(57)【要約】  本発明は、２型糖尿病の治療、改善及び／又は予防のための組成物、医薬組成物とワクチンを提供する。本発明の組成物、医薬組成物及びワクチンはＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と抗原とを含んでなり、前記抗原はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ムテインを含む。動物に、好ましくはヒトに投与される場合、前記組成物、医薬組成物及びワクチンは有効な免疫反応、特に抗体応答を誘導し、一般的に、好ましくは前記抗体応答はＩＬ−１βに向かうものである。したがって、本発明は、ＩＬ−１βに対する能動免疫化を介して２型糖尿病を治療、改善または予防する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病の治療方法に用いられる組成物であって、
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されたアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記突然変異されたアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、前記突然変異されたアミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されている、少なくとも一つの抗原とを含んでなり、
（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結される、組成物。
【請求項２】
突然変異された前記アミノ酸配列は配列番号４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
突然変異された前記アミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基がリジン残基により交換される、請求項１又は２の組成物。
【請求項４】
前記ＩＬ−１βムテインが配列番号６のアミノ酸配列から成る、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は、
（ｉ）前記ＩＬ−１βムテイン、及び
（ｉｉ）リンカーであって、前記リンカーが前記第２の付着部位を含み、前記リンカーはＧＧＣＧ（配列番号７）を含むか又は好ましくはそれから成っており、
好ましくは前記リンカーはペプチド結合を介して前記ＩＬ−１βムテインのＣ末端に共有結合している、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は配列番号１１から１４の何れか一つであって、好ましくは少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は配列番号１１である、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＲＮＡバクテリオファージが
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＡＰ２０５、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、および
（ｄ）バクテリオファージＧＡからなる群から選択され、
好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβである、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子がＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれから成るか、あるいはそれから成り、好ましくは前記組換えコートタンパク質は配列番号３を含むか、好ましくはそれから成る、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の付着部位が、少なくとも一つの共有結合を経て前記第２の付着部位に連結され、好ましくは前記少なくとも一つの共有結合が非ペプチド結合である、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれからなる、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそれからである、請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の付着部位がアミノ基であり、前記第２の付着部位がスルフヒドリル基であり、好ましくは前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２の付着部位のただ１つが、少なくとも１つの非ペプチド共有結合を介して前記第１の付着部位に結合して、前記ウイルス様粒子への前記抗原の単一で均一型の結合となり、前記第１の付着部位に結合する前記ただ１つの第２の付着部位はスルフヒドリル基であり、前記抗原と前記ウイルス様粒子は前記結合を介して相互作用して、規則正しい反復性の抗原アレイを作成する、請求項１から１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの第１の付着部位と前記少なくとも１つの第２の付着部位はヘテロ二官能性架橋剤を経て共有結合され、好ましくは前記ヘテロ二官能性架橋剤はスクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）である、請求項１から１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
安定化剤を更に含む請求項１から１４の何れか一項に記載の組成物であって、前記安定化剤は無機塩、好ましくは塩化ナトリウムであり、更に好ましくは前記組成物中の前記安定化剤の濃度は５〜２００ｍＭであり、より好ましくは前記組成物中の前記安定化剤の濃度は１０〜１００ｍＭであり、更により好ましくは前記組成物中の前記安定化剤の濃度は２５〜７５ｍＭであり、最も好ましくは前記組成物中の前記安定化剤の濃度は５０ｍＭである、組成物。
【請求項１６】
非イオン性界面活性剤を更に含む請求項１から１５の何れか一項に記載の組成物であって、好ましくは前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート２０であり、更に好ましくは前記組成物中の前記非イオン性界面活性剤の濃度は０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌであり、また更に好ましくは前記組成物中の前記非イオン性界面活性剤の濃度は０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌであり、また更に好ましくは前記組成物中の前記非イオン性活性剤の濃度は０．１０ｍｇ／ｍｌある、組成物。
【請求項１７】
請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物の有効量を含むか、あるいはそれから成っているワクチン組成物。
【請求項１８】
２型糖尿病の治療用ワクチン組成物であって、
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記突然変異されたアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、前記突然変異されたアミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されている、少なくとも一つの抗原とを含んでなり、
（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結される、ワクチン組成物。
【請求項１９】
請求項１から１６の何れか一項に記載のように定義された、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記ワクチン組成物がアジュバント、好ましくはアルミニウム水酸化物を含む、請求項１７から１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
（ａ）請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物又は請求項１７から２０の何れか一項に記載のワクチン組成物、及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２２】
２型糖尿病を治療する方法に使用するための医薬組成物であって、
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、と
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記アミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、突然変異された前記アミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されており、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合された、少なくとも一つの抗原、と
（ｃ）薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。  
【請求項２３】
請求項１から１６の何れか一項に記載のとおりに定義された、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
安定化剤を更に含む請求項２１から２３の何れか一項に記載の医薬組成物であって、前記安定化剤は無機塩、好ましくは塩化ナトリウムであり、更に好ましくは前記医薬組成物中の前記安定化剤の濃度は５から２００ｍＭであり、より好ましくは前記医薬組成物中の前記安定化剤の濃度は１０から１００ｍＭであり、更により好ましくは前記医薬組成物中の前記安定化剤の濃度は２５から７５ｍＭであり、最も好ましくは前記医薬組成物中の前記安定化剤の濃度は５０ｍＭである、医薬組成物。
【請求項２５】
非イオン性界面活性剤を更に含む請求項２１から２４の何れか一項に記載の医薬組成物であって、好ましくは前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート２０であり、更に好ましくは前記医薬組成物中の前記非イオン性界面活性剤の濃度は０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌであり、また更に好ましくは前記医薬組成物中の前記非イオン性界面活性剤の濃度は０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌであり、また更に好ましくは前記医薬組成物中の前記非イオン性活性剤の濃度は０．１０ｍｇ／ｍｌある、医薬組成物。
【請求項２６】
免疫学的有効量の請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物、請求項１７から２０の何れか一項に記載のワクチン組成物、及び／又は請求項２１から２５の何れか一項に記載の医薬組成物を、動物、好ましくはヒトに投与することを含んでなる、２型糖尿病の治療方法。
【請求項２７】
動物、好ましくはヒトの２型糖尿病を治療するための医薬の製造方法における、請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物、請求項１７から２０の何れか一項に記載のワクチン組成物、及び／又は請求項２１から２５の何れか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物、請求項１７から２０の何れか一項に記載のワクチン組成物、請求項２１から２５の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項２６に記載の方法又は請求項２７に記載の使用であって、前記組成物、前記ワクチン組成物、又は前記医薬組成物は、動物、好ましくはヒトに投与され、前記動物、好ましくは前記ヒトに投与される一回投与量は総タンパク質として１から１５００μｇ、好ましくは５から１０００μｇ、より好ましくは５から９００μｇ、更により好ましくは５から６００μｇ、更により好ましくは５から４００μｇ、更により好ましくは１０から３００μｇ、更により好ましくは１０から１００μｇ、最も好ましくは１００μｇを含み、好ましくは前記総タンパク質は（ａ）前記少なくとも１つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と（ｂ）前記少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原からなる、請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物、請求項１７から２０の何れか一項に記載のワクチン組成物、請求項２１から２５の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項２６に記載の方法又は請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記一回投与量が０．１から５ｍｇ、好ましくは０．２から２ｍｇ、より好ましくは０．５から１．５ｍｇ、最も好ましくは１．０ｍｇの水酸化アルミニウムを更に含む、請求項２８に記載の組成物、ワクチン組成物、医薬組成物、方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病の治療、改善および／または予防のための組成物、医薬組成物及びワクチンを提供する。本発明の組成物、医薬組成物及びワクチンは、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と抗原とを含んでなり、前記抗原はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ムテインを含む。動物に、好ましくはヒトに投与される場合、前記組成物、医薬組成物及びワクチンは効率的な免疫反応、特に抗体応答を誘導し、通常は、好ましくは、前記抗体応答はＩＬ−１βに向かうものである。したがって、本発明は、ＩＬ−１βに対する能動免疫化を介して２型糖尿病を治療、改善又は予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病は、インスリン分泌不全、インスリン作用不全または両方の組合せによる高血糖の存在により特徴づけられる慢性的代謝異常である。２型糖尿病の膵臓のβ細胞不全の機構が完全に解明されていないが、ストレスと炎症性経路が関係していることが示された。反復的なグルコース襲撃、脂質異常症及びアディポカインによって生じる代謝ストレスは局所的サイトカイン分泌、膵島免疫性β細胞浸潤、β−細胞アポトーシス、アミロイド沈着及び線維によって特徴づけられるすい臓の炎症性反応を誘導することがある。ＩＬ−１βはマスター・サイトカインとして現れて、膵島ケモカイン産生を調整し、インシュリン産生不全とβ−細胞死が生じる。組換えＩＬ−１β受容体アンタゴニストまたは中和モノクローン抗体の投与によるＩＬ−１β信号伝達の遮断は、２型糖尿病の動物モデルの血糖コントロールを改良することが示された（Sauter et al. 2008, Endocrinology, Vol. 149(5) pp. 2208-18; Osborn et al. 2008, Cytokine, Vol. 44(1) pp. 141-8)。さらにまた、組換えヒトＩＬ−１β受容体アンタゴニスト（Ａｎａｋｉｎｒａ）による２型糖尿病患者の治療は、糖化ヘモグロビン濃度（長期糖血症の確実な示度）の減少とβ細胞機能の改善に結果としてなった(Larsen et al. 2007, N Engl J Med, Vol. 356(15) pp. 1517-1526, 2007)。
【発明の概要】
【０００３】
我々は、少なくとも一つのＩＬ−１βムテインを含んで成る本発明の組成物がＩＬ−１βに対して免疫反応、特にこれによる抗体応答を誘導することができるだけでなく、さらにインビボでＩＬ−１βの炎症誘発活性を中和することができることも見いだした。これはマウスモデル（実施例３を参照）と、ヒトの状態と密接に類似していると考えられるサル・モデル（実施例１１を参照）において示された。
【０００４】
我々は、現在、驚くべきことに、本発明の組成物による能動免疫化が、糖尿病のマウスモデル(Surwit et al., DIABETES, Vol. 37, 1988, 1163-1167)の食事誘導性糖尿病性表現型の改善に結果としてなったことを見いだした（実施例５を参照）。さらにまた、驚くべきことに、受容体結合とそれによるヒトＩＬ−１βの生物的活性が、そのＮ末端アミノ酸残基をアミノ酸配列ＭＤＩ（実施例６）と交換することによって減少される可能性があることが見いだした。変異されたＮ末端が、ヒトＩＬ−１βの生物的活性を減じることが知られている突然変異であるＤ１４５Ｋ突然変異と相乗作用的に相互作用することも見いだされた（実施例６）。両方の突然変異を含むＩＬ−１βムテインは、非常に低い生物活性を示した。霊長類の研究において、Ｄ１４５Ｋ突然変異とＮ末端にアミノ酸配列ＭＤＩを含むヒトＩＬ−１βムテインは、野生型ヒト及び霊長類ＩＬ−１βと比較した場合に、かなり有意に減少した反応性を示した（実施例７）。ＩＬ−１βムテインの低い生物活性はインビボでワクチンの反応性を減少させ（実施例１０を参照）、したがって最終的にワクチンの安全に寄与する。
【０００５】
したがって、本発明の一態様は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療方法に使用される組成物であって、該組成物が（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されたアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記突然変異されたアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、前記突然変異されたアミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されている、少なくとも一つの抗原；とを含んでなり、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合される組成物である。
【０００６】
下で開示されるように、本発明の更なる態様はワクチンの組成物、医薬組成物、方法及び使用である。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
アジュバント：ここで用いられる「アジュバント」なる用語は、ワクチン又は医薬組成物と組み合わせると、それぞれ、より亢進した免疫応答をもたらしうる貯蔵所の生成を宿主内において可能にする物質又は免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。好ましいアジュバントは、完全及び不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウム、最も好ましくはミョウバン、修飾ムラミルジペプチドである。更に好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホール  リンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールとＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムのようなヒト・アジュバントである。本発明の組成物と共に投与することができる更なるアジュバントは、一リン酸化脂質免疫調節薬、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４とビロソームアジュバント技術を含むが、これに限定されるものではない。アジュバントなる用語は、更にこれらの物質の混合物を含む。ＶＬＰは、一般にはアジュバントとして記載されている。しかしながら、本願の文脈内で使用される「アジュバント」なる用語は、本発明の組成物に使用されるＶＬＰではないアジュバントを意味し、むしろ追加の別個の成分に関する。特に、アジュバントなる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を意味するものではない。
【０００８】
抗原：本明細書で用いる「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子により提示された場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合されることができる分子を指す。抗原は免疫系により認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、これは、少なくとも特定の場合に、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むか、又は結合していて、アジュバントで投与される必要がある場合がある。抗原は、一つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上に記載した特異的反応は、抗原が、好ましくは、一般的に、非常に選択的にその対応する抗体又はＴＣＲと反応するが、他の抗原により誘起される他の多数の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意味する。抗原は、本明細書で用いる数種の抗原の混合物であってもよい。本願明細書において使用する「抗原」なる用語は、好ましくはポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＩＬ−１βムテインを含むかまたはそれから成るポリペプチドに関する。しかしながら、本願明細書において使用する「抗原」なる用語はウイルス様粒子を意味するものではなく、特にＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を指すものではない。
【０００９】
特異的結合（抗体／抗原）：本出願において、抗体は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上及び最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）で抗原に結合する場合、特異的に結合していると定義される。抗体の親和性は当業者によって容易に測定されうる（例えばスキャッチャード分析、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ分析によって）。
【００１０】
特異的結合（ＩＬ−１β／ＩＬ−１レセプター）：レセプターとレセプターリガンドとの相互作用は、一般に当分野で公知の生物物理学的な方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅ分析によって特徴付けされうる。ＩＬ−１βムテインを含むＩＬ−１β分子がＩＬ−１レセプターを特異的に結合することができるとみなすのは、ＩＬ−１レセプターへのＩＬ−１β分子又はＩＬ−の結合親和性（Ｋａ）が少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０６Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、さらにより好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、及び最も好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１である場合であり、好ましくは該ＩＬ−１レセプターがヒトのＩＬ−１レセプターである。さらに好ましくは、前記ＩＬ−１レセプターは、配列番号１又は配列番号２のいずれか一つを含むか、より好ましくはそれから成り、更に好ましくは前記ＩＬ−１レセプターは配列番号１を含むか、好ましくはそれから成る。
【００１１】
会合(associated)：本願明細書において使用する「結合(associated)」または「結合(association)」なる用語は、２つの分子を結合する、全てのありうる方法であって、好ましくは化学相互作用を意味する。好ましくは、結合は共有結合を介するものであり、更に好ましくは前記共有結合的相互作用はエステル結合、エーテル結合、ホスホエステル結合、アミド結合、ペプチド結合、炭素−リン結合、炭素−硫黄結合（例えばチオエーテル）またはイミド結合から選択される。
【００１２】
付着部位、第１：本明細書で用いる「第１の付着部位」という句は、ＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに天然に存在する要素、又はＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに人工的に付加された要素であって、第２の付着部位に結合されうる要素をさす。第１の付着部位は好ましくはアミノ酸残基を含むか、更により好ましくはアミノ酸残基またはアミノ基のような化学反応基である。第１の付着部位はアミノ酸残基のアミノ基であることが好ましい。更なる好ましい実施態様において、第１の付着部位はリジン残基である。また更なる好ましい実施態様において、第１の付着部位はリジン残基のアミノ基である。好ましい実施態様において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、好ましくは前記リジン残基はＲＮＡバクテリオファージの前記ＶＬＰに天然に存在するリジン残基である。第１の付着部位は、通常、好ましくは表面に位置しており、更に好ましくはＲＮＡバクテリオファージの、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰの外面上に位置する。複数の第１の付着部位は、表面上に、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰの、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの外表面上に、基本的に、好ましくは反復性の配置で存在する。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに、少なくとも１つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合により結合する。更なる好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰに天然に存在する。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージの前記ＶＬＰは、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合により結合し、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージはＱβである。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であって、前記リジン残基は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質のリジン残基のアミノ基であって、好ましくは前記コートタンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれから成る。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位はリジン残基であって、前記リジン残基は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。
【００１３】
付着部位、第２：本明細書で用いる際、「第２の付着部位」という句は、抗原に、好ましくは抗原を含むＩＬ−１βムテインに天然に存在するか又は人工的に付加される要素であって、第１の付着部位が連結される要素をさす。第２の付着部位は好ましくはアミノ酸残基である。より好ましくは、第２の付着部位は、化学反応基、好ましくはアミノ酸残基の化学反応基である。非常に好ましくは、前記第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。従って、「少なくとも一つの第２の付着部位を有する抗原」なる用語は、抗原、好ましくはＩＬ−１βムテインと少なくとも一つの第２の付着部位を含んで成るコンストラクトに関する。しかしながら、特に、第２の付着部位が抗原中に天然に存在しない場合、上記のコンストラクトは基本的に好ましくは「リンカー」を更に含む。好ましい実施態様において、第２の付着部位は、抗原、好ましくはＩＬ−１βムテインに、少なくとも一つの共有結合を介して、少なくとも一つのペプチド結合を介して結合する。さらなる実施態様において、第２の付着部位は、抗原中に天然に存在し、好ましくはＩＬ−１βムテインに存在する。別の更なる好ましい実施態様において、第２の付着部位はＩＬ−１βムテインに人工的に、好ましくはリンカーを介して付加され、更に好ましくは前記リンカーはシステイン残基を含むか、またはそれから成る。非常に好ましくは、前記リンカーはペプチド結合を介してＩＬ−１βムテインに融合される。
【００１４】
連結した：「連結した」（またはその名詞：連結）なる用語は、本願明細書において使われる場合、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位が連結される全てのありうる方法、好ましくは化学相互作用を指す。連結は、好ましくは共有結合である。共有結合的相互作用は、好ましくは、エステル結合、エーテ結合ル、リン酸エステル結合、アミド結合、ペプチド結合、炭素−リン結合、炭素−硫黄結合（例えばチオエーテル）またはイミド結合から選択される共有結合である。特定の好ましい実施形態において、第１の付着部位と第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つの非ペプチド結合により、更により好ましくは独占的に非ペプチド結合により連結される。しかしながら、本願明細書において使用される「連結される」なる用語は、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位の直接的な連結を含むだけでなく、代わりに、好ましくは、中間体分子を介した少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位との間接的な連結であって、典型的に、好ましくは、少なくとも一つの、好ましくは一つのヘテロ二官能性架橋剤による連結をも含む。したがって、好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位は、少なくとも一つの、好ましくは正確に一つのヘテロ二官能性架橋剤を経て連結される共有結合であって、好ましくは前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であって、更に好ましくは前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。
【００１５】
リンカー：本願明細書において使われる場合、「リンカー」は第２の付着部位をＩＬ−１βムテインに結合させるか、又は第２の付着部位を含むか、又はそれから成る。好ましくは、本願明細書において使われる場合、「リンカー」は第２の付着部位を、基本的には、好ましくは、しかし必然的ではなく、一つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含む。好ましい実施態様において、前記リンカーは、アミノ酸リンカーである。好ましい実施態様において、前記リンカーは正確に一つのシステイン残基を含み、前記第２の付着部位は前記正確に一つのシステイン残基のスルフヒドリル基である。ＩＬ−１βムテインへのリンカーの結合は、少なくとも一つの共有結合を経由して、より好ましくは少なくとも一つのペプチド結合を経由する。
【００１６】
アミノ酸リンカー：「アミノ酸リンカー」なる用語は、少なくとも一つのアミノ酸残基を含むリンカーを指す。好ましい実施態様において、前記アミノ酸リンカーは、アミノ酸残基のみから成る。
【００１７】
規則正しい反復性抗原アレイ：本願明細書で使用する「規則正しい反復性抗原アレイ」なる用語は、通常抗原の反復パターンまたは構造を指し、それぞれ典型的に、好ましくは、ウイルス様粒子に関して抗原の空間配置の非常に規則正しい均一性によって特徴づけられる。本発明の一実施形態において、反復パターンは幾何学模様であってもよい。本発明の特定の実施態様は、例えばＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰは、１から３０ナノメーター、好ましくは２から１５ナノメーター、より好ましくは２から１０ナノメーター、さらにより好ましくは２から８ナノメーター、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する抗原の準結晶性の厳密に反復性の規則性を持つ、適切に規則正しい反復性抗原アレイの典型的及び好適な例である。
【００１８】
ＩＬ−１β：ヒトＩＬ−１βなる用語は、ヒトＩＬ−１β１１６−２６９（配列番号４）に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、更により好ましくは少なくとも９８％、更により好ましくは少なくとも９９％、及び最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列からなる任意のポリペプチドを意味する。非常に好ましい実施態様において、ヒトＩＬ−１βは、配列番号４からなるポリペプチドに関する。また、ヒトＩＬ−１βは組換えにより発現されるヒトＩＬ−１βを含む。大腸菌のような原核生物発現系において発現されるポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基によって基本的には特徴づけられる。したがって、ヒトＩＬ−１βなる用語は、好ましくは配列番号２０、及び配列番号２０と配列番号４の任意の混合物を意味する。
【００１９】
ＩＬ−１βムテイン：「ＩＬ−１βムテイン」なる用語は、本願明細書において使用する際、突然変異アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、突然変異されたアミノ酸配列がヒトＩＬ−１βであるポリペプチドに関する。典型的に、好ましくは、ＩＬ−１βムテインは、前記突然変異アミノ酸配列から成るポリペプチドの生物活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満の生物活性を含み、好ましくは前記生物活性はヒト細胞で、好ましくはＰＢＭＣ又はＨｅＬａ細胞で、ＩＬ−６形成を誘導する前記ポリペプチドの能力により測定される。動物に導入された場合、好適なＩＬ−１βムテインを含む本発明の組成物は、基本的に、好ましくは、突然変異された前記アミノ酸配列からなるポリペプチドに対する交差反応性を含む抗体を、誘導する。したがって、動物に導入された場合、好適なＩＬ−１βムテインを含む本発明の組成物は、基本的に好ましくは、ヒトＩＬ−１β、好ましくは配列番号４に特異的に結合することができる抗体を誘導する。本発明において、突然変異されたＮ末端を含んで成るＩＬ−１βムテインが好ましい。非常に好ましくは、ＩＬ−１βムテインはＮ末端アミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）を含む。非常に好ましくは、ＩＬ−１βムテインは突然変異されたアミノ酸配列から成り、突然変異された前記アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）と置換される。更に好ましくは、ＩＬ−１βムテインは、突然変異された前記アミノ酸配列からなるポリペプチドと比較した場合、ＩＬ−１βムテインの減少した生物活性を生じる少なくとも一つの、好ましくは正確に一つの更なる突然変異を含む。非常に好ましくは、ＩＬ−１βムテインは、突然変異されたアミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、好ましくは配列番号４であり、突然変異される前記アミノ酸配列、好ましくは配列番号４の位置１４５のアミノ酸残基は、別のアミノ酸残基に置換される。また更に好ましくは、ＩＬ−１βムテインは、突然変異されたアミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、好ましくは配列番号４であり、突然変異される前記アミノ酸配列、好ましくは配列番号４の位置１４５のアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基であり、前記アスパラギン酸残基はリジン残基により置換される。また更に好ましくは、ＩＬ−１βムテインは、突然変異されたアミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、好ましくは配列番号４であり、突然変異される前記アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）により置換され、更に突然変異される前記アミノ酸配列、好ましくは配列番号４の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基により、好ましくはリジン残基により置換される。
【００２０】
アミノ酸置換：アミノ酸置換なる表現は、他の任意のアミノ酸残基によるアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸残基の置換に関する。
【００２１】
生物活性：本願明細書において使用する「生物活性」(biological activity又はbiologically active)なる用語は、ＩＬー１βを含むＩＬー１β分子に関して、動物、好ましくはヒトへの全身投与後、ＩＬー６の産生を誘導するＩＬー１β分子及び／又はＩＬー１βムテインの能力を意味する。好ましくは、インビボでＩＬ−６形成を誘導するためのＩＬ−１β分子および／またはＩＬ−１βムテインの能力は、実施例２Ａ及び７に記載のように測定される。「生物活性」（biological activity又はbiologically active)なる用語は、胸腺細胞(Epps et al., Cytokine 9(3): 149-156 (1997），Ｄ１０．Ｇ４．１ヘルパーＴ細胞(Orencole and Dinarello, Cytokine 1(1): 14-22 (1989)の増殖を誘導するＩＬ−１β分子及び／又はＩＬ−１βムテインの能力、又はＭＧ６４又はＨａＣａＴ細胞(Boraschi et al., J. Immunol. 155:4719-4725 (1995)又は繊維芽細胞(Dinarello et al., Current Protocols in Immunology 6.2.1-6-2-7 (2000))の産生を誘導する能力，又はＥＬ−４胸腺種細胞からのＩＬー２の産生(Simon et al., J. Immunol. Methods 84(1-2): 85-94 (1985))，又はヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５を阻害する能力(Nakai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 154:1189-1196 (1988))を誘導するＩＬ−１β分子及び／又はＩＬ−１βムテインの能力を意味する。非常に好ましくは、ＩＬ−１β分子またはＩＬ−１βムテインの生物活性は、ヒト細胞の、好ましくはＰＢＭＣ細胞の又はＨｅＬａ細胞のＩＬ−６形成を誘導するための能力に関連する。
【００２２】
ポリペプチド：本願明細書において使用する際、「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（別名ペプチド結合）によって線形に連結されるモノマー（アミノ酸）から成る分子を意味する。それはアミノ酸の分子鎖を示し、生成物の特異的な長さに関連しない。  
【００２３】
ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、公知のコンピュータプログラム（例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム）を使用して、従来技術により決定されうる。対照標準アミノ酸配列に対して、例えば９５％同一性を有するかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔ又は他の任意の配列配列プログラムも使用する場合、好ましくはＢｅｓｔｆｉｔを使用する場合、同一性のパーセンテージは対照標準アミノ酸配列の完全長に対して算出され、対照標準配列におけるアミノ酸残基の総数の多くとも５％の相同性におけるギャップが許可されるように、パラメータは設定される。
【００２４】
コートタンパク質：「コートタンパク質」なる用語はウイルスキャプシド又はＶＬＰに組み込まれることができる、ウイルスタンパク質、好ましくはウイルスの、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの天然のキャプシド集合体を指す。コートタンパク質なる用語は、キャプシドタンパク質としても知られている。
【００２５】
組換えＶＬＰ：本願明細書において使われる「組換えＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一つの工程を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。
【００２６】
本明細書で用いられる「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」なる用語は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性又は非感染性のウイルス粒子、又は非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性又は非感染性のウイルス粒子に類似した構造、好ましくはウイルスのキャプシドを指す。本願明細書において使われる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰによって含まれるゲノムを複製することができないことを指す。本願明細書において使われる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に入ることができないことを指す。好ましくは、ウイルスゲノム又はウイルスゲノム機能の全部または一部を欠いているので、本発明のウイルス様粒子は、非複製性及び非感染性である。一実施態様において、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、そこでウイルスゲノムは物理的に又は化学的に不活化されている。基本的に、より好ましくは、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの複製性及び非感染性成分の全て又は一部を欠く。本発明に係るウイルス様粒子は、ゲノムとは別の核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の基本的及び好適な実施態様は、対応するウイルス、好ましくはバクテリオファージ、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのウイルスカプシドのようなウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」または「カプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質サブユニットから成る巨大分子アセンブリをさす。通常は、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウィルスタンパク質サブユニットがある。基本的には、好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、本来の反復性の構成を有するウイルスカプシド又はウイルスカプシド様の構造の形成につながり、前記構造は、典型的には球状又は管状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージコートのカプシドは、正二十面体対称性の球面形状を有する。本明細書で使用する場合、「カプシド様構造」なる用語は、上記定義の意味でカプシド形態に類似するが、十分な次数と繰り返しを維持しながら典型的な対称組立体からは逸脱するウイルスタンパク質サブユニットからなる巨大分子組立体を意味する。従ってウイルス様粒子の典型的な特徴はそのサブユニットの非常に規則正しい繰り返し配置である。
【００２７】
ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：ここで使用される場合、「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又はそれからなるウイルス様粒子を指す。また、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージの構造に類似する。更に、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性である。基本的に、好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも一つの遺伝子、好ましくは全ての遺伝子を欠損している。更に好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子も欠損する。しかしながら、この定義は、上述の遺伝子又は遺伝子群がなお存在しているが不活性であり、よってまたＲＮＡバクテリオファージの非複製性及び／又は非感染性ウイルス粒子を生じるＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子をさらに包含する。ＲＮＡバクテリオファージ由来の好ましいＶＬＰは正二十面体対称を示し、１８０のサブユニットからなる。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス粒子を非複製性及び／又は非感染性にするために好適な方法は物理的、化学的不活化、例えばＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理により、典型的かつ好ましくは遺伝子操作による。
【００２８】
糖尿病：「糖尿病」なる用語は糖尿病の任意の種類に関する。好ましくは、糖尿病は１型糖尿病および／または２型糖尿病に関する。最も好ましくは、糖尿病は２型糖尿病に関する。
【００２９】
用量：用量なる用語は、１日に、動物に、好ましくはヒトに投与される本発明の組成物、本発明のワクチン組成物、または本発明の医薬品組成物の総量に関する。基本的に、好ましくは、しかし必然的ではないが、一用量は、前記動物に、好ましくは前記ヒトに１回で、好ましくは単回注射によって投与される。
【００３０】
本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善及び予防方法に用いられる組成物であって、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記アミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、突然変異される前記アミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されている、少なくとも一つの抗原を含んでなり、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合される、組成物を提供する。
【００３１】
好ましくは、前記ＩＬ−１βムテインは、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子に結合され、それにより規則正しい反復性抗原−ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好ましい実施態様では、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、またより好ましくは少なくとも１２０、更により好ましくは少なくとも１８０のＩＬ−１βムテイン分子は、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子に結合される。好ましい一実施形態において、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、組換えウイルス様粒子である。
【００３２】
好ましい一実施形態において、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれから成るか、またはそれからなる。好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージは以下からなるグループから選択される：（ａ）バクテリオファージＱβ、（ｂ）バクテリオファージＲ１７、（ｃ）バクテリオファージｆｒ、（ｄ）バクテリオファージＧＡ  、（ｅ）バクテリオファージＳＰ、（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、（ｇ）バクテリオファージＭ１１、（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｋ）バクテリオファージｆ２、（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、（ｍ）バクテリオファージＰＲＲ１、及び（ｎ）バクテリオファージＡＰ２０５。
【００３３】
更なる好ましい実施態様において、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、あるいは本質的にそれから成るか、あるいはそれからなる。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、特にＲＮＡバクテリオファージＱβは、ＷＯ０２／０５６９０５に開示される。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰの調製の詳細な説明を提供する。
【００３４】
更なる好ましい実施態様において、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、組換えコートタンパク質を含むか、あるいは本質的にそれから成り、前記組換えコートタンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれから成る。
【００３５】
好ましい一実施形態において、本発明の組成物及びワクチンは、０．５から４．０の抗原密度を有する。本願明細書において使われるように、「抗原密度」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰのサブユニットごとに、好ましくはコートタンパク質ごとに結合されるＩＬ−１βの平均数を表す。したがって、この値は、本発明の組成物またはワクチンにおいて、ＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰの、全てのサブユニットにおける平均として算出される。
【００３６】
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、定まった数のリジン残基をそれらの表面に提示し、３つのリジン残基がカプシドの内部を向いてＲＮＡと相互作用し、４つの別のリジン残基がカプシドの外側に曝らされる定まったトポロジーを有する。好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位は、ＶＬＰの外側を向いているか又はそこに存在するリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は配列番号３のリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号３の位置２、１３、１６、４６、６０、６３及び６７のリジン残基のいずれか一つのアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、カプシドの外側に曝される、好ましくは配列番号３の、コートタンパク質のリジン残基の任意の一つのアミノ基である。
【００３７】
更なる実施態様において、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異されたアミノ酸配列から成り、突然変異されたアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、好ましくは突然変異されたアミノ酸配列は配列番号４であり、突然変異された前記アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）と交換され、突然変異された前記アミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基はリジン残基によって交換される。したがって、非常に好ましい実施態様では、前記ＩＬ−１βムテインは、配列番号６のアミノ酸配列から成る。
【００３８】
典型的に、好ましくは、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は、組換え発現により、好ましくは細菌系、最も好ましくは大腸菌の組換え発現を経由して産生される。少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原はアミノ酸リンカーを含んでもよく、前記アミノ酸リンカーが前記第２の付着部位を含む。加えて又は代わりに、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は、精製を容易にするために、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦｃタグまたはＨＡタグのようなタグを含む場合がある。
【００３９】
好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は、共有結合を経由して、好ましくは非ペプチド共有結合を経由して連結される。更に好ましい実施態様において、前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、共有結合を経由して、好ましくは非ペプチド共有結合を経由して連結される。
【００４０】
更なる好ましい実施態様において、前記第２の付着部位の一つだけが、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して、前記第１の付着部位に結合し、それは前記抗原の、ＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子への単一で均一型結合を導き、前記第１の付着部位と結合する前記一つだけの第２の付着部位はスルフヒドリル基であり、ＲＮＡバクテリオファージの前記抗原と前記ウイルス様粒子は前記結合を介して相互作用して規則正しい反復的な抗原アレイを形成し、更に好ましくは前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基である。
【００４１】
好ましい実施態様において、第１の付着部位はアミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれである。別の好ましい実施態様において、第２の付着部位はスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそれである。
【００４２】
別の好ましい実施態様では、前記第１の付着部位はアミノ基であり、前記第２の付着部位はスルフヒドリル基である。なお更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。
【００４３】
好ましい実施態様において、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は、化学的架橋を経由して、典型的に、好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を用いてＶＬＰに連結される。好ましい実施態様において、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基のアミノ基を有する好適な第１の付着部位と反応できる官能基と、好ましくはスルフヒドリル基、より好ましくはＩＬ−１βムテインに本来備わっているか人工的に付加されたシステイン残基のスルフヒドリル基を有する好適な第２の付着部位と反応できる更なる官能基とを含み、場合により還元によって反応が可能となる。ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはＳＭＰＨ（ピアス）、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ及びＳＩＡからなるグループから選択される。上記架橋剤は全て、アミノ基との反応後アミド結合の形成につながり、スルフヒドリル基との反応後チオエーテル結合につながる。最も好ましくは、前記ヘテロ二官能性架橋剤は、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）である。
【００４４】
更なる好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は更にリンカーを含み、前記リンカーは前記第２の付着部位を含み、そして前記リンカーはペプチド結合を介して前記抗原に結合する。好ましい実施態様において、前記リンカーは、少なくとも一つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも一つの、好ましくは一つのペプチド結合を介して、ＩＬ−１βムテインに結合する。好ましくは、リンカーは、第２の付着部位を含むか、またはそれからなる。別の好ましい実施態様では、リンカーはスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーはシステイン残基である。
【００４５】
更なる好ましい実施態様において、リンカーは、ＩＬ−１βムテインのＣ末端に付加される。この発明の好適なリンカーはグリシン・リンカー（Ｇ）ｎであって、更に第２の付着部位としてシステイン残基を含む。非常に好ましい実施態様において、前記リンカーはＧＧＣＧ（配列番号７）またはＧＧＣ（配列番号８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号７）である。また更なる好ましい実施態様において、前記リンカーはＧＧＣＧ（配列番号７）であり、前記リンカーは前記ＩＬ−１βムテインのＣ末端に加えられる。
【００４６】
更なる好ましい実施態様において、前記リンカーはＨｉｓ−タグを更に含み、好ましくは前記Ｈｉｓ−タグは前記ＩＬ−１βムテインとＣ末端のシステイン含有グリシン・リンカーとの間に位置する。したがって、非常に好ましい実施態様において、前記リンカーはＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ（配列番号９）又はＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号１０）を含むか又は好ましくはそれから成るか、最も好ましくは前記リンカーはＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ（配列番号９）から成る。更なる好ましい実施態様において、前記リンカーはＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ（配列番号９）からなり、前記リンカーはＩＬ−１βムテインのＣ末端に付与される。
【００４７】
好ましい実施形態において、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は配列番号１１から１４または２１の何れか１つを含む。非常に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は配列番号１１から１４のいずれか一つからなり、好ましくは少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は配列番号１１または１２の何れか一つから成る。もっとも好ましくは、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記抗原は配列番号１１を含む。
【００４８】
１又は複数の抗原分子、すなわちＩＬ−１β分子は、ＶＬＰのサブユニットに、好ましくはＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質の１つのサブユニットに、立体配置的に許容可能であるならば、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質の露出したリジン残基を介して結合される。したがって、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰの特異的な特徴は、サブユニットにつき複数の抗原を結合させる可能性である。これは、高密度抗原アレイの生成を可能にする。
【００４９】
本発明の組成物の安定性が塩の付加によって改良される可能性があることが分かった。したがって、好ましい実施態様では、本発明の組成物は、更に安定化剤を含み、好ましくは前記安定化剤は無機塩である。更なる好ましい実施態様において、前記安定化剤は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであり、最も好ましくは塩化ナトリウムである。更なる好ましい実施態様において、前記組成物中の前記安定化剤の、好ましくは前記無機塩の、最も好ましくは塩化ナトリウムの濃度は、５から２００ｍＭであり、より好ましくは１０から１００ｍＭであり、さらにより好ましくは２５から７５ｍＭであり、最も好ましくは５０ｍＭである。非常に好ましい実施態様において、前記組成物中の塩化ナトリウムの濃度は５から２００ｍＭであり、より好ましくは前記組成物中の塩化ナトリウムの濃度は１０から１００ｍＭであり、さらにより好ましくは前記組成物中の塩化ナトリウムの濃度は２５から７５ｍＭであり、最も好ましくは前記組成物の塩化ナトリウムの濃度は５０ｍＭである。
【００５０】
さらに水溶液中の本発明の組成物の溶解度は、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０またはポリソルベート８０の添加によって改良される可能性があることが分かった。したがって、更なる好ましい実施態様では、本発明の組成物は非イオン性界面活性剤を更に含み、好ましくは前記非イオン性活性剤はポリソルベート２０またはポリソルベート８０であり、更に好ましくは前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０である。更なる好ましい実施態様において、本発明の組成物は、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．１０ｍｇ／ｍｌの濃度の前記非イオン性界面活性剤を含む。非常に好ましい実施態様において、本発明の組成物は非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、前記医薬品組成物中のポリソルベート  ２０の濃度は０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌであり、更に好ましくは前記医薬品組成物中のポリソルベート２０の濃度は０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌであり、また更に好ましくは前記医薬品組成物中のポリソルベート２０の濃度は０．１０ｍｇ／ｍｌである。
【００５１】
一態様では、本発明は、本発明の組成物の何れか一つを含んで成るワクチン組成物を提供する。更なる態様において、本発明は２型糖尿病を治療するためのワクチン組成物を提供し、前記ワクチン組成物は、以下を含む組成物の有効量を含むかまたはそれから成る：（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記アミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、突然変異される前記アミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されている、少なくとも一つの抗原とを含んでなり、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合される、組成物を提供する。
【００５２】
本発明の組成物の有効量は、処理された被検体で、好ましくはヒトで、免疫反応を、好ましくはヒトＩＬー１βに対する免疫反応を誘導することができる量であり、前記免疫反応は糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療又は予防効果に結果としてなる。
【００５３】
一実施態様において、ワクチンの組成物は、少なくとも一つのアジュバント、好ましくはアルミニウム水酸化物から更に成る。しかしながら、本発明の有利な特徴は、アジュバントが存在しない場合でも、組成物の高い免疫抗原性である。従って、好ましい実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントがない。アジュバントの欠如は、さらに、自己抗原に対するワクチン接種の安全性に関する懸念を代表する不必要な炎症性Ｔ細胞応答の発生を最小限に抑える。したがって、患者に対する本発明のワクチン組成物の投与は、好ましくはワクチンの組成物の投与前、同時又は後に、同じ患者に少なくとも一つのアジュバントを投与せずに実施される。しかしながら、アジュバントが投与される場合に、少なくとも１つのアジュバントの投与は、ワクチンの組成物の投与前、同時または後にあってもよい。
【００５４】
組成物及び／又はワクチン組成物が個体に投与される場合、それは塩類、バッファー、アジュバントまたはコンジュゲートの効果を改良するために所望の他の物質を含む形態であってもよい。医薬組成物の調製ために使用する適切な物質の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む数多くの出典に提供されている。これは、無菌水溶液（例えば、生理食塩水）か非水性溶液及び懸濁液とを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯は、皮膚透過性を増大して抗原吸収を高めるために用いることができる。
【００５５】
本発明のワクチンは、その投与が受容者個体に、好ましくはヒトに許容されうる場合、「薬学的に許容可能である」と言われる。更に、本発明のワクチンは、「治療上有効量」（すなわち所望の生理作用を産生する量）において投与される。免疫反応の性質または種類は、この開示の限定要因でない。以下の機械的説明によって本発明を制限する意図はないが、本発明のワクチン組成物は、ＩＬ−１βに結合する抗体を誘導し、それによりその濃度を減少させ、および／またはその生理学的又は病的機能を妨げる。
【００５６】
更なる態様において、本発明は、（ａ）本発明の組成物またはワクチン組成物の何れか１つ、及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬品組成物を提供する。
【００５７】
更なる態様において、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療する方法に使用するための医薬組成物であって、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記アミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、突然変異される前記アミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されており、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合される、少なくとも一つの抗原、及び（ｃ）薬学的に許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００５８】
したがって、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療、改善及び／又は予防方法であって、動物に、好ましくはヒトに、本発明の組成物、ワクチン組成物、又は医薬組成物の何れか一つを投与することを含む方法を提供する。特に、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善及び／又は予防方法であって、該組成物が：（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されたアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記突然変異されたアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、前記突然変異されたアミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換された、少なくとも一つの抗原とを含んでなり、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結された組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含んでなる方法を提供する。
【００５９】
本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善及び／又は予防方法であって、前記方法は、動物に、好ましくはヒトに、以下を含む医薬組成物を投与することを含んでなる：（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、突然変異されたアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記アミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、前記突然変異されたアミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換された少なくとも一つの抗原とを含んでなり、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合される医薬組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含んでなる方法を更に提供する。
【００６０】
更なる好ましい実施態様において、前記方法は、動物に、好ましくはヒトに、医薬品組成物を投与することを含んでなり、前記医薬組成物の一回投与量は１から１５００μｇの総タンパク質を含み、好ましくは前記総タンパク質は（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原を含むか、それからなる。更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量は５から１０００μｇ、より好ましくは５から９００μｇ、更により好ましくは５から６００μｇ、更により好ましくは５から４００μｇ、更により好ましくは１０から３００μｇ、更により好ましくは１０から１００μｇの総タンパク質を含む。更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量が１０、３０、１００又は３００μｇの総タンパク質を含み、最も好ましくは前記一回投与量が総タンパク質の１００μｇを含み、前記総タンパク質は（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原を含む。更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量は、０．１から５ｍｇ、好ましくは０．２から２ｍｇ、より好ましくは０．５から１．５ｍｇ、最も好ましくは１．０ｍｇの水酸化アルミニウムを含む。
【００６１】
本発明の方法に関して、前記組成物、前記ワクチンおよび／または前記医薬組成物は、免疫学的に有効量で、前記動物に、好ましくは前記ヒトに投与される。
【００６２】
一実施態様において、組成物、ワクチン組成物および／または医薬組成物は、注射、注入、吸入、経口投与または他の適切な物理的方法によって、前記動物に、好ましくは前記ヒトに投与される。好ましい実施形態において、組成物、ワクチン組成物および／または医薬組成物は、前記動物に、好ましくは前記ヒトに、筋肉内に、静脈内に、経粘膜的に、経皮的に、鼻腔内に、腹膜内に、皮下にまたはリンパ節に直接、投与される。
【００６３】
本発明の更なる態様は、本明細書に記載の組成物、ワクチン組成物及び／又は医薬組成物の、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防のための使用である。  
【００６４】
本発明の更なる態様は、本明細書に記載の組成物、ワクチン組成物及び／又は医薬組成物の、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防のための医薬の製造における使用である。より詳細には、本発明は糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防のための医薬の製造における、組成物の使用であって、当該組成物は、
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子、及び
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは突然変異アミノ酸配列から成り、前記突然変異されたアミノ酸配列はヒトＩＬ−１βであり、前記突然変異されたアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸残基はアミノ酸配列ＭＤＩ（配列番号５）に置き換えられ、前記突然変異されたアミノ酸配列の位置１４５のアミノ酸残基は別のアミノ酸残基と交換されている、少なくとも一つの抗原を含んでなり、（ａ）と（ｂ）とが前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結された組成物である、使用を提供する。
【００６５】
更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量が総たんぱく質として１から１５００μｇを含んでなり、好ましくは前記総たんぱく質は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原を含むか、それから成る。更に好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量は、５から１０００μｇ、より好ましくは５から９００μｇ、更により好ましくは５から６００μｇ、更により好ましくは５から４００μｇ、更により好ましくは１０から３００μｇ、更により好ましくは１０から１００μｇの総タンパク質を含む。更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量が１０、３０、１００又は３００μｇの総タンパク質を含み、最も好ましくは前記一回投与量が総タンパク質の１００μｇを含み、前記総タンパク質は（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原を含む。更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量は、０．１から５ｍｇ、好ましくは０．２から２ｍｇ、より好ましくは、０．５から１．５ｍｇ、最も好ましくは１．０ｍｇの水酸化アルミニウムから更に成る。
【００６６】
実施態様が本願明細書に記載の全ての技術的特徴と実施態様、特に本発明の組成物に関するものは、本発明の全ての態様に、特にワクチン組成物、医薬組成物、方法及び使用に、何れかの可能な組合せ又は単独で、適用されてもよい。これに関連して、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原の以下の実施態様が特に好ましいことは明白に強調される。
【００６７】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージがバクテリオファージＱβである、ウイルス様粒子、および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは配列番号６から成る、抗原であって、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結される（ａ）と（ｂ）とを含む。
【００６８】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチンの組成物または医薬組成物が、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が配列番号３を含むか、基本的にそれから成るか、又はそれからなる、ウイルス様粒子、および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは配列番号６から成る、抗原であって、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結される（ａ）と（ｂ）とを含む。
【００６９】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージがバクテリオファージＱβである、ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原は配列番号１１である、抗原であって；前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結される（ａ）と（ｂ）とを含む。
【００７０】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は配列番号３を含むか、基本的にそれから成るか、又はそれからなる、ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原は配列番号１１である、抗原であって；前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結される（ａ）と（ｂ）とを含む。
【００７１】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチンの組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージがバクテリオファージＱβである、ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは配列番号６から成る、抗原であって；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結され、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基であり、前記第１の付着部位が前記第２の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して連結される、（ａ）と（ｂ）を含む。
【００７２】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は配列番号３を含むか、基本的にそれから成るか、又はそれからなる、ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ−１βムテインから成り、前記ＩＬ−１βムテインは配列番号６から成る、抗原であって；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結され、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基であり、前記第１の付着部位が前記第２の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して連結される、（ａ）と（ｂ）を含む。
【００７３】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージがバクテリオファージＱβである、ウイルス様粒子、および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原は配列番号１１である、抗原であって、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結され、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基であり、前記第１の付着部位が前記第２の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して連結される、（ａ）と（ｂ）を含む。
【００７４】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は配列番号３を含むか、基本的にそれから成るか、又はそれからなる、ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原は配列番号１１である、抗原であって、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合され、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基であり、前記第１の付着部位が前記第２の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して連結される、（ａ）と（ｂ）を含む。
【００７５】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は、安定化剤を更に含み、前記安定化剤は無機塩、好ましくは塩化ナトリウムであり、好ましくは前記組成物、ワクチン組成物又は医薬組成物中の前記安定化剤の濃度は５から２００ｍＭ、より好ましくは１０から１００ｍＭ、更により好ましくは２５から７５ｍＭであり、最も好ましくは５０ｍＭである。
【００７６】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は、安定化剤を更に含み、前記安定化剤は無機塩、好ましくは塩化ナトリウムであり、好ましくは前記組成物、ワクチン組成物又は医薬組成物中の塩化ナトリウムの濃度は５から２００ｍＭ、より好ましくは１０から１００ｍＭ、更により好ましくは２５から７５ｍＭであり、最も好ましくは５０ｍＭである。
【００７７】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は、非イオン性界面活性剤を更に含み、前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、更に好ましくは組成物、ワクチン組成物または医薬組成物中の非イオン性界面活性の濃度は、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．１０  ｍｇ／ｍｌである。
【００７８】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は、非イオン性界面活性剤を更に含み、前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、更に好ましくは組成物、ワクチン組成物または医薬組成物中のポリソルベート２０の濃度は、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．１０  ｍｇ／ｍｌである。
【００７９】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は配列番号３を含むか、基本的にそれから成るか、又はそれからなる、ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原は配列番号１１である、抗原であって、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結され、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基であり、前記第１の付着部位が前記第２の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して連結される、（ａ）と（ｂ）を含み、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は安定化剤を更に含み、前記安定化剤は無機塩、好ましくは塩化ナトリウムであり、更に好ましくは前記組成物、ワクチン組成物又は医薬組成物中の塩化ナトリウムの濃度は５から２００ｍＭ、より好ましくは１０から１００ｍＭ、更により好ましくは２５から７５ｍＭであり、最も好ましくは５０ｍＭである。
【００８０】
非常に好ましい実施態様において、前記組成物、ワクチンの組成物または医薬組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は配列番号３を含むか、基本的にそれから成るか、又はそれからなる、ウイルス様粒子、および（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原は配列番号１１である、抗原であって、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結され、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基であり、前記第１の付着部位が前記第２の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して連結される、（ａ）と（ｂ）を含み、前記組成物、ワクチン組成物または医薬品組成物は、非イオン性界面活性剤を更に含み、前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、更に好ましくは組成物、ワクチン組成物または医薬組成物中のポリソルベート２０の濃度は、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５から０．２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．１０  ｍｇ／ｍｌである。
【００８１】
更なる好ましい実施態様において、前記組成物、前記ワクチン組成物及び／又は医薬組成物は、動物に、好ましくはヒトに投与され、前記動物、好ましくはヒトへの一回投与量が総たんぱく質を１から１５００μｇ含んでなり、好ましくは前記総たんぱく質は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原を含むか、それから成る。更に好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量は、５から１０００μｇ、より好ましくは５から９００μｇ、更により好ましくは５から６００μｇ、更により好ましくは５から４００μｇ、更により好ましくは１０から３００μｇ、更により好ましくは１０から１００μｇの総タンパク質を含む。更なる好ましい実施態様において、前記医薬の一回投与量が１０、３０、１００又は３００μｇの総タンパク質を含み、最も好ましくは前記一回投与量が総タンパク質の１００μｇを含み、前記総タンパク質は（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージの前記ウイルス様粒子と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原を含む。更なる好ましい実施態様において、前記一回投与量は、０．１から５ｍｇ、好ましくは０．２から２ｍｇ、より好ましくは０．５から１．５ｍｇ、最も好ましくは１．０ｍｇの水酸化アルミニウムを更に含む。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ｈＩＬ−１β１１６−２６９及びｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）のクローニング、発現及び精製
ヒトＩＬ−１β１１６−２６９及びＩＬ−１βムテインのｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）は、ＷＯ２００８／０３７５０４Ａ１の実施例１０Ａ及び１０Ｂに開示の手順に従って、クローニング、発現及び精製を行った。
【００８３】
実施例２
Ａ．マウスにおけるｈＩＬ−１β１１６−２６９及びｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）の生物活性
３匹の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、１０μｇの野生型ヒトＩＬ−１β１１９−２６９タンパク質かｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインを静脈内に注入された。注射前と注射後３時間に血清試料が採取され、炎症誘発性サイトカインＩＬ−６の濃度の相対的増加について分析された。野生型ヒトＩＬ−１β１１９−２６９タンパク質が注入されたマウスは、血清ＩＬ−６濃度について２．３８±０．６９ｎｇ／ｍｌの増加を示したが、ｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインを注入されたマウスの血清ＩＬ−６濃度は１．３９±０．２６ｎｇ／ｍｌの増加を示した。
【００８４】
Ｂ．ヒトＰＢＭＣにおけるｈＩＬ−１β１１６−２６９及びｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）の生物活性
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール密度勾配遠心沈殿法によって健康な提供者のヘパリン添加血から分離された。ウェルにつき５ｘ１０５細胞は、ｈＩＬ−１β１１６−２６９またはｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）の何れかの滴定量と共にインキュベートされた。結果を表１に示す。
表１：ヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ−１β１１６−２６９及びＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインの生物活性
2013504539.tif 000002
【００８５】
実施例３
Ａ．ヒトＩＬ−１β１１６−２６９及びヒトＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインのＱβウイルス様粒子への結合
野生型ヒトＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質及びヒトＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）の化学的架橋は、基本的にはＷＯ２００８／０３７５０４Ａ１の実施例２Ａに開示されている手順に従って行われた。
【００８６】
Ｂ．Ｑβカプシドに結合されたヒトＩＬ−１β１１６−２６９及びＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインによる免疫化
グループに付き４匹の雌のｂａｌｂ／ｃマウスは、野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質かＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインの何れかを結合したＱβによって免疫化された。総タンパク質５０ｇは２００μｌまでＰＢＳにより希釈されて、日０、１４及び２８に皮下注入された（腹側の２箇所に１００μｌ）。マウスは日３５に眼窩後から採血され、血清はＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインか野生型ヒトＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質の何れかに特異的なＥＬＩＳＡを使用して分析された。
【００８７】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートは、野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質かＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）ムテインの何れかの各々により、１μｇ／ｍｌの濃度で被覆された。プレートはブロックされて、次に連続的に希釈された日３５のマウス血清と共にインキュベートされた。結合した抗体は、酵素的に標識化された抗マウスＩｇＧ抗体によって検出された。マウス血清の抗体価は、４５０ｎｍの光学密度の半値を導く希釈度の平均として算出して、表２に示す。
表２：Ｑβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９またはＱβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインワクチンによる免疫化により生じた抗ｈＩＬ−１β１１６−２６９（野生型及びムテイン）−特異的ＩｇＧ力価
2013504539.tif 000003
【００８８】
Ｑβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９−免疫化は、ｈＩＬ−１β１１６−２６９に対してＩｇＧ抗体の高い力価を誘導した。さらに、Ｑβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインワクチンによるワクチン接種は、イムノゲンとして使用されるＱβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインと野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質の両方に対して、高いＩｇＧ力価を誘導した。
【００８９】
Ｄ．ヒトＩＬ−１βのインビトロ中和
野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質又はＱβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインのどちらかに結合されたＱβによって免疫化されたマウスの血清は、ヒトＩＬ−１βタンパク質がその受容体に結合することを抑制する能力を試験された。ＥＬＩＳＡプレートは、組換えヒトＩＬ−１β受容体Ｉ−ｈＦｃ融合タンパクで１μｇ／ｍｌの濃度で被覆され、上述した血清の連続希釈物と１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質と共にインキュベートされた。固定されたヒトＩＬ−１β受容体Ｉ−ｈＦｃ融合タンパクへのｈＩＬ−１β１１６−２６９の結合は、ビオチン化された抗ヒトＩＬ−１β抗体とワサビ・ペルオキシダーゼを接合したストレプトアビジンによって検出された。Ｑβ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインワクチンに対して生じる全ての血清は、血清濃度３．３％で、ｈＩＬ−１ＲＩへの１００ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９の結合を抑制した。
【００９０】
また、同じ血清は、ｈＩＬ−１β１１６−２６９誘導性のヒト細胞からのＩＬ−６分泌を抑制する能力について試験された。従って、ヒトＰＢＭＣは実施例２Ｂに記載のとおりに調製されて、上記血清の滴定濃度と共に前もって混合された１０ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９と共にインキュベートされた。一晩のインキュベーション後、細胞培養上清は、ＩＬ−６の存在について分析された。血清の中和能は、ＩＬ−６分泌の最大阻害の半分値を導く希釈度として発現された。野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９に対して生じた血清の中和能との直接比較を可能にするために、Ｑ−ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインに対して生じた血清の中和力価は、野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９に対して測定されたそれぞれのＥＬＩＳＡ力価について修正された（表２を参照）。表３に示すように、ｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインに対して生じた血清は、野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９によって誘導されるＩＬ−６の分泌を抑制することが可能だった。
表３：ＩＬ−１βムテインによって免疫化されたマウスの血清において決定された中和力価
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【００９１】
Ｅ．ＩＬ−１βのインビボ中和
野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質またはｈＩＬ−１β１１６−２６９Ｄ１４５Ｋムテインの何れかに結合されたＱβによる免疫化により生じた抗体のインビボ中和能は調査される。従って、グループにつき３匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、いずれかのワクチンの５０μｇにより日０、１４及び２８の３回免疫化される。日３５に、全ての免疫化マウスは、１μｇのフリーの野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９を静脈内に注入される。対照として、３匹のナイーヴ・マウスは、同一量の野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９を同じ時に注入される。注入されたｈＩＬ−１β１１６−２６９の炎症活性の情報として、注射直前及び３時間後に血清が取られ、炎症誘発性サイトカインＩＬ−６の濃度の相対的増加を分析した。ナイーヴマウスは、ｈＩＬ−１β１１６−２６９の注入３時間後に血清ＩＬ−６濃度の高い増大を示したが、その一方で野生型ｈＩＬ−１β１１６−２６９タンパク質又はｈＩＬ−１β１１６−２６９ムテインの１つに結合されたＱβにより免疫化された全てのマウスは血清ＩＬ−６の如何なる増加も示さず、これは注入されたｈＩＬ−１β１１６−２６９はワクチンにより誘導された抗体により効率的に中和されたことを示している。
【００９２】
実施例４
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの食事誘導性２型糖尿病の改善（予防セット）
マウスＩＬ−１α１１５−２７０は、ＷＯ２００８／０３７５０４Ａ１の実施例１５に開示された手順に従ってクローンを作成されて、ＱβＶＬＰに結合された。マウスＩＬ−１β１１９−２６９は、ＷＯ２００８／０３７５０４Ａ１の実施例１に開示される手順に従ってクローンを作成されて、ＱβＶＬＰに結合した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、日０、１４及び２８に、Ｑβ、Ｑβ−ｍＩＬ−１α１１５−２７０、Ｑβ−ｍＩＬ−１β１１９−２６９の何れかの５０μｇ、または５０μｇのＱβ−ｍＩＬ−１α１１５−２７０と５０μｇのＱβ−ｍＩＬ−１βの混合物により免疫化された（グループにつきｎ＝１６）。全てのマウスは、免疫化期間に、齧歯目の通常食(Provimi Kliba no. 3436:１８．５％のタンパク質、４．５％の脂肪、４．５％の繊維、６．５％の灰分、５４％の炭水化物）を給餌された。各グループのマウスの半分（ｎ＝８）について、日３５にこの食事が高脂肪食(Provimi Kliba no. 2127:２３．９％のタンパク質、３５％の脂肪、４．９％の繊維、５％の灰分、２３．２％の炭水化物）と交換され、残り半分（ｎ＝８）については通常食を続けた。最後の免疫化の５ヵ月後に、高脂肪食を給餌されたマウスは太りすぎ（平均体重＞４５ｇ）であり、高い空腹時血糖値を（表４、０’）を示した。
【００９３】
これらのマウスの糖尿病表現型に調査するために、経口的ブドウ糖負荷試験は、胃内に用量２ｍｇ／体重ｇのＤ−グルコースを投与して実施され、アキュチェック（Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ）血糖メーター（ロシュ）を使用して通常の間隔で血糖値を測定することによって行われた。表４は、通常の餌のＱβ免疫化マウスの血糖値は、１５分後に２９１．５ｍｇ／ｄｌの初期ピーク、続いて急激な降下、及び９０分以内にチャレンジ前レベルに完全に復帰することが示された。この反応のピークのレベルと動態は、通常食でに維持された全てのマウス群において基本的に同一だった（表４）。一方で、高脂肪食Ｑβ−免疫化マウスは、より高いレベル（３６７．９ｍｇ／ｄｌ）でピークに達し、チャレンジ後６０分まで有意な減少を示すことができなかった；やっとその後に血糖値は減少を開始したが、２時間の観察時間中にベースラインレベルに戻らなかった。グルコース・クリアランスにおけるこの高度の障害は、肥満Ｑβ−免疫化マウスが糖尿病表現型を発病したことを示す。肥満Ｑβ−ｍＩＬ−１α−、Ｑβ−ｍＩＬ−１β−、またはダブル免疫化マウスは〜３５０ｍｇ／ｄｌまで血糖値の増加、その後直ちに持続した減少があり、肥満Ｑβ免疫化対照マウスよりも一貫して低い血糖値に結果としてなった。表４に示される反復したグルコース測定の結果から得られた濃度曲線下面積を計算により、肥満Ｑβ−ｍＩＬ−１α−、Ｑβ−ｍＩＬ−１β−、またはダブル免疫化マウスは、肥満Ｑβ免疫化対照マウスよりも改善したグルコース・クリアランスを示した（表５）。これらのデータを組合わせると、Ｑβ−ｍＩＬ−１α−、Ｑβ−ｍＩＬ−１β−、または両方の組合せによる免疫化は、食事誘導性糖尿病性表現型のはっきりした改善に結果としてなったことを示す。
表４：２ｍｇ／ｇのグルコースの胃内投与前及び投与後の様々な時点での血糖値（ｍｇ／ｄｌ；平均±ＳＥＭ）（実験前５時間の間マウスは絶食させた）
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表５：免疫マウスのグルコース・クリアランス。表１０に示す連続的なグルコース測定の結果から濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を個々のマウスについて計算した。ＡＵＣのグループ平均はＳＥＭと共に示す。
2013504539.tif 000006
【００９４】
実施例５
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの食事誘導性２型糖尿病の改善
マウスＩＬ−１βのアミノ酸１１９−２６９を、ＴＮＦα活性化マウスのマクロファージのｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＩＬ１β−３（５’−ＡＴＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧ−３；配列番号１５）及びＩＬ１β−２（５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’；配列番号１６）を使用してＰＣＲにより増幅されて、ベクターｐＥＴ４２Ｔ（ＷＯ２００８／０３７５０４Ａ１の実施例１０）にクローニングされた。結果として生じたプラスミドｐＥＴ４２Ｔ−ｍＩＬ−１β１１９−２６９は、Ｃ末端でシステイン含有リンカー及びヘキサヒスチジン・タグに融合した成熟マウスＩＬ−１βタンパク質をコードする。ＥｃｏＲＶ制限サイトの導入のために、マウスＩＬ−１βのＮ末端のバリン残基は、３つのアミノ酸（ＭＤＩ）からなる短いＮ末端伸長によって置換される。プラスミドｐＥＴ４２Ｔ−ｍＩＬ−１β１１６−２６９の部位指定突然変異導入によって、配列番号１０のＣ末端のタグを有するヒトＩＬ−１βムテインｈＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）（配列番号６）のマウスバージョン、すなわちｍＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）（配列番号１７）、をコードする発現ベクターが構築された。突然変異は、Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位指定突然変異導入キット（ストラタジーン）及びオリゴヌクレオチドＤ１４３Ｋ−１（５’−ＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧ  ＧＡＣＡＴＡＡＴＴＡ  ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣ−３’；配列番号１８）及びＤ１４３Ｋ−２（５’−ＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴ  ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡ  ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＧ  ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧ−３’；配列番号１９）を使用して導入した。ムテインｍＩＬ−１β１１６−２６９（Ｄ１４５Ｋ）の発現と精製は、ＷＯ２００８／０３７５０４Ａ１に開示された手順に従って行われた。
【００９５】
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週間目、ｎ＝８）のグループは、ＱβまたはＱβ−ｍＩＬ−１β１１９−２６９（Ｄ１４５Ｋ）のいずれかの５０ｇにより、日０、１４、２８、４２及び１４７に皮下に免疫化された。日０から始めて実験の全体にわたって、マウスの半数（ｎ＝１６）は高脂肪食（Provimi Kliba no. 2127:２３．９％のタンパク質、３５％の脂肪、４．９％の繊維、５％の灰分、２３．２％の炭水化物）で太らせ、残り半数（ｎ＝１６）は普通食(Provimi Kliba no. 3436:１８．５％のタンパク質、４．５％の脂肪、４．５％の繊維、６．５％の灰分、５４％の炭水化物）で維持された。８ヵ月後、高脂肪食を給餌されたマウスは肥満であり（平均体重＞４５ｇ）、高い空腹時血糖値を示した（表６）。
【００９６】
高脂肪食を与えられたマウスの糖尿病表現型に調査するために、経口的ブドウ糖負荷試験は、胃内に用量２ｍｇ／体重ｇのＤ−グルコースを投与して実施され、アキュチェック（Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ）血糖メーター（ロシュ）を使用して通常の間隔で血糖値を測定することによって行われた。表７は、高脂肪食を与えられたＱβ免疫化マウスは注射後３０分に３１８．５ｍｇ／ｄｌのピークとなり、投与後６０分まで有意な減少を示すことができなかった。やっとその後に血糖値は減少を開始したが、２時間の観察時間中にベースラインレベルに戻らなかった。グルコース・クリアランスにおけるこの高度の障害は、肥満Ｑβ−免疫化マウスが糖尿病表現型を発病したことを示す。肥満Ｑβ−ｍＩＬ−１β１１９−２６９（Ｄ１４５Ｋ）−免疫化マウスは３１８．６ｍｇ／ｄｌの初期ピーク、続いてすぐに連続的な降下を示し、肥満Ｑβ−免疫化対照マウスに比べて一貫して低い血糖値となった。投与後２時間で、血糖値はこれらのマウスの投与前レベルに戻った。表７に示される反復したグルコース測定の結果から得られた濃度曲線下面積を計算により、肥満Ｑβ−ｍＩＬ−１β１１９−２６９（Ｄ１４５Ｋ）−免疫化マウスは、肥満Ｑβ免疫化対照マウスよりも改善したグルコース・クリアランスを示した（表８）。これらのデータを組合わせると、肥満Ｑβ−ｍＩＬ−１β１１９−２６９（Ｄ１４５Ｋ）による免疫化は、食事誘導性糖尿病性表現型のはっきりした改善に結果としてなったことを示す。
表６：平均体重及び絶食後５時間の空腹時血糖（平均値±ＳＥＭ）
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表７：２ｍｇ／ｇのグルコースの胃内投与前及び投与後の様々な時点での血糖値（ｍｇ／ｄｌ；平均値±ＳＥＭ）。マウスは実験の５時間前に絶食させた。
2013504539.tif 000008
表８：免疫マウスのグルコースクリアランス。表７に示した連続的グルコース測定の結果から濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は、個々のマウスについて計算した。ＡＵＣのグループ平均はＳＥＭと共に示す。ベスラインの下のピークは分析から除いた。
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【００９７】
実施例６
ｈＩＬ−１βムテイン・コンストラクにおける一次構造変異が生物機能に与える影響
配列番号１１のヒトＩＬ−１βムテインコンストラクトは、以下の構造的な要素でヒトＩＬ−１β（配列番号６）とは異なる：（ａ）Ｎ末端アラニン残基のＮ末端伸長配列ＭＤＩによる置き換え、（ｂ）突然変異Ｄ１４５Ｋ、及び（Ｃ）ヘキサヒスチジン−タグＬＥＨＨＨＨＨＨを含むＣ末端リンカー配列、及び（ｄ）配列ＧＧＣＧを含むシステイン。分子の機能的特性におけるこれらの配列要素の各々の影響を評価するために、コンストラクトの異なる変異体は生物的活性及びインビトロ受容体結合によって比較した。
【００９８】
７つの異なるコンストラクトは表９に示されるように作成した。コンストラクト「ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６」は、配列番号１１に対応する。ＭＡ−ｗｔは、Ｎ末端メチオニンを含むインターロイキン−１β野生型の配列に対応する（配列番号２０）。Ｎ末端伸長の存在は、「ＭＡ」の代わりに「ＭＤＩ」によって示され、「Ｄ１４５Ｋ突然変異」の存在は「ｗｔ」の代わりに「Ｄ１４５Ｋ」によって示され、Ｃ末端のリンカー配列ＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧの存在はＨｉｓ６によって示される。コンストラクト「ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−ＣＧ」とコンストラクト「ＭＡ−ｗｔ−ＣＧ」については、Ｃ末端のリンカー配列は配列ＣＧと交換される。
【００９９】
全てのタンパク質変異体の生物活性は、２つの独立の細胞ベースのインビトロ・アッセイにおいて決定された。突然変異Ｄ１４５Ｋは、ＩＬ１−受容体のＩ型への親和性に影響を及ぼすことなしに、ＩＬ−１β野生型の生物活性を減少することが知られている。生物活性が、インビボのＩＬ−１βの反応性に少なくともある程度、相関することが期待されるので、医薬として使われた場合に、この突然変異は潜在的な毒性を減少することも期待される。ＨｅＬａ細胞からのＩＬ−１β−誘導性ＩＬ−６放出及びヒトＡ３７５メラノーマ細胞を用いた細胞毒性アッセイの両方の活性アッセイは対応する結果を示す。突然変異Ｄ１４５Ｋ及びＮ末端伸長ＭＤＩの導入は、両方ともコンストラクトの生理活性に高い減少効果を有する。両方の配列修飾の組合せは、およそ１０５倍の減少された生理活性を有するより活性が低いタンパク質変異体にさえ結果としてなる。ヘキサヒスチジン・タグの導入は、タンパク質の活性に対する著しい効果に結果としてならない。重要なことに、導入された修飾のいずれもタンパク質生理活性の増大を引き起こさない。
【０１００】
さらにまた、全てのタンパク質変異体の受容体結合親和性の違いは均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって測定され、Ｎ末端伸長ＭＤＩによって生じる活性減少がＩＬ−１受容体に対する減少した結合親和性に関連することを明確に示した。Ｃ末端上の修飾は親和性に影響を及ぼさず、重要でない効果だけが突然変異Ｄ１４５Ｋについて観察される。生理活性について決定された減少指数と受容体結合研究において決定されたＩＣ５０値を、表９にまとめた。
表９：構造的な要素の異なる組合せを含んで成る構造物の生理活性測定とインビトロ受容体結合。ＩＬ−６放出アッセイに関する、生理活性の減少は、それぞれのタンパク質変異体の測定値ＥＣ５０値と４−パラメータロジスティック適合に由来する測定値野生型タンパク質（ＭＡ−ｗｔ）のＬＣ５０値の比率として示される。同様に、Ａ３７５細胞毒性アッセイによって測定された生理活性減少指数は、それぞれのタンパク質変異体について測定されたＬＣ５０値と野生型タンパク質（ＭＡｗｔ）のＥＣ５０値との比率として測定された。
2013504539.tif 000010
【０１０１】
実施例７
アカゲザルにおけるＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６（配列番号１１）の反応性
インビボ研究は、ｗｔＩＬ−１βと比較してムテインＩＬ−１βの反応性を評価するために、霊長類で実施された。ナイーブのアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）は、ヒト野生型ＩＬ−１βまたはヒトＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６（配列番号１１）の何れかにより、さまざまな濃度で、静注された。ＩＬ−６濃度は、ＩＬ−１β活性のための示度として血清において測定された。数日にわたって、アカゲザル（グループにつき１匹の♂と１匹の♀）のグループは、０．１、０．３、１．０及び１．５μｇ／ｋｇのヒトＩＬ−１β又はアカザルＩＬ−１βの何れか、０．３、１．０、１０及び１００μｇ／ｋｇのＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６を静注された。血清は、ＩＬ−１βのＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６の投与後の３時間に、サイトカイン解析のために採血された。ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６の生理活性は、野生型ＩＬ−１βに比較しておよそ７．５倍減少された。
【０１０２】
実施例８
塩濃度のワクチン安定性への影響
処理の間のワクチンの安定性におけるＮａＣｌの影響を評価するために、抗原に結合するＱβＶＬＰを含んで成るワクチンのバッチは、ＮａＣｌ（０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ）のさまざまな濃度を含んで産生された。ワクチンの完全性は、ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  ５０００ＰＷＸＬカラムを有するＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステムにおける解析）によって評価された。粒子完全性についてのＮａＣｌ濃度依存性の影響が観察された（表１０）。５０ｍＭのＮａＣｌ濃度は、１％未満の分解を達成することを必要とした。
表１０：ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定されたワクチンの処理の間の安定性におけるＮａＣｌ濃度の影響。バッチ１の結果は２つの独立バッチの手段である（バッチ１ａ：９７．２％の相対面積メインピーク、２．８％の相対面積分解、バッチ１ｂ：９７．４％の相対面積メインピーク、２．６％の相対面積分解）。
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【０１０３】
実施例９
界面活性剤濃度のワクチン溶解性への影響
抗原に結合させた（ヒトＩＬ−１βムテイン、配列番号１１）ＱβＶＬＰの１．９ｍｇ／ｍｌを含有するワクチン調製物は、様々な濃度のポリソルベート２０の異なる濃度によって作成され、強いピペット操作によってせん断力にさらされた。０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０の存在下で、強いピペット操作は、ワクチン調製物中の粒子様の可視フィラメントの形成に結果としてなった。０．１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０の存在下で、調製物は強いピペット操作後に透明溶液のままだった。０．１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０が調製物に存在する場合に、粒子様の可視フィラメントの形成は観察されなかった。
【０１０４】
実施例１０
Ｑβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６及びアカゲザルのＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６の反応性 
アカゲザルの３つのグループ（ｎ＝１２、６匹の雄及び６匹の雌）は、Ｑβ単独、ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６（配列番号１１）に結合させたＱβ、又はそのアカゲザル特異化バージョン、ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６（配列番号２１）に結合したＱβ、アジュバントとしてアルハイドロゲル（１．０  ｍｇ／投与のＡｌ（ＯＨ）３）とそれぞれ組合わせたもののいずれか３００ｍｇにより、６回の隔週の皮下注射を受けた。ワクチン反応性のための示度として、ＩＬ−６濃度は、それぞれ初回及び第３回目のワクチン注射の３時間後に血清において測定された。かろうじてアッセイ（２０ｐｇ／ｍｌ）の検出限界より上になる低濃度のＩＬ−６は、Ｑβ、Ｑβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６またはＱβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６のそれぞれ最初の注射後に、１／１２、５／１２及び４／１２の動物において測定された。Ｑβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６を受けた２匹の動物は、わずかにより高い濃度を有した。第３回目の免疫化後に顕著なＩＬ−６応答はなかった。これに対して、ＩＬ−６血清濃度の大きな増加（〜２０００ｐｇ／ｍｌ）は、１μｇ／ｋｇのｗｔＩＬ−１βの静脈内投与の３時間後のＱβ免疫化対照動物において記録された。
【０１０５】
実施例１１
Ｑβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６及びアカゲザルのＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６の免疫原性
ヒトｗｔＩＬ−１βに特異的なＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価は、実施例１０に記載のようにＱβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６またはＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６によって免疫化されたアカゲザルの血清中で、様々な時点で測定された。表１１は、両方のワクチンによって誘導されたヒトＩＬ−１β特異的ＩｇＧ抗体の高い抗体価であって、第５回目の注射後にピークに達して、続く６週でおよそ５から７倍に減少したことを示す。
表１１：アカゲザルのＱβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６及びＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６によって生じた抗ヒトＩＬ−１β特異的なＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ+/-ＳＥＭ）。抗体価は、ＥＬＩＳＡの４５０ｎｍでＯＤの半値につながる血清希釈度の逆数として表した。n.d.＝測定なし。 
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【０１０６】
免疫化されたサルの血清は、また、インビトロ・ヒトｗｔＩＬ−１βの生物活性を中和する能力を試験された。ＨｅＬａ細胞は、６ｐＭのｗｔＩＬ−１βの一定量及びさまざまな時点の免疫血清の連続希釈と共にインキュベートした。ＩＬ−６は、ヒトｗｔＩＬ−１βの生物活性の示度として、細胞培養上清中で測定された。ワクチンの第３回目の注射後、中和活性は血清中で始めて検出され、第６回目の注射後にピークに到達するまで時間と共に増大することができた。続く４週において、中和力価はおよそ２〜３倍を減少した（表１２）。
表１２：アカゲザルのＱβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６とＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６によって誘導された中和力価（ＧＭＴ+/-ＳＥＭ）力価は、ＩＬ−１β誘導性ＩＬ−６放出の最大阻害の半値につながる血清希釈度の逆数として示した。定量下限（ＬＬＯＱ）は３５であった。
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【０１０７】
インビボでＱβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６またはＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６によって誘導される抗体の中和活性を測定するために、第６回目のワクチン注射の２週後に、各グループの動物とＱβ免疫化対照群の動物の半分は、１μｇ／ｋｇのｗｔＩＬ−１βの静注を投与された。血清中のＩＬ−６濃度は、ｗｔＩＬ−１βの生物活性の示度として投与３、６及び９時間後に測定された。表１３に示すように、Ｑβ免疫化サルは、注射後３時間でピークに達して、次に９時間までバックグラウンドレベル近くまでに減少する、強いＩＬ−６応答を備えた。対照的に、Ｑβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６及びＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６によって接種された動物の場合、ＩＬ−６はＩＬ−１β注射後のすべての時点で検出限界以下のままであり、これらのワクチンによって誘導された抗体が、ＩＬ−１βの生物的活性を中和することを示した。
表１３：アカゲザルのＱβ−ＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６及びＱβ−ｒｈｅｓｕｓＭＤＩ−Ｄ１４５Ｋ−Ｈｉｓ６によって誘導される抗体によるインビボのＩＬ−１βの生物活性の中和。血清ＩＬ−６は、マルチプレックス・サイトカイン・ビーズ・アレイ・キットによって定量化された。値は、ｐｇ／血清ｍｌにおいて表される。定量の下限（ＬＬＯＱ）は、２０ｐｇ／ｍｌであった。
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【配列表】
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【国際調査報告】
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