(57)【要約】  本発明は、試料中のＭＲＳＡの存在を検出及び確認するために使用され得るマルチプレックスアッセイ、方法及びキットを提供する。その方法は、リアルタイムＰＣＲアッセイを含み、キット及び組成物は、プライマー及びプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む。本発明はさらに、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するために有用なアッセイを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれる１つより多いアッセイを含み、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別することができるマルチプレックスアッセイ。
【請求項２】
前記アッセイが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション法及びそれらの任意の組合せから選ばれる解析の１種類であり、プライマーセットもしくはプローブまたはこれらの両方が、ｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ遺伝子、ｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子から選ばれる少なくとも一つの標的配列の存在又は非存在を検出するために適用され；それぞれの標的遺伝子を検出する前記アッセイは、単独で、又は、１つの、組み合わされかつ混合された反応系において、実行され得、前記反応系は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション法又はそれらの任意の組合せ用である、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項３】
他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｎｕｃ−Ｓａアッセイが、配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１を含む、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項４】
他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｎｕｃ−Ｓａアッセイが、配列番号３によって表わされるプローブ１をさらに含む、請求項３に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項５】
他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイが、配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２を含む、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項６】
他の菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイが、配列番号６によって表わされるプローブ２をさらに含む、請求項５に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項７】
他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイが、配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３を含む、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項８】
他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイが、配列番号９によって表わされるプローブ３をさらに含む、請求項７に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項９】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを検出する前記ｔｕｆ−Ｓａアッセイが、配列番号１０及び１１によって表わされるプライマーセット４を含む、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１０】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを検出する前記ｔｕｆ−Ｓａアッセイが、配列番号１２によって表わされるプローブ４をさらに含む、請求項９に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１１】
ＣＮＳを検出する前記ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイが、配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５を含む、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１２】
ＣＮＳを検出する前記ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイが、配列番号１５によって表わされるプローブ５をさらに含む、請求項１１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１３】
メチシリン耐性表現型及びペニシリン耐性表現型を鑑別する前記ｍｅｃＡアッセイが、配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６を含む、請求項１に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１４】
メチシリン耐性表現型及びペニシリン耐性表現型を鑑別する前記ｍｅｃＡアッセイが、配列番号１８によって表わされるプローブ６をさらに含む、請求項１３に記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１５】
ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ；ｍｅｃＡアッセイ；並びにｎｕｃ−Ｓａアッセイ及びｆｅｍＡ−Ｓａアッセイから選ばれる少なくとも一つのアッセイ；を含むマルチプレックスアッセイであって、ここで前記マルチプレックスアッセイが、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ及びＭＳＳＥを同定及び鑑別するためであり；
ａ．ここで、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイが、配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３、並びに配列番号９によって表わされるプローブ３、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｂ．ここで、メチシリン耐性表現型及びペニシリン耐性表現型を鑑別する前記ｍｅｃＡアッセイが、配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６、並びに配列番号１８によって表わされるプローブ６、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｃ．ここで、他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｎｕｃ−Ｓａアッセイが、配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１、並びに配列番号３によって表わされるプローブ１、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｄ．ここで、他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイが、配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２、並びに配列番号６によって表わされるプローブ２、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行される；
マルチプレックスアッセイ。
【請求項１６】
ｍｅｃＡアッセイ並びにｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイから選ばれる二つのアッセイを含むマルチプレックスアッセイであって；ここで前記マルチプレックスアッセイが、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためであり；
ａ．ここで、メチシリン耐性表現型及びペニシリン耐性表現型を鑑別する前記ｍｅｃＡアッセイが、配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６、並びに配列番号１８によって表わされるプローブ６、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｂ．ここで、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイが、配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３、並びに配列番号９によって表わされるプローブ３、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｃ．ここで、少なくとも、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを検出する前記ｔｕｆ−Ｓａアッセイが、配列番号１０及び１１によって表わされるプライマーセット４、並びに配列番号１０によって表わされるプローブ４、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｄ．ここで、ＣＮＳを検出する前記ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイが、配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５、並びに配列番号１５によって表わされるプローブ５、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行される；
マルチプレックスアッセイ。
【請求項１７】
ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイを含むマルチプレックスアッセイであって、ここで前記マルチプレックスアッセイが、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためである、マルチプレックスアッセイ。
【請求項１８】
試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するための方法であって、
ａ．試料を受け取る工程；
ｂ．ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれる少なくとも一つのアッセイを実行することによって、試料をスクリーニングする工程であって、ここでこれらのアッセイがそれぞれ、配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１若しくは配列番号３によって表わされるプローブ１によって検出可能なｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の存在又は非存在；配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２若しくは配列番号６によって表わされるプローブ２によって検出可能なｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の存在又は非存在；配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３若しくは配列番号９によって表わされるプローブ３によって検出可能なｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ遺伝子の存在又は非存在；配列番号１０及び１１によって表わされるプライマーセット４若しくは配列番号１２によって表わされるプローブ４によって検出可能なｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の存在又は非存在；並びに配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５若しくは配列番号１５によって表わされるプローブ５によって検出可能なｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子の存在又は非存在；並びに配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６若しくは配列番号１８によって表わされるプローブ６によって検出可能なｍｅｃＡ遺伝子の存在又は非存在、を解析する、工程；
ｃ．ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれる少なくとも一つのアッセイの解析に基づいて、試料中に含有される細菌を、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳと同定する工程；
を含む、方法。
【請求項１９】
ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれるアッセイ用の一つ以上のプライマーセット及びプローブを含むキットであって；ここで前記キットが、マルチプレックスアッセイを通して、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためであり；
ａ．ここで、他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｎｕｃ−Ｓａアッセイが、配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１、並びに配列番号３によって表わされるプローブ１、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｂ．ここで、他の菌種からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイが、配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２、並びに配列番号６によって表わされるプローブ２、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｃ．ここで、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを鑑別する前記ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイが、配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３、並びに配列番号９によって表わされるプローブ３、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｄ．ここで、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを検出する前記ｔｕｆ−Ｓａアッセイが、配列番号１０及び１１によって表わされるプライマーセット４、並びに配列番号１２によって表わされるプローブ４、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｅ．ここで、ＣＮＳを検出する前記ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイが、配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５、並びに配列番号１５によって表わされるプローブ５、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行され；
ｆ．ここで、メチシリン耐性表現型及びペニシリン耐性表現型を鑑別する前記ｍｅｃＡアッセイが、配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６、並びに配列番号１８によって表わされるプローブ６、から選ばれる少なくとも一つのアプローチを通して実行される；
キット。
【請求項２０】
前記マルチプレックスアッセイが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション法及びそれらの任意の組合せから選ばれる解析の種類であり、ここで、プライマーセット又はプローブ又は両方が適用されてｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、ｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子から選ばれる少なくとも一つの標的配列の存在又は非存在が検出され、ここでそれぞれの標的遺伝子を検出する前記アッセイが、単独で、複数の別々の反応系において、又はＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション法若しくはそれらの任意の組合せ用の、一つの、組合わされ、かつ混合された反応系において実行され得る、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ用；ｍｅｃＡアッセイ用；並びにｎｕｃ−Ｓａアッセイ及びｆｅｍＡ−Ｓａアッセイから選ばれる少なくとも一つの他のアッセイ用のプライマーセット及びプローブを含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
ｍｅｃＡアッセイ用並びにｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイから選ばれる二つの他のアッセイ用のプライマーセット及びプローブを含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイ用のプライマーセット及びプローブを含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年３月１９日に出願された「ＭＲＳＡの検出において有用である方法、キット及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ，  ＫＩＴＳ，  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＵＳＥＦＵＬ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＲＳＡ）」と題された米国仮特許出願第６１／３１５，６６４号；及び２０１１年１月１３日に出願された「ＭＲＳＡの検出のための方法、キット及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ，  ＫＩＴＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＲＳＡ）」と題された米国仮特許出願第６１／４３２，５１１号に基づく優先権を主張し、それらの両方は、参照することによりそれらの全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
技術の分野
本発明は、概して、所定の試料中に、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）が存在するかどうかを決定するための組成物及び方法を提供する。より詳細には、本発明は、ＭＲＳＡの存在を検出するための、同定された遺伝子配列、それに応じて設計されたプライマー及びプローブに基づくアッセイを提供する。本発明はさらに、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するために有用であるアッセイを含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、米国及び他国において、最も危険な感染因子の一つとなっており、ＨＩＶ−ＡＩＤＳよりも高い死亡率を有する。ＭＲＳＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）細菌のある菌株であり、これは健康な人々の皮膚上及び鼻腔中に生息し得る一般的な種類の細菌である。ＭＲＳＡは、ブドウ球菌及び他の細菌感染を処置するために一般的に使用される抗生物質のいくつかには反応しない。
【０００４】
院内感染型ＭＲＳＡ（ＨＡ−ＭＲＳＡ）感染は、病院又は他の医療施設に現在いるか又は最近いたことのある人々において発生する。多くの人々は、ＭＲＳＡ細菌が、表面上、医療従事者、その患者又は他の患者に定着している環境において、医療サービスを受けたことによって、ＭＲＳＡ感染のリスクを有し得る。市中感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）感染は、病院に最近いたことのない、その他の点では健康な人々において発生する。実際に、ＭＲＳＡは、医療の場に広く曝されていない人における皮膚及び軟組織感染症の主因となっており、競技チーム施設、矯正施設及び軍隊の基礎訓練所において大発生が起こっている。
【０００５】
メチシリン感受性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）及びメチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）菌株に加えて、ヒトにおいて一般に見られ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌の近縁種である、ＣＮＳ又はＣｏＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ））種がある。ＣＮＳの多くの菌株はまた、メチシリンに耐性であり（ＭＲＣＮＳ）、ＭＲＳＡと類似したＳＣＣｍｅｃ遺伝子カセット機構を含有する。具体的には、メチシリン耐性Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＭＲＳＥ）が、ＣＮＳ菌種の集合体中で、ＭＲＣＮＳ保菌者において最も一般的に見られる菌種である。免疫無防備状態の患者において、ＭＲＣＮＳ、特にＭＲＳＥは、感染症をもたらし得、創傷感染、血液感染及び呼吸器感染の共通の原因である。ＭＲＳＥは、免疫抑制された患者及び中心静脈カテーテルを持つ患者において、重篤な感染症を引き起こし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
臨床医及び患者における除菌、隔離手順、又は職業活動における制限を通じた、ＭＲＳＡ定着用の治療介入は、医療従事者中における、ＭＲＳＡが定着した患者を迅速に同定する方法があれば、より効果的となるだろう。しかしながら、現行の同定系は、例えば培養等の、旧式で、煩雑であり、かつ時間がかかる技術に基づいており、ＭＲＳＡのみに焦点をおいている。したがって、感染の定着のスクリーニング及び診断の両方に対する高い精度を持つ、より迅速で情報価値のある試験を使用する、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳの確実な同定及び鑑別を可能とする技術に対する継続した必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
したがって、簡潔には、本発明の一態様は、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのマルチプレックスアッセイを提供する。マルチプレックスアッセイはｎｕｃ−ＳＡアッセイ、ｆｅｍＡ−ＳＡアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれる一つより多いアッセイを含む。
【０００８】
発明の別の態様は、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ及びＭＳＳＥを同定及び鑑別するためのマルチプレックスアッセイを包含し、マルチプレックスアッセイは、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ；ｍｅｃＡアッセイ；並びにｎｕｃ−Ｓａアッセイ及びｆｅｍＡ−Ｓａアッセイから選ばれる少なくとも一つのアッセイ、を含む。
【０００９】
発明の別の態様は、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのマルチプレックスアッセイを提供し、マルチプレックスアッセイは、ｍｅｃＡアッセイと、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイから選ばれる二つのアッセイとを含む。
【００１０】
発明のさらなる態様は、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するための方法を包含する。その方法は、試料を受け取る工程；ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれる少なくとも一つのアッセイを実行することによって試料をスクリーニングする工程であって、それらがそれぞれｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ遺伝子、ｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子の存在又は非存在を解析する工程；並びに各々の選ばれたアッセイの解析に基づいて、試料中に含有される細菌を、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳと同定する工程；を含む。
【００１１】
発明のまた別の態様は、マルチプレックスアッセイを通して、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのキットを提供する。キットは、ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれるアッセイ用の一つ以上のプライマーセット及びプローブを含む。
【００１２】
発明の他の態様及び実行は、以下に、さらに詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ｎｕｃ−Ｓａ、ｆｅｍＡ−ＳＡ（ｆｅｍＡ−Ｓａと同一である、以下同様）、ｆｅｍＡ−Ｓｅｐｉ（ｆｅｍ−Ｓｅと同一である、以下同様）及びｍｅｃＡアッセイを含む、４回のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を示す；マルチプレックスアッセイを使用して、ＴＧ６６０４と指定された咽頭スワブ試料を解析した。
【図２】図２は、ｎｕｃ−Ｓａ、ｆｅｍＡ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−Ｓｅｐｉ及びｍｅｃＡアッセイを含む、４回のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を示す；マルチプレックスアッセイを使用して、ＴＧ６６０８と指定された咽頭スワブ試料を解析した。
【図３】図３は、ｎｕｃ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−Ｓｅｐｉ及びｍｅｃＡアッセイを含む、４回のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を示す；マルチプレックスアッセイを使用して、ＴＧ６５８８と指定された咽頭スワブ試料を解析した。
【図４】図４は、ｎｕｃ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−Ｓｅｐｉ及びｍｅｃＡアッセイを含む、４回のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を示す；マルチプレックスアッセイを使用して、ＴＧ６６０７と指定された咽頭スワブ試料を解析した。
【図５】図５は、ｎｕｃ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−Ｓｅｐｉ及びｍｅｃＡアッセイを含む、４回のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を示す；マルチプレックスアッセイを使用して、ＴＧ６７５９と指定された咽頭スワブ試料を解析した。
【図６】図６は、Ｎｕｃ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−ＳＡ、ｆｅｍＡ−Ｓｅｐｉ及びｍｅｃＡアッセイを含む、４回のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を示す；マルチプレックスアッセイを使用して、ＴＧ６７７５と指定された咽頭スワブ試料を解析した。
【図７】図７は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの混合物を含む、ＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ群の試料を解析した。
【図８】図８は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＲＳＡ及びＭＳＣＮＳの混合物を含む、ＭＲＳＡ／ＭＳＣＮＳ群の試料を解析した。
【図９】図９は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＲＳＡ及びＭＳＣＮＳの混合物を含む、ＭＲＳＡ／ＭＳＣＮＳ群の試料を解析した。
【図１０】図１０は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＳＳＡ及びＭＲＣＮＳの混合物を含む、ＭＳＳＡ／ＭＲＣＮＳ群の試料を解析した。
【図１１】図１１は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの混合物を含む、ＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ群の試料を解析した。
【図１２】図１２は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＲＳＡ及びＭＲＣＮＳの混合物を含む、ＭＲＳＡ／ＭＲＣＮＳ群の試料を解析した。
【図１３】図１３は、ｆｅｍＡ−Ｓａ、ｎｕｃ−Ｓａ、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲマルチプレックスアッセイの結果並びに増幅曲線パターンを示す；マルチプレックスアッセイを使用して、１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１の比率でＭＲＳＡ及びＭＳＣＮＳの混合物を含む、ＭＲＳＡ／ＭＲＣＮＳ群の試料を解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、その適用によって、可変の単独のアッセイの組合せを含むマルチプレックスアッセイを使用して、又は単独のアッセイを使用して、混合検体中の、ＣＮＳ菌種のＭＲＳＥ及びＭＳＳＥを含む、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するために設計されたアッセイ、方法及びキットを開示する。
【００１５】
（Ｉ）ＭＲＳＡ及び他の菌種又は菌株の検出
（ａ）ＭＲＳＡ及び他の菌種又は菌株を同定及び鑑別する分子
メチシリン感受性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）及びメチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）に加えて、ヒトにおいて一般的に見られ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの近縁種である、ＣＮＳ又はＣｏＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ））がある。多くのＣＮＳはまた、メチシリンに耐性であり（ＭＲＣＮＳ）、ＭＲＳＡと類似したＳＣＣｍｅｃ遺伝子カセット機構を保有する。ＣＮＳ菌種における例証的な例としては：Ｓ．  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｓｉｍｕｌａｎｓ及びＳ．  ｗａｒｎｅｒｉが挙げられる。具体的には、メチシリン耐性Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＭＲＳＥ）が、ＭＲＣＮＳ保菌者において最も一般的に見られるＣＮＳ菌種である。免疫無防備状態の患者において、ＭＲＣＮＳ、特にＭＲＳＥは、感染症をもたらし得、創傷感染、血液感染、医療機器感染及び呼吸器感染の共通の原因である。
【００１６】
対象は、ＭＲＳＡ感染を含む細菌感染の徴候又は症状を示し得る。しかしながら、これらの徴候又は症状は、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＲＣＮＳを診断することにおいては、信頼できるものではない。それに対し、菌種特異的若しくは菌株特異的な核酸配列、それらの配列の対立遺伝子、又は菌種特異的若しくは菌株特異的な核酸配列及びそれらの対立遺伝子の転写産物若しくは翻訳産物に由来するバイオマーカーを、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳの同定及び鑑別のために利用することは、ずっと迅速で、正確かつ情報価値がある。
【００１７】
（ｉ）菌種又は菌株特異的核酸配列
菌種又は菌株特異的配列は、菌種又は菌株に特有の配列であり、つまり、他の以前に特徴付けられている菌種又は菌株によって共有されないものである。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ菌種、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＣＮＳ又はこれらの菌株に特異的な配列に相補的な配列を含有するプローブ又はプライマーは典型的には、他の菌種又は菌株のゲノムの対応する部分には、ストリンジェントな条件下ではハイブリダイズしないだろう。特定の菌種又は菌株配列が同定された場合、プローブ又はプライマーは、配列の任意の部分に基づいて設計され得る。プローブ又はプライマーはまた、配列の全体であってもよい。特定の菌種若しくは菌株配列に従って設計されたプライマー若しくはプローブはまた、縮重型で表わされ得、又は菌株若しくは菌種の同定配列の同定を容易にする化学修飾核酸、又は任意の他の成分を含み得る。菌種又は菌株に特異的であると同定された配列の概念はさらに、その特異的な配列に対して１００％未満同一であるにもかかわらず、菌種又は菌株を特異的に検出する能力のある核酸配列を包含する。核酸配列において、Ｔ又はＵは、核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであるかに依存して、互換的に使用され得ることに留意すべきである。同定配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％未満の同一性を有する配列もやはり、その相補的配列と結合でき、かつ／又は所望の標的配列の核酸増幅を容易にすることができるのであれば、発明に包含され得る。特定の菌種若しくは菌株配列に従って設計されたプライマー若しくはプローブはまた、縮重型で表わされ得、又は菌株若しくは菌種の同定配列の同定を容易にする化学修飾核酸、又は任意の他の成分を含み得る。
【００１８】
菌種又は菌株特異的配列を同定し、それらの配列の存在を検出するためのプローブ又はプライマーを開発して、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＲＣＮＳを同定及び鑑別することが、本明細書中に開示される。本発明の一態様は、ｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを特異的に検出するために使用され得ることを開示する。本発明の別の態様は、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子もまた、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを特異的に検出するために使用され得ることを開示する。本発明の別の態様は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＣＮＳにおけるｔｕｆ遺伝子の差が使用されて、２つの近縁種が鑑別され得ることを開示する。本発明のさらに別の態様は、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉ遺伝子が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、つまり、ＭＳＳＥ又はＭＲＳＥ、を特異的に検出するために使用され得ることを開示する。本発明のさらなる態様は、ｍｅｃＡ遺伝子が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＣＮＳにおけるメチシリン／ペニシリン耐性を特異的に決定するために使用され得ることを開示する。
【００１９】
（ｉｉ）菌種又は菌株特異的核酸の対立遺伝子
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ菌種、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＣＮＳ又はこれらの菌株に特異的な配列の対立遺伝子を同定することは、この発明の別の態様である。対立遺伝子は、その位置、配列、又はそれを特定の遺伝子のある形態であると同定し得るその任意の他の特徴を理由に、それが特定の核酸のある形態であると認識され得る、その特定の核酸の任意の形態を含む。対立遺伝子は、点突然変異、サイレント突然変異、欠失、フレームシフト突然変異、一塩基遺伝子多形（ＳＮＰ）、反転、転座、異質染色体挿入（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、及び参照配列と比較してメチル化状態が異なる配列を、単独で又は組合せでのいずれかに関わらず含む遺伝子の形態を含むが、それらに限定されない。ある遺伝子の対立遺伝子は、機能性タンパク質を生成しても生成しなくてもよく；変化した機能、局在性、安定性、二量体形成、又はタンパク質−タンパク質相互作用を持つタンパク質を生成し得；過剰発現を有しているか、過小発現を有しているか又は発現を有していなくてもよく；変化した時間的又は空間的発現特異性を有し得る。対立遺伝子の存在又は非存在は、ＰＣＲに合うように設計されたプライマー及びプローブの使用、シークエンシング、ハイブリダイゼーション解析を含む、当技術分野において公知の任意のプロセスの使用を通して検出され得る。対立遺伝子はまた、突然変異又は突然変異体と呼ばれ得る。対立遺伝子は、対立遺伝子の野生型形態と呼ばれ得る別の対立遺伝子と比較され得る。場合によっては、野生型対立遺伝子は、突然変異体よりも一般的である。
【００２０】
本発明の一態様は、ｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の対立遺伝子が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを特異的に検出するために使用され得ることを規定する。本発明の別の態様は、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の対立遺伝子もまた、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを特異的に検出するために使用され得ることを規定する。本発明の別の態様は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＣＮＳにおけるｔｕｆ遺伝子の差が使用されて、２つの近縁種が鑑別され得ることを規定する。本発明のさらに別の態様は、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉ遺伝子の対立遺伝子が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、つまり、ＭＳＳＥ又はＭＲＳＥ、を特異的に検出するために使用され得ることを規定する。本発明のさらなる態様は、ｍｅｃＡ遺伝子の対立遺伝子が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＣＮＳにおけるメチシリン／ペニシリン耐性を特異的に決定するために使用され得ることを規定する。本発明はまた、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳの同定及び鑑別アッセイを開発するために使用され得る追加のＤＮＡ配列を提供する（実施例５及び配列番号１９−３０を参照のこと）。
【００２１】
（ｉｉｉ）具体的な菌種又は菌株の存在の指標としてのバイオマーカー
ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ、ＭＳＣＮＳ又は他の菌種若しくは菌株特異的核酸配列及びそれらの対立遺伝子の転写又は翻訳プロセスに由来する、小型ＲＮＡ、ぺプチド及びタンパク質を含むがそれらに限定されない分子が、特定の菌種又は菌株の存在を示すバイオマーカーとなり得る。ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ、又はＭＳＣＮＳから防御するために、免疫系によって生成される、例えば、 等のいくつかの分子もまた、バイオマーカーとなり得る。対立遺伝子を検出する方法は一般的に、ＲＮＡ又はタンパク質分子等のゲノムＤＮＡ鋳型から作成される物質の発現を評価することを含む。そのような発現は、当技術分野において現在使用されている、及びまだ開発されていない、数々の方法の任意のものによって評価され得る。
【００２２】
一度、菌株特異的遺伝子、それらの対立遺伝子又はそれらの他の核酸ベースのバイオマーカーが同定されると、試料をスクリーニングするためにプライマー及びプローブが設計されて、これらの遺伝子、対立遺伝子又はバイオマーカーの存在又は非存在が、特異的かつ選択的に検出され得、したがって、ブドウ球菌属の特定の菌種又は菌株が、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲに基づいた方法；対立遺伝子特異的ライゲーション；比較ゲノムハイブリダイゼーション；シークエンシング；及び当技術分野において公知の他の方法、を含む種々の方法を通して決定され得る。一つの例証的な例において、ＣＮＳを検出するためのアッセイにおいて使用されるプライマーを設計するために、ＣＮＳ菌種のｔｕｆ遺伝子が整列された。ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲにおけるプライマーの作用機構は、当技術分野において公知である。発明の一態様は、混合検体におけるＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを鑑別するための適用に依存して特異的なプライマーセット及びプローブを含む、種々の数のアッセイが組み合わされたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイを提供する。
【００２３】
プローブについては、それらは、単一プローブ解析又はマルチプレックスプローブ／プライマーが組み合わされたＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ解析のために使用され得る。標的配列内の選択配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブが設計され得る。一つの例証的な例において、ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ産物の検出を容易にするオリゴヌクレオチドプローブは、上流プライマー又は下流プライマーのいずれかから下流にある標的配列内の選択配列に相補的である。したがって、これらのプローブは、標的配列の増幅断片の内部配列にハイブリダイズする。
【００２４】
オリゴヌクレオチドの概念は、天然源に由来するか、人工的に合成されたか、又は組換えＤＮＡ技術の使用を通して生成されたかにかかわらず、二つ以上のヌクレオチドの任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む。ヌクレオチドとは、単独のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基である。ヌクレオチドの例としては：オリゴヌクレオチド配列の表示においてＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵと省略され得る、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルが挙げられるが、それらに限定されない。オリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチドがどのようにして使用されるかに依存する。当業者は、任意の所定の方法において、必要であるオリゴヌクレオチドのおよその長さを理解するだろう。その方法によって、オリゴヌクレオチドは、０〜１０００塩基長であり得る。他の態様において、それは５〜５００塩基長、５〜１００塩基長、５〜５０塩基長、又は１０〜３０塩基長であり得る。特定の菌種若しくは菌株配列に従って設計されたプライマー若しくはプローブはまた、縮重型で表わされ得、又は菌株若しくは菌種の同定配列の同定を容易にする化学修飾核酸、又は任意の他の成分を含み得る。オリゴヌクレオチドは、固体（必要に応じて結晶塩を含む）を含む任意の物理的剤形であり得、又は緩衝溶液等の溶液であり得る。
【００２５】
（ｂ）ＭＲＳＡ及び他の菌種又は菌株を含有し得る試料
試料にはしばしば、細菌菌種の混合物が付いてくる。ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡに加えて、ＣＮＳ、又はＣｏＮＳがある。ＣＮＳ菌種の中では、ＭＲＳＥが最も一般的にＭＲＣＮＳ保菌者において見られる菌株である。本発明は、その適用によって可変の単独のアッセイの組合せを含むマルチプレックスアッセイを使用して、試料中の、ＣＮＳ菌種のＭＲＳＥ及びＭＳＳＥを含む、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを鑑別するために設計されたプライマーセット及び／又はプローブを利用するマルチプレックスアッセイ、方法及びキットを開示する。
【００２６】
本明細書中に開示されるアッセイ、方法又はキットに供される試料は、興味の対象である細菌からの核酸を含有する疑いがあっても、疑いがなくてもよい。核酸としては、細菌から生ずるＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は任意の他の天然起源の若しくは人工的な核酸分子が挙げられるが、それらに限定される必要はない。試料が、細菌感染の症状を呈する対象由来、又は細菌が風土性であると考えられる地域からの環境試料由来、又はＭＲＳＡ若しくはＭＲＳＥを含むことが発見された病院若しくは他の環境に最近居合わせた対象由来である場合、それらの試料は、細菌を含有する疑いがあり得る。対象は、ＭＲＳＡ感染の徴候又は症状を呈し得、徴候又は症状としては、皮膚上の赤く、腫れてかつ有痛性の領域、その部位からの膿若しくは他の体液の排液、発熱、皮膚膿瘍、感染領域の周囲の温感、胸痛、悪寒、咳、疲労、倦怠感、頭痛、筋肉痛、発疹及び息切れが挙げられる。
【００２７】
試料は、土壌、大気、水、固体面（天然であるか人工的であるかに関わらず）、培地、食料品、医学的手順及び／又は身体の装飾手順（入れ墨針又はボディピアス針等）において使用される装置を含む装置、を含むが、それらに限定されない、細菌又は細菌の任意の部分が発見され得るどこにでも由来し得る。そのうえ、試料は、対象由来であってもよく、又は農業、環境若しくは任意かつ全ての他の供給源由来であってもよい。
【００２８】
対象は、植物；ヒト、伴侶動物（イヌ、ネコ、トリ又は小哺乳類等）、家畜動物（ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽類等）及び他の任意の家畜化された動物又は野生動物を含むが、それらに限定されない動物、等の、細菌に感染し得る任意の生物体であり得る。対象由来の試料としては、全ての形態の核酸の収集物、前立腺、乳房、皮膚、筋肉、顔面、脳、子宮内膜、肺、頭頚部、膵臓、小腸、血液、肝臓、精巣、卵巣、大腸、皮膚、胃、食道、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、胎盤若しくは胎児のバイオプシー又は他のインビボ解析又はエクスビボ解析の収集物が挙げられるが、それらに限定されない。対象由来の試料はまた、末梢血、リンパ液、腹水、漿液、胸水、痰、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、脳脊髄液、精液、羊水、涙液、便、尿、毛又は細菌若しくは細菌の任意の部分が存在するかもしれない任意の他の供給源、等の液体試料の形態をとり得る。
【００２９】
試料は、領域若しくは開口部を拭いとる若しくはふき取る方法、バイオプシーにおけるように組織の小片の除去、体液を採取するための任意の公知の方法、ある表面をふく方法、液体試料を採取する方法、大気試料を採取する方法又は解析用のＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはタンパク質等の生体物質を保存するような方法で細菌を採取するのに使用され得る任意の他の方法を含む、任意かつ全ての現在公知である、又はまだ開示されていない方法によって採取され得る。
【００３０】
（ｃ）好ましい実施態様
表Ａに示されるように、本発明の一つの好ましい実施態様において、配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種が鑑別され得るように、ｎｕｃ遺伝子を保有するＳ．  ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列に選択的である。
【００３１】
一つの好ましい実施態様において、配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種が鑑別され得るように、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列に選択的である。
【００３２】
一つの好ましい実施態様において、配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３は、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ及び他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種が鑑別され得るように、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉ遺伝子を保有するＳ．  ｅｐｉ特異的核酸配列に選択的である。
【００３３】
一つの好ましい実施態様において、配列番号１０及び１１よって表わされるプライマーセット４は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓが検出され得るように、ｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列に選択的である。
【００３４】
一つの好ましい実施態様において、配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５は、ＣＮＳが検出され得るように、ｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子を保有するＣＮＳ特異的核酸配列に選択的である。
【００３５】
さらに別の好ましい実施態様において、配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６は、メチシリン及びペニシリン耐性表現型が鑑別され得るように、メチシリン又はペニシリン耐性に選択的であり、この表現型は、ｍｅｃＡ遺伝子を保有する核酸配列の存在又は非存在によって決定される。
【００３６】
また別の好ましい実施態様において、配列番号３によって表わされるプローブ１は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種が鑑別され得るように、ｎｕｃ遺伝子を保有するＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列に選択的である。
【００３７】
一つの好ましい実施態様において、配列番号６によって表わされるプローブ２は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種が鑑別され得るように、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列に選択的である。
【００３８】
一つの好ましい実施態様において、配列番号９によって表わされるプローブ３は、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが鑑別され得るように、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉ遺伝子を保有するＳ．  ｅｐｉ特異的核酸配列に選択的である。
【００３９】
一つの好ましい実施態様において、配列番号１２よって表わされるプローブ４は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓが検出され得るように、ｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子を保有するＳ．  ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列に選択的である。
【００４０】
さらに別の好ましい実施態様において、配列番号１５によって表わされるプローブ５は、ＣＮＳが検出され得るように、ｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子を保有するＣＮＳ特異的核酸配列に選択的である。
【００４１】
また別の好ましい実施態様において、配列番号１８によって表わされるプローブ６は、メチシリン及びペニシリン耐性表現型が鑑別され得るように、メチシリン又はペニシリン耐性に選択的であり、この表現型は、ｍｅｃＡ遺伝子を保有する核酸配列の存在又は非存在によって決定される。
【００４２】
プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドは、逐次合成、固相合成、又は現在公知若しくはまだ開示されていない任意の他の合成方法を含む数々の方法の任意のものによって、化学的に合成され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、組換えＤＮＡベースの方法によって生成され得る。当業者は、特定の課題を実施するために必要なオリゴヌクレオチドの長さを理解するだろう。
【００４３】
【表１】
2013535951.tif 000002
【００４４】
（ＩＩ）ＭＲＳＡ及び他の菌種又は菌株の検出方法
菌株特異的核酸、菌株特異的核酸の対立遺伝子及び菌株特異的核酸並びにそれらの対立遺伝子の転写及び翻訳産物由来のバイオマーカーを同定するのに使用される方法としては、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法、シークエンシング及び上記方法の任意の組合せが挙げられる。
【００４５】
核酸は、手動の方法、機械的な方法、又はそれらの任意の組合せを含む、数々の方法の任意のものによって試料へ添加され得る。対立遺伝子の存在は、特定の核酸配列の増幅、ネイティブ核酸若しくは増幅核酸のシークエンシング、又は核酸に結合したか若しくは核酸から放出されたかのいずれかの標識の検出を含む、数々の方法の任意のものによって示され得る。試料への核酸の添加はまた、核酸が特異性を有する標的対立遺伝子が存在しない試料への核酸の添加も包含する。
【００４６】
（ａ）ＰＣＲ
核酸は、試料中に含有される鋳型核酸から選択的かつ特異的に増幅され得る。いくつかの核酸増幅方法において、コピーは、指数関数的に作出される。当技術分野において公知の非限定的な核酸増幅方法としては：ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼでの増幅、φ２９等の酵素での全ゲノム増幅、全ゲノムＰＣＲ、クレノー若しくは任意の他のＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写、又は所望される配列のコピーが作出される任意の他の方法、が挙げられる。
【００４７】
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）は、鋳型ＤＮＡを増幅する効率性の高い方法であり、核酸試料の混合、鋳型ＤＮＡを認識するように設計された二つ以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ又はＰｆｕ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり得る）及びデオキシリボースヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｄＮＴＰ）を一般的に含む。逆転写ＰＣＲ、定量逆転写ＰＣＲ及び定量リアルタイム逆転写ＰＣＲは、ＰＣＲの他の具体的な例である。一般に、反応混合物は、変性段階（典型的には８０〜１００℃）、プライマーの融解温度（Ｔｍ）及びプライマーの縮重度に基づいて選択された温度を持つアニーリング段階、並びに伸長段階（例えば４０〜７５℃）を含む温度サイクルへ供される。リアルタイムＰＣＲ解析においては、増幅ＤＮＡの濃度に比例して蛍光の大きさの測定を可能とする、追加の試薬、方法、光学検出系及び当技術分野において公知である装置、が使用される。そのような解析において、増幅された鎖中への蛍光色素の取込みが、検出又は測定され得る。
【００４８】
あるいは、ＰＣＲのアニーリング期の間に特異的な配列に結合する標識プローブが、プライマーと共に使用され得る。標識プローブは、蛍光レベルが検出又は測定され得るように、伸長期の間に、それらの蛍光タグを放出する。一般的に、プローブは、上流又は下流プライマーのいずれかの下流にある標識配列内の配列に相補的である。プローブは、一つ以上の標識を含み得る。標識は、機械、検出器、感知器、装置、又は増強された若しくは増強されていないヒトの目が、非標識組成物から標識組成物を鑑別する助けをする能力のある任意の物質であり得る。標識の例としては：放射性同位元素若しくはそれらのキレート、色素（蛍光又は無蛍光）、染色、酵素、又は非放射性金属が挙げられるが、それらに限定されない。具体的な例としては：フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、ビオチン、ストレプトアビジン、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ若しくは放射線を放射する能力のある任意の他の化合物、ローダミン、４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（「Ｄａｂｃｙｌ」）；４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）スルホン酸（塩化スルホニル）（「Ｄａｂｓｙｌ」）；５−（（２−アミノエチル）−アミノ）−ナフタレン−１−スルホン酸（「ＥＤＡＮＳ」）；ソラレン誘導体、ハプテン、シアニン、アクリジン、蛍光ロードール誘導体、コレステロール誘導体；エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）及びその誘導体、又は分別して検出され得る任意の他の化合物、が挙げられるが、それらに限定されない。標識はまた、遺伝子型判定における使用のために最適化された一つ以上の蛍光色素を含み得る。そのような色素の例としては：ＣＡＬ−Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ−Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ｄＲ１１０、５−ＦＡＭ、６ＦＡＭ、ｄＲ６Ｇ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ｄＴＡＭＲＡ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ、ｄＲＯＸ、ＰＥＴ、ＢＨＱ＋、Ｇｏｌｄ５４０及びＬＩＺが挙げられるが、それらに限定されない。ＰＣＲは、標的物の増幅の判断を容易にする。
【００４９】
上記のとおり、プライマーか又はプローブと一緒のプライマー、のいずれかは、初期試料中に存在する特異的な鋳型ＤＮＡの量の定量化を可能とするだろう。また、ＲＮＡは、まず逆転写酵素を通してＲＮＡからＤＮＡ鋳型を作製することによって、ＰＣＲ解析によって検出され得る。発明のいくつかの態様において、対立遺伝子は、試料の遺伝子型判定解析を容易にする定量ＰＣＲ解析によって検出され得る。
【００５０】
例証的な例としては、ＤｉＣｅｓａｒｅに与えられた米国特許第５，７１６，７８４号において、ＰＣＲ反応における二重標識オリゴヌクレオチドプローブの使用が開示されている。本発明のマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ反応のＰＣＲ工程において、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブは、隣接するオリゴヌクレオチドプライマー間の標的核酸に、ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間に結合する。オリゴヌクレオチドプローブの５’末端は、エネルギー移行ドナーフルオロフォア（レポーター蛍光体（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｆｌｕｏｒ））を含有し、３’末端は、エネルギー移行アクセプターフルオロフォア（クエンチング蛍光体）を含有する。インタクトなオリゴヌクレオチドプローブにおいては、３’クエンチング蛍光体が、５’レポーター蛍光体の蛍光を消光させる。しかしながら、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸に結合している時、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の、ＤＮＡポリメラーゼの、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、増幅工程の間、結合した標識オリゴヌクレオチドプローブを効率的に消化するだろう。オリゴヌクレオチドプローブの消化は、３’クエンチング蛍光体の阻止効果から、５’レポーター蛍光体を分離させる。レポーター蛍光体による蛍光の出現は、反応の間に検出及びモニタリングされ、検出された蛍光の量は、放出された蛍光産物の量に比例する。検出に適した器具としては、アプライドバイオシステムズ（商標）７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲプラットフォーム及びロシュ社の４８０  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、９６ウェルの反応プレートを使用するＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００シークエンス検出器又は９６００エミュレーション・モードにおけるＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００若しくは９７００に続くＡＢＡ  Ｐｒｉｓｍシークエンス検出器若しくはＴＡＱＭＡＮ  ＬＳ−５０Ｂ  ＰＣＲ検出系における解析、が挙げられる。標識プローブによって容易になったマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲはまた、マルチプレックス能を有する他のリアルタイムＰＣＲ系においても実施され得る。
【００５１】
マルチプレックスＰＣＲアッセイにおいて、複数の試料間の遺伝子の定常状態ｍＲＮＡレベルにおける変化を決定し、ｍＲＮＡレベルを、内部標準ＲＮＡのレベル（基準）に関連して決定するために、相対定量がしばしば使用される。コントロールＲＮＡは、マルチプレックスアッセイにおいて同一のチューブ中で共増幅され得、又は別々のチューブ中で増幅され得る。一般的にコントロールＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子、又は構成的発現をする遺伝子、又は濃度が知られた標準物質であり得る。しかしながら、相対定量においては、濃度が知られた標準物質は必要とされず、基準は、その配列が公知である限り、任意の転写物であり得る。相対定量は、標的遺伝子の発現レベル対一つ以上の基準遺伝子の発現レベルに基づいており、多くの実験において、相対定量は遺伝子発現レベルにおける生理学的変化を検討するのに十分である。適当な基準遺伝子に関連する標的遺伝子の発現を計算するために、種々の数学的モデルが確立されている。計算は、例えば、一定レベルの蛍光でのクロッシングポイント（ＣＰ）及びサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅ）（Ｃｔ）；又は確立された数学アルゴリズムに従ったＣＰの取得、等の、種々の方法によって決定された別個のサイクルの比較に基づく。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣｔ値のためのアルゴリズムは、各ＰＣＲ増幅が有意な閾値に達するサイクルを計算する。計算されたＣｔ値は、試料中に存在する標的のコピー数と比例し、Ｃｔ値は、任意の試料中に見られる標的のコピーの正確な定量測定値である。換言すれば、Ｃｔ値は、プライマーセットが認識するように設計されたそれぞれの標的の存在を表わす。試料中に標的がない場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応において増幅は起こらないはずである。
【００５３】
あるいは、Ｃｐ値が利用され得る。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最も高く、ＰＣＲの対数増幅期が開始するサイクルを表わす。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアは、全体の増幅曲線の二次導関数を計算し、この値が最高値である個所を決定する。二次導関数アルゴリズムを使用することによって、蛍光が相対的に低い場合でも、得られたデータはより信頼できかつ再現可能である。
【００５４】
（ｂ）ハイブリダイゼーション法
ＰＣＲに加えて、遺伝子型判定解析はまた、興味の対象である核酸配列にハイブリダイズする能力のあるプローブを使用して実施され得る。プローブは、核酸、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、タンパク質、タンパク質複合体、接合体、天然のリガンド、小分子、ナノ粒子、又は上記の一つ以上を含む分子の任意の組合せ、又は任意の対立遺伝子に特異的に結合する能力のある任意の他の分子実体（そのような分子実体が現在実在するか、まだ開示されていないかにかかわらず）、を含み得る。発明の一態様において、プローブはオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの記載は、第Ｉ（ｉｉ）節中にある。
【００５５】
遺伝子又は対立遺伝子の検出方法は一般的に、それらの発現レベルを、ＲＮＡ又はタンパク質分子等のそれらの転写産物又は翻訳産物を通して評価することを含む。遺伝子又は対立遺伝子の発現は、当技術分野において現在使用されている及びまだ開発されていない数々の方法のうちの任意のものによって評価され得る。例としては、以下の非限定的な例を含む、任意の核酸検出方法が挙げられる：マイクロアレイ解析、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ、ノザンブロット。他の例としては、以下の非限定的な例を含む、抗体を使用する発現検出の任意のプロセスが挙げられる：フローサイトメトリー、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ノースウェスタンブロット及びイムノアフィニティクロマトグラフィ。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル又は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ファージディスプレイ抗体、ペプチボディ、多選択性リガンド若しくは標的に特異的結合をする任意の他の試薬のような、任意の抗体断片であり得る。他のタンパク質発現の評価方法としては、以下の非限定的な例が挙げられる：ＨＰＬＣ、質量分析法、プロテインマイクロアレイ解析、ＰＡＧＥ解析、等電点電気泳動、２−Ｄゲル電気泳動及び酵素アッセイ。
【００５６】
発明のいくつかの態様において、対立遺伝子の存在は、ＤＮＡチップなどのマイクロアレイ上のプローブへの結合によって立証され得る。ＤＮＡチップの例としては、数々の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブがシリコンガラス等の固体基質に付着されたチップ、が挙げられる。ある対立遺伝子に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドは、その特定の対立遺伝子と一つ以上のヌクレオチドにおいて異なる対立遺伝子を除外して、そのある対立遺伝子に特異的に結合する能力がある。標識された試料ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、標識の検出は試料の結合、したがって、試料中の対立遺伝子の存在、と相関する。
【００５７】
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション法において、多型部位にあり得る全てのバリエーションを表わすオリゴヌクレオチド配列がチップ上に含まれる。チップ及び試料は、標識された試料ＤＮＡが、正確な配列の一致を有するオリゴヌクレオチドのみに結合するであろう条件下に供される。対立遺伝子特異的プライマー伸長において、付着されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、チップにハイブリダイズされた試料ＤＮＡは合成鋳型として使用され得る。この方法下では、添加されるｄＮＴＰのみが標識される。標識されたｄＮＴＰの取込みは次いで、対立遺伝子の存在を示すシグナルとして役立つ。蛍光標識は、ＤＮＡチップ上の少なくとも４つの異なる蛍光標識を読み取るように構成された数々の機器のうちの任意のものによって検出され得る。別の選択肢において、オリゴヌクレオチドに付加された最後のｄＮＴＰの正体は、質量分析によって評価され得る。この選択肢において、ｄＮＴＰは、公知の分子量を持つ標識で標識されていてもよいが、その必要はない。
【００５８】
核酸プローブは、基質に付着されていてもよい。あるいは、試料が基質に付着されていてもよい。プローブ又は試料は、基質に共有結合していてもよく、又は静電結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、若しくはオリゴヌクレオチドプローブ等のプローブが、それらが特異性を有する対立遺伝子を認識するその能力を保持しつつ基質に付着され得る任意の他の相互作用、を含む、何らかの非共有的な相互作用によって結合され得る。基質は、プローブが、単独か又はマイクロアレイにおいて例証されるように、一つ以上の追加のプローブ若しくは試料の存在下、のいずれかでその基質上に付着され得る、任意の固体又は半固体の物質であり得る。基質物質の例としては、ポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル若しくは任意の他のプラスチック、ガラス、二酸化ケイ素若しくは他のシラン化合物、ヒドロゲル、金、プラチナ、マイクロビーズ、ミセル及び他の脂質構造、ニトロセルロース、又はナイロン膜、が挙げられるが、それらに限定されない。基質は、球状のビーズ又は平面を含む、任意の形態をとり得る。例えば、プローブは、アレイ又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ反応の場合には、基質に結合され得る。サザンブロットの場合には、試料が基質に結合され得る。
【００５９】
核酸プローブは、標識を含み得る。標識は、機械、検出器、感知器、装置、又は増強された若しくは増強されていないヒトの目が、非標識組成物から標識組成物を鑑別する助けをする能力のある任意の物質であり得る。標識の例としては：放射性同位元素若しくはそれらのキレート、色素（蛍光又は無蛍光）、染色、酵素、又は非放射性金属が挙げられるが、それらに限定されない。具体的な例としては：フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、ビオチン、ストレプトアビジン、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ若しくは放射線を放射する能力のある任意の他の化合物、ローダミン、４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（「Ｄａｂｃｙｌ」）；４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）スルホン酸（塩化スルホニル）（「Ｄａｂｓｙｌ」）；５−（（２−アミノエチル）−アミノ）−ナフタレン−１−スルホン酸（「ＥＤＡＮＳ」）；ソラレン誘導体、ハプテン、シアニン、アクリジン、蛍光ロードール誘導体、コレステロール誘導体；エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）及びその誘導体、又は分別して検出され得る任意の他の化合物、が挙げられるが、それらに限定されない。標識はまた、遺伝子型判定における使用に最適化された一つ以上の蛍光標識を含み得る。そのような色素の例としては：ｄＲ１１０、５−ＦＡＭ、６ＦＡＭ、ｄＲ６Ｇ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ｄＴＡＭＲＡ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ、ｄＲＯＸ、ＰＥＴ、ＢＨＱ＋、Ｇｏｌｄ５４０及びＬＩＺが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６０】
（ｃ）シークエンシング
遺伝子又は対立遺伝子の存在を検出する方法はさらに、サンガー、次世代シークエンシング、ピロシークエンシング、ＳＯＬＩＤシークエンシング、大量並列シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、プール化ＤＮＡシークエンシング及びバーコードＤＮＡシークエンシング、又は現在公知若しくはまだ開示されていない任意の他のシークエンシング方法を含む、ＤＮＡシークエンシングの任意の形態；又は試料中の特定の核酸配列の検出をすることができる、若しくはある核酸と一つ以上のヌクレオチドにおいて異なる別の核酸からの最初の核酸の鑑別を可能にする任意の他の方法、又はこれらの任意の組合せ、を含むが、それらに限定されない。
【００６１】
サンガーシークエンシングにおいて、一本鎖ＤＮＡ鋳型、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド及びヌクレオチド塩基と接合した放射性標識又はプライマーと接合した蛍光標識等の標識並びにジデオキシヌクレオチドを含む一つの鎖停止塩基（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ又はｄｄＴＴＰ）が４つの反応の各々に添加される（各鎖停止塩基につき一つの反応）。配列は、結果として生じた鎖の電気泳動によって決定され得る。ダイターミネイターシークエンシングにおいて、各鎖停止塩基は、シークエンシングを単一の反応中で実施することができるような、異なる波長の蛍光標識で標識されている。
【００６２】
ピロシークエンスにおいて、配列決定されるべき一本鎖鋳型へのポリメラーゼによる塩基の付加は、ヌクレオチドの取込みにあたり、ピロリン酸の放出をもたらす。ＡＴＰスルフリラーゼ酵素が、ピロリン酸をＡＴＰへと変換し、それは順に、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換を触媒し、それが次にカメラによって検出される可視光の作出をもたらす。
【００６３】
ＳＯＬＩＤシークエンスにおいて、配列決定されるべき分子は、断片化され、アダプター配列、あるいはバーコード配列、を持つクローナルな磁気ビーズ（ここで、各ビーズは、単一断片の複数のコピーに接合されている）の集合を調製するのに使用される。ビーズは、ガラス表面に結合されている。次いで、２塩基コード化を通して、シークエンシングが実施される。
【００６４】
大量並列シークエンスにおいて、無作為に断片化された標的ＤＮＡが、ある表面へと付着される。断片は、伸長され、ブリッジ増幅されて、各々が単一断片の配列の複数のコピーを有するクラスターを持つフローセルが作製される。鋳型は、並列に断片を合成することによって配列決定される。塩基は、断片への特定の塩基の付加に相関する、蛍光色素の放出によって示される。
【００６５】
（ｄ）好ましい実施態様
例証的な実施態様の群が、表Ａに示される。本発明は、一実施態様において、配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１並びに／又は配列番号３によって表わされるプローブ１を適用するアッセイ１−ｎｕｃ−Ｓａアッセイが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種を同定及び鑑別するために実行され得ることを規定する。
【００６６】
別の実施態様において、配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２並びに／又は配列番号６によって表わされるプローブ２を適用するアッセイ２−ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種を同定及び鑑別するために実行され得る。
【００６７】
一実施態様において、配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３並びに／又は配列番号９によって表わされるプローブ３を適用するアッセイ３−ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイは、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを同定及び鑑別するために実行され得る。
【００６８】
一実施態様において、配列番号１０及び１１によって表わされるプライマーセット４並びに／又は配列番号１２によって表わされるプローブ４を適用するアッセイ４−ｔｕｆ−Ｓａアッセイは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを同定するために実行され得る。
【００６９】
一実施態様において、配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５並びに／又は配列番号１５によって表わされるプローブ５を適用するアッセイ５−ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイは、ＣＮＳを同定するために実行され得る。
【００７０】
一実施態様において、配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６並びに／又は配列番号１８によって表わされるプローブ６を適用するアッセイ６−ｍｅｃＡアッセイは、メチシリン及びペニシリン耐性表現型を同定及び鑑別するために実行され得る。
【００７１】
一つの好ましい実施態様において、上記のｔｕｆ−Ｓａアッセイ（アッセイ４）及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ（アッセイ５）を、両方のプライマーセット及びプローブを一つのＲＴ−ＰＣＲ反応中に適用することによって組み合わせたマルチプレックスアッセイ−ｔｕｆディファレンシャルマルチプレックスアッセイ、がＳ．  ａｕｒｅｕｓ及びＣＮＳを鑑別するために使用され得る。
【００７２】
試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ又はＭＳＳＥを同定及び鑑別するための別の好ましいマルチプレックスアッセイは、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ（アッセイ３）；ｍｅｃＡアッセイ（アッセイ６）；並びにｎｕｃ−Ｓａアッセイ（アッセイ１）及びｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ（アッセイ２）から選ばれる少なくとも一つのアッセイ、を含む。
【００７３】
試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのさらに別の好ましいマルチプレックスアッセイは、ｍｅｃＡアッセイ（アッセイ６）と、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ（アッセイ３）、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ（アッセイ４）及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ（アッセイ５）から選ばれる二つのアッセイとを含む。
【００７４】
マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲアッセイにおけるアッセイの組合せは、一つのＲＴ−ＰＣＲ反応において、それぞれ複数のプライマーセット及び／又はプローブを適用することを通してである。マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲアッセイは、たとえいくつかのアッセイが目的において重複しているが検証ツールとして役立つ場合でも、任意の数又は任意の組合せの個々のアッセイを含み得る。
【００７５】
いくつかの他の実施態様において、本明細書中に開示される個々のアッセイ（アッセイ１〜６）はまた、別々に実行され得るが、しかしこれらの個々のアッセイの結果は、内部標準での標準化後に、重ね書きされて比較可能となり得る。
【００７６】
（ＩＩＩ）キット
発明のまた別の態様は、試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのキットを包含する。好ましい実施態様において、キットは、ｎｕｃ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ、ｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ及びｍｅｃＡアッセイから選ばれるアッセイ用の、一つ以上のプライマーセット及びプローブを含む。前記の節及び表Ａにおいて詳しく記載されているとおり：配列番号１及び２によって表わされるプライマーセット１、並びに／又は配列番号３によって表わされるプローブ１を適用することによって、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及び他の菌種を同定及び鑑別するｎｕｃ−Ｓａアッセイ；配列番号４及び５によって表わされるプライマーセット２、並びに／又は配列番号６によって表わされるプローブ２を適用することによって、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及び他の菌種を同定及び鑑別するｆｅｍＡ−Ｓａアッセイ；配列番号７及び８によって表わされるプライマーセット３、並びに／又は配列番号９によって表わされるプローブ３を適用することによって、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌種からＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを同定及び鑑別するｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ；配列番号１０及び１１によって表わされるプライマーセット４、並びに／又は配列番号１２によって表わされるプローブ４を適用することによって、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを同定するｔｕｆ−Ｓａアッセイ；配列番号１３及び１４によって表わされるプライマーセット５、並びに／又は配列番号１５によって表わされるプローブ５を適用することによって、ＣＮＳを同定するｔｕｆ−ＣＮＳアッセイ；並びに配列番号１６及び１７によって表わされるプライマーセット６、並びに／又は配列番号１８によって表わされるプローブ６を適用することによって、メチシリン及びペニシリン耐性表現型を同定及び鑑別するｍｅｃＡアッセイ。
【００７７】
マルチプレックスアッセイは、ｎｕｃ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、ｔｕｆ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子、ｔｕｆ−ＣＮＳ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子から選ばれる少なくとも一つの他の標的配列の存在又は非存在を検出するために、プライマーセット又はプローブ又は両方が適用される、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション法及びそれらの任意の組合せから選ばれる解析の種類である。それぞれの標的遺伝子を検出するアッセイは、複数の別々の反応系において個々に、又はＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション法若しくはそれらの任意の組合せのための、一つの、組み合わされ、かつ混合された反応系において、実行され得る。
【００７８】
一つの好ましい実施態様において、キットは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＣＮＳを鑑別するためにｔｕｆ−Ｓａアッセイ及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイを、両方のプライマーセット及び／又はプローブを一つのＲＴ−ＰＣＲ反応中に適用することによって組み合わせた、ｔｕｆディファレンシャルマルチプレックスアッセイ等のマルチプレックスアッセイ用のプライマーセット及びプローブを含む。
【００７９】
一つの好ましい実施態様において、マルチプレックスアッセイによって試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのキットは、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｍｅｃＡアッセイ用のプライマーセット及びプローブ並びにｎｕｃ−Ｓａアッセイ及びｆｅｍＡ−Ｓａアッセイから選ばれる少なくとも一つの他のアッセイ用のプライマーセット及びプローブ、を含む。
【００８０】
さらに別の好ましい実施態様において、マルチプレックスアッセイによって試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのキットは、ｍｅｃＡアッセイと、ｆｅｍＡ−Ｓｅアッセイ、ｔｕｆ−Ｓａアッセイ及びｔｕｆ−ＣＮＳアッセイから選ばれる二つの他のアッセイ用のプライマーセット及びプローブとを含む。
【００８１】
核酸ベースのアッセイを容易にするキットはさらに、以下の一つ以上を含み得る：核酸抽出試薬、コントロール、使い捨てカートリッジ、標識試薬、ＤＮＡポリメラーゼのＴａｑ若しくはＰｆｕ等のＰＣＲ増幅試薬、逆転写酵素又は一つ以上の他のポリメラーゼを含む酵素、逆転写酵素及び／又はハイブリダイゼーションを容易にする試薬。
【００８２】
別の実施態様において、キットはさらに、プライマー又はプローブオリゴヌクレオチドを標識するために使用され得る標識を含み得る。標識は、機械、検出器、感知器、装置、又は増強された若しくは増強されていないヒトの目が、発現の減少を示す試料から陽性の発現を示す試料を鑑別する助けをする能力のある任意の物質であり得る。標識の例としては：放射性同位元素若しくはそれらのキレート、色素（蛍光又は無蛍光）、染色、酵素、又は非放射性金属が挙げられるが、それらに限定されない。具体的な例としては：フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、ビオチン、ストレプトアビジン、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ若しくは放射線を放射する能力のある任意の他の化合物、ローダミン、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（「Ｄａｂｃｙｌ」）；４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）スルホン酸（塩化スルホニル）（「Ｄａｂｓｙｌ」）；５−（（２−アミノエチル）−アミノ）−ナフタレン−１−スルホン酸（「ＥＤＡＮＳ」）；ソラレン誘導体、ハプテン、シアニン、アクリジン、蛍光ロードール誘導体、コレステロール誘導体；エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）及びその誘導体、又は標識核酸の存在を知らせる任意の他の化合物、が挙げられるが、それらに限定されない。発明の一実施態様において、標識は、遺伝子型判定における使用のために最適化された一つ以上の色素を含む。そのような色素の例としては：ｄＲ１１０、５−ＦＡＭ、６ＦＡＭ、ｄＲ６Ｇ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ｄＴＡＭＲＡ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ、ｄＲＯＸ、ＰＥＴ、ＢＨＱ＋、Ｇｏｌｄ５４０及びＬＩＺが挙げられるが、それらに限定されない。
【００８３】
さらに別の実施態様において、キット中のプライマー及びプローブは、標識されていてもよく、ＰＣＲ、シークエンシング反応、又はオリゴヌクレオチドアレイ等の固体基質への結合において、標識のプロセスを経ず適用され得る。
【００８４】
試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのキットはまた、使用のための説明書を含み得る。一実施態様において、キットはさらに、キットによって提供されるアッセイのアウトプットを特定の結果と関連付ける指標を含み得る。例えば、指標は、一つ以上の配列の存在又は非存在と、特定の細菌の門、綱、目、科、属種、亜種、菌株、又は細菌群の任意の他の叙述の同定と、を関係づける指針を提供し得る。指標は、試料中に存在する細菌の量を定量化するように設定された標準曲線を含有し得る。アッセイのアウトプットは、特定の配列、特定の遺伝子型、リアルタイム定量ＰＣＲ反応における特定のΔＣｔレベル、蛍光若しくは放射性崩壊のレベル、標準曲線又は陽性コントロール若しくは陰性コントロールから導き出した値、又はこれら及び他のアウトプットの任意の組合せの形態であり得る。指標は、キット中に含まれ得る文書上に印刷されていてもよく、又はインターネット上に掲出されているか、若しくはソフトウェアパッケージ中に組み込まれていてもよい。文書は、顕微鏡写真又は増幅プロット等の結果の、図面による描写を含み得る。
【００８５】
試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するためのキットはさらに、試料を採取するために使用される装置を含み得る。そのような装置としては：スワブ、針、採血管、ワイプ又は患者若しくは環境から生体試料を採取するために使用され得る現在公知若しくはまだ開示されていない任意の他の器具：が挙げられ得るが、それらに限定されない。
【実施例】
【００８６】
実施例
以下の実施例は、発明の一定の態様を説明する。
【００８７】
実施例１−特異性及び選択性
本発明は、適用によって、４つまでのアッセイの特異的な組合せ使用して、混合検体中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ、ＭＳＳＥ、ＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳを鑑別するように設計されたリアルタイムＰＣＲアッセイを開示する。細菌の単離物のパネルを使用した、個々のアッセイの成績を、表２〜６に示す。全てのアッセイは、高感度かつ高特異的であることが示されている。ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡを同定するためのアッセイがスクリーニングアッセイに含まれている。ＭＳＳＡ感染は一般的に、処置が簡単である一方、それらは院内感染における重要な要因のままである。また、ＭＲＳＡ又はＭＳＳＡのいずれかの定着は、感染症のリスクを増大させることが示されている。ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ及びＣｏＮＳアッセイが診断アッセイに含まれており、それは、それら全てが外科感染症、菌血症及び埋込装置感染症における主因であり、またＭＲＣＮＳ及びＭＳＣＮＳの両方が深刻化する問題となっているためである。
【００８８】
これらのアッセイは、ＭＲＳＡを同定するために組合わされて使用され得、ｎｕｃ及びｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子をマーカーとして使用してＳ．  ａｕｒｅｕｓを検出し、ｔｕｆ遺伝子をマーカーとして使用してコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）からＳ．  ａｕｒｅｕｓを鑑別し、ｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉ遺伝子をマーカーとして使用してＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを除外し、かつｍｅｃＡ遺伝子をマーカーとして使用してメチシリン／ペニシリン耐性を決定し得る。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌については、ＣＮＳを検出するためにアッセイにおいて使用されるプライマーを設計するために、ＣＮＳ菌種のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓ．  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．  ｓａｐｒｏｐｈｉｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｓｉｍｕｌａｎｓ及びＳ．  ｗａｒｎｅｒｉのｔｕｆ遺伝子からの配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５によって表わされるプライマーを整列させた（表１及び表５）。配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を使用するアッセイは、列挙されたＣＮＳ菌種の任意のものにおけるｔｕｆ遺伝子を検出し得る。
【００８９】
【表２】
2013535951.tif 000003
【００９０】
【表３】
2013535951.tif 000004
【００９１】
【表４】
2013535951.tif 000005
【００９２】
【表５】
2013535951.tif 000006
【００９３】
【表６】
2013535951.tif 000007
【００９４】
【表７】
2013535951.tif 000008
【００９５】
開示されたアッセイは、上記の表中に示されている通り、以下のものを含む：（１）配列番号４、配列番号５、配列番号６によって表わされるプライマーを使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種を検出するためのｆｅｍＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓアッセイ（表２）；（２）配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表わされるプライマーを使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、ＣＮＳ及び他の菌種を検出するためのｎｕｃアッセイ（表３）；（３）配列番号４、配列番号５及び配列番号６によって表わされるプライマーを使用して、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを検出するためのｆｅｍＡ−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓアッセイ（表４）；（４）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２を使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを検出する、又は配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５によって表わされるプライマーを使用して、ＣＮＳを検出するためのｔｕｆディファレンシャルマルチプレックスアッセイ（表５）；並びに（５）配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８によって表わされるプライマーを使用して、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するためのｍｅｃＡアッセイ（表６）。
【００９６】
また、より広範なＣｏＮＳアッセイを使用して、ＣｏＮＳアッセイの成績を以下の表７Ａ〜Ｄ中に反映した。
【００９７】
【表８】
2013535951.tif 000009
【００９８】
【表９】
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【００９９】
【表１０】
2013535951.tif 000011
【０１００】
【表１１】
2013535951.tif 000012
【０１０１】
表２〜７中に示された上記アッセイは、個々に、任意の互いの組合せで、又は追加のアッセイと一緒に使用されて、試料中にＭＲＳＡが存在するか否かが確認され得る。これは、全てのアッセイの、別々の実施、単一のＰＣＲのランにおける実施、単一のシークエンシング反応における実施、単一のアレイ上での実施、又は現在公知の若しくはまだ開示されていない任意の他の組合せにおける実施、を含む。これらのアッセイにおいて試験される菌種としては、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．  ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓ．  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓ．  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．  ｋｌｏｏｓｉ、Ｓ．  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｓ．  ｃｈｏｎｉｉ及びＳ．  ａｒｌｅｔｔａｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
実施例２−ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＥ及びＭＳＳＥ（それらの混合物を含む）を鑑別するディファレンシャルＣｔ値
類似した効率を持つ複数のアッセイを用いると、相対Ｃｔ値の使用を通してｍｅｃＡ遺伝子はＳＡ又はＣｏＮＳのいずれかと関連付けられ得る。図１〜６中に図示される増幅プロットは、結果をもたらすためにアッセイの増幅がどのように結び付けられるかを示す。これらのプロット例を作成するために使用した検体は；咽頭スワブ、鼻腔スワブ又は痰；の５０の呼吸器検体の残物のコホートであった。結果は、培養結果とＰＣＲ結果との間で、強い相関を示す（表８を参照のこと）。
【０１０３】
本明細書中に開示されるアッセイにおいて用いられるＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ及びＣｏＮＳを同定及び鑑別するための方法論は、空カセット偽陽性（Ｗａｎｇ  Ｈ．  ＪＣＭ  ２０１０；４８：３５２８）及び失われたクローン型偽陽性（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＬＲ．  ＪＣＭ  ２０１０；４８：１６６１）等の、標的としてＳＣＣｍｅｃカセット挿入を使用した場合に記述されてきた落とし穴のいくつかを回避する。また、本明細書中に開示されるアッセイは、臨床上の問題と大いに関連性があり、かつ他の商業的に入手可能なＭＲＳＡアッセイからは入手できない、スクリーニング及び診断の両方のための臨床情報を提供する。
【０１０４】
図１〜６は、開示されたアッセイが、臨床試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＥ、ＭＲＳＥ及びＭＳＳＥを直接同定するためにどのように組合わされて働くかを図示する、一組の組み合わされた増幅プロットを示す。結果は、別々のアッセイを単一の増幅プロット上へと重ね書きしたものである。呼吸器、という検体の種類を考えると、その多くは、ｍｅｃＡ遺伝子あり及びなしで、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを同定及び鑑別するアッセイの能力を検証及び説明するのに役立つ混合検体であった。二つの異なるＳ．  ａｕｒｅｕｓアッセイ、すなわち、ｆｅｍＡ及びｎｕｃアッセイ、が示されているものの、それらは、アッセイの成績を比較的に評価する目的のために、冗長かつ有用である。ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡを同定及び鑑別するために、ｆｅｍＡ又はｎｕｃのいずれか、の一つのＳ．  ａｕｒｅｕｓアッセイと、ｍｅｃＡアッセイと、が使用され得る。図１〜６中の特定のプロットは、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓアッセイを使用する。より広範なＣｏＮＳアッセイを使用して、そのアッセイの成績を実施例１表７Ａ〜Ｄ中に反映させた。
【０１０５】
図１は、ＴＧ６６０４と命名された咽頭スワブ試料を解析するのに使用した一組のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を描写する。ｎｕｃ（配列番号１、配列番号２及び配列番号３）の存在を検出するために使用したアッセイは、３３．２というＣｔをもたらした。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡ（配列番号４、配列番号５及び配列番号６）の存在を検出するために使用したアッセイは、３３．６というＣｔをもたらした。これらの両結果は、試料がＳ．  ａｕｒｅｕｓを含んでいたことを示す。ｍｅｃＡ（配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８）の存在を検出するために使用したアッセイは、増幅を示さなかった。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡ（配列番号７、配列番号８、及び配列番号９）の存在を検出するためのアッセイもまた、増幅を示さなかった。要約すると、この試料は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを含有していたが、存在していたＳ．  ａｕｒｅｕｓは、メチシリン耐性ではなかった。試料は、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含有していなかった。したがって、この増幅パターンを示す試料は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）と分類され得る。
【０１０６】
図２は、ＴＧ６６０８と命名された咽頭スワブ試料を解析するのに使用した一組のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を描写する。ｎｕｃの存在を検出するためのアッセイは、３３．６というＣｔをもたらした。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡの存在を検出するためのアッセイは、３３．５というＣｔをもたらした。ｍｅｃＡの存在を検出するためのアッセイは、３３．９というＣｔをもたらした。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡの存在を検出するためのアッセイは、増幅を示さなかった。要約すると、この試料は、メチシリン耐性であるＳ．  ａｕｒｅｕｓを含有していた。試料は、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含有していなかった。この増幅パターンを示す試料は、メチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）と分類され得る。ＭＲＳＡの存在は、細菌培養を通して確認した。
【０１０７】
図３は、ＴＧ６５８８と命名された咽頭スワブ試料を解析するのに使用した一組のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を描写する。ｎｕｃの存在を検出するためのアッセイは、３２．０というＣｔをもたらした。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡの存在を検出するためのアッセイは、３１．３というＣｔをもたらした。ｍｅｃＡの存在を検出するためのアッセイは、３５．２というＣｔをもたらした。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡの存在を検出するためのアッセイは、３５．９というＣｔをもたらした。要約すると、この試料は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方を含有していた。ｍｅｃＡの増幅は、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡの増幅と類似したＣｔを有するため、メチシリン耐性は、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの特徴であって、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの特徴ではない。この増幅パターンを示す試料は、メチシリン感受性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）及びメチシリン耐性Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＭＲＳＥ）の混合物を含有するものと分類され得る。
【０１０８】
図４は、ＴＧ６６０７と命名された咽頭スワブ試料を解析するのに使用した一組のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を描写する。ｎｕｃ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３０．１というＣｔをもたらした。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡの存在を検出するためのアッセイは、３０．３というＣｔをもたらした。ｍｅｃＡ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３０．８というΔＣｔをもたらした。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３４．６というΔＣｔをもたらした。要約すると、この試料は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方を含有している。ｍｅｃＡの増幅は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡの増幅と類似したＣｔを有するため、メチシリン耐性は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの特徴であって、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの特徴ではない。この増幅パターンを示す試料は、メチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）及びメチシリン感受性Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＭＳＳＥ）の混合物を含有するものと分類され得る。
【０１０９】
図５は、ＴＧ６７５９と命名された咽頭スワブ試料を解析するのに使用した一組のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を描写する。ｎｕｃ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３１．９というＣｔをもたらした。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３２．１というＣｔをもたらした。ｍｅｃＡ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、２８．８というＣｔをもたらした。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３４．８というＣｔをもたらした。要約すると、この試料は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方を含有していた。ｍｅｃＡの増幅は、ｎｕｃ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡアッセイよりも早く起こったため、メチシリン耐性は、試料中に含有されるＳ．  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方の特徴である。これは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方に存在するｍｅｃＡ遺伝子の相加効果のためである。この増幅パターンを示す試料は、メチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）及びメチシリン耐性Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＭＲＳＥ）の混合物を含有するものと分類され得る。
【０１１０】
図６は、ＴＧ６７７５と命名された咽頭スワブ試料を解析するのに使用した一組のリアルタイムＰＣＲアッセイの結果を描写する。ｎｕｃの存在を検出するためのアッセイは、３０．２というＣｔをもたらした。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡの存在を検出するためのアッセイは、３０．１というＣｔをもたらした。ｍｅｃＡの存在を検出するためのアッセイは、２６．８というＣｔをもたらした。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡ遺伝子の存在を検出するためのアッセイは、３４．１というＣｔをもたらした。この試料は、図５中と同じ増幅パターンを示し、したがって、ＭＲＳＡ及びＭＲＳＥの両方を含有するものと特徴付けられ得る。患者試料からのそれぞれの遺伝子の存在を表わすＣｔ値を、表８中に要約した。Ｃｔ値解析には、アプライドバイオシステムズ（商標）の７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲプラットフォーム及びロシュ社の４８０  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用した。
【０１１１】
【表１２】
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【０１１２】
実施例３−Ｃｐ値を使用した、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲスクリーニング
この実施例は、本明細書中に開示されるアッセイの相対Ｃｑ値を使用して、臨床単離物又は検体から抽出されたメチシリン耐性及び／又は感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ並びにコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）のゲノムＤＮＡの存在又は非存在を決定するために、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０機器上でマルチプレックスリアルタイムＰＣＲを実施するために必要な手順、設備及び試薬を説明する。
【０１１３】
必要な物品：ＰｅｒｆｅＣＴａ（登録商標）マルチプレックスｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａカタログ番号９５０６３）；アッセイプライマー及びプローブ（表１）；分子生物学グレード水；微量遠心機チューブ；リアルタイム機器適合性の光学反応プレート；光学接着フィルム及び塗布器；マイクロピペット及びチップ；鋳型ＤＮＡ及び適切なコントロール（ＭＲＳＡ及びＣＮＳからのｇＤＮＡ）；チューブ及びプレート用のローターを持つ遠心機；ロシュ社のＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０。
【０１１４】
反応の準備：
ｉ．色補正：機器上で初めてアッセイを実行する場合、色補正ファイルを作成する必要がある。ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ及びｍｅｃＡ並びに各シングルプレックスアッセイの陽性コントロールＤＮＡ、の少なくとも５つの複写物並びに鋳型のないコントロールの合計５つの複写物、の反応が実行されなくてはならない。このマルチプレックスアッセイ用の色補正ファイルは、一度だけ作成すればよい。詳細については、ＬＣ４８０ユーザーマニュアルを参照のこと。以下の通り、色補正反応を準備する。
【０１１５】
ｉｉ．アッセイ手順：（１）必要なマスターミックスの体積を計算する（反応体積×試料数×１．１）；（２）試薬をその体積まで混合し、最終反応濃度を以下とする：１×ＰｅｒｆｅＣＴａ（登録商標）マルチプレックスｑＰＣＲスーパーミックス；３００ｎＭのフォワードプライマー；３００ｎＭのリバースプライマー；１２５ｎＭのプローブ；鋳型の添加に際し最終濃度が達成される体積となるように、水を添加する；（３）アレイのマスターミックスを光学反応プレート中へと移動させる；（４）コントロール鋳型を添加する：ＭＲＳＡ  ＤＮＡ鋳型を、各ｔｕｆ−Ｓａ及びｍｅｃＡ反応ウェルへ添加する；ＣＮＳ  ＤＮＡ鋳型を、各ｔｕｆ−ＣＮＳ反応ウェルへ添加する；水を、鋳型のないコントロールの反応ウェルへ添加する。同一機器上でのその後のランについては、シングルプレックスアッセイは実行する必要がない。以前に作成された色補正ファイルは、これらのフルオロフォアを使用する全てのその後のマルチプレックスアッセイに適用され得る。
【０１１６】
ｉｉｉ．マルチプレックスの用意：（１）必要なマスターミックスの体積を計算する（反応体積×試料数×１．１）；（２）試薬をその体積まで混合し、最終濃度を以下とする：１×ＰｅｒｆｅＣＴａ（登録商標）マルチプレックスｑＰＣＲスーパーミックス；３００ｎＭの各プライマー；１２５ｎＭの各プローブ；次いで、鋳型の添加に際し最終濃度が達成される体積となるように、水を添加する；（３）アレイのマスターミックスを光学反応プレート中へと移動させる；（４）培養物から抽出されたＤＮＡを０．５〜ｌ０ｎｇ添加し、ＤＮＡが検体から抽出された場合には、より多い量を添加する（鋳型の量の最適化が必要であり得る）；光学プレートを光学接着フィルムで封着し、液体を遠心沈殿させる。
【０１１７】
サーマルサイクリング：まず、プレートを機器上へ載せる；次いで、ＬＣ４８０ソフトウェアにおいて、以下のプログラムで新たな実験を作成する：（１）「検出フォーマット（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍａｔ）」メニューにおいて、「マルチカラー加水分解プローブ（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｂｅ）」を選択する；（２）「カスタマイズ（Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅ）」を選択し、ＦＡＭ（４８３−５３３）、Ｈｅｘ（５２３−５６８）及びＲｅｄ  ６１０（５５８−６１０）の色を選択し、他を選択解除する；（３）適切な反応体積を入力する；（４）ランを開始し、ファイルを名付ける。ここ表９中に、例証的なプログラムを示す：
【０１１８】
【表１３】
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【０１１９】
色補正用のソフトウェアの設定：色補正ファイルの作成のためには、以下の通り色補正反応を指定する：（１）「サンプルエディタ（Ｓａｍｐｌｅ  Ｅｄｉｔｏｒ）」メニュー、次いで「ワークフロー（Ｗｏｒｋｆｌｏｗ）」メニューにおいて、「色補正（Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｍｐ）」を選択する；（２）一つのアッセイからの陽性コントロール色補正試料を強調する；（３）「ドミナントチャンネル（Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｃｈａｎｎｅｌ）」プルダウンメニューにおいて、そのアッセイ用の検出器を選ぶ；（４）「複製を作る（Ｍａｋｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）」をクリックする；（５）他の二つのアッセイについて繰り返す；（６）鋳型のないコントロールを強調し、「ドミナントチャンネル（Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｃｈａｎｎｅｌ）」メニューにおいて「水（Ｗａｔｅｒ）」を選ぶ；（７）全ての色補正反応ウェルを含むサブセットを作成する。上記工程後、設定は、マルチプレックスアッセイ上で実行されている試料を名付け、試料のサブセットを指定するための通常のソフトウェア設定で進行する。
【０１２０】
解析：
ｉ．色補正：「新たな解析を作成する（Ｃｒｅａｔｅ  Ｎｅｗ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」メニューから、「色補正（Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）」を選び、色補正反応のサブセットを選択し、次いで「計算（Ｃａｌｃｕｌａｔｅ）」を選択する；次いで、このファイルを、このマルチプレックスアッセイの、後の解析に適用するために「保存（Ｓａｖｅ）」する。
【０１２１】
ｉｉ．マルチプレックス：（１）「新たな解析を作成する（Ｃｒｅａｔｅ  Ｎｅｗ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」メニューから、「ＡｂｘＱｕａｎｔ／２ｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘ」を選び、解析すべき試料のサブセットを選択する；（２）「色補正（Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）」プルダウンメニューにおいて、「データベース中（Ｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）」を選び、次いで以前に作成した色補正ファイルを選ぶ；（３）「計算（Ｃａｌｃｕｌａｔｅ）」を選択し、データが必要な反応を選択し、次いで結果をエクスポートする；（４）「フィルタ・コーム（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｏｍｂ）」において次の色を選択し「計算（Ｃａｌｃｕｌａｔｅ）」し、次いで反応を選択して結果をエクスポートする；（５）最後の色について繰り返す。
【０１２２】
結果：表１０は、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ又はＭＳＣＮＳを異なる組合せ及び比率で混合した数々の試料から収集された、シングルプレックス及びマルチプレックスＣｐデータを提示する。例えば、第１群において、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡを５つの異なる比率（１：１、１：０．１、０．１：１、１：０．０１及び０．０１：１）で混合した。各混合物は、再現性のために、同一の実験において重複物を有する。第１群の試料について、ｆｅｍＡ、ｍｅｃＡ、ｎｕｃ、ｔｕｆ−Ｓａ及びｔｕｆ−ＣＮＳシングルプレックスアッセイを実行し、各アッセイのＣｐ値を表１０に含めた。次いで、三つのマルチプレックスアッセイを実行した：１）ｆｅｍＡ及びｍｅｃＡ；２）ｎｕｃ及びｍｅｃＡ；並びに３）ｔｕｆ及びｍｅｃＡ。ｆｅｍＡとｍｅｃＡ、ｎｕｃとｍｅｃＡ、ｔｕｆとｍｅｃＡ、との相対Ｃｐ値を次いで収集し、表１０中に列挙した。アルゴリズム及びシングルプレックス結果に基づいて予測された各相対Ｃｐ値差を、表１０中に表示し、列挙した。観測されたＣｐ値差は、マルチプレックスの結果からの実際のデータである。予測されたＣｐ値差と観測されたＣｐ値差との間の近接度は、本明細書中に開示されるマルチプレックスアッセイの精度及び信頼度を反映する。同様に、シングルプレックス及びマルチプレックスアッセイを、第２〜６群（ＭＲＳＡ／ＭＳＣＮＳ、ＭＲＳＡ／ＭＲＣＮＳ、ＭＳＳＡ／ＭＲＣＮＳ、ＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ及びＭＳＣＮＳ／ＭＲＣＮＳ）について実行し、Ｃｐ値を表１０中に含めた。さらに、第１〜５群についてのマルチプレックスアッセイ、及びＭＲＳＡ／ＭＳＣＮＳ、ＭＲＳＡ／ＭＲＣＮＳについての増幅曲線を、図７〜１３中に示す。図７〜１３において、異なる比率の混合物を含む試料を含む各群について、ｔｕｆ−Ｓａ、ｔｕｆ−ＣＮＳ、ｆｅｍＡ、又はｍｅｃＡアッセイの増幅曲線パターンの異なる組合せが示されている。これらの曲線パターンは、本明細書中に開示されるマルチプレックスアッセイの結果を解釈し、次いでマルチプレックスアッセイ下で、任意の所定の試料中のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲＣＮＳ、ＭＳＣＮＳを同定及び鑑別するために有用である。
【０１２３】
【表１４】
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【０１２４】
【表１５】
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【０１２５】
【表１６】
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【０１２６】
【表１７】
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【０１２７】
【表１８】
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【０１２８】
【表１９】
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【０１２９】
解釈：マルチプレックスアッセイでの菌種及びｍｅｃＡ保因の決定は、複数のアッセイ結果間の相対Ｃｐ値に依存する。ｍｅｃＡ  Ｃｐは、ｍｅｃＡを保有する菌種を標的とするアッセイのＣｐと等しいはずである。例証的な適用において、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ中のｔｕｆ、ＣＮＳ中のｔｕｆ及びｍｅｃＡを標的とするアッセイの相対Ｃｐ値を使用している。両菌種がｍｅｃＡを保有する場合、ｍｅｃＡ  Ｃｐは両菌種のアッセイよりも低いはずである。結果及び解釈のいくつかの非限定的な例を、表１１に提示する：
【０１３０】
【表２０】
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【０１３１】
実施例４−ＭＲＳＡの存在を検出するための類似のアッセイを開発するために使用され得る追加の配列
ＭＲＳＡの存在を検出するための、本明細書中に開示されるアッセイと類似のアッセイを開発するために使用され得る追加の配列はさらに、以下を含み：配列番号１９−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｎｕｃ、配列番号２０−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｆｅｍＡ、配列番号２１−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｆｅｍＡ、配列番号２２−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｔｕｆ、配列番号２３  Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ  ｔｕｆ、配列番号２４−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｔｕｆ、配列番号２５−Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｔｕｆ、配列番号２６  Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ  ｔｕｆ、配列番号２７−Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ｔｕｆ、配列番号２８−Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ  ｔｕｆ、配列番号２９−Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ  ｔｕｆ及び配列番号３０−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｍｅｃＡ：これらは配列表に詳述されている。
【０１３２】
出願人が、出願書類の提出時点で知っている発明の好ましい実施態様及び最良の形態の前述の記載が提示され、それらは例証及び説明の目的を意図している。それは、網羅的又は開示された正確な形態に発明を限定することを意図せず、上記教示に照らして、多くの変形例及びバリエーションが可能である。実施態様は、発明の原理及びその実用的な適用を最もよく説明し、かつ当業者が発明を種々の実施態様で、意図される特定の用途に適している種々の変更と共に最も上手に利用できるように、選ばれかつ記載された。したがって、発明が、本発明を実施するために開示されている特定の実施態様に限定されることは意図されず、しかし発明が、添付の請求項の範囲内に属する全ての実施態様を含むことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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