(57)【要約】水溶性の橋で分子内架橋された化学的に反応性の高い色素、それらのバイオ複合体およびそれらの使用について記述する。水溶性の橋を有する反応性の高い蛍光性色素は、スペクトル的に架橋されていないまたは疎水性橋で架橋された色素の複合体よりも優れている。本発明は、反応性の高い蛍光性色素、それらの生物学的複合体および使用を包含する。
2013539015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2013539015.tif 000099
を有する化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表し、ＲＭは、化学的に反応性の高い部分であり、かつ、ＷＳＢは、発光性色素の同じ環の２つの巨大な置換基を架橋するため、または発光性色素の２つの異なる環を架橋するためのいずれかに使用される水溶性の橋であり、但し、ＷＳＢは少なくとも１つのスルホネートまたはホスホネート基を含有することを特徴とする発光性色素。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、ＤＹＥは、シアニン、フルオレセイン、ローダミン、オキサジン、オキサゾール、ボディピー、フタロシアニンまたは金属錯体誘導体であることを特徴とする化合物。
【請求項３】
前記請求項のいずれかに記載の化合物であって、ＲＭは、アクリルアミド、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニルまたはソラーレン誘導体であることを特徴とする化合物。
【請求項４】
前記請求項のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、スルホネートおよびホスホネート基から選択される少なくとも２つの基を含有することを特徴とする化合物。
【請求項５】
前記請求項のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、下記の構造またはそれらの類似体：
【化２−１】
2013539015.tif 000100
【化２−２】
2013539015.tif 000101
【化２−３】
2013539015.tif 000102
の１つを含有することを特徴とする化合物。
【請求項６】
式：
【化３】
2013539015.tif 000103
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ５およびＲ６は、独立に、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ１０およびＲ２１、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ５およびＲ１３、Ｒ６およびＲ１５、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲＩ７、Ｒ１７およびＲ１８、またはＲ１８およびＲ２０の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；ＲＭは、化学的に反応性の高い部分であり；かつ、ｎは０から３であることを特徴とする発光性色素。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であって、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする化合物。
【請求項８】
請求項６および７のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、スルホネートおよびホスホネート基から選択される少なくとも２つの基を含有することを特徴とする化合物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、ＲＭを含有することを特徴とする化合物。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の化合物であって、Ｒ１２およびＲ１６は、独立に、スルホネートまたはホスホネート基であることを特徴とする化合物。
【請求項１１】
式：
【化４】
2013539015.tif 000104
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＣＲ２０Ｒ２１であり；ｎは０から３であり；Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；ＹおよびＲ１０、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、ＸおよびＲ１８、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲ１７、またはＲ１７およびＲ１８の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキルまたはヘテロ環を形成し；かつ、ＲＭは、化学的に反応性の高い部分であることを特徴とする発光性色素。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物であって、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする化合物。
【請求項１３】
請求項１１〜１２のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、スルホネートおよびホスホネート基から選択される少なくとも２つの基を含有することを特徴とする化合物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、ＲＭを含有することを特徴とする化合物。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の化合物であって、Ｒ１１およびＲ１７は、独立に、スルホネートまたはホスホネート基であることを特徴とする化合物。
【請求項１６】
式：
【化５】
2013539015.tif 000105
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ４からＲ６は、独立に、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０は、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ４およびＲ１０、Ｒ５およびＲ１０、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ６およびＲ１５、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲ１７、Ｒ１７およびＲ１８、またはＲ１８およびＲ２０の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；ＲＭは、化学的に反応性の高い部分であり；ｎは０から３であることを特徴とする発光性色素。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物であって、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする化合物。
【請求項１８】
請求項１６〜１７のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、スルホネートおよびホスホネート基から選択される少なくとも２つの基を含有することを特徴とする化合物。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、ＲＭを含有することを特徴とする化合物。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の化合物であって、Ｒ１１およびＲ１６は、独立に、スルホネートまたはホスホネート基であることを特徴とする化合物。
【請求項２１】
式：
【化６】
2013539015.tif 000106
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、Ｒ１は、水素、アルキル、アルコキシ、カルボキシまたはスルホであり；Ｒ２からＲ９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、独立に、アルキル、ハロゲン化アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ８およびＲ１０、またはＲ７およびＲ１３の１つまたは複数は、組み合わさって、５から８員環を形成し；Ｒ６およびＲ７、またはＲ８およびＲ９の１つまたは複数は、組み合わさって、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；かつ、ＲＭは、化学的に反応性の高い部分であることを特徴とする発光性色素。
【請求項２２】
請求項２１に記載の化合物であって、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする化合物。
【請求項２３】
請求項２１〜２２のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、スルホネートおよびホスホネート基から選択される少なくとも２つの基を含有することを特徴とする化合物。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれかに記載の化合物であって、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、独立に、カルボキシまたはスルホネート基であることを特徴とする化合物。
【請求項２５】
式：
【化７】
2013539015.tif 000107
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、Ｌは、０〜３０原子の長さのリンカーであり；かつ、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする発光性色素。
【請求項２６】
式：
【化８】
2013539015.tif 000108
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、Ｒ１からＲ６は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；かつ、ＲＭは、化学的に反応性の高い部分であることを特徴とする発光性色素。
【請求項２７】
請求項２６に記載の化合物であって、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする化合物。
【請求項２８】
請求項２６〜２７のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、スルホネートおよびホスホネート基から選択される少なくとも２つの基を含有することを特徴とする化合物。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の化合物であって、ＷＳＢは、ＲＭを含有することを特徴とする化合物。
【請求項３０】
式：
【化９】
2013539015.tif 000109
を有する請求項１に記載の化学的に反応性の高い発光性色素であって、式中、Ｌは、０〜３０原子の長さのリンカーであり；かつ、ＲＭは、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソチオシアネート、マレイミドまたはハロゲン化スルホニルであることを特徴とする発光性色素。
【請求項３１】
式：
【化１０】
2013539015.tif 000110
を有する複合体であって、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表し；ＷＳＢは、発光性色素の同じ環の２つの巨大な置換基を架橋するため、または発光性色素の２つの異なる環を架橋するために使用される水溶性の橋であり、かつ、少なくとも１つのスルホネートまたはホスホネート基を含有し；ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲは、１０００ダルトンより大きい分子量を有する生物学的物質であり；ｎは、１〜３０の整数であり、但し、ＤＹＥは、直接的に、またはリンカー「Ｌ」を介して間接的にＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲと共有結合しており；かつ、Ｌは、０〜３０原子の長さのリンカーであることを特徴とする複合体。
【請求項３２】
請求項３１に記載の複合体であって、ＤＹＥは、シアニン、フルオレセイン、ローダミン、オキサジン、オキサゾール、ボディピー、チオフェン、フタロシアニンまたは金属錯体誘導体であることを特徴とする複合体。
【請求項３３】
請求項３１〜３２のいずれかに記載の複合体であって、前記複合体は、式２、３、４、５、６、７または８を有する化学的に反応性の高い発光性色素と、ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲとの反応から誘導されることを特徴とする複合体。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれかに記載の複合体であって、ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲは、ペプチド、タンパク質、多糖、オリゴヌクレオチド、核酸、脂質、リン脂質、リポタンパク質、リポ多糖、リポソーム、脂溶性高分子、高分子微粒子、動物細胞、植物細胞、細菌、酵母またはウイルスであることを特徴とする複合体。
【請求項３５】
請求項３１〜３４のいずれかに記載の複合体であって、ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲは抗体であることを特徴とする複合体。
【請求項３６】
試料中における特異的な結合対の相補的メンバーを検出する方法であって、
ａ）前記試料に請求項３１に記載の複合体を添加し、前記ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲは、前記特異的な結合対の一方のメンバーを含むステップと、
ｂ）前記複合体が前記試料中において前記相補的メンバーとの錯体を形成するための十分な時間を与え、前記錯体は検出可能な蛍光応答を呈するステップと、
ｃ）蛍光機器で前記錯体を検出して前記相補的メンバーを位置づけるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記特異的な結合対の第１のメンバーは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸高分子または多糖であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記特異的な結合対の第１のメンバーは、抗体、抗体フラグメント、アビジン、ストレプトアビジン、レクチンまたは酵素を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記相補的メンバーは、細胞、細菌、ウイルスもしくは酵母細胞中に存在する、または高分子、高分子膜もしくは高分子粒子に固定化されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記蛍光応答を、検出可能に異なる光学特性を有する第２のフルオロフォアの蛍光応答と区別するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記蛍光応答は、フローサイトメーターを使用して検出され、前記蛍光応答に基づいて前記錯体を分類するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
細胞機能をモニターする方法であって、
ａ）請求項３１に記載の複合体を、細胞を含有する試料に添加し、前記ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲは、特異的な結合対の一方のメンバーを含み、前記細胞は、前記特異的な結合対の他方のメンバーを含有するステップと、
ｂ）前記試料を、前記複合体が前記特異的な結合対の前記他方のメンバーとの錯体を形成するための十分な時間にわたってインキュベートするステップと、
ｃ）前記試料を、前記複合体からの蛍光応答を発生させる波長で照射するステップと、
ｄ）前記複合体からの蛍光応答を検出するステップと、
ｅ）前記蛍光応答を細胞機能と相関させるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
ａ）前記細胞を刺激するステップと、
ｂ）前記複合体からの前記蛍光応答の強度における変化をモニターするステップと、
ｃ）前記蛍光強度における前記変化を細胞機能と相関させるステップと
をさらに含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３１に記載の複合体と、
第２のアッセイ構成要素と
を含むことを特徴とする、細胞アッセイを実施するためのキット。
【請求項４５】
前記第２の構成要素は、生物学的緩衝液であることを特徴とする、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性色素および色素複合体を包含する発光性色素；ならびにそれらの生物学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年７月２１日に出願した米国特許仮出願第６１／３９９，９９５号明細書、および２０１１年７月１２日に出願した米国特許出願第１３／１８１，１０７号明細書の出願日の優先権を主張するものである。
【０００３】
発光性プローブは、分子および細胞の分析および分離のため、ならびに他の材料の検出および定量化のための有益な試薬である。極めて少数の発光性分子が、最適な環境下で検出され得る。蛍光性プローブの用途のいくつかの具体例は、（１）蛍光フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類および蛍光顕微鏡検査法の技術による、細胞の混合物中における細胞の亜集団の同定および分離；（２）蛍光イムノアッセイの技術における、第２の種（例えば、抗原−抗体反応物）に結合する物質の濃度の決定；（３）蛍光染色の技術による、ゲルおよび他の不溶性の支持体中における物質の局所化である。これらの技術は、その全部が参照により本明細書に組み込まれている文献によって記述されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４参照）。
【０００４】
上記の目的で発光性色素を用いる場合、蛍光性色素の選択には多くの制約がある。１つの制約は、蛍光性色素の吸収および発光特徴であり、これは、被験試料、例えば血液、尿、脳脊髄液中の多くの配位子、受容体および材料が蛍光を発し、蛍光性標識の蛍光の正確な決定を妨げることになるためである。この現象は、自己蛍光またはバックグラウンド蛍光と呼ばれる。別の考慮すべき事項は、蛍光性色素を、配位子および受容体ならびに他の生物学的および非生物学的材料と複合させる能力、ならびに蛍光性色素に対するそのような複合の影響である。多くの状況において、別の分子との複合は、蛍光性色素の蛍光性特徴における実質的な変化をもたらし得、いくつかの事例においては、蛍光性色素の量子効率を実質的に破壊しまたは低減させ得る。蛍光性色素との複合により、標識された分子の機能を不活性化することも可能である。第３の考慮すべき事項は、高感度な検出のために高くなくてはならない発光性色素の量子効率である。第４の考慮すべき事項は、同じく可能な限り大きくなくてはならない、発光性色素の光吸収能または減衰係数である。蛍光性分子がごく接近している際に互いに相互作用して自己消光をもたらすか否かも関心事である。さらなる関心事は、単独で、または蛍光性色素が複合される化合物と併せてのいずれかによる、他の化合物または容器の壁への発光性色素の非特異的結合があるか否かである。
【０００５】
上記に示した方法の適用性および価値は、適切な蛍光性化合物のアベイラビリティーと密接に結び付いている。特に、これらの発色団の励起は生成する自己蛍光が少なく、また、スペクトルの全可視および近赤外領域を利用できれば、異なる波長での複数の発色団の蛍光発光を同時に分析することもできるため、より長い波長領域（黄色から近赤外）で発光する蛍光性物質が必要である。フルオレセインは、広く使用されている蛍光性化合物であり、緑色領域において有用な発光体であるが、ある特定のイムノアッセイおよび細胞分析システムにおいて、フルオレセイン吸収波長での励起によって発生したバックグラウンド自己蛍光が、検出感度を限定する。しかしながら、従来の赤色蛍光性標識であるローダミンは、フルオレセインよりも有効性が低いことが証明されている。
【０００６】
フィコビリタンパク質は、その高い減衰係数および高い量子収率により、重要な貢献をしてきた。これらの発色団含有タンパク質は、多くのタンパク質と共有結合することができ、顕微鏡検査法およびフローサイトメトリーにおける蛍光抗体アッセイに使用される。フィコビリタンパク質は、（１）タンパク質を標識する手順（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）が比較的複雑である；（２）タンパク質を標識する効率（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が通常高くない（典型的には、タンパク質１個当たり平均０．５個のフィコビリタンパク質分子）；（３）フィコビリタンパク質が天然生成物であり、その調製および精製が複雑である；（４）フィコビリタンパク質が高価である；（５）現時点では、６８０ｎｍで最大限に蛍光を発するアロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）よりもスペクトルのさらに赤色領域まで蛍光を発する標識試薬として利用可能なフィコビリタンパク質がない；（６）フィコビリタンパク質が、３３，０００から２４０，０００までの範囲の分子量を持つ大きなタンパク質であり、代謝産物、薬物、ホルモン、誘導体化されたヌクレオチド、および抗体を包含する多くのタンパク質等、標識するのに望ましい多くの材料よりも大きいという不利点を有する。後者の不利点は、大きなフィコビリタンパク質で標識された抗体、アビジン、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ、ホルモンおよび低分子が、複合した錯体のサイズによって課される立体的制限によりそれらの標的と結合できないため、特に重要である。
【０００７】
組織学、細胞学、イムノアッセイを伴う他の技術も、より長い波長で高い量子効率、吸収および発光特徴を持つ蛍光性色素の使用により、複合のための単純な手段を有し、かつ非特異的な妨害が実質的にないという実質的な利益を享受するであろう。
【０００８】
蛍光性化合物は、他の材料に共有的にまたは非共有的に付着して、色および蛍光を付与する。鮮やかに蛍光を発する色素（Ｂｒｉｇｈｔｌｙ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ）は、卓越した感度で、付着した材料の検出または位置づけを可能にする。ある特定のカルボシアニン色素は、様々な生物学的用途のための、標識試薬としての有用性を実証した（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋらの特許文献１（１９９１）、Ｗａｇｇｏｎｅｒらの特許文献２（１９９３）、Ｗａｇｇｏｎｅｒの特許文献３（１９９６）、Ｗａｇｇｏｎｅｒらの特許文献４（１９９６）、Ｗａｇｇｏｎｅｒらの特許文献５（１９９６）、Ｗａｇｇｏｎｅｒの特許文献６（１９９７）、Ｂｒｕｓｈらの特許文献７（１９９８）、Ｒｅｄｄｉｎｇｔｏｎらの特許文献８（１９９９）、Ｓｈｅｎらの特許文献９（１９９９）、Ｌｅｕｎｇらの特許文献１０（１９９９）、Ｗａｇｇｏｎｅｒらの特許文献１１（１９９９）、Ｍｉｎｄｅｎらの特許文献１２（２０００）、Ｍｉｎｄｅｎらの特許文献１３（２０００）、Ｗａｇｇｏｎｅｒらの特許文献１４（２０００）、Ｗａｇｇｏｎｅｒらの特許文献１５（２０００）参照）。それでもやはり、多くのカルボシアニン色素は、論じられているように、ある特定の不利点、例えば、生体高分子複合体におけるカルボシアニン色素の蛍光の極端な消光、例えば、複合体上のＣｙ５およびＣｙ７色素変異体の消光、が知られている（例えば、非特許文献５参照）。加えて、反応性カルボシアニン色素の、ある特定の所望のスルホアルキル誘導体は、Ｃｙ３およびＣｙ５変異体について示されている通り、調製するのが困難である（例えば、非特許文献６参照）。シアニン色素も自己集合する（すなわち、堆積する）傾向が極めて強く、これにより、広範な総説において記述されている通り、蛍光量子収率を有意に低減させることができる（例えば、非特許文献７参照）。
【０００９】
現存するカルボシアニン標識色素に関連するもう１つの問題は、それらの蛍光強度を有意に低減させる、中心が複合した（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）二重結合の周囲にある２つのインドリウム（つまり、ベンゾチアゾリウムまたはベンゾイミダゾリウム）頭部の自由回転／振動である。この現象は、「ベルト緩め効果（ｌｏｏｓｅ  ｂｅｌｔ  ｅｆｆｅｃｔ）」と呼ばれることが記述されている（例えば、非特許文献８参照）。
【００１０】
このいわゆる「ベルト緩め効果」は、２つの頭部の架橋によって解消することができる。上述した「ベルト緩め効果」を解消することが期待されるシアニンの１，１’−架橋が開示されている（例えば、Ｒ．Ｓｉｎｇｈらの特許文献１６（２００１）参照）。しかしながら、１，１’−架橋は、同様の色素／タンパク質比での架橋されていないカルボシカニン（ｃａｒｂｏｃｙｃａｎｉｎｅ）−タンパク質複合体の蛍光量子収率と比較して減少した色素−タンパク質複合体の蛍光量子収率を実際に引き起こすことが観察された（例えば、Ｄｉｗｕらの特許文献１７参照）。この不都合な蛍光減少は、１，１’−架橋の不適切な立体化学によって、または高度に疎水性の橋の付加に起因する疎水性の増大によって引き起こされるかもしれない。
【００１１】
シアニン標識色素の蛍光特性は、１位と３’位との間にある２つのインドリン部分の分子内架橋によって改善されることが観察された（例えば、Ｄｉｗｕらの特許文献１７参照）。１，３’−架橋されたカルボシアニンは、スペクトル的に同様の１，１’−架橋されたまたは架橋されていない色素の複合体よりも優れている。１，３’−架橋されたシアニンによるこの改善は、好都合な配置に起因するかもしれない。しかしながら、疎水性橋は色素の疎水性を有意に増大させる。架橋されていないカルボシアニン色素と比較して、１，３’−架橋または１，１’−架橋されたカルボシアニンのいずれかとタンパク質および他の生物学的分子との複合は、高度に疎水性の架橋剤によって引き起こされる有意に低減した標識色素の水溶性による、標識化標的分子の沈殿をしばしば引き起こした。いくつかの事例においては、高度に疎水性の橋によるカルボシアニンの架橋は、標識される標的分子の完全な活性喪失をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，９８１，９７７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２６８，４８６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５６９，５８７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５６９，７６６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４８６，６１６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６２７，０２７号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８０８，０４４号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８７７，３１０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，００２，００３号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，００４，５３６号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，００８，３７３号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，０４３，０２５号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，１２７，１３４号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，１３０，０９４号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，１３３，４４５号明細書
【特許文献１６】国際公開第０１／０２３７４号パンフレット
【特許文献１７】米国特許第７，４６５，８１０号明細書
【特許文献１８】米国特許第７，７０４，２８４号明細書
【特許文献１９】米国特許第７，４９１，８３０号明細書
【特許文献２０】米国特許第７，３４４，７０１号明細書
【特許文献２１】米国特許第６，２２９，０５５号明細書
【特許文献２２】米国特許第６，１３０，１０１号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，５８０，９９０号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，７１４，３２７号明細書
【特許文献２５】米国特許第５，９８５，５６６号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，７１４，３８６号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，０４７，５１９号明細書
【特許文献２８】米国特許第４，７１１，９５５号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，６８４，１４２号明細書
【特許文献３０】米国特許第５，６５９，０２５号明細書
【特許文献３１】米国特許第５，６６８，２６８号明細書
【特許文献３２】米国特許第５，６７９，７８５号明細書
【特許文献３３】米国特許第６，１５０，５１０号明細書
【特許文献３４】米国特許第５，５３９，０８２号明細書
【特許文献３５】米国特許第５，５６７，５８８号明細書
【特許文献３６】米国特許第５，４０５，９７５号明細書
【特許文献３７】米国特許第５，４５３，５１７号明細書
【特許文献３８】米国特許第５，５１６，９１１号明細書
【特許文献３９】米国特許第５，０４９，６７３号明細書
【特許文献４０】米国特許第５，６４８，２７０号明細書
【特許文献４１】米国特許第６，０８３，４８５号明細書
【特許文献４２】米国特許第５，８３１，０９８号明細書
【特許文献４３】米国特許第６，０８６，７３７号明細書
【特許文献４４】米国特許第６，０４８，９８２号明細書
【特許文献４５】米国特許第５，４５３，５０５号明細書
【特許文献４６】米国特許第５，６３９，８７４号明細書
【特許文献４７】米国特許第３，８６４，６４４号明細書
【特許文献４８】米国特許第４，０１１，０８６号明細書
【特許文献４９】国際公開第０２／２６８９１号パンフレット
【特許文献５０】英国特許第８７０，７５３号明細書
【特許文献５１】米国特許出願公開第２００７／００７７５４号明細書
【特許文献５２】米国特許第５，４５１，６６３号明細書
【特許文献５３】米国特許第５，４３３，８９６号明細書
【特許文献５４】米国特許第５，１８７，２８８号明細書
【特許文献５５】米国特許第５，２４８，７８２号明細書
【特許文献５６】米国特許第４，７７４，３３９号明細書
【特許文献５７】米国特許第６，３２９，２０５号明細書
【特許文献５８】米国特許第６，３１６，２６７号明細書
【特許文献５９】米国特許第７，０８７，３８４号明細書
【特許文献６０】米国特許第５，３３２，６６６号明細書
【特許文献６１】米国特許第５，１７１，５３４号明細書
【特許文献６２】米国特許第４，９９７，９２８号明細書
【特許文献６３】国際公開第９４／０５６８８号パンフレット
【特許文献６４】米国特許出願公開第２００８／０１７７０８６号明細書
【特許文献６５】米国特許出願公開第２００７／００７７５４９号明細書
【特許文献６６】米国特許第５，１６２，５０８号明細書
【非特許文献】
【００１３】
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【非特許文献２９】Jones and Bean, “CHEMISTRY OF PYRROLES, ORGANIC CHEMICAL MONOGRAPH”, 1977
【非特許文献３０】Jones, “CHEMISTRY OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS, VOLUME 48, PART 1 AND PART 2, THE SYNTHESIS AND THE PHYSICAL AND CHEMICAL ASPECTS OF THE PYRROLE RING, THE SYNTHESIS, REACTIVITY, AND PHYSICAL PROPERTIES OF SUBSTITUTED PYRROLES”, 1992
【非特許文献３１】Bunzli, CHEM. REV. 2010, 110, 2729
【非特許文献３２】BIOCONJUGATE CHEM. 2001, 12, 7
【非特許文献３３】Bunzli and Piguet, CHEM. REV. 2002, 102, 1897
【非特許文献３４】Kido, CHEM. REV. 2002, 102, 2357
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【非特許文献３６】Haugland, et al., METH. MOL. BIOL., 45, 205 (1995)
【非特許文献３７】Haugland, METH. MOL. BIOL., 45, 223 (1995)
【非特許文献３８】Haugland, METH. MOL. BIOL., 45, 235 (1995)
【非特許文献３９】Haugland, CURRENT PROTOCOLS IN CELL BIOLOGY, 16.5.1-16.5.22 (2000)
【非特許文献４０】Estep et al., ANAL. BIOCHEM., 157, 100-105 (1986)
【非特許文献４１】Nimmakayalu M, et al., BIOTECHNIQUES, 28, 518-522 (2000)
【非特許文献４２】Giaid A, et al. HISTOCHEMISTRY, 93, 191-196 (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明人らは、「ベルト緩め効果」を解消して標識色素の蛍光量子収率を増大させるだけでなく、それらの水溶性も増大させ、故に疎水性の架橋結合した橋（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｒｉｄｇｅ）を含有する現存する発光性色素でのタンパク質沈殿という欠点を解消する、新たな水溶性架橋剤を発見した。本発明人らは、この水溶性の橋の戦略を使用して、他の種類の発光性色素の標識特性およびスペクトル特性も改善し得ることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
キサンテン色素は、標識タンパク質および他の生物学的分子に主に使用される別のクラスの蛍光性プローブである（例えば、Ｅｌｉｕらの特許文献１８（２０１０）、Ｌａｍらの特許文献１９（２００９）、Ｒｅｄｄｉｎｇｔｏｎらの特許文献２０（２００８）、Ｋｌａｕｂｅｒｔらの特許文献２１（２００１）、Ｍａｏらの特許文献２２（２０００）参照）。本発明人らは、キサンテン色素の「ベルト緩め効果」を、それらの水溶性も有意に増大させながら、２つの置換基頭部と新たな水溶性架橋剤との架橋によって解消できることを発見した。同じ原理を使用して、オキサゾール色素−タンパク質複合体および発光性の金属錯体−タンパク質複合体の蛍光量子収率および水溶性を同時に増大させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】シアニン１３３、１３４および１３５（Ｃｙ５  ＮＨＳエステル）からそれぞれ調製され、実施例５６において記述されている通りに特徴づけられる、色素−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）複合体の蛍光量子収率の比較を示す図である。それらのＰＢＳ溶液を、６００ｎｍでＯＤ＝０．０５の同じ吸収を有するように調整する。ＰＢＳ溶液を６００ｎｍで励起させ、発光を６２０から８００ｎｍまで走査する。化合物１３４から調製されるタンパク質複合体（曲線Ａ、色素／タンパク質＝４．８）は、化合物１３３（曲線Ｂ、色素／タンパク質＝４．６）または１３５（曲線Ｃ、色素／タンパク質＝４．５）のいずれかから調製される複合体よりもはるかに鮮やかである。化合物１３３は、色素／タンパク質比が１０より大きい場合にはタンパク質を沈殿させるのに対し、化合物１３４の色素−タンパク質複合体は、色素／タンパク質比が１０より大きい場合も依然として水溶性である。
【図２】シアニン３９、１３６および１３７（Ｃｙ５ビス−ＮＨＳエステル）からそれぞれ調製され、実施例５６において記述されている通りに特徴づけられる、色素−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）複合体の蛍光量子収率の比較を示す図である。それらのＰＢＳ溶液を、６００ｎｍでＯＤ＝０．０５の同じ吸収を有するように調整する。ＰＢＳ溶液を６００ｎｍで励起させ、発光を６２０から８００ｎｍまで走査する。化合物３９から調製されるタンパク質複合体（曲線Ａ、色素／タンパク質＝５．１）は、化合物１３６（曲線Ｃ、色素／タンパク質＝５．０）または１３７（曲線Ｂ、色素／タンパク質＝５．３）のいずれかから調製される複合体よりもはるかに鮮やかである。化合物１３６は、色素／タンパク質比が８より大きい場合にはタンパク質を沈殿させるのに対し、化合物３９の色素−タンパク質複合体は、色素／タンパク質比が８より大きい場合も依然として水溶性である。
【図３】ローダミン４３および１３２からそれぞれ調製され、実施例５６において記述されている通りに特徴づけられる、色素−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）複合体の蛍光量子収率の比較を示す図である。それらのＰＢＳ溶液を、４５０ｎｍでＯＤ＝０．１の同じ吸収を有するように調整する。ＰＢＳ溶液を４６０ｎｍで励起させ、発光を４７０から６５０ｎｍまで走査する。化合物４３から調製されるタンパク質複合体（曲線Ａ、色素／タンパク質＝４．５）は、化合物１３２から調製される複合体（曲線Ｂ、色素／タンパク質＝４．７）よりもはるかに鮮やかである。化合物１３２は、色素／タンパク質比が１２より大きい場合にはタンパク質を沈殿させるのに対し、化合物４３の色素−タンパク質複合体は、色素／タンパク質比が１２より大きい場合も依然として水溶性である。
【図４】水溶性の１，１’−架橋された分子内橋を有するシアニンの合成を示す図である。
【図５】水溶性の１，３’−架橋された分子内橋を有するシアニンの合成を示す図である。
【図６】水溶性の３，３’−架橋された分子内橋を有するシアニンの合成を示す図である。
【図７】水溶性の分子内橋を有するオキサゾールの合成を示す図である。
【図８】水溶性の分子内橋を有するローダミンの合成を示す図である。
【図９】水溶性の分子内橋を有するユーロピウム錯体の合成を示す図である。
【図１０】化合物４９のマウス抗ヒトＣＤ４複合体とパシフィックオレンジ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのフローサイトメトリー比較を示す図である。正常ヒト血液を、化合物１０８のマウス抗ヒトＣＤ４複合体およびパシフィックオレンジとともにインキュベートする。抗体複合体とともにインキュベーション後、処理された血液をデカントし、ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）での分析のため、ペレットを０．５ｍｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁させる。分析を紫色レーザーの４０５ｎｍ励起で実施し、５５０／４０ｎｍバンドパスフィルターに通して発光を収集する。ＦＳＣ対ＳＳＣドットプロットを使用して、リンパ球をゲートし、蛍光中央値を測定する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明人らは、新たなクラスの水溶性の架橋結合した橋が、背景技術の節において論じられている問題を思いがけなく緩和し、構造的に同様に架橋されていない色素または疎水性の橋で架橋されている色素で標識された複合体よりも、タンパク質、核酸および他の生体高分子上で実質的に発光性が高い、色素−高分子複合体をもたらすことを見出した（図１、２および３を参照）。本発明の色素−生体分子複合体の増強された発光強度および保持された結合親和性は、より卓越したアッセイ感度をもたらす。
【００１８】
さらに、本発明の色素は、典型的には約４００ｎｍから１０００ｎｍの間の吸光度最大値を呈するため、これらの色素を、紫色レーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、水銀アーク灯（５４６ｎｍ）、周波数が２倍のＮｄ−Ｙａｇレーザー（５３２ｎｍ）、Ｋｒイオンレーザー（５６８ｎｍおよび６４７ｎｍ）、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（５４３ｎｍ、５９４ｎｍおよび６３３ｎｍ）または長波長のレーザーダイオード（とりわけ６３５ｎｍ以上）の主要な輝線に一致するように選択することができる。本発明のいくつかの色素は、極めて長波長の励起（少なくとも６４０ｎｍであるが、約７３０ｎｍより大きいものもある）および発光バンド（少なくとも６６５ｎｍであり、約７５０ｎｍより大きいものもある）を呈するため、それらの色素は、赤外波長に透明な試料に特に有用である。
【００１９】
本発明は、水溶性の橋（ＷＳＢ）で架橋されている反応性の高い発光性色素およびその複合体を含む。これらの色素および色素複合体は、試料中における分析物または配位子の相互作用または存在を位置づけるまたは検出するために使用される。そのような色素または色素複合体を組み込んだキットは、そのような方法におけるそれらの使用を容易にする。
【００２０】
別の態様において、本発明は、基質と複合されている、水溶性の橋（ＷＳＢ）で架橋された本発明の発光性色素の１つまたは複数を含む色素−複合体を提供する。好ましい実施形態において、色素−複合体は、試料中における分析物を検出し、同定し、位置づけし、または定量化するための蛍光性検出試薬として使用される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、色素−複合体基質は生体高分子であり、この生体高分子を、水溶性の橋（ＷＳＢ）で架橋された本発明の発光性色素の１つまたは複数と複合して、蛍光性生体高分子を取得する。本発明の蛍光性生体高分子色素−複合体は、分析物特異的な検出試薬を包含する検出試薬としての、またはその一部としての有用性を有する。有用な生体高分子は、例えば、アミノ酸高分子、核酸高分子、多糖、炭水化物および脂質を包含する。好ましい実施形態において、色素−生体高分子複合体の生体高分子構成要素は、本明細書において広く定義されている通りのアミノ酸高分子である。好ましい実施形態において、生体高分子はモノクローナル抗体である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明の反応性色素または色素−複合体を含有するキットを提供する。本発明のキットは、他の試薬または緩衝液等、意図されている用途を行うために有用なさらなる構成要素を含有し得る。
【００２３】
本発明の色素は、典型的には、式１を有し、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ）部分であり；ＷＳＢは、発光性色素の同じ環の２つの巨大な置換基または発光性色素の２つの異なる環のいずれかを架橋するために使用される、水溶性の橋である。
【００２４】
【化１】
2013539015.tif 000003
【００２５】
本発明の色素は、１）ＲＭ基と；２）発光性色素の同じ環の２つの巨大な置換基または発光性色素の２つの異なる環のいずれかを分子内架橋する水溶性かつ複合されていない橋とを含有する発光性色素を含む。本発明の一実施形態において、第１の環系または第２の環系は、ＲＭ基を含有する側鎖によって置換されている。別の実施形態において、ＷＳＢはＲＭ基を含有する。
【００２６】
本発明の一態様において、本発明の発光性色素は、１回以上スルホン化される。加えて、本発明の色素は、後述する通り、１つまたは複数の化学的に反応性の高い部分（ＲＭ）または複合した物質によって置換されている。好ましい実施形態において、本発明の色素は、１つのみのＲＭによって置換されている。
【００２７】
好ましいＷＳＢは、少なくとも１つの負に帯電した基（例えば、カルボキシ、スルホネート、ホスフェートおよびホホネート（ｐｈｏｐｈｏｎａｔｅ））を組み込んで、水溶性を増大させる。「スルホネート」が意味するのは、スルホン酸またはスルホン酸の塩（スルホネート）である。同様に、「カルボキシ」が意味するのは、カルボン酸またはカルボン酸の塩である。「ホスフェート」は、本明細書において使用される場合、リン酸のエステルであり、ホスフェートの塩を包含する。「ホスホネート」は、本明細書において使用される場合、ホスホン酸を意味し、ホスホネートの塩を包含する。加えて、「スルホネート」および「ホスホネート」は、それぞれ「スルホニル」および「ホスホニル」と交換可能である。本明細書において使用される場合、別段の指定がない限り、アルキル、アルコキシ、アリールアルキル、アリルアミノ（ａｌｙｌａｍｉｎｏ）、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウムまたはペルフルオロアルキル等、置換基のアルキル部は、任意選択的に飽和、不飽和、直鎖状または分枝鎖状であり、すべてのアルキル、アルコキシ、アルキルアミノおよびジアルキルアミノ置換基は、カルボキシ、スルホネート、アミノまたはヒドロキシによってそれ自体が任意選択的にさらに置換される。
【００２８】
別の好ましいＷＳＢは、スルホアルキル、スルホアリール、スルホヘテロアリール、ホスホニルアルキル、ホスホニルアリールまたはホスホニルヘテロアリール基から誘導された少なくとも２つの水溶性部分を含有するペプチドである。別の好ましいＷＳＢは、チオフェン部分を含有する。別の好ましいＷＳＢは、ＲＭを含有する。
【００２９】
好ましいＤＹＥは、フルオレセイン、ローダミン、オキサジン、シアニン、オキサゾール、ボディピー、フタロシアニン、チオフェン、ルテルニウム（ｒｕｔｈｅｒｎｉｕｍ）錯体またはランタニド錯体である。
【００３０】
別の好ましい実施形態は、式２の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００３１】
【化２】
2013539015.tif 000004
【００３２】
別の好ましい実施形態は、式３の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００３３】
【化３】
2013539015.tif 000005
【００３４】
別の好ましい実施形態は、式４の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００３５】
【化４】
2013539015.tif 000006
【００３６】
別の好ましい実施形態は、式５の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００３７】
【化５】
2013539015.tif 000007
【００３８】
別の好ましい実施形態は、式６の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００３９】
【化６】
2013539015.tif 000008
【００４０】
別の好ましい実施形態は、式７の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００４１】
【化７】
2013539015.tif 000009
【００４２】
別の好ましい実施形態は、式８の化合物であり、式中、ＤＹＥは、発光性色素を表す。ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００４３】
【化８】
2013539015.tif 000010
【００４４】
別の好ましい実施形態は、式９の化合物であり、式中、Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ５およびＲ６は、独立に、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ１０およびＲ２１、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ５およびＲ１３、Ｒ６およびＲ１５、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲ１７、Ｒ１７およびＲ１８、またはＲ１８およびＲ２０の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分であり；ｎは０から３である。
【００４５】
【化９】
2013539015.tif 000011
【００４６】
２つの環系の間の複合したポリメチン橋の長さは、色素の吸収特性および発光特性に大きな影響を及ぼす。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のそれぞれは、存在する場合、独立に、水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｎ−ヘテロ芳香族部分またはイミニウムイオンである。あるいは、２つの置換基Ｒ１／Ｒ２、Ｒ２／Ｒ３は、組み合わさった場合、非置換であるか、または１〜６個の炭素、ハロゲンもしくはカルボニル酸素を有する飽和もしくは不飽和アルキルによって任意選択的に１回以上置換された、４、５または６員の飽和または不飽和の炭化水素環を形成する。典型的には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、存在する場合、水素である。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つが非水素である場合、それは、典型的には橋かけおよび複合した二重結合の中心の炭素上の置換基である。同様に、橋かけおよび複合した二重結合が４、５または６員環を組み込んでいる場合、それは、典型的には複合した橋部分の中心で生じる。
【００４７】
別の好ましい実施形態は、式１０の化合物であり、式中、Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ５およびＲ６は、独立に、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ１０およびＲ２１、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ５およびＲ１３、Ｒ６およびＲ１５、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲ１７、Ｒ１７およびＲ１８、またはＲ１８およびＲ２０の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分であり；ｎは０から３である。
【００４８】
【化１０】
2013539015.tif 000012
【００４９】
別の好ましい実施形態は、式１１の化合物であり、式中、Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ５およびＲ６は、独立に、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ１０およびＲ２１、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ５およびＲ１３、Ｒ６およびＲ１５、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲ１７、Ｒ１７およびＲ１８、またはＲ１８およびＲ２０の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分であり；ｎは０から３である。
【００５０】
【化１１】
2013539015.tif 000013
【００５１】
別の好ましい実施形態は、式１２の化合物であり、式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＣＲ２０Ｒ２１であり；Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ５およびＲ６は、独立に、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０からＲ１９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ１０およびＲ２０、Ｒ１０およびＲ２１、Ｒ１０およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１５およびＲ１６、Ｒ１６およびＲ１７、Ｒ１７およびＲ１８、またはＲ１８およびＲ２０、Ｒ１８およびＲ２１の１つまたは複数は、任意選択的に組み合わさって、シクロアルキル、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環を形成し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分であり；ｎは０から３である。
【００５２】
【化１２】
2013539015.tif 000014
【００５３】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１３の化合物であり、式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＣＲ３０Ｒ３１であり；ｎは０から３であり；Ｒ１からＲ３は、独立に、水素、ハロゲン、１〜２０個の炭素を有するアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ８からＲ２７は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ３０およびＲ３１は、独立に、アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００５４】
【化１３】
2013539015.tif 000015
【００５５】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１４の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００５６】
【化１４】
2013539015.tif 000016
【００５７】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１５の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００５８】
【化１５】
2013539015.tif 000017
【００５９】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１６の化合物であり、式中、Ｒ１は、水素、アルキル、アルコキシ、カルボキシまたはスルホであり；Ｒ２からＲ９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、独立に、アルキル、ハロゲン化アルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ８およびＲ１０、またはＲ７およびＲ１３の１つまたは複数は、組み合わさって、５から８員環を形成し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００６０】
【化１６】
2013539015.tif 000018
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１７の化合物であり、式中、Ｒ１は、水素、アルキル、アルコキシ、カルボキシまたはスルホであり；Ｒ２からＲ９は、独立に、水素、１〜２０個の炭素を有するアルキル、１〜２０個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、メチルチオ、スルホニル、ボロニル、ホスホニル、シアノ、カルボニル、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリールまたはＲＭであり；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、独立に、アルキル、ハロゲン化されたアルキル、アリールアルキル、アルコキシアルキル、ポリエチレングリコールまたはＲＭであり；Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ８およびＲ１０、またはＲ７およびＲ１３の１つまたは複数は、組み合わさって、５から８員環を形成し；ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００６２】
【化１７】
2013539015.tif 000019
【００６３】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１８の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００６４】
【化１８】
2013539015.tif 000020
【００６５】
本発明の別の好ましい実施形態は、式１９の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００６６】
【化１９】
2013539015.tif 000021
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態は、式２０の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００６８】
【化２０】
2013539015.tif 000022
【００６９】
本発明の別の好ましい実施形態は、式２１の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００７０】
【化２１】
2013539015.tif 000023
【００７１】
本発明の別の好ましい実施形態は、式２２の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００７２】
【化２２】
2013539015.tif 000024
【００７３】
本発明の別の好ましい実施形態は、式２３の化合物であり、式中、ＲＭは、後述する化学的に反応性の高い部分である。
【００７４】
【化２３】
2013539015.tif 000025
【００７５】
本発明の化合物の多くの実施形態は、全体的な電子電荷を保有する。そのような電子電荷が存在することが示されている場合、明示的に同定されてもされなくてもよい適正な対イオンの存在によって平衡されていることを理解すべきである。いくつかの用途に好ましい生物学的に適合する対イオンは、生物学的用途において毒性ではなく、生体分子に対して実質的に有害な影響を有さない。本発明の化合物が正に帯電している場合、対イオンは、典型的には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、アルカンスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、テトラアリールホウ化物（ｔｅｔｒａａｒｙｌｂｏｒｉｄｅ）、硝酸塩、および芳香族または脂肪族カルボン酸のアニオンから選択されるがこれらに限定されない。本発明の化合物が負に帯電している場合、対イオンは、典型的には、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、アンモニウム、または置換されているアンモニウムもしくはピリジニウムイオンから選択されるがこれらに限定されない。好ましくは、任意の必要な対イオンは生物学的に適合するものであり、使用される際には毒性でなく、かつ生体分子に対して実質的に有害な影響を有さない。対イオンは、イオン交換クロマトグラフィーまたは選択的沈殿等、当技術分野において周知の方法によって容易に変化する。
【００７６】
本発明の色素は、１つのまたは別の特定の電子共鳴構造で描かれてきたことを理解すべきである。本発明のあらゆる態様は、主題の色素上の電子電荷が色素自体の全体にわたって非局在化されているため、他の許容される共鳴構造で形式的に描かれる色素に等しく当てはまる。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「ＲＭ」と表示される「反応性部分」は、異なる化合物上の官能基と化学的に反応して共有結合を形成することができる化合物上の部分を指す。
【００７８】
本発明の一実施形態において、色素は少なくとも１つのＲＭを含有し、ここで、ＲＭは、共有結合Ｌによって色素に付着している反応性部分である。ある特定の実施形態において、色素をＲＭに付着させる共有結合は、スペーサーとしての役割を果たす複数の介在原子を含有する。ＲＭを有する色素は、適切な反応性を持つ官能基を含有する、または含有するように修飾されている多種多様な有機または無機物質を標識して、複合した物質の化学的付着をもたらす。本明細書において使用される場合、反応性部分「ＲＭ」は、異なる化合物上の官能基と化学的に反応して共有結合を形成することができる化合物上の部分を意味する。典型的には、反応性部分は、それぞれ求核試薬または求電子試薬である対応する官能基への暴露によって共有結合を形成することができる、求電子試薬または求核試薬である。あるいは、反応性部分は光活性化可能な基であり、適正な波長の光による照射の後にのみ化学的に反応性が高くなる。典型的には、反応性色素と複合される物質との間の複合反応は、反応性部分ＲＭの１つまたは複数の原子を組み込んで、複合した物質に色素を付着させる新たな結合Ｌをもたらす。反応性部分および結合の選択された例を表１に示し、ここで、求電子基と求核基との反応は共有結合を生み出す。
【００７９】
【表１−１】
2013539015.tif 000026
【００８０】
【表１−２】
2013539015.tif 000027
【００８１】
2013539015.tif 000028
【００８２】
色素を、複合される物質に付着させるために使用される反応性部分の選択は、典型的には、複合される物質上の官能基および所望される共有結合の種類または長さによって決まる。典型的には有機または無機物質上に存在する官能基の種類は、アミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスホネート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、カルボキシレートエステル、スルホネートエステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらの基の組合せを包含するがこれらに限定されない。単一種の反応性部位が物質上で利用可能（多糖に典型的）となってもよく、または、タンパク質に典型的なように、様々な部位が生じてもよい（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）。複合した物質は、同じであっても異なっていてもよい１つを超える色素と、またはビオチン等のハプテンによってさらに修飾されている物質と複合され得る。若干の選択性は反応条件の慎重な制御によって取得できるが、標識化の選択性は、適正な反応性色素の選択によって最もよく取得される。
【００８３】
典型的には、ＲＭは、アミン、チオール、アルコール、アルデヒドまたはケトンと反応することになる。好ましくは、ＲＭは、アミンまたはチオール官能基と反応する。一実施形態において、ＲＭは、アクリルアミド、反応性アミン（カダベリンまたはエチレンジアミンを含む）、カルボン酸の活性化エステル（典型的には、カルボン酸のスクシンイミジルエステル）、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニルまたはチオール基である。「反応性白金錯体」が特に意味するのは、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５において記述されているもの等の化学的に反応性の高い白金錯体である。
【００８４】
反応性部分が、アジド、ジアジリニル、アジドアリールまたはソラーレン誘導体等の光活性化可能な基である場合、色素は、適正な波長の光による照射の後にのみ化学的に反応性が高くなる。ＲＭがカルボン酸の活性化エステルである場合、反応性色素は、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはハプテンの色素−複合体を調製するために特に有用である。ＲＭがマレイミドまたはハロアセトアミドである場合、反応性色素は、チオール含有物質との複合に特に有用である。ＲＭがヒドラジドである場合、反応性色素は、過ヨウ素酸塩で酸化された炭水化物および糖タンパク質との複合に特に有用であり、加えて、細胞マイクロインジェクションのためのアルデヒド固定可能な極性トレーサーである。好ましくは、ＲＭは、カルボン酸、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミン、パーフルオロベンズアミド、アジドパーフルオロベンズアミド基またはソラーレンである。より好ましくは、ＲＭは、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミドまたは反応性白金錯体である。
【００８５】
上記で述べた特質に基づいて、本発明の適正な反応性色素は、所望の色素−複合体の調製のために選択され、その有利な特性により、それらの色素−複合体は多種多様な用途に有用となる。特に有用な色素−複合体は、中でも、基質がペプチド、ヌクレオチド、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、タンパク質、核酸、核酸高分子、炭水化物、脂質、イオン錯化部分、ガラスまたは非生物学的高分子である複合体を包含する。あるいは、基質は、細胞、細胞系、細胞断片もしくは細胞内粒子（例えば、とりわけ）、ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス構成要素、生物学的細胞（動物細胞、植物細胞、細菌、酵母または原生生物等）、または細胞構成要素である。反応性色素は、典型的には、細胞表面、細胞膜、細胞小器官または細胞質中にある官能基を標識する。
【００８６】
典型的には、基質は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、チラミン、多糖、イオン錯化部分、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラーレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、高分子、高分子微粒子、生物学的細胞またはウイルスである。より典型的には、基質は、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸である。本発明の色素をそのような生体高分子と複合させる場合、１分子当たりより多くの色素を組み込んで蛍光シグナルを増大させることが可能である。例えば、総蛍光を喪失することなく、抗体の分子１個当たりそのような色素の少なくとも３個の分子を組み込むことが可能であるのに対し、スペクトル的に同等のＣｙ５の蛍光（ここで、ｎ＝２）は、抗体１個当たりおよそ２個を超えるＣｙ５色素が組み込まれた場合に強く消光される。これらの結果は、他の文献によって報告されているＣｙ５複合体に関連する問題を裏付けるものである（例えば、非特許文献５参照）。本発明の最適に標識された複合体は、典型的には、同じ抗体濃度のＣｙ５色素または１，１’−架橋されたＣｙ５の複合体よりもはるかに蛍光性である。
【００８７】
一実施形態において、基質は、アミノ酸（ホスホネート、炭水化物またはＣ１からＣ２５カルボン酸によって保護または置換されているものを含む）であるか、またはペプチドもしくはタンパク質等のアミノ酸の高分子である。ペプチドの好ましい複合体は、少なくとも５個のアミノ酸を含み、より好ましくは５から３６個のアミノ酸を含む。好ましいペプチドは、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質およびタンパク質キナーゼ基質を包含するがこれらに限定されない。好ましいタンパク質複合体は、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、フィコビリタンパク質および他の蛍光性タンパク質、ホルモン、毒素、ケモカイン、ならびに成長因子を包含する。１つの好ましい態様において、複合したタンパク質は、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリン、アロフィコシアニンＢ、Ｂ−フィコエリトリンおよびフィコエリトロシアニン等のフィコビリタンパク質である（例えば、Ｒｏｅｄｅｒｅｒの特許文献２６（１９９８）参照）。特に好ましいのは、Ｒ−フィコエリトリンの、およびアロフィコシアニンの、本発明の選択される色素との複合体であり、これらは励起状態のエネルギーアクセプターまたはドナーとしての役割を果たす。これらの複合体において、励起状態のエネルギー移動は、比較的短い波長で励起された場合に、長波長の蛍光発光をもたらす。
【００８８】
本発明の一態様において、基質は、抗体（無傷の抗体、抗体フラグメントおよび抗体血清等を含む）、アミノ酸、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、ビオチン（例えば、アミドビオチン、ビオシチン、デスチオビオチン等）、血液構成要素のタンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノゲン、プラスミノーゲン等）、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、ＩｇＧ結合タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ等）、蛍光性タンパク質（例えば、フィコビリタンパク質、エクオリン、緑色蛍光性タンパク質等）、成長因子、ホルモン、レクチン（例えば、コムギ胚芽凝集素、コンコナバリン（ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ）Ａ等）、リポ多糖、金属結合タンパク質（例えば、カルモデュリン等）、微生物もしくはその一部分（例えば、細菌、ウイルス、酵母等）、神経ペプチドおよび他の生物学的に活性な因子（例えば、デルモルフィン、デルトロピン（ｄｅｌｔｒｏｐｉｎ）、エンドモルフィン、エンドルフィン、腫瘍壊死因子等）、非生物学的微粒子（例えば、フェロ流体、金、ポリスチレン等のもの）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド毒素（例えば、アパミン、ブンガロトキシン、ファロイジン等）、リン脂質結合タンパク質（例えば、アネキシン等）、低分子薬物（例えば、メトトレキサート等）、構造タンパク質（例えば、アクチン、フィブロネクチン、ラミニン、微小管会合タンパク質、チューブリン（ｔｕｂｌｉｎ）等）、またはチラミドである、複合した物質である。
【００８９】
別の実施形態において、基質は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸高分子であり、アルキニル結合（例えば、特許文献２７参照）、アミノアリル結合（例えば、特許文献２８参照）、またはヘテロ原子置換リンカー（例えば、特許文献２９参照）または他の結合等、本発明の色素の付着のためのさらなるリンカーまたはスペーサーを保有するように修飾されているものを包含する。別の実施形態において、複合した物質は、プリンまたはピリミジン塩基をホスフェートまたはポリホスフェート部分と、非環式スペーサーを経由して結合させる、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である。別の実施形態において、色素は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの炭水化物部と、典型的にはヒドロキシル基を経由してであるがさらにチオールまたはアミノ基を経由して複合される（例えば、特許文献３０、特許文献３１、特許文献３２参照）。典型的には、複合したヌクレオチドは、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸またはジデオキシヌクレオシド三リン酸である。ホスフェートまたはポリホスフェート部分への、メチレン部分または窒素もしくは硫黄ヘテロ原子の組み込みも有用である。７−デアザプリン等の非プリン（Ｎｏｎｐｕｒｉｎｅ）および非ピリミジン（ｎｏｎｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）塩基（例えば、特許文献３３参照）、ならびにそのような塩基を含有する核酸を、本発明の色素とカップリングしてもよい。脱プリン化した核酸と、アミン、ヒドラジドまたはヒドロキシルアミン誘導体との反応によって調製される核酸付加物は、核酸を標識し、検出するというさらなる意味を提供する（例えば、非特許文献９参照）。
【００９０】
好ましい核酸高分子複合体は、標識された、一本鎖もしくは多重鎖の、天然もしくは合成のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるか、または、モルホリン誘導体化ホスフェート等の珍しいリンカーもしくはＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニット等のペプチド核酸を組み込んでいる。核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合、核酸は、典型的には５０個より少ないヌクレオチドを含有し、より典型的には２５個より少ないヌクレオチドを含有する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）の複合体（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、特許文献３４参照）は、それらの概してより高速のハイブリダイゼーション速度のため、いくつかの用途に好ましいことがある。
【００９１】
一実施形態において、本発明の複合したオリゴヌクレオチドは、代謝産物、色素、ハプテンまたはタンパク質等の特定の標的分子のためのアプタマーである。すなわち、オリゴヌクレオチドは、標的分子と優先的に結合するために選択されたものである。所与の標的分子のためのアプタマーを調製しスクリーニングするための方法は、既に記述されており、当技術分野において公知である（例えば、Ｇｏｌｄの特許文献３５（１９９６）参照）。
【００９２】
別の実施形態において、基質は、典型的にはデキストラン、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロースおよびセルロース等の多糖である、炭水化物である。あるいは、炭水化物は、リポ多糖である多糖である。好ましい多糖複合体は、デキストランまたはリポ多糖複合体である。
【００９３】
イオン錯化部分を有する複合体は、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、亜鉛、カリウム、または他の生物学的に重要な金属イオンの指示薬としての役割を果たす。好ましいイオン錯化部分は、クラウンエーテル（例えば、特許文献３６参照）；１，２−ビス−（２−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸の誘導体（ＢＡＰＴＡキレート剤；例えば、特許文献３７、特許文献３８および特許文献３９参照）；２−カルボキシメトキシアニリン−Ｎ，Ｎ−ジ−酢酸の誘導体（ＡＰＴＲＡキレート剤；例えば、非特許文献１０参照）；またはピリジンベースおよびフェナントロリンベースの金属イオンキレート剤（例えば、特許文献４０参照）；またはニトリロ三酢酸の誘導体（例えば、非特許文献１１参照）である。好ましくは、イオン錯化部分は、クラウンエーテルキレート剤、ＢＡＰＴＡキレート剤、ＡＰＴＲＡキレート剤、またはニトリロ三酢酸の誘導体である。
【００９４】
非生物学的材料の他の複合体は、有機もしくは無機高分子、高分子フィルム、高分子ウエハー、高分子膜、高分子粒子、または高分子微粒子（磁性および非磁性のミクロスフェア）；鉄、金または銀の粒子；伝導性および非伝導性の金属および非金属；ならびに、ガラスおよびプラスチックの表面および粒子の色素−複合体を包含する。複合体は、任意選択的に、高分子を調製する間に、適正な官能性を含有する色素を共重合すること、または適切な化学反応性を持つ官能基を含有する高分子を化学修飾することによって調製される。高分子の色素−複合体を調製するために有用な他の種類の反応は、アルケンの触媒重合または共重合、およびジエンとジエノフィルとの反応、エステル交換またはアミノ基転移を包含する。別の実施形態において、複合した物質は、光ファイバーまたは他の構造に形成され得るガラスまたはシリカである。
【００９５】
一実施形態において、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸高分子等の生物学的高分子の複合体はまた、任意選択的に本発明のさらなる色素である少なくとも第２の発光性色素で標識されて、エネルギー移動対を形成する。本発明のいくつかの態様において、標識された複合体は酵素基質として機能し、酵素的加水分解はエネルギー移動を中断させる。本発明の別の実施形態において、本発明の色素を組み込んだエネルギー移動対は、そのヘアピン立体配座において効率的な蛍光消光を見せるオリゴヌクレオチドと複合される（例えば、いわゆる「分子指標」、非特許文献１２参照）。
【００９６】
反応性色素を使用する色素複合体の調製は、文書で十分に立証されている（例えば、非特許文献１３、非特許文献１４、および非特許文献１５参照）。複合体は、典型的には、適正な反応性色素および複合される物質を、その両方が可溶性である適切な溶媒中で混合することによって得られる。本発明の色素の大多数は、水溶液に易溶性であり、ほとんどの生物学的材料との複合反応を容易にする。光活性化されている反応性色素では、複合には反応性色素を活性化するための反応混合物の照射を要する。
【００９７】
合成
本発明の発光性色素は、２つの異なる経路を使用して容易に合成できる。（１）．ＷＳＢ架橋剤を最初に調製する。ＷＳＢリンカーは、標準的な液相化学を使用して作製できる。ＷＳＢが３つを超える水溶性の基を有するならば、標準的な固相ペプチド合成によってＷＳＢリンカーを調製することができることもある。ＷＳＢを、２つの官能基を含有する発光性色素とカップリングしてよい。この戦略を、図５、７、８および９において例証する。（２）．ＷＳＢを発光性色素前駆体とカップリングし、その後これを凝縮して、所望の色素を得る。この戦略を、図４および６において例証する。
【００９８】
発光性色素の合成については、文献において十分に記述されている。これらの基本構造を、合成の最中または後に、任意選択的にさらに置換して、上記で定義した通りの対応する色素置換基を得る。カルボシアニンでは、重要中間体は、フィッシャーのインドール合成に類似する反応によって容易に合成される（例えば、非特許文献１６、非特許文献１７参照）。本発明のシアニン色素の合成は、重要なインドリン中間体の最初の調製に依拠する。Ｌｉｃｈａら、特許文献４１（２０００）には、インドリン中間体の典型的な合成（ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ）が記述されている。これらの基本構造を、合成の最中または後に、任意選択的にさらに置換して、上記で定義した通りの対応する色素置換基を得る。新規重要中間体は、フィッシャーのインドール合成に類似する反応によって、またはフェニレンジアミン（ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）とカルボニル化合物との縮合によって、容易に合成される。ＷＳＢ置換カルボシアニンを図４において例証する。
【００９９】
本発明のシアニン色素の合成は、結合が橋かけおよび複合した二重結合である場合、ある特定の重要な橋かけ中間体の最初の調製に依拠する。例えば、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン、トリエチルオルトホルメートマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）塩酸塩、１，１，３−トリメトキシプロパン、１，１，３，３−テトラメトキシプロパンおよびグルタコンアルデヒドジアニル一塩化物が、カルボシカニンの合成において使用される周知の橋かけ中間体である。橋かけおよび複合した二重結合を有する適正なカルボシアニンのさらなる例は、文献において以前に記述されている（例えば、Ｄｉｗｕらの特許文献１７、Ｏｌｌｍａｎｎ二世の特許文献４２（１９９８）、Ｐａｔｏｎａｙらの特許文献４３（２０００）、Ｗａｇｇｏｎｅｒの特許文献４４（２０００）、およびＬｅｅらの特許文献４５（１９９５）、Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｆらの特許文献４６（１９９７）、Ｌｉｎｃｏｌｎらの特許文献４７（１９７５）、Ｓｉｍｓｏｎらの特許文献４８（１９７７）参照）。橋かけおよび複合した炭素原子がＲＭで置換されているカルボシアニンの典型的な全合成を、図４、５および６において例証する。
【０１００】
カルボシアニンの合成のために、適正に置換されているアリールヒドラジン（典型的には適正に置換されているフェニルヒドラジンである）を、適正に置換されているメチルケトンと反応させて、３，３−二置換２−メチルインドール誘導体を生み出す。スルホン化フェニルヒドラジン誘導体またはスルホン化ナフチルヒドラジン誘導体を利用して最終色素の溶解性を増大させることが特に適切である。次いで、３，３−二置換−２−メチルインドールを、典型的にはヨウ化エチル等のハロゲン化アルキル、ｐ−トルエンスルホン酸メチル等のスルホン酸アルキル、またはプロパンスルトンもしくはブタンスルトン等の環式スルホネートであるアルキル化剤により、窒素原子上で四級化してインドリウム誘導体とする。典型的には、重要なインドリウムまたはベンゾインドリウム中間体を、四級化の前または後に１回以上スルホン化し、その後ベンザゾリウム部分およびポリメチン部分と縮合して、対象の色素を形成する。ポリメチン橋上の、または色素前駆体のインドリウムもしくはベンゾリウム部上の置換基を生み出す、これらの方法の変形形態が当技術分野において周知である。
【０１０１】
本発明のアザカルボシアニン色素を同様にして合成することができる（例えば、Ｌｅｕｎｇ  Ｗら、特許文献４９、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、Ｆｉｃｋｅｎらの特許文献５０（１９６１）参照）。概して、これらの色素の合成には、３つの前駆体：適正なベンザゾリウムまたはアザベンザゾリウム塩、およびポリメチンスペーサー源を要する。典型的には、各構成要素は、適正な化学置換基、または適正な置換基に変換され得る官能基（例えばＲＭ）を組み込むように選択される。対象の誘導体のいずれかを生み出すようにこれらの前駆体を調製し組み合わせるために要される化学は、概して当業者によく理解されている。
【０１０２】
キサンテン色素は、レゾルシノール誘導体（フルオレセインを得る）、３−アミノフェノール（ローダミンを得る）、またはレゾルシノールと３−アミノフェノールとの組合せ（ロドールを得る）から調製される（例えば、Ｅｌｉｕらの特許文献１８（２０１０）、Ｌａｍらの特許文献１９（２００９）、Ｒｅｄｄｉｎｇｔｏｎらの特許文献２０（２００８）、Ｋｌａｕｂｅｒｔらの特許文献２１（２００１）、Ｍａｏらの特許文献２２（２０００）、非特許文献２２を参照）。
【０１０３】
オキサゾール色素は、典型的には、酸誘導体（例えば、塩化アシル、無水物または活性化エステル）と２−アミノケトンとの縮合、続いて脱水により合成され、所望のオキサゾール色素を得る（例えば、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、Ｂｕｌｌｅｒらの特許文献５１参照）。様々なオキサゾール色素を調製するための他の代替的な合成方法も文献において公知である（例えば、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８参照）。
【０１０４】
適正に置換されているピロールとカルボニル化合物との縮合、続くＢＦ３錯体形成のためにボディピーを合成し、続いてＢＦ３錯体形成により、所望のボディピー色素を得る（例えば、Ｋａｎｇらの特許文献５２（１９９５）、Ｋａｎｇらの特許文献５３（１９９５）、Ｋａｎｇらの特許文献５４（１９９３）、Ｋａｎｇらの特許文献５５（１９９３）、Ｋａｎｇらの特許文献５６（１９８８）参照）。これらの基本構造を、合成の最中または後に、任意選択的にさらに置換して、上記で定義した通りの対応する色素置換基を得る。ピロール前駆体の合成は、文献において極めてよく知られている（例えば、非特許文献２９、非特許文献３０参照）。
【０１０５】
金属錯体の合成は、よく研究されているビピリジン誘導体等の配位子に大いに依拠する（例えば、Ｄｉｗｕらの特許文献５７、Ｂｈａｌｇａｔらの特許文献５８、Ａｕｔｉｅｒｏらの特許文献５９参照）。同等の結果を生み出すことができる多くの可能な変形形態があると認められる。金属配位子の合成は、文献において十分に記述されている（例えば、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５参照）。
【０１０６】
表１において記述されているもの等の様々な反応性部分を含有する色素の合成のための方法は、当技術分野において文書で十分に立証されている。特に有用なのは、カルボン酸の「活性化エステル」等のアミン反応性色素であり、これは、典型的には、カルボン酸を比較的酸性の「脱離基」とカップリングすることによって合成される。他の好ましいアミン反応性部分は、ＰＣｌ５またはＰＯＣｌ３等のハロゲン化剤を使用してスルホン酸から調製されるハロゲン化スルホニル；ハロゲン化シアヌルとアミンとの反応によって調製されるハロトリアジン；および、アミンとホスゲンまたはチオホスゲンとからそれぞれ調製されるイソシアネートまたはイソチオシアネートを包含する。
【０１０７】
アミンおよびヒドラジドを含有する色素は、カルボン酸、アルデヒドおよびケトンとの複合に特に有用である。ほとんどの場合、これらは、カルボン酸の活性化エステルまたはハロゲン化スルホニルと、カダベリン等のジアミンとの、またはヒドラジンとの反応によって合成される。あるいは、芳香族アミンは、一般に、芳香族ニトロ化合物の化学的還元によって合成される。アミンおよびヒドラジンは、標準的な方法によるチオール反応性ハロアセトアミドまたはマレイミドの合成に特に有用な前駆体である（例えば、非特許文献１３、非特許文献１５参照）。本発明の選択された実施形態を、表２に記す。
【０１０８】
【表２−１】
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【０１０９】
【表２−２】
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【０１１０】
【表２−３】
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【０１１１】
【表２−４】
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【０１１２】
【表２−５】
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【０１１３】
【表２−６】
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【０１１４】
【表２−７】
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【０１１５】
【表２−８】
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【０１１６】
【表２−９】
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【０１１７】
【表２−１０】
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【０１１８】
【表２−１１】
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【０１１９】
【表２−１２】
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【０１２０】
【表２−１３】
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【０１２１】
【表２−１４】
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【０１２２】
【表２−１５】
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【０１２３】
用途および使用方法
本発明の一態様において、本発明の色素化合物は、試料を同定または定量化できるよう、試料を直接的に染色または標識するために使用される。例えば、そのような色素は、生物学的な標的分析物のためのアッセイの一部として、生物学的もしくは非生物学的流体中の検出可能なトレーサー元素として；または、腫瘍細胞および腫瘍組織を選択的に破壊するために着色した試料に放射線照射する、腫瘍の光線力学的療法等の目的のため；または、通常は一重項酸素の光増感生成によって、動脈プラークもしくは細胞を光剥離するために添加され得る。１つの好ましい実施形態において、色素複合体は、複合した物質が特異的な結合対の相補的メンバーである配位子を含む試料を染色するために使用される（例えば、表３）。典型的には、試料は、液体源から直接的に、または、固体材料（有機もしくは無機）、もしくは培養するために細胞が導入された成長培地、もしくは評価のために細胞を入れた緩衝溶液か、洗浄液として、取得される。試料が細胞を含む場合、その細胞は、場合により、微生物を包含する単細胞、または多細胞生物、胚、組織、生検、フィラメント、生物膜等を包含する二次元または三次元の層で他の細胞と会合している多細胞である。
【０１２４】
あるいは、試料は、固体、任意選択的に、スメアもしくはスクレープ、または濾過によって液体もしくは蒸気から除去された残余分である。本発明の一態様において、試料は、尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質液、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、便、生理的分泌物または他の同様の流体等、分離した、もしくは濾過されていない生物学的流体を包含する生物学的流体から取得される。
【０１２５】
あるいは、試料は、土、水もしくは空気等の環境源から；または、廃水流、水源、供給ラインもしくは製造ロットから採取したもの等の産業発生源から取得される。
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
また別の実施形態において、試料は、固体または半固体マトリックスの上または中に存在する。本発明の一態様において、マトリックスは膜である。別の態様において、マトリックスは、核酸もしくはタンパク質を分離し特徴づけるために使用されるもののような電気泳動ゲルであるか、または電気泳動ゲルから膜への移動によって調製されるブロットである。別の態様において、マトリックスはシリコンチップまたはスライドガラスであり、関心対象の分析物は、チップまたはスライド上に配列して固定化されている（例えば、試料はマイクロアレイ中のタンパク質または核酸高分子を含む）。また別の態様において、マトリックスはマイクロウェルプレートまたはマイクロ流体チップであり、試料は、自動化法によって、典型的には、薬剤スクリーニング等のハイスループットスクリーニングの種々の方法によって分析される。
【０１２８】
本発明の色素化合物は、概して、上述した通りの本発明の色素化合物を関心対象の試料と、検出可能な光学的応答を生み出すように選択された条件下で組み合わせることによって利用される。用語「色素化合物」は、本明細書において、反応性色素および色素複合体の両方を包含する、特許請求されている色素のすべての態様を指すために使用される。色素化合物は、典型的には、試料の元素と共有もしくは非共有結合性の会合もしくは錯体を形成するか、または単純に試料または試料の一部の境界内に存在する。次いで、光学的応答を導出するように選択された波長で試料を照射する。典型的には、試料の染色を使用して、光学的応答を標準的なまたは期待される応答とさらに比較することにより、試料の特定の特徴を決定する。
【０１２９】
検出可能な光学的応答は、観察によってまたは機器を用いてのいずれかで検出可能な光学的シグナルにおける変化またはその光学的シグナルの発生を意味する。典型的には、検出可能な応答は、強度、蛍光の励起もしくは発光波長分布、蛍光寿命、蛍光偏光、またはそれらの組合せにおける変化等の、蛍光における変化である。染色の程度および／または位置は、標準的なまたは期待される応答と比較して、試料が所与の特徴を保有するか否か、およびどの程度まで保有するかを示す。本発明のいくつかの色素は、蛍光発光をほとんど呈さないことがあるが、発色団色素としては依然として有用である。そのような発色団は、ＦＲＥＴ用途におけるエネルギーアクセプターとして、または単純に試料もしくは試料の一部に所望の色を付与するために有用である。
【０１３０】
生物学的用途では、本発明の色素化合物は、典型的には、水溶液中、ほぼ水溶液中、または当技術分野において概して公知である方法に従って調製された水混和性（aｑｕｅｏｕｓ−ｍｉｓｃｉｂｌｅ）溶液中で使用される。色素化合物の正確な濃度は、実験条件および所望の結果に依存するが、典型的には約１ナノモル濃度から１ミリモル濃度以上までの範囲である。最適濃度は、バックグラウンド蛍光が最小になる満足のいく結果が達成されるまでの体系的変動によって決定される。
【０１３１】
色素化合物は、試料を生物学的構成要素で染色するために最も有利に使用される。試料は、構成要素の異種混合物（無傷細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、細胞小器官、およびそれらの混合物を含む）、または単一の構成要素もしくは構成要素の同種の群（例えば、天然もしくは合成アミノ酸、核酸もしくは炭水化物高分子、または脂質膜錯体）を含んでもよい。これらの色素は概して、生きている細胞および他の生物学的構成要素に対し、使用濃度内では非毒性である。
【０１３２】
色素化合物は、色素化合物と関心対象の試料構成要素との間の接触を容易にする任意の手法で試料と組み合わせられる。典型的には、色素化合物、または色素化合物を含有する溶液が、単純に試料に添加される。本発明のある特定の色素、特に１つまたは複数のスルホン酸部分によって置換されているものは、生物学的細胞の膜に非透過性である傾向があり、一旦内部に入ると生存細胞は典型的には十分に保持される。エレクトロポレーション、衝撃療法または高細胞外ＡＴＰ等、原形質膜を透過化する処理を使用して、選択された色素化合物を細胞に導入することができる。あるいは、選択された色素化合物は、例えば、圧力マイクロインジェクション、スクレープローディング、パッチクランプ法または食作用によって、細胞に物理的に挿入され得る。
【０１３３】
脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を組み込んだ色素を細胞に微量注入することができ、ここで、色素はホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド等のアルデヒド系固定液によってその場に固定され得る。この固定能力（ｆｉｘａｂｉｌｉｔｙ）は、そのような色素をニューロントレーシング等の細胞内用途に有用なものとする。
【０１３４】
リン脂質等の親油性置換基を保有する色素化合物は、例えば、膜構造のプローブとして使用するため；またはリポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスチック、親油性ミクロスフェアもしくは同様の材料中への組み込みのため；またはトレーシングのために、脂質集合体中に非共有的に組み込むことになる。親油性色素は、膜構造の蛍光性プローブとして有用である。
【０１３５】
化学的に反応性の高い色素化合物は、多種多様な材料上の対応する官能基に共有的に付着して、上述した通りの色素複合体を形成する。
【０１３６】
細胞の表面上、細胞膜中もしくは細胞小器官等の細胞内区画中、または細胞の細胞質中の反応性部位を標識するために色素化合物を使用して、それらの存在もしくは分量、アクセス性、または試料中におけるそれらの空間的および時間的分布の決定が可能になる。光反応性色素を、生物学的細胞の外膜の構成要素を光標識するために、または細胞の光固定可能な極性トレーサーとして、同様に使用することができる。
【０１３７】
任意選択的に、染色後に試料を洗浄して、残留、過剰または未結合の色素化合物を除去する。試料は、任意選択的に、染色の過程で、洗浄溶液、透過化および／または固定溶液、ならびにさらなる検出試薬を含有する溶液を包含する１つまたは複数の他の溶液と組み合わせられる。さらなる検出試薬は、典型的には、当技術分野において概して公知の方法に従って、特異的な細胞構成要素、細胞内物質または細胞条件の存在による検出可能な応答を生成する。さらなる検出試薬が、主題の色素化合物のものとは異なるスペクトル特性を有する場合、またはその特性を持つ生成物を生み出す場合、多色用途が可能である。これは、さらなる検出試薬が、染色色素のものとは検出可能に弁別的なスペクトル特性を有する本発明の色素または色素−複合体である場合に特に有用である。
【０１３８】
本発明の色素複合体は、当技術分野において広範囲にわたって知られている方法；例えば、顕微鏡検査法および免疫蛍光アッセイにおける抗体複合体；ならびに、核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび核酸配列決定のためのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体の使用、によって使用される（例えば、Ｐｒｏｂｅｒらの特許文献６０（１９９４）、Ｓｍｉｔｈらの特許文献６１（１９９２）、Ｈｏｂｂｓの特許文献６２（１９９１）、およびＭｅｎｃｈｅｎらの特許文献６３参照）。本発明の複数の独立した色素の色素−複合体は、多色用途のための有用性を保有する。
【０１３９】
染色の後または最中の任意の時点で、検出可能な光学的応答を得るように選択された光の波長で試料を照射し、光学的応答を検出するための手段で観察する。本発明の色素化合物を照射するのに有用な設備は、携帯型紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、レーザーおよびレーザーダイオードを包含するがこれらに限定されない。これらの照射源は、任意選択的にレーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的なもしくは小型の蛍光光度計、またはクロマトグラフ検出器に統合される。本発明の好ましい実施形態は、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５４６ｎｍ、５９４ｎｍ、６３３〜６３６ｎｍ、６４７ｎｍ、６６０ｎｍ、６８０ｎｍおよび７００ｎｍ超の波長またはその付近で励起可能な色素であり、それは、これらの領域が比較的安価な励起源の出力と密接に一致するためである。
【０１４０】
光学的応答は、任意選択的に、目視検査によって、または下記のデバイス：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査デバイス、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかの使用によって、または光電子増倍管等のシグナルを増幅するための手段によって検出される。フローサイトメーターを使用して試料を調査する場合、試料の調査は、任意選択的に、それらの蛍光応答に従って試料の複数部分を分類することを包含する。
【０１４１】
本発明の一態様は、上述した通りの本発明の色素のいずれかを使用して種々のアッセイの実践を容易にするキットの設計である。本発明のキットは、典型的には、色素−複合体を調製するために有用な化学的に反応性の高い標識として存在するか、または、複合した物質が特異的な結合対のメンバーである色素−複合体、またはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸高分子、ペプチドもしくはタンパク質として存在するかのいずれかである、本発明の有色色素または発光性色素を含む。キットは、典型的には水溶液として存在する１つまたは複数の緩衝剤を場合によりさらに含む。本発明のキットは、任意選択的に、さらなる検出試薬、得られた標識物質を精製するための精製培地、発光標準物質、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、または本発明のアッセイを行うための説明書をさらに含む。
【実施例】
【０１４２】
本発明の選択された色素についての合成戦略、複合体および使用方法の例を、以下の実施例において提供する。さらなる修正形態および変更形態（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が当業者には明らかとなるであろう。以下の実施例は、本発明の実践を例証するように記されるものである。これらは、本発明の全範囲を限定または定義することを意図するものではない。
【０１４３】
実施例１．化合物１の調製
【０１４４】
【化２４】
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【０１４５】
ＦＭＯＣ−システイン酸トリエチルアミン塩の溶液（２５ｍＬのＤＭＳＯ中６ｇ）に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（４ｇ）を添加し、続いてトリエチルアミン（１．４ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）、エーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物１を得る。
【０１４６】
実施例２．化合物２の調製
【０１４７】
【化２５】
2013539015.tif 000046
【０１４８】
化合物１の溶液（１５ｍＬのＤＭＳＯ中６ｇ）に、システイン酸トリエチルアミン塩（１０ｍＬのＤＭＳＯ中３ｇ）を室温で添加する。混合物を室温で１２時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）、エーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、粗製の化合物２を得る。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗固体を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物２を生成する。
【０１４９】
実施例３．化合物３の調製
【０１５０】
【化２６】
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【０１５１】
化合物３は、化合物１の手順に従い、化合物２とＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとの反応から同様にして調製する。
【０１５２】
実施例４．化合物４の調製
【０１５３】
【化２７】
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【０１５４】
化合物３の溶液（１５ｍＬのＤＭＦ中３ｇ）に、ＦＭＯＣカダベリンＨＣｌ塩（１５ｍＬのＤＭＦ中５ｇ）を室温で添加し、続いてトリエチルアミン（１．５ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１２時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）、エーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、粗製の化合物４を得る。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗固体を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物を生成する。
【０１５５】
実施例５．化合物５の調製
【０１５６】
【化２８】
2013539015.tif 000049
【０１５７】
化合物４の溶液（１５ｍＬのＤＭＦ中１ｇ）に、ピペリジン（１．２ｍＬ）を室温で添加する。混合物を室温で６時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）、エーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、粗製の化合物５を得る。粗固体を５％ＨＣｌに溶解し、０．１％ＨＣｌを溶離系として使用するセファデックスＬＨ−２０カラム上でさらに精製して、純粋な生成物を得る。
【０１５８】
実施例６．化合物６の調製
【０１５９】
【化２９】
2013539015.tif 000050
【０１６０】
化合物６は、化合物４の手順に従い、化合物３とＦＭＯＣエチレンジアミンとの反応から同様にして調製する。
【０１６１】
実施例７．化合物７の調製
【０１６２】
【化３０】
2013539015.tif 000051
【０１６３】
化合物７は、化合物５の手順に従い、ピペリジンによる化合物６の脱保護から同様にして調製する。
【０１６４】
実施例８．化合物８の調製
【０１６５】
【化３１】
2013539015.tif 000052
【０１６６】
化合物８は、化合物２の手順に従い、化合物３とシステイン酸との反応から同様にして調製する。
【０１６７】
実施例９．化合物９の調製
【０１６８】
【化３２】
2013539015.tif 000053
【０１６９】
化合物９は、化合物１の手順に従い、化合物８とＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとの反応から同様にし
【０１７０】
実施例１０．化合物１０の調製
【０１７１】
【化３３】
2013539015.tif 000054
【０１７２】
化合物１０は、化合物４の手順に従い、化合物９とＦＭＯＣカダベリンとの反応から同様にして調製する。
【０１７３】
実施例１１．化合物１１の調製
【０１７４】
【化３４】
2013539015.tif 000055
【０１７５】
化合物１１は、化合物５の手順に従い、ピペリジンによる化合物１０の脱保護から同様にして調製する。
【０１７６】
実施例１２．化合物１２の調製
【０１７７】
【化３５】
2013539015.tif 000056
【０１７８】
化合物１２は、化合物４の手順に従い、化合物９とＦＭＯＣエチレンジアミンとの反応から同様にして調製する。
【０１７９】
実施例１３．化合物１３の調製
【０１８０】
【化３６】
2013539015.tif 000057
【０１８１】
化合物１３は、化合物５の手順に従い、ピペリジンによる化合物９の脱保護から同様にして調製する。
【０１８２】
実施例１４．化合物１４の調製
【０１８３】
【化３７】
2013539015.tif 000058
【０１８４】
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１０ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４ｇ）およびＤＣＣ（７ｇ）の混合物を、室温で終夜撹拌する。固体（ＤＣＵ）の除去後、濾液［Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＳｕ］を、水（５０ｍＬ）中の６−アミノカプリオン（ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ）酸（４ｇ）の溶液に添加し、続いて５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を添加してｐＨを８〜９に調整する。混合物を室温で終夜撹拌する。水（５００ｍＬ）で希釈後、混合物を５％ＨＣｌ水溶液でｐＨ３に酸性化し、酢酸エチル（５×２５０ｍＬ）で抽出する。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。溶媒の除去後、残留物［Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＯＨ］を１，４−ジオキサン（１０００ｍＬ）に溶解し、続いてジオキサン中４ＭのＨＣｌ（１０００ｍＬ）を添加する。混合物を６時間撹拌する。溶媒をデカントし、固体を酢酸エチル（５×２５０ｍＬ）およびエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄する。化合物１４のＨＣｌ塩を、真空下で乾燥させる。
【０１８５】
実施例１５．化合物１５の調製
【０１８６】
【化３８】
2013539015.tif 000059
【０１８７】
化合物１５は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと２−アミノメチルチオフェンとの反応から同様にして調製する。
【０１８８】
実施例１６．化合物１６の調製
【０１８９】
【化３９】
2013539015.tif 000060
【０１９０】
化合物１５（１ｇ）を濃Ｈ２ＳＯ４（５ｍＬ）に懸濁させる。懸濁液に、２０％発煙Ｈ２ＳＯ４（５ｍＬ）を添加する。ＴＬＣによって示される通り反応が完了するまで、反応混合物を０℃で撹拌する。冷エーテル（２００ｍｌ）に、激しく撹拌しながら反応混合物を滴下添加して、粗製の化合物１６を得る。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗材料を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物１６を生成する。
【０１９１】
実施例１７．化合物１７の調製
【０１９２】
【化４０】
2013539015.tif 000061
【０１９３】
化合物１７は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと２’，４’−ジスルホベンジルアミンとの反応から同様にして調製する。
【０１９４】
実施例１８．化合物１８の調製
【０１９５】
【化４１】
2013539015.tif 000062
【０１９６】
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の、β−（２−チエニル）−ＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１０ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｇ）およびＤＣＣ（１５ｇ）の混合物を、室温で終夜撹拌する。反応混合物を濾過して不溶性の固体を除去する。濾液に水（２５０ｍＬ）を添加し、固体を濾過によって収集する。固体を水で洗浄し、高真空下で乾燥させる。粗固体をさらに精製することなく次のステップの反応に直接使用する。
【０１９７】
実施例１９．化合物１９の調製
【０１９８】
【化４２】
2013539015.tif 000063
【０１９９】
化合物１４（５ｇ）および１８（２ｇ）の混合物を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解する。溶液にトリエチルアミン（３ｍＬ）を添加し、室温で終夜撹拌する。反応混合物を水（２５０ｍＬ）に滴下添加し、濾過して沈殿物を収集する。固体を水で洗浄し、高真空下で乾燥させる。クロロホルム／メタノールの勾配を使用し、粗材料をシリカゲルカラムによってさらに精製して、純粋な化合物１９を生成する。
【０２００】
実施例２０．化合物２０の調製
【０２０１】
【化４３】
2013539015.tif 000064
【０２０２】
化合物１９の溶液（２０ｍＬのＤＭＦ中２ｇ）に、ピペリジン（１．２ｍＬ）を室温で添加する。混合物を室温で６時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）、エーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物２０を得る。
【０２０３】
実施例２１．化合物２１の調製
【０２０４】
【化４４】
2013539015.tif 000065
【０２０５】
化合物２１は、化合物１６の手順に従い、発煙硫酸を使用する化合物２０のスルホン化から同様にして調製する。
【０２０６】
実施例２２．化合物２２の調製
【０２０７】
【化４５】
2013539015.tif 000066
【０２０８】
化合物２２は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと４−アミノ−１−ヒドロキシ−１−ホスホノブチルホスホン酸ナトリウム塩との反応から同様にして調製する。
【０２０９】
実施例２３．化合物２３の調製
【０２１０】
【化４６】
2013539015.tif 000067
【０２１１】
化合物２３は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと２−（２’，４’−ジホスホニルチエニル）メチルアミンとの反応から同様にして調製する。
【０２１２】
実施例２４．化合物２４の調製
【０２１３】
【化４７】
2013539015.tif 000068
【０２１４】
化合物２４は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと１−アミノメチル−２，４−ジホスホニルベンゼンとの反応から同様にして調製する。
【０２１５】
実施例２５．化合物２５の調製
【０２１６】
【化４８】
2013539015.tif 000069
【０２１７】
化合物２５は、特許文献１７（２００８）において記述されている通りに調製する。
【０２１８】
実施例２６．化合物２６の調製
【０２１９】
【化４９】
2013539015.tif 000070
【０２２０】
化合物２６は、特許文献１７（２００８）において記述されている通りに調製する。
【０２２１】
実施例２７．化合物２７の調製
【０２２２】
【化５０】
2013539015.tif 000071
【０２２３】
化合物２７は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと１−アミノメチル−２−スルホニル−４−ホスホニルベンゼンとの反応から同様にして調製する。
【０２２４】
実施例２８．化合物２８の調製
【０２２５】
【化５１】
2013539015.tif 000072
【０２２６】
化合物２８は、特許文献６（１９９７）において記述されている通りに調製する。
【０２２７】
実施例２９．化合物２９の調製
【０２２８】
【化５２】
2013539015.tif 000073
【０２２９】
化合物２９は、特許文献１７（２００８）において記述されている通りに調製する。
【０２３０】
実施例３０．化合物３０の調製
【０２３１】
【化５３】
2013539015.tif 000074
【０２３２】
酢酸（５ｍＬ）および無水酢酸（５ｍＬ）中の化合物２８（１ｇ）およびマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（０．８ｇ）の溶液を、１２０℃で２時間加熱する。反応の完了を、メタノール中の吸収スペクトルによってモニターする。アニル（ａｎｙｌ）中間体の溶液を化合物２９（１．５ｇ）と混合し、次いでさらなる無水酢酸（５ｍＬ）およびピリジン（１０ｍＬ）を添加する。反応混合物を、アニル中間体が消失するまで（吸収スペクトルによってモニターする）３０分間加熱する。反応混合物を冷却し、酢酸エチル（５０ｍＬ）に注ぎ入れる。粗生成物を遠心分離によって収集し、酢酸エチルで２回洗浄し、水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物３０を生成する。
【０２３３】
実施例３１．化合物３１の調製
【０２３４】
【化５４】
2013539015.tif 000075
【０２３５】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物３０（３００ｍｇ）およびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（３００ｍｇ）の溶液に、トリエチルアミン（０．４ｍＬ）を添加する。混合物を室温で２時間撹拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に注ぎ入れる。ジ−スクシンイミジルエステルを遠心分離によって収集し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）、ＥｔＯＥｔ（５×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させる。
【０２３６】
実施例３２．化合物３２の調製
【０２３７】
【化５５】
2013539015.tif 000076
【０２３８】
粗製の化合物３１（１００ｍｇ）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、水（２５ｍＬ）中の化合物１１（１００ｍｇ）の溶液［Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ８．０に中性化したもの］を２時間のあいだにゆっくり添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。溶媒の除去後、水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物３２を生成する。
【０２３９】
実施例３３．化合物３３の調製
【０２４０】
【化５６】
2013539015.tif 000077
【０２４１】
化合物３２（５０ｍｇ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解する。溶液に、０．１Ｍ  ＮａＯＨ（０．５ｍＬ）を室温で添加する。混合物を室温で３〜６時間撹拌し、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ６．０に中性化する。溶媒の除去後、水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物３３を生成する。
【０２４２】
実施例３４．化合物３４の調製
【０２４３】
【化５７】
2013539015.tif 000078
【０２４４】
ＤＭＦ（０．４ｍＬ）中の化合物３３（１０ｍｇ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（４ｍｇ）、続いてトリエチルアミン（０．０３ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物３４を得る。
【０２４５】
実施例３５．化合物３５の調製
【０２４６】
【化５８】
2013539015.tif 000079
【０２４７】
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２９のエチルエステル（５ｇ）の溶液に、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４ｇ）、続いてトリエチルアミン（４ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（５×１００ｍＬ）、エーテル（３×１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物３５を得る。
【０２４８】
実施例３６．化合物３６の調製
【０２４９】
【化５９】
2013539015.tif 000080
【０２５０】
化合物１１（１００ｍｇ）および３５（５００ｍｇ）の混合物を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解する。溶液にトリエチルアミン（３ｍＬ）を添加し、室温で終夜撹拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に滴下添加し、濾過して沈殿物を収集する。固体をＥｔＯＡｃで洗浄し、高真空下で乾燥させる。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗材料を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物３６を生成する。
【０２５１】
実施例３７．化合物３７の調製
【０２５２】
【化６０】
2013539015.tif 000081
【０２５３】
化合物３６（５００ｍｇ）およびマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（３００ｍｇ）を無水酢酸（１ｍＬ）に溶解し、続いてピリジン（１ｍＬ）を添加する。混合物を１２０℃に１時間加熱する。室温に冷却後、混合物を酢酸エチルに滴下する。粗色素を遠心分離によって収集し、酢酸エチルで２回洗浄する。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗材料を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物３７を生成する。
【０２５４】
実施例３８．化合物３８の調製
【０２５５】
【化６１】
2013539015.tif 000082
【０２５６】
化合物３７（２０ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解する。溶液に、０．１Ｍ  ＮａＯＨ（０．５ｍＬ）を室温でゆっくり添加する。混合物を１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ６．０に中性化する。溶媒の除去後、水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物３８を生成する。
【０２５７】
実施例３９．化合物３９の調製
【０２５８】
【化６２】
2013539015.tif 000083
【０２５９】
ＤＭＦ（０．４ｍＬ）中の化合物３８（１０ｍｇ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１０ｍｇ）、続いてトリエチルアミン（０．１ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。溶液混合物をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物３９を鮮やかな青色の粉末として得る。
【０２６０】
実施例４０．化合物４０の調製
【０２６１】
【化６３】
2013539015.tif 000084
【０２６２】
室温のＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物３４（５０ｍｇ）に、トリエチルアミン（０．１ｍＬ）およびＮ−（２−アミノエチル）マレイミド、トリフルオロ酢酸塩（５０ｍｇ）を添加する。混合物を周囲温度で２時間撹拌する。溶液混合物をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、粗製の化合物４０を得る。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物４０を生成する。
【０２６３】
実施例４１．化合物４１の調製
【０２６４】
【化６４】
2013539015.tif 000085
【０２６５】
化合物４１は、特許文献６４（２００８）において記述されている通りに調製する。
【０２６６】
実施例４２．化合物４２の調製
【０２６７】
【化６５】
2013539015.tif 000086
【０２６８】
化合物４１（１ｇ）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解する。化合物４１のＤＭＦ溶液に、化合物１３のＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３溶液（１５０ｍＬ、ｐＨ約９．０）をゆっくり添加し、室温で終夜撹拌する。反応混合物を約５ｍＬに濃縮し、１：１  ＥｔＯＡｃ−アセトン（２５０ｍＬ）に滴下添加し、濾過して沈殿物を収集する。固体をＥｔＯＡｃで洗浄し、高真空下で乾燥させる。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗材料を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物４２を生成する。
【０２６９】
実施例４３．化合物４３の調製
【０２７０】
【化６６】
2013539015.tif 000087
【０２７１】
ＤＭＦ（０．４ｍＬ）中の化合物４２（１０ｍｇ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１０ｍｇ）、続いてトリエチルアミン（０．１ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。溶液混合物をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に注ぎ入れる。固体を遠心分離し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物４３を得る。
【０２７２】
実施例４４．化合物４４の調製
【０２７３】
【化６７】
2013539015.tif 000088
【０２７４】
化合物４４は、特許文献６５（２００９）において記述されている通りに調製する。
【０２７５】
実施例４５．化合物４５の調製
【０２７６】
【化６８】
2013539015.tif 000089
【０２７７】
化合物４４（２０ｇ）を１，２−ジクロロベンゼン（３０ｍＬ）に懸濁させる。懸濁液に、６−ブロモヘキサン酸メチル（３０ｍＬ）を添加する。化合物４４がほとんど消費されるまで、反応混合物を約１３０℃で加熱する。反応混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＥｔ（５００ｍＬ）に注ぎ入れる。ＥｔＯＥｔ懸濁液を遠心分離して沈殿物を収集し、これをＥｔＯＥｔで洗浄する。クロロホルム／メタノールの勾配を使用し、粗材料をシリカゲルカラムによってさらに精製して、純粋な化合物４５を生成する。
【０２７８】
実施例４６．化合物４６の調製
【０２７９】
【化６９】
2013539015.tif 000090
【０２８０】
化合物４５（１０ｇ）を濃Ｈ２ＳＯ４（５ｍＬ）に懸濁させる。懸濁液に、２０％発煙Ｈ２ＳＯ４（１０ｍｌ）を添加する。ＴＬＣによって示される通り反応が完了するまで、反応混合物を室温で撹拌する。冷エーテル（５００ｍｌ）に、激しく撹拌しながら反応混合物を滴下添加して、化合物４６とそのモノおよびジエステルとの粗混合物を得る。粗材料を２０％ＨＣｌに懸濁させ、モノエステルおよびジエステルがほとんど遊離酸に変換されるまで、約６０℃で加熱する。水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、粗材料を分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物４６を生成する。
【０２８１】
実施例４７．化合物４７の調製
【０２８２】
【化７０】
2013539015.tif 000091
【０２８３】
化合物４７は、化合物３９の手順に従い、化合物４６とＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとの反応から同様にして調製する。
【０２８４】
実施例４８．化合物４８の調製
【０２８５】
【化７１】
2013539015.tif 000092
【０２８６】
粗製の化合物４７（４ｇ）を無水ＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解し、無水ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中の化合物２１（３ｇ）の溶液［トリエチルアミンでｐＨ８．０に中性化したもの］を８時間のあいだにゆっくり添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。溶媒の除去後、水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物４８を生成する。
【０２８７】
実施例４９．化合物４９の調製
【０２８８】
【化７２】
2013539015.tif 000093
【０２８９】
化合物４９は、化合物４３の手順に従い、化合物４８とＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとの反応から同様にして調製する。
【０２９０】
実施例５０．化合物５０の調製
【０２９１】
【化７３】
2013539015.tif 000094
【０２９２】
化合物５０は、特許文献６６（１９９２）において記述されている通りに調製する。
【０２９３】
実施例５１．化合物５１の調製
【０２９４】
【化７４】
2013539015.tif 000095
【０２９５】
化合物５１は、化合物１４の手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと２−アミノメチル−５−（５’−カルボキシペンチル）チオフェンとの反応から同様にして調製する。
【０２９６】
実施例５２．化合物５２の調製
【０２９７】
【化７５】
2013539015.tif 000096
【０２９８】
化合物５２は、化合物１６の手順に従い、化合物５１のスルホン化から同様にして調製する。
【０２９９】
実施例５３．化合物５３の調製
【０３００】
【化７６】
2013539015.tif 000097
【０３０１】
粗製の化合物５０（１ｇ）を無水ＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解し、無水ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中の化合物５２（４５０ｍｇ）の溶液［トリエチルアミンでｐＨ８．０に中性化したもの］を１０時間のあいだにゆっくり添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。溶媒の除去後、水中０．１％ＴＦＡ〜ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ緩衝系を使用し、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物５３を生成する。精製された化合物をメタノールに再溶解し、ｐＨ７．０に中性化する。溶液の蒸発により、化合物５３をナトリウム塩として得る。
【０３０２】
実施例５４．化合物５４の調製
【０３０３】
【化７７】
2013539015.tif 000098
【０３０４】
化合物５３を、記述されている通り、ＥｕＣｌ３によりその対応するＥｕ錯体にその場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）変換する（例えば、特許文献６６（１９９２）参照）。化合物５３−Ｅｕ錯体（１０ｍｇ）および炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（５ｍｇ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解する。溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（０．５ｍｇ）および無水ピリジン（０．５ｍｌ）を、乾燥窒素保護下、室温で激しく撹拌しながら添加する。ＨＰＬＣによって示される通り反応が完了するまで、反応混合物を乾燥窒素保護下、室温で撹拌する。反応混合物をエーテルに注ぎ入れ、結果として得られる沈殿物を濾過によって収集する。固体をエーテルで洗浄して、所望の化合物５４を生成する。
【０３０５】
実施例５５．ペプチド−色素複合体の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のアミノファロイジン（５ｍｇ）およびスクシンイミジルエステル誘導体化合物３４（１０ｍｇ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５μＬ）を添加する。混合物を室温で３時間撹拌する。この溶液に、５ｍＬのＥｔＯＡｃを添加する。固体を遠心分離によって収集する。粗生成物を、水で溶離するセファデックスＬＨ−２０上で、続いて分取ＨＰＬＣによって精製して、純粋なファロイジン複合体を得る。生成物は、固定細胞調製物におけるＦ−アクチンフィラメントのための有効な染色剤である。
【０３０６】
実施例５６．タンパク質−色素複合体の調製
ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）、ストレプトアビジン、トランスフェリン、ならびにＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を包含する他のタンパク質、の一連の色素複合体は、モノ−スクシンイミジルエステルまたはビス−スクシンイミジルエステル化合物を使用し、標準的な手段によって調製される（例えば、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９参照）。本発明のスクシンイミジルエステルとのタンパク質複合のための典型的な方法は、次の通りである。色素対タンパク質の比、タンパク質濃度、時間、温度、緩衝液組成および当技術分野において周知である他の変数における変動は、依然として有用な複合体を生成するものであれば可能である。タンパク質の溶液は、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中約１０ｍｇ／ｍＬで調製される。標識試薬を、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ等の適切な溶媒に約１０ｍｇ／ｍＬで溶解する。水は、本発明の多くの色素に適した溶媒である。所定量の標識試薬を、タンパク質溶液に撹拌しながら添加する。１０当量の色素対１当量のタンパク質のモル比が典型的であるが、最適な量は、特定の標識試薬、標識されているタンパク質およびタンパク質の濃度に伴って変動し、実験的に決定される。
【０３０７】
蛍光収率を最適化する場合およびこの明るさに対する置換度（ＤＯＳ）の影響を決定する場合、反応性色素対タンパク質の比を数倍の範囲にわたって変動させることが典型的である。反応混合物を、室温で１時間、または氷上で数時間インキュベートする。色素−タンパク質複合体は、典型的には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＡｍｅｒｓｈａｍ  ＰＤ−１０樹脂上で等、サイズ排除クロマトグラフィーによって、遊離した未反応の試薬から分離される。タンパク質を含有する最初の有色バンドを収集し、遊離フルオロフォアの減衰係数を使用して、各フルオロフォアの吸光度最大値における吸光度から置換度を決定する。このようにして取得された色素−タンパク質複合体を細分画して、より高い、より低い、またはより均一なＤＯＳを持つ複合体を生成することができる。
【０３０８】
下記は、化合物３４を使用してＩｇＧ−色素複合体を調製する具体例である。
【０３０９】
ステップ１．タンパク質溶液（溶液Ａ）を調製する：５０μＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を４５０μＬのＩｇＧタンパク質溶液（４ｍｇ／ｍＬ）と混合して、０．５ｍＬのタンパク質試料溶液を得る。結果として得られる溶液は、ｐＨ８．５±０．５を有することとなる。
【０３１０】
ステップ２．色素溶液（溶液Ｂ）を調製する：５０μＬのＤＭＳＯに、１ｍｇの化合物３４を添加し、化合物が完全に溶解するまで撹拌する。
【０３１１】
ステップ３．複合反応を実行する：色素溶液（Ｂ）をタンパク質溶液（Ａ）に有効に撹拌または振とうしながら添加し、反応混合物を１〜３時間撹拌または振とうし続ける。
【０３１２】
ステップ４．複合体を精製する：ａ）．１０×溶離緩衝液を脱イオン水で希釈して１×溶離緩衝液（溶液Ｃ）を得、これを使用してＰＤ−１０カラムからタンパク質複合体を溶離する；ｂ）．プレパックカラム中の液体が上面の直下を流れたらすぐ、カラムに反応混合物（ステップ３から、必要ならば濾過したもの）または上清をロードする；ｃ）．試料が上部の樹脂表面の直下を流れたらすぐ、１ｍＬの１×溶離緩衝液を添加し；この「試料洗浄」プロセスを２回繰り返し；さらなる１×溶離緩衝溶液を添加して所望の試料を溶離する；ｄ）．通常は所望の標識タンパク質である速い流れのバンドを収集する。通常は遊離または加水分解された色素である遅い流れのバンドを、所望の生成物が同定されるまで保つ。
【０３１３】
ステップ５．所望の色素−タンパク質複合体を特徴づけする：ａ）．２８０ｎｍにおけるＯＤ（吸光度）および色素の最大吸収波長を測定する（注記：ほとんどの分光光度計では、ＯＤ値が０．１から０．９の範囲内となるように、試料（カラム画分から）を脱イオン水で希釈する必要がある）。２８０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）は、タンパク質の最大吸収である（注記：正確なＤＯＳを取得するためには、複合体に複合されていない色素がないことを確認しなくてはならない）；ｂ）．下記の方程式を使用して、ＤＯＳを算出する。
ＤＯＳ＝［色素］／［タンパク質］＝Ａｄｙｅ×εｐ／２５００００（Ａ２８０−ＣＦ×Ａｄｙｅ）
［色素］は色素濃度であり、ランベルトベールの法則：Ａ＝εｄｙｅＣ×Ｌから容易に算出でき；［タンパク質］は標的タンパク質濃度である。この値は、複合効率が十分に高ければ（好ましくは７０％超）（反応物に添加された）重量によって推定するか、またはランベルトベールの法則：Ａ＝εｐｒｏｔｅｉｎＣ×Ｌによってより正確に算出するかのいずれでもよい。例えば、ＩｇＧは２０３，０００ｃｍ−１Ｍ−１のε値を有する。ＣＦは色素補正係数であり、ＯＤ２８０ｎｍ／ＯＤｄｙｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈの比によって算出される。
【０３１４】
実施例５７．過ヨウ素酸塩で酸化されたタンパク質の蛍光性標識
１ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１３５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５中の各５ｍｇのヤギＩｇＧ抗体の２つの試料を、氷上、２．１ｍｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムでそれぞれ１時間および２時間処理する。３０μＬのエチレングリコールの添加によって反応を停止させる。ＰＢＳ  ｐＨ７．２で満たしたセファデックスＧ２５カラム上で抗体を精製する。１０分の１の体積の１Ｍ重炭酸ナトリウムを添加してｐＨを上昇させ、化合物１０２または１１７を色素対タンパク質のモル比５０：１で添加する。反応物を室温で２時間撹拌する。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加して１０ｍＭの最終濃度とし、反応物を室温で４時間撹拌する。抗体複合体を、透析によって、および上述した通りのセファデックスＧ２５カラム上で精製する。１時間酸化された抗体は、典型的には、ＩｇＧ１モル当たり色素１モルの置換度を生み出す。２時間酸化された抗体は、典型的には、ＩｇＧ１モル当たり色素およそ２モルのＤＯＳを生み出す。ゲル中およびブロット上の過ヨウ素酸塩で酸化されたタンパク質を、基本的に記述されている通りに標識することもできる（例えば、非特許文献４０参照）。
【０３１５】
実施例５８．ベータ−ガラクトシダーゼのチオール反応性色素を用いた標識
遊離チオール基に富むタンパク質であるβ−ガラクトシダーゼの溶液を、ＰＢＳ中で調製する（４００μＬ中２．０ｍｇ）。次いで、タンパク質溶液を、ＤＭＦ中マレイミド誘導体化合物４０の２０ｍｇ／Ｌ溶液で処理する。未反応の色素をスピンカラム上で除去する。実施例５６において記述されている通りの遊離色素の減衰係数を使用して、色素による置換度を推定する。２８０ｎｍでの吸光度からタンパク質濃度を推定し、その波長での化合物４０の吸光度に対して補正する。
【０３１６】
実施例５９．架橋されていない色素とＷＳＢ架橋された色素とから調製されたタンパク質複合体の比較
色素−タンパク質複合体を、実施例５６において記述されている通りに合成し、種々のＤＯＳでＧＡＲと複合する。図１〜３は、架橋されていない色素ＳＥから調製されたＧＡＲ複合体、疎水性橋で架橋された色素ＳＥ、および本発明のＷＳＢで架橋された色素ＳＥの、蛍光特性の直接比較である。ＷＳＢ架橋（ｃｏｒｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）は、色素化合物の蛍光性能の有意な改善をもたらしたことが分かる。ＷＳＢ化合物のより鮮やかな蛍光発光は、試験したＤＯＳのすべてにおいて観察される。
【０３１７】
実施例６０．Ｒ−フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンの複合体における蛍光エネルギー移動
色素ＳＥ化合物のＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）複合体は、実施例５６のように、ドナーの蛍光をほぼ完全に消光するために十分高いＤＯＳ（ＤＯＳ約４〜８）で調製する。得られたフィコビリタンパク質複合体を４８８ｎｍで励起させ、蛍光発光を、同じ波長で励起させた未修飾のＲ−フィコエリトリンのものと比較する。高効率のエネルギー移動（９９％超）は、タンパク質から蛍光性色素へ生じる。これらの錯体とストレプトアビジンとの複合体は、基本的に記述されている通りに調製される（例えば、非特許文献３６参照）。このストレプトアビジン複合体は、エネルギー移動特性を保持し、励起のためにアルゴンイオンレーザーを利用するフローサイトメーターにおける細胞染色に有用である。アロフィコシアニンと、化合物３４または３９等、本発明のより長い波長の色素とのタンデム複合も生成することができ、６３３ｎｍ付近で励起された場合、７００ｎｍをはるかに超える発光を生み出す。
【０３１８】
実施例６１．培養された哺乳類細胞におけるアクチンの標識
ウシ肺動脈細胞（ＢＰＡＥＣ）を、ガラス上で３０〜５０％の集密まで成長させる。細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．２％トリトンＸ−１００で透過化し、６％ＢＳＡでブロックする。細胞を、実施例５５のファロイジン色素−複合体とともにインキュベートする。細胞をブロック緩衝液ですすぎ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中でマウントする。染色された細胞は、赤色蛍光で装飾されたアクチンフィラメントを見せる。
【０３１９】
実施例６２．蛍光性チラミドの調製および使用
２倍モル過剰の塩酸チラミンを、室温の水溶液中の化合物３４に添加し、続いて過剰のトリエチルアミンを添加する。３０分後、赤色固体をアセトンで沈殿させ、エーテルで洗浄し、分取ＨＰＬＣによって精製する。ウシ肺動脈細胞（ＢＰＡＥＣ）を、ガラス上で３０〜５０％の集密まで成長させる。細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．２％トリトンＸ−１００で透過化し、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンおよび１ｍＭのビオチンでブロックする。洗浄後、細胞を約０．０５μｇ／ｍＬのビオチン化抗シトクロムＣオキシダーゼ（抗ＣＯＸ）に暴露させ、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体とともに室温でインキュベートする。細胞を再度すすぐ。次いで、試料を化合物３４のチラミドとともにインキュベートし、蛍光顕微鏡検査法を使用して調査する。
【０３２０】
実施例６３．アミノデキストラン色素−複合体の調製
平均１３個のアミノ基で誘導体化した７０，０００ＭＷアミノデキストラン（５０ｍｇ）を、１０ｍｇ／ｍＬで０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解する。約１０〜１５の色素／デキストラン比を得るように、色素ＳＥ化合物を添加する。６〜１２時間後、水で溶離するセファデックスＧ−５０上で複合体を精製する。典型的には、４〜６モルの色素を７０，０００ＭＷデキストランと複合する。
【０３２１】
実施例６４．蛍光性色素で標識されたミクロスフェアの調製
均一なミクロスフェアを、アミノまたはカルボキシルまたはアルデヒド等の官能基を有するように化学的に修飾する。これらの官能化されたミクロスフェアを、表１に収載されている通りの対応する反応性色素と共有的に複合する。例えば、アミンで修飾されたミクロスフェアは、化合物３４、３９、４９および５４等のスクシンイミジルエステルを経由して本発明の色素と容易に複合される。色素で標識されたタンパク質を、エチル３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用し、そのアミン残基を経由して、高分子のカルボキシレート基と共有的にカップリングする。
【０３２２】
実施例６５．色素−細菌複合体の調製
加熱死滅させた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を１０ｍｇ／ｍＬでｐＨ８〜９の緩衝液に懸濁させ、０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬのアミン反応性色素、典型的にはスクシンイミジルエステル誘導体（化合物３４、３９、４９および５４等）とともにインキュベートする。３０〜６０分後、標識された細菌を遠心分離し、緩衝液で数回洗浄して、複合されなかったあらゆる色素を除去する。標識された細菌をフローサイトメトリーによって分析する。
【０３２３】
実施例６６．クレオチド−色素複合体の調製
１００μＬの水中の２ｍｇの５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に、１００μＬのＤＭＦおよび５μＬのトリエチルアミン中の化合物３４、３９、４９または５４を添加する。３時間後、溶液を蒸発させ、残留物をＨＰＬＣによって精製する。生成物画分を凍結乾燥させて、蛍光性ヌクレオチド複合体を得る。あるいは、デオキシウリジン５’−三リン酸の蛍光性色素−複合体は、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸から、またはチオール化ヌクレオチドもしくはチオリン酸ヌクレオチドを本発明のチオール反応性色素（化合物１０１等）で処理することによって調製される。加えて、２’−（または３’）−２−アムニノエチルアミノカルボニルアデノシン（ａｍｎｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）５’−三リン酸を、わずかに過剰の化合物３４、３９、４９または５４と反応させ、エタノールによる沈殿の後、リボース修飾された生成物を分取ＨＰＬＣによって精製する。本発明の色素と複合されたさらなるヌクレオチドは、公開されている手順に準拠して当業者によって容易に調製され得る（例えば、非特許文献４１、非特許文献４２参照）。
【０３２４】
実施例６７．オリゴヌクレオチド色素−複合体の調製
５’−アミンで修飾された１８塩基Ｍ１３プライマー配列（約１００μｇ）を４μＬの水に溶解する。これに、１００μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の２５０μｇの化合物３４、３９、４９または５４を添加する。１６時間後、１０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌおよび３体積の冷エタノールを添加する。混合物を−２０℃に冷却し、遠心分離し、上清をデカントし、ペレットをエタノールですすぎ、次いで１００μＬの水に溶解する。標識されたオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製する。所望のピークを収集し、蒸発させて、蛍光性オリゴヌクレオチドを得る。
【０３２５】
実施例６８．ＲＮＡプローブのインシチュハイブリダイゼーション
マウス線維芽細胞を固定し、標準的な手順を使用して、ｍＲＮＡインシチュハイブリダイゼーション用に調製する。色素で標識されたＲＮＡプローブは、ファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流でクローン化されたマウスアクチン構造遺伝子を含有するプラスミドのインビトロ転写によって調製する。標識反応物は、２μＬのＤＮＡ鋳型（１μｇのＤＮＡ）、１μＬの各１０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、０．７５μＬの１０ｍＭ  ＵＴＰ、２．５μＬの１ｍＭアミノアリルで標識されたＵＴＰ、２μＬの１０×転写緩衝液（４００ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）、１μＬのＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（４０ユニット／μＬ）、１μＬの２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡおよび８．７５μＬの水を組み合わせて含む。反応物を３７℃で２時間インキュベートする。ＤＮＡ鋳型を、３７℃で１５分間の２０ユニットのＤＮａｓｅ  Ｉによる処理によって除去する。ＲＮＡ転写産物を、等体積のフェノール：クロロホルム、１：１での抽出、次いでセファデックスＧ５０上でのクロマトグラフィーによって精製する。標識されたＲＮＡを５０℃で５分間変性させ、次いで標準的な手順を使用してハイブリダイズして、細胞調製物とする。
【０３２６】
実施例６９．アミンで修飾されたＤＮＡおよび本発明のアミン反応性色素を使用するＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの調製
ニック翻訳は、染色体１ヒトα−サテライトプローブを含有するｐＵＣｌ．７７プラスミドＤＮＡを使用して実施する。微小遠心管に、下記の順序で添加する：２３．５μＬの水、５μＬの１０×Ｎｉｃｋ翻訳緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．８）、５μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、４μＬのｄ（ＧＡＣ）ＴＰ混合物（０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ）、１μＬの０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ、４μＬの０．５ｍＭアミノアリル−ｄＵＴＰ、１μＬの１μｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ、５μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（１μｇ／ｍＬ、２０００Ｋｕｎｉｔｚユニット／ｍｇ）、１．５μＬのＤＮＡポリメラーゼＩ（１０Ｕ／μＬ）。該管を１５℃で２時間インキュベートし、次いで水で１００μＬの最終体積にする。アミン修飾されたＤＮＡを、キアクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。該アミン修飾されたＤＮＡを５μＬの水に再懸濁させる。この溶液に、５μＬのＤＭＦ中の３μＬの２５ｍｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウムおよび５０μｇの化合物３４、３９、４９または５４を添加する。反応物を室温、暗所で１時間インキュベートし、反応物に９０μＬの水を添加し、これを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製する。標識されたＤＮＡ生成物は、その場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション実験、マイクロアレイ上でのおよびハイブリダイゼーションベースのアッセイにおける蛍光ドナーまたはアクセプターとしての使用に適している。
【０３２７】
実施例７０．タンデム色素で標識されたストレプトアビジンでの細胞の染色
ジャーカット細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。次いで、ジャーカット細胞を氷上で６０分間、１×１０６細胞当たり１０μＬの推奨濃度のマウス抗ヒトＣＤ４ビオチンとともにインキュベートする。一次抗体とともにインキュベーション後、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間、実施例５９の蛍光性ストレプトアビジン−フィコエリトリン複合体とともにインキュベートする。細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、４００μＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁する。アルゴンレーザーの４８８ｎｍ線またはＨｅ−Ｎｅレーザーの６３３ｎｍ線で励起するＢＤキャリバーフローサイトメーターで試料を分析し、ロングパスフィルターによって発光を収集する。ＦＳＣ対ＳＳＣドットプロットを使用して生細胞をゲートし、蛍光の幾何平均を測定する。蛍光強度およびシグナル／ノイズ比の両方についてデータを分析する。
【０３２８】
実施例７１．フローサイトメトリーによるＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５複合体の特徴づけ
ＥＤＴＡ中に収集した正常ヒト血液を、周囲温度で３０分間、血液１．１ｍｌにつき１μｇの濃度の化合物３４、３９、４３または４９のマウス抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ４５複合体とともにインキュベートする。抗体複合体とともにインキュベーション後、血液を２０倍体積（２ｍｌ）のＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液に懸濁させ、周囲温度で８〜１０分間インキュベートする。試料を２〜３００×ｇで５分間遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを懸濁させ、２ｍｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄する。ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでの分析のために、上清を再度デカントし、ペレットを０．５ｍｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁させる。試料を、紫色レーザーの４０５ｎｍ線、アルゴンレーザーの４８８ｎｍ線またはＨｅ−Ｎｅレーザーの６３３ｎｍ線で励起し、妥当なバンドパスフィルターによって発光を収集するように分析を実施する。ＦＳＣ対ＳＳＣドットプロットを使用してリンパ球をゲートし、蛍光中央値を測定する。図１０は、マウス抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５複合体が高度に蛍光性であり、細胞分析に良好な染色シグナルを与えていることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2013539015.tif 000122
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