(57)【要約】【課題】化学式１で表される化合物１、シタグリプチン(Sitagliption)、ビルダグリプチン(vildagliptin)、リナグリプチン(linagliptin)またはこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる活性成分を含有する、非アルコール性脂肪肝疾患（Non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）の予防または治療用薬学的組成物を提供する。【解決手段】また、本発明は、化学式１で表される化合物１、シタグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチンまたはこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれた活性成分の有効量を、非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防を必要とするヒトを含む哺乳類に投与し、前記疾患を予防または治療する方法を提供する。さらに、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を製造するための、化学式１で表される化合物１、シタグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチンまたはこれらの薬学的に許容される塩の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表される化合物１、シタグリプチン(Sitagliption)、ビルダグリプチン(vildagliptin)、リナグリプチン(linagliptin)またはこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる活性成分を含有する、非アルコール性脂肪肝疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【化１】
2013522359.tif 000012
【請求項２】
活性成分が、前記化学式１で表される化合物１またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
活性成分が前記化学式１の酒石酸塩である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
活性成分がシタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
活性成分がシタグリプチンリン酸塩である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
活性成分がビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
活性成分がリナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、 請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
非アルコール性脂肪肝疾患が高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
非アルコール性脂肪肝疾患が単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症及び肝硬変よりなる群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
下記化学式１で表される化合物１、シタグリプチン(Sitagliption)、ビルダグリプチン(vildagliptin)、リナグリプチン(linagliptin)またはこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれた活性成分の有効量を、非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防を必要とするヒトを含む哺乳類に投与し、前記疾患を予防または治療する方法。
【化２】
2013522359.tif 000013
【請求項１１】
活性成分が、前記化学式１で表される化合物１またはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
活性成分が前記化学式１の酒石酸塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
活性成分がシタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
活性成分がシタグリプチンリン酸塩である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
活性成分がビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
活性成分がリナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、 請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
非アルコール性脂肪肝疾患が高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
非アルコール性脂肪肝疾患が単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症及び肝硬変よりなる群から選ばれる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
非アルコール性脂肪肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を製造するための、化学式１で表される化合物１、シタグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチンまたはこれらの薬学的に許容される塩の使用。
【化３】
2013522359.tif 000014
【請求項２０】
活性成分が、化学式１で表される化合物１またはその薬学的に許容される塩である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
活性成分が化合物１の酒石酸塩である、請求項２０に記載の使用。  
【請求項２２】
活性成分がシタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
活性成分がシタグリプチンリン酸塩である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
活性成分がビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２５】
活性成分がリナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、 請求項１９に記載の使用。
【請求項２６】
非アルコール性脂肪肝疾患が高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
非アルコール性脂肪肝疾患が単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症及び肝硬変よりなる群から選ばれる、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の予防または治療用薬学的組成物、及び脂肪肝疾患の予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、過量のアルコールを摂取していない患者で炎症反応を伴わない単純脂肪症、及びこれにより進展し、肝細胞の炎症反応(hepatocellular inflammation)を示す非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis、ＮＡＳＨ）、肝線維症並びに肝硬変を含む広い範囲の疾患を意味し、従前から使用されていた非アルコール性脂肪肝炎(Ludwig J et al., Mayo Clin Proc 1980, 55(7):434-438)と比較して広義の概念である。
【０００３】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤｓ）は、原因によって原発性ＮＡＦＬＤ(primary NAFLD)と続発性ＮＡＦＬＤ(secondary NAFLD)に分けられるが、原発性のものは代謝症候群(metabolic syndrome)の特徴である高脂血、糖尿病、または肥満などによって発生し、続発性のものは栄養的原因（急激な体重減少、飢餓、腸迂回術）、多様な薬物（グルココルチコイド(glucocorticoids)、エストロゲン(estrogens)、タモキシフェン(tamoxifen)、メトトレキサート(methotrexate)、ジドブジン(zidovudine)、アミオダロン(amiodarone)、テトラサイクリン(tetracycline)、ジダノシン(didanosine)、コカイン(cocaine)、ジルチアゼム(diltiazem)、ペルヘキシリン(perhexiline)）、毒性物質（毒キノコ、細菌毒素）、代謝性原因（リポジストロフィー(lipodystrophy)、異常βリポタンパク血症(dysbetalipoporoteinemia)、ウェーバークリスチャン症候群(Weber-Christian syndrome)、ウォルマン病(Wolman's disease)、妊娠性急性脂肪肝(acute fatty liver of pregnancy)、ライ症候群(Reye's syndrome)）、及びその他の要因（炎症性腸疾患(inflammatory bowel syndrome)、ＡＩＤＳ感染(HIV infection)）によって発生することが知られている(Admas LA et al., CMAJ 2005, 172(7): 899-905)。原発性のものの主要因である代謝症候群の重要な特徴である糖尿病及び肥満に関連した非アルコール性脂肪肝疾患の発生率は、糖尿病患者の約５０％、肥満患者の約７６％、肥満糖尿病患者のほぼ大部分であることが知られている(Gupte P et al., J Gastroenterol Hepatol 2004, 19(8):854-858)。また、アラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ＡＬＴ）値の上昇が見られる糖尿病及び肥満患者に対して肝生検を行った結果、脂肪肝炎の発生率は１８〜３６％であり(Braillon A et al., Gut 1985, 26(2):133-139)、脂肪肝炎がインスリン抵抗性(insulin resistance)によって発生することが知られている。また、糖尿病、肥満及び高脂血症を伴う脂肪肝炎患者における肝硬変への進行比率は疾病の調査期間によって異なるが、３〜１１年の調査期間内に脂肪肝炎から肝硬変に進展した患者の比率は４〜２６％であると報告されており、一般集団群に比べて致死率が高いことが報告されている(Powell EE et al., Hepatology 1990, 11(1):74-80, Bacon BR et al., Gastroenterology 1994, 107(4):1103-1109, Matteoni CA et al., Gastroenterology 1999, 116(6):1413-1419)。
【０００４】
非アルコール性脂肪肝疾患に直接関連するトリグリセリドの肝蓄積及びこれによる肝細胞の損傷(hepatocellular damage)は、局所因子、及びインスリン抵抗性などの全身性因子の変化による脂質の肝臓への流入／生成と、放出／酸化の不均衡によって引き起こされ得ることが知られている。すなわち、インスリン抵抗性に起因するインスリン高血症(hyperinsulinemia)によって、肝細胞(hepatocyte)のミトコンドリア(mitochondria)が酸化できる量を超える脂肪酸が肝臓に流入した結果(Reid AE. Gastroenterology 2001, 121(3): 710-723)、肝臓にトリグリセリドが蓄積されることが知られている。また、インスリン抵抗性によって脂肪合成転写因子(lipogenic transcription factor)としてのＰＰＡＲ−γ(peroxisome proliferator-activiated receptor-gamma)及びＳＲＥＢＰ−１ｃ(sterol regulatory element binding protein-1c)の発現が増加(up-regulation)し、肝の脂肪新生合成(de novo hepatic lipogenesis)が増加した結果、トリグリセリドが蓄積することもある(Fromenty B et al., Diabetes Metab 2004, 30(2):121-138)。
【０００５】
肝臓において、脂肪は超低密度リポタンパク質（very low density lipoprotein、ＶＬＤＬ）の形で血中に放出されるが、超低密度リポタンパク質はトリグリセリドとアポリポプロテインＢ(apolipoprotein B)（ａｐｏ Ｂ）とを結合させるミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（microsomal triglyceride transfer protein、ＭＴＰ）によって形成される。インスリン抵抗性によって脂肪組織における脂肪分解が増加し、その結果、血中脂肪酸が増加する。続いて、ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質の活性及びａｐｏ Ｂ合成の減少が、肝臓の脂肪放出を減少させ、トリグリセリドの蓄積を引き起こす(Namikawa C et al., J Hepatol 2004, 40(5):781-786)。インスリン抵抗性が非アルコール性脂肪肝疾患の原因として特に重要であるのは、糖尿病、肥満、高脂血を特徴とする代謝症候群と非アルコール性脂肪肝との間に高い相関関係があるためである。脂肪が蓄積された肝臓は、二次的な損傷を受けやすく、肝細胞の炎症及び線維化へと進行することになる。
【０００６】
そのような二次的な損傷は、腫瘍壊死因子−α（tumor necrosis factor-alpha、ＴＮＦ−α）、レプチン(leptin)、アディポネクチン(adiponectin)を含む多様なアディポカイン(adipocytokine)、酸化的ストレス(oxidative stress)、脂質過酸化(lipid peroxidation)、及び増加した脂肪酸(Hui JM et al., Hepatology 2004, 40(1):46-54)によって発生し、空腸回腸迂回術(jejunoileal bypass surgery)を施された患者の場合には、腸に由来する細菌の内毒素(gut-derived bacterial endotoxin)によって発生する(Day CP and James OF. Gastroenterology 1998, 114(4):842-845)。
【０００７】
肝損傷及び類洞周囲の線維化(perisinusoidal fibrosis)の進行により脂肪滴が沈着した肝細胞は、微細血管の血流を阻害し、続いて酸素及び栄養分の交換を減少させ、微細血管性炎症反応を引き起こす(Magalotti D et al., Dig Liver Dis 2004, 36(6):406-411)。また、血中フェリチン(ferritin)値及び鉄イオン(iron)値が脂肪肝炎患者で増加するが、増加した鉄イオン、腫瘍成長因子−β１（tumor growth factor-β1、ＴＧＦ−β１）及びサイトカインにより肝星細胞(hepatic stellate cell)及びコラーゲン(collagen)合成が活性化され、肝線維症及び肝硬変へと進展する(Pietrangelo A et al., Hepatology 1994, 19(3):714-721)。
【０００８】
一方、最近では、非アルコール性脂肪肝疾患が動脈硬化(artherosclerosis)を含む心血管疾患（cardiovascular disease、ＣＶＤ）、脳血管疾患(Francazani A et al., Am J Med 2008, 121:72-78)、微細血管疾患、腎症(nephropathy)、及び網膜症(retinopathy)(Targher G et al., Diabetologia 2008; 51(3):444-450)、多嚢胞性卵巣症候群（polycystic ovarian syndrome 、ＰＣＯＳ）(Targher G et al., Atherosclerosis 2007, 191:235-240, Cerda C et al., J Hepatol 2007, 47:412-417)、または閉塞性睡眠時無呼吸症（obstructive sleep anpea、ＯＳＡ）(Tanne F et al., Hepatology 2005, 41:1290-1296)などの疾患に関連していることが報告されている。
【０００９】
現在に至るまで、非アルコール性脂肪肝疾患に対する治療法は確立されていないが、非アルコール性脂肪肝疾患の発症が、糖尿病、肥満、冠状動脈疾患、座る習慣などの多様な要因に関連しているためである。肥満は非アルコール性脂肪肝疾患の治療において重要なターゲットであるが、体重の減少により、肝損傷の危険因子であるインスリン抵抗性に関連する因子、肝臓に流入する脂肪酸量、及び炎症性または線維化性アディポカイン(adipokine)の減少を誘導することができるためである。食事制限及び運動による体重の減少によりアラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ＡＬＴ）値及び肝臓のトリグリセリド含量が減少し得るが、壊死性炎症または肝線維症を有する患者の場合、体重の減少によるＡＬＴ値及び肝臓のトリグリセリド含量の改善は殆ど知られていない(Harrison SA et al., Gut 2007, 56:1760-1769)。食事性飽和脂肪の摂取は、肝臓のトリグリセリド量及びインスリン抵抗性との関連性が高いため(Westerbacka J et al., J Clin Endocrinol Metab 2005, 2804-2809)、食事制限は非常に重要であり、体重の減量及びインスリン抵抗性の改善のための運動が、組織学的に脂肪肝を改善することが知られている(Ueno T et al., J Hepatol 1997, 27:103-110)。
【００１０】
小腸のリパーゼ阻害剤(lipase inhibitor)であって経口用肥満治療剤として使われているオリスタット(orlistat)の場合、脂肪肝炎患者で肝臓の組織学的向上を誘導したという報告があるが(Hussein O et al., Dig Dis Sci 2007, 52:2512-2519)、このような組織学的向上が体重の減少によるものか、他のメカニズムによるものかについては明らかではない。
【００１１】
第２型糖尿病及びインスリン抵抗性が肝臓の炎症及び線維化に関与することが知られているが(Adachi M et al., Gastroenterology 2007, 132:1434-1446)、非アルコール性脂肪肝疾患を示す第２型糖尿病患者にメトホルミン(metformin)を投与する場合、血液検査及び核磁気共鳴画像法上、脂肪肝の改善は明らかではなかった。ところが、糖尿病を伴わない非アルコール性脂肪肝患者に１年間メトホルミンを投与した結果、ビタミンＥ(vitamin E)または体重減少薬物投与群と比較して、血中肝酵素値と肝臓の壊死性炎症及び線維化が減少したという報告がある(Bugianesi E et al., Am J Gastroenterol 2005, 100:1082-1090)。
【００１２】
チアゾリジンジオン(Thiazolidinedione、ＴＺＤ)系の薬物は、ＰＰＡＲ−γ作用物質(agonist)であり、インスリン感受性(insulin sensitivity)を改善し、肝臓及び筋肉における脂肪蓄積を抑制するうえ、脂肪細胞において抗炎症及び抗線維化性作用を示すアディポカイン(adipokine)の分泌を増加させる。ＴＺＤ系の薬物は非アルコール性脂肪肝疾患の動物モデルにおいて、肝臓に対して直接的な抗線維化作用を示すと報告されたことがある(Galli A et al., Gastroenterology 2002, 122:1924-1940)。
【００１３】
第２世代ＴＺＤ薬物であるピオグリタゾン(pioglitazone)の場合、脂肪肝炎患者において、脂肪肝を改善し且つ炎症反応及び壊死反応を有意に改善することが報告されたが(Belfort R et al., N Engl J Med 2006, 355:2297-2307)、脂肪肝炎患者への薬物投与を中断すると、脂肪肝及び炎症が悪化してしまうという欠点がある(Lutchman G et al., Hepatology 2007, 46:424-429)。
【００１４】
脂質異常症(dyslipidemia)は非アルコール性脂肪肝疾患と関連する。高トリグリセリド血症(hypertriglyceridemia)は非アルコール性脂肪肝患者の２０〜８０％に見られ、血中トリグリセリド低下薬であるフィブラート(fibrate)系の薬物が治療に有用である。フィブラート系の薬物は、ＰＰＡＲ−α受容体作用物質であり、脂肪肝炎の動物モデルにおける薬効が検証された (Ip E et al., Hepatology 2004, 39:1286-1296)。ところが、臨床試験において、フィブラート系の薬物の一つであるクロフィブラート(clofibrate)が、肝酵素値及び組織学的病変に効果を有しないことが報告された (Laurin J et al., Hepatology 1996, 23:1464-1467)。
【００１５】
コレステロール低下物質である３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡ(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA)還元酵素阻害剤(HMG CoA reductase inhibitor)の作用を有するスタチン(statin)系の薬物の場合、非アルコール性脂肪肝疾患患者における効果は未だ確立されていないが、第２型糖尿病患者及び心血管疾患の危険因子を有する患者に安全に処方できるという利点がある。ところが、スタチン系の薬物の肝毒性(hepatotoxicity)は、血中アラニンアミノトランスフェラーゼ(alanine aminotransferase)の増加を不都合なほどに誘導し得る (Browning J et al., Hepatology 2006, 44:466-471)。
【００１６】
高血圧治療剤の場合は、肝線維症及び脂肪肝炎を示す動物モデルにおいてα受容体遮断剤(alpha-blocker)が薬効を示し (Hirose A et al., Hepatology 2007, 45:1375-1381)、臨床試験では、脂肪肝炎患者において肝線維症の血清因子を減少させ、インスリン感受性向上効果を奏し、その治療可能性を示している(Ichikawa Y et al., Intern Med 2007, 46:1331-1336)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
そこで、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（Non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）の予防または治療用薬学的組成物、及びこれを用いた治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、下記化学式１、２、３、４で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を活性成分(active ingredient)として含有する、非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防用薬学的組成物に関する。
【００１９】
化学式１で表される化合物１は、（（Ｒ）−４−［（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）−ブタノイル］−３−（ｔ−ブトキシメチル）ピペラジン−２−オン）であり、韓国特許出願第２００８−００３６０５２号にて開示されている。
【００２０】
化学式２で表される化合物２は、シタグリプチン(sitagliptin)であり、Ｊａｎｕｖｉａという商標で市販されており、化学式３で表される化合物３は、ビルダグリプチン(vildagliptin)であり、Ｇｌａｖｕｓという商標で市販されており、化学式４で表される化合物４は、リナグリプチン(linagliptin)として知られている。
【００２１】
【化１】
2013522359.tif 000002
【００２２】
【化２】
2013522359.tif 000003
【００２３】
【化３】
2013522359.tif 000004
【００２４】
【化４】
2013522359.tif 000005
【００２５】
本発明の化学式１〜４は、公知の方法によって製造して使用してもよく、市販するもの（例えば、ビルダグリプチン(vildagliptin)はＴｒａｄｅｍａｘ社（中国）から販売されるもの）を使用してもよい。
【００２６】
前記化学式１または２に示すように、化合物１または２はβ炭素とピペラジノンの３位の炭素に非対称中心を有することができ、単一鏡像異性体、単一ジアステレオ異性体、ラセミ体、またはジアステレオ異性体の混合物は、本発明の化学式１または２の化合物１または２に含まれ得る。また、本発明の化学式１または２の化合物１または２は、互変異性体(tautomer)としても存在し得る。さらに、それぞれの互変異性体だけでなく、それらの混合物も本発明の化合物１または２に含まれ得る。本発明に係る前記化合物１または２のβアミノ基を含むヘテロ化合物は、その薬学的に許容される塩、該塩から製造できる水和物及び溶媒和物を含む。前記化合物１または２のβアミノ基を含むヘテロ化合物の薬学的に許容される塩は、通常用いられる塩の調製方法によって調製され得る。また、化合物３及び４も、それらが示し得る全ての光学異性体及びその薬学的に許容される塩を含む。
【００２７】
本発明において、「薬学的に許容される塩」は、無機または有機塩基及び無機または有機酸を含む、薬学的に許容される非毒性塩基または酸により調製される塩をいう。無機塩基から誘導される塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などを含む。特にアンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムまたはナトリウム塩が好ましい。固形の塩は一つ以上の結晶構造形態で存在していてもよく、水和物の形態で存在してもよい。薬学的に許容される非毒性有機塩基から誘導される塩の例には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなど、一級、二級または三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンの塩、塩基性イオン交換樹脂が含まれる。
【００２８】
本発明の化合物が塩基性である場合、その塩は、無機及び有機酸を含む薬学的に許容される非毒性酸により調製され得る。前記酸の例には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれ、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、フマル酸または酒石酸が好ましい。
【００２９】
本発明の化合物１、２、３または４、またはその薬学的に許容される塩の水和物は、非共有結合的な分子間力を介して結合した化学量論量または非化学量論量の水を含むものと解される。前記水和物は、１当量以上、通常１〜５当量の水を含有し得る。かかる水和物は、水または水を含有する溶媒中において、本発明の化合物１または２、または薬学的に許容される塩を結晶化させることにより調製され得る。
【００３０】
本発明の薬学的組成物において、活性成分は、化学式１で表される化合物１、またはその薬学的に許容される塩であることが好ましく、化合物１の酒石酸塩であることがより好ましい。
【００３１】
本発明の薬学的組成物において、活性成分は、シタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましく、シタグリプチンリン酸塩であることがより好ましい。
【００３２】
本発明の薬学的組成物において、活性成分は、ビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００３３】
本発明の薬学的組成物において、活性成分は、リナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防用薬学的組成物は、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。すなわち、実際臨床的に投与する際、種々の経口的及び非経口的な剤形で投与することができ、本発明では経口投与が好ましい。さらに、薬学的組成物を所望の剤形に製剤化する際には、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤など、当技術分野で通常知られ、使用される希釈剤または賦形剤が用いられる。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ得る。このような固形製剤は、少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム(Calcium carbonate)、スクロース(sucrose)、またはラクトース(lactose)、ゼラチンなどと、活性成分とを混合して調製される。さらに、賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も使用され得る。
【００３５】
経口投与のための液体製剤には、懸濁剤、内服液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれる。水、流動パラフィンなどの汎用される希釈剤に加えて、液状製剤には、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶液、懸濁剤の溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィッテプゾール(witepsol)（ハードファット）、マクロゴール、ツイーン(tween)６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
【００３６】
本発明に係る薬学的組成物の活性成分の１日投与量または服用量は０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇであるが、これは患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、 投与回数、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度によって異なる。
【００３７】
本発明において、非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）は、原発性及び続発性の非アルコール性脂肪肝疾患の双方を含むが、好ましくは原発性高脂血症、糖尿病または肥満に起因する非アルコール性脂肪肝疾患を意味する。
【００３８】
また、本発明において、非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）は、単純脂肪症(simple steatosis)、非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis、ＮＡＳＨ）、ならびにこれら疾患の進展により発症する肝線維症(liver fibrosis)及び肝硬変(liver cirrhosis)を含む。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、化学式１〜４の化合物またはその薬学的に許容される塩に加えて、同一または類似の機能を示す活性成分を１種以上含有することができる。
【００４０】
また、本発明は、前記化学式１、２、３、４で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩の有効量を、非アルコール性脂肪肝疾患の治療及び予防を必要とするヒトを含む哺乳類に投与し、非アルコール性脂肪肝疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００４１】
本発明において、「投与」の用語は、何らかの適切な方法で、患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の薬学的組成物は、それが標的組織に到達し得る限り、何らかの一般的な経路を介して投与することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、内皮、鼻内、肺内、直腸内、腔内、硬膜下投与等することができるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、１日１回または一定の時間間隔で１日２回以上投与できる。
【００４３】
非アルコール性脂肪肝疾患の予防及び治療には、本発明の薬学的組成物は単独で、または外科手術、ホルモン療法、薬物療法及び生物学的反応調節剤を採用する方法と併用して用いることができる。
【００４４】
また、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の予防及び治療用薬学的組成物を製造するための、化学式１〜４の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【発明の効果】
【００４５】
本発明の薬学的組成物は、非アルコール性脂肪肝の典型的な病変として現れるトリグリセリド（Triglyceride、ＴＧ）の蓄積を予防及び治療し、血中に検出される肝細胞(hepatocyte)損傷の指標であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ＡＬＴ）を正常化させる効果を有する。また、本発明の薬学的組成物は、肝線維症を誘発する肝星細胞（hepatic stellate cell、ＨＳＣ）の活性化及び分化を抑制して、肝線維症(liver fibrosis)、さらには肝繊維症から肝硬変(liver cirrhosis)への進展を抑制し、肝線維症または肝硬変を予防及び治療する効果を有する。従って、本発明の薬学的組成物は、非アルコール性脂肪肝の予防または治療剤として使用することができる。
【００４６】
本発明の治療方法は、非アルコール性脂肪肝疾患の予防及び治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたマウスにおいて、化合物１の酒石酸塩またはシタグリプチンのリン酸塩よる血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）低下効果を示す図である。
【図２】図２は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたマウスにおいて、化合物１の酒石酸塩またはシタグリプチンのリン酸塩による肝トリグリセリド低下効果を示す、肝トリグリセリド含有量の分析グラフである。
【図３】図３は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたマウスにおいて、化合物１の酒石酸塩による肝トリグリセリド低下効果を示す組織標本写真である。
【図４】図４は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたラットにおいて、化合物１の酒石酸塩による血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）低下効果を示す図である。
【図５】図５は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたラットにおいて、化合物１の酒石酸塩による肝トリグリセリド低下効果を示す、肝トリグリセリド含有量の分析グラフである。
【図６】図６は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたラットにおいて、化合物１の酒石酸塩による肝トリグリセリド低下効果を示す組織標本写真である。
【図７】図７は、非アルコール性脂肪肝が誘導されたラットにおいて、化合物１の酒石酸塩による肝トリグリセリド低下効果を示した組織標本を画像分析した際の、標本の単位面積当たりの脂肪滴の面積を示すグラフである。
【図８】図８は、マウスにおいて、高脂肪飼料により誘導される脂肪肝に対する化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩及びビルダグリプチンの肝トリグリセリド蓄積予防効果を示す組織標本画像である。
【図９】図９は、活性化された肝星細胞において、化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンによる標的タンパク質発現低下効果を示す電気泳動写真である。
【図１０】図１０は、化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩及びビルダグリプチンの遊離脂肪酸により誘導された肝細胞の脂肪蓄積抑制効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＣＣｌ４により誘発された急性肝損傷動物モデルにおいて、化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩及びビルダグリプチンによるＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示す分析グラフである。
【００４８】
<数値及び記号の説明>
図１、図２、図４、図５及び図７において、＊：標準飼料群と比較して９５％信頼度（ｐ＜０．０５）で有意に増加、＃：高脂肪飼料群と比較して９５％信頼度（ｐ＜０．０５）で有意に減少。
図１０において、＊：０．１％ＤＭＳＯ対照群と比較して９５％信頼度（ｐ＜０．０５）で有意に減少、＊＊：０．１％ＤＭＳＯ対照群と比較して９９％信頼度（ｐ＜０．０１）で有意に減少。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、以下の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲及び精神を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５０】
<実施例１>マウスにおける、高脂肪飼料により誘導された単純脂肪症に対する化合物１の酒石酸塩(tartrate)及びシタグリプチンリン酸塩(sitagliptin phosphate)の予防効果
化合物１の酒石酸塩（韓国特許出願第２００８−００３６０５２号に開示された方法により製造）及びシタグリプチンリン酸塩の単純脂肪症(simple steatosis)に対する予防効果を調べるため、次の実験を行った。
【００５１】
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを安定化させた後、５群に分けた。１個群には１０％の脂肪を含有する標準飼料（商品名：Ｄ１２４５０Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｓ社製）を供給し、もう１個群には６０％の脂肪を含有する高脂肪飼料（商品名：Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｓ社製）を供給した。薬物処理群として、残りの３個群には、高脂肪飼料と薬物を混合し、特別に処方された薬物混合飼料を供給した。化合物１の酒石酸塩の場合、１日の平均高脂肪飼料消費量に基き、化合物１の酒石酸塩の１日目標用量(target dose)である１００ｍｇ／ｋｇ及び３００ｍｇ／ｋｇを供給するため、高脂肪飼料と０．２重量％及び０．５重量％の化合物１の酒石酸塩をそれぞれ混合し、飼料を処方した。シタグリプチンリン酸塩の場合も、１日の平均高脂肪飼料消費量に基き、１日の目標用量である３００ｍｇ／ｋｇを供給するため、高脂肪飼料と約０．５重量％のシタグリプチンリン酸塩を混合し、飼料を処方した。各薬物処理群に、処方した薬物混合飼料を供給した。各飼料を供給してから８週後、１６週後及び２４週後に、動物を解剖して血清を分離し、血液分析器を用いて血清ＡＬＴレベル（アラニンアミノトランスフェラーゼ(alanine aminotransferase)、ＧＰＴ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(glutamic pyruvate transaminase)）を測定した（表１及び図１）。摘出された肝臓は、５（ｖ／ｖ）％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液中でホモジナイズ(homogenization)した後、トリグリセリド  ｗｏｒｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ［遊離グリセリン試薬(free glycerol reagent)（Ｆ６４２８、Ｓｉｇｍａ）及びトリグリセリド試薬(triglyceride reagent)（Ｓｉｇｍａ、Ｔ２４４９）を４：１（ｖ／ｖ）で混合して調製する］を添加し、５４０ｎｍで吸光度を測定してトリグリセリド含量を測定した（表１及び図２）。また、摘出された肝臓の一部分は、組織学的脂肪分布を観察するため、１０（ｖ／ｖ）％ホルマリン溶液で固定した後、組織標本を作成してヘマトキシリン・エオシン(hematoxylin & eosin)染色を行い、画像分析プログラム(computerized image analysis)を用いて写真撮影した（図３、紫色に染色された部分は正常な肝臓組織を示し、白色に染色された部分は脂肪滴(lipid droplet)を示す。）。
【００５２】
その結果、図１に示すように、化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の供給は、１６週と２４週において、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の有意な減少を示した。また、肝臓のトリグリセリド含量も、肝臓トリグリセリド分析（図２）及び組織学的分析（図３）において、高脂肪飼料供給群に比べて有意な減少を示した。これらの結果は、化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩が、高脂肪飼料により誘導される脂肪肝に対し、肝臓のトリグリセリド含量を減少させ、脂肪肝に対する予防効果を有することを示す。
【００５３】
【表１】
2013522359.tif 000006
【００５４】
<実施例２>ラットにおいて高脂肪飼料により誘導された単純脂肪症に対する化合物１の酒石酸塩の治療効果
化合物１の酒石酸塩（韓国特許出願第２００８−００３６０５２号に開示された方法により製造）の単純脂肪症(simple steatosis)に対する治療効果を調べるため、次の実験を行った。
【００５５】
６週齢の雄性ウィスター系ラット(Wistar rat )を安定化させた後、２群に分け、それぞれ、１０％の脂肪を含有する標準飼料（商品名：Ｄ１２４５０Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｓ社製）及び６０％の脂肪を含有する高脂肪飼料（商品名：Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｓ社製）を２４週間供給した。飼料供給２２週目に飼料消費量を計算すると、高脂肪飼料群は、３３．４０ｇ／ｋｇの飼料摂取を示した。化合物１の酒石酸塩の１日目標用量(target dose)である１０ｍｇ／ｋｇを供給するために、高脂肪飼料と０．０３重量％の化合物１の酒石酸塩を混合し、飼料を処方した。各飼料供給から２４週後に、動物を高脂肪飼料供給群（ｎ＝８）、高脂肪飼料＋化合物１の酒石酸塩０．０３重量％混合供給群（ｎ＝８）、標準飼料供給群（ｎ＝８）に分けて、さらに１４週間供給した。その後、動物を解剖して血清を分離した後、血液分析器を用いて血清ＡＬＴレベル(alanine aminotransferase)、ＧＰＴ(glutamic pyruvate transaminase)を測定した（図４）。摘出された肝臓は、５（ｖ／ｖ）％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液中でホモジナイズ(homogenization)した後、トリグリセリドｗｏｒｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ［遊離グリセリン試薬(free glycerol reagent)（Ｓｉｇｍａ、Ｆ６４２８）及びトリグリセリド試薬(triglyceride reagent)（Ｓｉｇｍａ、Ｔ２４４９）を４：１（ｖ／ｖ）で混合して調製する］を添加し、５４０ｎｍで吸光度を測定してトリグリセリド含量を測定した（図５）。また、摘出された肝臓の一部分は、組織学的脂肪分布を観察するため、１０（ｖ／ｖ）％ホルマリン溶液で固定した後、組織標本を作成してヘマトキシリン・エオシン(hematoxylin & eosin)(H&E) 染色を行い、画像分析プログラム(computerized image analysis)を用いて写真撮影した（図６において、紫色に染色された部分は正常な肝臓組織を示し、白色に染色された部分は脂肪滴(lipid droplet)を示す）。その後、標本の単位面積当たりの脂肪滴の面積を計算した（図７）。
【００５６】
その結果、図４に示すように、化合物１の酒石酸塩の投与は、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の有意な減少を示した。また、肝臓のトリグリセリド含量も、肝トリグリセリド分析（図５）及び組織学的分析（図７）において、高脂肪飼料供給群と比較して有意な減少を示した。これらの結果は、既存の脂肪肝に対して化合物１の酒石酸塩が肝臓のトリグリセリド含量を減少させ、脂肪肝の治療剤として使用できることを示す。
【００５７】
<実施例３>マウスにおいて、高脂肪飼料により誘導される単純脂肪症に対する化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩及びビルダグリプチンの非アルコール性脂肪肝予防効果
化合物１の酒石酸塩の非アルコール性脂肪肝（単純脂肪症）に対する予防効果を調べるため、次の実験を行った。
【００５８】
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを安定化させた後、体重及び血糖値により９群（ｎ＝９）に分けた。標準飼料供給群と高脂肪飼料供給群は、各飼料のビヒクル(vehicle)溶液（０．５％ ＭＣ(methylcellulose)）を１日１回１０ｍＬ／ｋｇで経口投与し、残りの群は、高脂肪飼料と共に、指定された群に応じて、化合物１の酒石酸塩３０、１００、３００ｍｇ／ｋｇ、シタグリプチンリン酸塩１００、３００ｍｇ／ｋｇ及びビルダグリプチン１００、３００ｍｇ／ｋｇを１日１回、それぞれ２８日間経口投与した。最後の経口投与から２４時間後に動物を解剖し、摘出された肝臓を５（ｖ／ｖ）％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液中でホモジナイズした後、トリグリセリドｗｏｒｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを添加し、５４０ｎｍで吸光度を測定してトリグリセリド含量を測定した（表２）。また、摘出された肝臓の一部分は、１０（ｖ／ｖ）％ホルマリン溶液で固定し、組織標本を作成してヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色を行い、写真撮影した（図８）。
【００５９】
【表２】
2013522359.tif 000007
【００６０】
表２に示すように、高脂肪飼料供給群は、標準飼料供給群に比べて、肝臓のトリグリセリド含量において５４％の増加を示した。化合物１の酒石酸塩３００ｍｇ／ｋｇ投与群は肝臓のトリグリセリド含量において１１％、シタグリプチンリン酸塩１００ｍｇ／ｋｇ投与群は肝臓のトリグリセリド含量において２１％、ビルダグリプチン３００ｍｇ／ｋｇ投与群は肝臓のトリグリセリド含量において１１％の増加を示し、本発明の化合物が、高脂肪飼料による脂肪肝の発生に対し予防効果を有することが示された。
【００６１】
また、高脂肪飼料供給群に対する肝臓のトリグリセリド含量の最大減少量は、化合物１の酒石酸塩投与群では最大８１％、シタグリプチンリン酸塩投与群では最大６１％、ビルダグリプチン投与群では最大７９％の減少であり、これも脂肪肝の発生に対する本発明の化合物の予防薬効を示す。かかる予防効果の組織学的評価のために組織標本を写真撮影したところ、化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、及びビルダグリプチンによる脂肪滴の減少が確認された（図８）。これらの結果は、脂肪肝の発生に対して３種の薬物すべてが予防効果を有することを示唆する。
【００６２】
<実施例４>ラット肝星細胞活性化に対する化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンの抑制効果
本発明の化合物の肝星細胞活性化に対する抑制作用を、次の細胞培養法により試験した。体重が５００〜７００ｇの雄性ウィスター系ラットを麻酔し、腹部を切開した後、肝門脈にカニューレ(cannular)を連結して、ヘパリン含有ＨＢＳＳ(Hank’s Balanced Salt Solution)と第１型コラゲナーゼ含有ＨＢＳＳを順次灌流した。灌流が終わった後、肝臓を摘出し、手術用はさみを用いて粉砕した後、第１型コラゲナーゼ含有ＨＢＳＳに入れて３７℃で１５分間振盪培養した。
【００６３】
完全に粉砕された液体状態の肝臓組織をガーゼに通した後、５００ｇで１０分間遠心分離した。得られた細胞沈殿物をリン酸緩衝液で洗浄し、次いで１００ｇで５分間遠心分離して上澄み液を回収した。上澄み液をさらに５００ｇで１０分間遠心分離して得た沈殿物にＦｉｃｏｌｌ液（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）液の９：１（ｖ／ｖ）混合液を加えて混合した後、リン酸緩衝液を混合層上に載せ、１，４００ｇで１５分間遠心分離した。次に、上層と下層との間に設けられた細胞層を回収し、１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ)で１回洗浄した。得られた細胞を３．１×１０５個／ｃｍ２の細胞密度で加え、２４時間後に培地を新しい培地と交換し、２〜３日ごとに培地を交換しながら７日間培養した。その後、ヒトＴＧＦ(transforming growth factor)β１ １ｎｇ／ｍＬを含有する培地及びＴＧＦβ１を含有しない培地中、薬物を提示の濃度でそれぞれ処理した。ＴＧＦβ１は、薬物の処理濃度の１０００倍高い濃度となるようにジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、１倍（１×）容積となるように培地にて１０００倍に希釈し、細胞に処理された。
【００６４】
７日間の薬物処置の後、培地を収集してリン酸緩衝液で洗浄し、界面活性剤を含む緩衝液を加えて細胞を溶解させた。次いでタンパク質を定量し、４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて電気泳動した後、ニトロセルロースメンブランに移動させた。移動させたタンパク質は、α−平滑筋アクチン(α-ＳＭＡ)またはＴＧＦβ１に対して特異的な１次抗体と反応させた後、セイヨウワサビペルオキシダーゼが結合した特異的２次抗体と反応させた。標的タンパク質の発現量は化学発光液を用いて確め、アクチン（β-actin）発現量を単位として補正した（図９）。本発明の各化合物１００μＭによる観察タンパク質発現の減少は、ＤＭＳＯのみ加えた陰性対照群と比較して、ＴＧＦβ１で処理した陽性対照群におけるタンパク質発現の増加に基づき、薬物による減少率を百分率で表した（表３）。
【００６５】
【表３】
2013522359.tif 000008
【００６６】
その結果、表３及び図９に示すように、ラットの活性化された肝星細胞において、ｈＴＧＦ−β１によって増加した肝の線維症の病態生理学的に重要な因子であるＴＧＦβ１とα−ＳＭＡのタンパク質発現量が、化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンによって減少し、また、化合物１の酒石酸塩の濃度の増加に伴って、ＴＧＦβ１及びα−ＳＭＡのタンパク質発現減少率が増加することが確認された（図９）。これらの結果は、脂肪肝炎及び肝線維症に対して化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンが治療効果を示し得ることを示唆する。
【００６７】
<実施例５>ヒト肝癌細胞において、遊離脂肪酸により誘導された細胞内脂肪蓄積に対する化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の抑制効果
肝細胞の遊離脂肪酸による処置は、細胞内脂肪蓄積の増加をもたらす。遊離脂肪酸と薬物の併用処理により細胞内脂肪蓄積に対して各薬物が及ぼす抑制効果を、トリグリセリド染色法で定量した。
【００６８】
ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清を含む最小基礎培地（ＭＥＭ)で４８時間培養した。その後、培地を、１（ｖ／ｖ）％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ培地にオレイン酸塩及びパルミチン酸塩（Ｓｉｇｍａ）をモル比が２：１となるように溶解して調製した０．５ｍＭ遊離脂肪酸混合液に交換した後、０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または各試験薬物を加え、２４時間細胞培養した。陰性対照群は、１（ｖ／ｖ）％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭを、遊離脂肪酸を加えずに、０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシドで処理した。培養終了後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液で洗浄した。１（ｖ／ｖ）％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するジメチルスルホキシドに溶解した１０ｍＭ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）原液を、リン酸緩衝液で１，０００倍希釈して細胞に加えた後、３７℃、２００ｒｐｍ、遮光条件下で３０分間細胞内脂肪を染色した。染色後、上澄み液を除去してリン酸緩衝液に交換し、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５５０ｎｍの条件下に蛍光強度を測定した。次いで、細胞数計測による偏差を補正するために、同一のウェル内に１０μＭ レザズリン(resazurin)（Ｓｉｇｍａ）を溶解したリン酸緩衝液を加えた後、３７℃で１時間遮光状態で反応させた前後において、蛍光光度計で励起波長５３５ｎ、発光波長５８０ｎｍの条件で蛍光強度を測定し、細胞内ミトコンドリア活性により還元、生成されたレソルフィン(resorufin)による蛍光強度の増加を測定した。実験結果は、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄの蛍光強度をレザズリン還元による蛍光強度の増加について補正した値を用いて、陰性対照群と比較して、遊離脂肪酸処理により増加した脂肪蓄積に対する百分率で表した。
【００６９】
その結果、図１０に示すように、化合物１の酒石酸塩とシタグリプチンリン酸塩は、遊離脂肪酸による肝細胞における脂肪蓄積を濃度依存的に抑制した。１μＭ濃度における２８．７±３．２％の抑制効果は、肝細胞膜のグルカゴン様ペプチド−１（glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１）受容体の活性化を介して脂肪酸生合成を抑制することが知られているＧＬＰ−１(Ding X, et al., Hepatology 2006, 43:173-181; Gupta NA, et al., Hepatology 2010, 51(5):1584-1592)が１００ｎＭの濃度で示す２８．０±４．９％の抑制効果、脂肪酸の酸化促進を介して脂肪蓄積を減少させることが知られているフェノフィブラート(fenofibrate)( Hahn SE & Goldgerg DM, Biochem Pharmacol 1992, 43(3):625-33)が３０μｍの濃度で示す３５．６±６．５％の抑制効果、及びＡＭＰＫ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ)活性化を介して脂肪酸の酸化を促進し且つ脂肪酸生合成を抑制することが報告されたメトホルミン(metformin)(Zang M et al., J Biol Chem, 2004, 279(46):47898-47905)が１ｍＭの濃度で示す２３．６±５．０％の抑制効果と同等である。これらの結果は、化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩が、内因性ＧＬＰ−１量の増加による間接的効果と共に、肝細胞に直接作用して脂肪蓄積を抑制することにより、脂肪肝予防効果を示し得ことを示唆する。
【００７０】
<実施例６>ＣＣｌ４誘発急性肝損傷マウスモデルにおける化合物１の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、及びビルダグリプチンのＴＧＦ−β１活性化抑制効果
ＣＣｌ４により誘発される急性肝損傷マウスモデルにおいて、肝細胞の線維化過程で重要な役割を果たすことが知られているＴＧＦ−β１発現に対する本発明の化合物の抑制効果を調べるために、次の実験を行った。７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを安定化させ、体重によって９群（ｎ＝７）に分けた後、ＣＣｌ４（０．１ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内に投与した。正常対照群にはオリーブ油を投与した。対照群には、ビヒクル(vehicle)溶液（０．５％ＭＣ）を１日１回１０ｍＬ／ｋｇにて３日間２４時間間隔で経口投与した。残りの群には、指定された群に応じて、化合物１の酒石酸塩３０、１００、３００ｍｇ／ｋｇ、シタグリプチンリン酸塩（ＷＯ２００４／０８５３７８またはＷＯ２００５／００３１３５に開示された方法で製造する）１００、３００ｍｇ／ｋｇ、及びビルダグリプチン（Ｔｒａｄｅｍａｘ、Ｃｈｉｎａ）１００、３００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ１日１回経口投与した。最後の経口投与の１時間後に解剖し、摘出された肝臓をＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現の評価に供した。液体窒素中で保管した肝臓組織をＴＲＩＺＯＬ溶液中でホモジナイズ(homogenization)した後、全ＲＮＡを抽出した。単離したＲＮＡを０．１（ｖ／ｖ）％ＤＥＰＣ(diethyl pyrocarbonate)で希釈して１μｇ／μＬの濃度とした後、ＲＮＡ混合液［各ＲＮＡ  ２μｇ／μＬ＋０．５μｇ／μＬ ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）１５  ２μＬ＋０．１％ ＤＥＰＣ水  １５μＬとする量］をＰＣＲ装置を用いて７２℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷した。混合液［ＰＣＲ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘ  １μＬ＋５Ｘ ＭＭＬＶ ＲＴ ｂｆ．（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ５３１Ａ）  ５μＬ＋２００μｇ／μＬ Ｍ−ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ  １μＬ］を調製し、４２℃で６０分間伸長(elongation)させ、９５℃で５分間変性(denaturation)させた後、８℃で急冷してｃＤＮＡを生成し、次の使用まで−２０℃で保管した。ＲＴ−ＰＣＲを行うために、混合液［２０ ｐｍｏｌ各プライマー  １μＬ＋ヌクリアーゼ−フリー水  ９．５μＬ］を調製した後、各ｃＤＮＡ２μＬを、滅菌したＰＣＲチューブに入れ、ｒｅｍｉｘ ＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ００３Ａ）１２．５μＬを添加して混合した後、下記条件（表４）にてＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ−２００、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＴ生成物を電気泳動した後、画像分析機（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）を用いて分析し、β−ａｃｔｉｎの発現を用いてターゲット遺伝子ＴＧＦ−β１の発現を正規化(normalization)した（図１１）。その結果は表５のとおりである。
【００７１】
【表４】
2013522359.tif 000009
【００７２】
【表５】
2013522359.tif 000010
【００７３】
その結果、表５及び図１１に示すように、ＣＣｌ４対照群では肝臓のＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡ発現が正常群と比較して２２％増加し、化合物１の酒石酸塩及びビルダグリプチン処理により、ＴＧＦ−β１の発現は正常化(normalization)された。シタグリプチンリン酸塩処理群においても、ＣＣｌ４群と比較してＴＧＦ−β１の発現が減少し、ＣＣｌ４誘発性ＴＧＦ−β１の発現に対する抑制効果を示した。また、ＣＣｌ４対照群と比較した肝臓のＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡ発現の減少率は、化合物１の酒石酸塩投与群では最大１３５％、シタグリプチン投与群では最大４１％、ビルダグリプチン投与群では最大１１５％であり、本発明の化合物がＴＧＦ−β１の発現増加による肝線維症の発生に薬効を有することが示唆される。
【００７４】
<実施例７>肥満動物モデルｏｂ／ｏｂマウスにおける、化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩のアラニンアミノトランスフェラーゼ低下効果
化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の単純脂肪症(simple steatosis)に対する治療効果を調べるために、次の実験を行った。
【００７５】
５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（正常マウス群）及びｏｂ／ｏｂマウス（肥満マウス群）を安定化させた後、体重及び血糖値によって６群に分け、標準飼料及び薬物混合飼料を供給した。マウスの飼料消費量は、マウス体重の１０ｇ当たり約１ｇの飼料摂取を示す。よって、化合物１の酒石酸塩の１日目標用量である１０、１００、３００ｍｇ／ｋｇを供給するために、標準飼料と、０．０１重量％、０．１重量％、０．３重量％の化合物１の酒石酸塩、及び０．３重量％のシタグリプチンリン酸塩とをそれぞれ混合して、飼料を処方した。飼料供給４週後に解剖して血清を分離した後、血液分析器を用いて血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ値を測定した（表６）。
【００７６】
【表６】
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【００７７】
その結果、化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の投与によって血漿アラニンアミノトランスフェラーゼが減少したことが確認された。これらの結果は、脂肪肝により増加したアラニンアミノトランスフェラーゼに対して化合物１の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩が減少作用を示し、単純脂肪肝の治療剤として使用できることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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