(57)【要約】  本発明は、これに限定されないが、癌マーカーの標的化阻害を含む、癌治療のための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、前立腺癌の臨床標的としての再発性遺伝子融合に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子のＥＴＳドメインに結合するペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子は、ＥＲＧである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは、ペプチド配列ＲＡＬＲＹＹＹＤＫ（配列番号１）を含む前記ＥＴＳドメインの領域に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＥＲＧのＲ３６７を含む前記ＥＴＳドメインの領域に結合する、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＥＲＧのアミノ酸Ｒ３６７〜Ｋ３７５に結合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドは、アミノ酸配列ＬＳＦＧＳＬＰ（配列番号２）、ＦＴＦＧＴＦＰ（配列番号４４）、およびＬＰＰＹＬＦＴ（配列番号４５）を含むペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドは、ＬＳＦＧＳＬＰ（配列番号２）からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
細胞におけるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の生物学的活性を阻害する方法であって、前記細胞を前記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子のＥＴＳドメインに結合するペプチドに接触させることを含む、方法。
【請求項９】
前記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子は、ＥＲＧである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドは、ペプチド配列ＲＡＬＲＹＹＹＤＫ（配列番号１）を含む前記ＥＴＳドメインの領域に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドは、ＥＲＧのＲ３６７を含む前記ＥＴＳドメインの領域に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドは、ＥＲＧのアミノ酸Ｒ３６７〜Ｋ３７５に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドは、ＬＳＦＧＳＬＰ（配列番号２）、ＦＴＦＧＴＦＰ（配列番号４４）、およびＬＰＰＹＬＦＴ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドは、ＬＳＦＧＳＬＰ（配列番号２）からなるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は、癌細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌細胞は、前立腺癌細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、インビボである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、動物内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物は、ヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、エクスビボである、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子は、アンドロゲン制御遺伝子に融合する、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子は、ＥＲＧであり、前記アンドロゲン制御遺伝子は、ＴＭＰＲＳＳ２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的活性は、前記細胞の浸潤である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年２月１９日に出願された特許仮出願第６１／３０６，２６２号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ０６９５６８、ＣＡ１２９５６５、ＣＡ１３２８７４、およびＣＡ１１１２７５、ならびに米国陸軍医学研究司令部によって授与されたＷ８１ＸＷＨ−０８−０１１０に基づいて連邦政府の支援のもとに実施された。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、これに限定されないが、癌マーカーの標的化阻害を含む、癌治療のための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、前立腺癌の臨床標的としての再発性遺伝子融合に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌の研究において中心となる目的は、原因として発癌に関与する変化した遺伝子を同定することである。塩基置換、挿入、欠失、転座、ならびに染色体の増加および消失を含む数種類の体細胞変異が同定されており、それらは全て、発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の活性に変化をもたらす。１９００年代初期に最初の仮説が立てられ、現在では、癌における染色体再配列の因果的役割に関する有力な証拠が存在する（Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １：２４５（２００１））。再発性染色体異常は、主に、白血病、リンパ腫、および肉腫の特徴であると考えられていた。遙かに一般的であり、ヒトの癌に関連する罹患率および死亡率の相対的に大部分に寄与する上皮腫瘍（癌腫）は、既知の疾患特異的染色体再配列の１％未満を占める（Ｍｉｔｅｌｍａｎ，Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ４６２：２４７（２０００））。血液学的悪性疾患は、平衡のとれた疾患特異的染色体再配列によって特徴付けられることが多いのに対し、ほとんどの固形腫瘍は、過多の非特異的染色体異常を有する。固形腫瘍の核型の複雑性は、癌の発生または進行を通じて獲得される二次的な変化によるものであると考えられる。
【０００４】
染色体再配列の２つの主要な機構が説明されている。１つの機構において、１つの遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素が、癌原遺伝子に隣接して再配列され、それによって発癌タンパク質の発現の変化が引き起こされる。この種類の転座は、免疫グロブリン（ＩＧ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のＭＹＣへの並置によって例示され、それぞれ、Ｂ細胞およびＴ細胞の悪性腫瘍においてこの発癌遺伝子の活性化をもたらす（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：１４３（１９９４））。第２の機構において、再配列は、２つの遺伝子の融合をもたらし、それが、新しい機能または変化した活性を有し得る融合タンパク質を生成する。この転座の典型例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合である（Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ２４３：２９０（１９７３）；ｄｅ  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７６５（１９８２））。重要なのは、この知見が、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼを良好に標的とするイマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）の合理的な開発を導いたということである（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：２６４０（２００５））。したがって、一般的な上皮腫瘍における再発性遺伝子再配列を標的とする治療が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、これに限定されないが、癌マーカーの標的化阻害を含む、癌治療のための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、前立腺癌の臨床標的としての再発性遺伝子融合に関する。
【０００６】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞におけるＥＲＧ遺伝子の発現を阻害する方法であって、該遺伝子をＥＲＧに対するｓｉＲＮＡ（例えば、例えば配列番号３０〜４１から選択されるｓｉＲＮＡ）に接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞（例えば、前立腺癌細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボである。いくつかの実施形態において、細胞は、動物（例えば、ヒト）内にある。いくつかの実施形態において、細胞は、エクスビボである。いくつかの実施形態において、ＥＲＧ遺伝子は、ＴＭＰＲＳＳ２に融合する。
【０００７】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞におけるＥＲＧ遺伝子の発現を阻害する薬学的組成物を含むキットであって、該組成物は、ＥＲＧに対するｓｉＲＮＡ（例えば、例えば配列番号３０〜４１から選択される配列を有するｓｉＲＮＡ）を含む、キットを提供する。
【０００８】
他の実施形態において、本発明は、アンチセンス、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、平滑末端を含むｓｉＲＮＡ、オーバーハング、およびｍｉＲＮＡ療法、ならびにそれらの使用のための方法を含む、細胞におけるＥＲＧ遺伝子の発現を阻害する方法および組成物を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子（例えば、ＥＲＧ）のＥＴＳドメインに結合するペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ペプチド配列ＲＡＬＲＹＹＹＤＫ（配列番号１）を含むＥＴＳドメインの領域に結合する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＥＲＧのＲ３６７を含むＥＴＳドメインの領域（例えば、ＥＲＧのアミノ酸Ｒ３６７〜Ｋ３７５）に結合する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＳＦＧＳＬＰ（配列番号２）、ＦＴＦＧＴＦＰ（配列番号４４）、またはＬＰＰＹＬＦＴ（配列番号４５）を含む。
【００１０】
本発明の実施形態は、細胞においてＥＴＳファミリーメンバー遺伝子産物の少なくとも１つの生物学的活性（例えば、浸潤）を阻害するためにペプチドを使用する方法であって、該細胞をＥＴＳファミリーメンバーのＥＴＳドメインに結合するペプチドに接触させることを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞（例えば、前立腺癌細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボ（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物等の動物内）である。他の実施形態において、細胞は、エクスビボまたはインビトロである。いくつかの実施形態において、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子（例えば、ＥＲＧ）は、アンドロゲン制御遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２）に融合する。
【００１１】
さらなる実施形態を本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】前立腺癌におけるＡＲ結合のゲノムランドスケープを示す。（Ａ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑによる代表的な染色体上のＡＲ結合ピーク（Ｂ）ＫＬＫ３エンハンサー上のＡＲ結合のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ読み取り値を示すプロット。（Ｃ）ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞由来のＡＲ結合ゲノム領域の重複を表すベン図（Ｄ）ＡＲ結合部位（ＡＲＢＳ）から最も近い遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）までの距離。（Ｅ）ＡＲ結合ピークの高さは、ＡＲＥモチーフを含む配列の割合（％ＡＲＥ）およびピーク領域当たりのＡＲＥの平均数（＃ＡＲＥ）と正に関連している。（Ｆ）ＡＲ結合ピークの高さは、アンドロゲン応答性と関連している（４時間：ｒ＝０．７２および１６時間：ｒ＝０．６８）。（Ｇ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって同定されたＡＲ結合領域に存在するコンセンサスモチーフ
【図２】前立腺癌の５’融合パートナー上のＡＲ結合と、そのアンドロゲン媒介性遺伝子発現との相関を示す。（Ａ〜Ｅ）前立腺癌において以前に特徴付けられた５’融合パートナーの制御領域におけるＡＲ結合ピーク。プロットは、図１Ｂに示される通りである。Ｙ軸上は、ＶＣａＰ（左）およびＬＮＣａＰ（右）における各２５ｂｐスライドウィンドウにおける読み取りの数である。挿入図は、３日間ホルモンを枯渇させ、エタノール（Ｅ）またはＲ１８８１（Ｒ）で１６時間処理したＬＮＣａＰ細胞内の標的遺伝子に関する、従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲによるＡＲ結合の検証を表す（インプットの割合として測定）。（Ｅ）のプロットの下は、アンドロゲン非感受性ハウスキーピング遺伝子ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対応する領域でＰｏｌＩＩおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３が濃縮されたＣｈＩＰ‐Ｓｅｑピークである。（Ｆ）アンドロゲン制御遺伝子の発現とＡＲ結合との相関。上のパネル：ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞において、アンドロゲン刺激の４時間後および１６時間後に０時間に対してｔ統計値によってランク付けされた、アンドロゲンによって誘導されるかまたは抑制される遺伝子。下のパネル：（４時間）および（１６時間）の曲線は、その遺伝子内領域内またはそれらのＴＳＳの５０ｋｂ上流に少なくとも１つのＣｈＩＰ−ＳｅｑによるＡＲ結合部位を有する差次的に発現される遺伝子の分画についての５００個の遺伝子の移動平均を表す。（Ｇ）少なくとも１つのＡＲ結合部位を含む、アンドロゲンによって誘導されるかまたは抑制される遺伝子の割合。
【図３】前立腺癌細胞におけるＥＲＧ結合のゲノムランドスケープを示す。（Ａ）ＶＣａＰのＡＲ結合遺伝子が濃縮された分子概念のネットワーク図。各ノードは、分子概念または遺伝子セットを表し、ノードの大きさは、各概念内の遺伝子数に比例する。（Ｂ）ＶＣａＰ細胞において以前に報告されたＥＲＧ標的上のＥＲＧ結合の例。（Ｃ）最も近いＴＳＳに対するＡＲまたはＥＲＧ結合部位の分布。（Ｄ）ＶＣａＰ細胞内で同定された内因性ＥＲＧ結合部位と、安定したＥＲＧ過剰発現を示すＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞に見られる異所性ＥＲＧ結合部位との重複を示すベン図。
【図４】ＥＲＧ媒介性経路とＡＲ媒介性経路との分子クロストークを示す。（Ａ）ＬＮＣａＰのＡＲ、ＶＣａＰのＡＲ、ＶＣａＰのＥＲＧ、ＶＣａＰのＨ３Ｋ４ｍｅ３、およびＶＣａＰのＰｏｌＩＩ結合領域の重複。超幾何学的テストによる＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＶＣａＰ細胞内でＡＲおよびＥＲＧによって共占有される遺伝子の代表的な例。プロットは図１Ｂに示す通りであるが、Ｙ軸は、ＡＲ結合（左）およびＥＲＧ結合（右）のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ読み取りの数を表す。（Ｃ）４Ｂに示される遺伝子のリスト上でのＡＲおよびＥＲＧの共占有のＣｈＩＰ−ＰＣＲによる確認。左側のＹ軸は、３日間ホルモンを枯渇させたエタノール（Ｅ）処理済ＶＣａＰ細胞と比較した、Ｒ１８８１（Ｒ）処理済ＶＣａＰ細胞における標的遺伝子のＡＲのＣｈＩＰによる濃縮を表す。
【図５】ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、野生型ＥＲＧ、およびＡＲを接続するフィードバックループを示す。（Ａ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析によりＥＲＧがＡＲの制御領域に結合する。Ａ、Ｅ、およびＩのプロットは図１Ｂに示す通りであるが、Ｙスケールは、示されるように、ＶＣａＰ細胞におけるＡＲまたはＥＲＧ結合のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ読み取りの数である。（Ｂ）従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲによるＡＲの制御領域へのＥＲＧ結合の確認。（Ｃ）ＶＣａＰ細胞における異所性ＥＲＧの過剰発現は、ＡＲ  ｍＲＮＡを抑制する。（Ｄ）ＶＣａＰ細胞における異所性ＥＲＧの過剰発現は、ＡＲタンパク質レベルを阻害する。（Ｅ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析によりＡＲがＡＲの制御領域に結合する。（Ｆ）従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲによるＡＲの制御領域へのＡＲ結合の確認。（Ｇ）合成アンドロゲンＲ１８８１は、ＶＣａＰ細胞におけるＡＲ  ｍＲＮＡの発現を阻害する。（Ｈ）Ｒ１８８１は、ＶＣａＰ細胞におけるＡＲタンパク質の発現を阻害する。（Ｉ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析によりＥＲＧが野生型ＥＲＧの制御領域に結合する。（Ｊ）従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲによる野生型ＥＲＧの制御領域へのＥＲＧ結合の確認。エラーバー：ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、Ｐ＜０．０１。（Ｋ）前立腺癌に頻繁に見られる融合産物である切断型ＥＲＧ（エクソン２〜１２）の異所性発現は、野生型ＥＲＧの発現を誘導するが、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよび全ＥＲＧの発現は誘導しない。（Ｌ）ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの特異的ＲＮＡ干渉は、野生型ＥＲＧの抑制をもたらす。（Ｍ）野生型ＥＲＧは、ＥＴＳ遺伝子融合を発現するヒト前立腺癌のサブセットにおいて誘導される。
【図６】ヒト前立腺癌組織におけるゲノムワイドなＥＲＧおよびＡＲの共局在化の確認を示す。（Ａ）代表的なヒト前立腺癌組織のＥＲＧおよびＡＲのＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析。（Ｂ）ＡＲまたはＥＲＧ結合ゲノム領域と、活性クロマチンおよび遺伝子発現と関連するヒストンマークであるＨ３Ｋ４ｍｅ３が濃縮された領域との重複を示すベン図。（Ｃ）前立腺癌組織においてＡＲおよびＥＲＧによって共占有される遺伝子の代表的な例。プロットは図１Ｂに示す通りであるが、Ｙ軸は、組織におけるＡＲおよびＥＲＧの結合を示し、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑプロットの下に染色体の位置に対する縮尺で示された概略的遺伝子構造を示す。（Ｄ）ＣｈＩＰ−ＰＣＲによるＴＭＰＲＳＳ２およびＡＲのエンハンサー上のＡＲ占有の確認。（Ｅ）ＣｈＩＰ−ＰＣＲによるＡＲおよび野生型ＥＲＧの制御領域上のＥＲＧ占有の確認。（Ｆ）転移性前立腺癌組織中のＥＲＧ結合遺伝子（組織−ＥＲＧ）が濃縮された分子概念のネットワーク図。
【図７】異所性ＥＲＧの発現が、アンドロゲンの非存在下でアンドロゲン感受性前立腺癌細胞の腫瘍特性を維持することを示す。（Ａ）結合したＤＮＡによって媒介される間接的なＡＲおよびＥＲＧの相互作用。ＶＣａＰ  （Ｂ）異所性ＥＲＧの過剰発現は、アンドロゲンの非存在下においてＶＣａＰ細胞の増殖を誘導する。（Ｃ）異所性ＥＲＧの過剰発現は、ホルモンを枯渇させたＶＣａＰ細胞におけるアンドロゲン媒介性の細胞浸潤を一部補助する。（Ｄ）アンドロゲン誘導性およびＥＲＧ媒介性の遺伝子発現パターンの著しい重複（Ｐ＜０．００１）。（Ｅ）前立腺癌細胞における異所性ＥＲＧの過剰発現は、細胞増殖を増大させる。（Ｆ）異所性ＥＲＧの過剰発現は、アンドロゲン非依存性細胞増殖をもたらす。（Ｇ）ヒト前立腺腫瘍における相互接続された転写制御回路の概念モデル。
【図８】ＣｈＩＰ−Ｓｅｑの技術的および生物学的再現性を示す。（Ａ）同じＣｈＩＰ−Ｓｅｑ試料の技術的複製間の再現性（黒い上向きのピーク対赤い下向きのピーク）（ｂ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析による別個のＣｈＩＰおよび試料調製物に由来する２つの生物学的試料間の再現性。
【図９】ＦＫＢＰ５エンハンサー上のＡＲのＣｈＩＰ−Ｓｅｑ結合ピークを示す。
【図１０】ヒト、マウス、および別の１５の脊椎動物のゲノム間の転写因子結合部位の保存を示す。
【図１１】上位ＡＲ結合遺伝子の前立腺組織特異性を示す。
【図１２】ＶＣａＰにおける差次的発現とＡＲ結合との相関を示す。（Ａ）上のパネル：  ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株において、４時間後および１６時間後に０時間に対してｔ統計値によってランク付けされた、アンドロゲンによって上方制御または下方制御された遺伝子。下のパネル：  （４時間）および（１６時間）の曲線は、ＶＣａＰ細胞の転写開始部位の５０ｋｂ上流内または遺伝子内領域内にＡＲ結合部位を含む遺伝子の分画についての５００個の遺伝子の移動平均を表す。（Ｂ）ＣｈＩＰｓｅｑによって同定されるように、ＶＣａＰ内に少なくとも１つのＡＲ結合部位を含むＬＮＣａＰにおいて、０時間に対してアンドロゲン処理の４時間後または１６時間後にアンドロゲンによって上方制御または下方制御された遺伝子の割合（右のパネルに示される）。
【図１３】ＡＲ結合遺伝子のインビボ遺伝子発現との関連性を示す。ＡＲ結合遺伝子は、アンドロゲン応答性（Ａ）、前立腺癌のグレード（Ｂ〜Ｃ）、およびＥＲＧの状態（Ｃ〜Ｄ）と関連する。
【図１４】ＥＲＧによって誘導される差次的発現とＥＲＧ結合との相関を示す。（Ａ）上のパネル：  ＲＷＰＥ良性前立腺上皮細胞においてｔ統計値によってランク付けされた、ＥＲＧの過剰発現によって上方制御または下方制御された遺伝子。下のパネル：  赤い線は、ＶＣａＰ細胞の転写開始部位の５０ｋｂ上流内または遺伝子内領域内にＥＲＧ結合部位を含む遺伝子の分画についての５００個の遺伝子の移動平均を表す。（Ｂ）  ＣｈＩＰｓｅｑによって同定されるように、ＶＣａＰに少なくとも１つのＥＲＧ結合部位を含むＲＷＰＥにおけるＥＲＧの過剰発現によって上方制御または下方制御された遺伝子の割合。
【図１５】ＶＣａＰのＥＲＧ結合遺伝子が濃縮された分子概念のネットワーク図を示す。ＣｈＩＰ−ＳｅｑによりＶＣａＰ細胞内のＥＲＧ結合遺伝子をピークの高さに基づいてランク付けし、上位３０００個の遺伝子を分子シグネチャーまたはＭＣＭに示される遺伝子セットにおける不均衡な濃縮について分析した。
【図１６】ＥＲＧの発現が、ＡＲの発現レベルを負に制御することを示す。（Ａ）ＶＣａＰ細胞をアデノウイルスＥＲＧまたはｌａｃＺ対照に感染させた。ｌａｃＺまたはＥＲＧに感染させた細胞内におけるＥＲＧおよびＡＲのレベルを測定するためにＱＲＴＰＣＲを行った。（Ｂ）ＶＣａＰ細胞を、ＥＲＧに対するｓｉＲＮＡ２本鎖（ｓｉＥＲＧ）または対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＥＲＧおよびＡＲのレベルを測定するためにＱＲＴ−ＰＣＲを行った。（Ｃ）ＲＷＰＥ良性前立腺上皮細胞をアデノウイルスＥＲＧまたはｌａｃＺ対照に感染させた。ＱＲＴ−ＰＣＲ。
【図１７】合成アンドロゲンＲ１８８１の経時的処理後のＡＲ転写物の抑制を示す。
【図１８】一次融合ＥＲＧ産物の過剰発現が、ＬＮＣａＰおよびＰＲＥＣ細胞において野生型ＥＲＧの発現を上方制御することを示す。
【図１９】アンドロゲン処理経過後のＥＲＧ変異体の発現解析を示す。
【図２０】種々のＥＲＧ変異体のＲＮＡ干渉により浸潤が減少されたことを示す。各ＥＲＧ変異体に特異的なＲＮＡ干渉をＶＣａＰ細胞において行った。（Ａ）浸潤アッセイは、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙを用いて行った。（Ｂ）浸潤された細胞の写真を示す。
【図２１】転移性前立腺癌組織のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析によって、ＫＬＫ３およびＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の以前に報告されたエンハンサーにおけるＡＲ結合が明らかになったことを示す。
【図２２】ＷＳＴ細胞増殖アッセイによって判定されるように、ＥＲＧ過剰発現が、ホルモンを枯渇させた前立腺癌細胞の増殖を誘導することを示す。
【図２３】ＥＲＧ過剰発現が、ホルモンを枯渇させたＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ前立腺癌細胞の細胞浸潤を補助することを示す。
【図２４】ホルモンを枯渇させた（Ａ）ＶＣａＰおよび（Ｂ）ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるＥＲＧ過剰発現が、アンドロゲン誘導性の細胞浸潤を一部補助することを示す。
【図２５】（Ａ）〜（Ｄ）ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧのｓｉＲＮＡによる阻害を示す。
【図２６】ＤＱ２０４７７２（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合）の配列を示す。
【図２７】ａ）ファージＥＬＩＳＡによる代表的なファージクローンのＥＲＧタンパク質への特異的結合と、ｂ）濃縮されたファージクローンのコンセンサスペプチド配列を示す。
【図２８】ａ）ＨａｌｏＬｉｎｋ  ＡｒｒａｙによるＥＲＧにおける結合ドメインのマッピングと、ｂ）ＥＲＧ上の相互作用する部位のマッピングを示す。
【図２９】ＥＴＳドメインにおけるファージペプチド結合部位のマッピングを示す。
【図３０】ＬＳＦＧＳＬＰペプチドによるＡＲ−ＥＴＳ相互作用の阻害を示す（ランダムペプチドは阻害しなかった）。
【図３１】合成ペプチドが、ＥＲＧアデノウイルスでトランスフェクトしたＲＷＰＥ細胞のＥＲＧ媒介性浸潤を阻止したことを示す。
【図３２】（Ａ）エタノールまたはＤＨＴ（１００ｎＭ）で６０分間刺激した際にＬＮＣａＰ細胞において誘導されたＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の近接のＦＩＳＨに基づく評価である。（Ｂ）ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に誘導された近接は、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞の共局在化シグナルを示す核の割合として定量化され、表される。
【図３３】（Ａ）キメラ領域および内因性ＥＲＧに及ぶ複数のプライマーを用いたＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合転写物のＱＲＴ−ＰＣＲ解析（挿入図を参照）。（Ｂ）ＴＭＰＲＳＳ２の第１のエクソンおよびＥＲＧの第６のエクソンに及ぶプライマーを用いた、代表的なクローンのゲルベースのＲＴ−ＰＣＲ解析。（Ｃ）遺伝子再配列を評価するために、ＥＲＧ座位の５’（ＲＰ１１−９５Ｉ２１）および３’（ＲＰ１１−４７６Ｄ１７）領域に及ぶＢＡＣプローブを用いたＦＩＳＨを示す。ＥＲＧの再配列を表すスプリットシグナルを矢印で強調する。（Ｄ）アンドロゲンによって誘導される染色体の近接および遺伝子融合の発生のモデル。
【図３４】前立腺癌におけるＡＲ結合のゲノムランドスケープを示す。（Ａ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑによる代表的な染色体上のＡＲ結合ピーク。（Ｂ）  ＫＬＫ３エンハンサー上のＡＲ結合のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ読み取り値を示すプロット。
【図３５】ＣｈＩＡ−ＰＥＴ法の概略図を示す。
【図３６】ＬＮＣａＰ細胞の遺伝子工学のためのストラテジーを示す。（Ａ）ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合の概略図。（Ｂ）遺伝子融合を検出するためのルシフェラーゼ系の概略図。（Ｃ）  遺伝子融合を検出するためのスプリットルシフェラーゼ系の概略図。
【図３７】ＥＲＧ内の相互作用する残基を示す。
【図３８】ＳＰＲにより、例示的ペプチドのＥＲＧに対する結合親和性を示す。
【図３９】ＴＡＴペプチドは、ＶＣａＰの浸潤を阻害するが、ＤＵ１４５およびＰＣ３においては阻害しないことを示す。
【図４０】本発明の実施形態のＴＡＴペプチドが、ＶＣａＰ増殖を阻害することを示す。
【図４１】遺伝子発現がＥＲＧによって制御されることを示す。
【図４２】本発明の実施形態のＴＡＴペプチドがＶＣａＰにおけるＤＮＡ損傷を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語および表現を以下の通り定義する。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「遺伝子融合の少なくとも１つの生物学的活性を阻害する」という用語は、遺伝子融合タンパク質に直接接触するか、遺伝子融合ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに接触するか、遺伝子融合ポリペプチドの立体構造的変化を引き起こすか、遺伝子融合タンパク質レベルを低下させるか、またはシグナルパートナーとの遺伝子融合の相互作用に干渉して、遺伝子融合の標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことによって、遺伝子融合のあらゆる活性（例えば、これに限定されないが、本明細書に記載される活性を含む）を低下させる任意の薬剤を指す。また、阻害剤は、上流シグナル分子を妨害することによって遺伝子融合の生物学的活性を間接的に制御する分子も含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子融合は、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子を含む。
【００１５】
本明細書において使用される場合、「ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の少なくとも１つの生物学的活性を阻害する」という用語は、ＥＴＳファミリーメンバーのタンパク質に直接接触するか、ＥＴＳファミリーメンバーのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに接触するか、ＥＴＳファミリーメンバーのポリペプチドの立体構造的変化を引き起こすか、ＥＴＳファミリーメンバーのタンパク質レベルを低下させるか、またはＥＴＳファミリーメンバーのシグナルパートナーとの相互作用に干渉して、ＥＴＳファミリーメンバーの標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことによって、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子（例えばＥＲＧ）のあらゆる活性（例えば、これらに限定されないが、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子を発現する細胞の浸潤、および本明細書に記載される他の活性を含む）を低下させる任意の薬剤を指す。また、阻害剤は、上流シグナル分子を妨害することによってＥＴＳファミリーメンバーの生物学的活性を間接的に制御する分子も含む。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「遺伝子融合」という用語は、第１の遺伝子の少なくとも一部の第２の遺伝子の少なくとも一部への融合から生じるキメラゲノムＤＮＡ、キメラメッセンジャーＲＮＡ、切断されたタンパク質、またはキメラタンパク質を指す。遺伝子融合は、遺伝子全体または遺伝子のエクソンを含む必要はない。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「検出する」、「検出している」、または「検出」という用語は、発見もしくは識別するという一般的な行動、または検出可能に標識された組成物の特定な観察のいずれかを説明し得る。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「アンドロゲン制御遺伝子」という用語は、その発現がアンドロゲン（例えば、テストステロン）によって誘導または抑制される遺伝子または遺伝子の一部を指す。アンドロゲン制御遺伝子のプロモーター領域は、アンドロゲンまたはアンドロゲンシグナル分子（例えば、下流シグナル分子）と相互作用する「アンドロゲン応答配列」を含み得る。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１８〜２５ヌクレオチド長の２本鎖または２本鎖領域を含む：ｓｉＲＮＡは、各鎖の３´末端に約２〜４個の不対ヌクレオチドを含むことが多い。ｓｉＲＮＡの２本鎖または２本鎖領域のうちの少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子に実質的に相同であるか、または実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス鎖」であり、標的ＲＮＡ分子に相同な鎖は「センス」鎖であり、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に対しても相補的である。ｓｉＲＮＡは、さらなる配列を含んでもよく、そのような配列の非限定的な例として、連結配列またはループ、ならびにステムおよび他の折り畳み構造が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物にＲＮＡ干渉を引き起こす際、および植物において転写後の遺伝子サイレンシングの間に配列特異的なＲＮＡの分解を引き起こす際に、重要な中間体として機能すると考えられる。
【００２０】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。これは、その２本鎖領域内で、サイレンシングされる遺伝子の配列に相同なｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、その生物に内因性または外来性であり得、染色体に組み込まれて存在するか、またはゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクター中に存在してもよい。遺伝子の発現は、完全にまたは一部阻害される。また、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられ得、標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であり得る。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「癌の段階」という用語は、癌の進行のレベルの定性的または定量的な評価を指す。癌の段階を判定するために用いられる基準は、これらに限定されないが、腫瘍のサイズおよび転移の程度（例えば、局在または遠隔）を含む。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「遺伝子導入システム」という用語は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入システムは、これらに限定されないが、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他の核酸ベースの送達システム）、裸の核酸の微量注入、ポリマーベースの送達システム（例えば、リポソームベースおよび金属粒子ベースのシステム）、バイオリスティック注入等を含む。本明細書において使用される場合、「ウイルス遺伝子導入システム」という用語は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためのウイルス要素（例えば、無傷のウイルス、変化したウイルス、および核酸またはタンパク質等のウイルス成分）を含む遺伝子導入システムを指す。本明細書において使用される場合、「アデノウイルス遺伝子導入システム」という用語は、アデノウイルス科に属する無傷のウイルスまたは変化したウイルスを含む遺伝子導入システムを指す。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、これに限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、任意の核酸含有分子を指す。この用語は、これらに限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル‐アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５´−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体の全てを包含する。
【００２４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、ポリペプチドは、全長コード配列、またはコード配列の任意の部分によってコード化することができる。また、この用語は、構造遺伝子のコード領域、ならびに、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端に約１ｋｂ以上の距離で５´および３´末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５´に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５´非翻訳配列と称される。コード領域の３´または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３´非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列によって分断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサー等の制御要素を含み得る。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去されるか、または「スプライシングで切り出され」、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には含まれない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定するよう機能する。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「異種遺伝子」という用語は、天然の環境には存在しない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、ある種から別の種に導入された遺伝子を含む。また、異種遺伝子は、なんらかの方法（例えば、変異、複数のコピーへの付加、変性制御配列への結合等）で変化した生物に生来存在する遺伝子も含む。異種遺伝子配列は、典型的には、染色体中の遺伝子配列とともに天然には見られないか、または天然には見られない染色体の一部とともにＤＮＡ配列に連結されている（例えば、通常は遺伝子が発現されない座位に発現される遺伝子）という点で、異種遺伝子は内因性遺伝子と区別される。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、１本鎖ポリヌクレオチド鎖の長さの短いものを指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には２００残基長未満（例えば、１５〜１００）であるが、本明細書において使用される場合、この用語は、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図する。オリゴヌクレオチドは、その長さで称されることが多い。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４塩基長」と称される。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、２次および３次構造を形成することができる。そのような構造は、これらに限定されないが、２本鎖、ヘアピン、十字型、屈曲型、および３本鎖を含むことができる。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に言及して使用される。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従ってマッチする。または、核酸間には「完全」または「全」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を有する。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法において、特に重要である。
【００２８】
「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分相同性および完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が「実質的に相同」である標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも一部阻害する核酸分子である。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションを阻害することは、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に相同である配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下における完全に相同な核酸分子の標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合しかつそれを阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を可能にするような条件であることを意味するものではない：低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特定の（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、実質的に非相補的（例えば、同一性が約３０％未満）である第２の標的の使用によって検査することができ、非特異的結合が存在しない場合、プローブは、第２の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
【００２９】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローン等の２本鎖核酸配列に言及して使用される場合、「実質的に相同である」という用語は、上述のような低ストリンジェンシー条件下で２本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズできる任意のプローブを指す。
【００３０】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物の差次的スプライシングによって生成される複数のＲＮＡ種を生成し得る。同じ遺伝子のスプライス変異体であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性の領域（同じエクソンまたは両ｃＤＮＡ上の同一エクソンの一部の存在を表す）および完全非同一性の領域（例えば、ｃＤＮＡ１上にエクソン「Ａ」の存在を示し、代わりにｃＤＮＡ２はエクソン「Ｂ」を含む）を有する。２つのｃＤＮＡが配列同一性の領域を含むため、これらはどちらも、遺伝子全体または両方のｃＤＮＡに見られる配列を含む遺伝子の一部に由来するプローブにハイブリダイズする：２つのスプライス変異体は、このようなプローブに対しておよび互いに実質的に相同である。
【００３１】
１本鎖核酸配列に言及して使用される場合、「実質的に相同である」という用語は、上述のような低ストリンジェンシー条件下で１本鎖核酸配列とハイブリダイズできる（すなわち、その補体である）任意のプローブを指す。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合に言及して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比等の要因によって影響を受ける。その構造内に相補的な核酸の対を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズ」していると言われる。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および有機溶媒等の他の化合物の存在といった条件に言及して使用される。「低ストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、密接に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）、および部分的な相同性のみを有する配列（例えば、５０〜９０％の相同性を有する配列）とハイブリダイズする。「中程度のストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、および密接に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性）とのみハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、および（温度等の条件に依存して）単一の塩基ミスマッチを有する配列とのみハイブリダイズする。換言すると、高ストリンジェンシーの条件下では、単一の塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリダイゼーションを排除するために温度を上昇させることができる。
【００３４】
核酸ハイブリダイゼーションに言及して使用される場合の「高ストリンジェンシー条件」は、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ＬのＮａＣｌ、６．９ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡから構成される溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズさせ、次いで、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合は、４２℃で０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄するのと同等の条件を含む。
【００３５】
核酸ハイブリダイゼーションに言及して使用される場合の「中程度のストリンジェンシー条件」は、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ＬのＮａＣｌ、６．９ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡから構成される溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズさせ、ついで、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合は、４２℃で１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄するのと同等の条件を含む。
【００３６】
「低ストリンジェンシー条件」は、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ＬのＮａＣｌ、６．９ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／１ＥＤＴＡ、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハート試薬［５０×デンハート液は、５００ｍＬ当たり、５ｇのＦｉｃｏｌｌ（４００型；Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｓｉｇｍａ）を含む］、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡから構成される溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズさせ、次いで、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合は、４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄するのと同等の条件を含む。
【００３７】
当該技術分野において、低ストリンジェンシー条件を含むように数多くの同等の条件が用いられてもよいことは周知であり、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（溶液中に存在または固定化されたＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成等）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在）等の要因が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液は、上述の条件とは異なるが同等である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を作成するために異なってもよい。また、当該技術分野において、高ストリンジェンシー条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液中でのホルムアミドの使用等）下でハイブリダイゼーションを促進する条件は既知である（「ストリンジェンシー」については上記定義を参照のこと）。
【００３８】
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように、核酸に関連して使用される場合の「単離された」という用語は、同定された、通常、その天然の源に関連する少なくとも１つの成分または混入物から分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、天然に見られるものとは異なる形態または設定で存在する核酸である。対照的に、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸のように単離されていない核酸は、天然に存在する状態で見出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接する宿主細胞染色体上に見られ、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列は、多くのタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に見られる。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然の細胞とは異なる染色体の位置にある場合、または自然に見られるものとは異なる核酸配列が隣接する場合に所与のタンパク質を通常通り発現する細胞内の核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドがタンパク質を発現させるために用いられる場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最低でもセンス鎖またはコード鎖を有するが（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは１本鎖であってもよい）、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは２本鎖であってもよい）。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「精製された」または「精製する」という用語は、試料から成分（例えば、混入物）を除去することを指す。例えば、抗体は、混入する非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製され、また、それらは、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によって、試料中の標的反応性免疫グロブリンの増加がもたらされる。別の例において、組換えポリペプチドが細菌宿主細胞中に発現され、ポリペプチドは宿主細胞タンパク質の除去によって精製され、それによって、試料中の組換えポリペプチドの割合が増加する。
【００４０】
本発明は、これに限定されないが、癌マーカーの標的化阻害を含む、癌治療のための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、前立腺癌の臨床標的としての再発性遺伝子融合に関する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合を標的とする治療薬（例えば、核酸ベースの治療薬または小分子治療薬）を提供する。遺伝子融合は、例えば、米国特許出願第１１／８２５，５５２号および米国特許公開第２００７−０２１２７０２号に記載され、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、治療薬は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合を標的とする。本発明は、特定の機構に限定されるものではない。実際、機構を理解することは、本発明を実施するために必ずしも必要ではない。それにもかかわらず、癌細胞においてのみ見られる、未変性の遺伝子には見られない遺伝子融合の部分（例えば、融合接合部）を標的とすることは、全ての細胞に見られる遺伝子の領域を標的とすることに関連して副作用を低下させることが企図される。
【００４２】
Ｉ．遺伝子融合
本明細書に記載されるように、本発明の実施形態は、癌（例えば前立腺癌）に関連する再発性遺伝子融合の活性を阻害するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子融合は、抗癌治療薬として標的とされる。いくつかの実施形態において、遺伝子融合は、アンドロゲン制御遺伝子またはハウスキーピング遺伝子とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との融合の結果である。
【００４３】
Ａ．アンドロゲン制御遺伝子
雄性ホルモンによって制御される遺伝子は、ヒト前立腺の正常な生理機能にとって非常に重要である。またこれらは、前立腺癌腫の発生および進行にも寄与している。認識されているＡＲＧは、これらに限定されないが、ＤＤＸ５、ＴＭＰＲＳＳ２、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＫＬＫ２、ＳＮＲＫ、Ｓｅｌａｄｉｎ−１、およびＦＫＢＰ５１（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４：  ３０９（１９９７）；Ｖｅｌａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５（８）：３９１３（２００４））を含む。膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＭ＿００５６５６）は、他の正常なヒト組織と比較して前立腺上皮において高度に発現されることが示されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：４１８０（１９９９））。ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子は、２１番染色体上に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから４１，７５０，７９７〜４１，８０１，９４８ｂｐに位置する（５１，１５１全ｂｐ、マイナス鎖配向）。ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５１７８４  （Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  アクセッション番号Ｏ１５３９３））およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７５３２９の対応するｃＤＮＡ  に見ることができる（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４：３０９（１９９７）も参照のこと）。
【００４４】
いくつかの実施形態において、遺伝子融合は、ＡＲＧの転写制御領域を含む。ＡＲＧの転写制御領域は、プロモーター領域を含む、ＡＲＧのコードまたは非コード領域を含み得る。ＡＲＧのプロモーター領域は、アンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）をさらに含み得る。具体的には、ＴＭＰＲＳＳ２のプロモーター領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２７６４０４によって提供される。
【００４５】
Ｂ．ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子は、構成的に発現され、一般に全ての組織において遍在的に発現される。これらの遺伝子は、全ての細胞が生存するために必要とする基本的な必須機能を提供するタンパク質をコードする。ハウスキーピング遺伝子は、通常、全ての細胞および組織において同じレベルで発現されるが、特に細胞増殖の間および生物が発達する間には、いくらかの変動を伴う。ヒト細胞がいくつのハウスキーピング遺伝子を有するかは正確には分かっていないが、最も多くて３００〜５００個の範囲であると推定される。
【００４６】
数百もあるハウスキーピング遺伝子の多くは同定されている。最も一般的に知られる遺伝子であるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）は、解糖経路にとって重要な酵素をコードする。別の重要なハウスキーピング遺伝子は、体中への化合物の輸送を補助するアルブミンである。いくつかのハウスキーピング遺伝子は、β−アクチンおよびチューブリン等の細胞骨格を構成する構造タンパク質をコードする。他は、リボソームの１８Ｓまたは２８ＳｒＲＮＡサブユニットをコードする。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、遍在的に発現されるヘテロ核リボ核タンパク質の１つである。そのプロモーターは、メチル化されておらず、導入遺伝子内のＣＭＶプロモーターの転写サイレンシングを阻止することが分かっている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５，１７（２００５））。ハウスキーピング遺伝子の例示的なリストは、例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，３６２−３６５（２００３）に見出すことができる。
【００４７】
Ｃ．ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子
転写因子のＥ‐２６（ＥＴＳ）ファミリーは、遺伝子発現をコントロールする細胞内シグナル伝達経路を制御する。下流エフェクターとして、これらは特定の標的遺伝子を活性化または抑制する。上流エフェクターとして、これらは数々の増殖因子受容体の空間的および時間的発現に寄与する。このファミリーのほぼ３０個のメンバーが同定されており、生理学的および病理学的プロセスの広い範囲に関与している。それらは、これらに限定されないが、ＥＲＧ、ＥＴＶ１（ＥＲ８１）、ＦＬＩ１、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＬＫ１、ＥＴＶ６（ＴＥＬ１）、ＥＴＶ７（ＴＥＬ２）、ＧＡＢＰα、ＥＬＦ１、ＥＴＶ４（Ｅ１ＡＦ、ＰＥＡ３）、ＥＴＶ５（ＥＲＭ）、ＥＲＦ、ＰＥＡ３／Ｅ１ＡＦ、ＰＵ．１、ＥＳＥ１／ＥＳＸ、ＳＡＰ１（ＥＬＫ４）、ＥＴＶ３（ＭＥＴＳ）、ＥＷＳ／ＦＬＩ１、ＥＳＥ１、ＥＳＥ２（ＥＬＦ５）、ＥＳＥ３、ＰＤＥＦ、ＮＥＴ（ＥＬＫ３、ＳＡＰ２）、ＮＥＲＦ（ＥＬＦ２）、およびＦＥＶを含む。例示的なＥＴＳファミリーメンバー遺伝子配列を図９に示す。
【００４８】
ＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ；ＮＭ＿００４４４９）は、特に、他の正常なヒト組織と比較して前立腺上皮において高度に発現されることが示されている。ＥＲＧ遺伝子は、２１番染色体上に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，６７５，６７１〜３８，９５５，４８８塩基対に位置する。ＥＲＧ遺伝子は、２７９，８１７全ｂｐ、マイナス鎖配向である。対応するＥＲＧ  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１７２５４およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ０４４４０（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号Ｐｌ１３０８）で特定される。
【００４９】
ＥＴＳ転座変位体１（ＥＴＶ１）遺伝子は、７番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００７．１１、ＮＣ＿０８６７０３．１１、およびＮＴ＿００７８１９．１５）上に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから１３，７０８３３０〜１３，８０３，５５５塩基対に位置する。ＥＴＶ１遺伝子は、全長９５，２２５ｂｐ、マイナス鎖配向である。対応するＥＴＶ１  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４９５６  およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４９４７  （Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号Ｐ５０５４９）で特定される。
【００５０】
ヒトＥＴＶ４遺伝子は、１４番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＮＣ＿００００１７．９、ＮＴ＿０１０７８３．１４、およびＮＴ＿０８６８８０．１）上に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，９６０，７４０〜３８，９７９，２２８塩基対である。ＥＴＶ４遺伝子は、全長１８，４８８ｂｐ、マイナス鎖配向である。対応するＥＴＶ４ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１９８６およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１９７７  （Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号Ｐ４３２６８）で特定される。
【００５１】
ＩＩ．治療上の用途
いくつかの実施形態において、本発明は、癌（例えば、前立腺癌）の治療薬を提供する。いくつかの実施形態において、治療薬は、本発明の遺伝子融合を直接的または間接的に標的とする。
【００５２】
Ａ．ＲＮＡ干渉およびアンチセンス療法
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合の発現を標的とする。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合をコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には発現される遺伝子融合の量を調節する際に使用するために、オリゴマーアンチセンスまたはＲＮＡｉ化合物、特に、オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む組成物を用いる。
【００５３】
１．ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態において、融合タンパク質の機能を阻害するためにＲＮＡｉが用いられる。ＲＮＡｉは、ヒトを含むほとんどの真核生物における外来遺伝子の発現をコントロールするための進化する上で保存された細胞防御を表す。ＲＮＡｉは、典型的には２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導され、ｄｓＲＮＡに応じて相同な１本鎖標的ＲＮＡの配列特異的なｍＲＮＡ分解を引き起こす。ｍＲＮＡ分解の介在物質は、通常、細胞中の酵素切断によって長鎖ｄｓＲＮＡから生成される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２本鎖である。ｓｉＲＮＡは、一般に、約２１ヌクレオチド長（例えば２１〜２３ヌクレオチド長）であり、２つのヌクレオチド３´−オーバーハングによって特徴付けられる塩基対構造を有する。低分子ＲＮＡまたはＲＮＡｉの細胞内への導入後、この配列は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と称される酵素複合体に送達されると考えられる。ＲＩＳＣは、標的を認識し、エンドヌクレアーゼで切断する。より大きなＲＮＡ配列が細胞に送達される場合、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素（Ｄｉｃｅｒ）は、より長いｄｓＲＮＡを２１〜２３ｎｔのｄｓ−ｓｉＲＮＡ断片に変換することに留意されたい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、融合タンパク質の接合領域を標的とするように設計される。
【００５４】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、培養体細胞における哺乳類の遺伝子機能の全ゲノム的解析のための強力な試薬となっている。遺伝子機能を検証するためのそれらの価値以外にも、ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的治療薬としての大きな可能性も有する（Ｔｕｓｃｈｌ  ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．２００２；２（３）：１５８−６７、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
動物細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、特定の遺伝子の強力で長期的な転写後サイレンシングをもたらす（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１；９８：  ９７４２−７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１；４１１：４９４−８、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００１；１５：１８８−２００、およびＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：  ６８７７−８８、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）。ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行うための方法および組成物は、例えば米国特許第６，５０６，５５９号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
ｓｉＲＮＡは、伸長タンパク質によって、多くの場合は検出不能なレベルまで、標的となるＲＮＡの量を減少させる際に極めて効果的である。サイレンシング効果は、数ヶ月間持続し得、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡの中心領域との間の１つのヌクレオチドミスマッチがサイレンシングを防ぐのに十分であることが多いため、極めて特異的である（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２；２９６：５５０−３、およびＨｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００２；３０：１７５７−６６、これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
ｓｉＲＮＡの設計における重要な要因は、ｓｉＲＮＡ結合のための到達可能な部位の存在である。Ｂａｈｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３；２７８：  １５９９１−１５９９７、参照により本明細書に組み込まれる）は、効果的なｓｉＲＮＡを設計するためにｍＲＮＡ内の到達可能な部位を見つけるための、走査アレイと称される一種のＤＮＡアレイの使用について記載している。これらのアレイは、物理的バリア（マスク）を使用して、配列に各塩基を段階的に加えることによって合成される、モノマーから特定の最大サイズにまで及ぶオリゴヌクレオチド、通常はコマー（ｃｏｍｅｒ）を含む。したがって、これらのアレイは、標的遺伝子の領域の完全なオリゴヌクレオチド補体を表す。これらのアレイとの標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡのこの領域に関する徹底した到達性プロファイルを提供する。そのようなデータは、有効性および標的特異性を保持するためにオリゴヌクレオチド長と結合親和性との間の妥協点に達することが重要であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（７塩基長〜２５塩基長の範囲）の設計に有用である（Ｓｏｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００１；２９（１０）：  ２０４１−  ２０４５）。ｓｉＲＮＡｓを選択するためのさらなる方法および検討事項は、例えば、第ＷＯ０５０５４２７０号、第ＷＯ０５０３８０５４Ａ１号、第ＷＯ０３０７０９６６Ａ２号、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５  Ｍａｙ  １３；３４８（４）：８８３−９３，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５  Ｍａｙ  １３；３４８（４）：８７１−８１、およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ａｕｇ  １；３１（１５）：４４１７−２４に記載され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、ｓｉＲＮＡを選択する際に使用するためのソフトウェア（例えば、ＭＷＧオンラインｓｉＭＡＸ  ｓｉＲＮＡデザインツール）が市販されているかまたは一般に入手可能である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明は、平滑末端（例えば、米国特許第２００８０２００４２０号を参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる））、オーバーハング（例えば、米国特許第２００８０２６９１４７Ａ１号を参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる））、固定核酸（例えば、第ＷＯ２００８／００６３６９号、第ＷＯ２００８／０４３７５３号、および第ＷＯ２００８／０５１３０６号を参照のこと（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））を含むｓｉＲＮＡを用いる。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を介して、または細菌を使用して送達される（例えば、Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２４：  ６（２００６）および第ＷＯ０６０６６０４８号を参照、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５９】
他の実施形態において、ｓｈＲＮＡ法（例えば、第２００８００２５９５８号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が用いられる。低分子ヘアピンＲＮＡまたはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる急なヘアピンカーブを形成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞に導入されたベクターを使用し、ｓｈＲＮＡが常に発現されていることを確実にするためにＵ６プロモーターを用いる。このベクターは、通常、娘細胞に継承され、遺伝子サイレンシングが受け継がれることを可能にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、次いで、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、それに結合するｓｉＲＮＡにマッチするｍＲＮＡに結合して切断する。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される。
【００６０】
また、本発明は、後に記載されるような本発明のＲＮＡｉ化合物を含む薬学的組成物および製剤を含む。
【００６１】
２．アンチセンス
他の実施形態において、融合タンパク質の発現は、遺伝子融合をコードする１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を使用して調節される。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨げる。特異的にハイブリダイズする化合物によるこの標的核酸の機能の調節は、一般的に「アンチセンス」と称される。妨げられるＤＮＡの機能は、複製および転写を含む。妨げられるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるようなＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るまたはＲＮＡによって促進され得る触媒活性等の全ての重要な機能を含む。標的核酸の機能に対するこのような干渉の全体的な影響は、遺伝子融合の発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」とは、遺伝子の発現における増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。例えば、発現は、腫瘍増殖を防ぐために阻害され得る。
【００６２】
アンチセンスに特異的な核酸を標的とすることが好ましい。本発明の文脈において、特定の核酸に対するアンチセンス化合物を「標的化する」ことは、多段階にわたるプロセスである。通常、このプロセスは、機能が調節される核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、特定の疾患または病態に関連する細胞遺伝子（もしくは遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明において、標的は、本発明の遺伝子融合をコードする核酸分子である。また、標的化プロセスは、所望の効果、例えば、タンパク質の発現の検出または調節がもたらされるようにアンチセンスの相互作用を生じさせるための遺伝子内の１つの部位または複数の部位の特定も含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。翻訳開始コドンは、典型的には５´−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；  対応するＤＮＡ分子においては５´−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５´−ＧＵＧ、５´−ＵＵＧまたは５´−ＣＵＧ、および５´−ＡＵＡを有する翻訳開始コドンを有し、５´−ＡＣＧおよび５´−ＣＵＧは、インビボで機能することが分かっている。したがって、各場合において、開始アミノ酸が典型的にはメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物および原核生物の遺伝子は、２つ以上の代替の開始コドンを有し得、これらのうちのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件下で、翻訳開始に優先的に用いることができる。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、そのようなコドンの配列に関係なく、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにインビボで使用される１つまたは複数のコドンを指す。
【００６３】
遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、３つの配列（すなわち、５´−ＵＡＡ、５´−ＵＡＧ、および５´−ＵＧＡ、対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５´−ＴＡＡ、５´−ＴＡＧ、および５´−ＴＧＡ）のうちの１つを有し得る。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）に約２５〜約５０個の近接するヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）に約２５〜約５０個の近接するヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。
【００６４】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指す翻訳領域（ＯＲＦ）または「コード領域」とは、効果的に標的とされ得る領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、したがって、５´キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）と、翻訳終止コドンから３´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、したがって翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３´末端との間のヌクレオチドまたはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡの５´キャップは、ｍＲＮＡの最も５´側の残基に５´−５´トリホスフェート結合を介して結合するＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５´キャップ領域は、５´キャップ構造自体、およびそのキャップに隣接する第１の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。キャップ領域も、好ましい標的領域であり得る。
【００６５】
真核生物のｍＲＮＡ転写物の中には直接的に翻訳されるものもあるが、その多くは、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる１つ以上の領域を含む。残りの（したがって翻訳された）領域は、「エクソン」として知られ、ともにスプライスされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、イントロン−エクソン接合部）も、好ましい標的領域であり得、異常なスプライシングが疾患と関連する状況、または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰生成が疾患と関連している状況において、特に有用である。再配列または欠失による異常な融合接合部も、好ましい標的である。イントロンは、例えば、ＤＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物の、効果的な、したがって好ましい標的領域であり得ることも分かっている。
【００６６】
いくつかの実施形態において、アンチセンス阻害のための標的部位は、市販のソフトウェアプログラム（例えば、Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳｙｓＡｒｒｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ（Ｉｎｄｉａ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＧｅｎｅＴｒｏｖｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して同定される。他の実施形態において、アンチセンス阻害のための標的部位は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０１９８５３７Ａ２号に記載される到達可能部位法を用いて同定され、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００６７】
一旦、１つ以上の標的部位が同定されると、所望の効果を付与するように、標的に十分相補的な（すなわち、十分に、かつ十分な特異性を持って、ハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。例えば、本発明の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、開始コドンまたその近くを標的とする。
【００６８】
この発明の文脈において、アンチセンス組成物および方法に関する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間でのワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合等の水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的な核酸塩基である。標的核酸が特異的にハイブリダイズ可能な核酸であるために、アンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことを理解されたい。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げて有用性の損失を引き起こし、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的な結合が所望される条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、またインビトロアッセイの場合は、アッセイが実施される条件下で）、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００６９】
アンチセンス化合物は、研究試薬および診断薬として一般的に使用される。例えば、特異性を持って遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために使用することができる。また、アンチセンス化合物は、例えば、種々の生物学的経路の機能を識別するためにも使用される。
【００７０】
アンチセンスの特異性および感度は、治療上の用途にも適用される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける病態の治療における治療部分として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全かつ効果的にヒトに投与されてきており、現在、数多くの臨床試験が行われている。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように構成することができる、有用な治療様式であることが確立されている。
【００７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい形態である一方で、本発明は、これに限定されないが、後に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体を含む他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含する。より長い配列およびより短い配列のどちらも本発明とともに使用され得るが、この発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約３０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約３０個の結合塩基）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約１２〜約２５の核酸塩基を含む化合物である。
【００７２】
本発明を用いると有用である好ましいアンチセンス化合物の具体例として、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖中にリン原子を保持するものおよび主鎖中にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のために、それらのヌクレオシド主鎖中にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【００７３】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３´−アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３´−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートを含む）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３´−５´結合を有するボラノホスフェート、これらの２´−５´結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が結合５´−３´に対しては３´−５´または５´−２´に対しては２´−５´である反転極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩類、および遊離酸型も含まれる。
【００７４】
その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン主鎖、硫化物、スルホキシドおよびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の部分を混合して有する他のものを有するものを含む。
【００７５】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミドを含む主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は、保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、これらに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７（１９９１）に見出すことができる。
【００７６】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドであり、特に、−−ＣＨ２、−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、上述の米国特許第５，４８９，６７７号記載の−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、未変性のホスホジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−で表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号記載のアミド主鎖を有するものである。また、上述の米国特許第５，０３４，５０６号記載のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００７７】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分を有してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２´位に有する：  ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または未置換のＣ１―１０アルキルまたはＣ２−１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい）。特に好ましいものは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２´位に有する：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、２´−メトキシエトキシ（２´−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、２´−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２´−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７８：４８６［１９９５］）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、２´−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、２´−ＤＭＡＯＥ、および２´−ジメチルアミノエトキシエトキシとしても知られる（当該技術分野において２´−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２´−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２´−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２を含む。
【００７８】
他の好ましい修飾は、２´−メトキシ（２´−Ｏ−−ＣＨ３）、２´−アミノプロポキシ（２´−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２´−フルオロ（２´−Ｆ）を含む。同様の修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３´末端ヌクレオチドまたは２´−５´結合オリゴヌクレオチド上の糖の３´位、および５´末端ヌクレオチドの５´位にも形成され得る。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。
【００７９】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野において、単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるものを含む。これらの核酸塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。それらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸２本鎖の安定性を増加させることが分かっており、現在のところ好ましい塩基置換であり、特に、２´−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合により一層好ましい。
【００８０】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞内取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートのオリゴヌクレオチドへの化学的結合に関与する。そのような部分は、これらに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖、（例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基）、リン脂質、（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ‐グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ‐グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。
【００８１】
関連技術分野の当業者は、上記修飾を含むオリゴヌクレオチドの生成の仕方を十分に分かっている。本発明は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。任意の好適な修飾または置換が用いられ得る。
【００８２】
所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、上記修飾のうちの１つ以上が、オリゴヌクレオチド内の単一化合物または単一ヌクレオシドにさえも組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の文脈において「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物であり、特に、各々が少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）からなる、化学的に異なる２つ以上の領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞内取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大をヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大幅に高める。その結果、同じ標的領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、より短い鎖のオリゴヌクレオチドで同程度の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当該技術分野において既知である関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、ルーチン的に検出することができる。
【００８３】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述のようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。
【００８４】
本発明は、以下に記載する本発明のアンチセンス化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。
【００８５】
Ｂ．遺伝子療法
本発明は、本発明の遺伝子融合の発現を調節する際に使用するための任意の遺伝子操作の使用を企図する。遺伝子操作の例として、これらに限定されないが、遺伝子ノックアウト（例えば、例えば組換えを用いて、染色体から融合遺伝子を除去する）、誘導性プロモーターを含む／含まないアンチセンスコンストラクトの発現等が挙げられる。インビトロまたはインビボでの核酸コンストラクトの細胞への送達は、任意の好適な方法を用いて実施され得る。好適な方法とは、所望の事象（例えば、アンチセンスコンストラクトの発現）が起こるように核酸コンストラクトを細胞に導入する方法である。また、遺伝子療法は、（例えば、誘導性プロモーター（例えば、アンドロゲン応答性プロモーター）による刺激の際に）インビボで発現されるｓｉＲＮＡまたは他の干渉する分子を送達するためにも用いられ得る。
【００８６】
遺伝子情報を保有する分子の細胞内への導入は、これらに限定されないが、裸のＤＮＡコンストラクトの直接注入、該コンストラクトを添加した金粒子を用いた打ち込み、および例えば、リポソーム、生体高分子等を用いた、巨大分子の介在による遺伝子導入等を含む種々の方法のうちのいずれかによって達成される。好ましい方法は、これらに限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等の、ウイルス由来の遺伝子送達ビヒクルを用いる。レトロウイルスと比較すると効率がより高いため、アデノウイルス由来のベクターは、核酸分子をインビボで宿主細胞に導入するための好ましい遺伝子送達ビヒクルである。アデノウイルスベクターは、動物モデルにおける様々な固形腫瘍および免疫欠乏マウスにおけるヒト固形腫瘍異種移植片に、非常に効率的なインビボ遺伝子導入を提供することが分かっている。遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターおよび方法の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／１２７３８号およびＷＯ  ００／０９６７５号、ならびに米国特許出願第  ６，０３３，９０８号、６，０１９，９７８号、６，００１，５５７号、５，９９４，１３２号、５，９９４，１２８号、５，９９４，１０６号、５，９８１，２２５号、５，８８５，８０８号、５，８７２，１５４号、５，８３０，７３０号、および５，８２４，５４４号に記載され、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
ベクターは、様々な方法において対象に投与され得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ベクターは、直接注射を用いて、腫瘍または腫瘍を伴う組織に投与される。他の実施形態において、投与は、血液またはリンパ循環を介する（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第９９／０２６８５号を参照）。アデノウイルスベクターの例示的な投与レベルは、好ましくは灌流液に添加された１０８〜１０１１のベクター粒子である。
【００８８】
Ｃ．抗体療法
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合を発現する前立腺腫瘍を標的とする抗体を提供する。任意の好適な抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成）が、本明細書に開示される治療法に用いられ得る。好ましい実施形態において、癌治療に使用される抗体は、ヒト化抗体である。抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，５８５，０８９号、第６，０５４，２９７号、および第５，５６５，３３２号を参照のこと、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
いくつかの実施形態において、治療抗体は、本発明の遺伝子融合に対して生成された抗体を含み、該抗体は、細胞毒性薬物とコンジュゲートされる。そのような実施形態において、正常細胞を標的としない腫瘍特異的治療剤が生成され、したがって、従来の化学療法の有害な副作用の多くを軽減する。特定の用途の場合、治療剤は、抗体への付加に有用な薬剤としての役割を果たす薬理学的薬剤であり、特に、内皮細胞を死滅させるか増殖または細胞分割を抑制する能力を有する細胞毒性またはさもなければ抗細胞剤（ａｎｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｇｅｎｔ）であることが構想される。本発明は、抗体にコンジュゲートし、活性型で送達される、任意の薬理学的薬剤の使用を企図する。例示的な抗細胞剤として、化学療法剤、放射性同位元素、および細胞毒が挙げられる。本発明の治療抗体は、これらに限定されないが、例えば放射性同位元素（例えば、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、テクニシウム−９９ｍ、インジウム−１１１、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６７、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、またはアスタチン−２１１）、ステロイド等のホルモン、シトシン等の代謝拮抗剤（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、またはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デモコルチン、エトポシド、ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファラン等の抗腫瘍アルキル化剤を含む、様々な細胞毒性部分を含んでもよい。他の実施形態は、血液凝固剤、サイトカイン、増殖因子、細菌性内毒素、または細菌性内毒素の脂質Ａ部分等の薬剤を含む。例えば、いくつかの実施形態において、数個の例を挙げると、治療薬剤として、Ａ鎖毒素、リボソーム失活性タンパク質、αサルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、またはシュードモナス外毒素等の、植物、真菌、または細菌由来の毒素が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、脱グリコシル化リシンＡ鎖が用いられる。
【００９０】
いずれの場合においても、それらのような薬剤は、所望の場合、既知のコンジュゲーション技術を用いて、必要に応じて、標的とされる腫瘍細胞の部位での標的化、内部移行、血液成分に対する遊離または提示を可能にする様式で、抗体と良好にコンジュゲートさせることができることが提唱されている（例えば、Ｇｈｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９３：２８０［１９８３］を参照）。
【００９１】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合（例えば、ＥＲＧ融合）を標的とする免疫毒素を提供する。免疫毒素は、典型的には腫瘍指向性の抗体または断片である特異的標的薬剤の毒素部分等の細胞毒性薬とのコンジュゲートである。標的化薬剤は、標的とされる抗原を保持する細胞に毒素を誘導し、それによって選択的に該細胞を死滅させる。いくつかの実施形態において、治療抗体は、高いインビボ安定性を提供する架橋剤を用いる（Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８：６３９６［１９８８］）。
【００９２】
特に固形腫瘍の治療に関与する他の実施形態において、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することによって、腫瘍脈管構造に対して細胞毒性またはさもなければ抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は、腫瘍細胞、特に脈管構造の遠位の腫瘍細胞から、酸素および栄養分を奪い、最終的には細胞死および腫瘍壊死をもたらす、腫瘍に局在化する血管崩壊を引き起こすことを意図する。
【００９３】
好ましい実施形態において、抗体ベースの治療薬は、後に記載するように薬学的組成物として調剤される。好ましい実施形態において、本発明の抗体組成物の投与は、癌において測定可能な減少（例えば、腫瘍の軽減または排除）をもたらす。
【００９４】
また本発明は、後に記載するような本発明の抗体化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。
【００９５】
Ｄ．ペプチド模倣体
いくつかの実施形態において、本発明は、ペプチド模倣体に基づく治療薬を提供する。主要化合物としてのペプチドの使用、またその後の低分子量の非ペプチド分子（ペプチド模倣体）への変換は、細胞内標的の低分子拮抗薬の開発を導くことに成功した（Ｂｏｔｔｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９７．２６９（５）：  ｐ．７４４−５６；Ｂｏｔｔｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６．１３（１０）：ｐ．２１４１−７）。したがって、ペプチド模倣体は、ペプチドの物理的特性に固有の限界を克服し、治療可能性を向上させるための強力な手段として登場した（Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９７．８（４）：ｐ．４３５−４１、Ｂｅｅｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９４．１２（６）：ｐ．２１３−６、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ，１９９４．１５（４）：ｐ．１２４−９）。いくつかの実施形態において、天然のペプチドと比較して、ペプチド模倣体は、良好な経口作用、長期間の作用、細胞膜を通るより良好な輸送、排泄率の低下、およびぺプチダーゼによる加水分解の低下を含む、天然のペプチドよりも優れた望ましい薬力学的特性を保有する。
【００９６】
低分子ペプチド模倣体の開発は、一般に、標的とされる相互作用を阻害することができる最も小さい機能的ペプチド単位の同定を伴う。増え続ける文献によって、高親和性リガンドは、バクテリオファージ上に示されるペプチドライブラリーから選択することができることが示されており（Ｓｕｌｏｃｈａｎａ  ａｎｄ  Ｇｅ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，２００７．１３（２０）：ｐ．２０７４−８６、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９０．８７（１６）：ｐ．６３７８−８２、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０．２４９（４９６７）：ｐ．３８６−９０、Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０．２４９（４９６７）：ｐ．４０４−６）、多くの用途が、タンパク質リガンドの機能を拮抗することを対象としてきている（Ｄｏｗｅｒ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１９９８．２（３）：ｐ．３２８−３４、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００．３２８：ｐ．３３３−６３）。ライブラリーは非常に大規模であり得るため（１０１１以上の個々のメンバー）、ライブラリーにどのようにバイアスをかけるかについての初期推定の必要はなく、また、生物学的な増幅および再スクリーニングによる稀な結合ファージの選択的濃縮も必要ではない。結合するこれらの配列は、それらのコードするＤＮＡをシーケンスすることによって容易に同定することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、そのようにして同定されたペプチドリガンドは、さらに、新しい標的化治療剤の開発のための、コンビナトリアルケミストリーによるアプローチまたは医薬化学に基づくペプチド模倣アプローチのための始点としての役割を果たす。また、これらのペプチドのそれらの基質への高結合親和性のための構造的基盤を決定することは、治療剤の合理的な設計に寄与する。
【００９８】
また、本発明は、後に記載するような本発明のペプチド模倣化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。
【００９９】
Ｅ．薬学的組成物
本発明は、（例えば、本発明の遺伝子融合の発現または活性を調節する薬剤を含む）薬学的組成物をさらに提供する。本発明の薬学的組成物は、局所的または全身的な治療が望ましいかどうかおよび治療される領域に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は、局所的（点眼、ならびに膣内および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、肺（例えば、ネブライザーによる散剤またはエアロゾルの吸入またはガス注入、気管内、鼻腔内、上皮、および経皮）、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射または点滴、あるいは頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与を含む。
【０１００】
局所的投与のための薬学的組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および散剤を含んでもよい。従来の薬学的担体、水性、粉末状または油状基剤、増粘剤等が、必要であるかまたは望ましいかもしれない。
【０１０１】
経口投与のための組成物および製剤は、散剤または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェまたは錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。
【０１０２】
非経口、くも膜下腔内、または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加物、例えば、これらに限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体、または賦形剤等を含み得る滅菌水溶液を含んでもよい。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物は、これらに限定されないが、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、これらに限定されないが、予め作製された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含む様々な成分から生成され得る。
【０１０４】
単位剤形として簡便に提供され得る本発明の薬学的製剤は、製薬産業において周知の従来技法に従って調製され得る。このような技術は、有効成分を薬学的担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体もしくは微紛化した固形担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【０１０５】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬、および浣腸等の多くの可能な剤型のうちのいずれかに調剤され得る。また、本発明の組成物は、水性、非水性、または混合媒体中の懸濁液として調剤されてもよい。水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加させる物質をさらに含んでもよい。また懸濁液は、安定化剤を含んでもよい。
【０１０６】
本発明の一実施形態において、薬学的組成物は、泡沫として調剤または使用されてもよい。薬学的泡沫は、これらに限定されないが、乳濁液、ミクロ乳濁液、クリーム、ゼリー、およびリポソーム等の製剤を含む。これらの製剤は、基本的に同様の性質であるが、組成および最終産物の粘稠度が異なる。
【０１０７】
また、細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する薬剤が、本発明の薬学的および他の組成物に添加されてもよい。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）等のカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（第ＷＯ９７／３０７３１号）等のポリカチオン分子も、オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを増強する。
【０１０８】
本発明の組成物は、薬学的組成物に従来見られる他の補助的成分をさらに含んでもよい。したがって、例えば、組成物は、例えば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤、または抗炎症剤等の、追加の、相溶性のある、薬学的に活性な材料を含んでもよいか、あるいは、染料、香味剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤等の、本発明の組成物の種々の剤形を物理的に調剤する際に有用なさらなる材料を含んでもよい。しかしながら、そのような材料は、添加された時に、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。製剤は、殺菌することができ、所望の場合、製剤の核酸（１種または複数種）と悪影響を与えるように相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色剤、香味剤、および／または芳香性物質等の助剤と混合することができる。
【０１０９】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）１つ以上のアンチセンス化合物と、（ｂ）非アンチセンス機構によって機能する１つ以上の他の化学療法剤とを含む薬学的組成物を提供する。そのような化学療法剤の例として、これらに限定されないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン，６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の抗癌剤が挙げられる。これらに限定されないが、非ステロイド系抗炎症剤および副腎皮質ステロイドを含む抗炎症剤、およびこれらに限定されないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含む抗ウイルス剤も、本発明の組成物と組み合わされてもよい。他の非アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲内である。組み合わされた２つ以上の化合物は、一緒にまたは経時的に使用され得る。
【０１１０】
投薬は、治療される病態の重症度および応答性に依存し、数日間から数ヶ月にわたる、または、治癒がもたらされるまでもしくは病態の軽減が達成されるまで継続する治療過程を伴う。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算することができる。投与医は、最適な投与量、投薬方法、および反復率を容易に決定することができる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な強度によって異なり、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが分かっているＥＣ５０に基づいて、または本明細書に記載される実施例に基づいて、推定することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回以上与えられてもよい。治療医は、体液または組織中の薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投与の反復率を推定することができる。治療成功後、対象に病態の再発を防ぐための維持療法を受けさせることが望ましい可能性があり、その場合、オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇで、１日に１回以上〜２０年ごとに１回の範囲の維持投与量で投与される。
【０１１１】
Ｆ．併用療法
いくつかの実施形態において、本発明は、追加の薬剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせて、本明細書に記載される１つ以上の組成物を含む治療法を提供する。本発明は、特定の化学療法剤に限定されるものではない。
【０１１２】
種々のクラスの抗腫瘍性（例えば、抗癌性）薬剤が、特定の本発明の実施形態において使用するために企図される。本発明の実施形態とともに使用するのに好適な抗癌剤は、これらに限定されないが、アポトーシスを誘導する薬剤、，アデノシンデアミナーゼの機能を阻害する薬剤、ピリミジン生合成を阻害する、プリン環生合成を阻害する、ヌクレオチド相互変換を阻害する、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害する、チミジンモノホスフェート（ＴＭＰ）合成を阻害する、ジヒドロフォレート還元を阻害する、ＤＮＡ合成を阻害する、ＤＮＡとの付加体を形成する、ＤＮＡを損傷する、ＤＮＡ修復を阻害する、ＤＮＡとインターカレートする、アスパラギン類を脱アミノ化する、ＲＮＡ合成を阻害する、タンパク質の合成または安定性を阻害する、微小管の合成または機能を阻害するもの等を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態の組成物および方法において使用するのに好適な例示的な抗癌剤として、これらに限定されないが、１）アルカロイド、例えば、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシン等）、微小管安定剤（例えば、パクリタキセル（タキソール）、およびドセタキセル等）、およびクロマチン機能阻害剤、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）等）、ならびにトポイソメラーゼＩを標的とする薬剤（例えば、カンプトテシンおよびイリノテカン（ＣＰＴ−１１）等）、２）共有結合性ＤＮＡ結合剤（アルキル化剤）、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、およびブスルファン（マイレラン）等）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチン等）、ならびに他のアルキル化剤（例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、およびマイトシシン等）、３）非共有結合性ＤＮＡ結合剤（抗腫瘍抗生物質）、例えば、核酸阻害剤（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ等）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシン、およびセルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシン（イダマイシン）等）、アントラセンジオン（例えば、アントラサイクリン類似体、例えば、ミトキサントロン等）、ブレオマイシン（ブレノキサン）等、ならびにプリカマイシン（ミトラマイシン）等、４）代謝拮抗物質、例えば、葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、フォレックスおよびメキサート等）、プリン代謝拮抗薬（例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、プリントール）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、２−クロロデオキシアデノシン（ＣｄＡ）、および２´−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）等）、ピリミジン拮抗薬（例えば、フルオロピリミジン（例えば、５−フルオロウラシル（アドルシル）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）（フロクスウリジン）等）、ならびにシトシンアラビノシド（例えば、シトサール（ａｒａ−Ｃ）およびフルダラビン等）、５）酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびヒドロキシ尿素等、６）ホルモン、例えば、グルココルチコイド、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン等）、非ステロイド性抗アンドロゲン（例えば、フルタミド等）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（アリミデックス）等）、７）白金化合物（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン等）、８）抗癌剤、毒素、および／または放射性核種等とコンジュゲートしたモノクローナル抗体、９）生物学的応答調節因子（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）等］およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２等）等）、１０）養子免疫療法、１１）造血成長因子、１２）腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オールトランスレチノイン酸等）、１３）遺伝子療法の技法、１４）アンチセンス療法の技法、１５）��瘍ワクチン、１６）腫瘍転移に対する薬剤（例えば、バチマスタット等）、１７）血管新生阻害剤、１８）プロテオソーム阻害剤（例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ）、１９）アセチル化および／またはメチル化の阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤）、２０）ＮＦ‐κＢの調節因子、２１）細胞周期制御の阻害剤（例えば、ＣＤＫ阻害剤）、２２）ｐ５３タンパク質機能の調節因子、そして２３）放射線が挙げられる。
【０１１４】
癌治療の状況においてルーチン的に使用される任意の腫瘍退縮剤を、本発明の実施形態の組成物および方法において使用することができる。例えば、米国食品医薬品局は、米国内での使用が認可された腫瘍退縮剤の処方集を維持する。Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａと同等の国際機関が、同様の処方集を維持する。下の表は、米国内での使用が認可された例示的な抗腫瘍剤のリストを提供する。当業者は、米国で認可された全ての化学療法剤に必要とされる「製品ラベル」が、例示的な薬剤について認可された適応症、投与情報、毒性データ等を記載していることを認識するであろう。
【０１１５】
【表１】
2013520419.tif 000002
【０１１６】
【表２】
2013520419.tif 000003
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
ＩＩＩ．薬物スクリーニング用途
いくつかの実施形態において、本発明は、薬物スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌剤のスクリーニング）を提供する。本発明のスクリーニング法は、本発明に記載される遺伝子融合を用いる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合の発現を変化させる（例えば減少させる）化合物のスクリーニング法を提供する。化合物または薬剤は、例えば、プロモーター領域との相互作用によって、転写を妨げることができる。化合物または薬剤は、融合によって生成されるｍＲＮＡを阻害することができる（例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術等）。化合物または薬剤は、融合の生物学的活性の上流または下流である経路を妨げることができる。いくつかの実施形態において、候補化合物は、遺伝子融合に対するアンチセンスまたは干渉ＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。他の実施形態において、候補化合物は、遺伝子融合制御因子または本発明の発現産物に特異的に結合し、その生物学的機能を阻害する抗体または小分子である。
【０１２５】
あるスクリーニング法において、候補化合物は、遺伝子融合を発現する細胞に化合物を接触させ、次いで、候補化合物が発現に与える影響を評価することによって、遺伝子融合の発現を変化させる能力について評価される。いくつかの実施形態において、候補化合物が遺伝子融合の発現に与える影響は、細胞によって発現される遺伝子融合のｍＲＮＡのレベルを検出することによって評価される。ｍＲＮＡの発現は、任意の好適な方法によって検出することができる。
【０１２６】
他の実施形態において、候補化合物が遺伝子融合の発現に与える影響は、遺伝子融合によってコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって評価される。発現されるポリペプチドのレベルは、これに限定されないが、本明細書に開示されるものを含む任意の好適な方法によって測定することができる。
【０１２７】
具体的には、本発明は、修飾物質、すなわち、遺伝子融合に結合し、例えば、遺伝子融合の発現または遺伝子融合の活性に対する阻害（または促進）効果を有するか、あるいは、例えば、遺伝子融合基質の発現または活性に対して促進または阻害効果を有する候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、小分子または他の薬剤）を同定するためのスクリーニング法を提供する。したがって、同定された化合物は、標的遺伝子産物の生物学的機能を生成するため、または正常な標的遺伝子の相互作用を妨げる化合物を同定するために、治療プロトコルにおいて標的遺伝子産物（例えば、遺伝子融合）の活性を直接的または間接的に調節するために使用することができる。遺伝子融合の活性または発現を阻害する化合物は、増殖性疾患、例えば癌、特に前立腺癌の治療において有用である。
【０１２８】
一実施形態において、本発明は、遺伝子融合タンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、遺伝子融合タンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性部分に結合するかまたはそれらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１２９】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有する分子のライブラリーであるが、酵素分解に耐性を示すにもかかわらず生物活性を保持する、新規の非ペプチド主鎖を有する、例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５［１９９４］）を参照）、空間的に位置指定可能な平行固相または溶液相ライブラリー、逆重畳を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリー法を含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのうちのいずれかを用いることによって得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーとともに用いるのが好ましく、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子化合物ライブラリーに適用される（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１３０】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９［１９９３］、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２［１９９４］、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８［１９９４］、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３［１９９３］、Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０５９［１９９４］、Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１［１９９４］、およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３［１９９４］に見ることができる。
【０１３１】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１［１９９２］）、またはビーズ上（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４［１９９１］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６［１９９３］）、細菌または胞子（米国特許第５，２２３，４０９号、参照により、本明細書に組み込まれる）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５１８６９［１９９２］）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０［１９９０］、Ｄｅｖｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６［１９９０］、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２［１９９０］、Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１［１９９１］）に存在し得る。
【０１３２】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、またさらに例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものであると見なされるべきではない。
【実施例】
【０１３３】
〔実施例１〕
Ａ．実験手順
細胞株  前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから調達し、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩおよびＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ培地中でそれぞれ増殖させた。ＧＵＳ（ＲＷＰＥ＋ＧＵＳ）対照およびＥＲＧ（ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ）の安定した過剰発現を示す不死化良性前立腺細胞株ＲＷＰＥ（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １０，１７７−１８８  ２００８）を、ウシ下垂体抽出物を添加したケラチノサイト無血清培地中で増殖させた。ＶＣａＰ細胞をＥＲＧまたは対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、さらなる分析のためにＥＲＧ（ＶＣａＰ＋ＥＲＧ）またはＧＵＳ（ＶＣａＰ＋ＧＵＳ）を発現する安定したクローンを選択した。
【０１３４】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）  ＡＲに対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０６−６８０番）、ＥＲＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ３５４番）、およびウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２０２７番）を用いて、以前に記載されるように（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １２，４１９−４３１  ２００７）ＣｈＩＰを実施した。ＡＲのＣｈＩＰアッセイでは、ホルモンを枯渇させるために活性炭処理した血清を含むフェノールレッド不含培地中でＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞を３日間増殖させた後、１％エタノールまたはエタノール中に溶解した１０ｎＭのメチルトリエノロン（Ｒ１８８１、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で１６時間処理した。ＡＲのＣｈＩＰは、対になったエタノール処理済試料およびＲ１８８１処理済試料において行った。ＥＲＧのＣｈＩＰには、対応する通常の培地中で増殖させたＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ、およびＲＷＰＥ＋ＧＵＳ細胞を用いた。
【０１３５】
ＣｈＩＰ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ解析  以前に記載されるように（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７，１０６５７−１０６６３  ２００７）、Ａｇｉｌｅｎｔのプロモーターアレイ（−８ｋｂ上流〜２ｋｂ下流）を用いてＣｈＩＰ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ解析を行った。スライドウィンドウを横断するスコアリングスキームを用いて、ＣｈＩＰで濃縮された領域を同定した。各プローブごとに、そのプローブを囲むウィンドウ内の全プローブのスケーリング済ｌｏｇ−ｒａｔｉｏ値を平均化することによって（ｘＤｅｖ、Ａｇｉｌｅｎｔソフトウェアによるシングルアレイエラーモデルから算出）、このプローブを囲む４００ｂｐのウィンドウをスコアと見なして割り当てた。各スコアにＰ値を割り当てるために、スコアが正常に分布していると仮定し、スコアの上位５％および下位５％を排除した調整済みのスコアセットから分散および平均（ゼロに近い可能性が高い）を推定した。Ｐ値＜０．０１のウィンドウがＣｈＩＰで濃縮された領域であると判定し、最も近い遺伝子を特定するためにさらにヒトゲノムにマッピングした。
【０１３６】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  製造者のプロトコルに従って、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングのためにＣｈＩＰ試料を調製した。標準的な製造者の手順に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＣｈＩＰシーケンシングを行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａの解析パイプラインによりシーケンス画像の原データを分析し、ＥＬＡＮＤソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてマスキングされていないヒト参照ゲノム（ＮＣＢＩ  ｖ３６、ｈｇ１８）にアライメントし、２５〜３２ｂｐの配列読み取り値を産出した。
【０１３７】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータの解析  最初に、各試料に一意的にマッピングされた読み取り値がいくつあるかをカウントし、２つのカウントの比を正規化係数として用いて、両方の試料で使用可能な読み取りの合計数を同レベルにした。次に、一意的にマッピングされた各読み取り値を一方向に伸長し、各試料において２００ｂｐの仮想ＤＮＡ断片（ＨＤＦ）を形成した。２００が、試料調製（１７５〜２２５ｂｐ）の間にサイズ選択されたＤＮＡピースの平均長さであると推定される。
【０１３８】
刺激試料対非刺激試料に濃縮が見られないという帰無仮説のもとでは、両方の試料からの読み取り値が、同じポアソン分布に従うゲノムに当てはまると推定される（非刺激試料における読み取りカウントに補正後）。全ゲノムにわたる平均シーケンシング深度をバックグラウンド比の推定値ｒ０として用いた。各対象範囲領域において２つの試料間の読み取りの差が観察される確率を数値的に算出した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正したＰ値０．００１を用いて、どの対象範囲領域が有意に濃縮されているかを判定した。
【０１３９】
濃縮された領域がどこから始まって終わるのかを特定するために、ＨＭＭを適用した。具体的には、全ゲノムを２５ｂｐのビンに分割し、２つの試料の各ビンにおいて読み取り対象範囲をカウントした。２つの状態は、濃縮された領域およびバックグラウンドである。観察されたデータは、ＨＤＦの対象範囲差である。濃縮された領域において、刺激試料にはＨＤＦの濃縮が見られるが、非刺激試料には見られないであろうと予想した。したがって、この差は、２つの異なるポアソン分布の結果であると推定される（比率ｒ１およびｒ２、ｒ１＞ｒ２）。バックグラウンドにおいて、差は２つの同一のポアソン分布（比率ｒ０）に由来すると推定される。遷移確率は、経験的に予測される。ＨＭＭの出力から、濃縮された領域にあるという事後確率に基づいて領域を選択する。ビンにおけるその最大読み取りカウントが、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正したＰ値０．００１に相当する閾値（バックグラウンド比ｒ０で２つのポアソン分布の差を用いて算出）を超えない外部領域を除外する。
【０１４０】
結合部位モチーフ解析  ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒパッケージを用いて既知の転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の探索を行った（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２１，２９３３−２９４２  ２００５）（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。過剰出現されるＴＦＢＳを同定するために、ＣｈＩＰで濃縮された領域と、ＣｈＩＰで濃縮された元の領域内の全塩基をランダムにシャッフルすることによって得られた対照配列の両方において、モチーフスキャンを行った。これらの２種類の領域における各ＴＦＢＳの過剰出現の有意性を、フィッシャーの直接確率検定のＰ値によって測定した。モチーフ探索のためのＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒにおける同じデフォルト閾値を、全ての配列および５０８個全ての個々の脊椎動物ＴＦＢＳマトリクスに用いた。ＭＥＭＥを用いて新規モチーフの検索を行った。ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞の両方に重複し、かつＡＲの処理下で差次的発現を示した遺伝子の上流５０ｋｂ以内の１２８配列を使用した。
【０１４１】
遺伝子発現プロファイル解析  ２日間ＶＣａＰ細胞のホルモンを除去し、１％エタノールもしくは１０ｎＭのＲ１８８１で処理するか、またはＬａｃＺ対照アデノウイルスもしくはＥＲＧアデノウイルスに感染させた。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。製造者（Ａｇｉｌｅｎｔ）のプロトコルに従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓを用いて発現プロファイリングを行った。
【０１４２】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙｓを用いた０時間、４時間、および１６時間ＤＨＴ処理に供した除去済ＬＮＣａＰ細胞をプロファイリングする経時的な遺伝子発現データセットを、ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベース（ＧＳＥ７８６８）からダウンロードした。最新のプローブマッピングを用いたＲＭＡアルゴリズム（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）４，２４９−２６４  ２００３）を使用してＣＥＬの原データを分析し、調整済みのベイズｔ統計値（Ｂａｌｄｉ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）１７，５０９−５１９  ２００１）を用いて０時間に対する各時点での差次的発現レベルを算出した。
【０１４３】
配列保存性解析    ＡＲの濃縮された領域をＣｈｉｐ−Ｓｅｑにより同定し、それらの中心にアライメントした。ｐｈａｓｔＣｏｎｓスコア（Ｓｉｅｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５，１０３４−１０５０  ２００５）を検索し、各位置で平均化した。
【０１４４】
遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）  Ａｇｉｌｅｎｔの全ヒトゲノムアレイにより、ＡＲ処理ＶＣａＰ、ＥＲＧアデノウイルス感染ＶＣａＰ、および対照細胞の発現プロファイリングデータを生成した。対照と比較した実験細胞における遺伝子発現の倍数変化を算出し、ＡＲ処理細胞において少なくとも４倍の変化を有する遺伝子をＡＲ制御遺伝子セットとして定義した。対照と比較したＥＲＧアデノウイルス感染ＶＣａＰ細胞における遺伝子発現の倍数変化を用いて遺伝子を予めランク付けし、ＧＳＥＡプログラム（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１５５４５−１５５５０  ２００５）にインポートし、そのデータにおいてＡＲ制御遺伝子セットが濃縮されるかどうかを調べた。
【０１４５】
定量ＰＣＲ  以前に記載されるように（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １２，４１９−４３１  ２００７ａ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機上でＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＱ−ＰＣＲを行った。全てのプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３を用いて設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成し、表８に列挙される。全てのＰＣＲ実験を３通り行った。
【０１４６】
共免疫沈降法およびウエスタンブロット法  １０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、ＶＣａＰ細胞を８０％コンフルエンスまで増殖させた。ホルムアルデヒドでクロスリンクを行うかまたは行わずに細胞を採取し、続いて核を単離した。ＴＢＳで２回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含むＲＩＰＡ緩衝液中に核を溶解し、超音波分解した。溶解物を遠心分離し、抗体を用いた共免疫沈降に用いた。共免疫沈降に使用した抗体は、  抗ＡＲ（ポリクローナル（ＰＧ２１）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＥＲＧ（ポリクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、対照抗体（ウサギＩｇＧポリクローナル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ  （Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のマウスモノクローナル抗ＡＲ抗体（ＡＲ４４１）をウエスタンブロット実験に用いた。
【０１４７】
ＲＮＡ干渉  非標的ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１２１０−０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＲＧの両方のアイソマーに特異的なｓｉＲＮＡ（Ｄ−００３８８６−０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合転写物、および野生型ＥＲＧ（ＵＧＧ  ＵＣＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＡＡＵ  Ａ；配列番号４３）でＶＣａＰ細胞を処理した。
【０１４８】
細胞増殖およびＷＳＴ細胞増殖アッセイ  ＤＭＥＭ−  ＧｌｕｔａＭＡＸ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）培地中の２４ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）でＶＣａＰ細胞を増殖させた。細胞は、アデノ−ＥＲＧウイルスまたはアデノ−ＬａｃＺ対照ウイルス（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）１０，１７７−１８８  ２００８）に感染させる前に、活性炭処理済１０％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ中で４８時間アンドロゲンを枯渇させた。エタノールに溶解したＲ１８８１を最終濃度１ｎＭで用いた。処理後４８時間にアッセイを行った。細胞カウントアッセイでは、細胞をトリプシン処理し、Ｚ２  Ｃｏｕｌｔｅｒ粒子カウンターおよびサイズアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用してカウントした。製造者の指示（Ｒｏｃｈｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って、ＷＳＴ−１試薬を用いた細胞増殖アッセイを行った。２４ウェル培養プレート上で反応を行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用した読み取りのために溶液を９６ウェルプレートに移した。
【０１４９】
細胞浸潤アッセイ  以前に記載されるように（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １２，４１９−４３１  ２００７ａ）、改良された基底膜チャンバーアッセイを用いて細胞浸潤を実施した。簡潔に述べると、２４ウェル培養プレートのインサートに存在する基底膜マトリクス（ＥＣ  ｍａｔｒｉｘ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）上に等しい数の指定された細胞を播種し、化学誘引物質としてウシ胎仔血清を下のチャンバーに加えた。４８時間後、非浸潤細胞およびＥＣマトリクスを綿棒で除去した。浸潤細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真を撮影した。インサートを１０％酢酸で処理し、５６０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１５０】
Ｂ．  結果
ＡＲによる占有のゲノムランドスケープ  台頭するＣｈＩＰ−Ｓｅｑ技術（Ｂａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２９，８２３−８３７  ２００７、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ３１６，１４９７−１５０２  ２００７、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，５５３−５６０  ２００７、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ４，６５１−６５７  ２００７）を利用して、２つのアンドロゲン感受性前立腺癌細胞株においてＡＲが結合したゲノム領域を特定した。これらは、最も一般的な前立腺癌の遺伝子融合であるＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧを内部に有するＶＣａＰ細胞（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，６４４−６４８  ２００５）と、ＥＲＧ融合に対して陰性であるがＥＴＶ１の潜在的転移に対して陽性であるＬＮＣａＰ細胞（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，５９５−５９９  ２００７）とを含んでいた。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ実験において濃縮されたゲノム領域を特定するために、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピーク検索用のＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌベースのアルゴリズムを適用したプログラムであるＨＰｅａｋを使用した。結果は、ＣｈＩＰＳｅｑ実験の技術的複製と生物学的複製との間に高い再現性があることを示した（図８）。アンドロゲンの非存在下では、基本的ＡＲ結合活性のレベルは非常に低いが、アンドロゲン処理を行うと、ＡＲは約１０倍多くのゲノム領域に結合し、より強い濃縮を示した（図１Ａ、表１）。ＨＰｅａｋを使用して対応するエタノール処理済対照試料に正規化した後、アンドロゲン処理したＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞において、それぞれ、合計３７，４３９個および１２，９６５個のＡＲ結合ピークが検出された。
【０１５１】
以前に報告されたＡＲ標的遺伝子が多数同定された。例えば、ＦＫＢＰ５は、遠位エンハンサーを介してＡＲによって制御されることが知られており（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４７，５９０−５９８  ２００６）、以前にＣｈＩＰ−ｏｎ−Ｃｈｉｐによって上位のＡＲ標的遺伝子として検出されている（Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２１，２００５−２０１７  ２００７）。ＦＫＢＰ５は、ＬＮＣａＰ細胞およびＶＣａＰ細胞の両方において最適な標的遺伝子として同定され、単一の２５ｂｐスライドウィンドウにマッピングされた最多読み取り数は、それぞれ１７７１および６６９であった（図９）。また、ＰＳＡ遺伝子の十分に定義されたエンハンサーにＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって鋭いＡＲ結合ピークが検出され、ＰＳＡプロモーターに小さな第２のピークが見られた（Ｊｉａ  ａｎｄ  Ｃｏｅｔｚｅｅ，  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，８００３−８００８  ２００５）（図１Ｂ）。さらに、ＬＮＣａＰ細胞とＶＣａＰ細胞とのＡＲ結合領域の比較により著しい重複が明らかになった：ＨＰｅａｋによって規定される２５ｂｐウィンドウの解像度で、ＶＣａＰ細胞のＡＲ結合ゲノム領域の約６１％も、ＬＮＣａＰ細胞でＡＲをリクルートする（図１Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＡＲ結合部位の同定におけるＣｈＩＰ−Ｓｅｑアッセイの正確性を立証するものである。
【０１５２】
限られた数の遺伝子についての以前の研究は、遠位エンハンサーを介したＡＲによる標的遺伝子の制御を支持している（Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上記参照）。ゲノムスケールでＡＲによる占有のパターンを評価するために、ＡＲ結合領域の中間点から最も近い遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）までの距離を測定した。ＬＮＣａＰ細胞内で同定された全ＡＲ結合領域のわずか５％が、標的遺伝子のＴＳＳに近接して位置する（表２）。いくつかの結合部位はＴＳＳの１００ｋｂ以上上流にある一方、結合部位の約５０％は遺伝子内領域内にあり、プロモーター、エンハンサー、または遺伝子内要素によって媒介されるアンドロゲン制御機構の多様性を示唆している。ＬＮＣａＰ細胞とは対照的に、遥かに高い割合（１４％）のＡＲ結合部位がＶＣａＰ細胞のプロモーター領域内にあり（図１Ｄ）、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合を内部に有するＶＣａＰ細胞における細胞株特異的プロモーターの媒介による標的遺伝子の制御を示唆している。
【０１５３】
ＡＲ結合部位のモチーフ解析  ＡＲの好ましいコンセンサス結合配列を特定するために、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって同定されたＡＲ結合領域を、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘデータベース内の脊椎動物転写因子のうち全部で５０８個の予め定義されたコンセンサス配列マトリクスの発生について調べた。このスクリーニングにより、ＡＲ結合部位において最も有意に濃縮されたモチーフとして１５ｂｐの基準ＡＲＥが発見された（表３）：ＬＮＣａＰからの最大３６．１％のＡＲ結合ピーク、およびＶＣａＰからの３３．２％が、少なくとも１つのＡＲＥ部位を含む（表４）。ＡＲＥ部位の発生は、ＡＲ結合ピークの高さによって示されるＡＲの濃縮と確実に相関している（ｒ＝０．８７、Ｐ＜０．００１）：ピークの高さによって上位１０％にランク付けされたＡＲ結合部位の最大６０％がＡＲＥを含む（図１Ｅ）。さらに、いくつかのＡＲ結合ピークは、１つより多くのＡＲＥを含み、ピーク当たりのＡＲＥ部位の平均数もピークの高さと確実に相関しており（ｒ＝０．９３、Ｐ＜０．００１）、転写因子をリクルートする際のＡＲＥ部位の重要性をさらに裏付けるものであった。遺伝子発現プロファイリングによって定義されたアンドロゲン制御遺伝子内のＡＲ結合部位の分析（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ２７，３８０−３９２  ２００７）により、ピークの高さとアンドロゲン応答性との確実な相関性（ｒ＝０．７２、Ｐ＜０．００１）が明らかになった（図１Ｆ）。
【０１５４】
ＡＲＥ部位以外にも、ＡＲ結合配列のモチーフスキャンによって、フォークヘッド転写因子（Ｈｅｅｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８，７７８−８０８  ２００７）等の以前に特徴付けられたＡＲ共因子を含む、他の転写因子の結合モチーフの有意な（フィッシャーの直接確率検定によるＰ＜１×１０−１５８）濃縮が同定された（表３）。ＥＴＳファミリー結合モチーフは、２番目に有意に（フィッシャーの直接確率検定によるＰ＜１×１０−３００）濃縮されたモチーフであることが分かった：ＡＲＥ部位の発生率３３％および３６％と比較して、それぞれ、ＶＣａＰのＡＲ結合ピークの約２９％およびＬＮＣａＰの２７％がＥＴＳ部位を含む（表４）。これらの結果は、ＡＲとＥＴＳ遺伝子の融合産物ＥＲＧとは、特に、ＶＣａＰ細胞等の、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよびＡＲの両方を発現する細胞において、共通するセットの配列に結合し得ることを示唆している。ＡＲおよびＥＲＧ結合モチーフの共局在化をさらに裏付けるために、ＡＲＥおよびＥＴＳ部位の両方を含む１，４２２個のＡＲ結合領域のサブセットを分析した。これらの配列の５１％において、ＡＲＥおよびＥＴＳモチーフは、互いの５０ｂｐ以内にある。
【０１５５】
次に、対応する転写因子の未知のコンセンサスモチーフを予測するのにＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータが有用であり得るかどうかを調査した。最初に、種間のＡＲ結合配列の分析により、ピークの中心に高い保存が示され、それは転写因子結合座位が系統発生的に保存されることが多いという考えと一致するものであった（図１０）。次に、ＬＮＣａＰとＶＣａＰとの間で重複し、かつアンドロゲン応答遺伝子にマッピングする１２８ＡＲ結合ピークのサブセットにおいて、ＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｔｉｆ  Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）Ｐｒｏｇｒａｍによる新規モチーフ探索により（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ２７，３８０−３９２  ２００７）、基準ＡＲＥ部位に対して著しい類似性を有する「ｍｅｍｅＡＲＥ」と名付けられた頻繁に発生するコンセンサスモチーフが同定された（図１Ｇ）。
【０１５６】
ＡＲ結合は遺伝子発現と相関する。ＡＲ結合と遺伝子発現のアンドロゲン制御との関連性を調査するために、上位のＡＲ結合遺伝子を調べた。ＦＫＢＰ５の他に、ＬＮＣａＰ細胞内のさらなる上位５つの標的は、Ｃ６ＯＲＦ８１、ＴＡＣＣ２、ＣＵＴＬ２、およびＳＬＣ４３Ａ１であり、それらは全て、ＶＣａＰ細胞における上位１０個のＡＲ結合標的にも含まれる。特徴付けされていない転写物であるＣ６ＯＲＦ８１を除くこれらの遺伝子は全て、大規模な多腫瘍マイクロアレイデータセットにおいて他の腫瘍型と比較して前立腺癌における著しい過剰発現を示し（図１１）、これらの遺伝子が比較的「前立腺特異的」であることが示唆された。
【０１５７】
再発性遺伝子融合と関連してＡＲ結合を確認するために、前立腺癌において以前に報告されている５’遺伝子融合パートナー上のＡＲによる占有を調べた。ＡＲは、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｃ１５ＯＲＦ２１、ＨＥＲＶ−Ｋ、およびＳＬＣ４５Ａ３を含む、アンドロゲン感受性５’融合パートナー遺伝子全ての制御要素に結合する（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，５９５−５９９  ２００７）（図２Ａ〜Ｄ）。さらに、各標的遺伝子に特異的なプライマーを用いた従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲにより、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑアッセイによって検出されたＡＲ結合が確認された（図２Ａ〜Ｄの挿入図）。一方、アンドロゲン感受性ではないが遍在的に発現される５’融合パートナー（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，５９５−５９９  ２００７）であるＨＮＲＰＡ２Ｂ１の制御領域内では、融合産物の上方制御をもたらし得る特徴であるＡＲの占有は検出されなかった（図２Ｅ）。ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩおよびヒストンＨ３リシン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）に対する抗体を用いたＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析によって、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１プロモーターの活性かつ解放的なクロマチン構造が確認された（図２Ｅ）。
【０１５８】
次に、ゲノムスケール上でＡＲ結合をアンドロゲンによる発現制御と相関させるために、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の発現マイクロアレイ試験（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上記参照）によって特定されるアンドロゲン制御遺伝子上のＡＲ結合の過剰出現を調べた。結果は、アンドロゲン応答遺伝子のゲノム領域において実質的により多くのＡＲ結合を示した（図２Ｆ）。アンドロゲン処理の初期（４時間）と後期（１６時間）の時点で、この濃縮に大きな違いは見られなかった。ＡＲ結合領域を含むアンドロゲンによって誘導される遺伝子が、アンドロゲンによって抑制される遺伝子よりも高い割合で観察され（図２Ｇ）、ＡＲの転写活性因子としての主な役割を裏付けた。ＡＲが結合したアンドロゲンによって誘導される遺伝子の割合は、アンドロゲン処理４時間後の８５％から１６時間後には７７％まで減少したのに対し、アンドロゲンによって抑制される遺伝子の割合は、初期および後期の時点の両方とも約６０％と実質的に同じままであった。ＶＣａＰ細胞に、ＡＲの占有とアンドロゲン応答性に同様の相関が観察された（図１２）。
【０１５９】
ＡＲ結合遺伝子の機能的アノテーションを得るために、ＯｎｃｏｍｉｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｍａｐ（ＭＣＭ）（Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ９，４４３−４５４  ２００７）内の１５，０００個を超える分子概念または生物学的相関において、ＡＲに占有された上位３０００個の遺伝子の濃縮について分析した。結果は、ＶＣａＰ内のＡＲ結合遺伝子を、ＬＮＣａＰ細胞内のＡＲ結合遺伝子、およびインビトロまたはインビボの両方の複数のアンドロゲン制御遺伝子セットと有意に（Ｐ＜１．０×１０−１００）リンクする濃縮ネットワークを示した（Ｐ＜１．０×１０−１０）（図３Ａ、表５）。最も濃縮された（Ｐ＜１．０×１０−２０）分子概念は、胚性幹細胞または転移性前立腺癌においてポリコーム群タンパク質によってサイレンシングされる遺伝子セットであり、アンドロゲンシグナル伝達と正常な細胞分化のプロセスとの関連性を裏付けるものである。アンドロゲン非依存性の転移性前立腺癌においてアンドロゲンシグナル伝達の減少が観察されたことと一致して（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９，４１−５１  ２００７）、「転移性または高悪性度の腫瘍における遺伝子の低発現」に相当する遺伝子発現の概念を伴うＡＲ結合の高度に有意な濃縮（Ｐ＜４．０×１０−１５）が観察された。ＭＣＭ解析から、前立腺癌におけるＡＲ結合遺伝子のＥＲＧ過剰発現シグネチャーへの新規リンク（Ｐ＜４．０×１０−１３）が明らかになり、ＡＲとＥＲＧ制御経路との潜在的な関連性が示唆された。要約すると、ＡＲ結合遺伝子は、アンドロゲン感受性前立腺腫瘍の亜型、病態、ＥＲＧの発現、および患者の生存率と有意に（Ｐ＜２．０×１０−１０）関連している（表５）。ＡＲ結合遺伝子を用いた遺伝子発現データベースの階層的クラスタリングのヒートマップを図６に示す。
【０１６０】
前立腺癌細胞におけるゲノムワイドなＥＲＧによる占有  ＡＲ媒介性転写経路とＥＲＧ媒介性転写経路との潜在的なリンクを調査するために、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合を含むＶＣａＰ細胞においてＥＲＧのＣｈＩＰ−Ｓｅｑを行った。陰性対照実験として、ＥＲＧ融合に陰性であり、そのため非常に低レベルのＥＲＧを発現するＬＮＣａＰ細胞において、ＥＲＧのＣｈＩＰ−Ｓｅｑも実施した。ＶＣａＰ細胞に４２，５６８個のＥＲＧ結合ピークが同定されたのに対し、ＬＮＣａＰ細胞には、バックグラウンドレベルを表すわずか６０８個のＥＲＧ結合領域があったのみであった（表１）。さらに、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑは、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＰＬＡＴ、およびＰＬＡＵを含む以前に報告されている標的遺伝子（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １０，１７７−１８８  ２００８）上でＥＲＧ結合を検出することに成功した（図３Ｂ）。より大きな規模でＥＲＧ結合を遺伝子発現と相関させるために、異所性ＥＲＧの過剰発現によって差次的に制御される遺伝子上のＥＲＧ結合の過剰出現を調べた（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、上記参照）。結果は、ＥＲＧ制御遺伝子のゲノム領域にＥＲＧ結合の濃縮を示した（図１４）。
【０１６１】
次に、ＲｅｆＳｅｑから最も近い遺伝子のＴＳＳまでＥＲＧ結合部位のゲノム距離を測定した。ＬＮＣａＰのＡＲ結合部位のわずか５％およびＶＣａＰのＡＲ結合部位の１４％がプロモーター領域にマッピングし、ＥＲＧ結合部位の約３４％が標的遺伝子のＴＳＳに近接して位置する（表２）。これは、プロモーター媒介性のＥＲＧ制御ではなく（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、上記参照）、主としてエンハンサー媒介性であるＡＲ制御（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上記参照）の理解と一致する。さらに、ＶＣａＰにおけるＡＲ結合部位の分布は、ＬＮＣａＰにおけるエンハンサー優勢のＡＲ結合パターンからＶＣａＰ細胞におけるよりプロモーター優勢のＥＲＧ結合の分布への全体的なシフトを示しており（図３Ｃ）、後者においてこれらのプロモーターにＡＲをリクルートする際のＥＲＧの潜在的役割を示すものであった。
【０１６２】
ＥＲＧ結合活性をさらに調べるために、異所性ＥＲＧ遺伝子の融合産物（ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ）またはＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）対照（ＲＷＰＥ＋ＧＵＳ）の安定した過剰発現を示すＲＷＰＥ良性前立腺上皮細胞においてＥＲＧのＣｈＩＰ−Ｓｅｑを行った。ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞に１０，７６５個のＥＲＧ結合ピークが観察され、ＲＷＰＥ＋ＧＵＳ対照細胞に検出されたものよりも約１０倍多かった。非特異的結合を除去するために、ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞におけるＥＲＧ結合ピークを２５ｂｐの各スライドウィンドウでＲＷＰＥ＋ＧＵＳ対照におけるピークと比較したところ、ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞に特異的なＥＲＧ結合領域は６，６８５個となった。これらのゲノム領域の５８％も、ＶＣａＰ細胞において内因性ＥＲＧをリクルートした（図３Ｄ）。ＶＣａＰには、ＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞の異所性ＥＲＧの結合ピークよりも約３０，０００個多い内因性ＥＲＧの結合ピークが存在し、内因性の環境においてＥＲＧがその標的遺伝子に完全にリクルートするための追加補因子の使用を示唆している。ＶＣａＰおよびＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞の両方におけるＥＲＧ結合領域のモチーフ解析により、最も有意に濃縮されたモチーフとしてＥＴＳファミリー結合部位が明らかになり（表４）、一方、ＡＲＥは、ＡＲ結合ピークにおいて最も濃縮されたモチーフであり、ＮＲＳＦ結合モチーフがＮＲＳＦ結合部位に最適である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ３１６，１４９７−１５０２  ２００７）ことが分かり、そのためＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータの特異性を支持していた。
【０１６３】
ＥＲＧ媒介性経路についての理解を深めるために、ＶＣａＰ細胞内でＥＲＧに占有される遺伝子の濃縮ＭＣＭ解析（図１５および表６）を行った。最も有意な（Ｐ＜１．０×１０−１００）濃縮ネットワークが、「ＶＣａＰにおけるＥＲＧ結合」（索引表照会）、「ＲＷＰＥ＋ＥＲＧにおけるＥＲＧ結合」、および「ＥＴＳ結合モチーフ」の分子概念を相互接続した。さらに、ＥＲＧに占有される遺伝子は、ＥＴＳ陽性前立腺癌をＥＴＳ陰性腫瘍と区別する遺伝子と有意に重複する。また、ＥＲＧに占有される遺伝子は、転移性前立腺癌、または膀胱癌、乳癌、退形成乏突起膠腫、およびメラノーマ等の他の固形腫瘍のより侵襲性の高い形態において過剰発現される遺伝子とも重複する。これは、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陽性前立腺癌が、より高い侵襲性の経過を有するという意見が増えていることと一致している（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７，１９９３−２００３  ２００８、Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，４５９６−４５９９  ２００７、Ｆｕｒｕｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１，６７−７５  ２００８、Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ９７，１６９０−１６９５  ２００７、Ｒａｊｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６０，１２３８−１２４３  ２００７、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，８３４７−８３５１  ２００６）。ＥＲＧ結合遺伝子に関する最も強力な（Ｐ＜１．０×１０−１００）濃縮ネットワークにあるのは、「ＬＮＣａＰにおけるＡＲ結合」および「ＶＣａＰにおけるＡＲ結合」の概念であり、前立腺癌におけるこれら２つの転写因子間のリンクについて最初の証拠を提供する。
【０１６４】
ＡＲおよびＥＲＧは、多くの標的遺伝子を共占有する。潜在的なＡＲおよびＥＲＧによる標的遺伝子の共占有を調べるために、各転写因子が結合したゲノム領域を２５ｂｐスライドウィンドウごとに重複について比較した。ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰのＡＲ結合領域の６１％が重複しており、ＡＲ結合領域の約４４％が、ＶＣａＰ細胞内でＥＲＧが結合した領域と重複する（図４Ａ）。しかしながら、ＬＮＣａＰのＡＲ結合領域のわずか１６．６％がＶＣａＰ細胞のＥＲＧ結合部位と重複しており、細胞株間での違いが示されている。ＡＲ結合領域およびＥＲＧ結合領域は、全ヒトゲノムの０．１％および０．７％未満を占めており、したがって、この低い割合が重複する可能性は極めて低いため、ＡＲ結合領域とＥＲＧ結合領域との間に観察された重複には重要性がある。この可能性は、ＡＲが主にエンハンサー要素に結合し、ＥＲＧが標的遺伝子のプロモーターに結合するという事実によってさらに減少する。ＡＲとＥＲＧの重複がランダムな事象ではないことを統計的に裏付けるために、ＡＲまたはＥＲＧのいずれとも関連性が示されていない神経特異的転写因子であるＮＲＳＦのＣｈＩＰ−Ｓｅｑ由来結合部位（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ３１６，１４９７−１５０２  ２００７）を対照として用いた。ＡＲまたはＥＲＧのいずれかとＮＲＳＦとの結合領域の重複は２％未満である。したがって、ＡＲ結合部位とＥＲＧ結合部位の重複は、それらのＮＲＳＦ結合領域との重複よりも有意に（カイ二乗検定によるＰ＜０．０００１）高いものである。
【０１６５】
単にＡＲおよびＥＲＧの両方が活発に転写される遺伝子に結合するので、それらが標的領域を共占有する、という可能性を除外するために、主として活発に転写される遺伝子のＴＳＳの近くに結合するＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＲＮＡ  ＰｏｌＩＩのＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析（Ｂａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２９，８２３−８３７  ２００７）を行った。ＬＮＣａＰのＡＲ、ＶＣａＰのＡＲ、およびＶＣａＰのＥＲＧ結合領域のそれぞれ４．３％、１４％、および３１％が、ＲＮＡのＰｏｌＩＩ結合部位と重複することが観察された（図４Ａ）。ＡＲとＰｏｌＩＩの重複は、ＥＲＧとＰｏｌＩＩの重複よりも実質的に低かった。本発明は、特定の機構に限定されるものではない。実際、機構を理解することは、本発明を実施するために必ずしも必要ではない。それにもかかわらず、結果は、ＡＲ結合領域のわずか１４％がＲＮＡ  ＰｏｌＩＩと重複するが、実質的により多くの（４４％）ＡＲ結合領域がＥＲＧ結合部位と重複することを示しており、そのため、発現遺伝子への結合以外の機構に起因するそれらの共占有が示唆される。したがって、ＰｏｌＩＩとの重複の量は、特異的転写因子の活性なＴＳＳへの結合を実際に反映するが、ＡＲとＥＲＧの重複は、それらのＰｏｌＩＩとの重複よりもはるかに高く、そのため、それらの重複はＰｏｌＩＩ結合を有する発現遺伝子とのみ関連するという機構が除外される。このことは、ＡＲおよびＥＲＧの、活性遺伝子のＨ３Ｋ４ｍｅ３マークとの同様の重複パターンによってさらに裏付けられる（図４Ａ）。さらに、ＬＮＣａＰのＡＲ（４．３％）結合部位よりも遥かに高い割合（１４％）のＶＣａＰのＡＲ結合部位がＰｏｌＩＩまたはＨ３Ｋ４ｍｅ３のいずれかと重複することから、ＶＣａＰ細胞におけるプロモーター媒介性のＡＲ制御の増強が示唆される（図３Ｃ）。
【０１６６】
標的遺伝子におけるＡＲおよびＥＲＧの共占有を裏付けるために、異なる染色体上に位置するＮＤＲＧ１、Ｃ６０ｒｆ８１、ＬＯＣ４００４５１、ＺＢＴＢ１６、およびＣＵＴＬ２を含む、ＡＲおよびＥＲＧの両方が結合した５つの遺伝子からなるセットをランダムに選択した。結果は、これらの標的遺伝子の近くでＡＲ結合領域とＥＲＧ結合領域の明らかな重複を示した（図４Ｂ）。これらの遺伝子の各々に特異的なプライマーを用いて、従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲアッセイによりＡＲとＥＲＧの結合を確認した（図４Ｃ）。合成アンドロゲンで処理したＶＣａＰ細胞においてＡＲ結合の濃縮をビヒクル処理細胞と比較して評価した。ＥＲＧ結合の濃縮は、ＣｈＩＰに用いたＩｇＧ対照と比較して評価した。
【０１６７】
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、野生型ＥＲＧ、およびＡＲを接続するフィードバックループ。ＶＣａＰ細胞においてＥＲＧが強力に結合した遺伝子の１つはＡＲであった（図５Ａ）。そのため、ＥＲＧによるＡＲの制御は、その間のフィードバックループを示唆し得る。従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲアッセイにより、ＶＣａＰ細胞のＡＲ座位上のＥＲＧ結合を確認した（図５Ｂ）。また、異所性ＥＲＧの過剰発現アッセイおよびＲＮＡ干渉アッセイの両方によって、ＡＲの転写レベルがＥＲＧによって負に制御されることが示された（図５Ｃ、図１６）。さらに、ＶＣａＰ細胞の免疫ブロット分析により、ＥＲＧ過剰発現の際のＡＲタンパク質の明らかな抑制が示された（図５Ｄ）。ＡＲ遺伝子におけるＡＲおよびＥＲＧの共占有の調査により、ＡＲが自身のゲノム制御領域に結合していることが明らかになった（図５Ｅ）。従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲアッセイにより、アンドロゲン処理したＶＣａＰ細胞において、ビヒクル処理細胞と比較してＡＲ自身における強い濃縮が示された（図５Ｆ）。さらに、合成アンドロゲンで処理したホルモンを枯渇させたＶＣａＰ細胞は、ビヒクル処理細胞と比較して有意に少ない量のＡＲを発現し（図５Ｇ）、この抑制は、処理後２４時間で１０培以上に達した（図１７）。免疫ブロット分析により、このＡＲの負のフィードバックループがタンパク質レベルでさらに確認された（図５Ｈ）。ＡＲとＥＲＧの相互制御、そしてＡＲの自己制御が観察されたため、ＥＲＧが自身を制御し得るかどうかを調査した。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析により、ＥＲＧ遺伝子のゲノム座位に複数のＥＲＧ結合ピークが示された（図５Ｉ）。ＥＲＧゲノム領域内の最も高い結合ピークに隣接するプライマーを使用した従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲにより、ＶＣａＰ細胞に強力なＥＲＧ結合が確認された（図  ５Ｊ）。ＥＲＧ発現の自己制御を調査するために、エクソン２から始まる報告されている停止コドンまでの切断型ＥＲＧをＶＣａＰ細胞で過剰発現させ、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、野生型ＥＲＧ、およびその両方に特異的なプライマーを用いて対応する発現の変化を測定した（図５Ｋ）。結果は、前立腺癌に頻繁に見られる融合産物である切断型ＥＲＧは、野生型ＥＲＧの発現を誘導するが、ＴＭＰＲＳＳ２エンハンサーの制御下にあるＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの発現は誘導しないことを示した。融合ＥＲＧを過剰発現させ、野生型ＥＲＧを評価することによって、良性前立腺上皮細胞（ＰＲＥＣ）およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞においてこの知見を確認した（図１８）。それと一致して、アンドロゲン処理後に、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧと比較して野生型ＥＲＧの上方制御の遅延が観察され、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧに与える一次的影響を介してアンドロゲンが野生型ＥＲＧに与える二次的影響が示された（図１９）。さらに、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの特異的ＲＮＡ干渉は、野生型ＥＲＧの抑制をもたらしたが、野生型ＥＲＧの特異的ＲＮＡ干渉は、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの発現に影響を与えなかった（図５Ｌ）。ＥＲＧ変異体のＲＮＡ干渉も、ＶＣａＰ前立腺癌細胞の浸潤の潜在性を大きく低下させた（図２０）。さらには、良性前立腺組織、局在化前立腺癌および転移性前立腺癌のパネルにおける３つのＥＲＧ変異体���ｑＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＥＴＳ遺伝子融合を発現するヒト前立腺癌のサブセットにおける野生型ＥＲＧの誘導が示された（図５Ｍ）。したがって、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合を内部に有する前立腺癌のサブセットも、固有の分子亜型を定義する野生型ＥＲＧの発現を誘導し得る。総合すると、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、野生型ＥＲＧ、およびＡＲの相互制御および自己制御は、ＡＲ−ＥＲＧ制御ネットワークおよび前立腺癌の進行のホメオスタシスに関与する相互接続された転写「スイッチ」を形成する。
【０１６８】
前立腺癌組織におけるＥＲＧおよびＡＲの制御回路。インビトロ細胞株モデルを用いて、ＡＲおよびＥＲＧの相互接続制御ネットワークを実証した。その関連性をインビボでさらに調査するために、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合を内部に有し、かつ高レベルのＡＲを発現するヒト前立腺腫瘍のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析によりＡＲおよびＥＲＧの共占有を検証した。多くの技術的な課題のために、当業界において、（細胞株とは対照的に）ヒト腫瘍における転写因子のゲノムワイドなマップを開発することは困難であった。ヒト凍結組織検体に由来するＤＮＡに最適化したＣｈＩＰ−Ｓｅｑプロトコルを開発した。ＥＲＧ＋、ＡＲ＋ヒト前立腺癌組織のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析により、１２，０３６個のＡＲ結合領域および６，９６７個のＥＲＧ結合領域を検出することができた（表１）。細胞株のデータによって示されるように、ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の以前に定義されたエンハンサー要素にＡＲ結合ピークが同定された（図２１）。
【０１６９】
組織のＡＲ結合領域とＥＲＧ結合領域の比較により著しいな重複が明らかになり（４４％）、前立腺腫瘍におけるＡＲおよびＥＲＧのゲノムワイドな共占有がインビボで立証された（図６Ａ）。この重複の特異性をさらに検証するために、活性な転写のためのヒストンマークであるＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析を同じ組織において行った。抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体が高品質であること、そしてこの活性ヒストンマークが豊富であることに起因して、３１，８３６個の結合領域が観察された。しかしながら、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マークがゲノム全体の広い範囲に及んでいたにもかかわらず、これらの領域のわずか５．５％および６．５％が、それぞれ、組織のＡＲおよびＥＲＧ結合部位と重複するのみであった（図６Ｂ）。組織のＡＲ結合領域とＥＲＧ結合領域との重複は、それらのＨ３Ｋ４ｍｅ３との重複よりも有意に（カイ二乗検定によるＰ＜０．０００１）多かった。また、ＮＤＲＧ１、Ｃ６ｏｒｆ８１、およびＺＢＴＢ１６を含む、ＡＲおよびＥＲＧが共占有するた遺伝子セットをより詳細に調べることにより、組織のＡＲおよびＥＲＧ結合部位は、ＶＣａＰのＥＲＧ結合部位と重複することが確認された（図６Ｃ）。
【０１７０】
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、野生型ＥＲＧ、およびＡＲを接続するＶＣａＰ細胞内で検出されたフィードバックループを組織において分析した。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析に用いられたのと同じ転移性前立腺癌組織内の個々の遺伝子に対して従来のＣｈＩＰ−ＰＣＲアッセイを実施した。抗ＡＲ抗体または抗ＥＲＧ抗体による標的遺伝子の濃縮を、濃縮を有さない対照ＩｇＧと比較して評価し、ＫＩＡＡ００６６非標的対照遺伝子の３’イントロン領域に正規化した。ＴＭＰＲＳＳ２エンハンサー上でＡＲの強力な結合が確認された（図６Ｄ）。ＣｈＩＰによる有意な（ｔ検定によるＰ＜０．０５）濃縮がＡＲ自身のゲノム領域上で観察された。同様に、ＣｈＩＰ−ＰＣＲ解析により、前立腺腫瘍のＥＲＧおよびＡＲ遺伝子の両方の制御領域上でＥＲＧ結合が確認された（図６Ｅ）。
【０１７１】
転移性前立腺癌におけるＥＲＧ結合遺伝子の潜在的機能を検討するために、ＴＳＳの近くにＥＲＧ結合ピークを含む１，５３４個の遺伝子を選択した。この遺伝子のセットを、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ  ＭＣＭデータベース内の全ての分子概念または遺伝子セットにおける不均衡な濃縮について比較した（Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上記参照）。この分析により、高度に有意な重複（Ｐ＜１．０×１０−１００）との生物学的相関からなる中核的な転写制御回路が明らかになった：これらは、腫瘍におけるＥＲＧ結合およびＡＲ結合、ＶＣａＰ細胞におけるＥＲＧ結合およびＡＲ結合、ならびに安定したＲＷＰＥ＋ＥＲＧ細胞におけるＥＲＧ結合を含む（図６Ｆ）。ＡＲ＋およびＥＲＧ＋組織ならびにＶＣａＰ細胞におけるＡＲ結合部位とＥＲＧ結合部位の重複が高度に有意なものである一方で、ＥＲＧ陰性ＬＮＣａＰ細胞ではそれらの重複の有意性はかなり低かった（Ｐ＜１．０×１０−５０）（表７）。また、組織のＥＲＧ結合遺伝子とＥＴＳモチーフを含む遺伝子との間に著しい重複が観察され、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって同定されたＥＲＧ結合領域におけるＥＴＳモチーフの関連する濃縮を支持するものであった。ＥＲＧ結合遺伝子は、ＥＴＳ＋前立腺癌および転移性前立腺癌において差次的に制御される遺伝子と関連しており、そのうちの最大８０％がＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合を内部に有する。このように、組織におけるＥＲＧ結合遺伝子のＭＣＭ解析により、前立腺癌における発現の脱制御と機能的に関連するＡＲおよびＥＲＧの中核的な転写制御ネットワークが明らかになった。
【０１７２】
ＥＲＧの過剰発現は、アンドロゲンの非存在下でアンドロゲン感受性前立腺癌細胞の腫瘍特性を維持する。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ実験により、インビトロ細胞株およびインビボ組織の両方にゲノム領域におけるＡＲおよびＥＲＧの共占有が示され、そのため、ＡＲおよびＥＲＧタンパク質が、標的ＤＮＡにごく接近して相互作用するかまたは結合する可能性を示している。この相互作用を実験的に裏付けるために、ＶＣａＰ細胞において共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）アッセイを実施した。結果は、ＡＲおよびＥＲＧタンパク質は、タンパク質複合体を形成するために互いと直接的には協調しないことを示した（図７Ａ）。しかしながら、タンパク質−ＤＮＡのクロスリンキングに続くｃｏ−ＩＰ分析により、ＡＲ沈殿物中にＥＲＧタンパク質が検出されたが、対照ＩｇＧプルダウンには検出されず、それらの両方が結合するＤＮＡによって媒介されるＡＲとＥＲＧタンパク質との間接的な相互作用が示された。
【０１７３】
ＡＲおよびＥＲＧによる標的遺伝子の共占有の機能的結果を調査するために、ＥＲＧ過剰発現の影響をアンドロゲン刺激の影響と比較した。仮説は、共有された標的遺伝子のセットを制御することにより、ＥＲＧ過剰発現が何らかのアンドロゲン媒介性の影響を伝え得るというものであった。ホルモンを除去したＶＣａＰ細胞のアンドロゲン処理は、細胞カウントおよびＷＳＴ細胞増殖アッセイによってモニタリングされるように細胞増殖を誘導した（図７Ｂおよび図２２）。ＥＲＧ遺伝子融合産物の過剰発現は、たとえアンドロゲンの非存在下であっても、実質的にＶＣａＰ細胞の増殖を誘導した。同様に、アンドロゲンの使用中止により、予想されたようにアンドロゲン感受性ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の浸潤能力が減衰し、この阻害は、ＥＲＧ過剰発現によって一部補助されている可能性がある（図７Ｃおよび図２３〜２４）。この共有された機能性の根底にある機構を評価するために、アンドロゲンおよび異所性ＥＲＧの過剰発現によって誘導された遺伝子発現の変化について調査した。ＧＳＥＡ（遺伝子セット濃縮解析）による分析により、ＡＲおよびＥＲＧに共通の腫瘍特性を付与する可能性がある、ＡＲおよびＥＲＧ媒介性の遺伝子発現パターンの有意な重複（ｐ＜０．００１）が明らかになった（図７Ｄ）。
【０１７４】
次に、ＡＲ媒介性経路とのクロストークを通して、ＥＲＧが、アンドロゲン非依存性の様式でアンドロゲン感受性細胞の増殖を促進することができるかもしれないという仮説を立てた。この仮説を検証するために、アンドロゲン感受性ＶＣａＰ前立腺癌細胞をＧＵＳ対照レンチウイルスまたはＥＲＧレンチウイルスに感染させた。ＥＲＧ（ＶＣａＰ＋ＥＲＧ）またはＧＵＳ（ＶＣａＰ＋ＧＵＳ）を発現する安定したクローンを選択し、細胞増殖を評価した。ＶＣａＰ＋ＥＲＧ細胞がＶＣａＰ＋ＧＵＳ対照細胞よりも著しく急速に増殖することが観察された：その差は、アンドロゲンの非存在下において特に顕著である（図７Ｅ〜Ｆ）。ＶＣａＰ＋ＥＲＧ細胞は、アンドロゲンの非存在下において連続的に増殖することが可能であったのに対し、ＶＣａＰ＋ＧＵＳ細胞は増殖できなかった。したがって、アンドロゲン非依存性前立腺癌の進行を制御する際に、ＥＲＧが非常に重要な役割を果たしている可能性がある。
【０１７５】
【表１０】
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【０１７６】
【表１１】
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【０１７７】
【表１２】
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【０１７８】
【表１３】
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【０１７９】
【表１４】
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【０１８０】
【表１５】
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【０１８１】
【表１６】
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【０１８２】
【表１７】
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【０１８３】
【表１８】
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【０１８４】
【表１９】
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【０１８５】
【表２０】
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【０１８６】
【表２１】
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【０１８７】
【表２２】
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【０１８８】
【表２３】
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【０１８９】
【表２４】
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【０１９０】
【表２５】
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【０１９１】
【表２６】
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【０１９２】
【表２７】
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【０１９３】
【表２８】
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【０１９４】
【表２９】
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【０１９５】
【表３０】
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【０１９６】
【表３１】
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【０１９７】
〔実施例２〕
ｓｉＲＮＡによる標的化
ＥＲＧまたはＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合を標的化するｓｉＲＮＡを設計した。例示的なオリゴヌクレオチドを表９に示す。
【０１９８】
【表３２】
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【０１９９】
〔実施例３〕
ペプチド阻害剤
標的ＥＴＳファミリータンパク質（予備試験としてＥＲＧタンパク質）と相互作用させるための短鎖ペプチドを同定するために、ファージディスプレイランダムペプチドライブラリーを用いてＥＲＧ結合パートナーを同定した。Ｎ末端のＨｉｓタグ融合タンパク質として全長ＥＲＧタンパク質がバキュロウイルス発現系に発現され、ニッケルビーズ上で細胞ライセートから精製した。溶出したＨｉｓ−ＥＲＧ融合タンパク質で予めコーティングしたイムノチューブ内でファージディスプレイライブラリーをインキュベートした。ＥＲＧタンパク質に特異的に結合するペプチドを選択するために、イムノチューブにコーティングしたＨｉｓ−ＧＵＳタンパク質を用いてファージライブラリーを予め選択した。結合親和性および特異性を高めるために４ラウンドの濃縮を実施した。結合したファージを溶出し、ＥＲＧタンパク質への結合特異性の検証のために、ファージＥＬＩＳＡを用いてコロニーをランダムに選択した（図２７ａ）。
【０２００】
相互作用性ファージコロニーのシーケンシングを行い、生物情報学的アプローチを用いて分析し、コンセンサスペプチド配列を同定した。５７個のファージコロニーのシーケンシング解析によって、コンセンサスモチーフが明らかになった（図２７ｂ）。また、このモチーフを示すファージに濃縮が観察された（第２ラウンドでは２０個中５個、第３ラウンドでは２０個中１６個）。これらの結果は、対象とするタンパク質の相互作用性パートナーを良好に同定するためにファージディスプレイライブラリーを使用することができることを示唆するものである。Ｈａｌｏタグ融合タンパク質として発現されたＥＲＧ欠失変異体のパネルを用いて、単離されたファージクローンの結合を媒介するＥＲＧ内のドメインをマッピングした。合計６つのドメイン、すなわち、Ｎ末端、ＥＴＳ、ＣＡＥ、ＰＮＴ、ＣＤ、およびＣＴＤ（Ｃａｒｒｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８．１６（２５）：  ｐ．３２６１−８）をクローン化し、ＴＮＴ  ＳＰ６コムギ胚芽系に発現させた。精製を行わずに、発現反応物をＨａｌｏＬｉｎｋ  Ａｒｒａｙシステムにコーティングし、個々のファージクローンでインキュベートした。ファージカプシドタンパク質を特異的に標的とするＣｙ３標識抗Ｍ１３抗体によって相互作用シグナルを検出した（図２８）。ペプチドＬＳＦＧＳＬＰをコードする１つのファージクローンは、全長ＥＲＧタンパク質およびＥＴＳドメインに強力に結合したが、他のドメインには結合しなかった。対照的に、挿入断片を有さない空のファージはシグナルを産生せず、標的タンパク質が組換えファージに非特異的には結合しなかったことが示唆された。ＥＴＳドメインの一連の重複する１９個のアミノ酸セグメントを用いたさらなるマッピング試験により、ＥＲＧの残基Ａｒｇ３６７〜Ｌｙｓ３７５に対応する９個のアミノ酸を保存するストレッチＲＡＬＲＹＹＹＤＫに対する結合部位を特異的に局在化した（図２９）。次に、ペプチド結合に特異的に関与するアミノ酸の保存領域を特定した。Ｒ（ＥＲＧ中の残基Ａｒｇ３６７）→Ｋの単一アミノ酸置換により、ファージペプチドの結合が完全に無効となり、Ｒ３６７が、ファージペプチドＬＳＦＧＳＬＰとＥＲＧとの相互作用にとって重要な残基であることが示唆された。また、この局在化によって、ファージペプチドが、必須転写因子の相互作用に関する立体的競合を介してＥＲＧの機能を阻害したことも示された。
【０２０１】
Ｍ１３ファージ上に示されたペプチドが、他のファージ成分とは別個にＥＲＧと相互作用することをさらに確認するために、合成ペプチドを用いて実験を行った。ＥＴＳドメインは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合するために必要であり、かつ十分であることが示されたため、プルダウンアッセイを用いて、合成ペプチドがＥＴＳドメインへの結合に関してＡＲと競合するかどうかを調べた。Ｈａｌｏ−ＥＴＳ融合タンパク質をＨａｌｏＬｉｎｋ磁気ビーズ上に固定化し、種々の濃度の合成ペプチドＬＳＦＧＳＬＰおよび陰性対照としてのランダムペプチドＨＳＫＩＮＰＴの存在下で、大腸菌系に発現された組換えＧＳＴ−ＡＲ融合タンパク質を用いてインキュベートした。ＳＤＳ添加緩衝液によりビーズを溶出し、ＧＳＴ−ＡＲに対して特異的な抗ＧＳＴ  ｍＡｂでブロッティングした（図３０）。ＬＳＦＧＳＬＰを添加すると、ＥＴＳドメインへのＡＲの結合が濃度依存性様式で阻害された。対照的に、ランダムペプチドは、ＡＲのＥＴＳへの結合を阻止しなかった。これらのデータから、ペプチドＬＳＦＧＳＬＰが、ＡＲ結合に関与する部位と重複するかまたは隣接するＥＴＳドメイン上の部位を占有することが示唆された。
【０２０２】
ＥＲＧに結合するペプチドがＥＲＧ媒介性浸潤を阻止する能力を調査するために、ＥＲＧまたはＬＡＣＺアデノウイルスで形質導入した前立腺細胞株ＲＷＰＥ−１をＴＡＴタグ化ペプチドでインキュベートした。４８時間後、２μＭの濃度でペプチドＬＳＦＧＳＬＰを添加することによりＥＲＧによって促進された浸潤が著しく減少されたが、対照細胞と比較すると、ランダムペプチドＨＳＫＩＮＰＴには減少が見られなかった（図３１）。浸潤された細胞の相対数も比色分析アッセイによって定量化した。
【０２０３】
これらの試験は、ファージライブラリーに由来するペプチドがＥＲＧの相互作用経路を特異的に妨げる能力を示している。本発明は、特定の機構に限定されるものではない。実際、機構を理解することは、本発明を実施するために必ずしも必要ではない。それにもかかわらず、ＥＲＧタンパク質中のＥＴＳドメインの結合を防ぐことによって拮抗性ペプチドが機能することが企図され、それは、下流シグナル伝達経路を活性化するために必要なステップである。
【０２０４】
図３７〜４２は、ペプチド阻害剤のさらなる特徴を示す。図３７〜４５は、ペプチド（例えば、ＴＡＴ−ＬＳＦＧＳＬＰ、ＴＡＴ−ＦＴＦＧＴＦＰ、またはＴＡＴ−ＬＰＰＹＬＦＴ）が、ＥＲＧインタラクトームを阻止し（ＥＴＳドメインを介して）、ＥＲＧによって促進された細胞浸潤を減衰させ、ＥＲＧ転写活性を阻止し、細胞増殖を阻害したことを示す。
【０２０５】
〔実施例４〕
ペプチドの同定
ＥＴＳタンパク質の発現および精製  ＥＲＧ、ＥＴＶ１、およびＥＴＶ４等を含むＥＴＳファミリー遺伝子のｃＤＮＡ断片をｐＤＥＳＴ１０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化する。製造者の指示に従って、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムに基づいてバキュロウイルスを構築する。昆虫細胞内でタンパク質を誘導し、ニッケルビーズから精製した。
【０２０６】
ＥＴＳ特異的ファージペプチドの濃縮  Ｍ１３ファージディスプレイランダムペプチドライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を精製ＥＴＳタンパク質を用いた選択および増幅の５回の連続サイクルで濃縮した。非特異的ファージペプチドを除去するために、ランダムペプチドファージライブラリーを予め清浄するための陰性選択として精製ＧＵＳを使用した。
【０２０７】
逆ファージＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを精製ＥＴＳタンパク質でコーティングする。ブロッキング後、選択したファージおよび陰性対照のクローン（空のファージおよびランダムクローン）を添加し、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、結合したファージをＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出する。ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、波長４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定する。
【０２０８】
ペプチドの合成  ペプチドおよびそれらの誘導体を合成し、ＡｎａＳｐｅｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。
【０２０９】
インビトロタンパク質合成およびプルダウンアッセイ。製造者のプロトコルに従ってｃＤＮＡおよび断片をｐＦＮ１９Ａベクターにクローン化する。インビトロ転写タンパク質をコムギ胚芽発現系（Ｐｒｏｍｅｇａ）により生成し、ＨａｌｏＬｉｎｋ磁気ビーズ上に固定化する。洗浄後、ペプチドの存在下または非存在下において、コンジュゲートしたビーズをＧＳＴ−ＡＲ融合タンパク質でインキュベートする。結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、抗ＧＳＴ  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）でブロッティングする。
【０２１０】
表面プラズモン共鳴法。Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してペプチドとＥＴＳタンパク質との相互作用を調査する。昆虫細胞由来の精製ＥＴＳタンパク質を一級アミン残基を介してセンサチップに共有結合させる。共鳴単位における結合を検出するために、ＨＢＳ緩衝液中の幅広い濃度の種々の合成ペプチドを注入する。実行後は毎回グリシンでチップ表面を再生する。非線形回帰分析を用いて、単一部位結合モデルに合う平衡結合定数を決定する。
【０２１１】
モデルおよびペプチド膜貫通効率のモニタリング  ＶＣａＰ細胞および組み込まれたＥＲＧまたはＬＡＣＺウイルスを有するＰｒＥＣまたはＲＷＰＥ細胞でＴＡＴタグ化ペプチドをインキュベートする。ペプチドをＦＩＴＣで標識し、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーのいずれかにより膜貫通効率をモニタリングする。
【０２１２】
細胞増殖、生存率、およびアポトーシスアッセイ  過剰発現シリーズおよび安定ノックダウンシリーズの両方を使用して、標準的な細胞増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイ  （Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５．８１（４）：ｐ．５０５−１２；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０００．９７（４）：  ｐ．１７５４−９；Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２．４１９（６９０７）：  ｐ．６２４−９）を用いてペプチドがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合によって促進される前立腺細胞の増殖を阻害する役割を評価する。
【０２１３】
統計的分析  ＥＴＳ遺伝子融合を過剰発現する細胞株においてペプチドを制御するＥＲＧ結合ペプチドによって誘導される表現型を比較するために、基本の生物統計的アプローチを用いる。
【０２１４】
〔実施例５〕
阻害剤の同定
この実施例は、遺伝子融合の阻害剤をスクリーニングするための方法を説明する。
アンドロゲンシグナル伝達は、前立腺癌における５’および３’遺伝子融合パートナー遺伝子間の近接を誘導する。
【０２１５】
複数の証拠が、前立腺癌におけるＥＴＳ遺伝子融合の形成にアンドロゲンシグナル伝達が関与していることを示唆している。（Ａ）ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＳ遺伝子融合は前立腺癌に限定されており、アンドロゲンシグナル伝達は前立腺癌の特徴的な特色である。（Ｂ）最近の文献は、アンドロゲンシグナル伝達と本質的に同様であるエストロゲンシグナル伝達が、エストロゲン受容体α結合遺伝子のサブセット間で染色体間の相互作用に関与することを示している（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ｌ２００８；１０５：１９１９９−２０４）。
【０２１６】
アンドロゲンシグナル伝達が、５’および３’遺伝子融合パートナー間の近接を誘導する染色体間／染色体内の動きをもたらすかどうかを調査した。（Ｃ）データは、ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）によるＬＮＣａＰ細胞（アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌細胞）の処理が、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧ座位の間に近接を誘導したことを示した（図３２）。ＬＮＣａＰ細胞はＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合を内部に有さないため、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧによる近接誘導実験に有用である。アンドロゲンによって誘導されるＬＮＣａＰ細胞内のこれらの２つの座位の間の近接は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）によって媒介される。アンドロゲンによって誘導されるＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の近接は、ＤＵ１４５細胞（アンドロゲン非感受性前立腺癌細胞株）には観察されない。
アンドロゲンシグナル伝達とＤＮＡ２本鎖の破壊を引き起こす薬剤との組み合わせが、前立腺癌における発癌遺伝子融合の根底にある。
【０２１７】
アンドロゲン刺激をＤＮＡ２本鎖の破壊を引き起こす薬剤と組み合わせることによって、アンドロゲン（例えばＤＨＴ）による刺激が遺伝子融合を形成することができるかどうかを調査した。ＬＮＣａＰ細胞のホルモンを除去した後、ＤＨＴによる刺激（１０ｎＭ、１２時間）、放射線照射（１または３Ｇｙ）、およびフローソーティングを用いた９６ウェルプレート内の単一細胞のクローン性増殖を行った。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合転写物の存在は、キメラ領域に及ぶＳＹＢＲグリーン法およびＴａｑＭａｎアッセイの両方とともに定量的逆転写ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を用いて判定した。１Ｇｙおよび３Ｇｙを放射したクローンの２．３％（１／４３）および２５％（３／１２）が、それぞれＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合転写物を内部に有することが観察された（図３３Ａ、３３Ｂ）。陽性ＬＮＣａＰクローンが、この遺伝子融合を内在的に有するＶＣａＰ細胞と同様のＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧのレベルを発現した。さらに、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧを発現するＬＮＣａＰ細胞が、ＥＲＧ座位で染色体異常を示した（図２Ｃ）。
【０２１８】
前立腺癌におけるＡＲ結合のゲノムランドスケープ
超並列シーケンシング（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）と組み合わせたクロマチン免疫沈降を用いて（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの抗体、０６−６８０番）、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＡＲのゲノムランドスケープを体系的にマッピングした。結果は、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ実験の技術的複製と生物学的複製との間に高い再現性があることを示した。アンドロゲンの非存在下では、基本的ＡＲ結合活性のレベルは非常に低いが、アンドロゲン処理を行うと、ＡＲは約１０倍多くのゲノム領域に結合し、より強い濃縮を示した（図３４Ａ）。以前に報告されたＡＲ標的遺伝子が多数同定された。例えば、予想された通りに、ＰＳＡ遺伝子の十分に定義されたエンハンサーにＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって鋭いＡＲ結合ピークが検出され、ＰＳＡプロモーターに小さな第２のピークが見られた（図３４Ｂ）。総合すると、これらの結果は、ＡＲ結合部位の同定におけるＣｈＩＰ−Ｓｅｑアッセイの正確性を立証するものである。ＶＣａＰ細胞のＡＲ結合部位の約６１％がＬＮＣａＰのＡＲ結合部位と物理的に重複しており、共有されたおよび細胞型特異的なＡＲのリクルートメントを示唆している。
【０２１９】
次に、ＡＲ結合部位におけるコンセンサス配列モチーフの存在を調べた。それらが完全な基準ＡＲＥを含むか、または半ＡＲＥを含むか、またはＡＲＥモチーフを含まないかに基づいて全てのＡＲ結合部位を分類することにより、完全なＡＲＥモチーフを含む結合部位は、いずれのＡＲＥモチーフも有さないもの結合部位も高いピークを有していた半ＡＲＥモチーフを有する結合部位と比べて、有意に（ｔ検定によるｐ＜０．００１）高度な濃縮ピークを有していたことが明らかになり、ＡＲＥがＡＲをリクルートする役割を支持していた。ＡＲ結合遺伝子の機能的分類法を得るために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースの何千という予め定義された分子概念／遺伝子セットにおいて、ＡＲ結合遺伝子の濃縮に関するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  Ｍａｐ（ＭＣＭ）解析を行った。約２０，０００個の分子概念のうち、合計１４６２個（約７％）が有意な（Ｐ＜０．００１）濃縮を示した。当然ながら、ＶＣａＰ細胞内のＡＲ結合遺伝子は、ＬＮＣａＰ細胞内のＡＲ結合遺伝子と有意に重複しており（Ｐ＜１．０×１０−１００）、それらは両方ともインビトロまたはインビボでアンドロゲンによって制御される遺伝子と関連していた（Ｐ＜１．０×１０−１０）。
【０２２０】
染色体の相互作用を媒介する際のアンドロゲンシグナル伝達の役割
ＣｈＩＡ−ＰＥＴは、対象とする転写因子によって媒介される大域的クロマチン相互作用の新規検出のための方法である。図３５は、ＣｈＩＡ−ＰＥＴのストラテジーを説明している。このストラテジーを除去条件およびアンドロゲン刺激条件下でＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞に適用する。ホルムアルデヒドでクロスリンクすることにより、大範囲にわたるクロマチン相互作用を捕獲する。ＡＲに対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０６−６８０番）を用いたＣｈＩＰにより、超音波分解したＤＮＡ−ＡＲ複合体を濃縮する。クロマチン複合体の各々における連結したＤＮＡ断片を近接ライゲーションによりＤＮＡリンカーと接続させ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩを用いたシーケンシングのためにペアエンドタグ（ＰＥＴ）を抽出する。得られたＣｈＩＡ−ＰＥＴ配列を参照ゲノムにマッピングして、ＡＲによって共に空間的に接近させられた遠隔クロマチン領域間の関係を明らかにする。ＣｈＩＡ−ＰＥＴ、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ、および遺伝子発現データセットを比較することによって同定された陽性相互作用を、ＱＲＴＰＣＲ（定量的逆転写ＰＣＲ）によりさらに検証する。
【０２２１】
ＤＮＡ損傷および遺伝子融合を検出することができる細胞デバイス
ＤＮＡ損傷および遺伝子融合を感知することができる細胞デバイスを開発する。容易に同定可能な表現型またはタグを表示することによってＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合の形成を明らかにするようにＬＮＣａＰ細胞を遺伝子操作する。例えば、いくつかの実施形態において、ＥＲＧ遺伝子の一部がルシフェラーゼカセットで置換される（図３６）。ＬＮＣａＰ細胞はＥＲＧ発現を有さないので、遺伝子操作された細胞は、ルシフェラーゼ活性をごく僅かに示すかまたは全く示さない。ＴＭＰＳＳ２−ＥＲＧは、これまでに同定されている最も頻繁に見られる遺伝子融合であり、高レベルのＥＲＧ活性をもたらす。染色体転座の形成を引き起こすいずれの処理も、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合の形成によって明らかにされるように、容易に検出可能なルシフェラーゼ活性をもたらす。細胞デバイスのための代替の設計は、スプリットルシフェラーゼ系を用いることを伴う。例えば、いくつかの実施形態において、それらがＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合と最も一般的に関連するエクソンであるため、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１が５’ルシフェラーゼカセットで置換され、ＥＲＧのエクソン４が３’ルシフェラーゼカセットで置換される。重要なのは、スプリットルシフェラーゼ系がアッセイに固有のノイズを減少させるということである。
【０２２２】
遺伝子操作したジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、哺乳動物の細胞におけるゲノム編集のための最適な方法としてますます採択されている（Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ｌ２００８；１０５：５８０９−１４）。この方法は、ＬＮＣａＰ細胞を遺伝子操作するために用いられる。この技術は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに融合されたカスタム設計の異種ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン（指定された標的配列に特異的に結合する）を用いる。そのＤＮＡ結合依存性エンドヌクレアーゼ活性には、このＦｏｋＩドメインの二量化が必要である。したがって、２つの個別のＺＦＮは、二量化およびその後のＤＮＡ切断を促進するために、正確な配列特異性、空間、および配向で標的ＤＮＡストレッチに結合するための対として設計される。細胞内で一時的に発現されると、ＺＦＮは、相同性アームによって隣接されるルシフェラーゼカセットとドナープラスミドを共トランスフェクションすることにより、相同的組換えを介して後に編集することができる内因性標的遺伝子において部位特異的ＤＳＢを生成する。アンドロゲンによる刺激および異なる線量の放射線の投与によって、遺伝子操作したルシフェラーゼＬＮＣａＰおよびスプリットルシフェラーゼＬＮＣａＰ細胞がＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合を検出する能力を検査する。
【０２２３】
遺伝子融合／染色体転座を促進または防止する化合物を同定するための低分子化合物ライブラリーのスクリーニング
上述の遺伝子操作したＬＮＣａＰ細胞を用いて低分子化合物ライブラリーをスクリーニングする。Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにあるハイスループットケミカルライブラリースクリーニング設備を利用する。最初に、２０００個の小分子および天然産物のパイロットスクリーニングを実行し、その結果に基づいて、３０，０００個の化合物からなるより大規模な摘要をスクリーニングする。化合物添加の１８時間前に細胞をトリプシン処理し、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ機器を用いて培地６０μｌ中の３８４ウェルプレートに分配する。ゼロ時に、化合物を１．５ｍＭのＤＭＳＯ原液から約５μＭの最終濃度で細胞プレートに移す。４８時間後、５０μｌの培地および１０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することにより発現されたルシフェラーゼ活性を測定する。Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で試料プレートを読み取る。スクリーニングにおいて各プレートは、検査される３２０個の化合物と、プレートの各側の外側２カラムに配置された６４個の対照ウェルとを含む。「陽性」対照は、遺伝毒性ストレスを引き起こし、エトポシドおよびドキソルビシン等の転座を誘導する薬剤である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９  １３９：１０６９）。
【０２２４】
上述の明細書に記載したすべての刊行物、特許、特許出願、およびアクセッション番号は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態と関連させて本発明を記載してきたが、請求されるような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明に記載される組成物および方法の種々の変形例および変更例は、当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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