(57)【要約】本発明は、液体クロマトグラフィー装置に使われる多機能選択弁に関するものであって、多重ポートを含み、多重ポートの一部に試料分離カラムの両端が連結される多機能選択弁であって、流入される流体が、試料分離カラムを通過せずに排出される流体通過モードと、流入される流体が、試料分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、を含み、このような多機能選択弁を利用すれば、流体の移動経路を変更させることによって、必要に応じてオンライン消化機能、１次元分離機能、及び２次元分離機能を逆相液体クロマトグラフィー装置で具現することができる。
2013504756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に試料分離カラムの両端が連結される多機能選択弁であって、
流入される流体が、前記試料分離カラムを通過せずに排出される流体通過モードと、
流入される流体が、前記試料分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、
を含むことを特徴とする多機能選択弁。
【請求項２】
前記多機能選択弁の多重ポートは、
流入ポートと、流出ポートと、前記試料分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第１試料分離カラム連結ポート及び第２試料分離カラム連結ポートと、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の多機能選択弁。
【請求項３】
前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、
前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１試料分離カラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２試料分離カラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶されることを特徴とする請求項２に記載の多機能選択弁。
【請求項４】
前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、
前記流体通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、前記第２試料分離カラム連結ポートと前記第１選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記カラム通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記第１試料分離カラム連結ポートと前記第２選択ポートが、前記第２試料分離カラム連結ポートと前記第３選択ポートが、前記第１選択ポートと前記流出ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする請求項３に記載の多機能選択弁。
【請求項５】
多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に試料分離カラムの両端が連結され、前記多重ポートの他の一部に二酸化チタンカラムの両端が連結される多機能選択弁であって、
流入される流体が、前記試料分離カラム及び前記二酸化チタンカラムを通過せずに排出される流体通過モードと、
流入される流体が、前記試料分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、
流入される流体が、前記二酸化チタンカラムを通過して排出される二酸化チタンカラム通過モードと、
を含むことを特徴とする多機能選択弁。
【請求項６】
前記多機能選択弁の多重ポートは、
流入ポートと、流出ポートと、前記試料分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第１試料分離カラム連結ポート及び第２試料分離カラム連結ポートと、前記二酸化チタンカラムの両端にそれぞれ連結される、第１二酸化チタンカラム連結ポート及び第２二酸化チタンカラム連結ポートと、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートと、を含むことを特徴とする請求項５に記載の多機能選択弁。
【請求項７】
前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、
前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１試料分離カラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２試料分離カラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶され、
前記二酸化チタンカラム通過モードで前記流入ポートと前記第１二酸化チタンカラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする請求項６に記載の多機能選択弁。
【請求項８】
前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、
前記流体通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記カラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記第１二酸化チタンカラム連結ポートを閉鎖させ、
前記二酸化チタンカラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第１試料分離カラム連結ポートが、前記第３選択ポートと前記第２試料分離カラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする請求項７に記載の多機能選択弁。
【請求項９】
前記試料分離カラムは、強陽イオン交換カラム、弱陰イオン交換カラム、親水クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラム、または強弱イオン混合カラムのうちの何れか一つであることをを特徴とする請求項１または５に記載の多機能選択弁。
【請求項１０】
分析対象となる試料が注入される試料流入弁と、
固相抽出カラム及び逆相液体クロマトグラフィーカラムと流体連通されるトラップ弁と、
前記試料流入弁から前記トラップ弁に向ける流路に位置し、請求項１または請求項５による多機能選択弁と、
前記試料流入弁から流出される流体を前記多機能選択弁または前記トラップ弁に選択的に供給する連結弁と、
を含むことを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を供給する溶媒供給ポンプをさらに含み、
前記溶媒供給ポンプには、前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を選択的に供給するＴ字型溶媒分離管が連結されていることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１２】
前記試料流入弁は、試料流入ポートと、試料放出ポートと、試料貯蔵ループによって互いに連結された、第１試料貯蔵ループ連結ポート及び第２試料貯蔵ループ連結ポートと、溶媒流入ポートと、溶媒流出ポートとを含み、
前記試料流入弁は、
前記試料流入ポートと前記第１試料貯蔵ループ連結ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記試料放出ポートが流体連通される、第１モードと、
前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流出ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流入ポートが流体連通される、第２モードと、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１３】
前記連結弁は、第１流入ポート、第２流入ポート、第１連結ポート、第２連結ポート、第１流出ポート、及び第２流出ポートを含み、
前記連結弁は、
前記第１流入ポート、前記第１連結ポート、前記第２連結ポート、前記第１流出ポートが順次に流体連通される、第１モードと、
前記第２流入ポート、前記第２連結ポート、前記第１連結ポート、前記第２流出ポートが順次に流体連通される、第２モードと、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１４】
前記連結弁には、互いに流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成されることを特徴とする請求項１３に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１５】
前記多機能選択弁が流体通過モードである時、前記試料の１次元分離機能が行われ、カラム通過モードである時、前記試料の２次元分離機能が行われ、流体閉鎖モードである時、前記試料のオンライン消化機能が行われ、二酸化チタンカラム通過モードである時、リン酸化ペプチド抽出機能が行われることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１６】
前記トラップ弁は、前記固相抽出カラムと連通される固相抽出カラム連結ポートと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムと連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと、第１流入ポートと、第２流入ポートと、前記固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループによって連結された試料移動ループ連結ポートと、放出ポートと、を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１７】
前記トラップ弁は、
前記固相抽出カラム連結ポートと前記第１流入ポートが流体連通され、前記試料移動ループ連結ポートと前記放出ポートが流体連通される、第１モードと、
前記逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと前記固相抽出カラム連結ポートが流体連通され、前記第２流入ポートと前記試料移動ループ連結ポートが流体連通される、第２モードと、
を含むことを特徴とする請求項１６に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１８】
前記試料流入弁の溶媒流出ポートと前記連結弁の第１流入ポートは、流体連通され、
前記連結弁の第１流出ポートと前記多機能選択弁の流入ポートは、流体連通され、
前記多機能選択弁の流出ポートと前記トラップ弁の第１流入ポートは、流体連通され、
前記連結弁の第２流出ポートと前記トラップ弁の第２流入ポートは、流体連通されることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１９】
前記固相抽出カラムで、流入される試料の流れ方向と前記逆相液体クロマトグラフィーカラムに向けて溶出される試料の流れ方向は、互いに反対であることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２０】
前記溶媒供給ポンプには、第１溶媒、または第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を供給できるように溶媒選択弁が設けられたことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２１】
請求項１０による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、
（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、
（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体通過モードに設定するステップと、
（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、
（ｄ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、
前記（ｄ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２２】
前記（ｃ）ステップ中に、
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２１に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２３】
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２２に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２４】
請求項１０による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、
（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、
（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体閉鎖モードに設定するステップと、
（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒の圧力を上昇させるステップと、
（ｄ）前記多機能選択弁を流体通過モードに変更し、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、
（ｅ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料流入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、
前記（ｅ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２５】
前記（ｄ）ステップ中に、
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２４に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２６】
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２５に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多機能選択弁に係り、より詳細には、溶媒の流れを変更させることによって、逆相液体クロマトグラフィー装置で１次元及び２次元分離機能、オンライン消化機能だけではなく、選択的にリン酸化ペプチド抽出機能の遂行が可能な多機能選択弁、それを含む多機能全自動液体クロマトグラフィー装置及びそれを利用した試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オンライン固相抽出及び逆相液体クロマトグラフィー（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、その分析効率性が非常に優れて、プロテオーム研究において、非常に重要な技術として認識されている。特に、これは、微細量の生体物質を効果的に分離し、分析物−固相反応範囲が広くて高効率で微細量のタンパク質を同定することを可能にする。
【０００３】
タンパク質を分析する方法として、質量分析法に基づいた方法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ）は、プロテオーム研究の標準分析プラットフォームになっており、代表的な例として、ショットガン方法またはボトムアップ方法などは、質量分析器を使った分析以前にタンパク質を加水分解してペプチドに分解するが、このような加水分解は、生体試料の溶解度を増加させ、質量分析器中で容易にイオン化及び検出が可能なペプチド切片を生成する。
【０００４】
しかし、このような工程は、不可避に試料の複雑性を引き起こすようになり、例えば、最も単純なプロテオームのうちの一つである酵母プロテオームの場合にも、約６，０００余個の多様なタンパク質から３００，０００個以上のペプチド切片が生成される。したがって、このような試料複雑性を解決するための方便として、オン／オフライン多次元タンパク質同定技術（ｏｎ−／ｏｆｆ−ｌｉｎｅ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような多様な方法が開発されたが（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．，Ｅｎｇ，Ｊ．，Ｓｃｈｉｅｌｔｚ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｒｍａｃｋ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，６７６−６８２；Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｉ．，Ｈｅｗｅｌ，Ｊ．，Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｂ．，Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．ＩＩＩ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００６，５，５３−５６．）、液体クロマトグラフィーカラムの効率性及び感度を改善しなければならない必要性は依然として存在する。この際、液体クロマトグラフィー／質量分析法実験の感度は、分離カラム長を一定に保持した状態で、内径を減少させる場合に急増するという事実が知られている（Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｓ．，Ｃｈｏｉｅ，Ｗ．−Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｓ．−Ｗ．，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，２５，１８３３−１８３９．）。
【０００５】
また、相当量の洗剤及び塩を含む生物試料の場合において、オンライン脱塩工程（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｓｔｅｐ）は、質量分析以前に経なければならない必須的な過程であるが、これは、このような不純物が分析しようとするペプチド試料のイオン化過程を妨害して、ペプチド試料に対する検出感度を落とすためである。この際、時間節約及び試料損失などを勘案すれば、オンライン脱塩工程がオフライン脱塩工程より有利である。
【０００６】
一方、従来の逆相液体クロマトグラフィー装置は、固相抽出カラムを採用して試料を脱塩させて濃縮させる１次元分離機能のみを有するか、強陽イオン交換クロマトグラフィー装置と逆相液体クロマトグラフィーをオンラインで連結して２次元分離機能を行う２次元逆相液体クロマトグラフィー装置の場合にも、相互干渉現象などによって正確な分析を行いにくいか、複数個の溶媒供給ポンプが不可避であって、これを制御するための多数個の弁によって、その構造が複雑になる問題点があった。さらに、このような２次元オンライン逆相液体クロマトグラフィー装置では、タンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化（Ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）機能や、リン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出する機能を行うことができない問題点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前述した問題点を解決するためのものであって、本発明が解決しようとする第１の課題は、脱塩過程及び試料濃縮が可能な逆相１次元分離機能、試料分離カラムを利用した１次元分離と逆相２次元分離とを連結して分離効率を高めうる２次元分離機能、溶媒に高圧を生成してタンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能、及び二酸化チタンカラムを用いてリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出する機能を逆相液体クロマトグラフィー装置で具現することができる多機能選択弁を提供することである。
【０００８】
本発明が解決しようとする第２の課題は、１個の溶媒供給ポンプを使いながら、前述した機能を自動化して、多機能選択弁の単純操作のみで選択的に行うことができる多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を提供することである。
【０００９】
本発明が解決しようとする第３の課題は、前述した多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料の分析を効率的に行うことができる試料分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前述した第１の課題を果たすために、多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に試料分離カラムの両端が連結される多機能選択弁であって、流入される流体が、前記試料分離カラムを通過せずに排出される流体通過モード（ｍｏｄｅ）と、流入される流体が、前記試料分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、を含む多機能選択弁を提供する。
【００１１】
ここで、前記多機能選択弁の多重ポートは、流入ポートと、流出ポートと、前記試料分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第１試料分離カラム連結ポート及び第２試料分離カラム連結ポートと、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートとを含みうる。
【００１２】
また、前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１試料分離カラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２試料分離カラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶されることが望ましい。
【００１３】
また、前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、前記流体通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、前記第２試料分離カラム連結ポートと前記第１選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記カラム通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記第１試料分離カラム連結ポートと前記第２選択ポートが、前記第２試料分離カラム連結ポートと前記第３選択ポートが、前記第１選択ポートと前記流出ポートが、それぞれ互いに流体連通されることが望ましい。
【００１４】
本発明の他の側面によれば、多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に試料分離カラムの両端が連結され、前記多重ポートの他の一部に二酸化チタンカラムの両端が連結される多機能選択弁であって、流入される流体が、前記試料分離カラム及び前記二酸化チタンカラムを通過せずに排出される流体通過モードと、流入される流体が、前記試料分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、流入される流体が、前記二酸化チタンカラムを通過して排出される二酸化チタンカラム通過モードと、を含む多機能選択弁を提供する。
【００１５】
ここで、前記多機能選択弁の多重ポートは、流入ポート、流出ポート、前記試料分離カラムの両端にそれぞれ連結される第１試料分離カラム連結ポート、及び第２試料分離カラム連結ポート、前記二酸化チタンカラムの両端にそれぞれ連結される第１二酸化チタンカラム連結ポート、及び第２二酸化チタンカラム連結ポート、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートを含みうる。
【００１６】
また、前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１試料分離カラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２試料分離カラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶され、前記二酸化チタンカラム通過モードで前記流入ポートと前記第１二酸化チタンカラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることが望ましい。
【００１７】
また、前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、前記流体通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記カラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記第１二酸化チタンカラム連結ポートを閉鎖させ、前記二酸化チタンカラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第１試料分離カラム連結ポート、前記第３選択ポートと前記第２試料分離カラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることが望ましい。
【００１８】
また、前記試料分離カラムは、強陽イオン交換カラム、弱陰イオン交換カラム、親水クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムまたは強弱イオン混合カラムのうちの何れか一つであることをが望ましい。
【００１９】
本発明は、前述した第２の課題を果たすために、分析対象となる試料が注入される試料流入弁と、固相抽出カラム及び逆相液体クロマトグラフィーカラムと流体連通されるトラップ弁と、前記試料流入弁から前記トラップ弁に向ける流路に位置し、請求項１または請求項５による多機能選択弁と、前記試料流入弁から流出される流体を前記多機能選択弁または前記トラップ弁に選択的に供給する連結弁と、を含む多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を提供する。
【００２０】
ここで、多機能液体クロマトグラフィー装置は、前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を供給する溶媒供給ポンプをさらに含み、前記溶媒供給ポンプには、前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を選択的に供給するＴ字型溶媒分離管が連結されていることが望ましい。
【００２１】
また、前記試料流入弁は、試料流入ポートと、試料放出ポートと、試料貯蔵ループによって互いに連結された、第１試料貯蔵ループ連結ポート及び第２試料貯蔵ループ連結ポートと、溶媒流入ポート、溶媒流出ポートとを含み、前記試料流入弁は、前記試料流入ポートと前記第１試料貯蔵ループ連結ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記試料放出ポートが流体連通される、第１モードと、前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流出ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流入ポートが流体連通される、第２モードと、を含みうる。
【００２２】
また、前記連結弁は、第１流入ポート、第２流入ポート、第１連結ポート、第２連結ポート、第１流出ポート、及び第２流出ポートを含み、前記連結弁は、前記第１流入ポート、前記第１連結ポート、前記第２連結ポート、前記第１流出ポートが順次に流体連通される第１モードと、前記第２流入ポート、前記第２連結ポート、前記第１連結ポート、前記第２流出ポートが順次に流体連通される第２モードと、を含みうる。
また、前記連結弁には、互いに流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成されることが望ましい。
【００２３】
また、前記多機能選択弁が流体通過モードである時、前記試料の１次元分離機能が行われ、カラム通過モードである時、前記試料の２次元分離機能が行われ、流体閉鎖モードである時、前記試料のオンライン消化機能が行われ、二酸化チタンカラム通過モードである時、リン酸化ペプチド抽出機能が行われることが望ましい。
【００２４】
また、前記トラップ弁は、前記固相抽出カラムと連通される固相抽出カラム連結ポートと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムと連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと、第１流入ポートと、第２流入ポートと、前記固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループによって連結された試料移動ループ連結ポートと、放出ポートとを含みうる。
【００２５】
また、前記トラップ弁は、前記固相抽出カラム連結ポートと前記第１流入ポートが流体連通され、前記試料移動ループ連結ポートと前記放出ポートが流体連通される、第１モードと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと前記固相抽出カラム連結ポートが流体連通され、前記第２流入ポートと前記試料移動ループ連結ポートが流体連通される、第２モードと、を含みうる。
【００２６】
また、前記試料流入弁の溶媒流出ポートと前記連結弁の第１流入ポートは、流体連通され、前記連結弁の第１流出ポートと前記多機能選択弁の流入ポートは、流体連通され、前記多機能選択弁の流出ポートと前記トラップ弁の第１流入ポートは、流体連通され、前記連結弁の第２流出ポートと前記トラップ弁の第２流入ポートは、流体連通されることが望ましい。
【００２７】
また、前記固相抽出カラムで、流入される試料の流れ方向と前記逆相液体クロマトグラフィーカラムに向けて溶出される試料の流れ方向は、互いに反対であることが望ましい。
また、前記溶媒供給ポンプには、第１溶媒、または第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を供給できるように溶媒選択弁が設けられたことが望ましい。
【００２８】
本発明は、前述した第３の課題を果たすために、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体通過モードに設定するステップと、（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、（ｄ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、前記（ｄ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法を提供する。
ここで、前記（ｃ）ステップ中に、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
【００２９】
また、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
【００３０】
また、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体閉鎖モードに設定するステップと、（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒の圧力を上昇させるステップと、（ｄ）前記多機能選択弁を流体通過モードに変更し、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、（ｅ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料流入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、前記（ｅ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法を提供する。
【００３１】
ここで、前記（ｄ）ステップ中に、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
また、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の一実施形態による多機能選択弁を利用すれば、流体の移動経路を変更させることによって、脱塩過程及び試料濃縮が可能な１次元分離機能、試料分離カラムを利用した１次元分離と逆相２次元分離とを連結して分離効率を高めうる２次元分離機能、溶媒に高圧を生成してタンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能を逆相液体クロマトグラフィー装置で行うことができる。さらに、二酸化チタンカラムを用いてリン酸化ペプチドを選択的に抽出する機能も、逆相液体クロマトグラフィー装置で具現することができる。
【００３３】
また、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、１個の溶媒供給ポンプを使いながら、１次元分離機能、２次元分離機能、オンライン消化機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能を選択的に行うことができる。
【００３４】
また、本発明の一実施形態による試料分析方法によれば、前述した多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて１次元分離機能、２次元分離機能、オンライン消化機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能を必要に応じて組み合わせて試料の分析を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】本発明の一実施形態による多機能選択弁の多様なモードの構成図である。
【図１Ｂ】本発明の他の実施形態による多機能選択弁の多様なモードの構成図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、試料注入での各弁の構成図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、オンライン消化機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｃ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、１次元分離機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｄ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、２次元分離機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｅ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、リン酸化ペプチド抽出機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｆ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、試料分析段階での各弁の構成図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、エノラーゼペプチドに対して１次元及び２次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、エノラーゼペプチドに対して１次元及び２次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図４Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、イーストペプチドに対して２次元及び１次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、イーストペプチドに対して２次元及び１次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図５Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、β−カゼインペプチドに対して１次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、β−カゼインペプチドに対して１次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、望ましい実施形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これら実施形態は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲が、これによって制限されないということは、当業者に自明である。
【００３７】
本発明の一実施形態による多機能選択弁３００は、図１Ａに示したように、流入ポート３０１、流出ポート３０７、試料分離カラム３１０の両端がそれぞれ連結される第１試料分離カラム連結ポート３０２、第２試料分離カラム連結ポート３０３、これらポートと選択的に連結可能に構成された第１選択ポート３０４、第２選択ポート３０５、及び第３選択ポート３０６を含んで構成される。
【００３８】
この多機能選択弁３００は、液体クロマトグラフィー装置で試料が注入される試料流入弁で注入された試料の分析がなされる逆相液体クロマトグラフィーカラムが連結されるトラップ弁に向ける流路に位置することができる。
本発明による多機能選択弁３００は、各フォードの連結状態を変更することによって、次のような３種のモードを含みうる。
【００３９】
まず、最初のモードは、試料流入弁から排出される流体を流入してトラップ弁に排出させる流体通過モードである。この流体通過モードでは、図１Ａ（ａ）に示したように、流入ポート３０１と流出ポート３０７とを互いに直接流体連通させる。この際、第２試料分離カラム連結ポート３０３と第１選択ポート３０４、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６が、それぞれ互いに流体連通されうる。したがって、このようなポートの連結関係では、試料流入弁から流入される流体が試料分離カラム３１０を通過せずに流入ポート３０１及び流出ポート３０７を経て直ちにトラップ弁側に排出させる。
【００４０】
二番目のモードは、試料流入弁から排出される流体が試料分離カラム３１０を通過してトラップ弁に排出させるカラム通過モードである。このカラム通過モードの各ポートの間の連結関係が、図１Ａ（ｂ）に示されている。すなわち、流入ポート３０１と第１試料分離カラム連結ポート３０２、第２試料分離カラム連結ポート３０３と流出ポート３０７が、それぞれ互いに流体連通されるように連結されている。この際、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６は、互いに流体連通されうる。したがって、多機能選択弁３００に流入される流体は、流入ポート３０１、第１試料分離カラム連結ポート３０２、試料分離カラム３１０、第２試料分離カラム連結ポート３０３、流出ポート３０７を順次に経てトラップ弁側に排出される。
【００４１】
三番目のモードは、試料流入弁から排出される流体が、多機能選択弁３００の内部への流入が防止される流体閉鎖モードである。図１Ａ（ｃ）に示したように、このモードでは、流入ポート３０１と流出ポート３０７が、互いに流体断絶されている。したがって、試料流入弁から排出される流体は、多機能選択弁３００の入口で詰まる。流体閉鎖モードの一例として、流入ポート３０１に流体が流入されないようにするために、第１試料分離カラム連結ポート３０２と第２選択ポート３０５、第２試料分離カラム連結ポート３０３と第３選択ポート３０６、第１選択ポート３０４と流出ポート３０７が、それぞれ互いに流体連通されるように構成することができる。
【００４２】
後述するように、多機能選択弁の流体通過モードは、液体クロマトグラフィー装置の１次元分離機能、カラム通過モードは、試料分離カラムを利用した２次元分離機能、流体閉鎖モードは、溶媒の圧力を高めてタンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能を液体クロマトグラフィー装置で具現する。したがって、多機能選択弁に流入及び流出される流体の流路を案内または閉鎖するポートの構成であれば、前述したポートの個数及びその連結関係は、一実施形態に過ぎず、これに限定されるものではないことは、当業者に自明である。
【００４３】
一方、試料分離カラム３１０は、逆相液体クロマトグラフィーカラムと結合して２次元分離機能を行うことができるあらゆるカラムになる。例えば、強陽イオン交換（Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  ｅＸｃｈａｎｇｅ、ＳＣＸ）カラム、弱陰イオン交換（Ｗｅａｋ  Ａｎｉｏｎ  ｅＸｃｈａｎｇｅ、ＷＡＸ）カラム、親水クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＬＩＣ）カラム、強弱イオン混合（ＳＣＸ−ＷＡＸ  ＭＩＸＥＤ）カラムなどが試料分離カラムとして利用されうる。
図１Ｂは、本発明の他の実施形態による多機能選択弁の多様なモードにおいて、各ポートの構成を示す図である。
【００４４】
図１Ｂに示された多機能選択弁には、試料分離カラム３１０と別途に二酸化チタンカラム３１１が連結されうるので、前述した機能の以外に試料を二酸化チタンカラム３１１に通過させることによって、リン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出することができるリン酸化ペプチド抽出機能を付加的に行うことができる。
【００４５】
すなわち、図１Ｂに示された多機能選択弁は、図１Ａに示された多機能選択弁にさらに二酸化チタンカラム３１１の両端が連結される第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８、及び第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９を含んで構成することができる。したがって、以下、図１Ａに示された多機能選択弁と異なる構成についてのみ別途に説明する。
【００４６】
図１Ｂ（ａ）は、流体通過モードを示すものであって、流入ポート３０１と流出ポート３０７が、流体連通されるが、この際、選択ポートの連結関係は、第１選択ポート３０４と第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６が、それぞれ互いに流体連通されて構成することができる。
【００４７】
図１Ｂ（ｂ）は、カラム通過モードを示すものであって、流入ポート３０１と第１試料分離カラム連結ポート３０２、流出ポート３０７と第２試料分離カラム連結ポート３０３が、それぞれ互いに流体連通されるが、この際、選択ポートの連結関係は、図１Ａ（ａ）と同様に構成することができる。
図１Ｂ（ｃ）は、流体閉鎖モードを示すものであって、第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８を閉鎖させて具現することができる。
【００４８】
図１Ｂ（ｄ）は、二酸化チタンカラム通過モードを示すものであって、流入ポート３０１と第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８、流出ポート３０７と第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９とを、それぞれ互いに流体連通させるが、この際、選択ポートの連結関係は、第１選択ポート３０４と第１試料分離カラム連結ポート３０２、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６が、それぞれ互いに流体連通されて構成することができる。
前述した選択ポートの連結構成は、各モードを行うことができる場合であれば、如何なる組合わせでも可能であるということはいうまでもない。
【００４９】
以下、前述した多機能選択弁３００を含む本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置について説明する。図１Ｂに示された多機能選択弁は、図１Ａに示された多機能選択弁のあらゆる機能を含んで具現可能であるので、以下、便宜上、図１Ｂに示された９ポートを含む多機能選択弁３００を例として説明する。
【００５０】
本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、図２Ａに示したように、分析対象となる試料が注入される試料流入弁１００と、固相抽出カラム４１０、及び逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０と流体連通されるトラップ弁４００と、前記試料流入弁から前記トラップ弁に向ける流路に位置し、試料分離カラム３１０と選択的に二酸化チタンカラム３１１が連結される多機能選択弁３００と、試料流入弁から流出される流体を多機能選択弁３００、またはトラップ弁４００に選択的に供給する連結弁２００と、を含む。
【００５１】
図２Ａは、試料注入段階で弁の構成図を示す図である。
試料流入弁１００は、分析しようとする試料を流入して試料を注入する弁であって、試料流入ポート１０１、試料放出ポート１０２、試料貯蔵ループ１０７によって互いに連結された第１試料貯蔵ループ連結ポート１０３、及び第２試料貯蔵ループ連結ポート１０４、溶媒流入ポート１０５、及び溶媒流出ポート１０６を含みうる。
【００５２】
図２Ａに示された試料流入弁の状態は、試料が注入される段階を示すものであって、試料流入ポート１０１と第１試料貯蔵ループ連結ポート１０３、試料放出ポート１０２と第２試料貯蔵ループ連結ポート１０４が、それぞれ互いに流体連通されていて、試料は、試料流入ポート１０１を通じて試料貯蔵ループ１０７に流入されうる。このような試料貯蔵ループ１０７を通じてユーザが試料の濃度が過度に低いと判断する場合には、試料注入を複数回反復することによって、十分な試料濃度が得られる。
【００５３】
試料貯蔵ループ１０７は、１μｌないし１０μｌの体積を有することが望ましく、試料貯蔵ループ１０７の体積が１μｌ未満である場合には、試料の取り扱いが難しいという問題点があり、１０μｌを超過する場合には、試料注入時間が長くなる問題点があって望ましくない。
【００５４】
また、試料流入弁１００は、試料放出ポート１０２を含むが、試料放出ポート１０２は、試料が試料貯蔵ループ１０７で前述した体積範囲内に収容されるように余分の試料を放出する役割を果たす。
【００５５】
前述したように、試料の流入が完了すれば、試料流入弁１００のモード転換スイッチ（図示せず）を用いて試料流入弁の連結状態を図２Ａに示された第１モードから図２Ｂに示された第２モードに変換させる。
【００５６】
試料流入弁１００の第２モードでは、第１試料貯蔵ループ連結ポート１０３と溶媒流出ポート１０６が、流体連通され、第２試料貯蔵ループ連結ポート１０４と溶媒流入ポート１０５が、流体連通されるように構成される。
【００５７】
本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、試料流入弁１００または連結弁２００に溶媒を供給する溶媒供給ポンプ５００をさらに含みうる。
【００５８】
溶媒供給ポンプ５００は、５，０００ｐｓｉないし２０，０００ｐｓｉの圧力で溶媒を供給することが望ましいが、溶媒の供給圧力が５，０００ｐｓｉ未満である場合には、使用可能なカラム長が短くなって分離分解能が低下する問題点があり、２０，０００ｐｓｉを超過する場合には、弁で溶媒が漏れる恐れがあって望ましくない。
【００５９】
溶媒供給ポンプ５００から供給される溶媒は、第１溶媒または第１溶媒と第２溶媒との混合物であり得る。このために、溶媒供給ポンプ５００には、第１溶媒または第１溶媒と第２溶媒とが一定比率で混ぜられた混合溶媒を供給できるように溶媒選択弁（図示せず）が設けられることもある。
また、溶媒供給ポンプ５００には、試料流入弁１００または連結弁２００に溶媒を選択的に供給するＴ字型溶媒分離管５１０が連結されうる。
【００６０】
図２Ｂは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置がオンライン消化機能を行う場合の弁の構成図である。
溶媒供給ポンプを通じて溶媒流入ポートから第１溶媒が試料流入弁１００に流入され、供給される第１溶媒の油圧によって試料貯蔵ループ１０７に泊まった試料は、溶媒流出ポート１０６を通じて排出され、連結弁に至る。
【００６１】
連結弁２００は、第１流入ポート２０１、第２流入ポート２０２、第１連結ポート２０３、第２連結ポート２０４、第１流出ポート２０５、及び第２流出ポート２０６を含みうる。
【００６２】
連結弁２００の第１流入ポート２０１は、試料流入弁１００の溶媒流出ポート１０６と流体連通されているので、溶媒供給ポンプから流入された第１溶媒は、試料と共に連結弁２００の第１流入ポート２０１、第１連結ポート２０３、第２連結ポート２０４、第１流出ポート２０５を順次に経ながら連結弁を通過する。この際、図２Ｂに示したように、連結弁には、互いに流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成される。
【００６３】
連結弁２００を通過した第１溶媒は、連結弁２００の第１流出ポート２０５と流体連通された多機能選択弁３００の流入ポート３０１とを通じて多機能選択弁に至る。この際、多機能選択弁３００の各ポートの構成は、前述した流体閉鎖モード状態になる。すなわち、流入ポート３０１と流出ポート３０７は、互いに流体断絶されているが、これは、第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８を閉鎖させることで具現可能である。前述したように、流体閉鎖モードの具現は、多機能選択弁３００の流入ポート３０１と流出ポート３０７とを流体断絶させる構成であれば、如何なるものでも可能である。
【００６４】
したがって、流入される第１溶媒は、多機能選択弁３００を通過することができず、これにより、供給される第１溶媒の圧力は次第に増加する。このように、溶媒の移送過程で溶媒の流れを塞いで高圧力を発生させることによって、タンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能が行われる。この場合、オンライン消化機能は、溶媒の圧力が増加するほどその効率が向上するので、第１溶媒の圧力を弁の最大許容圧力まで高めることが良い。
【００６５】
オンライン消化機能が行われた以後、試料の脱塩及び濃縮のための１次元分離過程が行われる。図２Ｃは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、１次元分離機能を行う場合の弁の構成図である。
【００６６】
図２Ｃに示したように、１次元分離機能を行うために、多機能選択弁３００で流入ポート３０１と流出ポート３０７とを互いに流体連通させる。したがって、流入ポートから流入された溶媒が試料分離カラム３１０を通過せずに流出ポートを通じてトラップ弁４００側に排出されうる。
【００６７】
トラップ弁４００は、固相抽出カラム４１０と連通される固相抽出カラム連結ポート４０２、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０と連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポート４０６、第１流入ポート４０１、第２流入ポート４０４、固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループ４０７とによって、連結された試料移動ループ連結ポート４０３、及び放出ポート４０５を含みうる。そして、トラップ弁４００の第１流入ポート４０１は、多機能選択弁３００の流出ポート３０７と流体連通されている。
【００６８】
多機能選択弁３００を通過した第１溶媒は、トラップ弁４００に至るが、この際、トラップ弁の各フォードは、第１流入ポート４０１と固相抽出カラム連結ポート４０２、試料移動ループ連結ポート４０３と放出ポート４０５が、それぞれ互いに流体連通されるように構成されている。
【００６９】
したがって、多機能選択弁３００から排出されて第１溶媒と共に移送された試料は、第１流入ポート４０１を経由して固相抽出カラム連結ポート４０２を通じて固相抽出カラム４１０に注入される。この際、注入される試料の流れ方向は、示された矢印方向のようである。
【００７０】
固相抽出カラム４１０は、固相抽出カラム連結ポート４０２に直接結合されたカラムであって、本発明において、固相抽出カラム４１０は、５０μｍないし５００μｍの内径及び１ｃｍないし４ｃｍの長さを有するが、これは、従来の通常的な固相抽出カラムに比べて非常に短い長さを有するものであって、本発明では、約１０，０００ｐｓｉ程度の超高圧で駆動されるにもかかわらず、固相抽出カラム長が前述したように非常に小さいために、試料の分離分解能を極大化させうる。また、後述するように、流入される試料の流れ方向と逆相液体クロマトグラフィーカラムに向けて溶出される試料の流れ方向が、互いに反対であるので、さらに向上した試料分離分解能を果たすことができる。
【００７１】
また、本発明では、固相抽出カラム４１０で内部インデューサ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ）のステンレススチールライナー（ｌｉｎｅｒ）を使い、Ｃ１８などの物質を内部に充填させた後、両末端を約２μｍ程度の細工サイズを有するステンレススチールスクリーンで塞いで充填物の流出を遮断することによって、高圧力に耐えることができる堅固な固相抽出カラムを利用できる。
【００７２】
一方、第１溶媒の油圧によって固相抽出カラム４１０に流入される試料は、０．５μｌ／分ないし１０μｌ／分の流速で第１溶媒が放出されることによって、その流速が調節される。また、放出ポート４０５は、試料中に含有された塩成分を共に放出することによって、効率的な脱塩工程がなされるようにする。
次いで、第１溶媒が試料分離カラムを通過させて試料を分画した後、試料の脱塩及び濃縮効率を高めうる２次元分離機能を説明する。
図２Ｄは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、２次元分離機能を行う場合の弁の構成図である。
【００７３】
２次元分離機能を行うためには、１次元分離機能での試料流入弁１００、連結弁２００、及びトラップ弁４００の弁構成は、そのまま保持し、多機能選択弁３００のモードを流体通過モードからカラム通過モードに転換させれば良い。すなわち、図２Ｄに示したように、カラム通過モードでは、流入ポート３０１と第１試料分離カラム連結ポート３０２、流出ポート３０７と第２試料分離カラム連結ポート３０３が、それぞれ互いに流体連通される。したがって、多機能選択弁３００に流入された第１溶媒は、試料分離カラム３１０を通過してトラップ弁４００に移送され、これにより、試料の分画がなされた後に試料の脱塩及び試料の濃縮効率をさらに高めうる。
次いで、第１溶媒が、二酸化チタンカラムを通過させてリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出するリン酸化ペプチド抽出機能を説明する。
図２Ｅは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、リン酸化ペプチド抽出機能を行う場合の弁の構成図である。
【００７４】
リン酸化ペプチド抽出機能を行うためには、２次元分離機能での試料流入弁１００、連結弁２００、及びトラップ弁４００の弁構成は、そのまま保持し、多機能選択弁３００のモードをカラム通過モードから二酸化チタンカラム通過モードに転換させれば良い。すなわち、図２Ｅに示したように、二酸化チタンカラム通過モードでは、流入ポート３０１と第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８、流出ポート３０７と第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９が、それぞれ互いに流体連通される。したがって、多機能選択弁３００に流入された第１溶媒は、二酸化チタンカラム３１１を通過してトラップ弁４００に移送され、これにより、試料内にリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出する。
【００７５】
今までは、試料が試料流入ポート１０１を通じて試料貯蔵ループ１０７に所定量満たされた後、第１溶媒を用いて試料のオンライン消化機能、１次元分離機能、２次元分離機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能が行われる過程を説明した。
【００７６】
次の過程としては、固相抽出カラム４１０に注入された試料を第２溶媒を使って分離することによって、試料を分析する過程が行われなければならないので、これについて説明する。
図２Ｆは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置で試料分析段階での弁の構成図である。
【００７７】
図２Ｆを参照すると、試料分析過程で試料流入弁１００の連結関係は、溶媒流入ポート１０５、及び溶媒流出ポート１０６を断絶させて、溶媒分離管５１０を通じて注入される溶媒が試料流入弁１００を経ずに直接連結弁２００に供給させうる。すなわち、この際の試料流入弁１００の各ポートの連結関係は、試料注入段階でのそれと同様に構成することができる。
試料分析過程での溶媒は、第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒が使われ、混合溶媒の比率を異ならせて溶媒の傾きを通じて試料の分離がなされる。
【００７８】
また、連結弁２００の各ポートの連結関係は、第２流入ポート２０２、第２連結ポート２０４、第１連結ポート２０３、第２流出ポート２０６が順次に流体連通されて流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成される。
【００７９】
連結弁２００の第２流出ポート２０６は、トラップ弁４００の第２流入ポート４０４と流体連通されて、連結弁２００を通過した混合溶媒が多機能選択弁３００を経ずにトラップ弁４００に移送される。
【００８０】
トラップ弁４００では、逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポート４０６と固相抽出カラム連結ポート４０２、第２流入ポート４０４と試料移動ループ連結ポート４０３が、それぞれ互いに流体連通されるように、モードを変更する。したがって、第２流入ポート４０４を通じて流入された混合溶媒は、試料移動ループ４０７を経て固相抽出カラム４１０に至り、固相抽出カラム連結ポート４０２と逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポート４０６とを経て逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０を通過する。この際、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０に向けて溶出される試料の流れ方向（または、混合溶媒の流れ方向）は、矢印のようであり、これは、固相抽出カラムに流入される試料の流れ方向（または、第１溶媒の流れ方向）と反対であるので、試料の分離分解能をさらに改善させることができる。
【００８１】
固相抽出カラム４１０での試料分離は、溶媒供給ポンプ５００から供給される混合溶媒中の第１溶媒及び第２溶媒の比率を経時的に変化させながら行われる。すなわち、混合溶媒中の第２溶媒の比率が増加するほど固相抽出カラム４１０に結合された試料の解離程度が増加して、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０に流入され、以後試料の分離を通じて分析がなされる。
【００８２】
第１溶媒及び第２溶媒としては、前述したような目的を果たすために、多様な組合わせの溶媒が選択され、これに制限されるものではないが、前記第１溶媒として、０．１％のギ酸水溶液が使われ、前記第２溶媒として、９０％のアセトニトリル水溶液が使われる。すなわち、これは、全体溶媒のうちアセトニトリルの含量が増加するほど固相抽出カラムに結合された試料の解離程度が増加するシステムを採択したものと言える。
【００８３】
試料の分離が行われる逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０は、１０μｍないし１５０μｍの内径及び１０ｃｍないし１５０ｃｍの長さを有することが望ましく、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０は、質量分析器（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に連結されることによって、後続分析工程が行われる。
【００８４】
このように、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、試料流入弁１００、連結弁２００、多機能選択弁３００、及びトラップ弁４００を用いて１次元分離機能、２次元分離機能、オンライン消化機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能を必要に応じて選択的に行うことができる。本実施形態では、第１溶媒を用いてオンライン消化機能、１次元分離機能、２次元分離機能、リン酸化ペプチド抽出機能をいずれも行い、以後混合溶媒を用いて試料を分離及び分析する過程を一例として説明したが、必要に応じて多様な組合わせが可能であるということはいうまでもない。例えば、混合溶媒を使って試料の分離及び分析がなされる前に、１次元分離機能のみを行うか、１次元分離機能、及び２次元分離機能を共に行うか、先にオンライン消化機能を使って実験を行った後、１次元分離機能または２次元分離機能を選択して行うことができる。さらに、前述した各過程でリン酸化ペプチド抽出機能をさらに行うことができる。
【実施例】
【００８５】
機器
第１溶媒としては、０．１％のギ酸水溶液（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入）を使い、第２溶媒としては、０．１％ギ酸が含まれた１００％アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡから購入）を使った。
【００８６】
固相抽出カラム（７５μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×３ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）は、１２，０００ｐｓｉの圧力で融合−シリカ毛細管にＣ１８物質で充填させることで製作された。充填段階が完了した以後には、カラムに対して１２，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填されたＣ１８物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部分には、フリット（ｆｒｉｔ）を作って充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させて使った。
【００８７】
毛細管カラム（７５μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×８０ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）、すなわち、逆相液体クロマトグラフィーカラムは、融合−シリカ毛細管をＣ１８−結合粒子にスラリーパーキングさせることで製作した（Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｒ．，Ｂｌｏｎｄｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，３５９６−３６０５；Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｔｏｌｉｃ  Ｎ．，Ｍａｓｓｅｌｏｎ，Ｃ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，７６，１４４−１５４；Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｕｎｇｅｒ  Ｋ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ，Ｄ．，Ｌｕｂｄａ，Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，７７，６６９２−６７０１）。
【００８８】
充填段階が完了した以後には、カラムに対して１２，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填されたＣ１８物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部には、フリットを作って充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させて使った。
【００８９】
試料分離カラムの一例として使われた強陽イオン交換カラム（１５０μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×１５ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）は、１０，０００ｐｓｉの圧力で５μｍパーティースペア強陽イオン交換レジン（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）にスラリーパーキングさせることで製作された。充填段階が完了した以後には、カラムに対して１０，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填された物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部には、フリットを作った後に充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させた。
【００９０】
二酸化チタンカラム（１５０μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×１０ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）は、５，０００ｐｓｉの圧力で粒子大きさが１０μｍになる二酸化チタン（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）をスラリーパーキングさせることで製作された。充填段階が完了した以後には、カラムに対して５，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填された物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部には、フリットを作った後に充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させた。
【００９１】
一方、逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される質量分析器（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）としては、ナノ電子噴霧イオン化インターフェース（ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を備えた７−テスラフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器（７−ｔｅｓｌａ  Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｏｎ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＦＴＩＣＲ、ＬＴＱ−ＦＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を使った。
【００９２】
＜第１実施例＞
試料
分析試料として、パン用イースト（ｂａｋｅｒｓ  ｙｅａｓｔ）から分離したエノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから購入）を使い、試料の前処理は、配列級変形ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡから購入）を用いてタンパク質消化過程を経て得られたペプチドを使い、試料の濃度は２０ｎｇである。
【００９３】
分析結果の評価
濃度２０ｎｇのエノラーゼに対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、１次元分離実験を行った。すなわち、第１溶媒として、０．１％のギ酸水溶液を用いてエノラーゼ試料を固相抽出カラムに送った後、これを逆相クロマトグラフィー方法によって分離し、引き続き、質量分析器を通じて得た分離された試料のクロマトグラムを図３Ａに示した。３回の実験を行った時、ほぼ類似した再現性ある結果を得て、分離分解能も優れると確認された。
【００９４】
一方、同じ試料に対して２次元分離試験の結果を図３Ｂに示した。図３Ｂで、上側５個のグラフは、第１溶媒（５００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリル水溶液またはこれらの混合物）の組成を順次に変更しながら、強陽イオン交換カラムを通過させて２次元分離実験を行った結果であり、最も下側のグラフは、１次元分離実験の結果である。図３Ｂに示したように、１次元分離実験の結果と２次元分離実験の結果とを総合的に比較した時、互いに一致する結果が見えることを確認することができた。
【００９５】
＜第２実施例＞
試料
さらに複雑なプロテオーム試料に対する分析を行うために、酵母前溶解液（ｗｈｏｌｅｌｙｓａｔｅ）のトリプシン分解ペプチドを使った。酵母プロテオームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ半数体菌株（ｈａｐｌｏｉｄ  ｓｔｒａｉｎｓ）であるＹ２８０５（ＭＡＴｐｅｐ：ｈｉｓ３  ｐｒｂ１−Ｄ１．６Ｒ  ｃａｎ１  ｈｉｓ１−２００  ｕｒａ３−５２）及びＡＦ−２（ＨＭＬａ  ｏｒ  ＨＭＲａ  ｈｏ  ａｄｅ２−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００  ｌｅｕ２−３、１１２  ｈｉｓ３−１１、１５  ｕｒａ３−１  ｓｓｄ１）を使った（Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｓ．，Ｃｈｏｉｅ，Ｗ．−Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｓ．−Ｗ．，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，２５，１８３３−１８３９．）。この場合、タンパク質を１００ｍＭアンモニウム重炭酸塩水溶液に溶解させた後、トリプシンを加えて３７℃で２４時間タンパク質消化を通じて加水分解をさせた。結果物は、ＳｐｅｅｄＶａｃ  ｓｙｓｔｅｍ（ＳＰＤ１０１０；ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ、Ｈｏｌｂｒｏｏｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使って完全に乾燥させた後、次の実験を行うまで−２０℃で保管した。使ったイーストペプチド試料の濃度は、２０μｇである。
【００９６】
分析結果の評価
濃度２０μｇのイーストペプチドに対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、１次元及び２次元分離実験を行った。図４Ａは、第１溶媒（５００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリル水溶液またはこれらの混合物）の組成を順次に増加させながら、強陽イオン交換カラムを通過させて２次元分離実験を行った結果であり、図４Ｂは、第１溶媒として、０．１％ギ酸が含まれた１００％アセトニトリルの組成変化を利用した１次元分離実験の結果である。１次元で得られる結果より２次元分離実験の結果で、各区画別にさらに多いピークが存在することを示す結果であって、２次元分離実験を通じてさらに多いペプチドが確認され、１次元分析結果に情報力を高めると同時に、分析の効率性を増大させることが分かった。
【００９７】
＜第３実施例＞
試料
分析試料として、β−カゼイン（β−ｃａｓｅｉｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから購入）を使い、試料の前処理は、配列級変形ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡから購入）を用いてタンパク質消化過程を経て得られたペプチドを使い、この際、試料の濃度は、５０ｎｇである。
【００９８】
分析結果の評価
前述した試料に対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、１次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った。図５Ａは、第１溶媒として、０．１％ギ酸が含まれた１００％アセトニトリルの組成変化を用いて行った１次元分離実験結果を、図５Ｂは、第１溶媒として、０．１％トリフルオロ酢酸と乳酸とが含まれた８０％アセトニトリルを用いて二酸化チタンカラムを通過させながら、リン酸化ペプチドのみをカラムに付着させた後、３００ｍＭアンモニウム重炭酸塩水溶液で溶出させてリン酸化ペプチドのみを選択的に抽出した結果を示すグラフである。図５Ａに示したように、１次元分離のみでは、リン酸化ペプチドが存在するが、他のピークに遮蔽されて確認しにくいが、図５Ｂに示したように、β−カゼインペプチドを二酸化チタンカラムを通過させた時、リン酸化されたペプチドのみ選択的に抽出される結果を確認することができた。
本発明の単純な変形または変更は、いずれも当業者によって容易に実施され、このような変形や変更は、いずれも本発明の領域に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、多機能選択弁、それを含む多機能液体クロマトグラフィー装置及びそれを利用した試料分析方法に利用されうる。
【図１Ａ】
2013504756.tif 000003
【図１Ｂ】
2013504756.tif 000004
【図２Ａ】
2013504756.tif 000005
【図２Ｂ】
2013504756.tif 000006
【図２Ｃ】
2013504756.tif 000007
【図２Ｄ】
2013504756.tif 000008
【図２Ｅ】
2013504756.tif 000009
【図２Ｆ】
2013504756.tif 000010
【図３Ａ】
2013504756.tif 000011
【図３Ｂ】
2013504756.tif 000012
【図４Ａ】
2013504756.tif 000013
【図４Ｂ】
2013504756.tif 000014
【図５Ａ】
2013504756.tif 000015
【図５Ｂ】
2013504756.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月13日(2012.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多機能選択弁に係り、より詳細には、クロマトグラフィー用溶媒の流れを変更させることによって、逆相液体クロマトグラフィー装置で１次元及び２次元分離機能、オンライン消化機能だけではなく、選択的にリン酸化ペプチド抽出機能の遂行が可能な多機能選択弁、それを含む多機能全自動液体クロマトグラフィー装置及びそれを利用した試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オンライン固相抽出及び逆相液体クロマトグラフィー（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、その分析効率性が非常に優れて、プロテオーム研究において、非常に重要な技術として認識されている。特に、これは、微細量の生体物質を効果的に分離し、分析物−固相反応範囲が広くて高効率で微細量のタンパク質を同定することを可能にする。
【０００３】
タンパク質を分析する方法として、質量分析法に基づいた方法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ）は、プロテオーム研究の標準分析プラットフォームになっており、代表的な例として、ショットガン方法またはボトムアップ方法などは、質量分析器を使った分析以前にタンパク質を加水分解してペプチドに分解するが、このような加水分解は、生体試料の溶解度を増加させ、質量分析器中で容易にイオン化及び検出が可能なペプチド切片を生成する。
【０００４】
しかし、このような工程は、不可避に試料の複雑性を引き起こすようになり、例えば、最も単純なプロテオームのうちの一つである酵母プロテオームの場合にも、約６，０００余個の多様なタンパク質から３００，０００個以上のペプチド切片が生成される。したがって、このような試料複雑性を解決するための方便として、オン／オフライン多次元タンパク質同定技術（ｏｎ−／ｏｆｆ−ｌｉｎｅ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような多様な方法が開発されたが（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．，Ｅｎｇ，Ｊ．，Ｓｃｈｉｅｌｔｚ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｒｍａｃｋ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，６７６−６８２；Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｉ．，Ｈｅｗｅｌ，Ｊ．，Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｂ．，Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．ＩＩＩ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００６，５，５３−５６．）、液体クロマトグラフィーカラムの効率性及び感度を改善しなければならない必要性は依然として存在する。この際、液体クロマトグラフィー／質量分析法実験の感度は、分離カラム長を一定に保持した状態で、内径を減少させる場合に急増するという事実が知られている（Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｓ．，Ｃｈｏｉｅ，Ｗ．−Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｓ．−Ｗ．，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，２５，１８３３−１８３９．）。
【０００５】
また、相当量の洗剤及び塩を含む生物試料の場合において、オンライン脱塩工程（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｓｔｅｐ）は、質量分析以前に経なければならない必須的な過程であるが、これは、このような不純物が分析しようとするペプチド試料のイオン化過程を妨害して、ペプチド試料に対する検出感度を落とすためである。この際、時間節約及び試料損失などを勘案すれば、オンライン脱塩工程がオフライン脱塩工程より有利である。
【０００６】
一方、従来の逆相液体クロマトグラフィー装置は、固相抽出カラムを採用して試料を脱塩させて濃縮させる１次元分離機能のみを有するか、強陽イオン交換クロマトグラフィー装置と逆相液体クロマトグラフィーをオンラインで連結して２次元分離機能を行う２次元逆相液体クロマトグラフィー装置の場合にも、相互干渉現象などによって正確な分析を行いにくいか、複数個の溶媒供給ポンプが不可避であって、これを制御するための多数個の弁によって、その構造が複雑になる問題点があった。さらに、このような２次元オンライン逆相液体クロマトグラフィー装置では、タンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化（Ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）機能や、リン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出する機能を行うことができない問題点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前述した問題点を解決するためのものであって、本発明が解決しようとする第１の課題は、脱塩過程及び試料濃縮が可能な逆相１次元分離機能、１次元分離カラムを利用した１次元分離と逆相２次元分離とを連結して分離効率を高めうる２次元分離機能、クロマトグラフィー用溶媒に高圧を生成してタンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能、及び二酸化チタンカラムを用いてリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出する機能を逆相液体クロマトグラフィー装置で具現することができる多機能選択弁を提供することである。
【０００８】
本発明が解決しようとする第２の課題は、１個の溶媒供給ポンプを使いながら、前述した機能を自動化して、多機能選択弁の単純操作のみで選択的に行うことができる多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を提供することである。
【０００９】
本発明が解決しようとする第３の課題は、前述した多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料の分析を効率的に行うことができる試料分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前述した第１の課題を果たすために、多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に１次元分離カラムの両端が連結される多機能選択弁であって、流入される流体が、如何なるカラムも通過せずに排出される流体通過モード（ｍｏｄｅ）と、流入される流体が、前記１次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、を含む多機能選択弁を提供する。
【００１１】
ここで、前記多機能選択弁の多重ポートは、流入ポートと、流出ポートと、前記１次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第１連結ポート及び第２連結ポートと、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートとを含みうる。
【００１２】
また、前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１連結ポートが、前記流出ポートと前記第２連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶されることが望ましい。
【００１３】
また、前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、前記流体通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、前記第２連結ポートと前記第１選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記カラム通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記第１連結ポートと前記第２選択ポートが、前記第２連結ポートと前記第３選択ポートが、前記第１選択ポートと前記流出ポートが、それぞれ互いに流体連通されることが望ましい。
【００１４】
本発明の他の側面によれば、多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に１次元分離カラムの両端が連結され、前記多重ポートの他の一部に二酸化チタンカラムの両端が連結される多機能選択弁であって、流入される流体が、如何なるカラムも通過せずに排出される流体通過モードと、流入される流体が、前記１次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、流入される流体が、前記二酸化チタンカラムを通過して排出される二酸化チタンカラム通過モードと、を含む多機能選択弁を提供する。
【００１５】
ここで、前記多機能選択弁の多重ポートは、流入ポート、流出ポート、前記１次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される第１連結ポート、及び第２連結ポート、前記二酸化チタンカラムの両端にそれぞれ連結される第１二酸化チタンカラム連結ポート、及び第２二酸化チタンカラム連結ポート、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートを含みうる。
【００１６】
また、前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１連結ポートが、前記流出ポートと前記第２連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶され、前記二酸化チタンカラム通過モードで前記流入ポートと前記第１二酸化チタンカラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることが望ましい。
【００１７】
また、前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、前記流体通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記カラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、前記流体閉鎖モードで前記第１二酸化チタンカラム連結ポートを閉鎖させ、前記二酸化チタンカラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第１連結ポート、前記第３選択ポートと前記第２連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることが望ましい。
【００１８】
また、前記１次元分離カラムは、強陽イオン交換カラム、弱陰イオン交換カラム、親水クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムまたは強弱イオン混合カラムのうちの何れか一つであることをが望ましい。
【００１９】
本発明は、前述した第２の課題を果たすために、分析対象となる試料が注入される試料流入弁と、固相抽出カラム及び逆相液体クロマトグラフィーカラムと流体連通されるトラップ弁と、前記試料流入弁から前記トラップ弁に向ける流路に位置し、請求項１または請求項５による多機能選択弁と、前記試料流入弁から流出される流体を前記多機能選択弁または前記トラップ弁に選択的に供給する連結弁と、を含む多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を提供する。
【００２０】
ここで、多機能液体クロマトグラフィー装置は、前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を供給する溶媒供給ポンプをさらに含み、前記溶媒供給ポンプには、前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を選択的に供給するＴ字型溶媒分離管が連結されていることが望ましい。
【００２１】
また、前記試料流入弁は、試料流入ポートと、試料放出ポートと、試料貯蔵ループによって互いに連結された、第１試料貯蔵ループ連結ポート及び第２試料貯蔵ループ連結ポートと、溶媒流入ポート、溶媒流出ポートとを含み、前記試料流入弁は、前記試料流入ポートと前記第１試料貯蔵ループ連結ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記試料放出ポートが流体連通される、第１モードと、前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流出ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流入ポートが流体連通される、第２モードと、を含みうる。
【００２２】
また、前記連結弁は、第１流入ポート、第２流入ポート、第１連結ポート、第２連結ポート、第１流出ポート、及び第２流出ポートを含み、前記連結弁は、前記第１流入ポート、前記第１連結ポート、前記第２連結ポート、前記第１流出ポートが順次に流体連通される第１モードと、前記第２流入ポート、前記第２連結ポート、前記第１連結ポート、前記第２流出ポートが順次に流体連通される第２モードと、を含みうる。
また、前記連結弁には、互いに流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成されることが望ましい。
【００２３】
また、前記多機能選択弁が流体通過モードである時、前記試料の１次元分離機能が行われ、カラム通過モードである時、前記試料の２次元分離機能が行われ、流体閉鎖モードである時、前記試料のオンライン消化機能が行われ、二酸化チタンカラム通過モードである時、リン酸化ペプチド抽出機能が行われることが望ましい。
【００２４】
また、前記トラップ弁は、前記固相抽出カラムと連通される固相抽出カラム連結ポートと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムと連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと、第１流入ポートと、第２流入ポートと、前記固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループによって連結された試料移動ループ連結ポートと、放出ポートとを含みうる。
【００２５】
また、前記トラップ弁は、前記固相抽出カラム連結ポートと前記第１流入ポートが流体連通され、前記試料移動ループ連結ポートと前記放出ポートが流体連通される、第１モードと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと前記固相抽出カラム連結ポートが流体連通され、前記第２流入ポートと前記試料移動ループ連結ポートが流体連通される、第２モードと、を含みうる。
【００２６】
また、前記試料流入弁の溶媒流出ポートと前記連結弁の第１流入ポートは、流体連通され、前記連結弁の第１流出ポートと前記多機能選択弁の流入ポートは、流体連通され、前記多機能選択弁の流出ポートと前記トラップ弁の第１流入ポートは、流体連通され、前記連結弁の第２流出ポートと前記トラップ弁の第２流入ポートは、流体連通されることが望ましい。
【００２７】
また、前記固相抽出カラムで、流入される試料の流れ方向と前記逆相液体クロマトグラフィーカラムに向けて溶出される試料の流れ方向は、互いに反対であることが望ましい。
また、前記溶媒供給ポンプには、第１溶媒、または第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を供給できるように溶媒選択弁が設けられたことが望ましい。
【００２８】
本発明は、前述した第３の課題を果たすために、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体通過モードに設定するステップと、（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、（ｄ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、前記（ｄ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法を提供する。
ここで、前記（ｃ）ステップ中に、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
【００２９】
また、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
【００３０】
また、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体閉鎖モードに設定するステップと、（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒の圧力を上昇させるステップと、（ｄ）前記多機能選択弁を流体通過モードに変更し、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、（ｅ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料流入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、前記（ｅ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法を提供する。
【００３１】
ここで、前記（ｄ）ステップ中に、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
また、前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の一実施形態による多機能選択弁を利用すれば、流体の移動経路を変更させることによって、脱塩過程及び試料濃縮が可能な１次元分離機能、１次元分離カラムを利用した１次元分離と逆相２次元分離とを連結して分離効率を高めうる２次元分離機能、溶媒に高圧を生成してタンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能を逆相液体クロマトグラフィー装置で行うことができる。さらに、二酸化チタンカラムを用いてリン酸化ペプチドを選択的に抽出する機能も、逆相液体クロマトグラフィー装置で具現することができる。
【００３３】
また、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、１個の溶媒供給ポンプを使いながら、１次元分離機能、２次元分離機能、オンライン消化機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能を選択的に行うことができる。
【００３４】
また、本発明の一実施形態による試料分析方法によれば、前述した多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて１次元分離機能、２次元分離機能、オンライン消化機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能を必要に応じて組み合わせて試料の分析を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】本発明の一実施形態による多機能選択弁の多様なモードの構成図である。
【図１Ｂ】本発明の他の実施形態による多機能選択弁の多様なモードの構成図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、試料注入での各弁の構成図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、オンライン消化機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｃ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、１次元分離機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｄ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、２次元分離機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｅ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、リン酸化ペプチド抽出機能を行う過程での各弁の構成図である。
【図２Ｆ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置において、試料分析段階での各弁の構成図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、エノラーゼペプチドに対して１次元及び２次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、エノラーゼペプチドに対して１次元及び２次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図４Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、イーストペプチドに対して２次元及び１次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、イーストペプチドに対して２次元及び１次元分離実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図５Ａ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、β−カゼインペプチドに対して１次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて、β−カゼインペプチドに対して１次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、望ましい実施形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これら実施形態は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲が、これによって制限されないということは、当業者に自明である。
【００３７】
本発明の一実施形態による多機能選択弁３００は、図１Ａに示したように、流入ポート３０１、流出ポート３０７、１次元分離カラム３１０の両端がそれぞれ連結される第１連結ポート３０２、第２連結ポート３０３、これらポートと選択的に連結可能に構成された第１選択ポート３０４、第２選択ポート３０５、及び第３選択ポート３０６を含んで構成される。
【００３８】
この多機能選択弁３００は、液体クロマトグラフィー装置で試料が注入される試料流入弁で注入された試料の分析がなされる逆相液体クロマトグラフィーカラムが連結されるトラップ弁に向ける流路に位置することができる。
本発明による多機能選択弁３００は、各フォードの連結状態を変更することによって、次のような３種のモードを含みうる。
【００３９】
まず、最初のモードは、試料流入弁から排出される流体を流入してトラップ弁に排出させる流体通過モードである。この流体通過モードでは、図１Ａ（ａ）に示したように、流入ポート３０１と流出ポート３０７とを互いに直接流体連通させる。この際、第２連結ポート３０３と第１選択ポート３０４、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６が、それぞれ互いに流体連通されうる。したがって、このようなポートの連結関係では、試料流入弁から流入される流体が１次元分離カラム３１０を通過せずに流入ポート３０１及び流出ポート３０７を経て直ちにトラップ弁側に排出させる。
【００４０】
二番目のモードは、試料流入弁から排出される流体が１次元分離カラム３１０を通過してトラップ弁に排出させるカラム通過モードである。このカラム通過モードの各ポートの間の連結関係が、図１Ａ（ｂ）に示されている。すなわち、流入ポート３０１と第１連結ポート３０２、第２連結ポート３０３と流出ポート３０７が、それぞれ互いに流体連通されるように連結されている。この際、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６は、互いに流体連通されうる。したがって、多機能選択弁３００に流入される流体は、流入ポート３０１、第１連結ポート３０２、１次元分離カラム３１０、第２連結ポート３０３、流出ポート３０７を順次に経てトラップ弁側に排出される。
【００４１】
三番目のモードは、試料流入弁から排出される流体が、多機能選択弁３００の内部への流入が防止される流体閉鎖モードである。図１Ａ（ｃ）に示したように、このモードでは、流入ポート３０１と流出ポート３０７が、互いに流体断絶されている。したがって、試料流入弁から排出される流体は、多機能選択弁３００の入口で詰まる。流体閉鎖モードの一例として、流入ポート３０１に流体が流入されないようにするために、第１連結ポート３０２と第２選択ポート３０５、第２連結ポート３０３と第３選択ポート３０６、第１選択ポート３０４と流出ポート３０７が、それぞれ互いに流体連通されるように構成することができる。
【００４２】
後述するように、多機能選択弁の流体通過モードは、液体クロマトグラフィー装置の１次元分離機能、カラム通過モードは、１次元分離カラムを利用した２次元分離機能、流体閉鎖モードは、溶媒の圧力を高めてタンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能を液体クロマトグラフィー装置で具現する。したがって、多機能選択弁に流入及び流出される流体の流路を案内または閉鎖するポートの構成であれば、前述したポートの個数及びその連結関係は、一実施形態に過ぎず、これに限定されるものではないことは、当業者に自明である。
【００４３】
一方、１次元分離カラム３１０は、逆相液体クロマトグラフィーカラムと結合して２次元分離機能を行うことができるあらゆるカラムになる。例えば、強陽イオン交換（Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  ｅＸｃｈａｎｇｅ、ＳＣＸ）カラム、弱陰イオン交換（Ｗｅａｋ  Ａｎｉｏｎ  ｅＸｃｈａｎｇｅ、ＷＡＸ）カラム、親水クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＬＩＣ）カラム、強弱イオン混合（ＳＣＸ−ＷＡＸ  ＭＩＸＥＤ）カラムなどが１次元分離カラムとして利用されうる。
図１Ｂは、本発明の他の実施形態による多機能選択弁の多様なモードにおいて、各ポートの構成を示す図である。
【００４４】
図１Ｂに示された多機能選択弁には、１次元分離カラム３１０と別途に二酸化チタンカラム３１１が連結されうるので、前述した機能の以外に試料を二酸化チタンカラム３１１に通過させることによって、リン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出することができるリン酸化ペプチド抽出機能を付加的に行うことができる。
【００４５】
すなわち、図１Ｂに示された多機能選択弁は、図１Ａに示された多機能選択弁にさらに二酸化チタンカラム３１１の両端が連結される第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８、及び第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９を含んで構成することができる。したがって、以下、図１Ａに示された多機能選択弁と異なる構成についてのみ別途に説明する。
【００４６】
図１Ｂ（ａ）は、流体通過モードを示すものであって、流入ポート３０１と流出ポート３０７が、流体連通されるが、この際、選択ポートの連結関係は、第１選択ポート３０４と第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６が、それぞれ互いに流体連通されて構成することができる。
【００４７】
図１Ｂ（ｂ）は、カラム通過モードを示すものであって、流入ポート３０１と第１連結ポート３０２、流出ポート３０７と第２連結ポート３０３が、それぞれ互いに流体連通されるが、この際、選択ポートの連結関係は、図１Ａ（ａ）と同様に構成することができる。
図１Ｂ（ｃ）は、流体閉鎖モードを示すものであって、第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８を閉鎖させて具現することができる。
【００４８】
図１Ｂ（ｄ）は、二酸化チタンカラム通過モードを示すものであって、流入ポート３０１と第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８、流出ポート３０７と第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９とを、それぞれ互いに流体連通させるが、この際、選択ポートの連結関係は、第１選択ポート３０４と第１連結ポート３０２、第２選択ポート３０５と第３選択ポート３０６が、それぞれ互いに流体連通されて構成することができる。
前述した選択ポートの連結構成は、各モードを行うことができる場合であれば、如何なる組合わせでも可能であるということはいうまでもない。
【００４９】
以下、前述した多機能選択弁３００を含む本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置について説明する。図１Ｂに示された多機能選択弁は、図１Ａに示された多機能選択弁のあらゆる機能を含んで具現可能であるので、以下、便宜上、図１Ｂに示された９ポートを含む多機能選択弁３００を例として説明する。
【００５０】
本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、図２Ａに示したように、分析対象となる試料が注入される試料流入弁１００と、固相抽出カラム４１０、及び逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０と流体連通されるトラップ弁４００と、前記試料流入弁から前記トラップ弁に向ける流路に位置し、１次元分離カラム３１０と選択的に二酸化チタンカラム３１１が連結される多機能選択弁３００と、試料流入弁から流出される流体を多機能選択弁３００、またはトラップ弁４００に選択的に供給する連結弁２００と、を含む。
【００５１】
図２Ａは、試料注入段階で弁の構成図を示す図である。
試料流入弁１００は、分析しようとする試料を流入して試料を注入する弁であって、試料流入ポート１０１、試料放出ポート１０２、試料貯蔵ループ１０７によって互いに連結された第１試料貯蔵ループ連結ポート１０３、及び第２試料貯蔵ループ連結ポート１０４、溶媒流入ポート１０５、及び溶媒流出ポート１０６を含みうる。
【００５２】
図２Ａに示された試料流入弁の状態は、試料が注入される段階を示すものであって、試料流入ポート１０１と第１試料貯蔵ループ連結ポート１０３、試料放出ポート１０２と第２試料貯蔵ループ連結ポート１０４が、それぞれ互いに流体連通されていて、試料は、試料流入ポート１０１を通じて試料貯蔵ループ１０７に流入されうる。このような試料貯蔵ループ１０７を通じてユーザが試料の濃度が過度に低いと判断する場合には、試料注入を複数回反復することによって、十分な試料濃度が得られる。
【００５３】
試料貯蔵ループ１０７は、１μｌないし１０μｌの体積を有することが望ましく、試料貯蔵ループ１０７の体積が１μｌ未満である場合には、試料の取り扱いが難しいという問題点があり、１０μｌを超過する場合には、試料注入時間が長くなる問題点があって望ましくない。
【００５４】
また、試料流入弁１００は、試料放出ポート１０２を含むが、試料放出ポート１０２は、試料が試料貯蔵ループ１０７で前述した体積範囲内に収容されるように余分の試料を放出する役割を果たす。
【００５５】
前述したように、試料の流入が完了すれば、試料流入弁１００のモード転換スイッチ（図示せず）を用いて試料流入弁の連結状態を図２Ａに示された第１モードから図２Ｂに示された第２モードに変換させる。
【００５６】
試料流入弁１００の第２モードでは、第１試料貯蔵ループ連結ポート１０３と溶媒流出ポート１０６が、流体連通され、第２試料貯蔵ループ連結ポート１０４と溶媒流入ポート１０５が、流体連通されるように構成される。
【００５７】
本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、試料流入弁１００または連結弁２００に溶媒を供給する溶媒供給ポンプ５００をさらに含みうる。
【００５８】
溶媒供給ポンプ５００は、５，０００ｐｓｉないし２０，０００ｐｓｉの圧力で溶媒を供給することが望ましいが、溶媒の供給圧力が５，０００ｐｓｉ未満である場合には、使用可能なカラム長が短くなって分離分解能が低下する問題点があり、２０，０００ｐｓｉを超過する場合には、弁で溶媒が漏れる恐れがあって望ましくない。
【００５９】
溶媒供給ポンプ５００から供給される溶媒は、第１溶媒または第１溶媒と第２溶媒との混合物であり得る。このために、溶媒供給ポンプ５００には、第１溶媒または第１溶媒と第２溶媒とが一定比率で混ぜられた混合溶媒を供給できるように溶媒選択弁（図示せず）が設けられることもある。
また、溶媒供給ポンプ５００には、試料流入弁１００または連結弁２００に溶媒を選択的に供給するＴ字型溶媒分離管５１０が連結されうる。
【００６０】
図２Ｂは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置がオンライン消化機能を行う場合の弁の構成図である。
溶媒供給ポンプを通じて溶媒流入ポートから第１溶媒が試料流入弁１００に流入され、供給される第１溶媒の油圧によって試料貯蔵ループ１０７に泊まった試料は、溶媒流出ポート１０６を通じて排出され、連結弁に至る。
【００６１】
連結弁２００は、第１流入ポート２０１、第２流入ポート２０２、第１連結ポート２０３、第２連結ポート２０４、第１流出ポート２０５、及び第２流出ポート２０６を含みうる。
【００６２】
連結弁２００の第１流入ポート２０１は、試料流入弁１００の溶媒流出ポート１０６と流体連通されているので、溶媒供給ポンプから流入された第１溶媒は、試料と共に連結弁２００の第１流入ポート２０１、第１連結ポート２０３、第２連結ポート２０４、第１流出ポート２０５を順次に経ながら連結弁を通過する。この際、図２Ｂに示したように、連結弁には、互いに流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成される。
【００６３】
連結弁２００を通過した第１溶媒は、連結弁２００の第１流出ポート２０５と流体連通された多機能選択弁３００の流入ポート３０１とを通じて多機能選択弁に至る。この際、多機能選択弁３００の各ポートの構成は、前述した流体閉鎖モード状態になる。すなわち、流入ポート３０１と流出ポート３０７は、互いに流体断絶されているが、これは、第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８を閉鎖させることで具現可能である。前述したように、流体閉鎖モードの具現は、多機能選択弁３００の流入ポート３０１と流出ポート３０７とを流体断絶させる構成であれば、如何なるものでも可能である。
【００６４】
したがって、流入される第１溶媒は、多機能選択弁３００を通過することができず、これにより、供給される第１溶媒の圧力は次第に増加する。このように、溶媒の移送過程で溶媒の流れを塞いで高圧力を発生させることによって、タンパク質をペプチド状態で消化させるオンライン消化機能が行われる。この場合、オンライン消化機能は、溶媒の圧力が増加するほどその効率が向上するので、第１溶媒の圧力を弁の最大許容圧力まで高めることが良い。
【００６５】
オンライン消化機能が行われた以後、試料の脱塩及び濃縮のための１次元分離過程が行われる。図２Ｃは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、１次元分離機能を行う場合の弁の構成図である。
【００６６】
図２Ｃに示したように、１次元分離機能を行うために、多機能選択弁３００で流入ポート３０１と流出ポート３０７とを互いに流体連通させる。したがって、流入ポートから流入された溶媒が１次元分離カラム３１０を通過せずに流出ポートを通じてトラップ弁４００側に排出されうる。
【００６７】
トラップ弁４００は、固相抽出カラム４１０と連通される固相抽出カラム連結ポート４０２、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０と連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポート４０６、第１流入ポート４０１、第２流入ポート４０４、固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループ４０７とによって、連結された試料移動ループ連結ポート４０３、及び放出ポート４０５を含みうる。そして、トラップ弁４００の第１流入ポート４０１は、多機能選択弁３００の流出ポート３０７と流体連通されている。
【００６８】
多機能選択弁３００を通過した第１溶媒は、トラップ弁４００に至るが、この際、トラップ弁の各フォードは、第１流入ポート４０１と固相抽出カラム連結ポート４０２、試料移動ループ連結ポート４０３と放出ポート４０５が、それぞれ互いに流体連通されるように構成されている。
【００６９】
したがって、多機能選択弁３００から排出されて第１溶媒と共に移送された試料は、第１流入ポート４０１を経由して固相抽出カラム連結ポート４０２を通じて固相抽出カラム４１０に注入される。この際、注入される試料の流れ方向は、示された矢印方向のようである。
【００７０】
固相抽出カラム４１０は、固相抽出カラム連結ポート４０２に直接結合されたカラムであって、本発明において、固相抽出カラム４１０は、５０μｍないし５００μｍの内径及び１ｃｍないし４ｃｍの長さを有するが、これは、従来の通常的な固相抽出カラムに比べて非常に短い長さを有するものであって、本発明では、約１０，０００ｐｓｉ程度の超高圧で駆動されるにもかかわらず、固相抽出カラム長が前述したように非常に小さいために、試料の分離分解能を極大化させうる。また、後述するように、流入される試料の流れ方向と逆相液体クロマトグラフィーカラムに向けて溶出される試料の流れ方向が、互いに反対であるので、さらに向上した試料分離分解能を果たすことができる。
【００７１】
また、本発明では、固相抽出カラム４１０で内部インデューサ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ）のステンレススチールライナー（ｌｉｎｅｒ）を使い、Ｃ１８などの物質を内部に充填させた後、両末端を約２μｍ程度の細工サイズを有するステンレススチールスクリーンで塞いで充填物の流出を遮断することによって、高圧力に耐えることができる堅固な固相抽出カラムを利用できる。
【００７２】
一方、第１溶媒の油圧によって固相抽出カラム４１０に流入される試料は、０．５μｌ／分ないし１０μｌ／分の流速で第１溶媒が放出されることによって、その流速が調節される。また、放出ポート４０５は、試料中に含有された塩成分を共に放出することによって、効率的な脱塩工程がなされるようにする。
次いで、第１溶媒が１次元分離カラムを通過させて試料を分画した後、試料の脱塩及び濃縮効率を高めうる２次元分離機能を説明する。
図２Ｄは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、２次元分離機能を行う場合の弁の構成図である。
【００７３】
２次元分離機能を行うためには、１次元分離機能での試料流入弁１００、連結弁２００、及びトラップ弁４００の弁構成は、そのまま保持し、多機能選択弁３００のモードを流体通過モードからカラム通過モードに転換させれば良い。すなわち、図２Ｄに示したように、カラム通過モードでは、流入ポート３０１と第１連結ポート３０２、流出ポート３０７と第２連結ポート３０３が、それぞれ互いに流体連通される。したがって、多機能選択弁３００に流入された第１溶媒は、１次元分離カラム３１０を通過してトラップ弁４００に移送され、これにより、試料の分画がなされた後に試料の脱塩及び試料の濃縮効率をさらに高めうる。
次いで、第１溶媒が、二酸化チタンカラムを通過させてリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出するリン酸化ペプチド抽出機能を説明する。
図２Ｅは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、リン酸化ペプチド抽出機能を行う場合の弁の構成図である。
【００７４】
リン酸化ペプチド抽出機能を行うためには、２次元分離機能での試料流入弁１００、連結弁２００、及びトラップ弁４００の弁構成は、そのまま保持し、多機能選択弁３００のモードをカラム通過モードから二酸化チタンカラム通過モードに転換させれば良い。すなわち、図２Ｅに示したように、二酸化チタンカラム通過モードでは、流入ポート３０１と第１二酸化チタンカラム連結ポート３０８、流出ポート３０７と第２二酸化チタンカラム連結ポート３０９が、それぞれ互いに流体連通される。したがって、多機能選択弁３００に流入された第１溶媒は、二酸化チタンカラム３１１を通過してトラップ弁４００に移送され、これにより、試料内にリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出する。
【００７５】
今までは、試料が試料流入ポート１０１を通じて試料貯蔵ループ１０７に所定量満たされた後、第１溶媒を用いて試料のオンライン消化機能、１次元分離機能、２次元分離機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能が行われる過程を説明した。
【００７６】
次の過程としては、固相抽出カラム４１０に注入された試料を第２溶媒を使って分離することによって、試料を分析する過程が行われなければならないので、これについて説明する。
図２Ｆは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置で試料分析段階での弁の構成図である。
【００７７】
図２Ｆを参照すると、試料分析過程で試料流入弁１００の連結関係は、溶媒流入ポート１０５、及び溶媒流出ポート１０６を断絶させて、溶媒分離管５１０を通じて注入される溶媒が試料流入弁１００を経ずに直接連結弁２００に供給させうる。すなわち、この際の試料流入弁１００の各ポートの連結関係は、試料注入段階でのそれと同様に構成することができる。
試料分析過程での溶媒は、第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒が使われ、混合溶媒の比率を異ならせて溶媒の傾きを通じて試料の分離がなされる。
【００７８】
また、連結弁２００の各ポートの連結関係は、第２流入ポート２０２、第２連結ポート２０４、第１連結ポート２０３、第２流出ポート２０６が順次に流体連通されて流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成される。
【００７９】
連結弁２００の第２流出ポート２０６は、トラップ弁４００の第２流入ポート４０４と流体連通されて、連結弁２００を通過した混合溶媒が多機能選択弁３００を経ずにトラップ弁４００に移送される。
【００８０】
トラップ弁４００では、逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポート４０６と固相抽出カラム連結ポート４０２、第２流入ポート４０４と試料移動ループ連結ポート４０３が、それぞれ互いに流体連通されるように、モードを変更する。したがって、第２流入ポート４０４を通じて流入された混合溶媒は、試料移動ループ４０７を経て固相抽出カラム４１０に至り、固相抽出カラム連結ポート４０２と逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポート４０６とを経て逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０を通過する。この際、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０に向けて溶出される試料の流れ方向（または、混合溶媒の流れ方向）は、矢印のようであり、これは、固相抽出カラムに流入される試料の流れ方向（または、第１溶媒の流れ方向）と反対であるので、試料の分離分解能をさらに改善させることができる。
【００８１】
固相抽出カラム４１０での試料分離は、溶媒供給ポンプ５００から供給される混合溶媒中の第１溶媒及び第２溶媒の比率を経時的に変化させながら行われる。すなわち、混合溶媒中の第２溶媒の比率が増加するほど固相抽出カラム４１０に結合された試料の解離程度が増加して、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０に流入され、以後試料の分離を通じて分析がなされる。
【００８２】
第１溶媒及び第２溶媒としては、前述したような目的を果たすために、多様な組合わせの溶媒が選択され、これに制限されるものではないが、前記第１溶媒として、０．１％のギ酸水溶液が使われ、前記第２溶媒として、９０％のアセトニトリル水溶液が使われる。すなわち、これは、全体溶媒のうちアセトニトリルの含量が増加するほど固相抽出カラムに結合された試料の解離程度が増加するシステムを採択したものと言える。
【００８３】
試料の分離が行われる逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０は、１０μｍないし１５０μｍの内径及び１０ｃｍないし１５０ｃｍの長さを有することが望ましく、逆相液体クロマトグラフィーカラム４２０は、質量分析器（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に連結されることによって、後続分析工程が行われる。
【００８４】
このように、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置は、試料流入弁１００、連結弁２００、多機能選択弁３００、及びトラップ弁４００を用いて１次元分離機能、２次元分離機能、オンライン消化機能、及びリン酸化ペプチド抽出機能を必要に応じて選択的に行うことができる。本実施形態では、第１溶媒を用いてオンライン消化機能、１次元分離機能、２次元分離機能、リン酸化ペプチド抽出機能をいずれも行い、以後混合溶媒を用いて試料を分離及び分析する過程を一例として説明したが、必要に応じて多様な組合わせが可能であるということはいうまでもない。例えば、混合溶媒を使って試料の分離及び分析がなされる前に、１次元分離機能のみを行うか、１次元分離機能、及び２次元分離機能を共に行うか、先にオンライン消化機能を使って実験を行った後、１次元分離機能または２次元分離機能を選択して行うことができる。さらに、前述した各過程でリン酸化ペプチド抽出機能をさらに行うことができる。
【実施例】
【００８５】
機器
第１溶媒としては、０．１％のギ酸水溶液（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入）を使い、第２溶媒としては、０．１％ギ酸が含まれた１００％アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡから購入）を使った。
【００８６】
固相抽出カラム（７５μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×３ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）は、１２，０００ｐｓｉの圧力で融合−シリカ毛細管にＣ１８物質で充填させることで製作された。充填段階が完了した以後には、カラムに対して１２，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填されたＣ１８物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部分には、フリット（ｆｒｉｔ）を作って充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させて使った。
【００８７】
毛細管カラム（７５μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×８０ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）、すなわち、逆相液体クロマトグラフィーカラムは、融合−シリカ毛細管をＣ１８−結合粒子にスラリーパーキングさせることで製作した（Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｒ．，Ｂｌｏｎｄｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，３５９６−３６０５；Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｔｏｌｉｃ  Ｎ．，Ｍａｓｓｅｌｏｎ，Ｃ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，７６，１４４−１５４；Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｕｎｇｅｒ  Ｋ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ，Ｄ．，Ｌｕｂｄａ，Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，７７，６６９２−６７０１）。
【００８８】
充填段階が完了した以後には、カラムに対して１２，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填されたＣ１８物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部には、フリットを作って充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させて使った。
【００８９】
１次元分離カラムの一例として使われた強陽イオン交換カラム（１５０μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×１５ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）は、１０，０００ｐｓｉの圧力で５μｍパーティースペア強陽イオン交換レジン（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）にスラリーパーキングさせることで製作された。充填段階が完了した以後には、カラムに対して１０，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填された物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部には、フリットを作った後に充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させた。
【００９０】
二酸化チタンカラム（１５０μｍ  ＩＤ×３６０μｍ  ＯＤ×１０ｃｍ  ｌｅｎｇｔｈ）は、５，０００ｐｓｉの圧力で粒子大きさが１０μｍになる二酸化チタン（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）をスラリーパーキングさせることで製作された。充填段階が完了した以後には、カラムに対して５，０００ｐｓｉの圧力を保持しながら５分間超音波処理し、カラム使用以前に圧力を徐々に低めたが、これは、充填された物質の分散を防止するためである。また、充填させる以前に、ライナーの前部には、フリットを作った後に充填物を満たし、裏部分には、ステンレススチールスクリーン（２μｍ細工）を付着させた。
【００９１】
一方、逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される質量分析器（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）としては、ナノ電子噴霧イオン化インターフェース（ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を備えた７−テスラフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器（７−ｔｅｓｌａ  Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｏｎ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＦＴＩＣＲ、ＬＴＱ−ＦＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を使った。
【００９２】
＜第１実施例＞
試料
分析試料として、パン用イースト（ｂａｋｅｒｓ  ｙｅａｓｔ）から分離したエノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから購入）を使い、試料の前処理は、配列級変形ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡから購入）を用いてタンパク質消化過程を経て得られたペプチドを使い、試料の濃度は２０ｎｇである。
【００９３】
分析結果の評価
濃度２０ｎｇのエノラーゼに対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、１次元分離実験を行った。すなわち、第１溶媒として、０．１％のギ酸水溶液を用いてエノラーゼ試料を固相抽出カラムに送った後、これを逆相クロマトグラフィー方法によって分離し、引き続き、質量分析器を通じて得た分離された試料のクロマトグラムを図３Ａに示した。３回の実験を行った時、ほぼ類似した再現性ある結果を得て、分離分解能も優れると確認された。
【００９４】
一方、同じ試料に対して２次元分離試験の結果を図３Ｂに示した。図３Ｂで、上側５個のグラフは、第１溶媒（５００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリル水溶液またはこれらの混合物）の組成を順次に変更しながら、強陽イオン交換カラムを通過させて２次元分離実験を行った結果であり、最も下側のグラフは、１次元分離実験の結果である。図３Ｂに示したように、１次元分離実験の結果と２次元分離実験の結果とを総合的に比較した時、互いに一致する結果が見えることを確認することができた。
【００９５】
＜第２実施例＞
試料
さらに複雑なプロテオーム試料に対する分析を行うために、酵母前溶解液（ｗｈｏｌｅｌｙｓａｔｅ）のトリプシン分解ペプチドを使った。酵母プロテオームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ半数体菌株（ｈａｐｌｏｉｄ  ｓｔｒａｉｎｓ）であるＹ２８０５（ＭＡＴｐｅｐ：ｈｉｓ３  ｐｒｂ１−Ｄ１．６Ｒ  ｃａｎ１  ｈｉｓ１−２００  ｕｒａ３−５２）及びＡＦ−２（ＨＭＬａ  ｏｒ  ＨＭＲａ  ｈｏ  ａｄｅ２−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００  ｌｅｕ２−３、１１２  ｈｉｓ３−１１、１５  ｕｒａ３−１  ｓｓｄ１）を使った（Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｓ．，Ｃｈｏｉｅ，Ｗ．−Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｓ．−Ｗ．，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，２５，１８３３−１８３９．）。この場合、タンパク質を１００ｍＭアンモニウム重炭酸塩水溶液に溶解させた後、トリプシンを加えて３７℃で２４時間タンパク質消化を通じて加水分解をさせた。結果物は、ＳｐｅｅｄＶａｃ  ｓｙｓｔｅｍ（ＳＰＤ１０１０；ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ、Ｈｏｌｂｒｏｏｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使って完全に乾燥させた後、次の実験を行うまで−２０℃で保管した。使ったイーストペプチド試料の濃度は、２０■である。
【００９６】
分析結果の評価
濃度２０■のイーストペプチドに対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、１次元及び２次元分離実験を行った。図４Ａは、第１溶媒（５００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリル水溶液またはこれらの混合物）の組成を順次に増加させながら、強陽イオン交換カラムを通過させて２次元分離実験を行った結果であり、図４Ｂは、第１溶媒として、０．１％ギ酸が含まれた１００％アセトニトリルの組成変化を利用した１次元分離実験の結果である。１次元で得られる結果より２次元分離実験の結果で、各区画別にさらに多いピークが存在することを示す結果であって、２次元分離実験を通じてさらに多いペプチドが確認され、１次元分析結果に情報力を高めると同時に、分析の効率性を増大させることが分かった。
【００９７】
＜第３実施例＞
試料
分析試料として、β−カゼイン（β−ｃａｓｅｉｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから購入）を使い、試料の前処理は、配列級変形ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡから購入）を用いてタンパク質消化過程を経て得られたペプチドを使い、この際、試料の濃度は、５０ｎｇである。
【００９８】
分析結果の評価
前述した試料に対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、１次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った。図５Ａは、第１溶媒として、０．１％ギ酸が含まれた１００％アセトニトリルの組成変化を用いて行った１次元分離実験結果を、図５Ｂは、第１溶媒として、０．１％トリフルオロ酢酸と乳酸とが含まれた８０％アセトニトリルを用いて二酸化チタンカラムを通過させながら、リン酸化ペプチドのみをカラムに付着させた後、３００ｍＭアンモニウム重炭酸塩水溶液で溶出させてリン酸化ペプチドのみを選択的に抽出した結果を示すグラフである。図５Ａに示したように、１次元分離のみでは、リン酸化ペプチドが存在するが、他のピークに遮蔽されて確認しにくいが、図５Ｂに示したように、β−カゼインペプチドを二酸化チタンカラムを通過させた時、リン酸化されたペプチドのみ選択的に抽出される結果を確認することができた。
本発明の単純な変形または変更は、いずれも当業者によって容易に実施され、このような変形や変更は、いずれも本発明の領域に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、多機能選択弁、それを含む多機能液体クロマトグラフィー装置及びそれを利用した試料分析方法に利用されうる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に１次元分離カラムの両端が連結される多機能選択弁であって、
流入される流体が、如何なるカラムも通過せずに排出される流体通過モードと、
流入される流体が、前記１次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、
を含むことを特徴とする多機能選択弁。
【請求項２】
前記多機能選択弁の多重ポートは、
流入ポートと、流出ポートと、前記１次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第１連結ポート及び第２連結ポートと、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の多機能選択弁。
【請求項３】
前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、
前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１連結ポートが、前記流出ポートと前記第２連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶されることを特徴とする請求項２に記載の多機能選択弁。
【請求項４】
前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、
前記流体通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、前記第２連結ポートと前記第１選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記カラム通過モードで前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記第１連結ポートと前記第２選択ポートが、前記第２連結ポートと前記第３選択ポートが、前記第１選択ポートと前記流出ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする請求項３に記載の多機能選択弁。
【請求項５】
多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に１次元分離カラムの両端が連結され、前記多重ポートの他の一部に二酸化チタンカラムの両端が連結される多機能選択弁であって、
流入される流体が、如何なるカラムも通過せずに排出される流体通過モードと、
流入される流体が、前記１次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードと、
流入される流体が、前記二酸化チタンカラムを通過して排出される二酸化チタンカラム通過モードと、
を含むことを特徴とする多機能選択弁。
【請求項６】
前記多機能選択弁の多重ポートは、
流入ポートと、流出ポートと、前記１次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第１連結ポート及び第２連結ポートと、前記二酸化チタンカラムの両端にそれぞれ連結される、第１二酸化チタンカラム連結ポート及び第２二酸化チタンカラム連結ポートと、前記両モードを具現するように他のポートと選択的に流体連通される複数の選択ポートと、を含むことを特徴とする請求項５に記載の多機能選択弁。
【請求項７】
前記流体通過モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体連通され、
前記カラム通過モードで前記流入ポートと前記第１連結ポートが、前記流出ポートと前記第２連結ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記流入ポートと前記流出ポートが、流体断絶され、
前記二酸化チタンカラム通過モードで前記流入ポートと前記第１二酸化チタンカラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする請求項６に記載の多機能選択弁。
【請求項８】
前記複数の選択ポートは、第１、第２、第３選択ポートを含み、
前記流体通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記カラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第２二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第２選択ポートと前記第３選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで前記第１二酸化チタンカラム連結ポートを閉鎖させ、
前記二酸化チタンカラム通過モードで前記第１選択ポートと前記第１連結ポートが、前記第３選択ポートと前記第２連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする請求項７に記載の多機能選択弁。
【請求項９】
前記１次元分離カラムは、強陽イオン交換カラム、弱陰イオン交換カラム、親水クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラム、または強弱イオン混合カラムのうちの何れか一つであることをを特徴とする請求項１または５に記載の多機能選択弁。
【請求項１０】
分析対象となる試料が注入される試料流入弁と、
固相抽出カラム及び逆相液体クロマトグラフィーカラムと流体連通されるトラップ弁と、
前記試料流入弁から前記トラップ弁に向ける流路に位置し、請求項１または請求項５による多機能選択弁と、
前記試料流入弁から流出される流体を前記多機能選択弁または前記トラップ弁に選択的に供給する連結弁と、
を含むことを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を供給する溶媒供給ポンプをさらに含み、
前記溶媒供給ポンプには、前記試料流入弁または前記連結弁に溶媒を選択的に供給するＴ字型溶媒分離管が連結されていることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１２】
前記試料流入弁は、試料流入ポートと、試料放出ポートと、試料貯蔵ループによって互いに連結された、第１試料貯蔵ループ連結ポート及び第２試料貯蔵ループ連結ポートと、溶媒流入ポートと、溶媒流出ポートとを含み、
前記試料流入弁は、
前記試料流入ポートと前記第１試料貯蔵ループ連結ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記試料放出ポートが流体連通される、第１モードと、
前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流出ポートが流体連通され、前記第２試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流入ポートが流体連通される、第２モードと、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１３】
前記連結弁は、第１流入ポート、第２流入ポート、第１連結ポート、第２連結ポート、第１流出ポート、及び第２流出ポートを含み、
前記連結弁は、
前記第１流入ポート、前記第１連結ポート、前記第２連結ポート、前記第１流出ポートが順次に流体連通される、第１モードと、
前記第２流入ポート、前記第２連結ポート、前記第１連結ポート、前記第２流出ポートが順次に流体連通される、第２モードと、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１４】
前記連結弁には、互いに流体連通されたポートの間にＺ字型流路が形成されることを特徴とする請求項１３に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１５】
前記多機能選択弁が流体通過モードである時、前記試料の１次元分離機能が行われ、カラム通過モードである時、前記試料の２次元分離機能が行われ、流体閉鎖モードである時、前記試料のオンライン消化機能が行われ、二酸化チタンカラム通過モードである時、リン酸化ペプチド抽出機能が行われることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１６】
前記トラップ弁は、前記固相抽出カラムと連通される固相抽出カラム連結ポートと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムと連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと、第１流入ポートと、第２流入ポートと、前記固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループによって連結された試料移動ループ連結ポートと、放出ポートと、を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１７】
前記トラップ弁は、
前記固相抽出カラム連結ポートと前記第１流入ポートが流体連通され、前記試料移動ループ連結ポートと前記放出ポートが流体連通される、第１モードと、
前記逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと前記固相抽出カラム連結ポートが流体連通され、前記第２流入ポートと前記試料移動ループ連結ポートが流体連通される、第２モードと、
を含むことを特徴とする請求項１６に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１８】
前記試料流入弁の溶媒流出ポートと前記連結弁の第１流入ポートは、流体連通され、
前記連結弁の第１流出ポートと前記多機能選択弁の流入ポートは、流体連通され、
前記多機能選択弁の流出ポートと前記トラップ弁の第１流入ポートは、流体連通され、
前記連結弁の第２流出ポートと前記トラップ弁の第２流入ポートは、流体連通されることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１９】
前記固相抽出カラムで、流入される試料の流れ方向と前記逆相液体クロマトグラフィーカラムに向けて溶出される試料の流れ方向は、互いに反対であることを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２０】
前記溶媒供給ポンプには、第１溶媒、または第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を供給できるように溶媒選択弁が設けられたことを特徴とする請求項１０に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２１】
請求項１０による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、
（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、
（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体通過モードに設定するステップと、
（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、
（ｄ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、
前記（ｄ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２２】
前記（ｃ）ステップ中に、
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２１に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２３】
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２２に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２４】
請求項１０による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、
（ａ）前記試料注入弁に分析対象試料を注入するステップと、
（ｂ）前記試料流入弁と前記多機能選択弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを設定し、前記多機能選択弁を流体閉鎖モードに設定するステップと、
（ｃ）前記試料の第１溶媒を前記試料注入弁に流入させて、前記第１溶媒の圧力を上昇させるステップと、
（ｄ）前記多機能選択弁を流体通過モードに変更し、前記第１溶媒を前記トリップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、
（ｅ）前記試料流入弁と前記トラップ弁とを流体連通させるために、前記連結弁のモードを変更し、前記第１溶媒と第２溶媒との混合溶媒を前記試料流入弁に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ弁の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、
前記（ｅ）ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２５】
前記（ｄ）ステップ中に、
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２４に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【請求項２６】
前記多機能選択弁をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択弁を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項２５に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
【国際調査報告】
2013504756.tif 000017
2013504756.tif 000018
2013504756.tif 000019
2013504756.tif 000020