(57)【要約】  カルボン酸（例えば、脂肪酸）、およびカルボン酸とともにブタノールなどの生成物アルコールをエステル化して、アルコールエステルを形成することが可能な触媒（例えば、リパーゼ）を含む発酵培地中での生成物アルコールのエステル化によるアルコールエステルの生成を含む、アルコール発酵プロセスおよび組成物。アルコールエステルは、発酵培地から抽出され、生成物アルコールがアルコールエステルから回収され得る。カルボン酸は、発酵培地からアルコールエステルを除去するための抽出剤としても働き得る。
2013535956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブチルエステルを生成するための方法であって：
発酵プロセスにおいて生成されるブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって；
前記発酵プロセスにおける前記カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程を含む方法。
【請求項２】
ブタノールの前記生成およびブチルエステルの前記生成が、同時にまたは連続して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵プロセスの原料が、１種またはそれ以上の発酵性糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵プロセスの前記原料が、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する１種またはそれ以上の発酵性糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
天然油を提供する工程と、前記油を１種またはそれ以上の酵素と接触させることによって、前記天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記カルボン酸が１２〜２２個の炭素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記カルボン酸が、カルボン酸の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボン酸の前記ブチルエステルが、脂肪酸のブチルエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記触媒が、前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
原料からブタノールおよびブチルエステルを生成するための方法であって：
（ａ）原料を提供する工程と；
（ｂ）前記原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；
（ｃ）前記原料スラリーを分離して、オリゴ糖を含む水流、油流、および固体を含む生成物を生成する工程と；
（ｄ）前記水流を、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；
（ｅ）前記水流の前記オリゴ糖を糖化する工程と；
（ｆ）前記水流中に存在する前記オリゴ糖糖化の前記生成物を発酵させて、ブタノールを生成するのと同時に、前記ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、前記カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程とを含み；
場合により、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法。
【請求項１３】
前記油流から油を得る工程と、前記油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記原料スラリーが、デカンターボウル遠心分離、トリカンター遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるい分けろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって分離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記カルボン酸が１２〜２２個の炭素を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する前記工程の前に、前記油を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
さらなるカルボン酸を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記さらなるカルボン酸を加える工程の後、前記油が、カルボン酸に転化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記カルボン酸が、トウモロコシ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、またはトウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記油流から得られる前記油が、グリセリドを含み、前記１種またはそれ以上の触媒が、前記グリセリドを脂肪酸へと加水分解する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記カルボン酸のブチルエステルが、脂肪酸のブチルエステルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記触媒が、前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体を溶媒で洗浄する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶媒が、ヘキサン、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記固体が、動物飼料製品を形成するように処理される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記固体が、動物飼料製品を形成するように処理される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
前記動物飼料製品が、１種またはそれ以上の粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物飼料製品が、１種またはそれ以上のビタミン、ミネラル、香料、または着色料をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記動物飼料製品が、２０〜３５質量％の粗タンパク質、１〜２０質量％の粗脂肪、０〜５質量％のトリグリセリド、４〜１０質量％の脂肪酸、および２〜６質量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記原料スラリーから前記固体を分離する前記工程が、前記発酵ブロスから前記抽出剤への前記ブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；抽出剤により前記ブタノールの抽出効率を高めることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；前記発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；または抽出剤の流量を減少させることによって、前記ブタノール生成の効率を高める、請求項１２に記載の方法。
【請求項３３】
原料からブタノールおよびブチルエステルを生成するための方法であって：
（ａ）原料を提供する工程と；
（ｂ）前記原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；
（ｃ）前記原料スラリーを分離して、オリゴ糖および油を含む流れ、および固体を生成する工程と；
（ｄ）前記流れを、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；
（ｅ）前記流れの前記オリゴ糖を糖化する工程と；
（ｆ）前記流れ中に存在する前記オリゴ糖糖化の前記生成物を発酵させて、ブタノールを生成すると同時に、前記ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、前記カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程とを含み；
場合により、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法。
【請求項３４】
前記油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記原料スラリーが、デカンターボウル遠心分離、トリカンター遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるい分けろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって分離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記カルボン酸が１２〜２２個の炭素を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
油を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
さらなるカルボン酸を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記さらなるカルボン酸を加える前記工程の後、前記油が、カルボン酸に転化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記カルボン酸が、トウモロコシ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、またはトウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記油が、グリセリドを含み、前記１種またはそれ以上の触媒が、前記グリセリドを脂肪酸へと加水分解する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記カルボン酸のブチルエステルが、脂肪酸のブチルエステルである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記触媒が、前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固体を溶媒で洗浄する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶媒が、ヘキサン、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記固体が、動物飼料製品を形成するように処理される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記固体が、動物飼料製品を形成するように処理される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物飼料製品が、１種またはそれ以上の粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記動物飼料製品が、１種またはそれ以上のビタミン、ミネラル、香料、または着色料をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記動物飼料製品が、２０〜３５質量％の粗タンパク質、１〜２０質量％の粗脂肪、０〜５質量％のトリグリセリド、４〜１０質量％の脂肪酸、および２〜６質量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記原料スラリーから前記固体を分離する前記工程が、前記発酵ブロスから前記抽出剤への前記ブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；抽出剤により前記ブタノールの抽出効率を高めることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；前記発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、前記ブタノール生成の効率を高めるか；または抽出剤の流量を減少させることによって、前記ブタノール生成の効率を高める、請求項３３に記載の方法。
【請求項５４】
ブタノールを生成するための方法であって：
（ａ）発酵プロセスにおいて生成されるブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって；
前記発酵プロセスにおける前記カルボン酸が、水相およびブチルエステル含有有機相を含む二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程と；
（ｂ）前記水相から前記ブチルエステル含有有機相を分離する工程と；
（ｃ）前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程とを含む方法。
【請求項５５】
前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程が、前記エステルを、カルボン酸およびブタノールへと加水分解する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ブチルエステルが、加水分解触媒の存在下で加水分解される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ブチルエステルが、水の存在下で加水分解され、前記加水分解触媒が、酸触媒、有機酸、無機酸、水溶性酸、または不水溶性酸を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記加水分解触媒が、前記ブチルエステルを加水分解して、カルボン酸およびブタノールを形成することが可能な酵素を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
酵素反応条件が、エステル化より酵素加水分解に有利に働く、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記酵素反応条件が共溶媒を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
脂肪酸ブチルエステル、脂肪酸、イソブタノール、および水が、前記共溶媒に可溶であり、遊離脂肪酸が、前記共溶媒と反応しない、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記共溶媒が、アセトン、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−Ｍｅ−２−ブタノール、２−Ｍｅ−２−ペンタノール、および３−Ｍｅ−３−ペンタノールから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記酵素反応条件が最終生成物除去を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記最終生成物が、イソブタノールまたは脂肪酸である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
イソブタノールが、真空蒸留、パーベーパレーション、選択透過性ろ過、またはガスのスパージによって除去される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記脂肪酸が、沈殿、選択透過性ろ過、または電気泳動法によって除去される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記加水分解反応が、反応槽中で起こる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程が、前記ブチルエステルを、ブタノールおよび脂肪酸アルキルエステルまたはアシルグリセリドへとエステル交換する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７０】
前記脂肪酸アルキルエステルが、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、または脂肪酸プロピルエステルを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
天然油を提供する工程と、前記油を１種またはそれ以上の酵素と接触させることによって、前記天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７２】
前記酵素が、前記ブチルエステルを加水分解またはエステル交換してブタノールを形成することが可能な酵素である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７５】
前記カルボン酸が、１２〜２２個の炭素の範囲の炭素鎖長を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項７６】
ブタノールの少なくとも約１０％が、前記ブチルエステルから回収される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７７】
ブタノールの少なくとも約５０％が、前記ブチルエステルから回収される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７８】
ブタノールの少なくとも約９０％が、前記ブチルエステルから回収される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７９】
カルボン酸が、前記ブチルエステルから回収される、請求項５４に記載の方法。
【請求項８０】
抽出剤流として前記発酵装置からブタノールを除去する工程と；
前記抽出剤流を２つまたはそれ以上の蒸留塔に加える工程とをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項８１】
前記蒸留塔が、蒸気加熱されるリボイラーを備えた過圧蒸留塔である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記蒸留塔から水および溶媒を回収する工程と；前記水および溶媒を再利用する工程とをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記蒸留プロセスから熱を回収する工程と；水を蒸発させるために前記熱を再利用する工程とをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
原料からブタノールを生成するための方法であって：
（ａ）原料を提供する工程と；
（ｂ）前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と；
（ｃ）前記原料スラリーを分離して、水流、油流、および固体を含む生成物を生成する工程と；
（ｄ）前記水流を、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；
（ｅ）前記水流を糖化する工程と；
（ｆ）前記糖化された水流を発酵させて、ブタノールを生成すると同時に、前記ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、前記カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程と；
（ｇ）前記水相から前記ブチルエステル含有有機相を分離する工程と；
（ｈ）前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程とを含み；
場合により、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法。
【請求項８５】
前記油流から油を得る工程と、前記油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記原料スラリーが、遠心分離、ろ過、またはデカンテーションによって分離される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
前記カルボン酸が、１２〜２２個の炭素の範囲の炭素鎖長を有する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する前記工程の前に、前記油を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
さらなるカルボン酸を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
前記さらなるカルボン酸を加える前記工程の後、前記油が、カルボン酸に転化される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記カルボン酸が、トウモロコシ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、またはトウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９３】
前記油流から得られる前記油が、グリセリドを含み、前記１種またはそれ以上の触媒が、前記グリセリドを脂肪酸へと加水分解する、請求項８４に記載の方法。
【請求項９４】
前記カルボン酸のブチルエステルが、脂肪酸のブチルエステルである、請求項８４に記載の方法。
【請求項９５】
前記触媒が、前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９６】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記固体が、動物飼料製品を形成するように処理される、請求項８４に記載の方法。
【請求項９８】
前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程が、前記エステルを、カルボン酸およびブタノールへと加水分解する工程を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項９９】
前記ブチルエステルが、加水分解触媒の存在下で加水分解される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ブチルエステルが、水の存在下で加水分解され、前記加水分解触媒が、酸触媒、有機酸、無機酸、水溶性酸、または不水溶性酸を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記加水分解触媒が、前記ブチルエステルを加水分解して、カルボン酸およびブタノールを形成することが可能な酵素を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記加水分解反応が、反応槽中で起こる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程が、前記ブチルエステルを、ブタノールおよび脂肪酸アルキルエステルまたはアシルグリセリドへとエステル交換する工程を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項１０５】
前記脂肪酸アルキルエステルが、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、または脂肪酸プロピルエステルを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
天然油を提供する工程と、前記油を１種またはそれ以上の酵素と接触させることによって、前記天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記酵素が、前記ブチルエステルを加水分解またはエステル交換してブタノールを形成することが可能な酵素である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
原料からブタノールおよびブチルエステルを生成するための方法であって：
（ａ）原料を提供する工程と；
（ｂ）前記原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；
（ｃ）前記原料スラリーを分離して、オリゴ糖および油を含む水流、および固体を生成する工程と；
（ｄ）前記水流を、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；
（ｅ）前記水流の前記オリゴ糖を糖化する工程と；
（ｆ）前記水流中に存在する前記オリゴ糖糖化の前記生成物を発酵させて、ブタノールを生成するのと同時に、前記ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、前記カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程と；
（ｇ）前記水相から前記ブチルエステル含有有機相を分離する工程と；
（ｈ）前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程とを含み；
場合により、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法。
【請求項１１０】
前記油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記原料スラリーが、遠心分離、ろ過、またはデカンテーションによって分離される、
請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記カルボン酸が１２〜２２個の炭素を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
油を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
さらなるカルボン酸を前記発酵槽に加える工程をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１６】
前記さらなるカルボン酸を加える前記工程の後、前記油が、カルボン酸に転化される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記カルボン酸が、トウモロコシ油脂肪酸または大豆油脂肪酸である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１８】
前記カルボン酸が、トウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１９】
前記油が、グリセリドを含み、前記１種またはそれ以上の触媒が、前記グリセリドを脂肪酸へと加水分解する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２０】
前記カルボン酸のブチルエステルが、脂肪酸のブチルエステルである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記触媒が、前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記固体が、動物飼料製品を形成するように処理される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程が、前記エステルを、カルボン酸およびブタノールへと加水分解する工程を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ブチルエステルが、加水分解触媒の存在下で加水分解される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ブチルエステルが、水の存在下で加水分解され、前記加水分解触媒が、酸触媒、有機酸、水溶性酸、または不水溶性酸を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記加水分解触媒が、前記ブチルエステルを加水分解して、カルボン酸およびブタノールを形成することが可能な酵素を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記加水分解反応が、反応槽中で起こる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ブチルエステルからブタノールを回収する工程が、前記ブチルエステルを、ブタノールおよび他の脂肪酸アルキルエステルまたはアシルグリセリドへとエステル交換する工程を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記他の脂肪酸アルキルエステルが、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、または脂肪酸プロピルエステルを含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
天然油を提供する工程と、前記油を１種またはそれ以上の酵素と接触させることによって、前記天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１３３】
前記酵素が、前記ブチルエステルを加水分解またはエステル交換してブタノールを形成することが可能な酵素である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
アルコールエステルを生成するための方法であって：
発酵プロセスにおいて生成されるアルコールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記カルボン酸を前記アルコールとともにエステル化して、前記カルボン酸のアルコールエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって；
前記発酵プロセスにおける前記カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程を含む方法。
【請求項１３６】
前記アルコールの前記生成およびアルコールエステルの前記生成が、同時にまたは連続して行われる、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記発酵プロセスの原料が、１種またはそれ以上の発酵性糖を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記発酵プロセスの前記原料が、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する１種またはそれ以上の発酵性糖を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３９】
天然油を提供する工程と、前記油を１種またはそれ以上の酵素と接触させることによって、前記天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４０】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４１】
前記カルボン酸が、１２〜２２個の炭素の範囲の炭素鎖長を有する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４２】
前記カルボン酸の前記アルコールエステルが脂肪酸のアルコールエステルである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４３】
前記触媒が、前記ブタノールとともに前記カルボン酸をエステル化して、前記カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４４】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記アルコールが、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４６】
前記Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールが、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、または２−メチル−１ブタノールである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
アルコールを生成するための方法であって：
（ａ）発酵プロセスにおいて生成されるアルコールを、少なくとも１種のカルボン酸、および前記カルボン酸を前記アルコールとともにエステル化して、前記カルボン酸のアルコールエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって；前記発酵プロセスにおける前記カルボン酸が、水相およびアルコールエステル含有有機相を含む二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程と；
（ｂ）前記水相から前記アルコールエステル含有有機相を分離する工程と；
（ｃ）前記アルコールエステルからアルコールを回収する工程とを含む方法。
【請求項１４８】
前記アルコールエステルからアルコールを回収する工程が、前記エステルをカルボン酸およびアルコールへと加水分解する工程を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記アルコールエステルが、加水分解触媒の存在下で加水分解される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記アルコールエステルが、水の存在下で加水分解され、前記加水分解触媒が、酸触媒、有機酸、水溶性酸、または不水溶性酸を含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記加水分解触媒が、前記ブチルエステルを加水分解して、カルボン酸およびブタノールを形成することが可能な酵素を含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記加水分解反応が、反応槽中で起こる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５４】
前記アルコールエステルから前記アルコールを回収する工程が、前記アルコールエステルを、アルコールおよび脂肪酸アルキルエステルまたはアシルグリセリドへとエステル交換する工程を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５５】
前記脂肪酸アルキルエステルが、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、または脂肪酸プロピルエステルを含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
天然油を提供する工程と、前記油を１種またはそれ以上の酵素と接触させることによって、前記天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５７】
前記酵素が、前記アルコールエステルを加水分解またはエステル交換してアルコールを形成することが可能な酵素である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記カルボン酸が脂肪酸を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記カルボン酸が、１２〜２２個の炭素の範囲の炭素鎖長を有する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６１】
前記アルコールが、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールが、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、または２−メチル−１ブタノールである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
カルボン酸が、前記ブチルエステルから回収される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１６４】
（ａ）生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物と；
（ｂ）発酵性炭素基質と；
（ｃ）前記生成物アルコールとともに脂肪酸を、脂肪酸アルコールエステルへと細胞外でエステル交換することが可能な触媒と；
（ｄ）発酵中に生成される脂肪酸アルコールエステルと
を含む発酵ブロス。
【請求項１６５】
アシルグリセリド、脂肪酸、生成物アルコール、またはオレイン酸のうちの１つまたはそれ以上をさらに含む、請求項１６４に記載の発酵ブロス。
【請求項１６６】
触媒をさらに含む発酵ブロスであって、前記触媒が、アルコールとともに脂肪酸を脂肪酸アルコールエステルへとエステル化し、トリグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解する、請求項１６４に記載の発酵ブロス。
【請求項１６７】
前記触媒が、１種またはそれ以上のリパーゼ酵素である、請求項１６６に記載の発酵ブロス。
【請求項１６８】
オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素をさらに含む、請求項１６７に記載の発酵ブロス。
【請求項１６９】
前記糖化酵素がグルコアミラーゼを含む、請求項１６８に記載の発酵ブロス。
【請求項１７０】
前記発酵性糖がモノマーグルコースを含む、請求項１６９に記載の発酵ブロス。
【請求項１７１】
前記組み換え微生物が、ブタノールを生成することが可能である、請求項１６４に記載の発酵ブロス。
【請求項１７２】
前記脂肪酸アルコールエステルが脂肪酸ブチルエステルである、請求項１６４に記載の発酵ブロス。
【請求項１７３】
イソブタノールをさらに含む、請求項１６４に記載の発酵ブロス。
【請求項１７４】
イソブタノール生合成経路を含む、イソブタノールを生成することが可能な組み換え酵母細胞であって、前記イソブタノール生合成経路が、以下の基質−生成物転化：
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸；
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および
ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール
のそれぞれを触媒する少なくとも１種の酵素を含み；
ｉｉｉ）の前記酵素またはｖ）の前記酵素の少なくとも１つが、染色体中に組み込まれた異種のポリヌクレオチドによってコードされる組み換え酵母細胞。
【請求項１７５】
前記酵母細胞が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に有さない、請求項１７４に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１７６】
ｐｄｃ１、ｐｄｃ５、およびｐｄｃ６遺伝子の欠失を含む、請求項１７５に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１７７】
前記酵母細胞が、ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない、請求項１７６に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１７８】
ｇｐｄ２の欠失を含む、請求項１７７に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１７９】
ｉｉｉ）の前記酵素およびｉｖ）の前記酵素の両方が、染色体中に組み込まれた異種のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１７８に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１８０】
前記イソブタノール生合成経路が、前記基質−生成物転化のそれぞれのための酵素をコードする少なくとも１種の異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１７９に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１８１】
ｐＹＺ０９０の前記コード領域のそれぞれに対する少なくとも８０％の同一性を有するプラスミドまたはｐＬＨ４６８の前記コード領域のそれぞれに対する少なくとも８０％の同一性を有するプラスミドをさらに含む、請求項１８０に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１８２】
配列番号１のプラスミドまたは配列番号２のプラスミドあるいは両方を含む、請求項１８０に記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１８３】
（ａ）発酵性炭素基質と；
（ｂ）アルコールとともに遊離脂肪酸を脂肪酸アルキルエステルへとエステル化することが可能であり、そして場合によりグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な触媒と；
（ｃ）アルコールと；
（ｄ）遊離脂肪酸と；
（ｅ）前記触媒を用いた前記アルコールによる前記遊離脂肪酸のエステル化から原位置で形成される脂肪酸アルコールエステルと
を含む発酵組成物。
【請求項１８４】
グリセリドを含む油をさらに含む、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記油、前記遊離脂肪酸、および前記発酵性炭素基質がバイオマスに由来する、請求項１８４に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記油および前記発酵性炭素基質が、同じバイオマス源または異なるバイオマス源に由来する、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記油の前記バイオマス源が、大豆またはトウモロコシ油であり、前記発酵性炭素基質のバイオマス源がトウモロコシである、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記（ｄ）遊離脂肪酸がトウモロコシ油脂肪酸である、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記（ｄ）遊離脂肪酸が、前記触媒を用いた前記油中の前記グリセリドの少なくとも一部の加水分解から形成される、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記触媒を用いた前記油中の前記グリセリドの一部の部分加水分解から形成されるジグリセリドおよびモノグリセリドのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１９１】
グリセロールをさらに含む、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記発酵性炭素基質の前記バイオマス源に由来する非溶解固体をさらに含む、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１９３】
約２５質量％未満の前記非溶解固体を含有する、請求項１９２に記載の組成物。
【請求項１９４】
でんぷんを発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素をさらに含み、前記アルコールがブタノールである、請求項１８３に記載の組成物。
【請求項１９５】
請求項１、１２、３３、５４、８４、および１０９に記載の方法によって生成されるブタノールを含む組成物。
【請求項１９６】
燃料添加剤、原料化学物質、試薬、溶媒、消毒剤、または食品グレードの抽出剤として使用される、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項１９７】
燃料添加剤、原料化学物質、試薬、溶媒、消毒剤、または食品グレードの抽出剤としての、請求項１、１２、３３、５４、８４、および１０９に記載の方法によって生成されるブタノールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号；２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号；および２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，０３４号；２０１１年６月１５日に出願された米国特許出願第１３／１６０，７６６号の利益を主張するものであり；これらの内容全体が全て、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願に関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子書式で提出され、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、エタノールおよびブタノールを含むアルコールの発酵生成、および全ての関連する副産物、および原位置生成物除去方法を用いてアルコール発酵を改良するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルコールには、飲料（すなわち、エタノール）、燃料、試薬、溶媒、および消毒剤などの、産業および科学における様々な用途がある。例えば、ブタノールは、再生可能な燃料添加剤として、プラスチック産業における原料化学物質として、ならびに食品および香料産業における食品グレードの抽出剤としての使用を含む様々な用途を有する重要な産業用化学物質およびドロップイン燃料（ｄｒｏｐ−ｉｎ  ｆｕｅｌ）の成分であるアルコールである。したがって、ブタノールなどのアルコール、ならびに効率的でかつ環境に優しい生成方法に対する高い需要がある。
【０００５】
微生物による発酵を用いたアルコールの生成は、１つのこのような環境に優しい生成方法である。ブタノールの生成において、特に、高収率でブタノールを生成するいくつかの微生物は、低いブタノール毒性閾値も有する。ブタノールが生成されるにつれてブタノールを発酵槽から除去することは、こうした低いブタノール毒性閾値を管理する手段である。したがって、発酵培地中のブタノール生成微生物の低いブタノール毒性閾値にもかかわらず、高収率でブタノールを生成するための効率的な方法およびシステムを開発することが引き続き必要とされている。
【０００６】
原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも呼ばれる）を用いて、ブタノール（または他の発酵アルコール）を、それが生成されるにつれて発酵槽から除去し、それによって、微生物が高収率でブタノールを生成することが可能になり得る。当該技術分野で説明されている発酵アルコールを除去するための１つのＩＳＰＲ方法は、液液抽出（特許文献１）である。一般に、ブタノール発酵に関して、微生物を含む発酵培地は、ブタノール濃度が有毒なレベルに達する前の時点で、有機抽出剤と接触される。有機抽出剤および発酵培地は、二相混合物を形成する。ブタノールが有機抽出剤相中に分離し、微生物を含有する水相中のブタノールの濃度が低下し、それによって、抑制性のブタノールへの微生物の曝露が抑えられる。技術的および経済的に実行可能であるために、液液抽出は、抽出剤中への生成物アルコールの効率的な物質移動のための抽出剤と発酵ブロスとの間の接触；発酵ブロスからの抽出剤の相分離（発酵中および／または発酵後）；抽出剤の効率的な回収および再利用；および長期間の運転にわたる抽出剤の分配係数の低下が最小限であることを必要とする。
【０００７】
抽出剤は、例えば、加水分解性でんぷんの原料として発酵槽に供給されるバイオマス中に存在する脂質の蓄積によって、再利用ごとに時間の経過とともに汚染され得る。例として、ブタノールへのグルコースの転化の際、３０重量％の乾燥トウモロコシ固体で発酵槽に充填される液化トウモロコシマッシュは、同時糖化発酵（グルコースを生成するためのグルコアミラーゼの添加による発酵中に、液化されたマッシュの糖化が起こる）によって生成される約１．２重量％のトウモロコシ油を含有する発酵ブロスをもたらし得る。ＩＳＰＲの際の抽出剤として働くオレイルアルコール（ＯＡ）へのトウモロコシ油脂質の溶解により、ＯＡの再利用ごとに脂質濃度が増加し、ＯＡ中の脂質濃度がＯＡの再利用ごとに増加するにつれて、ＯＡ中の生成物アルコールのための分配係数が低下され得る。
【０００８】
さらに、抽出発酵中の非溶解固体の存在は、アルコール生成の効率に悪影響を与え得る。例えば、非溶解固体の存在は、発酵槽の内部の物質移動係数を低下させることがあり、発酵槽中の相分離を妨げることがあり、抽出剤中の非溶解固体からのトウモロコシ油の蓄積を生じ、時間の経過とともに抽出効率の低下を招くことがあり、溶媒が固体に捕捉され、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）として最終的に除去されるため、溶媒の損失を増加することがあり、発酵ブロスからの抽出剤液滴の離脱を遅くすることがあり、および／または発酵槽体積効率を低下させることがある。
【０００９】
抽出発酵に使用される抽出剤の分配係数の低下を抑えるためのいくつかの方法は、湿式粉砕、分画、および固体の除去を含んでいた。湿式粉砕は、各副産物から別々に価値を得るために、バイオマス（例えば、トウモロコシ）をその主要な構成要素（胚芽、種皮繊維、でんぷん、およびグルテン）に分離する高コストの多工程プロセスである。このプロセスにより、精製されたでんぷん流が得られるが；このプロセスはコストがかかり、バイオマスを、発酵アルコール生成に不要なその非でんぷん構成要素に分離することを含む。分画により、磨砕された全粒トウモロコシ中に存在する脂質の大部分を含有する繊維および胚芽が除去され、より高いでんぷん（胚乳）含量を有する分画されたトウモロコシが得られる。乾式分画は、胚芽を繊維から分離しないため、湿式粉砕よりコストが低い。しかしながら、分画は、繊維または胚芽の全体を除去せず、固体を完全に除去しない。さらに、分画の際にでんぷんをいくらか損失する。トウモロコシの湿式粉砕は、乾式分画よりさらにコストが高いが、乾式分画は、分画されていないトウモロコシの乾式磨砕よりコストが高い。例えば、２０１０年６月１８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書に記載されるように、発酵に使用する前に、液化されたマッシュから、脂質を含有する胚芽を含む固体を除去すると、非溶解固体を実質的に除去することができる。しかしながら、非溶解固体の実質的に全ての分画または除去さえ行わずに、脂質による汚染によって引き起こされる抽出剤の分配係数の低下を抑えることができれば有利であろう。液化されたマッシュ中に存在する脂質の、ＩＳＰＲに使用され得る抽出剤への転化は、例えば、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号明細書および米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号明細書（両方とも２０１０年７月２８日に出願された）に記載されるように、発酵槽に供給される脂質の量を減少させる別の方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
微生物に対するブタノールなどの生成物アルコールの毒性作用を減少させるための手段として、発酵培地とＩＳＰＲ抽出剤とに分液する必要なく、発酵生成物抽出剤の分配係数の低下も抑えることができる代替的な抽出発酵方法が引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
微生物に対する毒性が少ない物質への、発酵培地中で微生物から生成されるブタノールなどのアルコールの転化により、所与の発酵槽体積についての、ブタノールなどのアルコールの生成を増加させることができる。アルコールエステルは、発酵培地中のアルコールを、カルボン酸（例えば、脂肪酸）、およびカルボン酸とともにアルコールをエステル化することが可能な触媒と接触させることによって形成され得る。さらに、カルボン酸は、アルコールエステルが中に分離するＩＳＰＲ抽出剤として働き得る。カルボン酸は、発酵槽に供給され、および／または発酵性炭素原料を発酵槽に供給するバイオマスに由来し得る。原料中に存在する脂質は、カルボン酸に触媒により加水分解され得、同じ触媒（例えば、酵素）が、カルボン酸を、アルコール（例えば、ブタノール）とともにエステル化することができ；脂質も、触媒によって直接エステル交換されて、アルコールエステルが生成され得る。触媒は、発酵前に原料に供給され得、または原料を供給する前またはそれと同時に発酵槽に供給され得る。触媒が発酵槽に供給される場合、アルコールエステルは、脂質をカルボン酸へと加水分解することおよび発酵槽中に存在するブタノールとともにカルボン酸を同時にエステル化することによって得られ；脂質も、触媒によってブタノールとともに直接エステル交換されて、アルコールエステルが生成され得る。上記の原料に由来しないカルボン酸および／または天然油も、発酵槽に直接供給することができ、天然油は、カルボン酸へと加水分解される。上記の原料に由来しないカルボン酸および／または天然油は、有機相および水相を含む二相混合物が形成されるように十分な量で発酵槽に供給され得る。したがって、ある実施形態において、アルコールとともにエステル化されない任意のカルボン酸が、ＩＳＰＲ抽出剤またはその一部として働き得る。アルコールエステルを含有する抽出剤は、発酵培地から分離され得、アルコールは、抽出剤から回収され得る。抽出剤は、発酵槽に再利用され得る。したがって、例えばブタノール生成の場合、ブタノールのエステルへの転化により、発酵培地中の遊離ブタノール濃度を低下し、増加するブタノール濃度の有毒な作用から微生物を保護する。さらに、脂質がカルボン酸に触媒により加水分解され、それによって、ＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の増加の速度を低下させることができるため、分画されていない穀類を、その中の脂質を分離することなく原料として使用することができる。
【００１３】
本発明は、ブチルエステルを生成するための方法であって、発酵プロセスにおいて生成されるブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、およびブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって；発酵プロセスにおけるカルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程を含む方法に関する。一実施形態において、ブタノールの生成およびブチルエステルの生成が、同時にまたは連続して行われる。一実施形態において、発酵プロセスの原料が、１種以上の発酵性糖を含む。別の実施形態において、発酵プロセスの原料が、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する１種以上の発酵性糖を含む。一実施形態において、本方法は、天然油を提供する工程と、油を１種以上の酵素と接触させることによって、天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む。一実施形態において、カルボン酸は脂肪酸を含む。別の実施形態において、カルボン酸は１２〜２２個の炭素を含む。一実施形態において、カルボン酸は、カルボン酸の混合物である。別の実施形態において、カルボン酸のブチルエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。一実施形態において、触媒は、ブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である。別の実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。
【００１４】
本発明は、原料からブタノールおよびブチルエステルを生成するための方法であって：（ａ）原料を提供する工程と；（ｂ）原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；（ｃ）原料スラリーを分離して、オリゴ糖を含む水流、油流、および固体を含む生成物を生成する工程と；（ｄ）水流を、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；（ｅ）水流のオリゴ糖を糖化する工程と；（ｆ）水流中に存在するオリゴ糖糖化の生成物を発酵させて、ブタノールを生成するのと同時に、ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、およびブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程とを含み；任意に、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法にも関する。一実施形態において、本方法は、油流から油を得る工程と、油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む。一実施形態において、原料スラリーは、デカンターボウル遠心分離、トリカンター（ｔｒｉｃａｎｔｅｒ）遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるい分けろ過、ふるい分け分離、格子（ｇｒａｔｉｎｇ）、多孔質格子、浮遊法（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ）、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器（ｖｏｒｔｅｘ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、またはそれらの組合せによって分離される。別の実施形態において、カルボン酸は脂肪酸を含む。一実施形態において、カルボン酸は１２〜２２個の炭素を含む。一実施形態において、本方法は、油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程の前に、油を発酵槽に加える工程をさらに含む。一実施形態において、本方法は、さらなるカルボン酸を発酵槽に加える工程をさらに含む。一実施形態において、さらなるカルボン酸を加える工程の後、油は、カルボン酸に転化される。別の実施形態において、カルボン酸は、トウモロコシ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、またはトウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である。一実施形態において、油流から得られる油は、グリセリドを含み、１種以上の触媒は、グリセリドを脂肪酸へと加水分解する。別の実施形態において、カルボン酸のブチルエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。一実施形態において、触媒は、ブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。一実施形態において、本方法は、固体を溶媒で洗浄する工程をさらに含む。一実施形態において、溶媒は、ヘキサン、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物から選択される。別の実施形態において、固体は、動物飼料製品を形成するように処理される。一実施形態において、固体は、動物飼料製品を形成するように処理される。一実施形態において、動物飼料製品は、１種以上の粗タンパク質、粗脂���、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含む。別の実施形態において、動物飼料製品は、１種以上のビタミン、ミネラル、香料、または着色料をさらに含む。一実施形態において、動物飼料製品は、２０〜３５重量％の粗タンパク質、１〜２０重量％の粗脂肪、０〜５重量％のトリグリセリド、４〜１０重量％の脂肪酸、および２〜６重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む。一実施形態において、原料スラリーから固体を分離する工程は、発酵ブロスから抽出剤へのブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、ブタノール生成の効率を高め；抽出剤によりブタノールの抽出効率を高めることによって、ブタノール生成の効率を高め；発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、ブタノール生成の効率を高め；抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、ブタノール生成の効率を高め；または抽出剤の流量を減少させることによって、ブタノール生成の効率を高める。
【００１５】
本発明は、原料からブタノールおよびブチルエステルを生成するための方法であって：（ａ）原料を提供する工程と；（ｂ）原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；（ｃ）原料スラリーを分離して、オリゴ糖および油を含む流れ、および固体を生成する工程と；（ｄ）流れを、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；（ｅ）流れのオリゴ糖を糖化する工程と；（ｆ）流れ中に存在するオリゴ糖糖化の生成物を発酵させて、ブタノールを生成すると同時に、ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、およびブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程とを含み；任意に、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法にも関する。一実施形態において、本方法は、油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程をさらに含む。一実施形態において、原料スラリーは、デカンターボウル遠心分離、トリカンター遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるい分けろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって分離される。別の実施形態において、カルボン酸は脂肪酸を含む。一実施形態において、カルボン酸は１２〜２２個の炭素を含む。一実施形態において、本方法は、油を発酵槽に加える工程をさらに含む。一実施形態において、本方法は、さらなるカルボン酸を発酵槽に加える工程をさらに含む。一実施形態において、さらなるカルボン酸を加える工程の後、油は、カルボン酸に転化される。一実施形態において、カルボン酸は、トウモロコシ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、またはトウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である。一実施形態において、油は、グリセリドを含み、１種以上の触媒は、グリセリドを脂肪酸へと加水分解する。一実施形態において、カルボン酸のブチルエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。一実施形態において、触媒は、ブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。一実施形態において、本方法は、固体を溶媒で洗浄する工程をさらに含む。一実施形態において、溶媒は、ヘキサン、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物から選択される。一実施形態において、固体は、動物飼料製品を形成するように処理される。一実施形態において、固体は、動物飼料製品を形成するように処理される。ある実施形態において、動物飼料製品は、１種以上の粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含む。ある実施形態において、動物飼料製品は、１種以上のビタミン、ミネラル、香料、または着色料をさらに含む。ある実施形態において、動物飼料製品は、２０〜３５重量％の粗タンパク質、１〜２０重量％の粗脂肪、０〜５重量％のトリグリセリド、４〜１０重量％の脂肪酸、および２〜６重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む。ある実施形態において、原料スラリーから固体を分離する工程は、発酵ブロスから抽出剤へのブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、ブタノール生成の効率を高め；抽出剤によりブタノールの抽出効率を高めることによって、ブタノール生成の効率を高め；発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、ブタノール生成の効率を高め；抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、ブタノール生成の効率を高め；または抽出剤の流量を減少させることによって、ブタノール生成の効率を高める。
【００１６】
本発明は、ブタノールを生成するための方法であって、（ａ）発酵プロセスにおいて生成されるブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、およびブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって；発酵プロセスにおけるカルボン酸が、水相およびブチルエステル含有有機相を含む二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程と；（ｂ）水相からブチルエステル含有有機相を分離する工程と；（ｃ）ブチルエステルからブタノールを回収する工程とを含む方法にも関する。ある実施形態において、ブチルエステルからブタノールを回収する工程は、エステルを、カルボン酸およびブタノールへと加水分解する工程を含む。ある実施形態において、ブチルエステルは、加水分解触媒の存在下で加水分解される。ある実施形態において、ブチルエステルは、水の存在下で加水分解され、加水分解触媒は、酸触媒、有機酸、無機酸、水溶性酸、または不水溶性酸を含む。ある実施形態において、加水分解触媒は、ブチルエステルを加水分解して、カルボン酸およびブタノールを形成することが可能な酵素を含む。ある実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。ある実施形態において、酵素反応条件は、エステル化より酵素加水分解に有利に働く。ある実施形態において、酵素反応条件は共溶媒を含む。ある実施形態において、脂肪酸ブチルエステル、脂肪酸、イソブタノール、および水が、共溶媒に可溶であり、遊離脂肪酸が、共溶媒と反応しない。ある実施形態において、共溶媒は、アセトン、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−Ｍｅ−２−ブタノール、２−Ｍｅ−２−ペンタノール、および３−Ｍｅ−３−ペンタノールから選択される。ある実施形態において、酵素反応条件は最終生成物除去を含む。ある実施形態において、最終生成物は、イソブタノールまたは脂肪酸である。ある実施形態において、イソブタノールは、真空蒸留、パーベーパレーション、選択透過性ろ過、またはガスのスパージによって除去される。ある実施形態において、脂肪酸は、沈殿、選択透過性ろ過、または電気泳動法によって除去される。ある実施形態において、加水分解反応は、反応槽中で起こる。ある実施形態において、ブチルエステルからブタノールを回収する工程は、ブチルエステルを、ブタノールおよび脂肪酸アルキルエステルまたはアシルグリセリドへとエステル交換する工程を含む。ある実施形態において、脂肪酸アルキルエステルは、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、または脂肪酸プロピルエステルを含む。ある実施形態において、本方法は、天然油を提供する工程と、油を１種以上の酵素と接触させることによって、天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む。ある実施形態において、酵素は、ブチルエステルを加水分解またはエステル交換してブタノールを形成することが可能な酵素である。ある実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。ある実施形態において、カルボン酸は脂肪酸を含む。ある実施形態において、カルボン酸は、１２〜２２個の炭素の範囲の炭素鎖長を有する。ある実施形態において、ブタノールの少なくとも約１０％が、ブチルエステルから回収される。ある実施形態において、ブタノールの少なくとも約５０％が、ブチルエステルから回収される。ある実施形態において、ブタノールの少なくとも約９０％が、ブチルエステルから回収される。ある実施形態において、カルボン酸が、ブチルエステルから回収される。ある実施形態において、本方法は、抽出剤流として発酵装置からブタノールを除去する工程と；抽出剤流を２つ以上の蒸留塔に加える工程とをさらに含む。ある実施形態において、蒸留塔は、蒸気加熱されるリボイラーを備えた過圧（ｓｕｐｅｒ−ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ）蒸留塔である。ある実施形態において、本方法は、蒸留塔から水および溶媒を回収する工程と；水および溶媒を再利用する工程とをさらに含む。ある実施形態において、本方法は、蒸留プロセスから熱を回収する工程と；水を蒸発させるために熱を再利用する工程とをさらに含む。
【００１７】
本発明は、原料からブタノールを生成するための方法であって、（ａ）原料を提供する工程と；（ｂ）原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と；（ｃ）原料スラリーを分離して、水流、油流、および固体を含む生成物を生成する工程と；（ｄ）水流を、発酵ブロスを含む発酵槽に加える工程と；（ｅ）水流を糖化する工程と；（ｆ）糖化された水流を発酵させて、ブタノールを生成すると同時に、ブタノールを、少なくとも１種のカルボン酸、およびブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な少なくとも１種の触媒と接触させる工程であって、カルボン酸が、二相混合物を生成するのに十分な濃度で存在する工程と；（ｇ）水相からブチルエステル含有有機相を分離する工程と；（ｈ）ブチルエステルからブタノールを回収する工程とを含み；任意に、工程（ｅ）および（ｆ）が同時に行われる方法にも関する。ある実施形態において、本方法は、油流から油を得る工程と、油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む。ある実施形態において、原料スラリーは、遠心分離、ろ過、またはデカンテーションによって分離される。ある実施形態において、カルボン酸は脂肪酸を含む。ある実施形態において、カルボン酸は、１２〜２２個の炭素の範囲の炭素鎖長を有する。ある実施形態において、本方法は、油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程の前に、油を前記発酵槽に加える工程をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、さらなるカルボン酸を発酵槽に加える工程をさらに含む。ある実施形態において、さらなるカルボン酸を加える工程の後、油は、カルボン酸に転化される。ある実施形態において、カルボン酸は、トウモロコシ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、またはトウモロコシ油脂肪酸と大豆油脂肪酸との混合物である。ある実施形態において、油流から得られる油は、グリセリドを含み、１種以上の触媒は、グリセリドを脂肪酸へと加水分解する。ある実施形態において、カルボン酸のブチルエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。ある実施形態において、触媒は、ブタノールとともにカルボン酸をエステル化して、カルボン酸のブチルエステルを形成することが可能な酵素である。ある実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。ある実施形態において、固体は、動物飼料製品を形成するように処理される。ある実施形態において、ブチルエステルからブタノールを回収する工程は、エステルを、カルボン酸およびブタノールへと加水分解する工程を含む。ある実施形態において、ブチルエステルは、加水分解触媒の存在下で加水分解される。ある実施形態において、ブチルエステルは、水の存在下で加水分解され、加水分解触媒は、酸触媒、有機酸、無機酸、水溶性酸、または不水溶性酸を含む。ある実施形態において、加水分解触媒は、ブチルエステルを加水分解して、カルボン酸およびブタノールを形成することが可能な酵素を含む。ある実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。ある実施形態において、加水分解反応は、反応槽中で起こる。ある実施形態において、ブチルエステルからブタノールを回収する工程は、ブチルエステルを、ブタノールおよび脂肪酸アルキルエステルまたはアシルグリセリドへとエステル交換する工程を含む。ある実施形態において、脂肪酸アルキルエステルは、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、または脂肪酸プロピルエステルを含む。ある実施形態において、本方法は、天然油を提供する工程と、油を１種以上の酵素と接触させることによって、天然油の少なくとも一部をカルボン酸へと転化する工程とをさらに含む。ある実施形態において、酵素は、ブチルエステルを加水分解またはエステル交換して、ブタノールを形成することが可能な酵素である。ある実施形態において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはリゾホスホリパーゼである。
【００１８】
他の実施形態において、発酵方法は、バイオマスから得られる水性原料流を提供する工程であって、水性原料流が、水、バイオマスに由来する発酵性炭素源、および油を含む工程と；水性原料流を触媒と接触させ、それによって、油の少なくとも一部が、遊離脂肪酸へと加水分解されて、遊離脂肪酸および触媒を含む触媒で処理された原料流が形成される工程と；触媒で処理された原料流を、発酵槽中の発酵ブロスと接触させる工程と；発酵槽中の発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程と；発酵槽中の遊離脂肪酸および生成物アルコールのエステル化を触媒して、脂肪酸のアルコールエステルを生成するように、発酵の際に、生成物アルコールを、遊離脂肪酸および触媒と接触させる工程とを含み得る。ある実施形態において、原料流を、触媒および発酵ブロスと接触させる工程および発酵させる工程および生成物アルコールを、遊離脂肪酸および触媒と接触させる工程は、同時に行われ得る。ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、脂肪酸のアルコールエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。
【００１９】
本発明は、発酵の際に、発酵培地からアルコールを除去するための方法であって：発酵培地中でアルコールを生成する微生物を含む発酵培地を提供する工程と；発酵の際に、発酵培地を、カルボン酸、およびカルボン酸とともにアルコールをエステル化して、アルコールエステルを形成することが可能な触媒と接触させる工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、微生物によって生成されるアルコールはブタノールであり、アルコールエステルはブチルエステルである。ある実施形態において、発酵培地は、発酵培地に実質的に不溶のカルボン酸、およびカルボン酸とともにアルコールをエステル化して、アルコールエステルを形成することが可能な触媒と接触される。
【００２０】
本発明は、発酵プロセスの際に、脂肪酸のアルコールエステルを生成するための方法であって：アルコール、発酵性炭素源、および遊離脂肪酸を含む発酵培地を提供する工程と；発酵培地を、アルコールとともに遊離脂肪酸をエステル化することが可能な１種以上の酵素と接触させ、それによって、遊離脂肪酸が、アルコールとともにエステル化されて、脂肪酸のアルコールエステルが形成される工程とを含む方法も提供する。ある実施形態において、発酵性炭素源は、バイオマスに由来する。ある実施形態において、発酵培地の微生物は組み換え微生物である。ある実施形態において、アルコールはブタノールであり、脂肪酸のアルコールエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。
【００２１】
別の実施形態において、生成物アルコールを生成するための方法が、水、発酵性炭素源、および油を含むバイオマス原料を提供する工程であって、油がアシルグリセリドを含む工程と；バイオマス原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；バイオマス原料または液化されたバイオマスを、アシルグリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸へと転化することが可能な１種以上の酵素を含む組成物と接触させ、それによって、遊離脂肪酸が抽出剤を形成する工程であって、１種以上の酵素が、生成物アルコールとともに遊離脂肪酸を、脂肪酸のアルコールエステルへとエステル化することも可能である工程と；液化されたバイオマスを、オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と接触させる工程と；液化されたバイオマスを、発酵性糖を生成物アルコールに転化することが可能な組み換え微生物と接触させ、それによって、生成物アルコールを含む発酵生成物が生成される工程と；遊離脂肪酸および生成物アルコールのエステル化を触媒して、脂肪酸のアルコールエステルを生成するように、生成物アルコールを、遊離脂肪酸および１種以上の酵素と接触させる工程と；発酵生成物を抽出剤と接触させる工程とを含み得る。実施形態において、抽出剤との接触により、水相および抽出剤相を含む二相混合物が形成され、脂肪酸のアルコールエステルは、抽出剤相中に分離して、エステル含有抽出剤相を形成する。ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、脂肪酸のアルコールエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。
【００２２】
別の実施形態において、生成物アルコールを生成するための方法が、水、発酵性炭素源、および油を含むバイオマス原料を提供する工程であって、油がアシルグリセリドを含む工程と；バイオマス原料を液化して、オリゴ糖を含む液化されたバイオマスを生成する工程と；液化されたバイオマスを、アシルグリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸へと転化することが可能な１種以上の酵素を含む組成物と接触させる工程であって、１種以上の酵素が、生成物アルコールとともに遊離脂肪酸を、脂肪酸のアルコールエステルへとエステル化することも可能である工程と；液化されたバイオマスを、オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と接触させる工程と；糖化されたバイオマスを、発酵の際に、発酵性糖を生成物アルコールに転化することが可能な組み換え微生物と接触させ、それによって、生成物アルコールを含む発酵培地が生成される工程と；発酵の際に、発酵培地をカルボン酸抽出剤と接触させる工程であって、発酵培地が、生成物アルコールとともに遊離脂肪酸をエステル化して、脂肪酸のアルコールエステルを形成することが可能な１種以上の酵素を含む工程とを含み得る。本方法のさらなる実施形態において、発酵培地は、発酵培地に実質的に不溶のカルボン酸、およびカルボン酸とともにアルコールをエステル化して、アルコールエステルを形成することが可能な触媒と接触される。本方法の他の実施形態において、微生物によって生成されるアルコールはブタノールであり、アルコールエステルはブチルエステルである。
【００２３】
本発明は、原料から生成物アルコールを生成するための方法であって：原料中のでんぷんまたは発酵性炭素源を液化して、オリゴ糖を有するスラリーを生成する工程と；原料スラリーを遠心分離して、（ｉ）オリゴ糖を含む水層、（ｉｉ）油層、および（ｉｉｉ）固体を含む遠心分離生成物を生成する工程と；水層を、発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程と；水層を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程とを含む方法も提供する。次に、生成物アルコールは、カルボン酸および触媒と接触され、それによって、カルボン酸は、生成物アルコールとともにエステル化されて、アルコールエステルが形成される。ある実施形態において、油は植物由来油である。他の実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、カルボン酸のアルコールエステルは、脂肪酸のブチルエステルである。
【００２４】
ある実施形態において、生成物アルコールを生成するための方法が、水、でんぷん、および／または発酵性炭素源を含む分画されたバイオマス原料、ならびにバイオマスの分画の後に残るわずかな残留量の油を提供する工程であって、残留油がアシルグリセリドを含む工程と；分画されたバイオマス原料を液化して、オリゴ糖を含む液化された、分画されたバイオマスを生成する工程と；液化された、分画されたバイオマスを、残留アシルグリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸へと転化することが可能な１種以上の酵素を含む組成物と接触させる工程であって、１種以上の酵素が、生成物アルコールとともに遊離脂肪酸をエステル化して、脂肪酸のアルコールエステルを形成することも可能である工程と；液化された、分画されたバイオマスを、オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と接触させる工程と；糖化されたバイオマスを、発酵の際に、発酵性糖を生成物アルコールに転化することが可能な組み換え微生物と接触させ、それによって、生成物アルコールを含む発酵培地が生成される工程と；発酵の際に、発酵培地をカルボン酸抽出剤と接触させる工程であって、発酵培地が、生成物アルコールとともに遊離脂肪酸をエステル化して、脂肪酸のアルコールエステルを形成することが可能な１種以上の酵素を含む工程とを含む。本方法のさらなる実施形態において、発酵培地は、発酵培地中のカルボン酸、およびカルボン酸とともにアルコールをエステル化して、アルコールエステルを形成することが可能な触媒と接触される。さらなる実施形態において、カルボン酸は、発酵培地に実質的に不溶であり得る。本方法の他の実施形態において、微生物によって生成されるアルコールはブタノールであり、アルコールエステルはブチルエステルである。
【００２５】
本発明は、バイオマスから形成され、水および発酵性糖を含むマッシュと；アルコールとともに遊離脂肪酸を、脂肪酸アルキルエステルへとエステル化することが可能であり、かつ任意にアシルグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な触媒と；アルコールと；遊離脂肪酸と；触媒によるアルコールによる遊離脂肪酸のエステル化から原位置で形成される脂肪酸アルコールエステルとを含む組成物も提供する。ある実施形態において、アルコールはブタノールであり、脂肪酸アルコールエステルは脂肪酸ブチルエステルである。
【００２６】
本発明は、アルコールを生成することが可能な組み換え微生物と；発酵性炭素源と；脂肪酸アルコールエステルとを含む発酵ブロスであって、脂肪酸アルコールエステルが、発酵の際に生成される発酵ブロスも提供する。ある実施形態において、組み換え微生物は、ブタノールを生成することが可能である。ある実施形態において、脂肪酸アルコールエステルは脂肪酸ブチルエステルである。ある実施形態において、発酵性炭素源は糖を含む。ある実施形態において、発酵性炭素源はメタンを含み、組み換え微生物は、メタノールを生成することが可能であり、脂肪酸アルコールエステルは脂肪酸メチルエステルである。
【００２７】
生成物アルコールの生成に有用な組み換え酵母細胞も本明細書において提供される。実施形態において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、遺伝子組み換えおよび組み換え遺伝子発現に有用な、任意の細菌、酵母または真菌宿主であり得る。他の実施形態において、組み換え宿主細胞は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーであり得る。他の実施形態において、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピヒア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であリ得る。さらに他の実施形態において、宿主細胞は酵母宿主細胞である。ある実施形態において、宿主細胞は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーである。ある実施形態において、宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）である。ある実施形態において、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ���）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母が、当該技術分野において公知であり、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄを含むがこれらに限定されない様々な供給元から入手可能である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、以下に限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｔｕｒｂｏ酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられる。
【００２８】
イソブタノールを生成する方法であって：イソブタノール生合成経路を含む組み換え宿主細胞を提供する工程であって、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの基質−生成物転化を触媒する酵素またはイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質−生成物転化を触媒する酵素の少なくとも一方が、染色体中に組み込まれた異種のポリヌクレオチドによってコードされる工程と；組み換え宿主細胞を発酵性炭素源と接触させて、イソブタノールが生成される条件下で発酵ブロスを形成する工程とを含む方法も提供される。ある実施形態において、本方法は、抽出剤を加えて、二相混合物を形成する工程をさらに含む。他の実施形態において、抽出剤はカルボン酸を含む。ある実施形態において、抽出剤は脂肪酸を含む。他の実施形態において、本方法は、カルボン酸によるイソブタノールのエステル化を触媒することが可能なエステル化酵素を加える工程をさらに含む。
【００２９】
生成物アルコール、水、発酵性炭素源、および生成物アルコールを生成する微生物を含む発酵培地を提供する工程と；発酵の際に、発酵培地を抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程と；発酵培地を、カルボン酸、および生成物アルコールとともにカルボン酸をエステル化することが可能な酵素と接触させる工程とを含む方法も本明細書において提供される。ある実施形態において、抽出剤はカルボン酸を含む。ある実施形態において、カルボン酸は、バイオマス原料から、油の加水分解によって生成される。ある実施形態において、発酵性炭素およびカルボン酸は、同じバイオマス原料源に由来する。ある実施形態において、カルボン酸は、１２〜２２個の炭素を有する飽和、単不飽和、多価不飽和カルボン酸、およびそれらの混合物を含む。ある実施形態において、発酵培地を、抽出剤およびカルボン酸および酵素と接触させる工程は同時に行われる。ある実施形態において、微生物は、遺伝子組み換え微生物（例えば、組み換え微生物または組み換え酵母細胞などの宿主細胞）である。
【００３０】
ＰＮＹ１５０４、ＰＮＹ２２０５、または組み換え宿主細胞；抽出剤；および任意にエステル化酵素を含む組成物も本明細書において提供される。ＰＮＹ１５０４、ＰＮＹ２２０５、または組み換え宿主細胞およびブチルエステルを含む組成物も本明細書において提供される。
【００３１】
イソブタノールの生成のための、ＰＮＹ１５０４、ＰＮＹ２２０５、または他の組み換え酵母細胞、および組み換え酵母細胞を含む組成物の使用も本明細書においてさらに提供される。
【００３２】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、本発明を例示し、さらに、本明細書とともに、本発明の原理を説明し、関連技術分野の当業者が本発明を行い、使用できるようにする働きを果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】アルコールエステル化のための触媒が、カルボン酸および／または天然油とともに発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図２】天然油が、触媒を用いてカルボン酸へと転化され、カルボン酸および触媒が発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図３】液化バイオマスが、発酵の前に脂質加水分解のための触媒と接触される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図４】液化され、糖化されたバイオマスが、発酵の前に脂質加水分解のための触媒と接触される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図５】所定の量の脂質および非溶解固体が、発酵の前に液化されたバイオマスから除去され、除去された脂質が、触媒を用いてカルボン酸へと転化され、カルボン酸および触媒が発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図６】炭素源としてのスクロースを用いた発酵によって生成されるイソブタノールの水相および溶媒相の濃度を示す。水相力価（パネルＡ）が、ｇ／Ｌの単位で報告され、溶媒相種（イソブタノール、パネルＢおよびＦＡＢＥとしてのイソブタノール、パネルＣ。パネルＤは、溶媒相中の全イソブタノールである）は、重量パーセントの単位で報告される。
【図７】経時的なイソブタノールの有効力価（ｇ／Ｌ）を示す。この例における有効力価を、接種後の水性発酵ブロスの初期体積に基づいて、テキストに記載されるように計算した。
【図８】経時的なグルコース当量で報告される糖類の消費を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含めて本出願が優先するものとする。また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および他の参照文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
【００３５】
特に規定されない限り、以下の略語が本明細書において使用される場合、それらは以下の意味を有する：
ＡＤＨ                  アルコールデヒドロゲナーゼ
ＡＬＳ                  アセト乳酸シンターゼ
ＡＱ                    水性画分
ＢｕＯ−ＣＯＦＡ        トウモロコシ油脂肪酸のブチルエステル
ＣＡＬＢ                カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ
ＣＯＦＡ                トウモロコシ油脂肪酸
ＤＤＧＳ                可溶物含有乾燥穀類蒸留粕
ＤＧ                    ジグリセリド
ＤＨＡＤ                ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ
ＥＯＲ                  実行終了
ＥｔＯＨ                エタノール
ＥｔＯ−ＣＯＦＡ        トウモロコシ油脂肪酸のエチルエステル
ＦＡＢＥ                脂肪酸ブチルエステル
ＦＡＥＥ                脂肪酸エチルエステル
ＦＡＭＥ                脂肪酸メチルエステル
ＦＦＡ                  遊離脂肪酸
ＦＯＡ                  フルオロオロチン酸
ＨＡＤＨ                ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ
ＩＢＡ                  イソブタノール
ｉ−ＢｕＯＨ            イソブタノール
ｉ−ＢｕＯ−ＣＯＦＡ    トウモロコシ油脂肪酸のイソブチルエステル
ｉ−ＢｕＯ−オレエート  オレイン酸イソ−ブチル
ｉ−ＰｒＯＨ            イソプロパノール
ｉ−ＰｒＯ−ＣＯＦＡ    トウモロコシ油脂肪酸のイソプロピルエステル
ＩＳＰＲ                原位置生成物除去
ＫＡＲＩ                ケトール酸レダクトイソメラーゼ
ＫｉｖＤ                ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ
ＭＡＧ                  モノアシルグリセリド
ＭｅＢＯＨ              ２−メチル−１−ブタノール
ＭｅＢＯ−ＣＯＦＡ      トウモロコシ油脂肪酸の２−メチル−１−ブチルエステル
ＭｅＯＨ                メタノール
ＭｅＯ−ＣＯＦＡ        トウモロコシ油脂肪酸のメチルエステル
ＭＧ                    モノグリセリド
ｎ−ＢｕＯＨ            ｎ−ブタノール
ＯＡ                    オレイルアルコール
ＯＲＧ                  有機画分
ＰｅｎＯＨ              １−ペンタノール
ＰｅｎＯ−ＣＯＦＡ      トウモロコシ油脂肪酸の１−ペンチルエステル
ＰｒＯＨ                １−プロパノール
ＰｒＯ−ＣＯＦＡ        トウモロコシ油脂肪酸の１−プロピルエステル
ＳＯＦＡ                大豆油脂肪酸
ＳＳＦ                  同時糖化発酵
ｔ−ＢｕＯＨ            ｔｅｒｔ−ブチルアルコール
ＴＧ                    トリグリセリド
３Ｍ３Ｐ                ３−Ｍｅ−３−ペンタノール
【００３６】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書において提供される。
【００３７】
本明細書において使用される際の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の活用形は、記載される整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを意味することが理解されよう。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないかあるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、相反する明示的な記載がない限り、「または」は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のうちの１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在する）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００３８】
また、本発明の要素または構成要素の前にある不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、事例の数、すなわち、要素または構成要素の出現の数に関して限定されないことが意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読まれるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数値が単数であることを明白に意味しない限り、複数も含む。
【００３９】
本明細書において使用される際の「発明」または「本発明」の用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の１つの実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される考えられる全ての実施形態を包含する。
【００４０】
本明細書において使用される際の、用いられる本発明の成分または反応剤の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作製するのに使用される典型的な測定および液体処理手順によって；これらの手順における不注意による誤りによって；組成物を作製するかまたは方法を行うのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差などによって起こり得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物のための平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、量に対する均等物を含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、あるいは報告される数値の５％以内を意味する。
【００４１】
本明細書において使用される際の「バイオマス」は、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、セルロース系またはリグノセルロース系材料ならびにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、オリゴ糖、二糖類および／または単糖類、およびそれらの混合物を含む材料などの天然資源に由来する任意の糖類およびでんぷんを含む発酵性糖を提供する加水分解性多糖類を含有する天然産物を指す。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは、１つの供給源に由来してもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含み得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、以下に限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙からの汚泥、庭ごみ、サトウキビ廃棄物、木くずおよび林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから形成され得、発酵性糖を含み、水を含み得る。例えば、セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスは、当業者に公知の任意の方法によって発酵性糖を含有する加水分解物を得るように処理され得る。参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に開示されている低アンモニア前処理が特に有用である。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、通常、セルロースおよびヘミセルロースを分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含む糖類を含有する加水分解物を生成するために酵素群（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を利用する。（セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスに適した糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７，２００２）に概説されている。
【００４２】
マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物は、本明細書に記載される原料１２および原料スラリー１６を含み得る。水性原料流が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから誘導または形成され得、発酵性炭素基質（例えば、糖）を含み、水を含み得る。水性原料流が、本明細書に記載される原料１２および原料スラリー１６を含み得る。
【００４３】
本明細書において使用される際の「バイオマス収量」は、生成される炭素基質のグラム当たり生成されるバイオマス（すなわち、細胞バイオマス生成）のグラムを指す。
【００４４】
本明細書において使用される際の「原料」は、発酵プロセスにおける原料であって、非溶解固体を含むかまたは含まずに発酵性炭素源を含有し、該当する場合、発酵性炭素源がでんぷんから遊離されたかあるいは液化、糖化、または他のプロセスなどによるさらなる処理によって複合糖類を分解することから得られる前または後に発酵性炭素源を含有する原料を意味する。原料は、バイオマスを含むかまたはバイオマスに由来する。好適な原料としては、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、トウモロコシマッシュ、サトウキビ、サトウキビマッシュ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物が挙げられる。「原料油」に言及される場合、この用語が、所与の原料から生成される油を包含することが理解されよう。
【００４５】
本明細書において使用される際の「発酵培地」は、水と、糖類と、溶解固体と、任意にアルコールを生成する微生物と、生成物アルコールと、存在する微生物による、アルコール、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への糖類の反応によって生成物アルコールが作製される発酵槽中に保持される材料の全ての他の成分との混合物を意味する。場合により、本明細書において使用される際の「発酵ブロス」および「発酵された混合物」という用語は、「発酵培地」と同義に使用することができる。
【００４６】
本明細書において使用される際の「発酵性炭素源」または「発酵性炭素基質」は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝されることが可能な炭素源を意味する。好適な発酵性炭素源としては、以下に限定はされないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；ラクトースまたはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖類；メタンを含む一炭素基質；およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４７】
本明細書において使用される際の「発酵性糖」は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝されることが可能な１種以上の糖類を指す。
【００４８】
本明細書において使用される際の「発酵槽」は、発酵反応が行われ、それによって、ブタノールなどの生成物アルコールが糖類から作製される槽を意味する。
【００４９】
本明細書において使用される際の「液化槽」は、液化が行われる槽を意味する。液化は、オリゴ糖が原料から遊離されるプロセスである。原料がトウモロコシである、ある実施形態において、オリゴ糖は、液化中にトウモロコシでんぷん含有物から遊離される。
【００５０】
本明細書において使用される際の「糖化槽」は、糖化（すなわち、オリゴ糖の単糖類への分解）が行われる槽を意味する。発酵および糖化が同時に行われる場合、糖化槽および発酵槽は、同じ槽であってもよい。
【００５１】
本明細書において使用される際の「糖」は、オリゴ糖、二糖類、単糖類、および／またはそれらの混合物を指す。「糖」という用語は、でんぷん、デキストラン、グリコーゲン、セルロース、ペントサン、ならびに糖類を含む炭水化物も含む。
【００５２】
本明細書において使用される際の「糖化酵素」は、多糖類および／またはオリゴ糖、例えば、グリコーゲン、またはでんぷんのα−１，４−グルコシド結合を加水分解することが可能な１種以上の酵素を意味する。糖化酵素は、セルロース系またはリグノセルロース系材料を加水分解することが可能な酵素も含み得る。
【００５３】
本明細書において使用される際の「非溶解固体」は、原料の非発酵性部分、例えば、胚芽、繊維、およびグルテンを意味する。例えば、原料の非発酵性部分は、原料の固体として残る部分を含み、発酵ブロスから液体を吸収し得る。
【００５４】
本明細書において使用される際の可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）は、原料またはバイオマスの発酵（例えば、生成物アルコールを生成する穀類または穀類混合物の発酵）からの副産物または副生成物を指す。ある実施形態において、ＤＤＧＳは、生成物アルコール（例えば、ブタノール、イソブタノールなど）を作製する方法から生成される動物飼料製品も指す。
【００５５】
本明細書において使用される際の「生成物アルコール」は、発酵性炭素基質の供給源としてバイオマスを用いる発酵プロセスにおいて微生物によって生成され得る任意のアルコールを指す。生成物アルコールとしては、以下に限定はされないが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールが挙げられる。ある実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである。他の実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ５のアルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられることが理解されよう。同様に、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられる。「アルコール」はまた、生成物アルコールに関連して本明細書において使用される。
【００５６】
本明細書において使用される際の「ブタノール」は、特に、ブタノール異性体１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔ−ＢｕＯＨ）、および／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨまたはｉ−ＢｕＯＨまたはＩ−ＢＵＯＨ、２−メチル−１−プロパノールとしても知られている）を、個々にまたはそれらの混合物として指す。場合により、ブタノールのエステルに言及される場合、「ブチルエステル」および「ブタノールエステル」という用語は、同義に使用することができる。
【００５７】
本明細書において使用される際の「プロパノール」は、プロパノール異性体イソプロパノールまたは１−プロパノールを指す。
【００５８】
本明細書において使用される際の「ペンタノール」は、ペンタノール異性体１−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、３−ペンタノール、２−ペンタノール、３−メチル−２−ブタノール、または２−メチル−２−ブタノールを指す。
【００５９】
本明細書において使用される際の「アルコール当量」という用語は、アルコールエステルの完全な加水分解および所定の量のアルコールエステルからのアルコールのその後の回収によって得られるであろうアルコールの重量を指す。
【００６０】
本明細書において使用される際の「水相力価」という用語は、発酵ブロス中の特定のアルコール（例えば、ブタノール）の濃度を指す。
【００６１】
本明細書において使用される際の「有効力価」という用語は、発酵によって生成される特定のアルコール（例えば、ブタノール）または発酵培地のリットル当たりの、アルコールエステル化によって生成されるアルコールエステルのアルコール当量の総量を指す。例えば、発酵の単位体積におけるブタノールの有効力価は：（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノールの量；（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合、気相から回収されるブタノールの量；および（ｉｖ）有機相または水相中のブチルエステルのアルコール当量を含む。
【００６２】
本明細書において使用される際の「有効率（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅ）」という用語は、有効力価を発酵時間で除算した値である。
【００６３】
本明細書において使用される際の「有効収量」という用語は、消費されるグルコースのグラム当たり生成される生成物アルコールの合計グラムである。
【００６４】
本明細書において使用される際の「原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）」は、生成物が生成される際に、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御するために、発酵などの生物学的プロセスから特定の発酵生成物を選択的に除去することを意味する。
【００６５】
本明細書において使用される際の「抽出剤」または「ＩＳＰＲ抽出剤」は、ブタノールなどの任意の生成物アルコールを抽出するのに使用され、または生成物アルコールおよびカルボン酸または脂質から触媒によって生成される任意の生成物アルコールエステルを抽出するのに使用される有機溶媒を意味する。場合により、本明細書において使用される際の「溶媒」という用語は、「抽出剤」と同義に使用することができる。本明細書に記載される方法では、抽出剤は水不混和性である。
【００６６】
「水不混和性」または「不溶性」という用語は、１つの液相を形成するように、発酵ブロスなどの水溶液と混合することができない抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。
【００６７】
本明細書において使用される際の「水相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。発酵抽出を含む本明細書に記載されるプロセスの一実施形態において、「発酵ブロス」という用語は、この場合、二相性発酵抽出における水相を特に指す。
【００６８】
本明細書において使用される際の「有機相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。
【００６９】
本明細書において使用される際の「カルボン酸」という用語は、一般化学式−ＣＯＯＨ（式中、炭素原子が、カルボニル基（−Ｃ＝Ｏ）を構成するために二重結合によって酸素原子に結合され、単結合によってヒドロキシル基（−ＯＨ）に結合される）で表される任意の有機化合物を指す。カルボン酸は、プロトン化したカルボン酸の形態、カルボン酸の塩の形態（例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩）、またはプロトン化したカルボン酸とカルボン酸の塩との混合物としての形態であってもよい。カルボン酸という用語は、単一の化学種（例えば、オレイン酸）または例えば、バイオマス由来の脂肪酸エステルまたはトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質の加水分解によって生成され得るカルボン酸の混合物を表し得る。
【００７０】
本明細書において使用される際の「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２８の炭素原子（最も一般的にはＣ１２〜Ｃ２４の炭素原子）を有するカルボン酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸）を指す。脂肪酸はまた、分枝鎖状または非分枝鎖状であってもよい。脂肪酸は、動物性または植物性脂肪、油、またはワックスに由来するか、あるいはそれらの中にエステル化された形態で含まれ得る。脂肪酸は、脂肪および脂肪油中のグリセリドの形態で天然に存在するものであってもよく、あるいは脂肪の加水分解によってまたは合成によって得られる。脂肪酸という用語は、単一の化学種または脂肪酸の混合物を表し得る。さらに、脂肪酸という用語は、遊離脂肪酸も包含する。
【００７１】
本明細書において使用される際の「脂肪アルコール」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族鎖を有するアルコールを指す。
【００７２】
本明細書において使用される際の「脂肪アルデヒド」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族鎖を有するアルデヒドを指す。
【００７３】
本明細書において使用される際の「脂肪アミド」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族長鎖を有するアミドを指す。
【００７４】
本明細書において使用される際の「脂肪酸エステル」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族長鎖を有するエステルを指す。
【００７５】
本明細書において使用される際の「天然油」は、植物（例えば、バイオマス）または動物から得られる脂質を指す。本明細書において使用される際の「植物由来油」は、特に植物から得られる脂質を指す。場合により、「脂質」は、「油」および「アシルグリセリド」と同義に使用することができる。天然油としては、以下に限定はされないが、獣脂、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、および植物油ブレンドが挙げられる。
【００７６】
本明細書において使用される際の「分離」という用語は、「回収」と同義であり、初期混合物から化学化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度または濃度より高い純度またはより高い濃度の化合物を得ることを指す。
【００７７】
本明細書において使用される際の「ブタノール生合成経路」という用語は、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００７８】
本明細書において使用される際の「１−ブタノール生合成経路」という用語は、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００７９】
本明細書において使用される際の「２−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から２−ブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００８０】
本明細書において使用される際の「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩からイソブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００８１】
「遺伝子」という用語は、任意に、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）および後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する自然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない（すなわち、その天然状態から改変されるかまたは別の源に由来する）任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコード配列または同じ源に由来するが、自然に見出されるのとは異なる様式で配置される調節配列およびコード配列を含み得る。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム内のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来遺伝子」または「異種遺伝子」は、宿主生物の天然遺伝子として通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含み得る。
【００８２】
本明細書において使用される際の「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、内部に位置するヌクレオチド配列、または下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード配列）を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を与える。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステム・ループ構造が挙げられる。
【００８３】
「コドン最適化」という用語は、様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域に言及する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変化させずに、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するように、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を指す。コドン最適化は、当業者の技能の範囲内である。
【００８４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、１つの核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。本明細書において使用される際の「遺伝子」は、ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、非翻訳５’および３’配列ならびにコード配列を含む、完全長ｃＤＮＡ配列またはその断片のヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、異種ＤＮＡ）であり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的に、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成分子から構成され得る。「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００８５】
ポリヌクレオチド配列は、その自然環境から取り出された「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」ものとして言及され得る。例えば、ベクターに含まれるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種のポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの他の例としては、溶液中の異種宿主細胞あるいは（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチド中に維持される組み換えポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により産生されるこのような分子をさらに含む。ＤＮＡのポリマーの形態の単離されたポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含み得る。
【００８６】
本明細書において使用される際の「ポリペプチド」という用語は、１つの「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線状に結合されるモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」あるいは２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すのに使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、すなわちこれらの用語と同義に使用することができる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来しても、または組み換え技術によって産生されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。
【００８７】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、その変異体、または誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドが意図される。精製の具体的なレベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現される、組み換えによって産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって、分離、分画、または部分的にまたは実質的に精製された天然または組み換えポリペプチドであるように、本発明の目的のために単離されると考えられる。
【００８８】
本明細書において使用される際の「組み換え微生物」は、例えば、ブタノールなどのアルコールを生成するための生合成経路などの生合成経路を含むように宿主細胞を改変することによる、組み換えＤＮＡ技術の使用によって改変される、細菌または酵母などの微生物を指す。
【００８９】
本発明は、微生物に対する生成物アルコール（ブタノールなど）の毒性作用を減少させる手段として、生成物アルコールを発酵培地とＩＳＰＲ抽出剤とに分液することを必要としない代替的な抽出発酵方法の必要性を満たす。本発明は、ブタノールなどのアルコールを生成するための方法であって、生成物アルコールが、微生物に対する毒性が低くなり得るアルコールエステルへと転化され、ここで、発酵生成物抽出剤の分配係数の低下の同時の減少が実現され、アルコール（発酵培地からの分離後にアルコールに再び転化され得る遊離アルコールとアルコールエステルとの組合せとして）の生成収率の改良をもたらす方法を提供することによって、発酵生成物ＩＳＰＲ抽出剤の分配係数の低下を抑える必要性も満たす。さらに、本明細書の方法を、既存の方法（例えば、固体除去）と組み合わせて、経済的および環境的に有利に生成物除去を増加させることができるように、本発明は、別のアルコール生成物除去方法の欠点に対する解決法を提供する。したがって、本発明は、以下の実施形態の説明によって明らかになるであろうように、さらなる関連する利点を提供する。
【００９０】
本発明は、カルボン酸とともにアルコールをエステル化し、得られたアルコールエステルを発酵培地から抽出することによって、発酵培地からアルコールを除去するための方法であって、その後、アルコールをアルコールエステルから回収することができる方法を提供する。酸は、遊離脂肪酸として直接発酵培地に加えられてもよく、または油から誘導されてもよい。本発明は、原料に由来する油を、アルコールのエステル化に使用することができ、および／またはアルコールエステルを抽出するためのＩＳＰＲ抽出剤またはＩＳＰＲ抽出剤の成分として働き得るカルボン酸へと加水分解することによって、アルコール発酵プロセスから油を除去するかまたは減少させるための方法も提供する。
【００９１】
反応系中に存在する水の量の減少、あるいは単一または複数の非水性溶媒を使用する反応系の利用が、リパーゼなどの酵素によって触媒される場合のカルボン酸によるアルコールのエステル化に通常必要とされてきた。リパーゼ酵素が、発酵性炭素源の発酵の際のカルボン酸による生成物アルコールのエステル化を効果的に触媒して、生成物アルコールを生成することができるという意外な発見が本明細書に記載されている。発酵の際のカルボン酸による生成物アルコールのエステル化により、発酵性能を改良することができるという意外な発見も本明細書に記載されている。それは、例えば、エステル形態で生成される生成物アルコール（例えば、ブタノール）を捕捉することによって、水相中の生成物アルコールの濃度を効果的に低下させ、したがって、グルコース消費および生成物生成に対する生成物アルコールの毒性作用を軽減する。
【００９２】
本発明は、図を参照して説明される。図１は、本発明の一実施形態に係る、エタノールまたはブタノールなどの発酵アルコールの生成のための例示的なプロセス流れ図を示す。図示されるように、原料１２は、液化槽１０の入口に導入され、液化されて、原料スラリー１６が生成され得る。原料１２は、発酵性炭素基質（例えば、グルコースなどの発酵性糖）を供給する加水分解性多糖類を含有し、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、サトウキビまたはトウモロコシなどのバイオマスであり得るか、あるいはバイオマスに由来し得る。ある実施形態において、原料１２は、分画されたバイオマスの１種以上の成分であり得、他の実施形態において、原料１２は、粉砕された、分画されていないバイオマスであり得る。ある実施形態において、原料１２は、乾式粉砕された、分画されていないトウモロコシの実などのトウモロコシであり得、非溶解粒子は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。非溶解固体は、原料１２の非発酵性部分である。図に示される実施形態を参照した本明細書における説明のために、原料１２は、非溶解固体が分離されていない、粉砕された、分画されていないトウモロコシであるものとして説明されることが多い。しかしながら、当業者に明らかなように、本明細書に記載される例示的な方法およびシステムは、分画されるか否かにかかわらず様々な原料向けに変更することができることを理解されたい。さらに、当業者が理解することができるように、原料含量（例えば、トウモロコシ含量）を最大にすると、糖含量ならびに生成物力価を最大にすることができる。ある実施形態において、原料１２は、高オレイン酸トウモロコシであり得るため、それに由来するトウモロコシ油は、少なくとも約５５重量％のオレイン酸のオレイン酸含量を有する高オレイン酸トウモロコシ油である。ある実施形態において、約２４重量％である通常のトウモロコシ油中のオレイン酸含量と比較して、高オレイン酸トウモロコシ油中のオレイン酸含量は、最大で約６５重量％であり得る。油の加水分解により、発酵ブロスと接触させるための高いオレイン酸含量を有する遊離脂肪酸が得られるため、高オレイン酸油は、本発明の方法に使用するのにいくつかの利点を提供し得る。
【００９３】
原料１２を液化するプロセスは、原料１２中の多糖を、例えば、デキストリンおよびオリゴ糖を含む糖類へと加水分解することを含み、従来のプロセスである。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の液化プロセス、ならびに対応する液化槽が使用され得る。このようなプロセスは、単独でまたは組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、酵素プロセスを用いることができ、適切な酵素１４、例えば、α−アミラーゼが、液化槽１０の入口に導入される。水も液化槽１０に導入することができる。ある実施形態において、糖化酵素、例えば、グルコアミラーゼも、液化槽１０に導入され得る。さらなる実施形態において、油の１つ以上の成分の、遊離脂肪酸への転化を触媒するために、リパーゼも液化槽１０に導入され得る。
【００９４】
原料１２を液化することから生成される原料スラリー１６は、原料に由来する、発酵性炭素基質（例えば、糖）、油、および非溶解固体を含む。原料スラリー１６は、液化槽１０の出口から排出され得る。ある実施形態において、原料１２は、トウモロコシまたはトウモロコシの実であるため、原料スラリー１６はトウモロコシマッシュスラリーである。ある実施形態において、原料１２は、リグノセルロース系原料であるため、原料スラリー１６は、リグノセルロース系加水分解物であり得る。ある実施形態において、原料１２はサトウキビである。
【００９５】
原料スラリー１６は、微生物３２とともに発酵槽３０に導入される。発酵槽３０は、スラリー１６を発酵させて、アルコールを生成するように構成される。特に、微生物３２が、スラリー１６中の発酵性糖を代謝し、生成物アルコールを排出する。微生物３２は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される。ある実施形態において、微生物３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌であり得る。ある実施形態において、微生物３２は、発酵性組み換え微生物であり得る。スラリーは、例えば、オリゴ糖の形態の糖、および水を含んでいてもよく、ある実施形態において、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、約１０ｇ／Ｌ未満、または約５ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含み得る。モノマーグルコースの量を決定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において公知のこのような好適な方法は、ＨＰＬＣを含む。
【００９６】
ある実施形態において、スラリー１６中の複合糖類（例えば、オリゴ糖）を、微生物３２によって容易に代謝され得る単糖類へと分解するために、スラリー１６が、糖化プロセスに供される。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。ある実施形態において、同時糖化発酵（ＳＳＦ）は、図１に示されるように、発酵槽３０の内部で行われ得る。ある実施形態において、でんぷんまたはオリゴ糖を、微生物３２によって代謝可能なグルコースに分解するために、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、発酵槽３０の入口に導入され得る。
【００９７】
カルボン酸２８および／または天然油２６が、触媒４２とともに、発酵槽３０に導入される。触媒４２は、酵素３８の前、後、またはそれと同時に導入され得る。したがって、ある実施形態において、酵素３８および触媒４２の添加は段階的であり得（例えば、触媒４２、次に酵素３８、または逆の場合もある）またはほぼ同時（すなわち、人または機械が一回で添加を行うのにかかる時間と全く同じ時間で、あるいは人または機械が２回で添加を行うのにかかる時間と同じように１つの酵素／触媒の直後に他の触媒／酵素を添加する）であり得る。触媒４２は、カルボン酸２８とともに生成物アルコールをエステル化して、アルコールエステルを形成することが可能である。例えば、ブタノール生成の場合、触媒４２は、カルボン酸２８とともにブタノールをエステル化して、ブチルエステルを形成することが可能である。
【００９８】
天然油２６が発酵槽３０に供給される場合、油２６を触媒４２と接触させることによって、油２６中のアシルグリセリドの少なくとも一部が、カルボン酸２８へと加水分解され得る。油２６の加水分解から得られる酸／油組成物は、通常、少なくとも約１７重量％のカルボン酸２８（遊離脂肪酸として）である。ある実施形態において、油２６の加水分解から得られる酸／油組成物は、少なくとも約２０重量％のカルボン酸、少なくとも約２５重量％のカルボン酸、少なくとも約３０重量％のカルボン酸、少なくとも約３５重量％のカルボン酸、少なくとも約４０重量％のカルボン酸、少なくとも約４５重量％のカルボン酸、少なくとも約５０重量％のカルボン酸、少なくとも約５５重量％のカルボン酸、少なくとも約６０重量％のカルボン酸、少なくとも約６５重量％のカルボン酸、少なくとも約７０重量％のカルボン酸、少なくとも約７５重量％のカルボン酸、少なくとも約８０重量％のカルボン酸、少なくとも約８５重量％のカルボン酸、少なくとも約９０重量％のカルボン酸、少なくとも約９５重量％のカルボン酸、または少なくとも約９９重量％のカルボン酸である。ある実施形態において、得られる酸／油組成物は、油中のアシルグリセリドの部分加水分解からのモノグリセリドおよび／またはジグリセリドを含む。ある実施形態において、得られる酸／油組成物は、アシルグリセリド加水分解の副生成物であるグリセロールを含む。あるさらなる実施形態において、得られる酸／油組成物は、油中のリン脂質の部分加水分解からのリゾリン脂質を含む。
【００９９】
ある実施形態において、油２６中のアシルグリセリドの加水分解の後、油２６からの残留アシルグリセリドは、発酵ブロス組成の約０重量％〜少なくとも約２重量％である。あるさらなる実施形態において、油２６中のアシルグリセリドの加水分解の後、油２６からの残留アシルグリセリドは、発酵ブロス組成の少なくとも約０．５重量％である。したがって、ある実施形態において、油２６からのアシルグリセリドは、触媒４２を用いてカルボン酸２８に触媒により加水分解され得、触媒４２は、生成物アルコールとともにカルボン酸２８をエステル化することもできる。ある実施形態において、第２の触媒（図示せず）が、アシルグリセリドの加水分解のために発酵槽に導入され得る。さらに、原料１２に由来し、スラリー１６中に存在する油中のアシルグリセリドは、カルボン酸２８’へと加水分解することもできる（例えば、図３の実施形態を参照）。ある実施形態において、発酵槽中のカルボン酸（脂肪酸など）の濃度は、水相中の溶解限度を超え、有機相および水相を含む二相発酵混合物が生成される。ある実施形態において、発酵ブロス中のカルボン酸の濃度は、通常、約０．８ｇ／Ｌ以下であり、ブロス中のカルボン酸の溶解性によって制限される。
【０１００】
ある実施形態において、触媒４２および第２の触媒は、使用される場合、１種以上の酵素、例えば、リパーゼ酵素であり得る。ある実施形態において、触媒４２は、１種以上の酵素、例えば、リパーゼ酵素などの加水分解酵素であり得る。使用されるリパーゼ酵素は、例えば、アブシディア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビューベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、ブロコトリックス属（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロモバクター属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ハイホジーマ属（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イノシシ属（Ｓｕｓ）、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、チアロスポレラ（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、および／またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の菌株を含む任意の供給原に由来し得る。好ましい態様において、リパーゼの供給源は、アブシディア・ブラケスレーナ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅｎａ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アクロモバクター・イオファガス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｏｐｈａｇｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、アルタナリア・ブラシキコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｏｌａ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｒｅａｒｏｔｈｅ��ｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブロコトリクス・サーモソハタ（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ  ｔｈｅｒｍｏｓｏｈａｔａ）、カンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ））、カンジダ・パラリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、カンジダ・エルノビ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｒｎｏｂｉｉ）、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、クロモバクター・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、ネナガヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｉｕｓ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）、フザリウム・ロゼウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ゲオトリクム・ペニシラツム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ  ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）、フミコーラ・ブレビスポラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｂｒｅｖｉｓｐｏｒａ）、フミコーラ・ブレビス変種サーモイデア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｂｒｅｖｉｓ  ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ラクトバチルス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）、ペニシリウム・クラストサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンザム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｉ、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＩＩ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）（バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）と同義）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、  シュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス・メフィティカ・リポリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｐｈｉｔｉｃａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プランタリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓ���ｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、およびシュードモナス・ウィスコンシネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・ジャポニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ノドスス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロマイセス・シバタヌス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、サーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（以前はフミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））、チアロスポレラ・ファセオリナ（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。さらなる好ましい態様において、リパーゼは、サーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｃｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）リパーゼ、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）リパーゼ、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）リパーゼ、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）リパーゼ、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）リパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）リパーゼ、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼ、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するリパーゼＡおよびＢ、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）リパーゼ、ネクトリア・ハエマトコカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）リパーゼ、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓ���ｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）リパーゼ、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ、およびリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）リパーゼからなる群から選択される。触媒４２として適した好適な市販のリパーゼ調製物としては、以下に限定はされないが、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能な、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）２０００Ｔ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＡ  Ｌ、およびＰａｌａｔａｓｅ  ２００００Ｌ、あるいはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手可能な、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ブタ膵臓、カンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するリパーゼが挙げられる。
【０１０１】
ホスホリパーゼは、リン脂質のエステル結合を加水分解する酵素であるが、多くのホスホリパーゼは、トリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリドも加水分解することができる（脂質アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）活性）。本明細書において使用される際の「ホスホリパーゼ」という用語は、任意のホスホリパーゼ活性を有し、例えば、原油または植物油などの油中の、例えば、グリセロールリン酸エステル結合を開裂させる（グリセロールリン酸エステル結合の加水分解を触媒する）酵素を包含する。本発明のホスホリパーゼ活性は、水で抽出可能なリン酸化塩基およびジグリセリドを生成し得る。ホスホリパーゼ活性は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性；ＰＩ−ＰＬＣ活性、ホスホリパーゼＡ１またはホスホリパーゼＡ２活性などのホスホリパーゼＡ（ＰＬＡ）活性；リゾホスホリパーゼ（ＬＰＬ）活性および／またはリゾホスホリパーゼ−トランスアシラーゼ（ＬＰＴ  Ａ）活性を含む、ホスホリパーゼＢ１またはホスホリパーゼＢ２活性などのホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性；ホスホリパーゼＤ１またはホスホリパーゼＤ２活性などのホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）活性；および／またはパタチン活性あるいはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１０２】
「ホスホリパーゼ」という用語は、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素も包含し、ここで、この酵素の２つの基質は、２−リゾホスファチジルコリンおよびＨ２Ｏであり、その２つの生成物は、グリセロホスホコリンおよびカルボキシレートである。ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）酵素は、１位脂肪酸を除去して、遊離脂肪酸および１−リゾ−２−アシルリン脂質を生成する。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）酵素は、２位脂肪酸を除去して、遊離脂肪酸および１−アシル−２−リゾリン脂質を生成する。ＰＬＡ１およびＰＬＡ２酵素は、細胞内または細胞外、膜結合型または可溶性であり得る。ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）酵素は、ホスフェート部分を除去して、１，２ジアシルグリセロールおよびリン酸エステルを生成する。ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）酵素は、１，２−ジアシルグリセロホスフェートおよび塩基（ｂａｓｅ  ｇｒｏｕｐ）を生成する。本発明に有用なホスホリパーゼは、様々な生物学的供給源、例えば、以下に限定されないが、Ｆ．クルモルム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、Ｆ．ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、またはＦ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の菌株などのフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）内の糸状菌種；あるいはアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の菌株などの、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）内の糸状菌種から得られる。市販品のＬｅｃｉｔａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ’Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）などのサーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ホスホリパーゼ変異体も本発明に有用である。１種以上のホスホリパーゼが、凍結乾燥粉末として、固定化された状態でまたは水溶液に溶解させて適用され得る。
【０１０３】
１種以上の発酵性糖の発酵によって生成されるアルコール（例えば、ブタノール）は、カルボン酸がアルコールとともにエステル化される酵素触媒反応によって、カルボン酸エステルに転化され得る。リパーゼ、ホスホリパーゼ、およびリゾホスホリパーゼなどの酵素は、この反応を触媒し得たが；これらの酵素は、以下に限定はされないが、流体力学的せん断または気液界面および液液界面における不活性化を含む１つ以上の要因によって不活性化され得る。オリゴ糖が１種以上の発酵性糖にさらに転化される発酵において、オリゴ糖を発酵性糖（例えば、グルコアミラーゼ）に転化する酵素はまた、これらの上記の要因のうちの１つ以上によって不活性化され得る。
【０１０４】
発酵ブロスの通気（ａｅｒａｔｉｏｎ）から生じるか、および／または１つ以上の発酵性糖の発酵の際のブロス中の気体二酸化炭素の発生によって生成される、気液界面における酵素の不活性化（例えば、発酵ブロスによって気泡の界面で起こり得る）は、当該技術分野において周知である。ニワトリ卵白リゾチームおよびアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標））中で生成されるサーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの不活性化が、３つの異なる反応機構造：気泡塔、バッフルを備えた撹拌槽（ガスのスパージによる通気なし）、および流下フィルム（Ｇｈａｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．５８：５１２５−５１３４，２００３）の気液界面において観察された。バッフル付きの撹拌タンク反応器（ガスのスパージによる通気なし）中の気液界面におけるサーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）中で生成される；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｌｉｐｏｌａｓｅ  １００Ｌ（登録商標））の不活性化の機構が、報告されている（Ｐａｔｉｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＣｈＥ  Ｊ．４６：１２８０−１２８３，２０００）。
【０１０５】
Ｓｔａｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：２２０−２２５，１９９７）は、アシュビア・ゴシッピ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）リパーゼが、撹拌されたガス／水、トリオレオイルグリセロール／水またはオレイン酸／水混合物中で、気／液または液／液界面のいずれかにおける界面の不活性化により、数分以内で不活性化されたことを報告した。Ｅｌｉａｓ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５９：４７−７１，１９９８）は、（ｉ）いくつかの酵素が、気液界面が存在しない場合でさえ流体力学的せん断によって不活性化され；（ｉｉ）流体力学的せん断によって不活性化される酵素について、不活性化の速度が、気液界面の存在下で上昇し；（ｉｉｉ）いくつかの酵素が、加えられる流体力学的せん断の有無にかかわらず、気液界面が存在しない場合、不活性化されず；（ｉｖ）不活性化のために気液界面を必要とする酵素について、不活性化の速度が、流体力学的せん断の増加とともに上昇することを報告した。Ｒｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ８：１８３−１９２，２０００）は、気泡塔装置において溶媒液滴を酵素水溶液に通すことによって、様々な水性／有機溶媒混合物に溶解させた、α−キモトリプシン、β−キモトリプシン、パパイン、およびブタ肝臓エステラーゼの界面の不活性化を記載した。撹拌タンク反応器におけるカンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼのせん断による不活性化の動力学および機構も報告されており、ここで、不活性化の機構は、せん断に起因する気液界面効果によるものであることが分かった（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３３：１８３−１９０，１９８９）。
【０１０６】
本明細書に記載されるいくつかの方法に用いられる発酵条件下で、流体力学的せん断ならびに気液界面および液液界面は、それぞれ、発酵の間に存在し、酵素の不活性化を引き起こすことができる。本明細書に記載される条件下における発酵の際に、二相混合物（例えば、発酵ブロスおよびカルボン酸）中に存在する酵素（例えば、グルコアミラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、およびリゾホスホリパーゼ）のうちの１つ以上の安定性および活性に対するこれらの要因のそれぞれの潜在的影響は、従来技術に基づいて予測することができなかった。これらの要因のそれぞれが、発酵混合物中の１種以上の酵素の不活性化をもたらし得たが、カルボン酸エステルを生成するための、カルボン酸による生成物アルコールのエステル化を触媒するのに十分な酵素活性を、発酵の間に維持した。グルコアミラーゼも、発酵ブロスおよびカルボン酸の二相発酵混合物中に存在する反応において、十分な酵素活性（すなわち、オリゴ糖を発酵性糖に転化するための）も維持した。
【０１０７】
カルボン酸２８は、ブタノールまたはエタノールなどの生成物アルコールとともにエステル化して、カルボン酸のアルコールエステルを生成することが可能な任意のカルボン酸であり得る。例えば、ある実施形態において、カルボン酸２８は、遊離脂肪酸であり得、ある実施形態において、カルボン酸または遊離脂肪酸は、４〜２８個の炭素、他の実施形態において４〜２２個の炭素、他の実施形態において８〜２２個の炭素、他の実施形態において１０〜２８個の炭素、他の実施形態において７〜２２個の炭素、他の実施形態において１２〜２２個の炭素、他の実施形態において４〜１８個の炭素、他の実施形態において１２〜２２個の炭素、さらに他の実施形態において１２〜１８個の炭素を有する。ある実施形態において、カルボン酸２８は、以下の脂肪酸：アゼライン酸、カプリン酸、カプリル酸、ヒマシ油、ヤシ油（すなわち、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、カプリル酸、カプリン酸、ステアリン酸、カプロン酸、アラキジン酸、オレイン酸、およびリノール酸を含む脂肪酸の天然に存在する組合せとして）、イソステアリン酸、ラウリン酸、亜麻仁油、ミリスチン酸、オレイン酸、パーム油、パルミチン酸、パーム核油、ペラルゴン酸、リシノール酸、セバシン酸、大豆油、ステアリン酸、トール油、獣脂、および＃１２ヒドロキシステアリン酸のうちの１つ以上である。ある実施形態において、カルボン酸２８は、二酸の１つ以上である。
【０１０８】
ある実施形態において、カルボン酸２８は、２種以上の異なる脂肪酸の混合物であり得る。ある実施形態において、カルボン酸２８は、化学的または酵素加水分解を含む当該技術分野において公知の任意の方法によって、アシルグリセリドの加水分解から誘導される遊離脂肪酸を含む。上述したある実施形態において、カルボン酸２８は、触媒４２として酵素を用いた油グリセリドの酵素加水分解によって、天然油２６から誘導され得る。ある実施形態において、脂肪酸またはそれらの混合物は、不飽和脂肪酸を含む。不飽和脂肪酸の存在は、融点を低下させ、取り扱いの際の利点を提供する。不飽和脂肪酸のうち、単不飽和であるもの、すなわち、１つの炭素−炭素二重結合を有するものが、プロセス検討の際に好適な熱安定性および酸化安定性を犠牲にせずに融点に関する利点を提供し得る。
【０１０９】
ある実施形態において、天然油２６は、獣脂、トウモロコシ、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、カボチャ油、グレープシードオイル、および植物油ブレンド（またはより高い濃度の異なる鎖長およびレベルの不飽和（すなわち、１８：１）へと精製され得る油）であり得る。ある実施形態において、天然油２６は、例えばパーム油と大豆油との混合物などの２種以上の天然油の混合物である。ある実施形態において、天然油２６は植物由来油である。ある実施形態において、植物由来油は、必ずしもではないが、発酵プロセスに使用され得るバイオマスに由来し得る。バイオマスは、原料１２が得られる同じかまたは異なる供給源であり得る。したがって、例えば、ある実施形態において、油２６はトウモロコシに由来し得るが、原料１２はサトウキビであり得る。例えば、ある実施形態において、油２６は、トウモロコシに由来し得、原料１２のバイオマス源もトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料１２に対して油２６の異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。ある実施形態において、油２６は、発酵プロセスに使用されるバイオマスに由来する。したがって、ある実施形態において、図３を参照して後述されるように、油２６は、油２６’として、原料１２から直接誘導される。例えば、原料１２がトウモロコシである場合、油２６’は、原料の成分であるトウモロコシ油である。
【０１１０】
任意に、エタノール３３が、発酵ブロスに含まれるべく、発酵槽３０に供給され得る。ある実施形態において、ブタノール生合成経路を有し、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼの発現が減少または消失された組み換え微生物が、微生物３２として使用される場合、微生物３２は、生存し、成長するために２−炭素基質、例えば、エタノールの補充を必要とし得る。したがって、ある実施形態において、エタノール３３が、発酵槽３０に供給され得る。
【０１１１】
しかしながら、脂肪酸などのカルボン酸が発酵槽中に存在する本発明の方法が、組み換え微生物の生命力を損なうことなく、所与の組み換え微生物に通常供給されるエタノール３３の量を減少させることができることが意外にも分かった。さらに、本発明の方法のある実施形態において、エタノールを補充しないアルコール（例えば、ブタノール）生成速度を、エタノール３３が補充される場合に実現され得る生成速度と同等にすることができる。以下の実施例１〜１４に示される比較例によってさらに示されるように、発酵槽中に脂肪酸はあるもののエタノールがない場合のブタノール生成速度は、発酵槽中に脂肪酸もエタノールもない場合のブタノール生成速度と同等かまたはそれより高くなり得る。したがって、ある実施形態において、エタノール３３の補充の量が、従来のプロセスと比較して減少される。例えば、２−炭素基質の補充を必要とする微生物のために発酵槽に加えられるエタノールの通常の量は、約５ｇ／Ｌの無水エタノール（すなわち、発酵培地のリットル当たり５ｇの無水エタノール）である。ある実施形態において、発酵にエタノール３３が一切補充されない。後者の場合、エタノール３３の流れ全体が、発酵槽から除外される。したがって、本発明のある実施形態において、補充するエタノール３３に付随するコスト、ならびに大量のエタノール３３の貯蔵およびブタノール発酵中または生存し、成長するために２−炭素基質の補充を必要とし得る微生物を用いる他のアルコール発酵中の発酵槽へのエタノールの供給に付随する不都合を低減するかまたはなくすことが可能である。
【０１１２】
さらに、エタノールの補充に関係なく、ある実施形態において、本発明の方法は、発酵中の脂肪酸の存在のために、微生物３２によるより高いグルコース取り込み率を提供することができる。脂肪酸は、カルボン酸２８として発酵槽３０に導入され得、供給される油２６から加水分解され得、および／またはスラリー１６の成分のバイオマス油の加水分解から得られる。遊離脂肪酸がプロセス中の工程で生成され、微生物成長速度およびグルコース消費を向上するために発酵槽中の微生物培地と接触される発酵プロセスから生成物アルコールを生成するための方法が、全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号明細書に記載されている。
【０１１３】
発酵槽３０において、微生物３２によって生成されるアルコールは、触媒４２を用いてカルボン酸２８とともにエステル化されて、アルコールエステルが形成される。例えば、ブタノール生成の場合、微生物３２によって生成されるブタノールは、触媒４２を用いてカルボン酸２８とともにエステル化されて、ブチルエステルが形成される。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を用いて、発酵ブロスからアルコールエステルを除去することができる。本明細書に示されるように、ＩＳＰＲとともにエステルを形成するために触媒を使用すると、発酵の性能を向上することができる。ある実施形態において、ＩＳＰＲ（例えば、液液抽出など）とともにエステルを形成するために触媒を使用すると、エステルを形成する触媒なしでＩＳＰＲを用いた同様の発酵における有効力価と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％だけ有効力価を増加することができる。同様に、ある実施形態において、ＩＳＰＲ（例えば、液液抽出など）とともにエステルを形成するために触媒を使用すると、エステルを形成する触媒なしでＩＳＰＲを用いた同様の発酵における有効率（例えば、実施例９および１１〜１４、表３を参照）と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％だけ有効率を増加することができる。ある実施形態において、有効収量は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％だけ増加される。ある実施形態において、アルコールエステル化の後に得られる発酵ブロスは、遊離（すなわち、非エステル化）アルコールを含み得、ある実施形態において、生成物アルコールがブタノールである場合、アルコールエステル化の後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、１、３、６、１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、または６０ｇ／Ｌ以下であり、または生成物アルコールがエタノールである場合、アルコールエステル化の後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｇ／Ｌ以下である。ある実施形態において、発酵槽中のアルコールエステル対アルコールの比率は、約１：１であり得る。ある実施形態において、アルコールの有効力価の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、アルコールエステルに転化される。
【０１１４】
ある実施形態において、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｇ／Ｌの最終的な有効力価を得るのに十分な濃度における水に対する穀類の充填が、ブタノールなどのアルコールを生成することが可能な微生物を含む穀類マッシュ発酵に使用され得る。他の実施形態において、穀類マッシュ発酵は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）を使用してもよく、グルコースの濃度は比較的低いままであり得、例えば、発酵の間、発酵ブロス相中でグルコースのＬ当たり少なくとも約７５ｇである。
【０１１５】
ある実施形態において、脂肪酸は、発酵装置の体積の約７０％未満、発酵装置の体積の約５０％未満、または発酵装置の体積の約３０％未満の量で発酵装置に加えられ得る。発酵装置に加えられる脂肪酸の量は、発酵の際のブタノールの水相力価を維持するための手段であり得る。他の実施形態において、ブタノールの水相力価は、発酵ブロスのＬ当たり約３５ｇ未満、発酵ブロスのＬ当たり約２５ｇ未満、または発酵ブロスのＬ当たり約２０ｇ未満のレベルに維持され得る。他の実施形態において、発酵ブロス中の活性なエステル化酵素の量は、約１００ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満の活性酵素であり得る。ある実施形態において、発酵ブロスに用いられる細胞質量は、約５０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ未満、約２０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ未満、または約１０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ未満であり得る。他の実施形態において、発酵プロセスは、少なくとも約３０時間〜少なくとも約１００時間、少なくとも約４０時間〜少なくとも約８０時間、または少なくとも約５０時間〜少なくとも約７０時間実行され得る。
【０１１６】
ある実施形態において、発酵ブロス相のリットル当たり少なくとも約３０ｇのブタノール、発酵ブロス相のリットル当たり少なくとも約４５ｇのブタノール、または発酵ブロス相のリットル当たり少なくとも約６０ｇのブタノールの最終的な有効力価を得るのに十分な濃度での水におけるブリックスが、ブタノールを生成することが可能な微生物を含むサトウキビ発酵に使用され得る。ある実施形態において、脂肪酸は、発酵装置の体積の約７０％未満、発酵装置の体積の約５０％未満、または発酵装置の体積の約３０％未満の量で発酵装置に加えられ得る。発酵装置に加えられる脂肪酸の量は、発酵の際のブタノールの水相力価を維持するための手段であり得る。他の実施形態において、ブタノールの水相力価は、発酵ブロスのＬ当たり約３５ｇ未満、発酵ブロスのＬ当たり約２５ｇ未満、または発酵ブロスのＬ当たり約１５ｇ未満のレベルに維持され得る。他の実施形態において、発酵ブロス中の活性なエステル化酵素の量は、約２００ｐｐｍ未満、約１００ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満の活性酵素であり得る。ある実施形態において、発酵ブロスに用いられる細胞質量は、最初に、発酵装置の体積の少なくとも約３０％を占める初期充填量で、ブロスのリットル当たり少なくとも約１００ｇの細胞であり得る。３〜７時間の発酵の後、細胞質量は、サトウキビ原料を加えることによって、発酵ブロスのリットル当たり少なくとも約２５ｇの細胞になるまで希釈され得る。細胞は、全発酵時間のうちの８〜１５時間にわたって、発酵ブロスのリットル当たり少なくとも約３０ｇの細胞になるまで増殖し続け得る。
【０１１７】
ある実施形態において、発酵ブロスは、発酵の際に抽出剤と接触されて、水相および有機相を含む二相混合物が形成される。このような実施形態において、液液抽出を含むＩＳＰＲが、好都合に行われ得る。液液抽出は、開示内容の全体が、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法にしたがって行われ得る。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを生成し、回収するための方法が記載されており、この方法は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程を含む。通常、抽出剤は、飽和、単不飽和、多価不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。抽出剤はまた、飽和、単不飽和、多価不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸のエステル、Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。本明細書に記載される方法とともに使用する場合、アルコール抽出剤によるカルボン酸２８の触媒によるエステル化によって、発酵槽３０中のカルボン酸２８の消費を避け、それによって、より少ないカルボン酸が、生成物アルコールによるエステル化に利用可能であろうように、ＩＳＰＲ用の抽出剤は、通常、非アルコール抽出剤である。以下の実施例２４にさらに示されるように、例えば、オレイルアルコールがＩＳＰＲ抽出剤として使用される場合、カルボン酸のオレイルアルコールエステルが、活性触媒４２の存在のために、発酵槽中で生成され得る。
【０１１８】
図１の実施形態を参照して、カルボン酸２８は、ＩＳＰＲ抽出剤２８またはその成分としても働き得る。上述したように、天然油２６が発酵槽３０に供給される場合、カルボン酸２８は、原位置で供給および／または形成され得、および／または原料１６が加水分解され得る油を含む場合、原位置で形成される。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２８は遊離脂肪酸を含む。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２８はトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）を含む。ある実施形態において、油２６はトウモロコシ油であり、それによって、ＩＳＰＲ抽出剤２８はＣＯＦＡである。ＩＳＰＲ抽出剤（カルボン酸）２８は、発酵ブロスと接触し、水相３４および有機相を含む二相混合物を形成する。発酵槽中で形成される生成物アルコールエステルは、優先的に有機相中に分離して、エステル含有有機相３６が形成される。すなわち、生成物アルコールエステルは、水相３４中に存在するアルコールエステルの平衡濃度を超える濃度で生成され、したがって、優先的に有機相中に分離する。発酵ブロス中の任意の遊離生成物アルコールも、優先的にエステル含有有機相中に分離する。二相混合物は、流れ３９として発酵槽３０から除去され、槽３５に導入され得、槽３５において、エステル含有有機相３６は、水相３４から分離される。エステル含有有機相３６および水相３４への二相混合物３９の分離は、以下に限定はされないが、サイフォニング、吸入、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離、ハイドロサイクロンなどを含む当該技術分野において公知の任意の方法を用いて行われ得る。水相３４の全てまたは一部が、発酵培地（図示される）として発酵槽３０中に再利用されるかあるいは廃棄され、新しい培地と交換されるか、または残っている生成物アルコールを除去するために処理され、次に発酵槽３０へと再利用され得る。
【０１１９】
図１を参照して、エステル含有有機相３６が、槽５０に導入され、槽５０において、アルコールエステルは、１種以上の物質５２と反応されて、生成物アルコール５４が回収される。生成物アルコール５４は、アルコールエステルからアルコールを得るための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて回収され得る。例えば、ある実施形態において、生成物アルコールは、塩基を用いた加水分解とその後の酸性化によって、アルコールエステルから回収され得る。他の実施形態において、生成物アルコールエステルは、物質５２としての加水分解触媒の存在下で、水によって加水分解され得る。例えば、ある実施形態において、生成物アルコールエステルからアルコールおよびカルボン酸２８（例えば、カルボン酸２８が脂肪酸である場合は脂肪酸）への加水分解は、物質５２としての、リパーゼ、水溶性酸、無機酸、有機酸、または固体酸触媒を用いて行われ得る。例えば、硫酸は、アルコールエステル加水分解のための無機酸触媒として使用され得る。いくつかの好適な加水分解触媒は、リパーゼ酵素；エステラーゼ酵素；硫酸、塩酸、またはリン酸などの強無機酸；トルエンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸などの強有機酸；またはＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）スルホン化ポリスチレン樹脂などの固体酸触媒、またはゼオライトである。ある実施形態において、アルコールエステルの加水分解は、温度を上昇させることによって、および／または圧力をかけることによって、物質５２としての蒸気を用いて行われ得る。ある実施形態において、アルコールエステルの加水分解は、例えば、反応蒸留塔などの塔において行われ得る。実施例４５〜５４および５６〜５８は、アルコールエステルから生成物アルコールを回収するためのいくつかの方法を示す。ある実施形態において、副生成物５６が、生成物アルコール５４の回収から得られる。副生成物５６は、アルコールエステルの加水分解から回収され得るカルボン酸２８を含まない。
【０１２０】
ある実施形態において、エステル含有有機相３６中に存在する脂肪酸のアルコールエステルの、生成物アルコールおよび遊離脂肪酸への加水分解は、約１０：１〜約１：１０の脂肪酸対水の比率で、または他の実施形態において、約１００：１〜約１：１００の脂肪酸対水の比率で行われる。ある実施形態において、脂肪酸のアルコールエステルは、約１００℃未満の温度で、水を用いて加水分解される。ある実施形態において、加水分解は、１００℃超、１５０℃超、２００℃超、または２５０℃超の温度で行われる。
【０１２１】
例えば、ある実施形態において、アルコールエステルは、エステル交換されて、生成物アルコール５４が生成され得、ある実施形態において、第２級（ｓｅｃｏｎｄ）アルコールエステル５６、例えば、脂肪酸アルキルエステルも、副生成物５６として生成され得る。このようなエステル交換を行うために、アルコールエステルは、アルコールエステルをエステル交換して、ブタノールを放出することが可能な触媒と接触され得る。ある実施形態において、アルコールエステルは、グリセロールを用いてエステル交換されて、生成物アルコール５４および副生成物５６としてのアシルグリセリドが生成され得る。生成されるアシルグリセリドは、モノ−およびジアシルグリセリドを含み得る。エステル交換反応のためのいくつかの好適な触媒は、例えば、リパーゼ酵素、特に第２級アルコールのアルコキシド塩、チタン酸アルキル、硫酸およびリン酸などの可溶性無機酸、トルエンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などの可溶性有機酸、およびＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）スルホン化ポリスチレン樹脂などの固体酸、またはゼオライトである。エステル交換または加水分解のための好適なリパーゼとしては、以下に限定はされないが、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、サーモマイセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、またはカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に由来するリパーゼが挙げられる。ある実施形態において、リパーゼは、当業者に周知の方法を用いて、可溶性または不溶性の担体上に固定化される（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７を参照）。酵素の固定化は、１）共有結合担体、物理吸着、静電結合、または親和結合による、多孔質または非多孔質のキャリア担体への酵素の結合；２）二官能性または多官能性の試薬による架橋；３）ゲル母材、ポリマー、エマルジョン、またはある形態の膜への閉じ込め；および４）これらの方法のいずれかの組合せを含む様々な技術を用いて行われ得る。他の実施形態において、リパーゼは、固定化されなくてもよい。ある実施形態において、リパーゼは可溶性である。脂肪酸アルキルエステル５６は、例えば脂肪酸メチルエステルを含み得る。他の脂肪酸アルキルエステル５６は、例えば、Ｃ２〜Ｃ１２の直鎖状、分枝鎖状、および環式アルコールエステルを含み得る。次に、生成物アルコール５４は、例えば蒸留などの当該技術分野において公知の任意の分離手段を用いて、副生成物５６を含む反応混合物から分離され得る。他の好適な分離機構は、例えば、抽出および膜分離を含み得る。
【０１２２】
ある実施形態において、生成物アルコールの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％が、アルコールエステルから回収される。
【０１２３】
ＩＳＰＲ抽出剤（カルボン酸）２８が、生成物アルコール５４を回収するためのアルコールエステルの反応の前に、アルコールエステルから分離され得る。あるいは、アルコールエステルの反応の後、ＩＳＰＲ抽出剤２８は、生成物アルコールおよび何らかの副生成物から分離され得る。次に、得られる回収された希薄な抽出剤２７は、通常、アルコールエステルのさらなる生成および／または抽出のための新鮮な補給（ｍａｋｅ−ｕｐ）抽出剤２８（供給される場合、油２６に由来し得る）と組み合わせて、発酵槽３０に戻って再利用され得る。あるいは、新鮮な抽出剤２８（または油２６）は、二相混合物流３９において除去される抽出剤の代わりにするために、発酵槽に連続して加えられ得る。
【０１２４】
ある実施形態において、触媒４２が、二相混合物３９から回収され、発酵自体または生成物アルコールの回収などの発酵プロセス中の工程において再利用され得る。
【０１２５】
ある実施形態において、１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９（図２を参照）が、発酵槽３０に導入されて、水相および有機相を含む二相混合物が形成され得る。このような実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリン酸アルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの外部からの有機抽出剤であり得る。しかしながら、上述した理由のため、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、好ましくはアルコールでない。むしろ、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、好ましくはカルボン酸（例えば遊離脂肪酸）である。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９はＣＯＦＡである。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、アマニ油脂肪酸、大豆油脂肪酸、ジャトロファ油脂肪酸、あるいはパーム油、ヒマシ油、オリーブ油、ヤシ油、ピーナッツ油、または任意の種油に由来する脂肪酸である。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、例えば、参照により本明細書に援用される、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号明細書に記載されるようなバイオマス脂質などの天然油の化学的転化から得られる、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル（特に、アルコール部分に１〜８個の炭素原子を含むもの、例えば、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪酸のより低級のアルコールエステル）、脂肪酸グリコールエステル、水酸化トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸抽出剤であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、バイオマス脂質の化学的加水分解によって得られる遊離脂肪酸である。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、例えば、参照により本明細書に援用される、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号明細書に記載されるようなバイオマス脂質などの天然油の酵素加水分解から生成される遊離脂肪酸であり得る。
【０１２６】
原位置生成物除去は、発酵槽３０中でバッチモードまたは連続モードで行われ得る。原位置生成物除去の連続モードにおいて、生成物が、槽（または反応器）から連続して除去される。原位置生成物除去のバッチモードにおいて、ある体積の有機抽出剤が、発酵槽に加えられ、抽出剤は、プロセス中に除去されない。原位置生成物除去では、有機抽出剤を、発酵の開始時に発酵培地と接触させ、二相発酵培地を形成することができる。あるいは、微生物が所望の量の増殖（培地の光学密度を測定することによって決定され得る）を達成した後、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。さらに、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選択したレベルに達した時点で、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。本発明のある実施形態に係るブタノール生成の場合、ブタノール濃度が有毒なレベルに達する前の時点で、カルボン酸抽出剤を、発酵培地と接触させて、カルボン酸とともにブタノールをエステル化して、ブチルエステルを生成することができ、ある実施形態において、水相およびブチルエステルを含む有機相を含む二相混合物を生成することができる。したがって、発酵槽中のブタノールの濃度が低下され、結果として、微生物に対するブタノールの毒性作用を最小限に抑える。次に、ブチルエステルの所望の有効力価が達成された後、エステル含有有機相は、発酵槽から除去され得る（そして、水相を構成する発酵ブロスから分離され得る）。例えば、ある実施形態において、ブチルエステルの有効力価が、発酵ブロスのｋｇ当たり約１０ｇを超えた後、エステル含有有機相は、発酵ブロスから分離され得る。他の実施形態において、ブチルエステルの有効力価が、発酵ブロスのｋｇ当たり約２３０ｇ超、発酵ブロスのｋｇ当たり約３００ｇ超、発酵ブロスのｋｇ当たり約４００ｇ超、発酵ブロスのｋｇ当たり約５００ｇ超、または発酵ブロスのｋｇ当たり約６００ｇ超になった後、エステル含有有機相は、発酵培地から分離され得る。別の実施形態において、ＣＯＦＡの転化率％が、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％になった後、エステル含有有機相は、発酵培地から分離され得る。ある実施形態において、発酵槽中の利用可能な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後、エステル含有有機相は水相から分離される。
【０１２７】
図１に記載される実施形態の例において、アルコールエステルは、発酵ブロスから原位置で抽出され、二相混合物３９の分離が、別個の槽３５で起こる。ある実施形態において、二相混合物の分離は、後述される図３および４の実施形態の例に示されるように、発酵槽で行うことができ、これらの図では、エステル含有有機相流３６が発酵槽３０から直接出る。水相流３４も発酵槽３０から直接出ることができ、一切の残っているアルコールエステルまたは生成物アルコールを除去するように処理され、再利用され、または廃棄され、新しい発酵培地と交換され得る。有機抽出剤によるアルコールエステルおよび生成物アルコールの抽出は、発酵ブロスからの微生物３２の除去を伴うかまたは伴わずに行うことができる。微生物３２は、以下に限定はされないが、ろ過または遠心分離を含む、当該技術分野において公知の手段によって、発酵ブロスから除去され得る。例えば、水相流３４は、酵母などの微生物３２を含み得る。微生物３２は、例えば、遠心分離機（図示せず）において、水相流から容易に分離され得る。その後、微生物３２は、発酵槽３０に再利用することができ、発酵槽３０は、時間の経過とともにアルコール生成の生成速度を上げ、それによって、アルコール生成の効率を高めることができる。
【０１２８】
当業者に明らかであるはずであるように、ある実施形態において、図１のシステムおよび方法は、発酵槽３０中の同時糖化発酵が、発酵槽３０の前に別個の糖化槽６０に置き換えられるように変更され得る（例えば、図４の実施形態を参照）。
【０１２９】
さらに他の実施形態において、例えば、図２の実施形態の例に示されるように、（発酵槽３０に直接供給される代わりに）天然油２６が、触媒４２も供給される槽４０に供給され、それによって、油２６中のアシルグリセリドの少なくとも一部が加水分解されて、カルボン酸２８が形成される。次に、カルボン酸２８および触媒４２を含有する槽４０からの生成物流が、発酵槽３０に導入される。カルボン酸２８および触媒４２は、発酵培地中で生成される生成物アルコールと接触し、それによって、生成物アルコールのアルコールエステルが、図１を参照して上述したのと同じ方法で、生成物アルコールによるカルボン酸の触媒されたエステル化から原位置で形成される。カルボン酸２８は、ＩＳＰＲ抽出剤として働くこともでき、ある実施形態において、十分なカルボン酸２８および／または１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９が、発酵槽３０に導入されて、水相および有機相を含む二相混合物が形成され得、アルコールエステルが、有機相中に分離する。図２の実施形態の残りのプロセス作業は、図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１３０】
本発明のある実施形態において、例えば、図３の実施形態に示されるように、触媒４２は、原料１２を形成するバイオマスに由来する油２６’を含む原料スラリー１６に加えられ得る。示される実施形態において、触媒４２は、油２６’中のグリセリドを遊離脂肪酸２８’へと加水分解することができる。したがって、原料スラリー１６への触媒４２の導入の後、油２６’中のグリセリドの少なくとも一部が加水分解され、遊離脂肪酸２８’および触媒４２を有する原料スラリー１８が得られる。例えば、原料１２がトウモロコシである場合、油２６’は、原料の成分であるトウモロコシ油であり、遊離脂肪酸２８’はトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）である。
【０１３１】
原料スラリー１８は、発酵培地に含まれるべく、アルコール生成微生物３２とともに発酵槽３０に導入される。ある実施形態において、グルコアミラーゼなどの酵素３８も、スラリー１８中の糖の糖化および発酵槽３０の内部のアルコールの発酵を同時に行うために、発酵槽に導入され得る。発酵槽中の触媒４２（スラリー１８を介して導入される）の存在により、遊離脂肪酸２８’（スラリー１８を介して導入される）によるアルコールのエステル化が触媒されて、図１を参照して上述されるのと同じ方法で、脂肪酸アルコールエステルが原位置で形成される。ある実施形態において、ブタノール生成では、ブタノール生成微生物３２が、原料スラリー１８とともに発酵槽３０に導入される。発酵槽中の触媒４２（スラリー１８を介して導入される）が、遊離脂肪酸２８’（スラリー１８を介して導入される）によるブタノールのエステル化を触媒して、脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）を原位置で形成する。遊離脂肪酸２８’は、ＩＳＰＲ抽出剤として働くこともできる。例えば、遊離脂肪酸２８’がＣＯＦＡである場合、ＣＯＦＡのアルコールエステルが原位置で形成され、ＣＯＦＡは、ＩＳＰＲ抽出剤またはその一部として働く。
【０１３２】
ある実施形態において、１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９が、アルコールエステル（および任意の遊離アルコール）を水相から優先的に分離するために、発酵槽３０に導入され得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、図１および２の実施形態を参照して記載されるカルボン酸２８であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、油２６として発酵槽３０に導入され、次に、ＩＳＰＲ抽出剤２９になるために、触媒４２によって脂肪酸へと加水分解される。ある実施形態において、油２６はトウモロコシ油であり、それによって、ＩＳＰＲ抽出剤２９はＣＯＦＡである。ある実施形態において、図１および２の実施形態を参照して上述したように、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル（特に、アルコール部分に１〜８個の炭素原子を含むもの、例えば、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪酸のより低級のアルコールエステル）、脂肪酸グリコールエステル、水酸化トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸抽出剤であり得る。さらに他の実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、バイオマス脂質の化学的または酵素加水分解によって得られる遊離脂肪酸であり得る。このような実施形態において、抽出剤２９を生成するためのバイオマス脂質は、原料１２が得られる同じかまたは異なるバイオマス源に由来し得る。例えば、ある実施形態において、抽出剤２９を生成するためのバイオマス脂質が、大豆に由来し得るが、原料１２のバイオマス源はトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料１２に対する抽出剤２９のための異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。図２の実施形態の残りのプロセス作業は、図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１３３】
非限定的なデータの裏づけのない（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）実施例として、図３の実施形態を参照して、約４重量％のトウモロコシ油を通常含有し得る、磨砕された全粒トウモロコシ（原料１２としての）の水性懸濁液が、約８５℃〜１２０℃で３０分間〜２時間にわたって、アミラーゼ（液化酵素１４としての）で処理され得、得られた液化されたマッシュ１６が、６５℃〜３０℃に冷却され、ｐＨ４．５〜７．５（ある実施形態において、ｐＨ５．５〜６．５）で、脂質中の利用可能な脂肪酸含量の、遊離脂肪酸への転化率が少なくとも３０％から少なくとも９９％もの高さになるのに十分な時間にわたって、０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ（ある実施形態において、０．５ｐｐｍ〜１．０ｐｐｍ）のリパーゼ（触媒４２としての）で処理され得る。液化され、リパーゼ処理されたマッシュ１８は、（例えば、熱交換器を用いて）約３０℃に冷却され、約２５％〜３０重量％の乾燥トウモロコシ固体で発酵槽３０に充填され得る。グルコアミラーゼ（糖化酵素３８としての）の添加による発酵中の液化されたマッシュ１８の糖化により、グルコースが生成され得る。得られた発酵ブロスは、リパーゼ４２で処理されていない液化されたマッシュを用いて、ブロス中に存在し得るトウモロコシ油（例えば、約１．２重量％のトウモロコシ油）の量よりかなり少ない量を含有し得る。特に、リパーゼ４２処理により、トウモロコシ油脂質２６’（トリグリセリド（ＴＧ））を、ＣＯＦＡ２８’（およびいくらかのジグリセリド（ＤＧ）またはモノグリセリド（ＭＧ））に転化し、ＣＯＦＡ  ＩＳＰＲ抽出溶媒２８’または２９中の脂質２６’の蓄積の速度を低下させることができる。リパーゼ４２処理により、発酵中に生成されるブタノールを、ＣＯＦＡのブチルエステルに転化することもでき、ここで、ＣＯＦＡのブチルエステルは、液液抽出ＩＳＰＲの際のＣＯＦＡ相３６中への溶解についての高い分配係数を有する。発酵の終了時、ＣＯＦＡのブチルエステルを含有するＣＯＦＡ相３６は、（槽３０／３５において）発酵ブロスから分離され得、ブタノール５４は、限定はされないが、例えば、リパーゼ５２、固体酸触媒５２または蒸気５２を用いたエステルの加水分解を含むいくつかの方法のうちの１つを用いて、（槽５０において）この有機混合物３６から回収されて、ブタノール５４およびＣＯＦＡ２７が生成され得る。
【０１３４】
さらに他の実施形態において、例えば、図４の実施形態に示されるように、図３のシステムおよび方法は、発酵槽３０中の同時糖化発酵（ＳＳＦ）が、発酵槽３０の前に別個の糖化槽６０に置き換えられるように変更され得る。図４は、酵素３８を受け入れる別個の糖化槽６０を含み、触媒４２が、液化され、糖化された原料流６２に導入される以外は図３とほぼ同一である。原料スラリー１６が、グルコアミラーゼなどの酵素３８とともに糖化槽６０に導入され、それによって、スラリー１６中のオリゴ糖の形態の糖類が、単糖類へと分解され得る。液化され、糖化された原料流６２が、糖化槽６０を出て、それに触媒４２が導入される。原料流６２は、原料に由来する、単糖類、および油２６’および非溶解固体を含む。油２６’は、触媒４２の導入によって加水分解され、遊離脂肪酸２８’および触媒４２を有する液化され、糖化された原料スラリー６４が得られる。
【０１３５】
あるいは、ある実施形態において、図１の実施形態におけるＳＳＦのための発酵槽３０への酵素３８と触媒４２の導入と同様に、触媒４２が、糖化酵素３８とともに加えられて、グルコースを生成するのと同時に、油脂質２６’を遊離脂肪酸２８’に加水分解することができる。酵素３８および触媒４２の添加は段階的であり得（例えば、触媒４２、次に酵素３８、または逆の場合もある）または同時であり得る。しかしながら、ＳＳＦの際の発酵槽３０への触媒４２の添加も、生成物アルコールをアルコールエステルにほぼ同時に転化する図１の実施形態と対照的に、触媒４２を含有するスラリー６４が発酵槽３０に導入されるまで、アルコールエステルは形成されない。あるいは、ある実施形態において、スラリー６２が発酵槽３０に導入され得、触媒４２が発酵槽３０に直接加えられる。
【０１３６】
図４の実施形態において、スラリー６４が、単糖類を代謝して生成物アルコールを生成するアルコール生成微生物３２とともに発酵槽３０に導入される。発酵槽中の触媒４２（スラリー６４を介して導入される）の存在により、遊離脂肪酸２８’（スラリー６２を介して導入される）によるアルコールのエステル化が触媒されて、図１を参照して上述したのと同じ方法で、脂肪酸アルコールエステルが原位置で形成される。遊離脂肪酸２８’は、アルコールエステル（および任意の遊離アルコール）を水相から優先的に分離するためのＩＳＰＲ抽出剤として働くこともできる。ある実施形態において、図３を参照して上述したように、１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９も、発酵槽３０に導入することができる。図４の実施形態の残りのプロセス作業は、図３と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１３７】
図１〜４を参照して上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、非溶解固体が、発酵槽３０に導入される前に、原料スラリー１６から除去され得る。例えば、図５の実施形態に示されるように、原料スラリー１６が、非溶解固体を固相またはウェットケーキ２４として排出するように構成される分離器２０の入口に導入される。例えば、ある実施形態において、分離器２０は、原料スラリー１６から非溶解固体を分離するための、フィルタープレス、真空ろ過、機械的加圧ろ過、または遠心分離機（例えば、デカンター遠心分離機）を含み得る。ある実施形態において、例えば、デカンターボウル遠心分離機、トリカンター遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、ろ過遠心分離機、またはデカンター遠心分離機を含む、当業界で用いられる任意の従来の遠心分離機を用いて、非溶解固体を分離することができる。ある実施形態において、原料スラリー１６からの非溶解固体の除去は、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、火格子（ｇｒａｔｅ）または格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、または液体から固体を分離するのに使用され得る任意の方法によって行われ得る。任意に、ある実施形態において、分離器２０は、原料スラリー１６中に存在する油２６’の一部または実質的に全てを除去するように構成することもできる。このような実施形態において、分離器２０は、以下に限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む、水性原料流から油を除去するための、当該技術分野において公知の任意の好適な分離器であり得る。糖および水を含む残りの原料は、水流２２として発酵槽３０に排出される。
【０１３８】
例えば、ある実施形態において、分離器２０は、糖および水を含有する水層（すなわち、流れ２２）、非溶解固体を含有する固体層（すなわち、ウェットケーキ２４）、および油層（すなわち、油流２６’）を含む遠心分離生成物を生成するように原料スラリー１６を撹拌または回転させるトリカンター遠心分離機２０を含む。このような場合、触媒４２が、除去された油２６’と接触されて、遊離脂肪酸２８’および触媒４２の流れが生成され得る。次に、遊離脂肪酸２８’および触媒４２の流れは、発酵培地と接触させるために発酵槽３０に導入され得、それによって、発酵培地中の生成物アルコールの、脂肪酸アルコールエステルへの触媒によるエステル化が、図１を参照して上述したのと同じ方法で、原位置で行われ得る。
【０１３９】
遊離脂肪酸２８’は、ＩＳＰＲ抽出剤２８’として働くこともでき、１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤２９も、発酵槽３０に導入することができる。したがって、原料油２６’は、カルボン酸へと触媒により加水分解され、それによって、ＩＳＰＲ抽出剤も生成しつつ、ＩＳＰＲ抽出剤中に存在する脂質の量を減少させることができる。エステル含有有機相３６は、槽３５において二相混合物３９の水相３４から分離され得、生成物アルコールは、槽５０（図１を参照）においてアルコールエステルから回収され得る。図５の実施形態の残りのプロセス作業は、図３と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１４０】
ウェットケーキ２４が遠心分離機２０によって除去される場合、ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料１２に由来する油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。水溶液２２が遠心分離機２０から排出されてから、ウェットケーキ２４は、遠心分離機においてさらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖および水は、液化槽１０に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ２４は、任意の好適な公知の方法によって、可溶物と組み合わされ、次に、乾燥されて、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）が形成され得る。遠心分離機２０において形成されるウェットケーキ２４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。非溶解固体が発酵槽に送られないため、ＤＤＧＳは、抽出剤および／またはブタノールなどの生成物アルコールを捕捉せず、ＤＤＧＳは、発酵槽の条件に供されず、発酵槽中に存在する微生物と接触しない。全てのこれらの利点が、例えば、動物飼料としてのＤＤＧＳの処理および販売をより容易にする。ある実施形態において、油２６’は、ウェットケーキ２４から別々に排出されず、油２６’は、ウェットケーキ２４の一部として含まれ、最終的にＤＤＧＳ中に存在する。このような場合、油は、ＤＤＧＳから分離され、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤２９に転化され得る。遠心分離によって原料スラリー１６から非溶解固体を除去するための方法およびシステムが、全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書に詳細に記載されている。
【０１４１】
上述したように、油２６’は、例えば、溶媒抽出プロセスを含む任意の好適な公知の方法を用いてＤＤＧＳから分離され得る。本発明の一実施形態において、ＤＤＧＳは、抽出槽に充填され、ヘキサンなどの溶媒で洗浄されて、油２６’が除去される。用いられ得る他の溶媒としては、例えば、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物が挙げられる。油２６’の抽出の後、ＤＤＧＳは、一切の残留溶媒を除去するように処理され得る。例えば、ＤＤＧＳは、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、一切の残留溶媒を蒸発させるように加熱され得る。溶媒を除去した後、ＤＤＧＳは、一切の残留水を除去するように乾式処理に供され得る。処理されたＤＤＧＳは、家禽、家畜、およびペットなどの動物用の補足飼料として使用され得る。
【０１４２】
ＤＤＧＳからの抽出の後、得られる油２６’および溶媒混合物は、溶媒から油２６’を分離するために収集され得る。一実施形態において、油２６’／溶媒混合物は、蒸発によって処理されてもよく、それによって、溶媒は蒸発され、収集され、再利用され得る。回収された油は、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤２９に転化され得る。
【０１４３】
固体の回収に加えて、発酵プロセスの他の副生成物を回収することが所望され得る。一実施形態において、例えば、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）は、炭水化物の、生成物アルコール（例えば、ブタノール）への収率を高めるために回収され得る。これは、例えば、溶媒を用いて、例えば、いくつかの副生成物流を組み合わせて混合し、組み合わせて混合する工程の生成物を乾燥させることによって形成される副生成物から脂肪酸イソブチルエステルを抽出することによって行われ得る。ＤＤＧＳからトウモロコシ油トリグリセリドを回収するためのこのような溶媒系の抽出システムは、米国特許出願公開第２０１０／００９２６０３号明細書に記載されており、その教示内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１４４】
脂肪酸エステルの溶媒抽出の一実施形態において、固体が、全蒸留廃液から分離され得る（「分離された固体」）が、これは、その流れが、組み合わされない副生成物流中の脂肪酸エステルの最も多い割合を含有し得るためである。次に、これらの分離された固体は、抽出器に供給され、溶媒で洗浄され得る。一実施形態において、分離された固体の全ての側が溶媒で確実に洗浄されるように、分離された固体は、少なくとも１回、回転される。洗浄後、ミセラとして知られている、脂質と溶媒との得られる混合物が、溶媒からの抽出される脂質の分離のために収集される。例えば、脂質と溶媒との得られる混合物は、さらなる処理のために分離器に堆積され得る。抽出プロセスの際、溶媒が分離された固体を洗浄するにつれて、溶媒は、脂質を溶液に入れるだけでなく、固体微粒子も収集する。これらの「微粒子」は、一般に、ミセラ中の望ましくない不純物であり、一実施形態において、ミセラは、ミセラから微粒子を分離するかまたは洗い落とす（ｓｃｒｕｂ）装置によって、抽出器または分離器から排出され得る。
【０１４５】
ミセラ中に含まれる脂質および溶媒を分離するために、ミセラは、蒸留工程に供され得る。この工程において、ミセラは、例えば、蒸発器によって処理することができ、蒸発器は、溶媒を蒸発させるのに十分に高いが、抽出される脂質に悪影響を与えるかまたは蒸発させるほど十分高くはない温度にミセラを加熱する。溶媒が蒸発するにつれて、溶媒は、例えば、凝縮器に収集され、将来の使用のために再利用され得る。ミセラからの溶媒の分離により、粗脂質の蓄積が得られ、これは、水、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）、脂肪酸、およびトリグリセリドを分離するようにさらに処理され得る。
【０１４６】
脂質の抽出の後、固体は、抽出器の外に送られ、残留溶媒を除去するストリッピングプロセスに供され得る。残留溶媒の回収は、プロセス経済性にとって重要である。一実施形態において、湿潤固体は、溶媒が脱溶媒器（ｄｅｓｏｌｖｅｎｔｉｚｅｒ）に送られる際に湿潤固体から一時的に蒸発する溶媒を貯蔵し、収集するための気密（ｖａｐｏｒ  ｔｉｇｈｔ）環境に送られ得る。固体が脱溶媒器に入る際、固体は加熱されて、残留溶媒が蒸発され、除去され得る。固体を加熱するために、脱溶媒器は、固体を１つ以上のトレイに分配するための機構を含んでいてもよく、固体は、加熱された空気または蒸気との直接接触などによって、直接加熱されるか、あるいは食事を運ぶトレイを加熱することなどによって間接的に加熱され得る。１つのトレイから別のトレイへの固体の移動を容易にするために、固体を運ぶトレイは、固体を１つのトレイから次のトレイへと送らせる開口部を含み得る。脱溶媒器から、固体は、任意に、混合器に送られてもよく、ここで、固体は、乾燥器に送られる前に、他の副生成物と混合される。固体抽出の例が、実施例６３に記載されている。この例では、固体は、脱溶媒器に供給され、ここで、固体は、蒸気によって接触される。一実施形態において、脱溶媒器中の蒸気および固体の流れは、逆行していてもよい。次に、固体は、脱溶媒器を出て、乾燥器または任意に混合器に供給されてもよく、ここで、様々な副生成物が混合され得る。脱溶媒器を出る蒸気は凝縮され、任意にミセラと混合され、次にデカンターに供給され得る。デカンターを出る水富化相は、蒸留塔に供給されてもよく、ここで、ヘキサンが、水富化流から除去される。一実施形態において、ヘキサン減損水富化流は、蒸留塔の塔底を出て、発酵プロセスに戻って再利用されてもよく、例えば、それは、磨砕されたトウモロコシ固体をスラリー化するために使用され得る。別の実施形態において、塔頂および塔底生成物は、発酵プロセスに再利用され得る。例えば、脂質富化塔底物は、加水分解装置の原料に加えられ得る。塔頂物は、例えば、凝縮され、デカンターに供給され得る。このデカンターを出るヘキサン富化流は、抽出器への溶媒原料の一部として任意に使用され得る。このデカンターを出る水富化相は、ヘキサンを水から取り除く塔に供給され得る。当業者が理解することができるように、本発明の方法は、ブタノールなどの生成物アルコールの生成のための発酵プロセスを最適化するために様々な方法で変更され得る。
【０１４７】
脂肪酸エステルの溶媒抽出の別の実施形態において、固体は、異種混合物としてプレフラッシュ塔（ｐｒｅｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ）に導入される前に発酵から排出されるビールおよび溶媒から分離され得る。これらの固体のウェットケーキが、ふるい分けフィルターまたは遠心分離機などの分離装置を用いて形成され得る。固体のふるい分けされたケーキが、含水イソブタノールを用いて置換洗浄されて、湿潤固体中に保持された脂肪酸エステルが除去され得る。あるいは、固体の遠心分離されたケーキが、含水イソブタノール中で再パルプ化され、湿潤固体中に保持された脂肪酸エステルの除去を行うために再度分離され得る。固体抽出のこの実施形態の例が、実施例６３に記載されている。
【０１４８】
さらなる実施形態において、副生成物（または副産物）が、発酵プロセスに使用されるマッシュから得られる。例えば、トウモロコシ油は、マッシュから分離され得、このトウモロコシ油は、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質（例えば、実施例６６を参照）を含有し得る。トウモロコシ油は、様々な率で、他の副生成物（または副産物）に任意に加えられてもよく、したがって、例えば、得られる副生成物中のトリグリセリドの量を変化させる能力を生み出す。このように、得られる副生成物の脂肪含量は、例えば、高脂肪製品と比較して乳牛の必要性によく適合するであろうより低脂肪で高タンパク質の動物飼料が得られるように制御され得る。
【０１４９】
一実施形態において、マッシュから分離された粗トウモロコシ油は、消費者用途向けの食用油へとさらに処理されてもよく、またはその高いトリグリセリド含量により代謝エネルギーの優れた供給源となり得るため、動物飼料の成分としても使用され得る。別の実施形態において、この粗トウモロコシ油は、バイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルの原料としても使用され得る。
【０１５０】
一実施形態において、抽出剤副生成物は、動物飼料副生成物の成分として、全てまたは部分的に使用されてもよく、またはバイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルの原料として使用され得る。
【０１５１】
さらなる実施形態において、固体は、マッシュから分離されてもよく、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸を含み得る。これらの固体（または流れ）は、動物飼料として使用されてもよく、遠心分離からの排出としてまたは乾燥後のいずれかで回収される。固体（またはウェットケーキ）は、利用可能なリジンおよびバイパスまたは第一胃非分解性タンパク質の含量が高いため、反すう動物（例えば、乳牛）の飼料として特に適し得る。例えば、これらの固体は、高タンパク質、低脂肪の飼料に特に有用であり得る。別の実施形態において、これらの固体は、基剤として使用されてもよく、すなわち、シロップなどの他の副生成物が、動物飼料として使用され得る生成物を形成するためにこの固体に加えられてもよい。別の実施形態において、様々な量の他の副生成物が、得られる生成物の特性が特定の動物種の必要性を満たすように調整するために固体に加えられてもよい。
【０１５２】
実施例６２に記載される全蒸留廃液から分離される固体の組成物は、例えば、粗タンパク質、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。一実施形態において、この組成物（または副生成物）は、動物飼料として湿潤または乾燥した状態で使用されてもよく、その場合、例えば、高タンパク質（例えば、高リジン）、低脂肪、および高い繊維含量が所望される。別の実施形態において、より高脂肪、低繊維の動物飼料が所望される場合、例えば、別の副生成物流から、脂肪がこの組成物に加えられてもよい。一実施形態において、このより高脂肪、低繊維の動物飼料は、ブタまたは家禽に使用され得る。さらなる実施形態において、凝縮蒸留可溶物（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｓｏｌｕｂｌｅ）（ＣＤＳ）（例えば、実施例６６を参照）の非水性組成物は、例えば、タンパク質、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルならびに塩および炭水化物などの他の溶解および懸濁固体を含み得る。このＣＤＳ組成物は、例えば、動物飼料として湿潤または乾燥した状態で使用されてもよく、その場合、高タンパク質、低脂肪、高無機塩の飼料成分が所望される。一実施形態において、この組成物は、乳牛の飼料の成分として使用されてもよい。
【０１５３】
別の実施形態において、発酵プロセスからの油が、蒸発によって回収され得る。この非水性組成物は、脂肪酸イソブチルエステルおよび脂肪酸（例えば、実施例６６を参照）を含んでいてもよく、この組成物（または流れ）は、イソブタノールおよび脂肪酸を回収するために加水分解装置に供給され得る。さらなる実施形態において、この流れは、バイオディーゼル生成の原料として使用され得る。
【０１５４】
発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される様々な流れは、いくつかの副産物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。例えば、マッシュからの粗トウモロコシを用いて、抽出剤として用いられる脂肪酸を生成し、脂質が、他の目的のために蒸発器によって抽出される場合、残りの流れが、組み合わされ、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含む副産物組成物を生成するように処理され得る。一実施形態において、この組成物は、少なくとも約２０〜３５重量％の粗タンパク質、少なくとも約１〜２０重量％の粗脂肪、少なくとも約０〜５重量％のトリグリセリド、少なくとも約４〜１０重量％の脂肪酸、および少なくとも約２〜６重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。特定の一実施形態において、副産物組成物は、約２５重量％の粗タンパク質、約１０重量％の粗脂肪、約０．５重量％のトリグリセリド、約６重量％の脂肪酸、および約４重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。
【０１５５】
別の実施形態において、脂質は、蒸発器によって抽出され、脂肪酸は、他の目的のために使用され、マッシュからの粗トウモロコシの約５０重量％および残りの流れが、組み合わされ、処理され、得られる副産物組成物は、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。一実施形態において、この組成物は、少なくとも約２５〜３１重量％の粗タンパク質、少なくとも約６〜１０重量％の粗脂肪、少なくとも約４〜８重量％のトリグリセリド、少なくとも約０〜２重量％の脂肪酸、および少なくとも約１〜３重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。特定の一実施形態において、副産物組成物は、約２８重量％の粗タンパク質、約８重量％の粗脂肪、約６重量％のトリグリセリド、約０．７重量％の脂肪酸、および約１重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。
【０１５６】
別の実施形態において、全蒸留廃液から分離される固体およびマッシュから抽出されるトウモロコシ油の５０重量％が、組み合わされ、得られる副産物組成物は、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含み得る。一実施形態において、この組成物は、少なくとも約２６〜３４重量％の粗タンパク質、少なくとも約１５〜２５重量％の粗脂肪、少なくとも約１２〜２０重量％のトリグリセリド、少なくとも約１〜２重量％の脂肪酸、少なくとも約２〜４重量％の脂肪酸イソブチルエステル、少なくとも約１〜２重量％のリジン、少なくとも約１１〜２３重量％のＮＤＦ、および少なくとも約５〜１１重量％のＡＤＦを含み得る。特定の一実施形態において、副産物組成物は、約２９重量％の粗タンパク質、約２１重量％の粗脂肪、約１６重量％のトリグリセリド、約１重量％の脂肪酸、約３重量％の脂肪酸イソブチルエステル、約１重量％のリジン、約１７重量％のＮＤＦ、および約８重量％のＡＤＦを含み得る。この副産物組成物の高脂肪、高トリグリセリド、および高リジン含量およびより低い繊維含量は、ブタおよび家禽の飼料として望ましいことがある。
【０１５７】
上述したように、発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される様々な流れは、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含む副産物組成物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。例えば、少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２８％の粗タンパク質を含む組成物が、乳畜の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２６％の粗タンパク質を含む組成物が、フィードロット牛の動物飼料製品として用いられ得る一方、少なくとも約１％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、越冬牛の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１３％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、家禽の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１８％の粗脂肪および少なくとも約２２％の粗タンパク質を含む組成物が、単胃動物の動物飼料製品として用いられ得る。したがって、様々な流れは、特定の動物種向けに飼料製品をカスタマイズするように組み合わされ得る。
【０１５８】
一実施形態において、発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される１つ以上の流れが、バイオディーゼルなどの燃料源として使用され得る少なくとも約９０％のＣＯＦＡを含む組成物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。
【０１５９】
本発明の方法の一実施形態の例として、粉砕された穀類（例えば、ハンマーミルによって処理されたトウモロコシ）および１種以上の酵素が組み合わされて、スラリー化された穀類が生成される。このスラリー化された穀類は、調理され、液化され、任意にフラッシュ蒸気でフラッシュされて、調理されたマッシュが得られる。次に、調理されたマッシュはろ過されて、懸濁固体が除去され、ウェットケーキおよびろ液が生成される。ろ過は、遠心分離、ふるい分け、または真空ろ過などのいくつかの方法によって行うことができ、このろ過工程は、少なくとも約８０％〜少なくとも約９９％の懸濁固体をマッシュから除去し得る。
【０１６０】
ウェットケーキは、水を用いて再スラリー化され、再ろ過されて、さらなるでんぷんが除去され、洗浄されたろ過ケーキが生成される。再スラリー化プロセスは、何回か、例えば、１〜５回繰り返され得る。ウェットケーキを再スラリー化するのに使用される水は、発酵プロセス中に生成される再利用水であってもよい。再スラリー化／再ろ過プロセスによって生成されるろ液は、最初の混合工程に戻されて、粉砕された穀類とともにスラリーが形成され得る。ろ液は、混合工程の前に加熱または冷却され得る。
【０１６１】
洗浄されたろ過ケーキは、生成プロセスの際にいくつかの段階でビールを用いて再スラリー化され得る。例えば、洗浄されたろ過ケーキは、発酵装置の後、プレフラッシュ塔の前、または蒸留器の穀類乾燥器への供給点において、ビールを用いて再スラリー化され得る。洗浄されたろ過ケーキは、他の副生成物と別々に乾燥されてもよく、またはＤＤＧＳまたは動物飼料製品の生成のためのウェットケーキとして直接使用されてもよい。
【０１６２】
最初の混合工程の結果として生成されるろ液は、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。例えば、ろ液は、蒸気またはプロセス間熱交換（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｏ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｈｅａｔ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）を用いて加熱され得る。糖化酵素が、ろ液に加えられてもよく、ろ液の溶解されたでんぷんは、部分的にまたは完全に糖化され得る。糖化されたろ液は、プロセス間交換、冷却水による交換、または冷水による交換などのいくつかの手段によって冷却され得る。
【０１６３】
次に、冷却されたろ液は、発酵装置ならびにアルコール生成に適した微生物、例えば、ブタノールを生成することが可能な組み換え酵母に加えられ得る。さらに、アンモニアおよび再利用流も、発酵装置に加えられ得る。このプロセスは、少なくとも１つの発酵装置、少なくとも２つの発酵装置、少なくとも３つの発酵装置、または少なくとも４つの発酵装置を含み得る。大気放出（例えば、ブタノール大気放出）を減少させ、生成物の収率を高めるために、発酵中に生成される二酸化炭素がスクラバーに排気され得る。
【０１６４】
溶媒が、再利用ループを介して発酵装置に加えられてもよく、または発酵装置に直接加えられてもよい。溶媒は、アルコール（例えば、ブタノール）を溶解させるかまたはそれと反応することができ、かつ水への限られた溶解性を有し得る１種以上の有機化合物であり得る。溶媒は、１つの液相としてまたは２つの液相材料として連続して発酵装置から取り出されてもよく、または溶媒は、１つまたは２つの液相材料としてバッチ式に引き抜かれ得る。
【０１６５】
ビールが脱気され得る。ビールは、例えば、高温マッシュによるプロセス間交換またはプレフラッシュ塔の塔頂物によるプロセス間交換によって、脱気の前に加熱され得る。蒸気が、凝縮器、次に、スクラバーに排気されてもよい。脱気されたビールは、例えば、蒸留領域中の他の流れによるプロセス間熱交換によってさらに加熱され得る。
【０１６６】
予め加熱されたビールおよび溶媒は、従来の乾式磨砕燃料エタノールプラントのビール塔から改造され得るプレフラッシュ塔に入り得る。この塔は、大気圧より低い圧力で運転され、一連の蒸発器からまたはマッシュ調理工程から取り出された水蒸気によって駆動され得る。プレフラッシュ塔の塔頂物は、冷却水と、プレフラッシュ塔原料による熱交換を含むプロセス間熱交換とのいくつかの組み合わせによる熱交換によって凝縮され得る。液体凝縮物は、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）に送られ得る。
【０１６７】
プレフラッシュ塔の塔底物は、溶媒デカンターに進められ得る。プレフラッシュ塔の塔底物は、遊離アルコール（例えば、ブタノール）を実質的に取り除かれ得る。デカンターは、スチルウェル（ｓｔｉｌｌ  ｗｅｌｌ）、遠心分離機、またはハイドロクロンであり得る。水が、このデカンター中の溶媒相から実質的に分離され、水相が生成される。懸濁され、溶解された固体を含む水相は、遠心分離されて、ウェットケーキおよび希薄な蒸留廃液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）が生成され得る。ウェットケーキは、他の流れと組み合わされ、乾燥されて、ＤＤＧＳが生成され得、それは、ＤＤＧＳを生成する他の流れと別個に、乾燥され、販売され得るか、またはそれはウェットケーキとして販売され得る。水相は、上記のろ過ケーキを再スラリー化するために部分的に使用される逆流（ｂａｃｋｓｅｔ）を提供するために分割され得る。分割は、希薄な蒸留廃液も提供し、これは、さらなる処理のために蒸発器に注入され得る。
【０１６８】
溶媒デカンター中で生成される有機相は、アルコール（例えば、ブタノール）のエステルであり得る。溶媒は、加水分解されて、反応性溶媒が再生され、さらなるアルコール（例えば、ブタノール）が回収され得る。あるいは、有機相は、ろ過され、製品として販売され得る。加水分解は、熱によって推進され、均一触媒によるか、または不均一触媒により得る。加水分解はまた、酵素反応によって起こり得る。このプロセスへの熱注入は、加熱炉、高温油、電気的熱注入、または高圧蒸気であり得る。加水分解を推進するために加えられる水は、再利用された水流、新鮮な水、または蒸気に由来し得る。
【０１６９】
冷却され、加水分解された溶媒は、大気圧より低い圧力の溶媒塔に注入されてもよく、ここで、溶媒は、蒸気によってアルコール（例えば、ブタノール）を実質的に取り除かれ得る。この蒸気は、蒸発器からの水蒸気であってもよく、マッシュプロセスのフラッシュ工程からの蒸気であってもよく、またはボイラーからの蒸気であってもよい（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０１７１１２９号明細書を参照）。従来の乾式磨砕エタノールプラントからの整流塔が、溶媒塔として適し得る。整流塔は、溶媒塔として働くように改造され得る。溶媒塔の塔底物は、例えば、冷却水またはプロセス間熱交換によって冷却され得る。冷却された塔底物は、残留水を除去するためにデカントされてもよく、この水は、このプロセスを含む他の工程に再利用されてもよく、またはマッシュ工程に再利用されてもよい。
【０１７０】
溶媒塔の塔頂物は、冷却水による交換によってまたはプロセス間熱交換によって冷却されてもよく、凝縮物が、プレフラッシュ塔の塔頂物と共用され得る排気されたアルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）に送られ得る。スクラバー塔底物および脱気工程からの凝縮物を含む、他の混合される水およびアルコール（例えば、ブタノール）流が、このデカンターに加えられてもよい。二酸化炭素を含む排気が、水スクラバーに送られてもよい。このデカンターの水層はまた、溶媒塔に供給されてもよく、または小型の専用の蒸留塔中でアルコール（例えば、ブタノール）を取り除かれ得る。水層は、プレフラッシュ塔の塔頂物、溶媒塔の塔頂物、または溶媒塔の塔底物によるプロセス間交換によって予め加熱され得る。この専用の塔は、従来の乾式磨砕燃料エタノールプロセスのサイドストリッパーから改造され得る。
【０１７１】
アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）の有機層は、アルコール（例えば、ブタノール）塔に注入され得る。この塔は、過圧塔であってもよく、リボイラー内の蒸気凝縮によって駆動され得る。塔を運転するためのエネルギー需要を減少させるために、塔への原料がプロセス間熱交換によって加熱され得る。このプロセス間熱交換器は、プレフラッシュ塔の分縮器、溶媒塔の分縮器、加水分解装置の生成物、蒸発器からの水蒸気、またはブタノール塔の塔底物を含み得る。アルコール（例えば、ブタノール）塔の蒸気の凝縮物は、冷却されてもよく、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）に戻されてもよい。アルコール（例えば、ブタノール）塔の塔底物は、アルコール（例えば、ブタノール）塔原料による交換を含むプロセス間熱交換によって冷却されてもよく、冷却水によってさらに冷却され、ろ過され、生成物アルコール（例えば、ブタノール）として販売され得る。
【０１７２】
上述されるプレフラッシュ塔の塔底物から生成される希薄な蒸留廃液は、多重効用蒸発器に送られ得る。この蒸発器は、２つ、３つ、またはそれ以上の段階を有し得る。蒸発器は、燃料エタノールプラントの従来の設計と同様の２つの効用部による４つの本体の構成を有してもよく、３つの効用部による３つの本体を有してもよく、または他の構成を有してもよい。希薄な蒸留廃液は、複数の効用部のいずれかに入り得る。第１の効用部本体の少なくとも１つが、過圧アルコール（例えば、ブタノール）塔からの蒸気によって加熱され得る。蒸気は、最も圧力の低い効用部から取り出されて、水蒸気の形態の熱が、大気圧より低い圧力のプレフラッシュ塔および溶媒塔に与えられ得る。蒸発器からのシロップが、蒸留器の穀類乾燥器に加えられてもよい。
【０１７３】
発酵装置、脱気装置（ｄｅｇａｓｓｅｒ）、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）および他の供給源からの二酸化炭素放出は、水スクラバーに送られ得る。このスクラバーの上部に供給される水は、新鮮な補給水であってもよく、または再利用水であってもよい。再利用水は、揮発性有機化合物を除去するために処理（例えば、生物学的に消化）され、急冷され得る。スクラバーの塔底物は、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）、溶媒塔に送られてもよく、または他の再利用水とともに使用されて、上記のウェットケーキが再スラリー化されてもよい。蒸発器からの凝縮物は、嫌気性の生物学的消化または他のプロセスによって処理されて、ろ過ケーキを再スラリー化するために再利用する前に水が精製され得る。
【０１７４】
トウモロコシが、粉砕された穀類の供給源として使用される場合、トウモロコシ油は、いくつかの点のいずれかにおいてプロセス流から分離され得る。例えば、遠心分離機が、調理されたマッシュのろ過の後にトウモロコシ油流を生成するように運転されてもよく、またはプレフラッシュ塔水相遠心分離機が、トウモロコシ油流を生成するように運転されてもよい。最終的なシロップのための中間の濃縮シロップが遠心分離されて、トウモロコシ油流が生成され得る。
【０１７５】
本発明の方法の一実施形態の別の例において、発酵装置から排出される材料は、遠心分離機、沈降機、ハイドロサイクロンなど、およびそれらの組合せなどの装置を含む分離システムにおいて処理されて、直接またはいくらかの再調整の後に次の発酵バッチにおける再度の使用のために再利用され得る濃縮された形態の生酵母が回収され得る。この分離システムは、発酵から生成される脂肪酸エステル（例えばイソブチル脂肪酸エステル）およびアルコール（例えば、イソブタノール）を含む有機流ならびにわずかな微量レベルの不混和性有機物を含む水流も生成し得る。この水流は、液化されたマッシュから分離され、洗浄された低でんぷん固体を再パルプ化し、注入するために、アルコール（例えば、イソブタノール）含有物を取り除く前または後に使用され得る。これには、本来であれば、液化領域から穀類乾燥およびシロップ混合領域へとこれらの固体を移動するための長いベルトで駆動される搬送システムであり得るものを回避するという利点がある。さらに、アルコール（例えば、イソブタノール）が取り除かれた後に得られるこの全蒸留廃液は、既存のまたは新規な分離装置を用いて、希薄な蒸留廃液とウェットケーキ画分とに分離される必要があり、この希薄な蒸留廃液は、発酵性マッシュの新しいバッチを調製するために調理水と組み合わせるために戻る逆流を部分的に形成することになる。この実施形態の別の利点は、液化されたマッシュから分離される固体の水分中に保持された任意の残留溶解でんぷんの一部が捕捉され、この逆流を通して回収され得ることである。あるいは、固体流に含まれる酵母は、生育不能とみなされ、水流に再分配され得、この組み合わされた流れは、発酵から残っているあらゆるアルコール（例えば、ブタノール）含有物を蒸留によって取り除かれる。生育不能の有機物は、繁殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）プロセスにおける栄養として使用するためにさらに分離され得る。
【０１７６】
別の実施形態において、多相材料が、プレフラッシュ塔の塔底を出て、上述したように分離システムにおいて処理され得る。濃縮された固体は、水流に再分配され得、この組み合わされた流れは、液化されたマッシュから分離され、洗浄された低でんぷん固体を再パルプ化し、注入するのに使用され得る。
【０１７７】
上記のプロセスならびに本明細書に記載される他のプロセスは、Ａｓｐｅｎモデル化などの計算機モデル化を用いて実証され得る（例えば、米国特許第７，６６６，２８２号明細書を参照）。例えば、市販のモデル化ソフトウェアＡｓｐｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）は、統合されたブタノール発酵、精製、および水管理プロセスのためのＡｓｐｅｎモデルを作り出すために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手可能なＤＩＰＰＲなどの物理的特性データベースとともに使用され得る。このプロセスモデル化は、多くの基礎工学的計算、例えば、物質収支およびエネルギー収支、気／液平衡、および反応速度計算を行うことができる。Ａｓｐｅｎモデルを生成するために、情報入力は、例えば、実験データ、含水量および原料の組成、マッシュの調理およびフラッシュのための温度、糖化条件（例えば、酵素原料、でんぷん転化率、温度、圧力）、発酵条件（例えば、微生物原料、グルコース転化率、温度、圧力）、脱気条件、溶媒塔、プレフラッシュ塔、凝縮器、蒸発器、遠心分離機などを含み得る。
【０１７８】
本発明は、バイオマスの処理生産性および費用対効果を高めつつ、発酵によって生成物アルコールなどの発酵生成物を生成するためのシステムおよび方法を提供する。ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。原料は、液化されて、原料スラリーを生成することができ、ここで、原料スラリーは、可溶性糖および非溶解固体を含む。原料スラリーが、発酵装置に直接供給される場合、非溶解固体は、発酵装置からの、ブタノールなどの生成物アルコールの効率的な除去および回収を妨げ得る。特に、液液抽出が、発酵ブロスからブタノールを抽出するのに用いられる場合、非溶解粒子の存在は、抽出剤と発酵ブロスとの接触を妨げることによって、抽出剤へのブタノールの物質移動速度を低下させること；発酵装置中でエマルジョンを生成し、それによって、抽出剤および発酵ブロスの良好な相分離を妨げること；抽出剤およびブタノールの少なくとも一部が、ＤＤＧＳとして最終的に除去される固体に「捕捉される」ため、抽出剤を回収し、再利用する効率を低下させること；発酵装置中の体積を占める固体があるため、また、発酵ブロスからの抽出剤の離脱がより遅いため、発酵装置体積効率がより低いこと；およびトウモロコシ油による汚染によって抽出剤の寿命が短縮されることを含むがこれらに限定されないシステムの非効率を招き得る。これらの影響は全て、資本コストおよび運転コストを増加させる。さらに、ＤＤＧＳに「捕捉される」抽出剤は、ＤＤＧＳ値および動物飼料として販売するための必要条件から外れ得る。したがって、これらの問題を回避し、および／または最小限に抑えるために、非溶解粒子（または固体）の少なくとも一部が、原料スラリー中に存在する糖を発酵装置に加える前に原料スラリーから除去される。ブタノール生成の抽出活性および効率が、非溶解粒子が除去されていない水溶液を含有する発酵ブロスにおいて行われる抽出と比べて、非溶解粒子が除去された水溶液を含有する発酵ブロスにおいて抽出が行われる場合に高められる。
【０１７９】
非溶解固体の存在のない抽出発酵は、発酵ブロスから抽出剤への生成物アルコールのより高い物質移動速度、発酵装置の内部または外部の発酵からの抽出剤のより良好な相分離、およびより高い抽出剤液滴上昇速度の結果としての抽出剤のより低い保持（ｈｏｌｄ  ｕｐ）をもたらし得る。また、例えば、発酵の際に発酵ブロス中に保持される抽出剤液滴は、発酵ブロスからより速く、より完全に離脱し、それによって、発酵ブロス中の遊離抽出剤が少なくなり、プロセス中に喪失される抽出剤の量を減少させることができる。さらに、例えば、微生物は再利用することができ、例えば、ビール塔および／または全蒸留廃液遠心分離機の一部または全てなどの、下流の処理におけるさらなる設備を省略することができる。さらに、例えば、抽出剤がＤＤＧＳ中で喪失される可能性がなくなる。また、例えば、微生物を再利用する能力は、生成物アルコール生成の全体速度を上げ、全力価要件を低下させ、および／または水性力価要件を低下させ、それによって、より健康な微生物およびより高い生成速度をもたらすことができる。さらに、例えば、資本コストを削減するために発酵装置における撹拌器を省略し；保持される抽出剤が最小限に抑えられ、非溶解固体が存在しないために体積がより効率的に使用されるため、発酵装置の生産性を向上し；および／または未建設のプラントにおいて連続発酵またはより小型の発酵装置を使用することが可能であり得る。
【０１８０】
向上した抽出効率の例としては、例えば、安定化した分配係数、向上した（例えば、より速いまたはより完全な）相分離、向上した液液物質移動係数、より低い力価での運転、向上したプロセス流再利用性、向上した発酵体積効率、向上した原料（例えば、トウモロコシ）負荷供給、微生物（例えば、組み換え微生物）の向上したブタノール力価耐性、水の再利用、エネルギーの減少、抽出剤の増加した再利用、および／または微生物の再利用が挙げられる。
【０１８１】
例えば、発酵装置中で固体が占める体積が減少される。したがって、発酵に利用可能な発酵装置の有効体積が増加され得る。ある実施形態において、発酵に利用可能な発酵装置の体積は、少なくとも約１０％だけ増加される。
【０１８２】
例えば、分配係数の安定化があり得る。発酵装置中のトウモロコシ油が、発酵の前に原料スラリーから固体を除去することによって減少され得るため、抽出剤は、より少ないトウモロコシ油に曝される。トウモロコシ油は、抽出剤と組み合わされて、十分な量で存在する場合に分配係数を低下させ得る。したがって、発酵装置に導入されるトウモロコシ油の減少により、発酵装置における抽出剤相の分配係数がより安定する。ある実施形態において、分配係数は、１０回の発酵サイクルにわたって約１０％未満だけ減少される。
【０１８３】
例えば、発酵ブロスから抽出剤への生成物アルコールのより高い物質移動速度（例えば、より高い物質移動係数の形態における）があり、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られるため、抽出剤によるブタノールの抽出効率の向上があり得る。ある実施形態において、物質移動係数は、少なくとも２倍増加される（実施例４および５を参照）。
【０１８４】
さらに、発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の向上があり得、これは、放出物の形成の可能性を減少させ、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。例えば、相分離は、より速く行うことができ、またはより完全であり得る。ある実施形態において、感知できる相分離が２４時間予め観察されなかった場合に相分離が行われ得る。ある実施形態において、相分離は、固体が除去されなかった場合の相分離と比較して、少なくとも約２倍速く、少なくとも約５倍速く、または少なくとも約１０倍速く行われる（実施例６および７を参照）。
【０１８５】
さらに、抽出剤の回収および再利用の増加があり得る。抽出剤は、ＤＤＧＳとして最終的に除去され得る固体中に「捕捉」されず、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる（実施例８および９を参照）。また、トウモロコシ油による抽出剤の希釈が少なくなり、抽出剤の劣化が少なくなり得る（実施例１０を参照）。
【０１８６】
また、抽出剤の流量が減少され得るため、運転コストが低下し、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。
【０１８７】
さらにまた、抽出剤の保持が、抽出剤液滴がより高い速度で上昇する結果として減少され、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。発酵装置中の非溶解固体の量の減少は、生成物アルコール生成の向上した効率ももたらす。
【０１８８】
さらに、非溶解固体を懸濁させる必要がもはやないため、撹拌器を、発酵装置から除去することができ、それによって、資本コストおよびエネルギーを減少させ、生成物アルコール生成の効率を高める。
【０１８９】
図１〜５は、アルコールエステルが原位置で生成され、発酵培地から抽出され、反応されて生成物アルコールが回収される発酵プロセスを含む方法およびシステムの様々な非限定的な実施形態を提供する。図１〜５は、生成物アルコールとともにエステル化され得ると同時にＩＳＰＲ抽出剤として働き得るカルボン酸を用いた方法およびシステムの様々な非限定的な実施形態も提供する。図１〜５は、原料中の脂質を、生成物アルコールとともにエステル化され得ると同時にＩＳＰＲ抽出剤として働き得るカルボン酸に転化する方法およびシステムの様々な非限定的な実施形態も提供する。
【０１９０】
図１〜５を参照して記載される上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、発酵槽３０中の発酵ブロスは、少なくとも１つの発酵性炭素源からの生合成経路を介してブタノールを生成するように遺伝子組み換え（すなわち、遺伝子操作）された少なくとも１種の組み換え微生物３２を含む。特に、組み換え微生物は、好適な炭素基質を含有する発酵ブロス中で増殖され得る。さらなる炭素基質としては、以下に限定はされないが、フルクトースおよびガラクターゼなどの単糖類；ラクトース、マルトース、またはスクロースなどのオリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能な原料からの精製されていない混合物が挙げられる。他の炭素基質としては、エタノール、乳酸塩、コハク酸塩、またはグリセロールが挙げられる。
【０１９１】
さらに、炭素基質は、主要な生化学中間体への代謝的転化が示された、二酸化炭素またはメタノールなどの一炭素基質でもあり得る。一炭素基質および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかの他の炭素含有化合物を用いることも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を用いて、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３）、４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９，１９９０）。したがって、本発明に用いられる炭素の供給源が、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物の選択のみによって限定されると考えられる。
【０１９２】
上記の炭素基質およびそれらの混合物の全てが好適であると考えられるが、ある実施形態において、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、あるいはこれらと、Ｃ５糖類を使用するように改変された酵母細胞のためのキシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびそれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀類を含むでんぷんベースの原料の糖化によって、再生可能な穀類源から誘導され得る。さらに、発酵性糖は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８  Ａ１号明細書に記載されるような、前処理および糖化のプロセスによって、再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスから誘導され得る。適切な炭素源（水流２２からの）に加えて、発酵ブロスは、培養物の成長および生成物アルコールの生成のための酵素経路の促進に適した、当業者に公知の、好適な無機物、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有しなければならない。
【０１９３】
上記の説明および実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明から逸脱せずに様々な用途および条件に適合させるように、本発明の様々な変形および変更を行うことができる。例えば、ある実施形態において、本発明に係るアルコールのエステル化および抽出は、発酵前、すなわち、発酵槽３０中の発酵の前の微生物３２のシード培養中に用いられ得る。当該技術分野において公知であるように、通常、酵母などの微生物３２は、採取され、発酵槽３０に接種される前に、所望の細胞濃度になるようにシード培地から増殖され得る。
【０１９４】
炭素源原料は、酵母生成などの微生物生成における重要なコスト要因であるため、糖類に対するバイオマス収量は、重要な最適化基準である。アルコール発酵からのＡＴＰ収量は、呼吸による糖の異化からのＡＴＰ収量よりはるかに少ないため、アルコール発酵の発生は、バイオマス収量に悪影響を与え、酵母生成（すなわち、シード培養）の際には回避しようとされている。それにもかかわらず、シード培地中の微生物の培養により、アルコールを含む所定の量の発酵生成物を生成することができる。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母において、比増殖速度（μ）および／または好気性培地中の糖濃度が基準値を超える場合は常に、アルコール発酵および呼吸は同時に起こる（例えば、ｖａｎ  Ｈｏｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：５１７−５２３，２０００を参照）。高いバイオマス収量を得るために、酵母の増殖は、通常、例えば、シード培養のための流加発酵技術を用いた呼吸条件によって制御される。糖代謝が実質的に呼吸によるものであり得るように、例えば、糖が低い速度で供給され、培地中の低い糖濃度および糖の低い取り込み率が得られる。これらの条件下で、高いバイオマス収量が得られ、毒性生成物の蓄積が最小限に抑えられ得る。実際には、大規模な流加産業プロセスにおいて、非効率的な混合のために細胞で濃度勾配が生じることがある（例えば、Ｅｎｆｏｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８５：１７５−１８５，２００１を参照）。発酵副生成物の生成および再吸収（ｒｅａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）は、実験室規模と比較して大規模な生物反応器において、グルコース当たりのバイオマス収量の減少の理由の１つであり得る。
【０１９５】
しかしながら、これらの条件で、ブタノール生成酵母を培養する場合、例えば、ブタノールを含む発酵生成物は再吸収されることはなく、高濃度で微生物に対して有毒であり得る培地中に蓄積し得る。生成物の蓄積が、限界細胞増殖抑制濃度を超える（例えば、細胞増殖が、原料によって抑えられ得る増殖より低い）場合、流加制御の喪失が起こり得る。本発明によれば、アルコールのエステル化および抽出を用いて、培地からブタノールを除去すると、非効率的な混合およびブタノールの毒性に関する問題にもかかわらず、流加発酵を進行させることが可能になる。
【０１９６】
したがって、ある実施形態によれば、シード培地は、触媒４２およびカルボン酸２８と接触され、生成物アルコールのエステル化によるアルコールエステルの生成および最終的に、大規模な生物反応器におけるグルコース当たりのバイオマス収量の向上につながり得る。さらに、培地中の生成物アルコールの濃度が、アルコールのエステル化によって制御されるため、微生物に対する生成物アルコールの悪影響を最小限に抑えるかまたは回避することができる。ある実施形態において、発酵槽３０からのアルコールエステルの抽出および生成物アルコール５４の回収に関して上述したのと同じ方法で、アルコールエステルが、シード培地から抽出され、アルコールが、アルコールエステルから回収され得る。ある実施形態において、本発明に係るアルコールのエステル化を用いて、シード培地および発酵培地の両方における生成物アルコールをエステル化することができる。このような実施形態において、概して、発酵培地からアルコールエステル（および遊離生成物アルコール）を回収するだけでなく、シード培養の際に生成されるアルコールエステルも回収する（例えば、繁殖タンクからアルコールエステルおよび／または生成物アルコールを回収する）ことによって、発酵プロセスについて、生成物アルコールのより高い収率が達成され得る。ある実施形態において、本発明に係るアルコールエステル化は、シード培地からのアルコールの除去のために発酵前に用いられ得る一方、生成物アルコールの従来のＩＳＰＲは、発酵槽３０中の発酵の際の生成物アルコールの除去に用いられ得る。
【０１９７】
したがって、本発明に係るアルコールのエステル化および抽出が、本発明から逸脱せずに、アルコール発酵プロセスの様々な段階で用いられ得ることが明らかであるはずである。
【０１９８】
本発明の方法によって生成されるアルコール生成物には、例えば、試薬、溶媒、および燃料としてのいくつかの用途がある。権利請求される方法によって生成されるブタノールは、ディーゼルまたはバイオディーゼル燃料、プラスチック産業における原料化学物質、化粧品などの配合製品の成分、および化学中間体として使用され得るエステルの生成に使用される、燃料（例えば、バイオ燃料）、燃料添加剤、アルコールとして直接使用され得る。ブタノールは、塗料、コーティング、ワニス、樹脂、ガム、染料、脂肪、ワックス、樹脂、シェラック、ゴム、およびアルカロイドのための溶媒としても使用され得る。したがって、本発明は、これらの産業用化学物質に対する高い需要を支え得る、ブタノールを含むアルコールを生成するための代替的な方法を提供する。
【０１９９】
組み換え微生物およびブタノール生合成経路
理論によって制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される方法は、任意のアルコール生成微生物、特に、それらの耐性レベルを超える力価でアルコールを生成する組み換え微生物に関連して有用であると考えられる。
【０２００】
アルコール生成微生物は、当該技術分野において公知である。例えば、メタン資化性細菌（例えば、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））によるメタンの発酵酸化により、メタノールが生成され、メタノール（Ｃ１アルキルアルコール）を、カルボン酸およびメタノールとともにカルボン酸をエステル化することが可能な触媒と接触させることにより、カルボン酸のメタノールエステルが形成される。酵母菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０，ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｏ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ；ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ．２６：７０６−７１４，２０００）により、エタノールが生成され得、エタノールを、カルボン酸およびエタノールとともにカルボン酸をエステル化することが可能な触媒と接触させることにより、エチルエステルが形成される（例えば、実施例３６を参照）。
【０２０１】
アルコールを生成する組み換え微生物も、当該技術分野において公知である（例えば、Ｏｈｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００，１９９１；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１，２００２；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０：３１２−３２０，２００８；Ｈａｈｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８，２００７；米国特許第５，５１４，５８３号明細書；米国特許第５，７１２，１３３号明細書；ＰＣＴ出願公開番号国際公開第１９９５／０２８４７６号パンフレット；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１，１９９２；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３，１９９５；米国特許出願公開第２００７／００３１９１８  Ａ１号明細書；米国特許第７，２２３，５７５号明細書；米国特許第７，７４１，１１９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２０３０９９  Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６  Ａ１号明細書；およびＰＣＴ出願公開番号国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット、これらは全て参照により本明細書に援用される）。
【０２０２】
ブタノールを生成することが可能な好適な組み換え微生物は、当該技術分野において公知であり、ブタノールを生成することが可能な特定の好適な微生物が本明細書に記載される。生合成経路を介してブタノールを生成する組み換え微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。一実施形態において、組み換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。一実施形態において、組み換え微生物は酵母である。一実施形態において、組み換え微生物は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択されるクラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母種としては、以下に限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋ���ｔａｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。
【０２０３】
ある実施形態において、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母が、当該技術分野において公知であり、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄを含むがこれらに限定されない様々な供給元から入手可能である。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、以下に限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられる。
【０２０４】
微生物による発酵を用いたブタノールの生成、ならびにブタノールを生成する微生物は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されている。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する全てのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に有さない微生物が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。ＧＰＤ２などのＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物も、この文献に記載されている。
【０２０５】
ブタノールの生成に適した生合成経路は、当該技術分野において公知であり、特定の好適な経路が本明細書に記載される。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対して異種の少なくとも１つの遺伝子を含む。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対して異種の２つ以上の遺伝子を含む。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、生合成経路のあらゆる工程に対応するポリペプチドをコードする異種遺伝子を含む。
【０２０６】
指定の基質−生成物転化を触媒する能力を有する特定の好適なタンパク質が本明細書に記載され、他の好適なタンパク質が、当該技術分野において提供される。例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、同第２００９／０１６３３７６号明細書、および同第２０１０／０１９７５１９号明細書は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを記載しており；参照により援用される米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを記載しており；アルコールデヒドロゲナーゼが、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に記載されている。
【０２０７】
多くのレベルの配列同一性が、他の種からポリペプチドを同定するのに有用であり、このようなポリペプチドが、同じかまたは同様の機能または活性を有し、本明細書に記載される組み換え微生物に使用するのに適していることが、当業者によってよく理解される。パーセント同一性の有用な例としては、以下に限定はされないが、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられ、あるいは７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの、７５％〜１００％の任意の整数パーセンテージが、本発明を説明する際に有用であり得る。
【０２０８】
１−ブタノール生合成経路
１−ブタノールならびに使用され得る好適なポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成のための生合成経路が、参照により本明細書に援用されるＤｏｎａｌｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８  Ａ１号明細書に記載されている。この生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒され得る、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ；
ｂ）例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；
ｃ）例えば、クロトナーゼによって触媒され得る、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ；
ｄ）例えば、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ；
ｅ）例えば、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド；および
ｆ）例えば、１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、ブチルアルデヒドから１−ブタノール。
【０２０９】
ある実施形態において、１−ブタノール生合成経路は、酵母細胞に対して異種の、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、少なくとも４つの遺伝子、または少なくとも５つの遺伝子を含む。ある実施形態において、組み換え宿主細胞は、１−ブタノール生合成経路の各基質−生成物転化のための異種遺伝子を含む。
【０２１０】
２−ブタノール生合成経路
２−ブタノールならびに使用され得る好適なポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成のための生合成経路が、全て参照により本明細書に援用される、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０  Ａ１号明細書および同第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書、およびＰＣＴ出願公開番号国際公開第２００７／１３０５２１号明細書に記載されている。１つの２−ブタノール生合成経路が、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸塩からα−アセト乳酸；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−アセト乳酸からアセトイン；
ｃ）例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、アセトインから２，３−ブタンジオール；
ｄ）例えば、ブタンジオールデヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；および
ｅ）例えば、２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、２−ブタノンから２−ブタノール。
【０２１１】
ある実施形態において、２−ブタノール生合成経路は、酵母細胞に対して異種の、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、または少なくとも４つの遺伝子を含む。ある実施形態において、組み換え宿主細胞は、２−ブタノール生合成経路の各基質−生成物転化のための異種遺伝子を含む。
【０２１２】
イソブタノール生合成経路
イソブタノールならびに使用され得る好適なポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成のための生合成経路が、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７  Ａ１号明細書およびＰＣＴ出願公開番号国際公開第２００７／０５０６７１号明細書に記載されている。１つのイソブタノール生合成経路が、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸塩からアセト乳酸塩；
ｂ）例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒され得る、アセト乳酸塩から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
ｃ）例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；
ｄ）例えば、分枝鎖状ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および
ｅ）例えば、分枝鎖状アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、イソブチルアルデヒドからイソブタノール。
【０２１３】
イソブタノール生合成経路の基質−生成物転化を触媒する酵素をコードする好適なポリペプチド配列ならびに指定の経路工程に適した酵素に対応するＥ．Ｃ．番号としては、以下に限定はされないが、表ＡＡおよびＢＢに記載されるものが挙げられる。所与のＥ．Ｃ．番号に関連する好適な酵素が、例えば、ＢＲＥＮＤＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｏｒｇ／）によって、当業者に容易に入手される。
【０２１４】
【表１】
2013535956.tif 000003
【０２１５】
【表２】
2013535956.tif 000004
【０２１６】
工程ａ）〜ｅ）（上記）を含むイソブタノール生合成経路を含む組み換え微生物が本明細書において提供され、ここで、工程ｃ）を触媒する酵素および工程ｅ）を触媒する酵素からなる群から選択される酵素の少なくとも一方が、微生物の染色体に組み込まれる異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、工程ｃ）を触媒する酵素が、微生物の染色体に組み込まれる異種のポリヌクレオチドによってコードされ、かつ工程ｅ）を触媒する酵素が、微生物の染色体に組み込まれる異種のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０２１７】
イソブタノール生合成経路などのブタノール生合成経路を含む組み換え微生物に適したポリヌクレオチドが本明細書において提供される。このようなポリヌクレオチドは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するａｌｓＳ遺伝子のコード領域（配列番号１のｎｔ位置４５７〜２１７２）および乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（配列番号１のｎｔ  ３６３４〜４６５６）ならびにいずれかまたは両方を含むプラスミドを含む。ＡＬＳの発現のために、酵母ＣＵＰ１プロモーター（配列番号１のｎｔ  ２〜４４９）、続いてＣＹＣ１ターミネーター（配列番号１のｎｔ  ２１８１〜２４３０）から発現される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するａｌｓＳ遺伝子のコード領域（配列番号１のｎｔ位置４５７〜２１７２）を有するキメラ遺伝子、およびＫＡＲＩの発現のために、酵母ＩＬＶ５プロモーター（配列番号１の２４３３〜３６２６）、続いてＩＬＶ５ターミネーター（配列番号１のｎｔ  ４６８２〜５３０４）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（配列番号１のｎｔ  ３６３４〜４６５６）を有するキメラ遺伝子、ならびにいずれかまたは両方のキメラ遺伝子を含むプラスミドも適している。
【０２１８】
好適なポリヌクレオチドは、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（配列番号２のｎｔ位置３３１３〜４８４９）、コドン最適化されたウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼのコード領域（配列番号２のｎｔ  ６２８６〜７４１３）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するコドン最適化されたｋｉｖＤ遺伝子のコード領域（配列番号２のｎｔ  ９２４９〜１０８９５）ならびにそれらの任意のまたは全てのまたは任意の組合せを含むプラスミドを含む。ＤＨＡＤの発現のために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１プロモーター（配列番号２のｎｔ  ２１０９〜３１０５）、続いてＦＢＡ１ターミネーター（配列番号２のｎｔ  ４８５８〜５８５７）から発現されるミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（配列番号２のｎｔ位置３３１３〜４８４９）を有するキメラ遺伝子；ＡＤＨの発現のために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭ１プロモーター（配列番号２のｎｔ  ７４２５〜８１８１）、続いてＡＤＨ１ターミネーター（配列番号２のｎｔ  ５９６２〜６２７７）から発現されるコドン最適化されたウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼに由来するコード領域（配列番号２のｎｔ  ６２８６〜７４１３）を有するキメラ遺伝子；およびＫｉｖＤの発現のために、ＴＤＨ３プロモーター（配列番号２のｎｔ  １０８９６〜１１９１８）、続いてＴＤＨ３ターミネーター（配列番号２のｎｔ  ８２３７〜９２３５）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するコドン最適化されたｋｉｖＤ遺伝子のコード領域（配列番号２のｎｔ  ９２４９〜１０８９５）を有するキメラ遺伝子ならびにこのようなキメラ遺伝子の任意の、全ての、または任意の組合せを含むプラスミドも適している。さらに、好適なポリヌクレオチドとしては、コード領域および規定されるキメラ遺伝子、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含むプラスミドに対して少なくとも約７５％の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【０２１９】
ある実施形態において、イソブタノール生合成経路は、酵母細胞に対して異種の、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、または少なくとも４つの遺伝子を含む。ある実施形態において、組み換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路の各基質−生成物転化のための異種遺伝子を含む。
【０２２０】
好適な菌株としては、参照により本明細書に引用され、援用される特定の出願ならびに２０１０年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３８０，５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。実施例に使用されるものを含む特定の好適な菌株の作成が、本明細書において提供される。
【０２２１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０８３（「ＮＧＣＩ−０７０」；ＰＮＹ１５０４）の作成
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、以下の遺伝子の欠失を含む：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２。ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１、米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載される）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３、ＰＮＹ１５０４）を生成した。
【０２２２】
標的遺伝子および形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかの上流および下流の相同領域を含むＰＣＲ断片による相同的組み換えによって、全コード配列を完全に除去した欠失を作り出した。ｌｏｘＰ部位が側面にあるＧ４１８耐性マーカーを、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同的組み換えによって除去して、無瘢痕（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作り出し、またはｌｏｘＰ部位が側面にある場合、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。
【０２２３】
無瘢痕欠失の手順を、Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９−４０５，２００６）から適応させた。一般に、各無瘢痕欠失のためのＰＣＲカセットを、ＰＣＲを重複させることによって、４つの断片、Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることによって作製した。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流の２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流の１５０ｂｐ）とともに、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能な／対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカー、ＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有していた。それぞれ長さ５００ｂｐの断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流の５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応していた。断片ＡおよびＣを、相同的組み換えによる、染色体へのカセットの組み込みに使用した。断片Ｂに対応する配列の直接の繰り返しが、染色体へのカセットの組み込みの際に生成された際、断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに対応し、それを、相同的組み換えによる、染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除に使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、ＵＲＡ３マーカーを、相同的組み換えによって、まず染色体に組み込み、次に染色体から切除した。最初の組み込みにより、３’５００ｂｐを除いて、遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’５００ｂｐ領域も欠失させた。この方法を用いた遺伝子の組み込みでは、組み込まれる遺伝子が、断片ＡとＢとの間のＰＣＲカセットに含まれていた。
【０２２４】
ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４鋳型ＤＮＡ（配列番号３）からＰＣＲで増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組み換えおよびマーカーの除去を可能にするｌｏｘＰ部位が側面にある。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号４および５）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＵＲＡ３部分を、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄへと形質転換し、３０℃でＧ４１８（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＹＰＤにおいて形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号６および７）ならびに指定されるＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸを用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
【０２２５】
ＨＩＳ３の欠失
無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ、キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ａを、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１５）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂを、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１６）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕを、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１９）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃを、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５８（配列番号２０）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＡＢを生成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２２６】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養（ｐｌａｔｅ）した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体をスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
【０２２７】
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）でＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を形質転換し、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地において平板培養することによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体を、３０℃で約６時間にわたって１％のガラクトースが補充されたＹＰ中で増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートに平板培養した。分離株を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ、０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために、ＹＰＤにおいて増殖させ、平板培養した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地のプレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地のプレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を調べた。Ｇ４１８に対して感受性であり、かつウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性であった正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７として表した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３についてはプライマーｏＢＰ４５０（配列番号２４）およびｏＢＰ４５１（配列番号２５）、およびΔｈｉｓ３についてはプライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。
【０２２８】
ＰＤＣ６の欠失
無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ａを、ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびプライマーｏＢＰ４４１（配列番号２７）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂを、ＰＤＣ６断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４２（配列番号２８）、およびＰＤＣ６断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕを、ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）、およびＰＤＣ６断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４５（配列番号３１）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｃを、ＰＤＣ６断片Ｕ３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４６（配列番号３２）、およびプライマーｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＡＢを生成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２２９】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ６  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
【０２３０】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびｏＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号３６）およびｏＢＰ５５５（配列番号３７）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ６遺伝子がないことを実証した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１として表した。
【０２３１】
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組み込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６１０に由来するｉｌｖＤコード領域で置換した。Ａ断片、続いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤコード領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＮＹＬＡ８３ゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＮＹＬＡ８３は、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する株（全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書に記載される作成）である。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１４１）を、ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号３９）を用いて増殖した。ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂを、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１６（配列番号４０）、およびＰＤＣ１断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕを、ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）、およびＰＤＣ１断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１９（配列番号４３）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｃを、ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５２０（配列番号４４）、およびプライマーｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを生成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ���１８（配列番号４２）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号１４２）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２３２】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号４８）およびｏＢＰ５５１（配列番号４９）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ１遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
【０２３３】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７として表した。
【０２３４】
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組み込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するｓａｄＢコード領域で置換した。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組み込みのためのＰＣＲカセットのセグメントを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
【０２３５】
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳは、ｐＵＣ１９をベースとしており、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するＵＲＡ３遺伝子の配列を含む。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコンおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における複製および選択のためのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。ＵＲＡ３のためのコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流の配列が、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために含まれていた。ベクターを、クローニングプロセスに使用することができ、酵母組み込みベクターとして使用することができる。
【０２３６】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡに由来するＵＲＡ３コード領域の上流の２５０ｂｐおよび下流の１５０ｂｐとともにＵＲＡ３コード領域を含むＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１２）、およびＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１３）を用いて増幅した。ゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号１５０）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを生成した。プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０）およびｏＢＰ２６５（配列番号１１）によるＰＣＲおよび配列決定によって、ベクターを確認した。
【０２３７】
ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂのコード配列を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングして、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を生成した。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）、およびＰＤＣ５断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３１（配列番号５１）とともに、鋳型としてｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号６７）を用いて、ｓａｄＢのコード配列を増幅した。ＰＤＣ５断片Ｂを、ｓａｄＢの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３２（配列番号５２）、およびＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）およびｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅することによって、ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを生成した。得られたＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＰｍｅＩによって消化させ、適切な酵素による消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、ＰＤＣ５断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５４６（配列番号５５）を用いて、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のための鋳型として使用した。ＰＤＣ５断片Ｃを、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４７（配列番号５６）、およびプライマーｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。天然のＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０ヌクレオチドに対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４２（配列番号５８）、およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いてＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１４３）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２３８】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号６１）およびｏＢＰ５５３（配列番号６２）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ５遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
【０２３９】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３を、ＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノール（グルコースではない）が補充され、かつ３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３として表した。
【０２４０】
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１５１）を、鋳型ＤＮＡとしてｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号６８）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が側面にある（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号８および９）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分を、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を、１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において選択した。プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（配列番号６３および６４）を用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
【０２４１】
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６）を用いた形質転換、および３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地における平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。形質転換体を、１％のエタノールが補充され、かつ５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地においてストリークし（ｓｔｒｅａｋ）、３０℃で培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のためにＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去を、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号６３）およびｏＢＰ５９１（配列番号６５）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）として表した。
【０２４２】
ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３；ＰＮＹ１５０４）を生成した。
【０２４３】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２０５の作成
株ＰＮＹ２２０５は、上述したＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）から得られた。
【０２４４】
標的遺伝子および形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子の上流および下流の相同領域を含むＰＣＲ断片による相同的組み換えによって、一般に全コード配列を除去した欠失を作り出した。ＵＲＡ３遺伝子を相同的組み換えによって除去して、無瘢痕（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作り出した。遺伝子組み込みを、同様に生成した。
【０２４５】
無瘢痕欠失の手順を、Ａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ，２３：３９９，２００６）から適応させた。一般に、各無瘢痕欠失のためのＰＣＲカセットを、ＰＣＲを重複させることによって、４つの断片、Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることによって作製した。場合によっては、個々の断片を、カセット全体が欠失／組み込み手順のためのＰＣＲによって増幅される前に、まずプラスミドにクローニングした。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流の２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流の１５０ｂｐ）領域とともに、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能な／対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカー、ＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有していた。それぞれ一般に長さ５００ｂｐの断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流の５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応していた。断片ＡおよびＣを、相同的組み換えによる、染色体へのカセットの組み込みに使用した。断片Ｂに対応する配列の直接の繰り返しが、染色体へのカセットの組み込みの際に生成された際、断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに対応し、それを、相同的組み換えによる、染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除に使用した。
【０２４６】
ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、ＵＲＡ３マーカーを、相同的組み換えによって、まず染色体に組み込み、次に染色体から切除した。最初の組み込みにより、３’５００ｂｐを除いて、遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’５００ｂｐ領域も欠失させた。この方法を用いた遺伝子の組み込みでは、組み込まれる遺伝子が、断片ＡとＢとの間のＰＣＲカセットに含まれていた。
【０２４７】
ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２欠失を、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドを欠失させるように設計し、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドを無傷のまま残した。インフレーム終止コドンは、欠失の下流の７ヌクレオチドに存在していた。無瘢痕ＦＲＡ２欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＦＲＡ２断片Ａを、ＦＲＡ２断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９４（配列番号１５２）およびプライマーｏＢＰ５９５（配列番号１５３）を用いて増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂを、ＦＲＡ２断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９６（配列番号１５４）、およびＦＲＡ２断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９７（配列番号１５５）を用いて増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕを、ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９８（配列番号１５６）、およびＦＲＡ２断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９９（配列番号１５７）を用いて増幅した。ＦＲＡ２断片Ｃを、ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ６００（配列番号１５８）、およびプライマーｏＢＰ６０１（配列番号１５９）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＦＲＡ２断片ＡおよびＦＲＡ２断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１５２）およびｏＢＰ５９７（配列番号１５５）を用いて増幅することによって、ＦＲＡ２断片ＡＢを生成した。ＦＲＡ２断片ＵおよびＦＲＡ２断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号１５６）およびｏＢＰ６０１（配列番号１５９）を用いて増幅することによって、ＦＲＡ２断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＦＲＡ２断片ＡＢおよびＦＲＡ２断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１５２）およびｏＢＰ６０１（配列番号１５９）を用いて増幅することによって、ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２４８】
ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＦＲＡ２  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で１％のエタノールが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養（ｐｌａｔｅ）した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１６０）およびｏＢＰ６０３（配列番号１６１）によるＰＣＲによって、ｆｒａ２ノックアウトを有する形質転換体をスクリーニングした。正確な形質転換体を、ＹＰＥ（酵母抽出物、ペプトン、１％のエタノール）中で増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１６０）およびｏＢＰ６０３（配列番号１６１）によるＰＣＲによって、欠失およびマーカー除去を確認した。ＦＲＡ２、ｏＢＰ６０５（配列番号１６２）およびｏＢＰ６０６（配列番号１６３）の欠失されたコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＦＲＡ２遺伝子がないことを実証した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δとして選択し、ＰＮＹ１５０５（ＢＰ１１３５）として表した。
【０２４９】
ＡＤＨ１欠失およびｋｉｖＤ  Ｌｌ（ｙ）組み込み
ＡＤＨ１遺伝子を欠失させ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現についてコドン最適化された乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｋｉｖＤコード領域で置換した。参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載されるように、ＡＤＨ１欠失−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みのための無瘢痕カセットを、プラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにまずクローニングした。ベクターはｐＵＣ１９をベースとしており、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄに由来するＵＲＡ３遺伝子の配列を含む。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコンおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における複製および選択のためのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。ＵＲＡ３のためのコード配列に加えて、この遺伝子の上流（２５０ｂｐ）および下流（１５０ｂｐ）の配列が、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために存在する。
【０２５０】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現についてコドン最適化された乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｋｉｖＤコード領域を、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６２（配列番号１６４）、およびＡＤＨ１断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１６５）を鋳型として用いて、ｐＬＨ４６８（２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書）を用いて増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂを、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６４（配列番号１６６）、およびＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６５（配列番号１６７）を用いて上記のように調製されたゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１６４）およびｏＢＰ５６５（配列番号１６７）を用いて増幅することによって、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを生成した。得られたＰＣＲ産物を、ＰｍｅＩおよびＦｓｅＩによって消化させ、適切な酵素による消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＡＤＨ１断片Ａを、ＳａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０５（配列番号１６８）、およびＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０６（配列番号１６９）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ  ＰＣＲ産物を、ＳａｃＩおよびＡｓｃＩによって消化させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡＤＨ１断片Ｃを、ＰａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０７（配列番号１７０）、およびＳａｌＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０８（配列番号１７１）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ  ＰＣＲ産物を、ＰａｃＩおよびＳａｌＩによって消化させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７４（配列番号１７３）、およびＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７５（配列番号１７４）を用いて、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号１７２）から増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１ＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ  Ｉによって消化させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。全組み込みカセットを、プライマーｏＢＰ５０５（配列番号１６８）およびｏＢＰ５０８（配列番号１７１）を用いて、得られたプラスミドから増幅し、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２５１】
ＰＮＹ１５０５のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて上記で作成されたＡＤＨ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で１％のエタノールが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。形質転換体を、ＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含む合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、外部プライマーｏＢＰ４９５（配列番号１７５）およびｏＢＰ４９６（配列番号１７６）およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）特異的プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１６４）および外部プライマーｏＢＰ４９６（配列番号１７６）によるＰＣＲによって、ＡＤＨ１の欠失およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の組み込みを確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ
１１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔとして選択し、ＰＮＹ１５０７（ＢＰ１２０１）として表した。ＰＮＹ１５０７を、イソブタノール経路プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＢＰ９１５（後述される）で形質転換した。
【０２５２】
ｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳベクターの作成
カセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号１７７）をクローニングするために、まず、６０２ｂｐのＦＢＡ１プロモーター（ＦＢＡ１ｐ）を、プライマーＴ−ＦＢＡ１（ＳａｌＩ）（配列番号１７８）およびＢ−ＦＢＡ１（ＳｐｅＩ）（配列番号１７９）を用いて、ＣＥＮ．ＰＫのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＰＧＫ１ｐプロモーターがプラスミドをＳａｌＩ／ＳｐｅＩ消化によって除去した後、プラスミドｐＷＳ３５８−ＰＧＫ１ｐ−ＧＵＳ（配列番号１８０）におけるＳａｌＩおよびＳｐｅＩ部位にクローニングし、ｐＷＳ３５８−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳを得た。ＰＧＫ１ｐおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）ＤＮＡ断片を、ｐＲＳ４２３ベクターから誘導されたｐＷＳ３５８の多重クローニング部位に挿入することによって、ｐＷＳ３５８−ＰＧＫ１ｐ−ＧＵＳプラスミドを生成した（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１２２，１９９２）。第２に、得られたｐＷＳ３５８−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳプラスミドを、ＳａｌＩおよびＳａｃＩによって消化させ、ＦＢＡ１ｐプロモーターを含むＤＮＡ断片、ＧＵＳ遺伝子、およびＦＢＡｔターミネーターをゲル精製し、ｐＲＳ３１６におけるＳａｌＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングして、ｐＲＳ３１６−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳを生成した。第３に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）オープンリーディングフレームの上流の位置−５１９〜−４０２に位置する上流活性化配列（ＵＡＳ）、すなわちＵＡＳ（ＰＧＫ１）を含む１１８ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーＴ−Ｕ／ＰＧＫ１（ＫｐｎＩ）（配列番号１８１）およびＢ−Ｕ／ＰＧＫ１（ＳａｌＩ）（配列番号１８２）を用いて、ＣＥＮ．ＰＫのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩによって消化させ、ｐＲＳ３１６−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳにおけるＫｐｎＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳを生成した。
【０２５３】
組み込みベクターｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１の作成
１．７ｋｂのＢｂｖＣＩ／ＰａｃＩ断片を、ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ：：ａｌｓＳ：：ＣＹＣ（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書）から、ｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ：：ＩＬＶ５：：ＣＹＣ（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書、ＢｂｖＣＩ／ＰａｃＩを用いて予め消化されて、ＩＬＶ５遺伝子が放出される）へと移動させることによって、ＦＢＡ−ａｌｓＳ−ＣＹＣｔカセットを作成した。ライゲーション反応物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞へと形質転換し、形質転換体を、プライマーＮ９８ＳｅｑＦ１（配列番号１８３）およびＮ９９ＳｅｑＲ２（配列番号１８４）を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。ＦＢＡ−ａｌｓＳ−ＣＹＣｔカセットを、ＡｆｌＩＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて、ライゲーションに適合する末端を作製した）においてｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１（参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される、クローン「Ｂ」）にクローニングするために、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いてベクターから単離した。ベクター中で両方の配向でａｌｓＳカセットを含む形質転換体を得て、構造「Ａ」についてはプライマーＮ９８ＳｅｑＦ４（配列番号１８５）およびＮ１１１１（配列番号１８６）を用いて、および構造「Ｂ」についてはＮ９８ＳｅｑＦ４（配列番号１８５）およびＮ１１１０（配列番号１８７）を用いて、ＰＣＲによって確認した。次に、ジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）選択可能な形態の「Ａ」構造ベクターを、ＵＲＡ３遺伝子（１．２ｋｂのＮｏｔＩ／ＮａｅＩ断片）を除去し、上述したジェネティシンカセット（参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載の配列番号６５５）を加えることによって作製した。Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて、ライゲーションに適合する全ての末端を作製し、形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＢＫ４６８（配列番号１８８）およびＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１８９）を用いて、前のＵＲＡ３マーカーと同じ配向のジェネティシン耐性遺伝子を有するクローンを選択した。得られたクローンは、ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１（クローンＡ）（配列番号１９０）と称された。
【０２５４】
上記のｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ組み込みベクターを、ＰｍｅＩを用いて線状化し、ＰＮＹ１５０７（上記）へと形質転換した。ＰｍｅＩは、クローニングされたｐｄｃ１−ＴＲＸ１組み込み領域内でベクターを切断し、それによって、当該位置において標的化された組み込みをもたらす（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：２８１−３０１，１９９１）。形質転換体を、ＹＰＥプラス５０μｇ／ｍｌのＧ４１８において選択した。パッチされた形質転換体を、プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１８９）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）を用いて、組み込み事象のためのＰＣＲによってスクリーニングした。２つの形質転換体を、イソブタノールを作製する株の能力を評価することによって、アセト乳酸シンターゼの機能について間接的に試験した。このために、さらなるイソブタノール経路遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター（後述されるｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳおよびｐＢＰ９１５）に供給した。１つのクローン、株ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−ｐＵＣ１９−ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ  ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを、ＰＮＹ２２０４として表した。ＰＮＹ２２０５は、ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳおよびｐＢＰ９１５プラスミドで形質転換されたＰＮＹ２２０４である。
【０２５５】
イソブタノール経路プラスミド（ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳおよびｐＢＰ９１５）
ｐＹＺ０９０（配列番号１）を、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩによって消化させて、ＣＵＰ１プロモーターのほとんどおよびａｌｓＳコード配列およびＣＹＣターミネーターの全てを除去した。次に、ベクターを、Ｋｌｅｎｏｗ断片による処理の後、セルフライゲートさせ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞へと形質転換し、アンピシリン耐性を選択した。ＤＮＡ領域の除去を、プライマーＮ１９１（配列番号１９１）を用いたＰＣＲによってライゲーション接合部にわたってＤＮＡ配列決定することによって、２つの独立したクローンについて確認した。得られたプラスミドはｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号１９２）と称された。
【０２５６】
ｋｉｖＤの上流のＴＤＨ３プロモーターのｋｉｖＤ遺伝子および９５７塩基対を欠失させることによって、ｐＢＰ９１５を、ｐＬＨ４６８（配列番号２；２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書）から作成した。ｐＬＨ４６８を、ＳｗａＩによって消化させ、大きい断片（１２８９６ｂｐ）を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＤＮＡの単離された断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによってセルフライゲートさせ、それを用いて、エレクトロコンピテントＴＯＰ１０大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換した。形質転換体からのプラスミドを単離し、ＳｗａＩ制限酵素を用いた制限分析によって適切な欠失について調べた。分離株も、プライマーｏＢＰ５５６（配列番号１９３）およびｏＢＰ５６１（配列番号１９４）を用いて、欠失部位にわたって配列決定した。適切な欠失を有するクローンは、ｐＢＰ９１５（ｐＬＨ４６８ΔｋｉｖＤ）（配列番号１９５）と称された。
【０２５７】
株ＮＹＬＡ７４、ＮＹＬＡ８３、およびＮＹＬＡ８４の作成
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内因性ＰＤＣ１およびＰＤＣ６遺伝子の挿入不活化。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、以下に記載されるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主なアイソザイムをコードする：
【０２５８】
ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢの作成
アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するブタノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（配列番号７０）（米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）をクローニングした。第２級アルコールデヒドロゲナーゼのためのｓａｄＢと呼ばれるこの遺伝子のコード領域（配列番号６９）を、それぞれ順方向および逆方向プライマーＮ４７３およびＮ４６９（配列番号７４および７５）を用いてグラム陰性菌のために推奨されるプロトコルにしたがって、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製される、Ａ．キシロソキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから、標準条件を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）４  ＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとＴＯＰＯ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔでクローニングを行って、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、それを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞へと形質転換した。次に、プラスミドを４つのクローンから単離し、配列を確認した。
【０２５９】
ｓａｄＢコード領域を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーは、酵母ＧＰＭ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７６および７７として提供されるＮ５８３およびＮ５８４）と重複し得る追加の５’配列を含んでいた。次に、ＰＣＲ産物を、以下のように、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における「ギャップ修復（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ）」方法を用いてクローニングした（Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５８：２０１−２１６，１９８７）。ＧＰＭ１プロモーター（配列番号７２）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｋｉｖＤコード領域（配列番号７１）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７３）を含有する酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ：：ｋｉｖＤ：：ＡＤＨ（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７  Ａ１号明細書の実施例１７に記載される）を、ＢｂｖＣＩおよびＰａｃＩ制限酵素で消化して、ｋｉｖＤコード領域を放出した。約１μｇの残っているベクター断片を、１μｇのｓａｄＢ  ＰＣＲ産物とともに、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１へと形質転換した。形質転換体を、ロイシン欠損合成完全培地において選択した。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢを生成する適切な組み換え事象を、プライマーＮ１４２およびＮ４５９（配列番号１０８および１０９）を用いたＰＣＲによって確認した。
【０２６０】
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ６の欠失：
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号７８）に由来するＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号７９）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒに由来するＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合することによって作製した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号８０）は、インビボででの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、７５ｂｐの相同反復配列が側面にあるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含む。２つのＤＮＡセグメントを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７Ａ−１１Ｄ（配列番号８１、８２、８３、および８４）、ならびに１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号８５および８６）とともに、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８，１９８９に記載される）によって結合した。
【０２６１】
ＳＯＥ  ＰＣＲ（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）のための外部プライマーは、それぞれＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、完成されたカセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２００８６６）へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号８７および８８）、ならびに１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号８９および９０）を用いたＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＤＣ６コード領域の欠失を有するＰＤＣ６遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、ＵＲＡ３ｒマーカーを、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーを、ＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有する。
【０２６２】
ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ１の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号１１１、１１２、１１３、および１１４）とともに、ｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８，１９８９によって記載される）によって、ｐＬＨ４６８（配列番号２）に由来するｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号９１）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒに由来するＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合することによって、ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを作製した。
【０２６３】
ＳＯＥ  ＰＣＲ（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）のための外部プライマーは、ＰＤＣ１プロモーターの下流およびＰＤＣ１コード配列の下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、完成されたカセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔへと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号９２および９３）、ならびにプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号９０および９４）を用いたＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＤＣ１コード配列の欠失を有するＰＤＣ１遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、ＵＲＡ３ｒマーカーを、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有する。
【０２６４】
ＨＩＳ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットを、ＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号９５）からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、５００ｂｐの相同反復配列が側面にあるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含む。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号９６および９７）を用いてＰＣＲを行い、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組み込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ６７へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をスクリーニングして、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地において形質転換体をレプリカ平板培養することによって、正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって、ＵＲＡ３ｒマーカーを再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。ＮＹＬＡ７３と呼ばれる得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３を有する。
【０２６５】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号９８および９９）を用いて株ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３４０９１）からＰＣＲ増幅し、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカーの組み込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ７３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で１％のエタノールおよびジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２００μｇ／ｍＬ）が補充されたＹＰ培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号１００および１０１）を用いたＰＤＣ５コード領域の置換によりＰＤＣ遺伝子座における正確な組み込みを確認した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。株はＮＹＬＡ７４と称された。
【０２６６】
プラスミドベクターｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡおよびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ｂｕｄＣ＋ＧＰＭ−ｓａｄＢを、ＮＹＬＡ７４へと形質転換して、ブタンジオール生成株（ＮＧＣＩ−０４７）を生成した。
【０２６７】
プラスミドベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８（配列番号１４０）およびｐＬＨ４６８をＮＹＬＡ７４へと形質転換して、イソブタノール生成株（ＮＧＣＩ−０４９）を生成した。
【０２６８】
ＨＸＫ２（ヘキソキナーゼＩＩ）の欠失：
ｈｘｋ２：：ＵＲＡ３ｒカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー３８４および３８５（配列番号１０２および１０３）を用いてＵＲＡ３ｒ２鋳型（上記）からＰＣＲ増幅し、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＸＫ２部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組み込みがＨＸＫ２コード領域の置換をもたらすように、ＨＸＫ２プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ７３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＮ８６９およびＮ８７１（配列番号１０４および１０５）を用いたＨＸＫ２コード領域の置換によりＨＸＫ２遺伝子座における正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって、ＵＲＡ３ｒ２マーカーを再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、およびＰＣＲによって、プライマーＮ９４６およびＮ９４７（配列番号１０６および１０７）を用いて正確なマーカーの除去を確認することによって、マーカーの除去を確認した。ＮＹＬＡ８３と称される、得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２を有する。
【０２６９】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、上述したようにＰＣＲ増幅した。上述したように、ＰＣＲ断片をＮＹＬＡ８３へと形質転換し、形質転換体を選択し、スクリーニングした。ＮＹＬＡ８４と称される、同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。
【０２７０】
標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、プラスミドベクターｐＬＨ４６８およびｐＬＨ５３２を、株ＮＹＬＡ８４（ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４）へと同時に形質転換し、得られた「ブタノロジェンＮＹＬＡ８４」を、３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地上で維持した。
【０２７１】
発現ベクターｐＬＨ４６８
ｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号２）を、酵母中のＤＨＡＤ、ＫｉｖＤ、およびＨＡＤＨの発現のために作成し、これは、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。ＤＨＡＤの発現のために、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  ２１０９〜３１０５）、続いてＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ  ４８５８〜５８５７）から発現されるミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置３３１３〜４８４９）を有するキメラ遺伝子；ＡＤＨの発現のために、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭ１プロモーター（ｎｔ  ７４２５〜８１８１）、続いてＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ  ５９６２〜６２７７）から発現されるコドン最適化されたウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼのコード領域（ｎｔ  ６２８６〜７４１３）を有するキメラ遺伝子；およびＫｉｖＤの発現のために、ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ  １０８９６〜１１９１８）、続いてＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ  ８２３７〜９２３５）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するコドン最適化されたｋｉｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ９２４９〜１０８９５）を有するキメラ遺伝子を含むようにｐＬＨ４８６を作成した。
【０２７２】
乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）のためのコード領域（それぞれ配列番号７１および１１８）を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって合成し、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０において提供した。コードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１１７および１１９である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨのための個々の発現ベクターを作成した。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）を構築するために、ベクターｐＮＹ８（配列番号１２１；ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも称され、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書の実施例１７に記載されている）を、ＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化し、それによって、ＧＰＤプロモーターおよびａｌｄコード領域を切断した。５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号１２３および１２４）を用いて、５’末端にＡｓｃＩ部位および３’末端にＳｐｅＩ部位を付加するために、ｐＮＹ８に由来するＴＤＨ３プロモーター断片（配列番号１２２）をＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩで消化されたｐＮＹ８ベクター断片を、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化されたＴＤＨ３プロモーターＰＣＲ産物とライゲートし、コドン最適化されたｋｉｖＤコード領域を含むＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片を、ベクターｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離した。３通りのライゲーションにより、ベクターｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）が生成された。ｐＬＨ４６７を、制限マッピング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ）および配列決定によって確認した。
【０２７３】
ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／０５８，９７０号明細書の実施例３に記載されるベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号７８）から得られた。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモーター（配列番号７２）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼに由来するコード領域（ｓａｄＢ；ＤＮＡ配列番号６９；タンパク質配列番号７０：米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７３）を含むキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、ｓａｄＢコード領域の５’および３’末端においてそれぞれＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を含む。プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号１２６および１２７）を用いた部位特異的突然変異誘発法によって、ＮｈｅＩ部位をｓａｄＢコード領域の５’末端に付加して、ベクターｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを生成し、それを配列決定によって確認した。ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩをＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化して、ｓａｄＢコード領域を除外し、ベクターｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０に由来するコドン最適化されたＨＡＤＨコード領域を含むＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片とライゲートして、ｐＬＨ４３５を生成した。
【０２７４】
単一のベクター中でＫｉｖＤおよびＨＡＤＨ発現カセットを組み合わせるために、酵母ベクターｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８７４７４）を、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、３通りのライゲーション反応において、ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを含むｐＬＨ４３５に由来するＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片とともに、ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔカセットを含むｐＬＨ４６７に由来するＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片とライゲートした。これにより、ベクターｐＲＳ４１１：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１）が生成され、それを制限マッピングによって確認した。
【０２７５】
低級イソブタノール経路における全ての３つの遺伝子：ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙ、およびＨａｄｈｙのための同時発現ベクターを生成するために、ＩｌｖＤ遺伝子の供給源として、米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書に記載されるｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号１２８）を使用した。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のためのＦ１複製起点（ｎｔ  １４２３〜１８７９）および酵母における複製のための２ミクロンの起点（ｎｔ  ８０８２〜９４２６）を含む。ベクターは、ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  ２１１１〜３１０８；配列番号１２０）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ  ４８６１〜５８６０；配列番号１２９）を有する。さらに、ベクターは、酵母における選択のためのＨｉｓマーカー（ｎｔ  ５０４〜１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ  ７０９２〜７９４９）を有する。ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６１０）に由来するｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ３１１６〜４８２８；配列番号１１５；タンパク質配列番号１１６）は、ＦＢＡプロモーターとＦＢＡターミネーターとの間にあり、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ４８２９〜４８４９）に融合されたｌｕｍｉｏタグがある。
【０２７６】
第１の工程は、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（ＳａｃＩＩ部位はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化された）を用いて、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも呼ばれる）を線状化して、９，４８２ｂｐの全長を有するベクターを得ることであった。第２の工程は、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（ＫｐｎＩ部位はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化された）を用いて、ｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットをｐＬＨ４４１から単離し、６，０６３ｂｐの断片を得ることであった。この断片を、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏに由来する９，４８２ｂｐのベクター断片とライゲートした。これにより、ベクターｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：ＰＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ−ＰＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）が生成され、それを、制限マッピングおよび配列決定によって確認した。
【０２７７】
ｐＬＨ５３２の作成
ｐＬＨ５３２プラスミド（配列番号１３０）を、酵母中のＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のために作成した。ｐＬＨ５３２は、以下のキメラ遺伝子：１）ＣＵＰ１プロモーター（配列番号１３９）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するアセト乳酸シンターゼコード領域（ＡｌｓＳ；配列番号１３７；タンパク質配列番号１３８）およびＣＹＣ１ターミネーター２（配列番号１３３）；２）ＩＬＶ５プロモーター（配列番号１３４）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣコード領域（配列番号１３２）およびＩＬＶ５ターミネーター（配列番号１３５）；ならびに３）ＦＢＡ１プロモーター（配列番号１３６）、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５；配列番号１３１）；およびＣＹＣ１ターミネーターを含むｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８７５４１）である。
【０２７８】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣコード領域は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書に記載された、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するＫＡＲＩをコードする配列である。
【０２７９】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣコード領域を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ；配列番号１３２）によって合成した。
【０２８０】
ｐＹＺ０９０の作成
ｐＹＺ０９０（配列番号１）は、ｐＨＲ８１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８７５４１）骨格をベースとし、ＡＬＳの発現のために、酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ  ２〜４４９）、続いてＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ  ２１８１〜２４３０）から発現される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するａｌｓＳ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置４５７〜２１７２）を有するキメラ遺伝子、およびＫＡＲＩの発現のために、酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３〜３６２６）、続いてＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ  ４６８２〜５３０４）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ３６３４〜４６５６）を有するキメラ遺伝子を含むように作成される。
【０２８１】
ｐＹＺ０６７の作成
ｐＹＺ０６７を、以下のキメラ遺伝子：１）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）の発現のために、酵母ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  １１６１〜２２５０）、続いてＦＢＡターミネーター（ｎｔ  ４００５〜４３１７）から発現されるミュータンス連鎖球菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置２２６０〜３９７１）、２）アルコールデヒドロゲナーゼの発現のために、酵母ＧＰＭプロモーター（ｎｔ  ５８１９〜６５７５）、続いてＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ  ４３５６〜４６７１）から発現されるウマ肝臓ＡＤＨのためのコード領域（ｎｔ  ４６８０〜５８０７）、および３）ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現のために、酵母ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ  ８８３０〜９４９３）、続いてＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ  ５６８２〜７１６１）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するＫｉｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ７１７５〜８８２１）を含むように作成した。
【０２８２】
ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡおよびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ｂｕｄＣ＋ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８の作成
ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡおよびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ｂｕｄＣ＋ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８の作成が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。
【０２８３】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２４２の作成
株ＰＮＹ２２４２を、ＰＮＹ１５０７（上記）からいくつかの工程で作成した。まず、ＦＢＡ１プロモーター、ａｌｓＳコード領域、およびＣＹＣ１ターミネーターを含むキメラ遺伝子を、ＴＲＸ１遺伝子の上流の染色体ＸＩＩに組み込んだ。修飾された遺伝子座の配列を、配列番号１９６として示す。次に、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の２つのコピーを、染色体ＶＩＩおよびＸＶＩに組み込んだ。染色体ＶＩＩにおいて、ＰＤＣ１プロモーター、ｈＡＤＨコード領域、およびＡＤＨ１ターミネーターを含むキメラ遺伝子を、ｆｒａ２Δ遺伝子座に入れた（ＦＲＡ２の元の欠失が上述されている）。修飾された遺伝子座の配列を、配列番号１９７として示す。染色体ＸＶＩにおいて、ＰＤＣ５プロモーター、ｈＡＤＨコード領域、およびＡＤＨ１ターミネーターを含むキメラ遺伝子を、長期反復要素（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）ＹＰＲＣデルタ１５が元々占める領域に組み込んだ。修飾された遺伝子座の配列を、配列番号１９８として示す。次に、天然遺伝子ＹＭＲ２２６ｃおよびＡＬＤ６を欠失させた。ＹＭＲ２２６ｃの消失は、コード領域のみの無瘢痕欠失であった。修飾された遺伝子座の配列を、配列番号１９９として示す。上流の配列のＡＬＤ６コード領域プラス７００ｂｐを、ＣＲＥ−ｌｏｘで媒介されるマーカー除去（上記の方法）を用いて欠失させ、それによって、得られる遺伝子座は、１つのｌｏｘＰ部位を含む。修飾された遺伝子座の配列を、配列番号２００として示す。最後に、プラスミドを、ＫＡＲＩ（ｐＬＨ７０２、配列番号２０１）およびＤＨＡＤ（ｐＹＺ０６７ＤｋｉｖＤＤｈＡＤＨ、配列番号２０２）の発現のために株に導入し、株ＰＮＹ２２４２を得た。
【０２８４】
組み換え微生物がイソブタノールを生成する場合、特定の実施形態において、微生物は、より高い比生産性を示す。さらに、体積速度が約５０％だけ向上された。
【０２８５】
理論によって制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される方法は、生成物アルコールの生成収率が向上された抽出発酵方法を提供すると考えられる。上述したように、微生物による発酵を用いたアルコール生成は、微生物のアルコール毒性閾値のため非効率になり得る。ある実施形態において、本明細書の方法は、生成物アルコールを、微生物に対する毒性の低い物質へと転化する手段を提供する。例えば、生成物アルコールは、カルボン酸とともにアルコールをエステル化し、それによって、微生物に対する毒性の低いアルコールエステルを生成する触媒の存在下で、カルボン酸と接触され得る。さらに、生成物アルコールからのアルコールエステルの生成は、発酵培地中のより低濃度の生成物アルコールをもたらす。生成物アルコールの濃度が低下されると、微生物に対する生成物アルコールの毒性作用が最小限に抑えられるため、生成物アルコールの生成収率が向上される。
【０２８６】
カルボン酸は抽出剤として働き得、アルコールエステルは抽出剤中に分離し得る。しかしながら、抽出剤の分配係数は、脂質の汚染によって低下され得る。抽出剤の分配係数の低下を抑えるために、発酵培地中に存在する脂質が抽出剤に転化され、次に、脂質濃度が最小限に抑えられ得る。ある実施形態において、本明細書の方法は、脂質をカルボン酸へと触媒により加水分解することによって、原料またはバイオマス中に存在する脂質を抽出剤へと転化する手段を提供する。この加水分解によって生成されるカルボン酸は、抽出剤として働き得、または生成物アルコールとともにエステル化されてアルコールエステルが形成され得る。したがって、本明細書に記載される方法は、抽出剤の分配係数を保つための手段（例えば、脂質加水分解）ならびに生成物アルコールの毒性作用を最小限に抑えるための手段（例えば、生成物アルコールのエステル化）を提供する。
【０２８７】
カルボン酸が、発酵槽に供給され、または発酵槽に供給される脂質（例えば、バイオマス）から加水分解によって誘導され得る。カルボン酸の量は、有機相および水相を含む二相混合物を形成するのに十分である必要がある。すなわち、適切な濃度のカルボン酸（すなわち、抽出剤）が発酵ブロスと接触し、二相混合物を形成する。発酵ブロス中で形成されるアルコールエステルは、優先的に有機相中に分離し、その理由は、これらのエステルが、水相の平衡濃度を超える濃度で形成されるためである。アルコールエステル含有有機相は、発酵ブロスから分離され得、生成物アルコールは、有機相から回収され得、抽出剤は、発酵槽に再利用され得る。
【０２８８】
さらに、本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０２８９】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０２９０】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示する。以下の実施例は、原料としてのトウモロコシおよびカルボン酸としてのＣＯＦＡを含むが、本発明から逸脱せずに、他のバイオマス源を原料に使用することができ、ＣＯＦＡ以外の酸がカルボン酸として働き得ることを理解されたい。さらに、以下の実施例は、ブタノールおよびブチルエステルの生成を含むが、本発明から逸脱せずに、エタノールを含む他のアルコール、およびアルコールエステルが生成され得る。
【０２９１】
本明細書において使用される際、使用される略語の意味は以下のとおりであった：「ｇ」はグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ／Ｌ」はミリリットル／リットルを意味し、「ｍＬ／分」はミリリットル／分を意味し、「ＤＩ」は脱イオン化されていることを意味し、「ｕＭ」はマイクロメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎＭの波長における光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥菌体重量を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「℃／分」は摂氏温度／分を意味し、「ｓｌｐｍ」は標準リットル／分を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｐｄｃ」はピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素を意味し、後ろに酵素番号が付く。
【０２９２】
一般的な方法
シードフラスコ増殖（Ｓｅｅｄ  Ｆｌａｓｋ  Ｇｒｏｗｔｈ）
ｐｄｃ１が欠損した、ｐｄｃ５が欠損した、およびｐｄｃ６が欠損した、炭水化物源からイソブタノールを生成するように改変されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、凍結された培地からのシードフラスコ中で０．５５〜１．１ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００  １．３〜２．６−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｅｌｉｏｓ  α  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。培地を、３００ｒｐｍで回転する培養器中、２３〜２６℃で増殖させた。凍結した培地を−８０℃で予め貯蔵した。第１のシードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった：
３．０〜５．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．０〜３．５ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）。
【０２９３】
第１のシードフラスコ培地からの８〜１２ミリリットルを、２Ｌのフラスコに移し、３００ｒｐｍで回転する培養器中、３０℃で増殖させた。第２のシードフラスコは、２２０ｍＬの以下の培地を有する：
３０．０ｇ／Ｌのデキストロース
５．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）
ｐＨ５．５〜６．０に滴定された０．２ＭのＭＥＳ緩衝液。
【０２９４】
培地を、０．５５〜１．１ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００  １．３〜２．６）で増殖させた。２００ｇ／Ｌのペプトンおよび１００ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有するさらなる３０ｍＬの溶液を、この細胞濃縮物に加えた。次に、さらなる２５０〜３００ｍＬの０．２ｕＭのろ過滅菌されたＨＤ  ＯＣＥＮＯＬ（登録商標）９０／９５オレイルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｏｎｈｅｉｍ，ＤＥ）をフラスコに加えた。４ｇ／Ｌ  ｄｃｗ超（ＯＤ６００＞１０）まで培地を増殖させ続けてから、採取し、発酵に加えた。
【０２９５】
発酵の調製
初期の発酵槽の調製
ガラスの被覆された２Ｌの発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、家庭用水を、６６％の液化重量になるまで投入した。ｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｅａｓｙｆｅｒｍ  Ｐｌｕｓ  Ｋ８、部品番号：２３８６２７、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂｏｎａｄｕｚ  ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＤＣＵ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｗｅｒ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎメニューによって較正した。ｐＨ＝７でゼロ較正を行った。ｐＨ＝４でスパン較正を行った。次に、プローブを、ステンレス鋼のヘッドプレートを通して発酵槽に入れた。溶解された酸素プローブ（ｐＯ２プローブ）も、ヘッドプレートを通して発酵槽に入れた。栄養、シード培地、抽出溶媒、および基剤を送達するのに使用される管をヘッドプレートに取り付け、端部に箔を被せた（ｆｏｉｌ）。発酵槽全体をＳｔｅｒｉｓ（Ｓｔｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）オートクレーブに入れ、液体サイクル中で３０分間滅菌した。
【０２９６】
発酵槽をオートクレーブから取り出し、ロードセル上に設置した。ジャケット水供給および戻り配管を、それぞれ家庭用水および排水管（ｃｌｅａｎ  ｄｒａｉｎ）に連結した。流入水および流出水の配管を冷却する凝縮器を、７℃で運転される６Ｌの再循環温度浴に連結した。発酵槽からのガスを移送する通気管路を、Ｔｈｅｒｍｏ質量分析計（Ｐｒｉｍａ  ｄＢ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に連結された移送管路に連結した。スパージャ管路をガス供給管路に連結した。栄養、抽出溶媒、シード培地、および基剤を加えるための管を、ポンプを通して配管し（ｐｌｕｍｂ）、またはしっかりと固定した。
【０２９７】
発酵槽温度を、熱電対および家庭用水循環ループを用いて５５℃に制御した。湿潤したトウモロコシの実（＃２イエローデント）を、１．０ｍｍのふるいを備えたハンマーミルを用いて磨砕し、次に、得られた、磨砕された全粒トウモロコシの実を、２９〜３０％（乾燥トウモロコシ固体重量）の液化反応塊の投入量で発酵槽に加えた。
【０２９８】
液化前のリパーゼ処理
リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように発酵槽に加えた。発酵槽を、５５℃、３００ｒｐｍ、および０．３ｓｌｐｍのＮ２重層（ｏｖｅｒｌａｙ）で６時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、後述されるように液化を行った（液化）。
【０２９９】
液化
滅菌した家庭用Ｎ２をスパージャによって０．３ｓｌｐｍで加えつつ、発酵槽を３００〜１２００ｒｐｍで混合しながら、α−アミラーゼを、その仕様書どおりに発酵槽に加えた。温度設定点を、５５℃から８５℃に変化させた。温度が８０℃を超える場合、液化調理時間を開始し、液化サイクルを、９０〜１２０分間８０℃超に保持した。液化サイクルが完了した後、発酵槽温度設定点を、３０℃の発酵温度に設定した。化学的消泡剤を加えずに発泡を防ぐために、Ｎ２をスパージャからヘッドスペースへと向け直した。
【０３００】
液化後のリパーゼ処理
液化サイクルが完了した後（液化）、発酵槽温度を３０℃の代わりに５５℃に設定した。必要に応じて酸または塩基のボーラス添加を行うことによって、ｐＨをｐＨ＝５．８に手作業で制御した。リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように発酵槽に加えた。発酵槽を、５５℃、３００ｒｐｍ、および０．３ｓｌｐｍのＮ２重層で６時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、発酵槽温度を３０℃に設定した。
【０３０１】
リパーゼの熱による失活処理（加熱殺菌処理方法）
発酵槽温度を、１５分間より長く８０℃超に保持して、リパーゼを失活させた。熱による失活処理が完了した後、発酵槽温度を３０℃に設定した。
【０３０２】
接種の前の栄養添加
接種の直前にエタノール（６．３６ｍＬ／Ｌ、接種後の体積、２００プルーフ、無水）を発酵槽に加えた。最終濃度が２０ｍｇ／Ｌになるようにチアミンを加え、接種の直前に１００ｍｇ／Ｌのニコチン酸も加えた。
【０３０３】
接種の前のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸の添加
接種の直後に１Ｌ／Ｌ（接種後の体積）のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸を加えた。
【０３０４】
発酵作業
発酵槽の接種
Ｎ２を発酵槽に加えながら、発酵槽ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵槽ｐＯ２プローブを、３００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。第２のシードフラスコが４ｇ／Ｌ  ｄｃｗ超になった後、発酵槽に接種した。振とうフラスコを培養器／振とう器から５分間取り出して、オレイルアルコール相と水相との相分離を可能にした。水相（１１０ｍＬ）を滅菌した接種ボトルに移した。接種材料を、蠕動ポンプを通して発酵槽に注入した。
【０３０５】
発酵槽の運転条件
発酵槽を、増殖および生成段階全体について３０℃で運転した。ｐＨを、酸を全く加えずに５．７〜５．９のｐＨから５．２の制御設定点まで低下させた。増殖および生成段階の残りでは、水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨをｐＨ＝５．２に制御した。増殖および生成段階の残りでは、無菌の空気を、スパージャを介して、０．３ｓｌｐｍで発酵槽に加えた。ＤＣＵ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｘ  ＰＩＤ制御ループによって、撹拌制御のみを用いて、撹拌器を最小で３００ｒｐｍに設定し、最大で２０００ｒｐｍに設定して、ｐＯ２を、３．０％に制御されるように設定した。a−アミラーゼ（グルコアミラーゼ）を加えることによって、液化トウモロコシマッシュの同時糖化発酵によってグルコースを供給した。でんぷんが糖化に利用できる限り、グルコースを過剰（１〜５０ｇ／Ｌ）に保った。
【０３０６】
分析
ガスの分析
処理空気を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｒｉｍａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）質量分析計で分析した。これは、滅菌してから各発酵槽に加えたのと同じ処理空気であった。各発酵槽のオフガスを、同じ質量分析計で分析した。このＴｈｅｒｍｏ  Ｐｒｉｍａ  ｄＢは、毎週月曜の午前６：００に較正チェックを実行する機能を有する。較正チェックを、質量分析計に関連するＧａｓ  Ｗｏｒｋｓ  ｖ１．０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）ソフトウェアによってスケジューリングした。較正されるガスは以下のとおりであった：
【０３０７】
【表３】
2013535956.tif 000005
【０３０８】
二酸化炭素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて、較正サイクル中５％および１５％でチェックした。酸素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて１５％でチェックした。各発酵槽のオフガスの分析に基づいて、ストリッピングされたイソブタノール、消費された酸素、およびオフガスに吸入された二酸化炭素の量を、質量分析計のモル分率分析および発酵槽に入るガス流量（質量流制御装置）を用いて測定した。１時間当たりのガス速度を計算し、次に、発酵の間のその速度を積分した。
【０３０９】
バイオマスの測定
０．０８％のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液を、１×ＰＢＳによる、ＮａＣｌ（ＶＷＲ  ＢＤＨ８７２１−０）中の０．４％のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅの１：５の希釈液から調製した。１．０ｍＬの試料を、発酵槽から引き抜き、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機管に入れ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，５４１５において、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離の後、上部の溶媒層を、２０〜２００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ２００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて除去した。溶媒と水層との間の層を除去しないように注意した。溶媒層を除去してから、試料を、２７００ｒｐｍに設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて再懸濁した。
【０３１０】
血球計計数のための理想的な濃度を準備するために、一連の希釈が必要とされた。ＯＤが１０であった場合、理想的な量（２０〜３０）の細胞が平方当たり計数されるようにし得る０．５のＯＤを得るために、１：２０の希釈を行い得る。トウモロコシの固体による、希釈の不正確性を低下させるために、カットされた１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を用いた複数回の希釈が必要とされた。先端が詰まるのを防いで開口を広げるために、約１ｃｍを先端からカットした。１：２０の最終的な希釈の場合、発酵試料および０．９％のＮａＣｌ溶液の初期の１：１の希釈液を調製した。次に、前の溶液の１：１の希釈液（すなわち、初期の１：１の希釈液）および０．９％のＮａＣｌ溶液（第２の希釈液）を生成した後、第２の希釈液およびＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液の１：５の希釈液を生成した。試料を各希釈の間にボルテックスし、カットされた先端を０．９％のＮａＣｌおよびＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液に入れてすすいだ。
【０３１１】
カバースリップを、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｒｉｇｈｔ−Ｌｉｎｅ  １４９２）の上部に注意深く入れた。２〜２０μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ２０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、アリコート（１０μＬ）を、最終的なＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ希釈液から抜き取り、血球計に注入した。血球計を４０倍の倍率のＺｅｉｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ４０顕微鏡に設置した。中央の４分の１（ｃｅｎｔｅｒ  ｑｕａｄｒａｎｔ）を２５個の方形に分割し、次に、両方のチャンバーにおける４隅および中央の方形（ｃｅｎｔｅｒ  ｓｑｕａｒｅ）を計数し、記録した。両方のチャンバーを計数した後、平均値を取り、希釈係数（２０）を乗算し、次に血球計における中央の４分の１における方形の数の２５を乗算し、次に計数された４分の１の体積である０．０００１ｍＬで除算した。この計算の合計は、ｍＬ当たりの細胞の数である。
【０３１２】
水相中の発酵生成物のＬＣ分析
試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、冷蔵から取り出して、室温にした（約１時間）。約３００μＬの試料を、１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ１０００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、０．２ｕｍの遠心分離機フィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）ＭＦの改造されたナイロン遠心分離機フィルター）に移し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ，５４１５Ｃを用いて、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。約２００μＬのろ過された試料を、ポリマーフィート（ｆｅｅｔ）とともに２５０μＬのガラス容器挿入部（ｉｎｓｅｒｔ）を備えた１．８オートサンプラー容器に移した。ＰＴＦＥ隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をしてから、２７００ｒｐｍに設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて試料をボルテックスした。
【０３１３】
次に、試料を、バイナリアイソクラティックポンプ、真空脱気装置、加熱されたカラム区画、サンプラー冷却システム、ＵＶ  ＤＡＤ検出器およびＲＩ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＬＣで実験した。使用されたカラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈリフィル、３０Ｘ４．６ガードカラムを備えたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，３００  Ｘ  ７．８であった。カラム温度は、０．０１Ｎの硫酸の移動相を用いて、０．６ｍＬ／分の流量で４０分間、４０℃であった。結果を表１に示す。
【０３１４】
【表４】
2013535956.tif 000006
【０３１５】
試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、冷蔵から取り出して、室温にした（約１時間）。約１５０μＬの試料を、１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ１０００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、ポリマーフィートとともに２５０μＬのガラス容器挿入部を備えた１．８オートサンプラー容器に移した。ＰＴＦＥ隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をした。
【０３１６】
次に、試料を、７６８３Ｂ注入器およびＧ２６１４Ａオートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａ  ＧＣで実験した。カラムは、ＨＰ−ＩｎｎｏＷａｘカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍの内径（ＩＤ）、０．２５μｍのフィルム）であった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて４５℃で測定される１．５ｍＬ／分の流量でヘリウムであり；注入器スプリットは、２２５℃で１：５０であり；オーブン温度は、１．５分間４５℃、１０℃／分で０分間、４５℃〜１６０℃、次に２９分間の実行時間について、３５℃／分で１４分間、２３０℃であった。炎イオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウムメイクアップガスを用いて２６０℃で使用した。結果を表２に示す。
【０３１７】
【表５】
2013535956.tif 000007
【０３１８】
脂肪酸ブチルエステルについて分析される試料を、７６８３Ｂ注入器およびＧ２６１４Ａオートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣで実験した。カラムは、ＨＰ−ＤＢ−ＦＦＡＰカラム（１５メートル×０．５３ｍｍの内径（Ｍｅｇａｂｏｒｅ）、１−ミクロンのフィルム厚さのカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍの内径、０．２５μｍのフィルム）であった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて４５℃で測定される３．７ｍＬ／分の流量でヘリウムであり；注入器スプリットは、２２５℃で１：５０であり；オーブン温度は、２．０分間１００℃、１０℃／分で１００℃〜２５０℃、次に、２６分間の実行時間について、９分間２５０℃であった。炎イオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウムメイクアップガスを用いて３００℃で使用した。以下のＧＣ標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ；Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を用いて、脂肪酸イソブチルエステル生成物：パルミチン酸イソ−ブチル、ステアリン酸イソ−ブチル、オレイン酸イソ−ブチル、リノール酸イソ−ブチル、リノレン酸イソ−ブチル、アラキドン酸イソ−ブチルの属性を確認した。
【０３１９】
実施例１〜１４は、権利請求される方法に使用され得る様々な発酵条件を説明する。例として、液化前のリパーゼ処理を行う発酵もあれば、液化後のリパーゼ処理を行う発酵もあった。他の実施例では、発酵に熱による失活処理を行った。発酵の後、有効イソブタノール力価（有効イソ力価）、すなわち、水性体積のリットル当たり生成されるイソブタノールの合計グラムを測定した。結果を表３に示す。
【０３２０】
実施例１−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０１４は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２１】
実施例２
実験識別子２０１０Ｙ０１５は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２２】
実施例３
実験識別子２０１０Ｙ０１６は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、エタノールの除外を除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２３】
実施例４
実験識別子２０１０Ｙ０１７は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後の加熱殺菌処理方法、エタノールの除外を除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２４】
実施例５
実験識別子２０１０Ｙ０１８は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後に７．２ｐｐｍのリパーゼを加えたことのみを除いた液化後のリパーゼ処理方法、液化後の加熱殺菌処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２５】
実施例６−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０１９は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後の加熱殺菌処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２６】
実施例７−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０２１は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２７】
実施例８
実験識別子２０１０Ｙ０２２は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２８】
実施例９
実験識別子２０１０Ｙ０２３は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３２９】
実施例１０
実験識別子２０１０Ｙ０２４は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３３０】
実施例１１
実験識別子２０１０Ｙ０２９は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３３１】
実施例１２
実験識別子２０１０Ｙ０３０は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３３２】
実施例１３−（対照）
実験識別子２０１０Ｙ０３１は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３３３】
実施例１４
実験識別子２０１０Ｙ０３２は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはＮＧＣＩ−０７０であった。
【０３３４】
【表６】
2013535956.tif 000008
【０３３５】
実施例１５および１６は、液化後のリパーゼ処理がある場合とない場合の発酵およびイソブタノール生成の比較を示す。結果を表４および５に示す。
【０３３６】
実施例１５
実験識別子２０１０Ｙ０２６は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、接種の前の栄養添加方法、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されたトウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。トウモロコシ油脂肪酸抽出溶媒を、ブロスの体積と等しい体積で加えた。ブタノロジェン（ｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）は、ＰＮＹ２２０５であった。トウモロコシマッシュから作製されたグルコースがほとんど欠失されたため、４６時間〜６１時間の発酵時間で、２７４ｇの５０％  ｗ／ｗの滅菌したグルコース溶液の添加を行った。
【０３３７】
実施例１６
実験識別子２０１０Ｙ０２７は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種の前の栄養添加方法、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。ＨＤ  ＯＣＥＮＯＬ（登録商標）９０／９５（オレイルアルコール、ＣＡＳ番号１４３−２８−２、Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｏｎｈｅｉｍ，ＤＥ）を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。オレイルアルコール抽出溶媒を、ブロスの体積と等しい体積で加えた。ブタノロジェンは、ＰＮＹ２２０５であった。
【０３３８】
【表７】
2013535956.tif 000009
【０３３９】
【表８】
2013535956.tif 000010
【０３４０】
実施例１７〜２２は、発酵およびイソブタノール生成への、再利用される抽出剤に対する新鮮な抽出剤の影響の比較を示す。結果を表６に示す。これらの実施例では、２Ｌおよび１０Ｌの発酵を、後述されるように調製した。
【０３４１】
１０Ｌのプレシードフラスコ増殖
ｐｄｃ１が欠損した、ｐｄｃ５が欠損した、およびｐｄｃ６が欠損した、炭水化物源からイソブタノールを生成するように改変されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株（上記の株ＰＮＹ２２４２）を、凍結された培地からのシードフラスコ（１２５ｍＬの通気式フラスコ中、１０ｍＬの合成培地）中で０．６〜０．７ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００１．５〜２．５−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｅｌｉｏｓ  α  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。培地を２６０ｒｐｍで回転する培養器中、２９〜３１℃で増殖させた。凍結された培地を−８０℃で予め貯蔵した。合成シードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった：
１０．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．５ｍＬ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）
１：１：：Ｔｗｅｅｎ  ８０：エタノール中１％のエルゴステロール。
【０３４２】
第１のシードフラスコ培地からの２ミリリットルを、２５０ｍＬの通気式フラスコ中の２５ｍＬに移し、２６０ｒｐｍで回転する培養器中、２９〜３１℃で増殖させた。第２のシードフラスコは、上記で使用したものと同じ合成培地を使用する。
【０３４３】
培地を、０．６〜０．７ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００１．０〜３．０）まで増殖させた。次に、８ｍＬのこの第２のフラスコ培地を、２００ｍＬの合成培地を含む３つのフラスコ（２Ｌのフラスコ、通気式フラスコ、バッフル付きフラスコ）に加えた。培地を、培養器中、２９〜３１℃で１８〜２４時間増殖させた。３つのシードフラスコは、始めの２つのシードフラスコに使用されるのと同じ合成培地を使用する。これらの３つのフラスコ（６００ｍＬのフラスコブロス）を用いて、６Ｌの最終的な水性体積で繁殖タンクに接種する。
【０３４４】
１０Ｌの繁殖タンク液化
１０Ｌの、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  ＢｉｏＳｔａｔ  Ｃ発酵装置を使用するために準備した。インラインｐＨプローブを発酵装置に入れた。ｐＨ＝７でゼロ較正を行った。ｐＨ＝４でスパン較正を行った。次に、プローブを、サイドポートを通して発酵槽に入れた。溶解された酸素プローブ（ｐＯ２プローブ）も、サイドポートを通して発酵装置に入れた。栄養、シード培地、抽出溶媒、および基剤を送達するのに使用される管をヘッドプレートに取り付け、端部に箔を被せた（ｆｏｉｌ）。取り入れ、採取するための弁を、低圧蒸気および１２１℃超で２０分間超にわたる蒸気トラップで滅菌した。
【０３４５】
発酵槽温度を、熱電対および家庭用水循環ループを用いて、３０℃に制御した。湿潤したトウモロコシの実（＃２イエローデント）を、１．０ｍｍのふるいを備えたハンマーミルを用いて磨砕し、次に、得られた、磨砕された全粒トウモロコシの実を、１０〜２０％（乾燥トウモロコシ固体重量）の液化反応塊の投入量で発酵槽に加えた。Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔを、０．５％  ｗ／ｗの全バッチ重量で発酵装置に加えた。
【０３４６】
滅菌した家庭用Ｎ２をスパージャによって１〜２ｓｌｐｍで加えつつ、発酵槽を３００〜１５００ｒｐｍで混合しながら、α−アミラーゼを、その仕様書どおりに発酵槽に加えた。温度設定点を、各段階で５〜１５分間の保持を伴う５℃の段階的変化で５５℃から９５℃に変化させて、十分な混合を確実にした。温度が９０℃を超える場合、液化調理時間を開始し、液化サイクルを、６０分間９０℃超に保持した。液化サイクルが完了した後、発酵槽温度設定点を、３０℃の発酵温度に設定した。化学的消泡剤を加えずに発泡を防ぐために、Ｎ２をスパージャからヘッドスペースへと向け直した。
【０３４７】
１０Ｌの繁殖タンク運転
Ｎ２を発酵槽に加えながら、発酵槽ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵槽ｐＯ２プローブを、４００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。プレシードフラスコ増殖工程の最終段階から発酵槽に接種した。３つの振とうフラスコを、培養器／振とう器から取り出し、滅菌した槽に加えた。滅菌した槽の内容物を、繁殖タンク液化方法中に作製された、５．３〜５．５Ｌの液化されたマッシュに加えた。
【０３４８】
発酵温度を２９〜３１℃に制御した。撹拌速度を４００ｒｐｍに固定した。空気を２．０ｓｌｐｍで発酵全体についてスパージした。発酵装置のためのＮＨ４ＯＨおよびＰＩＤ制御ループを用いて、ｐＨを５．４〜５．５に制御した。背圧制御弁を制御するＰＩＤループによって制御される、０．３〜０．５バールの背圧が発酵装置において設定された。
【０３４９】
接種後１６〜２０時間の時点で、グルコアミラーゼ（１．８ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ（登録商標）Ｌ−４００，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を加えて、同時糖化発酵を開始し、溶解されたでんぷんからグルコースを放出した。また、５．５ＬのＨＤ  ＯＣＥＮＯＬ（登録商標）９０／９５（オレイルアルコール、Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｏｎｈｅｉｍ，ＤＥ）を発酵装置に加えた。３４〜３６時間の時点で、撹拌器速度を１００ｒｐｍまで低下させた。１０分後、撹拌器をオフにし、発酵装置への空気流をスパージモードからオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）モードに変更した。
【０３５０】
１０Ｌの生成タンク液化
１０Ｌの生成タンク液化を上述したように行った。発酵槽温度を、熱電対および家庭用水循環ループを用いて、３０℃に制御した。湿潤したトウモロコシの実（＃２イエローデント）を、１．０ｍｍのふるいを備えたハンマーミルを用いて磨砕し、次に、得られた、磨砕された全粒トウモロコシの実を、２５〜３５％（乾燥トウモロコシ固体重量）の液化反応塊の投入量で発酵槽に加えた。１００倍ビタミン溶液（１００Ｘ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２ｇ／Ｌのチアミンおよび１０ｇ／Ｌのニコチン酸）の７５ｍＬを発酵装置に添加した。α−アミラーゼを、上述したように発酵槽に加えた。また、発酵装置が３０℃に戻された後、６〜７ｍＬ／Ｌの無水エタノールを発酵装置に添加した。
【０３５１】
１０Ｌの生成タンク運転
Ｎ２を発酵槽に加えながら、発酵槽ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵槽ｐＯ２プローブを、４００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。発酵槽を繁殖タンクから接種した。繁殖タンク中の増殖時間の３６時間後に、無菌の移動を繁殖タンクから行い、発酵撹拌を、１０分間超にわたってオフにした。これにより、オレイルアルコールと水相とのかなりの分離が可能になった。無菌の移動を、繁殖タンクにおける採取弁（この発酵装置の底部に位置する）から行った。移動後のタンクの最終的な非溶媒体積を基準にして、約１０％  ｖ／ｖを生成タンクに加えた。
【０３５２】
発酵温度を２９〜３１℃に制御した。撹拌速度を４００ｒｐｍに固定した。空気を２．０ｓｌｐｍで発酵全体についてスパージした。発酵装置のためのＮＨ４ＯＨおよびＰＩＤ制御ループを用いて、ｐＨを５．２〜５．３に制御した。背圧制御弁を制御するＰＩＤループによって制御される、０．３〜０．５バールの背圧が発酵装置において設定された。
【０３５３】
接種の直前に、２５〜３５％  ｖ／ｖのＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸を、発酵装置に無菌で加えた。１０Ｌの繁殖タンク運転方法が完了した後、発酵装置に１０％  ｖ／ｖの発酵ブロスを接種した。接種の直後、グルコアミラーゼ（Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ（登録商標）Ｌ−４００）を加えて、でんぷんからグルコースを放出した。グルコース過剰を維持するために必要な場合、さらなるグルコアミラーゼの添加を行った。接種の直後、リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ）を、４〜１５ｐｐｍで発酵装置に加えた。
【０３５４】
２Ｌのプレシードフラスコ増殖
２Ｌのプレシードフラスコ増殖を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株（上記の株ＰＮＹ２２４２）を用いて調製し、凍結された培地からのシードフラスコ（１２５ｍＬの通気式フラスコ中、１０ｍＬの合成培地）中で０．６〜０．７ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００１．５〜２．５−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｅｌｉｏｓ  α  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。培地を、２６０ｒｐｍで回転する培養器中、２９〜３１℃で増殖させた。凍結された培地を−８０℃で予め貯蔵した。合成シードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった：
１０．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．５ｍＬ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｎｏ．２９１９２０）
１：１：：Ｔｗｅｅｎ  ８０：エタノール中１％のエルゴステロール。
【０３５５】
第１のシードフラスコ培地からの２ミリリットルを、２５０ｍＬの通気式フラスコ中の２５ｍＬに移し、２６０ｒｐｍで回転する培養器中、２９〜３１℃で増殖させた。第２のシードフラスコは、上記で使用したものと同じ合成培地を使用する。
【０３５６】
培地を、０．６〜０．７ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００１．０〜３．０）まで増殖させた。次に、４ｍＬのこの第２のフラスコ培地を、２Ｌのフラスコ中の１００ｍＬのトウモロコシマッシュ遠心分離液に加えた。培地を、培養器中、２９〜３１℃で１８〜２４時間増殖させた。次に、５００ｍＬのＨＤ  ＯＣＥＮＯＬ（登録商標）９０／９５（オレイルアルコール、Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｏｎｈｅｉｍ，ＤＥ）をフラスコに加えた。フラスコを、６〜８時間増殖させた。次に、８０ｍＬの脱イオン水中の２ｍＬの１．２ｇのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ（登録商標）Ｌ−４００、（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を遠心分離液に加えて、遠心分離液中の溶解されたでんぷんからグルコースを放出した。培地を１８〜２４時間増殖させ続けた。最終的なバイオマス濃度は、６〜１２ｇ／Ｌ  ｄｃｗであった。
【０３５７】
以下の処方でトウモロコシを液化することによって、トウモロコシマッシュ遠心分離液を作製した：
１１５０ｇの水道水
３４０．５ｇの１ｍｍのふるいでふるい分けされた、磨砕されたトウモロコシ
１３．５ｇの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ番号９１０２３３３、低粉塵性（ｌｏｗ  ｄｕｓｔｉｎｇ））
２７ｇのペプトン
４．１ｇの尿素
４０．５ｍｇのニコチン酸
４０．５ｍｇのチアミン。
【０３５８】
次に、材料を、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ５Ｃ遠心分離機中で３０分間遠心分離した。上清を固体ペレットから分離した。上清を、Ｓｔｅｒｉｓオートクレーブ中で５分間の液体サイクルにわたって加熱した。これを遠心分離液として定義する。
【０３５９】
２Ｌの発酵調製
２Ｌの初期の発酵槽調製物
２Ｌの初期の発酵槽調製物を、上述したように調製した。発酵槽温度を、熱電対および家庭用水循環ループを用いて、５５℃に制御した。湿潤したトウモロコシの実（＃２イエローデント）を、１．０ｍｍのふるいを備えたハンマーミルを用いて磨砕し、次に、得られた、磨砕された全粒トウモロコシの実を、２５〜３０％（乾燥トウモロコシ固体重量）の液化反応塊の投入量で発酵槽に加えた。さらに、液化を上述したように行った。滅菌した家庭用Ｎ２をスパージャによって０．３ｓｌｐｍで加えつつ、発酵槽を３００〜１２００ｒｐｍで混合しながら、α−アミラーゼを、その仕様書どおりに発酵槽に加えた。
【０３６０】
接種の前の２Ｌの添加
以下の栄養を、接種の前、液化後に、接種後の体積基準で発酵槽に加えた：
３０ｍｇ／Ｌのニコチン酸
３０ｍｇ／Ｌのチアミン
１：１：Ｔｗｅｅｎ  ８０：エタノール中の１ｍＬ／Ｌの１％のエルゴステロールｗ／ｖ溶液
６．３ｍＬ／Ｌのエタノール
２ｇ／Ｌの尿素。
【０３６１】
２Ｌの発酵槽接種
Ｎ２を発酵槽に加えながら、発酵槽ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵槽ｐＯ２プローブを、３００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。プレシードフラスコ増殖工程の最終段階から発酵槽に接種した。振とうフラスコを培養器／振とう器から取り出し、３０分間遠心分離した。液体（オレイルアルコールおよび水性上清）を廃棄し、細胞ペレットを、プレシードフラスコ増殖培地（合成培地）中で再懸濁した。１００ｍＬの水相を、滅菌した接種ボトルに移した。接種材料を、蠕動ポンプを通して発酵槽に注入した。
【０３６２】
接種後の２Ｌのリパーゼ添加
Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）溶液（１００Ｌのストック溶液）を、１．２〜１．４ｍｇ／ｍＬの酵素濃度で調製した。非溶媒体積を基準にして所望の百万分率濃度まで発酵装置に接種した後、溶液を発酵に加えた。添加時間は、発酵装置を接種した後１時間未満にわたった。
【０３６３】
２Ｌの大豆油脂肪酸添加
発酵槽に、０〜３０重量パーセントの脂肪酸ブチルエステルを含有する未使用のＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸または再利用されるＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸のいずれかを０．１〜０．５Ｌ／Ｌ（接種後の体積）加えた。
【０３６４】
２Ｌの発酵槽運転条件
発酵槽を、増殖および生成段階全体について３０℃で運転した。ｐＨを、酸を全く加えずに５．７〜５．９のｐＨから５．２５の制御設定点まで低下させた。増殖および生成段階の残りでは、水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨをｐＨ＝５．２に制御した。増殖および生成段階の残りでは、無菌の空気を、スパージャを介して、０．２〜０．３ｓｌｐｍで発酵槽に加えた。ｐＯ２を制御しなかった。撹拌器を３００ｒｐｍで一定のｒｐｍに設定した。撹拌軸は、液面の下に２つのＲｕｓｈｔｏｎ羽根車および液面の上に１つの傾斜した羽根車を有していた。グルコアミラーゼを加えることによって、液化トウモロコシマッシュの同時糖化発酵によってグルコースを供給した。でんぷんが糖化に利用できる限り、グルコースを過剰（１〜５０ｇ／Ｌ）に保った。
【０３６５】
５〜２０ｍＬの試料を、発酵槽から引き抜き、遠心分離管に入れ、上記の手順を用いて細胞質量測定のために遠心分離した。さらに、ガス分析ならびに水相中の発酵生成物のＬＣ分析および溶媒相中の発酵生成物のＧＣ分析などの分析方法を、上述したように行った。
【０３６６】
実施例１７〜２２の発酵条件が以下に示され、結果の概要（脂肪酸ブチルエステルを含む未使用の大豆油脂肪酸および再利用される大豆脂肪酸）が表６に示される。
【０３６７】
実施例１７
実験識別子ＧＬＮＯＲ１０５０は以下のものを含んでいた：１０Ｌのプレシードフラスコ増殖、１０Ｌの繁殖タンク液化、１０Ｌの繁殖タンク運転、１０Ｌの生成タンク液化、１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が発酵装置に加えられる１０Ｌの生成タンク運転、抽出剤：未使用のＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸（未使用の大豆油脂肪酸）。液体溶媒および非溶媒材料を、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−１２遠心分離機中で分離した、および全ての分析方法。
【０３６８】
実施例１８
実験識別子ＧＬＮＯＲ１０５１は以下のものを含んでいた：１０Ｌのプレシードフラスコ増殖、１０Ｌの繁殖タンク液化、１０Ｌの繁殖タンク運転、１０Ｌの生成タンク液化、４ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が発酵装置に加えられる１０Ｌの生成タンク運転、抽出剤：未使用のＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸（未使用の大豆油脂肪酸）。液体溶媒および非溶媒材料を、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−１２遠心分離機中で分離した、および全ての分析方法。
【０３６９】
実施例１９
識別子２０１１Ｙ０２９は以下のものを含んでいた：２Ｌのプレシードフラスコ増殖、２Ｌの発酵調製、２Ｌの液化、接種の前の２Ｌの添加、２Ｌの発酵槽接種、１０ｐｐｍの最終濃度における、接種後の２Ｌのリパーゼ添加、２Ｌの再利用される大豆油脂肪酸添加（再利用されるＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸および実施例５６Ａからの脂肪酸ブチルエステル−５０％  ｖ／ｖの溶媒充填）、２Ｌの発酵槽運転条件、および全ての分析方法。
【０３７０】
実施例２０
識別子２０１１Ｙ０３０は以下のものを含んでいた：２Ｌのプレシードフラスコ増殖、２Ｌの発酵調製、２Ｌの液化、接種の前の２Ｌの添加、２Ｌの発酵槽接種、１０ｐｐｍの最終濃度における、接種後の２Ｌのリパーゼ添加、２０〜３０％の脂肪酸ブチルエステルを含む０．４Ｌ／Ｌ（接種後の体積）の未使用のＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸の添加、２Ｌの発酵槽運転条件、および全ての分析方法。
【０３７１】
実施例２１
識別子２０１１Ｙ０３１は以下のものを含んでいた：２Ｌのプレシードフラスコ増殖、２Ｌの発酵調製、２Ｌの液化、接種の前の２Ｌの添加、２Ｌの発酵槽接種、１０ｐｐｍの最終濃度における、接種後の２Ｌのリパーゼ添加、２Ｌの再利用される大豆油脂肪酸添加（再利用されるＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸および実施例５６Ｂからの脂肪酸ブチルエステル−１０％  ｖ／ｖの溶媒充填）、２Ｌの発酵槽運転条件、および全ての分析方法。
【０３７２】
実施例２２
識別子２０１１Ｙ０３２は以下のものを含んでいた：２Ｌのプレシードフラスコ増殖、２Ｌの発酵調製、２Ｌの液化、接種の前の２Ｌの添加、２Ｌの発酵槽接種、１０ｐｐｍの最終濃度における、接種後の２Ｌのリパーゼ添加、０．４Ｌ／Ｌ（接種後の体積）の未使用のＣｏｇｎｉｓ  Ｅｍｅｒｙ（登録商標）６１０大豆脂肪酸の添加、２Ｌの発酵槽運転条件、および全ての分析方法。
【０３７３】
【表９】
2013535956.tif 000011
【０３７４】
実施例２３
以下の実施例は、発酵性炭素源としてスクロースを用いた発酵によるイソブタノールの生成を説明する。
【０３７５】
バイオマスの生成
接種材料：イソブタノロジェンの増殖を開始させるためのシード培地を準備した。シード培地の組成は以下のとおりであった：硫酸アンモニウム、５ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム、３ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物、０．５ｇ／Ｌ；エタノール、３．２ｇ／Ｌ；酵母抽出物（ＢＢＬ）、５ｇ／Ｌ；グルコース、１０ｇ／Ｌ；ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ；ビオチン、５０μｇ／Ｌ；および１Ｌの水中に、１５ｇのＥＤＴＡ、４．５ｇの硫酸亜鉛七水和物、０．８ｇの無水塩化マンガン、０．３ｇの塩化コバルト六水和物、０．３ｇの硫酸銅五水和物、０．４ｇの無水モリブデン酸ニナトリウム、４．５ｇの塩化カルシウム二水和物、３ｇの硫酸鉄七水和物、１ｇのホウ酸、０．１ｇのヨウ化カリウムを含有する微量元素溶液、１ｍＬ／Ｌ。ｐＨを５．５に調整し、次に、培地フィルターを、０．２２μの滅菌フィルター装置によって滅菌した。
【０３７６】
バイオマス生成のための１０Ｌの発酵装置の調製
イソブタノロジェンＰＮＹ２２０５の１つのバイアルを、３０℃で一晩の増殖および２６０ｒｐｍの振とうのために、１２５ｍＬの通気式フラスコ中１５ｍＬのシード培地に無菌で移した。培地を、３０℃で一晩の増殖および２６０ｒｐｍの振とうのために、２Ｌのバッフル付きの通気式フラスコ中５００ｍＬの同じ培地に無菌で移し、培地がＯＤ６００７に達したときに、準備された１０ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃ発酵装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。
【０３７７】
６Ｌの初期体積の増殖培地を含む１０ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃ発酵装置を調製した。増殖培地の組成および調製は以下のとおりであった：滅菌の前に、硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物、２ｇ／Ｌ；酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ（商標）６９５）、２ｇ／Ｌ；Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｓｉｇｍａ  ２０４、０．５ｍＬ／Ｌ；ビオチン、１００μｇ／Ｌ；および１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（１Ｌの水中で調製される：１５ｇのＥＤＴＡ、４．５ｇの硫酸亜鉛七水和物、０．８ｇの無水塩化マンガン、０．３ｇの塩化コバルト六水和物、０．３ｇの硫酸銅五水和物、０．４ｇの無水モリブデン酸ニナトリウム、４．５ｇの塩化カルシウム二水和物、３ｇの硫酸鉄七水和物、１ｇのホウ酸、０．１ｇのヨウ化カリウム）。所定の位置における１２１℃での蒸気滅菌の後、槽を冷却し、６０ｇの原料培地を加えた。原料培地を以下のとおりに調製した：スクロース、５０％の溶液、２．９７Ｌ；ビオチン、１．４ｍｇ；３４ｍＬの微量元素溶液；５Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．５まで滴定し、蒸気滅菌し；滅菌後に冷却し、１３０ｍＬのエタノールおよび酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ（商標）６９５）の３２０ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）のろ過滅菌された溶液を加えた。ここで、１０Ｌの発酵装置中の初期の糖濃度は、３．７ｇ／Ｌのスクロース、０．８ｇ／Ｌのグルコース、および０．８ｇ／Ｌのフルクトースであった。
【０３７８】
発酵を、ｐＨ５．５（水酸化アンモニウムの添加による）、３０℃、２．０標準リットル／分における空気流、撹拌制御によって３０％で溶解される酸素、および０．５バールの背圧に制御した。接種後、グルコースの残留測定が、０．１ｇ／Ｌ未満になるまで糖を消費し、次に供給プログラムを開始し；これを、１１時間の経過発酵時間で行った。０．１／時のプログラムされた増殖速度で２０のＯＤ６００（約８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量）が達成されるまでスクロース限度を保つようにプログラムを設定した。この実験の実際の測定される増殖速度は、０．１８／時であった。２０時間の発酵時間の後、目標のＯＤ６００が達成された。
【０３７９】
目標を達成したら、培地を無菌で採取し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機中で遠心分離した。得られたペレットを、後述されるイソブタノール生成培地とともに最終的な体積が３００ｍＬになるように再懸濁した。この培地を、イソブタノール生成発酵装置のための接種材料として使用した。
【０３８０】
イソブタノールの生成
生成発酵装置の調製：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢｉｏＳｔａｔ  Ｂ  Ｐｌｕｓ  Ｔｗｉｎ制御ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた２つの１リットルのガラスＡｐｐｌｉｋｏｎ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ，Ｈｏｌｌａｎｄ）発酵装置を、イソブタノール生成に使用した。発酵装置を１Ｌの脱イオン水を用いて調製し、１２１℃で３０分間オートクレーブすることによって滅菌した。発酵装置が冷めたら、水を無菌で除去し、表７に示されるようなろ過滅菌された生成培地の体積を加えた。生成培地の組成は以下のとおりであった：アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）、６．７ｇ／Ｌ；ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、およびウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地補充物（Ｓｉｇｍａ）、２．７０ｇ／Ｌ；トリプトファン、１．６ｍｇ／Ｌ；ロイシン、８ｍｇ／Ｌ；エタノール、２．８ｇ／Ｌ；Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｓｉｇｍａ  ２０４、０．２ｍＬ／Ｌ；スクロース、２５ｇ／Ｌ。接種の直前に、ろ過滅菌したリパーゼ溶液は、表７に示されるとおりであった。ｐＨ７の、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中のＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）Ｌ１００（Ｓｉｇｍａ）を、１．２５ｍｇのタンパク質／ｍＬの最終濃度まで希釈することによって、リパーゼ溶液を調製した。溶液を調製し、発酵装置に加える前に、５℃で１日貯蔵した。
【０３８１】
【表１０】
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【０３８２】
発酵装置を、ｐＨ５．２（２０％の水酸化カリウムの添加による）、３０℃、０．２標準リットル／分における空気流、および撹拌制御によって３％で溶解された酸素に制御した。
【０３８３】
発酵装置にそれぞれ、初期ＯＤ６００２０〜２５（約８〜１０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量）まで、４０ｍＬの濃縮されたバイオマスを接種した。表７に示されるろ過滅菌された大豆油脂肪酸（ＳＯＦＡ）の体積と同様に、４ｍＬのろ過滅菌されたビタミン溶液（水中、チアミン−ＨＣｌ、１ｍｇ／ｍＬ；ニコチン酸、１ｍｇ／ｍＬ）の添加を接種時に追加した。試料（５〜１０ｍＬ）を、２〜３時間ごとに抜き取り、ＹＳＩ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ，Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ）によって、グルコースおよびスクロースについて検定した。スクロースが消費されるにつれて、５〜３０ｇ／Ｌの濃度を維持するために５０％のスクロース（ｗ／ｗ）の原料を加えた。試料の水相および有機相を分離し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣによる上記のＨＰＬＣ方法によって分析した。有機酸およびアルコールの分析のために、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１カラムを、０．０１Ｎの硫酸移動相とともに使用した。スクロース、グルコース、およびフルクトースの分析のために、０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８）移動相とともにＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｎカラムを使用した。
【０３８４】
リパーゼが加えられた発酵装置のそれぞれは、水相中のイソブタノールおよび溶媒相中の遊離イソブタノールのより低い濃度を有していた。イソブタノールの水相および溶媒相の濃度が、図６に示される。また、同じ溶媒充填量でより多くのリパーゼを加えることにより、イソブタノールのより低い水性力価および溶媒中のより低い遊離イソブタノール、およびより多いＦＡＢＥとしてのイソブタノールが得られた。
【０３８５】
リパーゼを含む培地では、リパーゼを含まない対照の発酵装置より高い、イソブタノールの有効力価が得られた。図７は、イソブタノールの有効力価を示す。この実施例では、有効力価を、接種後の発酵装置中のブロスの初期測定重量および発酵装置に投入される溶媒の初期測定重量に基づいて計算した。発酵全体にわたって、溶媒密度は、０．８８ｇ／ｍＬであると仮定され、水性ブロス密度は、１．００ｇ／ｍＬであると仮定された。より低い溶媒充填量におけるより多いリパーゼの添加により、イソブタノールのより高い有効力価（Ｄ対Ｃ）が得られたが、溶媒の相対体積（Ｃ対Ｂ）の増加ほど多くはなかった。
【０３８６】
図８に示されるように、グルコース当量で計算される、消費される糖は、リパーゼを加えた発酵装置においてより高い。消費されるグルコース当量を、スクロースの各モルをグルコース２モルと数え、およびフルクトースの各モルをグルコース１モルと数えて、発酵装置に供給されて残っている測定される糖から計算し、次に、グルコースの分子量によってグラムに換算した。消費されるグルコース当量の濃度も、接種後の発酵ブロスの初期体積に基づいて計算する。
【０３８７】
実施例２４
オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のための液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理
実施例１、２、および３において上述したように実行された発酵から取られたブロスおよびオレイルアルコールの試料を、Ｅ．Ｇ．ＢｌｉｇｈおよびＷ．Ｊ．Ｄｙｅｒ（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３７：９１１−１７，１９５９、以後、参照文献１）によって記載される方法にしたがって、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析した。３つの発酵のそれぞれについて調製された液化トウモロコシマッシュも、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（３０重量％の磨砕されたトウモロコシの実を含有する液化反応塊のｋｇ当たり１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質（ＢＣＡタンパク質分析、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））による処理の後、脂質の重量％およびＦＦＡの重量％について分析した。実施例１（対照）の液化トウモロコシマッシュにリパーゼを加えず、リパーゼ（リパーゼの熱による失活なし）で処理された、液化トウモロコシマッシュを含有する実施例２および３に記載される発酵は、エタノールを実施例３に記載される発酵に加えなかったことを除いて同一であった。
【０３８８】
実施例２および３に記載されるように実行された発酵のために調製された、リパーゼ処理された液化トウモロコシマッシュのＦＦＡの％は、リパーゼ処理しなかった場合（実施例１）の３１％と比較して、それぞれ８８％および８９％であった。７０時間（実行終了（ＥＯＲ））の時点で、実施例２および３（活性リパーゼを含有する）に記載されるように実行された発酵のＯＡ相中のＦＦＡの濃度は、それぞれ１４％および２０％であり、対応する脂質の増加（トウモロコシ油脂肪酸メチルエステル誘導体として測定される）は、ＧＣ／ＭＳによって、ＯＡによるＣＯＦＡのリパーゼ触媒エステル化に起因することが分かり、その際、液化トウモロコシマッシュ中のトウモロコシ油のリパーゼ触媒加水分解によってＣＯＦＡがまず生成され；パルミチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、およびオレイン酸オレイルの生成をＧＣ／ＭＳによって確認し、第４のエステルを、リノール酸オレイルとして暫定的に特定した。ＦＦＡおよび脂質分析の結果を表８に示す。
【０３８９】
【表１１】
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【０３９０】
実施例２５
トウモロコシ油遊離脂肪酸のオレイルアルコールエステルの生成を制限するための、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼの熱による失活
水道水（９１８．４ｇ）を、被覆された２Ｌの樹脂ケトルに加え、次に、４７４．６ｇの湿重量（４１７．６ｇの乾燥重量）の磨砕された全粒トウモロコシの実（ハンマーミルにおける１．０ｍｍのふるい）を撹拌しながら加えた。混合物を、３００ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、２Ｎの硫酸を用いてｐＨを５．８に調整した。混合物に０．６７２ｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）−ＦＲＥＤ  Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有する１４．０ｇの水溶液を加え、混合物の温度を、６００ｒｐｍで撹拌しながらおよびｐＨ５．８で、８５℃まで上昇させた。８５℃で１２０分後、混合物を５０℃に冷却し、得られた液化トウモロコシマッシュの４５．０ｍＬのアリコートを、５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離機管に移し、−８０℃で冷凍貯蔵した。
【０３９１】
第１の反応において、上述したように調製された５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と、５５℃で６時間混合し、８５℃で１時間のリパーゼの失活を行わず、混合物を３０℃に冷却した。第２の反応において、５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）と、５５℃で６時間混合し、次に１時間にわたって８５℃まで加熱し（リパーゼの失活）、次に３０℃に冷却した。第３の反応において、リパーゼを加えない５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、５５℃で６時間混合し、８５℃で１時間の加熱を行わず、混合物を３０℃に冷却し、３８ｇのオレイルアルコールを加え、得られた混合物を３０℃で７３時間撹拌した。第４の反応において、リパーゼを加えない５０ｇの液化トウモロコシマッシュを、５５℃で６時間混合し、次に１時間にわたって８５℃まで加熱し、次に３０℃に冷却した。４つの反応混合物のそれぞれを、６時間の時点で採取し、次に、３８ｇのオレイルアルコールを加え、得られた混合物を３０℃で撹拌し、２５時間および７３時間の時点で採取した。参照文献１によって記載される方法にしたがって、試料（液化されたマッシュおよびオレイルアルコール（ＯＡ）の両方）を、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析した。
【０３９２】
ＯＡ添加の前にリパーゼの熱による失活を伴って実行された第２の反応のＯＡ相中のＦＦＡの％は、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼを熱により失活させなかった場合（第１の反応）の、２５時間および７３時間の時点におけるわずか４０％のＦＦＡおよび２１％のＦＦＡと比較して、２５時間で９９％および７３時間で９５％であった。リパーゼを加えない２つの対照反応においてＦＦＡの％の大きな変化は観察されなかった。結果を表９に示す。
【０３９３】
【表１２】
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【０３９４】
実施例２６
オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のためのリパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼの熱による失活
３つの発酵を、実施例４、５、および６において上述したように実行した。実施例４および６の液化トウモロコシマッシュには、発酵前にリパーゼを加えず、実施例５に記載される発酵における液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理（７．２ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質を用いて）の直後に、熱による失活処理（リパーゼを完全に失活させるため）を行い、その後、接種の前の栄養添加および発酵を行った。実施例４および６に記載されるように実行された発酵のためにリパーゼ処理なしで調製された液化トウモロコシマッシュのＦＦＡの％は、リパーゼ処理を伴う場合（実施例５）の８９％と比較して、それぞれ３１％および３４％であった。表１０に列挙される発酵の間、ＯＡ相中のＦＦＡの濃度は、熱により失活したリパーゼを含有するものを含む３つの発酵のいずれにおいても低下しなかった。実施例５（発酵前にリパーゼの熱による失活を伴う）にしたがって実行された発酵のＯＡ相中のＦＦＡの％は、液化トウモロコシマッシュをリパーゼで処理しなかった残りの２つの発酵（実施例４および６）についてのわずか３３％のＦＦＡと比較して、７０時間（実行終了（ＥＯＲ））の時点で９５％であった。結果を表１０に示す。
【０３９５】
【表１３】
2013535956.tif 000015
【０３９６】
実施例２７
液化の前の磨砕された全粒トウモロコシの実のリパーゼ処理
水道水（１３７７．６ｇ）を、２つの被覆された２Ｌの樹脂ケトルのそれぞれに加え、次に、７１１．９ｇの湿重量（６２５．８ｇの乾燥重量）の磨砕された全粒トウモロコシの実（ハンマーミルにおける１．０ｍｍのふるい）を、撹拌しながら各ケトルに加えた。各混合物を、３００ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、２Ｎの硫酸を用いてｐＨを５．８に調整した。各混合物に、１．００８ｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）−ＦＲＥＤ  Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有する２１．０ｇの水溶液を加えた。次に、１つの混合物に、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ溶液（２１ｍｇの全可溶性タンパク質、１０ｐｐｍのリパーゼ最終濃度）の１０．５ｍＬの水溶液を加え、第２の混合物に、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ溶液（２．１ｍｇの全可溶性タンパク質、１．０ｐｐｍのリパーゼ最終濃度）の１．０５ｍＬの水溶液を加えた。５５℃で１時間、２時間、４時間および６時間の時点で試料を各反応混合物から抜き取り、次に、混合物の温度を、６００ｒｐｍで撹拌しながら、ｐＨ５．８で８５℃まで上昇させ、混合物が最初に８５℃に達したときに試料を採取した。８５℃で１２０時間後、試料を採取し、混合物を５０℃に冷却し、得られた液化トウモロコシマッシュの最終的な試料を５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離機管に移し；全ての試料を−８０℃で冷凍貯蔵した。
【０３９７】
２つの別個の反応において、上述したように調製された、１０ｐｐｍのリパーゼで処理される液化トウモロコシマッシュの５０ｇの試料または１．０ｐｐｍのリパーゼで処理される液化トウモロコシマッシュの５５ｇの試料を、オレイルアルコール（ＯＡ）（３８ｇ）と、３０℃で２０時間混合し、次に、各反応混合物中の液化されたマッシュおよびＯＡを遠心分離によって分離し、参照文献１によって記載される方法にしたがって、各相を、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析した。液化中の１０ｐｐｍのリパーゼの熱による失活を用いて調製された、液化されたマッシュ／ＯＡ混合物のＯＡ相中のＦＦＡの％は、液化中の１．０ｐｐｍのリパーゼの熱による失活を用いて調製された、液化されたマッシュ／ＯＡ混合物のＯＡ相中のわずか６２％のＦＦＡと比較して、２０時間で９８％であった。結果を表１１に示す。
【０３９８】
【表１４】
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【０３９９】
実施例２８
液化の前の磨砕された全粒トウモロコシの実の処理のためのリパーゼのスクリーニング
ｐＨ５．８で水道水（６７．９ｇ）および磨砕された全粒トウモロコシの実（３５．１ｇの湿重量、ハンマーミルを用いて１．０ｍｍのふるいで磨砕されたもの）を含有する７つの反応混合物を、栓をしたフラスコ中で５５℃で撹拌した。３ｍＬの試料（ｔ＝０時間）を、各フラスコから取り出し、試料をドライアイスですぐに凍結させ、次に、以下のリパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）：Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）２０００Ｔ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＡ  Ｌ、およびＰａｌａｔａｓｅ  ２００００Ｌのうちの１つの１ｍｇの全可溶性タンパク質（反応混合物中１０ｐｐｍの最終濃度）を含有する約０．５ｍＬの１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を、各フラスコのうちの１つに加え；７つ目のフラスコにはリパーゼを加えなかった。得られた混合物を、栓をしたフラスコ中で５５℃で撹拌し、３ｍＬの試料を、１時間、２時間、４時間および６時間の時点で各反応混合物から引き抜き、参照文献１によって記載される方法にしたがって、脂質の重量％（脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）および遊離脂肪酸の重量％（ＦＦＡ、脂肪酸メチルエステル、ＦＡＭＥとして誘導体化される）について分析するまで、ドライアイスですぐに凍結させ、遊離脂肪酸含量のパーセントを、脂質および遊離脂肪酸を合わせた全濃度に対して計算し、各試料について測定した。結果を表１２に示す。
【０４００】
【表１５】
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【０４０１】
実施例２９
オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵の前の磨砕された全粒トウモロコシの実のリパーゼ処理
３つの発酵を、実施例７、８、および１０に上述したように実行した。実施例７および１０に記載されるように実行された発酵では、リパーゼ（１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質）を、磨砕トウモロコシの懸濁液に加え、液化の前に５５℃で６時間加熱して、熱により失活したリパーゼを含有する液化トウモロコシマッシュを生成した。実施例８に記載される発酵のための液化トウモロコシマッシュを調製するのに使用される磨砕トウモロコシの懸濁液にはリパーゼを加えなかったが、この懸濁液に、液化の前に５５℃における同じ加熱工程を行った。実施例７および１０に記載されるように実行された発酵のために調製された、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のＦＦＡの％は、リパーゼ処理を行わない場合（実施例８）の４１％と比較して、それぞれ８３％および８６％であった。発酵の間、ＦＦＡの濃度は、熱により失活したリパーゼを含有するものを含む発酵のいずれにおいても低下しなかった。実施例７および１０（発酵の前にリパーゼの熱による失活を伴う）にしたがって実行された発酵のＯＡ相中のＦＦＡの％は、磨砕された全粒トウモロコシの実を液化の前にリパーゼで処理しなかった実施例８にしたがって実行された発酵についてのわずか４９％のＦＦＡと比較して、７０時間（実行終了（ＥＯＲ））の時点でそれぞれ９７％であった。結果を表１３に示す。
【０４０２】
【表１６】
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【０４０３】
実施例３０
トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）を用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のための磨砕された全粒トウモロコシの実または液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理
５つの発酵を、実施例９、１１、１２、１３、および１４に上述したように実行した。実施例９、１３、および１４に記載されるように実行された発酵では、リパーゼ（１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質）を液化後に加え、リパーゼの熱による失活は行わなかった。実施例９および１４に記載されるように実行された発酵には、接種の前に５ｇ／Ｌのエタノールが加えられた一方、実施例１３に記載されるように実行された発酵にはエタノールが加えられなかった。実施例１１および１２に記載されるように実行された発酵は、液化の前の磨砕トウモロコシの懸濁液への１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）全可溶性タンパク質の添加を用いて、液化中にリパーゼを熱により失活させた。実施例１１に記載されるように実行された発酵には、接種の前に５ｇ／Ｌのエタノールが加えられた一方、実施例１２に記載されるように実行された発酵には、エタノールが加えられなかった。活性リパーゼを含有する発酵のＣＯＦＡ相中に存在するイソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）の最終的な合計グラムは、不活性なリパーゼを含有する発酵のＣＯＦＡ相中に存在するｉ−ＢｕＯＨの最終的な合計グラムよりかなり多かった。活性リパーゼを含有する発酵ブロス中に存在するイソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）の最終的な合計グラムは、不活性なリパーゼを含有する発酵ブロス（水相）中に存在するｉ−ＢｕＯＨ（ＦＡＢＥとして存在するｉ−ＢｕＯＨを含む）の最終的な合計グラムより若干少なく、それによって、ｉ−ＢｕＯＨ（遊離ｉ−ＢｕＯＨおよびＣＯＦＡのイソブチルエステル（ＦＡＢＥ）の組合せとして）の全体の生成が、熱により失活したリパーゼの存在下で得られるものと比較して、活性リパーゼの存在下でかなり多かった。結果を表１４および１５に示す。
【０４０４】
【表１７】
2013535956.tif 000019
【０４０５】
【表１８】
2013535956.tif 000020
【０４０６】
実施例３１
イソブタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のホスホリパーゼ触媒反応によるイソ−ブチルＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．３）、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）、ホスホリパーゼ（ホスホリパーゼＡ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｌ３２９５−２５０）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表１６）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）およびトウモロコシ油脂肪酸のイソブチルエステル（ｉ−ＢｕＯ−ＣＯＦＡ）（表１７）について分析した。
【０４０７】
【表１９】
2013535956.tif 000021
【０４０８】
【表２０】
2013535956.tif 000022
【０４０９】
実施例３２
リパーゼ触媒反応に対する水性／ＣＯＦＡ比率に対するイソブチル−ＣＯＦＡエステル濃度の依存度
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．２）、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸（表１８）を含有する反応混合物を、３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）およびトウモロコシ油脂肪酸のイソブチルエステル（ｉ−ＢｕＯ−ＣＯＦＡ）（表１９）について分析した。
【０４１０】
【表２１】
2013535956.tif 000023
【０４１１】
【表２２】
2013535956.tif 000024
【０４１２】
実施例３３
リパーゼ触媒反応におけるエステル化アルコールに対するブチル−ＣＯＦＡエステル濃度の依存度
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．２）、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）またはｎ−ブタノール、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸（表２０）を含有する反応混合物を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）またはｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）およびトウモロコシ油脂肪酸のイソブチル−またはブチルエステル（ＢｕＯ−ＣＯＦＡ）（表２１）について分析した。
【０４１３】
【表２３】
2013535956.tif 000025
【０４１４】
【表２４】
2013535956.tif 000026
【０４１５】
実施例３４
イソブタノールおよびオレイン酸のリパーゼ触媒反応によるオレイン酸イソ−ブチルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．２）、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）、リパーゼ（０ｐｐｍまたは１０ｐｐｍのＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）およびオレイン酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）（表２２）を含有する反応混合物を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）およびオレイン酸イソ−ブチル（ｉ−ＢｕＯ−オレエート）（表２３）について分析した。
【０４１６】
【表２５】
2013535956.tif 000027
【０４１７】
【表２６】
2013535956.tif 000028
【０４１８】
実施例３５
イソブタノールおよびオレイン酸のリパーゼ触媒反応によるオレイン酸イソ−ブチルの生成の比較
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ、０．２０Ｍ、ｐＨ５．２）、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）、オレイン酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、ならびにＮｏｖｏｚｙｍｅｓ製の、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＡ  Ｌ、Ｐａｌａｔａｓｅ（登録商標）に由来するリパーゼ（１０ｐｐｍ）、あるいはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製の、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ブタ膵臓、カンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するリパーゼ（１０ｐｐｍ）（表２４）を含有する反応混合物を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）およびオレイン酸イソ−ブチル（ｉ−ＢｕＯ−オレエート）（表２５）について分析した。
【０４１９】
【表２７】
2013535956.tif 000029
【０４２０】
【表２８】
2013535956.tif 000030
【０４２１】
エタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応によるエチル−ＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．５）、エタノール、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００ＬまたはＬｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表２６）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から撹拌しながら抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、エタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸のエチルエステル（ＥｔＯ−ＣＯＦＡ）（表２７）について分析した。
【０４２２】
【表２９】
2013535956.tif 000031
【０４２３】
【表３０】
2013535956.tif 000032
【０４２４】
実施例３７
酵母の発酵の際のエタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応によるエチル−ＣＯＦＡエステルの生成
野生型酵母株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄを、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（６．７ｇ／Ｌ）、デキストロース（２５ｇ／Ｌ）、およびＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５で０．１Ｍ）を含有する培地中で一晩繁殖させた。６００ｎｍで得られる光学密度が０．１になるように、一晩培養物を新鮮な培地に希釈した。希釈された培地を、フラスコ当たり２５ｍＬずつ、６つの２５０ｍＬの密閉キャップ振とうフラスコ中に等分した。培地のうちの４つに、培地中の最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように２種のリパーゼ酵素ストック溶液（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  ＬまたはＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌの１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のｍＬ当たり２ｍｇのタンパク質）のいずれかを補充した。トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）を、フラスコの３つの水性培地（酵素なし、ＣＡＬＢ  Ｌ、またはＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ）に１：１の体積比で加えた。１つのフラスコは補充物を有さなかった。培地を、３０℃で温度制御された振とう培養器で、２５０ｒｐｍの振とう速度で２３時間増殖させた。細胞質量測定用の試料を、１５ｍＬの円錐底管中で相分離させた。６００ｎｍにおける試料の光学密度を、生理食塩水中での２０倍の希釈で測定した。クロマトグラフ分析用の試料（５ｍＬの水性または１０ｍＬの培地／ＣＯＦＡエマルジョン）を、１５ｍＬの円錐底管中のＴＸ−４００スイングバケットローターにおいて４０００ｒｐｍで５分間、直ぐに遠心分離した。水性試料については、０．２２μｍのスピンフィルターを分析の前に使用した。水性試料を、５０℃で０．０１Ｍの硫酸移動相および１分当たり０．５ｍＬの流量を用いて、ＳＨ−Ｇガードカラムを備えたＳｈｏｄｅｘ  ＳＨ１０１１カラムにおいて分析した。糖類およびアルコールの検出は、屈折率および２１０ｎｍの吸収によるものであり、標準曲線を用いて定量化を行った。試料を、水性培地（ＣＯＦＡの添加なし）または培地／ＣＯＦＡエマルジョンから取り、ＣＯＦＡのエチルエステルについての前の実施例に記載されるように分析した。結果を表２８および２９に示す。
【０４２５】
【表３１】
2013535956.tif 000033
【０４２６】
【表３２】
2013535956.tif 000034
【０４２７】
実施例３８
メタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応によるメチル−ＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．５）、メタノール、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、およびカンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表３０）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から撹拌しながら抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、エタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸のエチルエステル（ＥｔＯ−ＣＯＦＡ）（表３１）について分析した。
【０４２８】
【表３３】
2013535956.tif 000035
【０４２９】
【表３４】
2013535956.tif 000036
【０４３０】
実施例３９
１−プロパノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応による１−プロピル−ＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．５）、１−プロパノール、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、およびカンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表３２）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から撹拌しながら抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、１−プロパノールおよびトウモロコシ油脂肪酸の１−プロピルエステル（ＰｒＯ−ＣＯＦＡ）（表３３）について分析した。
【０４３１】
【表３５】
2013535956.tif 000037
【０４３２】
【表３６】
2013535956.tif 000038
【０４３３】
実施例４０
１−ペンタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応による１−ペンチル−ＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．５）、１−ペンタノール、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、およびカンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表３４）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から撹拌しながら抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、１−ペンタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸の１−ペンチルエステル（ＰｅｎＯ−ＣＯＦＡ）（表３５）について分析した。
【０４３４】
【表３７】
2013535956.tif 000039
【０４３５】
【表３８】
2013535956.tif 000040
【０４３６】
実施例４１
２−メチル−１−ブタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応による２−メチル−１−ブチル−ＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．５）、２−メチル−１−ブタノール、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、およびカンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表３６）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から撹拌しながら抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、２−メチル−１−ブタノールおよびトウモロコシ油脂肪酸の２−メチル−１−ブチルエステル（ＭｅＢＯ−ＣＯＦＡ）（表３７）について分析した。
【０４３７】
【表３９】
2013535956.tif 000041
【０４３８】
【表４０】
2013535956.tif 000042
【０４３９】
実施例４２
イソプロパノールおよびトウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）のリパーゼ触媒反応によるイソプロピル−ＣＯＦＡエステルの生成
水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．５）、イソプロパノール（２−プロパノール）、リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、およびカンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびトウモロコシ油から調製されるトウモロコシ油脂肪酸を含有する反応混合物（表３８）を３０℃で撹拌し、試料を所定の時点で各反応混合物から撹拌しながら抜き取り、すぐに遠心分離し、水層と有機層とを分離し、イソプロパノールおよびトウモロコシ油脂肪酸のイソプロピルエステル（ｉ−ＰｒＯ−ＣＯＦＡ）（表３９）について分析した。
【０４４０】
【表４１】
2013535956.tif 000043
【０４４１】
【表４２】
2013535956.tif 000044
【０４４２】
実施例４３
水と抽出剤との間のイソブタノールのための分配係数の比較
イソブタノール（３０ｇ／Ｌ）の水溶液を、トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）、またはオレイン酸またはトウモロコシ油トリグリセリドと混合し、それらの測定された分配係数を、オレイルアルコールについて測定された分配係数と比較して表中で報告した。結果を表４０に示す。
【０４４３】
【表４３】
2013535956.tif 000045
【０４４４】
実施例４４
トウモロコシ油脂肪酸の生成
機械的撹拌器、熱電対、加熱マントル、凝縮器および窒素ティー（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｔｅｅ）を備えた５リットル（５Ｌ）の丸底フラスコに、７５０ｇの粗トウモロコシ油（非食品グレード、エタノール発酵設備から回収される）、２１１２ｇの水および２８５ｇの５０％の水酸化ナトリウム溶液を投入した。混合物を９０℃まで加熱し、２時間保持し、その間に、混合物は、１つの高粘度の、エマルジョン状の単相になった。この時間の終了時に、ＴＬＣは、混合物中に残っているトウモロコシ油がないことを示す。次に、混合物を７４℃に冷却し、９００ｇの２５％の硫酸を加えて、混合物を酸性化した。次に、混合物を５０℃に冷却し、水層を排出した。油層を、１５００ｍＬの４０℃の水で２回洗浄し、次に１リットルの飽和塩水で１回洗浄した。それを硫酸マグネシウム上で乾燥させ、セライトを通してろ過した。収量は６１０ｇの透明の赤色の油であった。ＡＯＣＳ方法Ｃａ  ５ａ−４０による遊離脂肪酸の滴定により、オレイン酸として表される９５％の脂肪酸含量が示される。１０４ｍｇを１ｍＬの乾燥ピリジン中の１００ｕＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドと反応させることによって、試料をシラン処理した。シラン処理された生成物のガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）は、１６：０、１８：２、１８：１、１８：０、および２０：０の酸のＴＭＳ誘導体の存在を示す。
【０４４５】
実施例４５
ＦＡＢＥの化学合成
３Ｌのフラスコは、機械的撹拌器、熱電対、窒素入口、加熱マントルおよび凝縮器を備えていた。フラスコに、ＣＯＦＡ（５９５ｇ）（実施例４４のように調製される）、イソブタノール（５９５ｇ）、および硫酸（１２ｇ）を投入した。混合物を１．５時間還流させ、その時間で、凝縮器を取り外し、スチルヘッドと取り替えた。蒸留物を、９０℃の初期ヘッド温度および１０５℃の最終ヘッド温度で３時間にわたって収集した。次に、混合物を室温に冷まし、５００ｍＬの脱イオン水を加えた。層を分離し、有機層を５００ｍＬの脱イオン水で５回洗浄した。次に、それを５００ｍＬの１０％の塩化カルシウム溶液で１回洗浄した後、５００ｍＬの脱イオン水で６回洗浄した。次に、油を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、セライト床を通してろ過したところ、６０１ｇの透明の赤色の油が得られた。ＧＣ分析は、０．３６重量％のイソブタノールの存在を示す。ＧＣ／ＭＳ分析は、パルミチン酸イソブチル、ステアリン酸イソブチル、オレイン酸イソブチル、リノール酸イソブチル、およびリノレン酸イソブチルの存在を示す。
【０４４６】
実施例４６
無機酸触媒を用いたブタノールの回収
機械的撹拌ならびにスチルヘッドおよび窒素入口を上に備えたラシヒリングが装着された１２インチカラムを備えた１リットルの丸底フラスコを使用した。フラスコに、実施例４５のように合成された２５４ｇのＦＡＢＥ、２５５ｇのＣＯＦＡ、１００ｍＬの水、および５ｇの硫酸を投入し、９３℃のポット温度まで加熱した。ヘッド温度は８９．７℃で平衡化した。第１の留分を、８９〜９４℃のヘッド温度を維持する還流比で収集した。
【０４４７】
反応物を冷却し、室温で３日間静置させた。ポットのＧＣ分析は、ポット中の合計１ｇのイソブタノールを示す。蒸留を再開し、３つ以上の留分を、それぞれ２５ｍＬずつ、収集した。留分＃２を収集した後、１００ｍＬの水をポットに加えた。４つの留分を収集し、分析し、結果を表４１に示す。
【０４４８】
ＧＣ分析を、３０ｍのＦＦＡＰカラムを用いたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣを用いて行った。試料をイソプロパノールに溶解させ、１−ペンタノールを、内部標準として加えた。イソブタノール、パルミチン酸イソブチル、ステアリン酸イソブチル、オレイン酸イソブチル、リノール酸イソブチル、リノレン酸イソブチル、アラキドン酸イソブチル、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸についての標準曲線を作成した。ＦＡＢＥ含量をブチルエステルの合計として報告し、ＣＯＦＡ含量を脂肪酸の合計として報告した。
【０４４９】
【表４４】
2013535956.tif 000046
【０４５０】
実施例４７
有機酸触媒を用いたブタノールの回収
マグネチックスターラー、熱電対、滴下漏斗およびスチルヘッドを備えた１リットルの三つ口丸底フラスコを使用した。フラスコに、実施例４５のように合成された１００ｇのＦＡＢＥ、１００ｇのＣＯＦＡ、５ｇのｐ−トルエンスルホン酸、および２５ｍＬの水を投入した。初期ポットのイソブタノール分析は、１．１ｇのイソブタノールが存在する（ＦＡＢＥ中の汚染物質）ことを示す。ポットを１２５℃まで加熱した。ポットが１１６℃に達したとき、ヘッド温度は９６℃であり、１２５ｍＬの水を２．５時間にわたって加えた。水を加えた時間にわたって６つの留分を収集し、それらを、実施例４６のようにＧＣによって分析した。結果を表４２に示す。
【０４５１】
【表４５】
2013535956.tif 000047
【０４５２】
残りのスチルポットのブタノール分析は、０．９ｇの遊離イソブタノールが存在することを示す。分析される初期のＣＯＦＡ：ＦＡＢＥ混合物は、４５重量％のＦＡＢＥであった。分析される最終的なポットは、３２重量％のＦＡＢＥであった。
【０４５３】
実施例４８
高温における水によるＦＡＢＥの加水分解
１リットルのオートクレーブに、実施例４５のように合成されたＦＡＢＥ、３００ｍＬおよび３００ｍＬの水を投入した。オートクレーブを密閉し、窒素でパージした。撹拌を開始し、次に、４５分間にわたって２５０℃まで加熱し、温度に達した後、試料を１時間ごとに取り出した。試料を、実施例４６のようにＧＣによって分析した。油相試料は、表４３に示される時間に応じた組成を示した。
【０４５４】
【表４６】
2013535956.tif 000048
【０４５５】
実施例４９
高温における希酸によるＦＡＢＥの加水分解
１リットルのオートクレーブに、実施例４５のように合成されたＦＡＢＥと、ＣＯＦＡとの４５０ｇの７５／２５混合物および１５０ｇの２％の硫酸を投入した。オートクレーブを密閉し、窒素でパージした。撹拌を開始し、次に、それを４５分間にわたって２２５℃まで加熱し、温度に達した後、試料を１時間ごとに取り出した。試料を、実施例４６のようにＧＣによって分析した。油相試料は、表４４に示される時間に応じた組成を示した。
【０４５６】
【表４７】
2013535956.tif 000049
【０４５７】
実施例５０
１００℃における溶媒中の硫酸によるＦＡＢＥの加水分解
実施例４５のように合成された５ｇのＦＡＢＥ、５ｇの２５％の硫酸、および６０ｇのジエチレングリコールジメチルエーテルの溶液を調製した。１０ｇの溶液を、５つのバイアルのそれぞれに加え、次にそれを密閉した。バイアルの全てを１００℃まで加熱し、１つのバイアルを加熱器から取り出し、１時間ごとに分析した。得られた組成物を、ＧＣ（実施例４６に記載されるように）によって測定し、表４５に報告した。
【０４５８】
【表４８】
2013535956.tif 000050
【０４５９】
実施例５１
反応蒸留によるＦＡＢＥの加水分解
１２リットルのフラスコは、原料入口およびスチルヘッドを上に備えた絶縁された２インチ×３０インチのカラムを備えていた。カラムに、１リットルのＰｒｏ−ｐａｋ（登録商標）（３１６  ＳＳ  ０．１６インチ）蒸留器充填材（ｓｔｉｌｌ  ｐａｃｋｉｎｇ）および５００ｇのＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）３６固体酸触媒（Ｄｏｗ）をランダムに充填した。フラスコに、６リットルの水を投入し、沸騰させた。熱を、約１．８ｍＬ／分の水蒸留速度を有するように制御した。実施例４５に記載される方法どおりに合成されたＦＡＢＥを、２ｇ／分の速度でカラムの上部に加えた。合計６０分間、供給し続けた。さらに３０分間、蒸留し続けた。合計１９４ｇの蒸留物を収集したところ、２．１ｇのイソブタノールを含有していた。供給されたＦＡＢＥの量に基づいて、これは、ブタノールへのＦＡＢＥの９％の転化率を表す。
【０４６０】
実施例５２
逆流蒸気によるＦＡＢＥの加水分解
実施例５０に記載される装置を、蒸留塔の周囲に巻き付けられた熱テープ（ｈｅａｔ  
ｔａｐｅ）の追加によって変更した。塔の上半分の温度を１１５℃に調整し、塔の下半分の温度を１０４℃に調整した。ポットを沸騰させ、ポットの熱を、水が１．５〜２ｍＬ／分の速度で蒸留するまで調整した。蒸留を続けながら、実施例４５に記載される方法どおりに合成されたＦＡＢＥ（３４６ｇ）を、３時間かけて充填カラムの上部に供給した。供給期間の後、蒸留をさらに９０分間続けた。合計４８６ｇの蒸留物を収集したところ、３０．１ｇのイソブタノールを含有していた。これは、３９％の、イソブタノールへのＦＡＢＥの転化率を表す。
【０４６１】
実施例５３
不水溶性有機酸によって触媒される加水分解
油浴、機械的撹拌器、窒素入口、表面下（ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ）水入口、およびスチルヘッドを備えた１リットルの三つ口丸底フラスコに、１５０ｇのＦＡＢＥ、５０ｇの水、および５ｇのドデシルベンゼンスルホン酸を投入した。油浴を９５〜１００℃まで加熱し、ゆっくりとした窒素掃引を開始した。蒸留物留分を、合計５時間にわたって３０分ごとに収集した。３時間後、水を、１５ｍＬ／時の速度でスチルポットに供給した。蒸留物留分を、実施例４６に記載されるＧＣ方法によってイソブタノール含量について分析し、結果を表４６に示す。ＦＡＢＥに含まれるイソブタノールの約４４％を５時間にわたって収集した。
【０４６２】
【表４９】
2013535956.tif 000051
【０４６３】
実施例５４
固体酸触媒によって触媒される加水分解
油浴、機械的撹拌器、表面下窒素入口、表面下水入口、およびスチルヘッドを備えた１リットルの三つ口丸底フラスコに、１５０ｇのＦＡＢＥおよび５０ｇの乾燥Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５固体酸触媒を投入した。フラスコを油浴によって１１０℃まで加熱し、水を１５ｍＬ／時の速度でシリンジポンプを介して加えた。蒸留留分を、合計５時間にわたって３０分ごとに収集した。留分を、実施例４６に記載されるＧＣ方法によってイソブタノール含量について分析し、結果を表４７に示す。ＦＡＢＥに含まれるイソブタノールの理論量の約４４％を５時間にわたって収集した。
【０４６４】
【表５０】
2013535956.tif 000052
【０４６５】
実施例５５
水溶性有機酸触媒によって触媒される加水分解
機械的撹拌器、表面下窒素入口、表面下水入口、およびスチルヘッドを備えた１リットルのフラスコに、２００ｇのＦＡＢＥおよび１０ｇのｐ−トルエンスルホン酸を投入した。フラスコを撹拌し、油浴によって１１０℃まで加熱し、その時間に、水を、シリンジポンプを介して２０ｍＬ／時の速度で加えた。蒸留留分を、合計３時間にわたって３０分ごとに収集した。留分を、実施例４６に記載されるＧＣ方法によってイソブタノール含量について分析し、結果を表４８に示す。ＦＡＢＥに含まれるイソブタノールの理論量の約３０％を５時間にわたって収集した。
【０４６６】
【表５１】
2013535956.tif 000053
【０４６７】
実施例５６
発酵からの溶媒相の加水分解
Ａ．溶媒相１
実施例１７に示される発酵からの溶媒相を、実施例４６に示されるＧＣ方法によって分析し、結果を表４９に示す。分析は、ＦＡＥＥと一致する保持時間を有する少量の材料とともに主にＦＡＢＥおよび脂肪酸を示す。ブチルエステルおよび酸のみの分析は、６２％のＦＡＢＥおよび３９％の脂肪酸の比率を示す。
【０４６８】
溶媒相（１．２５リットル、１０９０ｇ）および１．２５リットルの水を１ガロンのオートクレーブに投入した。オートクレーブを密閉し、２５０℃まで加熱し、その温度で４時間保持した。次に、オートクレーブを冷却し、開放し、エマルジョンを得た。混合物を、セライト床を通してろ過し、層を分離した。有機層を、１リットルの水で３回洗浄した。次に、試料を５０℃まで加熱し、６時間、窒素でパージした。ＧＣ分析は、ｉ−ＢｕＯＨがないことおよび３３％のＦＡＢＥおよび６７％の脂肪酸の比率を示す。琥珀色の油（９９３．９ｇ）が得られた。発酵の実施例１７からの元の溶媒相および加水分解後の溶媒相の詳細な組成分析を表５０に示す。
【０４６９】
Ｂ．溶媒相２
実施例１８に示される発酵からの溶媒相を、実施例４６に示されるＧＣ方法によって分析し、結果を表４９に示す。分析は、ＦＡＥＥと一致する保持時間を有する少量の材料とともに主にＦＡＢＥおよび脂肪酸を示す。ブチルエステルおよび酸のみの分析は、４５％のＦＡＢＥおよび５５％の脂肪酸の比率を示す。
【０４７０】
溶媒（１．２５リットル、１１００ｇ）および１．２５リットルの水を、１ガロンのオートクレーブに投入した。オートクレーブを密閉し、２５０℃まで加熱し、その温度で４時間保持した。次に、オートクレーブを冷却し、開放し、エマルジョンを得た。混合物を、セライト床を通してろ過し、層を分離した。有機層を、１リットルの水で３回洗浄した。次に、試料を５０℃まで加熱し、６時間、窒素でパージした。ＧＣ分析は、ｉ−ＢｕＯＨがないことおよび２８％のＦＡＢＥおよび７２％の脂肪酸の比率を示す。琥珀色の油（７２０．５ｇ）が得られた。
【０４７１】
【表５２】
2013535956.tif 000054
【０４７２】
【表５３】
2013535956.tif 000055
【０４７３】
実施例５７
生成物アルコールの回収−リパーゼ触媒を用いた加水分解
ＦＡＢＥを、実施例４４に記載される方法どおりにトウモロコシ油脂肪酸から合成した。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（Ｎｏｖｏ  ４３５、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、アクリル樹脂上に固定化される）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢを、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）から購入した。ｔ−ＢｕＯＨ、アセトン、エタノール、メタノール、およびグリセロールを、全てＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析では、使用されるガスクロマトグラフは、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ＧＣクロマトグラムであり、ペンタデカン酸メチルを内部標準として使用した。
【０４７４】
Ａ．大気圧、４０℃
２ｍＬのＦＡＢＥと５ｍＬの水との混合物に、４０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、反応混合物を２０ｍＬのバイアルに入れ、回転式振とう器（３００ｒｐｍ）中で４０℃で培養した。反応混合物を、２４時間の反応中にＧＣを用いて分析して、表５１に示される以下の転化率％プロファイルを生成した：
【０４７５】
【表５４】
2013535956.tif 000056
【０４７６】
Ｂ．大気圧、４０℃、６５℃および８０℃、有機溶媒なし
この実施例のパートＡとともに、これらのデータは、温度とともに平衡がどのように変化するかを示す。
【０４７７】
１ｍＬのＦＡＢＥと２ｍＬの水との混合物に、２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、反応混合物を、６ｍＬの隔壁キャップ付き（ｓｅｐｔｕｍ−ｃａｐｐｅｄ）バイアル中で、４０℃で４５時間回転させた。ＧＣを用いて反応混合物を分析したところ、平衡状態でＦＡＢＥの１８．２％の転化率が示された。
【０４７８】
１ｇのＦＡＢＥと２ｍＬの水との混合物に、２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、反応混合物を、６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアル中で、６５℃で４２時間回転させた。ＧＣを用いて反応混合物を分析したところ、平衡状態でＦＡＢＥの１９．８％の転化率が示された。
【０４７９】
１ｇのＦＡＢＥと２ｍＬの水との混合物に、２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、反応混合物を、６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアル中で、８０℃で４２時間回転させた。ＧＣを用いて反応混合物を分析したところ、平衡状態でＦＡＢＥの２１．４％の転化率が示された。
【０４８０】
Ｃ．平衡状態に対する有機溶媒（ｔ−ＢｕＯＨ）の影響を示す実施例
０．２５ｍＬのＦＡＢＥ、０．７５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ、および０．１〜０．３ｍＬの水を含有する３種の反応混合物に、２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、混合物を、６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアル中で、それらが平衡状態に達した時点で、４０℃で一晩回転させておいた。反応の２４時間後にＧＣを用いて反応混合物を分析したところ、表５２に示される７７〜８２％のＦＡＢＥ転化率が得られた。同様の反応条件下でｔ−ＢｕＯＨを３−Ｍｅ−３−ペンタノールに置き換えると、７０〜８０％のＦＡＢＥ加水分解収率が得られた。
【０４８１】
【表５５】
2013535956.tif 000057
【０４８２】
Ｄ．溶媒としてのアセトン
０．２５ｍＬのＦＡＢＥ、０．７５ｍＬのアセトン、および０．１〜０．３ｍＬの水を含有する３種の反応混合物に、２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、混合物を、６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアル中で、それらが平衡状態に達した時点で、４０℃で一晩回転させておいた。反応の２４時間後にＧＣを用いて反応混合物を分析したところ、表５３に示される７１〜７８％のＦＡＢＥ転化率が示された。
【０４８３】
【表５６】
2013535956.tif 000058
【０４８４】
Ｅ．ＦＡＢＥ転化率に対する、加水分解中にｉ−ＢｕＯＨを除去することの影響を示す実施例−大気圧における窒素パージ
２５ｍＬの丸底フラスコに、２ｍＬのＦＡＢＥ、５ｍＬの水、および４０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を投入した。反応混合物を９５℃まで加熱し、反応中に形成されるｉ−ＢｕＯＨを、反応混合物に窒素をバブリングすることによって除去した。反応中に混合物から試料を取り、ＧＣを用いて有機相を分析した。表５４に示されるように６時間後に９４％の転化率が得られた：
【０４８５】
【表５７】
2013535956.tif 000059
【０４８６】
Ｆ．転化率に対する、加水分解中にｉ−ＢｕＯＨを除去することの影響を示す実施例−真空蒸留
２５ｍＬの丸底フラスコに、３ｍＬのＦＡＢＥ、７．５ｍＬの水、および６０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を投入した。フラスコを真空蒸留装置に取り付け、圧力を９１ｍｍ  Ｈｇに設定した。次に、反応混合物を７４℃まで加熱し、反応中に形成されるｉ−ＢｕＯＨを、蒸留により取り除いた。反応中に混合物から試料を取り、ＧＣを用いて有機相を分析した。表５５に示されるように、１０時間後に９１％の転化率が得られた。
【０４８７】
【表５８】
2013535956.tif 000060
【０４８８】
Ｇ．転化率に対する、加水分解中にｉ−ＢｕＯＨを除去することの影響を示す実施例−真空蒸留実施例−可変のＦＡＢＥ／ＣＯＦＡ出発比率：２３％のＦＡＢＥ：７７％のＣＯＦＡ  ｖ／ｖ
２５ｍＬの丸底フラスコに、０．６９ｍＬのＦＡＢＥ、２．３１ｍＬのＣＯＦＡ、７．５ｍＬの水、および６０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を投入した。フラスコを真空蒸留装置に取り付け、圧力を９１ｍｍ  Ｈｇに設定した。次に、反応混合物を７４℃まで加熱し、反応中に形成されるｉ−ＢｕＯＨを、蒸留により取り除いた。反応中に混合物から試料を取り、ＧＣを用いて有機相を分析した。表５６に示されるように、１０時間後に９８％の転化率が得られた。
【０４８９】
【表５９】
2013535956.tif 000061
【０４９０】
Ｈ．転化率に対する、加水分解中にｉ−ＢｕＯＨを除去することの影響を示す実施例−真空蒸留実施例−可変のＦＡＢＥ／ＣＯＦＡ出発比率：７０％のＦＡＢＥ：３０％のＣＯＦＡ  ｖ／ｖ
２５ｍＬの丸底フラスコに、２．１ｍＬのＦＡＢＥ、０．９ｍＬのＣＯＦＡ、７．５ｍＬの水、および６０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を投入した。フラスコを真空蒸留装置に取り付け、圧力を９１ｍｍ  Ｈｇに設定した。次に、反応混合物を７４℃まで加熱し、反応中に形成されるｉ−ＢｕＯＨを、蒸留により取り除いた。反応中に混合物から試料を取り、ＧＣを用いて有機相を分析した。表５７に示されるように、１０時間後に９６％の転化率が得られた：
【０４９１】
【表６０】
2013535956.tif 000062
【０４９２】
Ｉ．真空蒸留条件下でのＦＡＢＥ加水分解の際の遊離Ｃａｌ  Ｂ酵素を示す実施例
２つの丸底フラスコに、３ｍＬ（２．７ｇ）のＦＡＢＥおよび７．５ｍＬのＨ２Ｏをそれぞれ投入した。一方の混合物に５．９ｍｇのカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢを加え、他方に０．５９ｍｇの酵素を加えた。反応フラスコを別々に蒸留装置に連結し、９１ｍｍ  Ｈｇの圧力にかけた。反応混合物を６５〜６８℃まで加熱した。試料を１０時間かけて反応混合物から取り、ガスクロマトグラフィーを用いて分析した。最終的なＦＡＢＥ転化率はそれぞれ９６および７８％であった。実験は、酵素濃度の量が１０分の１に減少すると、速度および転化率がそれぞれ３分の１におよび１８％だけ低下することを示す。結果を表５８に示す。
【０４９３】
【表６１】
2013535956.tif 000063
【０４９４】
実施例５８
生成物アルコールの回収−エステル交換
ＦＡＢＥを、実施例４４に記載される方法どおりにトウモロコシ油脂肪酸から合成し；Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、アクリル樹脂上に固定化される）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢを、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）から購入した。ｔ−ＢｕＯＨ、アセトン、エタノール、メタノール、およびグリセロールを、全てＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。ＧＣ分析では、使用されるガスクロマトグラフは、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ＧＣクロマトグラムであり、ペンタデカン酸メチルを内部標準として使用した。
【０４９５】
Ａ．リパーゼの試験−ＦＡＢＥからＦＡＭＥ
使用される試薬は、ｔ−ＢｕＯＨ（Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＭｅＯＨ（Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＰＳ３０（バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｉｎｃ，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）；Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｔ（サーモマイセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、シリカ上に固定化される、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）；Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ（サーモマイセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）；Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＴＬＩＭ（固定化されたサーモマイセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）；Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）２０００Ｔ（リパーゼの固定化された混合物；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）；ＮＺＬ−１０３−ＬＹＯ（リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｉ）に由来するリパーゼ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）であった。
【０４９６】
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＦＡＢＥ（１．４８ｍｍｏｌ）、４００μＬのｔ−ＢｕＯＨ、６０μＬのＭｅＯＨ（１．４８ｍｍｏｌ）、３μＬの水、および２．５ｍｇのリパーゼ（表５７を参照）を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、９〜５６％の転化率が示された。結果を表５９に示す。
【０４９７】
【表６２】
2013535956.tif 000064
【０４９８】
Ｂ．ＦＡＢＥからＦＡＭＥへの形質転換−メタノールの量の最適化
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＦＡＢＥ（１．４８ｍｍｏｌ）、４００μＬのｔ−ＢｕＯＨ、６０〜２４０μＬのＭｅＯＨ（１．４８〜５．９２ｍｍｏｌ）、３μＬの水、および２．５ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、表６０に示されるように５３〜７３％の転化率が示された。
【０４９９】
【表６３】
2013535956.tif 000065
【０５００】
Ｃ．酵素の量の最適化−ＦＡＢＥからＦＡＭＥ
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＦＡＢＥ（１．４８ｍｍｏｌ）、４００μＬのｔ−ＢｕＯＨ、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍｍｏｌ）、および５〜２５ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、表６１に示されるように７６〜７９％の転化率が示された。
【０５０１】
【表６４】
2013535956.tif 000066
【０５０２】
Ｄ．溶媒（ｔ−ＢｕＯＨ）の量の最小化−ＦＡＢＥからＦＡＭＥ
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＦＡＢＥ（１．４８ｍｍｏｌ）、０〜３００μＬのｔ−ＢｕＯＨ、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍｍｏｌ）、および１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、表６２に示されるように３０〜８１％の転化率が示された。
【０５０３】
【表６５】
2013535956.tif 000067
【０５０４】
Ｅ．溶媒（３−Ｍｅ−３−ペンタノール）の量の最小化−ＦＡＢＥからＦＡＭＥ
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＦＡＢＥ（１．４８ｍｍｏｌ）、０〜３００μＬの３−Ｍｅ−３−ペンタノール、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍｍｏｌ）、および１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、表６３に示されるように３０〜７８％の転化率が示された。
【０５０５】
【表６６】
2013535956.tif 000068
【０５０６】
Ｆ．溶媒を用いないＦＡＢＥからＦＡＭＥへの転化
ＦＡＢＥ（５００ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）とメタノール（０．１３μＬ、３．２５ｍｍｏｌ）との混合物に、４０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加え、反応混合物を４０℃で一晩撹拌した。次に、混合物をろ過し、ＧＣによって分析したところ、７６％の転化率が示された。
【０５０７】
Ｇ．酵素の再利用−ＦＡＢＥからＦＡＭＥ
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＦＡＢＥ（１．４８ｍｍｏｌ）、４００μＬのｔ−ＢｕＯＨ、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍｍｏｌ）、および１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。その後、反応混合物をろ過し、ＧＣを用いて転化率について分析し、固定化酵素を含有するろ過ケーキを、ＦＡＢＥからＦＡＭＥへの別の転化に使用した。このプロセスを１０回繰り返した（表６４）。実験は、一晩の反応で転化率を低下させずに最大１０回まで酵素を再利用することが可能であることを示す。
【０５０８】
【表６７】
2013535956.tif 000069
【０５０９】
Ｈ．ＦＡＢＥからＦＡＥＥへの転化
６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアルに、０．８ｍＬのＦＡＢＥ（２．０８ｍｍｏｌ）および０．２ｍＬのＥｔＯＨ（３．４３ｍｍｏｌ）を加えて、単相を形成した。酵素を加えないかまたは２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５をバイアルに加えた。次に、バイアルを、培養振とう器（３００ｒｐｍ）中２５℃および４０℃で１７時間培養し、その後、溶液を、ガスクロマトグラフィーによって分析して、表６５に示される含量およびＦＡＢＥからＦＡＥＥへの転化率パーセントを得た。
【０５１０】
【表６８】
2013535956.tif 000070
【０５１１】
実施例５９
ＦＡＢＥのグリセロール分解
６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアルに、０．７５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ、０．２５ｍＬのＦＡＢＥ、０．１ｍＬ（０．１２６ｇ）のグリセロール＋４μＬのＨ２Ｏ、酵素２０のｍｇをそれぞれ加えて、単相を形成した。反応物を、３００ｒｐｍにおける回転式振とう器中４０℃で、様々なリパーゼを用いて培養した。２０時間後、試料をガスクロマトグラフィーによって分析して、表６６に示される含量を得た。ＣＯＦＡおよびＦＡＢＥ含量の比較により、生成物が、ｉ−ＢｕＯＨおよびＣＯＦＡとアシルグリセロールとの混合物（モル基準で約６４％のアシルグリセロール／３６％のＣＯＦＡ）であることを示す。
【０５１２】
【表６９】
2013535956.tif 000071
【０５１３】
Ａ．水およびグリセロール／ＦＡＢＥに対する依存度
６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアルに、０．７５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ、０．２５ｍＬのＦＡＢＥ、０．１または０．２ｇのグリセロール＋Ａｍａｎｏ  ＰＳ−３０またはＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５のいずれかのそれぞれ２０ｍｇを加えて、単相を形成した。水は加えなかった。反応物を、３００ｒｐｍにおける回転式振とう器において４０℃で培養した。２０時間後、試料をガスクロマトグラフィーによって分析して、表６７に示される含量を得た。ＣＯＦＡおよびＦＡＢＥ含量の比較により、生成物がｉ−ＢｕＯＨおよび主にアシルグリセロール（大部分はモノグリセリド）であることが示される。前の実施例と比べて、アシルグリセロールの形態の生成物のパーセントは、加えられる水がない場合およびグリセロール／ＦＡＢＥの増加とともに増加する（１．６グリセロール／ＦＡＢＥ、モル／モルの場合、モル基準で約９１％のアシルグリセロール／９％のＣＯＦＡおよび３．２グリセロール／ＦＡＢＥ、モル／モルの場合、モル基準で約９５％のアシルグリセロール／５％のＣＯＦＡ）。加えられる水がないと、Ａｍａｎｏ  ＰＳ−３０の酵素活性が消失される。しかしながら、固定化されるアクリル樹脂中に水（約３％  ｗ／ｗ）を有するＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５には、まだ活性がある。
【０５１４】
【表７０】
2013535956.tif 000072
【０５１５】
Ｂ．酵素濃度に対する依存度
６ｍＬの隔壁キャップ付きバイアルに、０．７５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ、０．２５ｍＬのＦＡＢＥ、０．２ｇのグリセロール（グリセロール／ＦＡＢＥ３．２／１、モル／モル）＋２または２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（Ｎｏｖｏ  ４３５）を加えた。水は加えなかった。反応物を、３００ｒｐｍにおける回転式振とう器において４０℃で培養し、ガスクロマトグラフィーによって、反応を、時間の関数として追跡した。収率を表６８に示す。モル基準で反応したＦＡＢＥの約９７％がアシルグリセロール（大部分はモノグリセリド）に転化された。
【０５１６】
【表７１】
2013535956.tif 000073
【０５１７】
反応の速度は、酵素濃度に対して線形の関係にあり、２ｍｇおよび２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５のｔ１／２がそれぞれ２０８分間および２０分間である。しかしながら、反応は、２４時間後にＦＡＢＥの転化のほぼ同じ収率に達する。
【０５１８】
これらの最後の反応を、０．７５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨの代わりに０．７５ｍＬの３−メチル−３−ペンタノールを用いて繰り返した。２４時間後に得られるＦＡＢＥ加水分解の程度は、両方の溶媒について同じであった。３−メチル−３−ペンタノールの利点は、１２２℃の沸点で、ｉ−ＢｕＯＨが最初に純粋な形態（沸点１０８℃）で留去され得ることである。次に、３−メチル−３−ペンタノールが留去され、加水分解反応に再利用され、保持液アシルグリセロール、ＣＯＦＡ、およびグリセロール中に残って、ＦＡＢＥの生成に再度使用するために発酵タンクに再利用され得る。第３級アルコールは単独で溶媒として働き、ＣＡＬＢの存在下で脂肪酸アルキルエステルを形成するように脂肪酸と反応しないという利点を有する。
【０５１９】
Ｃ．有機共溶媒を用いない場合のＦＡＢＥのグリセロール分解（ＦＡＢＥからＣＯＦＡ＋アシルグリセロール）−グリセロール濃度に対する依存度
１ｇのＦＡＢＥを、２ｍＬの５０、７０、９０、および１００％（ｗ／ｗ）のグリセロールと混合し、２０ｍｇのＬｉｐｏｂｏｎｄ（Ｓｐｒｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｒｉｅｓｔｅ，Ｉｔａｌｙ）の存在下で６ｍＬの隔壁で密閉したバイアルに入れた。バイアルを６２℃で２４時間回転させた（ｔｕｍｂｌｅｄ  ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）。水相中のグリセロール濃度が上がるにつれて、アシルグリセロールの形態の生成物（表６９、大部分はモノグリセリド）のパーセントが上がる。しかしながら、ＦＡＢＥ転化の程度は、グリセロール濃度に対する依存度を示さない。
【０５２０】
【表７２】
2013535956.tif 000074
【０５２１】
実施例６０
ＣＯＦＡからＦＡＥＥおよびモノアシルグリセロールへの転化
以下の実施例は、ＣＯＦＡが、固定化酵素を用いた穏やかな条件で高収率で、ＥｔＯＨまたはグリセロールとともにエステル化され得ることを示す。
【０５２２】
Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、アクリル樹脂上に固定化される）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。アセトン、ｔ−ＢｕＯＨ、エタノール、メタノール、およびグリセロールを、全てＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。ＧＣ分析では、使用されるガスクロマトグラフは、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ＧＣクロマトグラムであり、ペンタデカン酸メチルを内部標準として使用した。
【０５２３】
Ａ．エタノールを用いたＣＯＦＡからＦＡＥＥ＋ｉ−ＢｕＯＨへの転化
トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ、０．２５ｇ）を、２．０ｍＬのＥｔＯＨに溶解させて単相を形成した。アクリル樹脂上に固定化された２０ｍｇのカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５）を加え（１．７ｍｇの酵素を含有する）、懸濁液を、隔壁キャップで密閉された６ｍＬのガラスバイアル中で、回転式振とう器（３００ｒｐｍ）において４０℃で２４時間培養した。反応を実際に完了させたところ、９８％のＣＯＦＡがＦＡＥＥ（脂肪酸エチルエステル）に転化された。２４時間後のＧＣ分析は、表７０に示されるように脂肪酸エチルエステルへのＣＯＦＡの９８％の転化率を示した。
【０５２４】
【表７３】
2013535956.tif 000075
【０５２５】
Ｂ．グリセロールを用いたＣＯＦＡからモノアシルグリセリド（ＭＡＧ）＋ｉ−ＢｕＯＨへの転化
トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ、０．２５ｇ）および０．３２５ｇのグリセロールを、２．０ｍＬのアセトンに溶解させた。成分のほとんどが溶解された大きい上相および小さい残りのグリセロール含有相があった。アクリル樹脂上に固定化された２０ｍｇのカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５）を加え（１．７ｍｇの酵素を含有する）、懸濁液を、隔壁キャップで密閉された６ｍＬのガラスバイアル中で、回転式振とう器（３００ｒｐｍ）において４０℃で２４時間培養した。上相のＧＣは、ＣＯＦＡの８７％が、アシルグリセリド（大部分がモノアシルグリセリドであると予想される）に転化されたことを示した。結果を表７１に示す。
【０５２６】
【表７４】
2013535956.tif 000076
【０５２７】
実施例６１
ＣＯＦＡからＦＡＭＥへの転化
以下の実施例は、ＣＯＦＡが、固定化されたリパーゼを用いた穏やかな条件で高収率で、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、およびグリセロールとともにエステル化され得ることを示す。
【０５２８】
Ａ．溶媒を用いない場合のＣＯＦＡからＦＡＭＥへの転化
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＣＯＦＡ（１．４８ｍｍｏｌ）、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍｍｏｌ）、および１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、９５％の転化率が示された。
【０５２９】
Ｂ．ＣＯＦＡからＦＡＭＥへの反応の経時的測定
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＣＯＦＡ（１．４８ｍｍｏｌ）、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍｍｏｌ）、および１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。試料を、培養器／振とう器中４０℃で培養し、反応の際の時点を取り、ＧＣを用いて分析した。結果を表７２に示す。
【０５３０】
【表７５】
2013535956.tif 000077
【０５３１】
Ｃ．ＣＯＦＡ→ＦＡＭＥ反応へのより多くのＭｅＯＨの添加
６ｍＬのバイアルに、５００ｍｇのＣＯＦＡ（１．４８ｍｍｏｌ）、１８０、２４０、３００、または１３２０μＬのＭｅＯＨ（４．４４、５．９２、７．４１、および１４．８２ｍｍｏｌ）、および１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を加えた。得られた混合物を培養器／振とう器に入れ、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、９６〜９７％の転化率が示された。結果を表７３に示す。
【０５３２】
【表７６】
2013535956.tif 000078
【０５３３】
実施例６２
この実施例は、蒸留廃液からの固体の除去ならびに脂肪酸、エステル、およびトリグリセリドを固体から回収するための脱溶媒器による抽出を示した。発酵中、固体を全蒸留廃液から分離し、脱溶媒器に供給し、脱溶媒器において固体を１．１トン／時の蒸気と接触させる。全蒸留廃液のウェットケーキ（抽出器原料）、溶媒、抽出器のミセラ、および抽出器の排出固体の流量は、表７４に示されるとおりである。表の値の単位は、ショートトン／時である。
【０５３４】
【表７７】
2013535956.tif 000079
【０５３５】
脱溶媒器を出る固体を、乾燥器に供給する。脱溶媒器を出る蒸気は、０．５５トン／時のヘキサンおよび１．１０２トン／時の水を含有する。この流れを凝縮し、デカンターに供給する。デカンターを出る水富化相は、約３６０ｐｐｍのヘキサンを含有する。この流れを蒸留塔に供給し、蒸留塔において、ヘキサンを水富化流から除去する。蒸留塔の上部を出るヘキサン富化流を凝縮し、デカンターに供給する。デカンターを出る有機物富化流を蒸留塔に供給する。蒸気（１１．０２トン／時）を、蒸留塔の塔底に供給する。この塔の塔頂および塔底生成物の組成を表７５に示す。表の値の単位は、トン／時である。
【０５３６】
【表７８】
2013535956.tif 000080
【０５３７】
実施例６３
固体の抽出
含水イソブタノールの調製
１００ｍＬの容量フラスコ中に、６５ｇの無水試薬グレードイソブタノール（Ａｌｄｒｉｃｈから供給される）を、１０ｇの蒸留水と組み合わせて、無色透明の均一な相が得られるまで振とうした。さらなる１０ｇの蒸留水を容量フラスコに加え、再度振とうしたところ、２つの粘性の無色透明の液体層が得られた。上層は、通常２０重量％の水分を含有する含水イソブタノールであると考えられ、底層は、主に、通常８重量％の溶解されたアルコールを含む水である。
【０５３８】
ふるい分けろ過および置換洗浄を用いた抽出
再利用される脂肪酸（実施例１９）を用いて発酵を完了した。得られる異種混合物を代表する１８５ｇの分量を取り出し、下側にわずかな減圧（水柱−２０インチ）を用いて、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）プラスチックろ過漏斗内に支持され、密閉された８０ＭＥＳＨふるい皿に５分間にわたって通した。ろ液は、９０．５ｇの赤褐色の油相と、分散した微粒子を含有するが粒子状物質の沈降はない５０．９ｇの濁った水相とに分離した。ふるい皿上にウェットケーキが残った。この未洗浄のウェットケーキの１．５ｇの試料を取り出し、空気乾燥させた。含水イソブタノール（２３ｇ）を、容量フラスコ内の上層から抜き取り、さらなる液滴が収集されなくなるまでふるい皿の下側に弱い減圧を保ちながら、５分間にわたってウェットケーキに通した。１８ｇの全ろ液質量は、少量の不混和性の底部の濁った水層および黄色の透明の含水イソブタノール層からなっていた。ウェットケーキをふるい皿から取り出し、３８．４ｇの全質量を取り出した。この洗浄されたウェットケーキ１．５ｇの試料を取り出し、空気乾燥させた。未洗浄の固体の乾燥試料を分析したところ、トリグリセリド基準で５３．３５重量％の全脂肪を含有することが分かり、洗浄された固体の乾燥試料を分析したところ、トリグリセリド基準で１５．９重量％の全脂肪を含有することが分かった。
【０５３９】
遠心分離および再スラリー洗浄を用いた抽出
再利用される脂肪酸（実施例１９）を用いて発酵を完了した。得られる異種混合物を代表する２２５ｇの分量を取り出し、１０，０００ｒｐｍで１０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６４Ｒ機械を用いて遠心分離した。合計で６７．２ｇになる透明の赤褐色の油相をデカントにより取り除いた。残りの材料を再度遠心分離し、９５．１ｇの濁った水性ろ液をデカントにより取り除いた。湿潤固体の１．５ｇの試料を取り出し、空気乾燥させ、５６．５ｇを回収し、４００ｍＬのビーカーに移した。容量フラスコ内の上層から抜き取られた含水イソブタノール（２０ｇ）をビーカーに加えて、湿潤固体を再パルプ化し、撹拌を５分間行った。３２ｇの遠心分離液とともにさらなる３２ｇの含水イソブタノールを加え、固体を、静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）有機層の下の水性懸濁液中で５分間撹拌した。次に、混合物を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、透明の黄色の含水イソブタノール層をデカントにより取り除き、洗浄された湿潤固体の１．５ｇの試料を単離し、乾燥させるために再度遠心分離した。未洗浄の湿潤固体の乾燥試料を分析したところ、トリグリセリド基準で２１．６重量％の全脂肪を含有することが分かり、洗浄された湿潤固体の乾燥試料を分析したところ、トリグリセリド基準で４．０４重量％の全脂肪を含有することが分かった。
【０５４０】
実施例６４
非溶解固体を除去することによるトウモロコシ油の除去
約１０００ｇの液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。以下のプロトコルを使用した：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２６重量％のトウモロコシ）、スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、２５℃に冷却した。使用されるトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ製の全粒イエローコーン（３３３５）であった。トウモロコシを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は約１１．７重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の総量は：２９４．５ｇの磨砕トウモロコシ（１１．７％の水分）、７０５．５ｇの水道水、および０．０５９ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。酵素を希釈するためにＨ２Ｏ（４．３ｇ）を加え、ｐＨを制御するために合計２．３ｇの２０％のＮａＯＨ溶液を加えた。約９５２ｇのマッシュを回収した。ケトルおよびＣＦボトルの壁へのマッシュの付着のための損失があったことに留意されたい。
【０５４１】
液化されたトウモロコシマッシュを、４０℃で３０分間、５０００ｒｐｍ（７２６０ｇ’ｓ）で遠心分離して、オリゴ糖の水溶液から非溶解固体を除去した。遠心分離によって固体を除去すると、水相の上部の別個の有機液体層としてフリートウモロコシ油も除去される。約１．５ｇのトウモロコシ油を、水相の上部に浮遊する有機層から回収した。液化されたマッシュを生成するのに使用される磨砕トウモロコシは、乾燥トウモロコシ基準で約３．５重量％のトウモロコシ油を含有していたことが、ヘキサン抽出によって分かった。これは、磨砕トウモロコシを含む、液化プロセスに供給される約９ｇのトウモロコシ油に相当する。
【０５４２】
約１ｇのトウモロコシ油を、水相の上部に浮遊する有機層から回収した。約６１７ｇの液化でんぷん溶液を回収したところ、約３３４ｇのウェットケーキが残った。ウェットケーキは、液化されたマッシュ中にあった非溶解固体の大部分を含有していた。液化でんぷん溶液は、約０．２重量％の非溶解固体を含有していた。ウェットケーキは、約２１重量％の非溶解固体を含有していた。ウェットケーキを１０００ｇの水道水で洗浄して、ケーキ中に残っているオリゴ糖を除去した。ケーキを水と混合して、スラリーを形成することによって、これを行った。次に、洗浄された固体を回収するために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じ条件下でスラリーを遠心分離した。遠心分離によって洗浄された固体を除去すると、水相の上部における別個の有機液体層としてのいくらかのさらなるフリートウモロコシ油も除去された。トウモロコシ油を、水相の上部に浮遊する有機層から回収した。
【０５４３】
湿潤固体を、毎回１０００ｇの水道水を用いてさらに２回洗浄して、液化でんぷんの実質的に全てを除去した。最終的な洗浄固体を、真空オーブン中で一晩、８０℃および約２０水銀柱インチの真空下で乾燥させた。乾燥固体中に残っている（おそらく胚芽中に残っている）トウモロコシ油の量を、ヘキサン抽出によって測定した。比較的乾燥した固体（約２重量％の水分）の３．６０ｇの試料が、０．２２ｇのトウモロコシ油を含有していたことが測定された。この結果は、乾燥固体のｇ当たり０．０６２４ｇのトウモロコシ油に相当する。これは、湿潤固体中に残留オリゴ糖がないことを意味する洗浄された固体の場合であった。液化されたトウモロコシマッシュを遠心分離して、フリートウモロコシ油の層およびオリゴ糖の水溶液をウェットケーキから分離した後、約２１重量％の非溶解固体を含有する約３３４ｇのウェットケーキが残っていたことが分かった。これは、約７０．１ｇの非溶解固体を含むウェットケーキに相当する。乾燥固体のｇ当たり０．０６２４ｇのトウモロコシ油において、ウェットケーキ中の固体は、約４．４ｇのトウモロコシ油を含有するはずである。
【０５４４】
実施例６５
脂質の分析
エステル交換によって、様々な脂肪酸含有化合物種を、脂肪酸メチルエステル（「ＦＡＭＥ」）に転化することによって、脂質の分析を行った。グリセリドおよびリン脂質を、メタノール中のナトリウムメトキシドを用いてエステル交換した。グリセリド、リン脂質、および遊離脂肪酸を、メタノール中の塩化アセチルを用いてエステル交換した。得られたＦＡＭＥを、トルエン／ヘキサン（２：３）中での希釈の後、３０−ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＯＭＥＧＡＷＡＸ（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０  ＧＣを用いたガスクロマトグラフィーによって分析した。オーブン温度を、５℃／分で１６０℃から２００℃まで、次に１０℃／分で２００℃から２５０℃（１０分間保持した）まで上昇させた。ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、公知のメチルエステル（ＭＥ）の保持時間と比較したときの、それらの保持時間によって特定し、ＦＡＭＥピーク面積を、公知の量の内部標準（Ｃ１５：０のトリグリセリド、試料によるエステル交換手順によって取られた）の面積と比較することによって定量化した。したがって、概算量（ｍｇ）の任意の脂肪酸ＦＡＭＥ（「ｍｇ  ＦＡＭＥ」）を、下式にしたがって計算する：（所定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピークの面積／１５：０のＦＡＭＥピークの面積）＊（内部標準Ｃ１５：０のＦＡＭＥのｍｇ）。次に、ＦＡＭＥの結果を、１．０５２の適切な分子量換算係数で除算することによって、対応する脂肪酸のｍｇに補正することができる。全ての内部標準および参照標準は、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．から入手される。
【０５４５】
メタノール中のナトリウムメトキシドを用いてエステル交換された試料から得られる脂肪酸の結果を、１．０４５の分子量換算係数を乗算することによって、対応するトリグリセリドレベルに換算する。トリグリセリドは、一般に、この実施例について調べられた試料中のグリセリドの約８０〜９０％を占め、残りはジグリセリドである。モノグリセリドおよびリン脂質含量は一般にごくわずかである。メタノール中の塩化アセチルを用いてエステル交換された試料について得られる全脂肪酸の結果を、ナトリウムメトキシド手順を用いて同じ試料について決定された脂肪酸を減算することによって、グリセリド含量について補正する。結果は、試料の遊離脂肪酸含量である。
【０５４６】
グリセリド含量（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質）の分布を、薄層クロマトグラフィーを用いて決定した。６：１のクロロホルム／メタノールに溶解される油の溶液を、シリカゲルで予め被覆されたガラスプレートの底部の近くに垂らした。次に、そのスポット（ｓｐｏｔ）を、７０：３０：１のヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸溶媒系を用いたプレート上でクロマトグラフにかける。次に、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質に対応する分離されたスポットを、ヨウ素蒸気でプレートを染色することによって検出する。次に、スポットをプレートから落とし、メタノール手順で塩化アセチルを用いてエステル交換し、ガスクロマトグラフィーによって分析する。全てのスポットの合計ピーク面積に対する各スポットの合計ピーク面積の比率が、様々なグリセリドの分布である。
【０５４７】
実施例６６
この実施例は、マッシュからの副生成物の回収を示す。トリカンター遠心分離機（Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｚ２３−４ボウル直径、２３０ｍｍ、長さ対直径の比率４：１）をこれらの条件で使用したことを除いて、実施例６４に記載される条件下でトウモロコシ油をマッシュから分離した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・差速：１０ｒｐｍ
・供給速度：３ガロン／分
・相分離機ディスク：１３８ｍｍ
・羽根車の設定：１４４ｍｍ。
【０５４８】
分離されたトウモロコシ油は、実施例６５に記載される方法および薄層クロマトグラフィーによって測定した際に、８１％のトリグリセリド、６％の遊離脂肪酸、４％のジグリセリド、および合計５％のリン脂質およびモノグリセリドを有していた。
【０５４９】
上記の条件下でマッシュから分離された固体は、乾燥時の重量損失によって測定した際に５８％の水分含量を有し、実施例６５に記載される方法によって測定した際に１．２％のトリグリセリドおよび０．２７％の遊離脂肪酸を有していた。
【０５５０】
表７８中の全蒸留廃液から分離された固体、蒸発器段階の間に抽出された油、副生成物抽出剤および凝縮蒸留可溶物（ＣＤＳ）の組成を、表７６に示される全蒸留廃液の組成を前提とし、表７７（トリカンター遠心分離機における分離）を前提として計算した。表７５の値を、Ａｓｐｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）モデル（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得た。このモデルは、トウモロコシ油がマッシュから抽出されていないことを前提としている。細胞、溶解固体、および懸濁固体の乾燥量基準でのタンパク質含量が、それぞれ約５０％、２２％、および３５．５％であることが推定される。副生成物抽出剤の組成は、乾燥量基準で７０．７％の脂肪酸および２９．３％の脂肪酸イソブチルエステルであることが推定される。
【０５５１】
【表７９】
2013535956.tif 000081
【０５５２】
【表８０】
2013535956.tif 000082
【０５５３】
【表８１】
2013535956.tif 000083
【０５５４】
本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０５５５】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図１】
2013535956.tif 000084
【図２】
2013535956.tif 000085
【図３】
2013535956.tif 000086
【図４】
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【図５】
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【図６】
2013535956.tif 000089
【図７】
2013535956.tif 000090
【図８】
2013535956.tif 000091
【配列表】
2013535956000001.app
【国際調査報告】
2013535956.tif 000092
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