(57)【要約】  糖尿病に関連する網膜細胞における機能を改善し、被験体における糖尿病による網膜症を処置するための方法が本明細書で提供される。該方法は、網膜細胞を接触させる工程又は被験体に化学構造式（Ｉ）を有するようなβ−アドレナリン受容体アゴニストを投与する工程を含む：【化１】2013522195.tif 000025ここで、Ｒ１はｎが１乃至４である（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２又は式（ＩＩ）あり、【化２】2013522195.tif 000026Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり、Ｒ３は１つ以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３である。Ｒ１が（ＣＨ２）ｎ−フェニル−Ｒ２置換基であり、ヒドロキシ−ベンゼン部分が１，２−ベンゼンジオールまたは１，３−ベンゼンジオールである構造を有するＢＡＲアゴニストも提供される。【選択図】なし
2013522195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病に関連する網膜細胞における機能を改善するための方法であって、該方法は：
細胞をベータ−アドレナリン受容体アゴニストと接触させる工程含み、前記ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、インスリンシグナル伝達を増加させ、ＴＮＦαに誘発されたアポトーシスを減少させ、それにより網膜細胞における機能を改善する、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、以下の化学構造式を有し：
【化１】
2013522195.tif 000019
ここで、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２又は以下の式であり、
【化２】
2013522195.tif 000020
ここで、ｎは１乃至４であり；
Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり；
Ｒ３は１以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３である、
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＨであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、イソプロテレノールであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１は（ＣＨ２）２−フェニルであり、Ｒ２はＨ又はＨ・ＨＣｌであり、Ｒ３はＣ３、Ｃ４及びＣ５にてＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール、４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩、５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）エチルアミノ］エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール、５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール塩酸塩又はそのＲ異性体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
網膜細胞は、インビトロ又はインビボで接触されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病は、糖尿病網膜症、増殖前糖尿病網膜症又は他の高血糖の疾病であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
被験体における糖尿病による網膜症の疾病を処置する方法であって、該方法は：
被験体に薬理学的に効果的な量の１以上のベータ−アドレナリン受容体アゴニストを１回以上投与する工程を含み、ここで、前記アゴニストは網膜細胞機能を改善し、それにより糖尿病網膜症を処置することを特徴とする、方法。
【請求項１０】
ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、以下の構造式を有し：
【化３】
2013522195.tif 000021
ここで、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２又は以下の式であり、
【化４】
2013522195.tif 000022
ここで、ｎは１乃至４であり；
Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり；及び
Ｒ３は１つ以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＨであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、イソプロテレノールであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１は（ＣＨ２）２−フェニルであり、Ｒ２はＨ又はＨ・ＨＣｌであり、Ｒ３はＣ３、Ｃ４及びＣ５にてＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール、４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩、５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）エチルアミノ］エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール、又は５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール塩酸塩あるいはそのＲ異性体であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験体に１以上の他の糖尿病又は網膜症の薬物を投与する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記他の薬物は、ベータ−アドレナリン受容体アゴニストにより同時に又は連続して投与されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベータ−アドレナリン受容体アゴニストは、薬学的に許容可能な担体を有する医薬組成物を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物は、局所、結膜又は静脈内投与に適していることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖尿による病網膜症は、増殖前網膜症であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
以下の化学構造式を有するベータアドレナリン受容体アゴニストであって：
【化５】
2013522195.tif 000023
ここで、ｎは１乃至４であり；
Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり；及び
Ｒ３は１つ以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３であることを特徴とする、ベータアドレナリン受容体アゴニスト。
【請求項２１】
以下の化学構造式を有することを特徴とする、請求項２０に記載のベータアドレナリン受容体アゴニスト。
【化６】
2013522195.tif 000024
【請求項２２】
前記構造はＲ−異性体の形態であることを特徴とする、請求項２０に記載のアゴニスト。
【請求項２３】
請求項２１に記載のベータ−アドレナリン受容体アゴニストと薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〈関連出願への相互参照〉
この国際出願は、２０１０年３月８日に出願され、現在は放棄されている米国仮特許出願第６１／３３９，６７９号の、アメリカ合衆国法典第３５巻の第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものであり、その全体は、引用文によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、糖尿病及び眼疾患の分野に関する。具体的には、本発明は、増殖前糖尿病網膜症を処置するための化合物及び方法を提供する。
【０００３】
〈関連技術の説明〉
糖尿病網膜症は、就業年齢の成人における失明の主要な原因である。略全ての糖尿病患者は、診断の２０年以内に網膜症の幾つかの兆候を示す。米国での糖尿病患者のヘルスケアに係る費用は、２００７年だけで１７４０億ドルであった。ヒト糖尿病網膜症、同様に疾患の動物モデルの主な特徴は、増加した神経膠の炎症性マーカー及び視力喪失をもたらす神経細胞の細胞死を含む。インスリン療法が疾患の全体的な進行を遅くできる一方で、網膜におけるインスリン調整のメカニズムは不明瞭なままであり、視力喪失を防ぐための標的とされた処置は無い。
【０００４】
糖尿病網膜症の最小の処置は、１９７０年代から臨床用に向けられ、いずれも増殖前糖尿病網膜症を標的とするよう設計されていない。糖尿病網膜症の増殖期に関する現在の処置は、レーザー光凝固術であり、それは増殖性糖尿病網膜症の後期において効果的である。多くの糖尿病の及び高血圧の患者は、β−アドレナリン受容体アンタゴニストを受け、これは血圧の減少に効果的である。しかしながら、ヒト網膜に関するこれらの薬剤の効果の徹底的な分析はなかった。
【０００５】
げっ歯類における１つの報告は、β−アドレナリン受容体アンタゴニストが網膜にほとんど影響を及ぼさないことを示唆した（１）。対照的に、げっ歯類に全身に与えられるβ−アドレナリン受容体アンタゴニストを使用する他の研究は、プロプラノロール、一般に使用されるβ−アドレナリン受容体アンタゴニストが、網膜における電気活性の著しい欠如を産出し、血管新生を促進し得る成長因子を活性化したことを実証した（２）。
【０００６】
炎症性メディエーターは糖尿病網膜症における主な要因である。インスリン受容体シグナル伝達は、インスリンの放出によって引き起こされる。β−アドレナリン受容体は、炎症性メディエーター及びインスリンシグナル伝達の両方のタンパク質レベルを調節した。特に、ＴＮＦαレベルは、網膜の複数の細胞型において、β−アドレナリン受容体アゴニストによって減少する。
【０００７】
血管損傷が進行する前に生じる、増殖前期の糖尿病網膜症（ｐｒｅ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）を処置する手法は限定される。しかしながら、視覚が恒久的な失明の進行前に理論上弱められるため、これは処置に最も適切な段階である。多数の仮説は、高血糖症に関連する網膜の病理学について説明するために提供されてきたが、いずれも、疾患の増殖前期に関して患者のケアに置き換えられなかった。疾患進行の初期段階を反映する生物学的なマーカーを同定することは合理的に思われ、その結果、処置は不可逆性の血管損傷前に開始することができる。
【０００８】
それ故、先行技術は、増殖前糖尿病網膜症の処置のための効果的な方法及び器具において不足している。本発明は、この長年の必要性及び当該技術分野の要求を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、糖尿病に関連する網膜細胞における機能を改善する方法に向けられる。該方法は、細胞をβ−アドレナリン受容体（ＢＡＲ）アゴニストに接触させる工程を含み、ここで、ＢＡＲアゴニストは、インスリンシグナル伝達及びインスリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）を増加させ、ＴＮＦαに誘発されたアポトーシスを減少させて、それにより網膜細胞における機能を改善する。ＢＡＲアゴニストは、一般的な以下の化学構造を有し：
【００１０】
【化１】
2013522195.tif 000003
【００１１】
ここで、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２又は以下の式であり
【００１２】
【化２】
2013522195.tif 000004
【００１３】
ｎは１乃至４であり、Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり、Ｒ３は１以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３である。
【００１４】
本発明はまた、被験体の糖尿病による網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を処置する方法に向けられる。該方法は、被験体に、薬理学的に効果的な量の１以上のβ−アドレナリン受容体（ＢＡＲ）アゴニスト又はその医薬組成物を１回以上投与する工程を含み、ここで、アゴニストは網膜細胞機能を改善し、それにより糖尿病網膜症を処置する。本発明は、被験体に、１以上の他の糖尿病又は網膜症の薬物を投与する工程をさらに含む関連方法に向けられる。ＢＡＲアゴニストは、本明細書に記載の一般的な化学構造を有し得る。
【００１５】
本発明は、さらに以下の化学構造式を有するβ−アドレナリン受容体アゴニスト又はその医薬組成物に向けられる：
【００１６】
【化３】
2013522195.tif 000005
【００１７】
ここで、ｎは１乃至４であり、Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり、Ｒ３は１以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３である。
【００１８】
他の及びさらなる本発明の態様、特徴及び利点は、開示の目的のために与えられた本発明の現在好ましい実施形態の、以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
他のものと同様、本発明の上記の列挙された特徴、利点及び対象が明らかになることが得られ、詳細に理解することができるため、上記で簡潔に要約された本発明のより多くの特定の記載、及び特定の実施形態は、添付の図面で図示される。これらの図面は、本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面が本発明の好ましい実施形態を示し、それ故、それらの範囲内で限定することを考慮されるべきではないということも注目すべきである。
【図１】ＰＫＡ活性及びＣＲＥＢリン酸化に対する化合物２の効果を図示し、糖尿病のラットに毎日与えられる１ｍＭのこの化合物が、１０ｍＭと比べて、及び対照ラット（図１，  Ｐ＜０．０５，  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）に対する効果なしで、網膜におけるＰＫＡ活性を著しく増加させたことを実証する。このデータは、化合物２の局所投与が網膜に達し、正常な細胞のシグナル伝達を開始することを示す。
【図２Ａ】波形を表す。グループの各々における１匹の動物からの代表的な波形は、ＥＲＧ（図２Ａ）又はＯＰ（図２Ｂ）を使用して記録された。各々のグループにおけるすべての動物に関する平均（ｍｅａｎｓ）及び標準偏差を伴う折線グラフは、ＥＲＧを使用して記録されるａ−波（図２Ｃ）、ｂ−波（図２Ｄ）及び振動電位（図２Ｅ）に関して増加する光の強さにて示される。局所用の化合物２が、全体で８か月の期間にわたってＥＲＧの全て３つの化合物の損失を阻害することができることは、明らかである。エラーバーは平均ＳＤである。Ａ−波、Ｂ−波の振幅及びＯＣＴの振幅は、網膜電位図（ＥＲＧ）分析を介して各々のグループで毎月測定された。データは、糖尿病の２、６及び８か月目に、動物に関して提示される。対照ラットのＥＲＧの振幅と、２及び８か月での１ｍＭの化合物２を受ける振幅との間に差がほとんど見られなかった一方で、糖尿病のラットのみが、ａ−波、ｂ−波の振幅及び振動電位の振幅の著しい減少を示した（図２Ａ−２Ｅ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）。結果は、化合物２の処置が、実験を通じて、網膜における正常な電気的活性を維持できたことを示す。
【図２Ｂ】波形を表す。グループの各々における１匹の動物からの代表的な波形は、ＥＲＧ（図２Ａ）又はＯＰ（図２Ｂ）を使用して記録された。各々のグループにおけるすべての動物に関する平均（ｍｅａｎｓ）及び標準偏差を伴う折線グラフは、ＥＲＧを使用して記録されるａ−波（図２Ｃ）、ｂ−波（図２Ｄ）及び振動電位（図２Ｅ）に関して増加する光の強さにて示される。局所用の化合物２が、全体で８か月の期間にわたってＥＲＧの全て３つの化合物の損失を阻害することができることは、明らかである。エラーバーは平均ＳＤである。Ａ−波、Ｂ−波の振幅及びＯＣＴの振幅は、網膜電位図（ＥＲＧ）分析を介して各々のグループで毎月測定された。データは、糖尿病の２、６及び８か月目に、動物に関して提示される。対照ラットのＥＲＧの振幅と、２及び８か月での１ｍＭの化合物２を受ける振幅との間に差がほとんど見られなかった一方で、糖尿病のラットのみが、ａ−波、ｂ−波の振幅及び振動電位の振幅の著しい減少を示した（図２Ａ−２Ｅ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）。結果は、化合物２の処置が、実験を通じて、網膜における正常な電気的活性を維持できたことを示す。
【図２Ｃ】波形を表す。グループの各々における１匹の動物からの代表的な波形は、ＥＲＧ（図２Ａ）又はＯＰ（図２Ｂ）を使用して記録された。各々のグループにおけるすべての動物に関する平均（ｍｅａｎｓ）及び標準偏差を伴う折線グラフは、ＥＲＧを使用して記録されるａ−波（図２Ｃ）、ｂ−波（図２Ｄ）及び振動電位（図２Ｅ）に関して増加する光の強さにて示される。局所用の化合物２が、全体で８か月の期間にわたってＥＲＧの全て３つの化合物の損失を阻害することができることは、明らかである。エラーバーは平均ＳＤである。Ａ−波、Ｂ−波の振幅及びＯＣＴの振幅は、網膜電位図（ＥＲＧ）分析を介して各々のグループで毎月測定された。データは、糖尿病の２、６及び８か月目に、動物に関して提示される。対照ラットのＥＲＧの振幅と、２及び８か月での１ｍＭの化合物２を受ける振幅との間に差がほとんど見られなかった一方で、糖尿病のラットのみが、ａ−波、ｂ−波の振幅及び振動電位の振幅の著しい減少を示した（図２Ａ−２Ｅ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）。結果は、化合物２の処置が、実験を通じて、網膜における正常な電気的活性を維持できたことを示す。
【図２Ｄ】波形を表す。グループの各々における１匹の動物からの代表的な波形は、ＥＲＧ（図２Ａ）又はＯＰ（図２Ｂ）を使用して記録された。各々のグループにおけるすべての動物に関する平均（ｍｅａｎｓ）及び標準偏差を伴う折線グラフは、ＥＲＧを使用して記録されるａ−波（図２Ｃ）、ｂ−波（図２Ｄ）及び振動電位（図２Ｅ）に関して増加する光の強さにて示される。局所用の化合物２が、全体で８か月の期間にわたってＥＲＧの全て３つの化合物の損失を阻害することができることは、明らかである。エラーバーは平均ＳＤである。Ａ−波、Ｂ−波の振幅及びＯＣＴの振幅は、網膜電位図（ＥＲＧ）分析を介して各々のグループで毎月測定された。データは、糖尿病の２、６及び８か月目に、動物に関して提示される。対照ラットのＥＲＧの振幅と、２及び８か月での１ｍＭの化合物２を受ける振幅との間に差がほとんど見られなかった一方で、糖尿病のラットのみが、ａ−波、ｂ−波の振幅及び振動電位の振幅の著しい減少を示した（図２Ａ−２Ｅ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）。結果は、化合物２の処置が、実験を通じて、網膜における正常な電気的活性を維持できたことを示す。
【図２Ｅ】波形を表す。グループの各々における１匹の動物からの代表的な波形は、ＥＲＧ（図２Ａ）又はＯＰ（図２Ｂ）を使用して記録された。各々のグループにおけるすべての動物に関する平均（ｍｅａｎｓ）及び標準偏差を伴う折線グラフは、ＥＲＧを使用して記録されるａ−波（図２Ｃ）、ｂ−波（図２Ｄ）及び振動電位（図２Ｅ）に関して増加する光の強さにて示される。局所用の化合物２が、全体で８か月の期間にわたってＥＲＧの全て３つの化合物の損失を阻害することができることは、明らかである。エラーバーは平均ＳＤである。Ａ−波、Ｂ−波の振幅及びＯＣＴの振幅は、網膜電位図（ＥＲＧ）分析を介して各々のグループで毎月測定された。データは、糖尿病の２、６及び８か月目に、動物に関して提示される。対照ラットのＥＲＧの振幅と、２及び８か月での１ｍＭの化合物２を受ける振幅との間に差がほとんど見られなかった一方で、糖尿病のラットのみが、ａ−波、ｂ−波の振幅及び振動電位の振幅の著しい減少を示した（図２Ａ−２Ｅ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）。結果は、化合物２の処置が、実験を通じて、網膜における正常な電気的活性を維持できたことを示す。
【図３Ａ】中心及び周辺の網膜の厚さと、対照ラット、糖尿病のラット及び化合物２を加えた糖尿病のラットにおける神経細胞層中の細胞の数とを比較し、化合物２が予防処置（図３Ａ）及び遅くされた処置（図３Ｂ）として投与される場合、光受容細胞体、両極細胞及び神経細胞層を画像化する。内部の網膜の厚さが減少されるため、糖尿病のラットに関する画像はより短い。糖尿病が２か月で細胞数及び網膜の厚さを減少させることが実証されてきた（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１０）。周辺及び中心の網膜の両方において、網膜の厚さは、処置を受けない糖尿病のラットにおいて著しく減少した。周辺及び中心の網膜の神経細胞層（ＧＣＬ）における細胞数は、対照の又は糖尿病＋２の動物と比較して、糖尿病のラットにおいて著しく減少した（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）。化合物２での処置は、網膜中の糖尿病にもかかわらず、網膜の厚さ及び細胞数を維持する。
【図３Ｂ】中心及び周辺の網膜の厚さと、対照ラット、糖尿病のラット及び化合物２を加えた糖尿病のラットにおける神経細胞層中の細胞の数とを比較し、化合物２が予防処置（図３Ａ）及び遅くされた処置（図３Ｂ）として投与される場合、光受容細胞体、両極細胞及び神経細胞層を画像化する。内部の網膜の厚さが減少されるため、糖尿病のラットに関する画像はより短い。糖尿病が２か月で細胞数及び網膜の厚さを減少させることが実証されてきた（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１０）。周辺及び中心の網膜の両方において、網膜の厚さは、処置を受けない糖尿病のラットにおいて著しく減少した。周辺及び中心の網膜の神経細胞層（ＧＣＬ）における細胞数は、対照の又は糖尿病＋２の動物と比較して、糖尿病のラットにおいて著しく減少した（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）。化合物２での処置は、網膜中の糖尿病にもかかわらず、網膜の厚さ及び細胞数を維持する。
【図４Ａ】目における化合物２の効果を示す。図４Ａは、網膜の１平方ミリメートル当たりの退化した毛細管の数を示す（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝４）。点眼薬処置は、糖尿病のラットにおける退化した毛細管の数を著しく減少した。１，０００本の毛細管当たりの周皮細胞ゴースト（Ｐｅｒｉｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔｓ）の数は、図４Ｂで示される（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝４）。
【図４Ｂ】目における化合物２の効果を示す。図４Ａは、網膜の１平方ミリメートル当たりの退化した毛細管の数を示す（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝４）。点眼薬処置は、糖尿病のラットにおける退化した毛細管の数を著しく減少した。１，０００本の毛細管当たりの周皮細胞ゴースト（Ｐｅｒｉｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔｓ）の数は、図４Ｂで示される（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝４）。
【図５Ａ】化合物２がインビトロでのＴＮＦα活性のレベルを著しく減少したことを示す。同じ化合物は、糖尿病のラットにおける炎症性マーカーレベルの減少を引き起こすように、インビボで試験された。図５Ａ−５Ｂは、ＥＬＩＳＡ分析によって明らかにされるように、糖尿病の２か月目（図５Ａ）（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）、及び８ヶ月目（図５Ｂ）（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）での網膜におけるＴＮＦ活性を示す。
【図５Ｂ】化合物２がインビトロでのＴＮＦα活性のレベルを著しく減少したことを示す。同じ化合物は、糖尿病のラットにおける炎症性マーカーレベルの減少を引き起こすように、インビボで試験された。図５Ａ−５Ｂは、ＥＬＩＳＡ分析によって明らかにされるように、糖尿病の２か月目（図５Ａ）（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）、及び８ヶ月目（図５Ｂ）（Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）での網膜におけるＴＮＦ活性を示す。
【図６Ａ】リン酸化されたインスリン受容体ベータと、２か月（図６Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のインスリン受容体ベータとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフを示す。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに（ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｇｉｎｇ）、実質的に減少する。リン酸化されたＡｋｔと、２か月（図６Ｃ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｄ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のＡｋｔとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフが示される。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。
【図６Ｂ】リン酸化されたインスリン受容体ベータと、２か月（図６Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のインスリン受容体ベータとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフを示す。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。リン酸化されたＡｋｔと、２か月（図６Ｃ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２、Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｄ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のＡｋｔとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフが示される。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。
【図６Ｃ】リン酸化されたインスリン受容体ベータと、２か月（図６Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２、Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のインスリン受容体ベータとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフを示す。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。リン酸化されたＡｋｔと、２か月（図６Ｃ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｄ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のＡｋｔとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフが示される。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。
【図６Ｄ】リン酸化されたインスリン受容体ベータと、２か月（図６Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のインスリン受容体ベータとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフを示す。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。リン酸化されたＡｋｔと、２か月（図６Ｃ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）及び８か月（図６Ｄ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）でのラットの網膜における合計のＡｋｔとの比率の、代表的なウェスタンブロット及び棒グラフが示される。全体比率は、処置の８か月目又は対照が歳をとるごとに、実質的に減少する。
【図６Ｅ】ホスホ−ＡＫＴと合計のＡＫＴとの比率に対する化合物２の効果を示す。図６Ｅ−６Ｆ：糖尿病の２ヶ月目（左）及び糖尿病の８か月目（右）での全体の網膜の可溶化液におけるＡｋｔリン酸化。処置は、最初のグルコース測定＞２５０ｍｇ／ｄｌの時に開始された。図６Ｇ−６Ｈ、幾つかの動物は、６か月の間介入なしで糖尿病にされた。６か月目に、糖尿病の動物の亜集団は、１ｍＭの局所用の化合物２上で開始された。糖尿病の８か月目に（２ヶ月目の化合物２）又は糖尿病の１２か月目及び６ヶ月目の化合物２に、Ａｋｔのリン酸化は、対照の、糖尿病の、及び糖尿病＋化合物２で処置されたラットにおいて測定された。
【図６Ｆ】ホスホ−ＡＫＴと合計のＡＫＴとの比率に対する化合物２の効果を示す。図６Ｅ−６Ｆ：糖尿病の２ヶ月目（左）及び糖尿病の８か月目（右）での全体の網膜の可溶化液におけるＡｋｔリン酸化。処置は、最初のグルコース測定＞２５０ｍｇ／ｄｌの時に開始された。図６Ｇ−６Ｈ、幾つかの動物は、６か月の間介入なしで糖尿病にされた。６か月目に、糖尿病の動物の亜集団は、１ｍＭの局所用の化合物２上で開始された。糖尿病の８か月目に（２ヶ月目の化合物２）又は糖尿病の１２か月目及び６ヶ月目の化合物２に、Ａｋｔのリン酸化は、対照の、糖尿病の、及び糖尿病＋化合物２で処置されたラットにおいて測定された。
【図６Ｇ】ホスホ−ＡＫＴと合計のＡＫＴとの比率に対する化合物２の効果を示す。図６Ｅ−６Ｆ：糖尿病の２ヶ月目（左）及び糖尿病の８か月目（右）での全体の網膜の可溶化液におけるＡｋｔリン酸化。処置は、最初のグルコース測定＞２５０ｍｇ／ｄｌの時に開始された。図６Ｇ−６Ｈ、幾つかの動物は、６か月の間介入なしで糖尿病にされた。６か月目に、糖尿病の動物の亜集団は、１ｍＭの局所用の化合物２上で開始された。糖尿病の８か月目に（２ヶ月目の化合物２）又は糖尿病の１２か月目及び６ヶ月目の化合物２に、Ａｋｔのリン酸化は、対照の、糖尿病の、及び糖尿病＋化合物２で処置されたラットにおいて測定された。
【図６Ｈ】ホスホ−ＡＫＴと合計のＡＫＴとの比率に対する化合物２の効果を示す。図６Ｅ−６Ｆ：糖尿病の２ヶ月目（左）及び糖尿病の８か月目（右）での全体の網膜の可溶化液におけるＡｋｔリン酸化。処置は、最初のグルコース測定＞２５０ｍｇ／ｄｌの時に開始された。図６Ｇ−６Ｈ、幾つかの動物は、６か月の間介入なしで糖尿病にされた。６か月目に、糖尿病の動物の亜集団は、１ｍＭの局所用の化合物２上で開始された。糖尿病の８か月目に（２ヶ月目の化合物２）又は糖尿病の１２か月目及び６ヶ月目の化合物２に、Ａｋｔのリン酸化は、対照の、糖尿病の、及び糖尿病＋化合物２で処置されたラットにおいて測定された。
【図７Ａ】２か月目（図７Ａ）及び８か月目（図７Ｂ）で切断されたカスパーゼのＥＬＩＳＡ分析を示す。アポトーシスが、８か月目にすべてのグループにおける網膜において増加されることは明らかである。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋４９ｂ；各年齢での各グループにおいてＮ＝４。
【図７Ｂ】２か月目（図７Ａ）及び８か月目（図７Ｂ）で切断されたカスパーゼのＥＬＩＳＡ分析を示す。アポトーシスが、８か月目にすべてのグループにおける網膜において増加されることは明らかである。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋４９ｂ；各年齢での各グループにおいてＮ＝４。
【図８】イソプロテレノール１（４−［１−ヒドロキシ−２−（イソプロピルアミノ）エチル］ベンゼン−１，２−ジオール、化合物４９ｂ  ４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩、及び化合物４  ５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール塩酸塩の化学構造を示す。
【図９Ａ】Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞の処置が、１０、５０及び１００ｎＭの化合物２によって、高いグルコースにおいて培養されたことを示す。化合物２での処置は、イソプロテレノールでの処置と比較して、５０ｎＭでの切断されたカスパーゼ３（図９Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）及びＴＮＦαのレベルを著しく減少し、それは、同じ反応のため１０μＭを必要とした（図９Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）。
【図９Ｂ】Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞の処置が、１０、５０及び１００ｎＭの化合物２によって、高いグルコースにおいて培養されたことを示す。化合物２での処置は、イソプロテレノールでの処置と比較して、５０ｎＭでの切断されたカスパーゼ３（図９Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）及びＴＮＦαのレベルを著しく減少し、それは、同じ反応のため１０μＭを必要とした（図９Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）。
【図１０Ａ】１０、５０及び１００ｎＭの化合物２でのＲＥＣ細胞の処置を示す。化合物２での処置は、イソプロテレノールでの処置と比較して、３０及び６０分後、切断されたカスパーゼ３（図１０Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）及びＴＮＦα（図１０Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）のレベルを著しく減少した。
【図１０Ｂ】１０、５０及び１００ｎＭの化合物２でのＲＥＣ細胞の処置を示す。化合物２での処置は、イソプロテレノールでの処置と比較して、３０及び６０分後、切断されたカスパーゼ３（図１０Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）及びＴＮＦα（図１０Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ，  Ｎ＝４）のレベルを著しく減少した。
【図１１】１ｍＭの化合物２で毎日処置されるＩ型糖尿病のラットにおける効果を示す。
【図１２Ａ】５０ｎＭの化合物３でのＭｕｅｌｌｅｒ細胞の処置が、１時間でのカスパーゼ３の開裂（図１２Ａ）対非処置の細胞を減少させ、非処置の細胞と比較して、１時間以内にＴＮＦα（図１２Ｂ）を著しく減少したことを示す。
【図１２Ｂ】５０ｎＭの化合物３でのＭｕｅｌｌｅｒ細胞の処置が、１時間でのカスパーゼ３の開裂（図１２Ａ）対非処置の細胞を減少させ、非処置の細胞と比較して、１時間以内にＴＮＦα（図１２Ｂ）を著しく減少したことを示す。
【図１３Ａ】５０ｎＭの化合物３でのＲＥＣ細胞の処置が、１時間でのカスパーゼ３の開裂（図１３Ａ）及びＴＮＦα（図１３Ｂ）対非処置の細胞を減少したことを示す。
【図１３Ｂ】５０ｎＭの化合物３でのＲＥＣ細胞の処置が、１時間でのカスパーゼ３の開裂（図１３Ａ）及びＴＮＦα（図１３Ｂ）対非処置の細胞を減少したことを示す。
【図１４】処置の１時間又は２４時間での、化合物２のＲ−異性体（５０ｎＭ）、化合物２のＳ−異性体（５０ｎＭ）及びラセミ化合物２の、Ｍｕｅｌｌｅｒ及び網膜の内皮細胞におけるＴＮＦα濃度への効果を示す。
【図１５】処置の１時間又は２４時間での、化合物２のＲ−異性体（５０ｎＭ）、化合物２のＳ−異性体（５０ｎＭ）及びラセミ化合物２の、Ｍｕｅｌｌｅｒ及び網膜の内皮細胞における切断されたカスパーゼ３濃度への効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で使用されるように、用語「ａ」又は「ａｎ」は、請求項及び／又は明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される時、「１（ｏｎｅ）」を示すが、「１以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」及び「１又は１より多くの（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味とも一致する。本発明の幾つかの実施形態は、本発明の１以上の要素、方法の工程、及び／又は方法から成り、又は本質的に成り得る。本明細書に記載の任意の方法又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施されることができることが熟慮される。
【００２１】
本明細書で使用されるように、請求項における用語「又は（ｏｒ）」は、代替物のみを指すよう明確に示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を指すが、本開示は代替物及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、１以上の本明細書に記載のβ−アドレナリン受容体（ＢＡＲ）アゴニスト、又は網膜細胞或いは網膜細胞と接触する網膜の維管束組織機能及び／又は構造、又は糖尿病網膜症又は増殖前網膜症などの糖尿病に関連した、同じ物を含む組織を改善する、他の抑制的又は刺激的な薬剤をもたらす任意の適切な方法を指す。インビトロ又はエクスビボで、これは、適切な培地におけるＢＡＲアゴニストに網膜細胞又は組織をさらすことにより達成される。インビボでの適用に関して、投与の任意の既知の方法は、本明細書に記載されるように適切である。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「効果的な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、「薬理学的に効果的な量（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は互換性があり、糖尿病に関連した網膜症の状態の発症の遅延又は予防をもたらすか、又は同じものの症状の改善又は治療をもたらす量を指す。当業者は、効果的な量が、患者又は被験体の疾病を改善するが、疾病の完全な治療ではないと理解する。本明細書に使用されるように、用語「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、処置の任意の標的を指す。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、糖尿病に関連した網膜細胞における機能を改善する方法が提供され、該方法は、細胞をβ−アドレナリン受容体（ＢＡＲ）アゴニストと接触させる工程を含み、ここで、ＢＡＲアゴニストは、インスリンシグナル伝達を増加させ、ＴＮＦαに誘発されたアポトーシスを減少させ、それにより網膜細胞における機能を改善する。
【００２５】
この実施形態において、ＢＡＲアゴニストは以下の化学構造式を有し：
【００２６】
【化４】
2013522195.tif 000006
【００２７】
ここで、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２又は以下の式であり、
【００２８】
【化５】
2013522195.tif 000007
【００２９】
ここで、ｎは１乃至４であり；Ｒ２はＨ又はＸがハライドであるＨ・ＨＸであり；Ｒ３は１以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４Ｏである（ＣＨ２）ｍＣＨ３である。
【００３０】
この実施形態の１つの態様において、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＨであり得る。この態様において、ＢＡＲアゴニストは化合物２であり得る。別の態様において、Ｒ１は（ＣＨ２）２−フェニルであり、Ｒ２はＨ又はＨ・ＨＣｌであり、Ｒ３はＣ３、Ｃ４及びＣ５にてＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３であり得る。この他の態様において、ＢＡＲアゴニストは、４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール、４−［１−ヒドロキシ−２−［３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩、５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ（ｔｒｉｍｅｔｈｏｓｙ）−フェニル）エチルアミノ］エチル）ベンゼン−１，３−ジオール、又は５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール塩酸塩であり得る。すべての態様及び実施形態において、網膜細胞は、インビトロ又はインビボで接触され得る。また、糖尿病は、糖尿病網膜症、増殖前糖尿病網膜症又は他の高血糖の疾病であり得る。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、被験体の糖尿病による網膜症を処置する方法が提供され、該方法は、被験体に薬理学的に効果的な量の１以上のβ−アドレナリン受容体（ＢＡＲ）アゴニストを１回以上投与する工程を含み、ここで、アゴニストは網膜細胞機能を改善し、それにより糖尿病網膜症を処置する。この実施形態に加えて、前記方法は、被験体に１以上の他の糖尿病又は網膜症の薬物を投与する工程を含む。このさらなる実施形態において、他の薬物は、β−アドレナリン受容体アゴニストにより同時に又は連続して投与され得る。
【００３２】
両方の実施形態において、ベータアドレナリン受容体アゴニストは、上述されたようなものであってもよい。また、両方の実施形態において、糖尿病による網膜症は、増殖前網膜症であり得る。加えて、ベータアドレナリン受容体アゴニストは、薬学的に許容可能な担体を有する医薬組成物を含み、それは、局所、結膜又は静脈内投与に適している。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、以下の化学構造式を有するベータアドレナリン受容体アゴニストが提供され：
【００３４】
【化６】
2013522195.tif 000008
【００３５】
ここで、ｎは１乃至４であり、Ｒ２は１つ以上のＣ２−Ｃ６にて、ｍが０乃至４であるＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３である。ＢＡＲアゴニストの特定の化学構造の例は、以下のとおりである：
【００３６】
【化７】
2013522195.tif 000009
【００３７】
関連する実施形態において、本発明は、上述されるようなβ−アドレナリン受容体アゴニスト及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
インスリン受容体及びβ−アドレナリン受容体シグナル伝達の間に、予期しない重複がある。重要なことに、増加したβ−アドレナリン受容体シグナル伝達は、β−アドレナリン受容体アゴニストでの処置の後の糖尿病のラットにおけるアポトーシスの細胞死の減少によって実証されるように、糖尿病のインスリンシグナル伝達の損失を補い得る。関係する細胞の機構は、細胞死、又は代わりに、ＴＮＦαなど炎症性メディエーターに関係する経路によるインスリン受容体の阻害防止への、β−アドレナリン受容体シグナル伝達の直接の補足的な効果を含み得る。それはまた、網膜の内皮細胞死を阻害するＩＧＦＢＰ−３のアップレギュレーションを含み得る。
【００３９】
本発明は、化合物２の誘導体及びアナログ化合物を提供する。化合物２及び誘導体／アナログ化合物の両方は、β−アドレナリン受容体アゴニストである。これらの化合物は、カテコールアミン作動性の特性を有し、またβ−１−及びβ−２−アドレナリン受容体の両方を活性化する。これらの化合物は、いくつかの実施形態におけるイソプロテレノールと比較される。イソプロテロノール及び本発明の化合物の両方が、β−アドレナリン受容体活性を有する一方で、イソプロテレノールは非選択的アゴニストであるが、本発明のベータアドレナリン受容体アゴニストがイソプロテレノールより強力で特異的な効果を有することが実証される。
【００４０】
本明細書で提供される本発明のベータアドレナリン受容体アゴニストは、既知の標準の化学合成方法によって合成され得る。一般に、既知のイソプロテレノールを含むこれらのベータアドレナリン受容体アゴニストは、以下の化学構造を有し得る：
【００４１】
【化８】
2013522195.tif 000010
【００４２】
Ｒ１置換基は、ｎが１乃至４である（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ３）２、例えば、イソプロテレノール１におけるようにイソプロピル部分ＣＨ２（ＣＨ３）２を含み、又は置換されたフェニル部分を含み得る：
【００４３】
【化９】
2013522195.tif 000011
【００４４】
ここで、ｎは１乃至４である。Ｒ２は、水素、又は薬理学的に許容可能な塩、又はＸがハライドであるＨ・ＨＸなどの水和物部分、例えば限定されないが塩化物のいずれかである。Ｒ３は１つ以上のＣ２−Ｃ６フェニル炭素にて置換され、ここで、Ｒ３は独立して−Ｏ（ＣＨ２）ｍＣＨ３であり、ｍは０乃至４である。
【００４５】
一般に、本明細書で提供される新しいベータアドレナリン受容体アゴニストは、ベンゼンジオール部分を含む。例えば、β−アドレナリン受容体アゴニストは、以下の化学構造を有し得る：
【００４６】
【化１０】
2013522195.tif 000012
【００４７】
ベンゼン１，２−ジオール部分を有する好ましいＢＡＲアゴニストは、４−［１−ヒドロキシ−２−（１−エチルアミノ−３−，４−，５−トリメトキシフェニル）エチル］ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩（化合物２）であり、以下の化学構造を有し：
【００４８】
【化１１】
2013522195.tif 000013
【００４９】
以下の化学構造を有する４−［１−ヒドロキシ−２−（１−エチルアミノ−３−，４−，５−トリメトキシフェニル）エチル］ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩（化合物３）を有する：
【００５０】
【化１２】
2013522195.tif 000014
【００５１】
また、β−アドレナリン受容体アゴニストは以下の化学構造を有する：
【００５２】
【化１３】
2013522195.tif 000015
【００５３】
ベンゼン１，３−ジオール部分を有するより好ましいベータアドレナリン受容体アゴニストは、以下の化学構造を有する５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ（ｔｒｉｍｅｔｈｏｓｙ）−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール塩酸塩（化合物４）：
【００５４】
【化１４】
2013522195.tif 000016
【００５５】
以下の化学構造を有する５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール（化合物５）である：
【００５６】
【化１５】
2013522195.tif 000017
【００５７】
本明細書に記載の化合物２及び他のベータアドレナリン受容体アゴニストの作用の潜在的な機構が、ＴＮＦα及びＭｕｅｌｌｅｒ細胞のための増加したインスリンシグナル伝達の減少を介し、及び網膜の内皮細胞中の増加したＩＧＦＢＰ−３レベルを介することが決定される。これらの作用が、ヒト糖尿病網膜症のためのバイオマーカーを表わし得ることが熟考される。本発明は、β−アドレナリン受容体アゴニストが、複数の網膜細胞型を損傷させる糖尿病又は高血糖の疾病によって引き起こされた損傷を予防することを実証する。本明細書で提示されたベータアドレナリン受容体アゴニストでの処置の重大な特徴は、選択的な特異性であり、即ち、その一方でそれらは網膜損傷を減少させ、それらは血圧を下げず、眼内圧を変え、現在のアンギオテンシン変換酵素薬剤よりもかなり効果的である。
【００５８】
したがって、本発明はまた、インスリン受容体シグナル伝達のための補足又はその維持を通じて糖尿病網膜症を予防する及び／又は逆転することによるなど、網膜細胞の機能及び構造、及び網膜の組織毛細管に対する、糖尿病に関連する網膜損傷を減少させる又は予防する方法を提供する。これらの方法はインビトロ又はインビボで実行され得る。例えば、ｂ−アドレナリン受容体アゴニストを有する糖尿病に関連する網膜細胞を接触させることは、とりわけインスリンシグナル伝達を特に増加し、及びＴＮＦαに誘発されたアポトーシスを減少することにより、細胞の網膜の機能を改善する。
【００５９】
特に、本明細書で提供されるインビボでの処置方法は、臨床的に顕著な症状が明白でない時、及び細胞死並びに結果として生じる失明が起こる前に、糖尿病網膜症の増殖前期を標的とする。処置は、本明細書に記載のβ−アドレナリン受容体アゴニスト又はその薬理学的に効果的で許容可能な塩又は水和物の１つ以上の投与によって影響を受ける。当該技術分野において既知及び標準であるような、β−アドレナリン受容体アゴニスト及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物も投与され得る。１つ以上の他の糖尿病又は網膜症の薬物又は治療薬が、β−アドレナリン受容体アゴニストにより同時に又は連続して投与され得ることが熟慮される。
【００６０】
β−アドレナリン受容体アゴニスト化合物又はその薬理学的に許容可能な塩又は水和物の投薬製剤は、投与の方法に適した従来の無毒で、生理学的に又は薬学的に許容可能な担体又はビヒクルを含み得る。投与の方法は、当該技術分野では既知であり、好ましくは、結膜送達及び局所送達であるが、該方法は静脈内送達を含み得る。これらの化合物又はその医薬組成物は、これらの化合物又は他の抗糖尿病薬物又は薬剤に由来する薬理学又は治療効果を達成する、維持する、又は改善するために独立して１回以上投与され得る。それは、投薬を決定し、又は適切な投薬が単一で投与される投与量又は複数で投与される投与量を含むかどうかを決定する技能者の技術内に十分にある。適切な投薬は、被験体の健康状態、糖尿病及び／又は網膜症の進行又は段階、投与経路及び使用される製剤に依存する。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を示す目的で挙げられ、任意の様式で本発明を限定することを目的としない。
【００６２】
〈動物の調製〉
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入されたオスのルイスラットを使用した。糖尿病のラットは、６０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）の単独注入を受けた。対照のラットは、シトラート緩衝液の注入を受けた。すべてのラットの重量を毎週量り、非絶食の血液グルコースレベル＞２５０ｍｇ／ｄｌを有するマウスのみを、糖尿病であると考えた。糖尿病の指定を、実験の初めに行った。グルコースを隔月で測定した。インスリンを、いかなる時にもラットに投与しなかった。
【００６３】
化合物２の局所適用が網膜に達し、反応を誘発するかどうかを決定するために、投与量と時間経過の研究を行った。それらの研究のため、動物を、ＳＴＺを使用して２か月の間糖尿病にした。４日間、ラットは、毎日１回又は２回、化合物２（１ｍＭ乃至２０ｍＭ）又はＰＢＳのいずれかの様々な投与量を受けた。両眼に対する点眼薬処置の４日後に、糖尿病及び対照の動物を安楽死させた。β−アドレナリン受容体刺激が環式のアデノシンモノホスファーゼ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｓｅ）生成を増加し、タンパク質キナーゼＡを活性化するべきであるため、網膜の溶解産物を、ＰＫＡ  ＥＬＩＳＡ（ＭｅｓａＣｕｐ  ＰＫＡ  ＥＬＩＳＡ，  Ｕｐｓｔａｔｅ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）のために処理した。化合物２のための点眼薬処置用の適量及び時間経過の決定後、ラットの３つのグループを、研究のこの部分のために使用した（対照、糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｉｃ）、及び糖尿病＋点眼薬（Ｄｉａｂ＋２））。ＳＴＺ−注入の１週以内に、１２のラットに点眼薬治療を行った。点眼薬治療中のラットは、各々の目に１ｍＭの化合物２の４滴の毎日の適用を受けた。インスリンレベルが糖尿病の動物で失われたことを確認するために、インスリンＥＬＩＳＡ（Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，  Ｌｉｎｃｏ，  Ｓｔ．  Ｃｈａｒｌｅｓ，  ＭＯ）を、２か月齢でのすべてのラットからサンプリングされた血液上で行った。ラットを、２又は８か月齢で犠牲にした。２又は８か月で、網膜を、網膜細胞数及び網膜の厚さの糖尿病に誘発された悪化のために（２か月）、及び退化した毛細管のために（８か月）評価した。ＴＮＦ活性、切断されたカスパーゼ３、及びインスリン受容体ベータ及びＡｋｔのリン酸化を、両方の時点で評価した。
【００６４】
〈網膜電位図〉
実験の各月に、網膜電位図（ＥＲＧ）分析を、３つのグループからのラット上で行った。網膜電位図分析を、網膜の電気活性における変化を評価するために、及び薬物効果の基準として評価するために行った。網膜電位図分析のため、ラットを一晩暗闇に適応させた。翌朝、ラットに、ケタミン（０．６ｍｌ／ｋｇの体重）及びキシラジン（０．３７５ｍｌ／ｋｇの体重）カクテルの腹膜腔内注入を使用して麻酔をかけた。各々の目の瞳を、１％のトロピカミド溶液（Ａｌｃｏｎ）を使用して十分に拡大した。目を保護し、良い電気的な結合を維持するのを支援するために、１滴のメチルセルロース溶液を、各々の目に加えた（Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ；Ａｌｌｅｒｇａｎ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）。体温を、水性の熱パッドで３７℃に維持した。網膜電位図反応を、白金線の角膜電極、前頭照合電極、及び尾の外側電極を同時に使用して、両眼から記録した。網膜電位図刺激をＤｉａｇｎｏｓｙｓ  ＬＬＣシステムによって送達した。検査されたすべての動物は、網膜電位図記録セッション（ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎｓ）の後に麻酔から回復した。肉眼的白内障（ｇｒｏｓｓ  ｃａｔａｒａｃｔ）を有する動物は、網膜電位図分析に使用しなかった。
【００６５】
網膜電位図反応を、簡潔な（４ｍｓ）白色のＬＥＤに応じて、次に、暗い刺激用の２．１秒の間隔及びより明るい刺激のための３５秒の間隔で送達されたキセノンアークランプから報告した。刺激強度の範囲は、ｂ波の振幅の分析に関して−４．０から１．０  ｌｏｇ  ｃｄ＊ｓ／ｍ２までに及んだ。網膜電位図波形を、０．３−５００Ｈｚの帯域幅により記録し、デジタル収集システム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ）によって２ｋＨｚでサンプリングし、ＭａｔＬａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ）を使用して分析した。ａ−波及びｂ−波のための強度反応関数のプロットを、形態Ｒ（Ｉ）／Ｒｍａｘ＝Ｉｋ／Ｉｋ＋ｋｎの双曲線の誇張した（Ｎａｋａ−Ｒｕｓｈｔｏｎ）機能に適合し、ここで、Ｒはフラッシュ強度Ｉの反応幅であり、Ｒｍａｘは誘発されることができる最大の反応の幅であり；及びＫは、最大の半分の反応を喚起する強度であった。
【００６６】
振動電位の評価のため、刺激を３  ｌｏｇ（ｃｄ＊ｓ／ｍ２）で投与した。振動電位のためのデータ分析を、６０−３００Ｈｚで設定されたデジタルバンドパスフィルターを有するＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して得て、４つの小波のピーク小波を、トラフからピークまで測定した。（３−４）。統計学を、２、６、及び８か月での各々の処置グループのａ−及びｂ−波の平均ＳＤ振幅上で行った。
【００６７】
〈トリプシンにより消化された網膜の血管の調製〉
無細胞の毛細管の計算のため、対照、糖尿病、及び糖尿病＋２の目からの網膜を使用した。目を摘出し、５日間、１０％の緩衝ホルマリンに入れた。網膜を、２時間、３７℃で０．２Ｍのフッ化ナトリウムを含む、３％の未精製のトリプシン溶液（Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  ２５０，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）において解剖した（５）。神経の網膜をそっと払いのけ、残存する網膜の血管ツリー（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｒｅｅ）を、スライドガラス上で乾燥した。
【００６８】
〈無細胞の毛細管の定量化〉
一旦分離された網膜の血管ツリーをスライドガラス上で乾燥して、スライドをヘマトキシリン−過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆで染色した。退化した（無細胞の）毛細管を、網膜のまわりで均一に間隔を置いた６乃至７の領域における中央の網膜において数えた。退化した毛細管を、それらの長さに沿っていかなる場所にも核を有さない毛細管サイズの管であると同定した。それらの平均直径が、周りを囲む健康な毛細管で見出された直径の少なくとも２０％であった場合のみ、退化した毛細管を数えた（６−７）。
【００６９】
網膜の菲薄化及び神経細胞層のホルマリン固定パラフィン切片の細胞の欠失を評価し、網膜の厚さの光顕微鏡検査及び地形測定用のトルイジンブルーで染色した（８）。写真を、４００ｘにて網膜における４つの部位（視神経及び中央の網膜の両側）にて撮った。網膜の神経細胞層（ＧＣＬ）中の核を、各々の写真の１００ｍのセクションにおいて数え、内部の網膜（内部の核層の上部から内部の制限膜まで）の厚さを、Ｑｃａｐｔｕｒｅソフトウェア（ＱＩｍａｇｉｎｇ，  Ｂｕｒｂａｙ，  ＢＣ，  カナダ）を有するＮｉｋｏｎ  Ｂｉｏｐｈｏｔ光学顕微鏡に付けられたＲｅｔｉｇａカメラを使用して評価した。神経細胞層中の細胞の網膜の厚さ及び数を、ＯｐｅｎＬａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）を使用して測定した。
【００７０】
〈タンパク質分析〉
各々の動物からの他の目を、炎症性のマーカー及びインスリン受容体シグナル伝達のためのタンパク質分析に使用した。ウェスタンブロッティングを記載されるように行った（９）。使用される抗体は、合計のインスリン受容体ベータ（１：５００，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）、リン酸化されたインスリン受容体ベータ（Ｔｙｒ  １１５０／１１５１，  １：５００，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、合計のＡｋｔ（１：５００，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）及びリン酸化されたＡｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３，  １：５００，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）であった。データの分析のため、平均デンシトメトリー値をＫｏｄａｋ  ２．０ソフトウェアを使用して得た。リン酸化されたタンパク質の比率を、合計のタンパク質のレベルと比較した。
【００７１】
〈ＥＬＩＳＡ分析〉
ＴＮＦ濃度（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）及び切断されたカスパーゼ３のレベル（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）を測定するために、ＥＬＩＳＡ分析を、光電密度番号を使用することができるように、等しいタンパク質を切断されたカスパーゼ３  ＥＬＩＳＡに充填することを除き、製造業者の指示に従って行った。
【００７２】
〈細胞〉
ヒト網膜の内皮細胞（ＨＲＥＣ）をＣｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｋｉｒｋｌａｎｄ，  ＷＡ）  から購入し、基本培地（５ｍＭのグルコース）又は成長培地（２５ｍＭのグルコース）のいずれかで成長させた。両方の培地を、１０％のＦＢＳ及び抗生物質で補う。実験の前日、細胞を１８−２４時間、血清不足にする。ラットＭｕｅｌｌｅｒ細胞（ｒＭＣ−１）を、５ｍＭのグルコース又は２５ｍＭグルコースによりＤＭＥＭ培地で育てた。培地を１０％のＦＢＳ及び抗生物質で補った。細胞を１８−２４時間、すべての実験前に血清不足にした。
【００７３】
〈統計学〉
統計学を、事後分析（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ）のためのＤｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔと共に、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析を使用して、対照、糖尿病、及び糖尿病＋処置（Ｄｉａｂ＋化合物２）を比較するために行った。Ｐ＜０．０５を、有意なものとして得た。
【００７４】
〈化合物２のインビボでの効果〉
〈化合物２は、体重又はグルコースレベルに影響を及ぼさなかった〉
１ｍＭの化合物２の毎日の投与は、体重又は血中グルコースレベルに影響を与えなかった（表１）。化合物２の血漿濃度は、４５分にわたり、約１００ｎｇ／ｍｌから約６ｎｇ／ｍｌまで減少した。体重と血中グルコースレベルは、２及び８か月の時点の間の変化をほとんど示さなかった。また、化合物２での処置後に、血圧又は眼内圧への観察された効果はなかった（表１）。正常なインスリンレベルを、対照網膜で測定し、一方、糖尿病及び糖尿病の＋化合物２の動物は、全くかほとんどインスリンを有さなかった。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
〈化合物２はＰＫＡ活性を増加させた〉
薬物投与のための適量及び時間枠を測定するために、２か月間ＳＴＺで処置されたラットを使用し、各々の目に対する化合物２の４滴の異なる投与量により、４日間処置した。最初の研究において、調べられた適量範囲は、１ｍＭ乃至２０ｍＭの間にあり、１日につき１回与えられた（図１）。β−アドレナリン受容体が通常ＰＫＡを活性化するため、化合物２が網膜に達し、正常な細胞の反応を誘発していたバイオマーカーとして、ＰＫＡの測定を使用した。
【００７７】
毎日１回与えられる１ｍＭの局所投薬量は、他の投与される投与量と比較して、ＰＫＡ活性の最も高い増加を示した（図１Ａ  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ，  Ｎ＝６）。１ｍＭの濃度での処置を、すべての後の実験で使用した。
【００７８】
化合物２は、８か月にわたり網膜電位図におけるＢ−波及び振動電位の振幅の損失を阻害した（図２Ａ−２Ｂ）。視覚機能の網膜電位図分析を、対照、糖尿病、及び糖尿病＋点眼薬で処置された動物に毎月行った。ａ−波（図２Ｃ）、ｂ−波（図２Ｄ）及び振動電位（図２Ｅ）の振幅を、糖尿病の２か月以内に糖尿病の動物で実質的に減少させ、それを８か月の期間にわたり維持した。対照ラットと化合物２の処置を受ける糖尿病のラットとの間のＥＲＧ振幅において、違いはほとんど観察されなかった。これらの結果は、点眼薬が、ラットの糖尿病にもかかわらず、網膜の電気活性を維持することに効果的であったことを示唆する。
【００７９】
〈内部の網膜の厚さ及び中央の網膜の神経細胞層における細胞数を、点眼薬で処置した糖尿病のラットにおいて維持した〉
視神経（中央の網膜）の近くの網膜の厚さを、対照と比較される糖尿病のラットにおいて著しく減少した（図３Ａ−３Ｂ）。内部の網膜の厚さのこの損失を、点眼薬処置を受ける糖尿病のラットにおいて予防した。同様に、糖尿病のラットは、中央の網膜の領域で指摘された細胞をあまり有さず（図３Ｂ）、それを化合物２で処置された動物において予防した。神経細胞層中の減少した細胞数は、おそらく網膜の神経節細胞及び置換されたアマクリン細胞の両方である。網膜の厚さ又は細胞数の変化は、周辺の網膜（視神経から離れた）で示されなかった。
【００８０】
〈化合物２での治療は、網膜の毛細管の退化を予防した〉
退化した毛細管の数は、糖尿病のラットの網膜における血管の変化の重要な発見である（６−７）。１ｍＭの化合物２での処置は、糖尿病の動物において退化した毛細管の数を、糖尿病の８か月後の対照動物に類似しているレベルにまで著しく減らした（図４Ａ−４Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｃｔｒｌ  ａｎｄ  ｄｉａｂ＋２）。
【００８１】
〈ＴＮＦαレベルは、化合物２で処置した動物において著しく減少した〉
インビトロで観察されたＴＮＦαレベルにおける著しい減少のため、レベルを、化合物２が糖尿病のラットにおける炎症性のマーカーレベルを減少させることができたことを確実にするためにも評価した。データは、ＴＮＦαの処置タンパク質レベルの２カ月後、糖尿病のラットのみで著しく上昇したことを示す。一方、化合物２で処置されたラットにおける同じレベルは、対照のレベルに類似した（図５Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝６）。同様に、ＴＮＦαレベルを、糖尿病のラットのみで著しく上昇した一方で、処置されたラットが、化合物２での処置の８か月後にＣｔｒｌラットに類似するレベルを示した（図５Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｃｔｒｌ，  Ｎ＝６）。これらの結果は、β−アドレナリン受容体アゴニストが、培養及び生理学的に関連するモデルにおける炎症性マーカーレベルを減少できることを示唆する。
【００８２】
〈化合物２は、糖尿病のラットのインスリン受容体チロシンリン酸化の損失を阻害した〉
インスリン受容体ベータの刺激が、主にラットにおけるチロシン１１５０／１１５１残基に生じ（Ｐｅｔｒｏｚｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４）、インスリン受容体シグナル伝達が、網膜に生じる（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６；  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１０）ことが報告されてきた。化合物２での処置は、糖尿病のラットのみと比べて、糖尿病の２カ月後（図６Ａ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ，  ｃｏｎｔｒｏｌ）、対照動物に類似するレベルで、インスリン受容体ベータチロシンリン酸化を維持した。インスリン受容体ベータチロシンリン酸化も、成分２で処置されたラットにおける糖尿病の８か月後に維持した（図６Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｃｏｎｔｒｏｌ）。Ａｋｔリン酸化が細胞生存を示すため、合計のＡｋｔ及びリン酸化されたＡｋｔの両方のタンパク質レベルを、各々の処置グループからラットの網膜の溶解産物において分析した。１ｍＭの化合物２での毎日の処置は、対照のレベルに類似するレベルでリン酸化されたＡｋｔの比率を維持し、一方で糖尿病は、Ａｋｔリン酸化を著しく減少した（図６Ｃ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｃｏｎｔｒｏｌ）。８か月後に対照のラットと比較した時、タンパク質レベルは、糖尿病のラットのみで著しく減少した（図６Ｄ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂ＋２，  Ｎ＝５）。同様に、図６Ｅ−６Ｈは、ホスホ−ＡＫＴ対合計のＡＫＴの比率での化合物２の効果を示す。
【００８３】
〈点眼薬で処置された動物における、減少した切断されたカスパーゼ３のレベル〉
中央の網膜において、処置された動物における糖尿病により誘発された細胞損失における減少が生じたため、アポトーシスは、おそらく処置後に減少した。Ａｋｔリン酸化を、糖尿病のラットに対する点眼薬処置により維持し、アポトーシスが減少させることを再び示唆する。実際、糖尿病は、網膜の溶解産物における切断されたカスパーゼ３のレベルの著しい増加をもたらし（図７Ａ−７Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｃｏｎｔｒｏｌ）、糖尿病は、化合物２の点眼での処置後に減少した（図７Ａ−７Ｂ）。これらの結果は、糖尿病が、カスパーゼ３経路を介していくつかの細胞においてアポトーシスをもたらすことを示唆し、それはβ−アドレナリン受容体アゴニストによって阻害され得る。
【００８４】
上述の化合物２を伴う細胞培養作業に基づいて、糖尿病性非増殖性網膜症に関する、インビボでのβ−アドレナリン受容体アゴニストを検査するための強い証拠が存在する。それ故、８か月間毎日１回与えられる５０ｍＭの化合物４９ｂの点眼の試験を始めた。化合物２での糖尿病のラットの処置が、疾患に対する急性反応として糖尿病のげっ歯類に生じることができる、網膜の厚さ及び神経細胞層の細胞のアポトーシスの損失を予防するのに効果的であったことが見出された。
【００８５】
糖尿病網膜症に共通の重要な血管の結果のうちの１つは、糖尿病の約６カ月目に生じる、退化した毛細管の形成である［２３、２４］。１ｍＭの化合物２での処置は、退化した毛細管の数を対照に類似するレベルにまで著しく減少することができた。糖尿病の減少後の中央の網膜における細胞の損失に加えて、点眼薬治療はまた、処置レジメンの全体にわたってＴＮＦα濃度を減少させるのに効果的であったが、それは疾患の初期の時間枠において最も効果的である。
【００８６】
糖尿病は、インスリン受容体リン酸化の著しい減少をもたらし、それはインビボでの化合物２の点眼によって増加された。これらの実験のため、１ｍＭの化合物２での処置後の２及び８か月での糖尿病のラットからの網膜溶解産物を使用した。化合物２の点眼の研究において、３つのグループすべての合計の振幅は８か月の期間の間減退したが、ＥＲＧを全時間枠上の点眼薬処置により改善した。
【００８７】
糖尿病のラットにおける網膜の厚さ及び細胞数の損失の予防に関する研究と同様、化合物２は、網膜における糖尿病様変化（ｄｉａｂｅｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｃｈａｎｇｅｓ）を逆転することができる。図２Ｄ−２Ｆで言及されるように、２か月間化合物２での治療を受ける６か月の糖尿病のラットが、網膜の機能を改善した。これは、糖尿病のラットのみに対する網膜の厚さのおよそ５０％の増加に関連し、及び神経細胞層の細胞の損失が無かったことに関連した。本発明は、ＢＡＲアゴニストが糖尿病から損傷を機能的にまた組織学的に逆転できることを示唆する。
【００８８】
イソプロテレノールは、高血糖の疾病で培養された網膜の内皮細胞（ＲＥＣ）及びＭｕｅｌｌｅｒ細胞で切断されたカスパーゼ３レベルを減少させ（Ｓｔｅｉｎｌｅ，  ２００５；  Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｌｅ，  ２００７）、心臓血管の変化を誘発することができる。それ故、β−アドレナリン受容体アゴニスト化合物２が発達した。カスパーゼ３は、そのアポトーシス促進性のタンパク質開裂であり、活性化は細胞死を示す（Ｓａｌｖｅｓｅｎ，  ２００２）。５０ｎＭの濃度での化合物２による処置は、２４時間の時点でのＭｕｅｌｌｅｒ細胞（図１２Ａ−１２Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＮＴ−ＨＧ）において、及び３０分の時点でのＲＥＣにおいて（図１３Ａ−１３Ｂ，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  Ｎｔ−ＨＧ）、カスパーゼ３レベルを著しく減少させた。これらの結果は、化合物２がインビトロでの細胞アポトーシスの重要なマーカーを減少できることを示す。
【００８９】
〈化合物２のインビトロ及びインビボでの効果〉
〈化合物２は、高血糖症で培養されたＲＥＣとＭｕｅｌｌｅｒ細胞におけるアポトーシス及びＴＮＦα活性化を予防する〉
β−アドレナリン受容体様特性を有する化合物が発達し、それは本明細書では化合物２と称され、その化学名は、４−［１−ヒドロキシ−２−（１−エチルアミノ−３−，４−，５−トリメトキシフェニル）エチル］ベンゼン−１，２−ジオール塩酸塩であり、その化学構造は図８において示され、イソプロテレノールと比較される。
【００９０】
化合物２がカスパーゼ３の増加した開裂及びＴＮＦα活性を予防する能力を、高いグルコースで培養された細胞において調べた。アポトーシスの阻害及び炎症性メディエーターの活性化は、糖尿病網膜症に関連する神経細胞及び血管の病状の両方を著しく予防する（７、１１−１３）。Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞において、アポトーシスの遮断は２４時間かかり、一方で細胞が１０μＭのイソプロテレノールで処置された時、ＴＮＦα活性の阻害が１時間以内に、非常に速く生じた。化合物２で処置されたＭｕｅｌｌｅｒ細胞のアポトーシス及びＴＮＦα活性の遮断のための非常に類似した時間的経過を見出したが、それは、著しくより低い投与量（５０ｎＭの化合物２対１０μＭのイソプロテレノール）で見出された。化合物２は、処置されていない細胞と比較して、ＴＮＦαレベルを１９％減少し、カスパーゼ３を５５％減少した（図９Ａ−９Ｂ）。
【００９１】
Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞における結果と同様、化合物２は、２５ｍＭのグルコースで培養された網膜の内皮細胞（ＲＥＣ）中のカスパーゼ３の開裂及びＴＮＦα活性を著しく減少させた。５０ｎＭの化合物２での処置は、処置されていない対照に対して、カスパーゼ３レベルを５４％著しく減少し、及びＴＮＦαレベルを２３％著しく減少した（図１０Ａ−１０Ｂ）。イソプロテレノールは、インビトロで１０μＭでの網膜の内皮細胞においてＴＮＦαを著しく減少させなかった。
【００９２】
図１１は、１ｍＭの化合物２で毎日処置されたＩ型糖尿病のラットにおける効果を示す。未処置の糖尿病のラットと比較して、左心室に違いはなかった。染色は、糖尿病において増加されるコラーゲン強度のためのものである。
【００９３】
〈化合物２は、１０μＭ未満の投与量でＴＮＦαレベル及びカスパーゼ３の開裂を減少した〉
両方のグルコース状態のヒト網膜の内皮細胞（ＨＲＥＣ）及びラットＭｕｅｌｌｅｒ細胞（ｒＭＣ−１）を、化合物２の１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、及び１０μＭの投与量で、化合物２により処置した。各々の型の細胞を、モル浸透圧濃度における変化のために制御するＬ−グルコースを含む培地で成長させた。１０μＭのイソプロテレノールも、陽性対照として各々の状態のために使用した。Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞を１時間及び２４時間処置し、一方でＨＲＥＣを３０及び６０分間処置した。
【００９４】
処置の後、細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む溶解緩衝液に収集した。ＴＮＦα、切断されたカスパーゼ３、及びＰＫＡのためのＥＬＩＳＡ分析を、製造業者の指示に従って行った。データを、非処置の細胞及び様々な投与量での細胞に対して比較する。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を、二次的な分析のためのＤｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて行う。化合物２は、１０μＭ未満の投与量（イソプロテレノールに必要とされる）でのＴＮＦαレベル及びカスパーゼ３の開裂を著しく減少するはずである。ＴＮＦα及びカスパーゼ３のレベルを減少させる投与量はまた、ＰＫＡ活性を増加させる。
【００９５】
〈化合物２は、ＰＫＡ活性化によってＴＮＦα及びカスパーゼ３のレベルを減少させる〉
ＨＲＥＣ及びＭｕｅｌｌｅｒ細胞を、実施例１に記載されるように、培養した。血清不足の後、細胞を１μＭのＫＴ５７２０で処置し、３０分間ＰＫＡ活性を阻害した。その後細胞を、Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞に関して１及び２４時間、及びＨＲＥＣに関して３０及び６０分間、適量の化合物２で処置した。刺激の後の適切な時間に、細胞を収集し、製造業者の指示に従って、ＴＮＦα及びカスパーゼ３のＥＬＩＳＡ分析のために処理した。ＰＫＡ  ＥＬＩＳＡをまた、ＰＫＡが適切に阻害されたことを確実にするために行った。処置された細胞に加えて、いくつかの細胞は血清不足となり、対照として処置を受けなかった。追加の培養皿（ｄｉｓｈｅｓ）に入った各々の細胞型を、ＫＴ５７２０単独で処置し、ＰＫＡインヒビターだけが細胞に効果がなかったことを確実にし、それはデータを混乱する。データを、非処置の細胞と様々な投与量での細胞に対して比較した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を、二次的な分析のためのＤｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて行った。Ｐ＜０．０５を、有意なものとして許容した。
【００９６】
〈糖尿病のラットにおける網膜の損傷に対してインビボで効果的な化合物２〉
ラットを、ＳＴＺ注入により糖尿病にした。ＳＴＺ注入の１週間後、毎日の局所用の化合物２を１ｍＭで与えた。ＥＲＧを６週間後に測定した。１ｍＭで、化合物２は、糖尿病において生じたＢ−波の振幅の損失を阻害した。
【００９７】
〈化合物２の投与後の網膜における活性化されたＰＫＡレベル〉
化合物２のその局所送達は：１）網膜に達し、結膜送達又は全身（静脈内）送達よりも低い投与量でＰＫＡを活性化し、２）増加した心臓血管の肥大及び生理的な血圧などの、より少ない負側効果を作り出すことが予期された。
【００９８】
Ｂ／ＰＫを、ラットへの静脈内投与によって特徴づけた。薬物投与の後、血液サンプル（２−３００μＬ）を、Ｋ３−ＥＤＴＡ抗凝結試料採取管（ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｔｕｂｅｓ）へ投薬した後に一定間隔で（５、１５、３０、４５分及び１、２、４、８、１６及び２４時間）、頚静脈カテーテルから引き抜いた。血漿を遠心分離によって得て、分析まで−８０℃で保管した。心臓、肺及び脾臓を、化合物２の組織分布を測定するために採取した。蓄積した尿のサンプルを２４時間後の投薬にわたって収集し、分析まで−８０℃で保管した。
【００９９】
Ｂ／ＰＫを、ラットへの局所投与によって特徴付けた。薬物投与の後、目を摘出し、生理食塩水、及び１８ゲージの注射針を使用して硝子体腔の内部の領域から吸引された硝子体液により潅漑した。血液サンプルを、局所投与後の全身的な曝露の程度を測定するために同時に得た。硝子体液と血液サンプルを、投薬の後に一定間隔で得た。時点を、化合物２の静脈内投与の後に得られる濃縮時間特性に基づいて測定した。
【０１００】
データ分析のため、Ｂ／ＰＫパラメータを、標準の仕切られていない分析によって得られた血漿、硝子体液、尿及び糞便濃度のデータから導き出した。末端の半減期を、λｚで割られたｌｎ  ２の比率、終末期中の自然対数濃度対時間プロファイルの線形回帰の勾配の負数として測定した。全身的及び眼の曝露を、台形法を使用して、血漿又は眼の血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として測定した。化合物２の濃度の測定及び代謝物のプロファイリングを、記載された方法論に基づき、有効になったＬＣ／ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して実行する（１４−１５）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステム（Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）、ターボイオンスプレーを装備したＡＰＩ−４０００  Ｑ  Ｔｒａｐタンデム質量分析計（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、及びＨＴＣ−ＰＡＬオートサンプラー（Ｌｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｒｂｏｒｏ，  ＮＣ，  ＵＳＡ）を含む。
【０１０１】
〈化合物２はインスリン受容体シグナル伝達阻害を減少した〉
ラットＭｕｅｌｌｅｒ細胞（ｒＭＣ−１）を、正常なグルコース（低度、５ｍＭ）、糖尿病レベルのグルコース（中度、１５ｍＭ）及び非常に高いグルコース（高度、２５ｍＭ）の状態で育てられたＤＭＥＭ培地において培養した。培地を、１０％のＦＢＳ及び抗生物質で補った。５枚の培養皿に入った各々の型の細胞を、低度、中度及び高度のグルコースのみにおいて培養し、非処置の対照として機能する。各々のグルコースレベル及び各々の処置での５枚の皿を、モル浸透圧濃度に関する対照としてＬ−グルコースを使用して、各々の時点で使用した。各々のグルコース状態の５枚の培養皿もまた、陽性対照として機能する１０ｎＭのインスリンで処置した。以下の処置を、ｒＭＣ−１細胞及びすべての３つのグルコース状態の調整培地において評価する。
【０１０２】
化合物２はβ−アドレナリン受容体を刺激する。化合物２が単独で、インスリン受容体チロシンのみのリン酸化を増加するかどうかを測定した。５枚の培養皿に入った各々の細胞型を、３０分、１、２、６及び１２時間にて、５０ｎＭの化合物２（又は異なる場合は適量）を使用して評価した。細胞を適切な時間に化合物２で処置した後、細胞を、ホスファターゼ及びプロテアーゼのインヒビターを含む溶解緩衝液で処置した。タンパク質アッセイの後、サンプルを、リン酸化したインスリン受容体（Ｔｙｒ  １１５０／１１５１）、リン酸化したＥＲＫ／１２（Ｔｙｒ  ４４／４２）、Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）、及びリン酸化したＰＩ３Ｋ（ｐ８５Ｔｙｒ４５８、ｐ５５Ｔｙｒ１９９）に関するウェスタンブロッティングによって検査した。各々のタンパク質の合計のタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を、リン酸化されたタンパク質の合計のタンパクに対する比率を測定するために使用した。
【０１０３】
インスリン受容体及び下流の中間物の増加したチロシンリン酸化を誘発するために、化合物２がＰＫＡを活性化するかどうかも測定した。ｒＭＣ−１細胞を、上述の３つのグルコース状態で培養した。血清不足の後、細胞を、１μＭのＫＴ５７２０、特異的なＰＫＡインヒビターにより３０分間処置した。ＫＴ５７２０での処置の３０分後、５０ｎＭの化合物２を、さらに６０分又は１８０分間加えた。いくつかの細胞は、ＫＴ５７２０での処置のみを受け、このインヒビターでの処置がインスリン受容体リン酸化に効果がなかったことを確実にした。Ｌ−グルコース及び非処置の対照も使用した。加えて、上述の部位特異的変異誘発を処置前に行った。一旦収集されると、分析を上述のように行った。加えて、ＰＫＡ  ＥＬＩＳＡを行い、ＰＫＡ活性が存在しなかったことを確実にした。
【０１０４】
〈ＴＮＦαは、インスリン受容体リン酸化の化合物２の調整における主要な中間体であった〉
ラットＭｕｅｌｌｅｒ細胞（ｒＭＣ−１）をこれらの実験のために使用し、上述の３つのグルコース状態で培養した。すべての処置のため、各々の細胞型の５枚の培養皿を、モル浸透圧濃度に関してＬ−グルコース対照を使用する適切な投薬及び時点にて使用した。各々の実験に関して５枚の培養皿を、非処置の対照として使用した。血清不足の後、多くの処置を培地に適用した。
【０１０５】
〈ＴＮＦα刺激のみと化合物２によるＴＮＦα刺激との比較〉
ＴＮＦαがＩＲＳ−１によってインスリンシグナル伝達を阻害するかどうか評価し、ＴＮＦα活性におけるＰＫＡの役割を決定するために、ＩＲＳ−１上のＳｅｒ  ３０７リン酸化、インスリン受容体チロシンリン酸化、及びセリン４７３上のＡｋｔリン酸化を測定した。ｒＭＣ−１細胞を、上述のようなグルコース状態のための同じプロトコルに従って成長させた。一旦細胞が不足すると、５枚の培養皿を３０分間、５ｎｇ／ｍｌでＴＮＦαのみで処置した；５枚の皿を３０分間ＴＮＦαで処置し、その後６０分間５０ｎＭの化合物２で処置し、及び５枚の皿を３０分間ＴＮＦα及びＫＴ５７２０で処置し、その後６０分間化合物２で処置した。処置の後、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）の評価については除き、細胞を上述のように処理し、これがインスリンシグナル伝達のＴＮＦα遮断のための重要な部位であるように、セリン３０７上に焦点を当てた（１６）。セリン３０７をＩＲＳ−１上でアラニンに転換し、ＴＮＦαが網膜のＭｕｅｌｌｅｒ細胞のこの部位を通じてインスリン受容体反応性を調節するかどうか測定するために、部位特異的変異誘発を行った。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡ分析を、ＴＮＦα活性及び切断されたカスパーゼ３を測定するために行った。ＴＵＮＥＬ標識化を、アポトーシスの細胞を局在化するために行った。インスリンレベルを細胞及び培地で測定し、ＴＮＦα刺激がインスリン生成又は分泌を調節するかどうかを測定した。すべての処置のため、平均デンシトメトリー値を、Ｋｏｄａｋ  ２．０ソフトウェアを使用して得た。リン酸化されたタンパク質の比率を、合計のタンパク質のレベルと比較した。最低４つの独立した実験を、各々の処置グループに関して行った。ＥＬＩＳＡデータの分析を、アッセイにおいて生成された標準曲線に基づいた製造業者の推奨を使用して行った。統計分析を、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析を使用して行い、その後プリズムソフトウェアを使用してすべてのカラムに関するＤｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔを行った。分析を、処置グループと非処置のグループを比較するために行った。Ｐ＜０．０５を、有意なものとして許容した。
【０１０７】
〈化合物２は、糖尿病網膜症に共通の長期的な神経細胞及び血管の変化を予防及び／又は逆転した〉
げっ歯類の増殖前糖尿病網膜症において生じる網膜の変化を予防して逆転する、化合物２の能力が示された。３０の対照ラット、３０の糖尿病ラット、及び化合物２に関する３０のラットを使用した。０日目に、６０のラット（３０の糖尿病、３０の化合物２）に６０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを注入し、それらの膵臓のβ細胞によってインスリン生成を除去した。ストレプトゾトシン注入の２日後に、グルコース測定を、２５０ｍｇ／ｄｌより高いグルコースレベルとして許容されている糖尿病を伴う、すべてのラット上で得た。最初のグルコーススクリーニングの日の始めに、１ｍＭの化合物２の点眼薬治療を３０のラット上で始める。ストレプトゾトシンを受けなかった３０のラットは、対照のラットとして機能する。グルコースレベルを隔週で測定した。
【０１０８】
ラットに関する分析を、急性の変化（糖尿病の８週間、４５のラット）及び慢性の変化（糖尿病の８か月、４５のラット）に関して行った。網膜に関するすべての測定に加えて、心臓の組織切片を８週目及び８か月目に得て、薬物による心室の肥大がないことを確実にした。ミオシンＬ鎖に関するウェスタンブロット、心臓血管の肥大の代用マーカーも行った。毎月、すべてのラットは、光学式干渉局所解剖学（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＯＣＴ）を使用して、視覚機能、網膜電位図（ＥＲＧ）及び生網膜（ｌｉｖｅ  ｒｅｔｉｎａｌ）の画像化の２つの分析を受ける。網膜の厚さ及び生網膜の画像化を、げっ歯類ＯＣＴを使用して評価した。この技術は、同じ動物の複数の試験のための網膜の各々の層の非侵襲性の視覚化を可能にする。
【０１０９】
上記で測定された化合物２の適量及び時間経過を使用した。３０の対照ラット、３０の糖尿病のラット、及び化合物２に関する３０のラット。０日目に、６０のラット（３０の糖尿病、３０の化合物２）に６０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを注入し、それらの膵臓のβ細胞によってインスリン生成を除去した。ストレプトゾトシン注入の２日後に、グルコース測定を、２５０ｍｇ／ｄｌより高いグルコースレベルとして許容されている糖尿病を伴う、すべてのラット上で得た。最初のグルコーススクリーニングの日の始めに、１ｍＭの化合物２の点眼薬治療を３０のラット上で始める。ストレプトゾトシンを受けなかった３０のラットは、対照のラットとして機能する。グルコースレベルを隔週で測定した。ラットに関する分析を、急性の変化（糖尿病の８週間、４５のラット）及び慢性の変化（糖尿病の８か月、４５のラット）に関して行った。網膜に関するすべての測定に加えて、心臓の組織切片を８週目及び８か月目に得て、薬物による心室の肥大が無かったことを確実にした。心臓血管の肥大の代用マーカーとしてのミオシンＬ鎖を、ウェスタンブロットを使用して検査した。毎月、全てのラットを視覚機能に関して試験した：網膜電位図（ＥＲＧ）及び生網膜の画像化を、光学式干渉局所解剖学（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＯＣＴ）を使用して行った。ＥＲＧ分析のため、実験を上記方法（２）に従って行った。動物がＥＲＧ分析のため眠っていた間、血圧と脈を監視し、潜在的な負の心血管系事象を検出した。イソプロテレノールの５０ｍＭの局所用投与量では、これらの事象は観察されず、そのため、それらは化合物２を使用するときには恐らく起こらなかった。
【０１１０】
網膜の厚さ及び生網膜の画像化を、げっ歯類ＯＣＴを使用して評価した。網膜の各々の層を、非侵襲性の方法で、同じ動物上で複数回検査し、実験の間にわたり特定範囲で変化することを測定した。このデータを、網膜の厚さの組織学の測定と組み合わせた。光学顕微鏡検査を、急性期にしばしば生じる神経細胞の変化の組織学的検査に使用した。ホルマリンにより固定されたパラフィン切片を、網膜の厚さの光学顕微鏡検査及び形態測定学用のトルイジンブルーで染色した。写真を、４００ｘで、網膜における４つの位置（視神経及び中央の網膜の両側）で撮った。網膜の神経細胞層（ＧＣＬ）における核を、各々の写真の１００μｍの切片で数えた。内顆粒層の上部から内境界膜までの内部の網膜の厚さを、Ｑｃａｐｔｕｒｅソフトウェア（ＱＩｍａｇｉｎｇ，  Ｂｕｒｂａｙ，  ＢＣ，  Ｃａｎａｄａ）を備えるＮｉｋｏｎ  Ｂｉｏｐｈｏｔ光学顕微鏡に付けられたＲｅｔｉｇａカメラを使用して評価した。網膜の厚さ及び網膜の神経細胞層中の細胞の数を、ＯｐｅｎＬａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）を使用して測定した。対応の無いｔ検定を、有意なものとして許容されるＰ＜０．０５を伴う、対照、糖尿病及び糖尿病＋点眼薬処置された動物からのデータを比較するために使用した。
【０１１１】
網膜の血管の分析は、公表された方法に基づいた（６−７）。炎症性の分析のため、全体の網膜の溶解産物を、プロテアーゼ及びホスファターゼのインヒビターを含む溶解緩衝液へ収集した。ＢＣＡタンパク質アッセイを、溶解産物のタンパク質含有量を測定するために行った。Ｌｕｍｉｎｅｘ多重サイトカイン分析を、化合物２がインビボでの主要な炎症性メディエーターのタンパク質活性を著しく減少できるかどうか評価するために行った。インスリン受容体シグナル経路を分析するため、対照、糖尿病、及び糖尿病＋化合物２の動物からの網膜の溶解産物を収集して評価した。
【０１１２】
〈化合物２は、６か月齢の未処置の誘発された糖尿病による網膜の損傷を逆転した〉
９０のラットを使用した（糖尿病のない３０の点眼薬、糖尿病のみを有する３０、６か月の未処置の糖尿病の後の局所用の化合物２の３０）。ストレプトゾトシンを、ラットにおける糖尿病を誘発するために、０日目及び６０日目に６０ｍｇ／ｋｇの投与量において使用した。実験的糖尿病の進行のための基準（ｃｒｉｔｅｒｉｕｍ）は、ストレプトゾトシンでの処置の２日後に２５０ｍｇ／ｄｌより高い血液グルコースレベルであった。動物の最後のグループを、１ｍＭで化合物２を使用する局所用の点眼薬治療にさらした。残りの３０のラットは、純粋な糖尿病の対照として機能した。記載されるような同じ測定を使用する、急性（点眼の開始の８週後、４５のラット）、及び慢性の変化（点眼薬治療の開始の８カ月後、４５のラット）。
【０１１３】
〈化合物４は、高血糖症において培養されたＲＥＣ及びＭｕｅｌｌｅｒ細胞内のアポトーシス及びＴＮＦα活性化を予防した〉
図８は、化合物４、５−（１−ヒドロキシ−２−［２−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−エチルアミノ］−エチル）−ベンゼン−１，３−ジオール塩酸塩の化学構造を表わす。Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞及び網膜の内皮細胞（ＲＥＣ）細胞を、実施例３における化合物２に関するプロトコルにより、５０ｎＭの化合物４で培養及び処置した。ＥＬＩＳＡデータは、化合物４がＭｕｅｌｌｅｒ細胞及びＲＥＣ細胞の中により多くのベータ−２−アドレナリン受容体活性を有することを示し、それは、恐らく心臓にあまり影響がないことを意味し、ＴＮＦαレベル及びカスパーゼ３の開裂を減少させるためにインビトロにて５０ｎＭで作用する。おそらくＭｕｅｌｌｅｒ細胞の優性のβ−アドレナリン受容体がベータ−２−アドレナリン様の受容体亜型であるため、化合物４は、Ｍｕｅｌｌｅｒ細胞の化合物２より効果的であり、より速く作用する。おそらく、網膜の内皮細胞における優性受容体である、ベータ−１−アドレナリン様受容体活性があまりないため、網膜の内皮細胞において、化合物４の投与量は、網膜の内皮細胞の反応を活性化するのにより長くかかる。
【０１１４】
〈化合物２の異性体〉
図１４Ａ−１４Ｂは、処置の１時間又は２４時間での、化合物２のＲ異性体、化合物２のＳ異性体及びラセミ化合物２の、Ｍｕｅｌｌｅｒ及び網膜の内皮細胞におけるＴＮＦアルファ濃度への効果を示す。図１５Ａ−１５Ｂは、処置の１時間又は２４時間での、化合物２のＲ異性体、化合物２のＳ異性体及びラセミ化合物２の、切断されたカスパーゼ３への効果を示す。このデータは、化合物２のＲ異性体が化合物２のＳ異性体及びラセミ化合物２より優れていることを明確に示す。以下の引用文が本明細書で引用される。
【０１１５】
１．  Ｐｈｉｐｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，  ２００７，  ４８（２）：９２７−３４．
２．  Ｊｉａｎｇ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．  Ｓｔｅｉｎｌｅ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，  ２００９．
３．  Ｆｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００７；  １６９：１９１−２００．
４．  Ｗｅｙｍｏｕｔｈ，  Ａ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｖｉｎｇｒｙｓ，  Ａ．Ｊ．，  Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，  ２００８，  ２７：１−４４．
５．  Ｋｅｒｎ，  Ｔ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｒｍａｎ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，  １９９４，  １３：８６３−８６７．
６．  Ｋｏｗｌｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２００１，  ５６：３７３−３７９．
７．  Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  １９９６，  ９７：２８８３−２８９０．
８．  Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，  ２００９，  ８８：１０１４−１０１９．
９．  Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，  ２００８，  ８７：３０−３４．
１０．  Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２００６，  ５５：１１４８−１１５６．
１１．  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，  ２００７，  ４８（１１）：５２７６−８１．
１２．  Ｊｏｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆａｓｅｂ  Ｊ，  ２００４，  １８（１２）：１４５０−１４５２．
１３．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｋ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｌｅ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，  ２００９，  ８９（４）：４４８−４５５．
１４．  Ｔｒｅｓｔｅｒ−Ｚｅｄｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００５，  ４４（１６）：６１３３−４６１３．
１５．  Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，  ２００８，  ６０９（２）：１９２−２００．
１６．  Ｂｏｕｒａ−Ｈａｌｆｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，  ２００９，  ２９６（４）：Ｅ５８１−９１．
【０１１６】
この明細書で言及された任意の特許又は公報は、当業者のレベルを示す。さらに、これらの特許及び公報は、各々の公報が具体的で引用文によって組込まれたかのような、同じ程度で本明細書における引用文により組み込まれる。当業者は、本発明が対象を実行し、それらの対象と同様に、言及された目的及び本明細書に固有の利点を得るのにかなり適していることを認識するであろう。その中の変化及び請求項の範囲によって定義されるような本発明の精神内に包含される他の使用は、当業者に生じるであろう。
【図１】
2013522195.tif 000027
【図２Ａ】
2013522195.tif 000028
【図２Ｂ】
2013522195.tif 000029
【図２Ｃ】
2013522195.tif 000030
【図２Ｄ】
2013522195.tif 000031
【図２Ｅ】
2013522195.tif 000032
【図４Ａ】
2013522195.tif 000033
【図４Ｂ】
2013522195.tif 000034
【図５Ａ】
2013522195.tif 000035
【図５Ｂ】
2013522195.tif 000036
【図７Ａ】
2013522195.tif 000037
【図７Ｂ】
2013522195.tif 000038
【図８】
2013522195.tif 000039
【図９Ａ】
2013522195.tif 000040
【図９Ｂ】
2013522195.tif 000041
【図１０Ａ】
2013522195.tif 000042
【図１０Ｂ】
2013522195.tif 000043
【図１２Ａ】
2013522195.tif 000044
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2013522195.tif 000047
【図１４】
2013522195.tif 000048
【図１５】
2013522195.tif 000049
【図３Ａ】
2013522195.tif 000050
【図３Ｂ】
2013522195.tif 000051
【図６Ａ】
2013522195.tif 000052
【図６Ｂ】
2013522195.tif 000053
【図６Ｃ】
2013522195.tif 000054
【図６Ｄ】
2013522195.tif 000055
【図６Ｅ】
2013522195.tif 000056
【図６Ｆ】
2013522195.tif 000057
【図６Ｇ】
2013522195.tif 000058
【図６Ｈ】
2013522195.tif 000059
【図１１】
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【国際調査報告】
2013522195.tif 000061
2013522195.tif 000062
2013522195.tif 000063