(57)【要約】アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とを酵素によって３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸に変換することを含む、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とから３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（あるいはベータ−ヒドロキシイソバレレートまたはＨＩＶとも称される）を製造する方法を説明する。上記変換は、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を利用する。好ましくは、本方法で用いられる酵素は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼの活性を有する酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、および／または、ＰｋｓＧタンパク質、および／または、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）のようなＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素である。また、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とから３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産することができる生物、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための上述した酵素および生物の使用、加えて３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するためのアセトンの使用も説明される。【選択図】図５
2013504312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、式（Ｉ）：
【化１】
2013504312.tif 000011
［式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−ポリペプチド（アシルキャリアータンパク質）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＯＨ（パンテテイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３（Ｎ−アセチル−システアミン）、Ｓ−ＣＨ３（メタンチオール）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（システイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（ホモシステイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ−Ｃ５Ｈ８ＮＯ３）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（グルタチオン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ（補酵素Ｍ）、および、ＯＨ（酢酸）からなる群より選択される］
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を用いた、アセトンと、式（Ｉ）で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物との酵素による変換を含む３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の製造方法。
【請求項２】
Ｘが補酵素Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｘがアシルキャリアータンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素であるか、または、前記酵素が、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）の活性を有する酵素であるか、または、前記酵素が、ＰｋｓＧタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記変換が、アセトンを生産して請求項１に記載の酵素を発現することができる生物の存在下で認識されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）アセトンを生産できる特性；および、
（ｂ）アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、式（１）で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を発現する特性；
を特徴とする組換え生物。
【請求項７】
前記酵素が、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の酵素活性、および／または、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）、および／または、ＰｋｓＧタンパク質のようなＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの酵素活性を有する酵素である、請求項６に記載の生物。
【請求項８】
前記生物が、もともとアセトンを生産する能力を有する生物であり、好ましくはクロストリジウム属、バチルス属、または、シュードモナス属に属する微生物、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）種、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）種、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）種、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）種、または、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）種に属する微生物である、請求項６または７に記載の生物。
【請求項９】
前記生物が、本来アセトンを生産しないが、（ａ）生物中でアセトン生産を可能にするのに必要な遺伝子を導入することによってアセトンを生産できるように遺伝子組換えされている生物から誘導される、請求項６または７に記載の生物。
【請求項１０】
前記生物が、光合成することができる生物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための請求項７〜１０のいずれか一項に記載の生物の使用。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の生物を含む組成物。
【請求項１３】
（i）アセトン；および、
（ii）式（Ｉ）；
【化２】
2013504312.tif 000012
［式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−ポリペプチド（アシルキャリアータンパク質）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＯＨ（パンテテイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３（Ｎ−アセチル−システアミン）、Ｓ−ＣＨ３（メタンチオール）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（システイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（ホモシステイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ−Ｃ５Ｈ８ＮＯ３）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（グルタチオン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ（補酵素Ｍ）、および、ＯＨ（酢酸）からなる群より選択される］
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物；および、
（iii）アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、式（Ｉ）で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素、
を含む組成物。
【請求項１４】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための請求項１に記載の酵素の使用。
【請求項１５】
アセトンと、以下の式（Ｉ）：
【化３】
2013504312.tif 000013
［式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−ポリペプチド（アシルキャリアータンパク質）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＯＨ（パンテテイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３（Ｎ−アセチル−システアミン）、Ｓ−ＣＨ３（メタンチオール）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（システイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（ホモシステイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ−Ｃ５Ｈ８ＮＯ３）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（グルタチオン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ（補酵素Ｍ）、および、ＯＨ（酢酸）からなる群より選択される］
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物との酵素による変換を含む、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するためのアセトンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とを酵素によって３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸に変換することを含む、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とから３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（あるいはベータ−ヒドロキシイソバレレートまたはＨＩＶとも称される）を製造する方法に関する。上記変換は、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を利用するものである。好ましくは、本方法で用いられる酵素は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素、および／または、ＰｋｓＧタンパク質、および／または、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）のようなＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素である。本発明はまた、アセトン、および、活性化されたアセチル基を提供する化合物から３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産することができる生物、および、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための上記酵素および生物の使用にも関する。最後に、本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するためのアセトンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（あるいはベータ−ヒドロキシイソバレレートまたはＨＩＶとも称される；図１を参照）は、必須アミノ酸であるロイシンの代謝産物であり、ヒトの体内で合成される。これはグレープフルーツ、アルファルファおよびナマズで少量見出すことができる。これはまた、ある種のロイシン代謝の代謝性疾患、すなわち高吉草酸血症（hypovaleric acidemia）で生じることも知られている。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸は、筋肉の量と強度の増加に対して作用を有する可能性があることが示されている（Nissen et al., J. Appl.Physiol. 81 (1996), 2095-2104）。Wilsonらは、は、作用機序として以下を提唱している（Nutrition & Metabolism 5 (2008)）。
−ＨＭＧＣｏＡ還元酵素での変換による筋細胞膜に傷がない状態の増強
−ｍＴＯＲ経路を介したタンパク質合成の強化
−ユビキチン経路の阻害を介したタンパク質分解の抑制
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸は、筋肉がタンパク質の破壊と闘い、筋肉の修復を助け高い耐久性を維持するように作用するものと仮定されている。これまでに、病院の集中治療室内にいる慢性閉塞性肺疾患を有する患者、ＨＩＶおよび癌に伴う筋肉の衰弱、および、外傷を受けた重傷被害者の役に立つことが説明されている。従ってこれは、ボディービルのための筋肉増強剤として、および、筋肉の衰弱を回避するための医薬品としての用途のために商業的に注目されている。米国特許第７０２６５０７号は、固形状のナトリウム３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の製造方法を説明しており、その方法において、第一の処理工程で、４，４−ジメチルオキセタン−２−オンを水酸化ナトリウム水溶液と反応させ、ナトリウム３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の溶液を形成し、続いて適切な場合に濃縮した後、この溶液を次の処理工程で合成シリカに適用するが、ここで得られた生成物を適切な場合に乾燥させる。
【０００３】
無機生成工程を含まず、生物中で実行することができるために環境に優しく廉価な３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の製造方法を提供することが望ましいと思われる。これに関連して、Lee et al., Appl. Environ. Microbiol.63 (1997), 4191-4195には、微生物のガラクトマイセス・リーシー（Galactomyces reessii）を用いて３−メチル酪酸を３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸に変換することによる３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の製造方法が記載されている。しかしながら、この方法で３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産できるが、それでもなお、代替の効率的で費用効率が高い、特に生物学的プロセスを用いた３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産する方法を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nissen et al., J. Appl.Physiol. 81 (1996), 2095-2104
【非特許文献２】Wilson et al., Nutrition & Metabolism 5 (2008)
【非特許文献３】Lee et al., Appl. Environ. Microbiol.63 (1997), 4191-4195
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、このような３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産する代替法に対する要求を満たすものであり、さらに生物資源に基づく方法を提供し、微生物やその他の種でインビトロまたはインビボでの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産することを可能にするものである。
【０００６】
具体的には、本発明は、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とを酵素によって３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸に変換することを含む、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物とから３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（あるいはベータ−ヒドロキシイソバレレートまたはＨＩＶとも称される）を製造する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（また、ベータ−ヒドロキシイソバレレートとも称される）の化学構造である。
【図２】図２は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼによって触媒される反応の反応スキームである。
【図３】図３は、ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼによって触媒される反応の反応スキームである。
【図４】図４は、ＰｋｓＧタンパク質によって触媒される反応を含むｐｋｓＸ経路反応の反応スキームである。
【図５】図５は、アセトンと活性化されたアセチル基を含む化合物との３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸への変換反応の反応スキームである。
【図６】図６は、市販の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩のマススペクトルである。
【図７】図７は、ニワトリ（Gallus gallus）（Ｐ２３２２８）由来のＨＭＧＣｏＡシンターゼの存在下におけ。アセチル−ＣｏＡおよびアセトンからの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の形成のマススペクトルである。
【図８】図８は、酵素を用いないコントロール分析のマススペクトルである。
【図９】図９は、実施例７におけるスタフィロコッカス・エピデルミディス（S. epidermidis）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの反応に関するミカエリス−メンテンプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
アセトンは、以下の式；ＣＨ３−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３示される。好ましい実施態様において、活性化されたアセチル基を提供する化合物は、以下の式（Ｉ）で示されることを特徴とする：
【０００９】
【化１】
2013504312.tif 000003
【００１０】
式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−ポリペプチド（アシルキャリアータンパク質）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＯＨ（パンテテイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３（Ｎ−アセチル−システアミン）、Ｓ−ＣＨ３（メタンチオール）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（システイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（ホモシステイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ−Ｃ５Ｈ８ＮＯ３）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（グルタチオン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ（補酵素Ｍ）、および、ＯＨ（酢酸）からなる群より選択される。
【００１１】
この変換は、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、式（Ｉ）に従って活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を利用する。この反応スキームによれば、アセトンのオキソ基は、求電子剤として反応し、式（Ｉ）に従って活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基は、求核剤として反応する。図５に、アセトンと式（Ｉ）に従って活性化されたアセチル基を提供する化合物とを変換する一般的な反応を示す。
【００１２】
この反応は、一つの工程で起こすことができ、すなわち３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を、上記で説明した酵素で触媒された反応の直接的な生成物とすることが可能である。あるいは、この反応は、特に活性化されたアセチル基を提供する化合物としてアセチルＣｏＡが用いられるケースにおいて、まず３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩と活性化されたアセチル基を提供する化合物との付加物、例えば３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを生産し、その後これを例えば３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩とＣｏＡとに加水分解するという意味で、二工程で構成することもできる。従って、第一の代替法において、上記酵素は、図５で示されるように完全な反応を触媒する。第二の代替物において、上記酵素は、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒するが、Ｘは分子中に保持されたままである。続いてＸはこの分子から加水分解によって除去される。
【００１３】
本発明は、初めて、活性化されたアセチル基をアセトンに移動させることができる酵素を利用することによって３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産することが可能であることをを示すものである。従来技術でも、真菌のガラクトマイセス・リーシー（Galactomyces reessii）を用いた生物変換反応を介したイソ吉草酸からの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の生産が報告されている。しかしながら、イソ吉草酸は脱炭酸反応を介してロイシンから得られること、加えてロイシンそれ自身が代謝において２分子のピルビン酸塩と１分子のアセチルＣｏＡとの総体的な縮合で生成することを考慮すると、この製造法はエネルギー的に都合の悪い。本発明の方法はこの不利点を回避するものである。
【００１４】
一般的に、本発明の環境において、基質の一種として上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物、加えて構成要素としてアセトン基を含む基質を受容するあらゆる酵素を使用することができる。１つの好ましい実施態様において、このような酵素は、基質としてアセチルＣｏＡを受容する酵素である。このような酵素の例は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧＣｏＡリアーゼ、または、その他のＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼである。しかしながら、以下で説明するように、本来アセチルＣｏＡとは異なるアセチル供与体を実際に触媒する反応で一般的に用いられる酵素も、アセチルＣｏＡまたはそれらの類似体、例えばＰｋｓＧタンパク質を使用することが可能である。
【００１５】
その他の好ましい実施態様において、このような酵素は、基質として式（Ｉ）に従って活性化されたアセチル基を提供する化合物（式中Ｘは、アシルキャリアータンパク質である）を受容する酵素であり、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）においてバシラエン（bacillaene）を生産するためのｐｋｓＸ遺伝子クラスターによってコードされたアセチル−Ｓ−ＡｃｐＫタンパク質である。このような酵素の例は、ＰｋｓＧタンパク質である。ＰｋｓＧタンパク質は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のｐｋｓＸ遺伝子クラスターによってコードされたタンパク質の一種である。ＰｋｓＧタンパク質は、アセチル−Ｓ−ＡｃｐＫから、ＰｋｓＬタンパク質のチオール化ドメインの１つに連結したβ−ケトチオエステルポリケチド中間体へのカルボキシメチル基−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈの移動を、ＨＭＧＣｏＡシンターゼによって触媒される反応に類似した反応で触媒することができる。しかしながら、本発明の環境において、ＰｋｓＧタンパク質は、活性化されたアセチル基の供与体としてアセチル−Ｓ−ＡｃｐＫタンパク質の代わりにアセチルＣｏＡも利用できることが示された。
【００１６】
一つの好ましい実施態様において、活性化されたアセチル基を提供する化合物は、アセチルＣｏＡである。化学構造におけるアセチルＣｏＡ（また、アセチル補酵素Ａとして知られている）は、補酵素Ａ（チオール）と酢酸との間のチオエステルである。
【００１７】
その他の好ましい実施態様において、活性化されたアセチル基を提供する化合物は、式（Ｉ）で示され（式中Ｘは、アシルキャリアータンパク質である）、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)においてバシラエンを生産するためのｐｋｓＸ遺伝子クラスターによってコードされたアセチル−Ｓ−ＡｃｐＫタンパク質である。
【００１８】
好ましくは、本方法で用いられる酵素は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼの活性を有する酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、および／または、ＰｋｓＧタンパク質、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）である。一つの好ましい実施態様において、本発明に係る方法は、式（Ｉ）に従って、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子とアセチルＣｏＡの炭素原子Ｃ２との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を用いた、酵素によるアセトンとアセチルＣｏＡとの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩への変換を含む。
【００１９】
好ましい実施態様において、本発明に係るプロセスで用いられる酵素は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素、または、ＰｋｓＧタンパク質の活性を有する酵素、または、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）のようなＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素である。
【００２０】
具体的に言えば、本発明の環境において、ＨＭＧＣｏＡシンターゼは、その通常の基質アセトアセチル−ＣｏＡの代わりにアセトンを受容することによって、アセチル−ＣｏＡ（または式（Ｉ）で示される化合物）およびアセトンを３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩に変換できることが示された。
【００２１】
さらに、本発明の環境において、ＰｋｓＧタンパク質は、基質としてＡｃ−Ｓ−ＡｃｐＫタンパク質の代わりにアセチルＣｏＡを使用できること、加えて、一般的にはＨＭＧＣｏＡシンターゼによって触媒される反応を触媒できることが示された。従って、ＨＭＧＣｏＡシンターゼの反応に類似した反応を触媒するＰｋｓＧタンパク質は、アセトンと式（Ｉ）で示される化合物との３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩への変換を触媒することができると予想されることも考えられる。さらに、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼは、アセチル−ＣｏＡおよびアセトンの３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒することができ、続いて３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩およびＣｏＡに加水分解できることも考えられる。
【００２２】
本願に関して、用語「ＨＭＧＣｏＡシンターゼ」または「ＨＭＧＣｏＡシンターゼの活性を有するタンパク質／酵素」は、ＥＣ番号ＥＣ２．３．３．１０（以前は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼはＥＣ４．１．３．５として分類されていたが、ＥＣ２．３．３．１０に移されている）に分類されるあらゆる酵素を意味し、具体的には、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡとを縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する反応（図２を参照）を触媒することができるあらゆる酵素を意味し、さらにこの用語はまた、このようなＨＭＧＣｏＡシンターゼから誘導され、アセトンと、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物、好ましくはアセチルＣｏＡとの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩への変換を触媒することができるあらゆる酵素も意味する。
【００２３】
アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡとを縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する酵素の活性は、当業界公知の方法によって測定することができる。一つの可能性のある好ましく使用される分析は、例えばClinkenbeard et al.(J. Biol. Chem. 250 (1975), 3108-3116)で説明されている。この分析において、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性は、アセトアセチル−ＣｏＡのエノラートの形態のアセチル−ＣｏＡ依存性の消失に付随する３０３ｎｍにおける吸光度の減少をモニターすることによって測定される。好ましくは、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ活性は、実施例３で説明されているようにして分析される。
【００２４】
ＨＭＧＣｏＡシンターゼは、メバロン酸経路の一部である。イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の合成、すなわちメバロン酸経路、および、グリセルアルデヒド−３−リン酸−ピルビン酸経路に関して、２つの経路が同定されている。ＨＭＧＣｏＡシンターゼは、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡとの生物学的なクライゼン縮合を触媒するものであり、これは、ベータ−ケトチオラーゼ、脂肪酸シンターゼ（ベータ−ケトアシルキャリアータンパク質シンターゼ）、および、ポリケチドシンターゼなどを含む、アシル縮合酵素のスーパーファミリーの一員である。
【００２５】
ＨＭＧＣｏＡシンターゼは、様々な生物に関して説明されている。また、様々な源に由来するＨＭＧＣｏＡシンターゼをコードするアミノ酸および核酸配列も利用可能である。一般的に、このような配列は、全体の配列とわずかしか同一性を有さない。例えば、ブドウ球菌属（Staphylococcus）または連鎖球菌属（Streptococcus）由来の酵素は、ヒトおよび鳥類のＨＭＧＣｏＡシンターゼとわずか約２０％の同一性しか示さない。いくつかの源において、細菌のＨＭＧＣｏＡシンターゼおよび動物においてそれらに相当するものは、全体の配列のわずかの約１０％同一性しか示さないことが報告されている（Sutherlin et al., J. Bacteriol. 184 (2002), 4065-4070)。しかしながら、細菌および真核生物のＨＭＧＣｏＡシンターゼ間では、アセチル化および縮合反応に関与するアミノ酸残基は保存されている（Campobasso et al., J. Biol. Chem, 279 (2004), 44883-44888）。３種のＨＭＧＣｏＡシンターゼ酵素の三次元構造が決定されており、酵素反応重要なアミノ酸がおおむねよく特徴付けられている（上記で引用したCampobasso et al.; Chun et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 17946-17953; Nagegowda et al., Biochem, J. 383 (2004), 517-527; Hegardt, Biochem. J, 338 (1999), 569-582）。真核生物において、ＨＭＧＣｏＡシンターゼの２種の形態が存在し、すなわち細胞質中の形態とミトコンドリア中の形態とが存在する。細胞質中の形態は、コレステロールおよびその他のイソプレノイドの生産において主要な役割を果たし、一方ミトコンドリア中の形態は、ケトン体の生産に関与する。
【００２６】
本発明の環境において、原理的に、あらゆるＨＭＧＣｏＡシンターゼ酵素が使用でき、特に原核性生物原、または、真核性の生物原由来のＨＭＧＣｏＡシンターゼ酵素が使用できる。
【００２７】
原核生物のＨＭＧＣｏＡシンターゼとしては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（上記で引用したCampobasso et al.；ユニプロット（Uniprot）受託番号Ｑ９ＦＤ８７）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）（ユニプロット受託番号Ｑ９ＦＤ７６）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Staphylococcus haemolyticus）（ユニプロット受託番号Ｑ９ＦＤ８２）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）（上記で引用したSutherlin et al.；ユニプロット受託番号Ｑ９ＦＤ７）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）（ユニプロット受託番号Ｑ９ＦＤ６６）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumonia）（ユニプロット受託番号Ｑ９ＦＤ５６）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（ユニプロット受託番号Ｑ９ＦＤ６１）、および、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（受託番号ＡＥ０００８５７）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）（ＮＣＢＩ受託番号ＢＢ０６８３）由来のものが挙げられる。
【００２８】
さらに、以下の表Ａに原核生物由来の既知のＨＭＧＣｏＡシンターゼのうち数種を列挙した：
【００２９】
【表１−１】
2013504312.tif 000004
【００３０】
【表１−２】
2013504312.tif 000005
【００３１】
真核生物のＨＭＧＣｏＡシンターゼとして、例えば、菌類、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（受託番号Ｕ３２１８７およびＰ５４８７４）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）（受託番号Ｐ５４８３９）、植物、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（受託番号Ｘ８３８８２、および、Ｐ５４８７３）、オウシュウアカマツ（Pinus sylvestris）（受託番号Ｘ９６３８６）、および、動物、例えばカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）（受託番号Ｐ５４８７１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ミトコンドリア中の形態：受託番号Ｐ５４８６９、および、Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（ミトコンドリア中の形態：受託番号Ｐ２２７９１、および、Hegardt, Biochem. J. 338 (1999)；細胞質由来：受託番号Ｐ１７４２５），５６９−５８２）、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus：受託番号Ｐ１３７０４）、イノシシ（Sus scrofa）（ミトコンドリア中の形態：受託番号Ｕ９０８８４、および、Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ミトコンドリア中の形態：受託番号Ｐ５４８６８、および、Hegardt Biochem. J. 338 (1999), 569-582；細胞質中の形態：受託番号Ｑ０１５８１）、チャバネゴキブリ（Blattella germanica）（細胞質中の形態１；受託番号Ｐ５４９６１）、チャバネゴキブリ（Blattella germanica）（細胞質中の形態２；受託番号Ｐ５４８７０）、および、ニワトリ（Gallus gallus）（細胞質中の形態；受託番号Ｐ２３２２８）由来のＨＭＧＣｏＡシンターゼが挙げられる。
【００３２】
配列番号１〜１４に様々な生物由来のＨＭＧＣｏＡシンターゼの例を示す。配列番号１は、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）（Ｐ５４８７１，遺伝子バンクＦ２５Ｂ４．６）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号２は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母；Ｐ５４８７４）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号３は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン屋で用いる酵母；Ｐ５４８３９，遺伝子バンクＣＡＡ６５４３７．１）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号４は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（シロイヌナズナ（Mouse-ear cress）；Ｐ５４８７３）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号５は、細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）（変形菌類；Ｐ５４８７２，遺伝子バンクＬ２１１４）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号６はチャバネゴキブリ（Blattella germanica）（ドイツのゴキブリ；Ｐ５４９６１，遺伝子バンクＸ７３６７９）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号７は、ニワトリ（Gallus galius）（ニワトリ；Ｐ２３２２８，遺伝子バンクＣＨＫＨＭＧＣＯＡＳ）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号８は、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト；Ｑ０１５８１，遺伝子バンクＸ６６４３５）の細胞質内のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号９は、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト；Ｐ５４８６８，遺伝子バンクＸ８３６１８）のミトコンドリアＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１０は、細胞性粘菌（変形菌類；Ｑ８６ＨＬ５，遺伝子バンクＸＭ＿６３８９８４）のミトコンドリアＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１１は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）（Ｑ９ＦＤ７６）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１２は、発酵乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum）（Ｂ２ＧＢＬ１）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１３は、ハイパーサーマス・ブチリカス（Hyperthermus butylicus）（Ａ２ＢＭＹ８）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１４は、クロロフレクサス・アグレガンス（Chloroflexus aggregans）（Ｂ８Ｇ７９５）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号２４は、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）（Ｑ１ＧＡＨ５）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示し、および、配列番号２５は、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Staphylococcus haemolyticus）Ｑ４Ｌ９５８のＨＭＧＣｏＡシンターゼの配列を示す（Ｉ９８＞野生型タンパク質と比較した差Ｖ）。
【００３３】
好ましい本発明の実施態様において、ＨＭＧＣｏＡシンターゼは、配列番号１〜１４、または、配列番号１〜１４のいずれか一種と少なくともｎ％同一な配列（ここでｎは、１０〜１００の整数であり、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または、９９である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、さらにＨＭＧＣｏＡシンターゼの活性を有する酵素である。
【００３４】
好ましくは、同一性の程度は、それぞれの配列を上述した配列番号のいずれか一つのアミノ酸配列と比較することによって決定される。比較される配列が同じ長さではない場合、同一性の程度は、好ましくは、短いほうの配列における、長いほうの配列におけるアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージ、または、長いほうの配列における、短いほうの配列におけるアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージのいずれかを意味する。配列同一性の程度は、当業界公知の方法に従って、好ましくはクラスタル（ＣＬＵＳＴＡＬ）のような適切なコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００３５】
クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）解析法を用いて特定の配列が例えば参考配列と８０％同一かどうかを決定する場合、デフォルト設定を使用してもよいし、または、好ましくは以下のように設定される：マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティー；１０．０；伸張ギャップペナルティー；０．０５；ディレイ・ダイバージェント（Delay divergent）：４０；ギャップ分離距離：アミノ酸配列比較の場合は８。ヌクレオチド配列比較の場合、伸張ギャップペナルティーは、好ましくは５．０に設定される。
【００３６】
好ましくは、同一性の程度は、配列の長さ全体にわたり計算される。
本発明に係るプロセスで用いられるＨＭＧＣｏＡシンターゼは、天然に存在するＨＭＧＣｏＡシンターゼでもよいし、または、天然に存在するＨＭＧＣｏＡシンターゼから誘導されるＨＭＧＣｏＡシンターゼであってもよく、このような誘導は、例えば突然変異導入によってなされるものでもよいし、または、例えば酵素活性、安定性などを改変または改善するその他の改変によってなされるものでもよい。
【００３７】
本願に関して、用語「ＨＭＧＣｏＡシンターゼ」または「ＨＭＧＣｏＡシンターゼの活性を有するタンパク質／酵素」はまた、ＨＭＧＣｏＡシンターゼから誘導されたものであり、アセトンと、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物、好ましくはアセチル−ＣｏＡとの酵素による変換によって３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産することができるが、基質としてアセトアセチル−ＣｏＡに低い親和性しか有さないか、または、基質としてアセトアセチル−ＣｏＡを受容しない酵素も包含する。このようなＨＭＧＣｏＡシンターゼの好ましい基質の改変は、アセトンの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩への変換を改善し、例えばＨＭＧ−ＣｏＡのような副産物生成を減少させることができる。タンパク質の望ましい酵素活性を改変および／または改善する方法は当業者にはよく知られており、例えば、ランダム変異誘発、または、部位特異的変異誘発、およびそれに続く望ましい特性を有する酵素の選択、または、いわゆる「定向進化」法が挙げられる。
【００３８】
例えば原核細胞における遺伝子工学で、ＨＭＧＣｏＡシンターゼをコードする核酸分子を、ＤＮＡ配列の組換えにより変異誘発または配列の改変を許容するプラスミドに導入することができる。
【００３９】
標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHプレス(CSH Press), コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor), 米国ニューヨーク州を参照）では、塩基を変換させたり、または、天然または合成配列を付加したりすることができる。ＤＮＡフラグメントは、フラグメントにアダプターおよびリンカーを適用することによって互いに連結させることができる。さらに、適切な制限部位を提供したり、または、余分なＤＮＡまたは制限部位を除去したりする工学的手段を用いてもよい。挿入、欠失または置換が可能なケースにおいては、インビトロでの変異誘発、「プライマー修復」、制限またはライゲーションを用いてもよい。一般的に、解析方法として、配列解析、制限分析およびその他の生化学および分子生物学的な方法が行われる。続いて、その結果得られたＨＭＧＣｏＡシンターゼ変異体を、それらの酵素活性に関して、および、具体的には基質としてアセトアセチルＣｏＡではなくアセトンを選択するそれらの能力に関して試験する。実施例５において、ＨＭＧＣｏＡシンターゼの基質としてアセトンを利用する能力を測定するための分析を説明する。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の形成は、例えばそれらを誘導体化した後に薄層クロマトグラフィー、ＬＣ／ＭＳおよび比色分析によって、または、マススペクトロメトリーによって分離した後に標準化合物と比較することによって、検出が可能である。
【００４０】
具体的に言えば、反応は、４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、５〜５０ｍＭのアセチル−ＣｏＡ、１００〜５００ｍＭのアセトン、１ＭｇＣｌ２（ただしミトコンドリアＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを除く）、０．５ｍＭのＤＴＴ、および、０．２〜８ｍｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度の酵素を含む反応混合物中で行われる。コントロール反応は、酵素およびいずれかの基質の非存在下で行われる。
【００４１】
合成を進行させ、それに続いて３０または３７℃でのインキュベート期間を延長した後に採取されたアリコートを解析する。典型的には、４８時間インキュベートした後に５０μｌのアリコートを取り、タンパク質を除去するために１００℃で１分間加熱し、遠心分離し、上清をマススペクトロメトリーによるＨＩＶ検出のために清潔なバイアルに移す。４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ中で３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の溶液を調製し、上述のようにして加熱して、これを参照としてとして用いる。
【００４２】
サンプルの解析は、ＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ２０００トリプル四重極型質量分析計で、陰イオンモードで、移動相として０．１％トリエチルアミンを含むＨ２Ｏ／アセトニトリル（６０／４０）を用いて行われ、流速は４０μｌ／分とする。１０μｌの各上清を等量の移動相と混合し、マススペクトロメーターに直接注入する。［３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩−Ｈ］−イオンの存在をモニターする。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の合成はまた、放射標識した［２−１４Ｃ］アセトンの存在下で行ってもよい。ＴＬＣまたはＨＰＬＣで反応混合物を分離した後、生成物の形成を解析する。
【００４３】
好ましい実施態様において、本発明で用いられるＨＭＧＣｏＡシンターゼは、アセトンに関して３００ｍＭまたはそれより低い、好ましくは２５０ｍＭまたはそれより低い、さらにより好ましくは２００ｍＭまたはそれより低い、特に好ましくは１５０ｍＭまたはそれより低いＫＭ値を有する酵素である。好ましくは、ＫＭ値は、実施例７で説明されている条件下で決定される。その他の好ましい実施態様において、本発明で用いられるＨＭＧＣｏＡシンターゼは、上述の反応に関して、少なくとも０．１×１０−４秒−１、好ましくは少なくとも０．２×１０−４秒−１、さらにより好ましくは少なくとも０，５×１０−４秒−１、および、特に好ましくは少なくとも１×１０−４秒−１、少なくとも２×１０−４秒−１、少なくとも３×１０−４秒−１、または、少なくとも５×１０−４秒−１のｋｃａｔ値を有する。好ましくは、ｋｃａｔ値は、実施例７で説明されている条件下で決定される。
【００４４】
当業界では、鳥類のＨＭＧＣｏＡシンターゼのＨｉｓ２６４は、酵素とアセトアセチル−ＣｏＡとの相互作用において役割を果たすものであり、Ａｌａ２６４変異体は、アセトアセチル−ＣｏＡのチオエステル部分の酸素と相互作用しないことがよく知られている（Misraa et al., Biochem.35 (1996), 9610-9616）。従って、基質として比較的低いアセトアセチル−ＣｏＡの受容しか示さないが、基質としてアセトンを受容するＨＭＧＣｏＡシンターゼの変異体を開発するために、ＨＭＧＣｏＡシンターゼにおいて、基質としてアセトアセチル−ＣｏＡの受容を低減させるか、または、受容できなくなるように、Misraa et al.（上記で引用した）で説明されている鳥類のＨＭＧＣｏＡシンターゼのＨｉｓ２６４に相当するヒスチジン残基を計画的に突然変異させることが考えられる。
【００４５】
加えて、高められた活性を示すＨＭＧＣｏＡシンターゼ変異体は、提供することができる。例えば、Steussy et al. (Biochemistry 45 (2006), 14407-14414)は、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）のＨＭＧＣｏＡシンターゼのの突然変異体を説明しており、これは、Ａｌａ１１０をＧｌｙ１１０に変化させたものであり、総体的な反応速度の１４０倍の増加を示す。
【００４６】
また３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の生産に関して改善された酵素特性を有する変異体を同定する方法は、補因子の存在下で行うこともでき、それにより、基質のアセトンはＨＭＧＣｏＡシンターゼの天然の基質のアセトアセチル−ＣｏＡよりも短いということに基づき、酵素／酵素触媒部位における立体的および／または電子的な相補を可能にすることができる。このような補因子の一例としては、補酵素Ａ、または、構造的に十分な関連性を有する分子、例えばＳ−ニトロソ−ＣｏＡが挙げられる。
【００４７】
基質としてアセトンを受容するが基質としてアセトアセチル−ＣｏＡに対して低い親和性しか有さないかまたは基質としてアセトアセチル−ＣｏＡを受容しなくなったＨＭＧＣｏＡシンターゼの改変型は、天然に存在するＨＭＧＣｏＡシンターゼから誘導することもできるし、または、すでに改変された、最適化された、または、計画的に合成されたＨＭＧＣｏＡシンターゼから誘導することもできる。
【００４８】
本発明に係る方法で使用することができるタンパク質のその他の例は、ＰｋｓＧタンパク質である。本願に関して、用語「ＰｋｓＧタンパク質」または「ＰｋｓＧタンパク質の活性を有するタンパク質／酵素」は、本来ＰｋｓＧタンパク質によって触媒される反応、すなわちアセチル−Ｓ−ＡｃｐＫ（Ａｃ−Ｓ−ＡｃｐＫ）からＰｋｓＬタンパク質のチオール化ドメインの１つに連結したβ−ケトチオエステルポリケチド中間体への−ＣＨ２ＣＯＯ−の移動を触媒することができるあらゆる酵素を意味する。これはＨＭＧＣｏＡシンターゼによって触媒される反応と類似した反応であり、その違いは、ホスホパンテテイル部分のアセチル−チオエステルが、補酵素Ａの一部ではなくキャリアータンパク質に結合することである。ＰｋｓＧタンパク質は、本来触媒する反応においてアセチル−Ｓ−ＡｃｐＫのアセチル基をアクセプターへ移動させるが、本発明の環境において、ＰｋｓＧタンパク質はまた、本来ＨＭＧＣｏＡシンターゼによって触媒される反応、すなわちアセトアセチルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから開始するＨＭＧＣｏＡの合成を行うこともできることが示された（表１に示されるように、マイコバクテリウム・マリヌム（Mycobacterium marinum）（Ｂ２ＨＧＴ６）由来の酵素がアセトアセチルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡに作用することができる実施例３を参照）。
【００４９】
ＰｋｓＧタンパク質の酵素活性は、当業界公知の方法によって測定することができる。一つの可能性のある好ましく使用される分析は、例えばCalderone et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982)で説明されている。この分析において、モデル基質としてアセトアセチル（Ａｃａｃ）−Ｓ−ＰｋｓＬ−Ｔ２が用いられ、これは、Ａｃ−Ｓ−ＡｃｐＫおよびＰｋｓＧタンパク質と共にインキュベートされる。ＨＭＧ−Ｓ−ＰｋｓＬ−Ｔ２の形成は、ＰｋｓＧタンパク質が、カルボキシメチル基−ＣＨ２−ＣＯ２ＨをＡｃ−Ｓ−ＡｃｐＫから（Ａｃａｃ）−３−ＰｋｓＬ−Ｔ２に移動させることができることを示す。ＨＭＧ−Ｓ−ＰｋｓＬ−Ｔ２の形成は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＦＴＭＳ、または、オートラジオグラフィーのいずれかによって決定することができる。好ましい実施態様において、これに相当する対応する分析は、Calderone et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982)第８９８２頁で説明されているように行う。
【００５０】
ＰｋｓＧタンパク質は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)におけるｐｋｓＸ経路の一部であり、バシラエン生合成に関与する酵素をコードする（Butcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007), 1506-1509）、コードされたタンパク質は、ＡｃｐＫ、ＰｋｓＣ、ＰｋｓＬ、ＰｋｓＦ、ＰｋｓＧ、ＰｋｓＨ、および、Ｐｋｓｌである。Calderone et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 103 (2006), 8977-8982)によれば、これらの酵素は、アセトアセチル−Ｓ−キャリアータンパク質上の酢酸部分から誘導されたβ−メチル分枝を取り込むように作用する。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様において、ＰｋｓＧタンパク質は、配列番号１５または１６、または、配列番号１５または１６に少なくともｎ％同一であり（ここでｎは１０〜１００の整数であり、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または、９９である）、ＰｋｓＧタンパク質の活性を有する配列で示されるアミノ酸配列を含む酵素である。配列番号１５は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）（Ｐ４０８３０）のＰｋｓＧタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号１６は、マイコバクテリウム・マリヌム（Mycobacteriummarinum）（Ｂ２ＨＧＴ６）のＰｋｓＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列同一性の程度の決定に関して、上記でＨＭＧＣｏＡシンターゼに関して述べられたことと同じことが適用される。
本発明に係るプロセスで用いられるＰｋｓＧタンパク質は、天然に存在するＰｋｓＧタンパク質であってもよいし、または、例えば酵素活性、安定性などを変更または改善する突然変異またはその他の変更の導入によって天然に存在するＰｋｓＧタンパク質から誘導されるＰｋｓＧタンパク質であってもよい。
【００５３】
本願に関して、用語「ＰｋｓＧタンパク質」または「ＰｋｓＧタンパク質の活性を有するタンパク質／酵素」はまた、ＰｋｓＧタンパク質から誘導されたものであり、アセトンと、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物、好ましくはアセチル−ＣｏＡとの酵素による変換によって３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産することができるが、それらの天然の基質に対して低い親和性しか有さないかまたはそれらの天然の基質を受容しなくなった酵素も包含する。このようなＰｋｓＧタンパク質の好ましい基質の改変は、アセトンの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩への変換を改善し、不要な副産物の生産を低減させることを可能にする。タンパク質の望ましい酵素活性を改変および／または改善する方法は当業者によく知られており、上述した通りである。続いて結果得られたＰｋｓＧタンパク質変異体を、それらの酵素活性に関して、具体的には基質としてアセトンを選択するそれらの能力に関して試験する。基質としてアセトンを使用するＰｋｓＧタンパク質の能力を測定するための分析は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼに関して実施例５で説明した分析である。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の形成は、上述したように検出することができる。
【００５４】
また、このような３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の生産に関して改善された酵素特性を有する変異体を同定する方法は、補因子の存在下で行うこともでき、それにより、基質のアセトンはＰｋｓＧタンパク質の天然の基質よりも短いということに基づき、酵素／酵素触媒部位における立体的および／または電子的な相補性を考慮することができる。
【００５５】
基質としてアセトンを受容するがその天然の基質に対して低い親和性しか有さないかまたは親和性を失ったＰｋｓＧタンパク質の改変型は、天然に存在するＰｋｓＧタンパク質から誘導することもできるし、または、すでに改変された、最適化された、または、計画的に合成されたＰｋｓＧタンパク質から誘導することもできる。
【００５６】
本発明の環境において、用語「Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ」または「Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有するタンパク質／酵素」は、縮合によってＣ−Ｃ結合を切断または形成することができ、加えていわゆるＴＩＭ（トリオース−リン酸イソメラーゼ）バレルドメインを含む酵素を意味する。このＴＩＭバレルドメインは、多数のピルビン酸結合酵素、および、アセチル−ＣｏＡ依存性酵素で見出される（Forouhar et al. J. Biol. Chem. 281 (2006), 7533-7545）。ＴＩＭバレルドメインは、ＣＡＴＨタンパク質分類データベースにおいて分類系統３，２０．２０．１５０を有する（www.cathdb.info/cathnode/3.20.20.150）。
【００５７】
用語「Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ」は、具体的には、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１３）として、ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１４）として、または、４−ヒドロキシＮ２−ケト吉草酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．３９）として分類される酵素を含む。イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、以下の反応を触媒する：アセチル−ＣｏＡ＋３−メチル−２−オキソブタノエート＋Ｈ２Ｏ⇔（２Ｓ）−２−イソプロピルリンゴ酸塩＋ＣｏＡ。このような酵素に関する例は、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）（２３０８株；Ｑ２ＹＲＴ１）由来のそれに相当する酵素、および、ハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）（ＫＣＴＣ２３９６株；Ｑ２ＳＦＡ７）由来のそれに相当する酵素である。
【００５８】
ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１４）は、アセチル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ＋２−オキソグルタレート←→（Ｒ）−２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート＋ＣｏＡという化学反応を触媒する酵素である。４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸アルドラーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタノエート←→アセトアルデヒド＋ピルビン酸塩という化学反応を触媒する。
【００５９】
本発明の環境において、用語「ＨＭＧＣｏＡリアーゼ」または「ＨＭＧＣｏＡリアーゼの活性を有するタンパク質／酵素」は、ＥＣ番号ＥＣ４．１．３．４に分類されるあらゆる酵素を意味し、具体的には、ＨＭＧＣｏＡのアセチルＣｏＡおよびアセトアセテートへの切断（図３を参照）、または、この逆の反応、すなわちアセチルＣｏＡとアセトアセテートとを縮合することによるＨＭＧＣｏＡの生産を触媒することができるあらゆる酵素を意味し、さらにこの用語はまた、このようなＨＭＧＣｏＡリアーゼから誘導され、アセトンと上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物、好ましくはアセチルＣｏＡとの３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒することができるあらゆる酵素も意味する。本発明の環境において、生産された３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを続いて加水分解し、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を生産してもよい。これは、当業者によく知られている手段によって達成することができ、例えばアシル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＥＣ３．１．２．２０）、または、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）を利用することによって達成することができる。
【００６０】
ＨＭＧＣｏＡリアーゼの酵素活性は、当業界公知の方法によって測定することができる。一つの可能性のある分析が、例えば、Mellanby et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. (1963), 454-458)で説明されている。具体的に言えば、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨ依存性のアセトアセテート還元を用いた分光光度分析によって酵素活性を測定する。
【００６１】
好ましくは、ＨＭＧＣｏＡリアーゼ活性は、実施例４で説明されているようにして分析される。このような分析において、反応混合物（１ｍｌ）は、４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．４ｍＭのＨＭＧ−ＣｏＡ、０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５ユニットの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含み、これを５分間インキュベートし、その後０．００５ｍｇ／ｍｌのＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼを添加し、続いて反応の進行を３４０ｎｍにおける吸光度の減少でモニターする。
【００６２】
ＨＭＧＣｏＡリアーゼによって触媒される反応は、場合によっては例えばＭｇ２＋またはＭｎ２＋のような２価カチオンの存在を必要とすると言われている。従って、ＨＭＧＣｏＡリアーゼの活性を決定する分析はこのような２価カチオンを含むことが好ましく、さらに、本発明に係る３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための方法が、ＨＭＧＣｏＡリアーゼを利用する場合、このようなカチオンの存在下で行われることが好ましい。
【００６３】
ＨＭＧＣｏＡリアーゼは、肝臓のケトン体生成の一部である。これは、肝臓のケトン体生成において、この経路の主要な工程である最後の反応を触媒する。またこの反応は、ロイシン代謝における重要な工程でもある。
【００６４】
ＨＭＧＣｏＡリアーゼは、様々な生物に関して説明されてきた。ＨＭＧＣｏＡリアーゼをコードするアミノ酸および核酸配列は、多数のソースから入手可能である。一般的に、それらの配列は、配列全体において中程度の配列同一性しか有さない。例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)またはブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）由来の酵素は、ヒトＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列に対して約４５％の同一性しか示さない（Forouhar et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 7533-7545）。様々なＨＭＧＣｏＡリアーゼ酵素の三次元構造が決定されており、酵素反応に重要なアミノ酸が概してよく特徴付けられている（上記で引用したForouhar et al.; Fu et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 7526-7532）。真核生物において、ＨＭＧＣｏＡリアーゼは、ミトコンドリアマトリックス中に存在する。
【００６５】
本発明の環境において、原則的にあらゆるＨＭＧＣｏＡリアーゼ酵素を使用することができ、具体的には原核または真核生物由来の酵素を使用することができる。
原核生物のＨＭＧＣｏＡリアーゼとしては、例えば、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）（ユニプロット受託番号Ｑ２ＹＰＬ０およびＢ２Ｓ７Ｓ２）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）（ユニプロット受託番号Ｏ３４８７３）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（上記で引用したFu et al.）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）（ユニプロット受託番号Ｑ４ＺＴＬ２、および、Ｑ４ＺＲＷ６）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）（ユニプロット受託番号Ｐ１３７Ｑ３）、シュワネラ・ピエゾトレランス（Shewanella piezotolerans）（ユニプロット受託番号Ｂ８ＣＲＹ９）、セルビブリオ・ジャポニカス（Cellvibrio japonicus）（ユニプロット受託番号Ｂ３ＰＣＱ７）、アゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）（ユニプロット受託番号Ｃ１ＤＪＫ８、および、Ｃ１ＤＬ５３）、ヘルミニモナス・アルセニコキシダンス（Herminiimonas arsenicoxydans）（ユニプロット受託番号Ａ４Ｇ１Ｆ２）、および、ブルクホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）（ユニプロット受託番号Ａ２ＶＵＷ７）由来のものが挙げられる。
【００６６】
さらに、以下の表Ｂにいくつかの既知の原核生物由来のＨＭＧＣｏＡリアーゼを列挙する。
【００６７】
【表２−１】
2013504312.tif 000006
【００６８】
【表２−２】
2013504312.tif 000007
【００６９】
真核生物のＨＭＧＣｏＡリアーゼは、説明される、例えばラディッシュ（Raphanus sativus）、および、トウモロコシ（Zea mays）（受託番号Ｂ６Ｕ７Ｂ９，遺伝子バンクＡＣＧ４５２５２）のような植物由来のもの、ならびに、例えばヒト（Homo sapiens；ユニプロット受託番号Ｐ３５９１４）、カニクイザル（ユニプロット受託番号Ｑ８ＸＺ６）、スマトラオランウータン（Pongo abelii；ユニプロット受託番号Ｑ５Ｒ９Ｅ１）、ラット（Rattus norvegicus；ユニプロット受託番号Ｐ９７５１９；上記で引用したFu et al.）、ハツカネズミ（ユニプロット受託番号Ｐ３８０６０）、アヒル（Anas spec）、ウシ（Bos taurus；ユニプロット受託番号Ｑ２９４４８）、ヤギ（Capra hircus）、ハト（Columba livia）、ニワトリ（Gallus galius；ユニプロット受託番号Ｐ３５９１５）、ヒツジ（Ovis aries）、ブタ（Sus scrota）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）（Brachydanio rerio；Ａ８ＷＧ５７，遺伝子バンクＢＣ１５４５８７）動物のような植物由来のもの、ならびに、原生動物のテトラヒメナ（Tetrahymena pyriformis）由来のものが挙げられる。
【００７０】
配列番号１７〜２３に、様々な生物由来のＨＭＧＣｏＡリアーゼの例を示す。配列番号１７は、トウモロコシ（Zea mays）（受託番号Ｂ６Ｕ７Ｂ９，遺伝子バンクＡＣＧ４５２５２）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号１８は、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）（Brachydanio rerio；Ａ８ＷＧ５７，遺伝子バンクＢＣ１５４５８７）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号１９は、ウシ（Bos taurus）（ユニプロット受託番号Ｑ２９４４８）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示し、および、配列番号２０は、ヒト（ミトコンドリア，ユニプロット受託番号Ｐ３５９１４，遺伝子バンクＨＵＭＨＹＭＥＧＬＡ）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２１は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（Ｑ８８Ｈ２５）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２２は、アシネトバクター・バウマニー（Acinetobacter baumannii）（Ｂ７Ｈ４Ｃ６）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示し、および、配列番号２３は、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)（Ｑ７２ＩＨ０）のＨＭＧＣｏＡリアーゼの配列を示す。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様において、ＨＭＧＣｏＡリアーゼは、配列番号１７〜２３、または、配列番号１７〜２３のいずれか一種と少なくともｎ％同一である配列（ここでｎは、１０〜１００の整数であり、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３，９４、９５、９６，９７、９８、または、９９である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＭＧＣｏＡリアーゼの活性を有する酵素である。
【００７２】
配列同一性の程度の決定に関して、上記でＨＭＧＣｏＡシンターゼに関して述べられたことと同じことが適用される。
本発明に係るプロセスで用いられるＨＭＧＣｏＡリアーゼは、天然に存在するＨＭＧＣｏＡリアーゼであってもよいし、または、例えば酵素活性、安定性などを変更または改善する突然変異またはその他の変更の導入によって天然に存在するＨＭＧＣｏＡリアーゼから誘導されるＨＭＧＣｏＡリアーゼであってもよい。
【００７３】
また、本願に関して、用語「ＨＭＧＣｏＡリアーゼ」または「ＨＭＧＣｏＡリアーゼの活性を有するタンパク質／酵素」は、ＨＭＧＣｏＡリアーゼから誘導されたものであり、アセトンと、上記で定義されたように活性化されたアセチル基を提供する化合物、好ましくはアセチル−ＣｏＡとの縮合によって３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを生産することができるが、基質としてアセトアセテートに対して低い親和性しか有さないかまたは基質としてアセトアセテートを受容しなくなった酵素も包含する。このようなＨＭＧＣｏＡリアーゼの好ましい基質の改変は、アセトンの３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換を改善し、副産物であるＨＭＧ−ＣｏＡの生産を低減させることを可能にする。タンパク質の望ましい酵素活性を改変および／または改善する方法は当業者によく知られており、上述した通りである。
【００７４】
３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡの生産を触媒する特定の酵素の能力は、実施例６で説明されているような分析で決定することができる。
基質としてアセトンを受容するが基質としてアセトアセテートに対して低い親和性しか有さないかまたは基質としてアセトアセテートを受容しなくなったＨＭＧＣｏＡリアーゼの改変型は、天然に存在するＨＭＧＣｏＡリアーゼから誘導することもできるし、または、すでに改変された、最適化された、または、計画的に合成されたＨＭＧＣｏＡリアーゼから誘導することもできる。
【００７５】
本発明に係るプロセスにおいて、上記で定義されたように１種のみの酵素を用いてもよく、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼのみ、または、ＨＭＧＣｏＡリアーゼのみ、または、ＰｋｓＧタンパク質のみを用いてもよい。しかしながら、当然のことながら１種より多くの活性、すなわち様々な酵素を用いてもよく、具体的にはＨＭＧＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および、ＰｋｓＧタンパク質のあらゆる組み合わせを用いることができる。例えばインビトロでの方法の場合、反応混合物に１種より多くの酵素活性を、同時に添加してもよいし、または、あらゆる可能性な順番で順次添加してもよい。生物、具体的には微生物を用いるインビボでの方法において、例えば、上記で定義されたような酵素を発現する生物、具体的には微生物を用いてもよい。しかしながら、上述した酵素のあらゆる可能性のある組み合わせを発現する生物／微生物を用いることも考えられる。さらに、２種またはそれより多くのタイプの生物／微生物の混合物（そのうち１つのタイプは１種の酵素を発現し、その他のタイプがその他の酵素を発現する）を用いることも可能である。続いてこれらの異なるタイプを共に培養してもよい。
【００７６】
本発明に係るプロセスで用いられる酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼは、タンパク質の野生型でもよいし、または、合成タンパク質でもよいし、加えて化学合成された、または、生物系で、または、組換え法によって生産されたタンパク質でもよい。またこのような酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼは、その／それらの精製またはその支持体への固定を容易にするために、例えばその／それらの安定性、耐性（例えば温度耐性）を改善するために化学修飾されていてもよい。このような酵素／酵素（複数）は、単離した形態で、精製した形態で、固定された形態で、酵素／酵素（複数）を合成する細胞から得られた粗生成物または一部精製した抽出物として、化学合成された酵素として、組換え生産された酵素として、それらを生産する微生物の形態などの状態で使用してもよい。
【００７７】
本発明に係るプロセスは、インビトロで行ってもよいし、または、インビボで行ってもよい。
インビトロでの反応は、細胞を用いない反応、すなわち無細胞反応のことと理解されている。インビトロでの方法を行うことに関して、この反応のための基質および酵素／酵素（複数）を、酵素／酵素（複数）を活性化して酵素による変換を引き起こすような条件（緩衝液、温度、補因子など）下でインキュベートする。このような反応は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩が生産されるのに十分な時間進行させることができる。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩および／または３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡの生産は、それらを誘導体化した後に薄層クロマトグラフィー、ＬＣ／ＭＳ、および、比色分析によって分離した後に標準化合物と比較することによって検出が可能である。
【００７８】
酵素／酵素（複数）は、酵素反応を起こすことができるあらゆる適切な形態が可能である。これらは、精製または一部精製されていてもよいし、または、未精製の細胞抽出物、または、一部精製した抽出物の形態であってもよい。また、酵素／酵素（複数）を適切なキャリアーに固定させてもよい。
【００７９】
基質のアセトンは、一般的には、酵素によって利用される天然の基質、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼおよびＨＭＧＣｏＡリアーゼそれぞれによって利用されるアセトアセチル−ＣｏＡ／アセトアセテートよりも短いために、反応混合物に酵素／酵素（複数）触媒部位における立体的／または電子的な相補を可能にする補因子を添加することが有利な場合がある。このような補因子の一例としては、ＨＭＧＣｏＡシンターゼの場合において、補酵素Ａ、または、構造的に十分な関連性を有する分子、例えばＳ−ニトロソ−ＣｏＡが挙げられる。
【００８０】
このような方法を行うために、インビボでの使用は、基質、すなわちアセトン、および、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物、ならびに、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を提供することができる適切な生物／微生物で構成される。好ましい実施態様において、前記酵素は、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼである。
【００８１】
従って、この実施態様の場合において、本発明に係る方法は、アセトンを生産し、さらに、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合を形成することができる酵素を発現すること、好ましくはＨＭＧＣｏＡシンターゼの活性を有する酵素（ＥＣ２．３．３．１０）を発現すること、および／または、ＰｋｓＧタンパク質を発現すること、および／または、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）のようなＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素を発現することができる生物、好ましくは微生物の存在下で、アセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物との変換が認識されることを特徴とする。
【００８２】
本発明の環境において、用語「アセトンを生産することができる〜」は、その生物／微生物が、代謝前駆体からアセトン生産を可能にする酵素活性を提供する酵素の存在によって細胞内でアセトンを生産する能力を有することを意味する。
【００８３】
アセトンは、所定の微生物、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）、および、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）によって生産される。アセトンの合成は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）で最もよく特徴付けられている。これは、２分子のアセチル−ＣｏＡがアセトアセチル−ＣｏＡに縮合される反応（反応工程１）から開始される。この反応は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）によって触媒される。続いてアセトアセチル−ＣｏＡを酢酸または酪酸と反応させることによってアセトアセテートに変換すると、アセチル−ＣｏＡ、または、ブチリル−ＣｏＡが生産される（反応工程２）。この反応は、例えばアセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）によって触媒される。アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼは、様々な生物由来のものが知られており、例えば大腸菌（E. coli）由来のもの（ここで上記トランスフェラーゼは、ａｔｏＡＤ遺伝子によってコードされている）、または、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum)由来のもの（ここで上記トランスフェラーゼは、ｃｔｆＡＢ遺伝子によってコードされている）が挙げられる。しかしながら、その他の酵素でもこの反応を触媒することができ、例えば３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．５）、または、コハク酸塩ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．５）が挙げられる。
【００８４】
最終的に、アセトアセテートは、アセトアセテート脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．４）によって触媒される脱炭酸反応工程（反応工程３）によってアセトンに変換される。
上記で説明した反応工程１および２、ならびにそれらを触媒する酵素はアセトン合成に固有のものではなく、様々な生物で見出すことができる。それに対して、アセトアセテート脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．４）によって触媒される反応工程３は、アセトンを生産することができる生物でしか見出されない。
【００８５】
一つの好ましい実施態様において、本発明に係る方法で用いられる生物  は、もともとアセトンを生産する能力を有する生物、好ましくは微生物である。従って、このような微生物は、好ましくは、クロストリジウム属、バチルス属、または、シュードモナス属に属しており、より好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）種、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）種、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）種、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）種、または、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）種である。
【００８６】
さらに好ましい実施態様において、本発明に係る方法で用いられる生物は、もともとアセトンを生産する能力を有し、さらに組換えされた、すなわち上記で定義されたような酵素が発現されるようにさらに遺伝子組換えされたという意味で組換えされた生物、好ましくは微生物である。一実施態様において、用語「組換え」は、その生物が、上記で定義されたような酵素をコードする外来の核酸分子を含むように遺伝子組換えされていることを意味する。好ましい実施態様において、このような生物が、上記で定義されたような酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、または、ＰｋｓＧタンパク質をコードする外来の核酸分子、または、このようなタンパク質のあらゆる可能性のある組み合わせをコードする外来の核酸配列を含むように遺伝子組換えされている。このような場合において、用語「外来」は、前記生物／微生物中に本来存在しない核酸分子を意味する。これは、生物／微生物中で同じ構造で存在しないか、または、同じ位置に存在しないことを意味する。一つの好ましい実施態様において、外来の核酸分子は、プロモーターと、それぞれの酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質をコードするコード配列とを含む組換え分子であり、ここで上記プロモーターによって駆動されるこれらのコード配列の発現は、そのコード配列にとって異種である。このような場合において、異種は、そのプロモーターが、本来前記コード配列の発現を稼働させるプロモーターではないが、本来異なるコード配列の発現を駆動させるプロモーターであることを意味し、すなわち上記プロモーターは、その他の遺伝子から誘導されたものか、または、合成プロモーター、または、キメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、プロモーターは、生物／微生物にとって異種のプロモーター、すなわちそれぞれの生物／微生物中に本来存在しないプロモーターである。さらにより好ましくは、プロモーターは、誘導性プロモーターである。異なるタイプの生物、具体的には微生物中で発現を駆動させるためのプロモーターは、当業者によく知られている。
【００８７】
その他の好ましい実施態様において、核酸分子が、それによってコードされた酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、コードされたＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質がその生物／微生物にとって内因性ではない、すなわち、それが遺伝子組換えされていない場合、本来その生物／微生物によって発現されないという点で、生物／微生物にとって外来である。言い換えれば、その生物／微生物にとって、コードされたＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、コードされたＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質は、異種である。
【００８８】
その他の実施態様において、用語「組換え」は、生物が、それぞれの酵素の発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較して増加するように、上記で定義されたような本来その生物中に存在する酵素の発現を制御する調節領域で遺伝子組換えされていることを意味する。高いという用語における「より高い発現」の意味は、以下でさらに説明されている。
【００８９】
このような調節領域の改変は、当業者によく知られた方法によって達成できる。その例としては、天然に存在するプロモーターをより高い発現を可能にするプロモーターと交換すること、または、より高い発現を示すように天然に存在するプロモーターを改変することが挙げられる。従って、この実施態様において、生物は、上記で定義されたような酵素をコードする遺伝子の調節領域中に、本来生物中には存在するものではなく、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較してより高い酵素発現を起こす外来の核酸分子を含む。
【００９０】
このような外来の核酸分子は、生物／微生物中で、例えばプラスミドのように染色体外の形態で存在する可能性があり、または、染色体中に安定して統合されている可能性もある。安定に統合されていることが好ましい。
【００９１】
さらに好ましい実施態様において、生物／微生物は、上記で定義されたような酵素の発現／活性、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の発現／活性が、外来の核酸分子で遺伝子組換えされた生物／微生物において、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物と比較してより高いことを特徴とする。「より高い」発現／活性は、遺伝子組換え微生物における酵素の発現／活性、具体的にはＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の発現／活性が、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物における発現／活性よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、または、５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、または、８０％、および、特に好ましい少なくとも９０％、または、１００％高いことを意味する。さらにより好ましい実施態様において、発現／活性の増加は、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または、少なくとも５００％であり得る。特に好ましい実施態様において、上記発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物における発現よりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、および、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【００９２】
用語「より高い」発現／活性はまた、非遺伝子組換え生物／微生物におけるそれに相当する発現／活性がゼロになるように、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物が、それに相当する酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質を発現しない状況も包含する。
【００９３】
細胞中の所定のタンパク質の発現レベルを測定する方法は、当業者によく知られている。一つの実施態様において、発現レベルの測定は、それに相当するタンパク質の量を測定することによってなされる。
【００９４】
それに相当する方法は当業者によく知られており、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。その他の実施態様において、発現レベルの測定は、それに対応するＲＮＡの量を測定することによってなされる。
【００９５】
それに相当する方法は当業者によく知られており、例えばノーザンブロットが挙げられる。
上述した酵素の酵素活性、具体的にはＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の酵素活性を測定する方法はそれぞれ当業界でよく知られており、上述した通りである。
【００９６】
その他の好ましい実施態様において、本発明に係る方法で用いられる生物は、遺伝子組換え生物、好ましくは本来アセトンを生産しないが、アセトンを生産するように遺伝子組換えされている、すなわちその生物／微生物においてアセトン生産を可能にするのに必要な遺伝子を導入することによって遺伝子組換えされている生物／微生物から誘導された微生物である。原則的にあらゆる微生物をこの方法で遺伝子組換えすることができる。アセトンの合成に関与する酵素は上述した通りである。それに相当する酵素をコードする遺伝子は当業界でよく知られており、所定の微生物をアセトンを生産するように遺伝学的に改変するために使用することができる。
【００９７】
上述したように、アセトン合成の反応工程１および２は、ほとんどの生物において自然に起こるものである。しかしながら反応工程３はアセトン合成に特徴的で重要なものであるため、好ましい実施態様において、本来アセトンを生産しない生物／微生物から誘導された遺伝子組換え生物／微生物は、脱炭酸反応によってアセトアセテートのアセトンへの変換を触媒する酵素、例えばアセトアセテート脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．４）をコードするヌクレオチド配列を含むように改変される。この酵素をコードする数種の生物由来のヌクレオチド配列が当業界でよく知られており、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum)（ユニプロット受託番号Ｐ２３６７０、および、Ｐ２３６７３）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）（クロストリジウムＭＰ；Ｑ９ＲＰＫ１）、クロストリジウム・パストウリアヌム（Clostridium pasteurianum）（ユニプロット受託番号Ｐ８１３３６）、ブラディリゾビウム種（Bradyrhizobium）（ＢＴＡｉ１／ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１１８２株；ユニプロット受託番号Ａ５ＥＢＵ７）、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）（ＡＴＣＣ１０３９９Ａ９ＬＢＳ０）、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）（ユニプロット受託番号Ａ３ＭＡＥ３）、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）ＦＭＨ Ａ５ＸＪＢ２、ブルクホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia)（ユニプロット受託番号Ａ０Ｂ４７１）、ブルクホルデリア・アンビファリア（Burkholderia ambifaria）（ユニプロット受託番号Ｑ０ｂ５Ｐ１）、ブルクホルデリア・フィトフィルマンス（Burkholderia phytofirmans）（ユニプロット受託番号Ｂ２Ｔ３１９）、ブルクホルデリア種（ユニプロット受託番号Ｑ３８ＺＵ０）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）（ユニプロット受託番号Ｂ２ＴＬＮ８）、ラルストニア・ピケッティ（Ralstonia pickettii）（ユニプロット受託番号Ｂ２ＵＩＧ７）、ストレプトマイセス・ノガレーター（Streptomyces nogalater）（ユニプロット受託番号Ｑ９ＥＹＩ７）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）（ユニプロット受託番号Ｑ８２ＮＦ４）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）（ユニプロット受託番号Ｑ５ＺＸＱ９）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）（ユニプロット受託番号Ｑ１ＷＶＧ５）、ロドコッカス種（ユニプロット受託番号Ｑ０Ｓ７Ｗ４）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ユニプロット受託番号Ｑ８９０Ｇ０）、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）（ユニプロット受託番号Ｑ１Ｍ９１１）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）（ユニプロット受託番号Ｑ０３Ｂ６６）、野兎病菌（Francisella tularensis）（ユニプロット受託番号Ｑ０ＢＬＣ９）、サッカロポリスポラ・エリトリア（Saccharopolyspora erythreae）（ユニプロット受託番号Ａ４ＦＫＲ９）、コラルカエウム・クリュプトフィルム（Korarchaeum cryptofilum）（ユニプロット受託番号Ｂ１Ｌ３Ｎ６）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）（ユニプロット受託番号Ａ７Ｚ８Ｋ８）、コクリオボルス・ヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus）（ユニプロット受託番号Ｑ８ＮＪＱ３）、スル���ォロブス・アイランディカス（Sulfolobus islandicus）（ユニプロット受託番号Ｃ３ＭＬ２２）、および、野兎病菌（Francisella tularensis）の亜種のホラークティカ（holarctica）（ＯＳＵ１８株）由来のａｄｃ遺伝子が挙げられる。
【００９８】
より好ましくは、生物（好ましくは微生物）は、上述したアセトン合成の反応工程２、すなわちアセトアセチルＣｏＡのアセトアセテートへの変換を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子組換えされる。
【００９９】
さらにより好ましくは、生物（好ましくは微生物）は、上述したアセトン合成の反応工程１、すなわち２分子のアセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの縮合を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子組換えされる。
【０１００】
特に好ましい実施態様において、生物／微生物は、上述したアセトン合成の反応工程１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、または、上述したアセトン合成の反応工程１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、または、上述したアセトン合成の反応工程２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、または、上述したアセトン合成の反応工程１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子組換えされる。
【０１０１】
上述した遺伝子組換え生物、好ましくは微生物を製造する方法は当業界公知である。従って、一般的には、生物／微生物は、微生物中でそれぞれの酵素の発現を可能にするＤＮＡコンストラクトで形質転換される。このようなコンストラクトは通常、それぞれの宿主細胞中で転写および翻訳を可能にする調節配列、例えばプロモーターおよび／エンハンサー、および／または、転写ターミネーター、および／または、リボソーム結合部位などに連結された対象のコード配列を含む。従来技術ではすでに、アセトンを生産できるように遺伝子組換えされた微生物が説明されている。具体的に言えば、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum)由来の遺伝子を大腸菌（E. coli）に導入することによって、本来アセトンを生産しない細菌である大腸菌（E. coli）中でアセトンの合成を可能にしている（Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085; Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818）。具体的に言えば、Hanai et al. (上記で引用した)は、大腸菌（E. coli）中でアセトンの生産を達成するためには、アセトアセテート脱炭酸酵素（例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のもの）をコードする核酸配列を導入すれば十分であることを示しており、これはすなわち、上述した反応工程１および２を触媒する大腸菌（E. coli）の内因性の酵素（すなわち大腸菌（E. coli）のａｔｏＢおよびａｔｏＡＤ遺伝子の発現産物）は、アセトン生産のための基質を提供するのに十分であることを示す。
【０１０２】
特に好ましい実施態様において、本発明に係る方法で用いられる生物、好ましくは微生物は、上述したように本来アセトンを生産しないが、アセトンを生産するように遺伝子組換えされており、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を発現する生物／微生物から誘導された組換え生物／微生物である。このような場合において、用語「組換え」は、好ましくは、その生物が、上記で定義されたような酵素が発現されるようにさらに遺伝子組換えされたという意味で組換えされていることを意味する。一実施態様において、用語「組換え」は、その生物が、上記で定義されたような酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、または、ＰｋｓＧタンパク質をコードする外来の核酸分子か、または、上記で定義された酵素のあらゆる可能性のある組み合わせをコードする外来の核酸分子を含むように遺伝子組換えされていることを意味する。
【０１０３】
用語「外来の核酸分子」に関して、その定義はすでに上述された定義と同じである。
その他の実施態様において、用語「組換え」は、生物が、それぞれの酵素の発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較して増加するように、上記で定義されたような本来その生物中に存在する酵素の発現を制御する調節領域で遺伝子組換えされていることを意味する。高いという用語における「より高い発現」の意味を、以下でさらに説明する。
【０１０４】
このような調節領域の改変は、当業者によく知られた方法によって達成できる。その例としては、天然に存在するプロモーターをより高い発現を可能にするプロモーターと交換すること、または、より高い発現を示すように天然に存在するプロモーターを改変することが挙げられる。従って、この実施態様において、生物は、上記で定義されたような酵素をコードする遺伝子の調節領域中に、本来生物中には存在するものではなく、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較してより高い酵素発現を起こす外来の核酸分子を含む。
【０１０５】
好ましくは、このような生物／微生物は、前記酵素の発現／活性、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の発現／活性が、組換え生物／微生物において、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物と比較してより高いことを特徴とする。「より高い」発現／活性は、遺伝子組換え生物／微生物における酵素の発現／活性、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の発現／活性が、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物における発現／活性よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、または、５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、または、８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、または、１００％高いことを意味する。さらにより好ましい実施態様において、発現／活性の増加は、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または、少なくとも５００％であり得る。特に好ましい実施態様において、上記発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物における発現よりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、および、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【０１０６】
用語「より高い」発現／活性はまた、非遺伝子組換え生物／微生物におけるそれに相当する発現／活性がゼロになるように、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物が、前記酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質を発現しない状況も包含する。発現または活性のレベルを測定する方法に関しても、その方法はすでに上述された定義と同じである。
【０１０７】
用語「生物」は、本発明の環境において用いられているように、一般的には、あらゆる可能性のあるタイプの生物、具体的には真核生物、原核生物、および、古細菌を意味する。この用語は、動物、植物、菌類、細菌、および、古細菌を含む。この用語はまた、単離された細胞、または、組織またはカルス（calli）などの上記生物の細胞の集合体も含む。
【０１０８】
一つの好ましい実施態様において、生物は、微生物である。本発明の環境において、用語「微生物」は、原核細胞、具体的には細菌、加えて酵母のような菌類を意味し、さらには藻類および古細菌も意味する。一つの好ましい実施態様において、このような微生物は、細菌である。原則的に、あらゆる細菌を使用することができる。本発明に係るプロセスで用いることができる好ましい細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、シュードモナス属、または、エシェリキア属の細菌である。特に好ましい実施態様において、このような細菌は、エシェリキア属に属するものであり、さらにより好ましくは大腸菌（Escherichia coli)種に属するものである。
【０１０９】
その他の好ましい実施態様において、上記微生物は、真菌であり、より好ましくはサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、アスペルギルス属、または、トリコデルマ属の真菌であり、さらにより好ましくはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）種、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）種、または、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）種の真菌である。
【０１１０】
さらにその他の好ましい実施態様において、上記微生物は、光合成活性を有する微生物、例えば光合成を行うことができる細菌、または、微小藻類（micro-algae）である。
特に好ましい実施態様において、上記微生物は、藻類であり、より好ましくは珪藻に属する藻類である。
【０１１１】
本発明の方法の環境で微生物が用いられる場合、本発明に係る方法を２種の微生物を用いる方式で実施することも考えられ、すなわちそのうちの１種はアセトンを生産するものであり、残りの１種は、第一のタイプの微生物によって生産されたアセトンを用いて、それを上記で定義されたような酵素によって変換するものである。
【０１１２】
本発明に係るプロセスがそれぞれの酵素活性／活性を提供する微生物を用いることによってインビボで行われる場合、その微生物は、酵素反応を起こすことができるような適切な培養条件下で培養される。具体的な培養条件は、用いられる具体的な微生物によって様々であるが、このような条件は当業者によく知られている。培養条件は、一般的に、それによってそれぞれの反応に関する酵素をコードする遺伝子の発現が可能になるように選択される。特定の培養段階で特定の遺伝子の発現を改善および調節するための様々な方法が当業者に知られており、例えば化学的な誘導物質または温度変化による遺伝子発現の誘導が挙げられる。
【０１１３】
その他の好ましい実施態様において、本発明に係る方法で用いられる生物は、光合成できる生物、例えば植物または微小藻類である。原則的に、あらゆる可能性のある植物を使用することができ、すなわち単子葉植物または双子葉植物を使用することができる。好ましくは、農業的に有意義な規模で培養することができ、さらに大量のバイオマスを生産することを可能にする植物を使用することである。例としては、イネ科植物、例えばライグラス（lolium）、穀草、例えばライ、大麦、オートムギ、キビ、トウモロコシ、その他のでんぷんを貯蔵する植物、例えばジャガイモ、または、糖を貯蔵する植物、例えば蔗糖、または、砂糖大根が挙げられる。さらに、タバコの使用、または、野菜植物、例えばトマト、トウガラシ、キュウリ、ナスなどの使用も考えられる。その他の可能性は、油を貯蔵する植物、例えばセイヨウアブラナ種、オリーブなどの使用である。さらに、樹木、具体的には早生樹、例えばユーカリ、ポプラ、または、ゴムの木（Hevea brasiliensis）の使用も考えられる。
【０１１４】
本発明はまた、以下の特性を特徴とする生物、好ましくは微生物にも関する。
（ａ）  アセトンを生産できる特性
（ｂ）  アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、上記で定義されたように活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素、好ましくはＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）、および／または、ＰｋｓＧタンパク質を発現する特性
本発明に係る生物中で発現される酵素、具体的にはＨＭＧＣｏＡシンターゼ、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の源、性質、特性、配列などに関しては、本発明に係る方法に関してすでに上述したことと同じものが適用される。
【０１１５】
一つの好ましい実施態様において、本発明に係る生物は、もともとアセトンを生産する能力を有する生物、好ましくは微生物である、すなわち上述の特性（ａ）は、その生物、好ましくは微生物が自然状態で示す特性である。従って、このような生物は、好ましくはクロストリジウム属、バチルス属、または、シュードモナス属に属する微生物であり、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）種、クロストリジウム・ベイジェリンキ（（Ciostridium beijerinckii)種、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）種、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）種、または、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）種に属する微生物である。
【０１１６】
その他の好ましい実施態様において、本発明に係る生物、好ましくは微生物は、本来アセトンを生産しないが、アセトンを生産するように遺伝子組換えされている、すなわちその生物／微生物においてアセトン生産を可能にするのに必要な遺伝子を導入することによって遺伝子組換えされている生物／微生物から誘導された遺伝子組換え生物／微生物である。原則的にあらゆる生物／微生物をこの方法で遺伝子組換えすることができる。アセトンの合成に関与する酵素は上述した通りである。それに相当する酵素をコードする遺伝子は当業界でよく知られており、所定の生物、好ましくは微生物がアセトンを生産するようにそれらを遺伝学的に改変するのに使用することができる。
【０１１７】
好ましい実施態様において、本来アセトンを生産しない生物／微生物から誘導された遺伝子組換え生物／微生物は、脱炭酸反応によってアセトアセテートのアセトンへの変換を触媒する酵素、例えばアセトアセテート脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．４）をコードするヌクレオチド配列を含むように改変される。この酵素をコードする数種の生物由来のヌクレオチド配列が当業界でよく知られており、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum)由来のａｄｃ遺伝子が挙げられる。より好ましくは、このような生物／微生物は、上述したアセトン合成の反応工程２、すなわちアセトアセチルＣｏＡのアセトアセテートへの変換を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子組換えされる。
【０１１８】
さらにより好ましくは、このような生物／微生物は、上述したアセトン合成の反応工程１、すなわち２分子のアセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの縮合を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子組換えされる。
【０１１９】
特に好ましい実施態様において、生物／微生物は、上述したアセトン合成の反応工程１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、または、上述したアセトン合成の反応工程１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、または、上述したアセトン合成の反応工程２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、または、上述したアセトン合成の反応工程１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子、および、上述したアセトン合成の反応工程３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子組換えされる。
【０１２０】
上述した遺伝子組換え生物／微生物を製造する方法は当業界公知である。従って、一般的には、生物／微生物は、生物／微生物中でそれぞれの酵素の発現を可能にするＤＮＡコンストラクトで形質転換される。このようなコンストラクトは通常、それぞれの宿主細胞中で転写および翻訳を可能にする調節配列、例えばプロモーターおよび／エンハンサー、および／または、転写ターミネーター、および／または、リボソーム結合部位などに連結された対象のコード配列を含む。従来技術ではすでに、アセトンを生産できるように遺伝子組換えされた生物、具体的には微生物が説明されている。具体的に言えば、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum)由来の遺伝子を大腸菌（E. coli）に導入することによって、本来アセトンを生産しない細菌である大腸菌（E. coli）中でアセトンの合成を可能にしている（Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085; Hanai et at., Appl. Environ. Microbiol 73 (2007), 7814-7818）。具体的に言えば、Hanai et al.(上記で引用した)は、大腸菌（E. coli）中でアセトンの生産を達成するためには、アセトアセテート脱炭酸酵素（例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のもの）をコードする核酸配列を導入すれば十分であることを示しており、これはすなわち、上述した反応工程１および２を触媒する大腸菌（E. coli）の内因性の酵素（すなわち大腸菌（E. coli）のａｔｏＢおよびａｔｏＡＤ遺伝子の発現産物）は、アセトン生産のための基質を提供するのに十分であることを示す。
【０１２１】
さらに好ましい実施態様において、本発明に係る生物、好ましくは微生物は、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を発現するように遺伝子組換えされている。このような状況において、用語「組換え」は、第一の形態において、生物が、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素をコードする外来の核酸分子、好ましくはＨＭＧＣｏＡシンターゼをコードする外来の核酸分子、または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼをコードする外来の核酸分子、または、ＰｋｓＧタンパク質をコードする外来の核酸分子、または、上述した特性を有する酵素のあらゆる可能性のある組み合わせをコードする外来の核酸分子を含むことを意味する。このような場合において、用語「外来の」は、その核酸分子が、前記生物／微生物中に本来存在しないことを意味する。これは、生物／微生物中で同じ構造で存在しないか、または、同じ位置に存在しないことを意味する。一つの好ましい実施態様において、このような外来の核酸分子は、プロモーターと、前記酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質をコードするコード配列とを含む組換え分子であり、ここで上記プロモーターによって駆動されるコード配列の発現は、そのコード配列にとって異種である。このような場合において、異種は、そのプロモーターが、本来前記コード配列の発現を稼働させるプロモーターではないが、本来異なるコード配列の発現を駆動させるプロモーターであることを意味し、すなわち上記プロモーターは、その他の遺伝子から誘導されたものか、または、合成プロモーター、または、キメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、プロモーターは、生物／微生物にとって異種のプロモーター、すなわちそれぞれの生物／微生物中に本来存在しないプロモーターである。さらにより好ましくは、プロモーターは、誘導性プロモーターである異なるタイプの生物、具体的には微生物中で発現を駆動させるためのプロモーターは、当業者によく知られている。
【０１２２】
その他の好ましい実施態様において、核酸分子は、それによってコードされた酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、コードされたＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、コードされたＰｋｓＧタンパク質がその生物／微生物にとって内因性ではない、すなわち、それが遺伝子組換えされていない場合、本来その生物／微生物によって発現されないという点で、生物／微生物にとって外来である。言い換えれば、その生物／微生物にとって、コードされた酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、コードされたＣ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、コードされたＰｋｓＧタンパク質は、異種である。
【０１２３】
その他の形態において、用語「組換え」は、生物が、それぞれの酵素の発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較して増加するように、上記で定義されたような本来その生物中に存在する酵素の発現を制御する調節領域で遺伝子組換えされていることを意味する。高いという用語における「より高い発現」の意味を、以下でさらに説明する。
【０１２４】
このような調節領域の改変は、当業者によく知られた方法によって達成できる。その例としては、天然に存在するプロモーターをより高い発現を可能にするプロモーターと交換すること、または、より高い発現を示すように天然に存在するプロモーターを改変することが挙げられる。従って、この実施態様において、生物は、上記で定義されたような酵素をコードする遺伝子の調節領域中に、本来生物中には存在するものではなく、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較してより高い酵素発現を起こす外来の核酸分子を含む。
【０１２５】
さらに好ましい実施態様において、生物／微生物は、前記酵素の発現／活性、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の発現／活性は、外来の核酸分子で遺伝子組換えされた生物／微生物において、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物と比較してより高いことを特徴とする。「より高い」発現／活性は、遺伝子組換え生物／微生物における酵素の発現／活性、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の発現／活性が、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物における発現／活性よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、または、５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、または、８０％、および、特に好ましい少なくとも９０％、または、１００％高いことを意味する。さらにより好ましい実施態様において、発現／活性の増加は、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または、少なくとも５００％であり得る。特に好ましい実施態様において、上記発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物における発現よりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、および、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【０１２６】
用語「より高い」発現／活性はまた、非遺伝子組換え生物／微生物におけるそれに相当する発現／活性がゼロになるように、それに相当する非遺伝子組換え生物／微生物が、それに相当する酵素、例えばＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼ、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質を発現しない状況も包含する。
【０１２７】
細胞中の所定のタンパク質の発現レベルを測定する方法は、当業者によく知られている。一実施態様において、発現レベルの測定は、それに相当するタンパク質の量を測定することによってなされる。それに相当する方法は当業者によく知られており、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。その他の実施態様において、発現レベルの測定は、それに対応するＲＮＡの量を測定することによってなされる。それに相当する方法は当業者によく知られており、例えばノーザンブロットが挙げられる。
【０１２８】
上述した酵素、具体的にはＨＭＧＣｏＡシンターゼ、および／または、ＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質の酵素活性を測定する方法はそれぞれ当業界でよく知られており、上述した通りである。
【０１２９】
用語「生物」は、本発明の環境において用いられているように、一般的には、あらゆる可能性のあるタイプの生物、具体的には真核生物、原核生物、および、古細菌を意味する。この用語は、動物、植物、菌類、細菌、および、古細菌を含む。この用語はまた、単離された細胞、または、組織またはカルス（calli）などの上記生物の細胞の集合体も含む。
【０１３０】
一つの好ましい実施態様において、上記生物は、微生物である。本発明の環境において、用語「微生物」は、原核細胞、具体的には細菌、加えて酵母のような菌類を意味し、さらには藻類および古細菌も意味する。一つの好ましい実施態様において、このような微生物は、細菌である。原則的に、あらゆる細菌を使用することができる、本発明に係るプロセスで用いることができる好ましい細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、シュードモナス属、または、エシェリキア属の細菌である。特に好ましい実施態様において、このような細菌は、エシェリキア属に属するものであり、さらにより好ましくは大腸菌（Escherichia coli)種に属するものである。
【０１３１】
その他の好ましい実施態様において、上記微生物は、真菌であり、より好ましくはサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、アスペルギルス属、または、トリコデルマ属の真菌であり、さらにより好ましくはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae)種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）種、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）種、または、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）種の真菌である。
【０１３２】
さらにその他の好ましい実施態様において、上記微生物は、光合成活性を有する微生物、例えば光合成を行うことができる細菌、または、微小藻類である。
特に好ましい実施態様において、上記微生物は、藻類であり、より好ましくは珪藻に属する属に由来する藻類である。
【０１３３】
その他の好ましい実施態様において、本発明に係る生物は、光合成できる生物、例えば植物または微小藻類である。原則的に、このような生物は、あらゆる可能性のある植物であってもよく、すなわち単子葉植物または双子葉植物であってもよい。好ましくは、農業的に有意義な規模で培養することができ、さらに大量のバイオマスを生産することを可能にする植物である。例としては、イネ科植物、例えばライグラス（lolium）、穀草、例えばライ、大麦、オートムギ、キビ、トウモロコシ、その他のでんぷんを貯蔵する植物、例えばジャガイモ、または、糖を貯蔵する植物、例えば蔗糖、または、砂糖大根が挙げられる。さらに、タバコの使用、または、野菜植物、例えばトマト、トウガラシ、キュウリ、ナスなどの使用も考えられる。その他の好ましい実施態様において、このような植物は、油を貯蔵する植物、例えばセイヨウアブラナ種、オリーブなどである。さらに、樹木、具体的には早生樹、例えばユーカリ、ポプラ、または、ゴムの木（Hevea brasiliensis）の使用も考えられる。
【０１３４】
本発明はまた、以下の特性を特徴とする生物、好ましくは微生物の使用にも関する。
（ａ）  アセトンを生産できる特性
（ｂ）  アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素、好ましくはＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの活性を有する酵素、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）、および／または、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するためのＰｋｓＧタンパク質を発現する特性
すなわち、本発明はまた、本発明に係る生物／微生物の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための使用にも関する。
【０１３５】
本発明はまた、本発明に係る生物を含む組成物にも関する。
さらに本発明はまた、（i）アセトン；および、（ii）上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物；および、（iii）アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を含む組成物にも関する。
【０１３６】
酵素の好ましい実施態様に関して、本発明に係る方法および生物に関してすでに上述したことと同じものが適用される。
さらに本発明はまた、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するために、アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素の使用にも関する。
【０１３７】
このような酵素の好ましい実施態様に関しては、本発明に係る方法および生物に関してすでに上述したことと同じものが適用される。
最終的に、本発明はまた、上記で定義されたようなアセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物との酵素による変換を含む、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するためのアセトンの使用にも関する。好ましい実施態様において、酵素による変換は、本発明に係る方法に関して上述したような酵素、より好ましくはＨＭＧＣｏＡシンターゼの酵素活性を有する酵素、および／または、Ｃ−Ｃ結合を切断／縮合するリアーゼの酵素活性を有する酵素、例えばＨＭＧＣｏＡリアーゼ、および／または、ＰｋｓＧタンパク質によって達成され、最も好ましくは本発明に係る生物の使用によって達成される。
【０１３８】
図１：３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（また、ベータ−ヒドロキシイソバレレートとも称される）の化学構造である。
図２：ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼによって触媒される反応の反応スキームである。
【０１３９】
図３：ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼによって触媒される反応の反応スキームである。
図４：ＰｋｓＧタンパク質によって触媒される反応を含むｐｋｓＸ経路反応の反応スキームである。
【０１４０】
図５：アセトンと活性化されたアセチル基を含む化合物との３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸への変換反応の反応スキームであり、
式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−ポリペプチド（アシルキャリアータンパク質）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＯＨ（パンテテイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３（Ｎ−アセチル−システアミン）、Ｓ−ＣＨ３（メタンチオール）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（システイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ（ホモシステイン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ−Ｃ５Ｈ８ＮＯ３）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（グルタチオン）、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ（補酵素Ｍ）、および、ＯＨ（酢酸）を意味する。
【０１４１】
図６：市販の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩のマススペクトルである。
図７：ニワトリ（Gallus gallus）（Ｐ２３２２８）由来のＨＭＧＣｏＡシンターゼの存在下におけ。アセチル−ＣｏＡおよびアセトンからの３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の形成のマススペクトルである。
【０１４２】
図８：酵素を用いないコントロール分析のマススペクトルである。
図９：実施例７におけるスタフィロコッカス・エピデルミディス（S. epidermidis）のＨＭＧＣｏＡシンターゼの反応に関するミカエリス−メンテンプロットである。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明を説明するのに有用である。
【実施例】
【０１４４】
実施例１：生物情報学による方法を利用したＨＭＧ−ＣｏＡ合成およびＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼのデータベースの作製
これらの酵素クラスが、真核生物全体にわたりどの程度の多様性がみられるかを示すために、１２のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよび８のＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼのパネルを選択して重複のないタンパク質セットを作製した。ユニバーサル・プロテイン・リソース・データベース・ユニプロット（Universal Protein Resource Database Uniprot）（http://www.uniprot.org/）で複数回の配列ベースおよびテキストベースの検索を行うことによってこれらのタンパク質を同定した。これらははいずれも、対象の酵素クラスに特徴的な保存されたタンパク質ドメインおよびモチーフのような固有の特徴を含む。大量のタンパク質セットをスクリーニングしなくても配列多様性を効果的に調べるために、最初の酵素プールを８５％よりも高い相同性を有する配列のクラスターにグループ分けし、続いて各クラスターの代表となる単一の候補配列を選択することにより、最初の酵素プールの範囲を限定した。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼパネルおよびリアーゼパネルそれぞれからのいずれか２種のタンパク質間におけるタンパク質の配列同一性は、３０％〜８０％、および、５０％〜８０％であった。
【０１４５】
同じアプローチを適用して、原核生物由来のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、および、ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼを選択した。作製されたセットは、ＰｋｓＧタンパク質などのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼに対するタンパク質相同体を５０種、および、ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼに相同なタンパク質を５９種含む。
【０１４６】
実施例２：回収されたＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ、および、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼのクローニング、発現および精製
遺伝子クローニング
真核生物由来のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびリアーゼをコードする核酸配列を大腸菌（E. coli）のコドンに適合するようにし、化学合成（GeneArt）によって遺伝子を得た。
【０１４７】
原核生物由来のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびリアーゼをコードする遺伝子を、慣例的な組換え技術によって、異なる源のゲノムＤＮＡからクローニングした。続いてこれらの遺伝子を、それぞれ真核生物および原核生物用のＰＥＴ２５ｂおよびＰＥＴ２２ｂベクター（ノバジェン（Novagen））を含むＨｉｓ−タグに挿入した。
【０１４８】
大腸菌（E. coli）での過剰発現
プラスミドを大腸菌（E. coli）ＢＬ２１細菌（ノバジェン（Novagen））にエレクトロポレーションし、続いてこれをアンピシリンを含むＬＢ寒天のペトリ皿上に塗り広げた。その培養物を、３０℃で、０．５Ｍのソルビトール、５ｍＭのベタイン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地上で、穏やかに振盪しながら増殖させた。ＯＤ（６００ｎｍ）が０．８に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるまで添加し、穏やかに振盪しながら２０℃で１６時間発現させ続けた。続いて細菌の細胞を４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離で回収し、これを−８０℃で凍結させた。
【０１４９】
細胞抽出物の製造
１．６ｇの細胞ペレットを３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ８）を含む５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液５ｍｌに再懸濁することによって細胞抽出物を製造した。続いてこの調製物に２０μｌのリソナーゼ（lysonase）（ノバジェン（Novagen））を添加し、これを室温で１０分間、および、氷上で２０分間インキュベートした。細胞の溶解を、氷上の超音波の水槽中で５分間の超音波破砕処理を３回行うことによって達成し、パルスとパルスとの間に抽出物をホモジナイズした。続いて未精製抽出物を４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離で透明化した。
【０１５０】
タンパク質精製
透明な上清を、６−ヒスチジンの尾部を有するタンパク質の特異的な固定が可能なＰＲＯＴＩＮＯ−１０００ＮＭＤＡカラム（マッハライ・ナーゲル（Macherey-Nagel））にローディングした。このカラムを洗浄し、酵素を、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、２５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８）を含む５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液４ｍｌで溶出させた。続いて酵素を含む分画を濃縮し、アミコン（Amicon）のウルトラ−４１０ｋＤａフィルターユニット（ミリポア（Millipore））で脱塩し、０．５ｍＭのＤＴＴを含む４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）２５０μｌに再懸濁した。タンパク質濃度はブラッドフォード法によって測定した。
【０１５１】
精製した酵素の等質性は、２０％〜７５％の範囲で様々であった。
実施例３：天然の基質のアセトアセチル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを用いたＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性の測定
Clinkenbeard et al. (J. Biol. Chem. 250 (1975), 3108-3116に従ってＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を測定した。ＨＭＧ−ＣｏＡ合成のための標準的な分析培地混合物は、合計体積１ｍｌ中に４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのアセトアセチル−ＣｏＡ、２００μＭのアセチル−ＣｏＡ、０．５ｍＭのＤＴＴを含む。ミトコンドリアＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは、この酵素で観察された阻害を回避するためにＭｇＣｌ２の非存在下で分析した(Reed et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 3117-3123)。０．０２ｍｇ／ｍＬの酵素を添加することによって反応を開始させた。
【０１５２】
コントロール分析を酵素の非存在下で行った。アセトアセチル−ＣｏＡのエノラートの形態のアセチル−ＣｏＡ依存性の消失に付随する３０３ｎｍにおける吸光度の減少をモニターすることによって、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を測定した。アセトアセチル−ＣｏＡの非特異的な消失を明らかにするために、試験サンプルで得られた結果から、酵素を用いていないコントロール分析で得られた結果を差し引いた。分析条件下におけるアセトアセチル−ＣｏＡの見かけの吸収係数は５６００Ｍ−１であった。
【０１５３】
【表３】
2013504312.tif 000008
【０１５４】
実施例４：天然の基質ＨＭＧ−ＣｏＡを用いたＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ活性の測定
ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ活性を、Mellanby J et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. (1963), 454-458)に従って測定した。４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．４ｍＭのＨＭＧ−ＧｏＡ、０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５ユニットの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む完全な反応混合物（１ｍｌ）を５分間インキュベートし、その後０．００５ｍｇ／ｍｌのＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼを添加し、続いて反応の進行を３４０ｎｍにおける吸光度の減少でモニターした。コントロール分析を酵素の非存在下で行った。
【０１５５】
ＮＡＤＨの非特異的な消失を明らかにするために、試験サンプルで得られた結果から酵素を用いていないコントロール分析で得られた結果を差し引いた。特異的な活性をΔμｍｏｌ（ＮＡＤＨ）／分・ｍｇ（タンパク質）として計算した。
【０１５６】
【表４】
2013504312.tif 000009
【０１５７】
実施例５：３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の生産
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の合成の完全な反応液は、４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、５〜５０ｍＭのアセチル−ＣｏＡ、１００〜５００ｍＭのアセトン、１ＭｇＣｌ２（ただしミトコンドリアＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを除く）、０．５ｍＭのＤＴＴ、および、０．２〜８ｍｇ／ｍｌの範囲で様々な濃度の酵素を含む。コントロール反応を酵素およびいずれか１種の基質の非存在下で行った。
【０１５８】
合成を進行させ、それに続いてそれに続いて３０または３７℃でのインキュベート期間を延長した後に採取されたアリコートを解析した。典型的には、４８時間インキュベートした後に５０μｌのアリコートを採取し、タンパク質を除去するために１００℃で１分間加熱し、遠心分離し、上清をマススペクトロメトリーによるＨＩＶ検出のための清潔なバイアルに移した。４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ中で３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の溶液を調製し、上記で説明したように加熱し、これを参照として用いた。
【０１５９】
サンプルの解析は、ＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ２０００トリプル四重極型質量分析計で、陰イオンモードで、移動相として０．１％トリエチルアミンを含むＨ２Ｏ／アセトニトリル（６０／４０）を用いて行われ、流速は４０μｌ／分とした。１０μｌの各上清を等量の移動相と混合し、直接マススペクトロメーターに注入した。［３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩−Ｈ］−イオンの存在をモニターした。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩に相当するピークを以下の酵素に関して観察した：
チャバネゴキブリ（Blattella germanica）（ドイツのゴキブリ）Ｐ５４９６１（配列番号６）、
ガルス・ガルス（Gallus gallus）（ニワトリ）Ｐ２３２２８（配列番号７）、
ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト）Ｑ０１５８１（配列番号８）、
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）Ｐ５４８７３（ＣＡＡ５８７６３）（配列番号４）、
カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）Ｐ５４８７１（配列番号１）、
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母）Ｐ５４８７４（配列番号２）、
サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン屋で用いる酵母）Ｐ５４８３９（配列番号３）、
細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）（変形菌類）Ｑ８６ＨＬ５（配列番号１０）、
ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）Ｑ０３ＷＺ０（配列番号）、
スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）Ｑ８ＣＮ０６（配列番号１１）、
ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）Ｑ１ＧＡＨ５（配列番号２４）、
スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Staphylococcus haemolyticus）Ｑ４Ｌ９５８（Ｉ９８＞野生型タンパク質と比較した差Ｖ）（配列番号２５）。
【０１６０】
図６〜８は、市販の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩、ニワトリ（Gallusgallus）（Ｐ２３２２８）由来のＨＭＧＣｏＡシンターゼを用いた反応、および、酵素を用いないコントロール分析の代表的な結果を示す。
【０１６１】
実施例６：リアーゼを用いた３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡの生産
３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡ合成は、放射標識した［２−１４Ｃ］アセトンの存在下で行った。３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡ合成のための完全な反応液は、４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、５〜５０ｍＭのアセチル−ＣｏＡ、１００〜５００ｍＭのアセトン、１〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、および、０．５〜７ｍｇ／ｍｌの範囲で様々な濃度の酵素を含む。ＴＬＣまたはＨＰＬＣで反応混合物を分離した後に生成物の形成を解析した。
【０１６２】
さらに３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡもＴＬＣ法で解析した（Stadtman E.R., J. Biol. Chem. 196 (1952), 535-546）。反応液のアリコートをセルロースプレートに載せて、以下の溶媒システム：エタノール／０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）（１／１）でクロマトグラフィーで処理した。内部標準としてＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを用いた。３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡに関して報告されたＲｆは、０．８８であった。
【０１６３】
実施例７：ＨＭＧシンターゼの場合におけるアセチル−ＣｏＡとアセトンとの酵素反応に関する反応速度パラメーター
以下の条件で、可変のアセトン濃度および一定のアセチル−ＣｏＡ濃度（１０ｍＭ）を用いて反応速度パラメーターを測定した：
４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、
２ｍＭのＭｇＣｌ２、
０〜１Ｍのアセトン。
【０１６４】
最終的なｐＨを８に調節した。
１ｍｌの反応混合物に３ｍｇの精製した酵素を添加することによって反応を開始させた。続いて混合物を振盪しないで３７℃で４０時間インキュベートした。
【０１６５】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩生産の解析
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩のイソブテンへの分解を起こす熱化学条件を適用した（Pressman et al., JACS, 1940, 2069-2080）：まず反応混合物のｐＨを６ＮのＨＣｌを用いてｐＨ４に調節し、続いてサンプルをガスクロマトグラフィーバイアル（インターキム（Interchim））に移した。バイアルを密封し、１１０℃で４時間インキュベートしたところ、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩のイソブテンへの分解が起こった。
【０１６６】
同じ条件で市販の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩を用いて検量線を作製した。
上部空間のガスを１ミリリットル回収し、ＦＩＤ検出器およびＣＰシリカプロット（SilicaPlot）カラム（バリアン（Varian））を備えたＨＰ５８９０ガスクロマトグラフ（ＨＰ）に注入した。参照として市販のイソブテンを用いた。イソブテンシグナルから初めにサンプル中に存在する３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸塩の量を計算した。
【０１６７】
以下の表に、実験された数種のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼに関する反応速度パラメーターを示す。
【０１６８】
【表５】
2013504312.tif 000010
【０１６９】
Ｓ．エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）由来の酵素に関して、図９は、それに相当するミカエリス−メンテンプロットを示す。
【図１】
2013504312.tif 000014
【図２】
2013504312.tif 000015
【図３】
2013504312.tif 000016
【図４】
2013504312.tif 000017
【図５】
2013504312.tif 000018
【図６】
2013504312.tif 000019
【図７】
2013504312.tif 000020
【図８】
2013504312.tif 000021
【図９】
2013504312.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月16日(2012.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2013504312.tif 000023
［式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）である］
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物とアセトンとを酵素によって変換することを含む３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の製造方法であって、
アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、式（Ｉ）で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素であって、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素を用いる、上記方法。
【請求項２】
前記変換が、アセトンを生産して請求項１に記載の酵素を発現することができる生物の存在下でなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）アセトンを生産できる特性；および、
（ｂ）アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、Ｘが補酵素Ａである式（１）で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素であって、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素を発現する特性；
を特徴とする組換え生物。
【請求項４】
前記生物が、もともとアセトンを生産する能力を有する生物である、請求項３に記載の生物。
【請求項５】
クロストリジウム属、バチルス属、または、シュードモナス属に属する微生物である、請求項４に記載の生物。
【請求項６】
前記微生物が、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）種、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）種、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）種、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）種、または、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）種に属する微生物である、請求項５に記載の生物。
【請求項７】
前記生物が、本来アセトンを生産しないが、（ａ）生物中でアセトン生産を可能にするのに必要な遺伝子を導入することによってアセトンを生産できるように遺伝子組換えされている生物から誘導される、請求項３に記載の生物。
【請求項８】
前記生物が、光合成することができる生物である、請求項７に記載の生物。
【請求項９】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための、請求項３〜８のいずれか一項に記載の生物の使用。
【請求項１０】
請求項３〜８のいずれか一項に記載の生物を含む組成物。
【請求項１１】
（１）アセトン；および、
（２）式（Ｉ）；
【化２】
2013504312.tif 000024
［式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）である］
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物；および、
（３）アセトンのオキソ（すなわちＣ＝Ｏ）基の炭素原子と、式（Ｉ）で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子（Ｃ２）との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素であって、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素、
を含む組成物。
【請求項１２】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための請求項１に記載の酵素の使用。
【請求項１３】
以下の式（Ｉ）：
【化３】
2013504312.tif 000025
［式中、Ｘは、Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７Ｐ（補酵素Ａ）である］
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物とアセトンの酵素による変換を含む３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸を生産するための、アセトンの使用であって、
酵素による変換が、ＨＭＧＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の酵素活性を有する酵素によって行われる、上記使用。
【国際調査報告】
2013504312.tif 000026
2013504312.tif 000027