例えば、改変されている生成宿主における生成物および副生成物の形成が監視され得る。最終生成物および中間生成物、ならびに他の有機化合物は、または当該分野に公知の定法にしたがう手法を用いた方法（例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）、およびＬＣ-ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）、または好適な他の分析方法）によって分析され得る。また、発酵ブロスにおける生成物の放出は、培養の上清を用いて試験され得る。副生成物、および残余のグルコースは、例えばグルコースおよびアルコールのための屈折率検出器、および有機酸のためのＵＶ吸光検出器（Lin et al.,Biotechnol. Bioeng. 90：775−779(2005)）、または当該分野に公知の好適な他の分析および検出の方法を用いた、ＨＰＬＣによって定量化され得る。また、外来性のＤＮＡ配列に由来する個々の酵素またはタンパク質の活性は、当該分野に公知の方法を用いて分析され得る。種々のアルコールは、Atsumi et al. Metab Eng (2007)およびHanai et al. Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)に記載のような水素炎イオン化検出器を用いたガスクロマトグラフィーによって定量化され得る。
【０２５９】
ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡは、当該分野に公知の種々の方法を用いて、培養液における他の成分から分離され得る。そのような分離方法としては、抽出手法および抽出方法（例えば、連続的な液体−液体抽出、浸透気化法、膜ろ過法、膜分離法、逆浸透法、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよび限外ろ過が挙げられる）が挙げられる。上述の方法のすべては当該分野において公知である。
【０２６０】
本明細書に記載の天然に存在しない微生物のいずれかは、培養されて、本発明の生合成の産物を生成し得るか、および／または分泌し得る。例えば、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成体は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成のために培養され得る。
【０２６１】
ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成のために、組換え株は、炭素源および他の必須栄養素を有している培地において培養される。全過程のコストを低下させるために、発酵槽において嫌気性の条件を維持させることが非常に望ましい。当該条件は、例えば、窒素を有している培地をまず噴霧すること、それから隔壁および圧着蓋を用いてフラスコを密閉することによって実現され得る。嫌気的な成長が観察されない株のために、微好気性の条件は、部分的な曝気のための小さな穴を隔壁に開けることによって適用され得る。例示的な嫌気性の条件は、これまでに説明されており、当該分野において公知である。例示的な好気性および嫌気性の条件は、例えば米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号（２００７年８月１０日出願）に記載されている。発酵は、本明細書に開示されているように、バッチ方式、流加方式、または連続方式において実施され得る。
【０２６２】
培地のｐＨは、培養培地を所望のｐＨに維持する必要性にしたがって、塩基（例えばＮａＯＨ）もしくは他の塩基、または酸の添加によって、所望のｐＨ（特に中性のｐＨ（例えば約７のｐＨ））に必要に応じて維持され得る。成長速度は、分光光度計を用いた吸光度（６００ｎｍ）、および長期にわたる炭素源の消耗の監視によるグルコース取込み速度の測定によって決定され得る。
【０２６３】
成長培地は、例えば、天然に存在しない微生物に炭素の原料を供給し得る任意の炭化水素源を含み得る。当該炭化水素源としては、例えば糖（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプン）が挙げられる。他の炭化水素源としては、例えば、再生可能な供給原料およびバイオマスが挙げられる。本発明の方法において、供給原料として使用され得る例示的な種類のバイオマスは、セルロースのバイオマス、ヘミセルロースのバイオマス、およびリグニン供給原料もしくは供給原料の一部が挙げられる。そのようなバイオマス供給原料は、炭素源として有用な炭化水素の基材（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンが挙げられる）を含んでいる。また、本明細書における記載および示唆を考慮すれば、当業者は、以上の例示以外の再生可能な供給原料およびバイオマスが、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成のための、本発明の微生物の培養に用いられ得ることを理解する。
【０２６４】
また、以上に例示した再生可能な供給原料に加えて、本発明のｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの微生物、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノールの微生物、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノールの微生物またはＭＡＡおよびイソプロパノールの微生物は、その炭素源としての合成ガスに基づく成長のために改変され得る。この特定の実施形態において、１つ以上のタンパク質または酵素は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成する生物において発現されて、合成ガスまたは気体の他の炭素源の利用にとっての代謝経路をもたらす。
【０２６５】
合成ガス（synthetic gas）（合成ガス（syngas）または発生炉ガスとしても知られている）は、石炭および炭質（例えばバイオマス物質（農作物および農業の残余物が挙げられる））のガス化の主な生成物である。合成ガスは、主にＨ２およびＣＯの混合物であり、任意の有機物の供給原料（石炭、コールオイル、天然ガス、バイオマスおよび有機廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない）のガス化に基づいて入手され得る。ガス化は、酸素比に対する高燃料の条件において一般的に実施される。Ｈ２およびＣＯが大部分であるが、合成ガスはまた、より少量のＣＯ２および他の気体を含み得る。このようにして、合成ガスは、費用効果の高いガス状の炭素源（例えば、ＣＯに加えてＣＯ２）を提供する。
【０２６６】
Wood-Ljungdahl経路は、アセチル−ＣｏＡおよびその他の生成物（例えば酢酸塩）へのＣＯおよびＨ２の変換を触媒する。また、ＣＯおよび合成ガスを利用可能な生物は、Wood-Ljungdahl経路に包含されている酵素および変換の基本的な同じ組を介して、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２の混合物の利用能を有している。微生物によるＨ２依存的な酢酸塩へのＣＯ２の変換は、ＣＯがまた同じ生物によって使用され得ることおよび同じ経路が関与することが明らかになるよりはるか以前に認識されていた。多くのアセトゲン（acetogen）は、必要な還元当量を供給するための水素が存在する限り、ＣＯ２の存在下において成長し、化合物（例えば酢酸塩）を生成することが示されている（例えばDrake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)を参照すればよい）。これは、以下の反応式：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
に要約され得る。
【０２６７】
したがって、Wood-Ljungdahl経路を有している天然に存在しない微生物は、アセチル−ＣｏＡおよび他の所望の生成物の生成のために、ＣＯ２およびＨ２の混合物を首尾よく利用し得る。
【０２６８】
Wood-Ljungdahl経路は、当該分野において公知であり、２つの分岐：（１）メチル分枝、および（２）カルボニル分枝に分離され得る１２の反応からなる。メチル分枝は合成ガスをメチルテトラヒドロ葉酸（メチル−ＴＨＦ）に変換し、カルボニル分枝はメチル−ＴＨＦをアセチル−ＣｏＡに変換する。メチル分枝における反応は、以下の酵素またはタンパク質：フェレドキシン酸化還元酵素、蟻酸脱水素酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロ脱水酵素、メチレンテトラヒドロ葉酸脱水素酵素およびメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素によって順に触媒される。カルボニル分枝における反応は、以下の酵素またはタンパク質：メチルテトラヒドロ葉酸： コリノイドタンパク質メチル転移酵素（例えば、ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質集合タンパク質（例えば、ＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチル−ＣｏＡ合成酵素、一酸化炭素脱水素酵素およびニッケル−タンパク質集合タンパク質（例えば、ＣｏｏＣ）によって順に触媒される。また、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ経路を生成させるための十分な数の翻訳領域の核酸を導入するための本明細書の記載および示唆にしたがって、当業者は、同じ改変の設計が、宿主生物に存在しないWood-Ljungdahlの酵素またはタンパク質をコードしている核酸を少なくとも導入することに関して実施され得ることを理解する。したがって、改変された微生物が完全なWood-Ljungdahl経路を含ませる本発明の微生物への翻訳領域の核酸の１つ以上の導入は、合成ガスの利用能をもたらす。
【０２６９】
またさらに、還元的な（逆の）トリカルボン酸回路および／またはヒドロゲナーゼ活性は、アセチル−ＣｏＡおよび他の生成物（例えば酢酸塩）への、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２の変換のために使用され得る。還元的なＴＣＡ経路を介した炭素の固定能を有している生物は、以下の酵素：ＡＴＰクエン酸脱離酵素、クエン酸脱離酵素、アコニターゼ、イソクエン酸脱水素酵素、アルファケトグルタル酸：フェレドキシン酸化還元酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素、フマル酸還元酵素、フマラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシン酸化還元酵素、一酸化炭素脱水素酵素、およびヒドロゲナーゼの１つ以上を利用し得る。特に、一酸化炭素脱水素酵素およびヒドロゲナーゼによって、ＣＯおよび／またはＨ２から取出された還元当量は、還元的なＴＣＡ経路を介して、アセチル−ＣｏＡまたは酢酸塩にＣＯ２を戻すことに利用される。酢酸塩は、アセチル−ＣｏＡ転移酵素、酢酸キナーゼ／ホスホトランスアセチラーゼおよびアセチル−ＣｏＡ合成酵素のような酵素によって、アセチル−ＣｏＡに変換され得る。アセチル−ＣｏＡは、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素および糖新生の酵素によって、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ前駆体、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ホスホエノ−ルピルビン酸およびピルビン酸に変換され得る。ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ経路を生成するための十分な数の翻訳領域の核酸を導入するための本明細書における記載および示唆にしたがって、当業者は、同じ改変の設計が、宿主生物に存在しない還元的なＴＣＡ経路の酵素またはタンパク質をコードしている核酸を少なくとも導入することに関して実施され得ることを理解する。したがって、改変された微生物が完全なＴＣＡ経路を含ませる本発明の微生物への翻訳領域の核酸の１つ以上の導入は、合成ガスの利用能をもたらす。
【０２７０】
したがって、本明細書における記載および示唆を考慮すれば、当業者は、炭素源（例えば炭化水素）に基づいて成長されているときに生合成された本発明の化合物を分泌する天然に存在しない微生物が作製され得ることを理解する。当該化合物としては、例えば、ｎ−プロパノール経路、イソプロパノール経路、１４−ＢＤＯ経路、１３−ＢＤＯ経路および／またはＭＡＡ経路におけるｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡ、ならびに任意の中間代謝物が挙げられる。求められているすべては、例えば、必要な酵素またはタンパク質の活性の１つ以上を改変して、所望の化合物または中間体（ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成経路のいくつかまたはすべての構成物が挙げられる）の生合成を実現させることである。したがって、本発明は、炭化水素または他の炭素源に基づいて成長されるとき、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成するか、および／または分泌し、炭化水素または他の炭素源に基づいて成長されるときｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの経路に認められる中間代謝物を生成するか、および／または分泌する、天然に存在しない微生物を提供する。ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールを生成する本発明の微生物は、中間体（例えばスクシニル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡおよび／またはアセチル−ＣｏＡ）から合成を開始し得る。
【０２７１】
天然に存在しない本発明の微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの経路の酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸を、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成させるための十分な量において外因的に発現させるために、本明細書に例示されるような当該分野に公知の方法を用いて構築される。本発明の微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成させるための十分な条件において培養されることが理解される。本明細書における記載および示唆を考慮すれば、天然に存在しない本発明の微生物は、約０．１〜２００ｍＭ以上の細胞内濃度を生じるｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生合成を実現し得る。一般的に、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの細胞内濃度は、約３〜１５０ｍＭの間、特に約５〜１２５ｍＭの間、より詳細には約８〜１００ｍＭの間（約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭまたはそれ以上）である。また、これらの例示的な範囲のそれぞれの間にある細胞内濃度および当該範囲を超える細胞内濃度は、天然に存在しない本発明の微生物に基づいて実現され得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、培養条件としては、嫌気性のまたは実質的に嫌気性の成長条件または維持条件が挙げられる。例示的な嫌気性の条件は、これまでに説明されており、当技術分野において公知である。発酵過程にとっての嫌気性の条件は、本明細書に記載されており、例えば、米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号（２００７年８月１０日出願）に記載されている。これらの任意の条件は、当該分野に公知の他の嫌気性の条件と同様に、天然に存在しない微生物に適用され得る。そのような嫌気性の条件において、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成体は、本明細書に例示されているすべての他の濃度と同様に、５〜１０ｍＭ以上の細胞内濃度において、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを合成し得る。上述の説明が細胞内濃度を指すとしても、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを生成する微生物は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡを細胞内に生成し得るか、および／または生成物を培養培地に分泌し得ることが理解される。
【０２７３】
培養条件としては、例えば、液体培養、ならびに発酵および他の大規模培養の条件が挙げられる。本明細書に記載の通り、本発明の生合成の生成物の特に有用な産物は、嫌気性または実質的に嫌気性の培養条件において入手され得る。
【０２７４】
本明細書に記載の通り、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノールまたはＭＡＡおよびイソプロパノールの生合成を実現させる例示的な１つの成長条件としては、嫌気性の培養条件または発酵条件が挙げられる。特定の実施形態において、天然に存在しない本発明の微生物は、嫌気性または実質的に嫌気性の条件において、維持されるか、培養されるか、または発酵され得る。簡単に説明すると、嫌気性の条件は酸素を欠いている環境を指す。実質的に嫌気性の条件としては、例えば、培地における溶存酸素濃度が飽和状態の０〜１０％を維持しているような、培養、バッチ発酵または連続発酵が挙げられる。また、実質的に嫌気性の条件は、１％未満の酸素の雰囲気を有して維持されている密封された容器内にある液体培地または固体の寒天上において、成長しているか、または休止している細胞を包含している。酸素の割合は、例えばＮ２／ＣＯ２混合物または他の好適な非酸素の（複数の）気体を培養物に噴霧することによって、維持され得る。
【０２７５】
本明細書に記載の培養条件は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノールまたはＭＡＡおよびイソプロパノールの生成のために、大規模化され得、連続的に増大させられ得る。例示的な成長の手法としては、例えば、流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が挙げられる。これらの過程のすべては、当該分野において公知である。発酵の手順は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの工業的な生合成のために特に有用である。一般的かつ非連続的な培養手順と同様に、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの連続的および／または実質的に連続的な生成は、対数増殖期における成長を維持させるか、および／またはほぼ維持するための十分な栄養素および培地において、天然には生じないｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノールまたはＭＡＡおよびイソプロパノールを生成する本発明の生物を培養することを包含している。そのような条件における連続的な培養（例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日またはそれ以上にわたる成長）が包含され得る。さらに、連続的な培養は、１、２、３、４もしくは５週またはそれ以上、および数ヶ月のより長い期間を包含し得る。代替的に、特定の用途に好適な場合に、本発明の生物は数時間にわたって培養され得る。また、連続的および／または実質的に連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間におけるすべての時間の間隔を包含し得ることが理解されるべきである。さらに、本発明の微生物を培養する時間は、所望の目的にとって十分な量の生成物を生成させるための十分な期間であることが理解される。
【０２７６】
発酵の手法は当該分野において公知である。簡単に説明すると、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの生合成のための発酵は、例えば、流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離において利用され得る。バッチ発酵および連続発酵の手法の例は当該分野において公知である。
【０２７７】
ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの連続的な大量生成のために、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの本発明の生成体を用いる発酵の手順に加えて、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡの生成体は生成物を他の化合物に変換するための化学合成の手順に供され得るか、または当該生成物は、発酵培養物から分離され得、必要に応じて当該生成物を他の化合物に変換する化学変換に続いて供され得る。
【０２７８】
本明細書に記載の培養および発酵の条件に加えて、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、１４−ＢＤＯおよびイソプロパノール、１３−ＢＤＯおよびイソプロパノール、またはＭＡＡおよびイソプロパノールの生合成を実現させる成長条件は、培養条件に対する浸透圧保護剤の追加を包含し得る。特定の実施形態において、天然に存在しない本発明の微生物は、浸透圧保護剤の存在下において、本明細書に記載のように維持され得るか、培養され得るか、または発酵され得る。簡単に説明すると、浸透圧保護剤は、浸透圧調節物質として作用し、浸透圧ストレスにおける本明細書に記載の微生物の生存を補助する化合物を意味する。浸透圧保護剤としては、ベタイン、アミノ酸、そして糖トレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な浸透圧保護剤の例としては、グリシンベタイン、プラリネベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロピオナート、３−ジメチルスルホニオ−２−メチルプロピオナート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオ酢酸、コリン、Ｌ−カルニチンおよびエクトインが挙げられる。１つの局面において、浸透圧保護剤はグリシンベタインである。浸透圧ストレスから本明細書に記載の微生物を保護するために好適な浸透圧保護剤の量および種類が使用される微生物に依存することを当業者は理解する０。培養条件における浸透圧保護剤の量は、例えば約０．１ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満、約１．０ｍＭ未満、約１．５ｍＭ未満、約２．０ｍＭ未満、約２．５ｍＭ未満、約３．０ｍＭ未満、約５．０ｍＭ未満、約７．０ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、約１００ｍＭ未満、または約５００ｍＭ未満である。
【０２７９】
より良好な生成体を作製するために、代謝モデリングは成長条件を最適化するために利用され得る。また、モデリングは、経路の利用をさらに最適化する遺伝子のノックアウトを設計するために使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号、米国特許出願公開第２００３／０２２４３６３号、米国特許出願公開第２００４／００２９１４９号、米国特許出願公開第２００４／００７２７２３号、米国特許出願公開第２００３／００５９７９２号、米国特許出願公開第２００２／０１６８６５４号、米国特許出願公開第２００４／０００９４６６号、および米国特許第７，１２７，３７９号を参照すればよい）。モデリング解析は、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、１４−ＢＤＯ、１３−ＢＤＯおよび／またはＭＡＡのより効率的な生成へと代謝を変更させることの、細胞の成長に対する影響の信頼性の高い予測を可能にする。
【０２８０】
所望の生成物の生合成を支持する代謝の変更を特定し、設計するコンピュータを利用した方法の１つは、OptKnockのコンピュータを利用した構成である（Burgard et al.、Biotechnol. Bioeng. 84：647−657 （2003））。OptKnockは、標的の生成物を過剰に生成させる遺伝的に安定な微生物をもたらす遺伝子の欠失または破壊の方法を示す、代謝のモデリングおよびシミュレーションのプログラムである。特に、当該構成は、所望の生化学物質を細胞成長の不可避な副産物に強制的にさせる強化する遺伝子操作を示すために、微生物の完全な代謝のネットワークおよび／または生化学的なネットワークを調査する。戦略的に配置された遺伝子の欠失または他の機能性の遺伝子の破壊を通じて、生化学的な生成物を細胞成長に結びつけることによって、バイオリアクターにおいて長時間が経過した後の改変株に対して加えられている成長の選択圧は、強制的な成長と結びつけられている生化学的な生成物の結果として性能の改善を導く。最後に、遺伝子の欠失が構築されている場合に、OptKnockによって選択された遺伝子がゲノムから完全に除去されているので、それらの野生型の状態への復帰の可能性を無視し得る。したがってこのコンピュータの方法論は、所望の生成物の生合成へと導く代替的な経路を特定するか、または所望の生成物の生合成のさらなる最適化のために、天然に存在しない微生物に対して使用され得る。
【０２８１】
簡単に説明すると、OptKnockは、細胞の代謝をモデリングするためのコンピュータの方法およびシステムを指して本明細書に使用される用語である。OptKnockプログラムは、特定の制約をＦＢＡ（流束均衡解析）モデルに組み込む、モデルおよび方法の構成に関する。これらの制約としては、例えば、質的動的情報、質的調整情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイの実験データが挙げられる。また、OptKnockは、例えば流束均衡モデルを介して得られる流束の境界を狭めること、それから遺伝子の付加または欠失の存在下における代謝ネットワークの性能の限界を確認することによって、代謝の種々の問題に対する解決法を計算する。OptKnockのコンピュータを利用した構成は、代謝ネットワークの性能の限界を効率的に照会可能なモデルの定式化の構築を可能にし、生じた複合性の整数の線形性プログラミングの問題を解決する方法をもたらす。本明細書においてOptKnockとして言及されている代謝のモデリング方法およびシミュレーション方法は、例えば米国特許出願公開第２００２／０１６８６５４号（２００２年２月１０日出願）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２/００６６０号（２００２年２月１０日出願）、および米国特許出願公開第号（２００７年８月１０日出願）に記載されている。
【０２８２】
生成物の生合成的な生成に好適な代謝の変更を特定し、設計するためのコンピュータを利用した方法は、SimPheny（登録商標）と呼ばれる代謝のモデリングおよびシミュレーションのシステムである。コンピュータを利用したこの方法およびシステムは、例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３３２１８号（２００２年６月１４日出願）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８号（２００３年６月１３日出願）に説明されている。SimPhenyは、ネットワークモデルをコンピュータ上で生成するために使用され、解空間を定義するために、生物学的システムの化学反応を通して、質量の流束、エネルギー、または電荷をシミュレートするために使用され得、当該解空間はシステムにおける化学反応の、可能性を有しているすべての機能性を含み、それによってその生物学的システムにおいて可能な活動の範囲を決定する、コンピュータのシステムである。このアプローチは、反応による最大流束に関連した熱力学の反応および許容量の制約と同様に、解空間が、含まれる反応の既知の化学量論のような制約によって定義されるため、制約ベースのモデリングとして参照される。これらの制約によって定義された空間は、表現型の能力および生物学的システムまたは生化学的な要素の挙動を決定するために、応答させられ得る。
【０２８３】
生物のシステムは可動性があり、多くの異なる方法において同じ結果に達し得るため、これらのコンピュータによるアプローチは、生物学的な現実と一致する。すべての生物系が直面しなければならない根本的な制約により制限されてきた進化のメカニズムを通じて、生物学的なシステムは設計される。したがって制約ベースのモデリング戦略はこれらの一般的な現実を包含している。さらに、制約を厳しくすることを介してネットワークモデル上に更なる制限を連続的に課す能力は、解空間のサイズの減少という結果になり、それによって物理的な性能または表現型が予測され得る正確さを増大する。
【０２８４】
本明細書における記載および示唆を考慮すれば、当業者は、種々のコンピュータのフレームワークを、代謝のモデリングおよびシミュレーションのために宿主の微生物における所望の化合物の生合成の設計および実施に適用し得るであろう。当該代謝のモデリングおよびシミュレーション方法としては、例えば、SimPheny（登録商標）およびOptKnockとして上記に例示されているコンピュータのシステムが挙げられる。本発明の図解のために、いくつかの方法が、モデリングおよびシミュレーションのためのOptKnockコンピューテーションフレームワークを参照して本明細書に記載の。当業者は、OptKnockを用いた代謝の変化の同定、設計および実施を、任意のそのような他の代謝のモデリングおよびシミュレーションコンピューテーショナルフレームワークおよび当該分野において公知の方法に適用する方法を知るであろう。
【０２８５】
以上に記載されている方法は、代謝反応の１つの集合の破壊を提供する。集合におけるそれぞれの反応の排除、または代謝の改変は、当該生物の成長期の間における強制的な生成物として、結果として所望の生成物になり得る。また、当該反応は公知であるため、２階構造のOptKnockの問題の解は、反応の集合の中で、関連した遺伝子およびそれぞれの反応を触媒する１つ以上の酵素をコードしている遺伝子を提供する。反応の集合およびそれぞれの反応に関与する酵素をコードしている、当該反応に対応する遺伝子の集合の同定は、一般的に、酵素およびコードしている遺伝子の間の関係を有している反応のデータベースを用いて、反応の相関関係を通じて達成される、自動化された処理である。
【０２８６】
一度特定されると、所望の生成物の生成を達成するために破壊されるその反応の集合は、対象の細胞または生物において、集合内のそれぞれの代謝反応をコードしている少なくとも１つの遺伝子の機能的な破壊によって実施される。当該反応の集合の機能の破壊を達成するための、１つの特に有効な手段は、それぞれのコードしている遺伝子の欠失による。しかしながら、ある場合では、他の遺伝的な異常（例えば突然変異、プロモーターのような調節領域や調節因子のためのシス結合部位の欠失が挙げられる）、または任意の多くの部位をコードしている配列の切断によって、反応を破壊することは有益となり得る。遺伝子の集合のすべての欠失よりも少なくなる後者の異常は、例えば、生成物の共役の迅速な評価が望まれている場合または遺伝的な回復が生じそうにない場合において、有効になり得る。
【０２８７】
破壊するさらなる反応の集合または、所望の生成物の成長に結びついている生合成を含んでいる生合成となる代謝の改変を導く、以上に記載されている二階構造のOptKnock問題に対するさらなる生成の解を同定するために、整数カットと称される最適化方法が実施され得る。この方法は、それぞれの繰り返しにおいて、整数カットと称される付加的な制約の導入を用いて上記で例示されているOptKnock問題を反復して解くことにより進行する。整数カットの制約は、解の手順を、強制的に生成物の生合成を成長に結びつける任意の以前の反復において同定される、まさに同じ反応の集合を選ぶことから効率的に防ぐ。例えば、以前に同定された成長に結びついている代謝の改変が、破壊される反応の１、２および３を特定する場合、次に続く制約が同じ反応を次の解において同時に考慮されることから防ぐ。整数カットの方法は当該分野によく知られており、例えば、Burgard et al.、Biotechnol. Prog. 17：791−797 （2001）において説明されていることが見出される。
【０２８８】
代謝のモデリングおよびシミュレーションのためのOptKnockコンピューテーショナルフレームワークを用いた組み合わせにおけるそれらの使用に対する参照を本明細書に記載のすべての方法と同様に、繰り返し計算解析における冗長性を減少させる整数カット方法はまた、例えばSimPheny（登録商標）などの当該分野において公知の他の計算フレームワークに適用される。
【０２８９】
本明細書に例示されている方法は、所望の生成物を生合成的に生成する細胞および生物の構築（改変されて特定された遺伝学上の変更を有している細胞または生物の成長に対して、標的の生合成的な生成物の生成を強制的に結びつけることが挙げられる）を可能にする。したがって、本明細書に記載の計算方法は、OptKnockまたはSimPheny（登録商標）から選ばれたコンピュータ上の方法で特定された代謝の改変の同定およびと実施を可能にする。その代謝の改変の集合としては、例えば、１つ以上の生合成経路の酵素および／または例えば遺伝子欠失による破壊を含んでいる１つ以上の代謝反応の機能の破壊の付加が挙げられ得る。
【０２９０】
上述のように、OptKnock方法論は、長期の成長選択に従うとき、突然変異の微生物のネットワークがそれらの計算的に予測された最大の成長の表現型へと進化し得るという前提の上で開発された。言い換えれば、そのアプローチは選択圧の下で自己最適化する生物の能力を活用する。OptKnockフレームワークは、ネットワークの化学量論に基づく生化学的な生成物と、細胞の成長の間の結びつきを強制する遺伝子の欠失の組み合わせの網羅的な列挙を可能にする。最適な遺伝子／反応のノックアウトの同定は、結果となるネットワークのための最適な成長の解が、対象の生化学物質を過剰生成するような、活性状態の反応の集合を選択する二階構造の最適化問題の解を必要とする（Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)）。
【０２９１】
コンピュータ上のE. coliの代謝の化学量論的なモデルは、以前に例示され、例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号、米国特許出願公開第２００３／０２２４３６３号、米国特許出願公開第２００４／００２９１４９号、米国特許出願公開第２００４／００７２７２３号、米国特許出願公開第２００３／００５９７９２号、米国特許出願公開第２００２／０１６８６５４号、米国特許出願公開第２００４／０００９４６６号、および米国特許第７，１２７，３７９号に説明されているように、代謝経路のための必須の遺伝子の同定に採用され得る。本明細書に開示されているように、OptKnockの数学的なフレームワークは、所望の生成物の成長に結びついている生成を導く、正確な位置の遺伝子の欠失に適用され得る。さらに、二階構造のOptKnock問題の解は、欠失の１つの集合のみを提供する。すべての有意な解、または成長に結びついている生成の形成を導くノックアウトのすべての集合を列挙するために、整数カットと称される最適化技術が実施され得る。これは、上記で議論されているように、それぞれの繰り返しにおいて整数カットと呼ばれる付加的な制約の導入を用いてOptKnock問題を繰り返し解くことを伴う。
【０２９２】
また、本発明の種々の実施形態の作用に実質的に影響を与えない変更は、本明細書に与えられている本発明の定義において提供されるということが理解される。したがって、以下の実施例は本発明を説明するが、これに限定しないことが意図される。
【実施例】
【０２９３】
〔実施例１〕
（グルコースからのｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のための経路）
この実施例では、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成の典型的な経路について説明している。ｎ−プロパノール、イソプロパノールおよび関連する産物の共生成の新規の経路が本明細書に記載されている。本発明は、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成のための選択可能な４つの方法を提供する。E. coliにおけるイソプロパノールの生成は、これまでに説明されている（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)）。簡単に説明すると、アセチル−ＣｏＡは、アセトアセチル−ＣｏＡに変換され、アセト酢酸塩に変化させられ、脱カルボキシル化されてアセトンを形成し、続いて、還元されてイソプロパノールを形成する（図１〜４）。本明細書に記載されている微生物および方法は、ｎ−プロパノールを合成するための４つの新規の経路と、この既知のルートを組み合わせる。この共生成は、上記Hanai et al.によって説明されているような、イソプロパノールがアセトンを経て単独に生成される場合の酸素の必要性と対照的に、Ｃ３アルコール（すなわちｎ−プロパノールおよびイソプロパノール）の生成のための、酸化還元について完全に平衡化された、嫌気性の生成を可能にする経路を提供する。本明細書に記載されている経路のうちのいずれかを用いたｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの共生成の１つの利点は、Ｃ３アルコールの理論上の最大収量が得られることである：
１  グルコース→１．３３  Ｃ３Ｈ８Ｏ＋２  ＣＯ２＋０．６７  Ｈ２Ｏ
さらに、すべてのこれらの経路は、ＡＴＰの正味の正の収量を有している。
【０２９４】
（アセチルＣｏＡを利用したイソプロパノールの生成）
イソプロパノールの生成は、図１〜４に例示されているように、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ；アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素もしくはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素；アセト酢酸塩デカルボキシラーゼ；ならびにイソプロパノール脱水素酵素によるアセチル−ＣｏＡの変換を介して実現される。イソプロパノールの生成は、アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸塩：ＣｏＡ転移酵素活性をコードしている天然のａｔｏＡおよびａｔｏＤ遺伝子（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)）の増強された発現をともなう、C. acetobutylicum由来の２つの異種の遺伝子（それぞれアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードしているｔｈｌおよびａｂｃ）、C. beijerinckii由来の１つの異種の遺伝子（第２級アルコール脱水素酵素をコードしているａｄｈ）の発現にしたがう組換えE.coliについて説明されている（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)）。アセトアセテートへのアセトアセチル−ＣｏＡの変換は、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素またはアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の活性を有している酵素によって選択可能に触媒される。
【０２９５】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡアセチル転移酵素としても知られている）は、２分子のアセチル−ＣｏＡをそれぞれ１分子のアセトアセチル−ＣｏＡおよびＣｏＡに変換する。典型的なアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ酵素としては、E.coli由来のａｔｏＢの遺伝子産物（Martin et al., Nat.Biotechnol 21:796-802 (2003)）、C. acetobutylicum由来のｔｈｌＡおよびｔｈｌＢ（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzer et al., J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000)）、ならびにS.cerevisiae由来のＥＲＧ１０（Hiser et al., J.Biol.Chem. 269:31383-31389 (1994)）が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１に特定されている。
【０２９６】
【表１】
2013504326.tif 000003
【０２９７】
アセトアセチルＣｏＡ転移酵素
アセトアセチル転移酵素は、ＣｏＡアクセプタ分子にＣｏＡ部分を転移させる一方で、アセト酢酸塩へのアセトアセチルＣｏＡの変換を触媒する。多くの転移酵素は、幅広い特異性を有しており、したがって、特に酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、２−メチルアセト酢酸塩、３−ケトヘキサン酸塩、３−ケトペンタン酸塩、吉草酸塩、クロトン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸塩、プロピオン酸塩、酸酸ビニル、酪酸塩の広範なＣｏＡアクセプタを利用し得る。
【０２９８】
アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸塩：ＣｏＡ転移酵素は、アセトアセチルＣｏＡおよび酢酸塩を、アセト酢酸塩およびアセチルＣｏＡに変換させる。典型的な酵素としては、E.coli由来のａｔｏＡＤ遺伝子産物（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)、C. acetobutylicum由来のｃｔｆＡＢ産物（Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)、およびClostridium saccharoperbutylacetonicum由来のｃｔｆＡＢ産物(Kosaka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)）が挙げられ、当該酵素は以下の表２に示されている。また、スクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡ転移酵素（ＳＣＯＴ）は、３−ケト酸、アセト酢酸塩への、３−ケトアシルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡの変換を触媒する。アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸塩：ＣｏＡ転移酵素と対照的に、ＳＣＯＴは、酢酸塩のかわりにコハク酸塩をＣｏＡアクセプタとして使用する。典型的なスクニシル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡ転移酵素は、Helicobacter pylori（Corthesy-Theulaz et al., J Biol Chem 272:25659-25667 (1997)）、Bacillus subtilis（Stols et al., Protein Expr Purif 53:396-403 (2007)）、およびHomo sapiens（Fukao et al., Genomics 68:144-151 (2000)；Tanaka et al., Mol Hum Reprod 8:16-23 (2002)）に存在する。この変換能を有しているさらなる他の転移酵素は、ブチリル−ＣｏＡ：アセト酢酸塩−ＣｏＡ転移酵素である。典型的な酵素は、Fusobacterium nucleatum（Barker et al., J Bacteriol 152(1):201-7 (1982)）、Clostridium SB4（Barker et al., J Biol Chem 253(4):1219-25 (1978)）、およびClostridium acetobutylicum（Wiesenborn et al., Appl Environ Microbiol 55(2):323-9 (1989)）に見出され得る。特定の遺伝子配列は、これらの参考文献ではブチリル−ＣｏＡ：アセト酢酸塩ＣｏＡ転移酵素に与えられていなかったが、ＦＮ０２７２およびＦＮ０２７３の遺伝子は、酪酸塩−アセト酢酸塩ＣｏＡ転移酵素と注釈されている（Kapatral et al., J Bact 184(7) 2005-2018 (2002)）。また、Fusobacterium nucleatumにおける相同物（例えば、ＦＮ１８５７およびＦＮ１８５６）は、所望されるアセトアセチルＣｏＡ転移酵素活性を有していると考えられる。ＦＮ１８５７およびＦＮ１８５６は、リジン発酵に関与する多くの他の遺伝子に隣接して位置しており、したがって、アセト酢酸塩：酪酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードしている可能性が高い（Kreimeyer, et al., J Biol Chem 282 (10) 7191-7197 (2007)）。Porphyrmonas gingivalisおよびThermoanaerobacter tengcongensis由来のさらなる候補物は、類似の方法において同定され得る（Kreimeyer, et al., J Biol Chem 282 (10) 7191-7197 (2007)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２に特定されている。
【０２９９】
【表２】
2013504326.tif 000004
【０３００】
アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素
また、ＣｏＡ合成酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡからのＣｏＡ部分の除去を触媒し得る。酵素の候補物の１つであるＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、アシル−ＣｏＡエステルの、それらの対応する酸への変換、および同時発生のＡＴＰの合成を結びつけている。幅広い基質特異性を有しているいくつかの酵素が文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされているArchaeoglobus fulgidus由来のＡＣＤ  Ｉは、直鎖状および分枝鎖状の種々の基質（アセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、イソ酪酸塩、イソ吉草酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酢酸フェニル、インドール酢酸が挙げられる）
に作用することが示された（Musfeldt et al., J Bacteriol 184:636-644 (2002)）。Haloarcula marismortui由来の酵素（スクシニル−ＣｏＡ合成酵素として注釈されている）は、プロピオン酸塩、酪酸塩、および分枝鎖状の酸（イソ吉草酸塩ならびにイソ酪酸塩）を基質として受容し、順方向ならびに逆方向において作用することが示された（Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287 (2004)）。超好熱性のクレンアーキオータ門の古細菌Pyrobaculum aerophilum由来のＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡ（上記のBrasen et al.）と反応する性質決定されたすべてのＡＣＤのうち、最も幅広い基質の範囲を示した。A. fulgidus、H. marismortuiおよびP. aerophilum由来の酵素のすべては、E.coliにおいてクローン化され、機能的に発現され、性質決定されている（上記のMusfeldt et al.；上記のBrasen et al.）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３に特定されている。
【０３０１】
【表３】
2013504326.tif 000005
【０３０２】
ＣｏＡ合成酵素の他の候補物はスクシニル−ＣｏＡ合成酵素である。E. coliのｓｕｃＣＤ遺伝子はスクシニル−ＣｏＡ合成酵素複合体を形成している。当該複合体は、１つのＡＴＰの同時の消費とともに、コハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成を天然に触媒しており、当該反応は生体内における可逆的な反応である（Buck et al., Biochem. 24:6245-6252 (1985)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４に特定されている。
【０３０３】
【表４】
2013504326.tif 000006
【０３０４】
さらなる典型的なＣｏＡリガーゼとしては、配列が性質決定されていないラットのジカルボン酸塩ＣｏＡリガーゼ（Vamecq et al., Biochemical Journal 230:683-693 (1985)）、P. chrysogenum由来のいずれも性質決定されている２つの酢酸フェニル−ＣｏＡリガーゼ（Lamas-Maceiras et al., Biochem. J. 395:147-155 (2005)；Wang et al.,Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458 (2007)）、Pseudomonas putida由来の酢酸フェニル−ＣｏＡリガーゼ(Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem. 265:7084-7090 (1990)）、およびBacilis subtilis由来の６−カルボキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ（Boweret al., J. Bacteriol. 178(14):4122-4130 (1996)）が挙げられる。酵素のさらなる候補物は、アセトアセチル−ＣｏＡへのアセト酢酸塩の、ＡＴＰ依存性の変換を天然に触媒する、Mus musculus（Hasegawa et al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)）およびHomo sapiens (Ohgami et al., Biochem Pharmacol 65:989-994 (2003)）由来のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素である。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５に特定されている。
【０３０５】
【表５】
2013504326.tif 000007
【０３０６】
アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素
また、アセトアセチル−ＣｏＡはＣｏＡ加水分解酵素によって変換され得る。アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素の候補物としては、アシル−ＣｏＡ加水分解酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセチルＣｏＡ−加水分解酵素、およびジカルボン酸チオエステラーゼが挙げられる。ラットの肝臓のミトコンドリアにおける短鎖のアシル−ＣｏＡ加水分解酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡを基質として受容することが見出された。しかし、この酵素に関連づけられている遺伝子は、これまで同定されていない（Svensson et al. Eur. J. Biochem., 239:526-531 (1996)）。
【０３０７】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素は、バリン分解の間における３−ヒドロキシイソ酪酸塩への３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの変換を効率的に触媒する（Shimomura et al., J Biol Chem. 269:14248-14253 (1994)）。この酵素をコードしている遺伝子としては、Rattus norvegicus（上記のShimomura et al.；Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)）、およびHomo sapiens（上記のShimomura et al）のｈｉｂｃｈが挙げられる。また、H. sapiensの酵素は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピニル−ＣｏＡを基質として受容する（上記のShimomura et al.）。配列相同性による遺伝子の候補物としては、Saccharomyces cerevisiaeのｈｉｂｃｈおよびBacillus cereusのＢＣ＿２２９２が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６に特定されている。
【０３０８】
【表６】
2013504326.tif 000008
【０３０９】
いくつかの真核生物のアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ３．１．２．１）は、幅広い基質特異性を有しており、したがって、酵素の好適な候補物を示している。例えば、Rattus norvegicusの脳由来の酵素（Robinson et al., Res. Commun. 71:959-965 (1976)）は、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡと反応し得る。その配列は報告されていないが、アセチル−ＣｏＡ、プロピニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、オレイル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ、およびクロニル−ＣｏＡに対する証明されている活性を有しているエンドウマメの葉のミトコンドリア由来の酵素は、幅広い基質特異性を有している（Zeiher et al., Plant. Physiol. 94:20-27 (1990)）。アセチル−ＣｏＡ加水分解酵素であるS. cerevisiae由来のＡＣＨ１は、加水分解酵素の他の候補物であることを示している（Buu et al., J. Biol. Chem. 278:17203-17209 (2003)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７に特定されている。
【０３１０】
【表７】
2013504326.tif 000009
【０３１１】
加水分解酵素の他の候補物は、グルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、スベリル−ＣｏＡ、セバシル−ＣｏＡ、ならびにドデカンジオイル−ＣｏＡにおいて活性を示す、ヒトのジカルボン酸チオエステラーゼであるａｃｏｔ８（Westin et al., J Biol. Chem. 280:38125-38132 (2005)）、および広範なＣｏＡチオエステルを加水分解する、E. coliにおける最も近縁の相同物であるｔｅｓＢ（Naggert et al., J Biol. Chem. 266:11044-11050 (1991)）である。また、類似の酵素はラットの肝臓において性質決定されている（Deana et al., Biochem. Int. 26:767-773 (1992)）。見込みのあるE. coliの他のチオエステル加水分解酵素としては、ｔｅｓＡ（Bonner et al., Chem. 247:3123-3133 (1972)）、ｙｂｇＣ（Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005)；および（Zhuang et al., FEBS Lett. 516:161-163 (2002)）、ｐａａＩ（Song et al., J Biol. Chem. 281:11028-11038 (2006)）、ならびにｙｂｄＢ（Leduc et al., J Bacteriol. 189:7112-7126 (2007)）の遺伝子産物が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８に特定されている。
【０３１２】
【表８】
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【０３１３】
加水分解酵素のさらなる他の候補物は、Acidaminococcus fermentans由来のグルタコン酸塩ＣｏＡ転移酵素である。この酵素は、グルタリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、および３−ブタノイル−ＣｏＡ（Mack et al., FEBS. Lett. 405:209-212 (1997)）に対する活性を有しているアシル−ＣｏＡ加水分解酵素への部位特異的な突然変異生成によって転換された。これは、スクシニル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素、およびアセトアセチル−ＣｏＡ：アセチルアシル−ＣｏＡ加水分解酵素ＣｏＡ転移酵素をコードしている酵素がまた、この反応段階に対する候補物として機能し得るが、それらの機能を変化させる特定の変異を必要とすることを示している。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９に特定されている。
【０３１４】
【表９】
2013504326.tif 000011
【０３１５】
アセト酢酸塩デカルボキシラーゼ
アセト酢酸塩デカルボキシラーゼはアセト酢酸塩を二酸化炭素およびアセトンに変換する。典型的なアセト酢酸塩デカルボキシラーゼ酵素は、C. acetobutylicum由来のａｄｃ（Petersen and Bennett, Appl Environ.Microbiol 56:3491-3498 (1990)）、およびClostridium saccharoperbutylacetonicum由来のａｄｃ（Kosaka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)）の遺伝子産物によってコードされている。C. beijerinkii由来の酵素は配列の類似性から推測され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０に特定されている。
【０３１６】
【表１０】
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【０３１７】
イソプロパノール脱水素酵素
イソプロパノール合成経路の最終段階は、イソプロパノールへのアセトンの還元に関する。この変化を可能にさせる典型的なアルコール脱水素酵素としては、C. beijerinckii由来のａｄｈ（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)；Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)）、およびThermoanaerobacter brockii由来のａｄｈ（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)；Peretz et al., Anaerobe 3:259-270 (1997)）が挙げられる。性質決定されているさらなる酵素としては、Ralstonia eutropha（以前はAlcaligenes eutrophus）由来のアルコール脱水素酵素（Steinbuchel and Schlegel et al., Eur.J.Biochem. 141:555-564 (1984)）およびPhytomonas種（Uttaro and Opperdoes et al., Mol.Biochem.Parasitol. 85:213-219 (1997)）が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１に特定されている。
【０３１８】
【表１１】
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【０３１９】
（プロピニルＣｏＡを利用したｎ−プロパノールの生成）
ｎ−プロパノールの生成のための本明細書に記載されている経路は、ＣｏＡ依存性のアルデヒド脱水素酵素による、プロピオンアルデヒドへのプロピオニル−ＣｏＡの還元を利用する（図１〜４）。当該プロピオンアルデヒドは、それから還元されて、ｎ−プロパノールを形成する。この変換は、２つの異なる酵素：アルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素によって行われるか、または二機能性のアルデヒド／アルコール脱水素酵素による１段階において行われる。代替的にプロピオニル−ＣｏＡは、リン酸プロピオニルに変換され、続いてアシルリン酸塩還元酵素によってプロピオンアルデヒドに変化され得る。
【０３２０】
プロピオンアルデヒド脱水素酵素およびプロパノール脱水素酵素
プロパノールへのプロピオニル−ＣｏＡの変換は、アルコール脱水素酵素活性およびＣｏＡ依存性のアルデヒド脱水素酵素活性の両方を有している二機能性の酵素、またはアルデヒド脱水素酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性を有している２つの異なる酵素のいずれかによって触媒される。
【０３２１】
アシル−ＣｏＡをアルコールに変換する典型的な２段階の酸化還元酵素としては、アセチル−ＣｏＡのような基質をエタノールに変化させる酵素（例えばE. coli由来のａｄｈＥ）（Kessler, FEBS. Lett. 281:59-63 (1991)）、およびブチリル−ＣｏＡをブタノールに変化させる酵素（例えばC. acetobutylicum由来のａｄｈＥ２)（Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002)）が挙げられる。Leuconostoc mesenteroidesにおいてａｄｈＥによってコードされている酵素は、アセチル−ＣｏＡをエタノールに還元させることに加えて、分枝鎖状の化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化させることが示されている（Kazahaya, Microbiol. 18:43-55 (1972); and Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２に特定されている。
【０３２２】
【表１２】
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【０３２３】
典型的な他の酵素はマロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換する。この活性を有しているＮＡＤＰＨ依存性の酵素は、Chloroflexus aurantiacusにおいて性質決定されており、当該生物において３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関与している（Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)；およびStrauss, Eur. J. Biochem. 215:633-643 (1993)）。３００ｋＤａの分子量を有しているこの酵素は、非常に基質特異的であり、他の既知の酸化還元酵素と配列の類似性をほとんど示さない（Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)）。他の生物における酵素では、この特異的な反応を触媒することが示されている酵素はない。しかし、他の生物が類似の経路を有し得るというバイオインフォマティクスの証拠が存在している（Klatt, Environ. Microbiol. 9:2067-2078 (2007)）。他の生物における酵素の候補物（Roseiflexus castenholzii、Erythrobacter種のＮＡＰ１、および海洋のガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０が挙げられる）は、配列の類似性によって推測され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１３において同定されている。
【０３２４】
【表１３】
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【０３２５】
より長鎖のアシル−ＣｏＡ分子は、酵素（例えばアルコール形成アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードしているホホバ（Simmondsia chinensis）ＦＡＲ）によって還元され得る。E. coliにおけるその過剰発現は、ＦＡＲ活性および脂肪アルコールの蓄積をもたらした（Metz, Plant Physiology 122:635-644 (2000)。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１４に特定されている。
【０３２６】
【表１４】
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【０３２７】
いくつかのアシル−ＣｏＡ脱水素酵素は、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元する能力を有している。そのような酵素をコードしている典型的な遺伝子としては、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードしているAcinetobacter calcoaceticusのａｃｒ１（Reiser, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)）、Acinetobactersp.  Ｍ−１の脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素（Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)）、ならびにClostridium kluyveriにおいてｓｕｃＤ遺伝子によってコードされているＣｏＡ依存性のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＮＡＤＰ依存性のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Sohling, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)）が挙げられる。P. gingivalisのｓｕｃＤは、他のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素である（Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000)）。Pseudomonas種においてアセトアルデヒド脱水素酵素をアシル化する、ｂｐｈＧによってコードされている酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、およびホルムアルデヒドを酸化させ、アシル化させることが証明されているため、さらなる他の候補物である（Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)）。Leuconostoc mesenteroideにおいてａｄｈＥによってコードされている酵素は、アセチル−ＣｏＡをエタノールに還元することに加えて、分枝鎖状の化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化させることが示されている（Kazahaya, J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972)；およびKoo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１５に特定されている。
【０３２８】
【表１５】
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【０３２９】
アシル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに変換するさらなる酵素種は、マロニルＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに変化させるマロニルＣｏＡ還元酵素である。マロニルＣｏＡ還元酵素は、好熱好酸性の古細菌における、３−ヒドロキシプロピオン酸回路を介した独立栄養性の炭素固定における重要な酵素である（Berg, Science 318:1782-1786 (2007)；およびThauer, Science 318:1732-1733 (2007)）。当該酵素は、ＮＡＤＰＨを補助因子として利用しており、MetallosphaeraおよびSulfolobus亜種において性質決定されている（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)；およびBerg, Science 318:1782-1786 (2007)）。当該酵素は、Metallosphaera sedulaにおけるＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされている（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)；およびBerg, Science 318:1782-1786 (2007)）。Sulfolobus tokodaii由来のマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている遺伝子は、クローン化され、E. coliにおいて異種的に発現された（Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006)。また、この酵素は、その対応するアルデヒドへのメチルマロニル−ＣｏＡの変換を触媒することが示されている（国際公開第２００７／１４１２０８号（２００７））。これらの酵素のアルデヒド脱水素酵素機能性は、Chloroflexus aurantiacus由来の二機能性の脱水素酵素と類似しているが、配列の類似性はわずかしかない。両方のマロニル−ＣｏＡ還元酵素の候補物は、アスパラギン酸セミアルデヒドへのアスパルチル−４−リン酸塩の還元および同時の脱リン酸化を触媒する酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素と、高い配列の類似性を有している。遺伝子のさらなる候補物は、他の生物（Sulfolobus solfataricusおよびSulfolobus acidocaldariusが挙げられる）におけるタンパク質に対する配列の相同性によって見出され得、以下に挙げられている。ＣｏＡをアシル化するアルデヒド脱水素酵素についてのさらなる他の候補物は、Clostridium beijerinckii由来のａｌｄ遺伝子である（Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999)。この酵素は、アセチル−ＣｏＡおよびブチリル−ＣｏＡをそれらの対応するアルデヒドに還元することが報告されている。この遺伝子は、Salmonella typhimuriumおよびE. coliのアセトアルデヒド脱水素酵素をコードしているｅｕｔＥと非常に類似している（Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999)。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１６に特定されている。
【０３３０】
【表１６】
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【０３３１】
アルコールへのアルデヒドの変換を触媒する酵素（すなわち、アルコール脱水素酵素すなわちアルデヒド還元酵素）をコードしている典型的な遺伝子としては、Ｃ２〜Ｃ１４にとっての中鎖アルコール脱水素酵素をコードしているａｌｒＡ（Tani, Appl. Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)）、Saccharomyces cerevisiae由来のＡＤＨ２（Atsumi, Nature 451:86-89 (2008)）、Ｃ３より長い分子に対して選択性を有しているE. coli由来のｙｑｈＤ（Sulzenbacher et al., Journal of Molecular Biology 342:489-502 (2004)）、ならびにブチルアルデヒドをブタノールに変換するC. acetobutylicum由来のｂｄｈ  Ｉおよびｂｄｈ  ＩＩ（Walter, Journal of Bacteriology 174: 7149-7158 (1992)）が挙げられる。ｙｑｈＤの遺伝子産物は、補助因子としてＮＡＤＰＨを用いて、アセトアルデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインの還元を触媒する（Perez, J. Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008)）。Zymomonas mobilis由来のＡＤＨ１は、多くのアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインが挙げられる）に対する活性を有していることが証明されている（Kinoshita, Appl. Microbiol. Biotechnol. 22:249-254 (1985)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１７に特定されている。
【０３３２】
【表１７】
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【０３３３】
また、３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素活性を示す酵素（ＥＣ  １．１．１．６１）、このカテゴリーに分類されている。そのような酵素は、Ralstonia eutropha（Bravo J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)）、Clostridium kluyveri（Wolff, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)）、およびArabidopsis thaliana（Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)）において性質決定されている。遺伝子のさらなる他の候補物は、Geobacillus thermoglucosidasius由来のアルコール脱水素酵素であるａｄｈＩである（Jeon et al., J. Biotechnal 135:127-133 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１８に特定されている。
【０３３４】
【表１８】
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【０３３５】
典型的な他の酵素は、メチルマロン酸セミアルデヒドへの３−ヒドロキシイソ酪酸塩の可逆的な酸化を触媒する３−ヒドロキシイソ酪酸塩脱水素酵素である。この酵素は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解に関与しており、細菌、真核生物および哺乳類において同定されている。Thermus thermophilusＨＢ８由来のＰ８４０６７によってコードされている酵素は、構造的に性質決定されている（Lokanath et al., J Mol Biol 352:905-917 (2005)）。ヒトの３−ヒドロキシイソ酪酸塩脱水素酵素の可逆性は、同位体標識された基質を用いて証明された（Manning, Biochem J 231:481-484 (1985)）。この酵素をコードしているさらなる遺伝子としては、Homo sapiens（Hawes et al., Methods Enzymol. 324:218-228 (2000)）、およびOryctolagus cuniculus（Hawes et al., Methods Enzymol. 324:218-228 (2000)およびChowdhury, Biosci. Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996)）における３ｈｉｄｈが挙げられる（Pseudomonas aeruginosaにおけるｍｍｓｂ、およびPseudomonas putidaにおけるｄｈａｔ（Aberhart, J Chem. Soc. 6:1404-1406 (1979)；Chowdhury, Biosci. Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996)ならびにChowdhury, Biosci. Biotechnol Biochem. 67:438-441 (2003)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１９に特定されている。
【０３３６】
【表１９】
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【０３３７】
プロピオニル−ＣｏＡ：プロパノイルリン酸転移酵素
リン酸プロパノイルへのプロパノイル−ＣｏＡの変換は、リン酸転移酵素によって触媒され得る。リン酸  アセチル転移酵素（ＥＣ  ２．３．１．８）のうちのいくつかの酵素（Bacillus subtilis由来の酵素（Rado, Biochem. Biophys. Acta 321:114-125 (1973)）、Clostridium kluyveri由来の酵素（Stadtman, Methods Enzymol 1:596-599 (1955)）、およびThermotoga maritima由来の酵素（Bock, J Bacteriol. 181:1861-1867 (1999)が挙げられる）は、プロピオニル−ＣｏＡに対する活性を有していることが示されている。したがって、Escherichia coliのｐｔａ遺伝子と同様に、これらのリン酸塩のアセチル転移酵素をコードしている遺伝子は、この段階を触媒するために利用されている。
【０３３８】
【表２０】
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【０３３９】
リン酸プロピオニル還元酵素
プロピオンアルデヒドへのリン酸プロパノイルの変換は、リン酸プロピオニル還元酵素によって触媒されている。そのような直接的な変換はいまだ証明されていないが、類似の変化は十分に実証された（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびアスパラギン酸塩セミアルデヒド脱水素酵素が挙げられる）。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードしている以下の遺伝子は、この段階を触媒すると考えられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２１に特定されている。
【０３４０】
【表２１】
2013504326.tif 000023
【０３４１】
プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素
プロピオニルＣｏＡは、ＣｏＡ加水分解酵素、ＣｏＡ合成酵素またはＣｏＡ転移酵素によって、プロピオン酸塩に変換され得る。プロピオン酸塩へのプロピオニルＣｏＡの加水分解は、中間体２−オキソブタン酸塩を経て進行する有機酸分解経路において起こる。この反応は、アシルＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ  ３．１．２．１８）によって触媒される。プロピオニル−ＣｏＡは、ラットの肝臓のミトコンドリアにおいて見出された短鎖のアシルＣｏＡ加水分解酵素の好ましい基質である（Alexson et al., Biochim Biophys. Acta., 1105(1):13-9 (1989)）。この酵素は性質決定されているが、遺伝子をコードしている配列はいまだ同定されていない（Garras et al., Biochim.Biophys. Acta., 1255:154-160 (1995)）。プロピニル−ＣｏＡに対してＣｏＡ加水分解酵素活性を示す他の酵素は、エンドウマメの葉のミトコンドリアに見出されている。その配列は報告されていないが、この酵素は、アセチル−ＣＯＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、オレイル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡおよびクロトニル−ＣｏＡに対する証明されている活性を有している、幅広い基質特異性を有している（Zeiher et al., Plant. Physiol. 94:20-27 (1990)）。プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素のさらなる候補物としては、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、およびジカルボン酸チオエステラーゼが挙げられる。
【０３４２】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素は、バリン分解の間における３−ヒドロキシイソ酪酸塩への３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの変換を触媒する（Shimomura et al., J Biol Chem. 269:14248-14253 (1994)）。この酵素をコードしている遺伝子としては、Rattus norvegicus（上記のShimomura et al.；Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)）、およびHomo sapiens（上記のShimomura et al.）のｈｉｂｃｈが挙げられる。また、H. sapiensの酵素は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピニル−ＣｏＡを基質として受容する（上記のShimomura et al.）。配列の相同性による遺伝子の候補物としては、Saccharomyces cerevisiaeのｈｉｂｃｈおよびBacillus cereusのＢＣ＿２２９２が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２２に特定されている。
【０３４３】
【表２２】
2013504326.tif 000024
【０３４４】
いくつかの真核生物のアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ．３．１．２．１）は、幅広い基質特異性を有しており、したがって酵素の好適な候補物を代表している。例えば、Rattus norvegicusの脳に由来する酵素（Robinson et al., Res. Commun. 71:959-965 (1976)）は、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡ、およびマロニルＣｏＡと反応し得る。S. cerevisiae由来のアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素であるＡＣＨ１は、加水分解酵素の他の候補物を代表している（Buu et al., J. Biol. Chem. 278:17203-17209 (2003)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２３に特定されている。
【０３４５】
【表２３】
2013504326.tif 000025
【０３４６】
加水分解酵素の他の候補物は、グルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、スベリル−ＣｏＡ、セバシル−ＣｏＡならびにドデカンジオイル−ＣｏＡに対する活性を示すヒトのジカルボン酸チオエステラーゼであるａｃｏｔ８（Westin et al., J Biol. Chem. 280:38125-38132 (2005)）、ならびに広範なＣｏＡチオエステルを加水分解するE. coliにおける最も近縁の相同物であるｔｅｓＢ（Naggert et al., J Biol. Chem. 266:11044-11050 (1991)）である。また、類似の酵素がラットの肝臓において性質決定されている（Deana et al., Biochem. Int. 26:767-773 (1992)）。見込みのある他のE. coliのチオエステル加水分解酵素としては、ｔｅｓＡ（Bonner et al., Chem. 247:3123-3133 (1972)）、ｙｂｇＣ（Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005)；および（Zhuang et al., FEBS Lett. 516:161-163 (2002)）、ｐａａＩ（Song et al., J Biol. Chem. 281:11028-11038 (2006)）、およびｙｂｄＢ（Leduc et al., J Bacteriol. 189:7112-7126 (2007)）の遺伝子産物が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２４に特定されている。
【０３４７】
【表２４】
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【０３４８】
加水分解酵素のさらなる他の候補物は、Acidaminococcus fermentans由来のグルタコン酸塩のＣｏＡ転移酵素である。この酵素は、グルタリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、および３−ブタノイル−ＣｏＡに対する活性を有しているアシル−ＣｏＡ加水分解酵素に対する部位特異的な突然変異生成によって転換された（Mack et al., FEBS. Lett. 405:209-212 (1997)）。これは、スクシニル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素、およびアセトアセチル−ＣｏＡ：アセチルアシル−ＣｏＡ加水分解酵素ＣｏＡ転移酵素をコードしている酵素は、この反応段階に対する候補物になり得るが、それらの機能を変更させる特定の変異を必要とすることを示している。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２５に特定されている。
【０３４９】
【表２５】
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【０３５０】
プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素
また、ＣｏＡ合成酵素は、プロピオニル−ＣｏＡからのＣｏＡ部分の除去を触媒し得る。酵素の候補物の１つである、ＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、それらの対応する酸へのアシル−ＣｏＡエステルの変換、および同時のＡＴＰの合成を結びつけている。幅広い基質特異性を有しているいくつかの酵素が文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされているArchaeoglobus fulgidus由来のＡＣＤ  Ｉは、種々の直鎖状および分枝鎖状の基質（アセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、イソ酪酸塩、イソ吉草酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酢酸フェニル、インドール酢酸が挙げられる）に作用することが示された（Musfeldt et al., J Bacteriol 184:636-644 (2002)）。Haloarcula marismortui由来の酵素（スクシニル−ＣｏＡ合成酵素として注釈されている）は、プロピオン酸塩、酪酸塩および分枝鎖状の酸（イソ吉草酸塩およびイソ酪酸塩）を基質として受容し、順方向および逆方向において作用することが示された（Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287 (2004)）。超好熱性のクレンアーキオータ門の古細菌Pyrobaculum aerophilum由来のＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡと反応する性質決定されたすべてのＡＣＤのうち、最も幅広い基質の範囲を示した（上記のBrasen et al）。A. fulgidus、H. marismortuiおよびP. aerophilum由来の酵素のすべては、E.coliにおいてクローン化され、機能的に発現され、性質決定されている（上記のMusfeldt et al.；上記のBrasen et al.）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２６に特定されている。
【０３５１】
【表２６】
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【０３５２】
ＣｏＡ合成酵素の他の候補物はスクシニル−ＣｏＡ合成酵素である。E. coliのｓｕｃＣＤ遺伝子はスクシニル−ＣｏＡ合成酵素の複合体を形成している。当該複合体は、１つのＡＴＰの同時の消費とともに、コハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成を天然に触媒しており、当該反応は生体内において可逆的な反応である（Buck et al., Biochem. 24:6245-6252 (1985)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２７に特定されている。
【０３５３】
【表２７】
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【０３５４】
さらなる典型的なＣｏＡリガーゼとしては、いまだ配列が性質決定されていないラットのジカルボン酸塩ＣｏＡリガーゼ（Vamecq et al., Biochemical Journal 230:683-693 (1985)）、P. chrysogenum由来の性質決定されている２つの酢酸フェニル−ＣｏＡリガーゼ（Lamas-Maceiras et al., Biochem. J. 395:147-155 (2005)；Wang et al.,Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458 (2007)）、Pseudomonas putida由来の酢酸フェニル−ＣｏＡリガーゼ(Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem. 265:7084-7090 (1990)）、およびBacilis subtilis由来の６−カルボキシヘキサン酸塩−ＣｏＡリガーゼ（Boweret al., J. Bacteriol. 178(14):4122-4130 (1996)）が挙げられる。さらなる酵素の候補物は、アセトアセチル−ＣｏＡへのアセト酢酸塩の、ＡＴＰ依存性の変換を天然に触媒する、Mus musculus（Hasegawa et al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)）およびHomo sapiens (Ohgami et al., Biochem Pharmacol 65:989-994 (2003)）由来のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素である。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２８に特定されている。
【０３５５】
【表２８】
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【０３５６】
プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素
プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素は、ＣｏＡ部分をＣｏＡアクセプタ分子に転移させる一方で、プロピオン酸塩へのプロピオニル−ＣｏＡの変換を触媒する。多くの転移酵素は、幅広い特異性を有しており、したがって、特に酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、２−メチルアセト酢酸塩、３−ケトヘキサン酸塩、３−ケトペンタン酸塩、吉草酸塩、クロトン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸塩、プロピオン酸塩、酸酸ビニル、酪酸塩の広範なＣｏＡアクセプタを利用し得る。
【０３５７】
プロピオニルＣｏＡ転移酵素活性を有しているいくつかの遺伝子が同定されている。Roseburia sp.のＡ２−１８３は、ブチリル−ＣｏＡ：酢酸塩：ＣｏＡ転移酵素およびプロピオニル−ＣｏＡ：酢酸塩：ＣｏＡ転移酵素活性を有していることが示された（Charrier et al., Microbiology 152, 179-185 (2006)）。近縁の相同物は、例えば、Roseburia intestinalisのＬ１−８２、Roseburia inulinivoransのＤＳＭ  １６８４１、Eubacterium rectaleのＡＴＣＣ  ３３６５６に見出され得る。プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素活性を有している他の酵素は、Clostridium propionicumに見出され得る（Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002)）。この酵素は、アクセプタ酢酸塩、（Ｒ）−乳酸塩、（Ｓ）−乳酸塩、アクリル酸塩および酪酸塩をＣｏＡアクセプタとして用い得る（Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002)；Schweiger and Buckel, FEBS Letters, 171(1) 79-84 (1984)）。近縁の相同物は、例えば、Clostridium novyiのＮＴ、Clostridium beijerinckiiのＮＣＩＭＢ  ８０５２、およびClostridium botulinumのＣ  Eklund株に見出され得る。ＹｇｆＨは、E. coliにおけるプロピオニルＣｏＡ：コハク酸ＣｏＡ転移酵素をコードしている（Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629）。近縁の相同物は、例えば、Citrobacter youngaeのＡＴＣＣ  ２９２２０、Salmonella enterica  arizonae serovar亜種、およびYersinia intermediaのＡＴＣＣ  ２９９０９に見出され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表２９に特定されている。
【０３５８】
【表２９】
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【０３５９】
さらなる酵素の候補物は、３−オキソアジピル−ＣｏＡ／コハク酸塩転移酵素活性を有していることが示されている、PseudomonasにおけるｐｃａＩおよびｐｃａＩＩによってコードされている２つの構成単位の酵素である（上記のK aschabek et al.）。相同性に基づいた類似の酵素は、Acinetobacter sp.のＡＤＰ１（Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994)）およびStreptomyces coelicolorに存在する。さらなる典型的なスクシニル−ＣｏＡ：３：オキソ酸−ＣｏＡ転移酵素は、Helicobacter pylori（Corthesy-Theulaz et al., J.Biol.Chem. 272:25659-25667 (1997)）、およびBacillus subtilis（Stols et al., Protein.Expr.Purif. 53:396-403 (2007)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３０に特定されている。
【０３６０】
【表３０】
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【０３６１】
ＣｏＡアクセプタとして酢酸塩を利用し得るＣｏＡ転移酵素は、E. coliのａｔｏＡ（αサブユニット）遺伝子およびａｔｏＤ（βサブユニット）遺伝子によってコードされているアセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素である（Vanderwinkel et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 33:902-908 (1968)；Korolev et al., Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)）。また、この酵素は、分枝鎖状および直鎖状の種々のアシル−ＣｏＡ基質（イソ酪酸塩（Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)）、吉草酸塩（上記のVanderwinkel et al.）およびブタン酸塩（上記のVanderwinkel et al.）が挙げられる）から、酢酸塩にＣｏＡ部分を転移することが示されている。類似の酵素は、Corynebacterium glutamicumのＡＴＣＣ  １３０３２（Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)）、Clostridium acetobutylicum（Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)）、およびClostridium saccharoperbutylacetonicum（Kosaka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３１に特定されている。
【０３６２】
【表３１】
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【０３６３】
また、上述の酵素はプロピオニル−ＣｏＡに対する所望の活性を示し得る。転移酵素のさらなる例示的な候補物は、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素活性、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素活性、およびブチリル−ＣｏＡ転移酵素活性のそれぞれを示すことが示されているｃａｔ１、ｃａｔ２およびｃａｔ３の遺伝子産物によって触媒される（Seedorf et al., supra;Sohling et al., Eur.J Biochem. 212:121-127 (1993)；Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)）。また、類似のＣｏＡ転移酵素活性は、Trichomonas vaginalis（van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418 (2008)）およびTrypanosoma brucei（Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３２に特定されている。
【０３６４】
【表３２】
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【０３６５】
嫌気性細菌Acidaminococcus fermentans由来のグルタコン酸塩のＣｏＡ転移酵素（ＥＣ  ２．８．３．１２）は、二酸のグルタコニル−ＣｏＡおよび３−ブテノイル−ＣｏＡと反応する（Mack et al., FEBS Lett. 405:209-212 (1997)）。この酵素をコードしている遺伝子はｇｃｔＡおよびｇｃｔＢである。この酵素は、他のＣｏＡ誘導体（グルタリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、およびアクリロイル−ＣｏＡが挙げられる）に対する、低下しているが検出可能な活性を有している（Buckel et al., Eur.J.Biochem. 118:315-321 (1981)）。当該酵素は、E. coliにおいてクローン化され、発現されている（Mack et al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３３に特定されている。
【０３６６】
【表３３】
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【０３６７】
プロピオン酸キナーゼ
プロピオン酸は、プロピオン酸キナーゼ活性を有している酵素によってリン酸プロピオニルへと活性化される。酪酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．７）は、C. acetobutylicumの酸発酵の間における酪酸塩へのリン酸ブチリルの可逆的な変換を行う（Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)）。この酵素は、２つのｂｕｋ遺伝子産物のいずれかによってコードされている（Huang et al., J Mol. Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000)）。この酵素は、プロピオン酸塩、イソブタン酸塩および吉草酸塩を代替の基質として受容することが示された（Hartmanis, J. Biol. Chem., 262(2):617-21 (1987)）。他の酪酸キナーゼは、C. butyricumおよびC. tetanomorphumに見出されている（Twarog et al., J Bacteriol. 86:112-117 (1963)）。また、これらの酵素は、プロピオン酸塩、イソブタン酸塩および吉草酸塩を副次的な基質として受容する。また、関連する酵素であるThermotoga maritima由来のイソ酪酸キナーゼは、E. coliにおいて発現され、結晶化されている（Diao et al., E. Biol. Crystallogr. 59:1100-1102 (2003)；およびDiao et al., J Bacteriol. 191:2521-2529 (2009)）。アスパラギン酸キナーゼは、アスパラギン酸塩のＡＴＰ依存性のリン酸化を触媒し、いくつかのアミノ酸の合成に関与する。ｌｙｓＣによってコードされているE. coliにおけるアスパラギン酸キナーゼＩＩＩ酵素は、広範な基質を有しており、基質特異性に関与している触媒作用性の残基が明らかにされている（Keng et al., Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81 (1996)）。また、E. coliにおける２つのさらなるキナーゼ（酢酸キナーゼおよびガンマ−グルタミルキナーゼ）は有力な候補物である。ａｃｋＡによってコードされているE. coliの酢酸キナーゼ（Skarstedt et al., J. Biol. Chem. 251:6775-6783 (1976)）は、酢酸塩に加えてプロピオン酸塩をリン酸化する（Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)）。ｐｒｏＢによってコードされているE. coliのγ−グルタミルキナーゼ（Smith et al., J. Bacteriol. 157:545-551 (1984)）は、グルタミン酸塩のγ位の炭酸基をリン酸化する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３４に特定されている。
【０３６８】
【表３４】
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【０３６９】
プロピオン酸還元酵素
プロピオン酸セミアルデヒドへのプロピオン酸塩の還元は、カルボン酸還元酵素によって触媒される。また、以下に記載されている、コハク酸還元酵素および４−ヒドロキシ酪酸還元酵素に対する酵素の例示的な候補物は、本項に適用可能である。
【０３７０】
〔実施例２〕
（グルコースからのアセチル−ＣｏＡの生成のための経路）
実施例１に加えて、グルコースからのアセチル−ＣｏＡの生成のための経路は、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）を介して進行する（図１〜４）。グルコースは微生物の天然の解糖経路によってＰＥＰに変換される。ＰＥＰはピルビン酸キナーゼによってピルビン酸塩に変換され、次にピルビン酸脱水素酵素またはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素によってアセチル−ＣｏＡに変換される。代替的に、ピルビン酸塩はピルビン酸蟻酸リアーゼによってアセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩に変換される。また、蟻酸塩はＮＡＤＨを生成する蟻酸脱水素酵素によって二酸化炭素に続いて変換される。これらの経路によって生成されるアセチル−ＣｏＡは、それから実施例１に記載されているようにイソプロパノールの生成に利用されるか、または後述する実施例５に記載されているようにｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの両方の生成に利用される（図３）。
【０３７１】
ピルビン酸脱水素酵素
アセチル−ＣｏＡへのピルビン酸塩の変換を触媒するピルビン酸デドロゲナーゼ複合体は、大規模に研究されている。S. cerevisiaeの複合体は、Ｅ１の構成要素（ＰＤＡ１およびＰＤＢ１）、Ｅ３の構成要素（ＬＰＤ１）、ならびにタンパク質Ｘ（ＰＤＸ１）の構成要素を結び付けているＥ２（ＬＡＴ１）コアによって構成されている（Pronk, Yeast 12:1607-1633 (1996)）。E. coliの酵素において、Ｅ１構成要素における特定の残基は、基質特異性を担っている（Bisswanger, J. Biol Chem. 256:815-822 (1981)；Bremer, Eur. J Biochem. 8:535-540 (1969)およびGong et al., J. Biol Chem. 275:13645-13653 (2000)）。遺伝子工学的な試みは、嫌気性条件下におけるE. coliのＰＤＨ酵素活性を向上させている（Kim, J. Bacteriol 190:3851-3858 (2008); Kim, Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771 (2007)およびZhou, Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)）。E. coliのＰＤＨとは対照的に、B. subtilisの複合体は、活性であり、嫌気性条件下における成長に必要とされる（Nakano, J. Bacteriol179:6749-6755 (1997)）。また、グリセロールに基づく成長において性質決定されているKlebsiella pneumoniaeのＰＤＨは、嫌気性条件下において活性である（Menzel, J. Biotechnol. 56:135-142 (1997)）。ウシの腎臓に由来する酵素の複合体の結晶構造（Zhou, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807 (2001)）、およびAzotobacter vinelandii由来のＥ２触媒作用性領域の結晶構造が利用可能である（Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)）。いくつかの哺乳類のＰＤＨ酵素複合体は、代替の基質（例えば２−オキソブタン酸塩）に対して反応し得る（Paxton, J Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３５に特定されている。
【０３７２】
【表３５】
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【０３７３】
ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素
ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素（ＰＦＯＲ）は、ピルビン酸塩の酸化を触媒して、アセチル−ＣｏＡを形成させる。Desulfovibrio africanus由来のＰＦＯＲは、E. coliにおいて、クローン化され、発現されており、酸素の存在下において数日にわたって安定である活性な組換え酵素を生じさせた（Pieulle, J Bacteriol 179:5684-5692 (1997)）。酸素による安定性は、ＰＦＯＲでは相対的にまれであり、D. africanusの酵素のポリペプチド鎖における６０残基のアミノ酸の伸長によってもたらされると考えられている。また、M. thermoaceticaのＰＦＯＲは十分に性質決定されており（Menon, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)）、独立栄養性の成長の間におけるピルビン酸塩の合成に対する高い活性を有していることがさらに示された（Furdui, J Biol Chem. 275:28494-28499 (2000)）。さらに、E. coliは、M. thermoaceticaのＰＦＯＲと５１％同一であるタンパク質をコードしている、性質決定されていないオープンリーディングフレームであるｙｄｂＫを有している。E. coliにおけるピルビン酸酸化還元酵素活性についての証拠が説明されている（Blaschkowski, Eur. J Biochem. 123:563-569 (1982)）。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が以下の総説に説明されている（Ragsdale, Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)）。フラボドキシン還元酵素（例えば、Helicobacter pyloriまたはCampylobacter jejuni由来のｆｑｒＢ）（St Maurice et al., J. Bacteriol. 189:4764-4773 (2007)）、またはＲｎｆ型タンパク質（Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133 (2008)；およびHerrmann, J. Bacteriol 190:784-791 (2008)）は、ＰＦＯＲによって生成される還元型のフェレドキシンからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成するための手段を最終的にもたしている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３６に特定されている。
【０３７４】
【表３６】
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【０３７５】
ピルビン酸蟻酸リアーゼ
ピルビン酸蟻酸リアーゼは、アセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩へのピルビン酸塩の変換を触媒する酵素である。ピルビン酸蟻酸リアーゼは、嫌気性の酸化還元平衡の調整を補助するために用いられる原核生物に共通の酵素である。例示的な酵素は、Escherichia coli（Knappe, FEMS. Microbiol Rev. 6:383-398 (1990)）、Lactococcus lactis（Melchiorsen, Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344(2002)）、およびStreptococcus mutans.（Takahashi-Abbe, Oral. Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003)）に見出され得る。また、ミトコンドリアのピルビン酸蟻酸リアーゼは、真核生物であるChlamydomonas reinhardtiiにおいて同定されている（Hemschemeier, Eukaryot. Cell 7:518-526 (2008)；およびAtteia, J. Biol. Chem. 281:9909-9918 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３７に特定されている。
【０３７６】
【表３７】
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【０３７７】
蟻酸水素脱離酵素
蟻酸水素脱離酵素は、二酸化炭素および水素に蟻酸を変換するために使用され得る。例示的な蟻酸水素脱離酵素はEscherichia coliに見出され得る。E. coliの蟻酸水素脱離酵素は、ヒドロゲナーゼ３および蟻酸脱水素酵素−Ｈによって構成されている（Maeda, Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007)）。当該酵素は、ｆｈｌＡの遺伝子産物によって活性化される（Maeda, Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007)）。微量元素であるセレン、ニッケルおよびモリブデンの発酵培地への添加は、蟻酸水素脱離酵素活性を促進させることが示されている（Soini, Microb. Cell Fact. 7:26 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３８に特定されている。
【０３７８】
【表３８】
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【０３７９】
また、蟻酸水素脱離酵素は、超好熱性の古細菌であるThermococcus litoralisに存在する（Takacs et al., BMC. Microbiol 8:88 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表３９に特定されている。
【０３８０】
【表３９】
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【０３８１】
さらなる蟻酸水素脱離酵素の系は、Salmonella typhimurium、Klebsiella pneumoniae、Rhodospirillum rubrum、Methanobacterium formicicumに見出されている（Vardar-Schara, Microbial Biotechnology 1:107-125 (2008)）。
【０３８２】
蟻酸脱水素酵素
蟻酸脱水素酵素活性は、他の生物のなかでも特にE. coliおよびSaccharomyces cerevisiaeの両方に存在する。S. cerevisiaeは、ＣＯ２への蟻酸塩の酸化を触媒する２つの蟻酸脱水素酵素であるＦＤＨ１およびＦＤＨ２を含んでいる（Overkamp et al., Yeast 19:509-520 (2002)）。Moorella thermoaceticaにおいて、Ｍｏｔｈ＿２３１２およびＭｏｔｈ＿２３１３の遺伝子座は、βサブユニットがＭｏｔｈ＿２３１４によってコードされている一方で、蟻酸脱水素酵素のαサブユニットをコードする役割を担っている実質的に１つの遺伝子である（Pierce et al., Environ. Microbiol (2008)；Andreesen, J. Bacteriol. 116:867-873 (1973)；Li, J. Bacteriol 92:405-412 (1966)およびYamamoto, J. Biol. Chem. 258:1826-1832 (1983)）。蟻酸脱水素酵素活性をコードしている遺伝子の他の組は、Syntrophobacter fumaroxidansにおいてＳｆｕｍ＿２７０３からＳｆｕｍ＿２７０６によってコードされている（Reda, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:10654-10658 (2008)；de Bok et al., Eur. J. Biochem. 270:2476-2485 (2003)）。それらのM. thermoaceticaにおける等価物と同様に、Ｓｆｕｍ＿２７０５およびＳｆｕｍ＿２７０６は、実質的に１つの遺伝子である。E. coliは複数の蟻酸脱水素酵素を含んでいる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４０に特定されている。
【０３８３】
【表４０】
2013504326.tif 000042
【０３８４】
〔実施例３〕
（還元的なＴＣＡ回路を利用したグルコースからのプロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路）
実施例１および２に加えて、プロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、オキサロ酢酸塩を介して進行する（図１）。ＰＥＰは、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼを介してオキサロ酢酸塩に変換される。代替的に、ＰＥＰはピルビン酸キナーゼによってピルビン酸塩にまず変換され、それからメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素またはピルビン酸カルボキシラーゼによってオキサロ酢酸塩に変換される。オキサロ酢酸塩は、還元的なＴＣＡ回路（メチル転位酵素、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、およびデカルボキシラーゼ）によってプロピニル−ＣｏＡに変換される。
【０３８５】
ＰＥＰカルボキシキナーゼ
オキサロ酢酸塩へのホスホエノールピルビン酸塩の正味の変換は、酸化還元的に中性であるが、この変換の機序は、共生成の経路の全体のエネルギー論にとって重要である。オキサロ酢酸塩へのＰＥＰの変換における最も好ましい酵素は、ＰＥＰをカルボキシル化するときにＡＴＰを同時に形成するＰＥＰカルボキシキナーゼである。しかし、ほとんどの生物において、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、糖新生に寄与し、１つのＡＴＰを消費してオキサロ酢酸塩をＰＥＰに変換する。S. cerevisiaeは、天然のＰＥＰカルボキシキナーゼであるＰＣＫ１が糖新生の機能を果たす生物の１つである（Valdes-Hevia, FEBS. Lett. 258:313-316 (1989)）。オキサロ酢酸塩の生成におけるＰＥＰカルボキシキナーゼの役割が、ＡＴＰを形成しないＰＥＰカルボキシキナーゼと比べて、ＰＥＰカルボキシキナーゼのジカルボン酸塩に対するより高いＫｍにおそらく起因して重要ではないと考えられるので、E.coliは、そのような他の生物である（Kim, Appl Environ Microbiol 70:1238-1241 (2004)）。それにもかかわらず、ＰＥＰからオキサロ酢酸塩に変換させるE.coliの天然のＰＥＰカルボキシキナーゼの活性は、E. coliのＫ−１２のｐｐｃ変異株において近年、証明されている（Kwon, Journal of Microbiology and Biotechnology 16:1448-1452 (2006)）。これらの株は、成長不良を示さず、高いＮａＨＣＯ３濃度においてコハク酸塩の生成を増強させた。いくつかの生物（特にルーメン細菌）において、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、ＰＥＰからのオキサロ酢酸塩の生成およびＡＴＰの生成にとって非常に有効である。E. coliにおいてクローン化されているＰＥＰカルボキシキナーゼの例としては、Mannheimia succiniciproducens由来のもの（Lee, Biotechnol. Bioprocess Eng. 7:95-99 (2002)）、Anaerobiospirillum succiniciproducens由来のもの（Laivenieks, Appl Environ Microbiol 63:2273-2280 (1997)）およびActinobacillus succinogenes由来のもの（Kim, Appl Environ Microbiol 70:1238-1241 (2004)）が挙げられる。また、内部実験において、Haemophilus influenzaによってコードされているＰＥＰカルボキシキナーゼ酵素は、ＰＥＰからのオキサロ酢酸塩の形成にとって非常に有効であることが見出されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４１に特定されている。
【０３８６】
【表４１】
2013504326.tif 000043
【０３８７】
この実施例において挙げられている後述の酵素にとってのこれらの（複数の）配列は、配列の類似性の検索を介したGenBankまたは他のデータベース（例えばＢＬＡＳＴｐ）におけるタンパク質の相同物を同定するために用いられ得る。結果として得られる相同物のタンパク質およびそれらの対応する遺伝子の配列は、選択される宿主細胞への形質転換に対してさらなるＤＮＡ配列を提供する。
【０３８８】
ＰＥＰカルボキシラーゼ
ＰＥＰカルボキシラーゼは、ＰＥＰからのオキサロ酢酸塩の形成にとっての代替的な酵素を代表する。当該酵素は、オキサロ酢酸塩を脱カルボキシル化することによってＡＴＰを生成しないので、その利用は、生成経路の最大のＡＴＰの収量を低下させ、オキサロ酢酸塩をＰＥＰに変換するためのあまり好ましくない代替法を意味している。それにもかかわらず、１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌの最大の理論的なＣ３アルコールの収量は、ＰＥＰカルボキシラーゼがオキサロ酢酸にＰＥＰを変換するために利用される場合、不変である。S. cerevisiaeは、ＰＥＰカルボキシラーゼを天然にコードしていないが、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を有している例示的な生物としては、E. coli（Kai, Arch. Biochem. Biophys. 414:170-179 (2003)）、Methylobacterium extorquens  ＡＭ１（Arps, J. Bacteriol. 175:3776-3783 (1993)）およびCorynebacterium glutamicum（Eikmanns, Mol. Gen. Genet. 218:330-339 (1989)）が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４２において同定されている。
【０３８９】
【表４２】
2013504326.tif 000044
【０３９０】
ピルビン酸キナーゼおよびメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシル転移酵素
ＰＥＰからオキサロ酢酸塩へのエネルギー的に効率的なルートは、２つの酵素的な活性（ピルビン酸キナーゼおよびメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシル転移酵素）を必要とする。ピルビン酸キナーゼは、ピルビン酸塩へのＰＥＰの、ＡＴＰを生成する変換を触媒し、S. cerevisiaeにおいて、ＰＹＫ１（Burke, J. Biol. Chem. 258:2193-2201 (1983)）およびＰＹＫ２（Boles et al., J. Bacteriol. 179:2987-2993 (1997)）の遺伝子によってコードされている。E. coliにおいて、この活性はｐｙｋＦおよびｐｙｋＡの遺伝子産物によって触媒される。メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素は、オキサロ酢酸塩へのピルビン酸塩の変換を触媒する。また、重要なことに、この反応は、プロピオニル−ＣｏＡへの（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡの変換を同時に触媒する（図１および２を参照）。１．３Ｓ、５Ｓおよび１２Ｓサブユニットによって構成されている例示的なメチルマロニル−ＣｏＡは、Propionibacterium freudenreichiiに見出され得る（Thornton et al., J. Bacteriol 175:5301-5308 (1993)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４３に特定されている。
【０３９１】
【表４３】
2013504326.tif 000045
【０３９２】
ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼ
当該酵素の組合せは、ＰＥＰカルボキシラーゼと化学量論的に等しくＰＥＰをオキサロ酢酸塩に変換し得る。これらの酵素は、ピルビン酸キナーゼＰＹＫ１（Burke, J. Biol. Chem. 258:2193-2201 (1983)）またはＰＹＫ２（Boles et al., J. Bacteriol, 179:2987-2993 (1997)）、およびピルビン酸カルボキシラーゼであるＰＹＣ１（Walker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:1210-1217 (1991)）またはＰＹＣ２（Walker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:1210-1217 (1991)）によってコードされている。後者の遺伝子／タンパク質は以下の表４４において同定されている。
【０３９３】
【表４４】
2013504326.tif 000046
【０３９４】
リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素
オキサロ酢酸塩は、還元的なサイクルにおいてＴＣＡ回路が作動しているとき、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素によってコハク酸塩に変換され得る。S. cerevisiaeは、ミトコンドリア、細胞質およびペルオキシソームにそれぞれ局在する、３コピーのリンゴ酸脱水素酵素ＭＤＨ１（McAlister-Henn, J. Bacteriol 169:5157-5166 (1987)）、ＭＤＨ２（Minard, Mol. Cell. Biol. 11:370-380 (1991)；およびGibson, J. Biol. Chem. 278:25628-25636 (2003)）およびＭＤＨ３（Steffan, J. Biol. Chem. 267:24708-24715 (1992)）を有している。S. cerevisiaeは、フマラーゼをコードしている遺伝子である１コピーのＦＵＭ１を含んでおり、当該遺伝子の産物は細胞質およびミトコンドアの両方に局在する（Sass et al., J. Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)）。フマル酸還元酵素は、２つの可溶性の酵素であるＦＲＤＳ１（Enomoto, DNA. Res. 3:263-267 (1996)）ならびにＦＲＤＳ２（Muratsubaki, Arch. Biochem. Biophys. 352:175-181 (1998)）によってコードされており、細胞質およびプロミトコンドリアにそれぞれ局在し、グルコースに基づく嫌気性の成長に必要とされる（Arikawa, Microbiol Lett. 165:111-116 (1998)）。E. coliは、活性なリンゴ酸脱水素酵素を有していることが知られている。E. coliは、酸素の利用可能性の異なる条件下においてそれぞれ活性な、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣによってコードされている３つのフマラーゼを有している。E. coliにおけるフマル酸還元酵素は４つのサブユニットによって構成されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４５において同定されている。
【０３９５】
【表４５】
2013504326.tif 000047
【０３９６】
スクシニル−ＣｏＡ転移酵素
スクシニル−ＣｏＡ転移酵素は、ＣｏＡアクセプタ分子にＣｏＡ部分を転移する一方で、コハク酸塩へのスクシニル−ＣｏＡの変換を触媒する。多くの転移酵素が、幅広い特異性を有しており、したがって特に、酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、２−メチルアセト酢酸塩、３−ケトヘキサン酸塩、３−ケトペンタン酸塩、吉草酸塩、クロトン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸塩、プロピオン酸塩、酢酸ビニル、酪酸塩のように広範なＣｏＡアクセプタを利用し得る。
【０３９７】
スクシニル−ＣｏＡへのコハク酸塩の変換は、ＡＴＰまたはＧＴＰの直接的な消費を必要としない転移酵素によって理想的に行われる。この種類の反応は、多くの生物に共通している。この反応に対する酵素の最上の候補物は、おそらくスクニシル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素である。この酵素は、３−ケト酸に３−ケトアシル−ＣｏＡを変換する一方で、スクシニル−ＣｏＡにコハク酸塩を変換する。例示的なスクニシル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素は、Helicobacter pylori（Corthesy-Theulaz et al., J. Biol. Chem. 272:25659-25667 (1997)）、Bacillus subtilis（Stols et al., Protein. Expr. Purif. 53:396-403 (2007)）およびHomo sapiens （Fukao et al., Genomics, 68:144-151 (2000)；およびTanaka, Mol. Hum. Reprod. 8:16-23 (2002)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４６に特定されている。
【０３９８】
【表４６】
2013504326.tif 000048
【０３９９】
また、スクシニル−ＣｏＡへのコハク酸塩の変換は、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素によって触媒される。Clostridium kluyveriのｃａｔ１の遺伝子産物は、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素活性を示す（Sohling, J Bacteriol. 178:871-880 (1996)）。さらに、当該活性は、Trichomonas vaginalis（van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418 (2008)）およびTrypanosoma brucei（Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４７に特定されている。
【０４００】
【表４７】
2013504326.tif 000049
【０４０１】
見込みのあるさらなる他のＣｏＡアクセプタはコハク酸ベンジルである。スクシニル−ＣｏＡ：（Ｒ）−コハク酸ベンジル−ＣｏＡ転移酵素は、生物（例えばThauera aromatica）におけるトルエンのための嫌気性の分解経路の一部として機能する（Leutwein and Heider, J. Bact. 183(14) 4288-4295 (2001)）。相同物は、AzoarcusのＴ種、Aromatoleum aromaticumのＥｂＮ１およびGeobacter metallireducensのＧＳ−１５に見出され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４８に特定されている。
【０４０２】
【表４８】
2013504326.tif 000050
【０４０３】
最後に、ｙｇｈＨは、E. coliにおけるプロピオニル−ＣｏＡ：コハク酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードしている（Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629）。類似の相同物は、例えば、Citrobacter youngaeのＡＴＣＣ  ２９２２０、Salmonella enterica arizonae serovar亜種およびYersinia intermediaのＡＴＣＣ  ２９９０９に見出され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表４９に特定されている。
【０４０４】
【表４９】
2013504326.tif 000051
【０４０５】
スクシニル−ＣｏＡ合成酵素
S. cerevisiaeのＬＳＣ１遺伝子およびＬＳＣ２遺伝子、ならびにE. coliのｓｕｃＣ遺伝子およびｓｕｃＤ遺伝子の産物は、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素の複合体を天然に形成する。当該複合体は、１つのＡＴＰの同時の消費とともに、コハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成を触媒しており、この反応は生体内において可逆的な反応である（Przybyla-Zawilask et al., Eur. J. Biochem. 258(2):736-743 (1998)およびBuck et al., J. Gen. Microbiol. 132(6):1753-1762 (1986)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５０に特定されている。
【０４０６】
【表５０】
2013504326.tif 000052
【０４０７】
メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素
スクシニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素（ＭＣＭ）によって（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡに変換され得る。E. coliにおいて、可逆的なアデノシルコバラミン依存性の転位酵素は、プロピオン酸塩へのコハク酸塩の変換を導く３段階の経路に関与する（Haller, Biochemistry 39:4622-9 (2000)）。ＭＣＭは、Escherichia coliにおけるｓｃｐＡ遺伝子（Haller, Biochemistry 39: 4622-4629 (2000)；およびBobik, Anal. Bioanal. Chem. 375:344-349 (2003)）およびHomo sapiensにおけるｍｕｔＡ遺伝子（Padovani, Biochemistry 45:9300-9306 (2006)）によってコードされている。いくつかの他の生物において、ＭＣＭは、αサブユニットおよびβサブユニットを含んでおり、２つの遺伝子によってコードされている。２つのサブユニットのタンパク質をコードしている例示的な遺伝子の候補物は、Propionibacterium fredenreichiiのshermani種のｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ（Korotkova, J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)）ならびにMethylobacterium extorquensのｍｃｍＡおよびｍｃｍＢ（Korotkova, J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)）である。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５１に特定されている。
【０４０８】
【表５１】
2013504326.tif 000053
【０４０９】
E. coliのｓｐｃＡ遺伝子産物に対する高い相同性に基づいて同定されているさらなる酵素の候補物は、以下の表５２において同定されている。
【０４１０】
【表５２】
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【０４１１】
また、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素触媒作用性の遺伝子に隣接した遺伝子は、最大の活性に必要であるという証拠がさらに存在する。例えば、M. extorquens由来のｍｅａＢ遺伝子は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素と複合体を形成し、インビトロにおける転位酵素活性を刺激し、おそらく当該転位酵素を不可逆的な不活性化から保護することが証明されている（Korotkova, J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)）。M. extorquensのｍｅａＢ遺伝子産物は、染色体上においてｓｃｐＡに隣接しているE. coliのａｒｇＫ遺伝子の産物と非常に類似している（ＢＬＡＳＴｐ：４５％同一性、期待値：４ｅ−６７）。P. freudenreichiiにおけるｍｅａＢ相同物の配列はGenBankに登録されていない。しかし、Propionibacterium acnesのＫＰＡ１７１２０２の遺伝子産物であるＹＰ＿０５５３１０．１は、M. extorquensのｍｅａＢのタンパク質と５１％同一であり、また、その遺伝子は染色体上においてメチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素遺伝子に隣接している。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５３に特定されている。
【０４１２】
【表５３】
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【０４１３】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＭＭＣＥ）は、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡおよび（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡを相互変換する酵素である。ＭＭＣＥは、奇数の脂肪酸およびアミノ酸（バリン、イソロイシンおよびメチオニン）の分解に必須な酵素である。メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、例えばBacillus subtilis（ＹｑｊＣ）（Haller, Biochemistry. 39:4622-4629 (2000)）、Homo sapiens（ＹｑｊＣ）（Fuller, Biochem. J 213:643-650 (1983)）、Rattus norvegicus（Ｍｃｅｅ）（Bobik, J Biol Chem. 276:37194-37198 (2001)）、Propionibacterium shermanii（ＡＦ４５４５１１）（Haller, Biochemistry 39:4622-9 (2000)；McCarthy, Structure 9:637-46 (2001)および（Fuller, Biochem. J 213:643-650 (1983)）およびCaenorhabditis elegans（ｍｍｃｅ）（Kuhnl et al., FEBS J 272:1465-1477 (2005)）のような生物に存在する。Bacillus cereusにおけるさらなる遺伝子の候補物であるＡＥ０１６８７７は、性質決定されている他の酵素に対して高い配列の相同性を有している。ＭＭＣＥの活性は、用いられるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素が、メチルマロニル−ＣｏＡのＳ型の立体異性体を要求する場合に必要とされる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５４に特定されている。
【０４１４】
【表５４】
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【０４１５】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、E. coliにおいてプロピオニル−ＣｏＡへのメチルマロニル−ＣｏＡの変換を触媒するビオチン非依存性の酵素である（Benning, Biochemistry. 39:4630-4639 (2000)；およびHaller, Biochemistry. 39:4622-4629 (2000)）。E. coliの酵素の立体特異性は報告されていないが、Propionigenium modestum（Bott et al., Eur. J. Biochem. 250:590-599 (1997)）およびVeillonella parvula(Huder, J. Biol. Chem. 268:24564-24571 (1993)）における酵素は、メチルマロニル−ＣｏＡのＳ型の立体異性体の脱カルボキシル化を触媒する（Hoffmann, FEBS. Lett. 220:121-125 (1987)。P. modestum由来およびV. parvula由来の酵素は、（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡを脱カルボキシル化するだけではなく、エネルギーを生成するための手段として、細胞膜を越えてナトリウムイオンを輸送するポンプを作り出す複数のサブユニットによって構成されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５５に特定されている。
【０４１６】
【表５５】
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【０４１７】
〔実施例４〕
（スレオニンを介したグルコースからのプロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路）
実施例１および２に加えて、スレオニンを介したグルコースからのプロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路が、図２に例示されている。ＰＥＰは、実施例３に記載のように、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼのいずれかを介してオキサロ酢酸塩に変換される。代替的に、ＰＥＰは、ピルビン酸キナーゼによってピルビン酸塩にまず変換され、それから実施例３に記載のように、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素またはピルビン酸カルボキシラーゼによってオキサロ酢酸塩に変換される。オキサロ酢酸塩は、高い収量のために改変されている天然のスレオニン経路によってスレオニンに変換される。当該スレオニンは、脱アミノ化されて２−オキソブタン酸塩を形成し、それからプロピオニル−ＣｏＡに変換される。１つの代替経路において、２−オキソブタン酸塩は、デカルボキシラーゼによってプロピオンアルデヒドに変換され、当該プロピオンアルデヒドは、それからプロパノール脱水素酵素によってｎ−プロパノールに還元される。
【０４１８】
スレオニン脱アミノ化酵素
２−オキソブタン酸塩（または２−ケト酪酸塩）へのスレオニンの変換は、スレオニン脱アミノ化酵素によって達成され得る。当該酵素は、ｉｌｖＡ（Calhoun et al., J. Biol. Chem. 248(10):3511-6, (1973)）およびｔｄｃＢ（Umbarger et al., J. Bacteriol. 73(1):105-12, (1957)；Datta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 84(2): 393-7(1987)）から選択される１つ以上の遺伝子によってコードされている。Rhodospirillum rubrumは、スレオニン脱アミノ化酵素を含んでいるさらなる例示的な生物を代表している（Feldberg et al., Eur. J. Biochem. 21(3): 438-46 (1971); U.S. Patent 5,958,745）。この変化を起こさせるための例示的な酵素の詳細は以下に示されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５６に特定されている。
【０４１９】
【表５６】
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【０４２０】
２−オキソブタン酸脱水素酵素
２−オキソブタン酸塩（２−ケト酪酸塩）は、ピルビン酸蟻酸脱離酵素およびピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化する酵素を介してプロピニル−ＣｏＡに変換され得る。ピルビン酸蟻酸脱離酵素を活性化する酵素は、ｐｆｌＡ遺伝子によってコードされており、ピルビン酸蟻酸脱離酵素は、ｐｆｌＢおよびｔｄｃＥから選択される遺伝子によってコードされている。この変化を起こさせるためのこれらの例示的な酵素に関する詳細はすでにが挙げられている。
【０４２１】
代替的に、２−オキソブタン酸塩は、ピルビン酸脱水素酵素、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素（ＰＦＯＲ）または２−ケト酸脱水素酵素の機能性を有している任意の他の酵素によってプロピニル−ＣｏＡに変換され得る。また、当該酵素は、アセチル−ＣｏＡへのピルビン酸塩の変換能を有している。例示的なピルビン酸脱水素酵素は、例えば、E. coli（Bisswanger, H., J. Biol. Chem. 256:815-822 (1981)；Bremer, J., Eur.J. Biochem. 8:535-540 (1969)；Gong et al., J. Biol. Chem. 275:13645-13653 (2000)）、B. subtilis（Nakano et al., J.Bacteriol. 179:6749-6755 (1997)）、K. pneumonia（Menzel et al., J.Biotechnol. 56:135-142 (1997)）、R. norvegicus（Paxton et al., Biochem. J. 234:295-303 (1986)）に存在する。例示的な遺伝子の情報は以下に与えられている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５７に特定されている。
【０４２２】
【表５７】
2013504326.tif 000059
【０４２３】
例示的なＰＦＯＲ酵素としては、例えば、E. coliにおいてクローン化され、発現され、酸素の存在下において数日にわたって安定な活性状態の組換え酵素を生じる、Desulfovibrio africanus由来の酵素が挙げられる（Pieulle et al., J. Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)）。酸素による安定性は、ＰＦＯＲでは相対的にまれであり、D. africanusの酵素のポリペプチド鎖における６０残基のアミノ酸が伸長することによってもたらされることが報告されている。また、M. thermoaceticaのＰＦＯＲは、十分に性質決定されており（Menon, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)）、独立栄養性の成長の間におけるピルビン酸塩の合成に対して高い活性を有していることがさらに示された（Furdui, J Biol Chem. 275:28494-28499 (2000)）。さらに、E. coliは、M. thermoaceticaのＰＦＯＲと５１％同一であるタンパク質をコードしている性質決定されていないオープンリーディングフレームであるｙｄｂＫを有している。E. coliにおけるピルビン酸酸化還元酵素活性についての証拠が説明されている（Blaschkowski, Eur. J Biochem. 123:563-569 (1982)）。これらの例示的なＰＦＯＲ酵素のタンパク質の配列は、以下に示されているように以下のGenBank登録番号および／またはＧＩ番号によって特定され得る。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が説明されている（Ragsdale, Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５８に特定されている。
【０４２４】
【表５８】
2013504326.tif 000060
【０４２５】
プロピオニル−ＣｏＡの生成のためのさらなるルートが、参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許第５，９５８，７４５号に開示されている。そのような１つのルートは、ピルビン酸オキシダーゼによって２−ケト酪酸塩をプロピオン酸塩に変換すること、およびアシル−ＣｏＡ合成酵素を介してプロピオン酸塩をプロピオニル−ＣｏＡに変換することに関与する。
【０４２６】
２−オキソブタン酸デカルボキシラーゼ
ケト酸デカルボキシラーゼは、プロピオンアルデヒドへの２−オキソブタン酸塩の変換を触媒し得る。いくつかの２−ケト酸デカルボキシラーゼが同定されている。この段階の酵素の候補物としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１）、ベンゾイル蟻酸デカルボキシラーゼ（４．１.１．７）、α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７１）、分枝鎖状のα−ケト酸デカルボキシラーゼ（４．１．１．７２）およびインドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７４）が挙げられる。これらの分類のデカルボキシラーゼはＮＡＤＨ−非依存性であり、それらは補助因子としてチアミン二リン酸を利用し、酵素結合性の補助因子との基質の相互作用は、酵素活性化のための律速段階であると考えられている（Hubner, Eur. J Biochem. 92:175-181 (1978)）。ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびベンゾイル蟻酸デカルボキシラーゼは、種々のケト酸にための広範な基質を有しており、構造的な詳細について性質決定されている。わずかなα−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼおよび分枝鎖状のα−ケト酸デカルボキシラーゼは、実験的に性質決定されている。しかし、これらの酵素はまた、種々のケト酸の基質を脱カルボキシル化すると考えられる。
【０４２７】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）（ケト酸デカルボキシラーゼとも呼ばれる）は、アセトアルデヒドへのピルビン酸塩の脱カルボキシル化を触媒するアルコール発酵における重要な酵素である。Saccharomyces cerevisiae由来の酵素は、脂肪族の２−ケト酸（２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸塩、３−ヒドロキシピルビン酸塩および２−フェニルピルビン酸塩が挙げられる）に対する広範な基質を有している（２２）。Zymomonas mobilis由来のＰＤＣは、ｐｄｃによってコードされており、異なる基質に対する親和性を変化させる定方向性の遺伝工学的な研究の対象となっている（Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)）。また、Saccharomyces cerevisiae由来のＰＤＣは、大規模に研究され、活性を変化させるために改変され、E. coliにおいて機能的に発現されている（Li, Biochemistry. 38:10004-10012 (1999); ter Schure, Appl. Environ. Microbiol. 64:1303-1307 (1998)およびKillenberg-Jabs, Eur. J. Biochem. 268:1698-1704 (2001)）。この酵素の結晶構造は利用可能である（Killenberg-Jabs, Eur. J. Biochem. 268:1698-1704 (2001)）。十分に性質決定されているＰＤＣの他の候補物としては、Acetobacter pasteurians 由来の酵素（Chandra, Arch. Microbiol. 176:443-451 (2001)）、およびKluyveromyces lactis由来の酵素（Krieger, Eur. J. Biochem. 269:3256-3263 (2002)）が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表５９に特定されている。
【０４２８】
【表５９】
2013504326.tif 000061
【０４２９】
ＰＤＣと同様に、ベンゾイル蟻酸デカルボキシラーゼは、広範な基質を有しており、酵素工学的な研究の対象となっている。Pseudomonas putida由来の酵素は大規模に研究されており、この酵素の結晶構造は利用可能である（Polovnikova et al, Biochemistry 42:1820-1830 (2003)；およびHasson et al., Biochemistry 37:9918-9930 (1998)）。Pseudomonas putidaの酵素の活性部位における２つの残基の部位特異的な突然変異生成は、天然に存在する基質および天然に存在しない基質の親和性（Ｋｍ）を変化させた（Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)）。この酵素の機能は、定方向性の改変によってさらに変更されている（Lingen et al., Chembiochem. 4:721-726 (2003)；およびLingen, Protein Eng 15:585-593 (2002)）。ｍｄｌＣによってコードされているPseudomonas aeruginosa由来の酵素は、実験的に性質決定されている（Barrowman, FEMS Microbiology Letters 34:57-60 (1986)）。Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas fluorescensおよび他の生物に由来する遺伝子のさらなる候補物は、配列の相同性によって推測され得るか、またはPseudomonas putidaにおいて開発されている成長選抜系を用いて同定さ得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６０に特定されている。
【０４３０】
【表６０】
2013504326.tif 000062
【０４３１】
２−オキソ酸を脱カルボキシル化可能な第３の酵素は、α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ＫＧＤ）である。この分類の酵素の基質範囲は、これまで研究されていない。Mycobacterium tuberculosis由来のＫＤＣ（Tian, Proc Natl Acad Sci U S. A 102:10670-10675 (2005)）は、Genomaticaにおける他の内部プロジェクトにおいてクローン化され、機能的に発現されている。しかし、ＫＤＣは大きく（〜１３０ｋＤ）、ＧＣリッチであるため、株の改変にとって理想的な候補物ではない。ＫＤＣの酵素活性は、Rhizobiaのいくつかの種（Bradyrhizobium japonicumおよびMesorhizobium lotiが挙げられる）において検出されている（Green, J Bacteriol. 182:2838-2844 (2000)）。ＫＤＣをコードしている遺伝子はこれらの生物において単離されていないが、ゲノムの配列は利用可能であり、それぞれのゲノムにおけるいくつかの遺伝子は、推定上のＫＤＣとして注釈されている。また、Euglena gracilis由来のＫＤＣは性質決定されているが、この活性に関連する遺伝子は、これまで同定されていない（Shigeoka, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991)）。Ｎ末端から始じまる最初の２０アミノ酸は、ＭＴＹＫＡＰＶＫＤＶＫＦＬＬＤＫＶＦＫＶと配列決定された（Shigeoka, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991)）。当該遺伝子は、このＮ末端配列を含んでいる遺伝子の候補物のＫＤＣ活性を試験することによって同定され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６１に特定されている。
【０４３２】
【表６１】
2013504326.tif 000063
【０４３３】
この段階を触媒する第４の酵素の候補物は、分枝鎖状のα−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＢＣＫＡ）である。この分類の酵素は、炭素数３〜６の鎖長における種々のる化合物に対して作用することが示されている（Oku, J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988)；およびSmit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)）。Lactococcus lactisにおける酵素は、分枝鎖状および直鎖状の種々の基質（２−オキソブタン酸塩、２−オキソヘキサン酸塩、２−オキソペンタン酸塩、３−メチル−２−オキソブタン酸塩およびイソカプロン酸塩）に対して性質決定されている（Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)）。当該酵素は、構造的に性質決定されている（Berthold et al., Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 63:1217-1224 (2007)）。Lactococcus lactisの酵素およびZymomonas mobilisのピルビン酸デカルボキシラーゼの配列間の整列化は、触媒作用性のアミノ酸残基および基質を認識するアミノ酸残基はほぼ同一であるということを示しており（Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)）、したがってこの酵素は、定方向性の改変のための見込みのある候補物である。ＢＣＫＡによるα−ケトグルタル酸の脱カルボキシル化は、Bacillus subtilisにおいて検出されたが、この活性は、他の分枝鎖状の基質に対する活性に対して相対的に低く（５％）（Oku, J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988)）、この酵素をコードしている遺伝子はこれまで同定されていない。さらなるＢＣＫＡ遺伝子の候補物は、Lactococcus lactisのタンパク質の配列に対する相同性によって同定され得る。この酵素に対してＢＬＡＳＴｐにおいて高スコアに適合するものの多くは、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７４）として注釈されている。インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＩＰＤＡ）は、植物、および植物の細菌においてインドールアセトアルデヒドへのインドールピルビン酸の脱カルボキシル化を触媒する酵素である。この遺伝子／タンパク質は以下の表６２に特定されている。
【０４３４】
【表６２】
2013504326.tif 000064
【０４３５】
Homo sapiensおよびBos taurusに由来するミトコンドリアの分枝鎖状のケト酸脱水素酵素複合体のＥ１サブユニットから得られる、組換えの分枝鎖状のα−ケト酸デカルボキシラーゼ酵素は、E. coliにおいてクローン化され、機能的に発現されている（Wynn, J. Biol. Chem. 267:12400-12403 (1992)；Davie, J. Biol. Chem. 267:16601-16606 (1992) and Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:1881-1887 (1992)）。これらの研究において、著者らは、ＧｒｏＥＬシャペロンおよびＧｒｏＥＳシャペロンの共発現がデカルボキシラーゼの特異的な活性を５００倍に増強させることを見出した（Wynn, J. Biol. Chem. 267:12400-12403 (1992)）。これらの酵素は、２つのαサブユニットおよび２つのβサブユニットによって構成されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６３に特定されている。
【０４３６】
【表６３】
2013504326.tif 000065
【０４３７】
〔実施例５〕
（マロニル−ＣｏＡを介したグルコースからのプロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路）
実施例１および２に加えて、マロニル−ＣｏＡを介したプロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、図３に例示されている。アセチル−ＣｏＡはマロニル−ＣｏＡを形成するためにカルボキシル化される。これは、それからマロン酸セミアルデヒドに還元され、続いて３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）に変化させられる。３ＨＰはプロピオニル−ＣｏＡシンターゼを介してプロピオニル−ＣｏＡに変換される。
【０４３８】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ
多サブユニットのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体（ＡＣＣ）は、細菌の間に幅広く保存されており、アセチル−ＣｏＡおよび重炭酸塩によるマロニル−ＣｏＡのＡＴＰ依存性の形成を触媒する。この反応は、脂肪酸の生合成に最初に関与する段階としての役割を担い、当該酵素は、E. coli（Freiberg et al., J. Biol. Chem. 279: 26066-26073 (2004)）、酵母（Zhang, Proc. Natl. Acad. Sci. U S. A. 101:5910-5915 (2004)）、Bacillus subtilis（Freiberg et al., J. Biol. Chem. 279:26066-26073 (2004)）および他の生物（Barber, Biochim. Biophys. Acta 1733:1-28 (2005)）における抗菌剤および阻害剤の開発する試みにおいて標的とされている。E. coliおよび多くの他の細菌において、ＡＣＣは、ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣおよびａｃｃＤによってコードされている４つのサブユニットによって構成されている（Choi-Rhee, J. Biol. Chem. 278:30806-30812 (2003)）。ａｃｃＢおよびａｃｃＣの２つのサブユニットの発現は、ａｃｃＢの遺伝子産物によって自己調節されている（James, J. Biol. Chem. 279:2520-2527 (2004)）。酵母において、当該酵素は、２つの遺伝子ｈｆａ１およびａｃｃ１によってコードされている。ビオチン：アポタンパク質リガーゼをコードしているｂｐｌ１遺伝子は、酵素の機能に必要とされる。
【０４３９】
古細菌の分類学上のグループであるSulfolobalesの独立栄養性のメンバーは、３−ヒドロキシプロピオン酸回路と関連して、高いレベルのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を示す（Chuakrut, J. Bacteriol. 185:938-947 (2003)；およびHugler, Eur. J. Biochem. 270:736-744 (2003)）。Metallosphaera sedulaにおいて、アシル−ＣｏＡカルボキシラーゼのホロ酵素は、３つの遺伝子（Ｍｓｅｄ＿０１４８（ビオチン／リポイル接着））、Ｍｓｅｄ＿０１４７（ビオチンカルボキシラーゼ）およびＭｓｅｄ＿１３７５（カルボキシル転移酵素））によってコードされているサブユニットによって構成されている多量体である。当該酵素は、精製され、性質決定され、二機能性であり、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡと反応することが見出された。Acidanus brierleyi由来の二機能性の古細菌のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、３つの遺伝子によってコードされており、E. coliにおいてクローン化され、性質決定されている（Chuakrut, J. Bacteriol. 185:938-947 (2003）。A. brierleyiのアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子および隣接領域の配列は、登録番号ＡＢ０８８４１９のもとに日本のＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に送られた。これらの古細菌の酵素は、高い活性を示すが、最適温度は６５℃であることに注意すべきである（Chuakrut, J. Bacteriol. 185:938-947 (2003)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６４に特定されている。
【０４４０】
【表６４】
2013504326.tif 000066
【０４４１】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素およびマロン酸セミアルデヒド還元酵素
３−ＨＰへのマロニル−ＣｏＡの還元は、アルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素の機能性を有している二機能性のマロニル−ＣｏＡ還元酵素によって実現される。この活性を有しているＮＡＤＰＨ依存性の酵素は、Chloroflexus aurantiacusにおいて性質決定されており、当該酵素は３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関与する（Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002); and Strauss, Eur. J. Biochem. 215:633-643 (1993)）。この酵素は、３００ｋＤの分子量を有しており、非常に基質特異的であり、他の既知の酸化還元酵素と配列の類似性をほとんど示さない（Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)）。他の生物においてこの特異的な反応を触媒する酵素は示されていない。しかし、他の生物が類似の経路を有し得るというバイオインフォマティクスの証拠が存在する（Klatt, Environ. Microbiol. 9:2067-2078 (2007)。他の生物の酵素の候補物（Roseiflexus castenholzii、Erythrobacter種のＮＡＰ１および海洋のガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０が挙げられる）は、配列の類似性によって推測され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６５に特定されている。
【０４４２】
【表６５】
2013504326.tif 000067
【０４４３】
代替的に、３−ＨＰへのマロニル−ＣｏＡへの還元は、２つの別個の酵素（ＣｏＡをアシル化するアルデヒド脱水素酵素および第１級アルコール脱水素酵素）によって触媒され得る。このルートによって、マロニル−ＣｏＡは、マロン酸セミアルデヒド脱水素酵素またはマロニル−ＣｏＡ還元酵素によってマロン酸セミアルデヒド（ＭＳＡ）にまず還元される。ＭＳＡはそれから３−ＨＰ脱水素酵素によって３−ＨＰに変換される。
【０４４４】
マロニルＣｏＡ還元酵素は、好熱好酸性の古細菌における、３−ヒドロキシプロピオン酸回路を介した独立栄養性の炭素固定にとって重要な酵素である（Berg, Science 318:1782-1786 (2007)；およびThauer, Science 318:1732-1733 (2007)）。当該酵素は、ＮＡＤＰＨを補助因子として利用しており、MetallosphaeraならびにSulfolobus亜種において性質決定されている（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)；およびHugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)）。Metallosphaera sedulaにおけるＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされている酵素は、マロニル−ＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに変換し、所定の方向に作用することが知られている（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)；およびBerg, Science 318:1782-1786 (2007)）。Sulfolobus tokodaii由来のマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている遺伝子は、クローン化され、E. coliにおいて異種的に発現された（Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006)。これらの酵素のアルデヒド脱水素酵素の機能性は、Chloroflexus aurantiacus由来の二機能性の脱水素酵素と類似しているが、配列の類似性はほとんど存在していない。マロニル−ＣｏＡ還元酵素の両方の候補物は、アスパラギン酸セミアルデヒドへのアスパルチル−４−リン酸塩の還元および同時の脱リン酸化を触媒する酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素と高い配列の類似性を有している。さらなる遺伝子の候補物は、他の生物（Sulfolobus solfataricusおよびSulfolobus acidocaldariusが挙げられる）におけるタンパク質にとっての配列の相同性によって見出され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６６において同定されている。
【０４４５】
【表６６】
2013504326.tif 000068
【０４４６】
３−ＨＰへのマロン酸セミアルデヒドの後の変換は、３−ＨＰ脱水素酵素活性を有している酵素によって実現され得る。３つの酵素（ＮＡＤＨ依存性の３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ依存性のマロン酸セミアルデヒド還元酵素およびＮＡＤＨ依存性の３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素）は、これらの変換を触媒することが知られている。ＮＡＤＨ依存性の３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素は、細菌および植物において、プロピオン酸塩からのβ−アラニンの生合成経路に関与すると考えられている（Rathinasabapathi, Journal of Plant Pathology 159:671-674 (2002)；およびStadtman, A. J. Am. Chem. Soc. 77:5765-5766 (1955)）。この酵素は、あらゆる生物における遺伝子とこれまで関連づけられていない。ＮＡＤＨ依存性のマロン酸セミアルデヒド還元酵素は、独立栄養性のＣＯ２固定細菌における逆反応を触媒する。当該酵素の活性は、Metallosphaera sedulaにおいて検出されているが、遺伝子の同一性は知られていない（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)）。
【０４４７】
また、いくつかの３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素は、マロン酸セミアルデヒドを３−ＨＰに変換することが示されている。この活性を示す遺伝子の３つの候補物は、Pseudomonas aeruginosaのＰＡＯ１由来のｍｍｓＢ（Gokam et al., U.S. Patent 7,393,676 (2008)）、Pseudomonas putidaのＫＴ２４４０由来のｍｍｓＢ（Liao, U.S. Patent Publication 2005-0221466 (2005)）、および、Pseudomonas putidaのＥ２３由来のｍｍｓＢ（Chowdhury, Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:2043-2047 (1996)）である。Pseudomonas putidaのＥ２３由来のタンパク質は、性質決定され、E. coliにおいて機能的に発現されているが、３−ＨＰに対するその活性は相対的に低かった（Chowdhury, Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:2043-2047 (1996)）。また、Alcaligenes faecalisのＭ３Ａにおける３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有している酵素が同定されている（Liaoの米国特許出願公開第２００５−０２２１４６６号（２００５）；およびLiaoの米国特許出願公開第２００５−０２２１４６６号（２００５））。他の生物（Rhodobacter spaeroides）に由来するさらなる遺伝子の候補物は配列の類似性によって推測され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６７に同定され得る。
【０４４８】
【表６７】
2013504326.tif 000069
【０４４９】
また、３−ヒドロキシ酪酸塩活性を示す酵素（ＥＣ  １．１．１．６１）は、化学変化が非常に類似しているため、マロン酸セミアルデヒドを３−ＨＰに変換し得る。当該酵素は、Ralstonia eutropha（Bravo, J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)）、Clostridium kluyveri（Wolff, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)）、およびArabidopsis thaliana（Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)）において性質決定されている。マロン酸セミアルデヒドに対するこれらの酵素の活性は、これまで実験的に証明されていない。しかし、これらの酵素は、Genomaticaにおける他の内部プロジェクトにおいて研究されているため、３−ＨＰ脱水素酵素活性を容易に試験し得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６８に特定されている。
【０４５０】
【表６８】
2013504326.tif 000070
【０４５１】
プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ
プロピオニル−ＣｏＡへの３−ヒドロキシプロピオン酸塩（３ＨＰ）の変換は、プロピオニル−ＣｏＡシンターゼによって実現される。この段階は、Chloroflexus aurantiacusにおける単一の融合タンパク質によって触媒されることが知られている（Alber, J Biol. Chem. 277:12137-12143 (2002)）。当該タンパク質は、ＣｏＡリガーゼ、エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素およびエノイル−ＣｏＡ還元酵素によって構成されている。当該酵素は、ほぼ均質に３０倍まで精製され、５００および８００ｋＤａの間の非常に大きい天然の分子量を有している。好熱好酸性のMetallosphaera sedula（およびSulfolobaceaeファミリーのメンバー）において、この作用は、３つの異なる酵素である、３ＨＰをそのＣｏＡエステルへと活性化させる３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、３−ＨＰ−ＣｏＡをアクリロイル−ＣｏＡに変換する（続いてアクリロイル−ＣｏＡの還元によってプロピオニル−ＣｏＡが形成される）３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素によって触媒される。３−ＨＰ−ＣｏＡ合成酵素が報告されている（Alber, J Bacteriol. 190:1383-1389 (2008)）。タンパク質をコードしている遺伝子は配列決定され、Sulfolobus tokodaiiのゲノムにおいて相同性のタンパク質をコードしている遺伝子は同定され、類似の遺伝子はS. solfataricusおよびS. acidocaldariusに見出された。当該遺伝子は、Escherichia coli.において異種的に発現された。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表６９に特定されている。
【０４５２】
【表６９】
2013504326.tif 000071
【０４５３】
近年、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素およびアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素は、M. sedulaから精製され（Teufel, J Bacteriol. 191:4572-4581 (2009)）、コードしている遺伝子はM. sedulaのゲノムおよびSulfolobalesの他のメンバーのゲノムから同定され、組換え酵素は機能の証拠として産生された。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素およびアクリロイル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている遺伝子は、MetallosphaeraのゲノムまたはSulfolobusのゲノムにおいてクラスター形成していないことが結論付けられた。これらの２つの生物におけるプロピオニル−ＣｏＡシンターゼのそれぞれのドメインの比較によって、プロピオニル−ＣｏＡへの３ＨＰの変換を触媒する酵素は、これらの２つの系統において独立して進化していることが明らかにされている。M. sedula由来の３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素のGenBankのアクセッション番号および／またはＧＩ番号は以下の表７０に特定されている。
【０４５４】
【表７０】
2013504326.tif 000072
【０４５５】
アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素のGenBankのＩＤは、以下の表７１に特定されている。
【０４５６】
【表７１】
2013504326.tif 000073
【０４５７】
これらの２つの酵素をコードしている他の遺伝子の候補物は、配列の相同性検索によって得られ得る。
【０４５８】
実施例１および２に加えて、乳酸塩を介したプロピオニル−ＣｏＡの生成のための経路は、図４に例示されている。この経路は、プロピオニル−ＣｏＡの形成のための酸化還元について平衡化されたさらなる他のルートをもたらす。ピルビン酸塩は、還元されて乳酸塩を形成し、それから活性化されてラクチル−ＣｏＡを形成する。ラクチルＣｏＡは、脱水されてアクリロイル−ＣｏＡを形成し、それから還元されてプロピオニル−ＣｏＡを生成する。
【０４５９】
乳酸脱水素酵素
乳酸塩へのピルビン酸塩の変換は、乳酸脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．２７）によって触媒される。多くの乳酸脱水素酵素は詳細に説明されている（Garvie, Microbiol Rev 44:106-139 (1980)）。Escherichia coliの発酵性の乳酸脱水素酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換するために過剰発現される第１の候補物である（Bunch, Microbiology 143 ( Pt 1), 187-195 (1997)）。乳酸脱水素酵素の他の候補物は、この段階のために利用される（乳酸塩の形成に対して有利に働くピルビン酸塩に対する低いＫｍを有している酵素（例えばLactobacillus casei（Gordon, Eur. J Biochem. 67:543-555 (1976)）、Plasmodium falciparum（Brown et al., Biochemistry 43:6219-6229 (2004)）およびThermotoga maritime（Auerbach et al., Structure. 6:769-781 (1998)に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ）が挙げられる）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７２に特定されている。
【０４６０】
【表７２】
2013504326.tif 000074
【０４６１】
乳酸塩のＣｏＡ転移酵素
ラクチル−ＣｏＡへの乳酸塩の活性化は、プロピオン酸塩のＣｏＡ転移酵素（ＥＣ  ２．８．３．１）と関連づけられている乳酸−ＣｏＡ転移酵素活性によって触媒され得る。Clostridium propionicumは、特有の中間体としてアクリロイル−ＣｏＡを用いる非無作為化の経路を介してアラニンを発酵する。この経路において、乳酸塩は、プロピオニル−ＣｏＡまたはアセチル−ＣｏＡを補酵素Ａの供与体として用いて、プロオピオン酸塩：アセチル−ＣｏＡ  ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ  ２．８．３．１またはプロピオン酸塩  ＣｏＡ転移酵素）によって、ラクチルＣｏＡへと活性化される（Schweiger, FEBS Lett. 171:79-84 (1984)）。当該酵素は、モノカルボン酸塩（アクリル酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩が挙げられる）に対して幅広い基質特異性を示したが、重炭酸は利用されなかった。この酵素をコードしている遺伝子はクローン化された（Selmer, Eur. J Biochem. 269:372-380 (2002)）。他のプロピオン酸塩のＣｏＡ転移酵素は、この段階にとっての候補物（Clostridium propionicumのプロピオン酸塩  ＣｏＡ転移酵素の相同物が挙げられる）であり得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７３に特定されている。
【０４６２】
【表７３】
2013504326.tif 000075
【０４６３】
ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素
アクリロイル−ＣｏＡへのラクチル−ＣｏＡの脱水は、ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ  ４．２．１．５４）によって触媒される。Clostridium propionicumは、特有の中間体としてアクリロイル−ＣｏＡを用いる非ランダム化の経路を介してアラニンを発酵する（Schweiger, FEBS Lett. 171:79-84 (1984)）。この経路において、ラクチル−ＣｏＡは、ラクチル−ＣｏＡ脱水酵素によって脱水される（Hofmeister, Eur. J Biochem. 206:547-552 (1992)）。また、プロピオン酸塩のＣｏＡ転移酵素のクローン化によって、当該経路に必要とされるラクチル−ＣｏＡ脱水酵素の１つのサブユニットをコードしていると考えられる第２のＯＲＦ（ｌｃｄＢ）が同定された。ｌｃｄＢは２−ヒドロキシグリタリル−ＣｏＡ脱水素酵素のβサブユニットと類似している。ｌｃｄＢの相同物はこの段階におけるそれらの活性について試験される。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７４に特定されている。
【０４６４】
【表７４】
2013504326.tif 000076
【０４６５】
アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素
プロピオニル−ＣｏＡへのアクリロイル−ＣｏＡの変換は、アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素によって触媒される。アラニンを発酵させるClostridium propionicumにおいて、アクリロイル−ＣｏＡ還元酵素は、アクリロイル−ＣｏＡからの不可逆的なＮＡＤＨ依存性のプロピオニル−ＣｏＡの形成を触媒する。当該酵素は精製され、当該酵素のサブユニットのＮ末端は決定されている（Hetzel et al., Eur. J Biochem. 270:902-910 (2003)）。二量体のプロピオニル−ＣｏＡ脱水素酵素のサブユニットのＮ末端は、いくつかのClostridiaおよび関連する嫌気性の生物に由来するブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素のＮ末端と類似している（５５％以上の配列の同一性）。βおよびγサブユニットのＮ末端は、Megasphaera elsdenii由来の電子伝達性のフラビンタンパク質（ＥＴＦ）のＡサブユニットおよびＢサブユニットのＮ末端とそれぞれ４０％および３５％の配列の同一性を共有しており、他の嫌気性の生物に由来する推定上のＥＴＦのＮ末端と６０％以上の配列の同一性を共有している。Clostridium propionicumの完全なゲノム配列は利用可能ではないため、プロピオニル−ＣｏＡ脱水素酵素のサブユニットのＮ末端である“ＭＤＦＫＬＴＫＴＱＶＬＱＱＷＬＦＡＥＦＡＧＩＧＩＫＰＩＡＥ”（配列番号）が類似性の検索に用いられ、この段階のそれらの活性に対する以下のプロピオニル−ＣｏＡ脱水素酵素の相同物をもたらした。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７５に特定されている。
【０４６６】
【表７５】
2013504326.tif 000077
【０４６７】
三機能性のプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ｐｃｓ）遺伝子は、硫黄細菌ではない光栄養性の緑色の真正細菌であるChloroflexus aurantiacusからさらに同定された（Alber, J Biol. Chem. 277:12137-12143 (2002)）。プロピオニル−ＣｏＡシンターゼは、ＣｏＡリガーゼ、エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素およびエノイル−ＣｏＡ還元酵素によって構成されている２０１ｋＤａの天然の融合タンパク質である。当該酵素は、３−ヒドロキシプロピオン酸塩から、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ、アクリロイル−ＣｏＡ、それからプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する。この酵素はエノイル−ＣｏＡ還元酵素活性の全体または一部に利用され得る。遺伝子／タンパク質は以下の表７６に特定されている。
【０４６８】
【表７６】
2013504326.tif 000078
【０４６９】
〔実施例７〕
（グルコースからの１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの共生成のための経路）
この実施例では、１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの共生成の例示的な経路について説明する。
【０４７０】
１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）およびイソプロパノールおよび関連する産物を共生成する新規の経路は、本明細書に記載されている。図５の１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの共生成のための経路において、中心的な代謝の中間体は、スクシニル−ＣｏＡにまず導かれる。スクシニル−ＣｏＡの形成のために、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼのいずれかを介してオキサロ酢酸塩に変換される。代替的に、ＰＥＰは、ピルビン酸キナーゼによってピルビン酸塩にまず変換され、それからメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素またはピルビン酸カルボキシラーゼによってオキサロ酢酸塩に変換される。オキサロ酢酸塩は、還元的なＴＣＡ回路によってそれからスクシニル−ＣｏＡに変換される。スクシニル−ＣｏＡは、それからＣｏＡ依存性のアルデヒド脱水素酵素によってコハク酸セミアルデヒドに変換される。代替的に、コハク酸はコハク酸還元酵素によってコハク酸セミアルデヒドに変換され得る。コハク酸セミアルデヒドは、それから４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によって４−ヒドロキシ酪酸塩に還元される。アシル−ＣｏＡへの４−ＨＢの活性化は、ＣｏＡ転移酵素またはＣｏＡ合成酵素によって触媒される。代替的に、４−ＨＢは、４−ヒドロキシブチリルリン酸塩に変換され、それから４−ヒドロキシ酪酸ホスホ転移酵素によって４−ＨＢ−ＣｏＡに変化させられる。４−ＨＢ−ＣｏＡは、それから二機能性のＣｏＡ依存性のアルデヒド脱水素酵素／アルコール脱水素酵素、またはアルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素活性を有している２つの別個の酵素によって、１４−ＢＤＯに変換される。４−ＨＢ−ＣｏＡ中間体を回避するさらなる他の代替ルートは、カルボン酸還元酵素による４−ヒドロキシブチリルアルデヒドへの４−ＨＢの直接的な還元である。４−ヒドロキシブチリルアルデヒドは、それからアルコール脱水素酵素によって１４−ＢＤＯに還元される。ＣｏＡの中間体を回避するさらなる他のルートは、リン酸還元酵素による４−ヒドロキシブチリルアルデヒドへの４−ヒドロキシブチリルリン酸塩の還元である。イソプロパノールの生成のための経路は、上述の実施例１および２に記載のように進行する。
【０４７１】
１４−ＢＤＯおよびイソプロパノールを生成する生物の理論上の最大収量は、以下の反応式：
１２  グルコース→１０  ＩＰＡ＋６  １４−ＢＤＯ＋２４  ＣＯ２＋８  Ｈ２Ｏ
によって、消費される１モルのグルコースにつき、０．７７モルのイソプロパノールおよび０．４６モルの１４−ＢＤＯである（０．２６ｇ／ｇＩＰＡおよび０．２３ｇ／ｇ１４−ＢＤＯ）。
【０４７２】
〔実施例８〕
（グルコースからの１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの共生成のための経路）
この実施例では、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの共生成の例示的な経路について説明する。
【０４７３】
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）、イソプロパノールおよび関連する産物を共生成する新規の経路は、本明細書に記載されている。また、図６に示されている１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）およびイソプロパノールの共生成のための経路は、実施例６に記載のように形成される４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを経て進行する。このルートにおいて、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、脱水され、異性化されて、クロトニル−ＣｏＡを形成する。脱水反応およびビニル異性化反応は、二機能性の酵素である４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水酵素によって触媒される。クロトニル−ＣｏＡは、それから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに水和される。ＣｏＡ部分の除去および同時の還元は、３−ヒドロキシブチリルアルデヒドを生じさせる。３−ヒドロキシブチリルアルデヒド還元酵素によるアルデヒドの還元は、１３−ＢＤＯを最終的に生じさせる。代替的に、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素によって直接的に１３−ＢＤＯに変換され得る（アルコール形成）。いくつかの他の代替のルートが、この経路において考えられる。コハク酸塩は、スクシニル−ＣｏＡの形成を回避して、カルボン酸還元酵素によってコハク酸セミアルデヒドに変換され得る。４−ＨＢは、キナーゼによって４−ＨＢリン酸塩にリン酸化され、それから４−ＨＢ−ＣｏＡに変換され得る。最終的に３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、ＣｏＡ加水分解酵素、ＣｏＡ転移酵素またはＣｏＡ合成酵素によって脱アシル化され、それからカルボン酸還元酵素によって３−ヒドロキシブチルアルデヒドに最終的に還元され得る。
【０４７４】
イソプロパノールの生成のための経路は、上述の実施例１および２に記載のように進行する。
【０４７５】
１３−ＢＤＯおよびイソプロパノールを生成する生物の理論上の最大収量は、以下の反応式：
１３  グルコース→１０  ＩＰＡ＋６  １３−ＢＤＯ＋２４  ＣＯ２＋８  Ｈ２Ｏ
によって、消費される１モルのグルコースにつき、０．７７モルのイソプロパノールおよび０．４６モルの１３−ＢＤＯである（０．２６ｇ／ｇＩＰＡおよび０．２３ｇ／ｇ１３−ＢＤＯ）。
【０４７６】
〔実施例９〕
（グルコースからのメチルアクリル酸（ＭＭＡ）およびイソプロパノールの共生成のための経路）
この実施例では、メチルアクリル酸（ＭＭＡ）およびイソプロパノールの共生成の例示的な経路について説明する。
【０４７７】
メチルアクリル酸（ＭＭＡ）、イソプロパノールおよび関連する産物を共生成する新規の経路は、本明細書に記載されている。メチルアクリル酸（ＭＭＡ）の共生成のルートは図７および８に示されている。図７に示されているルートは、上述のように形成される４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを経て進行する。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、メチル転位酵素によって３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに変換される。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのＣｏＡ部分は、それからＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ加水分解酵素またはＣｏＡ合成酵素によって除去される。−ヒドロキシ基の脱水によって、ＭＡＡが最終的に生じる。このルートにおけるいくつかの重要な段階は、代替のルートによって回避され得る。例えば、コハク酸塩は、スクシニル−ＣｏＡの形成を回避し、コハク酸還元酵素によってコハク酸セミアルデヒドに直接的に変換され得る。４−ＨＢ−ＣｏＡへの４−ＨＢの変換は、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼおよび４−ヒドロキシ酪酸ホスホ転移酵素の酵素を介して中間体である４−ヒドロキシブチリルリン酸塩を経て進行し得る。３−ＨＩＢＣＯＡは中間体であるメタクリル−ＣｏＡを介してＭＡＡに変換され得る。イソプロパノールの生成のための経路は、上述の実施例１および２に記載のように進行する。
【０４７８】
図８に示されているＭＡＡの共生成のための代替ルートにおいて、スクシニル−ＣｏＡは、還元的なＴＣＡ回路を経て形成され、それからメチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素によってメチルマロニル−ＣｏＡに変換される。エピメラーゼは、メチルマロニル−ＣｏＡのＲ型の立体異性体をＳ型に変換するために必要とされ得る。ＣｏＡ依存性のアルデヒド脱水素酵素は、それからメチルマロニル−ＣｏＡをメチルマロン酸セミアルデヒドに変換する。脱水をともなう３−ヒドロキシイソ酪酸塩へのアルデヒドの還元によって、ＭＡＡが生じる。代替的に、メチルマロニル−ＣｏＡは、アルコールを形成するＣｏＡ還元酵素によって３−ヒドロキシイソ酪酸塩に変換される。さらなる他の代替のルートにおいて、メチルマロニル−ＣｏＡは、ＣｏＡ加水分解酵素、ＣｏＡ転移酵素またはＣｏＡ合成酵素によってマロン酸メチルに変換される。マロン酸メチルは、それからカルボン酸還元酵素によってメチルマロン酸セミアルデヒドに変換される。メチルマロン酸セミアルデヒドは、上述のようにＭＡＡに変換される。イソプロパノールの生成のための経路は、上述の実施例１および２に記載のように進行する。
【０４７９】
両方のＭＡＡの共生成のための経路は、以下の反応式：
３  グルコース→２  ＩＰＡ＋２  ＭＡＡ＋４  ＣＯ２＋４  Ｈ２Ｏ
によって、利用される１モルのグルコースにつき、それぞれ０．６７モルのイソプロパノールおよびＭＡＡの収量（０．２２ｇ／ｇイソプロパノールおよび０．３２ｇ／ｇＭＡＡ）をもたらす。
【０４８０】
〔実施例１０〕
（イソプロパノール、ならびに１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）またはメチルアクリル酸（ＭＡＡ）の生成における酵素の分類体系）
この実施例では、１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）またはメチルアクリル酸（ＭＡＡ）の生成のための、実施例７および９に記載の例示的な経路の酵素の分類体系を説明する。アセチル−ＣｏＡからのイソプロパノールの生成のための例示的な酵素は実施例１に記載されており、グルコースからのアセチル−ＣｏＡの生成のための例示的な酵素は実施例２に記載されている。
【０４８１】
ＰＥＰカルボキシキナーゼ
オキサロ酢酸塩へのホスホエノールピルビン酸塩の正味の変換は酸化還元的に中性であるが、この変換の機序は共生成の経路の全体のエネルギー論にとって重要である。オキサロ酢酸塩へのＰＥＰの変換の最も好ましい酵素は、ＰＥＰをカルボキシル化し、ＡＴＰを同時に形成するＰＥＰカルボキシキナーゼである。しかし、ほとんどの生物において、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、糖新生の作用に寄与し、１つのＡＴＰを消費してオキサロ酢酸塩をＰＥＰに変換する。S. cerevisiaeは、天然のＰＥＰカルボキシキナーゼであるＰＣＫ１が糖新生の機能を果たす生物の１つである（Valdes-Hevia, FEBS. Lett. 258:313-316 (1989)）。オキサロ酢酸塩の生成におけるＰＥＰカルボキシキナーゼの役割が、ＡＴＰを形成しないＰＥＰカルボキシキナーゼと比べて、ＰＥＰカルボキシキナーゼのジカルボン酸塩に対するより高いＫｍにおそらく起因して重要ではないと考えられるので、E.coliは、そのような他の生物である（Kim, Appl Environ Microbiol 70:1238-1241 (2004)）。それにもかかわらず、ＰＥＰからオキサロ酢酸塩に変換させるE.coliの天然のＰＥＰカルボキシキナーゼの活性は、E. coliのＫ−１２のｐｐｃ変異株において近年、証明されている（Kwon, Journal of Microbiology and Biotechnology 16:1448-1452 (2006)）。これらの株は、成長不良を示さず、高いＮａＨＣＯ３濃度においてコハク酸塩の生成を増強させた。いくつかの生物（特にルーメン細菌）において、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、ＰＥＰからのオキサロ酢酸塩の生成およびＡＴＰの生成にとって非常に有効である。E. coliにおいてクローン化されているＰＥＰカルボキシキナーゼの例としては、Mannheimia succiniciproducens由来のもの（Lee, Biotechnol. Bioprocess Eng. 7:95-99 (2002)）、Anaerobiospirillum succiniciproducens由来のもの（Laivenieks, Appl Environ Microbiol 63:2273-2280 (1997)）およびActinobacillus succinogenes由来のもの（Kim, Appl Environ Microbiol 70:1238-1241 (2004)）が挙げられる。また、内部実験においてHaemophilus influenzaによってコードされているＰＥＰカルボキシキナーゼ酵素は、ＰＥＰからのオキサロ酢酸塩の形成にとって非常に有効であることが見出されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７７に特定されている。
【０４８２】
【表７７】
2013504326.tif 000079
【０４８３】
この実施例において挙げられている後述の酵素にとってのこれらの（複数の）配列は、配列の類似性の検索を介したGenBankまたは他のデータベース（例えばＢＬＡＳＴｐ）におけるタンパク質の相同物を同定するために用いられ得る。結果として得られる相同物のタンパク質およびそれらの対応する遺伝子の配列は、選択される宿主細胞への形質転換に対してさらなるＤＮＡ配列を提供する。
【０４８４】
ＰＥＰカルボキシラーゼ
ＰＥＰカルボキシラーゼは、ＰＥＰからのオキサロ酢酸塩の形成に代替的な酵素を代表する。S. cerevisiaeは、ＰＥＰカルボキシラーゼを天然にコードしていないが、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を有している例示的な生物としては、E. coli（Kai, Arch. Biochem. Biophys. 414:170-179 (2003)）、Methylobacterium extorquens  ＡＭ１（Arps, J. Bacteriol. 175:3776-3783 (1993)）およびCorynebacterium glutamicum（Eikmanns, Mol. Gen. Genet. 218:330-339 (1989)）が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７８に特定されている。
【０４８５】
【表７８】
2013504326.tif 000080
【０４８６】
ピルビン酸キナーゼおよびメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシル転移酵素
ＰＥＰからオキサロ酢酸塩へのエネルギー的に効率的なルートは、２つの酵素的な活性（ピルビン酸キナーゼおよびメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシル転移酵素）を必要とする。ピルビン酸キナーゼは、ピルビン酸塩へのＰＥＰの、ＡＴＰを生成する変換を触媒し、S. cerevisiaeにおいて、ＰＹＫ１（Burke, J. Biol. Chem. 258:2193-2201 (1983)）およびＰＹＫ２（Boles et al., J. Bacteriol. 179:2987-2993 (1997)）の遺伝子によってコードされている。E. coliにおいて、この活性はｐｙｋＦおよびｐｙｋＡの遺伝子産物によって触媒される。メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシ転移酵素は、オキサロ酢酸塩へのピルビン酸塩の変換を触媒する。また、重要なことに、この反応は、プロピオニル−ＣｏＡへの（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡの変換を同時に触媒する（図１および２を参照）。１．３Ｓ、５Ｓおよび１２Ｓサブユニットによって構成されている例示的なメチルマロニル−ＣｏＡは、Propionibacterium freudenreichiiに見出され得る（Thornton et al., J. Bacteriol 175:5301-5308 (1993)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表７９に特定されている。
【０４８７】
【表７９】
2013504326.tif 000081
【０４８８】
ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼ
当該酵素の組合せは、ＰＥＰカルボキシラーゼと化学量論的に等しくＰＥＰをオキサロ酢酸塩に変換し得る。これらの酵素は、ピルビン酸キナーゼＰＹＫ１（Burke, J. Biol. Chem. 258:2193-2201 (1983)）またはＰＹＫ２（Boles et al., J. Bacteriol, 179:2987-2993 (1997)）、およびピルビン酸カルボキシラーゼであるＰＹＣ１（Walker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:1210-1217 (1991)）またはＰＹＣ２（２２４）（Walker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:1210-1217 (1991)）によってコードされている。ピルビン酸カルボキシラーゼの機能に対するいくつかの候補物は以下の表８０において同定されている。
【０４８９】
【表８０】
2013504326.tif 000082
【０４９０】
リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素
オキサロ酢酸塩は、還元的なサイクルにおいてＴＣＡ回路が作動しているとき、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、フマル酸還元酵素によってコハク酸塩に変換され得る。S. cerevisiaeは、ミトコンドリア、細胞質およびペルオキシソームにそれぞれ局在する、３コピーのリンゴ酸脱水素酵素ＭＤＨ１（McAlister-Henn, J. Bacteriol 169:5157-5166 (1987)）、ＭＤＨ２（Minard, Mol. Cell. Biol. 11:370-380 (1991)；およびGibson, J. Biol. Chem. 278:25628-25636 (2003)）およびＭＤＨ３（Steffan, J. Biol. Chem. 267:24708-24715 (1992)）を有している。S. cerevisiaeは、フマラーゼをコードしている遺伝子である１コピーのＦＵＭ１を含んでおり、当該遺伝子の産物は細胞質およびミトコンドアの両方に局在する（Sass et al., J. Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)）。フマル酸還元酵素は、２つの可溶性の酵素であるＦＲＤＳ１（Enomoto, DNA. Res. 3:263-267 (1996)）ならびにＦＲＤＳ２（Muratsubaki, Arch. Biochem. Biophys. 352:175-181 (1998)）によってコードされており、細胞質およびプロミトコンドリアにそれぞれ局在し、グルコースに基づく嫌気性の成長に必要とされる（Arikawa, Microbiol Lett. 165:111-116 (1998)）。E. coliは、活性なリンゴ酸脱水素酵素を有していることが知られている。E. coliは、酸素の利用可能性の異なる条件下においてそれぞれ活性な、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣによってコードされている３つのフマラーゼを有している。E. coliにおけるフマル酸還元酵素は４つのサブユニットによって構成されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８１において同定されている。
【０４９１】
【表８１】
2013504326.tif 000083
【０４９２】
スクシニル−ＣｏＡ転移酵素
スクシニル−ＣｏＡ転移酵素は、ＣｏＡアクセプタ分子にＣｏＡ部分を転移する一方で、コハク酸塩へのスクシニル−ＣｏＡの変換を触媒する。多くの転移酵素が、幅広い特異性を有しており、したがって特に、酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、２−メチルアセト酢酸塩、３−ケトヘキサン酸塩、３−ケトペンタン酸塩、吉草酸塩、クロトン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸塩、プロピオン酸塩、酢酸ビニル、酪酸塩のように広範なＣｏＡアクセプタを利用し得る。
【０４９３】
スクシニル−ＣｏＡへのコハク酸塩の変換は、ＡＴＰまたはＧＴＰの直接的な消費を必要としない転移酵素によって理想的に行われる。この種類の反応は、多くの生物に共通している。この反応に対する酵素の最上の候補物は、おそらくスクニシル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素である。この酵素は、３−ケト酸に３−ケトアシル−ＣｏＡを変換する一方で、スクシニル−ＣｏＡにコハク酸塩を変換する。例示的なスクニシル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素は、Helicobacter pylori（Corthesy-Theulaz et al., J. Biol. Chem. 272:25659-25667 (1997)）、Bacillus subtilis（Stols et al., Protein. Expr. Purif. 53:396-403 (2007)）およびHomo sapiens （Fukao et al., Genomics, 68:144-151 (2000)；およびTanaka, Mol. Hum. Reprod. 8:16-23 (2002)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８２に特定されている。
【０４９４】
【表８２】
2013504326.tif 000084
【０４９５】
スクシニル−ＣｏＡへのコハク酸塩の変換は、ＡＴＰまたはＧＴＰの直接的な消費を必要としない転移酵素によって理想的に行われる。この種類の反応は、多くの生物に共通している。この反応に対する酵素の最上の候補物は、おそらくスクニシル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素である。この酵素は、３−ケト酸に３−ケトアシル−ＣｏＡを変換する一方で、スクシニル−ＣｏＡにコハク酸塩を変換する。例示的なスクニシル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡ転移酵素は、Helicobacter pylori（Corthesy-Theulaz et al., J. Biol. Chem. 272:25659-25667 (1997)）、Bacillus subtilis（Stols et al., Protein. Expr. Purif. 53:396-403 (2007)）およびHomo sapiens （Fukao et al., Genomics, 68:144-151 (2000)；およびTanaka, Mol. Hum. Reprod. 8:16-23 (2002)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８３に特定されている。
【０４９６】
【表８３】
2013504326.tif 000085
【０４９７】
見込みのあるさらなる他のＣｏＡアクセプタはコハク酸ベンジルである。スクシニル−ＣｏＡ：（Ｒ）−コハク酸ベンジル−ＣｏＡ転移酵素は、生物（例えばThauera aromatica）におけるトルエンのための嫌気性の分解経路の一部として機能する（Leutwein and Heider, J. Bact. 183(14) 4288-4295 (2001)）。相同物は、AzoarcusのＴ種、Aromatoleum aromaticumのＥｂＮ１およびGeobacter metallireducensのＧＳ−１５に見出され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８４に特定されている。
【０４９８】
【表８４】
2013504326.tif 000086
【０４９９】
最後に、ｙｇｈＨは、E. coliにおけるプロピオニル−ＣｏＡ：コハク酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードしている（Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629）。類似の相同物は、例えば、Citrobacter youngaeのＡＴＣＣ  ２９２２０、Salmonella enterica arizonae serovar亜種およびYersinia intermediaのＡＴＣＣ  ２９９０９に見出され得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８５に特定されている。
【０５００】
【表８５】
2013504326.tif 000087
【０５０１】
スクシニル−ＣｏＡ合成酵素
S. cerevisiaeのＬＳＣ１遺伝子およびＬＳＣ２遺伝子、ならびにE. coliのｓｕｃＣ遺伝子およびｓｕｃＤ遺伝子の産物は、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素の複合体を天然に形成する。当該複合体は、１つのＡＴＰの同時の消費とともに、コハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成を触媒しており、この反応は生体内において可逆的な反応である（Bravo et al., J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８６に特定されている。
【０５０２】
【表８６】
2013504326.tif 000088
【０５０３】
ピルビン酸蟻酸リアーゼ
ピルビン酸蟻酸リアーゼは、アセチル−ＣｏＡおよび蟻酸塩へのピルビン酸塩の変換を触媒する酵素である。ピルビン酸蟻酸リアーゼは、嫌気性の酸化還元平衡の調整を補助するために用いられる原核生物に共通の酵素である。例示的な酵素は、Escherichia coli（Knappe, FEMS. Microbiol Rev. 6:383-398 (1990)）、Lactococcus lactis（Melchiorsen, Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344(2002)）、およびStreptococcus mutans.（Takahashi-Abbe, Oral. Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003)）に見出され得る。また、ミトコンドリアのピルビン酸蟻酸リアーゼは、真核生物であるChlamydomonas reinhardtiiにおいて同定されている（Hemschemeier, Eukaryot. Cell 7:518-526 (2008)；およびAtteia, J. Biol. Chem. 281:9909-9918 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８７に特定されている。
【０５０４】
【表８７】
2013504326.tif 000089
【０５０５】
蟻酸水素脱離酵素
蟻酸水素脱離酵素は、二酸化炭素および水素に蟻酸を変換するために使用され得る。例示的な蟻酸水素脱離酵素はEscherichia coliに見出され得る。E. coliの蟻酸水素脱離酵素は、ヒドロゲナーゼ３および蟻酸脱水素酵素−Ｈによって構成されている（Maeda, Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007)）。当該酵素は、ｆｈｌＡの遺伝子産物によって活性化される（Maeda, Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007)）。微量元素であるセレン、ニッケルおよびモリブデンの発酵培地への添加は、蟻酸水素脱離酵素活性を促進させることが示されている（Soini, Microb. Cell Fact. 7:26 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８８に特定されている。
【０５０６】
【表８８】
2013504326.tif 000090
【０５０７】
また、蟻酸水素脱離酵素は、超好熱性の古細菌であるThermococcus litoralisに存在する（Takacs et al., BMC. Microbiol 8:88 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表８９に特定されている。
【０５０８】
【表８９】
2013504326.tif 000091
【０５０９】
さらなる蟻酸水素脱離酵素の系は、Salmonella typhimurium、Klebsiella pneumoniae、Rhodospirillum rubrum、Methanobacterium formicicumに見出されている（Vardar-Schara, Microbial Biotechnology 1:107-125）。
【０５１０】
蟻酸脱水素酵素
蟻酸脱水素酵素活性は、他の生物のなかでも特にE. coliおよびSaccharomyces cerevisiaeの両方に存在する。S. cerevisiaeは、ＣＯ２への蟻酸塩の酸化を触媒する２つの蟻酸脱水素酵素であるＦＤＨ１およびＦＤＨ２を含んでいる（Overkamp et al., Yeast 19:509-520 (2002)）。Moorella thermoaceticaにおいて、Ｍｏｔｈ＿２３１２およびＭｏｔｈ＿２３１３の遺伝子座は、βサブユニットがＭｏｔｈ＿２３１４によってコードされている一方で、蟻酸脱水素酵素のαサブユニットをコードする役割を担っている実質的に１つの遺伝子である（Andreesen et al., J. Bacteriol. 116:867-873 (1973)；Li et al., J. Bacteriol. 92:405-412 (1966)；Pierce et al., Environ. Microbiol (2008)およびYamamoto et al., J. Biol. Chem. 258:1826-1832 (1983)）。蟻酸脱水素酵素活性をコードしている遺伝子の他の組は、Syntrophobacter fumaroxidansにおいてＳｆｕｍ＿２７０３からＳｆｕｍ＿２７０６によってコードされている（Reda, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:10654-10658 (2008)；de Bok et al., Eur. J. Biochem. 270:2476-2485 (2003)）。それらのM. thermoaceticaにおける等価物と同様に、Ｓｆｕｍ＿２７０５およびＳｆｕｍ＿２７０６は、実質的に１つの遺伝子である。E. coliは複数の蟻酸脱水素酵素を含んでいる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９０に特定されている。
【０５１１】
【表９０】
2013504326.tif 000092
【０５１２】
ピルビン酸脱水素酵素
アセチル−ＣｏＡへのピルビン酸塩の変換を触媒するピルビン酸デドロゲナーゼ複合体は、大規模に研究されている。S. cerevisiaeの複合体は、Ｅ１の構成要素（ＰＤＡ１およびＰＤＢ１）、Ｅ３の構成要素（ＬＰＤ１）、ならびにタンパク質Ｘ（ＰＤＸ１）の構成要素を結び付けているＥ２（ＬＡＴ１）コアによって構成されている（Pronk, Yeast 12:1607-1633 (1996)）。E. coliの酵素において、Ｅ１構成要素における特定の残基は、基質特異性を担っている（Bisswanger, J. Biol Chem. 256:815-822 (1981)；Bremer, Eur. J Biochem. 8:535-540 (1969)およびGong et al., J. Biol Chem. 275:13645-13653 (2000)）。遺伝子工学的な試みは、嫌気性条件下におけるE. coliのＰＤＨ酵素活性を向上させている（Kim, J. Bacteriol 190:3851-3858 (2008); Kim, Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771 (2007)およびZhou, Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)）。E. coliのＰＤＨとは対照的に、B. subtilisの複合体は、活性であり、嫌気性条件下における成長に必要とされる（Nakano, J. Bacteriol179:6749-6755 (1997)）。また、グリセロールに基づく成長において性質決定されているKlebsiella pneumoniaeのＰＤＨは、嫌気性条件下において活性である（Menzel, J. Biotechnol. 56:135-142 (1997)）。ウシの腎臓に由来する酵素の複合体の結晶構造（Zhou, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807 (2001)）、およびAzotobacter vinelandii由来のＥ２触媒作用性領域の結晶構造が利用可能である（Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)）。いくつかの哺乳類のＰＤＨ酵素複合体は、代替の基質（例えば２−オキソブタン酸塩）に対して反応し得る（Paxton, J Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９１に特定されている。
【０５１３】
【表９１】
2013504326.tif 000093
【０５１４】
ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素
ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素（ＰＦＯＲ）は、ピルビン酸塩の酸化を触媒して、アセチル−ＣｏＡを形成させる。Desulfovibrio africanus由来のＰＦＯＲは、E. coliにおいて、クローン化され、発現されており、酸素の存在下において数日にわたって安定である活性な組換え酵素を生じさせた（Pieulle, J Bacteriol 179:5684-5692 (1997)）。酸素による安定性は、ＰＦＯＲでは相対的にまれであり、D. africanusの酵素のポリペプチド鎖における６０残基のアミノ酸の伸長によってもたらされると考えられている。また、M. thermoaceticaのＰＦＯＲは十分に性質決定されており（Menon, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)）、独立栄養性の成長の間におけるピルビン酸塩の合成に対する高い活性を有していることがさらに示された（Furdui, J Biol Chem. 275:28494-28499 (2000)）。さらに、E. coliは、M. thermoaceticaのＰＦＯＲと５１％同一であるタンパク質をコードしている、性質決定されていないオープンリーディングフレームであるｙｄｂＫを有している。E. coliにおけるピルビン酸酸化還元酵素活性についての証拠が説明されている（Blaschkowski, Eur. J Biochem. 123:563-569 (1982)）。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が以下の総説に説明されている（Ragsdale, Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)）。フラボドキシン還元酵素（例えば、Helicobacter pyloriまたはCampylobacter jejuni由来のｆｑｒＢ）（St Maurice et al., J. Bacteriol. 189:4764-4773 (2007)）、またはＲｎｆ型タンパク質（Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133 (2008)；およびHerrmann, J. Bacteriol 190:784-791 (2008)）は、ＰＦＯＲによって生成される還元型のフェレドキシンからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成するための手段を最終的にもたしている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９２に特定されている。
【０５１５】
【表９２】
2013504326.tif 000094
【０５１６】
コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＣｏＡ依存性）
コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＣｏＡ依存性）は、スクシニル−ＣｏＡ還元酵素とも呼ばれており、スクシニル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元するＣｏＡ依存性およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性の酸化還元酵素である。例示的な酵素は、Clostridium kluyveriにおけるｓｕｃＤ遺伝子（Sohling et al., J Bacteriol 178:871-80 (1996)；およびSohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)）、およびP. gingivalisのｓｕｃＤ遺伝子（Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000)）によってコードされている。類似の反応を触媒する他の酵素は、Acinetobacter calcoaceticus（Reiser et al., Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (2007)）およびAcinetobacterのＭ−１種（Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)）の脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、ならびにPseudomonas種におけるアセトアルデヒド脱水素酵素をアシル化する酵素である。当該酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびホルムアルデヒドを酸化させ、アシル化させることが証明されている（Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)）。アセチル−ＣｏＡをエタノールに還元することに加えて、Leuconostoc mesenteroideにおいてａｄｈＥによってコードされている酵素は、分枝鎖状の化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化させることが示されている（Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９３に特定されている。
【０５１７】
【表９３】
2013504326.tif 000095
【０５１８】
４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、４−ＨＢへのコハク酸セミアルデヒドのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性の還元を触媒する。この活性を示す酵素は、Ralstonia eutropha（Bravo J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)）、Clostridium kluyveri（Wolff, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)）、およびArabidopsis thaliana（Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)）に見出されている。遺伝子のさらなる他の候補物は、Geobacillus thermoglucosidasius由来のアルコール脱水素酵素であるａｄｈＩである（Jeon et al., J. Biotechnal 135:127-133 (2008)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９４に特定されている。
【０５１９】
【表９４】
2013504326.tif 000096
【０５２０】
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの４−ＨＢの変換は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素活性を有している酵素によって触媒される。酵素の候補物としては、それぞれ、スクシニル−ＣｏＡ転移酵素活性、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素活性、およびブチリル−ＣｏＡ転移酵素活性を有していることが示されているClostridium kluyveriのｃａｔ１、ｃａｔ２、およびｃａｔ３の遺伝子産物が挙げられる（Gerhardt et al., Arch. Microbiol 174:189-199 (2000)；Arikawa et al., Microbiol Lett. 165:111-116 (1998)、およびSohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)）。また、類似のＣｏＡ転移酵素活性は、Trichomonas vaginalis（van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418 (2008)）、およびTrypanosoma brucei（Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004)）に存在する。E. coliのａｔｏＡ遺伝子およびａｔｏＤ遺伝子は、広範な基質を有しているアセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素をコードしている（Sramek et al., Arch. BioChem. Biophys. 171:14-26 (1975)）。この酵素は、分枝鎖状および直鎖状の種々のアシル−ＣｏＡ基質（イソ酪酸塩（Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)）、吉草酸塩（Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968)）、およびブタン酸塩（Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968)）が挙げられる）に、アセチル−ＣｏＡからＣｏＡ部分を転移することが示されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９５に特定されている。
【０５２１】
【表９５】
2013504326.tif 000097
【０５２２】
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素
また、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの４−ＨＢの変換は、ＣｏＡ酸−チオールリガーゼ（ＣｏＡ合成酵素としても知られている）によって触媒され得る。この変化自体をを触媒する酵素はこれまで性質決定されていないが、幅広い基質特異性を有しているいくつかの酵素が文献に記載されている。例示的な候補物は、E. coliのｓｕｃＣＤによってコードされている酵素である。当該酵素は、１つのＡＴＰの同時の消費とともに、コハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成を天然に触媒しており、当該反応は生体内において可逆的な反応である（Buck et al., Biochem. 24:6245-6252 (1985)）。ＣｏＡリガーゼのさらなる例示的な候補物としては、P. chrysogenum由来のＡＤＰを形成する酢酸フェニル−ＣｏＡリガーゼ（Lamas-Maceiras et al., Biochem. J. 395:147-155 (2005)；Wang et al.,Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458 (2007)）、およびPseudomonas mendocina由来のピメロイル−ＣｏＡリガーゼが挙げられる。E. coliにおいてクローン化されたPseudomonas mendocina由来のＡＭＰを形成する酵素は、代替の基質であるアジピン酸塩およびノナン酸塩を受容することが示された（Binieda et al., BioChem. J 340 (Pt 3):793-801 (1999)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９６に特定されている。また、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルアクリロイル−ＣｏＡ合成酵素として同定される合成酵素の候補物は本項に適用可能である。
【０５２３】
【表９６】
2013504326.tif 000098
【０５２４】
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドへの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性の還元を触媒する。この活性を示す酵素としては、Clostridium kluyveriにおけるｓｕｃＤ遺伝子（Sohling et al., J Bacteriol 178:871-80 (1996)；およびSohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)）、およびP. gingivalisのｓｕｃＤ遺伝子（Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000)）によってコードされているコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素が挙げられる。溶媒産生性の生物（例えばClostridium saccharoperbutylacetonicum（Kosaka et al., Biosci. Biotechnol BioChem. 71:58-68 (2007)））に見出されるブチルアルデヒド脱水素酵素は、類似の反応（ブチルアルデヒドへのブチリル−ＣｏＡの変換）を触媒する。Pseudomonas種においてアセトアルデヒド脱水素酵素をアシル化する、ｂｐｈＧによってコードされている酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、およびホルムアルデヒドを酸化させ、アシル化させることが証明されているため、さらなる他の候補物である（Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)）。Acinetobacter calcoaceticus由来（Reiser et al., Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)）およびAcinetobacterのＭ−１由来（Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)）の脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素は、類似の反応を触媒する。Leuconostoc mesenteroideにおけるａｄｈＥによってコードされている酵素は、アセチル−ＣｏＡをエタノールに還元することに加えて、分枝鎖状の化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化させることが示されている（Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９７において同定されている。
【０５２５】
【表９７】
2013504326.tif 000099
【０５２６】
４−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素
１４−ＢＤＯへの４−ヒドロキシブチリルアルデヒドの変換は、アルコール脱水素酵素によって触媒される。E. coliのいくつかの天然の脱水素酵素（例えばｙｑｈＤ）（Sulzenbacher et al., Journal of Molecular Biology 342:489-502 (2004)）は、幅広い基質特異性を示し、この反応を触媒することができる。ｙｑｈＤの遺伝子産物は、補助因子としてＮＡＤＰＨを用いて、アセトアデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインの還元を触媒する（Perez, J. Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008)；およびPerez, J. Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008)）。アルコールへのアルデヒドの変換を触媒するさらなる酵素の候補物としては、Ｃ２〜Ｃ１４にとっての中鎖アルコール脱水素酵素をコードしているａｌｒＡ（Tani, Appl. Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)）、Saccharomyces cerevisiae由来のＡＤＨ２（Atsumi, Nature 451:86-89 (2008)）、ならびにブチルアルデヒドをブタノールに変換するC. acetobutylicum由来のｂｄｈ  Ｉおよびｂｄｈ  ＩＩ（Walter, Journal of Bacteriology 174: 7149-7158 (1992)）が挙げられる。Zymomonas mobilis由来のａｄｈＡ遺伝子産物は、多くのアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインが挙げられる）に対する活性を有していることが証明されている（Kinoshita, Appl. Microbiol. Biotechnol. 22:249-254 (1985)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９８に特定されている。
【０５２７】
【表９８】
2013504326.tif 000100
【０５２８】
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）
また、１４−ＢＤＯへの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの変換は、アルデヒド脱水素酵素の活性およびアルコール脱水素酵素の能力を有している二機能性の酸化還元酵素によって触媒される。例えば、C. acetobutylicum由来のａｄｈＥ２の遺伝子産物は、ブチリル−ＣｏＡをブタノールに変換する（Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002)）。また、この酵素は４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを基質として受容する。アルコールを形成する二機能性のさらなる還元酵素としては、Leuconostoc mesenteroides由来のａｄｈＥの遺伝子産物（Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972)；およびKoo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)）、およびSimmondsia chinensis由来のＦＡＲが挙げられる。例示的な他の酵素は、ｍｃｒによってコードされているChloroflexus aurantiacusにおけるＮＡＤＰＨ−依存性のマロニル−ＣｏＡ還元酵素である（Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)；およびStrauss et al., Eur. J. BioChem. 215:633-643 (1993)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表９９に特定されている。
【０５２９】
【表９９】
2013504326.tif 000101
【０５３０】
４−ヒドロキシ酪酸ホスホ転移酵素（ａｋａ．キナーゼ）
４−ヒドロキシ酪酸ホスホ転移酵素（４−ヒドロキシ酪酸キナーゼとしても知られている）は、１つのＡＴＰの同時の加水分解とともに４−ＨＢを４−ヒドロキシブチリルリン酸塩に変化させる。これらの変化を触媒する酵素の候補物としては、酪酸キナーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、およびγ−グルタミルキナーゼが挙げられる。酪酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．７）の酵素は、C. acetobutylicumの酸発酵の間における酪酸塩へのリン酸ブチリルの可逆的な変換を行う（Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)）。この酵素は２つのｂｕｋ遺伝子産物のいずれかによってコードされている（Huang et al., J Mol. Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000)）。他の酪酸キナーゼの酵素は、C. butyricumおよびC. tetanomorphumに見出されている（TWAROG et al., J Bacteriol. 86:112-117 (1963)）。また、関連する酵素であるThermotoga maritima由来のイソ酪酸キナーゼは、E. coliにおいて発現され、結晶化されている（Diao et al., E. Biol. Crystallogr. 59:1100-1102 (2003)；およびDiao et al., J Bacteriol. 191:2521-2529 (2009)）。アスパラギン酸キナーゼは、アスパラギン酸塩のＡＴＰ依存性のリン酸化を触媒し、いくつかのアミノ酸の合成に関与する。ｌｙｓＣによってコードされているE. coliにおけるアスパラギン酸キナーゼＩＩＩの酵素は、広範な基質を有しており、基質特異性に関与している触媒作用性の残基が明らかにされている（Keng et al., Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81 (1996)）。また、E. coliにおけるさらなる２つのキナーゼ（酢酸キナーゼおよびγ−グルタミルキナーゼ）は有力な候補物である。ａｃｋＡによってコードされているE. coliの酢酸キナーゼ（Skarstedt et al., J. Biol. Chem. 251:6775-6783 (1976)）は、酢酸塩に加えて、プロピオン酸塩をリン酸化する（Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)）。ｐｒｏＢによってコードされているE. coliのγ−グルタミルキナーゼ（Smith et al., J. Bacteriol. 157:545-551 (1984)）は、グルタミン酸塩のγの炭酸基をリン酸化する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１００に特定されている。
【０５３１】
【表１００】
2013504326.tif 000102
【０５３２】
４−ヒドロキシ酪酸ホスホ転移酵素
４−ヒドロキシ酪酸ホスホ転移酵素は、リン酸４−ヒドロキシブチリルのリン酸部分をＣｏＡ部分に交換し、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを形成する。この変化にとっての酵素の候補物は、ブチリル−ＣｏＡをリン酸ブチリルに可逆的に変換する酵素である、酪酸ホスホ転移酵素（ＥＣ  ２．３．１．１９）である。この酵素は、C. acetobutylicum（Walter et al., Gene 134:107-111 (1993)；およびWiesenborn et al., Appl Environ. Microbiol 55:317-322 (1989)）、酪酸塩を生成する細菌Ｌ２−５０（Louis et al., J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)）、およびBacillus megaterium（Vazquez et al., Curr. Microbiol 42:345-349 (2001)）に見出されているｐｔｂ遺伝子によってコードされている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０１に特定されている。
【０５３３】
【表１０１】
2013504326.tif 000103
【０５３４】
リン酸４−ヒドロキシブチリル還元酵素
４−ヒドロキシブチリル−リン酸の、その対応するアルデヒドへの還元は、リン酸還元酵素によって触媒される。この反応は、既知の酵素によって触媒されないが、類似の反応：アスパラギン酸−４−セミアルデヒドへの４−アスパルチルリン酸のＮＡＤＰＨ依存性の還元は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＡＳＤ、ＥＣ  １．２．１．１１）によって触媒される。ＡＳＤは、アミノ酸の生合成に関与し、最近、抗菌剤の標的として研究されている（Hadfield et al., Biochemistry 40:14475-14483 (2001)）。E. coliのＡＳＤの構造が解析されており（Hadfield et al., J Mol. Biol. 289:991-1002 (1999)）、当該酵素は、代替の基質β−３−メチルアスパルチルリン酸を許容すると示されている（Shames et al., J Biol. Chem. 259:15331-15339 (1984)）。Haemophilus influenzaeの酵素は、活性部位における基質結合親和性を変更させるための、酵素を改変する研究の対象である（Blanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1388-1395 (2004)およびBlanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1808-1815 (2004)）。ＡＳＤの他の候補物は、Mycobacterium tuberculosis（Shafiani et al., J Appl Microbiol 98:832-838 (2005)）、Methanococcus jannaschii（Faehnle et al., J Mol. Biol. 353:1055-1068 (2005)）ならびに感染性の微生物Vibrio choleraおよびHeliobacter pylori（Moore et al., Protein Expr. Purif. 25:189-194 (2002)）に見出されている。関連する酵素の候補物は、アセチルグルタミルリン酸還元酵素（ＥＣ  １．２．１．３８）である。アセチルグルタミルリン酸還元酵素は、アセチルグルタミン酸−５−セミアルデヒドにアセチルグルタミルリン酸を天然に還元する酵素であり、S. cerevisiae（Pauwels et al., Eur. J Biochem. 270:1014-1024 (2003)）、B. subtilis（O'Reilly and Devine, Microbiology 140 (Pt 5):1023-1025 (1994)）および他の生物に見出されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０２に特定されている。
【０５３５】
【表１０２】
2013504326.tif 000104
【０５３６】
例示的な他のリン酸還元酵素としては、Ｄ−グリセリン酸１，３−ビスリン酸にグリセルアルデヒド−３−リン酸を変換するグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（例えば、E. coliのｇａｐＡ（Branlant et al., Eur. J. Biochem. 150:61-66 (1985)））、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−５−リン酸にＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸−５−セミアルデヒドを変換するＮ−アセチル−γ−グルタミル−リン酸還元酵素（例えば、E. coliのａｒｇＣ（Parsot et al. gene, 68: 275-283 (1988)））、およびＬ−グルタミル−５−リン酸にＬ−グルタミン酸−５−セミアルデヒドを変換するグルタミン酸−５−セミアルデヒド脱水素酵素（例えば、E. coliのｐｒｏＡ（Smith et al., J. Bacteriol., 157:545-551 (1984)））が挙げられる。Salmonella typhimurium（Mahan et al., J. Bacteriol., 156: 1249-1262 (1983)）およびCampylobacter jejuni（Louie et al., Mol. Gen. genet., 240:29-35 (1993)）に由来するグルタミン酸−５−セミアルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子は、E. coliにおいてクローン化され、発現されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０３に特定されている。
【０５３７】
【表１０３】
2013504326.tif 000105
【０５３８】
コハク酸還元酵素および４−ヒドロキシ酪酸還元酵素
コハク酸セミアルデヒドへのコハク酸塩の直接的な還元、または４−ヒドロキシブチルアルデヒドへの４−ＨＢの直接的な還元は、カルボン酸還元酵素によって触媒され得る。アリール−アルデヒド脱水素酵素として同じく知られているNocardia iowensisのカルボン酸還元酵素は、マグネシウム依存性、ＡＴＰ依存性およびＮＡＤＰＨ依存性の、カルボン酸の、それらの対応するアルデヒドへの還元を触媒し（Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485 (2007)）、４−ヒドロキシブタノールへの４−ヒドロキシ酪酸の変換を触媒可能である。ｃａｒによってコードされているこの酵素は、E. coliにおいてクローン化され、機能的に発現された（Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485 (2007)）。ｎｐｔ遺伝子産物の発現は、転写後修飾を介して当該酵素の活性を向上させた。上記ｎｐｔ遺伝子は、不活性なアポ酵素を活性なホロ酵素に変換する特異的なホスホパンテテイン転移酵素（ＰＰＴａｓｅ）をコードしている。この酵素の天然の基質は、バニリン酸であり、当該酵素は、芳香族の基質および脂肪族の基質の広い許容性を示す（Venkitasubramanian et al. “Biocatalytic Reduction of Calboxylic acids: Mechanism and Applications" Chapter 15 in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires, ed. R.N. Patel, CRC Press LLC, Boca Raton, FL. (2006)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０４に特定されている。
【０５３９】
【表１０４】
2013504326.tif 000106
【０５４０】
さらなるｃａｒ遺伝子およびｎｐｔ遺伝子が配列相同性に基づいて同定され得る。これらの遺伝子によってコードされているタンパク質の非限定的な例は、表１０５に示されている。
【０５４１】
【表１０５】
2013504326.tif 000107
【０５４２】
Streptomyces griseusに見られるさらなる酵素の候補物は、ｇｒｉＣ遺伝子およびｇｒｉＤ遺伝子によってコードされている。この酵素は、ｇｒｉＣまたはｇｒｉＤのいずれかの欠失が、細胞外の３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の蓄積、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸代謝物の枝分かれ生成を導くことにしたがって、３−アミノ−４−ヒドロキシベンズンアルデヒドに３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を変換すると考えられている（Suzuki, et al., J. Antibiot. 60(6):380-387 (2007)）。Nocardia iowensisのｎｐｔと配列において類似している酵素であるＳＧＲ＿６６５をともなった、ｇｒｉＣおよびｇｒｉＤの共発現は、有用であり得る。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０６に特定されている。
【０５４３】
【表１０６】
2013504326.tif 000108
【０５４４】
類似の特性を有している酵素α−アミノアジピン酸還元酵素（ＡＡＲ、ＥＣ  １．２．１．３１）は、いくつかの真菌の種においてリジン生合成経路に関与する。この酵素は、α−アミノアジピン酸セミアルデヒドにα−アミノアジピン酸を天然に還元する。カルボキシル基はアデニル酸塩のＡＴＰ依存性の形成を介してまず活性化され、当該アデニル酸塩はＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されて、アルデヒドおよびＡＭＰを生じる。ＣＡＲと同様に、この酵素は、マグネシウムを利用し、ＰＰＴａｓｅによる活性化を必要とする。ＡＡＲおよびその対応するＰＰＴａｓｅにとっての酵素の候補物は、Saccharomyces cerevisiae（Morris et al., gene 98:141-145 (1991)）、Candida albicans（Guo et al., Mol. genet. Genomics 269:271-279 (2003)）、およびSchizosaccharomyces pombe（Ford et al., Curr. genet. 28:131-137 (1995)）に見出されている。S. pombeに由来するＡＡＲは、E. coliにおいて発現されたときに有意な活性を示した（Guo et al., Yeast 21:1279-1288 (2004)）。Penicillium chrysogenumに由来するＡＡＲは、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインを代替の基質として許容するが、アジピン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩、またはジアミノピメリン酸塩と反応しなかった（Hijarrubia et al., J Biol. Chem 278:8250-8256 (2003)）。P. chrysogenumのＰＰＴａｓｅをコードしている遺伝子はこれまで同定されておらず、高い信憑性を有している該当物は配列比較および配列相同性の検索によって同定されなかった。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０７に特定されている。
【０５４５】
【表１０７】
2013504326.tif 000109
【０５４６】
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、クロトニル−ＣｏＡへの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの可逆性の変換を触媒する。この酵素は、固有のビニルアセチル−ＣｏＡΔ−イソメラーゼ活性を有しており、３，４位から２，３位に二重結合を移動させる（Scherf et al., Eur. J BioChem. 215:421-429 (1993)；およびScherf et al., Arch. Microbiol 161:239-245 (1994)）。C. aminobutyricumおよびC. kluyveriに由来する４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、精製され、性質決定され、Ｎ末端において配列決定された（Scherf et al., Eur. J BioChem. 215:421-429 (1993)；およびScherf et al., Arch. Microbiol 161:239-245 (1994)）。ａｂｆＤによってコードされているC. kluyveriの当該酵素は、E. coliにおいてクローン化され、発現された（Gerhardt et al., Arch. Microbiol 174:189-199 (2000)）。Porphyromonas gingivalis（ＡＴＣＣ  ３３２７７）に由来するａｂｆＤ遺伝子産物は、Clostridialの遺伝子産物に対する配列相同性によって非常に密接に関連付けられた。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０８に特定されている。
【０５４７】
【表１０８】
2013504326.tif 000110
【０５４８】
クロトナーゼ
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＥＣ  ４．２．１．５５）（クロトナーゼ）は、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを脱水してクロトニル−ＣｏＡを形成させるエノイル−ＣｏＡ加水分解酵素である。クロトナーゼ酵素は、いくつかの生物（特にClostridial種）においてｎ−ブタノール形成を必要とし、Sulfolobus属, Acidianus属, and Metallosphaera属の好熱好酸性の古細菌における３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路の一段階を構成している。クロトナーゼ酵素をコードしている例示的な遺伝子は、C. acetobutylicum（Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008); and Boynton et al., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996)）、C. kluyveri (Hillmer et al., FEBS Lett. 21:351-354 (1972)）、およびMetallosphaera sedula（Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)）に見出され得るが、後者の遺伝子配列は未知である。ｅｃｈによってコードされているPseudomonas putidaのエノイル−ＣｏＡ加水分解酵素は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへのクロトニル−ＣｏＡの変換を触媒する（Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)）。エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素のさらなる候補物は、P. putidaのｐｈａＡおよびｐｈａＢ、ならびにP. fluorescensに由来するｐａａＡおよびｐａａＢである（Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95:6419-6424 (1998)）。最後に、Escherichia coliの多くの遺伝子（ｍａｏＣ（Park et al., J Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)）、ｐａａＦ（Ismail et al., Eur. J BioChem. 270:3047-3054 (2003)；Park et al., Appl. BioChem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004)；およびPark et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)）、およびｐａａＧ（Ismail et al., Eur. J BioChem. 270:3047-3054 (2003)；Park et al., Appl. BioChem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004)；およびPark et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)）が挙げられる）は、エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素の機能性を証明していると示されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１０９に特定されている。
【０５４９】
【表１０９】
2013504326.tif 000111
【０５５０】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルデヒド形成）
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、３−ヒドロキシブチルアルデヒドへの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性の還元を触媒する。この変化を触媒する酵素は、これまで同定されていない。例示的なＣｏＡ−アシル化アルデヒド脱水素酵素は、Clostridium beijerinckiiに由来するａｌｄ遺伝子である（Toth et al., Appl Environ. Microbiol 65:4973-4980 (1999)）。この酵素は、アセチル−ＣｏＡおよびブチリル−ＣｏＡをそれらの対応するアルデヒドに還元すると報告されている。アシル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに変換する他の酵素は、マロニル−ＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに変化させるマロニル−ＣｏＡ還元酵素である。マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、好熱好酸性の古細菌における３−ヒドロキシプロピオン酸回路を介した独立栄養性の炭素固定に重要な酵素である（Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007); and Thauer, Science. 318:1732-1733 (2007)）。当該酵素は、補助因子としてＮＡＤＰＨを利用し、MetallosphaeraおよびSulfolobusの種において性質決定されている（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)；およびHugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)）。当該酵素は、Metallosphaera sedulaにおけるＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされている（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)）。Sulfolobus tokodaiiに由来するマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている遺伝子は、E. coliにおいてクローン化され、異種的に発現された（Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)）。また、この酵素は、メチルマロニル−ＣｏＡの、その対応するアルデヒドへの変換を触媒すると示されている（国際公開第２００７／１４１２０８号）。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを４−ヒドロキシブチルアルデヒドに変換する上述のアルデヒド脱水素酵素の候補物は、ここに適用可能である。また、これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１０に特定されている。
【０５５１】
【表１１０】
2013504326.tif 000112
【０５５２】
３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素
３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素活性を有している酵素は、３−ヒドロキシブチルアルデヒドを１，３−ブタンジオールにを変換するために必要である。アルコールへのアルデヒドの変換を触媒する酵素（すなわちアルコール脱水素酵素または同じくアルデヒド還元酵素）をコードしている例示的な遺伝子としては、Ｃ２〜Ｃ１４の中程度の鎖長を有しているアルコールを脱水する酵素をコードしているａｌｒＡ（Tani et al., Appl. Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)）、Saccharomyces cerevisiaeに由来するＡＤＨ２（Atsumi et al., Nature 451:86-89 (2008)）、Ｃ（３）より長い分子に対する選択性を有しているE. coliに由来するｙｑｈＤ（Sulzenbacher et al., Journal of Molecular Biology 342:489-502 (2004)）、ならびにブチルアルデヒドをブタノールに変換するC. acetobutylicumに由来するｂｄｈ  Ｉおよびｂｄｈ  ＩＩ（Walter et al., Journal of Bacteriology 174:7149-7158 (1992)）が挙げられる。ｙｑｈＤの遺伝子産物は、アセトアルデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインの還元を、補助因子としてＮＡＤＰＨを用いて触媒する（Perez et al., J Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008); and Perez et al., J Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008)）。Zymomonas mobilisに由来するａｄｈＡ遺伝子産物は、多くのアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインが挙げられる）に対する活性を有していると証明されている（Kinoshita et al., Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１１に特定されている。
【０５５３】
【表１１１】
2013504326.tif 000113
【０５５４】
さらなる候補物としては、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素および３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素が挙げられる。４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドを４−ＨＢに天然に変換し、Ralstonia eutropha（Bravo et al., J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)）、Clostridium kluyveri（Wolff et al., タンパク質 Expr. Purif. 6:206-212 (1995)）、およびArabidopsis thaliana（Breitkreuz, et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)）において性質決定されている。３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素の候補物としては、Pseudomonas aeruginosaのＰＡＯ１に由来するｍｍｓＢ（Gokam et al., United States patent 7393676 (2008)）、Pseudomonas putida KT2440（１１８）に由来するｍｍｓＢ、およびPseudomonas putidaのＥ２３に由来するｍｍｓＢ（Chowdhury, et al., Biosci. Biotechnol. BioChem. 60:2043-2047 (1996)）が挙げられる。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１２に特定されている。
【０５５５】
【表１１２】
2013504326.tif 000114
【０５５６】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ還元酵素（アルコール形成）
二機能性の酸化還元酵素は、１，３−ブタンジオールへの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの直接的な変換に必要とされる。アシル−ＣｏＡをアルコールに変換する例示的な酵素としては、基質を変化させる酵素（例えば、アセチル−ＣｏＡをエタノールに変化させる酵素（例えば、E. coliに由来するａｄｈＥ（Kessler et al., FEBS. Lett. 281:59-63 (1991)））ブチリル−ＣｏＡをブタノールに変化させる酵素（例えば、C. acetobutylicumに由来するａｄｈＥ２（Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002)））、および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを１，４−ブタンジオールに変化させる酵素（前項における候補物を参照））が挙げられる。ホホバ（Simmondsia chinensis）のＦＡＲは、アルコールを形成する脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードしている。この遺伝子は、E. coliにおいてクローン化され、過剰発現され、ＦＡＲ活性および脂肪アルコールの蓄積を生じさせた（Metz et al., Plant Physiology 122:635-644 (2000)）。例示的な他の酵素は、マロニル−ＣｏＡを３−ヒドロキシプロピオン酸に変換させる。この活性を有しているＮＡＤＰＨ依存性の酵素は、Chloroflexus aurantiacusにおいて性質決定され、当該酵素は、３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関与している（Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)；およびStrauss et al., Eur. J. BioChem. 215:633-643 (1993)）。３００ｋＤａの分子量を有しているこの酵素は、非常に基質特異的であり、他の既知の酸化還元酵素に対してわずかな配列類似性をを示す（Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１３に特定されている。
【０５５７】
【表１１３】
2013504326.tif 000115
【０５５８】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素
３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）への３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの変換は、ＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ加水分解酵素またはＣｏＡ合成酵素によって触媒される。この特定の変換を触媒するＣｏＡ転移酵素は、これまで同定されていない。E. coliの酵素であるアシル−ＣｏＡ：酢酸−ＣｏＡ転移酵素（酢酸−ＣｏＡ転移酵素としても知られている、ＥＣ  ２．８．３．８）は、分枝鎖状および直鎖状の種々のアシル−ＣｏＡ基質（イソ酪酸塩（Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)）、吉草酸塩（Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968)）およびブタン酸塩（Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968)）が挙げられる）から、ＣｏＡ部分を酢酸に転移させると示されている。この酵素は、E. coliのＫ１２のａｔｏＡ（αサブユニット）およびａｔｏＤ（βサブユニット）、ならびにCorynebacterium glutamicumのＡＴＣＣ  １３０３２におけるａｃｔＡおよびｃｇ０５９２（Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)）によってコードされている（Korolev et al., D Biol Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)；および; and Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968)）。類似の酵素は、Corynebacterium glutamicumのＡＴＣＣ  １３０３２（Eikmanns et al., Mol. Gen. genet. 218:330-339 (1989)）、Clostridium acetobutylicum（Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)；およびWiesenborn et al., Appl. Environ. Microbiol 55:323-329 (1989)）、およびClostridium saccharoperbutylacetonicum（Kosaka et al., Biosci. Biotechnol BioChem. 71:58-68 (2007)）に存在する。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１４に特定されている。
【０５５９】
【表１１４】
2013504326.tif 000116
【０５６０】
また、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、およびスクシニル−ＣｏＡ転移酵素について記載されているＣｏＡ転移酵素遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５６１】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素
また、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、ＣｏＡ合成酵素（リガーゼまたはシンターゼとしても知られている）によって３−ＨＢに変換され得る。ＡＴＰ合成酵素の候補物は、アシル−ＣｏＡエステルの、それらの対応する酸への変換をＡＴＰの合成と結び付けているＡＤＰを形成するアセチル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＣＤ、ＥＣ  ６．２．１．１３）である。この酵素は、基質としての３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡと反応するとは示されていないが、基質特異性を有している種々の酵素が、文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされているArchaeoglobus fulgidusに由来するＡＣＤ  Ｉは、直鎖状または分枝鎖状の種々の基質（イソ酪酸塩、イソペンタン酸塩およびフマル酸塩が挙げられる）に対して作用すると示された（Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。また、ＡＦ１９８３によってコードされているArchaeoglobus fulgidusにおける可逆性の他のＡＣＤは、環状化合物の酢酸フェニルおよび酢酸インドールに対して高い活性をともなって広い基質範囲を有していると示された（Musfeldt, et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。Haloarcula marismortuiに由来する酵素（スクシニル−ＣｏＡ合成酵素と注釈されている）は、プロピオン酸、酪酸および分枝鎖状の酸（イソ吉草酸およびイソ酪酸）を基質としてを許容し、順方向および逆方向において作用すると示された（Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)）。好熱好酸性のcrenarchaeon古細菌Pyrobaculum aerophilumに由来するＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、性質決定されたすべてのＡＣＤの最も広い基質範囲を示し、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡと反応した（Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)）。しかし、定方向の進化または改変は、宿主生物における生理学的温度において作用するためにこの酵素にとって必須である得る。A. fulgidus, H. marismortuiおよびP. aerophilumに由来する酵素のすべては、E. coliにおいてクローン化され、機能的に発現され、性質決定された（Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004); and Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。さらなる候補物は、１つのＡＴＰの消費をともなったコハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成（インビボにおける可逆的な反応）を天然に触媒する、E. coliにおけるｓｕｃＣＤによってコードされている酵素である（Buck et al., BioChemistry 24:6245-6252 (1984)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１５に特定されている。
【０５６２】
【表１１５】
2013504326.tif 000117
【０５６３】
また、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素に対して記載されているＣｏＡ合成酵素の遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５６４】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ＨＢに変換するために必要とされる。酵素３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ  ３．１．２．４）は、関連する変化：３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの加水分解を触媒する。また、Homo sapiensに由来する３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ加水分解酵素は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質として許容する（Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)）。また、この酵素は、Rattus norvegicusにおいて性質決定されている（Shimomura et al., J Biol Chem. 269:14248-14253 (1994)；およびShimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)）。配列相同性による遺伝子の候補物としては、Saccharomyces cerevisiaeのｈｉｂｃｈおよびBacillus cereusのＢＣ＿２２９２が挙げられる。これらのタンパク質は、以下の表１１６に特定されている。プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ加水分解酵素、メタクリリル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡについて同定されているさらなるＣｏＡ加水分解酵素の候補物は本明細書に適用可能である。また、これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１６に特定されている。
【０５６５】
【表１１６】
2013504326.tif 000118
【０５６６】
３−ヒドロキシ酪酸−ＣｏＡ転位酵素
３−ヒドロキシブチルアルデヒドへの３−ヒドロキシ酪酸の還元は、カルボン酸還元酵素によって触媒される。また、コハク酸還元酵素および４−ヒドロキシ酪酸還元酵素にとっての酵素の例示的な候補物は、ここに適用可能である。
【０５６７】
３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの変換は、メチル転位酵素によって触媒される。そのような変換は実験的に証明される必要がある。しかし、類似の反応を触媒する２つのメチル転位酵素（すなわちイソブチリルＣｏＡ転位酵素およびメチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素）は、それらの対応する基質の構造的な類似性によって示される見込みのある候補物である。
【０５６８】
メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素（ＭＣＭ）は、スクシニル−ＣｏＡをメチルマロニル−ＣｏＡに天然に変換するコバラミン依存性の酵素である。E. coliにおいて、アデノシルコバラミン依存性の可逆的な転位酵素は、プロピオン酸へのコハク酸塩の変換を導く３段階の経路に関与する（Haller et al., BioChemistry 39:4622-9 (2000)）。ＭＣＭは、Escherichia coliにおけるｓｃｐＡ遺伝子（Bobik et al., Anal. Bioanal. Chem. 375:344-349 (2003)；およびHaller et al., BioChemistry 39:4622-4629 (2000)）、およびHomo sapiensにおけるｍｕｔＡ（Padovani et al., BioChemistry 45:9300-9306 (2006)）によってコードされている。種々の他の生物において、ＭＣＭは、αサブユニットおよびβサブユニットを含んでおり、２つの遺伝子によってコードされている。２つのサブユニットタンパク質をコードしている例示的な遺伝子の候補物は、Propionibacterium freudenreichii sp. shermaniiのｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ（Korotkova et al., J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)）、ならびにMethylobacterium extorquensのｍｃｍＡおよびｍｃｍＢ（Korotkova et al., J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)）である。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１７に特定されている。
【０５６９】
【表１１７】
2013504326.tif 000119
【０５７０】
さらなる酵素の候補物としては、E. coliのｓｐｃＡ遺伝子産物に対する高い相同性に基づいて同定されている以下の表１１８に特定されている候補物が挙げられる。
【０５７１】
【表１１８】
2013504326.tif 000120
【０５７２】
また、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素の触媒作用性の遺伝子と隣接する遺伝子は、最大の活性に必要であるという証拠がさらに存在する。例えば、M. extorquensに由来する遺伝子は、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素と複合体を形成し、インビトロ転位酵素活性を刺激し、メチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素を不可逆的な不活性化からおそらく保護していることが証明されている（Korotkova et al.,J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)）。M. extorquensのｍｅａＢ遺伝子産物は、染色体上においてｓｃｐＡと隣接しているE. coliのａｒｇＫ遺伝子の産物と非常に類似している（ＢＬＡＳＴｐ：  ４５％の同一性、ｅ−ｖａｌｕｅ：４ｅ−６７）。P. freudenreichiiにおけるｍｅａＢ相同物にとっての配列は、GenBankのカタログに載っていない。しかし、遺伝子座ＰＰＡ０５９７にあるPropionibacterium acnesのＫＰＡ１７１２０２遺伝子産物は、M. extorquensのｍｅａＢタンパク質と５１％同一であり、またその遺伝子は、染色体上においてメチルマロニル−ＣｏＡ転位酵素の遺伝子と隣接している。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１１９に特定されている。
【０５７３】
【表１１９】
2013504326.tif 000121
【０５７４】
代替的に、イソブチリルＣｏＡ転位酵素（ＩＣＭ）は、提唱されている変化を触媒し得る。ＩＣＭは、ブチリル−ＣｏＡの炭素骨格をイソブチリルＣｏＡに可逆的に転位させるＭＣＭファミリーにおけるコバラミン依存性のメチル転位酵素である（Ratnatilleke, J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999)のFigure 7B）。これまでの研究に加えて、Methylibium petroleiphilumにおける新規なＩＣＭの最近の研究によって、活性部位の近傍における単一のアミノ酸の変更は、上記酵素の基質特異性を変化させる証拠が示された（Ratnatilleke et al., J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999)；およびRohwerder et al., Appl Environ Microbiol 72:4128-4135 (2006)）。これは、未変性の酵素が３ＨＩＢ−ＣｏＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの変換を触媒できず、当該酵素が合理的な改変を受け得ることを意味する。ホモ二量体の酵素をコードしている例示的なＩＣＭ遺伝子としては、Streptomyces coelicolor A3 (2)におけるｉｃｍＡおよびMethylibium petroleiphilum PM1におけるＭｐｅ＿Ｂ０５４１が挙げられる（Ratnatilleke et al., J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999)；およびRohwerder et al., Appl Environ Microbiol 72:4128-4135 (2006)）。ホモ二量体の酵素をコードしている遺伝子としては、Streptomyces cinnamonensisにおけるｉｃｍおよびｉｃｍＢが挙げられる（Ratnatilleke, et al., J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999)；Vrijbloed et al., J Bacteriol. 181:5600-5605 (1999)；およびZerbe-Burkhardt et al., J Biol Chem. 273:6508-6517 (1998)）。Streptomyces avermitilis MA-4680におけるｉｃｍＡ遺伝子およびｉｃｍＢ遺伝子によってコードされている酵素は、既知のＩＣＭと高い配列類似性を示している。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２０に特定されている。
【０５７５】
【表１２０】
2013504326.tif 000122
【０５７６】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素
この経路における次の段階は、ＣｏＡ転移酵素による３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）への３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの変換をともなっている。この特定の変換を触媒する酵素は、これまで同定されていない。E. coliの酵素アシル−ＣｏＡ：酢酸−ＣｏＡ転移酵素（酢酸−ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ  ２．８．３．８）としても知られている)は、分枝鎖状または直鎖状の種々のアシル−ＣｏＡ基質（イソ酪酸塩（Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)）、吉草酸塩（Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968)）、およびブタン酸塩（Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968)）が挙げられる）から、ＣｏＡ部分を酢酸に転移させると示されている。この酵素は、E. coli sp.のＫ１２におけるａｔｏＡ（αサブユニット）およびａｔｏＤ（βサブユニット）（Korolev et al., D Biol Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)；およびVanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968)）、ならびにCorynebacterium glutamicumのＡＴＣＣ  １３０３２におけるａｃｔＡおよびｃｇ０５９２（Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)）によってコードされている。類似の酵素は、Corynebacterium glutamicumのＡＴＣＣ  １３０３２（Eikmanns et al., Mol. Gen. genet. 218:330-339 (1989)）、Clostridium acetobutylicum（Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)：およびWiesenborn et al., Appl. Environ. Microbiol 55:323-329 (1989)）、およびClostridium saccharoperbutylacetonicum（Kosaka et al., Biosci. Biotechnol BioChem. 71:58-68 (2007)）に存在する。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素の上述の候補物は本明細書に適用可能である。また、これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２１に特定されている。
【０５７７】
【表１２１】
2013504326.tif 000123
【０５７８】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素
また、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡは、ＣｏＡ合成酵素（ＣｏＡリガーゼまたはシンターゼとしても知られている）によって３−ＨＩＢに変換され得る。ＡＴＰ合成酵素の候補物は、それらの対応する酸へのアシル−ＣｏＡエステルの変換をＡＴＰの同時の合成と結びつける酵素である、ＡＤＰを形成するアセチル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＣＤ、ＥＣ  ６．２．１．１３）である。この酵素は、基質としての３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡと反応しないと示されているが、広い基質特異性を有している種々の酵素が文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされている、Archaeoglobus fulgidusに由来するＡＣＤ  Ｉは、直鎖状または分枝鎖状の種々の基質（イソ酪酸塩、イソペンタン酸塩およびフマル酸塩が挙げられる）に対して作用すると示された（Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。また、ＡＦ１９８３によってコードされている、Archaeoglobus fulgidusにおける可逆的な他のＡＣＤは、環状化合物の酢酸フェニルおよび酢酸インドールに対する高い活性をともなって広い基質範囲を有していると示された（Musfeldt, et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。Haloarcula marismortuiに由来する当該酵素（スクシニル−ＣｏＡ合成酵素と注釈されている）は、プロピオン酸、酪酸および分枝鎖状の酸（イソ吉草酸およびイソ酪酸）を基質として許容し、順方向および逆方向において作用すると示された（Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)）。好熱好酸性のクレンアーキオンの古細菌Pyrobaculum aerophilumに由来するＰＡＥ３２５０によってコードされている上記ＡＣＤは、性質決定されたＡＣＤにおいて最も広い基質範囲を示し、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡと反応した（Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)）。しかし、定方向の進化または改変は、宿主生物における生理学的温度においてこの酵素が作用するために必須であり得る。A. fulgidus、H. marismortuiおよびP. aerophilumに由来する上記酵素のすべては、E. coliにおいてクローン化され、機能的に発現され、性質決定された（Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004); and Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。さらなる候補物は、E. coliにおけるｓｕｃＣＤ酵素 によってコードされている酵素であり、当該酵素は、１つのＡＴＰの消費をともなうコハク酸塩からのスクシニル−ＣｏＡの形成（インビボにおける可逆的な反応）を本質的に触媒する（Buck et al., BioChemistry 24:6245-6252 (1984)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２２に特定されている。
【０５７９】
【表１２２】
2013504326.tif 000124
【０５８０】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素
酵素３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ加水分解酵素は、バリン分解の間において３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを３−ＨＩＢに選択的に変換する（Shimomura et al., J Biol Chem 269:14248-53 (1994)）。この酵素をコードしている遺伝子はこれまでに説明されている。また、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素およびプロピオニル−ＣｏＡの遺伝子の上述の候補物は、ここに適用可能である。
【０５８１】
３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素
メチルアクリル酸への３−ヒドロキシイソ酪酸の脱水は、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性を有している酵素によって触媒される。特異的な酵素によるこの変化に対する直接の証拠は確認されていない。しかし、ほとんどの脱水素酵素は、電子求引性のカルボニル基、カルボン酸基またはＣｏＡ−チオールエステル基によるα−水素の活性化、ならびにβ位からのヒドロキシルの除去に関与する水のα、β−除去を触媒する（Buckel et al., J Bacteriol. 117:1248-1260 (1974); and Martins, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101:15645-9 (2004)）。これは、メチルアクリル酸経路における最終段階に対して提唱されている変化の正確な様式である。提唱されている変化は、Eubacterium barkeriの２−（ヒドロキシメチル）グルタール酸脱水素酵素と非常に類似している（図３Ａ）。この酵素は、ニコチン酸塩の代謝に関連して研究されており、ｈｍｄによってコードされている（Alhapel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103:12341-6 (2006)）。E. barkeriにおいて類似の機能性を有している酵素は、ジメチルマレイン酸加水分解酵素（ジメチルマレイン酸塩を水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルリンゴ酸塩を形成するコニターゼファミリーにおける酵素）である。この酵素は、ｄｍｄＡＢによってコードされている（Alhapel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103:12341-6 (2006)；およびKollmann-Koch et al., Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 365:847-857 (1984)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２３に特定されている。
【０５８２】
【表１２３】
2013504326.tif 000125
【０５８３】
さらなる酵素の候補物は、クエン酸リンゴ酸塩からの水のα、β除去を触媒してメサコン酸塩を形成する可逆的な脱水素酵素である２−メチルリンゴ酸脱水素酵素（クエン酸リンゴ酸脱水素酵素とも呼ばれる）である。この酵素は、２−オキソブタン酸塩に対するピルビン酸経路に関連してMethanocaldococcus jannaschiiにおいて研究されており、当該酵素は、広い基質特異性有していると示されている（Drevland et al., J Bacteriol. 189:4391-4400 (2007)）。また、この酵素活性は、Clostridium tetanomorphum、Morganella morganii、Citrobacter amalonaticusにおいて検出され、当該酵素は、グルタミン酸分解に関与すると考えられた（Kato et al., Arch. Microbiol 168:457-463 (1997)）。M. jannaschiiのタンパク質配列は、これらの生物における遺伝子に対する有意な相同性を有してない。この遺伝子／タンパク質は以下の表１２４に特定されている。
【０５８４】
【表１２４】
2013504326.tif 000126
【０５８５】
フマル酸塩へのリンゴ酸塩の脱水を天然に触媒するフマル酸加水分解酵素は、候補物のさらなる組を代表している。基質としての３−ヒドロキシイソ酪酸に対して反応するフマル酸加水分解酵素の能力は説明されていないが、構造的な多くの情報がこの酵素に関して利用可能であり、他の研究者は、当該酵素を改変して活性、阻害および局在を首尾よく変化させる（Weaver, D Biol Crystallogr. 61:1395-1401 (2005)）。E. coliは、成長条件によって調節される３つのフマラーゼ：ＦｕｍＡ、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣを有している。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気性条件においてのみ活性である。ＦｕｍＡは微嫌気性条件において活性であり、ＦｕｍＣは好気性条件においてのみ活性な酵素である（Guest et al., J Gen Microbiol 131:2971-2984 (1985)；Tseng et al., J Bacteriol 183:461-467 (2001)；およびWoods et al., Biochim Biophys Acta 954:14-26 (1988)）。さらなる酵素の候補物は、Campylobacter jejuni（Smith et al., Int. J BioChem. Cell Biol 31:961-975 (1999)）、Thermus thermophilus（Mizobata et al., Arch. BioChem. Biophys. 355:49-55 (1998)）およびRattus norvegicus（Kobayashi et al., J BioChem. 89:1923-1931 (1981)）に見出されている。Pelotomaculum thermopropionicumに由来するＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有している他の分類のフマラーゼである（Shimoyama et al., FEMS Microbiol Lett 270:207-213 (2007)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２５に特定されている。
【０５８６】
【表１２５】
2013504326.tif 000127
【０５８７】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素
ＣｏＡ脱水素酵素による３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの脱水は、メタクリリル−ＣｏＡをもたらす。エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ  ４．２.１．１７）は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質の脱水を触媒する（Agnihotri and Liu., J. Bacteriol. 188:8551-8559(2003)；Conrad et al., J. Bacteriol. 118:103-111 (1974)；およびRoberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)）。ウシの肝臓に見出されたエノイル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣＨ）は、種々の基質（メタクリリル−ＣｏＡ、２−メチル-クロトニル−ＣｏＡ、３−メチル-クロトニル−ＣｏＡ、アクリロイル−ＣｏＡおよび１−カルボキシシクロヘキセノイル−ＣｏＡが挙げられる）を許容する（Agnihotri et al., Bioorg Med Chem., 11(1):9-20 (2003)）。ウシの肝臓の組換えＥＣＨ酵素は、E. coliにおいて過剰発現されており、類似の触媒作用性を有していると分かった（Dakoji et al., J Am Chem Soc., 123:9749 (2001)）。ｅｃｈによってコードされているPseudomonas putidaのエノイル−ＣｏＡ加水分解酵素は、クロトニル−ＣｏＡへの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの変換を触媒する（Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)）。さらなるエノイル−ＣｏＡ加水分解酵素の候補物は、P. putidaのｐｈａＡおよびｐｈａＢ、ならびにP. fluorescensに由来するｐａａＡおよびｐａａＢである（Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95:6419-6424 (1998)）。Rhodopseudomonas palustrisにおけるｐｉｍＦの遺伝子産物は、ピメロイル−ＣｏＡ分解に関与するエノイル−ＣｏＡ加水分解酵素をコードしていると予測されている（Harrison and Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)）。最後に、Escherichia coliの遺伝子の多くは、エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素の機能性（ｍａｏＣ（Park and Lee, J. Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)）、ｐａａＦ（Ismail et al., J Biochem. 270:3047-3054 (2003)；Park and Lee, Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004)；およびPark and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)）、およびｐａａＧ（Ismail et al., J Biochem. 270:3047-3054(2003)；Park and Lee, Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004)；およびPark and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)）が挙げられる）を証明すると示されている。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２６に特定されている。
【０５８８】
【表１２６】
2013504326.tif 000128
【０５８９】
この反応を触媒する例示的な酵素の他の候補物は、クロトナーゼである。この酵素にとっての遺伝子の候補物は上述されている。代替的に、ｆａｄＡおよびｆａｄＢのE. coliの遺伝子産物は、エノイル−ＣｏＡ加水分解酵素活性を示す、脂肪酸酸化に関与する多酵素の複合体をコードしている（Nakahigashi and Inokuchi, Nucleic Acids Res. 18:4937 (1990)；Yang, J. Bacteriol. 173:7405-7406 (1991)；およびYang et al., Biochemistry 30:6788-6795 (1991)）。ｆａｄＲによってコードされている負の制御因子のノックアウトは、ｆａｄＢ遺伝子産物の活性化に利用され得る（Sato et al., J Biosci. Bioeng 103:38-44 (2007)）。ｆａｄＩ遺伝子およびｆａｄＪ遺伝子は、類似の機能をコードしており、好気性条件において天然に発現される（Campbell et al., Mol. Microbiol 47:793-805 (2003)）。これらの遺伝子／タンパク質は以下の表１２７に特定されている。
【０５９０】
【表１２７】
2013504326.tif 000129
【０５９１】
メタクリリル−ＣｏＡ加水分解酵素
ＭＡＡへのメタクリリル−ＣｏＡの変換は、ＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ合成酵素またはＣｏＡ加水分解酵素によって触媒される。また、プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ加水分解酵素について説明されているＣｏＡ加水分解酵素遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５９２】
メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素
ＭＡＡへのメタクリリル−ＣｏＡの変換は、ＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ合成酵素またはＣｏＡ加水分解酵素によって触媒される。プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、およびスクシニル−ＣｏＡ転移酵素について説明されているＣｏＡ転移酵素遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５９３】
メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素
ＭＡＡへのメタクリリル−ＣｏＡの変換は、ＣｏＡ転移酵素、ＣｏＡ合成酵素またはＣｏＡ加水分解酵素によって触媒される。プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素についてのＣｏＡ合成酵素遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５９４】
メチルマロニル−ＣｏＡ加水分解酵素
メチルマロニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ  ３．１．２．１７）によってメチルマロン酸に変換される。また、Rattus norvegicusの肝臓から単離されたこの酵素は、基質としてのマロニル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡに対して活性である（Kovachy et al., J. Biol. Chem., 258: 11415-11421 (1983)）。この酵素と関連付けられる遺伝子はいまだ知られていない。プロピオニル−ＣｏＡ加水分解酵素、メタクリリル−ＣｏＡ加水分解酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ加水分解酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素、および３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素についての、これまでの項に記載のＣｏＡ加水分解酵素の他の候補物は、ここに適用可能である。
【０５９５】
メチルマロニル−ＣｏＡ転移酵素
代替的に、メチルマロニル−ＣｏＡは、ＣｏＡ転移酵素によってメチルマロン酸に変換される。また、プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素、メタクリリル−ＣｏＡ転移酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、およびスクシニル−ＣｏＡ転移酵素に対して記載されているＣｏＡ転移酵素遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５９６】
メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素
メチルマロニル−ＣｏＡからメチルマロン酸を形成するさらなる他の酵素は、メチルマロニル−ＣｏＡ合成酵素である。プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、メタクリリル−ＣｏＡ合成酵素、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ合成酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成酵素、およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素について記載されているＣｏＡ合成酵素遺伝子の候補物は、ここに適用可能である。
【０５９７】
メチルマロン酸還元酵素
メチルマロン酸セミアルデヒドへのメチルマロン酸塩の変換は、カルボン酸還元酵素によって触媒される。また、コハク酸塩還元酵素および４−ヒドロキシ酪酸還元酵素にとっての酵素の例示的な候補物は、ここに適用可能である。
【０５９８】
本願の全体を通して種々の公開物が参照されている。これらの公開物の全体における開示事項（公開されているGenBank番号およびGI番号が挙げられる）は、本発明が属する技術の状態をより完全に説明するために、参照によって本明細書に援用される。本発明は、以上において示されている例を参照して説明されているが、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更がなされ得ることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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