(57)【要約】  プロモーターに作動可能に連結された１以上のステロイド合成ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変細胞（ここで、そのステロイド生合成ノックダウン核酸はＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＴＧ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減し、その細胞は１以上の前記遺伝子の低減された発現を含んでなる）。これらの細胞は内分泌攪乱物質を同定するために有用である。よって、本開示は、さらなる態様において、内分泌攪乱物質を同定するためのスクリーニングアッセイであって、ａ）本明細書に記載される細胞を試験物質と接触させること；ｂ）少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡ若しくは酵素活性のレベルを測定することを含んでなるスクリーニングアッセイ（ここで、対照と比べたその少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡ若しくは酵素活性のレベルの変動が、その試験物質が内分泌攪乱物質であることを示す）を含む。
2013504333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変細胞（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＴＧ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減し、その細胞が１以上の前記遺伝子の低減された発現を含んでなる）。
【請求項２】
ノックダウン核酸が、ｓｉＲＮＡ核酸、ｓｈＲＮＡ核酸またはアンチセンス核酸を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ２１Ａ２を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ２１Ａ２である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１】
2013504333.tif 000045
（配列番号１）
を含んでなる、請求項３または４に記載の細胞。
【請求項６】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１１Ａ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１１Ａ１である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化２】
2013504333.tif 000046
（配列番号２）
を含んでなる、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１７Ａ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１７Ａ１である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化３】
2013504333.tif 000047
（配列番号３）
を含んでなる、請求項９または１０に記載の細胞。
【請求項１２】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１９Ａ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１９Ａ１である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化４】
2013504333.tif 000048
（配列番号４）
を含んでなる、請求項１２または１に記載の細胞。
【請求項１５】
１以上の遺伝子が、３−βＨＳＤ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
１以上の遺伝子が、３−βＨＳＤ１である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化５】
2013504333.tif 000049
（配列番号５）
を含んでなる、請求項１５または１６に記載の細胞。
【請求項１８】
１以上の遺伝子が、３−βＨＳＤ２を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１９】
１以上の遺伝子が、３−βＨＳＤ２である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化６】
2013504333.tif 000050
（配列番号６）
を含んでなる、請求項１８または１９に記載の細胞。
【請求項２１】
１以上の遺伝子が、１７−βＨＳＤ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項２２】
１以上の遺伝子が、１７−βＨＳＤ１である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化７】
2013504333.tif 000051
（配列番号７）
を含んでなる、請求項２１または２２に記載の細胞。
【請求項２４】
１以上の遺伝子が、ＳｔＡＲを含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項２５】
１以上の遺伝子が、ＳｔＡＲである、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化８】
2013504333.tif 000052
（配列番号８）
を含んでなる、請求項２４または２５に記載の細胞。
【請求項２７】
１以上の遺伝子が、ＨＭＧＲを含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項２８】
１以上の遺伝子が、ＨＭＧＲである、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化９】
2013504333.tif 000053
（配列番号９）
を含んでなる、請求項２７または２８に記載の細胞。
【請求項３０】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１１Ｂ２を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３１】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１１Ｂ２である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１０】
2013504333.tif 000054
（配列番号１０）
を含んでなる、請求項３０または３１に記載の細胞。
【請求項３３】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１１Ｂ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３４】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ１１Ｂ１である、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１１】
2013504333.tif 000055
（配列番号１１）
を含んでなる、請求項３３または３４に記載の細胞。
【請求項３６】
１以上の遺伝子が、５α−レダクターゼ２を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３７】
１以上の遺伝子が、５α−レダクターゼ２である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１２】
2013504333.tif 000056
（配列番号１２）
を含んでなる、請求項３６または３７に記載の細胞。
【請求項３９】
１以上の遺伝子が、ＳＵＬＴ１Ｅ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項４０】
１以上の遺伝子が、ＳＵＬＴ１Ｅ１である、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１３】
2013504333.tif 000057
（配列番号１３）
を含んでなる、請求項３９または４０に記載の細胞。
【請求項４２】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ３Ａ４を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項４３】
１以上の遺伝子が、ＣＹＰ３Ａ４である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１４】
2013504333.tif 000058
（配列番号１４）
を含んでなる、請求項４２または４３に記載の細胞。
【請求項４５】
１以上の遺伝子が、ＵＧＴ１Ａ１を含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項４６】
１以上の遺伝子が、ＵＧＴ１Ａ１である、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、
【化１５】
2013504333.tif 000059
（配列番号１５）
を含んでなる、請求項４５または４６に記載の細胞。
【請求項４８】
単離されたステロイド産生改変細胞が、単離されたステロイド産生Ｈ２９５Ｒ改変細胞である、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４９】
単離されたステロイド産生改変細胞が、単離されたステロイド産生Ｈ２９５、ＪＥＧ−３またはＲ２Ｃ改変細胞である、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５０】
１以上の遺伝子の発現が、対照に比べて少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％未満である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５１】
対照に比べて高レベルの少なくとも１つのステロイドを産生する、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５２】
細胞が、高レベルのアンドロステンジオン（ＡＤ）、テストステロン（Ｔ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、エストロン（Ｅ１）および／または１７βエストラジオール（Ｅ２）を産生する、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
細胞が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれを超える少なくとも１つのステロイドを産生する、請求項５１または５２に記載の細胞。
【請求項５４】
細胞が、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１７５倍、少なくとも２００倍またはそれを超える少なくとも１つのステロイドを産生する、請求項５１または５２に記載の細胞。
【請求項５５】
少なくとも１０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも６０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１７５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも４００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも６００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも８００ｐｇ／ｍｌまたは少なくとも１，０００ｐｇ／ｍｌの１７β−エストラジオール、４８時間当たり少なくとも１ａｇ（アトグラム）／細胞、４８時間当たり少なくとも３ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも２０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも３０ａｇ／細胞または４８時間当たり少なくとも１００ａｇ／細胞のＥ２、少なくとも１ｆｇ（フェムトグラム）／細胞／４８時間、少なくとも３ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも５ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも２０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも３０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも４０ｆｇ／細胞／４８時間または少なくとも２００ｆｇ／細胞／４８時間のテストステロン、約１０ｆｇ／細胞／４８時間および約５００ｆｇ／細胞／４８時間のアンドロステンジオン、または約１ｆｇ／細胞／４８時間および約１００ｆｇ／細胞／４８時間のエストロンを産生する、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５６】
改変細胞が、プロモーターに作動可能に連結された抗生物質耐性遺伝子核酸をさらに含んでなる、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５７】
細胞が、抗生物質ピューロマイシン耐性である、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５８】
プロモーターに作動可能に連結されたＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸を含んでなる、請求項１に記載の単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞（ここで、ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２の発現を低減する）。
【請求項５９】
ステロイド生合成ノックダウン剤を含んでなる、請求項１に記載の単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞（ここで、ステロイド生合成ノックダウン剤は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＴＧ１Ａ１から選択される１以上の遺伝子の発現を低減する）。
【請求項６０】
プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸をステロイド産生細胞、場合によりＨ２９５Ｒ細胞に導入することと、細胞（細胞中で、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２およびＳＵＬＴ１Ｅ１の群から選択される１以上の遺伝子の発現を低減する）を選択することとを含んでなる、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の細胞を作出する方法。
【請求項６１】
ステロイド生合成ノックダウン核酸が、ｓｉＲＮＡ核酸、ｓｈＲＮＡ核酸またはアンチセンス核酸を含んでなる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸が、レンチウイルスプラスミド構築物に含まれる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー核酸がさらに導入される、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法（ここで、選択マーカー核酸は抗生物質耐性遺伝子をコードしていてもよく、細胞は抗生物質選択によって選択してもよい）。
【請求項６４】
細胞が、既知の選択技術を用いてピューロマイシンによって選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
内分泌攪乱物質を同定するためのスクリーニングアッセイであって、
ａ）請求項１〜５９のいずれか一項に記載の細胞を試験物質と接触させること、
ｂ）少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡまたは酵素活性のレベルを測定すること
を含んでなる、スクリーニングアッセイ（ここで、対照と比べたその少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡまたは酵素活性のレベルの変動が、その試験物質が内分泌攪乱物質であることを示す）。
【請求項６６】
少なくとも１つのステロイドが、アンドロステンジオン（Ａ）、テストステロン（Ｔ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、エストロン（Ｅ１）および／または１７βエストラジオール（Ｅ２）から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
試験物質が、工業用化学物質、医薬品、除草剤、殺真菌剤、ポリカーボネートプラスチックモノマー、農業用化学物質、抗がん剤、性交後避妊薬、合成物質、薬物、治療薬、ポリビニル添加物、有機リン系殺虫剤、ペプチドホルモン、賦形剤、医薬補助剤（pharmaceutical aid）、殺精子剤、食品、化粧品、トイレタリーおよび医薬品の保存剤、ならびに農薬共力剤から選択される、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも１つのステロイドのレベルがＬＣ−ＭＳ、ＥＬＩＳＡ（自動ＥＬＩＳＡでもよい）、または免疫ブロット法によって検出される、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子発現産物若しくは酵素活性のレベルの変動が、対照の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の多少である、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１〜５９のいずれか一項に記載の細胞と、少なくとも１つのステロイドのレベルを測定するための構成要素とを含んでなる、内分泌攪乱物質のスクリーニングのためのキット。
【請求項７１】
未知の機構を持つ内分泌攪乱物質の作用機序を推定するシステムであって、
（ｉ）内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を受け取るコントロールモジュール（ここで、このステロイド産生特性は、内分泌攪乱物質を請求項１〜５２のいずれか一項に記載のステロイド産生改変細胞と接触させること、およびその細胞系統によって産生された少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡ若しくは酵素活性のレベルを測定することによって得られる）；
（ｉｉ）複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を含んでなるデータベース；
（ｉｉｉ）
ａ．その内分泌攪乱物質のステロイド産生特性と複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を比較するため；および
ｂ．その内分泌攪乱物質のステロイド産生特性と複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性との最良の一致を同定するため
の分析モジュールを含んでなる、システム（ここで、最良に一致した参照内分泌攪乱物質の作用機序がその内分泌攪乱物質の作用機序であると推定される）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許協力条約出願は、２００９年９月１６日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／２４２，８２２号の優先権に基づく３５ＵＳＣ  １１９の利益を主張するものであり、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
本開示は、ステロイド産生に関与する１以上の酵素の発現を低減する（ノックダウンされる）ように改変された、改変Ｈ２９５Ｒ細胞などのステロイド産生改変細胞に関する。本開示はまた、内分泌攪乱物質を同定するためのこれらの細胞を含んでなる方法、使用および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ここ２０年にわたり、ヒトおよび野生生物における内分泌および生殖系に対する環境中の化学物質に対する曝露の影響に関する懸念が高まってきた(Kavlock et al. 1996)。これらの懸念に取り組むため、脊椎動物における潜在的内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）のスクリーニングおよび試験のための新たな指針を制定すべく国内および国際的なプログラムが始まった。１９９５年の改正安全飲料水法 (Safe Drinking Water Act Amendments)および１９９６年の食品品質保護法(Food Quality Protection Act)は、飲料水中の化学物質、または食物生産に用いる農薬の内分泌攪乱特性に関するスクリーニングを求めている。この法に応じて、連邦内分泌攪乱物質スクリーニングおよび試験諮問委員会(federal Endocrine Disrupter Screening and Testing Advisory Committee)（ＥＤＳＴＡＣ）は、３つの重要な内分泌核受容体、すなわち、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）および甲状腺ホルモン受容体（ＴｈＲ）への結合に加え、内分泌攪乱の重要な毒性経路の１つとしてステロイド産生プロセスの攪乱を特定した(Hilscherova et al. 2004; Sanderson et al. 2002; Zhang et al. 2005)。ヒトＨ２９５Ｒ腺癌細胞に基づくステロイド産生アッセイが、内分泌攪乱物質スクリーニングプログラム（ＥＤＳＰ）の第Ｉ階層に使用するために米国環境保護庁(United States Environmental Protection Agency)（ＵＳＥＰＡ）によって認可され、現在、ＯＥＣＤによる、化学物質の内分泌攪乱作用を試験するための国際標準としての検証の最終段階にある。これまで用いられていたアッセイではエンドポイントとして種々のｍＲＮＡの産生を用いていたが、現在用いられているアッセイでは、ステロイドホルモンであるテストステロン（Ｔ）および１７β−エストラジオール（Ｅ２）の産生および培地中への放出をエンドポイントとして用いる(Hecker et al. 2006)。
【０００４】
Ｈ２９５Ｒ細胞は、ステロイド産生に関与する重要な総ての酵素をコードする遺伝子を発現する（図１）(Gazdar et al. 1990; Staels et al. 1993; Rainey et al. 1994)。これらの遺伝子のin vivo発現は組織特異的かつ発達段階特異的であるが、ステロイド産生に関与する総ての遺伝子を同時に発現する組織または発達段階はないので、これはユニークな特性である。Ｈ２９５Ｒ細胞は、帯状の未分化ヒト胎児副腎細胞の生理学的特徴を有する。Ｈ２９５Ｒ細胞は、成体副腎皮質および性腺に見られるステロイドホルモンを産生する能力を持つというユニークなin vitro系を呈し、これにより、コルチコステロイド合成とアンドロゲンおよびエストロゲンなどの性ステロイドホルモンの産生の双方に対する影響を試験することができる。
【０００５】
着目する重要なホルモンの１つであるＥ２は、Ｈ２９５Ｒ細胞により比較的少量の様々な濃度（培養培地中、約１０〜５０ｐｇ  Ｅ２／ｍｌ）で産生され、自動ＥＬＩＳＡまたはより手間のかかるＬＣ／ＭＳ−ＭＳ法の使用によっては測定が困難である。Ｈ２９５Ｒ細胞によって培地中へ放出されたＥ２の濃度は、現行の定量限界（ＬＯＱ、およそ２〜１０ｐｇ  Ｅ２／ｍｌ）に近く、ＥＤＣによって引き起こされたＥ２放出の低下を測定することを困難にしている。検出限界付近におけるＥ２産生の比較的大きなばらつきも制限因子となる。さらに、Ｈ２９５Ｒ細胞によって培地中に放出される基底濃度が小さいために、スクリーニングツールとして使用にも重要である産生の低下を実証することが困難である。弱い阻害剤の評価に関しては特にそうである。
【０００６】
潜在的内分泌攪乱のスクリーニングにおいて着目されるもう１つのエンドポイントは、テストステロンをＥ２に変換する（芳香族化する）酵素アロマターゼ（ＣＹＰ１９）の遺伝子、タンパク質および酵素活性の発現の変化である。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本開示は、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変細胞（ここで、このステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＴＧ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減し、その細胞は１以上の前記遺伝子の低減された発現を含んでなる）を提供する。
【０００８】
一実施形態において、ノックダウン核酸は、ｓｉＲＮＡ核酸、ｓｈＲＮＡ核酸またはアンチセンス核酸を含んでなる。
【０００９】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ２１Ａ２を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１】
2013504333.tif 000003
（配列番号１）
を含んでなる。
【００１０】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１１Ａ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２】
2013504333.tif 000004
（配列番号２）
を含んでなる。
【００１１】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１７Ａ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化３】
2013504333.tif 000005
（配列番号３）
を含んでなる。
【００１２】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１９Ａ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化４】
2013504333.tif 000006
（配列番号４）
を含んでなる。
【００１３】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、３−βＨＳＤ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化５】
2013504333.tif 000007
（配列番号５）
を含んでなる。
【００１４】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、３−βＨＳＤ２を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化６】
2013504333.tif 000008
（配列番号６）
を含んでなる。
【００１５】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、１７−βＨＳＤ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化７】
2013504333.tif 000009
（配列番号７）
を含んでなる。
【００１６】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＳｔＡＲを含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化８】
2013504333.tif 000010
（配列番号８）
を含んでなる。
【００１７】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＨＭＧＲを含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化９】
2013504333.tif 000011
（配列番号９）
を含んでなる。
【００１８】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１１Ｂ２を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１０】
2013504333.tif 000012
（配列番号１０）
を含んでなる。
【００１９】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１１Ｂ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１１】
2013504333.tif 000013
（配列番号１１）
を含んでなる。
【００２０】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、５α−レダクターゼ２を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１２】
2013504333.tif 000014
（配列番号１２）
を含んでなる。
【００２１】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＳＵＬＴ１Ｅ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１３】
2013504333.tif 000015
（配列番号１３）
を含んでなる。
【００２２】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＣＹＰ３Ａ４を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１４】
2013504333.tif 000016
（配列番号１４）
を含んでなる。
【００２３】
一実施形態において、１以上の遺伝子は、ＵＧＴ１Ａ１を含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１５】
2013504333.tif 000017
（配列番号１５）
を含んでなる。
【００２４】
一実施形態において、単離されたステロイド産生改変細胞は、単離されたステロイド産生Ｈ２９５Ｒ改変細胞である。
【００２５】
一実施形態において、単離されたステロイド産生改変細胞は、単離されたステロイド産生Ｈ２９５、ＪＥＧ−３またはＲ２Ｃ改変細胞である。
【００２６】
一実施形態において、単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸を含んでなり、ここで、このＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸はＣＹＰ２１Ａ２の発現を低減する。
【００２７】
一実施形態において、単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたＣＹＰ１７Ａ１ノックダウン核酸を含んでなる（ここで、このＣＹＰ１７Ａ１ノックダウン核酸はＣＹＰ１７Ａ１の発現を低減する）。
【００２８】
一実施形態において、単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたＣＹＰ１９Ａ１ノックダウン核酸を含んでなる（ここで、このＣＹＰ１９Ａ１ノックダウン核酸はＣＹＰ１９Ａ１の発現を低減する）。
【００２９】
別の態様において、本開示は、内分泌攪乱物質を同定するためのスクリーニングアッセイであって、ａ）本開示のステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞などのステロイド産生細胞を試験物質と接触させること；ｂ）少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子発現産物、例えばｍＲＮＡ若しくはタンパク質、または酵素活性のレベルを測定することを含んでなる、スクリーニングアッセイをさらに提供する（ここで、対照と比べたその少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子発現産物若しくは酵素活性のレベルの変動（modulation）が、その試験物質が内分泌攪乱物質であることを示す）。
【００３０】
さらなる態様は、本明細書に記載されるステロイド産生細胞と、少なくとも１つのステロイドのレベルを測定するための構成要素とを含んでなる、内分泌攪乱物質のスクリーニングのためのキットを含む。
【００３１】
なおさらなる態様では、本開示は、未知の機構を持つ内分泌攪乱物質の作用機序を推定するシステムであって、（ｉ）内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を受け取るコントロールモジュール（ここで、このステロイド産生特性は、内分泌攪乱物質を本明細書で開示されるステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞などのステロイド産生細胞と接触させること、およびその細胞系統によって産生された少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子発現産物若しくは酵素活性のレベルを測定することによって得られる）；（ｉｉ）複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を含んでなるデータベース；（ｉｉｉ）その内分泌攪乱物質のステロイド産生特性と複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を比較するため；およびその内分泌攪乱物質のステロイド産生特性と複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性との最良の一致を同定するための分析モジュールを含んでなるシステム（ここで、最良に一致した参照内分泌攪乱物質の作用機序がその内分泌攪乱物質の作用機序であると推定される）を提供する。
【００３２】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本開示の趣旨および範囲の範囲内にある種々の変化および改変が明らかになることから、詳細な説明および具体例は本開示の好ましい実施形態を示すが単に例を示すに過ぎないと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ｈ２９５Ｒ細胞のステロイド産生経路。ＣＹＰ１１Ａ、デスモラーゼ（２０，２２デスモラーゼ）；ＣＹＰ１７、ステロイド１７α−ヒドロキシラーゼ；ＣＹＰ２１、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ；ＣＹＰ１９、アロマターゼ；３βＨＳＤ、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ；ＣＹＰ１１Ｂ１、ステロイド１１βヒドロキシラーゼ；ＣＹＰ１１Ｂ２、アルドステロンシンセターゼ；１７βＨＳＤ、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。ヒトＣＹＰ２１Ａ２遺伝子によりコードされている酵素ＣＹＰ２１が強調されている。
【図２】安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞および非改変Ｈ２９５Ｒ細胞におけるヒトＣＹＰ２１Ａ２タンパク質発現のウエスタンブロット解析。同じプロットメンブランで検出した無関連のＣＹＰ１１Ａタンパク質を参照として用いた。示された値は平均＋／−標準偏差である。
【図３】フォルスコリン（ＦＯＲ）およびプロクロラズ（ＰＲＯ）に曝露後のＨ２９５ＲおよびＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞系統におけるプロゲステロン（Ｐ）、Ｔ、Ｅ１およびＥ２の産生。ＳＣ：溶媒対照。
【図４】同じ化学物質曝露条件下でのＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞と非改変Ｈ２９５Ｒ細胞とのホルモン産生（ｐｇ／ｍＬ）の比較。
【図５】Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１７−ＫＤ細胞と、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１９−ＫＤ細胞と、非改変Ｈ２９５Ｒ細胞との基底ホルモン産生（ｐｇ／ｍＬ）の比較。
【発明の詳細な説明】
【００３４】
Ｉ．定義
本明細書において、「a」、「an」および／または「the」は、１および／または１を超えるものを含む。
【００３５】
「内分泌攪乱化学物質」または「内分泌攪乱化合物」とは、本明細書において、「内分泌攪乱物質」または「ホルモン活性剤」とも呼ばれ、ヒトおよび／または無脊椎動物（軟体動物、甲殻類など）を含む脊椎動物における内因性ホルモンの合成、分泌、輸送、結合、作用または排出を妨げる外因性物質を意味する。内分泌攪乱化合物としては、例えば、農薬、プラスチック工業および消費者向け製品に用いられる化合物、食品添加物として、および、化粧品に用いられる化合物、およびその他の工業副産物、医薬、天然ホルモン（例えば、フィトエストロゲン）、これらの任意の化合物種の分解産物および代謝産物、および生産の副産物、および汚染物質をはじめとする多くの化学物質種が挙げられる。
【００３６】
本明細書において「ステロイド産生細胞」とは、性ステロイド、鉱質ステロイドおよびコルチコステロイドを含む１以上のステロイドホルモンを産生する改変型または非改変型の任意の細胞を意味する。具体的には、これらには、エストロゲン（１７β−エストラジオール、エストロン）およびアンドロゲン（テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン）、ならびに鉱質ステロイドおよびコルチコステロイドおよび／またはそれらの前駆体が挙げられ、例えば、Ｈ２９５Ｒ細胞、ステロイド産生改変Ｈ２９５細胞、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞、ＪＥＧ−３、Ｒ２Ｃ細胞、ステロイド産生改変ＪＥＧ−３細胞およびステロイド産生改変Ｒ２Ｃ細胞が挙げられる。
【００３７】
本明細書において「ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞」は、ステロイド産生経路に関与する１以上の遺伝子、例えば、限定されるものではないが、以下の遺伝子：ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４を含むステロイド生合成遺伝子の遺伝子発現をノックダウンするために、例えば組換え技術によって改変されたＨ２９５Ｒ細胞を意味する。例えば、上記に挙げた遺伝子の２以上の発現を、例えば、それぞれステロイド産生経路に関与する遺伝子を標的とする２以上のｓｉＲＮＡ核酸を産生する構築物を用いて同時に若しくは同時期にノックダウンすることができるか、またはこれらの遺伝子の２以上を順次ノックダウンすることができる。例えば、ＣＹＰ２１Ａ２の遺伝子発現をノックダウンするように改変されたＨ２９５Ｒ細胞を、例えばＣＹＰ１１Ａ１などの別の遺伝子の発現をノックダウンするようにさらに改変することができる。さらに例えば、関連するステロイド産生遺伝子ファミリーメンバーの発現もノックダウンしてステロイド産生改変細胞を作出することができる。例えば、ステロイド産生に関与する新たなＣＹＰ２１サブファミリー遺伝子などの新たなステロイド産生遺伝子が同定されたならば、および／または改変されるステロイド産生細胞が、例えばさらなるＣＹＰ２１ファミリーメンバーなどの、本明細書に記載されている具体的なもの以外のさらなるステロイド産生遺伝子を発現したならば、これらの遺伝子の１以上の発現もまたノックダウンして、本明細書に記載される方法に有用な細胞を作出することができる。
【００３８】
本明細書において「ステロイド産生改変Ｈ２９５細胞」とは、ステロイド産生経路に関与する１以上の遺伝子、例えば、限定されるものではないが、以下の遺伝子：ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４を含むステロイド生合成遺伝子の遺伝子発現をノックダウンするために、例えば組換え技術によって改変されたＨ２９５細胞を意味する。例えば、上記に挙げた遺伝子の２以上の発現を、例えば、それぞれステロイド産生経路に関与する遺伝子を標的とする２以上のｓｉＲＮＡ核酸を産生する構築物を用いて同時に若しくは同時期にノックダウンすることができるか、またはこれらの遺伝子の２以上を順次ノックダウンすることができる。例えば、ＣＹＰ２１Ａ２の遺伝子発現をノックダウンするように改変されたＨ２９５細胞を、例えばＣＹＰ１１Ａ１などの別の遺伝子の発現をノックダウンするようにさらに改変することができる。
【００３９】
同様に、本明細書において「ステロイド産生改変ＪＥＧ−３細胞」とは、ステロイド産生経路に関与する１以上の遺伝子、例えば、限定されるものではないが、以下の遺伝子：ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４を含むステロイド生合成遺伝子の遺伝子発現をノックダウンするために、例えば組換え技術によって改変されたＪＥＧ−３細胞を意味し、本明細書において「ステロイド産生改変Ｒ２Ｃ細胞」とは、ステロイド産生経路に関与する１以上の遺伝子、例えば、限定されるものではないが、以下の遺伝子：ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４を含むステロイド生合成遺伝子の遺伝子発現をノックダウンするために、例えば組換え技術によって改変されたＲ２Ｃ細胞を意味する。
【００４０】
本明細書において、ステロイド産生改変細胞に関して「改変された」とは、ステロイド産生経路に関与する１以上の遺伝子の発現をノックダウンし、および／または低減するために、例えば、組換え技術によって細胞を遺伝的に改変することを意味する。これは例えばアンチセンス技術、および／または相同組換えによるその遺伝子の、例えばより弱いプロモーターのために低い発現を示す変異体での置換によって達成することができる。
【００４１】
本明細書において「ステロイド生合成遺伝子」とは、ステロイド産生経路に関与する遺伝子を意味し、限定されるものではないが、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４（例えば、図１、表１参照）から選択される遺伝子が挙げられる。
【００４２】
「ＣＹＰ２１Ａ２」は、「ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ」または「２１−ヒドロキシラーゼ」および場合により「ＣＹＰ２１」または「ＣＹＰ２１Ｂ」とも呼ばれ、シトクロムＰ４５０  ファミリー２１  サブファミリーＡ  ポリペプチド２、好ましくは、例えば、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  １５８９に開示されたヒトシトクロムＰ４５０  ファミリー２１  サブファミリーＡ  ポリペプチド２を意味する。
【００４３】
「ＣＹＰ１１Ａ１」は、「デスモラーゼ」または「２０，２２デスモラーゼ」とも呼ばれ、シトクロムＰ４５０  ファミリー１１  サブファミリーＡ  ポリペプチド１、好ましくは、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ１５８３に開示されたヒトシトクロムＰ４５０  ファミリー１１  サブァミリーＡ  ポリペプチド１を意味する。
【００４４】
「ＣＹＰ１７Ａ１」は、例えば、ステロイド１７α−ヒドロキシラーゼ、ＣＹＰ１７ＡおよびＣＹＰ１７とも呼ばれる。
【００４５】
「ＣＹＰ１９Ａ１」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ１５８８に開示されているように、例えば、アロマターゼ、「ＣＹＰ１９」、「ＣＹＰ１９Ａ」および「−４５０ＡＲＯＭ」とも呼ばれる。
【００４６】
「３βＨＳＤ１」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ３２８３に開示されているように、例えば、「１型３βＨＳＤ」、「３βＨＳＤ」、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型または３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとも呼ばれる。
【００４７】
「３βＨＳＤ２」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  ３２８４に開示されているように、例えば、「２型３βＨＳＤ」、「３βＨＳＤ」、「ＨＳＤ３Ｂ２」、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ２型または３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとも呼ばれる。
【００４８】
「ＣＹＰ１１Ｂ１」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ１５８４に開示されているように、例えば、「Ｐ４５０Ｃ１１」、ステロイド１１βヒドロキシラーゼとも呼ばれる。
【００４９】
「ＣＹＰ１１Ｂ２」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ１５８５に開示されているように、例えば、「Ｐ４５０Ｃ１８」、アルドステロンシンセターゼとも呼ばれる。
【００５０】
「１７βＨＳＤ１」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ３２９２に開示されているように、例えば、「１７βＨＳＤ」、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型または１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとも呼ばれる。
【００５１】
「ＳｔＡＲ」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ６７７０に開示されているように、例えば、ステロイド産生急性調節タンパク質とも呼ばれる。
【００５２】
「ＨＭＧＲ」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ３１５６に開示されているように、例えば、「ＨＭＧＣＲ」、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼとも呼ばれる。
【００５３】
「ＳＵＬＴ１Ｅ１」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ６７８３に開示されているように、例えば、「ＥＳＴ−１」、「ＥＳＴ」、５α−レダクターゼ２、エストロゲン向性スルホトランスフェラーゼとも呼ばれる。
【００５４】
「ＣＹＰ３Ａ４」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ１５７６に開示されているように、例えば、「ＣＹＰ３Ａ」、「Ｐ４５０Ｃ３」、シトクロムＰ４５０  ファミリー３  サブファミリーＡ  ポリペプチド４とも呼ばれる。
【００５５】
「ＵＧＴ１Ａ１」は、例えばＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ５４６５８に開示されているように、例えば、「ＵＧＴ１」、「ＵＤＰＧＴ」、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼとも呼ばれる。
【００５６】
本明細書において「ステロイド産生経路」は、例えば、コルチコステロイド合成（それぞれアルドステロンおよびコルチゾールなどの鉱質コルチコステロイドおよび糖質コルチコステロイドを含む）、ならびにアンドロゲンおよびエストロゲンなどの性ステロイドホルモンの産生を含むステロイド生合成に関与する遺伝子、酵素、基質、中間体および最終産物を意味する。
【００５７】
「ステロイド産生遺伝子」または「ステロイド生合成遺伝子」とは、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４から選択される遺伝子を意味する。
【００５８】
「ステロイド生合成ノックダウン核酸」とは、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４から選択される遺伝子などのステロイド生合成遺伝子の発現を低減または「ノックダウン」するための特異的な核酸分子を意味する。例えば、ステロイド生合成遺伝子の発現は、ステロイド生合成遺伝子に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡまたは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはアンチセンス核酸を導入することによって低減することができる。遺伝子を標的とする特異的なノックダウン核酸を表す場合にはノックダウンされる遺伝子を参照してなされ、従って、例えば、ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２の発現を低減するステロイド生合成ノックダウン核酸を意味し、ＳｔＡＲノックダウン核酸は、ＳｔＡＲの発現を低減するステロイド生合成ノックダウン核酸を意味する。例えばいくつかの遺伝子を同時に標的とすることもでき、および／または１つの遺伝子のいくつかの領域を標的とすることもでき、例えば、多重ＲＮＡｉは、例えばトランスフェクションおよび／またはウイルス導入により、複数のステロイド生合成ノックダウン核酸（例えば、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ種）を導入することによって達成することができる。あるいは、いくつかの連続するステロイド生合成ノックダウン核酸（例えば、それぞれ場合によりプロモーターに作動可能に連結されている）を有する構築物、または複数のｓｈＲＮＡ（例えば、個々のステロイド生合成ノックダウン核酸）に切断される、いくつかの連続するステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる混成ステロイド生合成ノックダウン核酸（例えばＲＮＡ）の発現を使用することができる。
【００５９】
本明細書において「細胞」とは、複数の細胞を含み、細胞系統を含む。
【００６０】
本明細書において「単離された細胞」とは、細胞が天然に存在する環境から取り出され、および／または細胞がその天然環境に存在する状態から改変された細胞または細胞集団（細胞系統を含む）を意味する。
【００６１】
本明細書において「Ｈ２９５Ｒ」または「ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ」とは、培養ディッシュに接着させるために選択され、ステロイド産生に関与する総ての重要な酵素をコードする遺伝子を発現する多能性ヒト副腎皮質癌細胞系統である、Ｈ２９５細胞の株を意味する。Ｈ２９５Ｒは、例えば、American Type Culture Collection (ATCC)から公的に入手可能である。Ｈ２９５ＲにはＨ２９５Ｒ細胞の亜株およびサブクローンも含まれる。Ｈ２９５Ｒ細胞は、ステロイド産生に関与する総ての重要な酵素を発現するＨ２９５細胞に由来する(Gazdar et al. 1990; Staels et al. 1993; Rainey et al. 1994)。Ｈ２９５Ｒ細胞はＨ２９５細胞の一株であるので、当業者ならば、親Ｈ２９５細胞およびその親細胞の他の株もまた、例えば、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに用いるための本開示の改変細胞を作出するために使用可能であることを認識するであろう。よって、本開示はステロイド産生改変Ｈ２９５細胞、このような細胞の作出および本明細書に開示される方法におけるステロイド産生改変Ｈ２９５細胞の使用を包含するものとする。
【００６２】
本明細書において「細胞系統」とは、無期限の期間、in vitroで増殖される遺伝的に均一な不死細胞の群を意味する。細胞系統は単一のクローン（例えば、モノクローナル細胞系統）または２以上のクローン（例えば、ポリクローナル細胞系統）に由来してもよい。
【００６３】
本明細書において「安定な細胞系統」とは、複数回の凍結−解凍サイクルの後に、一貫した増殖および／または１以上のパラメーターまたは導入特性の維持、例えば、ピューロマイシン耐性の維持（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子を含んでなる構築物の維持の代用）を示す細胞系統を意味する。
【００６４】
本明細書において「選択マーカー核酸」とは、当技術分野で周知の、ピューロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性マーカーなどのマーカーをコードする核酸を意味する。
【００６５】
本明細書において「選択マーカー」とは、細胞に導入され、人為的選択に好適な形質を付与する遺伝子を意味する。選択マーカーは、多くの場合、ピューロマイシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子である。選択マーカーは、トランスフェクションまたは外来ＤＮＡを細胞に導入することを意図する他の手法の成功を示すために一種のリポーターとして機能する。
【００６６】
本明細書において「核酸」および／または「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖および糖間(intersugar)（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーの配列を意味し、一本鎖分子および二本鎖分子、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む。この用語はまた、同様に機能する天然に存在しないモノマーまたはその一部を含んでなる改変または置換されたオリゴマーも含み、これらは本明細書において「化学類似体」および／または「ペプチド核酸」などの「オリゴヌクレオチド類似体」と呼ばれる。このような改変または置換核酸は、細胞取込みの増大またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの特性のために、天然に存在する形態よりも好ましい可能性がある。この用語はまた、２以上の化学的に別個の領域を含むキメラ核酸も含む。例えば、キメラ核酸は、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞への取込みの増大）を付与する改変ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含んでもよく、あるいは２以上の本開示の核酸は連結してキメラ核酸を形成してもよい。「核酸」としては、例えば、「アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチド」、「ｓｉＲＮＡ核酸またはオリゴヌクレオチド」、「ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド」および「ｍｉＲＮＡ」、ならびに「モルホリノオリゴヌクレオチド」、「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」並びに「ペプチド核酸」などのオリゴヌクレオチド類似体が挙げられる。「核酸」にはまた、アプタマーが挙げられる。
【００６７】
本明細書において「単離された核酸」または「単離された核酸分子」とは、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合には細胞材料または培養培地を、または化学合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸はまた、その核酸が由来する、その核酸に天然に隣接している配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を実質的に含まない。
【００６８】
「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、タンパク質をコードする「センス」核酸と相補的である、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的であるか、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含んでなる。よって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合することができる。例えば、核酸は、標的遺伝子によって産生されるｍＲＮＡと結合するＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学類似体を含んでなり得る。アンチセンス核酸の結合は翻訳を妨げ、それにより、標的タンパク質の発現を阻害または低減する。アンチセンス核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、または、その分子の生物学的安定性を増大するように、もしくは、ｍＲＮＡもしくは天然遺伝子とともに形成された二本鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々な改変ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る。アンチセンス核酸は、標的遺伝子コード鎖全体に相補的であっても、またはその一部にのみ相補的であってもよい。アンチセンス核酸は、アンチセンス配列が高効率調節領域の制御下で産生される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態で細胞に導入される発現ベクターを用いて生物学的に産生可能であり、その活性はベクターが導入される細胞種によって決定され得る。
【００６９】
本明細書において「アンチセンス技術または方法」とは、標的遺伝子の発現を阻害するために、例えば、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチド；ＲＮＡ切断を引き起こす触媒活性オリゴヌクレオチドであるリボザイムまたはデオキシリボザイム；ＲＮＡ干渉経路を用いるｓｉＲＮＡ核酸および／またはｓｈＲＮＡ核酸を用いる技術および方法を意味する。「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を意味する。
【００７０】
「非コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列を意味する（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【００７１】
「ｓｉＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ核酸」および／または「ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＲＮＡ干渉（すなわち、ＲＮＡｉ）によって特定の遺伝子の遺伝子発現を低減または阻害するために使用可能な短鎖阻害ＲＮＡを意味する。例えば、ｓｉＲＮＡは、例えば、注目する遺伝子の標的領域に対応する（例えば、標的ｍＲＮＡと相同なセンス鎖を含んでなる）２１〜２３ヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡ核酸であり得る。
【００７２】
「低分子ヘアピンＲＮＡ」、「短鎖ヘアピンＲＮＡ」および／または「ｓｈＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用可能なＲＮＡヘアピンを生じる短鎖核酸を意味する。例えば、ｓｈＲＮＡは、例えば、標的遺伝子に由来する１９〜２９ヌクレオチドの範囲の短いヌクレオチド配列、例えば、４〜１５ヌクレオチドの短いスペーサー（ループを形成する）および最初の標的配列の逆相補配列であるヌクレオチド配列を含んでなる。ｓｈＲＮＡは場合により、細胞に導入され、例えば、ヒトＨ１  ＲＮＡもしくはＵ６  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、またはｓｈＲＮＡが常に発現されるようにするための他のプロモーターを用いるベクターに含まれる。ベクターは通常、娘細胞に受け渡され、遺伝子サイレンシングの伝達を可能とする。例えば、安定な細胞では、ｓｈＲＮＡを含んでなるベクターは後代細胞で維持される。
【００７３】
本明細書において「ＲＮＡ干渉」とは、標的遺伝子の遺伝子発現を低減するまたはサイレンシングするために使用可能な経路を意味する。ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに対応する（例えば、相同な）ｍＲＮＡに向けて細胞分解経路を活性化する。特定のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ核酸を設計し、それらを投与する方法は当業者に公知である。当技術分野では、効率的なサイレンシングは２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合したｓｉＲＮＡ二本鎖複合体で得られることが知られている。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡはまた、安定性を高めるために改変することもできる。例えば、２つのチミジンヌクレオチドの付加および／または２’Ｏメチル化はヌクレアーゼ耐性を付与すると思われる。当業者ならば、他のヌクレオチドも付加することができ、他の改変も行えることを認識するであろう。別の例として、安定性を高めるためにデオキシヌクレオチド残基（例えば、ｄＴ）を使用することができる。
【００７４】
「ｍｉＲＮＡ」とは、例えば、約７０ヌクレオチド長のヘアピンＲＮＡ前駆体からプロセシングされた例えば２２ヌクレオチドからなる一本鎖ＲＮＡであるマイクロＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡは、相同なｍＲＮＡを標的とすることで遺伝子発現を阻害することができる。
【００７５】
「モルホリノオリゴヌクレオチド」とは、標的ｍＲＮＡ配列への他の分子の接近を遮断するために用いられるアンチセンス技術を意味する。モルホリノオリゴヌクレオチドは約２５モルホリノサブユニットの短鎖である。各サブユニットは核酸塩基と、６員モルホリン環と非イオン性のホスホロジアミデートサブユニット間結合から構成される。モルホリノは、リボ核酸（ＲＮＡ）の塩基対合面の小領域（約２５塩基）を遮断する。
【００７６】
本明細書において「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、デオキシリボースリン酸骨格がシュードペプチド骨格で置換され、４つの天然核酸塩基だけが保持されている核酸ミミック、例えばＤＮＡミミックを意味する。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡとＲＮＡの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup B. et al. (1996) 前掲； Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670 675に記載されているような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【００７７】
「少なくとも中ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中で２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全体または一部に起こり得る。ハイブリダイズ部分は一般に少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチド長である。当業者ならば、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有バッファー中ではナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍによって決定されることを認識するであろう（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または類似の式）。よって、ハイブリッド安定性を決定する洗浄条件でのパラメーターは、ナトリウムイオン濃度と温度である。既知の核酸分子と同一ではないが類似の分子を同定するためには、１％のミスマッチはＴｍに約１℃の低下をもたらすと仮定することができ、例えば、＞９５％の同一性を有する核酸分子が求められる場合には、最終洗浄温度を約５℃引き下げる。当業者ならば、これらの考慮に基づいて、適当なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができる。好ましい実施形態では、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、ストリンジェントハイブリダイゼーションを遂行するためには以下の条件を用いればよい：上式に基づき、Ｔｍ−５℃にて５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート溶液／１．０％ＳＤＳでハイブリダイゼーション、その後、６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄。中ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、４２℃にて３×ＳＳＣでの洗浄を含む。しかしながら、別のバッファー、塩および温度を用いても同等のストリンジェンシーが達成可能であると理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するその他の指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., (1989, 2002)、およびSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に見出すことができる。
【００７８】
本明細書において「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびキメラ抗体を含むものとする。抗体は組換え源に由来してもよく、かつ／またはトランスジェニック動物で産生されてもよい。本明細書において「抗体フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディー、ダイアボディー、およびその多量体ならびに二重特異性抗体フラグメントを含むものとする。抗体は従来の技術を用いてフラグメントにすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗体をペプシンで処理することによって作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド架橋を還元するよう処理すると、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化を行えば、Ｆａｂフラグメントを形成することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディー、ダイアボディー、二重特異性抗体フラグメントおよびその他のフラグメントは組換え技術によって合成することもできる。
【００７９】
本明細書において「ペプチドミメティック」とは、分子間の相互作用においてペプチドの代わりとして働く構造を意味する（総説としては、Morgan et al. (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252参照）。ペプチドミメティックは、アミノ酸および／またはペプチド結合を含んでも含まなくてもよいが、着目するステロイド産生酵素と結合し、その発現または活性を阻害するその能力などのペプチドの構造的および機能的特徴を保持する合成構造を含む。ペプチドミメティックはまた、ペプトイド、オリゴペプトイド(Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:9367)；およびペプチドライブラリーを含む。
【００８０】
本明細書において「アプタマー」とは、特異性の高い三次元コンフォメーションをとることができる短鎖の核酸を意味する。アプタマーは、標的分子に対して高い結合親和性および特異性を示し得る。これらの特性は、このような分子がタンパク質の機能活性を特異的に阻害することを可能とし、例えば、ＣＹＰ２１Ａ２などのステロイド産生酵素を阻害する薬剤として含められる。
【００８１】
本明細書において「内分泌攪乱物質のステロイド産生特性」とは、１セットの条件下で特定の内分泌攪乱物質または化学物質の混合物に応答して特定の改変細胞または非改変細胞によって産生されるステロイドのレベルにそれぞれ対応する複数のデータ点を意味する。どのステロイドが増加または減少しているか、また、それらがどの程度増加または減少しているかは、特定の内分泌攪乱物質または推定内分泌攪乱物質によってどの内分泌経路が影響を受けるかに関する情報を与えることができる。
【００８２】
特定の節に記載されている定義および実施形態は、当業者によって理解されているように、または特に断りのない限り、それらが好適である、本明細書の記載の他の実施形態にも適用可能であるものとする。
【００８３】
ＩＩ．ステロイド産生改変細胞
本明細書では、例えば、これもまた本明細書に開示されるステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒステロイド産生アッセイを用いて、内分泌攪乱化学物質または内分泌攪乱物質を同定するのに有用な、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞などのステロイド産生改変細胞が開示される。ＵＳＥＰＡおよびＯＥＣＤによって求められるように、今後１０年、何千もの化学物質を、ＥＰＡの第１階層スクリーニングバッテリーを用い、それらの内分泌攪乱特性に関してスクリーニングしなければならない。本明細書に開示されるステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞およびアッセイは、例えば、ＥＰＡのＥＤＳＰの現行の第１階層試験の１つの代替として、現行のＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイの不明確性と限界のいくつかを克服するユニークな、有意に改善されたスクリーニングアッセイを提供するであろう。例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞系統のいくつかは、親Ｈ２９５Ｒ細胞に比べて、高い基底エストラジオール産生を示すだけでなく、ホルモン産生という点でより良い安定性を示すことも見出された。また、本明細書において、ＪＥＧ−３およびＲ２Ｃは、Ｈ２９５Ｒ細胞に比べて、１以上のステロイド（例えば、エストラジオール、Ｒ２Ｃ細胞の場合には、１７αヒドロキシプロゲステロンおよびエストンも）に関して高い基底ステロイド産生を示し、これにより、これらの細胞もまた本明細書に開示される方法に有用となることが実証される。ＪＥＧ−３またはＲ２Ｃ細胞のステロイド産生経路における１以上の遺伝子のノックダウンも同様に、基底ステロイドレベルにさらなる増加を持つ細胞系統を生じると予想される。
【００８４】
よって、本開示の一態様は、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変細胞（ここで、このステロイド生合成ノックダウン核酸は、ステロイド産生経路遺伝子、例えば、デスモラーゼ（２０，２２  デスモラーゼ）（ＣＹＰ１１Ａ１）、ステロイド１７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）；ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２１Ａ２）；アロマターゼ（ＣＹＰ１９Ａ１）；３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２）；ステロイド１１βヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ１１Ｂ１）；アルドステロンシンセターゼ（ＣＹＰ１１Ｂ２）；１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１７βＨＳＤ１）；ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；５α−レダクターゼ２、エストロゲン向性スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ１Ｅ１）；シトクロムＰ４５０  ファミリー３  サブファミリーＡ  ポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）；およびＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１Ａ１）から選択される遺伝子の発現を低減する）を提供する。これらの各遺伝子のＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤの例を表１に示すが、対応するゲノム配列、ｍＲＮＡ配列およびタンパク質配列は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００８５】
一実施形態において、単離された改変ステロイド産生細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる単離された改変Ｈ２９５Ｒ細胞である（ここで、このステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１９Ａ１、３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、１７βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１から選択される遺伝子の発現を低減する）。
【００８６】
Ｈ２９５Ｒ細胞はＨ２９５細胞の一つの株であるので、当業者ならば、親Ｈ２９５細胞およびその親細胞の他の株も、ステロイド産生改変Ｈ２９５細胞を作出するために使用可能であることを認識するであろう。よって、一実施形態において、本開示は、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５細胞（ここで、このステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１９Ａ１、３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、１７βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１から選択される遺伝子の発現を低減する）を提供する。
【００８７】
同様に、ステロイドホルモンを産生する、例えば、性ホルモン、すなわち、アンドロゲンおよびエストロゲンを産生するＨ２９５Ｒ細胞と類似の特性を有する他の未分化胎児副腎細胞系統などの他の細胞が、例えば、エストラジオール（Ｅ２）の発現を増強すべくステロイド産生遺伝子の発現をノックダウンするように操作することができ、本明細書に記載される方法において有用である。例としては、ＪＥＧ−３細胞およびＲ２Ｃ細胞が挙げられる。
【００８８】
よって、別の実施形態では、単離された改変ステロイド産生細胞は、単離された改変ＪＥＧ−３細胞である。さらなる実施形態では、単離された改変ステロイド産生細胞は、単離された改変Ｒ２Ｃ細胞である。
【００８９】
一実施形態において、単離された細胞は安定な細胞系統である。さらなる実施形態では、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ｓｉＲＮＡ核酸、ｓｈＲＮＡ核酸またはアンチセンス核酸を含んでなる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンス核酸などのアンチセンス技術は当技術分野で周知であり、以下にさらに記載する。
【００９０】
ステロイド産生改変細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞はまた、ノックダウンされたステロイド産生遺伝子の組合せを含むこともできる。よって、一実施形態において、単離された改変ステロイド産生細胞は、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１９Ａ１、３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、１７βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１から選択される１以上の遺伝子のノックダウンを含んでなる。一実施形態において、ステロイド生合成核酸は、を含んでなる。一実施形態において、細胞は、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも２つのステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなり、ここで、各ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減する。さらなる実施形態では、細胞はプロモーターに作動可能に連結された少なくとも３つまたは少なくとも４つのステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる。例えば、２つの遺伝子の発現をノックダウンするためには二シストロン性ベクターを使用するか、または２つのベクターを使用することができる。さらに、複数の構築物の発現を駆動するためには単一のプロモーターが有用である。あるいは、各構築物または構築物のサブセット、例えば、各ｓｈＲＮＡ核酸を、専用のプロモーターによって駆動することもできる。例えば、各ステロイド生合成ノックダウン核酸を別個のプロモーターに作動可能に連結することができ、および／または単一のプロモーターを２以上のステロイド生合成ノックダウン核酸と作動可能に連結することもできる。
【００９１】
ａ）ＣＹＰ２１Ａ２改変細胞
Ｈ２９５Ｒ細胞系統のステロイド産生特性を鋭意検討し、ＣＹＰ２１Ａ遺伝子を、これらの細胞による性ステロイドホルモンの産生を変化させることができる重要な因子の１つとして同定した。市販のＲＮＡｉ技術を適用し、親Ｈ２９５Ｒ細胞においてＣＹＰ２１Ａ遺伝子を遺伝的にノックダウンしたところ、首尾よく新規の安定な細胞系統が得られた。この新規のＣＹＰ２１ＡノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統は、基底１７β−エストラジオール産生がおよそ１０〜５０ｐｇ／ｍｌから４００ｐｇ／ｍｌに増加したという好ましい特徴を持つ。結果として、安定なＣＹＰ２１ＡノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統の基底１７β−エストラジオールレベルは現行技術の検出限界よりも２００倍高く、現行のＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイよりも有意に感度を引き上げる。１７β−エストラジオールの基底レベルは、Ｈ２９５Ｒ細胞に比べ、ＪＥＧ−３細胞ではほぼ１０倍、Ｒ２Ｃ細胞では約６１倍高まり、ステロイド産生経路遺伝子の改変は、例えば、１７β−エストラジオールなどのいくつかのステロイドのレベルをさらに上昇させると予想される。
【００９２】
よって、本開示の一実施形態において、発現が低減される１以上の遺伝子はＣＹＰ２１Ａ２を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ２１Ａ２である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウンＨ２９５Ｒ細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２の発現を低減する）。ＣＹＰ２１Ａ２の発現が低減される改変細胞の場合、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２を標的としてその発現を低減する核酸（すなわち、ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸）を含んでなる。例えば、ＣＹＰ２１Ａ２に特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸を、ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸として使用することができる。一実施形態において、ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸は、
【化１６】
2013504333.tif 000018
（配列番号１）
を含んでなる。
【００９３】
一実施形態において、本開示は、プロモーターに作動可能に連結されたＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を提供する（ここで、このＣＹＰ２１Ａ２特異的ノックダウン核酸はＣＹＰ２１Ａ２の発現を低減するが、他の遺伝子の発現は低減しない）。
【００９４】
ｂ）他のステロイド産生経路酵素のノックダウン
本明細書では、ステロイド産生に関与する他の酵素の発現の低減またはノックダウンを含んでなるステロイド産生改変細胞も提供される。このような改変細胞は、ステロイド産生アッセイにおいて、特定の実施形態ではＣＹＰ２１Ａ２の代替となり、および／またはＣＹＰ２１Ａ２に加えて用いられ、コルチコイド合成経路の部分的なまたは完全な抑制を達成するためにＣＹＰ１１Ｂ１および２の変更を含む。性ステロイド合成の変更に加え、コルチゾールまたはアルドステロンなどのコルチコイド合成に対する影響も内分泌攪乱現象に関してますます懸念を増している。従って、コルチコイド合成に対する試験物質の影響を評価するためのステロイド産生アッセイでは、例えば、限定されるものではないが、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ２１、ならびにＣＹＰ１１Ｂ１および２の発現の変更によって鉱質コルチコイドおよび／または糖質コルチコイド合成経路に影響を及ぼすと予想されるステロイド生合成遺伝子のステロイド産生改変ノックダウン細胞が有用に用いられる可能性がある。
【００９５】
よって、本開示の一実施形態において、発現が低減される１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１１Ａ１を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ１１Ａ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＣＹＰ１１Ａ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１１Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ａ１の発現を低減する）。一実施形態において、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＣＹＰ１１Ａ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１１Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ａ１の発現を低減する）。ＣＹＰ１１Ａ１の発現が低減される改変細胞の場合、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ａ１を標的としてその発現を低減する核酸（すなわち、ＣＹＰ１１Ａ１ノックダウン核酸）を含んでなる。例えば、ＣＹＰ１１Ａ１に特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸を、ＣＹＰ１１Ａ１ノックダウン核酸として使用することができる。一実施形態において、このノックダウン核酸は、
【化１７】
2013504333.tif 000019
（配列番号２）
を含んでなる。
【００９６】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１７Ａ１を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ１７Ａ１である。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＣＹＰ１７Ａ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１７Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１８】
2013504333.tif 000020
（配列番号３）
を含んでなる）。
【００９７】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１９Ａ１を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ１９Ａ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＣＹＰ１９Ａ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１９Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１９Ａ１の発現を低減する）。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＣＹＰ１９Ａ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１９Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化１９】
2013504333.tif 000021
（配列番号４）
を含んでなる）。
【００９８】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、３−βＨＳＤ１を含んでなる。さらなる実施形態では、この１以上の遺伝子は３−βＨＳＤ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、３−βＨＳＤ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／３−βＨＳＤ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、３−βＨＳＤ１の発現を低減する）。なおさらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、３−βＨＳＤ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／３−βＨＳＤ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２０】
2013504333.tif 000022
（配列番号５）
を含んでなる）。
【００９９】
さらなる実施形態では、この１以上の遺伝子は、３−βＨＳＤ２を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子は３−βＨＳＤ２である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、３−Ｂｈｓｄ２ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／３−Ｂｈｓｄ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、３−Ｂｈｓｄ２の発現を低減する）。さらに別の実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、３−βＨＳＤ２ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／３−βＨＳＤ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２１】
2013504333.tif 000023
（配列番号６）
を含んでなる）。
【０１００】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、１７−βＨＳＤ１を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子は１７−βＨＳＤ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、１７−βＨＳＤ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／１７−βＨＳＤ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、１７−βＨＳＤ１の発現を低減する）。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、１７−βＨＳＤ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／１７−βＨＳＤ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２２】
2013504333.tif 000024
（配列番号７）
を含んでなる）。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＳｔＡＲを含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＳｔＡＲである。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＳｔＡＲノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＳｔＡＲ）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＳｔＡＲの発現を低減する）。なおさらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＳｔＡＲノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＳｔＡＲ）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２３】
2013504333.tif 000025
（配列番号８）
を含んでなる）。
【０１０２】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＨＭＧＲを含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＨＭＧＲである。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＨＭＧＲノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＨＭＧＲ）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＨＭＧＲの発現を低減する）。なおさらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＨＭＧＲノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＨＭＧＲ）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２４】
2013504333.tif 000026
（配列番号９）
を含んでなる）。
【０１０３】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１１Ｂ２を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ１１Ｂ２である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＣＹＰ１１Ｂ２ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１１Ｂ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ｂ２の発現を低減する）。なおさらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＣＹＰ１１Ｂ２ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１１Ｂ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２５】
2013504333.tif 000027
（配列番号１０）
を含んでなる）。
【０１０４】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＣＹＰ１１Ｂ１を含んでなる。さらなる実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ１１Ｂ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＣＹＰ１１Ｂ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１１Ｂ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ１１Ｂ１の発現を低減する）。なおさらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＣＹＰ１１Ｂ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ１１Ｂ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２６】
2013504333.tif 000028
（配列番号１１）
を含んでなる）。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、５α−レダクターゼ２を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子は５α−レダクターゼ２である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、５α−レダクターゼ２ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／５α−レダクターゼ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、５α−レダクターゼ２の発現を低減する）。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、５α−レダクターゼ２ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／５α−レダクターゼ２）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２７】
2013504333.tif 000029
（配列番号１２）
を含んでなる）。
【０１０６】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＳＵＬＴ１Ｅ１を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＳＵＬＴ１Ｅ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＳＵＬＴＩＥ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＳＵＬＴＩＥ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＳＵＬＴＩＥ１の発現を低減する）。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＳＵＬＴ１Ｅ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＳＵＬＴ１Ｅ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２８】
2013504333.tif 000030
（配列番号１３）
を含んでなる）。
【０１０７】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＣＹＰ３Ａ４を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＣＹＰ３Ａ４である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＣＹＰ３Ａ４ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ３Ａ４）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ３Ａ４の発現を低減する）。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＣＹＰ３Ａ４ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ３Ａ４）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化２９】
2013504333.tif 000031
（配列番号１４）
を含んでなる）。
【０１０８】
別の実施形態では、この１以上の遺伝子は、ＵＧＴ１Ａ１を含んでなる。別の実施形態では、この１以上の遺伝子はＵＧＴ１Ａ１である。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、ＵＧＴ１Ａ１ノックダウン細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ／ＵＧＴ１Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を低減する）。さらなる実施形態では、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、ＵＧＴ１Ａ１ノックダウン細胞（すなわち、Ｈ２９５Ｒ／ＵＧＴ１Ａ１）を含んでなる（ここで、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、
【化３０】
2013504333.tif 000032
（配列番号１５）
を含んでなる）。
【０１０９】
遺伝子ノックダウンレベルとホルモンレベル
本明細書に記載される改変細胞においては、１以上のステロイド産生遺伝子、例えば、ステロイド産生に関与する１以上の酵素の遺伝子の発現レベルが低減される。
【０１１０】
一実施形態において、例えば、発現されたｍＲＮＡまたはタンパク質および／または酵素活性のレベルを測定することによって評価した場合に、改変細胞が、対照に比べて１以上の遺伝子（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）の、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％未満を発現する。一実施形態において、対照は非改変Ｈ２９５Ｒ細胞である。
【０１１１】
別の実施形態では、細胞は、増加したレベルの少なくとも１つのステロイドまたはステロイド前駆体を産生する。この増加したレベルは、一実施形態では、増加した濃度のステロイドまたはステロイド前駆体である。
【０１１２】
一実施形態において、少なくとも１つのステロイドは性ステロイドである。別の実施形態では、改変細胞は、増加したレベルのアンドロステンジオン（ＡＤ）、テストステロン（Ｔ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、エストロン（Ｅ１）および／または１７βエストラジオール（Ｅ２）を産生する。
【０１１３】
別の実施形態では、ステロイドはコルチコステロイドである。さらなる実施形態では、コルチコステロイドは鉱質コルチコステロイドまたは糖質コルチコステロイドである。別の実施形態では、ステロイドはコルチゾールおよび／またはアルドステロンである。
【０１１４】
別の実施形態では、細胞は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれを超える少なくとも１つのステロイドを産生する。さらなる実施形態では、細胞は、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１７５倍、少なくとも２００倍またはそれを超える少なくとも１つのステロイドを産生する。
【０１１５】
ホルモン産生は一般に、ホルモン間で大きく異なる時間の関数である。例えば、Ｅ２産生は１００ｐｇ／ｍＬ／４８時間（例えば、２００，０００〜３００，０００細胞当たり）未満であり得るが、アンドロステンジオンの濃度は１００ｎｇ／ｍＬ／４８時間（例えば、２００，０００〜３００，０００細胞当たり）前後であり、さらには、コルチコステロイドにはそれを超える濃度で産生されるものがある。一実施形態において、ステロイド産生改変細胞は、少なくとも１０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも６０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１７５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも４００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも６００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも８００ｐｇ／ｍｌ、または少なくとも１，０００ｐｇ／ｍｌの１７β−エストラジオールを産生する。
【０１１６】
さらなる実施形態では、細胞は、４８時間当たり少なくとも１ａｇ（アトグラム）／細胞、４８時間当たり少なくとも３ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも２０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも３０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも４０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも５０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも６０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも７０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも８０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも９０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１００ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１２５ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１５０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１７５ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも２００ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも２５０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも３００ａｇ／細胞、または４８時間当たり少なくとも４００ａｇ／細胞、または４８時間当たり少なくとも８００ａｇ／細胞の少なくとも１つのステロイドを産生する。別の実施形態では、細胞は、少なくとも１ｆｇ（フェムトグラム）／細胞／４８時間、少なくとも３ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも５ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも２０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも３０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも４０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも５０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも６０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも７０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも８０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも９０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１００ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１２５ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１５０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１７５ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも２００ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも２５０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも３００ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも４００ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも８００ｆｇ／細胞／４８時間、または少なくとも１，０００ｆｇ／細胞／４８時間の少なくとも１つのステロイドを産生する。
【０１１７】
一実施形態において、細胞は、４８時間当たり少なくとも１ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも３ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも１０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも２０ａｇ／細胞、４８時間当たり少なくとも３０ａｇ／細胞、または４８時間当たり少なくとも１００ａｇ／細胞のＥ２を産生する。別の実施形態では、細胞は、少なくとも１ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも３ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも５ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも１０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも２０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも３０ｆｇ／細胞／４８時間、少なくとも４０ｆｇ／細胞／４８時間または少なくとも２００ｆｇ／細胞／４８時間のテストステロンを産生する。別の実施形態では、細胞は、約１０ｆｇ／細胞／４８時間〜約５００ｆｇ／細胞／４８時間の間のアンドロステンジオンを産生する。別の実施形態では、細胞は、約１ｆｇ／細胞／４８時間〜約１００ｆｇ／細胞／４８時間の間のエストロンを産生する。
【０１１８】
別の実施形態では、改変細胞は、プロモーターに作動可能に連結された抗生物質耐性遺伝子核酸をさらに含んでなる。一実施形態において、細胞は、抗生物質ピューロマイシン耐性である。ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼの他、他の抗生物質選択マーカーとしては、限定されるものではないが、タンパク質ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１１９】
送達ベクター
当業者ならば、本明細書に記載される核酸を細胞に導入するために種々の送達ベクターおよび発現ビヒクルが有用に使用されることが分かるであろう。有用なベクターは、レンチウイルス、オンコレトロウイルス、発現プラスミド、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含んでなる。慣用されるｓｈＲＮＡ送達ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターである。
【０１２０】
Ｈ２９５Ｒ細胞に導入され、実施例２に記載されるｓｈＲＮＡ核酸は、ｐＬＫＯ．１プラスミド(Thermo Scientific Open Biosystems社製)に含められた。当業者に理解されるように、他の安定組込みベクターなどの他のベクターも使用可能である。例えば、ｓｈＲＮＡ技術に好適なレンチウイルスベクターとしては、例えばThermo Scientific Open Biosystems社、Santa Cruz Biotechnology社(www.scbt.com)、Ambion社(www.ambion.com)、Invitrogen社(www.invitrogen.com)およびSignosis BioSignal Capture社(www.signosisinc.com)から入手可能なベクターが挙げられる。
【０１２１】
アンチセンスおよび／またはｓｈＲＮＡ核酸は、一実施形態では、プロモーターに作動可能に連結される。標的遺伝子の発現をノックダウンするのに十分なアンチセンスまたはｓｈＲＮＡ分子の発現を提供するプロモーターはいずれも使用可能である。好適なプロモーターとしては、例えば、ヒトＨ１  ＲＮＡプロモーター、ヒトＵ６プロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫ）ＳＶ４０、およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターが挙げられる。
【０１２２】
他の方法も標的遺伝子の発現をノックダウンするために使用可能であるので、一実施形態において、本開示は、ステロイド生合成ノックダウン剤を含んでなる単離されたステロイド産生改変細胞、例えば、単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を提供する（ここで、このステロイド生合成ノックダウン剤は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＴＧ１Ａ１から選択される遺伝子の発現を低減する）。
【０１２３】
ＩＩＩ．方法
ｉ）細胞系統を作出する方法
本開示は、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸を含んでなる単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５ＲまたはＨ２９５細胞などの単離されたステロイド産生改変細胞を作出する方法を提供する（ここで、このステロイド生合成ノックダウン核酸は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減する）。
【０１２４】
よって、別の態様は、ステロイド生合成改変細胞、一実施形態では、ステロイド生合成改変Ｈ２９５Ｒまたはステロイド生合成改変Ｈ２９５細胞を作出する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸をステロイド産生細胞（例えば、Ｈ２９５Ｒ、Ｈ２９５、ＪＥＧ−３またはＲＣ２細胞）に導入することとおよび細胞（細胞中で、ステロイド生合成ノックダウン核酸がＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減する）を選択することを含んでなる方法を提供する。
【０１２５】
本明細書に記載される単離された細胞を作出するためにはいくつかの技術を使用することができる。ノックダウンされる遺伝子に特異的な核酸を導入することによってステロイド産生改変細胞（ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒおよび／またはＨ２９５細胞など）を作出するために、組換え技術およびアンチセンス技術を使用することができる。一実施形態において、ステロイド生合成ノックダウン核酸は、ｓｉＲＮＡ核酸、ｓｈＲＮＡ核酸またはアンチセンス核酸を含んでなる。別の実施形態では、所望の遺伝子の発現をノックダウンするためにジンクフィンガータンパク質を用いる。他の実施形態においては、化学的阻害および化学的突然変異誘発法もまた使用可能である。所望の遺伝子の発現をノックダウンまたはノックアウトする他の方法も好適である。
【０１２６】
よって、一実施形態において、本開示は、単離されたステロイド産生改変細胞を作出する方法であって、ステロイド生合成ノックダウン剤を導入すること、および細胞（細胞中で、ステロイド生合成ノックダウン剤がＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＵＧＴ１Ａ１の群から選択される遺伝子の発現を低減する）を選択することを含んでなる方法を提供する。一実施形態において、単離されたステロイド産生改変細胞は、単離されたステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞である。
【０１２７】
本明細書に開示される細胞を作出するのに、いくつかのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンス核酸が好適である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ核酸（各鎖）は２０〜３０、３１〜４０、４１〜５０残基長の間である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ（各鎖）は２０、２１、２２、２３、２４または２５残基長である。別の実施形態では、ｓｈＲＮＡはヘアピンループを含んでなり、４０〜８０残基長の間である。一実施形態において、ｓｈＲＮＡはヘアピンループを含んでなり、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６残基長である。
【０１２８】
一実施形態において、ｓｈＲＮＡ核酸は表２に挙げられた配列を含んでなる。
【０１２９】
ステロイド生合成ノックダウン核酸、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、例えば安定な組込みによって改変細胞において維持されるベクターに含まれてよい。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはアンチセンス核酸はベクターに含まれる。レトロウイルスベクターは、それに含まれるｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を安定に組み込むのに好適である。よって、一実施形態において、プロモーターに作動可能に連結されたステロイド生合成ノックダウン核酸は、レンチウイルスプラスミド構築物に含まれる。他の好適なベクターも本明細書に記載される。
【０１３０】
一実施形態において、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー核酸もまた導入される（ここで、この選択マーカー核酸は抗生物質耐性遺伝子をコードしていてもよく、細胞は抗生物質選択によって選択してもよい）。一実施形態において、細胞は、既知の選択技術を用いてピューロマイシンによって選択される。
【０１３１】
本明細書に記載される核酸分子は、当技術分野で公知の手順を用い、化学合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）またはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増大するように、もしくはハイブリダイズする鎖間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々な改変ヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。アンチセンス核酸を作出するために使用できる改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、核酸分子は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に作出することができる（例えば、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは着目する標的核酸に対してアンチセンス配向であるか、またはｓｈＲＮＡの場合には、転写されたＲＮＡは着目する標的核酸に対応し、短鎖ヘアピン配向にある）。
【０１３２】
他のオリゴヌクレオチドは、ポリマー骨格、環状骨格または非環状骨格を含むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドはモルホリノ骨格構造を有してもよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。オリゴヌクレオチドはまた、リポーター基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基、および／またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基などの基も含んでよい。オリゴヌクレオチドはまた糖ミメティックを有してもよい。
【０１３３】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸は標的遺伝子のコード領域を標的としても、あるいは標的遺伝子の非コード領域を標的としてもよい。例えば、遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによって阻害することができる。一般に、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569 84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27 36;およびMaher, L. J. (1992) Bioassays 14(12):807 15参照。
【０１３４】
本明細書に開示される核酸は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改良するために塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を作出することができる（Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1): 5 23参照）。
【０１３５】
一実施形態において、核酸分子はＰＮＡである。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup B. et al. (1996) 前掲; Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670 675に記載されているように、標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【０１３６】
ｉｉ）ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒおよび／またはステロイド産生改変Ｈ２９５細胞などのステロイド産生改変細胞を用いて内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）を同定するためのアッセイ−改変ステロイド産生アッセイ
【０１３７】
物質が内分泌系の機能を変化させ、ヒトの健康に悪影響をもたらし得るという懸念の浮上を受けて、米議会は、１９９６年の食品品質保護法において連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＦＤＣＡ）に４０８条を加える条項を含めた。ＦＦＤＣＡのこの条はＥＰＡに、
ある化学物質が、ヒトにおいて、天然に存在するエストロゲンによって生じる作用と類似の作用、または長官が指定するそのような他の内分泌作用を持ち得るかどうかを決定するために、検証済みの適当な試験系および他の科学的に関連する情報を用いてスクリーニングプログラムを開発する［２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．３４６（ｐ）］
ことを求めている。
【０１３８】
これらの要件の履行において、ＥＰＡは、化学物質がヒトおよび野生生物の内分泌系および関連の機能と相互作用する可能性を決定するためのin vitroおよびin vivoアッセイの開発と検証を行ってきた。ＥＰＡは評価プロセスにおいて２階層のアプローチを推奨している。アッセイの第１階層スクリーニングバッテリーはＥＰＡの内分泌攪乱物質スクリーニングおよび試験諮問委員会（ＥＤＳＴＡＣ）の推奨に基づき、エストロゲン、アンドロゲンおよび甲状腺ホルモン系に影響を及ぼす化学物質を同定することをねらいとする。第２階層試験は、これらのエストロゲン、アンドロゲンおよび甲状腺活性化学物質に対する影響を確認、特性決定および定量することを意図する。
【０１３９】
第１階層スクリーニングバッテリーには、Ｈ２９５Ｒヒト副腎皮質癌細胞系統を用いるＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイが含まれる(http://www.epa.gov/endo/pubs/assayvalidation/status.htm)。ＥＰＡの内分泌受容体スクリーニングプログラム（ＥＤＳＰ）は、それらの第１階層スクリーニングバッテリープログラムにこの細胞に基づくアッセイを含んでいた。さらに、このＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイは現在、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の試験法検証プログラムの最終検証段階にあり、最終的に、化学物質がステロイドホルモン合成に影響を及ぼす可能性を評価するためのＯＥＣＤ試験ガイドラインの制定に至るであろう（ＯＥＣＤ２００２）。
【０１４０】
ＥＰＡは連邦官報に、最初の第１階層スクリーニングに関して選択された農薬活性成分およびＨＰＶ／農薬不活性化学物質のリストを公表している。この最初の試験用リストは、ＴＳＣＡインベントリの活性農薬成分、ならびに化粧品および食品添加物の成分に含まれる８７，０００件という多数の化学物質から優先順位を付けたものである。
【０１４１】
本開示では、ＣＹＰ２１ＡノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統、ＣＹＰ１７Ａ１ノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統およびＣＹＰ１９Ａ１ノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統を含む、いくつかの安定な改変ステロイド産生細胞系統が開発された。本明細書では、例えば、ＣＹＰ２１ＡノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統が原型のＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイに関連する問題のいくつか（すなわち、エストラジオールの低い基底ホルモン産生）を克服することが実証され、今では、有意に改良された感度が、１７β−エストラジオールおよびテストステロンの誘導剤を検出するための細胞の特性を変化させずに、このホルモンの産生の弱い阻害剤を同定することも可能とする。従って、１７β−エストラジオールの基底産生レベルにおける増加はこのアッセイの感度を有意に改良し、様々な強度の阻害剤の同定に関する現在の限界を克服する助けとなる。
【０１４２】
安定なＣＹＰ２１ＡノックダウンＨ２９５Ｒ細胞系統は、本明細書において、内分泌攪乱化学物質の有意に改良されたスクリーニングアッセイとして開発された。親Ｈ２９５Ｒ細胞系統のゲノムに遺伝的改変が導入された。この改変は、内在するステロイド産生経路の構造を変化させずに、テストステロンおよび１７β−エストラジオールの基底産生を有意に増加させた。これらの新規なステロイド産生特性は、この新規のＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１ノックダウン細胞を、原アッセイよりも性能の良い優れたスクリーニングツールとし、これにより、ＥＤＳＰおよび他の国内および／または国際的スクリーニングプログラムの一環としての適用のために好ましいアッセイとなる。
【０１４３】
よって、別の態様において、本開示は、内分泌攪乱物質を同定するためのスクリーニングアッセイであって、
ａ）本明細書に開示されるステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５ＲまたはＨ２９５細胞を試験物質、例えば、推定ＥＤＣと接触させること、
ｂ）少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質濃度）または酵素活性のレベルを測定すること
を含んでなる、スクリーニングアッセイ（ここで、対照と比べたその少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子産物または酵素活性のレベルの変動が、その試験物質が内分泌攪乱物質であることを示す）を提供する。
【０１４４】
一実施形態において、ステロイド産生細胞は、ＪＥＧ−３細胞またはステロイド産生改変ＪＥＧ−３細胞である。一実施形態において、ステロイド産生細胞は、ＲＣ２細胞またはステロイド産生改変ＲＣ−２細胞である。
【０１４５】
一実施形態において、検出される少なくとも１つのステロイドのレベルは、細胞により培養培地に放出されるステロイドである。別の実施形態では、検出される少なくとも１つのステロイドのレベルは、細胞内にあるステロイドである。一実施形態において、少なくとも１つのステロイド産生遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質濃度）または酵素活性のレベルは細胞内レベルである。
【０１４６】
試験物質は、脊椎動物または無脊椎動物の内分泌系に影響を及ぼすと推定される任意の化学物質または物質（例えば、推定ＥＤＣ）であり得る。一実施形態において、試験物質は、工業用化学物質、医薬品、除草剤、殺真菌剤、ポリカーボネートプラスチックモノマー、農業用化学物質、抗がん剤、性交後避妊薬、合成物質、薬物、治療薬、ポリビニル添加物、有機リン系殺虫剤、ペプチドホルモン、賦形剤、医薬補助剤（pharmaceutical aid）、殺精子剤、食品、化粧品、トイレタリーおよび医薬品の保存剤、ならびに農薬共力剤から選択される。各カテゴリーの例を表３に示す。例えばＨ２９５Ｒ細胞（例えば、親または非改変細胞）を用いたステロイド産生アッセイにおける「作用タイプ」を表３に示す。
【０１４７】
表３に挙げられている物質の大部分は、Ｈ２９５Ｒ細胞を用いると、弱いエフェクターまたは陰性として分類される。よって、本開示の一態様では、本明細書に記載のステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、以下に挙げた化学物質の評価に関連する不確定性を排除する有意に改良されたスクリーニングツールを提供する。
【０１４８】
一実施形態において、少なくとも１つのステロイドは、性ステロイドである。一実施形態において、少なくとも１つのステロイドは、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロンおよびＥ２から選択される。
【０１４９】
別の実施形態では、ステロイドは、コルチコステロイドである。さらなる実施形態では、コルチコステロイドは、鉱質コルチコステロイドまたは糖質コルチコステロイドである。別の実施形態では、ステロイドは、コルチゾールまたはアルドステロンである。
【０１５０】
別の実施形態では、少なくとも１つのステロイド産生遺伝子発現産物または酵素活性は、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、３−βＨＳＤ１、３−βＨＳＤ２、１７−βＨＳＤ１、ＳｔＡＲ、ＨＭＧＲ、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、５α−レダクターゼ２、およびＳＵＬＴ１Ｅ１遺伝子発現産物または酵素活性から選択される。
【０１５１】
別の実施形態では、少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子発現産物または酵素活性のレベルの変動は、対照の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％位である。一実施形態において、この変動は、対照に比べての増加である。別の実施形態では、この変動は対照に比べての低減である。
【０１５２】
対照は、例えば、試験物質の非在下で実施される同じアッセイ（例えば、加える細胞に試験物質を添加しない）、または溶媒もしくは担体（例えば、試験物質を溶解する溶媒または担体をステロイド産生細胞に加える）である。
【０１５３】
当業者ならば、ステロイドまたはステロイド産生遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質濃度）または酵素活性のレベルを測定するために使用可能なアッセイを知っている。一実施形態では、抗体に基づく方法を用いてステロイドのレベルを直接的または競合的に検出する。一実施形態では、ステロイドレベルを検出するための抗体または他の薬剤が標識される。
【０１５４】
ステロイドレベルを検出するための抗体または他の薬剤と結合した標識は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成し得ることが好適である。例えば、標識は、放射性不透過性であるか、または、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉもしくは１３１Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光（蛍光団）もしくは化学発光（発色団）化合物；アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤であるアセチルコリンエステラーゼ；または金属イオンであり得る。
【０１５５】
別の実施形態では、検出可能なシグナルは、間接的に検出可能である。例えば、標識二次抗体を用いて、目的のステロイドを検出することができる。
【０１５６】
一実施形態において、少なくとも１つのステロイドのレベルは、ＥＬＩＳＡ（自動ＥＬＩＳＡでもよい）、免疫ブロット法または液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって検出される。ステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡレベルは、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法および／またはノーザンブロット法によって測定することができる。さらに、アレイ（例えばｍＲＮＡを検出するためのマイクロアレイを含む）を使用することもできる。分光測定法も使用可能である。ステロイド産生遺伝子のタンパク質発現レベルは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロット法によって測定することができる。さらに、ステロイド産生酵素の酵素酵素活性は、例えば、以下の実施例に記載されているように、トリチウム放出アッセイまたはＥ２の細胞取り込みおよび代謝などの基質変換アッセイを用いて測定することができる。
【０１５７】
一実施形態において、スクリーニングアッセイは、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒステロイド産生アッセイであり、ここでは、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞が本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知のステロイド産生アッセイにおいて用いられる。
【０１５８】
一実施形態において、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒステロイド産生アッセイの目的は、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞の、例えば、アンドロゲンまたはエストロゲンなどのステロイドホルモン産生に影響を及ぼす物質を検出することである。このアッセイは、試験物質を添加して少なくとも１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、６０時間および少なくとも７２時間後に培地中の例えば、エストラジオール、エストロン、アンドロステンジオン、テストステロンおよびジヒドロテストステロンの濃度を測定することによって、ステロイド産生経路の酵素を阻害する物質およびホルモン合成を担う酵素を誘導する物質を検出することができる。
【０１５９】
一実施形態において、このアッセイは、２４または４８ウェル培養プレートにて、標準的な細胞培養条件下で実施される。別の実施形態では、このアッセイはまた、６、１２、９６または３８４ウェル培養プレートにて、標準的な細胞培養条件下で実施することもできる。別の実施形態では、細胞を約２４時間馴化させ、例えば、１〜１０種類の異なる濃度に約４８時間曝す。一実施形態では、６または７種類の濃度の試験物質を３回繰り返して試験する。別の実施形態では、陰性対照および陽性対照として溶媒および既知のホルモン産生阻害剤および誘導剤を１種類、２種類または３種類の一定濃度で実施する。一実施形態において、ホルモン産生阻害剤はプロクロラズである。一実施形態において、ホルモン産生誘導剤はフォルスコリンである。曝露期間の終了時に、一実施形態では、各ウェルから培地を取り出し、培地を取り出した後に各ウェルの細胞生存率を分析する。一実施形態では、細胞状態の遡及的解析を可能とするために、細胞生存率評価の目的で培地を取り出す前に、ウェル中の細胞の顕微鏡写真を撮影する。培地中のホルモン濃度は、例えば、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗体に基づくイムノアッセイ、および当業者に公知の他の生物分析ホルモン検出アッセイ、および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）などの機器的技術を含む様々な方法を用いて測定することができる。
【０１６０】
一実施形態において、データは溶媒対照に対する変化倍率として表され、最小影響濃度(lowest observed effect concentration)（ＬＯＥＣ）、無影響濃度(no observable effect concentration)（ＮＯＥＣ）、モデル化合物に対する相対的効力、および影響濃度(effective concentration)（ＥＣ）が報告される。このアッセイが陰性であれば、試験した最高濃度が無影響濃度（ＮＯＥＣ）として報告される。一実施形態では、化学物質の、ステロイド産生に影響を及ぼす能力に関する結果は３回の独立した試験実施に基づいた。
【０１６１】
一実施形態において、ステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を２４ウェルプレートに播種する。別の実施形態では、ステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を３７℃でインキュベートして、細胞をウェルに接着させる。一実施形態において、約８、約１６または約２４時間後に、培地を新鮮培地に置き換える。次に、例えば、ＤＭＳＯ／培地ｍＬにおいて、保存溶液０．１％ｖ／ｖ（例えば、２４ウェルプレートに対して１マイクロリットル）（例えば、ウェル中）を加えることによって、細胞を試験物質に曝す。一実施形態において、溶媒対照としては、０．１％ｖ／ｖ（例えば、２４ウェルプレートに対して１マイクロリットル）ＤＭＳＯ／培地ｍＬを入れる。このプレートを場合により、３７℃で約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間または約７２時間インキュベートする。
【０１６２】
別の実施形態では、培地を取り出し、場合によりアリコートに分け、場合により＜−２０℃、＜−８０℃および＜−１９６℃で冷凍する。
【０１６３】
別の実施形態では、標準曲線を作成する。
【０１６４】
最終的なホルモン濃度を例えば、実施例７に記載のように計算する。
【０１６５】
一実施形態において、ホルモン産生の相対的増加／低減を評価するために、結果を各試験プレートの平均溶媒（ＳＣ）値に対して標準化し、その結果を各試験プレートのＳＣに対する相対的変化として表す。
【０１６６】
これらのデータが正規分布するか、または正規分布に近ければ、試験物質処理と溶媒対照の間の差をパラメトリック検定（ダネット(Dunnett)検定など）を用いて分析する。データが正規分布しない場合には、適当なノンパラメトリック検定を用いる（例えば、クラスカル・ウォリス、スティールのメニーワンランク検定(many-one rank test)）。相対的変化は例えば次のように計算する：相対的変化＝（ウェル中の濃度／同一プレート中のＳＣの平均濃度）。
【０１６７】
一実施形態において、試験物質は、その誘導倍率が、濃度応答曲線の増加部分または減少部分内に入る用量で、溶媒対照と統計学的に異なる場合に陽性である。例えば、誘導倍率における統計学的に有意な増加は、その試験物質がステロイド合成経路の１以上の酵素の誘導剤であることを示し、誘導倍率における統計学的に有意な低下は、その試験物質がステロイド産生経路の１以上の酵素の阻害剤であることを示す。
【０１６８】
ステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、例えばステロイド代謝およびステロイド細胞取り込みを評価することによってステロイド産生酵素活性を評価するステロイド産生アッセイに使用することができる。別の態様において、本開示は、ステロイドの代謝率に対する試験物質の影響をスクリーニングする方法であって、
ａ）本開示のステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５ＲまたはＨ２９５細胞を培養培地中で試験物質と接触させること；
ｂ）試験物質を除去すること（細胞を洗浄することによって除去してもよい）；
ｃ）その細胞を標識ステロイド（放射性標識ステロイドでもよい）と接触させること；
ｄ）未変化のステロイドから水溶性ステロイド代謝産物を、溶媒抽出により分離すること（ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いてもよい）；
ｅ）水溶性標識ステロイド代謝産物のレベルを検出すること；および
ｆ）ステロイド代謝率を求めること（ここで、このステロイド代謝率は、水溶性ステロイド代謝産物の形成率によって求められる）
を含んでなる方法を提供する。
【０１６９】
別の実施形態では、試験物質と放射性標識ステロイドは同時に加えられる。よって、本開示は、一実施形態において、ステロイドの代謝率に対する試験物質の影響をスクリーニングする方法であって、
ａ）本開示のステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５ＲまたはＨ２９５細胞を、試験物質とともに、標識ステロイド（放射性標識ステロイドでもよい）と接触させること；
ｂ）未変化のステロイドから水溶性ステロイド代謝産物を溶媒抽出により分離すること（ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いてもよい）；
ｃ）水溶性標識ステロイド代謝産物のレベルを検出すること；および
ｄ）ステロイド代謝率を求めること（ここで、このステロイド代謝率は、水溶性ステロイド代謝産物の形成率によって求められる）
を含んでなる方法を提供する。
【０１７０】
別の態様において、本開示は、ステロイドの細胞取り込みに対する試験物質の影響をスクリーニングする方法であって、
ａ）本開示のステロイド産生細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５ＲまたはＨ２９５細胞を培養培地中で試験物質と接触させること；
ｂ）試験物質を除去すること（細胞を洗浄することによって除去してもよい）；
ｃ）その細胞を標識ステロイド（放射性標識ステロイドでもよい）と接触させること；
ｄ）細胞外標識ステロイドを除去すること（細胞を洗浄することによって除去してもよい）；
ｅ）細胞をホモジナイズすること；および
ｆ）細胞内標識ステロイドを検出すること
を含んでなる方法（標識ステロイドの細胞取り込みが細胞ホモジネートの放射能によって評価される）を提供する。
【０１７１】
一実施形態において、試験物質と標識ステロイドは同時に加えられる。よって、一実施形態において、本開示は、ステロイドの細胞取り込みに対する試験物質の影響をスクリーニングする方法であって、
ａ）本開示のステロイド産生細胞（ステロイド産生改変Ｈ２９５ＲまたはＨ２９５細胞でもよい）を、試験物質とともに、標識ステロイド（放射性標識ステロイドでもよい）と接触させること；
ｂ）細胞外標識ステロイドを除去すること（細胞を洗浄することによって除去してもよい）；
ｃ）細胞をホモジナイズすること；および
ｄ）細胞内標識ステロイドを検出すること
を含んでなる方法（標識ステロイドの細胞取り込みが細胞ホモジネートの放射能によって評価される）を提供する。
【０１７２】
一実施形態において、Ｅ２の細胞取り込みおよび代謝に対する試験物質誘導性の影響が評価される。別の実施形態では、それらの影響が、放射性標識エストラジオールを用いて評価される(Lancon et al. 2004の改変法)。例えば、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間または少なくとも７２時間曝露した後に、ステロイド産生細胞（例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞）を２回洗浄し、その後、直接的曝露の場合には、標識ステロイドを含んでなる、例えば、１ｎＭ  ６，７［３Ｈ］−Ｅ２(Perkin Elmer, Boston, MA)を含んでなる添加培地および試験物質とともにインキュベートする。一実施形態では、ＤＭＳＯを担体溶媒として用いるが、０．１％ｖ／ｖを超えないようにする。別の実施形態では、インキュベーション後、例えば、３７℃、５％ＣＯ２で３０分のインキュベーション後に、細胞を氷上に置いて反応を停止させる。細胞培養培地を抽出のために、例えば、５００μＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に２００μＬの培地を加えことによって回収する。例えば、他所に記載されているシンチレーションによってホルモンを測定するために上清（培地）を回収する。一実施形態では、Ｅ２代謝活性を測定する。例えば、Ｅ２代謝活性は、水溶性Ｅ２代謝産物の形成率によって求められる。一実施形態において、培地を除去した後、プレート内に残った細胞を氷冷ＰＢＳバッファーで２回洗浄する。一実施形態において、溶解バッファー、例えば、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳおよび０．１％Ｎａ２ＣＯ３を含有する２５０μＬの溶解バッファーを各ウェルに加えて、例えば、室温で約１５分間、細胞を溶解させる。別の実施形態では、エストラジオールの細胞組み込みを、細胞ホモジネートの放射能によって評価する。
【０１７３】
ＩＶ．キットおよびシステム
ｉ）内分泌攪乱物質の検出キット
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される細胞と少なくとも１つのステロイドのレベルを測定するための分析物特異的検出剤とを含んでなる、内分泌攪乱物質のスクリーニング用のキットを提供する。
【０１７４】
少なくとも１つのステロイドのレベルを測定するための分析物特異的検出剤は、例えば、そのステロイドと結合する抗体、またはそのステロイドに対するＥＬＩＳＡを含んでなる。
【０１７５】
一実施形態において、キットは、少なくとも１つのステロイドのレベルを測定するための分析物特異的検出剤、またはキット対照、例えば、較正および／または比較に使用可能なエストラジオールなどの、ある量のステロイドといった標品を含んでなる。
【０１７６】
別の実施形態では、キットは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリプシン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または対照として使用することができるフォルスコリンおよび／またはプロクロラズなどのモデル化合物の１以上を含んでなる。別の実施形態では、キットは、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および／または質量分析（ＭＳ）によってステロイドレベルを検出する際に標品として用いるための既知量の１以上のステロイドを含んでなる。
【０１７７】
キットに含み得る他の品目としては、例えば、細胞生存率、遺伝子発現、および／または、酵素濃度および活性を評価するための試薬が挙げられる。
【０１７８】
遺伝子発現は、例えば、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅｃｏｎまたはＴａｑｍａｎプローブを使用）、および／またはノーザンブロット法によって測定することができる。
【０１７９】
細胞生存率アッセイでは、ＭＴＴアッセイなど、生細胞および死細胞の両方の数を定量する種々のバイオマーカー検出を用いる。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ（テトラゾールである３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）をホルマザンに還元して紫色を生じる酵素の活性測定するための、臨床検査であり、標準的な比色定量アッセイ（色の変化を測定するアッセイ）である。
【０１８０】
別の態様は、本開示のステロイド産生改変細胞、例えば、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞と好適なバッファーまたは担体とを含んでなる組成物を提供する。一実施形態において、改変細胞は凍結乾燥されている。別の実施形態では、改変細胞は冷凍され、場合により、好適なバッファーに再懸濁されている。別の実施形態では、改変細胞は培養中である。一実施形態では、好適なバッファーは細胞培養培地を含んでなる。
【０１８１】
ｉｉ）ＥＤＣの作用機序を推定するためのシステム
本開示の一実施形態において、既知の物質の存在下での本開示の改変細胞系統におけるステロイド産生の特性が、「フィンガープリント」として用いられる。このようなフィンガープリントを収容するためのデータベースが構築される。化学物質により引き起こされるステロイド産生の特性が収集された後は、試験化合物に対して「最良の一致」（これは試験化合物の作用機序を示す可能性がある）となる特性をデータベースで検索するための戦略が適用される。
【０１８２】
よって、本開示の別の態様は、未知の機構を持つ内分泌攪乱物質の作用機序を推定するシステムであって、
（ｉ）内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を受け取るコントロールモジュール（ここで、このステロイド産生特性は、内分泌攪乱物質をステロイド産生細胞、場合により、ステロイド産生改変細胞、好ましくは、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞と接触させること、およびその細胞系統によって産生された少なくとも１つのステロイドまたはステロイド産生遺伝子ｍＲＮＡ、タンパク質もしくは酵素活性のレベルを測定することによって得られる）；
（ｉｉ）複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を含んでなるデータベース；
（ｉｉｉ）その内分泌攪乱物質のステロイド産生特性と複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性を比較するため、およびその内分泌攪乱物質のステロイド産生特性と複数の参照内分泌攪乱物質のステロイド産生特性との最良の一致を同定するための分析モジュール
を含んでなるシステム（ここで、最良に一致した参照内分泌攪乱物質の作用機序がその内分泌攪乱物質の作用機序であると推定される）を提供する。
【実施例】
【０１８３】
以下の限定されない例は本開示の例示である。
実施例１
Ｅ２の基底産生の測定の精度および精密性を高めるとともに、化学物質の阻害作用を検出するため、または化学物質間をより良く識別するためにより高い感度を可能とする方法が必要とされる。この目標を達成するために、２つのアプローチを考え、適用した。１つ目は、ＥＬＩＳＡおよびＬＣ／ＷＳ−ＭＳのＬＯＱを低減するためのものであった。両方法とも改良が達成されたが、この改良は十分でないと思われ、これらの手順はより多くの時間を浪費させるものであった。考えられたもう１つのアプローチは、培地に放出されるＥ２の産生を高めるためのものであった。
【０１８４】
プロゲステロンおよび１７α−ヒドロキシプロゲステロンは、鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド、ＴおよびＥ２の共通の前駆体である（図１）。ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２１）は、プロゲステロンおよび１７α−ヒドロキシプロゲステロンをそれぞれ１１−デオキシコルチコステロン（鉱質コルチコイド経路）および１１−デオキシコルチゾール（糖質コルチコイド経路）に変換することによる、鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイドの生合成に不可欠な酵素である(Sasano et al, 1988)。これらの前駆体は次に、アルドステロンシンセターゼ（ＣＹＰ１１Ｂ２）およびステロイド１１ｂ−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ１１Ｂ１）によってそれぞれ生物学的に活性なホルモンであるアルドステロンおよびコルチゾールに変換される。ＣＹＰ２１遺伝子の遺伝的阻害は鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイドの生合成を低減し、網状帯経路のためにより多くの基質を蓄積し、これがＨ２９５Ｒ細胞による着目するステロイドホルモン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストロンおよびＥ２のより多量の産生をもたらすはずであると仮定された。このような阻害はこれらのホルモンの測定の精度および精密性を改善し、Ｈ２９５Ｒ細胞をステロイドホルモンの産生および代謝に対する化学物質の阻害作用を決定するのにより高感度とするであろう。この仮説を検証するために、以下の実験を行った：１）Ｈ２９５Ｒ細胞においてｓｉＲＮＡの使用によりＣＹＰ２１Ａ２遺伝子を遺伝的に阻害し、ＣＹＰ２１Ａ２の発現がノックダウンされた安定なＨ２９５Ｒを開発する；２）新たなＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン（Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ）細胞を特性決定する、３）ステロイドホルモン、特にＥ２の産生を、培地中のＣＹＰ２１Ａ２タンパク質の量およびステロイドホルモン濃度の双方を測定することによって、親Ｈ２９５Ｒ細胞の場合と比較する。これらの結果を、以下のいくつかの実施例に記載する。
【０１８５】
細胞系統の作出法
構築物
ｓｈＲＮＡ構築物は、２１塩基対のセンスおよびアンチセンスステムのヘアピンと６塩基対のループを含むように設計された。各ヘアピン配列をレンチウイルスベクターにクローニングし、配列を確認した。標的遺伝子の十分なカバレッジを確保するために一遺伝子につき複数の構築物を作出した。ルールに基づくｓｈＲＮＡ設計は、効率的な遺伝子ノックダウンを可能とする。レンチウイルスベクターは、細胞におけるｓｈＲＮＡ構築物の一貫した高い発現を可能とし、安定な選択を可能とするために抗生物質耐性マーカーを含む。ヒトＣＹＰ２１Ａ２  ｐＬＫＯ．１レンチウイルスｓｈＲＮＡベクターはThermo Scientific Open Biosystems社 (Huntsville, AL USA)に発注した。ｓｈＲＮＡ分子の配列はオンラインで入手可能である(http://www.openbiosystems.com)。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）またはｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピン）は最近開発の進んだ技術であり、下記のような多くの他の企業も類似の製品を提供している。
・Santa Cruz Biotechnology社(www.scbt.com)
・Ambion社(www.ambion.com)
・Invitrogen社(www.invitrogen.com)
・Signosis BioSignal Capture社(www.signosisinc.com)
【０１８６】
細胞培養およびトランスフェクション
Ｈ２９５Ｒ細胞(ATCC社, Beltsville, MD)の培養および維持は従前に記載されているプロトコールに従った(Hecker et al. 2006; Hilscherova et al. 2004; Zhang et al. 2005)。要するに、Ｈ２９５Ｒ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、ハムの栄養混合物Ｆ−１２(Sigma社, St. Louis, MO)を１ｍｌ／１００ｍｌ  ＩＴＳ＋プレミックス(BD Bioscience社, San Jose, CA)および２．５％ＢＤ  Ｎｕ−Ｓｅｒｕｍ(BD Bioscience社, San Jose, CA)を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。トランスフェクションのために、細胞を６ウェルプレートに播種し、Ａｒｒｅｓｔ−Ｉｎトランスフェクション試薬(Thermo Scientific Open Biosystems社, Huntsville, AL USA)により、ヒトＣＹＰ２１Ａ２  ｐＬＫＯ．１レンチウイルス短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）(Thermo Scientific Open Biosystems社, Huntsville, AL USA)で５時間トランスフェクトした。培養２日後に、トランスフェクト細胞を、０．４μｇ／ｍＬピューロマイシン(Sigma社, St. Louis, MO)を含有する培養培地を用い、長期選択期間（＞３週間）選択した。生存細胞を増殖させ、種々のステロイドの産生を試験した。
【０１８７】
１．ホルモン測定
ステロイドの機器検出のために、培養培地サンプルを酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ、５０／５０）で抽出し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。抽出前にサンプルにサロゲート重水素化標品であるエストロン−ｄ４、エストラジオール−ｄ４、テストステロン−ｄ５、アンドロステンジオン−ｄ７、プロゲステロン−ｄ９、１７αＯＨプロゲステロン−ｄ８、２１αＯＨプロゲステロン−ｄ８およびコルチゾール−ｄ４を添加した。Ｃ−ｄ４はCambridge社(Andover, MA, USA)から供給され、他の標識標品はC/D/N Isotope社(Pointe-Claire, Quebec, Canada)から供給されたものである。試験化学物質（例えば、試験物質）はSigma社から入手した。Ｅ１およびＥ２の場合には、移動相はアセトニトリルおよび水中０．１％ギ酸からなった。他の総てのホルモンの場合には、クロマトグラフィーは超純粋およびメタノールを用いて行った。サンプル抽出液を１００ｍｍ×２．１ｍｍ  Thermo Scientific Betasil C１８カラム（孔径５μｍ）により分離した後、三連四重極タンデム質量分析計(Waters, USA)により分析した。データは総てＡｎａｌｙｓｔソフトウエア、Ｖｅｒ．１．４．１(ABI-Sciex社製)を用いて取得および処理した。
【０１８８】
テストステロンおよびエストロゲンのＥＬＩＳＡ測定は従前に記載されているように行った(Hecker et al. 2006)。要するに、ホルモンをジエチルエーテル（５ｍｌ）で２回抽出し、溶媒を窒素流下で蒸発させた。残渣をＥＬＩＳＡアッセイバッファーに溶かし、生産者の推奨(Cayman Chemical Company社, Ann Arbor, Ml; テストステロン［カタログ番号５８２７０１］、１７β−エストラジオール［カタログ番号５８２２５１］)を用いて競合的ＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０１８９】
２．統計分析
統計学的比較を行う前に、シャピロウィルク（Shapiro-Wilkes）検定およびを確率プロット用いてデータの正規性を検定した。必要に応じて、正規性に近づけるために値を対数変換した。２サンプルの比較をスチューデント(Student)のｔ検定を用いて行った。線形回帰モデルを用いて、２つの細胞系統の、化学物質曝露に応答したホルモン産生を比較した。Ｒプロジェクト言語(http://www.r-project.org/)を用いて統計学的分析を行った。ｐ＜０．０５での差を統計学的に有意であると見なした。
【０１９０】
ウエスタンブロット法
総タンパク質濃度を決定した後、細胞溶解液のアリコートを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動に付した後、従前に記載されているように(Zhang et al. 2009)、孔径０．４５μｍのニトロセルロース膜上に電気ブロットした。このニトロセルロース膜を脱脂乳中でブロッキングした後、ヤギ抗ヒトＣＹＰ２１Ａ２（Ｃ−１７）抗体(Santa Cruz Biotechnology社, USA)とともにインキュベートした。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット(Amersham社製)を用い、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させた抗ウサギＩｇＧによって免疫ブロットを検出し、VersaDoc Imaging System 4000 (BioRad社, CA, USA)を用いて可視化した。
【０１９１】
結果
安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞系統の確立
ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞系統であるＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤを、選択マーカーを有するヒトＣＹＰ２１Ａ２  ｐＬＫＯ．１レンチウイルスｓｈＲＮＡプラスミド構築物を用いることにより作出した。安定なトランスフェクトコロニーを、ピューロマイシンを用いて選択した後、さらに増殖させた。安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤのピューロマイシン耐性は複数回の凍結−解凍サイクルの後にも保存されており、これにより、ｓｉＲＮＡを有するプラスミドによる安定なトランスフェクションが確認された。ＣＹＰ２１Ａ２のノックダウンは、ウエスタンブロット法によって確認した（図２）。ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質レベルは、安定なノックダウン細胞系統では親Ｈ２９５Ｒ細胞の４８％であった。培養培地中の種々のステロイド濃度を機器で測定したところ、両細胞系統とも、４８時間以内のインキュベーションでは同等のプロゲステロンレベルを生じることが示された。安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞系統は、非改変Ｈ２９５Ｒ細胞よりも約１０倍高いＴおよび１５倍高いＥ１およびＥ２を産生した（表４）。
【０１９２】
Ｈ２９５Ｒ細胞は、化学物質により誘導されるステロイド産生に対する影響を評価するためのin vitroアッセイにおいて最良のものの１つとして特定されており、Ｅ２の産生を増大させた化学物質を検出するのに極めて効果的であったが、Ｅ２の産生低下を検出するその能力は限定されていた。これは、最も効力の高いエストロゲンＥ２が、標準的な培養条件下のＨ２９５Ｒ細胞によって比較的低濃度（細胞培養培地中で約１０〜５０ｐｇ／ｍｌ）で検出されるということによるものであった。現行のＥＬＩＳＡおよびＬＣ／ＭＳ−ＭＳによるＥ２のＬＯＱはおよそ２〜１０ｐｇ  Ｅ２／ｍｌであるので、Ｅ２の産生の低下を正確に測定するのは困難であった。また、ＬＯＱ付近に見られる大きなばらつきが、化学物質によるＥ２産生の阻害を検出するためのＨ２９５Ｒアッセイの感度をさらに低下させていた。従って、Ｅ２の基底産生の増大が、Ｈ２９５Ｒアッセイの感度ならびに精度および正確性を高めるのに有用であると思われた。
【０１９３】
ＣＹＰ２１Ａは、小胞体に局在し、ステロイドの２１位をヒドロキシル化するタンパク質である。その活性はコルチゾールおよびアルドステロンを含むステロイドホルモンの合成に必要とされる。ヒトゲノムには２つのＣＹＰ２１Ａ遺伝子が存在し、それぞれＣＹＰ２１Ａ１ＰおよびＣＹＰ２１Ａ２である。ヒトＣＹＰ２１Ａ１は偽遺伝子であり、そのタンパク質コード能を喪失している。ヒトＣＹＰ２１Ａ２はシトクロムＰ４５０ファミリー２１の酵素をコードし、この遺伝子の突然変異は、先天性副腎過形成を引き起こすが、これは、副腎ステロイド生合成の欠陥によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、糖質コルチコイドの減少とアンドロゲン産生の増加を招く(Merino et al., 2007)。安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞は、内在するステロイド産生経路の構造を変化させずに、またはモデルＥＤＣに対する応答パターンを変化させずに、Ｅ２産生の低下を検出するためのＨ２９５Ｒ細胞の有用性を著しく改善する。よって、Ｈ２９５Ｒ細胞による基底Ｅ２産生の制限を克服する安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞は感度を向上させ、今では、Ｅ２産生の弱い阻害剤を検出することが可能である。新たに開発されたＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞は、原Ｈ２９５Ｒ細胞よりも性能が良く、これらのノックダウン細胞をＥＤＳＰならびに他の国内および／または国際的なスクリーニングプログラムの一環として適用するのに好ましいものとする優れたスクリーニングツールである。
【０１９４】
図２  安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞および非改変Ｈ２９５Ｒ細胞におけるヒトＣＹＰ２１Ａ２タンパク質発現のウエスタンブロット解析。同じプロットメンブランで検出した無関連のＣＹＰ１１Ａタンパク質を参照として用いた。示された値は平均＋／−標準偏差である。
【０１９５】
実施例２
ステロイド産生に重要な他の酵素の遺伝子ノックダウン
種々のホルモンの産生に対する遺伝子ノックダウンを検討するため、実施例１に記載の方法を用いて、表１に挙げられた、ＥＤＣを評価するのに役立ち、かつ、内分泌攪乱物質による酵素阻害をシミュレートするためのモデルとして役立ち得るノックダウン細胞系統を作出した。これらの細胞系統を作出するために用いたｓｈＲＮＡ核酸を表２に挙げる。予測される細胞特性を表５に挙げる。ＣＹＰ１９Ａ１  ＫＤおよびＣＹＰ１７Ａ１  ＫＤに関して細胞特性を確認した。ＣＹＰ１９Ａ  ＫＤは、エストラジオールの代謝産物であるエストロン（Ｅ１）の産生が低いことが確認され、予測されるようにＥ１およびＥ２レベルが低減されていることが示唆された。ＣＹＰ１７Ａ  ＫＤは、２１ａヒドロキシプロゲステロンの産生が増加し、１７ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステンジオン、テストステロンおよびエストロンの産生が低下していることが確認され、予測されたように増加したプロゲステロン産生および低下した性ステロイド産生が確認された。
【０１９６】
これらの細胞系統を数学的・統計学的モデルに組み込んで環境化学物質の内分泌攪乱効力を評価した(Zhang, X., Newsted, J. L, Hecker, M., Higley, E. B., Jones, P. D., and Giesy, J. P. (2009). Classification of chemicals based on concentration-dependent toxicological data using ToxClust. Environ. Sci. Technol. 43(10), 3926-3932)。
【０１９７】
実施例３
多重遺伝子ノックダウン
実施例１に記載したものと類似の方法を用いれば、多重遺伝子ノックダウンを有するステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を作出することができる。ノックダウンされる遺伝子には、例えば表１に挙げられている任意の２以上の遺伝子が含まれる。トランスフェクションのため、細胞を６ウェルプレートに播種し、複数のｓｈＲＮＡ構築物を有する単一のベクターで５時間トランスフェクトする。培養２日後、トランスフェクションした細胞を、０．４μｇ／ｍＬピューロマイシン(Sigma社, St. Louis, MO)を含有する培養培地を用い、長期選択期間（＞３週間）選択する。生存細胞を増殖させ、種々のステロイドの産生を試験する。
【０１９８】
一例として、Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２＆ＳＵＬＴ１Ｅ１ノックダウン細胞は、ＣＹＰ２１Ａ２とＳＵＬＴ１Ｅ１のタンパク質発現をノックダウンすることをねらいとする。ＳＵＬＴ１Ｅ１は、エストロゲンの硫酸抱合を触媒するスルホトランスフェラーゼ酵素である。ＣＹＰ２１Ａ２とＳＵＬＴ１Ｅ１の両者の同時ノックダウンは、基底性ステロイド産生をさらに上昇させ、それにより、内分泌攪乱物質の検出におけるステロイド産生アッセイの感度を高めることができる。
【０１９９】
実施例４
ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を用いたステロイド産生アッセイ
Ｈ２９５Ｒヒト副腎皮質癌細胞系統は、ステロイドホルモンの合成および変換に関与する総ての遺伝子を同時に発現することから、副腎に対する化学物の影響および全般的なステロイド産生プロセスを調べるためのin vitroアッセイに有用であると提案されていた。Ｈ２９５Ｒステロイド産生アッセイは、ＵＳＥＰＡによって開発された階層的スクリーニングアプローチにおける使用がすでに認可されている。これは、ＥＰＡ内分泌攪乱物質スクリーニングプログラム（ＥＤＳＰ）の現第Ｉ階層試験において化学物質の内分泌攪乱作用に関して化学物質を試験するために認可されたものであり、現在、国際標準アッセイとして、ＯＥＣＤによる検証の最終段階にある。現行のアッセイのエンドポイントは、テストステロンおよび１７β−エストラジオールの２つの性ホルモンの産生であるが、ステロイド産生遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する作用もエンドポイントとして用いられていた。しかしながら、１７β−エストラジオール（Ｅ２）は比較的低濃度（細胞培養培地中で約１０〜５０ｐｇ／ｍｌ）で産生され、自動ＥＬＩＳＡ法による測定が困難である。従って、鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイドを合成するために性ホルモンであるプレグネノロンおよびプロゲステロンの同じ前駆体を使用できるＣＹＰ２１Ａ２の発現を遺伝的に低減することによってテストステロン、エストロンおよびＥ２の内因性産生が増強されたＨ２９５Ｒ細胞のノックダウン型。得られた安定なＨ２９５Ｒ  ＣＹＰ２１Ａ２ノックダウン（Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ）細胞系統は、この培養培地において、親Ｈ２９５Ｒ細胞の１０倍を超える高い濃度のステロイドホルモンであるテストステロン、エストロンおよび１７βエストラジオールを生じるが、プロゲステロンは親Ｈ２９５Ｒ細胞と同レベルである。さらに、安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞は、誘導剤（フォルスコリン）および阻害剤（プロクロラズ）に対して非改変Ｈ２９５Ｒ細胞と同じ応答を示した。さらに、他のステロイド産生経路酵素の低減された発現を含んでなる他の安定なステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞系統も構築された。従って、安定なステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞は、非改変Ｈ２９５Ｒ細胞に比べて精度および精密性の双方を高めることによって、ユニークな、有意に改善されたスクリーニングアッセイを提供する。
【０２００】
モデル化学物質、例えば、フォルスコリンおよびプロクロラズ
化学物質曝露
細胞を、２４ウェル細胞培養プレート(COSTAR社, Bucks, UK)中でモデル化学物質に曝した。１ｍｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、細胞を２４〜４８時間培養した。細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO）に溶かした化学物質に曝した。フォルスコリン（ＦＯＲ）はSigma Chemical社(St. Louis, MO, USA)から入手し、プロクロラズ（ＰＲＯ）はAldrich社(St. Louis, MO, USA)から購入した。４８時間後に各ウェルから培養培地を採取し、測定するまで−８０℃で保存した。
【０２０１】
結果
化学物質曝露
非改変Ｈ２９５Ｒ細胞および安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞を数種類の濃度のフォルスコリンおよびプロクロラズに４８時間曝し、培養培地において種々のステロイドの濃度を測定した。Ｈ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞は、化学物質曝露に対して非改変Ｈ２９５Ｒ細胞と同等の倍率の変動応答を示した（図３）。０．１μΜ〜１０μΜのプロクロラズに曝すと、Ｈ２９５Ｒ細胞およびＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞の双方で用量依存的にプロゲステロン産生濃度が高まった。両細胞種において、Ｔ、Ｅ１およびＥ２の産生はプロクロラズによって阻害された。これら２つの細胞種では、フォルスコリンによってＴ、Ｅ１およびＥ２濃度においてもまた、匹敵する上昇が見られた。線形回帰モデルを用いたさらなる解析によれば、安定なＨ２９５Ｒ／ＣＹＰ２１Ａ２−ＫＤ細胞系統において測定された４つのステロイド総ての濃度が、非改変Ｈ２９５Ｒ細胞での濃度と有意に相関していることが示唆された（図４）。
【０２０２】
考察
物質が内分泌系の機能を変化させ、ヒトの健康に悪影響をもたらし得るという懸念の浮上を受けて、多くの国および国際機関が潜在的内分泌攪乱物質（ＥＣＤ）を試験および評価するための戦略を打ち出した。ＵＳＥＰＡは、化学物質がヒトおよび野生生物の内分泌系および関連の機能と相互作用する可能性を決定するためのin vitroおよびin vivoアッセイの開発と検証を行ってきた。ＥＰＡは評価プロセスにおいて２階層のアプローチを推奨している。アッセイの第１階層スクリーニングバッテリーはＥＰＡの内分泌攪乱物質スクリーニングおよび試験諮問委員会（ＥＤＳＴＡＣ）の推奨に基づき、エストロゲン、アンドロゲンおよび甲状腺ホルモン系に影響を及ぼす化学物質を特定することをねらいとする。第２階層試験は、これらのエストロゲン、アンドロゲンおよび甲状腺活性化学物質に関する影響を確認、特性決定および定量することを意図する。第１階層スクリーニングバッテリーには、Ｈ２９５Ｒヒト副腎皮質癌細胞系統を用いるＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイが含まれる。さらに、このＨ２９５Ｒステロイド産生アッセイは現在、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の試験法検証プログラムの最終検証段階にあり、最終的に、化学物質がステロイドホルモン合成に影響を及ぼす可能性を評価するためのＯＥＣＤ試験ガイドラインの制定に至るであろう。
【０２０３】
実施例５
他の２つのノックダウン細胞系統ＣＹＰ１７Ａ−ＫＤおよびＣＹＰ１９Ａ−ＫＤのステロイド産生レベルを試験した（図５参照）。ＣＹＰ１７Ａは、プロゲステロンを１７ａヒドロキシプロゲステロンに変換する酵素であり、１７ａヒドロキシプロゲステロンからアンドロステンジオンへの変換も触媒する。図５に示されるように、Ｈ２９５ＲにおけるＣＹＰ１７Ａのノックダウンは、１７ａヒドロキシプロゲステロン産生とアンドロステンジオン産生の双方が対照に比べて有意に低下するという好都合の結果をもたらした。他方、２１ａヒドロキシプロゲステロンの産生は有意に増強された。ＣＹＰ１９Ａ−ＫＤ  ｈ２９５Ｒ細胞では、エストロンのレベルは、対照細胞系統に比べて有意に低かった。
【０２０４】
これらのＫＤ細胞系統の双方において、好都合の特性が達成された。ステロイド産生特性は、化学物質を試験し、化学物質に誘導されるステロイド産生経路に対する影響を推定するのに大きな価値を持つ。
【０２０５】
実施例６
他の２つの異なるステロイド産生細胞系統ＪＥＧ−３およびＲ２Ｃにおけるステロイドの基底産生については最近、決定された。ＪＥＧ−３およびＲ２Ｃ細胞は、Ｈ２９５Ｒ細胞に比べて高いレベルのエストラジオール（Ｅ２）を分泌する（表６参照）。Ｒ２Ｃ細胞はまた、高いレベルの１７ａヒドロキシプロゲステロンも分泌する。これらの細胞系統はまた、１以上のステロイド産生遺伝子の発現をノックダウンするために、本明細書に記載される方法に従ってさらに改変することができる。改変または非改変Ｒ２Ｃおよび／またはＪＥＧ−３細胞は、例えば、本明細書に記載される方法において改変Ｈ２９５Ｒ細胞の代わりに使用することができる。
【０２０６】
実施例７
Ｈ２９５、Ｈ２９５Ｒまたはステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を用いたステロイドの細胞取り込みおよび代謝を検出する方法
化学物質により誘導される、Ｅ２の細胞取り込みおよび代謝に対する影響は放射性標識エストラジオールを用いて評価される（Lancon et al. 2004の改変)。４８時間曝露の後、ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を２回洗浄した後、１ｎＭ  ６，７［３Ｈ］−Ｅ２(Perkin Elmer社, Boston, MA)および直接曝露の場合には化学物質を含有する添加培地０．２５ｍｌとともにインキュベートする。ＤＭＳＯを担体溶媒として用いるが、０．１％ｖ／ｖを超えないようにする。３７℃、５％ＣＯ２で３０分インキュベートした後、細胞を氷上に置いて反応を停止させる。抽出のために、細胞培養培地を５００μＬのＤＣＭに２００μＬの培地を加えことによって回収する。ボルテックスにかけた後、１００μＬの上清（培地）を、上記のようにシンチレーション測定のために回収する。Ｅ２代謝活性を、水溶性Ｅ２代謝産物の形成率によって求める。培地を除去した直後に、プレート内に残った細胞を氷冷ＰＢＳバッファーで２回洗浄する。０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳおよび０．１％Ｎａ２ＣＯ３を含有する２５０μＬの溶解バッファーを各ウェルに加え、室温で約１５分間、細胞を溶解させる。エストラジオールの細胞組み込みを、細胞ホモジネートの放射能によって評価する。
【０２０７】
実施例８
ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒステロイド産生アッセイ
ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒステロイド産生アッセイの目的は、例えば、アンドロゲンまたはエストロゲンなどのステロイドホルモンの産生に影響を及ぼす物質を検出することである。このアッセイは、ステロイド産生経路の酵素を阻害する物質およびホルモン合成を担う酵素を誘導する物質を検出することができる。
【０２０８】
このアッセイは、２４ウェル培養プレートにて、標準的な細胞培養条件下で実施される。細胞を約２４時間馴化させ、６種類の濃度の試験物質に４８時間曝し、３回繰り返した。陰性対照および陽性対照として溶媒および既知のホルモン産生阻害剤および誘導剤を一定濃度で実施する。曝露期間の終了時に、各ウェルから培地を取り出す。培地を取り出した後に各ウェルの細胞生存率または細胞傷害性を分析する。培地中のホルモン濃度は、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡなどの生物分析的なイムノアッセイ、および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）などの機器的技術を含む様々な方法を用いて測定することができる。データは溶媒対照に対する変化倍率および最小影響濃度（ＬＯＥＣ）として表される。このアッセイが陰性であれば、試験した最高濃度が無影響濃度（ＮＯＥＣ）として報告される。化学物質の、ステロイド産生に影響を及ぼす能力に関する結果は３回の独立した試験実施に基づくべきである。溶解度もしくは細胞傷害性の問題が見られる場合、または化学物質の活性が試験濃度範囲の終端にあると思われる場合には、１回目の試験は、次に２回目および３回目の濃度を調節して行えるよう、範囲調節をする実施として働き得る。
【０２０９】
ステロイド産生改変Ｈ２９５Ｒ細胞を２４ウェルプレートに播種し、３７℃でインキュベートして、細胞をウェルに接着させる。２４時間後に、培地を新鮮培地に置き換える。ＤＭＳＯ中の保存溶液１マイクロリットル／培地ｍＬを加えることによって、細胞を試験物質に曝す。溶媒対照としては、１マイクロリットルのＤＭＳＯ／培地ｍＬを入れる。このプレートを３７℃で４８時間インキュベートする。
【０２１０】
培地を取り出し、場合によりアリコートに分け、場合により冷凍する。
【０２１１】
各曝露プレートに関して細胞生存率を求める。
【０２１２】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはＬＣ−ＭＳなどの種々のホルモン検出系の１つを用いてホルモンを分析する。
【０２１３】
標準曲線を作成する。
【０２１４】
最終ホルモン濃度を例えば以下のように算出する。
例：
抽出：  ４５０マイクロリットル
再構成：  ２５０ｍＬアッセイバッファー
アッセイにおける希釈率：  １：１０（サンプルを標準曲線の直線範囲に入るようにする）
アッセイにおけるホルモン濃度：  １５０ｐｇ（すでに終濃度／ｍｌに調整）
回収率：  ８９％
最終ホルモン濃度＝（ホルモン濃度（ｍＬあたり）／回収率）（希釈率）
最終ホルモン濃度＝（１５０ｐｇ×（２５０マイクロリットル／４５０マイクロリットル）×１０／０．８９＝９３６．３３ｐｇ／ｍＬ
【０２１５】
ホルモン産生における相対的増加／低減を評価するためには、結果を各試験プレートの平均溶媒（ＳＣ）値に対して標準化すべきであり、結果を各試験プレートにおけるＳＣに対する相対的変化として表す。
【０２１６】
各ウェルの平均応答は、生細胞数のばらつきにより生じ得る差を標準化するために、同じウェルで測定された相対的細胞生存率で割るべきである。データが正規分布しているか、正規分布に近ければ、試験物質処理と溶媒対照間の差を、パラメトリック検定（ダネット検定など）を用いて分析すべきである。データが正規分布していなければ、適当なノンパラメトリック検定を用いるべきである（例えば、クラスカル・ウォリス、スティールのメニーワンランク検定）。相対的変化は、相対的変化＝（ウェル中の濃度／同じプレートのＳＣの平均濃度）として算出すべきである。
【０２１７】
試験物質は、その誘導倍率が、濃度応答曲線の増加部分または減少部分内に入る用量で、溶媒対照と統計学的に異なる場合に陽性である。誘導倍率における統計学的に有意な増加は、その試験物質がステロイド合成経路の１以上の酵素の誘導剤であることを示し、誘導倍率における統計学的に有意な低下は、その試験物質がステロイド産生経路の１以上の酵素の阻害剤であることを示す。
【０２１８】
本開示を、現在のところ好ましいと考えられることに関して記載してきたが、本開示は開示されている例に限定されないと理解されるべきである。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および等価な構成を包含することを意図する。
【０２１９】
総ての刊行物、特許および特許出願は、個々の各刊行物、特許または特許出願が引用することによりその全内容が組み込まれることが具体的かつ個々に示された場合と同程度に、引用することによりその全内容が組み込まれる。
【０２２０】
【表１】
2013504333.tif 000033
【０２２１】
【表２】
2013504333.tif 000034
【０２２２】
【表３】
2013504333.tif 000035
2013504333.tif 000036
2013504333.tif 000037
2013504333.tif 000038
2013504333.tif 000039
【０２２３】
【表４】
2013504333.tif 000040
【０２２４】
【表５】
2013504333.tif 000041
【０２２５】
【表６】
2013504333.tif 000042
【０２２６】
参考文献
2013504333.tif 000043
2013504333.tif 000044
【図１】
2013504333.tif 000060
【図３】
2013504333.tif 000061
【図４】
2013504333.tif 000062
【図５】
2013504333.tif 000063
【図２】
2013504333.tif 000064
【配列表】
2013504333000001.app
【国際調査報告】
2013504333.tif 000065
2013504333.tif 000066