(57)【要約】  ジホモ−γ−リノレン酸［ＤＧＬＡ；２０：３ω−６］をアラキドン酸［ＡＲＡ；２０：４ω−６］に、および／またはエイコサテトラエン酸［ＥＴＡ；２０：４ω−３］をエイコサペンタエン酸［ＥＰＡ；２０：５ω−３］に変換する能力を有し、チトクロームｂ５様ドメインのＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内の少なくとも１つの変異と、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内の少なくとも１つの変異とを有する、変異Δ５デサチュラーゼが開示される。Δ５デサチュラーゼをコードするこのような断片を含んでなる単離核酸断片および組換えコンストラクトもまた、長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］を製造する方法と共に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３４［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフと、
（ｂ）配列番号１［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフと
を含んでなり、配列番号３４［ＨｘＧｘ］が配列番号７［ＨＰＧＧ］と同一でなく、配列番号１［ＨｘｘｘＨ］が配列番号８［ＨＤＡＳＨ］と同一でない、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）前記アミノ酸モチーフ（ａ）が、配列番号９［ＨｇＧＧ］、配列番号１０［ＨｈＧＧ］、配列番号１１［ＨＰＧｓ］、配列番号１２［ＨｃＧＧ］、配列番号１３［ＨｗＧＧ］、および配列番号１４［ＨａＧＧ］からなる群から選択され；
（ｂ）前記アミノ酸モチーフ（ｂ）が、配列番号１５［ＨＤｇＳＨ］、配列番号１６［ＨＤｓＳＨ］、配列番号１７［ＨＤＡａＨ］、配列番号１８［ＨＤＡｇＨ］、および配列番号１９［ＨｅＡＳＨ］からなる群から選択される、請求項１に記載の変異ポリペプチド。
【請求項３】
前記変異ポリペプチドが、配列番号２１、配列番号２５、および配列番号２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドと比べて、ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて、少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の変異ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１３９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号１４１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号１４３［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１４５［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ａ］、配列番号１４７［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ｇ］、配列番号１４９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１５１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号１５３［ＥｇＤ５Ｍ、（コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）］、配列番号１５７［ＥｇＤ５Ｍ１、（コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ）］、配列番号１８１［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号１８３［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１８５［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１８７［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号２１３［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２１５［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、配列番号２１７［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］、配列番号２５５［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号２６０［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ａ］、配列番号２７１［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ｇ］、および配列番号２７６［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ａ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の変異ポリペプチド。
【請求項５】
前記変異ポリペプチドが、親ポリペプチドのジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への変換効率の少なくとも６４％のジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への変換効率を有し、前記親ポリペプチドが、配列番号７［ＨＰＧＧ］と同一のアミノ酸モチーフおよび配列番号８［ＨＤＡＳＨ］と同一のアミノ酸モチーフを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１３８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号１４０［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号１４２［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１４４［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ａ］、配列番号１４６［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ｇ］、配列番号１４８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１５０［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号１５２［ＥｇＤ５Ｍ、（コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）］、配列番号１５６［ＥｇＤ５Ｍ１、（コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ）］、配列番号１８０［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号１８２［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１８４［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１８６［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号２１２［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２１４［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、配列番号２１６［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］、配列番号２５４［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号２５９［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ａ］、配列番号２７０［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ｇ］、および配列番号２７５［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ａ］からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを発現する、形質転換宿主細胞。
【請求項９】
微生物および植物からなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
前記微生物宿主細胞が油性酵母である、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
前記油性酵母がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１８２、および配列番号２１２からなる群から選択される遺伝子を含んでなる、遺伝子コンストラクトを含んでなる、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１８３、および配列番号２１３からなる群から選択される配列を有するタンパク質を発現する、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、ω−６脂肪酸およびω−３脂肪酸からなる群から選択される多価不飽和脂肪酸を産生する、請求項８または１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
前記植物宿主細胞が、油料種子植物細胞である、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書および２０１０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２８２７７号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、（その中で少なくとも１つの変異がチトクロームｂ５様ドメインのＨＰＧＧ［配列番号７］モチーフ内で生じ、少なくとも１つの変異がＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内で生じる）、変異Δ５脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸断片の作成に関する。
【背景技術】
【０００３】
多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の商業的な生産手段として、植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が調査されている。遺伝子操作は、いくつかの宿主の自然の能力を実質的に変化させて（天然ではリノール酸［ＬＡ；１８：２  ω−６］およびα−リノレン酸［ＡＬＡ；１８：３  ω−３］脂肪酸産生に限定されるものでさえ）、様々な長鎖ω−３／ω−６  ＰＵＦＡの高レベル産生をもたらし得ることを実証している。これが自然の能力または組み換え技術の結果であるのかどうかに関わらず、アラキドン酸［ＡＲＡ；２０：４  ω−６］、エイコサペンタエン酸［ＥＰＡ；２０：５  ω−３］、およびドコサヘキサエン酸［ＤＨＡ；２２：６  ω−３］の産生には、全てΔ５デサチュラーゼ遺伝子の発現が必要であることもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって本発明は、商業的に有用な宿主細胞中のＰＵＦＡ生合成経路への組み込みに適した、高い活性を有する新しいΔ５デサチュラーゼに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号３４［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフと、
（ｂ）配列番号１［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフと
を含んでなり、配列番号３４［ＨｘＧｘ］が配列番号７［ＨＰＧＧ］と同一でなく、配列番号１［ＨｘｘｘＨ］が配列番号８［ＨＤＡＳＨ］と同一でない、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドに関する。
【０００６】
第２の実施形態では、アミノ酸モチーフ（ａ）は、配列番号９［ＨｇＧＧ］、配列番号１０［ＨｈＧＧ］、配列番号１１［ＨＰＧｓ］、配列番号１２［ＨｃＧＧ］、配列番号１３［ＨｗＧＧ］、および配列番号１４［ＨａＧＧ］からなる群から選択され；アミノ酸モチーフ（ｂ）は、配列番号１５［ＨＤｇＳＨ］、配列番号１６［ＨＤｓＳＨ］、配列番号１７［ＨＤＡａＨ］、配列番号１８［ＨＤＡｇＨ］、および配列番号１９［ＨｅＡＳＨ］からなる群から選択される。
【０００７】
第３の実施形態では、変異ポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２５、および配列番号２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドと比べて、ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて、少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【０００８】
第４の実施形態では、変異ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号１４１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号１４３［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１４５［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ａ］、配列番号１４７［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ｇ］、配列番号１４９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１５１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号１５３［ＥｇＤ５Ｍ、コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１５７［ＥｇＤ５Ｍ１、コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ］、配列番号１８１［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号１８３［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１８５［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１８７［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号２１３［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２１５［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、配列番号２１７［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］、配列番号２５５［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号２６０［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ａ］、配列番号２７１［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ｇ］、および配列番号２７６［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ａ］からなる群から選択される。
【０００９】
第５の実施形態では、変異ポリペプチドは、親ポリペプチドのジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への変換効率の少なくとも６４％のジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への変換効率を有し、前記親ポリペプチドは、配列番号７［ＨＰＧＧ］と同一のアミノ酸モチーフおよび配列番号８［ＨＤＡＳＨ］と同一のアミノ酸モチーフを含んでなる。
【００１０】
第６の実施形態では、本発明は、上述の変異ポリペプチドのいずれかをコードする単離核酸分子に関する。好ましくは、単離核酸分子は、配列番号１３８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号１４０［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号１４２［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１４４［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ａ］、配列番号１４６［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ｇ］、配列番号１４８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１５０［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号１５２［ＥｇＤ５Ｍ、コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１５６［ＥｇＤ５Ｍ１、コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ］、配列番号１８０［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号１８２［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１８４［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１８６［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号２１２［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２１４［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、配列番号２１６［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］、配列番号２５４［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号２５９［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ａ］、配列番号２７０［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ｇ］、および配列番号２７５［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ａ］からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
第７の実施形態では、本発明は、変異ポリペプチドのいずれかを発現する形質転換宿主細胞に関する。好ましくは、形質転換宿主細胞は、微生物、最も好ましくは油性酵母；および植物、最も好ましくは油料種子植物からなる群から選択される。
【００１２】
第８の実施形態では、形質転換宿主細胞は、ω−６脂肪酸およびω−３脂肪酸からなる群から選択される、多価不飽和脂肪酸を産生する。
【００１３】
生物学的寄託
以下の生物学的材料が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受入番号、および寄託日を有する。
【００１４】
【表１】
2013535988.tif 000002
【００１５】
上に列挙した生物学的材料は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙された寄託は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００１６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される手順に従って、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２から誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を示し、この経路の下記の説明を検討する際に合わせ見るべきである。
【図１Ｂ】ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を示し、この経路の下記の説明を検討する際に合わせ見るべきである。
【図２】ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ酵素の予測された位相モデルである。
【図３Ａ】ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５［配列番号２０］）と、Ｓ３４７Ｒ変異を含有する変種野生型ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ［配列番号２４］）とのＤＮＡ配列比較を示す。
【図３Ｂ】ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５［配列番号２０］）と、Ｓ３４７Ｒ変異を含有する変種野生型ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ［配列番号２４］）とのＤＮＡ配列比較を示す。
【図３Ｃ】ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５［配列番号２０］）と、Ｓ３４７Ｒ変異を含有する変種野生型ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ［配列番号２４］）とのＤＮＡ配列比較を示す。
【図３Ｄ】ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５［配列番号２０］）と、Ｓ３４７Ｒ変異を含有する変種野生型ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ［配列番号２４］）とのＤＮＡ配列比較を示す。
【図４】Ａ〜Ｃは、プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４の構築を図示する。
【図５】ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの変種野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子の５’部分（すなわちＥｇＤ５Ｒ［配列番号２４］）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する、ＨｇＧＧ［配列番号９］およびＨＤＡｇＨ［配列番号１８］モチーフを含んでなる、合成変異Δ５デサチュラーゼの最初の２０４ｂｐ（すなわちＥｇＤ５Ｍ［配列番号１５２］）との配列比較を示す。
【図６】（Ａ）ｐＥｇＤ５Ｍおよび（Ｂ）ｐＤＭＷ３６７−５Ｍのプラスミドマップを提供する。
【図７】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の開発を図示する。
【図８】（Ａ）ｐＺＫＵＭおよび（Ｂ）ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎのプラスミドマップを提供する。
【図９】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ８００１〜Ｚ８０５４株の開発を図示する。
【図１０Ａ】ｐＹＰＳ２３４による相同的組換え反応を概略的に図示する。
【図１０Ｂ】ｐＹＰＳ２３４のプラスミドマップを提供する。
【図１１Ａ】ｐＹＰＳ２３３による相同的組換え反応を概略的に図示する。
【図１１Ｂ】ｐＹＰＳ２３３のプラスミドマップを提供する。
【図１２Ａ】ｐＹＰＳ２４１による相同的組換え反応を概略的に図示する。
【図１２Ｂ】ｐＹＰＳ２４１のプラスミドマップを提供する。
【図１３】（Ａ）ｐＺＲ５ＡＵ−５５５および（Ｂ）ｐＺＲ５ＡＵ−５５５Ｍのプラスミドマップを提供する。
【００１８】
本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
【００１９】
以下の配列は、参照によって本明細書に援用する、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２０】
配列番号１〜３１１は、表１で同定される遺伝子またはタンパク質（またはその一部）、プライマーまたはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００２１】
【表２】
2013535988.tif 000003
【００２２】
【表３】
2013535988.tif 000004
【００２３】
【表４】
2013535988.tif 000005
【００２４】
【表５】
2013535988.tif 000006
【００２５】
【表６】
2013535988.tif 000007
【００２６】
【表７】
2013535988.tif 000008
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書で言及する全ての特許および非特許文献は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【００２８】
本開示では、いくつかの用語および略語が使用される。標準三文字コードまたは一文字コードを使用して、アミノ酸に言及する。以下の定義が提供される。
【００２９】
「読み取り枠」は、「ＯＲＦ」と略記される。
【００３０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略記される。
【００３１】
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略記される。
【００３２】
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略記される。
【００３３】
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略記される。
【００３４】
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略記される。
【００３５】
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略記される。
【００３６】
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と略記される。
【００３７】
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するモチーフ（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）は、「ＨＰＧＧ」と略記される。
【００３８】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するモチーフ（すなわちＨｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ）は、「ＨＤＡＳＨ」と略記される。
【００３９】
本明細書の用法では、「発明」または「本発明」という用語は、特許請求の範囲および明細書に記載される、本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されないものと解釈される。
【００４０】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の双方も知られている。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の簡易表記体系によって表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「ω６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対「ω３脂肪酸」［「ω−３」］または［「ｎ−３」］の間の区別の追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に提供される。
【００４１】
本明細書でＰＵＦＡを記述するのに使用される命名法を下の表２に示す。「略記法」と題された欄ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、そしてこの目的で１番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略称、および各化合物の化学名を要約する。
【００４２】
【表８】
2013535988.tif 000009
【００４３】
表２に列挙するω−３／ω−６  ＰＵＦＡは、本明細書に記載される方法を使用して微生物および植物宿主の油画分中に蓄積する可能性が最も高いが、この一覧は限定的または完全なものとみなすべきではない。
【００４４】
「油」という用語は２５℃で液体の脂質物質を指し；油は疎水性であるが、有機溶媒に可溶性である。油性生物では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は主にトリアシルグリセロールからなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００４５】
「中性脂肪」とは、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見られる脂質を指し、細胞のｐＨでは脂質は荷電基を有さないため、このように称される。一般にそれらは完全に非極性で、水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸によるグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールとも称され、または集合的にアシルグリセロールと称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出する為には、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００４６】
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに鎖長のより短い飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
【００４７】
「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では、例えば生物由来資源または油であってもよい特定サンプル中で、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化し得る、細胞性脂肪酸の総和を指す。したがって総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧをはじめとする）からの脂肪酸、および極性脂質画分（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
【００４８】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡ測定値であるが、総脂質含量は、ＤＣＷの％としてのＦＡＭＥ測定値［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として近似し得る。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムと同等である。
【００４９】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］として表される。本開示中では、特に断りのない限り、総脂質に対する特定脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００５０】
「脂質プロフィール」および「脂質組成」という用語は同義であり、総脂質中または油中などの特定の脂質画分に含有される個々の脂肪酸の量を指し、この量はＴＦＡの重量％として表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
【００５１】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に、およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程は、文献で十分に記載されている。例えば米国特許第７，９３２，０７７号明細書を参照されたい。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜内に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特有な延長酵素および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の付加を通じた分子の不飽和化とを伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素のいずれか（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼ。
【００５２】
「デサチュラーゼ」という用語は、不飽和化させる、すなわち１つまたは複数の脂肪酸に二重結合を導入して、対象の脂肪酸または前駆体を生成し得るポリペプチドを指す。特定脂肪酸に言及するための明細書全体を通じたω−基準系の使用にもかかわらず、Δシステムを使用して、基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼ活性を示すことがより都合が良い。本明細書で特に興味深いのは、分子のカルボキシル末端から数えて５番目と６番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化するΔ５デサチュラーゼであり、それは例えばＤＧＬＡからＡＲＡへおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒し得る。その他の脂肪酸デサチュラーゼとしては、例えばΔ８デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼは時に、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換する（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡ、およびＡＲＡからＥＰＡへの変換）それらの能力に基づいて、「ω−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」および／または「オメガ−３デサチュラーゼ」とも称される。適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定することにより、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判断することが望ましいかもしれない。
【００５３】
「ＥｇＤ５」という用語は、本明細書で配列番号２０によってコードされる、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ５デサチュラーゼ（配列番号２１）を指す。同様に「ＥｇＤ５Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号２２および２３）。ＥｇＤ５およびＥｇＤ５Ｓに関するさらなる詳細は、米国特許第７，６７８，５６０号明細書に記載される。「ＥｇＤ５Ｒ」という用語（すなわち配列番号２４および２５）は変種野生型ＥｇＤ５を指し、位置３４７のアミノ酸残基はアルギニンである。「ＥｇＤ５Ｒ＊」という用語（すなわち配列番号２６および２７）は修飾変種野生型ＥｇＤ５Ｒを指し、４つの制限酵素部位が野生型コード領域から除去されている。ＥｇＤ５ＲおよびＥｇＤ５Ｒ＊のアミノ酸配列は、同一である。
【００５４】
「ＥａＤ５」という用語は、本明細書で配列番号２８によってコードされる、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）から単離されたΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号２９）を指す。同様に「ＥａＤ５Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号３０および３１）。ＥｇＤ５およびＥｇＤ５Ｓに関するさらなる詳細は、米国特許第７，９４３，３６５号明細書に記載される。
【００５５】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される、一連のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変化し得るのに対し、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、これらのアミノ酸が、タンパク質の構造、安定性、または活性にとって重要なこともあることを示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新しく判定された配列があるタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定する識別子または「シグネチャー」として使用し得る。動物、植物、および真菌のΔ５デサチュラーゼ酵素中に普遍的に見られるモチーフとしては、３つのヒスチジンボックス（すなわちＨ（Ｘ）３〜４Ｈ［配列番号１および２］、Ｈ（Ｘ）２〜３ＨＨ［配列番号３および４］およびＨ／Ｑ（Ｘ）２〜３ＨＨ［配列番号５および６］）、およびＮ−末端の融合チトクロームｂ５ドメイン内のヘム結合モチーフ（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＰＧＧ［配列番号７］）が挙げられる。追加的なモチーフ（すなわちＨｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＨｉｓまたはＨＤＡＳＨ［配列番号８］）は、いくつかのΔ５デサチュラーゼ遺伝子中で保存されているように見える。
【００５６】
「変異Δ５デサチュラーゼ」および「二重変異体」という用語は、チトクロームｂ５ドメインのＨＰＧＧモチーフ（配列番号７）内の少なくとも１つの変異と、ＨＤＡＳＨモチーフ（配列番号８）内の少なくとも１つの変異とを有して、前記変異が保存的または非保存的のいずれかのアミノ酸置換をもたらす、本明細書に記載されるΔ５デサチュラーゼを指す。変異はあらゆるアミノ酸置換を含んでもよいが、変異Δ５デサチュラーゼは、好ましくは、Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａまたは「ＨｘＧｘ」（配列番号３４）（Ｘａａはあらゆるアミノ酸であり得る）の配列を有する変異ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフと、Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｉｓまたは「ＨｘｘｘＨ」（配列番号１）の配列を有する変異ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフとを含んでなる。より好ましくは、変異Δ５デサチュラーゼは、ＨｘＧＧ（配列番号３２）およびＨＰＧｘ（配列番号３３）からなる群から選択される変異ＨＰＧＧモチーフと、ＨｘＡＳＨ（配列番号３５）、ＨＤｘＳＨ（配列番号３６）、およびＨＤＡｘＨ（配列番号３７）からなる群から選択される変異ＨＤＡＳＨモチーフとを含んでなり、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性は、野生型Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性と、少なくとも機能的にほぼ同等である。より望ましくは、変異ＨＰＧＧモチーフは、配列番号９（ＨｇＧＧ）、配列番号１０（ＨｈＧＧ）、配列番号１１（ＨＰＧｓ）、配列番号１２（ＨｃＧＧ）、配列番号１３（ＨｗＧＧ）、および配列番号１４（ＨａＧＧ）からなる群から選択され、変異ＨＤＡＳＨモチーフは、配列番号１５（ＨＤｇＳＨ）、配列番号１６（ＨＤｓＳＨ）、配列番号１７（ＨＤＡａＨ）、配列番号１８（ＨＤＡｇＨ）、および配列番号１９（ＨｅＡＳＨ）からなる群から選択される。
【００５７】
各「変異Δ５デサチュラーゼ」は、「対応する野生型Δ５デサチュラーゼ」を有する。具体的には、野生型がチトクロームｂ５ドメイン内のＨＰＧＧモチーフ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨモチーフ（配列番号８）を含んでなるのに対し、変異体は（上述したように）これらの各モチーフ内の少なくとも１つの変異を含んでなることを除いては、変異Δ５デサチュラーゼおよび対応する野生型Δ５デサチュラーゼは、同一アミノ酸配列を共有する。
【００５８】
変異Δ５配列の酵素活性および特異的選択性が、対応する野生型Δ５デサチュラーゼと本質的に匹敵する場合、変異Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼと「少なくとも機能的にほぼ同等」である。したがって各酵素の「変換効率」を比較した場合、機能的に同等の変異Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼと比較してΔ５デサチュラーゼ活性が実質的に低下していない（すなわち変異Δ５デサチュラーゼは、野生型Δ５デサチュラーゼの少なくとも約５０〜６４％、より好ましくは少なくとも６０〜７４％、より好ましくは少なくとも約７５〜８５％、より好ましくは少なくとも約８５〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の酵素活性を有する）。好ましい範囲は上述のようであるが、変換効率の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられる。２つのポリペプチドのΔ５デサチュラーゼ活性は、実質的に同一であってもよい。好ましくは、変異Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼと比べて、増大した酵素活性と特異的選択性を有し、すなわち野生型Δ５デサチュラーゼの酵素活性の少なくとも約１０１％、１０２％、１０３％、１０４％または１０５％、より好ましくは少なくとも約１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％または１１５％、最も好ましくは少なくとも約１１６％以上を有する。
【００５９】
「親ポリペプチド」または「親酵素」という用語は、本明細書で開示される変異ポリペプチドまたは酵素がそれに由来する、あらゆるポリペプチドを指す。本用語は、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）アミノ酸モチーフを有する、野性型、変種野性型、および修飾変種野性型ポリペプチド、ならびにそれらをベースとした合成およびコドン最適化ポリペプチドを網羅する。本用語はそれから様々な制限酵素部位が除去されている、前述のポリペプチドのバージョンをさらに網羅する。
【００６０】
変異Δ５デサチュラーゼは２つの異なる命名システムを使用して命名されるが、どちらも変異体中の変異ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフおよびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの特定配列を記述する。第１のシステムは１）野生型親酵素；２）ハイフン（−）；３）変異ＨＰＧＧモチーフ；４）アンダースコア（＿）；５）変異ＨＤＡＳＨモチーフを特定する。変異アミノ酸残基は小文字で示される。したがって、例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼに由来する、ＨａＧＧ（配列番号１４）とＨＤｇＳＨ（配列番号１５）モチーフを含んでなる変異Δ５デサチュラーゼ（すなわち「ＥｇＤ５Ｓ」）は、「ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧｓ＿ＨＤｇＳＨ」と称される。代わりに、この同じ変異Δ５デサチュラーゼはまた、第２の命名システムを使用して「ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ」と称されてもよい。より具体的には、ＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフがアミノ酸残基３３〜３６の間に位置する一方で、ＥｇＤ５ＳのＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフはアミノ酸残基１５５〜１５９の間に位置する。したがって「３６ｓ」はアミノ酸残基３６が野生型からＳｅｒに変更されていることを示す一方で、「１５７ｇ」は、アミノ酸残基１５７が野生型からＧｌｙに変更されていることを示す。
【００６１】
「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換し得る効率を指す。変換効率は、次式に従って判定される。（［生成物］／［基質＋生成物）＊１００。したがって「ＤＧＬＡからＡＲＡへの変換効率」とは、それによって基質ＤＧＬＡが生成物ＡＲＡに変換される変換効率を指す。
【００６２】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分だけ長い酸を生成し得るポリペプチドを指す。この延長過程は、米国特許第７，６５９，１２０号明細書に記載されるように、脂肪酸シンターゼと共同して多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへ、ＳＴＡからＥＴＡへ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
【００６３】
一般に、エロンガーゼの基質選択性はやや広範であるが、鎖長と、不飽和の程度およびタイプとの双方によって区別される。例えばＣ１４／１６エロンガーゼはＣ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用しＣ１８／２０エロンガーゼはＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ、ＬＡ、ＡＬＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼ［Δ５エロンガーゼとも称される］はＣ２０基質（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的では、２つの異なるタイプのＣ１８／２０エロンガーゼを定義し得る。Δ６エロンガーゼは、それぞれＧＬＡおよびＳＴＡからＤＧＬＡおよびＥＴＡへの変換を触媒する一方、Δ９エロンガーゼは、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換を触媒し得る。
【００６４】
いくつかのエロンガーゼは広範な特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できてもよく、例えばそれによってＣ１６／１８エロンガーゼとＣ１８／２０エロンガーゼの双方として作用することに留意することが重要である。適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼ遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定することにより、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判断することが望ましいかもしれない。
【００６５】
一般に「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。この過程において、油性微生物の細胞油含量は概してＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または初期定常期にそれが最大に達するまで増大し、次に静止後期および死滅期において徐々に低下する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。本出願の目的では、そして微生物に関して使用される場合、「油性」という用語は、それらのＤＣＷの少なくとも約２５％を油として蓄積し得る微生物を指す。
【００６６】
「油性酵母」という用語は、油を産生し得る、すなわち油がそれらのＤＣＷの約２５％を超えて蓄積し得る、酵母に分類される油性微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。酵母がＤＣＷの約２５％を超えて油を蓄積する能力は、組換え遺伝子操作の試みを通じた、または生物の天然能力を通じたものであってもよい。
【００６７】
それから油が絞られる種子を生じる植物は、「油料種子」植物または作物と称され得る。油料種子植物の例としては、大豆、ヒマワリ種子、カノーラ、ナタネ、紅花、亜麻仁、芥子、落花生、綿実、トウゴマ種子、およびゴマが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６８】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質の化学的または機能的性質を変化させることなく、特定のタンパク質中のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換することを指す。例えば特定の部位において、化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす（しかしコードされた折り畳みタンパク質の構造および機能特性に影響しない）遺伝子の変更が一般的であることは、当該技術分野で良く知られている。本明細書の目的で、「保存的アミノ酸置換」は、次の５群の１つの中における交換と定義される。
１．小型脂肪族非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（Ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）；
２．負に帯電した極性残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］；
３．正に帯電した極性残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］；
４．大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）、および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］。
【００６９】
したがってわずかに疎水性のアミノ酸であるＡｌａは、別のより疎水性の低い残基（例えばＧｌｙ）によって置換されてもよい。同様に１つの負に帯電した残基による別の残基（例えばＡｓｐによるＧｌｕ）の置換、または１つの正に帯電した残基による別の残基（例えばＬｙｓによるＡｒｇ）の置換をもたらす変化は、機能的に同等の生成物を生じることが予期され得る。したがって保存的アミノ酸置換は、一般に、置換領域内のポリペプチド主鎖構造、標的部位の分子の電荷または疎水性、または大半の側鎖を保持する。さらに多くの場合、タンパク質分子のＮ末端とＣ末端部分の改変は、タンパク質活性を変更することが予期されない。
【００７０】
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質特性に最大変化を生じることが一般に予期されるアミノ酸置換を指す。したがって例えば非保存的アミノ酸置換は、次の１つである。１）親水性残基が疎水性残基を置換し、またはそれによって置換される（例えばＳｅｒまたはＴｈｒがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌを置換し、またはそれによって置換される）、２）ＣｙｓまたはＰｒｏがあらゆるその他の残基を置換し、またはそれによって置換される、３）電気陽性側鎖を有する残基が電気陰性残基を置換し、またはそれによって置換される（例えばＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓがＡｓｐまたはＧｌｕを置換し、またはそれによって置換される）、または４）かさ高い側鎖を有する残基が側鎖を有さないものを置換し、またはそれによって置換される（例えばＰｈｅがＧｌｙを置換し、またはそれによって置換される）。時として５群中の２群間の非保存的アミノ酸置換は、コードされるタンパク質の活性に影響しない。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離核酸断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は任意のヌクレオチドである。
【００７２】
核酸断片の一本鎖形態が、適切な温度および溶液イオン強度条件下でその他の核酸断片とアニールし得れば、ポリヌクレオチドまたは核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は良く知られており、参照によって本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．」）の特に第１１章および表１１．１で例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、（遠縁の生物からの相同的な配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の一組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間で開始して、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃で３０分間での反復、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で３０分間を２回繰り返す、一連の洗浄を使用する。よりストリンジェントな条件の組はより高い温度を使用し、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の最後の２回の３０分間の洗浄温度を６０℃に上げることを除いて、洗浄は上と同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件の組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で２回の最終洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００７３】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸がハイブリダイズするためのＴｍ値はより大きくなる。より高いＴｍに対応する核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。長さが１００個を超えるヌクレオチドのハイブリッドについて、Ｔｍを計算する方程式が誘導されている（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１１．７−１１．８参照）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドであり、最も好ましくは長さは少なくとも約３０個のヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識する。
【００７４】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価、またはＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ［“ＢＬＡＳＴ”］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子と相同的であると推定的に同定するために、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）中で、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。これに加えて、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、１２〜１５個の塩基の短鎖オリゴヌクレオチドをＰＣＲの増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を構成する核酸断片を明確に同定および／または分離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書の開示は、特定のデサチュラーゼタンパク質をコードする、完全長アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、開示される配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって添付の配列一覧に報告される完全な配列、ならびに上で定義されるこれらの配列のかなりの部分は、本開示に包含される。
【００７５】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって添付の配列一覧に報告される完全な配列に相補的な単離された核酸断片、ならびに実質的に同様の核酸配列は本開示に包含される。
【００７６】
「相同性」および「相同的」という用語は、同義的に使用される。それらは、類似しているが同一でない配列を有する、核酸断片またはポリペプチドを指す。これらの用語は、時に、最初の未修飾断片と比較して、得られた核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、（例えば１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入を介した）核酸断片の修飾もまた指す。したがって当業者は、本発明が特定の例示的な配列以上のものを包含することを理解するであろう。
【００７７】
さらに当業者は、相同的な核酸配列が、例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書で例示される配列と、または本明細書で開示されるヌクレオチド配列と機能的に同等のそのあらゆる部分と、ハイブリダイズするそれらの能力によってもまた定義されることも認識する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的な配列などの中程度に類似した断片から、近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの類似性の高い断片までスクリーニングするために調節し得る。
【００７８】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、核酸配列の特定の核酸標的配列へのハイブリダイゼーションを指し、それは非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能により高く（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）、非標的核酸は実質的に除外される。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的に互いに少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％（すなわち完全に相補的）以下の配列同一性を有する。
【００７９】
核酸またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ間で最大一致のために整列させると同じになる、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
【００８０】
「％同一性」および「％類似性」を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。「％同一性」および「％類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算され得る。
【００８１】
配列アラインメントおよび％同一性または類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、相同的な配列を検出するようにデザインされた多様な比較法を使用して判定されてもよい。配列の多重アラインメントは、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」をはじめとする、アルゴリズムのいくつかの変種を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載され、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラム（前出）にある）。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列のアラインメント後、プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
【００８２】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用した多重アラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用したタンパク質配列のペアワイズ配列比較および％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。
【００８３】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用した多重アラインメントのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。
【００８４】
「配列比較のＢＬＡＳＴＮ法」が、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するアルゴリズムである一方、「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメーターを使用してタンパク質配列を比較する、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
【００８５】
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書の開示に従った単離されたポリヌクレオチドが、本明細書で報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０〜８５％同一のポリペプチドをコードする一方、より好ましい核酸断片は少なくとも約８５〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上述のようであるが、％同一性の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられる。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的補体も興味深い。
【００８６】
適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８７】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝子コードの性質を指す。したがって本明細書に記載されるのは、配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５７、１８１、１８３、１８５、１８７、２１３、２１５、２１７、２５５、２６０、２７１、および２７６に記載の当該ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全部またはかなりの部分コードする、あらゆる核酸断片である。
【００８８】
当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００８９】
「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を使用して、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド構成単位から組み立て得る。これらのオリゴヌクレオチド構成単位はアニールされ、次にライゲートされて遺伝子セグメントを形成し、それは次に酵素的にアセンブリーされて遺伝子全体が構築される。したがって遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適遺伝子発現のために調整し得る。当業者は、宿主によって好まれるにコドンに向けて、コドン使用頻度を偏らせた場合の成功裏の遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づき得る。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロフィールは、米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供される。
【００９０】
「遺伝子」とは、特異的タンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード領域の上流および／または下流の調節配列（例えばコード領域の転写開始部位である上流の５’非翻訳領域、３’非コード領域）を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、天然に見られるのとは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を構成し得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するように、そのコドン使用頻度がデザインされている遺伝子である。
【００９１】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コード配列の転写開始部位上流に位置するヌクレオチド配列、５’非翻訳領域および３’非コード領域を指し、それらは関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすこともある。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、作動体結合部位、およびステムループ構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９２】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にプロモーター配列は、コード配列の５’上流に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプにおいて、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示してもよいことを理解する。細胞増殖および／または発達のほぼ全ての段階で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は（特にそれらの５’末端で）完全に定義されていないので、いくらかの変動があるＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有してもよいことがさらに認識される。
【００９３】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、「ターミネーター」、および「終結配列」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響し得る。
【００９４】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒する、ＤＮＡ配列転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完璧な相補コピーである場合、それは一次転写産物と称される。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写産物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列である場合に、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であり、逆転写酵素を使用してそれから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり得て、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して、二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含んで、細胞内または生体外でタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。
【００９５】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合し、すなわちコード配列はプロモーターの転写調節下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合し得る。
【００９６】
「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、２つのさもなければ分離した配列セグメントの人為的組み合わせを指す。
【００９７】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡの（前駆型または成熟型いずれかの）タンパク質への翻訳も含む。
【００９８】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物または宿主生物中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え」、「リコンビナント」、「形質転換」または「形質転換体」生物と称される。
【００９９】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状であってもよい、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列を有してもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合しまたは組み換えされて、細胞に発現カセットを導入できるユニークな構造になる。
【０１００】
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる、ＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に、１）プロモーター；２）コード配列（すなわちＯＲＦ］）；および３）真核生物中では通常、ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常はベクター内に含めて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対する妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。
【０１０１】
「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」という用語は、本明細書において同義的に使用される。組換えコンストラクトは、例えば自然界では一緒に見られない調節およびコード配列などの核酸断片の人工的組み合わせを含んでなる。例えば組換えコンストラクトは、１つまたは複数の発現カセットを含んでなってもよい。別の実施例では、組換えＤＮＡは、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、天然に見られるのとは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなってもよい。このようなコンストラクトは、単独で使用されてもよく、またはベクターと併せて使用されてもよい。ベクターが使用される場合、当業者に良く知られているように、ベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターを使用し得る。
【０１０２】
当業者は、本明細書に記載される単離核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するために、ベクター上に存在しなくてはならない遺伝要素を十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルとパターンの発現をもたらすことを認識し（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、したがって所望の発現レベルとパターンを呈する株または系統を得るために、複数事象をスクリーニングしなくてはならないこともまた認識する。このようなスクリーニングは特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
【０１０３】
「宿主細胞」および「宿主生物」という用語は、本明細書において同義的に使用され、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、これらの遺伝子を発現できる微生物または植物（すなわち油料種子植物）などのあらゆる生物を指す。「組換え宿主細胞」とは、組換え遺伝子操作されている宿主細胞を指す。
【０１０４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。特に断りのない限り、本説明中で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合はいつでも、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書での用法では「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターのあらゆる組を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．；ｂｙ  Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）（以下「Ｓｉｌｈａｖｙｕ  ｅｔ  ａｌ．」）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）（以下「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．」）によって、より詳しく記載される。
【０１０６】
図１Ａおよび図１Ｂは、組み合わさって、後述するようなω−３／ω−６脂肪酸生成の複数経路を記載する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることを要する。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換され；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され；４）ＡＲＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
【０１０７】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用して、長鎖ω−３脂肪酸を次のように生成し得る。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに変換され；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換され；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され；５）ＥＰＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。任意選択的に、ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えばＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によって、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【０１０８】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成の代わりの経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼを利用し、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」である。より具体的には、Δ６デサチュラーゼによって、ＬＡおよびＡＬＡがそれぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換されてもよく、次にＣ１８／２０エロンガー
ゼが、ＧＬＡをＤＧＬＡにおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。引き続いて上述のように、下流ＰＵＦＡが形成される。
【０１０９】
ω−３／ω−６脂肪酸を生成するために特定の宿主生物中に導入される必要がある特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。例えば実施形態によっては、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現は、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路発現との対比で好ましいこともあるが、それは前者の経路を介したＰＵＦＡ産生がＧＬＡおよび／またはＳＴＡを欠いているためである。
【０１１０】
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成で所望される酵素のそれぞれをコードする、様々な候補遺伝子を同定できる。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列は、あらゆる起源に由来してもよく、例えば天然原料から（細菌、藻類、真菌、植物、動物などから）単離され、半合成手段を介して生成され、または新規に合成されてもよい。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考察事項としては、以下が挙げられる。１）ポリペプチドの基質特異性；２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか；３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが、所望のＰＵＦＡの合成に必須であるかどうか；４）ポリペプチドに必要な補因子；および／または、５）ポリペプチドが、その生成後に（例えばキナーゼまたはプレニルトランスフェラーゼによって）修飾されたかどうか。発現されるポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその所在位置の生化学的環境に適合するパラメーターを有する（追加的詳細については米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい）。
【０１１１】
各特定のデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を検討することは、有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換する際に１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中で生成する未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流の中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって所望の脂肪酸生合成を最適化する場合、各酵素の変換効率もまた考慮すべき変数である。
【０１１２】
上の考察のそれぞれを念頭に置いて、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ）活性を有する候補遺伝子が、公的に入手できる文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡ生産能力を有する生物の実験解析に従って同定され得る。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは高めるのに適する。
【０１１３】
生物中で、（飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする）脂肪酸が合成されると、それらはＴＡＧに組み込まれてもよい。ＴＡＧは、脂肪酸の主要貯蔵単位である。
【０１１４】
これまでに同定されたほとんどのΔ５デサチュラーゼ酵素は、ＤＧＬＡをＡＲＡに変換する一次能力を有し、ＥＴＡをＥＰＡに変換する二次活性がある。公の文献および特許文献の双方で、いくつかのΔ５デサチュラーゼが開示されている。デサチュラーゼ進化に基づくΔ５デサチュラーゼの一般的特徴は、Ｐ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，６８：７３−９５（２００３）で詳述される。Δ６、Δ８、およびΔ４デサチュラーゼと並んで、Δ５デサチュラーゼは長鎖ＰＵＦＡ「フロントエンド」デサチュラーゼとして知られている（メチル依存性不飽和化とは対照的に、既存の二重結合と脂肪酸のアシル基のカルボキシル末端との間で不飽和化が起きる）。これらのデサチュラーゼは、３個のヒスチジンボックス［Ｈ（Ｘ）３−４Ｈ（配列番号１および２）、Ｈ（Ｘ）２−３ＨＨ（配列番号３および４）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）２−３ＨＨ（配列番号５および６）］によって特徴付けられ、電子供与体として機能するそれらのＮ末端に融合チトクロームｂ５ドメインを有することから、チトクロームｂ５融合スーパーファミリーのメンバーである。残るチトクロームｂ５ドメイン配列の多様性にもかかわらず、チトクロームｂ５ドメインは、保存ヘム結合モチーフ（すなわちＨＰＧＧ配列［配列番号７］）もまた含有する。酵素活性に対するＨＤＡＳＨモチーフの重要性は未だ解明されていないが、いくつかのΔ５デサチュラーゼ中で以前同定された追加的なモチーフもまた、ヒスチジンに富むようある（すなわちＨＤＡＳＨ配列［配列番号８］）。
【０１１５】
いくつかの研究は、ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフが酵素活性に関係することを示唆している。Ｓａｙａｎｏｖａ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２１：６４１（１９９９））は、部位特異的変異誘発を実施して、ルリヂサのΔ６デサチュラーゼ中でＨＰＧＧモチーフのＨｉｓ残基をＡｌａ残基で置換した。変異酵素はアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中で発現された；しかし酵素活性は測定できず、デサチュラーゼのチトクロームｂ５ドメイン中のＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＨｉｓ残基が機能にとって重要であることが示唆された。同様の研究がラットΔ６デサチュラーゼ中で実施され、ＡｌａによるＨｉｓの置換がＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内で操作された。この変異タンパク質もまた、活性を有さなかった（Ｇｕｉｌｌｏｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４５：３２−４０（２００４））。より最近では、Ｈｏｎｇｓｔｈｏｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７２：１１９２−１２０１（２００６））が、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）のΔ６デサチュラーゼ中のＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＨｉｓ残基のＡｌａ残基による置換を報告した。以前の報告同様、変異によって変異酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＧＬＡを生成できなくなり、チトクロームｂ５ドメインが活性のために重要であり、ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ中のＨｉｓ残基の変更は酵素活性低下をもたらすことが示唆された。Δ５デサチュラーゼ酵素は比較的一般的であり、特徴が良く分かっているが、ＰＵＦＡを産生できる生産宿主細胞中において、高レベルで効率的に発現される酵素に対する必要性が残されている。
【０１１６】
上述したように、Δ５デサチュラーゼはいくつかの保存された配列を含有する。しかしヘム結合モチーフ（すなわちＨＰＧＧ［配列番号７］）およびＨＤＡＳＨモチーフ（配列番号８）のみが、配列内変動を欠いている。これらのモチーフを本明細書の変異誘発の標的として選択した。酵素機能に対するＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの重要性は不明確なままであるが、文献は、少なくともＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内のＨｉｓ残基が機能にとって重要であることを提案する。その結果、残りの残基の置換を優先して、どちらのモチーフ内のＨｉｓ残基の置換も回避された。
【０１１７】
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書は、いくつかのΔ５デサチュラーゼのＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内のＰｒｏおよび第２のＧｌｙ残基における部位特異的変異誘発と、それに続く得られた変異ポリペプチドの発現、および野生型酵素と比較したそれらの活性測定を記載する。この出願は、ＨｘＧＧ（配列番号３２）およびＨＰＧｘ（配列番号３３）をはじめとする、アミノ酸変異モチーフを含んでなる様々な変異Δ５デサチュラーゼの作成を開示し、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性は、対応する野生型Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性と機能的に等しかった。
【０１１８】
多数の部位特異的変異誘発プロトコルが存在する［例えばＩｓｈｉｉ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２９３：５３−７１（１９９８）；Ｌｉｎｇ  Ｍ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂ．Ｈ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４：１５７−１７８（１９９７）；Ｂｒａｍａｎ  Ｊ．（ｅｄ．）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７−３８２（１９８７）；Ｓａｗａｎｏ  Ａ．ａｎｄ  Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：ｅ７８（２０００）］；しかしその容易な実行と高い効率に基づいて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を選択して使用した。基本的手順は、対象の挿入断片がある超らせん二本鎖ＤＮＡベクター、および所望の変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼによって、ベクターの逆ストランドにそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを温度サイクル中に延長させる。オリゴヌクレオチドプライマーの組み込みによって、スタッガードニックを含有する変異プラスミドが生じる。温度サイクルに続いて、親ＤＮＡテンプレートを消化して新たに合成された変異ＤＮＡを選択する手段として、（メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡに特異的な）ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼで生成物を処理する。次に所望の変異を含有するニックのあるベクターＤＮＡを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）宿主に形質転換して増殖させる。
【０１１９】
上述の技術を使用して、いくつかのΔ５デサチュラーゼのＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｓｐ［Ｄ］、Ａｌａ［Ａ］、およびＳｅｒ［Ｓ］残基上で、部位特異的変異誘発を独立して実施し、得られた変異ポリペプチドの発現と、野生型酵素と比較したそれらの活性測定がそれに続いた。驚くことに、ＨｘＡＳＨ（配列番号３５）、ＨＤｘＳＨ（配列番号３６）、およびＨＤＡｘＨ（配列番号３７）をはじめとするアミノ酸変異モチーフを含んでなる、様々な変異Δ５デサチュラーゼが作り出され、変異Δ５デサチュラーゼΔの５デサチュラーゼ活性は、対応する野生型Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性と機能的に同様であった。
【０１２０】
例えばキメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｒ＊：：Ｐｅｘ２０遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊［配列番号２７］、ＥｇＤ５［配列番号２１］と比べて、遺伝子内の４つの内部制限酵素部位を欠き、位置３４７にＳｅｒの代わりにＡｒｇを含んでなる）を含んでなるプラスミドコンストラクト内で、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する修飾変種野生型Δ５デサチュラーゼに、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｌａ残基の全ての可能なアミノ酸置換を部位特異的変異誘発によって導入した。変異した配列があるプラスミドを個々に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換して配列決定し、次に約１８％のＤＧＬＡを産生するようにあらかじめ遺伝子操作された適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株に形質転換した。これによりＡＲＡ生成に基づく（すなわちＧＣ分析による）、Δ５デサチュラーゼ活性のスクリーニングが可能になった。
【０１２１】
野生型酵素と比較して実質的に低下したΔ５デサチュラーゼ活性を有する変異Δ５デサチュラーゼをもたらす、多数の変異が同定された。しかし驚くことに、予備スクリーニングは、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｌａを置換できて、対応する野生型酵素（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊）のΔ５デサチュラーゼ活性との比較で、ほぼ同等のまたは増大したΔ５デサチュラーゼ活性を変異体中にもたらす、２つのアミノ酸残基を同定した。したがってこの予備実験は、ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性に顕著に影響を及ぼすことなく、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｌａ残基をＧｌｙまたはＳｅｒによって置換し得ることを示唆した。
【０１２２】
ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＳｅｒ残基を変異させる部位特異的変異誘発反応において、ＥｇＤ５Ｒ＊をテンプレートとして使用して、同様の実験を実施した。変異酵素の分析は、野生型アミノ酸（すなわちＳｅｒ）を置き換えて、同等のまたは改善されたΔ５デサチュラーゼ活性を有する変異ＥｇＤ５Ｒ＊酵素をもたらすのに、２つのアミノ酸残基（すなわちＡｌａまたはＧｌｙ）で十分であると判定した。
【０１２３】
ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ中のアミノ酸置換の予備分析が、上述したように完了すると、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異誘発をさらに利用して、上述のΔ５デサチュラーゼのいくつかの変異ＨＤＡＳＨモチーフと組み合わさった特異的点突然変異をＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内に作り出した。このようにして、それぞれプラスミドｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇ（配列番号１２９）、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａ（配列番号１３０）、およびｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ｇ（配列番号１３１）内で、上述した３つの変異ＨＤＡＳＨモチーフΔ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇ［配列番号８７］、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａ［配列番号１２７］、およびＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｇ［配列番号１２８］）のそれぞれに、ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内の様々なアミノ酸置換を部位特異的変異誘発によって導入し、それによってＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのそれぞれに単一変異を有する、二重変異体を作り出した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で二重変異体を増幅してＤＮＡ配列決定によって確認し、次に適切なＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株に形質転換した。この場合もやはり、ＡＲＡ生成に基づく（すなわちＧＣ分析による）、Δ５デサチュラーゼ活性のスクリーニングを実施した。
【０１２４】
全ての二重変異体は、非変異野生型ＥｇＤ５Ｒ＊酵素と比較して、いくらかの検出可能なレベルのΔ５デサチュラーゼ活性を有した。より具体的には、全ての７つの変異Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型ＥｇＤ５Ｒ＊対照と比較して、少なくとも６４％のＤＧＬＡからＡＲＡへの変換効率で機能した一方、３つは少なくとも８３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できた（表３、後述）。スクリーニングは、ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＰｒｏおよび第２のＧｌｙと、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＡｌａおよびＳｅｒとを同時に置換して、対応する野生型酵素（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊）中のΔ５デサチュラーゼ活性と比べて、ほぼ同等のΔ５デサチュラーゼ活性を有する二重変異体をもたらし得ることを確認した。したがってこの実験は、ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性に顕著に影響を及ぼすことなく、１）ａ）ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内のＡｌａ残基のＧｌｙによる置換、またはｂ）ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内のＳｅｒ残基のＡｌａまたはＧｌｙによる置換のいずれかの同時置換と共に、ＨＰＧＧ［配列番号７］モチーフ内のＰｒｏ残基をＧｌｙで置換し得て；２）ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙのいずれかによる同時置換と共に、ＨＰＧＧ［配列番号７］モチーフ内のＰｒｏ残基もまたＨｉｓで置換し得て；３）ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙのいずれかによる同時置換と共に、ＨＰＧＧ［配列番号７］モチーフ内の第２のＧｌｙ残基をＳｅｒで置換し得ることを示唆した。
【０１２５】
ＥｇＤ５Ｒ＊（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ；配列番号１４２）と比較して、最高変換効率を有すると同定された、二重変異ＥｇＤ５Ｒ＊Δ５デサチュラーゼをコードする遺伝子のＮ末端をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化した（すなわちＥｇＤ５Ｍ；配列番号１５２）。次にΔ５デサチュラーゼ活性に対するＲ３４７Ｓ変異の効果を分析するために、位置３４７でＳｅｒをコードするようにＥｇＤ５Ｍを修飾した（すなわちＥｇＤ５Ｍ１；配列番号１５６）。ＥｇＤ５Ｍ（すなわちｐＤＭＷ３６７−５Ｍ；配列番号１５５）またはＥｇＤ５Ｍ１（すなわちｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１；配列番号１５９）のいずれかを含んでなるプラスミドを適切なＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株に別々に形質転換し、Δ５デサチュラーゼ活性および変換効率を測定して、野生型ＥｇＤ５Ｒ＊と比較した。
【０１２６】
双方の二重変異Δ５デサチュラーゼ、すなわちＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５Ｍ１は、野生型ＥｇＤ５Ｒ＊と比較して増大した活性を有した（表３、後述）。驚くことに、ＥｇＤ５Ｍ１は、ＥｇＤ５Ｍと比較して改善されたΔ５デサチュラーゼ活性を実証し、アミノ酸残基３４７のＳｅｒが酵素活性を改善したことが示唆された。
【０１２７】
次に上述の技術を使用して、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドコンストラクト内で、部位特異的変異誘発によって、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する、変異ＨＰＧｓ（配列番号１１）モチーフを有する合成Δ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ［配列番号１６０］；米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書）のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＡｓｐ、Ａｌａ、またはＳｅｒ残基に、単一アミノ酸置換を個々に導入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されて、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来する、変異ＨａＧＧ（配列番号１４）モチーフ（すなわちＥａＤ５Ｓ−３５ａ［配列番号１８８］；米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書）を有する合成Δ５デサチュラーゼを使用して、プロトコルを繰り返した。二重変異があるプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で別々に増幅してＤＮＡ配列決定によって確認し、次にＡＲＡ生成に基づいた（すなわちＧＣ分析による）Δ５デサチュラーゼ活性スクリーニングのために、適切なＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株に形質転換した。ＨｘＧｘ（配列番号３４）とＨｘｘｘＨ（配列番号１）モチーフを含んでなり、適切なΔ５デサチュラーゼ活性を有する、二重変異Δ５デサチュラーゼを各実験から得た（追加的な詳細については、後述する実施例、および表３を参照されたい）。
【０１２８】
【表９】
2013535988.tif 000010
【０１２９】
上の研究は、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のどの特定の同時アミノ酸置換が、許容可能なΔ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドを生成するのに十分であるかに関する合意を示唆しない。しかし当該技術分野における以前の報告に反して、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基の置換と組み合わさった、ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＰｒｏまたはＧｌｙ残基のいずれかの置換が、その野生型親と比較して、機能的に同等のまたは改善されたΔ５デサチュラーゼ活性を有する酵素をもたらすこともあることを実証するデータは、驚くべきである。
【０１３０】
したがって配列番号９（ＨｇＧＧ）、配列番号１０（ＨｈＧＧ）、配列番号１１（ＨＰＧｓ）、配列番号１２（ＨｃＧＧ）、配列番号１３（ＨｗＧＧ）、および配列番号１４（ＨａＧＧ））からなる群から選択される第１のアミノ酸モチーフと、配列番号１５（ＨＤｇＳＨ）、配列番号１６（ＨＤｓＳＨ）、配列番号１７（ＨＤＡａＨ）、配列番号１８（ＨＤＡｇＨ）、および配列番号１９（ＨｅＡＳＨ）からなる群から選択される第２のアミノ酸モチーフとを含んでなる、Δ５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドを提供することは、本発明の範囲内である。
【０１３１】
より好ましくは、上述の変異Δ５デサチュラーゼ（すなわちＨｘＧｘ［配列番号３４］モチーフと変異ＨｘｘｘＨ［配列番号１］モチーフを含んでなる）は、ＨＰＧＧ（配列番号７）とＨＤＡＳＨ（配列番号８）アミノ酸モチーフの双方を有する、対応する野生型Δ５デサチュラーゼの少なくとも６４％のΔ５デサチュラーゼ活性をさらに有する。
【０１３２】
変異ＨＰＧＧモチーフと変異ＨＤＡＳＨモチーフを含んでなる変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２５、および配列番号２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドと比べて、ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有してもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ａ］、配列番号１４７［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ｇ］、配列番号１４９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１５１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２５５［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号２６０［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ａ］、配列番号２７１［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ｇ］、および配列番号２７６［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ａ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１３４】
当業者は、有用な変異Δ５デサチュラーゼが上述の変異に限定されるものではないことを理解するであろう。それよりむしろ結果は、チトクロームｂ５ドメイン内のＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフと、ＨＤＡＳＨモチーフ（配列番号８）とを有するあらゆるΔ５野生型デサチュラーゼ酵素を使用して、同様の実験を実施して、それによって適切なΔ５デサチュラーゼ活性を有する変異Δ５デサチュラーゼを改変し得て、変異は、変異ＨｘＧＧ（配列番号３２）またはＨＰＧｘモチーフ（配列番号３３）および変異ＨｘＡＳＨ（配列番号３５）、ＨＤｘＳＨ（配列番号３６）またはＨＤＡｘＨモチーフ（配列番号３７）をもたらすことを示唆する。適切なΔ５デサチュラーゼ活性を有する変異酵素は、ω−３／ω−６脂肪酸生成を増大させるのに有用たり得る。
【０１３５】
例えば生体外変異誘発と選択または誤りがちなＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１：１１−１５（１９８９）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：６０５２−６０５２（１９９１）；Ｓｐｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：７７７−７７８（１９９３）；Ｍｅｌｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７（４）：１０５６−１０６２（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，１９９９））もまた、天然Δ５デサチュラーゼ遺伝子の変異を得る手段として採用でき、変異としては、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせが挙げられる。誤りがちなＰＣＲの主な利点は、この方法によって導入される全ての変異が所望のデサチュラーゼ遺伝子内にあり、ＰＣＲ条件を変更することであらゆる変更が容易に制御できることである。代案としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｒｅｄ株およびＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ  ｍｕｔａｔｏｒ株などの市販材料を使用した生体内変異誘発を用いてもよい（Ｇｒｅｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，７：３２−３４（１９９４））。この株は主要ＤＮＡ修復経路の内３つ（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、およびｍｕｔＴ）が欠損しており、野生型より５０００倍高い変異率がもたらされる。生体内変異誘発は（誤りがちなＰＣＲと同様に）ライゲーション効率に依存しない；しかし変異はベクターのあらゆる領域で起きてもよく、変異率は一般にはるかにより低い。
【０１３６】
改変または改善されたΔ５デサチュラーゼ活性がある変異Δ５デサチュラーゼを「遺伝子シャフリング」法（米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書）を使用して構築してもよいこともまた考察される。遺伝子シャフリング法は、その容易な実行、および高率な変異誘発のために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、対象の遺伝子との類似性（または相違性）があるＤＮＡ領域の追加的集団存在下で、対象の遺伝子を制限酵素で切断して特定サイズ断片にすることを伴う。この断片のプールを変性させ、再アニールして変異遺伝子を作り出す。次に変異遺伝子は、活性変化についてスクリーニングされる。これらの方法のいずれかを使用して、置換モチーフＨｘＧＧ（配列番号３２）またはＨＰＧｘ（配列番号３３）、およびＨｘＡＳＨ（配列番号３５）、ＨＤｘＳＨ（配列番号３６）、またはＨＤＡｘＨ（配列番号３７）を有するΔ５デサチュラーゼ変異酵素を作成してもよく、次に本明細書に記載される方法を使用して、適切な活性についてスクリーニングしてもよい。
【０１３７】
適切なプロモーター制御下における、本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子（すなわち前記変異Δ５デサチュラーゼが、ＨＰＧＧアミノ酸モチーフをコードする領域の少なくとも１つの変異と、ＨＤＡＳＨアミノ酸モチーフをコードする領域の少なくとも１つの変異を含んでなり、前記変異Δ５デサチュラーゼが、好ましくは対応する野生型Δ５デサチュラーゼと比較して、少なくとも６４％のΔ５デサチュラーゼ活性を有する）の導入は、形質転換宿主生物中において、それぞれＡＲＡおよび／またはＥＰＡの生成をもたらすことが予測される。したがって本明細書で開示されるのは、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちそれぞれＡＲＡおよび／またはＥＰＡ）に変換されるように、脂肪酸基質（すなわちＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡ）を本明細書に記載される変異デサチュラーゼ（例えば配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５７、１８１、１８３、１８５、１８７、２１３、２１５、２１７、２５５、２６０、２７１、および２７６のいずれか）に曝露するステップを含んでなる、ＰＵＦＡを直接生成する方法である。
【０１３８】
より具体的には、本明細書に記載されるのは、微生物宿主細胞（例えば細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱および真菌）、または植物宿主細胞（例えば油料種子植物細胞）中でＰＵＦＡを生成する方法であり、微生物または植物宿主細胞は、
ａ）配列番号９（ＨｇＧＧ）、配列番号１０（ＨｈＧＧ）、配列番号１１（ＨＰＧｓ）、配列番号１２（ＨｃＧＧ）、配列番号１３（ＨｗＧＧ）、および配列番号１４（ＨａＧＧ）からなる群から選択される第１のアミノ酸モチーフと、配列番号１５（ＨＤｇＳＨ）、配列番号１６（ＨＤｓＳＨ）、配列番号１７（ＨＤＡａＨ）、配列番号１８（ＨＤＡｇＨ）、および
ｂ）配列番号１９（ＨｅＡＳＨ）からなる群から選択される第２のアミノ酸モチーフとを含んでなる、Δ５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチド；およびＤＧＬＡおよびＥＴＡ
からなる群から選択される基質脂肪酸源を含んでなり；宿主細胞は、変異Δ５デサチュラーゼが発現されて、基質脂肪酸が生成物ＰＵＦＡに変換されるような条件下で培養され、ＤＧＬＡはＡＲＡに変換されおよび／またはＥＴＡはＥＰＡに変換され；生成物ＰＵＦＡは任意選択的に回収される。
【０１３９】
代案としては、様々なω−６およびω−３ＰＵＦＡの製造のために、本明細書に記載される、各変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子とそれに対応する酵素生成物を間接的に使用し得る（図１；米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，６７８，５６０号明細書；米国特許第７，６９５，９５０号明細書を参照されたい）。ω−３／ω−６  ＰＵＦＡの間接的生成は、中間工程または経路中間体の手段を通じて、脂肪酸基質が所望の脂肪酸産物に間接的に変換されて起きる。したがってＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ）をコードする追加的な遺伝子と併せて、本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼを発現させ、例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡなどの長鎖ω−３／ω−６脂肪酸のより高いレベルの生成をもたらしてもよいことが検討される。
【０１４０】
好ましくは本明細書に記載されるΔ５デサチュラーゼは、少なくともΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼと併せて発現される。Δ５デサチュラーゼはまた、少なくともΔ６デサチュラーゼおよびΔ６エロンガーゼと併せて発現させ得る。しかし特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（そしてそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望の最終産物に左右される。
【０１４１】
変異Δ５デサチュラーゼ（すなわち前記変異体が、配列番号９（ＨｇＧＧ）、配列番号１０（ＨｈＧＧ）、配列番号１１（ＨＰＧｓ）、配列番号１２（ＨｃＧＧ）、配列番号１３（ＨｗＧＧ）、および配列番号１４（ＨａＧＧ）からなる群から選択される第１のアミノ酸モチーフと、配列番号１５（ＨＤｇＳＨ）、配列番号１６（ＨＤｓＳＨ）、配列番号１７（ＨＤＡａＨ）、配列番号１８（ＨＤＡｇＨ）、および配列番号１９（ＨｅＡＳＨ）からなる群から選択される第２のアミノ酸モチーフとを含んでなる）をコードするＯＲＦを含んでなる組換えコンストラクトを作成して、適切な宿主細胞に導入する必要がある。
【０１４２】
当業者は、以下を記載する、標準資料を承知している。１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの巨大分子の構築、操作、および単離のための特定条件と手順；２）組換えＤＮＡ断片と組換え発現コンストラクトの作成；および３）クローンまた植物系統のスクリーニングおよび単離。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｃｌａｒｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：ＮＹ（１９９７）を参照されたい。
【０１４３】
一般にコンストラクトに含まれる配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する提案される手段に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換させ、選択し、増殖させるために、プラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を承知している。しかし典型的に、ベクターまたはカセットは、妥当な遺伝子の転写と翻訳を誘導する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体の組み込みを可能にする配列を含有する。適切な発現カセットは、典型的に、プロモーター、選択された遺伝子のコード配列、およびターミネーターを含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も望ましい。
【０１４４】
所望の微生物宿主細胞または植物細胞中において、当該Δ５デサチュラーゼＯＲＦの発現を駆動するのに有用なプロモーターについては、良く知られている。選択された宿主細胞中においてこれらの遺伝子の発現を誘導できる、実質的にあらゆるプロモーター（すなわち天然、合成、またはキメラ）が、適切である。宿主細胞中の発現は、誘導的または構成的様式で達成できる。誘導性発現が、対象の遺伝子と作動的に連結する調節可能なプロモーターの活性を誘導することで起きるのに対し、構成的発現は構成的プロモーターの使用によって起きる。
【０１４５】
一例として、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用されるプロモーターを記載する。構成的または誘導性転写が所望されるのか、対象のＯＲＦの発現におけるプロモーターの効率、構築の容易さなどに応じて、いくつかのプロモーターのいずれか１つを使用し得る。
【０１４６】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲のヌクレオチド配列は、酵母細胞中の発現に影響を及ぼすことが分かっている。所望のポリペプチドが酵母中で不十分に発現される場合、効率的な酵母翻訳開始配列を含めるように外来性遺伝子のコード領域を修飾して、最適な遺伝子発現を得ることができる。酵母中における発現では、これは非効率的に発現される遺伝子を部位特異的変異誘発することで、またはそれを内在性酵母プロモーター、好ましくは高度に発現されるプロモーターにインフレームで融合させることで、成し得る。代案としては、異種遺伝子の最適発現のために、宿主のコンセンサス翻訳開始配列をそれに含め得る。
【０１４７】
ターミネーターは、それからプロモーターが得られる遺伝子の３’領域、または異なる遺伝子に由来し得る。多数のターミネーターが知られており、それらが由来したのと同じおよび異なる属および種のどちらで使用した場合も、多様な宿主中で満足に機能する。ターミネーターは、通常いかなる特性のためでもなく、便宜上選択される。ターミネーターはまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。当業者は、入手できる情報を利用してターミネーターをデザインおよび合成し得るので、ターミネーターはまた合成もされ得る。ターミネーターは不要なこともあるが、高度に好ましい。
【０１４８】
遺伝子をクローニングベクターに単に挿入することは、所望の速度、濃度、量などでのその発現を保証しない。高レベルの発現に対する必要性に応えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、ならびに微生物宿主細胞または植物細胞からの分泌を制御する、特定の特性を調節することにより、多数の特殊発現ベクターが作り出されている。これらの特性としては、以下が挙げられる。関連する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン遺伝子コピー数（単一発現コンストラクト中で追加的コピーをクローンしてもよく、および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはゲノム中へのクローン遺伝子の複数の組み込みにより、追加的コピーを宿主細胞中に導入してもよい）；遺伝子がプラスミド上にあるか、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれているかどうか；合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在；宿主生物中のタンパク質の翻訳と正しい折りたたみの効率；宿主細胞中のクローン遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；およびクローン遺伝子内のコドン使用頻度。これらのそれぞれを本明細書に記載される方法および宿主細胞中で使用して、変異Δ５デサチュラーゼの発現をさらに最適化してもよい。
【０１４９】
プロモーター、変異Δ５デサチュラーゼＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなる、少なくとも１つのキメラ遺伝子を含んでなる、組み換えコンストラクトを作り出した後、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に生じ得て、または宿主遺伝子座内で組換えを標的とするのに十分な、宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的化し得る。コンストラクトが内在性遺伝子座を標的とする場合、全部または一部の転写および翻訳調節領域は、内在性遺伝子座によって提供され得る。
【０１５０】
２つ以上の遺伝子が別個の自己複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、その他のコンストラクトとの相同性を欠いて、安定発現を維持し、コンストラクト間の要素の再集合を妨げるべきである。調節領域の賢明な選択、選択手段、および導入コンストラクトの増殖法は、導入遺伝子が所望の生成物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、実験的に判定し得る。
【０１５１】
対象の遺伝子を含んでなるコンストラクトは、任意の標準技術によって微生物宿主細胞または植物宿主細胞に導入されてもよい。これらの技術としては、例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１））などの形質転換、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または対象の遺伝子を宿主細胞に導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１５２】
便宜上、例えば発現カセット中に、ＤＮＡ配列を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「形質転換体」または「組み換え」と本明細書で称する。形質転換宿主は、発現カセットがゲノムに組み込まれるのか、増幅されるのか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するのかに応じて、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換された宿主細胞は、導入されたコンストラクト上に含有されるマーカーについて選択することで同定できる。代案としては、多くの形質転換技術は多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するので、所望のコンストラクトと共に別個のマーカーコンストラクトを同時形質転換してもよい。
【０１５３】
典型的に形質転換された宿主は、選択的培地上で成長するそれらの能力について選択され、選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または非形質転換宿主の成長に必要な栄養素または成長因子などの要素が欠如していてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると抗生物質耐性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での成長を可能にしてもよい。発現したマーカーを直接または間接に検出し得る場合にもまた、形質転換された宿主を選択し得る。追加的な選択技術は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、および米国特許第７，９３２，０７７号明細書に記載される。
【０１５４】
形質転換に続いて、当該変異Δ５デサチュラーゼに適する基質（および任意選択的に、宿主細胞内で同時発現されるその他ＰＵＦＡ酵素）は、宿主によって自然にまたは遺伝子導入によって産生されてもよく、またはそれらは外部から提供されてもよい。
【０１５５】
細菌、酵母、藻類、ストラメノパイル、卵菌綱、ユーグレナ属、真菌および／または植物をはじめとする多様な真核生物生物が、それによって本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼを含んでなる形質転換体をもたらす宿主として適切である。これは転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置が高度に保存されていることから考察される。したがって適切な宿主としては、広い温度およびｐＨ値範囲にわたり、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロール、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で成長するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５６】
好ましい微生物宿主は、油性生物である。これらの油性生物は天然に油を合成および蓄積でき、全含油量は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の約２５％を超え、より好ましくはＤＣＷの約３０％を超え、より好ましくはＤＣＷの約４０％を超え、より好ましくはＤＣＷの約５０％を超え、最も好ましくはＤＣＷの約６０％を超えて構成し得る。様々な細菌、藻類、ユーグレナ属、コケ、真菌、酵母、およびストラメノパイルが油性として自然に分類される。代案の実施態様では、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母などの非油性生物を遺伝子改変して、油性にし得る（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレットを参照されたい）。
【０１５７】
より好ましい実施態様では、微生物宿主細胞は、ＤＣＷの少なくとも２５％を油として産生できる油性酵母である。典型的に油性酵母として同定される属としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例示的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。
【０１５８】
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。さらなる実施態様では、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））。
【０１５９】
油性酵母（たとえばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の形質転換に応用できる特定の教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ生成の遺伝子操作に応用できる特定の教示は、それぞれ米国特許第７，５８８，９３１号明細書、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書、および米国特許第７，５５０，２８６号明細書で提供される。
【０１６０】
この酵母中における遺伝子の好ましい発現方法は、宿主ゲノムへの線状ＤＮＡの組み込みによる。遺伝子座Ｕｒａ３、Ｌｅｕ２、Ｌｙｓ５、Ａｃｏ２、Ｐｏｘ３、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、ＳＣＰ２、Ｐｅｘ３、Ｐｅｘ１６および／またはＰｅｘ１０などのゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベルの発現が所望される場合に、特に有用であり得る（例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書を参照されたい）。
【０１６１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で成長する能力である。５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）もまた、酵母Ｕｒａ−変異体の選択のために特に有用であることもあり（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）、またはスルホニル尿素除草剤耐性をもたらす天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）（米国特許第７，９３２，０７７号明細書）を利用して、形質転換体を選択してもよい。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを「再利用する」ユニークな方法もまた、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示される。
【０１６２】
上に基づいて、本明細書で開示されるのは
（ａ）（ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする、第１の組換えヌクレオチド分子；および
（ｉｉ）それぞれＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡからなるデサチュラーゼ基質源
を含んでなる、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））を提供するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の酵母を適切な発酵性炭素源の存在下で培養し、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現されて、それぞれＤＧＬＡがＡＲＡに変換されおよび／またはＥＴＡがＥＰＡに変換されるステップと；
（ｃ）任意選択的にステップ（ｂ）のＡＲＡおよび／またはＥＰＡをそれぞれ回収するステップを含んでなる、ＡＲＡまたはＥＰＡのいずれかをそれぞれ生成する方法である。
【０１６３】
基質供給が必要なこともある。好ましい実施形態では、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドは、配列番号１３９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号１４１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号１４３［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１４５［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ａ］、配列番号１４７［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｈ１５８ｇ］、配列番号１４９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１５１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号１５３［ＥｇＤ５Ｍ、（コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）］、配列番号１５７［ＥｇＤ５Ｍ１、（コドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ）］、配列番号１８１［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号１８３［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１８５［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号１８７［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号２１３［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２１５［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、配列番号２１７［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］、配列番号２５５［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号２６０［ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ａ］、配列番号２７１［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ｇ］、および配列番号２７６［ＥａＤ５−３５ｇ１５９ａ］からなる群から選択される。したがって例えば変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば配列番号１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５６、１８０、１８２、１８４、１８６、２１２、２１４、２１６、２５４、２５９、２７０、および２７５からなる群から選択されてもよい。
【０１６４】
天然では油性酵母中で生成されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）、および一般的ではないが１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限定されるので、油性酵母を遺伝子改変し、本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼに加えて長鎖ＰＵＦＡ生合成に必要な複数酵素を発現させて（それによって例えばＤＰＡｎ−６、ＤＰＡ、およびＤＨＡを生成できるようにして）もよい。
【０１６５】
具体的には、本明細書において油性酵母が検討され、前記酵母は、
ａ）少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを含んでなる第１の組換えＤＮＡコンストラクト；
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの追加的な組換えＤＮＡコンストラクトを含んでなる。
【０１６６】
その他の適切な微生物宿主としては、油性細菌、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌が挙げられる。この広範な微生物宿主グループ内で、特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物であり、またはこの目的で遺伝子改変し得るものである。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーター制御下における、本Δ５デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによるモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（ＡＲＡ生成のために商業的に使用される）の形質転換は、増大した量のＡＲＡを合成できる形質転換体生物を生じ得る。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）を形質転換する方法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００））によって記載される。同様に、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばスラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）を形質転換させる方法が、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示される。
【０１６７】
本明細書に記載されるΔ５デサチュラーゼ遺伝子および遺伝子産物は、一般に「油料種子」植物と称される、異種油性植物内の細胞中で生成されてもよい。油料種子植物の例としては、大豆（ＧｌｙｃｉｎｅおよびＳｏｊａ種）、亜麻（Ｌｉｎｕｍ種）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ種）、トウモロコシ、綿、紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ種）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ種）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６８】
一実施形態では、本発明は、植物中での発現に適する、少なくとも１つの調節配列と作動可能に結合して、本発明のΔ５デサチュラーゼポリヌクレオチドのいずれか１つを含んでなる、組換えコンストラクトに関する。
【０１６９】
適切な時に所望の宿主組織中で所望の核酸断片を与える、翻訳可能なｍＲＮＡの発現によって、本発明を達成するのに十分な転写活性を有しさえすれば、Δ５デサチュラーゼコード配列の発現を駆動するように選択される植物プロモーターは、重要でない。異種または非異種（すなわち内在性）プロモーターのどちらでも使用して、本発明を実施し得る。例えば適切なプロモーターとしては、１３−コングリシニンプロモーターのαプライムサブユニット、クニッツトリプシン阻害剤３プロモーター、アネキシンプロモーター（Ｐ３４プロモーターとしても知られる；国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレット）、Ｇｌｙｌプロモーター、１３−コングリシニンプロモーターの１３サブユニット、Ｐ３４／Ｇｌｙ  Ｂｄ  ｍ  ３０Ｋプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬｅｇＡｌプロモーター、およびＬｅｇＡ２プロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７０】
次にプロモーターは、当業者に良く知られている従来の手段を使用して、センス方向で作動可能に結合される。
【０１７１】
次に当業者に良く知られている方法（例えば形質移入、形質転換、および電気穿孔）によって、組換えコンストラクトを１つまたは複数の選択された植物細胞に導入してもよい。次に形質転換植物細胞を培養して、長鎖ＰＵＦＡ発現を可能にする適切な条件下で再生し、次にそれを任意選択的に回収して精製する。
【０１７２】
植物細胞中における、少なくとも１つの所望の長鎖ＰＵＦＡの一過性または安定発現のいずれかが、上述したように達成されてもよい。このようなＰＵＦＡはまた、形質転換植物から得られる種子、植物部位、または形質転換植物の種子から得られる油中で発現され得る。
【０１７３】
植物部位としては、根、茎、芽、苗条、花粉、種子、腫瘍組織、および細胞および培養物の様々な形態（例えば単一細胞、プロトプラスト、胚、およびカルス組織）をはじめとするが、これに限定されるものではない、分化および未分化組織が挙げられる。植物組織は、植物中または植物器官、組織または細胞培養中にあってもよい。
【０１７４】
「植物器官」という用語は、形態学的および機能的に異なった植物部位を構成する、植物組織または１群の組織を指す。
【０１７５】
したがって本発明は、本発明の組換えコンストラクトで細胞を形質転換するステップと、組換えコンストラクトで形質転換された細胞を選択するステップを含んでなる、細胞を形質転換する方法にも関し、前記組換えコンストラクトは、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、変異ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３４［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフおよび配列番号１［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフを含んでなり、配列番号３４［ＨｘＧｘ］は配列番号７［ＨＰＧＧ］と同一でなく、配列番号１［ＨｘｘｘＨ］は配列番号８［ＨＤＡＳＨ］と同一でない。
【０１７６】
また関心が持たれるのは、本発明の変異Δ５デサチュラーゼポリヌクレオチドがある形質転換植物細胞を生成し、形質転換植物細胞から植物を再生する方法である。
【０１７７】
双子葉植物を形質転換し（主にアグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用によって）、遺伝子導入植物を得る方法は、特に綿（米国特許第５，００４，８６３号明細書；米国特許第５，１５９，１３５号明細書）；大豆（米国特許第５，５６９，８３４号明細書；米国特許第５，４１６，０１１号明細書）；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（米国特許第５，４６３，１７４号明細書）；落花生（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１５：６５３−６５７（１９９６）；ＭｃＫｅｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１４：６９９−７０３（１９９５））；パパイア（Ｌｉｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：７５２−７５８（１９９１））；およびエンドウマメ（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１５：２５４−２５８（１９９５））で公表されている。その他の通常使用される植物形質転換方法のレビューについては、Ｎｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：５３−６５（２０００））を参照されたい。これらの形質転換方法の１つは、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用する（Ｔｅｐｆｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｃａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ，Ｆ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：２４−２８（１９８７））。ＰＥＧ融合（国際公開第９２／１７５９８号パンフレット）、電気穿孔（Ｃｈｏｗｒｉｒａ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：１７−２３（１９９５）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３９６２−３９６６（１９８７））、マイクロインジェクション、または粒子衝突（ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１−６７４（１９８８））を使用した、ＤＮＡの直接送達を使用した大豆の形質転換が公表されている。
【０１７８】
植物を植物組織から再生するための多様な方法がある。特定の再生方法は、出発植物組織および再生させる特定の植物種に依存する。単一植物プロトプラスト形質転換体からの、または様々な形質転換外植片からの植物の再生、発育、および栽培は、当該技術分野で周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８８））。この再生および成長プロセスは、典型的に、形質転換細胞を選択するステップと、これらの個別の細胞を、胚発生から根付いた小植物段階に至る、通常の段階を通じて培養するステップを含む。遺伝子導入胚および種子は、同様に再生される。その後、得られた遺伝子導入された根付いた苗条は、土壌などの適切な植物増殖培地に植え付けられる。好ましくは、再生植物は自家受粉して、ホモ接合遺伝子導入植物を提供する。そうでなければ、再生植物から得られる花粉を作物学的に重要な系列の種子成長植物と交配させる。その反対に、これらの重要な系統の植物からの花粉を使用して、再生植物に受粉させる。所望のポリペプチドを含有する本発明の遺伝子導入植物が、当業者に良く知られている方法を使用して栽培される。
【０１７９】
一実施形態では本発明は、
ａ）少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを含んでなる第１の組換えＤＮＡコンストラクト；および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの追加的な組換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、油料種子植物に関する。
【０１８０】
このような追加的なデサチュラーゼおよびエロンガーゼについては、特許および公開文献中の多数の参考文献で考察されている。（例えば米国特許第６，０７５，１８３号明細書、米国特許第５，９６８，８０９号明細書、米国特許第６，１３６，５７４号明細書、米国特許第５，９７２，６６４号明細書、米国特許第６，０５１，７５４号明細書、米国特許第６，４１０，２８８号明細書、米国特許第７，９３２，０７７、および国際公開第９８／４６７６３号パンフレット、国際公開第９８／４６７６４号パンフレット、国際公開第００／１２７２０号パンフレット、国際公開第００／４０７０５号パンフレット）。
【０１８１】
使用されるカセットの組み合わせの選択は、形質転換させる油料種子植物細胞のＰＵＦＡプロファイルおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロファイルと、発現させる長鎖ＰＵＦＡとにある程度左右される。
【０１８２】
別の態様では、本発明は、
ａ）細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換するステップと；
ｂ）長鎖ＰＵＦＡを産生する形質転換細胞を選択するステップと
を含んでなる、植物細胞中で長鎖ＰＵＦＡを生成する方法に関する。
【０１８３】
なおも別の態様では、本発明は、
（ａ）植物細胞を
ｉ．少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組換えＤＮＡコンストラクト；および
ｉｉ．少なくとも１つの制御配列と作動可能に結合して、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの追加的な組換えＤＮＡコンストラクト
で形質転換するステップと；
（ｂ）植物をステップ（ａ）の形質転換細胞から再生するステップと；
（ｃ）非形質転換植物から得られる種子中のレベルと比べて、ＰＵＦＡレベルが変化している、ステップ（ｂ）の植物から得られる種子を選択するステップと
を含んでなる、植物細胞中で少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する方法に関する。
【０１８４】
特に好ましい実施形態では、少なくとも１つの追加的な組換えＤＮＡコンストラクトが、Δ９エロンガーゼ活性およびΔ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１８５】
本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼ発現のために選択される宿主に関わりなく、所望の発現レベルおよびパターンを示す株または植物系統を得るためには、複数形質転換体をスクリーニングしなくてはならない。例えばＪｕｒｅｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，１８：９７ー１１３（２００１））は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性は、使用される個々の形質転換体、受容者株、および標的プラットフォームに左右されると述べた。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタンおよび／またはＥｌｉｓａ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【０１８６】
本変異Δ５デサチュラーゼの配列知識は、様々な宿主細胞中でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作する上で有用であろう。生化学的経路を操作する方法は当業者に良く知られており、油性酵母中、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、そして油料種子植物中で、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化する多数の操作が可能であることが予測される。この操作は、ＰＵＦＡ生合成経路内の直接的代謝エンジニアリング、または炭素からＰＵＦＡへの生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路のアップレギュレート、および望ましくない生化学的経路のダウンレギュレートに有用な方法は、当業者に良く知られている。
【０１８７】
例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子破壊によって除去し、または例えばアンチセンスｍＲＮＡなどのその他の手段によってダウンレギュレートしてもよい。
【０１８８】
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内操作、およびその関連技術の詳細な考察は、それぞれ米国特許第７，５８８，９３１号明細書、米国特許第７，９３２，０７７号明細書、米国特許出願公開第２００９−０９９３５４３−Ａ１号明細書、および米国特許第７，５５０，２８６号明細書に提示され、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路における望ましい操作（およびその関連技術）についても同様である。
【０１８９】
上述の戦略のいずれか１つによって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用かもしれない。例えば本明細書で提供されるのは、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生成のために、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ生合成経路およびΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ生合成経路中の鍵酵素をコードする遺伝子を油性酵母または油料種子植物に導入する方法である。天然ではω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を持たない油性酵母または油料種子中で本変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子を発現させ、宿主生物の代謝エンジニアリングの様々な手段を使用して、これらの遺伝子の発現を連係させて、好ましいＰＵＦＡ生成物の産生を最大化することが特に有用であろう。
【０１９０】
形質転換された微生物宿主細胞をキメラ遺伝子の発現（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ）を最適化する条件下で培養し、所望のＰＵＦＡの最大かつ最も経済的な収率を生じさせる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なる無機イオン量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生産相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。油性酵母（例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））などの対象の微生物は、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地［「ＹＰＤ」］などの複合培地上で、または生育に必要な構成要素が欠如していることで所望の発現カセットの選択を強要する規定最少培地（例えば酵母菌窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））上で一般に培養される。
【０１９１】
本明細書に記載される方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書で開示されるような、適切な炭素源を含有しなくてはならない。本明細書の方法で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖（例えばグルコース、転化糖、果糖、およびそれらの組み合わせ）、グリセロール、および／または脂肪酸である。
【０１９２】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸または「酵母抽出物」）原料から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、油性宿主の成長と、ＰＵＦＡ産生に必須の酵素経路の促進とに適することが当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、およびその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する、Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、およびＭｇ＋２などのいくつかの金属イオンが、特に注目された（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ６１−９７（１９９２））。
【０１９３】
本明細書に記載される方法および宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母窒素原礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、形質転換宿主細胞の成長に適した培地は、微生物学または発酵化学当業者に知られている。発酵のための適切なｐＨ範囲は典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期成長条件範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実行されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１９４】
典型的に、代謝状態は、成長と脂肪合成／貯蔵の間で「平衡状態」でなくてはならないので、油性酵母細胞中の高レベルのＰＵＦＡ蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中でのＰＵＦＡ生成のために、二段階発酵過程が必要である。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加、および連続）および成長中の配慮についても同様である。
【０１９５】
ＰＵＦＡは、宿主微生物中に、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などのエステル化形態で見られ、当該技術分野で周知の多様な手段を通じて、宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および許容基準に関する１つのレビューは、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３−４９１（１９９２））である。Ａ．Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｏ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１−３１２（１９９７））による後処理過程の簡単なレビューもまた入手できる。
【０１９６】
一般にＰＵＦＡ精製のための手段としては、有機溶剤による抽出（例えば米国特許第６，７９７，３０３号明細書、および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用する）、鹸化、および圧搾などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられる。追加的な詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。
【０１９７】
ω−３および／またはω−６脂肪酸、特に例えばＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡが組み込まれた多数の食品および飼料製品がある。長鎖ＰＵＦＡを含んでなる微生物または植物バイオマス、ＰＵＦＡを含んでなる部分的に精製されたバイオマス、ＰＵＦＡおよび／または精製ＰＵＦＡを含んでなる精製油は、食品および飼料製品中で機能して、現行の調合物に健康上の利点を与えることが考察される。より具体的にはω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する油は、類似食品、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な食品および飼料製品中での使用に適する（例えば米国特許第７，５８８，９３１号明細書を参照されたい）。
【０１９８】
本組成物を調合物中で使用して、医療栄養物、健康補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品をはじめとするメディカルフードに健康上の利点を与えてもよい。食品加工および食品調合の当業者は、一定量および組成の本油をどのように食品または飼料製品に添加してもよいかを理解するであろう。このような量は本明細書で「有効」量と称され、食品または飼料製品、栄養補給することが意図される食餌、またはメディカルフードまたは医療栄養物が矯正または治療することが意図される疾患によって決まる。
【０１９９】
本組成物はまた、動物の健康を改善するために使用されてもよく；それらは動物の食料、飼料、および医薬品中で使用されてもよい。
【実施例】
【０２００】
本発明の具体化を例示するが、その可能なバリエーションの全てを完全に定義するものではない、以下の実施例において本発明についてさらに詳述する。
【０２０１】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；２）Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．；および３）Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．によって記載される。
【０２０２】
微生物培養の維持および成長に適した材料と方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））；またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載される。微生物細胞の成長および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限りＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的に、ルリア・ベルターニ［「ＬＢ」］プレート上で、３７℃で培養された。
【０２０３】
一般的分子クローニングは、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出）に従って実施された。ＤＮＡ配列は、ダイターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用し、ベクターおよび挿入特異的プライマーの組み合わせを使用して、ＡＢＩ自動配列決定装置によって生成された。配列編集は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）中で実施された。全ての配列は、両方向の少なくとも２回のカバレッジに相当する。遺伝子配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して達成された。
【０２０４】
略語の意味は、次の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０２０５】
発現カセット命名法：
発現カセットの構造は簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」で表され、Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結する。
【０２０６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養：
ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、典型的に下に示すレシピに従った、いくつかの培地中で２８〜３０℃で培養した。寒天プレートは、標準手順に従って、各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加して、必要に応じて調製した。
【０２０７】
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］；２０ｇのバクトペプトン［Ｄｉｆｃｏ］；および２０ｇのグルコース。
【０２０８】
基礎最少培地（ＭＭ）（１Ｌあたり）：２０ｇのグルコース；アミノ酸を含まない１．７ｇの酵母窒素原礎培地；１．０ｇのプロリン；およびｐＨ６．１（調節なし）。
【０２０９】
最少培地＋ロイシン（ＭＭ＋ロイシンまたはＭＭＬｅｕ）（リットルあたり）：上の通りにＭＭ培地を作成して、０．１ｇのロイシンを添加する。
【０２１０】
高グルコース培地（ＨＧＭ）（リットルあたり）：８０のグルコース；２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４；および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．５（調節の必要なし）。
【０２１１】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるように実施した。
【０２１２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析：  脂肪酸分析のためには、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載されるようにして、細胞を遠心分離によって収集し脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換によってＦＡＭＥを調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、引き続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着した、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は、１７０℃（２５分間の保持時間）から、３．５℃／分で１８５℃にした。
【０２１３】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を採取して蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ内において真空下で５〜１０分間乾燥させた。サンプルにナトリウムメトキシド（１％；１００μＬ）を添加して、次にサンプルをボルテックスして２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠沈した。上層を除去し、上述のようにＧＣによって分析した。
【０２１４】
代わりとして、発酵またはフラスコサンプルのいずれかからのブロスサンプルをルーチン分析するために、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載される塩基触媒エステル交換法の変法を使用した。具体的には、ブロスサンプルを室温水中で迅速に解凍し、次に０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心管フィルター（カタログ番号８１６１）と共に、風袋を測定した２ｍＬ微量遠心管内に量り入れた（０．１ｍｇ）。あらかじめ測定したＤＣＷに応じて、サンプル（７５〜８００μｌ）を使用した。エッペンドルフ５４３０遠心分離機を使用して、サンプルを１４，０００ｒｐｍで５〜７分間、またはブロスを除去するのに必要な時間遠心分離した。フィルターを取り出して液体を排出し、約５００μｌの脱イオン水をフィルターに添加してサンプルを洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再度取り出して、液体を排出してフィルターを再度挿入した。遠心管を遠心分離機に今度は蓋を開けたまま、約３〜５分間再度挿入して乾燥させた。次にフィルターに遠心管の半ばまで切り込みを入れて、新鮮な２ｍＬ丸底エッペンドルフ管（カタログ番号２２３６３３５−２）に挿入した。切断されたフィルター容器の縁のみに接触し、サンプルまたはフィルター材料に接触しない適切な道具によって、フィルターを遠心管の底に押しつけた。既知量のトルエン中のＣ１５：０  ＴＡＧ（前出）、および５００μｌの新鮮に調整されたメタノール溶液中の１％ナトリウムメトキシドを添加した。サンプルペレットを適切な道具によってしっかりと砕き、遠心管を閉じて５０℃ヒートブロックに３０分間入れた（ＶＷＲ  カタログ番号１２６２１−０８８）。次に遠心管を少なくとも５分間放冷した。次に４００μｌのヘキサンおよび５００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を添加して、遠心管を２×６秒間ボルテックスして１分間遠心分離した。およそ１５０μｌの上（有機）層をインサート付きＧＣバイアルに入れ、ＧＣによって分析した。
【０２１５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株の構築
後述する実施例３〜５、７〜８、および１０では、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットに記載されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）を宿主として使用した。
【０２１６】
Ｙ４０３６Ｕ株は、Ｙ２２２４株（Ｕｒａ３−、Ｕｒａ３遺伝子の自律変異からのＦＯＡ耐性変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−表現型で１７％ＥＤＡを産生する）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、およびＹ４０３６株（Ｌｅｕ−表現型で１８％ＤＧＬＡを産生する）の構築を介して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導された。
【０２１７】
野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ４０３６Ｕ株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ３−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴであった（ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成変異Δ８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］である。
【０２１８】
実施例１
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」］のための位相モデルの開発
ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」；米国特許第７，６７８，５６０号明細書］内のＨＤＡＳＨモチーフの可能な重要性をより良く予測するために、下の論理および分析に基づいて位相モデル（図２）を開発した。
【０２１９】
最初に、ＴＭＨＭＭプログラム（「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；ＴＭＨＭＭ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．０，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍ−ＤＴＵ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ，ＤＫ−２８００  Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＥｇＤ５の膜貫通ドメインの分析を実施した。予測は、ＮおよびＣ末端の双方が膜の細胞質側に位置する、６つの膜貫通らせん（アミノ酸残基１０３〜１２５、１３０〜１５２、１６５〜１８７、２３４〜２５６、２８０〜３０２、および３０６〜３２８）を示唆した。
【０２２０】
以下のＥｇＤ５の相同体を使用して、同様のＴＭＨＭＭ分析を実施した。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＴ０９１６０［ニッチア・クロステリウム（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）ミヌティシマ（ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）品種］、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＧ７１００７［オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＳＥＫ３４７種］、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＬ９２５６２［フェオダクチラム・トリコルナタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）］。各相同体毎に、４つの膜貫通部分が予測され、それはＥｇＤ５で予測された最初の２つおよび最後の２つの膜貫通ドメインに相当した。
【０２２１】
膜結合脂肪酸デサチュラーゼは３つのヒスチジンに富む（Ｈｉｓに富む）モチーフ、ＨＸ（３−４）Ｈ（配列番号１および２）、ＨＸ（２−３）ＨＨ（配列番号３および４）、および（Ｈ／Ｑ）Ｘ（２−３）ＨＨ（配列番号５および６）を特徴とする、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する。これらのＨｉｓに富む残基は、膜の細胞質面に位置することが予測されており、酵素活性に重要であることが示されている（Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１２７８７−１２７９４（１９９４）；Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９：６１１−６４１（１９９８））。ＥｇＤ５内では、最初のＨｉｓに富む領域（ＨＤＡＳＨ［配列番号８］）が、アミノ酸残基１６５〜１８７に及ぶ第３の予測された膜貫通部分の前に位置する一方、第２のＨｉｓに富む領域（ＨＩＭＲＨＨ［配列番号４］）はこの膜貫通部分の後ろに位置する。第３の膜貫通部分が実際に膜の内外にまたがれば、第２のＨｉｓに富む領域は細胞膜周辺腔内に位置し、したがってその鉄活性部位への関与を妨げる。その結果、第３の膜貫通部分（アミノ酸残基１６５〜１８７）または第４の膜貫通部分（アミノ酸残基２３４〜２５６）のどちらも、膜貫通でないというという仮説が立てられた。これは３つのΔ５デサチュラーゼ相同体（すなわちＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＴ０９１６０、ＢＡＧ７１００７、およびＡＡＬ９２５６２）のＴＭＨＭＭ予測と一致した。
【０２２２】
Δ５デサチュラーゼ基質（すなわちＤＧＬＡ、ＥＴＡ）は高度に疎水性であるので、恐らく脂質二重層内に分配されることが推測された。同様に、３つのＨｉｓに富むクラスターから組み立てられる活性部位は、恐らく膜表面にまたはその非常に近くに現れることが推測された。したがって、それぞれ残基１６５〜１８７および２３４〜２５６の間に発見され、ＴＭＨＭＭによって最初は膜を貫通すると予測された第３および第４の膜貫通部分は、そうではなく、膜表面近くに位置して、活性部位が確実に膜の近くに配置されるようにすることが予測された。アミノ酸残基１０３〜１２５、１３０〜１５２、２８０〜３０２、および３０６〜３２８の膜貫通領域は、ＴＭＨＭＭによる予測通りであった。
【０２２３】
このようにして、ＥｇＤ５について予測された最終トポロジーモデルを図２に示す。垂直の円柱が膜貫通ドメインを示す一方、水平の円柱は膜を貫通しないが、内膜表面近くに位置する２つの高度に疎水性の領域を示す。丸は、恐らくは活性部位に関与するＨｉｓ残基に相当する。ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフおよびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの位置もまた同定された。最後に、「中」が細胞質空間に対応するのに対し、「外」は細胞膜周辺腔に相当する。
【０２２４】
実施例２
デサチュラーゼ中の天然ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ変動の測定
選択されたデサチュラーゼタンパク質配列を検査して、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内に自然変動が起きたかどうかを判定した。具体的には、デサチュラーゼタンパク質としては、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」；米国特許第７，６７８，５６０号明細書］と、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ［「ＭａＤ５」；米国特許第５，９７２，６６４号明細書］と、その他の既知のΔ５デサチュラーゼに対するおよび／またはΔ５デサチュラーゼに密接に関係していることが知られているΔ６デサチュラーゼに対するＢＬＡＳＴヒットとが挙げられる。ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して、選択された配列を配列比較し、ＨＤＡＳＨモチーフ（またはその変種）を下の表４に要約する。
【０２２５】
【表１０】
2013535988.tif 000011
【０２２６】
上の分析に基づいて、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＡｓｐ［「Ｄ」］残基は恐らくＧｌｕ残基［「Ｅ」］によって置換され、Ａｌａ［「Ａ」］残基は恐らくＧｌｙ［「Ｇ」］、Ｓｅｒ［「Ｓ」］、Ｐｈｅ［「Ｆ」］、Ｔｙｒ［「Ｙ」］またはＭｅｔ［「Ｍ」］残基によって置換され、および／またはＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＳｅｒ［
「Ｓ」］残基は恐らくＣｙｓ［「Ｃ」］、Ａｓｎ［「Ｎ」］、Ｇｌｙ［「Ｇ」］、Ａｌａ［「Ａ」］またはＴｈｒ［Ｔ」］残基によって置換され得るようであった。
【０２２７】
実施例３
野生型ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」］の配列
米国特許第７，６７８，５６０号明細書は、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５、配列番号２１）の単離およびクローニングを記載する。最近、クローンされたＥｇＤ５のより詳細な分析が、以前に認識されていなかった、ＥｇＤ５Ｒと称されて本明細書で配列番号２５として記載される、もう１つの変種「野生型」ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ配列を同定した。米国特許第７，６７８，５６０号明細書に記載されるＥｇＤ５の位置３４７のＳｅｒアミノ酸残基の代わりに、ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２５）は、位置３４７にＡｒｇ残基を含んでなる。この矛盾は、ＰＣＲまたはｃＤＮＡ作成手順の結果として生じるという仮説が立てられた。
【０２２８】
具体的には、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）の二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして５’−および３’−ＲＡＣＥ技術を使用して、ＥｇＤ５（配列番号２０；米国特許第７，６７８，５６０号明細書の配列番号１に相当する）が得られた（米国特許第７，６７８，５６０号明細書の実施例４〜５）。次にミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼをコードするＯＲＦをＰＣＲによって増幅し、精製して制限酵素消化して、次に適切なベクターに一方向性にライゲートしてｐＤＭＷ３６７を得た（米国特許第７，６７８，５６０号明細書の実施例６）。ｐＤＭＷ３６７の配列は、米国特許第７，６７８，５６０号明細書で配列番号２３として提供される（本明細書の配列番号３８に相当する）。米国特許第７，６７８，５６０号明細書では、ｐＤＭＷ３６７はキメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなると報告されたが、このキメラ遺伝子内のΔ５デサチュラーゼ配列は、実際にはＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４）のヌクレオチド配列であることが今は理解されている。
【０２２９】
ＥｇＤ５（配列番号２０）とＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４）（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄ）のアラインメントは、４つのヌクレオチドの相違を示し、配列番号２０に関する変異は、Ｇ８１９Ａ、Ｔ９４８Ｃ、Ｃ１０４１Ａ、およびＧ１３４９Ａである。Ｇ１３４９Ａの変異は、ｐＤＭＷ３６７へのクローニングのためにＥｇＤ５を増幅するのに利用される、特定プライマー配列に起因する。ＥｇＤ５（配列番号２１）およびＥｇＤ５Ｒ（すなわち配列番号２５）の翻訳産物のアラインメントは、単一アミノ酸の相違、すなわちＳ３４７Ｒの変異を明らかにする。
【０２３０】
米国特許第７，６７８，５６０号明細書の実施例９はまた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ＥｇＤ５に由来する、合成Δ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５Ｓ；配列番号２２および２３）の作成を記載する。ＥｇＤ５のコドン最適化は、１３５０ｂｐのコード領域の内１９６ｂｐ（１４．５％）の修飾、および全４４９コドンの内１８９コドン（４２％）の最適化をもたらした。コドン最適化ＥｇＤ５Ｓ遺伝子（すなわち配列番号２３）によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号２１）と同一であり、３４７位置のアミノ酸はＳｅｒである。
【０２３１】
実施例４
４つの制限エンドヌクレアーゼ部位が除去された野生型ＥｇＤ５Ｒを含んでなるコンストラクトｐＤＭＷ３６７−Ｍ４［「ＥｇＤ５Ｒ＊」］の作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｒ＊：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４の構築を記載する。ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２６）は、引き続くクローニング手順を容易にするために作成された野生型ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４）の修飾変種であり、修飾は、野生型ＥｇＤ５Ｒコード領域からの４つの制限酵素部位（すなわちＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＮｃｏＩ）の除去をもたらした。ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２５）およびＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２７）のアミノ酸配列は、同一であった。
【０２３２】
具体的には、プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（配列番号３９；図４Ｃ）は、ｐＤＭＷ３６７（配列番号３８、実施例３；図４Ａ）に由来した。ＥｇＤ５Ｒコード領域から、天然ＥｃｏＲＩ  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＮｃｏＩ制限酵素部位を逐次除去して、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４を作成した。最初に、ｐＤＭＷ３６７（配列番号３８）をテンプレートとして、２対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、生体外変異誘発によってＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ部位を除去した。ＹＬ８１３（配列番号４０）およびＹＬ８１４（配列番号４１）のプライマー対が、ＥｃｏＩ部位の変異を可能にした一方、ＹＬ８１５（配列番号４２）およびＹＬ８１６（配列番号４３）のプライマー対は、ＢｇｌＩＩ部位の変異を可能にした。これらの反応は、コンストラクトｐＤＭＷ３６７−Ｍ２（図４Ｂ；配列番号４４）を生成した。配列分析は、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ２中の変種ＥｇＤ５Ｒのアミノ酸配列が、ｐＤＭＷ３６７中のＥｇＤ５Ｒのアミノ酸配列と同一であることを確認した。
【０２３３】
次に、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ２をテンプレートとして、２対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、生体外変異誘発によってＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩ部位を除去した。ＹＬ８２９（配列番号４５）およびＹＬ８３０（配列番号４６）のプライマー対が、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の変異を可能にした一方、ＹＬ８３１（配列番号４７）およびＹＬ８３２（配列番号４８）のプライマー対は、ＮｃｏＩ部位の変異を可能にした。これは、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４の生成をもたらした。この場合もやはり、配列分析は、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４中の変種ＥｇＤ５（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊）のアミノ酸配列が、ｐＤＭＷ３６７中のＥｇＤ５Ｒのアミノ酸配列と同一であることを確認した。
【０２３４】
引き続く実施例では、野生型ＥｇＤ５への言及は、特に断りのない限り、事実上、ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４および２５）およびＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２６および２７）への言及を含む。
【０２３５】
実施例５
ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性と同様のΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＤｘＳＨ（配列番号３６）変異の同定
ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフは、ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２７）のアミノ酸残基１５５から１５９に広がる。ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（実施例４）をテンプレートとして、１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号４９〜８６；後述の表５）をプライマーとして使用して単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＡｌａ残基を個々に変異させ、それによって全ての可能なアミノ酸置換を作り出した（すなわちＨＤｘＳＨ［配列番号３６］変異体）。各変異からのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。１９個の各形質転換から３個のコロニーを拾い、液体培地中において３７℃で一晩、個別培養した。プラスミド（すなわち合計５７個）をこれらの培養物から単離し、個々に配列決定して変異を確認した。
【０２３６】
一般方法に記載されるように、野性型ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４プラスミドおよび単離された変異プラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に個々に形質転換した。形質転換体をＭＭＬｅｕプレート上で選択した。３０℃で２日間の培養後、形質転換反応からの各３つの形質転換体を新しいＭＭＬｅｕプレート上に画線塗抹し、３０℃でさらに２日間培養した。次にコロニーを使用して、２４ウェルＱｉａｇｅｎブロック内の３ｍＬのＭＭＬｅｕに接種した。３０℃の恒温器内でブロックを２００ｒｐｍで振盪しながら、インキュベートした。培養物を２日間インキュベートした後、ブロックを遠心分離して上清を除去し、３ｍＬのＨＧＭを添加した。ブロックを３０℃の恒温器内に戻し、さらに５日間２００ｒｐｍで振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２３７】
各変異体ＨＤｘＳＨ（配列番号３６）モチーフに起因する、Δ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表５に要約する。ＥｇＤ５Ｒ＊変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＥｇＤ５Ｒ＊内の位置１５７のＡｌａ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される（すなわち形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｃは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｃと称される、位置１５７でＡｌａを置換するＣｙｓを有し、それによってＨＤｃＳＨ［配列番号２７７］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇと称される、Ａｌａを置換するＧｌｙを有し、それによってＨＤｇＳＨ［配列番号１５］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなるなど）。変換効率（「平均変換効率」）は、次式に従って測定される：（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００、式中、「生成物」は、即時生成物と、それに由来する経路中の全ての生成物とを含む。結果をプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２６）と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１０．８％のＤＧＬＡおよび３．６％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２４．８％であった）。
【０２３８】
【表１１】
2013535988.tif 000012
【０２３９】
上に基づいて、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｌａ残基は、ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＧｌｙまたはＳｅｒのいずれかで置換し得ることが明らかである。具体的には、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇ（配列番号８７）が、２３．８％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できたのに対し、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｓ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｓ（配列番号８８）は、２３．３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できた。
【０２４０】
実施例６
ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性と同様のΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＤＡｘＨ（配列番号３７）変異の同定
ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（実施例４）をテンプレートとして、１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号８９〜１２６；後述の表６）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２７）のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフのＳｅｒ残基を個々に変異させ、それによって全ての可能なアミノ酸置換を作り出した（すなわちＨＤＡｘＨ［配列番号３７］変異体）。実施例５に記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
【０２４１】
各変異体ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内の各変異に起因する、Δ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表６に要約する。ＥｇＤ５Ｒ＊変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＥｇＤ５Ｒ＊内の位置１５８のＳｅｒ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される（すなわち形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａと称される、位置１５８でＳｅｒを置換するＡｌａを有し、それによってＨＤＡａＨ［配列番号１７］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ｒは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｒと称される、Ｓｅｒを置換するＡｒｇを有し、それによってＨＤＡｒＨ［配列番号３０６］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなるなど）。変換効率は、実施例５に記載される式に従って判定した。結果をプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２６）と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１１．３％のＤＧＬＡおよび３．４％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２３．３％であった）。
【０２４２】
【表１２】
2013535988.tif 000013
【０２４３】
結果は、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＳｅｒ残基が、ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＡｌａまたはＧｌｙのいずれかで置換し得ることを実証した。具体的には、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａ（配列番号１２７）が２３．５％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できたのに対し、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ｇ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｇ（配列番号１２８）は、２５．１％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できた。
【０２４４】
実施例７
ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性と同様のΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨｘＧｘ（配列番号３４）およびＨＤｘｘＨ（配列番号３１１）変異の同定
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書は、チトクロームｂ５様ドメインのＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内に少なくとも１つの変異を有する、変異Δ５デサチュラーゼを記載する（すなわちＨｘＧｘ［配列番号３４］変異）。ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフは、ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２５）のアミノ酸残基３３から３６に広がる。
【０２４５】
本実施例は、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇ（実施例５、配列番号８７）、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａ（実施例６、配列番号１２７）、およびＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｇ（実施例６、配列番号１２８）のＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内に変異を導入して、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）ドメイン内の二重変異の効果を調べる。
【０２４６】
ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇ（実施例５、配列番号１２９）、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａ（実施例６、配列番号１３０）、およびｐＤＭＷ３６７−１５８ｇ（実施例６、配列番号１３１）をテンプレートとして、数対のオリゴヌクレオチド（配列番号１３２〜１３７；表７）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子のＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＰｒｏ残基または第２のＧｌｙ残基のいずれかを個々に変異させ、それによってＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内に二重変異を作り出した。実施例５に記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
【０２４７】
ＨｘＧｘ（配列番号３４）およびＨＤｘｘＨ（配列番号３１１）変異の双方がある、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性を下の表７に要約する。ＥｇＤ５Ｒ＊変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６７Ｍ４コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｌａ残基またはＳｅｒ残基のアミノ酸置換と組み合わさった、ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内のＰｒｏ残基または第２のＧｌｙ残基のアミノ酸置換に準じて命名される。すなわち、例えば形質転換体ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５８ｇは、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇと称される、位置３４でＰｒｏを置換するＧｌｙを有し（それによってＨｇＧＧ［配列番号９］モチーフをもたらし）、位置１５８でＳｅｒを置換するＧｌｙを有する（それによってＨＤＡｇＧ［配列番号１８］モチーフをもたらす）、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなる。変換効率は、実施例５に記載される式に従って判定した。結果をプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１１．７％のＤＧＬＡおよび４．４％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２７．５％であった）。
【０２４８】
【表１３】
2013535988.tif 000014
【０２４９】
結果はＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフおよびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフがΔ５デサチュラーゼ酵素活性にとって重要ではあるが、野生型と比べて少なくとも６４％の
Δ５デサチュラーゼ活性を保つ、ＨｘＧｘ（配列番号３４）ＨＤｘｘＨ（配列番号３１１）モチーフを有するデサチュラーゼが構築されてもよいことを実証した。具体的には、１）ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｌａ残基のＧｌｙによる置換；または２）残基ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙによる置換のいずれかの同時置換と共に、ＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内のＰｒｏ残基をＧｌｙで置換し得る。ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙのいずれかによる同時置換と共に、ＨＰＧＧ［配列番号７］モチーフ内のＰｒｏ残基もまたＨｉｓで置換し得る。そしてＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙのいずれかによる同時置換と共に、ＨＰＧＧ［配列番号７］モチーフ内の第２のＧｌｙ残基をＳｅｒで置換し得る。
【０２５０】
好ましい二重変異体は、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ（配列番号１３９；ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５７ｇ形質転換体中において２２．９％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ（配列番号１４１；ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５８ａ形質転換体中において２４．３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ（配列番号１４３；ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５８ｇ形質転換体中において２６．８％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。
【０２５１】
実施例８
ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇに由来する、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における発現のためのＮ末端コドン最適化変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＥｇＤ５Ｍ」）の合成
米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載されるのと同様の方法で、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ（配列番号１４２、実施例７）の５’部分のコドン使用頻度をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的には、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇの最初の２０４ｂｐをコドン最適化して、「ＥｇＤ５Ｍ」（配列番号１５２および１５３）と称されるコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子の合成をもたらした。ＥｇＤ５Ｍは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（米国特許第７，１２５，６７２号明細書）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．ａｎｄ  Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１−２）：１１−２３（２００１））に従って、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇのΔ５デサチュラーゼ遺伝子のコード配列に基づいてデザインされた。翻訳開始部位の修飾の他に、コード領域のＮ末端内の２０４ｂｐの内５２ｂｐが修飾された（２５．５％；図５）、およびデサチュラーゼタンパク質のＮ末端内の６８個のアミノ酸の内４５個のコドンが最適化された（６６．２％）。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、ＥｇＤ５Ｍの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。コドン最適化ＥｇＤ５Ｍ遺伝子（すなわち配列番号１５３）によってコードされるタンパク質配列は、野生型ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇタンパク質配列（すなわち配列番号１４３）と同一である。デザインされたＥｇＤ５Ｍ遺伝子（配列番号１５２）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１４８３７）にクローンされて、ｐＥｇＤ５Ｍ（図６Ａ；配列番号１５４）を生じた。
【０２５２】
実施例９
ＥｇＤ５Ｍを含んでなるコンストラクトｐＤＭＷ３６７−５Ｍの作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍの構築を記載する。ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（図４；配列番号３９）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＥｇＤ５Ｒ＊断片をｐＥｇＤ５Ｍ（図６Ａ；配列番号１５４）からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＥｇＤ５Ｍ断片で置換して、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（図６Ｂ；配列番号１５５）を構築した。このライゲーションの生成物はｐＤＭＷ３６７−５Ｍであり、それは以下の構成要素を含有した。
【０２５３】
【表１４】
2013535988.tif 000015
【０２５４】
実施例１０
Ｎ末端コドン最適化変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子の変種「ＥｇＤ５Ｍ１」を含んでなるコンストラクトｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１の作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｍ１：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１の構築を記載する。ＥｇＤ５Ｍ中の位置３４７のＡｒｇのためのＣＧＡコドンが、ＥｇＤ５Ｍ１中ではＳｅｒのためのＡＧＣコドンをコードするように変化していることを除いて、ＥｇＤ５Ｍ１（配列番号１５６）のヌクレオチド配列は、ＥｇＤ５Ｍ（配列番号１５２）と同一である。この修飾は、Δ５デサチュラーゼ活性に対する、Ｒ３４７Ｓ変異（実施例３に記載される）の効果を分析するためにデザインされた。
【０２５５】
デザインされたＥｇＤ５Ｍ１遺伝子（「ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７Ｓ」とも称される；配列番号１５６）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１４８３７）にクローンされて、ｐＥｇＤ５Ｍ１（配列番号１５８）を生じた。
【０２５６】
ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（図４；配列番号３９）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＥｇＤ５Ｒ＊断片をｐＥｇＤ５Ｍ１（配列番号１５８）からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＥｇＤ５Ｍ１断片で置換して、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１（配列番号１５９）を構築した。このライゲーションの生成物は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｍ１：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１であった。
【０２５７】
実施例１１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株中のＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５Ｍ１Δ５デサチュラーゼの機能分析
対照プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（配列番号３９；実施例４）およびプラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（配列番号１５５；実施例９）、およびｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１（配列番号１５９；実施例１０）をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に、それぞれ別々に形質転換した。実施例５に記載されるようにして、形質転換体をＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ上で選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
【０２５８】
ＥｇＤ５Ｒ＊、ＥｇＤ５Ｍ、およびＥｇＤ５Ｍ１のΔ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表９に要約する。変換効率（「Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）は、実施例５に記載される式に従って判定した。結果をプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２６）と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１０．８％のＤＧＬＡおよび３．６％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２４．８％であった）。
【０２５９】
【表１５】
2013535988.tif 000016
【０２６０】
結果はＥｇＤ５Ｍ（配列番号１５３）およびＥｇＤ５Ｍ１（配列番号１５７）の双方が、野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号２７）よりも高いΔ５デサチュラーゼ活性を有したことを実証した。ＥｇＤ５Ｍと比べて改善されたＥｇＤ５Ｍ１のΔ５デサチュラーゼ活性は、アミノ酸残基３４７がタンパク質のΔ５デサチュラーゼ活性に影響を及ぼし、Ａｒｇとは対照的にＳｅｒが好ましいことを実証する。
【０２６１】
実施例１２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する、合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＥｇＤ５Ｓ」）中のＨＰＧｓ（配列番号１１）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１）変異の同定
本実施例は、変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（または「ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧｓ」）遺伝子のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内に変異を導入して、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）の保存ドメイン内の二重変異の効果を判定する。
【０２６２】
ＥｇＤ５Ｓ（配列番号２２および２３）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ＥｇＤ５（実施例３）に由来する、合成Δ５デサチュラーゼである（米国特許第７，６７８，５６０号明細書）。ＥｇＤ５Ｓのアミノ酸配列はＥｇＤ５と同一であるが、ヌクレオチド配列が異なり；具体的には、翻訳開始部位の修飾に加えて、１３５０ｂｐのコード領域の内１９６ｂｐ（１４．５％）が修飾され、１８９コドン（４２％）が最適化されていた。ＧＣ含有量は、野性型遺伝子（すなわちＥｇＤ５）内の５５．５％から、合成遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｓ）内の５４．４％に低下した。そしてＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、ＥｇＤ５Ｓの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。
【０２６３】
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書の実施例１〜４は、チトクロームｂ５様ドメインのアミノ酸残基３３〜３６に広がる、ＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフ内の第２のＧｌｙ残基の修飾（すなわちＨＰＧｘ［配列番号３３］変異）を標的とする、部位特異的変異誘発反応のテンプレートとしてＥｇＤ５Ｓを使用した、変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（配列番号１６０）の同定を記載する。このようにして変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓはＨＰＧｓ（配列番号１１）モチーフを含んでなり、その中でＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフの第２のＧｌｙ残基は、ＥｇＤ５Ｓ（配列番号２３）をテンプレートとして使用してＳｅｒによって置換された。ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓのΔ５デサチュラーゼ活性（米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書）は、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性の約１０６．９％であった。プラスミドｐＤＭＷ３６９Ｓ（配列番号１６１）は変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ遺伝子を含有し；ベクター構成要素は、ＥｇＤ５Ｍ遺伝子の代わりに変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ遺伝子があることを除いて）、ｐＤＭＥ３６７−５Ｍ（本明細書の図６Ｂ）と同様である。
【０２６４】
実施例７における二重ＥｇＤ５Ｒ＊変異体（すなわち変異ＨＰＧＧ［配列番号７］と変異ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフを同時に含んでなる）の成功裏の作成に基づいて、同様のＨｘｘｘＨ（配列番号１）変異をＥｇＤ５Ｓ−３６ｓに導入した際に、耐容されることが予期された。具体的には、ｐＤＭＷ３６９Ｓ（キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ−３６Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）をテンプレートとして、９対のオリゴヌクレオチド（配列番号１６２〜１７９；表１０）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（配列番号１６０）のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基のいずれかを個々に変異させ、それによって選択された９個のアミノ酸置換を作り出した。実施例５に記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
【０２６５】
ＨＰＧｓ（配列番号１１）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１）変異の双方がある、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表１０に要約する。ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓの変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６９Ｓコンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される（すなわち形質転換体ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５６ｅは、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅと称される、位置１５６でＡｓｐを置換するＧｌｕを有し、それによってＨｅＡＳＨ［配列番号１９］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５７ｇはＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇと命名される変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり、Ａｌａを置換するＧｌｙを有し、それによってＨＤｇＳＨ［配列番号１５］モチーフをもたらすなど）。変換効率は、実施例５に記載される式に従って判定した。結果をプラスミドｐＤＭＷ３６９Ｓ内のＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（配列番号１６０）と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の８．１％のＤＧＬＡおよび６．８％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は４５．８％であった）。
【０２６６】
【表１６】
2013535988.tif 000017
【０２６７】
結果は、変異ＨＰＧＧモチーフ（すなわちＨＰＧｓ［配列番号１１］）のみを有する変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓと比べて、なおも妥当なΔ５デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化ＥｇＤ５ＳΔ５デサチュラーゼが、変異ＨＰＧＧ（配列番号７）および変異ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ（配列番号１８０および１８１；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５６ｅ形質転換体中において３６．２％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ（配列番号１８２および１８３；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５７ｇ形質転換体中において３６．６％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ（配列番号１８４および１８５；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５８ａ形質転換体中において３９．１％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ（配列番号１８６および１８７；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５８ｇ形質転換体中において３４．３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。
【０２６８】
実施例１３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来する、合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＥａＤ５Ｓ」）中のＨａＧＧ（配列番号１４）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１）変異の同定
本実施例は、変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（または「ＥａＤ５Ｓ−ＨａＧＧ」）遺伝子のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内に変異を導入して、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）の保存ドメイン内の二重変異の効果を判定する。
【０２６９】
米国特許第７，９４３，３６５号明細書は、Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）からのΔ５デサチュラーゼ（すなわちＥａＤ５、配列番号２８）の単離およびクローニングを記載する。次にこの遺伝子は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化され、合成Δ５デサチュラーゼＥａＤ５Ｓ（配列番号３０）がもたらされる。ＥａＤ５Ｓのアミノ酸配列はＥａＤ５と同一であるが、ヌクレオチド配列が異なり；具体的には、翻訳開始部位の修飾に加えて、１３６２ｂｐのコード領域の内１８３ｂｐ（１３．４％）が修飾され、１７４コドン（３８．３％）が最適化されていた。ＧＣ含有量は、野性型遺伝子（すなわちＥａＤ５）内の５７．６％から、合成遺伝子（すなわちＥａＤ５Ｓ）内の５４．６％に低下した。そしてＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、ＥａＤ５Ｓの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。
【０２７０】
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書の実施例６は、チトクロームｂ５様ドメインのアミノ酸残基３４〜３７に広がる、ＥａＤ５ＳのＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＰｒｏ残基の修飾（すなわちＨｘＧＧ［配列番号３２］変異）を標的とする、部位特異的変異誘発反応のテンプレートとしてＥａＤ５Ｓを使用した、変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号１８８）の同定を記載する。このようにして変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号１８８）はＨａＧＧ（配列番号１４）モチーフを含んでなり、その中でＨＰＧＧ（配列番号７）モチーフのＰｒｏ残基は、ＥａＤ５Ｓ（配列番号３１）をテンプレートとして使用してＡｌａで置換された。ＥａＤ５Ｓ−３５ａのΔ５デサチュラーゼ活性（米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書）は、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性の約９９．２％であった。プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）（配列番号１８９）は変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ遺伝子を含有し；ベクター構成要素は、ＥｇＤ５Ｍ遺伝子の代わりに変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ遺伝子があることを除いて）、ｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（本明細書の図６Ｂ）と同一である。
【０２７１】
実施例７における二重ＥｇＤ５Ｒ＊変異体、および実施例１２における二重ＥｇＤ５Ｓ変異体（すなわちＨＰＧＧ［配列番号７］と変異ＨＤＡＳＨ［配列番号８］モチーフを同時に含んでなる変異）の成功裏の作成に基づいて、同様のＨｘｘｘＨ（配列番号１）変異をＥａＤ５Ｓ−３５ａに導入した際に、耐容されることが予期された。ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフは、ＥａＤ５Ｓ〜ＥａＤ５Ｓ−３５ａのアミノ酸残基１５６〜１６０に広がる。
【０２７２】
ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）（キメラＦＢＡＩＮ：：ＥａＤ５Ｓ−３５ａ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）をテンプレートとして、９対のオリゴヌクレオチド（配列番号１９０〜２１１；表１１）をプライマーとして使用して単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号１８８）のＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒを個々に変異させ、それによって選択された９個のアミノ酸置換を作り出した。実施例５に記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
【０２７３】
ＨａＧＧ（配列番号１４）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１）変異を含んでなる、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表１１に要約する。ＥａＤ５Ｓ−３５ａの変異体を含んでなる、変異ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される。すなわち形質転換体ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５７ｅは、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５７ｅと称される、位置１５７でＡｓｐを置換するＧｌｕを有し、それによってＨｅＡＳＨ［配列番号１９］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｇは、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇと称される、Ａｌａを置換するＧｌｙを有し、それによってＨＤｇＳＨ［配列番号１５］モチーフなどをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなる。変換効率は、実施例５に記載される式に従って判定した。結果をプラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）内のＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号１８８）と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の８．６％のＤＧＬＡおよび５．１％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は３７．２％であった）。
【０２７４】
【表１７】
2013535988.tif 000018
【０２７５】
結果は、変異ＨＰＧＧモチーフ（すなわちＨａＧＧ［配列番号１４］）のみを有する変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａと比べて、なおも妥当なΔ５デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化ＥａＤ５ＳΔ５デサチュラーゼが、変異ＨＰＧＧ（配列番号７）および変異ＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ（配列番号２１２および２１３；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｇ形質転換体中において２８．４％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ（配列番号２１４および２１５；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｓ形質転換体中において２７．４％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ（配列番号２１６および２１７；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５９ｇ形質転換体中において２６．５％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。
【０２７６】
実施例１４
総脂肪酸の約５８．７％のＥＰＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、３８．３％の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で、総脂肪酸に対して約５８．７％のＥＰＡ［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］を産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する、Ｚ１９７８株の構築を記載する。
【０２７７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の遺伝子型
Ｙ９５０２株の作成は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ９５０２株は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを産生できた（図７）。
【０２７８】
野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ９５０２株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ｕｎｋｎｏｗｎ５−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ｕｎｋｎｏｗｎ７−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ９−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ，ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６．略称は、次のとおり：ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来するΔ８デサチュラーゼ遺伝子合成変異体［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ��、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）属ＣＣＭＰ３８９種（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）と、Δ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、Δ９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前出）とΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）と、Δ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する、変異ＨＰＧｓ（配列番号１１）モチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含んでなる、合成変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＥａＤ５ＳＭは、Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］に由来する、変異ＨａＧＧ（配列番号１４）モチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含んでなる、合成変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、Ｐ．アファニデルマタム（Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子であり；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］であり；ＭＣＳはリゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種ビシアエ（ｖｉｃｉａｅ）３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来するコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子であり、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来する、コドン最適化リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子である。
【０２７９】
Ｙ９５０２株の総脂質含量および組成の詳述な分析のために、細胞を二段階で、合計７日間培養するフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ９５０２株は、３．８ｇ／ＬのＤＣＷ、３７．１ＴＦＡ％ＤＣＷ、２１．３ＥＰＡ％ＤＣＷを産生し、脂質プロフィールは次の通りであり、各脂肪酸濃度はＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］である。１６：０（パルミチン酸）−２．５、１６：１（パルミトレイン酸）−０．５、１８：０（ステアリン酸）−２．９、１８：１（オレイン酸）−５．０、１８：２（ＬＡ）−１２．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−３．５、ＤＧＬＡ−３．３、ＡＲＡ−０．８、ＥＴｒＡ−０．７、ＥＴＡ−２．４、ＥＰＡ−５７．０、その他ー７．５。
【０２８０】
Ｙ９５０２株からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の作成
Ｙ９５０２株からのＺ１９７８株の開発は図７に示され、参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書（代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＰＲＶ、２０１０年８月２６日出願）に記載される。
【０２８１】
具体的には、Ｙ９５０２株中でＵｒａ３遺伝子を中断するために、ＳａｌＩ／ＰａｃＩ消化されたコンストラクトｐＺＫＵＭ（図８Ａ；配列番号２１８；参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、一般方法に従って、Ｕｒａ３変異遺伝子をＹ９５０２株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計２７個の形質転換体（第１群から選択された８個の形質転換体、第２群から選択された８個の形質転換体、および第３群から選択された１１個の形質転換体を含んでなる）を最少培地＋５−フルオロオロト酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］選択プレート上で培養して、３０℃に２〜５日間保った。さらなる実験は、形質転換体の第３群のみが、真のＵｒａ−表現型を有すると判定した。
【０２８２】
Ｕｒａ−細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取って、一般方法に従って脂肪酸分析を行った。このようにして、ＧＣ分析は、第３群のｐＺＫＵＭ−形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０、および＃１１中に、それぞれＴＦＡの２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％、および２９．６％のＥＰＡがあったことを示した。これらの７株をそれぞれ、Ｙ９５０２Ｕ１２株、Ｙ９５０２Ｕ１４株、Ｙ９５０２Ｕ１７株、Ｙ９５０２Ｕ１８株、Ｙ９５０２Ｕ１９株、Ｙ９５０２Ｕ２１株、およびＹ９５０２Ｕ２２株と命名した（集合的にＹ９５０２Ｕ）。
【０２８３】
コンストラクトｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ（図８Ｂ；配列番号２１９）が作成されて、１つのΔ９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および１つのΔ９エロンガーゼ変異遺伝子をＹ９５０２Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０６１２１）に組み込んだ。ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０２８４】
【表１８】
2013535988.tif 000019
【０２８５】
一般方法に従って、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ９５０２Ｕ１７株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に３〜４日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。細胞に、前出の脂肪酸分析を行った。
【０２８６】
ＧＣ分析は、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮがあるＹ９５０２Ｕ１７の選択された９６株の大部分が、ＴＦＡの５０〜５６％のＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５９．０％、５６．６％、５８．９％、５６．５％、および５７．６％のＥＰＡを産生した５株（すなわち、＃３１、＃３２、＃３５、＃７０、および＃８０）をそれぞれＺ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０、およびＺ１９８１と命名した。
【０２８７】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したこれらのｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ｕｎｋｎｏｗｎ５−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ｕｎｋｎｏｗｎ７−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ９−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ，ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６．
【０２８８】
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０、およびＺ１９８１株中のＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０６１２）のノックアウトは、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎでの形質転換によって生じたＥＰＡ株のいずれでも確認されなかった。
【０２８９】
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０、およびＺ１９８１株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量と組成（前出）について分析した。下の表１３は、Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０、およびＺ１９８１株のフラスコアッセイで測定された、全ＤＣＷ、ｔＴＦＡｓ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％としての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（リノール酸）、ＡＬＡ（α−リノレン酸）、ＥＤＡ（エイコサジエン酸）、ＤＧＬＡ（ジホモ−γ−リノレン酸）、ＡＲＡ（アラキドン酸）、ＥＴｒＡ（エイコサトリエン酸）、ＥＴＡ（エイコサテトラエン酸）、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、その他である。
【０２９０】
【表１９】
2013535988.tif 000020
【０２９１】
米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書（代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＰＲＶ、２０１０年８月２６日提出）の提出に引き続いて、Ｚ１９７８株に部分的ゲノム配列決定を行った。この研究は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに組み込まれる６つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子でなく、遺伝子操作株は、実際には４つのみを有すると判定した。
【０２９２】
より具体的には、下でさらに記述されるように、２つの別個のプラスミド断片（またはその部分）は、Ｚ１９７８株中に検出されなかった。
（１）コンストラクトｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の配列番号１３１参照）は、１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ８０６９Ｕ株のＬｉｐ２遺伝子座に組み込むことが意図された。しかしゲノムの配列決定は、ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ断片のＬｉｐ２．３Ｎ末端部分、およびＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏキメラ遺伝子を検出できなかった。ＤＮＡ再配置は、Ｙ８１５４株作成中に、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏカセットの喪失をもたらした可能性がある（図７）。
（２）コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の配列番号１３２参照）は、１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ８１５４Ｕ１株のＬｉｐ１遺伝子座に組み込むことが意図された。しかしゲノム配列決定またはＰＣＲ増幅のどちらも、Ｚ１９７８株中のΔ５デサチュラーゼ遺伝子を検出できなかった。ＤＮＡ再配置は、Ｙ８２６９株作成中に、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔカセットの喪失をもたらした可能性がある（図７）。
【０２９３】
さらにコンストラクトｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の中の配列番号１３３参照）、およびコンストラクトｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書中の配列番号１３５参照）が、どちらもＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ遺伝子座に組み込まれたと判定された。
【０２９４】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＺ１９７８株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６．
【０２９５】
実施例１５
二重Δ５デサチュラーゼ変異体を含んでなりＴＦＡの５０％を上回るＥＰＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、ＤＣＷの３５％を超えるＴＦＡで、ＴＦＡの５０％を超えるＥＰＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株（実施例１４）に由来する一連の株の構築を記載する。ＥＰＡ株は、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの双方における二重変異を含んでなる、以下の変異Δ５デサチュラーゼを含んだ。ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ（配列番号１８３；実施例１２）およびＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ（配列番号２１３；実施例１３）、ならびにＥｇＤ５Ｍ（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ；配列番号１５３；実施例９および１１）またはＥｇＤ５Ｍ１（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ；配列番号１５７；実施例１０および１１）のいずれか。
【０２９６】
株は、図９に示されるように二段法で作成され、Ｚ１９７８株の元のΔ５デサチュラーゼ遺伝子を最初に欠失させて、少なくとも約５６％のＥＴＡを産生するが、もはやＥＰＡを産生できない、Ｙ０Ｓ９０１７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９０１９（Ｕｒａ−）株を得た。次にＹ０Ｓ９０１７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９０１９（Ｕｒａ−）株の染色体に、前出の二重変異Δ５デサチュラーゼを組み込み、それによって形質転換体株がＥＰＡを産生する能力を復元した。
【０２９７】
より具体的には、Ｚ１９７８株中の４つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子は、２つの異なるコンストラクトからの染色体に最初に組み込まれ；ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５（配列番号２２６；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の図４Ａおよび表６もまた参照されたい）が、キメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０およびＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：ＯＣＴ遺伝子を含んでなるのに対し、ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ（配列番号２２７；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の図７Ｂおよび表１３もまた参照されたい）は、キメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含んでなる。これらの４つのキメラ遺伝子を除去するために、３つの別個の相同的組換え事象が必要であった。
【０２９８】
最初に、Ｚ１９７８Ｕ株のゲノム中のキメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０遺伝子と、Ｌｅｕ遺伝子の大部分（すなわちｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５から）とが、相同的組換え（図１０Ａ）によって、プラスミドｐＹＰＳ２３４（図１０Ｂ；配列番号２２９）内の９９３ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ断片（配列番号２２８）で置き換えられ、その中で９９３ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）カルニチン／アシルカルニチンキャリア遺伝子の５’および３’部分を含んでなった。より具体的には、ｐＹＳＰ２３４プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０２９９】
【表２０】
2013535988.tif 000021
【０３００】
第１の乗換え事象がＬｙｓ５−５’  ＤＮＡ断片内で起きたのに対し、第２の乗換え事象はＹＡＴ１プロモーター領域内で起きた。この相同的組換えから、そのゲノム内に、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−表現型と、３つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を有するＹＯＳ９００１株が生じた。
【０３０１】
次にＹＯＳ９００１株のゲノム中のキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６およびＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：ＯＣＴ遺伝子が、相同的組換え（図１１Ａ）によって、プラスミドｐＹＰＳ２３３（図１１Ｂ；配列番号２３１）内の１０１９ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ断片（配列番号２３０）で置き換えられ、その中で１０１９ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＬＫ２遺伝子の５’および３’部分を含んでなった。ｐＹＳＰ２３３プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０３０２】
【表２１】
2013535988.tif 000022
【０３０３】
第１の乗換え事象がＬｙｓ５−３’  ＤＮＡ断片内で起きたのに対し、第２の乗換え事象は３’  ＬｅｕまたはＹＡＴ１プロモーター領域内で起きた。この相同的組換えから、それぞれゲノム内にＬｅｕ−、Ｕｒａ−表現型、および１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を有する、ＹＯＳ９００６株およびＹＯＳ９００９株（同一遺伝子型を有する２つの別個のコロニーに相当する）が生じた。
【０３０４】
最後に、ＹＯＳ９００６株およびＹＯＳ９００９株のゲノム中のキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１遺伝子を相同的組換え（図１２Ａ）によって、プラスミドｐＹＳＰ２４１（図１２Ｂ；配列番号２３２）内の機能性Ｌｅｕ２遺伝子で置き換えた。ｐＹＳＰ２４１プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０３０５】
【表２２】
2013535988.tif 000023
【０３０６】
第１の乗換え事象が染色体Ｂの位置２８７０１４８と２８７１２５０の間の領域で起きたのに対し、第２の乗換え事象はプラスミドｐＹＳＰ２４１のＥａＤ８Ｓ領域で起き、それによってＹＯＳ９０１７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９０１９（Ｕｒａ−）株が作り出された。この相同的組換えから、それぞれゲノム内にＵｒａ−表現型を有し、Δ５デサチュラーゼ遺伝子を有さない、ＹＯＳ９０１７株およびＹＯＳ９０１９株（同一遺伝子型を有する２つの別個のコロニーに相当する）が生じた。
【０３０７】
ＹＯＳ９００１（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９００６（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９００９（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９０１７（Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９０１９（Ｕｒａ−）株、およびＺ１９７８Ｕ（Ｕｒａ−）対照株の脂肪酸組成と含油量を分析するために、実施例１４の手順に従って、三連フラスコアッセイ（サンプル「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」と同定された）を実施した。
【０３０８】
表１７は、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］として、各脂肪酸濃度を要約する。脂肪酸は表１３の通りであり、２０：４（５，１１，１４，１７）はジュニペロン酸を指す。各サンプル中の全脂肪酸の総計は、１００になる。
【０３０９】
表１８は、全乾燥ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０３１０】
【表２３】
2013535988.tif 000024
【０３１１】
【表２４】
2013535988.tif 000025
【０３１２】
フラスコ実験のデータは、ＹＯＳ９００１（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株がゲノム内に３つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を含んでなり、約５７ＥＰＡ％ＴＦＡを産生した一方、ＹＯＳ９００６（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９００９（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株は、それらのゲノム内に１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子のみを含んでなり、約５２．０ＥＰＡ％ＴＦＡを産生したことを実証した。対照的に、ＹＯＳ９０１７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９０１９（Ｕｒａ−）株はＥＰＡを全く産生できなかったが、約５６％のＥＴＡを産生した。ＹＯＳ９０１７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９０１９（Ｕｒａ−）株中のΔ５デサチュラーゼ活性の欠如は、上の全脂肪酸分析によって検証された；ＰＣＲ分析もまた、Δ５デサチュラーゼをコードするあらゆるＤＮＡ配列の欠如を確認した。
【０３１３】
コンストラクトｐＺＲ５ＡＵ−５５５（図１３Ａ；配列番号２３３）が作成されて、３つのキメラ変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ：：Ｐｅｘ２０［実施例１２］、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ：：
Ｏｃｔ［実施例１３］、およびＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ（ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）：：Ｐｅｘ１６［実施例９および１１］をＹＯＳ９０１７株およびＹＯＳ９０１９株の染色体Ｃの１６８５３９２と１６８７２６７の間の領域に組み込んで、それによってＥＰＡの生成を可能にした。
【０３１４】
ｐＺＲ５ＡＵ−５５５プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０３１５】
【表２５】
2013535988.tif 000026
【０３１６】
コンストラクトｐＺＲ５ＡＵ−５５５Ｍ（図１３Ｂ；配列番号２３４）は、ｐＺＲ５Ａ
Ｕ−５５５のキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ（ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）：：Ｐｅｘ１６遺伝子の代わりに、キメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ１（ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ）：：Ｐｅｘ１６遺伝子［実施例１０および１１］が使用されたことを除いて、ｐＺＲ５ＡＵ−５５５と同一である。
【０３１７】
一般方法に従って、ｐＺＲ５ＡＵ−５５５およびｐＺＲ５ＡＵ−５５５ＭプラスミドをＡｓｃＩで別々に消化し、次にＹＯＳ９０１７株およびＹＯＳ９０１９株を個々に形質転換するために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に４〜５日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、引き続いて３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。
【０３１８】
ＹＯＳ９０１７株中の９６個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５形質転換体のＧＣ分析は、ＴＦＡの４８％を超えるＥＰＡを産生する２０株（すなわち、＃９、＃１７、＃２２、＃２７、＃３１、＃３２、＃４２、＃４４、＃４６、＃５２、＃５３、＃６３、＃６８、＃７２、＃７４、＃７５、＃７７、＃７９、＃８０、＃８４、および＃８９）を同定し；これらの株をそれぞれＺ８００１〜Ｚ８０２０株と命名した。
【０３１９】
ＹＯＳ９０１７株中の８２個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５Ｍ形質転換体のＧＣ分析は、ＴＦＡの４８％を超えるＥＰＡを産生する１０株（すなわち、＃１，＃２７，＃２９，＃３３，＃３９，＃４１，＃４４，＃４９，＃６９、および＃８２）を同定し；これらの株をそれぞれＺ８０２１〜Ｚ８０３０株と命名した。
【０３２０】
ＹＯＳ９０１９株中の８４個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５形質転換体のＧＣ分析は、ＴＦＡの４８％を超えるＥＰＡを産生する１２株（すなわち、＃２８、＃３１、＃３９、＃４１、＃４２、＃４５、＃６３、＃７１、＃７３、＃７５、＃７８、および＃８４）を同定し；これらの株をそれぞれＺ８０３１〜Ｚ８０４２株と命名した。
【０３２１】
そしてＹＯＳ９０１９株中の７６個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５Ｍ形質転換体のＧＣ分析は、ＴＦＡの４８％を超えるＥＰＡを産生する１２株（すなわち、＃２，＃２４，＃２８，＃３０，＃３８，＃４６，＃５０，＃６６，＃６７，＃６９，＃７２、および＃７３）を同定し；これらの株をそれぞれＺ８０４３〜Ｚ８０５４株と命名した。
【０３２２】
これらの新しいＥＰＡ株の脂肪酸組成と含油量を分析するために、代表的な１３株（すなわちＺ８００１、Ｚ８００５、Ｚ８００７、Ｚ８０１１、Ｚ８０１４、Ｚ８０１８、Ｚ８０２０、Ｚ８０２２、Ｚ８０２４、Ｚ８０２６、Ｚ８０３５、Ｚ８０４８、およびＺ８０４９）に複製フラスコアッセイを実施した。表２０は、全ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％としての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡ（％ＤＣＷ）を要約する。脂肪酸は、表１３および表１７の通りである。
【０３２３】
１３株は全て、ＴＦＡの５３％を超えるＥＰＡを産生でき、ＴＦＡはＤＣＷの３７％を超えた。Ｚ８０２４株およびＺ８０３５株は、それぞれ５８．５ＥＰＡ％ＴＦＡおよび５７．９ＥＰＡ％ＴＦＡを産生し、ＴＦＡはそれぞれ４０．８％ＤＣＷおよび３７．８％ＤＣＷであった。
【０３２４】
【表２６】
2013535988.tif 000027
【０３２５】
実施例１６
植物発現ベクターにクローニングするための変種ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５Ｒ」］中におけるＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡｘＨ（配列番号３７）変異の作成
実施例７の表７は、ＨＰＧＧ（配列番号７）およびＨＤＡＳＨ（配列番号８）モチーフの双方を変化させる変異を含んでなる、様々なＥｇＤ５Ｒ＊変種からのΔ５デサチュラーゼ活性を要約する。表７では、修飾ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡｇＨ（配列番号１８）モチーフ（ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ；配列番号１４３のような）または修飾ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡａＨ（配列番号１７）モチーフ（ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ；配列番号１４１のような）のいずれかを有するＥｇＤ５Ｒ＊タンパク質は、（ＥｇＤ５Ｒタンパク質と同一の）ＥｇＤ５Ｒ＊タンパク質活性の少なくとも８８％を有する。
【０３２６】
本実施例は、所望のヌクレオチド変化を含有するオリゴヌクレオチドによるＰＣＲベースの変異誘発を使用して、既存の植物発現ベクター（後述、実施例１８）中への容易なクローニングのためのＮｏｔＩ部位で挟まれるＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４）のＤＮＡ配列中へ、同様の変異を導入するのに使用される方法を記載する。より具体的には、２回のＰＣＲ増幅を通じて、Δ５デサチュラーゼ遺伝子中に二重変異体が導入され、各ＰＣＲは、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して実施された。生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、特に断りのない限り、製造業者のプロトコルに従って、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して精製した。
【０３２７】
ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をＮｏｔＩ部位で挟まれるＥｇＤ５Ｒに導入する
ＨｇＧＧ（配列番号９）変異は、プラスミドｐＫＲ１０３２をＤＮＡテンプレートとして使用して、２回のＰＣＲ増幅を通じて、ＥｇＤ５Ｒ遺伝子（配列番号２４）に導入された。プラスミドｐＫＲ１０３２は米国特許第７，６７８，５６０号明細書で以前記載されており、ＮｏｔＩ部位で挟まれるＥｇＤ５Ｒ遺伝子（配列番号２４）を含んでなる。ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４）の５’末端は、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５−５（配列番号２４５）およびプライマーＥｇＤ５Ｍ１−３（配列番号２４６）によって、ｐＫＲ１０３２から増幅された。ＥｇＤ５Ｒ（配列番号２４）の３’末端は、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされて、ＥｇＤ５Ｍ１−３（配列番号２４６）と完璧に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５Ｍ１−５（配列番号２４７）と、プライマーＥｇＤ５−３（配列番号２４８）とによって、同様にベクターｐＫＲ１０３２から増幅された。得られたＤＮＡ断片を分離し精製した。
【０３２８】
次に２つの精製ＤＮＡ断片を組み合わせて、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５−５（配列番号２４５）およびＥｇＤ５−３（配列番号２４８）を用いた２回目のＰＣＲ中で、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をコードするＤＮＡ変化を有する完全長遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片を精製した。
【０３２９】
ＨｇＧＧ（配列番号９）モチーフを含んでなる完全長Δ５デサチュラーゼＤＮＡ配列が配列番号２４９で示される一方、コードされたタンパク質は配列番号２５０で記載される。
【０３３０】
ＮｏｔＩ部位で挟まれるＥｇＤ５Ｒ中にＨｇＧＧ（配列番号９）変異とＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異を組み合わせる
ＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異は、上述の手順を使用して、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異を含有する精製ＤＮＡ断片をテンプレートとして使用して、２回の追加的なＰＣＲ増幅を通じて、配列番号２５０のΔ５デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列に導入された。具体的には配列番号２４９の５’末端が、ＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５−５（配列番号２４５）およびプライマーｇＤ５Ｍ２−３（配列番号２５１）によって増幅され；配列番号２４９の３’末端は、ＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされ、ＥｇＤ５Ｍ２−３（配列番号２５１）と完璧に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５Ｍ２−５（配列番号２５２）と、プライマーＥｇＤ５−３（配列番号２４８）とによって増幅された。得られたＤＮＡ断片を上述したように分離し精製した。
【０３３１】
次に２つの精製ＤＮＡ断片を組み合わせて、ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異をコードするＤＮＡ変化を有する完全長遺伝子をオリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５−５（配列番号２４５）およびＥｇＤ５−３（配列番号２４８）を用いた２回目のＰＣＲ中で増幅した。製造業者のプロトコルに従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ’（登録商標）クローニングベクターにクローンし、ｐＬＦ３３６（配列番号２５３）を生成した。
【０３３２】
ｐＬＦ３３６中にＨｇＧＧ（配列番号９）モチーフおよびＨＤＡｇＨ（配列番号１８）モチーフを含んでなる、得られたΔ５デサチュラーゼＤＮＡ配列が配列番号２５４で示される一方、コードされたタンパク質は配列番号２５５で記載される。
【０３３３】
ＮｏｔＩ部位で挟まれるＥｇＤ５Ｒ中にＨｇＧＧ（配列番号９）変異とＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異を組み合わせる
ＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異は、上述の手順を使用して、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異を含有する精製ＤＮＡ断片をテンプレートとして使用して、２回の追加的なＰＣＲ増幅を通じて、配列番号２５０のΔ５デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列に導入された。具体的には配列番号２４９の５’末端が、ＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５−５（配列番号２４５）およびプライマーＥｇＤ５Ｍ３−３（配列番号２５６）によって増幅され；配列番号２４９の３’末端は、ＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされ、ＥｇＤ５Ｍ３−３（配列番号２５６）と完璧に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーＥｇＤ５Ｍ３−５（配列番号２５７）と、プライマーＥｇＤ５−３（配列番号２４８）とによって、同様に増幅された。得られたＤＮＡ断片を上述したように分離し精製した。
【０３３４】
次に２つの精製ＤＮＡ断片を組み合わせて、ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異をコードするＤＮＡ変化を有する完全長遺伝子をＥｇＤ５−５（配列番号２４５）およびＥｇＤ５−３（配列番号２４８）を用いた２回目のＰＣＲ中で増幅した。製造業者のプロトコルに従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ’（商標）クローニングベクターにクローンし、ｐＬＦ３３７（配列番号２５８）を生成した。
【０３３５】
ｐＬＦ３３７中にＨｇＧＧ（配列番号９）モチーフおよびＨＤＡａＨ（配列番号１７）モチーフを含んでなる、得られたΔ５デサチュラーゼＤＮＡ配列が配列番号２５９で示される一方、コードされたタンパク質は配列番号２６０で記載される。
【０３３６】
実施例１７
植物発現ベクターにクローニングするための変種ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ
ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥａＤ５」］中におけるＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡｘＨ（配列番号３７）変異の作成
本実施例は、実施例１６に記載されるのと類似した様式でのＰＣＲ増幅による、ＥａＤ５（配列番号２８）のＤＮＡ配列へのＨｇＧＧ（配列番号９）変異と、ＨＤＡｇＨ（ＳＱＥＩＤＮＯ：１８）またはＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異のいずれかとの導入を記載する。得られた遺伝子は、一連の既存の植物発現ベクターへのクローニングを可能にする、ＮｏｔＩ部位で挟まれた（実施例１８、後述）；具体的には、２回のＰＣＲ増幅を通じて、Δ５デサチュラーゼ遺伝子中に二重変異体が導入され、各ＰＣＲは、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して実施された。生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、特に断りのない限り、製造業者のプロトコルに従って、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して精製した。
【０３３７】
ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をＮｏｔＩ部位で挟まれるＥａＤ５に導入する
ＨｇＧＧ（配列番号９）変異は、プラスミドｐＫＲ１１３６をＤＮＡテンプレートとして使用して、２回のＰＣＲ増幅を通じて、ＥａＤ５遺伝子（配列番号２８）に導入された。プラスミドｐＫＲ１１３６は、以前、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書記載されており、ＮｏｔＩ部位で挟まれるＥａＤ５遺伝子（配列番号２８）を含んでなる。ＥａＤ５（配列番号２８）の５’末端は、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマーＥａＤ５−５（配列番号２６１）およびプライマーＥａＤ５Ｍ１−３（配列番号２６２）によって、ｐＫＲ１１３６から増幅された。ＥａＤ５（配列番号２８）の３’末端は、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされて、ＥａＤ５Ｍ１−３（配列番号２６２）と完璧に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーＥａＤ５Ｍ１−５（配列番号２６３）と、ＥａＤ５−３（配列番号２６４）とによって、同様にベクターｐＫＲ１１３６から増幅された。得られたＤＮＡ断片を分離し精製した。
【０３３８】
次に２つの精製ＤＮＡ断片を組み合わせて、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異をコードするＤＮＡ変化を有する完全長遺伝子をオリゴヌクレオチドプライマーＥａＤ５−５（配列番号２６１）およびＥａＤ５−３（配列番号２６４）を用いた２回目のＰＣＲ中で増幅した。得られたＤＮＡ断片を精製した。
【０３３９】
ＨｇＧＧ（配列番号９）モチーフを含んでなる、得られたΔ５デサチュラーゼＤＮＡ配列が配列番号２６５で示される一方、コードされたタンパク質は配列番号２６６で記載される。
【０３４０】
ＮｏｔＩ部位で挟まれるＥａＤ５中にＨｇＧＧ（配列番号９）変異とＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異を組み合わせる
ＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異は、上述の手順を使用して、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異を含有する精製ＤＮＡ断片をテンプレートとして使用して、２回の追加的なＰＣＲ増幅を通じて、配列番号２６５のΔ５デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列に導入された。配列番号２６５の５’末端は、ＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマＥａＤ５−５（配列番号２６１）およびプライマーＥａＤ５Ｍ２−３（配列番号２６７）によって増幅され；配列番号２６５の３’末端は、ＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされ、ＥａＤ５Ｍ２−３（配列番号２６７）と完璧に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーＥａＤ５Ｍ２−５（配列番号２６８）と、プライマーＥａＤ５−３（配列番号２６４）とによって増幅された。得られたＤＮＡ断片を上述したように分離し精製した。
【０３４１】
次に２つの精製ＤＮＡ断片を組み合わせて、ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡｇＨ（配列番号１８）変異をコードするＤＮＡ変化を有する完全長遺伝子をＥａＤ５−５（配列番号２６１）およびＥａＤ５−３（配列番号２６４）を用いた２回目のＰＣＲ中で増幅した。製造業者のプロトコルに従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローンし、ｐＬＦ３３８（配列番号２６９）を生成した。
【０３４２】
ｐＬＦ３３８中にＨｇＧＧ（配列番号９）モチーフおよびＨＤＡｇＨ（配列番号１８）モチーフを含んでなる、得られたΔ５デサチュラーゼＤＮＡ配列が配列番号２７０で示される一方、コードされたタンパク質は配列番号２７１で記載される。
【０３４３】
ＮｏｔＩ部位で挟まれるＥａＤ５中にＨｇＧＧ（配列番号９）変異とＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異を組み合わせる
ＨＤＡａＨ変異は、ＨｇＧＧ（配列番号９）変異を含有する精製ＤＮＡ断片をテンプレートとして使用して、２回の追加的なＰＣＲ増幅を通じて、配列番号２７０のΔ５デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列に導入された。配列番号２７０の５’末端は、ＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマＥａＤ５−５（配列番号２６１）およびプライマーＥａＤ５Ｍ３−３（配列番号２７２）によって増幅され；配列番号２７０の３’末端は、ＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異をコードするＤＮＡ変化を導入するようにデザインされ、ＥａＤ５Ｍ３−３（配列番号２７２）と完璧に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーＥａＤ５Ｍ３−５（配列番号２７３）と、プライマーＥａＤ５−３（配列番号２６４）とによって、同様に増幅された。得られたＤＮＡ断片を上述したように分離し精製した。
【０３４４】
次に２つの精製ＤＮＡ断片を組み合わせて、ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡａＨ（配列番号１７）変異をコードするＤＮＡ変化を有する完全長遺伝子をＥａＤ５−５（配列番号２６１）およびＥａＤ５−３（配列番号２６４）を用いた２回目のＰＣＲ中で増幅した。製造業者のプロトコルに従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローンし、ｐＬＦ３３９（配列番号２７４）を生成した。
【０３４５】
ｐＬＦ３３９中にＨｇＧＧ（配列番号９）モチーフおよびＨＤＡａＨ（配列番号１７）モチーフを含んでなる、得られたΔ５デサチュラーゼＤＮＡ配列が配列番号２７５で示される一方、コードされたタンパク質は配列番号２７６で記載される。
【０３４６】
実施例１８
大豆中におけるΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼによるＥｇＤ５ＲまたはＥａＤ５二重Δ５デサチュラーゼ変異体の同時発現のための大豆発現ベクターの構築
本実施例は、大豆中の適切なΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼによる、それぞれ実施例１６および１７に記載される、ＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡｇＨ（配列番号１８）モチーフ、またはＨｇＧＧ（配列番号９）およびＨＤＡａＨ（配列番号１７）モチーフのいずれかを含んでなる、ＥｇＤ５ＲまたはＥａＤ５二重Δ５デサチュラーゼ変異体の同時発現のための大豆ベクターの構築を記載する。
【０３４７】
ｐＬＦ３３６およびｐＬＦ３３７（実施例１６に記載される）からのＥｇＤ５Ｒ変異体、およびｐＬＦ３３８およびｐＬＦ３３９（実施例１７に記載される）からのＥａＤ５変異体は、ＮｏｔＩでの消化によってそれぞれのベクターから放出させ得る。これによってΔ５デサチュラーゼが、強力な種子特異的プロモーターの後で、いくつもの既存の大豆発現ベクターに容易にクローンできるようになる。
【０３４８】
例えば変異Δ５デサチュラーゼのそれぞれを含んでなるＮｏｔＩ断片は、（その内容を参照によって本明細書に援用する）国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレットで以前記載されている、ｐＫＲ９７４のＮｏｔＩ断片にクローンし得る。このようにして、強力な種子特異的発現のために、大豆グリシニン（Ｇｙ１）プロモーターの後で、変異Δ５デサチュラーゼを発現させ得る。
【０３４９】
次にこれらのベクターをＳｂｆＩで消化して、変異Δ５デサチュラーゼを含有する断片をその内容を参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／１３７５１６号パンフレットで以前記載されている、ｐＫＲ９１３のＳｂｆＩ部位にクローンする。このようにして、強力な種子特異的プロモーターの後で、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ［「ＥｇＤ８」］およびミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ［「ＥｇＤ９ｅ」］と共に、変異Δ５デサチュラーゼを同時発現させ得る。
【０３５０】
このようにして生成されたいずれかのベクターを精製し、ベクターまたはベクターのＡｓｃＩ断片のいずれかをアネキシンプロモーター制御下のサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ［「ＳｄＤ１７」］を含んでなり、植物中における選択のためのハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットに記載される）ｐＫＲ３２８などであるが、これに限定されるものではない、ω−３ＰＵＦＡを増大させるようにデザインされたベクターと共に、国際公開第２００８／１３７５１６号パンフレットに記載されるように大豆胚培養物に同時形質転換する。形質転換後、遺伝子導入大豆胚を選択し、成熟させて脂肪酸プロファイルを分析し、植物を再生させる。
【０３５１】
このようにして、ＥＰＡおよび／またはＡＲＡなどの長鎖ＰＵＦＡを含んでなる、変異Δ５デサチュラーゼを発現する胚または種子が得られる。
【０３５２】
代案としては、ＥｇＤ９およびＥｇＤ８遺伝子と共に変異Δ５デサチュラーゼを同時発現する、ベクターまたはそれらに由来する断片を米国特許第７，６５９，１２０号明細書に記載されるｐＫＲ３２５のような適切な選択可能なマーカーを含有するその他のベクターで、同時形質転換し得る。全く同じ様にして、胚を成熟させて分析し、植物を再生させ、得られた植物の種子中で、ＡＲＡ増大とＥＰＡ低下などの代わりの脂肪酸プロファイルを達成し得る。
【０３５３】
ＥｇＤ９およびＥｇＤ８遺伝子と共に変異Δ５デサチュラーゼを発現するプラスミドもまた、米国特許出願公開第２００８−０１９４６８５Ａ１号明細書で以前記載されている、ｐＫＲ１１８９またはｐＫＲ１２４９またはその他のコンストラクトなどであるが、これに限定されるものではない、遺伝子、またはＤＮＡ断片、または内在性大豆ｆａｄ３遺伝子を発現停止するようにデザインされた人工マイクロＲＮＡを含んでなるベクターで、同時形質転換し得る。このようにして、大豆種子中で、より高濃度のＡＲＡおよびより低濃度のＥＰＡを達成し得る。
【０３５４】
本明細書に記載される、遺伝子、プロモーター、ターミネーター、および遺伝子カセットに加えて、その他プロモーター／遺伝子／ターミネーターカセットの組み合わせが、本明細書に記載されるΔ５デサチュラーゼ変異体を発現させる方法などであるが、これに限定されるものではない方法と同様に、合成し得ることを当業者は理解し得る。同様に、本発明のΔ５デサチュラーゼとの同時発現のために、その他のＰＵＦＡ遺伝子（表２３に後述するものなど）を発現させることが望ましいことがある。
【０３５５】
例えば国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレットは、大豆中の胚特異的発現で使用するためのいくつかのプロモーターおよび転写ターミネーター配列の単離を記載する。さらに国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット、および国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットは、個々のプロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを共にユニークな組み合わせに連結することによる、複数プロモーター／遺伝子／ターミネーターカセットの組み合わせの合成を記載する。一般に、（表２１に列挙されるものなどであるが、これに限定されるものではない）適切なプロモーターと（表２２に列挙されるものなどであるが、これに限定されるものではない）転写ターミネーターで挟まれるＮｏｔＩ部位を使用して、所望の遺伝子をクローンする。ＮｏｔＩ部位は、遺伝子の５’および３’末端にＮｏｔＩ部位を導入するようにデザインされたオリゴヌクレオチドによるＰＣＲ増幅を使用して、表２３に列挙されるものなどであるが、これに限定されるものではない対象の遺伝子に付加し得る。次に得られたＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化して、適切なプロモーター／ＮｏｔＩ／ターミネーターカセットにクローンする。
【０３５６】
これに加えて、国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット、および国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットは、所望の表現型の発現を得るために、適切な選択可能なマーカーカセットと共に、ユニークな組み合わせにさらに連結された個々の遺伝子カセットを記載する。これは主に異なる制限酵素部位を使用して実施されるが、当業者はいくつかの技術を利用して、所望のプロモーター／遺伝子／転写ターミネーターの組み合わせを達成し得ることを理解し得る。その際、胚特異的プロモーター／遺伝子／転写ターミネーターカセットのあらゆる組み合わせを達成し得る。当業者はまた、これらのカセットが、個々のＤＮＡ断片上にまたは複数断片上に位置し得て、複数ＤＮＡ断片の同時形質転換の成果が、遺伝子の同時発現であることを理解し得る。
【０３５７】
さらに米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書は、Δ８デサチュラーゼと共に個々のΔ９エロンガーゼを同時発現する、いくつかのベクターの作成、ならびにマルチザイムを作り出すこれらの遺伝子の融合を記載する。本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼのいずれでも、記載される発現ベクターへのクローニングによって、またはプラスミドまたは断片としての適切な発現ベクターの同時形質転換によって、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書に記載されるベクターと共に同時発現させて、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどであるが、これに限定されるものではないＰＵＦＡを生成する大豆種子を達成し得る。
【０３５８】
【表２７】
2013535988.tif 000028
【０３５９】
【表２８】
2013535988.tif 000029
【０３６０】
【表２９】
2013535988.tif 000030
【図１Ａ】
2013535988.tif 000031
【図１Ｂ】
2013535988.tif 000032
【図２】
2013535988.tif 000033
【図３Ａ】
2013535988.tif 000034
【図３Ｂ】
2013535988.tif 000035
【図３Ｃ】
2013535988.tif 000036
【図３Ｄ】
2013535988.tif 000037
【図４】
2013535988.tif 000038
【図５】
2013535988.tif 000039
【図６】
2013535988.tif 000040
【図７】
2013535988.tif 000041
【図８】
2013535988.tif 000042
【図９】
2013535988.tif 000043
【図１０Ａ】
2013535988.tif 000044
【図１０Ｂ】
2013535988.tif 000045
【図１１Ａ】
2013535988.tif 000046
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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