(57)【要約】  レビー小体認知症(DLB)に罹患している患者であるか否かを決定することを可能にする、BChE遺伝子における特異的な変化が発見されてきた。  本願発明は、対象に由来する生物学的サンプルにおける、ブチリルコリンエステラーゼ(BChE)遺伝子の以下の変化、または連鎖不均衡にあるその多型：NCBI受理番号(Accession Number) NG_009031における位置68974(すなわち、配列番号28における位置934)の多型部位;および NCBI受理番号NG_009031における位置4780から4786 (すなわち、配列番号1における位置4780から4786)のポリチミン領域の遺伝子型を決定することを含む、DLBを診断するためのin vitroの方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に由来する生物学的サンプルにおける、ブチリルコリンエステラーゼ(BChE)遺伝子の以下の変化、または連鎖不均衡にあるその多型：
NCBI受理番号NG_009031における位置68974(すなわち、配列番号28における位置934)の多型部位;および 
NCBI受理番号NG_009031における位置4780から4786 (すなわち、配列番号1における位置4780から4786)のポリチミン領域
の遺伝子型を決定することを含む、レビー小体認知症を診断するためのin vitroの方法。
【請求項２】
NCBI受理番号NG_009031における位置68974(すなわち、配列番号28における位置934)の多型部位;および 
NCBI受理番号NG_009031における位置4780から4786 (すなわち、配列番号1における位置4780から4786)のポリチミン領域
の遺伝子型を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下のBChE遺伝子の変化、または連鎖不均衡にあるその多型：
位置3687の多型部位、
位置4206の多型部位、および
位置4443における多型部位
（前記位置は、NCBI受理番号NG_009031を参照とする(すなわち、配列番号1における各位置3687、4206および4443)）
の遺伝子型を決定することをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
位置3687の多型部位、
位置4206の多型部位、および
位置4443における多型部位
（前記位置は、NCBI受理番号NG_009031を参照とする(すなわち、配列番号1における各位置3687、4206および4443)）
の遺伝子型を決定することを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子型が、
位置4780から4786が両アレルで7つのチミンであり；および、
位置68974が一方のアレルでグアニンであり、他方のアレルでアデニンであって;
レビー小体認知症を示し、アルツハイマー病と区別できる遺伝子型である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子型が、
位置68974が一方のアレルでアデニンであり;
位置4780から4786が一方のアレルで8つのチミンであり；
位置3687が両アレルでアデニンであり；
位置4206が一方のアレルでアデニンであり、他方のアレルでグアニンであり；および
位置4443が両アレルでシトシンであって；
レビー小体認知症を示し、アルツハイマー病と区別できる遺伝子型である、請求項3または4に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子型が、
位置68974が一方のアレルでアデニンであり、他方のアレルでグアニンであり;
位置4780から4786が両アレルで7つのチミンであり；
位置3687が両アレルでアデニンであり；
位置4206が両アレルでアデニンであり；および
位置4443が一方のアレルでシトシンであって；
レビー小体認知症を示し、アルツハイマー病と区別できる遺伝子型である、請求項3または4に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子型決定が、プライマー特異的多重PCRに続く検出、多重アレル特異的プライマー伸長、マイクロアレイに基づく方法、およびダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーションから成る群より選択される一つの技術によって行われる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記決定がプライマー特異的多重PCRによる増幅に続く検出によって行われる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが血液サンプルである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
BChE遺伝子おける変化の遺伝子型を決定するための適切な手段を含む、請求項1から10のいずれか一項に定義された方法を行うためのキット。
【請求項１２】
プライマー特異的多重PCRを行うための適切な手段を含む、請求項11に記載のキット。
【請求項１３】
レビー小体認知症の診断のための、請求項10から12のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項１４】
レビー小体認知症の診断マーカーとしての、
位置4780から4786のポリチミン領域、位置3687の多型部位；位置4206の多型部位；位置4443の多型部位（前記位置は、NCBI受理番号NG_009031を参照とする(すなわち、配列番号1における位置3687、4206、4443および4780から4786)）から成る群から選択される一つまたは複数のBChE遺伝子における変化と組み合わせた、NCBI受理番号NG_009031における位置68974(すなわち、配列番号28における位置934)の多型部位の使用。
【請求項１５】
位置68974の多型部位が、位置4780から4786のポリチミン領域と組み合わせて使用される、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
位置68974の多型部位が、
位置4780から4786のポリチミン領域、位置3687の多型部位；位置4206の多型部位；および位置4443の多型部位
と組み合わせて使用される、請求項14に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、医学分野、および特に神経変性疾患に関する。とりわけ、レビー小体認知症診断のマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
レビー小体疾患は、レビー小体(LB)と呼ばれるタンパク質性の神経系の封入体の存在によって特徴づけられる疾患群である。臨床的には、パーキンソン病(Parkinson disease：PD)およびレビー小体認知症(dementia with Lewy bodies：DLB)の二つの疾患に区別され得る。PDは、高齢者で最も一般的な進行性の運動性疾患である一方、DLBはアルツハイマー病に次いで二番目に頻度の高い認知症の原因である。実質的に、脳領域のあらゆる場所におけるLBの広汎な分布がDLBの特徴である一方、PDでは、黒質が最も侵襲される。
【０００３】
最初に記載されたときは、DLBは孤発性疾患であると考えられていたが、過去数年にわたる精力的な研究で、孤発性疾患は解剖症例の約10〜15％の割合であることが明らかになった。主なDLB徴候は、変動性認知機能障害、再発性幻覚症およびパーキンソニズムを含むが、ADと重複する多くの徴候は、頻繁なDLBの誤診断に繋がっている。ADおよびDLB患者は、薬物治療への応答および予後の点で異なり得るため、DLB診断の精度を向上させることは重要である。
【０００４】
DLBとADの間のより優れた臨床的識別を達成するために、様々な長期的な比較調査が、過去数年間行われてきた。レビー小体(LB)の症状のみの患者は、ADのみまたはAD/LBの複合型症状の患者よりも重篤な機能障害が比較的少なかったが、実行機能および注意の顕著な悪化は、ADのみまたはAD/LBの混合型症状の患者よりも多く見られた。さらに、DLB患者は、AD患者よりも緩やかな認知記憶の低下を示したが、精神科的徴候がより多く見られており、この類の徴候は疾患のより後期に観察される。最後に、早期の認知症における幻覚症状の存在は、DLBで最も特異的であることが示された。高い特異性(異なる調査において90から99%)の臨床的診断が達成されたが、その感度は比較的低い(18〜83%)ままであることは、特筆すべきである。従って、1996年に成立した、推定および可能性があるDLBの臨床診断の最初のコンセンサスガイドラインは、DLB診断の感度を向上させるために改正されてきたにもかかわらず、ADと重複する多くの徴候は、40〜80％の症例で、DLBの頻繁な誤診断に繋がっている。
【０００５】
DLB診断の感度が低い主な原因は、LB関連症状に加えてADの性質変化を示す症例の割合が上昇していることから来ている。この複合症状のタイプを評価するために、第3のDLBコンソーシアムは、AD関連症状をLB症状との関連で分類したモデルを提案した。AD型症状の段階が高くなるほど、正しいDLB診断を達成する感度は低下する。従って、近年の報告では、DLB誤診断はAD関連病状の増加と共に増大することが正式に発表されたが、例えそうであっても、AD関連症状段階が低い患者のわずか約52％しか正しいDLB診断を受けていない。
【０００６】
DLB治療は、対症療法であり、限られた数の臨床試験およびADにおける試験の結果からの拡張に基づいている。現在、AD治療は、脳内のアセチルコリンレベルの増大または神経細胞がアセチルコリンに対して応答する経路を強化することによって、アセチルコリンの有効性を向上させるためのコリンエステラーゼ阻害剤の使用から成る。さらには、神経弛緩性薬剤を使用して、疾患の進行中に通常は存在する精神病的徴候を減退させる。一方、DLBを治療するための神経弛緩薬の使用は、約50％のDLB患者で薬害反応を引き起こし、死亡を引き起こし得る。
【０００７】
従って、ADとDLBの差異的に診断する能力は、治療を受ける患者個人だけでなく公的保険制度の経済的負担の点でも大きな利点となる。しかしながら、現在、ADとDLBの正確な差異は脳組織の死後分析によってのみ可能である。
【０００８】
現在、DLB診断は徴候及び性質の臨床的評価に基づき、DLB国際ワークショップにおけるコンソーシアムで成立したガイドライン (I.G. McKeith, "Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): report of the Consortium on DLB International Workshop", J. Alzheimer's Dis. 2006, vol. 9, pp. 417-23) に従っているが、前記で説明したようにDLB誤診断に繋がっている。ポジトロン断層法(positron tomography：PET)および単一光子放射断層法(single photon emission computer tomography：SPECT)などの画像法が利用可能であるが、それらの感度はあまり高くなく、日常的に臨床使用するには非常に高価である。早期の明確な診断は、疾患の進行を減少または停止させる治療的な余裕を生み出し得る。
【０００９】
DLB患者を正確に同定する遺伝子マーカーを発見するために尽力する試みが、いくつかある。遺伝子試験は非常に便利な道具で、生存中のDLB診断を日常的な臨床現場で容易に実施することができる。この意味で、DLBとの関連を発見するために調査されたいくつかのタンパク質および遺伝子は、アルファ-7ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット、オステオポンチン、酸化窒素合成酵素、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1遺伝子、BDNF遺伝子またはベータ-シヌクレイン遺伝子である。それらの多くが、実験レベルで脳サンプルを用いて調査されていて、患者の脳生検を得ることの困難さのために実際の臨床診断には役に立たない。 
【００１０】
ブチリルコリンエステラーゼ(BChE)は肝臓で合成されるグリコプロテイン酵素である。ヒトの脳においては、主にグリア、特に皮質および皮質下構造に見られるが、とりわけニューロンにも見られ、認知機能に関連している。AD患者においてBChEは、アミロイド斑と神経原線維変化に見られる。この酵素は、有機リン酸化合物およびカルバメート化合物、の解毒酵素として機能し、スクシニルコリン、アスピリンおよびコカインを加水分解する。ヒトの脳におけるBChE機能はよく知られていないが、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)が減少しているまたは存在しない時に、アセチルコリン(ACh)を加水分解することが知られている。それは、無呼吸の感受性を決定するマーカーである。現在までに、3番染色体(3q26.1-q26.2)に位置するBChE遺伝子の65のバリアントが同定されている(cf. F. Parmo-Folloni et al., "Two new mutations of the human BCHE gene (IVS3-14T>C and L574fsX576)" Chemico-Biological Interactions 2008, vol. 175, pp. 135〜7)。
【００１１】
BChE遺伝子のエキソン4のA539T変異の存在は、Werner Kalowに敬意を表してKバリアントと名付けられている。Kバリアントは、DNA配列{NCBI受理番号(Accession Number NG_009031}の68974番目の位置に対応する、mRNAの1615番目のヌクレオチドのグアニンからアデニンへのDNA転移に関連しており、539番目のアラニンのスレオニンへの変化を引き起こす。K-バリアントは前記タンパク質のC末端に位置し、四量体化に関与する一方で、他方ではベータ-アミロイド線維形成の減弱化に関与する。血清中ではBChE Kバリアントは、血清中BChE活性レベルの1/3減少に関与している。脳における主なBChE機能は未知のままであるが、Kバリアントは、ADの進行に伴ってベータ-アミロイド線維形成の減弱率を減退させるようである。一方で、少なくとも1つのK-アレルを保有するAD患者においては、タウタンパクのリン酸化は低下しており、ADに対する防御メカニズムを意味している。
【００１２】
多くの調査で、BChE遺伝子、特にBChE Kバリアントと、ADの関連の可能性が調べられてきた。主な既知のADの遺伝的危険因子である、アポリポタンパクE遺伝子のイプシロン４アレル(epsilon 4 allele of the apolipoprotein E：ApoE4)の同時発生と、BDhE遺伝子バリアントとはAD症状に影響すると議論されてきた。いくつかの報告では、BChE野生型とApoE4遺伝子型の組み合わせを有する対象において、ADの危険性の増大することを示した。その他では、BChE KとApoE4の組み合わせがADの危険性を増大させることが発見された。ADにおける認知低下の進行は、BChE遺伝子型によって影響されることが示されてきた。しかしながら、ADの危険因子または進行マーカーとしてのBChE Kバリアントの役割について明確な結論はない。
【００１３】
さらに、BChE K遺伝子型およびDLBの間の関連の可能性も調査されてきた。Singletonらは、対照と比べて、DLBにおけるBChE Kホモ保有者の頻度が増すことを報告した(A.B. Singleton et al., “Butyrylcholinesterase K: an association with dementia with Lewy bodies”, Lancet 1998, vol. 351, pp. 1818)。近年の調査では、DLB患者においてはPDD患者と比べて、BChE KおよびApoE4頻度が増大していることが発見された(R. Lane et al., “BuChE-K and APOE epsilon4 allele frequencies in Lewy body dementias, and influence of genotype and hyperhomocysteinemia on cognitive decline”, Mov. Disord. 2009, vol. 24, pp. 392-400)。DLBの対象はPDDの対象よりもより高い割合で、さらなるAD型症状を有し、さらなるAD型症状はより速い認知低下に繋がるという仮説に基づいて、著者らは、この遺伝子型がLBDにおいて、認知症の開始およびの進行に重要であり得ると結論した。しかしながら、近年の調査では、前記BChE Kバリアントと認知症のDLB表現型の間には有意な関連はないことを示している(cf. W. Maetzler et al., “No differences of butyrylcholinesterase protein activity and allele frequency in Lewy body diseases” Neurobiol. Dis. 2009, vol. 35, pp. 296-301)。
【００１４】
従って、一般の臨床現場で使用され、レビー小体認知症に罹患している患者の正確な同定手段を提供する必要およびアルツハイマー病と区別する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】A.B. Singleton et al., “Butyrylcholinesterase K: an association with dementia with Lewy bodies”, Lancet 1998, vol. 351, pp. 1818
【非特許文献２】R. Lane et al., “BuChE-K and APOE epsilon4 allele frequencies in Lewy body dementias, and influence of genotype and hyperhomocysteinemia on cognitive decline”, Mov. Disord. 2009, vol. 24, pp. 392-400
【非特許文献３】W. Maetzler et al., “No differences of butyrylcholinesterase protein activity and allele frequency in Lewy body diseases” Neurobiol. Dis. 2009, vol. 35, pp. 296-301
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本願発明者は、レビー小体認知症に罹患している患者を決定し、アルツハイマー病と区別をすることを可能にする、BChE遺伝子の特異的な変化を発見した。
【００１７】
当該業界においては、BChE KバリアントとDLBの間の関連を発見することを目的とする文書があるが、以下に説明するように、近年の調査では有意な関連はないとみなしている(cf. W. Maetzler et al., supra)。驚くべきことに、本願発明者は、DLBの診断のための特異的な情報が、BChE遺伝子、位置4780から4786のポリチミン領域における現在未知の変化の遺伝子型と同時発生するKバリアントの遺伝子型によって得られることを発見した。従って、これら二つの遺伝子型を決定することは、DLBをADから区別するのに有用であり、これら二つの遺伝子型は、DLBの特異的な遺伝子マーカーを構成する。
【００１８】
本願発明者はさらに、遺伝子型の組み合わせは、DLBに罹患している患者群を同定しADから区別することに繋がることを見いだした。この組み合わせは、NCBI受理番号(NCBI Accession Number)NG_009031における位置3687、4206および4443の多型部位、位置4780から4786のポリチミン領域(すなわち、配列番号1における各位置3687、4206、4443および4780から4786)、および、NCBI受理番号NG_009031の位置68974(すなわち、配列番号28における位置934)の多型部位の遺伝子型により形成される。
【００１９】
BChEヌクレオチド配列の変化の位置は、プロモーターおよび遺伝子に対応するNCBI受理番号NG_009031のヌクレオチド配列から得られる。この配列は2010年1月に発表された。
【００２０】
多型部位3687、4206、4443および位置4780から4786のポリチミン領域は、プロモーター領域中である。これらの部位については、NCBIのBChEの全配列のヌクレオチド1からヌクレオチド5040に由来する配列に対応する、配列番号1も参照せよ。しばしば使用されるヌクレオチドの可能な番号付けは、転写開始点を1とし、結果としてこの位置より上流のヌクレオチド上流は負の位置とする。転写開始点1は、NG_0090031の位置5001に対応する。本願明細書で使用される番号付けと「負の」番号付けの対応は、本願明細書中で以下のように示される：
【００２１】
A3687GはA-1314Gに対応する
A4206GはA-795Gに対応する
C4443TはC-558Tに対応する
4780から4786のポリチミンは、-215から-221に対応する。 
【００２２】
位置68974の多型部位は、NG_009031がコードする領域中にある。NG_009031の位置68041から7020の領域は、配列番号28として含まれている。この領域だけをとって再度番号付けすると、結果として、全遺伝子配列中の位置68974は配列番号28の位置934となる。この多型は、BChEのエキソン4におけるアミノ酸の変化に関連し、結果としてKバリアントとなる。さらにこの多型の文献で使用される前記位置は、(シグナルペプチドなしで成熟BChEタンパクをコードするmRNA配列を参照して)異なる配列番号付けのために、1615である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
以下の実施例に記載の通り、独立して評価されたBChE遺伝子における5つの各変化とDLBの間に、特異的な関連は発見されなかったが、驚くべきことに、これらの変化を組み合わせた場合に、DLBに関する特異的な情報が得られた。
【００２４】
従って、本願発明の1つの実施態様は、対象の生物学的サンプルにおいて、ブチリルコリンエステラーゼ(BChE)遺伝子における以下の変化またはその連鎖不均衡における多型(位置68974における多型部位および位置4780から4786のポリチミン領域)の遺伝子型を決定することを含む、DLBを診断するin vitroの方法を提供する。
【００２５】
本願発明の特定の実施態様において、前記方法はさらに、BChE遺伝子における以下の変化またはその連鎖不均衡にある多型：位置3687、4206および4443の多型部位、の遺伝子型の決定を含む。
【００２６】
以下の実施例に記載の通り、AD死後サンプル(n=26)、純粋型DLB(n=12)、通常型DLB(n=24)および対照(n＝23)と、223人のADおよび160人の対照の対象から得られた臨床的に診断されたサンプルを分析した。結果として、3タイプの遺伝子マーカーを記載する。最初に、二つの多型部位における特異的な変化の同時発生は、一方のアレルの位置4780から4886における7つのチミンが存在すること、および、一方のアレルの位置68974においてグアニンが、他方のアレルにアデニンが存在することよって特徴づけられる。この同時発生は、ADに対するDLBの差異的な診断のための特異的な遺伝子マーカーである。誤診断の可能性を有する約50％のDLB患者が、このマーカーの使用により救済され得る。
【００２７】
本願発明の他の実施態様は、遺伝子型の組み合わせ、AAAGCC8+K+である、2番目の遺伝子マーカーに関する。それは、位置3687(両アレルがこの位置にアデニンを包含する)、4206(一方のアレルがアデニンを、他方のアレルがグアニンを包含する)、4443(両アレルがシトシンを包含する)、4780から4786(2つのアレルのうち少なくとも1つが8つのチミンによって構成される)および68974(2つのアレルのうち少なくとも1つがアデニンを包含する)の多型部位の特異的な遺伝子型によって構成される。認知症患者におけるこの遺伝子型の組み合わせの決定は、臨床的なDLB診断を提供する差異的な診断マーカーとしての役割を果たすが、無症状の個人におけるDLBの早期の診断マーカーとしての機能も果たしうる。
【００２８】
本願発明のもうひとつの実施態様は、遺伝子型の組み合わせ、AAAAC+77KWである、3番目の遺伝子マーカーに関する。それは、位置3687(両アレルがこの位置にアデニンを包含する)、4206(両アレルがこの位置にアデニンを包含する)、4443(2つのアレルのうち少なくとも1つがこの位置にシトシンを包含する)、4780から4786(両アレルが7つのチミンによって構成される)および68974(一方のアレルがアデニンを、他方のアレルがグアニンを包含する)の多型部位の特異的な遺伝子型によって構成される。認知症患者におけるこの遺伝子型の組み合わせの決定は、臨床的なDLB診断を提供する差異的な診断マーカーとしての役割を果たすが、無症状の個人におけるDLBの早期の診断マーカーとしての機能も果たしうる。
【００２９】
有利なことに、DLBの多数の不均一性の範囲内で実施例に従い、本願発明の方法により、さもなければADとして診断されたDLB症例の45〜60％を差異的に検出することが可能になる。臨床現場において診断することが困難であるこの割合の患者は、疾患の始まりから正しい診断を受けることが可能である。疾患に対する特異性は99％である。これは、DLBに対する最初の特異的なマーカーであることを意味している。
【００３０】
現在まで、利用可能な最新の道具は、臨床現場においてDLBを特異的に同定することは不可能であった。この方法において、対象はADと診断された際に、ADにおける精神的症状に対して最も適切な治療である神経弛緩薬による治療を受けたが、50%より多くのDLB患者はこの種類の治療に対して、多くの症例で死亡を引き起こす薬害反応を示した。本願発明の方法は、医学界が、DLBに罹患した患者に対して、誤った治療の危険性なしに適切な治療を適用することを可能にするため、重要である。従って、本願発明の方法を適用すると、DLBの診断の特異性が増大すると共に、神経弛緩薬による治療の薬害効果によって引き起こされる死亡が減少する。
【００３１】
さらには、本願発明の方法はDLB患者を特異的に診断することを可能にするため、臨床試験に含まれるべき患者の明確な群を得ることが可能になった
【００３２】
医療における「診断」により、外見的な症状、兆候および潜在的な生理学的/生化学的症例によって疾患または状態を認識する行動または段階を意味する。
【００３３】
本願明細書中の意味では、BChE遺伝子における「変化」は、野生型を考慮して、ヌクレオチド配列における任意の構造的変化を意味する。変化の例は、単一ヌクレオチド多型、欠失、挿入、置換またはひとつまたは複数のヌクレオチドの重複、および、ヌクレオチド上の化学的修飾(例えばメチル化)を含み得る。
【００３４】
本願明細書中の「遺伝子型を決定すること」により、所与の位置におけるヌクレオチドを同定することを意味する。
【００３５】
本願明細書における「1つのアレルにおける所与のヌクレオチド」は、対象は、その遺伝子におけるそのヌクレオチドがヘテロ接合体であることを意味し、「両アレルにおいて」は、そのヌクレオチドがホモ接合体であることを意味する。
【００３６】
本願発明に従い、前記方法はBChE遺伝子上で示された変化を決定することだけでなく、同じ情報を与えうる前記変化での連鎖不均衡にある多型を決定することも含む。集団遺伝学においては、連鎖不均衡は、必ずしも同じ染色体上ではない2つまたはそれ以上の位置におけるアレルの非作為的相関である。
【００３７】
本願発明の診断方法に従い、DLBの分析は以下の通りであり得る:認知症の始まりが疑われる患者および/または決定的ではない臨床性-家族性評価を有する患者が、前記のBChE遺伝子の変化を決定する遺伝子試験によって診断され得る。DLB特異的な遺伝子型を検出する場合、追加的な試験または検査は、正しくDLBを診断するために必要ではない。遺伝子型決定の直接的な利用は、日常的な臨床現場において、資金の重要な節約を意味する。
【００３８】
本願発明の方法は、以下の疑われる診断において役立つ:推定AD対潜在DLB;潜在AD対推定DLB;潜在AD対潜在DLB;推定AD対推定DLB;推定AD対潜在AD;潜在DLB;推定DLB。医師は、個人および家族の病歴を対象とし、実施された任意の神経科学的、精神医学的および実験室的試験の結果を組み合わせた、多くの患者インタビューに基づいて潜在ADを診断する。患者が記憶の減弱の段階的進行を訴える場合、および、記憶喪失を説明し得る任意のその他の状態を発見できない場合、医者はADを予期する傾向にある。医者はうつもしくは甲状腺機能低下などの病期、脳卒中によって引き起こされる神経科学的障害または記憶喪失の原因となり得る任意の医薬を探す。原因となりうる任意の病気を明らかにできない場合、ADの可能性があるという決定に繋がる。推定ADは、潜在アルツハイマーを越えた次の段階であり、医者が、患者が疾患を有していることを「比較的確信している」ことを意味する。
【００３９】
有利なことに、本願発明の方法は、生検などの侵襲的な方法;この場合においては脳組織マイクロ生検、でサンプルを得る必要なくDLBの診断を可能にする。本願発明の方法は遺伝子試験であり、身体の任意の細胞型に利用できるため、血液などの、対象から分離した任意の生物学的サンプルで実施される。
【００４０】
その他の実施態様において、遺伝子型の決定は、プライマー特異的多重PCR技術に続く検出、多重アレル特異的プライマー伸長、マイクロアレイに基づく方法およびダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーションからなる群より選択される技術の1つによって行われる。特定の実施態様においては、プライマー特異的多重PCRに続く検出によって行われる。
【００４１】
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)は、in vitroでの核酸の増幅のために最も広く使用されている方法である。PCRは、標識したプローブによる標的遺伝型の存在の検出が増幅に対してほとんど即時的である、リアルタイムPCRであり得る。
【００４２】
標的多型の増幅は、プライマー特異的多重PCRと、続くポリアクリルアミドゲル電気泳動による検出または遺伝学的分析装置による分析によって実施され得る。あるいは、様々なPCR反応と、続くアガロースゲル電気泳動により、または、シーケンシングにより実施され得る。
【００４３】
遺伝子型の決定は、Allele Specific Primer Extention(ASPE)によって実施され得る。これは、1つの試験管内での多重SNPのアッセイに使用し得る配列特異的酵素反応技術である。前記ASPE法は、2つの段階、標的遺伝子型を決定する酵素反応と、続く、検出のための固体微粒子表面での捕捉を伴う。溶液段階の動態を利用すると、この技術では配列標識された微粒子を、新しい鋳型を検出するために使用することができる。これは、アレル特異的なオリゴヌクレオチドに付着したふさわしいキャプチャー配列を利用して行われる。
【００４４】
任意で、検出は、任意のメカニズムで配置されたオリゴヌクレオチドで作られたDNAバイオチップ/マイクロアレイによって、in situで合成されたオリゴヌクレオチドで作られたDNAチップによってフォトリソグラフィーまたは任意の他のメカニズムによって、実施され得る。標的の増幅または完全な減少の必要なく、全ヒトゲノムDNAの多重SNPの遺伝子型決定を可能にするマイクロアレイに基づいた方法は、BChE変化の遺伝子型決定のために使用され得る。この直接的なSNP遺伝子型決定手法は、酵素が一切必要なく、金ナノコロイドプローブの高い感受性に依存している。特異性は、アレル特異的な表面固定化キャプチャープローブおよび遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド機能化金ナノコロイドプローブによる、標的への2つの連続的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに由来する。前記アッセイのフォーマットは、単純で、迅速で、しっかりしていて、「ポイントオブケア」で多重SNPをプロファイルするための安定性を示している。
【００４５】
さらには、遺伝子型の決定は、幾つかの実験室におけるスループットSNP遺伝子型決定のための基礎を意味する、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーション(dynamic allele-specific hybridization：DASH)によっても実施され得る。DASHの核となる反応原理は、DNA変性の過程におけるアレル特異的な差異のリアルタイム(ダイナミック)追跡である。これを達成するため、最初にオリゴヌクレオチドプローブを、本質的にすべての遺伝子型決定方法で必要な要素である、ターゲットDNAにハイブリダイズさせる。標的DNAは、固相表面に固定化されたPCR産物のうちの一方の鎖を含み、標的アレルのうちの1つと相補的である単一プローブが使用される。このアッセイの概念は非常に正確であることが示された(＞99.9％の正確さ)。
【００４６】
第二の態様において、本願発明は、BChE遺伝子における変化の遺伝子型を決定するための適切な手段を包含する、前記に定義の方法を実施するためのキットを提供する。
【００４７】
特定の実施態様では、前記キットはプライマー特異的多重PCRによる増幅を実施するための適切な手段を含む。
【００４８】
本願発明によって提供されるキットは、日常的な臨床現場において、DLBに罹患している患者を同定するために使用され得て、従って、前記患者はADに罹患している他の患者と区別される。本願発明のキットを使用すると、医療従事者は、より個人に合わせた、危険性に適合した治療戦略を、DLBに罹患している患者に利用することが可能になる。
【００４９】
他の実施態様においては、本願発明は前記で定義されたキットのDLB患者の診断のための使用に関する。
【００５０】
本願発明はまた、レビー小体認知症を診断するためのマーカーとして使用される、位置4780から4786のポリチミン、位置3687の多型部位；位置4206の多型部位；および位置4443の多型部位から成る群より選択された、BChE遺伝子の1つまたは複数の変化と組み合わせた、位置68974の多型部位の使用に関する。
【００５１】
特定の実施態様において、位置68974の多型部位は、位置4780から4786のポリチミン領域との組み合わせにおいて使用される。他の実施態様において、位置68974の多型部位は位置4780から4786のポリチミン領域、ならびに位置3687、4206および4443の多型部位との組み合わせにおいて使用される。
【００５２】
本願発明はまた、BChE遺伝子における前記の変化の遺伝子型の分析により、対象が神経弛緩薬による治療に応答するか否かを決定する方法に関する。前記方法は、患者がDLBに罹患しているのかADに罹患しているのかを決定することができるので、適切な治療を施すことを可能にする。
【００５３】
本願明細書と特許請求の範囲にわたり、「包含する」という単語および、「包含している」などの語に類するものは、その他の技術的特徴、添加物、要素またはステップを除外することを意図していない。本願発明のさらなる目的、利点および特徴は、本願明細書の審査において当業者に明らかであり、本願発明の実施によって学習され得る。さらには、本願発明は、本願明細書に開示された、特定のおよび好ましい可能性のあるすべての態様の組み合わせの範囲に及ぶ。
【００５４】
以下の実施例および図面は、例示によって提供され、本願発明を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1は、4つの群で得られた対応を示す。円は、四次元グラフにおいて異なる遺伝子型の組み合わせの位置を示唆する。星は、対応する、疾患群および対照群における、遺伝子型組み合わせ依存的な局在を示す。それらの位置は、明白に、cDLBおよび対照、ADおよび対照だけでなく、ADおよびcDLBの有意な違いも明らかにした。対照群では、両方の負の象限に位置したが、cDLBは第一象限の正および第二象限の負の範囲に位置し、ADは第一象限の正および第二象限の範囲に位置する。これらの結果は、3つの群が、BChEの遺伝的特徴という点において有意な差異を示したことを強く示唆する。それは、疾患特異的な遺伝子型の組み合わせが有用な疾患マーカーを表すことを意味する。
【図２】図2は、3つの遺伝子型組み合わせ依存的DLB群における、前頭葉の相対的なBChE発現レベルを示す: (1) 遺伝子型組み合わせAAAGCC8+K+保有者, n=4; (2)遺伝子型77KW保有者, n=7; (3)他のDLB患者, n=12. この結果は、BChE遺伝子発現を1として仮定した他のDLB患者と比較して、デルタデルタCt法により得られた相対的発現変化として表わされる。エラーバーは変動推定を表す。*有意な発現変化は、参照群より1.5〜2倍低く変化する。2つのDLB特異的な遺伝子型の組み合わせ(AAAGCC8+KまたはAAAAC+77WW)のうちの一つを保有するすべてのDLB患者は、その他のDLB患者よりも低いBChE発現レベルを示す。低下した発現は、対照群の脳におけるBChE発現レベルと類似しており、AAAGCC8+KまたはAAAAC+77WWを有するDLB患者が、通常使用されるコインエステラーゼ阻害剤による治療に応答しないという事実を示唆している。この発見は、さらに、これらのDLB患者の明確な特徴を表しており、DLB分子サブグループを定義している。
【実施例】
【００５６】
<死後サンプル>
臨床的および神経病理学的診断を受けた死後前頭葉サンプルは、地方倫理委員会で設立された規則に則って、バルセロナ大学の神経組織バンクおよびBellvitge Institute of Neuropathology Brain Bank(BrainNet Europe)により促進された。それらは、一般的なレビー小体疾患(cDLB)である24の脳(死亡時年齢:64〜90歳までの範囲で79.9歳;女性：男性比＝1.5:1)、純粋レビー小体認知症(pDLB)である12の脳は(死亡時年齢:60〜80歳までの範囲で74.4歳;女性:男性＝1:2)、ADである26の脳(死亡時年齢:61〜95歳までの、78.1歳;女性:男性＝1:1.1)、および対象である23脳(死亡時年齢:54〜83歳までの範囲で68.5歳;女性:男性＝1:1.1)に対応する。
【００５７】
神経病理学的試験は、すべてのADの脳がAD Braak & BraakステージVIを呈することを明らかにした。Braak & Braakは、脳におけるADを評価/定量化するための病期分類である。それは、神経病理学者によって、アミロイド斑および神経原線維変化の密度を評価するために使用される。ADは、Braak & Braakに従って、I-IV:神経原線維変化、A-C:アミロイド斑、と病期分類する。cLBDサンプルのうちの2つはBraak & Braak ステージIIIに対応し、3つはBraak & BraakステージIVに対応し、残り19サンプルはステージVおよびVIに対応した。pDLBの脳においては、Braak & Braakステージ0からIIが検出され、対照群においては、AD関連の変化はなかった。ADの脳も対象の脳もいずれも、PD関連病変を示さなかったが、すべてのpDLBとcDLBは、Braak & Braakの分類に従うと、PD関連変化に対応するステージ5および6を示した。
【００５８】
<臨床的に診断されたサンプル>
NINCDS-ADRDAおよびDSM-IV基準に従って、Department of Neurology of our Hospital Germans Trias i Pujolにおいて診断された、223人のAD患者(年齢:49〜86歳までの範囲で71.1歳;女性:男性比＝1:1.6)より血液サンプルを得た。さらに、年齢をマッチさせた対照対象(年齢:46〜91歳までの範囲で68.8歳;女性:男性比＝1:1.5)は59人であった。追加の実施態様において、160人の年齢をマッチさせた対照対象(年齢:46〜91歳までの範囲で68.8歳;女性:男性＝1:1.5)を鰓安打。この調査は、前記Hospitalの倫理委員会の承認後、インフォームド・コンセントへのサインを得て行った。
【００５９】
<DNA抽出>
凍結脳サンプル由来のDNAは、TRI Reagentを使用して、製造者の手引書に従って抽出した。TRI Reagent溶液は、単相の溶液中でフェノールおよびグアニジンチオシアネートと組み合わせ、RNA、DNAおよびタンパク質を同じサンプルから連続的に抽出するために使用する。純度および濃度を分光光度法で決定した後、DNAサンプルを使用時まで4℃で保存した。血液からのDNA抽出は、ガラスフィルター膜状へのDNA結合に基づいた標準的な手法によって実施した。
【００６０】
<BChEプロモーターシーケンシング>
BChEプロモーター配列は、約5000bpより構成されているため、配列分析のために3つのオーバーラップPCR断片を増幅した。PCR1(プライマーはBChEprom1UAおよびBChEprom1L;表1)では、位置-1869から位置-1031におよぶ838bpの断片を得た。PCR2(プライマーはBChEprom2UAおよびBChEpromS6;表1)においては、位置-1152から-315におよぶ837bpの断片を、そしてPCR3(プライマーはBChEprom2UBおよびBChEprom2L;表1)においては、位置-473から位置+231までにおよぶ688塩基対の断片を得た。PCR反応は、最終体積15μlで、1.7mMのMgCl2、200μMの各dNTP(Ecogen)、2pmolの各プライマー、 1unitのEcoTaq DNAポリメラーゼ(Ecogen)および約300ngのDNAを含有していた。標準的なPCRプログラムは、PCR1に対するアニーリング温度は58℃、PCR2および3に対するアニーリング温度は60℃で、PCR1は30サイクル、PCR2および3は35サイクルで構成された。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
PCR産物を、ExoSap-IT kit(GE Healthcare)を使用して精製した。シーケンス反応はBigDye(BigDyeTM Terminater vs 1.1 Cycle Sequencing Kit, Perkin Elmer)、10pmol/μlの各プライマーおよび3.5μgの精製PCR産物で行った。サイクルシーケンシングおよびDNA沈殿の後、ABI PRISMTM3100(Perkin Elmer)にて配列を得た。
【００６３】
<BChEプロモーター多型の分析>
BChE遺伝子のプロモーター領域において、4つの新しい多型を発見した。それらのうち3つは、良く知られたK-バリアント多型と同様で、mutation-specific-PCR (MS-PCR)を使用して：A3687G、A4206G、C4443TおよびBChE-Kにおいて調査された。最終体積15μlの各PCR反応は、1.7mMのMgCl2、200μMの各dNTP(Ecogen)、2pmolの3つの各プライマー(表2)、1ユニットのEcoTaq DNAポリメラーゼ(Ecogen)および300ngのDNAを含有した。35サイクルの標準的なPCRプログラムで、A3687G、BChE-Kについてはアニーリング温度62℃、A4206G、C4443Tについては57℃で増幅を行った。得られたPCR断片を、高分離能アガロースゲルにて分離した。BChE A3867G多型のA-アレルは153bpの断片であり、G-アレルは133bpの断片であった。K-アレルは149bpの断片であり、K-バリアント多型に由来する、野生型の対応するアレルは、169bpのバンドであった。BChE A4206G多型のA-アレルは124bp長で、G-アレルは104bpであった。最後に、C4443T多型については、T-アレルは145bpの断片に対応し、C-アレルは125bpの断片に対応した。
【００６４】
Poly T多型はただ一つのヌクレオチドによって異なる断片サイズで構成された。その遺伝子型決定は、フッ化クロム標識プライマー(表2)を用いたABI PRISM(商標)3100(Perkin Elmer)でのキャピラリー電気泳動によって達成された。前記PCRは、30サイクルのプログラムを使用する標準的条件下で行った。前記7T-アレルは、8T-アレルを表す196bpおよび197bpの断片を生じた。 
【００６５】
【表２】
2013520185.tif 000003
【００６６】
<統計分析>
対応分析(CORRESPONDENCE, Version 1.1, Data Theory Scaling System Group(DTSS), Faculty of Social and Behavioral Sciences, Leiden University, The Netherlands)により、神経病理学的に診断された患者群についての対応表が得られた。(神経病理学的および臨床的に診断された)両患者群に対する遺伝子型の組み合わせの分布は、SSPS version 11.0にて計算した。
【００６７】
<臨床的診断および神経病理学的診断の一致>
最初に、臨床的診断および神経病理学診断の間の一致を、Neurological Tissue Bankから得られたサンプルにおいて分析した。AD患者の100％が、臨床的および神経病理学的診断を同時に受けていたのに対して、pDLB患者の42%がDLBの診断を受けており、cLBD患者では臨床的にDLBの診断を受けたのはわずか17％であった。一方で、彼らの62％がADとして診断され、21％は他の認知症関連疾患であると診断された。この観察結果は、cLBDの診断基準がな不足していることと大いに関連している。
【００６８】
<BChE K-バリアント>
BChE K-バリアントは、位置68974、W(野生型)およびa-アレルK(変異型)と名付けられたg-アレルにおける、gからaへの単一のヌクレオチド置換で構成される。
【００６９】
この分析の興味深い発見は、cLBDばかりでなく、pDLDおよびADにおいても、対照と比べてK-アレル保有遺伝子型が過剰に出現していることであった(cLBDで0.62、pDLBで0.42およびADで0.38に対して、対照では0.13であり、各々p<0.001、p=0.090およびp=0.058)。さらなる遺伝子型分析では、KW遺伝子型はADおよび対照と似た頻度で存在すること、pDLBではわずかに高いが、cLBDサンプルの約3分の1がKW-遺伝子型保有者であることが明らかになった(表3)。調査サンプルにおいてはH-バリアントもJ-バリアントも存在しなかったが、A-バリアント保有遺伝子型は、異なる疾患において非常に低い頻度で発見された(cLBDで0.04、pDLBで0.08およびADで0.04に対して、対照では0;各々p=1、p=0.34、p=1)。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
<BChEプロモーター多型の特徴付け>
BChEプロモーターシーケンシングにより、以前は記載されていなかった4つの多型の存在が明らかになった。それらのうち3つは、単一のヌクレオチド変化であった：位置3687においてAがGに変化した;位置4206においてAがGに、位置4443においてCがT置換された。4つめの多型は、様々な長さのpolyT配列に対応し、位置4780から4786の間に位置していた。C4443TおよびBChE-Kにおいて調査した。同定された二つのアレルのうち、一方は7つのTによって構成され、他方は8つのTによって構成されていた。興味深いことに、8T-アレルは共通のエキソン4の多型のK-アレルによって分離された。
【００７２】
多型が疾患特異的な関連性を有するか否かを解明するため、神経病理学的に診断された、cLBD、pDLB、ADおよび対照を含む脳サンプルにおいて、4つのプロモーター多型すべてについてアレルおよび遺伝子型の頻度を決定した。まず、多型を独立して分析し、その後さらに遺伝子型の組み合わせを試験した。
【００７３】
A3687G多型の調査では、ADにおけるAA遺伝子型が、cLBD、pDLBおよび対照と比較して約3倍増大していることが明らかになった(ADで0.54に対して、cLBDでは0.21、p= 0.152;pDLBでは 0.16、p=0.298および対照では0.13、p<0.001)。一方、A4206G多型に対応するG-アレル保有遺伝子型は、野生型と比較して、cLBD、pDLBとADで蓄積していた(cLBDでは0.33、pDLBでは 0.17、ADでは0.23に対して対照では0.04、各々p=0.023、p=0.262およびp=0.105)。G-アレル保有遺伝子型の蓄積は疾患特異的ではなかったが、対照群においてはG-アレル保有遺伝子型がほとんどないことから、この蓄積はある程度重要であるように思われる。C4443T多型に対応するCC-遺伝子型は、cLBDおよび対照と比較する際、pDLBでは非常に低い頻度で存在する。逆に、TC-遺伝子型の頻度は、ADと比較して、pDLBおよびcDLBの両方においてはほとんど2倍に増大し、対照よりも有意に高かった。
【００７４】
8T-アレル保有遺伝子型の頻度は、対照と比較してcLBD、pDLBおよびADにおいて約2倍に増加していたが、これらの差は有意ではなかった(cLBDで0.25、ｐDLBで0.17、ADで0.19に対して、対照で0.09; 各々p=0.245、p=0.591およびp=0.421)。
【００７５】
<死後サンプルにおける遺伝子型比較の分析>
PolyT-77 K-バリアントKW遺伝子型の組み合わせ
BChE遺伝子型の独立した分析で、疾患間の重要の差異は明らかにならなかったあと、2つの多型によって構成されるすべての遺伝子型の組み合わせ(GenComb)の分析で、DLBにおいて特異的にKW/polyT-77遺伝子型の同時発生することが明らかになった。この遺伝子型の組み合わせはAD患者および対照には存在しなかったが、その頻度はcLBD群で0.3(患者24人中6人のKW/77保有者)、pDLB群で0.17であり(患者12人中2人のKW/77保有者)、DLBでの一般頻度0.25を構成していた(表4)。
【００７６】
【表４】
2013520185.tif 000005
【００７７】
対応分析
4つのプロモーターおよびK-バリアント多型によって構成されるGenCombの分布、頻度および特異性のさらなる分析を調査した。これらGenCombの対応分析は、cLBD、ADおよび対照間と、cLBDおよびAD間の、BChEに基づいた遺伝的差異を明らかにした。これらの差異は
四象限のダイアグラムで明らかに示され得た(図1)。対照群が第一及び第二次元の負の象限内に位置する一方で、cLBDは第一次元の負の象限および第二次元の正の象限に位置し、ADは両次元の正の象限に位置していた。これらの結果は、3つの群はBChE遺伝的特徴に関して関連がないこと、および疾患特異的GenCombの存在に対応することを強く示唆した。
【００７８】
共通遺伝子型組み合わせ
まず、総合的な分析により、31の異なるGenCombの存在が明らかになった(表5)。それらの多く(64.5%)は1つまたは2つのサンプルにのみ存在したため、その頻度は非常に低かった(0.01および0.02)。もっとも頻度が高いGenComb(N°20)は、すべての多型のホモ接合性野生型によって構成され、全サンプルの17.6％を示し、すべての群に同じ頻度で存在した。他の2つのもっとも頻度の高いGenComb(N°18および20)も、4つすべての群に存在したため非特異的であった。ADおよび対照とは対照的に、両方のLB認知症のタイプでは、BChE遺伝的特徴に関して、最も不均一な疾患であった(表5)。興味深いことに、ADは、両DLBおよび対照よりも疾患特異的なGenCombによって特徴づけられた(表5)。
【００７９】
【表５】
2013520185.tif 000006
【００８０】
疾患特異的遺伝子型組み合わせ
疾患によって分析した際、二つの重要な疾患特異的GenCombが検出された。一方は、GenComb AAAATT77WWで、ADサンプルにのみ、比較的高い頻度0.29で存在した。関連したGenComb AAAATT77KKもひとつのADサンプルに存在し、疾患特異性の基礎となっていた(表6)。polyT-8TアレルはK-アレルと同時分離するという事実は、関連するものとしてGenComb9〜11が成立することおよび共通のGenCombAAAGCC8+K+としてそれらを定義することを可能にした。このGenCombは、cLBDで発見されるもっとも頻度が高い疾患特異的GenComb(16.7%)であった。3つの関連のないpDLB特異的GenComb(N°3、5および30)は0.08という低い頻度であった(各々一人の患者にのみ存在した)。4つのGenCombは対照に特異的に発見された。それらのうち2つは(N°14および15)は関連があったが、その頻度は0.1を超えなかった。
【００８１】
【表６】
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【００８２】
〈臨床診断されたサンプルにおける遺伝子型組み合わせの分析〉
神経病理学的に診断された死後のAD、DLBおよび対照サンプルの調査によるデータを確認するため、我々は230人のAD患者群と59人の対照群を調査した。AD患者は1998年から2002年の間に診断されていた。臨床的DLB診断の最新のガイドラインは2005年に成立しており、これらAD患者の10％から25％は誤診断されたDLB患者である可能性があると予想され得る。
【００８３】
PolyT-77 K-バリアントのKW遺伝子型の組み合わせ
バリアント-KとPolyT遺伝子型の同時発生の分析により、AD群(0.19)および対照群(0.15)の両方におけるKW/polyT-77遺伝子型の同時発生の頻度と類似していることが明らかになった(表7)。 
【００８４】
【表７】
2013520185.tif 000008
【００８５】
それにもかかわらず、KW/77遺伝子型を保有する42人の患者の病歴は改正され、42人の患者にDLB診断に適合する兆候を呈した。
【００８６】
遺伝子型KW/77の同時発生は、患者および対照で同じ頻度で存在したが、ADとDLBを遺伝学的に区別する特異性の上昇によって特徴づけられた。AD患者の20〜40%が誤診断されたDLB患者であることを考慮すると、KW/77遺伝子型の疾患特異的頻度は50%よりも多くまで増大していた。
【００８７】
〈第2のDLB特異的BChE遺伝子型組み合わせの同定〉
BChE遺伝子発現分析の結果のために、臨床サンプルにおけるすべての遺伝子型組み合わせの再分析を実施した。77KWの遺伝子型の組み合わせの保有者は、AD群および対照群の両方に同じ頻度で発見された。代わりに、GenComb AAAAC+77KWがAD群の11人の患者(頻度0.05)および対照群の2個体(頻度0.012)で存在した。病歴の改正は、DLBに適合するこれらすべての兆候を明らかにした。われわれのAD群20〜40％が実際はDLB患者であることを考慮すると、GenComb AAAGCC8+K+と同様に、AAAAC+77KW頻度は12〜25%である。AAAAC+77KWの特異性は98.7％であり、その感度は30％以下である。
【００８８】
その後、両方のGenCombを組み合わせた場合、BChE遺伝子型組み合わせ試験は、特異性96.8％、感度60％まででDLB症例の検出が可能になった可能性がある。
【００８９】
対応分析
臨床的に診断されたサンプルを、AD群および対照群の2つの群によってしか示していなかったので、対応分析の結果を分割表で得た(表8および表10)。分析される遺伝子型の組み合わせの範囲内に含まれる5つの多型を考慮すると、289個体から構成されるサンプルで (243の可能性のある遺伝子型の組合せのうち)わずか25の異なる遺伝子型の組み合わせしか発見されなかったのは非常におどろくべきことである。検出されたすべての遺伝子型の組み合わせの64％は、神経病理学的に診断されたサンプル中においても観察された。
【００９０】
【表８】
2013520185.tif 000009
【００９１】
表8の共通の遺伝子型
5つの最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは:頻度0.34(ADで0.34および対照で0.35)の組み合わせ25、頻度0.16(ADで0.14および対照で0.22)の組み合わせ19，頻度0.10(ADで0.11および対照で0.08)の組み合わせ15、頻度0.10(ADで0.11および対照で0.07)の組み合わせ16、および最後に、頻度0.08(ADで0.08および対照で0.07；表8)の組み合わせ21、であった。最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは、両方：神経病理学的および臨床的サンプル、で同じであった。さらには、他の2つの遺伝子型の組み合わせは、両サンプルにおいて最も頻度が高く同時に起こった(表5および8)。
【００９２】
表8の疾患特異的遺伝子型の組み合わせ
初期にDLBおよびAD特異的であると検出されたGenCombnoの分布を分析し、我々は両方についてはるかに低く表現することを発見した。GenComb AAAATT77WWがADサンプルにおいてわずか2%しか存在しなかった一方で、対照群においては3.3%検出された。関連するGenComb AAAATT77KKはAD対照群のわずか1つのADサンプルでのみ発見された(0.4%)(表9)。 
【００９３】
GenComb 9〜11は神経病理学的なサンプルのGenCombと同時発生し、さらに共通GenComb AAAGCC8+K+として定義された。このGenCombは、AD群にのみ0.06(6％)の頻度で存在した(表9)。
【００９４】
【表９】
2013520185.tif 000010
【００９５】
約8年前、DLB診断の新しいガイドラインが成立するよりもはるかに前は、AD患者は臨床的に診断されていたことを考慮し、GenComb AAAGCC8+K+を保有する13人の患者の臨床的病歴を改正した。13人の患者すべてが、特異的なDLBマーカーであるAAAGCC8+K+と共同し、潜在または推定DLBに適合する兆候を示した。
【００９６】
さらに、AD患者群の20〜40％が誤診断されたDLB患者であることを考慮する場合、疾患特異的AAAGCC8+K+の頻度は増大し、15〜28％の範囲になるだろう。
【００９７】
【表１０】
2013520185.tif 000011
【００９８】
表10の共通する遺伝子型の組み合わせ
5つの最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは:頻度0.33(ADで0.34および対照で0.31)の組み合わせ29、頻度0.15(ADで0.14および対照で0.16)の組み合わせ22、頻度0.12(ADで0.11および対照で0.14)の組み合わせ18、頻度0.11(ADで0.11および対照で0.12)の組み合わせ19、および最後に、頻度0.07(ADで0.08および対照で0.05；表10)の組み合わせ25、であった。最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは、両方：神経病理学的および臨床的サンプル、で同じであった。さらには、他の2つの遺伝子型の組み合わせは、すべてのサンプルにおいて最も頻度が高く同時に起こった(表5、8および10)。
【００９９】
疾患特異的遺伝子型の組み合わせ
初期にDLBおよびAD特異的として検出されたGenCombの分布を分析し、我々は両方についてはるかに低く表現することを発見した。 GenComb AAAATT77WWがADサンプルにおいてわずか2%しか存在しなかった一方で、対照群においては3.1%検出された。関連するGenComb AAAATT77KKは、わずか1つのADサンプルでのみ発見された(0.4%)(表11)。 
【０１００】
GenComb 9〜11は神経病理学的なサンプルのGenCombと同時に起こり、さらに共通GenComb AAAGCC8+K+として定義された。このGenCombは、AD群には0.06(6％)の頻度で、対照群には0.01の頻度で存在した(表11)。
【０１０１】
【表１１】
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【０１０２】
約8年前、DLB診断の新しいガイドラインの成立よりもはるかに前は、AD患者は臨床的に診断されていたことを考慮し、GenComb AAAGCC8+K+を保有する13人の患者の臨床的病歴を改正した。13人の患者すべてが、特異的なDLBマーカーAAAGCC8+K+と共同し、潜在または推定DLBに適合する兆候を示した。
【０１０３】
さらに、AD患者群の20〜40％が誤診断されたDLB患者であることを考慮する場合、疾患特異的AAAGCC8+K+の頻度は増大し、15〜28％の範囲になった。
【０１０４】
〈遺伝子型の組み合わせに依存したDLBにおけるBChE発現〉
【０１０５】
〈RNA抽出および逆転写〉
RNA抽出には、TRI-Reagent(MRC, Cincinnati、USA)を製造者の手引書に従って使用した。簡潔に述べると、100mgの組織サンプルを、1.0mlのTRI-Reagent中で、無菌ピストンを使用して1.5mlチューブ中でホモジナイズした。ホモジネートを室温で5分間インキュベートし、4℃、12000gで10分間遠心分離し、不溶性材料および高分子量DNAをペレットにした。分離段階の後、RNAをイソプロパノールで沈殿させ、適切な容量のDEPC処理水で再懸濁した。RNA量は分光光度法でA260において決定し、RNA純度は、260nmと280nmの吸光度比率から確定した。RNA品質は、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)を使用して確定した。RIN値が6より高いサンプルのみ、使用時まで-80°Cで保存した。
【０１０６】
第一鎖cDNA合成はReady-to-go(商標) You-Prime First-Strand Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を使用して行った。2mgのRNAをランダムヘキサマーおよびFirst-Strand Beadsと共に37°Cで1時間インキュベートした。結果として得られたcDNAを直ちにPCRに使用するか、使用時まで−20°Cで保存した。
【０１０７】
〈リアルタイムPCR〉
BChE mRNAの相対的発現を、Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Sydney, Australia)を使用して決定した。QuantiTect SYBR Green PCR Kit (QiaGen, Hilden, Germany)をプライマーダイマー含量が最少となるように使用した。15mlの反応はさらに16pmolの各プライマー(BChE 2U GAGTAGATCCATAGTGAAACGG、配列番号22およびBChE 6LRNA CAGCGATGGAATCCTGCTTT、配列番号23)および1mlのcDNAを含有していた。相対BChE量を調査するため、2つの、ハウスキーピング遺伝子であるベータアクチン(プライマー: ベータアクチンU2 TCTACAATGAGCTGCGTGTG、配列番号24およびベータアクチンL3 TAGATGGGCACAGTGTGGGT, SEQ ID NO: 25)およびベータグルコシターゼ(GUS;プライマー: GUS−U1 ATGTGGTTGGAGAGCTCATT、配列番号26およびGUS−L2 TGTCTCTGCCGAGTGAAGAT、配列番号27)も分析した(M. Barrachina et al., "TaqMan PCR assay in the control of RNA normalization in human post-mortem brain tissue", Neurochem Int 2006, vol. 49, pp. 276-84)。
【０１０８】
15分間の変性ステップの後、続いて全てのBChE遺伝子、GUSおよびベータアクチンに対して56°Cで30秒アニーリングし、72℃の伸長ステップの間にエンドポイントの蛍光データを得た。最終的なメルティング分析は、全ての産物についてランし、特異的な増幅を決定した。相対的発現データは、同じPCR効率であるとの仮定に基づくデルタデルタCt法で相対的遺伝子発現を分析することによって達成した(T.D. Schmittgen et al., "Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method", Nat Protoc 2008, vol. 3, pp 1101-8)。従って、各遺伝子およびアイソフォームの異なるプライマー対を試験し、同じ効率で増幅する100から150塩基対の長さの断片を得た。PCR効率は各ランによって異なるので、標準曲線は最初のランだけではなく各ランに含まれた。正しい標準曲線(R>0.99 and R^2>0.99)である同じ効率のランのみが、さらなる分析に適していた。段階的に希釈された同じcDNA対照サンプルの増幅によって、標準曲線が生じた。すべてのアッセイは、2度行われ、独立して再現性を確認し、可能性のある誤差を最少にし、各ランにさらに陰性対照を含んだ。
【０１０９】
結果
遺伝子型組み合わせの存在に依存した、BChEの脳における相対的発現レベルの分析により、遺伝子型組み合わせ77/KWの保有者は脳におけるBChE発現が1/3未満に減少していること；および、遺伝子型組み合わせAAAGCC8+K+の保有者は、BChE発現が50%未満まで減少していることが示された。このことにより、すでにBChEが減少しているためにコリンエステラーゼおよび阻害因子、並びに、具体的にはブチリルコリンエステラーゼ阻害因子での治療に応答しない可能性があるDLBのサブグループが定義される。 
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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