(57)【要約】ｆＨＢＰは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけるタンパク質である。ｆＨＢＰの３つのファミリーが公知である。これらのファミリー間で交差反応性である抗体を惹起するｆＨＢＰタンパク質の能力を増すために、宿主動物への投与後に広いスペクトルの殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる配列を有するｆＨＢＰを選択する、または作製する。具体的な実施形態において、本発明は、アミノ酸配列である配列番号７７または配列番号７８を含むポリペプチドを提供する。これらのアミノ酸配列は、ＭＣ５８配列のＶａｌ−２７と一致する残基で開始するが、下流部位に様々なアミノ酸修飾を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の免疫原性アミノ酸配列と第二の免疫原性アミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、該第一の免疫原性アミノ酸配列が、配列番号２３、２０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
前記第一の免疫原性アミノ酸配列が、配列番号２０または配列番号２３である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記第二の免疫原性アミノ酸配列が、（ａ）非髄膜炎菌抗原；（ｂ）髄膜炎菌非ｆＨＢＰ抗原；（ｃ）野生型髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原；または（ｄ）配列番号２３、２０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択されるアミノ酸配列である、前記いずれかの請求項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１２６、１２４、１２５、１３３、１３４、１３５、１１２、１１３、１１７、１１８、１０４、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１６、１３１、１３７、１１９、１２１、１２０、１０９、１０６、１２９、１００、１０１、９９、１０２、１０３、１０７、１１０、１２２、１２３、１２７、１２８、１３０、１３２、１３６、１３８、１４０、１４１、１４２、７７および７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
第一の免疫原性アミノ酸配列、第二の免疫原性アミノ酸配列および第三の免疫原性アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
該第一の免疫原性アミノ酸配列が、配列番号２３、２０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択され；
該第二の免疫原性アミノ酸配列が、（ａ）非髄膜炎菌抗原；（ｂ）髄膜炎菌非ｆＨＢＰ抗原；（ｃ）野生型髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原；または（ｄ）配列番号２３、２０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択されるアミノ酸配列であり；ならびに
該第三の免疫原性アミノ酸配列が、配列番号２３、２０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択される、
ポリペプチド。
【請求項６】
前記第一の配列および前記第三の配列が互いに同じである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第一の配列および前記第三の配列が互いに異なる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記第一の配列および前記第二の配列が互いに同じである、請求項５、６または７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記第一の配列および前記第二の配列が互いに異なる、請求項５、６または７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記第一の配列、前記第二の配列および前記第三の配列が互いに同じである、請求項５から９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記第一の配列、前記第二の配列および前記第三の配列が互いに異なる、請求項５から９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１２６、１２４、１２５、１３３、１３４、１３５、１１２、１１３、１１７、１１８、１０４、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１６、１３１、１３７、１１９、１２１、１２０、１０９、１０６、１２９、１００、１０１、９９、１０２、１０３、１０７、１１０、１２２、１２３、１２７、１２８、１３０、１３２、１３６、１３８、１４０、１４１、１４２、７７および７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、（例えば、請求項５に記載の）ポリペプチド。
【請求項１３】
前記いずれかの請求項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
髄膜炎菌細菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、請求項１６に記載の宿主細胞から調製された膜小胞。
【請求項１８】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１７に記載の小胞を含む免疫原性組成物。
【請求項１９】
アミノ酸配列である配列番号９０を含む第一のポリペプチドと、アミノ酸配列である配列番号１３９を含む第二のポリペプチドと、アミノ酸配列である配列番号１２６を含む第三のポリペプチドとを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
髄膜炎菌外膜小胞を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
髄膜炎菌外膜小胞を含まない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
アジュバントを含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アジュバントが、アルミニウム塩を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を、哺乳動物に投与したとき、惹起する第二のポリペプチドをさらに含む、請求項１８から２３のいずれかに記載の組成物であって、但し、該第二のポリペプチドが髄膜炎菌ｆＨＢＰではないことを条件とする、組成物。
【請求項２５】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの結合体化した莢膜糖をさらに含む、請求項１８から２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
結合体化した肺炎球菌莢膜糖をさらに含む、請求項１８から２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１８から２６のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物における抗体応答を高めるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年８月２７日に出願された米国仮出願第６１／２３７，５７６号の利益を主張する。この完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、免疫処置および特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）などのＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原菌によって引き起こされる疾患に対する免疫処置の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、莢膜のあるグラム陰性菌性病原体である。多糖ワクチンおよび結合体ワクチンを血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対して利用できるが、莢膜多糖はヒトにおける自己抗原であるポリシアル酸のポリマーであるので、このアプローチを血清群Ｂに適用することはできない。血清群Ｂに対するワクチンを開発するために、外膜小胞（ＯＭＶ）が用いられてきた。これらのワクチンは、血清殺菌性抗体応答を惹起し、疾患から保護するが、株交差保護（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を誘導することはできない［１（非特許文献１）］。そのため、一部の研究者は、ワクチンにおいて使用するための特異的髄膜炎菌抗原に着目している［２（非特許文献２）］。
【０００４】
１つのそのような抗原が髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）であり、これは、タンパク質「７４１」［参考文献３（特許文献１）における配列番号２５３５および２５３６；本明細書における配列番号１］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献２（非特許文献２）に続いて、参考文献４〜６］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」または「ＯＲＦ２０８６」［７〜９］としても公知である。このリポタンパク質は、すべての髄膜炎菌血清群にわたって発現され、多数の株において見つけられている。ｆＨＢＰ配列は、３つのファミリーに分類されており［４］（本明細書ではファミリーＩ、ファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩと呼ぶ）、所与のファミリーに対して惹起される血清は、同じファミリー内では殺菌性であるが、他のファミリーのうちの１つを発現する株に対しては活性でない、すなわち、ファミリー内交差保護はあるが、ファミリー間交差保護はない。
【０００５】
そのため、ｆＨＢＰを使用して株交差保護を達成するために、１つより多くのファミリーが使用される。別個のタンパク質を発現および精製する必要を避けるために、異なるファミリーを、単一ポリペプチド鎖内にそれらのファミリーのうちの２つまたは３つを含むハイブリッドタンパク質として発現させることが提案されている［１０〜１２］。参考文献１３および１４には、ファミリーＩ、ファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩにわたって適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を増すようにｆＨＢＰ配列を修飾するための、変異誘発に基づく様々なアプローチが記載されている。参考文献１５には、ファミリー間適用範囲を改善するように修飾されているｆＨＢＰの様々なさらなる形態が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９９／５７２８０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｄａｒら、Ｌａｎｃｅｔ（２００２）３５９（９３１６）：１４９９〜１５０８
【非特許文献２】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６〜１８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ｆＨＢＰによってもたらされる保護のファミリー特異性を克服するためのさらなる改善されたアプローチを提供すること、ならびに髄膜炎菌性疾患および／または感染症、特に血清群Ｂについてのもの、に対する免疫を生じさせるためにこれらのアプローチを用いることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
完全長ｆＨＢＰは、株ＭＣ５８の場合、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有する：
【００１０】
【化１】
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【００１１】
成熟リポタンパク質には配列番号１の最初の１９のアミノ酸が無く、ΔＧ形態のｆＨＢＰには最初の２６のアミノ酸が無い。
【００１２】
ＭＣ５８配列（配列番号１）は、ｆＨＢＰファミリーＩ内のものである。ＭＣ５８配列を用いて惹起された抗体は、ＭＣ５８株に対して高い殺菌活性を有するが、ファミリーＩＩまたはＩＩＩ  ｆＨＢＰを発現する株に対してははるかに低い活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明は、修飾形態のｆＨＢＰに関し、この修飾（単数または複数）は、ファミリー交差殺菌性抗体を惹起するこのタンパク質の能力を改善させる。他の実施形態において、本発明は、修飾形態のｆＨＢＰが第二のアミノ酸配列、例えば別の髄膜炎菌免疫原または別のｆＨＢＰ（修飾ｆＨＢＰを含む）、に融合している融合タンパク質に関する。
【００１３】
従って、本発明は、アミノ酸配列である配列番号７７または配列番号７８を含むポリペプチドを提供する。これらのアミノ酸配列は、ＭＣ５８配列のＶａｌ−２７と一致する残基で開始するが、下流部位に様々なアミノ酸修飾を含む。
【００１４】
本発明は、第一の免疫原性アミノ酸配列と第二の免疫原性アミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、該第一の免疫原性アミノ酸配列が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択されるポリペプチドも提供する。２つの好ましい第一の免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２０および２３である。いくつかの実施形態において、第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列は同じであり得；他の実施形態において、それらは互いに異なる。適する第二の免疫原性アミノ酸配列は、下でより詳細に説明するが、それらとしては、（ａ）非髄膜炎菌抗原；（ｂ）髄膜炎菌非ｆＨＢＰ抗原；（ｃ）野生型髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原；および（ｄ）第一の免疫原性アミノ酸配列と同じであるまたは異なることがある、修飾髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。前記第一の配列および前記第二の配列は、Ｎ末端からＣ末端へいずれかの順序で配列され得る。
【００１５】
従って本発明は、配列番号９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１６】
これらの様々なポリペプチドは、宿主動物への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘導する能力を有し、好ましい実施形態では、３つのｆＨＢＰファミリーＩからＩＩＩのそれぞれにおける株に対して殺菌性である抗体を誘導することができる。殺菌性応答に関するさらなる情報は、下で与える。
【００１７】
第二の免疫原性アミノ酸配列
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、第二の免疫原性アミノ酸配列を含む。様々なそのような第二の配列を使用することができる。
【００１８】
第二の免疫原性アミノ酸配列は、非髄膜炎菌抗原を含み得る。これは、好ましくは、非髄膜炎菌病原体、例えば細菌またはウイルス、からのものであろう。例えば、前記第二の配列は、免疫原性肺炎球菌アミノ酸配列または免疫原性肝炎ウイルスアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
第二の免疫原性アミノ酸配列は、ｆＨＢＰ抗原以外の髄膜炎菌抗原を含み得る。例えば、第二の配列は、髄膜炎菌抗原２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、９３６またはＯｍｐ８５についての配列を含み得る。これらの第二の配列のさらなる詳細は、下で与える。そのような第二の免疫原性配列を含むポリペプチド配列の例は、配列番号１０２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８および１２９である。
【００２０】
第二の免疫原性アミノ酸配列は、野生型ｆＨＢＰ配列を含むこともあり、または修飾ｆＨＢＰ配列を含むこともある。この第二のアミノ酸配列は、好ましくは、本発明のポリペプチドの一部として被験体に投与されたとき、アミノ酸配列である配列番号１、２または３のうちの１つを有する野生型髄膜炎菌タンパク質に結合する抗体を含む抗体応答を惹起することができる。例えば、第二のアミノ酸配列は、次のもののいずれかを含み得る：
−  配列番号１、２および３（野生型ｆＨＢＰ配列）から選択される配列。
−  配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８（修飾ｆＨＢＰ配列）から選択される配列。いくつかのそのような実施形態において、前記第二の免疫原性配列は、前記第一の免疫原性配列と同一である。
−  配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８のうちのいずれか１つとの少なくともｘ％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【００２１】
ｘの値は、少なくとも８０、例えば８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９を超える。
【００２２】
そのようなｆＨＢＰ配列を第二の免疫原性配列として含むポリペプチドの例は、配列番号９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８である。
【００２３】
前記第一の免疫原性アミノ酸配列および前記第二の免疫原性アミノ酸配列は、（ｉ）該第一の免疫原性アミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、該第二の免疫原性アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸のすぐ上流にある、または（ｉｉ）該第二の免疫原性アミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、該第一の免疫原性アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸のすぐ上流にあるように、ペプチド結合によって直接接合していることがある。しかし、他の実施形態において、前記第一の免疫原性アミノ酸配列および前記第二の免疫原性アミノ酸配列は、依然として単一の翻訳ポリペプチド鎖を形成しているが、リンカーアミノ酸配列によって分離されている。そのようなリンカーアミノ酸配列（単数または複数）−Ｌ−は、概して短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）だろう。例は、クローニングを助長する短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ（この場合、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）を含む）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（この場合、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）、例えば配列番号９５）を含む。他の適するリンカーアミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号８１）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号８２）であり、この場合、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドはＢａｍＨＩ制限部位から形成され、従って、クローニングおよび操作を助成し、および（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは典型的なポリ−グリシンリンカーである。他の適するリンカーは、ＡＳＧＧＧＳ（例えば配列番号９４によってコードされている、配列番号９３）またはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。
【００２４】
これらの第二の配列のうちの１つより多くが存在し、その結果、そのポリペプチド内に第三、第四、第五などの免疫原性配列が備えられていることがある。そのようなポリペプチドとしては、第一の免疫原性アミノ酸配列、第二の免疫原性アミノ酸配列および第三の免疫原性アミノ酸配列を含むものが挙げられ、この場合、第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列は、上で定義したとおりであり；ならびに第三のアミノ酸配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より選択される。前記第一の配列および前記第三の配列は、互いに同じであるまたは異なることがあり；前記第二の配列は、前記第一の配列ともしくは第三の配列と同じであることがあり、またはそれらの両方と異なることがある。第一の配列、第二の配列および第三の配列を含むポリペプチドの例は、配列番号９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７である。
【００２５】
ポリペプチドの１つの有用な群は、（ｉ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群より独立して選択される２つのアミノ酸配列と、（ｉｉ）髄膜炎菌非ｆＨＢＰ抗原とを含む。そのようなポリペプチドの例としては、配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１４０、１４１および１４２が挙げられる。部分（ｉ）の２つのアミノ酸配列は、同じであるまたは異なることがある。非ｆＨＢＰ抗原は、部分（ｉ）の２つのアミノ酸配列の間に、部分（ｉ）の２つのアミノ酸配列のＣ末端に対して、または部分（ｉ）の２つのアミノ酸配列のＮ末端に対して存在することがある。
【００２６】
非ｆＨＢＰ髄膜炎菌抗原
本発明の組成物は、２８７抗原を含み得る。この２８７抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７３８８；本明細書における配列番号８３）として含まれていた。それ以来、多くの株からの２８７抗原の配列が公表されている。例えば、対立遺伝子形態の２８７は、参考文献１７の図５および１５において、ならびに参考文献１８の実施例１３および図２１（そこでは配列番号３１７９から３１８４）で見ることができる。２８７抗原の様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましい２８７抗原は、（ａ）配列番号８３との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号８３の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８３からのエピトープを含む。本発明の最も有用な２８７抗原は、アミノ酸配列である配列番号８３からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利な２８７抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【００２７】
本発明の組成物は、ＮａｄＡ抗原を含み得る。このＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書における配列番号８４）として含まれていた。それ以来、多くの株からのＮａｄＡ抗原の配列が公表されており、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ付着因子としてのこのタンパク質の活性は十分に立証されている。ＮａｄＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号８４との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号８４の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８４からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮａｄＡ抗原は、アミノ酸配列である配列番号８４からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。配列番号６が１つのそのようなフラグメントである。
【００２８】
本発明の組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含み得る。このＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７８８８；本明細書における配列番号８５）として含まれていた。この抗原は、参考文献１９および２０から従来公知であった。それ以来、多くの株からのＮｓｐＡ抗原の配列が公表されている。ＮｓｐＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号８５との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号８５の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８５からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｓｐＡ抗原は、アミノ酸配列である配列番号８５からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【００２９】
本発明の組成物は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含み得る。完全長ＨｍｂＲ配列は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書における配列番号８６）として含まれていた。本発明は、完全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用できるが、多くの場合、部分的ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用するであろう。従って、いくつかの実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号８６との少なくともｉ％の配列同一性（この場合のｉの値は、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９であるか、またはそれを超える）を有するアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号８６からの少なくともｊの連続アミノ酸（この場合のｊの値は、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０であるか、またはそれを超える）のフラグメントを含み得る。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号８６との少なくともｉ％の配列同一性を有するおよび／または（ｉｉ）配列番号８６からの少なくともｊの連続アミノ酸のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含み得る。ｊアミノ酸の好ましいフラグメントは、配列番号８６からのエピトープを含む。そのようなエピトープは、ＨｍｂＲの表面に位置するアミノ酸を通常は含むであろう。有用なエピトープとしては、ヘモグロビンへのＨｍｂＲの結合に関与するアミノ酸を有するものが挙げられる。なぜなら、これらのエピトープに結合する抗体は、宿主ヘモグロビンに結合する細菌の能力を阻止することができるからである。ＨｍｂＲのトポロジー、およびその重要な機能性残基が、参考文献２１の中で研究された。本発明の最も有用なＨｍｂＲ抗原は、アミノ酸配列である配列番号８６からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【００３０】
本発明の組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含み得る。このＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書における配列番号８７）として含まれていた。例えば参考文献１７および２２以来、多くの株からのＮｈｈＡ抗原の配列が公表されており、ＮｈｈＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。それはＨｓｆとしても公知である。本発明での使用に好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号８７との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号８７の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８７からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｈｈＡ抗原は、アミノ酸配列である配列番号８７からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【００３１】
本発明の組成物は、Ａｐｐ抗原を含み得る。このＡｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書における配列番号８８）として含まれていた。それ以来、多くの株からのＡｐｐ抗原の配列が公表されている。Ａｐｐの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号８８との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号８８の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８８からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＡｐｐ抗原は、アミノ酸配列である配列番号８８からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【００３２】
本発明の組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含み得る。このＯｍｐ８５抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［１６］の中に遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書における配列番号８９）として含まれていた。それ以来、多くの株からのＯｍｐ８５抗原の配列が公表されている。Ｏｍｐ８５に関するさらなる情報は、参考文献２３および２４において見つけることができる。Ｏｍｐ８５の様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号８９との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号８９の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８９からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＯｍｐ８５抗原は、アミノ酸配列である配列番号８９からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【００３３】
本発明の組成物は、９３６抗原を含み得る。この９３６抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［２５］の中に遺伝子ＮＭＢ２０９１（本明細書における配列番号９８）として含まれていた。本発明での使用に好ましい９３６抗原は、（ａ）配列番号９８との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号９８の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号９８からのエピトープを含む。本発明の最も有用な９３６抗原は、アミノ酸配列である配列番号９８からなる髄膜炎菌ポリペプチドに、被験体への投与後、結合することができる抗体を惹起することができる。９３６抗原は、ｆＨＢＰの良好な融合パートナーである（例えば、参考文献１０８および１０９参照）。
【００３４】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、様々な手段により、例えば化学合成により（少なくとも一部分）、プロテアーゼを使用してより長いポリペプチドを消化することにより、ＲＮＡからの翻訳により、細胞培養物からの（例えば、組換え発現からのまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養物からの）精製などにより調製することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種発現は、好ましい発現経路である。
【００３５】
ｆＨＢＰは、天然にはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけるリポタンパク質である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるとその天然リーダー配列で脂質付加されることも判っている。本発明のポリペプチドは、脂質付加され得るＮ末端システイン残基を有することがある、例えば、パルミトイル基を含み、通常はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システインを形成している。他の実施形態において、前記ポリペプチドは、脂質付加されない。
【００３６】
本発明の好ましいポリペプチドの特徴は、宿主動物への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘導する能力である。
【００３７】
ポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋なもしくは実質的に単離された形態（すなわち、他のＮｅｉｓｓｅｒｉａもしくは宿主細胞ポリペプチドが実質的に無い）または実質的に単離された形態で調製される。一般に、ポリペプチドは、天然に存在しない環境に提供される、例えば、それらは、それらの天然に存在する環境から分離される。一定の実施形態において、本ポリペプチドは、対照と比較して該ポリペプチドが豊富に存在する組成物で存在する。従って、精製されたポリペプチドを提供し、この場合の精製されたとは、そのポリペプチドが、他の発現ポリペプチドが実質的に無い組成物で存在することを意味し、実質的に無いとは、組成物の９０％未満、通常は６０％未満およびさらに通常は５０％未満を他の発現ポリペプチドが構成することを意味する。
【００３８】
ポリペプチドは、様々な形態（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、ジスルフィド架橋など）をとる場合がある。
【００３９】
配列番号４から７８は、Ｎ末端メチオニンを含まない。本発明のポリペプチドを生物学的宿主における翻訳によって生産する場合には開始コドンを必要とし、これは、殆どの宿主においてＮ末端メチオニンを提供する。従って、本発明のポリペプチドは、少なくとも発生期には、その配列番号の配列の上流にメチオニン残基を含むであろう。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、Ｎ末端に単一のメチオニン、そのすぐ後に前記配列番号の配列を有し；他の実施形態では、より長い上流配列を用いることがある。そのような上流配列は、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）こともある。例としては、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を助長する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（この場合、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）、例えば配列番号９５）が挙げられる。他の適するＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、前記配列番号の配列の最後のアミノ酸の下流にアミノ酸を含むこともある。そのようなＣ末端伸長部は、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）ことがある。例としては、タンパク質輸送を指示する配列、クローニングを助長する短鎖ペプチド配列（例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｕジペプチド）もしくは精製を助長する短鎖ペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（この場合、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）、を含むもの、例えば配列番号９５）、またはポリペプチド安定性を強化する配列が挙げられる。これらの組み合わせ、例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｕジペプチドとヘキサ−ヒスチジンタグとを提供する配列番号９６、を使用することもできる。他の適するＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。
【００４２】
用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。前記ポリマーは、線状であるまたは分岐していることがあり、修飾アミノ酸を含むことがあり、および非アミノ酸によって中断されていることもある。この用語は、天然に修飾されている、あるいは介入によって修飾されている（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合体化）アミノ酸ポリマーも包含する。例えば、当該技術分野において公知の他の修飾ばかりでなく、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチドも、この定義の中に含まれる。ポリペプチドは、一本鎖として存在する場合もあり、または会合鎖として存在する場合もある。
【００４３】
本発明のポリペプチドを固体支持体に取り付けるまたは固定することができる。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、検出可能標識、例えば放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識、を含み得る。これは、免疫学的検定法に特に有用である。
【００４５】
参考文献１３に開示されているように、ｆＨＢＰを、Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる３つのドメインに分割することができる。配列番号１を例にとると、３つのドメインは、（Ａ）１〜１１９、（Ｂ）１２０〜１８３および（Ｃ）１８４〜２７４である：
【００４６】
【化２】
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【００４７】
成熟形態のドメイン「Ａ」、そのＮ末端のＣｙｓ−２０からＬｙｓ−１１９まで、を「Ａ成熟」と呼ぶ。多数のｆＨＢＰ配列が公知であり、標準的な方法を用いてこれらを容易に整列することができる。そのようなアラインメントにより、当業者は、（ａ）ＭＣ５８配列内の座標との比較により、任意の所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ａ」（および「Ａ成熟」）、「Ｂ」および「Ｃ」を、ならびに（ｂ）例えば置換を同定するために、多数のｆＨＢＰ配列内の単一残基を同定することができる。しかし、参照を容易にするために、それらのドメインを下に定義する：
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ａ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＭｅｔ−１に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＬｙｓ−１１９に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ａ成熟」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＣｙｓ−２０に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＬｙｓ−１１９に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ｂ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＧｌｕ−１２０に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＧｌｙ−１８３に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ｃ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＬｙｓ−１８４に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＧｌｎ−２７４に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
【００４８】
前記ドメインを定義するために好ましいペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いる（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いて、ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５での）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｈグローバル・アラインメント・アルゴリズム［２６］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージの中のｎｅｅｄｌｅツールで適便に実行される［２７］。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド内のｆＨＢＰアミノ酸配列は、そのドメインＡを除去するように短縮される、すなわちドメインＡがＳＥＱ  ＩＤから省かれる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端の１０個までのアミノ酸（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）および／またはＣ末端の１０個までのアミノ酸（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）が欠失されることを除いて、上で説明したとおりのアミノ酸配列を含む。従って、本発明は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６および７７からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、前記フラグメントは、前記ＳＥＱ  ＩＤのアミノ酸ａからｂであり、この場合のａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１であり、ｂは、ｊ、ｊ−１、ｊ−２、ｊ−３、ｊ−４、ｊ−５、ｊ−６、ｊ−７、ｊ−８、ｊ−９またはｊ−１０であり、Ｊは、前記ＳＥＱ  ＩＤの長さである。より長い短縮（例えば、１５アミノ酸まで、２０アミノ酸までなど）を用いてもよい。
【００５１】
核酸
本発明は、上で定義したとおりの本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００５２】
本発明の核酸は、多くの方法で、例えば、全部または一部分、化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホルアミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用する、より長い核酸の消化によって、（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）より短い核酸またはヌクレオチドを接合させることによって、ゲノムまたはＤＮＡライブラリーから、等々、調製することができる。
【００５３】
本発明の核酸は、様々な形態、例えば、一本鎖形態、二本鎖形態、ベクター形態、プライマー形態、プローブ形態、標識形態、未標識形態などをとる場合がある。
【００５４】
本発明の核酸は、好ましくは、単離されたまたは実質的に単離された形態である。
【００５５】
用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにまたそれらの類似体、例えば修飾された主鎖を含有するもの、ならびにまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００５６】
本発明による核酸を、例えば放射性または蛍光標識で、標識することができる。
【００５７】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む（プラスミドなどの）ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター、例えば核酸免疫処置に適するもの）、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００５８】
殺菌性応答
本発明の好ましいポリペプチドは、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。殺菌性抗体応答は、マウスで適便に測定され、ワクチン効力の標準指標である［例えば、参考文献２の文末脚注１４を参照のこと］。本発明のポリペプチドは、好ましくは、以下の３群の株のうちの少なくとも２群それぞれからの少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる：
【００５９】
【化３】
2013502918.tif 000004
【００６０】
例えば、ポリペプチドは、血清群Ｂ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株ＭＣ５８、９６１−５９４５およびＭ１２３９のうちの２つまたは３つに対して有効な殺菌性応答を惹起することができる。
【００６１】
前記ポリペプチドは、好ましくは、臨床的に関連のある髄膜炎菌血清群Ｂ株の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超える）に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。前記ポリペプチドは、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株ならびに血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの少なくとも１（例えば、１、２、３、４）つの血清群の株に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。前記ポリペプチドは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよび／またはＮ．ｃｉｎｅｒｅａの株に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。前記ポリペプチドは、参考文献４の図５に示されている系統樹の３本の主枝のうちの少なくとも２本からの株に対して殺菌性である応答を惹起することができる。
【００６２】
前記ポリペプチドは、超強毒性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）系統ＥＴ−３７、ＥＴ−５、クラスターＡ４、系統３、亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）Ｉ、亜群ＩＩＩおよび亜群ＩＶ−１［２８、２９］のうちの少なくとも２（例えば、２、３、４、５、６、７）つにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。ポリペプチドは、１つ以上の超侵襲性（ｈｙｐｅｒｉｎｖａｓｉｖｅ）系統に対して殺菌性である抗体応答をさらに誘導することができる。
【００６３】
ポリペプチドは、次の多座位（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ）配列タイプのうちの少なくとも２（例えば、２、３、４、５、６、７）つにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる：ＳＴ１、ＳＴ４、ＳＴ５、ＳＴ８、ＳＴ１１、ＳＴ３２およびＳＴ４１［３０］。前記ポリペプチドは、ＳＴ４４株に対して殺菌性である抗体応答も惹起することができる。
【００６４】
前記ポリペプチドは、指定系統またはＭＬＳＴ内のそれぞれのおよびすべてのＭｅｎＢ株に対する殺菌性抗体を誘導する必要はない；むしろ、特定の超強毒性系統またはＭＬＳＴ内の血清群Ｂ髄膜炎菌の４つ以上の菌株の任意の所与の群について、前記組成物によって誘導された抗体は、好ましくは、該群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％以上）に対して殺菌性である。株の好ましい群は、次の国のうちの少なくとも４か国において単離された株を含むであろう：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵ。前記血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８以上、好ましくは、少なくとも２１４）の殺菌力価を有する、すなわち、前記血清は、例えば参考文献２の文末脚注１４に記載されているように、１：１０２４希釈したときに特定の株の被検細菌の少なくとも５０％を死滅させることができる。好ましいキメラポリペプチドは、血清を１：４０９６希釈したときまたはそれを超えて希釈したときでさえ殺菌性のままである抗体応答をマウスにおいて惹起することができる。
【００６５】
免疫処置
本発明のポリペプチドは、免疫原性組成物の活性成分として使用することができ、そのため本発明は、本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
【００６６】
本発明は、哺乳動物において抗体応答を高めるための方法も提供し、この方法は、本発明の免疫原性組成物を該哺乳動物に投与することを含む。前記抗体応答は、好ましくは、保護性抗体応答および／または殺菌性抗体応答である。本発明は、そのような方法において使用するための本発明のポリペプチドも提供する。
【００６７】
本発明は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎菌）感染症および／または疾患から（例えば、髄膜炎菌性髄膜炎から）哺乳動物を保護するための方法も提供する。
【００６８】
本発明は、医薬として（例えば、免疫原性組成物として、もしくはワクチンとして）または診断用試薬として使用するための本発明のポリペプチドを提供する。本発明は、哺乳動物におけるＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば髄膜炎菌）感染症を予防するための医薬の製造における本発明の核酸、ポリペプチドまたは抗体の使用も提供する。
【００６９】
前記哺乳動物は、好ましくはヒトである。前記ヒトは、成人または好ましくは小児であり得る。前記ワクチンが予防用のものである場合、前記ヒトは、好ましくは小児（例えば、幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または乳児）であり、前記ワクチンが治療用のものである場合、前記ヒトは、好ましくは成人である。小児のために意図されたワクチンを、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に投与することもできる。
【００７０】
前記使用および方法は、髄膜炎（特に、細菌性、例えば髄膜炎菌性、髄膜炎）および菌血症をはじめとする（しかしこれらに限定されない）疾患の予防／処置に特に有用である。
【００７１】
治療的処置の効力は、本発明の組成物の投与後にＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染をモニターすることによって試験することができる。予防的処置の効力は、前記組成物投与後にｆＨＢＰに対する免疫応答をモニターすることによって試験することができる。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験被験体（例えば、小児１２〜１６月齢、または動物モデル［３１］）に投与し、その後、血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）をはじめとする標準的なパラメータを測定することによって、決定することができる。これらの免疫応答を一般に組成物投与から約４週間後に測定し、その組成物の投与前に測定した値と比較することとなる。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。組成物の１回より多い用量を投与する場合、投与後測定を１回より多く行ってもよい。
【００７２】
本発明の好ましい組成物は、許容可能な割合のヒト被験体についての各抗原性成分に対する血清保護（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の基準を超える抗体力価を患者に付与することができる。それより上だと宿主をその抗原に対して血清変換させると考えられる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの機関によって公表されている。好ましくは、被験体の統計的に有意なサンプルの８０％より多く、さらに好ましくは９０％より多く、さらにいっそう好ましくは９３％より多く、および最も好ましくは９６〜１００％を血清変換させる。
【００７３】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与されることとなる。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下的に、腹腔内的に、静脈内的に、筋肉内的に、もしくは組織の間質腔に）、または直腸投与（ｒｅｃｔａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、経口投与、膣投与（（ｖａｇｉｎａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与（ｏｃｕｌａｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、耳への投与（ａｕｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、肺投与（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）もしくは他の粘膜投与によって達成することができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば皮下注射針）によるだろうが、無針注射を代替的に使用してもよい。典型的な筋肉内用量は、約０．５ｍＬである。
【００７４】
本発明を用いて、全身性免疫および／または粘膜免疫を惹起することができる。
【００７５】
投薬処置は、単回用量スケジュールである場合もあり、または多回用量スケジュールである場合もある。多回用量は、初回免疫処置スケジュールおよび／または追加免疫処置スケジュールで用いることができる。初回用量スケジュールの後、追加抗原量スケジュールを行うことができる。初回抗原刺激用量（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｄｏｓｅ）間（例えば、４〜１６週の間）および初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）と追加抗原刺激（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）の間の適切なタイミングを慣例的に決定することができる。
【００７６】
本発明の免疫原性組成物は、該組成物を受ける患者に有害な抗体の生産をそれ自体が誘導しない任意の物質であり得る、および過度の毒性を伴わずに投与することができる、薬学的に許容され得る担体を一般に含むであろう。薬学的に許容され得る担体としては、水、食塩液、グリセロールおよびエタノールなどの液体を挙げることができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質およびこれらに類するもの、もそのようなビヒクル中に存在する場合がある。適する担体の詳細な論述は、参考文献３２において入手できる。
【００７７】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染症は、身体の様々な領域を罹患させるため、本発明の組成物を様々な形態で調製することができる。例えば、前記組成物を注射剤として、液体の溶液または懸濁液いずれかとして、調製することができる。注射前の液体ビヒクルへの溶解（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または懸濁に適する固体形態も調製することができる。前記組成物を局所投与用に、例えば軟膏、クリームまたは粉末として、調製することができる。前記組成物を、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセルとして、または（場合により着香された）シロップとして、調製する。前記組成物を、微粉末または噴霧剤を使用する肺投与用に、例えば吸入剤として、調製することができる。前記組成物を坐剤またはペッサリーとして調製することができる。前記組成物を鼻、耳または眼投与用に、例えば滴剤（ｄｒｏｐ）として、調製することができる。
【００７８】
前記組成物は、好ましくは無菌である。好ましくは、発熱物質不含である。好ましくは、例えばｐＨ６とｐＨ８の間、一般におおよそｐＨ７に緩衝されている。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［３３］。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００７９】
免疫原性組成物は、免疫学的有効量の免疫原、ならびに必要に応じて他の指定成分のうちの任意の他のものを含む。「免疫学的有効量」とは、単回用量でのまたは一連の投与の一部としての個体に対するその量の投与が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置を受ける個体の健康および身体の状態、年齢、処置を受ける個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師の病状についての評価、および他の関連因子に依存して様々である。その量は比較的広い範囲になると予想され、慣例的な試行を通してそれを決定することができる。投薬処置は、単回用量スケジュールである場合もあり、または多回用量スケジュール（例えば、追加抗原量を含む）である場合もある。前記組成物を他の免疫調節剤と共に投与することができる。
【００８０】
本発明の組成物に使用することができるアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
Ａ．無機質含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する無機質含有組成物としては、無機塩類、例えばアルミニウム塩およびカルシウム塩が挙げられる。本発明は、無機塩類、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など［例えば、参考文献３４の第８および９章参照］、または異なる無機質化合物の混合物を含み、前記化合物は、任意の適する形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質など）をとり、吸着が好ましい。前記無機質含有組成物を金属塩の粒子として調合することもできる［３５］。
【００８１】
有用なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍＬで含まれる、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。
【００８２】
Ｂ．油エマルジョン（ｏｉｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する油エマルジョン組成物としては、水中スクアレン型エマルジョン、例えばＭＦ５９［参考文献３４の第１０章；参考文献３６も参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に調合された、５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用することもできる。
【００８３】
有用な水中油型エマルジョンは、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を代表的に含み、該油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生分解性（代謝性）および生体適合性である。前記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径が１μｍ未満であり、マイクロフルイダイザーでこれらの小さなサイズを達成して、適するエマルジョンを生じさせる。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に付すことができるので、好ましい。
【００８４】
前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）または植物源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀物粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロール（下記参照）である。油の混合物を使用することができる。
【００８５】
界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートをはじめとする（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００８６】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、とオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００８７】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。
【００８８】
好ましくは、油滴の実質的にすべて（例えば、個数で少なくとも９０％）が、１μｍ未満、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはそれより小さい直径を有する。
【００８９】
スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０およびＳｐａｎ８５のうちの１つの特に有用なサブミクロンエマルジョン。前記エマルジョンの体積による組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５である。重量によると、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、より詳細に参考文献４０の第１０章および参考文献４１の第１２章に記載されているように、「ＭＦ５９」［３７〜３９］として公知である。このＭＦ５９エマルジョンは、有利には、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液、を含む。
【００９０】
Ｃ．サポニン製剤［参考文献３４の第２２章］
サポニン製剤も本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根およびさらに花において見つけられるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））からのサポニンを市場で得ることもできる。サポニンアジュバント製剤としては、精製製剤、例えばＱＳ２１、ならびに脂質製剤、例えばＩＳＣＯＭ、が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。
【００９１】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて特定の精製画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は参考文献４２に開示されている。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールも含み得る［４３］。
【００９２】
サポニンとコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成することができる［参考文献３４の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン、も代表的に含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献４３〜４５にさらに記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭには追加の洗剤がまったく無いことがある［４６］。
【００９３】
サポニン系アジュバントの開発についての総説は、参考文献４７および４８において見つけることができる。
【００９４】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明においてアジュバントとして使用することができる。これらの構造は、場合によりリン脂質と併せられたまたはリン脂質を用いて調合された、ウイルス由来の１つ以上のタンパク質を一般に含有する。これらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に、天然ウイルスゲノムを全く含有しない。前記ウイルスタンパク質を組換え産生することができ、または完全なウイルスから単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適するこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献４９〜５４においてさらに論じられている。ビロソームは、例えば、参考文献５５においてさらに論じられている。
【００９５】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適するアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられる。
【００９６】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６本のアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は参考文献５６に開示されている。３ｄＭＰＬのそのような「小粒子」は、０．２２μｍ膜による滅菌濾過に充分な小ささである［５６］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えばアミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる［５７、５８］。
【００９７】
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献５９および６０に、記載されている
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｄ）によってグアノシンに連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが証明されている。
【００９８】
前記ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／アナログ、例えばホスホチオエート修飾、を含む場合があり、二本鎖または一本鎖である場合がある。参考文献６１、６２および６３には、可能なアナログ置換、例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果が、参考文献６４〜６９においてさらに論じられている。
【００９９】
前記ＣｐＧ配列をＴＬＲ９に指向させることができる（例えばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［７０］。前記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であることがあり（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）、またはＢ細胞応答の誘導にさらに特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献７１〜７３において論じられている。好ましくは、前記ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１００】
好ましくは、前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、５’末端がレセプター認識に利用できるように、構築する。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端で付着させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成していてもよい。例えば、参考文献７０および７４〜７６を参照のこと。
【０１０１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ３１ＴＭとして公知である［７７］。従って、本発明で使用するアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは多数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンに連結してジヌクレオチドを形成しているシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド数１５〜４０の間）と、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは多数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオン性ポリマー、例えばオリゴペプチド（例えば、アミノ酸数５〜２０の間）との混合物を含み得る。前記オリゴヌクレオチドは、２６−ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号７９）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。前記ポリカチオン性ポリマーは、１１−ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号８０）を含むペプチドであり得る。
【０１０２】
細菌のＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体を本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、前記タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献７８に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は参考文献７９に記載されている。前記毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方を含むホロトキシンの形態である。好ましくは、前記Ａサブユニットは、無毒化変異を含み；好ましくは、前記Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、前記アジュバントは無毒化ＬＴ変異体、例えばＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２である。アジュバントとしてのＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献８０〜８７において見つけることができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［８８］。アミノ酸置換に関する数値上の言及は、好ましくは、参考文献８９に示されているＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくものであり、この参考文献はその全体が参照により具体的に本明細書に援用されている。
【０１０３】
Ｆ．ヒト免疫修飾因子（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するヒト免疫修飾因子としては、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［９０］など）［９１］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫修飾因子は、ＩＬ−１２である。
【０１０４】
Ｇ．生体付着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）および粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）
生体付着剤および粘膜付着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。適する生体付着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［９２］または粘膜付着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。キトサンおよびその誘導体を本発明においてアジュバントとして使用することもできる［９３］。
【０１０５】
Ｈ．マイクロ粒子
マイクロ粒子も本発明においてアジュバントとして使用することができる。生分解性で非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）とポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から形成されるマイクロ粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍから約１５０μｍ、さらに好ましくは直径が約２００ｎｍから約３０μｍ、および最も好ましくは直径が約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）であって、負電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正電荷を有する表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤で）を有するように場合により処理されたものであるマイクロ粒子が好ましい。
【０１０６】
Ｉ．リポソーム（参考文献３４の第１３及び１４章）
アジュバントとしての使用に適するリポソーム製剤の例は、参考文献９４〜９６に記載されている。
【０１０７】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適するアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［９７］を含む。そのような製剤は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［９８］、ならびに少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤、例えばオクトキシノール、と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［９９］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１０８】
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、参考文献１００および１０１に記載されている。
【０１０９】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１１０】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献１０２および１０３にさらに記載されているＩｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる。
【０１１１】
本発明は、上で特定したアジュバントのうちの１つ以上の態様の組み合わせも含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１０４］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１０５］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）［１０６］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［１０７］；（６）サブミクロンエマルジョンにミクロ流動化された、またはより大きな粒径のエマルジョンを生じさせるようにボルテックスされた、１０％スクワランと０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭと５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１とｔｈｒ−ＭＤＰとを含有する、ＳＡＦ；（７）２％スクアレンと、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０と、モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分とを含有する、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１つ以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
【０１１２】
免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献３４の第７章に開示されている。
【０１１３】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、一般に、抗原は、これらの塩に吸着される。他の好ましいアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１およびＴｈ２アジュバント、例えばＣｐＧとミョウバンまたはレシキモドとミョウバン、の組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬの組み合わせを用いてもよい。
【０１１４】
さらなる抗原性成分
本発明の組成物は、修飾ｆＨＢＰ配列を含むポリペプチドを含む。これは、組成物が、抗原の複合体も不明確な（ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）混合物も含むべきでない場合、例えば、組成物に外膜小胞を含まないことが好ましい場合、有用である。好ましくは、本発明のポリペプチドを異種宿主において組み換え発現させ、その後、精製する。
【０１１５】
ｆＨＢＰ含有ポリペプチドを含むばかりでなく、本発明の組成物は、１つ以上のさらなるＮｅｉｓｅｒｉａ抗原も含み得る。なぜなら、１細菌あたり１つより多くの抗原をターゲットにするワクチンは、エスケープ突然変異体を選択する可能性を減少させるからである。従って、組成物は、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を、哺乳動物に投与されたとき、惹起する第二のポリペプチドを含む場合がある。前記第二のポリペプチドは、髄膜炎菌ｆＨＢＰではなく、例えば、２８７配列、ＮａｄＡ配列、９５３配列、９３６配列などであり得る。組成物は、配列番号９０を含むポリペプチド、配列番号９１を含むポリペプチド、および／または配列番号９２もしくは１３９を含むポリペプチドのうちの１つ以上を含み得る（参考文献１０８および１０９参照）。
【０１１６】
９３６抗原と少なくとも１つの修飾ｆＨＢＰとの融合体を含む第一のポリペプチド、アミノ酸配列である配列番号９０を含む第二のポリペプチド、およびアミノ酸配列である配列番号９２を含む第三のペプチドを含む組成物は有用である。前記第一のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列である配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９のうちのいずれか１つを含み得る。
【０１１７】
９３６抗原と少なくとも１つの修飾ｆＨＢＰとの融合体を含む第一のポリペプチド、アミノ酸配列である配列番号９０を含む第二のポリペプチド、およびアミノ酸配列である配列番号１３９を含む第三のペプチドを含む組成物は有用である。前記第一のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列である配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９のうちのいずれか１つを含むことがあり、好ましくは配列番号１２６を含む。この組成物は、本明細書の他の箇所で説明する髄膜炎菌外膜小胞を含み得るが、好ましくは含まない。
【０１１８】
前記組成物に含めるための抗原としては、
（ａ）参考文献１１０に開示されている４４６の偶数ＳＥＱ  ＩＤ（すなわち、２、４、６、．．．、８９０、８９２）；
（ｂ）参考文献１１１に開示されている４５の偶数ＳＥＱ  ＩＤ（すなわち、２、４、６、．．．、８８、９０）；
（ｃ）参考文献３に開示されている、１６７４の偶数ＳＥＱ  ＩＤ２〜３０２０、偶数ＳＥＱ  ＩＤ３０４０〜３１１４、およびすべてのＳＥＱ  ＩＤ３１１５〜３２４１；
（ｄ）参考文献２からの２１６０のアミノ酸配列ＮＭＢ０００１からＮＭＢ２１６０；
（ｅ）任意のサブタイプの、好ましくは組換え発現された、髄膜炎菌ＰｏｒＡタンパク質；
（ｆ）（ａ）から（ｅ）の改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など；または
（ｇ）好ましくはないが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの外膜小胞調製物［例えば、参考文献１７３参照］
のうちの１つ以上を含むポリペプチドが挙げられる。
【０１１９】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａポリペプチド抗原に加えて、前記組成物は、他の疾患または感染症に対する免疫処置のための抗原を含むことができる。例えば、前記組成物は、以下のさらなる抗原のうちの１つ以上を含むことができる：
−  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの糖抗原、例えば、血清群Ｃからの参考文献１１２に開示されている糖［参考文献１１３も参照のこと］または参考文献１１４に開示されている糖。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原［例えば、１１５、１１６、１１７］。
−  Ａ型肝炎ウイルスからの抗原、例えば不活化ウイルス［例えば、１１８、１１９］。
−  Ｂ型肝炎ウイルスからの抗原、例えば表面抗原および／またはコア抗原［例えば、１１９、１２０］。
−  ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイド［例えば、参考文献１２１の第３章］例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、１２２］。
−  破傷風抗原、例えば破傷風トキソイド［例えば、参考文献１２１の第４章］。
−  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの抗原、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＦＨＡ）、場合によりペルタクチンおよび／または凝集原２および３との組み合わせでも［例えば、参考文献１２３および１２４］。
−  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂからの糖抗原［例えば、１１３］。
−  ポリオ抗原（単数または複数）［例えば、１２５、１２６］例えばＩＰＶ。
−  麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原［例えば、参考文献１２１の第９、１０および１１章］。
−  インフルエンザ抗原（単数または複数）［例えば、参考文献１２１の第１９章］、例えば赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからの抗原［例えば、１２７］。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からのタンパク質抗原［例えば、１２８、１２９］。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からの糖抗原。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）からの抗原［例えば、１２９、１３０、１３１］。
−  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからの抗原［例えば、１３２］。
【０１２０】
前記組成物は、これらのさらなる抗原のうちの１つ以上を含み得る。
【０１２１】
毒性タンパク質抗原を、必要な場合には、無毒化することができる（例えば、化学的および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化［１２４］）。
【０１２２】
ジフテリア抗原を前記組成物に含める場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含めることが好ましい。従って、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０１２３】
糖抗原は、好ましくは、結合体の形態である。前記結合体のための担体タンパク質は、より詳細に下で論じる。
【０１２４】
前記組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度で存在するであろう。一般に、いずれの所与の抗原の濃度も、その抗原に対して免疫応答を惹起するために十分なものであろう。
【０１２５】
本発明の免疫原性組成物は、治療的に（すなわち、既存の感染症を処置するために）使用することもでき、予防的に（すなわち、将来の感染症を防ぐために）使用することもできる。
【０１２６】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質抗原の使用の代替として、該抗原をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えばプラスミド形態のもの）を使用することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｆＨＢＰ配列に加えて、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの１、２、３または４つからの結合体化した莢膜糖抗原を含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、ｆＨＢＰ配列に加えて、少なくとも１つの結合体化した肺炎球菌莢膜糖抗原を含む。
【０１２８】
髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡ
現行の血清群Ｃワクチン（ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ［１３３、１１２］、ＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ）は、結合体化した糖を含む。ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭは、ＣＲＭ１９７担体に結合体化したオリゴ糖抗原を有し、これに対してＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭは、破傷風トキソイド担体に結合体化した（脱−Ｏ−アセチル化した）完全な多糖を用いる。ＭｅｎａｃｔｒａＴＭワクチンは、血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡそれぞれからの結合体化した莢膜糖抗原を含有する。
【０１２９】
本発明の組成物は、髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡのうちの１つ以上からの莢膜糖抗原を含むことがあり、この場合、該抗原は、担体タンパク質（単数もしくは複数）に結合体化している、および／またはオリゴ糖である。例えば、前記組成物は、血清群Ｃ；血清群ＡおよびＣ；血清群Ａ、ＣおよびＷ１３５；血清群Ａ、ＣおよびＹ、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの；または血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４つすべてからの莢膜糖抗原を含み得る。
【０１３０】
１用量あたりの各髄膜炎菌糖抗原の典型的な量は、（糖として表して）１μｇと２０μｇの間、例えば約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇである。
【０１３１】
混合物が、血清群Ａと血清群Ｃの両方からの莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きいことがある（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより大きい）。
【０１３２】
混合物が、血清群Ｙと血清群ＣおよびＷ１３５の一方または両方とからの莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きいことがあり（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより大きい）、および／またはＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１未満であり得る（例えば、１：２、１：３、１；４、１；５、またはそれより低い）。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙからの糖の好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。血清群Ｃ：Ｗ１３５：Ｙからの糖の好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１；１：１：２；１：１：１；２：１：１；４：２：１；２：１：２；４：１：２；２：２：１および２：１：１である。実質的に等しい質量の各糖を使用することが好ましい。
【０１３３】
莢膜糖をオリゴ糖の形態で使用することができる。これらは、（例えば加水分解による）精製莢膜多糖のフラグメント化（通常は、この後に所望のサイズのフラグメントの精製が続くだろう）によって適便に形成される。
【０１３４】
多糖のフラグメント化は、好ましくは、オリゴ糖における３０未満（例えば、血清群Ａについては１０と２０の間、好ましくはおおよそ１０；血清群Ｗ１３５およびＹについては１５と２５の間、好ましくはおおよそ１５〜２０；血清群Ｃについては１２と２２の間；など）の最終平均重合度（ＤＰ）を生じさせるように行う。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによりまたは比色アッセイにより適便に測定することができる［１３４］。
【０１３５】
加水分解を行う場合、一般に、加水分解産物を寸法で分類して、短い長さのオリゴ糖を除去することとなる［１１３］。これは、様々な方法、例えば、限外濾過、その後のイオン交換クロマトグラフィー、で達成することができる。血清群Ａについては好ましくは約６以下の重合度を有するオリゴ糖を除去し、ならびに血清群Ｗ１３５およびＹについては好ましくはおおよそ４未満のものを除去する。
【０１３６】
ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭにおいて使用されているような、好ましいＭｅｎＣ糖抗原は、参考文献１１３に開示されている。
【０１３７】
糖抗原を化学修飾することができる。これは、血清群Ａについての加水分解の低減に特に有用である［１３５；下記参照］。髄膜炎菌糖の脱−Ｏ−アセチル化を行うことができる。オリゴ糖については、修飾を解重合の前に行ってもよいし、または後に行ってもよい。
【０１３８】
本発明の組成物がＭｅｎＡ糖抗原を含む場合、該抗原は、好ましくは、天然糖上のヒドロキシル基の１つ以上がブロッキング基によって置き換えられている修飾糖である［１３５］。この修飾は、加水分解に対する耐性を改善する。
【０１３９】
共有結合性結合体化（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）
本発明の組成物中の莢膜糖は、通常、担体タンパク質（単数または複数）に結合体化している。一般に、結合体化は、糖をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原へ変換させ、したがって免疫学的記憶に初回抗原刺激を充てるので、糖の免疫原性を強化する。結合体化は、小児用ワクチンに特に有用であり、周知の技術である。
【０１４０】
典型的な担体タンパク質は、細菌毒素、例えばジフテリアもしくは破傷風毒素、またはそれらのトキソイドもしくは変異体である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［１３６］は有用であり、ＰＲＥＶＮＡＲＴＭ製品における担体である。他の適する担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［１３７］、合成ペプチド［１３８、１３９］、熱ショックタンパク質［１４０、１４１］、百日咳タンパク質［１４２、１４３］、サイトカイン［１４４］、リンホカイン［１４４］、ホルモン［１４４］、成長因子［１４４］、様々な病原体由来抗原からの多数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピロープを含む人工タンパク質［１４５］、例えばＮ１９［１４６］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのプロテインＤ［１４７〜１４９］、ニューモリシン［１５０］またはその非毒性誘導体［１５１］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［１５２］、鉄取込みタンパク質［１５３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの毒素Ａまたは毒素Ｂ［１５４］、組換えＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［１５５］、などが挙げられる。
【０１４１】
任意の適する結合体化反応を、必要に応じて任意の適するリンカーと共に、用いることができる。
【０１４２】
前記糖は、典型的には、結合体化前に活性化または官能化される。活性化は、例えば、シアニル化試薬、例えばＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリミジニウムテトラフルオロボラート［１５６、１５７など］）を含み得る。他の適する技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性化エステル、ノルボラン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵなどを使用する。
【０１４３】
リンカー基による連結は、任意の公知の手順、例えば参考文献１５８および１５９に記載されている手順、を用いて行うことができる。他のタイプの連結は、多糖の還元アミノ化、得られたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一方の端とのカップリング、そしてその後、そのアジピン酸リンカー基のもう一方の端へのタンパク質のカップリングを含む［１６０、１６１］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［１６２］、ニトロフェニル−エチルアミン［１６３］、ハロアシルハリド［１６４］、グリコシド連結［１６５］、６−アミノカプロン酸［１６６］、ＡＤＨ［１６７］、Ｃ４からＣ１２部分［１６８］などが挙げられる。リンカーの使用の代替として、直接連結を用いることができる。タンパク質への直接連結は、例えば参考文献１６９および１７０に記載されているような、多糖の酸化、その後のタンパク質での還元アミノ化を含み得る。
【０１４４】
糖へのアミノ基の（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ２で置き換えることによる）導入、続いてアジビン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導体化、そして担体タンパク質との反応を含むプロセスが好ましい。もう１つの好ましい反応は、例えばＭｅｎＡまたはＭｅｎＣについて、プロテインＤ担体でのＣＤＡＰの活性化を用いる。
【０１４５】
外膜小胞
本発明の組成物は、ＯＭＶの典型的な特徴である、抗原の複合体も不明確な混合物も含むべきでないことが好適である。しかし、ｆＨＢＰはＯＭＶの効力を強化することが判っている［６］ので、特に、ＯＭＶ調製に使用される株において本発明のポリペプチドを、該ポリペプチドがＯＭＶ表面上に提示されるように、過剰発現させることにより、本発明をＯＭＶと併用することができる。
【０１４６】
このアプローチは、一般に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ微小小胞［１７１］、「天然ＯＭＶ」［１７２］、ブレブまたは外膜小胞［例えば、参考文献１７３から１７８、など］の調製を改善するために用いることができる。これらは、例えば免疫原性を増す（例えば免疫原を過剰発現する）ように、毒性を低減するように、莢膜多糖合成を阻害するように、ＰｏｒＡ発現をダウンレギュレートするように、等々、遺伝子操作された細菌から調製することができる［１７９〜１８２］。それらは、高ブレブ形成性の株（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）から調製することができる［１８３〜１８６］。非病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａからの小胞を含み得る［１８７］。ＯＭＶは、洗剤を使用せずに調製することができる［１８８、１８９］。それらは、それらの表面で非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質を発現することができる［１９０］。それらのＬＰＳを枯渇させることができる。それらを組換え抗原と混合することができる［１７３、１９１］。異なるクラスＩ外膜タンパク質サブタイプ（例えば、３つのサブタイプをそれぞれが提示する２つの異なる遺伝子操作小胞集団を使用して６つの異なるサブタイプ［１９２、１９３］、または３つのサブタイプをそれぞれが提示する３つの異なる遺伝子操作小胞集団を使用して９つの異なるサブタイプ、など）を有する細菌からの小胞を使用することができる。有用なサブタイプとしては、Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６が挙げられる。
【０１４７】
小胞が組成物中に存在する場合、その量をその小胞中の全タンパク質によって特定することができる。組成物は、１μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬの間、例えば１５μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬ、または好ましくは、より低い用量、例えば２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、の小胞を含むことができる。
【０１４８】
小胞についてのさらなる詳細は、下で与える。
【０１４９】
タンパク質発現
細菌発現技術は、当該技術分野において公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合することおよびコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５’末端の近位に通常は存在する転写開始領域を有するだろう。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２のドメインも有することがあり、このドメインは、ＲＮＡ合成が開始する隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複していることがある。遺伝子リプレッサータンパク質はオペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害することができるので、オペレーターは、ネガティブ調節（誘導性）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターなどのネガティブ調節エレメントの不在下で起こり得る。加えて、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列によってポジティブ調節を達成することができ、該配列は、存在する場合には通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写開始を助けるカタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）である［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節発現はポジティブであることまたはネガティブであることがあり、それにより、転写を増進することまたは低減することがある。
【０１５０】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、糖代謝酵素、例えばガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６］、およびマルトース、に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５］。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する。興味深いもう１つのプロモーターは、誘導性アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤ）である。
【０１５１】
加えて、天然に存在しない合成プロモーターも細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と接合して、合成ハイブリッドプロモーターを作ることができる［米国特許第４，５５１，４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレセッサーによって調節される、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃオペロン配列の両方から構成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌プロモーターとしては、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを挙げることができる。非細菌起源の天然に存在するプロモーターを、適合性ＲＮＡポリメラーゼとカップリングさせて、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルの発現を生じさせることもできる。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、カップリングされたプロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８２：１０７４］。加えて、ハイブリッドプロモーターは、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成される場合もある（ＥＰ−Ａ−０  ２６７  ８５１）。
【０１５２】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位は、原核生物における外来遺伝子の発現にも有用である。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、このリボソーム結合部位は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と該開始コドンの３ヌクレオチド〜１１ヌクレオチド上流に位置する３ヌクレオチド〜９ヌクレオチドの長さの配列とを含む。ＳＤ配列は、該ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間の塩基対合によってリボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．」Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させるために［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ］。
【０１５３】
プロモーター配列をＤＮＡ分子と直接連結することができ、この場合、Ｎ末端の第１のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望される場合には、Ｎ末端のメチオニンを、ブロモシアンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによってまたは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによって、タンパク質から切断することができる（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。
【０１５４】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンに対して３’に位置する、従って、プロモーターと共にコーディング配列に隣接する、調節領域である。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳することができるｍＲＮＡの転写を指示する。転写終結配列は、転写の終結を支援するステムループ構造を形成することができる約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含むことが多い。例としては、強力プロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｔｒｐ遺伝子、および他の生合成遺伝子）に由来する転写終結配列が挙げられる。
【０１５５】
通常、プロモーターとシグナル配列（所望される場合）と関心のあるコーディング配列と転写終結配列とを含む、上で説明した成分を、一緒に発現構築物の中に入れる。発現構築物は、多くの場合、レプリコン、例えば、細菌などの宿主中で安定して維持することができる染色体外エレメント（例えば、プラスミド）、中に維持される。レプリコンは複製システムを有するので、発現のためにまたはクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中にレプリコンを維持することができる。加えて、レプリコンは、高コピー数プラスミドである場合もあり、低コピー数プラスミドである場合もある。高コピー数プラスミドは、一般に、約５から約２００、通常、約１０から約１５０の範囲のコピー数を有するであろう。高コピー数プラスミドを含有する宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびさらに好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含有するであろう。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかを、該宿主に対する該ベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択することができる。
【０１５６】
あるいは、発現構築物を、組み込みベクターを使用して細菌ゲノムに組み込むことができる。組み込みベクターは、通常、該ベクターを組み込むことが可能である細菌染色体に相同な配列を少なくとも１つは含有する。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との組換えの結果として生ずるようである。例えば、様々なＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡを用いて構築された組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０１２７３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージ配列またはトランスポゾン配列から構成されることもある。
【０１５７】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択が可能である選択マーカーを含有することができる。選択マーカーを細菌宿主において発現させることができ、ならびに選択マーカーは、細菌をアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリンなどの薬物に対して耐性にさせる遺伝子を含むことができる［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２：４６９］。選択マーカーは、生合成遺伝子、例えばヒスチジン生合成経路におけるもの、トリプトファン生合成経路におけるものおよびロイシン生合成経路におけるもの、も含むことができる。
【０１５８】
あるいは、上で説明した成分のいくつかを、一緒に形質転換ベクターに入れることができる。形質転換ベクターは、上で説明したように、レプリコン中に維持されるまたは組み込みベクターに発展される選択マーカーから、通常、構成される。
【０１５９】
発現ベクターおよび形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか、は、多数の細菌への形質転換のために開発された。例えば、とりわけ、以下の細菌のための発現ベクターが開発された：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−００３６２５９およびＥＰ−Ａ−００６３９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ７７６、ＥＰ−Ａ−０  １３６  ８２９およびＥＰ−Ａ−０  １３６  ９０７］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。
【０１６０】
細菌宿主への外因性ＤＮＡの導入方法は当該分野において周知であり、通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤、例えば二価陽イオンおよびＤＭＳＯ、で処理した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡをエレクトロポレーションによって細菌細胞に導入することもできる。形質転換手順は、通常、形質転換すべき細菌種によって変わる。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−００３６２５９およびＥＰ−Ａ−００６３９５３；ＷＯ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］参照。
【０１６１】
宿主細胞
本発明は、本発明のポリペプチドを発現する細菌を提供する。前記細菌は、髄膜炎菌であり得る。前記細菌は、前記ポリペプチドを構成的に発現することがあるが、いくつかの実施形態において、発現は、誘導性プロモーターの制御下にあることがある。前記細菌は、前記ポリペプチドを過剰発現することがある（参考文献１９４参照）。前記ポリペプチドの発現は、相変異性（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）でないことがある。
【０１６２】
本発明は、本発明の細菌から調製される外膜小胞も提供する。本発明の細菌から小胞を生産するためのプロセスも提供する。これらの株から調製される小胞は、該小胞内に免疫学的に利用可能な（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）形態で存在するはずである本発明のポリペプチドを好ましくは含む、すなわち、本発明の精製ポリペプチドに結合することができる抗体も、該小胞内に存在するポリペプチドには結合できるはずである。
【０１６３】
これらの外膜小胞は、該外膜のタンパク質成分を含む小胞をそこから形成する髄膜炎菌外膜の破壊または髄膜炎菌外膜からのブレブ形成によって得られる、任意のプロテオリポソーム小胞（proteoliposomic vesicle）を含む。従って、この用語は、ＯＭＶ（時として「ブレブ」と呼ぶ）、微小小胞（ＭＶ［１９５］）および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［１９６］）を含む。
【０１６４】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌成長中に自発的に形成して培地に放出される、天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、ブロス培地でＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養すること、（例えば、濾過により、または細胞のみをペレット化し、より小さい小胞はペレット化しない低速遠心分離により）そのブロス培地中の全細胞をより小さなＭＶから分離すること、その後、（例えば、濾過により、ＭＶの示差沈降または凝集により、ＭＶをペレット化する高速遠心分離により）その細胞枯渇培地からＭＶを回収することによって得ることができる。ＭＶの生産に使用するための株は、一般に、培養中に生産されるＭＶの量に基づいて選択することができる。例えば、参考文献１９７および１９８には高いＭＶ生産を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａが記載されている。
【０１６５】
ＯＭＶは、細菌から人工的に調製され、洗剤処理を用いて（例えば、デオキシコラートで）または非洗剤手段によって（例えば、参考文献１９９参照）ＯＭＶを調製することができる。ＯＭＶを形成するための技術としては、胆汁酸塩洗剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、デオキシコール酸ナトリウム［２００および２０１］がＮｅｉｓｓｅｒｉａの処理に好ましい）での、該洗剤を沈殿させない十分な高さのｐＨ［２０２］での、細菌の処理が挙げられる。他の技術は、超音波処理、均質化、微小流動化（microfluidisation）、キャビテーション、浸透圧性ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンディングなどのような技術を用いて、実質的に洗剤不在下で行うことができる［１９９］。洗剤をまったく使用しないまたは少ない洗剤を使用する方法は、ＮｓｐＡなどの有用な抗原を保持することができる［１９９］。例えば、ある方法は、約０．５％以下、例えば約０．２％、約０．１％、＜０．０５％または０％、デオキシコール酸塩を有するＯＭＶ抽出緩衝液を使用することがある。
【０１６６】
ＯＭＶ調製の有用なプロセスは、参考文献２０３に記載されており、高速遠心分離ではなくその代わりに粗製のＯＭＶの限外濾過を含む。このプロセスには、限外濾過後の超遠心分離の段階が含まれる。
【０１６７】
本発明で使用するための小胞は、任意の髄膜炎菌株から調製することができる。前記小胞は、通常は血清群Ｂ株からのものであるが、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹなどのＢ以外の血清群からそれらを調製することが可能である（例えば、参考文献２０２には血清群Ａについてのプロセスが開示されている）。前記株は、任意の血清型（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型、および任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０；など）のものであり得る。前記髄膜炎菌は、超侵襲性および超強毒性系統、例えば、次の７つの超強毒性系統：亜群Ｉ；亜群ＩＩＩ；亜群ＩＶ−１；ＥＴ−５複合体；ＥＴ−３７複合体；Ａ４クラスター；系統３を含めて、任意の適する系統からのものであり得る。
【０１６８】
本発明の細菌は、本発明のポリペプチドをコードすることに加えて、１つ以上のさらなる修飾を有することがある。例えば、それらは、修飾ｆｕｒ遺伝子［２０４］を有することがある。参考文献２１２には、ｎｓｐＡ発現が、付随するｐｏｒＡとｃｓｐのノックアウトでアップレギュレートされるはずであること、およびこれらの修飾を用いることができることが教示されている。さらに、ＯＭＶ生産のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのノックアウト変異体が、参考文献２１２および２１４に開示されている。参考文献２０５には、６つの異なるＰｏｒＡサブタイプを発現するように修飾された株からの小胞の構築が開示されている。ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成される低い内毒素レベルを有する変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａも使用することができる［２０６、２０７］。これらまたは他の変異体は、すべて、本発明で使用することができる。
【０１６９】
従って、本発明で使用する株は、いくつかの実施形態では、１つより多くのＰｏｒＡサブタイプを発現することができる。６価および９価のＰｏｒＡ株が以前に構築されている。株は、ＰｏｒＡサブタイプ：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１および／またはＰ１．１８−１，３，６のうちの２、３、４、５、６、７、８または９つを発現することができる。他の実施形態において、株はＰｏｒＡ発現についてダウンレギュレートされていることがあり、例えば、この場合、ＰｏｒＡの量は、野生型レベルに比べて（例えば株Ｈ４４／７６に比べて）、少なくとも２０％（例えば、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、など）低減されており、またはノックアウトされていることさえある。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、株は、一定のタンパク質を（対応する野生型株に比べて）過剰発現することができる。例えば、株は、ＮｓｐＡ、プロテイン２８７［２０８］、ｆＨＢＰ［１９４］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２０９］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドディスムスターゼ［２０９］、ＨｍｂＲなどを過剰発現することができる。
【０１７１】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を細菌染色体に組み込むことができ、または本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、エピソーム形態で、例えばプラスミド内に、存在することができる。
【０１７２】
有利には、小胞生産のために、前記ポリペプチドの発現が相変異を確実に受けないように髄膜炎菌を遺伝子操作することができる。髄膜炎菌における遺伝子発現の相変異性を低減するまたはそれを無くす方法は、参考文献２１０に開示されている。例えば、遺伝子を構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下に置くことができ、またはその相変異性の原因となるＤＮＡモチーフを除去または置き換えることによる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、株は、参考文献２１１から２１４に開示されているノックアウト変異および／または過剰発現変異のうちの１つ以上を含み得る。ダウンレギュレーションおよび／またはノックアウトのために好ましい遺伝子としては、：（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ［２１１］；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ［２１２］；（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ［２１３］；ならびに（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢ、および／またはＳｙｎＣ［２１４］が挙げられる。
【０１７４】
変異体株を使用する場合、いくつかの実施形態において、それは、以下の特徴のうちの１つ以上、またはすべて、を有することがある：（ｉ）髄膜炎菌ＬＯＳを短縮するためのダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）アップレギュレートされたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）アップレギュレートされたＮｈｈＡ；（ｉｖ）アップレギュレートされたＯｍｐ８５；（ｖ）アップレギュレートされたＬｂｐＡ；（ｖｉ）アップレギュレートされたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）ダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）ダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）ダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）欠失されたｃｐｓ遺伝子複合体。短縮されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないものであり得る、例えば、ガラクトース欠損ＬＯＳであり得る。ＬＯＳは、α鎖を有さないことがある。
【０１７５】
小胞の調製に使用する髄膜炎菌株に依存して、それらは、その株の天然ｆＨＢＰ抗原を含むことがあり、または含まないことがある［２１５］。
【０１７６】
ＬＯＳが小胞内に存在する場合、小胞をそのＬＯＳおよびタンパク質成分に連結するように処理することが可能である（「ブレブ内（ｉｎｔｒａ−ｂｌｅｂ）」結合体化［２１４］）。
【０１７７】
一般
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）ことがあり、または何かの追加、例えば、Ｘ＋Ｙ、を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）ことがある。
【０１７８】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１７９】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙが「実質的に無い」組成物には、Ｙが完全に無いことがある。必要に応じて、語「実質的に」を本発明の定義から割愛してもよい。
【０１８０】
「配列同一性」は、パラメーター・ギャップ開始ペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１でアフィンギャップ検索を用いて、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより、好ましくは、決定する。
【０１８１】
血清群の後、髄膜炎菌類分類は、血清型、血清亜型そしてその後、免疫型を含み、標準的な命名法により、血清群、血清型、血清亜型、および免疫型をそれぞれコロンで区切って列挙する、例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９。血清群Ｂの中には、しばしば疾患を引き起こす（超侵襲性）系統もあり、他の系統より重篤な形態の疾患を引き起こす（超強毒性）系統もあり、疾患をごく稀にしか引き起こさない系統もある。７つの超強毒性系統、すなわち、亜群Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスターおよび系統３、が認知されている。これらは、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されているが、髄膜炎菌を分類するために多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）も用いられている［参考文献３０］。４つの主要な超強毒性クラスターは、ＳＴ３２複合体、ＳＴ４４複合体、ＳＴ８複合体、およびＳＴ１１複合体である。
【０１８２】
一般に、本発明は、特に参考文献４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および２１６に開示されている様々なｆＨＢＰ配列を包含しない。
【発明を実施するための形態】
【０１８３】
実施例１
野生型ＭＣ５８配列（配列番号１）をベースラインとして用いて、参考文献１５は７２の修飾ｆＨＢＰ配列を調製した。これらは、配列番号４から７５であった。類似の設計経路により、本発明者らは、今般、配列番号７７および７８を提供する。
【０１８４】
Ｎ末端メチオニンのすぐ後に配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）のアミノ酸配列が続くポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。それらのポリペプチドを、時としてＩＣ３１ＴＭも含めた水酸化アルミニウムアジュバントと併せ、その後、それらを用いてマウスに免疫処置を施した。マウスからの抗血清を、髄膜炎菌株のパネルに対する殺菌アッセイで試験した。前記パネルは、３つのｆＨＢＰファミリーのそれぞれからの株を含んでいた。ファミリーＩおよびＩＩからの野生型ＭＣ５８ポリペプチドも比較のためにマウスへの免疫処置に用いた。
【０１８５】
配列番号７８を含むポリペプチドは、特に良好な結果をもたらした。このポリペプチドに対する血清は、５つの異なるファミリーＩ株（ＭＣ５８、ＮＭ００８、Ｍ４０３０、ＧＢ１８５、ＮＺ）および４つの異なるファミリーＩＩ株（９６１−５９４５、Ｍ３１５３、Ｃ１１、Ｍ２５５２）に対して殺菌性であった。これらの力価は、それらの株に対して、特定のファミリーからの野生型配列を使用したときより概ね低かったが、いずれの野生型配列も良好なファミリー間殺菌活性を示さなかった。従って、これらの修飾は、ｆＨＢＰの株交差保護を有効に増加させる。
【０１８６】
実施例２
様々な修飾ｆＨＢＰ配列が（ｉ）互いに；（ｉｉ）野生型ｆＨＢＰ配列に；または（ｉｉｉ）他の髄膜炎菌抗原に融合されている。これらをＣ末端ポリ−ヒスチジンタグと伴にまたは伴わずに発現させ、ＩＭＡＣを使用してＥ．ｃｏｌｉから精製した。
【０１８７】
それらの融合タンパク質は、４つのカテゴリーに分けられた：（ａ）同じであるまたは異なることがある２つの修飾ｆＨＢＰ配列の融合体；（ｂ）同じであるまたは異なることがある３つの修飾ｆＨＢＰ配列の融合体；（ｃ）１つまたは２つの修飾ｆＨＢＰ配列への野生型ｆＨＢＰ配列の融合体；および（ｄ）非ｆＨＢＰ髄膜炎菌抗原への修飾ｆＨＢＰ配列の融合体。これらの様々な融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
（ａ）同じであるまたは異なることがある２つの修飾ｆＨＢＰ配列の融合体
９Ｃ−９Ｃ．．．．．．．．．．．．．．配列番号１３２
１０Ａ−１０Ａ．．．．．．．．．．．．配列番号１３４
１０Ａ−９Ｃ．．．．．．．．．．．．．配列番号１３５
８Ｂ−８Ｂ．．．．．．．．．．．．．．配列番号１３８
９Ｃ−１０Ａ．．．．．．．．．．．．．配列番号１３３
（ｂ）同じであるまたは異なることがある３つの修飾ｆＨＢＰ配列の融合体
１０Ａ−１０Ａ−１０Ａ．．．．．．．．配列番号１１３
１０Ａ−１０Ａ−９Ｃ．．．．．．．．．配列番号１１７
１０Ａ−９Ｃ−１０Ａ．．．．．．．．．配列番号１１２
１０Ａ−９Ｃ−９Ｃ．．．．．．．．．．配列番号１１８
８Ｂ−８Ｂ−８Ｂ．．．．．．．．．．．配列番号１２３
９Ｃ−１０Ａ−１０Ａ．．．．．．．．．配列番号１０５
９Ｃ−１０Ａ−９Ｃ．．．．．．．．．．配列番号１０８
９Ｃ−９Ｃ−１０Ａ．．．．．．．．．．配列番号１０４
９Ｃ−９Ｃ−９Ｃ．．．．．．．．．．．配列番号１０７
（ｃ）１つまたは２つの修飾ｆＨＢＰ配列への野生型ｆＨＢＰ配列の融合体
１０Ａ−ＭＣ５８．．．．．．．．．．．配列番号１３１
１０Ａ−１０Ａ−ＭＣ５８．．．．．．．配列番号１１４
１０Ａ−ＭＣ５８−１０Ａ．．．．．．．配列番号１１５
１０Ａ−ＭＣ５８−９Ｃ．．．．．．．．配列番号１１６
１０Ａ−９Ｃ−ＭＣ５８．．．．．．．．配列番号１１１
ＭＣ５８−１０Ａ．．．．．．．．．．．配列番号１３７
ＭＣ５８−１０Ａ−１０Ａ．．．．．．．配列番号１２１
ＭＣ５８−１０Ａ−９Ｃ．．．．．．．．配列番号１１９
ＭＣ５８−９Ｃ．．．．．．．．．．．．配列番号１３６
ＭＣ５８−９Ｃ−１０Ａ．．．．．．．．配列番号１２０
ＭＣ５８−９Ｃ−９Ｃ．．．．．．．．．配列番号１２２
９Ｃ−１０Ａ−ＭＣ５８．．．．．．．．配列番号１０９
９Ｃ−ＭＣ５８．．．．．．．．．．．．配列番号１３０
９Ｃ−ＭＣ５８−１０Ａ．．．．．．．．配列番号１０６
９Ｃ−ＭＣ５８−９Ｃ．．．．．．．．．配列番号１１０
９Ｃ−９Ｃ−ＭＣ５８．．．．．．．．．配列番号１０３
（ｄ）非ｆＨＢＰ髄膜炎菌抗原への修飾ｆＨＢＰ配列の融合体。例えば：
９３６−１０Ａ−１０Ａ．．．．．．．．配列番号１２６
９３６−１０Ａ−９Ｃ．．．．．．．．．配列番号１２５
９３６−９Ｃ−１０Ａ．．．．．．．．．配列番号１２４
９３６−９Ｃ−９Ｃ．．．．．．．．．．配列番号１２７
９３６−１０Ａ．．．．．．．．．．．．配列番号１２９
９３６−９Ｃ．．．．．．．．．．．．．配列番号１２８
ＮＢ：１０Ａ配列は、配列番号２３であり；９Ｃ配列は、配列番号２０であり；８Ｂ配列は、配列番号１７であり；ＭＣ５８配列は、配列番号９７（すなわち、配列番号：１のアミノ酸２７−２７４）であり；および９３６配列は、その固有Ｎ末端メチオニンを含む、配列番号９８である。
【０１８８】
例えば、９Ｃ−９Ｃ融合体を作製するために、ＰＡＴＣＨ＿９Ｃ（配列番号２０）をコードする配列をＢａｍＨＩ制限部位およびグリシンリンカー（従って、配列番号８１をコードする）によって、コーディング配列の第二のコピーに連結し、続いてＸｈｏＩ制限部位およびＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（配列番号９５）に連結した。上流配列がＮ末端メチオニンを提供して、以下の最終発現５１１−ｍｅｒ配列（配列番号１３２を含む、配列番号９９）を得た：
【０１８９】
【化４】
2013502918.tif 000005
【０１９０】
同様に、１０Ａ−１０Ａ−１０Ａ融合体を作製するために、ＰＡＴＣＨ＿１０Ａ（配列番号２３）をコードする３つの配列をＢａｍＨＩ制限部位およびグリシンリンカー（従って、配列番号８１をコードする）によって連結し、続いてＸｈｏＩ制限部位およびＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（配列番号９５）に連結した。上流配列がＮ末端メチオニンを提供して、以下の最終発現７６２−ｍｅｒ配列（配列番号１１３を含む、配列番号１００）を得た：
【０１９１】
【化５】
2013502918.tif 000006
【０１９２】
同様に、１０Ａ−ＭＣ５８融合体を作製するために、ＰＡＴＣＨ＿１０Ａ（配列番号２３）をコードする配列をＢａｍＨＩ制限部位およびグリシンリンカー（従って、配列番号８１をコードする）によって、ＭＣ５８配列（配列番号９７をコードする）に連結し、続いてＸｈｏＩ制限部位およびＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（配列番号９５）に連結した。上流配列がＮ末端メチオニンを提供して、発現５０９−ｍｅｒ配列（配列番号１３１を含む、配列番号１０１）を得た：
【０１９３】
【化６】
2013502918.tif 000007
【０１９４】
同様に、９３６−９Ｃ融合体を作製するために、９３６（配列番号９８）をコードする配列をＢａｍＨＩ制限部位およびグリシンリンカー（従って、配列番号８１をコードする）によって、ＭＣ５８配列（配列番号９７をコードする）に連結し、続いてＸｈｏＩ制限部位およびＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（配列番号９５）に連結した。上流配列がＮ末端メチオニンを提供して、以下の最終発現４４２−ｍｅｒ配列（配列番号１２８を含む、配列番号１０２）を得た：
【０１９５】
【化７】
2013502918.tif 000008
【０１９６】
融合タンパク質を使用してマウスに免疫処置を施した。比較のため、次の抗原も使用した：株ＭＣ５８または２９９６からの野生型ｆＨＢＰ；修飾ｆＨＢＰ  ９Ｃまたは１０Ａ；ならびに参考文献１３に開示されているようなファミリーＩ、ファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩのハイブリッドも使用した。得られた血清を、ｆＨＢＰファミリーＩ、ｆＨＢＰファミリーＩＩおよびｆＨＢＰファミリーＩＩＩからの株のパネルに対する殺菌活性について試験した。ミョウバン＋ＩＣ３１ＴＭの混合物をアジュバントとして使用する２回の免疫処置後、力価は、以下のとおりであった；
【０１９７】
【表１】
2013502918.tif 000009
【０１９８】
ＭＣ５８（ファミリーＩ）配列および２９９６（ファミリーＩＩ）配列は、相同なｆＨＢＰを有する株に対してしか効力を示さないが、株交差効力は、本発明の融合タンパク質ではるかに向上される。さらに、修飾９Ｃおよび１０Ａ配列の効力は、それらを９３６または野生型ＭＣ５８  ｆＨＢＰ配列に融合することにより向上される。９Ｃ−１０Ａ−９Ｃ融合体は、全パネルを通して非常に良好な結果を示す。
【０１９９】
従って、修飾配列の他の抗原への融合は、抗髄膜炎菌免疫応答を惹起するそれらの能力を向上させる一般的方法をもたらす。
【０２００】
アジュバント研究
株２９９６からの野生型ｆＨＢＰ配列と共に、ＰＡＴＣＨ＿２Ｓポリペプチド、ＰＡＴＣＨ＿５ｂｉｓポリペプチド、ＰＡＴＣＨ＿５ｐｅｎｔａポリペプチド、ＰＡＴＣＨ＿９Ｃポリペプチド、ＰＡＴＣＨ＿９ＦポリペプチドおよびＰＡＴＣＨ＿１０Ａポリペプチドを使用して、水酸化アルミニウム（Ａｌ−Ｈ）および／またはＩＣ３１ＴＭアジュバント（単数または複数）を用いてマウスに免疫処置を施した。１０の異なる髄膜炎菌株のパネルに対して血清を試験した。
【０２０１】
Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１ＴＭの組み合わせは、ＰＡＴＣＨ＿９Ｃおよび／またはＰＡＴＣＨ＿１０Ａおよび／または野生型ＭＣ５８  ｆＨＢＰ配列および／または９３６抗原を含有する融合タンパク質で試験したとき、Ａｌ−Ｈ単独より良好な結果、例えば、ＰＡＴＣＨ＿１０Ａ（配列番号１８）の２つのコピーに融合した９３６を含有する融合タンパク質を使用したとき、Ａｌ−Ｈでのわずか１／１０株に対する効力を９／１０株に対する効力に変える結果、をもたらした。
【０２０２】
９３６−１０Ａ−１０Ａ配列または９３６−９Ｃ−１０Ａ配列を使用して、１０株のパネルに対する殺菌力価は、以下のとおりであった：
【０２０３】
【表２】
2013502918.tif 000010
【０２０４】
したがって、１つの例外を除き、ＩＣ３１の追加は力価を向上させた。
【０２０５】
９３６−１０Ａ−１０Ａ
９３６−１０Ａ−１０Ａ融合体をさらなる研究のために選択した（すなわち、配列番号１２６）。このポリペプチドを、Ａｌ−Ｈを用いて、９ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌと１０ｍＭのヒスチジンを含む組成物、ｐＨ６．５、に調合した。注射用蒸留水およびヒスチジン緩衝液を混合し、その後、ＮａＣｌを添加して、３０８ｍＯｓｍ／ｋｇの最終重量オスモル濃度にした。Ａｌ−Ｈを添加して、３ｍｇ／ｍＬの最終Ａｌ＋＋＋濃度にした。ポリペプチドを添加して、１００μｇ／ｍＬの最終濃度にし、１５分間、攪拌しながら室温で放置し、その後、一晩、４℃で保管した。投与の直前に、ＩＣ３１ＴＭ（２５：１のペプチド：ＤＮＡモル比で；１μｍｏｌペプチド）を水性懸濁液として添加した（等体積を混合）。最終混合物は、等張性であり、生理ｐＨであった。ポリペプチド吸着は、＞９０％であった（Ａｌ−Ｈのみで観察されるレベルに類似）。
【０２０６】
動物（６週齢ＣＤ１雌マウス）、１群に８匹、に２０μｇのアジュバント添加ポリペプチドを第０日に腹腔内に与え、第２１日および第３５日に，追加抗原量を与えた。分析のための血液サンプルを第４９日に採取し、ウサギ補体またはヒト補体の存在下で殺菌アッセイにより１１の髄膜炎菌株のパネルに対して分析した。力価は、以下のとおりであった：
【０２０７】
【表３】
2013502918.tif 000011
【０２０８】
９３６−１０Ａ−１０ＡポリペプチドがＣ末端ポリヒスチジンタグを有していようと、いまいと、同様の結果が観察されたが、使用したアジュバントに依存して、ヒスチジンタグを有する９３６−１０Ａ−１０Ａポリペプチドを使用したときに良好な力価が観察されることもあった。
【０２０９】
９３６−１０Ａ−１０Ａポリペプチドの代わりに、参考文献１０８に開示されている「５ＣＶＭＢ」ワクチン中の「９３６−ｆＨＢＰ」ポリペプチドを用いて、配列番号９０、１３９および１２６のアミノ酸配列を有する３つのポリペプチドの混合物を得た。この混合物を、以後、「５ＣＶＭＢ＊」と呼ぶ。殺菌力価は同様であったが、上記のように、使用したアジュバントに依存して、ヒスチジンタグを有する９３６−１０Ａ−１０Ａポリペプチドを使用したときに良好な力価が観察されることもあった。
【０２１０】
９３６−１０Ａ−１０ＡがＣ末端ヒスチジン精製タグを有する５ＣＶＭＢ＊混合物を、ＭｅＮＺＢＴＭワクチンからの２．５μｇ（タンパク質として測定して）の外膜小胞と併せた。この混合物（「５ＣＶＭＢ＊＋１／４ＯＭＶ」）を５ＣＶＭＢ＊単独と比較し、５ＣＶＭＢと比較し、または１０μｇのＯＭＶと組み合わせた５ＣＶＭＢと比較した。これら４つの組成物での免疫処置後に得た血清を、１３の株のパネルに対する殺菌活性について試験した。９３６−１０Ａ−１０Ａでの５ＣＶＭＢの９３６−ｆＨＢＰポリペプチドの代用は、ＯＭＶの存在下または不在下で、株適用範囲を改善し、殺菌力価が≧１０２４であった株の百分率は、５ＣＶＭＢと比較して５ＣＶＭＢ＊でのほうが７パーセントポイント高く、５ＣＶＭＢ＋ＯＭＶと比較して５ＣＶＭＢ＊＋１／４ＯＭＶでのほうが１５パーセントポイント高かった。異なる株パネルを使用すると、異なる結果が観察された。
【０２１１】
ＮＬ０９６ハイブリッド
参考文献１５には「ＮＬ０９６」と呼ばれるｆＨＢＰ配列が開示されている（本明細書での配列番号７６）。このｆＨＢＰタンパク質は、１１株のパネルのほぼすべてにわたって殺菌性である血清をもたらすことができ、水酸化アルミニウムアジュバントを使用すると、ＮＬ０９６によって達成される株適用範囲は、ＰＡＴＣＨ＿１０Ａによって達成される適用範囲に勝る。
【０２１２】
例えば、
９３６−１０Ａ−ＮＬ０９６．．．．．．配列番号１４０
９３６−ＮＬ０９６−Ｐ１０Ａ．．．．．配列番号１４１
９３６−ＮＬ０９６−ＮＬ０９６．．．．配列番号１４２
を含む、ＮＬ０９６配列のハイブリッドを設計した。
【０２１３】
Ｎ末端配列を有する（例えば、単一メチオニン残基を有する）および／またはＣ末端ヒスチジンタグ、例えばＣ末端への配列番号９６の付加、を有するこれら３つの配列それぞれを、発現させることができる。
【０２１４】
本発明を単なる例として上で説明しており、本発明の範囲および精神を維持しながら変更を加えることができることは理解されるであろう。
【０２１５】
【化８】
2013502918.tif 000012
【０２１６】
【化９】
2013502918.tif 000013
【０２１７】
【化１０】
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【０２１８】
【化１１】
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【０２１９】
【化１２】
2013502918.tif 000016
【０２２０】
【化１３】
2013502918.tif 000017
【０２２１】
【表４】
2013502918.tif 000018
【配列表】
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【国際調査報告】
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2013502918.tif 000022
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