(57)【要約】  本発明は、n-プロパノールを製造するための発酵法を提供する。本発明の方法は、適切な炭素源、ジカルボン酸経路を発現している微生物、還元等価物および、プロピオン酸/プロピオニルCoAのn-プロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を提供することを含む。本方法はさらに、n-プロパノールの製造に好ましい条件下で微生物と炭素源および還元等価物とを接触させることを含む。n-プロパノールからプロピレンおよびポリプロピレンを製造する方法および、本発明の方法に使用するのに適した微生物もまた提供される。【選択図】          図４
2013503647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ジカルボン酸経路を発現している微生物による発酵のための適切な炭素源、還元等価物および、プロピオン酸/プロピオニルCoAのn-プロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を用意し;
(b)微生物によるn-プロパノールの製造に好ましい条件下で微生物と炭素源および還元等価物とを接触させ、それによって発酵液を製造し;
(c)発酵液からn-プロパノールを回収すること
を含むn-プロパノールの製造方法。
【請求項２】
微生物が1以上の酵素を発現するように遺伝子操作され、それによって前記微生物がプロピオン酸/プロピオニルCoAをn-プロパノールに変換することができる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
プロピオニゲニウム種、プロピオニスピラ・アルボリス、プロピオニバクテリウム種およびセレノモナスからなる群から微生物が選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
基質としてプロピオン酸を用いることができるアルデヒド脱水素酵素;
基質としてアシルCoA中間体を用いることができるアルデヒド脱水素酵素;
アルデヒドのその対応する第一級アルコールへの変換を触媒するアルコール脱水素酵素;および
アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼドメインの両方を有する多機能性酵素
からなる群から酵素が選択される、請求項2記載の方法。
【請求項５】
酵素が、e値のしきい値が1e-2以下であるアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質ドメインを有する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
酵素が、e値のしきい値が1e-2以下であるアルデヒド脱水素酵素タンパク質ドメインを有する、請求項4記載の方法。
【請求項７】
基質としてプロピオン酸を用いることができるアルデヒド脱水素酵素が、ムス・ムスクルス(GenBankアクセッション番号AC162458.4);クロストリジウム・ボツリヌム(A株)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)番号3502(GenBankアクセッション番号AM412317.1);およびサッカロミセス・セレビシエ(GenBankアクセッション番号EU255273.1)からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
基質としてアシルCoA中間体を用いることができるアルデヒド脱水素酵素が、ロドコッカス・オパクス(GenBankアクセッション番号AP011115.1);エンタモエバ・ディスパル(GenBankアクセッション番号DS548207.1);およびラクトバチルス・ロイテリ(GenBankアクセッション番号ACHG01000187.1)からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
アルデヒドのその対応する第一級アルコールへの変換を触媒するアルコール脱水素酵素が、アスペルギルス・ニガー(GenBankアクセッション番号AM270229.1);ストレプトコッカス・ニューモニエ(Taiwan19F-14株)(GenBankアクセッション番号CP000921.1);およびサルモネラ・エンテリカ(GenBankアクセッション番号CP001127.1)からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼドメインの両方を有する多機能性酵素が、ラクトバチルス・サケイ(GenBankアクセッション番号CR936503.1);ジアルディア・インテスティナリス(GenBankアクセッション番号U93353.1);シュワネラ・アマゾネンシス(GenBankアクセッション番号CP000507.1);サーモシネココッカス・エロンガツス(GenBankアクセッション番号BA000039.2);クロストリジウム・アセトブチリクム(GenBankアクセッション番号AE001438.3);およびクロストリジウム・カルボキシディボランスATCC番号BAA-624T(GenBankアクセッション番号ACVI01000101.1)からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
発酵液がエタノールおよび/またはイソプロパノールをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
エタノールおよび/またはイソプロパノールが発酵液から回収される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
微生物が、活性が減少するように改変された酵素酢酸キナーゼ(E.C. 2.7.2.1)をコードするその遺伝子の発現を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
還元等価物がNAD(P)Hを含む、請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
電極およびメディエーター分子、高圧のH2または、ギ酸の存在下でNAD+依存性ギ酸脱水素酵素を発現する微生物の使用を含む、NAD(P)+がNAD(P)Hに還元される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
発酵液と電極およびメディエーター分子とを接触させることをさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
メディエーター分子がベンジルビオロゲン、メチルビオロゲン、アントラキノン2,6-ジスルホン酸、ニュートラルレッド、コバルトセプルクラート、1,4ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸(DHNA)およびフラビンである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
メディエーター分子が、酵母抽出物およびプロピオニバクテリウム種抽出物に存在する化合物である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
炭素源が、任意の形態のサトウキビ搾汁、サトウキビ糖蜜、加水分解デンプン、加水分解リグノセルロース系材料、グルコース、ショ糖、フルクトース、乳酸、ラクトース、キシロースもしくはグリセロールまたはそれらの混合物である、請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか1つに記載の方法に使用される微生物。
【請求項２１】
請求項1〜19のいずれか1つに記載の方法によって製造されるn-プロパノールを脱水してプロピレンを製造することを含む、プロピレンの製造方法。
【請求項２２】
請求項1〜19のいずれかに記載の方法によって製造されるn-プロパノールおよびイソプロパノールおよび/またはエタノールを同じリアクター内で脱水してプロピレンを製造することを含む、プロピレンの製造方法。
【請求項２３】
請求項21および22のいずれか1つに記載の方法によって製造されるプロピレンを重合させてポリプロピレンを製造すること含む、ポリプロピレンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵中にNAD(P)H型還元等価物を供給する方法と組み合わせて、遺伝子改変微生物を用いて生物起源(biobased)基質(例えばサトウキビ搾汁、加水分解デンプン、加水分解セルロースまたはグリセロール)をn-プロパノールに生物変換する方法に関する。こうして得られる生物起源n-プロパノールを、脱水してプロピレンに変換し、重合させてポリプロピレンに変換することによってバイオプラスチックにすることができる。
【背景技術】
【０００２】
n-プロパノール(1-プロパノール、第一級プロピルアルコール、プロパン-1-オール)は、印刷用インク、コーティング、洗剤、接着剤、除草剤、殺虫剤、医薬品、融氷液などの産業において、そしてエステル、プロピルアミン、ハロゲン化物および熱可塑性樹脂の製造のための化学中間体として多数の用途を有する、水および他の通常の溶媒と自由に混和できる無害の溶媒である。混合燃料におけるn-プロパノールの使用もまた示唆されている(米国特許第6,129,773号)。なぜなら、このアルコールは、Barannik V. P. et al. 2005, Chemistry and Technology of Fuels and Oils 41(6): 452-455によれば、アンチノック剤としてガソリンのオクタン価を上げるために用いられる場合、エタノールと同様な能力を有するからである。
【０００３】
n-プロパノールは、“フーゼル油”または“ジャガイモ油”の主成分の1つであり、酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)によるエタノール発酵の高級アルコール副生成物である(Hazelwood et al. 2008. The Ehrlich Pathway for Fusel Alcohol Production: a Century of Research on Saccharomyces cerevisiae Metabolism. Applied and Environmental Microbiology 74(8): 2259-2266)。従来、n-プロパノールはフーゼル油の分別蒸留によって得られたが、今日では、オキソ法(Oxo Process)として知られる、コバルトまたはロジウムカルボニルの存在下、80〜120℃および2.0MPaでのエチレンのヒドロホルミル化とそれに続く銅-クロム、ニッケル-クロムまたは多孔質コバルト触媒を用いる、得られたプロピオンアルデヒドの水素化を含む2段階法で化石原料から製造される(米国特許第4,263,449号および米国特許第5,866,725号)。
【０００４】
近年、特に、燃料としてあるいは石油化学産業のためのバルク化学物質として使用できる化合物に関して、世界中において、再生可能原料から製造される有機化合物への興味が大変増している。後者は特に興味が持たれる。なぜなら、これらの化合物は、再生可能な高耐久性材料中に固定でき、従って大気中のCO2を効果的に削減することができるからである(Rincones et al. 2009. The golden bridge for nature: the new biology applied to bioplastics. Polymer Reviews 49: 85-106)。従って、再生可能原料から得られる化学品の使用は、我々の社会の化石炭素源依存の抑制を目的とする実現可能な代替物としてますます受け入れられ、広まっている。技術規範ASTM D6866-06:“Standard Test Methods for Determining the Biobased Content of Natural Range Materials Using Radiocarbon and Isotope Ratio Mass Spectrometry Analysis”に記載されている方法論に従えば、グリーン(green)供給源から得られた製品は、それらの再生可能炭素含有量で証明することができる。
【０００５】
短鎖有機溶媒(主に還元されたアルコール)の微生物発酵による製造は広範に研究されてきた。最もめざましい例は汎用化学物質としてのエタノールの製造であり、これはおおよそ9000万m3/年に達し、酵母サッカロミセス・セレビシエによる再生可能炭素源(主にコーンスターチおよびサトウキビ搾汁)の発酵によって行われる主要な産業プロセスである。この方法は極めて効率的であり、発酵液から蒸留されるエタノールが理論収量の90〜95%で得られるところまで改善されている。こうして製造されたエタノールは産業溶媒、混合燃料中のガソリンの主要な添加剤として用いられ、ブラジルにおいては、小型車の単一燃料として用いられている。生物起源エタノールのもう1つの使用には、Morschbacker A. L. 2009, Bio-Ethanol Based Ethylene, Journal of Macromolecular Science, Part C: Polymer Reviews, 49:79-84 の記載に従った、脱水反応によるポリエチレン製造においてモノマーとして使用されるバイオエチレンの製造がある。
【０００６】
発酵による溶媒製造の他の公知例には、クロストリジウム属(Clostridium)の一部の細菌種によって行われるアセトン-ブタノール-エタノール(ABE)およびイソプロパノール-ブタノール-エタノール(IBE)発酵があり、35質量%を超える溶媒混合物が得られる(米国特許第5,192,673号)。さらに、クレブシエラ属(Klebsiella)およびエンテロバクター属(Enterobacter)の腸内細菌による炭水化物からの2,3-ブタンジオールの発酵の収率は47質量%までにも上る(Ji et al., 2009, Bioresource Technologies 100:3410-3414)。最近の成功は、単一微生物でのグルコースからの1,3プロパンジオールの高収率(35質量%)および高力価(129g/L)の発酵生産である(米国特許第7,169,588B2号;米国特許第7,067,300B2号;米国特許第5,686,276号)。コーンスターチからのこの低コストの生物起源1,3プロパンジオールの製造のための産業プロセスの確立およびポリエステル繊維ポリプロピレンテレフタラートの製造におけるその後のその使用は、生体高分子の製造における今日までの最も著しい進歩の1つとなっている。
【０００７】
n-プロパノールおよびイソプロパノールは、脱水によるプロピレンの製造およびその後のそれのポリプロピレンへの重合のための興味ある生物起源中間体である。今日まで、イソプロパノールの最高収率は、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)のアセトン生成経路の酵素およびクロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)のイソプロパノール生成経路の第2アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子操作された大腸菌株によって、グルコースからイソプロパノールが14質量%の収率で得られている(国際公開番号WO2008/131286 A1)。この収率は理論上の最大値のおおよそ50%に相当する。なぜなら、提唱されているイソプロパノールの生成経路は、以下の変換:a)解糖によるピルビン酸(pyruvate)2分子へのグルコースの切断;b)ピルビン酸分子のアセチルCoAへの酸化的脱炭酸;c)アセチルCoA 2分子のアセトアセチルCoAおよびCoAへの縮合;d)アセトアセチルCoAおよび酢酸(acetate)のアセト酢酸(acetoacetate)およびアセチルCoAへの変換;e)アセト酢酸のアセトンへの脱炭酸;およびf)アセトンのイソプロパノールへの還元を含むからである。中間代謝物の3つの脱炭酸段階を含む上記の変換からわかるように、この経路によるイソプロパノールの最大理論収率は、グルコース1モルからイソプロパノール1モル(0.33g/g)である。
【０００８】
天然では、微生物は、少ない量で、かつ主発酵生成物の副生成物としてn-プロパノールを生成する。酵母サッカロミセス・セレビシエにおいては、n-プロパノールは、Ehrlich経路によって、アミノ酸 2-ケト酪酸(2-ketobuyrate)の分解産物として生成される(Hazelwood et al., 2008, Appl. Env. Microbiol. 74:2259-2266)。この経路は、グルコースからのn-ブタノールおよびn-プロパノールの製造のためにモデル微生物であるエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)の遺伝子操作された株において最適化されたが、大変低い収率(4質量%)であった(Shen & Liao, 2008, Met. Eng. 10:312-320)。遺伝子操作された微生物を用い、この経路を介してグルコースからのアミノ酸 2-ケト酪酸の分解によるイソプロパノールまたはn-プロパノールの製造もまた最近の文書に開示されているが、大変低い収率が示されている(国際公開番号WO2009/103026A1)。プロピオニバクテリウム属の細菌種において、グルコースまたはショ糖と比較してより還元された基質であるグリセロールからのプロピオン酸発酵の副生成物としてn-プロパノールが観察されているが、低収率(4質量%)であった;P.アシドプロピオニシ(P. acidipropionici) アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)番号25562を用いる発酵において基質としてグルコース、ショ糖または乳酸(lactate)が用いられる場合、n-プロパノールは得られない(Barbirato et al., 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47: 441-446)。従って、先行技術では、炭水化物の発酵によって高収率でn-プロパノールを製造するための発酵法を示すことができていない。
【０００９】
いくつかの細菌種、例えばセレノモナス・ルミナンティウム(Selenomonas ruminantium)、プロピオニゲニウム(Propionigenium)種およびプロピオニバクテリウム種によるプロピオン酸発酵が広範に研究されてきた。プロピオニバクテリウム属のプロピオン酸細菌は、チーズの製造におけるその使用によって最もよく研究されている。これらの細菌は、グルコースおよび他の基質、例えばラクトース、グリセロールおよびショ糖から主発酵生成物として高収率でプロピオン酸を生成する(グルコースから65質量%、グリセロールから67質量%)(Suwannakham & Yang., 2005, Biotech. Bioeng 91:325-337; Barbirato et al., 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47: 441-446)。プロピオニバクテリウム種におけるプロピオン酸の生成経路はジカルボン酸回路として知られ、これは、オキサロ酢酸(oxaloacetate)を生じるメチルマロニルCoAからのピルビン酸(pyruvate)のトランスカルボキシル化によって開始され、次いでリンゴ酸(malate)、フマル酸(fumarate)、コハク酸(succinate)、スクシニルCoAおよびメチルマロニルCoAに変換され、これがピルビン酸にトランスカルボキシル化されてプロピオニルCoAおよびオキサロ酢酸を生じ、こうして回路が閉じる(Boyaval and Corre, 1995, Lait 75:453-461)。従って、この経路には脱炭酸反応は関与せず、この経路は、グルコース1モルに対してプロピオン酸の最大理論収率が2モルということになる(0.82g/g)。それにもかかわらず、通例、基質および培養条件に応じて種々の割合で副生成物である酢酸(acetic acid)およびコハク酸(succinic acid)が生じる。
【００１０】
いくつかの研究および特許出願は、特に、酢酸などの副生成物に関してその収率を増加させることおよび培養条件および分離戦略を改善することについて、プロピオン酸の収率を増加させる方法に関している(“Engineering Propionibacterium acidipropionici for Enhanced Propionic Acid Tolerance and Fermentation”, Zhang and Yang, 2009, Biotechnology and bioengineering, in press” and “Construction and Characterization of ack Knock-Out Mutants of Propionibacterium acidipropionici for Enhanced Propionic Acid Fermentation”, Suwannakham et al, 2006, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, No. 2, June 5)。しかしながら、代謝中間体としてプロピオン酸経路を用いてn-プロパノールの生成を改善することを目的とする研究は存在しない。
【００１１】
グルコースおよび他の糖から高収率でイソプロパノールまたはn-プロパノールを製造することができる天然微生物はない。その結果、このような生物変換を可能にする酵素の正しい組み合わせは天然には存在しない。しかしながら、Holtら(1984, Appl. Env. Microbiol 48:1166-1170)は、クロストリジウム・アセトブチリクムの増殖培養物に酸性pH(5.0)でプロピオン酸を外部から添加することにより、n-プロパノール(50質量%)が得られたことを示し、この細菌のアルコール/アルデヒド脱水素酵素(ADH)は、有機酸(酪酸および酢酸)を対応するアルコールに変換できるばかりでなく、プロピオン酸(propionate)をn-プロパノールに変換することもできることを示唆した。しかしながら、この文献の実験は大変低濃度で行われ、高濃度の望ましくない副生成物、例えば酢酸、酪酸、エタノール、ブタノールおよびアセトンが生じた。従って、このことは、プロパノールを高収率で得るためには、まだ解決すべき問題が存在することを示唆している。
【００１２】
さらに、産業的に重要な化合物の製造につながる代謝経路は酸化還元(レドックス)反応を含む。発酵中に、グルコースは、一連の酵素反応でより小さな分子に酸化され、それに付随してエネルギーを放出する。これらの反応は同時には起こらないため、放出された電子は、オキシドレダクターゼ酵素の補因子として機能するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)などの一般的な電子伝達体によって、1つの反応物からもう1つの反応物に移動する。微生物による異化作用において、グルコースは、補因子として酸化型NAD(P)+を用い、酵素によって酸化して、還元型NAD(P)H型還元等価物を生じる。発酵を継続するためには、NAD(P)+はNAD(P)Hを消費する代謝中間体の還元によって再生されなければならない。従って、バランスのとれたNAD(P)+/NAD(P)H比を維持することが微生物細胞にとって大変重要である。
【００１３】
一般に、NAD(P)Hの形態の還元等価物は酸化的脱炭酸反応によって得られるが、NAD(P)+は、中間体の還元、例えば酢酸のエタノールへの還元によって再生される。より低い酸化状態であるn-プロパノールへのグルコースの異化作用に必要なレドックスバランスの結果として、この化合物には、2炭素化合物および恐らくは4炭素化合物の副生成が付随する。この事実は、遺伝子操作された微生物が用いられた場合であっても、グルコースの酸化によって生成しうるNAD(P)Hの形態の還元等価物をより必要とすることによって、n-プロパノールの製造には低収率が観察されるであろうことを示唆する。従って、n-プロパノールに関するこの状況は、国際公開番号WO2008/131286 A1に開示されたグルコースからのイソプロパノールの発酵生産とは対照的である。この場合、生成物はグルコースからの3つの酸化的脱炭酸反応を含む一連の変換によって生成し、アセトンからイソプロパノールへの還元に対して十分な還元等価物を生じるが、CO2として放出される質量を犠牲にしている。
【００１４】
以前の研究は、異なる最終生成物を得るためのレドックスバランスを促進するために、バイオリアクター内部で電気刺激を使用することを報告している。クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・テルモセルム(Clostridium thermocellum)およびサッカロミセス・セレビシエへの電流の適用が報告されており、エタノール生産量の有意な増加が認められている(Pequin et. al. 1994, Biotechnology letters 16(3): 269-274; Shin et al 2002, Appl. Microbial. Biotechnol. 58: 476-481)。同様に、電気刺激およびメディエーターを用いた、プロピオニバクテリウム種による発酵の最終生成物の変化を報告する研究もある。EmdeおよびSchink(D.E.特許第4,024,937-C1号)は、3電極システムおよびメディエーターとしてのコバルトセプルクラートを用いて、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichi)のグルコース発酵中にプロピオン酸生成を促進させた。この方法により、酢酸に対するプロピオン酸のモル収率がそれぞれ73%から97%に増加する結果が示された。同様な研究において、Schuppertら(Appl. Microbiol. Biotechnol, 1992, 37:549-553)は、P.アシドプロピオニシの最終生成物比を変えるために、3電極システムおよびコバルトセプルクラートを用いた。この場合は、もっぱらプロピオン酸が生成され、従って最終収率が増加し、川下のプロセスが容易となった。最後に、最近の研究において、外因性の人工のメディエーターを添加しないで、電気刺激によって、P.フロイデンライヒ(P. freudenreichi)によるグルコース発酵の最終生成物の生成物プロフィールが改変された(Wang et. al. 2008, Biotechnol. Bioeng 101: 579-586)。この研究において、P.フロイデンライヒによって生成され、分泌される1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸分子がメディエーターとして機能し、他のメディエーターを添加しても反応の改善が見られなかったことをこの著者らは報告した。全体的に見て、プロピオニバクテリウム種によるグルコース発酵の代謝および最終生成物プロフィールは、生物電気リアクターの使用によって操作されることができることをこれらの結果は示している。しかしながら、外部からNAD(P)H型還元等価物が供給された場合であっても、このアッセイにおいてn-プロパノールはほとんど検出されなかった。従って、このことは、プロピオニバクテリアからのアルデヒド/アルコール脱水素酵素(ADH)は、プロピオン酸/プロピオニルCoAのn-プロパノールへの還元には十分ではないことを示唆している。
【００１５】
このようにして製造された生物起源n-プロパノールは、費用対効果が高い方法で、それを脱水してプロピレンに変換し、それを重合してポリプロピレンに変換することによるバイオプラスチックの製造にさらに使用することができる。
【００１６】
プロピレンは、広範囲の石油化学製品の合成に広く使用されている化学化合物である。例えばこのオレフィンは、ポリプロピレン、そのコポリマーならびにアクリロニトリル、アクリル酸、エピクロリドリン(epichloridrine)およびアセトンなどの他の化学物質の製造に用いられる原料である。主にポリプロピレンの市場需要の増加によって、プロピレン需要はエチレン需要よりも増加が速い。プロピレンは、堅いもしくは柔軟性の包装材料、ブロー成形および射出成形などの無数の用途のための熱可塑性樹脂を製造するために重合される。
【００１７】
近年、特にプラスチック製造において、再生可能材料に対する世界的な関心が高まりつつある。糖供給源から製造することができる利用可能な生体高分子にはポリ乳酸およびポリヒドロキシブチラートがある。もう1つの最近の代替物には、サトウキビエタノールから製造される“グリーン”ポリエチレンがある。これらの製品は、焼却処分された場合、化石炭素を生じない。
【００１８】
プロピレンは、主に、油の接触分解または熱分解の副生成物として得られるか、あるいは天然ガスからのエチレン製造の副生成物として得られる(Propylene, Jamie G. Lacson, CEH Marketing Research Report-2004, Chemical Economics Handbook-SRI International)。プロピレン製造のための代替経路の使用は、広範囲の再生可能原料を用いて継続的に評価されてきている(“Green Propylene”, Nexant, January 2009)。これらの経路は、エチレンを二量体化してブチレンを生じ、次いでさらなるエチレンとのメタセシスでプロピレンを生じるプロピレン製造を含む。もう1つの経路は、糖発酵によるバイオブタノール製造と、それに続く脱水、エチレンとのメタセシスである。バイオマスをガス化して合成ガスを製造し、次いでメタノールを合成し、次いでこれをメタノール-オレフィン転化(methanol-to-olefin)技術によってグリーンプロピレンを製造するなどの熱経路もまた評価されつつある。
【００１９】
イソプロパノールの脱水によるプロピレンの製造は、文書EP00498573B1に十分に記載されており、すべての例において、高い変換で90%以上というプロピレン選択性を示している。n-プロパノールの脱水は、以下の文献においても研究されている:“Mechanism and Kinetics of the Acid-Catalyzed Dehydration of 1- and iso-propanol in Hot Compressed Liquid Water” (Antal, M et al., Ind. Eng. Chem. Res. 1998, 37, 3820-3829)および“Fischer-Tropsch Aqueous Phase Refining by Catalytic Alcohol Dehydration” (Nel, R. et al., Ind. Eng. Chem. Res. 2007, 46, 3558-3565)。報告されている収率は90%よりも高い。
【発明の概要】
【００２０】
今日まで無数の開発がなされたにもかかわらず、再生可能炭素源の発酵中にNAD(P)H型還元等価物を供給する方法と組み合わせた、遺伝子改変微生物を用いる、プロピオン酸代謝経路による高収率でのn-プロパノールの製造に関連する何らかの記載を提供する、先行技術における教示はいまだに存在しない。このようにして得られる生物起源n-プロパノールは、脱水してプロピレンに変換し、重合させて生物起源ポリプロピレンに変換することが可能である。このようにして製造されるバイオポリプロピレンは、大部分の既知の生体高分子とは異なり、製造コストが低く、多種多様な用途に適した特性を明確に示す。
【００２１】
本発明は、プロピオン酸(propionate)生成に関するジカルボン酸経路の酵素をコードする遺伝子および、外部からNAD(P)H型で供給された還元等価物の存在下、電極およびメディエーター分子の使用、高圧のH2の使用または、NAD+依存性ギ酸脱水素酵素を発現する天然もしくは操作された経路および培地へのギ酸(formate)の添加の使用による、プロピオン酸(propionate)/プロピオニルCoAのn-プロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を有する操作された微生物によって、炭素源をn-プロパノールへ、そして最終的には、さらにイソプロパノールおよび/またはエタノールへ高収率で生物変換するための改善された方法を提供する。
【００２２】
本発明は、安価な炭素基質、例えばグルコース、ショ糖、他の糖、グリセロール、廃棄材料または混合炭素源から、全細胞を触媒として用い、費用対効果が高い方法で産業にスケールアップできる統合的方法を確立する、微生物による高収率でのn-プロパノールの生物学的製造方法を提供する。この目的のために、本発明はさらに、ジカルボン酸回路を介して高収率でプロピオン酸/プロピオニルCoAを製造でき、プロピオン酸/プロピオニルCoAをn-プロパノールに還元できるアルコール/アルデヒド脱水素酵素に相当するポリペプチドを発現する操作された微生物を提供する。
【００２３】
本発明は、n-プロパノールの発酵生産のための高収率な方法を提供する。本発明の一実施形態において、プロセスまたは方法は、グルコースまたは他の炭水化物のn-プロパノールへの変換におけるバランスのとれたエネルギー反応を含む。
【００２４】
本発明はまた、上記方法の生成物を含む。
【００２５】
特定の実施形態において、天然のジカルボン酸回路を含む微生物は、アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を導入することによってn-プロパノールへのさらなる変換を触媒するように操作されることができる。
【００２６】
特定の実施形態において、プロピオニルCoA/プロピオン酸のn-プロパノールの変換のための天然経路を有する適切な宿主がジカルボン酸回路の発現のために操作される。ここで、少なくとも1つの酵素の発現が異種であるか、あるいはその発現パターンが改変される。
【００２７】
特定の実施形態において、遺伝子操作技術が確立された適切な宿主が、ジカルボン酸回路および、プロピオン酸/プロピオニルCoAのn-プロパノールへの還元に必要な酵素の発現のために操作される。ここで少なくとも1つの酵素の発現が異種であるか、あるいはその発現パターンが改変される。
【００２８】
特定の実施形態において、天然または改変ジカルボン酸回路を含み、プロピオニルCoA/プロピオン酸のn-プロパノールへの変換のための天然または改変経路を含む微生物が、アセチルCoAのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素を発現するようにさらに操作されることができる。このイソプロパノールは、脱水反応によるプロピレン合成のために、n-プロパノールと共に用いることが考えられる。
【００２９】
特定の実施形態において、天然または改変ジカルボン酸回路、プロピオニルCoA/プロピオン酸のn-プロパノールへの変換のための天然または改変経路および、アセチルCoAのイソプロパノールへの変換のための天然または改変経路を含む微生物が、アセチルCoAからの酢酸合成に関与する欠損酵素の発現の変化(過剰発現または低発現)を示すように操作されることができ、それによりイソプロパノール合成が増加すると考えられる。このイソプロパノールは、脱水反応によるプロピレン合成のためにn-プロパノールと共に用いることが考えられる。
【００３０】
外部から電子を供給する好ましい方法は、電極およびメディエーター分子の使用によるが、メディエーター分子は微生物によって天然に製造されることもできるし、培地に外部から添加されることもできる。
【００３１】
特定の実施形態において、炭素源としてサトウキビ搾汁を含む発酵培地が優先的に用いられ、酵母抽出物またはN2からなる窒素源が優先的に用いられる。しかしながら、他の組み合わせを用いることもでき、これらの組み合わせもまた本発明の範囲内であることは、当業者には明らかであろう。
【００３２】
特定の実施形態において、収率および生産性を上げる目的で培地にパントテン酸が添加される。このパントテン酸は、純粋な形で添加することもできるし、粗抽出物で添加することもできる。
【００３３】
特定の実施形態において、このように製造されるn-プロパノールは、さらに脱水されてプロピレンに変換され、重合されてポリプロピレンに変換され、バイオプラスチックになる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
ここまで一般論として本発明を説明してきた。ここで添付図面を参照して説明するが、これらは必ずしも一定の比率の縮尺で描かれてはいない。
【図１】数種の細菌、例えばプロピオニゲニウム種、プロピオニスピラ・アルボリス(Propionispira arboris)、プロピオニバクテリウム種およびセレノモナス・ルミナンティウムによるグルコースからのプロピオン酸の製造が、以下の一連の段階によって達成されることができことを示す図である。このシリーズは、当業者に公知のいくつかの経路を代表する。グルコースは、一連の段階で解糖系の酵素によりピルビン酸(pyruvate)に変換される。ピルビン酸はアセチルCoAに変換されることができ、次いでジカルボン酸回路を経て酢酸またはプロピオン酸に変換されることができる。プロピオニバクテリウム属の一部の種は、還元された基質、例えばグリセロールを用いるときn-プロパノールを製造できることが報告されている。しかしながら、n-プロパノールの生成経路は記載されていない。n-プロパノールの製造のための可能な経路および補因子はグレーで強調表示されている。
【図２】クロストリジウムの種によるアルコールの製造が、以下の段階で説明できることを示す図である。グルコースは、一連の段階で解糖系の酵素によってピルビン酸に変換される。ピルビン酸から乳酸(lactate)またはアセチルCoAを生成されることができ、これは酢酸(acetate)およびエタノールの前駆体である。さらに、アセチルCoAは、アセトアセチルCoA、次いでアセトンに変換されることができ、これは最後にイソプロパノールに還元される。もう1つの可能性は、当業者に公知の一連の段階によるアセトアセチルCoAのブチリルCoaへの変換である。ブチリルCoAはブタノールまたは酪酸(butyrate)のいずれかに変換されることができる。
【図３】3電極システムを備える撹拌タンク生物電気リアクターの概略図である。
【図４】操作された微生物が、生物電気リアクターの使用により外部から供給された還元等価物の存在下でn-プロパノールの製造に使用される統合的方法の概略図である。得られたn-プロパノールは蒸留され、触媒リアクター中で脱水されてポリマーグレードプロピレンが製造され、次いでそれが重合段階に供されてポリプロピレンが製造される。
【図５】プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシにおけるクロストリジウム・カルボキシディボランスからのアルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼを発現するように設計された合成構築物を含む発現ベクターpBK1T1の概略図である。この二機能性酵素はプロピオニルCoAのn-プロパノールへの変換を触媒する。
【図６】プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシにおけるクロストリジウム・アセトブチリクムからのアルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼを発現するように設計された合成構築物を含む発現ベクターpBK1T2の概略図である。この二機能性酵素はプロピオニルCoAのn-プロパノールへの変換を触媒する。
【図７】合成構築物である、プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシのためのチオストレプトン耐性正の選択マーカーカセットを示す図である。NcoI部位(下線部)、調節領域(太字)ならびに耐性遺伝子ORFの開始および終止コドン(括弧内)が強調表示されている。
【図８】合成構築物である、プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシにおけるクロストリジウム・カルボキシディボランスの異種二機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼのための発現カセットを示す図である。XbaIおよびHindIII部位(下線部)、調節領域(太字)ならびに遺伝子ORFの開始および終始コドン(括弧内)が強調表示されている。
【図９】合成構築物である、プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシにおけるクロストリジウム・アセトブチリクムの異種二機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼのための発現カセットである。XbaIおよびHindIII部位(下線部)、調節領域(太字)ならびに遺伝子ORFの開始および終止コドン(括弧内)が強調表示されている。
【図１０】合成構築物である発現プラスミドpBK1T1を示す図である。プラスミドベクターの概略図は図5に示されている。
【図１１】合成構築物である発現プラスミドpBK1T2を示す図である。プラスミドベクターの概略図は図6に示されている。
【図１２】(a)対照発酵および(b)メディエーター分子として1.0mMコバルトセプルクラートを添加した発酵の36時間後に得られたHPLCスペクトルである。クロマトグラム(a):ショ糖(11.437分);コハク酸(17.782分);酢酸(22.610分);プロピオン酸(26.515分);クロマトグラム(b):ショ糖(11.420分);コハク酸(17.714分);酢酸(22.586分);プロピオン酸(26.493分);n-プロパノール(39.199)。不明確なピークは酵母抽出物からの化合物に相当する。
【図１３】1.0mMコバルトセプルクラートを用いる発酵に対応するGC-MSクロマトグラムである。ピーク強度は、発酵培地中の生成物の実際の濃度には対応しない。
【図１４】対照発酵および、メディエーター分子として1.0mMコバルトセプルクラートを添加した発酵の細胞増殖の経時変化を示す図である。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、発酵により高収率でn-プロパノールを製造するために、ジカルボン酸回路、アルコール生産微生物種、例えばクロストリジウム菌、酵母および腸内細菌のアルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ならびにNAD(P)H型還元等価物の外部からの供給による、再生可能原料からの高いプロピオン酸発酵収率を利用する新規統合的アプローチを提供する。従って、本発明は、高収率でのn-プロパノールの製造のための還元等価物の外部からの供給および、選択肢としての、目的とする分子の炭素収率を最大化させるためのイソプロパノールおよび/またはエタノールの相補的製造の使用と組み合わせた、微生物を用いる発明に関する新規な統合的方法を提供する。
【００３６】
本明細書において、NAD(P)H型還元等価物の外部からの供給の存在下で、電極およびメディエーター分子の使用、高圧のH2の使用または、NAD+依存性ギ酸脱水素酵素を発現する天然のもしくは操作されたの経路および培地へのギ酸の添加の使用によって、プロピオン酸生成のジカルボン酸経路の酵素および、n-プロパノールへのプロピオン酸/プロピオニルCoAの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子をコードする遺伝子を発現する操作された微生物において高収率で炭素源をn-プロパノールに生物変換するための方法が開示されている。
【００３７】
本明細書において、用語“微生物”は、古細菌ドメイン、真正細菌ドメインおよび真核生物ドメインからの原核種および真核種を含み、後者は糸状菌、酵母、藻、原生動物または高等原生生物に限定される。“細胞”、“微生物細胞”または“細菌”は微生物と同義で使用される。本明細書において、用語“生物体”は自己複製する実体のことを言う。
【００３８】
用語“炭素源”は、一般に、微生物の増殖を維持するのに適した基質または化合物のことを言う。炭素源は、限定するものではないが、ポリマー、炭水化物、アルコール、酸、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含む種々の形態のものであることができる。例えば、これらは、単糖(例えばグルコース、フルクトースおよびキシロース)、オリゴ糖(すなわちショ糖、ラクトース)、多糖(すなわちデンプン、セルロース、ヘミセルロース)、リグノセルロース材料、脂肪酸、コハク酸、乳酸、酢酸、グリセロールなどまたはそれらの混合物を含むことができる。炭素源は、光合成産物、例えばグルコースまたはセルロースであることができる。炭素源として用いられる単糖は、多糖の加水分解産物、例えばセルロース、デンプンおよびペクチンの酸または酵素による加水分解物であることができる。用語“エネルギー源”は、本明細書においては炭素源と同義で用いることができる。なぜなら、従属栄養代謝においては、炭素源は、異化作用中には電子ドナーとして用いられるとともに、細胞増殖中には炭素源として用いられるからである。
【００３９】
用語“核酸”は、ヌクレオシドのヌクレオチドの2以上を超えるモノマーからなる有機高分子のことを言い、限定するものではないが、任意の長さの一本鎖もしくは二本鎖のセンスもしくはアンチセンスデオキシリボ核酸(DNA)および、適切な場合には、任意の長さの一本鎖もしくは二本鎖のセンスもしくはアンチセンスリボ核酸(RNA)を含む。用語“ヌクレオチド”は、プリンもしくはピリミジン塩基およびリン酸基に結合したリボースもしくはデオキシリボース糖からなり、核酸の基本構造単位である任意のもしくはいくつかの化合物のことを言う。用語“ヌクレオシド’は、デオキシリボースまたはリボースと組み合わせたプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物(グアノシンまたはアデノシンとして)のことを言い、特に核酸において見られる。3〜200ヌクレオチドを含む核酸は、“オリゴヌクレオチド”と呼ぶこともできる。
【００４０】
用語“タンパク質”または“ポリペプチド”は、本明細書においては、2以上のアミノ酸モノマーおよび/またはそれらのアナログから構成される有機高分子を示すために用いられる。本明細書において、用語“アミノ酸”は、任意の天然および/または合成アミノ酸のことを言う。従って、用語ポリペプチドは、完全長のタンパク質およびペプチドばかりでなく、それらのアナログおよびフラグメントを含む任意の長さのアミノ酸ポリマーを含む。
【００４１】
用語“酵素”は、任意の化学または生化学反応を触媒または促進する任意の物質のことを言う。酵素は全体的または部分的にポリペプチドを含むが、核酸を含む異なる分子から構成される分子を含むことができる。
【００４２】
用語“ドメイン”、“タンパク質ドメイン”または“酵素ドメイン”は、特定の反応がそこで起こるか、または特定の機能がそこに帰属されるタンパク質またはポリペプチドの独特な構造単位のことを言う。タンパク質または酵素は、異なる機能を有することができ、独立したコンパクトなユニットとしてフォールディングされることができる1以上のドメインを含むことができる。
【００４３】
用語“E値(E-value)”または“期待値(expected value)”は、米国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)からの保存ドメインデータベース(Conserved Domain Database)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)を検索するとき、偶然に見出すことが期待されるヒット数を記載するパラメータのことを言う。
【００４４】
用語“経路”または“代謝経路”は、本明細書においては、基質が生成物に変換される1以上の酵素的に調節された化学反応を含む生物過程を指すために用いられる。従って、炭素源のn-プロパノールへの変換のための経路は、炭素源がn-プロパノールに変換される1以上の酵素的に調節された反応を含む生物過程である。“異種経路”は、経路の少なくとも1以上の化学反応が少なくとも1つの異種酵素により触媒される経路のことを言う。他方では、“天然経路”は、すべての化学反応が天然酵素により触媒される経路のことを言う
【００４５】
用語“NAD(P)H型還元等価物”は、還元型の補酵素ニコチンアミンアデニンジヌクレオチド(NAD)またはニコチンアミンアデニンジヌクレオチドホスファート(NADP)のことを言う。還元型においては、これらの補酵素は、これらの補酵素を補因子として用いる酵素、例えばオキシドレダクターゼのクラスの酵素により触媒される還元反応のために電子または還元等価物を供与することができる。
【００４６】
用語“微生物抽出物”または“酵母抽出物”または“プロピオニバクテリウム種抽出物”は、本明細書においては、酵母またはプロピオニバクテリウム種などの自己融解した微生物細胞培養物の水溶性部分のことを言う。微生物抽出物は、一般的には、炭水化物を多く含む培地中で微生物を増殖させることによって製造される。その後、微生物を採取し、洗浄し、水に再懸濁し、自己融解プロセス(酵素を用いる細胞壁の自己消化)を行う。微生物抽出物は、この自己溶解作用の全可溶性部分である。
【００４７】
用語“異種”または“外因性”は、本明細書においては、元の生物体とは異なる他の生物体において、天然の微生物において見られる分子の発現レベルと比較して低いか同等かあるいは高いことができる発現レベルで独立して発現される酵素および核酸を指すために用いられる。
【００４８】
用語“内因性”または“天然の”は、本明細書においては、それらの発現レベルとは独立して、自然界に見られる生物体において発現される酵素および核酸を指すために用いられる。
【００４９】
用語“宿主”または“宿主細胞”は、本明細書においては、炭素源のn-プロパノールへの変換のために操作されることができる、天然または野生型の真核または原核微生物を指すために同義で用いられる。用語宿主および宿主細胞は、特定の被験細胞ばかりでなく、遺伝的修飾を有する、このような細胞の子孫または潜在的子孫のことをも言う。変異または環境の違いによってこの子孫に改変が起こり得るので、このような子孫が親細胞と同一ではない場合があり、それでもなお、本明細書においてはこの用語の範囲に含まれる。
【００５０】
用語“収率”は、本明細書において、基質量から得られるg/gでの生成物量のことを言う。
【００５１】
本明細書に開示された微生物は、野生型微生物であることもできるし、高い炭素収率でn-プロパノールならびに、場合により、イソプロパノールおよび/またはエタノールを生成するために異種性にまたは内因的に発現された酵素を用いる微生物を提供するために遺伝子工学技術を用いて操作されることもできる。用語“改変された”または“改変”は、本明細書においては、経路における少なくとも1つの段階またはプロセス、例えば酵素の活性または核酸の発現が増加する(アップレギュレートされる)かまたは減少する(ダウンレギュレートされる)、変えられた代謝経路の状態を指すために用いられる。特定の実施形態において、改変は、経路における酵素としてコードする核酸配列の変化、経路における酵素をコードする核酸配列の発現の変化または経路における酵素(すなわちアルコール脱水素酵素)の翻訳もしくはタンパク質分解の変化、またはそれらの組み合わせの結果である。例えば欠失または過発現によって変化を得るために当該技術分野で一般的に用いられる方法があることは、当業者には明らかであろう。
【００５２】
用語“メディエーター”は、脂溶性もしくは水溶性であり、pH非依存性であり、安定であり、電子移動プロセスを駆動するための酸化還元電位を維持する特性を有する任意の分子を含む。
【００５３】
用語“電極”は、任意の導電性材料、好ましくは黒鉛または貴金属を含む。1以上の基準電極をこのシステムに含むことができる。
【００５４】
数種の細菌、例えばプロピオニゲニウム種、プロピオニスピラ・アルボリス、プロピオニバクテリウム種およびセレノモナス・ルミナンティウムによるグルコースからのプロピオン酸の製造は、以下の一連の段階で達成されることができる。このシリーズは、当業者に公知のいくつかの経路を代表する。グルコースは、一連の段階で解糖系の酵素によりピルビン酸に変換される。ピルビン酸はアセチルCoAに変換されることができ、次いでジカルボン酸回路を経て酢酸またはプロピオン酸に変換されることができるが、これは以下の変換段階:
変換a)酵素メチルマロニルCoAカルボキシトランスフェラーゼ(E.C. 2.1.3.1)の作用によるピルビン酸およびメチルマロニルCoAのオキサロ酢酸およびプロピオニルCoAへの変換;
変換b)酵素リンゴ酸(malate)脱水素酵素(E.C. 1.1.1.37)によるオキサロ酢酸(oxyaloacetate)およびNADHのリンゴ酸およびNAD+への変換;
変換c)酵素フマル酸(fumarate)ヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.2)の作用によるリンゴ酸のフマル酸およびH20への変換;
変換d)酵素コハク酸(succinate)脱水素酵素(E.C. 1.3.99.1)の作用によるフマル酸およびFPH2のコハク酸およびFPへの変換;
変換e)酵素プロピオニルCoA:コハク酸CoAトランスフェラーゼ(E.C. 2.8.3.1)の作用によるコハク酸およびプロピオニルCoAのスクシニルCoAおよびプロピオン酸への変換;
変換f)酵素メチルマロニルCoAムターゼ(E.C. 5.4.99.1)の作用によるスクシニルCoAの(S)メチルマロニルCoAへの変換;
変換g)酵素メチルマロニルCoAエピメラーゼ(E.C.5.1.99.1)の作用による(S)メチルマロニルCoAの(R)メチルマロニルCoAへの変換;および
変換h)酵素メチルマロニルCoAカルボキシトランスフェラーゼ(E.C. 2.1.3.1)の作用による(R)メチルマロニルCoAおよびピルビン酸のプロピオニルCoAおよびオキサロ酢酸への変換、
を含むことができ、こうして回路が閉じる。
【００５５】
変換a、b、c、d、e、f、gおよびhを触媒する酵素をコードする遺伝子を含む天然または組換え微生物は、単離されることもできるし、当業者に公知の技術、例えば異種DNA挿入、示差的発現または遺伝子欠失を用いて構築されることもできる。あるいは、変換a、b、c、d、e、f、gおよびhを触媒する当該技術分野で公知の酵素をコードする任意の遺伝子を、本明細書に開示された方法において用いることもできる。
【００５６】
生物体の一部においては、アルコールのその対応する有機酸またはアシルCoA中間体からの製造は、アルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素の遂次作用による二段階法で行われ、両段階ともNAD(P)H型還元等価物に依存する。有機酸に作用するアルデヒド脱水素酵素の例は、限定するものではないが、マス・マスクルス(Mus musculus)(GenBankアクセッション番号AC162458.4);クロストリジウム・ボツリヌム(A株)(Clostridium botulinum A str.) ATCC番号3502(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションまたは“ATCC”、P.O. Box 1549、Manassas、VA USA、(GenBankアクセッション番号AM412317.1)サッカロミセス・セレビシエ(GenBankアクセッション番号EU255273.1)において見られるものを含む。さらに、他の微生物においては、アルコールの製造は、NAD(P)H型還元等価物に依存する同様なアルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素により触媒される2つの遂次段階で有機酸のアシルCoA中間体によってのみ行われる。アシルCoA中間体に作用するアルデヒド脱水素酵素の例は、限定するものではないが、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)(GenBankアクセッション番号AP011115.1)、エンタモエバ・ディスパル(Entamoeba dispar)(GenBankアクセッション番号DS548207.1)およびラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)(GenBankアクセッション番号ACHG01000187.1)を含む。アルデヒドのその対応する第一級アルコールへの変換を触媒するアルコール脱水素酵素の例は、限定するものではないが、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)(GenBankアクセッション番号AM269994.1)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Taiwan19F-14株)(Streptococcus pneumoniae Taiwan19F-14)(GenBankアクセッション番号CP000921.1)およびサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)(GenBankアクセッション番号CP001127.1)を含む。さらに、他の微生物において、これら2つのドメインまたはそれ以上を有する酵素とは独立して、アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼドメインの両方を有する単一酵素の作用によって両方の反応を順次に起こすことができる。このような多機能性酵素の例は、限定するものではないが、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)(GenBankアクセッション番号CR936503.1)、ジアルディア・インテスティナリス(Giardia intestinalis)(GenBankアクセッション番号U93353.1)、シュワネラ・アマゾネンシス(Shewanella amazonensis)(GenBankアクセッション番号CP000507.1)、サーモシネココッカス・エロンガツス(Thermosynechococcus elongatus)(GenBankアクセッション番号BA000039.2)、クロストリジウム・アセトブチリクム(GenBankアクセッション番号AE001438.3)およびクロストリジウム・カルボキシディボランス(Clostridium carboxidivorans)ATCC番号BAA-624T(GenBankアクセッション番号ACVI01000101.1)を含む。
【００５７】
本発明に使用することができる酵素の例は、限定するものではないが、表1〜4に記載した酵素を含む。
【表１】
2013503647.tif 000003
【表２】
2013503647.tif 000004
【表３】
2013503647.tif 000005
【表４】
2013503647.tif 000006
【００５８】
アシルCoAまたは有機酸を還元し、次いでアルデヒドまたはケトンを対応する第一級アルコールに還元することができる酵素アルコール/アルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を含む天然または組換え生物体は、単離することもできるし、当該分野で公知の技術、例えば異種DNA挿入、示差的発現または遺伝子欠失を用いて構築することもできる。
2013503647.tif 000007
【００５９】
n-プロパノールの製造を最大化するためには、我々の操作された微生物の炭素フラックスが、ジカルボン酸回路を介してピルビン酸からプロピオン酸に優先的に流れることが大変重要である。しかしながら、ATPおよびNAD(P)Hに対する細胞の要求のために、炭素の一部は不可逆的酸化的脱炭酸反応を介してピルビン酸から酢酸の生成に流れるであろうことを本発明は理解する。従って、生成される酢酸またはアセチルCoA中間体には経済的利益がない。しかしながら、この酢酸またはそのアセチルCoA中間体は、前述の酵素アルデヒド/アルコール脱水素酵素の作用によってさらにエタノールに代謝されることもできるし、あるいは、これらの中間体は、さらに、アセチルCoA 2分子の縮合によってアセトアセチルCoAおよびCoAに変換され、次いで他の酸化的脱炭酸反応によってアセトンに変換され、最終的に、国際出願番号WO2008/131286A1に開示されているように、クロストリジウム・ベイジェリンキのイソプロパノール生成経路の酵素の作用によってイソプロパノールに還元されてイソプロパノールに代謝されることができる。
変換k)酵素チオラーゼ(E.C. 2.3.1.19)の作用によるアセチルCoA 2分子の縮合によるアセトアセチルCoAおよびCoAへの変換;
変換l)酵素アセトアセチルCoA加水分解酵素(E.C. 3.1.2.11)の作用によるアセトアセチルCoAのアセト酢酸およびCoAへの変換;
変換m)酵素アセト酢酸デカルボキシラーゼ(E.C. 4.1.1.4)の作用によるアセト酢酸の脱炭酸によるアセトンへの変換;
変換n)微生物、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ、ブルクホルデリア(Burkholderia)種およびサーモアナエロバクター・ブロッキイ(Thermoanaerobacter brockii)において見られる酵素第一級-第二級アルコール脱水素酵素(E.C. 1.1.1.1)の作用によるアセトンの還元によるイソプロパノールへの変換。
【００６０】
特定の実施形態において、操作された微生物は、変換の少なくとも1つが異種遺伝子によって行われ、発酵の最終アルコール生成物がn-プロパノールもしくはエタノールのいずれかまたはその混合物である、変換a、b、c、d、e、f、g、h、ia、ibおよびjに対応する酵素を発現する。
【００６１】
特定の実施形態において、操作された微生物は、変換の少なくとも1つが異種遺伝子によって行われ、発酵の最終アルコール生成物がn-プロパノール、エタノールもしくはイソプロパノールのいずれか、またはその混合物である、変換l a、b、c、d、e、f、g、h、ia、ib、j、k、l、mおよびnに対応する酵素を発現する。
【００６２】
特定の実施形態において、アセチルCoAの酢酸への変換を触媒する宿主生物の酵素酢酸キナーゼ(E.C. 2.7.2.1)をコードする遺伝子は、その活性を減少させるように改変されたその発現を有し、従って、イソプロパノール生成のためのアセチルCoAの利用可能性が増している。例えば、P.アシドプロピオニシの酢酸キナーゼをコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号AY936474.1)は、当業者に公知の技術を用いて改変、欠失または低発現されることができる。
【００６３】
本発明は、単離されたまたは実質的に精製されたポリヌクレオチドおよび酵素またはタンパク質組成物の使用を含む。"単離された"もしくは"精製された"ポリヌクレオチドもしくは酵素またはその生物活性部分は、天然に存在する環境において見られるようなポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随するかまたはそれと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない。従って、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたは酵素は、組換え技術によって製造された場合には、他の細胞物質または培地を実質的に含まないし、化学合成された場合には、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。最適には、"単離された"ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する生物体のゲノムDNAにおけるポリヌクレオチドに天然に隣接するポリヌクレオチド(すなわち、そのポリヌクレオチドの5'および3'末端に位置する配列)を含まない配列(最適には、タンパク質をコードする配列)である。例えば、種々の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNAにおけるポリヌクレオチドに天然に隣接する約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチド配列を含むことができる。細胞物質を実質的に含まない酵素またはタンパク質は、約30%、20%、10%、5%または1%未満(乾燥質量で)の混在するタンパク質を有するタンパク質調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物活性部分が組み換えにより製造される場合、最適には、培地は、約30%、20%、10%、5%または1%未満(乾燥質量で)の化学前駆体または目的としないタンパク質である化学物質を含む。
【００６４】
開示されたポリヌクレオチドおよびそれによってコードされる酵素のフラグメントおよびバリアントもまた本発明に含まれる。"フラグメント"はポリヌクレオチドの一部を意味するか、あるいはアミノ酸配列の一部、従ってそれによってコードされる酵素またはタンパク質を意味する。コード配列を含むポリヌクレオチドのフラグメントは、天然酵素の生物活性を保持する酵素またはタンパク質フラグメントをコードすることができる。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なポリヌクレオチドのフラグメントは、一般に、生物活性を保持するタンパク質をコードしないか、あるいはプロモーター活性を保持しない。従って、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約20ヌクレオチド、約50ヌクレオチド、約100ヌクレオチドから本発明の完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であることができる。
【００６５】
本発明の酵素の生物活性部分をコードするポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも15、25、30、50、100、150、200、300、400、500、750または1000連続アミノ酸から、本発明の完全長酵素に存在するアミノ酸の総数までをコードする。ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして有用な、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドのフラグメントは、一般に、酵素の生物活性部分をコードすることを必要としない。
【００６６】
従って、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、酵素の生物活性部分をコードすることもできるし、以下に開示された方法を用いてハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして用いることができるフラグメントであることができる。酵素タンパク質の生物活性部分は、コードされる酵素またはタンパク質の部分を発現する本発明のポリヌクレオチドの1つの一部を単離し(例えば、in vivoでの組換え発現によって)、その酵素のコードされる部分の酵素活性を評価することによって調製することができる。ヌクレオチド配列のフラグメントであるポリヌクレオチドは、少なくとも16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、または3000連続ヌクレオチドから、本明細書に開示された完全長ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチド数までを含む。
【００６７】
"バリアント"は実質的に同様な配列を意味するものとする。ポリヌクレオチドに関しては、バリアントは、5'および/または3'末端における欠失(すなわち、短縮化);天然のポリヌクレオチドの1以上の内部部位における1以上のヌクレオチドの欠失および/または付加;および/または天然のポリヌクレオチドの1以上の部位における1以上のヌクレオチドの置換を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において、"天然の"ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドに関しては、保存的バリアントは、遺伝コードの縮重のため、本発明のポリペプチドの1つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。このような天然に存在する対立遺伝子バリアントは、公知の分子生物学技術、例えば以下に概略を述べるようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技術を用いて同定できる。バリアントポリヌクレオチドはまた、合成的に誘導されたポリヌクレオチド、例えば部位特異的変異誘発を用いて作成し、それでもなお本発明の酵素をコードするものを含む。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、本明細書の他の部分で記載のように、配列のアラインメントプログラムおよびパラメータによって決定されるとき、特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００６８】
本発明の特定のポリヌクレオチド(すなわち、参照ポリヌクレオチド)のバリアントは、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間で配列同一性パーセントを比較することによって評価することもできる。任意の2つのポリペプチドの間の配列同一性パーセントは、本明細書の他の部分で説明する配列のアラインメントプログラムおよびパラメータを用いて算出することができる。任意の所定の本発明のポリヌクレオチド対を、それらがコードする2つのポリペプチドが共有する配列同一性パーセントの比較によって評価するとき、2つのコードされるポリペプチド間の配列同一性パーセントは、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性である。
【００６９】
"バリアント"タンパク質は、天然タンパク質のN末端および/またはC末端における1以上のアミノ酸の欠失(いわゆる短縮化);天然タンパク質の1以上の内部部位における1以上のアミノ酸の欠失および/または付加;または天然タンパク質の1以上の部位における1以上のアミノ酸の置換による天然タンパク質由来のタンパク質を意味するものとする。本発明に含まれるバリアントタンパク質は生物学的に活性である。すなわち、それは天然タンパク質の所望の生物活性を引き続き有する。本発明のバリアントタンパク質の生物活性は、当該技術分野で公知の方法によってアッセイできる。このようなバリアントは、例えば遺伝子多型またはヒトの操作に由来することができる。本発明の天然酵素の生物活性バリアントは、本明細書の他の部分で説明する配列のアラインメントプログラムおよびパラメータによって決定するとき、天然タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有する。本発明のタンパク質の生物活性バリアントは、わずか1〜15アミノ酸残基、わずか1〜10アミノ酸残基、例えば6〜10アミノ酸残基、わずか5、わずか4、3、2あるいはわずか1アミノ酸残基でそのタンパク質とは異なることができる。
【００７０】
"バリアント"タンパク質は、天然タンパク質のN末端および/またはC末端における1以上のアミノ酸の欠失(いわゆる短縮化);天然タンパク質の1以上の内部部位における1以上のアミノ酸の欠失および/または付加;または天然タンパク質の1以上の部位における1以上のアミノ酸の置換による天然タンパク質由来のタンパク質を意味するものとする。本発明に含まれるバリアントタンパク質は生物学的に活性である。すなわち、それは、天然タンパク質の所望の生物活性を引き続き有する。本発明のバリアントタンパク質の生物活性は、当該技術分野で公知の方法によってアッセイできる。このようなバリアントは、例えば遺伝子多型またはヒトの操作に由来することができる。本発明の天然酵素アルデヒド脱水素酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼの生物活性バリアントは、国立生物工学情報センターからの保存されているドメインタンパク質データベース(CDD)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)と比較するとき、1e-2以下のE値のしきい値を有する。
【００７１】
本発明の酵素またはタンパク質は、アミノ酸置換、欠失、短縮化および挿入を含む種々の方法で改変することができる。このような操作法は一般に当該技術分野で公知である。例えば、酵素のアミノ酸配列バリアントおよびフラグメントは、DNAにおける変異によって製造できる。変異誘発およびポリヌクレオチド改変のための方法は当該分野で公知である。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382;米国特許第4,873,192号; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) およびその引用文献を参照のこと。目的とするタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Dayhoffら(1978)のモデルAtlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)(参照により本願に組み込まれる)において見出すことができる。保存的置換、例えばあるアミノ酸と、同様な特性を有するもう1つのアミノ酸との交換は最適であることができる。
【００７２】
従って、本発明の遺伝子およびポリヌクレオチドは、天然に存在する配列と突然変異形の両方を含む。同様に、本発明のタンパク質は、天然に存在するタンパク質と、そのバリアントおよび改変体も共に含む。このようなバリアントは所望の酵素活性を引き続き有する。明らかに、バリアントをコードするDNAにおいて起きる変異は、配列をリーディングフレームを脱して配置させてはならないし、最適には、2次的なmRNA構造を生成しうるような相補的領域を作成しない。EP特許出願公開第75,444号を参照のこと。
【００７３】
本明細書に含まれるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、タンパク質の特性において劇的な変化が生じることが予想されていない。しかしながら、それを行う前に、置換、欠失または挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、その効果がルーチンのスクリーニングアッセイによって評価されることは、当業者には明らかであろう。すなわち、当該技術分野で公知のルーチンアッセイによって酵素活性を評価することができる。
【００７４】
バリアントポリヌクレオチドおよび酵素はまた、例えばDNAシャフリングなどの変異誘発および組み換え誘導手順に由来する配列および酵素を含む。このようなDNAシャフリングの戦略は当該技術分野で公知である。例えば、Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291;ならびに米国特許第5,605,793号および第5,837,458号を参照のこと。
【００７５】
本発明の方法が、本明細書に開示されたヌクレオチドまたはアミノ酸配列と十分に同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド分子およびタンパク質の使用を含むことが認められる。本明細書で用いられる用語"十分に同一である"は、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列が通常の構造ドメインおよび/または通常の機能活性を有するように、第2アミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分なまたは最小数の同一または等価な(例えば、同様な側鎖を有する)アミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第1アミノ酸またはヌクレオチド配列を指すために用いられる。例えば、少なくとも約45%、55%または65%の同一性を有し、好ましくは75%の同一性を有し、より好ましくは85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する通常の構造ドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書においては十分に同一であると定義される。
【００７６】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸の同一性パーセントを決定するために、最適比較目的のために配列がアラインメントされる。2つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置数の関数である(すなわち、同一性パーセント=同一位置数/位置の総数(例えば、オーバーラップする位置)x100)。一実施形態において、2つの配列は同じ長さである。2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ有り無しで、下記と同様な技術を用いて決定できる。同一性パーセントの算出において、一般的には正確なマッチ数が計数される。
【００７７】
2つの配列間の同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの限定するものではないが好ましい例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 において改良されている。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 のBLASTnおよびBLASTxプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明のポリヌクレオチド分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、スコア=100、ワード長=12でBLASTnプログラムを用いて行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、スコア=50、ワード長=3でBLASTxプログラムを用いて行うことができる。比較の目的で、ギャップ有りアラインメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 の記載に従ってGapped BLASTを用いることができる。あるいは、分子間の遠距離相互作用を検出する反復探索法を行うために、PSI-BLASTを用いることができる。前出のAltschulら(1997)を参照のこと。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTxおよびBLASTn)のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの他の好ましいが限定するものではない例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17 のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列のアラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを用いる場合、PAM120重み付き残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を用いることができる。アラインメントは、視認により手作業で行うこともできる。
【００７８】
特記しない限り、本明細書記載の配列同一性/類似性値は、本発明の完全長配列を用い、ソフトウェアパッケージVecrtor NTI Suiteバージョン7(InforMax社、米国メリーランド州ベセズダ)に含まれるプログラムAlignXを用い、デフォルトパラメータを用いてアルゴリズムClustal W(Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994)によるマルチプルアライメントまたはそれと等価な任意のプログラムを用いて得た値を指す。"等価なプログラム"は、当該の任意の2つの配列に関して、デフォルトパラメータを用いるCLUSTALW(バージョン1.83)(欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトで入手可能:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)によって作成される対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを意味する。特定の実施形態において、アルデヒド脱水素酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の1以上を有する酵素をコードする任意の遺伝子を用いることができる。これらの酵素は、異なる生物体からの野生型酵素であることもできるし、人工の、組換えの、または操作された酵素であることもできる。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明に記載されている代謝反応は、単一機能性または多機能性であることができる各酵素により触媒される段階数にかかわらず、1以上の酵素により触媒されることができ、それでもなお、本発明の範囲内であることができる。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明に記載されている任意の酵素と同じ活性を有する酵素をコードする任意の遺伝子を用いることができる。これらの酵素は、異なる生物体からの野生型酵素であることもできるし、人工の、組換えの、または操作された酵素であることもできる。
【００８１】
遺伝コードの固有の縮重のために、実質的に同じかまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列もまた、このような酵素を発現するために用いることができる。当業者には当然のことながら、特定の宿主においてその発現が増加するようにコード配列を改変することは有利であることができる。ある種において、ほとんどの場合に用いられているコドンは“最適コドン”と呼ばれ、あまり用いられないコドンは、“希少コドンまたは低頻度コドン”と分類される。コドンは、宿主の好ましいコドン使用頻度を反映するように置換されることができ、このプロセスは、“コドン最適化”または“種のコドンバイアスの調節”と呼ばれる場合がある。
【００８２】
遺伝子の発現は、分子生物学の技術によって改変できる複雑な機構である。例えば、異種遺伝子の発現は誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターによって調節できる。異種遺伝子は、宿主の染色体に組み込まれることもできるし、娘細胞によって受け継がれることができる染色体外遺伝因子(例えばプラスミド、BAC、YACなど)として存在することもできる。このような染色体外遺伝因子は選択マーカーを含むことができる。
【００８３】
外因性核酸分子からのポリペプチドの発現方法は、所望のポリペプチドをコードする核酸配列の発現を所望の条件で調節因子(プロモーター、エンハンサーなど)が促進する核酸を構築することを含む。
【００８４】
他の実施形態において、内因性または異種遺伝子の発現を活性化または抑制するために異種調節因子を用いることができる。さらに、発現が抑制または排除される場合、関連性のある酵素、タンパク質またはRNAの遺伝子は、例えば相同組換えによって得られるノックアウト変異または他の既知の欠失技術によって排除することができる。転写後遺伝子サイレンシングのための干渉RNA(iRNA)の技術の使用もまた使用できる。
【００８５】
微生物において遺伝子の発現を修飾する方法を、本発明の微生物細胞の構築に使用することが考えられる。
【００８６】
微生物に外因性核酸分子を導入できる任意の方法を用いることができる。例えば、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、ヒートショック、アグロバクテリウム・ツメファキエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換、プロトプラスト融合など。
【００８７】
ここで説明する微生物に含まれる外因性核酸分子は、任意の形態で細胞内に維持できる。すなわち、これらの分子は任意の染色体に組み込まれることもできるし、娘細胞に受け継ぐことができる染色体外状態で維持することもできる。さらに、これらの微生物は、安定的にまたは一過性に形質転換することができる。さらに、外因性核酸分子は、宿主微生物内で単一または複数コピーで存在することができる。
【００８８】
プロピオン酸/プロピオニルCoA中間体のn-プロパノールへの変換に必要な還元等価物は、組換えNAD(P)Hリサイクルシステムの使用およびギ酸塩の外部からの供給によってin vivoで微生物に供給することができる。
【００８９】
本発明によれば、主に3つの方法でレドックスバランスを人工的に促進することが可能である。例として、1つの方法は、ギ酸塩のCO2への変換とそれに付随する還元型NAD(P)Hの再生を触媒する酵素をコードする遺伝子の導入に基づく組換えNAD(P)Hおよび/またはリサイクルシステムの導入および増殖培地へのギ酸の外部からの供給である。米国特許出願公開第2003/0175903A1号を参照のこと(参照により本願に組み込まれる)。
【００９０】
プロピオン酸/プロピオニルCoA中間体のn-プロパノールへの変換に必要な還元等価物は、米国特許第4,732,855号(参照により本願に組み込まれる)に記載されているように、バイオリアクターに高圧のH2(低圧または高圧で、好ましくは1〜2気圧で)を添加することによって供給することもできる。この高圧は、天然または異種のヒドロゲナーゼ酵素を発現する微生物において使用することができる。
【００９１】
もう1つの代替法は、陰極およびメディエーター分子の使用による、プロピオン酸/プロピオニルCoA中間体のn-プロパノールへの変換に必要な還元等価物の供給である。この反応は、Thrash & Coates 2008, Environ. Sci. Technol. 42:3921-3931 (参照により本願に組み込まれる)の記載されているように、バイオ電気リアクターの醗酵過程と同時に行われ、ここでメディエーターは、生細胞の電子伝達体(NAD(P))に対して陰極から電子を伝達する機能を有する外部分子である。
【００９２】
作動陰極は、基準電極に対して、増殖している細胞に電極から電子を伝達するのにいろいろな電位値、例えば10mV、100mV、200mV、400mV、600mVおよび800mVまたは任意の電位値で均衡を取らせることができる。陰極は、種々の材料、形状、サイズおよび表面積で、例えばシングルワイヤ、ネットまたは固体形状の形状で構築されることができる。しかしながら、他の形状または形態もまた本発明の範囲であると考えることができる。
【００９３】
メディエーター分子は、外部から供給されるかまたは内分泌される任意の分子であることができ、高い性能で、目的とする最終生成物の濃度を最大化し、このプロセス中に生じる電流を最少化するために、細胞に電極から電子を伝達するのに必要な種々の濃度、例えば0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mMまたは任意の濃度で存在することができる。この方法のために適切なメディエーターの例は、ベンジルビオロゲン、メチルビオロゲン、アントラキノン2,6-ジスルホン酸、ニュートラルレッドおよびコバルトセプルクラートである。本発明の方法のための他の適切なメディエーター分子は、酵母抽出物に存在する化合物およびプロピオニバクテリウム種の抽出物に存在する内因性メディエーターである。本発明の他の実施形態は、バイオリアクターへの細胞の再循環による内因性メディエーターの使用である。
【００９４】
本発明において、培地への還元等価物の外部からの供給のための好ましい形は、電極およびメディエーター分子の使用による。
【００９５】
電極に供給するために使用する電流は、再生可能なエネルギー源に由来することもできるし、再生不可能なエネルギー源によることもできる。しかしながら、好ましい供給源は、再生可能供給源、例えば水力発電所であり、より好ましくは、例えばサトウキビバガスの燃焼によるような、バイオリファイナリーという概念によるものである。
【００９６】
生物電気リアクターは、作動電極(陰極)および補助の対電極(陽極)における電位の正確な測定および調節のための2つまたは3つの電極システムを用いる。リアクターの形態に必要であれば、電子シャトルを用いることができる。必要に応じて、基準電極として、水素電極または塩化銀電極などの、水性媒体に適した、現在の技術水準で公知の任意の種類の基準電極システムを本発明に用いることができる。
【００９７】
媒体のpHを好ましくなく上げたり、ガス状水素を放出する水の電気分解を防ぐために、陰極電圧は3.0V以下に維持すべきであり、好ましくは1.5V以下に維持すべきである。
【００９８】
さらに、水と反応して、微生物の増殖および完全性に大変有害な次亜塩素酸を生成する塩素を好ましくなく生成するその酸化をふせぐために、陽極コンパートメントにおいては高濃度のクロリドイオンは避けなければならない。
【００９９】
陽極および陰極は、現在の技術水準で公知のものの中から選択されたセパレータ要素によって分離された。このセパレータの目的は、イオンおよび電流の通過のみを可能にし、それを横切っての糖などの化学物質および代謝物の移動を阻止するかまたは少なくとも減少させることである。本発明に適したセパレータの例は、セラミックス多孔質セプタム、ファイバーダイヤフラムであり、好ましくは、商業的にNafionなどとして設計されている、選択透過性膜として知られるカチオン選択膜としての透過性固体電解質である。
【０１００】
陰極コンパートメントは、培地が供給され、発酵が行われる場所である。主に水ならびに可溶性栄養素、基質および代謝物からなるその組成物は、細胞の増殖および発酵を促進するその能力に加えて陰極液としてのその使用を可能にする。
【０１０１】
陽極コンパートメントは、陽極電位に対して安定で、電気を通すことができる水溶液を充填しなければならない。通例、それは100mMリン酸ナトリウム溶液としての水性緩衝液で構成されることができる。
【０１０２】
電極は、多くの異なる形状、例えば滑らかなまたは粗い表面を有する多くの異なる形状、例えばシングルワイヤ、棒、ロッド、ネット、多孔質集塊、織物構造もしくは固体または穴あきフォイルもしくはプレートに組み立てられることができる。陰極の場合は、撹拌される生物電気リアクターにおけるボルテックスを防ぐために、電極は、好ましくはそらせ板で用いられる。陽極の場合は、電極は、好ましくは、選択透過性膜によって区切られた生物電気リアクターの壁に組み立てられる。
【０１０３】
電極は、生物電気リアクターの操作条件で腐食に安定であり、優れた電気伝導体である材料でできていなければならない。陽極は、好ましくは、炭素、黒鉛または、ニッケル、白金、ステンレススチールもしくはチタニウムなどの金属もしくは合金でできていなければならない。陰極は、陰極として使用するのに適切な任意の材料、例えば黒鉛、ガラス状炭素、ステンレススチール、カーボンスチールまたは、ニッケル、鉄、鉛、チタニウム、商業的に設計されたモネル、sanicro、2RK65などの金属または合金でできていなければならない。好ましくは、陰極材料は、チタニウム、モネル、sanicroまたは2RK65などの高い水素過電圧の金属または合金で構成される。
【０１０４】
本発明における発酵培地は、天然のまたは操作された微生物によるジカルボン酸経路およびn-プロパノール生成経路を有する天然のまたは操作された微生物によるプロピオン酸の高い生産性を生じる適切な炭素源を含む。この炭素源は、単糖、例えばグルコース、フルクトースおよびキシロース;オリゴ糖、例えばショ糖およびラクトース;多糖、例えばデンプン、ペクチン、セルロースおよびヘミセルロースならびにリグノセルロース材料;脂肪酸;コハク酸;乳酸;酢酸;グリセロールおよびそれらの混合物を含むことができる。同様に、炭素源は、複雑な組成の再生可能原料由来の他の炭素源、例えばサトウキビ搾汁、サトウキビ糖蜜または、リグノセルロース材料の酸もしくは酵素による加水分解物を含むことができる。廃棄材料、例えばホエーまたは工業用グリセロール廃水もまた使用できる。
【０１０５】
本発明の特定の実施形態において、好ましくは、グリセロール、ショ糖および複雑な多成分のサトウキビ搾汁またはサトウキビ糖蜜が用いられる。
【０１０６】
適切な炭素源に加えて、生成微生物の要求に従って、当業者に公知の他の多量栄養素、例えば窒素ならびに微量栄養素、例えばリン、カリウム、ナトリウム、カルシウム、ビタミンおよび必須金属補因子を培地に加えることができる。
【０１０７】
特定の実施形態において、好ましくは、炭素源は少なくとも1つの窒素源とともに供給されることができる。
【０１０８】
特定の実施形態において、好ましい窒素源は酵母抽出物である。
【０１０９】
特定の実施形態において、好ましい窒素源はN2である。
【０１１０】
特定の実施形態において、生産性を上げる目的で培地にビタミンB5(パントテン酸)が供給される。このパントテン酸は、純粋形で提供されることもできるし、他の生物体による発酵の副生成物である粗抽出物で提供されることもできる。
【０１１１】
天然のまたは操作された微生物は、目的とする化合物の高収率生産のための条件で培養されなければならない。適切な培養条件が考慮される。プロピオン酸およびその後のn-プロパノールの製造のための天然のまたは操作された微生物は、25℃〜60℃の範囲の温度で培養され、ここで温度30℃〜32℃が好ましい。発酵の高生産のための適切なpH範囲は、pH5〜pH7.5であり、ここでpH6.5〜6.8が好ましい。嫌気的、微好気的または好気的条件下で反応を行うことができる。
【０１１２】
特定の実施形態において、嫌気性条件下での発酵が好ましい。
【０１１３】
本発明における発酵法は、種々の発酵の操作モードを用いることができる。バッチモード発酵は、プロセス維持に必要なpH調節、フォーム調節などのための試薬を除いて、発酵の最初にセットされた培地および生産微生物がさらに投入されないクローズシステムである。本発明に記載されている方法は、流加方式または連続方式において用いることもできる。
【０１１４】
この発酵法は、遊離細胞培養および固定化細胞培養において行うことができる。細胞培養物を固定化するために、種々の支持体、例えばアルギン酸塩、繊維状ベッド、アーガイル材料、例えばクリソタイル、モンモリロナイトKSFおよびモンモリロナイトK-10の使用が考えらえる。しかしながら、固定化のための他の方法は、本明細書においては本発明の範囲内であると考えられる。
【０１１５】
特定の実施形態において、好ましい条件は固定化細胞の使用である。
【０１１６】
本発明は、いくつかのバイオリアクター形状、例えば撹拌タンク、気泡塔、エアリフトリアクターおよび当業者に公知の形状で実施できる。
【０１１７】
生成物であるn-プロパノールおよび、ひいてはイソプロパノールおよび/またはエタノールは、現在の技術水準において公知の方法、例えばブロスからのエタノールの分離方法を用いて発酵液から抽出できる。これらの方法は、蒸留、反応蒸留、共沸蒸留および抽出蒸留を含む。培地から水の総量を除去する必要性はない。
【０１１８】
さらに、本発明によって得られるアルコールであるn-プロパノールおよびイソプロパノールおよび/またはエタノールは、高量のプロピレンおよびある程度の量のエチレンを生じる運転条件を用いて、同じリアクター内で脱水することができる。本発明の特定の実施形態において、リアクター供給流はn-プロパノールとイソプロパノールおよび/またはエタノールとの混合物あるいはこれらのアルコールと水との混合物であることができる。エチレンは、精製してプロピレンとのコポリマーとして用いることができる。
【０１１９】
脱水反応は、触媒、例えばアルミナ、シリカ-アルミナ、ゼオライトおよび他の金属酸化物の存在下で、180℃〜600℃の温度で、好ましくは300℃〜500℃の温度で行われる。反応は断熱反応器または等温反応器で行われるが、これらはまた、固定化リアクターまたは流動層リアクターであることもできる。
【０１２０】
n-プロパノールおよび、ひいてはイソプロパノールおよび/またはエタノールの脱水反応は、滞留時間0,1〜60秒間、好ましくは1〜30秒間を用いて最適化されることができる。未変換のアルコールは脱水リアクターに再循環させることができる。
【０１２１】
この方法において生成される汚染物質は、このタイプの反応で従来用いられている精製セクションによって除去される。プロピレンは、二酸化炭素などの酸化合物を除去するために純水または苛性アルカリ溶液で洗浄することができるし、かつ/または、水などの極性化合物を吸着させるため、また一酸化炭素を除去するため、ベッドに供給することができる。あるいは、高級炭化水素例えばプロパン、ブタン、ブチレンおよび高級化合物を分離するために、蒸留塔を用いることができる。プロピレンとエチレンの分離は、現在の技術水準において低温蒸留として知られる方法によって行われる。本発明の方法によってポリマーグレードプロピレンが得られ、これは再生可能炭素含有量100%を有する。
【０１２２】
本発明のポリプロピレンおよびそのコポリマーは、現在の技術水準において公知の重合方法によって製造され、これは105℃〜300℃の温度を用いてバルク重合法によって行うことできるし、50℃〜100℃の温度を用いて懸濁液での重合によっても行うことができる。あるいはポリプロピレンは、重合触媒、例えばチーグラーナッタまたはメタロセン触媒の存在下で、60℃〜80℃の温度を用いて気相リアクター内で生成させることができる。
【０１２３】
本発明に記載されている方法で得られた生成物は、温室ガス放出抑制に貢献する100%の生物起源含有量を有する。なぜなら、それが焼却された場合であっても、その寿命の終末においても化石二酸化炭素排出量はないと考えられるからである。
【実施例１】
【０１２４】
プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)によるサトウキビ搾汁の発酵
プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシ(ATCC番号4875)の天然株を用い、炭素源としてサトウキビ搾汁を用いるプロピオン酸およびn-プロパノールの製造を研究した。水に希釈した30%サトウキビ搾汁を含み、1g/Lの酵母抽出物を添加した培地でこの細菌を培養した。この希釈度において、希釈されたサトウキビ搾汁培地中の糖の出発濃度は、ショ糖53g/L、グルコース10.9g/Lおよびフルクトース7.4g/Lと測定された。使用前に、121℃、1kgf/cm2で20分間培地を滅菌した。
【０１２５】
P.アシドプロピオニシの馴化細胞20g/l(湿質量)を接種した滅菌培地2.0Lを含む2.5Lバイオリアクター(BioFlo 3000 、 New Brunswick社)中で遊離細胞のバッチ発酵を行った。バイオリアクター温度を30℃に維持し、撹拌速度は100rpmであった。4M NaOH溶液を添加することによって、一定のpH6.5に自動的に調節した。N2雰囲気の使用によって嫌気性条件を維持した。
【０１２６】
114時間後にバッチ発酵を停止し、所望の代謝物の標準品を用い、示差屈折率検出器(Ref action index detector)に連結された高速液体クロマトグラフィーによって生成物を定量した (Varian Chromatographer 、Transgenomic社製Aminex HPX-87H 有機酸カラムを使用し、室温で操作し、溶離液として0.002M H2SO4を用い、0.6mL/分の流量で行った)。表5は生成物の最終濃度を示す。見てわかるように、用いられた培養条件ではn-プロパノールは検出されない。
【表５】
2013503647.tif 000008
【実施例２】
【０１２７】
プロピオニルCoA還元経路の異種発現によるin vivo n-プロパノール製造のためのプロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシの操作
構築物:
pBK1T.シャトルプラスミドであるpBK1Tは、2段階で構築される。第1段階は、Kiatpapanら、2000(Appl. Env. Microbiol. 66:4688-4695) の記載に従って、P.アシドプロピオニシの天然のpRGO1プラスミドの一部と市販pUC18プラスミドの一部とを融合させることからなる。この融合の結果として、このプラスミドは、E.コリ(E.coli)およびP.アシドプロピオニシの両方の複製起点ならびに、アンピシリン耐性をE.コリに付与するマーカー遺伝子を有する。しかしながら、G+C含量およびコドン使用頻度の差異によって、この耐性遺伝子はP.アシドプロピオニシでは発現されない。P.アシドプロピオニシのメチルマロニルCoAトランスカルボキシラーゼ(E.C. 2.1.3.1)をコードする遺伝子であるpa-mmc遺伝子のプロモーターおよびターミネーター領域によって調節される、ストレプトミセス・ラウレンティ(Streptomyces laurentii)(GenBank登録番号L39157.1)から単離された抗生物質チオストレプトンに対する耐性を付与する遺伝子を含むP.アシドプロピオニシの適切な選択マーカーである合成構築物を設計した。この合成構築物は、順方向プライマーがプロモーター領域と融合させるためのハイブリダイゼーション尾部(下線部)を含み、逆方向プライマーがターミネーター領域と融合させるためのハイブリダイゼーション尾部(下線部)を含むアダプタープライマーPMMC_TSR-F(5’-CCGGGTTGCAATCAGGCTCTGATGCGCATGACTGAGTTGGACACCATCG-3’)およびTAPH_TSR-R(5’-TCAGGCTGAGAACGACCTGATCCGCCATTATCGGTTGGCCGCGAGAT-3’)を用いてプラスミドpIJ680からのチオストレプトン耐性遺伝子(Hopwood et al., 1985, “Genetic manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual”, John Innes Foundation, Norwich)を増幅することによって構築する。P.アシドプロピオニシのpa-mmc遺伝子のプロモーターおよびターミネーター領域は、プライマーNcoI_PMMC-F(5’-GATGACATCCATGGGTGTGCCATTTCTCACAATCC-3’)、PMMC-R(5’-CCGGGTTGCAATCAGGCT CTGATGCGC-3’)、TMMC-F(5’-TCAGGCTGAGAACGACCTGAT-3’)およびPsiI_TMMC-R(5’-GATCGTTTATAAGTAGGAGGCCTGCCTTGC-3’)を用いてゲノムDNAからPCR増幅する。Yuら、2004(Fungal Genetics and Biology 41:973-981)に従って、シングルジョイント(single-joint)PCRで2つのアンプリコンを結合させる。得られた合成構築物の配列を図7に示す。これをNcoIおよびPsiIで消化し、我々のシャトルベクターであるpBK1Tを作成するために、融合ベクターのPsiI(平滑)およびNcoI部位に挿入する。
pBK1T1.P.アシドプロピオニシのメチルマロニルCoAトランスカルボキシラーゼ(E.C. 2.1.3.1)をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーター領域により調節されるクロストリジウム・カルボキシディボランスの二機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ(ATCC番号BAA-624T)(Uniprotアクセッション番号C6PZV5)をコードする遺伝子をpBK1Tに挿入することによって発現プラスミドpBK1T1が構築される。P.アシドプロピオニシとC.カルボキシディボランス(C. carboxidivorans)との間のG+C含量およびコドン使用頻度の差異のために、一次アミノ酸配列の逆翻訳によって前記遺伝子を設計した。このために、強く発現される宿主のリポソームタンパク質遺伝子からコドン表を作成する。この表および全体の宿主G+C含量を類似させ、宿主の制限酵素の認識部位を避けてコドンが選択される。mRNAの二次構造を壊す逆位反復配列もまた避けた。最後に、制限酵素XbaIおよびHindIIIを用いる消化のためのアダプターをこの配列の5’末端および3’末端にそれぞれ付加する。この合成構築物の配列を図8に示す。遺伝子、その調節領域およびクローニングアダプターを含む設計された2950bp構築物は、Epoch Life Science社(http://epochlifescience.com/Service/Gene_Synthesis.aspx)により合成される。次いでこの構築物を消化し、pBK1TのXbaIおよびHindIII部位にクローニングして発現シャトルプラスミドpBK1T1を作成する。このプラスミドの概略図を図5に示し、その配列を図10に示す。
pBK1T2.P.アシドプロピオニシのメチルマロニルCoAトランスカルボキシラーゼ(E.C. 2.1.3.1)をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーター領域によって調節される、クロストリジウム・アセトブチリクムの二機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ(ATCC番号824)(Uniprotアクセッション番号P33744)をコードする遺伝子をpBK1Tに挿入することによって発現プラスミドpBK1T2が構築される。P.アシドプロピオニシとC.アセトブチリクム(C. acetobutylicum)との間のG+C含量およびコドン使用頻度の差異のために、一次アミノ酸配列の逆翻訳によって前記遺伝子を設計した。このために、強く発現される宿主のリポソームタンパク質遺伝子からコドン表を作成する。この表および全体の宿主G+C含量を類似させ、宿主の制限酵素の認識部位を避けてコドンが選択される。mRNAの二次構造を壊す逆位反復配列もまた避けた。最後に、制限酵素XbaIおよびHindIIIを用いる消化のためのアダプターをこの配列の5’末端および3’末端にそれぞれ付加する。この合成構築物の配列を図6に示す。遺伝子、その調節領域およびクローニングアダプターを含む設計された2959bp構築物は、Epoch Life Science社 (http://epochlifescience.com/Service/Gene_Synthesis.aspx)により合成される。次いでこの構築物を消化し、pBK1TのXbaIおよびHindIII部位にクローニングして発現シャトルプラスミドpBK1T2を作成する。このプラスミドの概略図を図6に示し、その配列を図11に示す。
形質転換:
pBK1T1およびpBK1T2プラスミドは、最初にE.コリGM2929株(dam-、dcm-)で増幅し、次いで標準的方法を用いて高収率で回収する。その後、これらのプラスミドを、KiatpapanおよびMurooka、2001 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:144-149)によるプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒのエレクトロコンピテント細胞(ATCC番号6207)に形質転換し、最終宿主P.アシドプロピオニシにおける消化を避けるために適切なメチル化パターンを得る。最後に、P.フロイデンライヒからプラスミドを回収し、P.アシドプロピオニシのエレクトロコンピテント細胞(ATCC番号4875)を形質転換するために用いる。50μg/mLチオストレプトンを含む培地において、発現プラスミドpBK1T1またはpBK1T2を含む形質転換細胞を選択し、4〜7日間増殖させる。
増殖:
発現プラスミドpBK1T1またはpBKT2を含むP.アシドプロピオニシの回収されたコロニーを、50μg/mLチオストレプトンおよび還元された炭素源としての5%グリセロールを含む培地(0.5%酵母抽出物、0.5%ペプトン、0.1%KH2PO4、0.2%(NH4)2HPO4、0.1%の生理食塩水溶液1および2-溶液1:1%MgSO4.7H2Oおよび0.25%MnSO4.H2O;溶液2:1%CaCl2.2H2Oおよび1%CoCl2.6H2O;pH6,8)125mLを含むエルレンマイヤーフラスコに接種するために用いる。比較例1で説明するように、OD600〜2.5に達するまで嫌気条件で培養物を増殖させ、同じ培地を用いるバイオリアクター培養物に播種するために用いる。この還元された炭素源からのn-プロパノールの製造は、示差屈折率検出器(Refraction Index detector)に連結された高速液体クロマトグラフィーによって測定され(Varian Chromatographer 、Transgenomic社製Aminex HPX-87H有機酸カラムを使用し、室温で操作し、溶離液として0.005M H2SO4を用い、1mL/分の流量で行う)、天然のP.アシドプロピオニシ株(ATCC番号4875)によるこの代謝物の製造と比較される。P.アシドプロピオニシの天然株は、おおよそ4%の収率でグリセロールからn-プロパノールを製造することが知られている(Barbirato et al., 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47: 441-446)。従って、グリセロールからのこの代謝物の製造の増加は、異種アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の効果に帰することができる。
【実施例３】
【０１２８】
生物電気リアクターおよびメディエーター分子を用いる、プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシによるショ糖の発酵
プロピオニバクテリウム・アシドプロピオニシの天然株(ATCC番号4875)を用いて、炭素源としてショ糖を用いるn-プロパノールの製造を研究した。n-プロパノールを得る目的で、レドックスバランスを促進するために生物電気リアクターおよび種々の濃度のメディエーター(コバルトセプルクラート)を用いた。
【０１２９】
1リットル当たり、KH2PO4 1g、(NH4)2HPO4 2g、FeSO4・7H2O 5mg、MgSO4・7H2O 10mg、MnSO4・H2O 2.5mg、CaCl2・6H2O 10mg、CoCl2・6H2O 10mg、酵母抽出物(Oxoid社)10gおよび炭素源としてのショ糖9gを含む合成培地でP.アシドプロピオニシを増殖させた。この培地を121℃および15psigで20分間オートクレーブした。分子の熱的不安定性を避けるために、コバルトセプルクラート(メディエーター)はオートクレーブ処理した培地に別に加えた。
【０１３０】
培地700mlを含む2.0Lファーメンター(APPLIKON社)で、生物電気リアクター内でのバッチ発酵を行った。温度を30℃に設定し、50rpmで撹拌しながら、4M NaOHの自動添加によってpHを6.5に維持した。発酵開始前および各試料採取後に、窒素置換により嫌気条件を維持した。酸化還元電位システムは、作動電極(WE)(黒鉛棒、面積4.9cm2または10.5cm2、厚さ3.0mm)および対陽極(黒鉛棒、面積30cm2、厚さ3.0mm、3M KCl 40mlを充填した対電極コンパートメントにおいて)からなる。DC電圧源(2.3〜3.1ボルト)を用いて、メディエーターの酸化還元電位(およそ-350mV)よりも150mV低く作動電極(WE)を釣り合わせた。コンピュータインターフェースを用いて、作動電極と対電極間の電流を記録した。システムに正確な電圧が印加されることを規定するために、システムに接続したポテンショスタット(AUTOLAB社製PGSTAT 302Nモデル)を用いてサイクリックボルタンメトリー実験を行った。バイオリアクターに対数期(OD〜3から5)の細胞70mlを接種し、これをポリプロピレン試験管中、30℃で増殖させた。2時間ごとに試料を採取した。吸光度(OD600)を測定した後、残った量の試料を10,000gで6分間遠心分離した。HPLCおよびSPME-GC/MS分析を行うまで、上清を-20℃で保存した。
【０１３１】
水に適切に希釈した後、ULTROSPEC 2000分光光度計UV/可視(Pharmacia Biotech社)において、600nmでの吸光度を測定することによって細胞バイオマスを算出した。HPLC-RI分析のために、0.2μmフィルター(Millipore社)によって試料を濾過した。イオン排除カラムAminex HPX-87H(Bio-Rad社)を用い、高速液体クロマトグラフィー(Waters 600 Chromatograph)によってプロピオン酸、コハク酸、酢酸、n-プロパノールおよび糖を分離し、定量した。運転条件:0.04mol L-1 H2SO4脱気溶離液、流速0.4mL/分、カラム温度35℃および屈折計温度35℃。
【０１３２】
揮発性生成物は、HS-SPMEおよびガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)を用いて確認した。この技術(SPME-固相ミクロ抽出)は、液体(溶液)から、液体もしくは固体上部のヘッドスペース(HS)から、または気相から検体を抽出するために、薄いポリマー層でコーティングされた溶融シリカ光ファイバを利用する。すべてのアッセイは、3mol L-1塩酸溶液でpH2〜3に酸性化した発酵ブロス6mLを用いて行った。アッセイの実験条件には、実験計画によって示されるものを用いた。SPMEにおける実験条件:浴槽温度(T:30〜35℃)、前平衡時間(PET:5分間)、抽出時間(Ext:3分間)。GC/MS分析は、キャリアガスとしてヘリウム(1mL min-1)を用いるStabilwax-DAキャピラリーカラム(30m×0.25mm×0.25μm)を備えたAgilent GC 6890/Hewlett-Packard5973ガスクロマトグラフによって行った。オーブン温度は次のとおりにプログラムした:40℃で3分間維持し、次いで5℃/分で130℃まで上げ、次いで40℃/分で210℃まで上げる。注入ポートには直径0.75mmのライナーを備え、インジェクターはスプリットレスモードで210℃に維持した。これらの条件下で、抽出間で行ったブランクランで試料のキャリーオーバーは認められなかった。揮発性生成物は、その実験スペクトルと、WILEY Mass Spectra Libraryのスペクトルおよび標準品の注入との比較によって同定した。
【０１３３】
表6に、発酵36時間後の、種々のメディエーター濃度および作動陰極面積でのいくつかの発酵により得られたn-プロパノールの最終濃度の概略を示す。対照発酵においては、印加電圧およびメディエーター濃度はゼロであった。見てわかるように、メディエーターを含む発酵においてn-プロパノールが検出され、その最終濃度は、用いられた濃度範囲におけるメディエーター濃度および作動陰極面積に応じて増加する。
【０１３４】
天然株を用いた場合、n-プロパノールは条件に応じて1.0〜9.6%の収率で生成され、0.8mMコバルトセプルクラート(WE面積4.9cm2)の条件で最良の結果が得られた。P.アシドプロピオニシのネイティブ遺伝子adhは、プロピオン酸のプロパノールへの変換に十分ではないことをこれらの結果は示唆している。次の段階は、実施例2に記載されているように、C.カルボキシディボランスからの遺伝子を発現する遺伝子改変株を用いて発酵を行うことからなる。
【０１３５】
対照発酵および1.0mMコバルトセプルクラートを添加した発酵の36時間後のHPLCを図12(a)および(b)に示し、GC-MSスペクトルをGC-MSスペクトルに示す。生物電気リアクターおよびメディエーター分子を用いた発酵においてのみ、n-プロパノールピークが出現する。図12は、1.0mMコバルトセプルクラートを用いた発酵液において得られたGC-MSクロマトグラムを示す。すべての発酵実験において、生成物であるプロピオン酸、酢酸およびn-プロパノールはGC-MSによって確認した。
【０１３６】
対照発酵および1.0mMコバルトセプルクラート発酵の細胞増殖の経時変化を図14に示す。両発酵において、ODおよび通常の最終生成物の生成を考慮すれば、同様な行動を観察することは可能である。しかしながら、メディエーター分子を用いる発酵においては、n-プロパノールは発酵の初めから生成され、その濃度は細胞増殖に従って増加する。
【表６】
2013503647.tif 000009
【０１３７】
本明細書に記載されているすべての公報および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示すものである。すべての公報および特許出願は、個別の公報または特許出願が個別・具体的に示されて参照により組み込まれるのと同様にして参照により本願に組み込まれる。
【０１３８】
前述の発明は、例示として、かつ理解を明らかにするための例として少し詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲を逸脱することなく特定の変更および改変を行うことができることは明らかであろう。
【図１】
2013503647.tif 000010
【図２】
2013503647.tif 000011
【図３】
2013503647.tif 000012
【図４】
2013503647.tif 000013
【図５】
2013503647.tif 000014
【図６】
2013503647.tif 000015
【図７】
2013503647.tif 000016
【図８−１】
2013503647.tif 000017
【図８−２】
2013503647.tif 000018
【図９−１】
2013503647.tif 000019
【図９−２】
2013503647.tif 000020
【図１０−１】
2013503647.tif 000021
【図１０−２】
2013503647.tif 000022
【図１０−３】
2013503647.tif 000023
【図１０−４】
2013503647.tif 000024
【図１０−５】
2013503647.tif 000025
【図１０−６】
2013503647.tif 000026
【図１０−７】
2013503647.tif 000027
【図１１−１】
2013503647.tif 000028
【図１１−２】
2013503647.tif 000029
【図１１−３】
2013503647.tif 000030
【図１１−４】
2013503647.tif 000031
【図１１−５】
2013503647.tif 000032
【図１１−６】
2013503647.tif 000033
【図１１−７】
2013503647.tif 000034
【図１２】
2013503647.tif 000035
【図１３】
2013503647.tif 000036
【図１４】
2013503647.tif 000037
【国際調査報告】
2013503647.tif 000038
2013503647.tif 000039
2013503647.tif 000040