(57)【要約】  本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、特にＭＳ２  ＶＬＰを含むＶＬＰでペプチドディスプレイ価数を制御するためのシステム及び方法に関する。この方法では、大量の野生型及び少量の一本鎖二量体コートタンパク質を、単一のＲＮＡから生成できる。価数は、単一のＲＮＡから大量の野生型及び少量の一本鎖二量体コーティングタンパク質の産生を可能にするシステムを提供することによって免疫原（ワクチン）産生において制御され、これによってＶＬＰ、特にＭＳ２  ＶＬＰで広い範囲にわたって、１粒子当たり平均で１未満から９０程度まで、提示（ディスプレイ）価数レベルの容易な調節が可能になる。これによって、低い価数を示すＶＬＰを含めて、免疫原及びワクチンの産生が容易になる。ウイルス様粒子の発現に有用な核酸構築物が開示されて、これは異種ペプチドの挿入によって改変されるＭＳ２のコートポリペプチドから構成され、ここでこの異種ペプチドは、ウイルス様粒子上で提示され、ＭＳ２  ｎｉＲＮＡをカプシドで包む。異種ペプチドであって、ウイルス様粒子上で提示され、ＰＰ７  ｍＲＮＡをカプシドで包む異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドから構成されるウイルス様粒子の発現において有用な核酸構築物もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の集団であって、それぞれのＶＬＰは、（ａ）ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰであり、前記ＶＬＰの一部は、（ｂ）異種ペプチドの挿入によって改変された前記ＲＮＡバクテリオファージのコートポリペプチドの一本鎖二量体を含み、前記二量体は、上流及び下流のサブユニットを含み、前記異種ペプチドは、前記ＶＬＰに提示されかつ（ｃ）前記バクテリオファージのｍＲＮＡをカプシドで包み、前記ＶＬＰは低い価数を示す、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の集団。
【請求項２】
前記異種ペプチドが少なくとも４アミノ酸長である、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記バクテリオファージの複数の前記コートポリペプチドが、野生型コートポリペプチドであり、残りの前記コートポリペプチドが、異種ペプチドを含む前記コートポリペプチドの一本鎖二量体を含み、前記バクテリオファージが、ＭＳ２及びＰＰ７からなる群より選択される、請求項１に記載の集団。
【請求項４】
前記異種ペプチドが、前記コートポリペプチドの下流サブユニット中のＡＢループでの部位又は前記ＲＮＡバクテリオファージのコートポリペプチドのカルボキシ末端での部位に挿入される、請求項１に記載の集団。
【請求項５】
前記異種ペプチドが、前記ＲＮＡバクテリオファージのコートポリペプチドのカルボキシ末端に対応する部位に挿入される、請求項４に記載の集団。
【請求項６】
前記ＲＮＡバクテリオファージが、ＭＳ２又はＰＰ７、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ、ＰＰ７、ＧＡ、Ｍ１１、ＭＸ１、ＡＰ２０５、ＰＲＲ１、ｆ４、Ｃｂ５、Ｃｂ１２ｒ、Ｃｂ２３ｒ、７ｓ及びｆ２からなる群より選択される、請求項１に記載の集団。
【請求項７】
前記コートポリペプチドが一本鎖二量体であり、前記コートポリペプチドの下流のコピーが、少なくとも４アミノ酸長を有する異種ペプチドの挿入によってＡＢループ中で改変される、請求項１に記載の集団。
【請求項８】
前記ＶＬＰで前記異種ペプチドの１コピーから１０コピーまでの間のコピーが提示される、請求項１に記載の集団。
【請求項９】
前記ＶＬＰで前記異種ペプチドの１コピーから５コピーまでの間のコピーが提示される、請求項１に記載の集団。
【請求項１０】
前記ＶＬＰで前記異種ペプチドの１コピーより少ないコピーが提示される、請求項１に記載の集団。
【請求項１１】
前記異種ペプチドが、前記二量体タンパク質のカルボキシ末端に、又は
（ａ）ＭＳ−２、Ｒ−１７及びｆｒコートポリペプチドのアミノ酸１１〜１７、
（ｂ）ＧＡコートポリペプチドのアミノ酸１０〜１６、
（ｃ）Ｑβ及びＳＰコートポリペプチドのアミノ酸１０〜１７、
（ｄ）ＰＰ７コートポリペプチドのアミノ酸８〜１１、
（ｅ）ＰＲＲ１コートポリペプチドのアミノ酸９〜１７
に対応する前記コートタンパク質のＡＢ−ループ中の部位に挿入される、請求項４に記載の集団。
【請求項１２】
細菌又はバクテリオファージプロモーターと、
上流サブユニット及び下流サブユニット、前記下流サブユニットに配置される異種ペプチドの挿入のための部位を含むＲＮＡバクテリオファージ一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と、
前記コートタンパク質の下流サブユニットの第一のアミノ酸をコードするコドンを置き換える終止コドンと、
細菌又はバクテリオファージターミネーターと、
を含む、単離された転写単位。
【請求項１３】
アラニン挿入サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の転写単位。
【請求項１４】
前記プロモーターがバクテリオファージプロモーターであり、前記ターミネーターがバクテリオファージターミネーターである、請求項１２又は１３に記載の単離された転写単位。
【請求項１５】
前記異種ペプチドの挿入のための部位が制限酵素部位である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の単離された転写単位。
【請求項１６】
一本鎖二量体が、改変された一本鎖コートポリペプチド二量体であり、前記改変が、前記挿入部位に挿入されている異種ペプチド配列を少なくとも４アミノ酸含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の単離された転写単位。
【請求項１７】
前記転写単位が、翻訳オペレーター配列を含まない、請求項１２に記載の単離された転写単位。
【請求項１８】
前記転写単位が、翻訳オペレーター配列を含む、請求項１２に記載の単離された転写単位。
【請求項１９】
前記終止コドンが、アンバー（ＵＡＧ）、オパール（ＵＧＡ）又はオーカー（ＵＡＡ）終止コドンである、請求項１２〜１８のいずれかに記載の単離された転写単位。
【請求項２０】
バクテリオファージプロモーターを含む単離された転写単位であって、ＲＮＡバクテリオファージ一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、前記二量体の下流半分において前記コード配列中の異種ペプチドの挿入のための部位を有し、前記コード配列が、前記二量体の上流半分におけるコドンジャグリングされた配列と、必要に応じてバクテリオファージターミネーターとを含む、単離された転写単位。
【請求項２１】
前記コドンジャグリングされたコード配列が、前記二量体の上流半分に挿入された複数のサイレントヌクレオチド置換を含む、請求項２０に記載の単離された転写単位。
【請求項２２】
前記一本鎖コートポリペプチド二量体の前記コード配列が、前記コートタンパク質の下流サブユニットの第一のアミノ酸をコードするコドンを置き換える終止コドンを含む、請求項１９又は２０に記載の単離された転写単位。
【請求項２３】
前記終止コドンが、アンバー（ＵＡＧ）、オパール（ＵＧＡ）又はオーカー（ＵＡＡ）終止コドンである、請求項２１に記載の単離された転写単位。
【請求項２４】
低い価数を示すウイルス様粒子のライブラリーを構築するための方法であって、それぞれのウイルス様粒子が、少なくとも１つの一本鎖二量体の下流の一本鎖ＲＮＡ中に異種ペプチドを含むが、前記ウイルス様粒子において全てがバクテリオファージコートポリペプチド二量体ではない方法であって、
（ａ）請求項１２に記載の複数の転写単位を提供する工程と、
（ｂ）（ａ）の前記転写単位を制限酵素で処理する工程と、
（ｃ）異種ペプチドのためのコード配列を前記転写単位に挿入して転写単位の集団を得る工程と、
（ｄ）（ｃ）の前記転写単位を発現する工程と、
（ｅ）前記ライブラリーを単離する工程と、
を含む方法。
【請求項２５】
前記転写単位が、結合された転写翻訳システムで発現される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記異種ペプチドが、少なくとも４ヌクレオチドの長さを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
結合された転写翻訳システムにおいて前記転写単位を発現する工程と、区画化された水／オイルエマルジョン中で結合された転写／翻訳の少なくとも１サイクルを行う工程とをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
目的の特性を有するペプチドを特定するための方法であって、
（ａ）請求項１の低い価数のＶＬＰの集団を提供する工程と、
（ｂ）目的の特性を有するペプチドを特定するために目的の特性について請求項１に記載の集団中においてＶＬＰで発現された異種ペプチドを試験する工程と、
を含む方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、（ａ）におけるＶＬＰの前記集団が、バクテリオファージプロモーター及び３’ターミネーターを含む転写単位を発現することによって得られ、ＲＮＡバクテリオファージ一本鎖コートポリペプチド二量体の改変コード配列が上流サブユニット及び下流サブユニットを含み、異種ペプチドを挿入するための部位が前記二量体の前記下流サブユニット中で少なくとも４アミノ酸単位の長さであり、終止コドンが、前記コートタンパク質の下流サブユニットの第一のアミノ酸又は前記下流サブユニットのカルボキシ末端後の第一のアミノ酸をコードするコドンを、区画化された水／オイルエマルジョン中の核酸テンプレート由来の結合された転写／翻訳システム中で置き換え、前記水／オイルのエマルジョンから前記集団を回収する方法。
【請求項３０】
目的の特性を有する前記ペプチドが免疫原性ペプチドである、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
目的の特性を有する前記ペプチドが自己抗原の免疫原性フラグメントである、請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫原性フラグメントが、免疫原性ＨＩＶペプチドのフラグメントである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
目的の特性を有する前記ペプチドがミモトープである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、
（ａ）請求項２４に記載の方法によってＶＬＰの集団から前記免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）前記免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含む方法。
【請求項３５】
前記免疫原性ペプチドが、アフィニティー選択によって単離される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
低い価数を示すＲＮＡバクテリオファージの単離されたＶＬＰであって、コートポリペプチドの下流サブユニット中の異種ペプチドの挿入によって改変された前記バクテリオファージの前記コートポリペプチドの一本鎖二量体を含み、前記異種ペプチドは、前記ＶＬＰで提示されており、前記異種ペプチドは、ＨＩＶペプチド、自己抗原、レセプター及び細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に対して親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又は前記バクテリオファージの表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択され、約１〜１０個以下の異種ペプチドが前記ＶＬＰで提示される、単離されたＶＬＰ。
【請求項３７】
前記ＶＬＰが検出可能標識に結合されている、請求項３６に記載の単離されたＶＬＰ。
【請求項３８】
低い価数を示すＲＮＡバクテリオファージの単離されたＶＬＰであって、異種ペプチドの挿入によって改変された前記ファージのコートポリペプチドの一本鎖二量体を含み、前記異種ペプチドは、前記ＶＬＰで提示されており、前記異種ペプチドは、細胞表面レセプターに結合するためのリガンドに結合された薬学的に有効な異種ポリペプチドであり、約１〜１０個以下の異種ペプチドが前記ＶＬＰで提示される、単離されたＶＬＰ。
【請求項３９】
請求項３６〜３８のいずれかに記載のＶＬＰを含む組成物。
【請求項４０】
免疫原性組成物であって、低い価数のＲＮＡバクテリオファージの１つ以上のＶＬＰと、前記ファージのコートポリペプチドの一本鎖二量体とを含み、前記コートポリペプチドは、上流サブユニット及び下流サブユニットを含み、前記下流サブユニットは、免疫原性の異種ペプチドの挿入によって改変されており、約１〜１０個以下の異種ペプチドが前記ＶＬＰで提示される、免疫原性組成物。
【請求項４１】
前記異種ペプチドが、カルボキシル末端で前記下流サブユニット中に挿入されている、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記異種ペプチドが、前記ＡＢループ内の前記下流サブユニット中に挿入されている、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記異種ペプチドが、自己抗原又はその免疫原性フラグメントである、請求項４０〜４２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記自己抗原が、ＥｒｂＢ−２、アミロイド−β、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、ガストリン、グレリン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、神経成長因子（ＮＧＦ）、アンジオテンシンＩＩ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ及びＭＵＣ−１からなる群由来のペプチドからなる群から選択される、請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記異種ペプチドがＨＩＶ免疫原性ペプチドである、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記異種ペプチドが、前記コートポリペプチドの前記下流サブユニットのＮ末端中に挿入される、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
核酸構築物であって、
（ａ）バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合されている細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、前記コートポリペプチド二量体のコード配列が、前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列の部分に対して５’側に配置された第一の制限部位を規定するように改変されている、プロモーターと、
（ｂ）前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｃ）抗生物質耐性遺伝子と、
（ｄ）原核生物中での複製のための複製起点と、
を含み、前記構築物は、必要に応じて前記第一の制限部位に対する５’側と前記第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
を含む核酸構築物。
【請求項４８】
前記第一の制限部位に対して５’側に配置された第一のプライマーと、前記第二の制限部位に対して３’側に配置された第二のプライマーとを含む、請求項４７に記載の核酸構築物。
【請求項４９】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがＴ７プロモーターであり、前記第一の制限部位がＳａｌＩ及びＫｐｎＩ制限部位のいずれかであり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記ＰＣＲプライマーがＴＰ７であり、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であり、前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項４７に記載の核酸構築物。
【請求項５０】
前記構築物がさらに、前記第二の制限部位に対して５’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項４７、４８又は４９に記載の核酸構築物。
【請求項５１】
請求項４７、４８又は４９に記載の核酸構築物であって、
（１）バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、
核酸構築物。
【請求項５２】
請求項５１に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＭＳ２の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項５３】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合され、一本鎖二量体配列の二等分のうちの１つが、改変された二量体を生じるために複数のサイレントヌクレオチド置換で改変され、それにより変異原性のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記改変された二量体の前記改変された半分又は未改変の半分に対して特異的にアニールされることができる、プロモーターと、
（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された任意の制限部位と、
（ｃ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
（ｄ）第一の抗生物質に対する耐性のための遺伝子と、
（ｅ）原核生物細胞における複製のための複製起点と、
（ｆ）一本鎖ＤＮＡバクテリオファージからの第二の複製起点と、
（ｇ）第二の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージと、
を含む、核酸構築物。
【請求項５４】
コドン配列が、ＡＢ−ループのいずれかの側に２０ヌクレオチド単位内の十分な数のサイレントなヌクレオチド置換を含む、請求項５３に記載の核酸構築物。
【請求項５５】
前記第一の抗生物質に対して耐性のリプレッサーがカナマイシン耐性遺伝子であり、ヘルパーファージがクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されている、請求項５３又は５４に記載の核酸構築物。
【請求項５６】
前記核酸構築物が、第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターをさらに含む、請求項５３又は５４に記載の核酸構築物。
【請求項５７】
請求項５３又は５４に記載の核酸構築物であって、前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがＴ７プロモーターであり、前記ＲＮＡバクテリオファージ一本鎖コートポリペプチド二量体が、ＭＳ２コートタンパク質一本鎖二量体であり、コドン配列が可能な最大数のサイレントヌクレオチド置換を含み、前記制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記ＰＣＲプライマーがＴＰ７であり、前記第一の抗生物質に対する耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であり、前記ヘルパーファージの遺伝子が、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されており、前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、核酸構築物。
【請求項５８】
請求項５３又は５４に記載の核酸構築物であって、
（１）前記バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、
核酸構築物。
【請求項５９】
請求項５３又は５４に記載の核酸構築物であって、
（１）前記バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含み、
（３）前記第一の抗生物質に対する耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子であり、かつ前記ヘルパーファージの遺伝子が、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されている、
核酸構築物。
【請求項６０】
請求項５８に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＭＳ２の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項６１】
請求項５９に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＭＳ２の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項６２】
配列番号１〜３の核酸構築物。
【請求項６３】
請求項４７〜６２に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物。
【請求項６４】
前記原核生物が大腸菌株である、請求項６３に記載の原核生物。
【請求項６５】
請求項５１に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項６６】
請求項５２に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項６７】
請求項５８に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項６８】
請求項５９に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項６９】
請求項６０に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項７０】
請求項６１に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項７１】
請求項６５〜７０に記載のウイルス様粒子の集団であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドは、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつＭＳ２のｍＲＮＡをカプシドで包む、
ウイルス様粒子の集団。
【請求項７２】
請求項７１に記載のウイルス様粒子の集団であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＭＳ２の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、ウイルス様粒子の集団。
【請求項７３】
ウイルス様粒子のライブラリーを構築するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項４７〜６２に記載の複数の核酸構築物を提供する工程と、
（ｂ）前記核酸構築物を制限酵素で処理する工程と、
（ｃ）異種ペプチドのコード配列を前記核酸構築物中に挿入して、転写単位の集団を得る工程と、
（ｄ）前記転写単位を発現する工程及び必要に応じてライブラリーを単離する工程と、
を含み、それぞれの粒子は、前記異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２のコートポリペプチドを含み、前記異種ペプチドは、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつ前記ＭＳ２のｍＲＮＡをカプシドで包む、方法。
【請求項７４】
目的の特性を有するペプチドを特定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１９〜２４に記載のウイルス様粒子の集団を提供する工程であって、（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２のコートポリペプチドを含み、（２）前記異種ペプチドが前記ウイルス様粒子上で提示され、かつＭＳ２のｍＲＮＡをカプシドで包む、工程と、
（ｂ）目的の特性について前記ウイルス様粒子上に発現される異種ペプチドを試験する工程と、
を含む、方法。
【請求項７５】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項７３に記載の方法によってウイルス様粒子の集団から免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）必要に応じて前記免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含む、方法。
【請求項７６】
請求項６５〜７０に記載の１つ以上のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつＭＳ２のｍＲＮＡをカプシドで包む、免疫原性組成物。
【請求項７７】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合され、前記コートポリペプチド二量体のコード配列は、前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列の部分に対して５’側に配置されるか又はその中に配置される第一の制限部位を規定するように改変される、プロモーターと、
（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｃ）抗生物質耐性遺伝子と、
（ｄ）原核生物細胞中の複製のための複製起点と、
を含み、前記構築物が、必要に応じて第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーを含む、核酸構築物。
【請求項７８】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがｌａｃプロモーターであり、前記第一の制限部位がＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシンであり、前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項７７に記載の核酸構築物。
【請求項７９】
前記核酸構築物が、さらに前記第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項７７又は７８に記載の核酸構築物。
【請求項８０】
請求項７７又は７８に記載の核酸構築物であって、
（１）バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が異種ペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて前記第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、核酸構築物。
【請求項８１】
請求項８０に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項８２】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＭＳ２又はＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合され、前記コートポリペプチド二量体のコード配列は、前記コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に配置されかつ前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列に対して５’側に配置されるか又はその中に配置される、第一の制限部位を規定するように改変される、プロモーターと、
（ｂ）前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｃ）前記第一の制限部位に対する５’側と前記第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
（ｄ）抗生物質耐性遺伝子と、
（ｅ）原核生物細胞中の複製のための複製起点と、
を含む、核酸構築物。
【請求項８３】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがｌａｃプロモーターであり、前記第一の制限部位がＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であり、前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項８２に記載の核酸構築物。
【請求項８４】
前記核酸構築物が、さらに第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項８２又は８３に記載の核酸構築物。
【請求項８５】
請求項８２又は８３に記載の核酸構築物であって、
（１）バクテリオファージＭＳ２又はＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、核酸構築物。
【請求項８６】
請求項８５に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項８７】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合され、前記コートポリペプチド二量体のコード配列は、前記コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に配置されかつ前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する前記配列に対して５’側に配置されるか又はその中に配置される、第一の制限部位を規定するように改変される、プロモーターと、
（ｂ）前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｃ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
（ｄ）抗生物質耐性遺伝子と、
（ｅ）原核生物細胞中の複製のための複製起点と、
（ｆ）一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の第二の複製起点と、
（ｇ）第二の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージと、
を含む、核酸構築物。
【請求項８８】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがＴ７プロモーターであり、前記第一の制限部位がＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記ＰＣＲプライマーがＴＰ７であり、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であり、前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項８７に記載の核酸構築物。
【請求項８９】
前記核酸構築物が、さらに第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項８７又は８８に記載の核酸構築物。
【請求項９０】
請求項８７又は８８に記載の核酸構築物であって、
（１）前記バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて前記第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、核酸構築物。
【請求項９１】
請求項９０に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項９２】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＭＳ２又はＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合され、前記コートポリペプチド二量体のコード配列は、（１）前記コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に配置され、前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する前記配列に対して５’側に配置されるか又はその中に配置される、第一の制限部位を規定するように、かつ（２）ヌクレオチド配列（ＮＮＳ）ｘを含むように改変され、ここでＮは任意のヌクレオチドであり、Ｓはグアノシンヌクレオチド（Ｇ）又はシチジンヌクレオチド（Ｃ）であり、ｘは１〜５００の整数である、プロモーターと、
（ｂ）前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｃ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
（ｄ）抗生物質耐性遺伝子と、
（ｅ）原核生物細胞中の複製のための複製起点と、
を含む、核酸構築物。
【請求項９３】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがｌａｃプロモーターであり、前記第一の制限部位がＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記抗生物質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項９２に記載の核酸構築物。
【請求項９４】
前記核酸構築物が、さらに第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項９２又は９３に記載の核酸構築物。
【請求項９５】
請求項９２又は９３に記載の核酸構築物であって、
（１）前記バクテリオファージＭＳ７又はＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、核酸構築物。
【請求項９６】
請求項９５に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項９７】
請求項７７〜９６に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物。
【請求項９８】
前記原核生物が大腸菌株である、請求項９７に記載の原核生物。
【請求項９９】
請求項８５に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１００】
請求項８６に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１０１】
請求項９０に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１０２】
請求項９１に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１０３】
請求項９５に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１０４】
請求項７６に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１０５】
請求項９９〜１０４に記載のウイルス様粒子の集団であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、
ウイルス様粒子の集団。
【請求項１０６】
一本鎖二量体の上流サブユニットと下流サブユニットとの間の接合部にナンセンスコドンを含む、請求項４７〜６２及び７７〜９６のいずれかに記載の構築物。
【請求項１０７】
前記ナンセンスコドンで翻訳終結を少なくとも部分的に抑制することができるサプレッサーｔＲＮＡを生成する、請求項１０６に記載の構築物。
【請求項１０８】
前記ナンセンスコドンで翻訳終結を少なくとも部分的に抑制することができるサプレッサーｔＲＮＡを生成するプラスミドと会合されている、請求項１０６に記載の構築物。
【請求項１０９】
前記ナンセンスコドンが、アンバー（ＵＡＧ）、オパール（ＵＧＡ）又はオーカー（ＵＡＡ）終止コドンである、請求項１０６〜１０８のいずれかに記載の構築物。
【請求項１０９】
前記サプレッサーｔＲＮＡがアラニン−挿入アンバー−サプレッサーである、請求項１０７又は１０８に記載の構築物。
【請求項１１０】
前記プラスミドが、第二の不適合性群由来の複製起点を有し、第二の抗生物質に対して耐性を付与する、請求項１０８に記載の構築物。
【請求項１１１】
ウイルス様粒子のライブラリーを構築するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項７７〜９６に記載の複数の核酸構築物を提供する工程と、
（ｂ）前記核酸構築物を制限酵素で処理する工程と、
（ｃ）異種ペプチドのコード配列を前記核酸構築物中に挿入して、転写単位の集団を得る工程と、
（ｄ）前記転写単位を発現する工程及び必要に応じてライブラリーを単離する工程と、
を含み、それぞれの粒子は、前記異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドを含み、前記異種ペプチドは、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、方法。
【請求項１１２】
目的の特性を有するペプチドを特定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項９９〜１０４に記載のウイルス様粒子の集団を提供する工程であって、（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドを含み、（２）前記異種ペプチドが前記ウイルス様粒子上で提示され、かつＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、工程と、
（ｂ）目的の特性について前記ウイルス様粒子上に発現される異種ペプチドを試験する工程と、
を含む、方法。
【請求項１１３】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１１２に記載の方法によってウイルス様粒子の集団から免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）必要に応じて前記免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含む、方法。
【請求項１１４】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１１２に記載の方法によってウイルス様粒子の集団から免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）必要に応じて免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含み、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、方法。
【請求項１１５】
請求項９９〜１０４に記載の１つ以上のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが前記ウイルス様粒子上で提示され、かつＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、免疫原性組成物。
【請求項１１５】
請求項９９〜１０４に記載の１つ以上のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが（ｉ）前記ウイルス様粒子上で提示され、かつＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包み、（ｉｉ）ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、免疫原性組成物。
【請求項１１６】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＭＳ２の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合され、一本鎖二量体配列の二等分のうちの１つは、改変された二量体を生成するために複数のサイレントヌクレオチドで改変され、それにより変異原性オリゴヌクレオチドプライマーは、前記改変された二量体の前記改変された半分又は未改変の半分に対して特異的にアニールされることができる、プロモーターと、
（ｂ）Ａ−Ｂループに特異的であるコートポリペプチド配列の部分に対して５’側に配置された第一の制限部位と、
（ｃ）前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｄ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
（ｅ）第一の抗生物質に対して耐性の遺伝子と、
（ｆ）原核生物細胞中の複製のための複製起点と、
（ｇ）一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の第二の複製起点と、
（ｈ）第二の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージと、
を含む、核酸構築物。
【請求項１１７】
前記第二の複製起点がＭ１３由来である、請求項１１６に記載の核酸構築物。
【請求項１１８】
前記ヘルパーバクテリオファージがＭ１３である、請求項１１６又は１１７に記載の核酸構築物。
【請求項１１９】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがＴ７プロモーターであり、前記第一の制限部位がＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記ＰＣＲプライマーがＴＰ７であり、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であり、かつ前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項１１６に記載の核酸構築物。
【請求項１２０】
前記核酸構築物が、さらに第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項１１６又は１１７に記載の核酸構築物。
【請求項１２１】
請求項１１６又は１１７に記載の核酸構築物であって、
（１）前記バクテリオファージＭＳ２の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、核酸構築物。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項１２３】
核酸構築物であって、
（ａ）細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体と作動可能に会合され、一本鎖二量体配列の二等分のうちの１つは、改変された二量体を生成するために複数のサイレントヌクレオチドで改変され、それにより変異原性オリゴヌクレオチドプライマーは、前記改変された二量体の前記改変された半分又は未改変の半分に対して特異的にアニールされることができる、プロモーターと、
（ｂ）Ａ−Ｂループに特異的であるコートポリペプチド配列の部分に対して５’側に配置された第一の制限部位と、
（ｃ）前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と、
（ｄ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと、
（ｅ）第一の抗生物質に対して耐性の遺伝子と、
（ｆ）原核生物細胞中の複製のための複製起点と、
（ｇ）一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の第二の複製起点と、
（ｈ）第二の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージと、
を含む、核酸構築物。
【請求項１２５】
前記第二の複製起点がＭ１３由来である、請求項１２４に記載の核酸構築物。
【請求項１２６】
前記ヘルパーバクテリオファージがＭ１３である、請求項１２４又は１２５に記載の核酸構築物。
【請求項１２７】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターがＴ７プロモーターであり、前記第一の制限部位がＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ部位であり、前記ＰＣＲプライマーがＴＰ７であり、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であり、かつ前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉである、請求項１２４に記載の核酸構築物。
【請求項１２７】
前記核酸構築物が、さらに第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、請求項１２４又は１２５に記載の核酸構築物。
【請求項１２８】
請求項１２４又は１２５に記載の核酸構築物であって、
（１）前記バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列が、さらに異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（２）前記構築物が、必要に応じて第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む、核酸構築物。
【請求項１２９】
請求項１２８に記載の核酸構築物であって、前記異種ペプチドが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、核酸構築物。
【請求項１３０】
請求項１１６〜１２９に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物。
【請求項１３１】
前記原核生物が大腸菌株である、請求項１３０に記載の原核生物。
【請求項１３２】
請求項１１６〜１２２のいずれかに記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１３３】
請求項１２３〜１２９のいずれか１項に記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項１３４】
請求項１３２に記載のウイルス様粒子の集団であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつＭＳ２のｍＲＮＡをそれぞれカプシドで包む、
ウイルス様粒子の集団。
【請求項１３５】
請求項１３３に記載のウイルス様粒子の集団であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＰＰ７のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつＰＰ７のｍＲＮＡをそれぞれカプシドで包む、
ウイルス様粒子の集団。
【請求項１４０】
一本鎖二量体の上流サブユニットと下流サブユニットとの間の接合部にナンセンスコドンを含む、請求項１１６〜１２９のいずれかに記載の構築物。
【請求項１４１】
前記ナンセンスコドンで翻訳終結を少なくとも部分的に抑制することができるサプレッサーｔＲＮＡを生成する、請求項１４０に記載の構築物。
【請求項１４２】
前記ナンセンスコドンで翻訳終結を少なくとも部分的に抑制することができるサプレッサーｔＲＮＡを生成するプラスミドと会合されている、請求項１４０に記載の構築物。
【請求項１４３】
前記ナンセンスコドンが、アンバー（ＵＡＧ）、オパール（ＵＧＡ）又はオーカー（ＵＡＡ）終止コドンである、請求項１４０〜１４２のいずれかに記載の構築物。
【請求項１４４】
前記サプレッサーｔＲＮＡが、アラニン−挿入アンバー−サプレッサーである、請求項１４１又は１４２に記載の構築物。
【請求項１４５】
前記プラスミドが、第二の不適合性群由来の複製起点を有し、追加の抗生物質に対して耐性を付与する、請求項１１６〜１４４のいずれかに記載の構築物。
【請求項１４６】
ウイルス様粒子のライブラリーを構築するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１１６〜１２９に記載の複数の核酸構築物を提供する工程と、
（ｂ）前記核酸構築物を制限酵素で処理する工程と、
（ｃ）異種ペプチドのコード配列を前記核酸構築物中に挿入して、転写単位の集団を得る工程と、
（ｄ）前記転写単位を発現する工程及び必要に応じてライブラリーを単離する工程と、
を含み、それぞれの粒子は、前記異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２又はＰＰ７のコートポリペプチドを含み、前記異種ペプチドは、前記ウイルス様粒子上に提示され、かつそれぞれＭＳ２又はＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、方法。
【請求項１４７】
目的の特性を有するペプチドを特定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１３２〜１３３に記載のウイルス様粒子の集団を提供する工程であって、（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２又はＰＰ７のコートポリペプチドを含み、（２）前記異種ペプチドが前記ウイルス様粒子上で提示され、かつそれぞれＭＳ２又はＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、工程と、
（ｂ）目的の特性について前記ウイルス様粒子上に発現される異種ペプチドを試験する工程と、
を含む、方法。
【請求項１４８】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１４７に記載の方法によってウイルス様粒子の集団から免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）必要に応じて前記免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含む、方法。
【請求項１４９】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１４７に記載の方法によってウイルス様粒子の集団から免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）必要に応じて免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含み、前記異種ペプチドは、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、方法。
【請求項１５０】
請求項１３２〜１３３に記載の１つ以上のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２又はＰＰ７のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが前記ウイルス様粒子上で提示され、かつそれぞれＭＳ２又はＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包む、
免疫原性組成物。
【請求項１５１】
請求項１３２〜１３３に記載の１つ以上のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物であって、
（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２又はＰＰ７のコートポリペプチドを含み、
（２）前記異種ペプチドが、（ｉ）前記ウイルス様粒子上で提示され、かつそれぞれＭＳ２又はＰＰ７のｍＲＮＡをカプシドで包み、（ｉｉ）ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、
免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び支援助成金
本出願は、発明の名称「ＶＬＰでのペプチドディスプレイ価数の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｖａｌｅｎｃｙ  ｏｎ  ＶＬＰ）」である２００９年１２月３１日出願の米国特許仮出願第６１／３３５，１２２号、発明の名称「バクテリオファージＭＳ２  ＶＬＰでのランダム配列ペプチドライブラリーの容易な構築のためのプラスミドベクター、並びに関連の構築物、ライブラリー及び方法（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｆａｃｉｌｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２  ＶＬＰｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」である２００９年１２月３１日出願の米国特許仮出願第６１／３３５，１２０号、及び発明の名称「バクテリオファージＰＰ７のウイルス様粒子でのペプチドディスプレイ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＰＰ７）」である２００９年１２月３１日出願の米国特許仮出願第６１／３３５，１２１号から優先権の利益を主張し、それぞれの出願の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本特許出願は、国立衛生研究所によって助成金番号ＧＭ０４２９０１及びＲ０１  ＡＩ０６５２４０により支援された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、ＲＮＡバクテリオファージ、特にＭＳ２及びＰＰ７のウイルス様粒子（virus-like particule, ＶＬＰ）でのペプチドのディスプレイ（提示）のためのシステム及び方法に関する。所望の結合機能を有するペプチドがアフィニティー選択によって単離される、高い複雑性のランダム配列及び抗原フラグメントライブラリーの構築を容易にする方法及びプラスミドベクターが記載されている。ペプチドディスプレイの密度は、アフィニティー選択のストリンジェンシーにおける重要な決定因子であるので、ＶＬＰでペプチドディスプレイ価数を制御するための方法及びプラスミドもまた記載される。本発明の方法によって、ＶＬＰ、特にＭＳ２  ＶＬＰでの広い範囲（すなわち、１粒子当たり平均で１未満から９０まで）にわたるディスプレイ価数レベルの容易な調節が可能になり、これによって、低価数を示すＶＬＰを含めて、免疫原及びワクチンの特定及び産生が容易になる。このシステムは、主にワクチン開発を視野に入れて開発されてきたが、薬物及び造影剤の細胞又は組織型特異的な標的送達に有用性を有するペプチド−ＶＬＰの特定を含め、様々な他の適用において、並びに新規な物質の鋳型合成において、有用性を有する。
【０００４】
本出願は、ＶＬＰディスプレイシステムの実現を容易にする方法及びプラスミドベクターを記載する。本発明は、ウイルス様粒子上で提示され、ＶＬＰの合成及びＶＬＰで提示されるペプチドの合成を指向する特定のＲＮＡ（ＭＳ２又はＰＰ７のいずれか）をカプシドで包む異種ペプチドの挿入によってそれぞれが改変される、ＭＳ２又はＰＰ７のコートポリペプチドから構成されるウイルス様粒子の発現において有用な核酸構築物を提供する。関連のウイルス様粒子、方法及び免疫原性組成物もまた提供される。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
ワクチンとしてのＶＬＰ。近年の組み換えＤＮＡ技術の進歩によって、動物及びヒトの両方において有効な防御免疫を可能にするための十分な量のタンパク質が得られるように、免疫原性タンパク質が特定され、クローニングされ、適切な宿主中で発現されたワクチンの導入がもたらされた。ほとんどの有効なワクチンの多くは、ビリオン表面が中和抗体を誘発する強力な能力に基づく。これらとしては、防御抗体の応答を効果的に誘導する、ポリオ、インフルエンザ及び狂犬病などの認可された不活化ウイルスワクチン又は弱毒化ウイルスワクチンが挙げられる。さらに最近では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の構造タンパク質の自己アセンブルに基づくサブユニットワクチンが、食品医薬品局によって承認された。このサブユニットは適切な宿主で発現され、次いで本物のウイルスを構造的に模倣するが、ウイルスのゲノムを欠いているので非感染性である粒子へと自己アセンブルされる。これらのいわゆるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、個々の粒子それぞれで、ウイルス様粒子を含む構造タンパク質が多数のコピーにおいて存在するので、一般に極めて免疫原性である。この高密度の抗原提示は、それらの粒子が強固な抗体応答を誘発するのを特に有効にする。ＨＢＶワクチン及びＨＰＶワクチンは、それぞれのウイルス自体の構造タンパク質からアセンブルされたＶＬＰに基づくが、ＶＬＰはまた、異種エピトープの高密度提示のための足場として利用されてもよい。ＶＬＰは一般に高度反復性を示し、従って極めて免疫原性の構造であるので、それらは多数の異なるウイルス種に由来し得る。本発明の方法は、ファージディスプレイと類似の方法によって、免疫原性提示及びエピトープ開発の両方のために、ＲＮＡバクテリオファージ（特にＭＳ２及びＰＰ７）のＶＬＰを利用することを目的に行われる［１，２］。
【０００６】
ＲＮＡバクテリオファージ。一本鎖ＲＮＡバクテリオファージは、天然に広く分布して見られるウイルスのグループである。いくつかは、ゲノム配列、分子生物学、並びにカプシド構造及び集合に関して詳細に特徴付けられた。ＭＳ２はおそらく、最も研究されたグループのメンバーであって、本発明者の研究室で行われたほとんどの研究の焦点であったが、近年の研究はまた、ＰＰ７と呼ばれる関連のファージも開拓している。ＭＳ２は、４つのタンパク質（マチュラーゼ、コート、溶解（lysis）及びレプリカーゼ）のみをコードする３５６９ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。このウイルス粒子は、１８０個のコートポリペプチド、１分子のマチュラーゼ、及び１コピーのＲＮＡゲノムから構成される。コートタンパク質自体が完全に正二十面体のシェルの形成を担うので、ＭＳ２  ＶＬＰは、プラスミドから単独の遺伝子の生成物として生成され得る。従って、ペプチドディスプレイのために用いられる他のファージと比較して、ＲＮＡ  ＶＬＰは著しく簡易である。ペプチドディスプレイ及びアフィニティー選択のためのＭＳ２及びＰＰ７のＶＬＰの操作は、本願の発明者によって近年示されており［１，２］、また本明細書の後段にも記載される。
【０００７】
従来のファージディスプレイによるエピトープ特定。ファージディスプレイは、ランダムなアミノ酸配列の大きいライブラリーの提示を可能にするいくつかの技術のうちの１つであり、それらから特定の専門的な機能（例えば、特定の抗体に結合する能力）を有するペプチドを選択する目的を備える。最も一般的に用いられるファージディスプレイ法は、繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）に基づく。この基本的な概念は、ウイルス構造タンパク質のうちの１つに対して、ファージのＤＮＡゲノム中に遺伝子的に融合されたランダムな配列のライブラリーを含んでいる組み換えバクテリオファージゲノムを作成することである。このような組み換え体が細菌にトランスフェクトされる時、それぞれがウイルス粒子を生成し、そのウイルス粒子は、その表面上に特定のペプチドを提示し、そのペプチドをコードする同じ組み換えゲノムをパッケージングする。これによって、この方法に必須の遺伝子型及び表現型の連鎖が確立される。任意関数（例えば、レセプターの結合、免疫原性）は、アフィニティー選択の使用と、続く大腸菌での増殖による選択物の増幅とによって、ペプチドディスプレイファージの複雑なライブラリーから選択され得る。ペプチドディスプレイファージの膨大なライブラリーでは、特定のレセプター（例えば、モノクローナル抗体）に結合できるごく少数が、アフィニティー精製されて、次いで大腸菌中での増殖によって増幅され得る。比較的単純な集団を得るには、通常数回の反復回数の選択及び増幅で十分であり、それから所望の活性を有するペプチドを提示する個々のファージをクローニングし、次いで特徴付けすることができる。選択する分子が抗体である場合、このようにして特定されたペプチドは、抗体によって認識されるエピトープであり、そして適切な条件下では、免疫された患者又は動物において、その天然の抗原中でそのエピトープに特異的な抗体応答を誘発し得る。
【０００８】
しかし、繊維状ファージディスプレイには不利な点がある。最も重要なことに、繊維状ファージの分子生物学の特異な様式によって、本当に強力な免疫原性について必要な高密度でペプチドを提示することが困難又は不可能となる場合が多い。このことは、免疫原（すなわち、ワクチン）として有用であるべきペプチドエピトープはアフィニティー選択によって特定され得るが、これらのペプチドエピトープは、通常は化学的に合成されて、次いでさらに免疫原性の担体に結合されなければならないということを意味する。不幸にも、ペプチドは、そのアフィニティー選択及び最適化の間にそのペプチドが存在する構造的状況からこのように分離された場合、活性を失う場合が多い。ここで記載したＲＮＡファージＶＬＰディスプレイシステムは、他方では、アフィニティー選択及び免疫原性エピトープの提示を単一のプラットフォーム上で行う能力を生み出す。これは、高密度ペプチドエピトープディスプレイとアフィニティー選択能力とを組み合わせた結果であって、エピトープのアフィニティー選択の間に存在する構造的制約が、免疫過程の間維持され得るということを意味し、エピトープが所望の抗体応答を誘発するのに必要な構造を保持する確率が増大する。
【０００９】
ＲＮＡファージＶＬＰディスプレイ法の概説。本発明者は、ＭＳ２及びＰＰ７を含めて、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰに基づくペプチドディスプレイ及びアフィニティー選択のための技術を以前に記載したが［１，２］、ここでその技術を簡略に説明する。ＶＬＰディスプレイ法の開発には、２つの前提条件が満足されることを必要とする：第一に、ＲＮＡファージコートタンパク質の形態、及びその中の適切に折り畳んでＶＬＰにアセンブルする能力を破壊することなく外来ペプチドの挿入を許容する部位を特定する必要があった。コートタンパク質の表面上のＡＢ−ループを、ペプチド挿入のための部位として選択した。ここに挿入されたペプチドは、ＶＬＰの表面上で顕著に提示される。不幸にも、コートタンパク質の野生型は、ＡＢ−ループ中のペプチド挿入に極めて耐性がなく、その圧倒的多数（通常は９８％を超える）が折り畳みの失敗に至る。コートタンパク質は、通常は二量体として折り畳まれるが、そのうちの９０が正二十面体ＶＬＰへとアセンブルされる。本発明者は、新規な形態のコートタンパク質を操作して、それを安定化し、さらなるＡＢ−ループ挿入の耐性を与えた。そうするために、本発明者は、二量体中で２つの同一のポリペプチド鎖のＮ末端及びＣ末端の近接性を利用した（図１）。コートタンパク質コード配列を複製すること、次いで２つのコピーを単一のリーディングフレームに融合することによって、本発明者は、いわゆる一本鎖の二量体を生成した。この形態のタンパク質は、劇的にさらに熱力学的に安定であり、その折り畳みは一本鎖二量体の下流のコピーのＡＢ−ループに挿入されたペプチドにかなり耐性である［１，２］。得られたＶＬＰは、１つの二量体当たり１つのペプチド、又は１つのＶＬＰ当たり９０のペプチドを提示する。ペプチドディスプレイ／アフィニティー選択能力についての第二の前提条件は、アフィニティー選択された配列を増幅するための手段を提供することが必須であることから、遺伝子型に対する表現型の連鎖である。この要件は、本発明者が、ＲＮＡファージＶＬＰがその合成を指示するメッセンジャーＲＮＡをカプシドで包むということを示した際に満たされた［１，２］。このことは、アフィニティー選択されたペプチド−ＶＬＰの配列が、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得ることを意味する。選択の標的がモノクローナル抗体である場合、得られたアフィニティー選択されたＶＬＰは、動物又は患者において、その活性が選択抗体の活性を模倣する抗体を引き出すためのワクチン候補物である。
【００１０】
ペプチドディスプレイ価数及びその制御に関する考慮。本出願は、ＲＮＡファージＶＬＰでの複雑なランダム配列及び抗原フラグメントのライブラリーの構築、並びに特定のモノクローナル抗体（又は他の任意のレセプター）に結合するペプチドのこのようなライブラリーからのアフィニティー選択を容易にするプラスミドベクターを記載する。元々記載されるとおり、ＲＮＡファージＶＬＰディスプレイ技術は、それぞれのＶＬＰに９０個のペプチドを提示することに注意されたい。これは、ペプチドが一本鎖二量体の１つのＡＢ−ループに挿入され、９０個の二量体がＶＬＰを作成するからである［１，２］。これらの粒子の多価数は、ＭＳ２  ＶＬＰのほとんどの適用について望ましい。例えば、この粒子の高い免疫原性は、提示されるペプチドの高密度に関連し、従ってワクチン中で価値のある特性である。しかし、複数の同時の弱い相互作用という理由のみにより、アフィニティー選択過程の間、多価数によって、選択標的について内因性の高い結合親和性を有するペプチドを提示する粒子を、密接に結合する粒子から識別することが困難になる。この「結合活性対親和性」のジレンマは、繊維状ファージディスプレイを用いての高い親和性のペプチドリガンドの選択において十分立証された問題である［３−５］。本発明は、広い範囲にわたって、すなわち１粒子当たり１未満から９０まで、平均のペプチドディスプレイ価数を調節する手段を導入することによって、ＶＬＰディスプレイシステムにおいてこの問題に取り組む。これによって、アフィニティー選択過程の間にペプチドディスプレイの密度を変更することが可能になる。選択は数回行われ、初回は通常は多価数の提示を用いて行われ、これによって標的に関してある程度の最小の親和性を有する全てのペプチドを含む比較的複雑な集団を得る。その後の回では、ペプチドディスプレイの価数は減少されることができ、それによって選択のストリンジェンシーが増大し、結果として抗体標的に関して高い親和性を有するペプチドの単離及び好ましいエピトープの良好な分子模倣物が得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、低価数の異種ペプチドを提示するＶＬＰを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、低価数又は高価数の異種ペプチドを提示するＶＬＰなどのＶＬＰを産生するための核酸構築物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、低価数又は高価数の異種ペプチドの提示を制御し得るＶＬＰなどのＶＬＰを産生するための核酸構築物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、高い親和性の免疫原を特定し、これらの免疫原を治療及び他の製剤又は適用において用いるために、低価数又は高価数の異種ペプチドの提示を制御し得るＶＬＰを産生するための核酸構築物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、選択された抗体に対して高い親和性を示す免疫原性ペプチドを特定するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、高い親和性のペプチドをＶＬＰに組み込むことである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、本発明によるＶＬＰを用いて免疫原性の方法及び組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のこれら及び／又は他の目的のいずれか１つ以上は、以下の本発明の説明から容易に得られる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の要旨
本発明は、選択的に免疫原性のペプチドを組み込むＶＬＰを特定及び提供することのさらに効果的な手段を提供するために、高い複雑性のランダム配列及び抗原フラグメントペプチドライブラリーの構築を容易にし、かつＭＳ２  ＶＬＰでのペプチドディスプレイの価数（すなわち、密度）を制御することを可能にする、組成物、構造（プラスミドを含む）、システム及び方法に関する。本発明は、その内容全体がここに援用され、上記及び［１，２，６，７］において簡略に記載された米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号及び出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１８６１４（ＷＯ０８／０２４４２７として公開）において別に開示された、方法、組成物、粒子、単位及びその他の開示の拡張を示す。
【００２０】
本発明は、所定のモノクローナル抗体に最も高い親和性を有するペプチドの選択が、天然の抗原の最良の分子模倣物を提供すること、そしてこれらのペプチドが、関係する抗体応答を提供又は誘導する可能性が最も高いことをもたらす。これらのペプチドは、患者において免疫原性を誘導し、防御応答を提供するために特に適しているものとして提案される。これらのペプチドから調製されるワクチン及び／又はこれらのペプチドを組み込むワクチンは、特にアジュバント無しで投与される本発明によるワクチンを含み、低減された副作用を有し、より効果的である。
【００２１】
ＲＮＡファージＭＳ２（ｐＤＳＰ１及びｐＤＳＰ６２）のＶＬＰ及びＲＮＡファージＰＰ７（ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２及びｐＤＳＰ７）由来のＶＬＰにおいて、ランダム配列又は抗原フラグメントペプチドライブラリーの構築を容易にするプラスミドベクターが記載される。これらのベクターは、１０11〜１０12個を超える個々のメンバーを有するライブラリーの作製を可能にする。しかし、これらのベクターは、高密度で（すなわち、１つのＶＬＰ当たり９０個）の外来ペプチドを均一に提示するＶＬＰを生じる。上記で説明したとおり、このことは、ペプチドに対して高レベルの免疫原性を与えるが、多価数が選択のストリンジェンシーを低下して、集団の中で最も緊密に結合する種を優先的に選択することを困難にすることでアフィニティー選択の間に問題を生じることが多いので、ワクチン適用のための明白な利点である。
【００２２】
本発明は、ペプチドディスプレイ価数制御の問題に対する簡易な解決である、単一のＲＮＡからの少なくとも四（４）アミノ酸長の異種ペプチドを含む大量の野生型及び少量の一本鎖（好ましくは、二量体）のコートタンパク質の産生を可能にするシステムを示す。このアプローチは、ｐＤＳＰ１（ａｍ）、ｐＤＳＰ６２（ａｍ）、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２（ａｍ）及びｐＤＳＰ７（ａｍ）のようなプラスミドを構築することを含む。これらは、例えば、一本鎖二量体中でコーティングタンパク質の下流の第一のアミノ酸を通常コードするコドン（アラニン）の代わりに、終止コドン（好ましくは、アンバー終止コドン）を含むように改変された、上記のプラスミドの単純な改変体である。これらのプラスミドは、一本鎖二量体の二等分の接合部に終止コドンを有するので（例えば、ｐＤＳＰ１を参照）、それらのプラスミドは正常には、単位長さの野生型コートタンパク質しか産生せず、このタンパク質は当然にＶＬＰにアセンブルする。しかし、本発明のアプローチでは、このプラスミド又は第二のプラスミド（例えば、ｐＮＭｓｕｐＡ）は、コート配列を翻訳するわずかな割合のリボソームに終止コドンを読み飛ばしさせ、異種ペプチドを含む一本鎖二量体を生じさせる量でサプレッサーｔＲＮＡがもたらされるようにして、プロモーター（例えば、異なる不適合性群からのクロラムフェニコール耐性プラスミド上のｌａｃプロモーター）の制御下で発現されるアラニン挿入サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子などのｔＲＮＡ遺伝子［８，９］を挿入して改変される。得られたタンパク質は、ゲストの異種ペプチドが、好ましくは、例えば第二のＡＢ−ループ中若しくはカルボキシル末端又は下流サブユニット内の他の位置に挿入されており、同じｍＲＮＡから発現された野生型タンパク質とコアセンブル（共集合）して、低い価数を呈するモザイクのＶＬＰを形成する。
【００２３】
本発明によれば、ＶＬＰは、１つのＶＬＰ当たり１未満から九十（９０）の異種ペプチド、好ましくは１つのＶＬＰ当たり約１〜約十（１０）の異種ペプチド、さらに好ましくは１つのＶＬＰ当たり約１〜約５の異種ペプチド、さらに好ましくは１つのＶＬＰ当たり約１〜約３の異種ペプチド、最も好ましくは１つのＶＬＰ当たり約２〜約４の異種ペプチドを提示するように制御された方式で生成され得る。本発明によるペプチド密度の低下は、アフィニティー選択のストリンジェンシーが増大したＶＬＰを生じ、後に高い提示密度の形式に戻った場合に強力に免疫原性となる高い親和性のペプチドの容易な特定が可能になる。アガロースゲル電気泳動及びノーザンブロットによって、本発明によって生じた粒子が関連のＲＮＡをカプシドで包むことを確認する。本発明の方法はさらに、価数（１つのＶＬＰ当たりに生じるペプチドの数）が、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを制御することによって、例えばサプレッサーｔＲＮＡ合成のレベルを調節することによって、広い範囲にわたって調節され得ることになり、これは、例えば誘導因子濃度の関数としてその活性が調節され得るプロモーター（例えば、ｐｒｏＢ又は他の適切なプロモーター）からｔＲＮＡを発現することによって、適宜達成され得る。価数のレベルはまた、異なるサプレッサーｔＲＮＡ又はその変異体の利用を通じて制御されることができ、より大きい又はより小さい内因性の抑制の効率を有する。
【００２４】
当業者は、価数の制御が過剰な野生型コートタンパク質と一緒に組み換えタンパク質を同時発現することによってより簡単に達成されることができ、これによって外来のペプチドの含量が低下されたモザイクカプシドが生じると考えるかもしれない。不幸にも、このアプローチは、価数を適切なレベルまで（例えば、平均で１つのＶＬＰ当たり１未満から２〜３のペプチドまで）低下することが、野生型タンパク質が組み換えペプチドよりもかなり過剰に発現されることを必要とするので実用的でない。このような同時発現の方法は、過剰な関連のない（すなわち、非外来ペプチドをコードする）ＲＮＡを生じ、これがかなり多量であることによって、ペプチドコードＲＮＡよりも優先してＶＬＰ内にパッケージングされる。特異的なカプシド形成は、ＲＮＡ中のいかなる簡易なパッケージングシグナルの存在からも独立して出現するので（１）、選択的なカプシド形成のために少数派のペプチドコード種を選び出すことは簡単な方法ではないと考えられる。この同時発現アプローチの実行可能な改変型が存在することは想像できるが、これらの改変型は、あまりにも複雑になりがちである。本発明者のシステムは、単一のｍＲＮＡから両方の型のタンパク質を生成することによって、この問題を解決する。
【００２５】
例として、以下の実施形態は、本発明をさらに実証するために用いられ得る。以下に記載される実施形態のそれぞれでは、ＭＳ２コートポリペプチド又はＰＰ７コートポリペプチドが個々の核酸構築物において用いられることができるが、ＭＳ２又はＰＰ７コートポリペプチドへの限定は、このような限定が記載の文脈の中で適当でない限り、考慮されるべきではないことに注意されたい。
【００２６】
本発明の一実施形態は、次のものを含む核酸構築物（例えば、ｐＤＳＰ１を参照）を提供する：
（ａ）バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合されている細菌又はバクテリオファージのプロモーター（例えば、本発明の詳細な説明において後述されるような）であって、このコートポリペプチド二量体のコード配列は、コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列のその部分に対して、５’側に配置された第一の制限部位（例えば、ＳａｌＩ又はＫｐｎＩ）を規定するように改変されている；
（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ）；
（ｃ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマー（関連するＰＣＲプライマーの定義及び列挙は、本発明の詳細な説明に示される）。
（ｄ）抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン）、及び
（ｅ）原核生物細胞での複製のための複製起点（例えば、プラスミドＣｏｌＥ１由来の複製起点）。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、次のものを含む核酸構築物（たとえば、ｐＤＳＰ６２を参照）を提供する：
（ａ）バクテリオファージＭＳ２一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合されている細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、この一本鎖二量体配列の二分の一が、改変された二量体を生成するために複数のサイレントヌクレオチド置換体で改変されて（すなわち、「コドンジャグリングされて（ｃｏｄｏｎ  ｊｕｇｇｌｅｄ）」）、突然変異のオリゴヌクレオチドプライマーが、この改変された二量体（好ましくは、２つの配列がプライマーのハイブリダイゼーションによって識別されることを可能にするＡＢ−ループのいずれかの側における２０ヌクレオチド単位内の十分な数の変異）の改変された半分又は未改変の半分に対して、特異的にアニールされ得る、プロモーターと；
（ｂ）ＡＢループを特定するコート配列のその部分に対して５’側に配置された第一の制限部位（例えば、ＳａｌＩ）と、
（ｃ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側の第二の制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ）と、
（ｄ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマー（関連するＰＣＲプライマーの定義及び列挙は、本発明の詳細な説明に示される）と；
（ｅ）第一の抗生物質に対して耐性の遺伝子と；
（ｆ）原核生物細胞での複製のための複製起点と；
（ｇ）一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の第二の複製起点（例えば、Ｍ１３又はｆｄ）と；
（ｈ）第二の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｄ）。
【００２８】
別の実施形態では、本発明の核酸構築物に関して、バクテリオファージＭＳ２（又はＰＰ７）一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列はさらに、異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、この構築物は必要に応じて、第二の制限部位に対して３’側に配置された転写ターミネーターを含む。そのような核酸構築物は、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２（又はＰＰ７）のコートポリペプチドから構成されるウイルス様粒子の発現に有用であり、ここでは異種ペプチドがウイルス様粒子に提示されて、ＭＳ２（又はＰＰ７）のｍＲＮＡをカプシドで包む。
【００２９】
別の実施形態では（例えば、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２）、核酸構築物は次のものを含む：
（ａ）バクテリオファージＰＰ７（又はＭＳ２）一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合されている細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、このコートポリペプチド二量体のコード配列は、コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に位置され、かつコートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列に対して５’側に、又はその中に配置された、第一の制限部位を規定するように改変されている、プロモーターと；
（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と；
（ｃ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマー（関連するＰＣＲプライマーの定義及び列挙は、本発明の詳細な説明に示される）と、
（ｄ）抗生物質耐性遺伝子と；
（ｅ）原核生物細胞での複製のための複製起点。
【００３０】
別の実施形態（例えば、ｐＤＳＰ７）では、核酸構築物は次のものを含む：
（ａ）バクテリオファージＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合されている細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、この一本鎖二量体配列の半分が、複数のサイレントヌクレオチド置換体で改変されて（すなわち、「コドンジャグリングされて（ｃｏｄｏｎ  ｊｕｇｇｌｅｄ）」）、変異原性のオリゴヌクレオチドプライマーが、一方又はもう一方の半分に対して特異的にアニールされ得る（好ましくは、２つの配列がプライマーのハイブリダイゼーションによって識別されることを可能にするＡＢ−ループのいずれかの側における２０ヌクレオチド単位内の十分な数の変異である）、プロモーターと；
（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に位置し、かつコートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列に対して５’側に、又はその中に配置された第一の制限部位と；
（ｃ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された制限部位と；
（ｄ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマー（関連するＰＣＲプライマーの定義及び列挙は、本発明の詳細な説明に示される）と、
（ｅ）第一の抗生物質に対して耐性の遺伝子と；
（ｆ）原核生物細胞での複製のための複製起点と；
（ｇ）一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の第二の複製起点（例えば、Ｍ１３、ｆｄ）と；
（ｈ）第二の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｄ）。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、核酸構築物は次のものを含む：
（ａ）バクテリオファージＭＳ２又はＰＰ７の一本鎖コートポリペプチド二量体のコード配列と作動可能に会合されている細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、このコートポリペプチド二量体のコード配列は、（１）コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に位置され、コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列に対して５’側に又はその中に配置された第一の制限部位を規定し、及び（２）ヌクレオチド配列（ＮＮＳ）xを含み、ここでＮは任意のヌクレオチドであり、Ｓはグアノシンヌクレオチド（Ｇ）又はシチジンヌクレオチド（Ｃ）であり、ｘは１〜５００の整数である、ように改変されている、プロモーターと；
（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置された第二の制限部位と；
（ｃ）第一の制限部位に対する５’側と第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーと；
（ｄ）抗生物質耐性遺伝子と；
（ｅ）原核生物細胞での複製のための複製起点。
【００３２】
本明細書に記載される本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載されるような、上記の特定の構成要素は、選択的ではあるが、構築物内に含まれ得ることが好ましい。
【００３３】
他の実施形態（例えば、ＤＳＰ１（ａｍ）、ｐＤＳＰ６２（ａｍ）、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２（ａｍ）及びｐＤＳＰ７（ａｍ）と呼ばれる上記のプラスミドの誘導体）では、提示価数の制御は、以下の追加の特徴を含むことによってもたらされる：
（ａ）一本鎖二量体の上流半分と下流半分との間の接合部のナンセンスコドン（例えば、本明細書で他に記載されるようなアンバーコドン）；
（ｂ）上記の（ａ）に記載されるナンセンスコドンで翻訳終結を部分的に抑制することができるサプレッサーｔＲＮＡ（例えば、アラニン−挿入アンバー−サプレッサー）を生成するプラスミド（例えば、ｐＮＭｓｕｐＡ）。このプラスミドは、第二の不適合性群由来の複製起点を有し、第二の抗生物質に対する耐性を付与し、これによって上記のコートタンパク質産生プラスミドの１つもまた含む細菌中で、そのプラスミドの安定な維持が可能になる。
【００３４】
ワクチン候補物のライブラリー構築及びアフィニティー選択の概略
ここではＭＳ２  ＶＬＰシステムを例として用いるが、同様の方法が、本出願でやはり示されるＰＰ７システムにもあてはまることが理解されるべきである。
【００３５】
１．ライブラリー構築。ランダムな配列ライブラリーは、２つの方法のいずれかによって生成され得る。これらは、後にさらに詳細に記載され、図９ｂ及び図１５に図示される。（Ａ）ＰＣＲ産物は、ｐＤＳＰ１へ、ランダムな配列でａｌＩとＢａｍＨＩとの間にクローニングされ、このランダムな配列は、ＡＢ−ループ中にそれを導入するような方法で結合される。この方法は、比較的低い複雑性のライブラリー（典型的には１０7〜１０8個のメンバー）の便利な構築物について適切であるが、より高レベルまで大規模化するには不便である。（Ｂ）より複雑性が高いライブラリー（例えば、１０9〜１０11個以上）については、合成オリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＤＳＰ６２の一本鎖バージョンにアニールされ、ＤＮＡポリメラーゼで伸長されて、二本鎖の環状分子を生じ、次にこれがＤＮＡリガーゼの作用によって共有結合的に閉じられる（図１２を参照）。いずれかの方法によって産生される組み換えＤＮＡ分子は、大腸菌の適切な発現株（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入され、そこでそれらの大腸菌がＶＬＰを合成する。ｐＤＳＰ１又はｐＤＳＰ６２から産生される粒子は、１粒子当たり９０という密度（高密度）で外来ペプチドを提示する。
【００３６】
２．アフィニティー選択は、例えば、ある手順（例えば、バイオパニング、又は抗体に高い親和性を示すペプチドを迅速に特定及び分離するための他のアプローチ）にＶＬＰライブラリーを供することによって行われ、ここでは、モノクローナル抗体はマルチウェルのプラスチックプレートの１つ以上のウェルの表面に吸着される。ＶＬＰライブラリー溶液を、免疫された抗体とともにインキュベートし、次いで未結合のＶＬＰを洗い流して廃棄し、いずれかの結合したＶＬＰを、通常は溶液のｐＨを低下することによって溶出する。続いて、溶出したＶＬＰは熱変性され、それが含むＲＮＡは、ＲＮＡに対してその３’末端（ＢａｍＨＩ部位の十分下流）付近でアニールするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写によってＤＮＡにコピーされる。次いで、得られたｃＤＮＡを、第一の制限部位（例えば、ＳａｌＩ）の上流及び第二の制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ）の下流に特異的にアニールするプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。
【００３７】
３．再クローニング（ｒｅｃｌｏｎｉｎｇ）。上記で得られたＰＣＲ産物を、第一及び第二の制限酵素（例えば、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ）で分解し、次いで適切な発現ベクター中に再クローニングする。２回目の選択回を低ペプチド価数で行うべき場合、ＰＣＲ産物は、ｐＤＳＰ１（ａｍ）又はｐＤＳＰ６２（ａｍ）中にクローニングされ、選択された集団全体を、ｐＮＭｓｕｐＡを含む大腸菌の発現株中に導入する（図７を参照）。このように生成されたＶＬＰは、一旦アフィニティー選択されれば、最初のライブラリーに存在したペプチドの集団よりもかなり簡素な集団しか提示しないので、平均して、その外来ペプチドの２〜３のコピーしか提示しない（すなわち、低価数である）。
【００３８】
４．アフィニティー選択及び再クローニングのさらなる反復回は、上記のとおり行う。２〜４回又は好ましくは３回若しくは４回（高い価数で１又は２回、続いて低い価数で１又は２回）が典型的には、選択のモノクローナル抗体に緊密に結合するペプチドを提示するＶＬＰの簡素な集団を生じるのには十分である。選択が完了したと考えられる場合、配列をｐＤＳＰ１又はｐＤＳＰ６２中に再度クローニングし、ここでペプチドは、最大の免疫原性について高密度（１カプシド当たり最大９０ペプチドまで）で再度提示される。個々のクローンが得られて、ＤＮＡ配列分析による特徴付けに供される。選択抗体についてのインビトロにおけるそれらの親和性を評価し、それらが所望の抗体応答を引き出す能力を決定する。十分特徴付けられたモノクローナル抗体標的を使用する実証実験では、本発明者は、その配列が以前に特定されたエピトープの配列を模倣するペプチドを回収した。得られたＶＬＰで免疫された動物は、もとの抗原のエピトープを認識する抗体を生じる。
【００３９】
本発明のプラスミド及び他の側面の詳細は、以下の発明の詳細な説明にさらに記載される。
【００４０】
本発明による上記の実施形態及び／又は他の実施形態のいずれか１つ以上が、以下の本発明の説明からさらに容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＭＳ２コートタンパク質二量体の構造を図示する。左側上の写真は、２つのサブユニット鎖のＮ末端及びＣ末端の近接性を強調する。この特徴によって、外来ペプチド挿入の高い耐性を有する、一本鎖二量体の構築が容易になった。また、図示（左下）されるのは、二量体及びインタクトなＶＬＰの両方における、ＡＢ−ループの高い接近性である。垂直方向には、ＶＬＰ自体の構造が示される。ＶＬＰが構成されるコートタンパク質は、準同一によって３つのわずかに異なる配置をとり、赤、青及び緑で示される。ＡＢ−ループは黄色で示される。ＶＬＰ表面上でのそれらの反復性の性質及びそれらの露出に注目されたい。
【図２】ＶＬＰのランダム配列ペプチドライブラリーの提示の基礎を示す。ランダム配列ペプチド挿入物のライブラリーは、組み換えＤＮＡ方法によって作成され、得られたプラスミド集団は、形質転換によって大腸菌に導入され、ＶＬＰのライブラリーが生成される。集団中の個々のＶＬＰのそれぞれは、その表面上に異なるペプチドを提示し、そしてその中に（ｍＲＮＡの形態で）、その合成のための遺伝情報を含む。
【図３】アフィニティー選択の過程を図示する。ランダム配列ペプチドライブラリーを提示するＶＬＰの集団を、表面で免疫されたモノクローナル抗体とともにインキュベートする。ＶＬＰのほとんどは、通常は抗体に結合できず、洗い流されて廃棄される。次いで、ペプチドが抗体との結合を示すいずれかのＶＬＰを特異的に溶出し、それらが含むＲＮＡを逆転写によってＤＮＡにコピーし、ＰＣＲによって増幅し、そしてアフィニティー選択されたＶＬＰの産生のために発現プラスミド（例えば、ｐＤＳＰ６２又はｐＤＳＰ６２（ａｍ））中に再クローニングする。選択は、典型的には反復して（すなわち、２回を超えて）、好ましくは３〜５回行われる。
【図４】ペプチドディスプレイ価数の重要性を示す。多価数のディスプレイによって、本質的に緊密な結合因子を複数のレセプターと同時に相互作用する弱い結合因子と識別することが困難になり得る。通常は、初回のアフィニティー選択は高い価数で行うが、その後の回では、価数は低レベルまで低下され、それによって選択のストリンジェンシーを増大し、選択抗体について最高の親和性を有するペプチドの単離を確実にする。
【図５】ＡＢ−ループ中に挿入するために都合のよいクローニング部位を有するプラスミドｐＤＳＰ１を示す。ｐＤＳＰ１は、例えば１つだけのＳａｌＩ及びＫｐｎＩ制限部位を含むように改変された、一本鎖二量体のコード配列を発現する。この二量体は、ＡＢ−ループへの外来配列の簡易なクローニングを容易にする。これらの部位を１つだけにするには、ベクター中及び上流のコート配列中で、多数のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ部位を破壊することが必要であった。
【図６】プラスミドｐＤＳＰ６２を示す。一本鎖のＤＮＡの産生を容易にするために、Ｍ１３複製起点をプラスミド中に導入し、Ｍ１３起点の配向に応じてｐＤＳＰ６１及びｐＤＳＰ６２として特定した。このプラスミドはまた、いわゆる「コドンジャグリングされた（ｃｏｄｏｎ  ｊｕｇｇｌｅｄ）」コート配列を、一本鎖二量体の上流半分に含む。コドンジャグリングされた半分は、下流の半分と同じアミノ酸配列をコードするが、可能な最大数のサイレント置換を含むことによってその配列とは異なり、２つの半分をオリゴヌクレオチドのアニールのために識別可能とする。
【図７】単一のＲＮＡから大量の野生型及び少量のＡＢ−ループ組み換えタンパク質を産生するための例示的なシステムを示す。一本鎖二量体においてコートタンパク質の下流のコピーの第一のアミノ酸を通常はコードするアラニンコドンの代わりにアンバー終止コドンを含む、ｐＤＳＰ１の改変体（ｐＤＳＰ１（ａｍ））を構築した。さらに、アラニン挿入サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を合成して、クローニングした。この遺伝子は、コート配列を翻訳する少ない割合のリボソームに終止コドンを読み飛ばしさせて一本鎖二量体を生じさせる量で産生される。得られたタンパク質（とそのゲストペプチド）は、同じｍＲＮＡから発現される野生型タンパク質とコアセンブル（共集合）して、本明細書の他で記載されるようなモザイクカプシド及び低減された価数を生じる。
【図８】下に列挙するプラスミドで産生される精製ＶＬＰのＳＤＳゲル電気泳動を示す。実験のポイントは、精製ＶＬＰにおける、上の図７について及び本出願の実施例の項において記載するような、一本鎖「読み飛ばし」（リードスルー、ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）生成物の含量を示すことである。精製されたＶＬＰは、以下のプラスミドから生成された（左から右へ）：  ｐＤＳＰ１は、コートタンパク質一本鎖二量体のみを含むＶＬＰを生成する。  ｐＤＳＰ１−Ｆｌａｇは、その第二のＡＢ−ループ中に挿入されたＦｌａｇエピトープを有する一本鎖二量体のみを含むＶＬＰを生成する。  ｐＤＳＰ１（ａｍ）は、一本鎖二量体中のコート配列の接合部にナンセンス変異を有し、これによってｐＤＳＰ１（ａｍ）は、大量の野生型コートタンパク質を生じ、そしてサプレッサー−ｔＲＮＡ（ｐＮＭｓｕｐＡから提供される）の存在下では、少量の一本鎖二量体を生じる。ナンセンス抑制は、この場合低い効率を有するので、ごくわずかなリボソームが、終止コドンを読み飛ばして一本鎖二量体を生成する。この２つの形態のコートタンパク質は、コアセンブルしてモザイク又はハイブリッドのＶＬＰになり、これは大部分の野生型コートタンパク質及び少量の一本鎖二量体（野生型コートタンパク質のレベルの約３％と推定される）からなる。  ｐＤＳＰ１（ａｍ）−Ｆｌａｇは、ｐＤＳＰ１（ａｍ）のようであるが、一本鎖二量体の第二のＡＢ−ループにフラグエピトープが挿入されている。それは、大部分の野生型コートタンパク質、及びそのＡＢ−ループにフラグペプチドが挿入されている少量の一本鎖二量体を生成する。  図の右の２つの矢印は、ｐＤＳＰ１（ａｍ）及びｐＤＳＰ１（ａｍ）−Ｆｌａｇの終止コドンの抑制によって生成される２つのタンパク質の位置を示す。
【図９】図９ａ及び図９ｂは、異種ペプチドをコードする核酸配列をそのプラスミド中に挿入するためのｐＤＳＰ１プラスミド（９ａ）及び技術（９ｂ）を示す。
【図１０】ｐＤＳＰ６２プラスミドを表し、一本鎖二量体の下流コピーのＡＢ−ループ中へ配列を特異的に挿入するために、どのように合成オリゴヌクレオチドプライマーが設計され得るかを模式的に示す。オリゴヌクレオチドは、ＡＢ−ループに隣接するコート配列に対して完全にアニールするように設計され、それらの間に外来配列を挿入する。
【図１１】図１１ａは、ｐＤＳＰ１プラスミドの核酸配列（配列番号１）を含む。図１１ｂは、ｐＤＳＰ１（ａｍ）の核酸配列（配列番号２）を示す。図１１ｃは、ｐＤＳＰ６２プラスミドの核酸配列（配列番号３）を示す。図１１ｄは、ｐＤＳＰ６２（ａｍ）の核酸配列（配列番号４）を示す。ｐＤＳＰ１（ａｍ）及びｐＤＳＰ６２（ａｍ）のプラスミド配列は、アンバーコドンを導入するヌクレオチド置換によってのみ、ｐＤＳＰ１及びｐＤＳＰ６２と異なる。図１１ｅは、Ｍ１３Ｋ０７のクロラムフェニコール耐性誘導体であるＭ１３ＣＭ１の核酸配列（配列番号５）である。
【図１２】ランダムなペプチド配列ライブラリーを生成するためにｐＤＳＰ６２及びＭ１３ＣＭ１を利用する方法を示す。Ｍ１３ＣＭ１は、ｐＤＳＰ６２がそのＭ１３起点から複製することを可能にするヘルパーウイルスである。従って、ｐＤＳＰ６２を含む大腸菌細胞のＭ１３ＣＭ１による感染によって、一本鎖の環状ｐＤＳＰ６２の生成が可能になる。ｄｕｔ−、ｕｎｇ−細菌株中で増殖した場合、ＤＮＡは、ＤＮＡ中に通常存在するｄＴＴＰのいくつかに代えてｄＵＴＰで置換される。ペプチドコード配列の部位特異的な挿入は、ＤＮＡポリメラーゼでの合成オリゴヌクレオチドの伸長によって達成され、その環は、ＤＮＡリガーゼの作用によって閉じられる。この得られた共有結合的に閉じられた環状ＤＮＡを、大腸菌のｄｕｔ＋、ｕｎｇ＋株中にエレクトロポレーションによって導入し、そこでｄＵＴＰ置換鎖が変性され、挿入の高頻度（通常は８５〜９０％）の組み込みを生じる［１０］。
【図１３】図１３ａ及び図１３ｂは、ｐＰ７Ｋプラスミド（１３ａ）及びｐ２Ｐ７Ｋ３２プラスミド（１３ｂ）を示す。これらのプラスミドは、翻訳抑制及びＶＬＰアセンブリ試験によってＰＰ７コートタンパク質ＡＢ−ループの挿入耐性を試験するためだけに、ＰＰ７  ＶＬＰプラットフォームの開発の間に利用された（実施例の項を参照）。それらは、後述されたアフィニティー選択のためのＶＬＰライブラリーの構築に用いられる、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２又はｐＤＳＰ７と混同されるべきではない。
【図１４】ＰＰ７コートタンパク質ＡＢ−ループ付近のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示し、また特異的なペプチド挿入物の挿入のために用いたプライマー配列を示す。多数の特異的及びランダムなペプチド配列を挿入して、ＡＢ−ループ挿入に対するＰＰ７一本鎖二量体の一般的な耐性を試験し、特定の挿入されたペプチドの免疫原性を決定した。
【図１５】ＰＰ７一本鎖コートタンパク質のＡＢ−ループの挿入耐性を実証するために、ｐ２Ｐ７Ｋ３２中のランダムな配列ペプチドライブラリーの構築のために用いたスキームを図示する。この方法は、ｐＤＳＰ１のＭＳ２一本鎖二量体中への挿入について図５ｂで示される方法と同様である。
【図１６】本明細書に記載される種々のライブラリーそれぞれからの２４個のクローンの細胞溶解液すべてのアガロースゲル電気泳動を示す。得られたクローンのほぼ１００％が翻訳抑制をすることができ、このことは、それぞれのタンパク質が適切に折り畳まれた確率を示している。タンパク質が正確に折り畳まれたことをさらに確認するために、それぞれのＶＬＰを形成する能力を、クローンのランダムな選択をこの図に示されるように電気泳動及びウエスタンブロットに供することによって評価した。それぞれのセットの上半分は、エチジウムブロマイド染色したゲルであり、下の半分は、複製のゲルのウエスタンブロットである。それぞれのセットにおける最も左側のレーンは、ｐ２Ｐ７Ｋ３２対照である。それぞれのクローンは、ランダムに生成された異なるペプチド配列を含み、ほぼ全てがＶＬＰを生じるという事実によって、ＰＰ７コートタンパク質一本鎖二量体の高レベルの挿入耐性が実証される。
【図１７】図１７ａはｐＥＴＰ７Ｋプラスミドを示し、図１７ｂはｐＥＴＰ７Ｋ３２プラスミドを示し、図１７ｃはｐＤＳＰ７プラスミドを示す。これらのプラスミドは、ＰＰ７コートタンパク質の高レベルの過剰発現のために生成された。ｐＤＳＰ７プラスミドは、ＰＰ７コートタンパク質の一本鎖二量体を含み、ここでは配列の二分の一が、ＡＢ−ループコード配列の近傍に十分な数のヌクレオチド置換を含んで、変異原性のオリゴヌクレオチドをアニールするために二つの半分を識別可能にする。ここで示される実施例では、上流の配列全体が、可能な最大数のサイレント変異を含むように改変される。ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２及びｐＤＳＰ７は、ＭＳ２コートタンパク質プロデューサー、ｐＤＳＰ１及びｐＤＳＰ６２のＰＰ７アナログとみなされるべきである。
【図１８】ｐＥＴＰ７Ｋ又はｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２を含む細菌中で生成されたＶＬＰから抽出されたＲＮＡのホルムアルデヒド／アガロースゲル上での電気泳動によって、それらが生成するＶＬＰが、それらの合成を指向するｍＲＮＡをカプシドで包むことが示される。これは、逆転写及びＰＣＲによってアフィニティー選択された配列を回収する手段を提供する。別のレーンは、同じプラスミドのインビトロでの転写によって生成されたＲＮＡを含む。左の写真は、エチジウム染色ゲルを示す。右側は、ＰＰ７コートタンパク質センス鎖に特異的なオリゴヌクレオチドでプローブされた複製ゲルのブロットである。このプローブは、ＭＳ２又はＱβコートタンパク質配列（示さず）のインビトロ転写に由来する同様の量のＲＮＡとは反応できない。
【図１９】ＰＰ７コートタンパク質中にクローニングされたいくつかの特異的なペプチド配列の列挙を示す。
【図２０】抗−Ｌ２  ｍＡｂ（ＲＧ−１）が、ＰＰ７  Ｌ２−ＶＬＰには結合するが、ＰＰ７  Ｖ３−ＶＬＰには結合しないことを示す。ｍＡｂ  ＲＧ−１の希釈物を、５００ｎｇ／ウェルのＬ２−ＶＬＰ又はＶ３−ＶＬＰと反応させた。結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ二次を用い、続いてＡＢＴＳでの発色によって検出した。反応性は、４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）の測定によって決定した。
【図２１】Ｖ３ペプチド提示のＰＰ７  ＶＬＰが免疫の際に抗−Ｖ３  ＩｇＧ応答を誘導することを図示する。ＰＰ７  Ｖ３−ＶＬＰで、又は対照としてＬ２−ＶＬＰで免疫されたマウスでの抗−Ｖ３  ＩｇＧ抗体応答を示す。マウスを、１０μｇのＶＬＰと不完全フロイントアジュバントとを用いて３回免疫し、次いで血清を最終の追加免疫の２週後に収集した。別々のマウス７匹から得た希釈血清（６匹はＶ３−ＶＬＰで免疫し、１匹はＬ２−ＶＬＰで免疫した）を、ＨＩＶLAI由来のＶ３ループの一部を提示するペプチドとの反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ二次を用い、続いてＡＢＴＳでの発色によって検出した。反応性は、４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）の測定によって決定した。
【図２２】抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体でのＭＳ２  ＶＬＰディスプレイを用いてのアフィニティー選択の結果を示す。抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体のエピトープ配列は、これ以前に他者により十分に明らかにされている。４回のそれぞれにおけるいくつかのペプチドの配列は、選択の進行を明らかにするために示される。１回及び２回で見い出されるペプチドは、天然のエピトープの認識可能なエレメントを含むが、３回及び４回では類似性は明白であり、配列は野性型エピトープの配列に密接にマッチしている。実際に、４回目の配列は、十分に確立された繊維状ファージディスプレイの方法によって以前に得られた配列よりも密接に天然のエピトープにマッチする（「ＮＥＢ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，Ｓｕｍｍｅｒ，１００６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのウェブサイト、ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍで入手可能）を参照）。
【図２３】図２３ａ〜２３ｄは、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２（配列番号６）、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２（ａｍ）（配列番号７）、ｐＤＳＰ７（配列番号８）、及びｐＤＳＰ７（ａｍ）（配列番号９）のプラスミドのヌクレオチド配列を示す。これらは、図１１ａ〜１１ｄに示される対応するＭＳ２ＶＬＰプロデューサーのＰＰ７コートタンパク質−産生アナログである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明によれば、当該分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献中で詳細に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；Ａｕｓｕｂｅｌ編集，１９９４年，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ｃｅｌｉｓ編集，１９９４年，「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ｃｏｌｉｇａｎ編集，１９９４年，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ｇａｉｔ編集、１９８４年，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」；Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８５年，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４年，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８６年，「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６年，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４年，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」を参照のこと。
【００４３】
ある範囲の値が示される場合、その範囲の上限と下限との間の、その状況が他を明確に示すのでない場合における下限の単位の十分の一までのそれぞれのその間の値、及びいずれかの他の言及された範囲における言及された値又はその間の値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してそのより小さい範囲内に含まれることができ、そしてその言及された範囲でいずれかの特に除外される限界が付された本発明の範囲内にもまた包含される。その言及される範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００４４】
別段規定しない限り、本明細書において用いられるすべての技術及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は等価の任意の方法及び材料もまた、本発明の実行又は試験において用いられ得るが、好ましい方法及び材料がここに記載される。
【００４５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形（ａ、ａｎ及びｔｈｅ）は、その状況が明らかに他を示すのでない限り、複数形の言及を包含する。
【００４６】
さらに、次の用語は、下記の定義を有するものとする。
【００４７】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語は、多量体形の任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかを指し、そして二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡの両方を包含する。ポリヌクレオチドは、例えばコード領域及び調節性配列（例えば、プロモーター又は転写ターミネーター）などの非コード領域といった、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から直接得られてもよいし、又は組み換え技術、酵素技術若しくは化学的技術の補助によって調製されてもよい。ポリヌクレオチドは、直線状であっても又は位相幾何学における環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター若しくはクローニングベクターなどのプラスミド若しくはバクテリオファージベクターの一部、又はフラグメントであってもよい。
【００４８】
制限エンドヌクレアーゼは、明確に規定された配列でＤＮＡを切断する酵素である。それらは、例えば、同じ制限エンドヌクレアーゼでの消化によって生成される他のＤＮＡフラグメントに、ＤＮＡリガーゼの作用を通じて容易に連結される特定のＤＮＡフラグメントを生成するために、組み換えＤＮＡ技術で用いられる。本出願では、その認識配列がそれぞれＧＴＣＧＡＣ、ＧＧＴＡＣＣ、及びＧＧＡＴＣＣであるＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩを含め、いくつかの特異的な制限エンドヌクレアーゼに対して言及する。
【００４９】
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は広義には、ペプチド結合によって一緒に連結される２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語はまた、ジスルフィド結合によって結合された２つ以上のポリペプチドを含む分子、又は多量体（例えば、二量体、四量体）として共有結合若しくは非共有結合的に結合されるポリペプチドの複合体を包含する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質という用語は、すべてがポリペプチドの定義内に包含され、そしてこれらの用語は交換可能に用いられる。これらの用語は、アミノ酸のポリマーの特定の長さを暗示するものでも、ポリペプチドが組み換え技術、化学的若しくは酵素的な合成を用いて生成されるか、又は天然に存在するかを暗示したり識別したりすることを意図するものでもないことが理解されるべきである。
【００５０】
「一本鎖二量体」という用語は、通常は二量体のタンパク質であって、その２つのサブユニットが遺伝子的に（化学的に、共有結合を通して）単一のポリペプチド鎖に融合されたタンパク質を指す。具体的には、本発明では、ＭＳ２及びＰＰ７コートタンパク質の両方の一本鎖二量体が構築された。これらのタンパク質のそれぞれは、天然には同一のポリペプチド鎖の二量体である。ＭＳ２及びＰＰ７コートタンパク質二量体の両方において、１つのサブユニットのＮ末端は、コンパニオンサブユニットのＣ末端に対して物理的に近接して存在する（図１を参照）。一本鎖コートタンパク質二量体は、コートタンパク質のＤＮＡコード配列を複製し、次いでそれらを尾−頭方式で互いに融合することによる組み換えＤＮＡ方法を用いて生成された。この結果は、単一のポリペプチド鎖であって、ここではコートタンパク質アミノ酸は２回存在し、上流コピーのＣ末端が、下流コピーのＮ末端に共有結合されている。通常の（野性型）の２つのサブユニットは、２つの鎖の間の非共有結合的な相互作用を通じてのみ会合される。一本鎖二量体では、これらの非共有結合的な相互作用が維持されるが、２つのサブユニットは、互いにさらに共有結合的に連結された。これは、タンパク質の折り畳み構造をかなり安定化し、そのタンパク質に対して上記のようなペプチド挿入の高い耐性を付与する。
【００５１】
本出願は、コートタンパク質の「ＡＢ−ループ」に言及することが多い。ＲＮＡファージコートタンパク質は、保存された三級構造を保有する。ＭＳ２及びＰＰ７コートタンパク質は、例えば、それぞれが図１で示されるＭＳ２コートタンパク質の構造によって例示される構造を有する。それぞれのポリペプチド鎖は、ＡからＧの文字で示される多数のβ鎖に折り畳まれる。β鎖のＡ及びＢは、ＶＬＰの表面に露出されるヘアピンの頂部に２つの鎖を接続する３アミノ酸鎖のループを有するヘアピンを形成する。本出願に示されるように、ＡＢループに挿入されるペプチドは、ＶＬＰの表面上に露出され、強力な免疫原性である。
【００５２】
本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性体型の残基は、そのポリペプチドによって所望の機能が保持される限り、いずれのＬアミノ酸残基とも代えることができる。ＮＨ2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシル基を指す。
【００５３】
「コード配列」の用語は、本明細書では、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列の部分として規定される。コード配列の境界は、一般に原核生物においては、リボソーム結合（又はシャイン・ダルガノ）部位及び翻訳開始コドン（通常はＡＵＧ）によって決定される。真核生物においては、オープンリーディングフレームの開始部位に位置するＡＵＧ開始コドン（ｍＲＮＡの５’末端に通常は近い）、及びオープンリーディングフレームの末端、通常はｍＲＮＡの３’末端付近に位置してそれを特定する翻訳終結配列（ナンセンスコドン：ＵＡＧ、ＵＧＡ、又はＵＡＡのうちの１つ）によって決定される。限定するものではないが、コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組み換え核酸配列などを挙げることができる。
【００５４】
上記で簡略に注記したとおり、「終止コドン」又は「終結コドン」とは、翻訳の終結をシグナル伝達するメッセンジャーＲＮＡ内のヌクレオチドトリプレットである。タンパク質は、アミノ酸の固有の配列であって、メッセンジャーＲＮＡにおけるほとんどのコドンは、成長しているタンパク質鎖へのアミノ酸の付加に相当する−終止コドンは、このプロセスの終結をシグナル伝達し、アミノ酸鎖を遊離する。標準的な遺伝子コードでは、３つの終止コドンがある：ＵＡＧ（ＲＮＡ中）／ＴＡＧ（ＤＮＡ中）（「アンバー」終止コドンとしても知られる）、ＵＡＡ／ＴＡＡ（「オーカー」終止コドンとしても知られる）、及びＵＧＡ／ＴＧＡ（「オパール」又は「アンバー」終止コドンとしても知られる）。この主要な群に対するいくつかの改変が知られている。本発明における終止コドンの使用は、通常はタンパク質合成を終止又は終結させる。しかし、ｔＲＮＡ中には、終止コドンを認識することを可能にさせ、リボソームに終止コドンを読み飛ばさせ、終止コドンの下流のコードされるペプチドの合成を可能にする変異がある［１１−１３］。例えば、アンバー終止コドンを認識するｔＲＮＡ中の変異は、翻訳がコドンを「読み飛ばし」て全長タンパク質を生じることを可能にし、それによって、正常な形態のタンパク質を回収し、終止コドンを「抑制する」。ほとんどの場合、終止コドンの抑制は、部分的にしか効果的でない−わずかな割合のリボソームしか終止コドンを読み飛ばすことができないことが多い。しかし、ある場合には、抑制はかなりより効果的であり得る。２〜３のサプレッサーｔＲＮＡは、簡単に高度な内因性の抑制効率を保有する。他の場合には、弱いサプレッサーは、単にそれをより高レベルで発現することによってさらに効率的にされ得る。本発明の特定の実施形態では、終止コドンは、その終止コドンの下流の転写単位内にコードされるペプチドの合成を制御するために転写単位内に組み込まれる。終止コドンを認識し、終止コドンの下流のペプチドの合成を可能にするｔＲＮＡの制御された合成を提供することによって、そのほとんどが異種ペプチドを含まないコートタンパク質の集団内に、異種ペプチドを含むコートタンパク質が生成され得る。野生型（異種ペプチドが存在しない）コートタンパク質を含む異種ペプチドのこの混合物からアセンブルされるこの得られたＶＬＰでは、異種提示の価数がかなり低くなる。
【００５５】
組み換え細胞の「異種」領域とは、より大きい分子と関連して見られることが全く無い、より大きい核酸分子内の核酸の特定可能なセグメントである。「異種」ペプチドとは、より大きいポリペプチドと関連して見られることが全く無い、ポリペプチドの特定可能なセグメントであるペプチドである。
【００５６】
ＶＬＰの価数とは、粒子に提示される異種ペプチドのコピー数を指す。「低い価数」の異種ペプチド、好ましくは少なくとも４のペプチド単位の免疫原性ペプチドを示すウイルス粒子は、このウイルス粒子を含むコートポリペプチド二量体中で、１未満から最大で約１０以上の異種ペプチドを提示する粒子である。低い価数を示すウイルス粒子は、異種ペプチド（好ましくは、野生型コートポリペプチド）を含まない複数のコートポリペプチド二量体、及び異種ペプチドを、好ましくはコートポリペプチドの下流サブユニットのＡ−Ｂループ内又は一本鎖二量体コートポリペプチドのカルボキシ末端に含む少数のコートポリペプチド二量体から形成され、従ってモザイクＶＬＰを形成する。
【００５７】
文脈内で用いられる「複製起点」とは、通常はＤＮＡ複製開始領域を特定することによってＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。必要な因子（ＤＮＡポリメラーゼなど）の存在下で、複製起点は、それに会合するＤＮＡを複製させる。例えば、ＣｏｌＥ１複製起点（ｐＤＳＰ１などのようなプラスミド中で用いられる）は、細菌の染色体とは独立して複製する能力を、多くの通常用いられるプラスミドクローニングベクターに与える。別の例はｐ１５Ａ複製起点であり、それは本願の他の箇所で記載されるプラスミドｐＮＭｓｕｐＡで用いらる（図７を参照）。ファージＭ１３由来の追加の複製起点がプラスミド上に存在すること（例えば、ｐＤＳＰ６２と同様）によって、大腸菌細胞がいわゆるヘルパーファージ（例えば、本出願中で記載されるＭ１３ＣＭ１）で感染される場合にその起点を用いて複製する追加の能力が付与され、これによって必須のタンパク質因子がもたらされる。Ｍ１３は、細胞内で二本鎖の環状ＤＮＡとして複製するが、一本鎖環状型も生じ、これはファージ粒子内にそれをパッケージングする。これらの粒子によって、図１２に図示される方法を用いたライブラリー構築のために有用である、ｐＤＳＰ６２及びｐＤＳＰ７（本出願中の他の箇所に記載される）のようなプラスミドのための一本鎖環状ＤＮＡの都合のよい供給源が得られる。
【００５８】
「プロモーター配列」とは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を規定するためには、このプロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター内では、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うＤＮＡ配列、及び転写開始に必須であるあらゆる関連の因子が見られる。細菌中では、プロモーターは通常、−３５及び−１０のコンセンサス配列と、多かれ少なかれ特定の転写開始部位とからなる。真核生物プロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む場合が多い。細菌の発現ベクター（通常はプラスミド又はファージ）は、一般的には大腸菌のＬａｃｔｏｓｅ、Ａｒａｂｉｎｏｓｅ、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ及びＰｒｏＢオペロン由来のプロモーター、並びにバクテリオファージ供給源由来の他のプロモーターなどの、天然の供給源由来のプロモーターを利用する。例としては、バクテリオファージλ、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６由来のプロモーターが挙げられる。
【００５９】
細菌では、転写は、一般的に細菌のｒｈｏ因子の作用をその活性のために必要とするか否かに応じてｒｈｏ依存性及びｒｈｏ非依存性（又は内因性）ターミネーターに分類される、特定の転写終結配列で通常は終わる。これらのターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼにその転写活性を停止させる部位を特定し、そのためそれらは主としてＲＮＡの３’末端を規定するが、リボヌクレアーゼの続いての作用がＲＮＡをさらに整える場合もある。
【００６０】
「抗生物質耐性遺伝子」とは、所定の抗生物質に対する耐性を細菌に付与するタンパク質をコードする遺伝子を指す。例えば、カナマイシン耐性遺伝子は、薬物を改変して不活性化するホスホトランスフェラーゼの合成を指向する。カナマイシン耐性遺伝子がプラスミド（例えば、ｐＤＳＰ１）上に存在すれば、形質転換された細菌内のプラスミドの存在について選択する機序が提供される。同様に、クロラムフェニコール耐性遺伝子は、アセチル化を通じて抗生物質を不活性化するアセチルトランスフェラーゼ酵素を生成することによって、細菌が薬物の存在下で増殖することを可能にする。本出願では、クロラムフェニコール耐性を用いて、ｐＮＭｓｕｐＡ及びＭ１３ＣＭ１の細菌内での維持を確実にする。
【００６１】
「逆転写及びＰＣＲ」は、アフィニティー選択されたＶＬＰの核酸配列を増幅する手段として本出願で示される。「逆転写」とは、ＲＮＡ分子のＤＮＡコピー（又はｃＤＮＡ）が、逆転写酵素の作用によって生成されるプロセスを指す。本出願では、逆転写を用いて、アフィニティー選択されたＶＬＰにおいてカプシドで包まれたＲＮＡ配列のＤＮＡコピーを生成する。逆転写酵素は、プライマーがＲＮＡにアニールされることを必要とする（以下を参照）。
【００６２】
「ＰＣＲ」という用語は、インビトロで特定のＤＮＡ配列の増幅のために用いられる技術である、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。「ＰＣＲプライマー」という用語は、標的ＤＮＡにアニールすることを可能にし、それによりＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ合成を開始することができるＤＮＡ配列（通常は合成オリゴヌクレオチド）を指す。ＰＣＲプライマーの対をポリメラーゼ連鎖反応で用いて、ＤＮＡの２つの鎖のそれぞれでＤＮＡ合成を開始し、これによって、例えば図９ｂ及び図１５に図示されるように２つのプライマーの間でＤＮＡセグメントを増幅する。
【００６３】
逆転写及びＰＣＲに用いられるプライマーの例をここに示す。
Ｅ２：５’  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡ  ３’−本出願に記載されるＶＬＰによってカプシドで包まれるＲＮＡの３’末端付近にアニールする；逆転写をプライムするために用いられる。
Ｅ３．２：５’  ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧ  ３’−Ｅ２プライマー部位のすぐ上流の部位において、上述の逆転写によって生成されるｃＤＮＡの３’末端付近にアニールする；ＰＣＲ反応中で３’−プライマーとして機能して、アフィニティー選択された配列を増幅する。
Ｅ２及びＥ３．２プライマーは、ｐＤＳＰ１、ｐＤＳＰ１（ａｍ）、ｐＤＳＰ６２、ｐＤＳＰ６２（ａｍ）、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２（ａｍ）、ｐＤＳＰ７、及びｐＤＳＰ７（ａｍ）と共通の配列を含み、従ってこれらの供給源のそれぞれに由来するＶＬＰによってカプシドで包まれるＲＮＡの逆転写及びＰＣＲに有用である。ＰＣＲは、下に記載されるプラスミド特異５’プライマーのうちの１つとのＥ３．２の対合に依存する。簡略のために、ｐＤＳＰ１及びｐＤＳＰ１（ａｍ）についてのプライマーのみを示すが、他のＶＬＰで見られる配列に特異的な類似のプライマーが必要に応じて利用されることも理解されるべきである。
Ｊ２：５’ＡＣＴ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＡＣ  ３’−ｐＤＳＰ１の一本鎖二量体配列の間の接合部で配列に特異的にアニールするプライマー。Ｅ３．２とのＰＣＲ反応では、一本鎖二量体の下流の半分を含むＤＮＡセグメントが増幅される（ＡＢ−ループ中に挿入されたペプチドの配列を含む）。ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩによるＰＣＲ産物の消化によって、関連のプラスミドのＳａｌＩとＢａｍＨＩとの間に挿入され得るフラグメントを生成する（例えば、図９ａを参照）。
Ｊ２（アンバー）：５’  ＡＣ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＡＣ  ３’−このプライマーは、上記Ｊ２と全く同じように機能するが、ｐＤＳＰ１（ａｍ）から生成される配列に特異的である。
【００６４】
「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡ（これは、次にコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される）に転写する場合、細胞中で転写及び翻訳制御配列の「制御下」にある。転写制御配列とは、宿主細胞中でコード配列の発現をもたらす、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節性配列である。翻訳制御配列は、メッセンジャーＲＮＡの翻訳の効率を、通常はリボソーム結合及び翻訳開始の効率を制御することによって決定する。例えば、本出願の他の箇所で考察されるように、ＲＮＡファージのコートタンパク質は、周知のファージレプリカーゼの翻訳リプレッサーである。コートタンパク質は、感染した細胞中において十分に高濃度で蓄積することで、ファージレプリカーゼ遺伝子の翻訳開始領域（シャイン・ダルガーノ及びイニシエーターＡＵＧ)を含むＲＮＡヘアピンに結合する。これは、複製からウイルスアセンブリまでの移行が起きるウイルスのライフサイクルのある時点で、リボソーム結合を妨げて、レプリカーゼの合成を遮断する。
【００６５】
細胞は、外因性又は異種のＤＮＡによって、このようなＤＮＡが細胞の内側に導入された場合に、「形質転換される」。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され）てもよいし、又は組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母及び哺乳動物細胞では、形質転換するＤＮＡは、複製起点のプラスミド上に存在するおかげで通常は細菌染色体とは独立に複製する、プラスミドのようなエピソームエレメント上で維持されてもよい。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換するＤＮＡが染色体中に組み込まれることで、染色体複製を通じて娘細胞によってＤＮＡが受け継がれる細胞である。この安定性は、形質転換するＤＮＡを含んでいる娘細胞の集団から構成される細胞株又はクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって実証される。
【００６６】
本明細書に開示される配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、本明細書に開示される核酸に縮重する、本発明のポリペプチド（単数又は複数）をコードする核酸配列もまた本発明の範囲内であることが理解されるべきである。「縮重する（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｏ）」とは、異なる３文字コドンを用いて個別のアミノ酸を特定することを意味する。
【００６７】
本明細書において、「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに特有の空間的高次構造中に３個のアミノ酸を含み得る。一般的には、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなり、さらに一般的には、少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的高次構造を決定する方法は、当該分野で公知であり、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００６８】
本明細書において、「ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）」とは、本物の抗原性エピトープを模倣するペプチドである。場合によっては、そのアミノ酸配列は、もとの抗原のエピトープとある程度の類似を示し得るが、場合によっては、配列の類似性はほとんど又は全く存在しない。そのような場合、ミモトープは、異なるアミノ酸配列を用いるエピトープの３Ｄ構造を模倣する。糖鎖抗原のエピトープのような、非ペプチドのエピトープさえも模倣するミモトープが確認され得る。
【００６９】
本明細書において、「コートタンパク質（単数又は複数）」という用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのカプシドアセンブリ内に組み込まれ得る、このバクテリオファージ又はＲＮＡ−ファージのタンパク質（単数又は複数）を指す。
【００７０】
本明細書において、「コートポリペプチド」とは、コートタンパク質の機能を保有し、さらに全長のコートタンパク質及び／又はその一本鎖改変体を包含する、コートタンパク質のポリペプチドフラグメントとして本明細書において規定される。
【００７１】
本明細書において、「免疫応答」という用語は、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化若しくは増殖をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。しかし、ある場合には、免疫応答は、低い強度であって、本発明による少なくとも１つの物質を用いる場合にのみ検出可能になることがある。「免疫原性」とは、生きている生物体の免疫系を刺激するために用いられる作用物であり、それによりその免疫系の１つ以上の機能が増大されて、免疫原に向けられる。「免疫原性ポリペプチド」とは、細胞性及び／又は体液性の免疫応答を引き出すポリペプチドであり、アジュバントの有無にかかわらず、単独か又は担体に対して連結されている。好ましくは、抗原提示細胞は活性化され得る。
【００７２】
本明細書において、「自己抗原」という用語は、宿主のＤＮＡによってコードされるタンパク質、及び宿主のＤＮＡによってコードされるタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を指す。さらに、２つの若しくはいくつかの自己分子の組み合わせから生じるか又は自己分子の画分に相当するタンパク質、及び高い相同性又は上記のように２つの自己分子を有する（＞９５％、好ましくは＞９７％、さらに好ましくは＞９９％）タンパク質もまた、自己とみなしてもよい。自己抗原の例としては、限定するものではないが、ＥｒｂＢ−２、アミロイド−β、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、ガストリン、グレリン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、神経成長因子（ＮＧＦ）、アンジオテンシンＩＩ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ及びＭＵＣ−１が挙げられる。
【００７３】
本明細書において、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含みかつ動物に投与され得る形態である処方物を指す。
【００７４】
本明細書において、「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、バクテリオファージの構造を模倣し、非複製的及び非感染性であり、通常は感染性ウイルスとしてそのバクテリオファージの増殖に必要な１つ以上のウイルス遺伝子を欠いているウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰは、通常はまた、宿主に対するウイルスの結合又は進入を担う１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の遺伝子を欠いている。
【００７５】
この定義はまた、前述の１又は複数の遺伝子が依然として存在しているが不活性であり、従ってやはりバクテリオファージの非複製的及び非感染性のウイルス様粒子ももたらす、バクテリオファージのウイルス様粒子を包含する。
【００７６】
「ＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質のＶＬＰ」とは、ＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質の１つ以上のサブユニットの自己アセンブリから形成されるカプシド構造として規定され、通常はそのコートタンパク質自体のｍＲＮＡを含み、さらに任意で宿主ＲＮＡを含む。本出願の目的のために、ＲＮＡファージＶＬＰは通常、１８０コピーの野生型コートタンパク質二量体から、若しくは９０コピーの一本鎖二量体コートタンパク質から、又は可変数の野生型二量体及び１粒子当たり全部で９０個の一本鎖二量体コートタンパク質を含むモザイクＶＬＰとして、アセンブルされる。
【００７７】
核酸分子は、発現制御配列が核酸配列の転写及び翻訳を制御及び調節する場合、その発現制御配列に対して「作動可能に連結される」か、又は「作動可能に会合される」。「作動可能に連結される」という用語は、発現されるべき核酸配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ)を有すること、並びに発現制御配列の制御下で核酸配列の発現及びこの核酸配列によってコードされる所望の生成物の産生を可能にするために正確なリーディングフレームを維持することを包含する。組み換えＤＮＡ分子に挿入することが望ましい遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルを遺伝子の前に挿入してもよい。
【００７８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｎ．Ｙ．（１９８９年），６．３．１−６．３．６．に見られる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約４５℃で６×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて０．２．×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて５０℃で、好ましくは５５℃で、さらに好ましくは６０℃又は６５℃での１回以上の洗浄である。
【００７９】
ウイルス様粒子の生成
本発明は、ウイルス様ファージ粒子、並びにこれらの粒子をインビボ及びインビトロで生成するための方法に関する。通常、これらの粒子はインビボで生成されるが、これらの粒子の使用はインビトロ状況で適用されてもよく、このアプローチは、本発明によって予想される。本発明によって、実験の複雑性を増大して、相互作用選択に必要な時間を短縮することが可能になる。この方法は典型的には、インビトロでビリオンを産生する工程、及びこのビリオンを回収する工程を包含する。本明細書において、ビリオンを「インビトロで」生成するとは、細胞の外側で、例えば無細胞系で、ビリオンを生成する工程を指し、一方で「インビボで」ビリオンを生成するとは、細胞、例えば大腸菌又は緑膿菌細胞の内側でビリオンを生成する工程を指す。
【００８０】
バクテリオファージ
本明細書で想定される系（システム）は、一本鎖ＲＮＡバクテリオファージの特性に基づく（Ｔｈｅ  ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓでのＲＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ，  Ｃａｌｅｎｄａｒ，ＲＬ編集．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．２００５年を参照）。この群の公知のウイルスは、大腸菌、緑膿菌及びアシネトバクターのなど多様な細菌を攻撃する。それぞれ、極めて類似のゲノム構成、複製ストラテジー及びビリオン構造を保有している。特に、バクテリオファージは、一本鎖の（＋）−センスＲＮＡゲノムを含み、マチュラーゼ、コート及びレプリカーゼの遺伝子を含み、かつ小型（３００オングストローム未満）の正二重面体のカプシドを有する。これらとしては、限定するものではないが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ、ＰＰ７、ＧＡ、Ｍ１１、ＭＸ１、ｆ４、Ｃｂ５、Ｃｂ１２ｒ、Ｃｂ２３ｒ、７ｓ及びｆ２  ＲＮＡバクテリオファージが挙げられる。
【００８１】
ＰＰ７は、緑膿菌の一本鎖ＲＮＡバクテリオファージであって、ＭＳ２及びＱβのような大腸菌ファージとは遠縁である。ＰＰ７バクテリオファージは、通常は緑膿菌に感染するが、ＰＰ７コートタンパク質が大腸菌中で図９及び図１３に記載されるプラスミドのようなプラスミドから発現される場合、ウイルス様粒子が容易に生成される。ＰＰ７コートタンパク質は、特異的なＲＮＡ結合活性を備え、ＰＰ７レプリカーゼの翻訳開始領域に融合された配列の翻訳を抑制し得る、特異的なＲＮＡ−結合タンパク質であるということが確認された。これは、ＰＰ７の翻訳オペレーターを抑制するが、ＭＳ２又はＱβファージのオペレーターは抑制しないためである。脱凝集したウイルス様粒子からのコートタンパク質の精製及びそのＲＮＡ結合活性を再構成するための条件は、確立されている。インビトロにおけるＰＰ７オペレーターＲＮＡの解離定数は、約１ｎＭであることが確認された。コートタンパク質がレプリカーゼ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の翻訳を抑制する遺伝子系を用いて、ＰＰ７  ＲＮＡの結合に重要なアミノ酸残基が特定された。Ｐｅａｂｏｄｙら、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｇｅ  ＰＰ７２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｊｕｎ  ２２；２７６（２５）：２２５０７−１３．Ｅｐｕｂ  ２００１年４月１６日。
【００８２】
いくつかの一本鎖ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質は、公知の翻訳リプレッサーであり、レプリカーゼリボソーム結合部位を含むＲＮＡヘアピンを結合することによってウイルスレプリカーゼ合成を遮断する。ＲＮＡファージのＸ線構造決定によって、コートタンパク質アミノ酸配列の比較から明らかになる相同性が、三次構造において反映されることが示される。リプレッサー及びウイルス粒子の基本的構築ブロックの両方であるコートタンパク質二量体は、一緒になってＲＮＡが結合される大きいβシート表面を形成する２つの結び付けられた単量体からなる。コートタンパク質のそれぞれは、異なるＲＮＡを結合するために共通の構造的なフレームワークを用い、それによって特定のＲＮＡ−タンパク質認識の根拠を調査する機会を与える。そのコートタンパク質がＭＳ２のアミノ酸配列に対してわずか１３％のアミノ酸配列同一性しか示さない緑膿菌のＲＮＡバクテリオファージである、ＰＰ７のコートタンパク質のＲＮＡ結合特性を本明細書に記載する。以下の知見もまた示される：（１）ＰＰ７のコートタンパク質は、翻訳リプレッサーである；（２）ＰＰ７レプリカーゼ翻訳開始部位を含むＲＮＡヘアピンは、インビボ及びインビトロの両方でＰＰ７コートタンパク質によって特異的に結合され、このことはこの構造が翻訳オペレーターであることを示す；並びに（３）ＲＮＡ結合部位がコートタンパク質β−シートに存在する。この部位のマップは上に示した。
【００８３】
例示のために、この群での特によく特徴付けられたメンバー、ＭＳ２のゲノムを利用し、これはわずか４個のタンパク質（そのうち２つがビリオンの構造的な成分である）をコードする一本鎖の（＋）−センスＲＮＡの３５６９ヌクレオチド長である。ウイルス粒子は、１８０コピーのコートタンパク質から形成される正二重面体のカプシド及び１分子のマチュラーゼタンパク質と一緒になった１分子のＲＮＡゲノムから構成される。コートタンパク質はまた、特異的なＲＮＡ結合タンパク質である。アセンブリは、コートタンパク質が、レプリカーゼシストロンの５’末端に近いＲＮＡヘアピンである、その特異的な認識標識と会合する場合に開始され得る（その全体が本明細書に援用される、２００９年２月２６日公開の米国特許出願公開第２００９００５４２４６の図１Ｂ及び配列番号１を参照）。次いでウイルス粒子は、細胞がウイルス溶解タンパク質の影響下で破裂する時に培地中に遊離される。感染性ウイルスの形成は、少なくとも３つの構成要素、すなわちコートタンパク質、マチュラーゼ及びウイルスゲノムＲＮＡを必要とするが、実験では、正二重面体のカプシドのシェルのアセンブリに必要な情報は、コートタンパク質自体の中に完全に含まれることが示される。例えば、精製されたコートタンパク質は、ＲＮＡの存在によって刺激されるプロセスにおいてインビトロでカプシドを形成し得る（Ｂｅｃｋｅｔｔら、，１９８８年，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０４：９３９〜４７）。さらに、細胞中でプラスミドから発現されるコートタンパク質は、インビボでウイルス様粒子にアセンブルする（Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｄ．Ｓ．，１９９０年，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：５６８４〜５６８９）。
【００８４】
コートポリペプチド
コード領域によってコードされるコートポリペプチドは、典型的には、少なくとも１２０、好ましくは少なくとも１２５アミノ酸長であり、約１３５アミノ酸長以下、好ましくは１３０アミノ酸長以下である。本質的にいずれかの一本鎖のＲＮＡバクテリオファージ由来のコートポリペプチドが用いられ得ることが予想される。コートポリペプチドの例としては、限定するものではないが、ＭＳ２コートポリペプチド（例えば、米国特許出願公開第２００９００５４２４６号の配列番号２を参照）、Ｒ１７コートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｐ０３６１２を参照）、ＰＲＲ１コートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号ＡＢＨ０３６２７を参照）、ｆｒファージコートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号ＮＰ＿０３９６２４を参照）、ＧＡコートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号Ｐ０７２３４を参照）、Ｑβコートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号Ｐ０３６１５を参照）、ＳＰコートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号Ｐ０９６７３を参照）、ｆ４コートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号Ｍ３７９７９．１を参照）及びＰＰ７コートポリペプチド（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号Ｐ０３６３  ０を参照）が挙げられる。
【００８５】
ＰＰ７コートポリペプチドの例としては、限定するものではないが、ＲＮＡヘアピンを有する複合体でのＰＰ７コートタンパク質二量体の種々の鎖が挙げられる（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号２ＱＵＸＲ；２ＱＵＸＯ；２ＱＵＸ＿Ｌ；２ＱＵＸ＿Ｉ；２ＱＵＸ＿Ｆ；及び２ＱＵＸ＿Ｃ）。また、本明細書の実施例１、及びＰｅａｂｏｄｙら、ＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＰＰ７  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００２年，第３０巻，第１９号、４１３８〜４１４４．［１４，１５］も参照のこと。
【００８６】
本発明において有用なコートポリペプチドとしてはまた、上記で開示されたコートポリペプチドの１つ以上と類似性を有するポリペプチドが挙げられる。この類似性は、構造的類似性と見なされる。構造的類似性は、２つのアミノ酸配列（すなわち、候補アミノ酸配列及びアミノ酸配列）の残基を整列させて、それらの配列の長さに沿った同一のアミノ酸の数を最大限に利用することによって決定され得る；いずれか又は両方の配列におけるギャップは、同一のアミノ酸の数を最大限に利用するために整列させることにおいて許されるが、それぞれの配列におけるアミノ酸は、それにかかわらずその適切な順序のままでなければならない。候補アミノ酸配列とは、例えば米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号の配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列である。候補アミノ酸配列は、一本鎖ＲＮＡウイルスから単離されることも、組み換え技術を用いて産生されることも、又は化学的若しくは酵素的に合成されることもできる。好ましくは、２つのアミノ酸配列は、Ｔａｔｕｓｏｖａら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９年，１７４：２４７〜２５０）に記載されたような、またｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で入手可能である、ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）でのＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズム、又はＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを用いて比較される。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ  ２サーチパラメーターのデフォールト値を用い、これはマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティー＝１１、エクステンションギャップペナルティー＝１、ギャップ  ｘドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝３、及び任意でフィルターオンを含む。ＢＬＡＳＴサーチアルゴリズムを用いる２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性」と呼ばれる。
【００８７】
また好ましくは、コートポリペプチドとしては、上記で開示されるアミノ酸配列の１つ以上に対して、少なくとも８０％のアミノ酸同一性、少なくとも８５％のアミノ酸同一性、少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、コートポリペプチドは活性である。コートポリペプチドが活性であるか否かは、カプシドを形成して一本鎖ＲＮＡ分子をパッケージングするポリペプチドの能力を評価することによって決定され得る。このような評価は、インビボ又はインビトロの系を用いて行われることができ、このような方法は当該分野及び通常作業において公知である。あるいは、ポリペプチドは、言及されたコートポリペプチド及び／又は機能的活性のように類似の３次元構造を有する場合に、構造的に類似であるとみなされ得る。
【００８８】
コートポリペプチド又はポリペプチド中に挿入された異種ペプチド配列は、ランダムなペプチド配列であり得る。特定の実施形態では、ランダム配列は配列Ｘａａnを有し、ここでｎは、少なくとも４、少なくとも６、又は少なくとも８及び２０以下、１８以下、又は１６以下であり、そしてそれぞれのＸａａは、独立したランダムなアミノ酸である。あるいは、ペプチドフラグメントは、規定された配列を有し、公知の機能（例えば、抗原性、免疫原性）を保有し得る。異種配列は、コートポリペプチドのアミノ末端、コートポリペプチドのカルボキシ末端に存在してもよいし、又はコートポリペプチド内の他の箇所に存在してもよい。好ましくは、異種配列は、挿入配列がカプシドの外面に発現されるようにして、コートポリペプチド中のある位置に存在する。特定の実施形態において、及び本明細書の後述の実施例に記載されるように、ペプチド配列は、上述のコートポリペプチドのＡＢループ領域に挿入されてもよい。このような位置の例としては、例えば、コートポリペプチドのアミノ酸１１〜１７、又はアミノ酸１３〜１７の直後のコートポリペプチド中への挿入配列の挿入が挙げられる。最も特殊な実施形態では、異種ペプチドが、ＭＳ−２のアミノ酸１１〜１７、又は特に１３〜１７に対応する部位に挿入される。
【００８９】
本発明による特定の実施形態では、異種ペプチドが、以下に対応する部位に挿入される：
（ａ）ＭＳ−２、Ｒ１７及びｆｒコートポリペプチドのアミノ酸１１〜１７、又は特に１３〜１７；
（ｂ）ＧＡコートポリペプチドのアミノ酸１０〜１６
（ｃ）Ｑβ及びＳＰコートポリペプチドのアミノ酸１０〜１７；
（ｄ）ＰＰ７コートポリペプチドのアミノ酸８〜１１、及び
（ｅ）ＰＲＲ１コートポリペプチドのアミノ酸９〜１７。
【００９０】
あるいは、異種ペプチドは、コートポリペプチドのＮ−末端に挿入されても、又はＣ−末端に挿入されてもよい。
【００９１】
異種ペプチドは、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＭＳ２の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択できる。
【００９２】
この異種ペプチドとしては、限定するものではないが、ＨＩＶペプチド、自己抗原、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、金属結合ペプチド又はＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドが挙げられる。
【００９３】
構造的に類似のコートポリペプチドにおいて対応する位置を決定するために、この構造的に類似のコートポリペプチドのアミノ酸配列を、上記で特定されたような名前を挙げられたコートポリペプチドの配列と整列させる。例えば、ＭＳ−２コートポリペプチドに対して構造的に類似のコートポリペプチドの対応する位置を、配列番号２（本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号の）と整列させる。この整列から、配列番号１（やはり米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号の）の所定の位置に対応する他のコートポリペプチドにおける位置を決定し得る。
【００９４】
特定の実施形態では、コートポリペプチドは、上流及び下流のサブユニットを含む一本鎖二量体である。それぞれのサブユニットは、機能的なコートポリペプチド配列を含む。異種ペプチドは、本明細書において上述された部位で上流及び／又は下流のサブユニットに挿入されることができ、例えば、好ましくは下流サブユニットのＡ−Ｂループ領域に挿入されることができる。特定の実施形態では、このコートポリペプチドは、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号の配列番号１２に示される配列を有し得るＭＳ２コートポリペプチドの一本鎖二量体である。
【００９５】
特定の実施形態では、コートポリペプチドは、上流及び下流のサブユニットを含む一本鎖二量体である。それぞれのサブユニットは、機能的なコートポリペプチド配列を含む。異種ペプチドは、本明細書において上述された部位で上流及び／又は下流のサブユニットに挿入されることができ、例えば、下流サブユニットのＡ−Ｂ領域に挿入されることができる。特定の実施形態では、このコートポリペプチドは、ＰＰ７コートポリペプチドの一本鎖二量体である。
【００９６】
転写単位の調製
本発明の転写単位は、発現調節性領域（例えばプロモーター）、コートポリペプチド
をコードする配列、及び転写ターミネーターを含む。ＲＮＡポリヌクレオチドは、任意でコート認識部位（「パッケージングシグナル」、「翻訳オペレーター配列」、「コート認識部位」とも呼ばれる）を含んでもよい。あるいは、転写単位は、翻訳オペレーター配列を含まなくてもよい。プロモーター、コード領域、転写ターミネーター、及び存在する場合はコート認識部位は、一般的に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」又は「〜と作動可能に会合される」とは、そのように記載された構成要素が、それらの意図する方法で機能することを可能にする関係にある並列状態を指す。調節性配列は、コード領域の発現が、調節性配列と両立する条件下で達成されるような方法で連結される場合に、そのコード領域と「作動可能に連結される」か、又は「作動可能に会合される」。コート認識部位は、存在する場合、それが意図する方法で機能するならば、ＲＮＡポリヌクレオチド内の任意の位置でよい。
【００９７】
本発明は、いずれかの特定のプロモーターの使用によって限定されず、広範な種々のプロモーターが公知である。本発明で用いられるプロモーターは、構成的プロモーターであっても、誘導プロモーターであってもよい。好ましいプロモーターは、コートポリペプチドをコードするコード領域によってコードされた高レベルのＲＮＡを駆動することができる。このようなプロモーターの例は、当該分野で公知であり、例えばｌａｃプロモーターＴ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。
【００９８】
本明細書に記載されるコートポリペプチドをコードするコード領域のヌクレオチド配列は、容易に決定される。本明細書に記載されるコートポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列の分類の例は、配列番号３（本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／００５４２４６の）のヌクレオチド４０８０〜４４７０である。これらの分類のヌクレオチド配列は、大型だが有限であり、この分類のそれぞれのメンバーのヌクレオチド配列は、標準的な遺伝子コードを参照して当業者によって容易に決定され得る。
【００９９】
さらに、ＲＮＡバクテリオファージ一本鎖コートポリペプチドのコード配列は、異種ペプチドの挿入のための部位、及びその異種ペプチドのコード配列自体を含む。特定の実施形態では、その異種ペプチドの挿入のための部位は、制限酵素部位である。
【０１００】
特定の実施形態では、コード領域は、コートポリペプチドの一本鎖二量体をコードする。最も特殊な実施形態では、コード領域は、改変された一本鎖コートポリペプチド二量体をコードし、ここでこの改変は、挿入部位に少なくとも４個のアミノ酸のコード配列の挿入を含む。このような転写単位の特定の実施形態の概略図は、米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号の図３に示される。転写単位は、ｌａｃプロモーターのような細菌のプロモーターを含んでもよく、又はＴ７プロモーターのようなバクテリオファージプロモーター、及び任意でＴ７転写ターミネーターを含んでもよい。
【０１０１】
プロモーター及び融合ポリペプチドをコードするコード領域を含むことに加えて、ＲＮＡポリヌクレオチドは、通常は転写ターミネーター及び任意でコート認識部位を含む。コート認識部位は、ＲＮＡとして存在する場合、ヘアピンを形成するヌクレオチド配列である。これはまた、当該分野では、翻訳オペレーター、パッケージングシグナル、及びＲＮＡ結合部位とも呼ばれる。限定する意図はないが、この構造は、翻訳リプレッサー（例えば、コートポリペプチド）によって認識される結合部位として機能し、ＲＮＡパッケージングを開始すると考えられる。コート認識部位のヌクレオチド配列は当該分野で公知であり、これには例えば配列番号１（米国特許出願公開第２００９／００５４２４６号の図１Ｂを参照）のヌクレオチドが挙げられる。他のコート認識配列は、一本鎖ＲＮＡバクテリオファージＲ１７、ＧＡ、Ｑβ、ＳＰ、及びＰＰ７において特徴付けられており、そして当業者にとって容易に利用可能である。本質的に任意の転写ターミネーターが、それがプロモーターとともに機能するならば、ＲＮＡポリヌクレオチド中で用いられ得る。転写ターミネーターは、当業者に公知であり、容易に利用可能であり、そしてごく普通に用いられる。
【０１０２】
合成
後にさらに詳細に記載されるように、本発明のＶＬＰは、特に転写単位が細菌のプロモーターを含むならば、転写単位を細菌に導入することによってインビボで合成され得る。あるいは、ＶＬＰは、カップリングされた無細胞の転写／翻訳システムにおいてインビトロで生成されることができる。
【０１０３】
異種の物質をカプシドで包むＶＬＰのアセンブリ
合成の間、ＶＬＰは通常、ＶＬＰが翻訳によって生成されるメッセンジャー−ＲＮＡと会合する。これは、本出願に記載されるシステムのアフィニティー選択能力にとって重要である。しかし、いくつかの他の適用（例えば、薬物又は造影剤の標的化送達）では、ＶＬＰへの他の物質の導入が所望され得る。これらのＶＬＰは、異種物質の存在下でインビトロのＶＬＰアセンブリ反応を行うことによってアセンブルされ得る。具体的には、精製されたコートタンパク質サブユニットは、変性剤（通常は酢酸）で脱凝集されたＶＬＰから得られる。タンパク質サブユニットは、異種の物質と混合される。特定の実施形態では、この物質は、ＶＬＰの内部に対してある程度の親和性を有し、好ましくは負に荷電されている。
【０１０４】
別の方法は、翻訳オペレーターの合成ＲＮＡバージョンに対して異種の物質を結合する工程を含む。インビトロのアセンブリ反応の間、ＲＮＡは、その認識部位に緊密に結合し、得られたＶＬＰ中に効率的に組み込まれ、それと一緒に外来物質を保持する。
【０１０５】
別の実施形態では、この物質は、ＶＬＰ表面に自然に存在する細孔を通じてＶＬＰ中に受動的に拡散される。特定の実施形態では、この物質はこれらの細孔を通過するのに十分小さく（ＭＳでは、それは直径約１０オングストロームである）、かつＶＬＰの内部に高い親和性を有する。
【０１０６】
ＶＬＰ集団
上記のとおり、本発明は、ＶＬＰ集団又はライブラリーに関する。本明細書における「集団」及び「ライブラリー」という用語は、交換可能に用いられ、従って同義であるとみなされる。１つの特定の実施形態では、ライブラリーはランダムなライブラリーであってもよい；別の実施形態では、このライブラリーは、抗原性ポリペプチド由来のフラグメントのライブラリーである、抗原フラグメントライブラリーである。
【０１０７】
ランダムライブラリー（集団）
ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドが調製され得る。１つの特定の実施形態では、特定のアミノ酸をコードするトリプレットは、組成ＮＮＳ（ここでＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴであり、ＳはＧ又はＴである）か、あるいはＮＮＹ（ここでＮはＡ、Ｇ、Ｃ、又はＴであり、ＹはＣ又はＴである）を有する。複数のトリプレットがコートタンパク質遺伝子に挿入されて、タンパク質生成物への対応するペプチドの挿入がもたらされる。終止コドンの存在を最小化するために、ペプチドライブラリーは、天然のアミノ酸組成をより正確に反映するように設計された特注の三ヌクレオチドのホスホラミダイト混合物（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）から合成され、終止コドンを完全に欠いているオリゴヌクレオチドを用いて構築されることができる。
【０１０８】
コートタンパク質へのこのようなランダム配列の挿入によって、ＶＬＰの集団（又はライブラリー）の合成がもたらされ、それぞれの粒子は、その表面上で異なるペプチドを提示する。このような集団は、極度に大きくてもよく、数十億の個々のメンバーからなってもよい。実質的に任意のレセプター（例えば、モノクローナル抗体）に特異的なリガンドがこのようなライブラリーに存在することが一般に観察されるが、それらは通常、集団全体のわずかな画分に相当する。アフィニティー選択とその後の増幅（本発明の場合は、カプシドで包まれたＲＮＡの逆転写及びＰＣＲによる）によって、このような希少な種の回収、分析及び開発が可能になる。
【実施例】
【０１０９】
本発明は、本発明の例示として示される以下の非限定的な例を参照することによってさらによく理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに詳細に例示するために示しているが、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１０】
低い価数の異種ペプチドを示すＶＬＰの生成
本出願は、ＭＳ２  ＶＬＰのペプチドディスプレイのための技術の開発における近年の進歩を詳述しており、これはランダム配列ペプチドライブラリーの容易な生成のため及びペプチドディスプレイの価数の制御のための新規なプラスミドベクターの説明を含む。これは、米国特許出願公開２００９００５４２４６号に記載される方法の進歩を表す。
【０１１１】
本発明は、繊維状ファージディスプレイの能力に類似するアフィニティー選択能力を有するＭＳ２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラットフォームの開発に関する。本発明は、部分的には、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質の、外来のペプチドを提示する能力及びそれらの合成のためにテンプレートとして働く同じｍＲＮＡをカプシドで包む能力の両方に基づく。このプロセスは、ＶＬＰを形成する細菌細胞中のプラスミドからのコートタンパク質のランダムなペプチド融合物の合成を必要とする。ＶＬＰは、細胞から抽出されて、特定の抗体に対する結合のためのアフィニティー選択に供される。最終的に、ＲＮＡは、選択されたＶＬＰから抽出されて、カプシドで包まれた配列を回収及び増幅するために逆転写及びＰＣＲに供され、この配列が次にクローニングされて細菌中に再導入され、ここでそれらの配列は、別の回の合成、アセンブリ及び選択のためのテンプレートとして機能する。このプロセスは、必要な回数だけサイクルが繰り返され、最後に、選択された配列を選択されたＶＬＰの高レベルの細菌発現のためにクローニングする。
【０１１２】
いくつかの他の用途の中でも、ワクチン開発を容易にするために開発されている本発明の方法は、単一のプラットフォームでは一緒に利用できなかった重要な特徴を有する。第一に、本発明の方法は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の表面上の高密度反復性アレイとして外来ペプチドを提示することによって高い免疫原性を確実なものにする。これは、外来抗原に対する活発な免疫応答を生じるだけでなく、免疫寛容を克服し、さらに自己抗原に対する抗体を誘導することもできる。第二に、ファージディスプレイと類似のプロセスでは、本発明のプラットフォームは、複雑なランダム配列ライブラリーからアフィニティー選択された配列の回収及び増幅を可能にする。従って、本発明は、単一のプラットフォームにおいて、価数制限及びアフィニティー選択によって関連のエピトープを特定する能力と、その次に免疫系に対してそれらのエピトープをワクチンとして示す能力とを合わせ持つ。エピトープは、抗体標的に対するアフィニティー選択によって特定され、最適化され、次いでプラットフォームを変化することなく、免疫系に対して直接ワクチンとして提示され得る。このペプチドは、それらのもともとの選択の間に存在する構造的連結を変更することなく高密度で提示され、これによって天然のエピトープの忠実な分子模倣物が単離され、それらの最適構造が免疫プロセスの間に維持され、関係する抗体応答が誘導される確率が増大する。
【０１１３】
ＭＳ２  ＶＬＰでの高い複雑性のランダム配列ペプチドライブラリー構築物のためのプラスミドベクター
ＭＳ２  ＶＬＰのランダム配列ペプチドライブラリーを利用する最初の実験は、Ｔ７転写単位を有するアンピシリン耐性プラスミドであるｐＥＴ３ｄの単純な誘導体で実施された。これは、高い複雑性のライブラリーの作成に便利な最適なシステムよりはいくらか劣ると判明したが、そのため本発明者は、重要であると思われる多数の最適特徴を組み合わせた一連のベクターを作成した。
これらとしては以下が挙げられる：
【０１１４】
Ａ．ＡＢ−ループでの挿入のために従来のクローニング部位を有する一本鎖二量体。
ｐＤＳＰ１（図１）は、ＡＢ−ループ−コード配列又はその近位において、例えば１つだけのＳａｌＩ及びＫｐｎＩ制限部位を含むように改変された、一本鎖二量体のコード配列を発現する。典型的には、ＢａｍＨＩ部位は、コート配列の下流に含まれる。この形態の二量体は、外来配列のＡＢ−ループ中への簡易なクローニングを容易にする。これらの部位を１つだけにするため、ベクター中、上流コート配列中及びプラスミド配列中で、多数のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ部位を破壊する必要があった。
【０１１５】
Ｂ．カナマイシン耐性。ｐＤＳＰ１は、カナマイシンに対する耐性を付与する。これによって、形質転換されてない細胞の最初の高いバックグラウンドに対して、液体培養物中の形質転換された細菌の選択を可能にすることにより、ライブラリー構築がかなり容易になる。最初の生成プラスミドベクターによって付与されたアンピシリン耐性は、この目的に対して不適当であった。これは、形質転換された大腸菌による抗生物質の急速な分解によって、培養物中で驚くほど短時間後に選択の損失が生じるからである。これは形質転換されていない細胞の過剰増殖を可能にした。当然ながらこの細胞は、効率的な形質転換方法が利用される場合でさえ、通常はこの集団の大部分に相当する。
【０１１６】
Ｃ．Ｍ１３の複製起点。今日に至るまで、本発明者は、ＰＣＲプライマーを利用して一方の末端にランダムな配列が結合されたフラグメントを生成する手順によって、ランダム配列ライブラリーを構築している。次いで、このフラグメントを適切な制限エンドヌクレアーゼによって消化して、上述される１つだけの部位（典型的にはＳａｌＩとＢａｍＨＩとの間、図１を参照）においてｐＤＳＰ１中にクローニングする。このような方法を用いて、本発明者は、最大１０9までの個々の組み換え体からなるライブラリーを作成した。しかし、このサイズのライブラリーは、これらの方法を用いて構築するには不便である；かなり大きいライブラリーの構築は、典型的なライゲーション反応で見られるよりもさらに高収率の組み換えＤＮＡを効果的に生じる方法によって容易にされる。具体的には、本発明者は、部位特異的な突然変異誘発（２）のための方法のバリエーションを利用するが、この方法は、１０11個の複雑性の範囲で繊維状ファージライブラリーを生成するために他者によって既に用いられている（３）。この方法は、ｄＵＴＰ置換一本鎖環状テンプレート上のミスマッチのプライマーの伸長に依拠する（ｄＵによるｄＴの置換は、ＣＪ２３６又はＢＷ３１３のようなｄｕｔ−、ｕｎｇ−宿主におけるテンプレートＤＮＡの成長によって達成される）。ランダム配列ペプチドライブラリーを作成するために、プライマーは、ＡＢ−ループのいずれかの側でのコート配列に対する相補的な配列が、それぞれの側に配置されたランダムなＤＮＡ配列を含む。このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼで伸長されて、共有結合的に閉鎖された二本鎖環が、ＤＮＡリガーゼの作用によって生成される。ｕｎｇ＋株の形質転換（例えば、エレクトロポレーションによる）は、変異鎖の選択的増殖のための強力な選択をもたらし、そして挿入された配列を保有する組み換え体を高収率で生じる。これらの挿入の変異原性反応は、エレクトロポレーションによっておよそ１０11個以上の個々の組み換え体を容易に生成するのに十分な比較的大量のＤＮＡ（例えば、２０ｕｇ）で行われることができる。
【０１１７】
一本鎖ＤＮＡの生成を容易にするために、Ｍ１３の複製起点がプラスミド中に導入され、そしてＭ１３起点の方向に応じて、ｐＤＳＰ６１及びｐＤＳＰ６２と呼ばれる（図２）。また、Ｍ１３ＣＭ１と呼ばれるヘルパーファージを構築した。これは、クロラムフェニコールでカナマイシン耐性を置き換えるＭ１３Ｋ０７の誘導体であり、これによってカナマイシン耐性を付与するＭ１３ｃｍ１ヘルパー及びｐＤＳＰ６の同時の存在が選択可能になる。プラスミドを含むｄｕｔ-、ｕｎｇ-株（例えば、ＣＪ２３６）のＭ１３ヘルパーファージによる重複感染によって、ｄＵＴＰ−置換一本鎖ＤＮＡの容易な生成がもたらされる。
【０１１８】
Ｄ．合成の「コドンジャグリングされた」コート遺伝子。ライブラリー構築のためにプライマー伸長突然変異を用いる要望によって、新しい問題が導入され、いわゆる「コドンジャグリングされた」コート配列をｐＤＳＰ６へ導入することが必要になった。本発明のペプチドディスプレイ法は、外来のペプチドを一本鎖二量体の２つのＡＢ−ループのうちの一方にのみ特異的に導入する能力に依拠する。上記のスキームでは、変異原性プライマーは、通常は一本鎖二量体の両方の半分での配列にアニールして、二重挿入が生じる。しかし、ＡＢ−ループの両方における同時挿入は、タンパク質折り畳みの失敗を高頻度に生じる。この理由のために、コートタンパク質のコドンジャグリングされたバージョンの合成が完成された。このコドンジャグリングされたバージョンは、可能な最大数のサイレントヌクレオチド置換を一本鎖二量体の上流側半分に導入し、これによって野生型コートタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生じる。しかし、多くの変異の存在によって、ジャグリングされた配列は、変異原性のオリゴヌクレオチドに対して効率的にアニールできなくなる。この方法では、挿入は、一本鎖二量体の下流側半分を標的にする。
【０１１９】
それぞれｐＤＳＰ１（ａｍ）及びｐＤＳＰ６２（ａｍ）と呼ばれるｐＤＳＰ１及びｐＤＳＰ６２の改変体は、ｐＤＳＰ１及びＰＤＳＰ６２の特徴の全てを保持するが、部位指向性の突然変異によって改変されて、アラニンコドン（一本鎖二量体中のコートタンパク質の下流のコピーの最初のアミノ酸を特定する）が、ＵＡＧ（アンバーコドンとして公知の特異的なナンセンスコドン又は終止コドン）に変換される。この終止コドンの抑制によって、単一のｍＲＮＡから、野性型及び一本鎖二量体のコートタンパク質の両方の合成が可能になる。これによって、後でさらに詳細に記載されるような平均のペプチドディスプレイ価数を制御する能力が得られる。
【０１２０】
ナンセンスコドンの読み飛ばしは、通常は抑制されている特定の終止コドンに特異的なサプレッサーｔＲＮＡの存在を必要とする。３つの終止コドン全てに活性なサプレッサーｔＲＮＡが記載されたが、分子生物学者には周知である。本明細書に記載される研究は、アンバーコドンを利用し、従ってこの場合、アラニンを挿入するために特別に設計されたアンバー−サプレッサーｔＲＮＡの使用を必要とする。しかし、他の終止コドン（ＵＡＡ及びＵＧＡ）のそれぞれについて特異的なサプレッサーｔＲＮＡ、及び種々のアミノ酸を挿入することが同様に利用され得ることが理解されるべきである。
【０１２１】
細菌細胞中でサプレッサーｔＲＮＡを生成するために、ｐＮＭｓｕｐＡと呼ばれるプラスミドを生成した（図３を参照）。これは、ｐＡＣＹＣ１８の誘導体であり、ｐ１５Ａプラスミド不適合性群由来の複製起点を含む。これはまた、クロラムフェニコールに対する耐性も提供する。このことは、このプラスミドが、ＣｏｌＥ１起点を有しかつカナマイシンに対する耐性を付与するｐＤＳＰ１（ａｍ）又はｐＤＳＰ６２（ａｍ）をすでに含んでいる細菌細胞では、安定に維持され得るということを意味する。プラスミドｐＮＭｓｕｐＡはまた、ｌａｃプロモーター、及び合成のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１８のポリリンカー領域を含む。ｔＲＮＡ遺伝子の転写は、ｌａｃプロモーターの制御下であり、このことは、サプレッサーｔＲＮＡの合成が、ｌａｃオペロンの誘導因子（例えば、ＩＰＴＧ）によって制御されるということを意味する。合成ｔＲＮＡ遺伝子の配列は、Ｋｌｅｉｎａら（４）によって以前に記載された配列を基にしており、下に示される。これには、ｐＮＭｓｕｐＡ中でそのクローニングを容易にするＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位が隣接する。
【０１２２】
【化１】
2013516181.tif 000002
【０１２３】
サプレッサーｔＲＮＡのレベルを変更することは、ナンセンス抑制のレベルを変更するためにも知られている。ｐＤＳＰ１（ａｍ）又はｐＤＳＰ６２（ａｍ）からの一本鎖二量体の合成のレベルをこのように変更することによって、１個のＶＬＰ当たりに提示されるペプチドの平均数を制御することが可能になり、これによって広い範囲にわたって提示価数の制御が可能になると考えられた。ｐＮＭｓｕｐＡはｌａｃプロモーターを使用するが、サプレッサーｔＲＮＡ合成の制御のために種々のプロモーターが用いられ得ること、及びいくつか（例えば、プロピオン酸塩オペロン（５）のプロモーター）は、実際に、それらのそれぞれの誘導因子の種々の濃度に対して、適切に管理された、段階的な応答を良好に提供できるということは明らかであろう。
【０１２４】
ＩＩＩ．提示価数の制御
ＭＳ２  ＶＬＰで提示されたペプチドの数を制御する手段があることが望ましい。多価数のＭＳ２  ＶＬＰディスプレイ（１粒子当たり９０コピーのエピトープ）によって、抗体について高い内因性の親和性を有するペプチドを提示するＶＬＰを、低い内因性の親和性を有するが、複数の弱い相互作用をする能力のおかげで依然として緊密に結合するものから、区別することが困難になるはずである（すなわち、結合活性対親和性）。これは、繊維状ファージディスプレイについての周知の問題であり、ここでは高い親和性の相互作用の選択は、通常は低い提示価数の使用を必要とする。最高の親和性のペプチドを選択する場合に、適切な分子模倣物の発見はかなり増加される。以下は、選択のストリンジェンシーを改善するために提示価数を減少するための方法の説明である。
【０１２５】
価数の制御。所定のモノクローナル抗体に対する最高の親和性を有するペプチドの選択が天然の抗原の最良の分子模倣物を提供すること、及びこれらは関係する抗体応答を誘導する可能性が最も高いことが仮定される。理想的には、このアプローチは、多価提示を用いて初回の選択を行い、これにより標的に対していくつかの最少の親和性を有する全てのペプチドを含む比較的複雑な集団を得る。次いで、親和性選択のストリンジェンシーを増大するために、その後の回では提示価数を少なくすることが望ましい。
【０１２６】
このアプローチでは、単一のＲＮＡから大量の野性型及び少量のＡＢ−ループ組み換えタンパク質の生成を可能にするシステム（系）が提供される。一本鎖二量体中のコートタンパク質の下流のコピーの最初のアミノ酸を普通はコードするアラニンコドンの代わりにアンバー終止コドンを含む、ｐＤＳＰ１の改変体（ｐＤＳＰ１（ａｍ））を構築した（図３を参照）。従って、ｐＤＳＰ１（ａｍ）は、普通は野性型コートタンパク質のみを産生し、これは当然ながら普通はＶＬＰにアセンブルされる。さらに、本発明者は、アラニン−挿入サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を合成してクローニングした。異なる不適合性群由来のクロラムフェニコール耐性プラスミド上でのｌａｃプロモーターの制御下で発現されて、サプレッサーｔＲＮＡは、コート配列を翻訳するわずかな割合のリボソームにアンバー（終止）コドンを読み飛ばしさせて、一本鎖二量体を産生する量で産生される。得られたタンパク質は（そのゲストペプチドとともに）、同じｍＲＮＡから発現される野性型タンパク質とアセンブルして、モザイクカプシドを形成する。精製されたＶＬＰはこのベクターから産生され、それらは平均して、１個のＶＬＰ当たり約３個のペプチドを提示すると予測された。ＳＤＳゲル電気泳動（図４を参照）によって、精製されたＶＬＰ中の「読み飛ばし」生成物の内容を示す。これらを試験して、予想どおりアフィニティー選択のストリンジェンシーの増大を確認した。アガロースゲル電気泳動及びノーザンブロットによって、粒子が関係するＲＮＡをカプシドで包むことが確認される。必要であれば、価数はさらに、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを減少することによって減少されることができる。実際に、サプレッサーｔＲＮＡ合成のレベルを調節することによって、広い範囲にわたって読み飛ばし生成物の発現（及び提示価数）を制御することが可能である。これは、活性が誘導因子の濃度に応じて正確に調節され得るプロモーター（例えば、ｐｒｏＢ）からｔＲＮＡを発現することによって達成される。
【０１２７】
抗原フラグメントライブラリー
別の方法では、クローニングされた抗原遺伝子又は表現型ゲノムの存在を利用してランダムな抗原フラグメントライブラリーを作成する。このようなライブラリーの作製のためには、いくつかの方法が存在する。１つは、例えば適切な平均サイズ（例えば、３０ｂｐ）のフラグメントを生成するためにＤＮａｓｅＩで処理することによる、抗原遺伝子のランダムなフラグメントを要件とする。これらは、コートポリペプチドをコードする遺伝子中の適切な部位に対して平滑末端で連結（ライゲート）される（例えば、一本鎖コートタンパク質二量体のＡＢ−ループ中において）。次いで得られたライブラリーを、アフィニティー選択に供して、抗体によって認識されるペプチドを提示するＶＬＰを回収する。特定の実施形態では、制限部位を、コートポリペプチドのＡＢ−ループ又はＮ−末端に挿入してもよい。
【０１２８】
合成
ＲＮＡファージＶＬＰは、溶解されてＶＬＰが抽出される生きている大腸菌細胞中のプラスミドから通常は生成される。本発明者によって今まで行われ、本出願の別の箇所で記載された実験では、ＭＳ２及びＰＰ７のＶＬＰのランダム配列ペプチドライブラリーは、この方法で正確に生成された。しかし、特定の別の実施形態では、本発明の集団は、当該分野で公知の手順を用いて、結合されたインビトロの転写／翻訳システムにおいて合成されてもよい（例えば、米国特許第７，００８，６５１号；Ｋｒａｒｎｅｒら、１９９９年，Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＨａｍｅｓ（編集），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）。特定の実施形態では、バクテリオファージＴ７の（又は関連の）ＲＮＡポリメラーゼを用いて、このようにして生成された大量のＲＮＡを効率的に翻訳するために最適化されたシステム（系）において、Ｔ７プロモーターの制御下で、クローニングされた遺伝子の高レベル転写を指向する（例えば、Ｋｉｍら、１９９６年，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３９：８８１〜８８６；Ｊｅｗｅｔｔら、２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＢｉｏｅｎｇ  ８６：１９〜２６を参照）。
【０１２９】
ＶＬＰがインビボで生成される場合、大腸菌の細胞自体が区画化を提供して、これが所定のコートタンパク質−ペプチド組み換え体の複数のコピーがそのｍＲＮＡと特異的にアセンブルすることを確実にする。同様の形態の区画化が提供されないと、特に本発明の集団において、テンプレートの混合物（すなわち、ライブラリー）からインビトロで合成の間に、異なるペプチドに対するそれらの融合によって識別される異なる個々のコートポリペプチドは、恐らく互いのｍＲＮＡをパッケージングし、それによって有効なファージディスプレイに必要な遺伝子型／表現型の連鎖を破壊する可能性がある。さらに、それぞれのＶＬＰは、多数のサブユニットからアセンブルされるので、ハイブリッドＶＬＰの形成が生じ得る。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の集団又はライブラリーを調製する場合、１回以上のサイクルの転写／翻訳反応を、水／オイルのエマルジョン中で行う（Ｔａｗｆｉｋら，１９９８年，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：６５２〜６）。この現在では十分に確立された方法では、個々のテンプレートを、水／オイルのエマルジョンの水の部分に隔離する。適切な条件下で、多数の水性の微小液滴が形成されることができ、それぞれが平均して単一のＤＮＡテンプレート分子及び転写／翻訳の機構を含む。それらはオイルに囲まれるので、これらの部分は互いに通じない。このような液滴中で合成されたコートポリペプチドは、それらをコードする同じｍＲＮＡと特異的に会合するはずであり、１つのペプチドのみを提示するＶＬＰへとアセンブルするはずである。合成後に、このエマルジョンは破壊され、ＶＬＰは回収されて選択に供されることができる。１つの特定の実施形態では、転写／翻訳反応の全てが水／オイルのエマルジョン中で行われる。１つの特定の実施形態では、１つの液滴当たり１つのテンプレートのみを含む液滴（１つのペプチドのみを提示するＶＬＰ）だけが単離される。別の実施形態では、混合ＶＬＰを含む液滴が、１回以上のサイクルの転写／翻訳反応で単離され（１つの液滴当たり複数のテンプレート）、その後にペプチドを１つだけ提示するＶＬＰ（１つの液滴当たり１個のテンプレート）が単離される。
【０１３０】
ＶＬＰ及びＶＬＰ集団の使用
本発明のＶＬＰ及びＶＬＰ集団は、多くの用途の可能性がある。以下にさらに詳細に記載されるように、ＶＬＰは、免疫原性組成物、特にワクチンとして、薬物送達デバイスとして、生体医学造影剤として、又は自己アセンブリナノデバイスとして用いられ得る。本発明のＶＬＰ集団は、適切なワクチン候補を選択するために用いられ得る。
【０１３１】
ワクチン候補の選択
本発明のＶＬＰ集団又はライブラリーは、ワクチン候補物を選択するために用いられ得る。このライブラリーは、ランダムライブラリーであっても、又は抗原性ライブラリーであってもよい。ランダムあるいは抗原由来ペプチドの配列ライブラリーは、ＶＬＰの表面及び特異的な標的エピトープ、又はおそらくミモトープ上に提示され、次いで抗体を用いるアフィニティー選択によって単離される。ＶＬＰは、それら自体のｍＲＮＡをカプシドで包むので、それら（及びそれらのゲストペプチド）をコードする配列は、逆転写及びＰＣＲによって回収され得る。個々のアフィニティー選択されたＶＬＰは、続いてクローニング、過剰発現及び精製される。
【０１３２】
ファージディスプレイにおけるアフィニティー選択のための技術は十分開発されており、本発明のＶＬＰディスプレイシステムに直接適用可能である。つまり、抗体（又は抗血清）は、ランダム配列又は抗原フラグメント提示ライブラリー中のＶＬＰのペプチドとの複合体を形成することができる。典型的には、抗体はビオチンで標識され、それによりこの複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされた表面、磁気ビーズ又は他の適切な固定媒体に対する結合によって捕獲されることができる。洗浄後、結合されたＶＬＰが溶出され、ＲＮＡは、アフィニティー選択された集団から抽出されて、逆転写及びＰＣＲに供されてコートをコードする配列を回収し、この配列が次に再クローニングされて、最良結合の改変体が得られるまで、発現及びアフィニティー選択のさらなる回に供される。ＶＬＰからＲＮＡを回収するための多数のスキームが、容易に想定される。１つの魅力的な可能性は、ストレプトアビジンコーティングされたＰＣＲチューブ中でビオチン−ｍＡｂ−ＶＬＰ複合体を単に捕獲し、次にＶＬＰを熱的に変性し、それらのＲＮＡ内容物を直接ＲＴ−ＰＣＲに供することである。多くの明らかな代替手段が存在し、種々の固定媒体の結合能力などの考慮に応じて調節が必要な場合もある。一旦、選択された配列がＲＴ−ＰＣＲによって回収されれば、それらをクローニングして大腸菌中に再導入することは簡単なことであり、それぞれの段階で注意して必須のライブラリー多様性（これは当然ながら各回の選択で減少する）を保存する。選択が完了したら、それぞれのクローンは、ＶＬＰワクチン候補を産生するために過剰発現されることができる。
【０１３３】
ＭＳ２  ＶＬＰプラットフォーム上でのアフィニティー選択の効率を確立するため、エピトープが十分特徴付けされたモノクローナル抗体標的を用いて上記の方法によって選択が行われた。Ｍ２  抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体、及びライブラリーは、ｐＤＳＰ１中で構築され、アミノ酸１３及び１６についてのコドンの間に挿入された（すなわち、１３／１６挿入モード）１０個のＮＮＳトリプレットを含む。この特定のライブラリーは、約１０8個の独立したクローンを含み、かつ外来のペプチドを高い価数で提示した。それ以降、さらに複雑なライブラリーをｐＤＳＰ６２（上記参照）を用いて構築した。しかし、ｐＤＳＰ１ライブラリーが、Ｆｌａｇエピトープに遭遇する合理的な可能性を得るために十分複雑であると考えられた。第一回の選択を、抗体分子に対して１０倍過剰であると推測されたＶＬＰを用いて、プラスチックウェルに対する吸着によって固定された２５０ｎｇの抗体に対して行った。過剰の洗浄後に、結合したＶＬＰを溶出し、次に逆転写及びＰＣＲに供した。ＰＣＲ生成物をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、２回目で使用されるＶＬＰの産生のためにｐＤＳＰ６２中にクローニングした。ここにおいて、及び全ての引き続く回において、選択物のクローニングによって、少なくとも５×１０6個の独立したクローンを得た。２回目の選択は、１回目と同じ条件下で行われた。２回目及び３回目の生成物を、ｐＤＳＰ６２（ａｍ）にクローニングして、ＶＬＰを上記のアンバーサプレッサー（ｐＮＭｓｕｐＡ）の存在下で生成した。このことは、３回目及び４回目では、ペプチドが低価数で提示されたことを意味する。４回目では、抗体の量は５０ｎｇまで減少され、それによりＶＬＰは、抗体に比較して約５０倍過剰で存在する。４回目の後、ＶＬＰの過剰産生及び精製を期待して、高価数の提示のために生成物をｐＤＳＰ６２中にクローニングした。それぞれの回からの２〜３の選択物の配列を図２２に示す。初期の回に得られた配列は、公知のＦｌａｇエピトープＤＹＫＤＤＤＤＫＬに対して限られた類似性を示すが、特にＹＫジペプチドなどの、特定の重要なエレメントが既に明白である。３回目まで、全ての配列は、少なくとも１つの下流ＤとともにＤＹＫエレメントを示す。４回目までに、１個の配列のみを、配列分析に供された７個のクローンから得た。野生型フラグエピトープの配列に対するその類似性は明白である。Ｆｌａｇエピトープは、従来の繊維状ファージディスプレイ方法を用いて以前にマッピングされており、その結果は、ＮＥＢ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，１９９６年  夏で報告された（Ｔｈｅ  ＮＥＢ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔは、ファージディスプレイライブラリー及びアフィニティー選択キットの商業的供給業者である、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓの刊行物である（彼らのウェブサイト、ｗｗｗ．Ｎｅｂ．ｃｏｍで入手可能））。図２２に報告される配列は、現実にＮＥＢの実験で得られた配列よりも実際のエピトープに対してよく適合しており、このことは、ＭＳ２  ＶＬＰディスプレイシステムが、アフィニティー選択によるエピトープ特定のための繊維状ファージディスプレイと少なくとも同じ程度に効率的であることを示す。
【０１３４】
免疫原性組成物
上述したとおり、本発明のスクリーニング手順によって特定されるＶＬＰを用いて、免疫原性組成物、特にワクチンを処方してもよい。ワクチンは、動物に対して投与され得る形態でなければならない。典型的には、ワクチンは、本発明の組成物が懸濁又は溶解されている、従来の生理食塩水又は緩衝化水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物は、ある状態又は障害を予防、緩和又は処置するために都合よく用いられ得る。宿主への導入の際、ワクチンは、これらに限定されないが、抗体及び／若しくはサイトカインの産生、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／若しくは他の細胞の活性化などの免疫応答、並びに／又は他の細胞性応答を誘発することができる。
【０１３５】
任意で、本発明のワクチンはさらに、本発明の化合物に対してわずかな割合でも又は大きな割合でも存在することができるアジュバントを含む。「アジュバント」という用語は、本明細書において、免疫応答の非特異的な刺激因子又は宿主中でデポの生成を可能にする物質であって、本発明のワクチンと組み合された場合、さらにより増強された免疫応答を提供するものを指す。種々のアジュバントが用いられることができる。例としては、完全及び不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム及び改変ムラミルジペプチドが挙げられる。
【０１３６】
任意で、本発明のワクチンは、本発明の化合物に対してわずかな割合でも又は大きな割合でも存在することができるアジュバントをさらに含む。
【０１３７】
標的化薬物送達
特定の細胞レセプターに結合するペプチドを特定し、それによって標的細胞に結合かつ進入する能力を持った（例えば、エンドサイトーシスによる）粒子を生成するために、アフィニティー選択を用いることができる。ＭＳ２  ＶＬＰは、２０ｎｍの大きさの内径を有する中空の球体である。特定の実施形態では、ＶＬＰは、薬物、例えば送達されるべきタンパク質毒素及び任意で細胞型特異的なレセプターに結合するリガンドを含む。このような粒子の内部組成は、例えば、リシンのようなタンパク質毒素をそれに特異的に充填することによって、又は合成の翻訳オペレーター模倣物に対してカップリングすることによって調整され得る。このような粒子の外面に対して細胞特異的なレセプターを結合する能力を付与することによって、選択される細胞型を毒素（又は他の薬物）の送達の標的とすることができる。関連する側面では、コートポリペプチド二量体を含むＶＬＰは、細菌毒素、アジュバント又は免疫刺激性核酸などの異種物質を実際にカプシドで包み得る。
【０１３８】
生体医学造影剤
薬物が特定の細胞型を標的とし得る同じ方法では、核磁気共鳴画像化のための造影剤が、特定の細胞又は組織に対して送達されることができると考えられ、可能性としては、ＭＲＩの診断力を大いに増大する。実際に、ＭＳ２粒子は、ＭＲＩのコントラストを大きく増大するために、既にガンドリニウムで標識されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，２００６年，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６（６），１１６０〜１１６４）。従って、特定の実施形態では、このような粒子は、それらの表面上で適切なレセプター特異的ペプチドを提示することによって、特定の部位を標的とすることができるであろう。関連の側面では、コートポリペプチド二量体を含んでいるＶＬＰは、実際に造影剤をカプシドで包み得る。
【０１３９】
自己アセンブリするナノデバイス
本発明のＶＬＰは、金属結合タンパク質を提示する繊維状ファージ粒子のいずれかの末端に親和性を有するペプチドを含み得る。繊維状ファージ粒子のいずれかの末端に親和性を有するＶＬＰは、繊維状ファージナノワイヤの末端に対してこれらの球体（及びそれらが含むものなら何でも）を連結する可能性を生じる。あるいは、ＶＬＰは、金属結合ペプチド（例えば、金及び亜鉛）を提示でき、それにより通常ではない電気的及び光学的な特性を有するアレイが得られる場合がある。あるいは、これらのアレイに自己アセンブリする能力が改善されたＶＬＰは、特定の表面に対する親和性を有するペプチド、又はＶＬＰ自体の自己会合の特性を変更するペプチドを提示することによって産生され得る。
【０１４０】
実験の概説
バクテリオファージＭＳ２のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の上でランダム−配列ペプチドライブラリーの構築を容易にする２つのプラスミドベクターを記載する。最初のｐＤＳＰ１は、ＰＣＲ−生成されたフラグメント又は他の二本鎖ＤＮＡフラグメントを、コートタンパク質一本鎖二量体の下流のコピーのＡＢ−ループ中に都合よくクローニングするために構築された。二番目はｐＤＳＰ６２と呼ばれ、これは、Ｋｕｎｋｅｌら［１６］の部位指向性突然変異誘発法によって一本鎖二量体中の事実上任意の位置（通常はＡＢ−ループ）にペプチド配列を導入するために、特異的に構築された。これらのプラスミドの一般的な特徴を下に示す。
【実施例１】
【０１４１】
ｐＤＳＰ１−都合のよいＡＢ−ループ中の挿入のためのクローニング部位を有する一本鎖二量体を発現するプラスミド
プラスミドｐＤＳＰ１（図５ａ及び図７ａを参照）は、ｐＥＴ３ｄのＴ７転写シグナル、カナマイシン耐性、及びｐＥＴ９ｄの複製起点を含む（ｐＥＴ３ｄ及びｐＥＴ９ｄに関する情報は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｖｅｃｔｏｒのデータベース、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌａｂｌｉｆｅ．ｏｒｇ／ｃｔ？ｆ＝ｖ＆ａ＝ｌｉｓｔｖｅｃｉｎｆｏで見られる）。これは、１つだけのＳａｌＩ及びＫｐｎＩ制限部位を含むように改変された、ＭＳ２一本鎖コートタンパク質二量体（６）のコード配列を発現する。これによって、外来の配列をＡＢ−ループに簡易にクローニングすることが容易になる。これらの部位を１つだけにするには、ベクター中及び上流コート配列において、他のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ部位を破壊することが必要であった。
【０１４２】
ｐＤＳＰ１のＡＢ−ループ挿入部位の近傍のＭＳ２コート配列を下に示す。ＳａｌＩ及びＫｐｎＩ部位の存在に注意されたい。
【０１４３】
【化２】
2013516181.tif 000003
【０１４４】
下に示すのは、ｐＤＳＰ１中のランダムな７マーのライブラリーの例であって、ここではランダムな配列が、いわゆる１３／１６モードで挿入されている。
【０１４５】
【化３】
2013516181.tif 000004
【０１４６】
ＡＢ−ループをコードする配列中又はその付近に、１つしかない複数の制限部位が存在することは、それらがその切断によって適合性の「付着末端」を生じる部位に隣接する場合、外来配列を簡易に挿入することが可能になる。しかし、これは時に、図５ｂに示されるようなＰＣＲ法及び組み換えＤＮＡ法の組み合わせを用いて外来配列を結合するのにさらに便利である。例えば、下に示される５’ＰＣＲプライマーを、ＢａｍＨＩの下流のプラスミドベクター配列にアニールする３’プライマーとともに用いて、アミノ酸１３と１６との間に挿入されたランダム配列を有するコートタンパク質コード配列のフラグメントを生成してもよい。Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴであり、Ｓ＝Ｇ又はＣである。ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩでの消化後、このフラグメントは、ｐＤＳＰ１のＳａｌＩとＢａｍＨＩとの間に挿入される。下に示すのは、このようなライブラリーを生成するために用いられ得る５’−プライマーの例である：
【０１４７】
【化４】
2013516181.tif 000005
【０１４８】
ｐＤＳＰ１を用いれば、ランダム−配列ペプチドライブラリーは通常、テンプレートとして単量体のコートタンパク質配列を用いて生成されたＰＣＲフラグメントをＡＢ−ループ中にクローニングすることによって構築される（例えば、ｐＭＣＴ）。合成のオリゴヌクレオチド５’−プライマーは、ＳａｌＩ（又はＫｐｎＩ）部位及びランダムなコドンの配列（例えば、６〜１０コピーのＮＮＹ）をＡＢ−ループのすぐ上流の部位に結合するように設計される。３’−プライマーは、ＢａｍＨＩのすぐ下流のプラスミドベクター中の配列にアニールする。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ（又はＫｐｎＩ）及びＢａｍＨＩで消化して、ｐＤＳＰ１の対応する部位にクローニングする。これによってＡＢ−ループへのペプチドの挿入が生じるが、挿入の正確な部位は、５’−プライマーの特異的な設計に依存する。ほとんどの挿入に関し、ＳａｌＩ部位の使用は、挿入部位の選択においてＫｐｎＩよりも柔軟性を与えるので好ましい。これらの方法によれば、最大で１０8〜１０9個の個々のメンバーを有するペプチドＶＬＰライブラリーを比較的直接的に生成する。
【０１４９】
ペプチドディスプレイ価数の制御のための手段を導入するために、ｐＤＳＰ１の誘導体（ｐＤＳＰ１（ａｍ）と呼ばれる）を、一本鎖二量体の半分の間の接合部でのナンセンスコドンの導入によって構築した。ｐＮＭｓｕｐＡによって産生されたようなナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの存在下で発現される場合、少量の一本鎖二量体が（その外来ペプチドとともに）産生される。しかし、ｐＤＳＰ１（ａｍ）から産生されるほとんどのコートタンパク質は、野生型の単位長タンパク質の形態で合成される。２つの形態のコートタンパク質は、平均でわずか約３個のペプチドしか提示しないハイブリッド粒子へとコアセンブル（共集合）する。提示価数の平均レベルは、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを変更することによって、又はより大きいか若しくは小さい抑制効率を示すサプレッサーを使用することによって、大小に調節され得る。
【実施例２】
【０１５０】
ｐＤＳＰ６２−効率的な部位指向性突然変異誘発方法を用いるライブラリー構築のために適切なプラスミド
Ｍ１３複製起点の導入
ｐＤＳＰ１について上述したようなライブラリー生成のための方法は、大規模にするのが困難である。これは、ＤＮＡ制限フラグメントを必要な量で精製するのに不便なためである。さらに、ライゲーション反応の間、無用な副産物へ否応なく変換されるＤＮＡがあり、これが所望のプラスミドの収率を下げる。複雑なライブラリーの構築は、代表的なライゲーション反応で見られるよりも正確な組み換えＤＮＡをより高い収率で効率的に生じる方法によって容易にされる。具体的には、部位指向性の突然変異誘発のための古い方法のバリエーションを用いることが好ましく、これは既に他者により、１０11個の複雑性の範囲で、繊維状ファージ上でペプチドライブラリーが生成されている（２，６）。この方法を、Ｍ１３複製起点を含む特定の種類のプラスミド（ファージミドとしても公知）から生成された一本鎖の環状ＤＮＡに適用する。プラスミドを含んでいるｄｕｔ-、ｕｎｇ-株（例えば、ＢＷ３１３）のＭ１３ヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０７）による感染の結果として、ｄＵＴＰ−置換の一本鎖のＤＮＡの産生が容易になる。現実の突然変異誘発の反応では、ミスマッチのオリゴヌクレオチドプライマーは、一本鎖のＤＮＡテンプレートにアニールされて、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ファージのもの）を用いて延長される。ＤＮＡを、閉鎖した環状ＤＮＡを生成するために連結し、形質転換によってｕｎｇ＋株に導入し、ここでこの変異株を優先的に複製する。ペプチド−ＶＬＰライブラリーの産生における以前の実験では、典型的には約９０％の形質転換体が所望のペプチド挿入物を含むことが示される。プライマー伸長の突然変異誘発反応は、エレクトロポレーションによって１０11個程度の個々の組み換え体を容易に生成するのに十分な、比較的大量のＤＮＡ（例えば、２０μｇ）で行われることができる。
【０１５１】
一本鎖のＤＮＡの産生を容易にするため、Ｍ１３複製起点をｐＤＳＰ１に導入した。これを行うために、ｐＵＣ１１９で見られるＭ１３起点をＰＣＲによって増幅して、ｐＤＳＰ１における唯一のＡ１ｗＮＩ部位にクローニングした。ｐＤＳＰ１−ＩＧと呼ばれるこのプラスミドは、ｐＤＳＰ６２の前駆体である。これは、ｐＤＳＰ６２Ｉの構築における唯一の中間体であるので、その配列は示していない。
【０１５２】
合成の「コドンジャグリングされた」コート遺伝子の使用を通じた一本鎖二量体の半分のみへの標的化挿入
効率的なペプチドライブラリー構築物のためにプライマー伸長突然変異誘発を用いるという要望によって、新しい問題がもたらされた。本発明の提示方法は、外来ペプチドを一本鎖二量体の２つのＡＢ−ループの一方にのみ特異的に導入する能力に依拠する。ｐＤＳＰ１に存在する一本鎖二量体配列を用いると、変異原性のプライマーは、両方の半分での配列にアニールして二重の挿入を生じたが、ＡＢ−ループの両方における挿入は、タンパク質折り畳みの失敗を高頻度で生じることが既に公知である。さらに、挿入に耐えた場合でも、一本鎖二量体の半分のみを標的とすることができなかった部位指向性の突然変異誘発は、それぞれのＶＬＰで、２つの異なるペプチドの提示をもたらすであろう。
【０１５３】
これらの理由で、コートタンパク質の「コドンジャグリングされた」ものを合成して、一本鎖二量体の正常な上流の半分と交換した。このコドンジャグリングされた配列は、可能な最大数のサイレントヌクレオチド置換を含み、従って野生型コートタンパク質アミノ酸配列を有するポリペプチドを生じる。しかし、多数の変異体の存在によって、このジャグリングされた配列は、変異原性のオリゴヌクレオチドに対して効率的にアニールできなくなり、従ってこの変異原性のプライマーは特異的に、下流のＡＢ−ループ配列に指向される。プラスミドｐＤＳＰ６２は図６に示され、その配列は図７ｂで提供される。
【０１５４】
一本鎖ｐＤＳＰ６２産生のためのクロラムフェニコール耐性Ｍ１３ヘルパーファージ
プラスミドｐＤＳＰ６２は、カナマイシンに対する耐性を付与する。一本鎖ファージミドＤＮＡの産生のために通常用いられるヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３ＫＯ７）もカナマイシン耐性を付与し、従ってここで記載されるプラスミドでの使用には不適切である。この理由で、Ｍ１３ＫＯ７のクロラムフェニコール耐性誘導体である、Ｍ１３ＣＭ１を構築した。ｐＡＣＹＣ１８４（７）のクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩに対する認識配列を結合したプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、そのフラグメントを、カナマイシン耐性決定基にほぼ隣接するＸｈｏＩ及びＳａｃＩ部位を利用して、カナマイシン耐性遺伝子の代わりにＭ１３ＫＯ７に挿入した。カナマイシン（ｐＤＳＰ６２維持を選択する）及びクロラムフェニコール（ヘルパーファージを選択する）の存在下で、細胞は、Ｍ１３  ＣＭ１での感染後に大量の一本鎖のプラスミドＤＮＡを産生する。これらの一本鎖のテンプレート及びＫｕｎｋｅｌら（２）の方法を用いて、［ＮＮＳ］6、［ＮＮＳ］7、［ＮＮＳ］8及び［ＮＮＳ］10について１０10個を超える個々のメンバーを含むランダム配列ペプチドライブラリーが容易に産生された。著しく高い複雑性が、大規模化とともに可能である。
【０１５５】
ペプチドディスプレイ価数の制御のための手段を導入するために、ｐＤＳＰ６２の誘導体（ｐＤＳＰ６２（ａｍ）と呼ばれる）を、一本鎖二量体の半分の間の接合部におけるナンセンスコドンの導入によって構築した。ｐＮＭｓｕｐＡによって産生されるもののようなナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの存在下で発現した場合、少量の一本鎖二量体が（その外来ペプチドとともに）産生される。しかし、ｐＤＳＰ１（ａｍ）から産生されるほとんどのコートタンパク質は、野生型の単位長のタンパク質の形態で合成される。２つの形態のコートタンパク質は、平均でわずか約３個のペプチドしか提示しないハイブリッド粒子へとコアセンブル（共集合）する。提示価数の平均レベルは、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを変更することによって、又はより大きいか若しくは小さい抑制効率を示すサプレッサーを使用することによって、大小に調節され得る。
【０１５６】
上述されるとおり、バクテリオファージＭＳ２のウイルス様粒子がペプチドディスプレイのために用いられて、ＭＳ２コートタンパク質一本鎖二量体がペプチド挿入に極めて耐性であること、及びそれらがその合成をコードするｍＲＮＡを特異的にカプシドで包む正確にアセンブルされたＶＬＰを生成することが確認された［２］。しかし、ＭＳ２は、個々のメンバーが同様の分子生物学を共有するウイルスの大きいファミリーの１つのメンバーでしかない。上記のプラスミド及び方法は、本発明者が、ＭＳ２コートタンパク質一本鎖二量体の挿入耐性、及びＭＳ２  ＶＬＰがその合成を指向するｍＲＮＡをカプシドで包む能力を実証した、以前に記載されたＭＳ２  ＶＬＰディスプレイシステムに対して改良点を示す［２］。以下の例は、ＰＰ７  ＶＬＰについて最近得られたもの［１］と同様の結果を実証しており、このことは、ＰＰ７一本鎖コートタンパク質二量体の折り畳み及びアセンブリがまた、外来ペプチド挿入に対して高い耐性を示すこと、並びにこのようにして得られたＶＬＰが、ｍＲＮＡの形態でそれらの合成のための遺伝的情報を含むことを明確に示している。
【０１５７】
ここで次に、ペプチドディスプレイを目的として、緑膿菌のバクテリオファージである、ＰＰ７のＶＬＰの操作を記載する。
【０１５８】
ＰＰ７  ＶＬＰは、ＭＳ２  ＶＬＰを上回るいくつかの潜在的な利点及び改善を提供する。第一に、安定化した内部サブユニットジスルフィド結合が存在するおかげで、この粒子は熱力学的に劇的により安定である（８）。ワクチンを含む多くの実質的な適用のために、安定性の増大は所望の特質である。第二に、ＰＰ７  ＶＬＰは、ＭＳ２のものと免疫学的に交差反応性でない（９）。このことは、ＶＬＰの一連の投与が必要となる場合があるワクチン又は標的化薬物送達の適用において、重要であり得る。第三に、ＰＰ７  ＶＬＰの正確な折り畳み及びアセンブリがペプチド挿入の脱安定化効果に対してさらに耐性であり得ること、又はこれが、ＭＳ２  ＶＬＰにおいて耐性でないいくつかのペプチドの耐性を少なくとも示し得ることが予想される。
【実施例３】
【０１５９】
ＰＰ７ペプチドディスプレイベクターの設計
大腸菌中でのＰＰ７コートタンパク質の合成のために、２つの一般的な種類のプラスミドを構築した（図９及び図１３を参照）。第一は、ｌａｃプロモーターからコートタンパク質を発現し、これを使用して（ｐＲＺＰ７と組み合わせて、以下を参照）、翻訳リプレッサー及びＶＬＰアセンブリ試験を用いて、ペプチド挿入のコートタンパク質の耐性について試験する。第二の種類のプラスミドは、Ｔ７プロモーター及び転写ターミネーターからタンパク質を発現する。これらのプラスミドは、正確にＶＬＰにアセンブルする大量のコートタンパク質を産生する。それらはまた、ＶＬＰへのカプシド形成のために別個の５’及び３’末端を有するコート特異的なｍＲＮＡを生じる。
【０１６０】
ペプチド挿入部位の設計
ＰＰ７カプシドの三次元構造は、たとえ２つのタンパク質のアミノ酸配列がわずか約１２％の配列同一性しか示さなくても、三次構造がＭＳ２の構造をよく模倣しているコートタンパク質から構成されることを示す（１０）［１７］。ＰＰ７タンパク質は、ＡＢ−ループを保有し、その中にペプチドが、ＭＳ２について以前に記載されたスキームと同様のスキームに従って挿入され得る［２］。ＭＳ２の場合のように、これは、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩの部位を含むようにＰＰ７コート配列を変異させることによって開始し、これによって、ｐＰ７Ｋと呼ばれるプラスミド中の外来配列の挿入が容易になる（図９ａ）。この改変により、図１０に示されるアミノ酸置換（Ｅ１１Ｔ）が生じた。この置換は、変異体コートタンパク質は翻訳を抑制して正確にＶＬＰにアセンブルするので、十分に耐えられた。やはりＭＳ２の実施例によれば、ＰＰ７コートタンパク質の一本鎖二量体バージョンの折り畳みは、従来の二量体よりもＡＢ−ループ挿入に対してさらに耐性であると考えられた。その構築は以前に記載されたが（８）、ここでペプチドディスプレイへの使用については初めて記載される。一本鎖二量体は、コード配列の下流コピー中にのみＫｐｎＩ部位を含むように改変され、ｐ２Ｐ７Ｋ３２を生成した（図９ｂ）。この設計では、ペプチドをアミノ酸１１に挿入したが、他の特定の挿入部位が、おそらくＡＢ−ループ内のいずれかで用いられ得ることに注目すべきである。実際には、下記の試験は、２つの別の挿入モードから記載される（図１０及び１１）。第一は、１１番目のアミノ酸が、挿入されたペプチドのＮ末端側のｔｈｒ及びＣ末端側の野生型ｇｌｕ１１として２回出現するので、１１／１１モードと呼ばれる。いわゆる１１／１２モードでは、挿入物は片側ではｔｈｒ１１に、他の側ではａｌａ１２に隣接する。
【０１６１】
ＡＢ−ループ挿入物に対するＰＰ７コートタンパク質の一般的な耐性を試験するために、ＰＰ７コートタンパク質のＡＢ−ループ中に挿入されるランダム配列ペプチドのライブラリーを、図１１に示されるスキームを用いて作成した。このランダム配列は、６、８又は１０コピーの配列ＮＮＹ（ここでＮは任意のヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンである）から構成された。このようなライブラリーは、２０個の可能なアミノ酸のうち１５個を含み、従ってかなり多様性であり得る。しかし、終止コドンの可能性を回避することによって、それに続く分析はかなり容易になる。
【実施例４】
【０１６２】
コートタンパク質機能の保持のためのランダム−配列ペプチドライブラリーの個々のメンバーを試験するための方法
ＭＳ２コートタンパク質と同様に、ＰＰ７コートは、翻訳リプレッサーである。大腸菌  ｌａｃＺ遺伝子に対してＰＰ７翻訳オペレーターを融合するプラスミドであるｐＲＺＰ７の構築物は以前に記載されており、これは、コートタンパク質の翻訳リプレッサー活性の制御下にβ−ガラクトシダーゼ合成を置く（１１）。これは、異なる抗生物質（クロラムフェニコール）に対する耐性を付与するとともに、異なる不適合性群に由来する（すなわち、これはｐ１５Ａ複製起点を用いる）ので、その両方がアンピシリンに対する耐性を付与しかつｃｏｌＥ１起点を用いるｐＰ７Ｋ又はｐ２Ｐ７Ｋ３２のいずれかと同じ大腸菌株で容易に維持され得る。これらのプラスミドの両方とも、ｐＵＣ１１９に由来し、ｌａｃプロモーターから比較的低レベルでコートタンパク質を発現する。ｐＰ７Ｋ又はｐ２Ｐ７Ｋ３２からのＰＰ７コートタンパク質の発現は、ｐＲＺＰ７から発現されるβ−ガラクトシダーゼの翻訳を抑制する。このことは、所定のペプチド挿入物が、コートタンパク質が正確に折り畳む能力を妨害したか否かを決定することを容易にする。それは、不完全なコートタンパク質は、「ｘｇａｌ」として公知のβ−ガラクトシダーゼ発色性基質を含むプレート上に青色のコロニーを生じ、一方では適切に機能するコートタンパク質は白いコロニーを生じるからである。
【０１６３】
機能の維持のさらに厳密な試験は、ペプチドコートタンパク質組み換え体を発現する細胞の溶解液中のＶＬＰの存在について直接試験することである。これは、超音波処理によって溶解される細胞のアガロースゲル上での電気泳動によって達成される。エチジウムブロマイド染色によってＲＮＡ含有ＶＬＰを検出し、次にその存在を、抗ＰＰ７血清を用いるウエスタンブロット分析によって確認する。
【０１６４】
次のアイデアは、ＰＰ７コートタンパク質のペプチド挿入耐性を試験し、ランダム配列ペプチドライブラリーを作成すること及び翻訳リプレッサー機能を保持する（すなわち、白色コロニーを生成する）クローンの画分を決定することによってアセンブルし、ＶＬＰを生成することである。ＭＳ２コートタンパク質一本鎖二量体のペプチド挿入耐性の同様の試験は、本願の発明者によって以前に報告されたことに注意されたい［２］。
【実施例５】
【０１６５】
ほとんどのランダムな６マー、８マー、及び１０マーのペプチド挿入物に耐えるＰＰ７コートタンパク質の折り畳み及びアセンブリ
（ＮＮＹ）8ライブラリーは、ｐＰ７Ｋ及びｐ２Ｐ７Ｋ３２中で構築して、形質転換によって大腸菌株ＣＳＨ４１Ｆ−／ｐＲＺＰ７中に導入した。形質転換体は、ｘｇａｌを含む固形培地上にプレートした。挿入フラグメントなしの対照ライゲーションで、１０００分の１のコロニーが得られたので、大部分が真正の組み換え体であった。ごく少数のｐＰ７Ｋ組み換え体を試験したが、全てがタンパク質の折り畳みに関して欠損しており、かつＶＬＰを作成できなかったことが分かった。これによって、従来の二量体は、通常はＡＢ−ループ中のペプチド挿入によって不安定化されるというＭＳ２での以前の実験［２］からの予想が確認される。しかし、ｐ２Ｐ７Ｋ３２の一本鎖二量体では、ほぼ１００％のコロニーが白色であった。それぞれのライブラリー由来の２４個の白色コロニーから１ｍｌの培養物を複製した。１つの培養セットから、粗細胞溶解液をＶＬＰのアガロースゲル分析のために調製した。他のセットでプラスミドを単離して制限酵素消化及びゲル電気泳動に供し、全てが予想される長さの挿入物を含むことを確認した。２〜３個の青色コロニーからのプラスミドも単離した。
【０１６６】
全てが、異常なライゲーション事象から生じるプラスミドを含むことが判明し、一般にはインタクトなコート配列を含まなかった。ほぼ１００％のペプチド挿入物が、コートタンパク質の翻訳リプレッサー機能と適合した。すなわち、それらは十分に適切に折り畳まれたコートタンパク質を生じて、野生型タンパク質のような翻訳を抑制する。この結果は、全てのＮＮＹライブラリー（６マー、８マー及び１０マー）で、それらが１１／１１モードでクローニングされたか、又は１１／１２モードでクローニングされたかには依存せずに得られた。
【０１６７】
ＶＬＰの存在について直接試験するために、粗細胞溶解液をそれぞれの複製培養から調製して、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色して、複製をニトロセルロースでブロットして、マウスの抗−ＰＰ７血清と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した二次抗体とでプローブした。クローンは、それが染色したゲル及びウエスタンブロットの両方にバンドを含む場合、ＶＬＰ合成について陽性とみなす。結果を図１３に示す。これによって、いくつかは収率の低下を示すが、６マーのクローンのほぼ全てがある程度のレベルでＶＬＰを生成することが示された。このことは、１１／１１挿入モード及び１１／１２挿入モードの両方について当てはまった。８マーのクローンの大部分は、容易に同定可能なＶＬＰを生じる。しかし、この効率は、挿入長が１０マーまで増大するにつれていくらか低下するようであるが、やはりクローンの明らかに大部分がＶＬＰを生じる。いくつかのペプチドが荷電されたアミノ酸を組み込むことによってＶＬＰの表面荷電を変更するという予想と一致して、個々の粒子の移動度は可変であることに注意されたい。
【実施例６】
【０１６８】
ＰＰ７  ＶＬＰは、コート−特異的なｍＲＮＡをカプシドで包む。
高レベルの発現及びＲＮＡカプシド形成試験のために、ｐＰ７Ｋ及びｐ２Ｐ７Ｋ３２のＰＰ７コート配列を、Ｔ７プロモーター及び転写ターミネーターを含んでいるプラスミド中にクローニングして、ｐＥＴＰ７Ｋ及びｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２と呼ばれるプラスミドを生成した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中のプラスミドは、大量のコートタンパク質を合成した。得られたＶＬＰを、以前に記載（１１、１２）されたようなセファロースＣＬ４Ｂでのクロマトグラフィーによって精製した。ＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出によってＶＬＰから精製して、ホルムアルデヒドを含んでいる複製アガロースゲル中の電気泳動に供した。一方のゲルをエチジウムブロマイドで染色し、他のゲルはニトロセルロースにブロットして（ノーザンブロット）、ここでＰＰ７配列を、コートのセンス鎖に特異的な標識された合成のオリゴヌクレオチドを用いて検出した。Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを用いたｐＥＴＰ７Ｋ及びｐＥＴ２Ｐ７３２のインビトロでの転写によって生成したＲＮＡを、標準として利用した。それぞれのＶＬＰは、その移動度がインビトロ転写生成物の移動度と同一であり、ＰＰ７コート特異的なプローブと特異的にハイブリダイズする、優越した種を含む。ＰＰ７  ＶＬＰがそれらのｍＲＮＡをカプシドで包むことが確認され、これによって、アフィニティー選択のために必要な遺伝子型−表現型の連鎖を確立した。ＭＳ２コートタンパク質がそのｍＲＮＡをカプシドで包む能力の同様の試験が、本願の発明者によって以前に報告されていることに注意されたい。
【実施例７】
【０１６９】
ＰＰ７  ＶＬＰに提示されるペプチドは、免疫系に提示され、かつ免疫原性である。
図１０及び図１５に示される特異的なペプチド配列を提示するＰＰ７  ＶＬＰを構築した。これらは、いわゆるＦｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来の配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、及び炭疽菌の防御抗原を含んだ。これらの挿入されたペプチドがＶＬＰの表面上に実際に提示されることを示すために、ＨＰＶ１６Ｌ２に対するモノクローナル抗体（ＲＧ−１と呼ばれる）がＰＰ７  Ｌ２−ＶＬＰに結合する能力をＥＬＩＳＡによって評価した。図１６に示されるとおり、ＲＧ−１は、Ｌ２−ＶＬＰには結合したが、Ｖ３ペプチドを提示したＰＰ７  ＶＬＰには結合しなかった。ＶＬＰの免疫原性を示すために、マウスを以前に記載されたように［２］、筋肉内注射によってＶ３−ＶＬＰで免疫した。図１７に示されるように、マウス由来の血清がＥＬＩＳＡによって試験され、Ｖ３ペプチドの合成バージョンと特異的に反応する高力価のＩｇＧ抗体を有することが示された。ＭＳ２  ＶＬＰで提示されるペプチドの免疫原性の同様の試験は、本願の発明者によって以前に報告されていることに注意されたい。
【０１７０】
実施例８。プラスミドｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２及びｐＤＳＰ７は、上記のＭＳ２コートタンパク質プロデューサーｐＤＳＰ１及びｐＤＳＰ６２のＰＰ７アナログである。ＰＰ７  ＶＬＰでのペプチドディスプレイ価数の制御のために、ｐＥＴ２Ｐ７Ｋ３２（ａｍ）及びｐＤＳＰ７（ａｍ）も構築した。それらは、それぞれｐＤＳＰ１（ａｍ）及びｐＤＳＰ７（ａｍ）のアナログである。
【０１７１】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、刊行物、及び電子的に利用可能なもの（例えばＧｅｎＢａｎｋ  ａｎｄ  ＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列寄託、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列寄託、並びにＧｅｎＢａｎｋ  ａｎｄ  ＲｅｆＳｅｑにおけるアノテーションされたコード領域からの翻訳など）の全体の開示は、参照によって援用される。援用されるものと、オリジナルとして提出された明細書中に示されるものとの間の何らかの不一致は、オリジナルとして提出された明細書を優先して解消されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解の明確化のためにのみ示された。それらから不必要な制限が理解されることはない。本発明は、表示及び記載された厳密な詳細に限定されるものではなく、当業者に明白な変形については、特許請求の範囲に規定される本発明内に含まれる。
【０１７２】
全ての見出しは、読む者の便利のためであって、そうであると特定されない限り、見出しの下にある文章の意味を限定するために用いられるべきではない。
【０１７３】
引用文献（参考文献の第一セット）
１．Peabody, DS, Jordan, SK, Caldeira, JC, Manifold-Wheeler, B. Medford, A and Chackerian, B (2007年) Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2. J. Mol. Biol. 380: 252-263. 
２．Kunkel TA, Bebenek. McClary J. (1991年) Efficient Site-Directed Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA. Methods Enzymol. 204:125-139. 
３．Sidhu SS, Lowman HB, Cunningham BC, Wells JA. (2000年) Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328:333-363. 
４．Kleina LG, Masson J-M. Normanly J, Abelson J, and Miller JH. (1990年) Construction of Escherichia coli Amber Suppressor tRNA Genes. J. Mol. Biol. 213: 705-717.
５．Lee SK and Deasling JD. (2005年) A propionate-inducible expression system for enteric bacteria. Appl. Env. Microbiol. 71:6856-6862. 
６．Peabody. D. S., and Lim, F. (1996年) Nucleic Acids Res 24, 2352-2359. 
７．Chang, A. C, and Cohen, S. N. (1978年) J Bacterial 134, 1141-1156. 
８．Caldeira, J. C, and Peabody, D. S. (2007年) J Nanobiotechnology 5, 10 
９．Olsthoom, R. C, Garde, G., Dayhuff, T., Atkins, J. F., and Van Duin, J. (1995年) Virology 206, 611-625. 
１０．Tars K, F. K., Bundule M, Liljas L. (2000年) Virology 272. 331-337 
１１．Lim, F., Downey, T. D., and Peabody, D. S. (2001年) Journal of Biological Chemistry 276, 22507-22512. 
１２．Peabody, D. S. (1990年) J Biol Chem 265, 5684-5689.
【０１７４】
引用文献（参考文献の第二セット）
１．Caldeira Jdo C. Medford A, Kines RC. Lino CA, Schiller JT, Chackerian B, Peabody PS: Immunogenic display of diverse peptides, including a broadly cross-type neutralizing human papillomavirus L2 epitope, on virus-like particles of the RNA bacteriophage PP7. Vaccine, 28(27):4384-4393.
２．Peabody PS. Manifold-Wheeler B, Medford A, Jordan SK, do Carmo Caldeira J, 
Chackerian B: Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2. J Mol Biol 2008年, 380(1):252-263.
３．Lowman HB, Bass SH, Simpson N, Wells JA: Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display, Biochemistry 1991, 30(45'): 10832- 10838.
４．Sidhu SS, Lowman HB, Cunningham BC, Wells JA: Phage display for selection of novel binding peptides. Methods in Ezymology 2000年, 328:333-363.
５．Wells JA: Hormone mimicry. Science 1996年, 273(5274):449-450.
６．Peabody PS: Subunit fusion confers tolerance to peptide insertions in a virus coat protein. Arch Biochem Biophvs 1997年, 347(1):85-92.
７．Peabody PS, Chakerian A: Asymmetric contributions to RNA binding by the Thr(45) residues of the MS2 coat protein dimmer. J Biol Chem 1999年, 274(36):25403-25410.
８．Lim F, Peabody PS: RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Res 2002年, 30(19):4138-4144.
９．Lim F, Powney TP, Peabody PS: Translational repression and specific RNA binding by the coat protein of the Pseudomonas phage PP7. J Biol Chem 2001年, 276(25):22507-22513.
１０．Kunkel TA, Bebenek K, Mcclary J: Efficient Site-Directed Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA. Methods in Enzymoloev 1991年, 204:125-139.
１１．Tars K FK, Bundule M, Liljas L: The Three-Dimensional Structure of Bacteriophage PP7 from Pseudomonas aeruginosa at 3.7 A Resolution. Virology 2000年, 272:331-337.
１２．Kleina LG, Masson JM, Normanly J, Abelson J, Miller JH: Construction of Escherichia coli amber suppressor tRNA genes. II. Synthesis of additional tRNA genes and improvement of suppressor efficiency. J Mol Biol 1990年, 213(4):705-717.
１３．Normanly J, Kleina LG, Masson JM, Abelson J, Miller JH: Construction of Escherichia coli amber suppressor tRNA genes. III. Determination of tRNA specificity. J Mol Biol 1990年, 213(4):719-726.
１４．Kunkel TA: Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA 1985年, 82(2):488-492.
１５．Maruyama IN, Maruyama HI, Brenner S: Lambda foo: a lambda phage vector for the expression of foreign proteins, Proc Natl Acad Sci USA 1994年, 91(17):8273-8277.
１６．Mikawa YG, Maruyama IN, Brenner S: Surface display of proteins on bacteriophage lambda heads. J Mol Biol 1996年, 262(1):21-30.
１７．Dunn IS: Assembly of functional bacteriophage lambda virions incorporating C-terminal peptide or protein fusions with the major tail protein. J Mol Biol 1995, 248(3):497-506.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ（１）】
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【図１１ａ（２）】
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【図１１ａ（３）】
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【図１１ｂ（１）】
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【図１１ｂ（２）】
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【図１１ｂ（３）】
2013516181.tif 000022
【図１１ｃ（１）】
2013516181.tif 000023
【図１１ｃ（２）】
2013516181.tif 000024
【図１１ｃ（３）】
2013516181.tif 000025
【図１１ｄ（１）】
2013516181.tif 000026
【図１１ｄ（２）】
2013516181.tif 000027
【図１１ｅ（１）】
2013516181.tif 000028
【図１１ｅ（２）】
2013516181.tif 000029
【図１１ｅ（３）】
2013516181.tif 000030
【図１１ｅ（４）】
2013516181.tif 000031
【図１２】
2013516181.tif 000032
【図１３ａ】
2013516181.tif 000033
【図１３ｂ】
2013516181.tif 000034
【図１４】
2013516181.tif 000035
【図１５】
2013516181.tif 000036
【図１６】
2013516181.tif 000037
【図１７ａ】
2013516181.tif 000038
【図１７ｂ】
2013516181.tif 000039
【図１７ｃ】
2013516181.tif 000040
【図１８】
2013516181.tif 000041
【図１９】
2013516181.tif 000042
【図２０】
2013516181.tif 000043
【図２１】
2013516181.tif 000044
【図２２】
2013516181.tif 000045
【図２３ａ（１）】
2013516181.tif 000046
【図２３ａ（２）】
2013516181.tif 000047
【図２３ｂ（１）】
2013516181.tif 000048
【図２３ｂ（２）】
2013516181.tif 000049
【図２３ｃ（１）】
2013516181.tif 000050
【図２３ｃ（２）】
2013516181.tif 000051
【図２３ｄ（１）】
2013516181.tif 000052
【図２３ｄ（２）】
2013516181.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月11日(2012.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物であって、
（ａ）二つの半分を含むバクテリオファージの一本鎖コートポリペプチドの一本鎖二量体のコード配列と作動可能に会合される、細菌又はバクテリオファージのプロモーターと、ここでコートポリペプチド二量体の前記コード配列は、外来配列の挿入のための部位を規定するように改変され、前記コートポリペプチド二量体は、必要に応じて異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（ｂ）原核生物における複製のための複製起点と、
（ｃ）抗生物質耐性遺伝子と、
を含み、さらに次のうちの少なくとも１つ、
（ｄ）一本鎖二量体の前記二つの半分の間の接合部における翻訳終止コドン、
（ｅ）前記コートポリペプチドを規定する配列の部分に対して５’側に配置された制限部位、
（ｆ）複数のサイレントヌクレオチド置換による前記ポリペプチド二量体のコード配列の前記半分のうちの一方の改変であって、それにより変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが、前記二量体のいずれかの半分に対してアニールされ得る改変、
（ｇ）第二の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を含むように改変された、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ及びヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の複製起点、
を含む、核酸構築物。
【請求項２】
前記コートポリペプチド二量体が、異種ペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列の部分に対して５’側に配置された制限部位を含む、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記ポリペプチド二量体のコード配列の前記半分のうちの一方が複数のサイレントヌクレオチド置換で改変され、それにより変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが、前記二量体のいずれかの半分に対してアニールされ得る、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記バクテリオファージの一本鎖コートポリペプチドの一本鎖二量体のコード配列が、ＭＳ２又はＰＰ７バクテリオファージの一本鎖コートポリペプチドの一本鎖二量体である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６】
一本鎖二量体の前記二つの半分の間の接合部に翻訳終止コドンを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記翻訳終止コドンが、ＴＡＧ、ＵＡＧ、ＴＧＡ、ＵＧＡ、ＴＡＡ又はＵＡＡである、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
２つの制限部位を含み、第一の制限部位は、前記コートポリペプチド二量体のＡＢループを規定する配列の部分に対して５’側に配置され、第二の制限部位は、前記コートポリペプチド二量体のコード配列に対して３’側に配置される、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記第一の制限部位に対する５’側と前記第二の制限部位に対する３’側とに配置されたＰＣＲプライマーをさらに含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記第二の制限部位に対して５’側に配置された転写ターミネーターをさらに含む、請求項７〜９のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記細菌又はバクテリオファージのプロモーターが、Ｔ７又はｌａｃプロモーターである、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記制限部位がＳａｌＩ又はＫｐｎＩ制限部位である、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記第一の制限部位がＳａｌＩ又はＫｐｎＩ制限部位であり、前記第二の制限部位がＢａｍＨＩ制限部位である、請求項８〜１２のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン、アンピシリン又はクロラムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記複製起点がｃｏｌＥ１  ｏｒｉ又はｐ１５Ａである、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１６】
一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の前記複製起点が、Ｍ１３複製起点である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記翻訳終止コドンで翻訳終結を少なくとも部分的に抑制することができるｔＲＮＡを生成するか、又は前記翻訳終止コドンで翻訳終結を少なくとも部分的に抑制することができるサプレッサーｔＲＮＡを生成するプラスミドと会合されている、請求項５及び７〜１６のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記異種ペプチドが、前記コートポリペプチドの下流半分におけるＡＢループ内での部位に、又は前記ＲＮＡバクテリオファージのコートポリペプチドのカルボキシ末端若しくはアミノ末端での部位に挿入される、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記異種ペプチドが、自己抗原、レセプター、細胞表面レセプターに結合するリガンド、繊維状ファージ粒子特異的ペプチドのいずれかの末端に親和性を有するペプチド、ＨＩＶペプチド、Ｆｌａｇペプチド、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループ、炭疽菌の防御抗原、金属結合ペプチド、又はＭＳ２若しくはＰＰ７の表面に親和性を有するペプチドからなる群より選択される、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
（ａ）二つの半分を含むバクテリオファージの一本鎖コートポリペプチドの一本鎖二量体のコード配列と作動可能に会合される、細菌又はバクテリオファージのプロモーターと、ここでコートポリペプチド二量体の前記コード配列は、外来配列の挿入のための部位を規定するように改変され、前記コートポリペプチド二量体は、必要に応じて異種ペプチドをコードする核酸配列を含み、
（ｂ）原核生物における複製のための複製起点と、
（ｃ）抗生物質耐性遺伝子と、
（ｆ）複数のサイレントヌクレオチド置換による前記ポリペプチド二量体のコード配列の前記半分のうちの一方の改変であって、それにより変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが、前記二量体のいずれかの半分に対してアニールされ得る改変と、
（ｇ）第二の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を含むように改変された、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ及びヘルパー一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ由来の複製起点と、
を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物。
【請求項２２】
大腸菌である、請求項２０に記載の原核生物。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれかに記載の核酸構築物によって形質転換された原核生物によって発現されたウイルス様粒子。
【請求項２４】
請求項２３に記載のウイルス様粒子を含む集団であって、それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたＭＳ２又はＰＰ７バクテリオファージのコートポリペプチドを含み、前記異種ペプチドが、前記ウイルス様粒子上で提示されかつ前記バクテリオファージのｍＲＮＡをカプシドで包む、ウイルス様粒子を含む集団。
【請求項２５】
ウイルス様粒子のライブラリーを構築するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１、３〜１８又は２０のいずれかに記載の核酸構築物を複数提供する工程と、
（ｂ）前記核酸構築物を制限酵素で処理する工程と、
（ｃ）異種ペプチドのコード配列を前記核酸構築物中に挿入して転写単位の集団を得る工程と、
（ｄ）前記転写単位を発現する工程及び必要に応じてライブラリーを単離する工程と、
を含み、それぞれの粒子は、異種ペプチドの挿入によって改変されたバクテリオファージのコートポリペプチドを含み、前記異種ペプチドは、前記ウイルス様粒子上に提示されかつバクテリオファージのｍＲＮＡをカプシドで包む、方法。
【請求項２６】
ウイルス様粒子のライブラリーを構築するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１、３〜５又は２０のいずれかに記載の核酸構築物を複数提供する工程と、
（ｂ）前記核酸構築物の一本鎖環状ＤＮＡ型に対して変異原性オリゴヌクレオチドプライマーをアニールすることによって、前記構築物中に異種ペプチドのコード配列を挿入する工程と、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼでプライマーを伸長し、前記プライマーと前記一本鎖環状ＤＮＡとを連結して、共有結合的に閉じたＤＮＡを生成し、転写単位の集団を得る工程と、
（ｄ）前記転写単位を発現する工程と、
（ｅ）必要に応じてライブラリーを単離する工程と、
を含み、それぞれの粒子は、異種ペプチドの挿入によって改変されたバクテリオファージのコートポリペプチドを含み、前記異種ペプチドは、前記ウイルス様粒子上に提示されかつバクテリオファージのｍＲＮＡをカプシドで包む、方法。
【請求項２７】
目的の特性を有するペプチドを特定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項２５又は２６に記載の前記ウイルス様粒子の集団を提供する工程であって、（１）それぞれの粒子が、異種ペプチドの挿入によって改変されたバクテリオファージのコートポリペプチドを含み、（２）前記異種ペプチドが、前記ウイルス様粒子上に提示されかつバクテリオファージのｍＲＮＡをカプシドで包む、工程と、
（ｂ）目的の特性について前記ウイルス様粒子上に発現された異種ペプチドを試験する工程と、
を含む、方法。
【請求項２８】
免疫原性タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は
（ａ）請求項２５又は２６に記載の方法によって生成されたウイルス様粒子の集団から免疫原性ペプチドを特定する工程と、
（ｂ）前記特定された免疫原性ペプチドを増幅する工程と、
（ｃ）必要に応じて前記特定された免疫原性ペプチドを単離する工程と、
を含む、方法。
【請求項２９】
有効量の請求項２３又は２４に記載のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択される核酸配列。
【請求項３１】
配列番号１に記載の核酸配列。
【請求項３２】
配列番号２に記載の核酸配列。
【請求項３３】
配列番号３に記載の核酸配列。
【請求項３４】
配列番号４に記載の核酸配列。
【請求項３５】
配列番号５に記載の核酸配列。
【請求項３６】
配列番号６に記載の核酸配列。
【請求項３７】
配列番号７に記載の核酸配列。
【請求項３８】
配列番号８に記載の核酸配列。
【請求項３９】
配列番号９に記載の核酸配列。
【国際調査報告】
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