(57)【要約】本明細書において、水溶性担体に連結されたフィトステロール中間体を含むフィトステロール誘導体組成物の調製方法を提供する。この方法は、生成物の分子構造を制御して、高濃度の水溶性フィトステロール誘導体をもたらす。本明細書において提供するフィトステロール誘導体は、食品用および医薬用の成分として有用であり、コレステロール低減効果を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、式I：
X-L-P
の化合物またはその塩型の作製方法であって、式中、
Xがフィトステロールであり；
Lがリンカーであり；かつ
Pが、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコール、ポリアルコール、およびポリエーテルからなる群より選択される水溶性担体である、方法：
（a）X-LとPとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、X-L、P、酸、および第一の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階；
（b）段階（a）の混合物を中和し、第二の有機溶媒を加える段階；
（c）段階（b）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに
（d）式Iの化合物を含む組成物を単離する段階。
【請求項２】
式Iの化合物を再結晶化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
X-LとPとのモル比が約1：2〜約1：6である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
X-LとPとのモル比が約1：3である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
フィトステロールが、シトステロール、シトスタノール、カンペステロール、カンペスタノール、スチグマステロール、スチグマスタノール、エルゴステロール、エルゴスタノール、アベナステロール、アベナスタノール、スピナステロール、スピナスタノール、ブラシカステロール、ブラシカスタノール、クリオナステロール、クリオナスタノール、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
シトステロールがβ-シトステロールである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
リンカーがジカルボン酸エステルである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ジカルボン酸エステルが、コハク酸エステル、アジピン酸エステル、グルタル酸エステル、ピメリン酸エステル、およびマロン酸エステルからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
Pが、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
Pが約400〜約1000の平均分子量を有する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
酸が、硫酸、p-トルエンスルホン酸、およびメタンスルホン酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
酸が硫酸である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
酸が触媒量で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
第一および第二の有機溶媒が、GRAS溶媒から独立に選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
第一の溶媒がトルエンであり、第二の溶媒が酢酸エチルである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
反応させる段階が加熱を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
化合物X-Lまたはその塩型を
（a）XおよびLの混合物を有機溶媒中で反応させる段階；
（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；
（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；ならびに
（d）ろ液を水で洗浄し、化合物X-Lを含む組成物を単離する段階
を含む方法によって調製する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
段階（a）の混合物が塩基をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
塩基が、DMAP、DIPEA、ピリジン、およびTEAからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
塩基が触媒量で存在する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
式Iの化合物を含む組成物が、水1mLあたり少なくとも30mgのフィトステロール量で水に可溶性かつ/または分散性であり、澄明な分散液を形成する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
式Iの化合物を含む組成物が、約1.0〜約1.3の置換度を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、式I：
X-L-P
の化合物またはその塩型の精製方法であって、式中、
Xがフィトステロールであり；
Lがリンカーであり；かつ
Pが、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコールである、方法：
（a）X-L-Pおよび有機溶媒を含む溶液を供給する段階；
（b）該溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに
（c）式Iの化合物を単離する段階。
【請求項２４】
以下の段階を含む、式I：
X-L-P
の化合物またはその塩型の作製方法であって、式中
Xがフィトステロールであり；
Lがリンカーであり；かつ
Pが、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコールである、方法：
X-LとPとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、X-L、P、および酸を含む混合物を反応させる段階。
【請求項２５】
以下の段階を含む、式II：
X-L
の化合物またはその塩型の作製方法であって、式中、
Xがフィトステロールであり；かつ
Lがリンカーである、方法：
（a）XおよびLの混合物を有機溶媒中で反応させる段階；
（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；
（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；および
（d）ろ液を水で洗浄し、式IIの化合物を含む組成物を単離する段階。
【請求項２６】
以下の段階を含む、式I：
X-L-P
の化合物またはその塩型の作製方法であって、式中、
Xがフィトステロールであり；
Lがリンカーであり；かつ
Pが、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコールである、方法：
（a）XおよびLの混合物を第一の有機溶媒中で反応させる段階；
（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；
（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；
（d）ろ液を水で洗浄し、化合物X-Lを含む組成物を単離する段階；
（e）X-LとPとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、X-L、P、酸、および第二の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階；
（f）段階（e）の混合物を中和し、第三の有機溶媒を加える段階；
（g）段階（f）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに
（h）式Iの化合物を含む組成物を単離する段階。
【請求項２７】
第一および第二の有機溶媒が、GRAS溶媒から独立に選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
以下の段階を含む、式III：
2013522298.tif 000010
の化合物またはその塩型の作製方法：
（a）式IV：
2013522298.tif 000011
の化合物またはその塩型、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコール、酸、および第一の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階であって、式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、段階；
（b）段階（a）の混合物を中和し、第二の有機溶媒を加える段階；
（c）段階（b）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに
（d）式IIIの化合物を含む組成物を単離する段階。
【請求項２９】
式IIIの化合物を再結晶化する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比が約1：2〜約1：6である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比が約1：3である、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
ポリエチレングリコールが約400〜約1000の平均分子量を有する、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
酸が、硫酸、p-トルエンスルホン酸、およびメタンスルホン酸からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
酸が硫酸である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
酸が触媒量で存在する、請求項28記載の方法。
【請求項３６】
第一および第二の有機溶媒が、GRAS溶媒から独立に選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３７】
第一の溶媒がトルエンであり、第二の溶媒が酢酸エチルである、請求項28記載の方法。
【請求項３８】
反応させる段階が加熱を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３９】
（a）β-シトステロールおよび無水コハク酸の混合物を有機溶媒中で反応させる段階；
（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；
（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；ならびに
（d）ろ液を水で洗浄し、式IVの化合物を含む組成物を単離する段階
を含む方法によって、式IVの化合物またはその塩型を調製する、請求項28記載の方法。
【請求項４０】
段階（a）の混合物が塩基をさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
塩基が、DMAP、DIPEA、ピリジン、およびTEAからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
塩基が触媒量で存在する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
式IIIの化合物を含む組成物が、水1mLあたり少なくとも30mgのフィトステロール量で水に可溶性かつ/または分散性であり、澄明な分散液を形成する、請求項28記載の方法。
【請求項４４】
式IIIの化合物を含む組成物が、約1.0〜約1.3の置換度を有する、請求項28記載の方法。
【請求項４５】
以下の段階を含む、式III：
2013522298.tif 000012
の化合物またはその塩型の作製方法：
（a）β-シトステロールおよび無水コハク酸の混合物を有機溶媒中で反応させる段階；
（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；
（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；ならびに
（d）ろ液を水で洗浄し、式IV：
2013522298.tif 000013
の化合物またはその塩型を含む組成物を単離する段階；
（e）式IVの化合物またはその塩型、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコール、酸、および第二の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階であって、式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、段階；
（f）段階（e）の混合物を中和し、第三の有機溶媒を加える段階；
（g）段階（f）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに
（h）式IIIの化合物を含む組成物を単離する段階。
【請求項４６】
第一、第二および第三の有機溶媒が、GRAS溶媒から独立に選択される、請求項45記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2010年3月12日提出の米国特許仮出願第61/313,421号に対する優先権を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示は、コレステロール低減効果を有する水溶性フィトステロール誘導体を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
β-シトステロール（24-エチル-5-コレステン-3-オール）および他のフィトステロールは、食品成分として用いると、コレステロール低下剤として機能することが明らかにされている。β-シトステロールなどのフィトステロールは体内でLDL-コレステロールと直接競合し、腸内でLDL-コレステロールの吸収を低減して血清コレステロールレベルを低減する。そのようなステロールの食品成分としての広範な適用は、化合物の疎水性および親油性の性質によって妨げられる。これらの特性は、調製しうる製剤の型を制限して、食品成分としてのフィトステロールの利用を妨げうる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書において提供するのは、Xがフィトステロールであり；Lがリンカーであり；かつPが、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコール、ポリアルコール、およびポリエーテルからなる群より選択される水溶性担体である、式I：
X-L-P
の化合物またはその塩型の作製方法である。いくつかの態様において、前記方法は、（a）X-LとPとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、X-L、P、酸、および第一の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階；（b）段階（a）の混合物を中和し、第二の有機溶媒を加える段階；（c）段階（b）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに（d）式Iの化合物を含む組成物を単離する段階を含む。
【０００５】
いくつかの態様において、前記方法は式Iの化合物を再結晶化する段階をさらに含む。
【０００６】
X-LとPとのモル比は約1：2〜約1：6でありうる。例えば、X-LとPとのモル比は約1：3でありうる。
【０００７】
フィトステロール（X）は、シトステロール、シトスタノール、カンペステロール、カンペスタノール、スチグマステロール、スチグマスタノール、エルゴステロール、エルゴスタノール、アベナステロール、アベナスタノール、スピナステロール、スピナスタノール、ブラシカステロール、ブラシカスタノール、クリオナステロール、クリオナスタノール、およびそれらの混合物からなる群より選択することができる。例えば、シトステロールはβ-シトステロールでありうる。
【０００８】
リンカー（L）はジカルボン酸エステルでありうる。例えば、リンカーはコハク酸エステル、アジピン酸エステル、グルタル酸エステル、ピメリン酸エステル、およびマロン酸エステルからなる群より選択することができる。
【０００９】
いくつかの態様において、Pは約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコールである。例えば、Pは約400〜約1000の平均分子量を有しうる。
【００１０】
本明細書に記載の方法において、化合物X-L、またはその塩型は、（a）XおよびLの混合物を有機溶媒中で反応させる段階；（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；ならびに（d）ろ液を水で洗浄し、化合物X-Lを含む組成物を単離する段階を含む方法によって調製することができる。いくつかの態様において、段階（a）の混合物は塩基をさらに含む。例えば、塩基はDMAP、DIPEA、ピリジン、およびTEAからなる群より選択することができる。いくつかの場合には、塩基は触媒量で存在する。
【００１１】
酸は、例えば、硫酸、p-トルエンスルホン酸、またはメタンスルホン酸でありうる。いくつかの態様において、酸は触媒量で存在する。
【００１２】
本明細書において用いる有機溶媒は、GRAS溶媒から独立に選択することができる。いくつかの態様において、第一の溶媒はトルエンであり、第二の溶媒は酢酸エチルである。
【００１３】
いくつかの態様において、前記反応は加熱を含む。
【００１４】
同様に本明細書において提供するのは、式Iの化合物の作製方法であって、X-LとPとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、X-L、P、および酸を含む混合物を反応させる段階を含む方法である。
【００１５】
本明細書においてさらに提供するのは、式Iの化合物の精製方法であって、（a）X-L-Pおよび有機溶媒を含む溶液を供給する段階；（b）溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに（c）式Iの化合物を単離する段階を含む方法である。式Iの化合物の作製方法であって、（a）XおよびLの混合物を第一の有機溶媒中で反応させる段階；（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；（d）ろ液を水で洗浄し、化合物X-Lを含む組成物を単離する段階；（e）X-LとPとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、X-L、P、酸、および第二の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階；（f）段階（e）の混合物を中和し、第三の有機溶媒を加える段階；（g）段階（f）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに（h）式Iの化合物を含む組成物を単離する段階を含む方法を、本明細書において提供する。
【００１６】
例えば、本明細書において提供するのは、式III：
2013522298.tif 000002
の化合物またはその塩型の作製方法であって、（a）式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、式IV：
2013522298.tif 000003
の化合物またはその塩型、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコール、酸、および第一の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階；（b）段階（a）の混合物を中和し、第二の有機溶媒を加える段階；（c）段階（b）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに（d）式IIIの化合物を含む組成物を単離する段階を含む方法である。
【００１７】
いくつかの態様において、前述の方法は式IIIの化合物を再結晶化する段階をさらに含みうる。
【００１８】
式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比は約1：2〜約1：6でありうる。例えば、式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比は約1：3でありうる。
【００１９】
いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは約400〜約1000の平均分子量を有する。
【００２０】
前述の方法は、式IVの化合物またはその塩型の調製を含みうる。方法は（a）β-シトステロールおよび無水コハク酸の混合物を有機溶媒中で反応させる段階；（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；ならびに（d）ろ液を水で洗浄し、式IVの化合物を含む組成物を単離する段階を含みうる。
【００２１】
いくつかの態様において、段階（a）の混合物は塩基をさらに含む。例えば、塩基はDMAP、DIPEA、ピリジン、およびTEAからなる群より選択することができる。いくつかの場合には、塩基は触媒量で存在しうる。
【００２２】
本明細書においてさらに提供するのは、式III：
2013522298.tif 000004
の化合物またはその塩型の作製方法であって、（a）β-シトステロールおよび無水コハク酸の混合物を有機溶媒中で反応させる段階；（b）段階（a）の反応混合物を冷却する段階；（c）段階（b）の冷却した反応混合物をろ過する段階；ならびに（d）ろ液を水で洗浄し、式IV：
2013522298.tif 000005
の化合物またはその塩型を含む組成物を単離する段階；
（e）式IVの化合物とポリエチレングリコールとのモル比が約1：1.5〜約1：10である、式IVの化合物またはその塩型、約200〜約2000の平均分子量を有するポリエチレングリコール、酸、および第二の有機溶媒を含む混合物を反応させる段階；（f）段階（e）の混合物を中和し、第三の有機溶媒を加える段階；（g）段階（f）由来の溶液をブラインで洗浄する段階；ならびに（h）式IIIの化合物を含む組成物を単離する段階を含む方法である。
【００２３】
本明細書に記載の方法によって調製した式IまたはIIIの化合物を含む組成物は、水1mLあたり少なくとも30mgのフィトステロール量で水に可溶性かつ/または分散性でありえ、澄明な分散液を形成する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法によって調製した式IまたはIIIの化合物を含む組成物は、約1.0〜約1.3の置換度を有しうる。
【００２４】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細を、添付の図面および以下の説明において示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本明細書において提供するのは、既存のフィトステロール化合物に比べて高い溶解性および安全性を有するフィトステロール誘導体の調製法である。水溶性誘導体を生成するための以前の試みは、水溶性担体PEGの両端に連結されたフィトステロール（「ジ型」）、PEGの一端に連結されたフィトステロール（「モノ型」）、および未反応のPEGを含む混合物を生じていた。例えば、D. Chung and Y.T. Choi, J. Ind. Eng. Chem., 13(3): 367-372 (2007)および国際公開公報第2000/52029号を参照されたく、これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる。前述のジ型結合体の存在は、これらの混合物の限られた溶解性の主な原因であることが明らかにされている。本明細書に記載の水溶性フィトステロール誘導体は、誘導体中のフィトステロールの重量比を高めるため、および食品添加物としてのFDAによる誘導体の認可を容易にするため、低分子量の水溶性担体（例えば、低分子量PEG）を用いる。本明細書に記載の方法は、誘導体の合成を制御し、カップリング反応における水溶性担体とフィトステロールとのモル比の調節を通して主にモノ型誘導体を生成するようはたらく。本明細書に記載の方法を用いて調製した水溶性フィトステロール誘導体は、安全で、水溶性が高く、食品および薬物適用の両方において有用で、かつ高コレステロール血症、特定の心障害、および高血圧の治療に適用可能でありうる、フィトステロール誘導体を提供する。
【００２６】
水溶性フィトステロール誘導体
水溶性フィトステロール誘導体には、Xがフィトステロールであり、Lがリンカーであり、かつPが水溶性担体部分である、式I：
X-L-P
を有する化合物またはその塩型が含まれる。
【００２７】
フィトステロール（X）とは、植物中で天然に見いだされる任意のステロールおよびスタノールの群、または植物から取り出した後に生成するその部分的もしくは完全に水素化された型（ステロールをスタノールに変換する）を意味する。フィトステロールは軟植物、例えば、ダイズ由来、または木本植物、例えば、松から抽出したいわゆる「トール油」由来でありうる。または、対応する化合物を合成的に生成することもできる。フィトステロールの製剤はこれらの異なる原料由来のフィトステロールの組み合わせを含んでいてもよく、典型的にはステロールおよびスタノールの両方の混合物を含む。フィトステロールの定義は、シトステロールおよびシトスタノール（例えば、β-シトステロールおよびβ-シトスタノール）、カンペステロールおよびカンペスタノール、スチグマステロールおよびスチグマスタノール、エルゴステロールおよびエルゴスタノール、アベナステロールおよびアベナスタノール、スピナステロールおよびスピナスタノール、ブラシカステロールおよびブラシカスタノール、ならびにクリオナステロールおよびクリオナスタノールなどの、植物由来ステロールおよびスタノールの任意のおよびすべての組み合わせを含むことが意図される。この用語は、典型的には化学的水素化により、非エステル化スタノールに部分的または完全に変換された非エステル化フィトステロールも含む。いくつかの態様において、フィトステロールはβ-シトステロールなどのシトステロールである。
【００２８】
本明細書において用いられるリンカー（L）とは、例えば、nが1〜10（例えば、1〜8、1〜6、1〜4、および1〜3）の整数である、-O2C(CH2)nCO2-などの、ジカルボン酸エステル部分を意味する。例えば、リンカーはコハク酸エステル、アジピン酸エステル、グルタル酸エステル、ピメリン酸エステル、およびマロン酸エステルからなる群より選択することができる。いくつかの態様において、リンカーはコハク酸エステルである。カップリング反応において、リンカーは反応中に酸、塩、または無水物として存在しうる。例えば、リンカーがコハク酸エステルである場合、カップリング反応において無水コハク酸を用いることができる。
【００２９】
水溶性担体部分は、エステル化可能なヒドロキシまたはカルボキシ基を有する親水性分子である。例えば、水溶性担体部分は、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、およびポリエーテルからなる群より選択することができる。適切なポリエチレングリコールには、約200〜約2000（例えば、約200〜約1500；約200〜約1200；約200〜約1000；約200〜約800、約200〜約600、約400〜約1000、約400〜約800、約400〜約600；約400〜約1500；約500〜約1200；および約800〜約1200）の平均分子量を有するものが含まれる。いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは約600の平均分子量を有する。他の態様において、ポリエチレングリコールは約1000の平均分子量を有する。
【００３０】
本明細書において用いられる「約」とは、標準の実験誤差による変動（例えば、±10％）を説明することが意図される。
【００３１】
「塩型」なる用語は、様々な適用において用途を有する塩を意味する。例えば、塩は、例えば、本明細書に記載の化合物の合成、精製または製剤の工程においてそれらを有用にしうる、高い結晶性などの特性を有しうる。一般に、本明細書に記載の化合物の有用な特性は、化合物が塩型であるかないかに決定的に依存することはなく、したがって明らかにそうではないとの記載（化合物が「遊離塩基」または「遊離酸」型であるべきとの明示など）がないかぎり、これが明確に述べられているかどうかにかかわらず、式Iの化合物への本明細書における言及は化合物の塩型を含むと理解されるべきである。塩は、例えば、適切な酸または塩基を本明細書に記載の化合物と反応させることにより、対応する化合物から通常の手段によって調製してもよい。当業者であれば、例えば、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use By P. H. Stahl and C. G. Wermuth (Wiley-VCH 2002)に記載のとおり、適切な塩型をどのように調製し、選択するかを知っているであろう。
【００３２】
水溶性フィトステロール誘導体の作製方法
本明細書に記載の水溶性フィトステロール誘導体（X-L-P）を調製するための工程は、フィトステロール中間体（X-L）および水溶性担体部分（例えば、約200〜約2,000の平均分子量を有するポリエチレングリコール（PEG））を約1：1〜1：10のモル比で含む混合物にカップリング試薬を加えて、水溶性担体部分の片側に連結されたフィトステロール中間体を有する水溶性フィトステロール誘導体を調製する、カップリング反応を含む。
【００３３】
一つの態様において、式I（X-L-P）の水溶性フィトステロール誘導体、またはその塩型の調製のために本明細書において提供する方法は、Xがフィトステロールであり、かつLがリンカーである、式II：
X-L
のフィトステロール中間体、またはその塩型；水溶性担体部分（P）；および酸の混合物を第一の溶媒中で反応させる段階を含みうる。いくつかの場合には、フィトステロール中間体と水溶性担体部分とのモル比は約1：1.5〜約1：10である。この反応に続き、得られた混合物を中和し、第二の有機溶媒を加えることができる。中和した溶液をブラインで洗浄し、水溶性フィトステロール誘導体（X-L-P）を有する組成物を単離することができる。
【００３４】
フィトステロール中間体および水溶性担体部分を反応（例えば、カップリング）させることは、反応物を加熱することを含みうる。例えば、反応混合物を第一の有機溶媒の還流温度よりも高い温度まで、カップリング反応が完了するのに必要な時間加熱することができる。
【００３５】
本明細書において用いられる酸は、水溶性担体部分のフィトステロール中間体によるエステル化を促進することができる任意の酸でありうる。例えば、酸には硫酸、p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、シュウ酸、塩酸などが含まれうる。いくつかの態様において、酸は硫酸などの強酸である。酸はカップリング反応を促進するのに必要な任意の量で存在しうる。例えば、酸は触媒量で存在しうる。
【００３６】
いくつかの場合には、本明細書において用いる有機溶媒は、優良製造基準の下で用いる場合に、GRAS（一般に安全と認められた、Generally Recognized As Safe）認可に適した溶媒から独立に選択することができる。いくつかの態様において、溶媒は、21 C.F.R 170.3および21 C.F.R. 170.30に示される記載に適合するものなどの、GRAS溶媒と考えられるものでありうる。本明細書に記載の方法において用いるのに適した有機溶媒の例には、酢酸、アセトン、アセトニトリル、アニソール、1-ブタノール、2-ブタノール、酢酸ブチル、tert-ブチルメチルエーテル、クメン、シクロヘキサン、1,2-ジクロロエテン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルアセトアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、エチレングリコール、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、メタノール、メチルシクロヘキサン、N-メチルピロリドン、酢酸メチル、3-メチル-1-ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、2-メチル-1-プロパノール、ペンタン、1-ペンタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、酢酸プロピル、テトラヒドロフラン、トルエン、キシレン、およびそれらの混合物が含まれる。いくつかの態様において、有機溶媒はトルエンおよび酢酸エチルから選択することができる。本明細書において用いられる第一の有機溶媒、第二の有機溶媒、および/または第三の有機溶媒は、同じでも異なっていてもよく、前述の1つまたは複数の有機溶媒で構成されうる。
【００３７】
フィトステロール中間体と水溶性担体とのモル比は約1：1.5〜1：10の範囲でありうる。例えば、比は約1：1.5〜約1：9；約1：1.5〜約1：8；約1：1.5〜約1：6；約1.1.5〜約1：4；約1.15〜約1：3、1：2〜約1：8、約1：2〜約1：6、約1：2〜約1：5、約1：2〜約1：4、約1：2.5〜約1：8、約1：2.5〜約1：6、約1：2.5〜約1：4、約1：3〜約1：9、約1：3〜約1：7、約1：3〜約1：6、約1：4〜約1：8、および約1：5〜約1：8から選択しうる。いくつかの場合には、フィトステロール中間体と水溶性担体とのモル比は約1：5でありうる。いくつかの場合には、フィトステロール中間体と水溶性担体とのモル比は約1：3でありうる。いくつかの場合には、フィトステロール中間体と水溶性担体とのモル比は約1：1.5〜約1：3の間でありうる。カップリング反応におけるこれら2つの成分のモル比を制御することで、望まれないジ型フィトステロール誘導体の生成が低減し、したがって最終生成物中のモノ型誘導体の濃度が高まることが明らかにされている。
【００３８】
粗製水溶性フィトステロール誘導体を、反応生成物をブライン溶液で洗浄することにより精製する。本明細書において用いられるブラインは、少なくとも15重量％の1つまたは複数のアルカリ金属（例えば、少なくとも20重量％の1つまたは複数のアルカリ金属、少なくとも25重量％の1つまたは複数のアルカリ金属、少なくとも30重量％の1つまたは複数のアルカリ金属、少なくとも35重量％の1つまたは複数のアルカリ金属、および少なくとも39重量％の1つまたは複数のアルカリ金属）を有する水溶液である。いくつかの態様において、少なくとも15重量％塩化ナトリウムを有する溶液を用いうる（例えば、少なくとも20重量％塩化ナトリウム、少なくとも25重量％塩化ナトリウム、少なくとも30重量％塩化ナトリウム、少なくとも35重量％塩化ナトリウム、および少なくとも39重量％塩化ナトリウム）。例えば、約35重量％塩化ナトリウムを有する溶液を用いうる。いくつかの態様において、ブラインは1つまたは複数のアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、およびカリウム）の塩で飽和またはほぼ飽和した水でありうる。例えば、ブラインは塩化ナトリウムを用いて調製することができる。
【００３９】
理論に縛られることなく、水溶性フィトステロール誘導体の精製は、ポリエチレングリコールが水溶性フィトステロール誘導体よりもブラインへの溶解性が高いために起こると考えられる。この溶解性の差によって、未反応のポリエチレングリコールの所望の水溶性フィトステロール誘導体生成物からの好都合な除去が促進される。いくつかの場合には、この水溶性フィトステロール誘導体を含む溶液の精製方法を、さらなる精製を必要としている水溶性フィトステロール誘導体を含む任意の組成物に対して用いることができる。例えば、水溶性フィトステロール誘導体および有機溶媒を含む溶液をブラインで洗浄することができ、次いで精製した水溶性フィトステロール誘導体を1つまたは複数の不純物を除去した有機溶媒から単離することができる。
【００４０】
水溶性フィトステロール誘導体、フィトステロール中間体またはこれらを含む組成物を単離することは、任意の通常の単離および/または精製方法を含みうる。単離法には、例えば、蒸留、再結晶化、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、調製用薄層クロマトグラフィ、溶媒での抽出などが含まれうる。いくつかの態様において、水溶性フィトステロール誘導体を、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、メチルtert-ブチルエーテル）からの再結晶化を通して単離または精製することができる。
【００４１】
前述の方法の非限定例として、式III：
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の水溶性フィトステロール誘導体、またはその塩型をスキームIに従って調製することができる：
2013522298.tif 000007
上に示す水溶性フィトステロール誘導体を、例えば、平均分子量1000のポリエチレングリコール3モル当量を第一の有機溶媒（例えば、トルエン）中で酸（例えば、硫酸）と混合し、加熱還流することによって調製することができる。この混合物に、フィトステロール中間体（例えば、コハク酸β-シトステロール）1モル当量を第一の有機溶媒に溶解し、反応混合物に1〜5時間かけてゆっくり加えることができる。反応が完了すれば（1〜10時間後）、反応混合物を室温まで冷却し、中和（例えば、炭酸カリウムなどの塩基の添加により）することができる。得られた混合物を第二の有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で希釈し、ブラインで1〜6回洗浄することができる。次いで、有機層を減圧下で濃縮し、水溶性フィトステロール誘導体を有機溶媒（例えば、酢酸エチル）から再結晶化して、精製した水溶性フィトステロール誘導体を得ることができる。
【００４２】
前述のフィトステロール中間体（例えば、X-Lまたは式IIの化合物）を当業者には公知の方法を用いて調製することができる（例えば、Chung et al., J. Ind. Eng. Chem., 13(3): 367-372 (2007)参照）。
【００４３】
いくつかの態様において、フィトステロール中間体は、Xがフィトステロールであり、かつLがリンカーである、式II：
X-L
またはその塩型の構造を有し、フィトステロールおよびリンカーの混合物を有機溶媒中で反応させることにより調製することができる。次いで、反応混合物を冷却してろ過することができる。次いで、ろ液を水で洗浄し、次いでフィトステロール中間体を有機層から単離することができる。いくつかの態様において、反応を塩基非存在下で実施する。いくつかの態様において、塩基をフィトステロールおよびリンカーの初期反応に加えることができる。例えば、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）、ピリジン、またはトリエチルアミン（TEA）の1つまたは複数を用いて、カップリング反応を促進することができる。いくつかの態様において、塩基は触媒量で存在する。
【００４４】
一例として、フィトステロールを有機溶媒中でスラリー化することができる。この混合物に、無水コハク酸を加え、混合物を撹拌して加熱還流することができる。反応が完了すれば、混合物を4℃に冷却して固体を除去することができる。次いで、有機層を分離し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、有機溶媒でスラリー化することができる。次いで、沈澱をろ取し、冷有機溶媒で洗浄する。次いで、得られた固体を前述のとおりに精製することができる。
【００４５】
フィストステロール中間体を反応混合物から単離することができ、いくつかの場合には、当技術分野において公知の方法を用いて精製することができる。いくつかの態様において、フィトステロール中間体を調製し、例えば、水溶性フィトステロール誘導体の産生において直接（例えば、反応混合物から固体を単離せずに）用いることができる。
【００４６】
いくつかの態様において、式IIの化合物は式IV：
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の化合物またはその塩型でありうる。
【００４７】
特性および使用方法
本明細書に記載の方法により調製した水溶性フィトステロール誘導体は、水1mLあたり少なくとも30mg重量のフィトステロール量で水に可溶性かつ/または分散性であり、澄明な溶液を生じることができる。これらの化合物の溶解性/分散性は、部分的には約1.0〜約1.3（例えば、1.0、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.2、1.22、1.24、1.25、1.26、1.28、および1.3）の範囲の置換度（DS）を有する誘導体による。いくつかの態様において、DSは約1.0〜約1.15の範囲でありうる。本明細書において用いられる「置換度」またはDSなる用語は、水溶性フィトステロール誘導体に関する場合、水溶性担体（例えば、PEG）1分子あたりのフィトステロール基の総数を意味する。
【００４８】
本明細書において提供する水溶性フィトステロール誘導体を、それらのコレステロール低減効果ゆえに、食品中の成分として、および医薬として用いてもよい。例えば、水溶性フィトステロール誘導体を、食品および飲料用のコレステロール低下添加物などの、様々な型の製品中、成人におけるフィトステロールの有効1日用量に適合するように用いることができる。そのような製品は高コレステロール血症の治療ならびにいくつかの心疾患および高血圧の予防のために有用でありうる。
【００４９】
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開出願、および他の出版物はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における用語に対して複数の定義がある場合、特に記載がないかぎり本項のものが優先される。
【実施例】
【００５０】
実施例1：水溶性フィトステロール誘導体の調製
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【００５１】
フィトステロール中間体の調製（段階1）
フィトステロール（100g、0.24mol）を無水トルエン中でスラリー化し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、残留する水があればこれを除去した。トルエン中のフィトステロール（400mL）および無水コハク酸（32.6g、1.3当量）を合わせ、混合物を撹拌しながら111℃に加熱した。反応の進行をTLC/NMRでモニターした。反応が完了した時点で、混合物を4℃に冷却し、固体をブフナー漏斗、PPろ布およびろ過フラスコを用いてろ過した（6.4g）。ろ液をMTBEで希釈し、水で洗浄した。有機層をロータリーエバポレーターで蒸発させ、ヘプタンでスラリー化した。沈澱をろ取し、冷ヘプタンで洗浄した。白色固体を減圧乾燥器内で乾燥して、フィトステロール中間体104.4g（84.5％）を得た。
【００５２】
水溶性フィトステロール誘導体の調製（段階2）
トルエン（750mL）中のPEG 1000（292g、0.2928mol、5当量）および硫酸（0.69g）を緩やかに還流するまで加熱した。段階1のフィトステロール中間体（30.1g、0.0585mol、1.0当量）をトルエン（140mL）に溶解し、反応混合物にゆっくり加えた（3時間かけて）。反応の進行をTLCでモニターした。反応が完了した時点（約4時間）で、室温まで冷却し、固体炭酸カリウム（約1g）を加えた。混合物を酢酸エチル（1400mL）で希釈し、ブライン（5×1400mL）で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮して淡黄色固体（78.1g）とし、これは置換度（DS）＝1.19を示した。固体を40℃で酢酸エチル（55mL）に溶解し、次いで5℃に冷却した。沈澱した固体をろ取し、冷酢酸エチル（20mL）で洗浄した。オフホワイト固体を減圧乾燥器内で乾燥して、DS＝1.06の水溶性フィトステロール誘導体46.9g（53％）を得た。化合物の構造を1H NMRにより確認した。
【００５３】
実施例2：フィトステロール中間体の調製
フィトステロール（1当量）、無水コハク酸（1.5当量）、トルエン（4当量）、およびジイソプロピルエチルアミン触媒（0.2％）を合わせ、100℃で3時間加熱した。得られた溶液を4℃に冷却し、ろ過した。メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）をろ液に加え（1：1）、溶液を水で洗浄した。次いで、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮して、フィトステロール中間体を得た（90.3％）。
【００５４】
実施例3：フィトステロール中間体の調製
フィトステロール（1当量）、無水コハク酸（1.3当量）、トルエン（4当量）、および4-ジメチルアミノピリジン（0.5％）を合わせ、100℃で終夜加熱した。メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）を加え（1：1）、溶液を水で洗浄した。次いで、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過た。ろ液を減圧下で濃縮し、ヘプタンでスラリー化した後、ろ過して、フィトステロール中間体を単離した。
【００５５】
実施例4：フィトステロール中間体の調製
フィトステロール（5g）、無水コハク酸（1.5当量）およびトルエン（4当量）を合わせ、110℃で終夜加熱した。得られた溶液を4℃に冷却し、ろ過した。メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）をろ液に加え（1：1）、溶液を水で洗浄した。次いで、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮して、フィトステロール中間体を得た（73％）。
【００５６】
実施例5：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（5当量）、コハク酸β-シトステロール（1当量）および硫酸（触媒）をトルエン（約30当量）と合わせ、3時間加熱還流し、次いで冷却した。固体炭酸カリウムナトリウムを加えて溶液を中和し、得られた混合物をろ過した。次いで、様々な後処理手順を実行した。
a）ろ液を4℃に冷却し、昇温させた。この手順によりDS＝0.45の生成物を生じた。
b）ろ液を4℃に冷却し、氷冷ろ過し；DS＝1.04の生成物を生じた。
c）25％ヘプタンをろ液に加えた。生成した油状物を除去し、DS＝0.53のろう状固体を得た。このろう状固体の一部を酢酸エチル中5％メタノールでシリカプラグフィルターを通過させた。所望の生成物は最初の分画で、DS＝0.53の生成物を得た。ろう状固体の残りをトルエンに溶解した。15％の水を得られた溶液に加え、混合物をろ過した。DS＝1.04の生成物を単離した。
【００５７】
実施例6：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（3当量）、コハク酸β-シトステロール（1当量）および硫酸（触媒）をトルエン（約30当量）と合わせ、3時間加熱還流し、次いで冷却した。固体炭酸カリウムナトリウムを加えて溶液を中和し、得られた混合物をろ過した。次いで、様々な後処理手順を実行した。
a）15％の水をろ液に加えたが、得られた固体はろ過により除去し得ないことが明らかとなった。
b）トルエン：ヘプタン（1：1）を用いて分液漏斗内のろ液を洗浄した。得られた油層を除去した。残留する溶液の一部に水を加え、これを次いで冷却ろ過し、有機層を濃縮した。得られた生成物はDS＝1.96であった。溶液の残りの部分を昇温させ、次いでろ過した。得られた生成物はDS＝0.98であった。
【００５８】
実施例7：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（3当量）および硫酸（触媒）をトルエン（約30当量）と合わせ、加熱還流した。コハク酸β-シトステロール（1当量）をトルエンに溶解し、還流中の反応混合物にゆっくり加えた（30分間添加および30分間停止を2.5時間）。反応は添加の1時間後に完了した。次いで、様々な後処理手順を実行した。
a）トルエン：ヘプタン（1：1）を溶液に加え、混合物を1時間放置した。得られた油層を除去した。有機層の一部を取り出してろ過し、DS＝0.76の生成物を得た。残りの有機溶液に対し、トルエン：ヘプタンの比を1：3に上げたが、得られた溶液はろ過後もまだ混濁していた。得られた生成物はDS＝1.02であった。
b）混合物を少なくとも48時間放置した。この後、溶液は澄明であった。ヘプタンを加えてトルエン：ヘプタンの比を1：3に上げ、混濁混合物を得た。混合物の一部を減圧ろ過して混濁ろ液を得、生成物はDS＝1.49であった。混合物の残留部分を重力ろ過し、澄明な溶液を得た。得られた生成物はDS＝2.25であった。
【００５９】
実施例8：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（3当量）および硫酸（触媒）をトルエン（約20当量）と合わせ、加熱還流した。コハク酸β-シトステロール（1当量）をトルエンに溶解し、還流中の反応混合物にゆっくり加えた（30分間添加および30分間停止を2.5時間）。反応は添加の1時間後に完了した。次いで、様々な後処理手順を実行した。
a）ヘプタン：トルエン（0.5：1）を加えた。得られたろ液から単離した生成物はDS＝0.88であった。
b）ヘプタン：トルエン（1：1）を加えた。得られたろ液から単離した生成物はDS＝0.87であった。
c）ヘプタン：トルエン（2：1）を加えた。得られたろ液から単離した生成物はDS＝1.3であった。
d）ヘプタン：トルエン（3：1）を加えた。得られたろ液から単離した生成物はDS＝2.3であった。
e）後処理a）由来の固体をジクロロメタンに溶解し、ブラインで洗浄した。得られたろ液はDS＝0.88であった。
f）後処理a）由来の固体をMTBEで滴定した。得られたろ液はDS＝1.08であったが、非常に低収率であった。
g）後処理a）由来の固体をMTBE：トルエン（90：10）で滴定した。得られたろ液はDS＝1.05で、収率30％であった。
h）溶媒を反応混合物から除去し、固体をトルエンに溶解した。この溶液に、同量のMTBEを加えた。この溶液を1当量のブライン（4回）、15％NaClで1回洗浄し、次いでブラインで再度洗浄した。次いで、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過した。ろ液から単離した生成物はDS＝2.6であった。
i）後処理c）およびd）由来の固体を6当量のトルエンに溶解した。これに5当量のヘプタンを加えた。溶液を結晶化させ、得られた結晶はDS＝1.01であった。
【００６０】
実施例9：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（3当量）および硫酸（触媒）をトルエン（150mL）と合わせ、加熱還流した。コハク酸β-シトステロール（1当量）をトルエンに溶解し、還流中の反応混合物にゆっくり加えた（30分間添加および30分間停止を2.5時間）。反応は添加の1時間後に完了した。反応混合物を1当量のジクロロメタンで希釈し、飽和ブライン溶液（6回）で洗浄した。得られた生成物はDS＝0.51で、少なくとも1当量の未反応PEGを示していた。この固体の半分をトルエン/DCM（100mL、1：1 v/v）に再度溶解し、24％ブライン（6回）で洗浄した。得られた生成物はDS＝1.16であった。固体の他の半分をトルエン/酢酸エチルに再度溶解し、36％ブライン（3回）で洗浄し、DS＝1.2の生成物を得た。ブラインでさらに洗浄してもDSは変わらず（1.22）、すべての未反応PEGはその前の洗浄で除去されたことを示していた。
【００６１】
実施例10：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（3当量）、硫酸（触媒）、およびトルエン（約20当量）を用い、加熱還流して、15g規模の反応を完了した。コハク酸β-シトステロール（1当量）をトルエンに溶解し、還流中の混合物に1.5時間かけてゆっくり加えた。反応はコハク酸β-シトステロール添加の2時間後に完了したようであった。塩基を加えて反応混合物を中和した後、溶液を冷却し、酢酸エチルを加えた（1当量）。この溶液をブライン（1.0当量）で8回洗浄した。有機層を濃縮して黄色油状物（38.1g、収率85％）とし、DS＝1.13であった。次いで、油状物を1グラムのイソプロパノールに溶解し、48時間冷却した。DS＝1.13のわずかに黄色の材料（0.6g）を単離した。
【００６２】
実施例11：水溶性フィトステロール誘導体の調製
PEG 1000（5当量）、硫酸（触媒）、およびトルエン（約30当量）を用い、加熱還流して、30g規模の反応を完了した。コハク酸β-シトステロール（1当量）をトルエンに溶解し、還流中の混合物に4.5時間かけてゆっくり加えた（2回に分けて添加し、その間に45分間中断した）。反応はコハク酸β-シトステロール添加の4時間後に完了したようであった。塩基を加えて反応混合物を中和した後、溶液を冷却し、酢酸エチルを加えた（1当量）。この溶液をブライン（1.0当量）で5回洗浄した。有機層を濃縮して黄色油状物（78.1g、収率88％）とし、DS＝1.19であった。次いで、油状物を55mLの酢酸エチルに溶解し、4℃で終夜冷却した。得られた固体を20mLの冷酢酸エチルでろ過した。生成したオフホワイト固体（50.8g、収率58％）はDS＝1.06であった。
【００６３】
本発明のいくつかの態様を記載してきた。しかし、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な改変を行いうることが理解されるであろう。したがって、他の態様は添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【国際調査報告】
2013522298.tif 000014
2013522298.tif 000015