(57)【要約】  本発明は、シードインフルエンザワクチンの調製のための鳥類細胞系統の使用、およびそれから製造されるワクチンに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、
（ｉ）鳥類細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させる工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の感染細胞系統から得られたウイルスを増幅させてインフルエンザシードウイルスを生産する工程と、
を含んでなる、プロセス。
【請求項２】
ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、
（ｉ）細胞系統に第一のインフルエンザウイルスを感染させる工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた感染細胞系統により生産された前記第一のインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを逆遺伝学的手法で用いて、前記工程（ｉ）の第一のインフルエンザウイルスと共通した少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たな第二のインフルエンザウイルスを調製する工程と、
（ｉｉｉ）細胞系統に前記新たな第二のインフルエンザウイルスを感染させる工程と、
（ｉｖ）シードウイルスとして使用するための新たな第二のインフルエンザウイルスを生産するためにこのウイルスを増幅させる工程と、
を含んでなる、前記細胞系統が工程ｉ、ｉｉｉおよびｉｖの１以上に関して鳥類細胞系統である、プロセス。
【請求項３】
前記工程（ｉ）のインフルエンザウイルスが、細胞系統の初代分離株；直接的に患者；集団中に循環している株；集団中に循環しているインフルエンザウイルスの抗原性として典型的な血球凝集素を有する株、の１つから得られる、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
鳥類細胞系統に感染させる前に哺乳類細胞系統でインフルエンザウイルスを増殖させることを含んでなる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記哺乳類細胞系統がＭＤＣＫ細胞系統である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
いずれの工程にも卵におけるインフルエンザウイルスの増殖または継代を含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記鳥類細胞系統が連続的二倍体鳥類細胞系統である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記鳥類細胞系統がカモ細胞系統である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記カモ細胞系統が国際公開第２００８１２９０５８号もしくは同第２００３０７６６０１号、米国特許出願第２００９０２３９２９７Ａ１号または同第２００４００５８４４１Ａ１号で製造された通り、またはそうでなければ開示されている通りである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記細胞系統が幹細胞系統である、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記細胞系統がＥＢ６６である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記鳥類細胞系統の使用後に非ヒト細胞系統に前記インフルエンザウイルスを感染させる工程をさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記非ヒト細胞系統がＭＤＣＫ細胞系統である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
鳥類細胞がシードワクチンの生産に使用される唯一の細胞培養細胞である、請求項１〜４、６〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
使用される前記鳥類細胞系統に腫瘍形成表現型を有するものがない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシードウイルスがワクチン製造用のインフルエンザウイルスを生産するために培養される、インフルエンザウイルスワクチンの調製プロセス。
【請求項１７】
ワクチンを生産するために前記ウイルスが処理される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
個々のインフルエンザウイルス株に対して請求項１７に記載のプロセスを実施することと、その株を、所望により請求項１５に記載のプロセスを用いて作製された１以上の他のインフルエンザワクチンと混合して、多価インフルエンザワクチンを作製することと、を含んでなる、多価インフルエンザワクチンの作製プロセス。
【請求項１９】
請求項１７または１８に従って製造されたワクチン。
【請求項２０】
請求項１９に記載のワクチンを用いて個体に接種を行うことを含んでなる、それを必要とする個体の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスから保護するためのワクチンの製造の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
ライセンスが取得された不活化インフルエンザワクチンのほとんどは卵で生産される。ヒトサンプルから採取された野外株は、遺伝的および抗原的特性決定のために分離され、有胚卵で増幅される。次に、典型的な分離株が選択され、高増殖シードが遺伝子再集合または逆遺伝学の使用によって調製される。シードがワクチン製造に移される場合には、有胚鶏卵で数代の継代培養を経てきた。
【０００３】
有胚卵基質での増幅は、同じ供給源から分離され、哺乳類細胞系統、すなわちＭＤＣＫ細胞で増幅されたウイルスとは抗原性として、また、生物学的に異なる変異体の選択に至る場合がある。
【０００４】
宿主による抗原性の変動が報告されており、卵または細胞に基づく基質で増幅させた後に異なる部分集団が選択されることを示唆している(Katz; Virology 156, 386-395;(1987))。
【０００５】
有胚鶏卵において培養した後の、血球凝集素における一アミノ酸置換の結果、ＭＤＣＫで増殖させたウイルスに比べて免疫原性の低いワクチンが生じ得る(Kodihalli & all; J of Virol, Aug 1995, 4888-4897)。
【０００６】
ひと度、卵に順応した突然変異体が確立されると、組織培養で増殖させても一般にさらなる変化は起こらず、最初の卵に順応したその突然変異が維持される。
【０００７】
卵で増殖させたウイルスと比較して、ＶｅｒｏまたはＭＤＣＫで増殖させたウイルスでマウスの免疫誘導を行い、続いて同種または異種のウイルスを用いて抗原投与を行ったところ、細胞由来のワクチンに対する抗体応答の方が、卵由来のワクチンにより誘発される応答よりも交差反応性が高いことが示された(Govorkova et al 1999, Dev Biol Stand. 1999;98:39-51; discussion 73-4)。
【０００８】
ＨＡタンパク質に有意な変異を誘発することなくインフルエンザウイルスを複製できる能力は、数種の哺乳類細胞系統（ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５、ＬＬＣ−ＭＫ２）に共通であることが示されている(Meyer JL Virology 1993 196:1,130-137)。
【０００９】
フェレットでは、ＭＤＣＫ由来のインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２ウイルスが卵由来のウイルスよりも、抗原刺激からのより良好な保護を誘発することが示されている(Katz and Webster; 1989. J. Infect. Dis.160:191-98)。
【００１０】
マウスモデルにおいて細胞性免疫を誘発する、優れた能力がＶｅｒｏ由来の不活化ワクチンで見られた(Bruhl & all; Vaccine 19; 2000 1149-1158)。
【００１１】
ヒトインフルエンザウイルスに対する季節性ワクチンを調製するための現行のプロセスおよび細胞培養技術の使用の態様は、国際公開第２００８０３２２１９号に記載されている。国際公開第２００８０３２２１９号は、上記背景の立場を裏付けるいくつかの参照文献を開示し、インフルエンザワクチンの製造（卵の使用は避けることが好ましい）において細胞系統を用いる手法を提案している。最も好ましい細胞系統は哺乳類細胞系統であることが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、細胞培養インフルエンザワクチン製造の問題に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様において、本発明は、ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、（ｉ）細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させる工程と、（ｉｉ）（ｉ）の感染細胞系統から得られたウイルスを増幅させてシードウイルスとして使用するためのインフルエンザウイルスを生産する工程とを含んでなるプロセスに関する。
【００１４】
一態様において、本発明は、ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、（ｉ）細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させる工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた感染細胞系統により生産されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを逆遺伝学的手法で用いて、工程（ｉ）のインフルエンザウイルスと共通した少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製する工程と、（ｉｉｉ）細胞系統にこの新たなインフルエンザウイルスを感染させる工程と、（ｉｖ）シードウイルスとして使用するための新たなインフルエンザウイルスを生産するためにこのウイルスを増幅させる工程とを含んでなる、該細胞系統が工程（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の１以上に関して鳥類細胞系統である、前記プロセスに関する。
【００１５】
一態様において、本発明は、工程（ｉ）のインフルエンザウイルスが、直接患者から、もしくは細胞系統の初代分離株から得られるか、または集団中に循環しているか、もしくは集団中に循環しているインフルエンザウイルスの抗原性として典型的な血球凝集素を有する株である、上記のプロセスに関する。
【００１６】
一態様において、本発明は、ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、（ｉ）細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させる工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた感染細胞系統からウイルスを少なくとも１回継代する工程と、（ｉｉｉ）シードウイルスとして使用するためのインフルエンザウイルスを生産するために工程（ｉｉ）からの感染細胞系統を培養する工程とを含んでなる、該細胞系統が工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１つ、またはそれを超える、または全てに関して鳥類細胞系統である、前記プロセスに関する。
【００１７】
一態様において、本発明は、インフルエンザウイルスワクチンを調製するプロセスであって、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを生産するために前記請求項のいずれか一項に記載のシードウイルスが培養され、その後、ワクチンを得るために所望によりさらに処理されるプロセスに関する。
【００１８】
一態様において、使用される鳥類細胞系統には腫瘍形成表現型を有するものがない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】卵培養プロセスと細胞培養プロセスを比較するための方法論を示す。
【図２】逆遺伝学を用いて卵培養プロセスと細胞培養プロセスを比較する方法論を示す。
【図３】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤の比較免疫原性：フェレットにおける抗Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＨＩ力価、を示す。
【図４】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤の比較免疫原性：フェレットにおける抗Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＮＴ力価、を示す。
【図５】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤の比較免疫原性：マウスにおける抗Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＨＩ力価、を示す。
【図６】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤の比較免疫原性：マウスにおける抗Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＮＴ力価、を示す。
【図７】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤の比較免疫原性：ＭＤＣＫにおけるフェレット鼻腔スワブ(nasal swap)ウイルス力価測定：Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６のウイルス量、を示す。
【図８】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤およびＭＤＣＫ由来製剤の比較免疫原性：ＭＤＣＫにおけるフェレット鼻腔スワブ(nasal swap)ウイルス力価測定：Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５のウイルス量、を示す。
【図９】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤およびＭＤＣＫ由来製剤の比較免疫原性：ＭＤＣＫにおけるフェレット鼻腔スワブ(nasal swap)ウイルス力価測定：Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４のウイルス量、を示す。
【図１０】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤およびＭＤＣＫ由来製剤の比較免疫原性:フェレットにおけるＨ１Ｎ１型インフルエンザ同種および異種ＮＴ力価、を示す。
【図１１】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤およびＭＤＣＫ由来製剤の比較免疫原性：フェレットにおけるＨ３Ｎ２型インフルエンザ同種および異種ＮＴ力価、を示す。
【図１２】ＥＢ６６由来製剤と卵由来製剤およびＭＤＣＫ由来製剤の比較免疫原性：フェレットにおけるＢ型インフルエンザ同種および異種ＮＴ力価、を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、シードインフルエンザワクチンの調製のための鳥類細胞系統の使用、およびそれから製造されるワクチンに関する。
【００２１】
本明細書に言及されるシードウイルスは、ワクチンバッチの生産に直接的または間接的に用いられるウイルスである。一般に、ウイルスの分離株を用いてマスターシードを含んでなる一定量のウイルスを生産することができ、これが一般にアリコートに分けられ、保存される。一アリコートのマスターシードを用いて一定量のワーキングシードを生産することができ、これが再びアリコートに分けられ、保存される。次にこの一アリコートのワーキングシードを用いて一バッチのワクチンを生産することができる。従って、全てのワクチンバッチはマスターシードから２継代しか経ていない。
【００２２】
ワクチンの製造に使用されるシードウイルスは、使用前に適宜特性決定が行われている。特性決定は、コンタミネーション試験および／またはウイルスの均一性試験を含み得る。シードウイルスは単一の均一な株であることが好適である。
【００２３】
本明細書に言及される場合、細胞系統にウイルスを「感染させる」とは、その細胞にウイルスＤＮＡ、またはその細胞内で機能的ウイルスを生成させるに十分な遺伝物質でトランスフェクトすることを含む。
【００２４】
本明細書に言及される場合、ウイルスを「増幅する」とは、ウイルスのコピー数を増加させるための細胞培養内でのウイルスの好適な増殖である。
【００２５】
本明細書に言及される場合、インフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡの調製とは、逆遺伝学的手法で使用するのに好適なｃＤＮＡの分離、精製もしくは生成、またはそうでなければ取得を含む。
【００２６】
本明細書に言及される場合、初代分離株とは、感染個体から得られたウイルス分離株を含む。
【００２７】
本明細書に言及される場合、集団中に循環している株とは、アトランタ、イギリスのロンドン、オーストラリアのメルボルンおよび日本の東京の疾病管理予防センター（ＣＤＣ）にある世界保健機関（ＷＨＯ）インフルエンザ調査研究協力センターにより承認されたいずれの株も含む。
【００２８】
ワクチンを生産するためのウイルスの処理には、分割、サブユニットワクチンの作製、および化学的不活化（ホルムアルデヒド処理など）を含む当技術分野で周知の方法によるインフルエンザウイルスの不活化を含む。
【００２９】
鳥類細胞系統は、患者サンプルを直接感染させ、初代分離株の生成に使用することができる。
【００３０】
あるいは、鳥類細胞系統に、別の細胞系統（非ヒト哺乳類細胞系統、例えばＭＤＣＫ細胞系統、好ましくは、腫瘍形成表現型を持たないＭＤＣＫ細胞系統）に事前に感染していたインフルエンザサンプルを感染させてもよい。
【００３１】
一態様において、インフルエンザウイルスは、鳥類細胞系統で用いるまでに卵内に存在したことがない。
【００３２】
鳥類細胞系統
一態様において、鳥類細胞系統は、鳥類胚幹細胞系統などの連続的な遺伝的に安定な鳥類細胞系統である。好適な細胞系統はニワトリ細胞系統ＥＢ１４またはカモ細胞系統ＥＢ２４もしくはＥＢ６６細胞、例えば、国際公開第２００８１２９０５８号もしくは同第２００３０７６６０１号で製造またはそうでなければ開示されているもの（Vivalisにより生産：www.vivalis.comも参照）などである。好ましい細胞系統はＥＢ６６である。米国特許出願第２００９０２３９２９７Ａ１号および同第２００４００５８４４１Ａ１号などの同等の米国公開を含め、これらの開示は参照により全内容を本明細書に組み入れる。
【００３３】
一態様において、国際公開第２００８１２９０５８号の教示によれば、連続的二倍体鳥類細胞系統が好ましい。本発明に適用可能なこの開示では、本発明の連続的二倍体鳥類細胞系統（すなわちＥＢｘ（登録商標））の確立プロセスは、ａ）増殖を可能とする全ての因子を含有する完全培養培地中、フィーダー層の存在下、動物血清の添加下で、複製能を有する内因性レトロウイルス粒子、より具体的には、ＥＡＶおよび／またはＡＬＶ−Ｅプロウイルス配列またはそのフラグメントを生産することのできる完全な内因性プロウイルス配列またはそのフラグメントを含まない鳥類由来胚幹細胞の分離、培養および拡大（所望により、該完全培養培地は付加的アミノ酸（すなわち、グルタミン、非必須アミノ酸など）、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、ビタミン類、非動物起源のタンパク質加水分解物（すなわち、イーストレート(yeastolate)、植物加水分解物（ダイズ、コムギなど））などの添加物を含んでもよい）；ｂ）前記因子、前記フィーダー層および前記血清、ならびに任意選択の前記添加物の完全な除去が得られるように培養培地を改変すること、およびさらに外因性増殖因子、フィーダー層および動物血清の不在下、基本培地で長期間増殖可能な、複製能を有する内在性レトロウイルス粒子を生産しない接着性または懸濁状態の鳥類細胞系統（すなわちＥＢｘ（登録商標））を得ることによる継代、の２つの工程を含んでなる。
【００３４】
より具体的には、ＥＳ細胞由来の連続的二倍体鳥類細胞系統（該鳥類細胞系統は複製能を有する内因性レトロウイルス粒子を生産しない）を得るためのプロセスは、ａ）好ましくはカモまたはｅｖ−０ニワトリから、イヤル−ギラディ(EYAL-GILADI)の分類(EYAL-GILADI's classification: EYAL-GILADI and KOCHAN, 1976, 《 From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick 》. "General Morphology" Dev. Biol., 49:321-337)の第ＶＩ段階前後から孵化前、好ましくは産卵前後を含む発達段階の鳥類胚を分離する工程（この鳥類のゲノムは、複製能を有する内因性レトロウイルス粒子を生産することのできる内因性プロウイルス配列を含まない）；ｂ）工程ａ）の胚を解離させることにより得られた鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）および繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；動物血清；ならびにインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群から選択される任意選択の増殖因子を添加した基本培養培地に懸濁させる工程；ｃ）工程ｂ）で得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層の上に播種し、さらにこのＥＳ細胞を少なくとも１継代培養する工程；ｄ）所望により、１〜１５継代前後、好ましくは３〜１５継代前後の数継代の間、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦからなる群から選択される全ての増殖因子を培養培地から除去し、さらにこの鳥類ＥＳ細胞を少なくとも１継代培養する工程（好ましくは、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦからなる群から選択される全ての増殖因子の培養培地からの除去は１継代の間、同時に行う。通常、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦの除去は１０〜１５継代前後で行う。）；ｅ）ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦを培養培地から除去し、さらにこの鳥類ＥＳ細胞を少なくとも１継代培養する工程（好ましくは、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦからなる群から選択される増殖因子の培養培地からの除去は１継代の間、同時に行う。通常、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦの除去は１５〜２５継代前後で行う。あるいは、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦの除去は数継代（少なくとも２継代、およそ１５継代まで）にわたって段階的に引き下げることにより行う。）；ｆ）数継代後にフィーダー層の完全な除去が得られるように培養培地のフィーダー細胞の濃度を段階的に引き下げ、さらに細胞を培養する工程；ｇ）所望により、少なくとも１継代後に添加物の完全な除去が得られるように培養培地の添加物の濃度を段階的に引き下げる工程；ｈ）所望により、数継代後に動物血清の完全な除去が得られるように培養培地の動物血清の濃度を段階的に引き下げる工程；ｉ）増殖因子、フィーダー層の不在下、所望により、動物血清および添加物を含まない基本培地で増殖することができるＥＳ細胞由来の接着性鳥類細胞系統（すなわち、ＥＢｘ（登録商標））（該連続的二倍体鳥類細胞系統は複製能を有する内在性レトロウイルス粒子を生産しない）を得る工程；ｊ）所望により、さらに該接着性鳥類ＥＢｘ（登録商標）細胞系統を懸濁培養条件に順応させる工程（細胞培養を懸濁状態に順応させる工程は、全てＥＢｘ（登録商標）細胞を確立するプロセスに沿って行うことができる。例えば、Ｍｕｓｃｏｖｙ胚幹細胞に由来するカモＥＢｘ（登録商標）細胞を用いる場合、これらの細胞はフィーダー層除去の前に懸濁液での増殖に順応したものである。北京ダック由来のカモＥＢ（登録商標）細胞（ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６）の場合、これらの細胞は動物血清除去の前に懸濁液での増殖に順応したものである。）；ｋ）所望により、さらに該鳥類ＥＢｘ（登録商標）細胞を、例えば制限希釈によってサブクローニングする工程を含んでなる。
【００３５】
別の態様では、鳥類胚幹細胞（ＥＳ）由来の連続的二倍体鳥類細胞系統（すなわち、ＥＢｘ（登録商標））（該鳥類細胞系統は複製能を有する内在性レトロウイルス粒子を生産しない）を得るためのプロセスは、ａ）産卵前後の発達段階の鳥類胚を分離する工程（該鳥類のゲノムは、複製能を有する内因性レトロウイルス粒子を生産することのできる内因性プロウイルス配列を含まない）；ｂ）工程ａ）の胚を解離させることによって得られた鳥類胚幹（ＥＳ）細胞を、少なくともインスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）および繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ならびにウシ胎仔血清などの哺乳類血清を添加した基本培養培地に懸濁させる工程；ｃ）工程ｂ）で得られたＥＳ細胞の懸濁液をフィーダー細胞層の上に播種し、さらにこのＥＳ細胞を少なくとも１継代培養する工程；ｅ）ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦを培養培地から除去し、さらにこの細胞を少なくとも１継代培養する工程；ｆ）数継代後にフィーダー層の完全な除去が得られるように培養培地のフィーダー細胞の濃度を段階的に引き下げ、さらに細胞を培養する工程；ｇ）数継代後に哺乳類血清の完全な除去が得られるように培養培地の哺乳類血清の濃度を段階的に引き下げる工程；ｈ）増殖因子、フィーダー層および哺乳類血清の不在下、基本培地中で増殖することができるＥＳ細胞由来の接着性鳥類ＥＢｘ（登録商標）細胞系統（該連続的二倍体鳥類細胞系統は、複製能を有する内在性レトロウイルス粒子を生産しない）を得る工程；ｉ）所望により、さらに接着性鳥類ＥＢｘ（登録商標）細胞系統を、懸濁液としての増殖を促進することによって、より好ましくは、工程ｈ）で得られた接着性鳥類ＥＢｘ（登録商標）細胞系統を、最初の支持体よりも接着性の低い別の支持体（すなわち、Ultra Low attachment support）に移すことによって、懸濁培養条件に順応させる工程を含んでなる。
【００３６】
接着性鳥類ＥＢｘ（登録商標）細胞系統を懸濁培養条件に順応させる工程ｊ）は、実施される場合、別の好ましい実施形態では、培養培地の哺乳類血清の濃度を段階的に引き下げる工程ｇ）の前に行うことができる。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、本発明に従って連続的二倍体鳥類細胞系統を得るためのプロセスの工程ｂ）の基本培養培地には、さらにインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群から選択される増殖因子を添加し、該プロセスはさらに、ｄ）所望により、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦからなる群から選択される全ての増殖因子を培養培地から除去し、さらにこのＥＳ細胞を少なくとも１継代培養する工程ｄ）を含んでなる。
【００３８】
より好ましい実施形態では、工程ｄ）が実施される場合、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦを培養培地から除去する工程ｅ）は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ＦＧＦからなる群から選択される増殖因子を培養培地から除去する工程ｄ）の後に行う。
【００３９】
一態様において、鳥類細胞は懸濁液で増殖させることができる。一態様において、鳥類細胞は血清不含培地で増殖させることができる。
【００４０】
一態様において、鳥類細胞はin vivoにおいて腫瘍形成能を持たない。
【００４１】
一態様において、鳥類細胞系統は、哺乳類細胞系統とα２−６シアル酸受容体を共有する。
【００４２】
ＥＢ６６の増殖に好適な培地は、ＳＡＦＣ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるＥＸ−ＣＥＬＬ  ＥＢｘ培地である。
【００４３】
このような鳥類細胞系統はインフルエンザウイルスの直接的分離に使用可能であるか、または集団中に循環しているか、もしくは集団中に循環しているインフルエンザウイルスに抗原性として典型的な血球凝集素を有する株などの、ワクチン製造に好適なインフルエンザ株に感染させることができる。
【００４４】
本発明の一態様において、患者サンプルからシードワクチンの調製に用いられるのは鳥類細胞系統だけであり、本プロセスでは種々の鳥類細胞系統の使用が具体的に意図されるが、他のタイプの細胞系統は使用されない。本発明の一態様において、ワクチンの調製に用いられるのは鳥類細胞系統だけであり、他のタイプの細胞系統は使用されない。
【００４５】
よって一態様において、インフルエンザウイルスを患者サンプル（例えば、臨床分離株）から鳥類細胞、好適にはＥＢ６６細胞に直接感染させ、卵または哺乳類細胞培養を使用せずに、ワクチンシードの調製に用いる。
【００４６】
一態様において、インフルエンザウイルスを患者サンプル（例えば、臨床分離株）から鳥類細胞、好適にはＥＢ６６細胞に直接感染させた後、所望により種々のタイプの鳥類細胞に再び感染させ、ワクチンシードを調製する。
【００４７】
一態様において、インフルエンザウイルスは鳥類細胞系統で１回または２回継代し、一態様においては、抗原の採取およびワクチン調製のためにウイルスを増殖させる前に行う継代は２回以下である。
【００４８】
一態様において、インフルエンザ株がＨ３Ｎ２株、特に、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株である場合、インフルエンザウイルスは２回を超えて継代されない。
【００４９】
複数の異なる細胞系統の使用
上述の特定の細胞系統を含め、鳥類細胞系統は、細胞系統（この細胞系統は、ウイルス複製を助ける哺乳類細胞、例えば、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌ細胞を含み得るが、ヒトおよび他の霊長類細胞の使用は好ましくない）にすでに感染していたインフルエンザサンプルに感染させてもよい。腎臓細胞、繊維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの種々細胞種を使用することができる。好適なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名称の細胞系統である。好適なサル細胞は例えば、アフリカミドリザル細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系統のような腎臓細胞がある。好適なイヌ細胞は例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系統のような腎臓細胞がある。好適な細胞系統は、限定されるものではないが、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＣＬＤＫ、ＨＫＣＣ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＦＲｈＬ２、ＷＩ−３８などが挙げられる。好適な細胞系統は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （ＡＴＣＣ）  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  （ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。これらの細胞種のいずれを本発明に従って増殖、遺伝子再集合および／または継代に使用してもよい。ＭＤＣＫ細胞系統は種々の腫瘍形成表現型を呈する。ＡＴＣＣ細胞系統ＣＣＬ−３４は、Krauseにより、非腫瘍形成性であることが記載されている。他のＭＤＣＫ細胞、特に、懸濁に順応した細胞は腫瘍形成表現型を示す。ＢＶ５Ｆ１などのＭＤＣＫのいくつかのクローンは、非腫瘍形成性であることが分かっている（国際公開第０５／１１３７５８号）。
【００５０】
一態様において、インフルエンザウイルスを患者サンプルから非ヒト哺乳類細胞、好適にはＭＤＣＫ細胞に直接感染させ、その後、鳥類細胞、好適にはニワトリ細胞ＥＢ１４またはカモ細胞ＥＢ２４もしくはＥＢ６６細胞などの鳥類胚幹細胞に感染させて、ワクチン製造に使用するためのウイルスシードを作製する。
【００５１】
一態様において、インフルエンザウイルスを患者サンプルから鳥類細胞、好適にはＥＢ６６細胞に直接感染させ、その後、非ヒト哺乳類細胞、好適にはＭＤＣＫ細胞、好ましくは腫瘍形成表現型を持たないＭＤＣＫ細胞に感染させて、ワクチン製造に使用するためのウイルスシードを作製する。
【００５２】
概説（非鳥類細胞特異的特徴）
インフルエンザウイルス株、哺乳類細胞系統、逆遺伝学的技術、ワクチン調製法、インフルエンザ受容体結合、および医薬組成物を記載した好適な背景情報は国際公開第２００８０３２２１９号に示されており、この教示は参照により本明細書に組み入れる。
【００５３】
本発明の一態様において、シードウイルスは配列決定してもよく、かつ／または抗血清を惹起するために使用してもよく、かつ／またはワーキングシードロットを調製するために使用してもよい。
【００５４】
一態様において、シードウイルスゲノムはＰＲ／８／３４セグメントを持たない。
【００５５】
一態様において、シードウイルスは、Ｓｉａ（［α］２，３）Ｇａｌ末端二糖を含むオリゴ糖に比べて、Ｓｉａ（［α］２，６）Ｇａｌ末端二糖を含むオリゴ糖に結合選択性を有する血球凝集素を持つ。
【００５６】
一態様において、本発明のプロセスは、（ｉ）細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させること、および（ｉｉ）ウイルスを増幅させる前に、工程（ｉ）で得られた感染細胞系統からウイルスを少なくとも１回継代継代することを含む。継代工程は一般に、インフルエンザウイルスを細胞培養で複製させること；複製したウイルスを例えば培養上清から回収すること；および回収した複製ウイルスを非感染細胞培養物に移すことを含む。このプロセスを繰り返すことができる。少なくとも１回の継代の後、ウイルスを複製させ、ウイルスをシードウイルスとして使用するために回収する。
【００５７】
ワクチン
一態様において、本発明はまた、インフルエンザウイルスワクチンを調製するプロセスに関し、本明細書で開示されるように作製されたシードウイルスがワクチン製造用のインフルエンザウイルスを生産するために培養される。その後、このウイルスを、ワクチンを生産するために、例えば、不活化完全ワクチン、スプリットワクチン、サブユニットワクチン（ＨＡ、ＶＬＰまたはビロソームに基づくワクチンなどの、組換え発現されたインフルエンザウイルス抗原に基づくサブユニットワクチンを含む）を生産することによって処理してもよい。このようなワクチンを生産する方法は当技術分野で周知であり、以下にさらに記載する。
【００５８】
一態様において、このようにして生産されたワクチンは、１用量当たり２５ｎｇ未満、好適には１０ｎｇ未満の残存宿主細胞ＤＮＡを含有する。
【００５９】
一態様において、多価インフルエンザワクチンは、単一の株に対して本明細書に開示されるようにワクチンを製造し、その後、このワクチンを、所望により、これもまた本発明方法を用いて生産された他の１以上の個々のワクチンと混合して多価インフルエンザワクチンを作製することにより、生産することができる。一態様において、多価インフルエンザワクチンは、２種のＡ型インフルエンザウイルス株と１種のＢ型インフルエンザウイルス株を含み得る。一態様において、ワクチンは少なくとも１種のパンデミック株を含んでなる。
【００６０】
一態様において、ワクチンは実質的に水銀を含まない。
【００６１】
一態様において、ワクチンはアジュバントを含む。
【００６２】
アジュバント
一態様において、本発明の医薬組成物はアジュバントを含まない。別の態様において、本発明の医薬組成物はアジュバントを含んでなる。
【００６３】
水中油型エマルションアジュバント
一態様において、本発明のアジュバントはエマルション、特に、水中油型エマルションであり、所望により他の免疫賦活剤を含んでもよい。特に、エマルション系の油相は、代謝可能な油を含んでなる。代謝可能な油という意味は当技術分野で周知である。代謝可能なとは、「代謝により変換可能である」ことと定義することができる(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company,第25版(1974))。油は、レシピエントに毒性が無く、代謝により変換可能ないずれの植物油、魚油、動物油または合成油であってもよい。ナッツ類、種子および穀粒が植物油の一般的な供給源である。合成油もまた本発明の一部であり、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）およびその他などの市販の油を含み得る。特に好適な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）は、サメ肝油中に大量に見られ、また、オリーブ油、コムギ胚芽油、糠油および酵母中に少量見られる不飽和油であり、本発明で用いるための油である。スクアレンは、コレステロール生合成の中間体であるということによって代謝可能な油である(Merck index,第10版, entry no.8619)。
【００６４】
水中油型エマルションはそれ自体当技術分野で周知であり、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（欧州特許第３９９８４３Ｂ号）、また、水中油型エマルションと他の活性剤の組合せもワクチン用のアジュバントとして記載されている（所望により免疫賦活剤ＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬとともに製剤化されたスクアレン、α−トコフェロールおよびＴＷＥＥＮ  ８０に基づくエマルションアジュバントを開示している国際公開第９５／１７２１０号；同第９８／５６４１４号；同第９９／１２５６５号；同第９９／１１２４１号；同第２００６／１００１０９号；同第２００６／１００１１０号；同第２００６／１００１１１号；同第２００８／１２８９３９号；同第２００８／０４３７７４）。国際公開第９０／１４８３７号；同第００／５０００６号；同第２００７／０５２１５５号；同第２００７／０８０３０８号；同第２００７／００６９３９号に開示されているものなどの他の水中油型エマルションに基づくアジュバントも記載されており、これらは全てオイルエマルション系（特に、スクアレンに基づく場合）を形成し、本発明の別のアジュバントおよび組成物を形成する。
【００６５】
特定の実施形態では、水中油型エマルションは、スクアランまたはスクアレンなどの代謝可能な無毒な油、所望により、トコフェロール、特に、αトコフェロールなどのトコール（および所望により、スクアレンとαトコフェロールの双方）および非イオン界面活性剤ＴＷＥＥＮ  ８０（商標）もしくはポリソルベート８０などの乳化剤（または界面活性剤）を含んでなる。特定の実施形態では、このオイルエマルションはさらにコレステロールなどのステロールを含でなる。例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０（もしくはポリソルベート８０（商標））／Ｓｐａｎ  ８５混合物、またはＴｗｅｅｎ  ８０（もしくはポリソルベート８０（商標））／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物などの界面活性剤の混合物が使用可能である。
【００６６】
トコール（例えば、ビタミンＥ）もまた、オイルエマルションアジュバントに用いられる（欧州特許第０３８２２７１Ｂ１号；米国特許出願第５６６７７８４号；国際公開第９５／１７２１０号）。オイルエマルション（所望により、水中油型エマルション）に用いられるトコールは、欧州特許第０３８２２７１Ｂ１号に記載のとおりに調剤することができ、この場合、トコールは、所望により乳化剤を含む、所望により直径１ミクロン未満のトコール液滴の分散物であり得る。あるいは、トコールは、別の油と併用してオイルエマルションの油相を形成してもよい。トコールと併用可能なオイルエマルションの例は、上記の代謝可能な油など、本明細書に記載されている。
【００６７】
水中油型エマルションを生産する方法は当業者に周知である。一般に、その方法は、油相をＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（商標）溶液などの界面活性剤と混合した後、ホモジナイザーを用いてホモジナイズすることを含んでなる。当業者には、混合物をシリンジニードルに２回通すことを含んでなる方法は少量の液体をホモジナイズするのに適していることが明らかであろう。同様に、当業者ならば、マイクロフルイダイザー（Ｍ１１０Ｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ機、最大５０パス、最大入口圧６バール（出口圧約８５０バール）で２分間）における乳化プロセスを、少量または多量のエマルションを作製するために適合させることができるであろう。この適合は、必要な直径の油滴を有する調製物が得られるまで、生じたエマルションを測定することを含んでなる慣例の実験によって達成することができた。
【００６８】
水中油型エマルションでは、油および乳化剤は水性担体中とすべきである。水性担体は例えばリン酸緩衝生理食塩水であり得る。
【００６９】
安定な水中油型エマルション内に見られる油滴の大きさは所望により１ミクロン未満であり、光子相関分光法によって測定した際に実質的に直径３０〜６００ｎｍの範囲、所望により実質的に直径３０〜５００ｎｍ前後、所望により実質的に直径１５０〜５００ｎｍ、特に、直径約１５０ｎｍであり得る。これに関しては、数において油滴の８０％がその範囲にあるべきであり、所望により、数において９０％を超える油滴、所望により９５％を超える油滴が定義される大きさの範囲内ある。
【００７０】
一態様において、免疫原性組成物のアジュバントは、下記組成のサブミクロンの水中油型エマルションを含んでなる：
２〜１０％のスクアレン、０．３〜３％のＴＷＥＥＮ８０（商標）および所望により２〜１０％のα−トコフェロール；
約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ  ８５。このアジュバントはＭＦ５９と呼ばれる。
【００７１】
別の態様では、免疫原性組成物のアジュバント中に存在する成分は、これまでに有用であると思われていたものよりも低量であり、好適には、免疫原性組成物のヒト１用量当たり、代謝可能な油（スクアレンなど）１１ｍｇ未満、例えば、０．５〜１１ｍｇ、０．５〜１０ｍｇまたは０．５〜９ｍｇの間、および乳化剤（好適にはポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタンなど）５ｍｇ未満、例えば、０．１〜５ｍｇの間である。好適には、トコール（例えば、α−トコフェロール）は、存在する場合、１２ｍｇ未満、例えば、０．５〜１２ｍｇの間である。本発明のアジュバント組成物は、好適には、０．５〜１０ｍｇの量の代謝可能な油と０．４〜４ｍｇの量の乳化剤、および所望により０．５〜１１ｍｇの量のトコールを含んでなる水中油型エマルションアジュバントを含んでなる。本発明の別のアジュバント組成物は、好適には、１〜７ｍｇの量の代謝可能な油と０．３〜３ｍｇの量の乳化剤、および所望により１〜８ｍｇの量のトコールを含んでなる水中油型エマルションアジュバントを含んでなる。好適には、該エマルションは、その少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％強度が１μｍ未満の直径を有する油滴を持つ。
【００７２】
「ヒト用量」とは、ヒト用途に好適な用量で送達されるインフルエンザ組成物用量（アジュバントと抗原成分を混合した後）を意味する。一般に、この用量は０．２５〜１．５ｍｌの間である。一実施形態では、ヒト用量は約０．５ｍｌである。さらなる実施形態では、ヒト用量は０．５ｍｌより多く、例えば、約０．６、０．７、０．８、０．９または約１ｍｌである。さらなる実施形態では、ヒト用量は１ｍｌ〜１．５ｍｌの間である。別の実施形態では、特に、免疫原性組成物がパンデミック集団に用いられる場合、ヒト用量は０．５ｍｌ未満、例えば、０．２５〜０．５ｍｌの間、または厳密には０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．２５ｍｌ、０．３ｍｌまたは０．４ｍｌであり得る。本発明は、免疫原性組成物内の個々のアジュバント成分のそれぞれまたは全てがこれまでに有用であると思われていたものよりも低レベルであり、一般に上記に挙げられた通りであることを特徴とする。特に好適な組成物は、下記のｏ／ｗアジュバント成分を、ヒト用量の最終容量（好適には約０．５ｍｌまたは約０．７ｍｌ）中に下記の量で含んでなる（表１および表２）。
【表１】
2013509167.tif 000002
【表２】
2013509167.tif 000003
【００７３】
表１および表２に示されている全ての数値（例えば、％またはｍｇ）は、５％の変動を見込んで理解すべきであり、すなわち、４．８８ｍｇのスクアレンは、４．６４〜５．１２ｍｇの間を意味すると理解すべきである。
【００７４】
必要なＨＡ量および必要なアジュバント成分量を送達するアジュバント含有ワクチンを作製するために、各成分（ｏ／ｗエマルションおよび抗原）の前希釈を行うことができる。
【００７５】
一実施形態では、凍結乾燥したインフルエンザ抗原組成物を再構成するために液体アジュバントが使用される。この実施形態では、アジュバント組成物のヒト用量として好適な容量はヒト用量の最終容量にほぼ等しい。液体アジュバント組成物は、凍結乾燥した抗原組成物の入ったバイアルに加える。最終ヒト用量は０．５〜１．５ｍｌの間で可変である。
【００７６】
所望により、油（例えば、スクアレン）：トコール（例えば、α−トコフェロール）の比率は１以下であるが、これはより安定なエマルションを提供するためである。
【００７７】
本発明のワクチンが安定剤、好適には、α−トコフェロールコハク酸などのα−トコフェロールの誘導体をさらに含有することが有利な場合もある。
【００７８】
免疫原性組成物においてアジュバントを働かせる成分の用量は、ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強し得ることが好適である。特に、代謝可能な油、トコールおよびポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタンの好適な量は、アジュバント不含組成物に比べて組成物の免疫能を増強する量、または対象ヒト集団において別の（より高い）量の該成分を含んでなるアジュバントで増強される組成物で得られるものと同等の免疫能を与えるとともに、反応原性特性から許容される量である。
【００７９】
任意選択の免疫賦活剤
一態様において、アジュバントは、スクアレンなどの代謝可能な油、α−トコフェロールなどのトコールおよびポリソルベート８０などの界面活性剤を、上記で定義された量で含む水中油型エマルションアジュバントであり、付加的免疫賦活剤は含まず、特に、非毒性脂質Ａ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）またはサポニン（ＱＳ２１など）を含まない。
【００８０】
本発明の別の態様では、抗原または抗原組成物と、水中油型エマルションおよび任意選択の１以上のさらなる免疫賦活剤を含んでなるアジュバント組成物とを含んでなるワクチン組成物が提供される。付加的免疫賦活剤は非毒性脂質Ａ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）またはサポニン（ＱＳ２１など）であり得る。本発明の別の態様では、水中油型エマルションアジュバントは所望により１以上の付加的アジュバント、またはＱＳ２１および／もしくはＭＰＬ以外の免疫賦活剤を含んでなる。
【００８１】
本発明の別の態様では、本発明の医薬組成物は、本明細書に挙げられている成分をはじめとする、水中油アジュバント以外のアジュバントを単独で、または例えば、非毒性脂質Ａ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）もしくはサポニン（ＱＳ２１など）と組み合わせて含んでなる。
【００８２】
本発明の別の態様では、アジュバントは、リポ多糖類、好適には、脂質Ａの非毒性誘導体、特に、モノホスホリル脂質Ａ、またはより詳しくは、３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）を含む。３Ｄ−ＭＰＬはGlaxoSmithKline Biologicals N.A.によりＭＰＬの名称で販売されており、ＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬとして文献に参照される。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号参照。３Ｄ−ＭＰＬは主として、ＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１Ａに開示されている方法に従って生産することができる。化学的には、この３Ｄ−ＭＰＬは、３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと３、４、５または６本のアシル化鎖の混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬが使用可能である。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターで濾過除菌できる粒径を持つ。このような調製物は国際公開第９４／２１２９２号に記載されている。
【００８３】
３Ｄ−ＭＰＬなどの該リポ多糖類は、免疫原性組成物のヒト１用量当たり１〜５０μｇの間の量で使用することができる。このような３Ｄ−ＭＰＬは約２５μｇのレベルで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、３Ｄ−ＭＰＬを約１０μｇ、例えば５〜１５μｇの間のレベルで含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は３Ｄ−ＭＰＬを約５μｇのレベルで含んでなる。
【００８４】
別の実施形態では、脂質Ａの合成誘導体は任意選択の付加的免疫賦活剤として用いられ、ＴＬＲ−４アゴニストと記載される場合もあり、限定されるものではないが、下記のものを含む。
【００８５】
ＯＭ１７４  （２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸二水素）、（国際公開第９５／１４０２６号）
ＯＭ２９４  ＤＰ  （３Ｓ，９Ｒ）−３−−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（リン酸二水素）（国際公開第９９／６４３０１号および同第００／０４６２号）
ＯＭ１９７  ＭＰ−Ａｃ  ＤＰ  （３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノエート）（国際公開第０１／４６１２７号）
使用可能な他のＴＬＲ４リガンドとしては、国際公開第９８５０３９９号または米国特許出願第６３０３３４７号（ＡＧＰの調製プロセスも開示されている）に開示されているものなどのアルキルグルコサミニドリン酸（ＡＧＰ）、好適には、ＲＣ５２７もしくはＲＣ５２９、または米国特許出願第６７６４８４０号に開示されているようなＡＧＰの薬学上許容される塩がある。ＡＧＰのあるものはＴＬＲ４アゴニストであり、またあるものはＴＬＲ４アンタゴニストである。双方ともアジュバントとして有用であると考えられる。
【００８６】
ＴＬＲ−４を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5) 他の好適なＴＬＲ−４リガンドとしては、例えば、グラム陰性菌由来のリポ多糖類およびその誘導体、またはその断片、特に、ＬＰＳの非毒性誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）がある。他の好適なＴＬＲアゴニストは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５もしくは９０；界面活性剤プロテインＡ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチドおよびｂ−デフェンシン−２、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）または呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質である。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストはＨＳＰ６０、７０または９０である。他の好適なＴＬＲ−４リガンドは、米国特許出願第２００３／０１１２２３号および同第２００３／０９９１９５号に記載されている通りであり、例えば、国際公開第２００３／０１１２２３号の第４〜５頁または同第２００３／０９９１９５号の第３〜４頁に開示されている化合物Ｉ、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩ、特に、国際公開第２００３／０１１２２３号にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０およびＥＲ８０４７６４として開示されている化合物である。好適には、該ＴＬＲ−４リガンドはＥＲ８０４０５７である。
【００８７】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、昆虫とヒトの間で進化的に保存されているＩ型膜貫通型受容体である。ＴＬＲはこれまでに確立されている（ＴＬＲ１〜１０）(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。ＴＬＲファミリーのメンバーは類似の細胞外ドメインと細胞内ドメインを有し、それらの細胞外ドメインはロイシンリッチリピート配列を有し、細胞内ドメインはインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞内領域と類似していることが示されている。ＴＬＲ細胞は免疫細胞と他の細胞（血管上皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞および腸管上皮細胞を含む）との間で差次的に発現される。ＴＬＲの細胞内ドメインは、アダプタータンパク質Ｍｙｄ８８（その細胞質領域にＩＬ−１Ｒドメインもまた有する）と相互作用して、サイトカインのＮＦ−ＫＢ活性化をもたらすことができ、このＭｙｄ８８経路は、サイトカイン放出がＴＬＲの活性化によって達成される１つの経路である。ＴＬＲの主要な発現は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージなど）のような細胞種における。
【００８８】
ＴＬＲを介した刺激による樹状細胞の活性化は、樹状細胞の成熟およびＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの生産をもたらす。これまでに行われた研究では、ＴＬＲは異なるタイプのアゴニストを認識するが、いくつかのＴＬＲに共通のアゴニストもあることが分かっている。ＴＬＲアゴニストは主として細菌またはウイルスに由来し、フラジェリンまたは細菌リポ多糖（ＬＰＳ）などの分子を含む。「ＴＬＲアゴニスト」は、直接的リガンドとして、または内因性もしくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介してシグナル伝達応答を生じ得る成分を意味する(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。
【００８９】
別の実施形態では、ＴＬＲ分子の他の天然または合成アゴニストが任意選択の付加的免疫賦活剤として用いられる。これらには、限定されるものではないが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のアゴニストが含まれる。
【００９０】
よって、一実施形態では、アジュバント組成物は、ＴＬＲ−１アゴニスト、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−３アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−６アゴニスト、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−８アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはその組合せからなる群から選択される免疫賦活剤を含んでなる。
【００９１】
本発明の一実施形態では、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、トリ−アシル化リポペプチド（ＬＰ）；フェノール可溶性モジュリン；結核菌(Mycobacterium tuberculosis)ＬＰ；細菌リポタンパク質のアセチル化アミノ末端を模倣するＳ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ三塩酸（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰおよびライム病ボレリア(Borrelia burgdorfei)由来のＯｓｐＡ  ＬＰから選択される。
【００９２】
別の実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、リポタンパク質、ペプチドグリカン、結核菌、ライム病ボレリア、梅毒トレポネーマ(T pallidum)由来の細菌リポペプチド；黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む種に由来するペプチドグリカン；リポテイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリア・ポリンズ(Neisseria porins)、細菌線毛、エルシナ(Yersina)病原因子、ＣＭＶビリオン、麻疹血球凝集素、および酵母由来ザイモサンの１以上である。
【００９３】
別の実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはウイルス感染に関連する分子核酸パターンであるポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）である。
【００９４】
別の実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、細菌フラジェリンである。
【００９５】
別の実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、マイコバクテリアのリポタンパク質、ジアシル化ＬＰ、およびフェノール可溶性モジュリンである。さらなるＴＬＲ６アゴニストは国際公開第２００３０４３５７２号に記載されている。
【００９６】
別の実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、Ｎ７およびＣ８位におけるグアノシン類似体、またはイミダゾキノリン化合物もしくはその誘導体である。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストはイミキモドである。さらなるＴＬＲ７アゴニストは国際公開第０２０８５９０５号に記載されている。
【００９７】
別の実施形態ではＴＬＲ−８を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、例えば、レシキモド（Ｒ８４８）であり、レシキモドはまたＴＬＲ−７によっても認識され得る。使用可能な他のＴＬＲ−８アゴニストには、国際公開第２００４０７１４５９号に記載されているものが含まれる。
【００９８】
別の実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。一実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、細菌またはウイルスＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧヌクレオチドを含有するＤＮＡ、特に、ＣｐＧモチーフとして知られる配列構成を含有するＤＮＡ（国際公開第９６／０２５５５号、同第９９／３３４８８号、米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２第）である。好適には、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般にデオキシヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間はホスホロジチオエート結合、または好適にはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル結合および他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、混合型のヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの作製方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号および国際公開第９５／２６２０４号に記載されている。好ましいオリゴヌクレオチドは、国際公開第２００８／１２８９３９号に開示されているＣｐＧ７９０９である。
【００９９】
別の実施形態では、アジュバント組成物は、サポニンアジュバントを含んでなる。本発明での使用に特に好適なサポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａおよびその誘導体、例えば、ＱＳ２１（欧州特許第０３６２２７８号）（ＱＡ２１としても知られる）である。ＱＳ−２１は、キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の樹皮に由来する天然サポニンであり、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞および優勢なＩｇＧ２ａ抗体応答を誘発し、本発明に関して好ましいサポニンである。ＱＳ２１のようなこの免疫学的に活性なサポニンは、免疫原性組成物のヒト１用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。
【０１００】
３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはＱＳ２１の用量は好適には、ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強することができる。特に、好適な３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはＱＳ２１量は、アジュバント不含組成物に比べて、または別の３Ｄ−ＭＰＬもしくはＱＳ２１量のアジュバント含有組成物に比べて組成物の免疫能を高めるとともに、反応原性特性から許容される量である。一般にヒト投与の場合、サポニン（例えば、ＱＳ２１）および／またはＬＰＳ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）は、免疫原性組成物のヒト１用量中に、１用量当たり１μｇ〜２００μｇ、例えば１０〜５０μｇ、または１μｇ〜２５μｇの範囲で存在する。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明のアジュバントおよび免疫原性組成物は、上記のオイルエマルション中のサポニン（例えば、ＱＳ２１）および／またはＬＰＳ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を、ステロール（例えば、コレステロール）とともに含んでなる。これらのステロールは当技術分野で周知であり、例えば、コレステロールは、Merck Index, 11th Edn.,第341頁に動物脂肪中に見られる天然ステロールとして開示されている。さらに、オイルエマルション（特に、水中油型エマルション）はＳｐａｎ  ８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含み得る。水中油型エマルション、ステロールおよびサポニンを含んでなるアジュバントは、国際公開第９９／１２５６５号に記載されている。さらなる免疫賦活剤の例は本明細書および“Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach” 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-Xに記載されている。
【０１０２】
スクアレンおよびサポニン（任意に、ＱＳ２１）が含まれる場合には、その製剤にステロール（任意に、コレステロール）も含ませるのが有利であり、これはエマルション中の油の総レベルを少なくすることができるからである。これにより製造コストが低減され、ワクチンの全体的な快適性が改善され、ＩＦＮ−γ生産の向上など、得られる免疫応答が質的および量的に向上する。よって、本発明のアジュバント系は一般に、２００：１〜３００：１の範囲の比率の代謝可能な油：サポニン（ｗ／ｗ）を含んでなり、また、本発明は「低油」型でも使用することができ、その任意選択の範囲は１：１〜２００：１、所望により２０：１〜１００：１、または実質的に４８：１であり、このワクチンは、はるかに低い反応原性特性を持ちながら、全ての成分の有益なアジュバント特性を保持している。よって、いくつかの実施形態では、スクアレン：ＱＳ２１（ｗ／ｗ）の比率は１：１〜２５０：１、または２０：１〜２００：１、または２０：１〜１００：１の範囲、または実質的に４８：１である。所望により、ステロール（例えば、コレステロール）も含まれ、上記のようなサポニン：ステロール比で存在する。
【０１０３】
付加的免疫賦活剤が所望により含まれるアジュバントは、小児および／または高齢者のワクチン製剤に特に好適である。
【０１０４】
別の態様では、水中油型エマルションアジュバントは所望により、５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）の脂質Ａ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）をさらに含んでなる。
【０１０５】
インフルエンザワクチンの製造プロセス
一実施形態では、本発明のワクチンは、不活化スプリットワクチン、完全ワクチン、サブユニットワクチン（ＨＡ、ビロソームまたはＶＬＰに基づくワクチンなどの、組換え発現されたインフルエンザウイルス抗原に基づくサブユニットワクチンを含む）であり得る。
【０１０６】
本発明に従って使用するためのスプリットインフルエンザウイルスワクチンは好適には、スプリットウイルスまたはスプリットウイルス抗原調製物を含んでなり、この場合、ウイルス粒子は界面活性剤または脂質エンベロープを可溶化するための他の試薬で破壊されている。スプリットウイルスまたはそのスプリットウイルス抗原調製物は好適には完全なインフルエンザウイルス（感染性または不活化）を可溶化濃度の有機溶媒または界面活性剤で断片化した後、全てまたは大部分の可溶化剤および一部または大部分のウイルス脂質材料を除去することによって調製される。そのスプリットウイルス抗原調製物とは、スプリットウイルス成分の大部分の抗原特性を保持しつつ、スプリットウイルスに比べてある程度の精製を受けたと思われるスプリットウイルス調製物を意味する。例えば、細胞培養で生産された場合には、スプリットウイルスは宿主細胞夾雑物を除去することができる。スプリットウイルス抗原調製物は、２以上のウイルス株のスプリットウイルス抗原成分を含んでもよい。スプリットウイルスを含有するワクチン（「インフルエンザスプリットワクチン」と呼ばれる）またはスプリットウイルス抗原調製物を含有するワクチンは一般に、残留マトリックスタンパク質および核タンパク質および場合によっては脂質、ならびに膜エンベロープタンパク質を含んでなる。このようなスプリットウイルスワクチンは通常、ウイルスの構造タンパク質の大部分または全てを含んでいるが、完全なウイルスに見られるものと同じ特性である必要はない。市販のスプリットワクチンの例としては、例えば、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）またはＦＬＵＺＯＮＥ（商標）がある。
【０１０７】
別の実施形態では、インフルエンザウイルスワクチンは、精製サブユニットインフルエンザワクチンの形態である。サブユニットインフルエンザワクチンは一般に、２つの主要なエンベロープタンパク質ＨＡとＮＡを含み、それらは、特に若年のワクチン接種者では反応原性が低いので、完全ビリオンワクチンに優る付加的利点を持ち得る。サブユニットワクチンは破壊されたウイルス粒子から精製することができる。市販のサブユニットワクチンの例としては、例えば、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）またはＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）がある。特定の実施形態では、サブユニットワクチンは、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミダーゼ（ＮＡ）またはＭ２などの少なくとも１つの主要なエンベロープ成分、好適にはＨＡから調製される。好適には、それらはインフルエンザ構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、マトリックス１（Ｍ１）およびＭ２の少なくとも２つの組合せ、好適には、ＨＡおよびＮＡの双方と、所望によりＭ１を含んでなる組合せなど、２以上の抗原の組合せを含んでなる。
【０１０８】
あるいは、インフルエンザウイルスワクチンは、完全ウイルスワクチンの形態であってもよい。
【０１０９】
一実施形態では、インフルエンザウイルスワクチンは、ビロソームを含んでなる。ビロソームは、ビロソームのリン脂質二重膜に組み込まれた、正確なコンフォメーションで機能的なウイルスエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを保持する球形の単ラメラ小胞である。市販のビロソームワクチンの例としては、例えば、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  Ｖ（商標）またはＩＮＶＡＶＡＣ（商標）がある。
【０１１０】
別の実施形態では、サブユニットインフルエンザ成分は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはカプソマー、好適には植物が生成したまたは昆虫細胞が生成したＶＬＰの形態で発現される。ＶＬＰは、それらの天然形態で抗原を提示する。ＶＬＰサブユニット技術はもっぱらインフルエンザタンパク質に基づいてもよいし、あるいはネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のウイルスに頼ってもよく、従って、ＭＬＶ  ｇａｇタンパク質などの非インフルエンザ抗原を含んでもよい。好適なＶＬＰは、少なくとも１つの、好適には少なくとも２つのインフルエンザタンパク質を、所望によりインフルエンザまたは非インフルエンザタンパク質とともに含んでなる、例えば、Ｍ１とＨＡ、ＨＡとＮＡ、ＨＡとＮＡとＭ１、またはＨＡとＮＡとＭＬＶ  ｇａｇなどである。ＶＬＰは植物細胞または昆虫細胞のいずれかで生産され得る。ＶＬＰはまた、例えば、２種の季節株（例えば、Ｈ１Ｎ１とＨ３Ｎ２）から、または季節株とパンデミック株（例えば、Ｈ３Ｎ２とＨ５Ｎ１）から作製されたＶＬＰなど、２つ以上のインフルエンザ株に由来する抗原を有することもできる。
【０１１１】
インフルエンザウイルス抗原またはその抗原調製物は、例えば、特許ＤＤ３００８３３およびＤＤ２１１４４４、または国際公開第２００２０９７０７２号（米国特許第７３１６８１３号に同じ）（全て参照により本明細書に組み入れる）に記載されているスプリットインフルエンザプロセスなどの商業的に適用可能ないくつかのプロセスのいずれによって生産してもよい。
【０１１２】
スプリットワクチンの調製プロセスは、複数の異なる濾過、および／または超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換）工程などの他の分離工程を様々な組合せで、所望により、例えば、熱、ホルムアルデヒドもしくはβ−プロピオラクトン、またはＵ．Ｖ．（分割の前または後に行うことができる）などの不活性化工程とともに含み得る。この分割プロセスは回分法、連続法または半連続法として行うことができる。スプリット免疫原性組成物に好ましい分割および精製プロセスは、国際公開第２００２０９７０７２号に記載されている。
【０１１３】
一実施形態では、インフルエンザワクチンは、低レベルのチオメルサールの存在下、またはチオメルサールの不在下で調製される。別の実施形態では、得られるインフルエンザワクチンは有機水銀系保存剤の不在下で安定であり、特に、この調製物はチオメルサールの残留が無い。特に、このインフルエンザウイルス調製物は、チオメルサールの不在下で、または低レベルのチオメルサール（一般に２０μｇ／ｍｌ以下、例えば１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、または２μｇ／ｍｌ以下）下で安定化された血球凝集素抗原を含んでなる。具体的には、Ｂ型インフルエンザ株の安定化は、コハク酸αトコフェロール（ビタミンＥコハク酸エステル、すなわち、ＶＥＳとしても知られる）などのαトコフェロール誘導体によって行われる。このような調製物およびそれらを調製する方法は国際公開第０２／０９７０７２号に開示されている。
【０１１４】
好ましいワクチンは、ＷＨＯが推奨する適当なインフルエンザ季節株から調製される３つの不活化スプリットビリオン抗原を含有する。
【０１１５】
一態様において、本発明はまた、患者サンプルを鳥類細胞とともにインキュベートする工程を含む、患者サンプルからインフルエンザウイルスを分離する方法（ここで、鳥類細胞は懸濁培養、血清不含培地、タンパク質不含培地、またはその任意の組合せの１つで増殖している）、および該方法によって分離されたインフルエンザウイルスに関する。
【０１１６】
一態様において、本発明は、ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するプロセスであって、該方法は、（ｉ）卵基質で増殖されたことのないインフルエンザウイルスを入手する工程；（ｉｉ）このインフルエンザウイルスに細胞系統を感染させ工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた感染細胞をインフルエンザウイルスを生産するために培養する工程を含んでなるプロセスに関し、このプロセスは数工程または全工程に鳥類細胞系統を用いる。
【０１１７】
これに関して入手するとは、以下に記載されるように、使用することまたは使用のために準備することを意味し得る。
【０１１８】
一態様において、本発明は、ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するプロセスであって、（ｉ）血清含有培地中で増殖する基質上で増殖されたことのないインフルエンザウイルスを入手する工程；（ｉｉ）細胞系統にこのインフルエンザウイルスを感染させる工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた感染細胞をインフルエンザウイルスを生産するために培養する工程を含んでなるプロセスに関し、このプロセスは数工程または全工程に鳥類細胞系統を用いる。
【０１１９】
一態様において、本発明は、ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するプロセスであって、（ｉ）逆遺伝学的技術を用いて作出されたインフルエンザウイルスを入手する工程；（ｉｉ）細胞系統にこのインフルエンザウイルスを感染させる工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた感染細胞をインフルエンザウイルスを生産するために培養する工程を含んでなるプロセスに関し、この細胞系統は鳥類細胞系統である。
【０１２０】
一態様において、本発明は、遺伝子再集合体インフルエンザウイルスを調製するプロセスであって、（ｉ）細胞系統に、第一のゲノムセグメントセットを有する第一のインフルエンザウイルス株と、第二のゲノムセグメントセットを有する第二のインフルエンザウイルス株の双方を感染させる工程（この第一の株は所望の血球凝集素をコードするＨＡセグメントを有する）；および（ｉｉ）工程（ｉ）から得られた感染細胞を、第一のゲノムセグメントセットに由来する少なくとも１つのセグメントと第二のゲノムセグメントセットに由来する少なくとも１つのセグメントを有するインフルエンザウイルスを生産するために培養する工程を含み、ただし、前記第一のゲノムセグメントセットに由来する少なくとも１つのセグメントが第一の株に由来するＨＡセグメントを含んでなる、プロセスに関し、このプロセスは数工程または全工程に鳥類細胞系統を用いる。
【０１２１】
医学的処置および送達
一態様において、本発明は、ヒト被験体に免疫応答を誘発する方法に関し、該方法は本発明のワクチンを被験体に投与することを含んでなる。
【０１２２】
本発明のワクチンは、例えば皮内、粘膜、例えば、鼻腔内、経口、具体的には、舌下、筋肉内または皮下などの任意の好適な送達経路によって投与することができる。他の送達経路も当技術分野で周知である。
【０１２３】
筋肉内送達経路は、アジュバント含有インフルエンザ組成物に好適であり得る。本発明の組成物は、単回用量容器、あるいはまた、パンデミックワクチンに特に好適な多回用量容器で提供することができる。この場合、使用中の汚染を避けるためにチオメルサールなどの抗微生物保存剤が一般に存在する。チオメルサール濃度は２５μｇ／０．５ｍｌ用量（すなわち、５０μｇ／ｍＬ）であり得る。好適には、５μｇ／０．５ｍｌ用量（すなわち、１０μｇ／ｍｌ）または１０μｇ／０．５ｍｌ用量（すなわち、２０μｇ／ｍｌ）のチオメルサール濃度が存在する。好適なＩＭ送達デバイスとしては、無針液体ジェット注射デバイス、例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  ２０００(Bioject, Portland, OR)などを使用することができる。あるいは、エピネフリンの自宅送達に使用されるものなどのペンインジェクターが、ワクチンの自己投与を可能とするために使用することができる。このような送達デバイスの使用は、パンデミック時に必要となるような大規模な免疫誘導キャンペーンに特に沿いやすい。
【０１２４】
皮内送達はもう１つの好適な経路である。皮内送達には、例えば、短針デバイスなどの任意の好適なデバイスを使用することができる。皮内ワクチンはまた、参照により本明細書に組み入れる国際公開第９９／３４８５０号および欧州特許第１０９２４４４号に記載されているもの、およびその機能的等価物など、皮膚への針の有効侵入長を制限するデバイスによって投与してもよい。また、液体ジェット注射器を介して、または角質層に穿入して真皮に到達するジェットを作り出す針を介して真皮に液体ワクチンを送達するジェット注射デバイスも好適である。また、皮膚の外層から真皮へ粉末状のワクチンを加速化する圧縮ガスを用いる弾道粉末／粒子送達デバイスも好適である。さらに、従来のシリンジも、皮内投与の従来のマントー法に使用可能である。
【０１２５】
別の好適な投与経路は皮下経路である。皮下送達には、例えば、従来の針などの任意の好適なデバイスが使用可能である。好適には、無針ジェット注射器デバイスが用いられる。好適には、該デバイスに液体ワクチン製剤を予め充填する。
【０１２６】
あるいは、ワクチンを鼻腔内に投与する。一般に、ワクチンは、好適には肺に吸入されずに、鼻咽頭領域に局所的に投与される。ワクチン製剤を、肺に入ることなく、または実質的に入ることなく、鼻咽頭領域に送達する鼻腔送達デバイスを使用することが望ましい。
【０１２７】
本発明のワクチンの鼻腔内投与に好適なデバイスは噴霧デバイスである。好適な市販の鼻腔用噴霧デバイスとしては、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）(Becton Dickinson)がある。ネブライザーは肺に容易に吸入され得る極めて微細な噴霧を作り出すが、そのため鼻腔粘膜には効率的に到達しない。従って、ネブライザーは好ましくない。
【０１２８】
鼻腔用に好適な噴霧デバイスは、デバイスの性能が、使用者によってかけられる圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは圧力閾値デバイスとして知られる。液体は、閾値圧がかけられた際にのみノズルから放出される。これらのデバイスは、規則的な液滴サイズを有する噴霧を達成することを容易にする。本発明とともに使用するのに好適な圧力閾値デバイスは当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れる国際公開第９１／１３２８１号ならびに欧州特許第３１１８６３Ｂ号および同第５１６６３６号に記載されている。このようなデバイスはPfeiffer GmbHから市販されており、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999にも記載されている。
【０１２９】
好適な鼻腔用デバイスは、１〜２００μｍ、好適には１０〜１２０μｍの範囲の液滴（液体として水を用いて測定）を作り出す。１０μｍ以下では吸入のリスクがあることから、１０μｍ以下の液滴は約５％以下であることが望ましい。１２０μｍを超える液滴も、小さな液滴と同様に拡散しないので、１２０μｍを超える液滴は約５％以下であることが望ましい。
【０１３０】
２用量送達は、本発明のワクチンとともに使用するための鼻腔送達系のさらに好適な特徴である。２用量デバイスは単回ワクチン用量の２つの分割用量を含み、１つの分割用量は各鼻孔への投与のためのものである。一般に、この２つの分割用量は単一のチャンバーに存在し、このデバイスの構築は、単一の分割用量を一度に効率的に送達することを可能にする。あるいは、本発明のワクチンの投与に単回用量デバイスを用いてもよい。
【０１３１】
あるいは、経表皮または経皮または経皮膚ワクチン接種経路も本発明において意図される。
【０１３２】
本発明の一態様において、ワクチン接種はプライム・ブースト・アプローチであってもよい。
【０１３３】
本発明の一態様において、初回投与用のアジュバント含有免疫原性組成物を筋肉内に施し、追加免疫組成物（アジュバント含有または不含）を、例えば、経皮膚、皮内、皮下、鼻腔または舌下などの異なる経路で投与してもよい。
【０１３４】
特定の実施形態では、初回投与用の組成物は、パンデミックインフルエンザ株に対しては１５μｇ未満の量のＨＡを含有し、追加免疫組成物は投与経路によって、標準量１５μｇ、または好適には低用量、すなわち１５μｇ未満のＨＡを含有してよく、より少量で与えてもよい。
【０１３５】
本発明のワクチンは単回用量として投与してもよいが、その成分はまた同時に一緒にまたは異なる時点で投与することもできる（例えば、インフルエンザ抗原は別に、好適にはアジュバントの投与と同時に投与することができる）。単一の投与経路の他、２回の注射を行う場合には、異なる投与経路を用いてもよい。例えば、第一の投与（例えば、プライミング用量）のアジュバント含有インフルエンザ抗原をＩＭ（またはＩＤ）投与し、第二の投与（例えば、追加免疫用量）をＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。さらに、本発明のワクチンは、プライミング用量をＩＭ投与し、追加免疫用量をＩＮ投与してもよい。
【０１３６】
ワクチン中のインフルエンザ抗原の含量は、特にパンデミックワクチンの場合には、インフルエンザ一株当たりＨＡ０．１〜１５μｇ、好適には１〜１０μｇの範囲、最も一般には１〜８μｇの範囲であり得る。インフルエンザ抗原の好適な含量は、ワクチン中に含まれるインフルエンザ一株当たりＨＡ５μｇ未満または正確に５μｇである、初回接種の後、被験体に十分な間隔をおいて１または数回の追加免疫誘導を行うことができる。
【０１３７】
インフルエンザ株
免疫原性組成物またはワクチン組成物中に含まれるべきインフルエンザウイルス株は好適には、季節株、またはパンデミック大発生に関連するか、もしくはパンデミック大発生に関連する可能性を有する株であり、あるいは好適にはこれらの株の混合物である多価組成物である。
【０１３８】
パンデミック間期株は例えば、限定されるものではないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２またはＢなどの季節的に世界的に循環している株である。市販のインフルエンザワクチンは、１株のインフルエンザＢ株と２株のインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）を含む三価の組合せである。
【０１３９】
パンデミック、すなわち、パンデミックインフルエンザ株に関連するインフルエンザ疾患の大発生を起こす可能性を与えるインフルエンザウイルス株の特徴は、それが現在循環している株の血球凝集素に比べて新しい血球凝集素を含み、従って、ほぼ全ての人々が免疫学的にナイーブであること、あるいはそれが大多数の人々が免疫学的にナイーブである循環株のバリエーションを含むこと；それがヒト集団において水平伝播され得ること：およびそれがヒトに対して病原性であることである。新しい血球凝集素は、Ｈ２など、おそらく何十年もの長期間ヒト集団には顕現しなかったものであり得る。あるいは、それは、これまでにヒト集団には循環していなかった鳥類種に見られる、例えば、Ｈ５、Ｈ９、Ｈ７またはＨ６などの血球凝集素であり得る。いずれにせよ、集団の大部分、または集団の少なくとも大きな割合、またはさらには集団全体は過去にその抗原に出くわしたことがなく、それに対して免疫学的にナイーブである。現在、ＷＨＯによりヒトにおいてパンデミックを引き起こす可能性のあるものとして特定されているＡ型インフルエンザウイルスは高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスである。従って、本発明のパンデミックワクチンは好適には、Ｈ５Ｎ１ウイルスを含んでなる。特許請求される組成物に包含させるための他の３種の好適な株はＨ１Ｎ１、Ｈ９Ｎ２またはＨ７Ｎ１である。
【０１４０】
一般にある特定の集団に、パンデミック状況でインフルエンザに感染する高いリスクがある。高齢者、慢性疾患患者および小児は特に罹患しやすいが、多くの若年層および見かけ上健康な人々にもリスクがある。Ｈ２インフルエンザでは、１９６８年以降に産まれた集団の一部に高いリスクがある。これらのグループはできる限り速やかに、簡単な方法で効果的に保護することが重要である。
【０１４１】
高リスクのもう１つのグループが旅行者である。今日、旅行者はかつてより増え、近年、最新のウイルスが出現する地域である中国および東南アジアが任期のある旅行先になっている。この旅行パターンの変化が、新しいウイルスが数ヶ月または数年ではなくおよそ数週間で地球を一巡りすることを可能にしている。
【０１４２】
よって、これらのグループの人々には、特に、パンデミック状況または潜在的パンデミック状況において、インフルエンザから保護するための予防接種の必要がある。好適な株は、限定されるものではないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２およびＨ７Ｎ１である。ヒトにおける他のパンデミック株としては、Ｈ７Ｎ３（カナダで２例が報告）、Ｈ１０Ｎ７（エジプトで２例が報告）およびＨ５Ｎ２（日本で１例が報告）およびＨ７Ｎ２がある。パンデミック株またはパンデミックに関連し得る株であるインフルエンザ株は、本明細書では短く「パンデミック株」と呼ぶ。
【０１４３】
一態様において、インフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザ株またはＢ型インフルエンザ株である。一態様において、Ａ型インフルエンザウイルス株はＨ１、Ｈ３またはＨ５血球凝集素亜型のものである。インフルエンザウイルスはパンデミック株または非パンデミック株であり得る。
【０１４４】
一態様において、この株は鳥類細胞に対して致死性が無いように改変される。
【０１４５】
本発明の好ましいインフルエンザウイルス（シードウイルス、鳥類細胞を用いて患者サンプルから分離されたウイルス、遺伝子再集合体ウイルスなどを含む）は、Ｓｉａ（［α］２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に比べて、Ｓｉａ（［α］２，６）Ｇａｌ末端二糖を含むオリゴ糖に結合選択性を有する血球凝集素を含む。
【０１４６】
本発明の好ましいインフルエンザウイルス（シードウイルス、鳥類細胞を用いて患者サンプルから分離されたウイルス、遺伝子再集合体ウイルスなどを含む）は、卵由来のウイルスから得られたものとは異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（血球凝集素を含む）を含む。よって、これらの糖タンパク質は、鶏卵で増殖させたウイルスには見られない糖型を含んでなり、例えば、それらは哺乳類様の糖結合を含む非鳥類の糖結合を持ち得る。
【０１４７】
本発明の一態様において、免疫原性組成物のヒト用量は、単一のインフルエンザ株に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含有し、「一価」インフルエンザ組成物と呼ばれる。本発明の別の態様では、免疫原性組成物のヒト用量は、２種類以上のインフルエンザ株に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる、「多価」インフルエンザ組成物と呼ばれる。本発明による好適な多価組成物は、二価組成物（２種のインフルエンザウイルス株、例えば、限定されるものではないがパンデミックに関連するか、またはパンデミックに関連し得る２株、に由来する血球凝集素（ＨＡ）、例えば、Ｈ５＝Ｈ２）、三価組成物（３種のインフルエンザウイルス株、所望により２種のＡ株と１種のＢ株、例えば、限定されるものではないが、Ｂ／山形またはＢ／ビクトリア）に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる）、四価組成物（４種のインフルエンザウイルス株に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる）または五価組成物（５種のインフルエンザウイルス株に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる）である。好適な四価組成物は、異なる系列の２種のＡ株と２種のＢ株（Ｂ／山形またはＢ／ビクトリアなど）に由来する血球凝集素を含んでなる。あるいは、四価組成物は、３種のＡ株（所望によりＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびパンデミックに関連するか、またはパンデミックに関連し得る１種のＡ株）と１種のＢ株（例えば、Ｂ／山形またはＢ／ビクトリア）に由来する血球凝集素を含んでなる。さらに別の四価組成物は、パンデミックに関連するか、またはパンデミックに関連し得る株からの４種のＡ株、例えば、Ｈ５＋Ｈ２＋Ｈ７＋Ｈ９のような鳥類株に由来する血球凝集素を含んでなる。具体的には、多価アジュバント含有パンデミック組成物、例えば、パンデミック二価（例えば、Ｈ５＋Ｈ２）または三価または四価（例えば、Ｈ５＋Ｈ２＋Ｈ７＋Ｈ９）は、パンデミックインフルエンザＡ脅威亜型に対する先取免疫および脅威亜型に対する永続的プライミングの利点を付与する。一般に、６週齢から、便宜な計画（例えば、６〜１２か月間隔）を用いて２用量を投与し、所望により、想定された周期的追加免疫（例えば、１０歳）を行う。所望により、このようなパンデミックワクチンを季節性ワクチンと組み合わせてもよい。
【０１４８】
多価組成物はまた、６種以上のインフルエンザ株、例えば６、７、８、９または１０種のインフルエンザ株を含んでなることもできる。
【０１４９】
２種のＢ株を多価季節性組成物に用いる場合、それらは２種の異なる系列（所望によりＢ／ビクトリアおよびＢ／山形）に由来してもよい。前記Ｂ株の少なくとも一方、好適にはＢ株の双方は循環系列に由来する。このような組成物は特に、小児に好適である。好適には、小児に用いるための多価組成物が２種のＢ株を含む場合、Ｂ株に通常当てられている抗原量がその２種のＢ株間で分配される。具体的には、アジュバント含有四価（Ｈ１＋Ｈ３＋両Ｂ系列）インフルエンザワクチンは、（相同性ドリフト保護と、２種の循環Ｂ系列に対するその有効性の両面で）アジュバント不含ワクチンに比べて優れた有効性としてナイーブ小児の予防効果を増強し、年齢に基づき、年中、免疫誘導が可能であるという利点を付与する。好適には、６週齢といった早期から、または６〜３５か月の間に１用量または２用量が投与される。
【０１５０】
特定の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、２種のＡ株（所望により、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）と１種のＢ株に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる三価の免疫原性組成物またはワクチン組成物である。好適には、１株当たりのＨＡは低量のＨＡ（所望により、１株当たり１０μｇＨＡ以下）であり、上記に定義される通りである。好適には、１株当たりのＨＡは約５μｇ以下、約２．５μｇ以下である。本明細書に定義されるようなアジュバントを特に表１に定義されるように包含させることができる。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α−トコフェロールおよびポリソルベート８０をそれぞれ１用量当たり５〜６ｍｇの間、５〜６ｍｇの間および２〜３ｍｇの間の量で含む水中油型エマルションである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α−トコフェロールおよびポリソルベート８０をそれぞれ１用量当たり２．５〜３．５ｍｇの間、２〜３ｍｇの間および１〜２ｍｇの間の量で含んでなる水中油型エマルションである。これらのアジュバント含有免疫原性組成物またはワクチンは、成人（１８〜６０歳）または年長の子供（３〜１７歳）の集団に特に好適であり、Ｈ３Ｎ２ドリフト変異体に対して、また、異なる系列に由来するＢ株に対して交差保護を提供し得る。
【０１５１】
別の特定の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、２種のＡ株（所望により、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）および２種のＢ株（所望により、異なる系列、例えばＢ／ビクトリアおよびＢ／山形に由来）に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる四価免疫原性またはワクチン組成物である。別の特定の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、２種のパンデミック間期Ａ株（所望により、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、１種のＢ株およびパンデミックに関連するか、またはパンデミックに関連し得る１種のＡ株（所望により、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ２およびＨ７Ｎ１）に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる四価免疫原性またはワクチン組成物である。別の特定の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、３種のパンデミック間期Ａ株（所望により、Ｈ１Ｎ１および２種のＨ３Ｎ２株）と１種のＢ株に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる四価免疫原性またはワクチン組成物である。好適には、１用量当たり１株当たりのＨＡは約１５μｇである。好適には、１株当たりのＨＡは低量のＨＡ（所望により、四価組成物１用量当たり最大４０〜４５μｇＨＡを達成するために、１用量当たり１株当たり約１０μｇＨＡ以下）であり、上記に定義される通りである。好適には、１株当たりのＨＡは約５μｇ以下、約２．５μｇ以下である。存在する場合、アジュバントは本明細書に記載されるようないずれのアジュバントであってもよい。
【０１５２】
別の特定の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、２種のパンデミック間期Ａ株（所望により、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、２種のＢ株（所望により、異なる系列、例えば、Ｂ／ビクトリアおよびＢ／山形に由来）およびパンデミックに関連するか、またはパンデミックに関連し得る１種のＡ株（所望により、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ５Ｎ２およびＨ７Ｎ１）に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる五価免疫原性またはワクチン組成物である。別の特定の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、３種のパンデミック間期Ａ株（所望により、Ｈ１Ｎ１および２種のＨ３Ｎ２株）および２種のＢ株（所望により、異なる系列、例えば、Ｂ／ビクトリアおよびＢ／山形由来）に由来する血球凝集素（ＨＡ）を含んでなる五価免疫原性またはワクチン組成物である。好適には、１株当たりのＨＡは低量のＨＡ（所望により、１株当たり１０μｇＨＡ以下）であり、上記に定義される通りである。
【０１５３】
一実施形態では、多価組成物は、好適にはスクアレンに基づく水中油型エマルションアジュバントを含有する。よって、特定の実施形態では、本発明は、スクアレンとＨＡを含んでなり、スクアレン：ＨＡ総重量（含まれる全てのインフルエンザ株）の重量比が約５０〜１５０または約１５０〜４００（例えば、約２００〜３００）の間の範囲である、インフルエンザ免疫原性組成物を提供する。このような組成物は、限定されるものではないが好適には、高齢者集団における使用、および反応原性と免疫原性の最良のバランスを目的とするものである。別の実施形態では、本発明は、スクアレンとＨＡを含んでなり、スクアレン：ＨＡ総重量（含まれる全てのインフルエンザ株）の重量比が約５０〜４００、例えば、約５０〜１００、７５〜１５０、７５〜２００、７５〜４００、１００〜２００、１００〜２５０または２００〜４００の間である、インフルエンザ免疫原性組成物を提供する。この比は好適には、特定の集団に対して保護に関する少なくとも２つ、好適には３つ全ての基準（下記表３または４参照）を満たすものである。ＴＬＲアゴニスト、好適にはＴＬＲ−４（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ、ＭＰＬ、ＡＧＰ分子（ＲＣ５２７もしくはＲＣ５２９など）、またはＥＲ８０４０５７から選択）またはＴＬＲ−９（好適には、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧ７９０９）アゴニストが包含され得る。好適なスクアレン：ＴＬＲ−４重量比は、約１００〜４５０、例えば、５０〜２５０、５０〜１５０、１００〜２５０、２００〜２５０、３５０〜４５０の間である。好適なスクアレン：ＴＬＲ−９重量比は、約５０〜１０００、例えば、５０〜５００、１００〜１０００、１００〜４００、４００〜６００の間である。ＨＡは季節性インフルエンザ株に由来し得る。このような組成物は、限定されるものではないが好適には、成人または小児集団における使用、および反応原性と免疫原性の最良のバランスを目的とするものである。好適には、ＨＡは少なくとも３種、少なくとも４種のインフルエンザ株に由来する。好適には、３種の季節性（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ）株が存在する。好適には、４種の株が存在する場合、それらは４種の季節性株（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、２種のＢ株；またはＨ１Ｎ１、Ｂ、２種のＨ３Ｎ２株）の群、または１種のパンデミック（例えば、鳥類）株と３種の季節性株（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ）の群に由来するものである。
【０１５４】
特許請求されるアジュバント含有免疫原性組成物またはワクチンは全て、接種後６か月を超える期間、好適には１２か月を超える期間の間、持続的免疫応答を提供するアジュバントに頼るのが有利である。
【０１５５】
好適には、上記の応答、例えば、持続的免疫応答および表３または４に概要が示されているものが１用量の後、または同じ進行中の一次免疫応答の間に２用量を投与した後に得られる。１用量のみのアジュバント含有組成物またはワクチンの投与後に免疫応答が得られる特許請求組成物が特に有利である。また、同じ進行中の一次免疫応答の間に、好適にはナイーブまたは免疫抑制集団もしくは個体に対して２用量を投与することも好適である。好適には、２用量は、それまでにワクチン接種を受けていない小児、特に、６歳未満、もしくは９〜１０歳、または０〜３歳児に必要であると思われる。
【０１５６】
よって、本発明の一態様において、インフルエンザに対して１用量または２用量で使用するための、非生パンデミックインフルエンザウイルス抗原調製物、特に、スプリットインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含んでなる免疫原性組成物が提供され、ここで、１用量または２用量の接種は、インフルエンザワクチンの国際規制要件の少なくとも１つ、好適には２つまたは３つを満たす免疫応答を生成する。別の特定の実施形態では、前記１用量の接種はまた、またはそれに加えて非アジュバント含有ワクチンで得られるものよりも高いＣＤ４  Ｔ細胞免疫応答および／またはＢ細胞記憶応答を生成する。特定の実施形態では、前記免疫応答は交差反応性抗体応答または交差反応性ＣＤ４Ｔ細胞応答またはその双方である。特定の実施形態では、ヒト患者はワクチン接種株に対して免疫学的にナイーブである（すなわち、既存の免疫性を持たない）。一態様において、ワクチン組成物は低量のＨＡ抗原と、これまでに有用であると考えられていた量および本明細書で定義されているような量よりも低レベルの成分を含む水中油型エマルションアジュバントとを含有する。具体的には、ワクチン組成物は本明細書に定義されている通りである。特に、ワクチン組成物の免疫原性特性は本明細書に定義されている通りである。好適には、ワクチンは筋肉内に投与される。
【０１５７】
有効性基準
本発明のインフルエンザ薬は好適には、ワクチンに関するある特定の国際基準を満たす。インフルエンザワクチンの有効性を評価するための標準が国際的に適用される。インフルエンザワクチンの年間ライセンス手続きに関連する臨床試験のヒト用途に関する欧州医薬品審査局(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)の基準(CHMP/BWP/214/96, Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP) Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997. CHMP/BWP/214/96 circular N°96-0666:1-22)に従って血清学的変数が評価され（表３または表４）。これらの要件は成人集団（１８〜６０歳）および高齢者集団（＞６０歳）では異なる（表３）。パンデミック間期インフルエンザワクチンでは、少なくとも１つの評価（セロコンバージョン係数、セロコンバージョン、セロプロテクション率）は、ワクチンに含まれる全てのインフルエンザ株に関して要件をみたすべきである。１：４０以上の力価の割合が、保護の最良の相関であると思われることから、最も適切であると考えられる[Beyer W et al. 1998. Clin Drug Invest.;15:1-12]。
【０１５８】
www.emea.eu.intで入手可能な‘Guidelines on flu vaccines prepared from viruses with a potential to cause a pandemic’と題された”Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorisation application". (２００４年４月５日のCHMP/VEG/4717/03またはより最近の2007年１月２４日のEMEA/CHMP/VWP/263499/2006）に明示されているように、非循環株に由来するインフルエンザに関して基準が無い場合には、パンデミック候補ワクチンが、２用量のワクチンの投与後に、プライムされていない成人または高齢被験者における既存のワクチンに関する現行の３つの標準のセットの、好適には全てを満たすに十分な免疫応答を（少なくとも）惹起できるはずである。このＥＭＥＡのガイドラインにはパンデミックの場合には、集団が免疫学的にナイーブであり、従って、季節性ワクチンの３つのＣＨＭＰ基準の全てがパンデミック候補ワクチンによって満たされると想定されるという場合が記載されている。
【０１５９】
本発明の組成物は好適には、組成物に含まれる株に関して、表３に示されるような保護のための３つの基準のうち少なくとも１つ（認可を得るには１つの基準で十分である）、好適には少なくとも２つ、または一般には少なくとも全てを満たす。
【表３】
2013509167.tif 000004
【０１６０】
＊セロコンバージョン率は、接種後の保護力価が１：４０以上である各群の被験者の割合として定義される。簡単に言えば、セロコンバージョン率は、ＨＩ力価が接種前には１：１０より小さく、接種後には１：４０以上となる被験者の％である。しかしながら、最初の力価が１：１０以上である場合には、接種後の抗体量が少なくとも４倍増である必要がある。
【０１６１】
＊＊変換係数は、各ワクチン株に関する、接種後の血清ＨＩ幾何平均力価（ＧＭＴ）における増加倍率として定義される。
【０１６２】
＊＊＊保護率は、接種前に血清陰性で、（保護的）接種後ＨＩ力価が１：４０以上である被験体、または接種前に血清反応陽性であり、接種後力価が有意に４倍増加した被験者（それは通常、保護を示すと認識される）の割合として定義される。
【０１６３】
ＦＤＡは若干異なる年齢カットオフポイントを用いているが、それらの基準はＣＨＭＰ基準に基づくものである。適当なエンドポイントは同様に、１）１：４０以上のＨＩ抗体力価に達した被験者の割合％、および２）接種後ＨＩ抗体力価の４倍の上昇として定義されるセロコンバージョン率を含む。幾何平均力価（ＧＭＴ）も結果に含められるべきであるが、これらのデータは点推定値だけでなく、セロコンバージョンの発生率の９５％信頼区間の下限も含むべきであり、４２日目の１：４０以上のＨＩ力価発生率は、目標値を超えなければならない。従って、これらのデータおよびこれらの評価の点推定値の９５％信頼区間（ＣＩ）が提供される。ＦＤＡドラフトガイダンスでは、両目標値が満たされることを求めている。これを表４にまとめる。
【表４】
2013509167.tif 000005
【０１６４】
＊セロコンバージョン率は、ａ）ベースライン力価が１：１０以上である被験者では、４倍以上の上昇；またはｂ）ベースライン力価が１：１０より小さい被験者では、１：４０以上の上昇として定義される。これらの基準は、真の値に関して９５％ＣＩの下限を満たさなければならない。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明の組成物は好適には、組成物に含まれる株に関して、表４に示されるような保護のための基準のうち少なくとも１つ、好適には双方の基準を満たす。
【０１６６】
好適には、この効果は、７．５μｇＨＡのような低用量の抗原、または３．８μｇもしくは１．９μｇＨＡのようないっそう低用量の抗原で達成される。
【０１６７】
好適には、このような基準のいずれか、または全ては、小児および任意の免疫抑制集団のような他の集団に関しても満たされる。
【０１６８】
本発明の特定の特徴としては以下のものが挙げられる。
【０１６９】
１）ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、
（ｉ）細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させる工程、および
（ｉｉ）（ｉ）の感染細胞系統から得られたウイルスを増幅させてシードウイルスとして使用するためのインフルエンザウイルスを生産する工程
を含んでなる、該細胞系統が鳥類細胞系統である、プロセス。
【０１７０】
２）ワクチン製造用のインフルエンザシードウイルスを調製するプロセスであって、
（ｉ）細胞系統にインフルエンザウイルスを感染させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた感染細胞系統により生産されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを逆遺伝学的手法で用いて、工程（ｉ）のインフルエンザウイルスと共通した少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製する工程；
（ｉｉｉ）細胞系統にこの新たなインフルエンザウイルスを感染させる工程；および
（ｉｖ）シードウイルスとして使用するための新たなインフルエンザウイルスを生産するためにこのウイルスを増幅させる工程
を含んでなる、該細胞系統が工程ｉ、ｉｉｉおよびｉｖの１以上に関して鳥類細胞系統である、プロセス。
【０１７１】
３）工程（ｉ）のインフルエンザウイルスが、直接的に患者もしくは細胞系統の初代分離株から得られるか、または集団中に循環している株、もしくは集団中に循環しているインフルエンザウイルスの抗原性として典型的な血球凝集素を有する株である、前記１）または２）に記載のプロセス。
【０１７２】
４）インフルエンザウイルスが鳥類細胞系統に感染させる前に哺乳類細胞系統で増殖される、前記３）に記載のプロセス。
【０１７３】
５）前記哺乳類細胞系統がＭＤＣＫ細胞系統である、前記４）に記載のプロセス。
【０１７４】
６）いずれの工程にも卵におけるインフルエンザウイルスの増殖または継代を含まない、前記１）〜５）のいずれか一項に記載のプロセス。
【０１７５】
７）前記鳥類細胞系統が連続的二倍体鳥類細胞系統である、前記１）〜６）のいずれか一項に記載のプロセス。
【０１７６】
８）前記鳥類細胞系統がカモ細胞系統である、前記１）〜７）のいずれか一項に記載のプロセス。
【０１７７】
９）カモ細胞系統が国際公開第２００８１２９０５８号または同第２００３０７６６０１号で製造された通り、またはそうでなければ開示されている通りである、前記１）〜８）のいずれか一項に記載のプロセス。
【０１７８】
１０）前記細胞系統が幹細胞系統、例えばＥＢ６６である、前記９）に記載のプロセス。
【０１７９】
１１）インフルエンザウイルスが、鳥類細胞系統の使用後にＭＤＣＫ細胞系統などの非ヒト細胞系統に感染される、前記１）〜１０）のいずれか一項に記載のプロセス。
【０１８０】
１２）鳥類細胞がシードワクチンの生産に使用される唯一の細胞培養細胞である、前記１）〜３）、６）〜１０）のいずれか一項に記載のプロセス。
【０１８１】
１３）前記１）〜１２）のいずれか一項に記載のシードウイルスがワクチン製造用のインフルエンザウイルスを生産するために培養される、インフルエンザウイルスワクチンの調製プロセス。
【０１８２】
１４）ワクチンを生産するためにウイルスが処理される、前記１３）に記載のプロセス。
【０１８３】
１５）個々のインフルエンザウイルス株に対して前記１４）に記載のプロセスを実施すること、およびその株を、所望により前記１３）に記載のプロセスを用いて作製された１以上の他のインフルエンザワクチンと混合して、多価インフルエンザワクチンを作製することを含んでなる、多価インフルエンザワクチンの作製プロセス。
【０１８４】
１６）前記１４）または１５）に従って製造されたワクチン。
【０１８５】
１７）前記１６）に記載のワクチンを用いて個体に接種を行うことを含んでなる、それを必要とする個体の処置方法。
【０１８６】
一般用語
特許出願および付与された特許を含む本願の全ての参照文献の教示は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。本願が優先権を主張するいずれの特許出願も、公開および参照のために本明細書に記載されている様式で参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【０１８７】
疑念を避けるため、本明細書において「含んでなる（「comprising」、「comprise」および「comprises」）」という用語は、いずれの場合にも、「からなる（それぞれ「consisting of」、「consist of」および「consists of」）という用語と所望により置換可能であることが、本発明者らにより意図される。本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、「含んでなる(comprising)」（ならびに「comprise」および「comprises」などの「comprising」のいずれの形態も）、「有する(having)」（ならびに「have」および「has」などの「having」のいずれの形態も）、「包含する(including)」（ならびに「includes」および「include」などの「including」のいずれの形態も)または「含有する(containing)」（ならびに「contains」および「contain」などの「containing」のいずれの形態も）という用語は、包括的または「オープンエンド形式」であり、付加的な、記載されていない要素または方法工程を排除するものではない。
【０１８８】
本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書の実施形態はまた、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、その逆も可能である。全ての数値において「約」（または「前後」）は５％の変動を見込み、すなわち、約１．２５％という値は１．１９％〜１．３１％の間を意味する。
【０１８９】
本特許請求の範囲および／または本明細書において「含んでなる」という用語とともに用いる場合、「a」または「an」は、「１つ」を意味し得るが、それはまた「１以上の」、「少なくとも１つの」および「１を超える」の意味とも一致する。本特許請求の範囲で「または」という用語は、唯一の選択肢を指すこと、または選択肢が相互に相容れないことが明示されない限り、「および／または」を意味して用いられるが、本開示では唯一の選択肢ならびに「および／または」を指す定義を支持する。本願を通じ、「約」という用語は、値が測定、その値を測定するために用いられる方法、または被験体間に存在する変動に関する固有の誤差変動を含むことを示して用いられる。
【０１９０】
本明細書において「またはその組合せ」という用語は、その用語の前に挙げられている項目の全ての順列および組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはその組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、特定の文脈で順番が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢも含むことを意図する。この例を用いて続ければ、ＢＢ、ＡＡＡ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような１以上の項目または用語の繰り返しを含む組合せも明らかに含まれる。当業者ならば、文脈からそうではないことが明らかでない限り、一般に、任意の組合せの項目または用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【０１９１】
本明細書において開示および特許請求される組成物および／または方法は全て、本開示に照らして過度な実験無く、作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者には、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法、方法の工程または方法の一連の工程には変形形態が適用可能であることが明らかである。当業者に明らかなこのような同等の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【０１９２】
本明細書に記載の特定の実施形態は例示により示され、本発明の限定ではないと理解される。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態に使用することができる。当業者ならば、慣例の検討だけを用い、本明細書に記載の特定の手法の多くの均等物を認識または確認することができる。このような均等物は本発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。本明細書に挙げられている全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、各個の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み入れられ場合と同じ程度で参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９３】
本発明を以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明する。
【実施例】
【０１９４】
Ｉ．ウイルスの分離および増幅
臨床分離株（通常４℃または−７０℃で維持）を入手するとすぐ、サンプルを解凍する。サンプルの一部または全部を細胞培養培地で希釈する。残りのサンプルは冷凍することができる。
【０１９５】
培養培地、一般にＳＡＦＣ製のＥＢｘ−ＰＲＯＩ培地またはＬｏｎｚａ製のｕｌｔｒａＭＤＣＫで希釈したサンプルをＥＢ６６などの鳥類細胞、またはＭＤＣＫ細胞の細胞培養に、適当であれば、１：１０から１０〜８：１の範囲の最終容量／容量比に基づいて加える。特に、温度は３０〜３７℃、好ましくは３３〜３５℃の間に設定する。細胞密度は１×１０５〜５×１０６細胞／ｍｌまで可変である。動物、細菌または植物起源のトリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼを使用することができる。トリプシン濃度はLenette et al (1995)に記載されている。好ましい方法は、細胞を、ＥＢｘ−ＰＲＯＩ培地で希釈した臨床分離株とともにマルチウェルプレート内に種々の臨床分離株容量で、またはサンプルの希釈率が高い場合にはフラスコ内に播種することである（増幅については同じ方法、下記参照）。
【０１９６】
数日、一般には２〜７日のウイルス増幅後に、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察する。ＣＰＥが確実であると明らかになった際にウイルスを回収し、この回収物をウイルスシードとすることができ、−７０℃で保存する。
【０１９７】
細胞基質は好ましくは、連続的鳥類細胞系統および／またはカモ細胞系統または非腫瘍形成表現型を有する細胞系統である。
【０１９８】
ウイルス増幅を別の動物細胞系統、例えばＭＤＣＫ細胞系統で行った場合には、この増幅から得られるウイルスはウイルスサンプルとみなされ、ウイルス増幅は上記のように行う。
【０１９９】
インフルエンザ株の調製に逆遺伝学が用いられる場合には（図２）、救済ウイルスを卵または細胞系統のいずれで増殖させてもよいが、好ましくは細胞系統である。本明細書に記載の方法は、新たなシード調製物またはそのワクチン調製物のための例えばＥＢ６６細胞系統で拡大させる場合、両タイプのシードに適用可能である。
【０２００】
以下のパラメーターは、従来の技術を用いて当業者により至適化され得る。
【０２０１】
・感染日前の前培養期間：２または３日
・温度：３３または３５℃
・１回添加またはウイルス複製中、毎日の添加における組換えトリプシン（ＴｒｙｐｚｅａｎまたはＴｒｙｐＬＥ）の性質
・ＭＯＩ：１０−３〜１０−６
・観戦後３日目、４日目または５日目に回収
ＩＩ：ＥＢ６６細胞培養で増幅されたインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡの配列が変更されているかどうかを調べるための細胞系統の試験
ＥＢ６６細胞系統を、ＥＢ６６細胞系統内で増殖されたインフルエンザウイルスのＨＡ配列に影響があるかどうかを調べるために試験した。
【０２０２】
ＩＩ．１．パンデミックウイルス株の分離および増幅
この方法の原理は、ＥＢ６６細胞基質上で、次世代のための複数の候補シード（そのうち最良のものが選択される）を生産するために、ある世代の選択シードの希釈範囲を試験することであった。この方法には、Ｐ０と称する最初のシードの力価を知る必要がある。
【０２０３】
詳しくは、ＣＤＣから入手したＰ０シードを用いた。このＰ０シードは、インドネシアで感染者から最初に分離され、低病原性Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ−Ｒｉｃｏ／８／３４株に由来する６つの内部ビリオンタンパク質コード遺伝子を含有する、インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ２と呼ばれる遺伝子再集合体ウイルスへとさらに処理されたＨ５Ｎ１パンデミック株である。この遺伝子再集合体ウイルス（以降、Ａ／インドネシア／０５／２００５と呼ぶ）は、プラスミドＤＮＡをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトすることにより回復させた。この遺伝子再集合体株が、卵で２回継代された後、ＣＤＣ（米国）により供給された（ヒト分離株、８．３７ｌｏｇ  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）。
【０２０４】
ＥＢ６６由来抗原の場合には、このＰ０シードを用いて、１〜３  １０６細胞／ｍｌ前後のＥＢ６６細胞に感染させた。この感染は、感染時にＴｒｙｐＬＥ（０．５〜２．５ｍｒＰＵ／１０６細胞／ｍｌ）を加えて、ＭＯＩ（多重感染度、一般に１０−３〜１０−６）に基づいて行った。この結果得られたＰ１シードを３日後に回収および冷凍し、サンプルを解凍し、Reed and Muenchの方法(Am. J; Hyg.1938, 27: 493-497)に従ってそのウイルス量の力価測定を開始した。次に、得られた力価をランク付けし、最良の回収物をＰ１シードとして用い、Ｐ２シードを調製するためにＥＢ６６細胞に接種した。Ｐ２およびＰ３シードも同じプロトコールに従って調製した。
【０２０５】
卵由来抗原の場合には、同じシードを、例えば、国際公開第２００２０９７０７２号に概略が示される季節性「Ｆｌｕａｒｉｘ」卵プロセスで増幅させた。
【０２０６】
結果
ＥＢ６６細胞系統の増幅プロトコールを用い、Ｐ０およびＰ３シードのＨＡおよびＮＡ遺伝子の配列決定を行った。ヌクレオチド変化は見られなかった。このことは、ＥＢ６６が臨床分離株に見られる天然ＨＡ配列を維持するのに好適な細胞系統であることを示す。さらなる実験を実施例ＩＩＩのように行った。
【０２０７】
ＩＩ．２．季節性インフルエンザウイルス株の分離および増幅
ＩＩ．２．１  緒論
ＥＢ６６細胞のウイルス順応中に生じる可能性のある突然変異事象をさらに検討した。ＥＢ６６細胞での培養の前後で季節性株のＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子に対して配列決定を行い、卵に基づく増幅またはＭＤＣＫに基づく増幅と比較した。
【０２０８】
ＩＩ．２．２．材料および方法
サンプルの属性および卵またはＥＢ６６細胞での継代回数を表５に示す。Ｅ４Ｅ２は、卵、その後ＥＢ６６培養で６回の継代を意味する。Ｐ０およびＰ３は、ＥＢ６６細胞またはＭＤＣＫでの、それぞれ継代前および３回の継代後を意味する。
【表５】
2013509167.tif 000006
【０２０９】
第ＩＩ．１節に記載されるものと同じ原理に基づきウイルスを増幅させた。詳しくは、ＣＤＣまたはＮＩＢＳＣから入手したＰ０シードを用い、ＥＢ６６細胞に２．５〜５  １０６細胞／ｍｌで感染させた。この感染は、Ｔｒｙｐｚｅａｎを０．３〜０．８ＵＳＰ／１０６細胞／ｍｌの濃度で毎日加え、ＭＯＩ（多重感染度、一般に１０−３〜１０−６）に基づいて行った。細胞基質としてＭＤＣＫを用いた場合には、細胞を１５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。３日後、感染を１０−２〜１０−７の希釈容量に基づいて行い、組換えトリプシンｔｒｙｐ−ＬＥを、感染時と感染１日後に３ｍｒＰＵ／ｍｌの濃度で加えた。この結果得られたＰ１シードを３日後に回収および冷凍し、同日にサンプルを解凍し、Reed and Muenchの方法(Am. J; Hyg.1938, 27: 493-497)に従ってそのウイルス量の力価測定を開始した。次に、得られた力価をランク付けし、最良の回収物をそのままＰ１シードとして用い、２つのＰ２シードを調製するためにＥＢ６６細胞に接種した。Ｐ２およびＰ３シードも同じプロトコールに従って調製した。
【０２１０】
核酸抽出および逆転写酵素反応：
Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット(Roche)を製造者の説明書に従って用い、２００μｌのサンプルからＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを、スーパースクリプトＩＩＩ酵素(Invitrogen)を製造者の説明書に従って用い、逆転写させてｃＤＮＡを得た。ＲＴ反応は、初期変性６５℃５分、その後、２５℃５分、５０℃１時間、および７０℃１５分で行った。
【０２１１】
各遺伝子の全長を表６に記載の特異的プライマーを用い、２回の独立したＰＣＲ反応によって増幅させた。
【表６】
2013509167.tif 000007
【０２１２】
Ｐ３のサンプルのＨａ遺伝子およびＮａ遺伝子を２回の独立したＰＣＲ反応により増幅した。一方の反応はＰｌａｔｉｎｉｕｍ  ＨｉＦｉ酵素を用い、他方はＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ酵素を用いる。Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ  ＨｉＦｉを用いた増幅では、サイクル条件は、９５℃２分の１サイクルの後、９５℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分の３５サイクルとした。Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑを用いた増幅では、サイクル条件は、９５℃２分の１サイクルの後、９５℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃２分の３５サイクルとした。アニーリング温度５５℃を用いた場合には増幅が上手く行かなかったため、Ｎ１遺伝子に用いたアニーリング温度は、Ｐ０およびＰ３に関してそれぞれ４２℃および４５℃とした。各増幅は最終容量５０μｌで行った。次に、この増幅物５μｌを１．２５μｌのローディングバッファーと混合し、１．５％アガロースゲルに流した。電気泳動後、ゲルをＳｙｂｒｓａｆｅで染色した。この第一の実験セットにおいて、Ｅｘ  Ｔａｑ酵素での増幅はＰｌａｔｉｎｉｕｍ  ＨｉＦｉでの増殖よりも効果的であったことから、その後行った増幅はもっぱらＥｘ  Ｔａｑ酵素を用いることによって行った。
【０２１３】
ＥｘｏＳａｐ−ＩＴ  酵素(GE Healthcare)を製造者の説明書に従って用い、ＰＣＲ増幅物を精製した。次に、精製した増幅物の各ストランドについて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｙｏｒサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems)およびＡＢＩ３７３０シーケンサーを用い、以下に添付したファイルに示したシーケンシングプライマーで配列決定を行った。フォワードおよびリバース配列をアラインし、完全配列に相当する断片を得るためにトリミングを行った。
【表７】
2013509167.tif 000008
【０２１４】
ＩＩ．２．３．結果
試験サンプル（Ｐ０およびＰ３）から得られた配列をアラインし、データベースで入手可能な各季節性株配列と比較した。
【０２１５】
ＩＩ．２．３．１．  ＦｌｕＢ  ＨＡおよびＮＡ
ＦｌｕＢ  ＨＡの６３３位に、Ｐ０およびＰ３において、両継代間で配列進化を示さない二集団（Ｒ）が見られた。６４１位に、Ｐ０およびＰ３で二集団が見られ（Ｙ）、これはデータベースから収集した配列から予測されるものであった。これらの結果を考え合わせると、ＦｌｕＢ  ＨＡ遺伝子に対して、ＦｌｕＢ季節性株をＥＢ６６細胞上で培養する影響は無いということが示された。
【０２１６】
同様に、これらのアライメントはまた、ＥＢ６６細胞での継代の前後でＮＡ  ＦｌｕＢ配列にも１００％の配列相同性があることを示した。
【０２１７】
アライメントの結果はまた、ＥＢ６６細胞での継代の前後でＨ１  ＦｌｕＡ配列にも１００％の配列相同性があることを示した。
【０２１８】
これらのアライメントはまた、ＥＢ６６細胞での継代の前後でＮ１  ＦｌｕＡ配列にも１００％の配列相同性があることを示した。
【０２１９】
ＩＩ．２．３．２．  ＦｌｕＡ  ＨＡおよびＮＡ
ＦｌｕＡ  Ｈ３遺伝子配列アラインメントをＰ０、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で分析した。Ｐ１およびＰ２で観察された配列間には、Ｐ０開始配列と比べて違いは見られなかった。しかしながら、Ｐ３の配列には二集団（５２２位）（Ａ／Ｔ）が見られた。Ｐ４のアライメントでは、同じ位置に独特な集団が検出された（Ｔ）ことが示された。この突然変異は、リシン（ＡＡＡ）がアスパラギン（ＡＡＴ）に置き換わったため、サイレントではない。
【０２２０】
アライメントの結果は、ＥＢ６６細胞での継代の前後でＮ２  ＦｌｕＡ配列に１００％の配列相同性があることを示した。
【０２２１】
ＩＩ．２．４  要約
２種の季節性Ｆｌｕ株（Ｂ／マレーシア／２５０６／２０００４；Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６（Ｈ１Ｎ１））のＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子について、ＥＢ６６細胞での３回の継代の前後で配列決定試験を行った。これらの結果は、ＥＢ６６細胞での３回の継代後にＨＡ配列とＮＡ配列の間には参照配列（Ｐ０）と比べて１００％の配列相同性があることを示した。
【０２２２】
Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＮ２配列も、ＥＢ６６細胞での３回の継代の後に、ＮＡ配列間に参照配列（Ｐ０）と比べて１００％の配列相同性があることを示した。１つの例外がＡ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ遺伝子に見られ、継代Ｐ３において５２２位に１つの突然変異（ＡとＴの双方が検出）が見られた。さらに継代４で採取した配列決定データによれば、突然変異したヌクレオチド（Ｔ）が元の配列（Ａ）に完全に置き換わっていたことが示された。この突然変異は、アミノ酸変化（リシンがアスパラギンに置換）が見込まれることから非サイレント突然変異である。
【０２２３】
ＩＩＩ．インフルエンザ株のウイルス免疫原性に関する試験
各継代後にその株の血球凝集素の配列決定を行うことができ、卵由来シードにおいて有意な突然変異が確認され、細胞由来分離株には確認されなかった場合に、通常、前臨床in vivo試験を行う。
【０２２４】
卵培養プロセスと細胞培養プロセスを比較するのに適したアプローチを図１および２に示す。
【０２２５】
細胞に基づくウイルス単離株またはワクチンの抗原性（例えば、ｂｉ  ＳＲＤ試験）免疫原性能を卵由来ウイルスシードまたは精製不活化ウイルスとどのように比較を行うか決定するために、段階的に以下の試験を行うことができる。
【０２２６】
１．鳥類細胞系統、卵またはＭＤＣＫ細胞に由来する生シードをナイーブフェレットの鼻腔内に接種して、そのウイルスによって誘発された同種および異種双方の抗体応答の量を比較する。
【０２２７】
２．ナイーブまたはプライムしたマウスにおける、スプリットウイルスなどの精製した不活化ウイルスを、アジュバントとともに、またはアジュバントを伴わずに用いた場合の同種および異種双方の抗体応答の比較免疫原性。
【０２２８】
３．ナイーブフェレットにおける、精製不活化ウイルスを用いた同種および異種両株に対する比較免疫原性および保護。
【０２２９】
分析方法
血清血球凝集阻害アッセイ（ＨＩ）
このＨＩ試験の原理は、特定の抗インフルエンザ抗体の、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）によるニワトリまたはウマ赤血球（ＲＢＣ）の血球凝集を阻害する能力に基づく。
【０２３０】
このアッセイでは、ＨＡ阻害活性の測定の前に、血清を５６℃に加熱し、補体を不活化した。非特異的凝集の排除は、血清を受容体破壊酵素（ＲＤＥ）で処理することによって行った。５０μｌの血清に２００μｌのＲＤＥ（１００単位／ｍｌ）を３７℃で１２〜１８時間加えた。１５０μｌのクエン酸ナトリウム（２．５％）を５６℃で３０分間加え、ＲＤＥを不活化した。サンプル容量をＰＢＳで５００μｌとした（最終サンプル希釈率は１：１００となる）。標準的なＨＡＩアッセイにおいて、各サンプルの２倍連続希釈液で、抗原の生産に用いたシードと同種の完全／スプリットインフルエンザウイルスおよび異種亜型株による０．５％ニワトリ赤血球または１％ウマ赤血球の凝集を阻害する能力を試験した。
【０２３１】
中和抗体アッセイ
血清に含まれる抗体によるウイルス中和は中和アッセイで測定することができる。血清は、さらなる処理を行わずに本アッセイに用いた。
【０２３２】
このアッセイでは、標準化した量のウイルスを血清の連続希釈液と混合し、インキュベートして抗体とウイルスを結合させる。次に、所定量のＭＤＣＫ細胞を含有する細胞懸濁液を、このウイルスと抗血清の混合物に加え、３５℃で５〜７日間インキュベートする。このインキュベーション期間の後、ウイルス複製を直接評価するか、またはニワトリ赤血球の血球凝集により可視化する。血清の５０％中和力価を、Reed and Muenchの方法(Am. J; Hyg.1938, 27: 493-497)によって計算する。
【０２３３】
鼻腔洗液におけるウイルス力価測定
このアッセイでは、全ての鼻腔サンプルをまずＳｐｉｎ  Ｘフィルター(Costar)で濾過除菌して、混入細菌を除去した。鼻腔洗液の連続１０倍希釈液５０μｌを、５０μｌの培地を含有するマイクロタイタープレートに移す（一希釈液当たり１０ウェル）。次に、１００μｌのＭＤＣＫ細胞（２．４×１０５細胞／ｍｌ）を各ウェルに加え、３５℃で５〜７日間インキュベートする。
【０２３４】
インキュベーション６〜７日後に、培養培地を穏やかに除去し、１００μｌの１／１５  ＷＳＴ−１含有培地を加え、さらに１８時間インキュベートする。
【０２３５】
生細胞がＷＳＴ−１を還元した際に生じる黄色のホルマザン色素の強度は、ウイルス力価測定の終了時にウェル内に存在する生細胞の数に比例し、各ウェルに吸光度を適当な波長（４５０ナノメーター）で測定することによって定量される。カットオフ値は、非感染対照細胞のＯＤ平均値−０．３ＯＤ（０．３ＯＤは非感染対照細胞のＯＤの＋／−３ＳｔＤｅｖに相当する）として定義する。正のスコアはＯＤがカットオフ値よりも小さい場合と定義され、これに対して、負のスコアはＯＤがカットオフ値よりも大きい場合と定義される。ウイルス排出力価は、「Reed and Muench（参照）」により測定し、Ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。
【０２３６】
ＩＩＩ．１．パンデミック株
ＩＩＩ．１．１．フェレットの筋肉内接種
フェレットモデルにおけるインフルエンザ感染は、感受性および臨床症状の点でヒトインフルエンザを密接に模倣している。フェレットは、ウイルス株を事前に順応させなくとも、ヒトインフルエンザウイルス感染に極めて感受性が高い。従って、フェレットモデルは、投与されたインフルエンザワクチンによって付与される保護の検討のために優れたモデルを提供する。
【０２３７】
さらに、感染後のフェレット抗血清は、抗原ドリフトの評価および亜型株の抗原性比較のための重要なツールとなる。
【０２３８】
本研究では、（有胚卵由来シードに比べて）少なくとも同等レベルの中和抗体または血球凝集阻害抗体を誘導するＥＢ６６由来シードの潜在的利益を評価する。
【０２３９】
１４〜２０週齢の雌フェレット(Mustela putorius furo)（３〜５匹／群）に、細胞由来シードまたは有胚卵由来シード（用量範囲１．９〜１５μｇ）のいずれかを筋肉内経路で２回接種した。あるいは、必要に応じ、より高感度の比較を可能とするために、ある容量範囲の各接種物、すなわち、１０倍希釈溶液を接種することもできる。
【０２４０】
抗体応答を評価するため、免疫誘導前および各筋肉内投与後２１日目までに動物から血清サンプルを採取した。血清サンプルは、同型のインフルエンザ株に対しての血球凝集阻害と中和活性について試験することができる。
【０２４１】
本試験を、本明細書の上記第ＩＩ．１節に記載の通りに得たＨ５Ｎ１パンデミック株を用いて行った。フェレット各５匹の群の筋肉内に、ＥＢ６６細胞培養または卵のいずれかで生産した一価Ａ／インドネシア／０５／２００５  Ｈ５Ｎ１スプリット抗原を２１日間隔で２回接種して免疫誘導した。細胞培養に基づく製剤と卵に基づく製剤の双方に対し、ＡＳ０３アジュバント系を含むものと含まないもので比較を行った。用量および容量（５００μｌ）は第Ｉ相臨床試験に関して想定されたヒト用量と同じとした。
【０２４２】
群１：１５μｇ  ＨＡ  ＥＢ６６に基づく抗原（ｎ＝５）
群２：３．８μｇ  ＨＡ  ＥＢ６６に基づく抗原／ＡＳ０３Ａ（ｎ＝５）
群３：１．９μｇ  ＨＡ  ＥＢ６６に基づく抗原／ＡＳ０３Ｂ（ｎ＝５）
群４：１５μｇ  ＨＡ  卵に基づく抗原（ｎ＝５）
群５：３．８μｇ  ＨＡ  卵に基づく抗原／ＡＳ０３Ａ（ｎ＝５）
群６：１．９μｇ  ＨＡ  卵に基づく抗原／ＡＳ０３Ｂ（ｎ＝５）
群７：生理食塩水（ｎ＝３）。
【０２４３】
本試験ならびに下記試験に用いたＡＳ０３アジュバント系は、ＤＬ−α−トコフェロール、スクアレンおよびポリソルベート８０を含む水中油型エマルションに基づくアジュバント系である。その調製物は国際公開第２００８／０４３７７４号（その中の実施例ＩＩ）に記載されている。本発明の目的では、ＡＳ０３Ａ一用量には１１．８６ｍｇ  α−トコフェロールを含有し、ＡＳ０３ＢはＡＳ０３Ａの半分の用量からなる（５．９３ｍｇ  α−トコフェロール）。よって、ヒト用量と同じ抗原／アジュバント比を維持するために、フェレットには全ヒト用量を注射し、マウスにはヒト用量の１／１０を注射した。
【０２４４】
種々の製剤に対する体液性免疫応答を０日目（フェレット５匹／群のプール）、１回目の免疫誘導の後２１日目（ｐｏｓｔ−１、フェレット５匹／群のプール）、および２回目の免疫誘導の後２１日目（ｐｏｓｔ−２個別）に、ＨＩおよびＮＴアッセイにより測定した。ＥＢ６６に基づくスプリット抗原をＨＩアッセイの試薬として用いた。データを表８／図３（ＨＩ力価）および表９／図４（ＮＴ力価）に示す。
【表８】
2013509167.tif 000009
【表９】
2013509167.tif 000010
【０２４５】
結論として、このフェレットにおける予備免疫原性試験は、ＥＢ６６細胞培養由来のパンデミックＨ５Ｎ１ワクチン候補がフェレットにおいて卵に基づくＨ５Ｎ１ワクチンと同等の免疫応答を誘導することができることを示した。
【０２４６】
ＩＩＩ．１．２．ナイーブマウスにおける比較免疫原性
０日目および２１日目にＣ５７ＢＬ／Ｃ６マウスの筋肉内または腹腔内に、ＥＢ６６または有胚卵由来の精製不活化ウイルスに由来する、所望によりアジュバントを含有する抗原５０μｌを接種して免疫誘導した。１回目の免疫誘導後２１日目および２回目の投与後１４日目に動物から伏在静脈を介して、または心臓穿刺によって採血した。血清サンプルを同型および／または異種亜型インフルエンザ株パネルに対するそれらの血球凝集阻害および中和活性について試験し、それらの交差反応性抗体応答を誘導する能力を比較することができる。ＥＢ６６由来シードは、有胚卵由来シードと少なくとも同等の交差反応性抗体応答を誘導すると予測される。
【０２４７】
本試験のため、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群に、上記の第ＩＩ．１節に記載したようにＥＢ６６細胞培養また卵のいずれかで生産した一価Ａ／インドネシア／０５／２００５  Ｈ５Ｎ１スプリット抗原の筋肉内注射（各５０μｌ）を２１日間隔で２回施した。生体内利用率等価性（限界範囲０．５〜２％）を検定するために群の設計を行った。５群を次のように定義した。
【０２４８】
群８：（マウス２０匹）３．８μｇ  ＥＢ６６に基づく抗原／ＡＳ０３Ａ
群９：（マウス３０匹）１．９μｇ  ＥＢ６６に基づく抗原／ＡＳ０３Ｂ
群１０：（マウス２０匹）３．８μｇ  Ｅｇｇに基づく抗原／ＡＳ０３Ａ
群１１：（マウス３０匹）１．９μｇ  Ｅｇｇに基づく抗原／ＡＳ０３Ｂ
群１２：（マウス１４匹）生理食塩水。
【０２４９】
ＡＳ０３ＡおよびＡＳ０３Ｂは本明細書の上記に定義される通りである。１回目の免疫誘導後２１日目および２回目の免疫誘導後１４日目に血清サンプルを採取した。特定の抗Ａ／インドネシア／０５／２００５  Ｈ５Ｎ１  ＨＩ力価およびＮＴ力価を、１回目の投与後のサンプルでは１つのプールで、２回目の投与後のサンプルでは個別に測定した。
【０２５０】
データを表１０／図５（ＨＩ力価）および表１１／図６（ＮＴ力価）に示す。
【表１０】
2013509167.tif 000011
【０２５１】
全てのアジュバント含有ワクチン群で強いＨＩ力価が誘導された。ＥＢ６６細胞培養抗原で得られたＨＩ力価は卵に基づく抗原で得られるものよりも低かったが、抗原間の差は２倍より小さかった。in vivo試験の固有の変動の中で考えると、ＥＢ６６細胞培養由来の抗原と卵由来の抗原の間に生体内利用率等価性が検出された。
【表１１】
2013509167.tif 000012
【０２５２】
全てのアジュバント含有ワクチン群で高いＮＴ力価が誘導された。ＥＢ６６細胞培養由来抗原と卵由来抗原の間に生体内利用率等価性が検出された。
【０２５３】
血清サンプルはまた、異種亜型インフルエンザ株、すなわち、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４株に対するそれらの中和活性に関して試験し、交差反応性抗体応答を調べた。データを表１２に示す。セロコンバージョンは、免疫誘導後の力価が免疫誘導前より４倍高い場合に起こる。
【表１２】
2013509167.tif 000013
【０２５４】
交差応答が検出された：Ｈ５Ｎ１  Ａ／インドネシア／０５／２００５による免疫誘導後に、抗Ｈ５Ｎ１  Ａ／ベトナム／１１９４／２００４  ＮＴ力価が検出された。
【０２５５】
ＩＩＩ．１．３．フェレットにおける抗原チャレンジ試験
本試験の目的は、ＥＢ６６細胞培養由来製剤および卵由来製剤の免疫原性および有効性を、同種の野生型Ａ／Ｈ５Ｎ１／インドネシア／０５／２００５ウイルスチャレンジを用いて比較することである。
【０２５６】
約１２か月齢の雌フェレット(Mustela putorius furo)（６匹／群）に、ＥＢ６６または有胚卵由来の分離株からの精製（例えば、スプリットまたはサブユニット）抗原５００μｌを、２回の筋肉内免疫誘導でとして注射する。２回目の免疫誘導後２８日目に、フェレットに気管内経路により、１０５  Ｌｏｇ  ＣＣＩＤ５０の同型インフルエンザ株で抗原チャレンジを行う。抗原チャレンジ前と抗原チャレンジ後５日目までに鼻腔洗液を採取し、ウイルス複製を測定する。体温を連続的にモニタリングする。０日目、２１日目（１回目の免疫誘導後）、２回目の免疫誘導後２１日目および２７日目に血清サンプルを採取し、同型および異種亜型株に対する中和抗体力価および血球凝集素阻害抗体力価を測定する。
【０２５７】
ＩＩＩ．２．季節性株
細胞培養由来季節性(saisonal)インフルエンザ株を、フェレット抗原チャレンジ試験で評価した。本試験の目的は、ＥＢ６６細胞培養由来製剤、ＭＤＣＫ細胞培養由来製剤または卵由来製剤の免疫原性および有効性を比較すること、ならびにＥＢ６６由来シード、ＭＤＣＫ由来シードおよび卵由来シード間の交差反応性抗体応答を比較することである。
【０２５８】
１４〜２０週齢の雌フェレット(Mustela putorius furo)（４匹／群）に対して、ＭＤＣＫ、ＥＢ６６または有胚卵いずれかに由来の分離株からの精製５〜７Ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ  ２５０μｌで鼻腔内抗原チャレンジを行った。用いたウイルス株は第ＩＩ．２節に記載され、上記の表５に挙げられている通りである。従って、１０群を次のように定義する（Ｅ３は卵での３回の継代を意味し、Ｅ６は卵での６回の継代を意味し、Ｐ０は細胞での０回の継代を意味し、Ｐ３は細胞での３回の継代を意味する）。
【表１３】
2013509167.tif 000014
【０２５９】
抗原チャレンジの３日前およびチャレンジ後７日までに鼻腔洗液を採取し、ウイルス複製を測定した。ウイルス量はＭＤＣＫ細胞でのウイルス力価測定により評価し、その結果を図７、８および９に示す。
【０２６０】
血清サンプルを０日目および抗原チャレンジ後１４日目に採取し、同型および異種亜型株に対する中和抗体力価を測定する。測定された力価を図１０、１１および１２に示す。得られたセロプロテクション率およびセロコンバージョン率を表１４に示す（ＮＴ力価）。セロプロテクションは、力価が４０を超える場合に達成される。セロコンバージョンは、免疫誘導後の力価が免疫誘導前より４倍高い場合に起こる。
【表１４】
2013509167.tif 000015
【図１】
2013509167.tif 000016
【図２】
2013509167.tif 000017
【図３】
2013509167.tif 000018
【図４】
2013509167.tif 000019
【図５】
2013509167.tif 000020
【図６】
2013509167.tif 000021
【図７】
2013509167.tif 000022
【図８】
2013509167.tif 000023
【図９】
2013509167.tif 000024
【図１０】
2013509167.tif 000025
【図１１】
2013509167.tif 000026
【図１２】
2013509167.tif 000027
【配列表】
2013509167000001.app
【国際調査報告】
2013509167.tif 000028
2013509167.tif 000029
2013509167.tif 000030