(57)【要約】【課題】マラリアの原因となる各プラスモジウム属種を迅速かつ高精度に検出・識別することのできる新規プローブおよび方法を提供する。【解決手段】本発明の検出方法は、試料中のプラスモジウム属の有無を検出する方法であり、ａ）ハイブリダイゼーションアッセイにより、試料と、プラスモジウム属を検出するのに適した配列またはこれに対して相補的な配列からなるプローブとを、このプローブがプラスモジウム属の核酸にハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップと、ｂ）試料中のプラスモジウム属の核酸に結合したプローブを、試料中にプラスモジウム属が存在することを示す指標として検出するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）の有無を検出する方法であって、
ａ）ハイブリダイゼーションアッセイにより、前記試料と、三日熱マラリア原虫を検出するのに適した［配列番号：１］または［配列番号：１］に対して相補的な配列からなるプローブとを、当該プローブが三日熱マラリア原虫の核酸にハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップと、
ｂ）前記試料中の三日熱マラリア原虫の前記核酸に結合した前記プローブを、前記試料中に三日熱マラリア原虫が存在することを示す指標として検出するステップと、
を含む、三日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項２】
請求項１において、前記核酸プローブが、［配列番号：１］における少なくとも５個の連続したヌクレオチドから選択された配列、または当該配列に対して相補的な配列である、三日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項３】
請求項１において、前記核酸プローブが、［配列番号：１］における少なくとも１０個の連続したヌクレオチドから選択された配列、または当該配列に対して相補的な配列である、三日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項４】
請求項１において、前記核酸プローブが、［配列番号：１］における少なくとも１５個の連続したヌクレオチドから選択された配列、または当該配列に対して相補的な配列である、三日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項５】
［配列番号：１］におけるヌクレオチド配列からなるプローブ。
【請求項６】
［配列番号：１］におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるプローブ。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか一項において、検出方法が蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法である、三日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項において、検出方法がドットブロットアッセイ法である、三日熱マラリア原虫の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
プラスモジウム属（Plasmodium）は、寄生原虫属の１つである。プラスモジウム属による感染症が、いわゆるマラリアである。プラスモジウム属寄生生物は、その生活環において常に２つの宿主を有する。１つは媒介蚊であり、もう１つは脊椎動物である。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および卵形マラリア原虫（P. ovale）も含め、少なくとも１０種がヒトに感染する。マラリアは伝染病であり、熱帯地域や亜熱帯地域で流行する。マラリアは男性、女性、子供を問わず、生命の脅威である。感染者は毎年３億人〜５億人に及び、死者は年間１００万人〜３００万人に達し、特に、サハラ以南のアフリカの幼い子供達が犠牲となっている。
【０００２】
マラリアは最も日常的な伝染病の１つであり、重大な公衆衛生問題である。この疾病はプラスモジウム属（Plasmodium）の寄生原虫によって引き起こされる。なかでも、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）が最も深刻な病状を引き起こす。ただし、それ以外の近縁種［卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）や四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）］もヒトに感染し得る。感染種を判定できれば、患者に対する治療方針の決定にも役立つ。
【０００３】
上述したプラスモジウム属（Plasmodium）の４つの主な寄生種は、どれも独特な特徴を具備している。そのため、マラリアの好ましい診断方法のなかでも、血液塗抹標本を用いた顕微鏡検査によるものが最も信頼性が高い。２種類の血液塗抹標本が一般的に使用される。通常の血液塗抹標本に近い薄層塗抹標本を用いた調製法では、寄生生物の外形が最も良好に維持されるので、種の同定が容易である。厚層塗抹標本は、大量の血液をスクリーン検査することができ、薄層塗抹標本の約１１倍の感度を有するので、軽度感染（low levels of infection）であっても検出可能である。しかし、厚層塗抹標本を用いると、寄生生物の外形が大きく歪んで見えるので、種の識別は遥かに困難になる。
【０００４】
厚層塗抹標本を用いて顕微鏡検査を行う場合、熟練者であれば、寄生生物レベル（すなわち、寄生虫血症レベル）の検出精度は最高で赤血球0.0000001％にまで達する。しかしながら、顕微鏡を用いた診断方法は困難を伴うことがある。というのも、前述した４つの種のいずれも、早期栄養体（「リングフォーム（環状体）」）は同じに見えるため、１つのリングフォームに基づいて種を診断するのは不可能だからである。顕微鏡を用いた種の同定には、常に複数の段階の栄養体が必要となる。
【０００５】
顕微鏡法が利用できない場合、抗原検出試験法ならば、血液が一滴あれば十分に足りる。ＯｐｔｉＭＡＬ−ＩＴ（登録商標）（ＴＣＳ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製；イングランド国バッキンガム）は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の寄生虫血症を最高0.01％の精度で確実に検出でき、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）以外のマラリア寄生虫血症であっても最高0.1％のレベルで確実に検出することができる。Ｐａｒａｃｈｅｃｋ−Ｐｆ（登録商標）（Ｏｒｃｈａｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製；インド国）は、寄生虫血症を最高0.002％のレベルで検出できるが、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）のマラリアと熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）以外のマラリアとを識別することができない。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて寄生生物の核酸を検出する方法もある。この方法は顕微鏡法よりも高精度である。ただし、この方法は高価であり、かつ、特殊な研究施設が必要となる。また、特に、寄生生物が血管壁に付着可能な場合、寄生虫血症のレベルは必ずしも疾病の進行と相関しない。臨床研究施設における分子法は制限されており、迅速なリアルタイムアッセイ法、例えばポリメラーゼ連鎖反応法に基づくＱＴ−ＮＡＳＢＡ（リアルタイム定量核酸配列増幅法）などは、まだ発展途上である。そのため、軽度の寄生虫血症を現場で検出することのできる、高感度で簡便（ローテク）な診断ツールの開発が所望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
すなわち、マラリアの原因となる各プラスモジウム属種を迅速かつ高精度に検出・識別することのできる試薬および方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えばハイブリダイゼーションアッセイ等により、プラスモジウム属（Plasmodium）の異なる寄生種を検出・識別する核酸プローブに関する。すなわち、本発明の第１の構成は、ハイブリダイゼーションアッセイでプラスモジウム属（Plasmodium）を検出するためのプローブとして使用可能な核酸断片に関する。本発明には、さらに、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）と三日熱マラリア原虫（P. vivax）と四日熱マラリア原虫（P. malariae）と卵形マラリア原虫（P. ovale）とを識別可能なプローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ）が含まれる。本発明において「識別(discriminates between)」という用語（またはこれに似た用語）は、本発明にかかるプローブが、ある寄生種からの核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）等）に対して他の３種類の寄生種よりも有利に結合することを意味する。
【０００８】
本発明にかかるプローブは、試料中で、プラスモジウム属（Plasmodium）の特定の種を、プラスモジウム属（Plasmodium）のそれ以外の種に対して有意な交差反応を示すことなく検出することができる。この点に関して、プラスモジウム属（Plasmodium）の各種を検出するうえでの本発明にかかるプローブの交差反応率は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、または約２％未満である。
【０００９】
本発明の他の構成は、［配列番号：１］〜［配列番号：４］で表される少なくとも１つのプローブにおける少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１３個、さらに好ましくは少なくとも１５個、の連続したヌクレオチドから選択された配列；［配列番号：１］〜［配列番号：４］で表される少なくとも１つのプローブにおける全配列；またはこれらに対する部分長もしくは完全長の相補的な配列を含む、核酸断片に関する。
【００１０】
本発明のさらなる他の構成は、試料中のプラスモジウム属（Plasmodium）の有無を検出する方法に関する。この方法では、試料と、核酸断片とを、当該核酸断片がプラスモジウム属（Plasmodium）の核酸にハイブリダイズ可能な条件下で接触させる。前記核酸断片は、ＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１もしくはＰＯ１から選択された配列、好ましくはＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１もしくはＰＯ１における少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも１３個、なおいっそう好ましくは少なくとも１５個、の連続したヌクレオチドから選択された配列、ＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１もしくはＰＯ１の全配列、これらに対する部分長もしくは完全長の相補的な配列、これらに対する部分長もしくは完全長の相補的な配列から選択されたプローブ、またはこれらの任意の組合せを含む。そして、前記試料中のプラスモジウム属（Plasmodium）の核酸に結合する前記核酸断片が検出されれば、これは、前記試料中にプラスモジウム属（Plasmodium）が存在することを示す指標となる。既述したプラスモジウム属（Plasmodium）の４種を識別する本発明にかかるプローブで検出が得られるということは、プラスモジウム属（Plasmodium）の特定の種が存在することを指す。
【００１１】
本発明の具体的な一構成として、試料中のプラスモジウム属（Plasmodium）の有無を検出する方法であって、ハイブリダイゼーションアッセイにより、前記試料と、プラスモジウム属（Plasmodium）の各種を識別してプラスモジウム属（Plasmodium）を検出するプローブとを、当該プローブがプラスモジウム属（Plasmodium）の核酸にハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップと；前記試料中のプラスモジウム属（Plasmodium）の前記核酸に結合した前記プローブを、前記試料中にプラスモジウム属（Plasmodium）が存在することを示す指標として検出するステップと；を含む、プラスモジウム属（Plasmodium）の検出方法が挙げられる。
【００１２】
上記の実施形態において、核酸断片は、プローブＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１もしくはＰＯ１における少なくとも５個の連続したヌクレオチドから選択された配列、またはこれらに対する完全長の相補的な配列を含む。
【００１３】
本発明には、さらに、ＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１およびＰＯ１からなる群から選択されたプローブにおける少なくとも１０個の連続したヌクレオチドから選択された配列、少なくとも１３個の連続したヌクレオチドから選択された配列もしくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチドから選択された配列、またはこれらに対する完全長の相補的な配列を含む核酸断片が包含される。
【００１４】
本発明には、さらに、ＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１およびＰＯ１からなる群から選択されたプローブの全配列、またはこれらに対する完全長の相補的な配列を含む核酸断片が包含される。
【００１５】
本発明の具体的な一構成として、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）と三日熱マラリア原虫（P. vivax）と四日熱マラリア原虫（P. malariae）と卵形マラリア原虫（P. ovale）とを識別するための核酸プローブを選択する方法であって、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および卵形マラリア原虫（P. ovale）に由来する核酸における少なくとも５個のヌクレオチドの配列に対応（相当）する核酸断片もしくはポリペプチド核酸（ＰＮＡ）、または当該配列に対して相補的な核酸断片もしくはポリペプチド核酸（ＰＮＡ）を用意（調製）するステップと；プローブの、ハイブリダイゼーションアッセイによりプラスモジウム属（Plasmodium）の少なくとも１つの種を検出する能力を比較するステップと；プラスモジウム属（Plasmodium）の前記４種のうちの１種、２種もしくは３種を検出するが４種全ては検出しない少なくとも１つのプローブを選択するステップと；を含む、マラリア原虫を識別可能な核酸プローブの選択方法も挙げられる。
【００１６】
本発明には、さらに、試料中の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）と三日熱マラリア原虫（P. vivax）と四日熱マラリア原虫（P. malariae）と卵形マラリア原虫（P. ovale）とを検出・区別（判別）する方法であって、ｉ）試料、例えばマラリアへの感染が疑われる対象（subject）に由来する試料、およびｉｉ）熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）と三日熱マラリア原虫（P. vivax）と四日熱マラリア原虫（P. malariae）と卵形マラリア原虫（P. ovale）とを検出・区別（判別）するのに適した核酸を含むプローブを用意（調製）するステップと；前記試料と、前記プローブとを、当該プローブがターゲットにハイブリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと；前記試料中の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および卵形マラリア原虫（P. ovale）の有無を判定するステップと；を含む、マラリア原虫の検出・区別（判別）方法が包含される。
【００１７】
既述した任意の実施形態において、少なくとも１つのプローブは、本明細書に開示した任意のヌクレオチド配列の全配列であってもよいし、これらに対して相補的な相補鎖であってもよいし、あるいは、本明細書に開示した任意のプローブにおける少なくとも５個の連続したヌクレオチドに対して相補的な配列、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドに対して相補的な配列、少なくとも１３個の連続したヌクレオチドに対して相補的な配列、または少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに対して相補的な配列であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、例えばハイブリダイゼーションアッセイ等により、プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物（例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P. ovale）等）を検出する核酸プローブに関する。本発明にかかるプローブは、生体試料中のプラスモジウム属（Plasmodium）の有無を検出する方法にも使用可能である。このような方法では、ハイブリダイゼーションアッセイにより、生体試料または検体［例えば、全血、脳脊髄液（ＣＳＦ）、組織試料、またはプラスモジウム属（Plasmodium）の原虫を有すると疑われるその他のあらゆる生体試料］と本発明にかかるプローブとを接触させ、試料中で核酸に結合したプローブが検出されれば、これは、当該試料中にプラスモジウム属（Plasmodium）が存在することを示す指標となる。
【００１９】
本発明にかかるプローブは、例えば、以下のようにして特定可能である：
【００２０】
（例Ａ）
（１）熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に由来する核酸における少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチドまたは少なくとも１５個のヌクレオチドで構成される配列に対応（相当）するかまたは当該配列に対して相補的な、核酸断片（ＤＮＡ、ＲＮＡ）（すなわち、プローブ）またはポリペプチド核酸（ＰＮＡ）（すなわち、プローブ）を用意（調製）し、（２）そのプローブが、ハイブリダイゼーションアッセイによりプラスモジウム属（Plasmodium）の各種を検出する能力を比較することにより、本発明にかかるプローブを特定してもよい。本発明には、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に対するハイブリダイゼーションが、それ以外の３種に対するハイブリダイゼーションよりも有利なプローブが含まれる。
【００２１】
（例Ｂ）
（１）三日熱マラリア原虫（P. vivax）に由来する核酸における少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチドまたは少なくとも１５個のヌクレオチドで構成される配列に対応（相当）するかまたは当該配列に対して相補的な、核酸断片（ＤＮＡ、ＲＮＡ）（すなわち、プローブ）またはＰＮＡ（すなわち、プローブ）を用意（調製）し、（２）そのプローブが、ハイブリダイゼーションアッセイによりプラスモジウム属（Plasmodium）の各種を検出する能力を比較することにより、本発明にかかるプローブを特定してもよい。本発明には、三日熱マラリア原虫（P. vivax）に対するハイブリダイゼーションが、それ以外の３種に対するハイブリダイゼーションよりも有利なプローブが含まれる。
【００２２】
（例Ｃ）
（１）四日熱マラリア原虫（P. malariae）に由来する核酸における少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチドまたは少なくとも１５個のヌクレオチドで構成される配列に対応（相当）するかまたは当該配列に対して相補的な、核酸断片（ＤＮＡ、ＲＮＡ）（すなわち、プローブ）またはＰＮＡ（すなわち、プローブ）を用意（調製）し、（２）そのプローブが、ハイブリダイゼーションアッセイによりプラスモジウム属（Plasmodium）の各種を検出する能力を比較することにより、本発明にかかるプローブを特定してもよい。本発明には、四日熱マラリア原虫（P. malariae）に対するハイブリダイゼーションが、それ以外の３種に対するハイブリダイゼーションよりも有利なプローブが含まれる。
【００２３】
（例Ｄ）
（１）卵形マラリア原虫（P. ovale）に由来する核酸における少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチドまたは少なくとも１５個のヌクレオチドで構成される配列に対応（相当）するかまたは当該配列に対して相補的な、核酸断片（ＤＮＡ、ＲＮＡ）（すなわち、プローブ）またはＰＮＡ（すなわち、プローブ）を用意（調製）し、（２）そのプローブが、ハイブリダイゼーションアッセイによりプラスモジウム属（Plasmodium）の各種を検出する能力を比較することにより、本発明にかかるプローブを特定してもよい。本発明には、卵形マラリア原虫（P. ovale）に対するハイブリダイゼーションが、それ以外の３種に対するハイブリダイゼーションよりも有利なプローブが含まれる。
【００２４】
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の核酸、三日熱マラリア原虫（P. vivax）の核酸、四日熱マラリア原虫（P. malariae）の核酸、および卵形マラリア原虫（P. ovale）の核酸は、当該技術分野において一般的な核酸単離方法を用いて、感染者の生体試料（例えば、全血、骨髄、ＣＳＦ）から得ることができる。また、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）（三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、および卵形マラリア原虫（P. ovale））は、培養で得ることもできる。例えば、プラスモジウム属（Plasmodium）のリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡは、感染患者の全血試料から調製されたＤＮＡを、本明細書に記載された方法およびプライマーや当該技術分野において既知の方法およびプライマーを用いてＰＣＲ増幅して得ることもできる。
【００２５】
プローブを特定するうえで、プラスモジウム属（Plasmodium）におけるあらゆる配列（例えば、５８  リボソームＲＮＡをコードする配列、５．８Ｓ  リボソームＲＮＡをコードする配列、１８Ｓ  リボソームＲＮＡをコードする配列、２８Ｓ  リボソームＲＮＡをコードする配列等）を候補配列として選択してもよい。好ましい配列として、系統学的な比較により、ヒトに寄生しないプラスモジウム属（Plasmodium）における類似配列（analogous sequence）または他の寄生原虫（例えば、バベシア（Babesia）属、タイレリア（Theileria）属など）における類似配列から派生する配列が挙げられる。本発明にかかる核酸プローブは、少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチドまたは少なくとも１５個のヌクレオチドに相当する長さを有し、また、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡプローブ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡプローブ）、ペプチド核酸（ＰＮＡプローブ）、これらの組合せ、またはこれらの改変物を含み得る。本発明にかかるプローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また、当該技術分野において利用可能な多数の一般的な方法のうちの任意の方法で作製可能である。例えば、本発明にかかるプローブは、化学合成、制限酵素を用いたベクター（例えば、プローブに対応する配列を有するプラスミド等）の消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、プローブに対応する配列を有するベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写等で作製可能である［例えば、参照をもって本明細書に取り入れたものとする、Ausubelらの著書“Current Protocols in Molecular Biology”（ニューヨーク州ニューヨーク、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社）（1994年）を参照されたい］。本発明にかかるプローブは、合成中または合成後に標識してもよい。例えば、本発明にかかるプローブの合成中に、標識（例えば、放射性同位体（例えば、Ｐ３２、Ｓ３５、Ｈ３等）、ビオチン、ジゴキシゲニン等）を付けたヌクレオチドを組み込んでもよい。ビオチンを有するプローブは、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン等）や酵素（例えば、アルカリホスフォターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等）などの検出可能な標識を付した二次試薬（例えば、アビジン、ストレプトアビジン等）によって検出可能である。同様に、ジゴキシゲニンを有するプローブは、標識を付した抗ジゴキシゲニン抗体によって検出可能である。また、本発明にかかるプローブを、その合成後に、例えばニックトランスレーション法や、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等を用いた一般的な方法によって標識してもよい（例えば、上記のAusubelらの著書を参照されたい）。本発明にかかるプローブは、プローブの安定性を向上するように修飾されたヌクレオチドを含むものであってもよい。例えば、本発明にかかるプローブは、２’−Ｏ−アルキル基が付加したリボース残基を有するリボヌクレオチドを含むものであってもよい。また、本発明にかかるプローブには、プローブを固体担体に捕捉され易くするための修飾部位が含まれていてもよい。例えば、本発明にかかるプローブを固体担体（例えば、ポリ−ｄＴまたはポリ−ｄＣで���識された磁気粒子等）に結合し易くするために、当該プローブの３’末端に、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、ポリ−ｄＡテールまたはポリ−デアザ−グアノシンテールを付加してもよい。また、本発明にかかるプローブを、使用に先立って、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の一般的な方法を用いて精製してもよい（例えば、上記のAusubelらの著書を参照されたい）。本発明にかかるプローブを用いて試料中のプラスモジウム属（Plasmodium）の有無を検出するにあたっては、一般的なハイブリダイゼーションアッセイ法のどれを利用してもよい。例えば、サザンブロット法、ドットブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、バイオセンサまたはデュアルプローブを用いたリアルタイムハイブリダイゼーション検出法、サンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイ法等を利用してもよい［例えば、参照をもって本明細書に取り入れたものとする、米国特許出願第07/826,657号明細書（現在の米国特許第5,519,127号明細書）および米国特許第5,629,156号明細書（国際公報WO94/10335パンフレット）を参照されたい］。変形例として、本発明にかかるプローブを、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ法のプライマーに使用してもよい（例えば、上記のAusubelらの著書を参照されたい）。本発明にかかるプローブおよび方法を用いて分析可能な生体試料には、全血、ＣＳＦ、骨髄、および組織試料（例えば、脾臓の組織試料）が含まれる。核酸を一般的な方法を用いて試料から抽出し（細胞をそのままの状態で維持するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法の場合には必要ない）、これを既述のアッセイ法により本発明にかかるプローブを用いて分析する。アッセイでは、単一のプローブまたは複数のプローブの組合せを使用してもよい。本発明にかかるプローブで使用するハイブリダイゼーション条件（例えば、本発明にかかる方法で使用するハイブリダイゼーション条件）としては、例えば、約３０〜約５０％ホルムアミドで温度約２５℃〜約４２℃の範囲、またはＧｕＳＣＮ（チオシアン酸グアニジン）とホルムアミドとの混合溶液で温度約２５℃〜約３７℃の範囲が用いられる。「当該技術分野において常識」であるが、ハイブリダイゼーション条件の選択は、プローブの長さおよびヌクレオチド含有量（すなわち、ＡＴ含有量に対するＧＣ含有量）に依存する。したがって、ハイブリダイゼーション条件は、これらのファクタを考慮して調節してもよい。また、異なる塩（例えば、ＮａＣｌの代わりにチオシアン酸グアニジンまたは塩酸グアニジン）や、異なる変性剤（例えば、ＮＰ−４０、ドデシル硫酸ナトリウム等）を使用する場合には、塩濃度および温度の調節が必要になり得るが、当業者であれば容易になし得る。
【００２６】
本発明において利用可能なハイブリダイゼーション条件として、本発明を限定しない次のような例が挙げられる。サザンブロット解析の場合、次のようなハイブリダイゼーション条件を利用してもよい：約４２℃で３０％〜５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）。ハイブリダイゼーション後は、一般的な方法を用いてフィルタを洗浄する。例えば、約２５℃の２×ＳＳＣ〜０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）での１５分間のハイブリダイゼーション後洗浄を３回実行して、結合しなかったプローブを除去してもよい。ＲＮＡブロット法の場合、約３０％ホルムアミドを用いて室温で一晩のハイブリダイゼーションを実行した。プローブの過剰分については、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳでの１５分間の洗浄を３回実行することにより除去した。
【００２７】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、互いに相補的な核酸同士の対形成のことを指す。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸同士の会合強度）は、核酸同士の相補性の程度、関与する条件のストリンジェント度、形成されるハイブリッドのＴｍ、核酸内のＧ−Ｃ率等のファクタに影響される。単一の分子が、自身の構造内に相補的な核酸間の対を形成している場合、その分子は「自己ハイブリダイズ」したと称される。
【００２８】
また、周知のとおり、適切なハイブリダイゼーション条件には、それと等価的な条件がほかにも多数存在する。プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、ターゲットの性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在しているか、それとも固定されているか等）および塩やその他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール等の有無）など、様々なファクタを考慮したうえでハイブリダイゼーション溶液を調節し、既述した条件とは異なるが当該条件と等価的である、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を生成してもよい。また、当業者であれば、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーション温度および／または洗浄温度の上昇、ハイブリダイゼーション溶液に対するホルムアミドの添加等）を理解している。
【００２９】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いる場合、米国特許第6,165,723号明細書および米国特許出願第11/494,430号明細書（いずれも、参照をもって本明細書に取り入れたものとする）に記載された次のような条件を利用してもよい：ＧｕＳＣＮ（プローブの配列に応じて１．５〜３．５Ｍ）溶液で室温ないし約３７℃、またはＧｕＳＣＮとホルムアミドとの混合溶液で室温ないし約３７℃を３０分〜１時間実行し、ＳＳＣ（２×ないし０．１×）＋０．１％ＳＤＳで洗浄する。
【００３０】
本発明で使用するのに適した蛍光マーカー（色素）には、例えば、アレクサ４８８、ローダミン、テキサスレッド、フルオレセイン、オレゴングリーン、トーキョーグリーン、あるいは、本願発明がなされた時点で当業者に知られていたその他の適切な蛍光マーカーが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【実施例】
【００３１】
特に述べるまでもなく、当業者であれば、本明細書を参酌することにより、本発明を最大限に実施することができると思われる。よって、下記の具体的な実施例はあくまでも例示に過ぎず、当該実施例以外の部分の開示内容を限定するものではない。
【００３２】
（熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、および卵形マラリア原虫（P. ovale）に対する、プローブＰＦ４、プローブＰＶ１、プローブＰＭ１およびプローブＰＯ１のハイブリダイゼーション）
【００３３】
後述の表１にドットブロット解析データを示す。ドットブロット法のプロトコルおよびドットブロット解析は当該技術分野において公知である。例えば、Brown, T.による“Dot and Slot Blotting DNA”Curr. Protoc. Mol. Biol., 2001 May; Chapter 2:Unit2.9Bおよびその引用文献を参照されたい。本実施例では、プラスモジウム属（Plasmodium）の各種ごとに、その１８Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含ませたプラスミド約０．１μｇを調製し、これをスポットに使用した。各ブロットに対し、ジゴキシゲニンで標識したプローブを、既述したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせた。
【００３４】
他の実施例では、本発明にかかる少なくとも１つのプローブを検出するにあたって、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法を利用してもよい。ＦＩＳＨ法は、当業者にとって周知の技術である。例えば、VolpiおよびBridgerらによる“FISH glossary: An Overview of the Fluorescence in situ Hybridization Technique”Biotechniques, 2008 Oct;45(4):385-6, 388, 390 passimおよびその引用文献を参照されたい。
【００３５】
本実施例では、ドットブロットアッセイ法を利用した。ＲＮＡドットブロットとして、ＲＮＡを合成し、６×ＳＳＣ０．１μｇを用いて、ニトロセルロース膜にスポットを形成した。ホルムアミド中で、ジゴキシゲニンで標識したプローブにより、室温で一晩ハイブリダイゼーションを実行した。この方法により、プラスモジウム属（Plasmodium）の各種と各プローブとのハイブリダイゼーション信号を比較した。
【００３６】
（プラスモジウム属（Plasmodium）１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ）
本発明にかかるプラスモジウム属（Plasmodium）に特異的なプローブは、ＰＶ１、ＰＦ４、ＰＭ１およびＰＯ１から選択されたプローブの配列、またはこれに対する完全長の相補的な配列を有し得る。
【００３７】
（三日熱マラリア原虫（P. vivax）に特異的なプローブ）
ＰＶ１  5’-AGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACGAAGTATC-3’（配列番号：１）
【００３８】
（熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に特異的なプローブ）
ＰＦ４  5’-TTACAAAACCAAAAATTGGCCTTGCATTGTTATTT-3’（配列番号：２）
【００３９】
（四日熱マラリア原虫（P. malariae）に特異的なプローブ）
ＰＭ１  5’-GAAACACTCATATATAAGAATGTCTC-3’（配列番号：３）
【００４０】
（卵形マラリア原虫（P. ovale）に特異的なプローブ）
ＰＯ１  5’-AATTTCCCCGAAAGGAATTTTC-3’（配列番号：４）
【００４１】
【表１】
2013509186.tif 000002
【００４２】
当業者であれば、以上の説明から本発明の重要な特徴を容易に導き出すことができ、本発明の精神および範疇を逸脱することなく、各種用途および条件に応じて本発明の様々な変更および変形を実施することができるであろう。すなわち、本明細書で説明した以外の実施形態および実施例も特許請求の範囲に包含される。
【配列表】
2013509186000001.app
【国際調査報告】
2013509186.tif 000003
2013509186.tif 000004