(57)【要約】  本発明は、二パラトープ性A-ベータ結合ポリペプチド、より具体的にはA-ベータの異なるエピトープと結合する少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二パラトープ性A-ベータ結合ポリペプチドに関する。本発明はまた、そのようなポリペプチドの固有の配列、それらの生成方法、およびそれらを使用する方法（疾患（例えばアルツハイマー病）の治療方法を含む）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
A-ベータの第一のエピトープと特異的に結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および、A-ベータの第二のエピトープと特異的に結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメイン、を含むポリペプチドであって、A-ベータの前記第一および前記第二のエピトープが同一のエピトープではない、前記ポリペプチド。
【請求項２】
第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインが各々、本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成り、前記第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがリンカーペプチドによって共有結合されてあり、前記リンカーペプチドが場合によって第三の免疫グロブリンドメインを含むかまたは前記から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインが、抗体ドメイン、好ましくはVHHドメイン、より好ましくはヒト化VHHドメインである、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
A-ベータの第一のエピトープが配列番号：3によって規定されるエピトープであり、さらにA-ベータの第二のエピトープが配列番号：4によって規定されるエピトープであるか、またはA-ベータの前記第一のエピトープが配列番号：4によって規定されるエピトープであり、さらにA-ベータの前記第二のエピトープが配列番号：3によって規定されるエピトープである、請求項1から3のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
ヒトA-ベータペプチド（配列番号：1）の少なくともアミノ酸1（アスパルテート）、3（グルタメート）、19（フェニルアラニン）、20（フェニルアラニン）および23（アスパルテート）と接触する、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
TR-FRET結合アッセイ（競合物質としてABII002＝配列番号：62およびABII050＝配列番号：100を用いる）で測定されるIC50値が10-9モル/リットル以下の範囲、好ましくは5 x 10-10モル/リットルから10-12モル/リットルの範囲である、請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
2つのA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、それぞれ構造FR(1)1‐CDR(1)1‐FR(1)2‐CDR(1)2‐FR(1)3‐CDR(1)3‐FR(1)4およびFR(2)1‐CDR(2)1‐FR(2)2‐CDR(2)2‐FR(2)3‐CDR(2)3‐FR(2)4を有し、さらに
CDR(1)3が、
配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列、および、
配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、
から成る群から選択され、
CDR(2)3が、
配列番号：19のアミノ酸配列、および、
配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、
から成る群から選択されるか、または
CDR(1)3が、
配列番号：19のアミノ酸配列、および、
配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、
から成る群から選択され、
CDR(2)3が、
配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列、および、
配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、から成る群から選択される、
請求項2から6のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
第一の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(1)配列）および第二の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(2)配列）が以下のように規定される、請求項2から7のいずれかに記載のポリペプチド：
−CDR(1)1：配列番号：11
−CDR(1)2：配列番号：12
−CDR(1)3：配列番号：13
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：14
−CDR(1)2：配列番号：15
−CDR(1)3：配列番号：16
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：11
−CDR(2)2：配列番号：12
−CDR(2)3：配列番号：13
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：14
−CDR(2)2：配列番号：15
−CDR(2)3：配列番号：16。
【請求項９】
第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であるか、または前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）である、請求項1から8のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
さらに半減期延長成分を含む、請求項1から9のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
半減期延長成分がポリペプチドに共有結合しており、さらに前記成分が、アルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメントおよびアルブミン結合ペプチから成る群から選択される、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号：26から32、34から43、142、143および145から152を有するポリペプチドから成る群から選択される、請求項10および11のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成る免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、または前記から成るポリペプチドであって、前記CDR配列が以下のように規定される前記ポリペプチド：
−CDR1：配列番号：11
−CDR2：配列番号：12
−CDR3：配列番号：13
または
−CDR1：配列番号：14
−CDR2：配列番号：15
−CDR3：配列番号：16
または
−CDR1：配列番号：17
−CDR2：配列番号：18
−CDR3：配列番号：19。
【請求項１４】
配列番号：47から111から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するVHHドメインを含むかまたは前記から成るポリペプチド。
【請求項１５】
請求項1から12のいずれかに記載の二パラトープ性A-ベータ結合ポリペプチドの構築で使用される、請求項13または請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドをコードする領域を含む、好ましくは単離された形態の核酸分子。
【請求項１７】
請求項16に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項17に記載の発現ベクターを保有する宿主細胞であって、前記宿主細胞が、請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドを発現する能力を有し、さらに前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、前記宿主細胞。
【請求項１９】
（i）活性成分として、請求項1から15のいずれかに記載の1つまたは2つ以上のポリペプチド、および（ii）医薬的に許容できる担体、および場合によって（iii）希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
以下の工程を含む、請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法：
−請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドの発現を許容する条件下で請求項18に記載の宿主細胞を培養する工程；
−前記ポリペプチドを回収する工程；および
−前記ポリペプチドを精製する工程。
【請求項２１】
ヒトの疾患、異常または症状の治療、予防または緩和のための医薬として使用される、請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ヒトの疾患、異常または症状の治療的処置、予防または緩和のための医薬として使用される、請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項19に記載の医薬組成物であって、前記疾患、異常または症状が、神経変性疾患または異常、アルツハイマー病、アルツハイマー型痴呆、乾燥性AMD、緑内障、脳アミロイドアンギオパチー、トリソミー21（ダウン症候群）、成人ダウン症候群、オランダ人型アミロイド症随伴遺伝性脳出血（HCHWA-D）、レーヴィ小体随伴痴呆、前頭側頭葉委縮、緑内障、筋委縮性側索硬化症、散発性封入体筋炎および高齢ヒト対象者の不安症から成る群から選択される、前記ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２３】
ヒトに静脈内または皮下注射によって投与するために調製される、請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
A-ベータ沈着と密接に関係する疾患または異常を予防および／または治療する方法であって、請求項1から15のいずれかに記載の少なくとも1つのポリペプチドまたは請求項19に記載の医薬組成物の医薬的に活性な量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬との併用投与のために調製される、請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
患者への請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項19に記載の医薬組成物との併用投与のために調製される、ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬。
【請求項２７】
（i）請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチドの1つまたは2つ以上、（ii）1つまたは2つ以上のさらに別の治療薬であって、好ましくはELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬、（iii）医薬的に許容できる担体、並びに場合によって（iv）希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤を含む医薬組成物。
【請求項２８】
体液中のA-ベータレベルを低下させるため、および好ましくは血中の可溶性A-ベータレベルを低下させるための請求項1から15のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２９】
第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(1)配列）および前記第二の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(2)配列）が以下のように規定される、前記ポリペプチド：
−CDR(1)1：配列番号：11
−CDR(1)2：配列番号：12
−CDR(1)3：配列番号：13
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：14
−CDR(1)2：配列番号：15
−CDR(1)3：配列番号：16
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：11
−CDR(2)2：配列番号：12
−CDR(2)3：配列番号：13
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：14
−CDR(2)2：配列番号：15
−CDR(2)3：配列番号：16。
【請求項３０】
第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であるか、または前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）である、前記ポリペプチド。
【請求項３１】
さらに半減期延長成分を含み、前記半減期延長成分が、好ましくはアルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメントおよびアルブミン結合ペプチから成る群から選択される、請求項29または請求項30に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号：26から32、34から43、142、143および145から152のいずれかを有するポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固有の免疫グロブリンドメインを含む、新規なベータ-アミロイドペプチド（以下では“A-ベータ”と記す）結合ポリペプチドに関する。本発明はまた、そのようなポリペプチドをコードする核酸；そのようなポリペプチドを調製する方法；そのようなポリペプチドを発現しているかまたはそのようなポリペプチドの発現能力を有する宿主細胞；そのようなポリペプチドを含む組成物；並びにそのようなポリペプチドまたはそのような組成物の特に予防、治療および診断を目的とする使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの神経変性疾患は、タンパク質の不適切なフォールディングまたはプロセシングによってまたはプリオンによって引き起こされる（前記はともにアミロイド斑として知られる侵襲性神経沈着物を生じる）。もっともよく知られている神経変性疾患はおそらくアルツハイマー病（AD）である。
ADの発生率（65歳から85歳の全人口の10から40％がADを発症する）は、緊急かつ未だ充足されていない医学的要請の根拠となっている。さらにまた前記人口部分は指数関数的に増え続けている。したがって、人道的見地からだけでなく社会的および経済的見地からも、この激甚な疾患を効果的に診断し治療する方法を発見することは極めて重要である。治療に関しては、この疾患の進行を抑制するかまたは停止させるだけでなく、ADの初期（診断前）に既に生じた脳損傷を回復させる薬剤が希求される。現時点では、早期診断も治療方法も有効ではない。
ADは、細胞外アミロイド斑（主としてアミロイドペプチドを含む）の脳内存在を伴う痴呆および細胞内神経原線維タングル（NFT）（主としてタンパク質タウを含む）によって定義される。
【０００３】
ADに特徴的なアミロイド斑の主要成分はベータアミロイドペプチド（A-ベータ）である。前記は長さが39−43アミノ酸（aa）の高度に不溶性のペプチドであり、ベータシート構造を採ってオリゴマー化しタンパク質凝集物を形成する傾向が強い。A-ベータは、2つのタンパク質分解事象によってA-ベータ前駆体タンパク質（APP）から生成される。A-ベータセクレターゼ活性によって、APPはアミノ酸Met-671とAsp672の間のA-ベータのN-末端（“ベータ部位”）で切断される（APPの770aaアイソフォームの番号付けを用いる）。ベータ部位での切断によって99aaの膜結合APPフラグメント（C99）が得られる。C99のトランスメンブレンドメイン内の第二の部位（“ガンマ部位”）が続いてガンマセクレターゼによって切断されてA-ベータは遊離され得る。また別にAPPはそのA-ベータ領域内で切断され（もっぱらAPPのアルファセクレターゼ切断部位で）、83aaのC-末端APPフラグメント（C83）を生成することができる。前記はまたガンマセクレターゼによってさらに切断され、小さな可溶性の分泌ペプチドp3を生成し得る。この経路はA-ベータの潜在的蓄積を減少させる。
細胞内および細胞外A-ベータはベータシート構造を採り、ADDL（アミロイド由来拡散性リガンド）およびプロトフィブリルと称される中間体を形成し、最終的にアミロイド原線維の形で沈着し、前記は集合してアミロイド斑を形成する。これらのプロセスにおいて、より疎水性のA-ベータ(1-42)ペプチド（下記参照）が核形成物質として機能し、この核形成物質の周囲で斑が着実に成長すると推定される。
【０００４】
早期発症家族性ADではAPPにおける多数のミスセンス変異が関係している。これらの変異は全てAPPの正規の切断部位の1つにまたはその近くに存在する。したがってスウェーデン人家族の二重変異（K670N/M671L）は、ベータセクレターゼ切断部位に直に隣接してベータセクレターゼ活性の効率を高め、より完全なA-ベータの生成をもたらす。APP残基717（ガンマセクレターゼ切断部位近く）の3つの変異はいずれも、A-ベータのよりアミロイド原性の42aa型（A-ベータ(1-42)とも称される）の割合をより普遍的な40aa型（A-ベータ(1-40)）に対して増加させる。2つのさらに別のAPP変異も報告されている。前記変異はアルファ部位に近接するが隣接してはいない。あるフラマン人家族の変異（A692G、A-ベータ残基21）およびオランダ人家族の変異（E693Q、A-ベータ残基22）は家族性ADのそれぞれ別個の形態と関係がある。特にフラマン人の変異は、反復性脳内出血症候群として、またはAD型痴呆として現れる。神経病理学的所見には、皮質および海馬の老人斑および脳微細血管壁の通常は多発性のアミロイド沈着が含まれる。
【０００５】
数年前に、膜結合アスパルチルプロテアーゼ、BACE（メマプシンまたはAsp2とも称される）は、ベータセクレターゼと予想される特性を提示することが示された。この酵素は、APPのベータ部位およびA-ベータ領域のTyr-10とGlu-11との間でAPPを相応の効率で切断する。後者の部位で切断されたA-ベータフラグメントが、ADのアミロイド斑で、およびAPPをトランスフェクトしたHEK293ヒト胎児腎細胞培養液で認められた。いくつかのグループはまた、さらに別のアスパルチルプロテアーゼ、BACE2（Asp1とも称される）（BACEの近縁ホモローグ（今後はBACE1とも称する））がデータベースに存在することを認めた。BACE2はAPPをそのベータ部位で切断し、さらにより効率的にAPPのA-ベータ領域内の複数の部位で（A-ベータのPhe-19およびPhe-20の後ろで）切断する。これらの内部A-ベータ部位は残基21のフラマン人のAPP変異と隣接し、この変異はBACE2によって生じるベータ部位切断生成物の割合を顕著に増加させる。ベータセクレターゼ活性を増加（スウェーデン人の変異）または抑制（M671V）するAPPの保存的ベータ部位変異は、BACE1およびBACE2活性に同様に影響を及ぼす。BACE2は、BACE1と同様に酸性pHで最大限にAPPをタンパク分解する。
【０００６】
APP遺伝子またはプレセニリン1（PS1）遺伝子（“ガンマセクレターゼ”活性を保持する）における変異は早期発症家族性ADを引き起こす。APP変異の例は、上述の‘スウェーデン人’および‘ロンドン’（717）変異である（前記はそれぞれベータセクレターゼおよびガンマセクレターゼ切断部位近くに位置する）。これらの変異は、A-ベータペプチド形成、特にA-ベータ(1-42)形成を増加させ、したがってアミロイド凝集物およびアミロイド斑の形成を増加させる。初期には斑はAD発症の主要な引き金であると考えられていたが、現在の研究は、主要な有害成分としてプロトフィブリルおよびADDLの役割を力説している。斑は、それによって神経毒性ペプチドを実際には生物学的に不活性にするメカニズムであると考えることさえ可能である。
神経変性疾患および前記疾患におけるA-ベータの役割に関する更なる情報は以下の文献から入手できる：Wisniewski & Konietzko (2008)，Lancet Neurol. 7(9)，805-811；Spires-Jones et al. (2009)，Neurobiology of Disease，213-220；およびLichlen & Mohajeri (2008)，Journal of Neurochem. 104，859-874。
【０００７】
これまでのAD治療の大半はアセチルコリン欠乏を標的とし、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を用いる。それらは、例えばドネペジル（donepezil）（Aricept(商標)）、ガランタミン（galantamine）（Reminyl(商標)）およびリバスチグミン（rivastigmine）（Exelon(商標)）で、軽度から中等度のAD治療用に登録されている。米国およびカナダではドネペジルはまた重症アルツハイマー型痴呆のために承認されている。アセチルコリン欠損は基底前脳のコリン作動性ニューロンの変性を反映し、この疾患の神経精神病学的症状発現に対する相関性をよく示しているようである。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤による治療はある程度有益な効果を示すが（認知および全体的機能の臨床的尺度における有効性は一定で有意ではあるが高くはない）、神経変性の病因論には手がつけられていないのでこの疾患を治癒またはその進行を停止させることはできない。
メナンチン（Memantine）（Axura（商標）、Namenda(商標)、Ebixa(商標)；Merz Pharmaceuticals）はNMDAレセプターアンタゴニストであり、中等度から重度のアルツハイマー病のAD患者でプラセボと比較して臨床的ドメイン認知、日常生活活動性および全体的臨床応答において良好な成果を示した。メナンチンは、中等度から重度のアルツハイマー病にのみ承認された対症療法である。メナンチンはこの疾患を治療することも疾患の進行を停止させることもできない。メナンチンとアセチルコリンエステラーゼ阻害剤との併用は、中等度に重症のDATから重症のDATでは優れた有効性を示すが、軽度から中等度の病期にあるDATではそのような有効性は示されなかった。
【０００８】
これまでのいくつかの実験的治療方法は標的としてA-ベータに照準を当てている。以下のような3つの主要な研究系統が存在する：
a）ベータシート破壊剤と称される小分子（しばしばペプチド模倣体）の開発。前記はアミロイドペプチド凝集物のベータシート構造と干渉するように設計される。安定な“ベータシート破壊剤”は、ADのトランスジェニックマウスモデルに投与されたとき、脳血管関門を通過し斑の数を減少させ得ることが示された（Permanne et al. (2002)，FASEB J. 16，860-862）。このアプローチが認知の保護および／または回復をもたらすか否かはまだ明らかにされていない。
b）APPのアミロイドペプチドへのタンパク分解性プロセシングを阻害する小分子の開発。ベータまたはガンマセクレターゼの阻害物質はA-ベータの形成を効率的に遮断し、したがってアミロイドの神経毒性作用から脳を防御するはずである。既存の脳A-ベータ負荷（例えば何年かにわたり既に蓄積されたアミロイド斑）に対する作用は期待されない。
c）A-ベータに対する受動的および能動的ワクチン免疫。この研究系統は、Schenkら（Schenk et al. (1999)，Nature 400，173-177）による観察（トランスジェニックADマウスのA-ベータ(1-42)によるワクチン接種はアミロイド斑の形成を予防する）から始まった。第一の実験では、若い成熟マウス（6周齢）を毎月ワクチン接種することによって斑の形成および併発する脳内の炎症反応が本質的に予防された（すなわちアミロイド斑、星状細胞増加症および小神経膠細胞症が存在しない）。より遅い週齢（アミロイド斑が既に定着している）でのワクチン接種の開始は部分的除去をもたらした。続いて、A-ベータによるワクチン接種は、水迷路記憶試験で測定したとき行動および記憶の欠損を改善することが示された。全A-ベータによるワクチン接種の副作用を考慮して、また別のより短いペプチドを設計しトランスジェニックマウスのワクチン接種に用いた。臨床試験は、斑の除去の誘引、斑関連病変の緩和、タウレベルの低下および患畜の認知低下を遅らせることによって示されるように、A-ベータによる能動免疫は治療活性を有することを提示している。しかしながら、顕著な数の患畜が自己免疫性髄膜脳炎を発症した。前記は、能動免疫に応答して自己反応性Tリンパ球が脳内に浸潤することによって引き起こされた（Ferrer et al. (2004)，Brain Pathol. 14，11-20；Nicoll et al. (2003)，Nat. Med. 9，448-452；Masliah et al. (2005)，Neurology 64，1553-1562）。
【０００９】
能動免疫アプローチの代替として、A-ベータに対する抗体を患畜に投与することができる。そのような受動免疫アプローチは、トランスジェニックADマウスで脳A-ベータの減少に有効であることが示された（DeMattos et al. (2001)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98，8850-8855）。抗体が血液脳関門を通過し脳内に存在する斑の標的に達し得たということはあり得ないので、基本的メカニズムは推測の域を出ない。したがって、著者らは、脳から出たA-ベータと定量的に結合した抗体は血漿中で‘A-ベータシンク’を生成したと提唱した。続いて、ゲルソリンおよびガングリオシド1を用いて、いずれのA-ベータ結合リガンドも血液脳関門を通過することなくトランスジェニックADマウスでアミロイド負荷を減少させる潜在能力を有することが示された（Matsuoka et al. (2003) J. Neuroscience 23，29-33）。短期間（24時間）の受動免疫は、脳アミロイド総負荷に影響を及ぼすことすらなくトランスジェニックADマウスの認知欠損を回復させるように思われた（Dodart et al. (2002) Nature Neuroscience 5，452-457）。前記の結果は、より小さく依然として可溶性であるA-ベータ凝集物はまず初めにいくつかの抗体の標的となること、さらにまたこれら凝集物はA-ベータのもっとも有害な形態であることを示唆していよう。したがって、プロトフィブリルA-ベータの除去は少なくともトランスジェニックAPPマウスでは記憶を回復させることができるであろう。
【００１０】
ヒト化抗A-ベータモノクローナル抗体、バピニュズマブ（bapineuzumab）（“3D6”として知られている抗A-ベータマウス抗体のアナローグ）が臨床試験に入った。しかしながら、フェースII試験で報告された最初のデータは以下のように混乱した結果を示した。いくつかの有効性終末点における統計的に有意な効果はApoE4ノンキャリアでのみ認められた。さらにまた、ApoE4ノンキャリアではバピニュズマブは良好な耐性を示し安全であったが、ApoE4キャリアでは重篤な副作用の発生が、バピニュズマブ処置患畜でプラセボアームの場合よりも頻繁に認められた。さらにまた、血管原性浮腫の発生も認められた。症状発現前の脳微細出血の誘発もまた報告された。
抗A-ベータ受動免疫で用いられる通常の抗体（Fc部分を含む）は、ヒトおよび動物モデルで認められる血管原性浮腫または微細出血の誘発の理由となる可能性がある（前記は脳血管のA-ベータ沈着（脳アミロイドアンギオパチー）を標的とする（ADCCおよび／またはCDCにより微細出血をもたらす）ことと密接に関係する（Wilcock，DM，Colton，CA，CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1):50-64）。最後に、バイアコア（Biacore）によって測定したこの抗体の約2.5nMの結合親和性は、効率的な“末梢シンク効果”を誘発するには低すぎると思われる。
【００１１】
別の抗A-ベータ抗体、ソラネズマブ（solanezuma）（ヒト化抗体m266；LY-2062430）もまた臨床試験に入った。達成し得た最大の斑負荷減少は約60％と報告された。さらにまた、この抗体の特異性は可溶性A-ベータに限定され、したがって凝集物または斑との結合は期待できない。
第三の抗A-ベータ抗体、ポネズマブ（ponezumab；PF4360365）はA-ベータ(x-40)分子とのみ結合し、A-ベータ(x-42）分子とは結合しない（後者の分子は（より）病原性のA-ベータ種であると思われる）。その親和性はバピニュズマブの親和性よりもさらに低く、しかも抗体のFc部分の残存ADCC/CDC活性とともに、血管A-ベータ斑と結合する抗体の能力のゆえに脳の微細出血リスクを排除できない。
要約すれば、上記は、たとえ（古典的）抗体によるA-ベータ結合および除去が、例えばADの治療のための治療薬剤の開発にとって魅力的な作用態様であるように思われたとしても、まだ十分には解明されていないそのような免疫グロブリンの他の特徴および作用（例えばA-ベータの一定の形態と結合するそれらの特性の薬理学的意味）は、安全で有効な治療抗体の発見および開発を最初に想定したものよりも困難にすることを示している。
【００１２】
A-ベータに対して特異性を有する抗体フラグメント、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体またはVHHドメイン（下記に定義するもの）もまた当業界で報告されている（すなわちWO2004/44204；WO2006/40153；WO2007/35092；WO2008/122441およびWO2009/04494）。上記WO公開公報にしたがって本発明者らが合成したVHHの結合の特徴は満足なものではなく、そのためにそれらは臨床開発に進むとは思われない。
WO09/149185は、DVD構築物およびとりわけA-ベータ結合特異性を有するDVD構築物を開示する。そのようなDVD構築物における2つの異なる抗A-ベータ可変ドメインの合体に際して、親抗体の結合は維持されるが、親和性の増加はこの結合によって観察されなかった。さらにまた、開示されたDVD構築物は、“古典的”抗体に存在するFc部分を含み、したがってFcエフェクター機能（例えば補体依存細胞傷害性（CDC）または抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC））は回避できない（上記参照）。
【００１３】
ADの確実な診断には、アミロイド斑、神経原線維タングル、シナプス減少およびニューロン変性の存在を示すために死後の脳の病理学的試験がなお要求される。これは、Alois Alzheimaerが1906年に規定した方法と本質的に同じである。1984年に、国立神経性伝達障害研究所（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke）およびアルツハイマー病関連疾患協会（Alzheimer's Disease and Related Disorders Association）（NINCDS-ADRDA）は、AD診断の公式基準を確立した（概説：Petrella et al. (2003)，Radiology 226，315-336）。以下の基準の全てを満たす患者はプロバブルADと診断される：試験および検査（例えばミニメンタルテスト、ブレスト（Blessed）痴呆基準、または同様な検査）により立証された痴呆であること、記憶および他の少なくとも1つの認知機能の障害があること、意識は正常であること、40歳から90歳の間での発症であること、痴呆を引き起こす他の疾患の徴候が存在しないこと（除外基準）。認定可能な原因がなく徐々に進行する認知障害はポシブルADと診断されるであろう。プロバブルADはさらに軽度（初期）、中等度（中期）または重度（後期）痴呆と規定される。検査室解析を用い、また別の痴呆の原因を客観的に明らかにするかまたは除外する。ApoE4（発症素因遺伝因子）の遺伝子型判定と組み合わせた、脳脊髄液（CSF）中のA-ベータ(1-42)およびホスホ-タウのELISAアッセイは鋭敏で特異的であるように思われる。前記の方法は、しかしながら侵襲性CSF穿刺のために広く応用できるものではなく、この方法が日常的なスクリーニングとなることを妨げている。神経糸タンパク質（AD7C-NTP）のためのELISA（Nymoxが開発）は、前記が非AD痴呆患者または健常コントロールよりもAD患者の尿で高レベルであることを示した。しかしながら早期AD症例では平均レベルは有意に低く、この検査がADの早期開始の検査としては信頼できないことを告げている。
【００１４】
生化学的方法はADの初期段階の確実な診断のためには未だふさわしいものではなく、むしろそれらは進行症例の臨床的診断を確認するための単なる補助である。明らかに、不可逆的な脳損傷のシグナルである臨床症状の開始前に早期診断を可能にする、より進歩した技術が希求されている。
最後に、診断目的のためだけでなく、例えば前臨床的研究および開発でA-ベータ結合分子は研究ツールとして有用である。既に上記で説明した抗体（すなわち抗体3D6および抗体m266）は広く用いられている。抗体3D6は比較的低い親和性でA-ベータと結合し、したがっていずれの目的にも適切ではない。抗体m266はA-ベータのN-末端切端型（例えばp3）と交差反応し、疾患関連A-ベータ種（例えばA-ベータ(1-40)およびA-ベータ(1-42)）と他の分子（例えばp3）との識別が可能ではない。
上記に鑑みて、本発明の目的は、A-ベータと密接に関係するかおよび／またはA-ベータに媒介される疾患、異常または症状（例えばAD）の予防、治療、緩和および／または診断で用いることができる薬理学的に活性な薬剤とともに前記を含む組成物を提供すること、並びにそのような疾患、異常または症状の予防、治療、緩和および／または診断のための方法（そのような薬剤および組成物の使用および／または投与を必要とする）を提供することである。そのような薬剤はまた、一般的にAD分野における研究、さらに特にAD疾患メカニズムおよび可能な治療メカニズムおよび／または予防メカニズムの解明における研究の実施に有用であり得る。
【００１５】
特に、本発明の目的は、当業界でこれまで用いられてきたか、および／または公知である薬剤、組成物および／または方法と比較して一定の利点を提供する薬理学的に活性な薬剤、組成物および／または方法を提供することである。これらの利点には、特にA-ベータに対する通常の抗体またはそのフラグメント（上段に記載したもの）と比較して、治療的および／または薬理学的特性の改善および／または他の有益な特性（例えば製造の容易さの改善および／または製品コストの削減）が含まれる。更なる利点は以下の更なる記述から明白となろう。
より具体的には、本発明の目的は、新規なA-ベータ結合分子、および具体的には哺乳動物のおよび特にヒトのA-ベータと結合するポリペプチドを提供することであり、そのような分子またはポリペプチドは上記の診断、治療および研究目的に適切である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の第一の特徴にしたがえば、A-ベータの第一のエピトープと特異的に結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびA-ベータの第二のエピトープと特異的に結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが提供され、前記第一および前記第二のA-ベータエピトープは同一のエピトープではなく、すなわち異なるエピトープであり、それらは例えば一方のN-末端エピトープ（配列番号：3）および他方の中心部エピトープ（配列番号：4）である。
好ましくは、前記第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは、それぞれ本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成り、前記第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインはリンカーペプチドによって共有結合されてあり、前記リンカーペプチドは場合によって第三の免疫グロブリンドメイン、例えば第三の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかまたは前記から成る。
さらにまた、前記第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは抗体ドメイン、より好ましくはVHHドメイン、さらに好ましくはヒト化VHHドメインである。
【００１７】
本発明のそのようなポリペプチドに含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、典型的にはそれぞれ以下の構造を有するであろう：FR(1)1‐CDR(1)1‐FR(1)2‐CDR(1)2‐ FR(1)3‐CDR(1)3‐FR(1)4およびFR(2)1‐CDR(2)1‐FR(2)2‐CDR(2)2‐FR(2)3‐ CDR(2)3‐FR(2)4。
好ましくは、CDR(1)3は以下から成る群から選択され：
−配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列；および
−配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
さらに
CDR(2)3は以下から成る群から選択される：
−配列番号：19のアミノ酸配列；および
−配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列。
或いは、CDR(1)3は以下から成る群から選択され：
−配列番号：19のアミノ酸配列；および
−配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
さらに
CDR(2)3は以下から成る群から選択される：
−配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列；および
−配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列。
【００１８】
本発明の特に有用なポリペプチドは以下のCDR配列を含むであろう（番号付けは上記パラグラフで示したとおり）：
−CDR(1)1：配列番号：11
−CDR(1)2：配列番号：12
−CDR(1)3：配列番号：13
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：14
−CDR(1)2：配列番号：15
−CDR(1)3：配列番号：16
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：11
−CDR(2)2：配列番号：12
−CDR(2)3：配列番号：13
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：14
−CDR(2)2：配列番号：15
−CDR(2)3：配列番号：16
【００１９】
本発明の具体的な実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、第一の免疫グロブリン単一可変ドメインとしてVHHドメインABII035（配列番号：44）および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインとしてVHHドメインABII059（配列番号：45）またはその逆を含む。
特に好ましい実施態様では、本発明のそのようなポリペプチドはさらに別に半減期延長成分（好ましくは前記ポリペプチドに共有結合されてある）、例えばアルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメントおよびアルブミン結合ペプチドを含む。
本発明の極めて具体的な実施態様は、配列番号：26から31（Fc融合ポリペプチド）；配列番号：32（HSA融合ポリペプチド）；配列番号：34から39および145から152（アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン融合ポリペプチド）；および配列番号：40から43、142および143（PEG化ポリペプチド）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、その免疫グロブリン単一可変ドメインの1つにより配列番号：3によって規定されるA-ベータエピトープ（N-末端エピトープ）と、さらにもう1つの免疫グロブリン単一可変ドメインにより配列番号：4によって規定されるA-ベータエピトープ（中心部エピトープ）と結合する。より好ましくは、本発明のそのようなポリペプチドは、ヒトA-ベータペプチド（配列番号：1）の少なくともアミノ酸1（アスパルテート）、3（グルタメート）、19（フェニルアラニン）、20（フェニルアラニン）および23（アスパルテート）と接触する。TR-FRET結合アッセイ（競合物質としてABII002＝配列番号：62およびABII050＝配列番号：100を用いる）で測定されるIC50値は、好ましくは10-9モル/リットル以下の範囲、より好ましくは5 x 10-10モル/リットルから10-12モル/リットルの範囲である。
【００２０】
別の特徴にしたがえば、本発明は、本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成る免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、または前記から成るポリペプチドで、前記CDR配列が以下のように規定される前記ポリペプチド：
−CDR1：配列番号：11
−CDR2：配列番号：12
−CDR3：配列番号：13
または
−CDR1：配列番号：14
−CDR2：配列番号：15
−CDR3：配列番号：16
または
−CDR1：配列番号：17
−CDR2：配列番号：18
−CDR3：配列番号：19
および配列番号：47から111から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するVHHドメインを含むかまたは前記から成るポリペプチドに関する。
これらのポリペプチドは、本発明の第一の特徴にしたがって二パラトープ性A-ベータ結合ポリペプチドを構築するために有用な構築ブロックまたは中間体である。
【００２１】
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、本発明のポリペプチドの生成で用いられる核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および製造方法に関する。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、対応する発現ベクターの構築のために単離された形態で用いられ、続いて、本発明のポリペプチドの生物医薬製造のために用いられる宿主細胞に前記ベクターをトランスフェクトすることができる。そのような製造方法は、典型的には、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程、当業界で公知の方法に従って前記ポリペプチドを回収および精製する工程を含む。
本発明のポリペプチドは、下記に詳細に示す疾患、異常および症状を診断、予防、治療および／または緩和する方法で、および特にアルツハイマー病（AD）の治療のために特に有用である。したがって、この特徴にしたがえば、本発明のポリペプチドは、医薬組成物の形で、すなわち（好ましくはヒトの）疾患、異常または症状の治療、緩和または予防のための医薬として用いられるであろう。そのような疾患、異常または症状は、神経変性疾患または異常、アルツハイマー病、アルツハイマー型痴呆、脳アミロイドアンギオパチー（CAA）、トリソミー21（ダウン症候群）、成人ダウン症候群、オランダ人型アミロイド症随伴遺伝性脳出血（HCHWA-D）、レーヴィ小体随伴痴呆、前頭側頭葉委縮、緑内障、筋委縮性側索硬化症、散発性封入体筋炎および高齢者の不安症から成る群から選択される。本発明のポリペプチドはまたそのような疾患、異常または症状の診断に用いられるであろう。
【００２２】
上記に加えて、本発明のポリペプチドは、乾燥性AMD（年齢性黄斑変性）および緑内障の治療に特に有用である。AMDの“乾燥”型（“中心性地図状委縮”としてもまた知られている）は、神経センサー網膜の下に存在する網膜色素上皮細胞層の委縮から生じ、前記は眼の中心部分のフォトレセプター（杆状体および錐体）の消失により失明をもたらす。これまでのところ、この症状に対して利用可能な薬剤治療または外科治療は存在しない。今のところ利用可能な治療（例えばナショナル・アイ・インスチチュート（National Eye Institute）が提唱する）には、高用量の抗酸化薬、ルテインおよびゼアキサンチンとともにビタミン補充物を使用することが含まれ、前記は乾燥性黄斑変性の進行を遅らせることができる。緑内障は、眼球内の液体圧が増加し、視神経への不可逆的な損傷および失明を引き起こす疾患である。A-ベータは実験的緑内障でアポトーシスを発した網膜神経節細胞と一緒に存在し、用量依存および時間依存態様で顕著な網膜神経節細胞のアポトーシスを誘発する。
治療目的のために、本発明のポリペプチドまたはそのようなポリペプチドを含む医薬組成物をその必要があるヒトに、例えば非経口的（特に静脈内または皮下）または硝子体内（特に乾燥性AMDまたは緑内障治療のため）注射によって投与することができる。
本発明のさらに別の特徴、実施態様および適用は以下のさらに詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明白となろう。
【００２３】
A-ベータ結合モノクローナル抗体に対する徹底的な研究が既に実施され、A-ベータに対して高い親和性を有する高度に特異的な抗体が既に利用可能であるが、思いがけなく、本発明者らは、改善された特徴を有する、例えば抗体3D6およびm266（そのヒト化対応物はヒトでの治療的使用のために現在試験中である）よりも良好なIC50を有する一群のA-ベータ結合分子（表XVI参照）の提供に成功した。
さらにまた、当業界で公知の抗A-ベータ抗体は、A-ベータを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいてアミロイド斑負荷を実際減少させ得ることが示されたが（モノクローナル抗体m266またはそのヒト化対応物の投与によって達成される最大の斑負荷減少は約60％であると報告されている）、例えば抗体m266はアミロイド斑結合を欠いている。したがって、そのような従来の抗体は、抗A-ベータ分子とアミロイド凝集物に存在するA-ベータとの直接結合がさらに別の利点を生じる状況下では低い潜在能力を示すと予想され得る。それとは対照的に、本発明者らは、アミロイド斑と結合し、したがって該当リスクを高めまたは微細出血を誘発することなく物理的解離を促進することによって血管アミロイドを減少または除去すると期待されるA-ベータ結合分子を生成することができた。血管アミロイドはADの重症度と密接に関係するので、本発明のポリペプチドのこの利点は、後期ADまたは重症ADの治療に特に有用であることを証明することができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、長年にわたって蓄積された高い脳アミロイド斑負荷を有する患者の治療に特に有用であると期待できる。
したがって要約すれば、本発明のA-ベータ結合ポリペプチドのより高い親和性およびそれらの固有の斑結合能力は、当業界で報告された従来の抗A-ベータ抗体と比較して思いがけない卓越性を提供する。
【００２４】
現在臨床試験されている別の抗体、ポネズマブはA-ベータ(x-40)に対して特異性を有するが、A-ベータ(x-42)（ADの主要な病原性種）とは結合せず、したがってA-ベータ(x-40)：A-ベータ(x-42)バランスを有害なA-ベータ(x-42)種にシフトさせると予想される。それと対照的に、本発明者らは、少なくとも2つの異なるエピトープと結合することによって、A-ベータ(x-40)およびA-ベータ(x-42)を捕捉し両種の有害な作用を中和することができるA-ベータ結合分子の提供に成功した。
従来の抗体と一般的に比較したとき、本発明のポリペプチドは、はるかに容易に迅速にかつ安価に製造でき、より高い安定性および低い抗原性を有し、さらにその小さなサイズおよび構造ゆえに注射または輸液よりも便利な投与ルートに適切であり得る。より具体的には、通常的な組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E. coli）および酵母）での発酵による本発明のポリペプチドの製造は、従来の抗体の製造と比較して（従来の抗体は哺乳動物の細胞培養施設を必要とする）費用効果性が高い。さらにまた、発現の達成可能レベルは高く、本発明のポリペプチドの収量は大腸菌では1から10 g/Lの範囲、酵母では10 g/L以上である。本発明のポリペプチドはより可溶性であり、このことは通常の抗体と比較してより高濃度で保存および投与できることを意味する。それらは室温で安定であり、このことは冷蔵設備を使用することなく、輸送経費、時間および環境的節約無しにそれらを製造、保存および／または輸送できることを意味する。本発明のポリペプチドはまた極端なpHで長時間の安定性を示し、このことは経口投与によるデリバリーにそれらが適していることを意味しよう。
【００２５】
さらにまた、本発明のポリペプチドは、“古典的”抗体に存在するFc部分を含むことを必要とせず、したがってFcエフェクター機能によって引き起こされる副作用（例えば補体依存細胞傷害（CDC）または抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）を回避することができる。抗A-ベータ受動免疫で用いるとき、通常抗体（Fc部分を有する）は、ヒトおよび動物モデルで観察される微細出血の誘発の原因となると思われる（前記は脳血管のA-ベータ沈着（脳アミロイドアンギオパチー）を標的とすることと密接に関係し、ADCCおよび／またはCDCによる微細出血をもたらす（Wilcock，DM，Colton，CA，CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1):50-64））。
したがって要約すれば、本発明のポリペプチドは、通常抗体の有利な特徴（例えば高い特異性および高い選択性）と上記に概略した利点を併せもち、さらに通常のA-ベータ結合抗体と比較して親和性および特異性に関して驚愕するほどに改善された特徴を有する。
【００２６】
当業界で既に知られているA-ベータ結合VHH（例えばWO2006/040153、WO2007/35092およびWO2004/44204に記載されているVHH）と比較したとき、本発明のポリペプチドは、モノマーA-ベータとの結合に関しても凝集A-ベータとの結合に関しても顕著に改善された結合の特徴を示す（例えば下記の実施例3.2および6を参照）。さらにまた、例えばWO2008/122441または他の文献（Habicht et al. (2007)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA;104(49):19232-19237）に記載されたVHHドメイン（前記は凝集アミロイド斑とのみ結合する）とは対照的に、本発明のポリペプチドは、モノマーA-ベータおよびアミロイド斑の両方と結合する。
のみならず、本発明のA-ベータ結合ポリペプチドのVHHドメインは、実施例7および図2に示すように、ヒトおよびげっ歯類のA-ベータと等しく強力に結合する。本発明の二パラトープ性ポリペプチドの結合は、単一VHHドメインと比較してヒトおよびげっ歯類A-ベータへの親和性を少なくとも103のファクターで増加させる。したがって、本発明のポリペプチドは、前臨床研究および学術研究のために特にげっ歯類動物モデルを許容する、種を横断する疾患関連A-ベータ型（例えばA-ベータ(1-40)およびA-ベータ(1-42)）の理想的なツールである。前記は抗体3D6を凌ぐ卓越性を提供する（抗体3D6はA-ベータと極めて低い親和性で結合し、げっ歯類A-ベータとの交差反応性は低い）。抗体m266と比較したときにもまた卓越性が存在する。抗体m266は、げっ歯類およびヒトA-ベータを等しく良好に認識するが、A-ベータのN-末端切端型（例えばp3）と交差反応し、したがって前記抗体は、疾患関連A-ベータ種（例えばA-ベータ(1-40)およびA-ベータ(1-42)）の特異的な検出に依存するある種の検査またはアッセイには有用ではない。
最後に、本発明の二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物は、2つの異なるA-ベータエピトープを検出する2つのVHHを結合させたとき、1000倍を超えるファクターで親和性を獲得する。これはWO09/149185で開示された構築物との明瞭な差異である。
もちろんのこと、本発明のポリペプチドはまた、当業界で公知の他のA-ベータ結合分子と比較して、その親和性（感受性）、特異性（エピトープとともに種に関しても）および上記に概略した他の特徴によって診断目的においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】APPトランスジェニックマウス（n＝3）における、ABII320、ABII322、3D6-IgGおよびm266-IgGのi.p.投与後の血漿中の遊離/未結合A-ベータ(1-40)の減少を示す（注射2時間後に検出）。第一のカラム（空白枠）に表示されているもの：ビヒクル（PBS）、第二のカラム：ABII320（132nmol/kg）、第三のカラム：ABII322（132nmol/kg）、第四のカラム：IgG 3D6（132nmol/kg）、第五のカラム：IgG m266（66.6nmol/kg）（IgGの濃度は1結合部位につき算出される（IgG 1分子につき2つの結合部位））。
【図２】二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物（VHHドメインABII035およびABII059を含む）とヒトおよびげっ歯類（マウス）A-ベータとの結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
定義：
本発明の上記および他の特徴並びに実施態様はこの更なる説明から明白となろう：
a）特段の指示または規定がなければ、使用される全ての用語は、当業界におけるそれらの通常の意味（それらは当業者には明白であろう）を有する。例えば以下の標準的な手引書（Sambrook et al，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.)，VoIs. 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Lewin，"Genes IV"，Oxford University Press，New York，(1990)およびRoitt et al.，"Immunology" (2nd  Ed.)，Gower Medical Publishing，London，New York，1989）、とともに本明細書に引用した一般的な背景技術を参照できる。さらにまた、特段の指示がなければ、具体的に詳しく記載されていない全ての方法、工程、技術および操作は、それ自体公知の態様で実施できかつこれまで実施されており、したがって当業者には明白であろう。繰り返せば、標準的な手引書、上記で参照した一般的な背景技術、および本明細書に引用したさらに別の参考文献を参照できる。
【００２９】
b）特段の指示がなければ、“免疫グロブリン”および“免疫グロブリン配列”という用語（本明細書において、それらが重鎖抗体を指す、あるいは、通常の4鎖抗体を指す場合であれ）は一般的な用語として用いられ、前記には完全サイズの抗体、その個々の鎖の両方とともに、それらの全ての部分、ドメインまたはフラグメント（抗原結合ドメインまたはフラグメント（例えばそれぞれVHHドメインまたはVH/VLドメインを含むがただしこれらに限定されない）を含む）が含まれる。さらにまた、本明細書で用いられる“配列”という用語（例えば“免疫グロブリン配列”、“抗体配列”、“（一）可変ドメイン配列”、“VHH配列”または“タンパク質配列”のような用語として）は、文脈がより限定された解釈を要求していない場合は、一般的には、対応するアミノ酸配列とともにそれらをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列を含むと理解されるべきである。
c）本明細書で用いられる（ポリペプチドまたはタンパク質の）“ドメイン”という用語は折り畳まれたタンパク質構造を指し、前記構造は当該タンパク質の残余とは別個にその三次元構造を維持する能力を有する。一般的には、ドメインはタンパク質の明瞭に区別される機能的特性をもたらし、多くの事例でドメインは、タンパク質および／またはドメインの残余部分の機能を低下させることなく他のタンパク質に付加することも、タンパク質から除去することも他のタンパク質に移すこともできる。
【００３０】
d）本明細書で用いられる“免疫グロブリンドメイン”という用語は、抗体鎖（例えば通常の4鎖抗体または重鎖抗体の鎖）の球状領域、または本質的にそのような球状領域から成るポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンのフォールディングをそれらが保持していることを特徴とする。前記フォールディングは、場合によって保存されたジスルフィド結合によって安定化された、2つのベータシート内に配置された約7つのアンチパラレルなベータ鎖の2層のサンドイッチから成る。
e）本明細書で用いられる“免疫グロブリン可変ドメイン”という用語は、本質的に4つの“フレームワーク領域”から成る免疫グロブリンドメインを意味する。前記フレームワーク領域は、当業界および下記で、“フレームワーク領域1”または“FR1”、“フレームワーク領域2”または“FR2”、“フレームワーク領域3”または“FR3”、および“フレームワーク領域4”または“FR4”とそれぞれ称される。これらフレームワーク領域は、3つの“相補性決定領域”または“CDR”によって分断され、前記は当業界および下記で“相補性決定領域1”または“CDR1”、“相補性決定領域2”または“CDR2”、および“相補性決定領域3”または“CDR3”とそれぞれ称される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般構造または配列は、以下のように示すことができる：FR1‐CDR1‐FR2‐CDR2‐FR3‐CDR3‐FR4。抗原結合部位を保持することにより抗原に対する特異性を抗体に付与するのはこの免疫グロブリン可変ドメインである。
【００３１】
f）本明細書で用いられる“免疫グロブリン単一可変ドメイン”は、さらに別の可変性免疫グロブリンドメインと対を形成することなく抗原のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味する免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、“ドメイン抗体”、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインVHおよびVL（VHドメインおよびVLドメイン）である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、以下で定義する、ラクダ科の動物に由来する“VHHドメイン”（または単に“VHH”）である。上記の定義に鑑みて、通常の4鎖抗体（例えばIgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE分子；当業界で公知である）、またはそのような通常の4鎖抗体に由来するFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント（例えばジスルフィド連結FvまたはscFvフラグメント）もしくは二重特異性抗体（いずれも当業界で公知である）の抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとはみなされないであろう。なぜならば、これらの事例では、対応するエピトープと抗原の結合は、通常は1つの（単一の）免疫グロブリンドメインでは発生せず、一対の（結合している）免疫グロブリンドメイン（例えば軽鎖および重鎖可変ドメイン）によって、すなわち免疫グロブリンドメインのVH‐VL対（前記は対応する抗原のエピトープに一緒に結合する）によって発生するからである。
【００３２】
f1）“VHHドメイン”（VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメントおよびVHH抗体としても知られている）は、最初“重鎖抗体”（すなわち“軽鎖を欠く抗体”：Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363，446-448 (1993)）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されている。“VHHドメイン”という用語は、これらの可変ドメインを通常の4鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では“VHドメイン”または“VHドメイン”と称される）および通常の4鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では“VLドメイン”または“VLドメイン”と称される）と区別するために選択された。VHHドメインは、さらに別の抗原結合ドメインの非存在下でエピトープと特異的に結合することができる（通常の4鎖抗体のVHまたはVLドメインとは対照的であり、前記の場合には、エピトープはVHドメインと一緒になってVLドメインによって認識される）。VHHドメインは、ただ1つの免疫グロブリンドメインによって形成される、小さく強力で効率的な抗原認識ユニットである。
本発明の関係では、VHHドメイン、VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメント、VHH抗体という用語は、“Nanobody(商標)”および“Nanobody(商標)ドメイン”（“Nanobody”はAblynx N.V.社（Ghent，Belgium）の商標である）と同様に互換的に用いられ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（構造FR1‐CDR1‐FR2‐CDR2‐FR3‐CDR3‐FR4を有し、第二の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要とせずにエピトープと特異的に結合する）の代表であり、例えばWO2009/109635（図1）で規定されているとおり、いわゆる“認証残基”によってVHドメインとは区別される。
【００３３】
VHHドメインのアミノ酸残基は、Kabatら（"Sequence of proteins of immunological interest"，US Public Health Services，NIH Bethesda，MD，Publication No. 91）によって与えられ、例えば文献（Riechmann and Muyldermans，J. Immunol. Methods  231，25-38，1999）の図2に示されるようにラクダ科動物のVHHドメインに適用されるVHドメインのための一般的な番号付けにしたがって番号が付与される。この番号付けにしたがえば、
−FR1は1−30位のアミノ酸残基を含み、
−CDR1は31−35位のアミノ酸残基を含み、
−FR2は36−49位のアミノ酸残基を含み、
−CDR2は50−65位のアミノ酸残基を含み、
−FR3は66−94位のアミノ酸残基を含み、
−CDR3は95−102位のアミノ酸残基を含み、
−FR4は103−113位のアミノ酸残基を含む。
しかしながら、VHドメインおよびVHHドメインに関する分野では周知のように、CDRの各々に存在するアミノ酸残基の総数は変動することがあり、Kabatの番号付けによって示されたアミノ酸残基の総数と一致しないことがある（すなわち、Kabatの番号付けの1つまたは2つ以上の位置が実際の配列によって埋められないことがあり、実際の配列がKabatの番号付けによって許容される数よりも多いアミノ酸残基を含むこともある）ということは留意されるべきである。これは、一般的には、Kabatの番号付けは、実際の配列のアミノ酸残基の実際の番号付けと一致することもあり、一致しないこともあることを意味している。
【００３４】
VHドメインのアミノ酸残基に番号を付与するまた別の方法（前記方法はまた類似の態様でVHHドメインに適用できる）も当業界では公知である。しかしながら、本明細書、特許請求の範囲および図では、特段の指示がなければ、Kabatにより与えられ、さらに上記に記載したようにVHHドメインに適用された番号付けにしたがうであろう。
VHHドメインのアミノ酸残基総数は通常は110から120、しばしば112から115の範囲にある。しかしながら、それよりも短い配列および長い配列もまた本明細書に記載した目的に適切であることは留意されるべきである。
VHHドメインおよび前記を含むポリペプチドの更なる特徴および機能的特性は以下ように要約できる：
VHHドメイン（前記は軽鎖可変ドメインの非存在下でさらに軽鎖可変ドメインの一切の相互作用の非存在下で本質的に抗原と機能的に結合するように“設計”されている）は、単一の比較的小さく機能的な抗原結合性構造ユニット、ドメインまたはポリペプチドとして機能し得る。このことは、VHHドメインを通常の4鎖抗体のVHおよびVLドメインと峻別する。後者は、一般的には単一の抗原結合タンパク質としてまたは免疫グロブリン単一可変ドメインとして単独で実際に利用するにはふさわしくなく、何らかの形態または別の形態で合体させて、機能的な抗原結合ユニットを提供する必要がある（例えば通常の抗体フラグメント（例えばFabフラグメントのように、或いはVLドメインと共有結合させたVHドメインから成るscFvのように）。
【００３５】
これらの固有の特性のために、VHHドメインの使用は（単独であれより大きなポリペプチドの部分としてであれ）、通常のVHおよびVLドメイン、scFv、または通常の抗体フラグメント（例えばFabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメント）の使用を凌駕する、以下のような多数の顕著な利点を提供する：
−抗原との高い親和性および高い特異性での結合のためにただ1つのドメインが要求されるだけで、したがって2つの別々のドメインが存在する必要もなくこれら2つのドメインが正しい空間的コンフォーメーションおよび立体配置で存在することを担保する必要もない（すなわちscFvの場合のように特別に設計されたリンカーの使用を介する必要がない）；
−VHHドメインは単一遺伝子から発現ができ、翻訳後フォールディングまたは改変を必要としない；
−VHHドメインは、（本明細書でさらに考察するとおり）多重特異性および多価形式に向けて容易に操作できる；
−VHHドメインは高度に可溶性で、凝集傾向をもたない（Wardら（Nature 341: 544-546，1989）が記載したマウス由来抗原結合ドメインの場合のように）；
−VHHドメインは、熱、pH、プロテアーゼおよび他の変性剤または変性条件に高度に安定であり、したがって冷蔵装置を使用することなく、輸送経費、時間および環境的節約無しに調製、保存または輸送が可能である；
−VHHドメインは生産に必要な規模においてさえ調製が容易で比較的安価である。例えば、VHHドメインおよび前記を含むポリペプチドは、（例えば下記でさらに述べるように）細菌の発酵を用いて製造でき、（例えば通常の抗体フラグメントの場合のように）哺乳動物の発現系の使用を必要としない；
−VHHドメインは、通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントと比較して相対的に小さく（約15kDa、または通常のIgGの1/10）、したがって通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントよりも
--（より）強い組織への浸透性を示し、さらに
--より高用量で投与することができ；
−VHHは（とりわけ通常のVHドメインと比較してVHHの伸長CDR3ループのゆえに）いわゆる腔結合特性を示すことができ、したがってまた通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントが接近できない標的およびエピトープに接近することができる。
【００３６】
特異的抗原またはエピトープに結合するVHHドメインを入手する方法は、以前に例えばWO2006/040153およびWO2006/122786で述べられている。それらにもまた詳細に記載されているように、本来のVHH配列のアミノ酸配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の通常の4鎖抗体のVHドメイン中の対応する位置に存在する1つまたは2つ以上のアミノ酸残基で置き換えることによって、ラクダ科の動物に由来するVHHドメインを“ヒト化”することができる。ヒト化VHHドメインは1つまたは2つ以上の完全にヒトのフレームワーク領域配列を含むことができ、さらにより具体的な実施態様では、DP-29、DP-47、DP-51またはその部分（前記は場合によってJH配列（例えばJH5）と結合される）に由来するヒトフレームワーク領域配列を含むことができる。
【００３７】
f2）“ドメイン抗体”（“Dab”、“Domain Antibody”および“dAb”としても知られている（“Domain Antibody”および“dAb”はGlaxoSmithKlineのグループ会社が商標として用いている））は、例えば以下に記載されている：Ward，E.S.，et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989)；Holt，L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003)；およびWO2003/002609。
ドメイン抗体は非ラクダ科哺乳動物のVHまたはVLドメイン（特にヒトの4鎖抗体）と本質的に一致する。単一の抗原結合ドメインとして（すなわちそれぞれVLまたはVHドメインと対を形成することなく）エピトープと結合するために、例えばヒトの単一VHまたはVLドメイン配列のライブラリーを用いることによって、そのような抗原結合特性のために特別な選別が要求される。VHHのように、ドメイン抗体は約13から約16kDaの分子量を有し、完全にヒトの配列から誘導される場合は、ヒトでの治療的使用のためにヒト化することを要しない。VHHドメインの場合のように、それらは原核細胞発現系でもまた良好に発現され、全体的製造コストの顕著な削減を提供する。
ドメイン抗体は、VHHドメインと同様に、1つまたは2つ以上のCDRのアミノ酸配列に1つまたは2つ以上の変更を導入することによって親和性成熟に付すことができる（前記変更は、得られた免疫グロブリン単一可変ドメインのその対応する抗原に対する親和性を対応する親分子と比較して改善する）。本発明の親和性成熟免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、当業界で公知の方法によって調製することができる。前記方法は例えば以下に記載されている：Marks et al.，1992，Biotechnology 10:779-783；またはBarbas，et al.，1994，Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91: 3809‐3813；Shier et al.，1995，Gene 169:147-155；Yelton et al.，1995，Immunol. 155: 1994-2004；Jackson et al.，1995，J. Immunol. 154(7):3310-9；およびHawkins et al.，1992，J.MoI. Biol. 226(3): 889 896；KS Johnson and RE Hawkins，"Affinity maturation of antibodies using phage display"，Oxford University Press 1996。
【００３８】
f3）さらにまた、上記に記載したCDRの1つまたは2つ以上を他の“土台”（ヒト土台または非免疫グロブリン土台を含むがただしこれらに限定されない）に“移植”することもまた可能であることは当業者には明白であろう。適切な土台およびそのようなCDR移植技術は当業者には公知である。
g）“エピトープ”および“抗原性決定基“（前記は互換的に用いることができる）という用語は、抗原結合分子（例えば通常の抗体または本発明のポリペプチド）によって認識される、より具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される巨大分子（例えばポリペプチド）の部分を指す。エピトープは免疫グロブリンのための最小結合部位を規定し、したがって免疫グロブリンの特異性の標的を示す。
エピトープを認識する、抗原結合分子（例えば通常の抗体または本発明のポリペプチド）の部分はパラトープと呼ばれる。
h）本明細書で用いられる“二パラトープ性”（抗原）結合分子または“二パラトープ性”ポリペプチドという用語は、本明細書に規定する第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、ここで、これら2つの可変ドメインは1つの抗原の2つの別個のエピトープと結合することができ、エピトープは、通常は一特異的免疫グロブリン（例えば通常の抗体または1つの免疫グロブリン単一可変ドメイン）によって同時に結合されることはない。本発明の二パラトープ性ポリペプチドは複数の可変ドメインを含み、それら可変ドメインは異なるエピトープ特異性を有し、さらに同じエピトープと結合する相互に相補的な可変ドメイン対を含まない。したがってそれらはA-ベータとの結合について互いに競合しない。
【００３９】
i）一定のエピトープ、抗原またはタンパク質（または少なくともその1つの部分、フラグメントまたはエピトープ）と“結合”または“特異的に結合”することができ、それらに対して“親和性を有し”および／または“特異性を有する”ポリペプチド（例えば免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、本発明のポリペプチドまたは一般的に抗原結合分子またはそのフラグメント）は、前記エピトープ、抗原もしくはタンパク質に“対する”または“対抗する”と称されるか、またはそのようなエピトープ、抗原もしくはタンパク質に対する“結合”分子である。
k）一般的には、“特異性”という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（例えば免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチド）が結合することができる、異なるタイプの抗原またはエピトープの数に該当する。抗原結合タンパク質の特異性は、その親和性またはアビジチーを基準にして決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離の平衡定数（KD）によって表される）は、エピトープと抗原結合タンパク質の抗原結合部位との間の結合強度の測定値であり、KD値が低ければ低いほど、エピトープと抗原結合分子との間の結合強度は強い（或いは親和性はまた親和性定数（KA）として表すことができ、KAは1/KDである）。当業者には明瞭であろうが（例えば本明細書の更なる開示を基にして）、親和性は、問題の具体的な抗原に応じて、それ自体公知の態様で決定することができる。アビジチーは、抗原結合分子（例えば免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチド）と関連する抗原との間の結合強度の測定値である。アビジチーは、エピトープと抗原結合タンパク質のその抗原結合部位との間の親和性および抗原結合分子に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。
【００４０】
典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のポリペプチド）は、10E-5から10E-14 モル/リットル（M）以下、好ましくは10E-7から10E-14モル/リットル（M）以下、より好ましくは10E-8から10E-14モル/リットル、さらに好ましくは10E-11から10E-13の解離定数（KD）（実施例9.7に記載するようにKinexaアッセイで測定）で、および／または少なくとも10E7 ME-1、好ましくは少なくとも10E8 ME-1、より好ましくは少なくとも10E9 ME-1、例えば少なくとも10E11 ME-1の結合定数（KA）で結合するであろう。10E-4 Mを超えるいずれのKD値も、一般的には非特異的結合とみなされる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のKDで所望の抗原と結合するであろう。抗原結合タンパク質と抗原またはエピトープとの特異的結合は、それ自体公知の任意の適切な態様で決定することができる。前記には、例えば本明細書に記載したアッセイ、スキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素免疫アッセイ（EIA）およびサンドイッチ競合アッセイ、並びに前記のそれ自体当業界で公知の種々の変型が含まれる。
【００４１】
l）アミノ酸残基は、標準的な三文字または一文字アミノ酸コード（当業界で一般的に公知で認容されている）にしたがって示されるであろう。2つのアミノ酸配列と比較するとき、“アミノ酸の相違”という用語は、第二の配列と比較して参照配列の位置のアミノ酸残基の表示の数の挿入、欠失または置換を指す。置換の場合には、そのような置換は好ましくは保存的アミノ酸置換であろう（保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が類似の化学的構造の別のアミノ酸残基により置換されることを意味し、前記は当該ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を与えない）。そのような保存的アミノ酸置換は当業界で（例えばWO98/49185で）周知であり、この場合、保存的アミノ酸置換は、好ましくは下記グループ（i）−（v）内のあるアミノ酸が同じグループ内の別のアミノ酸残基によって置換される置換である：（i）小さな脂肪族非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、ProおよびGIy；（ii）極性、陰性荷電残基およびそれらの（非荷電）アミド：Asp、Asn、GIuおよびGin；（iii）極性、陽性荷電残基：His、Arg、Lys；（iv）大きな脂肪族非極性残基：Met、Leu、Ile、VaIおよびCys；並びに（v）芳香族残基：Phe、TyrおよびTrp。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下のとおりである：
AlaからGIyまたはSerに； 
ArgからLysに；
AsnからGinまたはHisに；
AspからGIuに；
CysからSerに；
GinからAsnに；
GIuからAspに；
GIyからAlaまたProに；
HisからAsnまたはGinに；
IleからLeuまたはVaIに；
LeuからIleまたはVaIに；
LysからArg、GlnまたはGIuに；
MetからLeu、TyrまたはIleに；
PheからMet、LeuまたはTyrに；
SerからThrに；
ThrからSerに；
TrpからTyrに；
TyrからTrpまたはPheに；
VaIからIleまたはLeuに。
【００４２】
m）核酸またはポリペプチド分子は、例えばその天然の供給源および／または核酸またはポリペプチドを入手した反応媒体または培養媒体と比較して、前記供給源または媒体中で前記核酸またはポリペプチドが通常結合している少なくとも1つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、または少なくとも1つの夾雑物質、不純物もしくは微量成分）から分離されているとき、“本質的に単離されている（単離された形態にある）”とみなされる。特に、核酸またはポリペプチド分子は、それらが少なくとも2倍、特に少なくとも10倍、より具体的には少なくとも100倍、さらに1000倍以上精製されてあるとき“本質的に単離されている”とみなされる。“本質的に単離された形態”である核酸またはポリペプチド分子は、適切な技術（例えば適切なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて決定したとき好ましくは本質的に均質である。
n）例えば２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン配列間の“配列同一性”は、これら2つの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。前記は、WO08/020079の49および50ページのパラグラフf）に記載されているように計算または決定することができる。“配列類似性”は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００４３】
標的特異性：
本発明のポリペプチドは、それらが1つまたは2つ以上のA-ベータ分子と、より厳密にはA-ベータ分子内のエピトープと特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むという点でA-ベータに対して特異性を有する。A-ベータは例えばヒトの体内で種々の形態を採ることができ、さらに種々の形態で、例えば、モノマー形、オリゴマー形およびマルチマー形、可溶性および不溶性凝集物形、原線維形、プロトフィブリル形、アミロイド斑およびアミロイド沈着の形態で存在でき、前記は中枢神経系、骨格筋、血小板、血管系、膵臓、腎臓、脾臓、心臓、肝臓、精巣、大動脈、肺臓、腸，皮膚、副腎、唾液腺および甲状腺に存在する（Roher et al.  Alzheimer’s & Dementia 5 (2009) p.18-29）。本発明のポリペプチドが、A-ベータの存在し得る任意の形態、特に生物学的および／または治療的観点からもっとも関係の深い形態と結合することは本発明の範囲内である。
本発明のポリペプチドは、例えば以下の種々の長さのA-ベータペプチド分子と結合することができる：A-ベータ(1-42) (配列番号：1に示すアミノ酸配列から成る)、A-ベータ(1-40) (配列番号：1に示すアミノ酸配列のアミノ酸1から40から成る)、A-ベータ(1-39)(アミノ酸1から39)、A-ベータ(1-38)(アミノ酸1から38)、A-ベータ(1-37)(アミノ酸1から37)など。本発明のポリペプチドの結合は、N-末端、C-末端またはその間のどこかで発生し得る。
【００４４】
さらにまた、本発明は種によるA-ベータ形に限定されない。したがって、本発明のポリペプチドは、治療目的を意図するならば好ましくはヒトA-ベータ（配列番号：1）と結合し得る。しかしながら、他の温血動物または好ましくは哺乳動物のA-ベータ形とのポリペプチド結合も同様に本発明の範囲内である。1つの種のA-ベータ形と結合する本発明のポリペプチドは、1つまたは2つ以上の他の種のA-ベータと交差反応し得る。例えば、ヒトA-ベータと結合する本発明のポリペプチドは、他の霊長類の1つまたは2つ以上の種由来のA-ベータ、および／または疾患の動物モデル、特にA-ベータ関連疾患および異常のための動物モデルでしばしば用いられる動物（例えばマウス（配列番号：2参照）、ラット、ウサギ、ブタまたはイヌ）の1つまたは2つ以上の種（例えば本明細書で述べた種および動物）由来のA-ベータとの交差活性を示すことも示さないこともある。そのような交差反応性を示す本発明のポリペプチドは、研究および／または薬剤開発の観点から利点を有し得る。なぜならば交差反応性は、重要な疾患モデル（例えばマウスまたはラット）で本発明のポリペプチドとヒトA-ベータとの結合を試験することを可能にするからである。
【００４５】
さらにまた、本発明は、本発明のポリペプチドが向けられている、A-ベータの特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンフォーメーション（適応可能な場合には）に限定されず、範囲を制限されることもない。本発明のポリペプチドが標的とし得るA-ベータの好ましいエピトープのいくつかは免疫療法、特にADの受動免疫療法に用いられるエピトープである。例えば文献（Weksler M.，Immunity and Ageing 1，2，2004）および本明細で参照した背景技術で述べられているように、A-ベータには3つの主要なエピトープが存在することが知られている。すなわち、N-末端エピトープ（アミノ酸1−16：DAEFRHDSGYEVHHQK、配列番号：3）、中心部エピトープ（アミノ酸16−28：KLVFFAEDVGSNK、配列番号：4）およびC-末端エピトープ（アミノ酸28−42：KGAIIGLMVGGVVIA、配列番号：5）である。本発明のポリペプチドはこれらのエピトープのいずれかを標的とし得る。特に好ましいものは、少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドであり、ここで1つの免疫グロブリン単一可変ドメインはN-末端エピトープと結合し、第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは中心部エピトープと結合する。
【００４６】
本発明のポリペプチド：
そのもっとも広い意味で、本発明は、A-ベータ関連疾患、異常または症状、および特にADの予防、治療、緩和および／または診断のために医薬的に活性な新規な薬剤を提供する。本発明の薬剤は、新規な種類のA-ベータ結合分子、すなわち抗原A-ベータと異なるエピトープで結合する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二パラトープ性ポリペプチドに属する。より具体的には、本発明のそのようなポリペプチドは本質的に、（i）A-ベータの第一のエピトープと特異的に結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および（ii）A-ベータの第二のエピトープと特異的に結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメインから成り、ここでA-ベータの第一のエピトープおよびA-ベータの第二のエピトープは同一のエピトープではない。換言すれば、本発明のそのようなポリペプチドは、A-ベータに存在する少なくとも2つの異なるエピトープに対抗する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、または本質的に前記から成り、ここで前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらがA-ベータと同時に結合することができる態様で互いに連結される。この意味では、本発明のポリペプチドはまた、全ポリペプチドがA-ベータに対して少なくとも2つの結合部位を含むという点で、“多価”免疫グロブリン構築物、特に“多価免疫グロブリン単一可変ドメイン構築物”とみなすことができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドは（少なくとも）2つの抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここで（前記）2つの免疫グロブリン単一可変ドメインはA-ベータ分子内の異なるエピトープに対抗する。したがって、これら2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは異なるエピトープ特異性、したがって異なるCDR配列を有するであろう。この理由のために、2つの免疫グロブリン単一可変ドメインが2つの異なるパラトープを含むとき、本発明のポリペプチドは本明細書ではまた、“二パラトープ性ポリペプチド”、または“二パラトープ性ドメイン抗体構築物”（免疫グロブリン単一可変ドメインがドメイン抗体から成るかまたは本質的に前記から成る場合）、または“二パラトープ性ナノボディ構築物”もしくは“二パラトープ性VHHドメイン構築物”もしくは“二パラトープ性VHH構築物”（免疫グロブリン単一可変ドメインがナノボディまたはVHHドメインから成るかまたは本質的に前記から成る場合）とそれぞれ呼ばれるであろう。
本発明の具体的な実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドが3つ以上の抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメイン（すなわち3つ、4つまたはそれより多い抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメイン）を含む場合には、少なくとも2つの抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメインはA-ベータ分子内の異なるエピトープに対抗し、ここでさらに別の免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれもこれら2つの異なるエピトープのいずれかと結合するか、および／またはA-ベータ分子内に存在するさらに別のエピトープと結合することができる。
【００４８】
本発明の別の具体的な実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、上記に記載した2つの抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメインに加えて、任意の他の追加成分、例えばリンカー（下記でさらに詳細に記述）および／または追加のタンパク質ドメイン（下記でさらに詳細に記述）を、そのA-ベータとの結合がそのような追加の成分によって妨げられないかぎり含む。本発明のポリペプチドはさらに別に改変（例えばグリコシル残基、改変アミノ酸側鎖など）を含むことができる。
先に説明したように、本発明の1つのポリペプチド内の2つの免疫グロブリン単一可変ドメインはA-ベータの異なるエピトープと結合する。これは以下の態様の1つで達成され得る。すなわち、2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは1つの同じA-ベータ分子内の2つのエピトープと結合するか（分子内結合）、或いはそれらは、2つの別個のA-ベータ分子内に存在するエピトープと結合することができる（すなわち1つの免疫グロブリン単一可変ドメインは1つのA-ベータ分子上の1つのエピトープと結合し、一方、他の免疫グロブリン単一可変ドメインは別のA-ベータ分子上の他のエピトープと結合し、したがって2つのA-ベータ分子を架橋（分子間結合）する）。
【００４９】
好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは1つの同じA-ベータ分子内の2つのエピトープと結合し、したがって架橋は発生せず、さらに本発明のポリペプチド‐A-ベータ複合体は1：1の相対量で形成されるであろう。したがって、分子間結合（優勢）よりも分子内結合（優勢）が好ましいが、小さな割合の分子間結合も生じ得ることは理解されよう。分子内結合と分子間結合との識別は、バイアコアまたはサイズ排除クロマトグラフィーアッセイ（以下に記載されている：Santora et al.，Anal. Biochem.，299: 119-129）（下記実施例8.2を参照）を用いて実施できる。しかしながら、別々のA-ベータの分子間結合を介して機能するポリペプチドもまた本発明の範囲内であることは留意されるべきである。
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドに含まれる第一および第二の抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメインは、各々本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成る。本発明のポリペプチドでは、前記第一および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは共有結合されてあり、場合によって下記に記載するようにリンカーペプチドによって共有結合されてあり、この場合、そのようなリンカーは、少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインと対応するA-ベータエピトープとの最適な結合を立体的に可能にする。
【００５０】
ヒトでの医薬的使用のためには、本発明のポリペプチドは好ましくはヒトA-ベータに対抗し、一方、獣医の目的のためには本発明のポリペプチドは好ましくは処置されるべき種のA-ベータに対抗することは当業者には明白であろう。
さらに、ヒトでの治療薬として用いられるとき、本発明のポリペプチドに含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは好ましくはヒト化された免疫グロブリン単一可変ドメインであることもまた当業者には明白であろう。
本発明にしたがえば、2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに独立してドメイン抗体（すなわち上記に記載のVLまたはVH抗体ドメイン）、および／または上記に記載のVHHドメイン、および／または免疫グロブリン単一可変ドメインの任意の他の種類であり得るが、ただし、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインが、（例えば通常抗体のVL‐VHドメインの場合のように）同じエピトープと一緒に結合する相互に相補的な可変ドメイン対を形成せずに、異なるエピトープとそれぞれ別個に結合することによって（すなわち上記に規定した“二パラトープ性”抗原結合分子のように）抗原（すなわちA-ベータ）と結合することを条件とする。
本発明の好ましい実施態様にしたがえば、第一および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは、本質的にドメイン抗体配列または上記に記載のVHHドメイン配列から成る。特に好ましい実施態様にしたがえば、第一および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは、本質的にVHHドメイン配列から成る。したがって、本発明は、本明細書および特に実験部分では、A-ベータの2つの異なるエピトープと結合する2つの（場合によってヒト化された）抗A-ベータVHHドメイン配列（VHH）、すなわち二パラトープ性VHHドメイン構築物に関してより詳細に記述されるであろう。しかしながら、本明細書の教示は、他の抗A-ベータ免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド（例えばドメイン抗体）にも同様に適用できることは当業者には明白であろう。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、従来の抗体の有益な特徴（例えば低い毒性および高い特異性）を有するだけでなく、それらはさらに別の特性もまた示す。本発明のポリペプチドはより可溶性であり、このことは従来の抗体と比較してより高濃度でそれらを保存および／または投与できることを意味する。それらは室温で安定であり、このことは、冷蔵設備を使用することなく、輸送経費、時間および環境的節約無しにそれらを製造、保存および／または輸送できることを意味する。本発明のポリペプチドはまた極端なpHで長時間の安定性を示し、このことは経口投与によるデリバリーにそれらが適していることを意味する。
さらにまた、本発明のポリペプチドは、“古典的”抗体に存在するFc部分を含むことを必要とせず、したがってFcエフェクター機能によって引き起こされる副作用（例えば補体依存細胞傷害（CDC）または抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）を回避することができる。抗A-ベータ受動免疫で用いるとき、通常抗体（Fc部分を有する）は、ヒトおよび動物モデルで観察される微細出血の誘発の原因となると思われる（前記は脳血管のA-ベータ沈着（脳アミロイドアンギオパチー）を標的とすることと密接に関係し、ADCCおよび／またはCDCによる微細出血をもたらす（Wilcock，DM，Colton，CA，CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1):50-64））。
【００５２】
本発明の別の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドに存在する少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに直接連結されるか（すなわちリンカーを使用しない）またはリンカーを介して連結され得る。リンカーは好ましくはリンカーペプチドであり、さらに本発明にしたがえば、少なくとも2つの異なる免疫グロブリン単一可変ドメインとそれらの少なくとも2つの異なるA-ベータエピトープの各々との結合を1つの同じA-ベータ内でまたは2つの異なる分子内で可能にするように、前記リンカーは選択されるであろう。
適切なリンカーはとりわけエピトープに左右され、具体的には免疫グロブリン単一可変ドメインが結合するA-ベータ上のエピトープ間の距離に左右され、それらは、本明細書の開示を基にして、場合によってある程度の日常的な実験の後で当業者には明白となろう。
さらに、A-ベータと結合する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインがドメイン抗体またはVHHドメインであるとき、それらはまた第三のドメイン抗体またはVHHドメインを介して互いに連結され得る（この場合、2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは第三のドメイン抗体またはVHHドメインと直接連結されるか、または適切なリンカーを介して連結され得る）。そのような第三のドメイン抗体またはVHHドメインは、例えば、本明細書でさらに記述するように半減期の延長を提供するドメイン抗体またはVHHドメインであり得る。例えば後者のドメイン抗体またはVHHドメインは、さらに本明細書で記述するように、（ヒト）血清蛋白質、例えば（ヒト）血清アルブミンまたは（ヒト）トランスフェリンと結合できるドメイン抗体またはVHHドメインであり得る。
或いは、A-ベータと結合する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは連続して連結され（直接または適切なリンカーを介して）、第三の（単一）ドメイン抗体またはVHHドメイン（上記に記載したように半減期の延長を提供できる）は、これら2つまたは3つ以上の上述の免疫グロブリン配列の1つと直接またはリンカーを介して連結され得る。
【００５３】
適切なリンカーは本発明の具体的なポリペプチドに関連して本明細書に記載されているが、例示として、ただしこれに限定されないが以下のようなアミノ酸配列が含まれる：好ましくは長さが、9以上のアミノ酸、より好ましくは少なくとも17のアミノ酸、例えば約20から40のアミノ酸。しかしながら上限は重大ではないが、例えばそのようなポリペプチドの生物薬の製造に関して便利であるという理由から選択される。
リンカー配列は天然に存在する配列でも天然に存在しない配列でもよい。治療薬の目的で使用される場合は、リンカーは、好ましくは本発明の抗A-ベータポリペプチドが投与される対象者で非免疫原性である。
ある有用なリンカー配列群は、WO 96/34103およびWO 94/04678に記載された重鎖抗体のヒンジ領域から誘導されたリンカーである。
他の例はポリアラニンリンカー配列、例えばAla-Ala-Alaである。
リンカー配列のさらに好ましい例は、異なる長さのGly/Serリンカー、例えば(GlyxSery)zリンカーであり、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)4、(Gly4Ser)、(Gly3Ser)、Gly3および(Gly3Ser2)3が含まれる。
【００５４】
本発明のポリペプチドがポリマーの付加、例えばポリエチレングリコール（PEG）成分の付加によって改変される場合、リンカー配列は好ましくは、そのような改変（例えばPEG化）を可能にするアミノ酸残基、例えばシステインまたはリジンをリンカー領域に含む。そのようなリンカーの好ましい例は以下のとおりである：
GGGGCGGGS（“GS9,C5”、配列番号：6）
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（“GS25,C5”、配列番号：7）
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG（“GS27,C14”、配列番号：8）
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（“GS35,C15”、配列番号：9）
および
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（“GS35,C5”、配列番号：10）
そのようなリンカーを含む本発明のPEG化ポリペプチドのいくつかの非限定的な例は配列番号：40から43，142および143に示されている。
さらにまた、リンカーは、例えばWO04/081026で示されているポリ(エチレングリコール)成分でもよい。
別の実施態様では、本発明のポリペプチドの少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、別の成分、例えば別のポリペプチドにより互いに連結される（場合によって1つまたは2つのリンカーを介する）。前記ポリペプチドは、好ましい実施態様（ただしこれに限定されない）では、上記で既に述べたさらに別の免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る。そのような成分は、本質的に活性がなくても、生物学的作用（例えばポリペプチドの所望の特性を改善する作用）を有していても、または1つもしくは2つ以上のさらに追加の所望の特性をポリペプチドに付与してもよい。例えば（ただしこれに限定されないが）、前記成分はタンパク質またはポリペプチドの半減期を改善し得るか、および／またはその免疫原性を低下させ得るかまたは他の任意の所望の特性を改善し得る。
そのような構築物のいくつかの非限定的な例は配列番号：34から39の構築物である。
【００５５】
好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、配列番号：3によって規定されるエピトープと結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび配列番号：4によって規定されるエピトープと結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または配列番号：4によって規定されるエピトープと結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび配列番号：3によって規定されるエピトープと結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
さらに好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインとA-ベータ分子との間の接触は、実施例8.2および8.3に記載したように生じる。すなわち、本発明のポリペプチドは、ヒトまたはマウスA-ベータペプチドの少なくともアミノ酸1、3、13、20および23に接触する。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、実施例9.7に記載するKinexaアッセイで測定したとき、10-6モル/リットル以下、より好ましくは10-9モル/リットル以下の範囲、さらに好ましくは10-11から10-13モル/リットルの範囲の解離定数（KD）値を有するか、または実施例9.3で説明するTR-FRET結合アッセイで測定したとき10-9モル/リットル以下、および好ましくは5 x 10-10モル/リットルから10-12モル/リットルの範囲のIC50値を有する。
本発明のさらに好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドのCDR配列は以下に規定されるとおりで、さらにまた前記CDR配列は、本発明のポリペプチドが、上記パラグラフで説明したような解離定数（KD）でA-ベータと結合するか、または上記に説明したようなIC50値を有するようなものである。
【００５６】
本発明の具体的な実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、以下の構造（配列番号は下記の表1に示される）を有する、2つのA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含み：
免疫グロブリン単一可変ドメイン1：
FR(1)1‐CDR(1)1‐FR(1)2‐CDR(1)2‐FR(1)3‐CDR(1)3‐FR(1)4；
免疫グロブリン単一可変ドメイン2：
FR(2)1‐CDR(2)1‐FR(2)2‐CDR(2)2‐FR(2)3‐CDR(2)3‐FR(2)4；
ここで、CDR(1)3は以下から成る群から選択され：
−配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列；および
−配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
さらにCDR(2)3は以下から成る群から選択され：
−配列番号：19のアミノ酸配列；および
−配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
さらにここで、
他のCDR配列およびフレームワーク領域配列は特に限定されないが、前記は特定の要求にしたがって当業者により選択され、例えばヒトでの使用を意図されるポリペプチドの場合には、本発明のポリペプチドの免疫原性を低下させるためにヒト化されたフレームワーク領域であろう。免疫グロブリン単一可変ドメイン1と2の順序は特に限定されず、それゆえ、本発明のポリペプチド内では免疫グロブリン単一可変ドメイン1はN-末端に位置し免疫グロブリン単一可変ドメイン2はC-末端に位置するか、またはその逆であり得る。
好ましくはCDR(1)3は配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列から成る群から選択され、CDR(2)3は配列番号：19のアミノ酸配列である。
【００５７】
さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、以下の構造（配列番号は下記の表1に示される）を有する、2つのA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含み：
免疫グロブリン単一可変ドメイン1：
FR(1)1‐CDR(1)1‐FR(1)2‐CDR(1)2‐FR(1)3‐CDR(1)3‐FR(1)4；
免疫グロブリン単一可変ドメイン2：
FR(2)1‐CDR(2)1‐FR(2)2‐CDR(2)2‐FR(2)3‐CDR(2)3‐FR(2)4；
ここで、
CDR(1)1は配列番号：11のアミノ酸配列（前記は配列番号：14のアミノ酸配列と同じである）であり；
CDR(1)2は配列番号：12および配列番号：15のアミノ酸配列から成る群から選択され；
CDR(1)3は配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列から成る群から選択され；
CDR(2)1は配列番号：17のアミノ酸配列であり；
CDR(2)2は配列番号：18のアミノ酸配列であり；
CDR(2)3は配列番号：19のアミノ酸配列であり；
さらにここで
他のフレームワーク領域配列は特に限定されないが、特定の要求にしたがって当業者により選択され、例えばヒトでの使用を意図されるポリペプチドの場合には、本発明のポリペプチドの免疫原性を低下させるためにヒト化されたフレームワーク領域であろう。
【００５８】
上記に記載した本発明のポリペプチドでは、上記に示した免疫グロブリン単一可変ドメイン1および2の本ポリペプチド内の具体的な順序は重大ではなく、それゆえ、上述の免疫グロブリン単一可変ドメイン1は本発明のポリペプチドのN-末端に位置し、上述の免疫グロブリン単一可変ドメイン2がその後に続いてもよく；或いは上述の免疫グロブリン単一可変ドメイン2がポリペプチドのN-末端に位置し、上述の免疫グロブリン単一可変ドメイン1がその後に続いてもよい。両方の場合において、本明細書でさらに詳しく説明するように、本発明のポリペプチド内、例えばN-末端、C-末端または2つの免疫グロブリン単一可変ドメインの間に追加の配列および成分が存在することができる。
上記のCDR配列および本発明のポリペプチドに存在し上記に概略した6CDR配列セットは以下の表IおよびIIにそれぞれ要約されている。
表Iおよび表II：2つの異なるA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドにおける好ましいCDRの組合せ
【００５９】
表I：CDR配列
2013520974.tif 000002
【００６０】
表II：好ましいCDR配列セット／CDR組合せ（配列は上記表Iに示すそれらの配列番号によって規定される）
2013520974.tif 000003
【００６１】
上記に記載した免疫グロブリン単一可変ドメインのためのフレームワーク領域配列として用いることができるヒト免疫グロブリンフレームワーク領域配列（FR）は当業界で知られている。ヒト以外の種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域をヒト化する方法もまた当業界で知られている。
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、以下のフレームワーク領域アミノ酸配列1から4（FR1からFR4；下記表IIIに示す配列番号）を含む：
FR1は、配列番号：20および配列番号：21のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であるか、または前記を含み；
FR2は、配列番号：22のアミノ酸配列であるか、または前記を含み；
FR3は、配列番号：23および配列番号：24のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であるか、または前記を含み；
FR4は、配列番号：25のアミノ酸配列であるか、または前記を含む。
【００６２】
表III：FRアミノ酸配列
2013520974.tif 000004
【００６３】
上記に示すFRおよびCDR配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインの具体的な例は以下のとおりである：
免疫グロブリン単一可変ドメイン1（最初のアミノ酸（すなわちグルタメート）は場合によって失われていてもよい）：
evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvss（ABII035；配列番号：44）
免疫グロブリン単一可変ドメイン2（最初のアミノ酸（すなわちグルタメート）は場合によって失われていてもよい）： 
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvss（ABII059；配列番号：45）。
1つの単一ポリペプチド鎖内に上記に示す2つの免疫グロブリン単一可変ドメインおよび場合によって前記2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを連結するリンカーを含む本発明のポリペプチドの具体的な例はさらにまた下記で与えられる。
好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、特に治療薬として用いられるとき、患者の血清中または他の体液中で本発明のポリペプチドの半減期を延長する成分を含む。“半減期” という用語は、前記（改変）ポリペプチドの血中濃度を例えば天然のメカニズムによる前記ポリペプチドの分解および／または除去および／または不活化のためにin vivoで50%低下させるために要する時間を意味する。
より具体的には、そのような半減期延長成分は前記ポリペプチドに共有結合させるかまたは融合させることができる。前記は、Fc部分、アルブミン成分、アルブミン成分のフラグメント、アルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリン単一可変ドメイン）、ポリオキシアルキレン分子（例えばポリエチレングリコール分子）、アルブミン結合ペプチド、またはヒドロキシエチルデンプン（HES）誘導体であるが、ただし前記に限定されない。
【００６４】
ある実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、1つまたは2つ以上のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与するか、および／または1つまたは2つ以上のFcレセプターと結合する能力を付与できる、1つまたは2つ以上の抗体部分、フラグメントまたはドメインと連結させることができる。例えばこの目的（前記に限定されないが）のために、前記抗体部分は抗体のCH2および／またはCH3ドメインであるか、または前記を含むことができる。前記ドメインは、例えば重鎖抗体（上記に記載）およびより好ましくは通常のヒト4鎖抗体に由来する。具体的には、本発明のポリペプチドは、例えばヒトIgG由来、ヒトIgE由来、または別のヒトIg由来Fc領域と連結できる。例えば、WO94/04678は、ラクダ科動物のVHHドメインまたはそのヒト化誘導体を含む重鎖抗体を述べている。前記では、ラクダ科動物のCH2および／またはCH3ドメインはヒトCH2および／またはCH3ドメインによって置き換えれ、したがって各々がVHHドメイン（場合によってヒト化されてある）並びにヒトCH2およびCH3ドメインを含む（ただしCH1ドメインは含まない）、2つの重鎖から成る免疫グロブリンを提供する。この免疫グロブリンはCH2およびCH3ドメインによって提供されるエフェクター機能を有し、軽鎖が全く存在しない状態で機能することができ、そのような改変をもたない対応するVHHドメインと比較して半減期の延長を示す。
【００６５】
Fc部分を含む本発明のポリペプチドの具体的な例（エフェクター機能を有するものまたは有さないもの）は、以下に示すポリペプチドである：
evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssggggsgggsevqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号：26）
【００６６】
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssgggsggggsggggsggggsggggsgggevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号：27）
【００６７】
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssggggsggggsggggcggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号：28）
【００６８】
evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssggggsgggsevqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号：29）
【００６９】
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssgggsggggsggggsggggsggggsgggevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号：30）
【００７０】
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssggggsggggsggggcggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号：31）
【００７１】
本発明のさらに別の実施態様にしたがえば、2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは血清アルブミン分子と、例えばWO01/79271およびWO03/59934に記載されたように融合させることができる。
ヒト血清アルブミン成分を含む本発明の二パラトープ性A-ベータ結合ポリペプチドの例は表IVに示される。
【００７２】
表IV：HAS-融合タンパク質
2013520974.tif 000005
【００７３】
別の好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、血液中で見出される抗原、例えば血清アルブミン、血清免疫グロブリン、サイロキシン結合タンパク質、フィブリノゲンまたはトランスフェリンと結合し、それによって半減期の延長を本発明の生成ポリペプチドに付与する成分を含む。特に好ましい実施態様にしたがえば、そのような成分は、アルブミン結合免疫グロブリンおよび特に好ましくはアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばアルブミン結合VHHドメイン）である。
ヒトでの使用が意図される場合、そのようなアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくはヒト血清アルブミンと結合し、前記は好ましくはヒト化アルブミン結合VHHドメインであろう。
ヒト血清アルブミンと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは当業界で公知であり、例えばWO2006/122786にさらに詳細に記載されている。特に有用なアルブミン結合VHHドメインは、以下のアミノ酸配列から成るか、または以下のアミノ酸配列を含む：
evqlvesggglvqpgnslrlscaasgftfssfgmswvrqapgkglewvssisgsgsdtlyadsvkgrftisrdnakttlylqmnslrpedtavyyctiggslsrssqgtlvtvss（配列番号：33）。 
アルブミン結合VHHドメインを含む本発明のポリペプチドの具体的な例は表Vに示される：
【００７４】
表V：2つの抗A-ベータVHHドメインおよび1つの抗HAS VHHドメインを含む、本発明の二パラトープ性ポリペプチド
2013520974.tif 000006
2013520974.tif 000007
【００７５】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは血清アルブミンと結合する成分を含み、そのような成分は、例えば国際特許出願公開公報WO2008/068280および WO2009/127691に記載されているアルブミン結合ペプチドである。
さらに別の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドの半減期延長改変（そのような改変はまた前記ポリペプチドの免疫原性を低下させる）は、薬理学的に許容できる適切なポリマー、例えば直鎖または分枝鎖のポリ(エチレングリコール)（PEG）またはその誘導体（例えばメトキシポリ(エチレングリコール)またはmPEG）の付加を含む。一般的には、任意の適切なPEG化形態（例えば当業界で抗体および抗体フラグメント（ドメイン抗体およびscFvが含まれるが、ただしこれらに限定されない）のために用いられるPEG化）を用いることができる（例えば以下を参照できる：Chapman，Nat. Biotechnol.，54，531-545 (2002)；Veronese and Harris，Adv. Drug Deliv. Rev. 54，453-456 (2003)；Harris and Chess，Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003)；WO 04/060965およびUS6,875,841。
ポリペプチドのPEG化のための種々の試薬もまた市場で、例えばNektar Therapeutics（USA）またはNOF Corporation（日本）から入手できる。前記は、例えば、Sunbright(商標) EAシリーズ、SHシリーズ、MAシリーズ、CAシリーズおよびMEシリーズ、例えばSunbright(商標) ME-100MA、Sunbright(商標) ME-200MAおよびSunbright(商標) ME-400MAである。
【００７６】
好ましくは、位置特異的PEG化が、具体的にはシステイン残基を介して用いられる(例えば以下を参照されたい：Yang et al.，Protein Engineering 16，761-770，2003)。例えばこの目的のために、本発明のポリペプチド内に天然に存在するシステイン残基にPEGを付加してもよく、1つまたは2つ以上のPEG付加用システイン残基を導入できるように本発明のポリペプチドを改変してもよく、または1つまたは2つ以上のPEG付加用システイン残基を含むアミノ酸配列を、N-および／またはC-末端、および／または本発明のポリペプチドの2つまたは3つ以上の機能的ドメインを架橋するリンカー領域に融合させてもよい。タンパク質操作技術を用いるいずれの技術もそれ自体は当業者に公知である。
好ましくは、本発明のポリペプチドのためには5ｋDaを超える分子量、例えば10kDaを超え200kDa未満、例えば100kDa未満、例えば20kDaから80kDaの範囲の分子量のPEGが用いられる。
PEG化に関しては、一般的に本発明は、PEG化が、好ましくは（1）in vivoでの半減期を延長するように；（2）免疫原性を低下させるように；（3）PEG化についてそれ自体公知のさらに別の1つまたは2つ以上の有益な特性を提供するように；（4）A-ベータに対するポリペプチドの親和性に影響を及ぼさないように（適切なアッセイ（例えば下記実施例に記載したもの）によって測定したとき、前記親和性を例えば50%以上（好ましくは10%を超えない）低下させないように）；および／または（4）本発明のポリペプチドの他の所望の特性のいずれにも影響を及ぼさないように、1つまたは2つ以上のアミノ酸の位置でPEG化された本発明の任意のポリペプチドを包含することは留意されるべきである。適切なPEG群およびそれらを付加する方法（特異的であれ非特異的であれ）は当業者には明白であろう。
【００７７】
特に好ましい本発明の実施態様にしたがえば、本発明のPEG化ポリペプチドは、分子量40kDaまたは60kDaを有する線状PEGの1つのPEG成分を含み、前記PEG成分は前記ポリペプチドにリンカー領域で、具体的には配列番号：6に示すGS9-リンカーペプチドの5位のCys残基で；配列番号：8に示すGS27-リンカーペプチドの14位のCys残基で；配列番号：9に示すGS35-リンカーペプチドの15位のCys残基で；または配列番号：10に示す35GS-リンカーペプチドの5位のCys残基で付加される。
本発明のポリペプチドの好ましい例は下記の表VIに示されている。前記ポリペプチドは、好ましくは上述のPEG試薬の1つ、例えば下記化学式で示される、40kDaの平均分子量を有する“Sunbright(商標) ME-400MA”でPEG化される：
【００７８】
【化１】
2013520974.tif 000008
【００７９】
表VI：本発明のPEG化ポリペプチド；C*はPEG成分を保持するCys残基を示す
2013520974.tif 000009
2013520974.tif 000010
【００８０】
さらに別の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの血液脳関門通過を可能にする成分をさらに別に含む。具体的には、得られた本発明のポリペプチドの血液脳関門通過を可能にする前記成分は、1つまたは2つ以上（例えば2つ、好ましくは1つ）の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばWO02/057445に記載された脳標的抗体フラグメント（VHH）FC44およびFC5であり得る。前記の例は下記の表XIXに示されている。
したがって、本発明のポリペプチドはまた下記一般式で記載することができる：
A‐ISVD1‐B‐ISVD2‐C
式中、
ISVD1およびISVD2は、A-ベータの異なるエピトープに結合する、上述のA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばそれぞれ配列番号：44および45の免疫グロブリン単一可変ドメインであり、さらに
A、BおよびCは互いに独立して：
−追加されない成分（すなわち、AはISVD1のN-末端、BはISVD1およびISVD2を連結するペプチド結合、並びにCはISVD2のC-末端）；
−ヒトIgG、IgM、IgD、IgEなどのCH1、CH2およびCH3ドメインの群から選択される1つまたは2つ以上のドメインで、好ましくは、CはCH2‐CH3；
−アルブミンおよびそのフラグメントで、好ましくはヒト血清アルブミンまたはそのフラグメント；
−アルブミン結合成分で、好ましくはアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアルブミン結合ペプチド；
−リンカーペプチド（場合によってPEG化される）で、好ましくは、Bは3から45アミノ酸を有するリンカーペプチドを指し、これらペプチドは少なくとも1つのシステイン残基を含み、前記システイン残基は好ましくはPEG40またはPEG60成分でPEG化されるもの；
−1つまたは2つ以上のA-ベータ結合成分、好ましくは追加の抗A-ベータ免疫グロブリン可変ドメインであってISVD1またはISVD2と同一であるかまたは同一ではないもの；
−ポリペプチド、好ましくは免疫グロブリン単一可変ドメインであって、当該ポリペプチドに血液脳関門通過特性を付与するもの、例えばWO02/057445に記載のFC44およびFC5；
以下を指すか、
または式中、ISVD1、ISVD2、BおよびCは上記のような意味を有し、さらに
−Aは、N-末端の、場合によってホルミル化されたMet残基（例えば異種宿主生物での発現の結果として）；および／または合成時に宿主細胞から本発明のポリペプチドの分泌を指令するシグナルまたはリーダー配列；および／または適切な宿主細胞での当該ポリペプチドの発現後に場合によって除去されるプロ配列を指すか；
または式中、
ISVD1、ISVD2、AおよびBは上記のような意味を有し、さらに
−Cは、“タグ”、例えば、本発明のポリペプチドの精製を可能にするかまたは促進するアミノ酸配列または残基（例えば前記配列または残基に対抗するアフィニティ技術が用いられる）を指し；そのようなタグは、例えば化学的または酵素的切断によって、そのような精製工程後に場合によって除去して当該ポリペプチドの成熟配列を提供でき；この目的のために、タグは場合によって切断可能リンカー配列を介して当該ポリペプチドに連結されるか、または切断可能モチーフを含むことができる。そのような残基のいくつかの好ましい（ただしこれらに限定されない）例は、マルチヒスチジン残基、グルタチオン残基およびmyc-タグ、例えばAAAEQKLISEEDLNGAA（配列番号：46）である。
【００８１】
治療的使用：
さらに別の重要な特徴にしたがえば、本発明のポリペプチドは例えば以下のように治療目的に用いられる：
−下記に示す、特にヒトの異常、疾患または症状、例えばアルツハイマー病（AD）、乾燥性AMD、または緑内障の予防、治療および／または緩和のため；
−そのような治療を必要とする患者の治療方法のため、前記方法は、その必要がある対象者に本発明の少なくとも1つのポリペプチドまたは本発明のそのようなポリペプチドを含む医薬組成物（下記で詳細に説明する）の治療的に活性な量を投与する工程を含み、そのような治療を必要とするそのような対象者は、下記で説明する異常、疾患または症状のいずれか、例えばAD、乾燥性AMDまたは緑内障に罹患するヒトであり得る；
−下記で説明する異常、疾患または症状、例えばヒトのAD、乾燥性AMDまたは緑内障を予防、治療または緩和する医薬の調製のため；
−上述の目的のために用いられる医薬組成物または医薬の活性成分として。
上述の異常、疾患または症状（以下の疾患におけるもの）は、患者または生物（ヒト）に本発明のポリペプチドを投与することによって予防および／または治療および／または緩和することができる疾患、より具体的には、A-ベータ機能不全（例えばA-ベータ産生不全）、沈着もしくは除去の欠陥によって媒介される疾患、および／またはアミロイド斑形性、A-ベータオリゴマーの形成などによって媒介される疾患である。さらに具体的には、前記疾患は、患者のA-ベータおよび／またはアミロイド斑および／またはA-ベータオリゴマーの（望ましくない）形性または構築を調節、低下および／または逆戻りさせることによって予防および／または治療および／または緩和することができる疾患であり、そのような疾患は例えば神経変性疾患を含み、最も有力なA-ベータ関連神経変性疾患はADである。
【００８２】
本発明のポリペプチドは、例えば以下の疾患を予防、治療または緩和する方法で用いることができる：
−アルツハイマー病（AD；全てのタイプおよび病期（前臨床期および前駆症状期を含む））、“アルツハイマー型痴呆”としてもまた知られている；
−年齢性黄斑変性の乾燥型（乾燥性AMD；中心性地図状委縮）；
−緑内障；
−脳アミロイドアンギオパチー（CAA）；
−トリソミー21（ダウン症候群）、成人ダウン症候群を含む；
−オランダ人型アミロイド症随伴遺伝性脳出血（HCHWA-D）；
−レーヴィ小体随伴痴呆；
−前頭側頭葉変性；
−緑内障；
−筋委縮性側索硬化症；
−散発性封入体筋炎；および
−高齢（例えば少なくとも55歳）ヒト対象者の不安症で、前記は、強迫性障害、恐慌性障害、恐慌性発作、広場恐怖症、外傷後ストレス障害、対人恐怖症、破壊性行動異常および慢性疲労症候群から成る群から選択される（この場合、前記高齢ヒト対象者は、症状出現または症状出現前AD、慢性アミロイドアンギオパチーおよびダウン症候群から選択されるA-ベータ関連症状と診断されていても診断されてなくてもよい）；
ここで、そのような方法は、その必要がある対象者に、本発明のポリペプチドおよび／または前記を含む医薬組成物の医薬的に活性な量を投与する工程を含む。
【００８３】
本発明の関係では、“予防、治療および／または緩和”という用語は、疾患の阻止および／または治療および／または緩和を含むだけでなく、一般的に発症を阻止し、疾患の執行を遅らすかまたは逆戻りさせ、当該疾患に付随する1つまたは2つ以上の徴候の開始を阻止または遅らせ、当該疾患に付随する1つまたは2つ以上の徴候を軽減および／または緩和し、当該疾患の重症度および／または期間および／または前記に付随する1つまたは2つ以上の徴候を軽減し、および／または当該疾患および／または前記に付随する任意の徴候の重症度の更なる進行を阻止し、前記疾患によって引き起こされる任意の生理学的損傷を軽減すること、および一般的に治療される患者に有益な薬理学的作用の一切もまた含む。
具体的には、ADの場合に本発明のポリペプチド、組成物および方法は、ADの認定リスク因子を有するかおよび／またはA-ベータ沈着が証明された患者でAD開始の予防または遅延を促進するために、軽度の認知障害（MCI）を有する患者（ADに転換するリスクを有する）を治療するために、および前臨床的または前駆的な病期から痴呆へと進行することが予想される患者でADの開始を予防または遅らせるために用いることができる。ADの遺伝的リスク因子には、APP遺伝子の固有の変異（特に670位および671位の変異並びに717位の変異）、プレセニリン遺伝子PS1およびPS2におけるもの、並びにApoE4におけるものが含まれる。他のリスク因子には、ADの家族歴、高コレステロール血症、アテローム性硬化症、糖尿病および／または高齢が含まれる。ADの傾向は、CSF中のA-ベータ(1-42)およびタウの濃度を解析することによって早期に診断できる。神経画像化技術（例えばPETおよびMRI）はAD転換リスクを有する患者を同定することができる。一般的には、いくつかのバイオマーカーの使用は、非常に早期に高い感受性および特異性でADの診断を可能にし得る。
【００８４】
ダウン症候群、オランダ人型アミロイド症による遺伝性脳出血、および脳ベータアミロイドアンギオパチーの素因がある場合には、それらの潜在的結果（例えば単発性および再発性脳葉内出血）を予防するために本発明のポリペプチド、組成物および方法をまた用いることができる。
治療されるべき対象動物は哺乳動物、より具体的にはヒトであろう。当業者には明瞭なところであるが、治療されるべき対象者は特に、本明細書で述べた疾患、異常または症状を有するか、またはそれらのリスクを有する者であろう。
疾患を治療する上記方法は前記疾患の治療用医薬の調製を含むことは当業者にはまた明白であろう。さらにまた、本発明のポリペプチドを上記疾患の治療のために意図される医薬または医薬組成物中の活性成分として用いることができることは明瞭である。したがって、本発明はまた、上述の疾患、異常または症状のいずれかの予防、治療および／または緩和用医薬組成物の調製における本発明のポリペプチドの使用にも関する。本発明はさらに、治療的または予防的使用のための本発明のポリペプチド、および具体的には上述の疾患、異常または症状のいずれかの予防、治療および／または緩和用の本発明のポリペプチドに関する。本発明はさらに、上述の疾患、異常または症状の予防、治療および／または緩和用医薬組成物に関し、そのような組成物は本発明の少なくとも1つのポリペプチドを含む。
【００８５】
具体的な理論に拘束されることを望まないが、上記の治療的または予防的作用は以下のメカニズムによって達成され得る：本発明のポリペプチドはA-ベータと結合し、それによって他の1つまたは2つ以上のA-ベータ分子とのその相互作用、またはA-ベータとレセプターとの相互作用、またはA-ベータと可溶性生物分子との相互作用、またはA-ベータと不溶性生物分子との相互作用を阻害する。標的A-ベータは斑または懸濁物もしくは溶液の一部分またはそれらの1つもしくは2つ以上であり、他のA-ベータ分子は斑の一部分、懸濁物もしくは溶液またはそれらの1つもしくは2つ以上に存在し得る。身体の脳、血管または他の部分から種々のA-ベータ形（例えばモノマー形、オリゴマーおよびマルチマー形、可溶性および不溶性凝集形、原線維形、プロトフィブリル形並びにアミロイド斑）を除去する工程は、本発明のポリペプチドとA-ベータとの結合に依拠し得る。体液中のA-ベータレベルの低下、および好ましくは血中の可溶性A-ベータレベルの低下（A-ベータ分子と別の分子（例えば別のA-ベータ分子）との間の相互作用による）は、神経変性疾患の徴候を緩和し、これら疾患の進行を遅らせるかまたは停止させ、および／または脳の損傷、記憶および認知を回復させるであろう。
【００８６】
さらに別のより一般的な特徴にしたがえば、本発明は、免疫療法、より具体的には受動免疫療法のための方法に関する。前記方法は、本明細書に記載する疾患に罹患した対象者または前記疾患のリスクがある対象者に、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の医薬として活性な量を投与する工程を含む。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、（i）認知低下の予防、治療および／または緩和の方法、および／または（ii）認知機能の回復および／または認知機能の改善の方法に関し、前記方法は、その必要がある対象者に本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の医薬として活性な量を投与する工程を含む。
本発明のポリペプチドおよび／または前記を含む組成物は、用いられるべき具体的な医薬処方物または組成物に応じて任意の適切な態様でその必要がある対象者に投与できる。したがって、本発明のポリペプチドおよび／または前記を含む組成物は、例えば静脈内に、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、経皮的に、経口的に、舌下に（例えば舌下錠、スプレーまたはドロップの形態で、前記は舌下に配置され粘膜から舌下の毛細血管ネットワークに吸収される）、鼻（内）に（例えば鼻スプレーおよび／またはエーロゾルの形態で）、局所的に、座薬の手段により、吸入により、硝子体内に（特に乾燥性AMDまたは緑内障の治療のため）、または任意の他の適切な態様で有効量または用量で投与することができる。
【００８７】
本発明のポリペプチドおよび／または前記を含む組成物は、予防、治療または緩和されるべき疾患、異常または症状を予防、治療および／または緩和するために適した治療の投薬計画にしたがって投与される。臨床医は一般的には複数の要件に応じて適切な治療の投薬計画を決定できよう。前記要件は、例えば予防、治療または緩和されるべき疾患、異常または症状、疾患の重症度、その徴候の重症度、用いられる具体的な本発明のポリペプチド、用いられる具体的な投与経路および医薬処方物または組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、一般的状態、並びに臨床医が周知する類似の要件である。一般的には、治療の投薬計画は、本発明の1つまた2つ以上のポリペプチド、または本発明のポリペプチドを含む1つまたは2つ以上の組成物を治療的および／または予防的に有効な量または用量で投与することを含むであろう。
一般的に、本明細書に記載した疾患、異常または症状の予防、治療および／または緩和のために、さらには治療されるべき具体的疾患、異常または症状、用いられるべき本発明の具体的ポリペプチドの能力、具体的投与ルート、および使用される具体的医薬処方物または組成物に応じて、本発明のポリペプチドは一般的には、0.005から20.0mg/kg体重および用量の間の量で、好ましくは0.05から10.0mg/kg/用量、より好ましくは0.5から10mg/kg/用量で、持続的に（例えば輸液によって）または単回投薬として（例えば毎日、毎週または毎月の投薬（下記を参照されたい））投与されるが、特に前述のパラメータにしたがって大きく変動させることができる。
予防的適用のためには、本発明のポリペプチドを含む組成物はまた、同様な投薬量でまたはわずかに低い投薬量で投与できる。投薬量はまた任意の合併症の発生にしたがい個々の医師が調節できる。
【００８８】
本発明の具体的なポリペプチド並びにその固有の薬理学的および他の特性に応じて、本発明のポリペプチドは、毎日、1日おき、2日おき、3日おき、4日おきもしくは5日おきに、毎週、毎月などに投与することができる。投薬計画は長期治療、1週間治療を含むことができよう。“長期”とは少なくとも2週間、好ましくは数カ月または数年の期間を意味する。
本発明のポリペプチドおよび前記を含む組成物の有効性は、関与する具体的な疾患に応じて、任意の適切なin vitroアッセイ、細胞系アッセイ、in vivoアッセイおよび／またはそれ自体公知の動物モデルまたは前記の組合せを用いて試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは当業者には明白であり、例えば下記実施例で用いられるアッセイおよび動物モデルが含まれよう。したがって、適切なアッセイは、抗A-ベータポリペプチドと被覆したモノマーもしくは凝集A-ベータペプチドまたは捕捉したビオチン化A-ベータとの結合を測定するELISA結合アッセイ、被覆したモノマーもしくは凝集A-ベータペプチドまたは捕捉したビオチン化A-ベータとの結合を測定するSPR（表面プラズモン共鳴（表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance））アッセイ（Malmqvist M.: Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics; Curr. Opin. Immunol. 5(2):282，1993）、A-ベータ(1-40)ペプチド/N-末端領域特異的結合物質の相互作用との競合またはA-ベータ(1-40)/中心部領域特異的結合物質の相互作用との競合を測定する競合TR-FRET（時間分解蛍光共鳴エネルギー伝達（Time Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer））、凝集の阻止または脱凝集を測定するin vitro A-ベータ凝集アッセイ、分子とアミロイド斑の結合を測定するTAPIR（組織アミロイド斑免疫反応性（Tissue Amyloid Plaque Immunoreactivity））（前記はアルツハイマー病患者またはAPPトランスジェニック動物由来の脳での免疫組織化学的解析を用いる）およびin vivo機構モデルであるが、ただしこれらに限定されない。
【００８９】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、これらのアッセイまたはモデルの少なくとも1つおよび好ましくはin vivoモデルの1つまたは2つ以上において、当業界で知られている通常の抗体（例えばm266および3D6抗A-ベータIgG抗体）またはNanobody(商標)（WO2006/40153に記載されている）よりも良好な特徴を有している。
医薬的な使用のために、本発明のポリペプチドは、（i）本発明の少なくとも1つのポリペプチドおよび（ii）少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤、並びに（iii）場合によって1つまたは2つ以上のさらに別の医薬として活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬調製物として処方できる。“医薬的に許容できる”とは、対応する物質が、個体に投与されたとき生物学的な或いは望ましくない作用を全く示さず、さらに当該医薬組成物中に含まれている他の成分（例えば医薬として活性な成分）のいずれとも有害な態様で相互作用しないことを意味する。具体的な例は、例えば以下の標準的な手引書で見出すことができる（Remington's Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Company，USA，1990）。例えば、本発明のポリペプチドは、通常の抗体および抗体フラグメント並びに他の医薬として活性なタンパク質についてそれ自体公知の任意の態様で処方し投与することができる。したがって、さらに別の実施態様にしたがえば、本発明は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤、並びに場合によって1つまたは2つ以上のさらに別の医薬として活性な物質を含む医薬組成物または調製物に関する。
【００９０】
非限定的な例によれば、そのような処方物は、経口投与用、非経口投与用（例えば静脈内、筋肉内、皮下、クモ膜下腔内、鼻洞内または腹腔内注射または静脈内輸液による）、局所投与用、舌下投与用、吸入、皮膚絆創膏、移植、座薬による投与用、経皮、鼻、硝子体内、直腸または膣投与用などに適した形態であり得る。そのような適切な投与形（投与態様にしたがって固体、半固体または液体であり得る）は、その調製において使用される方法および担体と同様に当業者には明白であろう。
非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、皮下注射または静脈内輸液）のための医薬調製物は活性成分を含み、さらに場合によって更なる溶解または希釈工程の後で輸液または注射に適切な、例えば無菌的溶液、懸濁液、分散液、乳液または散剤であり得る。そのような調製物のための適切な担体または希釈剤には例えば以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：無菌的な水および医薬的に許容できる水性バッファーおよび溶液、例えば生理学的なリン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液；水油；グリセロール；エタノール；グリコール、例えばプロピレングリコール、並びに鉱物油、動物油および植物油、例えばピーナツ油、ダイズ油とともに適切な前記の混合物。
【００９１】
活性化合物またはその塩の溶液はまた、微生物の増殖を防止するために保存料、例えば抗菌および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（チメルサール）などを含むことができる。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、バッファーまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。適切な流動性は、例えばリポソームの形成によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。吸収を遅らせる他の薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンもまた添加できる。
全ての場合に、最終的投薬形は、製造および保存条件下で無菌的であり、流動性を有しさらに安定でなければならない。無菌的な注射可能溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に上記に列挙した他の種々の成分とともに取り込み、続いて必要に応じてろ過滅菌することによって調製される。無菌的注射可能溶液を調製するための無菌的散剤の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、前記技術によって活性成分プラス以前にろ過滅菌した溶液に存在する任意の追加所望成分を含む散剤が得られる。
【００９２】
通常は水溶液または水性懸濁液が好ましいであろう。一般的には、治療用タンパク質（例えば本発明のポリペプチド）のための適切な処方物は緩衝タンパク質溶液であり、例えば適切な濃度のタンパク質（例えば0.001から400mg/mL、好ましくは0.005から200mg/mL、より好ましくは0.01から200mg/mL、より好ましくは1.0−100mg/mL、例えば1.0mg/mL（静脈内投与）または100mg/mL（皮下投与））、および水性バッファー、例えば
−リン酸緩衝食塩水、pH7.4
−他のリン酸緩衝液、pH6.2から8.2
−ヒスチジン緩衝液、pH5.5から7.0
−コハク酸緩衝液、pH3.2から6.6、および
−クエン酸緩衝液、pH2.1から6.2、
並びに場合によって溶液の等張性を提供するために塩（例えばNaCl）および／または砂糖またはポリアルコール（例えばトレハロース、マンニトールまたはグリセロール）を含む溶液である。
好ましい緩衝タンパク質溶液は、リン酸緩衝液（25mM、pH6.5）中に溶解させた本発明のポリペプチド約0.05mg/mLを含み、220mMのトレハロースの添加によって等張に調節した溶液である。さらにまた、他の薬剤（例えば洗剤）、例えば0.02%のトゥイーン20またはトゥイーン80をそのような溶液に含むことができる。皮下適用のための処方物は、顕著に高濃度の本発明のポリペプチド、例えば100mg/mLまでまたは100mg/mLを超えて含むことができる。しかしながら、上記に示した成分およびその量は、単に1つの好ましい選択肢であることは当業者には明白であろう。代替案およびその変型は当業者には即刻明らかであるか、または上記の開示から出発して容易に思いつき得るであろう。
【００９３】
本発明のポリペプチドはまた、適切なデポー製剤、徐放性または持続放出処方物（例えば注入に適切）を用いて、皮膚下の移植用制御放出装置を用いて、および／または用量計測ポンプまたは医薬として活性な物質または成分の投与にそれ自体公知の他の装置を用いて投与できる。さらにまた、本発明のポリペプチドは、ゲル、クリーム、スプレー、ドロップ、絆創膏、またはフィルム（皮膚上に置いたとき皮膚を通過する）の形態で処方できる。
さらにまた、通常の抗体または抗体フラグメントと比較して、本発明のポリペプチドを使用する主要な1つの利点は、それらはまた非経口投与以外のルートで容易に投与でき、そのような投与のために容易に処方できるということである。例えば、国際特許出願WO2004/041867に記載されているように、そのようなポリペプチドは、経口、鼻内、肺内および皮内投与用に処方できる。
本発明の別の実施態様にしたがえば、本明細書に開示した少なくとも1つの本発明の抗A-ベータポリペプチドおよび以下から成る群から選択される少なくとも1つの他の治療薬剤を含む医薬の組合せが提供される：コリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンおよびタクリン；NMDAアンタゴニスト、例えばメマンチン；A-ベータ減少剤、例えばA-ベータの生成に必要な1つまたは2つ以上の酵素を阻害することができる薬剤、例えばベータ-セクレターゼ阻害剤、ガンマ-セクレターゼ阻害剤およびガンマ-セクレターゼ調節物質；A-ベータ斑の構築を予防または低下させる薬剤；A-ベータ凝集阻害剤；RAGEアンタゴニスト；および神経変性疾患および／または認知機能低下を予防、治療または緩和する他の薬剤。そのような他の治療薬剤の例は、ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポスフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ジメボリン（ラトレピリジン）およびPF-4494700である。そのような医薬の組合せは場合によって追加の希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤を含むことができる。
【００９４】
併用治療の投薬計画の部分として2つまたは3つ以上の物質または成分が用いられるとき、それらは同じ投与ルートにより、または異なる投与ルートにより、本質的には同時にまたは異なる時間に（例えば本質的に同時、連続的に、または互い違いの投薬計画にしたがって）投与することができる。物質または成分が同時に同じ投与ルートにより投与されるとき、それらは異なる医薬処方物もしくは組成物として、または組合せ医薬処方物もしくは組成物の部分として投与できる。さらにまた、2つまたは3つ以上の活性物質または成分が併用療法の投薬計画の部分として投与されるとき、前記物質または成分の各々は、前記化合物または成分がその物だけで用いられるときに用いられるのと同じ量および同じ投薬計画にしたがって投与することができ、そのような組合せ使用は協調作用をもたらすことももたらさないこともある。しかしながら、2つまたは3つ以上の活性物質または成分の組合せ使用が協調作用をもたらすとき、投与される物質または成分の1つ、2つ以上または全部の量を減少させ、一方、所望の治療効果をなお達し得ることもまた可能である。このことは例えば、1つまたは2つ以上の物質または成分の使用に付随する望ましくない何らかの副作用を回避、限定または減少させ、一方で、所望の医薬的または治療的効果をなお得るために有用であり得る。
【００９５】
本発明のさらに別の実施態様は、上記に説明する疾患および異常を治療する方法である。前記方法は、少なくとも1つの本発明の抗A-ベータポリペプチドの有効量および以下から成る群から選択される少なくとも1つの薬剤を個体に同時に、別々に、または連続して投与する工程を含む：コリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンおよびタクリン；NMDAアンタゴニスト、例えばメマンチン；A-ベータ減少剤、例えばA-ベータの生成に必要な1つまたは2つ以上の酵素を阻害することができる薬剤、例えばベータ-セクレターゼ阻害剤、ガンマ-セクレターゼ阻害剤およびガンマ-セクレターゼ調節物質；A-ベータ斑の構築を予防または低下させる薬剤；A-ベータ凝集阻害剤；RAGEアンタゴニスト；および神経変性疾患および／または認知機能低下を予防、治療または緩和する他の薬剤（上記に説明した具体的な例を含む）。
本発明のさらに別の特徴にしたがえば、本発明のA-ベータ結合ポリペプチドは、上記に示した疾患及び以上の治療のために用いられる医薬と組み合わせて投与できるように調製される。そのような他の薬剤は以下から成る群から選択される：コリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンおよびタクリン；NMDAアンタゴニスト、例えばメマンチン；A-ベータ減少剤、例えばA-ベータの生成に必要な1つまたは2つ以上の酵素を阻害することができる薬剤、例えばベータ-セクレターゼ阻害剤、ガンマ-セクレターゼ阻害剤およびガンマ-セクレターゼ調節物質；A-ベータ斑の構築を予防または低下させる薬剤；A-ベータ凝集阻害剤；RAGEアンタゴニスト；および神経変性疾患および／または認知機能低下を予防、治療または緩和する他の薬剤（上記に説明した具体的な例を含む）。
【００９６】
本発明のなお別の特徴にしたがえば、上記に示した疾患および異常の治療に用いられる医薬（そのような医薬は、コリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンおよびタクリン；NMDAアンタゴニスト、例えばメマンチン；A-ベータ減少剤、例えばA-ベータの生成に必要な1つまたは2つ以上の酵素を阻害することができる薬剤、例えばベータ-セクレターゼ阻害剤、ガンマ-セクレターゼ阻害剤およびガンマ-セクレターゼ調節物質；A-ベータ斑の構築を予防または低下させる薬剤；A-ベータ凝集阻害剤；RAGEアンタゴニスト；および神経変性疾患および／または認知機能低下を予防、治療または緩和する他の薬剤（上記に説明した具体的な例を含む）から成る群から選択される）は、本発明のA-ベータ結合ポリペプチドと組み合わせて投与できるように調製される。
本発明のさらに別の特徴にしたがえば、本発明のA-ベータ結合ポリペプチドは、前記ポリペプチドの投与に有用な装置（例えば注射筒、注入ペンまたは他の装置）と組み合わせて用いられる。
【００９７】
本発明のさらに別の実施態様にしたがえば、以下の工程を含む、A-ベータ機能不全および／またはアミロイド斑形性によって媒介される疾患、異常または症状を診断する方法が提供される：
a）対象者からサンプルを入手する工程；および
b）サンプルを上記に規定した本発明のポリペプチドとin vitroで接触させる工程；および
c）前記ポリペプチドと前記サンプルとの結合を検出する工程；および
d）工程c）で検出された結合を標準物と比較する工程、ここで前記サンプルに対応する結合の相違は、A-ベータ機能不全および／またはアミロイド斑形性を特徴とする疾患、異常または症状の診断的特徴となる。
本発明の別の実施態様にしたがえば、以下の工程を含む、A-ベータ機能不全および／またはアミロイド斑形性によって媒介される疾患、異常または症状を診断する方法が提供される：
a）対象者からサンプルを入手する工程；および
b）サンプルを上記に規定した本発明のポリペプチドと接触させる工程；および
c）サンプル中のA-ベータの量を決定する工程；および
d）工程c）で決定された量を標準物と比較する工程、ここで前記サンプルに対応する量の相違は、A-ベータ機能不全および／またはアミロイド斑形性を特徴とする疾患、異常または症状の診断的特徴となる。
【００９８】
前記サンプルは例えば対象者の体液、例えば血液または脳脊髄液（CSF）であり得る。本発明のポリペプチドとA-ベータとの結合を検出する工程またはサンプル中のA-ベータの量を決定する工程は、一般的にはポリペプチドとA-ベータとの間での複合体形成の測定を必要とするであろう。この方法の異なる実施態様にしたがえば、複合体形成は溶液中でまたは基質上での1つの成分の固定化後に生じ、続いてそのような複合体が検出されるであろう。この目的のために、例えば特異的結合対（例えばビオチン-(ストレプト)アビジン結合対）の一部分である官能基を導入することによって、本発明のポリペプチドをさらに改変することが有用であり得る。そのような官能基を用いて、本発明のポリペプチドを別のタンパク質、ポリペプチドまたは化合物（前記は結合対の他の半分と、すなわち結合対の形成を介して結合する）と連結することができる。例えば、本発明のポリペプチドをビオチンと結合させ、さらにアビジンまたはストレプトアビジンと結合させた別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と連結させることができる。例えばそのような結合させた本発明のポリペプチドを、例えば検出可能なシグナルを生成する薬剤をアビジンまたはストレプトアビジンに結合させた診断系でレポーターとして用いることができる。
上記診断方法はまた、対象者の治療的処置の有効性をモニターするために用いることができる。
【００９９】
本発明の別の実施態様にしたがえば、上記で規定した方法で使用される、A-ベータ機能不全によって媒介される疾患、異常または症状、および特にアミロイド斑形性および／またはADを診断するキットが提供される。そのようなキットは、少なくとも1つの本発明のポリペプチドおよび場合によって1つまたは2つ以上の媒体、検出手段および／またはin vitroもしくはin vivoの画像化剤、さらに場合によって使用の指示を含む。適切なin vivo画像化剤には99mTc、111インジウム、123ヨウ素が、磁性共鳴画像化のためには常磁性化合物が含まれる。SPECT、PETまたはMRIと本発明の標識抗A-ベータポリペプチドとの組合せは‘A-ベータ脳スキャン’および各患者についての個々のリスク評価を可能にするであろう。
本発明のさらに別の実施態様にしたがえば、本発明のある種のA-ベータ結合ポリペプチドは、ヒトだけでなくマウスのA-ベータまたは他の動物由来A-ベータの特異的検出のため、およびそのような検出に依拠する検査およびアッセイのための研究用ツールとして用いることができる。これは、動物モデルを利用する検査およびアッセイに特に有用である。
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明のA-ベータ結合ポリペプチド、およびさらに別の1つまたは2つ以上の成分（上記に記載の疾患および異常の治療に用いられる他の薬剤から成る群から選択される）、および上記に記載の装置を含むキットを提供する。
【０１００】
本発明はさらに本発明のA-結合ポリペプチドを製造する方法を提供し、そのような方法は一般的に以下の工程を含む：
−本発明のポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明のポリペプチドをコードすることができる核酸（以下では“本発明の核酸”）を含む宿主細胞を培養する工程；および
−宿主細胞によって発現されたポリペプチドを培養から回収または単離する工程；および
−本発明のポリペプチドを場合によってさらに精製および／または改変および／または処方する工程。
本発明の核酸はゲノムDNA、cDNAまたは合成DNAであり得る（合成DNAは例えば目的の宿主細胞または宿主生物での発現に特に適応させたコドン使用頻度を有するDNA）。本発明のある実施態様にしたがえば、本発明の核酸は上記に定義したように本質的に単離された形態である。
本発明の核酸はまた、ベクター中に存在するのであれおよび／またはベクターの部分であれ、例えばプラスミド、コスミドまたはYACの形態であってもよく、前記は繰り返せば本質的に単離された形態である。前記ベクターは特に発現ベクター、すなわちin vitroおよび／またはin vivoで（例えば適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系で）ポリペプチドの発現を提供できるベクターであり得る。そのような発現ベクターは一般的に少なくとも1つの本発明の核酸を含み、前記核酸は、稼動できるように1つまたは2つ以上の適切な調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）に連結される。そのような調節エレメントおよび本発明のポリペプチドの発現に有用または必要な他のエレメント（例えば組み込み因子、選別マーカー、シグナルおよびリーダー配列、レポーター遺伝子など）の具体的な例は、例えばWO2006/040153の131から133ページに開示されている。
【０１０１】
本発明の核酸は、本明細書で提供した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報を基に、それ自体公知の態様で（例えば自動化DNA合成および／または組換えDNA技術により）調製または入手するか、および／または適切な天然の供給源から単離することができる。
別の実施態様にしたがえば、本発明は、本発明のポリペプチドを発現するかまたは発現する能力を有する宿主または宿主細胞、および／または本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞に関する。特に好ましい実施態様にしたがえば、前記宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞または哺乳動物細胞である。
適切な細菌細胞には、グラム陰性細菌細胞株（例えば大腸菌（Escherichia coli）、プロテウス（Proteus）、シュードモナス（Pseudomonas）の株）およびグラム陽性細菌株（例えばバシルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）およびラクトコッカス（Lactococcus）の株）が含まれる。適切な菌類細胞にはトリコデルマ（Trichoderma）、ニューロスポラ（Neurospora）およびアスペルギルス（Aspergillus）の種に由来する細胞が含まれる。適切な酵母細胞には、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae））、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）（例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe））、ピキア（Pichia）（例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica））およびハンセヌラ（Hansenula）の種由来の細胞が含まれる。
適切な哺乳動物細胞には、例えばCHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などが含まれる。しかしながら、両性動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、および異種タンパク質の発現のために当業界で用いられる任意の他の細胞も同様に用いることができる。
【０１０２】
工業規模での生産のために、免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドおよび前記を含むタンパク質治療薬の（工業的）生産のための好ましい異種宿主には、大腸菌、ピキア・パストリスおよびS.セレビシアエの株が含まれる。前記は、大規模発現、生産および発酵、特に大規模（生物）医薬の発現、生産および発酵に適切である。
具体的な発現系の選択は、部分的にはある種の翻訳後改変（より具体的にはグリコシル化）の必要性に左右されるであろう。グリコシル化が望ましいかまたは要求される本発明のポリペプチドの生産には、発現されたタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現宿主の使用が必要となろう。これに関しては、得られるグリコシル化パターン（すなわち付加される残基の種類、数および位置）は、発現に使用される細胞または細胞株に左右されることは当業者には明白であろう。
上記に示した細胞で生成される本発明のポリペプチドは、細胞内で（例えばサイトゾル、ペリプラズムまたは封入体中で）産生され続いて宿主細胞から単離され、場合によってさらに精製されるか、またはそれらは細胞外に生産され（宿主細胞が培養されている媒体中に分泌され）、続いて培養液から単離され場合によってさらに精製され得る。
【０１０３】
ポリペプチドの組換え体生産に用いられるさらに別の方法および試薬、例えば適切な発現ベクター、形質転換またはトランスフェクションの方法、選別マーカー、タンパク質発現の誘発方法、培養条件などは当業界では公知である。同様に、本発明のポリペプチドの製造方法で有用なタンパク質の単離および精製技術も当業者には周知である。
便利な組換え宿主生物（例えば大腸菌および酵母）での発酵による本発明のポリペプチドの生産は、高価な哺乳動物細胞の培養設備も要求される通常の抗体と比較して費用効率がよい。さらにまた達成可能な発現レベルも高く、本発明のポリペプチドの収量は1から10g/L（大腸菌）の範囲および10g/L以上（酵母）である。
本発明のさらに別の特徴にしたがえば、下記表VIIに列挙する免疫グロブリン単一可変ドメインが提供され、前記は本発明のA-ベータ結合ポリペプチドの構築に有用である。したがって、表VIIに列挙した免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれかを（場合によってヒト化した後で）、1つまたは2つ以上の他のA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（そのような他の免疫グロブリン単一可変ドメインはA-ベータの異なるエピトープと結合する）と結合させるならば（好ましくは1つの連続したポリペプチド鎖の形で）、本発明の二パラトープ性A-ベータ結合分子が得られるであろう（前記結合分子は下記実施例9から11に詳細に示すように有用な結合の特徴を有する）。
【０１０４】
表VII：A-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン
2013520974.tif 000011
2013520974.tif 000012
2013520974.tif 000013
2013520974.tif 000014
2013520974.tif 000015
2013520974.tif 000016
2013520974.tif 000017
2013520974.tif 000018
2013520974.tif 000019
【実施例１】
【０１０５】
実施例1：液性免疫応答誘発のためのA-ベータによるラマの免疫
モノマーA-ベータペプチド（BAM）の生成：モノマーA-ベータペプチド（BAM）をトリフルオロ酢酸（TFA；Sigma）／1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP；Fluka）処理により調製する。凍結乾燥A-ベータペプチドをその元のバイアル中にて100%のTFA中で最終濃度1mg/mLに溶解する。この溶液を続いて室温にてスピードヴァック（speedvac）中で蒸発させる。この工程およびこの後の全蒸発工程の後で残存するペレットを氷上に置く。ペレットをHFIPに再懸濁し、室温にて再びスピードヴァックで蒸発させ、続いてもう1回HFIP溶解を実施し、その後、溶液を適切な体積のアリコットに分割する。前記アリコットを室温にてスピードヴァックで蒸発させ、ペレットを-80℃で保存する。使用直前に、TFA/HFIP処理A-ベータペプチドのアリコットをピペットの反復吸引吹出し操作により100%のDMSOに溶解させる。A-ベータペプチド溶液を14000rpmで10分遠心分離して存在し得る凝集物を除去し、上清を種々のアッセイに用いる。
【０１０６】
ラマの免疫：凝集A-ベータペプチド（BAA）およびオリゴマーA-ベータペプチド（BAO）を用い、低い用量を首の領域の筋肉内に前記免疫原を所定期間注射することによってラマを免疫する。BAAは、本質的にSchenkら（Schenk et al.，1999，Nature 400: 173-177）が記載したように調製した合成A-ベータ(1-40)およびA-ベータ(1-42)ペプチドの混合物から成る。BAOは、本質的にKayedら（Science 300:486-489，2003）が記載したように調製される。最初の2回の抗原注射は各回100μg抗原/ラマから成り、その後に続く全ての投与について用量を50μg/ラマに減少させる。ラマ144および145を新しく調製したBAAでワクチン接種する。フロイントの完全アジュバント（初回注射）またはスチミューン（Stimune）（以下の全ての免疫原の追加免疫）を用いエマルジョンとして最大16日の間隔で合計9回BAA抗原用量を注射する。ラマ129、130、177および178はBAOでワクチン接種する。フロイントの完全アジュバント（初回注射）およびフロイントの不完全アジュバントまたはスチミューン（Stimune）（以下の全ての免疫原の追加免疫）を用いエマルジョンとして最大18日の間隔で合計6から9回BAO抗原用量を注射する。ラマはまた、ウシ血清アルブミン（BSA；ラマ181および186）を結合させたA-ベータペプチドフラグメント1-16、またはBSA結合A-ベータペプチドフラグメント1-30（ラマ185および187）で免疫される。フロイントの完全アジュバントまたはフロイントの不完全アジュバントを用い、ラマ当たり抗原用量を100μg（最初の2回の注射）から50μg（その後の2回の注射）に減少させながら4回の抗原注射を14日間隔で実施する。各免疫計画の開始直前に免疫前血清サンプルおよび免疫実験中の定期的時点の免疫血清サンプルを収集し、個々の動物のA-ベータペプチド特異的液性応答を評価する。
【０１０７】
A-ベータペプチド特異的血清力価をELISAによりモニターするために、C-末端でビオチン化した2μg/mLのA-ベータ(1-40) （Anaspec）をニュートラビジン被覆（0.2−0.5μg/ウェル）96ウェルマキシソープ（Maxisorp）プレート（Nunc）に室温で2時間固定する。ウェルをカゼイン溶液（PBSにて1%）でブロッキングする。免疫前および免疫血清サンプルの連続希釈を添加した後、特異的に結合したラマ免疫グロブリンをヤギ抗ラマセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合物（Bethyl Lab. Inc.）を用いて検出し、通常抗体および重鎖のみ抗体の両方により媒介される液性応答の検出を可能にする。ある種の事例では、連続ELISAを実施し、重鎖のみのラマIgG2およびIgG3抗体を特異的に認識するマウスmAb（Daley et al.，2005，Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386）、続いてウサギ抗マウス-HRP複合物（DAKO）を用いる検出により特異的に重鎖抗体媒介応答を評価する。ELISAは色素原基質としてTMB（Promega）を用いて発色させ、吸収は450nmで測定する。4つの全ての免疫原形式（BAA、BAO、A-ベータ(1-16)-BSAおよびA-ベータ(1-30)-BSA）について、（ビオチン化）モノマーA-ベータ(1-40)に特異的な、通常抗体および重鎖抗体媒介免疫応答の両方が検出される。モノマーA-ベータ(1-40)に対して陽性を示す血清サンプルはまた、マキシソーププレートに直接被覆したBAAに対して試験したときもまた陽性であり、用いたモノマーA-ベータとBAA調製物に少なくとも部分的に共通エピトープが存在することを物語っている。
【実施例２】
【０１０８】
実施例2：免疫ラマからのA-ベータ結合VHHドメイン（VHH）の単離
重鎖のみ抗体フラグメントレパートリーのクローニング：最後の免疫原注射に続いて、重鎖抗体を産生するB細胞供給源として免疫組織を免疫ラマから収集する。典型的には、2つの150mL血液サンプルを最後の抗原注射から4日後および8日後に収集し、さらに1つのリンパ節（最後の抗原注射から4日後に収集）を各動物から収集する。血液サンプルから末梢血単核細胞（PBMC）を、フィコール-ハイパーク（Ficoll-Hypaque）を製造業者（Amersham Biosciences）の指示にしたがって用いて調製する。PBMCおよびリンパ節生検から全RNAを抽出し、前記をRT-PCRのための出発材料として用いてVHHコード遺伝子セグメントを増幅する（以前にWO2005/044858に記載）。各免疫ラマについて、前記動物の全ての収集免疫組織から単離した全RNAをプールすることによってライブラリーを構築する。簡単に記せば、PCR増幅VHHレパートリーを固有の制限部位によりベクターでクローニングする（前記ベクターはVHHライブラリーのファージディスプレーを促進するように設計されている）。前記ベクターはpUC119から誘導され、LacZプロモーター、M13ファージgIIIタンパク質コード配列、アンピシリンまたはカルベニシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびハイブリッドgIII-pelBリーダー配列（pAX050）を含む。VHHコード配列とインフレームの状態で、前記ベクターはC-末端c-mycタグおよび(His)6タグをコードする。ファージは標準的プロトコルにしたがって調製され、更なる使用のためにろ過滅菌後4℃で保存される。
【０１０９】
ファージディスプレーによるA-ベータ特異的VHHの選別：全ラマから入手し、ファージライブラリーとしてクローニングしたVHHレパートリーを、多重選別条件を適用する種々の選別手法で用いる。可変因子は以下を含む：
i）A-ベータペプチド形式（A-ベータ(1-40)C-末端もしくはN-末端ビオチン化、A-ベータ(1-16)C-末端ビオチン化、A-ベータ(1-30)N-末端ビオチン化およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合、例えばA-ベータ(1-42)-GST、A-ベータ(1-10)-GSTまたはGST-A-ベータ(1-42)）、
ii）A-ベータペプチド凝集状態（モノマーA-ベータ、BAOまたはBAA）、
iii）抗原提示方法（固相：ニュートラビジン被覆プレートに直接被覆またはビオチンタグを介して；溶液相：溶液中でインキュベーション、続いてニュートラビジン被覆プレート上で捕捉）、
iv）抗原濃度、および
v）異なる溶出方法（トリプシンまたはTEA）
選別は以下のように実施される：固相および溶液相選別形式のための抗原調製物は複数の濃度で上記のように提示される。ファージライブラリーと2時間インキュベートし続いて十分に洗浄した後、結合ファージをトリプシン（1mg/mL）またはTEAで15分溶出させる。ファージ溶出にトリプシンを用いる場合、プロテアーゼ活性は、0.8mMのプロテアーゼ阻害剤ABSFを適用して直ちに中和する。コントロールとして、抗原無しの選別を並行して実施する。バックグラウンド（抗原無しコントロール）を超える濃縮を示すファージ産出物を用いて大腸菌に感染させる。感染大腸菌細胞を次の選別ラウンド（ファージレスキュー）のためのファージの調製に用いるか、または個々のVHHクローンの解析のために寒天プレート（LB＋Amp＋2%グルコース）にプレートするために用いる。特異的結合物について選別産出物をスクリーニングするために、寒天プレートから単一コロニーを採取し、1mLの96深ウェルプレートで増殖させる。グルコース非存在下でIPTG（最終0.1−1mM）を添加することによってplacZ制御VHH発現を誘発する。（約80μLの体積での）ペリプラズム抽出物は標準的方法にしたがって調製する。
【０１１０】
A-ベータ結合についてのペリプラズム抽出物のスクリーニング：C-末端でビオチン化した2μg/mL のA-ベータ(1-40)（Anaspec）をニュートラビジン被覆（0.2−0.5μg/ウェル）96ウェルマキシソーププレート（Nunc）で室温にて2時間捕捉する。ウェルをカゼイン溶液（PBSで1%）でブロッキングする。典型的には10倍希釈のペリプラズム抽出物を添加した後、マウス抗mycおよび抗マウス-HRP複合物（DAKO）を用いてVHH結合を検出する。最低限バックグラウンドの2倍を超えるELISAシグナルを生じるクローンを配列解析のために保持する。（ビオチン化）モノマーA-ベータ(1-40)と結合することができるVHHは、16の異なるB細胞系列に割り当てることができる。同じB細胞系列に由来するクローンは高度の類似するCDR3を共有し、したがって同じエピトープを認識しそうである。表VIIIは、16のB細胞系列の各々の典型的VHHの同定をもたらす選別パラメータの要旨である。表IXでは、表VIIIに列挙するVHHのアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
表VIII：A-ベータ特異的VHH B細胞系列の同定に用いられる選別パラメータ
2013520974.tif 000020
【０１１２】
表IX：得られた代表的VHHのアミノ酸配列
2013520974.tif 000021
2013520974.tif 000022
【０１１３】
各B細胞系列について見出される変種の総数（最低限1つのアミノ酸相違）は、1（ABII5D2）、195（ABII42D4）、1（ABII42G10）、1（ABII60D2）、1（ABII60H5）、23（ABII1E11）、3（ABII14D4）、3（ABII35C7）、6（ABII35G2）、1（ABII35D2）、7（ABII42B10）、2（ABII42F5）、3（ABII42E10）、2（ABII60A10）、2（ABII60G11）、および15（ABII61F6）である。
最良の結合特性を有するB細胞系列変種を同定するために、全てのVHH変種のペリプラズム抽出物を用いてオフ速度を決定した（Biacore T100，GE Healthcare）。モノマーA-ベータ(1-40)（C-末端でビオチン化；Anaspec）、モノマーA-ベータ(1-16)（C-末端でビオチン化；Bachem）およびモノマーA-ベータ(12-28)（N-末端でビオチン化；Bachem）を実施例1に記載したように調製し、同じSAセンサーチップ（GE Healthcare）の3つの別個のチャネル上にストレプトアビジンを介して不可逆的に捕捉する。表面を最初に表面洗浄緩衝液（50mMのNaOH中の1M NaCl）の1分注入により3回洗浄し、続いてビオチン化A-ベータ（50nM）を100RUの標的レベルまで注入する。捕捉後、過剰のd-ビオチン（200μg/mL）を5μL/分で180秒間注入することによって表面をブロッキングする。参照表面はd-ビオチンで洗浄およびブロッキングする。HBS-EP+緩衝液を泳動緩衝液として用い、実験は25℃で実施する。オフ速度スクリーニングのために、VHHのペリプラズム抽出物を10倍希釈で2分間45μL/分で注入し、10分間解離させる。精製参照結合物（100nMのVHH、10nMの3D6 Fab）を陽性コントロールとして注入し、各実験の少なくとも開始と終了時に判定する。別個のVHHサンプル間において、表面を再生緩衝液（50mMのNaOH）で25秒間45μL/分で、続いて（再生が不完全な場合は）6MのGuHClで10秒間45μL/分で再生する。オフ速度は、捕捉されたビオチン化A-ベータ(1-40)によりチャネルから得られたセンサーグラムから計算される。2つのVHH B細胞系列（ABII42D4およびABII60G11）の変種のみが単相の結合パターンを示し、1：1相互反応モデルによるオフ速度の計算を可能にした（すなわちそれぞれ6.1E-3 s-1および2.7E-2 s-1）。他の全てのVHH B細胞系列については、解離曲線の2つの異なる区画が別々に適合し、kd1（125から160秒間の解離枠から計算）およびkd2（400秒−700秒）を提示した。データは、参照チャネルの曲線およびブランク泳動緩衝液注入を差し引くことによって二重に照合する。センサーグラムは、バイアコア（Biacore）評価ソフトウェアバージョン1.1.1を用い、1：1解離モデルを適合することによって評価する。VHH ABII60D2およびABII60H5のA-ベータとの結合はELISAスクリーニングで観察されるが、これらのVHHはセンサーチップと低い結合を示す。
【０１１４】
一価の非VHH結合物の結合特徴を調べるために、モノクローナル抗体m266および3D6のFabフラグメントを用いる。モノクローナル抗体3D6は以下の文献に記載されてあり（Johnson-Wood et al.，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1550-1555およびBard et al.，2000，Nature Medicine 6:916-919）、特にA-ベータのアミノ酸残基1から5（N-末端エピトープ）と結合する。モノクローナル抗体m266は以下の文献（Seubert et al.，1992，Nature 359:325-327）に記載されてあり、特にA-ベータのアミノ酸残基16から24（A-ベータの中心部エピトープ）と結合する。Fabフラグメント（それぞれの抗体の可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）、定常軽鎖（CL）および重鎖の定常ドメイン1（CH1）（配列は下記に示す）、並びにさらに別にC-末端c-mycタグおよびヘキサヒスチジン（(His)6タグ）を含む）を通常的技術にしたがってクローニング、発現および精製し、宿主生物として大腸菌を用い、精製には固定金属アフィニティ（IMAC）およびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いる。m266および3D6の精製Fabフラグメントは、上記に記載の結合実験ではそれぞれ4.0E-5 s-1および4.7E-4 s-1のオフ速度を示す。
【０１１５】
3D6のFabフラグメントのVL-およびVH配列：
VL：
YVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRIEAEDLGLYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号：128）
VH：
EVKLVESGGGLVKPGASLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQNSDKRLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTTVTVSS（配列番号：129）
m266のFabフラグメントのVL-およびVH配列：
VL：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYSDGNAYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK（配列番号：130）
VH：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFTFSRYSMSWVRQTPEKRLELVAQINSVGNSTYYPDTVKGRFTISRDNAEYTLSLQMSGLRSDDTATYYCASGDYWGQGTTLTVSS（配列番号：131）
【実施例３】
【０１１６】
実施例3：精製VHHの性状決定
各B細胞系列について最も遅い解離速度を有するVHH変種をpUC119由来の発現ベクターで再クローニングする。前記発現ベクターは、LacZプロモーター、アンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびハイブリッドgIII-pelBリーダー配列を含む。VHHコード配列とインフレームの状態で、前記ベクターはC-末端c-mycタグおよび(His)6タグをコードする。VHHは大腸菌で生成し、固定化金属アフィニティ（IMAC）およびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）で精製し、SDS-PAGEで判定したとき純度95%が得られる。
3.1固定A-ベータとのVHHの結合（ELISA）：VHHとモノマーA-ベータペプチド（BAM）との結合を定量するために、実施例2に記載したものと同じ設定を用いVHHを連続希釈としてELISAに適用する。VHH ABII60D2およびABII60H5を除き、EC50値を計算し表Xに要約する。A-ベータのN-末端エピトープ（アミノ酸1から16）またはA-ベータの中心部エピトープ（アミノ酸12から28）と相互反応するもっとも強力なVHHは、それぞれABII42D4（EC50は14.2nM）およびABII60A10（EC50は4.9nM）であると決定される。
BAMに対して検出可能なシグナルを生じるVHHをA-ベータペプチド凝集物（BAA）との結合についてELISA（実施例2に記載したものと同じ設定を適用）で試験する。文献（Bohrmann et al.，1999，J Biol Chem 274: 15990-15995）にしたがって抗原を調製し固定する。簡単に記せば、TBS緩衝液（50 mMトリス、150 mM NaCl（pH 7.4）および0.05% アジ化ナトリウム）で希釈した10μg/mLのA-ベータ(1-40)（2mg/mLの合成A-ベータ(1-40)（Bachem）のDMSOストック溶液から）の100μLを37℃で60時間凝集させる。BAMを認識するVHHは全てBAAを認識する。対応するEC50は表Xに要約される。
【０１１７】
表X：BAMおよびBAA ELISAにおける精製VHHのEC50
2013520974.tif 000023
ND：実施せず；*：IC50は外挿曲線から計算される
【０１１８】
3.2溶液中でのA-ベータとのVHHの結合（TR-FRET）：溶液中での抗A-ベータVHHとA-ベータペプチドとの相互反応を時間分解蛍光共鳴エネルギー伝達（Time Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer（TR-FRET））競合アッセイを用いて評価する。2つの異なる設定で、A-ベータ(1-40)ペプチド‐ABII42D4相互反応（N-末端領域特異的）またはA-ベータ(1-40)ペプチド‐ABII60A10相互反応（中心部領域特異的）との競合を試験する。このアッセイのために、ストレプトアビジン‐ユーロピウムキレートで標識したモノマーA-ベータ(1-40)およびAlexaFluor647で標識したVHH ABII42D4またはABII60A1を種々の濃度の非標識競合物（VHH、IgGまたはFab）とともに1時間インキュベートする。それぞれ以下の濃度（0.2 nM (A-beta(1-40))、50 nM (ABII42D4)および 10nM (ABII60A10)）の標識化合物を用い、結合反応時に放出される蛍光シグナルを665nmで検出する。IC50をABII42D4およびABII60A10 TR-FRETアッセイで決定し、検査したN-末端領域特異的結合物について以下の能力ランキングが得られた：モノクローナル抗体3D6（2.5nM）＞Fabフラグメント3D6（3.4nM）＞ABII42D4（46.8nM）＞ABII5D2＝42G10（＞1000nM）。このアッセイで認定されたもっとも強力な中心部領域特異的VHHはABII60A10で、11.1nMのIC50を示し、一方、ベンチマーク抗体のIC50は0.50nM（モノクローナル抗体m266）および0.52nM（m266のFabフラグメント）であった。
比較のために、以前に開示された抗A-ベータVHH（“参照VHH”）を下記に示す国際特許出願公開公報から入手できる配列情報を用いて上記のように作製し精製する：
VHHs 2D2および2G6：WO2006/40153；
VHHs 3A、1B、11G、4Dおよび8B：WO2007/35092；および
VHH 31-1：WO2004/44204。
そのアミノ酸配列は表XIに示される。
【０１１９】
表XI：参照VHHのアミノ酸配列
2013520974.tif 000024
参照VHH 2G6（N-末端領域特異的）および2D2（中心部領域特異的）と比較して、VHH 42D4および60A10は、それぞれ21倍以上および36倍以上改善されたIC50を示す（表X参照）。
【０１２０】
3.3 A-ベータペプチド‐VHH相互作用の親和性の決定：A-ベータペプチド‐VHH／Fab相互作用の親和性を、以前（実施例2）に記載したようにストレプトアビジンセンサーチップ上に捕捉したC-末端ビオチン化A-ベータ(1-40)を用い表面プラズモン共鳴（Biacore）により決定する。精製VHHまたはFabフラグメントを異なる5つの濃度（ABII42D4およびABII60A10について2.5から300nM）で2分間注入し、10分間解離させる。ABII42D4については結合および解離曲線は1：1相互反応モデル（ラングミュア結合）を用いて適合させることができ（ただしABII60A10では適合しない）、正確なKD値を決定できる。親和性は、それぞれVHH ABII42D4については16nM、3D6のFabフラグメントについては5.1nM、およびm266のFabフラグメントについては0.3nMであることが見出される。
【０１２１】
3.4表面プラズモン共鳴によるエピトープマッピング：A-ベータ(1-16)（C-末端でビオチン化；Bachem）およびA-ベータ(12-28)（N-末端でビオチン化；Bachem）ペプチドを用いて表面プラズモン共鳴（Biacore）によりVHHの結合特異性を決定する（これらペプチドは上記に記載したようにストレプトアビジンセンサーチップ上で捕捉される）。上記の表IXに列挙したVHHのうち5つ（ABII5D2、ABII42D4、ABII42G10、ABII60D2およびABII60H5）がA-ベータペプチドのN-末端領域と相互反応し、11VHH（ABII1E11、ABII14D4、ABII35C7、ABII35G2、ABII35D2、ABII42B10、ABII42F5、ABII42E10、ABII60A10、ABII60G11およびABII61F6；表X参照）が中心部領域と相互反応することが見出される。
【０１２２】
3.5 in vitro A-ベータ凝集アッセイ：VHHをin vitro A-ベータ凝集アッセイで試験し、凝集を阻害または低下させることができるか否かを判定する。in vitro A-ベータ凝集はチオフラビンT（ThT）蛍光を用いて測定する。ThTはA-ベータ原線維形成時に典型的な赤色シフトを受ける（Levine，H. 1993. Protein Science (2): 404-410）アッセイのために、100% DMSO中の合成A-beta(1-40)（Bachem）のストック溶液および25mMグリシン‐NaOH（pH8.5）中のThTを調製し-20℃で保存する。使用前に、A-beta(1-40)ストック溶液を凝集緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、100mMのNaCl（pH5）、0.02%のNaN3）で56μMに希釈する。FabフラグメントおよびVHHを、56および7μMの間の濃度を用いてD-PBS中の連続希釈として試験する。56μMのA-beta(1-40)溶液および抗体／VHHサンプルまたは適切な陰性コントロールの等しい体積（20μL）を混合し（トリプリケート）、混合物を吸着性の低いマイクロ遠心分離管で37℃にて48時間暗環境でインキュベートする。このインキュベートサンプルの30μLを黒色の96ウェル平底ポリプロピレンプレート（Greiner Bio-One）に移した後、2.5μMのThT（ストック溶液を25mMグリシン‐NaOHで稀釈）250μLを加え、蛍光シグナルを測定する（Envision，PerkinElmer）。競合物質の非存在下で測定されたA-beta(1-40)の最大蛍光シグナルを100%凝集（または0%阻害）と設定する。試験した最高のVHH濃度（28μM）における最大阻害を少なくとも2つの独立した実験の平均として計算する。無関係の（非A-ベータ特異的）VHHについて約25%の定常的バックグラウンド阻害が検出されるが、一価のFabフラグメント3D6およびm266は、再現性のある用量依存阻害（それぞれ79%および85%の最大阻害）を示す。試験したVHHパネルのうちで、14D4、35C7、35G2、35D2、42B10、42F5、42E10および60A10がそれぞれ78、82、76、73、77、79、75および80%のペプチド凝集定常阻害を示す（非特異的コントロールVHHで誘発される25%のバックグラウンド阻害よりも高い）。
【実施例４】
【０１２３】
実施例4：VHHの親和性成熟
VHH ABII42D4を2サイクルの親和性成熟に付す。最初のサイクルでは、個々のCDRを他の全ての19アミノ酸に変異させる。以下の残基を標的にする：CDR1：G26−G35；CDR2：V51−N58；およびCDR3：H95−Y102（番号付与はKabatによる）。変異導入は、変異位置にNNSコドンを含む縮退オリゴヌクレオチドを用いるPCR系手法で実施する。PCR生成物を各CDRについてプールし、固有の制限部位を用いてABII42D4遺伝子鋳型に挿入する。pUC119から誘導した発現ベクターを用いて組換えタンパク質として個々の変異体を生成する。前記発現ベクターは、LacZプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびompAリーダー配列を含む（pAX100）。大腸菌TG1細胞をこの発現ベクターライブラリーで形質転換し、寒天プレート（LB＋Amp＋2%グルコース）にプレートする。寒天プレートから単一コロニーを採取し、1mLの96深ウェルプレートで増殖させる。VHH発現はIPTG（1mM）を添加することによって誘発する。ペリプラズム抽出物（約80μLの体積）は標準的方法にしたがって調製し、上記（実施例2）に記載したようにELISAおよびバイアコアオフ速度アッセイでA-ベータ(1-40)との結合についてスクリーニングする。6位での変異（S30、T57、L97、T100b、S100c、G100e）はわずかに（約2倍）改善されたオフ速度をもたらす。
【０１２４】
2回目のサイクルでは、サイクル1で同定した6つの感受性位置を同時にランダム化することによってコンビナトリアルライブラリーが作製される。この目的のために、前記ランダム化位置で縮退させたオリゴヌクレオチド（NNS）を用いてオーバーラップPCRを実施することによって完全長ABII42D4遺伝子を合成し、さらにレスキューPCRを実施する。ランダム化ABII42D4遺伝子をファージディスプレーベクター（pAX50）に挿入し、6x10E7の機能的ライブラリーサイズを生成する。ファージは標準的プロトコルにしたがって調製する。捕捉工程のためにストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Dynal）を用い、前記ファージライブラリーを（ビオチン化）モノマーA-ベータ(1-40)に対して3巡の溶液相選別に付す。1巡目の抗原濃度50nMから始めて各ラウンドで10倍ずつ抗原濃度を減少させる。結合ファージはトリプシン（1mg/mL）で30分間溶出させ、個々のVHHクローンのペリプラズム抽出物の調製のために産出ファージを大腸菌に感染させる。ELISAおよびバイアコアオフ速度アッセイ（実施例2）でのA-ベータ(1-40)との結合についてのスクリーニングによってオフ速度が10倍まで改善されたクローンが同定される。最良のABII42D4変種をC-末端c-mycタグおよび(His)6タグとインフレームの状態で、発現ベクターpAX100でクローニングする。VHHはHis6タグ付きタンパク質として大腸菌で増殖させ、固定金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）およびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって精製する。精製VHHの親和性は表面プラズモン共鳴（Biacore）により決定し、IC50値はABII42D4 TR-FRET競合アッセイ（実施例3.2）で決定する。
結合親和性のさらなる改善のために、変種ABIIPMP111B5を鋳型として用い、クローンABIIPMP111E4およびABIIPMP111B4で見出された多様な変異を1つずつ導入する。得られた変種を大腸菌で生産し、上記に記載したように性状を決定する。ABII111B5_M107R、ABII111B5_M107EおよびABII111B5_E109Qが最良の変種として同定され、IC50およびKDは両方とも本来のABII42D4より10倍以上改善されている。上記に記載した変種の配列情報および生物学的データは上記の表VIIに要約されている（一列目：42D4；2から9列目：親和性成熟の最初の2サイクルから得られた有用なクローン；10から18列目：さらに別の標的変異導入から得られた有用なクローン）。
【実施例５】
【０１２５】
実施例5：VHHのヒト化
抗A-ベータ VHH ABII111B5_M107R（= ABII002；配列番号：62）および抗A-ベータ VHH ABII60A10（= ABII050；配列番号：100）のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列のVH配列データベースに対してブラスト検索する。JH5と組み合わせたヒト生殖細胞系列VH3-23配列（DP47；配列番号：140）は両VHH配列に対して最高の配列同一性を示した。
配列DP-47/VH3-23：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK（配列番号：140）
配列JH5：
NWFDSWGQGTLVTVSS（配列番号：153）
ヒト化の目的のためにABII002およびABII050のそれぞれ17および10アミノ酸残基を置換し、各VHHの多数の種々の変種を作製した。全変種を、PCRオーバーラップ伸長法を用いてオリゴヌクレオチドからアッセンブリングし、発現ベクター（pAX100）でクローニングし、大腸菌で増殖させた。得られたABII002の変種（すなわちABII003から ABII037）および得られたABII0050の変種（すなわちABII051からABII061）についての配列情報および結合データは上記表VIIに要約されている（それぞれ列19から53および列55から最後の列65まで）。表XIIはさらに別にABII002からABII036およびABII050からABII060のヒト化の程度を列挙している。
【０１２６】
表XII：ABII002およびABII050のヒト化変種
2013520974.tif 000025
2013520974.tif 000026
【０１２７】
上記の表VIIおよびXIIに要約した生物学的データにしたがえば、そこに列挙したVHH変種のいずれも、少なくとも中間体として本発明のポリペプチドの構築に使用できる。特にヒトでの使用については、ヒト化VHH変種ABII003からABII037およびABII051からABII061は好ましいであろう。高度なヒト化を示すがそれらの結合特性を温存している、具体的に有用な変種は、原型クローン42D4に由来するABII035および原型クローン60A10に由来するABII059である。ABII035はA-ベータのN-末端と結合し、配列番号：14から16のCDR配列を含む。ABII059は中心部エピトープと結合し、配列番号：17から19のCDR配列を含む。
【実施例６】
【０１２８】
実施例6：ヒト化VHHと参照VHHとの比較
精製抗A-ベータ参照VHH（実施例3.2、表XI）を、C-末端ビオチン化モノマーA-ベータ(1-40)で被覆したSAセンサーチップとの結合（実施例について3に記載）について試験する。ABII035およびABII059は、それぞれ11および3nMの注入濃度で50を超えるRUレベルを示したが、VHH 1B、11G、8B、4D、3AおよびVHH31-1はいずれも、試験した条件下では1000nMの濃度でもセンサーチップと結合しない(＞10RU)。同じ実験で、参照VHH 2G6および2D2は、それぞれ1000および100nMの注入濃度で50を超えるRUレベルを示し、したがってABII035およびABII059より能力ははるかに低い。表面分解の徴候は実験中には検出されなかった。続いて、この参照VHHセットの結合もまた、以下の別個のペプチド形式を用いる多重ELISAセットアップ（実施例3に記載の検出）でのモノマーA-ベータとの結合について立証される（前記ペプチド形式は例えば以下の通り：捕捉A-ベータ(1-40)（C-またはN-末端ビオチン化）、直接固定のA-ベータ(1-40)およびA-ベータ(1-42)、GST-A-ベータ(1-42)またはA-ベータ(1-42)-GST（1μg/mLの濃度で捕捉）。参照VHH 1B、11G、8B、4D、3Aについては、モノマーA-ベータとの結合は検出されない。BAA ELISAでは、参照VHH 8Bだけが1000nMを超えるVHH濃度で凝集A-ベータとの結合を示す。2D2および2G6 VHHと比較して、ABII035およびABII059 VHHは50倍を超える高いEC50値を示す。結果は表XIIaに要約する。
【０１２９】
表XIIa：42D4および60A10由来VHHの結合特徴と参照抗A-ベータVHHの結合特徴との比較
2013520974.tif 000027
ND：実施せず；*：IC50は外挿曲線により計算
【実施例７】
【０１３０】
実施例7：抗ヒトA-ベータ VHHとげっ歯類A-ベータとの結合（ELISAおよびバイアコア）
上記で得たVHHとげっ歯類A-ベータとの結合をELISAで評価する。マウス（Bachem）またはヒトA-ベータ(1-40)（Anaspec）をマキシソーププレートに2μg/mLで被覆し、VHHとの結合、および比較のためにFabフラグメントとの結合をマウス抗myc抗体および抗マウスHRP複合体（DAKO）により検出する。EC50値を3D6のFabフラグメント、VHH ABII002およびVHH ABII035について決定する。結果は下記の表XIIIに列挙する（最低限2つの別個の実験の平均である）。
【０１３１】
表XIII：ヒトおよびマウスA-ベータとの結合についてのEC50
2013520974.tif 000028
【０１３２】
3D6 FabフラグメントはヒトA-ベータよりも有意に低く（26倍の相違）マウスA-ベータと結合する。ABII002およびABII035は、両A-ベータと等しく良好に結合し（それぞれ1.8および2.2倍の相違）、ABII002およびそのヒト化誘導体ABII035は、3D6によって認識されるエピトープとは別個のエピトープを認識することを示唆する。
VHHとマウスおよびヒトA-ベータとの結合を、チップに直接被覆した非ビオチン化エピトープを用いるバイアコアでさらに評価する。ヒトおよびげっ歯類A-ベータとの親和性における相違はヒト化前およびヒト化後のVHHについて検出されない。
【実施例８】
【０１３３】
実施例8：二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物の作製および性状決定
VHH ABII42D4（A-ベータペプチドのN-末端領域を認識する）およびVHH ABII60A10（中心部領域を認識）を可撓性グリシン‐セリンリンカー（例えば9GS：GGGGSGGGG、配列番号：141）を介して融合させ、二価VHH構築物を作製する。リンカーの長さおよび向きが異なる、以下の4つの二パラトープ性構築物（ABII42D4-25GS-ABII60A10、ABII60A10-25GS-ABII42D4、ABII42D4-35GS-ABII60A10およびABII60A10-35GS-ABII42D4（異なるエピトープ特異性を有する2つのVHHドメインを含む）をさらに詳細に調べ）、対応するVHHダイマー（2つの同一のVHHドメインを含む（例えば二価ABII42D4-9GS-ABII42D4構築物））と比較する。二パラトープ性およびダイマー性または二価VHHを大腸菌G1細胞で生成し、アフィニティクロマトグラフィー（IMACまたはプロテインA）およびサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス（Superdex）75またはセファクリル（Sephacryl）S100）を用いて精製し、SDS-PAGEで判定したとき純度95%以上を得た。
8.1 TR-FRET結合アッセイ：二パラトープ性VHH構築物とA-ベータ(1-40)との結合をABII42D4およびABII60A10 TR-FRETアッセイ（実施例3.2）を用いて判定する。二価ABII42D4-9GS-ABII42D4構築物はわずかに改善されたIC50を示すだけで（一価ABII42D4に対して3.2倍の改善）、一方、二パラトープ性VHHは、一価構築ブロック並びに3D6およびm266 Fabフラグメント（表XIV）さらには3D6およびm266 IgG（3D6 およびm266完全長モノクローナル抗体）よりも顕著に強く結合することが見出された。リンカーの長さおよび向きが異なる構築物間で能力の相違は見出されない。
【０１３４】
表XIV：ABII42D4およびABII60A10 TR-FRETアッセイにおける二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物と比較例のIC50
2013520974.tif 000029
【０１３５】
8.2結合様式の決定：二パラトープ性構築物の結合様式を調べるために、両VHH構築ブロックが同じペプチド分子に同時に結合できるか否かを判定する。サンドイッチELISAでは、タグ無しABII60A10またはhisタグABII42Dでマキシソーププレートを被覆し、A-ベータ(1-40)ペプチドとともにインキュベートする。続いて、得られたVHH‐ペプチド複合体を、N-末端または中心部A-ベータペプチドエピトープを認識するc-mycタグVHHとともにインキュベートする。以前（実施例2）に記載したようにc-mycによる検出を実施する。両設定について結合が認められ、N-末端または中心部エピトープを認識する2つのVHHは同時にA-ベータペプチドに結合できることを示唆した。
SPR系アッセイによる結合様式の決定：以前（実施例2）に記載したようにC-末端ビオチン化A-ベータ(1-40)をセンサーチップに固定する。ABII60A10を500nMの飽和濃度で注入し、A-ベータ(1-40)との結合を観察する。120秒後に、200nMのABII42D4および500nMのABII60A10を同時注入し、更なる結合がもたらされる。500nMの60A10のコントロール注入単独では更なる結合は全く発生せず、観察された更なる結合はABII42D4‐A-ベータ相互作用によることを物語っている。
【０１３６】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いる結合様式の決定：サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、カラムに充填されたゲルろ過媒体を分子が通過するときにサイズの相違にしたがって分子を分離する。二パラトープ性VHH構築物とそれらの標的との結合様式は、1：2のモル比の対応するVHH構築物および標的タンパク質をインキュベートした後で、タンパク複合体を解析することによって確認することができる。したがって、混合物をSECによって分離し、得られたピークの内容物をタンパク質ゲル電気泳動によって解析する。A-ベータ(1-28)-p38融合タンパク質（計算分子量46kDaを有する）をモノマーとしてSECで泳動させる。ヒト血清アルブミンと融合させた二パラトープ性VHH（60A10-27GS-42D4-Alb）は計算分子量95kDaを有する。二パラトープ性VHHが1つ（＝分子内結合）または2つの（＝分子間結合）A-ベータ(1-28)-p38融合タンパク質と結合するかどうかを確認するために、1：2のモル比のVHHおよび標的タンパク質を混合し、4℃で一晩インキュベートし、調製用サイズ排除カラム（HiLoad 26/60 Superdex 200調製用グレード、GE Healthcare，USA）とAKTAエクスプローラー（AKTAexplorer，GE Healthcare，USA）を組み合わせて用いるSECに適用し、単独タンパク質からタンパク複合体を分離する。ゲルろ過は2つのピークを生じ、これらピークをさらに、自動化電気泳動ステーションエクスペリオン（Experion，Bio-Rad，USA）および適切なチップ（Pro260 Chip，Bio-Rad，USA）を用いるSDS-PAGEによって解析する。エクスペリオンでの解析は、主要ピークはVHHおよびA-ベータ(1-28)-p38融合タンパク質を含むが、より小さいピークはA-ベータ(1-28)-p38融合タンパク質のみを含むことを明らかにした。複合体中のVHHおよびA-ベータ(1-28)-p38融合タンパク質の量を、エクスペリオンデータ解析ソフトウェアを用いて決定する。エクスペリオンで測定されるタンパク質の分子量は、A-ベータ(1-28)-p38融合タンパク質については53kDaおよび60A10-27GS-42D4-Albタンパク質については101kDaである。測定濃度、したがって計算モル濃度は、A-beta(1-28)-p38融合タンパク質および60A10-27GS-42D4-Albタンパク質についてそれぞれ0.87μMおよび0.86μMである。したがって、解析タンパク複合体中のA-beta(1-28)-p38対60A10-27GS-42D4-Albの比率は約1：1であるが、ただし前記は1：2のモル比で混合されている。この結果から、1つの二パラトープ性VHHは、1つのおよび同じA-ベータ分子内でA-ベータペプチド分子の2つのエピトープと結合し、したがって二価VHH構築物によりA-ベータ分子を架橋することにより作用するわけではない（少なくとももっぱら作用するわけではない）と結論することができる。
【０１３７】
8.3結晶化実験：結晶化のために、ABII035およびABII059（各々160μM）を3倍モル過剰のヒトA-ベータペプチド（残基1−24）とともに16時間インキュベートし、複合体をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。透析ろ過により前記複合体を4mg/mLの濃度に濃縮する。結晶化試験は、200nLのタンパク質を貯留槽体積100μLに対し200nLの貯留液と混合することによって静置液滴気化拡散（sitting drop vapour diffusion）実験として設定される。結晶は、種々の多様な条件下で数日後に出現する。これらの条件のうちで以下を用いて構造を決定する：100mM MMT緩衝液（pH5）、25% PEG1500。結晶を凍結保護剤（85mM MMT緩衝液（pH5）、35% PEG1500）で処理し、液体窒素で瞬間凍結する。データは、スイス光源（Paul-Scherrer Institute，Villigen，Switzerland）の6SAビームラインで収集する。
結晶構造では、ABII035、ABII059およびヒトA-ベータペプチド（残基1−24）から誘導されたペプチドの1つの分子が三元複合体を形成する。この複合体は、A-ベータペプチドの2つの分子によって形成されるアンチパラレルなベータシートによりダイマーを形成する。結晶の不整ユニットはこれらの構造の2つによって占められ、前記ユニットは合計して、各A-ベータペプチド、ABII035およびABII059で構成される分子4つ分である。A-ベータの残基1から9はアルファヘリックスコンフォーメーションを採り、残基10から20はベータ鎖を形成する。A-ベータの残基1から14はABII035に近接し、前記のうちAsp1、Ala2、Glu3、Phe4、Asp7およびHis14は直接ABII035と接触する。A-ベータの残基15から24はABII059と近接し、前記のうちGln15、Lys16、Val18、Phe19、Phe20、Glu22およびAsp23は直接ABII059と接触する。
上記に加えて、ABII035およびABII059はA-ベータの1つの同じ分子と同時に結合できることが結晶構造から明瞭になり、上記の実施例8.2で得られた結果が確認できる。
さらにまた、上記結晶構造データによって立証される、ABII035とA-ベータ誘導ペプチドとの相互作用の態様は、上記実施例7に記載した観察（ABII035はげっ歯類A-ベータペプチドに関して良好な種間交差反応性を示す）と一致する。ヒトとげっ歯類のA-ベータとの間の配列相違はR5G、Y10FおよびH13Rだけである。上記データにしたがえば、これら残基のいずれもVHHと接触しない。したがって、げっ歯類のA-ベータは、ヒトA-ベータと同じコンフォーメーションでABII035と結合すると推定され、このことは、前記を例えばマウスまたはラットのようなげっ歯類動物モデル（げっ歯類A-ベータペプチドを生成する）を必要とするアッセイのためのツール試薬として（研究ツールとして）特に有用なものにする。
【実施例９】
【０１３８】
実施例9：半減期延長ヒト化二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物の作製および性状決定
9.1構築物ABII314からABII323の作製：ヒト化二パラトープ性VHH構築物に関するin vivo立証実験のために、以下の異なる半減期延長（HLE）方法を調べる：1）アルブミン結合VHHとの遺伝的融合（例えばWO2004/041865に記載）、2）VHH間リンカーまたはVHHのC-末端に位置するCys残基のPEG化（WO2008/142164）および3）ヒトまたはマウス血清アルブミンとの遺伝的融合。種々のHLE方法を、ABII035およびABII059 VHHドメイン／構築ブロックを含む二パラトープ性VHH構築物を用い調べる。適切なオーバーラップオリゴヌクレオチドセットを用い遺伝子アッセンブリーにより構築物ABII314からABII323を作製する。ABII314からABII323の配列番号およびアミノ酸配列は表XVに列挙されている。構築物ABII314、ABII315、ABII322およびABII323で、構築ブロックABII059を種々の長さ（表XVに表示）のGly-SerリンカーによりABII035と融合させる（前記リンカーはPEGとの複合体形成のためのシステイン残基を（表XVに表示した位置に）含む）。構築物ABII316からABII321は、遺伝的に連結されたVHH ABII035、ABII059およびALB8（マウスアルブミンと交差反応性を有するヒト化抗ヒトアルブミンVHH）から成り、前記は異なる向きを有しさらに9-GSまたは35-GSリンカーによって分離されている。下記表XVに示す構築物は場合によってさらに6-ヒスチジンタグおよび／または他のタグ（例えば得られたポリペプチドの精製促進のためのタグ）を追加で含むことができる。
【０１３９】
表XV：二パラトープ性VHH構築物ABII314からABII323
2013520974.tif 000030
2013520974.tif 000031
2013520974.tif 000032
2013520974.tif 000033
【０１４０】
9.2ヒト化半減期延長二パラトープ性VHH構築物の製造、精製およびPEG化：His6-タグ付き二パラトープ性VHH構築物ABII314、ABII315、ABII322およびABII323を、アフィニティクロマトグラフィー（IMACまたはプロテインA）、陽イオン交換クロマトグラフィー（SPセファロース、ソース30SまたはPOROS 50HS）およびサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス75またはセファクリルS100）により精製する。、PEG化は、最低限90%（SDS-PAGEおよびその後のクーマシーブリリアントブルー染色により決定）のタンパク質純度レベルで実施する。まず初めにDL-ジチオスレイトール溶液（DTT）を最終濃度10mMで添加し、続いて室温で2から3時間または4℃で一晩インキュベートすることによって、VHHの分子間S‐S結合を還元する。その後、D-PBS泳動緩衝液中でのサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス75/200）により還元剤を除去し、主要ピークを収集する。還元剤の除去後ただちに、二パラトープ性ポリペプチド構築物を5倍のモル過剰のPEGとともに室温で1時間または4℃で一晩インキュベートする。PEG化ポリペプチドを遊離PEGおよび非PEG化ポリペプチドから陽イオン交換クロマトグラフィー（MacroCap SP）により分離する。最終仕上げ工程およびD-PBSへの緩衝液交換は、スーパーデックス200またはセファクリルS200での調製用サイズ排除クロマトグラフィーにより実施する。精製PEG化ポリペプチドの品質は、SDS-PAGとそれに続くCBB-およびPEG染色（以前にNatarajanら（Natarajan et al (1995)，Bioconjugate chemistry 16:113-121）が記載）により実証する。
9.3半減期延長ヒト化二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物のTR-FRETによる性状決定：上記に記載した半減期延長二パラトープ性VHH構築物の結合特性をモノクローナル抗体（IgG）3D6およびm266の結合特性と比較するために、ABII315からABII320、ABII322およびABII323をABII002およびABII050競合TR-FRETアッセイで試験する（実施例8.1および3.2を参照されたい）。少なくとも2つの別個の実験に由来する平均IC50は表XVIに要約されている。
【０１４１】
表XVI：アルブミン非存在下／存在下における半減期延長抗A-ベータ二パラトープ性VHHのIC50値
2013520974.tif 000034
NC：競合は検出されない
MSA：マウス血清アルブミン
MSA_D3：マウス血清アルブミンのドメインIII
ABII002 TR-FRET競合アッセイでは、試験した全ての半減期延長VHH構築物が、3D6 IgG（IC50は1.9nM）と比較して6.5倍から14.6倍（ABII315-PEG20）の大きく改善された能力を示す。IgG m266と比較したとき、全てのVHH構築物がABII050 TR-FRET競合アッセイで顕著に良好なIC50値を示し、VHH ABII320がもっとも低いIC50（0.21nM、IgG266より2.5倍の改善）を示す。
【０１４２】
一価VHH ABII035と比較して、もっとも高い能力を有する、誂えVHH構築物（ABII315-PEG20）は、ABII002 TR-FRET競合アッセイで27倍の改善されたIC50を示す。VHH構築物ABII320は、ABII050 TR-FRET競合アッセイで一価のABII059より61倍改善された能力を示す。
モノマー構築ブロックABII035およびABII059を凌ぐ二パラトープ性構築物の向上能力は、非ヒト化非成熟構築物により得られた結果（実施例8.1）を確認し、1つの二パラトープ性VHH構築物と1つのA-ベータペプチドとが分子内結合するという仮説（上記実施例8.2参照）を支持する。さらにまた、これらの実験は、上記に記載したVHH構築物に適用した半減期延長技術は構築物とA-ベータペプチドとの結合に干渉しないことを示している。
ALB8-含有VHH構築物とA-ベータペプチドとの結合がHSA（血流中に存在する）によって影響を受けるか否かを判定するために、ABII316-ABII320と等価であるが非ヒト化VHH構築ブロックを含む二パラトープ性構築物を、両方の競合TR-FRETアッセイにおいてμM量のアルブミンの存在下および非存在下で試験する。両アッセイ形式で、6.5−10μMのヒト、イヌまたはウシアルブミンによる予備インキュベーションはTR-FRETアッセイでの能力に影響を及ぼさない（後者の2アルブミン変種は検出可能なALB8相互作用を示さない）。
ALB8が二パラトープ性VHH構築物の環境においてなおアルブミンと結合できるか否かを試験するために、HSA被覆チップとの結合についてVHH構築物のカイネティクス解析を実施する（Biacore）。試験した一価ALB8およびALB8融合構築物について類似する親和性が測定され、ALB8構築ブロックのHAS-結合は影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１４３】
9.4 A-ベータ原線維形成の阻害：更なる実験では、二パラトープ性VHH構築物ABII320の連続希釈を、実施例3.5で述べたA-ベータ原線維形成をin vitroで阻害するその能力について評価し、さらにその一価構築ブロックABII035およびABII059並びにコントロール抗体の活性と比較する。試験したVHH構築物の最高濃度（26μM）での最大阻害を2つの別個の実験の平均として計算する。非関連（A-ベータ非特異的）VHHをコントロールとして用いたとき、約17%の定常的なバックグラウンド阻害が検出され、一方、一価3D6およびm266 Fabフラグメントは、最大阻害が82%の再現性のある用量依存性阻害を示す。（完全な）IgG 3D6およびm266はそれぞれ75%および83%の阻害をもたらす。一価VHH ABII035およびABII059はそれぞれ54%および80%の最大阻害を示し、一方、半減期延長二パラトープ性VHH構築物ABII320は26μMで最大阻害能力84%を示す。
【０１４４】
9.5可溶性APP-アルファとの結合：可溶性APP-アルファ（sAPPアルファ）は、アルファ-セクレターゼ活性によってその細胞結合前駆体タンパク質APPから遊離する。sAPPアルファのアミノ酸配列はA-ベータペプチドの最初の16アミノ酸残基を含むが、正確な3D6エピトープは含まない（なぜならば、A-ベータペプチドの遊離N-末端アミノ酸残基が完全な3D6相互作用に必須だからである）。エピトープマッピングは、N-末端領域特異的VHH ABII001およびその誘導体は、モノクローナル抗体3D6と比較して全く異なるエピトープと相互作用することを示す。A-ベータと比較してsAPPアルファとVHH-結合をTR-FRET系アッセイ設定を用いて試験する。最終濃度0.82nMのビオチン化sAPPアルファ（Sigma）を同じ濃度のストレプトアビジン-ユーロピウム標識ビーズおよび4.4nMのAlexaFluor647-標識ABII320と混合する。以下の非標識化合物を競合について試験する：ABII320、sAPPアルファ、IgG m266、IgG 3D6、ABII035およびA-beta(1-40)。競合化合物の連続希釈を用いて2つの別個の実験を実施する。平均IC50は、非標識ABII320、ABII035、A-ベータ(1-40)およびsAPPアルファについてそれぞれ0.72nM、25.6nM、0.23nMおよび14 nMである。期待したように、競合はIgG m266およびIgG 3D6については認められない。このアッセイ設定では、ABII320はsAPPアルファとの相互作用よりも63倍良好にA-ベータ(1-40)と相互作用する。ビオチン化sAPPアルファの代わりにビオチン化. A-ベータ(1-40)を用いるパラレル設定では、ABII320は、sAPPアルファの場合よりも少なくとも20000倍良好にA-ベータ(1-40)と相互反応し（より高濃度での外挿データにより概算したIC50）、ABII320はsAPPアルファよりもA-ベータ(1-40)との結合を好むことを示唆する。
【０１４５】
9.6二パラトープ性VHH構築物のエピトープマッピング：ペプチドマイクロアレイ（PepStarTM）として提示されるA-ベータ(1-42)誘導ペプチドを用いてVHHのエピトープを決定する。PepStarTMペプチドマイクロアレイ（JPT Peptide Technologies，Germany）は、ガラススライドに提示された抗体/VHHペプチド相互作用の迅速スクリーニング用の特注ペプチドマイクロアレイセットである。マイクロアレイのペプチドは、A-ベータ(1-42)のN-末端を介して固定したA-ベータ(1-42)の一次構造から誘導した12/11スキャンを表す。さらにまた、A-ベータ(1-42)の最初の16から最初の7アミノ酸を表すN-末端の切端ペプチドがそれらのC-末端を介して固定されている。VHHとのインキュベーション時に、VHHに対抗する標識二次抗体の蛍光強度を読み取ることによって結合事象を検出できる。
マイクロアレイをブロッキング緩衝液（PBS、1% BSA、0.1% Tween 20）により4℃で一晩ブロッキングした後、前記を洗浄緩衝液（(PBS、5 mM DTT、0.05% トリトン（Triton）X-100、5%グリセロール、1% BSA）中の5μg/mLの濃度の二パラトープ性VHH構築物ABII320（200μL）とともにインキュベートする。過剰のVHHを除去するために、マイクロアレイを洗浄緩衝液とともに氷上で3回2分間インキュベートする。その後、このマイクロアレイを洗浄緩衝液中の抗VHH AlexaFluor647（Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co KG，Germany）（濃度0.5μg/mL）とともに4℃で1時間インキュベートする。前記抗VHHは、VHHダイマーG6-G6で免疫した後ヤギ血清から誘導される。マイクロアレイを洗浄緩衝液とともに氷上で3回2分間インキュベートすることによって、未結合の二次抗体を除去する。最後に800ｘgで3分間遠心分離してスライドを乾燥させ、633nmのレーザーを用いプロスキャナレイ（ProScanArray，Perkin Elmer）でスキャンする。データはScanArray Express(商標)ソフトウェア（Perkin Elmer）を用いて解析する。
結果として、直径420μmを有するペプチドスポットが得られ、前記を蛍光強度について解析し、それによってVHHとペプチドとの相互作用を半定量的態様で評価することができる。したがって、二パラトープ性VHH構築物ABII320とペプチドマイクロアレイとのインキュベーションは、ABII320がA-ベータペプチドの残基1‐11および15−24と相互作用することを明示する。アラニンスキャンは、A-ベータペプチドの残基Asp1、Glu3、Phe19、Phe20およびAsp23が二パラトープ性VHHの結合に必須であることを示し、このことは結晶構造解析から得られたデータと一致する。同じ結果が2つの他の二パラトープ性VHH構築物（ABII035およびABII059 VHHドメインを含む）を用いて得られる。
【０１４６】
9.7動力学的排除アッセイ（KinExA）を用いる結合定数の決定：A-ベータペプチドに対する3つの二パラトープ性VHH構築物の親和性を、KinExA（動力学的排除アッセイ）を用いて決定する。KinExAは、溶液相で未改変分子を測定する能力をもつ技術である（Darling，R.J. and Brault，P.-A.: Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions; Assay and Drug Development Technologies 2(6):647，2004）。KinExA方法は、VHH、抗原およびVHH-抗原複合体の混合物中で複合体を形成していないVHH分子の濃度を測定する。複合体非形成VHHは溶液相混合物を固相固定抗原に極めて短時間曝露することによって測定される。溶液相混合物と固相固定抗原との間の“接触時間”は、VHH-抗原複合体の解離が些少であるように十分に短い時間維持される。VHH-抗原複合体の有意な解離の可能性が動力学的に排除されるとき、複合体非形成（“遊離”）VHHのみが固相と結合できる。固相と結合する遊離VHHの量（二次標識の蛍光放出によって測定される）は、溶液相サンプル中の遊離VHHの濃度と正比例する。
A-ベータ(1-28)ペプチド（Anaspec，USA）が二パラトープ性VHHとのインキュベーション用抗原として用いられる。融合タンパク質“His.Xa.Aベータ1-28.GS.p38”を用いて、複合体非形成VHHと結合する固相を調製する。融合タンパク質の構造は、His-タグ、Xa因子切断部位、A-ベータ(1-28)ペプチド、GS-リンカー、ネズミp38であり、以下の配列を有する：
MHHHHHHIEGRDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGGSGGSQERPTFYRQELNKTIWEVPERYQNLSPVGSGAYGSVCAAFDTKTGHRVAVKKLSRPFQSIIHAKRTYRELRLLKHMKHENVIGLLDVFTPARSLEEFNDVYLVTHLMGADLNNIVKCQKLTDDHVQFLIYQILRGLKYIHSADIIHRDLKPSNLAVNEDCELKILDFGLARHTDDEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIMAELLTGRTLFPGTDHIDQLKLILRLVGTPGAELLKKISSESARNYIQSLAQMPKMNFANVFIGANPLAVDLLEKMLVLDSDKRITAAQALAHAYFAQYHDPDDEPVADPYDQSFESRDLLIDEWKSLTYDEVISFVPPPLDQEEMES（配列番号:144）
【０１４７】
融合タンパク質は大腸菌で発現させ、Ni-NTA（Qiagen，Germany）で精製し、さらにヨードアセトアミド（Sigma，USA）でアルキル化する。ポリメチルメタクリレートビーズ（Sapidyne Instruments Inc.，USA）を0.02%のNaN3を含むPBS中の前記融合タンパク質で被覆し、同じ緩衝液中の1% BSAでブロッキングし、前記を全ての実験で固相として用いる。KinExA実験は、KinExA3000およびKinExA Proソフトウェア（Sapidyne Instruments Inc.，USA）を用い室温（約21℃）で実施する。0.02%のNaN3を含むPBSを泳動緩衝液として用いる。全実験について、定常的VHH濃度を有する、0.1% BSAおよび0.02%のNaN3を含むPBSで抗原を連続希釈する。抗原およびVHHの混合物を測定前に室温で24時間インキュベートする。サンプルおよび標識抗体の流速は全実験について0.25mL/分である。
ABII320 VHH構築物（第一のVHH構築物）の測定のための二次蛍光標識抗体は、上記9.6に記載したAlexa647複合体化ヤギ抗G6G6（抗VHH）抗体である。前記抗体を500μLの体積および0.1% BSAおよび0.02%のNaN3を含むPBS中の0.5μg/mLの濃度で用いる。ABII320はさらに別に、記載したように組換えヒトアルブミン（albcultTM，novozymes，USA）の存在下でも測定する。PEG化ABII320 VHH構築物（第二のVHH構築物）の固相への結合は、0.1% BSAおよび0.02%のNaN3を含むPBS中で0.1μg/mLの濃度のウサギ抗PEG（Epitomics Inc.，USA）（500μL）を装置のライン13で、同じ緩衝液中で0.25μg/mLの濃度のAlexa647複合体化ヤギ抗ウサギ抗体（Molecular Probes Inc.，USA）（250μL）と組み合わせて用いて決定する。上記表IVに示すHAS-二パラトープ性VHH構築物融合タンパク質（配列番号：32、第三のVHH構築物）の固相への結合は、0.1% BSAおよび0.02%のNaN3を含むPBS中で0.5μg/mLの濃度のヤギ抗HSA（Bethyl Laboratories Inc.，USA）（500μL）を装置のライン13で、同じ緩衝液中で0.5μg/mLの濃度のAlexa647複合体化ウサギ抗ヤギ抗体（Molecular Probes Inc.，USA）（500μL）と組み合わせて用いて決定する。
平衡力価測定データは、KinExA Proソフトウェアバージョン1.0.3（Sapidyne Instruments Inc.，USA）を用い1：1結合モデルに適合させる。第一のVHH構築物（二パラトープ性VHH ABII320）は3、5および10pMの濃度で測定される。サンプル体積は各々5mLである。測定KDは、1.1±0.3pMおよび1%の組換えヒトアルブミンの存在下では0.4±0.1pMである。第二のVHH構築物（二パラトープ性PEG化VHH ABII322）は3、4、5および6pMの濃度で測定される。サンプル体積は各々11mLである。測定KDは0.6±0.2pMである。第三のVHH構築物（HSA-VHH融合タンパク質）は2、3および4pMの濃度で測定される。サンプル体積は各々5mLである。測定KDは0.5±0.3pMである。
【０１４８】
9.8ピログルタミル-Aベータとの結合：ピログルタミル(pGlu)-A-ベータはアルツハイマー病の神経炎斑の主要成分である。前記は、グルタミニルシクラーゼ（QC）によって触媒される3位でのN-末端グルタメートの環化によって形成され、A-ベータの極めてアミロイド原性変種を生じる。pGlu-A-ベータのアミノ酸配列はA-ベータペプチドのアミノ酸残基3−42を含む。最初の2つのN-末端アミノ酸（抗体3D6との完全な相互反応に必須である）は失われている。pGlu-A-ベータ-ABII320/ABII322/m266/3D6相互反応に対する親和性が、上記（実施例2）に記載したようにストレプトアビジンセンサーチップに捕捉したC-末端ビオチン化pGlu-A-ベータ(1-28)を用い、表面プラズモン共鳴（Biacore）により決定される。精製ポリペプチドABII320もしくはABII322または抗体m266もしくは3D6を9種の異なる濃度（ABII320については0.195および50nM、ABII322については0.39−100nM並びに3D6およびm266については0.782−200nM）で3分間注入し、10分間解離させる。結合解離曲線は1：1相互反応モデルを用いて適合させ、正確なKD値を決定できる。親和性は、ABII320については2nM、 ABII322ついては1nM、抗体m266については224pMであることが分かる。
【実施例１０】
【０１４９】
実施例10：抗A-ベータVHHとアミロイド斑との結合
VHHのプロファイルを、Tg2576マウス脳スライスのアミロイド斑との結合能力にしたがって組織アミロイド斑免疫反応性（TAPIR）アッセイで明らかにする。TAPIRアッセイは、VHHの定性的評価（中心部濃密および／またはびまん性アミロイド斑）だけでなく定量的評価（最少有効用量決定）も可能にする。本アッセイのために、斑陽性マウスのクリオスタットによる冠切片を調製し、76x26 mmのスーパーフロスト（Superfrost）スライド（Roth）にマウントし、-20℃で保存する。凍結切片を20分間溶解させ、3%パラホルムアルデヒド（PFA）で氷上にて10分間固定する。続いて切片を0.3%の過酸化水素中で30分間インキュベートし、2.5%ウシ血清アルブミン（BSA）および2%マウス血清を含むPBSで1.5時間ブロッキングし、さらに2.5%BSA含有PBSに溶解させた種々の濃度（3.0mg/mLから4.11ng/mL）のmycタグ付きVHHまたはFabとともにインキュベートする。続いて、前記スライスを2.5%BSA含有PBSに溶解した10mg/mLのビオチン化マウス抗c-mycモノクローナル抗体（9E10）と1.5時間インキュベートする（ただしビオチン化ABII320とインキュベートしたスライスは除く）。これらの切片をベクタステイン（Vectastain）ABC ELITEキット溶液（Vector Laboratories）（製造業者の指示に従って調製）とともに1.5時間インキュベートし、ベクターVIP SK4600溶液（Vector Laboratories）（前記もまた製造業者の指示に従って調製）を用いて可視化する。切片を60%、80%、および100%エタノール並びに100%イソプロパノールで5分間インキュベートすることによって漸進的に脱水し、さらに5分間キシレン中で透明化する。続いて切片をエンテラン（Entellan）新マウントメジウム（Merck）によりマウントし、24x50mmのカバースリップ（Menzel-Glaeser）で覆う。結果は下記の表に要約される。
上記に記載したABII320およびモノクローナル抗体m266のFabフラグメントに加えて、いくつかの他の（myc-タグ付き）二パラトープ性VHH構築物を上記TAPIRアッセイで解析した。VHH構築物ABII300からABII305の構造は下記表XVIIに示され、全ての事例で、VHHドメインABII002（配列番号：62）およびABII050（配列番号：100）を異なる順序で含み、さらにアルブミン結合VHHドメイン（ABII300からABII304）またはPEG40成分（ABII305）のどちらかが組み合わされている。
これらの結果から、TAPIRアッセイでは、二パラトープ性VHH ABII300、ABII301、ABII302、ABII303およびABII304は、ABII305-PEG40と同様に組織アミロイド斑（中心部濃密およびびまん性型斑）に対して全く同じ親和性を示すと認めることができる。リンカーの特定の順序またはPEG40との複合体形成は斑への親和性に対して有意な影響をもつようには思われない。
【０１５０】
表XVII：二パラトープ性VHH構築物ABII300から305の構造およびTAPIRアッセイで得られた結果
2013520974.tif 000035
【実施例１１】
【０１５１】
実施例11：半減期延長二パラトープ性抗A-ベータVHH構築物の薬力学
VHHの薬物速度論的および薬力学的特性を決定するために、サンプルをAPPトランスジェニックマウスに静脈内または筋肉内注射する。伏在静脈採血により血漿サンプルを採取する。プレドースサンプルはVHH、IgGまたはビヒクル適用前並びに4時間および24時間後に採取する。
VHHおよびIgGの結合がELISAでの検出に干渉するので、血漿A-ベータ(1-40)の全量を検出するためにA-ベータ：VHHまたはA-ベータ：IgG複合体をアッセイ前に変性させる。簡単に記せば、サンプルを6MのGuHCl（Sigma Aldrich）で変性させ、固相の抽出カラムで精製する。60mgオアシス（Oasis）HLB96-ウェルプレート（Waters）を、家庭用真空乾燥機に連結させた抽出プレート多岐管（Waters）にセットする。カラムを1mLのメタノール（MeOH）、続いて1mLのH2Oで活性化する。GuHCl-抽出サンプルをロードし、1mLの5および30%のMeOHで連続して洗浄し、続いて90%MeOH中の2%NH4OHでA-ベータを溶出させる。溶出サンプルを収集し、1400rpm、60℃、90分真空遠心分離する（Eppendorf Vacufuge）。いったんサンプルが完全に乾燥したら、それらをブロッキング緩衝液で再構成し、解析まで-20℃で保存する。A-ベータ(1-40)の総血漿レベルを製造業者の指示にしたがいサンドイッチELISA（4G8/抗-A-beta(1-40)、mesoscale discoveries）により決定する。
APPトランスジェニックマウスのプレドース総A-ベータ(1-40)レベルは血漿中で約1.25nMである。15 nmol/kgの二パラトープ性VHHまたはIgG（同じ用量、結合部位について標準化）を注射したこれらのマウスでは、血漿中の総A-ベータレベルは静脈内適用後4時間頃にピークを示した。データは‘プレドースを超える増加倍数’として表され、この表示では注射後4時間および24時間に測定されたA-ベータ(1-40)血漿濃度をプレドースレベルで割っている。結果は表XVIIIに示されている。
【０１５２】
表XVIII：抗A-ベータ抗体3D6およびm266と比較した、抗A-ベータVHHの静脈内注射後の血漿A-ベータ(1-40)の増加倍数およびAUD
2013520974.tif 000036
*15nmol/kg：結合部位について算出（2ヶ所/IgG分子）
【０１５３】
したがって、当業界で公知のIgG分子と比較して、二パラトープ性VHH構築物は、総血漿A-ベータについて50%高いピークレベルおよび2倍を超えるAUD値の増加を示す潜在能力を有し、A-ベータ捕捉においてこれらVHH構築物はIgGよりも優れていることを示唆している。
遊離／未結合血漿A-ベータのレベルがVHH構築物の投与に続いて減少することを確認するために、競合ELISAを開発する。簡単に記せば、A-ベータ(1-40)をECL-ELISAプレート（Mesoscale Discoveries）に結合させたA-ベータ(1-40)特異的抗体により捕捉する。受動免疫療法で動物を処置するために用いられるVHHまたはIgG分子にMSD Sulfo-Tag NHS-Ester（Mesoscale Discoveries）を製造業者のマニュアルにしたがって用いてタグを付加し、このサンドイッチELISA形式での検出ツールとして用いる。VHHまたはIgGと結合するA-ベータ(1-40)はこれらの設定では検出できず、一方、遊離／未結合A-ベータ(1-40)は検出できる。異なるアッセイから得られたデータを比較するために、全ての値をビヒクル処置グループのデータに対して標準化する。APPトランスジェニックマウスを表示したようにVHHまたはIgGで処置し、血漿を収集し、遊離／未結合A-ベータ(1-40)について解析する。132 nmol/kgの抗A-ベータ VHH（それぞれABII320およびABII322）の腹腔内注射後2時間で、遊離／未結合A-ベータ(1-40)のレベルは大きくおよび極めて有意に基準レベル（約2nM）から2pMの検出限界以下へ減少した。等価用量の3D6-IgG（10mg/kg、132nmol/kg結合部位＝66nmol/kg IgG）は、血漿中の未結合A-ベータ(1-40)を52pMのレベルに減少することができただけである（図1）。この比較では、二パラトープ性VHH構築物ABII320およびABII322は、3D6 IgGと比較して同じ用量で、予想を超える血漿中の遊離／未結合A-ベータの大きな減少を示し、これもまた前記がIgG（3D6）よりもA-ベータ捕捉に優れていることを示している。このことは、VHHの治療的有効性に関してそのようなVHHを特に有用ならしめる。特に、血漿A-ベータのより効率的な枯渇は、血漿から脳へのA-ベータの輸入を完全に阻止し、それによって脳および血漿A-ベータプール間のより急激な濃度勾配が生じ、それによって脳から血漿へのA-ベータの流出が加速すると期待される。
【実施例１２】
【０１５４】
実施例12：BBB通過VHH
VHH構築物の血液脳関門（BBB）通過特性をさらに改善するために、二パラトープ性VHHおよびBBB通過VHH、FC44およびFC5を含む二特異性VHHを構築する（WO2002/057445に詳細に記載されている）。これらのVHHは、BBB上に発現された標的タンパク質と結合し、その後VHHは内皮細胞の細胞質を貫通し脳実質内に放出されることによってBBB通過性を改善する。したがって、FC44およびFC5 VHHに遺伝的に融合されたVHHは脳への活発な輸送を受け、より高い脳レベルをもたらし治療効果を改善すると期待される。構築物ABII400−ABII407（FC44またはFC5 VHHを含む）は、オーバーラップするオリゴヌクレオチドの適切なセットを用いて遺伝的アッセンブリーによって作製する。配列番号およびアミノ酸配列は下記の表XIXに列挙される。要約すれば、ABII035とABII059 VHH構築ブロックとの間、またはHSA結合VHHとABII035またはABII059構築ブロックとの間、または分子のアミノ末端もしくはカルボキシ末端にFC5またはFC44 VHHを含むVHHが作製される（表XIX参照）。VHHは大腸菌またはピキア・パストリスで発現され、実施例9.2の記載にしたがって精製される。精製VHHはin vitro BBB通過アッセイ（WO2002/057445およびその中のさらに別の参考文献に記載）で評価される。さらにまた、FC5およびFC44構築ブロックを含む放射性標識または非放射性標識VHHをin vivo投与し、液体シンチレーション計測またはELISAを用いて脳内レベルを決定する。
【０１５５】
表XIX：さらに別にFC5およびFC44成分を含む二パラトープ性A-ベータVHH構築物
2013520974.tif 000037
2013520974.tif 000038
2013520974.tif 000039
2013520974.tif 000040
【実施例１３】
【０１５６】
実施例13：本発明のPEG化二パラトープ性ポリペプチドの工業的製造プロセス
13.1発酵：ポリペプチドABII305、ABII306、ABII314、ABII315、ABII322およびABII323のいずれかを、種々の大腸菌株、例えばW3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294の細胞質で誘導性プロモーターの制御下で発現させることができる。このプロモーターはlacUV5、tac、T7、trp、T5、araBから選択できる。培養液は、Wilmsら（2001）（Wilms，B.，Hauck，A.，Reuss，M.，Syldatk，C.，Mattes，R.，Siemann，M.，and Altenbuchner，J. : High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering，73: 95-103，2001）、DeLisaら（1999）（DeLisa，M. P.，Li，J. C.，Rao，G.，Weigand，W. A.，and Bentley，W. E.: Monitoring GFP-operon fusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering，65: 54‐64，1999）または等価の文献にしたがって好ましくは完全に規定されている。しかしながら、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン）、または複雑な培地成分（例えば大豆ペプトンまたは酵母抽出物）による培地の補充は有益であり得る。発酵プロセスはバッチ式供給態様で実施される。条件：温度は30−40℃、pHは6−7.5、溶解酸素は20%より高く維持する。最初のC供給源の消費後、上記に記載の（または等価の）フィード培地を供給する。ファーメンター内の乾燥細胞質量が40から90g/Lに達したら、使用プロモーター系に対応する適切な誘導物質（例えばIPTG、ラクトース、アラビノース）で培養を誘導する。誘導はパルス的な完全誘発としてまたは部分的誘発として（対応する誘導物質を長時間にわたってファーメンターに供給することによる）実施できる。生産相は少なくとも4時間持続するはずである。細胞は、ボール遠心分離機、管状ボール遠心分離機またはディスクスタック遠心分離機での遠心分離によって回収され、培養上清は廃棄する。
【０１５７】
13.2精製：大腸菌細胞塊を6から8倍量の溶解緩衝液（リン酸緩衝液またはトリス緩衝液、pH7−8.5）に再懸濁する。細胞溶解は、好ましくは高圧均質化とそれに続くボール、管状ボールまたはディスクスタック遠心分離機の遠心分離による細胞屑の除去によって実施される。標的タンパク質を含む上清は、場合によって0.22−10μmフィルターを用いてろ過し、陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばトーヨーパール（Toyopearl）MegaCap(商標) II SP-550EC、トーヨーパールGigaCap S-650M、SPセファロースBB、SPセファロースFFまたはS HyperCelTM）によりpH7−8.5で分離する。溶出は、NaCl連続増加グラディエントによりpH7−8.5で実施する。標的タンパク質を含む分画をプールし、続いて5−10mMのDTTとともにインキュベートし、遊離システイン残基によって媒介されるダイマー化または凝集を防止する。0.8−1Mの硫酸アンモニウムまたは2−3MのNaClをさらに添加した後、溶液を親水性相互反応クロマトグラフィー（例えばフェニルセファロースHP、フェニルセファロースFF、ブチルセファロースHP、ブチルセファロースFF、ブチルトヨパール650（S,M,C）、フェニルトーヨーパール650（S,M,C））によりpH7−8.5で分離する。溶出は、硫酸アンモニウムまたはNaClの連続減少グラディエントにより5mMのDTTの存在下にてpH7−8.5で実施する。標的タンパク質を含む、最低限90%の純度レベルを有する分画をプールし、5mMのDTTの存在下で透析により脱塩し、続いて約5mg/mLに濃縮する。その後のリフォールディングは、50mMトリス、150mM NaCl、4mMシスタミン、10mM CHAPS（pH8.5）を用いて前記タンパク質溶液を1：5−1：20に希釈し、最終タンパク質濃度を0.25−1mg/mLにすることによって実施される。リフォールディング溶液を室温で12−36時間攪拌しながらインキュベートし、続いて陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばSPセファロースFF、SPセファロースHP、トーヨーパールSP-650（S,M,C）によってpH7−8.5で分離する。溶出は、NaCl連続増加グラディエントによりpH7−8.5で実施する。モノマーの標的タンパク質を含む分画をプールし、還元剤（例えばDTT、DTEまたはTCEP）の添加によってPEG化のために活性化する。続いてこの溶液を室温で2時間インキュベートする。リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5−7.5）または20mM HEPES緩衝液（pH6.5−7.5）またはトリス緩衝液（pH8.0）に対して透析し、さらに5−10mg/mLに濃縮した後、40-kDaのマレイミド-ポリエチレングリコール（PEG）を添加する（1：2から1：10のタンパク質：PEG比）。攪拌しながら溶液を3−18時間室温でインキュベートし、続いて0.22μmフィルターを用いてろ過する。陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばSPセファロースHP、トーヨーパールSP 650M、MacroCapTMSP、SourceTM30SまたはFractogel(商標)EMD（M））によりpH5−7でPEG化標的タンパク質を遊離PEGおよび非PEG化標的タンパク質から分離する。溶出は、NaCl連続増加グラディエントにより実施する。モノ-PEG化標的物を含む分画をプールし，25mMリン酸ナトリウム、220mMエンドトキシンフリートレハロース（pH7.5）中で透析により処方する。
【実施例１４】
【０１５８】
実施例14：医薬処方物および使用
14.1医薬処方物：本発明のヒト化二パラトープ性ポリペプチド構築物のいずれか、例えばABII314からAbII323を、以下の組成を有する皮下適用用医薬処方物の製造のために選択できる：
薬剤物質：          100mg/mL（1から3nmol/mL）
リン酸緩衝液：      25mM
トレハロース        220mM
トゥイーン20        0.02%
薬剤物質は上記組成を有する溶液中で処方し、滅菌して2から8℃で保存する。
14.2医薬的使用：上記14.1のように調製した溶液をその必要がある患者（例えばADに罹患したヒト）に、2から4週間毎に1から2mLの体積で腹部に皮下注射によって適用する。
【図１】
2013520974.tif 000041
【図２】
2013520974.tif 000042
【配列表】
2013520974000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月6日(2012.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(1)配列）および前記第二の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(2)配列）が以下のように規定される、前記ポリペプチド：
−CDR(1)1：配列番号：11
−CDR(1)2：配列番号：12
−CDR(1)3：配列番号：13
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：14
−CDR(1)2：配列番号：15
−CDR(1)3：配列番号：16
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：11
−CDR(2)2：配列番号：12
−CDR(2)3：配列番号：13
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：14
−CDR(2)2：配列番号：15
−CDR(2)3：配列番号：16。
【請求項２】
第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であるか、または前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）である、前記ポリペプチド。
【請求項３】
さらに半減期延長成分を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
半減期延長成分が、好ましくはアルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメントおよびアルブミン結合ペプチから成る群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：26から32、34から43、142、143および145から152のいずれかを有するポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド。
【請求項６】
請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドをコードする領域を含む、好ましくは単離された形態の核酸分子。
【請求項７】
請求項6に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項7に記載の発現ベクターを保有する宿主細胞であって、前記宿主細胞が、請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドを発現する能力を有し、さらに前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、前記宿主細胞。
【請求項９】
請求項1から15のいずれかに記載の1つまたは2つ以上のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法：
−請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドの発現を許容する条件下で請求項8に記載の宿主細胞を培養する工程；
−前記ポリペプチドを回収する工程；および
−前記ポリペプチドを精製する工程。
【請求項１１】
ヒトの疾患、異常または症状の治療、予防または緩和のための請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトの疾患、異常または症状の治療的処置、予防または緩和のための請求項9に記載の医薬組成物であって、前記疾患、異常または症状が、神経変性疾患または異常、アルツハイマー病、アルツハイマー型痴呆、乾燥性AMD、緑内障、脳アミロイドアンギオパチー、トリソミー21（ダウン症候群）、成人ダウン症候群、オランダ人型アミロイド症随伴遺伝性脳出血（HCHWA-D）、レーヴィ小体随伴痴呆、前頭側頭葉委縮、緑内障、筋委縮性側索硬化症、散発性封入体筋炎および高齢ヒト対象者の不安症から成る群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトに静脈内または皮下注射によって投与するための請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
A-ベータ沈着と密接に関係する疾患または異常を予防および／または治療するための請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬との併用投与のための請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ｉ）請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項9に記載の医薬組成物を含む処方物、および、
ii）ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬を含む処方物、
を組合せてなる医薬。
【請求項１７】
（i）請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドの1つまたは2つ以上、（ii）1つまたは2つ以上のさらに別の治療薬であって、好ましくはELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬、を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドを含む、体液中のA-ベータレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項１９】
請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドを含む、血中の可溶性A-ベータレベルを低下させるための医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
ポリペプチドの組換え体生産に用いられるさらに別の方法および試薬、例えば適切な発現ベクター、形質転換またはトランスフェクションの方法、選別マーカー、タンパク質発現の誘発方法、培養条件などは当業界では公知である。同様に、本発明のポリペプチドの製造方法で有用なタンパク質の単離および精製技術も当業者には周知である。
便利な組換え宿主生物（例えば大腸菌および酵母）での発酵による本発明のポリペプチドの生産は、高価な哺乳動物細胞の培養設備も要求される通常の抗体と比較して費用効率がよい。さらにまた達成可能な発現レベルも高く、本発明のポリペプチドの収量は1から10g/L（大腸菌）の範囲および10g/L以上（酵母）である。
本発明のさらに別の特徴にしたがえば、下記表VIIに列挙する免疫グロブリン単一可変ドメインが提供され、前記は本発明のA-ベータ結合ポリペプチドの構築に有用である。したがって、表VIIに列挙した免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれかを（場合によってヒト化した後で）、1つまたは2つ以上の他のA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（そのような他の免疫グロブリン単一可変ドメインはA-ベータの異なるエピトープと結合する）と結合させるならば（好ましくは1つの連続したポリペプチド鎖の形で）、本発明の二パラトープ性A-ベータ結合分子が得られるであろう（前記結合分子は下記実施例9から11に詳細に示すように有用な結合の特徴を有する）。
以下に本発明の例示的な実施態様を列挙する。
（１）A-ベータの第一のエピトープと特異的に結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および、A-ベータの第二のエピトープと特異的に結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメイン、を含むポリペプチドであって、A-ベータの前記第一および前記第二のエピトープが同一のエピトープではない、前記ポリペプチド。
（２）第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインが各々、本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成り、前記第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがリンカーペプチドによって共有結合されてあり、前記リンカーペプチドが場合によって第三の免疫グロブリンドメインを含むかまたは前記から成る、（1）に記載のポリペプチド。
（３）第一および前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインが、抗体ドメイン、好ましくはVHHドメイン、より好ましくはヒト化VHHドメインである、（1）または（２）に記載のポリペプチド。
（４）A-ベータの第一のエピトープが配列番号：3によって規定されるエピトープであり、さらにA-ベータの第二のエピトープが配列番号：4によって規定されるエピトープであるか、またはA-ベータの前記第一のエピトープが配列番号：4によって規定されるエピトープであり、さらにA-ベータの前記第二のエピトープが配列番号：3によって規定されるエピトープである、（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
（５）ヒトA-ベータペプチド（配列番号：1）の少なくともアミノ酸1（アスパルテート）、3（グルタメート）、19（フェニルアラニン）、20（フェニルアラニン）および23（アスパルテート）と接触する、（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチド。
（６）TR-FRET結合アッセイ（競合物質としてABII002＝配列番号：62およびABII050＝配列番号：100を用いる）で測定されるIC50値が10-9モル/リットル以下の範囲、好ましくは5 x 10-10モル/リットルから10-12モル/リットルの範囲である（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチド。
（７）2つのA-ベータ結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、それぞれ構造FR(1)1‐CDR(1)1‐FR(1)2‐CDR(1)2‐FR(1)3‐CDR(1)3‐FR(1)4およびFR(2)1‐CDR(2)1‐FR(2)2‐CDR(2)2‐FR(2)3‐CDR(2)3‐FR(2)4を有し、さらに
CDR(1)3が、
配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列、および、
配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、
から成る群から選択され、
CDR(2)3が、
配列番号：19のアミノ酸配列、および、
配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、
から成る群から選択されるか、または
CDR(1)3が、
配列番号：19のアミノ酸配列、および、
配列番号：19の前記アミノ酸配列と比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、
から成る群から選択され、
CDR(2)3が、
配列番号：13および配列番号：16のアミノ酸配列、および、
配列番号：13または配列番号：16の前記アミノ酸配列とそれぞれ比較したとき3つまで、好ましくは2つまで、より好ましくは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、から成る群から選択される、
（２）から（６）のいずれかに記載のポリペプチド。
（８）第一の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(1)配列）および第二の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(2)配列）が以下のように規定される、（２）から（７）のいずれかに記載のポリペプチド：
−CDR(1)1：配列番号：11
−CDR(1)2：配列番号：12
−CDR(1)3：配列番号：13
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：14
−CDR(1)2：配列番号：15
−CDR(1)3：配列番号：16
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：11
−CDR(2)2：配列番号：12
−CDR(2)3：配列番号：13
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：14
−CDR(2)2：配列番号：15
−CDR(2)3：配列番号：16。
（９）第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であるか、または前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）である、（１）から（８）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１０）さらに半減期延長成分を含む、（１）から（９）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１１）半減期延長成分がポリペプチドに共有結合しており、さらに前記成分が、アルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメントおよびアルブミン結合ペプチから成る群から選択される、（１０）に記載のポリペプチド。
（１２）配列番号：26から32、34から43、142、143および145から152を有するポリペプチドから成る群から選択される、（１０）および（１１）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１３）本質的に4つのフレームワーク領域（それぞれFR1からFR4）および3つの相補性決定領域（それぞれCDR1からCDR3）から成る免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、または前記から成るポリペプチドであって、前記CDR配列が以下のように規定される前記ポリペプチド：
−CDR1：配列番号：11
−CDR2：配列番号：12
−CDR3：配列番号：13
または
−CDR1：配列番号：14
−CDR2：配列番号：15
−CDR3：配列番号：16
または
−CDR1：配列番号：17
−CDR2：配列番号：18
−CDR3：配列番号：19。
（１４）配列番号：47から111から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するVHHドメインを含むかまたは前記から成るポリペプチド。
（１５）（１）から（１２）のいずれかに記載の二パラトープ性A-ベータ結合ポリペプチドの構築で使用される、（１３）または（１４）に記載のポリペプチド。
（１６）（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする領域を含む、好ましくは単離された形態の核酸分子。
（１７）（１６）に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（１８）（１７）に記載の発現ベクターを保有する宿主細胞であって、前記宿主細胞が、（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドを発現する能力を有し、さらに前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、前記宿主細胞。
（１９）（i）活性成分として、（１）から（１５）のいずれかに記載の1つまたは2つ以上のポリペプチド、および（ii）医薬的に許容できる担体、および場合によって（iii）希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤を含む医薬組成物。
（２０）以下の工程を含む、（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法：
−（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドの発現を許容する条件下で（１８）に記載の宿主細胞を培養する工程；
−前記ポリペプチドを回収する工程；および
−前記ポリペプチドを精製する工程。
（２１）ヒトの疾患、異常または症状の治療、予防または緩和のための医薬として使用される、（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドまたは（１９）に記載の医薬組成物。
（２２）ヒトの疾患、異常または症状の治療的処置、予防または緩和のための医薬として使用される、（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドまたは（１９）に記載の医薬組成物であって、前記疾患、異常または症状が、神経変性疾患または異常、アルツハイマー病、アルツハイマー型痴呆、乾燥性AMD、緑内障、脳アミロイドアンギオパチー、トリソミー21（ダウン症候群）、成人ダウン症候群、オランダ人型アミロイド症随伴遺伝性脳出血（HCHWA-D）、レーヴィ小体随伴痴呆、前頭側頭葉委縮、緑内障、筋委縮性側索硬化症、散発性封入体筋炎および高齢ヒト対象者の不安症から成る群から選択される、前記ポリペプチドまたは医薬組成物。
（２３）ヒトに静脈内または皮下注射によって投与するために調製される、（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドまたは（１９）に記載の医薬組成物。
（２４）A-ベータ沈着と密接に関係する疾患または異常を予防および／または治療する方法であって、（１）から（１５）のいずれかに記載の少なくとも1つのポリペプチドまたは（１９）に記載の医薬組成物の医薬的に活性な量を投与する工程を含む、前記方法。
（２５）ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬との併用投与のために調製される、（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドまたは（１９）に記載の医薬組成物。
（２６）患者への（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドまたは（１９）に記載の医薬組成物との併用投与のために調製される、ELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬。
（２７）（i）（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチドの1つまたは2つ以上、（ii）1つまたは2つ以上のさらに別の治療薬であって、好ましくはELND-005、カプロスピノール、NRM-8499、PBT-2、ポシフェン、EHT-0202、CTS-21166、セマガセスト、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、ベガセスタート、E-2012、CHF-5074、ディメボリンおよびPF-4494700から成る群から選択される治療薬、（iii）医薬的に許容できる担体、並びに場合によって（iv）希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または安定化剤を含む医薬組成物。
（２８）体液中のA-ベータレベルを低下させるため、および好ましくは血中の可溶性A-ベータレベルを低下させるための（１）から（１５）のいずれかに記載のポリペプチド。
（２９）第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(1)配列）および前記第二の免疫グロブリン可変ドメインのCDR配列（CDR(2)配列）が以下のように規定される、前記ポリペプチド：
−CDR(1)1：配列番号：11
−CDR(1)2：配列番号：12
−CDR(1)3：配列番号：13
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：14
−CDR(1)2：配列番号：15
−CDR(1)3：配列番号：16
−CDR(2)1：配列番号：17
−CDR(2)2：配列番号：18
−CDR(2)3：配列番号：19
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：11
−CDR(2)2：配列番号：12
−CDR(2)3：配列番号：13
または
−CDR(1)1：配列番号：17
−CDR(1)2：配列番号：18
−CDR(1)3：配列番号：19
−CDR(2)1：配列番号：14
−CDR(2)2：配列番号：15
−CDR(2)3：配列番号：16。
（３０）第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であるか、または前記第一の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII059（配列番号：45）であり、前記第二の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHドメインABII035（配列番号：44）である、前記ポリペプチド。
（３１）さらに半減期延長成分を含み、前記半減期延長成分が、好ましくはアルブミン結合成分（例えば抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合成分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメントおよびアルブミン結合ペプチから成る群から選択される、（２９）または（３０）に記載のポリペプチド。
（３２）配列番号：26から32、34から43、142、143および145から152のいずれかを有するポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド。
【国際調査報告】
2013520974.tif 000043
2013520974.tif 000044
2013520974.tif 000045
2013520974.tif 000046
2013520974.tif 000047