(57)【要約】  本発明は、一般に、糖尿病の治療のための薬物の有効性を測定する新規な方法、および糖尿病を診断する方法に関する。本発明のいくつかの具体例において、ＩＬ−１Ｒａをバイオマーカーとして使用して、糖尿病の治療のための薬物の有効性を測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを測定して第１の値を得る工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統においてＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法。
【請求項２】
対照群においてＩＬ−１Ｒａのレベルを測定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ−１Ｒａのレベルが体液または組織中で決定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、該化合物がベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスを阻害するかどうかを決定することを含み、ここに、ベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスの阻害が該化合物の有効性を示す、方法。
【請求項５】
糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキン受容体の内在性アンタゴニストのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法。
【請求項６】
対照群において該アンタゴニストのレベルを測定することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
化合物がジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される、請求項１、４または５記載の方法。
【請求項８】
糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項１、４または５記載の方法。
【請求項９】
化合物がジアセレインである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
糖尿病を診断する方法であって、
ａ．糖尿病を有する疑いのある患者において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを測定して第１の値を得る工程；
ｂ．診断上有効量の化合物を該患者に投与する工程であって、ここに、該化合物が糖尿病を有する患者においてＩＬ−１Ｒａのレベルを増加させる、工程；
ｃ．該患者においてＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が糖尿病の存在を示す、方法。
【請求項１１】
ＩＬ−１Ｒａのレベルが体液または組織中で決定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
糖尿病を診断する方法であって、
ａ．糖尿病を有する疑いのある患者において、インターロイキン受容体の内在性アンタゴニストのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．診断上有効量の化合物を該患者に投与する工程であって、ここに、該化合物が糖尿病を有する患者において該アンタゴニストのレベルを増加させる、工程；
ｃ．該患者において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が糖尿病の存在を示す、方法。
【請求項１３】
化合物がジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される、請求項１０または１２記載の方法。
【請求項１４】
糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項１０または１２記載の方法。
【請求項１５】
化合物がジアセレインである、請求項１０または１２記載の方法。
【請求項１６】
糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキンのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、低い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法。
【請求項１７】
糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキン受容体のレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキン受容体がＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２ＲおよびＩＬ−１８Ｒからなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、低い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する新規な方法、および糖尿病を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真性糖尿病は、血漿中のグルコースの量が異常に高い哺乳動物の状態である。いくつかの例において、上昇したグルコースレベルは、正常量より高い特定のヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃを導くことができる。該状態は、生命を脅かすことができる。血漿中の高グルコースレベル（高血糖）は、多くの慢性糖尿病症候群、例えば、アテローム性動脈硬化症、細小血管障害、腎臓障害または腎不全、心臓病、糖尿病性網膜症、および失明を包含する他の眼障害を導くことができる。
【０００３】
真性糖尿病は、少なくとも一千万人のアメリカ人が罹患していることが知られ、何百万もの人々が該疾患に罹患していることを知らずにいる可能性がある。該疾患には２つの形態がある。ＩＩ型として知られる該疾患の形態、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）または成人発症（若年性糖尿病またはＩ型と反対に）において、膵臓は、しばしば、正常量のインスリンを分泌し続ける。しかしながら、該インスリンは、高血糖、炭水化物（特にグルコース）代謝障害、糖尿、インスリン感受性低下、中心性（centralized）肥満高トリグリセリド血症、低ＨＤＬレベル、高血圧などの心血管危険因子、およびこれらの危険因子に付随する種々の心血管効果を包含する糖尿病の症状を防ぐのに有効ではない。これらの心血管危険因子の多くは、糖尿病の発症に１０年間も先立つことが知られている。これらの症状は、処置されないままであれば、しばしば、早期アテローム性動脈硬化症、網膜症、腎症、およびニューロパシーを包含する重篤な合併症を導く。インスリン耐性は、明白なＮＩＤＤＭの前兆であると考えられ、インスリン耐性の改善に向けられた手法は、ＮＩＤＤＭ患者に独特な利益を提供しうる。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病およびその前兆、例えば、インスリン耐性を管理するために使用される現行の薬物は、５つのクラスの化合物：ビグアニド類、チアゾリジンジオン類、スルホニル尿素類、安息香酸誘導体およびα−グルコシダーゼ阻害剤の範囲内にある。ビグアニド、例えば、メトフォルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）は、過剰な肝臓糖新生を防ぐと考えられる。チアゾリジンジオンは、末梢グルコース処理の速度を増加させることによって作用すると考えられる。スルホニル尿素、例えば、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）およびグリブリド（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、安息香酸誘導体、例えば、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）、およびα−グルコシダーゼ阻害剤、例えば、アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）は、主にインスリン分泌を刺激することによって、血漿グルコースを低下させる。
【０００５】
化合物が糖尿病の治療に有効であるかどうかを決定すること、および糖尿病の治療のための化合物の最適な投与量を決定することが重要であり得る。また、糖尿病を診断および治療する新規な方法を開発することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを測定して第１の値を得る工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統においてＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【０００７】
本発明の一の具体例において、ＩＬ−１Ｒａレベルの測定を対象群においても実施して、ＩＬ−１Ｒａレベルが試験化合物の投与以外の理由で変化しないことを確実にする。例えば、試験化合物の投与前に、糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統（すなわち、実験群）においてＩＬ−１Ｒａレベルを測定するのと同時に、対照群においてＩＬ−１Ｒａレベルを測定してもよい。次いで、試験化合物を実験群に投与するが、対照群には投与しない。次いで、実験群および対照群の両方において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定する。ＩＬ−１Ｒａのレベルが対照群において実質的に変化しない場合、該実験はおそらく有効である。
【０００８】
「対象」なる語は、ヒトおよび動物を包含する。
【０００９】
化合物の有効性を決定するのに十分な量は、種々の化合物によって変化するであろう。一般に、試験されるべき各化合物について十分量を決定することは、当業者に明らかである。例えば、ジアセレイン（ｄｉａｃｅｒｅｉｎ）の場合、糖尿病の治療のためのジアセレインの有効性を決定するのに十分な量は、一般に、１日につき５−２００ｍｇ、より好ましくは２５−１５０ｍｇの範囲内にある。
【００１０】
別の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキン受容体の内在性アンタゴニストのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００１１】
本発明の一の具体例において、該アンタゴニストレベルの測定を対照群においても行って、該アンタゴニストレベルが試験化合物の投与以外の理由で変化しないことを確実にする。例えば、試験化合物の投与前に、糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統（すなわち、実験群）において該アンタゴニストレベルを測定するのと同時に、対照群において該アンタゴニストレベルを測定してもよい。実験群および対照群は実質的に同一である。次いで、試験化合物を実験群に投与するが、対照群には投与しない。次いで、実験群および対照群の両方において、該アンタゴニストレベルを再測定する。該アンタゴニストレベルが対照群において実質的に変化しない場合、該実験はおそらく有効である。
【００１２】
糖尿病は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病であってもよい。
【００１３】
ＩＬ−１Ｒａまたはインターロイキン受容体の内在性アンタゴニスト（ここに、該インターロイキンがＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される）のレベルは、いずれかの適当な体液、組織、器官、細胞、および細胞培養の上清中で測定されうる。
【００１４】
好ましい具体例において、ＩＬ−１Ｒａまたはインターロイキン受容体の内在性アンタゴニスト（ここに、該インターロイキンがＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される）のレベルは、ヒト腎臓細胞および／または膵臓細胞において測定されうる。
【００１５】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン（ｒｈｅｉｎ）、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００１６】
別の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、該化合物がベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスを阻害するかどうかを決定することを含み、ここに、ベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスの阻害が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００１７】
該化合物は、ＪＵＮ  ＮＨ２−末端キナーゼ経路を介するベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスを阻害しうる。
【００１８】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００１９】
別の具体例において、本発明は、糖尿病を診断する方法であって、
ａ．糖尿病を有する疑いのある患者において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを測定して第１の値を得る工程；
ｂ．診断上有効量の化合物を該患者に投与する工程であって、ここに、該化合物が糖尿病を有する患者においてＩＬ−１Ｒａのレベルを増加させる、工程；
ｃ．該患者においてＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が糖尿病の存在を示す、方法を提供する。
【００２０】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００２１】
ＩＬ−１Ｒａのレベルは、いずれかの適当な体液、組織、器官、細胞、および細胞培養の上清中で測定されうる。好ましい具体例において、ＩＬ−１Ｒａのレベルは、ヒト腎臓細胞および／または膵臓細胞において測定されうる。
【００２２】
別の具体例において、本発明は、糖尿病を診断する方法であって、
ａ．糖尿病を有する疑いのある患者において、インターロイキン受容体の内在性アンタゴニストのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．診断上有効量の化合物を該患者に投与する工程であって、ここに、該化合物が糖尿病を有する患者において該アンタゴニストのレベルを増加させる、工程；
ｃ．該患者において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が糖尿病の存在を示す、方法を提供する。
【００２３】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００２４】
インターロイキン受容体の内在性アンタゴニスト（ここに、該インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される）のレベルは、いずれかの適当な体液、組織、器官、細胞、および細胞培養の上清中で測定されうる。
【００２５】
好ましい具体例において、該アンタゴニストのレベルは、ヒト腎臓細胞および／または膵臓細胞において測定されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、近位尿細管細胞の傷害からの保護におけるジアセレインの役割を研究することに向けられた実験における標準曲線を明らかにする。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒト腎臓近位細胞系統（ＨＫ−２）細胞における１６時間処理の間、ＩＬ−１Ｒａの産生に対するジアセレインの用量依存性効果を明らかにするグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な記載
定義
本発明の目的のために、「治療」なる語は、かかる語が適用される疾患、障害または状態の進行あるいはかかる疾患、障害または状態の１以上の症状を逆転させる、緩和する、阻害する、または遅くすることをいう。
【００２８】
本発明の化合物および医薬組成物の「治療上有効量」なる語は、いずれかの医学的処置に適用可能な妥当なリスク対効果比で、糖尿病を治療するのに十分な化合物および／または組成物の量をいう。しかしながら、本発明の化合物および／または組成物の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されることが理解されるであろう。いずれか特定の患者のための特定の有効投与量は、治療している障害および該障害の重篤度、使用される特定の化合物の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、および使用される特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、および医学分野でよく知られた同様の因子を包含する種々の因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な量よりも低いレベルの投与量の組成物で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やすことが当業者によく知られている。
【００２９】
本発明の化合物および医薬組成物の「診断上有効量」なる語は、妥当な確実性で糖尿病を診断するのに十分な化合物および／または組成物の量をいう。
【００３０】
「ジアセレイン」（４，５−ビス（アセチルオキシ）−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸または１，８−ジアセトキシ−３−カルボキシアントラキノン）なる語は、レイン（９，１０−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸）のアセチル化誘導体を示す。ジアセレインは、下記の構造式を有する。
【化１】
2013502587.tif 000002
【００３１】
また、４，５−ビス（アセチルオキシ）−９，１０−ジヒドロ−４，５ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸、４，５−ジアセトキシ−９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−カルボン酸、４，５−ビス（アセチルオキシ）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸、９，１０−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントロ酸ジアセテート、１，８−ジアセトキシ−３−カルボキシアントラキノン、ジアセレイン（ｄｉａｃｅｒｈｅｉｎ）、およびジアセチルレインともいう。
【００３２】
「レイン」なる語は、ダイオウ（Ｒｈｅｉ  ｒｈｉｚｏｍａ）に存在するアントラキノンを表す一般名である。レインは、下記の化学名および非化学名を有する：９，１０−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸、１，８−ジヒドロキシアントラキノン−３−カルボン酸、４，５−ジヒドロキシアントラキノン−２−カルボン酸、クリサジン−３−カルボン酸、モノレイン、レイン酸（ｒｈｅｉｃ  ａｃｉｄ）、カス酸（ｃａｓｓｉｃ  ａｃｉｄ）、アリエティック酸（ａｒｉｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、およびルバルブイエロー。
【００３３】
「レインまたはジアセレイン化合物」なる語は、レインおよびジアセレイン、ならびにそれらのアナログ、ホモログ、誘導体、塩、エステル、アミドおよびプロドラッグを示す。いくつかの特許がヒトへの使用のために効力を増強し、溶解性およびバイオアベイラビリティを増加したレインまたはジアセレインのアナログおよび誘導体を記述している（米国特許第４，２４４，９６８号、米国特許第５，９８６，１２９号、米国特許第５，６５２，２６５）。増加した溶解性およびバイオアベイラビリティは、界面活性剤、水溶性ポリマーおよび微粉化技術の手段によって改善された（米国特許第６，１２４，３５８号、欧州特許第０８０９９９５号）。多くの他のレイン関連誘導体が関節炎における使用のためのアントラキノン誘導体の使用のために、特許に記載されている（米国特許第４，３４６，１０３号）。さらに、関節内注射のための水溶性処方もまた記載されている（米国特許第４，９５０，６８７号）。
【００３４】
レインまたはジアセレインの構造に対して他の少しの修飾を施してもよく、本発明に開示されるのと類似の生物化学的効果をおそらく有するレインおよびジアセレインをもたらすであろうことは、当業者に知られているであろう。同様に、レインおよびジアセレインの三次構造はよく知られているので、レインまたはジアセレインと類似の三次形状（化学的には異なるけれども）を有する構造がレインまたはジアセレインのアナログとして知られており、本発明に開示されるのと類似の生物化学的効果を有すると予測されることは、当業者に既知であろう。
【００３５】
糖尿病を治療するための化合物の有効性を測定する方法
一の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを測定して第１の値を得る工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統においてＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００３６】
一の具体例において、ＩＬ−１Ｒａレベルの測定を対照群においても実施して、ＩＬ−１Ｒａレベルが試験化合物の投与以外の理由で変化しないことを確実にする。例えば、試験化合物の投与前に、糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統（すなわち、実験群）においてＩＬ−１Ｒａレベルを測定するのと同時に、対照群においてＩＬ−１Ｒａレベルを測定してもよい。次いで、試験化合物を実験群に投与するが、対照群には投与しない。次いで、実験群および対照群の両方において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定する。ＩＬ−１Ｒａのレベルが対照群において実質的に変化しない場合、該実験はおそらく有効である。
【００３７】
別の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキン受容体の内在性阻害剤のレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該阻害剤のレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００３８】
一の具体例において、該アンタゴニストレベルの測定を対照群においても行って、該アンタゴニストレベルが試験化合物の投与以外の理由で変化しないことを確実にする。例えば、試験化合物の投与前に、糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統（すなわち、実験群）において該アンタゴニストレベルを測定するのと同時に、対照群において該アンタゴニストレベルを測定してもよい。実験群および対照群は実質的に同一である。次いで、試験化合物を実験群に投与するが、対照群には投与しない。次いで、実験群および対照群の両方において、該アンタゴニストレベルを再測定する。該アンタゴニストレベルが対照群において実質的に変化しない場合、該実験はおそらく有効である。
【００３９】
「対象」なる語は、ヒトおよび動物を包含する。
【００４０】
化合物の有効性を決定するのに十分な量は、種々の化合物によって変化するであろう。一般に、試験されるべき各化合物について十分量を決定することは、当業者に明らかである。例えば、ジアセレインの場合、糖尿病の治療のためのジアセレインの有効性を決定するのに十分な量は、一般に、１日につき５−２００ｍｇ、より好ましくは２５−１５０ｍｇの範囲内にある。
【００４１】
糖尿病は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病であってもよい。
【００４２】
ＩＬ−１Ｒａまたはインターロイキン受容体の内在性アンタゴニスト（ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される）のレベルは、いずれかの適当な体液、組織、器官、細胞、および細胞培養の上清中で測定されうる。
【００４３】
好ましい具体例において、ＩＬ−１Ｒａまたはインターロイキン受容体の内在性アンタゴニスト（ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される）のレベルは、ヒト腎臓細胞および／または膵臓細胞において測定される。
【００４４】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００４５】
ジアセレインは、抗関節炎活性について知られており、骨関節炎、年齢による関節軟骨喪失をもたらす変性疾患を治療するために臨床的に使用されている。
【００４６】
ジアセレインは、インターロイキン−１（ＩＬ−１）の阻害剤である。骨関節炎（ＯＡ）治療におけるジアセレイン機能についての多くの刊行物のなかでも、ジアセレインおよびその活性な代謝産物、レインの効果は、ヒトＯＡ軟骨および滑液組織培養におけるＩＬ−１βならびにＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の産生および機能について評価された。結果は、ジアセレインおよびレインが有意に、軟骨培養培地において、ＩＬ−１β産生を阻害し、ＩＬ−１Ｒａレベルを増加させることを明らかにした。
【００４７】
かくして、ジアセレインの抗炎症性機能の一つは、ＩＬ−１Ｒａに関連するようである。
【００４８】
別の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、該化合物がベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスを阻害するかどうかを決定することを含み、ここに、ベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスの阻害が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００４９】
いずれかの特定の理論に縛られることは望ましくないが、現在、該化合物は、ＪＵＮ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路を介するベータ細胞のＩＬ−１β−誘導性アポトーシスを阻害しうると考えられている。
【００５０】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００５１】
糖尿病を診断する方法
本発明の知見の一つは、ＩＬ−１ＲａをＩＬ−１Ｒａのレベルに影響を及ぼす化合物と一緒に、糖尿病を診断するためのバイオマーカーとして使用しうることである。
【００５２】
かくして、一の具体例において、本発明は、糖尿病を診断する方法であって、
ａ．糖尿病を有する疑いのある患者において、ＩＬ−１Ｒａのレベルを測定して第１の値を得る工程；
ｂ．診断上有効量の化合物を該患者に投与する工程であって、ここに、該化合物が糖尿病を有する患者においてＩＬ−１Ｒａのレベルを増加させる、工程；
ｃ．該患者においてＩＬ−１Ｒａのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が糖尿病の存在を示す、方法を提供する。
【００５３】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００５４】
ＩＬ−１Ｒａのレベルは、いずれかの適当な細胞、最も好ましくは、ヒト腎臓細胞および／または膵臓細胞において測定されうる。
【００５５】
別の具体例において、本発明は、糖尿病を診断する方法であって、
ａ．糖尿病を有する疑いのある患者において、インターロイキン受容体の内在性アンタゴニストのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．診断上有効量の化合物を該患者に投与する工程であって、ここに、該化合物が糖尿病を有する患者において該アンタゴニストのレベルを増加させる、工程；
ｃ．該患者において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、高い第２の値が糖尿病の存在を示す、方法を提供する。
【００５６】
好ましくは、該化合物は、ジアセレイン、レイン、およびその医薬上許容される塩からなる群から選択される。
【００５７】
インターロイキン受容体の内在性アンタゴニスト（ここに、該インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される）のレベルは、いずれかの適当な体液、組織、器官、細胞、および細胞培養の上清中で測定されうる。好ましい具体例において、該アンタゴニストのレベルは、ヒト腎臓細胞および／または膵臓細胞において測定される。
【００５８】
別の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキンのレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキンがＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８からなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、低い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００５９】
別の具体例において、本発明は、糖尿病の治療のための化合物の有効性を決定する方法であって、
ａ．糖尿病を有する対象または糖尿病によって標的とされる身体器官の細胞系統において、インターロイキン受容体のレベルを測定して第１の値を得る工程であって、ここに、該インターロイキン受容体がＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２ＲおよびＩＬ−１８Ｒからなる群から選択される、工程；
ｂ．該化合物の有効性を決定するのに十分な量で該化合物を該対象または該細胞系統に投与する工程；
ｃ．該対象または該細胞系統において該アンタゴニストのレベルを再測定して第２の値を得る工程；および
ｄ．第１の値を第２の値と比較する工程
を含み、ここに、低い第２の値が該化合物の有効性を示す、方法を提供する。
【００６０】
適当な医薬処方
本記載は、主にジアセレインおよび／またはレインを利用する処方および方法について論じるが、他の化合物を同様に医薬処方として調製し、患者に投与しうることは、当業者は容易に理解されるであろう。
【００６１】
本明細書において使用するために記載された有効成分は、経口、直腸、非経口（例えば、静脈内、筋内、動脈内、腹腔内など）または吸入経路、浸透ポンプなどによる患者へのデリバリーに従う医薬上適当な組成物中に含ませることができる。
【００６２】
例えば、医薬上許容される塩は、ジアセレインおよび／またはレインを１〜１０当量の塩基、例えば、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、水素化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどと、エーテル、テトラヒドロフラン、メタノール、ｔ−ブタノール、ジオキサン、イソプロパノール、エタノールなどの溶媒中で反応させることによって調製されうる。溶媒混合物を使用してもよい。有機塩基、例えば、ジエタノールアミン、α−フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、ピペリジン、モルホリン、ピリジン、ヒドロキシエチルピロリジン、ヒドロキシエチルピペリジン、コリン、グアニジンなど、アンモニウムまたは置換アンモニウム塩、アルミニウム塩。アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、シスチン、システイン、リジン、アルギニン、フェニルアラニンなどは、アミノ酸塩の調製に使用されうる。別法では、適用可能であれば、酢酸エチル、エーテル、アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの溶媒中、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、サリチル酸、ヒドロキシナフトエ酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、コハク酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、酒石酸、シュウ酸などの酸での処理によって、酸付加塩を調製する。溶媒混合物を使用してもよい。
【００６３】
本発明の目的に適当な化合物の立体異性体は、その単一のエナンチオマー形態における反応物を用いることによって（可能であれば該プロセスにおいて）、またはその単一のエナンチオマー形態において試薬または触媒の存在下で反応を行うことによって、または常法により立体異性体の混合物を分割することによって、調製されうる。好ましい方法のいくつかは、微生物分解の使用を包含し、適用可能であれば、マンデル酸、カンファースルホン酸、酒石酸、乳酸などのキラル酸を用いて、またはブルシン（ｂｒｕｃｉｎｅ）、シンコナ（ｃｉｎｃｈｏｎａ）アルカロイド、その誘導体などのキラル塩基を用いることによって、形成されたジアステレオマー塩を分割する。
【００６４】
ジアセレインおよび／またはレインのプロドラッグもまた、本発明における使用に意図されている。プロドラッグは、該プロドラッグを患者に投与した後に、イン・ビボでの生理学的作用、例えば、加水分解、代謝などによって本発明において有用な化合物に化学的に修飾される活性または不活性な化合物である。プロドラッグの製造および使用に関与する適当な技術は、当業者によく知られている。
【００６５】
本発明のジアセレインおよびレイン化合物の種々の多型は、異なる条件下におけるジアセレインおよびレインの結晶化によって調製されうる。例えば、種々の一般に使用される溶媒、または再結晶化のためのそれらの混合物、種々の温度での結晶化、結晶化の間に非常に迅速な冷却から非常に遅い冷却という範囲の種々の冷却モードを用いる。該化合物を加熱または溶融した後、徐々にまたはすぐに冷却することによって、多型を得ることもできる。多型の存在は、固体プローブＮＭＲ分光学、ＩＲ分光学、示差走査熱量測定、および粉末Ｘ線回折または他のこのような技術によって決定されうる。
【００６６】
ジアセレインおよび／またはレインの医薬上許容される溶媒和物は、ジアセレインおよびレインを水、メタノール、エタノール、アセトン：水、ジオキサン：水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド：水などの溶媒混合物などの溶媒中に溶解するなど、常法によって調製されうる。
【００６７】
本発明の方法は、また、動物における障害の治療および／または予防に有用な、ジアセレインおよび／またはレイン、それらの誘導体、アナログ、互変形態、立体異性体、多型、水和物、代謝産物、プロドラッグ、医薬上許容される塩、医薬上許容される溶媒和物を通常の医薬上使用される担体、希釈剤などと共に含有する医薬組成物を利用してもよい。
【００６８】
適当な医薬上許容される担体は、固体増量剤または希釈剤および滅菌水性または有機性溶液を包含する。活性な化合物は、上記の範囲で所望の投与量を提供するのに十分な量で、かかる医薬組成物中に存在する。
【００６９】
本発明の方法で使用することが意図された医薬組成物は、固体、溶液、エマルジョン、分散液、ミセル、リポソームなどの形態で使用することができ、ここに、得られる組成物は、鼻、腸または非経口用途に適当な有機または無機担体または賦形剤と混合して、本明細書中での使用が意図された１以上の活性な化合物を有効成分として含有する。有効成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散可能な粉末または顆粒、座剤、溶液、エマルジョン、懸濁、ハードまたはソフトカプセル、カプレットまたはシロップまたはエリキシルおよびいずれか他の使用に適当な形態のための通常の非毒性の医薬上および生理学上許容される担体と共に配合されていてもよい。使用可能な担体は、固体、半固体または液体形態におけるグルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および製剤製造における使用に適当な他の担体を包含する。さらに、補助剤、安定化剤、濃厚剤および着色剤を用いてもよい。本明細書において使用が意図された活性な化合物は、標的プロセス、状態または疾患に対する所望の効果を生じるのに十分な量で医薬組成物中に含まれる。
【００７０】
該組成物は、当該分野で既知のプロセスによって調製されうる。該組成物中の有効成分の量は、７０重量％未満でありうる。かかる組成物は、典型的に、１〜２５重量％、好ましくは１〜１５重量％の活性化合物を含有し、該組成物の残りは医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤または溶媒である。
【００７１】
該組成物は、当該分野で既知のいずれかの手段を用いて、例えば、経口、経鼻、非経口、局所、経皮、または直腸的に投与されうる。また、外科的または医学的装置またはインプラント、例えば、ステント、縫糸、カテーテル、プロテーゼなどからの有効成分の放出も、本発明の範囲内である。該装置は、該化合物で被覆されていてもよく、該化合物と共に埋め込まれていてもよく、または該化合物で含浸されていてもよい。本発明の組成物は、また、フィルムとして形成されていてもよい。該組成物は、適当な非刺激性賦形剤、例えば、ココア脂、ポリエチレングリコールの合成グリセリドエステル（常温で固形であるが、直腸腔中で液体化および／または溶解して有効成分を放出する）などと有効成分を混合することによって調製されうる。
【００７２】
さらに、成形された製品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリックスを包含する徐放系もまた、本明細書中で使用される活性化合物の投与に使用できる。
【００７３】
注射可能な投与形態
本発明の目的に適当な化合物は、非経口投与できる。非経口投与は、もし用いるならば、一般に、注射によって特徴付けられる。注射可能な処方は、当該分野で既知または予想されるいずれかの方法または手段によって、液体懸濁液または溶液、注射前に液体中に溶解するのに適当な固体形態、またはエマルジョンとして、いずれかの通常の形態において調製することができる。非経口投与は、また、持続放出または徐放系を含みうる。投与は、また、治療レベルを維持するのに十分な連続的注入またはボーラス投与によるものであってもよい。
【００７４】
非経口投与の場合、化合物は、滅菌水性または有機性媒体と混合して、注射可能溶液または懸濁液を形成することができる。例えば、該化合物の水溶性の医薬上許容される酸付加塩またはアルカリもしくはアルカリ土類金属塩と同様に、ゴマ油または落花生油、水性プロピレングリコールなどにおける溶液を使用することができる。このように調製される注射可能溶液は、次いで、静脈内、腹腔内、皮下、または筋内投与することができ、筋内投与は、ヒトにおいて好ましい。バッファー、保存料、抗酸化剤などを必要に応じて配合することができる。
【００７５】
レインまたはジアセレイン化合物の正確な治療上有効な量は、患者の年齢、体重、糖尿病の程度、状態における個体差に依存し、また、使用される化合物に依存する。一般に、レインまたはジアセレイン化合物は、好ましくは、１注射用量あたり少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇの量、より好ましくは１用量あたり５ｍｇ／ｋｇまでの量で投与される。有効な一日量を複数回に分けてもよい。ヒトに投与される本発明の化合物の総一日量は、約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。糖尿病を有効に治療するために投与されるレインおよび／またはジアセレインの量は、１日当たり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは１日当たり約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、まだより好ましくは１日当たり約２５ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であってもよい。
【００７６】
経口投与形態
経口投与の場合、化合物は、適当な固形または液体担体または希釈剤と混合して、カプセル、錠剤、粉末、シロップ、溶液、懸濁液などを形成することができる。既知の有効成分を含有する錠剤およびカプセル、粉末および他の組成物の処方は、当業者によく知られており、当該分野で確立されている。一般に、経口用途のための錠剤およびカプセルは、一般に、１以上の一般に使用される担体、例えば、ラクトースまたはトウモロコシデンプンを包含するであろう。経口処方中に配合するための他の任意の成分は、保存料、懸濁化剤、濃厚剤などを包含しうる。
【００７７】
経口用途のための処方がハードゼラチンカプセルの形態である場合、有効成分を不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどと混合してもよい。それらはまた、ソフトゼラチンカプセルの形態であってもよく、ここに、有効成分を水または油媒体、例えば、落花生油、液体パラフィン、オリーブ油などと混合する。
【００７８】
さらに、かかる組成物は、医薬上許容される上品かつ口に合う製剤を提供するために、フレーバー剤（例えば、ペパーミント、冬緑油またはチェリー油）、着色剤、保存剤などから選択される１以上の剤を含有していてもよい。非毒性の医薬上許容される賦形剤と混合した有効成分を含有する錠剤は、また、既知の方法によって製造されうる。使用される賦形剤は、例えば、（１）不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなど、（２）顆粒化剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など、（３）結合剤、例えば、トラガカントゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン、アラビアゴムなど、および（４）滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどであってもよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または胃腸管中での崩壊および吸収を遅らせ、それにより、長期間にわたり持続的な作用を提供するための既知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、時間遅延物質、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを用いてもよい。錠剤はまた、米国特許第４，２５６，１０８号、第４，１６０，４５２号、および第４，２６５，８７４号（出典明示により、本明細書の一部とされる）に記載の技術によってコーティングして、制御放出のための浸透性治療錠剤を形成していてもよい。
【００７９】
経口投与の目的のために、好ましい投与量は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲でありうる。所望により、投与の目的のために、有効一日量を複数回にわけてもよく、結果的に、単回投与組成物は、一日量を形成するために、かかる量またはその約数を含有していてもよい。「持続放出」処方は、１日１回よりも頻度の少ない投与および一日量を複数含有するその単回投与組成物で、逆効果を提供しうる。
【００８０】
医学的装置からの組成物の放出
本発明の目的に適当な化合物、特に、ジアセレインおよび／またはレインは、インプラント、ステント、ステントグラフト、管移植片、留置カテーテル、縫糸、カテーテル、プロテーゼなどの市販の、または研究開発フェーズにおける医学的装置を被覆、埋め込む、または含浸するか、または他の方法で該医学的装置と接触しうるポリマーまたは非ポリマー処方を用いて、共有結合または混合してもよく、またはマイクロカプセル中に被包されていてもよい。他の場合、活性化合物は、いずれの処方も用いることなく、インプラント、ステント、ステントグラフト、管移植片、局所バルーンデリバリー、留置カテーテル、縫糸、カテーテル、プロテーゼなどの医学的装置と接触しうる。担体は、市販または研究開発フェーズのものであることができる。担体の代表例は、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、メタクリレートコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸およびカプロラクトン）のコポリマー、ゼラチン、ヒアルロン酸、コラーゲンマトリックス、セルロース、デンプン、カゼイン、デキストラン、多糖類、フィブリノーゲン、ビタミンＢ１２およびアルブミン、シリコンゴム、アクリル酸ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリウレタン、ビニルポリマーおよびポリ（エチレン−酢酸ビニル）コポリマーを包含する。ポリマーまたは非ポリマー担体は、所望の放出特徴および／または温度またはｐＨ変化のような特定の誘導事象に応答した特定の所望の性質を有するように、種々の形態において形成されていてもよい。
【００８１】
下記の実施例は、本発明のいくつかの態様を実証する。実施例は、いかなる方法においても、本発明を制限することを意味しない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ジアセレインの影響下におけるインスリン産生ラットベータ細胞系統（ラットＩＮＳ−１Ｅ）におけるＩＬ−１Ｒａの発現の機能分析
糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の結果である。したがって、該細胞型におけるジアセレインの保護的役割の可能性の研究は、ジアセレインの治療的役割の可能性を理解するうえで必須である。
【００８３】
ラットのインスリノーマ誘導性ＩＮＳ−１Ｅ細胞は、かかるヒト細胞はまだ入手不可能なので、幅広く使用されるβ−細胞代用物を構成する。しかしながら、それらの非クローン性の性質のために、ＩＮＳ−１Ｅ細胞は、不均一であり、長期の培養期間にわたって不安定である。Ｍｅｒｇｌｅｎらは、２００４年に初めて、インスリン含量およびグルコースに対する分泌応答の両方に基づいて、クローン性ＩＮＳ−１Ｅ細胞を親ＩＮＳ−１から単離した。Ｍｅｒｇｌｅｎ  Ａ，  Ｔｈｅａｎｄｅｒ  Ｓ，  Ｒｕｂｉ  Ｂ，  Ｃｈａｆｆａｒｄ  Ｇ，  Ｗｏｌｌｈｅｉｍ  ＣＢ，  Ｍａｅｃｈｌｅｒ  Ｐ．  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｗｏ−ｙｅａｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ＩＮＳ−１Ｅ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ（ＩＮＳ−１Ｅインスリノーマ細胞において２年連続培養の間に研究されたグルコース感受性および代謝−分泌カップリング），  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ２００４  Ｆｅｂ；１４５（２）：６６７−７８。彼らは、１１６継代（番号２７−１４２）にわたる安定な分化ＩＮＳ−１Ｅベータ細胞表現型を報告し、２．２年の連続的な追跡調査を示した。かくして、ＩＮＳ−１Ｅ細胞は、平均インスリン含量２．３０＋／−０．１１μｇ／百万細胞にて４０−１００継代内で、安全に培養し、使用するこができる。
【００８４】
グルコース誘導性インスリン分泌は、用量に関連し、ラットの小島応答に類似した。１５ｍｍグルコースにて６．２倍増加で飽和した分泌は、１０．４ｍｍの５０％有効濃度を示した。アミノ酸およびスルホニル尿素に対する分泌応答は、小島のものと類似した。さらに、ＩＮＳ−１Ｅ細胞は、脱分極状態においてインスリン放出のグルコース誘発性増加によって判断した場合、増幅経路を保持した。代謝パラメーターに関しては、ＩＮＳ−１Ｅ細胞は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、サイトソルＣａ（２＋）、およびミトコンドリアＣａ（２＋）レベルのグルコース用量依存性上昇を示した。対照的に、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰレベル、および細胞膜電位は全て、７．５ｍｍグルコースによって十分に活性化された。穿孔パッチクランプ技術を用いて、７．５および１５ｍｍグルコースは、類似の程度まで電気的活性を導き出した。Ｋ（ＡＴＰ）電流は、ジアゾキシドおよびトルブタミドを用いて、全細胞電圧クランプにおいて同定された。天然β−細胞におけるように、トルブタミドは電気的活性を誘導し、Ｋ（ＡＴＰ）コンダクタンスが静止電位を設定するのに重要であることを示した。したがって、ＩＮＳ−１Ｅ細胞は、安定かつ価値のあるβ細胞モデルを代表する。
【００８５】
ラットＩＮＳ−１Ｅ細胞系統は、研究者から容易に得ることができる。該細胞培養方法は、Ｍｅｒｇｌｅｎらによる刊行物によってよく説明されている。上記で説明するように、彼らの刊行物における記載にしたがってもよい。
【００８６】
ＩＮＳ−１Ｅ細胞がコンフルエンシーに達したとき、ジアセレインを生理学的に適切な濃度２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌで培養培地に加え、種々の時間、例えば、０時間、０．５時間、１時間、３時間、５時間、８時間、１６時間、３２時間、および７２時間インキュベートしてもよい。さらに、一群をジアセレインに曝露せず、ネガティブ対照としてビヒクルを用いてもよい。
【００８７】
各ジアセレイン曝露の最後に、培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１ベータ濃度についてアッセイしてもよい。三連の試料（ｎ＝３）をアッセイしてもよい。統計分析ソフトウェアを用いて、統計学的有意性に関して変化を決定しうる。
【００８８】
ジアセレインに曝露しない場合（または０時間曝露）と比べてジアセレインに曝露した場合に培養中のＩＮＳ−１Ｅ細胞が有意に高い量のＩＬ−１Ｒａを発現するとき、炎症性分子ＩＬ−１ベータに対する防御において、ジアセレインがＩＮＳ−１Ｅ細胞のための保護効果を有すると結論づけられうる。
【００８９】
ＩＬ−１Ｒａ  対  研究された種々のジアセレイン濃度のプロフィール、ならびに種々の時点での結果を用いて、保護的効果の最大値および／または範囲を決定する。
【００９０】
同様に、他の化合物を試験して、糖尿病治療におけるそれらの有効性を決定することができる。
【００９１】
実施例２
ＩＬ−１β−誘導性ラットＩＮＳ−１Ｅ細胞アポトーシスの阻害におけるジアセレインの役割の機能分析
プロ炎症性サイトカインＩＬ−１ベータがＪＵＮ  ＮＨ２末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路を介して、インスリン産生ベータ細胞のアポトーシスを誘導できることが知られている。ＩＬ−１ベータによって誘導される該アポトーシス経路の阻害におけるジアセレインの役割の研究は、糖尿病の治療におけるジアセレインの役割の可能性を理解するうえで必須である。
【００９２】
ジアセレインがＪＮＫ経路を介するＩＬ−１β−誘導性アポトーシスに干渉することができるかどうかを決定するために、ＩＮＳ−１Ｅ細胞を１００ｎｍｏｌ／Ｌ濃度のエキセンジン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）で前処理してもよい。エキセンジン−４は、ポジティブ対照として使用してもよく、ＩＬ−１β誘導性ＩＳＮ−１Ｅ細胞アポトーシスを阻害することが報告されている。生理学的に適切な濃度２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのジアセレインまたはビヒクル（ネガティブ対照）を８時間インキュベートした後、細胞をＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に１６時間インキュベートしてもよい。アポトーシスは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核酸染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で視覚化された濃い核（pycnotic nuclei）を展示する細胞をスコア付けすることによって決定されうる。
【００９３】
ジアセレインがその生理学的濃度２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌにおいて、プロ炎症性サイトカインＩＬ−１ベータによって誘導されるラットＩＮＳ−１Ｅ細胞アポトーシスを防ぐことができる場合、このことは、膵臓β細胞死の結果である糖尿病との関連で、ジアセレインの保護的役割を示す。ＩＬ−１Ｒａ  対  試験された種々のジアセレイン濃度のプロフィール、ならびに種々の時点にわたって集められたデータを用いて、保護的効果の最大値および／または範囲を決定してもよい。
【００９４】
実施例３
ヒト腎細胞におけるジアセレインの保護的役割の機能分析
近位尿細管細胞は、糖尿病性腎障害の発症において傷つけられる最初の細胞である。該実験は、近位尿細管細胞の傷害からの保護におけるジアセレインの役割を研究した。
【００９５】
ヒト腎近位細胞系統は、市販されており、例えば、記号ＨＫ−２の下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から購入してもよい。
【００９６】
不死化ヒト近位尿細管細胞系統（ＨＫ−２）は、５％ＣＯ２中において、２．５０ｇ／ｌ  ＨＥＰＥＳ、１．８０ｇ／ｌ重炭酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃で培養した。０．２５％トリプシンで消化後、１Ｘ１０５細胞を５０ｍｌプラスチック培養瓶中で生育させた。該細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２  ５％  ＦＣＳ中で一晩培養し、次いで、培地を、種々の濃度２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌのジアセレインまたはネガティブ（５％ＦＣＳ）対照を含有する新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２  ５％ＦＣＳに交換した。さらに、０時間、０．５時間、１時間、３時間、５時間、８時間、１６時間、３２時間、および７２時間の時点まで培養を続けた。各時点に達すると、培地を回収した。該細胞培養方法は、Ｙａｏら、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｂ  １−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２００９，  ３２（５）  ８８２−８８６において、よく説明されている。
【００９７】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、各時点および濃度にて回収した培地をＩＬ−１Ｒａ濃度についてアッセイした。
【００９８】
結果
ＩＬ−１Ｒａ産生は、最初、１６時間処理の間、５μｇ／ｍｌジアセレイン濃度にてＨＫ−２細胞で観察された。ジアセレインは、ＨＫ−２細胞における１６時間処理の間、
ＩＬ−１Ｒａ産生を用量依存的に増加させた。
【００９９】
図１Ａは、スパイク標準を用いてＥＬＩＳＡキットに添付の説明書に基づき調製された標準曲線（すなわち、検量線）を示す。表１は、標準曲線を構築するために使用されたデータを示す。
【表１】
2013502587.tif 000003
【０１００】
ＯＤは、「光学密度」を示す。
【０１０１】
図１Ｂは、ＨＫ−２細胞における１６時間処理の間のＩＬ−１Ｒａの産生に対するジアセレインの用量依存性効果を明らかにするグラフを示す。０μｇ／ｍｌ濃度のジアセレインで、ＩＬ−１Ｒａの濃度は約０、５μｇ／ｍｌ濃度のジアセレインで、ＩＬ−１Ｒａの濃度は約０．８ｐｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ濃度のジアセレインで、ＩＬ−１Ｒａの濃度は約１．３ｐｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ濃度のジアセレインで、ＩＬ−１Ｒａの濃度は約４．２ｐｇ／ｍｌであった。
【０１０２】
ＩＬ−１Ｒａの産生に対するジアセレインの用量依存性効果は、３２時間および７２時間処理の間に減少した。このことは、長期の曝露時間でのデータにおけるより大きな変化性が原因であるかもしれない。該結果は、イン・ビトロＨＫ−２培養におけるジアセレインの最適な曝露時間が約１６時間であることを示すようである。
【０１０３】
ジアセレインの観察された用量依存性効果は、プロ炎症性サイトカインＩＬ−１βに対するジアセレインの潜在的な保護的役割を示す。
【図１Ａ】
2013502587.tif 000004
【図１Ｂ】
2013502587.tif 000005
【国際調査報告】
2013502587.tif 000006