(57)【要約】本発明は、活性物質で処置される細胞に活性物質が直接放出されることが可能な、がんを治療するための新規な組成物に関する。該組成物は、ジスルフィド基を含むリポソームの形態である活性物質担体を含む。本発明はまた、細胞増殖抑制剤の局所的に限定された放出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分担体が少なくとも１つの式(I)：
2013539773.tif 000006
(I)
[ここで、少なくとも１つの式(I)で示される化合物は、
(a)Xに、少なくとも５つの炭素原子を含み、少なくとも１つのエーテル基および／またはアミン基またはアンモニウム基を含む化学基を有し；ここで、
(b)nおよびmは互いに独立して、1〜30の自然数であるが、nおよびmの合計は、少なくとも16である]
で示される化合物を含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤を含むリポソームの形態の活性成分担体を含む組成物。
【請求項２】
化学基Xが、少なくとも８個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
化学基Xが、さらに少なくとも１つのカルボン酸エステル基を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
活性成分担体における式(I)で示される化合物中の化学基Xの少なくとも１つのアミン基もしくはアンモニウム基が、第四級アンモニウム基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
活性成分担体が、式(I*)：
2013539773.tif 000007
(I*)
[式中、化学基Yは、ビオチン、たんぱく質、ペプチド、グリコ基、核酸、ヌクレオシドまたはヌクレオチドから選ばれる化学基である]
で示される化合物を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
活性成分担体が、式(Ia)：
2013539773.tif 000008
(Ia)
で示される化合物を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
活性成分担体中に、リン脂質、特に、ホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミンも含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
細胞増殖抑制剤が、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メルファラン、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブスルファン、イリノテカン、カルムスチン、ダウノルビシン、シスプラチン、ダクチノマイシン、ガンシクロビル、シタラビン、ダカルバジン、シタラビン、ビンデシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、セツキシマブ、エトポシド、エピルビシン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、トラスツズマブ、イホスファミド、トポテカン、クラドリビン、アレムツズマブ、リツキシマブ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ゲムツズマブ、カルボプラチン、アルデスロイキン、ベンダムスチン塩酸塩、パクリタキセル、ドセタキセル、チオテパ、三酸化ヒ素、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、アザシチジン、ビンクリスチン、ビノレルビン、シドフォビルおよびイダルビシンから選ばれることを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
組成物の活性成分担体中に存在する式(I、I*および／またはIa)で示される両親媒性化合物が、そのジスルフィド基にて疎水性部分と親水性部分に切断されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載のリポソームの形態の活性成分担体を含む組成物から細胞増殖抑制剤を放出する方法。
【請求項１０】
薬剤としての、請求項１〜８のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質で処置される細胞に活性物質が直接放出されることが可能な、がんを治療するための新規なタイプの組成物に関する。該組成物は、ジスルフィド基を含むリポソームの形態である活性物質担体を含み、細胞増殖抑制剤は、該活性物質担体に含まれる。本発明はまた、細胞増殖抑制剤の局所的に限定された放出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、100 nmの大きさのリポソーム担体に基づく活性成分の放出のための担体システムは、医療技術において一般に知られている。それらは、一般に、人体の特定の臓器に対して毒性があるが、他の部位で薬用有効成分として用いることができる物質が所望部位でのみ放出されるべきである場合に有利であるとみなされる。
【０００３】
上述の毒性物質は、正しい用量で、特定の、特に変性疾患組織型に用いる場合に医学的治療で用いることもできるいわゆる細胞増殖抑制剤も包含する。
【０００４】
上述のリポソーム担体は、一般に、非毒性リン脂質からなる物質グループを意味すると理解される。ポリエチレングリコールは、実際のリポソーム担体の周囲に立体的保護の形態を形成するので、このようなリポソーム担体は、たとえば、治療された患者の血流中の改良された安定性を特徴とするポリエチレングリコールなどのポリマーを含むことも多い。これは、いわゆるリポポリマーを提供する。
【０００５】
上記のリポソーム担体に関する記述は、Biochimica et Biophysica Acta 1609(2003) 95-101に公表されたJ. Davidsenらの「Secreted phospholipase A2 as a new enzymatic trigger mechanism for localised liposomal drug release and absorption in diseased tissue」によっても確認される。さらに、J. Davidsenらは、上述のリポソーム担体の形態の、このような活性成分担体の特性は、に、特にそれらの放出動態に関して、その相互作用はいまだ完全に理解されてはいないが、化学的および物理的パラメーターの大きさによって変わりうることを開示する。
【０００６】
これに関連して、J. Davidsenらは、直径100 nmのリポソーム担体からなるリポソーム製剤に関する彼らの研究を開示している。リポソーム担体は、1,2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)および／または1,2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DPPE-PEG2000)および／または1-O-ヘキサデカノイル-2-ヘキサノデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)および／または1-O-ヘキサデカノイル-2-ヘキサノデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG350)からなる。上述の物質は、多重膜小胞を形成することもでき、リン脂質の物質群に属する脂質と呼ばれる。
【０００７】
カルセインが、1-O-DPPCおよび10 mol%の1-O-DPPE-PEG350を含むリポソーム製剤に包含されうることもまた開示されている。カルセインは本明細書において薬物のモデル物質と称される。カルセインの放出は、ホスホリパーゼA2(PLA2)とともにこのリポソーム製剤を処置することを用いる、J. Davidsenらによる開示にしたがって達成されうる。該放出は、リゾ脂質および脂肪酸を付与する、PLA2によって触媒される、DPPCもしくは1-O-DPPC、または1-O-DPPE-PEG350のいずれかの加水分解によって起こる。によって開示されるリポソーム製剤は、その放出に関しては、上述のモデル物質のみに関連して記載される。J. Davidsenは、細胞増殖抑制剤であるドキソルビシンの放出のために一般にリポソーム製剤を用いる選択肢も記載している。しかしながら、この事実に関する実際の開示は提供されていない。
【０００８】
その結果として、J. Davidsenらは、疎水性および親水性部分への加水分解も、リポソーム担体がジスルフィド結合を含みうることも開示していない。特に、J. Davidsenらは、細胞増殖抑制剤がこの過程で放出されることを開示していない。
【０００９】
Biomaterials 30(2009) 2180-2198に発表された「Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications」において、Mengらは、ジスルフィド架橋を有する特定のポリマーが、ポリマー鎖またはその側鎖のいずれかに活性成分を組み込むのに適していることを開示している。 Mengらによれば、本明細書で用いる活性成分もまた、抗がん剤に包含される。しかしながら、そこに開示されている物質から、その中に潜在的な活性成分が組み込まれる粒子、すなわち固体が形成されるので、これらは、必ずポリマー特性をもっている。
【００１０】
したがって、これらは、いかなる場合でもリポソームを生成するのに適している脂質特性をもつ物質である。
【００１１】
開示された物質の作用機序は、ポリマーが除去されるか、またはジスルフィド基でポリマーに結合するポリエチレングリコール側鎖が切り離され、患者に用いられた後の粒子が、患者の免疫系によって認識され、破壊されうるかのいずれかの結果としてのジスルフィド基の結合切断の可能性に基づいている。したがって、Mengらの開示によれば、活性成分担体からの放出は、ポリマー結合の切断の結果としての固体の除去、または粒子が認識された後の患者の免疫系による固体の分解の結果としての固体の除去のいずれかに基づいている。いかなる場合でも、活性成分は、直接放出される。
【００１２】
WO 2000/059474 A1は、疎水性「テール基」および疎水性「テール基」に共有的に結合している親水性「ヘッド基」からなる脂質組成物を開示している。親水性「ヘッド基」内で、第一および第二領域の間に特徴があり、これらの２つの領域は、ジスルフィド結合によって結合されており、たとえば、グルタチオンによって切断することができる。WO 2000/059474 A1によれば、親水性「ヘッド基」の第一領域は、生理的pHにおいて正電荷を帯び、第二領域は、生理的pHにおいて負電荷を帯びる。第一領域は、疎水性「テール基」に共有的に結合する。
【００１３】
WO 2000/059474 A1に一般用語で開示された、上の脂質組成物の化学式は、X-Y-S-S-Zである。ここで、化学基Xは、上述の疎水性「テール基」を形成し、YおよびZは、親水性ヘッド基の第一または第二領域を形成する。
【００１４】
WO 2000/059474 A1のさらなる開示によれば、上述の化学式において、疎水性「テール基」としての化学基Xは、脂肪のグリセロール幹に本質的に類似している基であり、化学基Yがさらなる化学基Wを介して接合される基でありうる。
【００１５】
化学基Wは、CHR3、NR3、N+(R3)2、O、S、C(O)NH、NH(CO)、OC(O)NHおよびOP(O)(OR3)Oからなるリストから選ばれうる。化学基Wにも存在する化学基R3は、水素またはC1-C4アルキルラジカルでありうる。
【００１６】
化学基Yは、アルキルラジカル、アミノラジカル、アミノアルキルラジカル、グアニジンラジカル、グアニジンアルキルラジカル、アミドラジカルまたはアミドアルキルラジカルの形態の置換基を有するC1-C12アルキルラジカル、C2-C12アルケニルラジカルまたはC2-C12アルキニルラジカルでありうる。この場合、上述の化学基Yのアルキル、アルケニルまたはアルキニルラジカルは、NR3、N+(R3)2、C(O)、NHC(NH)、C(NH)NH、NHC(NH)NHによってさらに中断されうる。あるいは、化学基Yは、アミノ酸ラジカルまたはペプチドであることもできる。
【００１７】
WO 2000/059474 A1の開示によれば、化学基Zは、次にアルキルラジカル、カルボキシルラジカル、カルボキシアルキルラジカル、アミノ酸ラジカル、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはいわゆる「標的分子ラジカル」で置換されうる、C1-C12アルキルラジカル、アルケニルラジカルまたはアルキニルラジカルでありうる。
【００１８】
しかしながら、上述の化学基X、YおよびZは、それぞれ、基XおよびYが生理的pHにおいて正電荷をもち、基Zが生理的pHにおいて負電荷をもつように配置されなければならない。
【００１９】
その結果として、WO 2000/059474 A1によれば、ジスルフィド基における式X-Y-S-S-Zの切断物質は、正に荷電しているX-Y-S型の基および負に荷電しているS-Z型の化学基を生成する。
【００２０】
それぞれの場合において、X-Y-S型の基が「疎水性テール基」および正電荷を常に含むという事実の結果として、その基は、両親媒性特性を有する、すなわち、一方の領域で疎水性であり、他方の領域で親水性である化学基である。S-Z型の基が負電荷およびC1-C12アルキルラジカル、アルケニルラジカルまたはアルキニルラジカル含むという事実の結果として、その基は、同様に両親媒性であるか、または特に短いアルキルラジカル、アルケニルラジカルまたはアルキニルラジカルの場合、親水性のみであるかのいずれかである。
【００２１】
WO 2000/059474 A1は、さらに、上述の物質が、物質の標的化放出が作用の部位で行われうるリポソーム担体を生産するのに適していることを開示する。放出は、ジスルフィド基の化学的切断に基づく。WO 2000/059474 A1は、一般に制がん剤の放出のためのリポソーム担体の使用も開示する。
【００２２】
しかしながら、WO 2000/059474 A1は、両親媒性であった物質を親水性部分と疎水性部分に切断することが、達成されうることを開示していない。
【００２３】
しかしながら、このような親水性部分と疎水性部分への切断は、このような物質で構築されたリポソーム担体の特に効率的な不安定化および除去を許可するであろう。
【００２４】
上述の組成物以外に、哺乳動物の身体にある特定の酵素が、化合物の特定の結合を攻撃し、それらを切断することも一般に知られている。これに関連して、たとえば、D. Mustacichらは、Biochem. J. (2000) 346、1-8、「Thioredoxin reductase」において、このような酵素が、チオレドキシンレダクターゼ(TrxRsと略称する)であることを開示している。この酵素が、健康な組織と比べて少なくとも１０倍の量で特に腫瘍組織に存在することも開示されている。
【００２５】
がん性疾患の治療に用いる細胞増殖抑制剤は、それらの細胞増殖抑制効果に関して選択的ではない。したがって、この効果は、一般に、健康な細胞と疾患組織の両方に対して発現される。健康な細胞における細胞増殖抑制効果は、これらの活性成分の重篤な副作用である。
【００２６】
このような治療の過程において、患者に投与される活性成分の量が、十分に多い用量のままで作用の部位（腫瘍）に到達することが保証されなければならないので、患者は、実際の腫瘍性疾患が要求するよりも多い用量の細胞増殖抑制剤で治療されることも多い。
【００２７】
この目的のために、健康な細胞における細胞増殖抑制副作用は、細胞増殖抑制活性成分のいくつかが、健康な細胞に対してその有効性を発現し、したがって腫瘍組織に対する効果がもはや利用可能ではないことが想定される限りにおいて必要な用量を決定する場合に、計算に含まれる。したがって、上述の副作用は、このような場合における治療の本質的な要素である。
【００２８】
しかしながら、もし活性成分が作用の部位でのみ放出され、そこでのみ効果が発現されるのならば、それが望ましいであろう。このことは、第一に用量の低下をもたらし、第二に患者におけるマイナスの副作用の低減化をもたらす。
【００２９】
しかしながら、多くの場合、作用の候補部位における活性成分の放出が、迅速に、できるだけ定量的に、そして潜行性でなく起こることが同時に保証されなければならない。
【００３０】
しかしながら、これまでに、上述の問題は、上述の従来技術において、もしあったとしても、欠点としてのみ解釈されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
したがって、作用の部位における細胞増殖抑制剤の迅速で、できるだけ完全な放出が可能となるように、たとえば、活性成分担体に存在するジスルフィド基にて酵素的に切断しうる、細胞増殖抑制剤を含む活性成分担体を提供することが目的である。
【００３２】
また、該目的は、細胞増殖抑制剤が、人体の作用部位のすぐ近くのみに、迅速に、できるだけ定量的に放出される、たとえばがん性疾患などの標的治療に適した細胞増殖抑制剤の放出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本願発明の第１の主題として、活性成分担体が少なくとも１つの式(I)：
2013539773.tif 000002
(I)
[ここで、少なくとも１つの式(I)で示される化合物は、
(a)Xに、少なくとも５つの炭素原子を含み、少なくとも１つのエーテル基および／またはアミン基またはアンモニウム基を含む化学基を有し；ここで、
(b)nおよびmは互いに独立して、1〜30の自然数であるが、nおよびmの合計は、少なくとも16である]
で示される化合物を含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤を含むリポソームの形態の活性成分担体を含む組成物が見出されている。
【００３４】
1〜30の炭素原子を有するラジカル中に、疎水性特性をもち、式(I)で示される化合物が極性媒体に配合される場合にこれらの疎水性化学基が極性溶媒から離れて内側にアレンジされるようにこれらの化合物がそれら自体をアレンジするという事実を同時に立体的にもたらす化学基を有する本願発明組成物中の式(I)で示される化合物の特性の結果として、これらは、任意に同一もしくは類似の特性のさらなる化合物とともに、水などの極性溶媒に組み込まれた場合にリポソームを形成する。
【００３５】
したがって、極性媒体への式(I)で示される化合物の組み込みは、リポソームの形態の球体構造の形成をもたらすように、これらの化合物がそれら自体をアレンジすることをもたらす。
【００３６】
ここで、通常、いわゆる脂質二重層が形成され、ここで、式(I)で示される化合物の親水性化学基Xは、それら自体が極性溶媒に対して外側と内側の両方に向かい、上述の球体構造の内部に位置することもできるが、両方の層の疎水性化学基は、脂質二重層の内側に向かう。リポソームの内部に極性媒体に溶解した細胞増殖抑制剤があり、脂質二重層が安定である限り、ここを離れることができず、したがって、該組成物の近くに位置する細胞に対する細胞増殖抑制効果を発現することもできない。
【００３７】
しかしながら、同時に、本願発明組成物中の式(I)で示される化合物は、結果として化学基Xおよびイオウラジカルからなる親水性化学基ならびに1〜30の炭素原子を含むラジカルを含む疎水性化学基が形成されるように、提供されたジスルフィド基において選択的に切断することができる。このことは、上述のリポソームの迅速および完全な不安定化をもたらし、したがって、存在する細胞増殖抑制剤の迅速な放出をもたらす。
【００３８】
その結果として、新しいタイプの本発明組成物を用いて、初めて、ジスルフィド結合の切断によって細胞増殖抑制剤を放出させ、親水性および疎水性ラジカルを与えることができるようになり、このことに基づいて、細胞増殖抑制剤を自発的にかつ所望の作用部位においてのみ放出させることが可能になる。
【００３９】
式(I)においても示されるように、式(I)におけるn、m炭素原子を含むラジカルは、通常、飽和炭化水素ラジカルである。
【００４０】
n、m炭素原子を含むラジカルは、一価または多価不飽和ラジカルでもありうる。したがって、n、m炭素原子を含むラジカルは、１つ以上の二重および／または三重結合を有することもできる。
【００４１】
したがって、本発明の式(I)は、n、m炭素原子を有する炭化水素ラジカルがもっぱらn、m炭素原子を含む飽和炭化水素ラジカルを意味するものとして示される、n、m炭素原子を有する炭化水素ラジカルに関するものであると理解されるべきではない。
【００４２】
好ましい実施態様において、化学基Xは、少なくとも８個の炭素原子を含む。
【００４３】
化学基Xが、少なくとも１つのカルボン酸エステル基ならびに少なくとも１つのエーテル基および／またはアミン基もしくはアンモニウム基を含む場合が同様に好ましい。
【００４４】
化学基Xが、少なくとも２つのエーテル基または少なくとも１つのアミン基もしくはアンモニウム基のいずれか、および少なくとも２つのカルボン酸エステル基を含む場合が特に好ましい。
【００４５】
本発明組成物の活性成分担体中の式(I)で示される化合物の化学基Xの少なくとも１つのアミン基もしくはアンモニウム基が、第四級アンモニウム基である場合が同様に特に好ましい。
【００４６】
このような実施態様において、本発明組成物中の式(I)で示される化合物は、少なくとも１つの正電荷を有し、少なくとも１つの単もしくは多重負荷電対イオンとの組み合わせで存在する。このような対イオンは、たとえば、クロリド、ブロミドおよび／またはヨージドといったようなハロゲンイオンでありうるが、負電荷を有するいずれかの他の所望の対イオンであってもよい。
【００４７】
本発明組成物中の式(I)で示される化合物の化学基Xが、少なくとも３つのエーテル基を含む場合が非常に特に好ましい。これに関連して、下記の他の好ましい実施態様によれば、化学基Xが、カルボン酸エステル基を介して化学基Yに結合するのが好ましい。
【００４８】
本発明組成物中の式(I)で示される化合物の非常に特に好ましい実施態様において、さらにただ１つのアミン基もしくはアンモニウム基をさらに含むのが好ましい化学基Xが、このアミン基もしくはアンモニウム基を介して式(I)で示される化合物のラジカルに結合するのが同様に好ましい。
【００４９】
アミン基もしくはアンモニウム基および少なくとも３つのエーテル基が、全体として特に化学基Xの親水性特性をもたらすので、この実施態様は、特に有利である。
【００５０】
本発明組成物のさらなる好ましい実施態様において、式(I)で示される化合物中の化学基Xは、リン酸基を含む。
【００５１】
本発明組成物のさらなる好ましい実施態様において、この組成物中、細胞増殖抑制剤を含むリポソームの形態の活性成分担体は、少なくとも１つの式(I*)：
2013539773.tif 000003
(I*)
[式中、化学基Yは、ビオチン、たんぱく質、ペプチド、グリコ基、核酸、ヌクレオシドまたはヌクレオチドから選ばれる化学基であり、ここで、X、nおよびmは、式(I)または上述の好ましい態様と同意義である]
で示される化合物を含むこともできる。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様における化学基Yは、ビオチンである。
【００５３】
化学基Yがビオチンである好ましい実施態様において、これは、アミド結合によるか、またはカルボン酸エステル基を介するかのいずれかによって化学基Xに結合することができる。
【００５４】
式(I*)で示される化合物を有する活性成分担体を含む組成物のこの好ましい実施態様において、化学基Yは、化学基Xの末端に、あるいは側鎖基として結合することができる。
【００５５】
式(I*)で示される化合物を含む本発明のすべての実施態様において、化学基Yは、(生)化学的同定に役立つ。
【００５６】
たとえば、該好ましい実施態様におけるビオチンの使用の場合、(生)化学的に明らかにストレプトアビジンによってY基を同定することによって、式(I*)で示される化合物にさらなる化学的特性を与えるさらなる化学的および／または生化学的基が、Y基に結合することができる
【００５７】
したがって、たとえば、ストレプトアビジンと共役した抗体は、ビオチンに結合することができる。あるいは、ストレプトアビジンのみが、ビオチンに結合することもでき、ビオチンと共役した抗体は、次に、ストレプトアビジンに結合することができる。両方の場合、これは、活性成分担体が、抗体の選択的効果を介して治療される細胞の標的分子において優先的に蓄積するのを可能にする。
【００５８】
本発明組成物のさらなる好ましい実施態様は、Yが、ストレプトアビジンが結合形態で存在するビオチンであり、次にストレプトアビジンがビオチンと共役した抗体に結合する、式(I*)で示される化合物を有する活性成分担体を含む。
【００５９】
特に好ましい活性成分担体は、式(Ia)：
2013539773.tif 000004
(Ia)
で示される化合物を含む担体である。
【００６０】
式(Ia)で示される化合物を含む活性成分担体を有するこれらの特に好ましい組成物において、同様に、ストレプトアビジンが、式(Ia)で示される化合物のビオチンに結合し、次に、ストレプトアビジンが、ビオチンと共役した抗体に結合するのが好ましい。
【００６１】
上述の本発明組成物は、通常、活性成分担体中に、式(I)（(I*)および／または(Ia)）で示される化合物に加えて、新油性特性をもつ少なくとも１つの化学基および親水性特性をもつ少なくとも１つの化学基を有する少なくとも１つのさらなる化合物を含む。このようなさらなる化合物は、脂質であるのが好ましい。
【００６２】
このような脂質は、通常、リン脂質由来のもの、特に、ホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミンである。
【００６３】
好ましい脂質は、L-α-ホスファチジルコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、アンモニウム(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-リサミンローダミンBスルホニル)から選ばれる。
【００６４】
上述のさらなる化合物は、極性媒体に組み込まれる場合に、式(I、I*およびIa)で示される化合物と同じ方法で、それら自体を配置する。
【００６５】
上述のさらなる化合物を含む活性成分担体を有する本発明組成物は、活性成分担体に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、特に好ましくは80〜90%のモル画分のこれらの化合物を含む。
【００６６】
本発明組成物の好ましい実施態様において、活性成分担体は、さらなる化合物として脂質を含む。
【００６７】
好ましい実施態様において、２つの脂質のうちの１つが、L-α-ホスファチジルコリンであるのが好ましい。L-α-ホスファチジルコリンが、鶏卵から得られるL-α-ホスファチジルコリンであるのが特に好ましい。
【００６８】
本発明組成物の特に好ましい実施態様において、活性成分担体は、活性成分担体に対して、10〜90%のモル画分のL-α-ホスファチジルコリンおよび式(I、I*またはIa)で示される化合物の画分を含む。
【００６９】
本発明組成物の非常に特に好ましい実施態様において、活性成分担体は、活性成分担体に対して、合計100%のモル画分が得られるように、10〜30%のモル画分のL-α-ホスファチジルコリン、50〜65%のモル画分の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンおよび残りの画分の式(I、I*またはIa)で示される化合物からなる。
【００７０】
本発明組成物中の活性成分担体は、極性溶媒にそれ自体を配向させている、活性成分担体の構成要素である上述の式(I)、(I*)、(Ia)で示される化合物の親水性化学基Xを有する、いわゆる脂質二重層を含むリポソームであり、一方、式(I)、(I*)で示される化合物の疎水性化学基または上述の脂質の両層の疎水性化学基は、脂質二重層の内部へ配向している。
【００７１】
本発明組成物の活性成分担体に存在する細胞増殖抑制剤は、3 mmol/lまでの濃度で、水または水性媒体に溶解しうるものであるのが好ましい。
【００７２】
特に好ましい細胞増殖抑制剤は、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メルファラン、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブスルファン、イリノテカン、カルムスチン、ダウノルビシン、シスプラチン、ダクチノマイシン、ガンシクロビル、シタラビン、ダカルバジン、シタラビン、ビンデシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、セツキシマブ、エトポシド、エピルビシン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、トラスツズマブ、イホスファミド、トポテカン、クラドリビン、アレムツズマブ、リツキシマブ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ゲムツズマブ、カルボプラチン、アルデスロイキン、ベンダムスチン塩酸塩、パクリタキセル、ドセタキセル、チオテパ、三酸化ヒ素、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、アザシチジン、ビンクリスチン、ビノレルビン、シドフォビルおよびイダルビシンから選ばれる。
非常に特に好ましいのは、ドキソルビシンである。
【００７３】
本発明はさらに、組成物の活性成分担体中に存在する式(I、I*および／またはIa)で示される両親媒性化合物が、そのジスルフィド基にて疎水性部分と親水性部分に切断されることを特徴とする、リポソームの形態の活性成分担体を含む組成物から細胞増殖抑制剤を放出する方法を提供する。
【００７４】
本発明方法による切断は、酵素的に触媒された化学的切断でありうるか、または式(I、I*および／またはIa)で示される化合物のジスルフィド基がその還元の結果として切断される非酵素的に触媒された還元でありうる。
【００７５】
切断が、酵素的に触媒された切断であるのが好ましい。このような化学的切断を触媒する酵素が、チオレダクターゼ、チオオキシダーゼ、チオオキシレダクターゼまたはチオール-ジスルフィドオキシドレダクターゼであるのが好ましい。
【００７６】
同様に、還元によるジスルフィド基の非酵素的に触媒された切断が可能であり、この場合、用いる還元剤は、グルタチオン、システイン、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、ジチオスレイトール(DTT)および1,4-ジチオエリスリトール(DTE)から選ばれる物質である。還元剤がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)であるのが好ましい。
【００７７】
上述の還元剤は、結合が切断される結果として、通常、式(I、I*および／またはIa)で示される化合物のジスルフィド基の２つのイオウ原子の少なくとも１つを還元するに十分な還元電位のみを有するので、特定の環境下で有利である。しかしながら、同時に、上述の還元剤の還元電位は、式(I、I*および／またはIa)で示される化合物の他の化学基、あるいはリポソームの形態の本発明活性成分担体のさらなる化合物の基を還元するには十分ではない。
【００７８】
したがって、疎水性および親水性部分への、式(I、I*および／またはIa)で示される両親媒性化合物の切断が起こることが特に確実になり、その結果として、本発明の放出が特に有利に起こる。
【００７９】
グルタチオンおよびシステインは、炎症性変性部位において特に高濃度で、哺乳動物、特にヒトの身体にも現れ、その結果として、特に本発明において標的化放出を可能にする化合物である。
【００８０】
細胞増殖抑制剤を放出するための本発明方法は、それが、式(I、I*および／またはIa)で示される活性成分担体を親水性部分と疎水性部分に切断して、その中に存在する細胞増殖抑制剤を、理論にしばられるものではなく、開放し放出するような方法で不安定化されているリポソームをもたらすのに十分であるという驚くべき発見に基づく。
【００８１】
薬剤として、特にがんの治療用薬剤としての上述の組成物の使用をさらに提供する。
【００８２】
本発明を以下の実施例および図面によって説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】実施例３にしたがって、微分干渉コントラスト法によって得られた細胞の画像を示す。
【図２】図１に示すものと同じ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本発明を以下の実施例によって詳しく説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８５】
式(Ia)で示される化合物の活性成分担体を含む本発明組成物の製造
国際出願PCT/EP2010/064272の実施例１〜４にしたがって、式(Ia)で示される化合物を製造した。
【００８６】
式(Ia)で示される化合物ならびにL-α-ホスファチジルコリン(「卵PC」、Avanti Polar Lipids、Alabaster、USAより入手)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(「DOPE」、Avanti Polar Lipids、Alabaster、USAより入手)をクロロホルム／メタノール(5:1の比)に溶解した。
【００８７】
後にこの溶液から得られた活性成分担体中の上述の化合物の比率を表１に示す。
【００８８】
表１：本発明組成物の活性成分担体の組成
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【００８９】
次いで、上述のクロロホルム／メタノール混合液中の得られる溶液を回転蒸発器で処理して、回転蒸発器のガラス壁上に乾燥したフィルムとして表１の組成物が、固体として析出するように、溶媒を完全に除去した。
【００９０】
次いで、析出したフィルムをシクロヘキサン（5容量%エタノール混合液）中に入れ、得られる溶液をガラス管に移し、-80℃にて凍らせ、一夜凍結乾燥した。
【００９１】
その後、水性ドキソルビシン塩酸塩溶液（濃度0.5 mg/ml、1 ml）を乾燥組成物に加え、混合物を10分間超音波処理した。この方法で得られた懸濁液を5回凍結融解プロセスに付した。融解は、各回、70℃の湯浴を用いて行った。次いで、懸濁液に、最初に0.1 ml、そして、5分後にさらに0.4 mlのドキソルビシン溶液（各回、0.5 mg/mlの濃度）を加えた。その結果として、ドキソルビシン塩酸塩の最終濃度、〜3 mmol/lを達成することができた。
【００９２】
次いで、懸濁液を、孔径100 nmのポリカーボネートフィルターに11回通した。
【００９３】
これによって、本発明組成物は、細胞増殖抑制剤としてドキソルビシン塩酸塩および式(Ia)で示される化合物を含む活性成分担体を与えられ、上述の水溶液中で形成されるドキソルビシン塩酸塩を積載する単層小胞（活性成分担体）が得られる。
【００９４】
上述の組成物から、水溶液中に位置し、活性成分担体の内部に位置しない過剰のドキソルビシン塩酸塩を除去するために、上述のろ過からの透過液を、遠心分離ユニットに置いたゲルろ過カラムに通した(カラム：1 mlポリプロピレンカラム(Qiagen)中のセファデックスG 50(Fine、Sigma-Aldrich)；遠心分離：100-300 x gにて3分間)。
【実施例２】
【００９５】
モノクローナル抗体を含む組成物の官能化
実施例１の組成物を含む水溶液150 μlおよび水性ストレプトアビジン溶液(1 mg/ml)25 μlを、合計量1 mlが達成されるように、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まないPBS(リン酸緩衝生理食塩水)溶液に加えた。この混合物を室温にて30分間静置した。その後、抗ヒトp185HER2ビオチン複合体(Invitrogen、Karslruhe、入手して使用)を加え、混合物を4℃にて1時間インキュベートした。
【００９６】
これにより、細胞増殖抑制剤ドキソルビシン塩酸塩を含む、実施例１にしたがって構成された活性成分担体を含む組成物が得られ、ここで、これらの活性成分担体は、その外殻に、ヒト乳がん細胞の表面に位置するヒトp185HER2たんぱく質に特異的に結合することが知られている抗ヒトp185HER2抗体を有する。
【実施例３】
【００９７】
実施例２の組成物を用いる細胞培養試験
BT-474型のヒト乳がん細胞(DSMZ株 No.ACC 64)を、単層が約70%集密になるまで、12 mlの細胞培養フラスコ中で培養した。用いた培地は、10% FBS、5% ペニシリン-ストレプトマイシンおよび2 mM L-グルタミンを含むDMEMであった。
【００９８】
顕微鏡分析を行う１日前に、0.05%強度のトリプシン/EDTA溶液を用いて培養フラスコの底から細胞を除去し、35 mmのガラス底容器に移した(DMEM、1:4溶液)。細胞を37℃および5% CO2にてインキュベートし、25 μlの実施例２の組成物を含む1 mlのPBS溶液で処理した。
【００９９】
この暴露実験の結果を、蛍光顕微鏡検査法によって評価した(倒立落射蛍光顕微鏡、Zeiss、モデル：Axiovert 100)。各顕微鏡写真の前に、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含むPBSで細胞を4回洗浄した。
【０１００】
各評価のために、３つの顕微鏡写真を記録し、ケースごとに細胞内の10箇所で蛍光強度を決定し、それらから平均蛍光を計算した。平均バックグラウンド蛍光を確認するために、細胞の外側の10箇所で3回同様の手順を行った。差異は、そこから平均蛍光シグナルを与える。
【０１０１】
細胞増殖抑制剤ドキソルビシン塩酸塩は、蛍光活性であることが知られているので、細胞増殖抑制剤が放出されたかどうか、および細胞によって吸収されたかどうかを確認することが可能であった。
【０１０２】
この平均蛍光シグナル（活性成分による、バックグラウンドと細胞の蛍光の間の差異）が、58.94±11.17(a.u.)であることが見出された。これは、吸収、したがって細胞増殖抑制剤の先行放出を実証するのに十分である。
【０１０３】
このために別途、図２において細胞における選択的蛍光シグナルを示すが、明るい領域は、細胞内のドキソルビシンの蛍光シグナルを描く（微分干渉コントラスト写真で図１に示すように）。これらは、赤−オレンジ色の発光として色の観点から認識することができる。図１の各細胞について、対応する蛍光シグナルが細胞の内部に認識され、細胞による吸収、およびその結果としてのドキソルビシン塩酸塩の先行放出が検出される。細胞培養に還元剤は加えられなかったので、本発明組成物からの放出は、細胞の存在によって起こった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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