(57)【要約】本発明は、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ、および場合によってはＫｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａの抽出物を含有する製剤に関する。前記製剤は、口およびその付属器、咽喉ならびに気道の障害の治療および予防において、ならびにインフルエンザの治療において有用である。特に、好適な担体に組み込まれた、本発明による組合せは、乳児期の細菌性およびウイルス性の障害において特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）バクシニウム  ミルティルス（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物；
ｂ）プニカ  グラナトゥム（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）の抽出物；
ｃ）エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）の抽出物；
および場合によっては
ｄ）クラメリア  トリアンドラ（Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）の抽出物
を含む製剤。
【請求項２】
Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物が、９０％のポリフェノール含有量を有する果実から得られる抽出物である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物が、エキナセア  アングスティフォリア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）および／またはエキナセア  パープレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の根および地上部のアルコール抽出物である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物が、１４％のベンゾフラン含有量ならびに７０％のエラジタンニンおよびプロトカテクタンニン合計含有量を有する前記植物の根および地上部から得られる水／アルコール抽出物である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
単位用量あたり以下の重量の範囲内にある活性成分：
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物：２０から８０ｍｇ；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍの抽出物：２０から４０ｍｇ；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａの抽出物：２０から１００ｍｇ；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａの抽出物：１０から３０ｍｇ
を含有する、前記請求項に記載の製剤。
【請求項６】
単位用量あたり以下の重量の範囲内にある活性成分：
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物：４０から６０ｍｇ；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍの抽出物：２５から３５ｍｇ；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａの抽出物：４０から６０ｍｇ；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａの抽出物：１５から２０ｍｇ
を含有する、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
口およびその付属器、咽喉ならびに呼吸器系の障害、ならびにインフルエンザの治療および予防用の
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍの抽出物；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａの抽出物；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａの抽出物
を含む製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクシニウム  ミルティルス（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）、またはアントシアノシド（ａｎｔｈｏｃｙａｎｏｓｉｄｅ）が豊富な他の種、プニカ  グラナトゥム（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）、および場合によってはクラメリア  トリアンドラ（Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）の抽出物を含有する製剤に関する。前記製剤は、口およびその付属器（ａｄｎｅｘａ）、咽喉ならびに気道（気管）の障害の治療および予防において、ならびにインフルエンザの治療において有用である。
【０００２】
特に、好適な担体に組み込まれた、本発明による組合せは、幼児期、乳児期（ｉｎｆａｎｃｙ）の細菌性およびウイルス性の障害において特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（序論）
プラーク形成を伴う、咽喉の発赤、炎症ならびに細菌感染および／または真菌感染は、インフルエンザ、風邪および類似した障害に一般的に付随する症状である。一般的な風邪およびインフルエンザは、小児および成人の双方に平均して１年に最大３回まで影響を及ぼすが、主にウイルス感染に関連し、そのうちの４０％はライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）によって、１０％はコロナウィルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）によって、より少ない割合でアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）およびパラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）によって引き起こされる。
【０００４】
インフルエンザは、公衆衛生の観点では、死亡の深刻なリスクをもたらす、患者を衰弱させる高頻度の重篤な合併症のために、財政的な観点では、労働時間の減少のために、大きな反動を伴って、世界中で毎年何百万もの人々に影響を及ぼすので、この疾患の予防的および治癒的治療は重要な目標である。
【０００５】
インフルエンザは、特に、高齢者において、その合併症のために、またはそれらの患者に典型的な既存の呼吸障害のために、危険である。同一の問題が幼児、乳児において生じ、この場合、インフルエンザは継続的な風邪および再発の余波を残す。長年にわたり、予防ワクチン接種は、ウイルス疾患を取扱うのに最も有効な方法であると考えられていた；しかし、その有効性は、初期の株に対する免疫に打ち勝つことができるウイルスの新しい変異体の出現による異常な抗原変異性によって限定される。
【０００６】
これらの障害用の特定の治療はないが、抗ヒスタミン剤、充血緩和剤および抗炎症剤は、浮腫の減少が疼痛を緩和して、炎症の根底にある障害の長さを短縮するので、有用であると考えられている。これらの障害は、二次細菌感染の発症により時に合併症を伴う。これは、病原性細菌が容易に増殖できる場合に、鼻腔の出口が、粘膜のうっ血、充血によって妨げられることが多いからであり、発熱および局所的な疼痛を引き起こす。この場合、抗生物質または静菌剤での治療が、症状の治療に加えて必要とされる。しかし、抗生物質は、特に乳児において、身体の防御力を低下させ、再発をもたらす。
【０００７】
最近１０年で採り入れられたノイラミニダーゼ阻害剤も、低い有効性を示し、毒性およびウイルスへの耐性を誘因するという問題を示すことが多い。これらの物質は、Ａ型株およびＢ型株において異なる効果を有し、そのため、感染の型が経験学的にわからないときには、双方の株を攻撃する物質が不可欠である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、市場において現在利用可能なすべての製剤が、子供、小児および妊娠中の女性によって使用されうるわけではない。これは、成人患者（妊娠中の女性を含む）および小児の双方にほぼ無害であって、耐性ウイルスの発生を引き起こさない抗ウイルス製剤が不可欠であることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の説明）
バクシニウム  ミルティルス（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物、プニカ  グラナトゥム（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）抽出物、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）抽出物、および場合によってはクラメリア  トリアンドラ（Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）抽出物を含有する製剤は、比較的高い抗菌活性と共に、インフルエンザＡ型およびＢ型の多様な株に対する、ならびにアデノウイルス、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペス  カタハリス（ｈｅｒｐｅｓ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）および呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）に対する顕著な抗ウイルス活性を有し、口およびその付属器、咽喉ならびに気道（気管）の障害の治療において、ならびにインフルエンザの予防および治療において有効であることが結果的に判明したことが発見された。
【００１０】
したがって、本発明は、
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物
を含有する新しい製剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による製剤は、ウイルスの最も一般的な株、特にインフルエンザウイルスに対して高度に有効であり、風邪およびインフルエンザに通常伴う発熱で細菌プラークの形成を予防することが証明されている。これらの製剤は、一般に、化膿性耳炎および口腔感染においても有効である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物、および場合によってはＫｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物を含有する製剤は、かなりの抗菌活性と共に、インフルエンザＡおよびＢの多様な株に対する、ならびにアデノウイルス、パラミクソウイルス、ｈｅｒｐｅｓ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓウイルス、サイトメガロウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスに対する顕著な抗ウイルス活性を有し、口およびその付属器、咽喉ならびに気道の障害の治療において、ならびにインフルエンザの予防および治療において有効であることが結果的に判明したことが現在発見されている。
【００１３】
したがって、本発明は、
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物、
を含有する新しい製剤に関する。
【００１４】
本発明によれば、「Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓまたは他の種」という用語は、アントシアノシドを含有する植物を含む。これらの植物中に存在するアントシアノシドは、主にシアニジングルコシドおよびデルフィニジングルコシドであり、毛細血管（ｃａｐｉｌａｒｙ）保護、炎症、血管新生および免疫調節に関するその活性は記載されている。
【００１５】
アントシアノシドによって果たされる抗炎症効果は、ＮＦｋＢ阻害、およびそれらの抗血管新生力に関連する；血管新生の過程は炎症に不可欠であり、血管新生はＶＥＧＦ（血管内皮成長因子：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ））に依存するので、これらのパラメータを評価し、ナノモルレベルで活性が認められた。前記分子は、ナノモル濃度で５−リポキシゲナーゼおよび１２−リポキシゲナーゼも阻害する。核内因子ＮＦ−ｋＢは、炎症、および感染に対する免疫応答の双方に関与するが、アントシアンによって、ならびにタンニンおよびその代謝産物によって著しく阻害され、この因子は、ナノモル濃度においても阻害される。
【００１６】
本発明によれば、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物は、９０％のポリフェノール含有量を有する果実から得られる抽出物である。前記抽出物は、抗ウイルス特性および穏やかな抗菌特性を示し、より多いインターフェロンγの合成によって身体の防御力を増大させた。
【００１７】
この抽出物の調製は、水で種々の濃度に希釈されたＣ１〜Ｃ３アルコールによる果実及び／または植物の地上部からの抽出物を含み、抽出溶媒としてはエタノール／水の５０％ｖ／ｖ混合物が好ましい。続いて行われる濃縮によって水／エタノール抽出物から有機溶媒が完全に濃縮され、得られた濁った分散液がバイオマスの重量の０．２％となる量のポリビニルピロリドンによって処理され、所望としない重合タンニンを除去するために濾過され、そうして清澄化された溶液をポリスチレン樹脂に載せて成分を吸着させ、更に、この樹脂を洗浄して、可溶性成分をポリステリン樹脂から完全に除去する。本発明において用いられる抽出物の構成成分である活性成分は、上記の樹脂を９０％エタノールで洗浄することにより回収することができる。エタノール溶出液の少容量への濃縮及び残渣の５０℃をこえない温度での真空下での乾燥により、ポリフェノールを豊富に含むポリフェノール高濃度の抽出物が提供される。
【００１８】
本発明によれば、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）抽出物は、エキナセア  アングスティフォリア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）および／またはエキナセア  パープレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の根および地上部のアルコール抽出物であることが好ましい。
【００１９】
抗菌活性および抗ウイルス活性は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物について、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ペニシリン耐性）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの株において、記載されている。これらの活性は、ポリフェノール部分と、ポリ不飽和酸のイソブチルアミドが豊富な親油性部分との双方に関連する（Phytomedicine、17、563、2010）。イソブチルアミドは、カンナビノイドおよびバニロイドＴＲＰＶ１受容体の強力なリガンドであり、結果的に疼痛、炎症および免疫応答に作用する。カンナビノイドアゴニスト化合物も、Ｃａｎｎａｂｉｓ誘導体で最近示されたように、免疫応答の強化に関連する。
【００２０】
本発明によれば、Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物は、その植物の根および地上部から得られる水／アルコール抽出物である。この抽出物は、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物の調製用の先に記載の手順に従って抽出、精製される。
【００２１】
したがって、得られるＫｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物は、１４％のベンゾフラン含有量ならびに７０％のエラジタンニンおよびプロトカテクタンニン（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ  ｔａｎｎｉｎ）の合計含有量を有する。Ｋｒａｍｅｒｉａ抽出物は、１ｍＬあたりのマイクログラムの濃度におけるその抗菌作用および抗真菌作用について知られている。
【００２２】
現在、驚くべきことに、本発明による製剤は、別々に投与されたときの多様な抽出物のものを顕著に超える抗微生物活性および抗ウイルス活性を有することが見出されており、これは、治療または予防の観点で先験的に予知可能ではない、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相乗的メカニズム（機構）の存在を示唆しており、この相乗的機構が、特に、その物質の抗微生物活性および抗ウイルス活性を増強している。
【００２３】
本発明による製剤は、ウイルスの最も一般的な株、特にインフルエンザウイルスに対して高度に有効であり、風邪およびインフルエンザに通常伴う発熱での細菌プラークの形成を予防することが証明されている。これらの製剤は、一般に、化膿性耳炎および口腔感染においても有効である。
【００２４】
好ましい一態様によれば、本発明による製剤は、単位用量あたり以下の重量区間の範囲内にある活性成分：
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物：２０から８０ｍｇ；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物：２０から４０ｍｇ；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物：２０から１００ｍｇ；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物：１０から３０ｍｇ
を含有する。
【００２５】
特に好ましい一態様によれば、本発明による組成物は、単位用量あたり以下の重量の範囲内にある以下の活性成分：
ａ）Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ、またはアントシアノシドが豊富な他の種の抽出物：４０から６０ｍｇ；
ｂ）Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物：２５から３５ｍｇ；
ｃ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物：４０から６０ｍｇ；
および場合によっては
ｄ）Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物：１５から２０ｍｇ
を含有する。
【００２６】
使用される医薬製剤は、主に、口腔内で徐々に溶解する錠剤として、または活性成分の徐放を可能にするチューインガムとして製剤化される。これらの製剤は、予防的治療において主に使用されるが、治療用、および口腔衛生用にも使用される。
【００２７】
したがって、前記製剤は、よく知られている従来法、例えば、「Remington's Pharmaceutical Handbook」、Mack Publishing Co.、N.Y.、USAに記載されているものなどに従って、好適な添加剤と共に調製される。
【実施例】
【００２８】
以下の例は、本発明を詳細に例示するものである。
【００２９】
例Ｉ−以下を含有する１０００ｍｇチュアブル錠（ｃｈｅｗａｂｌｅ  ｔａｂｌｅｔ）
Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物  ３０．０ｍｇ
Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ抽出物（４０％アントシアノシド）  ６０．０ｍｇ
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物  ５０．０ｍｇ
マンニトール  ４２９．５ｍｇ
フルクトース  ３００．０ｍｇ
無水クエン酸  １０．０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム塩  ４０．０ｍｇ
ベヘン酸グリセリル  ２０．０ｍｇ
サッカリンナトリウム  ０．５ｍｇ
ソフト果樹香味剤（ｓｏｆｔ  ｆｒｕｉｔ  ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）  ２０．０ｍｇ
例ＩＩ−以下を含有する１０００ｍｇチュアブル錠
Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物  ４０．０ｍｇ
Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ抽出物（４０％アントシアノシド）  ８０．０ｍｇ
Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物  ３５．０ｍｇ
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物  ５０．０ｍｇ
サッカロース  ４７２．０ｍｇ
マンニトール  ２３０．０ｍｇ
無水クエン酸  １０．０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム塩  ４０．０ｍｇ
ベヘン酸グリセリル  ２０．０ｍｇ
サッカリンナトリウム  ０．５ｍｇ
グリチルリチン酸アンモニウム  ３．０ｍｇ
ソフト果樹香味剤  ２０．０ｍｇ
例ＩＩＩ−以下を含有する即席の懸濁液用の顆粒（ｇｒａｎｕｌａｔｅ）：
Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物  ４０．０ｍｇ
Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ抽出物（４０％アントシアノシド）  ６０．０ｍｇ
Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ抽出物  ２０．０ｍｇ
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物  ５０．０ｍｇ
マンニトール  ９００．０ｍｇ
グアーガム  １００．０ｍｇ
サイクラミン酸ナトリウム  ２１．０ｍｇ
無水クエン酸  ３０．０ｍｇ
グリチルリチン酸アンモニウム  １０．０ｍｇ
アセスルファムＫ  ３．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース  １．０ｍｇ
例ＩＶ−以下を含有する即席の懸濁液用の顆粒：
Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ抽出物  ４０．０ｍｇ
Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ抽出物（４０％アントシアノシド）  ６０．０ｍｇ
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物  ５０．０ｍｇ
マンニトール  ９２０．０ｍｇ
グアーガム  １００．０ｍｇ
サイクラミン酸ナトリウム  ２１．０ｍｇ
無水クエン酸  ３０．０ｍｇ
グリチルリチン酸アンモニウム  １０．０ｍｇ
アセスルファムＫ  ３．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース  １．０ｍｇ
例Ｖ−生物活性
本発明による組成物を、口腔内の細菌感染を患う両方の性別の１０名の患者の６群において試験した。
【００３０】
これらの患者を、組合せ（例ＩＩ）または単一成分を含有する錠剤で１日３回、３日間治療した。最初の治療の１時間前および最後の治療の１時間後に、咽頭および扁桃の充血も、４点の尺度（なし＝０、軽微＝１、中程度＝２、重度＝３）で評価した。
【００３１】
この結果を表１に示している。
【００３２】
【表１】
2013539770.tif 000002
【００３３】
同時に、患者に１０ｍＬの無菌蒸留水で２０秒間うがいをさせて、試料を採取した。
【００３４】
試料を、０．２％のジチオスレイトールを含有するＲｉｎｇｅｒ溶液中で適切に希釈し、０．５ｍｌの各希釈液を、５％のヒツジ血液を補った４枚の寒天プレート（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）上に播いた；これらのプレートを、嫌気培養のためにＣＯ２雰囲気中で７２時間インキュベートした。インキュベート後、コロニーの数を数えた。
【００３５】
この結果を表２に示している。
【００３６】
【表２】
2013539770.tif 000003
【国際調査報告】
2013539770.tif 000004
2013539770.tif 000005
2013539770.tif 000006