(57)【要約】本開示は、抗体連結型免疫沈降剤（その抗体は、その抗体の非抗原結合領域によって沈降剤に連結されている）およびその抗体連結型免疫沈降剤を用いてサンプルから標的を単離する方法に関する。その方法は、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球とともにサンプルを含む混合物を、赤血球ルローを形成するのに十分かつ抗体と抗原とが結合可能であるのに十分な条件下で形成する工程を包含する。別の態様において、本開示は、ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤ならびにその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤を提供する。
2013546002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから標的を単離する方法であって、該方法は：
ａ）サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程であって、ここで、該抗体連結型免疫沈降剤は、
１）少なくとも１つの沈降剤および
２）抗体の非抗原結合領域によって該少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体
を含む、工程；
ｂ）ルローを形成するのに十分であり、かつ該抗体が該混合物中に存在する抗原に結合可能であるのに十分な条件下で該混合物をインキュベートする工程；ならびに
ｃ）該混合物から標的を回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ルローの前記赤血球上への前記少なくとも１つの沈降剤の吸着によって、該ルローが形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗体が、前記混合物の形成前に、前記少なくとも１つの沈降剤に連結されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、前記サンプル中の標的抗原または非標的抗原に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ルローネットワークを形成するのに十分な条件下で前記混合物をインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、全血、血漿、血液幹細胞単離物、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球、臍帯血、骨髄、骨髄穿刺液、バフィーコート層、白血球アフェレーシス単離物、プラスマフェレーシス単離物、細胞懸濁液、細胞培養培地、細胞混合物、細胞ホモジネート、膵臓単離物、臓器ホモジネート、食塩水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液、リン酸緩衝化食塩水、ウイルス培養培地、卵母細胞混合物、精子、配偶子混合物およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が、内因性赤血球、外来性赤血球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される赤血球を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記外来性赤血球が、同種の赤血球、自己の赤血球、異種の赤血球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的が、多細胞生物、単細胞生物、細胞、細胞内成分、細胞フラグメント、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様標的、膜結合粒子、脂質粒子、巨大分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸様巨大分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの沈降剤が、可溶性の沈降剤、部分的に可溶性の沈降剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの沈降剤が、不溶性の沈降剤を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの沈降剤が、ポリマーを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーが、生体高分子、合成ポリマー、改変された生体高分子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体高分子が、多糖、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多糖が、デンプン、デキストラン、セルロース、キチン、キサンタンガム、グリコサミノグリカンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、アルブミン、コラーゲン、フィブリノゲン、免疫グロブリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記合成ポリマーが、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジオキサノンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変された生体高分子が、加水分解されたコラーゲン−ゼラチン、ＦＩＣＯＬＬ、エチレンオキシド修飾デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記改変された生体高分子が、ヨウ化造影剤を含み、該ヨウ化造影剤は、ジアトリゾアート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノールおよびイオキサグレートからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記エチレンオキシド修飾デンプンが、ヒドロキシエチルデンプン、ペンタスターチおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が、抗体フラグメント、キメラ抗体、二機能性抗体および二重特異性抗体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体フラグメントが、抗原結合ドメイン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルが、血液を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液が、全血、血漿、血液幹細胞単離物、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球、臍帯血、骨髄、骨髄穿刺液およびバフィーコート層を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記インキュベートする工程が、約１０分間〜約１２０分間である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、約０℃〜約４５℃の温度で行われる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、約５．４〜約９．４のｐＨで行われる、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記混合物から標的を回収する工程が、該混合物から前記ルローを分離する工程を包含する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合物から標的を回収する工程が、該混合物から前記ルローネットワークを分離する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物から標的を回収する工程が、沈降、遠心分離、密度勾配遠心分離、磁場、電場、細胞溶解、化学的架橋、抽出、相転移、凍結融解の繰り返し、蒸発、煮沸、昇華、融解、結晶化、可塑化、濾過およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに該混合物を供する工程を包含する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的が、ポジティブセレクションまたはネガティブセレクションによって単離される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的が、多細胞生物、単細胞生物、細胞、細胞内成分、細胞フラグメント、ウイルス、ウイルス様標的、膜結合粒子、脂質粒子、巨大分子、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体連結型免疫沈降剤が、少なくとも２つの異なる抗原に指向する抗体を含み、該抗体は、非抗原結合領域によって該沈降剤に連結されている、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体連結型免疫沈降剤が、少なくとも２つの異なる沈降剤を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記混合物にブロッキング剤を添加する工程をさらに包含する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ブロッキング剤が、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎仔血清、免疫グロブリン、抗ＣＤ１６抗体、抗ヒトＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）、Ｆｃレセプター抗体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
サンプルから標的を単離する方法であって、該方法は：
ａ）サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程であって、ここで、該抗体連結型免疫沈降剤は、
１）ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤；および
２）抗体の非抗原結合領域によって該少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体
を含み、ここで、該抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＴＣＲγ／δ抗体、抗グリコホリンＡ抗体および抗ＧＰ１２０抗体からなる群より選択される、工程；
ｂ）ルローを形成するのに十分であり、かつ該抗体が該混合物中に存在する抗原に結合可能であるのに十分な条件下で該混合物をインキュベートする工程；ならびに
ｃ）該混合物から標的を回収する工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
少なくとも１つの沈降剤および該少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤であって、ここで、該少なくとも１つの抗体は、非抗原結合領域によって該少なくとも１つの沈降剤に連結されている、抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの沈降剤に連結された前記少なくとも１つの抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４０に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの抗体が、キメラ抗体、二機能性抗体、二重特異性抗体、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、インタクトな抗体および抗体フラグメントのうちの少なくとも１つを含む、請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４３】
前記抗体フラグメントが、抗原結合領域、抗体超可変領域、抗体パラトープ、抗体軽鎖、抗体重鎖、対形成した抗体重鎖および軽鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ならびにＦ（ａｂ’）のうちの少なくとも１つを含む、請求項４２に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの沈降剤に連結された前記少なくとも１つの抗体が、Ｆｃ領域、ヒンジ領域、軽鎖定常（ＣＬ）領域、重鎖（ＣＨ１）領域、軽鎖（ＣＬ）領域および重鎖（ＣＨ１）領域、重鎖（ＣＨ２）領域ならびに重鎖（ＣＨ３）領域によって該少なくとも１つの沈降剤に連結されている、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの沈降剤に連結された前記少なくとも１つの抗体が、該少なくとも１つの沈降剤に直接連結されている、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの沈降剤に連結された前記少なくとも１つの抗体が、該少なくとも１つの沈降剤に間接的に連結されている、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの沈降剤が、可溶性の沈降剤、部分的に可溶性の沈降剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの沈降剤が、不溶性の沈降剤を含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの沈降剤が、ポリマーを含む、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５０】
前記ポリマーが、生体高分子、合成ポリマー、改変された生体高分子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４９に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５１】
前記生体高分子が、多糖およびポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項５０に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５２】
前記生体高分子が、多糖を含む、請求項５０または５１に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５３】
前記多糖が、デンプン、デキストラン、セルロース、キチン、キサンタンガムおよびグリコサミノグリカンのうちの少なくとも１つを含む、請求項５１または５２に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５４】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項５３に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが、アルブミン、コラーゲン、フィブリノゲンおよび免疫グロブリンのうちの少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５６】
前記ポリマーが、合成ポリマーを含む、請求項５０に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５７】
前記合成ポリマーが、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリジオキサノンのうちの少なくとも１つを含む、請求項５０または５６に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５８】
前記改変された生体高分子が、加水分解されたコラーゲン−ゼラチン、ＦＩＣＯＬＬおよびエチレンオキシド修飾デンプンのうちの少なくとも１つを含む、請求項５０に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項５９】
前記改変された生体高分子が、ヨウ化造影剤を含み、該ヨウ化造影剤は、ジアトリゾアート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノールおよびイオキサグレートからなる群より選択される、請求項５０に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項６０】
前記エチレンオキシド修飾デンプンが、ヒドロキシエチルデンプンおよびペンタスターチのうちの少なくとも１つを含む、請求項５８に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項６１】
少なくとも２つの異なる抗原に指向する抗体を含む、請求項４０〜６０のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤であって、該少なくとも２つの異なる抗体は、非抗原結合領域によって該沈降剤に連結されている、抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項６２】
少なくとも２つの異なる抗原に指向する前記抗体が、非抗原結合領域によって少なくとも２つの異なる沈降剤に連結されている、請求項６１に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項６３】
少なくとも２つの異なる沈降剤を含む、請求項４０〜６２のいずれか１項に記載の抗体連結型免疫沈降剤。
【請求項６４】
ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤ならびに該少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤であって、該少なくとも１つの抗体は、非抗原結合領域によって該少なくとも１つの沈降剤に連結されており、該少なくとも１つの抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＴＣＲγ／δ抗体、抗グリコホリンＡ抗体および抗ＧＰ１２０抗体からなる群より選択される、抗体連結型免疫沈降剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１０年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／４２３，３９１号の利益を主張する。上記出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
開示の背景
開示の分野
本開示は、概して、標的（例えば、細胞および分子）を含む溶液からのその標的の単離に関する。より詳細には、本開示は、抗体連結型免疫沈降剤（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）（ＡＬＩＳＡ）を用いて溶液から標的を分離する新規方法に関する。さらに、本開示は、その抗体連結型免疫沈降剤自体に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
溶液から標的（例えば、細胞、分子など）を単離するための方法が多く存在する。標的（例えば、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、タンパク質および他の分子）は、とりわけ、抽出、沈殿、クロマトグラフィーおよび免疫親和性によって単離され得る。免疫吸着などの手法は、ビーズおよび磁性粒子などの基材に連結された抗標的抗体を使用する。次いで、そのビーズを回収し、結合していない成分を除去することによって、ビーズに結合した標的がサンプルから単離される。
【０００４】
例えば細胞などの標的を単離、濃縮および精製するための方法も多く存在する。細胞の分離は、多種多様な手法のセットを用いて、不必要な細胞から求められている細胞を選別するための十分に確立された複雑な技術である。最も古い細胞分離法の１つは、標準的な血液沈降である。重力にさらされた血液は、自然に、赤血球（ＲＢＣ）層、白血球（ＷＢＣ）を含むバフィーコート層および血漿層に沈降する。赤血球沈降速度（ＥＳＲ）と呼ばれるこの沈降の速度は、炎症の検査マーカーとして使用され得る。この沈降速度は、沈降剤の添加および／または遠心分離によって上昇し得る。赤血球の沈降は、血液成分を大まかにその密度に従って分離する非特異的なプロセスである。その方法は、ルローおよびルローネットワークへのＲＢＣ接着の可逆プロセスに依存し、目的の標的の抗体媒介性の分離を含まない（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００５】
白血球アフェレーシスは、細胞沈降のより複雑な方法である。この方法では、血液が、患者から回収され、連続的なプロセスにおいて沈降され、ＷＢＣ（バフィーコート）が除去されるが、血漿およびＲＢＣは、その患者に戻される。
【０００６】
遠心分離は、密度勾配と組み合わされることにより、不必要な成分から標的を分離し得る。密度勾配は、特定の密度の媒質（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥおよびＰｅｒｃｏｌｌ−スクロース）を用いて形成される。サンプルの成分は、遠心分離中に密度勾配を通過するその移動に基づいて分離する。例えば、１．０７７ｇ／ｍｌの密度の標準的なＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥは、リンパ球および単球を含む末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と、より高密度のＲＢＣおよび好中球とを区別する。標準的なＲＢＣ沈降と同様に、抗体媒介性の標的分離は存在しない。
【０００７】
フローサイトメトリーは、細胞分離のために用いられる別の方法である。フローサイトメトリーでは、細胞が、分離液に懸濁され、細胞表面マーカーに指向するフルオロフォアで標識される。フルオロフォアは、細胞内の標的も対象とし得る。例えば、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ（抗ＣＤ）抗体（例えば、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８または抗ＣＤ５６）などの抗体が、分離を行うためにフルオロフォアに結合体化され得る。標識された細胞および標識されていない細胞が、フローセルを通過し、そこでそれらの細胞は、その蛍光、サイズおよび粒度について調べられる。実際には、複数の異なるフルオロフォアが、異なるレーザーによって励起され得、同時に異なるチャネルによって観察され得る。次いで、細胞は、その特定の蛍光、サイズまたは粒度に基づいて、回収チューブに分かれるように指示され得る。フローサイトメトリーは、細胞解析および細胞分離にとって効果的な方法であるが、複雑かつ機器集約型である。
【０００８】
別の細胞分離法は、アフィニティカラムクロマトグラフィーを用いる。アフィニティカラムクロマトグラフィーは、例えば、ポリスチレンまたはアガロースなどの固相を必要とする。その固相は、例えば、ストレプトアビジンなどのアフィニティ物質と結合され得る。次いで、ビオチン化された抗ＣＤ抗体が、そのカラムに接着され得る。細胞懸濁液が、そのカラムを通過すると、アフィニティ支持体に接着している抗体は、その抗ＣＤ抗体の表面抗原を有する細胞に結合する。そのようなプロセスにおける使用に適した他のアフィニティ物質としては、例えば、グルタチオンと相互作用するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびニッケルまたはコバルトと対形成するヒスチジンが挙げられる。しかしながら、これらのアフィニティ物質は、細胞分離の手法のために頻繁に使用されていない。
【０００９】
別の細胞分離法は、磁性ビーズを用いる。磁性ビーズは、標的に指向する抗体に直接または間接的に結合され得る。その抗体に結合した磁性ビーズと相互作用する標的は、磁場を適用することによってその懸濁液から分離され得る。次いで、不必要な成分は、一連の洗浄工程によって除去されるが、標的は、磁性ビーズとの相互作用および磁場の適用によって保持される。
【００１０】
特許文献１では、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）を形成する、細胞表面マーカーに対する抗体を使用する分離方法が開示されている。ＴＡＣは、抗標的細胞抗体、抗デキストリン抗体、および抗標的細胞抗体を抗デキストリン抗体と連結する２つの架橋抗体から構成される。ＴＡＣは、デキストリンでコーティングされた磁性ビーズに標的細胞を結合させる。ＴＡＣに結合した磁性ビーズと相互作用している標的は、磁場を適用することによってその懸濁液から分離され得る。次いで、不必要な成分は、一連の洗浄工程によって除去されるが、標的は、磁性ビーズとのＴＡＣ媒介性の相互作用および磁場の適用によって保持される。
【００１１】
特許文献２では、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）を形成する、細胞表面マーカーに対する抗体を使用するが磁性粒子を使用しない分離方法が開示されている。この場合、ＴＡＣは、抗標的細胞抗体、抗赤血球抗体、ならびに標的細胞および赤血球のイムノロゼット（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｅｓ）を形成するのに十分な条件下で抗標的細胞抗体を抗赤血球抗体と連結する２つの架橋抗体から構成される。遠心分離によって、標的細胞は、ＴＡＣが介在するイムノロゼットを介してＲＢＣ層に凝集する。他の細胞は、バフィーコート層に残存する。このイムノロゼット形成（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）法では凝集剤が使用され得る；しかしながら、その凝集剤は、抗体に連結されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，１１７，９８５号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１３５，３３５号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ＭａｅｄａおよびＳｈｉｇａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８５）８４３：１２８〜１３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
細胞分離のこれらの方法の多くは、非常に効果的であるが、高価であり得、複数の複雑な工程を必要とし得、かつ／または機器集約型であり得る。したがって、サンプルから標的を分離するための、より費用効果および／または時間効果の高い代替の試薬および方法が必要とされている。本発明は、これらのニーズを満たし、さらに、関係する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
開示の要旨
本開示は、概して、抗体連結型免疫沈降剤（ＡＬＩＳＡ）およびその抗体連結型免疫沈降剤を用いて標的を単離する方法に関する。より詳細には、１つの態様において、本開示は、少なくとも１つの沈降剤およびその沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤に関し、ここで、その少なくとも１つの抗体は、非抗原結合領域によって沈降剤に連結されている。
【００１６】
別の態様において、本開示は、サンプルから標的を得る方法に関する。その方法は、サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程を包含し、ここで、その抗体連結型免疫沈降剤は、少なくとも１つの沈降剤およびその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含み、さらに、その抗体は、抗体の非抗原結合領域によってその少なくとも１つの沈降剤に連結されている。その混合物は、形成されると、ルローを形成するのに十分な条件下でインキュベートされ、次いで、標的が混合物から回収される。様々な態様において、そのルローは、ルローの赤血球上へのその少なくとも１つの沈降剤の吸着によって形成される。１つの特定の実施形態において、ルローの形成が生じると、ルロー含有混合物は、標的を回収するために、相分離される。
【００１７】
別の態様において、本開示は、ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤ならびにその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤に関し、ここで、その少なくとも１つの抗体は、非抗原結合領域によってその少なくとも１つの沈降剤に連結されており、その少なくとも１つの抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＴＣＲγ／δ抗体、抗グリコホリンＡ抗体および抗ＧＰ１２０抗体からなる群より選択される。
【００１８】
別の態様において、本開示は、サンプルから標的を単離する方法に関する。その方法は、サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程（ここで、その抗体連結型免疫沈降剤は、ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤；ならびに抗体の非抗原結合領域によってその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含み、ここで、その抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＴＣＲγ／δ抗体、抗グリコホリンＡ抗体および抗ＧＰ１２０抗体からなる群より選択される）；ルローを形成するのに十分かつその抗体が混合物中に存在する抗原に結合可能であるのに十分な条件下でその混合物をインキュベートする工程；およびその混合物から標的を回収する工程を包含する。
【００１９】
以下の詳細な説明を考慮すると、本開示はより良く理解され、上に示されたもの以外の特徴、態様および利点が明らかになるだろう。そのような詳細な説明は、以下の図面に言及している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、赤血球（ＲＢＣ）マトリックス、標的（白丸）、不必要な成分（網掛けの丸）、および本開示の方法において使用される連結された抗体を有する沈降剤を含むＡＬＩＳＡを含む少なくとも４つの成分を示している説明図である。
【図２】図２は、不必要な成分がＡＬＩＳＡに結合されてルロー層に共沈するネガティブセレクション法における、不必要な成分（網掛けの丸）に結合したＡＬＩＳＡの抗体、ルロー（Ｒ）およびルローネットワーク（ＲＮ）ならびに標的（白丸）を示している混合物の説明図である。
【図３】図３は、ＡＬＩＳＡの抗体が、不必要な成分（網掛けの丸）、ルローおよびルローネットワークに結合されている、混合物の遠心分離／沈降を示している説明図であり、不必要な成分がＡＬＩＳＡに結合されてルロー層に共沈するネガティブセレクション法において、標的（白丸）は、バフィーコート層に沈降する。
【図４】図４Ａは、赤血球が共に積み重なってルローを形成しているのを示している走査型電子顕微鏡像である。図４Ｂは、赤血球ルローおよび赤血球ルローネットワークを示している線画である。
【図５】図５は、全血の遠心分離／沈降を示している説明図である。
【図６】図６は、沈降剤が加えられた全血の遠心分離／沈降を示している説明図である。
【図７】図７は、ＲＢＣルローを示している顕微鏡写真である。
【図８】図８は、サンプルから標的（網掛けの丸）を単離するためにＲＢＣイムノロゼット形成および四量体抗体複合体を使用する従来技術の方法の説明図である。
【図９】図９は、サンプルから標的を単離するために、ＲＢＣイムノロゼット形成、およびデキストランでコーティングされた磁性粒子と組み合わされた四量体抗体複合体を使用する従来技術の方法の説明図である。
【図１０】図１０は、サンプルから標的を単離するために、ＲＢＣイムノロゼット形成、およびデキストランでコーティングされた磁性粒子と組み合わされた四量体抗体複合体、および磁場の適用を使用する従来技術の方法の説明図である。
【図１１】図１１は、ポジティブセレクション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）に続く細胞の放出およびネガティブセレクション（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によってサンプルから標的を単離するために、ＲＢＣイムノロゼット形成、およびデキストランでコーティングされた磁性粒子と組み合わされた四量体抗体複合体、および磁場の適用を使用する従来技術の方法の説明図である。
【図１２】図１２は、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥ（ＦＨ層）を用いるＡＬＩＳＡ−ルローの沈降を示している説明図である。
【図１３】図１３は、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥ（ＦＨ層）を用いるＡＬＩＳＡの非存在下における全血の遠心分離／沈降を示している説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、様々な改変および代替の形態が可能であるが、その特定の実施形態が、例として図面に示されており、それらは、下記の本明細書中で詳細に説明される。しかしながら、その特定の実施形態の説明は、本開示を限定しないと意図されており、添付の請求項によって定義される本開示の精神および範囲内に入るすべての改変、等価物および代替物を包含すると理解されるべきである。
【００２２】
詳細な説明
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下記で説明される。
【００２３】
本開示によると、ＲＢＣ（標的およびＡＬＩＳＡを含む混合物中に存在する）によるルローおよび／またはルローネットワークへの形成を少なくとも部分的に誘導することによって、より効率的なおよび／またはより費用効果の高い様式でサンプルからの標的（分子、細胞など）の分離を都合良く可能にするかまたは容易にする抗体連結型免疫沈降剤（ＡＬＩＳＡ）が発見された。詳細には、ＡＬＩＳＡは、少なくとも１つの沈降剤およびその沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含み、ここで、その抗体は、非抗原結合領域によって沈降剤に連結されている。したがって、ＡＬＩＳＡを使用してサンプルから標的を単離するための方法も発見された。ＡＬＩＳＡの抗体は、標的または非標的の抗原に結合して、その標的または非標的とルローおよび／またはルローネットワークとの共沈をもたらす。
【００２４】
赤血球を含む任意のサンプルとともに使用されることに加えて、本開示の方法は、赤血球を欠いているかまたは赤血球が不足しているサンプルから標的を単離するために有用である。したがって、本開示の方法は、例えば、とりわけ、沈殿、アフィニティクロマトグラフィー、磁性粒子およびフローサイトメトリーなどの方法によって標的を単離するための代替方法として使用され得る。赤血球を使用してロゼットおよび／またはイムノロゼットを形成する他の従来技術の方法と比べて、本開示の方法は、赤血球および標的に結合する別個の抗体の組み合わせを必要としない。本開示の方法は、さらに、ロゼットを形成させるために、標的に指向する抗体を、赤血球に指向する抗体と連結することを必要としない。したがって、本開示の方法は、他の従来技術の方法において必要な試薬、必須の工程および高価な機器を排除する。
【００２５】
抗体連結型免疫沈降剤（ＡＬＩＳＡ）
本開示の１つの態様は、抗体連結型免疫沈降剤（ＡＬＩＳＡ）に関する。ＡＬＩＳＡは、少なくとも１つの沈降剤およびその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含み、ここで、その沈降剤に連結された抗体は、本明細書中の下記でさらに詳述されるように抗体の非抗原結合領域によって連結されている。あるいは、ＡＬＩＳＡは、少なくとも１つの沈降剤およびその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体からなり得るか、またはそれらから本質的になり得、ここで、その沈降剤に連結された抗体は、本明細書中の下記でさらに詳述されるように抗体の非抗原結合領域によって連結されている。
【００２６】
好都合なことに、ＡＬＩＳＡは、ロゼットを形成するために必要とされる方法において使用される、赤血球（ＲＢＣ）に指向する第２抗体（例えば、抗グリコホリン（ａｎｔｉ−ｇｌｙｃｏｐｈｒｉｎ）Ａ）を使用せずに、標的もしくは不必要な成分に指向する抗体または標的もしくは不必要な成分に結合するようにデザインされた抗体を含む。ＲＢＣ細胞表面マーカーに対する第２抗体に連結された目的の抗体の免疫学的同時標的化は、不要な面倒な問題およびコストである。ＡＬＩＳＡは、好都合なことに、抗ＲＢＣ抗体を使用する必要性を無くし、免疫沈降中に、ＲＢＣが積み重なったもの（ルローと呼ばれる）およびルローネットワークを形成する沈降剤に抗標的または抗不必要成分に対する抗体を直接結合することによって標的または不必要な成分を分離する。
【００２７】
ある特定の態様において、本開示は、ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤ならびにその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤に関し、ここで、その少なくとも１つの抗体は、非抗原結合領域によってその少なくとも１つの沈降剤に連結されており、その少なくとも１つの抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＴＣＲγ／δ抗体、抗グリコホリンＡ抗体および抗ＧＰ１２０抗体からなる群より選択される。
【００２８】
沈降剤
本開示の方法において使用される抗体連結型沈降剤は、少なくとも１つの沈降剤およびそれに連結または付着された少なくとも１つの（または１つのタイプの）抗体を含む。他の態様において、ＡＬＩＳＡは、２種以上の沈降剤を含む。その沈降剤の選択は、当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。変更可能な事項（例えば、とりわけ、沈降剤、標的およびＲＢＣの濃度、沈降剤の分子量、温度、標的と抗体との比、沈降剤とＲＢＣとの比、所望の沈降速度／時間、ルロー形成の所望の速度／時間、ならびに／またはルローネットワーク形成の所望の速度／時間）は、沈降剤を選択する際に当業者によって考慮され得る。
【００２９】
本開示のＡＬＩＳＡを調製する際の使用に適した沈降剤は、極めて多種多様な物質の群であり得る。好適な沈降剤の選択を導く特性または試薬としては、ＲＢＣルロー形成を誘導する能力、および所望の抗体（すなわち、ひいては所望の標的または不必要な成分に結合する抗体）を直接または間接的に連結する能力が挙げられる。沈降剤は、可溶性、半可溶性または不溶性の巨大分子であり得る。溶液に懸濁された半可溶性または不溶性の沈降剤を使用することが有益であり得、それにより、目的の標的をよりうまく分割しつつ、より迅速な沈降が可能になり得る。
【００３０】
好適な沈降剤は、例えば、ポリマーであり得る。好適なポリマーは、例えば、生体高分子、合成ポリマー、改変された生体高分子またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。好適な生体高分子は、例えば、多糖およびポリペプチドであり得る。様々な態様において、沈降剤は、生体高分子である。ある特定の態様において、生体高分子は、多糖である。さらなる態様において、多糖は、デンプン、デキストラン、セルロース、キチン、キサンタン（ｘａｎｔｈｕｍ）ガム、グリコサミノグリカンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。なおもさらなる態様において、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。他の態様において、生体高分子は、ポリペプチドである。ある特定の態様において、ポリペプチドは、アルブミン、コラーゲン、フィブリノゲン、免疫グロブリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３１】
好適な合成ポリマーは、例えば、ポリオキシエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリジオキサノンであり得る。より詳細には、ポリオキシエチレンポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であり得る。ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）は、例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配細胞分離のためにシリカ粒子をコーティングするために使用され得る。
【００３２】
好適な改変された生体高分子は、例えば、ヒドロキシエチルデンプンおよび加水分解されたコラーゲン（例えば、ゼラチン）であり得る。より詳細には、多糖生体高分子は、例えば、デンプン（例えば、アミロース（ａｍｙｌａｓｅ）およびアミロペクチン）、デキストラン、セルロース、キチン、キサンタンガムおよびグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｉｏｔｉｎ）硫酸）であり得る。他の好適な改変された生体高分子は、例えば、加水分解されたコラーゲン−ゼラチン、ＦＩＣＯＬＬおよびヒドロキシエチルデンプン誘導体であり得る。なおも他の好適な改変された生体高分子は、例えば、オリゴマーおよび小分子（例えば、シクロデキストリン）ならびにヨウ化造影剤（ｉｏｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）（例えば、ジアトリゾアート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノールおよびイオキサグレート）であり得る。ＨＹＰＡＱＵＥとしてより一般に知られているジアトリゾアートは、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ密度勾配細胞分離媒質において使用されている。ＦＩＣＯＬＬは、エピクロロヒドリン架橋多糖である。他の好適なエチレンオキシド修飾デンプン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｔａｒｃｈｅｓ）は、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）およびその関連するより低分子量の類縁体であるペンタスターチ（ｐｅｎｔａｓｔａｒｃｈ）であり得る。血液希釈剤のヘパリン／ヘパリン硫酸は、その抗血小板血液希釈作用と反対のＲＢＣ沈降を誘導するために使用され得、ゆえに好適な沈降剤である。好適なポリペプチド生体高分子は、例えば、アルブミン、コラーゲン、フィブリノゲンおよび免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびそれらの組み合わせ）であり得る。本明細書中で言及される免疫グロブリンは、抗ＲＢＣまたは抗標的細胞免疫グロブリンではなく、十分に高い濃度でＲＢＣルロー形成を誘導する、提供血漿から入手可能な混合免疫グロブリンである。
【００３３】
ある特定の態様において、ＡＬＩＳＡは、複数の沈降剤を含む。その沈降剤の選択は、当業者が容易に最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。複数の沈降剤が使用されるとき、それらは、抗体連結型免疫沈降剤を使用して標的を単離する方法を都合良く最適化する種々の比で存在し得る。例えば、好適な沈降剤は、およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈの混合物から生成され得る。
【００３４】
抗体
本開示の抗体連結型沈降剤は、少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含み得る。いくつかの態様において、異なる抗原に指向する２つ以上の抗体（または異なるタイプの抗体）が、その少なくとも１つの沈降剤に連結され得る。別の態様において、異なる抗原に指向する少なくとも２つの抗体が、２つ以上の異なる沈降剤に連結され得る。
【００３５】
抗体の選択は、沈降剤によって少なくとも部分的に規定される。抗体は、本明細書中でさらに詳述されるように、その抗体の非抗原結合領域によって沈降剤に直接または間接的に連結され得る；すなわち、それらの抗体は、超可変、パラトープまたは抗原結合ドメインが、その抗原に結合できるかまたは自由に結合できるような様式で、沈降剤に連結される。したがって、抗体は、抗原結合領域によって沈降剤に連結されない。
【００３６】
抗体の選択は、その抗体が結合する標的または不必要な成分によってもまた、少なくとも部分的に規定される。例えば、ＡＬＩＳＡの抗体は、標的抗原または非標的抗原を対象とし得る。本明細書中で使用されるとき、「標的抗原」とは、サンプルからの単離が意図されているかまたは望まれている標的上に見られる抗原のことを指す。例えば、本方法に従ってサンプルから白血球を単離することが意図されているかまたは望まれている場合、抗白血球抗体によって結合される白血球抗原が、標的抗原に相当し得る。標的抗原に結合する抗体は、例えば、ポジティブセレクション法において使用され得る。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、「非標的抗原」とは、ＡＬＩＳＡの抗体によって結合される「不必要な」成分上に見られる抗原のことを指す。したがって、本方法を行う当業者は、不必要な成分上の抗原に特異的な抗体を使用することによって、サンプルからその不必要な成分を除去し得るか、または枯渇させ得る。次いで、その不必要な成分は、ＡＬＩＳＡ−ルロー複合体の一部として共沈され、サンプルからの単離が意図されているかまたは望まれている標的が、別の層に残存する。非標的抗原に結合する抗体は、例えば、ネガティブセレクション法において使用され得る。
【００３８】
ＡＬＩＳＡを調製するために使用される抗体の濃度は、意図される目的のために当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。ＡＬＩＳＡを調製するために使用される抗体の濃度は、例えば、とりわけ、ＡＬＩＳＡを調製するために使用される沈降剤の濃度、沈降剤と抗体との比および／または抗体を沈降剤に連結するために使用される方法に依存し得る。
【００３９】
ＡＬＩＳＡは、少なくとも１つの抗体（または１つのタイプの抗体）を含む。その抗体は、標的抗原または非標的抗原に指向するので、その抗体によって結合される分子は、ＡＬＩＳＡの抗体との直接的な会合によって、ＡＬＩＳＡと会合するようになる。その分子は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク会合が原因で、ルロー／ルローネットワークとも間接的に会合する。このことにより、ＡＬＩＳＡの抗体が結合する分子の、混合物からＲＢＣルロー層への共沈が生じる。
【００４０】
別の態様において、ＡＬＩＳＡは、異なる抗原に指向する抗体を含み得る。この態様は、例えば、サンプル中の２種以上の分子に結合するために使用され得る。この態様は、例えば、同じ分子の異なる抗原に指向する抗体を連結するためにも使用され得る。
【００４１】
ＡＬＩＳＡを調製するために使用される抗体は、多くの異なる形態であり得る。好適な抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体であり得る。任意のタイプまたはサブタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方が、使用され得る。他の好適な抗体としては、キメラ抗体、二機能性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、インタクトな抗体および抗体フラグメントが挙げられる。好適な抗体フラグメントとしては、抗原結合（可変）領域、抗体軽鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ’）が挙げられる。
【００４２】
抗体は、ヒトまたは他の任意の種（例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、ニワトリ、ロバおよびラクダ）が起源であり得る。好適な抗体はまた、ヒト抗体成分を他の種の抗体に化学的に連結することによって、部分的にヒト化され得る。好適な抗体はまた、組換えタンパク質発現法を用いて作製され得る。
【００４３】
ＡＬＩＳＡを調製するための沈降剤への抗体の連結および付着
上記で先に述べたように、本開示のＡＬＩＳＡでは、沈降剤に抗体が連結されるかまたは付着される。その抗体は、沈降剤に直接または間接的に連結され得る。付着の性質は、いくつかの潜在的に変更可能な事項（例えば、沈降剤および／または抗体自体の化学組成）に依存し得る。抗体は、Ｆｃ領域、ヒンジ領域、軽鎖定常（ＣＬ）領域、重鎖（ＣＨ１）領域、軽鎖（ＣＬ）領域および重鎖（ＣＨ１）領域、重鎖（ＣＨ２）領域、重鎖（ＣＨ３）領域またはそれらのいくつかの組み合わせ（例えば、いくつかの異なる抗体が使用される場合）によって、沈降剤に連結され得る。
【００４４】
抗体を沈降剤に付着する行為は、当該分野で広く公知の方法または手法を用いて行われ得る。例えば、結合体化化学は、抗体を沈降剤に直接連結するまたは付着するのに適したプロセスである。好適な結合体化の方法は、当業者に周知である。例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２ｄ  ｅｄ．２００８）は、抗体などのポリペプチドに対する様々な物質の結合体化に利用可能な数多くの実験プロトコルを提供している。これらの結合体化プロトコルは、この目的のために本明細書中で参考として援用される。
【００４５】
結合体化化学は、抗体ポリペプチド上のいくつかの異なる官能性を利用し得る。連結は、ジスルフィド結合の形成による抗体上のシステイン残基へのスルフィド結合を介して行われ得る。連結はまた、ポリペプチドのリジン残基上またはアミノ末端上のアミン基を介して行われ得る。これにより、様々な反応性のカルボニル部分（例えば、酸無水物または塩化アシル）と縮合して、最初のアミン基からアミド結合が形成される。連結はまた、抗体のチロシン残基上またはトレオニン残基上のアルコール官能性によって行われることにより、様々な反応性カルボニル部分と反応した後にエステルが形成され得る。結合体化化学は、ポリペプチドのカルボキシ末端も使用して、エステルおよびアミドも形成し得る。抗標的抗体を沈降剤に連結するこれらの方法のすべてが、十分に確立されており、商業的供給業者からキットとして入手可能である。
【００４６】
沈降剤と抗体とを連結するためおよび付着するための他の好適な方法は、非共有結合によるものである。非共有結合は、抗体を沈降剤に連結する間接的な方法である。抗体を沈降剤に付着する好適な非共有結合の方法は、例えば、ビオチンとアビジンとの結合を使用し得る。アビジンは、４つのビオチン分子と堅固に結合する四量体タンパク質である。ビタミンＢ７とも呼ばれるビオチンは、標準的な化学キットを用いてビオチン化によって付着され得る。同様に、ストレプトアビジンおよびアビジンは、タンパク質化学連結キットを用いて連結され得る。ストレプトアビジンが、沈降剤に連結され得る。これは、一般的なストレプトアビジンまたはアビジンに結合体化されたＡＬＩＳＡ（例えば、ＨＥＳ−ＳＥ（ヒドロキシエチルデンプン−ストレプトアビジン））が、多くの種々のビオチン化された抗体に対して万能的に使用できるようにする。単一のインキュベーション工程によって、ビオチン化された抗体とストレプトアビジンで結合体化された沈降剤との非共有結合が可能になる。好適なビオチン化された抗体は、例えば、ビオチン−抗ＣＤ４、ビオチン−抗ＣＤ８またはビオチン−抗ＣＤ５６であり得る。
【００４７】
抗体を沈降剤に連結するかまたは付着する別の好適な間接的な方法は、スペーサー分子を使用し得る。スペーサー分子は、沈降剤と抗体との間にさらなる距離または分離を提供するか、またはそれにより、例えば、抗体と抗原との相互作用を別途干渉し得る可能性のある立体障害も制限する。好適なペプチドスペーサー分子は、例えば、化学スペーサー、アミノ酸スペーサー、ペプチドスペーサーまたはそれらのいくつかの組み合わせであり得る（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｐｕｒｇｏ，Ｉｌ  Ｆａｒｍａｃｏ  ５４：４９７−５１６（１９９９）を参照のこと）。
【００４８】
ＡＬＩＳＡ法
本開示の１つの態様は、抗体連結型免疫沈降剤（ＡＬＩＳＡ）を用いてサンプルから標的を単離する方法を含む。その方法は、少なくとも１つの標的、ＡＬＩＳＡおよび赤血球を含むサンプルを含む混合物を形成する工程ならびにその混合物から標的を回収する工程を包含する。ＡＬＩＳＡは、少なくとも１つの沈降剤およびその沈降剤に連結または付着された少なくとも１つの抗体を含む。次いで、混合物は、ルローを形成するのに十分な条件下でインキュベートされる。本明細書中に記載される様々な方法によると、ルローは、そのルローの赤血球上への少なくとも１つの沈降剤の吸着によって形成される。インキュベーション後、当該分野で広く公知の方法および／または本明細書中の他の箇所にさらに記載されるような方法を用いて標的が回収される。
【００４９】
図１は、本開示の方法において使用される少なくとも４つの成分を示している説明図である。図１に図示されている成分は、赤血球（「赤血球マトリックス」）、標的（白丸）、不必要な成分（網掛けの丸）およびＡＬＩＳＡ（すなわち、連結された抗体を有する沈降剤）を含む。この説明図では、ＡＬＩＳＡの抗体は、不必要な成分上の抗原に特異的である。しかしながら、代替の実施形態では、ＡＬＩＳＡの抗体が、求められているまたは所望の標的上の抗原（本明細書中の他の箇所にさらに記載されるような）に特異的であり得ることに注意されたい。本明細書中で使用されるとき、「標的」は、サンプルからの単離が求められているかまたは望まれている、サンプル中の分子または細胞である。本明細書中で使用されるとき、「不必要な成分」は、標的と分離される、サンプル中の分子または細胞である。
【００５０】
少なくとも１つの標的、ＡＬＩＳＡおよび赤血球を含むサンプルは、混合物を形成するために、任意の順序で加えられ得る。例えば、ＡＬＩＳＡは、赤血球を添加する前にサンプルに加えられ得る。あるいは、赤血球は、ＡＬＩＳＡを添加する前にサンプルに加えられ得る。なおも別の実施形態において、標的は、ＲＢＣを含むサンプルの一部であり得るがゆえに、ＲＢＣのさらなる添加が、必要でない場合がある（またはＲＢＣのさらなる添加は、随意であり得る）。１つの態様において、ＡＬＩＳＡは、混合物を形成するためにそれを添加する前に、調製される（すなわち（ｔｈａｔ  ｉｔｓ）、最初に抗体が沈降剤に付着される）。別の態様において、例えば、血液などのサンプルは、赤血球を含み得、ＡＬＩＳＡは、赤血球を含むサンプルに加えられることにより、混合物が形成される。別の態様において、ＡＬＩＳＡおよび赤血球は、サンプルを添加する前に混合されることにより、混合物が形成され得る。
【００５１】
次いで、混合物は、赤血球ルローの形成が可能であるのに十分かつＡＬＩＳＡ抗体がそれらの抗原に結合可能であるのに十分な時間にわたってインキュベートされる。別の態様において、混合物は、赤血球ルローネットワークの形成が可能であるのに十分かつＡＬＩＳＡ抗体がそれらの抗原に結合可能であるのに十分な時間にわたってさらにインキュベートされる。本明細書中に記載される様々な方法によると、ルローは、そのルローの赤血球上への少なくとも１つの沈降剤の吸着によって形成される。様々な態様において、その少なくとも１つの抗体は、混合物の形成の前に、その少なくとも１つの沈降剤に連結される。インキュベーション時間は、例えば、とりわけ、ＲＢＣの数および／もしくは濃度、抗体連結型沈降剤の濃度、ＡＬＩＳＡを調製するために使用される沈降剤の濃度、ＡＬＩＳＡにおける抗体の濃度、２種以上の沈降剤が使用されるとき、ＡＬＩＳＡを調製するために使用される沈降剤の組み合わせ、沈降剤の分子量、混合物のイオン強度、ＡＬＩＳＡの抗体によって結合される標的／不必要な成分の濃度、サンプルの組成、ｐＨならびに／または温度に応じて変動し得、ゆえに、これらのパラメータの１つ以上が、特定の条件に対して、当業者によって最適化され得る（例えば、Ｍａｅｄａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８４３：１２８−１３６（１９８５）を参照のこと）。好適な時間は、例えば、約１０分間〜約１２０分間であり得る。
【００５２】
図２は、不必要な成分（網掛けの丸）に結合された抗体、ルローおよびルローネットワークならびに標的（白丸）を示している混合物の説明図である。図２に示される説明図は、不必要な成分がＡＬＩＳＡの抗体に結合されている、ネガティブセレクション法を表している。しかしながら、代替の実施形態では、標的がＡＬＩＳＡの抗体に結合されるポジティブセレクション法が使用され得る（図示されず）。
【００５３】
次いで、インキュベートされて得られた混合物は、何らかの分離手法（例えば、相分離）に供されることにより、不必要な成分および／または混合物から標的が分離される。１つの実施形態において、分離は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体に結合される標的または不必要な成分をペレットにする沈降方法を用いて行われる。図３は、本開示に係る混合物の遠心分離／沈降を示している説明図である。遠心分離／沈降の前は、混合物の成分は反応チューブ内にランダムに分配される。遠心分離／沈降が行われると、混合物の成分は、血漿層、バフィーコート層およびルロー層に分離する。本明細書中で使用されるとき、「ルロー層」とは、ルローおよびルローネットワークによって形成される層のことを指す。ルロー層は、赤血球、およびＡＬＩＳＡの抗体が対象としている抗原を有する分子に結合されたＡＬＩＳＡを含む。ポジティブセレクション法では、単離される標的は、ＡＬＩＳＡに結合され、ルロー層中でペレットになり得る。ネガティブセレクション法では、単離される標的は、バフィーコート層または血漿層に存在し得、不必要な成分は、ＡＬＩＳＡに結合され得る。標的は、述べた層に分離されると、当該分野で公知の方法（例えば、デカント、濾過、抽出、沈殿、細胞溶解など）を用いて単離または回収され得る。
【００５４】
混合物中のＡＬＩＳＡの濃度は、所望の分離（および／または分離速度）を達成するために当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。ＡＬＩＳＡの好適な濃度は、約０．１ｇ／ｄＬ〜約１０ｇ／ｄＬであり得る。最適濃度は、例えば、ＡＬＩＳＡの分子量に依存し得る。より迅速な単離の場合、例えば、当業者は、ルロー形成の速度を上げるため、および／または標的がＡＬＩＳＡの抗体によって結合される速度を上げるために、ＡＬＩＳＡ濃度を上昇させ得る。より遅い単離の場合、例えば、当業者は、ルロー形成の速度を下げるため、および／またはＡＬＩＳＡの抗体による標的の結合速度を下げるために、ＡＬＩＳＡ濃度を低下させ得る。
【００５５】
混合物中の赤血球の数または濃度は、当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。赤血球の好適な濃度は、１マイクロリットルあたり約５０万〜約１０００万個の赤血球であり得る。より迅速な単離の場合、例えば、当業者は、ルローおよび／またはルローネットワーク形成の速度を上げるために、赤血球濃度を上昇させ得る。より遅い単離の場合、例えば、当業者は、ルローおよび／またはルローネットワーク形成の速度を下げるために、赤血球濃度を低下させ得る。しかしながら、この点において、ある場合では、赤血球が混合物に別個に加えられる必要があり得るが、他の場合では、赤血球は、単に標的または不必要な成分を含むサンプルの一部として存在することに注意されたい。
【００５６】
混合物の好適なｐＨは、約５．４〜約９．４であり得る。混合物の特に好適なｐＨは、約７．３〜約７．５であり得る。好適な温度は、約０℃〜約４５℃であり得る。特に好適な温度は、約１８℃〜約２５℃であり得る。
【００５７】
ＡＬＩＳＡにおける抗体と標的（求められているまたは不必要な成分）との比は、当業者によって最適化され得る。代表的には、抗体濃度は、標的濃度に対して有意に過剰であるまで漸減（ｔｉｔｒａｔｅｄ  ｄｏｗｎ）される。この過剰な濃度は、標的の単離を最適化する。この滴定閾値濃度を超えてより高い抗体濃度を使用しても、高価な抗体試薬のさらなる使用に対して標的の単離は少ししか増加しない可能性がある。ＡＬＩＳＡ比の抗体濃度に対する滴定調整は、当業者によって最適化され得る。
【００５８】
ある特定の態様において、本開示は、サンプルから標的を単離する方法に関する。その方法は、サンプル、抗体連結型免疫沈降剤および赤血球を含む混合物を形成する工程（ここで、その抗体連結型免疫沈降剤は、ポリエチレングリコール、デキストランおよびヒドロキシエチルデンプンからなる群より選択される少なくとも１つの沈降剤；ならびに抗体の非抗原結合領域によってその少なくとも１つの沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含み、その抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＴＣＲγ／δ抗体、抗グリコホリンＡ抗体および抗ＧＰ１２０抗体からなる群より選択される）；ルローを形成するのに十分かつその抗体が混合物中に存在する抗原に結合可能であるのに十分な条件下で混合物をインキュベートする工程；およびその混合物から標的を回収する工程を包含する。
【００５９】
ルローおよびルローネットワーク
本方法の１つの態様において、混合物は、ルローを形成するのに十分かつＡＬＩＳＡ抗体がその抗原に結合するのに十分な条件下でインキュベートされる。本方法の別の態様において、混合物は、ルローネットワークを形成するのに十分かつＡＬＩＳＡ抗体がその抗原に結合するのに十分な条件下でインキュベートされる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ルローまたはルローネットワークの形成のプロセスは、ＲＢＣの表面に吸着する沈降剤から開始すると考えられている。ＲＢＣ上への沈降剤の吸着は、ＲＢＣが積み重なってルローを形成する可逆プロセスを誘導する。図４Ａを参照のこと。次いで、ルローは、他のルローと架橋することにより、ルローネットワークを形成し得る。図４Ｂを参照のこと。図４Ｂは、他のルローと相互作用してルローネットワークを形成する個別のルローを示している。ルローおよびルローネットワークの形態のＲＢＣは、懸濁液からのＲＢＣの沈殿をもたらす。
【００６０】
ＲＢＣは、沈降剤の添加なしに、自然に（しかしながら、ゆっくりと）そのままで沈降する。図５は、全血の遠心分離／沈降を示している説明図である。遠心分離／沈降後、全血は、血漿層、バフィーコート層および赤血球層に分離する。従来、ＲＢＣの沈降を促進するために沈降剤が全血に加えられ得る。図６は、沈降剤が加えられた全血の従来の遠心分離／沈降を示している説明図である。遠心分離／沈降後、全血は、血漿層、バフィーコート層および沈降剤／赤血球層に分離する。この従来のアプローチは、本開示のプロセスと明確に異なる。なぜなら、最も明白には、その沈降剤が、それに連結された抗体を欠く（すなわち、ＡＬＩＳＡが混合物中に存在しない）からである。
【００６１】
ルローおよびルローネットワークの形成を用いる本開示のプロセスは、ロゼットまたはイムノロゼット（これらもまたＲＢＣによって形成され、他の以前の方法において使用される）を必要とするかまたは用いるプロセスとも区別される。ロゼットは、ＲＢＣの凝集物であって、ルローおよびルローネットワークに見られるようなＲＢＣが積み重なったものではない。イムノロゼットは、抗体介在性のロゼットである。イムノロゼットは、ＲＢＣを互いに連結することによって、ならびにＲＢＣおよび標的に指向する抗体を用いてＲＢＣを標的と連結することによって、ＲＢＣの凝集を促進する。図７は、ＲＢＣロゼットの顕微鏡写真である。ロゼットを形成するＲＢＣ凝集物は、ルローおよびルローネットワークにおいてＲＢＣによって形成される積み重なりと比べて、より塊状の構造を示す（図７）。図８は、サンプルから標的を単離するためにイムノロゼット形成を使用する従来技術の方法の説明図である。ＡＬＩＳＡ法とは異なり、イムノロゼット形成法では、抗ＲＢＣ抗体（例えば、抗グリコホリンＡ）、抗標的抗体、ならびに抗ＲＢＣ抗体および抗標的抗体に指向する抗体を使用して、抗ＲＢＣ抗体および抗標的抗体が四量体抗体複合体（ＴＡＣ）に共に連結される。
【００６２】
イムノロゼット形成法は、デキストランでコーティングされた磁性粒子、および抗体のＦｖ領域を介して磁性粒子上のデキストランコーティングに結合する抗デキストラン抗体も使用し得る（図９を参照のこと）。この磁性ビーズは、抗ＲＢＣ抗体および連結抗体と組み合わせて使用されることにより、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）が形成される。ＴＡＣは、赤血球を標的および／または磁性粒子および／または他の赤血球に連結することにより、ＲＢＣイムノロゼットを形成する。図１０および１１に図示されているように、混合物は、磁場に供される。磁場が適用されている間、磁性粒子に結合されていない任意の成分は、流出し得る。図１１に図示されているように、この方法は、ポジティブおよびネガティブセレクション法のために使用され得る。
【００６３】
サンプル
本開示のプロセスにおいて使用されるサンプルは、サンプルからの単離が望まれている標的を有する任意の溶液または混合物であり得る。好適なサンプルは、例えば、血液、骨髄、末梢血幹細胞単離物、骨髄穿刺液、バフィーコート層、白血球アフェレーシス単離物、プラスマフェレーシス単離物、細胞懸濁液、細胞培養培地、細胞混合物、細胞ホモジネート、膵臓単離物、臓器ホモジネート（例えば、肝臓、脳、腎臓、膵臓、肺、筋肉、脂肪組織、脾臓、リンパ節、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、卵巣、精巣、子宮、心臓または腫瘍細胞）、食塩水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液、リン酸緩衝化食塩水、ウイルス培養培地、卵母細胞、精子、配偶子混合物またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。１つの態様において、血液は、例えば、全血、血漿、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球（ｐａｃｋｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）、臍帯血、骨髄、幹細胞血液単離物またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。細胞混合物または細胞懸濁液は、例えば、細胞培養物、細胞ホモジネート、細菌含有サンプル、多細胞生物含有サンプル、アメーバ含有サンプルならびに他の細胞含有混合物および懸濁液またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。サンプルは、例えば、無細胞混合物、例えば、タンパク質含有サンプル、ポリペプチド含有サンプル、ヌクレオチド含有サンプル、多糖含有サンプル、脂質粒子含有サンプル、ミセル含有サンプル、ウイルス含有サンプル、ウイロイド含有サンプル、血小板含有サンプル、分子含有サンプルまたはそれらのいくつかの組み合わせでもあり得る。
【００６４】
赤血球（ＲＢＣ）
ＡＬＩＳＡを用いる本開示の方法は、ルローおよびルローネットワークへのＲＢＣの形成に依存し、ゆえに、ＲＢＣは、本方法において必須である。赤血球（Ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））は、循環器系を貫流して酸素を体組織に送達する血液細胞の１タイプである。ＲＢＣは、例えば、血液などのサンプルが起源であり得る。ある特定の態様において、その血液は、全血、血漿、血液幹細胞単離物、多血小板血漿、分画血液、濃厚赤血球、臍帯血、骨髄、骨髄穿刺液およびバフィーコート層を含む。あるいはまたはさらに、ＲＢＣは、ＲＢＣの数を増加させるためにサンプルに加えられ得る（例えば、骨髄穿刺液）。あるいはまたはさらに、ＲＢＣは、ＲＢＣを欠いているかまたはＲＢＣが不足している混合物に加えられ得る（例えば、細菌含有サンプルおよび膵臓ホモジネート）。
【００６５】
いくつかの実施形態において、赤血球は、内因性赤血球を含む。本明細書中で使用されるとき、「内因性赤血球」とは、サンプル中に本来的に存在しているかまたは見られる赤血球のことを指す。内因性赤血球を含むサンプルは、例えば、全血、分画血液、臍帯血および骨髄であり得る。したがって、例えば、全血がサンプルとして使用されるとき、その全血サンプルを占めている赤血球は、内因性赤血球である。
【００６６】
他の実施形態において、本方法は、外来性赤血球を添加する工程を包含し得る。本明細書中で使用されるとき、「外来性赤血球」とは、サンプルに別個に加えられる（本明細書中で詳述されるように）赤血球のことを指す。加えられるＲＢＣ（もしあれば）の最適な量は、標的の量、ならびにルローおよび／またはルローネットワーク形成の所望の速度に依存する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、加えられる外来性赤血球は、自己の赤血球であり得る。本明細書中で使用されるとき、「自己の赤血球」とは、サンプル中に含まれる内因性赤血球と同じ種から得られたかまたはその同じ種によって供与された赤血球のことを指す。したがって、サンプルが、例えば、ヒト被験体から得られた全血であり、その全血に外来性赤血球が加えられる場合に、加えられる赤血球が、同じ個体ではないがヒトドナーから得られる場合、その外来性赤血球は、自己の赤血球であり得る。「自己の赤血球」は、必要に応じて、サンプル溶液の起源と同じ種から得られたかまたはその同じ種によって供与された赤血球のことを指し得る。例えば、サンプルが、外来性赤血球が加えられるヒト膵臓細胞の溶液である場合に、加えられる赤血球が、必ずしも同じヒトドナーではないヒトドナー由来である場合、その外来性赤血球は、自己の赤血球と考えられ得る。
【００６８】
他の実施形態において、加えられる外来性赤血球は、同種の赤血球であり得る。本明細書中で使用されるとき、「同種の赤血球」とは、同じ個体から得られたかまたはその同じ個体によって供与された外来性赤血球のことを指す。したがって、同種の赤血球は、同じ個体から得られたかまたはその同じ個体によって供与された自己の赤血球である。したがって、サンプルが、例えば、ヒト個体から得られた全血であり、赤血球が加えられる場合に、加えられる赤血球が、同じヒト個体から得られる場合、その加えられる赤血球は、同種の赤血球であり得る。
【００６９】
なおも他の実施形態において、加えられる外来性赤血球は、異種の赤血球であり得る。本明細書中で使用されるとき、「異種の赤血球」とは、異なる種から得られたかまたはその異なる種によって供与された赤血球のことを指す。異なる種は、そのＲＢＣの異なる固有の沈降速度を有し、異なる種が起源であるＲＢＣの使用は、免疫沈降に影響し得る。例えば、より速くルロー形成するＲＢＣの使用は、ルローおよび／またはルローネットワークの形成速度を加速させ得、ひいては、沈降速度を加速させ得る。例えば、アンテロープ、ウマおよび他の競技用動物は、ヒトおよびウシのＲＢＣよりも迅速にルローを形成するＲＢＣを有し、沈降速度を高めてより迅速な沈降を可能にし得る。異種の赤血球を供与するのに好適な種は、例えば、哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ラット、マウス、アンテロープおよびネコ、鳥類、例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウまたはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。
【００７０】
ＡＬＩＳＡ法のためのＲＢＣは、ヒト供血者から回収された濃縮ＲＢＣにも由来し得る。その濃縮ＲＢＣは、サンプルに再懸濁される必要だけがある。
【００７１】
標的
標的は、先に記載されたような、サンプルの他の成分からの単離または分離が望まれているかまたは求められている、そのサンプル中の目的の任意の分子、細胞などであり得る。その標的は、例えば、多細胞生物、単細胞生物、細胞、細胞内成分（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、細胞フラグメント、ウイルスおよびウイルス様標的、膜結合粒子および脂質粒子、巨大分子、核酸ならびにタンパク質であり得る。多細胞生物は、例えば、虫、吸虫類および寄生生物であり得る。単細胞生物は、例えば、細菌、単細胞真核生物、原生動物、マラリア、トリパノソーマおよびアメーバであり得る。細胞収集物は、例えば、膵島、骨髄および幹細胞凝集物、肝細胞、腫瘍転移ならびに傍濾胞細胞（Ｃ細胞）であり得る。細胞内（Ｓｕｂｃｅｌｌａｒ）成分は、例えば、ミトコンドリア、核、核小体、中心小体、葉緑体、リソソーム、キネトプラスト、エンドソーム、リボソームおよび貯蔵小胞であり得る。細胞フラグメントは、例えば、アポトーシス小体、血小板およびエキソソームであり得る。ウイルスおよびウイルス様標的は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、ウイロイドならびにファージであり得る。膜結合粒子および脂質粒子は、例えば、リポソーム、リポタンパク質（キロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）およびミセルであり得る。巨大分子およびタンパク質は、例えば、抗体によって標的化され得る任意の化合物またはモチーフ（タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸様巨大分子（例えば、ペプチド核酸、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸および他の改変された核酸様分子）、合成ポリマー、オリゴマー、脂質、糖、グリコサミノグリカンおよびこれらの構成要素のヘテロ複合体を含む）であり得る。
【００７２】
ブロッキング剤
本方法は、さらに、ブロッキング剤の添加を包含し得る。本明細書中で使用されるとき、「ブロッキング剤」とは、上記抗体の非特異的な結合を回避するかまたは防止するために使用される任意の物質のことを指す。ブロッキング剤は、例えば、タンパク質コロイド、例えば、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミンもしくはウシ胎仔血清、免疫グロブリン、抗ＣＤ１６抗体、抗ヒトＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）、Ｆｃレセプター抗体またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。
【００７３】
混合物からの標的の回収
求められているかまたは望まれている標的の不必要な成分からの回収は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体によって結合された標的を分離すること、または不必要な成分がＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体によって結合されているときに混合物から標的を分離することを含み得る。分離は、種々の手法（そのすべてが当該分野で広く公知である）を用いて達成され得る。好適な手法は、例えば、重力（１×ｇ）または混合物を遠心分離することによってもたらされる遠心力に応答した沈降であり得る（例えば、図３を参照のこと）。サンプルの沈降は、重力（１×ｇ）および遠心分離によるものであり得る。したがって、本開示は、任意の重力または遠心力における分離を含むと意図される。
【００７４】
別の好適な手法は、例えば、連続的なまたは不連続の密度勾配を用いた密度分離であり得る。密度分離では、混合物は、浮遊密度溶液（例えば、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥ）の上に重層され、遠心分離される。抗体に結合した分子−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体のペレットおよび残存するサンプルの結合していない成分が、浮遊密度溶液と、抗体に結合した分子−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体との間の界面に集まる。ポジティブセレクション法が用いられる場合、例えば、ＡＬＩＳＡに結合された、抗体に結合した分子（標的）は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体としてペレットになり得る。その標的はさらに、種々の手法によって、標的−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体から分離され得る。好適な手法は、例えば、赤血球の溶解ならびにその溶解産物からの標的の分離および／または精製、抗体と抗原との結合の破壊、ならびに当業者が用いる他の方法であり得る。ネガティブセレクション法が用いられる場合、例えば、不必要な成分が、ＡＬＩＳＡの抗体によって結合され得る場合、不必要な分子は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体としてペレットになり得る。ネガティブセレクション法では、求められているかまたは所望の標的は、ペレットになった不必要な分子−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体より上の層に残存し得る。次いで、求められているかまたは所望の標的は、当該分野で広く公知の種々の手法によって、ペレットになった不必要な分子−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体より上の層から取り出され得る。
【００７５】
図１２は、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥを用いたＡＬＩＳＡ−ルローの沈降を示している説明図である。混合物が、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥ（ＦＨ）層の上に重層され、遠心分離／沈降に供される。その混合物は、血漿および血小板層、単核細胞層、ＦＨ層ならびにルロー層に分離する。この説明図では、ＡＬＩＳＡの抗体によって結合された分子は、ルロー層に存在し得る。比較として、図１３は、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥを用いた、ＡＬＩＳＡの非存在下における全血の遠心分離／沈降を示している説明図である。全血が、ＦＩＣＯＬＬ  ＨＹＰＡＱＵＥ（ＦＨ）の上に重層される。遠心分離の後、全血は、血漿および血小板層、単核細胞層、ＦＨ層ならびに赤血球および多形核白血球（ＰＭＮ）層に分離する。他の密度勾配（例えば、ポリビニルピロリドンでコーティングされたコロイドケイ酸粒子を有するＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配（例えば、約１．１３ｇ／ｍｌの密度を有する）、スクロース密度勾配（例えば、約１．０６ｇ／ｍｌの密度を有する約２０％スクロース）またはメトリザミド（例えば、約１．１３〜約１．１４ｇ／ｍｌの密度を有する））もまた使用され得る。他の密度ベースの方法は、例えば、密度ベースの浮遊物およびビーズを使用して標的を分離し得る。これらの浮遊物およびビーズは、ＡＬＩＳＡ試薬および方法とともに使用されるとき、標的または不必要な成分を分離する特定の密度を有するようにデザインされ得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、標的の回収は、混合物からのルローの分離を含み得る。別の実施形態において、例えば、標的の回収はさらに、混合物からのルローネットワークの分離を含み得る。なおも他の実施形態において、標的の回収は、濾過、沈降、遠心分離、密度勾配遠心分離、磁場、電場、赤血球溶解、抽出またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに混合物を供することを含み得る。
【００７７】
別の実施形態において、標的の回収は、少なくとも凍結、解凍、蒸発、煮沸、昇華、融解、結晶化、可塑化またはそれらの組み合わせの相転移または相変化に混合物を供することを含み得る。
【００７８】
他の実施形態において、標的の回収は、物理的障壁（例えば、フリット、フィルターおよび半透性障壁）を単独でまたは標的もしくは不必要な成分を混合物から分離する他の方法と組み合わせて使用することを含み得る。
【００７９】
他の実施形態において、標的の回収は、磁場および電場を単独でまたは重力および遠心分離と組み合わせて使用することを含み得る。交流電場は、ＲＢＣ沈降を誘導すると知られている。同様に、磁場もＲＢＣ沈降を誘導し得る。
【００８０】
他の実施形態において、標的の回収は、その分離を促進するように、混合物の化学反応を使用してその成分を架橋することを含み得る。ＡＬＩＳＡは、混合物に結合する化学結合を形成するように誘導され得る反応性部分を有する沈降剤を使用し得る。この化学反応は、温度、光、フリーラジカルまたは当業者に公知の他の任意の方法によって惹起され得る。次いで、得られた化学的に連結された混合物は、当業者によって、上で述べた方法のいずれか１つに供され得る。
【００８１】
この点において、当該分野で公知の他の分離方法も、請求項の範囲から逸脱することなく使用され得ることに注意されたい。
【００８２】
ポジティブおよびネガティブセレクション
本方法は、ポジティブおよびネガティブセレクション法のために使用され得る。本明細書中で使用されるとき、「ポジティブセレクション」とは、標的がＡＬＩＳＡ法によって沈降されるように、その標的に指向する抗体を用いて標的が不必要な成分から分離される条件のことを指す。例えば、本開示のＡＬＩＳＡを用いた、全血のポジティブセレクションでは、目的の標的細胞の表面抗原に指向する抗体が、ＡＬＩＳＡの沈降剤に連結される。ルローおよび／またはルローネットワークが形成されると、目的の標的は、他の不必要な成分から離れてＡＬＩＳＡ−ＲＢＣルロー／ルローネットワーク層に沈降され、その他の不必要な成分は、バフィーコート／ＷＢＣまたは血漿層に残存する。所望であれば、次いで、ＡＬＩＳＡ−ＲＢＣルロー／ルローネットワーク層は、共沈した標的または不必要な成分から取り出され得るおよび／または分離され得る。ＡＬＩＳＡ−ＲＢＣルロー／ルローネットワークから標的または不必要な成分を分離する１つの方法は、ＲＢＣを溶解することである。ＲＢＣは、例えば、凍結融解の繰り返し（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｉｎｇ）、均質化、ＲＢＣ溶解剤および当該分野で広く公知の他の手法を用いて、溶解され得る。
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、「ネガティブセレクション」とは、不必要な成分がＡＬＩＳＡ法によって沈降されるように、その不必要な成分に指向する抗体を用いて、その不必要な成分が標的および／またはサンプルから分離される条件のことを指す。例えば、本開示のＡＬＩＳＡを用いた、全血のネガティブ分離では、ＡＬＩＳＡに連結された抗体は、不必要な成分に指向する。ネガティブセレクション中、標的は、血漿またはバフィーコート／ＷＢＣ層に残存し、不必要な成分は、ＡＬＩＳＡの沈降剤に連結された抗体の抗原結合によって、ＡＬＩＳＡ−ＲＢＣルロー／ルローネットワーク層に沈降される。
【００８４】
上で詳細に論じられたように、ポジティブセレクション法が用いられる場合、標的−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体の標的は、種々の手法によって標的−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体からさらに分離され得る。好適な手法は、例えば、先に論じられたような、赤血球の溶解ならびにさらなる使用のための溶解産物からの標的の分離および／または精製であり得る。ネガティブセレクション法が用いられる場合、不必要な成分は、ＡＬＩＳＡ法に従って除去されるように選択される。ネガティブセレクション法では、標的は、ペレットになった不必要な分子−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体より上の層に残存し得る。次いで、その標的は、さらに使用するために、当該分野で広く公知の従来の手法および方法を用いて、ペレットになった不必要な分子−ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワーク複合体より上の層から取り出され得、単離され得、および／または精製され得る。
【００８５】
沈降剤
ＡＬＩＳＡを調製するために使用される沈降剤の選択は、上で詳細に記載されたように、当業者が最適化し得る種々の変更可能な事項に依存する。
【００８６】
抗体
上で詳細に記載されたように、本開示の方法は、目的の標的に指向する少なくとも１つのタイプの抗体を含むＡＬＩＳＡを使用する。したがって、この態様において、その抗体は、サンプル中の「標的抗原」に結合する。代替の実施形態において、本開示の方法は、サンプル中の標的抗原に指向する少なくとも１つのタイプの抗体からなるかまたはそれから本質的になるＡＬＩＳＡを使用する。本開示の別の態様において、本開示の方法は、サンプル中に含まれる不必要な成分に指向する少なくとも１つのタイプの抗体を含むＡＬＩＳＡを使用する。したがって、この態様において、その抗体は、サンプル中の「非標的抗原」に結合する。代替の実施形態において、本開示の方法は、サンプル中の非標的抗原に指向する少なくとも１つのタイプの抗体からなるかまたはそれから本質的になるＡＬＩＳＡを使用する。
【００８７】
別の態様において、ＡＬＩＳＡは、異なる抗原に指向する抗体を含み得る。したがって、この態様は、例えば、サンプル中の２種以上の標的および／または不必要な成分に結合するために使用され得る。この態様は、例えば、同じ標的または不必要な成分の異なる抗原に指向する抗体を連結するためにも使用され得る。代替の実施形態において、本開示の方法は、異なる抗原に指向する抗体からなるかまたはそれから本質的になるＡＬＩＳＡを使用する。
【００８８】
ＡＬＩＳＡを調製するために使用される抗体は、先に記載されたように、多くの種々の形態であり得る。抗体は、先に記載されたように、ヒトまたは他の任意の種が起源であり得る。
【００８９】
沈降剤への抗体の連結および付着
上で詳細に記載されたように、抗体は、本開示のＡＬＩＳＡを調製するために、沈降剤に連結されるかまたは付着される。それらの抗体は、沈降剤に直接または間接的に連結され得る。抗体を沈降剤に付着する作用は、先に記載されたような当該分野で広く公知の方法または手法を用いて行われ得る。
【００９０】
代替または随意の実施形態
本明細書中では、可能性のある沈降剤、抗体、標的、分離方法などの様々な列挙が例証のために提供され、ゆえに、限定の意味とみなされるべきでないことに注意されたい。当業者は、本開示のＡＬＩＳＡおよび方法において使用され得るいくつかの他の公知の沈降剤、抗体、標的、分離方法などを認識するだろう。さらに、沈降剤、抗体、標的、分離方法などの効果的なまたは所望の組み合わせの選択は、当業者によっておよそ通例の実験によって認識され得るかまたは判断され得る。しかしながら、例示的な組み合わせは、例えば、以下であり得る：
【００９１】
【表１】
2013546002.tif 000003
キット
本開示はさらに、サンプルから標的を単離するためのキットに関する。そのキットは、少なくとも１つの容器に、沈降剤およびその沈降剤に連結された少なくとも１つの抗体を含む抗体連結型免疫沈降剤を備える。そのキットは、例えば、標的および／または不必要な成分のポジティブおよび／またはネガティブセレクションについての詳細、分離の方法、沈降のための方法、層から標的を分離する方法などを含む、そのキットを使用する方法についての指示書も備える。指示書は、キットとともに含められる書面の指示書および別個に提供される指示書を含み得る。別個の指示書は、例えば、インターネットウェブサイト上に提供され得る。
【００９２】
あるいは、キットは、２つの別個の容器（例えば、沈降剤用の容器および抗体用の容器）を備え得、ＡＬＩＳＡを調製するために抗体を沈降剤に連結するための指示書をさらに備え得る。
【００９３】
本開示は、以下の非限定的な実施例を検討すると、より完全に理解されるだろう。
【実施例】
【００９４】
例示的な態様
実施例１
トリクロロ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｒ）−ｓ−トリアジンを用いたＡＬＩＳＡの調製
この実施例では、トリクロロ−ｓ−トリアジンを用いてＡＬＩＳＡを調製する。無水炭酸ナトリウム（１ｇ）を、２００ｍｌの無水有機溶媒（例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは１，４−ジオキサン）に加える。次いで、０．５５ｇのトリクロロ−ｓ−トリアジン（ＴｓＴ）をその炭酸ナトリウム溶液に溶解する。沈降剤（１ｍｍｏｌ）（およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）をその炭酸ナトリウム溶液に加える。次いで、その溶液を、室温で一晩撹拌する。次いで、その溶液を濾過する。次いで、濾液を十分量の無極性有機溶媒（例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル）（５００ｍｌ）に加えることにより、濾過によって回収される、活性化された沈降剤の沈殿物が得られる。この活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。その活性化された沈降剤に連結される抗体（１００ｍｇ，０．６７μｍｏｌ（ｅａ））を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０ｍｌの緩衝液（例えば、ｐＨ９．４の０．１Ｍホウ酸ナトリウム）に溶解する。上記の活性化された沈降剤（１０μｍｏｌ／抗体，およそ０．２ｇのＰＥＧ−２０Ｋ、０．７ｇのＤｅｘｔｒａｎ−７０または１．８ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、氷浴内（約４℃の温度）の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を４℃で１時間撹拌する。最終的なＡＬＩＳＡを単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【００９５】
実施例２
Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメートを用いたＡＬＩＳＡの調製
この実施例では、Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメートを用いてＡＬＩＳＡを調製する。沈降剤（１ｍｍｏｌ）（およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、室温の２００ｍｌの無水有機溶媒（例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは１，４−ジオキサン）に加える。別個で、Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメート（６ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥アセトンに溶解する。別個で、４−（ジメチルアミノ）ピリジンを１０ｍｌの乾燥アセトンに溶解する。そのスクシンイミジルクロロホルメート溶液を、沈降剤溶液に撹拌しながら加える。次に、４−（ジメチルアミノ）ピリジン溶液を、合わせたスクシンイミジルクロロホルメート／沈降剤反応溶液に加える。その溶液を、室温で２時間撹拌する。その溶液を濾過して、沈殿した４−（ジメチルアミノ）ピリジンハイドロクロライド副産物を除去する。無極性有機溶媒（例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル）（５００ｍｌ）を濾液に加えることにより、スクシンイミジルカーボネートによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。その活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。その沈降剤に連結される抗体（１００ｍｇ，０．６７μｍｏｌ（ｅａ））を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０ｍｌの緩衝液（例えば、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸ナトリウム）に溶解する。上記の活性化された沈降剤（１０μｍｏｌ／抗体）（およそ０．２ｇのＰＥＧ−２０Ｋ、０．７ｇのＤｅｘｔｒａｎ−７０または１．８ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、氷浴内（約４℃の温度）の上記反応溶液にゆっくり加える。その溶液を、４℃で１時間撹拌する。最終的なＡＬＩＳＡを単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【００９６】
実施例３
Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを用いたＡＬＩＳＡの調製
この実施例では、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いてＡＬＩＳＡを調製する。沈降剤（１ｍｍｏｌ）（およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、室温の２００ｍｌの無水有機溶媒（例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは１，４−ジオキサン）に加える。別個で、ＣＤＩ（６ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの上記有機溶媒に溶解する。そのＣＤＩ溶液を、沈降剤溶液に撹拌しながら加える。合わせた反応溶液を３７℃で２時間撹拌する。次いで、その反応溶液を、無極性有機溶媒（例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル）（５００ｍｌ）に加えることにより、ＣＤＩによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。その活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される抗体（１００ｍｇ，０．６７μｍｏｌ（ｅａ））を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０ｍｌの緩衝液（例えば、ｐＨ９〜１０の０．１Ｍ炭酸ナトリウム）に溶解する。上記の活性化された沈降剤（１抗体あたり１０μｍｏｌ）（およそ０．２ｇのＰＥＧ−２０Ｋ、０．７ｇのＤｅｘｔｒａｎ−７０または１．８ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、氷浴内（約４℃の温度）の上記反応溶液にゆっくり加える。その溶液を、４℃で４８時間撹拌する。最終的なＡＬＩＳＡを単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【００９７】
実施例４
Ｍｏｆｆａｔｔ酸化に続く還元的アミノ化を用いたＡＬＩＳＡの調製
この実施例では、Ｍｏｆｆａｔｔ酸化に続く還元的アミノ化を用いてＡＬＩＳＡを調製する。沈降剤１ｍｍｏｌ（およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、室温の１００〜２００ｍｌの無水ジメチルスルホキシドに加える。沈降剤を溶解するためにその溶液を加熱してもよいが、溶解したら、室温に冷却し戻す。別個で、その溶液に無水酢酸（３ｍｌ，３０ｍｍｏｌ）を滴下した後、５ｍｌのトリエチルアミンを添加する。合わせた反応溶液を、室温で２４時間撹拌する。次いで、その反応溶液を、無極性有機溶媒（例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル）（５００ｍｌ）に加えることにより、アルデヒドによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。この活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される抗体（１００ｍｇ，０．６７μｍｏｌ（ｅａ））を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０ｍｌの緩衝液（例えば、ｐＨ７．５の０．１Ｍ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ））に溶解する。別個で、その反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍＭ，０．６２８ｍｇ）を添加する。上記の活性化された沈降剤（１０μｍｏｌ／抗体）（およそ０．２ｇのＰＥＧ−２０Ｋ、０．７ｇのＤｅｘｔｒａｎ−７０または１．８ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、４℃の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を、４℃で２４時間撹拌する。エタノールアミン（１０ｍＭ，０．６１１ｍｇ）を加え、２時間撹拌することによって、その反応をクエンチする。最終的なＡＬＩＳＡを単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【００９８】
実施例５
トリクロロ−ｓ−トリアジンを用いた（ストレプト）アビジン−沈降剤の調製
この実施例では、トリクロロ−ｓ−トリアジンを用いて、（ストレプト）アビジン−沈降剤を調製する。無水炭酸ナトリウム（１ｇ）を、２００ｍｌの無水有機溶媒（例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは１，４−ジオキサン）に加える。次いで、０．５５ｇのトリクロロ−ｓ−トリアジン（ＴｓＴ）をその反応溶液に溶解する。沈降剤（１ｍｍｏｌ）（およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）をその反応溶液に加える。次いで、その反応溶液を室温で一晩撹拌する。次いで、その反応溶液を濾過する。次いで、濾液を、十分量の無極性有機溶媒（例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル）（５００ｍｌ）に加えることにより、濾過により回収される沈殿物を得る。この活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される（ストレプト（Ｓｔｒｅｐ））アビジン（１００ｍｇ）を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０ｍｌの緩衝液（例えば、ｐＨ９．４の０．１Ｍホウ酸ナトリウム）に溶解する。上記の活性化された沈降剤（１０μｍｏｌ）（およそ０．２ｇのＰＥＧ−２０Ｋ、０．７ｇのＤｅｘｔｒａｎ−７０または１．８ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、氷浴内（温度４℃）の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を、４℃で１時間撹拌する。最終的な（ストレプト）アビジン−沈降剤を単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【００９９】
実施例６
Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメートを用いた（ストレプト）アビジン沈降剤の調製
この実施例では、Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメートを用いて、（ストレプト）アビジン沈降剤を調製する。沈降剤（１ｍｍｏｌ）（およそ２０ｇのポリエチレングリコール−ＰＥＧ−２０，０００、７０ｇのデキストラン−Ｄｅｘｔｒａｎ−７０または１８０ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、室温の２００ｍｌの無水有機溶媒（例えば、アセトン、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたは１，４−ジオキサン）に加える。別個で、Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメート（６ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥アセトンに溶解する。別個で、４−（ジメチルアミノ）ピリジンを１０ｍｌの乾燥アセトンに溶解する。スクシンイミジルクロロホルメート溶液を、沈降剤溶液に撹拌しながら加える。次に、４−（ジメチルアミノ）ピリジン溶液を、合わせた反応溶液に加える。合わせた反応溶液を、室温で２時間撹拌する。その反応溶液を濾過することにより、沈殿した４−（ジメチルアミノ）ピリジンハイドロクロライド副産物を除去する。無極性有機溶媒（例えば、石油エーテルまたはジエチルエーテル）（５００ｍｌ）を濾液に加えることにより、スクシンイミジルカーボネートによって活性化された沈降剤を沈殿させる。その活性化された沈降剤を濾過により回収する。その活性化された沈降剤の沈殿物を、上記有機溶媒に再溶解し、濾過し、上記無極性溶媒中で沈殿させ、濾過することによって、さらに浄化する。沈降剤に連結される（ストレプト）アビジン（１００ｍｇ）を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０ｍｌの緩衝液（例えば、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸ナトリウム）に溶解する。上記の活性化された沈降剤（１０μｍｏｌ）（およそ０．２ｇのＰＥＧ−２０Ｋ、０．７ｇのＤｅｘｔｒａｎ−７０または１．８ｇのヒドロキシエチルデンプン−Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）を、氷浴内（温度４℃）の上記反応溶液にゆっくり加える。その反応溶液を、４℃で１時間撹拌する。最終的な（ストレプト）アビジン−沈降剤を単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【０１００】
実施例７
ビオチン化された抗体および（ストレプト）アビジン−沈降剤を用いたＡＬＩＳＡの調製
この実施例では、ビオチン化された抗体に連結された（ストレプト）アビジン−沈降剤を用いてＡＬＩＳＡを調製する。実施例５または６に従って合成された（ストレプト）アビジン−沈降連結型沈降剤を、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４；２８０〜３００ｍｏｓＭという容量オスモル濃度）に溶解する。その（ストレプト）アビジン−沈降剤の濃度は、ＡＬＩＳＡにおいて使用される抗体に対して過剰である（１．５〜１０倍）。選択されたビオチン化された抗体を、１抗体あたり約０．１２５μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌという最終濃度が達成されるように、ＡＬＩＳＡ溶液に加える。この抗体濃度は、高価な抗体試薬の使用量を最小にする滴定実験によって最適化される。その（ストレプト）アビジン−沈降剤およびビオチン化された抗体を、０℃〜３７℃で１０〜６０分間インキュベートする。過剰なビオチンがさらに加えられ、インキュベートされることにより、（ストレプト）アビジン−沈降剤上の非占有で残っている部位がブロッキングされ得る。最終的な（ストレプト）アビジン−ＡＬＩＳＡを単離または濃縮する（例えば、透析膜、アフィニティカラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって）。
【０１０１】
実施例８
ポジティブセレクションによるリンパ球の単離
この実施例では、ポジティブセレクション法における方法に従って、全血からリンパ球を単離する。全血（１０ｍｌ）を患者から採取し、ラベンダー色のキャップのＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ回収チューブに回収する（Ｋ２ＥＤＴＡ  １．８ｍｇ／ｍｌ血液）。他の抗凝固薬（例えば、３．２％クエン酸ナトリウムまたは１５ＵＳＰナトリウムヘパリン／ｍｌ血液）を同様に使用してもよい。直接的な注射器への採血システムおよび血液バッグ回収システムを含む他の回収システムも使用され得る。上記の実施例１〜４に記載されたように、ＰＥＧ２０Ｋに連結された抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ−１）およびＰＥＧ２０Ｋに連結された抗ＣＤ１９（クローンＡＥ１）を付着することによってＡＬＩＳＡを別個に調製する。約０．１２５μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌという最終的な抗体濃度が得られるように上記ＡＬＩＳＡ溶液を添加する。その抗体濃度は、滴定実験によって最適化される。この実施例では、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９試薬の各々のＡＬＩＳＡ（５０μｇ）（各２０μｌの１ｍｇ抗体／ｍｌの原液）を全血サンプルに加える。さらに、６０μｌの未標識沈降剤（この実施例ではＰＥＧ２０Ｋ）を添加することにより、０．６％という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を３０秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で２０分間インキュベートし、次いで、１０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離する。不必要な成分（血小板、血漿および好中球）は、バフィーコート／ＷＢＣ層および血漿層に残存し、標的にされているリンパ球は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワークＲＢＣ層内に沈降する。不必要な上層を除去し、ＲＢＣを溶解し（例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液）、洗浄後に、標的にされているリンパ球を回収する。
【０１０２】
実施例９
ポジティブセレクションによる膵ランゲルハンス島の単離
この実施例では、ポジティブセレクション法において、膵腺房細胞／外分泌細胞および間質細胞から膵ランゲルハンス島の細胞を分離する。コラゲナーゼ処理および可能なトリプシン阻害を含むＲｉｃｏｒｄｉ法によって、膵臓組織を調製する。この実施例では、抗インスリン抗体のＡＬＩＳＡ（８００μｇ）（３２０μｌの１ｍｇ抗体／ｍｌの原液）を、２０ｍｌの膵臓消化溶液に加える。抗グルカゴンおよび抗ソマトスタチンのＡＬＩＳＡも使用してよい。未標識沈降剤（この実施例ではＰＥＧ２０Ｋ）（２４０μｌ）を添加することにより、０．６％という沈降剤の総濃度を得る。さらに２０ｍｌの自己の濃縮ＲＢＣを混合物に加える。その混合物を３０秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で２０分間インキュベートし、次いで、１０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離する。不必要な成分（腺房細胞／外分泌細胞および間質細胞）は、バフィーコート／ＷＢＣ層および血漿層に残存し、標的にされている島は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワークＲＢＣ層内に沈降する。不必要な上層を除去し、ＲＢＣを溶解し（例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液）、洗浄後に、標的にされているランゲルハンス島を回収する。
【０１０３】
実施例１０
ポジティブセレクションによる骨髄単離物または末梢血幹細胞単離物からのＣＤ３４＋幹細胞の単離
この実施例では、ポジティブセレクション法において、骨髄単離物または末梢血幹細胞単離物からＣＤ３４＋幹細胞を単離する。ＰＢＳで１００ｍｌの出発体積に調整された骨髄または末梢血幹細胞単離物にＡＬＩＳＡを添加する。この実施例では、抗ＣＤ３４抗体のＡＬＩＳＡ（４ｍｇ）（４ｍｌの１ｍｇ抗体／ｍｌの原液）およびさらなる１００ｍｌの自己の濃縮ＲＢＣを上記幹細胞単離物溶液に加える。未標識沈降剤（この実施例ではＰＥＧ２０Ｋ）（１．２ｍｌ）を添加することにより、０．６％という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を２分間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で３０分間インキュベートし、次いで、１０００×ｇ、室温で１５分間遠心分離する。不必要な成分は、バフィーコート／ＷＢＣ層および血漿／ＰＢＳ層に残存し、標的にされているＣＤ３４＋幹細胞は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワークＲＢＣ層内に沈降する。不必要な上層を除去し、ＲＢＣを溶解し（例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液）、洗浄して遊離ヘモグロビンを除去した後に、標的にされているＣＤ３４＋幹細胞を回収する。
【０１０４】
実施例１１
ネガティブセレクションによるＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
この実施例では、ネガティブセレクション法における方法に従って、全血から細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する。全血（１０ｍｌ）を患者から採取し、ラベンダー色のキャップのＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ回収チューブに回収する（Ｋ２ＥＤＴＡ  １．８ｍｇ／ｍｌ血液）。他の抗凝固薬（例えば、３．２％クエン酸ナトリウムまたは１５ＵＳＰナトリウムヘパリン／ｍｌ血液）を同様に使用してもよい。直接的な注射器への採血システムおよび血液バッグ回収システムを含む他の回収システムも使用され得る。上記の実施例１〜４に記載されたように、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１２３、抗ＴＣＲγ／δおよび抗グリコホリンＡをＰＥＧ２０Ｋに付着することによってＡＬＩＳＡを別個に調製する。そのＡＬＩＳＡ溶液を添加することにより、各抗体につき約０．１２５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌという最終的な抗体濃度を得る。その抗体濃度は、滴定実験によって最適化される。この実施例では、各試薬抗体のＡＬＩＳＡ（２．５μｇ〜５０μｇ）（各抗体について、各４０μｌの０．１〜１ｍｇ／ｍｌの組み合わされた９抗体原液）を、全血サンプルに加える。さらに、６０μｌの未標識沈降剤（この実施例ではＰＥＧ２０Ｋ）を添加することにより、０．６％という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を３０秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で２０分間インキュベートし、次いで、１０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離する。標的にされていて求められているＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、バフィーコート／ＷＢＣ層に残存し、不必要な細胞（ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δ、グリコホリンＡ表面マーカーによって標的化される）は、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワークＲＢＣ層内に沈降する。
【０１０５】
実施例１２
ポジティブセレクションによるＨＩＶ−１ビリオンの単離
この実施例では、ポジティブセレクション法によって、サンプルからＨＩＶ−１ビリオンを単離する。全血（１０ｍｌ）をＨＩＶ感染患者から採取し、ラベンダー色のキャップのＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ回収チューブに回収する（Ｋ２ＥＤＴＡ  １．８ｍｇ／ｍｌ血液）。上記の実施例１〜４に記載されたように、ＰＥＧ２０Ｋに連結された抗ＧＰ１２０を付着することによって、ＡＬＩＳＡを別個に調製する。その抗体濃度は、滴定実験によって最適化される。この実施例では、上記抗体のＡＬＩＳＡ（５０μｇ）（２０μｌの１ｍｇ抗体／ｍｌの原液）を全血サンプルに加える。さらに、６０μｌの未標識沈降剤（この実施例ではＰＥＧ２０Ｋ）を添加することにより、０．６％という沈降剤の総濃度を得る。その混合物を３０秒間ボルテックスする。次いで、そのサンプルを室温で２０分間インキュベートし、次いで、１０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離する。不必要な成分（血小板、血漿およびＷＢＣ）は、バフィーコート／ＷＢＣ層および血漿層に残存し、標的にされているＨＩＶビリオンは、ＡＬＩＳＡ−ルロー／ルローネットワークＲＢＣ層内に沈降する。不必要な上層を除去する。ＨＩＶビリオンおよびＲＢＣは、溶解され得（例えば、塩化アンモニウム溶解緩衝液）、標的にされているＨＩＶビリオンは、リアルタイム定量的ＰＣＲによって定量され得る。
【０１０６】
上記を考慮すると、本開示のいくつかの利点が達成され、他の有益な結果も獲得されると理解されるだろう。本開示の範囲から逸脱することなく上記プロセスおよび複合物に様々な変更が行われ得るので、上記の説明に含まれるすべての事項および添付の図面に示されるすべての事項が、例証的であって、限定の意味でないと解釈されるものとすると意図される。
【０１０７】
本開示またはその様々なバージョン、実施形態もしくは態様のエレメントを紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「前記」は、それらのエレメントの１つ以上が存在することを意味すると意図されている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する」は、包括的であると意図されており、列挙されるエレメント以外の追加のエレメントが存在し得ることを意味する。
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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