(57)【要約】本開示は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、その細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞のゲノム安定性を高めるため、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるテロメア長を伸ばすため、もしくはその両方のための方法を提供する。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはＺｓｃａｎ４＋のｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団（Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞とＺｓｃａｎ４−のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の両方を含み得る）から選択することによって、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団におけるゲノム安定性を高めるため、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団におけるテロメア長を伸ばすため、もしくはその両方のための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された胚性幹（ＥＳ）細胞または単離された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のゲノム安定性を高めるため；または単離されたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるテロメア長を伸ばすため；もしくはその両方のための方法であって、該方法は、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞と薬剤とを接触させる工程であって、該薬剤が、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を、該薬剤が存在しないＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現と比較して増加させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記薬剤が、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離された核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を可能にするのに十分な条件下で、前記単離された核酸分子を該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞にトランスフェクトする工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離された核酸分子が、ベクターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、プラスミドベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが、プロモーターに作動可能に連結されたＺｓｃａｎ４をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｚｓｃａｎ４が、マウスＺｓｃａｎ４ｃまたはヒトＺＳＣＡＮ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マウスＺｓｃａｎ４ｃのヌクレオチド配列が、配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
マウスＺｓｃａｎ４ｃのヌクレオチド配列が、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトＺＳＣＡＮ４のヌクレオチド配列が、配列番号３６のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトＺＳＣＡＮ４のヌクレオチド配列が、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトＺＳＣＡＮ４のヌクレオチド配列が、配列番号３６からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、レチノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記レチノイドが、オールトランスレチノイン酸、９−ｃｉｓレチノイン酸、１３−ｃｉｓレチノイン酸またはビタミンＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、酸化ストレスを誘導する薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が、哺乳動物ＥＳ細胞または哺乳動物ｉＰＳ細胞である、請求項１〜１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物ＥＳ細胞または前記哺乳動物ｉＰＳ細胞が、マウスＥＳ細胞またはマウスｉＰＳ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞の集団におけるゲノム安定性を高めるため；または単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞の集団におけるテロメア長を伸ばすため；もしくはその両方のための方法であって、該方法は、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団からＺｓｃａｎ４＋細胞を選択する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団からＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を選択する工程は、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団を、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたＺｓｃａｎ４プロモーターを含む発現ベクターでトランスフェクトする工程を包含し、ここで、該レポーター遺伝子の発現は、Ｚｓｃａｎ４がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の部分集団において発現されていることを示す、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｚｓｃａｎ４プロモーターが、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターが、配列番号３８のヌクレオチド９０６〜４４６８として示されている核酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質またはそのバリアントである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現ベクターが、配列番号３８として示されている核酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が、哺乳動物ＥＳ細胞または哺乳動物ｉＰＳ細胞である、請求項２２〜２８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物ＥＳ細胞または前記哺乳動物ｉＰＳ細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物ＥＳ細胞または前記哺乳動物ｉＰＳ細胞が、マウスＥＳ細胞またはマウスｉＰＳ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＥＳ細胞治療を必要とする被験体を処置するための医薬の調製における、未分化なＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞または未分化なＺｓｃａｎ４＋のｉＰＳ細胞の部分集団の使用。
【請求項３３】
前記被験体が、がん、自己免疫疾患、神経損傷または神経変性障害を有する、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
ＥＳ細胞治療を必要とする被験体を処置するための医薬の調製における、インビトロにおいて分化させたＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはＺｓｃａｎ４＋のｉＰＳ細胞の部分集団の使用。
【請求項３５】
前記被験体が、がん、自己免疫疾患、神経損傷または神経変性障害を有する、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはＺｓｃａｎ４＋のｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団から選択する工程をさらに包含する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはＺｓｃａｎ４＋のｉＰＳ細胞を選択する工程が、前記細胞の集団を、Ｚｓｃａｎ４プロモーターおよびレポーター遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトする工程を包含し、ここで、該レポーター遺伝子の発現は、Ｚｓｃａｎ４がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の部分集団において発現されていることを示す、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記Ｚｓｃａｎ４プロモーターが、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターである、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
被験体におけるがんを処置するための医薬の調製における、単離されたＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドまたは単離されたＺｓｃａｎ４ポリペプチドの使用。
【請求項４０】
前記単離されたＺｓｃａｎ４ポリペプチドが、ナノ粒子に封入されている、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記単離されたＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドが、ベクターを含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導する方法であって、該方法は、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞または細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導するための医薬の調製における、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤の使用。
【請求項４４】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞において減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導する方法であって、該方法は、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞において減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞において減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導するための医薬の調製における、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤の使用。
【請求項４６】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞をＤＮＡ傷害剤から保護する方法であって、該方法は、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞と薬剤とを接触させる工程であって、該薬剤が、該ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を、該薬剤が存在しないＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現と比較して増加させる工程を包含する、方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ傷害剤が、マイトマイシンＣまたはシスプラチンである、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年９月４日に出願された米国仮特許出願６１／２７５，９８３号の利益を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
分野
本開示は、胚性幹（ＥＳ）細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ならびにＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞においてゲノムの安定性およびテロメアの伸長を促進することにおけるＺｓｃａｎ４の発現の役割に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、ＩＣＭと類似の遺伝子発現パターンを共有する。ＥＳ細胞を定義する特色は、多能性および自己複製であり、これらの両方ともが、長年にわたる集中的な研究の焦点である。マウスＥＳ細胞のもう一つの特徴は、細胞老化に抗し、クライシスまたは形質転換なく２５０回を超す倍加により増殖する能力である（非特許文献１）。正倍数性細胞の割合が、長期培養において減少する傾向があるが（非特許文献２）、マウスＥＳ細胞のゲノムの完全性は、その他の任意の培養細胞よりも厳しく維持される。例えば、ＥＳ細胞は、多数回の継代後でさえ生殖細胞系列となる適格性を有するキメラ動物を形成する能力を維持する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＥＳ細胞における変異頻度もまた、マウス胚性線維芽細胞およびその他の体細胞における変異頻度よりもかなり低い（＞１００倍）（非特許文献６）。マウスＥＳ細胞の独特の特色は、ＥＳ細胞と類似の特徴を共有する胎児性癌腫細胞（非特許文献７）ならびにいくつかのヒトＥＳ細胞（非特許文献８）と比べて低い頻度の染色体異常によってさらに強調され得る。しかしながら、マウスＥＳ細胞がゲノム安定性を維持する機構は、現在のところ理解されていないことが多い。
【０００３】
テロメアは、各細胞周期における継続的な分解から各染色体の末端をキャップおよび保護することによって染色体の完全性を確保および保護するタンパク質を伴っている、反復ＤＮＡ配列である。テロメアの短縮は、ゲノム不安定性に関与することによってがんをもたらし得（非特許文献９）、また、加齢および細胞老化に関連している（非特許文献１０）。テロメア伸長の維持に関わることが知られている主要な酵素としてテロメラーゼが同定された。テロメラーゼは、ＥＳ細胞において活性であるが（非特許文献１１）、テロメラーゼノックアウトＥＳ細胞（Ｔｅｒｃ−／−）は、４００回の細胞倍加で初めてテロメア長の著しい短縮を示し、その後１０〜３０回倍加した後に劇的な老化事象に達し、その後、著しく短いテロメアを有しないテロメラーゼ非依存的集団が確立される（非特許文献１２；非特許文献１３）。それゆえ、テロメア維持のためのテロメラーゼ非依存的機構（テロメアの代替延長（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ）（ＡＬＴ）と命名されている）（非特許文献１４）が、Ｔｅｒｃ−／−ＥＳ細胞について提唱されている。どうやら、テロメアの組換え、すなわちテロメア姉妹染色分体交換（Ｔ−ＳＣＥ）が、テロメラーゼ活性の欠如を補い得る。実際に、Ｔ−ＳＣＥ事象の頻度の上昇は、Ｔｅｒｃ−／−ＥＳ細胞の長期培養物において証明されている（非特許文献１５；非特許文献１６）。
【０００４】
さらに、テロメアの組換えは、着床前胚では正常な機構であると見られる。テロメラーゼの酵素活性が、未受精の卵母細胞期から胚盤胞期までの着床前胚において検出され得ないとしても（非特許文献１７）、テロメア長は、この期間中に急速に長くなる。たった１回の細胞周期において、２細胞期のマウス胚の平均テロメア長は、未受精卵と比べて２倍になる（非特許文献１８）。Ｔ−ＳＣＥ事象が、いくつかの研究において証明されているが、この重要なプロセスに関わる遺伝子は、依然として同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｄａら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３３：１９７−２０１，１９８７
【非特許文献２】Ｒｅｂｕｚｚｉｎｉら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５８：１７−２３，２００８
【非特許文献３】Ｌｏｎｇｏら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ６：３２１−３２８，１９９７
【非特許文献４】Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８４２４−８４２８，１９９３
【非特許文献５】Ｓｕｇａｗａｒａら、Ｃｏｍｐ  Ｍｅｄ  ５６：３１−３４，２００６
【非特許文献６】Ｃｅｒｖａｎｔｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：３５８６−３５９０，２００２
【非特許文献７】Ｂｌｅｌｌｏｃｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３９８５−１３９９０，２００４
【非特許文献８】Ｂｒｉｍｂｌｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １３：５８５−５９７，２００４
【非特許文献９】Ｒａｙｎａｕｄら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６６：９９−１１７，２００８
【非特許文献１０】Ｙａｎｇ，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２２：２１１−２１８，２００８
【非特許文献１１】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７，１９９８
【非特許文献１２】Ｎｉｉｄａら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：２０３−２０６，１９９８
【非特許文献１３】Ｎｉｉｄａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：４１１５−４１２７，２０００
【非特許文献１４】Ｂｒｙａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４２４０−４２４８，１９９５
【非特許文献１５】Ｂａｉｌｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：３７４３−３７５１，２００４
【非特許文献１６】Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１０２５６−１０２６０，２００５
【非特許文献１７】Ｗｒｉｇｈｔら、Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １８：１７３−１７９，１９９６
【非特許文献１８】Ｌｉｕら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１４３６−１４４１，２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本開示は、胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のゲノム安定性を高めるため、またはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞においてテロメア長を伸ばすため、もしくはその両方のための方法を提供する。例えば、そのような方法は、細胞において、正常な核型の存在を増加させ得るか、染色体の融合および断片化を減少させ得るか、ゲノム姉妹染色体交換（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）を減少させ得るか、テロメアの組換えを増加させ得るか、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の例において、方法は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤の非存在下の細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現と比べてＺｓｃａｎ４の発現を増加させるその薬剤と、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を接触させる工程（例えば、その薬剤をＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に導入する工程）を包含する。Ｚｓｃａｎ４の発現を増加させる例示的な薬剤としては、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子、レチノイン酸、および酸化ストレスを誘導する薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団においてゲノム安定性を高めるため、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団においてテロメア長を伸ばすため、もしくはその両方のための方法が、提供される。特定の例において、方法は、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団（Ｚｓｃａｎ４＋とＺｓｃａｎ４−の両方のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を含み得る）から選択する工程を包含する。例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたＺｓｃａｎ４プロモーターを含む発現ベクターでトランスフェクトされ得、ここで、そのレポーター遺伝子の発現は、Ｚｓｃａｎ４がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の部分集団において発現されていることを示す。レポーター遺伝子を発現している細胞が、検出され得（例えば、そのレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質によって生成されるシグナルを検出することによって）、次いで、単離され得る。例えば、そのレポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または関連する蛍光タンパク質（例えば、Ｅｍｅｒａｌｄ）である場合、Ｚｓｃａｎ４陽性細胞は、その蛍光に基づいて認識され得、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって選別され得る。そのレポーター遺伝子が、細胞表面マーカーである場合、Ｚｓｃａｎ４陽性細胞は、ＦＡＣＳ、またはその細胞表面マーカーに結合し得る磁気ビーズによって選別され得る。
【０００８】
Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、治療用に使用され得る。例えば、ＥＳ細胞治療を必要とする被験体が選択され得、そしてＺｓｃａｎ４＋である治療有効量の未分化なＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の部分集団が投与され得る。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から完全に分化した細胞もまた、治療上の投与のために使用され得る。そのような治療の恩恵を受けることができる被験体の例としては、がん、自己免疫疾患、神経損傷または神経変性障害、ならびに再生治療の恩恵を受け得るその他の障害を有する被験体が挙げられる。
【０００９】
がんを有する被験体にＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤を投与することによって、その被験体を処置する方法もまた本明細書において提供される。
【００１０】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導する方法がさらに提供される。いくつかの態様において、その方法は、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導する工程を包含する。
【００１１】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞において減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導する方法もまた提供される。いくつかの態様において、その方法は、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞において減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導する工程を包含する。
【００１２】
Ｚｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と上記細胞を接触させることによってその細胞をＤＮＡ傷害剤から保護する方法も提供される。
【００１３】
本開示の前述およびその他の目的および特色は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｚｓｃａｎ４の発現がマウスＥＳ細胞コロニーにおいて高度に不均一である（ＲＮＡホールマウントインサイチュハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）によって証明される）のに対し、コントロールＰｏｕ５ｆ１の発現は均一であることを示しているデジタル画像の対である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｚｓｃａｎ４−プロモーターＥｍｅｒａｌｄ−レポーターベクターの模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、位相差蛍光顕微鏡（左パネル）および共焦点顕微鏡セクション（右パネル）によるｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞におけるＺｓｃａｎ４プロモーター下のＥｍｅｒａｌｄ発現の可視化を示しているデジタル画像の対である。全ての核が、ＤＡＰＩで標識された。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ｐＺｓｃａｎ４  Ｅｍｅｒａｌｄ細胞のＦＡＣＳプロットである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、それらの蛍光強度に従った、ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞の４群へのＦＡＣＳ選別を示している（上パネル）。各細胞集団におけるＺｓｃａｎ４ｃの発現レベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された（下パネル）。
【図１Ｆ−１】図１Ｆは、ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞の経時的なＦＡＣＳ解析を示している一連のＦＡＣＳプロットである。
【図１Ｆ−２】図１Ｆは、ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞の経時的なＦＡＣＳ解析を示している一連のＦＡＣＳプロットである。
【図１Ｆ−３】図１Ｆは、ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞の経時的なＦＡＣＳ解析を示している一連のＦＡＣＳプロットである。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＤＮＡマイクロアレイ解析によるＥｍｅｒａｌｄ（＋）細胞とＥｍｅｒａｌｄ（−）細胞との間の遺伝子発現プロファイルの対比較を示している散布図である。色分けされたスポットは、統計的に有意に差次的に発現される遺伝子である（ＦＤＲ＜０．０５および変化倍率＞１）。
【図１Ｈ】図１Ｈは、Ｅｍ＋細胞における上位２０個の差次的に発現された遺伝子の表である。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｚｓｃａｎ４、およびＥｍ（＋）細胞におけるアップレギュレーションについて選択された８つの追加の遺伝子（Ｔｃｓｔｖ１、Ｅｉｆ１ａ、Ｐｉｆ１、ＡＦ０６７０６３、ＥＧ６６８７７７、ＬＯＣ３３２９２３、ＢＣ０６１２１２およびＥＧ６２７４８８）のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを示していて、かつ「Ｚｓｃａｎ４様」発現パターンを示している一連のデジタル画像である。コントロール遺伝子は、未分化なＥＳコロニーを取り囲む分化した細胞を染色する栄養外胚葉および臓側内胚葉マーカーであるＫｒｔ２−８／ＥｎｄｏＡ；および多能性マーカーとしてのＰｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４またはＯｃｔ３／４）である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｚｓｃａｎ４転写物（ＦＩＴＣ）と、Ｔｃｓｔｖ３、Ｅｉｆ１ａ、ＡＦ０６７０６３、ＥＧ６６８７７７、ＬＯＣ３３２９２３、ＢＣ０６１２１２およびＥＧ６２７４８８の転写物との同時発現を示している二重蛍光ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションのデジタル画像の一式である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｚｓｃａｎ４、およびＥｍ（＋）細胞においてアップレギュレートされるその他の６つの選択された遺伝子（ＥＧ６２７４８８、Ａｒｇ２、ＡＦ０６７０６３、Ｇｍ４２８、Ｔｃｓｔｖ１／３、ＢＣ０６１２１２）のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示している一連の棒グラフである。未受精の卵母細胞（ＭＩＩ）、１細胞胚（１）、初期２細胞胚（Ｅ２）、後期２細胞胚（Ｌ２）、４細胞胚（４）、８細胞胚（８）、桑実胚（Ｍ）および胚盤胞（ＢＬ）からの結果が示されている。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２ベクターの模式図である。ｃｒｅ−リコンビナーゼ遺伝子は、Ｚｓｃａｎ４プロモーターの下で発現される。タモキシフェンの存在下において、ＣｒｅＥＲＴ２融合酵素は、核に転位し、ＬａｃＺ遺伝子の上流のネオマイシン耐性遺伝子を切除し、ＬａｃＺ発現を活性化させる。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｚｓｃａｎ４に対するＲＮＡ−ＦＩＳＨおよびＣｒｅ−リコンビナーゼに対する免疫染色のデジタル画像の一式であり、これらは、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＥＳ細胞をタモキシフェンに短時間曝した後の細胞の小さい集団におけるＺｓｃａｎ４  ＲＮＡとＣｒｅ−リコンビナーゼとの共染色を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＥＳ細胞をタモキシフェンに長期間曝した後のＰｏｕ５ｆ１およびＬａｃＺの共免疫染色解析を示しているデジタル画像の一式である。全ての核が、ＤＡＰＩで標識された。
【図３Ｄ】図３Ｄは、９継代まで（２７日間）タモキシフェンの存在下において維持され、続いて、ＬａｃＺ活性を証明するためにＸ−ｇａｌで染色されたｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２細胞の一連の位相差像である。継代９代目まで、その細胞の大部分が、ＬａｃＺを特徴とする。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＣＭＦＤＧ染色によるＬａｃＺ発現の解析を示している一連のＦＡＣＳプロットである。タモキシフェンの持続的な存在下におけるＬａｃＺ陽性細胞集団の持続的な増加が観察された。
【図３Ｆ】図３Ｆは、２つの異なる方法：ＣＭＦＤＧを用いたＦＡＣＳ解析およびＸ−ｇａｌで細胞を染色した後の手動でのカウントによって計数されたＬａｃＺ陽性細胞を示しているグラフである。両方の方法が、継代するにつれてＬａｃＺ陽性細胞が直線的に増加するという類似の結果を示している。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＬａｃＺ陽性細胞が、胚様体（ＥＢ）分化アッセイによって３つ全ての主要な細胞系統に寄与することができることを示している一連のデジタル画像である。それらの細胞のＸ−ｇａｌ染色の位相差像は、内胚葉、外胚葉（上皮、分化の３日目までの神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ  ｒｏｓｅｔｔｅｓ）、分化の７日目までのニューロン）および中胚葉（拍動している筋肉）におけるＬａｃＺ陽性Ｚｓｃａｎ４娘細胞を示している。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ＬａｃＺおよび異なる胚葉マーカーに対する共免疫染色を示している一連のデジタル画像である。Ｚｓｃａｎ４娘細胞（ＬａｃＺ発現を特徴とする細胞）は、３つ全ての胚葉に寄与することができる：内胚葉についてはＤａｂ２；中胚葉についてはＡＳＭ−１；および神経外胚葉についてはＮｅｓｔｉｎ。
【図３Ｉ】図３Ｉは、９つの胚（Ｅ１０．５）のジェノタイピングを示しているゲルの像であり、これは、試験された９つの胚のうち８つの胚におけるキメラ現象を証明している。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｚｓｃａｎ４  ｓｈＲＮＡベクターが、Ｚｓｃａｎ４の発現を約９０％ダウンレギュレートしたのに対し、Ｄｏｘ除去によるＺｓｃａｎ４ｃ−ＯＲＦ誘導がＺｓｃａｎ４の発現をレスキューしたことを証明しているｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示しているグラフの対である（上パネル）。ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを、陰性コントロールとして同じ親細胞において使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、Ｚｓｃａｎ４ｄの誘導をもたらすＺｓｃａｎ４ｃの過剰発現を示した（下パネル）；両方のパラログが、ｓｈＲＮＡによってノックダウンされた。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞、および３日間Ｄｏｘを除去することによるＺｓｃａｎ４−ＯＲＦの誘導によってレスキューされた細胞の代表的な像の対である。Ｖｅｎｕｓを遺伝子誘導に対するレポーターとして使用した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン表現型の模式的な説明図である。細胞は、最初の数継代において正常なコロニーの形態を示した；しかしながら、クローン単離後の８継代（およそ３１回の細胞倍加）では、細胞培養物のクライシスが観察された。生き残った細胞を維持することができたが、それらの倍加時間は、異常に長かった。
【図４Ｄ】図４Ｄは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンによる細胞増殖の低下を示しているグラフである。各継代について、４×１０５細胞を播種し、培養３日後に細胞を数えた。
【図４Ｅ】図４Ｅは、細胞培養物のクライシス前の継代７代目における、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンによる増殖の低下（○，△）に対し、Ｚｓｃａｎ４のレスキューが増殖率を改善したこと（●，▲）を示しているグラフである。コントロールには、Ｄｏｘ＋（◇）およびＤｏｘ−（◆）のＴｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞；Ｄｏｘ＋（△）およびＤｏｘ−（▲）のｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞；ならびにＤｏｘ＋（□）およびＤｏｘ−（■）のｓｈＣｏｎｔ細胞が含まれた。２回の独立した実験において、生物学的な三つ組でアッセイを行った。
【図４Ｆ】図４Ｆは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞におけるアポトーシスの増加を示しているグラフである。アネキシン−Ｖによるアポトーシスアッセイを、ＦＡＣＳ解析によって行った。コントロールには、基礎アポトーシスレベルのためのｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞（Ｚｓｃａｎ４）；可能性のあるオフターゲット効果のためのｓｈＲＮＡコントロール細胞（ｓｈＣｏｎｔ）；およびドキシサイクリン効果のためのｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞（Ｅｍｐｔｙ）が含まれた。アポトーシス細胞を、Ｖ−ＰＥ結合体化アネキシン−Ｖ抗体、ならびに死細胞に対する指示薬としての細胞不透過色素（７−ＡＡＤ）によって可視化した。培養物中のアポトーシス生細胞の総数を得るために、死細胞を除外した。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ｓｈＲＮＡコントロールと比べたときの、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞およびＺｓｃａｎ４レスキュー細胞の核型解析を示している表である。継代３代目の結果（左パネル）は、Ｚｓｃａｎ４レスキューによって部分的に妨げられる、融合および断片化のような複数の核型異常を示している。細胞クライシス後の継代１０代目の結果（右パネル）は、Ｚｓｃａｎ４レスキューによって部分的に妨げられる、さらなる核型の変質（３０％だけが正常）を示している。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞の核型の不安定性を示している一連の像である。ＤＡＰＩによって染色された分裂中期染色体スプレッドでの代表的なテロメアＦＩＳＨ像が示されている。左の２つのパネルが、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞の像である。白色の矢印が、欠損したまたは非常に短いテロメアを指し示している。融合は、融合された染色体を示す。右の２つのパネルは、正常なテロメアを有するｓｈＲＮＡコントロール細胞、ならびにテロメア長および核型が改善されたＺｓｃａｎ４レスキュー細胞である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、細胞培養物のクライシスの前（継代６代目）および後（継代９代目）におけるＺｓｃａｎ４ノックダウン細胞のｑＰＣＲ解析によって測定された相対的なテロメア長の比（Ｔ／Ｓ）を示しているグラフである。相対的なテロメア長の比（Ｔ／Ｓ）は、単一コピー遺伝子によってテロメア長を正規化することによって算出された。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞において行われたＱ−ＦＩＳＨを示しているグラフの対であり、これによって有意なテロメアの短縮が確認された。相対的なテロメア長の分布図は、プールされた１０個の核（合計１６００個のテロメア）をＱ−ＦＩＳＨおよびＴＦＬ−Ｔｅｌｏソフトウェアによって解析した結果である。Ｘ軸：テロメア蛍光単位（１ＴＦＵ≒１ｋｂ）。
【図５Ｄ】図５Ｄは、Ｚｓｃａｎ４ｃを過剰発現している細胞におけるテロメアＦＩＳＨ：Ｃｙ３結合体化ＰＮＡ−テロメアプローブおよびＤＡＰＩの代表的な像の対である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、Ｚｓｃａｎ４ｃを過剰発現している細胞における相対的なテロメア長の分布を示しているグラフの対である。
【図５Ｆ】図５Ｆは、Ｚｓｃａｎ４ｃを過剰発現している細胞およびＦＡＣＳによって選別されたｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞（Ｅｍ＋およびＥｍ−）のｑＰＣＲ解析によって測定された、相対的なテロメア長の比（Ｔ／Ｓ）を示しているグラフである。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＲＡＰアッセイによって測定されたテロメラーゼ活性を示しているグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｄｏｘ＋およびＤｏｘ−条件におけるｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞の一連の代表的な像である：ＺＳＣＡＮ４Ｃ−ＦＬＡＧは、Ａｌｅｘａ５４６結合体化抗体によって可視化されている；Ｖｅｎｕｓレポーター；および全ての核が、ＤＡＰＩによって可視化されている。
【図６Ｃ】図６Ｃは、分裂中期スプレッドにおける姉妹染色分体におけるＺＳＣＡＮ４Ｃ−ＦＬＡＧの共局在を示している像の一式である。染色体は、ＤＡＰＩによって染色されている。矢印は、テロメア領域に強い染色を有する染色体を表わしている。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｚｓｃａｎ４を過剰発現している細胞におけるＴ−ＳＣＥの発生数の増加を示している像の一式である。テロメアの組換えの代表的な像が、染色体配向（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）ＦＩＳＨ（ＣＯ−ＦＩＳＨ）アッセイによって可視化されている。染色体は、ＤＡＰＩによって染色されている。Ｃｙ３結合体化（ｃｏｊｕｇａｔｅｄ）テロメアプローブは、テロメアを表わしている。左パネル：ほとんどの核においてテロメアの組換えが起きていないｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞（Ｄｏｘ＋）。中央および右パネル：テロメアの組換え事象の多いｔｅｓｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞（Ｄｏｘ−）（矢頭）。像は、３回の独立した実験の代表的なものである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞におけるＺｓｃａｎ４過剰発現によるＴ−ＳＣＥ頻度の１０倍を超える増加を示している表である。この表は、試料１つあたり２０個を超える核において観察されたＴ−ＳＣＥ事象の合計を示している。陰性コントロールとして、Ｄｏｘ＋条件におけるｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞、およびＴ−ＳＣＥに対する可能性のあるドキシサイクリン効果のためのｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞を使用した。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞における姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）の比率の増加を示している像の一式である。Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞において行われたＳＣＥアッセイの代表的な像が示されている。矢印は、ＳＣＥ事象を表わしている。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＣＥアッセイの結果を示しているグラフであり、これは、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞におけるＳＣＥを提示している細胞のパーセンテージの２．５倍の増加およびゲノム不安定性を証明している。このＳＣＥ実験は、３回の独立した実験において行われ、各実験につき分裂中期の５０個を解析した（ｎ＝５０，合計ｎ＝１５０）。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、影響を受けた分裂中期１つあたりのＳＣＥ事象数もまた有意に増加したことを示しているグラフである。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＥＳ＊状態の特色およびＥＳ細胞に対するＺｓｃａｎ４ノックダウンの影響を示している模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、共焦点顕微鏡検査によって証明されているように、ＺＳＣＡＮ４の免疫染色、およびＺＳＣＡＮ４とテロメアマーカーＴＲＦ１（上パネル）およびＴＲＦ２（下パネル）との共局在を示している一連の像である。核は、ＤＡＰＩによって示されている。サイズバー＝１０μｍ。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｑＰＣＲ解析の結果を示しているグラフであり、これにより、Ｚｓｃａｎ４が、減数分裂特異的相同組換え遺伝子Ｓｐｏ１１、Ｄｍｃ１およびＳｍｃ１βのアップレギュレーションを誘導することが確認された。
【図８Ｃ】図８Ｃは、共焦点顕微鏡検査による免疫染色解析を示している一連の像である。ＺＳＣＡＮ４細胞増殖巣は、ＳＰＯ１１と共局在しており（上パネル）、ほとんどの細胞においてγ−Ｈ２ＡＸ細胞増殖巣と共局在している（下パネル）。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞におけるＺＳＣＡＮ４と、ＴＲＦ１（上パネル）およびＤＭＣ１／γ−Ｈ２ＡＸ細胞増殖巣（下パネル）とのテロメア局在を示している一連の像である。
【図９】図９は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下または非存在下、およびレチノイン酸（ＲＡ）の存在下または非存在下でのＭＣ１−ＺＥ７細胞の処理後のＥｍｅｒａｌｄ＋細胞のパーセンテージを示している線グラフである。細胞を、ＬＩＦの存在下（ＬＩＦ＋）かつａｔＲＡの非存在下（ａｔＲＡ−）において、ゼラチンコートプレートに継代した。翌日（０日目）、各ウェルの培地を４つの異なる条件：ＬＩＦ＋ａｔＲＡ−、ＬＩＦ＋ａｔＲＡ＋、ＬＩＦ−ａｔＲＡ−およびＬＩＦ−ａｔＲＡ＋に変更した。その細胞を、培地を毎日交換するが継代せずに、同じ培地中で８日間維持した。細胞を毎日回収し、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＧＦＰ＋細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、培養物中のＺｓｃａｎ４＋細胞のパーセンテージに対する種々のレチノイド（ａｔＲＡ、９−ｃｉｓＲＡ、１３−ｃｉｓＲＡまたはビタミンＡ）の作用を示している線グラフである。レチノイドに曝された７日後までのＥｍｅｒａｌｄ＋ＭＣ１−ＺＥ−７細胞のパーセンテージが示されている。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＥＳ細胞増殖に対する種々のレチノイド（ｒｅｉｎｔｏｉｄ）の作用を示している線グラフである。
【図１１】図１１は、酸化ストレスに応答したＺｓｃａｎ４発現の誘導を示している一連のフローサイトメトリーのプロットである。ＭＣ１−ＺＥ７細胞を標準ＥＳ細胞培地（ＬＩＦ＋）中で培養した。その培地に、１００μＭ、３００μＭまたは１０００μＭの最終濃度で過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を加えた。それらの細胞を２日間培養し、Ｅｍｅｒａｌｄ＋（すなわち、Ｚｓｃａｎ４＋細胞）の割合をフローサイトメトリーによって測定した。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で処理した後のコントロールＥＳ細胞（Ａ）およびｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４  ＥＳ細胞（Ｂ）の生存を示しているグラフである。コントロールＥＳ細胞は、コントロールプラスミド（ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ）を含んでいた。細胞を標準ＥＳ培地（ＬＩＦ＋）中で培養し、２群：（１）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の非存在下、または（２）最終濃度０．２μｇ／ｍｌでのＤｏｘの存在下に継代した。そのＤｏｘ＋およびＤｏｘ−培地は、毎日交換した。４日目に、０〜６００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度のＭＭＣの存在下において細胞を６時間培養した。その培地を交換することによって、ＭＭＣをその培地から除去し、次いで、細胞をさらに３日間、Ｄｏｘ＋培地中でインキュベートし、その培地は毎日交換した。細胞を回収し、生細胞数を数えた。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で処理した後のコントロールＥＳ細胞（Ａ）およびｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４  ＥＳ細胞（Ｂ）の生存を示しているグラフである。コントロールＥＳ細胞は、コントロールプラスミド（ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ）を含んでいた。細胞を標準ＥＳ培地（ＬＩＦ＋）中で培養し、２群：（１）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の非存在下、または（２）最終濃度０．２μｇ／ｍｌでのＤｏｘの存在下に継代した。そのＤｏｘ＋およびＤｏｘ−培地は、毎日交換した。４日目に、０〜６００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度のＭＭＣの存在下において細胞を６時間培養した。その培地を交換することによって、ＭＭＣをその培地から除去し、次いで、細胞をさらに３日間、Ｄｏｘ＋培地中でインキュベートし、その培地は毎日交換した。細胞を回収し、生細胞数を数えた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列表
添付の配列表に収載された核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許法施工規則．１．８２２において定義されるようなヌクレオチド塩基のための標準的な略号およびアミノ酸のための３文字記号を使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、表示された鎖の参照により相補鎖も含まれるものと理解される。
【００１６】
配列表は、本明細書において参照により組み入れられる、２０１０年９月１日に作成された８８ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイル，Ａｎｎｅｘ  Ｃ／Ｓｔ．２５テキストファイルとして提出されている。
【００１７】
添付の配列表において：
配列番号１および２は、Ｚｓｃａｎ４プロモーターを増幅するために使用されたそれぞれ順方向プライマーおよび逆方向プライマーのヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号３〜２０は、ｑＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号２１および２２は、Ｚｓｃａｎ４  ｓｈＲＮＡを増幅するために使用されたプライマー配列である。
【００２０】
配列番号２３は、ＣＯ−ＦＩＳＨ解析のために使用されたヌクレオチドリピートの配列である。
【００２１】
配列番号２４および２５は、Ｚｓｃａｎ４ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号２６および２７は、Ｚｓｃａｎ４ｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号２８および２９は、Ｚｓｃａｎ４ｃのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号３０および３１は、Ｚｓｃａｎ４ｄのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号３２および３３は、Ｚｓｃａｎ４ｅのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号３４および３５は、Ｚｓｃａｎ４ｆのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号３６および３７は、２００９年９月４日現在でＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２６７７の下で寄託されているヒトＺＳＣＡＮ４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号３８は、Ｚｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ発現ベクターのヌクレオチド配列（９３９６ｂｐ）である。Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーター配列の開始ヌクレオチドは、９０６であり、終止ヌクレオチドは、４４６８である。
【００２９】
配列番号３９は、抗体を作製するために使用されたＺｓｃａｎ４のＮ末端エピトープである。
【００３０】
詳細な説明
Ｉ．緒言
Ｚｓｃａｎ４遺伝子は、大規模ｃＤＮＡ配列決定プロジェクト（Ｋｏら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：１７３７−１７４９，２０００；Ｓｈａｒｏｖら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  １：Ｅ７４，２００３；ＷＯ２００８／１１８９５７）およびＤＮＡマイクロアレイ解析（Ｈａｍａｔａｎｉら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ６：１１７−１３１，２００４）を用いたマウス胚の全ての着床前期の発現プロファイリングを用いて以前に同定された。Ｚｓｃａｎ４は、７番染色体のおよそ８５０ｋｂの領域にクラスター形成している６つのパラログ遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ａ〜Ｚｓｃａｎ４ｆ）および３つの偽遺伝子（Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ１〜Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ３）からなる。その６つのパラログのうち、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄおよびＺｓｃａｎ４ｆのオープンリーディングフレームは、ＳＣＡＮドメインならびに４つ全てのジンクフィンガードメインをコードすることから、転写因子としてのそれらの潜在的な役割が示唆される。Ｚｓｃａｎ４の高発現のピークは、マウス胚の後期２細胞期を特徴づける。Ｚｓｃａｎ４の発現（胚盤胞では通常、検出閾値未満である）は、培養下の少数のＥＳ細胞においてインビトロで再活性化される。６つ全てのＺｓｃａｎ４パラログがＥＳ細胞において発現されるが、Ｚｓｃａｎ４ｃが、主要なパラログであるのに対し、Ｚｓｃａｎ４ｄが、２細胞胚において主要なパラログである（Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）。
【００３１】
Ｚｓｃａｎ４が、未分化ＥＳ細胞（他の２細胞胚特異的遺伝子が活性化されている）における独特の一過性の状態に関連するという知見が、本明細書に開示される。さらに、Ｚｓｃａｎ４は、ゲノム完全性の長期間維持のために不可欠であること、および正常な未分化ＥＳ細胞におけるテロメア組換えの制御を媒介するがゆえに、それがＥＳ細胞における長期間にわたる適切な自己複製にとって欠くことができないものになっていることが解明された。Ｚｓｃａｎ４が、テロメアに対する減数分裂特異的相同組換え機構の誘導および動員に関わるという知見も本明細書に開示される。本発明者らはさらに、Ｚｓｃａｎ４の発現が、レチノイドまたは酸化ストレスによって誘導され得ること、およびＺｓｃａｎ４の発現が、ＤＮＡ傷害剤から細胞を保護することを解明した。
【００３２】
ＩＩ．省略形
ＡＬＴ            テロメアの代替延長
ａｔＲＡ          オールトランスレチノイド酸
ｂｐ              塩基対
ＢｒｄＵ          ブロモデオキシウリジン
ＢＳＡ            ウシ血清アルブミン
ｃＤＮＡ          相補ＤＮＡ
ＣＯ−ＦＩＳＨ    染色分体配向ＦＩＳＨ
ＤＮＡ            デオキシリボ核酸
Ｄｏｘ            ドキシサイクリン
ＤＳＢ            二本鎖ＤＮＡ切断
ＥＢ              胚様体
ＥＣ              胎児性癌腫
ＥＧ              胚性生殖
Ｅｍ（＋）        ｅｍｅｒａｌｄ陽性
Ｅｍ（−）        ｅｍｅｒａｌｄ陰性
ＥＳ              胚性幹
ＥＳ＊            ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞
ＦＡＣＳ          蛍光標示式細胞分取
ＦＢＳ            ウシ胎仔血清
ＦＩＳＨ          蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
ＧＳ              生殖細胞系列幹
ＧＦＰ            緑色蛍光タンパク質
ｈＣＧ            ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ＩＣＭ            内部細胞塊
ｉＰＳ細胞        人工多能性幹細胞
ＩＲＥＳ          内部リボソーム侵入部位
ＩＵ              国際単位
ＬＩＦ            白血病抑制因子
ｍａＧＳＣ        多分化能性成体生殖細胞系列幹細胞
ＭＡＰＣ          多分化能性成体前駆細胞
ＯＲＦ            オープンリーディングフレーム
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＦＡ            パラホルムアルデヒド
ＰＭＳＧ          妊娠ウマ血清ゴナドトロピン
Ｑ−ＦＩＳＨ      定量的ＦＩＳＨ
ｑＰＣＲ          定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ｑＲＴ−ＰＣＲ    定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＡ              レチノイン酸
ＲＮＡ            リボ核酸
ＳＥＭ            平均値の標準誤差
ｓｈＲＮＡ        短ヘアピンＲＮＡ
ＳＳＣ            食塩水−クエン酸ナトリウム
ＳＣＥ            姉妹染色分体交換
Ｔｅｔ            テトラサイクリン
ＴＦＵ            テロメア蛍光単位
ＴＲＡＰ          テロメア反復増幅プロトコル
ＴＳ              トロホブラスト幹
Ｔ−ＳＣＥ        テロメア姉妹染色分体交換
ＵＳＳＣ          非制限的体性幹細胞
ＵＴＲ            非翻訳領域
ＵＶ              紫外線
ＷＩＳＨ          ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーション。
【００３３】
ＩＩ．  用語および方法
特記しない限り、技術用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版のＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（１９９４）（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．出版のＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．出版のＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９５）（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出され得る。
【００３４】
本発明の様々な態様の概説を容易にするため、特定の用語の以下の説明を提供する。
【００３５】
投与：被験体に薬剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４を発現するＥＳ細胞またはＥＳ細胞の集団）を任意の有効な経路によって提供することまたは与えること。例示的な投与経路としては、注入（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内または動脈内）が挙げられるがこれに限定されない。
【００３６】
成体幹細胞：細胞分裂によって増加することにより、死んでいる細胞を埋め合わせて、損傷した組織を再生する、胚発生後の全身に見られる未分化な細胞。体性幹細胞としても知られる。
【００３７】
薬剤：任意のタンパク質、核酸分子、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物または関心対象のその他の分子。いくつかの態様において、「薬剤」は、Ｚｓｃａｎ４の発現を増加させる任意の薬剤である。特定の例において、その薬剤は、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子、レチノイド、または酸化ストレスを誘導する薬剤である。
【００３８】
自己免疫疾患：異常な免疫応答（例えば、自己抗原または被験体自身の細胞または組織に特異的な抗体または細胞傷害性Ｔ細胞の産生）に起因する疾患。
【００３９】
がん：異常なまたは制御されない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍。がんに関連することの多いその他の特色としては、転移、付近の細胞の正常な機能の干渉、サイトカインまたはその他の分泌産物の異常なレベルでの放出、および炎症性応答または免疫学的応答の抑制または悪化、周囲のまたは遠位の組織または器官（例えば、リンパ節）の浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」とは、最初の腫瘍部位に残っているがん細胞、および例えば血流またはリンパ系を介して身体のその他の部分に移動するがん細胞をさす。
【００４０】
接触させる：直接的な物理的結合に置くこと；固体と液体の両方の形態を含む。本明細書において使用されるように、「接触させる」は、「曝す」と交換可能に使用される。
【００４１】
縮重バリアント：遺伝暗号の結果として縮重している配列を含む、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天  然アミノ酸が存在し、その大部分が複数のコドンにより特定される。従って、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が不変である限  り、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【００４２】
分化：細胞が特定の型の細胞（例えば、筋細胞、皮膚細胞等）へと発達するプロセスをさす。本開示の情況において、胚性幹細胞の分化とは、特定の細胞系統に向け  た細胞の発達をさす。細胞は、より分化するにつれて、分化能、または複数の異なる細胞型になる能力を失う。本明細書において使用されるように、分化の阻害  とは、特定の系統への細胞の発達の防止または遅延を意味する。
【００４３】
ＤＮＡ修復：細胞が、そのゲノムをコードするＤＮＡ分子に対する損傷を特定し、訂正するプロセスの一群をさす。
【００４４】
胎児性癌腫（ＥＣ）細胞：胚性幹（ＥＳ）細胞の悪性の対応物と考えられている奇形癌腫に由来する多能性幹細胞。
【００４５】
胚性幹（ＥＳ）細胞：発生中の胚盤胞の内部細胞塊から単離された多能性細胞。ＥＳ細胞は、哺乳動物のような任意の生物に由来し得る。一つの態様において、ＥＳ細胞は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、サルおよびヒトから作製される。ヒトおよびマウスに由来するＥＳ細胞が例示的である。ＥＳ細胞は、多能性細胞であり、このことは、それらが、体内に存在する細胞の全て（骨細胞、筋肉細胞、脳細胞など）を生じ得ることを意味する。マウスＥＳ細胞を作製するための方法は、例えば、米国特許第５，６７０，３７２号に認め得る。ヒトＥＳ細胞を作製するための方法は、例えば、米国特許第６，０９０，６２２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／７００２１およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２７９９５に見られ得る。いくつかのヒトＥＳ細胞系が、当該分野で公知であり、公的に入手可能である。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙは、開発されたいくつかのヒトＥＳ細胞系のリストを提供している（リストは、ＮＩＨ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｍｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｇｒａｎｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ．ｈｔｍにてオンラインで閲覧できる）。
【００４６】
封入されている：本明細書において使用されるように、ナノ粒子に「封入されている」分子とは、ナノ粒子内に含まれているか、もしくはナノ粒子の表面に付着されているか、またはそれらの組み合わせである、分子（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質）をさす。
【００４７】
ＥＳ細胞治療：ＥＳ細胞を被験体に投与することを含む処置。特定の例において、そのＥＳ細胞は、Ｚｓｃａｎ４＋であり、ここで、そのＺｓｃａｎ４は、そのＥＳ細胞にとって内因性または外因性である。
【００４８】
蛍光タンパク質：特定の波長の光に曝されたときに蛍光を示す遺伝子にコードされるタンパク質。ほぼ全ての可視光線スペクトルに及ぶ蛍光発光スペクトルプロファイルを特色にする広範囲の蛍光タンパク質の遺伝子バリアントが開発されている。例としては、花虫類の蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（青色光に曝されると緑色蛍光を示す）ならびにそれらの変異体（例えば、ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１（ｍＫａｌａｍａ１以外のものはＹ６６Ｈ置換を含む））、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ（これらはＹ６６Ｗ置換を含む））、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ（これらはＴ２０３Ｙ置換を含む））が挙げられる。その他の特定の例としては、Ｅｍｅｒａｌｄ緑色蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）およびＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが挙げられる。概要については、例えば、Ｓｈａｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２（１２）：９０５−９０９，２００５を参照のこと。
【００４９】
ゲノム安定性：細胞がＤＮＡを正確に複製し、ＤＮＡ複製機構の完全性を維持する能力。安定なゲノムを有するＥＳ細胞は、一般に、細胞老化に抗し、クライシスまたは形質転換を起こすことなく２５０回を超す倍加により増殖し得、低変異頻度および低頻度の染色体異常を有し（例えば、胎児性癌腫細胞と比べて）、ゲノム完全性を維持する。長いテロメアは、細胞老化に対する緩衝を提供すると考えられており、一般に、ゲノム安定性および全体的な細胞の健康状態を示すと考えられている。染色体の安定性（例えば、変異がほとんどないこと、染色体再配列や染色体数の変化がないこと）もまた、ゲノム安定性に関連する。ゲノム安定性の喪失は、がん、神経障害および早期老化に関連する。ゲノム不安定性の徴候としては、変異率の上昇、甚だしい染色体再配列、染色体数の変化、およびテロメアの短縮が挙げられる。
【００５０】
生殖細胞：有性生殖する生物の配偶子（すなわち、卵および精子）を生じる細胞。
【００５１】
異種性：異種性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、異なる供給源または種に由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをさす。例えば、ヒトＥＳ細胞において発現するマウスＺｓｃａｎ４ペプチドは、そのＥＳ細胞にとって異種性である。
【００５２】
宿主細胞：ベクターが伝搬され得るおよびそのＤＮＡが発現され得る細胞。その細胞は、原核生物細胞であってもよいし、真核生物細胞であってもよい。この用語は、被験体宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に起きる変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一でない可能性があることが理解される。しかしながら、「宿主細胞」という用語が使用されるとき、そのような子孫は含まれる。
【００５３】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞：ある特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞から人工的に得られるあるタイプの多能性幹細胞。ｉＰＳ細胞は、哺乳動物のような任意の生物に由来し得る。一つの態様において、ｉＰＳ細胞は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、サルおよびヒトから作製される。ヒトおよびマウスに由来するｉＰＳ細胞が例示的である。特定の（ｐａｒｔｉｃｕａｌｒ）例において、ｉＰＳ細胞は、本明細書に記載されるＥＳ細胞の代わりに（またはそれに加えて）使用される。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋であるｉＰＳ細胞が、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の代わりに（またはそれに加えて）使用され得る。
【００５４】
ｉＰＳ細胞は、多くの点（例えば、ある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、ならびに分化能（ｐｏｔｅｎｃｙ）および分化能力（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ））においてＥＳ細胞と似ている。ｉＰＳ細胞を作製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ｉＰＳ細胞は、代表的には、成体の線維芽細胞のような非多能性細胞への、ある特定の幹細胞関連遺伝子（例えば、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２）のトランスフェクションによって得られる。トランスフェクションは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルス）によって達成され得る。例えば、細胞は、レトロウイルス系を用いてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃでトランスフェクトされ得るか、またはレンチウイルス系を用いてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８でトランスフェクトされ得る。３〜４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が、多能性幹細胞と形態学的におよび生化学的に類似し始め、そして代表的には、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択によって単離される。一つの例において、成体ヒト細胞からのｉＰＳは、Ｙｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５４）：１２２４，２００７）またはＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−７２，２００７）の方法によって作製される。
【００５５】
単離された：単離された核酸は、他の核酸配列、およびその核酸が天然に存在している生物の細胞、即ち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡから実質的に分離または精製されている。従って、「単離された」という用語には、標準的な核酸精製法により精製された核酸が包含される。その用語には、宿主細胞における組み換え発現により調製された核酸も、化学的に合成された核酸も包含される。同様に、「単離された」タンパク質は、そのタンパク質が天然に存在している生物の細胞の他のタンパク質から実質的に分離または精製されており、宿主細胞における組み換え発現により調製されたタンパク質も、化学的に合成されたタンパク質も包含する。
【００５６】
減数分裂：細胞１個あたりの染色体の数が半減する減数の分裂のプロセス。動物では、減数分裂は常に配偶子を形成し、その他の生物では、胞子を生じ得る。有糸分裂と同様に、減数分裂が開始する前に、細胞周期のＳ期の間に元の細胞内のＤＮＡが複製される。２回の細胞分裂によって、複製された染色体が４つの半数体の配偶子または胞子に分離する。減数分裂は、有性生殖にとって不可欠であり、ゆえに、有性生殖する全ての真核生物（単細胞生物を含む）において生じる。減数分裂中に、二倍体生殖細胞のゲノム（染色体に詰められたＤＮＡの長いセグメントから構成されている）は、ＤＮＡ複製の後、２回の分裂を起こし、４つの半数体の細胞を生じる。これらの細胞の各々は、１つの完全な染色体セット、または元の細胞の半分の遺伝子含量を含む。
【００５７】
多分化能細胞：全ての細胞系統ではないが複数の細胞系統を形成し得る細胞をさす。
【００５８】
ナノ粒子：直径が約１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の粒子。本明細書に提供される方法とともに使用するための例示的なナノ粒子は、生体適合性および生分解性のポリマー材料で作製される。いくつかの態様において、それらのナノ粒子は、ＰＬＧＡナノ粒子である。本明細書において使用されるように、「ポリマーナノ粒子」は、特定の物質（単数または複数）の反復サブユニットで構成されているナノ粒子である。「ポリ（乳酸）ナノ粒子」は、反復された乳酸サブユニットを有するナノ粒子である。同様に、「ポリ（グリコール酸）ナノ粒子」は、反復されたグリコール酸サブユニットを有するナノ粒子である。
【００５９】
神経損傷：損傷を受けた患者の運動および／または記憶に悪影響を及ぼす、神経系（例えば、脳または脊髄または特定のニューロン）に対する外傷。例えば、そのような患者は、構音障害（運動性言語障害）、片側不全麻痺または片麻痺に苦しんでいることがある。
【００６０】
神経変性障害：脳および脊髄の細胞を失った状態。神経変性疾患は、やがて機能不全および機能障害をもたらす、ニューロンまたはそのミエリン鞘の変質に起因する。結果として生じる状態は、運動に関する問題（例えば、運動失調）および記憶に関する問題（例えば、認知症）を引き起こし得る。
【００６１】
非ヒト動物：ヒト以外の全ての動物を含む。非ヒト動物には、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、および家禽のような家畜、イヌ、ネコ、ウマ、ハムスターのような競技動物もしくはペット、マウスのようなげっ歯動物、またはライオン、トラ、もしくはクマのような動物園動物が含まれるが、これらに限定はされない。一例に おいて、非ヒト動物は、トランスジェニックのマウス、ウシ、ヒツジ、またはヤギのようなトランスジェニック動物である。非限定的な一つの具体例において、トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。
【００６２】
作動可能に連結された：第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、その第一の核酸配列はその第二の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列と作動可能に連結されている。一 般に、作動可能に連結された核酸配列は、連続しており、二つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
【００６３】
酸化ストレス：活性酸素種の生成と、生体系がその反応中間体を容易に解毒する能力または生じた損傷を修復する能力との間の不均衡。組織の正常な酸化還元状態の撹乱は、細胞の全ての構成要素（タンパク質、脂質およびＤＮＡを含む）を損傷する過酸化物およびフリーラジカルの生成によって有毒作用を引き起こし得る。開示される方法のいくつかの態様において、酸化ストレスを誘導する薬剤は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。
【００６４】
薬学的に許容され得るキャリア：有用な薬学的に許容され得るキャリアは、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５）には、Ｚｓｃａｎ４タンパク質、Ｚｓｃａｎ４核酸分子または本明細書に開示される細胞の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００６５】
一般に、キャリアの性質は、利用される特定の投与モードに依るであろう。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリ  セロール等のような薬学的かつ生理学的に許容される液体を媒体として含んでいる注入可能な液体を含む。固形組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプ  セル剤）の場合、従来の非毒性の固形キャリアには、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。  生物学的に中性のキャリアに加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートのような微量の非毒性の補助物質を含有することができる。
【００６６】
薬学的薬剤：被験体または細胞に適切に投与された場合に、所望の治療的または予防的な効果を誘導することができる化学的化合物、低分子、またはその他の組成  物。「インキュベートすること」は、薬物が細胞と相互作用するために十分な量の時間を含む。「接触させること」は、固形または液状の薬物を細胞と共にイン  キュベートすることを含む。
【００６７】
多能性細胞：生殖細胞を含む、生物の細胞系統（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の全てを形成することができるが、完全な生物を自律的に形成することはできない細胞をさす。
【００６８】
ポリヌクレオチド：任意の長さの（直鎖配列のような）核酸配列。従って、ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが含まれ、染色体に見出される遺伝子配  列も含まれる。「オリゴヌクレオチド」とは、ネイティブのリン酸ジエステル結合により接合された複数の接合されたヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド  は６〜３００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドアナログとは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然には存在しない部分  を有するモエティをさす。例えば、オリゴヌクレオチドアナログは、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのような改変された糖モエティまたは糖間結合のような天然には存在しない部分を含有していてもよい。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的アナログは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合することができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。
【００６９】
ポリペプチド：単量体がアミド結合を通して接合されているアミノ酸残基である重合体。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得るが、Ｌ−異性体が好ましい。本明細書において使用されるような「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質のような修飾された配列を含むものとする。「ポリペプチド」という用語には、特に、天然に存在するタンパク質も、組み換えまたは合成により作製されたものも内含されるものとする。
【００７０】
「ポリペプチド断片」という用語は、少なくとも一つの有用なエピトープを示すポリペプチドの部分をさす。「ポリペプチドの機能的断片」という用語は、Ｚｓｃａｎ４のようなポリペプチドの活性を保持しているポリペプチドの断片全てをさす。生物学的に機能的な断片は、例えば、抗体分子に結合することができるエピトープのような小さいポリペプチド断片から、細胞内の表現型変化の特徴的な誘導またはプログラミングに関与することができる、例えば、細胞の増殖または分化に影響することができる大きなポリペプチドまで、様々なサイズであり得る。「エピトープ」とは、抗原との接触に応答して生成した免疫グロブリンに  結合することができるポリペプチドの領域である。従って、Ｚｓｃａｎ４またはＺｓｃａｎ４の保存的バリアントの生物学的活性を含有している、より小さいペプチドは、有用なものとして含まれる。
【００７１】
「可溶性の」という用語は、細胞膜に挿入されていないポリペプチドの型をさす。
【００７２】
本明細書において使用されるような「実質的に精製されたポリペプチド」という用語は、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、またはその他の材料が実質的に除去されているポリペプチドをさす。一つの態様において、ポリペプチドは、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、またはその他の材料が少なくとも５０％、例えば、少なくとも８０％除去されている。もう一つの態様において、ポリペプチドは、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、またはその他の材料が少なくとも９０％除去されている。さらにもう一つの態様において、ポリペプチドは、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、またはその他の材料が少なくとも９５％除去されている。
【００７３】
保存的置換は、あるアミノ酸を、サイズ、疎水性等が類似しているもう一つのアミノ酸に交換する。保存的置換の例は、以下に示される：
【００７４】
【化１】
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保存的であっても保存的でなくても、アミノ酸変化をもたらすｃＤＮＡ配列の変動は、コードされたタンパク質の機能的および免疫学的な同一性を保存するために、最小限に抑えられるべきである。従って、いくつかの非限定的な例において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドまたは本明細書に開示されたその他のポリペプチドは、高々２個、高々５個、高々１０個、高々２０個、または高々５０個の保存的置換を含む。タンパク質の免疫学的同一性は、それが抗体により認識されるか否かを決定することにより査定され得；そのような抗体により認識されるバリアントは、免疫学的に保存されている。ｃＤＮＡ配列バリアントは、好ましくは、２０個以下、好ましくは１０個以下のアミノ酸置換をコードされたポリペプチドへ導入するであろう。バリアントのアミノ酸配列は、ネイティブアミノ酸配列（例えば、ネイティブＺｓｃａｎ４配列）と、例えば、少なくとも８０％、９０％、またはさらには９５％もしくは９８％同一であり得る。
【００７５】
プロモーター：核酸の転写を指示する核酸調節配列。プロモーターは、必要な核酸配列を転写開始部位付近に含む。プロモーターには、必要に応じて、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントも含まれる。「構成的プロモーター」は、継続的に活性であり、かつ外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子（例えば、転写因子）によって調節される。
【００７６】
レポーター遺伝子：もう一つの遺伝子または関心対象の核酸配列（例えば、プロモーター配列）に作動可能に連結された遺伝子。レポーター遺伝子は、関心対象の遺伝子または核酸が、細胞内で発現されているかまたは細胞内で活性化されているかを決定するために使用される。レポーター遺伝子は、代表的には、蛍光のような容易に同定可能な特徴、または酵素のような容易にアッセイされる生成物を有する。レポーター遺伝子はまた、宿主細胞に抗生物質耐性を付与し得る。例示的なレポーター遺伝子としては、蛍光タンパク質および発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびｄｓＲｅｄ遺伝子由来の赤色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ酵素（ルシフェリンとの反応を触媒することにより光を生じる）、ｌａｃＺ遺伝子（基質アナログのＸ−ｇａｌを含む培地において生育させると、遺伝子を発現している細胞が青色に見えるようにするβ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする遺伝子）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子）が挙げられる。一つの態様において、上記レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質Ｅｍｅｒａｌｄをコードする。もう一つの態様において、上記レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙをコードする。追加の例は、以下に提供される。
【００７７】
レチノイド類：ビタミンＡと化学的に関係するあるクラスの化合物。レチノイド類は、それが上皮細胞の成長を調節する方法に主に起因して、医療において使用される。レチノイド類は、視力、細胞の増殖および分化の調節、骨組織の成長、免疫機能、ならびに腫瘍抑制遺伝子の活性化における役割をはじめとした、全身にわたる多くの重要かつ多様な機能を有する。レチノイド類の例としては、オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）、９−ｃｉｓレチノイン酸（９−ｃｉｓＲＡ）、１３−ｃｉｓＲＡおよびビタミンＡ（レチノール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
老化：細胞がそれ以上に分裂することができないこと。老化細胞は、なおも生存可能であるが、分裂しない。
【００７９】
配列同一性／類似性：２つ以上の核酸配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、それらの配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、同一性のパーセンテージに関して測定され得る；このパーセンテージが高いほど、配列がより同一である。配列類似性は、類似性のパーセンテージ（保存的アミノ酸置換を考慮に入れたもの）に関して測定され得る；このパーセンテージが高いほど、配列がより類似である。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を用いてアラインメントされるとき、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡがより密接な関係のある種に由来するとき（例えば、ヒト配列とマウス配列）、より遠縁の種（例えば、ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比べて、より意味がある。
【００８０】
比較するための配列のアラインメント方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０には、配列のアラインメント方法および相同性の計算に関する詳細な考慮すべき事柄が示されている。
【００８１】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）をはじめとしたいくつかの供給源から入手可能であり、また、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、インターネット上で利用可能である。追加情報は、ＮＣＢＩウェブサイトに見出し得る。
【００８２】
ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。比較された２つの配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、アラインメントされた配列として相同性領域を示し得る。比較された２つの配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、アラインメントされた配列を示さない。
【００８３】
いったんアラインメントされると、両方の配列において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を数えることによって、マッチ数が決定される。配列同一性パーセントは、そのマッチ数を、特定された配列に示される配列の長さで除すかまたはつながった長さ（例えば、特定された配列に示される配列からの１００個連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で除した後、得られた値に１００を乗じることによって決定される。例えば、１１５４ヌクレオチドを有する試験配列とアラインメントされたときに１１６６マッチを有する核酸配列は、その試験配列と７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。この配列同一性パーセントの値は、最も近い小数第１位に丸められる。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３および７５．１４は、７５．１に切り下げられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８および７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さの値は、常に整数である。もう一つの例において、特定された配列由来の２０個の連続したヌクレオチドとアラインメントする２０ヌクレオチド領域を含む標的配列は、以下のとおりその特定された配列と７５パーセントの配列同一性（つまり、１５÷２０＊１００＝７５）を共有する領域を含む。
【００８４】
約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列を比較する場合、デフォルトのパラメータ（１１というギャップ存在コスト（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｃｏｓｔ）および１という１残基当たりのギャップコスト（ｐｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔ））に設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いるＢｌａｓｔ２配列関数が使用される。ホモログは、代表的には、ｎｒまたはｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースのようなデータベースを用いたＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｂｌａｓｔ２．０，ｇａｐｐｅｄ  ｂｌａｓｔｐを用いてアミノ酸配列との完全長のアラインメントにわたってカウントされる少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする。ｂｌａｓｔｎプログラムを用いて検索されるクエリーは、ＤＵＳＴによってフィルターにかけられる（Ｈａｎｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，１９９４，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０）。その他のプログラムは、ＳＥＧを使用し得る。さらに、手動のアラインメントが行われ得る。
【００８５】
短いペプチド（およそ３０アミノ酸より短いペプチド）をアラインメントするとき、そのアラインメントは、デフォルトのパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１のペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０行列を使用するＢｌａｓｔ２配列関数を用いて行われる。全配列より短い配列が、配列同一性について比較されるとき、ホモログは、代表的には、１０〜２０アミノ酸という短い領域（ｓｈｏｒｔ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって少なくとも７５％の配列同一性を有し、また、参照配列に対するその同一性に応じて少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有し得る。そのような短い領域にわたる配列同一性を決定する方法は、ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されている。
【００８６】
２つの核酸分子が密接に関係する１つの指標は、その２つの分子が、上に記載したようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするというものである。それにもかかわらず、高い同一性の程度を示さない核酸配列が、遺伝暗号の縮重に起因して同一または類似の（保存された）アミノ酸配列をコードし得る。全てが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を生じるこの縮重を用いて、核酸配列の変化がもたらされ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることの代替の指標（必ずしも累積的なものではない）は、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるというものである。
【００８７】
当業者は、特定の配列同一性の範囲が、指針としてのみ提供されることを認識する；提供される範囲に入らない非常に重要なホモログが得られ得る可能性がある。
【００８８】
幹細胞：変更のない娘細胞を生じる独特の能力（自己複製；細胞分裂によって、親細胞と同一の少なくとも１つの娘細胞がもたらされること）および特殊化された細胞型を生じる独特の能力（分化能）を有する細胞。幹細胞としては、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＧＳ細胞、ＭＡＰＣ、ｍａＧＳＣ、ＵＳＳＣおよび成体幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一つの態様において、幹細胞は、１つより多い所与の細胞型の完全に分化した機能的な細胞を生じ得る。インビボにおける幹細胞の役割は、動物の通常の生存中に破壊される細胞を交換することである。一般に、幹細胞は、無制限に分裂することができる。幹細胞は、分裂後、幹細胞として残留する場合もあり、前駆細胞になる場合もあり、最終分化へ進む場合もある。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の完全に分化した機能的な細胞を生じ得る細胞である。一般に、前駆細胞は、分裂することができる。前駆細胞は、分裂後、前駆細胞のままであり得るか、または最終分化へ進むこともある。
【００８９】
部分集団：集団の同定可能な一部。本明細書において使用されるように、Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞の「部分集団」は、Ｚｓｃａｎ４を発現していると同定された所与の集団内のＥＳ細胞の一部である。一つの態様において、その部分集団は、Ｚｓｃａｎ４プロモーターおよびレポーター遺伝子を含む発現ベクターを用いて同定され、ここで、細胞におけるそのレポーター遺伝子の発現の検出によって、その細胞がＺｓｃａｎ４を発現していることおよびその部分集団の一部であることが示される。
【００９０】
テロメア：染色体の複製および安定性に関わる特殊化された構造である、真核生物の染色体の末端をさす。テロメアは、特定の配向の短いＤＮＡ配列の多くの反復からなる。テロメアの機能には、染色体の末端が接合されないように染色体の末端を保護すること、および染色体のもっとも末端の複製を可能にすること（テロメラーゼによって）が含まれる。染色体の末端におけるテロメアＤＮＡの反復の数は、加齢に伴って減少する。
【００９１】
治療量：意図される目的を達成するのに十分な治療薬の量。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の治療量は、ＥＳ細胞治療の恩恵を受け得る障害または障害の症状を減少させるのに十分な量である。治療量は、いくつかの例では、その障害または症状を１００％処置しないかもしれない。しかしながら、ＥＳ細胞治療（例えば、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞）の恩恵を受け得る障害の任意の公知の特色または症状の減少（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％またはそれより多くの減少）は、治療的であり得る。所与の治療薬の治療量は、薬剤の性質、投与経路、治療薬を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的のような因子によって変動し得る。各個別の場合における治療量は、当該分野における確立された方法に従って、当業者によって、過度の実験を行うことなく経験的に決定され得る。
【００９２】
全能性細胞：生物全体を自律的に形成することができる細胞をさす。受精卵（卵母細胞）だけが、この能力を有する（幹細胞は有しない）。
【００９３】
トランスフェクトするまたはトランスフェクション：核酸を細胞または組織に導入するプロセスをさす。トランスフェクションは、いくつかの方法（例えば、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび注入であるがこれらに限定されない）のうちのいずれか１つによって達成され得る。
【００９４】
ベクター：宿主細胞に導入されることにより、形質転換された宿主細胞をもたらす核酸分子。ベクターは、複製起点（ＤＮＡ合成の開始に関与するＤＮＡ配列）のような、宿主細胞内でそのベクターが複製することを可能にする核酸配列を含み得る。例えば、発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数または複数）の転写および翻訳を可能にするのに必要な制御配列を含む。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および当該分野で公知のその他の遺伝エレメントも含み得る。ベクターとしては、例えば、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターが挙げられる。
【００９５】
Ｚｓｃａｎ４：２細胞特異的発現およびＥＳ細胞特異的発現を示すものとして同定された遺伝子の群。マウスでは、「Ｚｓｃａｎ４」という用語は、３つの偽遺伝子（Ｚｓｃａｎ１−ｐｓ１、Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ２およびＺｓｃａｎ４−ｐｓ３）および６つの発現される遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅおよびＺｓｃａｎ４ｆ）を含む遺伝子の集団をさす。本明細書において使用されるように、Ｚｓｃａｎ４は、ヒトＺＳＣＡＮ４も含む。Ｚｓｃａｎ４とは、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド、およびそのＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドをさす。
【００９６】
他に説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語が、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明白に示さない限り、複数の対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈がそうでないことを明白に示さない限り、「および」を含むものとする。従って、「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子量値が、近似であり、説明のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書中に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号およびその他の参照が、参照により完全に組み入れられる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が適用されるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものであり、限定するためのものではない。
【００９７】
ＩＩＩ．いくつかの態様の概要
例外的なゲノム安定性は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の特徴の１つである。しかしながら、この安定性に寄与する遺伝子は、未だ同定されていない。Ｚｓｃａｎ４が、ＥＳ細胞におけるテロメアの維持および長期間にわたるゲノム安定性に関わることが本明細書において示される。ＥＳ細胞の未分化な状態を維持する標準ＥＳ細胞培養条件（例えば、ＬＩＦを含む）において、約５％のＥＳ細胞しか、所与の時点においてＺｓｃａｎ４を発現しないが、ほぼ全てのＥＳ細胞が、９回の継代以内にＺｓｃａｎ４＋状態を経験する。一過性のＺｓｃａｎ４陽性状態は、テロメアの組換え、およびテロメア上でＺＳＣＡＮ４と共局在するタンパク質をコードする減数分裂特異的な相同組換え遺伝子のアップレギュレーションによる迅速なテロメア伸長に関連する。さらに、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンは、８回の継代によるクライシスに達するまで、テロメアを徐々に短縮させ、核型の異常および自発的な姉妹染色分体交換を増加させ、細胞増殖を遅延させる。
【００９８】
Ｚｓｃａｎ４遺伝子クラスターは、６つの転写される偽の（ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ）遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ａ〜Ｚｓｃａｎ４ｆ）を含み、これらは、高い配列類似性を共有するので、ひとまとめにしてＺｓｃａｎ４と呼ばれる。Ｚｓｃａｎ４の鋭い発現ピークは、マウス胚の後期２細胞期を特徴づけ、胚の着床、および組織培養における胚盤胞の成長に不可欠である。Ｚｓｃａｎ４ｄは、主に２細胞胚において転写されるのに対し、Ｚｓｃａｎ４ｃは、主にＥＳ細胞において転写され、自己複製と関連する。Ｚｓｃａｎ４ｃとＺｓｃａｎ４ｄの両方が、タンパク質間相互作用を媒介すると予測されているＳＣＡＮドメイン、および４つのＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインをコードする。Ｚｓｃａｎ４が、正常な未分化ＥＳ細胞において、核型の完全性の長期間維持および調節されるテロメア組換えの媒介に関わることが本明細書において示される。
【００９９】
Ｚｓｃａｎ４が、未分化ＥＳ細胞における自発的なテロメア姉妹染色分体交換（ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｉｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）（Ｔ−ＳＣＥ）のアクチベーターとしての独特の機能を有し、テロメア長および核型安定性の調節に関わることも本明細書において示される（図７Ｄ）。Ｚｓｃａｎ４ノックダウンが、最終的に核型の変質および細胞増殖の減少をもたらすので、これらの結果は、Ｚｓｃａｎ４が、長期間にわたるＥＳ細胞の自己複製にとって重要であることを示す。さらに、そのデータから、核型の変質が、テロメアの分解ならびに自発的な非テロメアＳＣＥの増加に起因することが示される。したがって、本開示は、長期間にわたるゲノム安定性およびテロメア維持を持続させる、ＥＳ細胞によって利用される新規機構に対する初めての関連を提供する。
【０１００】
マウスＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４によるテロメアの調節は、以前に報告されたものと異なる。第１に、Ｚｓｃａｎ４が、ＥＳ細胞では一過性に発現されるので任意の所与の時点において約５％の未分化ＥＳ細胞だけしかＺｓｃａｎ４陽性でないことが本明細書で示されるのに対し、ＥＳ細胞において不均一に発現されるその他の遺伝子（Ｔａｎａｋａ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．２１：６７−７５，２００９；Ｃａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ８：１８１−１９８，２００８）は、特定の細胞系統を特徴づけることが多い（Ｔｏｙｏｏｋａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５：９０９−１８，２００８；Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：３９１−４０１，２００８）。構成的なＺｓｃａｎ４の発現は、異常に長いテロメアをもたらすことがあり、これは、なぜこの遺伝子が遍在的に発現されないかを説明し得る。実際に、本明細書における結果は、ＺＳＣＡＮ４タンパク質が、減数分裂特異的な相同組換えメディエーターとともに、テロメア上に細胞増殖巣を形成することができることを示し、これにより、ＥＳ細胞がＴ−ＳＣＥのための新規機構を利用することができることが示唆される。第２に、Ｔ−ＳＣＥによるテロメアの伸長は、例えば、テロメラーゼノックアウトＴｅｒｃ−／−ＥＳ細胞の長期培養物中のほとんどまたは全くテロメラーゼ活性のない細胞において以前に観察されていた（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１０２５６−６０，２００５；Ｎｉｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４１１５−２７，２０００；Ｂａｉｌｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：３７４３−５１，２００４）。同様に、Ｔ−ＳＣＥは通常、テロメラーゼの再活性化を示さない腫瘍細胞において生じる。対照的に、テロメラーゼが、Ｚｓｃａｎ４を発現している正常な未分化ＥＳ細胞において活性であることが本明細書において示される。第３に、テロメアの調節について以前に同定されたほとんどの遺伝子（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ１およびＤＮＭＴ３（Ｇｏｎｚａｌｏら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４１６−４２４，２００６）ならびにウェルナー症候群タンパク質（ＷＲＮ）（Ｌａｕｄら、  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９：２５６０−７０，２００５））のダウンレギュレーションが、Ｔ−ＳＣＥを増加させるおよび／またはテロメア長を伸ばす（Ｄｅ  Ｂｏｅｃｋら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２１７：３２７−４４，２００９）ので、これらの遺伝子は、Ｔ−ＳＣＥの阻害剤である。Ｒｔｅｌ−／−ＥＳ細胞は、分化誘導後にテロメアの短縮を示すので、Ｒｔｅｌ遺伝子は例外である（Ｄｉｎｇら、Ｃｅｌｌ  １１７：８７３−８６，２００４）が、Ｒｔｅｌとは異なり、Ｚｓｃａｎ４は、未分化ＥＳ細胞においてこの表現型を示す。第４に、Ｔ−ＳＣＥによるテロメアの伸長は、通常、非テロメア配列におけるＳＣＥの増加とともに、全体的な染色体の不安定性に起因する（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１０２５６−６０，２００５）。対照的に、Ｚｓｃａｎ４によって媒介されるＴ−ＳＣＥは、一般的なＳＣＥの増加と���連せず、正常な核型は、自発的なＳＣＥ率がより低い状態で安定したままである。
【０１０１】
Ｚｓｃａｎ４の発現レベルは、種々の多能性幹細胞の間で様々であり、このことは、ゲノム安定性の差と相関し得る。例えば、胎児性癌腫（ＥＣ）細胞がゲノム完全性を維持する能力が劣ることと一致して（Ｂｌｅｌｌｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３９８５−９０，２００４）、ＥＣ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現は、ＥＳ細胞よりもかなり低い（Ａｉｂａら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１６：７３−８０，２００９）。ｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現レベル（Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−７６，２００６）は、ＥＳ細胞に匹敵する（Ａｉｂａら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１６：７３−８０，２００９）ことから、ｉＰＳが、ＥＳ様のゲノム維持能力を取り戻した可能性があることが示される。Ｚｓｃａｎ４を活性化することができる細胞を選択することによって、将来の治療目的により適した細胞について富化された培養物が生成され得る。さらに、Ｚｓｃａｎ４の発現の誘導および制御は、その他の細胞型（例えば、幹細胞または癌細胞）におけるゲノム安定性を高める手段を提供する。
【０１０２】
これらの結果に基づいて、単離されたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞のゲノム安定性を高める方法、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞においてテロメア長を伸ばす方法、もしくはその両方の方法が本明細書に提供される。特定の例において、そのような方法は、上記ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞と薬剤とを接触させる工程であって、上記薬剤が、上記ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を、該薬剤が存在しないＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現と比較して増加させる工程を包含する。例えば、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、その薬剤がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に入ってＺｓｃａｎ４の発現を増加させるのを可能にする条件下で、その薬剤とともにインキュベートされ得る。
【０１０３】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導する方法が、さらに提供される。いくつかの態様において、その方法は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の生殖細胞への分化を誘導する工程を包含する。いくつかの態様において、その薬剤は、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子、またはＺｓｃａｎ４タンパク質もしくはその機能的断片である。その他の態様において、その薬剤は、レチノイド（例えば、ａｔＲＡ、９−ｃｉｓＲＡ、１３−ｃｉｓＲＡおよびビタミンＡであるがこれらに限定されない）である。その他の態様において、その薬剤は、酸化ストレスを誘導する。
【０１０４】
単離されたＥＳ細胞または単離されたｉＰＳ細胞における減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導する方法も提供される。いくつかの態様において、その方法は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と接触させることによって、そのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞における減数分裂、減数分裂特異的組換えおよび／またはＤＮＡ修復を誘導する工程を包含する。いくつかの態様において、その薬剤は、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子、またはＺｓｃａｎ４タンパク質もしくはその機能的断片である。その他の態様において、その薬剤は、レチノイド（例えば、ａｔＲＡ、９−ｃｉｓＲＡ、１３−ｃｉｓＲＡおよびビタミンＡであるがこれらに限定されない）である。その他の態様において、その薬剤は、酸化ストレスを誘導する。
【０１０５】
ＤＮＡ傷害剤から細胞を保護する方法であって、その方法は、Ｚｓｃａｎ４の発現を増加させる薬剤と細胞を接触させる工程およびその細胞をＤＮＡ傷害剤に曝す工程を包含し、ここで、コントロールと比べてその細胞の生存の増加は、その薬剤がそのＤＮＡ傷害剤からその細胞を保護していることを示唆する方法である。いくつかの態様において、そのコントロールは、そのＤＮＡ傷害剤に曝された、Ｚｓｃａｎ４を発現するように誘導されていない細胞である。いくつかの態様において、その細胞は、ＤＮＡ傷害剤に曝される前にその薬剤と接触される。その他の態様において、その細胞は、同時にＤＮＡ傷害剤に曝されつつ、その薬剤と接触される。なおもその他の態様において、その細胞は、ＤＮＡ傷害剤に曝された後にその薬剤と接触される。いくつかの態様において、その薬剤は、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子、またはＺｓｃａｎ４タンパク質もしくはその機能的断片である。いくつかの態様において、その薬剤は、レチノイド（例えば、ａｔＲＡ、９−ｃｉｓＲＡ、１３−ｃｉｓＲＡおよびビタミンＡであるがこれらに限定されない）である。いくつかの態様において、その薬剤は、酸化ストレスを誘導する。いくつかの態様において、そのＤＮＡ傷害剤は、化学療法薬である。特定の例において、そのＤＮＡ傷害剤は、マイトマイシンＣまたはシスプラチンである。
【０１０６】
ＥＳ細胞が本願全体にわたって記載されるが、当業者は、開示される組成物および方法においてＥＳ細胞の代わりにｉＰＳ細胞が使用され得ることを認識することに注意されたい。したがって、例えば、ＥＳ細胞治療を必要とする患者を処置するためにｉＰＳ細胞を使用する方法が提供されるのと同様に、ｉＰＳ細胞のゲノム安定性を高める方法、ｉＰＳ細胞におけるテロメア長を伸ばす方法またはその両方が提供される。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞に非常に似ているが、核移植（クローニング）の手法を経ることなく、ヒト線維芽細胞およびその他の分化した細胞から作製され得る。Ｚｓｃａｎ４は、ｉＰＳ細胞において、ＥＳ細胞内と同レベルで発現され、本発明者らは、Ｚｓｃａｎ４が、培養下の少数（５％）のｉＰＳ細胞だけで発現されることも示した。したがって、ヒトまたはその他の哺乳動物のｉＰＳ細胞（例えば、Ｚｓｃａｎ４を発現しているｉＰＳ細胞（Ｚｓｃａｎ４＋ｉＰＳ細胞））は、本明細書に提供される方法において、ＥＳ細胞の代わりに（またはそれに加えて）使用され得る。
【０１０７】
さらに、本開示される組成物および方法が、がんの処置に有用であり得ること（下記にさらに詳細に記載される）にさらに注意されたい。したがって、ＥＳ細胞が、本願全体にわたって記載されるが、当業者は、開示される組成物および方法においてＥＳ細胞の代わりにがん細胞が使用され得ることを認識する。例えば、がん細胞への直接的な投与のような、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することによってがんを有する被験体を処置する方法が提供されるのと同様に、がん細胞のゲノム安定性を高める方法、がん細胞においてテロメア長を伸ばす方法、またはその両方の方法が提供される。
【０１０８】
細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を増加させ得る例示的な薬剤としては、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離された核酸分子が挙げられる。Ｚｓｃａｎ４タンパク質およびコード配列は、下記で詳細に検討されるように当該分野で周知である。下記のＩＶ項に記載される分子のいずれかが、本明細書に提供される方法において使用され得る。当業者は、マウスＺｓｃａｎ４ｃまたはヒトＺＳＣＡＮ４をコードする核酸配列のような任意のＺｓｃａｎ４コード配列が使用され得ることを認識する。例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現を可能にするのに十分な条件下において、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離された核酸分子でトランスフェクトされ得る。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離された核酸分子は、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターのようなベクターの一部である。一つの例において、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離された核酸分子は、Ｚｃｓａｎ４の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結され得る。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターが使用され得る。
【０１０９】
いくつかの態様において、Ｚｓｃａｎ４の発現を誘導する薬剤は、レチノイドである。例示的なレチノイドとしては、ａｔＲＡ、９−ｃｉｓＲＡ、１３−ｃｉｓＲＡおよびビタミンＡが挙げられるが、これらに限定されない。その他の態様において、Ｚｓｃａｎ４の発現を誘導する薬剤は、酸化ストレス、例えば、過酸化水素を誘導する薬剤である。
【０１１０】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団におけるゲノム安定性を高めるため、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団におけるテロメア長を伸ばすため、もしくはその両方のための方法も提供される。特定の例において、その方法は、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団から選択する工程を包含する。つまり、Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞およびＺｓｃａｎ４を発現していないＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を含むＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団が、例えば、Ｚｓｃａｎ４を発現していない細胞を排除するかまたはＺｓｃａｎ４を発現している細胞を選択することによって、Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞について富化され得る。一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋細胞は、少なくともＺｓｃａｎ４プロモーターおよびレポーター遺伝子を含む発現ベクターで細胞の集団をトランスフェクトすることによって選択され、ここで、そのレポーター遺伝子の発現は、Ｚｓｃａｎ４が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の部分集団において発現されていることを示す。Ｚｓｃａｎ４の発現が検出される細胞は、例えば、ＦＡＣＳによって、選択され得る。一つの例において、発現ベクターは、配列番号３８として示されている核酸配列、または配列番号３８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有する配列である。もう一つの例において、レポーター遺伝子は、薬物（例えば、抗生物質）選択マーカーであり、ここで、Ｚｓｃａｎ４を発現していない細胞は、適切な薬物（例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシンなど）を加えることによって殺滅される。
【０１１１】
ＥＳ細胞治療を必要とする被験体を処置するための方法も提供される。いくつかの例において、その方法は、処置を必要とする被験体を選択する工程、および選択された被験体に、Ｚｓｃａｎ４＋である未分化なＥＳ（またはｉＰＳ）細胞の部分集団を投与する工程を包含する。ＥＳ細胞治療の恩恵を受け得る被験体の例としては、がん、自己免疫疾患、神経損傷または神経変性障害、ならびに細胞の再生が望まれるその他の障害（例えば、創傷治癒、筋肉修復（心筋を含む）、軟骨置換術（例えば、関節炎を処置するため）、歯の再生、失明、聴覚消失、骨髄移植およびクローン病）を有する被験体が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの例において、上記方法は、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団から選択する工程を包含し、そのＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が、被験体に投与される。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の集団を、Ｚｓｃａｎ４プロモーター（例えば、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーター）およびレポーター遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトすることによって選択され得、ここで、レポーター遺伝子の発現は、Ｚｓｃａｎ４が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の部分集団において発現されていることを示す。
【０１１２】
がんを有する被験体にＺｓｃａｎ４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することによって、その被験体を処置する方法もまた本明細書に提供される。いくつかの態様において、その方法は、そのような治療を必要とする患者を選択する工程をさらに包含する。いくつかの態様において、その方法は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、注入などによって腫瘍細胞、腫瘍組織に直接投与する工程を包含する。特定の例において、その被験体には、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを含むベクターが投与される。その他の態様において、そのＺｓｃａｎ４ポリペプチドは、ナノ粒子によって封入されている。
【０１１３】
被験体における腫瘍の化学療法反応性（ｃｈｅｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）を増強する方法がさらに提供され、その方法は、Ｚｓｃａｎ４の発現を阻害する薬剤を被験体に投与する工程を包含する。いくつかの例において、その薬剤は、腫瘍細胞に直接投与される。Ｚｓｃａｎ４の発現を阻害する薬剤と、単離された細胞を接触させることによって、その細胞における化学療法剤の効能を高める方法も提供される。
【０１１４】
ＩＶ．Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
Ｚｓｃａｎ４核酸配列およびアミノ酸配列は、当該分野において以前に報告されている（例えば、ＷＯ２００８／１１８９５７（この開示は、本明細書において参照により組み入れられる）；Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０７（２）：５３９−５５０，２００７；およびＣａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ．８（３）：１８１−１９８，２００８を参照のこと）。本明細書において使用されるように、「Ｚｓｃａｎ４」という用語には、２細胞胚期またはＥＳ細胞に特異的な発現を示すマウス遺伝子の群（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅおよびＺｓｃａｎ４ｆを含む）、ヒトオルソログＺＳＣＡＮ４、またはＺＳＣＡＮ４の他の任意の種のオルソログのうちのいずれか１つが含まれる。特定の例において、Ｚｓｃａｎ４は、マウスＺｓｃａｎ４ｃまたはヒトＺＳＣＡＮ４である。
【０１１５】
例示的なＺｓｃａｎ４アミノ酸配列は、配列番号２５（Ｚｓｃａｎ４ａ）、配列番号２７（Ｚｓｃａｎ４ｂ）、配列番号２９（Ｚｓｃａｎ４ｃ）、配列番号３１（Ｚｓｃａｎ４ｄ）、配列番号３３（Ｚｓｃａｎ４ｅ）、配列番号３５（Ｚｓｃａｎ４ｆ）および配列番号３７（ヒトＺＳＣＡＮ４）として配列表に示されている。当業者は、これらの配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有し、かつＺｓｃａｎ４活性（例えば、ＥＳ細胞においてゲノム安定性を高める能力およびテロメア長を伸ばす能力）を保持する配列が、本明細書に提供される方法において使用され得ることを認識する。
【０１１６】
イヌＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５４１３７０．２およびＸＰ＿８５３６５０．１）；ウシＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１７８９３０２．１）；およびウマＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１４９３９９４．１）をはじめとした、その他の種由来のＺＳＣＡＮ４アミノ酸配列が公的に入手可能である。上に列挙されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の各々は、２００９年９月４日付けのＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られるように、本明細書において参照により組み入れられる。
【０１１７】
本明細書に提供される方法を用いてＥＳ細胞において発現され得るＺｓｃａｎ４ポリペプチドの特定の非限定的な例としては、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５または３７に示されているアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。さらなる態様において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５または３７の保存的バリアントであり、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５または３７において５０個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、２個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下または５０個以下の保存的アミノ酸置換）を含む。もう一つの態様において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５または３７に示されているアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５または３７に示されているアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドの断片およびバリアントは、分子技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。一つの態様において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドの断片は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドの少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個または少なくとも５００個連続したアミノ酸を含む。さらなる態様において、Ｚｓｃａｎ４の断片は、関心対象の細胞に移されたときにＺｓｃａｎ４の機能（例えば、ゲノム安定性を高めることおよび／またはテロメア長を伸ばすことであるがこれらに限定されない）を付与する断片である。
【０１１９】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド一次アミノ酸配列の軽微な修飾は、本明細書に記載された未修飾の対応するポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を有するペプチドをもたらし得る。そのような修飾は、部位特異的変異誘発によるもののような計画的なものであるかもしれないし、または自発的なものであるかもしれない。これらの修飾により作製されたポリペプチドは、全て、本明細書に含まれる。
【０１２０】
当業者は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドおよび第二の関心対象のポリペプチドを含む融合タンパク質を容易に作製することができる。必要に応じて、リンカーが、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドと第二の関心対象のポリペプチドとの間に含まれていてもよい。融合タンパク質には、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドおよびマーカータンパク質を含むポリペプチドが含まれるが、これに限定はされない。一つの態様において、マーカータンパク質は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドを同定または精製するために使用され得る。例示的な融合タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、６ヒスチジン残基、またはｍｙｃと、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドとを含むが、これらに限定はされない。
【０１２１】
当業者は、開示される方法にとって有用なＺｓｃａｎ４のそのようなバリアント、断片および融合物が、Ｚｓｃａｎ４活性（例えば、ＥＳ細胞においてゲノム安定性を高めることができることおよびテロメア長を伸ばすことができることまたはその両方）を保持するものであることを認識する。
【０１２２】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする核酸分子は、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドまたはＺｓｃａｎ４核酸分子と呼ばれる。これらのポリヌクレオチドには、Ｚｓｃａｎ４をコードするＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列が含まれる。Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、認識されるＺｓｃａｎ４活性（例えば、ゲノム安定性またはテロメア長を調整することができること）を有するポリペプチドをコードする限り、それらのポリヌクレオチドの全ても本明細書に含まれることが理解される。それらのポリヌクレオチドは、遺伝暗号の結果として縮重する配列を含む。２０種の天然アミノ酸が存在し、その大部分が複数のコドンにより特定される。従って、ヌクレオチド配列によりコードされるＺｓｃａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようにＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする。本明細書に提供される方法を用いてＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞において発現され得るＺｓｃａｎ４をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２４（Ｚｓｃａｎ４ａ）、配列番号２６（Ｚｓｃａｎ４ｂ）、配列番号２８（Ｚｓｃａｎ４ｃ）、配列番号３０（Ｚｓｃａｎ４ｄ）、配列番号３２（Ｚｓｃａｎ４ｅ）、配列番号３４（Ｚｓｃａｎ４ｆ）および配列番号３６（ヒトＺＳＣＡＮ４）として配列表に示されている。
【０１２３】
イヌＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿５４１３７０．２およびＸＭ＿８４８５５７．１）；ウシＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１７８９２５０．１）；およびウマＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１４９３９４４．１）をはじめとした、その他の種由来のＺＳＣＡＮ４核酸配列が公的に入手可能である。上に列挙されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の各々は、２００９年８月１１日付けのＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られるように、本明細書において参照により組み入れられる。
【０１２４】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法を用いてＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞において発現されるＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列は、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。いくつかの態様において、そのＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列は、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６に示されている核酸配列を含む。いくつかの態様において、そのＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列は、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６に示されている核酸配列からなる。特定の例において、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞において発現されるＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列は、その細胞にとって外来性である。例えば、そのＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列は、組換えであり得るか、またはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞にとって非ネイティブ配列であり得る。
【０１２５】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの断片およびバリアントは、分子技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。一つの態様において、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの断片は、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個または少なくとも２０００個の連続した核酸を含む。さらなる態様において、Ｚｓｃａｎ４の断片は、関心対象の細胞において発現されたときにＺｓｃａｎ４の機能（例えば、ゲノム安定性を高めることおよび／またはテロメア長を伸ばすことであるがこれらに限定されない）を付与する断片である。
【０１２６】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列の軽微な修飾は、本明細書に記載された未修飾の対応するポリヌクレオチドと比較して実質的に等価な活性を有するペプチドの発現をもたらし得る。そのような修飾は、部位特異的変異誘発によるもののような計画的なものであるかもしれないし、または自発的なものであるかもしれない。これらの修飾により作製されたポリペプチドは、全て、本明細書に含まれる。
【０１２７】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドには、ベクターに；自己複製するプラスミドまたはウイルスに；あるいは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、またはその他の配列と独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。それらのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾型であり得る。この用語には、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡが含まれる。
【０１２８】
上に記載されたいくつかのＺｓｃａｎ４核酸配列およびタンパク質配列の提供によって、標準的な研究室の技術を用いたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞における任意のＺｓｃａｎ４タンパク質（例えば、異種性Ｚｓｃａｎ４タンパク質）の発現が、現在可能である。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４核酸配列は、プロモーターの制御下にある。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４を発現するために、ベクター系（例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルスおよび酵母人工染色体（ＹＡＣｓ））が用いられる。次いで、これらのベクターは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に導入され得、それらの細胞は、異種性Ｚｓｃａｎ４  ｃＤＮＡの導入によって組換えとなる。
【０１２９】
Ｚｓｃａｎ４コード配列は、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸配列の転写を指示する異種性プロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡエレメントの場合のように、必要な核酸配列を転写の開始部位付近に含む。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも必要に応じて含む。一つの例において、プロモーターは、ＣＡＧ−プロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １０８（２）：１９３−９，１９９１）またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのような構成的プロモーターである。もう一つの例において、プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ４３，２００５）のような誘導性プロモーターである。Ｚｓｃａｎ４の発現を駆動するために使用され得るその他の例示的なプロモーターとしては：ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスおよびサルウイルスに由来するプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター、酵母の酸ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母のアルファ接合因子のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの例において、ネイティブのＺｓｃａｎ４プロモーターが使用される。
【０１３０】
Ｚｓｃａｎ４を発現するために、ベクター系が使用され得る。ＥＳ細胞においてＺｓｃａｎ４を発現するために使用され得る例示的なベクターとしては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。一つの例において、ＳＶ４０のプロモーター領域およびエンハンサー領域またはラウス肉腫ウイルスの末端長反復配列（ＬＴＲ）ならびにＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルおよびスプライシングシグナルを含むベクター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２−６；Ｇｏｒｍａｎら、１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７７７−８１）が使用される。一つの例において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号（Ｃａｒｔｅｒら）およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−７３，１９８８）に記載されているもの、ならびにＡＡＶ４型（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３−３３，１９９７）およびＡＡＶ５型（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９−１９，１９９９）））、またはレトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルス）に由来するベクター）である。ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓら、１９８７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：３０５−２４）、ウシパピローマウイルス（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３９：６４２−５４）またはヘルペスウイルス群のメンバー（例えば、エプスタイン・バーウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２８３７−４７））をはじめとしたその他のウイルスによるトランスフェクション系を利用してもよい。さらに、ベクターは、そのベクター（およびゆえにＺｓｃａｎ４核酸）の長期間にわたる安定した発現を示すトランスフェクトされた細胞の選択を可能にする抗生物質選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｏｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））を含み得る。
【０１３１】
上記ベクターは、パピローマ（Ｓａｒｖｅｒら、１９８１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：４８６）またはエプスタイン・バー（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：４１０）のようなウイルスの調節エレメントを使用することによって、自由に複製するエピソーム実体として細胞内で維持され得る。あるいは、そのベクターをゲノムＤＮＡにインテグレートした細胞系を作製することもできる。これらのタイプの細胞系の両方が、継続的に遺伝子産物を産生する。ベクター（およびゆえに同様にｃＤＮＡ）のコピー数を増幅させた細胞系を作製することにより、高レベルの遺伝子産物を産生し得る細胞系を作り出すこともできる。
【０１３２】
ＤＮＡをヒトまたはその他の哺乳動物の細胞に移すことは、従来技術である。例えば、単離されたＺｓｃａｎ４核酸配列（例えば、裸のＤＮＡとして、または発現ベクターの一部として）は、例えば、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４６６）またはリン酸ストロンチウム（Ｂｒａｓｈら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２０１３）を用いた沈殿、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１）、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３）、ＤＥＡＥデキストラン（ＭｃＣｕｔｈａｎら、１９６８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４１：３５１）、マイクロインジェクション（Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９７８，Ｃｅｌｌ  １５：５７９）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｎｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１６３−７）またはペレットガン（Ｋｌｅｉｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０）によって、レシピエント細胞に導入され得る。あるいは、Ｚｓｃａｎ４核酸配列は、感染によってＥＳ細胞に導入されるウイルスベクターの一部であり得る。例えば、レトロウイルス（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｇｅｎ．Ｅｎｇｒｇ．７：２３５）、アデノウイルス（Ａｈｍａｄら、１９８６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）またはヘルペスウイルス（Ｓｐａｅｔｅら、１９８２，Ｃｅｌｌ  ３０：２９５）を使用する系が開発されている。
【０１３３】
Ｖ．ゲノム安定性の測定
ＥＳ細胞またはＥＳ細胞の集団（例えば、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞）におけるゲノム安定性を高めるためおよび／またはテロメア長を伸ばすための方法が提供される。特定の例において、ゲノム安定性は、例えば、Ｚｓｃａｎ４を発現していないＥＳ細胞（またはＺｓｃａｎ４−ＥＳ細胞において予想される値もしくは値の範囲）と比べて、またはマウス胚線維芽（ＭＥＦ）細胞または皮膚線維芽細胞と比べて、ＥＳ細胞において、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％高められる。ゲノム安定性およびテロメア長を測定する方法は、当該分野において常習的なものであり、本開示は、特定の方法に限定されない。本明細書に提供される特定の例は、例示的なものである。
【０１３４】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のようなＥＳ細胞におけるゲノム安定性は、細胞増殖を検出することによって測定される。ゲノム安定性は、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＳ細胞と比べて細胞増殖が増加している場合、高められている。例えば、ＥＳ細胞の増殖は、培養でＥＳ細胞を生育させ、各継代後にそれらの細胞の倍加時間を測定することによって検出され得る。一つの例において、ゲノム安定性は、継代８代目またはそれ以前の継代においてクライシス（例えば、細胞死）が起きない場合に、高められている。
【０１３５】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のようなＥＳ細胞におけるゲノム安定性は、核型解析を行うことによって測定される。ゲノム安定性は、核型の異常（例えば、染色体の融合および断片化）の存在が、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＳ細胞と比べて、減少しているかまたは存在しない場合に、高められている。例えば、核型解析は、分裂中期での停止を誘導し、次いで、分裂中期の染色体スプレッドを調製することによって、ＥＳ細胞において行われ得る。
【０１３６】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のようなＥＳ細胞におけるゲノム安定性は、テロメア姉妹染色分体交換（Ｔ−ＳＣＥ）を測定することによって測定される。ゲノム安定性は、Ｔ−ＳＣＥの存在が、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＳ細胞と比べて、増加している場合に、高められている。例えば、Ｔ−ＳＣＥは、テロメア染色体配向ＦＩＳＨ（ＣＯ−ＦＩＳＨ）を使用することによって、ＥＳ細胞において測定され得る。
【０１３７】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のようなＥＳ細胞におけるゲノム安定性は、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）を測定することによって測定される。ゲノム安定性は、ＳＣＥの存在が、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＳ細胞と比べて、減少している場合に、高められている。例えば、ＳＣＥは、分裂中期スプレッドにおいてＳＣＥを検出することによって、ＥＳ細胞において測定され得る。
【０１３８】
いくつかの例において、テロメア長は、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のようなＥＳ細胞において測定される。いくつかの例において、テロメア長は、テロメアの長さが、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＳ細胞におけるテロメア長と比べて長い場合に、ＥＳ細胞において長くなっている。例えば、テロメア長は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ＦＩＳＨ（Ｑ−ＦＩＳＨ）またはテロメアｑＰＣＲによって、ＥＳ細胞において検出され得る。
【０１３９】
ＶＩ．Ｚｓｃａｎ４プロモーター配列および発現ベクター
特定の例において、ＥＳ細胞の集団におけるゲノム安定性および／またはテロメア長は、ＥＳ細胞の集団からＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞を選択することによって高められる。例えば、異種性ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、レポーター遺伝子）に作動可能に連結されたＺｓａｎ４プロモーター配列を含む発現ベクターを用いることにより、Ｚｓｃａｎ４を発現する細胞が同定され得る。レポーター遺伝子の発現、ひいてはＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞を検出する方法は、レポーター遺伝子のタイプに応じて様々であり、当該分野で周知である。例えば、蛍光レポーターが使用されるとき、発現の検出は、ＦＡＣＳまたは蛍光顕微鏡検査によって達成され得る。Ｚｓｃａｎ４を発現している幹細胞の部分集団の同定は、Ｚｓｃａｎ４に特異的な抗体の使用またはインサイチュハイブリダイゼーションによる方法を含むがこれらに限定されない代替方法を用いて達成され得る。
【０１４０】
いくつかの例において、異種性核酸配列（例えば、レポーター分子）は、Ｚｓｃａｎ４プロモーター（例えば、ベクター内のもの）の調節下において発現される。いくつかの態様において、そのＺｓｃａｎ４プロモーターは、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターである。例えば、そのＺｓｃａｎ４ｃプロモーターは、配列番号３８のヌクレオチド９０６〜４４６８として示されている核酸配列を含み得る。いくつかの例において、そのＺｓｃａｎ４ｃプロモーターは、Ｚｓｃａｎ４ｃエキソンおよび／またはイントロンの配列を含む。その他の発現調節配列（適切なエンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の直前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、および終止コドンを含む）が、Ｚｓｃａｎ４プロモーターとともに発現ベクター内に含められ得る。一般に、そのプロモーターは、異種性核酸配列の転写を指示するのに十分な少なくとも最小の配列を含む。いくつかの例において、その異種性核酸配列は、レポーター分子をコードする。
【０１４１】
その他の例において、異種性核酸配列（例えば、レポーター分子）は、相同組換えなどによって被験体のゲノムＤＮＡに組み込まれる。例えば、ＧＦＰに対するコード配列は、ＧＦＰが内因性Ｚｓｃａｎ４と同じ様式で発現されるように、ＺＳＣＡＮ４のコード領域に挿入され得るか、またはＺＳＣＡＮ４のコード領域を置き換え得る。相同組換えによる遺伝子「ノックイン」方法が、当該分野で周知である。
【０１４２】
異種性核酸配列によってコードされる異種性タンパク質は、代表的には、レポーター分子（例えば、マーカー、酵素、蛍光タンパク質、細胞に抗生物質耐性を付与するポリペプチド、または従来の分子生物学手法を用いて同定され得る抗原）である。レポーター分子は、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のような関心対象の細胞または細胞の集団を同定するために使用され得る。一つの態様において、その異種性タンパク質は、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質またはそのバリアント、例えば、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、抗原マーカー（例えば、ヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、ヒトＨＬＡ抗原）；細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４または任意の細胞表面レセプター）；または酵素マーカー（例えば、ｌａｃＺ、アルカリホスファターゼ）である。レポーター遺伝子の発現は、その細胞がＺｓｃａｎ４を発現していることを示す。レポーター遺伝子の発現を検出する方法は、レポーター遺伝子のタイプに応じて様々であり、当該分野で周知である。例えば、蛍光レポーターが使用されるとき、発現の検出は、ＦＡＣＳまたは蛍光顕微鏡検査によって達成され得る。
【０１４３】
発現ベクターは、代表的には、複製起点、ならびに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含む。ウイルスベクターおよびプラスミドベクター（例えば、上記のＩＶ項に記載されたベクター）をはじめとした使用に適したベクターは、当該分野で周知である。一つの例において、エンハンサーは、Ｚｓｃａｎ４プロモーターの上流に位置するが、エンハンサーエレメントは、一般に、ベクター上の任意の場所に位置してもよく、なおも増強作用を有する。しかしながら、増加される活性の量は、一般に、距離とともに減少する。さらに、２コピー以上のエンハンサー配列は、順々に作動可能に連結されることにより、プロモーター活性がさらに大きく高められ得る。
【０１４４】
Ｚｓｃａｎ４プロモーターを含む発現ベクターが、宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞であるがこれに限定されない）を形質転換するために使用され得る。宿主において発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスベクターおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該分野で公知であり、関心対象の任意の細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【０１４５】
「トランスフェクトされた細胞」は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）（例えば、Ｚｓｃａｎ４プロモーターエレメントを含むＤＮＡ分子）が導入された宿主細胞（またはその祖先）である。組換え核酸分子による宿主細胞のトランスフェクションは、当業者に周知のような従来技術によって行われ得る。本明細書において使用されるように、トランスフェクションには、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、注入、または核酸分子を細胞に導入するためのその他の任意の好適な技術が含まれる。
【０１４６】
ＶＩＩ．胚性幹細胞の単離
哺乳動物のＥＳ細胞（例えば、マウス、霊長類またはヒトのＥＳ細胞）が、本明細書に開示される方法とともに使用され得る。ＥＳ細胞は、未分化な状態で無制限に増殖し得る。さらに、ＥＳ細胞は、多能性細胞であり、このことは、それらが、体内に存在する細胞の全て（骨細胞、筋肉細胞、脳細胞など）を生じ得ることを意味する。ＥＳ細胞は、発生中のマウス胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離された（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６，１９８１；Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：７６３４−７６３６，１９８１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：４４５−４４８，１９８６）。さらに、ＥＳ特性を有するヒト細胞が、胚盤胞の内部細胞塊（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７，１９９８）および発生中の生殖細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８）から単離されており、ヒトおよび非ヒト霊長類の胚性幹細胞が作製されている（米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと）。
【０１４７】
米国特許第６，２００，８０６号に開示されているように、ＥＳ細胞は、ヒトおよび非ヒト霊長類から作製され得る。一つの態様において、霊長類のＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を発現している細胞である（米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと）。ＥＳ細胞は、例えば、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸原液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む８０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ピルビン酸塩不含、高グルコース処方、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）からなるＥＳ培地を用いて、単離され得る。一般に、霊長類ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞培地の存在下でマウス胚性線維芽細胞のコンフルエントな層の上に単離される。一例において、胚性線維芽細胞は、（ＳＡＳＣＯより入手可能なＣＦ１のような）非近交系マウスに由来する１２日齢胎仔から入手されるが、その他の株が代用されてもよい。０．１％ゼラチン（Ｉ型；Ｓｉｇｍａ）により処理された組織培養ディッシュが利用され得る。成体に存在する拘束された「多分化能性」幹細胞と比較して、ＥＳ細胞を区別する特色には、培養物中で未分化状態を無限に維持するＥＳ細胞の能力、およびＥＳ細胞が有する全ての異なる細胞型へと発達する潜在能力が含まれる。マウスＥＳ細胞とは異なり、ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞は、期特異的な胚性抗原ＳＳＥＡ−１を発現せず、特異的なモノクローナル抗体により認識さ  れるもう一つの糖脂質細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−４を発現する（例えば、Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：２７１−２７８，２０００を参照のこと）。
【０１４８】
アカゲザル胚の場合、正常な卵巣周期を示す成体雌アカゲザル（４歳超）を、月経出血の証拠について毎日観察する（周期１日目＝月経開始日）。月経周期８日目から開始する卵胞期の間、毎日、血液試料を採取し、黄体形成ホルモンの血清濃度をラジオイムノアッセイにより決定する。月経周期９日目から黄体形成ホルモンサージの４８時間後まで、雌を、立証された繁殖能を有する雄アカゲザルと対にし；黄体形成ホルモンサージの翌日に排卵を採取する。排卵後６日目、拡大した胚盤胞を、非外科的子宮フラッシングにより収集する。この手法は、一般に、１ヶ月にアカゲザル１匹につき平均０．４〜０．６個の生存可能な胚の回収をもたらす（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ  ２９：８１−９１，  １９９３）。
【０１４９】
マーモセット胚の場合、規則的な卵巣周期を示す成体雌マーモセット（２歳超）を、繁殖性の雄および最大５匹の子孫を含む家族内で維持する。黄体期の中期か  ら後期の間、０．７５ｇのプロスタグランジンＰＧＦ２ａアナログクロプロステノール（Ｅｓｔｒｕｍａｔｅ，  Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ，Ｓｈａｗｎｅｅ，  ＫＳ）を筋肉注入することにより、卵巣周期を制御する。０日目（クロプロステノール注入直前）、３日目、７日目、９日目、１１日目、および１３日目に血液試料を採取する。血漿プロゲステロン濃度をＥＬＩＳＡにより決定する。血漿プロゲステロン濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以上になる前日を排卵日とする。排卵後８日目、拡大した胚盤胞を、非外科的子宮フラッシュ法（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ２３：３３３−３３６，  １９９４）により回収する。この手法は、１ヶ月にマーモセット１匹につき平均１個の生存可能な胚の作製をもたらす。
【０１５０】
プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）への短時間の曝露等により、透明帯を胚盤胞から除去する。免疫手術（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｅｒｙ）のため、胚盤胞を、３０分間、ＤＭＥＭ中の５０倍希釈のウサギ抗マーモセット脾臓細胞抗血清（マーモセット胚盤胞のため）または５０倍希釈のウサギ抗アカゲザル（アカゲザル胚盤胞のため）に曝し、次いで、ＤＭＥＭで５分間３回洗浄し、次いで５倍希釈のモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝す。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、穏和なピペッティングにより、完全な内部細胞塊（ＩＣＭ）から、溶解した栄養外胚葉細胞を除去し、ＩＣＭをマウス不活性化（３０００ラドのガンマ照射）胚性線維芽細胞に播種する。
【０１５１】
７〜２１日後、立体顕微鏡下で直接観察しながら、マイクロピペットにより、ＩＣＭに由来する塊を内胚葉アウトグロースから除去し、３〜５分間、１％ニワトリ血清が補足された０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）に曝し、火炎研磨されたマイクロピペットによる穏和なピペッティングにより穏和に分離させる。
【０１５２】
分離した細胞を、新鮮なＥＳ培地中の胚フィーダー層上に再び播き、コロニー形成について観察する。ＥＳ様の形態を示すコロニーを個別に選択し、上記のようにして再分割する。ＥＳ様の形態とは、高い核・細胞質比および大きな核小体を有する緻密なコロニーと定義される。次いで、得られたＥＳ細胞を、その培養物が密になる１〜２週毎に短時間のトリプシン処理またはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムまたはマグネシウム不含および２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有のＰＢＳ）への曝露により定期的に分割する。初期継代細胞も凍結し液体窒素中に保管する。
【０１５３】
細胞系は、（ルーチンの核型分析サービスを提供するＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによるもののような）標準的なＧバンディング（Ｇ−ｂａｎｄｉｎｇ）技術により核型分析され、霊長類種の公開された核型と比較され得る。
【０１５４】
その他の霊長類種からのＥＳ細胞系の単離は、類似の手法に従うであろう。ただし、胚盤胞への発達の速度は、種間で数日変動する場合があり、培養ＩＣＭの発達の速度が種間で変動するであろう。例えば、排卵の６日後、アカゲザル胚は拡大胚盤胞期にあるが、マーモセット胚は排卵の７〜８日後まで同期に達しない。アカゲザルＥＳ細胞系は、免疫手術の７〜１６日後に初めてＩＣＭ由来細胞を分割することにより入手され得るが；マーモセットＥＳ細胞は免疫手術の７〜１０日後の初回分割により導出された。その他の霊長類も発達速度が異なっているため、胚収集のタイミングおよび初回ＩＣＭ分割のタイミングは、霊長類種間で変動するが、同一の技術および培養条件が、ＥＳ細胞単離を可能にするであろう（霊長類ＥＳ細胞についての完全な考察およびそれらの作製については、米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと）。
【０１５５】
ヒトＥＳ細胞系は、存在しており、本明細書に開示される方法において使用され得る。ヒトＥＳ細胞は、インビトロで受精された（ＩＶＦ）胚由来の着床前胚からも得ることができる。高品質の胚だけが、ＥＳの単離に適している。１細胞ヒト胚を拡大した胚盤胞まで培養するための現在定義されている培養条件が報告されている（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．４：７０６−７１３，１９８９を参照のこと）。ヒト胚をヒト卵管細胞と共培養することにより、高品質の胚盤胞がもたらされる。細胞の共培養系または改善された限定培地において生育させたＩＶＦ由来の拡大したヒト胚盤胞は、非ヒト霊長類について上に記載された同じ手法を用いたヒトＥＳ細胞の単離を可能にする（米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと）。
【０１５６】
ＶＩＩＩ．Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の治療上の使用
ＥＳ細胞治療を必要とする被験体を処置するための方法が提供される。これらの方法には、ＥＳ細胞および／またはｉＰＳ細胞の使用が含まれる。特定の例において、その方法は、処置を必要とする被験体を選択する工程、および治療量の未分化ＥＳ細胞の部分集団をその被験体に投与する工程であった、ここで、その未分化ＥＳ細胞の部分集団は、Ｚｓｃａｎ４＋である工程を包含する。その他の例において、上記方法は、未分化ＥＳ細胞（特にＺｓｃａｎ４＋部分集団）からインビトロにおいて分化したより成熟した細胞（例えば、成熟したニューロン、筋細胞、特定の器官の細胞など）の投与を包含する。Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化した細胞は、Ｚｓｃａｎ４−細胞よりも良好なゲノム安定性を有する。それにより、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞（未分化な細胞またはより成熟した細胞のいずれか）の投与は、被験体における疾患を処置する。（Ｚｓｃａｎ４＋）を発現する未分化ＥＳ細胞を選択または作製する方法は、上に記載されている。
【０１５７】
未分化ＥＳ細胞をインビトロにおいて分化させる方法は、公知である。未分化ＥＳ細胞の分化は、より特殊化されてさらに分裂または分化することができないほぼ最終分化した細胞により近い細胞と関連することが知られているマーカーを発現している細胞の形成をもたらす。細胞がそれほど拘束されていない細胞から、次第に特定の細胞型に拘束されて最終的には最終分化した細胞に進む経路は、進行性分化または進行性拘束と呼ばれる。より特殊化されている（例えば、進行性分化の進路に沿って進み始めた）がまだ最終分化していない細胞は、部分的に分化していると呼ばれる。例えば、米国特許出願番号２００６／０１９４３２１には、内胚葉細胞（例えば、膵臓の細胞）へのＥＳ細胞の分化が記載されており、米国特許出願番号２００４／００１４２０９には、心臓細胞へのＥＳ細胞の分化が記載されており、米国特許出願番号２００８／０１９４０２３には、血管平滑筋細胞へのＥＳ細胞の分化が記載されている。
【０１５８】
本明細書に提供される方法を用いて処置され得る被験体には、哺乳動物の被験体（例えば、獣医学の被験体またはヒト被験体）が含まれる。被験体には、胎仔（児）、新生仔（児）、乳児、小児および／または成体が含まれる。特定の例において、処置される被験体が選択される（例えば、ＥＳ細胞治療、特に、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の投与を含む治療の恩恵を受ける被験体の選択）。
【０１５９】
Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞のようなＥＳ細胞の投与の恩恵を受け得る障害または疾患の例としては、がん、自己免疫疾患、および細胞再生が有益である疾患（例えば、神経損傷または神経変性障害、ならびに失明、聴覚消失、歯の脱落、関節炎、心筋梗塞、骨髄移植、禿頭症、クローン病、糖尿病および筋ジストロフィー）が挙げられる。特定の例において、これらの障害の１つ以上を有する被験体が、本明細書に開示されている処置のために選択される。
【０１６０】
がんには、異常なまたは制御されていない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍が含まれる。本明細書に開示されるＥＳ細胞で処置される患者は、がんを有し得るか、または過去に処置された（例えば、外科的切除、化学療法、放射線治療によって処置された）がんを有していた可能性がある。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、腫瘍が除去された患者において使用され得、ここで、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化した特定の細胞が、除去された組織／器官を復元するために使用される。さらに、ゲノム不安定性がしばしばがんと関連するので、ゲノム不安定性に起因してがん細胞がより高悪性度になるのを防ぐために、Ｚｓｃａｎ４の発現（例えば、がん細胞における外来性Ｚｓｃａｎ４核酸分子の発現）を誘導もしくは増強し得るかまたはＺｓｃａｎ４経路を活性化し得る薬剤が、投与され得る。
【０１６１】
本明細書に提供されるＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の恩恵を受け得る例示的ながんとしては、心臓（例えば、肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫）、肺（例えば、気管支原性癌腫（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌腫、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫）；消化管（例えば、食道（扁平上皮癌腫、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ（Ｋａｒｐｏｓｉ’ｓ）肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、泌尿生殖器（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胎児性癌腫、奇形癌腫、絨毛上皮腫、肉腫、間質細胞癌腫、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）、肝臓（例えば、ヘパトーム（肝細胞癌腫）、胆管癌、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍ）、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）、骨（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨性外骨腫症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫）、神経系（例えば、頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫＞松果体腫！、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））、婦人科がん（例えば、子宮（子宮内膜癌腫）、子宮頸部（子宮頸癌腫、前腫瘍（ｐｒｅ−ｔｕｍｏｒ）子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜腫瘍、腹部芽細胞腫（ｃｅｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、明細胞癌腫、未分類癌腫、顆粒膜卵胞膜（ｇｒａｎｕｌｏｓａ−ｔｈｅｃａｌ）細胞腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌腫、上皮内癌腫、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）、膣（明細胞癌腫、扁平上皮癌腫、ブドウ状肉腫、胎児性横紋筋肉腫、ファロピウス管（癌腫））、血液がん（例えば、血液（骨髄性白血病（急性および慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））、皮膚（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、カポジ肉腫、色素性母斑、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬）および副腎（例えば、神経芽細胞腫）のがんが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６２】
一つの例において、自己免疫疾患を有する患者が、処置のために選択される。自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の過活動の免疫応答に起因し得る。いくつかの例において、自己免疫疾患は、ある特定の器官に限定される（例えば、甲状腺炎）か、または種々の場所における特定の組織が関わり得る（例えば、肺と腎臓の両方における基底膜に影響し得るグッドパスチャー病）。本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞で処置される患者は、自己免疫疾患を有し得る。本明細書に提供されるＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の恩恵を受け得る例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、若年性少関節炎（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｏｌｉｇｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、コラーゲン誘導関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、１型糖尿病、非肥満性糖尿病、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血および悪性貧血が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６３】
いくつかの例において、選択される被験体は、神経損傷を受けた被験体または神経変性障害に罹患している被験体である。神経損傷は、損傷を受けた患者の運動および／または記憶に悪影響を及ぼす、神経系（例えば、脳または脊髄または特定のニューロン）に対する外傷に起因し得る。そのような外傷は、感染性病原体（例えば、細菌またはウイルス）、トキシン、転倒もしくはその他のタイプの事故に起因する損傷、または遺伝的障害によって、あるいはその他の不明な理由のために、引き起こされ得る。本明細書に開示されるＥＳ細胞で処置される患者は、神経損傷（例えば、事故（例えば、自動車事故もしくはダイビング中の事故）または脳卒中に起因する脳または脊髄の損傷）を受けた可能性がある。
【０１６４】
神経変性疾患は、脳および脊髄の細胞が失われた状態である。本明細書に開示されるＥＳ細胞で処置される患者は、神経変性疾患を有し得る。本明細書に提供されるＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞で処置され得る例示的な神経変性疾患としては：副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、毛細血管拡張性運動失調、バッテン病（シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても知られる）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉性変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（３型脊髄小脳失調）、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する脊髄亜急性連合性変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病（バッテン病としても知られる）、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー病、脊髄癆、中毒性脳症が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６５】
Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、本明細書に記載される方法を用いて得ることができるかまたは作製することができる。ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を哺乳動物被験体に投与する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳは、そのような治療を必要とする被験体に注入（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内または動脈内投与）を介して投与され得る。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、処置を必要とする領域（例えば、がんの器官もしくは組織、または脳もしくは脊髄）に直接投与される。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、薬学的に許容され得るキャリア（例えば、好適な重合体に封入されているキャリア）の存在下またはその他の治療薬の存在下において単独で投与される。いくつかの態様において、被験体には、少なくとも２０，０００個のＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞（例えば、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも５００，０００個、少なくとも１，０００，０００個または少なくとも２，０００，０００個のＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞）が投与される。
【０１６６】
一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、半透性重合体膜に封入され、その重合体膜は、宿主被験体の組織部位に移植される。そのような方法は、物質の放出を調節する能力を有する治療用物質の局所的な長期間にわたる長期的な送達を達成し得る。化合物および細胞の封入に関する説明については、米国特許第５，５７３，５２８号を参照のこと。一つの態様において、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞は、重合体膜内に封入される。次いで、その封入重合体膜は、宿主被験体の組織部位に移植される。一つの例において、その組織部位は、脳または脊髄のような中枢神経系である。
【０１６７】
上記半透性重合体膜は、合成のものまたは天然のものであり得る。使用され得る重合体の例としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル−ｃｏ−塩化ビニル（Ｐ［ＡＮ／ＶＣ］、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどが挙げられる。重合体膜内に封入されたＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の送達は、細胞に対する宿主の拒絶反応および免疫応答、ならびに拒絶反応および炎症に関連する問題を回避し得る。さらに、重合体膜内に含まれる細胞は、なおも細胞の生存能を維持しつつ、かつ重合体の壁（すなわち、個別の繊維、小繊維、フィルム、スプレー、液滴、粒子などの壁）を越えて分子、栄養分および代謝産物の輸送を可能にしつつ、その重合体の壁によって免疫監視機構から守られている。重合体に封入されている細胞の移植術は、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１１１：２６９−２７５によって開発され、非ヒト霊長類とヒトの両方において使用に成功している（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９４，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，５８：１２７５−１２７７）。米国特許第６，１１０，９０２号もまた参照のこと。
【０１６８】
一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、まずそれらの細胞をコラーゲン、アガロースまたはＰＶＡ（ポリビニルアルコール）のマトリックスに包埋することによって、封入される。続いて、包埋された細胞を、ポリアクリルニトリル：ポリ塩化ビニルの６０：４０共重合体のポリプロピレンで作製された中空糸の中に注入する。その繊維を小片に切断し、移植にむけて末端を塞ぐ。一つの例において、封入された細胞は、約２０，０００〜約２，０００，０００個のＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞を有する。
【０１６９】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、外来性起源のものである。「外来性」という用語は、処置のために細胞が移植される被験体以外の供給源から得られた細胞を意味する。外来性細胞は、同じ種の他の生物からの細胞であり得る（例えば、ヒト患者において使用するためのヒトに由来する細胞）。外来性細胞は、異種の供給源、すなわち、治療的に処置される被験体とは異なる種からの細胞でもあり得る（例えば、ヒトにおいて使用するためのマウス細胞）。Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、同遺伝子系の供給源、すなわち、それらの細胞を投与される被験体から採取された細胞でもあり得る。被験体から細胞を回収した後、その細胞は、遺伝子改変され得る（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸が導入される）か、またはＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞について選択／富化され、次いでその被験体に再移植され得る。それらの細胞は同遺伝子系であるので、免疫応答は予想されない。
【０１７０】
一つの局面において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、不死化される。限定のつもりではなく例えば、細胞は、当該分野で周知の方法によって、条件付きで不死化され得る（それらの細胞は、低温での組織培養ではよく成長するが、いったん患者に移植され、３７℃で維持されると分裂を中止する）かまたは恒常的に不死化され得る（例えば、ラージＴ抗原を発現する構築物でのトランスフェクション、またはエプスタイン・バーウイルスによる不死化）。
【０１７１】
Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を宿主被験体に送達するもう一つの方法は、それらの細胞を組織部位の標的領域に直接移植することである。これらの細胞は、いったん移植されると、生存し、移動し、途切れなく宿主組織に入り込む。一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、宿主被験体の神経系（例えば、発生中の神経系、または外傷を受けたもしくは神経障害を有する被験体内の神経系）に直接移植される。Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞は、発生中の神経系に移植されるとき、正常な発生のプロセスに参加し、宿主の発生上のキュー（ｃｕｅ）に応答する。移植された神経前駆細胞は、確立された移動経路に沿って移動し、神経系の散在した区域に広く広がり、時間的および領域的に適切な様式で、宿主の発生プログラムに合わせてニューロン系統とグリア系統の両方から子孫に分化する。移植されたＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、宿主の神経前駆細胞ならびに分化した細胞と非破壊的に混ざり合うことができる。移植された細胞は、欠陥のある特定のニューロン細胞またはグリア細胞の集団を置換し得、不完全な機能を回復し得、広範な分布において外来遺伝子を発現し得る。
【０１７２】
Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、発達した神経系にも移植され得る。移植される神経前駆体は、安定な移植片を形成し得、宿主神経系内を移動し得、宿主の神経前駆細胞および分化した細胞と混ざり合い、それらと相互作用し得る。それらは、欠陥のある特定のニューロン細胞集団またはグリア細胞集団を置換し得、欠陥のある機能を回復させ得、宿主の神経系における再生および治癒のプロセスを活性化し得る。一つの例において、安定な移植片は、中枢神経系または末梢神経系において確立された移植片である。
【０１７３】
同様の方法を用いることにより、ＥＳ細胞治療を必要とする任意の領域にＺｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を直接移植することができる。そのような細胞は、未分化であってもよいし、インビトロにおいて所望の細胞型に分化されていてもよい（次いで、それを必要とする被験体に投与される）。例えば、器官の再生が望まれる場合、例えば、がんを処置するために除去されたまたはその他の理由のために失われた器官または組織（例えば、歯、毛、耳もしくは眼の細胞、皮膚または筋肉）の置換のため。一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、例えば、心筋梗塞のために失われた心臓の組織または細胞を再生するために、心臓に直接移植される。一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、例えば、糖尿病を有する被験体における細胞を再生するために、膵臓に直接移植される。一つの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、例えば、がんを有する被験体における骨髄細胞を再生するために、骨に直接移植されるか、または全身投与される。
【０１７４】
患者の処置にとって最も適切な治療用量および治療レジメンは、処置される疾患または状態によって、ならびに患者の体重およびその他のパラメータに従って、変化する。効果的な投薬および処置プロトコルは、従来の手段によって、実験動物における低用量から開始し、次いで、その効果をモニターしながら投薬量を増加し、および計画的に投与レジメンを変更して、決定され得る。所与の被験体に対する最適な投薬量を決定するとき、数多くの因子が臨床医によって考慮され得る。因子としては、患者のサイズ、患者の年齢、患者の全般的な状態、処置される特定の疾患、疾患の重症度、患者におけるその他の薬物の存在などが挙げられる。試用投薬量は、動物試験の結果および臨床文献を考慮した後に選択される。
【０１７５】
したがって、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、特定の障害に関連する症状を減少させるかまたは回復させるために、被験体に投与される。がんの処置に対する治療上のエンドポイントとしては、腫瘍のサイズもしくは体積の減少、腫瘍への新脈管形成の減少、または腫瘍の転移の減少が挙げられ得る。腫瘍が除去された場合、もう一つの治療上のエンドポイントは、除去された組織または器官の再生であり得る。がんの処置の有効性は、当該分野における方法、例えば、腫瘍のイメージング、または腫瘍マーカーもしくはがんの存在のその他の指標の検出を用いて測定され得る。自己免疫疾患の処置に対する治療上のエンドポイントとしては、自己免疫性応答の減少が挙げられ得る。自己免疫疾患の処置の有効性は、当該分野における方法、例えば、自己免疫性抗体の測定を用いて測定され得、ここで、処置された被験体におけるそのような抗体の減少は、その治療が成功であることを示す。神経変性障害の処置に対する治療上のエンドポイントとしては、神経変性に関する欠陥の減少、例えば、運動、記憶または行動上の欠陥の増加が挙げられ得る。神経変性障害の処置の有効性は、当該分野における方法を用いて、例えば、認知障害を測定することによって、測定され得、ここで、処置された被験体におけるそのような機能障害の減少は、その治療が成功であることを示す。神経損傷の処置に対する治療上のエンドポイントは、損傷に関する欠陥の減少、例えば、運動、記憶または行動上の欠陥における増加が挙げられ得る。神経損傷の処置の有効性は、当該分野における方法を用いて、例えば、可動性および柔軟性を測定することによって、測定され得、ここで、処置された被験体におけるそのような点の増加は、その治療が成功であることを示す。処置は、１００％の有効性を要求しない。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞で処置されない場合と比べたときの、疾患（またはその症状）の少なくとも約１０％、約１５％、約２５％、約４０％、約５０％またはそれより多くの減少は、有効であると考えられる。
【０１７６】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４＋のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、マウスもしくはその他の小型哺乳動物においては約１×１０４細胞〜約１×１０７細胞の用量で、またはヒトもしくはその他の大型哺乳動物においては約１×１０４細胞〜約１×１０１０細胞の用量で、投与される。一つの特定の非限定的な例において、治療有効量は、約１×１０６細胞である。処置される被験体において所望の効果を達成するために、その他の治療薬（例えば、化合物、小分子またはペプチド）が、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞と組合わせてｂ（例えば、すぐ前もしくは後で、または同時に）治療的に有効な用量で投与され得る。有効量のＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞が、単回投与で、または数回の投与、例えば、処置期間中における毎日の投与で投与され得る。しかしながら、当業者は、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞の有効量が、適用される薬剤、処置される被験体、苦痛の重症度およびタイプ、ならびに薬剤の投与様式に依存することを認識する。
【０１７７】
ＩＸ．Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用
Ｚｓｃａｎ４の発現が、ゲノム安定性を高め、ＤＮＡ損傷から細胞を保護し、ＤＮＡ修復を促進することが本明細書に開示される。したがって、がんを有する被験体にＺｓｃａｎ４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することによってその被験体を処置する方法が本明細書に提供される。いくつかの態様において、その方法は、そのような治療を必要とする患者（例えば、がんと診断されている被験体）を選択する工程をさらに包含する。
【０１７８】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様において、被験体には、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドが投与される。いくつかの例において、被験体には、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを含むベクターが投与される。Ｚｓｃａｎ４を発現するベクターを作製および使用する方法は、本願の他の項に記載される。いくつかの場合において、Ｚｓｃａｎポリヌクレオチド（またはＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを含むベクター）が、注入などによって腫瘍細胞に、腫瘍組織に直接投与される。
【０１７９】
その他の態様において、被験体には、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドが投与される。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは、腫瘍細胞へのＺｓｃａｎ４ポリペプチドの送達を助けるナノ粒子によって封入される。開示される方法とともに使用するために適したナノ粒子は、当該分野で公知であり、下記に記載される。
【０１８０】
ナノ粒子は、迅速な放出または制御された放出のための、封入される薬物（例えば、合成小分子、タンパク質、ペプチドおよび核酸に基づく生物治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））を保持し得るサブミクロン（約１０００ｎｍ未満）のサイズの薬物送達媒体である。種々の分子（例えば、タンパク質、ペプチドおよび核酸分子）が、当該分野で周知のプロセスを用いてナノ粒子内に効率的に封入され得る。
【０１８１】
本明細書に記載される組成物および方法とともに使用するためのナノ粒子は、任意のタイプの生体適合性ナノ粒子（例えば、生分解性ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子（ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルケン、ポリビニルエーテル類およびセルロースエーテルナノ粒子が挙げられるがこれらに限定されない））であり得る。いくつかの態様において、ナノ粒子は、生体適合性かつ生分解性の材料で作製される。いくつかの態様において、ナノ粒子には、ポリ（乳酸）もしくはポリ（グリコール酸）、またはポリ（乳酸）とポリ（グリコール酸）の両方を含むナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である。
【０１８２】
ＰＬＧＡは、吸収性縫合糸および生分解性移植片として使用されている、ＦＤＡによって承認されたバイオマテリアルである。ＰＬＧＡナノ粒子は、数多くの投与経路（皮下、静脈内、眼球、経口および筋肉内が含まれるがこれらに限定されない）を介した種々の薬物のための薬物送達系においても使用されている。ＰＬＧＡは、天然の代謝副産物である、その単量体成分の乳酸およびグリコール酸に分解されることから、その材料は高度に生体適合性である。さらに、ＰＬＧＡは、ナノ粒子を合成するための臨床的等級の材料として商業的に入手可能である。
【０１８３】
その他の生分解性のポリマー材料（例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリグリコリド（ＰＧＡ））が、本明細書に記載される組成物および方法とともに使用するために企図される。さらなる有用なナノ粒子としては、生分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子（Ｖａｕｔｈｉｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５５：５１９−４８，２００３）が挙げられる。経口吸着もまた、粘膜付着性のカチオン性重合体であるキトサンでコーティングされたポリ（ラクチド−グリコリド）ナノ粒子を用いて促進され得る。そのようなナノ粒子の製造は、例えば、Ｔａｋｅｕｃｈｉら（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．４７：３９−５４，２００１）によって報告されている。
【０１８４】
ヒトにおける適用のために現在使用されている生分解性重合体のうち、ＰＬＡ、ＰＧＡおよびＰＬＧＡは、インビボにおいて、無害な乳酸およびグリコール酸への加水分解を受けるので、広く安全であることが知られている。これらの重合体は、手術後の除去を必要としない縫合糸を作製する際、およびヒトでの使用についてＦＤＡが承認した封入された酢酸ロイプロリドを製剤化する際に使用されている（Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７，１９９０）；Ｇｉｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２０：１４５９，１９７９；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：５，１９９４）。これらの重合体の分解速度は、そのグリコリド／ラクチド比およびその分子量によって様々である。ゆえに、封入されている分子（例えば、タンパク質またはペプチド）の放出は、その重合体の分子量およびグリコリド／ラクチド比、ならびにカプセル製剤の粒径およびコーティングの厚さを調整することによって、数ヶ月にわたって持続され得る（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．４：１５５，１９８６）。
【０１８５】
いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物および方法とともに使用するためのナノ粒子は、直径が約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍのサイズ範囲である。いくつかの場合において、そのナノ粒子は、約６００ｎｍ未満である。いくつかの態様において、そのナノ粒子は、直径約１００〜約６００ｎｍである。いくつかの態様において、そのナノ粒子は、直径約２００〜約５００ｎｍである。いくつかの態様において、そのナノ粒子は、直径約３００〜約４５０ｎｍである。当業者は、そのナノ粒子のサイズが、用いられる調製方法、臨床適用およびイメージング物質に応じて変動し得ることを容易に認識する。
【０１８６】
様々なタイプの生分解性および生体適合性のナノ粒子、そのようなナノ粒子（ＰＬＧＡナノ粒子を含む）を作製する方法、ならびに種々の合成化合物、タンパク質および核酸を封入する方法は、当該分野において十分に報告されている（例えば、米国特許出願公開番号２００７／０１４８０７４；米国特許出願公開番号２００７００９２５７５；米国特許出願公開番号２００６／０２４６１３９；米国特許第５，７５３，２３４号；米国特許第７，０８１，４８９号；およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ／２００６／０５２２８５を参照のこと）。
【０１８７】
以下の実施例は、ある特定の特色および／または態様を例証するために提供される。これらの実施例は、記載される特定の特色または態様に本開示を限定すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１８８】
実施例１：実験手法
ＥＳ細胞培養
１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃに由来するＭＣ１  ＥＳ細胞（Ｏｌｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，６６０２−６６０６，２００３）を、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡのＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｒ２６Ｒ３  ＥＳ細胞（Ｓｏｒｉａｎｏら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：７０−７１，１９９９）を、親系統として使用して、系統追跡実験のためにｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２細胞を作製した。通常は、全てのＥＳ細胞系を、さらなる実験の前に、ゼラチンコートフィーダー不含プレートで２回の継代にわたって培養し、続いて、完全ＥＳ培地：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；０．１ｍＭ非必須アミノ酸；２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ；０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール；およびペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／５０μｇ／ｍｌ）が入った、ゼラチンコート６ウェルプレートにおいて維持した。全ての細胞系について、培地を毎日交換し、細胞を２〜３日ごとに通例どおりに継代した。
【０１８９】
ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄベクターの構築
Ｚｓｃａｎ４ｃの開始メチオニンに対して３５６３ｂｐ上流にわたるゲノム領域を、推定上のＺｓｃａｎ４プロモーターとして選択した。このＤＮＡ領域を、５’末端におけるＭｌｕＩ切断配列で修飾した順方向プライマー
【０１９０】
【化２】
2013503638.tif 000003
および逆方向プライマー
【０１９１】
【化３】
2013503638.tif 000004
を使用し、高忠実度ＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭＴａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＢＡＣ  ＲＰ２３−６３Ｉ１から増幅した。続いて、そのＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ６．２／Ｃ−ＥｍＧＦＰ  ＴＯＰＯＴＭベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｚｓｃａｎ４プロモーター領域のクローニングの前に、配列が確認されたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ消化によって直鎖化した（それにより、サイトメガロウイルスプロモーターも除去した）。得られたベクターのヌクレオチド配列は、配列番号３８として示されている。
【０１９２】
ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ  ＥＳ細胞およびｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２細胞の作製
ＭＣ１  ＥＳ細胞（ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄトランスフェクション用）およびＲ２６Ｒ６  ＥＳ細胞（ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２トランスフェクション用）を、６ウェルプレート内のゼラチン上で生育し、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者のプロトコルに従って使用して、懸濁物中の５×１０５細胞を１μｇの直鎖化されたｐＺｓｃａｎ４−ＥｍｅｒａｌｄベクターまたはｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２ベクターでトランスフェクトし、ゼラチンコート１００ｍｍディッシュで培養した。５μｇ／ｍｌのブラスチシジンを用いて細胞を選択し、８日目にコロニーを拾い、増やし、さらなる解析のために凍結した。
【０１９３】
ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ  ＥＳ細胞の選別
細胞を少なくとも２時間にわたって育てた（ｆｅｄ）後、ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）によって回収し、１％ＦＢＳおよび１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含むＩｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に再懸濁した。細胞を、Ｅｍｅｒａｌｄ強度に従ってＦＡＣＳによって選別した。全ての実験について、同じゲーティングを使用した。それらの細胞を、３５％血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ、１００μＭ  β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを含むＩＭＤＭ中に選別した。マイクロアレイ実験のために、選別した直後に製造者のプロトコルに従ってＴＲＩＺＯＬＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＲＮＡを回収した。
【０１９４】
二重蛍光ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＲＮＡプローブおよびビオチン（ＢＩＯ）標識ＲＮＡプローブを、ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＰＣＲ産物の鋳型から転写した。エタノール沈殿させたプローブを、水に再懸濁し、２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＴＭ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙによって定量した。細胞（１０５細胞／ウェル）をガラスチャンバースライドに播き、３日間培養し、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。細胞を洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液中、６０℃において１２時間にわたって１μｇ／ｍｌのＤＩＧプローブおよびＢＩＯプローブとともにインキュベートした。プローブを、マウス抗ＤＩＧ抗体およびヒツジ抗ＢＩＯ抗体によって検出し、フルオロフォア結合体化二次抗体によって可視化した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。
【０１９５】
ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２ａ  Ｚｓｃａｎ４系統追跡ベクターの構築
ｐＣｒｅ−ＥＲＴ２  ＯＲＦを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）プラスミドのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした（Ｆｅｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７，１９９７）。続いて、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターのＰＣＲ断片を、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２  ＯＲＦの５’末端に位置するＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩとの間に平滑末端ライゲーションによってサブクローニングした。次いで、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーター−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２を含むＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯＴＭのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｍｅＩ断片に平滑末端ライゲーションによってサブクローニングした。
【０１９６】
ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２系を用いたＺｓｃａｎ４を発現している細胞の運命の追跡
ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＥＳ細胞を、１００ｎＭタモキシフェンを含む標準ＥＳ培地中で生育させた。継代１、２、３、４および９代目における生物学的な三つ組を、市販のキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を製造者のプロトコルに従って使用してベータ−ガラクトシダーゼについて染色した。さらに、タモキシフェンの存在下においてより長い期間にわたって維持された細胞を、継代１、２、３および４代目で回収し、ＤｅｔｅｃｔａＧｅｎｅＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＧ  ＬａｃＺ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベータ−ガラクトシダーゼについて染色し、ＣｙｔｏＳｏｆｔ４．１ソフトウェア（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉフローサイトメトリーシステムを用いて解析した。
【０１９７】
胚様体の分化を介したＺｓｃａｎ４系統の追跡
胚様体（ＥＢ）形成アッセイにおける系統追跡のために（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８７：２７−４５，１９８５）、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＥＳ細胞を、１００ｎＭタモキシフェンを含む完全培地中にて３日間ゼラチン上で生育させ、回収し、そして４×１０６個のＥＳを、タモキシフェンを含まないＬＩＦ不含培地が入った１００ｍｍの細菌学的Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養することにより、浮遊ＥＢを形成させた。７日目に、浮遊ＥＢを回収し、タモキシフェンを含まないＬＩＦ不含培地が入った、ゼラチンコート６ウェルプレートで培養することにより、接着を可能にした。１１日目に、拍動している領域を記録し、続いて、細胞をＬａｃＺ染色および免疫組織化学にむけて４％ＰＦＡ中で固定した。
【０１９８】
定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡを、生物学的な三つ組でＴＲＩＺＯＬＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞から単離した。１反応あたり１００ｎｇのオリゴｄＴプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、全ＲＮＡ（１μｇ）を製造者のプロトコルに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩによって逆転写した。ｑＰＣＲについては、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者のプロトコルに従って、９６ウェルの光学プレート、１ウェルあたり２５μｌの総反応体積および１０ｎｇのｃＤＮＡとともに、使用した。プレートを７９００ＨＴまたは７５００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実行した。別段述べられない限り、正規化するものとしてＨ２Ａを使用して、ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−８，２００１）によって誘導倍率を計算した。
【０１９９】
マウス着床前胚におけるＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製およびｑＰＣＲ解析
５ＩＵの妊娠ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）および５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、４〜６週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１雌マウスを過排卵させた。ｑＲＴ−ＰＣＲ実験用の卵または胚を、ＭＩＩ胚、１細胞胚、初期および後期２細胞胚、４細胞胚、８細胞胚、桑実胚ならびに胚盤胞胚について、それぞれｈＣＧ注入の２０、２３、３０、４３、５５、６６、８０および１０２時間後に回収した。３セットの１０個の同調卵または同調胚を液体窒素中に保管し、ｃＤＮＡ調製用鋳型にするために凍結／融解工程によって機械的に破裂させた。オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って使用した。ＡＢＩ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において解析を行った。ｑＰＣＲプライマー配列のリストを下記の表１に示す。データを、ΔΔＣｔ法（Ｆａｌｃｏら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ  １３：３９４−４０３，２００６；Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−８，２００１）を用いてＣｈｕｋによって正規化した。
【０２００】
表１
ｑＰＣＲプライマー配列
【０２０１】
【表１】
2013503638.tif 000005
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてプライマーを設計し、以前に記載されたように（Ｆａｌｃｏら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ  １３：３９４−４０３，２００６）Ｓｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とともに卵巣ｃＤＮＡ混合物を用いて試験した。
【０２０２】
ＲＯＳＡ／Ｅｍｐｔｙノックイン親細胞クローンの作製
ＭＣ１  ＥＳ細胞をフィーダー上で生育させ、３日目に回収した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭエレクトロポレーションシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、２６μｇの直鎖化されたｐＭＷＲｏｓａＴｃＨベクターで細胞（１０７個）をエレクトロポレートした。続いて細胞を、ゼラチンコートフィーダー不含プレートで培養した。１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを用いて細胞を１０日間にわたって選択した。１７個の耐性コロニーを拾い、ランダムプライムド３２Ｐ標識外部プローブおよびランダムプライムド３２Ｐ標識内部プローブを用いたサザンブロットによってノックインを確認した（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ４３，２００５）。
【０２０３】
ＲＯＳＡ／Ｔｅｔ−ｏｆｆ  Ｚｓｃａｎ４−Ｆｌａｇ標的化ベクターの構築、ならびにｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞およびｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞の作製
骨格のｐＺｈｃＳｆｉプラスミド（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ４３，２００５）を修飾し、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子で置き換えた。ＰＧＫｐＡをｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＳＶ４０ｐＡで置き換え、マルチクローニングサイトに挿入した。Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＯＲＦ断片をＰＣＲによって増幅し、修飾ｐＺｈｃＳｆｉにサブクローニングした。６ｘＨｉｓ−ＦＬＡＧエピトープタグ配列を、ＬｏｘＰＶの５’末端に挿入することにより、Ｚｓｃａｎ４ｃに融合されたＣ末端エピトープタグに隣接させた。Ｚｓｃａｎ４ｃのＯＲＦを配列決定によって確認した。ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の指示書に従って使用して、Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＯＲＦを有する修飾ｐＺｈｃＳｆｉおよびｐＣＡＧＧＳ−ＣｒｅプラスミドでＭＣ１  Ｒｏｓａ２６ノックイン親ＥＳ細胞を同時トランスフェクトし、ドキシサイクリン（０．２μｇ／ｍｌ）の存在下においてピューロマイシンによって選択した。クローンを単離し、その後、ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞と名付けた。上記ＯＲＦを有しない修飾ｐＺｈｃＳｆｉを用いることにより、ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙコントロール細胞を確立した。
【０２０４】
ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション
以前に報告されているように（Ｃａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ８：１８１−１９８，２００８）、インサイチュハイブリダイゼーションを行った。簡潔には、ドキシサイクリンの存在下または非存在下において３日間生育させた三つ組のｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞を、４℃において一晩、４％ＰＦＡ中で固定した。細胞をプロテイナーゼＫで消化した後、細胞を１μｇ／ｍｌのジゴキシゲニン標識リボプローブと６２℃において一晩ハイブリダイズさせた。次いで、細胞を洗浄し、ブロッキングし、アルカリホスファターゼ結合体化抗ジゴキシゲニン抗体とともにインキュベートし、そしてＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出緩衝液とともに３０分間インキュベートした。
【０２０５】
Ｚｓｃａｎ４ノックダウンベクターの構築
Ｚｓｃａｎ４ノックダウン実験にむけて、Ｚｓｃａｎ４遺伝子由来の４つの異なる１９マー（ｍｅｒ）配列を、１９マーのセンスオリゴ、ヘアピンループおよび同じ配列のアンチセンスを有する、Ｚｓｃａｎ４に対するｓｈＲＮＡとして設計した。最も効果的な配列は：プライマー順方向：
【０２０６】
【化４】
2013503638.tif 000006
プライマー逆方向：
【０２０７】
【化５】
2013503638.tif 000007
だった。
【０２０８】
ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｕ６−ＧＦＰ  ＰＣＲキット（Ｇｅｌａｎｔｉｓ）を製造者のプロトコルに従って用いて、ｓｈＲＮＡを増幅した。それらのｓｈＲＮＡは、外来性Ｚｓｃａｎ４の発現によるレスキューを可能にするＺｓｃａｎ４ｃおよびＺｓｃａｎ４ｄパラログの３’−ＵＴＲにおける共有配列を標的にすることを目的としていた。最初に、ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞を、製造者のプロトコルに従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）によって一過性にトランスフェクトし；ＧＦＰをトランスフェクション効率に対するレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｄ）遺伝子として使用した。ハイグロマイシンを用いて細胞を選択し、クローンを単離することにより、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞およびＺｓｃａｎ４レスキュー細胞を確立した。レスキューを達成するために、細胞を、Ｄｏｘを含まない完全ＥＳ培地とともに３日間インキュベートした。
【０２０９】
ＲＮＡを単離した；ｃＤＮＡを記載されているように作製し、ｑＰＣＲによって試験してＺｓｃａｎ４の発現を測定した。
【０２１０】
マイクロアレイ解析
ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞のＤＮＡマイクロアレイ解析を、記載されているように（Ａｉｂａら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１６：７３−８０，２００９）行った。簡潔には、ユニバーサルマウス参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、Ｃｙ５色素で標識し、Ｃｙ３標識試料と混合し、ＮＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ４４Ｋ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｖ２．２（Ｃａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．６：Ｒ６１，２００５）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが製造、＃０１４１１７）におけるハイブリダイゼーションのために使用した。各遺伝子機能（ｇｅｎｅ  ｆｅａｔｕｒｅ）に関する強度を、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ９．５．１．１ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、スキャンされたマイクロアレイイメージから抽出した。ＡＮＯＶＡおよびその他の解析を行うために開発されたアプリケーション（ＮＩＡ  Ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア；ｌｇｓｕｎ．ｇｒｃ．ｎｉａ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＡＮＯＶＡ／を参照のこと）（Ｓｈａｒｏｖら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２５４８−９，２００５）を使用することによって、マイクロアレイデータの解析を行った。全てのＤＮＡマイクロアレイデータは、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に寄託されており、ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓアクセッション番号（ＧＳＥ＃１５６０４）およびＮＩＡ  Ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアウェブサイト（ｌｇｓｕｎ．ｇｒｃ．ｎｉａ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＡＮＯＶＡ／）（Ｓｈａｒｏｖら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２５４８−９，２００５）を介してアクセス可能である。
【０２１１】
Ｚｓｃａｎ４抗体の作製
ポリクローナルウサギ抗Ｚｓｃａｎ４抗体（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を、製造者のプロトコルに従って、Ｚｓｃａｎ４のＮ末端エピトープ：ＬＱＴＮＮＬＥＦＴＰＴＤＳＳＣ（配列番号３９）に対して作製した。
【０２１２】
テロメア定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）
全ての細胞を、ドキシサイクリンを含む完全ＥＳ培地中で維持した。Ｚｓｃａｎ４誘導のために、合計３日間にわたってその培地からドキシサイクリンを除去した。培地を毎日交換した。３日目に、培地にコルセミド０．１μｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充し、４時間インキュベートすることにより、細胞を分裂中期において停止させた。低張性０．０７５Ｍ  ＫＣｌ緩衝液を試料に加え、次いで、細胞を３：１比の冷メタノール：酢酸中で固定した。分裂中期スプレッドを調製した。製造者のプロトコルに従ってテロメアペプチド核酸（ＰＮＡ）ＦＩＳＨキット／Ｃｙ３（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）によって、テロメアＦＩＳＨを行った。染色体を０．５μｇ  ｍｌのＤＡＰＩで染色した。染色体およびテロメアを、Ｃｙ３−ＤＡＰＩフィルターセットを備えたＺｅｉｓｓ顕微鏡においてデジタル画像化した。テロメア長の定量的測定のために、ＴＦＬ−ＴＥＬＯソフトウェア（Ｐｏｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３６：２６７−２７８，１９９９）によってテロメアのサイズおよび蛍光強度を評価した。
【０２１３】
テロメア染色体配向ＦＩＳＨ（ＣＯ−ＦＩＳＨ）
染色分体配向（ＣＯ）−ＦＩＳＨ解析を、いくつかの軽微な修飾を行って以前に報告されているように（Ｂａｉｌｅｙら、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  １１：１３９−４４，１９９６；Ｇｏｏｄｗｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｙｎｅ，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．６３：１２６−７，１９９３）行った。簡潔には、ＥＳ細胞を３日間の誘導のためにＤｏｘ＋またはＤｏｘ−条件のいずれかにおいて生育した。培地を毎日交換した。３日目に、５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１２時間加えることにより、１回の細胞周期に対してＢｒｄＵの取り込みを可能にさせた。最後の４時間にわたって、コルセミド０．１μｇ／ｍｌを加えた。分裂中期スプレッドを調製した。スライドを、０．５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｉｇｍａ）で染色し、２×食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液中、室温において２０分間洗浄し、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．０）を載せ、３６５ｎｍの紫外（ＵＶ）光（Ｓｔｒａｔｅｌｉｎｋｅｒ  １８００  ＵＶ照射器）に３０分間曝した。ＢｒｄＵで置換されたＤＮＡを、室温において１０分間、３単位／μｌのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。変性工程なしで、３’−Ｃｙ３結合体化（ＴＴＡＧＧＧ）７（配列番号２３）によってリーディング鎖のテロメアを明らかにし、３７℃で一晩インキュベートした。染色体を１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対比染色した。
【０２１４】
定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメアの測定
ゲノムＤＮＡを１０６個の細胞から抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって定量化した。以前に報告されているように（Ｃａｌｌｉｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｗｏｍａｃｋ，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５６：１７−２２，２００６）、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、平均テロメア長比を全ゲノムＤＮＡから測定した。テロメアのプライマー、コントロール単一コピー遺伝子Ｒｐｌｐ０および以前に報告されているようなＰＣＲ設定（同文献）を用いて、Ｐｒｉｓｍ  ７５００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＰＣＲ反応を行った。既知量のＤＮＡの１００ｎｇから３．１２５ｎｇまでの段階希釈によって、その参照遺伝子に対して検量線を作成した。テロメアのシグナルをＲｐｌｐ０に対して正規化することにより、相対的なテロメア長を示すＴ／Ｓ比を得た。
【０２１５】
テロメラーゼ活性の測定
ドキシサイクリンの存在下（Ｄｏｘ＋）または非存在下（Ｄｏｘ−）の完全ＥＳ培地が入った、ゼラチンコートディッシュにおいて細胞を三つ組で３日間培養した。複製物１つあたり１０６個の細胞から細胞溶解産物を調製した。ＴＲＡＰＥＺＥＴＭ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造者の指示書に従って使用するテロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイによって、テロメラーゼ活性を測定した。
【０２１６】
核型解析
ＥＳ細胞培養物を、２時間にわたって０．１μｇ／ｍｌのコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理することにより、分裂中期での停止を誘導した。分裂中期染色体スプレッドを調製し、２０分間にわたって０．３％Ｇｉｅｍｓａ試薬で染色し、試料１つあたりｎ≧４０分裂中期に対して染色体を数えた。ノックダウン細胞およびコントロール細胞に対する結果を、テロメアＦＩＳＨによって解析された細胞におけるＤＡＰＩ染色によっても確認した。
【０２１７】
姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）アッセイ
ＳＣＥアッセイを、以前に報告されているように（Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５１：１５６−８，１９７４）行った。簡潔には、マウスＥＳ細胞を、ドキシサイクリンを含む完全ＥＳ培地中で維持した。Ｚｓｃａｎ４誘導のために、合計３日間にわたってその培地からドキシサイクリンを除去した。最後の２４時間にわたって、ＢｒｄＵを含む培地を加えて、その細胞の２回の細胞周期を完了させた。最後の４時間にわたって培地に０．１μｇ／ｍｌのコルセミドを補充することにより、細胞を分裂中期で停止させた。分裂中期スプレッドを調製し、ＳＣＥ解析のために用いた。その実験については、試料１つあたりｎ＞５０分裂中期においてＳＣＥを数え、試料１つあたり３〜４回の独立した実験を繰り返した（合計ｎ＞１５０分裂中期）。
【０２１８】
免疫蛍光染色解析
滅菌したカバーガラスの上の２４ウェルプレートで細胞を培養した。複製物をドキシサイクリン培地（Ｄｏｘ＋）中で維持し、３つの複製物については、Ｚｓｃａｎ４の過剰発現を誘導するために、３日間にわたってドキシサイクリンを除去した（Ｄｏｘ−）。培地を毎日交換した。細胞を室温において１０分間、４％ＰＦＡで固定するか、または上に記載したような分裂中期スプレッドのために用いた。ＰＦＡ中の細胞を０．２５％ＮＰ−４０で１０分間にわたって透過処理した。細胞を１％ＢＳＡ、１０％ＦＢＳおよび０．２％サポニン中、室温において１０分間ブロッキングし、ブロッキング溶液中の一次抗体：抗ＦＬＡＧ抗体１：１０００希釈、抗ＺＳＣＡＮ４  １：４００、抗ＳＰＯ１１  １：２００、抗ＤＭＣ１  １：２００、抗ＴＲＦ１  １：５００、抗ＴＲＦ２  １：４００とともに４℃において一晩インキュベートした。陰性コントロールとして、一次抗体なしで染色した細胞ならびに抗ＦＬＡＧ抗体で染色したＤｏｘ＋細胞を用いた。結合した抗体を、蛍光Ａｌｅｘａ５４６二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＺｅｉｓｓ５１０共焦点顕微鏡下において可視化した。室温において５分間ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）で染色して、核を可視化した。
【０２１９】
実施例２：Ｚｓｃａｎ４は、未分化な状態のＥＳ細胞の５％において発現される
Ｚｓｃａｎ４のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションは、ＭＣ１マウスＥＳ細胞コロニーにおいて高度に不均一な染色パターンを示した（図１Ａ）（Ｃａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ８：１８１−１９８，２００８；Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０７：５３９−５５０，２００７）。Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞を特徴付ける第１の工程として、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーター下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−Ｅｍｅｒａｌｄを発現するように設計されたレポータープラスミド（図１Ｂ）を、ＭＣ１  ＥＳ細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体であるｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞を単離した。予想どおり、培養物中の少数のＥＳ細胞においてＥｍｅｒａｌｄの発現が観察されたことから、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションによって以前に観察されたものが再現された（図１Ｃ）。ＦＡＣＳ解析から、同じ培養条件を用いたとしてもわずかに数が変動する（２〜７％）が、上記ＥＳ細胞のおよそ５％がＥｍｅｒａｌｄ陽性であること（図１Ｄ）が示された。ＦＡＣＳによって選別された細胞の定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析から、Ｅｍｅｒａｌｄ（＋）（Ｅｍ（＋））細胞ではＥｍ（−）細胞と比べてＺｓｃａｎ４ｍＲＮＡの約１，０００倍の富化が証明された。さらに、それらの細胞をそれぞれのＥｍｅｒａｌｄ強度に従ってサブグループに選別したとき、Ｅｍｅｒａｌｄ蛍光強度とＺｓｃａｎ４ｍＲＮＡレベルとの間に直接的な相関関係が認められた（図１Ｅ）ので、Ｅｍ（＋）細胞がＺｓｃａｎ４（＋）細胞でもあることが立証された。
【０２２０】
実施例３：Ｚｓｃａｎ４の発現は、未分化ＥＳ細胞における一過性かつ可逆的な状態を特徴付ける
Ｚｓｃａｎ４の発現が、ＥＳ細胞コロニー内の示差的な細胞型を特徴付けるかどうかを調査するために、ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞を、ＦＡＣＳによってＥｍ（＋）細胞およびＥｍ（−）細胞に選別し、続いて、再度別々に標準ＥＳ細胞培地で培養した。Ｅｍ（＋）細胞とＥｍ（−）細胞の両方が、生存可能な未分化ＥＳ細胞コロニーを確立することができた。しかしながら、ＦＡＣＳ解析によって示されるように、培養中の２４時間までに、５４％のＥｍ（＋）細胞がＥｍ（−）になったのに対し、３．３％のＥｍ（−）細胞が、Ｅｍ（＋）になった（図１Ｆ）。さらに、経時的（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ）実験におけるｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞の生細胞のイメージングから、上記２つの状態間の細胞の移行が実証され、Ｅｍ（＋）細胞とＥｍ（−）細胞の両方が、適切に複製し得、不均一なＥｍｅｒａｌｄ発現パターンを有する新しいコロニーを確立することが確認された。ゆえに、Ｚｓｃａｎ４は、ＥＳ細胞において一過性に発現され、Ｚｓｃａｎ４（＋）状態とＺｓｃａｎ４（−）状態との間の移行は可逆的である。その一過性のＺｓｃａｎ４（＋）状態のＥＳ細胞は、本明細書において「ＥＳ−ｓｔａｒ（ＥＳ＊）状態」と呼ばれる。
【０２２１】
実施例４：ＥＳ＊状態は、初期胚マーカーのアップレギュレーションと関連する
ＥＳ＊状態を、ＦＡＣＳによって選別されたＥｍ（＋）細胞およびＥｍ（−）細胞のＤＮＡマイクロアレイ解析によってさらに特徴付けた。Ｅｍ（＋）細胞は、５５０個の差次的に発現された遺伝子とだけ、Ｅｍ（−）細胞と非常に似た遺伝子発現プロファイルを示した（図１Ｇ）。多能性に関するマーカーは、Ｅｍ（＋）細胞ではＥｍ（−）細胞と比べて変化しないままだったが、Ｔｃｓｔｖ１およびＴｃｓｔｖ３（２細胞特異的転写物バリアント１および３）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＦ０６７０５７．１；Ｚｈａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：４７８０−９０，２００６）が、上位２０個の最も高度にアップレギュレートした遺伝子に見られた（図１Ｈ）。
【０２２２】
ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションから、上記リスト内のその他の８個の遺伝子（Ｔｃｓｔｖ１／３、Ｅｉｆ１ａ、Ｐｉｆ１、ＡＦ０６７０６３、ＥＧ６６８７７７、ＬＯＣ３３２９２３、ＢＣ０６１２１２およびＥＧ６２７４８８）について「Ｚｓｃａｎ４様」発現が明らかになった（図２Ａ）。さらに、二重標識蛍光ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションから、これらの遺伝子のＺｓｃａｎ４との同時発現が確認された（図２Ｂ）。Ｚｓｃａｎ４は、２細胞胚マーカーであるので、Ｅｍ（＋）細胞において最も高度にアップレギュレートした上位２０個の遺伝子からの６つの遺伝子の発現プロファイルを、着床前胚においてｑＲＴ−ＰＣＲによって調べた。調べられた６つ全ての遺伝子が、２細胞胚において高発現ピークを示した；３つの遺伝子が、Ｚｓｃａｎ４のように２細胞期後期において最高ピークを示したのに対し、その他の３つは、２細胞期初期において最高の発現を示した（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果から、初期胚プログラムのいくつかは、ＥＳ＊状態において再活性化されることが示される。
【０２２３】
実施例５：培養物中のほとんどのＥＳ細胞は、ＥＳ＊状態を経る
ＥＳ＊細胞の運命を追跡するために、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターによって駆動されるＣｒｅＥＲＴ２を有するプラスミド（Ｆｅｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７，１９９７）を、ＬａｃＺオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内においてｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシンカセットを有するＲＯＳＡ２６ノックインＥＳ細胞系（Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：７０−７１，１９９９）および安定な細胞系である単離されたｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＥＳ細胞にトランスフェクトした（図３Ａ）。この系では、Ｃｒｅ−リコンビナーゼが、ＥＳ＊状態の細胞において発現され、タモキシフェンの存在下においてのみ細胞質から核に転位し、ＬａｃＺ−ＯＲＦからネオマイシンカセットを切り取ることにより、構成的ＬａｃＺ発現がもたらされる（図３Ａ）。したがって、ＥＳ＊状態の細胞は、ＬａｃＺで遺伝的に標識される。
【０２２４】
予想どおり、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションでＺｓｃａｎ４ＲＮＡについて陽性の細胞が、免疫染色によって証明されるとおり、核に局在するＣｒｅ−リコンビナーゼタンパク質と共染色された（図３Ｂ）。Ｚｓｃａｎ４の発現によって特徴付けられる細胞の全集団を同定するために、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２  ＥＳ細胞を、９回の継代（２７日間）にわたってタモキシフェンの存在下において未分化な状態で継続的に維持した。それらの細胞の免疫染色解析から、Ｐｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４またはＯｃｔ３／４）がＬａｃＺと共染色されることが証明されたことから、それらは、なおも未分化であることが示された（図３Ｃ）。Ｘ−ｇａｌ染色によるＬａｃＺ活性の可視化から、ＬａｃＺによって特徴付けられた細胞の数が、継代とともに徐々に増加し、ＥＳ細胞コロニーの大多数が、継代９代目までにＬａｃＺ陽性になることが示された（図３Ｄおよび３Ｆ）。これらの観察結果は、ＣＭＦＤＧ染色（緑色蛍光ＬａｃＺ基質）後のＦＡＣＳ解析によってさらに確認された（図３Ｅおよび３Ｆ）。ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ  ＥＳ細胞からの観察結果とまとめると、細胞運命追跡実験から、所与の時点において、５％のＥＳ細胞のみがＺｓｃａｎ４の発現について陽性であるが、９回継代した後は、培養物中のほとんどのＥＳ細胞が、Ｚｓｃａｎ４の発現を経験する（すなわち、ＥＳ＊状態）ことが確認された。
【０２２５】
実施例６：ＥＳ＊状態の細胞は、インビトロおよびインビボにおいて多能性を維持する
Ｚｓｃａｎ４の発現が、ＥＳ細胞においてある特定の細胞系統の拘束をもたらすかどうかを決定するために、ｐＺｓｃａｎ４−ＣｒｅＥＲＴ２細胞をタモキシフェンのパルスに曝した後、胚様体（ＥＢ）形成アッセイおよび接着アッセイを行った（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８７：２７−４５，２００７）。ＥＢの分化において、ＥＳ＊状態由来の細胞は、細胞の形態ならびに特定の系統マーカーに対する免疫染色によって判断されるとおり、３つ全ての胚性胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒ）からの系統を含む種々の細胞型に寄与することができた（図３Ｇおよび３Ｈ）。
【０２２６】
ＥＳ＊状態の細胞の多能性をインビボにおいて試験するために、ＦＡＣＳによって選別されたＥｍ（＋）細胞を１６個のマウス胚盤胞に微量注入したところ、４匹の子が得られ、そのうちの２匹が、外皮の色に基づいてキメラだった。もう一つの実験において、作製された９個の胚（Ｅ１０．５）のうち８個が、ＰＣＲ解析によるジェノタイピングに基づいて、キメラだった（図３Ｉ）。ゆえに、そのデータから、ＥＳ＊状態の細胞が、ＥＢ形成によるインビトロでの分化の後の全ての細胞系統に寄与し得、インビボにおいてキメラを形成する能力を有し得るので、それらの細胞が、インビトロおよびインビボにおいて多能性を保持することが証明される。まとめると、これらの結果は、細胞培養における生理学的なＺｓｃａｎ４の発現が、未分化ＥＳ細胞において一過性かつ可逆的であり、それらの細胞の多能性に影響しないことを示す。
【０２２７】
実施例７：Ｚｓｃａｎ４ｃノックダウンは、継代８代目までにＥＳ細胞の細胞培養物のクライシスに導く
Ｚｓｃａｎ４の断続的な発現がＥＳ細胞にとって必須のものであるかどうかを直接試験するために、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞およびＺｓｃａｎ４レスキュー細胞を作製した。第１に、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系を使用して、Ｚｓｃａｎ４ｃのテトラサイクリン（ｔｅｔ）抑制性ＯＲＦを、マウスゲノムのＲＯＳＡ２６遺伝子座にインテグレートすることによって、ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＥＳ細胞を作製した（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ４，２００５）。そのｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＥＳ細胞では、ＩＲＥＳによってＺｓｃａｎ４ｃ  ＲＮＡに連結されたＶｅｎｕｓレポーター遺伝子によって、遺伝子誘導のモニタリングが可能だった。続いて、ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＥＳ細胞を、Ｚｓｃａｎ４ｃとＺｓｃａｎ４ｄの両方に共通の３’非翻訳領域を標的にするＺｓｃａｎ４−ｓｈＲＮＡベクターでトランスフェクトし、正常な形態を有するＥＳ細胞クローンを単離した。この系は、ドキシサイクリンの存在下（Ｄｏｘ＋）においてＺｓｃａｎ４ｃとＺｓｃａｎ４ｄの両方の発現をノックダウンし、そしてドキシサイクリン除去（Ｄｏｘ−）によるＺｓｃａｎ４ｃ−ＯＲＦの外来性のコピーを発現することによってレスキューするように、設計された。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析から、Ｚｓｃａｎ４ｃ発現の９０±２．４％のダウンレギュレーションならびにＺｓｃａｎ４ｄ発現の７０±７．０％のダウンレギュレーションが確認された（図４Ａ）。上記細胞をＤｏｘ−条件で３日間培養することにより、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＯＲＦ発現が５．９±０．２２倍誘導されたのに対し、コントロールｓｈＲＮＡは、同じ親細胞においてＺｓｃａｎ４遺伝子発現に影響しなかった。Ｚｓｃａｎ４ｃの誘導は、２細胞胚において主に発現されるパラログであるＺｓｃａｎ４ｄのアップレギュレーションももたらしたことから、これらの２つのパラログ間の正のフィードバックが示唆される（図４Ａ）。
【０２２８】
Ｚｓｃａｎ４の一過性かつ断続的な発現からの予想どおり、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンは、ＥＳ細胞に直ちに影響せず、クローン単離の際には代表的なＥＳ細胞の形態を示した（図４Ｂ）。しかしながら、継代するにつれて、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞の集団の倍加時間は、コントロール細胞よりも長くなり、扁平な非分裂細胞が、培養物中に蓄積し始めた（図４Ｃおよび４Ｄ）。継代８代目（トランスフェクション後のおよそ３１回の細胞倍加）の間に、細胞の大部分が、培養１〜２日後に突然死滅し、非常に少数の小さなコロニーしか生き残らなかった（図４Ｃおよび４Ｄ）。それらの細胞を２週間にわたって分割せずに３日ごとに継代することによって、生き残ったコロニーを回復させることができた。しかしながら、生き残った細胞は、異常に長い倍加時間を有した。この表現型は、複数の独立した実験において再現性があった。
【０２２９】
実施例８：Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞における細胞増殖の減少
継代８代目における細胞培養物のクライシスをもたらす事象を調査するために、細胞増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイを継代７代目において行った。Ｄｏｘ＋およびＤｏｘ−条件におけるｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞、ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞およびｓｈＲＮＡコントロール細胞を含む全てのコントロール細胞が、正常な増殖曲線を示したので（図４Ｅ）、Ｄｏｘの存在または非存在だけでは、それらの細胞の増殖速度に影響しなかった。対照的に、増殖の有意な減少が、Ｄｏｘ＋条件におけるＺｓｃａｎ４ノックダウン細胞系１および２において観察された（図４Ｅ）。Ｄｏｘ−条件におけるＺｓｃａｎ４ｃの外来性コピーの誘導によるレスキュー実験は、細胞増殖を回復させることができた（図４Ｅ）。
【０２３０】
継代７代目におけるＺｓｃａｎ４ノックダウン細胞系およびコントロール細胞において３日間にわたって毎日、アポトーシス試験および生存能試験をさらに行った（図４Ｆ）。Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞におけるアポトーシスのレベルは、全てのコントロール細胞（すなわち、Ｄｏｘ＋およびＤｏｘ−条件におけるｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ親細胞、ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞、ならびにｓｈＲＮＡコントロール細胞）におけるそれ（最大２％）よりも高かったが、それは１４％までにしか達しなかったことから、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンによる細胞数の有意な減少は、アポトーシスによってではなく主として細胞増殖の減少によって引き起こされるということが示唆される。さらに、このアポトーシス率の中程度の上昇は、Ｄｏｘ−条件におけるＺｓｃａｎ４ｃ−ＯＲＦの誘導によってレスキューされなかったことから、このアポトーシス率の上昇は、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンの直接的な作用でなかったことが示唆される。
【０２３１】
実施例９：Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞における核型の変質およびゲノムの不安定性
最初期の継代を、クローンを単離した後に拡張し、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン（細胞系２）およびコントロール細胞を継代３代目において核型について解析した（図４Ｇ）。８２．５％の正常な核型を有するコントロール細胞（Ｄｏｘ＋）と対照的に、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞（Ｄｏｘ＋）は、６５％しか正倍数性の核型または正常な核型を示さず、様々なタイプの染色体の融合および断片化を含む複数の異常を有した。このことは、培養されたＥＳ細胞についてなおも許容され得ると考えられるが、レスキュー細胞（Ｄｏｘ−）が、より良い核型（７５％正常）を示すことは明白だった。同様の条件下で維持されたコントロール細胞および親細胞は、同様の異常を示さなかった（図４Ｇ）。Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞系１について同様の異常が観察されたことから（表２）、ゲノム不安定性が、特定のクローンの欠陥に起因せず、Ｚｓｃａｎ４ノックダウンによって引き起こされることが示唆された。細胞培養物のクライシス後の継代１０代目において細胞を核型分析したとき、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞の３５％しか正常な核型を示さなかった。注目すべきことに、レスキュー細胞は有意に良好であり、６０％が正常な核型を示した。
【０２３２】
表２
核型解析についてのさらなるデータ
【０２３３】
【表２】
2013503638.tif 000008
図４Ｇに示される細胞系２に対するデータと同様に、継代３代目においてＺｓｃａｎ４ノックダウン細胞が、融合および断片化のような複数の核型異常を示したのに対し、Ｚｓｃａｎ４レスキュー細胞は、改善された核型を有した。細胞のクライシス後の継代１０代目における核型が、さらに悪化したのに対し、Ｚｓｃａｎ４レスキュー細胞の核型は、６０％が正常だった。コントロールとして使用した親ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４細胞は、Ｚｓｃａｎ４誘導後に（Ｄｏｘ−条件において）核型のわずかな改善を示したのに対し、ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙコントロール細胞は、Ｄｏｘ＋条件とＤｏｘ−条件の両方において同様の結果を有した。
【０２３４】
実施例１０：Ｚｓｃａｎ４ノックダウンＥＳ細胞における異常に短いテロメア
Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞において核型が損なわれたことから、テロメア蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（図５Ａ）およびテロメアｑＰＣＲ（図５Ｂ）によるそれらのテロメアの検査が促された。ｑＰＣＲについては、テロメア長の比を、以前に報告されているように（Ｃａｌｌｉｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｗｏｍａｃｋ，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５６：１７−２２，２００６；Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ４７，２００２）単一コピーの遺伝子と比較した。細胞のクライシスの前および後の２つの異なる継代において細胞を回収した。
【０２３５】
注目すべきことに、テロメアＦＩＳＨとテロメアｑＰＣＲの両方が、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞系１および２の両方において有意なテロメアの短縮を示した。ｑＰＣＲ解析は、平均テロメア長が、継代６代目における細胞系１において３０±５％（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）および細胞系２において４５±０．１％短くなったことを示した（図５Ｂ）。対照的に、同じ条件下のｓｈＲＮＡコントロール細胞、ならびに誘導されていないＤｏｘ＋条件におけるｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞および親ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞のテロメアは、継代されてもインタクトなままだった。ｑＰＣＲデータは、テロメアの短縮が、Ｚｓｃａｎ４ｃの過剰発現によってレスキューされることを示したことから（図５Ｂ）、Ｚｓｃａｎ４のノックダウンがテロメアの短縮を引き起こすということが示唆された。
【０２３６】
定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）解析（Ｐｏｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３６：２６７−２７８，１９９９）によって、テロメアｑＰＣＲのデータをさらに検証した。Ｃｙ３結合体化プローブによってテロメアを可視化し（図５Ａ）、シグナル強度をＴＦＬ−Ｔｅｌｏソフトウェアによって測定した。テロメア長の分布図は、継代６代目のＺｓｃａｎ４ノックダウン細胞におけるテロメア長全体が（図５Ｃ）、コントロール細胞のそれ（図５Ｅ）よりも短いことを証明した。
【０２３７】
驚いたことに、テロメアは、Ｚｓｃａｎ４ｃを過剰発現させることによってＺｓｃａｎ４レスキュー細胞において伸長され；平均して、そのテロメアは、正常細胞におけるテロメアよりも１．７倍長く、ノックダウン細胞のテロメア（図５Ｃ）よりも２．４倍長かった。Ｚｓｃａｎ４レスキュー細胞についての分布図はまた、テロメア長の平均の延長が、異常に長いテロメアに起因するのではなく、テロメア長のより長いが正常な範囲への全体的なシフトに起因したことを示すものである（図５Ｃ）。
【０２３８】
実施例１１：Ｚｓｃａｎ４の一過性の発現はＥＳ細胞においてテロメア長を伸長する
遺伝子誘導の前および後の親ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞において、テロメアに対するＺｓｃａｎ４過剰発現の作用も調べた（図５Ｄおよび５Ｅ）。実際に、テロメアＱ−ＦＩＳＨの結果は、誘導されていないｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞における３９．４±０．１３ｋｂ（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）から、Ｚｓｃａｎ４を過剰発現している細胞における６５．９±０．２ｋｂへの、平均テロメア長の有意な増加（１．８倍）を示した（図５Ｅ）。図５Ｃに示されているＺｓｃａｎ４レスキューの結果と一致して、テロメア長の分布図は、テロメア長のより長いが正常な範囲へのシフトを示した（図５Ｅ）。
【０２３９】
Ｑ−ＦＩＳＨの結果を検証するために、テロメアｑＰＣＲによってもテロメアを測定した。Ｑ−ＦＩＳＨの結果に一致して、Ｄｏｘ−条件下のｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞における相対的なテロメア長は、誘導されていないＤｏｘ＋条件におけるテロメア長よりも長かった（２．４７±０．３８倍）（図５Ｆ）。予想どおり、コントロールｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞は、Ｄｏｘ＋条件とＤｏｘ−条件との間に有意差を示さなかったので、この作用は、Ｄｏｘ自体によって引き起こされたわけではなかった。さらに、テロメアｑＰＣＲ解析は、ＦＡＣＳによって選別されたｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ細胞を用いて、内因性ＥＳ＊状態とテロメア伸長を相関させることができた（図５Ｆ）。Ｅｍ（＋）細胞の相対的なテロメア長は、コントロールｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞よりも２．４４±０．２７倍長かったのに対し、Ｅｍ（−）細胞の相対的なテロメア長は、０．８９±０．１５倍短かった（図５Ｆ）。まとめると、テロメアＱ−ＦＩＳＨおよびｑＰＣＲデータから、ＥＳ＊状態（すなわち、Ｚｓｃａｎ４ｃの発現）が、伸長されたテロメア長と関連することが示される。
【０２４０】
Ｚｓｃａｎ４によるテロメアの延長が、テロメラーゼ活性の増加によって媒介される可能性を試験するために、テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイを実施した。ＴＲＡＰアッセイは、誘導されていないＤｏｘ＋細胞と比較して、誘導されたＤｏｘ−ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞におけるテロメラーゼ活性において軽度の効果（３０％高い）しか証明しなかった（図６Ａ）。しかしながら、ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞は、Ｄｏｘ除去に対しても同様の軽度の応答を示した（図６Ａ）。ゆえに、テロメラーゼ活性のわずかな上昇は、Ｄｏｘ除去に関係し得るが、Ｚｓｃａｎ４誘導によって直接引き起こされない可能性がある。さらに、テロメラーゼ活性のそのわずかな上昇は、Ｚｓｃａｎ４過剰発現に関連する迅速なテロメア伸長を説明し得ることはありそうにない。
【０２４１】
実施例１２：ＺＳＣＡＮ４は、テロメア上に減数分裂特異的相同組換えタンパク質と共局在する
ＺＳＣＡＮ４の予測される構造物から、ＳＣＡＮドメイン、ならびにその他のタンパク質をクロマチンにリクルートする役割を示すＤＮＡ結合ドメインの存在が示される。実際に、免疫染色解析から、Ｄｏｘ除去によって３日間誘導した後のＺＳＣＡＮ４Ｃ−ＦＬＡＧの核局在化が示された（図６Ｂ）。ＺＳＣＡＮ４タンパク質が、Ｍ期中にクロマチンで活性であるかどうかを決定するために、Ｚｓｃａｎ４を過剰発現している細胞の遺伝子誘導の前および後の分裂中期染色体スプレッドを免疫染色解析によってアッセイした（図６Ｃ）。ＺＳＣＡＮ４Ｃ−ＦＬＡＧは、分裂中期染色体に局在し；特に、その染色体のいくつかが、染色体の両端により強い染色を有したことから、ＺＳＣＡＮ４Ｃ−ＦＬＡＧの、これらの染色体のテロメアへのより特異的な局在が示唆された。
【０２４２】
ＺＳＣＡＮ４タンパク質がテロメアの組換えにおいて機能するかどうかを試験するために、共局在に関する研究を、テロメアマーカーを用いてＺＳＣＡＮ４に対して行った。共焦点顕微鏡検査による免疫染色解析から、ＺＳＣＡＮ４の細胞増殖巣が、テロメア上でＴＲＦ１（Ｃｈｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１６６３−７，１９９５）およびＴＲＦ２（Ｏｐｒｅｓｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４１１１０−９，２００２）と同時に標識されることが証明された（図８Ａ）。さらに、マイクロアレイ解析から、減数分裂特異的相同組換え遺伝子が、ＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４ｃの過剰発現によって誘導されることが示された。ｑＲＴ−ＰＣＲによる解析から、減数分裂の組換え中に二本鎖ＤＮＡの切断（ＤＳＢ）を促進する酵素Ｓｐｏ１１（Ｋｅｅｎｅｙら、Ｃｅｌｌ  ８８：３７５−８４，１９９７；Ｍａｈａｄｅｖａｉａｈら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２７１−６，２００１）、ＤＳＢの修復に必要なリコンビナーゼＤｍｃ１（Ｒｅｉｎｈｏｌｄｔら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １１４：１２７−３４，２００５）、およびコヒーシン（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）Ｓｍｃ１（Ｒｅｖｅｎｋｏｖａら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：５５５−６２，２００４）に対する結果が確証された（図８Ｂ）。免疫染色は、ＳＰＯ１１がＺＳＣＡＮ４細胞増殖巣と共局在することを示した（図８Ｃ，上パネル）ことから、ＳＰＯ１１が、Ｔ−ＳＣＥを開始する、テロメアにおけるＤＳＢの誘導において役割を果たすことが示された。減数分裂の組換え中に、ＤＳＢは、Ｚｓｃａｎ４ｃの過剰発現後に形成するＨ２ＡＸ／ＺＳＣＡＮ４細胞増殖巣に包まれる（図８Ｃ，下パネル）。ＲｅｃＡホモログＤＭＣ１は、さらにＥｍ＋細胞においてＴＲＦ１と共局在した（図８Ｄ，下パネル）；さらに、ＺＳＣＡＮ４細胞増殖巣は、Ｅｍ＋細胞においてＴＲＦ１と共局在することが確認された（図８Ｄ，上パネル）。まとめると、これらの結果から、Ｚｓｃａｎ４が、減数分裂特異的相同組換え機構の誘導およびテロメアへの動員に関わることが示される。
【０２４３】
実施例１３：Ｚｓｃａｎ４過剰発現はテロメアの組換えを促進する
最近の発見から、着床前胚が、テロメア姉妹染色分体交換（Ｔ−ＳＣＥ）による１細胞周期以内での迅速なテロメアの伸長を活性化する能力を有することが確証された（Ｌｉｕら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１４３６−４１，２００７）。Ｚｓｃａｎ４は、ＥＳ細胞および２細胞胚に対する共通のマーカーであるので、テロメア染色体配向ＦＩＳＨ（ＣＯ−ＦＩＳＨ）を行うことによって、テロメアの代替延長（ＡＬＴ）がＥＳ＊状態において活性化されるかどうかが調査された（Ｂａｉｌｅｙら、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  １１：１３９−１４４，１９９６）（図６Ｄ）。ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞（コントロール）におけるテロメアの組換え頻度は、非常に低く、Ｄｏｘ＋条件とＤｏｘ−条件との間で有意差は示されなかった：Ｄｏｘ＋条件では核１つあたり０．１９±０．１３（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）のＴ−ＳＣＥ事象が認められ、Ｄｏｘ−条件では核１つあたり０．２４±０．１４の事象が認められた（図６Ｅ）。Ｄｏｘ＋条件における誘導されていないｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞について同様の頻度が観察された：核１つあたり０．２６±０．１５のＴ−ＳＣＥ事象が認められた。対照的に、３日間にわたるＺｓｃａｎ４ｃ誘導は、Ｔ−ＳＣＥ事象を＞１０倍加加させた：７６％の核が、核１つあたり２．９７±０．２１のＴ−ＳＣＥ事象を示した（図６Ｅ）。ゆえに、このデータは、Ｚｓｃａｎ４の一過性の発現が、テロメアの組換えを促進することを明らかに示した。
【０２４４】
実施例１４：Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞における姉妹染色分体交換の発生率上昇
Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞のゲノム不安定性をさらに調べるために、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）アッセイを行った。ＳＣＥ事象の有意に高い頻度が、Ｚｓｃａｎ４ノックダウン細胞において認められた（図７Ａ）。Ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞ならびに親ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞をコントロールとして使用した。
【０２４５】
ＥＳ細胞についての以前の報告と一致して（Ｄｒｏｎｋｅｒｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：３１４７−５６，２０００；Ｔａｔｅｉｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：４７４−８１，２００３）、基礎のＳＣＥは、全てのコントロール細胞において比較的低かった：ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙ細胞は、Ｄｏｘ＋におけるＳＣＥ陽性核１つあたりわずか５．２５±２．５５のＳＣＥ事象（すなわち、解析された全ての細胞の１３±１．４％）（図７Ｂおよび７Ｃ）、およびＤｏｘ−条件におけるＳＣＥ陽性核１つあたり６．２５±２．６５のＳＣＥ事象（すなわち、解析された全ての細胞の１２．７±３％）であり、Ｄｏｘ除去による有意差がなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。Ｄｏｘ＋条件における親ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞に対する基礎のＳＣＥ率は、わずかに低く、わずか８±２％の核が、陽性核１つあたり４．７５±１．２６のＳＣＥを有した。対照的に、２９±０．７％のＺｓｃａｎ４ノックダウン細胞が、陽性核１つあたり１１．２７±４．２のＳＣＥを有した（図７Ｂおよび７Ｃ）。Ｚｓｃａｎ４の発現が、３日間にわたるＤｏｘ−条件によってレスキューされるとき、自発的なＳＣＥの数は、劇的に減少した。わずか１３％の分裂中期スプレッドがＳＣＥ陽性であり（図７Ｂ）、ＳＣＥ陽性核１つあたり少数（２．８６±２．１）のＳＣＥ（図７Ｃ）を有し、これはコントロール細胞に匹敵した。
【０２４６】
驚いたことに、親ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４ｃ細胞におけるＺｓｃａｎ４ｃ過剰発現は、ＳＣＥ事象を劇的に減少させ、わずか２±１．１５％の細胞が、陽性核１つあたり２．２５±１．５のＳＣＥ事象を有し、これは、Ｄｏｘ＋条件下におけるものより４倍低く、ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙコントロールにおけるものより６倍低かった（図７Ｂおよび７Ｃ）。このデータから、Ｚｓｃａｎ４の発現が、ＥＳ細胞におけるＳＣＥの発生率を減少させ得るのに対し、ノックダウンが、ゲノム不安定性およびＳＣＥ率を高めることが示される（図７Ｄ）。
【０２４７】
まとめると、これらのデータは、Ｚｓｃａｎ４が、例えば、ＳＣＥ率ならびにテロメアの調節を含む機構による、長期間にわたるゲノム安定性に欠くことができない複数の系列の証拠を提供している。
【０２４８】
実施例１５：レチノイン酸は、Ｚｓｃａｎ４の一過性発現を誘導する
この実施例には、レチノイド（ビタミンＡ、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸およびオールトランス−レチノイン酸を含む）が、マウスＥＳ細胞培養物におけるＺｓｃａｎ４＋細胞を一過性に増加させ得るという知見が記載される。
【０２４９】
材料
エタノール中のオールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）の２０ｍＭの原液を１μＭ、２μＭまたは５０ｎＭという最終濃度で使用した。９−ｃｉｓＲＡおよび１３−ｃｉｓＲＡを最終１μＭという最終濃度で使用した。ビタミンＡ（レチノール）を５μＭの最終濃度で使用した。
【０２５０】
結果
Ｚｓｃａｎ４の発現は、オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）によって一過性に誘導される
Ｚｓｃａｎ４ｃのプロモーター下で調節される緑色蛍光タンパク質（Ｅｍｅｒａｌｄ：Ｅｍ）を有するプラスミドがゲノム内にインテグレートされたマウスＥＳ細胞（ｐＺｓｃａｎ４−Ｅｍｅｒａｌｄ７（ＭＣ１−ＺＥ７）細胞と呼ばれる）を本研究において使用した。本発明者らの以前の研究では、Ｚｓｃａｎ４発現の誘導が、Ｅｍｅｒａｌｄ蛍光の誘導によってモニターされ得ることを示した。まず、白血病抑制因子の存在下（ＬＩＦ＋）かつａｔＲＡの非存在下（ａｔＲＡ−）のゼラチンコートプレートに細胞を継代した。翌日（０日目）、各ウェルの培地を４つの異なる条件：ＬＩＦ＋ａｔＲＡ−、ＬＩＦ＋ａｔＲＡ＋、ＬＩＦ−ａｔＲＡ−およびＬＩＦ−ａｔＲＡ＋に変更した。ａｔＲＡの最終濃度は、２μＭであった。その細胞を、培地を毎日交換するが継代せずに、同じ培地中で８日間維持した。細胞を毎日回収し、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＧＦＰ＋細胞の数をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。
【０２５１】
その培養物中のＥｍ＋細胞（すなわち、Ｚｓｃａｎ４＋細胞）の画分は、ａｔＲＡによって劇的に誘導され、ａｔＲＡ処理の２日目にピークに到達した（図９）。しかしながら、このＺｓｃａｎ４＋細胞の誘導は、一過性であり、ａｔＲＡ処理の４日目までに基礎レベルに低下した。ＬＩＦは、ＥＳ細胞を未分化な状態で維持し得、標準ＥＳ細胞培地の一部である十分に確立された因子である。ａｔＲＡによるＺｓｃａｎ４＋細胞の一過性の誘導は、ＬＩＦ＋条件とＬＩＦ−条件の両方において観察された。
【０２５２】
Ｚｓｃａｎ４の発現は、その他のレチノイドによって一過性に誘導される
ａｔＲＡは、哺乳動物の細胞培養系に対して最も一般的に使用されるが、それらの細胞に対して同様の活性を時折有するその他のレチノイドも存在する。その他のレチノイドをＺｓｃａｎ４誘導性について試験するために、同様の経時的動態アッセイを、ａｔＲＡ（最終濃度５０ｎＭ）、９−ｃｉｓＲＡ（最終濃度５０ｎＭ）、１３−ｃｉｓＲＡ（最終濃度５０ｎＭ）またはビタミンＡ（最終濃度５μＭ）を用いて行った。Ｚｓｃａｎ４＋細胞の画分が、各レチノイドによって一過性に増加し、２日目にピークに到達した（図１０Ａ）。しかしながら、処理の７日以内に、Ｚｓｃａｎ４＋細胞の第二の増加が、ビタミンＡおよび１３−ｃｉｓＲＡについて観察されたが、ａｔＲＡおよび９−ｃｉｓＲＡについては観察されなかった。このことは、細胞増殖に対するこれらのレチノイドの差次的な作用によって部分的に説明し得る；ビタミンＡは、細胞増殖に影響せず、１３−ｃｉｓＲＡは、細胞増殖に対して中程度の抑制を示し、ａｔＲＡと９−ｃｉｓＲＡの両方は、細胞増殖に対してほぼ完全な抑制を誘導した（図１０Ｂ）。Ｚｓｃａｎ４＋細胞は、ビタミンＡおよび１３−ｃｉｓＲＡの存在下においてＺｓｃａｎ４−細胞よりも増殖優位性を有し得る。
【０２５３】
これらの知見から、レチノイド（ビタミンＡ、１３−ｃｉｓ−ＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡおよびａｔＲＡを含む）が、マウスＥＳ細胞培養においてＺｓｃａｎ４＋細胞を一過性に増加させ得ることが証明される。
【０２５４】
実施例１６：酸化ストレスはＺｓｃａｎ４の発現を誘導する
この実施例には、Ｚｓｃａｎ４の発現が、酸化ストレスに曝されたＥＳ細胞において増加するという知見が記載される。
【０２５５】
ＭＣ１−ＺＥ７細胞を標準ＥＳ細胞培地（ＬＩＦ＋）中で培養した。その培地に、１００μＭ、３００μＭまたは１０００μＭの最終濃度で過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を加えた。それらの細胞を２日間培養し、Ｅｍ＋（すなわち、Ｚｓｃａｎ４＋細胞）のパーセンテージをＧｕａｖａフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。その結果から、酸化ストレス（Ｈ２Ｏ２によって誘導される）が、Ｚｓｃａｎ４＋細胞の数を増加させることが証明される（図１１）。
【０２５６】
実施例１７：Ｚｓｃａｎ４はＥＳ細胞をＤＮＡ傷害剤から保護する
この実施例には、ＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４の過剰発現が、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）およびシスプラチンを含むＤＮＡ傷害剤に曝された後のそれらの細胞の生存を増強するという知見が記載される。
【０２５７】
コントロール細胞（ｔｅｔ−Ｅｍｐｔｙプラスミドを有する）およびＺｓｃａｎ４を発現している細胞（ｔｅｔ−Ｚｓｃａｎ４プラスミドを有する）を本研究において使用した。これらの細胞を標準ＥＳ培地（ＬＩＦ＋）中で培養した。細胞を２群：（１）ドキシサイクリンの非存在下（Ｄｏｘ−）、または（２）最終濃度０．２μｇ／ｍｌでのドキシサイクリンの存在下（Ｄｏｘ＋）に継代した。Ｄｏｘ＋およびＤｏｘ−培地は、毎日交換した。４日目に、それらの細胞を０〜６００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度のＭＭＣの存在下において６時間培養した。次いで、その培地を交換することによって、ＭＭＣを培養物から除去した。それらの細胞をさらに３日間、Ｄｏｘ＋培地中でインキュベートし、その培地は毎日交換した。細胞を回収し、生細胞数を数えた。
【０２５８】
結果から、コントロール細胞では、ＭＭＣの用量が多くなるほど、細胞の生存率が低下することが示される（図１２Ａ）。しかしながら、コントロール細胞（Ｚｓｃａｎ４の発現が誘導されていない）の場合は、Ｄｏｘ＋条件とＤｏｘ−条件との間に有意差はない。対照的に、Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞ではＤｏｘ＋条件とＤｏｘ−条件との間に有意差が存在した（図１２Ｂ）。これらの細胞は、ＭＭＣ処理に対して生存率の上昇を示した。これらの結果から、Ｚｓｃａｎ４の過剰発現が、ＭＭＣのようなＤＮＡ傷害剤による遺伝毒性の攻撃からＥＳ細胞を保護することが示される。シスプラチンを用いたときも同様の結果が得られた。
【０２５９】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な態様に照らして、例証された態様は本開示の単なる例でしかないと認識されるべきであり、本発明の範囲を限定すると見なされるべきでない。むしろ本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。ゆえに、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神に入る全てを本発明者らの発明と主張する。
【図１Ｂ】
2013503638.tif 000009
【図１Ｄ】
2013503638.tif 000010
【図１Ｅ】
2013503638.tif 000011
【図１Ｆ−１】
2013503638.tif 000012
【図１Ｆ−２】
2013503638.tif 000013
【図１Ｆ−３】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ｃ】
2013503638.tif 000017
【図３Ａ】
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【図３Ｅ】
2013503638.tif 000019
【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
2013503638.tif 000021
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2013503638.tif 000023
【図４Ｅ】
2013503638.tif 000024
【図４Ｆ】
2013503638.tif 000025
【図４Ｇ】
2013503638.tif 000026
【図５Ｂ】
2013503638.tif 000027
【図５Ｃ】
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【図５Ｅ】
2013503638.tif 000029
【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
2013503638.tif 000031
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2013503638.tif 000033
【図７Ｂ】
2013503638.tif 000034
【図７Ｃ】
2013503638.tif 000035
【図７Ｄ】
2013503638.tif 000036
【図８Ｂ】
2013503638.tif 000037
【図９】
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【図１０Ａ】
2013503638.tif 000039
【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
2013503638.tif 000042
【図１２Ｂ】
2013503638.tif 000043
【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｇ】
2013503638.tif 000051
【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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