(57)【要約】  本発明は、抗体を親和性成熟する方法に関する。
2013508287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を親和性成熟させる方法であって、
ａ．抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）又は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体ＶＬ又はＶＨのアミノ酸配列のｒＳＤＲＵ残基を特定する工程と、
ｃ．多様化される前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットを選択する工程と、
ｄ．前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットを多様化するために使用されるアミノ酸のセット又はアミノ酸の普遍セットを選択する工程と、
ｅ．工程ｃ．で選択された前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットを、工程ｄ．で選択された前記アミノ酸のセットを用いて多様化することによって、抗体ＶＬ又はＶＨ変異体のライブラリーを作製する工程と、
ｆ．前記抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーを宿主で発現させる、又は前記抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーを生体外で翻訳する工程と、
ｇ．前記抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーから、抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の親和性成熟抗体を選択する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットが、ｒＳＤＲＵ＞５、ｒＳＤＲＵ＞１５、ｒＳＤＲＵ＞３０、ｒＳＤＲＵ＞４０、又はｒＳＤＲＵ＞６０を有する残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットが、ｒＳＤＲＵ＞４０を有する残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットが、前記抗体ＶＨに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｒＳＤＲＵ残基のサブセットが、前記抗体ＶＬに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｒＳＤＲＵ残基が、抗体ＶＬのＣｈｏｔｈｉａ残基３２、５０、９１、９２、９３、９４、及び９６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｒＳＤＲＵ残基が、抗体ＶＬのＣｈｏｔｈｉａ残基３０ａ、３０ｃ、３０ｄ、３０ｆ、３２、５０、９１、９２、９３、９４、及び９６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｔｒｐ、Ａｓｎ、又はＳｅｒが、前記アミノ酸のセット又は前記アミノ酸の普遍セットから除外される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アミノ酸の普遍セットが、ＲＮＤＧＨＳＷＹ、ＲＮＤＧＨＳＹ、ＲＮＤＧＨＷＹ、又はＲＤＧＨＳＷＹである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸のセットが、
ａ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基３０におけるＲＮＤＧＨＳＹと、
ｂ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基３０ａにおけるＲＮＤＧＨＷＹと、
ｃ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基３０ｃにおけるＲＮＤＧＨＳＹと、
ｄ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基３０ｆにおけるＲＮＤＧＨＷＹと、
ｅ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基３２におけるＲＮＤＹと、
ｆ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基５０におけるＹＷＮＫと、
ｇ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基９１におけるＳＹＧＨと、
ｈ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基９２におけるＳＹＧＮと、
ｉ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基９３におけるＳＴＥＲと、
ｊ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基９４におけるＹＳＨＴと、
ｋ．ＶＬ  Ｃｈｏｔｈｉａ残基９６におけるＹＲＷＬと、を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を親和性成熟する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療上の使用を目的とした抗体の産生は、典型的には、リードディスカバリー段階と、その後の最適化プロセスを必要とする（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０７〜３２７．Ｉｎ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ．Ｅｄ．Ｚｈｉｑｉａｎｇ  Ａｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００９）。リードディスカバリーに現在利用可能なプラットフォームには、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜７，１９７５）、生体外のディスプレイをベースとする技術（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１１０５〜１６，２００５）、及びヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９，１９９４）が含まれる。典型的な抗体リードの開発キャンペーンでは、親和性、溶解性、及び安定性を改善するために、最初の発見の成功（initial discovery hits）の最適化が通常必要である。
【０００３】
抗体の親和性を高めるための多くのストラテジーが報告されており、例えば、後続のスクリーニングのための変異体のライブラリーを生成するための、ファージ又はリボソームディスプレイなどの生体外のディスプレイをベースとする技術と組み合わせたランダム変異導入法（Ｇｒｏｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１３：１２９〜３９，２００６）及び部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）法などが挙げられる（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：３８０９〜１３，１９９４）（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０７〜３２７．Ｉｎ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ．Ｅｄ．ＺｈｉｑｉａｎｇＡｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００９）。しかしながら、ライブラリーのサイズは多様化残基ごとに指数関数的に増加するので、多様化することができるのは限られた数の残基だけである。例えば、全ての位置において３２のコドンを導入する共通のＮＮＫ多様化スキームで構築されたライブラリーは、残基の数ｎ毎に３２n増加する。ファージライブラリーは、通常、１０9〜１０10メンバーというサイズに制限され、そのライブラリーに完全な配列包括度を得ようとする場合、これは、６〜７残基のみを多様化できることを意味する。
【０００４】
最大配列包括度を得るための多様化ストラテジーは、溶媒接触可能抗体残基の標的化（ＵＳ２００５／０２６６０００）、又は配列の比較に基づく残基の標的化（ＷＯ２００６／０１４４９８）による抗体ライブラリーの生成を包含する。より集中的なストラテジーとしては、ＨＣＤＲ３の残基の多様化（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３：５５１〜６７，２００６）が挙げられ、その理由は、抗原結合部位のこの領域は、抗体の特異性及び親和性を確定するためにしばしば不可欠であることが良く知られているからである。ライブラリーの多様性は、ある場合には、自然抗体に見られるアミノ酸の組成及び頻度を忠実に反映するように設計されてきた（Ｃｏｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３７８：６２２〜３３，２００８；Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２９６：５７〜８６，２０００；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３４０：１０７３〜９３，２００４；Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：３４４〜８，２００５）。また、数個のアミノ酸の組み合わせ（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１：１２４６７〜７２，２００４；Ｓｉｄｈｕ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：６８２〜８，２００６）、又はチロシンとセリンに限定されたバイナリコード（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３４８：１１５３〜６２，２００５）が用いられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
より高い親和性を有する治療抗体の開発は、有効性並びに投与量、ひいては潜在的な免疫原性及び製造原価に直接的に影響を及ぼし得る。そのため、抗体を親和性成熟するために改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、抗体を親和性成熟する方法であり、
ａ．抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）又は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．抗体ＶＬ又はＶＨのアミノ酸配列のｒＳＤＲＵ残基を同定する工程と、
ｃ．多様化されるｒＳＤＲＵ残基のサブセットを選択する工程と、
ｄ．ｒＳＤＲＵ残基のサブセットを多様化するために使用されるアミノ酸のセットを選択する工程と、
ｅ．工程ｃ．で選択されたｒＳＤＲＵ残基のサブセットを、工程ｄ．で選択されたアミノ酸のセットを用いて多様化することによって、抗体ＶＬ又はＶＨ変異体のライブラリーを作製する工程と、
ｆ．抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーを宿主で発現させる、又は抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーを生体外で翻訳する工程と、
ｇ．抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーから、抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の親和性成熟抗体を選択する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】抗体Ｖκ鎖のＫａｂａｔの番号付けとＣｈｏｔｈｉａの番号付けとの間の対応。ＣＤＲ、ＨＶＬ、及びｒＳＤＲＵ残基の位置は、対応する欄に黒で表わされている。ＣＤＲ周辺のＶκ残基のみが示されている。
【図２】抗体ＶＨ鎖のＫａｂａｔの番号付けとＣｈｏｔｈｉａの番号付けとの間の対応。ＣＤＲ、ＨＶＬ、及びｒＳＤＲＵ残基の位置は、対応する欄に黒で表わされている。ＣＤＲ周辺のＶＨ残基のみが示されている。
【図３Ａ（１）】ｒＳＤＲＵを決定するために使用する抗体−抗原複合体の結晶構造。
【図３Ａ（２）】ｒＳＤＲＵを決定するために使用する抗体−抗原複合体の結晶構造（図３Ａ（１）の続き）。
【図３Ｂ】ｒＳＤＲＵを決定するために使用する抗体−抗原複合体の結晶構造。
【図３Ｃ】ｒＳＤＲＵを決定するために使用する抗体−抗原複合体の結晶構造。
【図４Ａ（１）】Ａ）抗タンパク質抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている。
【図４Ａ（２）】Ａ）抗タンパク質抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている（図４Ａ（１）の続き）。
【図４Ｂ】Ｂ）抗ペプチド抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている。
【図４Ｃ（１）】Ｃ）抗ハプテン抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている。
【図４Ｃ（２）】Ｃ）抗ハプテン抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている（図４Ｃ（１）の続き）。
【図５Ａ（１）】Ａ）抗タンパク質抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている。
【図５Ａ（２）】Ａ）抗タンパク質抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている（図５Ａ（１）の続き）。
【図５Ｂ】Ｂ）抗ペプチド抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている。
【図５Ｃ（１）】Ｃ）抗ハプテン抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている。
【図５Ｃ（２）】Ｃ）抗ハプテン抗体のｒＳＤＲＵを決定するのに使用される抗体のＶκ鎖のポリペプチド配列。抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触するＶκ残基は、灰色で強調表示されている。Ｌ３のアラインメントは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔではなく国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）の表記法に従う（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５〜７７，２００３）。ＳＤＲＲ配列が示されている（図５Ｃ（１）の続き）。
【図６Ａ】抗体の頻度（ｒＳＤＲＵ）は、Ａ）Ｖκ及びＢ）ＶＨの示される抗原と接触する。
【図６Ｂ】抗体の頻度（ｒＳＤＲＵ）は、Ａ）Ｖκ及びＢ）ＶＨの示される抗原と接触する。
【図７Ａ】Ａ）抗タンパク質抗体のＶκＳＤＲＭ。
【図７Ｂ】Ｂ）抗ペプチド抗体のＶκＳＤＲＭ。
【図７Ｃ】Ｃ）抗ハプテン抗体のＶκＳＤＲＭ。
【図８Ａ】Ａ）抗タンパク質抗体のＶＨ  ＳＤＲＭ。
【図８Ｂ】Ｂ）抗ペプチド抗体のＶＨ  ＳＤＲＭ。
【図８Ｃ】Ｃ）抗ハプテン抗体のＶＨ  ＳＤＲＭ。
【図９】抗ＯＳＭ親和性成熟抗体の結合倍数の分布。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本出願において引用される特許及び特許出願を含むがそれらには限定されない全ての刊行文献は、参照により本明細書に完全に説明されているごとくに組み込まれる。
【０００９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、文脈で明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は１つ以上のポリペプチドへの言及であり、当業者には既知のそれらの等価物を包含する。
【００１０】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているのと同様又は同等のあらゆる組成物及び方法を本発明において実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する。
【００１１】
用語「抗体」は、抗体全体及びそれらの任意の断片を包含する。抗体断片は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、例えば、抗体重鎖又は抗体軽鎖のいずれか相補的決定領域（ＣＤＲ）、可変領域（Ｖ）、定常（Ｃ）領域、あるいはフレームワーク領域（ＦＲ）などを含む。免疫グロブリンは、重鎖Ｃドメインアミノ酸配列に応じて、５つの主要クラス、つまりＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分けられることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4というアイソタイプに更に細かく分類される。
【００１２】
抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又は二重特異性抗体であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、若しくはヒト抗体、二量体、四量体、又は多重結合であってもよい。上述の抗体断片の構造、並びに抗体及びそれらの断片の作製及び使用技術は、当該技術分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  １９８７〜２００１；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  １９９４〜２００１；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９７〜２００１；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜７，１９７５；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：１００２９〜３３，１９８９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７）。
【００１３】
抗体の「軽鎖可変領域」（ＶＬ）及び抗体の「重鎖可変領域」（ＶＨ）は、本明細書で使用される場合、抗原結合部位（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）及びフレームワーク（ＦＲ、即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖及び重鎖の周知の部位を指す。軽鎖可変領域（ＶＬ）はκ又はλであり得、抗体のＩＧＶＫ又はＩＧＶＬ及びＩＧＪＫ又はＩＧＪＬ遺伝子によってコードされ、重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体のＩＧＶＨ、ＩｇＤＨ、及びＩＧＪＨ遺伝子によってコードされる。ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子ｌｏｃｉ（loci）、抗体遺伝子構造、遺伝子再配列のゲノム組織は周知である。
【００１４】
「親和性」は、本明細書で使用される場合、抗体と抗原との間の結合力の程度を指す。抗体の親和性は、例えば、シングルポイントＥＬＩＳＡを用いて親和性を測定することよって、又は解離定数（Ｋｄ）によって表わされることができる。典型的には、抗体は、定数（ＫD）が１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下、又は１０-10Ｍ以下で抗原−抗体複合体から解離する。
【００１５】
「改善された親和性」は、本明細書で使用される場合、シングルポイントＥＬＩＳＡアッセイにおける少なくとも２倍高いＥＬＩＳＡシグナル、又はその親抗体と比べて少なくとも２倍低下した親和性成熟された抗体のＫｄを指す。
【００１６】
「親和性成熟された抗体」は、本明細書で使用される場合、可変領域に１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体又はその断片であり、それらの置換を有さない親抗体と比べ、抗原に対して改善された抗体の親和性をもたらす。代表的な親和性成熟された抗体は、少なくとも１つのｒＳＤＲＵ残基に置換を有する。
【００１７】
「接触（Contact）（contacts）（in contact）」は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体のＸ線結晶構造のｘ、ｙ、及びｚ座標内に、抗原と複合した抗体の任意の重原子と約２．５Å〜４．５Å隔たった重原子を有する、抗体のＶＬ又はＶＨ残基を指す。
【００１８】
「相対的特異性決定残基の使用（Relative Specificity Determining Residue Usage）」、「ｒＳＤＲＵ」は、本明細書で使用される場合、類似の種類の抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、又はハプテン抗原）と複合した抗体の結晶構造集合体内の抗体重鎖又は軽鎖における接触頻度を指す。ｒＳＤＲＵは次のように定義される。
【００１９】
【数１】
2013508287.tif 000003
式中、Ｎｉは、抗体鎖のＣｈｏｔｈｉａ残基ｉにおける抗原との残基接触の数を定義する。抗体残基が抗原と接触している場合にはＮｉ＝１であり、接触していない場合には０である。「ｎ」は、抗体／抗原複合体の解析された結晶構造の数である。例えば、ｒＳＤＲＵ（５０）＝３６とは、解析された抗体の３６％が、重鎖又は軽鎖のＣｈｏｔｈｉａ残基５０においてそれらの抗原と接触していることを意味する（例えば、残基５０におけるｒＳＤＲＵ値は３６である）。低ｒＳＤＲＵは５〜１５のｒＳＤＲＵ値を指し、中間のｒＳＤＲＵは１５〜４０のｒＳＤＲＵ値を指し、高ｒＳＤＲＵは４０を超えるｒＳＤＲＵ値を指す。残基におけるｒＳＤＲＵ計算値が≧５である場合（例えば、ｒＳＤＲＵ≧５）、残基は、本明細書で使用される場合、「ｒＳＤＲＵ残基」である。
【００２０】
「特異性決定残基のマトリックス」、「ＳＤＲＭ」は、本明細書で使用される場合、任意の所与のｒＳＤＲＵ残基ｉにおける各アミノ酸ｊの頻度を指し、次のように定義される。
【００２１】
【数２】
2013508287.tif 000004
Ｍｉｊは、抗体のｒＳＤＲＵ残基における特定のアミノ酸残基の数を定義する。特定のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ）がｒＳＤＲＵ残基ｉにある場合、Ｍｉｊ＝１であり、さもなければＭｉｊ＝０である。「ｎ」は、解析された抗体／抗原結晶構造複合体の数である。例えば、ＳＤＲＭ（５０，Ａｌａ）＝４２とは、Ａｌａが残基５０における接触の４２％に貢献していることを意味する。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「特異性決定残基領域」又は「ＳＤＲＲ」は、Ｖκ及びＶＨの両方におけるアミノ酸接触の５つの異なる領域を指す。Ｖκ内にはＳＤＲＲ−Ｌ１、ＳＤＲＲ−Ｌ２、及びＳＤＲＲ−Ｌ３の３つの領域が存在し、ＶＨ内にはＳＤＲＲ−Ｈ１及びＳＤＲＲ−Ｈ２の２つの領域が存在する。ＳＤＲＲは、ＣＤＲ及びＨＶＬと部分的に重複し、それらの位置は表２に示されている。
【００２３】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「ハプテン」とは、抗体の抗原結合部位に結合する小有機化合物を意味する。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「抗原」とは、抗体により結合される分子を意味する。抗原は、タンパク質、ペプチド、及びハプテンなどの異なる種類に分類され得る。「類似の種類の抗原に結合する抗体」は、１つの種類に分類される抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、又はハプテンなど）に結合する抗体群である。
【００２６】
「融合タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、１つの連続したポリペプチドに連結された少なくとも２つのペプチド若しくはタンパク質又はこれらの組み合わせを有する分子を意味する。融合タンパク質において連結された少なくとも２つのペプチド又はタンパク質は、典型的には、２つの独立した供給源に由来し、したがって、融合ポリペプチドは、多くの場合、通常天然において連結して見られない２つの連結タンパク質を含む。連結配列は周知であり、例えば、アミド結合又はグリシンに富むリンカーを含む。代表的な融合タンパク質は、バクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩ、ｐＶＩＩ、又はｐＩＸ）とのＶＬ及びＶＨ融合である（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６：６０２５〜３０，１９９９）。融合タンパク質は、周知の方法（例えば、慣例のクローニングの後の組み換え発現）を用いて作製される。
【００２７】
抗体の「望ましい生物活性」は、例えば、強化又は改善された結合力、強化又は改善された親和力、オンレート、オフレート、特異性、半減期、低減された免疫原性、多様な宿主からの効率的な発現及び生成、抗体安定性、良好な溶解特性、又は他の任意の好適な特性を含む。
【００２８】
用語「置換する」、「バリエゲートする」、「変異する」、又は「多様化する」は、互換性を持って使用することができ、本明細書で使用される場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列における１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更して、その配列の変異体を産生することを指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合とき、「変異体」は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、変更された特性を有しても有さなくてもよい。変異体又は参照ポリペプチドは、１つ以上の修正によって、例えば置換、挿入、又は削除によって、アミノ酸配列が異なっている場合がある。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」は、２つ以上の変異体の集合を指す。
【００３１】
抗体ＶＨ及びＶＬ残基を同定するために、様々な付番方式が使用されている。最もよく使用されている２種類の付番方式であるＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）とＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９６：９０１〜１７，１９８７）との間の対応、並びに、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、超可変ループ（ＨＶ、ＨＲＬ）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９６：９０１〜１７，１９８７）、及びｒＳＤＲＵ残基は、抗体ＶＬに関して図１に、またＶＨに関して図２に示されている。本出願では、全ての抗体軽鎖及び重鎖の番号付けは、特に指定のない限り、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【００３２】
「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２７３：９２７〜４８，１９９７）に従って番号付けされた抗体軽鎖及び重鎖残基である。
【００３３】
本明細書では以下のようにアミノ酸の慣習的な１文字及び３文字の略号を用いる。
【００３４】
【表１】
2013508287.tif 000005
【００３５】
本発明は、抗体ＶＬ及びＶＨ変異体のライブラリーを生成するための集中的なアプローチを利用する、抗体を親和性成熟する方法を提供する。本発明は、ライブラリーの多様性を限定された数のＶＨ及びＶＬ残基（例えば、ｒＳＤＲＵ残基のサブセット）に制限し、かつ、抗体／抗原複合体の結晶構造中の抗原と接触しているのがしばしば認められる確定したアミノ酸のセットを使用して変異体を生成することによって、高水準の改善された親和性を有する抗体をもたらすライブラリーを生成することができるという発見に、少なくとも部分的に基づくものである。ライブラリーの設計は、所望のライブラリーサイズ、及び抗原の種類（この抗原に対してライブラリーをスクリーニングする）によって決まる。
【００３６】
多様化位置の選択
抗体／抗原複合体の既存の結晶構造を利用して、異なる種類の抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、又はハプテン）と結合する抗体に別々に接触する残基の位置及び頻度を決定することにより（例えば、ｒＳＤＲＵ）、任意の抗体の特定のＣｈｏｔｈｉａ残基が抗原と接触する可能性の尺度を提供する。この知識を用いて、標的抗原に結合する限定された数のみの抗体軽鎖又は重鎖残基を多様化する目的で、変異体の集中ライブラリーを設計することができる。特定の抗体−抗原複合体に関する結晶構造情報がなくても、集中ライブラリーを設計及び構築することができる。得られたライブラリーは、既存抗体の親和性成熟に用いられることができる。このライブラリーは、新規な抗体の発見のためのスクリーニングキャンペーンに用いられることもできる。制限された残基で多様性を設計することで、抗原の認識に関与しない残基（例えば、抗体に対して有害である中立突然変異体及び／又はアミノ酸残基）の不必要な多様化を回避することによって、ライブラリーの機能性を高めることになる。ライブラリーのより高い機能性は、ヒット率（抗原「結合分子」を生成する陽性クローンの数）、選択されたクローンの多様性、及び親和性がより高く、より可溶性で、かつより安定した抗体を入手する可能性を高めるはずである。
【００３７】
本発明の方法では、ライブラリーは、明細書で定義されるようなｒＳＤＲＵ残基のサブセットで多様化される。
【００３８】
抗原と接触する抗体ＶＬ及びＶＨ残基は、公共データベース（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ；ｗｗｗ＿ｐｄｂ＿ｏｒｇ））で入手可能な抗体−抗原複合体の結晶構造を解析することによって同定される。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ；ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｃｉｎｅｓ＿ｆｒ）は、結晶構造情報を集積し、抗原と複合体となった結晶構造を有する抗体のＶＬ及びＶＨポリペプチド配列を提供する（図３）。ＶＬ及びＶＨ配列を、類似の種類の抗原に結合する他の抗体配列とアラインさせる。対応の抗原と接触する抗体残基は、アラインメント（図４及び図５）に示されており、特定のＶＨ又はＶＬ残基と類似の種類の抗原との接触頻度を表すｒＳＤＲＵは、ダウンロードされたデータセット（図６及び図７）の中で決定される。
【００３９】
多様な抗原と複合する新しく解析された抗体の構造を組み込むことによってデータセットは展開する（evolve）ので、拡張されたデータセットの中の接触の位置及び／又は頻度、ひいては定義されたｒＳＤＲＵを変更し得ることが可能である。しかしながら、本明細書の方法で使用される解析データセットの３倍拡張は、接触している残基の頻度のわずかな違いのみをもたらしたので、大きな変動は見込まれない（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１７２：１３２〜４３，２００４）。
【００４０】
ｒＳＤＲＵを決定するために本発明で使用される抗原と複合した抗体の構造が、図３に示されている。抗体／抗原複合体結晶構造の中の抗原と接触するＶＬ及びＶＨ残基は、図４及び図５において、それぞれ灰色で強調表示されている。図６は、抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、又は抗ハプテン抗体のＶκ及びＶＨの各残基に関する接触頻度を示している。
【００４１】
ｒＳＤＲＵは、類似の種類の抗原に結合する抗体の各残基に関して、前掲のｒＳＤＲＵの式に従って個別に計算された。ｒＳＤＲＵ残基は、ｒＳＤＲＵ値が５以上であった残基、例えば、抗体−抗原複合体の解析された結晶構造の５％超過で抗原と接触している残基として同定された。表１は、抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、及び抗ハプテン抗体のＶＬ及びＶＨドメインのｒＳＤＲＵ残基を示す。ｒＳＤＲＵ値は、例えば、ｒＳＤＲＵ値が５〜１５の場合は低ｒＳＤＲＵ（Ｌ）、例えば、ｒＳＤＲＵ値が１５〜４０の場合は中間ｒＳＤＲＵ（Ｍ）、例えば、ｒＳＤＲＵ値が４０を超える場合は高ｒＳＤＲＵ（Ｈ）とされた。抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、及び抗ハプテン抗体に関する特異性決定残基領域（ＳＤＲＲ）が表２に示されている。
【００４２】
【表２】
2013508287.tif 000006
【００４３】
ライブラリーの所望の多様性及び配列包括度の程度に応じて、ｒＳＤＲＵ残基の異なるサブセットが多様化のために選択され得る。例えば、ｒＳＤＲＵ＞５、ｒＳＤＲＵ＞１５、ｒＳＤＲＵ＞３０、ｒＳＤＲＵ＞４０、ｒＳＤＲＵ＞５０、ｒＳＤＲＵ＞６０を有する、あるいは５〜１５、１５〜３０、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、４０〜５０、又は４０〜６０のｒＳＤＲＵ値を有するＶＬ又はＶＨ内のｒＳＤＲＵ残基のサブセットを、多様化のために選ぶことができる。「ｒＳＤＲＵ残基のサブセット」は、本明細書で使用される場合、定義されたｒＳＤＲＵ値範囲を有する残基群を指す。例えば、ｒＳＤＲＵ残基のサブセットは、残基３０、３１、４９、５３、及び９６（例えば、１５〜４０のｒＳＤＲＵ値を有するＶＬ残基）で構成され得る。多様化のために選択されるｒＳＤＲＵ残基のサブセットは、抗体が結合する抗原の種類に応じて異なる。ＶＬの代表的な多様化スキームでは、残基３２、５０、９１、９２、９３、９４、及び９６（例えば、抗タンパク質抗体で３０を超えるｒＳＤＲＵを有するｒＳＤＲＵ残基のサブセットのセット）が多様化される。ＶＨの代表的な多様化スキームでは、残基３１、３２、３３、３５、５０、５２、５３、５４、５５、５６、及び５８（例えば、抗ペプチド抗体で６０を超えるｒＳＤＲＵを有するｒＳＤＲＵ残基のサブセット）が多様化される。
【００４４】
【表３】
2013508287.tif 000007
【００４５】
本発明の方法では、ライブラリーの機能性を改善するために抗体変異体のライブラリーを生成するための多様化スキームを決定する際に、付加的な考慮点を含んでもよい。ライブラリー設計は、ＦｖのＸ線構造にｒＳＤＲＵ残基をマッピングすることによって改良され得る。実験的Ｘ線構造がない場合、Ｆｖの三次元モデルを使用することができる。ＰＩＧＳ（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏＧｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）と呼ばれるカノニカル構造モデルに基づく自動抗体モデリングに関するウェブサイトは、ｈｔｔｐ：／／ａｒｉａｎｎａ＿ｂｉｏ＿ｕｎｉｒｏｍａ１＿ｉｔ／ｐｉｇｓ／に見出すことができる。既知の構造の抗体に対する配列相同性に基づく抗体モデリング手順は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．によって、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＳｔｕｄｉｏのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓモデル化及びシミュレーション・ソフトウェアの一部として開発されている（ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｌｒｙｓ＿ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−ｓｔｕｄｉｏ／）。ＰＩＧＳ及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏは、ＶＬ及びＶＨの大部分のモデルを妥当な精度で生成する。
【００４６】
構造又はモデルでは、ｒＳＤＲＵ残基は、溶媒への暴露、並びに抗原との接触を確立するための位置決めに関して評価され得る。例えば、超可変ループ（ＨＶＬ）Ｌ１における残基の挿入は、残基３０及び３１の相対配向を変えるとともに、ＨＶＬ  Ｌ２の残基を妨害こともできる。ＨＶＬ  Ｈ２又はこのループの異なるカノニカル構造における挿入は、ＨＶＬ  Ｈ２の先端の残基（残基５０〜５４）を暴露又は埋没させることができる。長い又は短いＨＶＬ  Ｈ３ループもまた、ＨＶＬ  Ｌ３、Ｌ１、及びＨ２の残基を暴露又は妨害する役割を果たすことができる。したがって、構造又はモデルを使用して、所与のＦｖに関して抗原が接触する可能性が高いｒＳＤＲＵ残基の数（即ち、ｒＳＤＲＵ残基を多様化するために用いられる側鎖の溶媒暴露、側鎖の向く方向、並びに、側鎖のサイズ及び性質（極性、小型、芳香族））を最大にすることができる。例えば、所与のｒＳＤＲＵ残基における残基の側鎖が溶媒暴露されていない場合、又は抗原に向いていな場合、そのｒＳＤＲＵ残基は多様化のための標的となり得ない。
【００４７】
代表的な設計では、多様化のための標的とされる位置には、ＶκＢ３鎖、又はＢ３鎖の変異体（例えば、実施例３の抗ＯＳＭ抗体ＶＬ鎖など）を有する抗体のｒＳＤＲＵ残基３２、５０、９１、９２、９３、９４、及び９６（例えば、ｒＳＤＲＵが３０を超えるｒＳＤＲＵ残基）が含まれる。Ｂ３の三次元モデルは、Ｂ３において挿入されたＨＶＬ  Ｌ１の６つの残基のうち、残基３０ａ、３０ｃ、３０ｄ、及び３０ｆは抗原結合部位に向いているので、その挿入を有する十分な数の結晶構造がデータベースにないためにこれらの残基は５〜１５のｒＳＤＲＵ値を有するにもかかわらず、多様化のための標的となり得ることを示している（図４参照）。
【００４８】
多様化のための鋳型として使用することができるポリペプチドには、抗体軽鎖若しくは重鎖、又はその断片（例えば、ＶＬ及びＶＨ）をコードするポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは、天然又は合成のいずれかであってよい。代表的な鋳型には、実施例３に記載の本発明の抗ＯＳＭ抗体の抗体可変ドメイン配列が含まれる。
【００４９】
変異体の産生
各ｒＳＤＲＵ残基のアミノ酸分布を決定することにより、抗体が既知の構造の抗原−抗体複合体の異なる種類の抗原に接触するのに有利なアミノ酸のセットを同定する。こうしたアミノ酸のセットを使用して、ライブラリーの網羅性（coverage）を最大にするために集中的にライブラリーを多様化することができる。本発明の方法では、アミノ酸のセットを用いて限られたｒＳＤＲＵ残基のサブセットを多様化することにより（多様性は、既存の抗体−抗原構造における抗体接触で同定された自然多様性に偏る）、ｒＳＤＲＵ残基の同一サブセットにおいてランダムな多様性を有するライブラリー全体に、改善された特性を有する抗体の集合がもたらされた。生成された集中ライブラリーは、既存抗体の親和性成熟のために使用され得る。このライブラリーは、新規な抗体発見のためのスクリーニングキャンペーンのためにも使用され得る。
【００５０】
本発明の方法では、このライブラリーは、本明細書で定義されるようなアミノ酸のセットを使用して、ｒＳＤＲＵ残基のサブセットにおいて多様化される。
【００５１】
各ｒＳＤＲＵ残基のアミノ酸頻度は、利用可能な抗体−抗原複合体の結晶構造を解析することによって決定された。頻度は、抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、及び抗ハプテン抗体のＶκ及びＶＨについて別々に、各ｒＳＤＲＵ残基に関して上述のＳＤＲＭの式に従って決定された（図７及び図８）。例えば、アミノ酸Ｑ及びＥは、Ｖκ残基２７においてタンパク質抗原と複合した抗体の解析された結晶構造の７１％及び２８％に存在することが見出された（図７Ａ）。アミノ酸Ｉ、Ｋ、Ｓ、及びＴは、ＶＨ残基３０において抗原と複合した抗体の解析された結晶構造の８％、１１％、２６％、及び５２％に存在することが見出された。
【００５２】
「アミノ酸のセット」とは、本明細書で使用される場合、解析されたデータセットの中の抗体‐抗原複合体の結晶構造内の所定のｒＳＤＲＵ位置のそれぞれに存在するアミノ酸群を指す。代表的なアミノ酸のセットが、図７及び図８に示されている。例えば、「アミノ酸のセット」は、アミノ酸Ｉ、Ｋ、Ｓ、及びＴ（例えば、抗タンパク質抗体のＶＨ  ｒＳＤＲＵ残基３０で同定されたアミノ酸群）で構成され得る（図８ａ）。別の「アミノ酸のセット」は、アミノ酸Ｇ、Ｆ、及びＹ（例えば、抗タンパク質抗体のＶＨ  ｒＳＤＲＵ残基３２で同定されたアミノ酸群）で構成され得る（図８ｂ）。
【００５３】
選択されたｒＳＤＲＵ残基のそれぞれは、類似の種類の抗原に結合する抗体のＶκ及びＶＨ配列中の選択されたｒＳＤＲＵ残基に存在するアミノ酸のセットを用いて多様化され得る。
【００５４】
頻度カットオフは、特定のｒＳＤＲＵ残基を多様化するために用いられるアミノ酸の数を限定するために実施されることができ、例えば、得られたライブラリーサイズが所望のものより大きくなる場合に必要であり得る。例えば、特定のｒＳＤＲＵ残基において５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える頻度で同定されるアミノ酸は、そのｒＳＤＲＵ残基を多様化するために用いられ得る。したがって、「アミノ酸のセット」は、アミノ酸Ｋ、Ｓ、及びＴ（例えば、抗タンパク質抗体のＶＨ  ｒＳＤＲＵ残基３０で同定されるアミノ酸群）（図８ａ）、又は頻度カットオフが１０％で設定される場合、アミノ酸Ｙ（例えば、抗ペプチド抗体のＶＨ  ｒＳＤＲＵ残基３２で同定されるアミノ酸群）で構成され得る（図８ｂ）。代表的な多様化スキームでは、抗タンパク質抗体Ｖκ残基３０は、特定のｒＳＤＲＵ残基における所望の頻度厳密性（frequency stringency）（それぞれ、カットオフなし、５％、及び１０％）に応じて、アミノ酸ＮＧＨＫＳＹ、ＮＧＨＫＳＹ、又はＧＳＹを用いて多様化され得る。同様に、抗タンパク質抗体ＶＨ残基５０は、所望の頻度厳密性（それぞれ、カットオフなし、５％、及び１０％）に応じて、アミノ酸ＲＮＥＧＬＭＳＴＷＹＶ、ＥＧＬＴＷＹ、又はＥＷＹを用いて多様化され得る９（図７及び８）。
【００５５】
抗原と接触するアミノ酸の頻度は、上述のように各ｒＳＤＲＵ残基に関して独立して決定されるだけでなく、ＶＬ鎖及びＶＨ鎖の両方に位置する全てのｒＳＤＲＵ残基に関してまとめて決定され得る。「アミノ酸の普遍セット（universal set）」は、本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖抗体の両方において全てのｒＳＤＲＵ残基に最も高頻度に存在するアミノ酸群を指す。「アミノ酸の普遍セット」は、アミノ酸Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｗ、及びＹ，（ＲＮＤＧＨＳＷＹ）、若しくはアミノ酸Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、及びＹ，（ＲＮＤＧＨＳＹ）、又はアミノ酸Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、及びＹ（ＲＮＤＧＨＷＹ）、あるいはアミノ酸Ｒ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、及びＧ（ＲＤＧＨＳＷＹ）で構成され得る。これらアミノ酸は一緒になって、広範な分子認識特性を提供する。例として、ＳＤＲＲ−Ｌ１、ＳＤＲＲ−Ｌ２、ＳＤＲＲ−Ｌ３、ＳＤＲＲ−Ｈ１、及びＳＤＲＲ−Ｈ２のｒＳＤＲＵ残基における多様化に集中するために、全てのｒＳＤＲＵ残基のいくつかで最大多様性が生成される場合、アミノ酸の普遍セットは、それらの位置の多様化のために用いられてもよい。同一のコドンミックスを、多様化される位置の全てで採用することができるので、アミノ酸の普遍セットを使用して、ライブラリーの設計及び合成を単純化することも可能である。アミノ酸の普遍セットを用いて、接触に関するデータがわずかな残基を多様化し、その残基の人工的に低いｒＳＤＲＵ値を得ることができる。そのような代表的な残基は、ＨＶＬ  Ｌ１挿入（残基３０ａ〜３０ｆ）、Ｈ２挿入（残基５２ａ〜ｄ）、及びＬ３挿入（残基９５ａ〜ｃ）の残基、又は抗原結合部位を形成する所与のＨＶＬでの合成挿入における残基である。
【００５６】
任意のその他のタンパク質としての抗体は、様々な物理的及び／又は化学的不安定性となりやすく、抗体に基づく薬物の後処理プロセスに悪影響をもたらす結果となる。例えば、物理的及び化学的不安定性は、凝集、分解、低い製品収量、効力の喪失、免疫原性の可能性の増加、分子多様性、及び活性の喪失を引き起こす可能性がある。したがって、抗体変異体のライブラリーを設計する際には、不安定性を誘発する可能性のある残基及び認識配列の存在を最小限に抑えるように注意する。
【００５７】
例えば、表面が露出したＭｅｔ及びＴｒｐは、貯蔵条件において酸化する場合があり、抗体の有効性の喪失につながる可能性がある。したがって、Ｍｅｔ及びＴｒｐは、溶媒に暴露されるｒＳＤＲＵ残基の多様化に用いるアミノ酸の普遍セットから除外されてもよい。ｒＳＤＲＵ残基が溶媒に暴露されない場合、Ｔｒｐは含まれてもよいが、Ｓｅｒは除外されてもよい。更に、いくつかのｒＳＤＲＵが、抗原結合部位の同一領域に集中する場合、大きなサイズのＴｒｐに起因する干渉を防止するために、Ｔｒｐはアミノ酸の普遍セットから除外されてもよい。
【００５８】
アミノ酸の普遍セット中のＡｓｎの存在は、隣接配列によってはライブラリーに周知のＮ−グリコシル化認識部位（ＮＸＳ／Ｔ）を生成し得る。多様化されたｒＳＤＲＵ残基の後ろにＮ−グリコシル化部位を生成する残基が続く場合には、Ａｓｎはアミノ酸の普遍セットから除去されてもよい。Ａｓｎは、配列中でＧｌｙが後に続くと、タンパク質中で脱アミド化して異種性を作り出す可能性があり（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９９：５２８３〜８，２００２）、したがって、Ａｓｎは、Ｇｌｙの前の、又はＧｌｎで置換されるｒＳＤＲＵ残基を多様化するのに用いられる場合、アミノ酸の普遍セットから除外され得る。
【００５９】
同様に、Ｔｒｐ及びＡｓｎは、１つ以上のｒＳＤＲＵ残基を多様化するのに用いられる任意の又は全てのアミノ酸のセットから除外される。あるいは、Ｔｒｐ及びＡｓｎは、任意の抗体ライブラリーを多様化するのに用いられるアミノ酸のセットの中に、低濃度、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、又は２０％で保持されてもよい。
【００６０】
代表的な多様化スキームでは、抗タンパク質抗体において、Ｖκ  ｒＳＤＲＵ残基３０ａ、３０ｃ、３０ｄ、３０ｆ、３２、５０、９１、９２、９３、９４、及び９６は、それぞれＲＮＤＧＨＳＹ、ＲＮＤＧＨＷＹ、ＲＮＤＧＨＳＹ、ＲＮＤＧＨＷＹ、ＲＮＤＹ、ＹＷＮＫ、ＳＹＧＨ、ＳＹＧＮ、ＳＴＥＲ、ＷＹＳＨ、及びＹＲＷＬにより多様化される。
【００６１】
本発明の一実施形態は、抗体を親和性成熟する方法であって、次の工程を含む。
ａ．抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）又は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を得る工程。
ｂ．抗体ＶＬ又はＶＨのアミノ酸配列のｒＳＤＲＵ残基を特定する工程。
ｃ．多様化されるｒＳＤＲＵ残基のサブセットを選択する工程。
ｄ．ｒＳＤＲＵ残基のサブセットを多様化するために使用されるアミノ酸のセット又はアミノ酸の普遍セットを選択する工程。
ｅ．工程ｃ．で選択されたｒＳＤＲＵ残基のサブセットを、工程ｄ．で選択されたアミノ酸のセットを用いて多様化することによって、抗体ＶＬ又はＶＨ変異体のライブラリーを作製する工程。
ｆ．抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーを宿主で発現させる、又は抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーを生体外で翻訳する工程。
ｇ．抗体ＶＨ又はＶＬ変異体のライブラリーから、抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の親和性成熟抗体を選択する工程。
【００６２】
ＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列は、ルーチン的な配列決定法を用いて得ることができる。
【００６３】
ｒＳＤＲＵ残基は、前述のように同定することができる。多様化のために選択されるｒＳＤＲＵ残基の数は、得られるライブラリーの所望の複雑性によって異なる。５〜１５のｒＳＤＲＵ値、例えば、低使用頻度のｒＳＤＲＵ残基を有するｒＳＤＲＵ残基のサブセットを、多様化のために選択することができる。他の例では、４０を超えるｒＳＤＲＵ、例えば、高使用頻度のｒＳＤＲＵ残基を有するｒＳＤＲＵ残基のサブセットを、多様化のために選択することができる。抗体の親和性成熟では、Ｖκ又はＶＨのいずれかに存在するｒＳＤＲＵ残基が多様化されてもよい。選択したｒＳＤＲＵ残基のサブセットを多様化するために選ばれるアミノ酸のセットは、上述されている。選択されるアミノ酸のセット及びアミノ酸の普遍セットは、所要の抗体親和性、抗原の種類、生成されるライブラリーのサイズ、疎水性／親水性残基の望ましい含有量、及び有益でない抗体特性をもたらす可能性のあるアミノ酸残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、及びＡｓｎ）の頻度を低減するという要望、に応じて異なる。
【００６４】
抗体変異体の産生及びライブラリーの構築は、典型的には、核酸レベルで達成される。変更される位置に偏向したアミノ酸分布を有する抗体変異体のライブラリーは、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）テクノロジー（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成され得る。このテクノロジーは、何千もの遺伝子合成プロセスに十分な普遍的な構築ブロックとして機能する、あらかじめ作られた二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットのライブラリーは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。ライブラリーは、設計された多様性と一致する縮重オリゴヌクレオチドを使用して、米国特許ＵＳ６５２１４２７及びＵＳ６６７０１２７に記載されている方法に従って、化学的遺伝子合成によって合成され得る。ランダム置換を有するこのライブラリーの変異体は、２０の天然のアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを用いて産生することができる。ＣＧＴ／ＣＧＣ／ＣＧＡ／ＣＧＧ／ＡＧＡ／ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＡＴ／ＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＧＡＴ／ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＣＡＴ／ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＴＣＴ／ＴＣＣ／ＴＣＡ／ＴＣＧ／ＡＧＴ／ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）、ＴＡＴ／ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＧＧＴ／ＧＧＣ／ＧＧＡ／ＧＧＧ（Ｇｌｙ）コドンを使用して、アミノ酸の普遍セットの特性を作り出すことができる。
【００６５】
標準的なクローニング技術を用いて、発現及び／又はディスプレイのためにライブラリーをベクターにクローニングすることができる。ライブラリーは、既知の方式を用いて、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はＦｖなどの様々なフォーマットで発現され得る。ライブラリーは、融合タンパク質として発現されてもよく、また、任意の好適なファージの表面上に提示され得る。バクテリオファージの表面上に抗体断片を含む融合ポリペプチドのディスプレイ方法は周知である（米国特許第６，９６９，１０８号、米国特許第６，１７２，１９７号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第６，５８２，９１５号、米国特許第６，４７２，１４７号）。新規な抗体の分離及び親和性成熟のためのライブラリーは、ｐＩＸに提示され得る（ＷＯ２００９／０８５４６２，Ｔｏｒｎｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６０：３９〜４６，２０１０）。ライブラリーはまた、例えばリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：４９３７，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｓｔ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１２２９７，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）を使用して生体外で翻訳されることもできる。
【００６６】
その結果得られたライブラリーを、例えば、低減、強化、又は修正された結合力、交差反応性、親和性、オンレート、オフレート、又は特異性といった望ましい生物活性、あるいは他の任意の好適な特性の抗体又は抗体断片のためにスクリーニングすることができる。シングルポイントＥＬＩＳＡを用いて、成熟した抗体の親抗体と比較した結合活性をランク付けした後、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ分析を用いてトップランクの候補の親和性及び速度定数のより正確な推定を行うことができる。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
ｒＳＤＲＵの決定
ｒＳＤＲＵは、複合体構造のより小さなセットに関して前述されたのと同様の方法で、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：＿／／ｉｍｇｔ＿ｃｉｎｅｓ＿ｆｒ）で入手可能な抗原−抗体複合体を解析することによって同定された（Ａｌｍａｒｇｏ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜４３，２００４）。合計で９３３の構造が、２００８年３月２３日のデータベースに集積された。それらのうち、４７８のエントリーは、タンパク質、ペプチド、又はハプテンと複合した抗体を含んでいた。４７８の構造は、次の基準を用いて更に選別された：（１）３．０Å以下の分解能で解析された構造、（２）Ｖκ抗体、（３）ヒト又はマウス抗体、及び（４）抗体名及び配列比較によって判断された独特の抗体。この選別工程の後、得られた１４２の構造は、タンパク質と複合した６７の抗体、ペプチドと複合した２８の抗体、及びハプテンと複合した４７の抗体を含んでいた。データセットは、９１％のマウス抗体と９％のヒト抗体からなり、これは図３に要約されている。
【００６８】
図４及び図５は、それぞれ、この研究で使用された抗体のＶκ及びＶＨ配列を示している。対応の抗原と接触していると同定された抗体残基がＩＭＧＴから集積され、灰色で強調表示されている。データセットから、高、中、及び低使用頻度のｒＳＤＲＵを同定した。図６は、それぞれのＳＤＲＲ内のｒＳＤＲＵを示しており、データは表１にまとめられている。Ｖκ及びＶＨの両方の中の５つの特異的なＳＤＲＲが同定された。これらの領域は、ＣＤＲ及びＨＶＬと部分的に重複しており、それに応じてＳＤＲＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ１及び−Ｈ２と定義された。表２はＳＤＲＲ領域を示す。ＣＤＲ−Ｈ３に存在する残基の接触は、この領域のＣＤＲの長さ、立体構造、及びアミノ酸含有量が高度に可変性であったので計算されなかった。ＳＤＲＲは、認識される抗原の種類に応じて抗原と接触する可変鎖の領域を同定するので、これは、ヒトの配列中に移送されている非ヒト残基の数を低減するために、ヒト化プロトコルのガイドとして使用され得る。
【００６９】
全体的に、ＶＨは、全ての抗体種類に関してＶκよりも多くのｒＳＤＲＵを有し、このことは、抗原結合機構においてＶＬよりも優勢なＶＨの役割を反映し得る。抗タンパク質及び抗ペプチド抗体では、ｒＳＤＲＵの数及び位置は同様であるが、Ｖκの位置９２及びＶＨの３４を除いて全ての部位におけるｒＳＤＲＵの規模が４０未満である抗ハプテン抗体とは有意に異なる。タンパク質及びペプチドを認識する抗体では、いくつかの位置は６０を上回るｒＳＤＲＵ値に達する。残基３２、３４（ＳＤＲＲ−Ｌ１）、４９、５０（ＳＤＲＲ−Ｌ２）、並びに９１〜９４及び９６（ＳＤＲＲ−Ｌ３）は、３種類の抗原の全てと接触する。３種類の抗原がこれらの部位のそれぞれと接触する頻度にばらつきが観察される。
【００７０】
（実施例２）
特異性決定残基のマトリックス「ＳＤＲＭ」の計算
各Ｖκ又はＶＨ  ｒＳＤＲＵのアミノ酸分布を明らかにして、ＳＤＲＭ（特異性決定残基のマトリックス）の形態で示す。ＳＤＲＭは、各ｒＳＤＲＵ残基における２０個のアミノ酸のそれぞれの寄与を表す（図８及び図９）。全体的に、抗タンパク質抗体は、ＳＤＲＭ中のアミノ酸残基において最も高い多様性を呈した。抗ハプテン抗体は、抗原を認識するためにより制限されたアミノ酸のセットを使用した。
【００７１】
Ｖκ  ＳＤＲＭ
アミノ酸の種類の分布の違いが、ＳＤＲＲ領域内及びＶκ内の抗原の種類にわたって認められた（図７）。抗原の全種類にわたり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒは、接触部位において最も高い頻度で見られる。Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、及び疎水性アミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、及びＶａｌは、それほど高い頻度で見られない。このように、親水性アミノ酸は疎水性残基に対して優勢である。異なるＳＤＲＲ領域を比較すると、Ａｓｎ及びＡｓｐは、ＳＤＲＲ−Ｌ３よりもＳＤＲＲ−Ｌ１において高い頻度で見られる。ＳＤＲＲ−Ｌ１では、Ａｒｇはまれであり、Ｔｒｐは存在しない。ＳＤＲＲ−Ｌ２は、ＳＤＲＲ−Ｌ１及びＳＤＲＲ−Ｌ３よりも多様性が低い、即ち、例えば、ＳＤＲＲ−Ｌ２は、極めて少ないＳｅｒを有する。同様に、ＳＤＲＲ分布の違いが、同じ抗原クラス内で観察された。例えば、抗タンパク質抗体では、Ｔｒｐは、ＳＤＲＲ−Ｌ１又はＳＤＲＲ−Ｌ２よりもＳＤＲＲ−Ｌ３において高い頻度で見られる。
【００７２】
異なるクラスの抗原に結合している抗体のうちの同一領域に関して、類似性及び相違点が観察された。抗タンパク質抗体において、接触部位内の主な残基は、ＳＤＲＲ−Ｌ１ではＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒであり、ＳＤＲＲ−Ｌ２ではＡｒｇ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒであり、ＳＤＲＲ−Ｌ３ではＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒである。抗ペプチド抗体において、そうした残基は、ＳＤＲＲ−Ｌ１ではＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、及びＴｙｒであり、ＳＤＲＲ−Ｌ２ではＴｙｒであり、ＳＤＲＲ−Ｌ３ではＳｅｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。抗ハプテン抗体では、残基は、ＳＤＲＲ−Ｌ１ではＡｓｎ、Ｈｉｓ、及びＳｅｒであり、ＳＤＲＲ−Ｌ２ではＳｅｒであり、ＳＤＲＲ−Ｌ３ではＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、及びＴｙｒである。これらの分布の上に積層されるのは、抗原クラスの間の相対存在量の差である。したがって、抗タンパク質抗体は、ＳＤＲＲ−Ｌ１中により高い頻度のＡｓｐ及びより多数の接触残基の数を有し、ＳＤＲＲ−Ｌ３中により高い頻度のＡｒｇ及びＴｒｐを有する。これに対して、抗ハプテン抗体は、抗原接触部位により多くのＧｌｎ、Ｇｌｙ、及びＨｉｓを有する。
【００７３】
抗原と接触するアミノ酸のこの分析は、Ｖκ  ｒＳＤＲＵの位置における残基置換のためのガイドラインを提供する（図７）。例えば、残基３４は、カットオフ頻度が規定されていない場合、抗タンパク質抗体ではアミノ酸ＮＨＹＦを使用して、抗ペプチド抗体ではＮＥＨＳＴＹを使用して、抗ハプテン抗体ではＡＲＮＤＧＨＳＹを使用して多様化され得る。同様に、軽鎖残基９３は、抗タンパク質抗体ではＲＮＥＨＩＫＭＳＴＶ、抗ペプチド抗体ではＡＲＮＱＥＨＦＳ、及び抗ハプテン抗体ではＥＧＨＴを使用して多様化され得る。少なくとも１０％出現率のカットオフが適用される場合、位置９３の多様性は、抗タンパク質抗体でＥＳＴ、抗ペプチド抗体でＥＨＳ、及び抗ハプテン抗体でＥＧＨに低減される。
【００７４】
ＶＨ  ＳＤＲＭ
Ｖκと同様に、ＶＨにおける異なる種類の抗原との相互作用に関与するアミノ酸の種類の違いが図８に示されている。全ての抗原クラスにわたって、ＳＤＲＲ−Ｈ１及びＳＤＲＲ−Ｈ２と接触する主な残基は、ＳＤＲＲ−Ｈ１でＡｒｇ、Ａｓｎ、及びＡｓｐであり、ＳＤＲＲ−Ｈ２でＧｌｕ、Ｇｌｙ、及びＨｉｓであり、Ｈ３の基部でＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒである。Ｖκの場合と同様に、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒは、高い頻度で接触部位に見られ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、及び疎水性アミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、及びＶａｌは多くない。Ｖκと比べて、ＶＨは、特にＳＤＲＲ−Ｈ２において、負に帯電したアミノ酸を伴う接触がより多い。それに対応して、Ｌｙｓは、全体的にそれほど高い頻度で見られず、ＡｒｇはＳＤＲＲ−Ｈ１において少ない量で見られる。
【００７５】
抗タンパク質抗体では、接触部位の主な残基は、ＳＤＲＲ−Ｈ１でＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒであり、ＳＤＲＲ−Ｈ２でＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴＨｒ、及びＴｙｒである。抗ペプチド抗体では、そうした残基は、ＳＤＲＲ−Ｈ１ではＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒであり、ＳＤＲＲ−Ｈ２ではＡｒｇ、Ａｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒである。抗ハプテン抗体では、そうした残基は、ＳＤＲＲ−Ｈ１ではＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒであり、ＳＤＲＲ−Ｈ２ではＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒである。ｒＳＤＲＵ残基における残基置換のガイドラインが図８に示されている。例えば、ＶＨ残基５０では、アミノ酸ＲＮＥＧＬＭＳＴＷＹＶ、ＥＧＬＴＷＹ、又はＥＷＹが、抗タンパク質抗体に関してそれぞれカットオフ頻度０、５０％及び１０％で示されている。対応するアミノ酸は、抗ペプチド抗体に関してはＲＤＥＧＨＦＴＷＹ、ＲＥＧＨＴＷＹ、又はＲＧＷＹ、及び抗ハプテン抗体に関してはＲＮＤＥＬＭＳＴＷＹＶ、ＲＥＳＷＹ、又はＲＳＷＹである。
【００７６】
アミノ酸の普遍セット
アミノ酸の普遍セットは、重鎖及び軽鎖の両方の全ｒＳＤＲＵ残基におけるアミノ酸の頻度、並びにアミノ酸鎖の特性に基づき選択された。アミノ酸の普遍セットは、残基Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒで構成される。このセットにおいて、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、及びＳｅｒは、上述のようないくつかの場合には除去されてもよく、その結果、アミノ酸Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、及びＴｙｒ、若しくはアミノ酸Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ、又はアミノ酸Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＧｌｙで構成される代替のアミノ酸の普遍セットがもたらされる。広範な分子認識特性は、こうした限られたアミノ酸のセットを用いて達成され得る。Ａｒｇは、正に帯電したアミノ酸の代用となり、そのグアニジニウム基は、水素結合においてドナー及びアクセプターとして関与し得る。Ａｓｐは負電荷を提供するが、Ｇｌｕほど可動性ではないので、あまりエントロピー的ではなく、更に、塩橋を形成し、かつ水素結合のアクセプターとしての機能を果たすことができる。Ａｓｎは、水素結合のアクセプターとしての機能を果たすことができる。Ｈｉｓは、スタッキング相互作用を提供し、また、プロトン化状態で正電荷を与えることができる。Ｔｒｐ及びＴｙｒは、芳香族相互作用、水素結合、及びスタッキング相互作用を提供する。Ｓｅｒは水素結合を提供し、最も小さい側鎖残基でもある。Ｓｅｒ、及び特にＧｌｙは、立体化学的柔軟性を提供し、かつ、抗原との相互作用のために、隣接するアミノ酸の適切な配向を可能にする。可能な部位の数の自然減少、及び各部位におけるアミノ酸の普遍セットによる置換の数の減少により、コンビナトリアルライブラリーの大きな結合表面の調査が可能になる。アミノ酸の普遍セットを用いて、親和性成熟抗体のライブラリー、並びに新たな発見を目的としたライブラリーを多様化することができる。
【００７７】
（実施例３）
抗オンコスタチンＭ抗体の親和性成熟
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６５３９１）は、単球、マクロファージ、好中球、及び活性化したＴリンパ球から分泌されるサイトカインのＩＬ−６ファミリーの多機能なメンバー（multifunctional member）であり、（Ｔａｎａｋａ  ＆  Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１４９：３９〜５３，２００３）、発癌過程及び炎症並びに肥大経路において機能して、肺線維症などの有害な状態を引き起こす。
【００７８】
新たなＦａｂ−ｐＩＸライブラリー（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３９７：３８５〜９６，２０１０；ＷＯ２００９／０８５４６２；Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１２／５４６８５０）を、常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上に捕捉されたビオチン化ヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＮＰ＿０６５３９１のアミノ酸２６〜２２１）を用いて、発表されたファージ選択プロトコル（Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２４８：１６１〜１７６，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４）に従ってパニングした（panned）。ライブラリーは、ヒト生殖系列ＩＧＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ１−６９*０１、ＩＧＨＶ３−２３*０１、及びＩＧＨＶ５−５１*０１、並びにヒト生殖系列ＩＧＶＫ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９*０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１*０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０*０１）、及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１*０１）を多様化させて生成した。得られた３つのＶＨライブラリーを４つのＶＬライブラリーと組み合わせて、スクリーニングのための１２の固有のＶＨ：ＶＬ組み合わせを生成した。確認されたＯＳＭ結合Ｆａｂを、完全長のヒトＩｇＧ１  ｍＡｂｓに変換し、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による親和性測定、及びＳｔａｔ３シグナル伝達の阻害能力などの様々なアッセイを用いて特徴付けた。これら分析から、４つのｍＡｂｓ、ＯＳＭＭ５、ＯＳＭＭ６、ＯＳＭＭ９及びＯＳＭＭ１０が親和性成熟のために選択された。表３は、親和性成熟のために選ばれたｍＡｂの特性を示す。
【００７９】
【表４】
2013508287.tif 000008
【００８０】
親和性成熟
親和性成熟に関し、ｍＡｂ  ＯＳＭＭ５、ＯＳＭＭ６、ＯＳＭＭ９、及びＯＳＭＭ１０（Ｈ１３５、Ｈ１４、Ｈ１７、及びＨ２）のＶＨ鎖を、ｐＩＸに提示された３つの特異的なＶＬライブラリーと組み合わせ、ｈｕＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び成熟ｃｙｎｏＯＳＭを使用してパニングした。ｍＡｂ  Ｍ５、Ｍ６、Ｍ９、及びＭ１０（Ｌ１１１、Ｌ１２、Ｂ３、Ｌ２）のＶＬ鎖は全て、Ｂ３の新たなｐＩＸライブラリーから生じ、したがって、Ｂ３が、親和性成熟のためのライブラリーを生成するための鋳型として選択された。
【００８１】
成熟に使用されたライブラリーのうちの１つ（「ライブラリー３」）は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３９７：３８５〜３９６，２０１０及びＷＯ２００９／０８５４６２；米国特許出願第１２／５４６８５０号に記載の手順に従った新たな発見で使用したものと同じライブラリーであった。このライブラリーの多様性は、タンパク質及びペプチド抗原と最も高い頻度で接触しているのが観察される軽鎖における位置を同定し、Ｂ３生殖細胞系遺伝子ファミリー内及びＢ３に由来する再配列抗体内の対応位置に見られるアミノ酸を使用することによって設計された。２つの追加のライブラリーであるライブラリー１（「重点的（focused）ＳＤＲＵライブラリー」）及びライブラリー２（「ＮＮＫ  ＳＤＲＵライブラリー」）を生成して、特異的なｒＳＤＲＵ残基及び多様化ストラテジーの選択が親和性成熟の効率に与える影響を比較した。ライブラリー１及び２は、同じｒＳＤＲＵ残基を標的としたが、多様化のために使用したアミノ酸は異なった（表４）。
【００８２】
ライブラリー１及び２で多様化の標的となったｒＳＤＲＵ残基は、次のように選択された。最初に、タンパク質抗原との高い接触頻度（ｒＳＤＲＵ＞４０）を有し、かつ、Ｖκ鎖の挿入及び欠失内の残基（例えば、残基３０ａ〜ｆ及び９５ａ〜ｃ）は除いて全てのＶκ鎖に共通である、Ｖκ内の位置を同定した。２番目に、Ｊκ１と再結合されたＢ３の三次元構造モデルを組み立て、抗原結合部位の方向を向いている挿入内の３０ａ〜ｆ中の残基（３０ａ、３０ｃ、３０ｄ、及び３０ｆ）を、多様化されるべき位置に含ませた。Ｂ３において多様化の標的となったｒＳＤＲＵ残基の組み合されたセットは、Ｃｈｏｔｈｉａ残基３０ａ、３０ｃ、３０ｄ、３０ｆ、３２、５０、９１、９２、９３、９４、及び９６であった。
【００８３】
ライブラリー１に関し、各位置における多様性は、タンパク質配位子と接触しているのが最も高い頻度で見られるセット（例えば、ＳＤＲＭ中で最も頻度の高い残基）であった。位置３０ａ〜３０ｆに関しては、抗原接触と関係する残基の寄与を決定するのに利用できる十分な結晶構造情報が存在しなかった。これらの位置では、上述のアミノ酸の普遍セットが使用された。トリプトファン（Ｗ）は、酸化の可能性、及び凝集をもたらす可能性のある立体的衝突を避けるために、ごくわずかな位置（例えば、３０ｃ及び３０ｆ）にだけ含まれた。
【００８４】
ライブラリー１及び２は、米国特許第６，５２１，４２７号及び米国特許第６，６７０，１２７号に記載の方法に従って、化学的遺伝子合成を用いて合成された。ジヌクレオチドを使用して、ライブラリー１の多様性を調整する一方で、縮重オリゴヌクレオチド（ＮＮＫ）をライブラリー２の合成に使用した。ライブラリー３は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３９７：３８５〜９６，２０１０及びＷＯ２００９／０８５４６２；米国特許出願第１２／５４６８５０号に記載の通りに構築された。
【００８５】
表４にライブラリー１、２及び３の多様性がまとめてある。ライブラリーＱＣの間、当初の設計の一部でなく、したがって、合成法の結果として導入されたいくつかのアミノ酸を同定した。ライブラリー１に関し、こうしたアミノ酸は、Ｓ（位置３０Ｃ）、Ｔ（位置３０ｄ）、ＥＫ（位置３０ｆ）、ＩＷ（位置３２）、ＴＶ（位置５０）、Ｉ（位置９２）、Ｄ（位置９３）、及びＦ（位置９６）であった。
【００８６】
【表５】
2013508287.tif 000009
*Ｃｈｏｔｈｉａ残基
【００８７】
標準プロトコル（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３９７：３８５〜９６，２０１０；ＷＯ２００９／０８５４６２；米国特許出願第１２／５４６８５０号）に従って、ライブラリーをクローニングしかつ提示した。Ｆａｂは、ジシストロニックベクターからの発現を介してｐＩＸ上に提示され、ＶＨ−ＣＨ１ドメインは、外被タンパク質配列に融合し、ＶＬ−Ｃκは、ＶＨ−ＣＨ１と結合する遊離ポリペプチドとして発現される。１ｎＭのビオチン化されたヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、０．１ｎＭのビオチン化された成熟カニクイザルＯＳＭ、及び０．０１ｎＭのビオチン化されたヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、それぞれ各ラウンドで用いて、パニングを３ラウンド行った。
【００８８】
パニングの後、各ライブラリーからのＦａｂを、２ｎＭ及び０．２ｎＭのヒトＯＳＭを使用したＥＬＩＳＡアッセイで、ＯＳＭ結合に関して親Ｆａｂと比較した。ライブラリー１、２及び３からそれぞれ同定されたＦａｂの８１．３％、６３．５％、及び９７．９％は、親Ｆａｂと比べて改善された結合を示した。親結合に対する倍数改善の分布が図９に示されている。ライブラリー３のヒット率は、ライブラリー１及び２のヒット率よりも良好であったが、ライブラリー１及び２から生成された抗体の親和性は、ライブラリー３から生成されたものよりも高かった。更に、ライブラリー１は、比較した親抗体よりも結合が最大で９倍改善された、高い親和性を有するＦａｂをもたらした。こうして、ｒＳＤＲＵに基づいて選択された位置の組み合わせ、及び定義されたアミノ酸のセットに基づく多様化は、高水準の改善された親和性を有する抗体をもたらした。
【００８９】
選択の結果を更に特性決定するために、ライブラリー１のスクリーニングで得た選択されたＶκ領域を、ＯＳＭＭ６及びＯＳＭＭ９の親ＶＨ鎖と対にし、哺乳類細胞での発現（expression）のために、完全なＩｇＧ１／κ構築物としてクローニングした。ヒトＯＳＭ及びカニクイザルＯＳＭに対する純化した抗体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定し、それらの中和能力を、細胞培養でＳＴＡＴ３リン酸化の抑制によって測定した（表５）。多様化された位置における選択されたクローンの配列が表６に示されている。
【００９０】
【表６】
2013508287.tif 000010
【００９１】
【表７】
2013508287.tif 000011
【００９２】
選択されたクローンは全て、親Ａｂｓよりも高い親和性及び中和能力を示した。ＢＩＡｃｏｒｅにより測定した親和性は、３０ｐＭ〜１．７ｎＭの範囲であった。ＢＩＡｃｏｒｅで測定した場合の親和性改善の範囲は、変異体のランク付けに使用したＥＬＩＳＡアッセイで観察された親和性の分布と類似している。カニクイザルＯＳＭの親和性は、ヒトＯＳＭと良好に相関する。中和能力は、測定された親和性と厳密に相関していなかったが、全体的に同じ傾向を示した。これは、実験的ゆらぎを反映している可能性がある。こうして、ライブラリー１から選択された抗体は、親和性及び生体外での中和能力の両方で改善された。
【００９３】
アッセイ及び試薬
ＯＳＭの発現及び精製
ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＯＳＭ（ヒトＯＳＭ及びカニクイザルＯＳＭ）の前駆体型及び成熟型をＨＥＫ２９３に発現させ、標準的な方法を用いて精製した。成熟ヒトＯＳＭ及びカニクイザルＯＳＭは、それらの対応の前駆体型のａａ１〜１８４を含む。Ｈｉｓ6タグ及びＡｖｉタグを、クローニングプロセスの間にタンパク質に添加した。タンパク質機能活性を、Ａ３７５−Ｓ２細胞増殖及びｐＳｔａｔ３シグナル伝達アッセイで試験した。
【００９４】
ＥＬＩＳＡアッセイ
パニングの後、グリセロールストックを作製し、ポリクローナルＤＮＡを抽出した。ｐＩＸ外被タンパク質をコードする遺伝子をＤＮＡプールから切除し、これにより、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを、ＦａｂＣＨ１ドメインのＣ末端にフレームで添加することが可能となる。バクテリアへの形質転換の後、個々のクローンを採取し、Ｆａｂを細菌性上清から生成及び回収した。Ｆａｂを、ヒツジ抗ヒトＦｄ（ＣＨ１）抗体（１μｇ／ｍＬ）（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、カタログ番号ＰＣ０７５）を用いて黒のＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３７１１１）上に捕捉した。洗浄及びブロッキングの後、Ｆａｂを含有する５０μＬの不希釈細菌性上清をプレートに加えた。プレートを室温で静かに撹拌しながら１時間インキュベーションした。洗浄後、連続的に希釈したビオチン化ヒトＯＳＭＭ又はカニクイザルＯＳＭをウェルに加え、室温で１時間インキュベーションした後、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４３〜４３２３）及び化学発光法を用いてシグナルを検出した。
【００９５】
ＥＣ５０測定
Ａ３７５−Ｓ２細胞を、２００μＬの完全成長培地中、２５，０００細胞／ウェルで９６−ウェル組織培養プレートに播種し、２４時間インキュベーションした。細胞は、１０μｇ／ｍＬではじまって１：５で連続的に希釈された実験用のｍＡｂで予め３時間室温でインキュベーションされた５ｎｇ／ｍＬのヒトＯＳＭを含む溶液で処理された。リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＳＡＴ３）を、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３  Ｗｈｏｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｋｉｔ（ＭＳＤ；カタログ番号Ｋ１５０ＤＩＤ−１、ロット番号Ｋ００１０５７０）を使用して製造業者のプロトコルに従って測定した。
【００９６】
ＥＣ５０用量反応曲線を得て、正規化されたパーセントｐＳＴＡＴ３シグナルとしてプロットした。
【００９７】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による親和性測定
前述のヒト又はカニクイザルＯＳＭ構築物を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００光バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により結合親和性を測定した。バイオセンサー表面は、アミンカップリング化学に関する製造業者の説明書を使用して、抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号３１５−００５−０４６）及び抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−００５−０９８）の抗ＩｇＧＦｃ抗体混合物を、ＣＭ−５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）のカルボキシメチル化デキストラン表面に結合させることによって作製された。抗ＯＳＭ抗体の約１９，０００ＲＵ（反応単位）を、４つのフローセルそれぞれに固定化した。ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．００５％  Ｐ２０＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ）の中で２５℃で速度実験を実施した。１００ｎＭ〜０．４１２ｎＭの範囲の連続希釈ヒト及びカニクイザルＯＳＭ  ＥＣＤをランニング緩衝液中で調製した。約２００ＲＵのｍＡｂをセンサーチップのフローセル２〜４の上に捕捉した。フローセル１は、参照表面として用いた。ｍＡｂの捕捉に続いて、抗原を５０μＬ／分で３分間注入（結合相）し、次いで緩衝液フロー（解離相）を１０分間注入した。１００ｍＭのＨ３ＰＯ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７９６１）の５０μＬ／分での１８秒注入の２つのパルスによってチップ表面を再生させた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ（１）】
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【図３Ａ（２）】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ（１）】
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【図４Ａ（２）】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ（１）】
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【図４Ｃ（２）】
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【図５Ａ（１）】
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【図５Ａ（２）】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ（１）】
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【図５Ｃ（２）】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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