(57)【要約】本発明は、細菌による重金属捕捉システムを提供する。細菌は、ｐｐｋ遺伝子、ｍｔ遺伝子および／またはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を発現し、少なくとも２５μＭのＨｇ、１，０００μＭの亜鉛、２５０μＭのカドミウムおよび３，０００μＭのＰｂに耐えることができる。本発明のシステムは、液体における重金属汚染の存在を容易に決定することができ、また、多量の重金属を捕捉している細菌を容易に回収することができる。さらに、ファージおよび色素体の遺伝子発現要素を含み、かつ、特に高レベルのタンパク質発現および重金属抵抗性をもたらす、細菌における遺伝子発現システムが提供される。
2013502223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重金属キレート化遺伝子を細菌において発現させるためのベクターであって、下記の機能的につながれた要素：
ベクター骨格、
色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来する転写構成的プロモータ配列、
バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する翻訳エンハンサー要素配列、
キレーター作用因子のコード配列
を含み、前記細菌に存在するベクター。
【請求項２】
３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性転写ターミネータ配列をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記３’ＵＴＲターミネータが色素体のｒｐｓ１６遺伝子の転写ターミネータまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネータである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記３’ＵＴＲ転写ターミネータが色素体のｒｐｓ１６遺伝子の転写ターミネータである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記キレーター作用因子が、ｍｔ遺伝子、ｐｐｋ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子によってコードされる、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
前記キレーター作用因子が、ｐｐｋによって合成されるポリリン酸であり、かつ、前記細菌が、約１００μＭまでの水銀、２５０μＭのカドミウム、１０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ｍｔが哺乳動物のメタロチオネインである、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
前記キレーター作用因子がマウスのｍｔ１遺伝子配列によってコードされ、かつ、前記細菌が、約１６０μＭまでの水銀、少なくとも約２５０μＭのカドミウム、少なくとも約１，０００μＭの亜鉛または少なくとも約３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記キレーター作用因子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列によってコードされ、かつ、前記細菌が、約１４０μＭまでの水銀、少なくとも約２５０μＭのカドミウム、少なくとも約１，０００μＭの亜鉛または少なくとも約３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である、請求項５に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクター骨格がプラスミド骨格である、請求項１に記載のベクター。
【請求項１１】
少なくとも約２５μＭ〜約１００μＭの間のＨｇに対して抵抗性である、遺伝子組換えキレーター作用因子を含む細菌。
【請求項１２】
前記キレーター作用因子遺伝子は、強力なプロモータから転写され、かつ、選ばれた５’ＵＴＲと、場合によっては、選ばれた３’ＵＴＲとが隣接し、その結果、少なくとも、１ｎｇの総ｍＲＮＡあたり４，０００〜８，５００コピーの安定な転写物が前記キレーター遺伝子に対応する、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１３】
少なくとも、１ｎｇの総ｍＲＮＡあたり６，０００〜７，５００コピーの安定な転写物が前記キレーター遺伝子に対応する、請求項１２に記載の細菌。
【請求項１４】
前記キレーター作用因子遺伝子が、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来する転写構成的プロモータ配列から転写される、請求項１２に記載の細菌。
【請求項１５】
前記キレーター作用因子遺伝子が、バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲの翻訳エンハンサー要素配列、および、色素体のｒｐｓ１６遺伝子の３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性転写ターミネータ配列に隣接する、請求項１２に記載の細菌。
【請求項１６】
前記キレーター作用因子遺伝子が、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来する転写構成的プロモータ配列から転写され、かつ、バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲの転写エンハンサー要素配列、および、色素体のｒｐｓ１６遺伝子の３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性転写ターミネータ配列に隣接する、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１７】
前記キレーター作用因子コード配列がマウスのｍｔ１遺伝子に対応し、かつ、当該細菌が、約１６０μＭまでの水銀、少なくとも約２５０μＭのカドミウム、少なくとも約１，０００μＭの亜鉛または少なくとも約３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１８】
前記キレーター作用因子コード配列がβ−ｇａｌ遺伝子に対応し、かつ、当該細菌が、約１４０μＭまでの水銀、少なくとも約２５０μＭのカドミウム、少なくとも約１，０００μＭの亜鉛または少なくとも約３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１９】
前記キレーター作用因子コード配列がｐｐｋ遺伝子に対応し、かつ、当該細菌が、約１００μＭまでの水銀、約２５０μＭまでのカドミウム、少なくとも約１，０００μＭの亜鉛または少なくとも約３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２０】
水銀を含有する液体環境に存在するとき、前記水銀を蓄積し、かつ、着色において濃くなる、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２１】
水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を含有する液体環境に存在するとき、前記水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を蓄積し、かつ、着色において濃くなる、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の中から選択される、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２３】
水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を含有する液体環境に存在するとき、前記水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を蓄積し、凝集体を形成し、かつ、沈殿する、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２４】
重金属を汚染された液体から除くために取り扱い便利なバイオフィルタにおいて繁殖される、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２５】
前記キレーター導入遺伝子がβ−ガラクトシダーゼであり、かつ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を切断するβ−ガラクトシダーゼの能力が重金属の存在によって低下する、請求項１１に記載の細菌。
【請求項２６】
水銀を液体から汚染除去するための方法であって、
ｍｔ遺伝子、ｐｐｋ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する細菌培養物を前記液体に加えること（ただし、前記細菌培養物における細菌は約２５μＭのＨｇ〜少なくとも約１００μＭのＨｇの間に対して抵抗性である）、および
前記細菌を、前記水銀の捕捉を可能にするために十分な期間の後で前記液体から除くこと
を含む方法。
【請求項２７】
前記細菌が凝集塊を作り出した後、前記細菌を除去する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記凝集体を、吸引、ふるい分け、または、汚染除去を受けている液体からのフィルタの除去によって回収する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌がＢ−ガラクトシダーゼを発現し、当該方法がさらに、サンプルにおける水銀の濃度を求めるために、Ｘ−ｇａｌを少なくとも１つのサンプルに加え、前記サンプルを、前記細菌が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を代謝して、青色の着色を生成する能力を測定するために試験することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
水銀を液体から汚染除去するための方法であって、
前記液体を、固体マトリックスを含むデバイスに入れること（ただし、前記マトリックスはさらに、細胞キャリアを伴うことなくβ−ガラクトシダーゼを含む）、および、
前記液体が前記固体マトリックスから溶出される際の前記液体を集めること
を含む方法。
【請求項３１】
重金属汚染を検出するためのキットであって、
インジケータ細片上のβ−ガラクトシダーゼ発現細菌培養物またはβ−ガラクトシダーゼ酵素、
Ｘ−ｇａｌ、および
インジケータ細片上の前記β−ガラクトシダーゼ発現細菌培養物またはβ−ガラクトシダーゼ酵素と接触している液体におけるＨｇの様々な濃度に対応する着色を示すチャート
を含むキット。
【請求項３２】
比色分析向上剤をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
重金属汚染を検出するためのキットであって、
流体用容器、
β−ガラクトシダーゼ、ｐｐｋまたはｍｔ１を発現する細菌培養物、および
液体中の前記重金属の様々な濃度の存在下で繁殖する際、β−ガラクトシダーゼ、ｐｐｋまたはｍｔ１を発現する前記細菌培養物の着色に対応する暗い着色を示すインジケータ細片
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一部が、全米科学財団によって与えられた合衆国政府補助金ＮＳＦ  ＣＢＥＴ−０７５５６４９のもとで開発された材料を用いてなされた。政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
本特許出願は米国仮特許出願第６１／２３５，６２４号（２００９年８月２０日出願）の優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、汚染された液体および固体を生物浄化するための、水銀、鉛、亜鉛およびカドミウムを含む様々な重金属に対して抵抗性であり、かつ、当該重金属を捕捉および蓄積することができる遺伝子改変された細菌を作出するための分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
比較的大きい密度を有する金属性の化学元素は多くの場合、重金属と呼ばれる。重金属は低濃度でさえ有毒である。毒性の重金属には、水銀、カドミウム、鉛、亜鉛および銀が含まれる。重金属のなかでも、水銀、鉛およびカドミウムは、特に有毒であると見なされる。
【０００５】
水銀が工業プロセスおよび天然プロセスの副生成物として環境中に持ち込まれており、土壌および堆積物に高濃度で蓄積する可能性がある。パトラ（Patra,M.）およびシャーマ（Sharma,A.）、ボタニカル  レビュー（Bot.Rev.）、６６：３７９〜４２２（２０００）。合衆国では、石炭燃焼火力発電所により、約４８トンの水銀が毎年放出され、一方、アジアおよびアフリカでは、石炭燃焼火力発電所により、１年あたり１５００トン以上が放出される。大気浄化水銀規則、米国環境保護局（「ＥＰＡ」）、２００９年（２００９年２月８日検索、www.epa.gov/air/mercuryrule/basic.html）。世界中では、すべての排出源からの年間水銀放出が４８００トン〜８３００トンと見積もられる。水銀の人体暴露、ＥＰＡ、２００８年（２００９年２月８日検索、www.usepa.gov/mercury/exposure.html）。
【０００６】
水銀化合物は神経毒であり、かつ、細胞における電子伝達の強力な遮断剤である。すべての水銀形態が有毒であり、様々な危険を人の健康に対して、また、環境に対して示す。費用効率的かつ効果的な浄化システムを開発することが非常に重要である。
【０００７】
水銀を環境から清浄化するための現在の浄化戦略には、フラッシング、化学的な還元／酸化、掘削、回収およびオフサイト処分が含まれる。これらの取り組みは費用がかかり、環境破壊的であり、非効率的である。カレンランピ（Karenlampi,S.）ら、エンバイロンメンタル  ポルーション（Environ.Pollut.）、１００７：２２５〜２３１（２０００）。他の方法、例えば、ガラス化およびコンクリート覆いなどは、現場を使用不能にし、広大な面積の浄化においては非現実的である。１ポンドの水銀を現在の技術により環境から浄化する費用は数千ドルである。フセイン（Hussein,H.）ら、エンバイロンメンタル  サイエンス  アンド  テクノロジー（Env.Sci.Technol.）、４１：８４３９〜８４４６（２００７）。
【０００８】
水銀と同じように、他の重金属（例えば、鉛およびカドミウムなど）が深刻な環境脅威をもたらしており、浄化されなければならない。鉛は、軟組織および骨に蓄積し得る強力な神経毒である。その毒性のために、鉛は、塗料、ガソリン、送水管、玩具およびその他を含む様々な消費者製品において、ＥＰＡおよび他の当局によって禁止されている。ＥＰＡは鉛含有量を飲料水において０．０１５ｐｐｍ未満に制限する。鉛は、２００７年の包括的環境対処・補償・責任法（ＣＥＲＣＬＡ）による有害物質の優先順位リストにおいて２番目に位置づけられる。
【０００９】
多数の消費者適用品（とりわけ、電池）におけるカドミウムの現在の広範囲に及ぶ使用はこの重金属の環境汚染を増大させている。カドミウムは、非常に有毒であり、重篤な中毒、骨変性、細胞酵素の阻害および細胞膜破壊を引き起こすことが示されている。水銀の場合と同様に、鉛およびカドミウムを浄化または捕捉するための現在の方法は、イオン交換樹脂、沈殿化および抽出、埋設、現場を覆うこと、ならびに、オフサイト処分の使用を含む物理化学的方法の使用に頼っている。キム（Kim,S.）ら、ジャーナル  オブ  バイサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング（J.Biosci.Bioeng.）、９９：１０９〜１１４（２００５）。これらの方法は費用がかかり、かつ／または、回復されつつある環境に対して破壊的である。新しい技術が、汚染された環境の浄化を促進するために必要とされる。
【００１０】
生物浄化、すなわち、汚染された環境を回復するために生物を使用することが、潜在的に低コストかつ環境に優しい取り組みを与えうる。例えば、細菌はいくつかの毒性化合物をそれらの非毒性の代謝産物に分解することができる。しかしながら、重金属元素（例えば、水銀、カドミウムおよび鉛など）は非毒性の代謝産物に無毒化することができない。
【００１１】
水銀の生物浄化法の１つの方法が、水銀を揮発させることによる方法であり、Ｈｇ２＋の輸送および還元を制御するｍｅｒオペロンの発現に依拠する。ｍｅｒオペロン遺伝子の１つ、すなわち、ｍｅｒＡにより、二価水銀イオンレダクターゼ、すなわち、Ｈｇ２＋からＨｇ０への変換を触媒する酵素がコードされる。Ｈｇ０は、水銀の、揮発性がより小さく、反応性がより小さく、かつ、毒性がより少ない形態である。ジャクソン（Jackson,W.J.）およびサマーズ（Summers,A.O.）、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、１５１：９６２〜９７０（１９８２）。しかしながら、揮発プロセスにおいて、元素状水銀は、元素状水銀がより毒性の形態に変換されうる環境に放出される。揮発法に対する別の欠点は、細菌により、気化した元素状水銀が、浄化が行われている同じ水の中に放出されるので、揮発法は水処理には適していないことである。
【００１２】
細菌は、細胞内における水銀蓄積を可能にしながら、水銀に対する大きい抵抗性をもたらす内因性機構を有していない。水銀の抵抗性と蓄積を増大させることを目的として、他生物から遺伝子を統合するために遺伝子操作を用いてきた。キレーターまたは捕捉剤として知られている分子が、重金属を土壌または水から回収することを目標として生物において発現させることができる好適な重金属捕獲剤として提案されている。
【００１３】
細菌システムにおけるメタロチオネインおよびポリリン酸がいくつかの重金属の解毒において暗示されている。これら２つの作用因子は、これらが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたとき、水銀、カドミウムおよび鉛を捕捉することができ、したがって、この細菌をあるレベルのこれらの重金属元素から保護することができる。しかしながら、今日までの結果には失望させられている。この細菌はこれらの元素を効果的に捕捉することができず、また、高レベルのこれらの重金属のもとでは生存しない。これらの結果は、重金属に対する耐性が弱い細菌システムをもたらす、キレータータンパク質作用因子の安定性の喪失が認められたことに起因すると考えられる。
【００１４】
各種メタロチオネインは、哺乳動物、植物および菌類において見出されるｍｔ遺伝子によってコードされる。ソーサ（Ｓｏｕｓａ，Ｃ．）ら、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、１８０：２２８０〜２２８４（１９９８）。しかしながら、メタロチオネイン（ＭＴ）は、細菌において発現させたとき、不安定であることが示されている。ベルカ（Ｂｅｒｋａ，Ｔ．）ら、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、１７０：２１〜２６（１９８８）。ＭＴタンパク質は、細菌において発現させたとき、不安定であることが見出されたので、ｍｔ遺伝子はこれまで、安定化作用因子と融合されている：例えば、ＧＳＴ−ＭＴ融合物をもたらすグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など。チェン（Ｃｈｅｎ，Ｓ．）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｄ．Ｂ．）、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、６３：２４４２〜２４４５（１９９７）。様々なＧＳＴ−ＭＴ構築物には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧＳＴ−ＹＭＴ）、ヒト（ＧＳＴ−ＨＭＴ）およびエンドウマメ（ＧＳＴ−ＰＭＴ）が含まれた。ＧＳＴ−ＨＭＴを保有する細胞は、可溶性のＭＴタンパク質を産生することが示されたことがなく、この構築物は、水銀に対する抵抗性を何ら与えていない。ＹＭＴ構築物およびＰＭＴ構築物を発現する細胞は、最大でも５μＭの水銀（かろうじて毒性であるレベル）を有する液体に耐えることが示されている。より重要なことであるが、これら２つの構築物を発現する細胞は、この細胞がさらに遺伝子操作されて、ｍｅｒオペロンの水銀輸送遺伝子を発現しない限り、水銀を蓄積しないようであり、また、細胞を水銀から保護しないようである。不成功であった様々な試みもまた、細菌のペリプラズムに標的化されたが、多コピーのＮ．ｃｒａｓｓａのｍｔ遺伝子および他のヒト遺伝子を遺伝子操作するために行われている。しかしながら、これらのタンパク質の不安定性および不溶性は、効果的な浄化作用因子としてのそれらの使用を妨げ続けている。ボールズ（Valls,M.）およびローレンゾ（Lorenzo,V.）、エフイーエムエス  マイクロ．レビューズ（FEMS Micro.Reviews）、２６：３２７〜３３８（２００２）。これらの融合タンパク質は、水銀に対するいくらかの限られた耐性をもたらすが、この効果がＭＴタンパク質に起因すると明確に考えることができない。これは、ＧＳＴ（融合パートナー）もまた、重金属（例えば、水銀など）と結合することが知られているからである。チェン（Chen,S.）およびウィルソン（Wilson D.B.）、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Appl.Environ.Microbiol.）、６３：２４４２〜２４４５（１９９７）；デン（Deng,X.）およびウィルソン（Wilson D.B.）、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Appl.Microbiol.Biotechnol.）、５６：２７６〜２７９（２００１）；クストジオ（Custodio,H.M.）ら、アーカイブス  エンバイロンメンタル＆オキュペイショナル  ヘルス（Arch.Environ.Occup.Health）、６０：１７〜２３（２００５）。
【００１５】
したがって、メタロチオネイン遺伝子により改変された遺伝子組換え細菌は細胞における十分な抵抗性を提供していないと結論づけられている。ビーティー（Beattie,J.H.）ら、トキシコロジー  レターズ（Toxicol.Lett.）、１５７：６９〜７８（２００５）；オダワラ（Odawara,F.）ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（J.Biochem.）、１１８：１１３１〜１１３７（１９８５）；パーク（Park,J.D.）ら、トキシコロジー（Toxicology）、１６３：９３〜１００（２００１）。この失敗について得られる説明として、細胞プロテアーゼによるこの小さいメタロチオネインペプチドの急速な分解、低いタンパク質収量、および、細胞質におけるレドックス経路との起こり得る干渉が含まれる。ソーサ（Sousa,C.）ら、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、１８０：２２８０〜２２８４（１９９８）；ヤン（Yang,F.）ら、プロテイン  エクスプレッション  アンド  ピューリフィケーション（Protein Expr.Purif.）、５３：１８６〜１９４（２００７）。
【００１６】
同様にまた、細菌を、亜鉛に対する抵抗性を高めるためにメタロチオネイン遺伝子により遺伝子操作する試みは、効果的でないことが判明している。オダワラ（Odawara,F.）ら、上掲。
【００１７】
細菌において発現されるメタロチオネイン融合遺伝子は、５０ｍｇ／リットル（約１５０μＭ）までのカドミウム毒性に対するわずかばかりの耐性をもたらすことが示されている。オダワラ（Odawara,F.）ら、同上；キースリング（Keasling,J.D.）およびフプフ（Hupf,G.A.）、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Appl.Env.Microbiol.）、６２：７４３〜７４６（１９９６）。これらの研究は、５０ｍｇ／Ｌのカドミウムの後では、遺伝子組換え細胞は、カドミウムを含まない培地で増殖する遺伝子組換え細胞との比較において増殖における実質的な低下を有したので、細菌が高いカドミウム濃度において十分に増殖し得ることを示していない。
【００１８】
他の研究者たちは、ポリリン酸キナーゼ（「ｐｐｋ」）遺伝子を細菌で発現させるために遺伝子操作することに注目している。ｐｐｋ酵素は、水銀を吸収（捕捉）することが知られているオルトリン酸の長い線状ポリマーの合成に関わっている。ｍｔと同様に、ｐｐｋ融合構築物のみが提案され、利用されている。例えば、クレブシエラ・エアロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のｐｐｋ遺伝子がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のｍｅｒＴ遺伝子およびｍｅｒＰ遺伝子と融合されている。ｍｅｒＴ遺伝子およびｍｅｒＰ遺伝子は水銀の内在化を促進させる。この融合は、安定性を改善するために意図され、また、これらの融合成分は部分的には、水銀内在化が制限されるであろうという考えのために選ばれた。だが、このことはまた、ｐｐｋ遺伝子を発現する細菌の生物浄化作用を制限するかもしれない。パン−ホウ（Pan-Hou,H.）ら、バイオロジカル  アンド  ファーマシューティカル  ブレティン（Biol.Pharm.Bull.）、２４：１４２３〜１４２６（２００１）；パン−ホウ（Pan-Hou,H.）ら、エフイーエムエス  マイクロバイオロジー  レターズ（FEMS Microbiol.Lett.)、10325:159〜164(2002)。これらの構築物を発現する細菌は、１６μＭまでの水銀および２４μＭまでの有機水銀化合物を溶液から蓄積することができる。元素状水銀の存在下での細菌の増殖が１６μＭの水銀においてはなくなった。水銀に対する増大した抵抗性が、これらの構築物を発現する遺伝子操作された細菌がアルギン酸塩ビーズに置かれたときに示されている。それにもかかわらず、４０μＭ〜８０μＭの水銀の存在下では、水銀の浄化が不活化され、細菌は生存性を失う。キョーノ(Kyono,M.)ら、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Appl.Microbiol.Biotechnol.）、６２：２７４〜２７８（２００３）。
【００１９】
植物浄化法および菌類浄化法（非改変生物）は、鉛を根または葉に蓄積させることによって、鉛を生物浄化することを試みるために使用される方法である。フアン（Huang,L.Z.）ら、バイオデグラデーション（Biodegradation）、２０：６５１〜６６０（２００９）；ビマラ（Vimala,R.）およびダス（Das,N.）、ジャーナル  オブ  ハザーダス  マテリアルズ（J.Hazard.Mat.）、１６８：３７６〜３８２（２００９）。微生物による効果的な生物浄化技術は今日まで鉛について何ら提案されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上記システムによって達成される、遺伝子操作された細菌の重金属に対する抵抗性のレベルが低いことが、効果的な生物浄化システムとしてのそれらの適用を不可能にしている。低い水銀濃度を有する水においてでさえ、水銀が、システムによって耐えられるよりも高い濃度に細胞に蓄積するので、これらのシステムは効果的でない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の１つの態様において、本発明は、下記の機能的につながれた要素を含む、重金属キレート化遺伝子を細菌において発現させるためのベクターを提供する：
ベクター骨格、
色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来する転写構成的プロモータ配列、
バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する翻訳エンハンサー要素配列、
キレーター作用因子のコード配列、
ただし、当該ベクターは前記細菌に存在する。好ましい実施形態において、ベクターはさらに、３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性翻訳ターミネータを含む。好ましくは、３’ＵＴＲは色素体のｒｐｓ１６の転写ターミネータまたは大腸菌のｒｒｎＢの転写ターミネータである。より好ましくは、３’ＵＴＲは色素体のｒｐｓ１６の転写ターミネータである。
【００２２】
別の実施形態において、キレーター作用因子は、ｍｔ遺伝子、ｐｐｋ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子によってコードされ、この遺伝子が細菌において発現させられる。１つの実施形態によれば、キレーター作用因子は、ｐｐｋによって合成されるポリリン酸であり、かつ、細菌は、約１００μＭまでの水銀、少なくとも約１０００μＭの亜鉛、少なくとも約２５０μＭのカドミウムまたは少なくとも約３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である。
【００２３】
さらに別の実施形態において、ｍｔ遺伝子は哺乳動物のメタロチオネインである。より好ましくは、キレーター作用因子はマウスのｍｔ１遺伝子配列によってコードされ、かつ、細菌は、約１６０μＭまでの水銀、少なくとも２５０μＭのカドミウム、１，０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である。
【００２４】
なおも別の実施形態において、キレーター作用因子はβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子配列によってコードされ、かつ、細菌は、約１４０μＭまでの水銀と、少なくとも２５０μＭのカドミウム、１，０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛とに対して抵抗性である。
【００２５】
さらなるなおも別の実施形態において、ベクター骨格はプラスミド骨格である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、少なくとも約２５μＭ〜少なくとも約１００μＭの間のＨｇに対して抵抗性である、遺伝子組換えキレーター作用因子を含む細菌を提供する。好ましい実施形態において、キレーター作用因子遺伝子は、強いプロモータから転写され、かつ、選ばれた５’ＵＴＲと、場合によっては、選ばれた３’ＵＴＲとが隣接し、その結果、少なくとも、１ｎｇの総ＲＮＡあたり４，０００コピー〜８，５００コピーの間の安定な転写物がキレーター遺伝子に対応し、より好ましくは、１ｎｇの総ＲＮＡあたり６，０００コピー〜７，５００コピーの間の安定な転写物がキレーター遺伝子に対応する。さらにより好ましい実施形態において、キレーター作用因子遺伝子は、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来する転写構成的プロモータ配列から転写され、キレーター作用因子遺伝子は、バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲの翻訳エンハンサー要素配列が隣接する。さらに一層より好ましくは、キレーター作用因子遺伝子は、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子の転写構成的プロモータ配列から転写され、かつ、バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲの翻訳エンハンサー要素配列、および、色素体のｒｐｓ１６遺伝子の３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性翻訳ターミネータ配列が隣接する。
【００２７】
好ましい実施形態において、キレーター捕捉作用因子コード配列はｍｔ１遺伝子に対応し、かつ、細菌は、約１６０μＭまでの水銀に対して、あるいは、少なくとも約２５０μＭのカドミウム、１，０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である。別の好ましい実施形態において、捕捉作用因子コード配列はβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ／ｌａｃＺ）遺伝子に対応し、かつ、細菌は、約１４０μＭまでの水銀に対して、あるいは、少なくとも約２５０μＭのカドミウム、１，０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である。なおも別の好ましい実施形態において、捕捉作用因子コード配列はβ−ｇａｌ遺伝子に対応し、かつ、細菌は、約１４０μＭまでの水銀に対して、あるいは、少なくとも約１，０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である。なおもさらに別の好ましい実施形態において、捕捉作用因子コード配列はｐｐｋ遺伝子に対応し、この場合、細菌は、約２５０μＭのカドミウム、１，０００μＭの亜鉛または３，０００μＭの鉛に対して抵抗性である。
【００２８】
さらなる実施形態において、上記細菌は、ｍｔ遺伝子配列、ｐｐｋ遺伝子配列またはβ−ｇａｌ遺伝子配列を含み、ただし、これらの遺伝子配列は、
色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来する転写構成的プロモータ、
バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する翻訳エンハンサー要素、および
Ｒｈｏ非依存性転写ターミネータ配列
をさらに含む導入遺伝子発現システムに機能的につながれる。
【００２９】
なおもさらなる実施形態において、上記細菌は、水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を含有する液体環境に存在するとき、その水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を蓄積し、かつ、水銀の存在下で着色において濃くなる。
【００３０】
なおもさらにさらなる実施形態において、上記細菌は、水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を含有する液体環境に存在するとき、その水銀、カドミウム、亜鉛または鉛を蓄積し、上記細菌は凝集体を形成し、沈殿する。なおも異なるさらにさらなる実施形態において、上記細菌は、水銀を含有する液体環境に存在するとき、その水銀を蓄積し、上記細菌は凝集体を形成し、沈殿する。
【００３１】
１つの実施形態によれば、上記細菌は、大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。
【００３２】
異なる実施形態において、ｍｔ遺伝子配列、ｐｐｋ遺伝子配列またはβ−ｇａｌ遺伝子配列を含む細菌をバイオフィルタにおいて増殖させるとき、バイオフィルタは重金属を汚染された液体から除くことができる。また、そのようなバイオフィルタは都合よく取り扱われ、例えば、上記液体から都合よく除かれる。
【００３３】
別の異なる実施形態において、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を切断するβ−ガラクトシダーゼの能力が重金属の存在によって低下し、重金属の濃度に関して比例している。
【００３４】
別の態様において、本発明は、水銀を液体から汚染除去するための方法であって、
ｍｔ遺伝子、ｐｐｋ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する細菌培養物を前記液体に加えること（ただし、前記細菌培養物における細菌は約２５μＭのＨｇ〜少なくとも約１００μＭのＨｇの間に対して抵抗性である）、および
前記細菌を、前記水銀の捕捉を可能にするために十分な期間の後で前記液体から除くこと
を含む方法を提供する。本方法の１つの実施形態によれば、細菌は、細菌が凝集塊を生じさせた後で除かれる。好ましい実施形態によれば、細菌は、ふるい分け、吸引、または、フィルタからの細菌の除去によって除かれる。
【００３５】
別の態様によれば、水銀レベルをモニターするための方法であって、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する細菌培養物を液体に加えること（ただし、細菌培養物における細菌は約２５μＭのＨｇ〜少なくとも約１４０μＭのＨｇの間に対して抵抗性である）、および
サンプルにおける水銀の濃度を求めるために、Ｘ−ｇａｌをサンプルに加え、そして、前記サンプルを、前記細菌が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を代謝して、青色の着色を生じさせる能力を求めるために試験することを含む方法が提供される。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、水銀を液体から汚染除去するための方法であって、
前記液体を、固体マトリックスを含むデバイスに入れること（ただし、前記マトリックスはさらに、細胞キャリアを伴うことなくβ−ガラクトシダーゼを含む）、および、
前記液体が前記固体マトリックスから溶出される際の前記液体を集めること
を含む方法を提供する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、重金属汚染を検出するためのキットであって、
流体用容器、
インジケータ細片上のβ−ガラクトシダーゼ発現細菌培養物またはβ−ガラクトシダーゼ酵素、
Ｘ−ｇａｌ、および
インジケータ細片上の前記β−ガラクトシダーゼ発現細菌培養物またはβ−ガラクトシダーゼ酵素と接触している液体におけるＨｇの様々な濃度に対応する着色を示すチャート
を含むキットを提供する。１つの実施形態によれば、キットは比色分析向上剤を含む。
【００３８】
さらに別の態様において、本発明は、重金属汚染を検出するためのキットであって、
流体用容器、
β−ガラクトシダーゼ、ｐｐｋまたはｍｔ１を発現する細菌培養物、および
液体中の前記重金属の様々な濃度の存在下で繁殖する際、β−ガラクトシダーゼ、ｐｐｋまたはｍｔ１を発現する前記細菌培養物の着色に対応する暗い着色を示すインジケータ細片
を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、細菌の、示された濃度の水銀の存在下での増殖能を例示する。培養物を水銀において１６時間増殖させ、その後、その増殖を培養物の光学濃度（ＯＤ６００）の関数として測定した。図１Ａは非形質転換細菌を表す。図１Ｂは、β−ｇａｌタンパク質を発現させる示されたプラスミドを含む遺伝子操作された細菌培養物を表す。図１Ｃは、ｍｔ１タンパク質を発現させる示されたプラスミドを含む遺伝子操作された細菌培養物を表す。図１Ｄは、ｐｐｋ酵素を発現させる示されたプラスミドを含む遺伝子操作された細菌培養物を表す。
【図２】図２は、細菌の、示された濃度の水銀の存在下での増殖能を例示する。培養物を水銀において１２０時間増殖させ、その増殖を培養物の光学濃度（ＯＤ６００）の関数として測定した。図２Ａは非形質転換細菌を表す。図２Ｂは、β−ｇａｌタンパク質を発現する遺伝子操作された細菌培養物を表す。図２Ｃは、ｍｔ１タンパク質を発現する遺伝子操作された細菌培養物を表す。図２Ｄは、ｐｐｋ酵素を発現する遺伝子操作された細菌培養物を表す。
【図３】図３は、本発明に従って作製される構築物の転写効率を例示する。ｃＤＮＡを捕捉作用因子に関するｍＲＮＡから調製した。ｍＲＮＡコピー数を計算し、抽出された総ＲＮＡに対して正規化した。図３Ａは、ｍＲＮＡ転写物からインビトロ産生されたｃＤＮＡを、非形質転換細菌（「ｗｔ」）、および、Ｐ１６ｓ−ｇ１０−ｍｔ１−３’ＵＴＲ遺伝子構築物により形質転換された細菌において比較する。図３Ｂは、ｍＲＮＡ転写物からインビトロ産生されたｃＤＮＡを、ｗｔ細菌、および、Ｐ１６ｓ−ｇ１０−ｐｐｋ−３’ＵＴＲ遺伝子構築物により形質転換された細菌において比較する。
【図４】図４は、本発明の１つの態様に従う汚染された液体の生物浄化用装置の図的表示である。
【図５】図５は、細菌の強化発現カセットの概略的表示である。図に示される制限酵素部位は本発明のただ１つの実施形態を表すにすぎない。Ｐｒｒｎは転写プロモータを表す。好ましい実施形態において、プロモータは色素体の１６Ｓ  ｒｒｎプロモータである。５’ＵＴＲ（非翻訳領域）は翻訳エンハンサー要素を表す。好ましい５’ＵＴＲがバクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する。導入遺伝子は好ましくは、捕捉作用因子をコードする。好ましい実施形態において、捕捉作用因子は、ｌａｃＺ遺伝子、ｍｔ１遺伝子またはｐｐｋ遺伝子によってコードされる。３’ＵＴＲは転写ターミネータを示す。好ましい実施形態において、転写ターミネータは色素体のｒｐｓ１６ターミネータまたは大腸菌のｒｒｎＢターミネータである。特に好ましい実施形態において、転写ターミネータはｒｐｓ１６ターミネータである。
【図６】図６は、１２０μＭの水銀において増殖させた、ｌａｃＺ遺伝子およびｍｔ１遺伝子を発現する細菌の凝集を表す図である。図６の図は、観察された凝集物のポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）写真の概略的表示である。沈殿が、ｌａｃＺ遺伝子を発現させるために遺伝子操作された細菌の培養物（図６Ａ）、および、ｍｔ１遺伝子を発現させるために遺伝子操作された細菌の培養物（図６Ｂ）において観察された。
【図７】図７は、捕捉作用因子を発現させるために遺伝子操作された細菌の水銀汚染培地の浄化能、すなわちこの培地を捕捉作用因子を発現しない細菌（「ｗｔ」）に対して無害化することができることを例示する。図７Ａは、水銀を含まない培地；１２０μＭの水銀を含有する培地；および、処理済み培地における、ｗｔ細菌の２４時間の増殖を示す。処理済み培地は１２０μＭの水銀を最初に含有し、ｌａｃＺ遺伝子を発現させるために本発明に従って遺伝子操作された細菌への１２０時間の暴露によって処理され、その後、細菌細胞の除去が行われた。図７Ｂは、水銀を含まない培地、１２０μＭの水銀を含有する培地、および、処理済み培地における、ｗｔ細菌の２４時間の増殖を示す。処理済み培地は１２０μＭの水銀を最初に含有し、ｍｔ１遺伝子を発現させるために本発明に従って遺伝子操作された細菌への１２０時間の暴露によって処理され、その後、細菌細胞の除去が行われた。
【図８】図８は、液体サンプルの重金属汚染の程度を求めるための、ｌａｃＺ遺伝子を発現させるために本発明に従って遺伝子操作された細菌の使用を例示する。より見やすくするために、図が、キュベットのポラロイド写真に取り込まれたデータを示すために選ばれた（着色が、各キュベットについてポラロイド写真において観察される着色に対するその強度で表される）。キュベットＡは、０μＭの水銀を含有する培地における増殖であり；キュベットＢは、５μＭの水銀を含有する培地における増殖であり；キュベットＣは、１０μＭの水銀を含有する培地における増殖であり；そしてキュベットＤは、２０μＭの水銀を含有する培地における増殖である。パネルＩは、示されたレベルの水銀の存在下における１６時間の増殖の後でのＯＤ６００測定値を示す。パネルＩＩはパネルＩにおける測定値の画像表示である。パネルＩＩＩはパネルＩＩのそれぞれのキュベットにおける細菌であり、しかし、この場合、１ｍｌの培地あたり１００μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）基質を加えた。細菌は、Ｘ−ｇａｌを切断し、かつ、水銀への暴露レベルに反比例しているが、典型的な青色を生成する能力を失っている。
【図９】図９は、本発明に従ってβ−ｇａｌを発現する細菌におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の低下を実証している。図９Ａは、示された量の水銀および１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌの存在下で増殖させられた細菌の写真である。それぞれの培養バイアルの下側の着色された棒はバイアルにおける含有物の色とほぼ同じであり、検出キットとともに供給されることになるカラーコードとして使用されることが意図される。図９Ｂは、β−ｇａｌを発現する細菌、Ｘ−ｇａｌおよび汚染液を含む培養物の保持／増殖のためのチューブを示す。容器には、示された濃度の水銀の存在下における細菌培養物についての予想される色強度を示すカラーチャートが添付されるか、または付随する。図９Ｃは図９Ｂの概略的表示である。
【図１０】図１０は、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｌａｃＺ−３’ＵＴＲ発現カセットを含む細菌細胞株（「ｌａｃＺ」）、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｍｔ１−３’ＵＴＲ発現カセットを含む細菌細胞株（「ｍｔ１」）およびｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｐｐｋ−３’ＵＴＲ発現カセットを含む細菌細胞株（「ｐｐｋ」）が、示された濃度のカドミウム、鉛および亜鉛を含有する培地に耐え、その培地において増殖し得ることを明らかにする細菌バイオアッセイを示す。形質転換されていない大腸菌株ＪＭ１０９をコントロールとして使用した。細菌培養物の吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）を、亜鉛、カドミウムおよび鉛が補充されたＬＢ栄養培地における２４時間の増殖の後で測定した。図１０Ａは、１，０００μＭのＺｎＣｌ２において増殖する細菌細胞株を示す。図１０Ｂは、２５０μＭのＣｄＣｌ２において増殖する細菌株を示す。図１０Ｃは、３，０００μＭの酢酸鉛Ｐｂ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２・３Ｈ２Ｏにおいて増殖する細菌クローンを示す。
【図１１】図１１は、遺伝子組換え遺伝子を発現する細菌による水銀の捕捉を示す。本発明によるｌａｃＺ構築物によって形質転換された細菌を、１２０μＭの水銀を含有する培地において３７℃で１２０時間増殖させた。細菌を遠心分離によって除き、洗浄し、最初の培養の体積と同じ体積の培地に再懸濁した。再懸濁された細胞（「ＬａｃＺ細菌」）を、どのような水銀も放出させるために処理し、原子吸光分析法によって分析した。処理された培地の水銀濃度、および、ｌａｃＺ遺伝子を発現する細菌の水銀濃度を分光分析結果から計算した。
【００４０】
これらの図に示される実験を多数回行った。棒による偏差を示す図（図１、図２、図３、図７、図１０および図１１）に示される実験では、実験が少なくとも三連で行われた。棒は結果の範囲内での１標準偏差を示す。
【００４１】
別途示される場合を除き、細菌の増殖を測定したこれらの図に示される実験では、それぞれの培養のための開始接種物（「シード」）は、０．０１のＯＤ６００でのスターター培養物の同じサイズのアリコートであった。
【００４２】
ｌａｃＺ構築物の有効性を試験するいくつかの実験では、細菌培養物（非形質転換および形質転換）は２００ｍｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含有した。しかしながら、ｌａｃＺ遺伝子が構成的プロモータから転写される実験では、ＩＰＴＧによる発現の誘導が全く必要なかったことには留意しなければならない。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、キレート化／捕捉作用因子を使用する重金属浄化のための安全で、効率的かつ費用効果的な方法を提供する。好ましい実施形態は、捕捉作用因子を発現する細菌細胞の使用に着目する。
【００４４】
３つの例示的な捕捉作用因子が細菌において発現されており、これにより、細菌を高レベルの重金属に対して、具体的には、鉛、カドミウム、亜鉛および水銀に対して抵抗性にしている：すなわちメタロチオネイン（ｍｔ）、ポリリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）およびβ−ガラクトシダーゼの各タンパク質。驚くべきことに、今回、捕捉作用因子遺伝子が、高レベルの発現および重金属に対する宿主細胞の抵抗性を生じさせる様式で発現され得ることが示されている。別の好ましい実施形態によれば、細胞に基づかない捕捉作用因子が用いられる。
【００４５】
細菌細胞に基づくシステムにおいて、キレーター作用因子タンパク質が、融合タンパク質の必ずしも一部となることなく発現させられる。ｍｅｒ遺伝子の同時発現は全く要求されない。アルギン酸塩または同じような化合物の支持床が、これらの遺伝子を発現する細菌のために全く要求されない。遺伝子操作された細胞は高レベルの重金属に耐える。これらの驚くべき観察結果が、本出願において記載されるように、細胞およびタンパク質に基づく生物浄化法に対する効果的な取り組みの開発を可能にしている。
【００４６】
本発明の１つの実施形態において、ベクターが、遺伝子を宿主細菌細胞において導入し、発現させるために提供される。ベクターは、宿主細菌細胞において複製することができる核酸構築物である。ベクター骨格は、当該ベクターによる細菌細胞の形質転換を示すために、形質転換マーカーのための遺伝子を含んでもよい。形質転換マーカーは、ベクターが存在する細胞を分化させ、当該ベクターを含まない正常な細胞から選抜するために使用される選択マーカー遺伝子であり得る。そのようなマーカーが当業者には広く知られている。一般に使用される選択マーカーには、特定の抗生物質（例えば、アンピシリンなど）に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。いくつかのベクター骨格はまた、どの細胞が当該ベクターにより形質転換されたかを単に示すにすぎないマーカー遺伝子を含むことができる。様々な形質転換マーカーが当業者には広く知られている。一般に使用される指標マーカー遺伝子の１つが、β−ガラクトシダーゼ酵素をコードするｌａｃＺ遺伝子の配列である。他の一般に使用される形質転換マーカーには、様々なルシフェラーゼ遺伝子およびＧＦＰが含まれる。形質転換された細菌により、この細菌が増殖する液体または固体表面が浄化される。あるいは、固体表面を最初、液体にさらすことにより洗浄／重金属溶出に供し、その後、本発明に従って遺伝子操作された細菌により、重金属が液体から除かれる。
【００４７】
ベクターの１つの構成成分が、多数の制限酵素認識配列を含むクローニング部位であり、この部位において、これらのマーカーならびにさらなる所望の核酸配列をベクターに導入してもよく、また、形質転換によって細胞に導入してもよい。
【００４８】
本発明の好ましいベクターはプラスミドである。好ましいプラスミドは、遺伝子組換え遺伝子配列の発現を可能にするために遺伝子操作されるプラスミドである。多数のベクターが知られており、また、特徴づけられている。例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄデータベースを参照のこと（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｖｅｃｔｏｒｄｂ／ｖｅｃｔｏｒ＿ｐａｇｅｓ／ｐｌａｓｍｉｄ＿ｐａｇｅｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ．ｈｔｍｌ、最近の訪問：２００９年６月３０日）。発現カセットの比較的容易な導入に備えるプラスミドの様々な例がこの技術分野では広く知られており、また、市販されている。好ましいベクターはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）である。
【００４９】
１つの具体的な実施形態において、キレート化作用因子を細菌細胞において発現させるためのプラスミドが提供された。このプラスミドは、キレーター遺伝子と、プラスミドがキレーター遺伝子を高レベルに細菌細胞において発現させることを可能にする他の要素とを有する発現カセットを含んでいた。そのような他の要素（「遺伝子発現要素」）には、プロモータ配列、翻訳エンハンサー配列および転写終結配列が含まれ、ただし、これらはすべて、当業者によって十分に理解される様式で機能的につながれた。キレーター遺伝子は、転写終結配列の非存在下においてさえ、本明細書中に記載されるレベルに十分に発現されるかもしれないことには留意しなければならない。だが、発現を強く高めるそれらの能力のために選択されるので、３つすべての発現要素が存在することが望ましい。
【００５０】
調節性機能体の効果的な組合せはどれも、満足するほどに高発現かつ安定した発現システムをもたらすことができる。本発明は好ましくは、強力な転写プロモータを用いて実施される。プラスミドは、異なるタイプのプロモータ、例えば、構成的プロモータ、誘導可能なプロモータ、細胞特異的プロモータまたは組織特異的プロモータを含み得ることが意図される。同様に、他の効果的な転写エンハンサーおよび転写ターミネータが、特定の組合せにおいてであるが、満足するほどに高発現かつ安定した発現をもたらし得ることが可能である。
【００５１】
１つの好ましい実施形態において、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子配列に由来する構成的プロモータを利用した。スリラマン（Sriraman,P.）ら、プラント  フィジオロジー（Plant Physiol.）、１１７：１４９５〜１４９９（１９９８）、および、ユカワ（Yukawa,M.）ら、プラント  モレキュラー  バイオロジー（Plant Molecular Biology）、２３：３５９〜３６５（２００５）。１６Ｓ  ｒｒｎプロモータ配列がカセットの機能的要素として組み込まれた。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において提供される発現カセットの別の要素が翻訳エンハンサー配列（「５’ＵＴＲ」）である。翻訳エンハンサー配列により、プラスミド内の遺伝子組換えタンパク質配列の翻訳が増進する。本発明による好ましい翻訳エンハンサーがバクテリオファージＴ７の遺伝子１０の５’エンハンサー要素である。オリンズ（Olins,P.O.）およびラングワラ（Rangwala,S.H.）、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J.Biol.Chem.）、２６４：１６９７３〜１６９７６（１９８９）。本発明において利用されるエンハンサー要素の配列が、発現カセットにおいて、ｍｔ１遺伝子、ｐｐｋ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を増幅するために使用される合成された５’遺伝子隣接ＰＣＲオリゴヌクレオチド（プライマー）の中に組み込まれた。
【００５３】
適切な生物浄化戦略のために使用され得るプラスミドの別の要素が、自身がキレーターであるか、または、捕捉分子を生じさせることができる酵素であるタンパク質をコードする遺伝子配列からなる。キレータータンパク質、および、捕捉分子を生じさせることができる酵素の両方／どちらもが、本明細書中では、交換可能であるが、「キレーター作用因子」または「捕捉作用因子」として示される。言い換えれば、直接にキレーターである遺伝子産物、あるいは、キレート化分子または捕捉分子を生じさせる遺伝子産物はどれも、本発明によるキレーター作用因子である。いくつかのキレーター作用因子の例には、ｐｐｋ、ｍｔ１、フィトキラチン（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびｍｅｒＰが含まれる。
【００５４】
１つの好ましいそのようなキレーター作用因子は、メタロチオネイン（ＭＴ）タンパク質である。メタロチオネイン（ＭＴ）は、金属イオンを生物学的に不活性な形態で捕捉するシステインリッチな低分子量の金属結合性ペプチドである。ハマー（Hamer,D.H.）、アニュアル  レビュー  オブ  バイケミストリー（Annu.Rev.Biochem.）、５５：９１３〜５１（１９８６）。１つの特に好ましいｍｔ遺伝子がマウスに由来し（「ｍｔ１遺伝子」）、ｍｔ１タンパク質をコードする。マウスｍｔ１のｃＤＮＡを含有するｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ１０ベクターが、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）クローン＃ＭＧＣ４７１４７から得られた。ストラウスバーグ（Strausberg,R.L.）ら、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、９９：１６８９９〜１６９０３（２００２）もまた参照のこと。ｍｔ１遺伝子が、ｍｔ１遺伝子に対するｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ１０からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。ｍｔ１のコード配列に対する全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）の配列、すなわち、ｇｉ＃：ＢＣ０３６９９０が、ＰＣＲによってｍｔ１のコード配列をその後のクローニングのために単離するために使用されたＰＣＲ増幅プライマーを設計および開発するために使用された。
【００５５】
別の好ましいキレーター作用因子遺伝子配列が、強力にキレート化するポリリン酸の合成に関わるポリリン酸キナーゼ酵素をコードするｐｐｋ配列である。無機のポリリン酸は、高エネルギーのホスホアンヒドリド（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｈｙｄｒｉｄｅ）結合によって連結されるオルトリン酸の、負荷電の長い線状ポリマー鎖である。コーンバーグ（Kornberg,A.）、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、１７７：４９１〜４９６（１９９５）。これらのリン酸ポリマーは長さにおいて様々であり得るし、生命のあるすべての生物に対して遍在する。ｐｐｋ遺伝子によってコードされる酵素のポリリン酸キナーゼは、長いポリリン酸鎖を形成するためにＡＴＰからのγ−リン酸の重合を引き受ける。好ましいｐｐｋ遺伝子は細菌（とりわけ、大腸菌）に由来し、好ましいｐｐｋキレーター作用因子が、この遺伝子から発現されるポリリン酸キナーゼ酵素、および、このポリリン酸キナーゼ酵素のポリリン酸生成物である。好ましい実施形態において、ｐｐｋ遺伝子は、ＮＣＢＩ配列ＮＣ０００９１３から設計されるＰＣＲ増幅プライマーを使用して、大腸菌Ｋ１２からＰＣＲによって増幅された（このｐｐｋ遺伝子は、上記ＮＣＢＩ配列における塩基２，６２１，０６６から塩基２，６２３，１３２までの２．０７ｋｂの領域である）。アキヤマ（Akiyama,M.）ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J.Biol.Chem.）、２６７：２２５５６〜２２５６１（１９９２）、および、ブラットナー（Blattner,F.R.）ら、サイエンス（Science）、２７７：１４５３〜１４７４（１９９７）。
【００５６】
さらに別の好ましいキレーター作用因子遺伝子配列は、大腸菌Ｋ１２に由来する、β−ガラクトシダーゼについてのｌａｃＺ遺伝子配列である。Ｋ１２の３，０７２塩基対のｌａｃＺ遺伝子は大腸菌におけるラクトースオペロンの一部であり、二糖（例えば、ラクトースなど）の加水分解を触媒する酵素β−ガラクトシダーゼを発現する。カルニンス（Ｋａｌｎｉｎｓ，Ａ．）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）、２：５９３〜５９７（１９８３）ら。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼは、補因子としてのカリウムイオンおよびマグネシウムイオンによって活性化される４６４ｋＤａの四量体タンパク質である。この酵素は、Ｘ−Ｇａｌ、すなわち代謝されて、明るい青色で、かつ、指標マーカーまたはレポーターマーカーとして機能し得る不溶性生成物（５−ブロモ−４−クロロインドール）を形成する無色の修飾されたガラクトース糖を代謝することができるために、分子生物学および遺伝学において広く使用されている。ｌａｃＺ遺伝子は、ＮＣＢＩ配列ＮＣ＿０００９１３から設計されるＰＣＲ増幅プライマーを使用して、大腸菌Ｋ１２のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した（ｌａｃＺは塩基３６２，４５５から塩基３６５，５２９までの３．０８ｋｂの領域である）。ブラットナー（Blattner,F.R.）ら、サイエンス（Science）、２２７：１４５３〜１４７４（１９９７）。
【００５７】
水銀捕捉に関して、本発明は一般に、別途具体的に議論される場合を除き、無機水銀の捕捉を本明細書中には示し、例示することに留意しなければならない。しかしながら、システムが機能的な遺伝子組換えリアーゼ（例えば、ｍｅｒＢ遺伝子など）もまた含むならば、本発明は有機水銀の捕捉についてもまた可能にする。ルイズ（Ruiz,O.）ら、プラント  フィジオロジー（Plant Physiol.）、１３２：１３４４〜１３５２（２００３）；ビジリー（Bizily,S.）、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、９６：６８０８〜６８１３（１９９９）。
【００５８】
本発明の１つの実施形態において示される発現カセットの別の随意的要素が、転写終結配列からなる。１つの好ましい実施形態において、転写終結配列は３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性転写ターミネータ配列である。好ましい３’−ＵＴＲ配列の例には、細菌および色素体由来のｒｐｓ１６が含まれる。細菌のｒｒｎＢターミネータ配列についての記述が、アベ（Abe,H.）ら、ジーンズ  トゥー  セルズ（Genes to Cells）、４：８７〜９７（１９９９）によって提供される。特に好ましいターミネータが、ハイエス（Hayes,M.L.）ら、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic Acids Res.）、３４：３７４２〜３７５４（２００６）によって記載される色素体由来のｒｐｓ１６ターミネータである（これはまた、本明細書中どこか他のところではｒｐｓＴとして示される；この場合、「Ｔ」は「ターミネータ」を表す）。ｒｐｓ１６遺伝子の転写ターミネータ配列が、ｍｔ１遺伝子、ｐｐｋ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子に対する合成された３’ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチド（プライマー）の一部として組み込まれた。
【００５９】
これらの遺伝子要素を含むカセットを作製するための好都合なアプローチが、導入遺伝子のためのＰＣＲプライマーである合成オリゴヌクレオチドを作製することであり、この場合、２つのＰＣＲプライマーは５’制御要素（プロモータ、エンハンサー）および３’−ＵＴＲをそれぞれ含む。本明細書中上記で、本発明者らは、特定の遺伝子要素を得るために用いられ、また、特定の遺伝子要素を調製して、これを発現カセットに移すために用いられる特定の分子的方法（ＰＣＲ、合成オリゴヌクレオチドなど）を記載したにもかかわらず、代替プライマー、代替設計およびさらなる方法論が、これらの遺伝子要素を含む発現カセットおよび移入ベクターを作製するという同じ目標を達成するために利用可能であることが、当業者によって認識されるであろう。
【００６０】
発現カセットが構築されたが、この発現カセットは、発現のための導入遺伝子と、遺伝子発現制御要素とを機能的につながれて含む。上記には、好ましい要素が列挙される：色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子に由来するプロモータ；バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲ；および、ｒｒｎＢ配列またはｒｐｓ１６転写ターミネータ（３’−ＵＴＲ）のどちらか、好ましくは、ｒｐｓ１６。（ｒｐｓ１６およびｒｐｓＴは、本特許出願においては同じ３’ＵＴＲのために交換可能に使用される名称である）。このカセットは、下記でさらに詳述されるように、細菌における強い発現を提供することが今回明らかにされている、細菌における使用のための調節要素の予想外の組合せを含む。１つの実施形態によれば、本発明のベクターにおける発現制御配列は、強いプロモータと、５’ＵＴＲとを含み、好ましくは、１６Ｓ  ｒｒｎプロモータ配列と、バクテリオファージＴ７の遺伝子１０の５’ＵＴＲとを含む。より好ましい実施形態において、ベクターはさらに３’ＵＴＲを含み、好ましくはｒｒｎＢまたはｒｐｓ１６の３’ＵＴＲを含み、さらにより好ましくはｒｐｓ１６の３’ＵＴＲを含む。好ましい実施形態によれば、細菌は、これらのキレーター作用因子遺伝子組換え配列を非常に発現するように遺伝子操作された。得られた細菌は高レベルの重金属汚染に対して抵抗性である。
【００６１】
当然の結果として、本明細書中に記載される好ましいプロモータ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの組合せは、発現された導入遺伝子がキレーター作用因子または何らかの他の遺伝子産物であるかにかかわらず、安定な転写物および翻訳産物の高レベル発現のための好ましい発現システムを構成する。
【００６２】
ベクターを様々な細胞および生物に導入するための形質転換方法が広く知られている。例えば、ベクター構築物を、塩化カルシウム／熱ショック法（化学的コンピテント細胞法）、エレクトロポレーション、プラスミド接合および微粒子衝撃などにより導入してもよい。
【００６３】
ベクターは、キレート化作用因子を発現させるために生物に形質転換により導入される。好ましい実施形態において、ベクターは、生物浄化法のために利用され得る生物（例えば、植物、菌類、藻類または細菌など）に形質転換により導入される。
【００６４】
特に好ましい実施形態において、生物は細菌である。好ましい細菌は、環境に遍在し、細かい条件を必要とすることなく増殖し、自然環境において容易に持続可能な細菌である。本発明の捕捉作用因子をコードする発現カセットおよび／または導入遺伝子による形質転換のための特に好ましい細菌は、大腸菌、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）（例えば、シュードモナス・エウリギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｕｒｉｇｉｎｏｓａ））、シアノバクテリア・エスピー（Ｃｙａｎｏｂａｔｅｒｉａ  ｓｐ．）（例えば、ノストク・コンムネ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｃｏｍｍｕｎｅ）またはオシラトリア・アモエナ（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ａｍｏｅｎａ））およびバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（例えば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｒｅｕｓ））である。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、キレーター作用因子遺伝子配列は、ｌａｃＺ、ｍｔ１またはｐｐｋである。β−ガラクトシダーゼ、メタロチオネインおよびポリリン酸キナーゼを発現する遺伝子組換え細菌は、重金属および水銀を液体から除くことができることが示された。上記で記載される細菌構築物は、水銀抵抗性における著しい改善と、以前に報告されたよりも少なくとも８倍大きいレベルへの蓄積とを示している。
β−ガラクトシダーゼ（「β−ｇａｌ」）は、細菌がラクトース代謝のために必要とするテトラペプチド酵素である。β−ｇａｌは、そのタンパク質配列が１９７０年に明らかにされた以降、広く知られている。β−ｇａｌタンパク質は、重金属または水銀を捕捉することは知られていなかった。下記の実施例において記載されるように、今回、β−ｇａｌが、水銀に対する大きい親和性を有すること、および、過剰発現されたときには水銀と効率的に結合することが示されている。β−ｇａｌが、大きい濃度の水銀にさらされる細菌に抵抗性を与え得ることは知られていなかった。また、β−ｇａｌは、高濃度のカドミウム、亜鉛および鉛の有害な影響から保護した。
【００６６】
β−ガラクトシダーゼ発現カセット（ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−Ｂｇａｌ−ｒｐｓｔ）が細菌に導入されたとき、高レベルの転写が観察された。さらに、細菌は高濃度の水銀に対して抵抗性になった。形質転換されていない細菌は、５μｇ／ｍｌのＨｇにさらされたとき、著しい増殖低下を示し、また、より高い濃度では全く増殖しなかったが、β−ｇａｌを発現させるこのプラスミドにより形質転換された細菌は、０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、１００μＭ、１２０μＭ、１４０μＭおよび１６０μＭの水銀の試験された濃度のそれぞれに対して抵抗性である。図１および図２に示されるデータは、形質転換された細菌が約１４０μＭまでの水銀濃度において生存するだけでなく、これらのレベルの水銀において実際に繁殖することを示している。（図１および図２には示されない）他のデータは、同様にまた１６０μＭのＨｇにおける形質転換細菌の繁殖を示した。このプラスミドを含有する細菌は、汚染された水および土壌に見出される同じような濃度の水銀において容易に耐え、増殖し、かつ、複製する。
【００６７】
類似する実験において、本発明に従ってβ−ｇａｌにより形質転換されたとき、細菌が、少なくとも約２５０μＭまでのカドミウムを含有する培地において耐え、かつ、複製し得ることが明らかにされた（図１０を参照のこと）。また、本発明に従ってβ−ｇａｌにより形質転換された細菌は、少なくとも約１，０００μＭまでの亜鉛を含有する培地において耐え、かつ、効率的に複製することができた。この同じ遺伝子組換え細菌は、少なくとも約３，０００μＭまでの鉛に対する抵抗性を明らかにした。
【００６８】
ｍｔ１発現カセット（ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｍｔ１−ｒｐｓｔ）が細菌に導入されたとき、高レベルの転写が観察された。図３Ａを参照のこと。さらに、細菌は高濃度の水銀に対して抵抗性になった。ｍｔ１を発現させるこのプラスミドにより形質転換された細菌は、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、１００μＭ、１２０μＭ、１４０μＭおよび１６０μＭの水銀の濃度に対して抵抗性であった。図１および図２に示されるデータは、形質転換された細菌が、少なくとも約１６０μＭまでの水銀濃度において生存するだけでなく、これらのレベルの水銀において実際に繁殖することを示している。細菌増殖速度が、水銀レベルに比例しているが、やや低下することには留意しなければならない。それにもかかわらず、細菌増殖の飽和レベルが達成される。このプラスミドを含有する細菌は、汚染された水および土壌に見出される同じような濃度の水銀において容易に耐え、増殖し、かつ、複製する。
【００６９】
類似する実験において、ｍｔ１を本発明に従って発現する細菌クローンは、少なくとも約２５０μＭまでのカドミウムおよび少なくとも１０００μＭまでの亜鉛を含有する培地において耐え、かつ、複製し得ることが明らかにされた。ｍｔ１を発現する細菌クローンはまた、少なくとも約３，０００μＭまでの鉛に対する抵抗性を示した。図１０を参照のこと。
【００７０】
同様に、ｐｐｋ発現カセットが細菌に導入されたとき、高レベルの転写が観察された。図３Ｂを参照のこと。さらに、細菌は高濃度の水銀に対して抵抗性になった。ｍｔ１を発現させる上記のプラスミドにより形質転換された細菌は、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭおよび１００μＭの水銀に対して抵抗性であった。図１および図２に示されるデータは、形質転換された細菌が約１００μＭまでの水銀濃度において生存するだけでなく、これらのレベルの水銀において実際に繁殖することを示している。このプラスミドを含有する細菌は、汚染された水および土壌に見出される同じような濃度の水銀において容易に耐え、増殖し、かつ、複製する。
【００７１】
類似する実験において、ｐｐｋを本発明に従って発現する細菌クローンは、約３，０００μＭまでの鉛および約１，０００μＭまでの亜鉛を含有する培地において耐え、かつ、複製し得ることが明らかにされた。加えて、遺伝子組換え細菌は約２５０μＭまでのカドミウムに耐えた。図１０を参照のこと。
【００７２】
明らかに、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎに由来するプロモータと、Ｔ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲと、細菌由来ｒｒｎＢまたは色素体由来ｒｐｓ１６の３’ＵＴＲとを含むベクターは、これらの例示されたキレーター遺伝子を高コピー数で発現させている。当然の結果として、組合せでのこれらの発現制御配列は、他の遺伝子を、高レベルで、すなわち、これらのキレーター遺伝子について認められるのと類似するコピー数を伴って、または、１ｎｇの総ｍＲＮＡあたり少なくとも約４，０００コピー、４，５００コピー、５，０００コピー、５，５００コピー、６，０００コピー、６，５００コピー、７，０００コピー、７，５００コピー、８，０００コピー、８，５００コピーの全長体を伴って発現させるために使用し得る。
【００７３】
１ｎｇの総ｍＲＮＡあたり少なくとも約４，０００コピー、４，５００コピー、５，０００コピー、５，５００コピー、６，０００コピー、６，５００コピー、７，０００コピー、７，５００コピー、８，０００コピー、８，５００コピーの全長体の、細菌におけるキレート化作用因子ｍＲＮＡの産生を引き起こすための強いプロモータならびに／または適切な５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む細菌における遺伝子構築物はどれも、そのような構築物を含む細菌が、重金属を含む環境において耐え、かつ、繁殖しながら、重金属とキレート形成することによって、重金属を含有する液体または固体を効果的に浄化することを可能にする。好ましくは、細菌は１ｎｇの総ｍＲＮＡあたり約６，０００コピー〜７，５００コピーのキレーター作用因子を発現する。
【００７４】
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを有する遺伝子組換え細菌は、水銀ならびに水銀汚染および水銀流出跡、また、他の重金属を検出するためのバイオセンサーとしても効果的に使用し得る。Ｘ−ｇａｌの切断により、５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インジゴ、すなわち、不溶性の青色化合物が放出される。β−ガラクトシダーゼを化合物Ｘ−Ｇａｌ（およびＸ−ｇａｌ類似体）の存在下で発現する遺伝子組換え細菌は、容易に区別可能な濃青色反応を生じさせる。しかしながら、今回、この青色の強度が水銀の濃度に比例して低下したことが観察された。図８および図９を参照のこと。同様に、他の重金属（例えば、カドミウム）の存在は、Ｘ−ｇａｌ（およびＸ−ｇａｌ類似体）の切断および青色化合物の生成を妨害するという同じ効果を有することができた。これらの特徴はβ−ｇａｌをインシトゥーまたはインビトロでのバイオセンサーとして好適にする。したがって、細菌におけるβ−ガラクトシダーゼの発現は細菌を水銀の有害な影響から保護し、だが、ラクトースおよびラクトースアナログ（例えば、Ｘ−Ｇａｌなど）を代謝する酵素の能力をも低下させる。
【００７５】
本発明の１つの態様において、重金属を検出するためのキットが示される。１つの実施形態によれば、キットは、流体のための試験バイアルまたは容器、試験用細片上のβ−ガラクトシダーゼ発現細菌培養物またはβ−ガラクトシダーゼ酵素、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）、および、インジケータ細片を含む。インジケータ細片は、β−ガラクトシダーゼがＸ−ｇａｌを減少させる程度を特定するカラーマーカーを含有する。それぞれのマーカーが、異なる色調の青色を有することができ、ただし、そのような色調は、重金属（例えば、水銀）の異なる濃度にさらすことによって事前に決定される。
【００７６】
キットは、水銀、または、カドミウム、鉛および亜鉛を含む他の重金属を検出する方法を実行するために利用される。この方法は、試験サンプルを流体のための容器に入れる工程を含む。場合によっては、試験サンプルが固体である場合には、液体が、水銀／重金属を固体から放出させるために加えられる。Ｘ−ｇａｌが加えられる。流体が、所定の期間、β−ｇａｌタンパク質を含む細菌培養物または試験用細片との接触状態に置かれる。次に、培養物の色が、水銀が流体に存在するか、また、どのような濃度で存在するかを決定するために、インジケータ細片上のマーカーと比較される。重金属または水銀の濃度が高いいくつかの場合には、キットは陽性／陰性の結果を提供し得るだけであり、濃度の全範囲を示さないかもしれない。
【００７７】
上記で記載されるキットの代わりの実施形態はさらに、１組の標準物を含んでもよい。標準物は、様々な濃度のＨｇが溶液中に存在する様々な標準物容器を含むことができる。限定されない一例として、容器は下記のＨｇ濃度：Ａ：０μＭ；Ｂ：５μＭ；Ｃ：１０μＭ；および、Ｄ：２０μＭを有してもよい。
【００７８】
キットは下記の様式で利用してもよい。指定された体積の試験材料および液体（材料が固体であるならば）が試験バイアルに入れられ、示された濃度でのＨｇ標準物の所定の体積がそれぞれの標準物バイアル（Ａ：０μＭ；Ｂ：５μＭ；Ｃ：１０μＭ；およびＤ：２０μＭ）に入れられる。所定の体積の遺伝子組換え細菌が試験バイアルおよび標準物バイアルのそれぞれに入れられる。Ｘ−ｇａｌがそれぞれのバイアルに加えられる。培養物は、指定の期間インキュベーションされ得る。好ましくは、インキュベーション時間は約１分〜２０分の間であり、より好ましくは５分〜１０分の間である。インキュベーション期間が終了した後、試験バイアルの着色が、サンプルにおける水銀のおおよその濃度を求めるために標準物バイアルと比較される。
【００７９】
代わりとなる実施形態が、水銀および他の重金属が重金属の濃度に対する相関においてβ−ｇａｌのＸ−ｇａｌ切断能を次第に低下させるという概念に基づいて容易に設計されることが、当業者には十分に理解されるであろう。例として、しかし、これらの例に限定されないが、細菌が非液体形態（例えば、凍結乾燥された形態）で提供され、β−ｇａｌを含む細菌が環境株の細菌であり、インキュベーションが特定の温度で、例えば、３７℃または室温で行われ、精製されたβ−ｇａｌが、β−ｇａｌ遺伝子を発現する細菌の代わりに用いられ、あるいは、培養ミックスにおけるβ−ｇａｌ発現ベクターまたはβ−ｇａｌ酵素により、着色アッセイが水銀の濃度と相関し得る範囲が増大させられる。試験サンプルは固体または固体の液体洗浄物である。同様に、代替となるカラーアッセイ、および／または、色変化を正確に測定するための光学機器（例えば、分光光度計、比色計）の使用が可能である。色効果強化技術の使用もまた知られており、可能である。これらの代替設計および他の設計が当業者には広く知られており、本発明の範囲内である。
【００８０】
本発明のさらに別の態様において、β−ガラクトシダーゼタンパク質は、それ自体で、すなわち、細胞キャリアの非存在下、インシトゥー適用およびインビトロ適用のための流出跡清浄化システムの一部として重金属または水銀のためのキレート化作用因子として使用することができる。β−ｇａｌが市販されており、また、この酵素を発現する生物から、広く知られている標準的な分離技術によって容易に精製することができる。この酵素を多量に単離することが、その過剰発現によって、また、この酵素に対する抗体が商業的に入手可能であることによって容易になり得る。製造目的のために、細胞におけるβ−ｇａｌの発現をＩＰＴＧの添加によって遺伝子操作することができる／増大させることができる。β−ｇａｌタンパク質の様々な商業的供給者が知られている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００８１】
同様に、メタロチオネイン、および、ポリリン酸キナーゼのポリリン酸生成物を、それら自体で、すなわち、細胞キャリアの非存在下、浄化取り組みにおいて、亜鉛、カドミウム、鉛または水銀を含む重金属のためのキレート化作用因子として利用することができる。
【００８２】
また、強いプロモータ、または、特定の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ、または、好ましくは、強い色素体のプロモータ、バクテリオファージＴ７のエンハンサーおよび効果的な色素体由来転写ターミネータ配列の特定の組合せは、メタロチオネイン（ｍｔ１遺伝子）、ポリリン酸キナーゼ（ｐｐｋ遺伝子）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）の細菌における発現を、水銀および他の金属のための効果的な生物浄化システムとしてのそれらの使用および商業化を可能にするレベルにまで可能にすることが、本発明において示されている。上記で記載されるプラスミドは、これらの導入遺伝子および他の導入遺伝子の大きいｍＲＮＡ転写およびタンパク質翻訳を生じさせることができる強化された遺伝子発現構築物を提供する。
【００８３】
本発明の捕捉作用因子を含む細菌は、この細菌を捕捉による生物浄化法のために理想的に適したものにする性質を獲得した。１つには、この細菌は長期間にわたって高レベルの水銀に対して抵抗性であった。図１および図２を参照のこと。この細菌は高レベルの水銀に対して抵抗性であっただけでなく、この細菌はこれらのレベルにおいて繁殖した。管理された実験において、非形質転換細菌は、５μＭの水銀の存在下では低下した増殖を示し、１０μＭの水銀の存在下では増殖を全く示さなかった。それに反して、ｐｐｋ遺伝子を発現させる構築物により形質転換された細菌は、１０μＭの水銀を含有する培地において増殖における低下をほとんどまたは全く示さず、また、約１００μＭまでの水銀の濃度において増殖した。意義深いことに、細菌の繁殖が時間とともに続いた。同じ構築物が水銀における１２０時間の増殖の後で試験されたとき、ｌａｃＺ構築物は、さらなる増殖を約１４０μＭまでの水銀において時間とともに示し、水銀の非存在下で増殖した非形質転換細菌に対して総増殖レベルにおいて区別できないほどであった。ｍｔ１遺伝子構築物は、さらなる増殖を（やや低下した増殖速度においてであるにもかかわらず）約１６０μＭまでの水銀において示し、水銀の非存在下で増殖した形質転換細菌または非形質転換細菌の総増殖レベルにおいて区別できないほどであり、また、低下したが、著しい増殖を、１６０μＭまでの水銀を含有する培地において示した。ｐｐｋ構築物は、さらなる増殖を８０μＭまでの水銀において示し、水銀の非存在下で増殖した形質転換細菌の総増殖レベルにおいて区別できないほどであった。ｐｐｋ構築物は、０〜８０μＭの水銀のどの濃度においても、増殖における小さい低下を示した。リン酸利用能が、小さい影響をｐｐｋ遺伝子により形質転換された細菌の増殖に対して有したことが考えられる。
【００８４】
流体の成功した浄化が、１２０μＭの水銀を含有する液体が、本発明の捕捉作用因子を含む細菌への暴露によって試験された実験において示された。図７を参照のこと。遺伝子組換え細菌への暴露による水銀含有培地の１２０時間の処理の後、培地は、残留する細菌が除かれた（これにより、「処理済み培地」がもたらされた）。非形質転換（「ｗｔ」）細菌シードが、処理済み培地、０μＭの水銀を含有する新鮮な培地、および、１２０μＭの水銀を含有する新鮮な培地に加えられた。細菌が、処理済み培地と、水銀を含まない新鮮な培地とにおいて十分に等しく増殖した。このことは、処理済み培地は５μＭ未満の水銀濃度を有したことを示している。遺伝子組換え細菌はこれら３つの高いレベルの水銀において増殖しただけでなく、この重金属を捕捉し、除去した。
【００８５】
原子吸光分析法による分析によってもたらされる定量的データは遺伝子組換え細菌の浄化効率を示した。図１１を参照のこと。原子吸光分析法による分析は、ｌａｃＺ遺伝子を発現した遺伝子組換え大腸菌細菌における水銀の非常に高いレベルの蓄積を示した。ｌａｃＺを発現する大腸菌細胞を、１２０μＭのＨｇを有するＬＢ培地において３７℃で１２０時間増殖させた。細胞および培地を分光分析のために調製する方法は本質的には、環境保護局の方法３０１０Ａに従っている。細胞を遠心分離し、新鮮な培地において洗浄し、小体積の培地に再懸濁し、７０％（ｖ／ｖ）硝酸、３０％（ｖ／ｖ）過酸化水素および濃ＨＣｌにより９５℃で消化し、細胞が増殖させられた最初の体積に等しい体積にし、その後、原子吸光分析によって分析した。細菌細胞を遠心分離した後で得られる上清培地もまた、類似した処理の後で分析された。結果は、遺伝子組換え細菌が、水銀を培地から除き、その水銀を細菌細胞の内部に高い濃度で蓄積することにおいて非常に効率的であったことを示した。観察されたように、毒性水銀のほとんどが遺伝子組換え細菌において見出され、一方、培地中の水銀は５μＭ未満の非毒性濃度にまで除かれた。これらの結果は、遺伝子組換えｌａｃＺ大腸菌が、最適に増殖しながら、水銀により非常に汚染されている液体をキレート化によって生物浄化する能力を有することを明らかにする。
【００８６】
別の非常に有用な性質が、形質転換された細菌に関して、具体的にはこれらの細菌を重金属および水銀にさらした後で発見された。この細菌は、水銀を含む重金属の十分な蓄積の後、より暗い色調に変わった。さらに、この細菌は、密に凝集および集塊化する傾向があった。細菌が増殖し得る特殊化されたフィルタ、または、遠心分離を必要とすることなく、そのような凝集した細菌を容器からすくい取り、液体をピペッティングするなどの様式で吸引することが可能である。凝集した細菌は、変色を暗い色調に変化させたので、容易に見ることができた。図６；図８、パネルＩＩ；および、図９、パネルＡを参照のこと。
【００８７】
凝集および暗い色調化の性質は、個々に、または、組合せで、生物浄化法において良好に使用することができる。それに従えば、本発明はまた、液体からの重金属または水銀の生物浄化および取り込みのための新規で、簡便かつ低コストな機構を提供する。
【００８８】
本発明に従って使用される１つの方法が、汚染された液体をリザーバに入れる第１の工程を含む。その後の工程において、本発明の捕捉／キレート化作用因子を発現させるプラスミドを含む細菌が、汚染された液体に加えられる。細菌は増殖し、重金属をその液体から除去することができる。細菌が水銀を除き、細胞において高い濃度の水銀に達するにつれ、細菌は溶液から沈殿し、密に結合した凝集物を形成する。その後、凝集物がふるい分けデバイスにより除かれる。さらなる遺伝子組換え細菌が、必要に応じて加えられる。
【００８９】
別の１つについては、暗い色素沈着は、細菌の除去が必要である点にまでプロセスが進行したことを示すために有用であるか、または、プロセスが実際に進行中であるという性状制御として有用であり、また、特定の色調化レベルは、ｌａｃＺシステムによる水銀モニターリングについて上記で記載されるこれらに匹敵する方法によって、汚染された環境に存在する水銀のレベルを示すために、または、汚染された環境に存在する水銀のレベルをモニターするために利用することができる。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、本発明に従ってキレート化作用因子を発現する細菌は、重金属または水銀を液体または固体マトリックスから除くためのろ過システムの一部として使用するための自立型バイオフィルムを形成する。１つの好ましい実施形態において、図４に記載されるように、下記のものを含む生物浄化システムが提供される：水リザーバ１０４；多孔性固体マトリックス１０８；水リザーバおよび／または多孔性固体マトリックスにおける細胞バイオフィルム１００（ただし、本発明の遺伝子構築物を含むＨｇ抵抗性細菌により、バイオフィルム１００が組み立てられる）；多孔性フィルタ１１２；および処理水出口１１６。遺伝子操作された細菌を、バイオフィルム１００を形成させるために多孔性固体マトリックス１０８上において増殖させることができる。
【００９１】
上記細菌は水銀および他の重金属に対して非常に抵抗性であるので、上記細菌は水銀を液体から効率的に除き、一方、水銀を細胞の内部に高い濃度で蓄積する。高い水銀耐性はまた、細菌細胞が分裂し、増殖することを可能にし、このことはバイオフィルタの有用寿命を延ばす。フィルタ上の細菌の着色は、その生物浄化活性、および、細菌の取り替えが望ましいときを示すことができる。
【００９２】
本発明に従って使用される１つの方法において、汚染された水が水リザーバ１０４に負荷される。この水は多孔性の固体マトリックス２０８を通って流れ、細胞バイオフィルム１００と接触することができる。バイオフィルにおける細胞が重金属混入物（例えば、水銀など）を捕捉する。清浄な水が多孔性フィルタ１１２を通過し、多孔性フィルタ１１２において、バイオフィルム１００から外れた何らかの細胞物、および、他の不純物が除かれる。その後、清浄な水が処理水出口１１６から放出される。
【００９３】
本出願において記載される配列の組合せは、細菌、藻類、植物、動物および菌類を含む様々なインビトロシステム、細胞システムおよび生物における新規な生物浄化システムとして使用することができる。細胞または生物は、捕捉作用因子を発現させ、それにより、重金属に対して抵抗性にし、汚染物質をキレート化によって培地から取り除くために遺伝子操作することができる。生物は回収されてもよく、重金属または水銀を工業的適用のために回収し、再利用することができる。これらの配列によってコードされるタンパク質を発現または含有するインビトロシステム、細胞または生物はまた、バイオリアクターの一部として使用することができ、または、土壌、水および堆積物の原位置での生物浄化のために使用することができる。
【００９４】
本発明による別の実施形態において、上記で記載される重金属キレート化システムまたは水銀キレート化システムと、重金属／水銀輸送機構とを含む細菌細胞が提供される。１つの限定されない例において、本発明によるプラスミドはまた、ｍｅｒオペロンのｍｅｒＴ遺伝子およびＭｅｒＣ遺伝子についての遺伝子配列を含むことができる。その後、プラスミドは細菌細胞に形質転換により導入することができ、これにより、水銀または他の重金属を細胞質空間内に輸送する能力と、その後、水銀を細胞内に捕捉する能力との両方が与えられる。ｍｅｒオペロンの他の遺伝子もまた、細胞内における重金属の捕捉を高めるために、また、有機水銀剤（例えば、メチル水銀、ジメチル水銀および酢酸フェニル水銀など）に対する抵抗性を提供するために利用され得ることが意図される。代替では、他の重金属輸送システムを、本発明において記載されるような様式で本発明の捕捉作用因子との組合せで使用することができる。
【００９５】
捕捉作用因子をコードする２つ以上の遺伝子を含む細菌システムまたは他の生物システムが作出され得ることが想定される。このことが、（捕捉以外の）捕捉作用因子の細胞代謝作用が異なること、および、捕捉作用因子としてのそれらの活性もまた異なること（例えば、直接的捕捉またはポリリン酸分子の形成）を考慮することによってより容易になる。したがって、２つ以上のタイプの捕捉作用因子の存在が宿主細胞／生物によって比較的十分に許容されることが予想される。
【００９６】
（実施例）
実施例１．本発明の捕捉作用因子は、高濃度の水銀、カドミウム、亜鉛および鉛に対する耐性をもたらし、それらの存在下における細菌増殖を可能する。本発明の１つの実施形態において、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の商標で販売されるベクターを含むプラスミドを、導入遺伝子を高レベルで発現させるために構築した。このベクターにおける発現カセットは、図５に示されるように、色素体の１６Ｓ  ｒｒｎ遺伝子プロモータ；バクテリオファージＴ７の遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲ翻訳エンハンサー要素；導入遺伝子；および、３’ＵＴＲのＲｈｏ非依存性ターミネータを含んだ。１つの実施形態において、３’ＵＴＲは葉緑体のｒｐｓ１６配列であった。遺伝子１０に由来する５’ＵＴＲを合成オリゴヌクレオチドから作製した。他の調節配列をポリメラーゼ連鎖反応により構築した。遺伝子要素は、好都合な制限酵素部位をそれぞれの要素の末端の近くに含むように作製した。これらの方法は当業者には広く知られている。例えば、サンブロック（Sambrook,J.）およびラッセル（Russell,D.）、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular cloning: A laboratory manual）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１年）を参照のこと。多数のプラスミド構築物が作製された（導入遺伝子により、ｌａｃＺ、ｍｔ１またはｐｐｋがコードされた）。
【００９７】
これらの構築物を含有する細菌クローンを、図１に示されるように、異なる濃度のＨｇＣｌ２を含有するＬＢ培地で１６時間増殖させた。図１において、図１Ａは、形質転換されていない大腸菌株ＪＭ１０９を表し、図１Ｂは、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｌａｃＺ−３’ＵＴＲベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を表し、図１Ｃは、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｍｔ１−３’ＵＴＲベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を表し、図１Ｄは、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｐｐｋ−３’ＵＴＲベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を表す。シード細菌接種物を細菌培養フラスコに加え、フラスコを、細菌培養物を増殖させるための典型的な様式で、３７℃で振とうしながらインキュベーションした。１６時間のインキュベーション期間が終了したとき、培養培地の吸光度をＯＤ６００ｎｍで測定した。
【００９８】
ほぼ同一の構築物（Ｐ１６Ｓプロモータ要素が存在しないことを除いて）もまた遺伝子操作し、形質転換により大腸菌に導入した。これらのＰ１６Ｓ非含有構築物において、プロモータはベクター由来であり、すなわち、ｌａｃＺプロモータであった。これらのＰ１６Ｓ非含有構築物を含む遺伝子操作された細菌もまた、増大した抵抗性および増殖を高レベルの水銀において示した。例えば、ｍｔ１遺伝子構築物は約２０μＭまでのＨｇにおいて生存し、ｐｐｋ構築物は約４０μＭまでのＨｇにおいて生存した。しかしながら、明らかであったが、比較によって、Ｐ１６Ｓ要素を含んだ構築物は、著しくより高いレベルの水銀において生存することができた。
【００９９】
ポリリン酸キナーゼは、両方のタンパク質がより低いレベルで発現されるとき、例えば、ｐＢＳＫ−ｇ１０−ｍｔ１−ｒｐｓＴベクターおよびｐＢＳＫ−ｇ１０−ｐｐｋ−ｒｐｓＴベクターの場合、メタロチオネインよりも良好なＨｇ抵抗性をもたらすようである。これらのタンパク質が過剰発現されるとき、メタロチオネインは、ポリリン酸キナーゼよりも大きい、Ｈｇの毒性影響からの保護をもたらした。本発明は、特定のキレーター作用因子のどのような作用機構によっても限定されない。それにもかかわらず、ｐｐｋまたはｍｔ１を比較的より低いレベルまたはより大きいレベルで発現する細菌における水銀に対する抵抗性における差は、これら２つのタンパク質の作用機構によって説明されるかもしれない。メタロチオネインの場合には、メタロチオネインがＨｇを直接に捕捉するので、より大きい発現レベルが、よい大きい抵抗性レベルに匹敵する。このことがポリリン酸キナーゼと異なる。ポリリン酸キナーゼは、酵素であるので、より低い酵素濃度においてさえ、より高レベルのポリリン酸を産生することができる。より高い酵素濃度では、細胞における酵素基質の利用可能性が供給不足状態であり、このことにより、その活性が制限されるので、Ｈｇ抵抗性における増加が、予想されたよりも低いかもしれない。ポリリン酸キナーゼは、長いポリリン酸鎖を形成するためにＡＴＰからのガンマ−リン酸の重合を引き受ける。
【０１００】
図１にまとめられる実験結果は、キレート化作用因子により形質転換されていない大腸菌（「ｗｔ」）は、約５μＭまでのＨｇを含有する培地において増殖することができ、だが、５μＭの水銀にさらされると、増殖が低下することを示す。示されたプラスミドにより形質転換された大腸菌は、２０μＭから、最大でも約４０μＭの水銀（ｐｋｋ）にまで、最大でも約８０μＭの水銀（β−ｇａｌ）にまで、最大でも約８０μＭの水銀（ｍｔ１）にまで及ぶ水銀の濃度において増殖させたときの１６時間の期間における増殖を示す。類似する実験では、図２に示されるように、遺伝子組換え大腸菌は、より高濃度の水銀の存在下においてさえ増殖し続けることができ、培養物は、より大きい密度を、ｐｐｋ構築物については１００μＭ、β−ｇａｌ構築物については１４０μＭ、ｍｔ１構築物については１６０μＭのおおよその水銀濃度に至るまでの様々な示された濃度のＨｇを含有するＬＢ培地における１２０時間のインキュベーションの後で達成する。したがって、細菌はこれらの高濃度の水銀に耐え、かつ、これらの高濃度の水銀において増殖し続けた。
【０１０１】
実施例２．本発明の構築物（ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−キレーター作用因子−３’ＵＴＲ）はキレーター作用因子要素を非常に大きいレベルに転写した。ｍＲＮＡを、非形質転換細菌、ならびに、ｍｔ１発現細菌クローンおよびｐｐｋ発現細菌クローンから集めた。総細胞ＲＮＡを、３００ｒｐｍの撹拌を伴って３７℃で１６時間、ルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）ブロスで増殖させた細菌クローンおよび非形質転換大腸菌ＪＭ１０９培養物の１ｍｌから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびプロトコルを使用することによって単離した。ＲＮＡサンプルを１００μｇ／ｍｌの濃度でのＤＮＡｓｅＩにより処理した。サンプルを正規化し、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してランダムプライマー増幅によって逆転写した。ｃＤＮＡを、増幅後の融解曲線分析とともに、２段階リアルタイムＰＣＲ増幅プログラムを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。遺伝子特異的な標準曲線を合成オリゴヌクレオチドから定量化のために作製した。導入遺伝子特異的プライマーを使用するリアルタイムＰＣＲはｃＤＮＡをｍＲＮＡテンプレートに対する比例的量で生じさせた。非形質転換細菌由来のｍＲＮＡをテンプレートとして使用するコントロール実験では、導入遺伝子の発現が全く示されなかった。導入遺伝子特異的ｍＲＮＡのコピー数を計算し、存在する総ｍＲＮＡに対して正規化した。図３において認められ得るように、クローンは、１ｎｇの総ｍＲＮＡあたり約７，０００コピーの、転写物のそれぞれを含有した。類似するデータが、Ｂ−ｇａｌ要素を含む構築物に関して得られる。当業者は、導入遺伝子が非常に高いレベルに転写されたことをこれらの数字が示していることを認識するであろう。
【０１０２】
実施例３．本発明の捕捉作用因子を含有する細菌は、水銀を蓄積するとき、凝集物を形成する。暗い着色、凝集および沈殿形成が、細菌を、十分な期間、十分に高い濃度またはより低い濃度で水銀において増殖させたときに認められた。例えば、図６に示されるように、１２０μＭのＨｇを含有するＬＢ培地におけるインキュベーションの後でのｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０（５’ＵＴＲ）−ｍｔ１−３’ＵＴＲサンプル（「ｍｔ１」）およびｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０（５’ＵＴＲ）−ｌａｃＺ−３’ＵＴＲサンプル（「ｌａｃＺ」）は、容器の底に蓄積する凝集物を形成する。類似する効果がまた、８０μＭのＨｇの存在下で増殖させた、ｍｔ１遺伝子またはｐｐｋ遺伝子を含む遺伝子組換え細菌に関して認められた。これらの変化は約２４時間後に認められ、また、これらの変化は時間とともに増大し、蓄積と比例していた。これら３つの細菌クローンのすべてを１５ｍｌの円錐チューブにおいて撹拌（約２８０ｒｐｍで）とともに増殖させた。凝集および沈殿形成が、静置インキュベーションを必要とすることなく、撹拌期間中に生じた。色変化および沈殿形成のこれらの効果が、試験された３つのキレーター作用因子のそれぞれに関して生じている。
【０１０３】
このことは、細菌の除去および取り替えをいつ行わなければならないかの視覚的インジケータを提供する。この効果は、多量の水銀を蓄積している細菌を取り除くことを、この細菌を液体から単にふるい分けすることによって容易にする。
【０１０４】
凝集および沈殿形成のこれらの効果が、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｍｔ１−ｒｐｓＴおよびｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｐｐｋ−ｒｐｓＴの細菌クローンにおいて認められている。したがって、遺伝子型の直接的な機能ではなく、むしろ、水銀に対する抵抗性および細胞における水銀の蓄積の機能であるようである。凝集および沈殿形成が、８０μＭ以上の水銀濃度において少なくとも２４時間増殖させた細菌において認められただけであった。より低い水銀濃度では、細胞はおそらくは、より長期間にわたって低濃度での水銀にさらされる必要があるであろう。それにもかかわらず、細菌が十分な水銀を蓄積すると、色変化、凝集および沈殿形成が、水銀のより低い濃度でもまた生じる。
【０１０５】
水銀を蓄積する遺伝子組換え細菌は暗い色を呈し、この色は細胞における水銀濃度が高いことの目安として役立つ。細胞の暗色化を４０μＭのＨｇまたはそれ以上で察知することができる。凝集、沈殿形成および着色の各効果は、細菌細胞が高い水銀濃度を蓄積すると、細菌細胞の特定および回収のための非常に有用な特徴をもつ；それらは、細胞がいつ、浄化中の環境から回収される状態であるかを決定するための有用なマーカーとすることができ、また、これらの細菌システムを水銀の生物浄化のために適用する費用を減らすことを助けることができる。これは、高濃度の水銀を蓄積することによる細菌細胞において誘発される形態学的変化の最初の報告である。
【０１０６】
実施例４．本発明の構築物を含む細菌にさらすことによる培養培地の処理の後では、処理された培養培地は重金属を実質的に含まない；水銀が捕捉された。図７に示されるように、形質転換されていない大腸菌ＪＭ１０９を、水銀非含有（０μＭ）のＬＢ培地、処理済み培地、および、１２０μＭのＨｇＣｌ２の濃度を有するＬＢ培地において培養した。
【０１０７】
処理済み培地は、１２０μＭのＨｇＣｌ２を最初に含有するＬＢ培地で、ｐＢＳＫ−Ｐｒｒｎ−５’ＵＴＲ−ｌａｃＺ−３’ＵＴＲまたはｐＢＳＫ−Ｐｒｒｎ−５’ＵＴＲ−ｍｔ１−３’ＵＴＲのどちらかの細菌クローンを１２０時間増殖させたＬＢ培地である。細菌細胞を１３，０００ｒｐｍでの２分間の遠心分離によって液体培地から除き、この液体培地を、遠心分離プロセスから残るどのような遺伝子組換え細菌細胞も除くために０．２２μＭのフィルタに通すことによって無菌化した。
【０１０８】
処理済み培地に、形質転換されていない大腸菌ＪＭ１０９を再接種した。図７Ａに示される実験では、処理済み培地は、ｐＢＳＫ−Ｐｒｒｎ−５’ＵＴＲ−ｌａｃＺ−３’ＵＴＲ（「ｌａｃＺ」）構築物を含む細菌により処置された培地であった。図７Ｂに示される実験では、処理済み培地は、ｐＢＳＫ−Ｐｒｒｎ−５’ＵＴＲ−ｍｔ１−３’ＵＴＲ（「ｍｔ１」）構築物を含む細菌により処置された培地であった。非形質転換細菌を、標準的な細菌培養条件のもと、３７℃で、それぞれの処理済み培地において１６時間増殖させ、その後、培養物のＯＤ６００吸光度を測定した。結果は、形質転換されていない大腸菌の正常な増殖速度を、遺伝子組換え細菌によって処置された培地において示す。コントロールとして、１２０μＭのＨｇを含有する新鮮な培地もまたろ過滅菌し、大腸菌ＪＭ１０９細菌を加えた。形質転換されていないＪＭ１０９細菌は、１２０μＭのＨｇＣｌ２を含有する培地では増殖することができなかった。図７Ａおよび図７Ｂを参照のこと。このことは、本発明の遺伝子組換えクローンが、非常に高濃度の水銀を含有する液体の浄化処理のために使用できることを示している。処理はＨｇを非毒性レベル（約５μＭ未満）に低下させ、大腸菌ＪＭ１０９の正常な増殖を可能にした。
【０１０９】
実施例５．水銀が細菌内に捕捉される；遺伝子組換え細菌は水銀を細菌阻害量未満に低下させる。β−ガラクトシダーゼがキレーター作用因子として作用し得ることを確認するために、本発明者らは、１２０μＭのＨｇを有するＬＢ培地における１２０時間後の５ｍｌの培養物から得られるｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｌａｃＺ−ｒｐｓＴ細菌ペレットに対する冷蒸気原子吸光分析（ＣＶＡＡＳ）による分析を行った。細胞を遠心分離によって培養物から除き、洗浄し、１ｍｌのＬＢ培地に再懸濁した。細胞および上清をＥＰＡ方法３０１０Ａ（ＥＰＡ方法３０１０Ａ、水および廃棄物の化学分析のための方法；米国環境保護局：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９２年）に従って個々に酸消化し、最初のＨｇ割合を維持するために５ｍｌの体積にし、その後、ＣＶＡＡＡＳによって分析した。結果は、ｌａｃＺ細菌クローンが、Ｈｇを培地から除くことにおいて非常に効率的であり、１１６μＭのＨｇに等しい濃度を蓄積したことを示した（図１１）。１２０時間の処理の後で培地に残る濃度は２．７μＭであった（図１１）。これらの結果は、形質転換されていない大腸菌が、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｌａｃＺ−ｒｐｓＴ細菌クローンにより事前に処理された培地において非常によく増殖したことを示した結果を立証した。遺伝子組換え細菌はＨｇを液体培養物から５μＭ未満のレベルに除去することができたことが、両方の研究から明らかであった。
【０１１０】
実施例６．β−ガラクトシダーゼバイオアッセイ。水銀はβ−ｇａｌのＸ−ｇａｌ切断能を低下させる。図８に示されるように、ｐＢＳＫ−Ｐ１６Ｓ−ｇ１０−ｌａｃＺ−ｒｐｓ１６プラスミドを含む細菌クローンを、Ｈｇ＋２の示された濃度で増殖させた。パネルＩは、０μＭのＨｇ＋２から２０μＭのＨｇ＋２にまで及ぶＨｇ＋２の濃度における１６時間の後での細菌増殖測定（ＯＤ６００ｎｍ）を示す。その後、二連のキュベットを、示されたＨｇ濃度で増殖させたそれぞれの細菌のために準備した。パネルＩＩおよびパネルＩＩＩを参照のこと。１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌをパネルＩＩＩのキュベットに加えた。青色へのＸ−ｇａｌの変換における低下が、２０μＭまでのＨｇ＋２であったが、水銀の濃度における増大に比例していることが認められた。パネルＩおよびパネルＩＩにおいて認められるように、遺伝子組換えクローンの細菌増殖はこの濃度範囲の範囲内では水銀の増大する濃度によって影響されなかった。このことは、青色における低下がβ−ｇａｌ酵素活性の低下の要因であり、細菌増殖がないためでないことを示している。
【０１１１】
より見やすくするために、図８は、パネルＩＩおよびパネルＩＩＩにおけるサンプルを含有する実際のキュベットの写真の図を示す。図における陰影は写真の陰影に一致しており、異なる濃度のＨｇにさらされた細菌を含有するキュベットの相対的暗さが保たれている。パネルＩＩは、０μＭ〜２０μＭのＨｇ＋２における１６時間後の細菌増殖を示すキュベットの写真の正確な図描写である。パネルＩＩＩは、増大した暴露、および、β−ガラクトシダーゼによるＨｇ＋２のキレート化が、Ｘ−ｇａｌ基質を青色の代謝物に変換する酵素の能力を低下させることを示すキュベットの写真の正確な図描写である。Ａ：０μＭ；Ｂ：５μＭ；Ｃ：１０μＭ；Ｄ：２０μＭ。パネルＩＩおよびパネルＩＩＩにおけるキュベット「Ｄ」についての色調は視覚的に同一である。
【０１１２】
図９のパネルＡは、β−ｇａｌ発現細菌クローンを１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌおよび示された濃度の水銀の存在下において３７℃で１６時間増殖させた類似する実験の実際の写真を示す。認められ得るように、４０μＭの水銀において増殖させられる培養物は、より暗い色を現し始めている。色におけるこの暗色化は、捕捉された水銀の細胞における蓄積の効果である。それぞれのバイアルの下における着色された棒は、示された濃度の水銀にさらされたときの培養物の色調を模倣する／捕らえるために開発されたカラーコーディング細片である。
【０１１３】
図９のパネルＢは、重金属汚染を検出するための原型キットを示す。容器が提供され、容器において、試験液体が加えられ、同様にまた、高濃度のＸ−ｇａｌおよびβ−ｇａｌ発現構築物または精製β−ｇａｌが加えられる。培養チューブまたは近くには、カラーコードチャートが、カラーチャートに対する試験結果の目視比較を可能にするために付属する。図Ａは、図９Ｂにおけるキットの概略である。標準化された条件のもとでのインキュベーション期間の後、培養物の色がカラーチャートと比較される。
【０１１４】
実施例７．捕捉作用因子を、亜鉛、カドミウムおよび鉛に対する抵抗性をもたらす。形質転換されていない大腸菌ＪＭ１０９（「ｗｔ」）と、ｌａｃＺ遺伝子、ｍｔ１遺伝子およびｐｐｋ遺伝子を発現する細菌培養物とのそれぞれを、０．０１のＯＤ６００で細菌とともに播種し、１，０００μＭのＺｎＣｌ２が補充されたＬＢ培地（図１０、パネルＡ）、２５０μＭのＣｄＣｌ２が補充されたＬＢ培地（パネルＢ）、および、３，０００μＭのＰｂ（Ｃ２Ｈ３）２）２・３Ｈ２Ｏが補充されたＬＢ培地（パネルＣ）において２４時間増殖させた。図１０において認められ得るように、ｗｔ細菌はこれらの毒素に対するあるレベルの抵抗性を示した。しかしながら、遺伝子組換え細菌は著しくより抵抗性であった。これらの細菌クローンは、さらにより高いレベルの亜鉛、カドミウムおよび鉛の存在下において十分に増殖し続けることができると思われる。ほんの限られた抵抗性がｐｐｋ含有クローンによってカドミウムに対して示された。クローンは、低下したが、著しい増殖を、鉛補充培地において示した。亜鉛における３つすべての形質転換細菌の増殖、ならびに、カドミウムにおけるｍｔクローンおよびβ−ｇａｌクローンの増殖は本質的に妨げられなかった。コントロールとして、ｗｔ細菌株および３つすべての形質転換細菌株は、重金属非補充の培地において等しく十分に増殖した（データは示されず）。
【０１１５】
上記で記載される発明は、添付されている請求項および図面と併せて読み取らなければならない。様々な実施形態および実施例の説明は、本発明の様々な実施に従事することを可能にする。したがって、それらは、本発明を好ましい実施形態に限定するために意図されるのではなく、本発明の具体的例として役立たせるために意図される。当業者は、様々な実施形態および実施例の記載では、本発明の同じ目的を行うために他の方法およびシステムを改変または設計するための基礎として開示される概念および特定の実施形態が容易に使用され得ることを理解するであろう。
【０１１６】
本明細書中で引用される刊行物、特許出願、特許およびウェブサイト内容を含めて、すべての参考文献が、本明細書により、それぞれの参考文献が、参照によって組み込まれることが個々に、かつ、具体的に示され、また、その全体において本明細書中に示されていたかのような同じ程度に参照によって組み込まれる。
【０１１７】
本発明を記載することの関連における用語「ａ」および用語「ａｎ」および用語「ｔｈｅ」ならびに類似する指示対象の使用は、本明細書中に別途示される場合または文脈によって明らかに否定される場合を除き、単数であることおよび複数であることの両方を包含するように解釈されなければならない。
【０１１８】
本明細書中における値の範囲の列挙は、本明細書中に別途示される場合を除き、当該範囲に含まれるそれぞれの別個の値を個々に示すという簡略的方法として役立つことが単に意図されるだけであり、それぞれの別個の値が、それぞれの別個の値が個々に本明細書中に列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。表現「約」は、数値に付随するとき、言及された数値からの１０％までのずれ（１０％のずれを含む）を示すとして解釈されなければならない。ありとあらゆる例の使用、または、本明細書中で提供される例示的言葉（「ｅ．ｇ．（例えば）」または「ｓｕｃｈ  ａｓ（例えば）」）は、本発明を単により良く明らかにするために意図されるだけであり、別途主張される場合を除き、本発明の範囲に対する限定とならない。本明細書におけるどの言葉も、何らかの主張されていない要素を本発明の実施には必須であるように示しているとして解釈してはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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