(57)【要約】  本発明は、変異状態と遺伝子のコピー数同時に検出するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、組織サンプル中の遺伝子コピー数の測定と、Ｌ８５８Ｒ変異及びエクソン１９欠失変異の同時検出を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルのＥＧＦＲの状態を評価する方法であって、
前記サンプルを試薬で処理し、Ｌ８５８Ｒ ＥＧＦＲ変異、エクソン１９欠失ＥＧＦＲ変異及びＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無に対応した識別可能なシグナルを生成し、
前記識別可能なシグナルを同時に可視化すること
を含む方法。
【請求項２】
前記組織サンプルは癌に罹患が疑われる患者、癌と診断された患者、又は癌に罹患した患者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理が、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子と前記サンプルを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理が、ＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブと前記サンプルを接触させることを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
前記処理が、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記核酸結合分子とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な前記抗原プローブを、前記ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異の有無及びＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無に対応する検出可能なシグナルを生成する試薬と接触させることを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な前記核酸プローブが、シグナル生成部分を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲに特異的な前記核酸プローブが、シグナル生成システムで検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記シグナル生成システムが、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲに特異的な前記核酸プローブの分別検出のための試薬を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナル生成システムが、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲに特異的な前記核酸プローブの各々に対する異なる比色分析シグナルを生成するための試薬を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
異なる比色分析シグナルを生成するための前記試薬が、銀、ファストレッド、ファストブルー、ファストゴールド、ＤＡＢ，ＡＰオレンジ、及びＡＰブルーからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が、酵素的に標識された試薬を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の変化とＥＧＦＲ変異の有無を評価することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者の予後の診断を行うための評価を用いることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療的処置を決定するために前記評価を用いることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｌ８５８Ｒ変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第一の抗原結合分子、
エクソン１９欠失変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第二の抗原結合分子、
ＥＧＦＲに特異的な核酸プローブ、
及び、前記第一の抗原結合分子、前記第二の抗原結合分子、及び前記核酸プローブの各々に特異的な識別可能なシグナル生成試薬
を含むシステム。
【請求項１７】
Ｌ８５８Ｒ変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第一の抗原結合分子、
エクソン１９欠失変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第二の抗原結合分子、
ＥＧＦＲに特異的な核酸プローブ、
及び、前記第一の抗原結合分子、前記第二の抗原結合分子、及び前記核酸プローブの各々に特異的な識別可能なシグナル生成試薬
を含むキット。
【請求項１８】
患者の予後又は診断のための請求項１６に記載のシステムの使用。
【請求項１９】
患者に対する治療的処置を決定するための請求項１９に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、２００９年１２月３１日出願の保留中の米国仮特許出願第６１／２９１４４４号に対する優先権を主張し、ここにその全体が参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、変異状態と遺伝子のコピー数同時に検出するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、組織サンプル中のＥＧＦＲ遺伝子コピー数の測定と、ＥＧＦＲ遺伝子のＬ８５８Ｒ変異及びエクソン１９欠失（ｄｅｌ）変異の同時検出を提供する。
【０００３】
背景
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）や他の癌の治療標的であるとの認識は、癌の治療として低分子の受容体チロシンキナーゼ阻害剤の開発へと導いた。臨床試験において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、ＮＳＣＬＣ患者のごく少数に客観的反応を生じることが立証された。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する様々なＮＳＣＬＣ株の感受性に対して、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数と所定のＥＧＦＲ遺伝子変異の間に有意な相関があることが確立されている (Helfrich et al. Clin Cancer Res 2006;7117 12(23); ここにその全体が参照により援用される）。ＥＧＦＲ遺伝子コピーの増幅は、肺癌標本で、大部分が固形の組織診断による領域で、限局的に分布しており、ＥＧＦＲの増幅を持つ患者は著しく予後が悪かったことが実証されている。(Sholl et al. Cancer Res 2009; 69: (21); ここにその全体が参照により援用される）。ＥＧＦＲ遺伝子の増幅と特定のＥＧＦＲの欠失及び変異を有する肺腺癌は、著しい予後不良と関連する独特の臨床病理学的特徴を示している。
【０００４】
ヒト組織におけるＥＧＦＲ変異の検出に有用である方法が開発されてきた（Yu et al. Clin Cancer Res 3023 2009; 15(9);ここにその全体が参照により援用される）。本分野は現在、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数及び複数の遺伝子座におけるＥＧＦＲ突然変異状態の同時検出のための方法を欠いている。そのような方法は、ＥＧＦＲに関連する癌を診断し、癌患者の効果的な治療レジメンを決定するにおいて、著しい進歩を与えるであろう。本分野において、これらと他の不備に対処するための更なる技術が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、変異状態と遺伝子のコピー数同時に検出するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、例えば癌患者由来の組織サンプル中のＥＧＦＲ遺伝子コピー数の測定と、 ＥＧＦＲ遺伝子のＬ８５８Ｒ変異及びエクソン１９欠失変異の同時検出を提供する。
【０００６】
幾つかの実施態様において、本発明は、組織サンプルのＥＧＦＲ状態を評価するための方法を与え、（ａ）免疫組織化学により第一のＥＧＦＲ遺伝子変異を検出し、前記第一の変異はＬ８５８Ｒを含み、前記の検出は第一の検出可能な基質を利用し；（ｂ）免疫組織化学により第二のＥＧＦＲ遺伝子変異を検出し、前記第二の変異はエクソン１９欠失（ｄｅｌ１９）を含み、前記検出は、第二の検出基質を利用し、及び（ｃ）ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を決定することを含む。幾つかの実施態様において、組織サンプルは癌に罹患が疑われるか、癌と診断されるか、又は癌に罹患した患者から得られる。幾つかの実施態様において、第二の検出可能な基質は、最初に検出可能な基質とは異なる検出可能な基質を含有し、組織に適用した場合、第一及び第二の検出可能な基質は区別可能である。幾つかの実施態様において、第一の検出可能な基質と第二の検出可能基質は、ファストブルー、ファストレッド、ＤＡＢ又はファストゴールドから選択される。幾つかの実施態様において、工程（ａ）と工程（ｂ）は同時に実施される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を検出することは、発色性インサイツハイブリダイゼーションによって実行される。幾つかの実施態様において、発色性インサイツハイブリダイゼーションは、銀、ファストブルー又はファストレッドを利用する。幾つかの実施態様において、本発明は、（ｄ）工程（ａ）および工程（ｂ）からの検出可能な基質から組織染色の存在を決定し、及び（ｅ）ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の変化を評価することを含む。幾つかの実施態様において、本発明は、（ｆ）作用の処置経過を開発することを含む。幾つかの実施態様において、組織の異なる病巣は、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の異なる表現型、第一の検出可能な基質からの染色、及び第二の検出可能な基質からの染色を提示し、複数の治療戦略を考慮すべきである異種の組織を示している。
【０００７】
幾つかの実施態様において、本発明は、（ａ）免疫組織化学により第一のＥＧＦＲ変異を検出するための試薬であって、第一の変異がＬ８５８Ｒを含み；（ｂ）免疫組織化学により第二のＥＧＦＲ変異を検出するための試薬であって、第二の変異がエクソン欠失１９を含み；（ｃ）発色性インサイツハイブリダイゼーションによりＥＧＦＲ遺伝子コピー数を検出するための試薬を含む。幾つかの実施態様において、第一のＥＧＦＲ変異を検出するための試薬及び第二のＥＧＦＲ変異を検出するための試薬は、異なる検出可能な基質を含み、前記検出可能な基質がファストブルー、ファストレッド、ＤＡＢ及びファストゴールドから選択される。幾つかの実施態様において、発色性インサイツハイブリダイゼーションによりＥＧＦＲ遺伝子コピー数を検出するための試薬は、銀、ファストブルー、又はファストレッドから選択される検出可能な基質を含む。
【０００８】
幾つかの実施態様において、本発明は、組織サンプルのＥＧＦＲの状態を評価するための方法を提供し、Ｌ８５８ＲのＥＧＦＲ変異、エクソン１９欠失ＥＧＦＲ変異及びＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無に対応した識別可能なシグナルを生成するための試薬によりサンプルを処理し、区別できるシグナルを同時に可視化するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、組織サンプルは癌に罹患が疑われる患者、癌と診断された患者、又は癌に罹患した患者から得られる。幾つかの実施態様において、その処理は、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子と試料を接触させることを含む。幾つかの実施態様において、その処理はＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブと試料を接触させることを更に含む。幾つかの実施態様において、その処理は、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブを含むＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子を、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異の有無及びＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無に対応する検出可能なシグナルを生成する試薬と接触させることを更に含む。幾つかの実施態様において、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子、及びＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブは、シグナル生成部分を含む。幾つかの実施態様において、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子、及びＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブは、シグナル生成システムで検出される。幾つかの実施態様において、シグナル生成システムは、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブの分別検出のための試薬を含む。幾つかの実施態様において、シグナル生成システムは、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブの各々に対する異なる比色分析シグナルを生成するための試薬を含む。幾つかの実施態様において、異なる比色分析シグナルを生成するための試薬は、銀、ファストレッド、ファストブルー、ファストゴールド、ＤＡＢ，ＡＰオレンジ、及びＡＰブルーからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、試薬は酵素的に標識された試薬を含む。幾つかの実施態様において、酵素標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−ラクタマーゼから成る群から選択される。幾つかの実施態様において、本方法は、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の変化とＥＧＦＲ変異の有無を評価することを更に含む。幾つかの実施態様において、本方法は、患者の予後の診断を行うための評価を用いることを更に含む。幾つかの実施態様において、本方法は、治療的処置を決定するためにその評価を用いることを更に含む。
【０００９】
幾つかの実施態様において、本発明は、Ｌ８５８Ｒの変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な第一の抗原結合分子；エクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に対する特異的な第二の抗原結合分子；ＥＧＦＲに特異的な核酸プローブ、及び第一の抗原結合分子、第二の抗原結合分子、及び核酸プローブの各々に特異的な識別可能なシグナル生成試薬を含むシステムを提供する。
【００１０】
幾つかの実施態様において、本発明は、Ｌ８５８Ｒの変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な第一の抗原結合分子；エクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に対する特異的な第二の抗原結合分子；ＥＧＦＲに特異的な核酸プローブ、及び第一の抗原結合分子、第二の抗原結合分子、及び核酸プローブの各々に特異的な識別可能なシグナル生成試薬を含むキットを提供する。
【００１１】
幾つかの実施態様において、本発明は、患者の予後または診断のために上記のシステムの使用を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、患者の治療的処置を決定するための上記のシステムの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的なＩＨＣ（レッド）、エクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ブルー）、及びＥＧＦＲ遺伝子ＩＳＨ（ブラック）による（Ａ）野生型ＥＧＦＲ，（Ｂ）エクソン１９欠失ＥＧＦＲ、及び（Ｃ）Ｌ５８５Ｒ ＥＧＦＲの同時検出を示す。
【図２】図２は、銀インサイツハイブリダイゼーションのシグナルと炭粉症の色素の間の類似の外観を示している。
【図３】図３は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的なＩＨＣ（ブルー）、エクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ゴールド）、及びＥＧＦＲ遺伝子ＩＳＨ（レッド）による（Ａ）野生型ＥＧＦＲ，（Ｂ）エクソン１９欠失ＥＧＦＲ、及び（Ｃ）Ｌ５８５Ｒ ＥＧＦＲの同時検出を示す。
【図４】図４は、レッド免疫組織化学的検出とレッドインサイツハイブリダイゼーションの間の類似の外観を示す。
【図５】図５は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的なＩＨＣ（レッド）、エクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ゴールド）、及びＥＧＦＲ遺伝子ＩＳＨ（ブルー）による、（Ａ）野生型ＥＧＦＲ，（Ｂ）エクソン１９欠失ＥＧＦＲ、及び（Ｃ）Ｌ５８５Ｒ ＥＧＦＲの同時検出を示す。
【図６】図６は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的なＩＨＣ（レッド）、エクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ゴールド）、及びＥＧＦＲ遺伝子ＩＳＨ（ブルー）による、（Ａ）変異陰性ＥＧＦＲ，（Ｂ）エクソン１９欠失ＥＧＦＲ、及び（Ｃ）Ｌ５８５Ｒ ＥＧＦＲの同時検出を示す。
【図７】図７は、レッド免疫組織化学的検出（Ａ）とゴールド免疫組織化学的検出（Ｂ）の間の類似の外観を示す。
【図８】図８は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的、及びエクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ブルー）、及びＥＧＦＲ遺伝子ＩＳＨ（レッド）による、（Ａ）野生型ＥＧＦＲ，（Ｂ）エクソン１９欠失ＥＧＦＲ、及び（Ｃ）Ｌ５８５Ｒ ＥＧＦＲの同時検出を示す。
【図９】図９は、ＩＨＣタンパク質の検出（Ａ）と遺伝子／タンパク質の二重検出（Ｂ）の比較を示す。
【図１０】図１０は、ＩＨＣタンパク質の検出（Ａ）と遺伝子／タンパク質の二重検出（Ｂ）の比較を示す。
【図１１】図１１は、ＩＨＣタンパク質の検出（Ａ）と遺伝子／タンパク質の二重検出（Ｂ）の比較を示す。
【図１２】図１２は、ＩＨＣタンパク質の検出（Ａ）と遺伝子／タンパク質の二重検出（Ｂ）の比較を示す。
【図１３】図１３は、ＩＨＣタンパク質の検出（Ａ）と遺伝子／タンパク質の二重検出（Ｂ）の比較を示す。
【図１４】図１４は、Ｌ５８５Ｒ変異特異的、及びエクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ブルー）、及びＥＧＦＲ遺伝子ＩＳＨ（レッド）による、（Ａ）変異陰性ＥＧＦＲ，（Ｂ）変異が軽度に陽性なＥＧＦＲ、及び（Ｃ）変異陽性ＥＧＦＲの遺伝子／タンパク質の同時検出を示す。
【図１５】図１５は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的及びエクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ブルー）、及びＥＧＦＲ遺伝子のＩＳＨ（レッド）により、遺伝子／タンパク質の同時検出を用いた腫瘍の不均一性を示している。
【図１６】図１６は、Ｌ５８５Ｒ変異体特異的及びエクソン１９欠失特異的ＩＨＣ（ブルー）、及びＥＧＦＲ遺伝子のＩＳＨ（レッド）により、遺伝子／タンパク質の同時検出を用いた腫瘍の不均一性を示している。
【００１３】
定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語とフレーズが以下に定義される。
【００１４】
本明細書において使用されるように、特定の核酸配列（例えば、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲエクソン１９欠失型、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びコントロール）への参照において使用される「コピー数」又は「遺伝子コピー数」は、単一細胞あたりのこれらの配列の実際の数を言う。コピー数は、単一の細胞について報告されるか、又は細胞の群（例えば、組織サンプル）における平均数として報告され得る。細胞の「コピー数」を比較する場合（例えば、実験細胞とコントロール細胞）、細胞の実際のコピー数を決定する必要は無く、その代わりに、与えられた細胞が別の細胞に比べてより多くか又は少ない核酸配列を含有するかを決定することを可能にする近似値を得ることのみを必要とする。従って、実際のコピー数が決定されていない場合でも、信頼性高く直接的又は間接的に核酸の量を決定することができる任意の方法が、コピー数の測定として使用することができる。
【００１５】
本明細書において使用されるように、コピー数の参照に用いられる場合、用語「増幅」は、核酸配列（例えば、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲエクソン１９欠失型、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ）のコピー数がコントロール配列（例えば、第１７番染色体）のコピー数より大きい条件を言う。別の言葉では、増幅とは特定の核酸配列（例えば、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲエクソン１９欠失型、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ）の比率が、コントロール配列と比べて１：１より大きいこと（例えば、１．１：１、１．２：１、又は１．３：１）を示す。好ましい実施態様において、特定の核酸配列の比率は、少なくとも１．５倍コントロール配列のコピー数よりも大きい（例えば、１．５：１）。
【００１６】
本明細書において使用されるように、用語「核酸分子」と「核酸配列」は、限定されないがＤＮＡ又はＲＮＡを含む分子を含む任意の核酸を言う。この用語は、ＤＮＡやＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列を包含し、限定されないが、４-アセチルシトシン、８-ヒドロキシ-Ｎ６-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５-フルオロウラシル、５ブロモウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルアデニン、１-メチルプソイドウラシル、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２,２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-メチルアデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、ベータ-Ｄ-マンノシルケウオシン、５’-メトキシカルボニルメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、クエオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、Ｎ-ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２-チオシトシン、および２，６-ジアミノプリンを包含する。
【００１７】
本明細書において使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対形成の参照において用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（例えば、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、及び核酸の中にあるＧ：Ｃの比などの要因によって影響される。
【００１８】
本明細書において使用されるように、用語「プローブ」は、精製された制限消化にあるように天然に存在し、又は合成的、組換え的、又は増幅（ＰＣＲなど）により生産され、目的とするオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドの配列）、又はヌクレオチド断片のライブラリーを言う。本発明に有用なプローブは、一本鎖又は２本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列（例えば、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲエクソン１９欠失型、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ）の検出、同定、及び単離において有用である。本発明で使用されているプローブは、任意の「レポーター分子」又は検出可能な基質で標識され得、限定されないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ並びに酵素ベースの免疫組織化学的アッセイ）、蛍光（例えば、ＦＩＳＨ）、発色（例えばＣＩＳＨ）、放射性、質量分析、及び発光システムを含む、任意の検出系システムで検出可能であることが意図されている。本発明は、特定の検出システム又は標識に限定されることは意図されてない。
【００１９】
本明細書において使用されるように、用語「標識」は、検出されうる任意の分子を言う。例えば、標識は、限定されないが、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、アビジン、発色性、蛍光又は酵素分子である。
【００２０】
本明細書において使用されるように、用語「インサイツハイブリダイゼーション」及び「ＩＳＨ」は、細胞又は組織調製物内において核酸を検出し、局在化するための方法を言う。これらの方法は、個々の細胞又は染色体内の核酸配列に関する定量的かつ空間的情報を両方与える。ＩＳＨは、一般的に多くの分野で使用されており、出生前の遺伝性疾患の診断、分子細胞遺伝学、遺伝子発現及び過剰発現を検出すること、遺伝子発現の部位を同定すること、遺伝子をマップすること、標的遺伝子をローカライズすること、様々なウイルス性感染及び微生物感染を同定すること、腫瘍の診断、インビトロでの体外受精の解析、骨髄移植の分析、及び染色体解析を含む。本技術は、表面（例えば、スライドやその他の材料）上にマウントされている細胞内の染色体又はｍＲＮＡにハイブリダイズされた、標識核酸プローブの使用を一般的に包含する。プローブは、蛍光分子、染料、又は他の標識で標識することができる。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の一例は、Kuo et al., Am. J. Hum. Genet., 49:112-119, 1991に与えられる（ここにその全体が参照により援用される）。他のＩＳＨ及びＦＩＳＨ検出法はＫｉｍらによる米国特許第５，７５０，３４０号に与えられ、その全体が参照により援用される。発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）の一例は、米国特許第６９４２９７０号に与えられ、その全体が参照により援用される。ＣＩＳＨの更なる例は、米国特許第６６７０１１３号、米国特許第７１８３０７２号、米国特許第７３６４４８４号、米国特許第７５９２１５３号、米国特許第７６３２６５２号及び米国特許第７６４２０６４号、及び米国特許出願公開第２００７／０２２４６２５号、米国特許出願公開第２００８／０２１３７８３号に与えられるように、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）である（それらの全体が参照により援用される）。更なるプロトコルが、当業者に知られている。
【００２１】
本明細書において使用されるように、語句「インサイツハイブリダイゼーションの条件下で」とは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブの成功した検出を可能にするインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を実施するために用いられる条件の任意の一式を言う。一般的に、インサイツハイブリダイゼーションに使用される条件は、組織または他の生物試料の表面上への固定、試料中の標的核酸配列のアクセシビリティを高めるため（および非特異的結合を低減するため）のプレハイブリダイゼーション処置、標的核酸への標識核酸プローブのハイブリダイゼーション、非結合プローブを除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄、及びハイブリダイズされたプローブの検出を含む。これらの各手順は、当技術分野で知られており、多くの異なった実験条件下で行われている。再び、そうしたインサイツハイブリダイゼーションの条件の例は、Ｋｕｏらの米国特許第５７５０３４０号、及びＩｓｏｌａらによる米国特許第６９４２９７０号に与えられる。条件および試薬の更なる例は以下に示される。
【００２２】
組織又は生物学的サンプルは固定剤を使用して表面に固定することができる。好適な固定剤は、可逆的である沈殿作用によって細胞成分の固定化を引き起こし、適切な細胞部位で核酸による細胞形態を維持し、核酸のハイブリダイゼーションを妨げない。固定剤の例として、限定されないが、ホルムアルデヒド、アルコール、塩溶液、塩化第二水銀、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、重クロム酸カリウム、リン酸カリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、セシウム、酢酸カルシウム又は酢酸マグネシウム、硝酸カリウム、重クロム酸カリウム、クロム酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ素酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピクリン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、アセトン、クロロホルムグリセリン、チモールを包含する。
【００２３】
表面に固定された後、サンプルは、非特異的バックグランドの結合を引き起こし得るタンパク質および他の細胞性物質を除去するために処理される。タンパク質を除去する薬剤は、限定されないが、例えばプロナーゼ及びプロテイナーゼＫなどの酵素、又は例えば０．０２−０．２のＨＣｌなどの軽度の酸、並びにＲＮａｓｅ（ＲＮＡを除去するため）が含まれる。
【００２４】
表面上のＤＮＡはオリゴヌクレオチドプローブが結合することができるように変性されている。変性は、例えば、ｐＨを変えることにより、温度を上げることによる、又はホルムアミドなどの有機溶媒により達成することができる。標識したプローブはその後標準的ハイブリダイゼーション条件下で変性したＤＮＡとハイブリダイズする場合がある。組織または生物学的サンプルは、組織のセクショニング又は単一細胞懸濁液の塗布又は細胞遠心分離などの標準的技術を用いて、固体表面上に付着され得る。固体表面の例としては、限定されないが、ガラス、ニトロセルロース、粘着テープ、ナイロン、又はＧＥＮＥ ＳＣＲＥＥＮ ＰＬＵＳを含む。
【００２５】
本明細書において使用されるように、用語「抗癌剤」、「従来の抗癌剤」、又は「癌治療薬」は、（例えば、哺乳類、霊長類、ヒトにおける）癌の治療で使用される任意の治療剤（例えば、化学療法化合物及び／又は分子性治療用化合物）、放射線療法、又は外科的介入を言う。
【００２６】
本明細書において使用されるように、用語「薬物」及び「化学療法剤 」は、疾患又は生理系（例えば、患者、又は体内、試験管内、又は生体外での細胞、組織及び臓器など）における病態の診断、治療、又は予防のために使用される薬理学的に活性な分子である。薬物は、その薬物が投与されている、生物、組織、細胞の生理機能、又はインビトロ系を変化させることによって作用する。用語「薬物」及び「化学療法剤」は抗過剰増殖化合物及び抗腫瘍化合物並びに他の生物学的治療用化合物を含むことを意図している。
【００２７】
「有効量」とは、有益な又は所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、1回以上の投与で投与することができる。
【００２８】
本明細書において使用されるように、用語「投与」は、薬物、プロドラッグ、抗体、又は他の薬剤、または治療処置を生理学系（例えば、患者、又は体内、試験管内、又は生体外での細胞、組織及び臓器など）に与える行為を言う。人体への投与の典型的なルートは、目（眼）、口（経口）、皮膚（経皮）、鼻（鼻）、肺（吸入剤）、口腔粘膜（頬）、耳を介する、注射による（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内、等）などが可能である。
【００２９】
「同時投与」は、化学薬剤又は治療上の処置（例えば、放射線療法）の一以上を生理学系（例えば、患者、又は体内、試験管内、又は生体外での細胞、組織及び臓器など）に投与（実施）することを意味する。それぞれの化学薬剤の「同時投与」は、同時に、又は任意の時間的順序で、又は物理的な組み合わせであって良い。治療法の「同時投与」は、癌の多くの型について所望される治療の方針である。
【００３０】
本明細書において使用されるように、用語「被検体」は、本発明の組成物及び方法を受ける生物を言う。そのような生物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施態様において、組織、臓器、体液（例えば、血液、尿、唾液など）、サンプルなどが「被検体」から採取され、本発明と組み合わせて使用され得る。
【００３１】
本明細書において使用されるように、用語「患者」は一般的に、疾患又は病気の治療を受けるであろうか又は受けている被検体、又は疾患又は病気についてスクリーニングされている被検体を言う。
【００３２】
用語「診断される」とは、本明細書において使用される場合、徴候や症状又は遺伝学的解析、病理学的解析、組織学的分析などによる病気の認識を言う。被験体又は患者は、癌が任意の適切な手段によって被験体に同定された場合に癌と「診断」される。癌と「診断された」被検体は、癌の兆候や症状を示さない場合があり得る。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「癌を有すると疑われる被検体」は、本発明の実施態様を含む任意の適切な方法により、癌、癌細胞、腫瘍、前癌細胞などの存在について試験されるか又はアッセイされるべき被検体又は患者である。被験体は癌の危険因子を有し得るか又は有し得ず、及び癌の任意の兆候や症状を示し得るか又は示し得ない。
【００３４】
本明細書において使用されるように、「癌に罹患した被検体」は、癌の兆候や症状を示す任意の被検体又は患者である。「癌に罹患した被検体」は、任意の癌検査を受けている場合があるか又は受けていない場合があり、及び癌の診断を受けている場合があるか又は受けていない場合がある。
【００３５】
本明細書において使用されるように、用語「抗原結合タンパク質」は、特異的抗原に結合するタンパク質を言う。「抗原結合タンパク質」は、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、及びヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ ')２断片、及びＦａｂ発現ライブラリーを含む免疫グロブリンを包含する。当技術分野で公知の様々な方法が、ポリクローナル抗体の産生のために使用されている。抗体の産生のために、様々な宿主動物を、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなど（これらに限定しないが）を含む所望のエピトープに対応するペプチドを注射することにより免疫することができる。好ましい実施態様において、ペプチドは、免疫原性担体（例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合している。様々なアジュバントが、宿主種に応じて免疫応答を高めるために使用されており、限定されないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、ニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、そしてＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
【００３６】
モノクローナル抗体の調製のために、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる (例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照)。これらは、限定されるものではないが、ヒトモノクローナル抗体を産生するために、もともとKoehler とMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術(Koehler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975))、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)を参照)、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))を包含する。
【００３７】
本発明によれば、単一鎖抗体（米国特許第４９４６７７８号；本明細書中で参照により援用される）の生産のために記載されている技術は、所望に応じて特異的単鎖抗体を産生するために適合させることができる。本発明のさらなる実施態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために (Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989))当技術分野で公知の技術を利用し、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にする。
【００３８】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片は、公知の技術により生成することができる。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化により作成することができるＦ(ａｂ ')２断片、Ｆ(ａｂ')２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ’断片、及びパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生成することができるＦ（ａｂ’）２断片を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当該分野において公知の方法によって単離することができる。抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野において公知の技術によって達成することができる（例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイツムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等）等。
【００４０】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および標的抗原に特異的に結合する限り抗体断片を網羅する。
【００４１】
用語「一次抗体」は、本明細書においては、組織サンプル中の標的タンパク質の抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は、一般的に免疫組織化学的方法で使用される第一抗体である。一実施態様において、一次抗体は、ＩＨＣの手順で使用される唯一の抗体である。ＩＳＨに関しては、一次抗体は、通常、標識を対象とし、ここで、標識（例えば、ハプテンなど）は、標的配列に向けられているオリゴヌクレオチドプローブに組み込まれている。例えば、オリゴヌクレオチドプローブがＤＩＧで標識されている場合、一次抗体は、オリゴヌクレオチドのＤＩＧのハプテンを認識し、結合する抗ＤＩＧ抗体である。更に、ＩＳＨで使用されるような一次抗体は、通常、ハイブリダイゼーション事象を検出するための手段を提供する検出試薬または酵素にコンジュゲートしている。
【００４２】
用語 「二次抗体」は、本明細書では、一次抗体に特異的に結合し、それによって、一次抗体とそれに続く試薬（もしあれば）との間の架橋を形成する抗体を指す。二次抗体は、一般的に免疫組織化学的方法で使用される第二抗体である。
【００４３】
名詞として使用される用語「染色剤」又は用語「染色試薬」は、生物学的サンプル中の標的分子に適用されると、分子を（例えば、顕微鏡検査下で）検出可能にする、生物学的又は化学的化合物、及びそのような化合物を含む組成物を指す。染色剤は、組み合わせまたは単独で着色された最終産物を生じる、検出可能な核酸プローブ、抗体、及び他の試薬を含むが、これらに限定されない。用語「染色剤」は、用語「色素」と同じ意味で用いられる。動詞として用いられる用語「染色」又は用語「染色する」は、染色試薬、染色、又は色素を生物学的サンプルと接触させることを意味する。
【００４４】
本明細書において使用されるように、「組織サンプル」は、被検体又は患者から得た類似細胞の収集物を意味し、好ましくは、遺伝的及び／又は染色体物質を含有する、４つの主要なヒト組織は、（１）上皮、（２）血管、骨、軟骨を含む結合組織、（３）筋肉組織、（４）神経組織である。組織サンプルの起源は、新鮮な、冷凍された、及び／又は保存された臓器又は組織サンプル、又は生検又は吸引からの固形組織、血液又は任意の血液成分、脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液、被検体の妊娠期間又は発育の任意の時期に由来する細胞であり得る。組織サンプルはまた、初代細胞又は培養細胞又は細胞株であり得る。組織サンプルは、本質的に組織と自然に混在しない化合物、例えば、防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、定着剤、栄養剤、抗生物質などが含まれる場合がある。
【００４５】
本明細書の目的のために、組織サンプルの「切片」とは、組織サンプルの単一の部分又は小片、例えば、組織サンプルから切り出した組織又は細胞の薄いスライスである。組織サンプルの複数の切片が、採取され、本発明に係る分析に供され得ることが理解される。
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明は、変異状態と遺伝子のコピー数同時に検出するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、患者からの組織サンプル中の、遺伝子のコピー数、Ｌ８５８Ｒの変異状態及びエクソン１９欠失変異状態の同時測定を提供する。これらの測定から得られた情報は、その後、患者の診断及び／又は予後のために及び患者の治療的処置を決めるために使用することができる。
【００４７】
従って、本発明は、癌患者および腫瘍のクローンの変異状態を評価するための組成物及び方法を提供する。本発明は、被験体の癌に特異的な治療戦略を開発するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、インサイツで遺伝子コピー数とタンパク質の変異状態の同時検出を提供する。本発明はまた、複数のタンパク質の変異と遺伝子コピー数増幅の同時検出を提供する。本発明は、組織、サンプル、および/または被験体における癌を評価するための新規なアッセイを更に提供する。
【００４８】
患者の組織は、癌細胞のいくつかのクローンを提示し、幾つかは、遺伝子増幅と共にＥＧＦＲの共局在化の変異形態を発現し、幾つかは遺伝子コピーゲインとともに検出可能なＥＧＦＲ変異体タンパク質を発現しない。幾つかの実施態様において、本発明のアッセイは、第一のＥＧＦＲ遺伝子変異（Ｌ８５８Ｒ）を、例えば、第一のシグナル生成システム、例えば色の染色剤又は色素（例えば、ファストブルー、ファストレッド、ＤＡＢ，ファストゴールドなど）などを用いる、免疫組織化学（ＩＨＣ）により検出し；第二のＥＧＦＲ変異（エクソン１９欠失）の存在を、例えばＩＨＣにより、同じ組織切片またはコア上で、第二のシグナル生成システム、例えば色の染色剤又は色素（例えば、ファストブルー、ファストレッド、又はファストゴールド）を用いて一工程で検出し；第三工程で、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、銀、ファストブルー、又はファストレッドのような第三のシグナル生成システムを用いる発色性ＩＳＨ）で、同じ組織切片またはコア上のＥＧＦＲ遺伝子コピー数を検出することを含む。幾つかの実施態様において、アッセイはＩＨＣ染色剤の存在を決定し、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数のゲインを評価することによってスコア化される。幾つかの実施態様において、組織の表現型は、３つの要素：（１）ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒのの変異状態、（２）ＥＧＦＲ変異エクソン１９欠失の変異状態、及び（３）ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を含む。幾つかの実施態様において、組織の表現型は、組織に対する治療の方針（癌治療の種類など）を示している。幾つかの実施態様において、組織は、異なる病巣で異なる表現型（例えば、異なる変異状態、異なる遺伝子コピー数）を示す。幾つかの実施態様において、異なる病巣で異なる表現型を示す組織は異種性(heterogeneous)として認定される。幾つかの実施態様において、異種性組織が一以上（すなわち、複数の）治療戦略で治療される。
【００４９】
幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ９４７６１）、ＥＧＦＲの変異型（例えば、欠失（例えばエクソン１９欠失）、挿入、置換（例えば、Ｌ８５８Ｒ）など）、ＥＧＦＲの断片、ＥＧＦＲ変異体（例えば、エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒなど）の断片の特異的同定のための試薬を提供する。所定の実施態様において、ＥＧＦＲの状態を同定するための試薬は、限定されないが、タンパク質（例えば抗原結合タンパク質、免疫グロブリン、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片など）、核酸（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、標識−オリゴヌクレオチドコンジュゲートプローブ等）、小分子等を含む。
【００５０】
１．試薬
本発明のシステム及び方法は、限定されないが、抗原結合分子、核酸プローブ、検出可能な部分、信号生成部分及びシグナル生成システムを含む、様々な試薬を利用する。これらの試薬は、ＥＧＦＲ遺伝子変異とＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無を検出することができるように、検出可能なシグナルを生成するために使用される。
【００５１】
抗原結合分子
幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子変異を検出する抗原結合分子を利用する。幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及び／又はＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒを特異的に検出するための試薬を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失に特異的抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒに特異的な抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を提供する。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失とＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒは、本発明の試薬（例えば抗原結合タンパク質（例えば、抗体））を用いて、サンプル（例えば、細胞、細胞培養、組織サンプル、腫瘍サンプルなど）中に検出される。幾つかの実施態様において、抗体は、癌を有する疑いのある被検体、癌と診断された被検体、及び／又は癌に罹患した被検体からの組織サンプル中で、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及び／又はＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒを検出し、同定し、定量化するために使用される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及びＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒは、ＥＧＦＲの他の形態（例えば、野生型、変異型）と同時に検出される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及びＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒは、１つまたは複数の参照又は標準（例えば、別の遺伝子、野生型ＥＧＦＲなど）と同時に検出される。
【００５２】
本発明は、ＥＧＦＲに対する単離された抗体及び抗体断片、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体を提供する。抗体又は抗体断片は、これらのタンパク質を特異的に認識する任意のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることができる。幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体、又はその断片、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体を提供する。幾つかの実施態様において、モノクローナル抗体、又はその断片は、これらのタンパク質に特異的に結合するキメラ又はヒト化抗体である。他の実施態様において、モノクローナル抗体、又はその断片は、これらのタンパク質に特異的に結合するヒト抗体である。
【００５３】
ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体に対する抗体は、本明細書に記載の、実験的な診断及び治療方法に用途を見出す。所定の実施態様において、本発明の抗体は、生物学的サンプル、例えば、患者の組織生検または血液サンプルにおいて、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体の発現を検出するために使用される。
【００５４】
幾つかの好ましい実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子変異に特異的な抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡから得られる。一般に、ポリクローナル抗体は、公知の方法により調製することができる。ポリクローナル抗体は、関連抗原（精製されたペプチド断片、完全長組換えタンパク質、融合タンパク質など）（例えば、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変種）であって、任意で、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミンへコンジュゲートし、滅菌生理食塩水で希釈され、アジュバント（例えば完全または不完全フロイントアジュバント）と組み合わせ、安定なエマルジョンを形成する抗原の複数を皮下または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバなど）を免疫することにより産生することができる。ポリクローナル抗体は、そのように免疫した動物の血液、腹水等からその後回収される。採取した血液は凝固させ、血清をデカントし、遠心分離により清澄化し、抗体価を測定した。ポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む、当技術分野において標準的な方法に従って血清または腹水から精製することができる。
【００５５】
モノクローナル抗体は、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256:495に記載されるように、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、上述のように免疫され、免疫抗原（ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体）に特異的に結合する抗体のリンパ球によってその産生を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。免疫感作後、リンパ球が単離され、例えば、ポリエチレングリコールを使用して適切な骨髄腫細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成し、次いで、未融合リンパ球とミエローマ細胞を避けて選択することができる。免疫沈降法、免疫ブロット法により、または例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定されるように、選択された抗原（例えば、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体）に対して特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その後、標準的な方法を用いるインビトロでの培養（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)か、又は動物の腹水腫瘍としてインビボでの何れかで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、上記ポリクローナル抗体について記載したように培地又は腹水から精製することができる。
【００５６】
あるいは、モノクローナル抗体はまた、米国特許第４８１６５６７号に記載されるように、組換えＤＮＡ法を使用して作成することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、成熟したＢ細胞又はハイブリドーマ細胞などから、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲなどによって単離され、その配列は従来の手順を用いて決定される。重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは次いで適当な発現ベクターにクローニングされ、それを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞によって生成される。また、その所望の種の組換えモノクローナル抗体又はその断片は、説明されたファージディスプレイライブラリーから単離することができる(McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597)。
【００５７】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）は、他の代替的な抗体を生成するために、組換えＤＮＡ技術を使用して、多くの異なる様式で改変することができる。一実施態様において、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の定常ドメインは、１）例えばキメラ抗体を生成するヒト抗体のそれらの領域、又は２）融合抗体を生成するための非免疫グロブリンポリペプチドの代わりに置換することができる。他の実施態様において、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成するために、その定常領域が切断されたり又は除かれる。更に、可変領域の部位特異的変異誘発又は高濃度変異誘発は、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化するために使用することができる。
【００５８】
本発明の幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、および／またはＥＧＦＲの他の変異体に対するモノクローナル抗体はヒト化抗体である。
【００５９】
この発明はまた、ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲの他の変異体を特異的に認識する二重特異性抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識し、結合することができる抗体である。
【００６０】
二重特異性抗体は、インタクト抗体又は抗体断片であり得る。二重特異性抗体を作成するための技術は、当該技術分野において一般的である (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; and U.S. Patent 5,731,168)。
【００６１】
本発明の所定の実施態様において、例えば、組織浸透性を向上させるために、抗体断片ではなく、インタクトな抗体を使用することが望ましいかもしれない。様々な技術が抗体断片の産生のために知られている。伝統的に、これらの断片はインタクトな抗体のタンパク分解を介して誘導される（例えば、Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 and Brennan et al., 1985, Science, 229:81）。しかしながら、前述のように、現在はこれらの断片は一般的に、組換え宿主細胞により直接産生される。従って、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体断片はすべての大腸菌または他の宿主細胞中で発現させ、それらから分泌される、従ってこれらの断片の大量生産を可能にすることができる。あるいは、このような抗体断片は抗体ファージライブラリーから単離することができる。また、抗体断片は、例えば、米国特許５６４１８７０で説明したように線形抗体であり得、単一特異性又は二重特異性とすることができる。抗体断片の産生のための他の方法は当業者には明らかであろう。
【００６２】
本発明はさらに、本明細書に記載される、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体、又は抗体断片と実質的に相同である変異体および等価物を包含する。これらには、例えば、保存的置換変異、すなわち類似のアミノ酸による１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換を含むことができる。例えば、保存的置換は、同じ一般クラス内の別のアミノ酸の置換、例えば、一酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、一塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、又は一中性アミノ酸を別の中性アミノ酸での置換を言う。何が保守的なアミノ酸置換により意図されているかは、当該技術分野において周知である。
【００６３】
幾つかの実施態様において、上記の抗体は、検出可能なシグナルを生成するか又はそれがシグナル生成システムの一部である、検出可能な部分で標識されている。検出可能な部分は、以下に詳細に説明し、ハプテン、蛍光分子、酵素、発光分子、量子ドットなどが含まれる。幾つかの実施態様において、検出可能な部分が、例えば、蛍光分子、酵素、発光分子、または量子ドットである場合、直接検出が利用される。幾つかの実施態様において、例えば、検出可能な部分はハプテンである場合、シグナル生成システムを介するハプテン標識一次抗体の間接的検出（例えば、特定のＥＧＦＲ遺伝子変異に特異的な抗体）が利用される。当業者は、これを達成するための様々な技術に気付くであろう。幾つかの実施態様において、シグナル生成システムは、結合ペアの少なくとも第一及び第二のメンバーを含む。結合ペアの第一のメンバーは、一次抗体に結合体化され、結合ペアの第二のメンバーは第一のメンバーを検出するために使用される。幾つかの実施態様において、第二のメンバーはシグナル生成部分で標識される。他の実施態様において、第二のメンバーに結合する第三のメンバーが検出に利用される。これらの実施態様において、第三のメンバーはシグナル生成部分を含む。例えば、抗体はハプテンと結合させることができ、上述した標識の４つの大きなカテゴリーのいずれかを、検出を達成するために抗ハプテン抗体（例えば、二次抗体）と結合させることができる。酵素標識が使用される場合、検出可能なシグナルを生成するために、酵素に対する基質をサンプルと接触させる。あるいは、幾つかの実施態様において、二次抗体は標識されない。これらの実施態様において、二次抗体に特異的である三次抗体が利用される。例えば、二次抗体がウサギ抗体であれば、三次抗体は、上記の標識の何れかにコンジュゲートした抗ウサギ抗体であることができる。このように、抗体と標識の間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
【００６４】
２．核酸プローブ
本発明は、核酸プローブを利用する。好ましい実施態様において、核酸プローブは標的核酸配列（例えば、ＥＧＦＲの配列）の部分に結合又はハイブリダイズする。好ましくは、核酸プローブは、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＬＮＡ（ロックト核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、またはそれらの組み合わせなどの任意の適切な核酸を含み、デオキシリボヌクレオチドなどの標準ヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログを含み得る。
【００６５】
幾つかの実施態様において、核酸プローブは、標的核酸配列（例えばＥＧＦＲの配列）の所望の部分に８０％以上相補的であり、好ましくは、標的核酸配列の所望の部分に９０％以上相補的であり、より好ましくは、標的核酸配列の所望の部分に９９％以上相補的であり、最も好ましくは、標的核酸配列の所望の部分に約１００％相補的である。一般に、核酸プローブの設計は、当該分野で標準的である実践を使い遂行される。例えば、得られたプローブが、標的核酸に結合することを犠牲にして自分自身に折り重なるか、またはお互いにハイブリダイズするような自己相補性を有する配列は一般的に回避される。
【００６６】
標的プローブ部分の長さを選択する際の１つの考慮事項は、標的核酸を含むサンプルの複雑さである。例えば、ヒトゲノムは、長さが約３Ｘ１０９塩基対である。任意の１０ヌクレオチド配列は、３０億塩基対において約２８６１回の頻度で現れる。この長さの標的プローブ部分は、ヒトゲノムの大きさの配列を持つ標的内にある１０ヌクレオチド領域に一意的に結合する機会は乏しいであろう。しかし仮に、標的配列がプラスミド３キロバイト以内であった場合は、そのようなオリゴヌクレオチドは、一意的に結合することが非常に合理的な機会がある可能性がある。これと同じ計算により、１６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（すなわち、１６量体）が３Ｘ１０９塩基対に一回現れることが数学的に可能性がある配列の長さの最小値であることが分かる。このレベルの特異性はまた、２つ以上の短い核酸配列が協調的な方法で（すなわち、それらが両方もしくは全てがそれらの意図した標的配列に結合している場合にのみ、意図した複合体を生成することができるように）結合するように形成されている場合、２つ以上の短い核酸配列によって提供される場合があり、ここでその短い配列の組み合わせが所望の特異性を提供する。
【００６７】
標的プローブ部分の長さを選択する際の第二の考慮事項は、標的プローブ部分が機能することが期待されるであろう温度範囲である。平均塩基含有量（５０％のＧ−Ｃ塩基）の１６量体は、とりわけ、プローブとその標的の濃度、反応の塩濃度、及びヌクレオチドの正確な順序に依存する、約４１℃の計算されるＴｍを有するであろう。実際問題として、長い標的プローブ部分は、通常、ハイブリダイゼーションの特異性を高めるために選択される。例えば、長さが２０から２５ヌクレオチドの標的プローブ部分は、Ｔｍの近傍（Ｔｍの約５℃以内）の温度で行う反応で使用した場合、非常に特異的である可能性があるため、使用することができる。
【００６８】
好ましい実施態様において、標的プローブ部分がユーザーによって定義された適切な条件下で、標的核酸にハイブリダイズするように、核酸プローブはこれらの考慮事項を考慮して設計されている。
【００６９】
核酸は、手動で、又は、温度、長さ、ＧＣ含量などの所望のパラメータに基づいて、プライマーの選択を最適化する、コンピュータ実装されたアルゴリズムの支援を受けて選択することができる。インターネットを介して又はパーソナルコンピューター上で使用する数多くのコンピューターに実装されたアルゴリズムが入手できる。例えば、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から複数の結合領域を生成するため、反復的な（または他の望ましくない、例えば、バックグラウンドを生みだす）核酸配列を欠いた配列の領域が、例えば手動で、あるいはコンピューター・アルゴリズムを使用して、同定される。数キロから数百キロベースまたがる標的核酸配列内（例えば、ゲノム標的核酸配列）において、実質的に又は完全に反復が無い（または他の望ましくない、例えば、バックグラウンドを生じる）核酸配列である典型的な多くの結合領域が同定される。
【００７０】
核酸プローブは、任意の公知の方法により合成することができる。幾つかの実施態様において、核酸プローブをコードする配列は、プラスミド発現ベクターにクローニングされる。核酸プローブは、核酸プローブをコードするＲＮＡ分子を提供するために、好ましくはＲＮＡポリメラーゼによりベクターから転写される。幾つかの実施態様において、核酸プローブは、例えば、ホスホロアミダイトアナログを用いて、化学的に合成される。幾つかの実施態様において、ＤＮＡプローブは、プラスミドＤＮＡの増殖、精製、制限酵素消化によって合成され、標的核酸プローブをコードするＤＮＡ分子を提供する。二本鎖ＤＮＡは、続いてハイブリダイゼーションプロトコルにおける使用のための一本鎖に溶融させることができる。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブは、非対称ＰＣＲにより合成される。幾つかの実施態様において、一方のプライマーは、例えば、核酸アナログ（例えば、ＬＮＡ）である可能性がある。このプロセスは、ロックトヌクレオチド及び標準的ｄＮＴＰから作成される検出標的部分を含む標的特異的部分を有するプローブを生成する。幾つかの実施態様において、ＬＮＡ含有プライマーは、望まれるストランドの精製を容易にするためにビオチンを含有する。
【００７１】
幾つかの実施態様において、核酸プローブは、１つ又は検出可能な部分を含む。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は直接検出可能であり、他の実施態様において、検出可能な部分は、間接的に検出可能である。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、検出可能なシグナルを生成するシグナル生成部分である。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は検出プローブの合成に用いられるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに結合している。例えば、望まれる検出可能な部分に結合しているヌクレオシドホスホロアミダイトは、当技術分野で知られているように、化学合成を介して検出プローブを合成するために使用される。
【００７２】
幾つかの実施態様において、検出可能な部分を間接的に検出される。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、シグナル生成システムの第一のメンバーである。これらの実施態様において、結合ペアの第一のメンバーにコンジュゲートしたヌクレオチドは、好ましくは、結合ペアの第一のメンバーにコンジュゲートしたヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を介して、検出プローブに組み込まれる。次に、サンプルを結合ペアの第二メンバー（すなわち、特異的結合部分）を含む特異的結合剤と接触させる。幾つかの実施態様において、結合ペアの第二のメンバーは、シグナル生成部分に結合し、結合ペアの第一のメンバーへの結合を介して検出プローブを検出するために使用される。他の実施態様において、サンプルは第二の結合メンバーに特異的に結合する第三の結合メンバーと接触させる。これらの実施態様において、第三のメンバーはシグナル生成部分にコンジュゲートしている。適切な結合分子系の例としては、限定されないが、アビジン、ビオチン、ハプテンは、抗ハプテン抗体、抗抗体抗体、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、幾つかの実施態様において、検出プローブの検出可能な成分の部分は、１つまたは複数のハプテニル化された(haptenylated)ヌクレオチドを含む。これらのハプテニル化されたヌクレオチドは、抗ハプテン抗体及びシグナル生成部分にコンジュゲートした抗（抗ハプテン抗体）抗体の使用により検出される。
【００７３】
シグナル生成システム
上述したように、本発明のシステム及び方法は、様々な試薬、例えば、直接的検出のため（すなわち、シグナルグレーティング部分で標識される）、又は間接的検出のため（すなわち、結合ペアの第一のメンバー又はシグナル生成システムである検出可能部分で標識される）、検出可能な部分で標識された抗原結合分子および核酸プローブを利用する。本発明は、特定の標識又はシグナルに限定されない。実際に、様々なシグナル及びシグナル生成システムが、限定されないが、比色分析シグナル、蛍光シグナル、発光シグナルなどを含む説明されたシステムと方法において使用することができる。幾つかの好ましい実施態様において、比色分析シグナルが用いられる。幾つかの好ましい実施態様において、一次抗体及び核酸プローブはハプテニル化一次抗体及び核酸プローブの使用を介して間接的に検出することによって検出される。幾つかの更なる好ましい実施態様において、シグナルは互いに互換性があり、複数のシグナル（例えば、２つのＥＧＦＲ変異及びＥＧＦＲ増幅に対するシグナル）が、患者からのサンプルについて同時に可視化することができる。
【００７４】
したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、ハプテニル化一次抗体及び核酸プローブを活用したシグナル生成システムを提供する。そのようなハプテンは、限定されないが、ピラゾール、特にニトロピラゾール；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素及びチオ尿素類、特にフェニル尿素、更に具体的にはフェニルチオ尿素；ロテノン及びロテノン誘導体、ここではロテノイドとも言う；オキサゾール及びチアゾール、特にオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド；クマリンおよびクマリン誘導体;ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体に代表されるシクロリグナン;及びそれらの組み合わせが挙げられる。ハプテンの具体的な例としては、限定されないが、２,４-ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ビオチン、フルオレセイン誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッドなど）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、５-ニトロ-３-ピラゾールカルバミド（ニトロピラゾール、ＮＰ）、４,５,-ジメトキシ-２-ニトロシンナミド（ニトロシンナミド、ＮＣＡ）、２-（３,４-ジメトキシフェニル）-キノリン-４-カルバミド（フェニルキノロン、ＤＰＱ）、２,１,３-ベンゾオキサジアゾール-５-カルバミド（ベンゾフラザン、ＢＦ）、３-ヒドロキシ-２-キノキサリンカルバミド（ヒドロキシキノキサリン、ＨＱ）、４-（ジメチルアミノ）アゾベンゼン-４'-スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、ロテノンイソキサゾリン（Ｒｏｔ）、（Ｅ）-２-（２-（２-オキソ-２,３-ジヒドロ-１Ｈ-ベンゾ［ｂ］［１,４］ジアゼピン-４-イル）フェノキシ(phenozy)）アセトアミド（ベンゾジアゼピン、ＢＤ）、７-（ジエチルアミノ）-２-オキソ-２Ｈ-クロメン-３-カルボン酸（クマリン ３４３、ＣＤＯ）、２-アセトアミド-４-メチル-５-チアゾールスルホンアミド（チアゾールスルホンアミド、ＴＳ）、及びｐ-メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド（p-Mehtoxyphenylpyrazopodophyllamide）（Ｐｏｄｏ）が挙げられる。これらのハプテンとそれらのプローブにおける使用については、共同所有の出願である、米国特許出願公開第２００８０３０５４９７号、同２００８０２６８４６２号、及び同２００８００５７５１３号により詳細が説明されている。
【００７５】
一次抗体又は核酸プローブがハプテンを含む実施態様では、シグナル生成システムの第二のメンバーは、好ましくは、抗原結合分子としてハプテンに特異的に結合する分子である。適切な抗原結合分子の例としては、限定されないが、抗体、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子（一例として、限定するものでないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、抗体断片、例えば、当該技術分野において知られているＦ(ａｂ')２断片、抗体断片Ｆａｂ'断片、Ｆａｂ'−ＳＨ断片など、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性のｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ(ａｂ)'２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られている）及び、ラクダ科動物抗体が挙げられる（例えば、米国特許第６０１５６９５号；同６００５０７９号−同５８７４５４１号；同５８４０５２６号；同５８００９８８号；及び同５７５９８０８号を参照のこと）。幾つかの実施態様において、検出可能なシグナルを生成する検出可能な部分は、抗原結合分子に、付着するか、そうでなければ共有結合している。適切な第二の結合ペアのメンバーは、限定されないが、検出可能なシグナルを生成する検出可能な部分にコンジュゲートしている抗ＤＮＰ抗体、抗ビオチン抗体、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ＤＩＧ抗体、抗ＮＰ抗体、抗ＮＣＡ抗体は、抗ＤＰＱ抗体、抗ＢＦ抗体、抗ＨＱ抗体、抗ダブシル抗体、抗Ｒｏｔ抗体、抗ＢＤ抗体、抗ＣＤＯ抗体、抗ＴＳ抗体、および抗Ｐｏｄｏ抗体が挙げられる。更なる実施態様において、結合分子システムの第二のメンバーは、検出可能な部分を含まない抗ハプテン一次抗体である。これらの実施態様において、結合性分子システムの第三のメンバーは、二次抗抗体（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体など）であり、検出可能なシグナルを生成するために利用されるシグナルを生成する検出可能な部分を含む。
【００７６】
本発明のシグナル生成システムは、シグナル生成部分を含む。好ましい実施態様において、シグナル生成部分は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数と紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出及び／又は散乱を含む、任意の公知又は未発見のメカニズムによって検出することができる。シグナル生成部分は着色、蛍光、燐光及び発光分子や物質を含む。一つの物質を別の物質に変換し、（例えば、無色の物質を着色物質に変換したり、又はその逆であったり、又は沈殿物を生成するか、サンプルの濁度を増加させるなどにより）検出可能な差を与える触媒（酵素など）、及び常磁性分子及び磁性分子または物質を包含する。
【００７７】
幾つかの好ましい実施態様において、シグナル生成部分は酵素である。適切な酵素は、限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ、米国特許第４７３７４５６号；その全体が本明細書に援用される）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6 - リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素をコンジュゲートするための技術は、O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されており、本明細書においてその全体が援用される。
【００７８】
検出可能な標識が酵素を含む場合、色素原、蛍光発生化合物、又は発光性化合物が、酵素と組み合わせて使用することができ、検出可能なシグナルを生成する（多くのそうした化合物が、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｏｒｅｇ．から市販されている）。発色化合物の特定の例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、ファストレッド（ｆａｓｔ ｒｅｄ）、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２,２'-アジノ-ジ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４ークロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−βーガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−βーＤ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレッドを包含する。
【００７９】
あるいは、酵素は、金属組織学的検出方式で使用することができる。例えば、ＳＩＳＨの方法はハイブリダイズしたゲノムの標的核酸配列の同定及び局在についての金属組織学的検出方式を含む。金属組織学的検出方法は、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元に不活性な基質と組み合わせて、アルカリフォスファターゼ等の酵素を使用することを包含する。基質は酵素により酸化還元活性剤に変換され、その酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、それを検出可能な沈殿物を形成させる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ出願公開番号２００５／００３７７７及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照）。金属組織学的検出方法には、オキシドレダクターゼ酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と一緒に使用することを含み、再び検出された沈殿物を形成する。（例えば、米国特許第６６７０１１３号を参照）。
【００８０】
本発明において有用なシグナル生成部分の特定の例として、蛍光分子（又は色素）が含まれる。多数の蛍光色素が、当業者に知られており、例えばInvitrogenから選択することができ、例えば、The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg.)を参照。核酸分子又は抗原結合分子などのタンパク質に結合させる（例えば、化学的にコンジュゲートさせる）ことができる特定の蛍光色素は、限定されないが、以下を包含する；４-アセトアミド-４'-イソチオシアン酸スチルベン-２,２'-ジスルホン酸、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネートなどのアクリジン及び誘導体、５-((２-アミノエチル）アミノナフタレン-１-スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４-アミノ-Ｎ-[３-(ビニルスルホニル)フェニル］ナフタルイミド-３,５ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ-(４-アニリノ-ｌ-ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ブリリアントイエロー、例えば、クマリン、７-アミノ-４-メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）などのクマリン及び誘導体、７-アミノ-４-トリフルオロメチルクルアリン（７-ａｍｉｎｏ-４-ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマリン１５１）；シアノシン；４',６-ジアミジノ-２-フェニリンドール（ＤＡＰＩ）；５',５"-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７-ジエチルアミノ-３-(４'-イソチオシアナトフェニル）-４-メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４,４'-ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン-２,２'ジスルホン酸；４,４'-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２'ジスルホン酸；５-［ジメチルアミノ］ナフタレン-ｌ-スルホニルクロライド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４-（４'-ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４'-イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよびエオシンイソチオシアネートなどのエオシンおよび誘導体；エリトロシンＢおよびエリトロシンイソチオシアネートなどのエリトロシンおよび誘導体；エチジウム；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５-（４,６-ジクロロトリアジン-２-イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２'７'-ジメトキシ-４'５'-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）などのフルオレセインおよび誘導体；２′,７′-ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮＴＭ；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４‐メチルウンベリフェロン；オルト‐クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン酪酸、１−ピレン酪酸スクシンイミジルなどのピレンおよび誘導体；リアクティブレッド４（シバクロン（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６-カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）などのローダミン及び誘導体；リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テクサスレッド）、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）;テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体。
【００８１】
他の適切なフルオロフォアは、約６１７ｎｍで放射するチオール反応性ユウロピウムキレート (Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999)、並びにＧＦＰ、リサミン（Lissamine）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（Ｌｅｅらによる米国特許第５，８００，９９６号に記載された）及びそれらの誘導体を包含する。当業者に既知である他のフルオロフォア、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）から入手可能なものもまた使用でき、色素のＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲＴＭ系（例えば、米国特許第５６９６１５７号、同６１３０１０１号、及び同６６７１６９７９号に記載される）、色素のＢＯＤＩＰＹ系（ジピロメテンボロンジフルオリド色素（dipyrrometheneboron difluoride dyes)、例えば、米国特許第４７７４３３９号、同５１８７２８８号、同５２４８７８２号、同５２７４１１３号、同５３３８８５４号、同５４５１６６３号、及び同５４３３８９６号に記載される）、カスケードブルー（米国特許第５１３２４３２号に記載されるスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）、及びマリーナブルー（米国特許第５８３０９１２号）を包含する。
【００８２】
上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶などの蛍光ナノ粒子が可能であり、例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＴＭ(例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ Ｃｏｒｐ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇから入手される；米国特許第６８１５０６４号；同６６８２５９６号；及び同６６４９１３８号も参照）。半導体ナノ結晶は、大きさに依存する光学的および／または電気的特性を有する微細な粒子である。半導体ナノ結晶は、一次エネルギー源で照射されている場合、エネルギーの二次電子放出は、半導体ナノ結晶で使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数で発生する。この放出は、特定の波長または蛍光色の光として検出することができる。異なるスペクトル特性を持つ半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６６０２６７１号に記載されている。半導体ナノ結晶は、様々な生体分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）、及び基質に対して、例えば、Bruchez et. al. (1998) Science 281:2013-6, Chan et al. (1998) Science 281;及び米国特許第６２７４３２３号に記載された技術によって結合することができる。
【００８３】
様々な組成物の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６９２７０６９号；同６９１４２５６号；同６８５５２０２号；同６７０９９２９号；同６６８９３３８号；同６５００６２２号；同６３０６７３６号；同６２２５１９８号；同６２０７３９２号；同６１１４０３８号；同６０４８６１６号；同５９９０４７９号；同５６９０８０７号；同５５７１０１８号；同５５０５９２８号；同５２６２３５７号及び米国特許出願公開第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ出願公開番号第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日公開）に開示されている。半導体ナノ結晶の別個の集団を、その異なるスペクトル特性に基づいて識別可能であるように生成することができる。例えば、半導体ナノ結晶は、その組成、サイズまたはサイズおよび組成に基づいて異なる色の光を発するように生成することができる。例えば、サイズに基づいて異なる波長（５６５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０５ｎｍ、又は８００ｎｍの発光波長）で発光する量子ドットは、本明細書に開示されたプローブにおいて蛍光標識として適しており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手される。
【００８４】
更なるシグナル生成部分は、例えば、放射性同位元素（３Ｈ，３５Ｓ及び３２Ｐなど）、Ｇｄ３＋などの放射性金属イオン又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、及びリポソームを包含する。
【００８５】
幾つかの実施態様において、シグナル生成部分は、蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質はまた、可視化を容易にするために、担体として使用することができ、又は担体に結合させることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、もともとはオワンクラゲの発光器官から単離された。キメラＧＦＰ融合は、細胞への遺伝子導入によりインサイツで発現させることができ、適切な標的化シグナルによって、細胞内の特定の部位に局在化させることができる。青、シアン、黄緑色の発光を伴うスペクトルの変異が首尾よくオワンクラゲＧＦＰから生成されるが、何一つ５２９ｎｍより長い発光極大を示すものは無かった。ＧＦＰ様タンパク質が、生物学的用途のために利用可能な色の範囲を著しく拡大した花虫綱（サンゴ動物）から単離されている。配列データベースに寄託された「ＧＦＰ様タンパク質」のファミリーは、現在およそ３０の有意に異なるメンバーを有している。蛍光タンパク質は、発色団の自己触媒的合成によって自発的に蛍光を発することができるタンパク質を指す。赤色波長又は遠赤色波長（赤色蛍光タンパク質又はＲＦＰ）で蛍光を発するタンパク質が知られている。ＲＦＰは、多色標識実験及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）実験の両方において、より短い波長で蛍光を発する他の蛍光タンパク質との組み合わせで使用することができる。市販のＲＦＰは、２つの野生型ＧＦＰ様タンパク質に由来する。ＤｓＲｅｄ（ｄｒＦＰ５８３）は、５５８ｎｍと５８３ｎｍで、それぞれ励起極大及び発光極大を持つ。遠赤外蛍光タンパク質は、５７１ｎｍで吸収する色素タンパク質の変異誘発によって生成された。ＨｃＲｅｄ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、５８８ｎｍと６１８ｎｍで、それぞれ励起極大及び発光極大を持つ。最長波長（導入されている任意の変異なし）で蛍光を発する蛍光タンパク質は、イソギンチャクEntacmaea quadricolorからクローニングされた、ｅｑＦＰ６１１である。このタンパク質は、５５９ｎｍで吸収し、６１１ｎｍで発光する。
【００８６】
２．免疫組織化学法
幾つかの実施態様において、本発明は２以上の形態のＥＧＦＲ（例えば、野生型、ＥＧＦＲの変異株（例えば、エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒなど））の同時検出を提供する。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲの２以上（例えば、２、３、４、５など）の変異型が、本発明の試薬（例えば、抗体）で検出される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲの複数の形態が、細胞内、組織、腫瘍、細胞培養、サンプル等で検出される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲの複数の形態が、癌を有すると疑われた被検体、癌と診断された被検体、及び／又は癌に罹患した被検体由来の組織サンプル（例えば切片、コア、生検など）で検出されている。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲの複数の変異形態が、サンプル（例えば、組織サンプル）中で検出され、同定され、及び／又は定量化される。幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及び／又はＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒを特異的に検出することを含む。
【００８７】
幾つかの実施態様において、免疫組織化学法は、目的の遺伝子（例えば、ＥＧＦＲ）の遺伝子コピー数を検出するために組織サンプルで実行される。組織切片の免疫組織化学的染色は、不均一組織中のタンパク質の変質を評価するための信頼性の高い方法であることが示されている。免疫組織化学（ＩＨＣ）技術は、一般的に、発色法や蛍光法によって、その場で細胞抗原を探査して可視化するために抗体を利用する。この技術は、望ましくない脱凝集の影響を回避し、形態学との関連で個々の細胞の評価を可能にするため、優れている。加えて、標的タンパク質は、凍結プロセスによって変質されない。
【００８８】
幾つかの実施態様において、ＩＨＣは、直接的又は間接的なアッセイを介して行われる。直接的ＩＨＣアッセイでは、標的抗原に対する抗体の結合は、直接決定される。この直接的なアッセイは、更なる抗体相互作用無しに可視化することができる標識試薬（例えば染色、蛍光タグ、酵素標識一次抗体など）を使用している。典型的な間接的なアッセイでは、非結合型一次抗体が抗原に結合し、その後、標識二次抗体が一次抗体に結合する。幾つかの実施態様において、二次抗体は、色素、又は酵素標識にコンジュゲートしている。幾つかの実施態様において、発色性又は蛍光基質が、抗原の視覚化をもたらすために添加される。幾つかの実施態様において、間接的なアッセイは、いくつかの二次抗体の、一次抗体上の異なるエピトープとの相互作用を介してシグナル増幅を与える。
【００８９】
幾つかの実施態様において、任意のブロッキング工程に続いて、組織サンプル、切片、又はコアが、一次抗体が試料中の標的タンパク質の抗原に結合するように、十分な時間と適切な条件下で一次抗体に曝露される。結合を達成するための適切な典型的な条件が本明細書で提供され、かつ当業者によって理解される。幾つかの実施態様において、サンプルへの抗体の結合の程度は、上で議論された検出可能な標識や技術のいずれかを用いて決定される。幾つかの実施態様において、検出は、顕微鏡、蛍光、及び／又は更なる検出方法を必要とする。幾つかの実施態様において、サンプルがマウントされ、検出に備えて封入される。
【００９０】
幾つかの実施態様において、抗体によるＥＧＦＲの複数の形態の検出が、更なるアッセイ及び／又は検出技術と、同時に及び／又は組合わせて実行される。本発明は、限定されないが、免疫組織化学法（例えば、抗体検出）によるＥＧＦＲの複数の形態の検出、インサイツハイブリダイゼーション（発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）など）、ＥＧＦＲの一以上の形態のＰＣＲ増幅などによるＥＧＦＲの検出及び／又は定量化を含む。
【００９１】
３．インサイツハイブリダイゼーション
幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲのすべての形態、野生型ＥＧＦＲ、変異型ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及びＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒなど）に関連付けられている遺伝子配列の検出及び／又は定量化するための組成物及び方法を提供する。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ関連配列の検出及び／又は定量化のための本発明の試薬は、限定されないが、タンパク質（例えば抗原結合タンパク質、免疫グロブリン、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片など）、核酸（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、標識−オリゴヌクレオチドコンジュゲートプローブ等）、小分子等を含む。幾つかの実施態様において、核酸プローブは、細胞、細胞培養、組織、組織サンプル、腫瘍サンプルなどにおけるＥＧＦＲ関連配列を検出および／または定量するために使用される。幾つかの実施態様において、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば発色標識プローブ、蛍光標識プローブ、放射性標識プローブ、酵素結合プローブなど）は、ＥＧＦＲに関連した遺伝子配列の同定、検出、及び／又は定量化を提供する。幾つかの実施態様において、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨなど）は、ＥＧＦＲ関連配列の検出及び／又は定量を提供する。幾つかの実施態様において、発色インサイツハイブリダイゼーションは、ＥＧＦＲ配列（例えば、全てのＥＧＦＲ、ＥＧＦＲの変異体（例えば、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及びＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒなど）、野生型ＥＧＦＲなど）の検出及び／又は定量化を提供する。
【００９２】
幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ関連配列の検出及び／又は定量化は、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の正確値及び／又は推定値を得る。幾つかの実施態様において、ＥＦＧＲ遺伝子コピー数の検出、定量、及び／又は推定は、遺伝子のコピー数の利得（遺伝子コピー数の変化など）の評価を提供する。幾つかの実施態様において、測定された遺伝子コピーの、標準値、測定された標準又は参照、及び／又は同じ被検体由来の別のサンプル（例えば、異なる場所に由来する組織、異なる時間に採取された組織サンプルなど）に対する比較は、遺伝子コピー数の変化（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の利得）の評価を与える。幾つかの実施態様において、遺伝子コピー数の増加は組織における遺伝子増幅の結果である。
【００９３】
幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子増幅（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の増加）とＥＧＦＲの変異（例えば、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒなど）は、リンクしているか及び／又は関連している（Okabe et al. Cancer Res 2007; 67: (5); 本明細書において参照によりその全体が援用される）。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ変異及びＥＧＦＲのコピー数は、癌患者（ＮＳＣＬＣ患者）における臨床転帰の指標である。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ変異と増加コピー数は、患者（例えば、癌患者、乳癌患者、肺癌患者、非小細胞肺癌患者は、低分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えばゲフィチニブ）による治療を受けた患者）における良好な臨床転帰と有意に関連付けられる(Takano et al. J Clin Oncol 23:6829-6837;本明細書において参照によりその全体が援用される)。幾つかの実施態様において、高レベルのＥＧＦＲ遺伝子発現は、ＥＧＦＲ遺伝子増幅に対応する（例えば、高いＥＧＦＲ遺伝子コピー数、例えば、ＥＧＦＲコピー数の利得など）（Wong et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 84, pp. 6899-6903;本明細書において参照によりその全体が援用される）。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、ＥＧＦＲの過剰発現に対応する（Bhargava et al. Modern Pathology (2005) 18, 1027-1033;本明細書において参照によりその全体が援用される）。
【００９４】
幾つかの実施態様において、本発明は、インサイツハイブリダイゼーション法（発色又は銀インサイツハイブリダイゼーションなど）の使用を介するＥＧＦＲ遺伝子コピー数の検出を提供する。幾つかの実施態様において、標準のインサイツハイブリダイゼーション法が適用される。標準のインサイツハイブリダイゼーション法は技術的に説明されている（例えば、Gall and Pardue, Methods in Enzymology, Vol. 21, 頁470-480 (1981); Henderson, International Review of Cytology, Vol. 76,頁1-46 (1982); Angerer, et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Setlow and Hollaender, Eds., Vol. 7, 頁43-65 (Plenum Press, New York, 1985)l;本明細書において参照によりその全体が援用される）。
【００９５】
幾つかの実施態様において、インサイツハイブリダイゼーションは以下の主な工程を含む。（１）組織又は検査すべき生物学的構造の固定、（２）標的ＤＮＡの接近性を高め、非特異的結合を減らすための生物学的サンプルのプレハイブリダイゼーション処理、（３）生物学的サンプル中の核酸に対するハイブリダイゼーションプローブ、（４）特異的ハイブリッドに結合していないプローブを除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄、及び（５）ハイブリダイズされたプローブの検出。これらの工程、使用される試薬、及びそれらの使用の条件は、本発明の異なる実施態様において異なる。
【００９６】
幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の領域にハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲプローブは、低ストリンジェンシーの条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子領域に結合するように構成される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲプローブは、中程度のストリンジェンシーの条件下で、しかし低ストリンジェンシーの条件下でなく、ＥＧＦＲ遺伝子領域に結合するように構成される。幾つかの実施態様において、ＥＧＦＲプローブは、高ストリンジェンシーの条件下でのみ、ＥＧＦＲ遺伝子領域に結合するように構成される。
【００９７】
幾つかの実施態様において、インサイツハイブリダイゼーションは、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）又は蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む。幾つかの実施態様において、ＣＩＳＨはＥＧＦＲ遺伝子領域において実施される。例えば。組織切片は５５℃で一晩インキュベートされる。スライドはキシレン及びグレードエタノール中で脱パラフィンされる。熱前処理が、１５分間９８−１００℃で前処理バッファー（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で行われる。組織は室温で１０分間ペプシンで消化される。ＥＧＦＲのプローブの適用後、スライドは封入され、エッジはラバーセメントで密封される。スライドは９５℃で５分間加熱され、その後加湿したチャンバーを用いて、３７℃で一晩インキュベートされる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が行われ、ＣＩＳＨポリマー検出キット（例えば、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から）を用いる免疫検出が続く。ＣＩＳＨシグナルが、４０倍対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用して数えられる。幾つかの実施態様において、腫瘍は、遺伝子のコピー数の平均が核当たり４５だった場合、遺伝子増幅について陽性として解釈される。当業者であれば、インサイツハイブリダイゼーションを最適化するためのパラメータを調整することができる。
【００９８】
発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）は、インサイツハイブリダイゼーション法が、ＦＩＳＨで必要とされる蛍光顕微鏡の代わりに、明視野顕微鏡で行われて検出されることを可能にする技術である。ＦＩＳＨは、高品質の６０倍又は１００倍の油浸対物レンズとマルチバンドパス蛍光フィルターを備えた蛍光顕微鏡（ほとんどのルーチン的な臨床検査室では使用しない）を必要とするが、ＣＩＳＨは標準的な光学（明視野）顕微鏡（一般に臨床検査室で使用される）による検出が可能である。ＣＩＳＨは一般的にフェードせず、組織サンプルがアーカイブされ、後に再検討されるのを可能とする。組織学的な細部は、明視野での検出でより良く理解され、それはＣＩＳＨ検出で可能である。形態学的な詳細は低倍率対物レンズ（例えば、１０倍と２０倍）を使用して容易に明らかであるため、組織切片の大きな領域は、ＣＩＳＨ対比染色後に迅速にスキャンすることができるが、ＦＩＳＨ検出は一般的に実質的により高倍率を必要とする（従って、視野を縮小する）。
【００９９】
一般的な発色／比色インサイツハイブリダイゼーション法は、Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる国際公開第００２６４１５号、及び米国特許出願公開第２００３００１７４９１号（本明細書において参照によりその全体が援用される）に説明されている。ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル、並びにサンプル／中期染色体でＣＩＳＨを行うための特定の試薬と工程は、国際公開第００２６４１５号、米国特許出願公開第２００３００１７４９１号、及び以下に示されたセクションに記載されている。重要なことは、以下の詳細な説明は、例示的な方法、手順、および試薬を提供し、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１００】
４．診断及びキット
幾つかの実施態様において．本発明の組成物および方法は、癌を有することが疑われる被検体、癌と診断された被検体、及び／又は癌に罹患した被検体からの組織、細胞、生検組織、組織サンプル（例えばコア、切片等）等に適用される。幾つかの実施態様において、組織生検は薄片にされ、タンパク質が、例えば、免疫蛍光法、免疫組織化学、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、ＣＩＳＨ，ＦＩＳＨなど）を用いて検出される。
【０１０１】
幾つかの実施態様において、本発明の組成物と方法が、癌へアクセスすること及び癌を治療することにおける用途を見いだし、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、肺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫を包含する。
【０１０２】
幾つかの実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲの変異型（例えば、エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒなど）の検出、特性評価、及び／又は定量化のためのキットを与える。幾つかの実施態様において、キットは、検出試薬とバッファーに加えて、ＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲ変異体特異的な抗体を含む。幾つかの実施態様において、キットは、検出試薬とバッファーに加えて、ＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲ変異体特異的なオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含む。他の実施態様において、キットは、免疫組織化学とインサイツハイブリダイゼーション（例えば、ＣＩＳＨ）の同時及び／又は連続的実行のための試薬を含む。幾つかの実施態様において、キットは、同時及び／又は連続的検出及び／又は定量化アッセイ（例えば、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーション）の一以上を行うために必要、及び／又は十分な全ての構成要素を包含し、全試薬、コントロール、アッセイを行うための指示、及び解析及び結果のプレゼンテーションに必要なソフトウエアを含む。幾つかの実施態様において、キットのエンド・ユーザーは、キットで使用するために、一以上の標準試薬を供給する。幾つかの実施態様において、キットのエンド・ユーザーは、キットで使用するために、特定の目的に対して特異的な一以上の試薬を供給する。
【０１０３】
本発明のその他の実施態様は、特異的なポリヌクレオチド（例えばＥＧＦＲ遺伝子）及び／又はタンパク質（タンパク質、ＥＧＦＲ（例えば、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲエクソン１９欠失、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒなど））の存在を試験するためのキットを包含する。幾つかの実施態様において、キットは、例えば、免疫組織化学による、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及びＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒの検出のための抗体、及びＥＧＦＲの遺伝子のコピー数の検出および定量化のための一以上のプローブを含む。加えて、キットには、更なる試薬及びバッファー、参照又はコントロールサンプル、サンプルを処理し、試験を実施し、結果を解釈するための説明書、及び試験を実施するために必要なバッファーや他の試薬を含むことができる。他の実施態様において、キットは発現ＥＧＦＲ及びコントロール遺伝子を含む別の遺伝子を検出するためのプライマーのペアを含む。
【０１０４】
幾つかの実施態様において、本発明は、癌及び／又は癌組織を特徴付けするための組成物と方法を提供する。幾つかの実施態様において、癌及び／又は癌組織の特徴づけの後に、癌又は癌組織に特異的な治療の方針の決定が続く。幾つかの実施態様において、治療方針は、限定されないが、放射線治療、手術、化学療法、抗癌剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）の投与、代替療法が含まれ得る。本発明は、本明細書に記載の組成物及び方法で示される治療法の種類又は治療によって限定されない。幾つかの実施態様において、本発明は、研究、薬学、獣医学、薬剤スクリーニング、医療、臨床、及び／又は診断用途での使用を見出すことができる。
【実施例】
【０１０５】
実験
次の項では本発明の例示的な実施形態を提供し、明示的に本明細書中に記載されていない代替的な実施態様に関連して、その範囲を限定することを考えるべきではない。
【０１０６】
実施例１
遺伝子-タンパク質のアッセイのための組成物及び方法
次の項では本発明の例示的な実施形態を提供し、明示的に本明細書中に記載されていない代替的な実施態様に関連して、その範囲を限定することを考えるべきではない。図１−１６は、本明細書に記載の組成物及び方法を受ける組織の例を提供する。
【０１０７】
抗ＥＧＦＲ抗体。ウサギモノクローナルＬ８５８Ｒ変異特異的抗ＥＧＦＲ（クローン４３Ｂ２）及びＥ７４６−Ａ７５０欠失（ｄｅｌ）特異的抗ＥＧＦＲ（クローン６Ｂ６）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡから得られた。抗体はＳＩＧＮＡＬＳＴＡＩＮ抗体希釈液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１：３０で希釈された。
【０１０８】
ＥＧＦＲプローブ。ニックトランスレーション、ＤＮＰ標識ＩＮＦＯＲＭ ＥＧＦＲプローブ（カタログ番号９８０−４３４３）が、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺから得られた。
【０１０９】
異種移植腫瘍組織マイクロアレイ。以下の異種移植腫瘍が１０％中性緩衝ホルマリンで固定され、パラフィンに埋め込まれた：Ｈ４６０（一染色体性ＥＧＦＲ遺伝子、野生型ＥＧＦＲタンパク質）：Ｈ３２５５（増幅ＥＧＦＲ遺伝子、Ｌ８５８ＲＥＧＦＲタンパク質）、Ａ５４９（三染色体性ＥＧＦＲ遺伝子、野生型ＥＧＦＲタンパク質）：ＲＶＨ６８４９（増幅ＥＧＦＲ遺伝子、野生型ＥＧＦＲタンパク質）：ＨＣＣ８２７（増幅ＥＧＦＲ遺伝子、Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ＥＧＦＲタンパク質）、及びＡ４３１（増幅ＥＧＦＲ遺伝子、野生型ＥＧＦＲタンパク質）。組織のコアは異種移植腫瘍それぞれから調製され、６異種移植腫瘍組織のコアを持つ組織マイクロアレイとしてパラフィンに再包埋した。
【０１１０】
ＥＧＦＲ変異検出プロトコール。デュアルカラー遺伝子−蛋白法を用いて、ＥＧＦＲ免疫組織化学（ＩＨＣ）検出をＥＧＦＲインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に先立ち行った。スライドはＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴ上でＥＺ Ｐｒｅｐ（カタログ番号９５０−１０２）を用いて脱パラフィンした。その後、スライドは、抗体インキュベーションに先立ち、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（カタログ番号９５０−１２４）を用いて、加熱前処理に供された。Ｌ８５８Ｒ変異体に特異的な抗体及びＥ７４６−Ａ７５０欠失抗体の混合物がスライド上に分注され、３７℃で１時間インキュベートされた。反応バッファー（カタログ番号９５０から３００）を使用してスライドを洗浄した後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体をスライド上に塗布し、３７℃で１６分間インキュベートした。発色はナフトール及びファストブルーを用いて行った。次いで、スライドは、加熱前処理のために反応バッファーとともに処理され、ＩＳＨプロテアーゼ３（カタログ番号７８０−４１４９）で消化された。ＥＧＦＲプローブが組織切片に適用され、プローブとターゲットの共変性工程の後、５時間ハイブリダイズされた。ストリンジェンシー洗浄工程が、ＳＳＣ（カタログ番号９５０−１１０）で行われ、組織切片をウサギモノクローナル抗ＤＮＰ抗体（カタログ番号７８０−４３３５）と共にインキュベートした。その後、スライドはＡＰ標識抗ウサギ抗体とインキュベートされ、発色はナフトール及びファストレッド（Ｖｅｎｔａｎａの仮特許出願に基づく）で行った。組織切片をヘマトキシリンＩＩ（カタログ番号７９０−２２０８）とブルーイング試薬（カタログ番号７６０−２０３７）で対比染色した。
【０１１１】
トリプルカラー遺伝子−蛋白法を用いて、ＥＧＦＲ免疫組織化学（ＩＨＣ）検出をＥＧＦＲインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に先立ち行った。スライドはＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴ上でＥＺ Ｐｒｅｐ（カタログ番号９５０−１０２）を用いて脱パラフィンした。その後、スライドは、抗体インキュベーションに先立ち、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（カタログ番号９５０−１２４）を用いて、加熱前処理に供された。Ｅ７４６−Ａ７５０欠失抗体の混合物がスライド上に分注され、３７℃で１時間インキュベートされた。反応バッファーを使用してスライドを洗浄した後、ＡＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体をスライド上に塗布し、３７℃で１６分間インキュベートした。発色はナフトール及びファストブルーを用いて行った。その後、最初のＩＨＣ検出のための試薬を不活性化するために、スライドは加熱された。Ｌ８５８Ｒ変異体特異的抗体の混合物がスライド上に分注され、３７℃で１時間インキュベートされた。反応バッファーを使用してスライドを洗浄した後、ＡＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体をスライド上に塗布し、３７℃で１６分間インキュベートした。発色はナフトール及びファストブルーを用いて行った。次いで、スライドは、加熱前処理のために反応バッファーとともに処理され、ＩＳＨプロテアーゼ３（カタログ番号７８０−４１４９）で消化された。ＥＧＦＲプローブが組織切片に適用され、プローブとターゲットの共変性工程の後、５時間ハイブリダイズされた。ストリンジェンシー洗浄工程が、ＳＳＣ（カタログ番号９５０−１１０）で行われ、組織切片をウサギモノクローナル抗ＤＮＰ抗体（カタログ番号７８０−４３３５）と共にインキュベートした。その後、スライドを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体とインキュベートし、発色はｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＳＩＳＨキット（カタログ番号７８０−００２）で行った。組織切片をヘマトキシリンＩＩ（カタログ番号７９０−２２０８）とブルーイング試薬（カタログ番号７６０−２０３７）で対比染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月30日(2012.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルのＥＧＦＲの状態を評価する方法であって、
前記組織サンプルを試薬で処理し、Ｌ８５８Ｒ ＥＧＦＲ変異、エクソン１９欠失ＥＧＦＲ変異及びＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無に対応した識別可能なシグナルを生成し、
前記識別可能なシグナルを同時に可視化すること
を含む方法。
【請求項２】
前記組織サンプルは癌に罹患が疑われる患者、癌と診断された患者、又は癌に罹患した患者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理が、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な抗原結合分子と前記サンプルを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理が、ＥＧＦＲ遺伝子に特異的な核酸プローブと前記サンプルを接触させることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記処理が、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記核酸結合分子とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な前記抗原プローブを、前記ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異の有無及びＥＧＦＲ遺伝子増幅の有無に対応する検出可能なシグナルを生成する試薬と接触させることを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲ遺伝子に特異的な前記核酸プローブが、シグナル生成部分を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲに特異的な前記核酸プローブが、シグナル生成システムで検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記シグナル生成システムが、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲに特異的な前記核酸プローブの分別検出のための試薬を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナル生成システムが、Ｌ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９欠失変異を有するＥＧＦＲ分子に特異的な前記抗原結合分子とＥＧＦＲに特異的な前記核酸プローブの各々に対する異なる比色分析シグナルを生成するための試薬を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
異なる比色分析シグナルを生成するための前記試薬が、銀、ファストレッド、ファストブルー、ファストゴールド、ＤＡＢ，ＡＰオレンジ、及びＡＰブルーからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
異なる比色分析シグナルを生成するための前記試薬が、酵素的に標識された試薬を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素的に標識された試薬の酵素標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の変化とＥＧＦＲ変異の有無を評価することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者の予後の診断を行うために前記評価を用いることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療的処置を決定するために前記評価を用いることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｌ８５８Ｒ変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第一の抗原結合分子、
エクソン１９欠失変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第二の抗原結合分子、
ＥＧＦＲに特異的な核酸プローブ、
及び、前記第一の抗原結合分子、前記第二の抗原結合分子、及び前記核酸プローブの各々に特異的な識別可能なシグナル生成試薬
を含むシステム。
【請求項１７】
Ｌ８５８Ｒ変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第一の抗原結合分子、
エクソン１９欠失変異を含むＥＧＦＲ分子に特異的な第二の抗原結合分子、
ＥＧＦＲに特異的な核酸プローブ、
及び、前記第一の抗原結合分子、前記第二の抗原結合分子、及び前記核酸プローブの各々に特異的な識別可能なシグナル生成試薬
を含むキット。
【請求項１８】
患者の予後又は診断のための請求項１６に記載のシステムの使用。
を含むキット。
【請求項１９】
患者に対する治療的処置を決定するための請求項１６に記載のシステムの使用。
【国際調査報告】
2013516178.tif 000018