(57)【要約】局所治療薬、皮膚科学および化粧品において使用するための、成長因子、または遺伝子導入植物から精製された成長因子、またはエキスとしての、もしくは精製された形態にある遺伝子導入植物由来の成長因子の混合物を含有する遺伝子導入植物のエキスを含有するスキンケアのための美容用組成物および皮膚用組成物。重要なことは、本発明によって、安定化された、より安全な成長因子が、美容上の処置および局所的処置のための使用のために利用できるようになることである。好ましい組成物は、植物によって産生された成長因子およびヒアルロン酸を含む。安定化された成長因子を含むこのスキンケア／皮膚用組成物は、望ましくない分解生成物およびその結果生じる組成物の活性の喪失というリスクを有しない。さらには、当該組成物は、動物からまたは動物もしくはバクテリアの細胞に基づく発現系から生じる可能性がある混入物質および伝染性物質を含まない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸と、少なくとも１つの、遺伝子導入植物由来の成長因子と、少なくとも１つの薬学的におよび／または美容上許容できる賦形剤とを含むスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２】
前記成長因子タンパク質を安定化する賦形剤配合を含む、請求項１に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸は、約０．０１〜約２重量％の範囲の濃度で与えられる、請求項１または請求項２に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項４】
前記成長因子は、前記美容用組成物の中に含まれる遺伝子導入植物のエキスの成分として与えられる、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項５】
前記成長因子は、全タンパク質含有量の約０．０００１％〜約７０％の範囲の量で、前記遺伝子導入植物のエキスの中に存在する、請求項４に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項６】
前記植物エキスは、前記成長因子を濃縮するために精製されている、請求項４または請求項５に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項７】
乾燥肌、湿疹、皮膚炎、ひび割れた皮膚、発疹、皮膚の発赤、瘢痕組織、乾癬、および浮腫のうちの１以上から選択される皮膚の状態の処置に好適な、請求項４または請求項５に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項８】
前記タンパク質安定化配合は、グリセロール、水、および塩化カルシウムを含む、請求項２から請求項７のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項９】
前記タンパク質安定化配合は、以下の成分（重量％）、１０〜９０％の範囲のグリセロール、０．１ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の塩化カルシウム（６〜９のｐＨ範囲に緩衝化されている）、および適量の精製水を含む、請求項８に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１０】
さらなる抗菌剤または防腐剤を含有しない、請求項８または請求項９に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１１】
遺伝子導入植物由来の複数の成長因子を含む、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１２】
前記複数の成長因子は、遺伝子導入植物に由来のエキスの混合物の成分として存在する、請求項１１に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１３】
前記複数の成長因子は、タンパク質含有量の約０．０００１％〜約７０％の範囲の量で、遺伝子導入植物のエキスの混合物の中に存在する、請求項１１に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの成長因子または複数の成長因子は、遺伝子導入植物から、約７０％〜約９９．９％の範囲のレベルの純度まで単離されて精製されている、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１５】
１以上の植物由来の精製された成長因子が、植物由来の成長因子をすでに含有する遺伝子導入植物のエキスに添加されている、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの成長因子または複数の成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−Ｒｂなど）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ−ａ、およびＦＧＦ−ｂ、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−６など）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−ｂ）（ＴＧＦ  β−１、ＴＧＦ  β−２、ＴＧＦ  β−３など）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなど）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン  ５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−ｂ）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−ｇ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、レプチン、ノギン、およびチモシンβ４からなる群から選択される、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１７】
前記成長因子またはサイトカインは、対応するヒトの遺伝子配列に由来する、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１８】
前記成長因子またはサイトカインは、それぞれの成長因子またはサイトカインについてのヒトの遺伝子配列に対応する合成された遺伝子に由来する、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項１９】
前記遺伝子導入植物のエキスは、デヒドリンおよび／もしくはグロブリン、または他の種子タンパク質を含有する、請求項４から請求項６のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、クリーム、ローション、ゲル、ドレッシング材、洗髪剤、チンキ剤、ペースト、軟膏剤、膏薬、粉末、液体または半液体の製剤、血清、パッチ、リポソーム調剤、溶液、懸濁液、リポソーム懸濁液、Ｗ／ＯまたはＯ／Ｗエマルション、軟膏剤、ポマードおよびペーストおよび皮膚軟化剤クリーム、顔パック、マッサージクリーム、および栄養補給クリームまたは栄養補給エマルションから選択される形態にある、請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つの、遺伝子導入植物由来の成長因子と、グルセロール、および適量の精製水を含むタンパク質安定化配合とを含む、スキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２２】
塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムから選択される塩をさらに含む、請求項２１に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２３】
ヒアルロン酸をさらに含む、請求項２１または請求項２２に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２４】
遺伝子導入植物由来の成長因子と、少なくとも以下の成分（重量％）、１０〜９０％の範囲のグリセロール、０．１ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の塩化カルシウム、緩衝剤および適量の精製水を含むタンパク質安定化配合とを含む、請求項２２または請求項２３に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２５】
さらなる抗菌剤または防腐剤を含有しない、請求項２１から請求項２４のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２６】
前記成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−Ｒｂなど）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ−ａ、およびＦＧＦ−ｂ、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−６など）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−ｂ）（ＴＧＦ  β−１、ＴＧＦ  β−２、ＴＧＦ  β−３など）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなど）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン  ５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−ｂ）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−ｇ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、レプチン、ノギン、およびチモシンβ４からなる群から選択される１以上である、請求項１７から請求項２５のいずれか１項に記載のスキンケア／皮膚用組成物。
【請求項２７】
医薬として使用するための、非植物の遺伝的起源の植物によって産生された異種の成長因子。
【請求項２８】
乾燥肌、湿疹、皮膚炎、ひび割れた皮膚、発疹、瘢痕組織、乾癬、皮膚の発赤、および浮腫のうちの１以上から選択される皮膚の状態の処置のための医薬として使用するための、非植物の遺伝的起源の植物によって産生された異種の成長因子。
【請求項２９】
表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−Ｒｂなど）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ−ａ、およびＦＧＦ−ｂ、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−６など）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−ｂ）（ＴＧＦ  β−１、ＴＧＦ  β−２、ＴＧＦ  β−３など）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなど）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン  ５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−ｂ）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−ｇ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、レプチン、ノギン、およびチモシンβ４からなる群から選択される、請求項２７または請求項２８に記載の植物によって産生された異種の成長因子。
【請求項３０】
表皮成長因子である、請求項２７または請求項２８に記載の植物によって産生された異種の成長因子。
【請求項３１】
局所用製品を製造する方法であって、ヒアルロン酸と、少なくとも１つの賦形剤と、成長因子を含む遺伝子導入植物のエキスとを一緒に混合する工程を含み、前記成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−Ｒｂなど）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ−ａ、およびＦＧＦ−ｂ、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−６など）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−ｂ）（ＴＧＦ  β−１、ＴＧＦ  β−２、ＴＧＦ  β−３など）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなど）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン  ５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−ｂ）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−ｇ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、レプチン、ノギン、およびチモシンβ４から選択される、方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの賦形剤はグリセロール、塩化カルシウムおよび水を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子導入植物のエキスは大麦種子エキスである、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子導入植物のエキスから前記成長因子を単離する工程をさらに含む、請求項３１から請求項３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
単離する前記工程は、イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、スキンケア、皮膚用途のための、安定化された成長因子およびサイトカインを含む美容用および皮膚用組成物、ならびにスキンケア製品を製造するための方法に関する。特に、本発明は、遺伝子導入植物から得られる安定化された異種の成長因子、ならびに美容用製品および医薬品におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、保護、バリア、温度調節、排泄および呼吸などの種々の機能を果たす、人体の最大の器官である。時間とともに、そして加齢とともに、それらの機能は急速に衰え、様々な生理的な変化が皮膚に起こる。これらの変化は、皮膚の主要構成要素である表皮、真皮および皮下組織の厚さの減少として現れる。脂質組成の変化は、脂質層の水分バリアの役割を弱体化させ、皮膚の乾燥を生じる。さらに、年齢とともに、年齢によるしみ（ａｇｅ  ｓｐｏｔｓ）、雀卵斑（そばかす）、色素沈着または種々の皮膚病変の発生も増加する。
【０００３】
上皮の代謝回転速度の年齢依存的低下は、低い質の角質層の蓄積に関与し、老人性乾皮症、過度の色素沈着および縮緬皺を生じる。これは、一部には、異常な角化細胞分化に起因する可能性がある。汚染およびＵＶ線などの環境要素は、皮膚の老化を加速する可能性がある。活性酸素種およびフリーラジカル、ならびに疲労またはストレスなどのいくつかの生理的状態は、タンパク質、核酸および膜脂質にとって特に有害であり、皮膚の老化を導く。従って、これまでから、皺、年齢によるしみまたは雀卵斑、皮膚の弾力の喪失、色素沈着、ならびに皮膚の乾燥およびひび割れの発生に関する多くの研究がある。
【０００４】
皺、たるみおよび太陽光によって引き起こされる皮膚の弾力の低下を改善することを目的として、皮膚の老化および皮膚の皺の問題を防止または緩慢化するために、様々な美容用組成物が開発されてきた。特許文献１は、コラーゲンの合成によって皮膚の皺を改善するための方法を開示する。特許文献１は、コラーゲンを分解してコラーゲン代謝を促進するコラゲナーゼの活性は、加齢とともに低下し、これは架橋コラーゲンの増加および皮膚の皺の増加を導く可能性があるということを教示する。
【０００５】
皮膚の状態：
乾癬は、皮膚の赤い着色および鱗屑状の斑およびその場所での皮膚の剥離を生じる皮膚の状態である。乾癬性の斑は、表皮の細胞の変質した成長挙動から生じる、表皮における細胞発生および細胞分裂の速度の変化に起因する過剰の皮膚産生の部位である。乾癬性の斑の部位の細胞は、炎症反応を生じる細胞シグナル伝達化合物を産生するということが知られている。乾癬は、感染などの外的条件によって誘発される可能性がある自家不和合性を生じうる免疫応答の一形態であると仮定されてきた。
【０００６】
湿疹：
湿疹は、皮膚炎、または表皮の炎症の一形態である。用語「湿疹」は、ある範囲の持続的な皮膚の状態に広く適用される。これらの状態としては、乾燥、ならびに赤み、皮膚浮腫（腫脹）、かゆみおよび乾燥、痂皮形成、白点形成、水疱形成、ひび割れ、またはさらには滲み出しもしくは出血という症候のうちの１以上を有することができる再発性の発疹が挙げられる。皮膚炎は、コルチコステロイド剤を用いて処置されることが多い。コルチコイドに関連するリスク、例えば皮膚の菲薄化が原因で、ステロイドは、湿疹の症状の出現を制御するためだけに、慎重に施用される必要がある。
【０００７】
湿疹が重篤で、他の形態の処置に反応しないとき、シクロスポリンなどの免疫抑制薬が処方されることがある。これらは、免疫系を抑えるので、湿疹を改善する可能性があるが、副作用を引き起こす可能性がある。重篤なかゆみについては、鎮静作用がある抗ヒスタミン薬を使用することができるが、これは眠気を引き起こす可能性がある。
【０００８】
瘢痕組織は、内的および外的の両方で損傷を受けた組織の上に、例えば外科手術または創傷（ｗｏｕｎｄｉｎｇ）後に治癒した後の皮膚の上に残る印である。瘢痕組織は、治癒した創傷または傷口の上および／またはその周囲に生成する高密度の線維性の結合組織であり、皮膚の弾力に悪影響を及ぼす可能性があり、皮膚上で目に見えるときの美的な問題および不都合を生じる可能性がある。広範囲に及ぶ瘢痕組織は、熱傷などの外傷性の経験から回復している個体の外観および生活の質に対して悪影響をもたらす可能性がある。
【０００９】
成長因子は、細胞の増殖および分化を制御する上での中心的存在であり、傷害または損傷の際に表皮および基底板を再構築することに関与する。成長因子は細胞の再生にとって重要であり、従って、老化のいくつかの態様に対抗し、角化細胞分化、線維芽細胞成長を正常化し、細胞および細胞産物の代謝回転および再生を誘導することができる。
【００１０】
Ｉｔｏらの非特許文献１は、気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）および組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）の発現は、これらの細胞のコラーゲン代謝回転および遊走に関与することができ、従って気道の組織修復に寄与する可能性があるということを教示する。ＰＤＧＦは、ＲＮＡおよびタンパク質のレベルでマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の発現を強く上方制御する。ＰＤＧＦは、ＴＧＦ−βと組み合わされたとき、相乗的なＭＭＰ−３の上方制御を引き起こした。ＴＩＭＰ−１は、加えて、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦによって上方制御された。
【００１１】
Ｎａｋａｔａｎｉらの非特許文献２は、ヒアルロナンが歯周靭帯細胞におけるＭＭＰ−１の発現およびタンパク質レベルに影響を及ぼすということを教示する。ヒアルロナンオリゴ（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｏｌｉｇｏ、ＨＡｏｌｉｇｏ）は、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの両方でＭＭＰ−１発現を顕著に高めたが、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２のｍＲＮＡの発現に対しては効果を示さなかった。ＨＡｏｌｉｇｏはＨＰＤＬ細胞においてＭＭＰ−１発現を誘導し、ｐ３８ＭＡＰＫは、ＨＡｏｌｉｇｏによって誘導されるＭＭＰ−１についてのシグナル伝達において非常に重要な役割を果たすということが示唆された。
【００１２】
ＩｔｏおよびＮａｋａｔａｎｉの例は、気道平滑筋および靭帯細胞におけるシグナル経路に限定されるが、それらは、成長因子およびヒアルロナンが、細胞外マトリクスおよび基底板の構成要素の組織修復および代謝回転にどのように影響を及ぼしうるかを別々に記載する。
【００１３】
成長因子は、種々の皮膚障害および皮膚傷害に対して有益な効果を及ぼすことができ、細胞レベルで損なわれまたは衰えている保護機構の結果である老化の効果に対抗することができるということが認識されている。成長因子は、細胞の再生および増殖を促進することができ、創傷の治癒プロセスの自然の構成要素である。
【００１４】
表皮成長因子（ＥＧＦ）は、外胚葉および中胚葉に由来する種々の上皮細胞の分裂を促進する。ＥＧＦは、体液中に広範囲に、とりわけ尿および母乳中に分布している（非特許文献３）。ＥＧＦは、５３アミノ酸残基からなる単一のポリペプチドであり、６，２００ダルトンの分子量を有する（非特許文献４）。１９６２年に、Ｃｏｈｅｎは、成長した雄のマウスの顎の下の腺からＥＧＦを単離した。１９７２年に、ＳａｖａｇｅおよびＴａｙｌｏｒは、マウスＥＧＦの一次構造、および生理的機能にとって必須のＥＧＦの中の３つの分子内ジスルフィド結合の位置を特定した。
【００１５】
ＥＧＦは、皮膚の傷害に対して優れた効果を有すると考えられている。なぜなら、ＥＧＦは、上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞の増殖を強く促進し、上皮細胞が欠損している部位への上皮細胞の遊走および増殖も強く促進するからである。成長因子は、組織完全性の維持における、および細胞対細胞の情報交換における中心的存在であり、従って、上皮組織の変性に抵抗する際に保護的な役割を果たす。
【００１６】
参照によりその全体を本願明細書に援用したものとする特許文献２は、皮膚の老化を低減し、皮膚の外観を改善するためのＥＧＦ、ＴＧＦ−ａおよびＦＧＦを含む美容用組成物を開示する。
【００１７】
特許文献３は、ＥＧＦが、化粧品で使用されるレチノールの効果を顕著に高め、かつレチノールの皮膚刺激作用を効果的に緩和するということを教示する。
【００１８】
ＰＤＧＦなどの成長因子は、凝固段階のあいだに創傷部位で放出され、好中球、マクロファージおよび線維芽細胞についての化学誘引物質として作用する。これらの細胞は、細菌を死滅させることおよび創傷部位での壊死性残屑の除去において重要な役割を果たす。次に、活性化されたマクロファージは、血管新生を促進する成長因子を放出し、Ｂ細胞媒介性免疫応答およびＴ細胞媒介性免疫応答と情報交換する。マクロファージは、新しい細胞外マトリクスを産生するように線維芽細胞を刺激するＴＧＦ−β、および血管新生を刺激するＶＥＧＦを分泌する。角化細胞が分裂し、創床（ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ）を覆うにつれて、上皮化が進行する。このように、成長因子が治癒プロセスの重要なメディエーターであることが十分に確立されており、研究により、Ｇ−ＣＳＦは、感染性の糖尿病性潰瘍を処置するために有益である可能性があるということが示されている。ＥＧＦは、線維芽細胞および角化細胞の増殖を刺激する。
【００１９】
ＦＧＦは、上皮細胞に対して増殖効果を有し、動物モデルにおいて骨の治癒および創傷の治癒を加速することが観察されている。ＫＧＦ−２は、創傷の治癒、とりわけ創傷の閉鎖を顕著に加速する。
【００２０】
動物の組織または血液から単離された成長因子は、ウイルス、ビリオン（ウイルス粒子）、プリオン、他の同時精製する成長因子など（これらに限定されない）の望まれない混入物質および伝染性物質のリスクを運ぶ。汚染する伝染性物質および内在性の成長因子の同じリスクは、生物工学的な手段によって動物またはヒトの細胞で産生された成長因子にも存在する。生物工学的な手段を用いて細菌の中で産生された成長因子は、免疫系を乱すことが知られている細菌性内毒素の持ち越し汚染のリスクを引き起こす。多くの場合、細菌は、未変性の形態の成長因子またはサイトカインを産生できず、成長因子の生理活性にとって必要な、成長因子の三次構造を変性された状態へと変形させ、そして成長因子を細胞内の封入体の中へと詰め込む。単離された封入体からの変性された成長因子は、生理活性を取り戻すために、困難で広範な再折りたたみを必要とする。さらには、細菌はタンパク質をグリコシル化することができず、このことは、いくつかの症例では、タンパク質をより不安定に、プロテアーゼによる分解をより受けやすくさせるということが知られている場合がある。伝染性物質、内毒素または混入物質のリスクは、開放創および炎症の症候を有する障害を抱えた表皮を処置するための、細菌、酵母または動物細胞で産生された成長因子の使用、従って皮膚用途および美容上の用途における使用については、明らかに懸念材料である。
【００２１】
上記の問題および短所を最小にするかまたは解消するように調製された、高品質の成長因子および他の生物活性のあるタンパク質についての要求が継続して存在する。
【００２２】
植物の中で産生される成長因子およびサイトカインは、動物またはヒトのウイルス、ビリオンおよびプリオンおよび細菌性内毒素などの伝染性の感染病原体を含まない。人間に感染することができる多くの動物疾患とは異なり、人間において疾患を引き起こすことができた植物疾患の事例は報告されていない。従って、植物は、成長因子の産生については、上記の細胞のタイプ、動物細胞、動物組織、酵母および細菌よりも安全な生産生物を構成する。植物は、シグナル伝達エレメントとしての成長因子の作用および関与を必要とする動物の免疫系に相当する免疫系を欠く。それゆえ植物は、動物またはヒトの成長因子と同様の成長因子を自身で産生せず、遺伝子導入技術を使用する組み換え成長因子のための純粋な宿主源を与える。植物はタンパク質をグリコシル化することができ、このことは、タンパク質の安定性を改善し、その活性に影響を及ぼすことができ、それゆえ、細菌の中で産生される成長因子と比較して優れた成長因子を産生することができる。植物は、未変性の生理活性の形態の、従って細菌の中で産生される変性され再び折りたたまれた成長因子よりも上質の成長因子およびサイトカインを産生する。本発明に係る生物工学的な手段を用いて植物の中で成長因子を産生することで、これらの安全性、品質、および純度の問題が回避される。それゆえ植物由来の成長因子は、エキスの形態にあろうと、または精製された未変性の形態にあろうと、皮膚科学、局所治療薬、皮膚移植片、毛髪移植片、スキンケアおよび化粧品における使用について、現在の生産方法を用いて産生される成長因子よりも、安全でクリーンである。
【００２３】
植物は、植物において保護的な役割を果たし、非生物的要因および生物的要因によって引き起こされるストレス、例えば脱水および酸化的ストレスを緩和するいくつかのタンパク質を産生する。これらのタンパク質のうちのいくつかは、細胞組織の脱水を伴う種子の成熟の際に植物の種子の中に特異的に蓄積する。デヒドリンは、乾燥などのストレスに応答してまたは種子発生などの成熟プロセスの一部として蓄積する１つのクラスのタンパク質である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】特開平５−２４６８３８号公報
【特許文献２】米国特許第５，６１８，５４４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５８９，５４０号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｉｔｏ  Ｉ、Ｆｉｘｍａｎ  ＥＤ、Ａｓａｉ  Ｋ、Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ、Ｇｏｕｎｎｉ  ＡＳ、Ｍａｒｔｉｎ  ＪＧ、Ｈａｍｉｄ  Ｑ．、「Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ、２００９年９月、第３９巻、第９号、１３７０−８０頁、電子出版２００９年６月１１日。
【非特許文献２】Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｙ、Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｋ、Ｔａｎａｋａ  Ｎ、Ｔａｎｎｅ  Ｙ、Ｋａｍｉｙａ  Ｔ、Ｋｕｎｉｍａｔｓｕ  Ｒ、Ｔａｎａｋａ  Ｅ、Ｔａｎｎｅ  Ｋ．、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＭＰ−１  ｉｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．、２００９年８月、第５４巻、第８号、７５７−６３頁、電子出版２００９年６月１１日。
【非特許文献３】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｇ．およびＣｏｈｅｎ，Ｓ．、「Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７９年、第４８巻、１９２−２１６頁
【非特許文献４】Ｃａｍｐｉｏｎ，Ｓ．Ｒ．およびＮｉｙｏｇｉ，Ｓ．Ｋ．、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
美容上の製品およびスキンケア製品において成長因子の局所的使用を可能にする低アレルギー性の製剤における、安定化された、異種の植物によって産生された組み換え成長因子の使用方法を提供することが本発明の目的である。長期間にわたる成長因子の安定性は、局所的処置としての成長因子の使用にとって非常に重要である。なぜなら、タンパク質は、生来、分解および触媒反応に敏感だからである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
健康な皮膚に対してだけでなく、敏感な皮膚および（湿疹および乾癬におけるような）障害を抱えた皮膚に対しても、成長因子の施用および使用を可能にする非アレルゲン性の、非刺激性の組成物を得るための最小の数の成分を用いて、異種の植物によって産生された成長因子の製剤を、安定化された組成物として、提供することは本発明の重要な特徴である。
【００２８】
創傷、火傷、膿疱、潰瘍、病変または外科手術（医療用の外科手術および形成外科など）の治癒の際およびそれらの後の瘢痕組織形成に対して有益な軽減効果を有する植物由来の成長因子を含む組成物を提供することが本発明の一態様である。本発明のこの実施形態は、皮膚上での瘢痕組織の徴候を低減させる上で特に有用であり、従って、破裂した皮膚の肌色および治癒を改善し、皮膚の外観を改善する。
【００２９】
局所治療薬および化粧品において使用するための、成長因子、または遺伝子導入植物から精製された成長因子、またはエキスとしての、もしくは精製された形態にある遺伝子導入植物由来の成長因子の混合物を含有する遺伝子導入植物のエキスを含有するスキンケアのための美容用組成物を提供することが本発明の目的である。植物エキスは、本願明細書中では、注目する異種の成長因子を産生する宿主植物のタンパク質エキス（例えば種子タンパク質エキス）を指す。このエキスは、部分的にまたは実質的に精製することができ、これは、このエキスが、１以上の好適な精製工程を用いて注目するタンパク質について濃縮されているということを示す。重要なことは、本発明によって、より安全な成長因子が、美容上の処置および局所的処置のための使用のために利用できるようになることである。これらの植物によって産生された成長因子は、それら成長因子がそのアミノ酸骨格の中にグリコシル化部位を保有するとき（これは、タンパク質の安定性を改善することが知られておりかつその生物活性に影響を及ぼす可能性がある特徴である）、植物の中でグリコシル化されていてもよい。美容上の使用および局所的使用のための組成物のための、未変性の形態でのこれらの有効成分の生産は、本発明によってより経済的になる。より具体的には、成長因子、および任意に組成物の中に、エキスの中の他の天然に存在する植物系の有益なポリペプチド（デヒドリンおよびグロブリンなど）を含むスキンケア組成物を提供することが本発明の目的である。これらの種子タンパク質は、植物において細胞レベルおよび生化学的レベルで保護機能を有し、本発明の対象としての成長因子との独特の組み合わせにおいて、これらの種子タンパク質は、育成および治癒の条件をもたらすことができ、細胞レベルで脱水および酸化的ストレスを緩和することができる。ざ瘡、表皮の炎症、湿疹、乾癬の処置として、皮膚の皺、年齢によるしみ、雀卵斑、汚斑（痣）または他の色素沈着、特に手、肘、踵および足のひび割れた（ｃｒａｃｋｅｄ）表皮の改善として、ならびに皮膚の湿潤化、および創傷の治癒および瘢痕組織の減少として好適な安定なスキンケア組成物を提供することが本発明の目的である。
【００３０】
本発明の１つの態様では、安定化された成長因子は、移植外科手術の際およびその後の切除された濾胞ユニット（ＦＵ）の処置による、毛髪移植の成功を改善するために使用することができる。
【００３１】
本発明についての好適な成長因子または２以上の成長因子の組み合わせは、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ  酸性、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子：ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ−ｓ、ＩＬ−１、ＩＬ１−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０）、ノギン、チモシンβ４、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの（これらに限定されない）植物由来の組み換え成長因子から選択されてもよい。これらの植物によって産生された成長因子は、被害を受けた、病的状態のおよび外科的な創傷の治癒、ならびに瘢痕組織形成の低減／予防において、本発明に従って使用されてもよい。成長因子の選択物は、毛髪移植などの手術において、切除された濾胞ユニットの生存率を改善するため、および移植手術後の治癒プロセスを加速し進行させるために、例えば、切除された濾胞ユニットを、植物由来の組み換え成長因子を含有する溶液に浸漬することにより、エキソビボ処置のために使用されてもよい。
【００３２】
チモシンβ４およびノギンなどの成長因子の選択は、本発明のこの使用についての好ましい成長因子の例であり、それらは、移植後の段階で毛包の中の細胞の屈折段階（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅ）を乱し、髪の成長を誘導することが見出される。本発明は、髪の成長を再活性化するため、および移植外科手術の効果からの治癒のために、屈折段階の頭皮および濾胞および／または濾胞ユニット（ＦＵ）を、低アレルギー性の配合の安全な植物由来のヒトの成長因子を用いて処置するための組成物および手段を提供する。ヒトまたは動物源から調達されず、かつ細菌性内毒素で汚染されていない組み換えのヒトの成長因子を使用できることは、いくつかの治療への応用における顕著な改善である。
【００３３】
上記の植物由来の成長因子のうちのいずれかなどの１以上の植物由来の成長因子とヒアルロナンとを含む組成物を提供することは、本発明のさらなる態様である。さらに、皮膚の代謝に対する成長因子およびヒアルロナンの効果は、皮膚組成に対して有益な相乗効果、細胞分化の正常化、細胞分裂の活性化をもたらし、基底板の構成要素の再生を導き、若返った皮膚、創傷の治癒および持続的な皮膚の状態の軽減を生じ、炎症を低減することができる。
【００３４】
別の態様では、本発明は、局所用の美容用製品を製造する方法であって、成長因子を含む遺伝子導入植物のエキスを安定化媒体の中で準備することを含む方法、を提供する。この植物由来の異種の成長因子は、本願明細書中でこのあと列挙される成長因子のうちのいずれかから選択されることが好ましい。好ましくは、遺伝子導入植物のエキスは大麦種子エキスである。産生される成長因子は、スキンケア／皮膚用組成物を作製するために特に有用である。
【００３５】
なおさらなる態様では、本発明は、遺伝子導入植物から単離された１以上の異種の成長因子を提供する。この成長因子は、当業者に公知の他の応用例で使用されてもよい。
【００３６】
本発明のさらなる態様では、美容上の目的のために、および治癒軟膏剤または局所用医薬組成物の他の形態におけるような有効成分として使用されるための成長因子を含有する新規な植物エキスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＥＧＦを含有する遺伝子導入植物のエキスを含む、２つの染色されたゲルを示す。
【図２】ＶＥＧＦを含有する遺伝子導入植物のエキスを含む、２つの染色されたゲルを示す。
【図３】ＩＧＦ−１を含有する遺伝子導入植物のエキスを含む、２つの染色されたゲルを示す。
【図４】ＩＬ−１ａを含有する遺伝子導入植物のエキスを含む、２つの染色されたゲルを示す。
【図５】精製された、再構成された、凍結乾燥した植物由来のＥＧＦの安定性負荷試験を示す。
【図６】実施例７で説明されるように、本発明の局所用組成物の施用の前（ａ）および後（ｂ）の、冬季湿疹の徴候を呈する被験者の手を示す。
【図７】「冬季の足」（冬季湿疹）の皮膚の問題を抱える足を示し、実施例８で説明されるように、（ａ）および（ｂ）は、５日間の本発明の局所用組成物の施用の前の足の写真であり、図（ｃ）および（ｄ）は施用後の写真である。
【図８】実測のパラメータおよび計算によるパラメータを用いた典型的な皮膚変形曲線。
【図９】スプリットフェイス（ｓｐｌｉｔ−ｆａｃｅ）試験における、安定化された異種の植物由来のＥＧＦ製剤および無ＥＧＦ対照を用いて処置された顔の皮膚の力学的特性の比較測定の結果。実施例９を参照。
【図１０】植物由来の異種のＥＧＦ（ｐｄ−ＥＧＦ）を含有する製剤化された植物エキスまたはプラセボを用いた局所的処置を受けている１２人の個体における相対的弾力を測定する非侵襲的皮膚分析の結果。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本願明細書で使用する場合、「植物由来の」成長因子は、遺伝子導入植物または遺伝子導入植物の子孫から得られる成長因子であり、用語「植物によって産生された」とほとんど同義で使用される。従って、用語「植物由来の成長因子」は、本願に関しては、一般に、生産ビヒクル（媒体）として使用される宿主植物にとって未変性ではない、異種の成長因子を指す。本発明に係る成長因子は、いずれかのヒトのまたは非ヒトの成長因子であってもよく、その遺伝子は、好ましくは組み換え技術を使用して、植物またはその植物の先祖に導入される。単離された成長因子は、美容用組成物または治療用の局所用組成物の中の有効成分として使用されてもよい。
【００３９】
植物の中に異質の遺伝子を導入し発現させるための方法は当該技術分野で周知である。遺伝子的に形質転換することができる植物は、コード領域についてのＤＮＡ配列を含めた異種のＤＮＡ配列が導入され、発現され、安定に維持され、そして後の世代の子孫へと伝えられうる植物である。除草剤耐性（例えば、ビアラホスまたはバスタが挙げられる）、または抗生物質耐性（ハイグロマイシン耐性など）を選択可能なマーカーとして使用している遺伝子操作および形質転換の方法が使用されて、大麦植物が生成されている。
【００４０】
好適な栽培品種が選択され、異質の遺伝子の導入のための好適な方法が選択される。用語「形質転換」または「遺伝子的形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝を生じる、宿主生物のゲノムへの核酸分子の移植を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」生物と呼ばれる。本発明の「遺伝子導入植物宿主細胞」は、ゲノムの中に安定に組み込まれた少なくとも１つの異質の、好ましくは２つの異質の核酸分子を含有する。植物の形質転換の方法の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）媒介による形質転換（Ｄｅ  Ｂｌａｅｒｅら、１９８７）および粒子照射または「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年、米国特許第４，９４５，０５０号明細書）が挙げられる。
【００４１】
国際公開第２００６／０１６３８１号パンフレットは、形質転換を受けやすい特定の有用な大麦栽培品種を記載し、好適な形質転換方法を詳細に記載する。
【００４２】
国際公開第２００５／０２１７６２号パンフレットは、大規模に容易に精製されるキメラタンパク質を作製することによりタンパク質を改変するための方法を開示する。
【００４３】
本発明に従って好適に産生および使用される成長因子は、形質転換成長因子ｂ（またはβ）（ＴＧＦ−ｂまたはＴＧＦ−β、ＴＧＦ  β１、ＴＧＦ  β２、ＴＧＦ  β３など）、形質転換成長因子ａ（またはα）（ＴＧＦ−ａまたはＴＧＦ  α）、ＴＮＦ  α、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＰＤＧＦ  Ｒｂ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子ａおよびｂ（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなど）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン  １３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）、レプチン、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）、腫瘍壊死因子ｂ（ＴＮＦ−ｂ）、インターフェロン−ｇ（ＩＮＦ−ｇ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ノギン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−４）、およびチモシンβ４などの種および群から選択されてもよいが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明のある実施形態では、遺伝子導入植物の中で産生されようとする注目するポリペプチドは、そのポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに、または両末端に親和性タグを含有する。このようなタグは、反復ＨＱ配列、ポリヒスチジン尾部、ＧＳＴ、ＣＢＭまたは当該異種のペプチドの精製を単純にするいずれかの他の有用な親和性タグを含んでもよい。
【００４５】
ヒアルロナンは、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸塩とも呼ばれ、これらの用語は同義語であり、本願明細書の本文では互換的である。ヒアルロナンは、結合組織、上皮組織、および神経組織全体にわたって広く分布しているアニオン性の、非硫酸化グリコサミノグリカンである。
【００４６】
本願明細書で使用する用語「スキンケア／皮膚用組成物」は、治療用の皮膚用途のための医療用組成物／医薬組成物と、美容上の使用のための組成物および治療用の使用および美容上の使用の両方のために使用することができる組成物との両方を包含する。
【００４７】
投与量
本発明に係る局所的な治療への応用については、成長因子の用量は、好ましくは組成物１ｇあたり０．０１〜１００μｇの範囲、より好ましくは１ｇあたり０．１〜５０μｇの範囲にある。皮膚の老化または脱毛の処置のための局所的美容用組成物は、好ましくは、組成物１ｇあたり０．２〜５０μｇの活性物質を含む。
【００４８】
処置の長さは、病理または所望の効果に応じて変わる。強皮症の処置の場合には、施用は、病理の重症度に従って１日〜１２ヶ月の範囲である。皮膚の自然の老化または早期老化に対する処置の場合には、施用は、１〜４００日間の範囲、好ましくは少なくとも３０日間である。同様に、脱毛を予防するためまたは毛髪の再成長を促進するための処置の場合には、施用は、１〜４００日間の範囲である。
【００４９】
本発明に係る皮膚用組成物は、乾燥肌、湿疹、皮膚炎、発疹、乾癬、皮膚の発赤、および浮腫などの皮膚の状態の処置のために好適に使用することができる。本発明の組成物は、瘢痕組織の治癒および低減ならびに踵のひび割れた皮膚を治癒させ改善するためにも有用である。
【００５０】
好ましくは、当該遺伝子導入植物のエキスは、上記の成長因子のタンパク質、それらの模倣体、または成長因子受容体への結合および成長因子受容体の活性化を可能にする少なくともそれらのドメインのうちのいずれか１以上を含有する大麦の麦粒から調製される。記載した非限定的な実施例は、遺伝子導入大麦エキス由来の異なる成長因子の例示的使用を示す。
【００５１】
本発明に従って使用されるエキスは、注目する成長因子を含む、遺伝子導入の宿主植物由来のタンパク質エキスを指す。この成長因子以外のタンパク質が、この成長因子の活性に干渉せず、あらゆる他の望まれない効果をまったく引き起こさないならば、この成長因子は、エキスの少量成分にすぎなくてもよい。このようなエキスは、例えば、種子の中で当該異種の成長因子を発現する植物に由来の種子タンパク質エキスである。このエキスは、より高い程度まで精製されてもよいし、またはより低い程度までしか精製されなくてもよく、すなわちこのエキスは、当該異種の成長因子について濃縮するための１以上の精製工程によって部分的に精製されてもよい。
【００５２】
美容用組成物および医薬組成物の局所施用のための多くのビヒクルが当該技術分野で公知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編、第２０版、２０００年、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、米国、ペンシルベニア州を参照。局所投与する美容用組成物のために通常用いられるすべての組成物は、有効成分としての当該異種タンパク質が安定化されている限り、例えば、クリーム、ローション、ゲル、ドレッシング材、洗髪剤、チンキ剤、ペースト、血清、軟膏剤、膏薬、粉末、液体または半液体の製剤、パッチ、リポソーム調剤、溶液、懸濁液、リポソーム懸濁液、Ｗ／ＯまたはＯ／Ｗエマルション、ポマードおよびペーストなどとして使用されてもよい。当該組成物の施用は、適宜、例えば窒素、二酸化炭素、フレオンなどの噴霧剤を用いて、またはポンプ式スプレーのように噴霧剤なしでエアロゾルによってもよく、点滴薬、ローション、またはスワブによって施用することができる濃厚組成物などの半固体であってもよい。特定の組成物では、膏薬、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、軟膏剤などの半固体組成物が好都合に使用されるであろう。
【００５３】
本発明の組成物は、溶液、懸濁液、リポソーム懸濁液、Ｗ／Ｏ（水／油）またはＯ／Ｗ（油／水）エマルションを含む非経口の、全身性使用または局所的使用のために提供されてもよい。好ましい実施形態では、活性物質は、好適な凍結乾燥添加剤に混合され、治療的に許容できる希釈剤を用いて容易に再溶解できる、凍結乾燥された形態で製剤化される。有用な凍結乾燥添加剤は、バッファー、多糖、スクロース、マンニトール、イノシトール、ポリペプチド、アミノ酸および当該活性物質と相溶性のいずれかの他の添加剤である。本発明の好ましい実施形態では、活性物質は、凍結乾燥後の成長因子／リン酸塩比が１：１〜１：２に含まれるような量のリン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ２Ｏ−−Ｎａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ）に溶解される。非経口使用に好適な希釈剤は、水、生理溶液、砂糖溶液、ヒドロアルコール溶液、油性希釈剤、ポリオール（グリセロール、エチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなど）、または無菌性、ｐＨ、イオン強度および粘度に関して投与方法と適合するいずれかの他の希釈剤である。
【００５４】
好ましくは、局所的施用のビヒクルは、何らの非天然の防腐剤または抗菌剤なしに生来的に抗菌性である製剤である。わずかな数の成分を使用し、かつアレルギー誘発物質および／または刺激物質として作用する可能性がある複雑な成分を排除することが好ましいであろう。当該製剤は、活性タンパク質成分の長期安定性も確保し、好ましくは１年以上の室温での保存など長い貯蔵寿命ももたらすべきである。
【００５５】
好ましい実施形態では、活性化合物、植物によって産生された選択された組み換え成長因子、が、グリセロール、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムなどの塩（これらに限定されない）（塩化カルシウムが最も好ましい）、精製水、およびエタノールのうちの１以上、好ましくはこれらのすべてを含有する、局所的施用に好適な製剤に加えられる。このような組成物は、驚くべきことに、選択された成長因子によって表される組み換えタンパク質を効果的に安定化するということが示された。組み換えタンパク質がグリコシル化されているか否かによらず、この製剤が、組み換えタンパク質を効果的に安定化するということは、本発明の１つの態様である。当該製剤は、好ましくは、本質的に抗菌性であり、それゆえ皮膚用および美容上の使用のための局所用製剤として特に好適である。
【００５６】
本発明の組成物は、ヒアルロン酸（ヒアルロン酸塩）などの任意の添加剤をさらに含んでもよい。
【００５７】
エマルションまたは懸濁液の場合には、当該組成物は、医薬の製剤で一般に使用される非イオン型、双性イオン型、アニオン型またはカチオン型の好適な界面活性剤を含有してもよい。油／水型（Ｏ／Ｗ）親水性エマルションは非経口の全身性使用のために好ましいのに対し、水／油型（Ｗ／Ｏ）親油性エマルションは局所的使用または局所的使用のために好ましい。
【００５８】
さらに、本発明の組成物は、糖類またはポリアルコールなどの等張剤、バッファー、キレート剤、抗酸化物質、抗菌剤のような任意の添加剤を含有してもよい。
【００５９】
本発明に係る液体形態は、溶液またはローションを含むことができる。これらは、水性、エタノール／水のようなヒドロアルコール性、またはアルコール性であってもよく、凍結乾燥した物質を可溶化することにより得られる。
【００６０】
あるいは、活性物質溶液は、デンプン、グリセリン、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、ポリ（メタ）アクリレート、イソプロピルアルコール、およびヒドロキシステアレートのような公知のゲル化剤の添加によってゲルの形態で製剤化されてもよい。
【００６１】
局所的使用のための他のタイプの組成物は、ポマード、ペースト、クリームの形態のエマルションまたは懸濁液である。Ｗ／Ｏエマルションは好ましく、より速い吸収をもたらす。親油性賦形剤の例は、流動パラフィン、無水ラノリン、白色ワセリン、セチルアルコール、ステアリルアルコール、植物油、鉱油である。皮膚透過性を増大させ、これにより吸収を容易にする薬剤を、有利に使用してもよい。このような薬剤の例は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような生理的に許容できる添加剤である。
【００６２】
当該局所用組成物で使用される他の添加剤は、等張剤（糖類またはポリアルコールなど）、バッファー、キレート剤、抗酸化物質、抗菌剤、増粘剤、分散剤である。
【００６３】
さらには、当該調剤は、本願明細書に記載される調剤において通常用いられる従来の構成成分をさらに含有してもよく、そのような構成成分としては、油、脂肪、ワックス、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、抗酸化物質、粘度安定剤、キレート剤、バッファー、防腐剤、芳香剤、染料、低級アルカノールなどが挙げられる。
【００６４】
局所的使用または全身性使用のための遅延放出組成物が有用である可能性があり、このような遅延放出組成物は、ポリ酪酸、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよび当該技術分野で公知の他の物質のようなポリマーを含む。例えば、ポリ酪酸または他の生分解性ポリマーに基づく皮下インプラントの形態の遅延放出組成物も、同様に有用である可能性がある。
【００６５】
凍結乾燥された形態、従って安定な形態で活性物質が包装されることが好ましいが、当該医薬組成物は、有利に、当該成長因子を活性な形態で安定化する物質を含む。このような安定剤は、分子間ジスルフィド結合の形成を阻害し、これにより当該活性物質の重合を防止する。しかしながら、活性物質を不活性なモノマー形態へと還元することを同時に防止するために、安定剤の量は、慎重に測定されるべきである。このような物質の例は、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎ）、システアミン（Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）、または還元型のグルタチオンである。
【００６６】
油の非限定的な例としては、オリーブ油および硬化油などの油脂；ビーズワックスおよびラノリンなどのワックス；流動パラフィン、セレシン（切蝋）、およびスクアレンなどの炭化水素；ステアリン酸およびオレイン酸などの脂肪酸；セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラノリンアルコール、およびヘキサデカノールなどのアルコール；ならびにミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピルおよびステアリン酸ブチルなどのエステルが挙げられる。界面活性剤の例として、ステアリン酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸エステル、Ｎ−アシルグルタミン酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤；塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムおよび塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどのカチオン性界面活性剤；アルキルアミノエチルグリシン塩酸塩溶液およびレシチンなどの両性界面活性剤；ならびにグリセリンモノステアレート、ソルビタンモノステアレート、スクロース脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンココナツ脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシプロピレングリコール（例えば商標「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」として販売されている物質）、ポリオキシエチレンヒマシ油、およびポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性の界面活性剤が挙げられてもよい。湿潤剤の例としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、およびプロピレングリコールが挙げられ；低級アルコールの例としては、エタノールおよびイソプロパノールが挙げられ；増粘剤の例としては、キサンタンガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムが挙げられ；抗酸化物質の例としては、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、クエン酸およびエトキシキン（ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ）が挙げられ；キレート剤の例としては、エデト酸二ナトリウムおよびエタンヒドロキシ二リン酸が挙げられ；バッファーの例としては、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、およびリン酸水素二ナトリウムが挙げられ；防腐剤の例は、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、デヒドロ酢酸、サリチル酸および安息香酸である。これらの物質は、単に例示に過ぎず、当業者は、機能性の喪失なしに他の物質を代わりに用いてもよいということを認識するであろう。
【実施例】
【００６７】
実施例１：組み換えＥＧＦを含有する遺伝子導入植物のエキスの調製
成長因子ＥＧＦを含有する、収穫された遺伝子導入大麦の種子をミルの中で粉砕して、微粉末（穀粉）を得ることにより、遺伝子導入植物のエキスを調製した。抽出バッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ  ７．０）を、５／１の抽出バッファー／粉砕した穀粉の体積／重量比で、粉砕した大麦穀粉に加えた。得られた溶液を４℃で６０分間撹拌した。冷却した遠心分離機（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｐｒｉｍｏ  Ｒ）の中で８３００ｒｐｍ以上で１５分間遠心分離して、固形分を、遠心力によって液体エキスから分離し、上清を新しいバイアルにデカンテーションした。このエキスの成長因子含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＧＦ特異的抗体を用いたウエスタンブロット法によって分析した。この実験では、ＥＧＦ含有量は、このエキスのタンパク質含有量の約０．０１％であった。結果を図１に示す。
【００６８】
図１（Ａ）は、可溶性タンパク質全体を染色する、ゲルのクマシー・ブルーで染色した部分を示す。（Ｂ）は、同じエキスの抗ＥＧＦ抗体を用いたウエスタンブロットを示し、この遺伝子導入植物のエキスの中の成長因子ＥＧＦの存在を示す。レーン：１：サイズマーカー、２：遺伝子導入大麦種子エキス、３：ＩＭＡＣ精製工程からの素通り画分、４：ＩＭＡＣ捕捉工程からのＥＧＦの溶出。
【００６９】
実施例２：成長因子ＶＥＧＦおよびデヒドリンを含有する、部分的に精製した遺伝子導入植物のエキス
実施例１に従って調製した、ＶＥＧＦを含有する遺伝子導入大麦種子エキスを、効果的にＶＥＧＦに結合するＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂をこのエキスに添加することにより、さらに処理した。エキスおよび樹脂の混合物を、５０ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．０の中で、＋４℃で６０分間撹拌した。５０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、ＩＭＡＣ樹脂を液体から分離した。液相をデカンテーションして除き、樹脂を、洗浄バッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．０）に再懸濁し、回転して沈降させ、液相を樹脂からデカンテーションした。この洗浄を３回繰り返した。この樹脂を、イミダゾールを含有する溶出バッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．０）に再懸濁して、樹脂からＶＥＧＦを溶出させ、遠心分離後、上清を樹脂からデカンテーションし、バッファー交換のためにゲル濾過イオンクロマトグラフィーに流した。得られたタンパク質ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットで分析した。この場合、ＶＥＧＦはタンパク質エキスのおよそ２５％として存在した。結果を図２に示す。
【００７０】
図２。組み換え成長因子ＶＥＧＦおよびデヒドリンを含有する部分的に精製した遺伝子導入植物のエキス。Ａ）エキスの中に存在する全タンパク質を染色する、クマシー・ブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｂ）デヒドリンを含有する部分的に精製した大麦種子エキスの中のＶＥＧＦの存在を示すウエスタンブロット。レーン番号付け：１  サイズ標準、２  エキス、３  ＩＭＡＣ素通り画分、４  ＩＭＡＣ溶出液。矢印は、この部分的に精製したエキスの中のデヒドリンおよびＶＥＧＦの存在を示し、これらは、アミノ酸シーケンシングによって同定された。
【００７１】
実施例３：大麦グロブリンおよびＩＧＦ−１を含有する部分的に精製した遺伝子導入植物のエキス
遺伝子導入大麦種子を、実施例１に係る抽出バッファーＩＩ（５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．０  ２００ｍＭ  ＮａＣｌ）の中に抽出した。このエキスを、実施例２で説明したようにして、ＩＭＡＣ樹脂に結合して、溶出し、その後溶出液を脱塩し、バッファーを１００ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ  ６．８に変えた。次いで、この部分的に精製したエキスを、ＩＧＦ−１を効果的に結合する条件下でイオン交換クロマトグラフィー樹脂に添加することにより、この部分的に精製したエキスをさらに処理した。このとき使用したマトリクスはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。対応する分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色、および特異的抗ＩＧＦ−１抗体を用いたウエスタンブロットを用いて分析した。この部分的に精製した植物エキスのＩＧＦ−１含有量は６０％であった。
【００７２】
図３。大麦グロブリンおよびＩＧＦ−１を含有する部分的に精製した遺伝子導入植物のエキス。Ａ）銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン番号付け：１  サイズ標準、２  脱塩しバッファー交換した、ＩＭＡＣカラムからの溶出液、３  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＩＥＣからの素通り画分、４  ＩＧＦ−１および大麦グロブリンを含有するＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＩＥＣからの溶出液、５  陽性対照：細菌中で産生された組み換えＩＧＦ−１。
【００７３】
実施例４：遺伝子導入大麦種子エキスから精製した、精製し単離した成長因子ＩＬ−１α
遺伝子導入植物のエキスは、精製した形態で成長因子を単離するためにさらに精製してもよい。ゲル濾過を用いたバッファー交換後、ＩＭＡＣ溶出液を、イオン交換カラムＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦにかけ、溶出バッファーのＮａＣｌ含有量を増加させる段階的溶出によって、エキスの中のタンパク質を分離した。このようにして、デヒドリンから成長因子を成功裏に分離することが可能であった。図４に示すように、成長因子は、このようにして高純度、９５％超（レーン７）へと精製することができ、遺伝子導入植物のエキスから単離されて精製された単離されて精製されたＩＬ−１αをもたらすことができる。
【００７４】
図４。遺伝子導入植物のエキスからのＩＬ−１αの精製および単離。Ａ）エキスの中に存在する全タンパク質を染色する、クマシー・ブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｂ）ＩＬ−１αを含有するエキスのウエスタンブロット。レーン番号付け：１および９  サイズマーカー、２  エキス、３  ＩＭＡＣ素通り画分、４  ＩＭＡＣ溶出液、５  濃縮したＩＭＡＣ溶出液、６  ＩＥＣからの３５％  ＮａＣｌ溶出液、７  ７５％  ＮａＣｌ溶出液、８  １００％  ＮａＣｌ溶出液。Ｄ：デヒドリン、ＩＬ−１ａ：インターロイキン１α。
【００７５】
実施例５：組成物における植物由来の成長因子の使用
以下の実施例は、本発明に係る美容用組成物の製剤を説明するが、それらは、決して、本発明を限定することは意図されていない。
【００７６】
製剤１：皮膚軟化剤（皮膚ローション、血清）
６〜９のｐＨ範囲で緩衝して安定な組成物を調製することができる。
成分                              量（重量％）
ＥＧＦ（遺伝子導入植物に由来）  ０．０００２５
グリセロール                      １０〜９０％
塩化カルシウム          ０．１ｍＭ〜２００ｍＭ
精製水                                    適量
ヒアルロン酸ナトリウム            ０．０１〜２
エタノール                        ０．１〜１０
【００７７】
製剤２：栄養補給エマルション（ミルクローション）
成分                              量（重量％）
ＥＧＦ（遺伝子導入植物に由来）    ０．０００２
プロピレングリコール                    ６．０
グリセリン                              ４．０
トリエタノールアミン                    １．２
酢酸トコフェリル                        ３．０
流動パラフィン                          ５．０
スクアレン                              ３．０
マカダミアナッツオイル                  ２．０
ポリソルベート  ６０                    １．５
ソルビタンセスキオレエート              １．０
カルボキシビニルポリマー                １．０
香料                                    ０．２
メチルパラベン                          ０．２
イミダゾリジニル尿素                    ０．２
精製水                                    適量
【００７８】
製剤３：栄養補給クリーム
成分                            量（重量％）
ＶＥＧＦ（遺伝子導入植物に由来）  ０．０００５
ワセリン                                ７．０
流動パラフィン                        １０．０
ワックス                                ２．０
ポリソルベート  ６０                    ２．０
ソルビタンセスキオレエート              ２．５
スクアレン                              ３．０
プロピレングリコール                    ６．０
グリセリン                              ４．０
トリエタノールアミン                    ０．５
カルボキシビニルポリマー                ０．５
酢酸トコフェリル                        ０．１
香料                                    ０．２
メチルパラベン                          ０．２
イミダゾリジニル尿素                    ０．２
精製水                                    適量
【００７９】
製剤４：マッサージクリーム
成分                            量（重量％）
ＥＧＦ（遺伝子導入植物に由来）  ０．０００２
プロピレングリコール                  ６．０
グリセリン                            ４．０
トリエタノールアミン                  ０．５
ワックス                              ２．０
酢酸トコフェリル                      ０．１
ポリソルベート  ６０                  ３．０
ソルビタンセスキオレエート            ２．５
セテアリルアルコール                  ２．０
流動パラフィン                      ３０．０
カルボキシビニルポリマー              ０．５
香料                                  ０．２
メチルパラベン                        ０．２
イミダゾリジニル尿素                  ０．２
精製水                                  適量
【００８０】
製剤５：顔パック
成分                                量（重量％）
ＴＧＦ−ａ（遺伝子導入植物に由来）  ０．０００５
プロピレングリコール                      ２．０
グリセリン                                ４．０
カルボキシビニルポリマー                  ０．３
エタノール                                ７．０
ＰＥＧ−４０  硬化ヒマシ油                ０．８
トリエタノールアミン                      ０．３
香料                                      ０．２
メチルパラベン                            ０．２
イミダゾリジニル尿素                      ０．２
精製水                                      適量
【００８１】
製剤１〜５は、［発明を実施するための形態］で列挙されたいずれかの代替の成長因子を用いて、同様に製剤化することができる。
【００８２】
製剤６：局所的施用のためのＷ／Ｏエマルション
２０μｇの活性物質を含む量の凍結乾燥された物質を、１０％  ＤＭＳＯを含む、５ｍｌの１０％  エタノールのヒドロアルコール溶液にする。この溶液を、１０未満のＨＬＢ係数を有するＷ／Ｏエマルションに好適な界面活性剤を使用して、皮膚への施用のために、殺菌した植物油の中で乳化する。このエマルションは、組成物１ｇあたり約２μｇに等しい活性物質を含有する。
【００８３】
製剤７：Ｏ／Ｗエマルション
約２０μｇの活性物質を含む量の凍結乾燥された物質を、３０％  ＤＭＳＯを含む５ｍｌのヒドロアルコール溶液の中に可溶化し、好適な界面活性剤を用いて植物油系の親油性溶媒の中で乳化する。得られたＯ／Ｗエマルションは、組成物１ｇあたり約３μｇの濃度の活性物質を含有する。
【００８４】
製剤８：ゲルの形態の局所用組成物
１００μｇの活性物質を含む量の凍結乾燥された物質を、２０％  ＤＭＳＯを含む２０ｍｌの１０％  エタノールのヒドロアルコール溶液にする。次いで、この溶液に、ポリエチレングリコール（４００〜４０００）およびポリプロピレングリコールの混合物を加える。活性物質は、組成物１ｇあたり２μｇに等しい量で存在する。このゲルは、美容用途に好適である。
【００８５】
製剤９：カルボマー（１％）を含有する局所用ゲル製剤
ＥＧＦ（遺伝子導入植物に由来）  ５ｍｇ
カルボマー  ９３４Ｐ              １ｇ
パラオキシ安息香酸メチル      ０．２ｇ
プロピレングリコール            ２０ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
注射用蒸留水                      適量
合計                          １００ｇ
【００８６】
上記の成分を所与の量で使用して従来の方法に従って上記製剤を調製する。具体的には、パラオキシ安息香酸メチルを適切な量の注射用蒸留水に溶解させ、カルボマー９３４Ｐをこの溶液に加え、撹拌してその溶液に分散させる。水酸化ナトリウムを用いてこの溶液のｐＨを制御し、この溶液を、プロピレングリコールとブレンドし、加熱によって滅菌する。次いで、この溶液に、注射用蒸留水中のＥＧＦの濾過し滅菌した溶液を加え、１００ｇの製剤を得る。
【００８７】
製剤１０：ポロキサマー（１５％）を含有する局所用製剤
ＥＧＦ                      ２．５ｍｇ
ポロキサマー  ４０７            １５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル      ０．２ｇ
リン酸水素ナトリウム  ２７２．１８ｍｇ
塩化ナトリウム        ６６６．２２ｍｇ
リン酸                            適量
プロピレングリコール            ２０ｇ
注射用蒸留水                      適量
合計                          １００ｇ
【００８８】
上記の成分を所与の量で使用して従来の方法に従って上記製剤を調製する。具体的には、所与の量のリン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸を使用して、リン酸塩バッファーを調製する。防腐剤としてのパラオキシ安息香酸メチルを、このリン酸塩バッファーに溶解させる。ポロキサマー４０７（ＢＡＳＦ、ドイツ）をこの溶液に加え、撹拌してその溶液に分散させる。次いで、この溶液をプロピレングリコールとブレンドし、撹拌しながらその中に分散させる。次いで、水酸化ナトリウムを用いてこの溶液のｐＨを制御し、この溶液を、プロピレングリコールとブレンドし、加熱によって滅菌する。次いで、この溶液に、注射用蒸留水中のＥＧＦの濾過し滅菌した溶液を加え、１００ｇの製剤を得る。
【００８９】
製剤１１：カルボマー（０．１％）を含有するクリーム製剤
ＥＧＦ                              ０．０５ｍｇ
グリセリン                              ４．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル              ０．１５ｇ
パラオキシ安息香酸プロピル            ０．０５ｇ
カルボマー  ９４０                      ０．１ｇ
ステアリルアルコール                  １．７５ｇ
セチルアルコール                      ４．００ｇ
スパン  番号６０                      ０．５０ｇ
ポリオキシル  番号４０  ステアレート  ２．００ｇ
トリエタノールアミン                        適量
注射用蒸留水                                適量
合計                                    １００ｇ
【００９０】
上記の成分を所与の量で使用して従来の方法に従って上記製剤を調製する。具体的には、グリセリンおよびパラオキシ安息香酸メチルを適切な量の注射用蒸留水に溶解させ、カルボマー９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、米国）をこの溶液に加え、撹拌しながらその溶液に分散させる。次いで、パラオキシ安息香酸プロピルなどをこの溶液に加え、融解させて乳化させる。次いで、トリエタノールアミンを用いてｐＨを制御した後にこの溶液を滅菌し、注射用蒸留水中の（植物から発現され単離された）ＥＧＦの濾過し滅菌した溶液と混合し、１００ｇの製剤を得る。
【００９１】
実施例６：植物によって産生されたＥＧＦの安定性試験
この実施例は、３週間まで種々の温度でインキュベーションした（すなわち、＋４℃で冷蔵、＋３７℃および室温（ＲＴ）でインキュベーション）際の、実施例５、製剤１の製剤における、精製し、再構成した、非グリコシル化の、植物によって生成されたＥＧＦの安定性負荷試験を示す。結果を図５に示す。サイズマーカー１１ｋＤａおよび１７ｋＤａは第１のレーンにある。結果は、当該成長因子の、３７℃、ＲＴおよび＋４℃で数週間の優れた安定性を示す。細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により製造されたＥＧＦの製造業者の記載によれば、再構成した、精製した形態の細菌由来の組み換えＥＧＦは２℃〜４℃で一週間しか安定ではない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ＣＲＥ１００．ｐｄｆを参照）。
【００９２】
実施例７：手の冬季湿疹を緩和する施用
実施例５の製剤１のタンパク質安定化配合の植物由来の異種の表皮成長因子（ＥＧＦ）を含む部分的に精製した遺伝子導入大麦種子エキスを含有する本発明の組成物を、９歳の少年の発疹（すなわち冬季湿疹）のある乾燥してひび割れた、かゆみを伴う、赤い皮膚に局所的に施用する。明らかに冬季湿疹を患っている手の甲に、３滴の上記局所用製剤を均一に広げる。図６ａ）は、上記製剤としての本発明の組成物の局所的施用の前の手を示し、図６ｂ）は、本発明の組成物を用いた処置の２４時間後の同じ手を示し、図６ｂ）は、皮膚回復の明らかな徴候および冬季湿疹の症候の緩和を示す。
【００９３】
実施例８：冬季湿疹  −「冬季の足（Ｗｉｎｔｅｒ  ｆｏｏｔ）」
図７ａ）および図７ｂ）は、「冬季の足」を抱え重篤な皮膚の問題を生じている１０歳の少年の足を示す。この乾燥した、かゆみを伴う、赤い皮膚は、皮膚の深いひび割れおよび重篤な障害を受けた表皮からの刺激作用および出血を引き起こす。
【００９４】
図７ａ）および図７ｂ）は、処置の開始前に撮影したものであり、図７ｃ）およびｄ）は、実施例５の製剤１を構成するタンパク質安定化配合の植物由来の異種の表皮成長因子（ＥＧＦ）を含む部分的に精製した遺伝子導入大麦種子エキスを含有する本発明の組成物で、片方の足あたり４〜５滴、５日間毎日、局所的施用した後に撮影したものである。表皮は治癒し、高い程度に弾力および柔らかさおよび再水和を回復した。
【００９５】
実施例９：皮膚の弾力
実施例５の製剤１を構成するタンパク質安定化配合の植物由来の異種の表皮成長因子（ＥＧＦ）を含む部分的に精製した遺伝子導入大麦種子エキスを含有する本発明の組成物の、顔の皮膚の弾力および堅さに対する効果を客観的に測定するために、制御された吸引技術を用いて皮膚の力学的特性を評価した。
【００９６】
典型的な皮膚変形曲線を図８に例示する。以下のパラメータを分析した：Ｕｅ、即時膨張  −  これは、変形後に皮膚がその最初の位置に戻る能力を測定し、弾性線維の機能と関連する；Ｕｖ、遅れた膨張；［Ｒ０］  Ｕｆ、最終の膨張［皮膚の伸展性］；Ｕｒ、即時退縮；Ｒ、測定サイクルの最後での残留変形［反発的な膨張］；［Ｒ２］  Ｕａ／Ｕｆ、皮膚の全体の弾力（粘性変形を含む）；［Ｒ５］  Ｕｒ／Ｕｅ、粘性変形なしの皮膚の正味の弾力；［Ｒ７］  Ｕｒ／Ｕｆ、生体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）弾力、すなわち、全膨張に対する即時退縮の比；［Ｒ６］  Ｕｖ／Ｕｅ、弾性膨張に対する粘弾性膨張の比；およびＲ８、粘性部分、すなわち、変形曲線の吸引部分の下の面積。２回の測定の平均値を後の計算で使用した。
【００９７】
非侵襲的な吸引デバイス（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＭＰＡ５８０）を使用して、顔の皮膚の力学的特性を検討した。このデバイスは、小さい開口部の中へと引っ張り込まれ、陰圧に曝された皮膚の生体力学的特性を測定する。２つの異なるスキンケア製剤、すなわち、安定化された異種の植物によって産生されたＥＧＦを含む本発明の組成物を含有する血清およびＥＧＦを欠く対応する血清、を、頬、目の周囲および額を含めた、顔の両側にそれぞれ施用した。４ヶ月の処置の後、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＭＰＡ５８０を使用して弾力および堅さを測定した。簡潔に言えば、２秒間の一定圧力の印加時間、次いで２秒間の緩和時間、合わせて４秒の実行時間で、０ｍｂａｒから４５０ｍｂａｒまでの吸引の漸進的な増加を皮膚に加えた。顔の各側で皮膚の弾力および粘弾性を測定および評価し、次いで、２つの異なる処置領域の間で値の比較を行った。
【００９８】
結果を図９に示す。ＥＧＦで処置した皮膚（上側の曲線）は、有意に高い弾力パラメータ（すなわちＵｅ、Ｕｒ、Ｕａ／Ｕｆ、Ｕｒ／Ｕｆ、Ｕｒ／Ｕｅ）および低い粘弾性パラメータ（すなわちＵｖおよびＵｖ／Ｕｅ）を特徴とした。明らかに、これら２つの異なって処置した領域を比較すると、皮膚の弾力の上昇および粘弾性の低下は、安定化された異種の植物由来のＥＧＦを含む本発明の組成物を含有する血清を用いた処置と関連がある。本発明の組成物を用いて処置した皮膚は、高められた皮膚弾力および堅さを特徴とした。
【００９９】
実施例１０：植物由来の異種のＥＧＦ（ｐｄ−ＥＧＦ）を含有する製剤化された植物エキスの１ヶ月の施用後の、顔の皮膚の弾力の評価
被験者は、３０〜７０歳の１２人の女性であった。この研究は、老化している皮膚の明らかな徴候という試験対象患者基準を何ら含まなかった。額、頬および目の周囲に毎日２回、１ヶ月間施用するために、これらの被験者のうちの８人は、実施例５の製剤１を構成するタンパク質安定化配合の植物由来の異種の表皮成長因子（ＥＧＦ）を含む遺伝子導入大麦種子エキスを使用したのに対し、４人の被験者は、遺伝子導入大麦種子エキスを含まない血清、すなわちプラセボ血清を用いた。この検討期間のあいだ、被験者には、自身の通常の毎日のスキンケア手順を続けることを許容した。
【０１００】
最初に（ベースライン＝０日目）および施用期間の最後に、処置した領域の皮膚表面で非侵襲的分析による検査を実施し、ベースライン（０日目）の結果を１ヶ月の施用後の結果と比較した。定量的測定結果を、Ｓｏｆｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｋｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｌｅｇａｒｉ１９３０）によって得た。この検討で試験したパラメータは、吸引に対する抵抗性によって測定される、皮膚の弾力であった。検討を完了したすべての個体について、すべてのデータを、検討前（ベースライン＝０日目）の平均値および検討の最後での平均値として分析する。最終の結果を、ベースライン値と比較した未処置の領域と比較して、処置した領域の誘導倍率（すなわち相対値１＝０日目）として提示する（図１０）。
【０１０１】
実施例１０：抗菌活性
この実施例は、実施例５、製剤１に係る本発明の組成物の微生物負荷の試験、および抗菌性の維持の効果の判定を示す。
【０１０２】
細菌を用いてこの組成物を負荷し、この組成物の抗菌特性を確立した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エルジノーサ、緑膿菌）（株  ＡＴＣＣ  ９０２７）の０．５ｍｌの培養液を５０ｍｌの安定化組成物上に播いた。試料を標準条件下でインキュベーションし、欧州薬局方５．１．３．の「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（抗菌性の維持の効果）」について詳細に記載される方法に基づいて細菌の数を決定した。接種材料を、当該細菌の保存培養物、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有する滅菌懸濁液体から調製する。１０７細菌／ｍｌを得るようにこの培養物を上記液体で希釈し、１ｍｌを、当該安定化組成物が入っている容器の中に接種材料として加え、十分に混合する。接種した生成物を、光から保護して２２℃で維持する。特定の時間間隔で、接種した生成物から１ｍｌの試料を抜き取り、細菌の数をプレートカウントによって決定する。
【０１０３】
【表１】
2013516460.tif 000002
【０１０４】
これらの結果は、本発明の組成物の明らかな抗菌活性を示し、従来の防腐剤および抗菌剤の使用なしで、局所用調剤についての欧州薬局方による抗菌活性の推奨される効果を満たす。従って、これらの製剤は、局所用の美容用組成物および／または治療用組成物に好適であり、かつ潜在的に刺激性の防腐剤、抗菌剤、および敏感な皮膚にとって障害性である他の添加剤の起こりうる副作用を回避する。
【０１０５】
参考文献：
Ｉｔｏ  Ｉ、Ｆｉｘｍａｎ  ＥＤ、Ａｓａｉ  Ｋ、Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ、Ｇｏｕｎｎｉ  ＡＳ、Ｍａｒｔｉｎ  ＪＧ、Ｈａｍｉｄ  Ｑ．、「Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ、２００９年９月、第３９巻、第９号、１３７０−８０頁、電子出版２００９年６月１１日。
【０１０６】
Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｙ、Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｋ、Ｔａｎａｋａ  Ｎ、Ｔａｎｎｅ  Ｙ、Ｋａｍｉｙａ  Ｔ、Ｋｕｎｉｍａｔｓｕ  Ｒ、Ｔａｎａｋａ  Ｅ、Ｔａｎｎｅ  Ｋ．、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＭＰ−１  ｉｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．、２００９年８月、第５４巻、第８号、７５７−６３頁、電子出版２００９年６月１１日。
【０１０７】
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｈｅｅｔ，ＥＧＦ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、マサチューセッツ州（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ＣＲＥ１００．ｐｄｆ）
【０１０８】
５．１．３  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（抗菌性の維持の効果）：  ５２８−５２９、欧州薬局方  ６．０
【図１Ａ）】
2013516460.tif 000003
【図１Ｂ）】
2013516460.tif 000004
【図２】
2013516460.tif 000005
【図３】
2013516460.tif 000006
【図４】
2013516460.tif 000007
【図５】
2013516460.tif 000008
【図６ａ）】
2013516460.tif 000009
【図６ｂ）】
2013516460.tif 000010
【図７ａ）】
2013516460.tif 000011
【図７ｂ）】
2013516460.tif 000012
【図７ｃ）】
2013516460.tif 000013
【図７ｄ）】
2013516460.tif 000014
【図８】
2013516460.tif 000015
【図９】
2013516460.tif 000016
【図１０】
2013516460.tif 000017
【国際調査報告】
2013516460.tif 000018
2013516460.tif 000019
2013516460.tif 000020
2013516460.tif 000021
2013516460.tif 000022
2013516460.tif 000023