(57)【要約】ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）中に配列特異的二次増幅産物を生じさせるための方法および組成物が本明細書において提示される。従来のＬＡＭＰは、自己相補的ヘアピンに鎖状に連結された優勢な高分子量ＤＮＡ構造を生成するが、このヘアピンは通例のプローブベースのハイブリダイゼーション法による検出を受け入れられず、閉管フォーマットでの２つまたはそれよりも多い標的または配列バリアントの多重検出は極度に困難になる。例えば、欠如していれば標的配列のプローブベースの検出が増強される競合的ヘアピン構造を欠く低分子量産物内に包埋している最初の標的配列断片を坦持する二次ＬＡＭＰ産物を生じさせるための方法が本明細書において提供される。これら二次産物は、例えば、ＬＡＭＰ工程中にリアルタイムで生成することが可能であり、例えば、均質リアルタイム蛍光フォーマットを使用して単管内で複数の標的配列を検出するという選択肢を提供することができる。
2013509880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸張産物を生じさせるための方法であって、
ａ．核酸シグナルプライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含み、前記領域は前記ヘアピン構造のループ領域に位置していないステップと、
ｂ．前記ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを前記核酸標的配列上で伸張させて、第一のシグナル伸張産物を生成するステップと、
ｃ．前記第一のシグナル伸張産物を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一のシグナル伸張産物はヘアピン構造を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル産物を生じさせるための方法であって、
ａ．核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
ｂ．前記ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを前記核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
ｃ．核酸増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物は二本鎖でありヘアピン構造を欠くステップと、
ｄ．核酸シグナルプライマーを前記第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを前記第二のシグナル伸長産物上で伸長させて、第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物はその５’末端にヘアピン構造を有するステップと、
ｅ．前記第二のシグナル伸長産物または前記第三のシグナル伸長産物を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル産物を生じさせるための方法であって、
ａ．核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
ｂ．前記ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを前記核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
ｃ．核酸増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物は二本鎖でありヘアピン構造を欠くステップと、
ｄ．核酸シグナルプライマーを前記第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを前記第二のシグナル伸長産物上で伸長させて、第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物は一本鎖でありその５’末端にヘアピン構造を有するステップと、
ｅ．前記核酸シグナルプライマーを前記第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを前記第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物は二本鎖核酸を含むステップと、
ｆ．前記第四のシグナル伸長産物を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
２つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントが同時に使用され、前記２つまたはそれよりも多い標的配列にハイブリダイズする２つまたはそれよりも多い核酸シグナルプライマーが使用されることを特徴とする請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記２つまたはそれよりも多い標的配列は、同じ連続するヌクレオチド配列中または２つの異なるヌクレオチド配列上に存在する配列であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントは１つの生物または２つもしくはそれよりも多い異なる生物に由来することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物はリアルタイムで検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は閉管フォーマットで検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物はハイブリダイゼーションプローブにより検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーションプローブは単一ヌクレオチド差異感受性プローブであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイゼーションプローブは蛍光発生性であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記シグナルプライマーは、ハイブリダイゼーション領域およびレポーター領域を含み、前記ハイブリダイゼーション領域が前記核酸標的配列の前記領域にハイブリダイズし、前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物が前記レポーター領域によって検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター基は蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター基は蛍光発生ヘアピンであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一のシグナル伸長産物、前記第二のシグナル伸長産物、前記第三のシグナル伸長産物または前記第四のシグナル伸長産物は、前記シグナルプライマーのうちの１つに組み込まれた前記シグナル産物の捕獲を促進する改変物によって検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１８】
薬物耐性ＴＢを検出するための、請求項１、２、３、４、５または１３に記載の方法の使用。
【請求項１９】
前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は増幅後に検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、蛍光発生プローブまたはＳＥＲＳ標識プローブを使用して検出されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）少なくともその一部が第一の標的配列領域にハイブリダイズする核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）前記シグナルプライマーがハイブリダイズする前記第一の標的配列領域の上流の第二の標的配列領域にハイブリダイズする３’末端部分および前記３’末端部分がハイブリダイズする前記第二の標的配列領域の下流の前記標的配列の第三の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分とを含む、核酸増幅プライマー、ならびに（ｉｉｉ）前記核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする前記第二の標的配列領域の上流の第四の標的配列領域にハイブリダイズする、置換プライマーを含むことを特徴とするキット。
【請求項２２】
ハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンであることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記シグナルプライマーはレポーター領域を含むことを特徴とする請求項２１のキット。
【請求項２５】
前記レポーター基は蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記レポーター基は蛍光発生ヘアピンであることを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記核酸標的配列は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の配列であることを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２８】
前記核酸配列は、（ｉ）第二の標的配列にハイブリダイズする第二の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）前記第二の標的配列にハイブリダイズする第二の核酸増幅プライマー、および（ｉｉｉ）前記第二の標的配列にハイブリダイズする第二の置換プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２９】
前記核酸配列は、（ｉ）第三の標的配列にハイブリダイズする第三の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）前記第三の標的配列にハイブリダイズする第三の核酸増幅プライマー、および（ｉｉｉ）前記第三の標的配列にハイブリダイズする第三の置換プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記核酸配列は、（ｉ）第四の標的配列にハイブリダイズする第四の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）前記第四の標的配列にハイブリダイズする第四の核酸増幅プライマー、および（ｉｉｉ）前記第四の標的配列にハイブリダイズする第四の置換プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本方法は、一態様において、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）を使用して生じた標的配列のリアルタイム配列特異的検出のための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００９年１１月５日に出願された米国特許仮出願第６１／２５８，４０４号明細書の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
核酸増幅は、臨床医学において、例えば、感染症、遺伝的障害および遺伝形質の診断のためにもっとも価値あるツールの１つである。ＬＡＭＰは、単純、迅速、特異的および対費用効果の高い核酸増幅法である（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。ＰＣＲなどの増幅法と違って、ＬＡＭＰは等温条件下で行うことができ、次の回のＤＮＡ合成を促進するための二本鎖ＤＮＡ産物の熱変性の必要がなくなる（例えば、非特許文献１参照、以下「Notomi et al.」）。さらに、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）またはＳＤＡ（鎖置換増幅）のような増幅法と違って、ＬＡＭＰは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼに加えてどんな酵素の使用も必要とせず、このためにＬＡＭＰのほうが対費用効果は高くなる。しかし、従来のＬＡＭＰは、鎖状に連結されて自己相補的ヘアピン構造体になるオリジナル標的配列の数多くのコピーを含有する優勢な高分子量ＤＮＡを生成し、自己相補的ヘアピン構造体はその高融解温度および折り畳まれる強い傾向のせいで、分子ビーコンなどの通例のプローブベースのハイブリダイゼーション法による検出を受け入れられない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６９７４６７０号明細書
【特許文献２】米国特許第６４１０２７８号明細書
【特許文献３】米国特許第５６０７８３４号明細書
【特許文献４】米国特許第５５５００２５号明細書
【特許文献５】米国特許第５５９３８６７号明細書
【特許文献６】米国特許第５９２８８６９号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Notomi et al., Nucl. Acid Res. 28(12): e63 (2000)
【非特許文献２】Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410
【非特許文献３】Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656
【非特許文献４】Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489
【非特許文献５】Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989
【非特許文献６】Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology; Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York
【非特許文献７】Tijessen, 1993, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers, B.V.
【非特許文献８】Kricka, 1992, Non-Isotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, California
【非特許文献９】Nagamine et al. Mal. and Cell. Probes 16, 223-229 (2002)
【非特許文献１０】Tyagi and Kramer, "Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization," Nature Biotechnology 14, 303-308 (1996)
【非特許文献１１】B. Bagwell, et al. 1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425
【非特許文献１２】Natan, Proceedings of the NanoEurope (2008)
【非特許文献１３】Musser, Clin. Microbiol. Reviews 8(4):496-514 (1995)
【非特許文献１４】http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html
【非特許文献１５】El-Hajj et al. J. Clin. Micro. 39, 4131-4137 (2001)
【非特許文献１６】Down et al J. Clin. Micro. 34, 860-865. (1996)
【非特許文献１７】Telenti et al. Lancet 341, 647-650, 1993
【非特許文献１８】Miller et al., Antimicrob. Agents Chemother.38, 805-811, (1994)
【非特許文献１９】Piatek et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 103-110
【非特許文献２０】Iwamoto et al. J. Clin. Micro, 41, p. 2616-2622, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＬＡＭＰを使用する配列検出には改良の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、ループ媒介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）反応と併せて１つもしくは複数のシグナルプライマーまたはプライマー対を利用して、対象の標的核酸分子部分またはその相補体を含む核酸検出産物であって、ヘアピン核酸配列または構造を含まず、それにより核酸検出産物が検出を特に受け入れ可能になる核酸検出産物を生じさせることにより、標的核酸分子内の核酸配列のリアルタイム、配列特異的検出、例えば、多重検出を可能にする方法および組成物が本明細書では堤示される。例えば、核酸検出産物は、レポータープローブの従来のハイブリダイゼーションにより、または１つもしくは複数のシグナルプライマーにレポーター基を組み入れることにより検出することが可能である。
【０００８】
別の態様では、ＬＡＭＰ反応と併せてシグナルプライマーまたはプライマー対を利用して、対象の核酸標的部分またはその相補体を含む核酸検出産物であって、ヘアピン核酸配列または構造を含まず、それにより核酸検出産物が検出を特に受け入れ可能になる核酸検出産物を生じさせることにより、１つ、２つまたはそれより多い標的核酸分子内の２つまたはそれより多い核酸配列のリアルタイム、配列特異的、多重検出を可能にする方法および組成物が本明細書において堤示される。
【０００９】
例えば、核酸検出産物（単数または複数）は、レポータープローブの従来のハイブリダイゼーションにより、または１つもしくは複数のシグナルプライマーにレポーター基を組み入れることにより検出することが可能である。さらに、核酸検出産物は、ＬＡＭＰ工程と併せて、例えば、ＬＡＭＰ工程中にリアルタイムで生成され、例えば、リアルタイム蛍光フォーマットを使用して、単一反応容器、例えば、管内で複数の核酸検出産物を検出する選択肢を提供することができる。
【００１０】
一実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸張産物を生じさせるための方法であって、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含み、前記領域はヘアピン構造のループ領域に位置していないステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸張させて、第一のシグナル伸張産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸張産物は１つのヘアピン構造を含むステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
【００１１】
上記の方法は、第一のシグナル伸長産物を検出するステップをさらに含み得る。一実施形態では、シグナルプライマーは、ハイブリダイゼーション領域およびレポーター領域を含み、ハイブリダイゼーション領域は核酸標的配列の領域にハイブリダイズし、レポーター領域は蛍光シグナルを発生する。
【００１２】
別の実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を生じさせるための方法であって、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
（ｃ）核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、第一のシグナル伸長産物上でハイブリダイズした核酸増幅プライマーを伸長させて第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物はヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナル伸長産物はその５’末端にヘアピン構造を有するステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
【００１３】
別の実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル産物を生じさせるための方法であって、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
（ｂ）核酸標的配列上でハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
（ｃ）核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、第一のシグナル伸長産物上でハイブリダイズした核酸増幅プライマーを伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物は二本鎖でありヘアピン構造を欠くステップと、
（ｄ）核酸シグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、第二のシグナル伸長産物上でハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを伸長させて、第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物はその５’末端にヘアピン構造を有するステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
【００１４】
上記の方法は、第二のシグナル伸長産物および／または第三のシグナル伸長産物を検出するステップをさらに含み得る。
【００１５】
さらに別の実施形態では、本明細書において提示される本方法は、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を同時に生じさせるための方法であって、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
（ｃ）核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物はヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナル伸長産物は一本鎖でありその５’末端にヘアピン構造を有するステップと、
（ｄ）核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物は二本鎖核酸を含むステップと
を含む方法である。
【００１６】
別の実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル産物を生じさせるための方法であって、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
（ｃ）核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物は二本鎖でありヘアピン構造を欠くステップと、
（ｄ）核酸シグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物上で伸長させて、第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物は一本鎖でありその５’末端にヘアピン構造を有するステップと、
（ｅ）核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物は二本鎖核酸を含むステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
【００１７】
一実施形態では、上記の方法は、第四のシグナル伸長産物を検出するステップをさらに含む。
【００１８】
本明細書に提示される方法のある種の実施形態では、２つまたはそれより多い標的配列または配列バリアントが同時に使用され、前記２つまたはそれより多い標的配列にハイブリダイズする２つまたはそれより多い核酸シグナルプライマーが使用される。一実施形態では、２つまたはそれより多い標的配列は、同一の連続するヌクレオチド配列にまたは２つの異なるヌクレオチド配列上に存在する配列である。別の実施形態では、２つもしくはそれより多い標的配列または配列バリアントは、１つの生物由来であるまたは２つもしくはそれより多い異なる生物由来である。いくつかの実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物はリアルタイムで検出される。ある種の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は閉管フォーマットにおいて検出される。他の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は増幅後に検出される。
【００１９】
一実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、ハイブリダイゼーションプローブにより検出される。１つのそのような実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは単一ヌクレオチド差異感受性プローブ（ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ）である。別の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは蛍光発生性である。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンである。別の特定の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、蛍光発生プローブまたはＳＥＲＳ標識プローブを使用して検出される。
【００２０】
本明細書に提示される本方法のある種の実施形態では、シグナルプライマーは、ハイブリダイゼーション領域およびレポーター領域を含み、ハイブリダイゼーション領域は核酸標的配列の一領域にハイブリダイズし、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物はレポーター領域によって検出される。一実施形態では、レポーター基は蛍光シグナルを発生する。別の実施形態では、レポーター基は蛍光発生ヘアピンである。さらに別の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、シグナルプライマーのうちの１つに組み込まれているシグナル産物の捕獲を促進する改変物によって検出される。
【００２１】
一実施形態では、核酸検出産物を生じさせるための方法であって、
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせる条件下で、標的核酸分子とプライマー核酸Ｆ３、ＦＬＰ、ＦＳＰ、ＲＬＰ、ＲＳＰおよびＲ３を組み合わせるステップであって、
（ｉ）標的核酸およびプライマー核酸のそれぞれが５’末端（「５’」）および３’末端（「３’」）を含み；
（ｉｉ）プライマー核酸Ｆ３、ＦＬＰおよびＦＳＰのそれぞれが、標的核酸分子３’から５’の順に、以下のＦ３、ＦＬＰ、ＦＳＰの通りに、標的核酸分子の異なる部分に相補的であり；
（ｉｉｉ）ＦＬＰは、３’から５’の順に、標的核酸分子の部分（Ｆ２ｃ）に相補的である第一の部分（Ｆ２）およびＦ２ｃの５’側であるがＦＳＰが相補的である標的核酸の部分（ＦＳｃ）の３’側である標的核酸分子の部分（Ｆ１ｃ）と同一の第二の部分（Ｆ１ｃ）を含み；
（ｉｖ）ＦＳＰは、３’から５’の順に、標的核酸分子の部分（ＦＳｃ）に相補的である第一の部分（ＦＳ）、および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分（Ｓ１）を含み；
（ｖ）プライマー核酸Ｒ３、ＲＬＰおよびＲＳＰのそれぞれが、以下の、標的核酸分子５’から３’の順に：Ｒ３、ＲＬＰ、ＲＳＰの通りに標的核酸の異なる部分と同一であり；
（ｖｉ）ＲＬＰは、３’から５’の順に、標的核酸分子の部分（Ｒ２）と同一である第一の部分（Ｒ２）、およびＲ２の３’側であるがＲＳＰと同一の標的核酸の部分（ＲＳ）の上流の標的核酸分子の部分（Ｒ１）に相補的である第二の部分（Ｒ１ｃ）を含み；
（ｖｉｉ）ＲＳＰは、３’から５’の順に、ＦＳｃの５’側の標的核酸分子の部分（ＲＳ）と同一の第一の部分、および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分（Ｓ２）を含み、
その結果、５’から３’の順に、Ｒ１ｃ、Ｒ２、Ｒ１、ＲＳ、ＦＳｃおよび（随意に）Ｓ１ｃを含み、Ｓ１ｃがＳ１に相補的である核酸検出産物が生じるステップと
を含む方法が本明細書において提示される。ある種の実施形態では、標的核酸分子は、ＦＳｃの５’側およびＲＳの３’側である部分Ｄを含み、その結果、生じる核酸検出産物は、５’から３’の順に、Ｒ１ｃ、Ｒ２、Ｒ１、ＲＳ、Ｄおよび（随意に）Ｓ１ｃを含む。一般に、生じる核酸産物はＤの単一コピーのみを含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてＤの存在を検出するステップを含む。
【００２２】
別の実施形態では、方法は、５’から３’の順に、Ｓ１（随意）、ＦＳ、ＲＳｃ、Ｒ２ｃおよびＲ１を含む核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含む。ある種の実施形態では、標的核酸分子はＦＳｃの５’側およびＲＳの３’側である部分Ｄを含み、その結果、方法は、５’から３’の順に、Ｓ１（随意）、ＦＳ、Ｄｃ、ＲＳｃ、Ｒ２ｃおよびＲ１を含んで生じる核酸検出産物であって、ＤｃはＤに相補的である核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含む。一般に、生じるそのような核酸産物はＤｃの単一コピーのみを含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてＤｃの存在を検出するステップを含む。
【００２３】
ある種の実施形態では、複数の異なる標的核酸分子から複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれよりも多い）異なる核酸検出産物を生じさせるための方法であって、本明細書に記載される核酸プライマー（Ｆ３、ＦＬＰ、ＦＳＰ、Ｒ３、ＲＬＰ、ＲＳＰ）の別々の組が、対象の標的核酸分子ごとに利用される方法が提示される。ある種の実施形態では、複数の核酸検出産物が、単一反応容器、例えば、管またはウェルにおいて生じる。他の態様では、複数の異なる核酸検出産物が検出され、例えば、単一反応容器において、例えば、管またはウェルにおいて、例えば、閉管フォーマットにおいて検出される。
【００２４】
そのような実施形態では、プライマー核酸ＦＬＰおよびＲＬＰは、ＬＡＭＰ核酸増幅反応において使用するのに適した増幅プライマーである。いかなる特定の機構または理論にも縛られたくはないが、そのような方法はＦＬＰおよびＲＬＰ媒介ＬＡＭＰ核酸増幅反応を含む。
【００２５】
そのような実施形態では、プライマー核酸ＦＳＰおよびＲＳＰはシグナルプライマーの例である。
【００２６】
そのような実施形態では、プライマー核酸Ｆ３およびＲ３は置換プライマー（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｒｉｍｅｒｓ）の例である。
【００２７】
別の実施形態では、核酸伸長産物を生じさせるための方法であって、
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせ、それによってＦＳＰを標的核酸分子にハイブリダイズさせてＦＳＰを伸長する条件下で、（ｉ）３’および５’末端ヘアピン構造を含む標的核酸分子、ならびに（ｉｉ）３’から５’の順に、３’ヘアピン構造の５’側であり５’ヘアピン構造の３’側の直鎖状核酸分子の部分（ＦＳｃ）に相補的である第一の部分（ＦＳ）、および随意に、標的核酸分子に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分（Ｓ１）を含む核酸プライマー（ＦＳＰ）を組み合わせ、その結果、５’から３’の順に、ＦＳＰおよび５’末端ヘアピン構造の実質的にすべてに相補的である核酸配列を含む核酸伸長産物が生じるステップを含む方法が本明細書において提供される。さらに別の実施形態では、生じた核酸伸長産物は、ＦＳＰの実質的にすべてに相補的である３’末端をさらに含む。
【００２８】
本明細書で使用されるように、３’ヘアピン構造とは核酸分子の３’末端を含む自己相補的ヘアピン構造のことである。同様に、本明細書で使用されるように、５’ヘアピン構造とは核酸分子の５’末端を含む自己相補的ヘアピン構造のことである。したがって、５’末端ヘアピン構造と３’末端ヘアピン構造を含む核酸分子は、それ自体の各末端に自己相補的ヘアピン構造を含有する。
【００２９】
ある種の実施形態では、そのような方法は、複数の異なる標的核酸分子から複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれよりも多い）異なる核酸伸長産物を生じさせることが可能であり、対象の標的核酸分子ごとに別々のＦＳＰが利用される。
【００３０】
別の実施形態では、核酸検出産物を生じさせるための方法であって、
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせる条件下で、（ｉ）３’末端ヘアピン構造と５’末端ヘアピン構造を含む標的核酸分子、（ｉｉ）３’から５’の順に、３’ヘアピン構造の５’側であり５’ヘアピン構造の３’側の直鎖状核酸分子の部分（ＦＳｃ）に相補的である第一の部分（ＦＳ）、および随意に、標的核酸分子に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分（Ｓ１）を含む核酸プライマー（ＦＳＰ）、ならびに（ｉｉｉ）３’から５’の順に、５’末端ヘアピン構造のループ部分と同一の第一の部分（Ｒ２）および５’末端ヘアピン構造のヘアピン区分内のＲ２の３’側の標的核酸分子の部分（Ｒ１）に相補的である第二の部分（Ｒ１ｃ）を含む核酸プライマー（ＲＬＰ）を組み合わせ、その結果、５’から３’の順に、ＲＬＰ（Ｒ１ｃとＲ２）、Ｒ１およびＦＳＰの実質的にすべてに相補的である核酸配列を含む核酸検出産物が生じるステップを含む方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、方法は、５’から３’の順に、ＦＳＰ（Ｓ１（随意）およびＦＳ）、ＦＳ、ＲＳｃ、Ｒ２ｃならびにＲ１の実質的にすべてを含む核酸検出産物であって、ＲＳｃはＲＳに相補的であり、Ｒ２ｃはＲ２に相補的である核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含む。別の態様では、そのような方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含むことが可能である。
【００３１】
ある種の実施形態では、標的核酸分子は、ＦＳｃの５’側でありＲＳの３’側である部分Ｄを含み、その結果、方法が、５’から３’の順に、ＲＬＰ（Ｒ１ｃおよびＲ２）、Ｒ１、ＤならびにＦＳＰ（Ｓ１（随意）およびＦＳ）の実質的にすべてに相補的である核酸配列を含む核酸検出産物を生じさせるステップを含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含む。別の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてＤの存在を検出するステップを含む。別の実施形態では、そのような方法は、５’から３’の順に、ＦＳＰ、Ｄｃ、ＲＳｃ、Ｒ２ｃおよびＲ１を含む核酸検出産物であって、ＤｃはＤに相補的である核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含むことが可能である。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてＤｃの存在を検出するステップを含む。
【００３２】
ある種の実施形態では、そのような方法は、複数の異なる標的核酸分子から複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれよりも多い）異なる核酸検出産物を生じさせることができ、本明細書に記載される核酸プライマー（ＦＳＰおよびＲＬＰ）の別々の組が、対象の標的核酸分子ごとに利用される。
【００３３】
本明細書に提示される二次ＬＡＭＰ産物の作製および検出のためのキットであって、（ｉ）核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が第一の標的配列の領域にハイブリダイズする核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）シグナルプライマーがハイブリダイズする標的配列領域の３’側の第一の標的配列領域にハイブリダイズする３’末端部分および増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の５’側である第一の標的配列の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む核酸増幅プライマー、ならびに（ｉｉｉ）核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の３’側の第一の標的配列の領域にハイブリダイズする置換プライマーを含むキットも本明細書において提供される。
【００３４】
ある種の実施形態では、上記のキットのうちのいずれも、（ｉ）第二の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が第二の標的配列の領域にハイブリダイズする第二の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）第二のシグナルプライマーがハイブリダイズする標的配列領域の３’側の第二の標的配列領域にハイブリダイズする３’末端部分および第二の増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の５’側の第二の標的配列の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、第二の核酸増幅プライマー、ならびに（ｉｉｉ）核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の３’側の第二の標的配列の領域にハイブリダイズする、第二の置換プライマーをさらに含む。
【００３５】
別の実施形態では、上記のキットのうちのいずれも、（ｉ）核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が第三の標的配列の領域にハイブリダイズする第三の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）第三のシグナルプライマーがハイブリダイズする標的配列領域の３’側の第三の標的配列領域にハイブリダイズする３’末端部分および第三の増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の５’側の第三の標的配列の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む第三の核酸増幅プライマー、ならびに（ｉｉｉ）核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の３’側の第三の標的配列の領域にハイブリダイズする、第三の置換プライマーをさらに含む。さらに、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれよりも多い標的配列が本明細書に記載される方法を使用して増幅され検出されるキットが本明細書では企図されている。
【００３６】
一実施形態では、上記のキットのうちのいずれもハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。一特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンである。いくつかの実施形態では、上記のキットのうちのいずれにおけるシグナルプライマーもレポーター領域をさらに含む。一実施形態では、そのようなレポーター基は蛍光シグナルを発生する。一特定の実施形態では、レポーター基は蛍光発生ヘアピンである。一実施形態では、上記のキットのうちのいずれにおける核酸標的配列も結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の配列である。
【００３７】
本明細書に提示される方法、組成物およびキットの応用には、例えば、微生物の検出、疾患、例えば、感染症、遺伝的障害および遺伝形質の診断が含まれる。例えば、本明細書に提示される方法およびキットは、特定の核酸（単数または複数）、例えば、生物学的試料中の遺伝子、遺伝子配列または遺伝子変異（例えば、欠失、挿入もしくは点変異）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡもしくはｒＲＮＡのリアルタイム検出が望ましいいかなる生物学的または臨床的適用においても使用し得る。一特定の実施形態では、本明細書に提示される方法およびキットを使用して、例えば、生物学的試料由来の核酸における結核菌の特定のｒｐｏＢ変異の存在の検出によって薬物耐性結核を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】シグナルプライマー（ＦＳＰ）、増幅プライマー（ＦＬＰ）および置換プライマー（Ｆ３）を用いる、伸長産物Ｐ１、Ｐ２およびＰ３が生成されるＬＡＭＰ反応を示す図である。
【図２Ａ】増幅プライマー（ＲＬＰ）および置換プライマーＲ３を用いて、鋳型としてＰ１を使用する、伸長産物Ｐ１．２およびＰ１．３が生成されるＬＡＭＰ反応を示す図である。
【図２Ｂ】シグナルプライマー（ＲＳＰ）、増幅プライマー（ＦＬＰ）および置換プライマー（Ｆ３）を用いて、鋳型としてＰ１を使用する、伸長産物Ｐ１．１、Ｐ１．２およびＰ１．３が生成されるＬＡＭＰ反応を示す図である。
【図３Ａ】増幅プライマー（ＲＬＰ）および置換プライマー（Ｒ３）を用いて、鋳型としてＰ２を使用する、伸長産物Ｐ２．２およびＰ２．３が生成されるＬＡＭＰ反応を示す図である。
【図３Ｂ】シグナルプライマー（ＲＳＰ）、増幅プライマー（ＲＬＰ）および置換プライマー（Ｒ３）を用いて、鋳型としてＰ２を使用する、伸長産物Ｐ２．２およびＰ２．３が生成されるＬＡＭＰ反応を示す図である。
【図４】シグナルプライマー（ＦＳＰ）を用いて、鋳型としてＬＡＭＰ作製Ｐ２．２産物を使用する、伸長産物Ｐ２．２．１、Ｐ２．２．２およびＰ２．２．２．１が生成される増幅反応を示す図である。
【図５】増幅プライマー（ＲＬＰ）およびシグナルプライマー（ＦＳＰ）を用いて、鋳型としてＬＡＭＰ作製Ｐ２．２．２．１産物を使用する、伸長産物Ｐ２．２．２．１．２、Ｐ２．２．２．１．３およびＰ２．２．２．１．１が生成される増幅反応を示す図である。
【図６】シグナルプライマー（ＦＳＰ）を用いて、鋳型としてＰ２．２．２．１産物を使用する、伸長産物Ｐ２．２．２．１．１ｃが生成される増幅反応を示す図である。
【図７】結核菌ｒｐｏＢ遺伝子の領域（配列番号３６）を示す図である。
【図８】結核菌ｋａｔＧ遺伝子の領域（配列番号３７）を示す図である。示されたヌクレオチドは、ヌクレオチド７７１〜１１１２（ジェンバンク受託番号ＮＣ＿０００９６２  領域：相補体（２１５３８８９．．２１５６１１１）のｋａｔＧ遺伝子（遺伝子座タグ「Ｒｖ１９０８ｃ」）の第一のコードヌクレオチドから番号を付けられた）に一致する。
【図９】結核菌ｉｎｈＡ遺伝子の領域（配列番号３８）を示す図である。示されたヌクレオチドは、ジェンバンク受託番号ＮＣ＿０００９６２  領域：１６７３４４０．．１６７４１８３のｉｎｈＡ遺伝子を含有するオペロンの一部である、ヌクレオチド１６７３２８１〜１６７３５８０（ｆａｂＧ１（ａｋａ  ｍａｂＡ）遺伝子（遺伝子座タグ「Ｒｖ１４８３」）の調節領域に位置する非コードヌクレオチド）に一致する。
【図１０】結核菌ｇｙｒＢ遺伝子の領域（配列番号３９）を示す図である。示されたヌクレオチドは、ヌクレオチド４１２〜７２０（ｇｙｒＢ遺伝子（遺伝子座タグ「Ｒｖ０００５」）の第一のコードヌクレオチドから番号を付けられた）に一致する。
【図１１】ＬＡＭＰ反応中に標的配列の存在を検出するために、それぞれＦＬＰ−ｇｙｒおよびＱＰ−ｇｙｒに連結されたフルオロフォア／クエンチャー対の使用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
５．１．用語
本明細書において使用されるように、以下の用語および語句は以下の通りに使用される。
【００４０】
本明細書において使用されるように、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、その他の方法で示されない限り、用語により修飾されている値のわずか２０％上または下である値のことである。
【００４１】
核酸とは、２つまたはそれよりも多い単量体ヌクレオチドで構成されている分子のことであり、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡもしくはｒＲＮＡ分子、デオキシリボ核酸、例えば、ｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡ、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、天然に存在するヌクレオチド、天然に存在するヌクレオチドの類似体、ヌクレオチドの類似体、もしくはその組合せを含む核酸を挙げることができる。核酸は、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を挙げることができる。
【００４２】
「核酸プライマー」または「プライマー」とは、相補的核酸配列にハイブリダイズすると、例えば、酵素的核酸複製によって伸長させることができる３’末端−ＯＨ基を含む核酸分子のことである。核酸プライマーは、一般に、約１０〜２００、約２０〜１００、約２０〜５０、約３０〜１００、約３０〜５０または約２０〜３０ヌクレオチドを含む。一般的には、プライマーの少なくとも１０連続ヌクレオチドは、標的核酸分子に相補的である、例えば、完全に相補的である。
【００４３】
「シグナルプライマー」または「核酸シグナルプライマー」は、増幅プライマー（下参照）が相補的でありハイブリダイズ可能である標的核酸分子の部分の５’側の標的核酸分子の部分に相補的でありハイブリダイズ可能である少なくとも第一の部分を含む核酸プライマーである。シグナルプライマーは、標的核酸分子に相補的ではない、第一の部分の５’側の、第二の部分を随意に含む。シグナルプライマーは、シグナルプライマーが、伸長のための鋳型として使用される標的配列を有する標的配列にハイブリダイズされると、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより、例えば、伸長させることができる３’−ＯＨ基を含む。シグナルプライマーが標的核酸分子にハイブリダイズし、ハイブリダイズしたシグナルプライマーが伸長すると、伸長中に鋳型として使用される標的核酸の部分に相補的である配列を含む伸長産物が生成される。シグナルプライマーは、１つまたは複数の検出可能な成分、例えば、１つまたは複数の標識されたレポーター分子、例えば、蛍光分子をさらに含み得る。例となるシグナルプライマー、ＦＳＰおよびＲＳＰは、図１、２Ｂ、３Ｂおよび４〜６の図に示されている。１つまたは複数の増幅プライマーと併せて使用されると、シグナルプライマー（単数または複数）を、増幅プライマー（複数可）の添加に先立って、添加と同時に、または添加の後に標的核酸分子を含む反応に添加することが可能である。
【００４４】
「増幅プライマー」または「核酸増幅プライマー」は、ＬＡＭＰ反応中の標的核酸分子の増幅に適した核酸プライマーである。ＬＡＭＰ反応は、一般に、例えば、特許文献１、特許文献２におよび非特許文献１（以下「Notomi et al.」）に記載されており、これら文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。増幅プライマーは、３’から５’の順に、標的核酸分子の一部に相補的である第一の部分、および増幅プライマーの第一の部分がハイブリダイズする部分の５’側の標的核酸分子の部分と同一であるが、シグナルプライマーがハイブリダイズする標的核酸分子のもっとも近い部分の３’側である第二の部分を含む。増幅プライマーは、増幅プライマーの第一の部分が伸長のための鋳型として使用される標的配列を有する標的配列にハイブリダイズされると、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能になる３’−ＯＨ基を含む。増幅プライマーが標的核酸分子にハイブリダイズし、ハイブリダイズした増幅プライマーが伸長すると、伸長中に鋳型として使用される標的核酸の部分に相補的である配列を含む伸長産物が生成される。この伸長産物は、増幅プライマー、およびヘアピン構造を核酸配列と伸長産物の増幅プライマー部分のハイブリダイズにより形成することができるほど、増幅プライマー部分から十分な数のヌクレオチド離れて位置する増幅プライマーの第二の部分に相補的である核酸配列を含む。したがって、そのような伸長産物はヘアピン配列を含み、ヘアピン構造を形成することができる。いかなる特定の理論や機構にも縛られたくはないが、増幅プライマーとそれにもっとも近いシグナルプライマーが標的核酸分子にハイブリダイズすると、標的核酸分子に沿ったハイブリダイズしたプライマーの相対的位置は、ハイブリダイズした増幅プライマーの伸長が、ハイブリダイズしたシグナルプライマーおよび標的核酸分子からのその伸長産物を置換除去するような位置である。例となる増幅プライマー、ＦＬＰおよびＲＬＰは、図１〜３および５に示されている。
【００４５】
増幅産物、増幅された産物またはアンプリコンは、増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長により生じる標的配列のコピーである。これらの用語は、増幅反応の中間体を含めて最初の標的配列のコピーを含有する一本鎖増幅プライマー伸長産物および二本鎖増幅プライマー伸長産物のどちらかのことである。
【００４６】
二次増幅産物または二次産物は、シグナルプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長により生じる標的配列のコピーである。二次増幅産物または二次産物は、増幅された標的配列の内部セグメントを含む。これらの用語も、最終二本鎖形態を生じさせる工程における中間体を含む、シグナルプライマーの一本鎖伸長産物および二本鎖伸長産物のどちらかのことである。
【００４７】
「置換プライマー」は、増幅プライマーの下流の標的核酸分子の一部に相補的であり、ハイブリダイズ可能である核酸プライマーである。１つまたは複数の置換プライマーは、例えば、ＬＡＭＰ反応を実施するまたは開始するための増幅プライマーと併せて使用することが可能である。どんな特定の理論や機構にも縛られたくはないが、置換プライマーおよびそのもっとも近い増幅プライマーが標的核酸分子にハイブリダイズすると、標的核酸分子に沿ってハイブリダイズしたプライマーの相対的位置は、ハイブリダイズした置換プライマーの伸長が前記ハイブリダイズした増幅プライマーおよび前記標的核酸分子からのその伸長産物を置換除去するような位置である。例となる置換プライマー、Ｆ３およびＲ３は、図１〜３に示されている。
【００４８】
「標的核酸分子」は、本明細書に記載される方法によって検出することができる対象の核酸を含有することができる任意の核酸を指すことができる。例えば、標的核酸分子を使用して、本明細書に記載される核酸伸長産物および／または核酸検出産物を生じさせることができる。ある種の実施形態では、標的核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。標的核酸分子は、試料から採取した核酸を指すことができる、または試料から得られる最初の核酸由来の核酸、例えば、等温増幅による１回または複数回の複製、増幅、例えば、１つまたは複数のＬＡＭＰ反応によりおよび／または試料から得られる最初の核酸の逆転写により、例えば、生成される核酸を指すことができる。標的核酸分子は、１回または複数回の検出用途のために、特定の対象の部分Ｄまたはその相補体Ｄｃを含むことが可能である。他の方法で記述されなければ、用語「標的核酸分子」、「標的核酸」、「標的核酸配列」および「標的配列」は本明細書では互換的に使用される。
【００４９】
標的核酸分子は、例えば、生物学的試料中に存在することが可能である。生物学的試料は、例えば、動物、植物または微生物組織、細胞、培養物および排泄物またはそこからの抽出物を含むことが可能である。そのような微生物試料は、細菌試料、ウイルス試料またはマイコプラズマ試料などの生物学的試料を含むことが可能であるが、これらに限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含むことが可能である。生物学的試料は、例えば、気管支肺胞洗浄物、気管支洗浄物、咽頭滲出液、気管吸引物、血液試料、血清試料、血漿試料、骨試料、皮膚試料、軟組織試料、腸管検体、生殖器検体、母乳、リンパ試料、脳脊髄液、胸膜液、喀痰試料、尿試料、鼻汁、涙、胆汁試料、腹水液試料、膿汁、滑液、硝子体液、膣分泌液、精液および尿道試料などの対象試料または患者試料由来であることが可能である。いくつかの実施形態では、２つ、３つまたはそれよりも多い試料が対象から得られる。特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多い試料が、対象由来の２つまたはそれよりも多い組織、器官および／または分泌物から得られる。
【００５０】
本明細書で使用される「核酸検出産物」は、対象の標的核酸分子部分またはその相補体を含む核酸分子であり、核酸検出産物はヘアピン核酸配列または構造を含まない。例えば、核酸検出産物は、１つまたは複数の検出用途において特に重要である標的核酸分子部分Ｄまたはその相補体Ｄｃを含むことができる。一般に、核酸検出産物は全標的核酸分子を含まないことになる。核酸検出産物は、一般に、すべてのもしくは実質的にすべてのシグナルプライマーまたはその相補体を含むことになる。
【００５１】
２つの核酸は、２つの核酸間の対合（「塩基対合」、一般にワトソンクリック塩基対合）が生じることができるように、１つの核酸の十分な数の核酸塩基が第二の核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができる場合、互いに「相補的」である。本明細書で使用される「相補性」とは、第一の核酸と第二の核酸のヌクレオチド間で対合する能力のことである。２つの核酸間の非相補的核酸塩基は、２つの核酸が互いに特異的にハイブリダイズすることができるままであるという条件で、許容され得る。さらに、第一の核酸が、介在するまたは近接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、第二の核酸の１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズすることがある。ある種の実施形態では、第一の核酸、例えば、核酸プライマーまたはその特定の部分が、第二の核酸、例えば、標的核酸分子またはその特定の部分に、少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的である。
【００５２】
ある種の実施形態では、プライマーまたはその特定の部分は、標的核酸またはその特定の部分に完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。本明細書で使用されるように、「完全に相補的な」は、１つの核酸の各核酸塩基が第二の核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合することができることを意味する。例えば、２０核酸塩基プライマーは、プライマーに完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在するかぎり、４００核酸塩基長である標的配列に完全に相補的である。第一および／または第二の核酸の特定の部分に関連しても、「完全に相補的な」を使用することが可能である。例えば、３０核酸塩基プライマーのうちの２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長である標的配列に「完全に相補的」になることができる。３０核酸塩基プライマーのうちの２０核酸塩基部分は、各核酸塩基がプライマーのうちの２０核酸塩基部分に相補的である、対応する２０核酸塩基部分を標的配列が有するのであれば、標的配列に完全に相補的である。同時に、全３０核酸塩基アンチセンス化合物は、プライマーの残りの１０核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに応じて、標的配列に完全に相補的であることも完全には相補的でないこともある。非相補的核酸塩基（単数または複数）の位置は、核酸、例えば、プライマーの５’末端のこともあれば３’末端のこともある。あるいは、非相補的核酸塩基（単数または複数）は、核酸、例えば、プライマーの内部位置にあることもある。２つまたはそれよりも多い非相補的核酸塩基が存在する場合、この核酸塩基は連続している（すなわち、連結している）ことも連続していないこともある。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「部分」とは、標的核酸分子またはプライマー内の一定数の連続している（すなわち、連結している）核酸塩基のことである。核酸配列の一部は、全配列のうちの任意の小部分を指すことが可能であるが、一般には、最低でも、相補的核酸配列にハイブリダイズすることができる配列の長さ、例えば、少なくとも５〜８核酸塩基を指すことになる。
【００５４】
２つの核酸のパーセント相補性は、常法を使用して決定することが可能である。例えば、プライマーの２０核酸塩基のうちの１８が標的核酸分子のうちの一部に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズすると考えられる核酸プライマーは、９０パーセント相補性を表すであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化されていることもあれば相補的核酸塩基で分散されていることもあり、互いに隣接しているまたは相補的核酸塩基に隣接している必要はない。したがって、標的核酸と完全に相補的である２つの部分により隣接されている２つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長のプライマーは、標的核酸と９０％の全体的な相補性を有すると考えられる。これら２つの核酸のパーセント相補性は、当技術分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（塩基局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（非特許文献２および３）を使用して日常的に決定することが可能である。パーセント相同性、配列同一性または相補性は、例えば、スミスとウォーターマンのアルゴリズム（非特許文献４）を使用するデフォルト設定を使用して、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）により決定することができる。
【００５５】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸分子のアニーリングのことである。２つの核酸が互いに「ハイブリダイズする」と、または１つの核酸が別の核酸に「ハイブリダイズする」と、２つの核酸分子は、特定の反応に利用されている特定の条件（例えば、温度、塩および他の緩衝条件）下で、２つの核酸分子が互いにアニールすることができるほど十分な数の相補的核酸塩基を示す。ハイブリダイゼーションのもっとも一般的機構は、核酸分子の相補的核酸塩基間での水素結合（例えば、ワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合）を伴う。ハイブリダイゼーションは様々な条件下で起こることが可能である。厳密な条件は配列依存性であり、ハイブリダイズさせる核酸分子の性質および組成によって決定される。核酸ハイブリダイゼーション法および条件は当業者には公知であり、広範に記載されてきた。例えば、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７および非特許文献８を参照されたい。
【００５６】
本明細書で使用されるように、２つの核酸配列は、第一の核酸配列が第二の核酸配列の相補的配列に、これら２つの配列（すなわち、第一の核酸配列および第二の核酸配列の相補体）が互いに特異的にハイブリダイズすると考えられるほど十分相補的であれば、互いに「同一である」と呼ばれる場合。ある種の実施形態では、２つの同一の核酸配列またはその特定の部分は１００％同一である、すなわち、互いに正確な核酸塩基適合を共有する。
【００５７】
５．２．核酸検出および二次ＬＡＭＰ産物の作製のための方法
本明細書に提示される方法は、一般にＬＡＭＰ等温核酸増幅と併せて実施されるが、従来のＬＡＭＰを使用して生成される核酸中に存在する問題のある連鎖状の二次構造（例えば、標的核酸分子のいくつかの逆方向反復を有するステムループＤＮＡおよび同一鎖中に標的分子の交互逆方向反復間のアニーリングにより形成される複数のループを有するカリフラワー状構造であり、それぞれが高融解温度および折り畳まれる強い傾向を有する）のない核酸検出産物の作製を可能にする。例えば、一態様では、ＬＡＭＰ反応と併せてシグナルプライマーまたはプライマー対を利用して、対象の標的核酸分子部分またはその相補体を含む核酸検出産物であって、ヘアピン核酸配列または構造を含まず、それによって、特に検出を受け入れやすくなる核酸検出産物を生じさせることにより、１つまたは複数の標的核酸分子内の１つまたは複数の核酸配列のリアルタイム配列特異的作製および検出を可能にする方法および組成物が本明細書において提示される。例えば、核酸検出産物（単数または複数）は、レポータープローブの従来のハイブリダイゼーションによりまたは核酸検出産物（複数可）を生じさせるために使用される１つまたは複数のシグナルプライマーにレポーター基を組み込むことにより検出することが可能である。さらに、核酸検出産物は、例えば、ＬＡＭＰ工程と併せて、例えば、その工程中に、リアルタイムで生成され、例えば、リアルタイム蛍光フォーマットを使用して、単一反応容器、例えば、管内で複数の核酸検出産物を検出するという選択肢を提供することが可能である。
【００５８】
一実施形態では、核酸検出産物を生じさせるための方法が本明細書において提示される。この方法は、
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせる条件下で、標的核酸分子ならびに置換プライマー核酸Ｆ３とＲ３、増幅プライマーＦＬＰとＲＬＰ、およびシグナルプライマーＦＳＰとＲＳＰを組み合わせるステップであって、
（ｉ）標的核酸およびプライマー核酸のそれぞれが５’末端（「５’」）および３’末端（「３’」）を含み；
（ｉｉ）プライマー核酸Ｆ３、ＦＬＰおよびＦＳＰのそれぞれが、標的核酸分子３’から５’の順に、以下のＦ３、ＦＬＰ、ＦＳＰの通りに、標的核酸分子の異なる部分に相補的であり；
（ｉｉｉ）ＦＬＰは、３’から５’の順に、標的核酸分子の部分（Ｆ２ｃ）に相補的である第一の部分（Ｆ２）およびＦ２ｃの５’側であるがＦＳＰが相補的である標的核酸の部分（ＦＳｃ）の３’側の標的核酸分子の部分（Ｆ１）と同一である第二の部分（Ｆ１ｃ）を含み；
（ｉｖ）ＦＳＰは、３’から５’の順に、標的核酸分子の部分（ＦＳｃ）に相補的である第一の部分（ＦＳ）および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分（Ｓ１）を含み；
（ｖ）プライマー核酸Ｒ３、ＲＬＰおよびＲＳＰのそれぞれが、標的核酸分子５’から３’の順に、以下のＲ３、ＲＬＰ、ＲＳＰの通りに、標的核酸の異なる部分と同一であり；
（ｖｉ）ＲＬＰは、３’から５’の順に、標的核酸分子の部分（Ｒ２）と同一である第一の部分（Ｒ２）およびＲ２の３’側であるが、ＲＳＰと同一の標的核酸の部分（ＲＳ）の５’側の標的核酸分子の部分（Ｒ１）に相補的である第二の部分（Ｒ１ｃ）を含み；
（ｖｉｉ）ＲＳＰは、３’から５’の順に、ＦＳｃの５’側の標的核酸分子の部分（ＲＳ）と同一である第一の部分および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分（Ｓ２）を含み、その結果、５’から３’の順に、Ｒ１ｃ、Ｒ２、Ｒ１、ＲＳ、ＦＳｃおよび（随意に）Ｓ１ｃを含む核酸検出産物が生じるステップ、
を含む。ある種の実施形態では、標的核酸分子はＦＳｃの５’側およびＲＳの３’側である部分Ｄを含み、その結果、生じる核酸検出産物が５’から３’の順に、Ｒ１ｃ、Ｒ２、Ｒ１、ＲＳ、Ｄおよび（随意に）Ｓ１ｃを含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてＤの存在を検出するステップを含む。
【００５９】
別の実施形態では、方法は、５’から３’の順に、Ｓ１、ＦＳ、ＲＳｃ、Ｒ２ｃおよびＲ１を含む核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含む。ある種の実施形態では、標的核酸分子は、ＦＳｃの５’側およびＲＳの３’側である部分Ｄを含み、その結果、方法は、５’から３’の順に、Ｓ１、ＦＳ、Ｄｃ、ＲＳｃ、Ｒ２ｃおよびＲ１を含んで作製され、ＤｃはＤに相補的である核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および／または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてＤｃの存在を検出するステップを含む。
【００６０】
ある種の実施形態では、複数の異なる標的核酸分子から複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれよりも多い）異なる核酸検出産物を生じさせるための方法であって、本明細書に記載される核酸プライマー（Ｆ３、ＦＬＰ、ＦＳＰ、Ｒ３、ＲＬＰ、ＲＳＰ）の別々の組が、対象の標的核酸分子ごとに利用される方法が提示される。ある種の実施形態では、複数の核酸検出産物が、単一反応容器、例えば、管またはウェルにおいて生じる。他の態様では、複数の異なる核酸検出産物が検出され、例えば、単一反応容器、例えば、管またはウェルにおいて、例えば、閉管フォーマットにおいて検出される。
【００６１】
そのような実施形態では、プライマー核酸ＦＬＰおよびＲＬＰは、ＬＡＭＰ核酸増幅反応において使用するのに適した増幅プライマーである。いかなる特定の機構または理論にも縛られたくはないが、そのような方法はＦＬＰおよびＲＬＰ媒介ＬＡＭＰ核酸増幅反応を含む。
【００６２】
そのような実施形態では、プライマー核酸ＦＳＰおよびＲＳＰはシグナルプライマーの例である。
【００６３】
そのような実施形態では、プライマー核酸Ｆ３およびＲ３は置換プライマーの例である。
【００６４】
上の実施形態では、シグナルプライマー対が使用されたが、本明細書に提供される方法によれば、そのような反応における単一シグナルプライマーの使用も可能である。
【００６５】
そのような実施形態では、シグナルプライマー（単数または複数）は、置換プライマーおよび増幅プライマーと同時に組み合わせることが可能である。あるいは、シグナルプライマー（単数または複数）は、例えば、置換プライマーに先立って、または置換プライマーに続いて別々の時間に組み合わせることが可能である。例えば、ある種の実施形態では、１つまたは複数のシグナルプライマーは、増幅プライマーおよび置換プライマーの、例えば、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応の開始の約１分、２分、３分、４分、５分、１〜５分、５〜１０分、１０〜１５分、１５〜２０分、２０〜２５分、２５〜３０分、３０〜６０分または１〜２時間後に添加することが可能である。
【００６６】
本明細書に記載される方法の反応条件は、例えば、特定の核酸分子とプライマー分子配列およびハイブリダイズする長さ、ならびに選択された特定の伸長産物反応に応じて多少変化することになるが、そのような条件は当業者には周知であり、日常的に選択することが可能である。一般に、本明細書に記載される方法に適した条件は、従来のＬＡＭＰ反応を実施するのに適していると考えられる条件である。例えば、特許文献１（特に、コラム４〜７参照）および特許文献２、ならびに非特許文献１を参照されたい。これらの文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【００６７】
リアルタイムプライマー伸長によるＬＡＭＰ反応の増幅産物を検出するための方法も本明細書において提供されている。一実施形態では、ＬＡＭＰによる標的配列の同定は、その生成が標的配列の増幅と緊密に連動している二次増幅産物を同時に生じさせることにより検出される。ある種の実施形態では、この二次増幅産物は、どんな追加の増幅ステップまたは操作も必要とせずにＬＡＭＰ反応中に生成される。一実施形態では、二次増幅産物は、生じた後は、所望の標的配列の正常なＬＡＭＰに干渉することも阻害することもない。したがって、本方法は、特に、単一管フォーマット内での複数の標的配列または配列バリアントのリアルタイム検出が望ましい状況では、ＬＡＭＰのリアルタイムモニタリングおよび標的配列の増幅の検出に有用である。
【００６８】
ある種の態様では、ＬＡＭＰのための増幅プライマーは標的配列にハイブリダイズされ、標的配列は一般に、特許文献１、特許文献２および非特許文献１に記載されている通りに増幅される。これらの文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。これらの参考文献に記載されているように、ＬＡＭＰ法は、ＤＮＡポリメラーゼおよび標的ＤＮＡ上の合計で６個の異なる配列を認識する４つの特別に設計されたプライマーの組を用いることにより、等温条件下で、高度に特異的に、効率的におよび迅速にＤＮＡを増幅する。非特許文献１に記載されるように、ＬＡＭＰ反応中、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列を含有する内部プライマー（「増幅プライマー」）がＬＡＭＰを開始する。非特許文献１を参照されたい。次に、外部プライマー（「置換プライマー」）により刺激される鎖置換ＤＮＡ合成は一本鎖ＤＮＡを放出する。同文献。これは、標的のもう一方の末端にハイブリダイズする第二の増幅および置換プライマーにより刺激されるＤＮＡ合成の鋳型として働き、これによりダンベル状のステムループＤＮＡ構造が生成される。同文献。次に、このステムループＤＮＡはＬＡＭＰサイクリングの開始物質として働く。同文献。それに続くＬＡＭＰサイクリングでは、１つの増幅プライマーは産物上のループにハイブリダイズし、置換ＤＮＡ合成を開始して、最初のステムループＤＮＡおよび新しいステムループＤＮＡを生成する。同文献。サイクリング反応は続き、１時間未満で標的の１０9コピーが蓄積される。同文献。最終産物は、標的のいくつかの逆方向反復を有するステムループＤＮＡおよび同一鎖中に標的の交互逆方向反復間のアニーリングにより形成される複数のループを有するカリフラワー状構造である。その結果、ＬＡＭＰは、その高融解温度と折り畳まれる強い傾向のせいで通例のプローブベースのハイブリダイゼーション法による検出を受け入れにくい鎖状に連結されて自己相補的ヘアピン構造になる最初の標的配列（および相補体）の数多くのコピーからなる高分子量ＤＮＡを生成する。さらに、ＬＡＭＰ反応のステップは、例えば、特許文献１、コラム４〜７に詳細に記載されており、この文献の開示は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【００６９】
しかし、ＬＡＭＰ反応により生成された増幅産物を検出する、モニターするまたは場所を突き止めるのに使用するための二次増幅産物の同時（simultaneous or concurrent）生成をもたらす少なくとも１つのシグナルプライマーをさらに含むＬＡＭＰ反応が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、二次増幅産物は、その検出、捕獲または固定化を促進する特徴も含有し得る。
【００７０】
二次増幅産物は、反応混合物に少なくとも１つのシグナルプライマーを含めることにより本明細書に記載されるＬＡＭＰ反応において生成される。いくつかの実施形態では、フォワードＬＡＭＰ増幅プライマーとリバースＬＡＭＰ増幅プライマーのプライミング部位間に位置する部位にハイブリダイズする２つのシグナルプライマーを含むことが好ましいことがある。さらに他の実施形態では、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれよりも多いシグナルプライマーが使用され、そのようなシグナルプライマーは２つ、３つ、４つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントを同時に検出することが可能である。
【００７１】
本方法のある種の態様では、シグナルプライマー（単数または複数）は、増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列にハイブリダイズする。一実施形態では、そのようなプライマーは、増幅プライマーの伸長に類似する方法でポリメラーゼにより伸長される。シグナルプライマーは標的配列中の部位でハイブリダイズし、その結果、増幅プライマーの伸長がシグナルプライマーの伸長産物を置換除去する。一実施形態では、シグナルプライマーの３’末端は、標的配列にハイブリダイズする配列を含む。ある種の実施形態では、全シグナルプライマーは、例えば、それが改変されていないまたはレポーター基、標識もしくは親和性リガンドの付加による検出のために化学的に改変されるときに、標的配列にハイブリダイズし得る。他の実施形態では、シグナルプライマーの５’末端は、標的配列にハイブリダイズしていないが、二次増幅産物の検出または捕獲を促進する特別なヌクレオチド配列（構造的特徴を伴うことが多い）を含有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化学的改変および特別な配列は、シグナルプライマーがハイブリダイズされ鋳型上で伸長されるときには二次増幅産物に組み込まれる。
【００７２】
一実施形態では、反応のための鋳型は、相補的ヌクレオチド配列が一本鎖で連結されている核酸である。一本鎖は、塩基対合が解離すると２つまたはそれよりも多い分子に分離されていない鎖である。別の実施形態では、反応において鋳型の働きをする核酸は、鎖（単数または複数）中の相補的配列間でループを形成するためのヌクレオチド配列を含有する。一実施形態では、鋳型の相補的ヌクレオチド配列は塩基対合を形成することが可能である、または同一鎖でアニールすることが可能である。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、曲がった蝶番部分で塩基対合することができないループ／ヘアピン配列を含む。
【００７３】
２つの核酸配列という文脈において本明細書で使用される用語相補的は、完全な相補性を必要としないが、使用される条件下で２つの核酸をアニールさせるのに十分な相補性のみを必要とする。
【００７４】
本明細書で利用されるプライマーは、一般に、相補的核酸配列にハイブリダイズすると、例えば、核酸増幅反応において、例えば、酵素的核酸複製により伸長させることができる３’末端の−ＯＨ基を提供する核酸を含む。ある種の実施形態では、プライマーは、相補的鎖と塩基対合することができ核酸を合成する様々な反応において所与の環境下で必要な特異性を維持するのに十分なヌクレオチド長を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、プライマーは約５から２００ヌクレオチド、さらに好ましくは約１０から５０ヌクレオチドを含む。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＬＡＭＰ反応において増幅プライマーとして機能しないシグナルプライマーを用いる。非標的鋳型上でのそのようなシグナルプライマーの誤った伸長を通じて形成されるいかなる伸長産物も、それに続く増幅を受けることはない。ある種の実施形態では、シグナルプライマーは、バックグランドシグナルレベルが明らかに増加することなく、増幅の開始に先立って増幅反応に添加し得る。これにより、検出方法は多いに簡素化され、ＬＡＭＰ反応の均質なリアルタイム解析が可能になる。
【００７５】
標的核酸配列は、例えば、生物学的試料に含有されていても、生物学的試料から得られてもよい。生物学的試料は、例えば、動物、植物または微生物組織、細胞、培養物および排泄物またはそこからの抽出物を含むことが可能である。そのような微生物試料は、細菌試料、ウイルス試料またはマイコプラズマ試料などの生物学的試料を含むことが可能であるが、これらに限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含むことが可能である。
【００７６】
ある種の実施形態では、核酸は、等温条件下で単一酵素により増幅される。特定の実施形態では、本明細書の方法は、相補鎖の鎖置換型合成を触媒するポリメラーゼを利用することができる。
【００７７】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法は、温度サイクルの非存在下で行われる。鋳型として使用される核酸が二本鎖である実施形態では、核酸は、少なくとも最初は熱変性を受けてプライマーアニーリングを可能にし得る。
【００７８】
本明細書に記載される方法は、配列特異的方法で、１つを超える標的の検出、例えば、同時または多重検出を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントの検出が実施される。
【００７９】
本方法には、一態様では、ループ媒介等温増幅反応において核酸シグナル伸長産物および増幅を生じさせるための方法が含まれる。この方法は、
（ａ）第一の核酸シグナルプライマー、第一の核酸増幅プライマーおよび第一の核酸置換プライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、
第一の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が、第一の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の下流の標的配列領域にハイブリダイズし；
第一の核酸増幅プライマーが、ｉ）第一のシグナルプライマーがハイブリダイズする標的配列領域の上流の標的配列領域にハイブリダイズする３’末端部分、およびｉｉ）第一の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の下流の標的配列の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含み；
第一の核酸置換プライマーが、第一の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の上流の標的配列領域にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした第一の核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて第一のシグナル伸長産物を生成し；ハイブリダイズした第一の核酸増幅プライマーを核酸標的配列上で伸長させ、その結果、第一の増幅プライマーの伸長が核酸標的配列由来の第一のシグナル伸長産物を置換除去し；第一の核酸置換プライマーを伸長させ、その結果、第一の核酸置換プライマーの伸長が核酸標的配列由来の第一の増幅伸長産物を置換除去するステップと
を含む。
【００８０】
本明細書で使用されるように、用語「下流」とは、例えば、上記（ａ）において第一の核酸増幅プライマーと呼ばれるプライマーから伸長産物が伸長するほうの方向または領域のことである。本明細書で使用されるように、用語「上流」とは、例えば、上記（ａ）において第一のシグナルプライマーと呼ばれるプライマーから伸長産物が伸長するほうの方向または領域から離れている、または反対の領域または方向のことである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、上記方法は、
（ａ）第二の核酸シグナルプライマー、第二の核酸増幅プライマーおよび第二の核酸置換プライマーを第一のシグナル伸長産物の領域にハイブリダイズさせるステップであって、
第二の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が、第二の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズし；
第二の核酸増幅プライマーが、ｉ）第二のシグナルプライマーがハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズする３’末端部分、およびｉｉ）第二の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含み；
第二の核酸置換プライマーが、第二の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした第二の核酸シグナルプライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて第二のシグナル伸長産物を生成し；ハイブリダイズした第二の核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二のシグナル伸長産物を置換除去し；第二の核酸置換プライマーを伸長させ、その結果、第二の核酸置換プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二の増幅伸長産物を置換除去するステップと
をさらに含む。
【００８２】
ループ媒介等温増幅反応において核酸シグナル伸長産物および増幅を生じさせるための方法が本明細書ではさらに提供される。この方法は、
（ａ）第二の核酸シグナルプライマー、第二の核酸増幅プライマーおよび第二の核酸置換プライマーを第一のシグナル伸長産物の領域にハイブリダイズさせるステップであって、
第二の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が、第二の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズし；
第二の核酸増幅プライマーが、ｉ）第二のシグナルプライマーがハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズする３’末端部分、およびｉｉ）第二の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含み；
第二の核酸置換プライマーが、第二の核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズし；
第一のシグナル伸長産物が、ループ媒介等温増幅反応において増幅と同時に生じるステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした第二の核酸シグナルプライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて第二のシグナル伸長産物を生成し；ハイブリダイズした第二の核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二のシグナル伸長産物を置換除去し；第二の核酸置換プライマーを伸長させて、その結果、第二の核酸置換プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二の増幅伸長産物を置換除去するステップと
を含む。
【００８３】
一実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を生じさせるための方法が本明細書において提示される。この方法は、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含み、前記領域はヘアピン構造のループ領域に位置していないステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸張産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物は１つのヘアピン構造を含むステップと
を含む。
【００８４】
上記の方法は、例えば、第一のシグナル伸長産物を検出するステップをさらに含み得る。一実施形態では、シグナルプライマーは、ハイブリダイゼーション領域およびレポーター領域を含み、ハイブリダイゼーション領域は核酸標的配列の領域にハイブリダイズし、レポーター領域は蛍光シグナルを発生させる。別の実施形態では、シグナルプライマーはレポーター基を欠く。
【００８５】
別の実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を生じさせるための方法。この方法は、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズするステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物がヘアピン構造を含むステップと、
（ｃ）核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物がヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナルがその５’末端にヘアピン構造を有するステップと
を含む。
【００８６】
上記方法は、第二のシグナル伸長産物および／または第三のシグナル伸長産物を検出するステップをさらに含み得る。
【００８７】
さらに別の実施形態では、ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を生じさせるための方法が本明細書において提示される。この方法は、
（ａ）核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズするステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも１つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物がヘアピン構造を含むステップと、
（ｃ）核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物がヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナル伸長産物が一本鎖であり、その５’末端にヘアピン構造を有するステップと、
（ｄ）核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物が二本鎖核酸を含むステップと
を含む。
【００８８】
一実施形態では、上記の方法は、第四のシグナル伸長産物を検出するステップをさらに含む。
【００８９】
ある種の実施形態では、２つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントは同時に検出され、前記２つまたはそれよりも多い標的配列にハイブリダイズする２つまたはそれよりも多い核酸シグナルプライマーが使用される。一実施形態では、２つまたはそれよりも多い標的配列は、同じ連続するヌクレオチド配列に、または２つの異なるヌクレオチド配列上に存在する。別の実施形態では、２つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントは、１つの生物にまたは２つまたはそれよりも多い異なる生物に由来する。いくつかの実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物はリアルタイムで検出される。ある種の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は閉管フォーマットにおいて検出される。他の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は増幅後に検出される。
【００９０】
一実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、ハイブリダイゼーションプローブにより検出される。１つのそのような実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、単一ヌクレオチド差異感受性プローブである。別の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは蛍光発生性である。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンである。別の特定の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、蛍光発生プローブまたは表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）標識プローブを使用して検出される。
【００９１】
ある種の実施形態では、シグナルプライマーは、ハイブリダイゼーション領域およびレポーター領域を含み、ハイブリダイゼーション領域は核酸標的配列の領域にハイブリダイズし、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物はレポーター領域によって検出される。一実施形態では、レポーター基は蛍光シグナルを発生する。別の実施形態では、レポーター基は蛍光発生ヘアピンである。別の実施形態では、シグナルプライマーはレポーター基を欠く。さらに別の実施形態では、第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物、第三のシグナル伸長産物または第四のシグナル伸長産物は、シグナルプライマーのうちの１つに組み込まれたシグナル産物の捕獲を促進する改変によって検出される。本明細書に記載される方法を使用すれば、例えば、薬物耐性ＴＢを検出し得る。
【００９２】
一実施形態では、シグナルプライマー（単数または複数）は、ＬＡＭＰ反応の開始後に添加される。例えば、シグナルプライマー（単数または複数）は、ＬＡＭＰ反応の開始の１分、２分、３分、４分、５分、１〜５分、５〜１０分、１０〜１５分、１５〜２０分、２０〜２５分、２５〜３０分、または３０〜６０分または１時間を超えた後に添加し得る。
【００９３】
さらに別の実施形態では、シグナルプライマーは、増幅プライマー（単数または複数）および／もしくは置換プライマー（単数または複数）の添加と同時にＬＡＭＰ反応に添加される、またはＬＡＭＰ反応の開始と同時に添加される。
【００９４】
本方法は、ループ媒介等温増幅反応においてシグナル伸長産物および増幅を同時に生じさせるための方法であって、
（ａ）第一のシグナルプライマーを標的配列の第一の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
（ｂ）標的配列の第一の鎖にハイブリダイズする３’末端部分と標的配列の第一の鎖の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む第一の増幅プライマーを、第一のシグナルプライマーの上流の標的配列の第一の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
（ｃ）ハイブリダイズした第一のシグナルプライマーを標的配列の第一の鎖上で伸長させて第一のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第一の増幅プライマーを標的配列の第一の鎖上で伸長させ、その結果、第一の増幅プライマーの伸長が標的配列由来の第一のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
（ｄ）第一の増幅プライマーの上流の標的配列の第一の鎖に第一の置換プライマーをハイブリダイズさせ、第一の置換プライマーをその３’末端から伸長させて、標的配列由来の第一の増幅伸長産物を置換除去するステップと、
（ｅ）第二のシグナルプライマーを置換された第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズする３’末端部分と第一のシグナル伸長産物の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む第二の増幅プライマーを第二のシグナルプライマーの上流の第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
（ｇ）ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて第二のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第二の増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
（ｈ）第二の置換プライマーを第二の増幅プライマーの上流の第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、第二の置換プライマーをその３’末端から伸長させて、第一のシグナル伸長産物由来の第二の増幅伸長産物を置換除去するステップと、
を含む方法も含むことが可能である。
【００９５】
そのような方法の一実施形態では、第一のシグナル伸長産物と第二のシグナル伸長産物は自己相補的ヘアピン構造を欠く。そのような方法の別の実施形態では、第一のシグナルプライマーの５’末端部分は、標的配列の第一の鎖の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含まず、第二のシグナルプライマーの５’末端部分は第一のシグナル伸長産物の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含まない。
【００９６】
ある種の実施形態では、方法は、第一のシグナルプライマーを置換された第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした第一のシグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、二本鎖シグナル産物が生じるステップをさらに含む。
【００９７】
一実施形態では、方法は、
（ａ）第二のシグナルプライマーを標的配列の第二の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
（ｂ）標的配列の第二の鎖にハイブリダイズする３’末端部分および標的配列の第二の鎖の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む第二の増幅プライマーを、第二のシグナルプライマーの上流の標的配列の第二の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
（ｃ）ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーを標的配列の第二の鎖上で伸長させて第三のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第二の増幅プライマーを標的配列の第二の鎖上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が標的配列由来の第三のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
（ｄ）第二の増幅プライマーの上流の標的配列の第二の鎖に第二の置換プライマーをハイブリダイズさせ、第二の置換プライマーをその３’末端から伸長させて、標的配列由来の第三の増幅伸長産物を置換除去するステップと、
（ｅ）第一のシグナルプライマーを置換された第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズする３’末端部分および第三のシグナル伸長産物の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、第一の増幅プライマーを第一のシグナルプライマーの上流の第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
（ｇ）ハイブリダイズした第一のシグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて第四のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第一の増幅プライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第一の増幅プライマーの伸長が第三のシグナル伸長産物由来の第四のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
（ｈ）第一の置換プライマーを第一の増幅プライマーの上流の第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、第一の置換プライマーをその３’末端から伸長させて、第三のシグナル伸長産物由来の第四の増幅伸長産物を置換除去するステップと
をさらに含む。
【００９８】
これらの方法は、例えば、第二のシグナルプライマーを置換された第四のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーを第四のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、二本鎖シグナル産物が生じるステップをさらに含み得る。
【００９９】
ある種の実施形態では、２つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントは同時に使用され、前記標的配列または配列バリアントごとにシグナル産物および増幅産物が生じる。そのような実施形態では、２つまたはそれよりも多い標的または配列バリアントのシグナル伸長産物を検出し得る。いくつかの実施形態では、シグナル伸長産物は、プローブベースのハイブリダイゼーション法により検出される。特定の実施形態では、シグナル伸長産物は分子ビーコンにより検出される。
【０１００】
ある種の実施形態では、シグナル産物はリアルタイムで検出される。他の実施形態では、シグナル産物は増幅後に検出される。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、薬物耐性ＴＢを検出し得る。
【０１０１】
上記方法のいくつかの実施形態は、シグナルプライマーのうちの１つもしくは複数に組み込まれた化学的改変または特別なヌクレオチド配列によってシグナル産物を検出するステップをさらに含む。一実施形態では、シグナル産物は、シグナルプライマーのうちの１つに組み込まれたレポーター基によって検出される。特定の実施形態では、レポーター基は蛍光発生ヘアピンである。別の実施形態では、シグナルプライマーはレポーター基を欠く。さらに他の実施形態では、方法は、シグナルプライマーのうちの１つに組み込まれたシグナル産物の捕獲を促進する改変物によってシグナル産物を検出するステップをさらに含む。
【０１０２】
一実施形態では、シグナルプライマーは、それが用いられるＬＡＭＰ反応において増幅プライマーとしては機能しない。そのような実施形態では、この特徴のせいで、シグナルプライマーは、他のプライマーベースの方法により生じる高レベルのバックグランドシグナルを促進することなく、増幅反応混合物に添加することが可能になり得る。高レベルのバックグランドシグナルは、プライマーが増幅プライマーとして機能することができる場合の疑似的に刺激された非標的ＤＮＡの非特異的プライミングおよびそれに続く増幅のせいであると考えられている。
【０１０３】
図１、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４、５、６および７は、本明細書において提示される方法のある種の実施形態、例えば、１対のシグナルプライマーが標的配列の増幅を検出するために使用される実施形態を例示している。いかなる特定の機構にもまたは理論にも縛られたくはないが、置換プライマー、増幅プライマーおよびシグナルプライマーは、提示された標的作製計画において標的配列に同時にハイブリダイズし得、その結果、各上流プライマーの伸長が下流プライマーの伸長産物を置換除去し、増幅可能な標的断片および二次増幅産物を同時に生じさせる。
【０１０４】
図１は、シグナルプライマーＦＳＰがＬＡＭＰ反応混合物に含まれ、シグナルプライマーのＦＳ部分が標的配列のＦＳｃ領域にハイブリダイズすることにより第一の増幅プライマーの下流（本明細書において使用されるようにおよびこの図で例示されるように、この用語は、伸長産物がこの場合には第一の増幅プライマーと呼ばれるプライマーから伸長するほうの方向または領域を指す）の標的配列にハイブリダイズする実施形態を例示している。示されるＦＳＰシグナルプライマー配列のＳ１部分は、レポーター基もしくは標識を含み、または検出もしくは捕獲を促進する構造的特徴である。Ｓ１はハイブリダイズすることもしないこともあるが、シグナルプライマーの異なる機能的特徴を明確にするために、ここではハイブリダイズしないとして示されている。この説明のために、Ｓ１はレポーター基を含有することになるが、他の化学的改変または構造的特徴を含有することもある。いくつかの実施形態では、本明細書において利用されるシグナルプライマーは、図１〜６に示されているＳ１および／またはＳ２領域を欠く。ＦＬＰは、シグナルプライマーの上流（本明細書において使用されるようにおよびこの図で例示されるように、この用語は、伸長産物がこの場合にはシグナルプライマーと呼ばれるプライマーから伸長するほうの方向もしくは領域から離れている、または反対の領域もしくは方向を指す）の標的配列にハイブリダイズするＬＡＭＰ増幅プライマーである。ＦＬＰはＦ２部分およびＦ１ｃ部分を含有しており、Ｆ２部分は標的配列にハイブリダイズし、Ｆ１ｃ部分は、新たに合成される鎖の領域に相補的であり、その結果、標的配列由来の増幅プライマー伸長産物が置換されるとこの部分がループ構造を形成する（構造Ｐ２参照）。増幅プライマーＦＬＰもシグナルプライマーＦＳＰも、鋳型として標的配列を使用してＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。シグナルプライマー伸長産物Ｐ１は、増幅プライマーＦＬＰの伸長により鋳型から置換除去される。増幅プライマー伸長産物Ｐ２は、今度は、置換プライマーＦ３の伸長により鋳型から置換除去され、Ｐ２およびＰ３産物を生じる。増幅プライマー伸長産物のＦ１ｃ領域は同一鎖のＦ１領域にハイブリダイズし、したがって、その５’末端にループ状構造を形成する。シグナルプライマー伸長産物Ｐ１は、本明細書に記載される方法を使用して独自に生じる産物である。
【０１０５】
図２Ａは、第二のＬＡＭＰ増幅プライマー（ＲＬＰ）および第二の置換プライマー（Ｒ３）がシグナル伸長産物Ｐ１（図１に示される増幅工程において生成される）にハイブリダイズする実施形態を例示している。ＲＬＰのＲ２部分はＰ１のＲ２ｃ領域にハイブリダイズし、鋳型として第一のシグナル伸長産物を使用してＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。第二の増幅プライマー伸長産物は、第二の置換プライマーＲ３により鋳型から置換除去され、産物Ｐ１．２およびＰ１．３を生成する。Ｐ１．２産物のＲ１ｃ領域は同一鎖のＲ１領域にハイブリダイズし、したがって、その５’末端にループ状構造を形成する。
【０１０６】
図２Ｂは、第二のシグナルプライマー（ＲＳＰ）、第二のＬＡＭＰ増幅プライマー（ＲＬＰ）および第二の置換プライマー（Ｒ３）がシグナル伸長産物Ｐ１（図１に示される増幅工程において生成される）にハイブリダイズする実施形態を例示している。ＲＳＰのＲＳ部分は、第二の増幅プライマーの下流のＰ１標的配列のＲＳｃ領域にハイブリダイズする。ＲＳＰシグナルプライマー配列のＳ２部分は、レポーター基もしくは標識を含む、または検出もしくは捕獲を促進する構造的特徴である。Ｓ２は、Ｐ１にハイブリダイズすることもしないこともある（図２Ｂでは、Ｓ２はＰ１にハイブリダイズしない）。ＲＬＰは、シグナルプライマーの上流の標的配列にハイブリダイズする第二のＬＡＭＰ増幅プライマーである。ＲＬＰはＲ２部分とＲ１ｃ部分を含有しており、Ｒ２部分は標的配列にハイブリダイズし、Ｒ１ｃ部分は新たに合成された鎖の領域に相補的であり、その結果、増幅プライマー伸長産物が標的配列から置換除去されるとＲ１ｃ部分はループ構造を形成する（構造Ｐ２参照）。産物はＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。シグナルプライマー伸長産物Ｐ１．１は、増幅プライマーＲＬＰの伸長により鋳型Ｐ１から置換除去される。増幅プライマー伸長産物Ｐ１．２は、今度は置換プライマーＲ３の伸長により鋳型から置換除去され、Ｐ１．２およびＰ１．３産物を生じる。増幅プライマー伸長産物Ｐ１．２のＲ１ｃ領域は、同一鎖のＲ１領域にハイブリダイズし、したがって、その５’末端にループ状構造を形成する。Ｐ１．１のキーとなる特徴は、分子ビーコンなどの蛍光発生ハイブリダイゼーションプローブによる標的配列の検出を妨害すると考えられるヘアピン構造を欠くことである。このようなヘアピンの欠如の結果、そのような二次ＬＡＭＰ産物における変異（例えば、単一ヌクレオチド差異もしくはＳＮＰ）または配列バリアントは、分子ビーコンまたは他のプローブ（例えば、ＳＮＰ感受性プローブ）により検出することが可能である。
【０１０７】
図３Ａは、第二のＬＡＭＰ増幅プライマー（ＲＬＰ）および第二の置換プライマー（Ｒ３）が増幅伸長産物Ｐ２（図１に示される増幅工程において生成される）にハイブリダイズする実施形態を例示している。ＲＬＰのＲ２部分はＰ２のＲ２ｃ領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。第二の増幅プライマー伸長産物は、第二の置換プライマーＲ３によりその鋳型から置換除去され、産物Ｐ２．２およびＰ２．３を生成する。Ｐ２．２産物のＲ１ｃ領域は同一鎖のＲ１領域にハイブリダイズして、したがって、その５’末端にループ状構造を形成する。Ｐ２鋳型はその５’末端にループ構造を含有しているので、得られるＰ２．２産物は、５’と３’末端両方のループを特徴とし、ダンベル状構造を生成する。
【０１０８】
図３Ｂは、第二のシグナルプライマー（ＲＳＰ）、第二のＬＡＭＰ増幅プライマー（ＲＬＰ）および第二の置換プライマー（Ｒ３）が、シグナル伸長産物Ｐ２（図１に示される増幅工程において生成される）にハイブリダイズする実施形態を例示している。ＲＳＰのＲＳ部分は、第二の増幅プライマーの下流のＰ１標的配列のＲＳｃ領域にハイブリダイズする。ＲＳＰシグナルプライマー配列のＳ２部分は、レポーター基もしくは標識を含み、または検出もしくは捕獲を促進する構造的特徴である。Ｓ２はＰ２にハイブリダイズすることもしないこともある（図３Ｂでは、Ｓ２はＰ２にハイブリダイズしない）。ＲＬＰは、シグナルプライマーの上流の標的配列にハイブリダイズする第二のＬＡＭＰ増幅プライマーである。ＲＬＰはＲ２部分およびＲ１ｃ部分を含有し、Ｒ２部分は標的配列にハイブリダイズし、Ｒ１ｃ部分は新たに合成された鎖の領域に相補的であり、その結果、標的配列から増幅プライマー伸長産物が置換されるとそれがループ構造を形成する（構造Ｐ２．２参照）。産物はＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。シグナルプライマー伸長産物Ｐ２．１は、増幅プライマーＲＬＰの伸長により鋳型Ｐ２から置換除去される。増幅プライマー伸長産物Ｐ２．２は、今度は置換プライマーＲ３の伸長により鋳型から置き換えられ、Ｐ２．２およびＰ２．３産物を生じる。増幅プライマー伸長産物Ｐ２．２のＲ１ｃ領域は、同一鎖のＲ１領域にハイブリダイズし、したがって、その５’末端にループ状構造を形成する。Ｐ２鋳型はその５’末端にループ構造を含有しているので、得られるＰ２．２産物は、５’と３’末端両方のループを特徴とし、ダンベル状構造を生成する。
【０１０９】
図４は、第一のシグナルプライマー（ＦＳＰ）が、伸長産物Ｐ２．２（図３Ａおよび３Ｂに示される増幅工程において生成される）であって、その５’および３’末端にＬＡＭＰ反応中に生じるダンベルループ構造を含有しているＰ２．２にハイブリダイズする実施形態を例示している。ＦＳＰプライマーのＦＳ部分はＰ２．２のＦＳｃ部分にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。伸長産物は、図４に例示される内部５’から３’伸長により置換されて、Ｐ２．２．１およびＰ２．２．２を生成し、Ｐ２．２．１産物は二本鎖であり、Ｐ２．２．２シグナル伸長産物はその３’末端にループを含有し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて二本鎖産物Ｐ２．２．２．１を形成し得る。
【０１１０】
図５は、第二の増幅プライマー（ＲＬＰ）が、伸長産物Ｐ２．２．２．１（図４に示される増幅工程において生成される）にハイブリダイズし、ＲＬＰは、Ｐ２．２．２．１のループ領域であって、反対鎖と塩基対合を形成しない領域の内側の配列にハイブリダイズする。ＲＬＰプライマーのＲ２部分は、Ｐ２．２．２．１のループにおけるＲ２ｃ部分にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されてＰ．２．２．２．１．２を作製し、そのような伸長はＰ２．２．２．１のループ領域を開いてＰ．２．２．２．１．２を形成する。さらに、第一のシグナルプライマー（ＦＳＰ）はＰ．２．２．２．１．２にハイブリダイズし、ＦＳＰのＦＳ部分はＦＳｃにハイブリダイズし、Ｓ１部分はＳ１ｃにハイブリダイズしてＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、そのような伸長はＰ．２．２．２．１．２から伸長産物Ｐ．２．２．２．１．１を置換除去し、二本鎖産物Ｐ．２．２．２．１．３も生成する。Ｐ．２．２．２．１．１は一本鎖である。
【０１１１】
図６は、第一のシグナルプライマー（ＦＳＰ）が伸長産物Ｐ．２．２．２．１．１にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて二本鎖産物Ｐ．２．２．２．１．１ｃを生成する実施形態を示す。
【０１１２】
一実施形態では、シグナルプライマー（単数または複数）（例えば、図１〜６に示されているＦＳＰおよび／またはＲＳＰ）は、ＬＡＭＰ反応の開始後に、例えば、ＬＡＭＰ反応の開始の１分、２分、３分、４分、５分、１〜５分、５〜１０分、１０〜１５分、１５〜２０分、２０〜２５分、２５〜３０分、または３０〜６０分または１時間を超えた後に添加される。いくつかの実施形態では、シグナルプライマー（単数または複数）およびＬＡＭＰ増幅プライマー（単数または複数）は増幅反応に同時には添加されない。そのような一実施形態では、図１、２Ｂおよび３Ｂに示されるシグナル伸長産物は作製されない。なぜならば、シグナルプライマー（単数または複数）の添加時に、ＬＡＭＰ反応中のすべてのＤＮＡがＰ３（図１参照）などの二本鎖産物にまたはＰ２．２（図４参照）などの産物に変換されるからである。別のそのような実施形態では、図４、５および６に示される種類のシグナル伸長産物は生じる。いくつかのそのような実施形態では、生じたすべてのシグナル伸長産物は、Ｐ２．２．１、Ｐ２．２．２もしくはＰ２．２．２．１のうちの１つの構造（図４に示されている）、またはＰ２．２．２．１．２もしくはＰ２．２．２．１．３もしくはＰ２．２．２．１．１の構造（図５に示されている）、またはＰ２．２．２．１．１ｃの構造（図６に示されている）に実質的に類似しているまたは同一である少なくとも１つの構造を有する。他のそのような実施形態では、方法はＰ１（図１に示されている）、Ｐ１．１（図２Ｂ）またはＰ２．１（図３Ｂに示されている）などのシグナル伸長産物を作製しない。
【０１１３】
図１〜６は、説明の目的のためだけに提示されており、ＬＡＭＰ反応中に生成されるすべての分子種を示しているわけではなく、これらの図は、ＦＳＰおよびＲＳＰなどの二次プライマーがＬＡＭＰ反応に含まれているときに形成される二次産物の種類を示してもいない。同様に、図１〜６は、ＬＡＭＰ反応の産物の一部および方法のＬＡＭＰ反応中に生成される二次産物の一部のみを例示している。さらに、例えば、Ｐ１．１などの提示される増幅反応の伸長産物は、ＬＡＭＰ反応中の様々な中間体を含む多くの経路を通じて生成されることになる。
【０１１４】
本明細書に存在する方法は、ループプライマーなどのＬＡＭＰ増幅反応におけるループプライマーの使用をさらに企図している。例えば、非特許文献９を参照されたい。そのようなループプライマーは、一般に、ＬＡＭＰ増幅反応産物のステムループにハイブリダイズするが、増幅プライマーがハイブリダイズするループにはハイブリダイズしない。そのようなループプライマーを使用すれば、例えば、ＬＡＭＰ反応時間を実質的に減らすことが可能である。そのような実施形態では、本方法は、例えば、ループプライマー（単数または複数）をさらに含有することが可能である。例えば、方法は、１つの標的配列の増幅のために１つもしくは２つのループプライマーを利用することが可能であり、または、例えば、増幅されるおよび／または検出される標的配列の数に応じて３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多いループプライマーを利用することが可能である。そのようなループプライマーは、例えば、図１、３Ａもしくは３Ｂにおける領域Ｆ２とＦ１間のＰ２の一本鎖ループに；または図２Ａもしくは２Ｂにおける領域Ｒ２とＲ１の間のＰ１．２のループに；または図３Ａもしくは４におけるＰ２．２のループにハイブリダイズし得る。
【０１１５】
本方法は、例えば、１０分未満、１５分未満、２０分未満、３０分未満、４５分未満、５０分未満、６０分未満で、または１．５時間未満、または２時間未満、または３時間未満で、二次ＬＡＭＰシグナル伸長産物を生じさせるおよび／または検出するステップを含むことが可能である。
【０１１６】
５．３．核酸検出産物および二次ＬＡＭＰ産物の検出のための方法
本明細書に記載される核酸検出産物および二次ＬＡＭＰ産物のキーとなる特徴は、分子ビーコンなどの従来の技法による通例のＬＡＭＰ産物の検出を妨げると考えられるヘアピン構造を形成することができるヘアピン、潜在的ヘアピン構造またはヘアピン配列が存在しないことである。したがって、例えば、プローブもしくは他の配列ハイブリダイゼーションによって核酸配列を検出するための当業者には公知のいかなる技法も、本明細書に記載される核酸検出産物および二次ＬＡＭＰ産物を検出するのに日常的に使用することが可能である。そのような検出のために日常的に使用することが可能な技法の例となる非限定的例は下に提示されている。
【０１１７】
一実施形態では、上記の通りに作製され図１〜６に例示されている二次産物の配列Ｄ内に含有される特定の標的配列は、ハイブリダイゼーションプローブにより検出され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸配列にハイブリダイズしてその検出を促進する核酸ならいずれでもよい。一般に、ハイブリダイゼーションプローブは、可変長の核酸の断片（例えば、約１０、２５、５０もしくは１００塩基から、最大約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１５００もしくは２０００塩基長）であり、これを使用して、プローブ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的）の存在を核酸試料において検出する。いくつかの実施形態では、プローブは、プローブと標的間の相補性のせいでプローブ−標的塩基対形成を可能にする塩基配列を有する一本鎖核酸にハイブリダイズすることにより機能する。ある種の実施形態では、プローブのその標的配列へのハイブリダイゼーションを検出するために、プローブに検出可能マーカーを用いてタグを付けるまたは標識する。検出可能マーカーは、例えば、放射性同位元素、抗体ベースのマーカー、蛍光ベースのマーカー、または他の任意のマーカーでもよい。一実施形態では、分子マーカーは非放射性である。別の実施形態では、プローブは蛍光標識で標識される。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブを使用する標的検出法は、蛍光消光技術を用いる。いくつかの実施形態では、標識プローブは先ず、一本ＤＮＡ鎖に変性され（加熱により、またはアルカリ条件下で）、次に標的核酸にハイブリダイズされる。特定の実施形態では、使用される分子マーカーは、特定の核酸の合成をリアルタイムでモニターするのに適している。
【０１１８】
一実施形態では、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアを含有するオリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされない場合対オリゴヌクレオチドがその相補的配列にハイブリダイズされる場合で１つまたは両方の蛍光特性に検出可能な差が存在するようにしてやれば、特定の標的配列が検出され得る。このフォーマットでは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされるときには、典型的には、ドナー蛍光は増加し、エネルギー移動／消光は減少する。例えば、各末端で標識された自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピンを形成して、２つのフルオロフォア（例えば、５’および３’末端）を近接近させると、エネルギー移動と消光が起こり得る。自己相補的ヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチド上のその相補体にハイブリダイズするとヘアピンが乱され、２つの色素間の距離が増加し、したがって消光が減少する。そのようなヘアピン構造は非常に安定していることが知られており、そのため消光されないハイブリダイズした形態への転換は緩慢であることが多く、適度にしか好まれない。
【０１１９】
特定の実施形態では、特定の標的配列は、分子ビーコン（単数または複数）を使用して検出され得る。分子ビーコンは、その標的にハイブリダイズした場合、自発的な蛍光発生性立体構造変化を受ける核酸プローブである。非特許文献１０を参照されたい。この文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。分子ビーコンは、それが標的核酸配列に結合した場合に、その蛍光が回復される内部消光フルオロフォアを有するヘアピン状分子である。具体的には、分子ビーコンは、ステムを形成するヘアピンの自己相補的アーム間のループに検知配列（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有するヘアピンである。塩基対合ステムは、検知配列が標的にハイブリダイズし消光の減少を引き起こすためには融解しなければならない。分子ビーコンは、特定の核酸の合成をリアルタイムでモニターするのに特に適している。同文献。核酸増幅アッセイにおいて使用される場合、分子ビーコンを用いた遺伝子検出は、均質であり感度がよく、密封管内で実施することが可能である。同文献。典型的な分子ビーコンプローブは約２５ヌクレオチド長である。そのような典型的プローブでは、中央の約１５ヌクレオチドは標的ＤＮＡに相補的であり互いに対合せず、各末端の５（約５）ヌクレオチドは互いに相補的であり、標的ＤＮＡには相補的ではない。しかし、本方法では、１０、１５または２０ヌクレオチド長から３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、３００または最大５００ヌクレオチド長のプローブを使用してよく、そのようなプローブの中間領域および末端領域の長さは変え得る。分子ビーコンの使用はＳＮＰの検出には特に有利である。
【０１２０】
ある種の実施形態では、「二重ヘアピン」プローブを使用してよく、そのようなプローブを使用する方法は、Ｂ．Ｂａｇｗｅｌｌら（非特許文献１１および特許文献３）により記載されており、これら文献は参照により本明細書に組み込まれている。これらの構造物はそのヘアピン内に標的結合配列を含有しており、したがって、標的とヘアピンの自己相補的配列間での競合的ハイブリダイゼーションを伴う。
【０１２１】
他の実施形態では、ＳＥＲＳ標識ハイブリダイゼーションプローブが使用される（例えば、ＳＥＲＳ無洗浄アッセイ）。そのようなプローブは、例えば、非特許文献１２で詳細に考察されており、この文献の開示は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。さらに他の実施形態では、特許文献４（親油性色素および制限部位の組込みを含む）および特許文献５（蛍光偏光検出を含む）に記載されているシグナルプライマーを用いて使用するための検出法が使用され、特許文献４および特許文献５の開示は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１２２】
ある種の実施形態では、分子ビーコンなどのハイブリダイゼーションプローブを使用して、一本鎖核酸産物を検出することが可能である。産物が二本鎖である場合、その産物を熱または他の変性法に晒して一本鎖産物に変換し得る。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、一本鎖シグナル伸長産物、つまり、変性に晒された二本鎖シグナル伸長産物にハイブリダイズするが、ヘアピン含有二本鎖産物にはハイブリダイズしない。Ｐ１．１などの産物のキーとなる特徴は、分子ビーコンなどの蛍光発生ハイブリダイゼーションプローブによる標的配列の検出を妨げると考えられるヘアピン構造を欠くことである。このようにヘアピンを欠く結果、そのような二次ＬＡＭＰ産物における変異（例えば、単一ヌクレオチド差異もしくはＳＮＰ）または配列変動は、分子ビーコンまたは他のプローブ（例えば、ＳＮＰ感受性プローブ）により検出することが可能である。その上、分子ビーコンは、そのような配列を熱変性に晒せば、Ｐ１．３（図２Ｂ参照）またはＰ２．２．２．１．３（図５参照）に結合することができる。分子ビーコンは、Ｐ１．２中のＤ配列が一本鎖（図２Ｂ参照）であるために、Ｐ１．２にも結合することができる。他の実施形態では、分子ビーコンはＰ２．２．２．１．１（図５参照）などの伸長産物に優先的に結合する。なぜならば、そのような産物は一本鎖であるからである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、二次ＬＡＭＰ産物は増幅フォーマット後に検出され得る。そのような実施形態では、本明細書に記載されているハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に記載されているＬＡＭＰ増幅反応が完了すると反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に記載されているＬＡＭＰ反応開始の少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４５分または１時間後に添加される。他の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応終了後に反応に添加される。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ反応は、ハイブリダイゼーションプローブ、例えば、分子ビーコンの添加に先立って熱変性により停止される。
【０１２４】
さらに他の実施形態では、二次ＬＡＭＰ産物は増幅反応中に検出され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも１つのシグナルプライマーと同時に反応混合物に添加される。本方法のさらに他の実施形態では、少なくとも１つのＬＡＭＰ増幅プライマー、少なくとも１つのシグナルプライマーおよび少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが反応に同時に添加される。
【０１２５】
一実施形態では、本方法で使用されるシグナルプライマーはそれ自体レポーター基として機能し得る。
【０１２６】
ある種の実施形態では、シグナルプライマーの５’末端は、標的配列にはハイブリダイズしないが二次増幅産物の検出または捕獲を促進する特別なヌクレオチド配列（構造的特徴を伴うことが多い）を含有する配列を含み得る。化学的改変の例には、親和性リガンド（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ハプテン、抗原および抗体）ならびにレポーター基（標識、例えば、放射性同位元素、蛍光染料、検出可能な反応産物を生成するように作用する酵素および可視色素）が含まれる。特別なヌクレオチド配列の例には、（ｉ）標識オリゴヌクレオチドプローブの二本鎖二次増幅産物へのハイブリダイゼーションにより三重らせん体を形成することになる配列、および（ｉｉ）増幅中に二本鎖にされると、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に結合することができるようになる二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、リプレッサー、調節タンパク質、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ）の認識部位が含まれる。
【０１２７】
一実施形態では、シグナルプライマーは捕獲基またはレポーター基のどちらかを含有し得、標的配列それ自体または増幅プライマーは第二の捕獲基またはレポーター基を随意に提供してもよい。あるいは、捕獲基とレポーター基の両方が必要とされる場合、シグナルプライマーは、シグナルオリゴヌクレオチドが二本鎖になる場合のみ連動して作用する捕獲基とレポーター基の両方を含有し得る。この構造は、標的配列の存在によりプライミング、伸長、置換およびリプライミングが誘発される場合のみ形成される。そのような二機能性シグナルプライマーは、蛍光偏光測定または蛍光エネルギー移動などの様々な均質検出法の基礎もなし得る。
【０１２８】
方法が二本鎖標的配列の反対の鎖にハイブリダイズする２つのシグナルプライマーを用いる場合、シグナルプライマーのうちの１つは、二次増幅産物の捕獲または固定化を促進する特別なヌクレオチド配列または化学的改変を含み得、もう一方のシグナルプライマーは、捕獲されたまたは固定化された二次増幅産物の検出のための検出可能なレポーター基または標識を含有し得る。核酸の検出のための標識およびレポーター基の使用の他に核酸の捕獲または固定化のためのリガンド、化学的改変物および核酸の構造的特徴の使用も当技術分野では周知である。
【０１２９】
一実施形態では、本方法で使用されるシグナルプライマーは、それ自体がレポーター基として機能し得る。いくつかの実施形態では、プライマーＦＳＰの配列Ｓ１および／またはプライマーＲＳＰの配列Ｓ２（図１、２Ｂ、３Ｂ、４、５および６参照）は、レポーター基として機能し得る。ある種の実施形態では、シグナルプライマーのレポーター基は、フルオロフォアを含有する。特定の実施形態では、シグナルプライマーのレポーター基は蛍光発生ヘアピンを含有する。他の実施形態では、シグナルプライマーのレポーター基は蛍光発生ヘアピンではない。一実施形態では、シグナルプライマーは、シグナルプライマーの一本鎖領域の１つの末端にレポーター基（例えば、蛍光発生標識）を全体的にまたは部分的に、シグナルプライマーの一本鎖領域の別の末端に標的結合配列を含有する。さらに別の実施形態では、シグナルプライマーの標的結合配列は、シグナルプライマーの２つのフルオロフォア含有領域の中央に含有され、その結果、標的結合配列は標的へのそのハイブリダイゼーションに先立って分子内塩基対合二次構造内に含有される。
【０１３０】
蛍光発生ヘアピン技術は特許文献６に記載されており、この文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。そのような技術は、標的依存的に蛍光消光を減らすことによる核酸標的配列の検出のために検知オリゴヌクレオチドを用いる。そのような方法では、標的結合配列は一本鎖「尾部」領域に全体的にまたは部分的に位置している。したがって、二次構造（例えば、ヘアピン）は、最初に標的にハイブリダイズするためにアンフォールドする必要はない。検知オリゴヌクレオチドは分子内塩基対合二次構造を形成し、連結されたドナー／アクセプター色素対を含有しているので、蛍光消光は標的の非存在下で起こる。標的存在下で検知オリゴヌクレオチドにおける分子内塩基対合二次構造がアンフォールドするまたは直線化すれば色素間の距離が増加し、蛍光消光が減少する。塩基対合二次構造がアンフォールドすると、典型的には、二次構造の配列と相補鎖間で分子内塩基対合が起きるので、二次構造が少なくとも部分的に破壊される。そのような技術の実施形態のうちの１つでは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）が２つの色素間に存在しているので、二次構造と相補鎖間に分子内塩基対合ができればＲＥＲＳも二本鎖になり制限エンドヌクレアーゼにより切断可能にまたは切れ目を入れることが可能になる。制限エンドヌクレアーゼにより切断するまたは切れ目が入れば、別々の核酸断片上にドナー色素とアクセプター色素は分離され、消光の減少にさらに寄与する。
【０１３１】
一実施形態では、プライマーＦＳＰの配列Ｓ１および／またはプライマーＲＳＰの配列Ｓ２は蛍光発生ヘアピンを含有する。プライマーＦＳＰの配列Ｓ１が蛍光発生ヘアピンを含有すれば、図２Ｂ（伸長産物Ｐ１．３）、図４（伸長産物ｐ２．２．２．１）、図５（伸長産物Ｐ．２．２．２．１．２およびＰ．２．２．２．１．３）または図６（伸長産物ｐ２．２．２．１．１ｃ）に示されるように伸長過程中にプライマーＦＳＰの配列Ｓ１はアンフォールドされることになり、したがって、蛍光シグナルを発生することになる。
【０１３２】
Ｓ１またはＳ２などのレポーター基を含有するシグナルプライマー（単数または複数）による標的増幅の検出法であって、レポーター基が蛍光標識を含有し得、そのようなレポーター基が二本鎖のときは蛍光シグナルを発生し、一本鎖のときは不活性である検出法が本明細書では企図されている。例えば、そのような実施形態では、レポーター基は、産物Ｐ２．２．２．１．３（図５参照）または産物ｐ２．２．２．１．１ｃ（図６参照）が生じた場合には蛍光シグナルを発することになる。
【０１３３】
さらに、蛍光発生二次産物も、ハイブリダイズして標的部位Ｒ４およびＦ４から伸長されるヘアピン坦持プライマーを用いて生成され得る（図１〜５参照）。
【０１３４】
蛍光消光技術を用いる方法のうちのいずれでも、蛍光パラメータの関連する変化（例えば、ドナー蛍光強度の増加、アクセプター蛍光強度の減少またはアンフォールディング前および後の蛍光の比）は、標的配列の存在を示すものとしてモニターすることが可能である。
【０１３５】
一実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブまたはレポーター基は、発光シグナルを発生し得る。
【０１３６】
あるいは、他の実施形態では、シグナルプライマーは非改変、例えば、二次増幅産物の検出または捕獲を促進するレポーター基、捕獲基または構造的特徴がなくてもよい。次に、二次増幅産物は、そのサイズに基づいて、例えば、ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により検出され得る。
【０１３７】
本方法は、以前は２つの連続する増幅反応に頼って高感度および特異性を達成し、第二の反応が内部ネステッドシグナル発生増幅プライマーを用いて実施されていたプライマーベースの検出法のための手順を大幅に簡略化することが可能である。
【０１３８】
５．４．二次ＬＡＭＰ産物の作製および検出のためのキット
核酸検出産物および二次ＬＡＭＰ産物の作製および検出のためのキットが本明細書において提供される。このキットは、（ｉ）核酸シグナルプライマーであって、少なくとも核酸シグナルプライマーの一部が第一の標的配列領域にハイブリダイズするもの、（ｉｉ）核酸増幅プライマーであって、シグナルプライマーがハイブリダイズする第一の標的配列領域の上流の第二の標的配列領域にハイブリダイズする３’末端部分および３’末端部分がハイブリダイズする第二の標的配列領域の下流の標的配列の第三の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含むもの、ならびに（ｉｉｉ）置換プライマーであって、核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第二の標的配列領域の上流の第四の標的配列領域にハイブリダイズするものを含む。
【０１３９】
核酸検出産物および二次ＬＡＭＰ産物の作製および検出のためのキットも本明細書において提供される。このキットは、第一の構成成分および第二の構成成分を含み、第一の構成成分はＬＡＭＰ反応成分を含み、第二の構成成分は核酸検出産物および二次ＬＡＭＰ産物を生成するための成分を含む。そのような一実施形態では、キットの第一の構成成分は、（ｉ）増幅プライマーであって、標的配列の第一の領域にハイブリダイズする３’末端部分および３’末端部分がハイブリダイズする第二の標的配列領域の下流に標的配列の第二の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含むもの、ならびに（ｉｉ）置換プライマーであって、核酸増幅プライマーの３’末端部分がハイブリダイズする第一の標的配列領域の上流の第三の標的配列領域にハイブリダイズするものを含む。
【０１４０】
そのような実施形態では、キットの第二の構成成分は、核酸シグナルプライマーであって、核酸シグナルプライマーの少なくともその一部が、増幅プライマーがハイブリダイズする第一の標的配列領域の下流に位置している第四の標的配列領域にハイブリダイズするものを含むことが可能である。一実施形態では、第一の構成成分内容物を組み合わせて、ＬＡＭＰ反応を開始することが可能である。そのような一実施形態では、反応は鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの添加により開始される。さらに、そのような実施形態では、第二の構成成分は、例えば、後で添加する、例えば、反応開始の３０秒後に、反応開始の約１分後に、ＬＡＭＰ反応開始の１．５分後、２分後、３分後、４分後、５分後、６、７、８、９、１０、１１、１２、３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５分または最大１時間後に、反応混合物に添加することが可能である。さらに別の実施形態では、第一の構成成分と第二の構成成分は、ＬＡＭＰ反応の開始に先立って組み合わされる。さらに別の実施形態では、第一の構成成分と第二の構成成分は、反応の開始時に組み合わされる、例えば、第一の構成成分、第二の構成成分およびＤＮＡポリメラーゼが組み合わされて増幅反応を開始する。
【０１４１】
ある種の実施形態では、キットのいずれでも、（ｉ）第二の標的配列にハイブリダイズする第二の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）第二の標的配列にハイブリダイズする第二の核酸増幅プライマーおよび（ｉｉｉ）第二の標的配列にハイブリダイズする第二の置換プライマーをさらに含むことが可能である。
【０１４２】
別の実施形態では、キットのいずれでも、（ｉ）第三の標的配列にハイブリダイズする第三の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）第三の標的配列にハイブリダイズする第三の核酸増幅プライマーおよび（ｉｉｉ）第三の標的配列にハイブリダイズする第三の置換プライマーをさらに含むことが可能である。さらに別の実施形態では、キットのいずれでも、（ｉ）第四の標的配列にハイブリダイズする第四の核酸シグナルプライマー、（ｉｉ）第四の標的配列にハイブリダイズする第四の核酸増幅プライマーおよび（ｉｉｉ）第四の標的配列にハイブリダイズする第四の置換プライマーをさらに含むことが可能である。さらに、５つ、６つ、７つまたはそれよりも多い標的配列が本方法を使用して増幅され検出されるキットが本明細書では企図されている。
【０１４３】
一実施形態では、キットのいずれでも、ハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことが可能である。特定の一実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンである。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、上記キットのいずれにおけるシグナルプライマーもレポーター領域をさらに含む。一実施形態では、そのようなレポーター基は蛍光シグナルを発生する。特定の一実施形態では、レポーター基は蛍光発生ヘアピンである。一実施形態では、上記キットのいずれにおける核酸標的配列も、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の配列である。
【０１４５】
５．５．キットの使用および方法
本明細書に記載される方法およびキットは、例えば、２つまたはそれよりも多い（潜在的）標的または配列バリアントの多重検出を可能にすることができる。具体的には、本方法およびキットは、リアルタイムおよび単一閉管フォーマットでの（潜在的）標的のそのような検出を可能にすることができる。
【０１４６】
本方法の用途には、例えば、試料中の対象の遺伝物質の検出、例えば、試料中の特定の微生物核酸の検出が含まれる。用途は、例えば、感染症、遺伝的障害および遺伝形質の診断を含むことが可能である。具体的には、本明細書に提示される方法およびキットは、生物学的試料中の遺伝子、遺伝子配列、遺伝子中の変異（例えば、欠失、挿入、点変異またはＳＮＰ）のリアルタイム検出が望ましいいかなる生物学的または臨床的用途において使用し得る。さらに具体的には、キットおよび方法は、生物学的試料中の２つまたはそれよりも多い遺伝子、遺伝子配列または遺伝子（単数もしくは複数）中の変異の検出が望ましいところでは特に有利になることが可能である。
【０１４７】
例えば、一例示的非限定的例では、本明細書に提示される方法およびキットの一用途は、試料、例えば、患者試料中の細菌核酸、ウイルス核酸または寄生虫核酸の検出である。例えば、本明細書に提示される方法およびキットは、細菌における薬物耐性に関連する変異の検出において使用することが可能である。特定の一実施形態では、本明細書に記載される方法およびキットを使用して、マイコバクテリア（例えば、結核菌、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウムアフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｗｎ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムスメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ネズミ型結核菌（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウムフォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）および／もしくはマイコバクテリウムペレグリナム（Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ））の存在を検出する、またはマイコバクテリアにおいて薬物耐性変異を検出し得る。マイコバクテリアは、具体的には結核菌により引き起こされる復活した感染症およびＡＩＤＳ患者におけるマイコバクテリウムアビウム複合体（ＭＡＣ）病の発生の結果として、世界規模でのかなりのヒト罹患率および死亡率の原因である（非特許文献１３参照）。さらに具体的例では、本明細書に記載される方法およびキットは、実施例１および２に記載される結核菌における薬物耐性変異の検出のために使用し得る。
【０１４８】
したがって、本明細書に提示される方法およびキットを使用すれば、結核および／もしくはマイコバクテリアに関連する他の感染症を診断する、マイコバクテリアの薬物耐性株の存在もしくは非存在を診断するならびに／またはそのような薬物耐性の原因である特定の変異を同定し得る。別の特定の実施形態では、本方法は、患者におけるＭＡＣもしくは他の感染症の簡便で対費用効果の高い診断のために、および／または患者におけるＭＡＣの微生物耐性の根拠を同定するために使用し得る。一実施形態では、患者はヒトである。別の実施形態では、患者はＡＩＤＳ患者である。
【０１４９】
以下の実施例はここに提示される主題の理解を助けるために記載されており、本明細書に記載され、主張されている発明を具体的に限定するものとして解釈されるべきではない。現在公知でありまたは後で展開され、当業者の範囲内と考えられるすべての同等物の代替物および処方の変化または実験計画の小さな変化を含む、本発明のそのような変形は、本明細書の範囲内に収まる。
【実施例】
【０１５０】
（実施例１）
この実施例は、抗生物質リファンピンに対する結核菌の耐性に関連するｒｐｏＢ遺伝子中の変異の検出を促進する核酸検出産物を生じさせるためのＬＡＭＰ反応における本明細書に提示されるシグナルプライマーの使用および方法を例示する。
【０１５１】
図７は、結核菌ｒｐｏＢ遺伝子のうちのＬＡＭＰにより増幅される領域を示している（２本の相補的標的鎖のうちの１本のみが示されている；ジェンバンク受託番号Ｌ２７９８９、ヌクレオチド２２１１〜２５４６）。様々なプライマーにより認識される配列は、対象の標的領域（Ｄｃ）と同じように示されている（名称は図１〜６ａにおいて使用されている名称である）。この例では、Ｄｃは結核菌中のＲＮＡポリメラーゼ酵素の活性部位をコードする８１ヌクレオチド「コア」配列を表している。抗生物質リファンピンに耐性であることが知られている結核菌株の９５パーセントがこのコア配列内に変異を含有している。さらに、このコア配列における公知の変異すべてが、結核菌におけるリファピン耐性に関連していることが知られている（非特許文献１３、この文献は参照により本明細書に組み込まれている）。これらの耐性関連変異の大多数が単一ヌクレオチド変化である。
【０１５２】
ｒｐｏＢ標的配列に対するＬＡＭＰプライマーは、Ｅｉｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｉｔｅ（非特許文献１４）に提供されているガイドラインを考慮して設計された。いわゆるループプライマーは、非特許文献９に記載されている通りに全体的ＬＡＭＰ反応を加速するが、ループ配列Ｆ４およびＲ４を認識するように設計された。シグナルプライマーは、図７にＦＳとして示されている領域に相補的である配列を認識するように設計された。
【０１５３】
様々なプライマーのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１５４】
フォワードＬＡＭＰプライマー、ＦＬＰ（配列番号１）
５’ＡＣＣＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＴ
【０１５５】
リバースＬＡＭＰプライマー、ＲＬＰ（配列番号２）
５’ＣＣＧＧＣＧＧＴＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡａＧＧＣＣＧＴＡＧＴＧｔＧＡＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＴ
【０１５６】
フォワード外部プライマー、Ｆ３（配列番号３）
５’ＣＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣ
【０１５７】
リバース外部プライマー、Ｒ３（配列番号４）
５’ＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴ
【０１５８】
フォワードシグナルプライマー、ＦＳＰ（配列番号５）
５’ＣＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣ
【０１５９】
フォワードループプライマー、ＦＬｏｏｐ（Ｆ４）（配列番号６）
５’ＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴ
【０１６０】
リバースループプライマー、ＲＬｏｏｐ（Ｒ４）（配列番号７）
５’ＣＣＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＧＣ
【０１６１】
配列番号２（リバースＬＡＭＰプライマー）の小文字により示されるヌクレオチドは、そのヌクレオチド位置でジェンバンク配列とは異なっている。これらの変化は、プライマー内の潜在的に問題のある二次構造を破壊するためにプライマー内に設計されるが、それでも標的配列へのハイブリダイゼーションおよび標的配列のループ媒介増幅を可能にする。
【０１６２】
ＬＡＭＰに適した反応条件（下参照）下で、このプライマーのコレクションは、図１〜６に示されている一連の伸長および置換ステップを通じて、ｒｐｏＢの８１ｂｐコアを坦持している所望の標的領域（Ｄおよびその相補的配列Ｄｃ）を増幅する。これらの反応ステップにシグナルプライマーＦＳＰが存在することにより、分子Ｐ２．２．２．１．１およびその相補鎖（Ｐ２．２．２．１．１ｃ）が形成される（図６）。これらの二次ＬＡＭＰ産物はそれぞれが８１ヌクレオチドｒｐｏＢコア配列（いずれかの鎖）の単一コピーを含有しており、コア配列は増幅に先立ってそのような変異がゲノム標的配列に存在していたかどうかに応じて、リファンピン耐性に関連する変異を含有していることも含有していないこともある。これらの二次ＬＡＭＰ産物のキーとなる特徴は、ｒｐｏＢコア配列を覆いそれによって分子ビーコンなどの従来のハイブリダイゼーションベースのプローブによるこの標的配列の検出を妨げると考えられる潜在的ヘアピンがないことである。
【０１６３】
非特許文献１５に記載されているように（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）、５つの差次的に標識された分子ビーコンの組を使用すれば、閉鎖単管アッセイにおいて８１ｒｐｏＢコア配列内のどんな変異の存在でも検出し得る。アッセイは、分子ビーコンがプローブに完全に相補的である標的配列にのみハイブリダイズするという事実に依拠している。したがって、蛍光シグナルは、標的配列がプローブに完全に相補的である場合のみ発せられ、標的配列中にわずか１個でもヌクレオチド変化があれば分子ビーコンは結合を妨げられ、ビーコンは非蛍光ヘアピン状態に折り畳まれたままになる。全コア配列に一緒になってまたがっている５個の分子ビーコンであって、それぞれのビーコンが異なる着色されたフルオロフォアを坦持しており、それぞれがコア配列の異なるセグメント内の野生型配列に相補的であるように設計されている分子ビーコンの組合せを用いることにより、８１ｂｐコア配列内のいかなる変異の存在も検出し得る。野生型標的の存在下では、すべての分子ビーコンはそのそれぞれの標的セグメントに結合し、それぞれのビーコンは異なる色を発し、５つの別々の蛍光シグナルが得られることになる。いかなる所与のセグメントにおける変異も、そのセグメントに対応するビーコンの結合を妨げ、対応する蛍光シグナルは存在しないことになるが、残りの野生型セグメントに対応するビーコンは標的に結合し蛍光を発し続けることになる。したがって、５つの蛍光シグナルのうちのいずれか１つがなければ、リファンピン耐性結核菌が存在することが示される。５つの分子ビーコンすべてからのシグナルが存在すれば、リファンピンに対する感受性が示される。
【０１６４】
以下の分子ビーコン（非特許文献１５から採用）を使用すれば、ＬＡＭＰ二次産物に含有されるｒｐｏＢ配列における変異を検出し得る。
プローブＡ（配列番号３１）：５’−テキサスレッド−ＴＴＴＴＴＴ−フルオレセイン−ＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＧ−ダブシル−３’
プローブＢ（配列番号３２）：５’−テトラクロロフルオレセイン−ＧＣＴＡＣＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＣＧＴＡＧＣ−ダブシル−３’
プローブＣ（配列番号３３）：５’−テトラメチルローダミン−ＴＴＴＴＴＴ−
フルオレセイン−ＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＣＧＧ−ダブシル−３’
プローブＤ（配列番号３４）：５’−ローダミン−ＴＴＴＴＴＴ−フルオレセイン−ＣＣＡＣＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＴＧＧ−ダブシル−３’
プローブＥ（配列番号３５）：５’−フルオレセイン−ＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＣＴＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧ−ダブシル−３’
【０１６５】
各プローブの下線を施した配列は、ｒｐｏＢコア内の野生型配列に相補的である。プローブＡ、ＣおよびＤは野生型配列の鎖Ｄｃにハイブリダイズし、プローブＢおよびＥは鎖Ｄまたは野生型配列に結合する。上に収載されたもの以外の分子ビーコンは、ここで示されている分子ビーコンに代わって使用し得る。５個よりも少ない分子ビーコンを用いて８１ｂｐコア配列を覆うことは可能であり得る。キーとなる特徴は、まとめると、分子ビーコンの組合せは８１ｂｐコア配列をまたぐはずであり、各個々のビーコン（またはプローブ）はその目的とする標的セグメントの配列内のいかなる単一ヌクレオチド変化も必ず区別することができることである。単管アッセイでは、各ビーコンも、アッセイで使用されるその他のビーコンを標識する色素と区別することが可能な色素で標識されていなければならない。
【０１６６】
ｒｐｏＢ遺伝子の８１ｂｐコア配列内の変異についての閉管均質アッセイは、以下の通りに実施され得る。結核菌由来のゲノムＤＮＡは、非特許文献１６に記載されている喀痰試料または陽性増殖培養物に含有される細菌から調製される。次に、得られたゲノムＤＮＡ試料はＬＡＭＰ増幅反応に供せられる。各ウェルが以下の構成成分：１Ｍ  ベタイン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４ｍＭ  ＭｇＳＯ4；０．１％  トリトンＸ−１００；４００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；１６ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ標的断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；プライマーＦＬＰおよびＲＬＰ、それぞれ８００ｎＭ；プライマーＦ３およびＦ４、それぞれ２００ｎＭ；ループプライマーＦ４およびＲ４、それぞれ４００ｎＭ、シグナルプライマーＦＳＰ、８００ｎＭ；分子ビーコンプローブＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、それぞれ２００ｎＭ；ならびに標的試料（５μＬ）からなる合計反応容積５０μＬを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて増幅を実施してよい。すべての構成成分の集合に続いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ分光蛍光分析サーモサイクラー上６０℃でのインキュベーションに先立って、反応ウェルは密封される。増幅は６０分間実施され、蛍光は増幅反応の進行中ずっと各ウェルにおいて測定される。各プローブのバックグランド蛍光は増幅の開始に続く３分と６分の間の読取り測定値から決定され、これらの値はプローブごとに基線として使用される。
【０１６７】
混合物は６０℃で６０分間インキュベートした後、反応混合物を短時間で９０℃まで加熱するのが有利であり得る。この温度であれば、ＬＡＭＰ工程を停止させ、シグナルプライマーから生じるＬＡＭＰ二次産物への分子ビーコンプローブのハイブリダイゼーションを促進し得る。
【０１６８】
様々な公知のｒｐｏＢ変異のＬＡＭＰアッセイから予想される結果は表１に示されている。
【０１６９】
【表１】
2013509880.tif 000003
【０１７０】
【表２】
2013509880.tif 000004
【０１７１】
（実施例２）
この実施例は、結核菌中のイソニアジド耐性に関連する変異の同時検出を促進するためのＬＡＭＰ反応におけるシグナルプライマーの使用を例示している。ｋａｔＧ遺伝子のコドン３１５またはｉｎｈＡ転写物のリボソーム結合部位のどちらかにおける変異は、耐性株の最大７５％を占めることが知られている（非特許文献１９）。２つの標的特異的ＬＡＭＰ反応および関連するシグナルプライマーおよび分子ビーコンを用いることにより、この実施例に記載されるアッセイは、単一反応管においてｋａｔＧおよびｉｎｈＡ変異を同時に検出するように設計されている。反応管は、結核菌由来のＤＮＡの存在を立証する手段として結核菌ｇｙｒＢ遺伝子の一領域を増幅するように設計されている第三のＬＡＭＰ反応のためのプライマーおよびプローブも含有している。ｇｙｒＢ標的のＬＡＭＰベースの検出は、蛍光的に標識されたフォワードｌａｍｐプライマーの５’末端にハイブリダイズしたクエンチャータグ付きオリゴヌクレオチドの置換（ＬＡＭＰ工程中）により達成される。
【０１７２】
図８〜１０は、ＬＡＭＰにより増幅されることになる結核菌ｋａｔＧ、ｉｎｈＡおよびｇｙｒＢ遺伝子の領域を示している（２つの相補的標的鎖のうちの１つのみが示されている）。対象の標的領域（Ｄｃ）と同じように、様々なプライマーにより認識される配列が示されている（命名は図１〜６ａで使用されたものである）。この実施例では、Ｄｃは、イソニアジドについての変異を含有することが知られているｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡのＲＢＳのどちらかの領域を表す。これらの耐性関連変異は、単一ヌクレオチド変化である。
【０１７３】
様々な標的配列に対するＬＡＭＰプライマーは、Ｅｉｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｉｔｅ（非特許文献１４）に提供されているガイドラインを考慮して設計された。いわゆるループプライマーは、非特許文献９に記載されている通りに全体的ＬＡＭＰ反応を加速するが、ループ配列Ｆ４およびＲ４を認識するように設計された。シグナルプライマーは、図８および９にＦＳとして示されている領域に相補的である配列を認識するように設計された。
【０１７４】
表３はこの実施例において使用されるプライマーおよびプローブの一覧を含む。分子ビーコンＭＢＰ−ｋａｔおよびＭＢＰ−ｉｎｈは、非特許文献１９から採用された。各分子ビーコンの下線部は、その標的セグメント内の野生型配列に相補的である。標的セグメントに変異を含有する標的配列は分子ビーコンにハイブリダイズすることはなく、蛍光シグナルを発生しないことになる。分子ビーコン（ＭＢＰ−ｋａｔＧおよびＭＢＰ−ｉｎｈ）ならびにプライマーＦＬＰ−ｇｙｒを標識するフルオロフォアは、同じ管内で独立して観察されるように選択されている。表３のフルオロフォアの１つの適切な組合せは、色素１＝フルオレセイン、色素２＝テトラクロロフルオレセイン、色素３＝ローダミンである。
【０１７５】
ＦＬＰ−ｇｙｒＢおよび消光プローブＱＰ−ｇｙｒ上の蛍光標識の例外はあるが、ｇｙｒＢ標的に対するＬＡＭＰプライマーは非特許文献２０から採用された。
【０１７６】
【表３】
2013509880.tif 000005
【０１７７】
【表４】
2013509880.tif 000006
【０１７８】
ＬＡＭＰに適した反応条件（下参照）下で、図１〜６に示されている一連の伸長および置換ステップを通じて、プライマーのこのコレクションは、ｋａｔＧのコドン３１５およびリボソーム結合配列ｉｎｈＡに潜在的耐性付与変異を坦持する標的領域（Ｄおよび相補体Ｄｃ）を増幅することになる。これらの反応ステップにはシグナルプライマーＦＳＰが存在するために、分子Ｐ２．２．２．１．１およびその相補鎖（Ｐ２．２．２．１．１ｃ）が形成される（図６）。これらの二次ＬＡＭＰ産物はそれぞれが標的になるｋａｔＧまたはｉｎｈＡ配列の単一コピー（いずれかの鎖）を含有しており、コピーは増幅に先立ってそのような変異がゲノム標的配列に存在していたかどうかに応じて、イソニアジド耐性に関連する変異を含有していることも含有していないこともある。これらの二次ＬＡＭＰ産物のキーとなる特徴は、標的になる配列を覆いそれによって分子ビーコンなどの従来のハイブリダイゼーションベースのプローブによる検出を妨げると考えられる潜在的ヘアピンがないことである。
【０１７９】
ｇｙｒＢ標的は、それぞれＦＬＰ−ｇｙｒおよびＱＰ−ｇｙｒに連結されているフルオロフォア／クエンチャー対のＬＡＭＰ媒介分離により増幅中に検出される。図１１はこの過程に関与しているステップを示している。ＱＰはＦＬＰの５’末端に位置しているＦ１ｃ配列に相補的であり、標的非存在下ではこれらの２つのオリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズして、クエンチャーのダブシルをフルオロフォア（色素）に近接近させる。この立体配置では、蛍光は消光される。標的が存在すると、ＦＬＰは伸長され、その伸長産物Ｐ２（二重鎖）はその鋳型から置換除去される。この段階では、プローブＱＰはそれでもＦＬＰ伸長産物のＦ１ｃセグメントに一時的にハイブリダイズされる。しかし、この消光された二重鎖型のＰ２（Ｐ２−二重鎖）とヘアピン型のＦＬＰ伸長産物（Ｐ２−ヘアピン）の間には平衡が存在することになる。ＦＬＰ伸長産物によるヘアピンの形成により、クエンチャープローブＱＰが置換され、ダブシルをフルオロフォアから分離し、蛍光シグナルを発生する。ｇｙｒＢ  ＬＡＭＰ産物の場合には、熱力学的解析（図示せず）により、平衡では、Ｆ２−ヘアピンは、ＱＰの濃度が＜１００マイクロモルならば、Ｆ２−二重鎖よりも強く優勢であることが示される。
【０１８０】
ｒｐｏＢ遺伝子の８１ｂｐコア配列内の変異についての閉管均質アッセイは以下の通りに実施され得る。結核菌由来のゲノムＤＮＡは、非特許文献１６に記載されている喀痰試料または陽性増殖培養物に含有される細菌から調製される。次に、得られたゲノムＤＮＡ試料はＬＡＭＰ増幅反応に供せられる。各ウェルが以下の構成成分；１Ｍ  ベタイン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４ｍＭ  ＭｇＳＯ4；０．１％  トリトンＸ−１００；４００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；１６ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ標的断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；プライマーＦＬＰおよびＲＬＰ、それぞれ８００ｎＭ；プライマーＦ３およびＦ４、それぞれ２００ｎＭ；ループプライマーＦ４およびＲ４、それぞれ４００ｎＭ、シグナルプライマーＦＳＰ、８００ｎＭ；分子ビーコンＭＢＰ−ｋａｔおよびＭＢＰ−ｉｎｈ、それぞれ２００ｎＭ；クエンチャープローブＱＰ−ｇｙｒ、１６００ｎＭ；ならびに標的試料（５μＬ）からなる合計反応容積５０μＬを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて増幅を実施してよい。すべての構成成分の集合に続いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ分光蛍光分析サーモサイクラー上６３℃でのインキュベーションに先立って、反応ウェルは密封される。増幅は６０分間実施され、蛍光は増幅反応の進行中ずっと各ウェルにおいて測定される。各プローブのバックグランド蛍光は増幅の開始に続く３分と６分の間の読取り測定値から決定され、これらの値はプローブごとに基線として使用される。
【０１８１】
混合物は６３℃で６０分間インキュベートした後、反応混合物を短時間で９０℃まで加熱するのが有利であり得る。この温度であれば、ＬＡＭＰ工程を停止させ、シグナルプライマーから生じるＬＡＭＰ二次産物への分子ビーコンプローブのハイブリダイゼーションを促進し得る。
【０１８２】
様々な公知のイソニアジド耐性付与変異のＬＡＭＰアッセイから予想される結果は表４に示されている。
【０１８３】
【表５】
2013509880.tif 000007
【図１】
2013509880.tif 000008
【図２Ａ】
2013509880.tif 000009
【図２Ｂ】
2013509880.tif 000010
【図３Ａ】
2013509880.tif 000011
【図３Ｂ】
2013509880.tif 000012
【図４】
2013509880.tif 000013
【図５】
2013509880.tif 000014
【図６】
2013509880.tif 000015
【図７】
2013509880.tif 000016
【図８】
2013509880.tif 000017
【図９】
2013509880.tif 000018
【図１０】
2013509880.tif 000019
【図１１】
2013509880.tif 000020
【配列表】
2013509880000001.app
【国際調査報告】
2013509880.tif 000021
2013509880.tif 000022
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