(57)【要約】  本発明は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を有する、非天然に生じる微生物を提供する。本発明はさらに、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するためのそのような微生物を使用する方法を提供する。
2013535203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記トルエン経路は、（Ａ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つまたは両方、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、ならびに３）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ；（Ｂ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つ以上、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、３）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの１つ以上、ならびに４）フェニルアセテートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つ以上、２）フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに３）フェニルアセテートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートオキシダーゼならびに３）フェニルアセテートデカルボキシラーゼから選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項２】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項４】
前記３つの外因性核酸が、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼまたはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、３）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼをコードする、請求項３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項５】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６】
前記４つの外因性核酸が、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼまたはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、３）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼ、および４）フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードする、請求項５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項９】
トルエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、トルエンを生産する方法であって、前記経路は、トルエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記トルエン経路は、（Ａ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つまたは両方、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、ならびに３）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ；（Ｂ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つ以上、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、３）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの１つ以上、ならびに４）フェニルアセテートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つ以上、２）フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに３）フェニルアセテートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートオキシダーゼならびに３）フェニルアセテートデカルボキシラーゼから選択される、方法。
【請求項１０】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記３つの外因性核酸が、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼまたはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および３）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼをコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記４つの外因性核酸が、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼまたはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、３）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼ、および４）フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記ベンゼン経路はフェニルアラニンベンゼン−リアーゼを含む、非天然に生じる微生物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、前記フェニルアラニンベンゼン−リアーゼである、請求項１７に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項１７に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１７に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１】
ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、ベンゼンを生産する方法であって、前記経路は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記ベンゼン経路はフェニルアラニンベンゼン−リアーゼを含む、方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、前記フェニルアラニンベンゼン−リアーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
スチレンを生産するのに十分な量で発現されるスチレン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むスチレン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記スチレン経路は、（Ａ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ以上、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼ；または（Ｂ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼから選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項２６】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２７】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２８】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２９】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含む、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３０】
前記５つの外因性核酸が、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドラーゼの１つ、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする、請求項２９に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３１】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする６つの外因性核酸を含む、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３２】
前記６つの外因性核酸が、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、および６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする、請求項３１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３４】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項２５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項３５】
スチレン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、スチレンを生産する方法であって、前記経路は、スチレンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、スチレンを生産するのに十分な量で発現されるスチレン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記スチレン経路は、（Ａ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ以上、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼ；または（Ｂ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼから選択される、方法。
【請求項３６】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記５つの外因性核酸が、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記微生物が、スチレン経路の酵素を各々コードする６つの外因性核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記６つの外因性核酸が、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、および６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記１，３−ブタジエン経路は、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｅ）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｆ）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項４６】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項４５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項４７】
前記２つの外因性核酸が、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択されるセットをコードする、請求項４６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項４５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項４９】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項４５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項５０】
１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法であって、前記経路は、１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記１，３−ブタジエン経路は、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｅ）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｆ）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される、方法。
【請求項５１】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記２つの外因性核酸が、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択されるセットをコードする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含む、非天然に生じる微生物。
【請求項５６】
前記微生物が、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項５５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項５７】
前記２つの外因性核酸が、エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼをコードする、請求項５６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項５８】
少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項５５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項５９】
前記微生物が嫌気的に培養される、請求項５５に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６０】
ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゾエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記ベンゾエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼを含む、非天然に生じる微生物。
【請求項６１】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６２】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６３】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６４】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６５】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする６つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６６】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする７つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６７】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする８つの外因性核酸を含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６８】
前記８つの外因性核酸が、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼをコードする、請求項６７に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項６９】
エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項７０】
少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項７１】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項７２】
ベンゾエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項６０に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、ベンゾエートを生産する方法。
【請求項７３】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記微生物が、ベンゾエート経路の酵素を各々コードする８つの外因性核酸を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記８つの外因性核酸が、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼをコードする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記微生物が、エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記ベンゼン経路は、ａ）ベンゾエートデカルボキシラーゼ；ｂ）ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｃ）ベンゾエートキナーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｄ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、ならびにベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｅ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼならびにベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｆ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ベンゾエートデカルボキシラーゼ、ｇ）ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｈ）ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｉ）ホスホトランスベンゾイラーゼ、ベンゾエートキナーゼ、ベンゾエートデカルボキシラーゼ、ｊ）ホスホトランスベンゾイラーゼ、ベンゾエートキナーゼ、ベンゾエートレダクターゼ、ベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｋ）ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｌ）ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項７９】
前記ベンゼン経路が、ベンゾエートデカルボキシラーゼを含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８０】
前記ベンゼン経路が、ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８１】
前記ベンゼン経路が、ベンゾエートキナーゼ、（ベンジルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８２】
前記ベンゼン経路が、（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８３】
前記ベンゼン経路が、（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８４】
前記微生物が、ベンゼン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８５】
前記微生物が、ベンゼン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８６】
前記微生物が、ベンゼン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８７】
ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゾエート経路をさらに含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物であって、前記ベンゾエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼを含む、非天然に生じる微生物。
【請求項８８】
エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項８９】
少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項９０】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項９１】
ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項７８に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、ベンゼンを生産する方法。
【請求項９２】
前記ベンゼン経路が、ベンゾエートデカルボキシラーゼを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ベンゼン経路が、ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記ベンゼン経路が、ベンゾエートキナーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記ベンゼン経路が、（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記ベンゼン経路が、（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記微生物が、ベンゼン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物が、ベンゼン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物が、ベンゼン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゾエート経路をさらに含み、前記ベンゾエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地中で培養される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０４】
トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記トルエン経路は、ａ）ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ；ｂ）ｐ−トルエートレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｃ）ｐ−トルエートキナーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｄ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｅ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｆ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ、ｇ）ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｈ）ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｉ）ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、ｐ−トルエートキナーゼ、ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ、ｊ）ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、ｐ−トルエートキナーゼ、ｐ−トルエートレダクターゼ、ｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｋ）ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ（脱リン酸化）、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｌ）ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項１０５】
前記トルエン経路が、ｐ−トルエートデカルボキシラーゼを含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１０６】
前記トルエン経路が、ｐ−トルエートレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１０７】
前記トルエン経路が、ｃ）ｐ−トルエートキナーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１０８】
前記トルエン経路が、（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１０９】
前記トルエン経路が、（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１０】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１１】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１２】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１３】
ｐ−トルエートを生産するのに十分な量で発現されるｐ−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むｐ−トルエート経路をさらに含み、前記ｐ−トルエートの経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；ならびにコリスメートリアーゼを含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１４】
ＤＸＰシンターゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、および２ＭＥ４Ｐデヒドラターゼを含む（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１５】
少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１６】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１１７】
トルエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１０４に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、トルエンを生産する方法。
【請求項１１８】
前記トルエン経路が、ｐ−トルエートデカルボキシラーゼを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記トルエン経路が、ｐ−トルエートレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記トルエン経路が、ｃ）ｐ−トルエートキナーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記トルエン経路が、（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記トルエン経路が、（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記微生物が、トルエン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
ｐ−トルエートを生産するのに十分な量で発現されるｐ−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むｐ−トルエート経路をさらに含み、前記ｐ−トルエート経路が、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
ＤＸＰシンターゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、および２ＭＥ４Ｐデヒドラターゼを含む（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２８】
少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地中で培養される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３０】
２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、Ａ）ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ；Ｂ）ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；Ｃ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；Ｄ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ；ならびにＥ）ｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する、非天然に生じる微生物。
【請求項１３１】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３２】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３３】
前記３つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１３２に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３４】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３５】
前記４つの外因性核酸が、ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１３４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３６】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含む、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３７】
前記５つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１３６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３８】
前記５つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１３６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１３９】
前記５つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１３６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１４０】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１４１】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１４２】
２，４−ペンタジエノエートを１，３−ブタジエンに変換することにより１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼをさらに含む、請求項１３０に記載の天然に生じる微生物。
【請求項１４３】
ＡＫＰチオラーゼ、オルニチン４，５−アミノムターゼ、２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼおよび２，４−ジアミノペンタノエート４−デヒドロゲナーゼの少なくとも１つをさらに含む、請求項１３０に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１４４】
２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法であって、前記経路は、２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、Ａ）ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ；Ｂ）ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセトアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；Ｃ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセチルアクリレートレダクターゼ、ならびにｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；Ｄ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ；ならびにＥ）ｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される、方法。
【請求項１４５】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４８】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４９】
前記３つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５１】
前記４つの外因性核酸が、ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５３】
前記５つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセチルアクリレートレダクターゼ、ならびにｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記５つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンテノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
前記５つの外因性核酸が、ｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５６】
２，４−ペンタジエノエートを１，３−ブタジエンに変換するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼをさらに含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５７】
ＡＫＰチオラーゼ、オルニチン４，５−アミノムターゼ、２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼおよび２，４−ジアミノペンタノエート４−デヒドロゲナーゼの少なくとも１つをさらに含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５８】
２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、以下：
１）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
２）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
３）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
４）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
５）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
６）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
７）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
８）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
９）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１０）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１１）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１２）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１３）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｒ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１４）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
１５）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
１６）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｒ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１７）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
１８）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
１９）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
２０）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
２１）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
２２）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
２３）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
２４）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する、非天然に生じる微生物。
【請求項１５９】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７または８つの外因性核酸を含む、請求項１５８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１６０】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１５８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１６１】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１５８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１６２】
２，４−ペンタジエノエートを１，３−ブタジエンに変換するために２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼをさらに含む、請求項１５８に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１６３】
２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１５８に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法。
【請求項１６４】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７、または８つの外因性核酸を含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１６２に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法。
【請求項１６８】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７、または８つの外因性核酸を含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
前記非天然に生じる微生物が、実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７１】
１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記１，３−ブタジエン経路は、以下；
１）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
２）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
３）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
４）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
５）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
６）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素のセットを有する、非天然に生じる微生物。
【請求項１７２】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、または５つの外因性核酸を含む、請求項１７１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１７３】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１７１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１７４】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１７１に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１７５】
１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１７１に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法。
【請求項１７６】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、または５つの外因性核酸を含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７９】
３−ブテン−１−オールを生産するのに十分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記３−ブテン−１−オール経路は、以下：
１）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
２）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
３）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
４）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
５）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
６）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
７）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
８）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
９）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１０）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１１）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１２）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１３）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１４）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１５）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１６）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１７）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１８）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１９）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
２０）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ
から選択される酵素のセットを有する、非天然に生じる微生物。
【請求項１８０】
前記微生物が、３−ブテン−１−オール経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む、請求項１７９に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１８１】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１７９に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１８２】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１７９に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１８３】
３−ブテン−１−オールを１，３−ブタジエンに変換するために３−ブテン−１−オールデヒドラターゼをさらに含む、請求項１７９に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１８４】
３−ブテン−１−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１７９に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、３−ブテン−１−オールを生産する方法。
【請求項１８５】
前記微生物が、３−ブテン−１−オール経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、または７つの外因性核酸を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８７】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８８】
１，３−ブタジエンを提供するために３−ブテン−１−オールの化学的脱水をさらに含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８９】
１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１８３に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法。
【請求項１９０】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７、または８つの外因性核酸を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９２】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９３】
１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記１，３−ブタジエン経路は、以下；
（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｅ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｆ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｇ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；ならびに
（Ｈ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ
から選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項１９４】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む、請求項１９３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１９５】
前記微生物が、以下：
（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｅ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｆ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｇ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；ならびに
（Ｈ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ
から選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む、請求項１９４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１９６】
前記微生物が、
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸
をさらに含む、請求項１９３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１９７】
前記（ｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１９６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１９８】
前記（ｉｉ）を含む微生物が、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１９６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項１９９】
前記（ｉ）を含む微生物が、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；
前記（ｉｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２デヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または
前記（ｉｉｉ）を含む微生物が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸、
を含む、請求項１９６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２００】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項１９３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０１】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項１９３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０２】
１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項１９３〜２０１のいずれか一項に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法。
【請求項２０３】
２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、以下：
（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ
から選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項２０４】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、または６つの外因性核酸を含む、請求項２０３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０５】
前記微生物が、以下：
（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ
から選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む、請求項２０４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０６】
前記微生物が、
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸
をさらに含む、請求項２０３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０７】
前記（ｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２０６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０８】
前記（ｉｉ）を含む微生物が、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２０６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２０９】
前記（ｉ）を含む微生物が、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；
前記（ｉｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２デヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または
前記（ｉｉｉ）を含む微生物が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸、
を含む、請求項２０６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１０】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項２０３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１１】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項２０３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１２】
２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項２０３〜２１１のいずれか一項に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法。
【請求項２１３】
１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記１，３−ブタジエン経路は、以下：
（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｋ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｌ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｍ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｎ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；ならびに
（Ｏ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ
から選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項２１４】
前記微生物が、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む、請求項２１３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１５】
前記微生物が、以下：
（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｋ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｌ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；
（Ｍ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；
（Ｎ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；ならびに
（Ｏ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグリタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ
から選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む、請求項２１４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１６】
前記微生物が、
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸
をさらに含む、請求項２１３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１７】
前記（ｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２１６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１８】
前記（ｉｉ）を含む微生物が、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２１６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２１９】
前記（ｉ）を含む微生物が、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；
前記（ｉｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２デヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または
前記（ｉｉｉ）を含む微生物が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸、
を含む、請求項２１６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２０】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項２１３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２１】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項２１３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２２】
１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項２１３〜２２１のいずれか一項に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法。
【請求項２２３】
２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、以下：
（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元剤）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ
から選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項２２４】
前記微生物が、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５または６つの外因性核酸を含む、請求項２２３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２５】
前記微生物が、以下：
（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；
（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元剤）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ
から選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む、請求項２２４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２６】
前記微生物が、
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸
をさらに含む、請求項２２３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２７】
前記（ｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２２６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２８】
前記（ｉｉ）を含む微生物が、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２２６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２２９】
前記（ｉ）を含む微生物が、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；
前記（ｉｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２デヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または
前記（ｉｉｉ）を含む微生物が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸、
を含む、請求項２２６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３０】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項２２３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３１】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項２２３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３２】
２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項２２３〜２３１のいずれか一項に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法。
【請求項２３３】
３−ブテン−１−オールを生産するのに十分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ブテン−１−オール経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物であって、前記３−ブテン−１−オール経路は、以下：
（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；ならびに
（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ
から選択される、非天然に生じる微生物。
【請求項２３４】
前記微生物が、３−ブテン−１−オール形成の酵素を各々コードする２、３、４または５つの外因性核酸を含む、請求項２３３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３５】
前記微生物が、以下：
（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；ならびに
（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ
から選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む、請求項２３４に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３６】
前記微生物が、
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸
をさらに含む、請求項２３３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３７】
前記（ｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２３６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３８】
前記（ｉｉ）を含む微生物が、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２３６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２３９】
前記（ｉ）を含む微生物が、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；
前記（ｉｉ）を含む微生物が、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２デヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または
前記（ｉｉｉ）を含む微生物が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸、
を含む、請求項２３６に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２４０】
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、請求項２３３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２４１】
前記非天然に生じる微生物が実質的に嫌気性培地に存在する、請求項２３３に記載の非天然に生じる微生物。
【請求項２４２】
３−ブテン−１−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項２３３〜２４１のいずれか一項に記載の非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、３−ブテン−１−オールを生産する方法。
【請求項２４３】
３−ブテン−１−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、請求項２３３〜２４１のいずれか一項に記載の非天然に生じる微生物を培養し、前記３−ブテン−１−オールを１，３−ブタジエンに化学的に変換する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、生合成プロセス、より具体的には、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成能を有する生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
トルエンは、ベンゼンのより大きな発癌性に起因する置換ベンゼンを有し、工業原料であり、ＴＮＴ、ポリウレタンフォーム、ベンズアルデヒドおよび安息香酸の製造に使用される、一般的な溶媒である。トルエンは、ガソリンの製造における副産物であり、原油中に少しの濃度で存在する。
【０００３】
ベンゼンはしばしば、他の化学物質を生成するために中間体として使用される。その最も広範に生成される誘導体にはスチレンが含まれ、それは、ナイロンの製造に使用される、クメンおよびシクロヘキサンを用いて、ポリマーおよびプラスチック、樹脂および接着剤のためのフェノールを生成するために使用される。ベンゼンもまた、いくつかの種類のゴム、潤滑剤、染料、洗浄剤、薬物、爆発物、ナパームおよび殺虫剤を生成するために使用される。石油工業においてベンゼン生産は、触媒改質、トルエン水添脱アルキル化、トルエン不均化、および水蒸気分解を含む、種々のエネルギー集約型のプロセスによりなされる。
【０００４】
スチレンは、ポリスチレンおよび多数のコポリマーに対する前駆体である。スチレンに基づいた生成物には、アクリロニトリル、１，３−ブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレン−１，３−ブタジエン（ＳＢＲ）ゴム、スチレン−１，３−ブタジエンラテックス、ＳＩＳ（スチレン−イソプレン−スチレン）、Ｓ−ＥＢ−Ｓ（スチレン−エチレン／ブチレン−スチレン）、スチレン−ジビニルベンゼン（Ｓ−ＤＶＢ）、および不飽和ポリエステルが含まれる。これらの材料は、ゴム、プラスチック、絶縁材、繊維ガラス、パイプ、自動車およびボートの部品、食物容器、ならびにカーペット裏地に使用される。
【０００５】
スチレンは、エチルベンゼンの接触脱水素により最も一般的に生成される。エチルベンゼンは、高温蒸気中で１０〜１５倍のその体積で気相において混合され、固体触媒床を通過する。ほとんどのエチルベンゼン脱水素化触媒は、数パーセントの酸化カリウムまたは炭酸カリウムにより促進される、酸化鉄（ＩＩＩ）に基づく。蒸気がこの反応においていくつかの役割を果たす。それは、吸熱反応を供給するための熱源であり、それは、水性ガスシフト反応の間に酸化鉄触媒で形成する傾向があるコークスを取り除く。カリウムプロモーターはこのデコーキング反応を促進する。蒸気はまた、反応物および生成物を希釈し、生成物に対する化学平衡の位置をシフトする、典型的なスチレンプラントは、変換および選択性を促進させるために真空下で作動する、直列した２つまたは３つのリアクターからなる。典型的な１回通過により、２つのリアクターで約６５％、３つのリアクターで７０〜７５％が変換される。
【０００６】
２５０億ポンド以上の１，３−ブタジエン（または単にブタジエンまたはＢＤ）が毎年生産され、合成ゴムおよびＡＢＳ樹脂などのポリマー、ならびにヘキサメチレンジアミンおよび１，４−ブタンジオルールなどの化学物質の製造に適用されている。１，３−ブタジエンは典型的に、ナフサ、液化石油ガス、エタンまたは天然ガスなどの石油原料をエチレンおよび他のオレフィンに変換するための水蒸気分解プロセスの副産物として生産される。代替および／または再生可能な原料から１，３−ブタジエンを製造する能力は、十分に持続可能な化学生産プロセスの追及に関して大きな進展を示す。
【０００７】
１，３−ブタジエンを再生可能に生産する１つの可能な方法は、分離され、精製され、次いで金属ベースの触媒を含む第２の工程において１，３−ブタンジエンに脱水化される１，４−ブタンジオールまたは１，３−ブタンジオールなどのジオールを生産するために糖または他の原料の発酵を含む。再生可能な原料からの１，３−ブタジエンの直接的な発酵生産は、脱水工程の必要性を未然に取り除き、１，３−ブタジエンガス（ｂｐ−４．４℃）は、発酵槽から連続して排出され、すぐに濃縮され、回収される。発酵生産プロセスを開発することは、化石ベースの１，３−ブタジエンの必要性を取り除き、石油化学由来の１，３−ブタジエンと比べて、コスト、エネルギー、ならびに有害廃棄物および排出物の十分な削減を可能する。
【０００８】
２，４−ペンタジエノートは、それ自体で有用な置換ブタジエン誘導体である。例えば、クルチウス転位により入手可能な１−カルバモイル−１，３−ブタジエンを含む、他の置換１，３−ブタジエン誘導体の途中の価値が高い中間体である。結果として得られたＮ−保護−１，３−ブタジエン誘導体は、置換アニリンを調製するためにディールス・アルダー反応に使用され得る。２，４−ペンタジエノエートは種々のポリマーおよびコポリマーの調製に使用され得る。
【０００９】
テトラフタレート（テレフタル酸およびＰＴＡとしても知られている）は、衣類、樹脂、プラスチックボトルおよびさらに養鶏飼料添加物を生成するために使用されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の中間前駆体である。ほぼ全てのＰＴＡは、ミッドセンチュリー（Ｍｉｄ  Ｃｅｎｔｕｒｙ）プロセスとして公知のプロセスにおいて空気中での酸化によりｐａｒａ−キシレンから生産される。この酸化は、コバルトおよび／またはマンガン塩からなる触媒を用いて酸性溶媒中で高温にて行われる。ｐａｒａ−キシレンは、石油化学源から誘導され、高重度のナフサの触媒改質により形成される。キシレンはまた、ナフサ流熱分解装置において、およびトルエン不均衡により、熱分解ガソリン流から得られる。
【００１０】
再生可能なＰＴＡを生成するための費用効率が高い方法は今まで開発されていない。ＰＴＡ、トルエンおよび他の芳香族前駆体は一部の細菌により天然に分解される。しかしながら、これらの分解経路は典型的に、分解方向において不可逆的に作用するモノオキシゲナーゼを含む。それ故、ＰＴＡについての生合成経路は、今まで既知の酵素の特性により大きく制限されている。
【００１１】
ＰＴＡについての有望な前駆体は、ｐ−メチルベンゾエートとしても知られている、ｐ−トルエートである。ｐ−トルエートは、ｐ−キシレンからＰＴＡの酸化のための一部の工業プロセスにおける中間体である。それはまた、高分子安定剤、殺虫剤、感光性化合物、動物飼料補足物および他の有機化学物質についての中間体である。ｐ−トルエートのみが水溶液中でわずかに可溶性であり、２７５℃の融点を有し、生理的温度にて固体である。糖原料からこの化合物を合成するための微生物触媒は今まで特徴付けられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、１，３−ブタジエン、ｐ−トルエート、テレフタレート、ベンゼンおよびトルエンなどの化合物の商業的な量を効果的に生産するための代替の方法の必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、また、関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。本発明はさらに、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生成するためにこのような生物を用いる方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート（２Ｈ３Ｍ４ＯＰ）経路、ｐ−トルエート経路、テレフタレート経路、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート（２Ｈ４ＯＰ）経路、および／またはベンゾエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。本発明はさらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、またはベンゾエートを生成するためにこのような生物を用いる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、フェニルアセテートによるフェニルアラニンのトルエンへの変換を示す。酵素は、Ａ．フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、Ｂ．フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、Ｃ．フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼ、Ｄ．フェニルアセテートデカルボキシラーゼ、Ｅ．フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、およびＦ．フェニルピルベートオキシダーゼである。
【図２】図２は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼによるフェニルアラニンのベンゼンへの変換を示す。
【図３】図３は、ベンゾイル−ＣｏＡからスチレンへの経路を示す。酵素は、Ａ．ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、Ｄ．アセトフェノンレダクターゼおよびＥ．１−フェニルエタノールデヒドラターゼ、Ｆ．ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ（ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｙｌａｓｅ）、Ｇ．ベンゾイル−アセテートキナーゼである。
【図４】図４は、ムコネート立体異性体の１，３−ブタジエンへの変換を示す。酵素は、Ａ．ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼ、Ｂ．ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼ、Ｃ．ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ、Ｄ．ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼ、Ｅ．ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ、Ｆ．ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼである。
【図５】図５は、グリセルアルデヒド−３−ホスホネートおよびピルベートから（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート（２Ｈ３Ｍ４ＯＰ）への例示的な経路の概略図を示す。Ｇ３Ｐはグリセルアルデヒド−３−ホスフェートであり、ＤＸＰは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートであり、２ＭＥ４ＰはＣ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートである。酵素は、（Ａ）ＤＸＰシンターゼ、（Ｂ）ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、および（Ｃ）２ＭＥ４Ｐデヒドラターゼである。
【図６】図６は、例示的な代替のｐ−トルネートへのシキメート経路の概略図を示す。酵素は、（Ａ）２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；（Ｂ）３−デヒドロキナーゼシンターゼ；（Ｃ）３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；（Ｄ）シキメートデヒドロゲナーゼ；（Ｅ）シキメートキナーゼ；（Ｆ）３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；（Ｇ）コリスメートシンターゼ；および（Ｈ）コリスメートリアーゼである。化合物は、（１）（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート；（２）２，４−ジヒドロキシ−５−メチル−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート；（３）１，３−ジヒドロキシ−４−メチル−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート；（４）５−ヒドロキシ−４−メチル−３−オキソシクロヘキシ−１−エン−１−カルボキシレート；（５）３，５−ジヒドロキシ−４−メチルシクロヘキシ−１−エン−１−カルボキシレート；（６）５−ヒドロキシ−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキシ−１−エン−１−カルボキシレート；（７）５−［（１−カルボキシエテ−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキシ−１−エン−１−カルボキシレート；（８）３−［（１−カルボキシエテ−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチルシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレート；および（９）ｐ−トルエートである。
【図７】図７は、ｐ−トルエートのテレフタル酸（ＰＴＡ）への例示的な経路を示す。反応Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ、ｐ−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ、４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼおよび４−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒される。示した化合物は、（１）ｐ−トルイル酸；（２）４−カルボキシベンジルアルコール；（３）４−カルボキシベンズアルデヒドおよび（４）テレフタル酸である。
【図８】図８は、エリトロース−４−ホスホネートから（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートへの例示的な経路を示す。酵素は、Ａ．エリトロース−４−ホスホネートデヒドラターゼ、Ｂ．（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼである。化合物は、（１）エリトロース−４−ホスホネート、（２）（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートおよび（３）（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートである。
【図９】図９は、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートからベンゾエートへの代替のシキメート経路を示す。酵素は、Ａ．２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ、Ｂ．３−デヒドロキネートシンターゼ、Ｃ．３−デヒドロキネートデヒドラターゼ、Ｄ．シキメートデヒドロゲナーゼ、Ｅ．シキメートキナーゼ、Ｆ．３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ、Ｇ．コリスメートシンターゼ、Ｈ．コリスメートリアーゼである。化合物は、１．（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、２．２，４−ジヒドロキシ−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート、３．１，３−ジヒドロオキシ−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート、４．５−ヒドロキシ−３−オキソシクロヘキシ−１−エン−１−カルボキシレート、５．３，５−ジヒドロキシシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、６．５−ヒドロキシ−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、７．５−［（１−カルボキシエテ−１−エン−１−イル）オキシ］−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、８．３−［（１−カルボキシエテ−１−エン−１−イル）オキシ］シクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレート、９．ベンゾエートである。
【図１０】図１０は、ベンゾエートおよびベンゾイル−ＣｏＡからベンゼンへの経路を示す。酵素は、Ａ．ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｂ．ベンゾエートレダクターゼ、Ｃ．ベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、Ｄ．ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｅ．ベンゾエートデカルボキシラーゼ、Ｆ．ホスホトランスベンゾイラーゼ、Ｇ．（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ（脱リン酸）、Ｈ．ベンゾエートキナーゼである。
【図１１】図１１は、ｐ−トルエート（ｐ−トルイル酸とも呼ばれる）およびｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡからトルエンへの経路を示す。酵素は、Ａ．ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｂ．ｐ−トルエートレダクターゼ、Ｃ．ｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、Ｄ．ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｅ．ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ、Ｆ．ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、Ｇ．（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ（脱リン酸）、Ｈ．ｐ−トルエートキナーゼである。
【図１２】図１２は、ピルベートから２，４−ペンタジエノエートへの経路を示す。酵素は、Ａ．４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、Ｂ．４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、Ｃ．２−オキソペンテノエートレダクターゼ、Ｄ．２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、Ｅ．４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートレダクターゼ、Ｆ．２，４−ジヒドロキシペンタノエート２−デヒドラターゼ、Ｇ．４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼおよびＨ．２，４−ジヒドロキシペンタノエート４−デヒドラターゼである。
【図１３】図１３は、アラニンおよびオルニチンから２，４−ペンタジエノエートへの経路を示す。酵素は、Ａ．ＡＫＰチオラーゼ、Ｂ．ＡＫＰデアミナーゼ、Ｃ．アセチルアクリレートレダクターゼ、Ｄ．４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、Ｅ．ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、Ｆ．２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、Ｇ．２，４−ジヒドロキシペンタノエート２−デヒドラターゼ、Ｈ．２，４−ジオキソペンタノエート２−レダクターゼ、Ｉ．２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．ＡＫＰレダクターゼ、Ｋ．２，４−ジオキソペンタノエート４−レダクターゼ、Ｌ．２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、Ｍ．オルニチン４，５−アミノムターゼ、Ｎ．２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼおよび／または４−デヒドロゲナーゼである。ＡＫＰは２−アミノ−４−オキソペンタノエートである。
【図１４】図１４は、オルニチンから２，４−ペンタジエノエートへのさらなる経路を示す。酵素は、Ａ．オルニチン２，３−アミノムターゼ、Ｂ．３，５−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、Ｃ．５−アミノペント−２−エノエートデアミナーゼ、Ｄ．３，５−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼ、Ｅ．３−アミノ−５−オキソペンタノエートデアミナーゼ、Ｆ．５−オキソペント−２−エノエートレダクターゼ、Ｇ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−アミノペント−２−エノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、Ｉ．３−アミノ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３−アミノ−５−ヒドロキシペンタノエートデアミナーゼである。
【図１５】図１５は、３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡおよび／またはアクリリル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの経路を示す。酵素は、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラテーゼ、Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラテーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラテーゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、Ｒ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼである。３−ＨＰ−ＣｏＡは３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡである。
【図１６】図１６は、３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼによる３−ヒドロキシペント−４−エノエート（３ＨＰ４）からのブタジエンの形成を示す。
【図１７】図１７は、３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼおよび３−ブテン−１−オールデヒドラターゼによる３，５−ジヒドロキシペンタノエートからのブタジエンの形成を示す。３−ブテン−１−オールからブタジエンへの脱水はまた、化学触媒により行われ得る。
【図１８】図１８は、２，４−ペンタジエノエートヒドラターゼによる２，４−ペンタジエノエートからの３−ヒドロキシペント−４−エノエート（３ＨＰ４）中間体の形成を示す。
【図１９】図１９は、３−ＨＰ−ＣｏＡおよび／またはアクリリル−ＣｏＡからブタジエン、３−ヒドロキシペント−４−エノエート（３ＨＰ４）、２，４−ペンタジエノエートおよび３−ブテン−１−オールへの経路を示す。酵素は、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡエヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、Ｒ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ、Ｗ．３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ（または化学変換）、Ｘ．２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼである。３−ＨＰ−ＣｏＡは３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡである。
【図２０】図２０は、スクシニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシペント−４−エノエート（３ＨＰ４）、２，４−ペンタジエノエートおよびブタジエンへの経路を示す。酵素は、Ａ．スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｃ．３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ、Ｄ．２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ、Ｅ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｆ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ、Ｇ．３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｈ．３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンターゼまたはヒドロラーゼ、Ｉ．３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ、Ｊ．３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ、Ｋ．３−オキソアジペートレダクターゼ、Ｌ．２−フマリルアセテートレダクターゼ、Ｍ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ、Ｎ．２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼである。
【図２１】図２１は、マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡから３−ブテン−１−オール、ブタジエンおよび２，４−ペンタジエノエートへの経路を示す。識別された基質を生成物へ変換するための酵素としては、Ａ．マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン−還元）、Ｃ．３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｄ．３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ、Ｅ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｆ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、Ｇ．３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｈ．３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｉ．３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）、Ｊ．５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ、Ｋ．３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）、Ｌ．３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）、Ｍ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ、Ｎ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ、Ｏ．３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ（または化学変換）、Ｐ．２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼが挙げられる。
【図２２】図２２は、基質として炭水化物上にＣＯ２を固定するための逆ＴＣＡサイクルを示す。酵素変換反応は示した酵素により実施する。
【図２３】図２３は、合成ガスをアセチル−ＣｏＡに変換するための一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼと結合した逆ＴＣＡサイクルを示す。
【図２４】図２４は、１０マイクログラムのＡＣＳ９０（レーン１）、ＡＣＳ９１（レーン２）、Ｍｔａ９８／９９（レーン３および４）、サイズ基準物を有する細胞抽出物（レーン５）およびＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＣＯＤＨのコントロール（Ｍｏｔｈ＿１２０２／１２０３）またはＭｔｒ（Ｍｏｔｈ＿１１９７）タンパク質（５０、１５０、２５０、３５０、４５０、５００、７５０、９００、および１０００ｎｇ）のウェスタンブロットを示す。
【図２５】図２５はＣＯ酸化アッセイ結果を示す。細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを有するＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたはＥ．ｃｏｌｉ；ＡＣＳ９０もしくはＡＣＳ９１または空ベクター：ｐＺＡ３３Ｓ）を増殖させ、抽出物を調製した。抽出物を調製した日に種々の時間で５５℃にてアッセイを実施した。メチルビオローゲンの還元は１２０秒の時間にわたって５７８ｎｍに従った。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、トルエン、ベンゼン、スチレン、２，４−ペンタジエノエートおよび１，３−ブタジエンについての生合成生産能を有する細胞および生物の設計および生産に部分的に関する。トルエンおよびベンゼンの経路、図１および２は、天然のアミノ酸であるフェニルアラニンで開始するので、ほとんどの生物は、トルエンおよびベンゼンを生産するための非天然の生物の構築のための宿主として機能できる。フェニルアラニン生産を向上させるためのストラテジーは当該技術分野において公知である（Ｙａｋａｎｄａｗａｌａら，Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７８：２８３−２９１（２００８）；Ｌｅｅら，米国特許第５，００８，１９０号）。
【００１７】
スチレンの経路は、図３Ａに示すように、ベンゾイル−ＣｏＡを生成するための生物に依存する。ベンゾイル−ＣｏＡは、多くの生合成および分解経路の重要な代謝中間体である。ベンゾイル−ＣｏＡは、抗生物質、芳香族および防御シグナルなどの芳香族天然産物の重要な前駆体である。ベンゾイル−ＣｏＡ生合成の生物学的経路が当該技術分野において公知である（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３５：１９９３−２０１１（２００４）；Ｘｉａｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：３９９−４０４（２００３）；Ｍｏｏｒｅら，Ｊ  Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ  ６５：１９５６−１９６２（２００２））。ベンゾイル−ＣｏＡはまた、嫌気性および好気性芳香族化合物分解経路の共通の中間体である（Ｇｅｓｃｈｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４：６３０１−６３１５（２００２）；Ｐｈｉｌｉｐｐら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２１２：１３９−１４３（２００２）；Ｋｏｃｈら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：１９５−２０２（１９９２））。
【００１８】
本発明はまた、図４に示すように、１，３−ブタジエン生産を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物に部分的に関する。一部の実施形態において、ムコネートを生産するための経路は、主要な代謝前駆体から誘導される。ムコネートは、微生物における種々の芳香族化合物の共通の分解産物である。ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを生成するためのいくつかの生体触媒ストラテジーが開発されている。シキメート経路酵素を介してグルコースからムコネートを生産する遺伝子操作した大腸菌株がＦｒｏｓｔの研究室において開発されている（米国特許第５，４８７，９８７号（１９９６）；Ｎｉｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，１８：２０１−２１１（２００２））。これらの株は、供給バッチ発酵槽条件下で４８時間の培養後、３６．８ｇ／Ｌのｃｉｃ，ｃｉｓ−ムコネートを生産できる（グルコールから２２％の最大理論収率）。ムコネートはまた、トルエン、安息香酸およびカテコールなどの芳香族開始物質から生体触媒的に生産される。ベンゾエートからムコネートを生産する株は、１３．５ｇ／Ｌの力価および５．５ｇ／Ｌ／ｈｒの生産性を達成した（Ｃｈｏｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：７０−７６（１９９７））。ムコネートはまた、スチレンモノマー生産プラントの流出物から生成される（Ｗｕら，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３５：５９８−６０４（２００４））。
【００１９】
本発明はまた、図１２〜１５に示すように、２，４−ペンタジエノエート生産を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物に部分的に関する。これらの経路のいずれも、必要な２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼの包含によりさらに１，３−ブタジエン経路に供給され得る。図１２は、３つの経路によるピルベートの２，４−ペンタジエノエートへの全体の変換を示す。図１３は、共通の中間体である２−アミノ−４−ケトペンタノエート（ＡＫＰ）を介するオルニチンまたはアラニンの２，４−ペンタジエノエートへの全体の変換を示す。図１３は、ＡＫＰから２，４−ペンタジエノエートへの６つの経路を示し、そのうちの３つは図１２に示した中間体を阻害する。図１４は、オルニチンから２，４−ペンタジエノエートへの４つのさらなる経路を示す。図１５は、３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡ（３−ＨＰ−ＣｏＡ）およびアクリロイル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの多くの経路を示す。
【００２０】
本発明はまた、図１６〜１７および１９〜２１に示したように、１，３−ブタジエン生産を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物に部分的に関する。図１６は、３−ヒドロキシペント−４−エノエート（３ＨＰ４）の１，３−ブタジエンへの脱カルボキシル脱水（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｖｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を示し、ここで、３ＨＰ４は図１５および１９に示した経路により利用可能である。それ自体で重要である３ＨＰ４は、水和による中間体２，４−ペンタジエノエートにより図１８に示し、ならびに図１５、１９および２０の経路により示す。同様に、図１７は、それ自体、図１５、１９および２１に示した経路により利用可能である、中間体３，５−ジヒドロキシペンタノエートのタンデム脱カルボキシ脱水および排出（さらなる脱水）を示す。
【００２１】
図１９は、３−ＨＰ−ＣｏＡおよびアクリリル−ＣｏＡから１，３−ブタジエンおよび１，３−ブタジエン中間体への経路を示す。図２０は、スクシニル−ＣｏＡから１，３−ブタジエンおよび１，３−ブタジエン中間体への経路を示す。必要なスクシニル−ＣｏＡは主要な代謝中間体であり、その収率は、本明細書にさらに記載するように還元的ＴＣＡサイクルにより向上され得る。最後に、図２１は、マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡの濃縮物から１，３−ブタジエンおよび１，３−ブタジエン中間体への経路を示し、アセチル−ＣｏＡはまた、本明細書に記載される還元的ＴＣＡ経路による高スループットから利益を受ける。
【００２２】
本発明はまた、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスフェート、トルエン、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼンについての生合成生産能を有する細胞および生物の設計および生産に関する。本明細書に記載した結果は、代謝経路が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および他の細胞または生物においてｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、トルエン、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼンの生合成を達成するように設計され、組み換え的に操作され得ることを示す。ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、トルエン、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼンの生合成生産は、設計された代謝遺伝子型を有する株を構築することにより確認され得る。これらの代謝的に遺伝子操作された細胞または生物はまた、理論的最大増殖に近づく条件下を含む、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、トルエン、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼン生合成をさらに増大させるように適応進化に供され得る。
【００２３】
大腸菌におけるシキメート生合成経路は、エリトロース−４−ホスホネートを、４−ヒドロキシベンゾエートを含む多くの必須の代謝産物の生合成を導く重要な中間体である、コリスメートに変換する。４−ヒドロキシベンゾエートは、テレフタル酸およびベンゼンの工業的前駆体である、ｐ−トルエートに構造的に類似している。本明細書に開示されるように、シキメート経路酵素は、代替の基質、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート（２Ｈ３Ｍ４ＯＰ）を受け取り、それを、ｐ−トルエートまたはトルエン、あるいは代替の基質、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート（２Ｈ４ＯＰ）に変換し、それをベンゾエートまたはベンゼンに変換するために利用される。さらに、経路は、イソプレノイド生合成のための非メバロネート経路からの酵素を用いて２Ｈ３Ｍ４ＯＰまたは２Ｈ４ＯＰ前駆体を合成するために使用される。
【００２４】
本明細書に開示されるのは、炭水化物原料から再生可能なｐ−トルエート、テレフタレート（ＰＴＡ）、トルエン、ベンゾエート、またはベンゼンを産生するための微生物を遺伝子操作するためのストラテジーである。トルエンシリーズにおいて、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）およびピルベートは、３つの酵素的工程において２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート（２Ｈ３Ｍ４ＯＰ）に変換される（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。２Ｈ３Ｍ４ＯＰ中間体は、続いて、シキメート経路において酵素によりｐ−トルエートに変換される（実施例ＩＶおよび図６を参照のこと）。ｐ−トルエートは、微生物によりＰＴＡにさらに変換され得る（実施例Ｖおよび図７を参照のこと）。ベンゼンシリーズにおいて、２Ｈ４ＯＰは、エリトロース−４−ホスフェートの脱水および還元により調製される（実施例ＶＩおよび図８を参照のこと）。２Ｈ４ＯＰ中間体は、続いて、シキメート経路において酵素によりベンゾエートに変換される（実施例ＶＩおよび図９を参照のこと）。ベンゾエートおよびｐ−トルエートは、それぞれベンゼンおよびトルエンに変換される（実施例ＶＩＩ、ならびに図１０および１１を参照のこと）。
【００２５】
Ｇ３Ｐのｐ−トルエートへの変換は、以下の正味の反応に従って、１つのＡＴＰ、２つの還元当量の（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）、および２分子のホスホエノールピルベートを必要とする。
Ｇ３Ｐ＋２ＰＥＰ＋ＡＴＰ＋２ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋２Ｈ＋→ｐ−トルエート＋４Ｐｉ＋ＡＤＰ＋２ＮＡＤ（Ｐ）＋＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ
さらなるＡＴＰがグルコースからＧ３Ｐを合成するために必要とされる。最大の理論的ｐ−トルエート収率は、エネルギーに必要なグルコースマイナス炭素から０．６７ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．５１ｇ／ｇ）である。２ＡＴＰが合成されるｐ−トルエート分子ごとに消費されるという仮定の下で、グルコースからの予測されるｐ−トルエート収量は、０．６２ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．４６ｇ／ｇ）ｐ−トルエートである。
【００２６】
ｐ−トルエートが、実施例ＩＩＩに記載した酵素によりＰＴＡにさらに変換される場合、グルコースから予測されるＰＴＡ収量は０．６４ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．５８ｇ／ｇ）である。この場合、ｐ−トルエートのＰＴＡへの酸化は、正味の反応に従ってさらなる正味の還元当量を生じる：
ｐ−トルエート＋Ｏ２＋ＮＡＤ＋→ＰＴＡ＋ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋
上記の経路の各工程を触媒するための酵素候補を以下の段落に記載する。トルエン、ベンゼン、スチレン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエートまたは１，３−ブタジエンを生産するための首尾よい遺伝子操作経路は、十分な活性および特異性を有する適切な酵素のセットの識別、生産宿主内でのそれらの対応する遺伝子のクローニング、生産宿主におけるそれらの遺伝子の発現の最適化、発酵条件の最適化、および発酵後の生産物形成についての評価を必要とする。
【００２７】
本発明の微生物または微生物を参照して使用する場合、本明細書で使用される、「非天然に生じる」という用語は、微生物が、参照とした種の野生型株を含む、参照とした種の天然に生じる株に通常見出されない少なくとも１つの遺伝子変化を意味すると意図する。遺伝子変化としては、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を組み込む修飾、他の核酸付加、核酸欠失および／または微生物の遺伝物質の他の機能的崩壊が挙げられる。このような修飾としては、例えば、参照とする種についての異種、同種または異種および同種の両方のポリペプチドについてのコード領域およびその機能的断片が挙げられる。さらなる修飾としては、例えば、修飾が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が挙げられる。例示的な代謝ポリペプチドとしては、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、トルエン、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、または１，３−ブタジエン生合成経路内の酵素またはタンパク質が挙げられる。
【００２８】
代謝修飾とは、その天然に生じる状態から変化される生合成反応を指す。従って、非天然に生じる微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対して遺伝的修飾を有し得る。例示的な代謝修飾は本明細書に開示されている。
【００２９】
微生物に対する参照として使用する場合、本明細書で使用する、「単離された」という用語は、参照とする微生物が天然に見出されるような少なくとも１つの成分を実質的に含まない生物を意味する。この用語は、微生物がその天然の環境に見出されるような一部または全ての成分から除去される微生物を含む。この用語はまた、微生物が非天然に生じる環境で見出されるような一部または全ての成分から除去される微生物を含む。従って、単離された微生物は、天然に見出されるか、または非天然に生じる環境で増殖、保存または維持されるような他の物質から部分的または完全に分離される。単離された微生物の特定の例としては、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物および非天然に生じる培地中で培養される微生物が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される、「微生物（ｍｉｃｒｏｂａｉｌ）」、「微生物（ｍｉｃｒｏｂａｉｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」、または「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、古細菌、細菌または真核生物の領域内に含まれる微小細胞として存在する任意の生物を意味すると意図される。従って、この用語は、微小サイズを有する原核もしくは真核細胞または生物を包含し、全ての種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに酵母および真菌などの真核微生物を含むと意図される。この用語はまた、生化学物質を生産するために培養され得る任意の種の細胞培養物を含む。
【００３１】
本明細書で使用する、「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」という用語は、有機補因子または活性化酵素系を形成するために多くの酵素（アポ酵素）の活性化にその存在が必要とされる補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）を意味すると意図する。補酵素Ａは、特定の縮合酵素において機能し、アセチルまたは他のアシル基転移において、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルベート酸化ならびに他のアセチル化において作用する。
【００３２】
本明細書で使用する、「（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート」という用語は、本明細書において２Ｈ３Ｍ４ＯＰと省略され、図５に示す化学式を有する。このような化合物はまた、３−ヒドロキシ−２−メチルブタナール−４−ホスフェートと記載され得る。
【００３３】
本明細書で使用する、「（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート」という用語は、本明細書において２Ｈ４ＯＰと省略され、図８に示す化学式（化合物３）を有する。このような化合物はまた、３−ヒドロキシブタナール−４−ホスフェートと記載され得る。
【００３４】
分子式Ｃ８Ｈ７Ｏ２−（図６、化合物９を参照のこと）（ＩＵＰＡＣ名４−メチルベンゾエート）を有する、本明細書で使用する、「ｐ−トルエート」という用語は、ｐ−トルイル酸のイオン化形態であり、ｐ−トルエートおよびｐ−トルイル酸は、その任意の塩形態を含む、その天然またはイオン化形態のいずれかの化合物を示すために全体にわたって交換可能に使用され得ると理解される。特定の形態はｐＨに依存することは当業者により理解される。
【００３５】
分子式Ｃ７Ｈ６Ｏ２（図９、化合物９を参照のこと）を有する、本明細書で使用する、「ベンゾエート」という用語は、安息香酸のイオン化形態であり、ベンゾエートおよび安息香酸は、その任意の塩形態を含む、その天然またはイオン化形態のいずれかの化合物を示すために全体にわたって交換可能に使用され得ると理解される。特定の形態はｐＨに依存することは当業者により理解される。
【００３６】
分子式Ｃ８Ｈ４Ｏ４−２（図７、化合物４を参照のこと）（ＩＵＰＡＣ名テレフタレート）を有する、本明細書で使用する、「テレフタレート」という用語は、テレフタル酸のイオン化形態であり、ｐ−フタル酸またはＰＴＡとも称され、テレフタレートおよびテレフタル酸は、その任意の塩形態を含む、その天然またはイオン化形態のいずれかの化合物を示すために全体にわたって交換可能に使用され得ると理解される。特定の形態はｐＨに依存することは当業者により理解される。
【００３７】
培養または増殖条件を参照して使用する場合、本明細書で使用する、「実質的に嫌気性」という用語は、液体培地に溶解した酸素について酸素の量が飽和の約１０％未満であることを意味すると意図する。この用語はまた、約１％未満の酸素の雰囲気で維持される液体または固体培地の密閉チャンバを含むことが意図される。
【００３８】
本明細書で使用する、「外因性」は、参照分子または参照活性が宿主微生物に組み込まれることを意味すると意図する。分子は、例えば、宿主染色体内に、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として融合することによって、コード核酸を宿主遺伝物質に組み込むことによって組み込まれ得る。従って、この用語は、コード核酸の発現を参照して使用される場合、発現可能な形態のコード核酸の微生物への組み込みを指す。生合成活性を参照して使用する場合、この用語は、宿主参照生物へ組み込まれる活性を指す。その起源は、例えば、宿主微生物への組み込み後に参照活性を発現する同種または異種コード核酸であってもよい。従って、「内因性」という用語は、宿主に存在する参照分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に対する参照として使用する場合、微生物内に含まれるコード核酸の発現を指す。「異種」という用語は、参照種以外の起源由来の分子または活性を指すのに対して、「同種」は、宿主微生物由来の分子または活性を指す。従って、本発明のコード核酸の外因性発現は、異種または同種コード核酸のいずれかまたは両方を利用し得る。
【００３９】
１つより多い外因性核酸が微生物に含まれる場合、その１つより多い外因性核酸は、上記で議論した参照コード核酸または生合成活性を指すと理解される。本明細書に開示されるように、このような１つより多い外因性核酸は、別の核酸分子、多シストロン性核酸分子、またはそれらの組み合わせにおいて宿主微生物に組み込まれ得、それはなお、１つより多い外因性核酸とみなされることがさらに理解される。例えば、本明細書に開示されるように、微生物は、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードする２つ以上の外因性核酸を発現するように遺伝子操作され得る。所望の活性をコードする２つの外因性核酸が宿主微生物に組み込まれる場合、２つの外因性核酸は、例えば、単一のプラスミド、別のプラスミドにおいて単一の核酸として組み込まれ得、単一部位または複数部位において宿主染色体に融合され得、それはなお、２つの外因性核酸とみなされることは理解される。同様に、２つより多い外因性核酸が、任意の所望の組み合わせ、例えば、単一のプラスミド上、別のプラスミド上で宿主生物内に導入されてもよく、単一部位または複数部位において宿主染色体に導入されてもよく、それはなお、２つ以上の外因性核酸、例えば３つの外因性核酸とみなされることは理解される。従って、参照外因性核酸または生合成活性の数は、宿主生物に導入される別の核酸の数ではなく、コード核酸の数または生合成活性の数を指す。
【００４０】
本発明の非天然に生じる微生物は、変化を損失させずに５つより多い世代に培養され得る微生物を指す、安定な遺伝的変化を含み得る。一般に、安定な遺伝的変化は、１０より多い世代で存続する修飾を含み、特に安定な修飾は、約２５より多い世代で存続し、より特に安定な遺伝的修飾は、永久的を含む、５０より多い世代である。
【００４１】
当業者は、本明細書に例示された代謝的修飾を含む、遺伝的変化が、大腸菌などの適切な宿主生物およびそれらの対応する代謝反応または所望の代謝経路のための遺伝子などの所望の遺伝物質のための適切な起源生物を参照して記載されていることを理解するだろう。しかしながら、広範な種類の生物の完全なゲノム配列およびゲノム分野における高いレベルの技術を考慮して、当業者は、本明細書に提供される教示および指針を本質的に全ての他の生物に容易に適用できるだろう。例えば、本明細書に例示した大腸菌の代謝変化は、参照種以外の種から同じまたは類似のコード核酸を導入することにより、他の種に容易に適用できるだろう。このような遺伝的変化としては、例えば、種ホモログの遺伝的変化、および特に、オルソログ、パラログまたは非オルソロガスな遺伝子置換が挙げられる。
【００４２】
オルソログは、垂直の系統に関連する遺伝子（複数も含む）であり、異なる生物において実質的に同じまたは同一の機能に関与する。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログとみなされ得る。例えば、遺伝子が、ホモログであることを示すために十分な量の配列相同性を共有する場合、遺伝子は垂直の系統に関連するか、または共通の祖先からの進化に関連する。遺伝子はまた、それらが、一次配列相同性が識別できない範囲まで共通の祖先から進化したかを示すために、必ずしも配列相同性でないが、十分な量の三次元構造を共有する場合、オルソログとみなされ得る。オルソログである遺伝子は、約２５％〜１００％のアミノ酸配列同一性の配列相同性を有するタンパク質をコードできる。２５％未満のアミノ酸相同性を共有するタンパク質をコードする遺伝子はまた、それらの三次元構造もまた、相同性を有する場合、垂直の系統により生じるとみなされ得る。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む、酵素のセリンプロテアーゼファミリのメンバーは、共通の祖先から垂直の系統により生じるとみなされる。
【００４３】
オルソログは、例えば、進化により、構造または全体の活性において分岐している、遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子産物を含む。例えば、１つの種が、２つの機能を示す遺伝子産物をコードする場合、およびこのような機能が第２の種における別個の遺伝子に分けられる場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する産物はオルソログとみなされる。生化学的産物の生産に関して、当業者は、導入または分裂される代謝活性を保有するオルソログ遺伝子が、非天然に生じる微生物の構築のために選択されることを理解するだろう。分離可能な活性を示すオルソログの例は、別個の活性が、２つ以上の種の間、または単一種内の別個の遺伝子産物に分離される場合である。特定の例は、エラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解、２種のセリンプロテアーゼ活性の、プラスミノーゲン活性化因子またはエラスターゼとしての別個の分子への分離である。第２の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種由来のＤＮＡポリメラーゼは、第２の種由来のエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのいずれかまたは両方に対するオルソログ、およびその逆とみなされ得る。
【００４４】
対照的に、パラログは、例えば、複製後の進化的分岐に関連するホモログであり、同一ではないが、類似または共通の機能を有する。パラログは、例えば、同じ種を起源としてもよいか、または同じ種由来であってもよく、あるいは異なる種を起源としてもよいか、または異なる種由来であってもよい。例えば、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性エポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、それらが、共通の祖先から共進化した、２つの別個の酵素を表し、別個の反応を触媒し、同じ種において別個の機能を有するため、パラログとみなされ得る。パラログは、それらがホモログであるか、または共通の祖先から共進化を介して関連することを示唆する、互いに対して有意な配列相同性を有する同じ種由来のタンパク質である。パラログタンパク質ファミリーのグループとしては、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼ、および他のものが挙げられる。
【００４５】
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種において参照遺伝子機能に置換し得る１つの種由来の非オルソロガス遺伝子である。置換は例えば、異なる種における参照機能と比べて元の種において実質的に同一または類似の機能を実施できることを含む。一般的に、非オルソロガス遺伝子置換は、参照機能をコードする既知の遺伝子に構造的に関連すると識別可能であるが、ほとんど構造的に関連しないが、本明細書で使用される場合、機能的に類似の遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物は、それにも関わらず、なお、この用語の意味の範囲内である。機能的相同性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比べて非オルソロガス遺伝子産物の活性部位または結合領域において少なくとも一部の構造的相同性を必要とする。従って、非オルソロガス遺伝子は、例えば、パラログまたは関連しない遺伝子を含む。
【００４６】
従って、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成能を有する本発明の非天然に生じる微生物を識別および構築する際に、当業者は、本明細書に提供される教示および指針を特定の種に適用して、代謝修飾の識別が、オルソログの識別および包含または不活性化を含み得ることを理解するだろう。パラログおよび／または非オルソロガス遺伝子置換が、類似または実質的に類似の代謝反応触媒する酵素をコードする参照微生物に存在する範囲まで、当業者は、それらの進化に関連した遺伝子を利用できる。
【００４７】
オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子置換は、当業者に周知の方法により決定され得る。例えば、２つのポリペプチドについての核酸またはアミノ酸配列の検査は、比較配列の間の配列同一性および類似性を明らかにする。このような類似性に基づいて、当業者は、類似性が、タンパク質が共通の祖先からの進化に関連することを示すのに十分に高いか否かを決定できる。Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗおよび他のものなどの当業者に周知のアルゴリズムは、生の配列類似性または識別性を比較し、決定し、また、質量またはスコアを割り当てられ得る配列の存在またはギャップの有意性を決定する。このようなアルゴリズムはまた、当該技術分野において公知であり、ヌクレオチド配列類似性または同一性を決定するのに同様に適用可能である。関連性を決定するのに十分な類似性に関するパラメータは、統計的類似性を計算するための周知の方法、またはランダムポリペプチドにおいて類似性一致を発見する機会、および決定された一致の有意性に基づいてコンピューターで計算される。２つ以上の配列のコンピューター比較は、所望の場合、また、当業者により視覚的に最適化され得る。関連する遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％〜１００％配列同一性を有すると予想され得る。関連しないタンパク質は、十分なサイズのデータベースが走査される場合、偶然に起こると予想されるものと本質的に同じ同一性を有し得る（約５％）。５％〜２４％の間の配列は、比較した配列が関連すると結論付けるのに十分な相同性を表わしてもよいし、または表わさなくてもよい。データセットのサイズを考慮してこのような一致の有意性を決定するためのさらなる統計的解析が、これらの配列の関連性を決定するために実施され得る。
【００４８】
例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータが以下に記載され得る。手短に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（Ｊａｎ−０５−１９９９）および以下のパラメータ：マトリクス：０  ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップ開口：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワールドサイズ：３；フィルター：オンを用いて実施され得る。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（Ｓｅｐｔ−１６−１９９８）および以下のパラメータ：一致：１；不一致：−２：ギャップ開口：５；ギャップ伸長：２；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワールドサイズ：１１；フィルター：オフを用いて実施され得る。当業者は、比較の厳密性を増加または減少させるため、および２つ以上の配列の関連性を決定するために、どの修飾が上記パラメータになされ得るかを知るだろう。
【００４９】
一部の実施形態において、本発明は、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。トルエン経路は、図１の代替の経路に示すように、（Ａ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つまたは両方、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および３）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、（Ｂ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つ以上、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、３）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの１つ以上、ならびに４）フェニルアセテートデカルボキシラーゼの１つ以上；ならびに（Ｃ）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミン化）の１つ以上、２）フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに３）フェニルアセテートデカルボキシラーゼから選択される。
【００５０】
トルエン経路を有する非天然に生じる微生物は、トルエン経路酵素を各々コードする２つの外因性核酸、トルエン経路酵素を各々コードする３つの外因性核酸、トルエン経路酵素を各々コードする４つの外因性核酸、またはトルエン経路酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含み得る。３つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる微生物は、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、３）フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに５）フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する生物を含み得る。４つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる生物は、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、２）フェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、３）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および４）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼをコードする外因性遺伝子を有する生物を含み得る。５つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる微生物は、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、２）フェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、３）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、４）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼ、ならびに５）フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する微生物を含み得る。このように、特定の実施形態において、非天然に生じる微生物は、完全なトルエン経路においてあらゆる酵素をコードする完全なトルエン経路のあらゆる遺伝子を有し得る。一部の実施形態において、トルエン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を含み得る。最後に、トルエン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在し得る。
【００５１】
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。ベンゼン経路は、図２に示すように、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼを含んでもよい。少なくとも１つの外因性核酸は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ自体またはその前駆体フェニルアラニンの生産に影響を与える核酸であってもよい。一部の実施形態において、ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
【００５２】
一部の実施形態において、本発明は、スチレンを生産するのに十分な量で発現されるスチレン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むスチレン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。スチレン経路は、図３における代替の経路により示すように、（Ａ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ以上、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼ；ならびに（Ｂ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼから選択され得る。
【００５３】
一部の実施形態において、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物は、スチレン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする６つの外因性核酸などを含み得る。５つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる生物は、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする外因性遺伝子を有する生物を含み得る。６つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる生物は、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする外因性遺伝子を有する生物を含み得る。一部の実施形態において、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。１，３−ブタジエン経路は、図４における代替の経路に示されるように、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択され得る。
【００５５】
一部の実施形態において、１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含み得る。このように、２つの外因性核酸は、図４に示す完全な経路に対応する、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択されるセットをコードできる。一部の実施形態において、１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１２の工程Ａ〜Ｄに示すように、（Ａ）１）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、２）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、３）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、および４）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、図１３の工程Ｂ〜Ｄに示すように、（Ｂ）（１）ＡＫＰデアミナーゼ、２）アセチルアクリラートレダクターゼ、および３）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、図１３の工程Ｅ、Ｈ、Ｆ、ＣおよびＤに示すように、（Ｃ）１）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、２）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、３）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、４）アセチルアクリラートレダクターゼ、および５）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、図１２の工程Ｂ〜Ｄと共に、図１３の工程ＥおよびＫに示すように、（Ｄ）１）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、２）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、３）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、４）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに５）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、ならびに図１２の工程Ｂ〜Ｄと共に、図１３の工程ＪおよびＬにも示す、（Ｅ）１）ＡＫＰレダクターゼ、２）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、３）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、４）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに５）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される２，４−ペンタジエノエートにＡＫＰを変換できる酵素のセットを有する。一部の実施形態において、図１２に示す中間体４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートを含む図１３の経路もまた、図１２に示す２，４−ジヒドロキシペンタノエート経路により方向付けされ得て、２，４−ペンタジエノエートを得る。例えば、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートから、２，４−ペンタジエノエートまでの経路は、図１２における工程Ｅ、Ｈ、およびＤまたは工程Ｅ、Ｆ、およびＧにおける酵素を含み得る。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明はまた、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１２の工程Ａ、Ｅ、Ｆ、およびＧに示すように、（Ａ）１）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、２）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートレダクターゼ、３）２，４−ジヒドロキシペンタノエート２−デヒドラターゼ、および４）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼならびに図１２の工程Ａ、Ｅ、Ｈ、およびＤに示すように、（Ｂ）１）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、２）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートレダクターゼ、３）２，４−ジヒドロキシペンタノエート４−デヒドラターゼおよび４）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
【００５８】
一部の実施形態において、本発明はまた、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１３の工程Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｇ、およびＤに示すように、（Ａ）１）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、２）２，４−ジオキソペンタノエート２−レダクターゼ、３）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートレダクターゼ、４）２，４−ジヒドロキシペンタノエート２−デヒドラターゼ、および５）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼならびに図１２の工程ＦおよびＧまたはＨおよびＤと共に、図１３の工程Ｅ、ＨおよびＩにそれぞれ示すように、（Ｂ）１）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、２）２，４−ジオキソペンタノエート２−レダクターゼ、４）２，４−ジヒドロキシペンタノエート−２−デヒドラターゼと共に、３）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに５）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼまたは４）２，４−ジヒドロキシペンタノエート−４−デヒドラターゼならびに５）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。すなわち、２，４−ジヒドロキシペンタノエートの二重脱水が任意の順序で実施され得る。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明はまた、ＡＫＰを生産するのに十分な量で発現されるＡＫＰ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むＡＫＰ経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。ＡＫＰ経路は、図１３の工程ＭおよびＮに示すように、オルニチン４，５−アミノムターゼおよび２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼおよび／または４−デヒドロゲナーゼを含む。一部の実施形態において、ＡＫＰ経路を有する微生物は、オルニチン４，５−アミノムターゼおよび２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼまたは２，４−ジアミノペンタノエート４−デヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性酵素を含む。一部の実施形態において、このＡＫＰ経路は、上述の２，４−ペンタジエノエート経路および図１３に示したもののいずれかに加えられ得る。代替として、ＡＫＰは、図１３の工程Ａに示すように、ＡＫＰチオラーゼを付加することによってアラニンから入手でき、種々の２，４−ペンタジエノエート経路に供給され、図１２と共に図１３に示される。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明はまた、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１４の工程Ａ〜Ｃに示すように、（Ａ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、ならびに３）５−アミノペント−２−エノエートデアミナーゼ、図１４の工程Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｆ、およびＧに示すように、（Ｂ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、３）５−アミノペント−２−エノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、４）５−オキソペント−２−エノエートレダクターゼ、ならびに５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、図１４の工程Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧに示すように、（Ｃ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、３）３−アミノ−５−オキソペンタノエートデアミナーゼ、４）５−オキソペント−２−エノエートレダクターゼ、ならびに５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、ならびに図１４の工程Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、およびＧに示すように、（Ｄ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、３）３−アミノ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに４）３−アミノ−５−ヒドロキシペンタノエートデアミナーゼ、ならびに５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
【００６１】
一部の実施形態において、本発明はまた、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。２，４−ペンタジエノエート経路は、３−ＨＰ−ＣｏＡまたはアクリロイル−ＣｏＡから開始して図１５に示す多くの経路のいずれかから選択される酵素のセットを有する。
【００６２】
３−ＨＰ−ＣｏＡからの例示的な経路は、以下の酵素セット、図１５の工程Ａ〜Ｅに示すように、（Ａ）１）３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、３）３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、４）５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、ならびに５）ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ならびに図１５の工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、およびＱに示すように、（Ｂ）１）３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、３）３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、４）３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、ならびに５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼを含む。当業者は、３−ＨＰ−ＣｏＡからの経路（Ａ）および（Ｂ）を定義する酵素セットが、図１５の工程Ｇに示すように、可逆的酵素３，５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ならびに図１５の工程Ｈに示すように、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、３−ＨＰ−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエート経路は、図１５に各々示すように、工程Ａ、Ｂ、Ｇ、ＪおよびＱ、または工程Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨおよびＱ、または工程Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥ、または工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、ＨおよびＱ、または工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥにおける酵素を含み得る。
【００６３】
アクリロイル−ＣｏＡからの例示的な経路は、以下の酵素セット、図１５の工程Ｍ、Ｏ、Ｐ、およびＳに示すように、（Ｃ）１）アクリロイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、３）３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、４）３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼならびに工程Ｍ、Ｎ、Ｒ、およびＥに示すように、（Ｄ）、１）アクリロイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、３）３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、ならびに４）ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはデヒドラーゼを含む。当業者は、３−ＨＰ−ＣｏＡから経路（Ａ）および（Ｂ）ならびにアクリロイル−ＣｏＡから（Ｃ）および（Ｄ）を定義する酵素セットが、図１５の工程Ｋに示すように、可逆的酵素３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、ならびに図１５の工程Ｌに示すように、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、工程Ｋは、アクリロイル−ＣｏＡから、工程Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、およびＥまたは工程Ｋ、Ｍ、Ｏ、ＰおよびＳなどの２，４−ペンタジエノエート経路を提供する、２，４−ペンタジエノエートまでの列挙された経路のいずれかに加えられ得る。工程Ｋはまた、工程Ｋ、Ｍ、およびＬにより３−ＨＰ−ＣｏＡから３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡを提供するために工程Ａまで往復の代替物を使用され得る。このように、工程Ａの酵素を利用する上述の経路のいずれかは、その所定の位置において工程Ｋ、Ｍ、およびＬの酵素を利用できる。同じ３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ中間体は、図１５の工程ＫおよびＡまたはＭおよびＬの酵素による経路によりアクリロイル−ＣｏＡから入手できる。このように、アクリロイル−ＣｏＡは、３−ＨＰ−ＣｏＡから入手可能な全ての列挙された経路を入手するために使用され得る。このように、例えば、アクリロイル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエート経路は、図１５に全て示すように、工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、ＪおよびＱ、または工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、およびＱ、または工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、およびＱ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｈ、Ｑ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｈ、ＤおよびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、ＪおよびＱ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、およびＱ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、およびＱ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｈ、Ｑ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｈ、ＤおよびＥからの酵素を含み得る。同様に、３−ＨＰ−ＣｏＡは、工程Ｌの酵素を用いて中間体３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡにより列挙されたアクリロイル−ＣｏＡ経路に供給され得る。このように、３−ＨＰ−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエート経路は、工程Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＥまたは工程Ａ、Ｌ、Ｏ、Ｐ、およびＳからの酵素を含み得、各々の経路は図１５に示される。
【００６４】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供する。２，４−ペンタジエノエート経路は、以下から選択される酵素のセットを有する：
１）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
２）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
３）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
４）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
５）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
６）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
７）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
８）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
９）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１０）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１１）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１２）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｄ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１３）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｒ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１４）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
１５）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；
１６）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｒ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ；
１７）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；ならびに
１８）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｓ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７、または８つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性の培地に存在する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物はさらに、２，４−ペンタジエノエートを１，３−ブタジエンに変換するために２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼを含む。
【００６６】
一部の実施形態において、非天然に生じる微生物は、１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む。１，３−ブタジエン経路は、以下から選択される酵素のセットを有する：
１）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
２）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
３）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
４）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
５）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｎ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；
６）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｏ．３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｐ．３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、Ｙ．３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、または５つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
【００６８】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１−オールを生産するのに十分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。３−ブテン−１−オール経路は、以下から選択される酵素のセットを有する：
１）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
２）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
３）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
４）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
５）Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
６）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
７）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
８）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
９）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１０）Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１１）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１２）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１３）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１４）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１５）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ａ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１６）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１７）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｆ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｉ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
１８）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｕ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；
１９）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｇ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｊ．３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；
２０）Ｋ．３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｍ．アクリリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、Ｌ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｈ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、Ｖ．５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ。
【００６９】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、３−ブテン−１−オール経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物はさらに、３−ブテン−１−オールを１，３−ブタジエンに変換するための３−ブテン−１−オールデヒドラターゼを含む。
【００７０】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含み得る。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含み得る。例えば、本発明の非天然に生じる微生物は、ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼをコードする３つの外因性核酸を含み得るので、ＡＫＰを介する２，４−ペンタジエノエートへのアラニンまたはオルニチンが利用可能な経路を提供する。当業者は、これは単に例示的であり、３つの外因性核酸は、図１２〜１５の列挙した経路のいずれかにおいて任意の２，４−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる生物に基づき得ることを認識するだろう。
【００７１】
一部の実施形態において、本発明の微生物の非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする任意の４つの外因性核酸を含み得る。例えば、非天然に生じる微生物は、ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラーゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする４つの外因性核酸を含み得るので、図１２に示すように、ピルベートから２，４−ペンタジエノエートまでの完全な経路を定義する。当業者は、これは単に例示であり、４つの外因性核酸は、図１２〜１５の列挙した経路のいずれかにおいて任意の２，４−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる生物に基づき得ることを認識するだろう。
【００７２】
なおさらなる実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含み得る。５つの外因性核酸を有する本発明の例示的な非天然に生じる微生物は、図１３の工程Ｅ、Ｈ、Ｆ、Ｃ、およびＤに示すように、（Ａ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセトアクリレートレダクターゼ、ならびにｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、あるいは（Ｂ）図１２の工程Ｂ、Ｃ、およびＤと共に、図１３の工程ＥおよびＫに示すように、ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／もしくはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、または図１２の工程Ｂ、Ｃ、およびＤと共に、図１３の工程ＪおよびＬに示すように、ｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／もしくはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする酵素を含み得る。当業者は、これは単に例示であり、５つの外因性核酸は、図１２〜１５の列挙された経路のいずれかにおいて任意の２，４−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる生物に基づき得ることを認識するだろう。このように、一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート経路における２、３、４、５、６以下の全ての酵素は外因性核酸の挿入を提供できる。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。さらに、一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地中で提供され得る。
【００７３】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物はさらに、２，４−ペンタジエノエートの１，３−ブタジエンへの変換により１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼを含み得る。このように、図１２の任意の２，４−ペンタジエノエート経路は、図４におけるｃｉｓまたはｔｒａｎｓ２，４−ペンタジエノエートの１，３−ブタジエンへの変換により示されるように、１，３−ブタジエンのさらなる生産に基づいて形成できる。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、基質を生産物に変換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。例えば、トルエン経路（図１）において、そのような基質から生産物は、フェニルアラニンからフェニルピルベート、フェニルピルベートからフェニルアセトアルデヒド、フェニルピルベートからフェニルアセテート、フェニルアセトアルデヒドからフェニルアセテート、フェニルアセトアルデヒドからトルエン、およびフェニルアセテートからトルエンからなる群から選択される。スチレン経路（図３）において、そのような基質から生産物は、ベンゾイル−ＣｏＡから３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡから［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］ホスホネート、［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］ホスホネートからベンゾイル−アセテート、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡからベンゾイル−アセテート、ベンゾイル−アセテートからアセトフェノン、アセトフェノンから１−フェニルエタノール、および１−フェニルエタノールからスチレンからなる群から選択される。１，３−ブタジエン経路（図４）において、そのような基質から生産物は、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートからｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエート、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓムコネートからｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエート、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートからｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエート、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートからｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエート、ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートから１，３−ブタジエン、およびｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートから１，３−ブタジエンから選択される。当業者は、これらは単に例示であり、所望の生産物を生産するのに好適である本明細書に開示される基質−生産物対およびそれに関して基質から生産物の変換に利用可能である適切な活性のいずれかは、本明細書の教示に基づいて当業者により容易に決定できることを理解するだろう。
【００７５】
２，４−ペンタジエノエート経路において、そのような基質から生産物は、ピルベートから４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートから２−オキソペンテノエート、２−オキソペンテノエートから２−ヒドロキシペンテノエート、２−ヒドロキシペンテノエートから２，４−ペンタジエノエート、ＡＫＰからアセチルアクリレート、アセチルアクリレートから４−ヒドロキシペント−２−エノエート、４−ヒドロキシペント−２−エノエートから２，４−ペンタジエノエート、ＡＫＰから２，４−ジオキソペンタノエート、２，４−ジオキソペンタノエートから４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート、ＡＫＰから２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエート、２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートから４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート、オルニチンから２，４−ジアミノペンタノエート、２，４−ジアミノペンタノエートからＡＫＰ、アラニンからＡＫＰなどから選択される。
【００７６】
本発明はまた、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、その（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼを含む（実施例ＩＩＩおよび図５、工程Ｃを参照のこと）。（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含む非天然に生じる微生物はさらに、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼまたは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（実施例ＩＩＩおよび図５、工程ＡおよびＢを参照のこと）を含み得る。このように、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートは、５２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼ、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る。
【００７７】
本発明はまた、ｐ−トルエートを生産するのに十分な量で発現されるｐ−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むｐ−トルエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、そのｐ−トルエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；またはコリスメートリアーゼを含む（実施例ＩＶおよび図６、工程Ａ〜Ｈを参照のこと）。ｐ−トルエート経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含み得る（図５）。（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、例えば、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼ、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼまたは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る（図５）。
【００７８】
本発明はさらに、テレフタレートを生産するのに十分な量で発現されるテレフタレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むテレフタレート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、そのテレフタレート経路は、ｐ−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ；４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ；または４−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む（実施例Ｖおよび図７を参照のこと）。テレフタレート経路を含むこのような生物はさらに、ｐ−トルエート経路を含み得、ここで、そのｐ−トルエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；またはコリスメートリアーゼを含む（実施例ＩＶおよびＶならびに図６および７を参照のこと）。テレフタレート経路およびｐ−トルエート経路を有するこのような非天然に生じる微生物はさらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含み得る（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、例えば、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼ、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼまたは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。
【００７９】
一部の実施形態において、本発明は、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。トルエン経路は、ａ）ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ；ｂ）ｐ−トルエートレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボキシラーゼ；ｃ）ｐ−トルエートキナーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｄ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌａｓｅ）、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、ならびにｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｅ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される。
【００８０】
一部の実施形態において、本発明は、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含む。
【００８１】
一部の実施形態において、本発明は、ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゾエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。ベンゾエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼを含む。
【００８２】
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。ベンゼン経路は、ａ）ベンゾエートデカルボキシラーゼ；ｂ）ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｃ）ベンゾエートキナーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｄ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランスベンゾイラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｂｅｎｚｏｙｌａｓｅ）、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｅ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される。
【００８３】
さらなる実施形態において、本発明は、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ｐ−トルエート、テレフタレート、トルエン、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、基質から生産物に変換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。例えば、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路において、基質および生産物は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートおよびピルベートから１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェート；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートからＣ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェート；ならびにＣ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートから（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートからなる群から選択され得る（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。別の実施形態において、ｐ−トルエート経路は、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートから２，４−ジヒドロキシ−５−メチル−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート；２，４−ジヒドロキシ−５−メチル−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレートから１，３−ジヒドロキシ−４−メチル−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート；１，３−ジヒドロキシ−４−メチル−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレートから５−ヒドロキシ−４−メチル−３−オキソシクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸；５−ヒドロキシ−４−メチル−３−オキソシクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸から３，５−ジヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート；３，５−ジヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから５−ヒドロキシ−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート；５−ヒドロキシ−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート；５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチルシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレート；および３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチルシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレートからｐ−トルエートから選択される基質および生産物を含み得る（実施例ＩＶおよび図６を参照のこと）。なおさらに別の実施形態において、テレフタレート経路は、ｐ−トルエートから４−カルボキシベンジルアルコール；４−カルボキシベンジルアルコールから４−カルボキシベンズアルデヒド；および４−カルボキシベンズアルデヒドからテレフタル酸から選択される基質および生産物を含み得る（実施例Ｖおよび図７を参照のこと）。別の実施形態において、トルエン経路は、ｐ−トルエートからトルエン；ｐ−トルエートからｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡ；ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡからｐ−メチルベンゾイルオキシホスフェートからｐ−メチルベンズアルデヒド；ｐ−メチルベンゾイルオキシホスホネートからｐ−メチルベンズアルデヒド；およびｐ−メチルベンズアルデヒドからトルエンから選択される置換および生産物を含み得る（実施例ＶＩＩおよび図１１を参照のこと）。別の実施形態において、２Ｈ４ＯＰ経路は、エリトロース−４−ホスフェートから（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネート；および（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートから２Ｈ４ＯＰから選択される置換および生産物を含み得る（実施例ＶＩおよび図８を参照のこと）。別の実施形態において、ベンゾエート経路は、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートから２，４−ジヒドロキシ−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート；２，４−ジヒドロキシ−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレートから１，３−ジヒドロキシ−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート；１，３−ジヒドロキシ−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレートから５−ヒドロキシ−３−オキソシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート；５−ヒドロキシ−３−オキソシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから３，５−ジヒドロキシシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、３，５−ジヒドロキシシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから５−ヒドロキシ−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート；５−ヒドロキシ−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート；５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレートから３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］シクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレート；および３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］シクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレートからベンゾエートから選択される基質および生産物を含み得る（実施例ＶＩおよび図９を参照のこと）。別の実施形態において、ベンゼン経路は、ベンゾエートからベンゼン；ベンゾエートからベンゾイル−ＣｏＡ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートまたはベンズアルデヒド；ベンゾイル−ＣｏＡから（ベンゾイルオキシ）ホスホネートまたはベンズアルデヒド；（ベンゾイルオキシ）ホスホネートからベンズアルデヒド；およびベンズアルデヒドからベンゼンから選択される基質および生産物を含み得る。当業者は、これらは単に例示であり、所望の生産物を生産するのに好適である本明細書に開示される基質−生産物対およびそれに関して基質から生産物の変換に利用可能である適切な活性のいずれかは、本明細書の教示に基づいて当業者により容易に決定できることを理解するだろう。
【００８４】
本明細書に開示されるように、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を図５に例示する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。従って、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート生産する（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含む微生物に加えて、本発明はさらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その微生物は、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路中間体、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートまたはＣ−メチル−Ｄ−エリトルトール−４−ホスフェートを生産する。同様に、本発明はまた、ｐ−トルエートを生産するｐ−トルエート経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、ｐ−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、その微生物は、ｐ−トルエート経路中間体、例えば、２，４−ジヒドロキシ−５−メチル−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート、１，３−ジヒドロキシ−４−メチル−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート、５−ヒドロキシ−４−メチル−３−オキソシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、３，５−ジヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、５−ヒドロキシ−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、または３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチルシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレートを生産する。さらに、本発明は、テレフタレート経路の酵素を含む非天然に生じる微生物をさらに提供し、ここで、その微生物は、テレフタレート経路中間体、例えば、４−カルボキシベンジルアルコールまたは４−カルボキシベンズアルデヒドを生産する。
【００８５】
同様に、本発明はまた、トルエンを生産するトルエン経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、トルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、ここで、その微生物は、トルエン経路の中間体、例えば、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネート、またはｐ−メチルベンズアルデヒドを生産する。
【００８６】
同様に、本発明はまた、ベンゼンを産生するベンゼン経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、ベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、ここで、その微生物は、ベンゼン経路の中間体、例えば、ベンゾイル−ＣｏＡ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネート、およびベンズアルデヒドを生産する（図１０）。
【００８７】
同様に、本発明はまた、ベンゾエートを生産するベンゾエート経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、ベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、その微生物は、ベンゾエート経路中間体、例えば、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、２，４−ジヒドロキシ−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート、１，３−ジヒドロキシ−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート、５−ヒドロキシ−３−オキソシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、３，５−ジヒドロキシシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、５−ヒドロキシ−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、および３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］シクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレートを生産する（図９）。
【００８８】
このように、本発明は、酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その酵素またはタンパク質は、図１〜１１に示すものなどの、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の基質および生産物を変換する。
【００８９】
全体的に、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を含む微生物として本明細書に記載されているが、本発明はさらに、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体を生産するのに十分な量で発現されるトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供することが理解される。例えば、本明細書に開示されるように、トルエン、ベンゼン、スチレン、および１，３−ブタジエン経路は、図１〜２３に例示される。従って、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を含む微生物に加えて、本発明はさらに、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その微生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体、例えば、フェニルピルベート、フェニルアセトアルデヒド、フェニルアセテート、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡ、［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］ホスホネート、ベンゾイル−アセテート、アセトフェノン、１−フェニルエタノール、ＤＸＰ、２ＭＥ４Ｐ、ベンゾイル−ＣｏＡ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネート、ベンズアルデヒド、ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエート、およびｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエート、ならびに図６および９に示したいずれかのシキメート経路の中間体を生産する。
【００９０】
実施例に記載し、図１〜１１の経路を含む、図面に例示したように、本明細書に開示される経路のいずれかは、所望の場合、任意の経路の中間体またはタンパク質を生産する非天然に生じる微生物を生成するために利用できることは理解される。本明細書に開示されるように、中間体を産生するそのような微生物は、所望のタンパク質を生産するために下流の経路の酵素を発現する別の微生物と組み合わせて使用されてもよい。しかしながら、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体を生産する非天然に生じる微生物は、所望のタンパク質として中間体を生産するために利用され得ることは理解される。
【００９１】
本発明は、代謝反応、反応物もしくはその生産物に対する一般的参照と共に、あるいは参照する代謝反応、反応物もしくは生産物と関連するか、もしくはそれらを触媒する酵素、またはそれらに関連するタンパク質をコードする１つ以上の核酸もしくは遺伝子に対する特定の参照と共に本明細書に記載される。本明細書において他に明確に記載されない限り、当業者は、反応に対する参照はまた、その反応の反応物および生産物に対する参照を構成することも理解するだろう。同様に、本明細書において明確に記載されない限り、反応物または生産物に対する参照はまた、その反応を参照し、それらの代謝構成物質のいずれかに対する参照はまた、触媒する酵素または参照した反応、反応物もしくは生産物に関連するタンパク質をコードする遺伝子（複数も含む）を参照する。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノムの周知の分野を考慮して、遺伝子またはコード核酸に対する本明細書の参照はまた、対応するコードされた酵素およびそれが触媒する反応、またはその反応に関連するタンパク質ならびにその反応の反応物および生産物に対する参照を構成する。
【００９２】
本発明の非天然に生じる微生物は、１つ以上のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路に関与する１つ以上の酵素またはタンパク質をコードする発現可能な核酸を導入することによって生産され得る。生合成のために選択される宿主微生物に応じて、特定のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路の一部または全てについての核酸が発現され得る。例えば、選択された宿主が、所望の生合成経路についての１つ以上の酵素またはタンパク質において異なる場合、異なる酵素（複数も含む）またはタンパク質（複数も含む）についての発現可能な核酸が、後の外因性発現のために宿主に導入される。代替として、選択された宿主が一部の経路遺伝子の外因性発現を示すが、他が異なる場合、コード核酸が、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成を達成するために、欠失した酵素（複数も含む）またはタンパク質（複数も含む）に必要とされる。このように、本発明の非天然に生じる微生物は、所望の生合成経路を得るために、外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより生産され得るか、または所望の生合成経路は、１つ以上の外因性酵素またはタンパク質と共に、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンなどの所望のタンパク質を生産する、１つ以上の外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより得られ得る。
【００９３】
宿主微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌または発光プロセスに適用可能な種々の他の微生物のいずれかから選択され得、非天然に生じる微生物は、それらにおいて生成される。例示的な細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、アネロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｓ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択される種が挙げられる。例示的な酵母または真菌としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギウス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾブス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｂｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）から選択される種が挙げられる。大腸菌が遺伝子操作に好適な十分に特徴付けられている微生物であるため、大腸菌が特に有用な宿主生物である。他の特に有用な宿主微生物としては、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母が挙げられる。任意の好適な微生物宿主生物が、所望の生産物を生産するために代謝的および／または遺伝的修飾を導入するために使用され得ることが理解される。
【００９４】
選択された宿主微生物を構成するトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路に応じて、本発明の非天然に生じる微生物は、少なくとも１つの外因的に発現されたトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路をコードする核酸および１つ以上のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路についての最大で全てのコード核酸を含む。例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路は、対応するコード核酸の外因性発現を介する経路の酵素またはタンパク質を欠損した宿主において確立され得る。トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の全ての酵素またはタンパク質を欠損した宿主において、経路の全ての酵素またはタンパク質が発現され得ると理解されるが、たとえ宿主がその経路の酵素またはタンパク質の少なくとも１つを含んでいたとしても、その経路における全ての酵素またはタンパク質の外因性発現が含まれ得る。例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを産生するための経路における全ての酵素またはタンパク質、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼ、フェニルピルベートオキシダーゼ、フェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、アセトフェノンレダクターゼ、１−フェニルエタノールデヒドラターゼ、ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、ベンゾイル−アセテートキナーゼ、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼ、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼ、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼ、ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ、ならびにｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼなどの外因性発現が含まれ得る。
【００９５】
例えば、ｐ−トルエート経路における全ての酵素には、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；およびコリスメートリアーゼなどが含まれ得る。加えて、テレフタレート経路における全ての酵素には、ｐ−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ；４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ；および４−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼなどが含まれ得る。さらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路における全ての酵素には、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼ、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼなどが含まれ得る。同様に、トルエン経路における全ての酵素には、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ｐ−トルエートレダクターゼ、ｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼ、ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ、ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ（脱リン酸化）、およびｐ−トルエートキナーゼなどが含まれ得る。
【００９６】
同様に、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路における全ての酵素には、エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼなどが含まれ得る。
【００９７】
同様に、ベンゾエート経路における全ての酵素には、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、３−デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキメートデヒドロゲナーゼ、シキメートキナーゼ、３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ、コリスメートシンターゼ、およびコリスメートリアーゼなどが含まれ得る。
【００９８】
同様に、ベンゼン経路における全ての酵素には、ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ベンゾエートレダクターゼ、ベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼ、ベンゾエートデカルボキシラーゼ、ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ（脱リン酸化）、ならびにベンゾエートキナーゼなどが含まれ得る。
【００９９】
本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、発現可能な形態に導入するためのコード核酸の数は、少なくとも、選択された宿主微生物のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の欠損に対応することを理解するだろう。従って、本発明の非天然に生じる微生物は、１、２、３、４、５、６、７、８、すなわち全てまでの、本明細書に開示されるトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする核酸を有し得る。一部の実施形態において、非天然に生じる微生物はまた、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成を促進または最適化するか、あるいは宿主微生物に他の有用な機能を与える他の遺伝的修飾を含み得る。１つのこのような他の機能性には、例えば、フェニルアラニン、フェニルピルベート、フェニルアセトアルデヒド、フェニルアセテート、ベンゾイル−ＣｏＡ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡ、［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］ホスホネート、ベンゾイルアセテート、アセトフェノン、１−フェニルエタノール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネート、ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエート、ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエート、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート、２−オキソペンテノエート、２−ヒドロキシペンテノエート、２，４−ジヒドロキシペンタノエート、４−ヒドロキシペント−２−エノエート、２，４−ジアミノペンタノエート、ＡＫＰ、アセチルアクリレート、２，４−ジオキソペンタノエート、２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタノエート、２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエート、３，５−ジアミノペンタノエート、５−アミノペント−２−エノエート、３−アミノ−５−オキソペンタノエート、５−オキソペント−２−エノエート、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、３−アミノ−５−ヒドロキシペンタノエート、３−ＨＰ−ＣｏＡ、アクリロイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエート、３，５−ジヒドロキシペンタノエート、３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡ、３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡ、３−オキソペント−４−エノエート、および３−ヒドロキシペント−４−エノエートグリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ピルベート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートまたはｐ−トルエートなどのトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の前駆体の１つ以上の合成の増加が含まれ得る。さらに、本明細書に開示されるように、複数の経路は、所望の場合、ｐ−トルエート（図６）、テレフタレート（図７）、トルエン（図１１）および（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート（図５）、または２Ｈ４ＯＰ（図８）、ベンゾエート（図９）およびベンゼン（図１０）を生産するための経路などの単一の生物に含まれ得る。
【０１００】
一般に、宿主微生物は、それが、所望の前駆体のデノボ生産または宿主微生物により天然に生産された前駆体の増加した生産のいずれかを提供する天然に生産された分子または遺伝子操作された生産物のいずれかとして、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の前駆体を生産するように選択される。例えば、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートは、大腸菌などの宿主微生物中で天然に生産される。さらなる例として、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートおよびホスホエノールピルベートが、大腸菌などの宿主微生物中で天然に産生される。宿主生物は、本明細書に開示される、前駆体の生産を増加させるように遺伝子操作され得る。加えて、所望の前駆体を生産するように遺伝子操作されている微生物は、宿主微生物として使用され得、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作される。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを合成する酵素能力を含む宿主から生成される。この特定の実施形態において、それは、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生産に対する、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の反応を誘導するために、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の生産物の合成または蓄積を増加させるのに有用であり得る。増加した合成または蓄積は、例えば、上記のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質の１つ以上をコードする核酸の過剰発現により達成され得る。トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素（複数も含む）および／またはタンパク質（複数も含む）の過剰発現は、例えば、内因性遺伝子（複数も含む）の外因性発現により、または異種遺伝子（複数も含む）の外因性発現により生じ得る。従って、天然に生じる生物は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、すなわち全てまでの、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路の酵素またはタンパク質をコードする核酸の過剰発現により、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する、本発明の非天然に生じる微生物になるように容易に生成され得る。加えて、非天然に生じる生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路において酵素の活性の増加を生じる内因性遺伝子の突然変異により生成され得る。
【０１０２】
特に有用な実施形態において、コード核酸の外因性発現が利用される。外因性発現は、発現および／または調節要素を、使用者により制御される所望の発現レベルを達成するための宿主および用途に特別に変更できる能力を与える。しかしながら、外因性発現はまた、負の調節エフェクターの除去または誘導可能なプロモーターもしくは他の調節要素に結合される場合、遺伝子のプロモーターの挿入などにより、他の実施形態においても利用できる。このように、天然に生じる誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適切な誘導剤を提供することによって上方制御され得るか、または内因性遺伝子の調節領域は、誘発可能な調節要素を導入するために遺伝子操作され得、それにより、所望の時間にて内因性遺伝子の増加した発現の調節を可能にする。同様に、誘発可能なプロモーターは、非天然に生じる微生物に導入される外因性遺伝子のための調節要素として含まれ得る。
【０１０３】
本発明の方法において、１つ以上の外因性核酸のいずれかは、本発明の非天然に生じる微生物を生産するために微生物に導入され得ることは理解される。核酸は、例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路を微生物に与えるように導入され得る。代替として、コード核酸が、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成能を与えるのに必要な反応の一部を触媒する生合成能を有する中間微生物を生産するために導入されてもよい。例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路を有する非天然に生じる微生物は、トルエン経路において、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）およびフェニルピルベートデカルボキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）ならびにフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）ならびにフェニルピルベートオキシダーゼ、フェニルピルベートオキシダーゼならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）ならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび／またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）ならびにフェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、フェニルピルベートデカルボキシラーゼならびにフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、フェニルピルベートデカルボキシラーゼならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルピルベートデカルボキシラーゼならびにフェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、ならびにフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼの組み合わせなどの所望の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも２つの外因性核酸を含み得る。
【０１０４】
同様に、スチレン経路において、少なくとも２つの外因性核酸の組み合わせは、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよび３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびアセトフェノンレダクターゼ、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよび１−フェニルエタノールデヒドラターゼ、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびベンゾイル−アセテートキナーゼ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼおよびベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼおよびアセトフェノンレダクターゼ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼおよび１−フェニルエタノールデヒドラターゼなどを含み得る。
【０１０５】
同様に、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路において、発現される酵素の組み合わせは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ、または２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの組み合わせであり得る。ｐ−トルエート経路において、発現される酵素の組み合わせは、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼおよび３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートキナーゼおよび３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；シキメートキナーゼおよびシキメートデヒドロゲナーゼなどの組み合わせであり得る。同様に、テレフタレート経路において、発現される酵素の組み合わせは、ｐ−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼおよび４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ；または４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼおよび４−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼなどであり得る。このように、生合成経路の２つ以上の酵素またはタンパク質のいずれかの組み合わせは、本発明の非天然に生じる微生物に含まれ得ることが理解される。
【０１０６】
同様に、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組み合わせが対応する所望の生産物の生産を生じる限り、生合成経路の３つ以上の酵素またはタンパク質のいずれかの組み合わせは、本発明の非天然に生じる微生物に含まれ得ることなどが理解される。３つの酵素のそのような組み合わせには、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組み合わせが対応する所望の生産物の生産を生じる限り、例えば、所望の場合、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキメートデヒドロゲナーゼおよびシキメートキナーゼ；シキメートキナーゼ、コリスメートシンターゼおよびコリスメートリアーゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ、コリスメートシンターゼおよびコリスメートリアーゼなどが含まれ得る。
【０１０７】
同様に、本明細書に開示される生合成経路の４、５、６またはそれ以上の酵素またはタンパク質のいずれかの組み合わせは、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組み合わせが対応する所望の生産物の生産を生じる限り、所望の場合、本発明の非天然に生じる微生物に含まれ得る。
【０１０８】
本明細書に開示される、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成経路に加えて、本発明の非天然に生じる微生物および方法はまた、互いに、および他の微生物と共に種々の組み合わせで、ならびに他の経路による生産物の生合成を達成するために当該技術分野において周知の方法に利用され得る。例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生産物の使用以外のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する１つの代替法は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体を、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンに変換できる別の微生物の添加による。１つのこのような生産物は、例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体を含む。トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体は、次いで、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体を、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンに変換する第２の微生物のための基質として使用され得る。トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体は、第２の微生物の別の培養物に直接加えられてもよいか、あるいはトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体の生産物の元の培養物は、例えば、細胞分離によりこれらの微生物から枯渇され得、次いでその後、第２の微生物の発酵ブロスの添加が、中間体の精製工程を必要とせずに最終生産物を生産するために利用され得る。
【０１０９】
他の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物および方法は、例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成を達成するために広範なサブ経路に集合されてもよい。これらの実施形態において、本発明の所望の生産物のための生合成経路は、異なる微生物に分離され得、その異なる微生物は最終生産物を生産するために共培養され得る。このような生合成経路において、１つの微生物の生産物は、最終生産物が合成されるまで、第２の微生物のための基質である。例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成は、１つの経路の中間体を別の経路の中間体または生産物に変換するための生合成経路を含む微生物を構築することによって達成され得る。代替として、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンもまた、同じ容器内の２つの生物を用いて共培養または共発酵により微生物から生合成として生産され得、ここで、第１の微生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン中間体を生産し、第２の微生物は、中間体を、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンに変換する。
【０１１０】
本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、広範な組み合わせおよび置換が、他の微生物と一緒に、サブ経路を有する他の非天然に生じる微生物の共培養と共に、ならびにトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するための当該技術分野において周知の他の化学および／または生化学生産物の組み合わせと共に、本発明の非天然に生じる微生物および方法に対して存在することを理解するだろう。
【０１１１】
トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質についてのコード核酸の起源は、例えば、コードされた遺伝子産物が、参照反応を触媒できる任意の種を含み得る。そのような種は、限定されないが、古細菌および真正細菌を含む細菌を含む、原核生物および真核生物の両方、ならびに酵母、植物、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳動物を含む、真核生物を含む。このような起源についての例示的な種は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クロオコッカス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、シロイロナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ラクトバキュラス・コリノイド（Ｌａｃｔｏｂａｃｕｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロストリジウム・パステウラナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒａｎｕｍ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、アパカンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ニューモシスティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シンゴモナス（Ｓｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、例えばコマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）からの種ならびに本明細書に開示されるか、または対応する遺伝子についての起源微生物として利用可能な他の例示的な種を含む。しかしながら、３９５の微生物ゲノムおよび種々の酵母、真菌、植物、および哺乳動物ゲノムを含む、新規の５５０より多くの種（ＮＣＢＩなどの公開データベースに利用可能なそれらの半分より多くを含む）に利用可能な完全なゲノム配列に関して、例えば、既知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子置換を含む、関連または遠い種における１つ以上の遺伝子についての必要なトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成活性をコードする遺伝子の識別、ならびに遺伝子変化の交換は、当該技術分野において慣用的であり、周知である。従って、大腸菌などの特定に微生物に対する参照と共に本明細書に記載されるトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成を可能にする代謝変化は、原核生物および真核生物などを含む、他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、１つの微生物に例示される代謝変化が、他の微生物に等しく提供￥され得ることを知るだろう。
【０１１２】
一部の例において、代替のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路が、非関連種に存在する場合のように、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成は、例えば、参照反応を置換するために、同様のまだ識別されていない代謝反応を触媒する非関連種由来のパラログ（複数も含む）の外因性発現により宿主種に与えられ得る。代謝ネットワーク間の特定の相違が異なる生物の間に存在するため、当業者は、異なる微生物間の実際の遺伝子の使用が異なり得ることを理解するだろう。しかしながら、本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者はまた、本発明の教示および方法が、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを合成する対象の種において微生物を構築するために本明細書に例示されるものに対する同族の代謝変化を用いて全ての微生物に適用され得ることを理解するだろう。
【０１１３】
非天然に生じるトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する宿主の発現レベルを構築し、試験するための方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換えおよび検出方法により実施され得る。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）に記載され、見出され得る。
【０１１４】
トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するための経路に関連する外因性核酸配列は、限定されないが、共役、エレクトロポレーション、化学変換、形質導入、トランスフェクション、および超音波形質転換を含む、当該技術分野において周知の技術を用いて宿主細胞内に安定または一時的に導入され得る。大腸菌または他の原核細胞における外因性発現に関して、真核生物の核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおける一部の核酸配列は、所望の場合、原核生物宿主細胞への形質転換前に除去され得る、Ｎ末端ミトコンドリアなどの標的シグナルまたは他の標的シグナルをコードできる。例えば、ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ａ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｅｄ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８  （２００５））。酵母または他の真核細胞における外因性発現に関して、遺伝子は、リーダー配列を添加せずにサイトゾルにおいて発現され得るか、またはミトコンドリアもしくは他の細胞小器官に対して標的化され得るか、または宿主細胞に好適なミトコンドリア標的もしくは分泌シグナルなどの適切な標的配列を付加することによって分泌のために標的化され得る。このように、標的配列を除去または含むための核酸配列に対する適切な修飾は、所望の特性を与えるために外因性核酸配列内に導入され得ることは理解される。さらに、遺伝子は、タンパク質の最適化した発現を達成するために当該技術分野において周知の技術を用いてコドン最適化に供され得る。
【０１１５】
発現ベクター（複数も含む）は、宿主生物における制御配列機能を発現するように作動可能に連結される本明細書に例示される核酸をコードする１つ以上のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路を含むように構築され得る。本発明の微生物宿主生物の使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームならびに宿主染色体への安定な融合に作動可能なベクターおよび選択配列またはマーカーを含む人工染色体が含まれる。加えて、発現ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含み得る。選択可能なマーカー遺伝子はまた、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性の提供、補足的栄養要求性欠損、あるいは培地中に存在しない重要な栄養素の供給を含み得る。発現制御配列は、当該技術分野において周知の構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得る。２つ以上の外因性コード核酸が共発現される場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターまたは別個の発現ベクターに挿入されてもよい。単一の発現ベクターに関して、コード核酸は、１つの共通発現制御配列に作動可能に連結され得るか、または１つの誘導的プロモーターおよび１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結され得る。代謝または合成経路に関連する外因性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を用いて確認され得る。このような方法には、例えば、ノーザンブロットもしくはｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または遺伝子産物を発現するための免疫ブロット法、または誘導的核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の好適な分析法などの核酸分析が含まれる。外因性核酸が、所望の生産物を生産するのに十分な量で発現されることは当業者により理解され、さらに、発現レベルは、当該技術分野において周知および本明細書に開示される方法を用いて十分な発現を得るように最適化され得ることは理解される。
【０１１６】
一部の実施形態において、本発明は、トルエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、トルエンを生産する方法を提供する。トルエン経路は、トルエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。トルエン経路は、図１に示した代替の経路に示されるように、（Ａ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つまたは両方、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、ならびに３）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ；（Ｂ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、２）フェニルピルベートデカルボキシラーゼの１つ以上、３）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの１つ以上、ならびに４）フェニルアセテートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｃ）１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）の１つ以上、２）フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに３）フェニルアセテートデカルボキシラーゼから選択され得る。一部の実施形態において、この方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。
【０１１７】
一部の実施形態において、トルエンを生産する本発明の方法は、トルエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸、トルエン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸、トルエン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸、トルエン経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸などを含む、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。４つの外因性核酸を有する例示的な生物は、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、２）フェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、３）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および４）フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼをコードできる。５つの外因性核酸を有する例示的な生物は、１）フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、２）フェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）、３）フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、４）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼ、ならびに５）フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードできる。一部の実施形態において、トルエンを生産する本発明の方法は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
【０１１８】
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含むベンゼンを生産する方法を提供する。ベンゼン経路は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み得る。ベンゼン経路は、図２に示すように、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼを含み得る。一部の実施形態において、少なくとも１つの外因性核酸はフェニルアラニンベンゼン−リアーゼ自体であり、一方、代替の実施形態において、少なくとも１つの外因性核酸は前駆体の代謝産物フェニルアラニンの生産に影響を及ぼし得る。一部の実施形態において、ベンゼン経路の少なくとも１つの外因性核酸は異種核酸である。一部の実施形態において、ベンゼンを生産する本発明の方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
【０１１９】
一部の実施形態において、本発明は、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含むスチレンを生産する方法を提供する。スチレン経路は、スチレンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、スチレンを生産するのに十分な量で発現されるスチレン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み得る。スチレン経路は、図３における代替経路に示すように、（Ａ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ以上、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼ；ならびに（Ｂ）１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼから選択され得る。一部の実施形態において、スチレンを生産する本発明の方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
【０１２０】
一部の実施形態において、スチレンを生産する本発明の方法は、スチレン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする６つの外因性核酸などを含む、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。５つの外因性核酸を有する例示的な生物は、１）ベンジル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの１つ、３）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、４）アセトフェノンレダクターゼ、ならびに５）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードできる。６つの外因性核酸を有する例示的な生物は、１）ベンゾイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ、３）ベンゾイル−アセテートキナーゼ、４）ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、５）アセトフェノンレダクターゼ、および６）１−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする。一部の実施形態において、スチレンを生産する本発明の方法は、少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
【０１２１】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む１，３−ブタジエンを生産する方法を提供する。１，３−ブタジエン経路は、１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエンの経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。１，３−ブタジエン経路は、図４における代替の経路により示されるように、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択され得る。一部の実施形態において、１，３−ブタジエンを生産する方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含みできる。
【０１２２】
一部の実施形態において、本発明の方法は、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。２つの外因性核酸を有する例示的な微生物は、（Ａ）１）ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｃｉｓ−デカルボキシラーゼおよび２）ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）１）ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートｔｒａｎｓ−デカルボキシラーゼ２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｄ）１）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートデカルボキシラーゼおよび２）ｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素のセットをコードする遺伝子を含み得る。一部の実施形態において、本発明の方法は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
【０１２３】
本発明はさらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含む非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産する方法を提供する。このような微生物は、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を有し得、その（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼを含む（実施例ＩＩＩおよび図５、工程Ｃを参照のこと）。（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、必要に応じて、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼおよび／または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをさらに含み得る（実施例ＩＩＩならびに図５、工程ＡおよびＢを参照のこと）。
【０１２４】
別の実施形態において、本発明は、ｐ−トルエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、ｐ−トルエート経路を含む非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、ｐ−トルエートを生産する方法を提供する。ｐ−トルエート経路は、ｐ−トルエートを生産するのに十分な量で発現されるｐ−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み得、ｐ−トルエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ：３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；および／またはコリスメートリアーゼを含む（実施例ＩＶおよび図６、工程Ａ〜Ｈを参照のこと）。別の実施形態において、本発明の方法は、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路をさらに含む非天然に生じる微生物を利用できる（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。このような（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートデヒドラターゼ、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼおよび／または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。
【０１２５】
本発明はさらに、テレフタレートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、テレフタレート経路を含む非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、テレフタレートを生産する方法を提供する。このようなテレフタレート経路は、テレフタレートを生産するのに十分な量で発現されるテレフタレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み得、そのテレフタレート経路は、ｐ−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ；４−カルボキシルベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ；および／または４−カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。このような微生物はさらにｐ−トルエート経路を含み得、そのｐ−トルエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ；コリスメートシンターゼ；および／またはコリスメートリアーゼを含む（実施例ＩＶおよびＶならびに図６および７を参照のこと）。別の実施形態において、非天然に生じる微生物はさらに、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含み得る（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。一部の実施形態において、本発明は、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、トルエンを生産する方法を提供する。トルエン経路は、ａ）ｐ−トルエートデカルボキシラーゼ；ｂ）ｐ−トルエートレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｃ）ｐ−トルエートキナーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｄ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ、（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｅ）（ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびｐ−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択され得る。非天然に生じる微生物は、トルエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、培養され得る。特定の実施形態において、本発明は、非天然に生じる微生物および使用方法を提供し、その微生物は、ｐ−トルエート、テレフタレートまたはトルエン、および（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を含む。
【０１２６】
一部の実施形態において、本発明は、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネートを生産する方法を提供する。（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路は、エリトロース−４−ホスフェートデヒドラターゼおよび（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホネートレダクターゼを含み得る。
【０１２７】
一部の実施形態において、本発明は、ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゾエート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、ベンゾエートを生産する方法を提供する。ベンゾエート経路は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ；３−デヒドロキネートシンターゼ；３−デヒドロキネートデヒドラターゼ；シキメートデヒドロゲナーゼ；シキメートキナーゼ；３−ホスホシキメート−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼシンターゼ；およびコリスメートリアーゼを含む。その方法は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。
【０１２８】
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含むベンゼンを生産する方法を提供する。ベンゼン経路は、ａ）ベンゾエートデカルボキシラーゼ；ｂ）ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｃ）ベンゾエートキナーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ｄ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ホスホトランスベンゾイラーゼ、（ベンゾイルオキシ）ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ；ならびにｅ）（ベンゾイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ）、ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される。非天然に生じる微生物は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、培養され得る。特定の実施形態において、本発明は、非天然に生じる微生物および使用方法を提供し、その微生物は（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、およびベンゼン経路を有する。
【０１２９】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。その経路は、２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。２，４−ペンタジエノエート経路は、Ａ）ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ；Ｂ）ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；Ｃ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；Ｄ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ；ならびにＥ）ｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される。
【０１３０】
一部の実施形態において、本発明の方法は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１２の工程Ａ、Ｅ、Ｆ、およびＧに示されるように、（Ａ）１）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、２）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートレダクターゼ、３）２，４−ジヒドロキシペンタノエート２−デヒドラターゼ、および４）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼならびに図１２の工程Ａ、Ｅ、Ｈ、およびＤに示されるように、（Ｂ）１）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、２）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートレダクターゼ、３）２，４−ジヒドロキシペンタノエート４−デヒドラターゼおよび４）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
【０１３１】
一部の実施形態において、本発明の方法は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１３の工程Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｇ、およびＤに示すように、（Ａ）１）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、２）２，４−ジオキソペンタノエート２−レダクターゼ、３）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートレダクターゼ、４）２，４−ジヒドロキシペンタノエート２−デヒドラターゼ、ならびに５）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、ならびに（Ｂ）図１２の工程ＦおよびＧまたはＨおよびＤと共に、図１３の工程Ｅ、Ｈ、およびＩに示されるように、１）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、２）２，４−ジオキソペンタノエート２−レダクターゼ、４）２，４−ジヒドロオキシペンタノエート−２−デヒドラターゼと共に、３）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートレダクターゼならびに５）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼまたは４）２，４−ジヒドロキシペンタノエート−４−デヒドラターゼならびに５）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。すなわち、２，４−ジヒドロキシペンタノエートの二重脱水は、任意の順序で実施され得る。
【０１３２】
一部の実施形態において、本発明の方法は、ＡＫＰを生産するのに十分な量で発現されるＡＫＰ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むＡＫＰ経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。ＡＫＰ経路は、図１３の工程ＭおよびＮに示されるように、オルニチン４，５−アミノムターゼおよび２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼおよび／または４−デヒドロゲナーゼを含む。一部の実施形態において、ＡＫＰ経路を有する微生物は、オルニチン４，５−アミノムターゼおよび２，４−ジアミノペンタノエート４−アミノトランスフェラーゼまたは２，４−ジアミノペンタノエート４−デヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性酵素を含む。一部の実施形態において、このＡＫＰ経路は、図１３に示されるように、上述の２，４−ペンタジエノエート経路のいずれかに加えられ得る。代替として、ＡＫＰは、図１３の工程Ａに示されるように、ＡＫＰチオラーゼを添加することによりアラニンから入手され得、本明細書に記載され、図１２と共に図１３に示される種々の２，４−ペンタジエノエート経路に供給され得る。
【０１３３】
一部の実施形態は、本発明の方法は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。２，４−ペンタジエノエート経路は、図１４の工程Ａ〜Ｃに示されるように、（Ａ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、および３）５−アミノペント−２−エノエートデアミナーゼ、図１４の工程Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｆ、およびＧに示されるように、（Ｂ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、３）５−アミノペント−２−エノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、４）５−オキソペント−２−エノエートレダクターゼ、ならびに５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、図１４の工程Ａ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧに示されるように、（Ｃ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、３）３−アミノ−オキソペンタノエートデアミナーゼ、４）５−オキソペント−２−エノエートレダクターゼ、ならびに５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼならびに図１４の工程Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、およびＧに示されるように、（Ｄ）１）オルニチン２，３−アミノムターゼ、２）３，５−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、３）３−アミノ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに４）３−アミノ−５−ヒドロキシペンタノエートデアミナーゼ、および５）５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
【０１３４】
一部の実施形態において、本発明の方法は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。２，４−ペンタジエノエート経路は、３−ＨＰ−ＣｏＡまたはアクリロイル−ＣｏＡから開始して図１５に示される多くの経路のいずれかから選択される酵素のセットを有する。
【０１３５】
３−ＨＰからの例示的な経路は、以下の酵素のセット、図１５の工程Ａ〜Ｅに示されるように、（Ａ）１）３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、３）３，５−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、４）５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ならびに５）ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ならびに図１５の工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、およびＱに示されるように、（Ｂ）１）３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、３）３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、４）３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、および５  ５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ含む。当業者は、３−ＨＰ−ＣｏＡから経路（Ａ）および（Ｂ）を定義する酵素のセットは、図１５の工程Ｇにより示されるように、可逆的酵素３，５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、ならびに図１５の工程Ｈにより示されるように、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、３−ＨＰ−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの経路は、図１５に各々示される、工程Ａ、Ｂ、Ｇ、ＪおよびＱ、または工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、およびＱ、または工程Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥ、または工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｈ、およびＱまたは工程Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｈ、ＤおよびＥにおける酵素を含み得る。
【０１３６】
アクリロイル−ＣｏＡからの例示的な経路は、以下の酵素のセット、図１５の工程Ｍ、Ｏ、Ｐ、およびＳに示されるように、（Ｃ）１）アクリロイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼ、３）３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ、４）３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ、ならびに工程Ｍ、Ｎ、Ｅ、およびＥに示されるように、（Ｄ）１）アクリロイル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、２）３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、３）３−ヒドロキシペント−４−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、ならびに４）ペント−２，４−ジエノイル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび／またはヒドロラーゼを含む。当業者は、３−ＨＰ−ＣｏＡからの経路（Ａ）および（Ｂ）ならびにアクリロイル−ＣｏＡからの（Ｃ）および（Ｄ）を定義する酵素のセットは、図１５の工程Ｋに示されるように、可逆的酵素３−ヒドロキシプロパノイル−ＣｏＡデヒドラターゼならびに図１５の工程Ｌに示されるように、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、工程Ｋは、工程Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、およびＥまたは工程Ｋ、Ｍ、Ｏ、ＰおよびＳなどの２，４−ペンタジエノエート経路を提供するアクリロイル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートまでの列挙した経路のいずれかに加えられ得る。工程Ｋはまた、工程Ｋ、Ｍ、およびＬにより３−ＨＰ−ＣｏＡから３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡを提供するために工程Ａに対する往復の代替物を使用され得る。このように、工程Ａの酵素を利用する上述の経路のいずれかは、その所定の位置において工程Ｋ、Ｍ、およびＬの酵素を利用できる。同じ３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ中間体は、図１５の工程ＫおよびＡまたはＭおよびＬの酵素を介する経路によりアクリロイル−ＣｏＡから入手され得る。このように、アクリロイル−ＣｏＡは、３−ＨＰ−ＣｏＡから入手可能な全ての列挙された経路を入手するために使用され得る。このように、例えば、アクリロイル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの経路は、図１５に全て示されるように、工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、ＪおよびＱ、または工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、およびＱ、または工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｋ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、およびＱ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｈ、Ｑ、または工程Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｈ、ＤおよびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、ＪおよびＱ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、およびＱ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｇ、Ｊ、Ｈ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、およびＱ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｈ、Ｑ、または工程Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｈ、ＤおよびＥからの酵素を含み得る。同様に、３−ＨＰ−ＣｏＡは、工程Ｌの酵素を用いて中間体３−オキソペント−４−エノイル−ＣｏＡにより列挙されたアクリロイル−ＣｏＡ経路に供給され得る。このように、３−ＨＰ−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの経路は、工程Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＥまたは工程Ａ、Ｌ、Ｏ、Ｐ、およびＳからの酵素を含み得、各々の経路は図１５に示される。
【０１３７】
一部の実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含み得る。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含み得る。例えば、本発明の非天然に生じる微生物は、ｉ）ＡＫＰデアミナーゼ、ｉｉ）アセチルアクリレートレダクターゼ、およびｉｉｉ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼをコードする３つの外因性核酸を含み得るので、ＡＫＰにより２，４−ペンタジエノエートへのアラニンまたはオルニチンの入手可能な経路を提供する。当業者は、これは単に例示であり、３つの外因性核酸は、図１２〜１５の列挙した経路のいずれかにおける任意の２，４−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる微生物に基づき得ることを認識するだろう。
【０１３８】
一部の実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする４つの外因性核酸を含み得る。例えば、非天然に生じる微生物は、ｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ、ｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｉｉ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびｉｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする４つの外因性核酸を含み得るので、図１２に示されるように、ピルベートから２，４−ペンタジエノエートまでの完全な経路を定義する。当業者は、これは単に例示であり、４つの外因性核酸は、図１２〜１５の列挙された経路のいずれかにおける任意の２，４−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる微生物に基づき得ることを認識するだろう。
【０１３９】
なおさらなる実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする５つの外因性核酸を含み得る。５つの外因性核酸を有する本発明の例示的な非天然に生じる微生物は、図１３における工程Ｅ、Ｈ、Ｆ、ＣおよびＤに示されるように、（Ａ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−２−レダクターゼ、ｉｉｉ）２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、ｉｖ）アセチルアクリレートレダクターゼ、ならびにｖ）４−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ、あるいは図１２の工程Ｂ、Ｃ、およびＤと共に図１３の工程ＥおよびＫに示されるように、（Ｂ）ｉ）ＡＫＰアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉ）２，４−ジオキソペンタノエート−４−レダクターゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに図１２の工程Ｂ、Ｃ、およびＤと共に、図１３の工程ＪおよびＬに示されるように、ｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、あるいはｉ）ＡＫＰレダクターゼ、ｉｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼ、ｉｉｉ）４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートデヒドラターゼ、ｉｖ）２−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびｖ）２−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする酵素を含み得る。当業者は、これは単に例示であり、５つの外因性核酸は、図１２〜１５の列挙された経路の任意におけるいずれかの２，４−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる微生物に基づき得ることを認識するだろう。
【０１４０】
このように、一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート経路における２、３、４、５、６、全てまでの酵素は外因性核酸の挿入を提供され得る。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有する。さらに、一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物を利用する方法は、実質的に嫌気性の培地を利用できる。
【０１４１】
一部の実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物はさらに、２，４−ペンタジエノエートの１，３−ブタジエンへの変換により１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼを含み得る。このように、図１２のいずれかの２，４−ペンタジエノエートは、図４におけるｃｉｓまたはｔｒａｎｓ２，４−ペンタジエノエートの１，３−ブタジエンへの変換により示されるように、１，３−ブタジエンのさらなる生産物の主成分を形成できる。
【０１４２】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載される上述の経路に係る非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。一部の実施形態において、微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７、または８つの外因性核酸を含む。一部のこのような実施形態において、少なくとも１つの外因性核酸は異種核酸である。一部のこのような実施形態において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
【０１４３】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載される上述の経路に係る非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法を提供する。一部のこのような実施形態において、微生物は、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６、７または８つの外因性核酸を含む。一部のこのような実施形態において、少なくとも１つの外因性核酸は異種核酸である。一部のこのような実施形態において、非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
【０１４４】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１オールを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、本明細書に記載される上述の経路に係る非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、３−ブテン−１−オールを生産する方法を提供する。一部の実施形態において、微生物は、３−ブテン−１−オール経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの外因性核酸は異種核酸である。一部のこのような実施形態において、非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。一部のこのような実施形態において、本発明の方法はさらに、１，３−ブタジエンを提供するために３−ブテン−１−オールの化学的脱水を含む。
【０１４５】
３−ブテン−１−オールは、発酵溶液から単離された純粋な３−ブテン−１−オールで開始して、または発酵溶液のワークアップにおいて単離された３−ブテン−１−オールの水溶液もしくは有機溶液で開始して、１，３−ブタジエンの形成と共に化学的に脱水され得る。このような３−ブテン−１−オール溶液はまた、例えば、必要に応じて、適切な添加溶剤の存在下で蒸留によって脱水工程前に濃縮され得る。
【０１４６】
脱水反応は、液相または気相で実施され得る。脱水反応は、触媒の存在下で実施され得、利用される触媒の性質は、気相または液相反応が実施されるかどうかに依存する。
【０１４７】
適切な脱水触媒は、酸性触媒およびアルカリ性触媒の両方を含む。酸性触媒は特に、オリゴマーを形成する低い傾向を示し得る。脱水触媒は、同種触媒、異種触媒、またはそれらの組み合わせとして利用され得る。異種触媒は、適切な支持材と併せて使用され得る。そのような支持材自体は、酸性であっても、アルカリ性であってもよく、酸性またはアルカリ性の脱水触媒を提供するか、あるいは触媒は不活性支持材に適用され得る。
【０１４８】
脱水触媒として機能する適切な支持材は、モルデナイト、モンモリナイト、酸性ゼオライトなどの天然または合成ケイ酸塩を含み；支持材は、一塩基、二塩基または多塩基無機酸、例えばリン酸で、あるいは酸化物またはケイ酸塩などの無機酸の酸性塩、例えばＡｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２でコーティングされ；酸化物およびγ−Ａｌ２Ｏ３およびＺｎＯ−Ａｌ２Ｏ３などの混合酸化物は、ヘテロポリ酸の酸化物と混合される。アルカリ性物質は、脱水触媒および支持材の両方として作用し、支持材は、それらの酸化物として、アルカリ、アルカリ土類、ランタン、ラントイド（ｌａｎｔｈｏｉｄ）またはそれらの組み合わせを含む。脱水を作用し得る材料のさらなる分類は、アルカリ性または酸性形態のいずれかで使用され得るイオン交換体である。
【０１４９】
適切な同種脱水触媒は、リン酸を含有する酸、例えばリン酸などの無機酸を含む。無機酸は、浸漬または含浸により支持材上に固定され得る。
【０１５０】
一部の実施形態において、脱水反応は、当該技術分野において公知の従来の装置、例えば管型反応装置、シェルアンドチューブ熱交換器および熱交換器としてサーモプレートを備える反応器を用いて気相で実施される。一部の実施形態において、気相脱水は、単離された３−ブテン−１−オールまたはブテン−１−オールの溶液を利用でき、ブテン−１−オールは固定床触媒と共に反応器に導入される。液相における加熱脱水は、２００℃〜３５０℃、一部の実施形態において２５０〜３００℃の温度範囲で実施され得る。
【０１５１】
トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生産を試験するための適切な精製および／またはアッセイは周知の方法を用いて実施され得る。三連培養などの適切な反復が、試験される各々の遺伝子操作された株について行われ得る。例えば、遺伝子操作された生産宿主における生産物および副産物形成がモニターされ得る。最終生産物および中間体、ならびに他の有機化合物は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法または当該技術分野において周知の慣用的な手順を用いる他の適切な分析的方法により分析され得る。発酵ブロス中の生産物の放出もまた、培養物の上清を用いて試験されてもよい。副産物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコールのための屈折率検出器、ならびに有機酸のためのＵＶ検出器を用いてＨＰＬＣ（Ｌｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：７７５−７７９（２００５））、または当該技術分野において周知の他の適切なアッセイおよび検出方法により定量され得る。外因性ＤＮＡ配列由来の個々の酵素またはタンパク質活性もまた、当該技術分野において周知の方法を用いてアッセイされ得る。例えば、フェニルピルベートデカルボキシラーゼの活性が、Ｗｅｉｓｓら（Ｗｅｉｓｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２７：２１９７−２２０５（１９８８））に記載されているように、補助酵素としてアルコールデヒドロゲナーゼを用いる結合光度アッセイ（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）を用いて測定され得る。アセトフェノンレダクターゼなどのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、Ｓｃｈｌｉｅｂｅｎら（Ｓｃｈｌｉｅｂｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４９：８０１−８１３（２００５））に記載されているように、３４０ｎｍにて分光光学的に供され得る。典型的な炭化水素アッセイ法に関しては、炭化水素分析のマニュアルを参照のこと（ＡＳＴＭ  Ｍａｎｕｌａ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ａ．Ｗ．  Ｄｒｅｗｓ，ｅｄ．，第６版，１９９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ。ｐ−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼ活性は、タンパク質の沈殿により反応を停止して、水浴中で、精製した酵素をＮＡＤＨ、ＦｅＳＯ４およびｐ−トルエート基質とインキュベートすることによってアッセイされ得、ＨＰＬＣにより上清中の生産物を分析される（Ｌｏｃｈｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：３７４１−３７４８（１９９１））。
【０１５２】
トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンは、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて培地中で他の成分から分離され得る。このような分離法には、例えば、抽出処理および連続液液抽出を含む方法、パーベーパレーション、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出物濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、および限外濾過が含まれる。上記の方法の全ては当該技術分野において周知である。
【０１５３】
本明細書に記載される非天然に生じる微生物のいずれかは、本発明の生合成生産物を生産および／または分泌するために培養され得る。例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生産物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成生産のために培養され得る。
【０１５４】
トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生産に関して、組換え株は、炭素源および他の必須栄養素を含む培地中で培養される。全プロセスのコストを減少させるために発酵槽において嫌気性条件を維持することが、時々望まれ、非常に望まれる場合もある。そのような条件は、例えば、最初に培地に窒素を散布し、次に隔膜およびクリンプキャップでフラスコを密閉することにより得られ得る。増殖が嫌気性で観察されない菌について、嫌気的または実質的に嫌気的条件が、限られた通気のために隔膜に小さな穴を開けることにより適用されてもよい。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、当該技術分野において周知である。例示的な好気的および嫌気的条件は、例えば、２００７年８月１０日に出願された米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。発酵は、本明細書に開示されるように、バッチ、供給バッチまたは連続方式で実施され得る。
【０１５５】
所望の場合、所望のｐＨに培地を維持することが必要な場合、培地のｐＨは、所望のｐＨ、特に中性ｐＨ、例えばＮａＯＨまたは他の塩基などの塩基あるいは酸を添加することによりｐＨ７付近に維持され得る。増殖速度は、      分光光度計（６００ｎｍ）を用いて光学濃度、および時間にわたって炭素源枯渇をモニターすることによるグルコース摂取速度を測定することにより決定され得る。
【０１５６】
増殖速度は、例えば、炭素源を非天然に生じる微生物に供給できる任意の炭水化物源を含み得る。そのような源には、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプンなどの糖が含まれる。他の炭水化物源には、例えば、再生可能な原料およびバイオマスが含まれる。本発明の方法における原料として使用され得る例示的な種類のバイオマスには、セルロース性バイオマス、ヘミセルロース性バイオマスおよびリグニン原料または原料の一部が含まれる。そのようなバイオマス原料は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンなどの炭素源として有用な炭水化物物質を含む。本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、上記に例示したもの以外の再生可能な原料およびバイオマスもまた、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するための本発明の微生物を培養するために使用できることを理解するだろう。
【０１５７】
上記に例示したものなどの再生可能な原料に加えて、本発明のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン微生物はまた、その炭素源として合成ガスにおける増殖のために修飾されてもよい。この特定の実施形態において、１つ以上のタンパク質または酵素は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する微生物において発現されて、合成ガスまたは他のガス炭素源を利用するための代謝経路を提供する。
【０１５８】
合成ガスまたは生産ガスとしても知られている合成ガスは、石炭ならびに農作物および残留物を含む、バイオマス材料などの炭素材料のガス化の主な生産物である。合成ガスは、主にＨ２およびＣＯの混合物であり、限定されないが、石炭、石油、天然ガス、バイオマス、および有機性廃棄物を含む、いずれかの有機原料のガス化から得られ得る。ガス化は一般的に、高燃料対酸素比の下で実施される。大部分はＨ２およびＣＯであるが、合成ガスはまた、少量でＣＯ２および他のガスを含んでもよい。このように、合成ガスは、費用効率が高い気体炭素、例えばＣＯおよびさらにＣＯ２の源を提供する。
【０１５９】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯおよびＨ２のアセチル−ＣｏＡおよびアセトンなどの他の生産物への変換を触媒する。ＣＯおよび合成ガスを利用できる生物はまた一般に、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に含まれる酵素および形質転換の同じ基本セットを介してＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力を有する。微生物によるＣＯ２のアセトンへのＨ２依存性変換は、以前から認識されており、ＣＯはまた、同じ微生物により使用され得ることおよび同じ経路が関連することを表していた。多くのアセトゲンは、ＣＯ２の存在下で増加し、必要な還元等価物を供給するために水素が存在する限り、アセトンなどの化合物を生成することが示されている（例えば、Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｐ．３−６０ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９４）を参照のこと）。これは以下の式にまとめられる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
それ故、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を保有する非天然に生じる微生物は、アセチル−ＣｏＡおよび他の所望の生産物の生産と同様にＣＯ２およびＨ２混合物を利用できる。
【０１６０】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、当該技術分野において周知であり、２つの分岐：（１）メチル分岐および（２）カルボニル分岐に分離され得る１２の反応からなる。メチル分岐は、合成ガスをメチル−テトラヒドロホレート（メチル−ＴＨＦ）に変換するのに対して、カルボニル分岐はメチル−ＴＨＦをアセチル−ＣｏＡに変換する。メチル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホルメートデヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロフレートシンテターゼ、メテニルテトラヒドロホレートシクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロホレートデヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロホレートレダクターゼにより触媒される。カルボニル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質：メチルテトラヒドロホレート：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質集合タンパク質（例えば、ＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質集合タンパク質（例えば、ＣｏｏＣ）により順に触媒される。トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を生成するための十分な数のコード核酸を導入するために本明細書に提供される教示および指針に従って、当業者は、同じ遺伝子操作設計もまた、宿主生物に存在しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素またはタンパク質をコードする少なくとも核酸を導入することに対して実施され得ることを理解するだろう。従って、修飾された生物が完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むような１つ以上のコード核酸の本発明の微生物への導入は合成ガス利用能を与える。
【０１６１】
さらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび／またはヒドロゲナーゼ活性と関連した還元的（可逆的）トリカルボン酸サイクルもまた、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２をアセチル−ＣｏＡおよび酢酸塩などの他の生産物に変換するために使用され得る。還元的ＴＣＡ経路により炭素を固定できる生物は、１つ以上の以下の酵素：ＡＴＰクエン酸塩−リアーゼ、クエン酸塩リアーゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマレートレダクターゼ、フマラーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびヒドロゲナーゼを利用できる。具体的には、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼによりＣＯおよび／またはＨ２から抽出される還元当量は、アセチル−ＣｏＡまたは酢酸塩への還元的ＴＣＡサイクルによりＣＯ２を固定するために利用される。酢酸塩は、アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセテートキナーゼ／ホスホトランスアセチラーゼ、およびアセチル−ＣｏＡシンテターゼなどの酵素によりアセチル−ＣｏＡに変換され得る。アセチル−ＣｏＡは、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン前駆体、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ホスホエノールピルベート、およびピルベート、ピルベートにより：フェレドキシンオキシドレタクターゼおよびグルコネオゲネシスの酵素に変換され得る。トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路を生成するための十分な数のコード核酸を導入するための本明細書に提供される教示および指針に従って、当業者は、同じ遺伝子操作設計もまた、宿主生物に存在しない還元的ＴＣＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも核酸を導入することに対して実施され得ることを理解するだろう。従って、修飾された微生物が完全な還元的ＴＣＡ経路を含むような１つ以上のコード核酸の本発明の微生物への導入は、合成ガス利用能を与える。
【０１６２】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記１，３−ブタジエン経路は、（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｅ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｆ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｇ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；および（Ｈ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される。
【０１６３】
一部の態様において、非天然に生じる微生物は、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む。例えば、微生物は、以下：（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｅ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｆ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ；（Ｇ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデカルボキシラーゼ；および（Ｈ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素のセットの各々をコードする外因性核酸を含み得る。
【０１６４】
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、以下：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルターゼ：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸、から選択される。本発明の一部の態様において、（ｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。本発明の一部の態様において、（ｉｉ）を含む微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
【０１６５】
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記（ｉ）を含む微生物は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；前記（ｉｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または（ｉｉｉ）を含む微生物はＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
【０１６６】
一部の態様において、本発明は、前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を提供する。別の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。一部の実施形態において、本発明は、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法を提供する。
【０１６７】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、以下：（Ａ）スクシニルーＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピルーＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼから選択される。
【０１６８】
一部の態様において、微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５、または６つの外因性核酸を含む。例えば、微生物は、以下：（Ａ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピルＣｏＡ−トランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ；３−オキソペント−４−エノエートレダクターゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ；２−フマリルアセテートレダクターゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；（Ｃ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−オキソアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−オキソアジペートレダクターゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼ；および（Ｄ）スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ；３−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシヘキサ−４−エネジオエートデカルボキシラーゼ；および３−ヒドロキシペント−４−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含み得る。
【０１６９】
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレタクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホネートピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、（ｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、（ｉｉ）を含む微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
【０１７０】
一部の態様において、（ｉ）を含む非天然に生じる微生物は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；前記（ｉｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または前記（ｉｉｉ）を含む微生物は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
【０１７１】
一部の態様において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記少なくとも１つの外因性核酸は異種核酸である。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地である。
【０１７２】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。
【０１７３】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，３−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記１，３−ブタジエン経路は、以下：（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｋ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｌ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｍ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｎ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；ならびに（Ｏ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼから選択される。
【０１７４】
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物は、１，３−ブタジエン経路の酵素を各々コードする２、３、４、４、６または７つの外因性核酸を含む。例えば、一部の態様において、微生物は、以下：（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｋ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｌ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；（Ｍ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；および２，４−ペンタジエンデカルボキシラーゼ；（Ｎ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ；ならびに（Ｏ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；および３−ブテン−１−オールデヒドラターゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む。
【０１７５】
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、（ｉ）を含む非天然に生じる微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、（ｉｉ）を含む微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、（ｉ）を含む微生物は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；前記（ｉｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシレート、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または前記（ｉｉｉ）を含む微生物は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
【０１７６】
一部の態様において、前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に開示されるような非天然に生じる微生物を含む。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
【０１７７】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法を提供する。
【０１７８】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記２，４−ペンタジエノエート経路は、以下：（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；ならびに（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼから選択される。
【０１７９】
一部の態様において、上記のような非天然に生じる微生物は、２，４−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする２、３、４、５または６つの外因性核酸を含む。例えば、微生物は、以下：（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼ；ならびに（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む。
【０１８０】
一部の実施形態において、本発明は、上記に開示されるような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、（ｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、（ｉｉ）を含む非天然に生じる微生物は、アコニターゼ、イソシトレート、デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
【０１８１】
一部の態様において、上記のような（ｉ）を含む微生物は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み；前記（ｉｉ）を含む微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または前記（ｉｉｉ）を含む微生物は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
【０１８２】
一部の態様において、前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に開示されるような非天然に生じる微生物を含む。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
【０１８３】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、上記のような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、２，４−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。
【０１８４】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１−オールを生産するのに十分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ブテン−１−オール経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記３−ブテン−１−オール経路は、以下：（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼから選択される。
【０１８５】
一部の態様において、上記のような非天然に生じる微生物は、３−ブテン−１−オール経路の酵素を各々コードする２、３、４または５つの外因性核酸を含む。例えば、一部の態様において、微生物は、以下：（Ａ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｂ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（アルデヒド還元）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｃ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｄ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール形成）；５−ヒドロキシ−３−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｅ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｆ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３，５−ジオキソペンタノエートレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｇ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；（Ｈ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエートレダクターゼ；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ；（Ｉ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；３，５−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ；および５−ヒドロキシペント−２−エノエートデカルボキシラーゼ；ならびに（Ｊ）マロニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；および３，５−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む。
【０１８６】
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、（ｉ）を含む非天然に生じる微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の実施形態において、（ｉｉ）を含む非天然に生じる微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、（ｉ）を含む非天然に生じる微生物は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレタクターゼをコードする４つの外因性核酸を含み、（ｉｉ）を含む前記微生物は、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２デヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含み；または（ｉｉｉ）を含む前記微生物は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
【０１８７】
一部の態様において、前記少なくとも１つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に開示されるような非天然に生じる微生物を含む。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
【０１８８】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、上記のような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、３−ブテン−１−オールを生産する方法を提供する。
【０１８９】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、上記のような３−ブテン−１−オールを生産できる非天然に生じる微生物を培養し、前記３−ブテン−１−オールを１，３−ブタジエンに化学的に変換する、工程を含む、１，３−ブタジエンを生産する方法を提供する。３−ブテン−１−オールを１，３−ブタジエンに化学的に変換する方法は当該技術分野において周知であることは理解される。
【０１９０】
本発明はまた、途中で主要な代謝中間体を介して、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエンまで炭素フラックスを改良するように遺伝子操作された生合成経路に部分的に関する。本発明は、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエンまでの種々の酵素変換反応を途中で触媒できる酵素をコードする１つ以上の外因性遺伝子を有する非天然に生じる微生物を提供する。一部の実施形態において、これらの酵素変換反応は、還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）サイクルの一部であり、限定されないが、炭水化物ベースの炭素原料から生産物収率を改良するために使用される。
【０１９１】
多くの遺伝子操作された経路において、炭水化物原料に基づいた最大生産物収率の実現は、不十分な還元当量によって、あるいは還元当量および／または副産物に対する炭素の損失によって妨げられる。一部の実施形態によれば、本発明は、（ｉ）還元的ＴＣＡサイクルにより炭素固定を高めること、ならびに／あるいは（ｉｉ）気体炭素源および／またはＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２などの合成成分からさらなる還元当量を利用することによって、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエンの収率を増加させる。合成ガスに加えて、このようなガスの他の源には、限定されないが、天然に見出されるか、または生成される、空気が含まれる。
【０１９２】
ＣＯ２固定還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）サイクルは、還元当量およびＡＴＰを使用するＣＯ２同化のエネルギー吸収性の同化経路である（図２２）。ＲＴＣＡサイクルの１ターンは、２モルのＣＯ２を１モルのアセチル−ＣｏＡに同化するか、または４モルのＣＯ２を１モルのオキサロアセテートに同化する。アセチル−ＣｏＡのこのさらなる利用は、炭水化物ベースの炭素原料に由来する生産物分子の最大理論収率を改良する。例示的な炭水化物には、限定されないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールが含まれる。
【０１９３】
一部の実施形態において、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび／またはヒドロゲナーゼ酵素に結合した還元的ＴＣＡサイクルが、合成ガス、ＣＯ２、ＣＯ、Ｈ２、および／または他の気体炭素源を微生物が利用できるように使用され得る。合成ガス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ）（合成ガス（ｓｙｎｇａｓ））は特に、主にＨ２およびＣＯの混合物であり、時々、石炭、石油、天然ガス、バイオマス、または有機廃棄物などの任意の有機原料の気化により得られ得る少量のＣＯ２を含む。多くの気化プロセスが開発されており、ほとんどの設計は部分的酸化に基づき、０．５：１〜３：１  Ｈ２／ＣＯ混合物として合成ガスを提供するために、制限された酸素が高温（５００〜１５００℃）での有機材料の完全燃焼を回避する。石炭に加えて、多くの種類のバイオマスが、合成ガス産生のために使用され、再生可能な化学物質および燃料の生物学的生産のための安価かつ柔軟な原料を表す。二酸化炭素は、空気から提供され得るか、または例えば、固体ＣＯ２のタンクシリンダから、もしくは昇華により濃縮されて提供され得る。同様に、ＣＯおよび水素ガスは、試薬形態および／または任意の所望の比で混合されて提供され得る。他の気体炭素形態には、例えば、メタノールまたは同様の揮発性有機溶媒が含まれる。
【０１９４】
合成ガスおよび／または他の炭素源の成分は、十分なＣＯ２、還元当量、および作動するための還元的ＴＣＡサイクルのためのＡＴＰを提供できる。ＲＴＣＡサイクルの１ターンは、２モルのＣＯ２を１モルのアセチル−ＣｏＡに同化し、２ＡＴＰおよび４還元当量を必要とする。ＣＯおよび／またはＨ２は、それぞれ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼ酵素により還元当量を提供できる。還元当量は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ、還元型キノン、還元型フェレドキシン、還元型フラボドキシンおよびチオレドキシンの形態でもたらされ得る。還元当量、特にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、および還元型フェレドキシンは、ＲＴＣＡサイクル酵素、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ、フマレートレダクターゼ、アルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（あるいは２−オキソグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルファ−ケトグルタレートシンターゼ、または２−オキソグルタレートシンターゼとしても知られている）、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびイソシトレートデヒドロゲナーゼについての補因子として機能し得る。これらの還元当量からの電子は、代替として、それらが、酸素、窒素、酸化金属イオン、プロトン、または電極などの受容体に移動する電子伝達鎖を生成するイオン勾配を通過できる。次いで、イオン勾配は、ＡＴＰシンターゼまたは類似酵素によりＡＴＰ生成のために使用され得る。
【０１９５】
還元的ＴＣＡサイクルは、緑色硫黄光合成細菌クロロビウム・リミコーラ（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ）において最初に報告されていた（Ｅｖａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５：９２８−９３４（１９６６）
）。同様の経路が、一部の原核生物（プロテオバクテリア、緑色硫黄細菌および好熱性水素酸化細菌）および硫黄依存性古細菌において特徴付けられている（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３０２０−３０２７（２００５；Ｈｕｇｌｅｒら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：８１−９２（２００７））。一部の場合、還元および酸化（Ｋｒｅｂｓ）ＴＣＡサイクルは同じ生物に存在する（Ｈｕｇｌｅｒら，前出（２００７）；Ｓｉｅｂｅｒｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２１７９−２１９４（２００４））。一部のメタン細菌および偏性嫌気性菌は、生合成中間体を合成する機能をし得る不完全酸化または還元的ＴＣＡサイクルを保有している（Ｅｋｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：９０５−９０８（１９８５）：Ｗｏｏｄら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２８：３３５−３５２（２００４））。
【０１９６】
還元的ＴＣＡサイクルの重要な炭素固定酵素は、アルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびイソシトレートデヒドロゲナーゼである。さらなる炭素は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼカルボキシキナーゼによるホスホエノールピルベートのオキサロアセテートへの変換、またはリンゴ酸酵素によるピルベートのリンゴ酸塩への変換の間、固定され得る。
【０１９７】
ＴＣＡサイクルにおける酵素の多くは、可逆的であり、還元および酸化方向において反応を触媒できる。しかしながら、一部のＴＣＡサイクル反応は、インビボにおいて不可逆的であるので、異なる酵素が、逆ＴＣＡサイクルに必要な方向においてこれらの反応を触媒するために使用される。これらの反応は、（１）クエン酸塩のオキサロアセテートおよびアセチル−ＣｏＡへの変換、（２）フマレートのスクシネートへの変換、および（３）スクシニル−ＣｏＡのアルファ−ケトグルタレートへの変換である。ＴＣＡサイクルにおいて、クエン酸塩は、オキサロアセテートおよびアセチル−ＣｏＡの濃縮から形成される。逆反応、クエン酸塩のオキサロアセテートおよびアセチル−ＣｏＡへの開裂は、ＡＴＰ依存性であり、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、またはシトリル−ＣｏＡシンテターゼおよびシトリル−ＣｏＡリアーゼにより触媒される。あるいは、シトレートリアーゼは、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、またはホスホトランスアセチラーゼおよびアセテートキナーゼに結合されて、クエン酸からアセチル−ＣｏＡおよびオキサロアセテートを形成し得る。スクシネートのフマレートへの変換はスクシネートデヒドロゲナーゼにより触媒されるのに対して、逆反応はフマレートレダクターゼにより触媒される。ＴＣＡサイクルにおいて、スクシニル−ＣｏＡは、アルファ−ケトグルタレートデヒドロロゲナーゼ複合体によるアルファ−ケトグルタレートのＮＡＤ（Ｐ）＋依存性脱カルボキシル化から形成される。逆反応は、アルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼにより触媒される。
【０１９８】
１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスまたは他の気体炭素源でアセチル−ＣｏＡ由来生産物を生産できる逆トリカルボン酸サイクルを利用できる生物は、以下の酵素活性：ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、リアーゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマレートレダクターゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、およびフェレドキシンのいずれかを含み得る（図２３を参照のこと）。これらの活性に必要な酵素および対応する遺伝子は本明細書上記に記載されている。
【０１９９】
合成ガスまたは他の気体炭素源由来の炭素は、逆ＴＣＡサイクルおよびその成分により固定され得る。具体的には、特定の炭素ガス利用経路成分と、アセチル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエンを形成するための経路との組み合わせの結果、外から供給されるか、またはＣＯからアセチル−ＣｏＡへの内生的に生産される二酸化炭素に存在する炭素を固定するための効果的な機構を与えることによりこれらの生産物の高収率が得られる。
【０２００】
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物における２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路は、還元的ＴＣＡサイクルを駆動するための付加を含む、還元に関与する、生合成工程の収率を高めるために、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、またはそれらの混合物のいずれかの組み合わせを利用できる。
【０２０１】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択され；また、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される少なくとも１つの外因性核酸は、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、（４）ＣＯ２およびＨ２、（５）ＣＯおよびＣＯ２、（６）ＣＯおよびＨ２、または（７）ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２を利用できるように十分な量で発現される。
【０２０２】
一部の実施形態において、方法は、還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸も含む、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、アルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。さらに、このような生物はまた、生産物を生産するために（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、（４）ＣＯ２およびＨ２、（５）ＣＯおよびＣＯ２、（６）ＣＯおよびＨ２、または（７）ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２を利用できるように十分な量で発現される、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される少なくとも１つの外因性酵素を含み得る。
【０２０３】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、アセチル−ＣｏＡを介する炭素フラックスを高めるのに十分な量で発現される還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アコニターゼおよびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。
【０２０４】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、一酸化炭素および／または水素の存在下で還元当量の能力を高めるのに十分な量で発現される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、それにより、炭水化物ベースの炭素原料による酸化還元が制限された生産物の収率を増加させる。少なくとも１つの外因性核酸は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される。一部の実施形態において、本発明は、一酸化炭素または水素の存在下で還元当量の能力を高める方法を提供し、それにより、糖または気体炭素源などの炭水化物ベースの炭素原料による酸化還元が制限された生産物の収率を増加させ、この方法は、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、この非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。
【０２０５】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元的ＴＣＡ経路の酵素を各々コードする２つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元的ＴＣＡ経路の酵素を各々コードする３つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、非天然に生じる微生物は、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする３つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、非天然に生じる微生物は、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする３つの外因性核酸を含む。
【０２０６】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸を含む。
【０２０７】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、フェレドキシン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸を含む。
【０２０８】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）ＣＯ２およびＨ２、（４）ＣＯおよびＨ２、または（５）ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２から選択される炭素原料を利用する。一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元当量のために水素を利用する。一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元当量のためにＣＯを利用する。一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元当量のためにＣＯおよび水素の組み合わせを利用する。
【０２０９】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、およびリンゴ酸酵素から選択される酵素をコードする１つ以上の核酸を含む。
【０２１０】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、マレートデヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマレートレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、およびスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼから選択される酵素をコードする１つ以上の核酸を含む。
【０２１１】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、または１，３−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、シトレートリアーゼ、ＡＴＰ−シトレートリアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチレート、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、およびフェレドキシンをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。
【０２１２】
一部の実施形態において、炭素原料およびリン酸塩、アンモニア、硫黄、塩素および他のハロゲンなどの他の細胞摂取源は、１，３−ブタジエンまたはいずれかの１，３−ブタジエン経路の中間体に存在する原子の同位体分布を変更させるように選択され得る。上記に列挙した種々の炭素原料および他の摂取源は、本明細中でまとめて「摂取源」と称する。摂取源は、生産物のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路またはその途中のいずれかの中間体に存在するいずれかの原子についての同位体濃縮を提供できる。種々の炭素原料および上記に列挙した他の摂取源は、本明細書中でまとめて「摂取源」と称する。摂取源は、いずれかの時点で経路から離れて分岐して生成されたトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン不純物のいずれかを含む、生産物のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンまたはトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の中間体に存在するいずれかの原子についての同位体濃縮を提供できる。同位体濃縮は、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、塩素または他のハロゲンを含む、任意の標的原子に対して達成され得る。
【０２１３】
一部の実施形態において、摂取源は、炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、酸素−１６、酸素−１７、および酸素−１８の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、水素、重水素、および三重水素の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、窒素−１４および窒素−１５の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、硫黄−３２、硫黄−３３、硫黄−３４、および硫黄−３５の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、リン−３１、リン−３２、およびリン−３３の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、塩素−３５、塩素−３６、および塩素−３７の割合を変更させるように選択され得る。
【０２１４】
一部の実施形態において、摂取源の標的同位体の割合は、摂取源の合成化学濃縮により得られ得る。そのような同位体が濃縮された摂取源は、商業的に購入され得るか、または実験室で調製され得る。一部の実施形態において、摂取源の標的同位体の割合は、天然の摂取源の源を選択することにより得られ得る。一部のこのような実施形態において、炭素原は、例えば、炭素−１４が比較的少なくなり得る化石燃料、または石油由来の対応物より多量の炭素−１４を有し得る環境の炭素源、例えばＣＯ２由来の炭素源から選択され得る。
【０２１５】
同位体濃縮は、安定同位体比質量分析（ＳＩＲＭＳ）および核磁気共鳴による部位特異的天然同位体分別（ＳＮＩＦ−ＮＭＲ）などの当該技術分野において公知の技術を用いて質量分析により容易に評価される。このような質量分析技術は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分離技術と一体化されてもよい。
【０２１６】
一部の実施形態において、本発明は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンあるいは大気中炭素摂取源を反映する炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４の割合を有するトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン中間体を提供する。一部のこのような実施形態において、摂取源はＣＯ２である。一部の実施形態において、一部の実施形態において、本発明は、石油ベースの炭素摂取源を反映する炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４の割合を有するトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの中間体を提供する。一部の実施形態において、本発明は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンあるいは大気中炭素摂取源と石油ベースの摂取源との組み合わせにより得られる炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４の割合を有するトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの中間体を提供する。摂取源のこのような組み合わせは、炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４の割合を変更させ得る１つの手段である。
【０２１７】
従って、本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、炭水化物などの炭素源で増殖する場合、本発明の生合成した化合物を分泌する非天然に生じる微生物が生産され得ることを理解するだろう。そのような化合物には、例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンおよびトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路における中間代謝物のいずれかが含まれる。必要なもの全ては、例えば、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生合成経路の内容物を含む、所望の化合物または中間体の生合成を達成するために、必要な酵素またはタンパク質活性の１つ以上において操作することである。従って、本発明は、炭水化物または他の炭素源で増殖する場合、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産および／または分泌し、また、炭水化物または他の炭素源で増殖する場合、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路において示される中間代謝物のいずれかを生産および／または分泌する非天然に生じる微生物を提供する。本発明のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する微生物は、中間体、例えば、フェニルアラニン、フェニルピルベート、フェニルアセトアルデヒド、フェニルアセテート、ベンゾイル−ＣｏＡ、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡ、［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］ホスホネート、ベンゾイルアセテート、アセトフェノン、１−フェニルエタノール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネート、ｔｒａｎｓ−２，４−ペンタジエノエート、およびｃｉｓ−２，４−ペンタジエノエートから合成を開始できる。さらなる例として、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート経路の中間体は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートまたはＣ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートであり得る（実施例ＩＩＩおよび図５を参照のこと）。ｐ−トルエート経路の中間体は、例えば、２，４−ジヒドロキシ−５−メチル−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボキシレート、１，３−ジヒドロキシ−４−メチル−５−オキソシクロヘキサン−１−カルボキシレート、５−ヒドロキシ−４−メチル−３−オキソシクロヘキシ−１−エン−１−カルボキシレート、３，５−ジヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、５−ヒドロキシ−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、５−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチル−３−（ホスホノオキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート、または３−［（１−カルボキシエト−１−エン−１−イル）オキシ］−４−メチルシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボキシレートであり得る（実施例ＩＶおよび図６を参照のこと）。テレフタレート中間体は、例えば、４−カルボキシベンジルアルコールまたは４−カルボキシベンズアルデヒドであり得る（実施例Ｖおよび図７を参照のこと）。
【０２１８】
本明細書に開示されるように、ｐ−トルエートおよびベンゾエートは、非天然に生じる微生物の対象であり得る例示的な中間体である。このようなカルボキシレートはイオン化形態または完全にプロトン化形態で生じ得る。従って、接尾語「−エート」、または酸形態は、特にイオン化形態が、化合物が見られるｐＨに依存することが知られているため、遊離酸形態および任意の脱プロトン化形態の両方を説明するために交換可能に使用され得る。本発明に従って利用可能なプロピオネート産物は、Ｏ−カルボキシレートおよびＳ−カルボキシレートエステルなどのエステル形態を含むことが理解される。Ｏ−およびＳ−カルボキシレートは、Ｃ１〜Ｃ６、分岐または直鎖カルボキシレートである低級アルキルを含み得る。一部のこのようなＯ−またはＳ−カルボキシレートには、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルＯ−またはＳ−カルボキシレートが含まれ、それらのいずれかはさらに、例えば、プロぺニル、ブテニル、ペンチル、およびヘキセニルＯ−またはＳ−カルボキシレートを与える、不飽和を有し得る。Ｏ−カルボキシレートは生合成経路の生産物であり得る。生合成経路により利用可能な例示的なＯ−カルボキシレートには、限定されないが、メチルプロピオネート、エチルプロピオネート、およびｎ−プロピルプロピオネートが含まれ得る。他の生合成的に利用可能なＯ−プロピオネートには、長鎖基に対する媒体、すなわち、Ｃ７〜Ｃ２２、脂肪アルコール由来のＯ−プロピオネートエステル、例えば、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、パルミトリル、ヘプタデシル、ステアリル、ノンアデシル、アラチジル、ヘネイコシルおよびベヘニルアルコールが含まれ得、それらのいずれか１つは、必要に応じて分岐され得、および／または不飽和を含み得る。Ｏ−プロピオネートエステルはまた、遊離カルボン酸生産物のエステル化またはＯ−もしくはＳ−プロピオネートのエステル交換などの生合成または化学プロセスにより利用可能であり得る。
【０２１９】
本発明の非天然に生じる微生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するのに十分な量のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素またタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を外因的に発現させる、本明細書に例示されるような当該技術分野において周知の方法を用いて構築される。本発明の微生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産するのに十分な条件下で培養されることは理解される。本明細書に提供される教示および指針に従って、本発明の非天然に生じる微生物は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成を達成でき、約０．１〜２００ｍＭ以上の細胞濃度を生じる。通常、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの細胞内濃度は、約３〜１５０ｍＭ、特に約５〜１２５ｍＭ、より特には約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭまたはそれ以上を含む、約８〜１００ｍＭである。これらの例示的な範囲の各々の間、およびそれ以上の細胞内濃度もまた、本発明の非天然に生じる微生物から達成されてもよい。
【０２２０】
一部の実施形態において、培養条件は、嫌気性または実質的に嫌気性増殖あるいは維持条件を含む。例示的な嫌気性条件は以前に記載されており、当該技術分野において周知である。発酵プロセスについての例示的な嫌気性条件は、本明細書に記載されており、例えば、２００７年８月１０日に出願された米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。これらの条件のいずれかが、非天然に生じる微生物および当該技術分野において周知の他の嫌気性条件と共に利用され得る。このような嫌気性または実質的に嫌気性条件下で、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生産物は、５〜１０ｍＭ以上および本明細書に例示される全ての他の濃度の細胞内濃度でトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを合成できる。上記の説明は細胞内濃度を指しているが、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する微生物は、細胞内にトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産でき、および／または培地中に生産物を分泌できることが理解される。
【０２２１】
本明細書に開示される培養および発酵条件に加えて、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成を達成するための増殖条件は、培養条件に浸透圧保護剤の添加を含み得る。特定の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、浸透圧保護剤の存在下で本明細書に記載されるように、維持、培養または発酵され得る。手短に述べると、浸透圧保護剤は、浸透圧調節物質として作用し、本明細書に記載される微生物が浸透圧に対して生存するのを助ける化合物を指す。浸透圧保護剤には、限定されないが、ベタイン、アミノ酸および糖トレハロースが含まれる。このような非限定的な例は、グリシンベタイン、プラリネベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロプリオネート、３−ジメチルスルホニオ−２−メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、Ｌ−カルニチンおよびエクトインがある。一態様において、浸透圧保護剤はグリシンベタインである。当業者は、浸透圧から本明細書に記載される微生物を保護するのに好適な浸透圧保護剤の量および種類は使用する微生物によることを理解する。培地条件において浸透圧保護剤の量は、例えば、約０．１ｍＭ以下、約０．５ｍＭ以下、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下、約２．５ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、約５．０ｍＭ以下、約７．０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下または約５００ｍＭ以下であり得る。
【０２２２】
培養条件は、例えば、液体培養処理および発酵ならびに他の大規模処理を含み得る。本明細書に記載されるように、本発明の生合成生産物の特に有用な収率は、嫌気性または実質的に嫌気性培養条件下で得られ得る。
【０２２３】
本明細書に記載されるように、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成を達成するための１つの例示的な増殖条件は、嫌気性培養または発酵条件を含む。特定の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、嫌気性または実質的に嫌気性条件下で維持、培養または発酵され得る。手短に述べると、嫌気性条件は環境中に酸素がないことを指す。実質的に嫌気性条件は、例えば、培地中の溶解酸素濃度が飽和の０〜１０％で存在する、培養、バッチ発酵または連続発酵を含む。実質的に嫌気性条件はまた、１％未満の酸素の雰囲気に維持される密閉チャンバ内の液体培地中または固体寒天上の増殖または静止細胞を含む。酸素の割合は、例えば、培地にＮ２／ＣＯ２混合物または他の好適な非酸素ガス（複数も含む）を散布することによって維持され得る。
【０２２４】
本明細書に記載される培養条件は、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを製造するためにスケールアップされ、連続して増殖され得る。例示的な増殖手順は、例えば、供給バッチ発酵およびバッチ分離：供給バッチ発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離を含む。これらのプロセスの全ては当該技術分野において周知である。発酵処理は特に、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの市販量の生合成生産に有用である。通常、および非連続培養処理と同様に、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの連続および／またはほぼ連続生産は、対数増殖期の増殖を維持および／またはほぼ持続させる十分な栄養素および培地中で、非天然に生じるトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンを生産する本発明の微生物を培養することを含む。このような条件下での連続培養は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日以上の増殖を含み得る。さらに、連続培養は、１週間、２週間、３週間、４週間または５週間またはそれ以上から数ヶ月の長い期間を含み得る。あるいは、特定の用途に適切である場合、本発明の微生物は数時間培養されてもよい。連続および／またはほぼ連続培養条件はまた、これらの例示的な期間の間の全ての時間間隔を含み得ることは理解される。本発明の微生物を培養する時間は、所望の目的のための生産物の十分な量を生産するのに十分に長い期間であることはさらに理解される。
【０２２５】
発酵処理は当該技術分野において周知である。手短に述べると、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生合成生産のための発酵は、例えば、供給バッチ発酵およびバッチ分離；供給バッチ発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離に利用され得る。バッチおよび連続発酵処理の例は当該技術分野において周知である。
【０２２６】
十分な量のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの連続生産のための本発明のトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生産物を用いる上記の発酵処理に加えて、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン生産物はまた、例えば、生産物を他の化合物に変換するために化学合成手順に同時に供され得るか、または生産物は発酵培地から分離されて、所望の場合、生産物を他の化合物に変換するために化学変換に連続して供され得る。
【０２２７】
より良い生産物を生成するために、代謝モデリングは増殖条件を最適化するために利用され得る。モデリングはまた、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するために使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号、同第２００３／０２２４３６３号、同第２００４／００２９１４９号、同第２００４／００７２７２３号、同第２００３／００５９７９２号、同第２００２／０１６８６５４号、および同第２００４／０００９４６６号、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号を参照のこと）。モデリング分析は、代謝をより効果的なトルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生産にシフトする細胞増殖に対する効果の信頼可能な予測を可能にする。
【０２２８】
所望の生産物の生合成を支持する代謝変化を識別および設計するための１つのコンピューターによる方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピューターフレームワークである（Ｂｕｒｇａｒｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、遺伝子欠失または標的生産物を過剰生産する遺伝子的に安定な微生物を生じる破壊ストラテジーを教示する代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の副産物に強制的にする遺伝子操作を教示するために、微生物の完全な代謝および／または生化学ネットワークを調べる。戦略的に置かれた遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊の間にわたって生化学的産物を細胞増殖と関連付けることによって、バイオリアクタにおける長期間後の遺伝子操作された株に負荷される選択圧は、強制された増殖と関連した生化学生産物の結果として性能の向上を導く。最後に、遺伝子欠失が構築される場合、それらの野生型状態に戻る設計された株のごくわずかな可能性が存在する。なぜなら、ＯｐｔＫｎｏｃｋにより選択された遺伝子は、ゲノムから完全に除去されるからである。従って、このコンピューターによる方法は、所望の生産物の生合成を導く代替経路を識別するために使用され得るか、または所望の生産物の生合成のさらなる最適化のために非天然に生じる微生物と共に使用され得る。
【０２２９】
手短に述べると、本明細書で使用するＯｐｔＫｎｏｃｋという用語は、細胞代謝をモデリングするためのコンピューターによる方法およびシステムを指す。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の制限をフラックスバランス分析（ＦＢＡ）モデルに組み込むモデルおよび方法のフレームワークに関連する。これらの制限は、例えば、定性的動態情報、定性的規制情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データを含む。ＯｐｔＫｎｏｃｋはまた、例えば、フラックスバランスモデル由来のフラックス境界を狭くし、続いて、遺伝子付加または欠失の存在下で代謝ネットワークの性能限界を調べることによって、種々の代謝問題に対する解をコンピューターで計算する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピューターフレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル形成の構築を可能にし、得られる混合整数線形計画問題を解決するための方法を提供する。本明細書中でＯｐｔＫｎｏｃｋと称される代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、２００２年１月１０日に出願された米国特許出願公開第２００２／０１６８６５４号、２００２年１月１０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０号、および２００７年８月１０日に出願された米国特許出願第２００９／００４７７１９号に記載されている。
【０２３０】
生産物の生合成生産物を支持する代謝変化を識別および設計するための別のコンピューターによる方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピューターによる方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日に出願された米国特許出願第２００３／０２３３２１８号および２００３年６月１３日に出願された国際公開ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８号に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、コンピューター内でネットワークモデルを生成し、システムにおける化学反応のいずれかおよび全ての可能な機能性を含む解空間を定義するために生物学的システムの化学反応による質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートし、それにより、生物学的システムのための許容された活性の範囲を決定するために使用され得るコンピューターによるシステムである。このアプローチは制約ベースのモデリングと称される。なぜなら、解空間は、含まれる反応および反応熱力学の既知の化学量論ならびに反応の間の最大フラックスと関連した容量制約などの制約により規定されるからである。これらの制約により定義される空間は、生物学的システムまたはその生化学成分の表現型能力および挙動を決定するために問い合わせされ得る。
【０２３１】
生物学的システムは、フレキシブルであり、多くの異なる方法において同じ結果に到達し得るので、これらのコンピューターによるアプローチは生物学的事実と一致する。生物学的システムは、全ての生物系が直面しなければならない基本的制約によって制限されている進化機構を介して設計される。従って、制約に基づいたモデリングストラテジーはこれらの一般的事実を包含する。さらに、制約を狭くすることによってネットワークモデルに連続してさらなる制約を課す能力により、解空間のサイズの減少が生じるので、生理学的機能または表現型が予測され得る精度が向上する。
【０２３２】
本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのための種々のコンピューターフレームワークを、宿主微生物における所望の化合物の生合成の設計および実施に適用することができるだろう。このような代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋなどの上記に例示されるようなコンピューターによるシステムを含む。本発明の例示のために、一部の方法は、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークに対する参照と共に本明細書に記載される。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝変化の識別、設計および実施を、このような他の代謝モデリングおよびシミュレーション計算フレームワークならびに当該技術分野における周知の方法に適用する方法を知っているだろう。
【０２３３】
上記の方法は、破壊するための代謝反応の１つのセットを与える。セットまたは代謝修飾内の各反応の除外により、生物の増殖期の間の必須生産物として所望の生産物が得られ得る。その反応は知られているため、二相ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解もまた、反応のセット内の各反応を触媒する１つ以上の酵素をコードする関連遺伝子（複数も含む）を提供する。反応のセットおよび各反応に関与する酵素をコードするそれらの対応する遺伝子の識別は、通常、自動化プロセスであり、酵素とコード遺伝子との間の関係を有する反応データベースと反応の相互関係によりなされる。
【０２３４】
一旦識別されると、所望の生産物の生産を達成するために破壊され得る反応のセットは、セット内の各代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能的破壊により標的細胞または生物において実施される。反応セットの機能的破壊を達成するための１つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の欠失による。しかしながら、一部の例において、例えば、調節因子のためのプロモーターまたはｃｉｓ結合部位などの調節領域の突然変異、欠失を含む他の遺伝子異常により、あるいは多くの位置のいずれかにおけるコード配列の切断により反応を破壊することは有益であり得る。例えば、生産物の結合の迅速な評価が所望される場合、または遺伝的逆転が生じる可能が低い場合、これらの後の異常は、有用であり得る遺伝子セットの全ての欠失より少ない欠失を生じる。
【０２３５】
所望の生産物の増殖に関連した生合成を含む、生合成を生じ得る破壊または代謝修飾するために反応のさらなるセットを導く上記の二相ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対するさらなる生産的解を識別するために、整数カットと呼ばれる、最適化方法が実施され得る。この方法は、各々の反復における整数カットと称されるさらなる制約の組み込みと共に上記に例示したＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解くことにより進められる。整数カットの制約は、生産物生合成を増殖に強制的に関連させる任意の以前の反復において識別された正確な同じセットの反応を選択することから解決手順を効果的に防止する。例えば、以前に識別された増殖と関連した代謝修飾が、破壊するための反応１、２および３を特定する場合、以下の制約は、同じ反応が、後の解において同時に考慮されることを防止する。整数カット法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：７９１−７９７（２００１）の記載に見出され得る。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームと併せたそれらの使用に対する参照と共に本明細書に記載される全ての方法と同様に、反復計算分析において冗長性を減少させる整数カット法もまた、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）を含む、当該技術分野において周知の他の計算フレームワークと共に適用され得る。
【０２３６】
本明細書に例示される方法は、標的生化学生産物の生産を、識別される遺伝子変化を有するように遺伝子操作された細胞または生物の増殖に強制的に関連させることを含む、所望の生産物を生合成的に生産する細胞および生物の構築を可能にする。従って、本明細書に記載されるコンピューターによる方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるコンピューター内での方法により識別される代謝修飾の識別および実施を可能にする。代謝修飾のセットは、例えば、１つ以上の生合成経路の酵素および／または例えば遺伝子欠失による破壊を含む、１つ以上の代謝反応の機能的破壊の付加を含み得る。
【０２３７】
上で議論したように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法は、突然変異微生物ネットワークが、長期間の増殖選択に供される場合、それらのコンピューターにより予測された最大増殖表現型に対して進化され得るという前提で開発された。つまり、そのアプローチは、選択圧下で自己最適化する生物の能力を活用する。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づいて生化学生産物と細胞増殖とを強制的に関連させる遺伝子欠失の組み合わせの包括的な列挙を可能にする。最適遺伝子／反応ノックアウトの識別は、得られるネットワークについての最適増殖解が対象の生化学物質を過剰生産するように活性反応のセットを選択する二相最適化問題の解を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））。
【０２３８】
大腸菌代謝のコンピューター内での化学量論は、以前に例示され、例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号、同第２００３／０２２４３６３号、同第２００４／００２９１４９号、同第２００４／００７２７２３号、同第２００３／００５９７９２号、同第２００２／０１６８６５４号および同第２００４／０００９４６６号、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されるような代謝経路のための必須遺伝子を識別するために利用され得る。本明細書に開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的フレームワークは、所望の生産物の増殖と関連した生産を導くピンポイントの遺伝子欠失に適用され得る。さらに、二相ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題は、欠失の１つのセットのみを提供する。全ての有意義な解、すなわち、増殖と関連した生産物形成を導く全てのセットのノックアウトを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術が実施され得る。これは、上で議論したように各々の反復において整数カットと称されるさらなる制約の組み込みを有するＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することを必要とする。
【０２３９】
本明細書に開示されるように、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の所望の活性をコードする核酸が宿主生物内に導入され得る。一部の場合、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエンの生産を増加させるために、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質の活性を修飾することが好適であり得る。例えば、タンパク質または酵素の活性を増加させる既知の突然変異がコード核酸分子内に導入され得る。さらに、最適化方法が、酵素もしくはタンパク質の活性を増加させ、および／または阻害活性を減少させ、例えば負の調節因子の活性を減少させるために適用され得る。
【０２４０】
１つのこのような最適化方法は指向進化である。指向進化は、酵素の特性を改良および／または変更させるために特異的遺伝子に標的とされる突然変異の導入を含む強力なアプローチである。改良および／または変更された酵素は、多くの酵素変異体（例えば＞１０４）の自動化スクリーニングを可能にする感受性高スループットスクリーニングアッセイの開発および実施により識別され得る。突然変異生成およびスクリーニングの反復ラウンドは典型的に、最適化された特性を有する酵素に影響を与えるように実施される。突然変異生成のための遺伝子の領域を識別するのに役立ち得る計算アルゴリズムもまた開発されており、生成およびスクリーニングするのに必要とする酵素変異体の数を顕著に減少させ得る。多くの指向進化技術が、種々の変異体ライブラリーの作製に効果的であるように開発されており（レビューのために、Ｈｉｂｂｅｒｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ  ２２：１１−１９（２００５）；Ｈｕｉｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｌａｌｏｎｄｅ，Ｉｎ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｐｇｓ．７１７−７４２（２００７），Ｐａｔｅｌ（ｅｄ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｘ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ２２：１−９（２００５）．；ならびにＳｅｎら，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４３：２１２−２２３（２００７）を参照のこと）、それらの方法は、多くの酵素クラスにわたる広範囲の特性の改良に首尾良く適用されている。指向進化技術により改良および／または変更される酵素特性は、例えば、非天然に物質を変換するための選択性／特異性；強力な高温処理のための温度安定性；低または高ｐＨ条件下での生物学的処理のためのｐＨ安定性；高生産物力価が達成され得るように、基質または生産物耐性；非天然の物質を含むように広範囲の基質結合を含む、結合（Ｋｍ）；生産物、基質、または重要な中間体による阻害を除去するための阻害（Ｋｉ）；所望のフラックスを達成させるために酵素反応速度を増加させるための活性（ｋｃａｔ）；タンパク質収率および全経路のフラックスを増加させるための発現レベル；好気性条件下で空気感受性酵素を作用するための酸素安定性；ならびに酸素の非存在下で好気性酸素を作用するための嫌気性活性、を含む。
【０２４１】
特定の酵素の望ましい特性を目的とする突然変異生成および遺伝子の多様化のための多くの例示的な方法が開発されている。そのような方法は当業者に周知である。それらの任意のものが、トルエン、ベンゼン、ｐ−トルエート、テレフタレート、（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホネート、（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１オールまたは１，３−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質の活性を変更および／または最適化するために使用され得る。そのような方法は、限定されないが、ＰＣＲ反応においてＤＮＡポリメラーゼの忠実度を減少させることによりランダム点突然変異を導入する、ＥｐＰＣＲ；（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２３４：４９７−５０９（２００５））；環状プラスミドが、テンプレートとして使用され、最後の２つのヌクレオチド上にエキソヌクレアーゼ耐性チオホスフェート連結を有するランダム６−ｍｅｒが、プラスミドを増幅させるために使用され、続いて、プラスミドがタンデムリピートにおいて再環状にされる細胞内に形質転換されることを除いて、ｅｐＰＣＲと同様のエラープローンローリングサークル増幅（ｅｐＲＣＡ）（Ｆｕｊｉｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２ｅ１４５（２００４）；およびＦｕｊｉｉら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：２４９３−２４９７（２００６））；典型的に、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でアニーリングおよび伸長の周期によって再構築されるランダム断片のプールを生じて、キメラ遺伝子のライブラリーを作製するために、ＤｎａｓｅＩまたはＥｎｄｏＶなどのヌクレアーゼを用いた２以上の変異遺伝子の消化を包含する、ＤＮＡまたはファミリーシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−３９１（１９９４））；テンプレート刺激後に、変性および非常に短い時間のアニーリング／伸長（５秒程度短い。）を用いる反復した周期の２工程ＰＣＲを必要とする、付着伸長（ＳｔＥＰ）（Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１（１９９８））；ランダム配列プライマーを使用して、テンプレートの異なるセグメントと相補的な多くの短いＤＮＡ断片を作製する、ランダム刺激組換え（ＲＰＲ）（Ｓｈａｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：６８１−６８３（１９９８））を含む。
【０２４２】
さらなる方法は、直鎖状プラスミドＤＮＡを使用して、ミスマッチ修復によって修復されるヘテロ二本鎖を形成する、ヘテロ二本鎖組換え（Ｖｏｌｋｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：ｅ１８（１９９９）；およびＶｏｌｋｏｖら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４５６−４６３（２０００））；ＤｎａｓｅＩ断片化と一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のサイズ分画とを採用する、一過性テンプレートにおけるランダムキメラ形成（ＲＡＣＨＩＴＴ）（Ｃｏｃｏら．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３５４−３５９（２００１））；テンプレートのプールとして使用される一方向性ｓｓＤＮＡ断片の存在下でプライマーから一方向性に増殖する鎖のテンプレート切り替えを必要とする、切断型テンプレートに関する組換え伸長（ＲＥＴＴ）（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ２６：１１９−１２９（２００３））；縮重プライマーが、分子間の組換えを制御するために使用される、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（ＤＯＧＳ）（ＢｅｒｇｑｕｉｓｔおよびＧｉｂｂｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：１９１−２０４（２００７）；Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２：６３−７２（２００５）；Ｇｉｂｂｓら，Ｇｅｎｅ２７１：１３−２０（２００１））；対象の遺伝子または遺伝子断片の１塩基対の欠失をともなうコンビナトリアルライブラリーを作製する、ハイブリッド酵素の作製のための増加性切断（ＩＴＣＨＹ）（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５６２−３５６７（１９９９）；およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１２０５−１２０９（１９９９））；ＩＴＣＨＹとほぼ同じであるが、例外は、ホスホチオアートｄＮＴＰを使用して切断を生じる、ハイブリッド酵素の作製のためのチオ−増加性切断（ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ）（Ｌｕｔｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ１６（２００１））；組換え遺伝子のための２つの方法、ＩＴＣＨＹおよびＤＮＡシャッフリングを組み合わせた、ＳＣＲＡＴＣＨＹ（Ｌｕｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１１２４８−１１２５３（２００１））；突然変異は、ｅｐＰＣＲ後の、使用可能な活性を保持するものについてのスクリーニング／選択を介して実施される、ランダム浮動突然変異誘発（ＲＮＤＭ）（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２：６３−７２（２００５））；ホスホチオアートヌクレオチドのランダム組み込みおよび切断を用いてランダム長断片のプールを生じるランダム突然変異誘発法であり、このプールをテンプレートとして使用して、イノシンなどの「普編的な」塩基の存在下で伸長し、イノシン含有相補物の複製は、ランダムな塩基組み込みおよび結果として突然変異誘発を与える、配列飽和突然変異誘発（ＳｅＳａＭ）（Ｗｏｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．３：７４−８２（２００８）；Ｗｏｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ２６（２００４）；およびＷｏｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１：１８７−１８９（２００５））；重複するオリゴヌクレ��チドを設計して、「標的におけるすべての遺伝的多様性」をコードし、シャッフリングされた後代について非常に高い多様性を可能にする、合成シャッフリング（Ｎｅｓｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２５１−１２５５（２００２））；ｄＵＴＰの組み込みに次ぐウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびその後のピペリジンによる処理の組み合わせを活用して、エンドポイントＤＮＡ断片化を実施する、ヌクレオチド交換及び切除技術ＮｅｘＴ（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１１７（２００５））を含む。
【０２４３】
さらなる方法は、リンカーを使用して、２つの遠隔に関連したまたは関連していない遺伝子間の融合を促進させ、２つの遺伝子の間のある範囲のキメラを生じ、結果として、単一交差ハイブリッドのライブラリーを生じる、配列相同性非依存性タンパク質組換え（ＳＨＩＰＲＥＣ）（Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４５６−４６０（２００１））；出発物質がインサートを有するスーパーコイル二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プラスミドを含み、２つのプライマーは、突然変異に所望の部位で縮重する、遺伝子部位飽和突然変異誘発（商標）（ＧＳＳＭ（商標））（Ｋｒｅｔｚら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３−１１（２００４））；限定された領域を多数の起こり得るアミノ酸配列変更と置き換えるための短いオリゴヌクレオチドカセットの使用を包含する、コンビナトリアルカセット突然変異誘発（ＣＣＭ）（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６（１９９１）；およびＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５３−５７（１９８８））；ＣＣＭと本質的に同様であるが、高い突然変異率でのｅｐＰＣＲの使用により、ホットスポットおよびホット領域を同定した後、ＣＭＣＭによる伸長で、タンパク質配列空間の規定された領域をカバーする、コンビナトリアル多重カセット突然変異誘発（ＣＭＣＭ）（Ｒｅｅｔｚら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４０：３５８９−３５９１（２００１））；ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの突然変異サブユニットをコードする、ｍｕｔＤ５遺伝子を利用する、条件的ｔｓミューテータープラスミドは、ランダムな２０〜４０００倍の増加と選択の間の天然の突然変異頻度とを可能にし、選択が必要とされない場合、有害な突然変異の蓄積を遮断させる、ミューテーター株技術（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３６４５−３６４９（２００１））；Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８０（１９９６））を含む。
【０２４４】
さらなる例示的な方法は、選択されたアミノ酸の組み合わせ突然変異を評価および最適化する多次元突然変異誘発法である、探索型突然変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：８４６６−８４７１（２００５））；複数の遺伝子に一度に、または単一の遺伝子のキメラ（複数の突然変異）の大きなライブラリーを作製することに適用することのできるＤＮＡシャッフリング法であるである、遺伝子再構築（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給されるＴｕｎａｂｌｅ  ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）（ＴＧＲ（商標））技術）；特定の倍数を有する構造的に規定されたタンパク質骨格を固定し、かつ倍数および全体的なタンパク質エネルギー性を安定化させることのできるアミノ酸置換のための配列空間を検索する、最適化アルゴリズムであり、通常、既知の三次元構造を有するタンパク質に最も効果的に作用する、インシリコタンパク質設計自動化（ＰＤＡ）（Ｈａｙｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１５９２６−１５９３１（２００２））；ならびに構造／機能の知識を使用して、酵素の改良にありがちな部位を選択すること、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）などの突然変異誘発法を使用して選択された部位における飽和突然変異誘発を実施すること、所望の特性についてのスクリーニング／選択、改良されたクローンを用いて、所望の活性が得られるまで、別の部位および持続した反復でやり直すことを包含する、反復性飽和突然変異誘発（ＩＳＭ）（Ｒｅｅｔｚら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：８９１−９０３（２００７）；およびＲｅｅｔｚら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４５：７７４５−７７５１（２００６））を含む。
【０２４５】
変異誘発に関する上述の方法のいずれも、単独または任意の組み合わせで使用されてもよい。さらに、指向進化法のいずれか１つまたは組み合わせは、本明細書に記載されるような適応進化と併せて使用されてもよい。
【実施例】
【０２４６】
実施例Ｉ
ベンゼン及びトルエンへの経路
この実施例は、フェニルアラニンからトルエン、フェニルアラニンからベンゼン、及びベンゾイル−ＣｏＡからスチレンへの経路を示す。
【０２４７】
図１に、フェニルアラニンを酵素的に変換するための経路を示す。最初の工程は、アミノトランスフェラーゼ又は脱アミノ化オキシドレダクターゼによって行うことができる転換であるフェニルアラニンのフェニルピルビン酸への変換を含む。次いで、図１の工程Ｂにおいて、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに脱炭酸する。脱カルボニル化によってフェニルアセトアルデヒドから直接（図１、工程Ｅ）、又はフェニル酢酸中間体を介して間接的に（図１、工程Ｃ及びＤ）トルエンを生成することができる。フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼのいずれかによって、フェニル酢酸をフェニル酢酸に酸化することができる（図１、工程Ｃ）。別の経路は、フェニルピルビン酸オキシダーゼによるフェニルピルビン酸のフェニル酢酸への直接酸化的脱炭酸（図１、工程Ｆ）である。
【０２４８】
フェニルアラニンをベンゼンに酵素的に変換するための一段階経路を図２に示す。フェニルアラニン及び水から、ベンゼン、ピルビン酸塩及びアンモニアへの変換は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ活性を有する酵素により触媒される。
【０２４９】
ベンゾイル−ＣｏＡからのスチレンへの酵素的経路を図３に示す。ベンゾイル−ＣｏＡは、多数の生合成経路及び分解経路に共通の中間代謝産物である。ベンゾイル−ＣｏＡの生合成及び分解産物としてのベンゾイル−ＣｏＡの生成に関与する経路は、当技術分野において公知である。提唱されるスチレン経路では、まず、β−ケトチオラーゼによって、ベンゾイル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡを３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡに変換する（図３、工程Ａ）。次いで、ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ又はシンテターゼによって、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡのＣｏＡ部分が放出される（図３、工程Ｂ）。あるいは、ホスホトランス−３−オキソ−３−フェニルプロピオニラーゼ及びベンゾイル酢酸キナーゼによる２つの酵素的段階で３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡをベンゾイル酢酸に変換する（図３、工程Ｆ及びＧ）。形成されると、ベンゾイル酢酸は脱炭酸され、還元され、脱水されて、スチレンを形成する（図３、工程Ｃ、Ｄ及びＥ）。
【０２５０】
図１〜３に示す転換を触媒するための酵素をＥＣ番号（表１）により分類し、更に以下に記載する。
【０２５１】
【表１】
2013535203.tif 000003
【０２５２】
１．１．１．ａ  オキシドレダクターゼ（オキソからアルコールへ）：アセトフェノンの１−フェニルエタノールへの還元（図３の工程Ｄ）は、アセトフェノンレダクターゼ活性を有するケトンレダクターゼにより触媒される。この活性を有する酵素は、多数の生物において特性評価されており、生成物の形成は一般に立体選択性である。この活性を有する例示的な酵素は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のＲ特異的な短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼであり、これは、広範囲にわたって研究され、構造的に特性評価され、そして、補基質としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨを好むように再改変されている（Ｓｃｈｌｉｅｂｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４９：８０１−８１３（２００５年））。アセトフェノンレダクターゼ活性を有する更なる酵素は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のａｄｈＦ１（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：４８３−４８７（２００２年））、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｐｅｎｎａｃｃｈｉｏら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７４：３９４９−３９５８（２００８年））のａｄｈ及びレイフソニア属（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）の種Ｓ７４９のＬＳＡＤＨ（Ｉｎｏｕｅら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：４１８−４２６（２００６年））によりコードされている。Ｓ特異的酵素は、脱窒素細菌であるアロマトレウム・アロマチカム（Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）ＥｂＮ１のエチルベンゼン分解経路において特性評価された（Ｋｎｉｅｍｅｙｅｒら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７６：１２９−１３５（２００１年））。ｐｅｄによりコードされているこの酵素は、低ｐＨ（４）で還元方向を選好するが、中性ｐＨでは酸化方向を選好する。
【０２５３】
【表２】
2013535203.tif 000004
【０２５４】
様々なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、ケトンのアルコール官能基への還元を触媒する。また、これら酵素はアセトフェノンの還元を触媒するのに適している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこのような２つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）によりコードされている。ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、２−オキソ酪酸、２−オキソペンタン酸及び２−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の２−ケト酸に対して高い活性を示すことが示されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：３２９−３３４（１９８３年））。２−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である２−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒され得る（Ｓｕｄａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６年）；Ｓｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７年））。更なるオキシドレダクターゼは、ヒトの心臓に由来するミトコンドリアの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）であり、これは既にクローニングされ、特性評価されている（Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３（１９９２年））。Ｃ．ベエイジェリンキー（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（Ｉｓｍａｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５０９７−５１０５（１９９３年））及びＴ．ブロッキイ（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉｉ）（Ｌａｍｅｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５：１８３−１９０（１９８１年）；Ｐｅｒｅｔｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：６５４９−６５５５（１９８９年））のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼ、あるいは２−ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＭＥＫの還元を触媒して２−ブタノールを形成する。例示的なＭＥＫレダクターゼ酵素は、ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（Ｋｏｓｊｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８６：５５−６２（２００４年））及びパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ｖａｎ  ｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３０６２−３０６８（２００１年））において見出すことができる。
【０２５５】
【表３】
2013535203.tif 000005
【０２５６】
１．２．１．ａ  オキシドレダクターゼ（アルデヒドから酸へ）：フェニルアセトアルデヒドのフェニル酢酸への酸化は、ＥＣクラス１．２．１における酵素であるフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒される（図１の工程Ｃ）。ＮＡＤ＋依存性フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．３９）は、大腸菌、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）及びキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）において特性評価されている（Ｌｏｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ５９：２５６−２６５（２００９年）；Ａｒｉａｓら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０：４１３−４３２（２００８年）；Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０６：２３−２７（１９９７年））。フェニルアセトアルデヒドに対して高い活性を有するＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素は、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）等の哺乳類において特性評価されている（Ｋｌｙｏｓｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４４５７−４４６７（１９９６年ａ）；Ｌｉｎｄａｈｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１１９９１−１１９９６（１９８４年））。ヒトの肝臓でみられる２つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤＨ−１及びＡＬＤＨ−２は、様々な脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒド及び多環式アルデヒド等の広い基質範囲を有し、フェニルアセトアルデヒドに対する活性が実証されている（Ｋｌｙｏｓｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４４５７−４４６７（１９９６ｂ））。ｂａｄｈによってコードされているシュードモナス・プチダのＮＡＤＰ＋依存性ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼも、フェニルアセトアルデヒドに対する活性を示した（Ｙｅｕｎｇら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７８４：１２４８−１２５５（２００８年）））。フェニルアセトアルデヒドに対して高い活性を有するＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素は、ウシ、ラット及びヒト等の哺乳類においても特性評価されている（Ｋｌｙｏｓｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４４５７−４４６７（１９９６年ａ）；Ｌｉｎｄａｈｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１１９９１−１１９９６（１９８４年））。ヒトの肝臓でみられる２つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤＨ−１及びＡＬＤＨ−２は、様々な脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒド及び多環式アルデヒド等の広い基質範囲を有し、フェニルアセトアルデヒドに対する活性が実証されている（Ｋｌｙｏｓｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４４５７−４４６７（１９９６年ｂ））。
【０２５７】
【表４】
2013535203.tif 000006
【０２５８】
１．２．３．ａ  アルデヒドオキシダーゼ：Ｏ２依存性アルデヒドオキシダーゼ酵素を使用して、フェニルアセトアルデヒド又はフェニルピルビン酸をフェニル酢酸に変換することができる（図１の工程Ｃ及びＦ）。フェニルアセトアルデヒドオキシダーゼ酵素は、フェニルアセトアルデヒド、水及びＯ２をフェニル酢酸及び過酸化水素に変換する。例示的なフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼ酵素は、メチロバチルス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種、ストレプトミセス・モデラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｄｅｒａｔｕｓ）、モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、及びトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）でみられる（Ｋｏｓｈｉｂａら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１０：７８１−７８９（１９９６年））。トウモロコシの２つのフラビン−及びモリブデン−含有アルデヒドオキシダーゼは、ｚｍＡＯ−１及びｚｍＡＯ−２によりコードされている（Ｓｅｋｉｍｏｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５２８０−１５２８５（１９９７年））。また、フェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの活性は、マカラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）のインドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）においても実証されているが、この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されておらず、トウモロコシのアルデヒドオキシダーゼ遺伝子に対して著しい相同性を有してもいない（Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ２４：２７２−２８１（１９７１年））。トウモロコシ遺伝子に対する配列相同性によって更なるフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼを推測することができたので、それらを以下に示す。
【０２５９】
【表５】
2013535203.tif 000007
【０２６０】
フェニルピルビン酸オキシダーゼ酵素は、フェニルピルビン酸及びＯ２をフェニル酢酸、ＣＯ２及び水に変換する（図１の工程Ｆ）。アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．１３）は、チロシン異化作用中にフェニルピルビン酸のフェニル酢酸へのＯ２依存性酸化を触媒することが示された（Ｂｌａｋｌｅｙ，Ｃａｎ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２３：１１２８−１１３９（１９７７年））。この酵素活性は、細胞抽出液において実証されたが；この酵素をコードする遺伝子は、現在まで同定されていない。
【０２６１】
１．４．１．ａ  オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）：フェニルアラニンのフェニルピルビン酸へのＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酸化（図１の工程Ａ）は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼとも呼ばれるフェニルアラニンオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）によって触媒される。ｐｄｈ遺伝子によってコードされているＮＡＤ＋依存性フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ酵素は、バチルス・バジウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓ）、リシニバチルス・スパエリクス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）及びサーモアクチノミセス・インターメディウス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）において特性評価されている（Ｙａｍａｄａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：１９９４−１９９５（１９９５年）；Ｔａｋａｄａら，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９：３７１−３７６（１９９１年）；Ｏｋａｚａｋｉら，Ｇｅｎｅ  ６３：３３７−３４１（１９８８年））。
【０２６２】
【表６】
2013535203.tif 000008
【０２６３】
２．３．１．ａ  アシルトランスフェラーゼ（ホスホトランスアシラーゼ）：ホスホトランスベンゾイラーゼ活性を有する酵素は、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡを［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］リン酸にリン酸化するために必要である（図３の工程Ｆ）。この活性を有する酵素は、現在まで特性評価されていない。例示的なリン酸転移アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）及びホスホトランスブチリラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）が挙げられる。大腸菌に由来するｐｔａ遺伝子は、アセチル−ＣｏＡをアセチルリン酸に可逆的に変換するホスホトランスアセチラーゼをコードしている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５９−５６９（１９６９年））。また、幾つかの生物におけるホスホトランスアセチラーゼ酵素は、プロピオニル−ＣｏＡのプロピオニルリン酸への変換を触媒する。このような酵素は、大腸菌（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８年））、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｒａｄｏら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２１：１１４−１２５（１９７３年））、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（Ｓｔａｄｔｍａｎ，１：５９６−５９９（１９５５年））及びサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｂｏｃｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１８６１−１８６７（１９９９年））のｐｔａ遺伝子産物を含む。Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のｐｔｂ遺伝子は、ブチリル−ＣｏＡをブチリルリン酸に可逆的に変換する酵素であるホスホトランスブチリラーゼをコードしている（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：３１７−３２２（１９８９年）；Ｗａｌｔｅｒら，Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３年））。更なるｐｔｂ遺伝子は、酪酸産生細菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２０９９−２１０６（２００４年））及び巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（Ｖａｚｑｕｅｚら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：３４５−３４９（２００１年））で見出されている。
【０２６４】
【表７】
2013535203.tif 000009
【０２６５】
２．３．１．ｂ  β−ケトチオラーゼ。β−ケトチオラーゼ酵素は、ベンゾイル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡを３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡに変換するために必要である（図３の工程Ａ）。この転換が自然に生じることは知られていない。適切なβ−ケトチオラーゼ酵素としては、３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１７４）、３−オキソピメロイル−ＣｏＡ：グルタリル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）、３−オキソバレリル−ＣｏＡチオラーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．１．３．９）が挙げられる。
【０２６６】
３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１７４）は、β−ケトアジピル−ＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡに変換し、また、芳香族化合物を分解するためのβ−ケトアジピン酸経路の鍵となる酵素である。前記酵素は、シュードモナス・プチダ（Ｈａｒｗｏｏｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：６４７９−６４８８（１９９４年））及びアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（Ｄｏｔｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３１６８−３１７４（１９８７年））を含む土壌細菌及び真菌に広く存在する。シュードモナス属Ｂ１３株におけるｐｃａＦ（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２年））、シュードモナス・プチダＵにおけるｐｈａＤ（Ｏｌｉｖｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８年））、シュードモナス・フルオレッセンスＳＴにおけるｐａａＥ（Ｄｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８８：１１７−１２５（２００７年））及び大腸菌由来のｐａａＪ（Ｎｏｇａｌｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５３：３５７−３６５（２００７年））によってコードされている遺伝子産物もこの転換を触媒する。幾つかのβ−ケトチオラーゼは、シュードモナス・プチダ由来のｂｋｔ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１由来のｐｃａＦ及びｂｋｔ、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）ＡＭＭＤ由来のｂｋｔ、大腸菌由来のｐａａＪ、及びＰ．プチダ由来のｐｈａＤを含むオキソアジピル−ＣｏＡ形成方向において著しく且つ選択的な活性を示す。
【０２６７】
【表８】
2013535203.tif 000010
【０２６８】
３−オキソピメロイル−ＣｏＡチオラーゼは、グルタリル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡの３−オキソピメロイル−ＣｏＡへの縮合を触媒する（ＥＣ２．３．１．１６）。この転換を触媒する酵素は、ラルストニア・ユートロファ（以前はアルカリゲネス・ユートロファ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓとして知られていた）における遺伝子ｂｋｔＢ及びｂｋｔＣによりコードされている（Ｓｌａｔｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１９７９−１９８７（１９９８年）；Ｈａｙｗｏｏｄら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５２：９１−９６（１９８８年））。ＢｋｔＢタンパク質の配列は公知であるが、ＢｋｔＣタンパク質の配列は現在まで報告されていない。また、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）のｐｉｍオペロンは、ｐｉｍＢによってコードされているβ−ケトチオラーゼをコードし、ベンゾイル−ＣｏＡの分解中にこの転換を分解方向に触媒すると予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：７２７−７３６（２００５年））。Ｓ．アシジトロフィカス（Ｓ．ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）におけるβ−ケトチオラーゼ酵素は、ｂｋｔＢに対する配列相同性（４３％の同一性、ｅ値＝１ｅ−９３）により同定された。
【０２６９】
【表９】
2013535203.tif 000011
【０２７０】
アセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡからの３−オキソ吉草酸の形成を触媒するβ−ケトチオラーゼ酵素は、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡの形成を触媒することもできる。ズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）は、プロピオニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからβ−ケトバレリル−ＣｏＡを形成することができる２つのケトチオラーゼを有し、Ｒ．ユートロファは、同じ転換を触媒することができるβ−酸化ケトチオラーゼを有する（Ｇｒｕｙｓら，（１９９９年））。これら遺伝子又はそれが翻訳されたタンパク質の配列は報告されていないが、Ｒ．ユートロファ由来のｂｋｔＢに対する配列相同性に基いて、Ｒ．ユートロファ、Ｚ．ラミゲラ、又は他の生物における幾つかの遺伝子を同定することができたので、それらを以下に列挙する。
【０２７１】
【表１０】
2013535203.tif 000012
【０２７２】
更なる酵素としては、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換することが知られているβ−ケトチオラーゼが挙げられる（ＥＣ２．１．３．９）。例示的なアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ酵素としては、大腸菌由来のａｔｏＢ（Ｍａｒｔｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７９６−８０２（２００３年））、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のｔｈｌＡ及びｔｈｌＢ（Ｈａｎａｉら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：７８１４−７８１８（２００７年）；Ｗｉｎｚｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：５３１−５４１（２０００年））、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＥＲＧ１０（Ｈｉｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１３８３−３１３８９（１９９４年））の遺伝子産物が挙げられる。
【０２７３】
【表１１】
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【０２７４】
２．６．１．ａ  アミノトランスフェラーゼ：ＥＣクラス２．６．１におけるフェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ又はトランスアミナーゼは、フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換するために必要である（図１の工程Ａ）。フェニル酢酸アミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及び他の酵素を含む様々な酵素がこの転換を触媒する。大腸菌におけるフェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ｔｙｒＢ、ｉｌｖＥ及びａｓｐＣによりコードされている（Ｌｅｅ−Ｐｅｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３９：３３９−３４５（１９７９年）；Ｐｏｗｅｌｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：３９１−４００（１９７８年））。他の生物におけるフェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する例示的な酵素としては、ＡＲＯ９によりコードされている出芽酵母の芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｉｒａｑｕｉら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：２３８−２４８（１９９８年））、及びＴＡＡ１によりコードされているシロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼが挙げられる（Ｔａｏら，Ｃｅｌｌ  １３３：１６４−１７６（２００８年））。
【０２７５】
【表１２】
2013535203.tif 000014
【０２７６】
２．７．２．ａ  ホスホトランスフェラーゼ：ＥＣクラス２．７．２におけるホスホトランスフェラーゼ酵素は、１つのＡＴＰの加水分解と同時に、カルボン酸をホスホン酸に変換する。図３の工程Ｇでは、ホスホトランスフェラーゼは、［（３−オキソ−３−フェニルプロピオニル）オキシ］ホスホン酸及びＡＤＰをベンゾイル酢酸及びＡＴＰに変換するために必要である。この正確な活性を有する酵素は、現在まで特性評価されていない。例示的な酵素としては、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、イソ酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）、アスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）及びγ−グルタミルキナーゼ（ＥＣ２．７．２．１１）が挙げられる。アスパルトキナーゼは、アスパラギン酸のＡＴＰ依存性リン酸化を触媒し、幾つかのアミノ酸の合成に関与する。ｌｙｓＣによってコードされる大腸菌のアスパルトキナーゼＩＩＩ酵素は、芳香族化合物アスパラギン酸１−ベンジルエステルを含む広い基質範囲を有し、基質特異性に関与する触媒残基が解明されている（Ｋｅｎｇら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３５：７３−８１（１９９６年））。大腸菌における２つの更なるキナーゼとしては、酢酸キナーゼ及びγ−グルタミルキナーゼが挙げられる。ａｃｋＡによりコードされる大腸菌の酢酸キナーゼ（Ｓｋａｒｓｔｅｄｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６７７５−６７８３（１９７６年））は、酢酸に加えてプロピオン酸をリン酸化する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８年））。ｐｒｏＢによりコードされる大腸菌のγ−グルタミルキナーゼ（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：５４５−５５１（１９８４年））は、グルタミン酸のガンマ炭酸基をリン酸化する。酪酸キナーゼは、Ｃ．アセトブチリカムにおける酸生成中、ブチリルリン酸を酪酸に可逆的に変換する（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０年））。この酵素は、２つのｂｕｋ遺伝子産物のいずれによりコードされている（Ｈｕａｎｇら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：３３−３８（２０００年））。他の酪酸キナーゼ酵素は、Ｃ．ブチリカム及び破傷風様菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）でみられる（ＴＷＡＲＯＧら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８６：１１２−１１７（１９６３年））。関連酵素である、サーモトガ・マリティマ由来のイソ酪酸キナーゼは、大腸菌において発現し、結晶化された（Ｄｉａｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：２５２１−２５２９（２００９年）；Ｄｉａｏら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５９：１１００−１１０２（２００３年））。
【０２７７】
【表１３】
2013535203.tif 000015
【０２７８】
２．８．３．ａ  ＣｏＡトランスフェラーゼ：ＣｏＡトランスフェラーゼは、ある分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的な転移を触媒する。図３の工程Ｂは、３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素により触媒される。この転換では、ベンゾイル酢酸は、酢酸、コハク酸、又は他のもの等のＣｏＡアクセプターへのＣｏＡの転移により３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡから形成される。同様の基質と反応する例示的なＣｏＡトランスフェラーゼ酵素としては、シンナモイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１７）及びベンジルスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）におけるｆｌｄＡによってコードされているシンナモイル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、シンナモイル−ＣｏＡから、フェニル酢酸、３−フェニルプロピオン酸及び４−フェニル酪酸を含む様々な芳香族酸基質にＣｏＡ部分を転移する（Ｄｉｃｋｅｒｔら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：３８７４−３８８４（２０００年））。ベンジルスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡアクセプターとしてコハク酸又はマレイン酸を利用し、ベンジルスクシニル−ＣｏＡからコハク酸ベンジルを形成する。この酵素は、脱窒素細菌サウエラ・アロマチカ（Ｔｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ）（この細菌では、ｂｂｓＥＦによりコードされる）において逆方向に特性評価された（Ｌｅｕｔｗｅｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４２８８−４２９５（２００１年））。
【０２７９】
【表１４】
2013535203.tif 000016
【０２８０】
多様な基質範囲を有する更なるＣｏＡトランスフェラーゼ酵素としては、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、グルタコニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・クルイベリのｃａｔ１、ｃａｔ２及びｃａｔ３の遺伝子産物は、それぞれスクシニル−ＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ及びブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０５：２１２８−２１３３（２００８年）；Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６年））。また、同様のＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１４１１−１４１８（２００８年））及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）（Ｒｉｖｉｅｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４５３３７−４５３４６（２００４年））にも存在する。嫌気性細菌アシドアミノコックス・ファーメンタンス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のグルタコニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）は、グルタコニル−ＣｏＡ及び３−ブテノイル−ＣｏＡと反応する（Ｍａｃｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：４１−５１（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子は、ｇｃｔＡ及びｇｃｔＢである。この酵素は、グルタリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ及びアクリリル−ＣｏＡを含む幾つかの代替基質に対して、低いが検出可能な活性を示す（Ｂｕｃｋｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：３１５−３２１（１９８１年））。この酵素は、大腸菌でクローニングされ、発現している（Ｍａｃｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：４１−５１（１９９４年））。グルタコネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性は、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）及びクロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）でも検出されている。アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡドナーとしてアセチル−ＣｏＡを利用する。この酵素は、大腸菌のａｔｏＡ（αサブユニット）及びａｔｏＤ（βサブユニット）遺伝子によりコードされている（Ｋｏｒｏｌｅｖら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８：２１１６−２１２１（２００２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８年））。この酵素は広い基質範囲を有し（Ｓｒａｍｅｋら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１：１４−２６（１９７５年））、アセチル−ＣｏＡからイソ酪酸（Ｍａｔｔｈｉｅｓら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８：１４３５−１４３９（１９９２年））、吉草酸及びブタン酸（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８年））を含む様々な基質にＣｏＡ部分を転移することが示されている。類似の酵素が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２（Ｄｕｎｃａｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５１８６−５１９０（２００２年））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０年）；Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：３２３−３２９（１９８９年））及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））に存在する。
【０２８１】
【表１５】
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【０２８２】
３．１．２．ａ  ＣｏＡヒドロラーゼ：３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡは、ＥＣクラス３．１．２におけるＣｏＡヒドロラーゼ又はチオエステラーゼによって、対応する酸に加水分解され得る（図３の工程Ｂ）。芳香族基質を加水分解する例示的なＣｏＡチオエステルとしては、ベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２３）及びフェニルアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２５）が挙げられる。アゾアルカス・エバンシイ（Ａｚｏａｒｃｕｓ  ｅｖａｎｓｉｉ）の遺伝子ｏｒｆ１は、安息香酸代謝に関与するベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする（Ｉｓｍａｉｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９０：４５１−４６０（２００８年））。この酵素は、大腸菌において異種発現させたとき、多くの代替基質に対して活性を示した。配列類似性により、更なるベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ酵素が、マグネトスピリラム・マグネトタクチカム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ）、ジャナスチア属（Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ）の種ＣＣＳ１、及びサジッツラ・ステラータ（Ｓａｇｉｔｔｕｌａ  ｓｔｅｌｌａｔａ）Ｅ−３７の安息香酸分解遺伝子クラスターにおいて同定された。シュードモナス属の種ＣＢＳ３の４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼは、代替基質ベンゾイル−ＣｏＡ及びｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡに対して活性を示し、また、大腸菌で異種発現され、特性評価されている（Ｓｏｎｇら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：１−１０（２００７年））。アリール−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素としては、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のパルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（Ｗａｎｇら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４：５４３−５５１（２００７年））及びｅｎｔＨによりコードされている大腸菌のアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（Ｇｕｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８：１７１２−１７２２（２００９年））が挙げられる。
【０２８３】
【表１６】
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【０２８４】
広い基質範囲を有する幾つかの更なるＣｏＡヒドロラーゼは、ベンゾイル−ＣｏＡ及び／又はｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡを加水分解するのに適している。例えば、ラットの脳に由来するａｃｏｔ１２によってコードされる酵素（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７１：９５９−９６５（１９７６年））は、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡと反応することができる。ａｃｏｔ８によってコードされるヒトのジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、スベリル−ＣｏＡ、セバシル−ＣｏＡ及びドデカンジオイル−ＣｏＡに対する活性を示す（Ｗｅｓｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８１２５−３８１３２（２００５年））。また、この酵素に最も近い大腸菌ホモログｔｅｓＢも、様々なＣｏＡチオールエステルを加水分解することができる（Ｎａｇｇｅｒｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１１０４４−１１０５０（１９９１年））。また、類似の酵素が、ラットの肝臓において特性評価されている（Ｄｅａｎａ  Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ２６：７６７−７７３（１９９２年））。大腸菌においてヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素としては、ｙｂｇＣ、ｐａａＩ及びｙｂｄＢが挙げられる（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，２００５，２９（２）：２６３−２７９；Ｓｏｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００６，２８１（１６）：１１０２８−３８）。
【０２８５】
【表１７】
2013535203.tif 000019
【０２８６】
４．１．１ａ．カルボキシ−リアーゼ：ＥＣクラス４．１．１におけるデカルボキシラーゼ酵素は、図１〜３における幾つかの転換を触媒するのに必要である。フェニルピルビン酸のフェニルアセトアルデヒドへの変換（図１の工程Ｂ）は、ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される。フェニル酢酸のトルエンへの脱炭酸（図１の工程Ｄ）は、フェニル酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により触媒される。３−オキソ酸デカルボキシラーゼは、ベンゾイル酢酸のアセトフェノンへの脱炭酸（図７の工程Ｃ）に必要である。デカルボキシラーゼ（カルボキシリアーゼとしても知られている）は、カルボン酸基を有する有機化合物又は細胞内代謝物からの二酸化炭素の喪失を触媒する。デカルボキシラーゼは、本来優勢であり、補因子としてピリドキサールリン酸又はピリドキサールピルビン酸のいずれかを必要する場合もあるが、多くは、補因子の結合を必要としない。５０を超えるデカルボキシラーゼ酵素が、報告され、生化学的方法及び／又は分析法により特性評価されている。
【０２８７】
フェニル酢酸デカルボキシラーゼは、フェニル酢酸のトルエンへの脱炭酸（図１の工程Ｄ）を触媒するのに必要である。このような活性は、特性評価されているデカルボキシラーゼ酵素において現在まで検出されていない。類似の反応を触媒する酵素は、自然界で４−ヒドロキシフェニル酢酸をｐ−クレゾールに脱炭酸する４−ヒドロキシフェニル酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．８３）である。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びクロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）に由来する、特性評価されている４−ヒドロキシフェニル酢酸デカルボキシラーゼ酵素は、２つのサブユニットで構成され、特定の活性化酵素による活性化を必要とする（Ｙｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：９５８４−９５９２（２００６年）；Ａｎｄｒｅｉら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：２２２５−２２３０（２００４年））。Ｃ．スカトロゲネスではｃｓｄＡＢＣにより、そしてＣ．ディフィシレではｈｐｄＡＢＣによりコードされているこれら酵素は、大腸菌で異種発現されている。別の適切な酵素は、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）のアリールマロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７６）であり、これは、構造上関連する基質である２−フェニルプロピオン酸に対する活性を有する（Ｙａｔａｋｅら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８：７９３−７９９（２００８年））。この酵素の配列は、Ｙａｔａｋｅらによる刊行物から入手可能であるが；この酵素は、現在までＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が割り当てられていない。ＡＭＤＡ＿ＢＯＲＢＲによってコードされている気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）由来の関連酵素（９８％のアミノ酸同一性）が、最近結晶化された（Ｋｕｅｔｔｎｅｒら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７７：３８６−３９４（２００８年））。
【０２８８】
【表１８】
2013535203.tif 000020
【０２８９】
フェニルピルビン酸のフェニルアセトアルデヒドへの変換（図１、工程Ｂ）は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により触媒される。幾つかのケト酸デカルボキシラーゼ酵素は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４３）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１）、分枝鎖アルファケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７２）及びギ酸ベンジルデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７）を含むフェニルピルビン酸に対する活性が実証されている。例示的なフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）のｉｐｄＣ遺伝子によってコードされている（Ｓｐａｅｐｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：７６２６−７６３３（２００７年））。フェニルピルビン酸は、この酵素が好む基質である。また、遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６及びＡＲＯ１０によってコードされている出芽酵母の酵素も、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を示す（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８０２８−８０３４（２００３年））。フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する他の酵素としては、ザイゴサッカロミセス・ビスポラス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）のピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素（Ｎｅｕｓｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１：３４９−３５３（２０００年））、結核菌Ｈ３７Ｒｖ及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の分枝鎖２−オキソ酸デカルボキシラーゼ酵素（Ｇｏｃｋｅら，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３４９：１４２５−１４３５（２００７年）；Ｗｅｒｔｈｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：５３４４−５３５４（２００８年））、及びシュードモナス・プチダのギ酸ベンジルデカルボキシラーゼ酵素（Ｓｉｅｇｅｒｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １８：３４５−３５７（２００５年））が挙げられる。別の適切な酵素はザイモモナス・モビルス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｕｓ）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼであるが、その理由は、この酵素が広い基質範囲を有し、基質特異性を変化させるための指向改変研究の対象であったためである（Ｓｉｅｇｅｒｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １８：３４５−３５７（２００５年））。
【０２９０】
【表１９】
2013535203.tif 000021
【０２９１】
ベンゾイル酢酸のアセトフェノンへの脱炭酸（図３の工程Ｃ）は、ベンゾイル酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この活性を有するＡＴＰ依存性酵素であるアセトフェノンカルボキシラーゼは、アロマトレウム・アロマチカムＥｂＮ１においてエチルベンゼン分解中に逆（カルボキシル化）方向に作用する（Ｒａｂｕｓら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７８：５０６−５１６（２００２年））。この酵素はａｐｃ１〜５によってコードされる５つのサブユニットで構成され、カルボキシル化の方向においてＡＴＰ依存性である（ＡＭＰの形成）。配列相同性によって、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）及びルブロバクター・キシラノフィラス（Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ）において類似する酵素が見出されている。
【０２９２】
【表２０】
2013535203.tif 000022
【０２９３】
あるいは、３−オキソ酸デカルボキシラーゼは、ベンゾイル酢酸をアセトフェノンに変換することができる。例示的な３−オキソ酸デカルボキシラーゼは、アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）であり、これは、自然界ではアセト酢酸をアセトン及びＣＯ２に変換する。ａｄｃによってコードされているクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素は広い基質範囲を有し、ベンゾイル酢酸のアセトフェノンへの望ましい脱炭酸を触媒することが示されている（Ｒｏｚｚｅｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：４９３７−４９４１（１９８４年）；Ｂｅｎｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：９９３−９９４（１９８１年）；Ａｕｔｏｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：５２１４−５２２２（１９７０年））。関連するアセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・ベエイジェリンキーにおいて特性評価されている（Ｒａｖａｇｎａｎｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：１１７２−１１８５（２０００年））。また、無細胞抽出物において特性評価されているバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼは、３−ケト酸について広い基質特異性を有し、３−オキソペンタン酸を脱炭酸することができる（Ｍａｔｉａｓｅｋら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：２７６−２８１（２００１年））。この酵素をコードする遺伝子は、現在まで同定されておらず、Ｂ．ポリミキサのゲノム配列も未だ利用可能ではない。別のａｄｃは、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムでみられる（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））。配列相同性により、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＦＺＢ４２を含む他の生物における更なる遺伝子を推測することができる。
【０２９４】
【表２１】
2013535203.tif 000023
【０２９５】
４．１．９９．ａ  デカルボニラーゼ：デカルボニラーゼ酵素は、フェニルアセトアルデヒドをトルエンに変換するのに必要である（図１の工程Ｅ）。デカルボニラーゼ酵素は、植物、哺乳類、昆虫及び細菌におけるアルカン生合成の最後の工程を触媒する（Ｄｅｎｎｉｓら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８７：２６８−２７５（１９９１年））。非酸化的デカルボニラーゼは、同時にＣＯを放出しながらアルデヒドをアルカンに転換し、一方、酸化的デカルボキシラーゼは、補因子としてＮＡＤＰＨ及びＯ２を利用し、ＣＯ２、水及びＮＡＤＰ＋を放出するシトクロムＰ４５０酵素である。例示的なデカルボニラーゼ酵素としては、オクタデカナールデカルボニラーゼ（ＥＣ４．１．９９．５）、ステロールデサチュラーゼ及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。コバルト−ポルフィリン含有デカルボニラーゼは、藻類ボツリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）において精製され、特性評価されたが；この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されていない（Ｄｅｎｎｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８９：５３０６−５３１０（１９９２年））。エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来の銅含有デカルボニラーゼも精製され、特性評価されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｂｅｌｈａｄｄａｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７７：３４１−３４９（２０００年））。シロイヌナズナのＣＥＲ１遺伝子は、エピクチクラのろう形成に関与する脂肪酸デカルボニラーゼをコードしている（米国特許第６，４３７，２１８号）。更なる脂肪酸デカルボニラーゼは、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）及びイネでみられる（米国特許出願公開第２００９／００６１４９３号）。
【０２９６】
【表２２】
2013535203.tif 000024
【０２９７】
酸化的デカルボニラーゼ酵素は、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＣＹＰ４Ｇ２ｖ１及びＣＹＰ４Ｇ１遺伝子産物によってコードされている（米国特許出願公開第２０１０／０１３６５９５号）。酸化的デカルボニラーゼ活性を有する更なる酵素は、配列相同性により、他の生物、例えば、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、メリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、及びエンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）において同定することができる。
【０２９８】
【表２３】
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【０２９９】
４．１．９９．ｂ  リアーゼ：図２におけるフェニルアラニンのベンゼンへの変換は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ活性を有する酵素により触媒される。必要な新規活性は、同時にピルビン酸及びアンモニアを放出しながら、可逆的にチロシン及びフェノールを相互変換するチロシンフェノールリアーゼ（ＥＣ４．１．９９．２）の活性に類似している。ｔｕｔＡによってコードされているパンテア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）（旧エルウイニア・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ））由来の酵素は、ジヒドロキシフェニルアラニンを含む様々な置換誘導体と反応する（Ｆｏｏｒら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９：３０７０−３０７５（１９９３年））。この酵素は、大腸菌において異種発現され、カテコール、ピルビン酸及びアンモニアからジヒドロキシフェニルアラニンを合成するために利用された。更なるチロシンフェノール−リアーゼ酵素は、シトロバクター・インターメディウス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）（Ｎａｇａｓａｗａら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：３３−４０（１９８１年））、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６４７：１６７−１７２（２００３年））及びシンビオバクテリウム・サーモフィラム（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｈｉｒａｈａｒａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：３４１−３４６（１９９３年））でみられる。シトロバクター・フロインデイの酵素は、構造的に特性評価されており、基質結合に関与する残基が同定された（Ｍｉｌｉｃら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２９２０６−２９２１４（２００８年））。フェニルアラニンは、任意の特性評価されているチロシンフェノールリアーゼ酵素の天然基質ではなく；むしろ、幾つかの酵素の阻害剤として作用することが示されている。この活性を獲得し、且つ性能を改善するために、当技術分野において周知である指向進化又は他のタンパク質工学的アプローチが必要になる可能性がある。
【０３００】
【表２４】
2013535203.tif 000026
【０３０１】
同様の反応を触媒する酵素は、トリプトファナーゼとも呼ばれるトリプトファンインドールリアーゼ（ＥＣ４．１．９９．１）であり、この酵素は、トリプトファン及び水をインドール及びピルビン酸に変換する。例示的なトリプトファンインドールリアーゼ酵素としては、大腸菌のｔｎａＡ、シンビオバクテリウム・サーモフィラムのｔｎａ１、及びエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のｔｎａＡの遺伝子産物が挙げられる（Ｋｏｇａｎら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０：２０７３−２０７５（２００４年）；Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：１９３８−１９４３（１９９５年）；Ｓｕｚｕｋｉら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：３０５９−３０６６（１９９１年））。
【０３０２】
【表２５】
2013535203.tif 000027
【０３０３】
４．２．１．ａ  デヒドラターゼ：図３の工程Ｅは、１−フェニルエタノールをスチレンに変換するためにデヒドラターゼ（ＥＣ４．１．２．−）を使用する。この反応を触媒するための例示的な酵素としては、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、シトラマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３４）及びジメチルマレイン酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８５）が挙げられる。フマラーゼ酵素は、自然界において、リンゴ酸のフマル酸への可逆的な脱水を触媒する。フマラーゼ酵素の基質としての１−フェニルエタノールの適合性は、現在まで文献には記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造情報が利用可能であり、また、研究者は、活性、阻害及び局在を変化させるための酵素の改変に成功している（Ｗｅａｖｅｒ，６１：１３９５−１４０１（２００５年））。大腸菌は、３つのフマラーゼ：増殖条件により調節されるＦｕｍＡ、ＦｕｍＢ及びＦｕｍＣを有する。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気条件下でのみ活性を有する。ＦｕｍＡは、微小嫌気条件下で活性を有し、ＦｕｍＣは、好気増殖中に活性を有する唯一の酵素である（Ｔｓｅｎｇら，１８３：４６１−４６７（２００１年）；Ｗｏｏｄｓら，９５４：１４−２６（１９８８年）；Ｇｕｅｓｔら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３１：２９７１−２９８４（１９８５年））。更なる酵素は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：９６１−９７５（１９９９年））、サーマス・サーモフィラス（Ｍｉｚｏｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５：４９−５５（１９９８年））及びラット（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，８９：１９２３−１９３１（１９８１年））でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のｆｕｍ１及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｆｕｍＣが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のｍｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別のクラスのフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，２７０：２０７−２１３（２００７年））。シトラマル酸ヒドロリアーゼは、自然界で２−メチルリンゴ酸をメサコン酸に脱水する。この酵素は、広い基質特異性を有することが示されている、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）の２−オキソブタン酸へのピルビン酸経路において研究されている（Ｄｒｅｖｌａｎｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８９：４３９１−４４００（２００７年））。この酵素活性は、破傷風様菌、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、シトロバクター・アマロナティカス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）でも検出され、これら細菌においてグルタミン酸分解に関与していると考えられる（Ｋａｔｏ及びＡｓａｎｏ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７年））。Ｍ．ジャナスキイのタンパク質配列は、これらの生物における遺伝子に対してそれほど高い相同性を有する訳ではない。ジメチルマレイン酸ヒドラターゼは、ジメチルマレイン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍａｅａｔｅ）を水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける、可逆的なＦｅ２＋依存性且つ酸素感受性の酵素である。この酵素は、ユーバクテリウム・バーケリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ）におけるｄｍｄＡＢによってコードされている（Ａｌｈａｐｅｌら，上記；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６５：８４７−８５７（１９８４年））。
【０３０４】
【表２６】
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【０３０５】
６．２．１．ａ  酸−チオールリガーゼ：３−オキソ−３−フェニルプロピオニル−ＣｏＡのベンゾイル酢酸への変換（図３の工程Ｂ）は、ＥＣクラス６．２．１におけるＣｏＡシンテターゼ又は酸−チオールリガーゼによって触媒され得る。この正確な転換を触媒するＡＴＰ形成ＣｏＡシンテターゼは、現在まで特性評価されていないが；広い基質特異性を有する幾つかの酵素は、文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされているアーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来のＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、イソ酪酸、イソペンタン酸及びフマル酸を含む様々な直鎖及び分岐鎖の基質に対して作用することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。ＡＦ１９８３によってコードされているアーケオグロブス・フルギダスにおける第２の可逆的なＡＣＤも、芳香族化合物フェニル酢酸及びインドール酢酸に対して活性が高く広い基質範囲を有することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら，上記）。スクシニル−ＣｏＡシンテターゼであるとアノテーションされたハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）由来の酵素は、基質としてプロピオン酸、酪酸及び分枝鎖酸（イソ吉草酸及びイソ酪酸）を受容し、順方向及び逆方向に作用することが示された（Ｂｒａｓｅｎら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年））。超好熱性古細菌であるピロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）由来のＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、全ての特性評価されているＡＣＤのうち最も広い基質範囲を示し、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）、及びフェニルアセチル−ＣｏＡと反応する（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年））。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。Ａ．フルギダス、Ｈ．マリスモルツイ及びＰ．アエロフィラム由来の酵素は全て大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年）；Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。更なる酵素は、大腸菌におけるｓｕｃＣＤによってコードされており、これは、自然界では、１つのＡＴＰを消費すると同時にコハク酸からスクシニル−ＣｏＡへの形成を触媒する（この反応は、インビボにおいて可逆的である）（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５年））。シュードモナス・プチダ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが実証されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒ���ｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３年））。関連する酵素であるリゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）由来のマロニル−ＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができた（Ｐｏｈｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５８２２−５８２３（２００１年））。
【０３０６】
【表２７】
2013535203.tif 000029
【０３０７】
実施例ＩＩ  １，３−ブタジエンからムコン酸異性体への経路
この実施例は、ムコン酸異性体から１，３−ブタジエンへの経路を示す。
【０３０８】
図４は、デカルボキシラーゼ酵素によるムコン酸異性体の１，３−ブタジエンへの変換を示す。シス，シス−ムコン酸、シス，トランス−ムコン酸、又はトランス，トランス−ムコン酸は、まず、シス−２，４−ペンタジエノエート又はトランス−２，４−ペンタジエノエートのいずれかに脱炭酸される（図４の工程Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）。２，４−ペンタジエノエートは、次いで、脱炭酸されて１，３−ブタジエンを形成する（図４の工程Ｅ、Ｆ）。
【０３０９】
任意のムコン酸異性体の脱炭酸が、１，３−ブタジエンへの経路の一部として機能し得ることが理解される。シス，シス−ムコン酸の生物学的生成は、当技術分野において周知である（Ｄｒａｔｈｓ及びＦｒｏｓｔ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１１６：３９９−４００（１９９４年）；Ｎｉｕら．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１８：２０１−２１１（２００２年）；Ｂａｎｇ及びＣｈｏｉ．Ｊ  Ｆｅｒｍ  Ｂｉｏｅｎｇ．７９（４）：３８１−３８３（１９９５年））。ムコン酸の異性体は、ＥＣクラス５．２．１におけるムコン酸イソメラーゼ酵素により相互に変換され得る。
【０３１０】
更に、２，４−ペンタジエノエートのいずれかの異性体の脱炭酸により１，３−ブタジエンが形成されることが理解される。あるいは、２，４−ペンタジエノエートは、ムコン酸以外の出発物質から形成することもできる（例えば、ペンタ−２−エノエート又はペンタ−４−エノエートの脱水素を介する第２の二重結合の導入；ヒドロラーゼ、シンテターゼ、又はトランスフェラーゼを介する２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡからのＣｏＡの除去、それぞれアルデヒド又はアルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼを介する４−ペンタジエナール又は２，４−ペンタジエノールの脱水素）。２，４−ペンタジエノエートの異性体は、ＥＣクラス５．２．１におけるイソメラーゼ酵素により相互に変換され得る。
【０３１１】
多数のデカルボキシラーゼ酵素が特性評価されており、構造的に類似する基質をムコン酸又は２，４−ペンタジエノエート異性体に脱炭酸することが示されている。例示的な酵素としては、ソルビン酸デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１６）、４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）、ケイ皮酸デカルボキシラーゼ及びフェルラ酸デカルボキシラーゼが挙げられる。これら酵素は、図４に示す通り、ムコン酸及び／又は２，４−ペンタジエノエートを脱炭酸するために本発明において用いるために適用可能である。
【０３１２】
密接に関連する機能を有する１つのデカルボキシラーゼ酵素は、ソルビン酸を１，３−ペンタジエンに変換するソルビン酸デカルボキシラーゼである。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）によるソルビン酸の脱炭酸は、３つの遺伝子：ｐａｄＡ１、ｏｈｂＡ１、及びｓｄｒＡを必要とする（Ｐｌｕｍｒｉｄｇｅら．Ｆｕｎｇ．Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏ，４７：６８３−６９２（２０１０年）。ＰａｄＡ１は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼとしてアノテーションされており、ｏｈｂＡ１は、推定４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼであり、ｓｄｒＡは、ソルビン酸デカルボキシラーゼの調節因子である。また、幾つかの菌類及び酵母の種を含む更なる種もソルビン酸を脱炭酸することが示されている（Ｋｉｎｄｅｒｌｅｒｌｅｒ及びＨａｔｔｏｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔ  Ｃｏｎｔａｍ．，７（５）：６５７−６９（１９９０年）；Ｃａｓａｓら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏ．，９４（１）：９３−９６（２００４年）；Ｐｉｎｃｈｅｓ及びＡｐｐｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１６：１８２−１８５（２００７年））。例えば、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）及びネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）は、ソルビン酸を脱炭酸し、ｐａｄＡ１、ｏｈｂＡ１、及びｓｄｒＡに近いホモログを有することが示されている。
【０３１３】
【表２８】
2013535203.tif 000030
【０３１４】
アコニット酸デカルボキシラーゼは、本発明における別の有用な酵素である。この酵素は、カンジダ属の株、また糸状菌アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）においてもイタコネート生合成の最後の工程を触媒する（Ｂｏｎｎａｒｍｅら．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３５７３−３５７８（１９９５年）；Ｗｉｌｌｋｅ及びＶｏｒｌｏｐ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５６：２８９−２９５（２００１年））。アコニット酸デカルボキシラーゼは、アスペルギルス・テレウスから精製され、特性評価されている（Ｄｗｉａｒｔｉら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（１）：２９−３３（２００２年））。シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）酵素の遺伝子及びタンパク質の配列は、以下の表に列挙する幾つかの近いホモログとともに、既に報告されている（欧州特許出願公開第２０１７３４４  Ａ１号；国際公開第２００９／０１４４３７  Ａ１号）。
【０３１５】
【表２９】
2013535203.tif 000031
【０３１６】
４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼは、４−オキサロクロトン酸の２−オキソペンタン酸への脱炭酸を触媒する。この酵素は、多数の生物から単離され、特性評価されている。この酵素をコードする遺伝子としては、シュードモナス属の種（株６００）におけるｄｍｐＨ及びｄｍｐＥ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，１７４：７１１−７２４（１９９２年））、シュードモナス・プチダ由来のｘｙｌＩＩ及びｘｙｌＩＩＩ（Ｋａｔｏら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７年）；Ｓｔａｎｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：３５１４（２０００年）；Ｌｉａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１０４０３−１０４１１（１９９４年））、並びにラルストニア・ユートロファＪＭＰ１３４由来のＲｅｕｔ＿Ｂ５６９１及びＲｅｕｔ＿Ｂ５６９２（Ｈｕｇｈｅｓら，１５８：７９−８３（１９８４年））が挙げられる。シュードモナス属の種（株６００）由来の酵素をコードする遺伝子は、大腸菌でクローニングされ、発現している（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，１７４：７１１−７２４（１９９２年））。
【０３１７】
【表３０】
2013535203.tif 000032
【０３１８】
最後に、ケイ皮酸（フェニルアクリレート）及び置換ケイ皮酸誘導体の対応するスチレン誘導体への変換を触媒するデカルボキシラーゼの分類が特性評価されている。これら酵素は、様々な生物に共通であり、また、大腸菌でクローニングされ、発現しているこれら酵素をコードする具体的な遺伝子としては、出芽酵母由来のｐａｄ１（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｇｅｎｅ  １４２：１０７−１１２（１９９４年））、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら，６７：１０６３−１０６９（２００１年）；Ｑｉら，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ９：２６８−２７６（２００７年）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６：３０６８−３０７２（２００８年））、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）由来のｐｏｆＫ（ｐａｄ）（Ｕｃｈｉｙａｍａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：１１６−１２３（２００８年）；Ｈａｓｈｉｄｏｋｏら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：２１７−２１８（１９９４年））、ペジコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら，６７：１０６３−１０６９（２００１年））、並びに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）由来のｐａｄＣ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，１７４：７１１−７２４（１９９２年））が挙げられる。シュードモナス・フルオレッセンス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼも、精製され、特性評価されている（Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５９１２−５９１８（１９９４年））。この分類における酵素は安定であり、外因性の又は内部的に結合する補因子を必要としないので、これら酵素は生体内転換に理想的に適している（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：５１−６９（２００７年））。
【０３１９】
【表３１】
2013535203.tif 000033
【０３２０】
上記列挙したデカルボキシラーゼはそれぞれ、図４に示す望ましい転換に対して可能な適する酵素を表す。望ましい変換（例えば、ムコン酸から２，４−ペンタジエノエート、２，４−ペンタジエノエートからブタジエン）において酵素の望ましい活性又は生産能がみられない場合、デカルボキシラーゼ酵素は必要な性能を実現するために公知のタンパク質工学的方法を使用して進化させることができる。重要なことに、デカルボキシラーゼのＣ末端領域が基質特異性に関与していると考えられることが、キメラ酵素の使用を通じて示された（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓ，Ｌ．；Ｄｉｖｉｅｓ，Ｃ．；Ｃａｖｉｎ，Ｊ．−Ｆ．２００１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  Ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｈｅｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，１０６３−１０６９．）。したがって、ムコン酸又は２，４−ペンタジエノエートに対する活性を得るためにデカルボキシラーゼの特異性を広げるための指向進化実験は、これら酵素のＣ末端領域に集中してもよい。
【０３２１】
図４における転換を触媒するのに必要なデカルボキシラーゼのうちの幾つかは、ムコン酸又は２，４−ペンタジエノエートの特定の異性体に対してより高い活性を示し得る。イソメラーゼ酵素は、脱炭酸にとってそれほど望ましくないムコン酸又は２，４−ペンタジエノエートの異性体をより望ましい異性体に変換するために適用することができる。類似する変換を触媒し、ひいては本発明に適する酵素を表す例示的なイソメラーゼとしては、マレイン酸シス−トランスイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）、マレイルアセトンシス−トランスイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．２）及び脂肪酸シス−トランスイソメラーゼが挙げられる。マレイン酸シス−トランスイソメラーゼは、フマル酸をマレイン酸に変換する。この酵素は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら，１９９７年，Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｅａｔｅ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍ．２３９，７４−７９）又はセラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：１４７７−１４８５（２０００年））由来のｍａｉＡ遺伝子によってコードされている。配列相同性によって同定することができる類似の遺伝子としては、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラルストニア・ピッケティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）１２Ｄ、及びラルストニア・ユートロファＨ１６由来のものが挙げられる。更なるマレイン酸シス−トランスイソメラーゼ酵素は、そのアミノ酸配列が参照文献（Ｍｕｋｏｕｙａｍａら、米国特許第６，１３３，０１４号）に配列番号１〜４として提供されている酵素によってコードされている。マレイルアセトンシス，トランス−イソメラーゼは、４−マレイル−アセト酢酸の４−フマリル−アセチル酢酸への変換（シスからトランスへの変換）を触媒する。この酵素は、緑膿菌（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｎｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２９−３３７（１９９８年）））及びコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）（Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：２１５−２２２（１９７３年））におけるｍａｉＡによってコードされている。配列相同性によって、大腸菌Ｏ１５７において類似する酵素が同定された。ｃｔｉ遺伝子産物は、シス−不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）のトランス−ＵＦＡへの変換を触媒する。酵素は、Ｐ．ブチダにおいて特性評価されている（Ｊｕｎｋｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：５６９３−５７００（１９９９年））。類似する酵素が、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）の種ＭＲ−４及びコレラ菌でみられる。
【０３２２】
【表３２】
2013535203.tif 000034
【０３２３】
実施例ＩＩＩ
（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホン酸を生成するための例示的な経路
この実施例は、テレフタル酸（ＰＴＡ）前駆体（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホン酸（２Ｈ３Ｍ４ＯＰ）を生成するための例示的な経路について記載する。
【０３２４】
ｐ−トルイル酸及びＰＴＡ経路の前駆体は、２Ｈ３Ｍ４ＯＰである。この化学物質は、図５に示す３つの酵素的段階で、中央代謝産物グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸から誘導することができる。最初の２つの段階は、大腸菌、及びイソプレノイドを生合成するためにメチルエリスリトールリン酸（非メバロン酸）経路を利用する他の生物において自然界で行われる。ピルビン酸及びＧ３Ｐは、まず、ＤＸＰシンテターゼによって縮合されて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を形成する。続く炭素骨格の還元及び再配置は、ＤＸＰレダクトイソメラーゼによって触媒される。最後に、新規ジオールデヒドラターゼが、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸をｐ−トルイル酸前駆体２Ｈ３Ｍ４ＯＰに転換する。
【０３２５】
Ａ．１−デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）シンテターゼ。ピルビン酸及びＧ３Ｐは、ＤＸＰシンテターゼ（ＥＣ２．２．１．７）によって縮合されて、ＤＸＰを形成する。この酵素は、イソプレノイドを生合成する非メバロン酸経路の最初の段階を触媒する。前記酵素は、補因子としてチアミン二リン酸を必要とし、また、還元ＦＡＤを必要とするが、正味の酸化還元変化は存在しない。大腸菌の酵素の結晶構造は利用可能である（Ｘｉａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２６７６−２６８２（２００７年））。他の酵素は、結核菌（Ｂａｉｌｅｙら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：８１３−８２０（２００２年）及びアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２８：５５５−５６６（２００７年））においてクローニングされ、特性評価されている。枯草菌及びシネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３由来のＤＸＰシンテターゼ酵素は、大腸菌でクローニングされた（Ｈａｒｋｅｒ及びＢｒａｍｌｅｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４８：１１５−１１９（１９９９年））。
【０３２６】
【表３３】
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【０３２７】
Ｂ．１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＥＣ１．１．１．２６７）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）の２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸へのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元及び再配置は、イソプレノイドを生合成するための非メバロン酸経路の第２の段階においてＤＸＰレダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ、ＥＣ１．１．１．２６７）によって触媒される。ＮＡＤＰＨ依存性の大腸菌の酵素は、ｄｘｒによりコードされている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：９８７９−９８８４（１９９８年））。シロイヌナズナ由来の組み換え酵素は、大腸菌において機能的に発現した（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ−Ｐａｕｌｅｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１５８１−１５９１（２００２年））。ザイモモナス・モビルス及び結核菌由来のＤＸＲ酵素は、特性評価されており、結晶構造も利用可能である（Ｇｒｏｌｌｅら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９１：１３１−１３７（２０００年））；Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６２：８０７−８１３（２００６年））。特性評価されているＤＸＲ酵素の大部分は、厳密にＮＡＤＰＨ依存性であるが、シロイヌナズナ及び結核菌由来の酵素は、低い割合でＮＡＤＨと反応する（Ａｒｇｙｒｏｕ及びＢｌａｎｃｈａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４３７５−４３８４（２００４年））；Ｒｏｈｄｉｃｈら，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７３：４４４６−４４５８（２００６年））。
【０３２８】
【表３４】
2013535203.tif 000036
【０３２９】
Ｃ．２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸デヒドラターゼ。ジオールデヒドラターゼは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸をｐ−トルイル酸前駆体に変換するのに必要である（Ａｌｔｍｉｌｌｅｒ及びＷａｇｎｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３８：１６０−１７０（１９７０年））。この転換は実験的に実証されていないが、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）、プロパンジオールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８）、グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３０）及びミオイノシトールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．４４）を含む幾つかの酵素は、類似の転換を触媒する。
【０３３０】
二級ジオールである２，３−ブタンジオールを２−ブタノンに変換することができるジオールデヒドラターゼ又はプロパンジオールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．２８）は、この転換についての優れた候補である。アデノシルコバラミン依存性ジオールデヒドラターゼは、アルファ、ベータ及びガンマサブユニットを含有し、これらは全て酵素の機能に必要である。例示的な遺伝子候補は、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１７７４−１７７７（１９９８年）；Ｔｏｒａｙａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６９：４７５−４８０（１９７６年））、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（Ｂｏｂｉｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６６３３−６６３９（１９９７年））、クレブシエラ・オキシトカ（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７１４２−７１４８（１９９５年））及びラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）（Ｓａｕｖａｇｅｏｔら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０９：６９−７４（２００２年））でみられる。他の生物におけるジオールデヒドラターゼ遺伝子候補を単離する方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６８６，２７６号を参照されたい）。
【０３３１】
【表３５】
2013535203.tif 000037
【０３３２】
グリセロールデヒドラターゼファミリー（ＥＣ４．２．１．３０）の酵素も、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を脱水するために使用することができる。例示的な遺伝子候補は、肺炎杆菌におけるｇｌｄＡＢＣ及びｄｈａＢ１２３（国際公開第２００８／１３７４０３号及びＴｏｒａｙａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６９：４７５−４８０（１９７６年））、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒａｎｕｍ）におけるｄｈａＢＣＥ（Ｍａｃｉｓら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１６４：２１−２８（１９９８年））、及びシトロバクター・フロインデイにおけるｄｈａＢＣＥ（Ｓｅｙｆｒｉｅｄら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５７９３−５７９６（１９９６年））によってコードされている。ベータサブユニットの２つの残基に突然変異を導入することにより、８０〜３３６倍増強された活性を有する肺炎杆菌由来のＢ１２依存性ジオールデヒドラターゼの変異体が最近作製された（Ｑｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４４：４３−５０（２００９年））。低い不活化速度を有するジオールデヒドラターゼ酵素は、エラープローンＰＣＲを用いてＤｕＰｏｎｔにより開発された（国際公開第２００４／０５６９６３号）。
【０３３３】
【表３６】
2013535203.tif 000038
【０３３４】
Ｂ１２依存性ジオールデヒドラターゼを利用する場合、対応する再活性化因子の異種発現が推奨される。Ｂ１２依存性ジオールデヒドラターゼは、基質及び幾つかの下流産物による作用機序に基づく自殺活性化を起こす。不活性コバラミンとの緊密な結合により引き起こされる不活化は、ＡＴＰ依存性プロセスにおけるジオールデヒドラターゼ再活性化因子により部分的に克服することができる。Ｂ１２補因子の再生は、更なるＡＴＰを必要とする。ジオールデヒドラターゼ再生因子は、２つのサブユニットのタンパク質である。例示的な候補は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２０３４−３２０４１（１９９７年））、ネズミチフス菌（Ｂｏｂｉｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６６３３−６６３９（１９９７年）；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５４７４−５４８２（１９９４年））、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｓａｕｖａｇｅｏｔら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０９：６９−７４（２００２年））及び肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（国際公開第２００８／１３７４０３号）でみられる。
【０３３５】
【表３７】
2013535203.tif 000039
【０３３６】
Ｂ１２非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素は、補因子としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を利用し、厳密な嫌気条件下で機能し、特定の活性化酵素による活性化を必要とする（Ｆｒｅｙら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０３：２１２９−２１４８（２００３年））。ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ２によってコードされている酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）のグリセロールデヒドロゲナーゼ及び対応する活性化因子は、よく特性評価されている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４６３５−４６４５（２００４年）；Ｒａｙｎａｕｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：５０１０−５０１５（２００３年））。この酵素は、大腸菌の１，３−プロパンジオール過剰産生株において最近使用され、非常に高力価の産物を得ることができた（Ｔａｎｇら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：１６２８−１６３４（２００９年））。ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）由来の更なるＢ１２非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素及び活性化因子は、２，３−ブタンジオールの２−ブタノンへの変換を触媒することが示された（米国特許出願公開第２００９／０９１５５８７０号）。
【０３３７】
【表３８】
2013535203.tif 000040
【０３３８】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ、ＥＣ４．２．１．９）は、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与するＢ１２非依存性酵素である。そのネイティブな役割においては、２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸をイソロイシンの前駆体である２−ケト−３−メチル−吉草酸に変換する。バリンの生合成においては、前記酵素は、２，３−ジヒドロキシ−イソ吉草酸の２−オキソイソ吉草酸への脱水を触媒する。スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来のＤＨＡＤは広い基質範囲を有し、そして、大腸菌において発現した組み換え酵素の活性が様々なアルドン酸に対して実証された（Ｋｉｍ及びＬｅｅ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：５９１−５９６（２００６年））。Ｓ．ソルファタリカス酵素は、多くのジオールデヒドラターゼ酵素とは異なり酸素耐性である。ｉｌｖＤによってコードされている大腸菌の酵素は、その鉄−硫黄クラスターを不活化する酸素に対して感受性である（Ｆｌｉｎｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４７３２−１４７４２（１９９３年））。類似する酵素がアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ａｌｔｍｉｌｌｅｒ及びＷａｇｎｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３８：１６０−１７０（１９７０年））及びネズミチフス菌（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４９８：２８２−２９３（１９７７年））で特性評価されている。
【０３３９】
【表３９】
2013535203.tif 000041
【０３４０】
ジオールデヒドラターゼミオ−イノソーゼ−２−デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．４４）は、別の例示的な候補である。ミオ−イノソーゼは、隣接するアルコール基を含有する六員環である。ミオ−イノソーゼ−２−デヒドラターゼ機能をコードする精製酵素は、ミオイノシトール分解についてクレブシエラ・アエロゲネスにおいて研究されているが（Ｂｅｒｍａｎ及びＭａｇａｓａｎｉｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：８００−８０６（１９６６年））、現在まで関連する遺伝子は同定されていない。シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）のミオ−イノソーゼ−２−デヒドラターゼは、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現した（Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏｓｃｉ  ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：２９５７−２９６４（２００６年））。ｉｏｌＥによってコードされている枯草菌由来の類似する酵素についても研究されている（Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：５７１−５８０（２００４年））。
【０３４１】
【表４０】
2013535203.tif 000042
【０３４２】
実施例ＩＶ
シキミ酸経路酵素により（２−ヒドロキシ−３−メチル−４−オキソブトキシ）ホスホン酸からｐ−トルイル酸を合成するための例示的な経路
この実施例は、シキミ酸経路酵素を用いてｐ−トルイル酸を合成するための例示的な経路について記載する。
【０３４３】
ｐ−トルイル酸の化学構造は、電子伝達体ユビキノンの前駆体であるｐ−オキシ安息香酸と非常に類似している。４−ヒドロキシ安息香酸は、細菌、植物及び真菌でみられるシキミ酸経路における酵素によって中央代謝前駆体から合成される。シキミ酸経路は、Ｄ−エリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）をコリスミ酸に転換する７つの酵素的段階で構成される。経路酵素としては、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸（ＤＡＨＰ）シンテターゼ、デヒドロキナ酸（ＤＨＱ）シンテターゼ、ＤＨＱデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）シンテターゼ及びコリスミ酸シンテターゼが挙げられる。経路の最初の段階では、エリトロース−４−リン酸及びホスホエノールピルビン酸がＤＡＨＰシンテターゼによって連結されて、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソナート−７−リン酸を形成する。次いで、この化合物は脱リン酸化され、脱水され、還元されて、シキミ酸を形成する。シキミ酸は、３つの酵素：シキミ酸キナーゼ、３−ホスホシキミ酸−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びコリスミ酸シンテターゼの作用によってコリスミ酸に変換される。その後の、コリスミ酸の４−ヒドロキシ安息香酸への変換は、コリスミ酸リアーゼによって触媒される。
【０３４４】
ｐ−トルイル酸の合成は、図６に示す方法と同様の方法で進行する。前記経路は、ＰＥＰ及び２Ｈ３Ｍ４ＯＰ（Ｅ４Ｐの３−ヒドロキシル基の代りのメチル基を有するＥ４Ｐと類似する化合物）で出発する。Ｅ４Ｐのヒドロキシル基は、シキミ酸経路の反応の化学作用に直接関与しないので、メチル置換２Ｈ３Ｍ４ＯＰ前駆体が代替基質として反応すると予測される。指向又は適応進化を用いて、基質としての２Ｈ３Ｍ４ＯＰ及び下流の誘導体に対する選好性を改善することができる。このような方法は、当技術分野において周知である。
【０３４５】
また、シキミ酸経路酵素を通る流れの効率を改善するための株改変ストラテジーも適用可能である。グルコース輸送系を変化させることにより、経路前駆体ＰＥＰの利用可能性を上昇させることができる（Ｙｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：１４５０−１４５９（２００３年））。４−ヒドロキシ安息香酸過剰産生株を、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンテターゼのフィードバック非感受性アイソザイムの過剰発現を用いてシキミ酸経路を通る流れが改善されるように改変した（Ｂａｒｋｅｒ及びＦｒｏｓｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７６：３７６−３９０（２００１年））。更に、シキミ酸経路酵素及びコリスミ酸リアーゼの発現レベルが高まった。ｐ−トルイル酸を過剰産生する株において同様のストラテジーを使用することができる。
【０３４６】
Ａ．２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸シンテターゼ（ＥＣ２．５．１．５４）。エリトロース−４−リン酸及びホスホエノールピルビン酸の縮合は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸（ＤＡＨＰ）シンテターゼ（ＥＣ２．５．１．５４）によって触媒される。この酵素の３つのアイソザイムは、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ及びａｒｏＨによって大腸菌ゲノムにコードされており、それぞれ、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンによるフィードバック阻害の対象である。最小培地で増殖させた野生型の細胞では、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ及びａｒｏＨの遺伝子産物は、それぞれ、ＤＡＨＰシンテターゼ活性の８０％、２０％及び１％に寄与した（Ｈｕｄｓｏｎ及びＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８０：１０２３−１０５１（１９８４年））。ＡｒｏＧの２つの残基が、フェニルアラニンによる阻害を軽減することが見出された（Ｋｉｋｕｃｈｉら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：７６１−７６２（１９９７年））。チロシンによるＡｒｏＦのフィードバック阻害は、単一塩基対の変化により取り除かれた（Ｗｅａｖｅｒ及びＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５８１−６５８４（１９９０年））。チロシン非感受性ＤＡＨＰシンテターゼは、大腸菌の４−ヒドロキシ安息香酸過剰産生株において過剰発現した（Ｂａｒｋｅｒ及びＦｒｏｓｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７６：３７６−３９０（２００１年））。ａｒｏＧ遺伝子産物は、様々な別の４又は５炭素長の基質を受容することが示された（Ｓｈｅｆｌｙａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０（４３）：１１０２７−１１０３２（１９９８年）；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５：２３３９−２３４２（２００５年））。酵素は、（３Ｓ）−２−デオキシエリトロース−４−リン酸（エリトロース−４−リン酸と類似しているが、２位のアルコールが存在しない基質）と効率的に反応する（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，上記，２００５）。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）及びパイロコッカス・フリオサス由来の酵素も、この代替基質を受容し（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１１９５０−１１９６２（２００５年））；Ｗｅｂｂｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９０：２２３−２３０  ２００５））、大腸菌で発現している。野性型の大腸菌ＡｒｏＧ酵素とは７つのアミノ酸が異なるＤＡＨＰシンテターゼの進化した変異体は、Ｋｃａｔ／ＫＭにおいて６０倍の改良を示すことが示された（Ｒａｎ及びＦｒｏｓｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：６１３０−６１３９（２００７年））。
【０３４７】
【表４１】
2013535203.tif 000043
【０３４８】
Ｂ．３−デヒドロキナ酸シンテターゼ（ＥＣ４．２．３．４）。図２に示す通り、基質（２）（２，４−ジヒドロキシ−５−メチル−６−［（ホスホノオキシ）メチル］オキサン−２−カルボン酸）の基質（３）（１，３−ジヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸）への脱リン酸化は、３−デヒドロキナ酸シンテターゼによる３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロナート−７−リン酸の脱リン酸化と類似している。酵素は、大腸菌（Ｍｅｈｄｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：３０６−３１４（１９８７年）、枯草菌（Ｈａｓａｎ及びＮｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：４９９９−５００４（１９７８年））、及び結核菌Ｈ３７Ｒｖ（ｄｅ  Ｍｅｎｄｏｎｃａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：６２４６−６２５２（２００７年））において特性評価されている。大腸菌の酵素は、Ｌ−チロシンにより阻害される（Ｂａｒｋｅｒ及びＦｒｏｓｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７６：３７６−３９０（２００１年））。
【０３４９】
【表４２】
2013535203.tif 000044
【０３５０】
Ｃ．３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１０）。３−デヒドロキネース（ＤＨＱａｓｅ）と名付けられた３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼは、自然界において、図２のｐ−トルイル酸経路における工程Ｃと同様に、３−デヒドロキナ酸の３−デヒドロシキミ酸への脱水を触媒する。ＤＨＱａｓｅ酵素は、機序、立体化学及び配列相同性に基づいて２つのクラスに分類することができる（Ｇｏｕｒｌｅｙら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：５２１−５２５．（１９９９年））。一般に、１型酵素は生合成に関与し、一方、２型酵素は、逆（分解）方向に作用する。大腸菌（Ｋｉｎｇｈｏｒｎら，Ｇｅｎｅ  １４：７３−８０．１９８１年））、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）（Ｋｉｎｇｈｏｒｎら，上記，１９８１年；Ｓｅｒｖｏｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：１４７−１５２（１９９１年））及び枯草菌（Ｗａｒｂｕｒｇら，Ｇｅｎｅ  ３２：５７−６６  １９８４年））由来の１型酵素がクローニングされ、特性評価されている。例示的なＩＩ型の３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ酵素は、結核菌、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（Ｅｖａｎｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３０：２４−３０（２００２年））、及びヘリコバクター・ピロリ（Ｌｅｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５１：６１６−７（２００３年））でみられる。
【０３５１】
【表４３】
2013535203.tif 000045
【０３５２】
Ｄ．シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２５）。シキミ酸デヒドロゲナーゼは、図２の工程Ｄと同様に、３−デヒドロシキミ酸のシキミ酸へのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を触媒する。大腸菌ゲノムは、異なる補因子特異性を有する２つのシキミ酸デヒドロゲナーゼパラログをコードする。ａｒｏＥによってコードされている酵素は、ＮＡＤＰＨ特異的であり、一方、ｙｄｉＢ遺伝子産物は、補因子としてＮＡＤＨ（好ましい）又はＮＡＤＰＨを利用することができるキナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼである（Ｍｉｃｈｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１９４６３−１９４７２（２００３年））。結核菌（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：６２４−６３１（２００５年））、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｙｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：４１４４−４１５１（２００３年））及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈａｎら，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７３：４６８２−４６９２（２００６年））由来のＮＡＤＰＨ依存性酵素は、大腸菌において機能的に発現した。
【０３５３】
【表４４】
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【０３５４】
Ｅ．シキミ酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．７１）。シキミ酸キナーゼは、図２の工程Ｅと同様に、シキミ酸類似体の３−ヒドロキシル基のＡＴＰ依存性リン酸化を触媒する。２つのシキミ酸キナーゼ酵素が、大腸菌におけるａｒｏＫ（ＳＫ１）及びａｒｏＬ（ＳＫ２）によってコードされている（ＤｅＦｅｙｔｅｒ及びＰｉｔｔａｒｄ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：３３１−３３３（１９８６年）；Ｌｏｂｎｅｒ−Ｏｌｅｓｅｎ及びＭａｒｉｎｕｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５２５−５２９（１９９２年））。ａｒｏＬによってコードされているＳＫ２のＫｍは、ＳＫ１のＫｍよりも１００倍低く、これは、この酵素が芳香族生合成に関与することを示す（ＤｅＦｅｙｔｅｒら，上記，１９８６）。結核菌（Ｇｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１９：７７９−７８９（２００２年））；Ｏｌｉｖｅｉｒａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２２：４３０−４３５（２００１年）（ｄｏｉ：１０．１００６／ｐｒｅｐ．２００１．１４５７，ｄｏｉ；Ｓ１０４６−５９２８（０１）９１４５７−３，ｐｉｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｃｈｅｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：８１５６−８１６３（２００５年））及び黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）（Ｋｒｅｌｌら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１０：１１３７−１１４９（２００１年））由来の更なるシキミ酸キナーゼ酵素が、大腸菌でクローニングされている。
【０３５５】
【表４５】
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【０３５６】
Ｆ．３−ホスホシキミ酸−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１９）。５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンテターゼ（ＥＰＳＰＳ）としても知られている３−ホスホシキミ酸−２−カルボキシビニルトランスフェラーゼは、ホスホエノールピルビン酸のエノールピルビル部分のシキミ酸−３−リン酸の５−ヒドロキシルへの転移を触媒する。この酵素は、大腸菌におけるａｒｏＡによってコードされている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１６０４−１６１０（１９８８年））。結核菌（Ｏｌｉｖｅｉｒａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２２：４３０−４３５（２００１年））、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）（Ｙｉら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１５３−１５７（２００７年））及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｐｒｉｅｓｔｍａｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９：７２８−７３２（２００５年））由来のＥＰＳＰＳ酵素は、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現している。
【０３５７】
【表４６】
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【０３５８】
Ｇ．コリスミ酸シンテターゼ（ＥＣ４．２．３．５）。コリスミ酸シンテターゼは、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸のコリスミ酸への転換を触媒する、シキミ酸経路の７番目の酵素である。この酵素は補因子として還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を必要とするが、酵素の正味の反応は酸化還元変化を含まない。植物及び細菌でみられる酵素とは対照的に、真菌におけるコリスミ酸シンテターゼは、ＮＡＤＰＨと引き換えにＦＭＮを減少させることもできる（Ｍａｃｈｅｒｏｕｘら，Ｐｌａｎｔａ  ２０７：３２５−３３４（１９９９年））。代表的な単機能酵素は、大腸菌のａｒｏＣ（Ｗｈｉｔｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５１：３１３−３２２（１９８８年））及び肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍａｃｌｅａｎ及びＡｌｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１：１４９９−１５１１（２００３年）（ｄｏｉ：Ｓ０９６９２１２６０３００２６４８，ｐｉｉ）によってコードされている。真菌の二機能酵素は、アカパンカビ（Ｋｉｔｚｉｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４２６５８−４２６６６（２００１年））及び出芽酵母（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２１４３−２１５２（１９９１年））でみられる。
【０３５９】
【表４７】
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【０３６０】
Ｈ．コリスミ酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．４０）。コリスミ酸リアーゼは、ユビキノン生合成における最初の関与段階：コリスミ酸からピルビン酸を除去して４−ヒドロキシ安息香酸を形成する段階を触媒する。この酵素反応は、４−ヒドロキシ安息香酸生成物の緩徐な放出により速度が制限され（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４４：３０４−３１１（２００１年））、これは、下流の膜結合酵素への４−ヒドロキシ安息香酸の送達において役割を果たすと考えられる。大腸菌のコリスミ酸リアーゼは、クローニングされ、特性評価されており、またこの酵素は、結晶化されている（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら，上記，２００１；Ｓｉｅｂｅｒｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：３４７−３５０（１９９２年））。構造学的研究により、Ｇ９０残基が生成物阻害の一因とされている（Ｓｍｉｔｈら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４４５：７２−８０（２００６年））。２つの表面活性システイン残基の改変により、タンパク質の凝集が減少した（Ｈｏｌｄｅｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９４：１６０−１６７（２００２年））。組み換え型の結核菌コリスミ酸リアーゼは、大腸菌においてクローニングされ、特性評価されている（Ｓｔａｄｔｈａｇｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４０６９９−４０７０６（２００５年））。
【０３６１】
【表４８】
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【０３６２】
Ｂ−Ｆ．多機能ＡＲＯＭタンパク質。ほとんどの細菌では、シキミ酸経路酵素は別々のポリペプチドによってコードされている。微生物の真核生物では、５つの酵素機能が、五機能超遺伝子によりコードされている多機能タンパク質により触媒される（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３４：５−１３（２００４年））。多機能ＡＲＯＭタンパク質複合体は、図２の反応Ｂ〜Ｆと同様の反応を触媒する。ＡＲＯＭタンパク質複合体は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アカパンカビ、出芽酵母及びニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）を含む真菌において特性評価されている（Ｂａｎｅｒｊｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２９０１−２９１４（１９９３年）；Ｃｈａｒｌｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：２２０１−２２１３（１９８６年）；Ｃｏｇｇｉｎｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：３２５−３４１（１９８７年）；Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４６：３７５−３８６（１９８７年））。ＡＲＯＭの幾つかの構成要素は、個々のポリペプチドとして独立に機能することが示されている。例えば、デヒドロキナ酸シンテターゼ（ＤＨＱＳ）は、ＡＲＯＭのアミノ末端ドメインを形成し、大腸菌にクローニングしたとき独立に機能し得る（Ｍｏｏｒｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１（Ｐｔ１）：２９７−３０４（１９９４年））。アスペルギルス・ニデュランス由来のＡＲＯＭの構成要素の幾つかの結晶構造は、触媒機序を理解する手がかりとなる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：２９９−３０２（１９９８年））。
【０３６３】
【表４９】
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【０３６４】
実施例Ｖ
ｐ−トルイル酸をテレフタル酸に酵素転換するための例示的な経路
この実施例は、ｐ−トルイル酸をテレフタル酸（ＰＴＡ）に変換するための例示的な経路について記載する。
【０３６５】
ｐ−トルイル酸は、更に、図３に示す通り３つの酵素的段階でメチル基を酸に酸化させることによりＰＴＡに転換され得る。この経路は、ｐ−トルイル酸メチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ、４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼで構成される。最初の段階では、ｐ−トルイル酸メチル−モノオキシゲナーゼは、Ｏ２の存在下でｐ−トルイル酸を４−カルボキシベンジルアルコールに酸化する。基質としての４−トルエンスルホネートと反応する、コマモナス・テストステローニ酵素（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（ｔｓａＢＭ）は、精製され、特性評価されている（Ｌｏｃｈｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：３７４１−３７４８（１９９１年））。４−カルボキシベンジルアルコールは、次いで、４−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（ｔｓａＣ）によりアルデヒドに変換される。アルデヒドの酸への転換は、４−カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｔｓａＤ）によって触媒される。これら反応を触媒する酵素は、炭素及びエネルギーの唯一の供給源としてｐ−トルイル酸を利用することができる生物であるコマモナス・テストステローニＴ−２においてみられる（Ｊｕｎｋｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：９１９−９２７（１９９７年））。特に、バークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）及びコマモナス属のプロテオバクテリアに対する配列相同性により、ｐ−トルイル酸をＰＴＡに転換する更なる遺伝子を見出すことができる（米国特許第６，１８７，５６９号及び米国特許出願公開第２００３／０１７０８３６号）。コマモナス・テストステローニ酵素に関連するＧｅｎｂａｎｋ識別子を以下に列挙する。
【０３６６】
【表５０】
2013535203.tif 000052
【０３６７】
実施例ＶＩ ２Ｈ４ＯＰからの安息香酸の合成
この実施例は、シキミ酸経路酵素による２Ｈ４ＯＰからの安息香酸の合成（図９）、及び安息香酸経路前駆体２Ｈ４ＯＰを生成するための例示的な経路（図８）を示す。
【０３６８】
ｐ−トルイル酸のように、安息香酸の化学構造は、実施例ＩＶに上記したシキミ酸経路の生成物であるｐ−ヒドロキシ安息香酸に類似している。この実施例では、シキミ酸経路酵素を利用して、図９に示される経路によって経路前駆体（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホン酸（２Ｈ４ＯＰ）から安息香酸を合成する。２Ｈ４ＯＰに対するシキミ酸経路酵素の反応性、及び安息香酸形成において使用される代替基質は、任意で、基質としての２Ｈ４ＯＰ及び下流の誘導体に対する選好性を改善するために指向又は適応進化により最適化されてもよい。このような方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に記載される。
【０３６９】
安息香酸経路前駆体である（２−ヒドロキシ−４−オキソブトキシ）ホスホン酸（２Ｈ４ＯＰ）を合成するための例示的且つ新規な経路を図８に示す。この経路では、２Ｈ４ＯＰは、２つの酵素的段階で中央代謝産物エリトロース−４−リン酸から誘導される。最初の段階では、ジオールデヒドラターゼは、エリトロース−４−リン酸を（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホン酸（２４ＤＢＰ）に転換する。２４ＤＢＰの２−ケト基は、次いで、２４ＤＢＰレダクターゼ活性を有するオキシドレダクターゼによって２Ｈ４ＯＰのアルコールに還元される。図８の工程Ａ及びＢのための例示的な酵素を以下に示す。
【０３７０】
Ａ．エリトロース−４−リン酸デヒドラターゼ：ＥＣクラス４．２．１におけるジオールデヒドラターゼ酵素は、エリトロース−４−リン酸を２４ＤＢＰに変換するために使用される（図４、工程Ａ）。この転換を触媒する酵素は示されていないが、ジヒドロキシ−酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）、プロパンジオールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８）、グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３０）及びミオ−イノシトールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．４４）を含む幾つかの酵素は、類似の転換を触媒する。例示的なジオールデヒドラターゼ酵素は、実施例ＩＩＩに上記されている。
【０３７１】
二級ジオールである２，３−ブタンジオールを２−ブタノンに変換することができるジオールデヒドラターゼ又はプロパンジオールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．２８）を、この転換に用いることができる。アデノシルコバラミン−又はＢ１２−依存性ジオールデヒドラターゼは、アルファ、ベータ及びガンマサブユニットを含有し、これらは全て酵素の機能に用いられる。例示的な遺伝子は、肺炎杆菌（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１７７４−１７７７（１９９８年）；Ｔｏｒａｙａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６９：４７５−４８０（１９７６年））、ネズミチフス菌（Ｂｏｂｉｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６６３３−６６３９（１９９７年））、クレブシエラ・オキシトカ（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７１４２−７１４８（１９９５年））及びラクトバチルス・コリノイデス（Ｓａｕｖａｇｅｏｔら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０９：６９−７４（２００２年））でみられる。他の生物におけるジオールデヒドラターゼ遺伝子を単離する方法は、全文が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６８６，２７６号に例証されている通り、当技術分野において周知である。
【０３７２】
【表５１】
2013535203.tif 000053
【０３７３】
グリセロールデヒドラターゼファミリー（ＥＣ４．２．１．３０）の酵素も、エリトリトール−４−リン酸を脱水するために使用することができる。例示的な遺伝子としては、肺炎杆菌におけるｇｌｄＡＢＣ及びｄｈａＢ１２３（国際公開第２００８／１３７４０３号及びＴｏｒａｙａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６９：４７５−４８０（１９７６年））、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）におけるｄｈａＢＣＥ（Ｍａｃｉｓら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１６４：２１−２８（１９９８年））、及びシトロバクター・フロインデイにおけるｄｈａＢＣＥ（Ｓｅｙｆｒｉｅｄら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５７９３−５７９６（１９９６年））が挙げられる。ベータサブユニットの２つの残基に突然変異を導入することにより、８０〜３３６倍増強された活性を有する肺炎杆菌由来のＢ１２依存性ジオールデヒドラターゼの変異体が最近作製された（Ｑｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４４：４３−５０（２００９年））。低い不活化速度を有するジオールデヒドラターゼ酵素は、エラープローンＰＣＲを用いてＤｕＰｏｎｔにより開発された（国際公開第２００４／０５６９６３号）。
【０３７４】
【表５２】
2013535203.tif 000054
【０３７５】
Ｂ１２依存性ジオールデヒドラターゼを利用する場合、対応する再活性化因子の異種発現が有用である。Ｂ１２依存性ジオールデヒドラターゼは、基質及び幾つかの下流産物による作用機序に基づく自殺活性化を起こす。不活性コバラミンとの緊密な結合により引き起こされる不活化は、ＡＴＰ依存性プロセスにおけるジオールデヒドラターゼ再活性化因子により部分的に克服することができる。Ｂ１２補因子の再生は、ＡＴＰ依存性である。ジオールデヒドラターゼ再生因子は、２つのサブユニットのタンパク質である。例示的な遺伝子は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２０３４−３２０４１（１９９７年））、ネズミチフス菌（Ｂｏｂｉｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６６３３−６６３９（１９９７年）；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５４７４−５４８２（１９９４年））、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｓａｕｖａｇｅｏｔら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０９：６９−７４（２００２年））及び肺炎杆菌（国際公開第２００８／１３７４０３号）でみられる。
【０３７６】
【表５３】
2013535203.tif 000055
【０３７７】
Ｂ１２非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素は、補因子としてとしてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を利用し、厳密な嫌気条件下で機能し、特定の活性化酵素による活性化を必要とする（Ｆｒｅｙら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０３：２１２９−２１４８（２００３年））。ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ２によってコードされている酪酸菌のグリセロールデヒドロゲナーゼ及び対応する活性化因子は、よく特性評価されている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４６３５−４６４５（２００４年）；Ｒａｙｎａｕｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：５０１０−５０１５（２００３年））。この酵素は、大腸菌の１，３−プロパンジオール過剰産生株において最近使用され、非常に高力価の産物を得ることができた（Ｔａｎｇら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：１６２８−１６３４（２００９年））。ロゼブリア・イヌリニボランス由来の更なるＢ１２非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素及び活性化因子は、２，３−ブタンジオールの２−ブタノンへの変換を触媒することが示された（米国特許出願公開第２００９／０９１５５８７０号）。
【０３７８】
【表５４】
2013535203.tif 000056
【０３７９】
ジヒドロキシ−酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ、ＥＣ４．２．１．９）は、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与するＢ１２非依存性酵素である。そのネイティブな役割においては、２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸をイソロイシンの前駆体である２−ケト−３−メチル−吉草酸に変換する。バリンの生合成においては、前記酵素は、２，３−ジヒドロキシ−イソ吉草酸の２−オキソイソ吉草酸への脱水を触媒する。スルホロブス・ソルファタリカス由来のＤＨＡＤは広い基質範囲を有し、そして、大腸菌において発現した組み換え酵素の活性が様々なアルドン酸に対して実証された（Ｋｉｍ及びＬｅｅ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：５９１−５９６（２００６年））。Ｓ．ソルファタリカス酵素は、多くのジオールデヒドラターゼ酵素とは異なり酸素に対して耐性である。ｉｌｖＤによってコードされている大腸菌の酵素は、その鉄−硫黄クラスターを不活化する酸素に対して感受性である（Ｆｌｉｎｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４７３２−１４７４２（１９９３年））。類似する酵素がアカパンカビ（Ａｌｔｍｉｌｌｅｒ及びＷａｇｎｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３８：１６０−１７０（１９７０年））及びネズミチフス菌（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４９８：２８２−２９３（１９７７年））で特性評価されている。
【０３８０】
【表５５】
2013535203.tif 000057
【０３８１】
ジオールデヒドラターゼミオ−イノソーゼ−２−デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．４４）は、別の例示的な酵素である。ミオ−イノソーゼは、隣接するアルコール基を含有する六員環である。ミオ−イノソーゼ−２−デヒドラターゼ機能をコードする精製酵素は、ミオイノシトール分解についてクレブシエラ・アエロゲネスにおいて研究されているが（Ｂｅｒｍａｎ及びＭａｇａｓａｎｉｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：８００−８０６（１９６６年））、現在まで関連する遺伝子は同定されていない。シノリゾビウム・フレディのミオ−イノソーゼ−２−デヒドラターゼは、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現した（Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏｓｃｉ  ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：２９５７−２９６４（２００６年））。ｉｏｌＥによってコードされている枯草菌由来の類似する酵素についても研究されている（Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：５７１−５８０（２００４年））。
【０３８２】
【表５６】
2013535203.tif 000058
【０３８３】
Ｂ．（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホン酸レダクターゼ：（２，４−ジオキソブトキシ）ホスホン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、２４ＤＢＰを２Ｈ４ＯＰに変換するために使用される。この化合物は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の公知の基質ではないが、ＥＣクラス１．１．１における幾つかの酵素は、類似する反応を触媒する。リン酸化型基質のケトンを還元する例示的な酵素としては、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８）、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．９５）及びエリトロネート−４−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２９０）が挙げられる。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、ジヒドロキシアセトリン酸のグリセロール−３−リン酸へのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を触媒する。この酵素は、大腸菌のｇｐｓＡによってコードされている（Ｋｉｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：３３１６−３３２３（１９６９年））。３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌（遺伝子ｓｅｒＡによってコードされている）を含む幾つかの生物においてセリン生合成の最初の段階を触媒する（Ｔｏｂｅｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１２１７９−１２１８３（１９８６年））。エリトロネート−４−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２９０）は、２−オキソ−３−ヒドロキシ−４−ホスホブタン酸のエリトロネート−４−リン酸への可逆的な還元を触媒する。大腸菌のｐｄｘＢによってコードされているこの酵素は、通常、ピリドキサル−５’−リン酸生合成について逆方向に作用する（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：６０８４−６０９２（１９８９年））。緑膿菌におけるｐｄｘＢによってコードされている類似の酵素が、大腸菌で特性評価されており、異種発現されている（Ｈａら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６２：１３９−１４１（２００６年））。
【０３８４】
【表５７】
2013535203.tif 000059
【０３８５】
広範なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素が、ケトンのアルコール官能基への還元を触媒する。大腸菌由来のこのような２つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）によりコードされている。ラルストニア・ユートロファに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、２−オキソ酪酸、２−オキソペンタン酸及び２−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の２−ケト酸に対して高い活性を示すことが実証されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：３２９−３３４（１９８３年））。α−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である２−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒され得る（Ｓｕｄａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６年）；Ｓｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７年））。更なるオキシドレダクターゼは、既にクローニングされ、特性評価されているヒトの心臓に由来するミトコンドリアの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）である（Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３（１９９２年））。Ｃ．ベエイジェリンキー（Ｉｓｍａｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５０９７−５１０５（１９９３年））及びＴ．ブロッキイ（Ｌａｍｅｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５：１８３−１９０（１９８１年）；Ｐｅｒｅｔｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：６５４９−６５５５（１９８９年））のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼ、あるいは２−ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＭＥＫの還元を触媒して２−ブタノールを形成する。例示的な酵素は、ロドコッカス・ルーバー（Ｋｏｓｊｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８６：５５−６２（２００４年））及びパイロコッカス・フリオサス（ｖａｎ  ｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３０６２−３０６８（２００１年））において見出すことができる。
【０３８６】
【表５８】
2013535203.tif 000060
【０３８７】
Ｍａｔｓｕｙａｍａら（（１９９５年））によって記載されている通り、特にバチルス属、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びクレブシエラ属に属するものを含む多くの生物は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンの１，３−ブタンジオールへの還元を触媒することができる。突然変異型のロドコッカス属のフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（Ｓａｒ２６８）及びレイフソニア属のアルコールデヒドロゲナーゼも、高収率でこの転換を触媒することが示されている（Ｉｔｏｈら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：１２４９−１２５６（２００７年））。
【０３８８】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１３）は、アスパラギン酸セミアルデヒドのホモセリンへのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を触媒する。大腸菌を含む多くの生物では、ホモセリンデヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸のアスパルチル−４−リン酸へのＡＴＰ依存性変換も触媒する二機能酵素である（Ｓｔａｒｎｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：６７７−６８７（１９７２年））。機能ドメインは、触媒的に独立であり、リンカー領域によって連結され（Ｓｉｂｉｌｌｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０２２８−１０２３０（１９８１年））、また、両方のドメインはトレオニンによるアロステリック阻害に供される。ｔｈｒＡによってコードされている大腸菌酵素のホモセリンデヒドロゲナーゼドメインは、アスパラギン酸キナーゼドメインから分離され、特性評価され、高い触媒活性及びトレオニンによる阻害の減少を示すことが見出されている（Ｊａｍｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３７２０−３７２５（２００２年））。これは、例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（Ｃａｈｙａｎｔｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１０５−１１２（２００６年））及びシロイヌナズナのｈｏｍ１を含む他の二機能トレオニンキナーゼに適用することができる。出芽酵母におけるｈｏｍ６（Ｊａｃｑｕｅｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５４４：２８−４１（２００１年））及びラクトバチルス・プランタルムにおけるｈｏｍ２（Ｃａｈｙａｎｔｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１０５−１１２（２００６年））によってコードされている単機能ホモセリンデヒドロゲナーゼは、大腸菌において機能的に発現しており、特性評価されている。
【０３８９】
【表５９】
2013535203.tif 000061
【０３９０】
実施例ＶＩＩ
ベンゼン及びトルエンへの経路
この実施例は、安息香酸及びベンゾイル−ＣｏＡからベンゼンへ、並びにｐ−トルイル酸及びｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡからトルエンへの経路を示す。
【０３９１】
安息香酸又はベンゾイル−ＣｏＡからベンゼンを酵素的に生成するための経路を、図１０に示す。安息香酸及びベンゾイル−ＣｏＡは、多様な芳香族分解経路に共通の天然に存在する中間代謝産物である。また、安息香酸は、本明細書に記載する別のシキミ酸経路によって生成することもできる。安息香酸及び／又はベンゾイル−ＣｏＡからベンゼンへの幾つかの経路を図１０に示す。まず、脱炭酸を介して安息香酸から直接ベンゼンを生成することができる（図１０、経路Ｅ）。あるいは、安息香酸レダクターゼにより直接（図１０、経路Ｂ）、又はベンゾイル−ＣｏＡ及び／若しくは（ベンゾイルオキシ）ホスホン酸中間体を介して間接的に（図１０、経路Ａ及びＤ、経路Ｂ、経路Ｈ及びＧ、又は経路Ａ、Ｆ、及びＧ）、酸部分をアルデヒドに還元してもよい。次いで、ベンズアルデヒドを脱カルボニル化してベンゼンを形成することができる（図１０、経路Ｃ）。
【０３９２】
ｐ−トルイル酸及び／又はｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡからトルエンを酵素的に生成するための類似する経路を図１１に示す。ｐ−トルイル酸は、本明細書に記載する別のシキミ酸経路によって生成することができる。ｐ−トルイル酸（ｐ−安息香酸メチルとしても知られている）及び／又はｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡをトルエンに変換するための経路は、上記安息香酸又はベンゾイル−ＣｏＡのベンゼンへの転換と類似している。図１０及び１１に示す転換を触媒するための酵素をＥＣ番号により分類し、更に以下に記載する。
【０３９３】
【表６０】
2013535203.tif 000062
【０３９４】
１．２．１．ｂ  オキシドレダクターゼ（アシル−ＣｏＡからアルデヒドへ）：ベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素を用いて、ベンゾイル−ＣｏＡをベンズアルデヒドに変換する（図１０の経路Ｄ）。同様に、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡのｐ−メチルベンズアルデヒド（ｐ−トルアルデヒドとも呼ばれる）への還元は、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素によって触媒される（図１１の経路Ｄ）。これらの活性を有する酵素は特性評価されていないが、類似の反応を触媒する酵素は、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．４４）である。この酵素は、シンナモイル−ＣｏＡ、並びにクマロイル−ＣｏＡ及びフェルロイル−ＣｏＡ等の置換芳香族誘導体のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を触媒する。この酵素は、シロイヌナズナ（Ｌａｕｖｅｒｇｅａｔら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５７：１１８７−１１９５（２００１年））、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）及びスイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（Ｅｓｃａｍｉｌｌａ−Ｔｒｅｖｉｎｏら，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．１８５：１４３−１５５（２０１０年））を含む生物において特性評価されている。シロイヌナズナ及びスイッチグラス由来の酵素は、大腸菌で特性評価され、異種発現した。
【０３９５】
【表６１】
2013535203.tif 000063
【０３９６】
他の幾つかの十分に特性評価されているアシル−ＣｏＡレダクターゼは、アシル−ＣｏＡを対応するアルデヒドに還元する。例示的な酵素としては、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７６）、アセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．１０）及びブチリル−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。例示的な脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ｒｅｉｓｅｒら，１７９：２９６９−２９７５（１９９７年））及びアシネトバクター属の種Ｍ−１（Ｉｓｈｉｇｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１１９２−１１９５（２００２年））のａｃｒ１によってコードされている。スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・クルイベリのｓｕｃＤ（Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６年ａ）；Ｓｏｈｌｉｎｇら，１７８：８７１−８０（１９９６年））及びＰ．ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）のｓｕｃＤ（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：４７０４−４７１０（２０００年））によってコードされている。更なるスクシニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、メタッロスパエラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１７８２−１７８６（２００７年））及びサーモプロテウス・ニュートロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｒａｍｏｓ−Ｖｅｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：４２８６−４２９７（２００９年））等の好熱性古細菌の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路に関与している。Ｍｓｅｄ＿０７０９によってコードされているＭ．セデュラのＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ依存性であり、またマロニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する。Ｔ．ニュートロフィラス酵素は、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨの両方に対して活性を有する。ｂｐｈＧによってコードされているシュードモナス属の種のアシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びホルムアルデヒドを対応するＣｏＡエステルに酸化及びアシル化することが実証されている（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉら，１７５：３７７−３８５（１９９３年））。エタノールへのアセチル−ＣｏＡの還元に加えて、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）においてａｄｈＥによってコードされる酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化させることが示されている（Ｋｏｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２７：５０５−５１０（２００５年））。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム等の溶媒生成生物において、類似の反応、ブチリル−ＣｏＡのブチルアルデヒドへの変換を触媒する（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））。クロストリジウム・ベエイジェリンキー���おいてａｌｄによってコードされているアシル−ＣｏＡレダクターゼは、アセチル−ＣｏＡ及びブチリル−ＣｏＡを対応するアルデヒドに還元することが示されている（Ｔｏｔｈら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５：４９７３−４９８０（１９９９年））。この酵素は、ｅｕｔＥによってコードされているネズミチフス菌及び大腸菌のＣｏＡ依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素と高い配列相同性を示す。
【０３９７】
【表６２】
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【０３９８】
更なるＣｏＡレダクターゼ酵素は、マロニル−ＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに転換するマロニル−ＣｏＡレダクターゼである。マロニル−ＣｏＡレダクターゼは、好熱好酸性古細菌における３−ヒドロキシプロピオン酸回路を介する自己栄養性炭素固定において鍵となる酵素である（Ｂｅｒｇら，３１８：１７８２−１７８６（２００７年）；Ｔｈａｕｅｒ，３１８：１７３２−１７３３（２００７年））。この酵素は、補因子としてＮＡＤＰＨを利用し、メタッロスパエラ属及びスルホロブス属の種において特性評価されている（Ａｌｂｅｒら，１８８：８５５１−８５５９（２００６年）；Ｈｕｇｌｅｒら，１８４：２４０４−２４１０（２００２年））。酵素は、メタッロスパエラ・セデュラにおけるＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされている（Ａｌｂｅｒら，１８８：８５５１−８５５９（２００６年）；Ｂｅｒｇら，３１８：１７８２−１７８６（２００７年））。スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）由来のマロニル−ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、大腸菌でクローニングされ、異種発現した（Ａｌｂｅｒら，１８８：８５５１−８５５９（２００６年））。この酵素も、メチルマロニル−ＣｏＡの対応するアルデヒドへの変換を触媒することが示されている（国際公開第２００７／１４１２０８号）。両方のマロニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素の候補は、アスパルチル−４−リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元及び同時に生じる脱リン酸化を触媒する酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列相同性を有する。タンパク質への配列相同性により、スルホロブス・ソルファタリカス及びスルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）を含む他の生物で更なる遺伝子を見出すことができる。
【０３９９】
【表６３】
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【０４００】
１．２．１．ｄ  オキシドレダクターゼ（リン酸化／脱リン酸化）（１０／１１Ｇ）：（ベンゾイルオキシ）ホスホン酸のベンズアルデヒドへの還元（図１０の経路Ｇ）、及び（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホン酸のｐ−メチルベンズアルデヒドへの還元（図１１の経路Ｇ）は、ホスホン酸レダクターゼ活性を有する酵素によって触媒される。これら変換を触媒する酵素は現在まで同定されていないが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１２）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１１）アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（ＥＣ１．２．１．３８）及びグルタミン酸−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１）によって触媒される類似の転換は、十分報告されている。アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＳＤ、ＥＣ１．２．１．１１）は、４−アスパルチルリン酸のアスパラギン酸−４−セミアルデヒドへのＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する。ＡＳＤは、アミノ酸生合成に関与し、抗菌の標的として最近研究されている（Ｈａｄｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１４４７５−１４４８３（２００１年））。大腸菌のＡＳＤ構造は解明されており（Ｈａｄｆｉｅｌｄら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９：９９１−１００２（１９９９年））、酵素は、代替基質ベータ−３−メチルアスパルチルリン酸を受容することが示されている（Ｓｈａｍｅｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５３３１−１５３３９（１９８４年））。インフルエンザ菌酵素は、活性部位における基質結合親和性を変化させる酵素工学的研究の対象である（Ｂｌａｎｃｏら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０：１３８８−１３９５（２００４年））。他のＡＳＤ遺伝子／酵素は、結核菌（Ｓｈａｆｉａｎｉら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９８：８３２−８３８（２００５年））、メタノコッカス・ジャナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｆａｅｈｎｌｅら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５３：１０５５−１０６８（２００５年））、並びに感染性細菌であるコレラ菌及びヘリコバクター・ピロリ（Ｍｏｏｒｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５：１８９−１９４（２００２年））でみられる。関連する酵素は、出芽酵母（Ｐａｕｗｅｌｓら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０１４−１０２４（２００３年））、枯草菌（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０（Ｐｔ５）：１０２３−１０２５（１９９４年））、大腸菌（Ｐａｒｓｏｔら，Ｇｅｎｅ．６８：２７５−２８３（１９８８年））、及び他の生物でみられる、自然界ではアセチルグルタミルリン酸をアセチルグルタミン酸−５−セミアルデヒドに還元する酵素であるアセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（ＥＣ１．２．１．３８）である。大腸菌の更なるリン酸レダクターゼとしては、ｇａｐＡによりコードされているグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｂｒａｎｌａｎｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：６１−６６（１９８５年））及びｐｒｏＡによりコードされているグルタミン酸−５−セミアルデ���ドデヒドロゲナーゼ（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：５４５−５５１（１９８４年ｂ））が挙げられる。ネズミチフス菌（Ｍａｈａｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：１２４９−１２６２（１９８３年））及びカンピロバクター・ジェジュニ（Ｌｏｕｉｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：２９−３５（１９９３年））由来のグルタミン酸−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子は、大腸菌においてクローニングされ、発現された。
【０４０１】
【表６４】
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【０４０２】
１．２．１．ｅ  オキシドレダクターゼ（酸からアルデヒドへ）：安息香酸のベンズアルデヒドへの又はｐ−トルイル酸のｐ−メチルベンズアルデヒドへの直接変換（図１０及び１１の経路Ｂ）は、カルボン酸レダクターゼによって触媒される。例示的な酵素としては、カルボン酸レダクターゼ、α−アミノアジピン酸レダクターゼ及びレチン酸レダクターゼが挙げられる。カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）は、カルボン酸の対応するアルデヒドへのマグネシウム、ＡＴＰ及びＮＡＤＰＨ依存性の還元を触媒する（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：４７８−４８５（２００７年））。この酵素の天然基質は安息香酸であり、前記酵素は、ｐ−トルイル酸を含む芳香族基質を広く受容する（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ（２００６年））。ｃａｒによってコードされているノカルジア・イオウェンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｉｏｗｅｎｓｉｓ）由来の酵素は、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現した（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：４７８−４８５（２００７年））。ＣＡＲは、不活性なアポ酵素を活性を有するハロ酵素に変換するホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）による翻訳後活性化を必要とする（Ｈａｎｓｅｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７５：２７６５−２７７４（２００９年））。特定のＰＰＴａｓｅをコードするｎｐｔ遺伝子の発現は、酵素の活性を改善した。ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）でみられる類似の酵素は、ｇｒｉＣ及びｇｒｉＤの遺伝子によってコードされている。この酵素は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドに変換することが示されているが、その理由は、ｇｒｉＣ又はｇｒｉＤのいずれかの欠失が、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸代謝の短絡産物である細胞外３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の蓄積を導くためである（Ｓｕｚｕｋｉら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．６０（６）：３８０−３８７（２００７年））。Ｓ．グリセウスのＰＰＴａｓｅは、ノカルジア・イオウェンシスのｎｐｔ遺伝子に対する配列相同性により予測される通り、ＳＧＲ＿６６５によりコードされている可能性がある。
【０４０３】
【表６５】
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【０４０４】
類似の特性を有する酵素である、α−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＡＡＲ、ＥＣ１．２．１．３１）は、幾つかの真菌種におけるリシン生合成経路に関与する。この酵素は、自然界ではα−アミノアジピン酸をα−アミノアジピン酸セミアルデヒドに還元する。カルボキシル基は、まず、ＡＴＰ依存性のアデニル酸形成によって活性化され、次いで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されて、アルデヒド及びＡＭＰが生じる。ＣＡＲと同様に、この酵素はマグネシウムを利用し、ＰＰＴａｓｅによって活性化される。ＡＡＲ及び対応するＰＰＴａｓｅのための酵素は、出芽酵母（Ｍｏｒｒｉｓら，Ｇｅｎｅ  ９８：１４１−１４５（１９９１年））、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｇｕｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６９：２７１−２７９（２００３年））及び分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｆｏｒｄら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２８：１３１−１３７（１９９５年））でみられる。分裂酵母由来のＡＡＲは、大腸菌で発現したとき著しい活性を示した（Ｇｕｏら，Ｙｅａｓｔ  ２１：１２７９−１２８８（２００４年））。ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のＡＡＲは、代替基質としてＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システインを受容するが、アジピン酸、Ｌ−グルタミン酸又はジアミノピメリン酸とは反応しなかった（Ｈｉｊａｒｒｕｂｉａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８２５０−８２５６（２００３年））。Ｐ．クリソゲナムのＰＰＴａｓｅをコードする遺伝子は、現在まで同定されておらず、配列比較相同性探索によって信頼度の高いヒットは同定されなかった。
【０４０５】
【表６６】
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【０４０６】
２．３．１．ａ  アシルトランスフェラーゼ（ホスホトランスフェラーゼ）：ホスホトランスベンゾイラーゼ活性を有する酵素は、ベンゾイル−ＣｏＡ及び（ベンゾイルオキシ）ホスホン酸を相互変換するために使用される（図１０の経路Ｆ）。ホスホトランス−ｐ−メチルベンゾイラーゼ活性を有する類似の酵素は、ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡ及び（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホン酸を相互変換する（図１１の経路Ｆ）。例示的なリン酸転移アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）及びホスホトランスブチリラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）が挙げられる。大腸菌に由来するｐｔａ遺伝子は、アセチル−ＣｏＡをアセチルリン酸に可逆的に変換するホスホトランスアセチラーゼをコードしている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５９−５６９（１９６９年））。また、この酵素は、プロピオニル−ＣｏＡプロピオニルリン酸を変換することもできる（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８年））。プロピオニル−ＣｏＡに対して活性を示す他のリン酸アセチルトランスフェラーゼは、枯草菌（Ｒａｄｏら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２１：１１４−１２５（１９７３年））、クロストリジウム・クルイベリ（Ｓｔａｄｔｍａｎ，１：５９６−５９９（１９５５年））及びサーモトガ・マリティマ（Ｂｏｃｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１８６１−１８６７（１９９９年））でみられる。同様に、Ｃ．アセトブチリカム由来のｐｔｂ遺伝子は、ブチリル−ＣｏＡをブチリルリン酸に可逆的に変換する酵素であるホスホトランスブチリラーゼをコードしている（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：３１７−３２２（１９８９年）；Ｗａｌｔｅｒら，Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３年））。更なるｐｔｂ遺伝子は、酪酸産生細菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２０９９−２１０６（２００４年））及び巨大菌（Ｖａｚｑｕｅｚら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：３４５−３４９（２００１年））でみられる。
【０４０７】
【表６７】
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【０４０８】
２．７．２．ａ  ホスホトランスフェラーゼ（カルボキシル基アクセプター（キナーゼ））：キナーゼ又はホスホトランスフェラーゼの酵素は、１つのＡＴＰを加水分解すると同時にカルボン酸をホスホン酸に転換する。このような酵素は、安息香酸を（ベンゾイルオキシ）ホスホン酸に（図１０、経路Ｈ）、及びｐ−トルイル酸を（ｐ−メチルベンゾイルオキシ）ホスホン酸に（図１１、経路Ｈ）変換するために使用される。これらの正確な転換は、現在まで実証されていない。例示的な酵素としては、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、イソ酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）、アスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）及びγ−グルタミルキナーゼ（ＥＣ２．７．２．１１）が挙げられる。酪酸キナーゼは、クロストリジウム属において、酸生成中にブチリルリン酸を酪酸に可逆的に変換する（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０年））。クロストリジウム・アセトブチリカム酵素は、２つのｂｕｋ遺伝子産物のいずれかによりコードされている（Ｈｕａｎｇら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：３３−３８（２０００年））。他の酪酸キナーゼ酵素は、Ｃ．ブチリカム及び破傷風様菌でみられる（ＴＷＡＲＯＧら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８６：１１２−１１７（１９６３年））。関連酵素である、サーモトガ・マリティマ由来のイソ酪酸キナーゼは、大腸菌において発現し、結晶化された（Ｄｉａｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：２５２１−２５２９（２００９年）；Ｄｉａｏら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５９：１１００−１１０２（２００３年））。アスパルトキナーゼは、アスパラギン酸のＡＴＰ依存性リン酸化を触媒し、幾つかのアミノ酸の合成に関与する。ｌｙｓＣによってコードされている大腸菌におけるアスパルトキナーゼＩＩＩ酵素は、広い基質範囲を有し、基質特異性に関与する触媒残基が解明されている（Ｋｅｎｇら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３５：７３−８１（１９９６年））。大腸菌における２つの更なるキナーゼは、酢酸キナーゼ及びγ−グルタミルキナーゼである。ａｃｋＡによりコードされている大腸菌の酢酸キナーゼ（Ｓｋａｒｓｔｅｄｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６７７５−６７８３（１９７６年））は、酢酸に加えてプロピオン酸をリン酸化する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８年））。ｐｒｏＢによりコードされている大腸菌のγ−グルタミルキナーゼ（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：５４５−５５１（１９８４年ａ））は、グルタミン酸のガンマ炭酸基をリン酸化する。
【０４０９】
【表６８】
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【０４１０】
２．８．３．ａ  ＣｏＡトランスフェラーゼ（１０／１１Ａ）：ＣｏＡトランスフェラーゼは、ある分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的な転位を触媒する。図１０の経路Ａは、ベンゾイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この転換では、ベンゾイル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ又は他のもの等のＣｏＡドナー由来のＣｏＡ基の転移によって安息香酸から形成される。ｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、図１１の経路Ａにおいてｐ−トルイル酸からの類似する反応を触媒する。類似する基質と反応する例示的なＣｏＡトランスフェラーゼ酵素としては、シンナモイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１７）及びベンジルスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・スポロゲネスにおけるｆｌｄＡによってコードされているシンナモイル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、シンナモイル−ＣｏＡから、フェニル酢酸、３−フェニルプロピオン酸及び４−フェニル酪酸を含む様々な芳香族酸基質にＣｏＡ部分を転移する（Ｄｉｃｋｅｒｔら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：３８７４−３８８４（２０００年））。ベンジルスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡドナーとしてスクシニル−ＣｏＡ又はマレイル−ＣｏＡを利用し、コハク酸ベンジルからベンジルスクシニル−ＣｏＡを形成する。この酵素は、脱窒素細菌サウエラ・アロマチカ（この細菌では、ｂｂｓＥＦによりコードされる）において特性評価された（Ｌｅｕｔｗｅｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４２８８−４２９５（２００１年））。
【０４１１】
【表６９】
2013535203.tif 000071
【０４１２】
多様な基質範囲を有する更なるＣｏＡトランスフェラーゼ酵素としては、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、グルタコニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・クルイベリのｃａｔ１、ｃａｔ２及びｃａｔ３の遺伝子産物は、それぞれスクシニル−ＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ及びブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０５：２１２８−２１３３（２００８年）；Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６年ｂ））。また、同様のＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１４１１−１４１８（２００８年））及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｒｉｖｉｅｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４５３３７−４５３４６（２００４年））にも存在する。嫌気性細菌アシドアミノコックス・ファーメンタンス由来のグルタコニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）酵素は、グルタコニル−ＣｏＡ及び３−ブテノイル−ＣｏＡと反応する（Ｍａｃｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：４１−５１（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子は、ｇｃｔＡ及びｇｃｔＢである。この酵素は、グルタリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ及びアクリリル−ＣｏＡを含む他のＣｏＡ誘導体に対して、低いが検出可能な活性を示す（Ｂｕｃｋｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：３１５−３２１（１９８１年））。この酵素は、大腸菌でクローニングされ、発現している（Ｍａｃｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：４１−５１（１９９４年））。グルタコネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性は、クロストリジウム・スポロスフェロイデス及びクロストリジウム・シンビオサムでも検出されている。アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡドナーとしてアセチル−ＣｏＡを利用する。この酵素は、大腸菌のａｔｏＡ（アルファサブユニット）及びａｔｏＤ（ベータサブユニット）遺伝子によりコードされている（Ｋｏｒｏｌｅｖら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８：２１１６−２１２１（２００２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８年））。この酵素は広い基質範囲を有し（Ｓｒａｍｅｋら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１：１４−２６（１９７５年））、アセチル−ＣｏＡからイソ酪酸（Ｍａｔｔｈｉｅｓら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８：１４３５−１４３９（１９９２年））、吉草酸（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８年））及びブタン酸（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ��．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８年））を含む様々な基質にＣｏＡ部分を転移することが示されている。類似の酵素が、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（Ｄｕｎｃａｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５１８６−５１９０（２００２年））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０年）；Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：３２３−３２９（１９８９年））及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））に存在する。
【０４１３】
【表７０】
2013535203.tif 000072
【０４１４】
３．１．２．ａ  ＣｏＡヒドロラーゼ（１０／１１Ａ）：ベンゾイル−ＣｏＡ及びｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡは、ＥＣクラス３．１．２におけるＣｏＡヒドロラーゼ又はチオエステラーゼによって対応する酸に加水分解され得る（図１０及び１１の経路Ａ）。ベンゾイル−ＣｏＡ及び／又は類似する基質を加水分解する例示的なＣｏＡチオエステルとしては、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２３）及びフェニルグリオキサール−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２５）が挙げられる。アゾアルカス・エバンシイの遺伝子ｏｒｆ１は、安息香酸代謝に関与するベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードしている（Ｉｓｍａｉｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９０：４５１−４６０（２００８年））。この酵素は、大腸菌において異種発現させたとき、多くの代替基質に対して活性を示した。配列類似性により、更なるベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ酵素が、マグネトスピリラム・マグネトタクチカム、ジャナスチア属の種ＣＣＳ１、及びサジッツラ・ステラータＥ−３７の安息香酸分解遺伝子クラスターにおいて同定された（Ｉｓｍａｉｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９０：４５１−４６０（２００８年））。シュードモナス属の種ＣＢＳ３の４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼは、ベンゾイル−ＣｏＡ及びｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡを基質として受容し、また、大腸菌で異種発現され、特性評価されている（Ｓｏｎｇら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：１−１０（２００７年））。ベンゾイル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を示す更なる酵素としては、結核菌のパルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（Ｗａｎｇら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４：５４３−５５１（２００７年））及びｅｎｔＨによりコードされている大腸菌のアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（Ｇｕｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８：１７１２−１７２２（２００９年））が挙げられる。
【０４１５】
【表７１】
2013535203.tif 000073
【０４１６】
広い基質範囲を有する幾つかの更なるＣｏＡヒドロラーゼは、ベンゾイル−ＣｏＡ及び／又はｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡを加水分解するのに適した酵素である。例えば、ラットの脳に由来するａｃｏｔ１２によってコードされる酵素（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７１：９５９−９６５（１９７６年））は、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡと反応することができる。ａｃｏｔ８によってコードされているヒトのジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、スベリル−ＣｏＡ、セバシル−ＣｏＡ及びドデカンジオイル−ＣｏＡに対する活性を示す（Ｗｅｓｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８１２５−３８１３２（２００５年））。また、この酵素に最も近い大腸菌ホモログであるｔｅｓＢは、様々なＣｏＡチオールエステルを加水分解することができる（Ｎａｇｇｅｒｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１１０４４−１１０５０（１９９１年））。また、類似の酵素が、ラットの肝臓において特性評価されている（Ｄｅａｎａ  Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ２６：７６７−７７３（１９９２年））。
【０４１７】
【表７２】
2013535203.tif 000074
【０４１８】
４．１．１ａ．カルボキシ−リアーゼ（６／７Ｅ）：ＥＣクラス４．１．１におけるデカルボキシラーゼ酵素は、安息香酸をベンゼンに（図１０の経路Ｅ）、及びｐ−トルイル酸をトルエンに（図１１の経路Ｅ）変換するために使用される。これら又は類似する基質と反応する例示的な酵素としては、ベンゼンカルボキシラーゼ、バニリン酸デカルボキシラーゼ、ケイ皮酸デカルボキシラーゼ、アミノ安息香酸デカルボキシラーゼ及び様々なヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが挙げられる。利用される補因子に依存して、デカルボキシラーゼ酵素は酸化的であってもよく又は非酸化的であってもよい（Ｌｕｐａら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８６：３４２−３５１（２００５年ａ））。安息香酸カルボキシラーゼ活性を有すると予測される酵素は、クロストリジウム属細菌濃縮培地クローンＢＦにおいて同定された（Ａｂｕら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１０年））。
【０４１９】
【表７３】
2013535203.tif 000075
【０４２０】
４−ヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２，６−ジヒドロキシ安息香酸及び４，５−ジヒドロキシフタレート等のヒドロキシル化芳香族に対する活性が実証されている多数の特性評価されているデカルボキシラーゼは、ｐ−トルイル酸又は安息香酸等の代替基質に対しても活性を示す場合がある。例示的なヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素としては、コマモナス・テストステローニの４，５−ジヒドロキシフタレートデカルボキシラーゼ（Ｎａｋａｚａｗａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３６：２６４−２６９（１９７８年））、アスペルギルス・ニガーの２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（Ｋａｍａｔｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４５：５８６−５９５（１９８７年））、及び大腸菌の３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（Ｚｈａｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：６２４３−６２４６（２０００年））が挙げられる。例示的な４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは、セディメンチバクター・ヒドロキシベンゾイカス（Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃｕｓ）（旧クロストリジウム・ヒドロキシベンゾイカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃｕｍ）のｓｈｄＢＤ及びｕｂｉＤ、並びにエンテロバクター・クロアカエＰ２４０のｕｂｉＤによってコードによりコードされている（Ｍａｔｓｕｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８６：２１−２９（２００６年ａ）；Ｈｅら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：７７−８２（１９９５年））。ｕｂｉＤによってコードされている通性嫌気性生物エンテロバクター・クロアカエ由来の４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは、複数の基質に対する活性について試験されており、４−ヒドロキシ安息香酸及び４−アミノ安息香酸の両方によって誘導されることが示された（Ｍａｔｓｕｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８６：２１−２９（２００６年ｂ））。枯草菌のｂｓｄＢＣＤ遺伝子は、可逆的な非酸化的４−ヒドロキシ安息香酸／バニリン酸デカルボキシラーゼをコードする（Ｌｕｐａら，Ｃａｎ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４：７５−８１（２００８年））。この酵素は、大腸菌において異種発現した。類似するデカルボキシラーゼは、他の幾つかの生物において示されており（Ｌｕｐａら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８６：３４２−３５１（２００５年ｂ））、これらのうちの幾つかの遺伝子を以下に列挙する。
【０４２１】
【表７４】
2013535203.tif 000076
【０４２２】
ケイ皮酸（フェニルアクリレート）及び置換ケイ皮酸誘導体の脱炭酸を触媒する更なる分類のデカルボキシラーゼが特性評価されている。これら酵素は、様々な生物において共通であり、そして、大腸菌でクローニングされ、発現しているこれら酵素をコードする具体的な遺伝子としては、出芽酵母由来のｐａｄ１（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｇｅｎｅ  １４２：１０７−１１２（１９９４年））、ラクトバチルス・プランタルム由来のｐｄｃ（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら，６７：１０６３−１０６９（２００１年）；Ｑｉら，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ９：２６８−２７６（２００７年）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６：３０６８−３０７２（２００８年））、クレブシエラ・オキシトカ由来のｐｏｆＫ（ｐａｄ）（Ｕｃｈｉｙａｍａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：１１６−１２３（２００８年）；Ｈａｓｈｉｄｏｋｏら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：２１７−２１８（１９９４年））、ペジコッカス・ペントサセウス（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら，６７：１０６３−１０６９（２００１年））、並びに枯草菌及びバチルス・プミルス由来のｐａｄＣ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，１７４：７１１−７２４（１９９２年））が挙げられる。シュードモナス・フルオレッセンス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼも、精製され、特性評価されている（Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５９１２−５９１８（１９９４年））。この分類における酵素は安定であることが示されており、外因性の又は内部的に結合する補因子を必要としないので、これら酵素は生体内転換に理想的に適している（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：５１−６９（２００７年））。
【０４２３】
【表７５】
2013535203.tif 000077
【０４２４】
４．１．９９．ａ  デカルボニラーゼ：デカルボニラーゼ酵素は、ベンズアルデヒドをベンゼンに（図１０の経路Ｃ）、及びｐ−メチルベンズアルデヒドをトルエンに（図１１の経路Ｃ）変換するために使用される。デカルボニラーゼ酵素は、植物、哺乳類、昆虫及び細菌におけるアルカン生合成の最後の工程を触媒する（Ｄｅｎｎｉｓら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８７：２６８−２７５（１９９１年））。非酸化的デカルボニラーゼは、ＣＯを放出すると同時にアルデヒドをアルカンに転換する。例示的なデカルボニラーゼ酵素としては、オクタデカナールデカルボニラーゼ（ＥＣ４．１．９９．５）、ステロールデサチュラーゼ及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。シロイヌナズナのＣＥＲ１遺伝子は、エピクチクラのろう形成に関与する脂肪酸デカルボニラーゼをコードしている（米国特許第６，４３７，２１８号）。更なる脂肪酸デカルボニラーゼは、タルウマゴヤシ、ブドウ及びイネでみられる（米国特許出願公開第２００９／００６１４９３号）。コバルト−ポルフィリン含有デカルボニラーゼは、藻類ボツリオコッカス・ブラウニイにおいて精製され、特性評価されたが；この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されていない（Ｄｅｎｎｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８９：５３０６−５３１０（１９９２年））。エンドウマメ由来の銅含有デカルボニラーゼも精製され、特性評価されているが、関連する遺伝子は未だ同定されていない（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｂｅｌｈａｄｄａｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７７：３４１−３４９（２０００年））。
【０４２５】
【表７６】
2013535203.tif 000078
【０４２６】
あるいは、酸化的デカルボニラーゼは、アルデヒドをアルカンに変換することができる。酸化的デカルボニラーゼは、補因子としてＮＡＤＰＨ及びＯ２を利用し、ＣＯ２、水、及びＮＡＤＰ＋を放出するシトクロムＰ４５０酵素である。この活性は、イエバエ及びキイロショウジョウバエのＣＹＰ４Ｇ２ｖ１及びＣＹＰ４Ｇ１遺伝子産物において示されている（米国特許出願公開第２０１０／０１３６５９５号）。配列相同性により、他の生物、例えば、ヨトウガ、メリカタバコガ、及びエンドウヒゲナガアブラムシにおいて酸化的デカルボニラーゼ活性を有する更なる酵素を同定することができる。
【０４２７】
【表７７】
2013535203.tif 000079
【０４２８】
６．２．１．ａ  酸−チオールリガーゼ（８Ａ、１１Ｂ）：安息香酸のベンゾイル−ＣｏＡへの、又はｐ−トルイル酸のｐ−メチルベンゾイル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性活性化（図１０及び１１の経路Ａ）は、ＣｏＡシンテターゼ又は酸−チオールリガーゼによって触媒される。ＡＭＰ形成ＣｏＡリガーゼは、芳香族酸を対応するＣｏＡ誘導体に活性化させ、一方、ＡＤＰ形成ＣｏＡリガーゼは、一般に可逆的である。サウエラ・アロマチカ及びアゾアルカス属の種の株ＣＩＢ由来の例示的なＡＭＰ形成ベンゾイル−ＣｏＡリガーゼが特性評価されている（Ｌｏｐｅｚ  Ｂａｒｒａｇａｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：５７６２−５７７４（２００４年）；Ｓｃｈｕｈｌｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：４９２０−４９２９（２００３年））。あるいは、構造上類似する基質と反応するＡＭＰ形成ＣｏＡリガーゼは、安息香酸又はｐ−トルイル酸に対する活性を有し得る。ａｌｉＡによってコードされているロドシュードモナス・パルストリス由来のＡＭＰ形成シクロヘキサンカルボキシレートＣｏＡリガーゼは、十分に特性評価されており、活性部位の変化が酵素の基質特異性に影響を与えることが示されている（Ｓａｍａｎｔａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：１１５１−１１５９（２００５年））。また、この酵素は、嫌気性ベンゼン環分解中にシクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸ＣｏＡリガーゼとしても機能する（Ｅｇｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９４：６４８４−６４８９（１９９７年））。更なる例示的なＣｏＡリガーゼとしては、Ｐ．クリソゲナム由来の２つの特性評価されているフェニル酢酸−ＣｏＡ（Ｌａｍａｓ−Ｍａｃｅｉｒａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３９５：１４７−１５５（２００６年）；Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６０：４５３−４５８（２００７年））；Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６０：４５３−４５８（２００７年））、シュードモナス・プチダ由来のフェニル酢酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｃｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７０８４−７０９０（１９９０年））、及び枯草菌由来の６−カルボキシヘキサノエート−ＣｏＡ（Ｂｏｗｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４１２２−４１３０（１９９６年））が挙げられる。
【０４２９】
【表７８】
2013535203.tif 000080
【０４３０】
これら正確な転換を触媒するＡＤＰ形成ＣｏＡリガーゼは、現在まで特性評価されていないが；広い基質特異性を有する幾つかの酵素が文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされているアーケオグロブス・フルギダス由来のＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、イソ酪酸、イソペンタン酸及びフマル酸を含む様々な直鎖及び分岐鎖の基質に対して作用することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。ＡＦ１９８３によってコードされているアーケオグロブス・フルギダスにおける第２の可逆的なＡＣＤも、芳香族化合物フェニル酢酸及びインドール酢酸に対する活性が高く、広い基質範囲を有することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら，上記）。スクシニル−ＣｏＡシンテターゼであるとアノテーションされたハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素は、基質としてプロピオン酸、酪酸及び分枝鎖酸（イソ吉草酸及びイソ酪酸）を受容し、順方向及び逆方向に作用することが示された（Ｂｒａｓｅｎら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年））。超好熱性古細菌ピロバキュラム・アエロフィラム由来のＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、全ての特性評価されているＡＣＤのうち最も広い基質範囲を示し、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）、及びフェニルアセチル−ＣｏＡと反応する（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年））。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。Ａ．フルギダス、Ｈ．マリスモルツイ及びＰ．アエロフィラム由来の酵素は全て、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年）；Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。更なる酵素は、自然界では１つのＡＴＰを消費すると同時にコハク酸からのスクシニル−ＣｏＡの形成を触媒する（この反応は、インビボにおいて可逆的である）大腸菌におけるｓｕｃＣＤによってコードされている（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５年））。シュードモナス・プチダ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが示されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３年））。関連する酵素であるリゾビウム・レグミノサルム由来のマロニル−ＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができる（Ｐｏｈｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５８２２−５８２３（２００１年））。
【０４３１】
【表７９】
2013535203.tif 000081
【０４３２】
実施例ＶＩＩＩ ピルビン酸、オルニチン及びアラニンから２，４−ペンタジエノエートへの経路
この実施例は、ピルビン酸、オルニチン及びアラニンから２，４−ペンタジエノエートへの経路を示す。
【０４３３】
図１２は、ピルビン酸の２，４−ペンタジエノエートへの変換を示す。この変換は、４つの酵素的段階で行うことができる。まず、ピルビン酸及びアセトアルデヒドは、４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸アルドラーゼによって４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸に縮合される（図１２の工程Ａ）。次に、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸生成物が２−オキソペンテン酸に脱水される（図１２の工程Ｂ）。続く２−オキソペンテン酸の還元及び脱水により、２，４−ペンタジエノエートが生じる（図１２の工程Ｃ／Ｄ）。
【０４３４】
図１３は、アラニン又はオルニチンから２，４−ペンタジエノエートへの経路を示す。図１３の工程Ａでは、アラニン及びアセチル−ＣｏＡがＡＫＰチオラーゼによって結合して、ＡＫＰを形成する。１つの経路では、ＡＫＰはアセチルアクリレートに脱アミノ化される（工程Ｂ）。次いで、アセチルアクリレートの４−オキソ基が２，４−ペンタジエノエートに還元及び脱水される（工程Ｃ／Ｄ）。別の経路では、ＡＫＰは、アミノトランスフェラーゼ又はデヒドロゲナーゼにより２，４−ジオキソペンタン酸に変換される（工程Ｅ）。２，４−ジオキソペンタン酸の２−又は４−オキソ基の還元により、それぞれ、２−ヒドロキシ−４−オキソペンタン酸（工程Ｈ）又は４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸（工程Ｋ）が生じる。あるいは、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸は、ＡＫＰを２−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸に還元し（工程Ｊ）、次いで、アミノ基転移又は酸化的脱アミノ化（工程Ｌ）することにより形成することもできる。形成されると、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸は、図１２に示す通り３つの酵素的段階で２，４−ペンタジエノエートに変換することができる（図１２の工程Ｂ／Ｃ／Ｄ）。２−ヒドロキシ−４−オキソペンタン酸中間体は、アセチルアクリレートに脱水され（工程Ｆ）、次いで、還元及び脱水され得る（工程Ｃ／Ｄ）。
【０４３５】
図１３に示すＡＫＰからの経路への別の入口は、オルニチンである。オルニチンアミノムターゼは、まず、オルニチンを２，４−ジアミノペンタン酸に変換することを必要とする（工程Ｍ）。次いで、２，４−ジアミノペンタン酸中間体を、アミノ基転移又は酸化的脱アミノ化よってＡＫＰに変換する（工程Ｎ）。
【０４３６】
アラニン又はオルニチンのＤ−又はＬ−立体異性体のいずれも、図１３に示す２，４−ペンタジエノエート経路に対する前駆体又は中間体として機能することができると理解される。アラニン又はオルニチンのＤ−及びＬ−立体異性体は、アラニンラセマーゼ又はオルニチンラセマーゼ酵素によって容易に相互変換される。
【０４３７】
図５及び６に示す転換を触媒するための酵素をＥＣ番号により分類し（表２）、更に以下に記載する。
【０４３８】
【表８０】
2013535203.tif 000082
【０４３９】
１．１．１．ａ  オキシドレダクターゼ（オキソからアルコールへ）：図５及び６における多くの転換は、ケトンのアルコールへの還元を含む。図１２の工程Ｃにおいて、２−オキソペンテン酸は２−ヒドロキシペンテン酸に還元される。類似する転換は、ケト酸２，４−ジオキソペンタン酸の対応するヒドロキシ酸、２−ヒドロキシ−４−オキソペンタン酸への還元（図１３の工程Ｈ）である。図１３の工程Ｃ、Ｊ及びＫは、ＡＫＰ、２，４−ジオキソペンタン酸及びアセチルアクリレートの４−オキソ基の対応するアルコールへの還元を伴う。これら転換は、ＥＣクラス１．１．１におけるオキシドレダクターゼ酵素によって触媒される。
【０４４０】
幾つかの例示的なアルコールデヒドロゲナーゼは、ケトンをアルコール官能基に変換する。大腸菌由来のこのような２つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）によりコードされている。更に、ラルストニア・ユートロファに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、２−オキソ酪酸、２−オキソペンタン酸及び２−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の２−ケト酸に対して高い活性を示すことが示されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：３２９−３３４（１９８３年））。α−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である２−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒される（Ｓｕｄａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６年）；Ｓｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７年））。更なる候補オキシドレダクターゼは、ヒトの心臓に由来するミトコンドリアの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）であり、これは、既にクローニングされ、特性評価されている（Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３（１９９２年））。Ｃ．ベエイジェリンキー（Ｉｓｍａｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５０９７−５１０５（１９９３年））及びＴ．ブロッキイ（Ｌａｍｅｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５：１８３−１９０（１９８１年）；Ｐｅｒｅｔｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：６５４９−６５５５（１９８９年））のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼは、ＭＥＫの２−ブタノールへの還元を触媒する。例示的なＭＥＫレダクターゼ酵素は、ロドコッカス・ルーバー（Ｋｏｓｊｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８６：５５−６２（２００４年））及びパイロコッカス・フリオサス（ｖａｎ  ｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３０６２−３０６８（２００１年））において見出すことができる。
【０４４１】
【表８１】
2013535203.tif 000083
【０４４２】
１．４．１．ａ  オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）：ＥＣクラス１．４．１における酵素は、アクセプターとしてＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＦＡＤを有するアミノ基の酸化的脱アミノ化を触媒する。このような酵素は、ＡＫＰの２，４−ジオキソペンタン酸への（図１３、工程Ｅ）、２−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸への（図１３、工程Ｌ）、及び２，４−ジアミノペンタン酸のＡＫＰへの（図１３、工程Ｎ）酸化的脱アミノ化を触媒するために必要である。２，４−ジアミノペンタン酸のＡＫＰへの変換（図１３の工程Ｎ）は、２，４−ジアミノペンタン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１２）により触媒される。２，４−ジアミノペンタン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、クロストリジウム・スティックランディ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）のｏｒｄ遺伝子産物等、オルニチンの嫌気発酵を受ける生物において特性評価されている（Ｆｏｎｋｎｅｃｈｔｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ：（２００９年））。ｏｒｄ遺伝子産物に対する配列相同性により、他の生物において更なる２，４−ジアミノペンタン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子候補を推測することができる。関連する酵素である３，５−ジアミノヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１１）は、３，５−ジアミノヘキサン酸の５−アミノ−３−オキソヘキサン酸への酸化的脱アミノ化を触媒する。この酵素をコードする遺伝子ｋｄｄは、フソバクテリウム・ヌクレアトゥム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）において最近同定された（Ｋｒｅｉｍｅｙｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：７１９１−７１９７（２００７年））。この酵素は、リシンを発酵させる他の生物において既に精製され、特性評価されているが、これら酵素に関連した遺伝子は、現在まで同定されていない（Ｂａｋｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７７２４−７７３４（１９７２年）；Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２９２−２９９（１９７４年））。配列相同性によって、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３及び他の配列決定されている生物における候補を推測することができる。
【０４４３】
【表８２】
2013535203.tif 000084
【０４４４】
基質ＡＫＰ及び２−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸（図１３の工程Ｅ及びＬ）は、αアミノ酸に類似しており、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）及びアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２１）等のアミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素のための代替基質として機能することもできる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、グルタミン酸の２−オキソグルタル酸への可逆的なＮＡＤ（Ｐ）＋依存性変換を触媒する。例示的な酵素は、大腸菌におけるｇｄｈＡ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：５２５７−５２６６（１９８３年）；Ｋｏｒｂｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：１２７０−１２７３（１９９３年））、サーモトガ・マリティマにおけるｇｄｈ（Ｋｏｒｔら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １：５２−６０（１９９７年）；Ｌｅｂｂｉｎｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：２８７−２９６（１９９８年）；Ｌｅｂｂｉｎｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９：３５７−３６９（１９９９年））及びハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ）におけるｇｄｈＡ１（Ｉｎｇｏｌｄｓｂｙら，Ｇｅｎｅ．３４９：２３７−２４４（２００５年））によってコードされている。更なるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、枯草菌（Ｋｈａｎら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：１８６１−１８７０（２００５年））、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）（Ｐｕｒｎｅｌｌら，Ｐｌａｎｔａ  ２２２：１６７−１８０（２００５年））、イネ（Ａｂｉｋｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４６：１７２４−１７３４（２００５年））、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）（Ｄｉａｚら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．１０：１０５−１１５（２００６年））及びハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｙｄｅｎら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２１１：３７−４１（２００２年））において特性評価されている。タバコ酵素は、ｇｄｈ１及びｇｄｈ２によってコードされるアルファサブユニット及びベータサブユニットで構成される（Ｐｕｒｎｅｌｌら，Ｐｌａｎｔａ  ２２２：１６７−１８０（２００５年））。例示的なロイシンデヒドロゲナーゼは、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のｌｄｈによってコードされる。この酵素は、ロイシン、イソロイシン、バリン及び２−アミノブタン酸を含む一連の基質と反応する（Ｓｔｏｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５４：７７−８０（１９９７年）；Ａｎｓｏｒｇｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．６８：５５７−５６２（２０００年））。ｎａｄＸによってコードされるサーモトガ・マリティマ由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤの生合成に関与する（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８８０４−８８０８（２００３年））。
【０４４５】
【表８３】
2013535203.tif 000085
【０４４６】
２．６．１．ａ  アミノトランスフェラーゼ：ＡＫＰの２，４−ジオキソペンタン酸への（工程Ｅ）、２−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸への（工程Ｌ）、及び２，４−ジアミノペンタン酸のＡＫＰへの（工程Ｎ）変換を含む図１３における幾つかの転換は、アミノトランスフェラーゼ又はトランスアミナーゼ酵素によって触媒される。幾つかのアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸及び誘導体を対応する２−オキソ酸に変換する。このような酵素は、図１３の工程Ｅ及びＬに図示される転換を触媒するのに非常に適している（すなわち、ＡＫＰアミノトランスフェラーゼ及び２−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸アミノトランスフェラーゼ）。これらの転換に適切なアミノ酸アミノトランスフェラーゼの選択は、基質の立体化学に依存する場合がある。基質がＤ−立体配置である場合、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）を利用することができ、一方、Ｌ−立体異性体は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）等のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの好ましい基質である。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、自然界で、オキサロ酢酸からグルタミン酸にオキソ基を転移して、α−ケトグルタル酸及びアスパラギン酸を形成する。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性は、例えば大腸菌由来のａｓｐＣ（Ｙａｇｉら，１００：８１−８４（１９７９年）；Ｙａｇｉら，１１３：８３−８９（１９８５年））、出芽酵母由来のＡＡＴ２（Ｙａｇｉら，９２：３５−４３（１９８２年））、及びシロイヌナズナ由来のＡＳＰ５（Ｋｗｏｋら，５５：５９５−６０４（２００４年）；ｄｅ  ｌａら，４６：４１４−４２５（２００６年）；Ｗｉｌｋｉｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：３８１−３８９（１９９８年））の遺伝子産物によって触媒される。ラット由来の酵素は、２−アミノヘキサン二酸及び２，４−ジアミノ酪酸等の代替基質をアミノ基転移することが示されている（Ｒｅｃａｓｅｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：４５８３−４５８９（１９８０年））。他のＬ−アミノ酸基質に作用するアミノトランスフェラーゼも、これら転換を触媒することができる。バリンアミノトランスフェラーゼは、バリン及びピルビン酸の２−ケトイソ吉草酸及びアラニンへの変換を触媒する。大腸菌遺伝子ａｖｔＡは類似の酵素をコードし（Ｗｈａｌｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：７３９−７４６（１９８２年））、これも、α−ケト酪酸のアミノ基転移を触媒してα−アミノ酪酸を生成するが、この反応におけるアミノドナーは同定されていない（Ｗｈａｌｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５７１−５７４（１９８４年））。別の酵素候補は、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．３９）であり、これは、幾つかの生物におけるリシンの生合成及び分解に関与する酵素である。この酵素は、アミノアクセプターとしてα−ケトグルタル酸を使用して、２−アミノアジピン酸及び２−オキソアジピン酸を相互変換する。遺伝子の候補は、ヒト（Ｏｋｕｎｏら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４７：１３６−１４８（１９９３年）��及びサーマス・サーモフィラス（Ｍｉｙａｚａｋｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２３２７−２３３４（２００４年））でみられる。ｌｙｓＮによってコードされるサーマス・サーモフィラス酵素は、オキサロ酢酸、２−オキソイソカプロン酸、２−オキソイソ吉草酸及び２−オキソ−３−メチル吉草酸を含む幾つかの代替基質に対して活性を有する。
【０４４７】
【表８４】
2013535203.tif 000086
【０４４８】
基質がＤ−立体異性体で存在する場合、アミノ基転移は、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及びＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＤＡＡＴ）としても知られているＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）によって触媒され得る。この分類の酵素は、基質特異性が広いことで知られており、基質特異性は種特異的である。ｄａｔによってコードされるバチルス属種ＹＭ−１由来のＤアミノトランスフェラーゼは、クローニングされ、配列決定され（Ｔａｎｉｚａｗａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２４５０−２４５４（１９８９年））、結晶構造が解明されている（Ｐｅｉｓａｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：４９５８−４９６７（１９９８年））。この酵素も、基質特異性を変化させるために改変されている（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２１８−７２２３（２０００年）；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：５３−５８（１９９８年））。更なる遺伝子候補は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ１０７１６（Ｔａｙｌｏｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３５０：３８−４０（１９９７年））、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ｐｕｃｃｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３３６−３４２（１９９５年））及び枯草菌（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｒｒｉｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０：３５３８−３５４６（１９６５年））でみられる。
【０４４９】
【表８５】
2013535203.tif 000087
【０４５０】
２，４−ジアミノペンタン酸のＡＫＰへの変換（図１３の工程Ｎ）は、２，４−ジアミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素により触媒される。この活性は現在まで酵素において特性評価されていないが、幾つかの酵素は、類似する転換、２，４−ジアミノブタン酸のアスパラギン酸−４−セミアルデヒドへの変換を触媒する。例示的な酵素候補としては、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４６及びＥＣ２．６．１．７６）及びγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）が挙げられる。例示的なジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素は、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）及びインフルエンザ菌（Ｉｋａｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５１１８−５１２５（１９９７年）；Ｉｋａｉら，Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２１：１７０−１７３（１９９８年））におけるｄａｔ遺伝子産物によってコードされる。その天然基質に加えて、２，４−ジアミノ酪酸、Ａ．バウマニイのＤＡＴは、リシン、４−アミノ酪酸及びオルニチンの末端アミンをアミノ基転移する。更なるジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子候補としては、マリノコッカス・ハロフィルス（Ｍａｒｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）及びハロバチルス・デバネンシス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｂａｎｅｎｓｉｓ）のｅｃｔＢ遺伝子産物（Ｚｈａｏら，Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５３：１８３−１８８（２００６年）；Ｌｏｕｉｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３（Ｐｔ４）：１１４１−１１４９（１９９７年））、並びに緑膿菌のｐｖｄＨ遺伝子産物（Ｖａｎｄｅｎｅｎｄｅら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：５５９６−５６０２（２００４年））が挙げられる。アミノアクセプターとしてα−ケトグルタル酸を利用するジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．６．１．７６に含まれる。このような酵素は、アシネトバクター・バウマニイでみられる。
【０４５１】
また、シュードモナス・フルオレッセンスのβ−アラニンアミノトランスフェラーゼは、基質として２，４−ジアミノ酪酸を受容するが（Ｈａｙａｉｓｈｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３６：７８１−７９０（１９６１年））；この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されていない。γアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、自然界ではコハク酸セミアルデヒド及びグルタミン酸を４−アミノ酪酸及びα−ケトグルタル酸に相互変換する。一般に、ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼは、広範囲の代替基質と反応する（Ｓｃｈｕｌｚら，５６：１−６（１９９０年）；Ｌｉｕら，４３：１０８９６−１０９０５（２００４年））。大腸菌における２つのＧＡＢＡトランスアミナーゼは、ｇａｂＴ（Ｂａｒｔｓｃｈら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：７０３５−７０４２（１９９０年））及びｐｕｕＥ（Ｋｕｒｉｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４６０２−４６０８（２００５年））によってコードされる。ｇａｂＴ遺伝子産物は、広い基質特異性を有することが示されている（Ｓｃｈｕｌｚら，５６：１−６（１９９０年）；Ｌｉｕら，４３：１０８９６−１０９０５（２００４年））。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びイノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）におけるＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼは、様々な代替基質と反応することが示されている（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：８０−８２（１９８５年））。
【０４５２】
【表８６】
2013535203.tif 000088
【０４５３】
４．１．３．ａ  リアーゼ：ピルビン酸及びアセトアルデヒドの４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸への縮合（図１２の工程Ａ）は、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．３９）によって触媒される。この酵素は、フェノール、クレゾール及びカテコールを分解するための経路に関与する。ｍｈｐＥによってコードされる大腸菌酵素は、アクセプターとしてのアセトアルデヒドに対して非常に特異的であるが、代替基質２−ケト酪酸又はフェニルピルビン酸をドナーとして受容する（Ｐｏｌｌａｒｄら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：４０９３−４０９４（１９９８年））。類似する酵素が、シュードモナス・プチダのｃｍｔＧ及びｔｏｄＨの遺伝子によってコードされている（Ｌａｕら，Ｇｅｎｅ  １４６：７−１３（１９９４年）；Ｅａｔｏｎ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１３５１−１３６２（１９９６年））。シュードモナス属のＣＦ６００では、この酵素は、ｄｍｐＦＧによってコードされる二機能アルドラーゼデヒドロゲナーゼヘテロダイマーの一部である（Ｍａｎｊａｓｅｔｔｙら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：５８２−５８５（２００１年））。デヒドロゲナーゼの機能は、アセトアルデヒド及びアセチル−ＣｏＡを相互変換して、一部の細胞に対して毒性のあるアセトアルデヒドの細胞内濃度を低下させるという利点を提供することである。
【０４５４】
【表８７】
2013535203.tif 000089
【０４５５】
４．２．１．ａ  デヒドラターゼ：４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸の２−オキソペンテン酸への脱水（図１２の工程Ｂ）は、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８０）によって触媒される。類似する酵素は、４−ヒドロキシペンタ−２−エノエートの２，４−ペンタジエノエートへの脱水（図１３の工程Ｄ）を触媒するために必要とされる。４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸ヒドラターゼは、芳香族分解経路に関与し、典型的に、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子と共転写される。例示的な遺伝子産物は、大腸菌のｍｈｐＤ（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２５７３−２５８１（１９９７年）；Ｐｏｌｌａｒｄら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：９８−１０６（１９９８年））、シュードモナス・プチダのｔｏｄＧ及びｃｍｔＦ（Ｌａｕら，Ｇｅｎｅ  １４６：７−１３（１９９４年）；Ｅａｔｏｎ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１３５１−１３６２（１９９６年））、コマモナス属の種ＣＮＢ−１のｃｎｂＥ（Ｍａら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：４４７７−４４８３（２００７年））、及びバークホルデリア・キセノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）のｍｈｐＤ（Ｗａｎｇら，ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７２：９６６−９７４（２００５年））によってコードされる。緊密に関連する酵素である２−オキソヘプタ−４−エン−１，７−ジオエートヒドラターゼは、４−ヒドロキシフェニル酢酸の分解に関与し、そこで補因子としてマグネシウムを使用して、２−オキソ−ヘプタ−４−エン−１，７−ジオエート（ＯＨＥＤ）を２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘプタ−１，７−ジオエートに変換する（Ｂｕｒｋｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：（１９９８年））。ＯＨＥＤヒドラターゼ酵素の候補は、大腸菌Ｃ（Ｒｏｐｅｒら，Ｇｅｎｅ  １５６：４７−５１（１９９５年）；Ｉｚｕｍｉら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７０：８９９−９１１（２００７年））及び大腸菌Ｗ（Ｐｒｉｅｔｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１１１−１２０（１９９６年））で同定され、特性評価されている。配列比較により、広範囲の細菌、植物、及び動物におけるホモログが明らかになる。中でも、非常に類似する配列を有する酵素は、肺炎杆菌（９１％の同一性、ｅ値＝２ｅ−１３８）及びサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）（９１％の同一性、ｅ値＝４ｅ−１３８）に含有されている。
【０４５６】
【表８８】
2013535203.tif 000090
【０４５７】
２−ヒドロキシペンテン酸（図１２、工程Ｄ）又は２−ヒドロキシ−４−オキソペンタン酸（図１３、工程Ｆ）の脱水を触媒するための酵素候補としては、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、シトラマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３４）及びジメチルマレイン酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８５）が挙げられる。フマラーゼ酵素は、自然界において、リンゴ酸のフマル酸への可逆的な脱水を触媒する。基質としての２−ヒドロキシペンテン酸又は２−ヒドロキシ−４−オキソペンテン酸と反応するフマラーゼの能力は、文献には記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造情報が利用可能であり、また、他の研究者が、活性、阻害及び局在を変化させるための酵素の改変に成功している（Ｗｅａｖｅｒ，６１：１３９５−１４０１（２００５年））。大腸菌は、３つのフマラーゼ：増殖条件により調節されるＦｕｍＡ、ＦｕｍＢ及びＦｕｍＣを有する。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気条件下でのみ活性を有する。ＦｕｍＡは、微小嫌気条件下で活性を有し、ＦｕｍＣは、好気増殖中に活性を有する唯一の酵素である（Ｔｓｅｎｇら，１８３：４６１−４６７（２００１年）；Ｗｏｏｄｓら，９５４：１４−２６（１９８８年）；Ｇｕｅｓｔら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３１：２９７１−２９８４（１９８５年））。更なる酵素候補は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：９６１−９７５（１９９９年））、サーマス・サーモフィラス（Ｍｉｚｏｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５：４９−５５（１９９８年））及びラット（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，８９：１９２３−１９３１（１９８１年））でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のｆｕｍ１及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｆｕｍＣが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム由来のｍｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別の分類のフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，２７０：２０７−２１３（２００７年））。シトラマル酸ヒドロリアーゼは、自然界では、２−メチルリンゴ酸をメサコン酸に脱水する。この酵素は、広い基質特異性を有することが示されている、メタノカルドコッカス・ジャナスキイの２−オキソブタン酸へのピルビン酸経路において研究されている（Ｄｒｅｖｌａｎｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８９：４３９１−４４００（２００７年））。この酵素活性は、破傷風様菌、モルガネラ・モルガニー、シトロバクター・アマロナティカスでも検出され、これら細菌においてグルタミン酸分解に関与していると考えられる（Ｋａｔｏら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７年））。Ｍ．ジャナスキイのタンパク質配列は、これら生物における遺伝子に対してそれほど高い相同性を有する訳ではない。ジメチルマレイン酸ヒドラターゼは、ジメチルマレイン酸を水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける、可逆的なＦｅ２＋依存性且つ酸素感受性の酵素である。この酵素は、ユーバクテリウム・バーケリにおけるｄｍｄＡＢによってコードされている（Ａｌｈａｐｅｌら，上記；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６５：８４７−８５７（１９８４年））。
【０４５８】
【表８９】
2013535203.tif 000091
【０４５９】
４．３．１．ａ  アンモニア−リアーゼ：アンモニアリアーゼ酵素は、図１３の工程Ｂにおける２−アミノ−４−オキソペンタン酸（ＡＫＰ）のアセチルアクリレートへの脱アミノ化を触媒するために必要である。この正確な転換を触媒する酵素は同定されていない。しかし、ＡＫＰは、アスパルターゼ（ＥＣ４．３．１．１）の天然基質であるアスパラギン酸に構造上類似している。アスパルターゼは、微生物に広く存在する酵素であり、広範囲にわたって特性評価されている（Ｖｉｏｌａ，７４：２９５−３４１（２０００年））。大腸菌酵素は、アスパラギン酸フェニルメチルエステル、アスパラギン、ベンジルアスパラギン酸及びリンゴ酸を含む様々な代替基質と反応することが示されている（Ｍａら，６７２：６０−６５（１９９２年））。更に、基質特異性を変化させるためにこの酵素に対して指向進化が使用されている（Ａｓａｎｏら，２２：９５−１０１（２００５年））。ａｓｐＡによってコードされている大腸菌アスパルターゼの結晶構造は解明されている（Ｓｈｉら，３６：９１３６−９１４４（１９９７年））。アスパルターゼ機能を有する酵素は、インフルエンザ菌（Ｓｊｏｓｔｒｏｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３２４：１８２−１９０（１９９７年））、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｔａｋａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６：５４５−５５２（１９８４年））、枯草菌（Ｓｊｏｓｔｒｏｍら，１３２４：１８２−１９０（１９９７年））、及びセラチア・マルセスセンス（Ｔａｋａｇｉら，１６１：１−６（１９８５年））においても特性評価されている。
【０４６０】
【表９０】
2013535203.tif 000092
【０４６１】
ＡＫＰの脱アミノ化を触媒するための別の酵素候補は、３−メチルアスパルターゼ（ＥＣ４．３．１．２）である。β−メチルアスパルターゼ及び３−メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼとしても知られているこの酵素は、自然界では、トレオ−３−メチルアスパラギン酸のメサコン酸への脱アミノ化を触媒する。破傷風様菌由来の３−メチルアスパルターゼは、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、結晶化されている（Ａｓｕｎｃｉｏｎら，５７：７３１−７３３（２００１年）；Ａｓｕｎｃｉｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：８３０６−８３１１（２００２年）；Ｂｏｔｔｉｎｇら，２７：２９５３−２９５５（１９８８年）；Ｇｏｄａら，３１：１０７４７−１０７５６（１９９２年））。シトロバクター・アマロナティカスでは、この酵素はＢＡＡ２８７０９によってコードされている（Ｋａｔｏ及びＡｓａｎｏ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７年））。３−メチルアスパラギン酸も、大腸菌ＹＧ１００２から結晶化されているが（Ａｓａｎｏら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１１８：２５５−２５８（１９９４年））、タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベースに掲載されていない。配列相同性を用いて、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）におけるＣＴＣ＿０２５６３、及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７におけるＥＣｓ０７６１を含む更なる候補遺伝子を同定することができる。
【０４６２】
【表９１】
2013535203.tif 000093
【０４６３】
５．１．１．ａ  ラセマーゼ：ＥＣクラス５．１．１におけるラセマーゼ酵素は、Ｄ−及びＬ−アミノ酸を異性化する。このような酵素は、Ｄ−アラニン及び／又はＤ−オルニチンの生物学的利用能を高め、それによって、アラニンのＡＫＰへの（図１３の工程Ａ）又はオルニチンの２，４−ジアミノペンタン酸への（図１３の工程Ｍ）変換を増加させるために必要とされる場合がある。アラニンラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．１）及びオルニチンラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．１２）活性を有する酵素が特性評価されている。アラニンラセマーゼは、アラニンのＬ−及びＤ−立体異性体を相互変換する。大腸菌は、ａｌｒ及びｄａｄＸによりコードされている２つのアラニンアミノムターゼ酵素を有する（Ｌｉｌｌｅｙら，Ｇｅｎｅ  １２９：９−１６（１９９３年）；Ｗｉｌｄら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９８：３１５−３２２（１９８５年））。大腸菌で発現させたとき、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）のｖａｎＴ遺伝子もアラニンラセマーゼ活性を示した（Ａｒｉａｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ７）：１７２７−１７３４（２０００年））。更なるアラニンラセマーゼ酵素候補は、枯草菌及び結核菌において特性評価されている（Ｐｉｅｒｃｅら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２８３：６９−７４（２００８年）；Ｓｔｒｙｃｈら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９６：９３−９８（２００１年））。Ｄ−オルニチン及びＬ−オルニチンの相互転換はオルニチンラセマーゼによって触媒される。Ｃ．スティックランディのｏｒｒ遺伝子産物によってコードされている酵素は、精製され、特性評価されている（Ｆｏｎｋｎｅｃｈｔｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ：（２００９年））。配列類似性により、クロストリジウム・ディフィシレ及びフゾバクテリウム・ペリオドンチカム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ）等の生物において更なるオルニチンラセマーゼ遺伝子候補を同定することができる。
【０４６４】
【表９２】
2013535203.tif 000094
【０４６５】
５．４．３．ａ  アミノムターゼ：オルニチンアミノムターゼ（ＥＣ５．４．３．５）は、オルニチンの２，４−ジアミノペンタン酸への変換（図１３の工程Ｍ）を触媒する。クロストリジウム・スティックランディのｏｒａＳＥによってコードされている、この活性を有するＢ１２依存性の酵素は、大腸菌でクローニングされ、配列決定され、発現している（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４４７４４−４４７５０（２００１年））。この酵素は、オルニチンのＤ−立体異性体と優先的に反応する（Ｆｏｎｋｎｅｃｈｔｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ：（２００９年））。オルニチンアミノムターゼ酵素は、他の生物では現在まで特性評価されていない。配列相同性によって、アルカリフィラス・オレムランディイ（Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ）及びクロストリジウム・ディフィシレ等の生物における類似する酵素を同定することができる。リシンアミノムターゼは２つの類似する転換：２，５−ジアミノヘキサン酸（ＥＣ５．４．３．４）とリシンとの相互変換、及び３，５−ジアミノヘキサン酸（ＥＣ５．４．３．３）と３，６−ジアミノヘキサン酸との相互変換を触媒する。この酵素は、リシンの酢酸及び酪酸への発酵に関与し、クロストリジウム・スティックランディ（Ｂｅｒｋｏｖｉｔｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０１：１５８７０−１５８７５（２００４年））及びポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｔａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：８７６７−８７７６（２００２年））で特性評価されている。
【０４６６】
【表９３】
2013535203.tif 000095
【０４６７】
その他：２−アミノ−４−オキソペンタン酸（ＡＫＰ）は、ＡＫＰチオロアーゼによってアラニン及びアセチル−ＣｏＡから形成される（図１３の工程Ａ）。ＡＫＰチオラーゼ（ＡＫＰＴ、ＥＣ番号なし）は、クロストリジウム・スティックランディにおけるオルニチン分解に関与するピリドキサールリン酸依存性酵素である（Ｊｅｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２８９８−２９０３（１９７４年）；Ｋｅｎｋｌｉｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５（Ｐｔ４）：８１９−８２６（１９９９年））。ＡＫＰＴ（ｏｒ−２（ｏｒｔＡ）及びｏｒ−３（ｏｒｔＢ））のアルファサブユニット及びベータサブユニットをコードする遺伝子クラスターが最近報告され、酵素の生化学的性質が特性評価された（Ｆｏｎｋｎｅｃｈｔｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ：（２００９年））。酵素は、両方向に作用することができ、Ｄ−アラニンの異性体と反応する。酵素工学又は指向進化により、基質としてＬ−アラニンに作用する酵素を可能にして、一次基質に関して汎用性を有する更なる経路を提供することができる。あるいは、アラニンラセマーゼ酵素の共発現により、基質の利用可能性を高めることができる。高い配列相同性を有する酵素は、クロストリジウム・ディフィシレ、アルカリフィルス・メタリレジゲンス（Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｅｓ）ＱＹＦ、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の種Ｘ５１４、及びサーモアナエロバクター・テングコンゲンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）ＭＢ４でみられる（Ｆｏｎｋｎｅｃｈｔｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ：（２００９年））。
【０４６８】
【表９４】
2013535203.tif 000096
【０４６９】
実施例ＩＸ
合成ガスから還元当量を抽出するための例示的なヒドロゲナーゼ及びＣＯデヒドロゲナーゼ酵素、並びに例示的な還元ＴＣＡ回路酵素
本発明の天然には存在しない微生物において有用な還元ＴＣＡ回路の酵素としては、ＡＴＰクエン酸リアーゼ及び３つのＣＯ２固定酵素：イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼのうちの１以上が挙げられる。ＡＴＰクエン酸リアーゼ又はクエン酸リアーゼ及びα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼの存在は、生物において活発な還元ＴＣＡ回路が存在することを示す。還元ＴＣＡ回路の各段階の酵素を以下に示す。
【０４７０】
ＡＴＰクエン酸シンテターゼとも呼ばれるＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ、ＥＣ２．３．３．８）は、クエン酸のオキサロ酢酸及びアセチル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性切断を触媒する。ＡＣＬは、緑色硫黄細菌クロロビウム・リミコーラ（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ）及びクロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）において研究されているＲＴＣＡ回路の酵素である。クロロビウム・リミコーラ由来のアルファ（４）ベータ（４）ヘテロメリック酵素は、大腸菌でクローニングされ、特性評価された（Ｋａｎａｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：３４０９−３４１６（２００２年）。ａｃｌＡＢによってコードされるＣ．リミコーラ酵素は、不可逆的であり、また、酵素の活性はＡＤＰ／ＡＴＰの比率によって調節される。クロロビウム・テピダム由来の組み換えＡＣＬも大腸菌において発現し、触媒機構におけるアルファサブユニット及びベータサブユニットの役割を解明する研究において、ホロ酵素がインビトロで再構成された（Ｋｉｍ及びＴａｂｉｔａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：６５４４−６５５２（２００６年）。ＡＣＬ酵素は、バルネアリウム・リトトロフィカム（Ｂａｌｎｅａｒｉｕｍ  ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、スルフリハイドロゲニビウム・サブテラネウム（Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ）及びアクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）の細菌の他のメンバーにおいても同定されている（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：８１−９２（２００７年））。この活性は、幾つかの真菌においても同様に報告されている。例示的な生物としては、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）（Ｎｏｗｒｏｕｓｉａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１８９−９３（２０００年）、アスペルギルス・ニデュランス、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（Ｈｙｎｅｓ及びＭｕｒｒａｙ，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，Ｊｕｌｙ：１０３９−１０４８，（２０１０年）、及びアスペルギルス・ニガー（Ｍｅｉｊｅｒら．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：１２７５−１２８０（２００９年）が挙げられる。他の候補は、配列相同性に基いて見出すことができる。これら酵素に関する情報を以下に記載する。
【０４７１】
【表９５】
2013535203.tif 000097
【０４７２】
幾つかの生物では、クエン酸のオキサロ酢酸及びアセチル−ＣｏＡへの変換は、シトリル−ＣｏＡ中間体を通じて進行し、２つの別々の酵素シトリル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１８）及びシトリル−ＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．３４）によって触媒される（Ａｏｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：２４９−２５５（２００７年）。シトリル−ＣｏＡシンテターゼは、クエン酸のシトリル−ＣｏＡへの活性化を触媒する。ヒドロジェノバクター・サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）酵素は、それぞれｃｃｓＡ及びｃｃｓＢによってコードされる大サブユニット及び小サブユニットで構成される（Ａｏｓｈｉｍａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．５２：７５１−７６１（２００４年））。アキフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）のシトリル−ＣｏＡシンテターゼは、ｓｕｃＣ１及びｓｕｃＤ１によってコードされるアルファサブユニット及びベータサブユニットで構成される（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：８１−９２（２００７年））。シトリル−ＣｏＡリアーゼは、シトリル−ＣｏＡをオキサロ酢酸及びアセチル−ＣｏＡに分割する。この酵素は、ヒドロジェノバクター・サーモフィラスにおけるｃｃｌ（Ａｏｓｈｉｍａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：７６３−７７０（２００４年））及びアキフェクス・エオリクスにおけるａｑ＿１５０（Ｈｕｇｌｅｒら，上記（２００７年））によりコードされているホモトリマーである。クエン酸をオキサロ酢酸及びシトリル−ＣｏＡに変換するこの機序のための遺伝子は、クロロビウム・テピダムにおいても最近報告された（Ｅｉｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ９９（１４）：９５０９−１４（２００２年）。
【０４７３】
【表９６】
2013535203.tif 000098
【０４７４】
オキサロ酢酸は、順方向及び逆方向の両方に作用する酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）によってリンゴ酸に変換される。出芽酵母は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの３つのコピー、ＭＤＨ１（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５１５７−５１６６（１９８７年）、ＭＤＨ２（Ｍｉｎａｒｄ及びＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：３７０−３８０（１９９１年）；Ｇｉｂｓｏｎ及びＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２５６２８−２５６３６（２００３年））及びＭＤＨ３（Ｓｔｅｆｆａｎ及びＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７０８−２４７１５（１９９２年））を有し、これらはそれぞれミトコンドリア、サイトゾル及びペルオキシソームに局在する。大腸菌は、ｍｄｈによってコードされる、活性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼを有することが知られている。
【０４７５】
【表９７】
2013535203.tif 000099
【０４７６】
フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２）は、フマル酸のリンゴ酸への可逆的な水和を触媒する。ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ及びｆｕｍＣによってコードされる大腸菌の３つのフマラーゼは、酸素利用可能性の異なる条件下で調節される。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気条件下で活性を有する。ＦｕｍＡは、微小嫌気条件下で活性を有し、ＦｕｍＣは、好気増殖中に活性を有する（Ｔｓｅｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４６１−４６７（２００１年）；Ｗｏｏｄｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５４：１４−２６（１９８８年）；Ｇｕｅｓｔら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３１：２９７１−２９８４（１９８５年））。出芽酵母は、フマラーゼをコードする遺伝子ＦＵＭ１を１コピー含有し、その産物は、サイトゾル及びミトコンドリアの両方に局在する（Ｓａｓｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４５１０９−４５１１６（２００３年））。更なるフマラーゼ酵素は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：９６１−９７５（１９９９年））、サーマス・サーモフィラス（Ｍｉｚｏｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５：４９−５５（１９９８年））及びラット（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９：１９２３−１９３１（１９８１年））でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のｆｕｍ１及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｆｕｍＣが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム由来のＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別の分類のフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２７０：２０７−２１３（２００７年））。
【０４７７】
【表９８】
2013535203.tif 000100
【０４７８】
フマル酸レダクターゼは、フマル酸のコハク酸への還元を触媒する。ｆｒｄＡＢＣＤによってコードされる４つのサブユニットで構成される大腸菌のフマル酸レダクターゼは、膜結合型であり、嫌気条件下で活性を有する。この反応の電子供与体はメナキノンであり、この反応で生成される２つのプロトンはプロトン勾配には寄与しない（Ｉｖｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１９６１−１９６６（１９９９年））。酵母ゲノムは、ＦＲＤＳ１（Ｅｎｏｍｏｔｏら，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．３：２６３−２６７（１９９６年））及びＦＲＤＳ２（Ｍｕｒａｔｓｕｂａｋｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１７５−１８１（１９９８年））によってコードされる２つの可溶性フマル酸レダクターゼアイソザイムをコードし、これらは、それぞれサイトゾル及びプロミトコンドリアに局在し、グルコース上における嫌気増殖中に使用される（Ａｒｉｋａｗａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６５：１１１−１１６（１９９８年））。
【０４７９】
【表９９】
2013535203.tif 000101
【０４８０】
コハク酸のスクシニル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性アシル化は、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．５）によって触媒される。出芽酵母のＬＳＣ１及びＬＳＣ２遺伝子、並びに大腸菌のｓｕｃＣ及びｓｕｃＤ遺伝子の産物は、自然界では、１つのＡＴＰを消費すると同時にコハク酸からのスクシニル−ＣｏＡの形成を触媒するスクシニル−ＣｏＡシンテターゼ複合体を形成する（これはインビボでは可逆的な反応である）（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５年））。これらタンパク質は、以下の通り同定される：
【０４８１】
【表１００】
2013535203.tif 000102
【０４８２】
２−オキソグルタル酸シンテターゼ又は２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）としても知られているα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）は、２つの還元型フェレドキシン当量を消費すると同時にＣＯ２及びスクシニル−ＣｏＡからα−ケトグルタル酸を形成する。ＯＦＯＲ及びピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）は、補因子としてチアミンピロリン酸、ＣｏＡ及び鉄−硫黄クラスターを、そして電子伝達体としてフェレドキシン、フラボドキシン及びＦＡＤを利用する２−オキソ酸：フェレドキシン（フラボドキシン）オキシドレダクターゼの多様なファミリーのメンバーである（Ａｄａｍｓら，Ａｒｃｈａｅａ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．４８：１０１−１８０（１９９６年））。この分類における酵素は可逆的であり、ヒドロジェノバクター・サーモフィラス、デスルホバクター・ヒドロジェノフィラス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）及びクロストリジウム属の種等のＲＴＣＡ回路によって炭素を固定する生物においてカルボキシル化方向に機能する（Ｓｈｉｂａら．１９８５年；Ｅｖａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５：９２９３４（１９６６年）；Ｂｕｃｈａｎａｎ，１９７１年）。ｋｏｒＡＢによってコードされるＨ．サーモフィラス由来の２つのサブユニットの酵素は、大腸菌においてクローニングされ、発現している（Ｙｕｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２：５８９−５９４（２００１年））。ｆｏｒＤＡＢＧＥによってコードされる、スクシニル−ＣｏＡについて厳密な基質特異性を有する同じ生物由来の５つのサブユニットＯＦＯＲが、最近同定され、大腸菌で発現した（Ｙｕｎら．２００２年）。両方のＨ．サーモフィラスＯＦＯＲ酵素のＣＯ２固定速度は特性評価されている（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １４：７９−８５（２０１０年））。クロロビウム・チオスルファトフィラム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｏｐｈｉｌｕｍ）由来のＣＯ２固定ＯＦＯＲは、精製され、特性評価されているが、この酵素をコードする遺伝子は現在まで同定されていない。Ｈ．サーモフィラス遺伝子に対する配列相同性によって、クロロビウム属の種における酵素候補を推測することができる。例えば、クロロビウム・リミコーラゲノムは２つの類似するタンパク質をコードしている。ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）等の酢酸生成菌は、２つのＯＦＯＲ酵素をコードすると予測される。Ｍｏｔｈ＿００３４によってコードされる酵素は、ＣＯ２を同化する方向に機能すると予測される。この酵素に関係する遺伝子であるＭｏｔｈ＿００３４は、現在まで実験的には検証されていないが、公知のＯＦＯＲ酵素に対する配列相同性によって推測することができる。
【０４８３】
生理学的条件下で脱炭酸方向に機能するＯＦＯＲ酵素は、逆反応を触媒することもできる。ＳＴ２３００によりコードされている好熱好酸性古細菌スルホロブス属の種の株７由来のＯＦＯＲについては、広範囲に研究が行われている（Ｚｈａｎｇら．１９９６年）。大腸菌においてこのタンパク質を効率的に発現させるために、プラスミドに基づく発現系が開発されており（Ｆｕｋｕｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：５６３９−５６４６（２００１年））、基質特異性に関与する残基が決定された（Ｆｕｋｕｄａ及びＷａｋａｇｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９７：７４−８０（２００２年））。アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）株Ｋ１由来のＡｐｅ１４７２／Ａｐｅ１４７３によってコードされているＯＦＯＲが、最近、大腸菌にクローニングされ、特性評価され、２−オキソグルタル酸及び広範囲の２−オキソ酸と反応することが見出されてた（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９：２３１９−２３２２（２００５年））。別の例示的なＯＦＯＲは、ヘリコバクター・ピロリにおけるｏｏｒＤＡＢＣによってコードされている（Ｈｕｇｈｅｓら．１９９８年）。α−ケトグルタル酸に特異的な酵素は、サウエラ・アロマチカにおいて報告されている（Ｄｏｒｎｅｒ及びＢｏｌｌ，Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４（１４），３９７５−８３（２００２年）。配列相同性により、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）において類似する酵素を見出すことができる。また、２つのサブユニットの酵素は、クロロビウム・テピダムでも同定されている（Ｅｉｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ９９（１４）：９５０９−１４（２００２年））。
【０４８４】
【表１０１】
2013535203.tif 000103
【０４８５】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）＋の還元を伴い、イソクエン酸の２−オキソグルタル酸への可逆的な脱炭酸を触媒する。出芽酵母及び大腸菌におけるＩＤＨ酵素は、それぞれ、ＩＤＰ１及びｉｃｄによりコードされている（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋ及びＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３３９−２３４５（１９９１年）；Ｎｉｍｍｏ，Ｈ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３４：３１７−２３３２（１９８６年））。還元ＴＣＡ回路における逆反応である、２−オキソグルタル酸のイソクエン酸への還元的カルボキシル化は、クロロビウム・リミコーラ由来のＮＡＤＰＨ依存性ＣＯ２固定ＩＤＨに好まれ、大腸菌で機能的に発現した（Ｋａｎａｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：１９２６−１９３１（２００２年））。９５％の配列同一性を有する類似の酵素が、以下に列挙する他の幾つかの候補に加えて、Ｃ．テピダムゲノムで見出されている。
【０４８６】
【表１０２】
2013535203.tif 000104
【０４８７】
Ｈ．サーモフィラスでは、２−オキソグルタル酸のイソクエン酸への還元的カルボキシル化は、２つの酵素：２−オキソグルタル酸カルボキシラーゼ及びオキサロコハク酸レダクターゼによって触媒される。２−オキソグルタル酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．７）は、α−ケトグルタル酸のオキサロコハク酸へのＡＴＰ依存性カルボキシル化を触媒する（Ａｏｓｈｉｍａ及びＩｇａｒａｓｈｉ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：７４８−７５９（２００６年））。この酵素は、２つのサブユニットで構成される大きな複合体である。大（Ａ）サブユニットのビオチン化は、酵素機能に必要である（Ａｏｓｈｉｍａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：７９１−７９８（２００４年））。オキサロコハク酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．−）は、オキサロコハク酸のＤ−トレオ−イソクエン酸へのＮＡＤ依存性変換を触媒する。この酵素は、Ｈ．サーモフィラスにおけるｉｃｄによってコードされるホモダイマーである。この酵素の速度パラメータは、他の生物におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ酵素とは対照的に、インビボにおいて還元的カルボキシル化方向にのみ酵素が作用することを示す（Ａｏｓｈｉｍａ及びＩｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：２０５０−２０５５（２００８年））。配列相同性に基いて、チオバチルス・デニトリフィカンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）及びサーモクリニス・アルブス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ  ａｌｂｕｓ）でも遺伝子候補が見出されている。
【０４８８】
【表１０３】
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【０４８９】
アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）は、中間体シス−アコニット酸を介してクエン酸及びイソ−クエン酸の可逆的な異性化を触媒する鉄−硫黄含有タンパク質である。２つのアコニターゼ酵素が、ａｃｎＡ及びａｃｎＢによって大腸菌ゲノムにおいてコードされている。ＡｃｎＢが主な異化酵素であるが、ＡｃｎＡがより安定であり、且つ酸化又は酸ストレス条件下で活性を有すると考えられる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３（Ｐｔ１２）：３７９５−３８０５（１９９７年））。ネズミチフス菌におけるアコニターゼの２つのアイソザイムは、ａｃｎＡ及びａｃｎＢによってコードされている（Ｈｏｒｓｗｉｌｌ及びＥｓｃａｌａｎｔｅ−Ｓｅｍｅｒｅｎａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：４７０３−４７１３（２００１年））。ＡＣＯ１によってコードされる出芽酵母のアコニターゼは、ミトコンドリアに局在してＴＣＡ回路に関与する（Ｇａｎｇｌｏｆｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３５５１−３５６１（１９９０年））、及びサイトゾルに局在してグリオキシル酸短絡回路に関与する（Ｒｅｇｅｖ−Ｒｕｄｚｋｉら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６：４１６３−４１７１（２００５年））。
【０４９０】
【表１０４】
2013535203.tif 000106
【０４９１】
ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）は、ピルビン酸の可逆的な酸化を触媒してアセチル−ＣｏＡを形成する。デスルホビブリオ・アフリカヌス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）由来のＰＦＯＲは、大腸菌でクローニングされ、発現して、酸素の存在下で数日間安定である活性を有する組換え酵素が生成された（Ｐｉｅｕｌｌｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５６８４−５６９２（１９９７年））。酸素安定性は、ＰＦＯＲにおいて比較的珍しく、Ｄ．アフリカヌス酵素のポリペプチド鎖における６０残基の伸長によって付与されると考えられる。この酵素における２つのシステイン残基が、酸素の形態における不活化から酵素を保護するジスルフィド結合を形成する。このジスルフィド結合及び酸素の存在下における安定性は、他のデスルホビブリオ属の種でも見出されている（Ｖｉｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：９５７−６４（２００８年））。Ｍ．サーモアセチカのＰＦＯＲも十分に特性評価されており（Ｍｅｎｏｎ及びＲａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８４８４−８４９４（１９９７年））、独立栄養生長中にピルビン酸合成の方向に高活性を有することが示された（Ｆｕｒｄｕｉ及びＲａｇｓｄａｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２８４９４−２８４９９（２０００年））。更に、大腸菌は、Ｍ．サーモアセチカのＰＦＯＲに対して５１％同一であるタンパク質をコードする、特性評価されていないオープンリーディングフレームｙｄｂＫを有する。大腸菌におけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性を立証する証拠が報告されている（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３：５６３−５６９（１９８２年））。また、ＰＦＯＲは、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔａｓ）（Ｙａｋｕｎｉｎ及びＨａｌｌｅｎｂｅｃｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４０９（１９９８年）３９−４９（１９９８年））及びクロロビウム・テピダム（Ｃｈｏｌｏｂｏｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）（Ｅｉｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ９９（１４）：９５０９−１４（２００２年））を含む他の生物においても記載されている。ｐｏｒＥＤＡＢＧによってコードされるＨ．サーモフィラス由来の５つのサブユニットのＰＦＯＲは、大腸菌にクローニングされ、脱炭酸方向及びＣＯ２同化方向の両方において機能することが示された（Ｉｋｅｄａら．２００６年；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １４：７９−８５（２０１０年））。また、Ｃ．カルボキシジボランズ（Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）Ｐ７にもホモログが存在する。幾つかの更なるＰＦＯＲ酵素は、以下の総説に記載されている（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０３：２３３３−２３４６（２００３年））。最後に、フラボドキシンレダクターゼ（例えば、ヘリコバクター・ピロリ又はカンピロバクター・ジェジュニ由来のｆｑｒＢ）（Ｓｔ  Ｍａｕｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：４７６４−４７７３（２００７年）又はＲｎｆ型タンパク質（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．��．１０５：２１２８−２１３３（２００８年）；及びＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９０：７８４−７９１（２００８年））は、ＰＦＯＲによって生成される還元型フェレドキシンからＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する手段を提供する。これらタンパク質は、以下の通り同定される：
【０４９２】
【表１０５】
2013535203.tif 000107
【０４９３】
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換は、他の幾つかの酵素又はその組合せによって触媒され得る。例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤの分子をＮＡＤＨに還元すると同時に、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに転換することができる。ピルビン酸の酸化的脱炭酸をアシル化させる一連の部分的な反応を触媒するのは複数の酵素の複合体である。前記酵素は３つのサブユニット：ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）で構成される。この酵素は、大腸菌及び出芽酵母を含む幾つかの生物において天然に存在する。大腸菌酵素では、Ｅ１構成要素における特定の残基が基質特異性に関与している（Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ，Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：８１５−８２（１９８１年）；Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８：５３５−５４０（１９６９年）；Ｇｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３６４５−１３６５３（２０００年））。酵素工学的取り組みにより、嫌気条件下における大腸菌のＰＤＨ酵素活性が改善された（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：３８５１−３８５８（２００８年）；Ｋｉｍら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：１７６６−１７７１（２００７年）；Ｚｈｏｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０：３３５−３４２（２００８年））。大腸菌のＰＤＨとは対照的に、枯草菌の複合体は活性を有し、嫌気条件下で増殖するために必要である（Ｎａｋａｎｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６７４９−６７５５（１９９７年））。また、グリセロール上における増殖中に特性評価された肺炎杆菌のＰＤＨも、嫌気条件下で活性を有する（５）。ウシの腎臓（１８）由来の酵素複合体及びアゾトバクター・ビネランジイ由来のＥ２触媒ドメインの結晶構造は、利用可能である（４）。この変換を触媒することができる更に別の酵素は、ピルビン酸ギ酸リアーゼである。この酵素は、ピルビン酸及びＣｏＡのアセチル−ＣｏＡ及びギ酸への変換を触媒する。ピルビン酸ギ酸リアーゼは、嫌気性酸化還元バランスの調節を補助するために使用される原核生物に共通の酵素である。例示的な酵素は、ｐｆｌＢによりコードされている大腸菌（Ｋｎａｐｐｅ及びＳａｗｅｒｓ，ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６：３８３−３９８（１９９０年））、ラクトコッカス・ラクチス（Ｍｅｌｃｈｉｏｒｓｅｎら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：３３８−３４４（２００２年））、及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ−Ａｂｂｅら，Ｏｒａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２９３−２９７（２００３年））において見出すことができる。大腸菌は、ｔｄｃＥによってコードされている更なるピルビン酸ギ酸リアーゼを有し、これはピルビン酸又は２−オキソブタン酸のアセチル−ＣｏＡ又はプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８年））。大腸菌由来のｐｆｌＢ及びｔｄｃＥは両方とも���ｐｆｌＡによってコードされているピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素の存在を必要とする。更に、大腸菌においてｙｆｉＤによってコードされる短いタンパク質は、酸素切断されたピルビン酸ギ酸リアーゼに結合し、その活性を回復させることができる（Ｖｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１６１３７−１６１４１（２００８年）。大腸菌由来のｐｆｌＡ及びｐｆｌＢは、国際公開第２００８／０８０１２４号に記載の通りブタノールを生成するためにサイトゾルのアセチル−ＣｏＡを増加させる手段として出芽酵母で発現したことに留意されたい。それぞれｐｆｌ及びａｃｔによってコードされる更なるピルビン酸ギ酸リアーゼ及び活性化酵素の候補は、クロストリジウム・パストゥリアヌムでみられる（Ｗｅｉｄｎｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２４４０−２４４４（１９９６年））。
【０４９４】
更に、異なる酵素を併用して、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換することもできる。例えば、出芽酵母では、アセチル−ＣｏＡは、まずピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドを形成することによりサイトゾルにおいて得られる。アセトアルデヒドは、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸に酸化され、続いて、活性化されて、アセチル−ＣｏＡシンテターゼによってアセチル−ＣｏＡを形成する。アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、大腸菌（Ｋｕｍａｒｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２８７８−２８８６（１９９５年））、サルモネラ・エンテリカ（Ｓｔａｒａｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：３７９３−３８０１（２００５年）；Ｓｔａｒａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２６２００−２６２０５（２００５年））及びムーレラ・サーモアセチカ（既に記載した）を含む他の幾つかの生物におけるネイティブな酵素である。あるいは、酢酸は、酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼによって活性化されてアセチル−ＣｏＡを形成し得る。まず、酢酸キナーゼは、ＡＴＰ分子の使用を伴って、酢酸をアセチルリン酸に変換する。アセチルリン酸及びＣｏＡは、次に、ホスホトランスアセチラーゼによって１つのリン酸を放出するとともにアセチル−ＣｏＡに変換される。酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチリアーゼは両方とも、幾つかのクロストリジウム属及びメタノサルチナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）においてよく研究されている酵素である。
【０４９５】
ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する更に別の方法は、ピルビン酸オキシダーゼを介する。ピルビン酸オキシダーゼは、電子受容体としてユビキノンを使用して、ピルビン酸を酢酸に変換する。大腸菌では、この活性はｐｏｘＢによってコードされる。ｐｏｘＢは、出芽酵母及びザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼと類似性を有する。この酵素は、チアミンピロリン酸補因子（Ｋｏｌａｎｄ及びＧｅｎｎｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：４４３８−４４４２（１９８２年））；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：３１０５−３１０９（１９７７年）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ及びＧｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：３３０２−３３０７（１９８０年））、及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を有する。次いで、既に記載した通り、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、又は酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼのいずれかによって、酢酸はアセチル−ＣｏＡに変換され得る。また、これらの酵素のうちの一部は、アセチル−ＣｏＡからピルビン酸への逆反応を触媒することもできる。
【０４９６】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの形態で還元当量を使用する酵素については、還元型フェレドキシンから電子を転移することによりこれら還元型キャリアを生成することができる。２つの酵素、フェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１８．１．３）及びフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ、ＥＣ１．１８．１．２））が、還元型フェレドキシンからＮＡＤ（Ｐ）＋への電子の可逆的転移を触媒する。フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ、ＥＣ１．１８．１．２）は、ＮＡＤＰＨからフェレドキシン又はフラボドキシン等の低電位アクセプターへの電子の可逆的転移を促進する非共有結合したＦＡＤ補因子を有する（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３：５６３−５６９（１９８２年）；Ｆｕｊｉｉら，１９７７年）。ＨＰ１１６４（ｆｑｒＢ）によってコードされるヘリコバクター・ピロリＦＮＲは、ＮＡＤＰＨをピルビン酸依存的に産生させるピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）の活性に関連する（Ｓｔら．２００７年）。類似する酵素が、カンピロバクター・ジェジュニでみられる（Ｓｔら．２００７年）。フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ酵素は、ｆｐｒによって大腸菌ゲノムにおいてコードされている（Ｂｉａｎｃｈｉら．１９９３年）。フェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼは、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成するために還元型フェレドキシンを利用する。大腸菌を含む幾つかの生物では、この酵素は多機能ジオキシゲナーゼ酵素複合体の構成要素である。ｈｃａＤによってコードされる大腸菌のフェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼは、芳香族酸の利用に関与する３−フェニルプロピオン酸ジオキシゲナーゼ系の構成要素である（Ｄｉａｚら．１９９８年）。ＮＡＤＨ：フェレドキシンレダクターゼ活性は、ヒドロジェノバクター・サーモフィラス株ＴＫ−６の細胞抽出物において検出されたが、この活性に関連する遺伝子は未だ同定されていない（Ｙｏｏｎら．２００６年）。最後に、エネルギー節約型の膜結合Ｒｎｆ型タンパク質（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：２１２８−２１３３（２００８年）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：７８４−７９１（２００８年））は、還元型フェレドキシンからＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する手段を提供する。更なるフェレドキシン：ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼは、クロストリジウム・カルボキシジボランズＰ７においてアノテーションされている。
【０４９７】
【表１０６】
2013535203.tif 000108
【０４９８】
フェレドキシンは、低い還元電位を有する細胞内の電子伝達体として機能する、１以上の鉄−硫黄クラスターを含有する小さな酸性タンパク質である。還元型フェレドキシンは、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）、及び２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）等のＦｅ依存性酵素に電子を供与する。Ｈ．サーモフィラス遺伝子ｆｄｘ１は、それぞれＯＦＯＲ及びＰＦＯＲによる２−オキソグルタル酸及びピルビン酸の可逆的カルボキシル化に必要な［４Ｆｅ−４Ｓ］型フェレドキシンをコードする（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １４：７９−８５（２０１０年））。スルホロブス・ソルファタリカスの２−オキソ酸：フェレドキシンレダクターゼに結合するフェレドキシンは、モノマー性ジクラスター［３Ｆｅ−４Ｓ］［４Ｆｅ−４Ｓ］型フェレドキシンである（Ｐａｒｋら．２００６年）。このタンパク質に関連する遺伝子は完全には配列決定されていないが、Ｎ−末端ドメインはＳ．アシドカルダリウス由来のｚｆｘフェレドキシンと９３％の相同性を共有する。大腸菌ゲノムは、未知の生理機能を有する可溶性フェレドキシン、ｆｄｘをコードする。幾つかの証拠が、鉄−硫黄クラスターアセンブリにおいてこのタンパク質が機能できることを示している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＮａｋａｍｕｒａ，１９９９年）。更なるフェレドキシンタンパク質は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら．２００３年）及びカンピロバクター・ジェジュニ（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔら．２００１年）において特性評価されている。クロストリジウム・パストゥリアヌム由来の２Ｆｅ−２Ｓフェレドキシンは、大腸菌でクローニングされ、発現している（Ｆｕｊｉｎａｇａ及びＭｅｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９２（３）：（１９９３年））。ムーレラ・サーモアセチカ、クロストリジウム・カルボキシジボランズＰ７及びロドスピリラム・ラブラム等の酢酸生成菌は、以下の表に列挙される幾つかのフェレドキシンをコードするためと予測される。
【０４９９】
【表１０７】
2013535203.tif 000109
【０５００】
スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡアクセプター分子にＣｏＡ部分を転移すると同時にスクシニル−ＣｏＡのコハク酸への変換を触媒する。多くのトランスフェラーゼが広い特異性を有し、特に、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、２−アセト酢酸メチル、３−ケトヘキサン酸、３−ケトペンタン酸、吉草酸、クロトン酸、３−メルカプトプロピオン酸、プロピオン酸、酢酸ビニル及び酪酸もの多様なＣｏＡアクセプターを利用することができる。
【０５０１】
コハク酸のスクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＡＴＰ又はＧＴＰの直接の消費を必要としないトランスフェラーゼによって行うことができる。この種の反応は、多くの生物において一般的である。コハク酸のスクシニル−ＣｏＡへの変換は、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼによっても触媒され得る。クロストリジウム・クルイベリのｃａｔ１の遺伝子産物は、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（Ｓｏｈｌｉｎｇ及びＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６年））。更に、活性は膣トリコモナス（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら．２００８年）及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｒｉｖｉｅｒｅら．２００４年）に存在する。ａａｒＣによってコードされるアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）由来のスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、変異体ＴＣＡ回路におけるスクシニル−ＣｏＡシンテターゼを置換する（Ｍｕｌｌｉｎｓら．２００８年）。また、類似のスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら．２００８年）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｒｉｖｉｅｒｅら．２００４年）及びクロストリジウム・クルイベリ（Ｓｏｈｌｉｎｇ及びＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６年ｃ）にも存在する。シュードモナス・プチダにおけるｐｃａＩ及びｐｃａＪによってコードされるβ−ケトアジピン酸：スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、更に別の候補である（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら．２００２年）。前述のタンパク質は以下の通り同定される。
【０５０２】
【表１０８】
2013535203.tif 000110
【０５０３】
３−ケトアセチル−ＣｏＡを３−ケト酸に変換すると同時にコハク酸をスクシニル−ＣｏＡに変換する更なる例示的なトランスフェラーゼは、スクシニル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．５）である。例示的なスクシニル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら．１９９７年）、枯草菌、及びヒト（Ｆｕｋａｏら．２０００年；Ｔａｎａｋａら．２００２年）に存在する。前述のタンパク質は、以下の通り同定される。
【０５０４】
【表１０９】
2013535203.tif 000111
【０５０５】
スクシニル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼによるコハク酸のスクシニル−ＣｏＡへの変換は、アセトアセチル−ＣｏＡ等の３−ケトアシル−ＣｏＡのアセト酢酸等の３−ケト酸への同時変換を必要とする。３−ケト酸を３−ケトアシル−ＣｏＡに戻す変換は、アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼは、アセトアセチル−ＣｏＡ及び酢酸をアセト酢酸及びアセチル−ＣｏＡに変換し、逆もまた同様である。例示的な酵素としては、以下に示す大腸菌由来のａｔｏＡＤ（Ｈａｎａｉら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：７８１４−７８１８（２００７年）、Ｃ．アセトブチリカム由来のｃｔｆＡＢ（Ｊｏｊｉｍａら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１２１９−１２２４（２００８年）及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム由来のｃｔｆＡＢ（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））の遺伝子産物が挙げられる。
【０５０６】
【表１１０】
2013535203.tif 000112
【０５０７】
更に別の可能なＣｏＡアクセプターは、コハク酸ベンジルである。スクシニル−ＣｏＡ：（Ｒ）−ベンジルコハク酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、サウエラ・アロマチカ等の生物におけるトルエンのための嫌気性分解経路の一部として機能する（Ｌｅｕｔｗｅｉｎ及びＨｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３（１４）４２８８−４２９５（２００１年））。ホモログは、アゾアルカス属の種Ｔ、アロマトレウム・アロマチカムＥｂＮ１及びジオバクター・メタリレデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＧＳ−１５で見出すことができる。前述のタンパク質は以下の通り同定される。
【０５０８】
【表１１１】
2013535203.tif 000113
【０５０９】
更に、ｙｇｆＨは、大腸菌においてプロピオニルＣｏＡ：コハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする（Ｈａｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（１６）４６２２−４６２９）。近いホモログは、例えば、シトロバクター・ヤンガエ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｙｏｕｎｇａｅ）ＡＴＣＣ２９２２０、サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾナエ血清型、及びエルシニア・インターメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＡＴＣＣ２９９０９で見出すことができる。前述のタンパク質は以下の通り同定される。
【０５１０】
【表１１２】
2013535203.tif 000114
【０５１１】
クエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．６）は、クエン酸を酢酸及びオキサロ酢酸に切断する一連の反応を触媒する。この酵素は、嫌気条件下で活性を有し、３つのサブユニット：アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ、ガンマ）、ＡＣＰトランスフェラーゼ（アルファ）及びアシルリアーゼ（ベータ）で構成される。酵素の活性化には、アセチル−ＣｏＡに構造が類似する珍しい補欠分子族２’−（５’’−ホスホリボシル）−３−’−デホスホ−ＣｏＡの共有結合及びアセチル化が使用される。アシル化は、ＣｉｔＣ、クエン酸リアーゼシンテターゼによって触媒される。２つの更なるタンパク質ＣｉｔＧ及びＣｉｔＸは、アポ酵素を活性型ホロ酵素に変換するために使用される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：９４３８−９４５０（２０００年））。野性型大腸菌は、クエン酸リアーゼ活性を有しないが；モリブデン補因子合成が欠損している突然変異体は、活性型クエン酸リアーゼを有する（Ｃｌａｒｋ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：２４５−２４９（１９９０年））。大腸菌酵素はｃｉｔＥＦＤによってコードされ、クエン酸リアーゼシンテターゼはｃｉｔＣによってコードされる（Ｎｉｌｅｋａｎｉ及びＳｉｖａＲａｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：４６５７−４６６３（１９８３年））。リゥコノストック・メゼンテロイデスのクエン酸リアーゼは、大腸菌でクローニングされ、特性評価され、発現している（Ｂｅｋａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６４７−６５４（１９９８年））。クエン酸リアーゼ酵素は、ネズミチフス菌及び肺炎杆菌を含む炭素及びエネルギー源としてクエン酸を利用する腸内細菌においても同定されている（Ｂｏｔｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：７８−８８（１９９７年）；Ｂｏｔｔ及びＤｉｍｒｏｔｈ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３４７−３５６（１９９４年））。前述のタンパク質を以下に作表する。
【０５１２】
【表１１３】
2013535203.tif 000115
【０５１３】
酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）は、酢酸のアセチルリン酸への可逆的なＡＴＰ依存性リン酸化を触媒する。例示的な酢酸キナーゼ酵素は、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリカム及びメタノサルチナ・サーモフィラを含む多くの生物において特性評価されている（Ｉｎｇｒａｍ−Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：２３８６−２３９４（２００５年）；Ｆｏｘ及びＲｏｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３４８７−１３４９７（１９８６年）；Ｗｉｎｚｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙ  １４３（Ｐｔ１０）：３２７９−３２８６（１９９７年））。酢酸キナーゼ活性は、大腸菌ｐｕｒＴの遺伝子産物においても実証されている（Ｍａｒｏｌｅｗｓｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：２５３１−２５３７（１９９４年）。幾つかの酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のｂｕｋ１及びｂｕｋ２は、基質として酢酸も受容する（Ｈａｒｔｍａｎｉｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６１７−６２１（１９８７年））。
【０５１４】
【表１１４】
2013535203.tif 000116
【０５１５】
アセチルリン酸からのアセチル−ＣｏＡの形成は、リン酸トランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）によって触媒される。大腸菌に由来するｐｔａ遺伝子は、アセチル−ＣｏＡをアセチルリン酸に可逆的に変換する酵素をコードしている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５９−５６９（９６９））。更なるアセチルトランスフェラーゼ酵素は、枯草菌（Ｒａｄｏ及びＨｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２１：１１４−１２５（１９７３年）、クロストリジウム・クルイベリ（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１：５８９６−５９９（１９５５年）、及びサーモトガ・マリティマ（Ｂｏｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１８６１−１８６７（１９９９年））において特性評価されている。この反応は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のｐｔｂ遺伝子産物を含む幾つかのホスホトランスブチリラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）によっても触媒される（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：３１７−３２２（１９８９年）；Ｗａｌｔｅｒら，Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３年））。更なるｐｔｂ遺伝子は、酪酸産生細菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２０９９−２１０６（２００４年）、及び巨大菌（Ｖａｚｑｕｅｚら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：３４５−３４９（２００１年）でみられる。
【０５１６】
【表１１５】
2013535203.tif 000117
【０５１７】
酢酸のアセチル−ＣｏＡへのアシル化は、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有する酵素によって触媒される。この反応を触媒する２つの酵素は、ＡＭＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）及びＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１３）である。ＡＭＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）は、酢酸をアセチル−ＣｏＡに活性化するための主な酵素である。例示的なＡＣＳ酵素は、大腸菌（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０２：３２７−３３６（１９７７年）、ラルストニア・ユートロファ（Ｐｒｉｅｆｅｒｔ及びＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：６５９０−６５９９（１９９２年））、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｉｎｇｒａｍ−Ｓｍｉｔｈ及びＳｍｉｔｈ，Ａｒｃｈａｅａ  ２：９５−１０７（２００７年））、サルモネラ・エンテリカ（Ｇｕｌｉｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：２８６６−２８７３（２００３年））、及び出芽酵母（Ｊｏｇｌ及びＴｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１４２５−１４３１（２００４年））でみられる。ＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、一般に広い基質範囲を有する可逆的な酵素である（Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。ＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼの２つのアイソザイムは、アーケオグロブス・フルギダスのゲノムにおいて、ＡＦ１２１１及びＡＦ１９８３によってコードされる（Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，上記（２００２年））。ハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素（スクシニル−ＣｏＡシンテターゼとしてアノテーションされた）も、基質として酢酸を受容し、酵素の可逆性が示された（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２：２７７−２８７（２００４年））。超好熱性古細菌（ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｎ）であるピロバキュラム・アエロフィラム由来のＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、全ての特性評価されているＡＣＤのうち最も広い基質範囲を示し、酢酸、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）、及びフェニルアセチル−ＣｏＡと反応する（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，上記（２００４年））。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。Ａ．フルギダス、Ｈ．マリスモルツイ及びＰ．アエロフィラム由来の酵素は全て、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，上記（２００４年）；Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，上記（２００２年））。更なる候補としては、大腸菌においてｓｕｃＣＤによってコードされるスクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５年））、及びシュードモナス・プチダ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉ��ｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３年））が挙げられる。前述のタンパク質を以下に作表する。
【０５１８】
【表１１６】
2013535203.tif 000118
【０５１９】
アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの変換は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素によって行うことができる。これら酵素は、複数のサブユニットを含有する。このような酵素のうちの３つを以下に提供する。
【０５２０】
【表１１７】
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【０５２１】
２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、又は１，３−ブタンジエン等の還元型発酵産物を合成する微生物細胞の基質のＣ−ｍｏｌ当たりの生成物の収量は、炭水化物原料における不十分な還元当量によって限定される。還元当量、すなわち電子は、それぞれ一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）及びヒドロゲナーゼ酵素を使用するＣＯ及びＨ２等の合成ガス成分から抽出することができる。次いで、還元当量は、酸化型フェレドキシン、酸化型キノン、酸化型チトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）＋、水又は過酸化水素等のアクセプターに渡されて、それぞれ還元型フェレドキシン、還元型キノン、還元型チトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、Ｈ２又は水を形成する。様々なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び還元的ＴＣＡ回路酵素のための酸化還元キャリアとして機能し得るので、還元型フェレドキシン及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈが特に有用である。
【０５２２】
以下に、合成ガス成分からレドックスを抽出するために使用される酵素及び対応する遺伝子を記載する。ＣＯＤＨは、電子の消費又は獲得においてＣＯ及びＣＯ２を相互変換する可逆的な酵素である。ＡＣＳ／ＣＯＤＨ複合体におけるＣＯＤＨの自然界における生理学的な役割は、アセチル−ＣｏＡシンテターゼによってアセチル−ＣｏＡに取込むためにＣＯ２をＣＯに変換することである。それにもかかわらず、このようなＣＯＤＨ酵素は、このような酵素の可逆的な性質のために、ＣＯからの還元当量の抽出に適している。ＡＣＳの非存在下においてこのようなＣＯＤＨ酵素が発現することにより、前記酵素がこれらの自然界における生理学的な役割（すなわち、ＣＯ酸化）とは反対の方向に作用することが可能になる。
【０５２３】
Ｍ．サーモアセチカ、Ｃ．ヒドロジェノフォルマンス、Ｃ．カルボキシジボランズＰ７及び他の幾つかの生物では、ＣＯＤＨをコードする更なる遺伝子は、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンの外側に位置する。これら酵素は、一酸化炭素の二酸化炭素への変換から電子（すなわち、還元当量）を抽出するための手段を提供する。Ｍ．サーモアセチカ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＹＰ＿４３０８１３）は、オペロンにおいて単独で発現し、「ピンポン」反応においてＣＯからフェレドキシンのような外部伝達物質へ電子を伝達すると考えられる。次いで、還元型伝達物質は、他の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）キャリア又はフェレドキシン依存性細胞過程に連結される（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１２５：１２９−１３６（２００８年））。近接するタンパク質であるＣ．ヒドロジェノフォルマンスのＣＯＤＨ−ＩＩ及びＣｏｏＦをコードする遺伝子は、クローニングされ、配列決定された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＲｏｂｂ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９１：２４３−２４７（２０００年））。得られた複合体は膜結合型であったが、ＣＯＤＨ−ＩＩの細胞質画分は同化の役割を示唆するＮＡＤＰＨの形成を触媒することが示された（Ｓｖｅｔｌｉｔｃｈｎｙｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：５１３４−５１４４（２００１年））。また、ＣＯＤＨ−ＩＩの結晶構造も利用可能である（Ｄｏｂｂｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１２８１−１２８５（２００１年））。類似するＡＣＳ不含ＣＯＤＨ酵素は、ジオバクター・メタリレデュセンスＧＳ−１５、クロロビウム・ファエオバクテロイデス（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ２６６、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｈ１０、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）亜種デスルフリカンス株ＡＴＣＣ  ２７７７４、ペロバクター・カルビノリカス（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ）ＤＳＭ２３８０及びカンピロバクター・カルバス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｕｒｖｕｓ）５２５．９２を含む生物の多様なアレイにおいて見出すことができる。
【０５２４】
【表１１８】
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【０５２５】
場合によっては、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＣＯＤＨに隣接して位置する。ロドスピリラム・ラブラムでは、コードされたＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼタンパク質は、ＣＯ及びＨ２ＯのＣＯ２及びＨ２への変換からプロトン勾配の形態でエネルギーが生じる部位であることが示されている膜結合酵素複合体を形成する（Ｆｏｘら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：６２００−６２０８（１９９６年））。Ｃ．ヒドロジェノフォルマンスのＣＯＤＨ−Ｉ及びその隣接する遺伝子は、Ｒ．ラブラムＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターに対する類似性に基づいて、類似する機能的役割を触媒することが示唆されている（Ｗｕら，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．１：ｅ６５（２００５年））。Ｃ．ヒドロジェノフォルマンスＣＯＤＨ−Ｉも、電極につながれたきに強力なＣＯ酸化及びＣＯ２還元活性を示すことが示された（Ｐａｒｋｉｎら，Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１０３２８−１０３２９（２００７年））。例示的なＣＯＤＨ及びヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定することができる。
【０５２６】
【表１１９】
2013535203.tif 000121
【０５２７】
大腸菌及び他の腸内細菌においてネイティブなのは、４つ以下のヒドロゲナーゼをコードする複数の遺伝子である（Ｓａｗｅｒｓ，Ｇ．，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６６：５７−８８（１９９４年）；Ｓａｗｅｒｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：１３２４−１３３１（１９８５年）；Ｓａｗｅｒｓ及びＢｏｘｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６：２６５−２７５（１９８６年）；Ｓａｗｅｒｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：３９８−４０４（１９８６年））。酵素活性の多重性を考慮して、大腸菌又は別のホスト生物は、入って来る分子状の水素を分離し、対応するアクセプターを還元するのに十分なヒドロゲナーゼ活性を提供することができる。大腸菌は、それぞれｈｙａＡＢＣＤＥＦ及びｈｙｂＯＡＢＣＤＥＦＧの遺伝子クラスターによってコードされている、２つの取込みヒドロゲナーゼＨｙｄ−１及びＨｙｄ−２を有する（Ｌｕｋｅｙら，Ｈｏｗ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉｓ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｔｏ  ｏｘｉｄｉｚｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｕｎｄｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｄｏｘ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ，２００９年１１月１６日）。Ｈｙｄ−１は酸素耐性であり、不可逆的であり、ｈｙａＣチトクロムを介してキノン還元に関連する。Ｈｙｄ−２はＯ２感受性であり、可逆的であり、電子を周辺質のフェレドキシンｈｙｂＡに伝達し、これは次いで、ｈｙｂＢの内在性膜タンパク質を介してキノンを還元する。還元型キノンは、ＴＣＡ回路の還元的分岐におけるフマル酸レダクターゼのための電子供給源として機能し得る。還元型フェレドキシンは、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを生成するためにＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ等の酵素によって使用され得る。あるいは、還元型フェレドキシンは、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＡＫＧフェレドキシンオキシドレダクターゼ及び５，１０−メチレン−Ｈ４葉酸レダクターゼ等の反応に電子供与体として使用される場合もある。
【０５２８】
【表１２０】
2013535203.tif 000122
【０５２９】
大腸菌の水素−リアーゼ系は、ヒドロゲナーゼ３、アクセプターとしてフェレドキシンを使用する膜結合酵素複合体、及びフェレドキシンアクセプターを使用するヒドロゲナーゼ４を含む。ヒドロゲナーゼ３及び４は、それぞれｈｙｃ及びｈｙｆの遺伝子クラスターによってコードされる。ヒドロゲナーゼ３は、可逆的な酵素であることが示されている（Ｍａｅｄａら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７６（５）：１０３５−４２（２００７年））。また、大腸菌におけるヒドロゲナーゼ活性は、その対応するタンパク質がヒドロゲナーゼ複合体のアセンブリに含まれるｈｙｐ遺伝子の発現にも依存する（Ｊａｃｏｂｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５８：４４４−４５１（１９９２年）；Ｒａｎｇａｒａｊａｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：１４４７−１４５８（２００８年））。
【０５３０】
【表１２１】
2013535203.tif 000123
【０５３１】
Ｍ．サーモアセチカのヒドロゲナーゼは、十分な内因性のヒドロゲナーゼ活性を有しないホストに適している。Ｍ．サーモアセチカは、排他的な炭素源としてＣＯ２を用いて増殖することができ、これは、還元当量がＨ２から抽出されて、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介してアセチル−ＣｏＡを合成することが可能になることを示す（Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：７０２−７０９（１９８２年）；Ｄｒａｋｅ及びＤａｎｉｅｌ，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５：８６９−８８３（２００４年）；Ｋｅｌｌｕｍ及びＤｒａｋｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０：４６６−４６９（１９８４年））（図２２を参照されたい）。Ｍ．サーモアセチカは、大腸菌由来の幾つかのｈｙｐ、ｈｙｃ及びｈｙｆ遺伝子に対するホモログを有する。これら遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定される。
【０５３２】
その遺伝子が大腸菌ｈｙｐ遺伝子に相同であるＭ．サーモアセチカにおけるタンパク質を以下に示す。
【０５３３】
【表１２２】
2013535203.tif 000124
【０５３４】
大腸菌ヒドロゲナーゼ３及び／又は４タンパク質に相同なＭ．サーモアセチカにおけるタンパク質を以下の表に列挙する。
【０５３５】
【表１２３】
2013535203.tif 000125
【０５３６】
更に、ヒドロゲナーゼ機能をコードする幾つかの遺伝子クラスターがＭ．サーモアセチカに存在し、それらの対応するタンパク質配列を以下に提供する。
【０５３７】
【表１２４】
2013535203.tif 000126
【０５３８】
ラルストニア・ユートロファＨ１６は、末端電子受容体としての酸素とともに、エネルギー源として水素を使用する。その膜結合型取込み［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼは、周辺質に配向され、ｂ型チトクロムを介して呼吸鎖に結合する（Ｓｃｈｉｎｋ及びＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６７，３１５−３２４（１９７９年）；Ｂｅｒｎｈａｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８，１７９−１８６（１９９７年））、「Ｏ２耐性」ヒドロゲナーゼである（Ｃｒａｃｋｎｅｌｌら．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０６（４９）２０６８１−２０６８６（２００９年））。また、Ｒ．ユートロファは、細胞質に存在し、水素を消費して直接ＮＡＤ＋を還元するＨｏｘオペロンによってコードされるＯ２耐性の可溶性ヒドロゲナーゼを含有する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ及びＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４５２，６６−８０（１９７６年）；Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８７（９）３１２２−３１３２（２００５年））。可溶性ヒドロゲナーゼ酵素は、ジオバクター・スルフレドゥセンス（Ｃｏｐｐｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１，１２３９−１２５４（２００５年））、シネコシスティス属の株ＰＣＣ６８０３（Ｇｅｒｍｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（５２），３６４６２−３６４７２（２００９年））、及びチオカプサ・ロゼオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）（Ｒａｋｈｅｌｙ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）７２２−７２８（２００４年））を含む幾つかの生物に更に存在する。シネコシスティス属の酵素は、水素からＮＡＤＰＨを生成することができる。シネコシスティス属の株ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘオペロン、及びノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）の種ＰＣＣ７１２０由来のＨｙｐオペロンによってコードされるアクセサリー遺伝子の両方の過剰発現は、Ｈｏｘ遺伝子単独の発現と比較して、ヒドロゲナーゼ活性を上昇させた（Ｇｅｒｍｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（５２），３６４６２−３６４７２（２００９年））。
【０５３９】
【表１２５】
2013535203.tif 000127
【０５４０】
二酸化炭素をピルビン酸又はホスホエノールピルビン酸のいずれかに固定し、ＴＣＡ回路中間体であるオキサロ酢酸又はリンゴ酸を形成するために使用される幾つかの酵素及び対応する遺伝子を以下に記載する。
【０５４１】
ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸へのカルボキシル化は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される。例示的なＰＥＰカルボキシラーゼ酵素は、大腸菌におけるｐｐｃ（Ｋａｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４１４：１７０−１７９（２００３年）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１におけるｐｐｃＡ（Ａｒｐｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３７７６−３７８３（１９９３年）及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおけるｐｐｃ（Ｅｉｋｍａｎｎｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：３３０−３３９（１９８９年）によってコードされる。
【０５４２】
【表１２６】
2013535203.tif 000128
【０５４３】
ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換するための別の酵素は、ＰＥＰカルボキシキナーゼであり、これは、ＰＥＰをカルボキシル化すると同時にＡＴＰを形成する。ほとんどの生物では、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、糖新生機能を果たし、１つのＡＴＰを消費してオキサロ酢酸をＰＥＰに変換する。出芽酵母は、ネイティブなＰＥＰカルボキシキナーゼＰＣＫ１が糖新生の役割を果たすこのような生物の一例である（Ｖａｌｄｅｓ−Ｈｅｖｉａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５８：３１３−３１６（１９８９年）。大腸菌は、別のこのような生物であり、オキサロ酢酸の生成におけるＰＥＰカルボキシキナーゼの役割がＰＥＰカルボキシラーゼに比べて小さいと考えられるので、恐らくＰＥＰカルボキシキナーゼの重炭酸に対するより高いＫｍのために、これはＡＴＰを形成しない（Ｋｉｍら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：１２３８−１２４１（２００４年））。それにもかかわらず、ネイティブな大腸菌ＰＥＰカルボキシキナーゼのＰＥＰからオキサロ酢酸への活性が、大腸菌Ｋ−１２のｐｐｃ突然変異体において最近実証された（Ｋｗｏｎら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１４４８−１４５２（２００６年））。これらの株は増殖欠陥を示さず、高ＮａＨＣＯ３濃度においてコハク酸生成が増加した。大腸菌の突然変異株は、適応進化に従って優勢なＣＯ２固定酵素としてＰｃｋを採用することができる（Ｚｈａｎｇら．２００９年）。幾つかの生物、特にルーメン細菌では、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、ＰＥＰからのオキサロ酢酸の産生及びＡＴＰの生成においてかなり効率的である。大腸菌にクローニングされているＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の例としては、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（Ｌｅｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．７：９５−９９（２００２年））、アネロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（Ｌａｉｖｅｎｉｅｋｓら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：２２７３−２２８０（１９９７年）、及びアクチナバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｉｍら．上記）に由来するものが挙げられる。インフルエンザ菌によってコードされるＰＥＰカルボキシキナーゼ酵素は、ＰＥＰからのオキサロ酢酸の形成において有効である。
【０５４４】
【表１２７】
2013535203.tif 000129
【０５４５】
ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．１）は、１つのＡＴＰを消費して、ピルビン酸をオキサロ酢酸に直接変換する。ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素は、出芽酵母においてはＰＹＣ１（Ｗａｌｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７６：１２１０−１２１７（１９９１年）及びＰＹＣ２（Ｗａｌｋｅｒら，上記）、恥垢菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）においてはｐｙｃ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ及びＰｕｒｗａｎｔｉｎｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７５：１９１−２０６（２０００年））によってコードされる。
【０５４６】
【表１２８】
2013535203.tif 000130
【０５４７】
リンゴ酸酵素は、１還元当量を消費してＣＯ２及びピルビン酸をリンゴ酸に変換するために適用することができる。この目的のためのリンゴ酸酵素としては、制限するものではないが、リンゴ酸酵素（ＮＡＤ依存性）及びリンゴ酸酵素（ＮＡＤＰ依存性）を挙げることができる。例えば、大腸菌リンゴ酸酵素（Ｔａｋｅｏ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：３７９−３８７（１９６９年））又はより高い活性を有する類似酵素のうちの１つは、ピルビン酸及びＣＯ２のリンゴ酸への変換を可能にすると表すことができる。ＰＥＰとは対照的に炭素をピルビン酸に固定することによって、リンゴ酸酵素は、ＰＥＰ由来の高エネルギーリン酸結合をピルビン酸キナーゼによって変換して、ピルビン酸の形成においてＡＴＰを作成するか、又はグルコースを輸送するためのホスホトランスフェラーゼ系により変換することを可能にする。リンゴ酸酵素は、典型的に、リンゴ酸からのピルビン酸形成の方向に作用すると仮定されるが、ｍａｅＡによってコードされるＮＡＤ依存性酵素の過剰発現は、炭素を固定する方向に作用することにより、嫌気条件下で致死性のΔｐｆｌ−ΔｌｄｈＡ表現型を回復すると同時に大腸菌におけるコハク酸生成を増加させることが実証されている（Ｓｔｏｌｓ及びＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３（７）２６９５−２７０１（１９９７年））。類似する所見は、大腸菌において豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）由来のリンゴ酸酵素を過剰発現する際にもみられた（Ｓｔｏｌｓら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３−６５（１），１５３−１５８（１９９７年））。ｍａｅＢによってコードされる第２の大腸菌リンゴ酸酵素は、ＮＡＤＰ依存性であり、また、オキサロ酢酸及び他のアルファケト酸を脱カルボキシルする（Ｉｗａｋｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５（５）：１３５５−６５（１９７９年））。
【０５４８】
【表１２９】
2013535203.tif 000131
【０５４９】
ＴＣＡ回路の還元的分岐を介してオキサロ酢酸（例えば、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシキナーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼから形成される）又はリンゴ酸（例えば、リンゴ酸酵素又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼから形成される）をスクシニル−ＣｏＡに変換するために使用される酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸デヒドラターゼ（フマラーゼ）、フマル酸レダクターゼ及びスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼである。酵素の各々に対する遺伝子は、上記の通りである。
【０５５０】
微生物においてスクシニル−ＣｏＡから様々な生成物への経路を改変するための酵素、遺伝子及び方法は、現在当技術分野において公知である。本明細書に開示する通りＣＯ及び／又はＨ２から得られる更なる還元当量は、炭水化物系原料を利用するとき、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、又は１，３−ブタジエンの収量を向上させる。例えば、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、又は１，３−ブタジエンは、図２０に例証される経路を介してスクシニル−ＣｏＡから生成され得る。スクシニル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、又は１，３−ブタジエンに変換するための例示的な酵素としては、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼ、又はヒドロラーゼ、３−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−フマリル酢酸デカルボキシラーゼ、３−オキソペンタ−４−エノエートレダクターゼ、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートデヒドラターゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼ、又はヒドロラーゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシヘキサ−４−エンジオエートデカルボキシラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、２−フマリル酢酸レダクターゼ、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートデカルボキシラーゼ、２，４−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼが挙げられる。
【０５５１】
微生物において解糖中間体から様々な生成物への経路を改変するための酵素、遺伝子及び方法は、現在当技術分野において公知である。ＣＯ及びＨ２から得られる更なる還元当量は、本明細書に記載の通り、炭水化物におけるこれら全ての生成物の収量を向上させる。
実施例Ｘ
ＣＯの取り扱い及び嫌気培養の方法
この実施例は、ＣＯの取り扱い及び嫌気培養に使用される方法について記載する。
【０５５２】
Ａ．アッセイ及び少規模培養のための少量のＣＯの取り扱い。ＣＯは、毒性を有する無臭、無色、及び無味の気体である。したがって、ＣＯを利用する培養及びアッセイには特殊な取り扱いが必要とされた。ＣＯ酸化、アセチル−ＣｏＡ合成、ミオグロビンを使用するＣＯ濃縮、及び小規模バッチ式培養におけるＣＯ耐性／利用を含む幾つかのアッセイには、ドラフト内で分注され、取り扱われた少量のＣＯガスが必要とされた。生化学アッセイでは、非常に少量（＜２ｍＬ）の生化学アッセイ培地又はバッファをＣＯで飽和させ、次いで、アッセイを実施することが必要とされた。ＣＯの取り扱い工程は全て、適切な高さに設定されたサッシを備え且つ送風機の稼働しているドラフト内において実施した；ＣＯは、シュレンクラインに接続された圧縮ガスシリンダー及びレギュレータから分注した。後者を用いれば、幾つかの可能性のあるキュベット又はバイアルの各々に等濃度のＣＯを確実に分注することができる。シュレンクラインは、入力側に酸素スクラッバー、反対側に油圧放出バブラー及び通気孔を有するように設定した。アッセイキュベットは、嫌気的であり且つＣＯを含有していた。したがって、アッセイキュベットはゴム栓でしっかりと密閉し、試薬は、気密針及びシリンジを使用して添加又は除去した。次に、少量（約５０ｍＬ）の培養物を、しっかりと密閉された血清ボトル内においてＣＯ飽和状態で増殖させた。生化学アッセイと同様に、ＣＯ飽和微生物培養物は、シュレンクライン設備を用いてドラフトにおいて平衡化した。生化学アッセイ及び微生物培養はともに、ドラフトの外側における取り扱いを安全にするために持ち運び可能な密閉容器内で且つ小体積で行った。圧縮ＣＯタンクは、ドラフトに隣接していた。
【０５５３】
典型的には、シュレンクラインを用いて、それぞれ通気孔を有するキュベットにＣＯを分注した。キュベット上のゴム栓に１９又は２０ゲージの使い捨て注射針を刺し、同様に通気孔を設ける。油圧バブラーをＣＯタンク及び酸素スクラッバーと共に使用した。ガラス製又は石英製の分光光度計用キュベットは頂上部に円形の穴を有し、その中にＫｏｎｔｅｓストッパースリーブ、Ｓｚ７７７４２５０−０００７を設置した。ＣＯ検出器ユニットをドラフトの近くに配置した。
【０５５４】
Ｂ．大規模培養物に供給する多量のＣＯの取り扱い。発酵生産における原料としての合成ガスをシミュレートするために、発酵培養物にＣＯ又はＣＯとＨ２との混合物のいずれかを供給する。したがって、１リットル〜数リットルの範囲の量の細胞は、培地中のＣＯの溶解濃度を上昇させるためのＣＯ気体の添加を含み得る。これら状況では、かなり多量の連続投与されるＣＯ気体を培養物に添加する。様々な時点において、培養物を回収するか、又はサンプルを採取する。あるいは、発酵槽の一部である一体型連続流遠心分離機を用いて細胞を回収する。
【０５５５】
発酵プロセスは、嫌気条件下において実施される。場合によっては、酸素又は空気を発酵槽にポンプで注入して、呼吸環境を与えるのに適した酸素飽和状態を確保することは不経済である。更に、嫌気発酵中に生じる還元力が、呼吸よりも生成物の形成において必要とされる場合がある。更に、様々な経路における酵素の多くは、様々な程度酸素に対して感受性である。Ｍ．サーモアセチカ等の古典的な酢酸生成菌は偏性嫌気性菌であり、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路における酵素は、分子状酸素による不可逆的な不活化に対する感受性が高い。酸素耐性酢酸生成菌が存在する一方で、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路における酵素のレパートリーは、酸素の存在下において不適合である場合がある。その理由は、大部分が金属酵素であり、重要な構成要素がフェレドキシンであり、且つエネルギー獲得を最大化するために、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路から離れた代謝を迂回させるよう調節される場合があるためである。同時に、培養中の細胞は、大規模な細胞増殖の存在下での非常手段の必要性を抑える酸素スカベンジャーとして作用する。
【０５５６】
Ｃ．嫌気性チャンバー及び条件。例示的な嫌気性チャンバーは、市販されている（例えば、Ｖａｃｕｕｍ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ  ＣＡ；ＭＢｒａｕｎ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ  ＭＡを参照されたい）。条件は、１ｐｐｍ以下のＯ２濃度及び１ａｔｍの純Ｎ２を含んでいた。一例では、３つの酸素スクラッバー／触媒再生器が使用され、チャンバーはＯ２電極を含んでいた（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ；Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ＣＡ等）。ほぼ全ての物品及び試薬を、内側チャンバーのドアを開く前にチャンバーのエアロックにおいて４回循環させた。＞５ｍＬの体積を有する試薬は、チャンバーに導入する前に純Ｎ２でスパージした。グローブは１年間に２回取り替え、酸素レベルの変化に対するチャンバーの反応が次第に鈍くなってきたら、触媒容器を定期的に再生させる。チャンバーの圧力は、ソレノイドにより起動される一方向バルブによって制御した。これによって周囲よりも高いレベルにチャンバー圧を設定することができ、パージバルブを通じて非常に小さなチューブを移動させることが可能になった。
【０５５７】
嫌気性チャンバーにより、常に非常に低く、且つ高度に酸素感受性である嫌気条件に必要とされるＯ２濃度が実現された。しかし、細胞の増殖及び取扱いは通常このような予防措置を必要としない。別の嫌気性チャンバーの構成では、混合物中にいくらかの水素ガスを必要とする触媒として白金又はパラジウムを使用することができる。ソレノイドバルブを使用する代わりに、バブラーによって圧力放出を制御してもよい。機器を使用するＯ２モニタリングを用いる代わりに、試験用ストリップを使用してもよい。
【０５５８】
Ｄ．嫌気性微生物学。ＣＯの取扱いに関して上記した通り、少量の培養物を取り扱った。具体的には、血清ボトル又は培地ボトルに厚いゴム栓を取り付け、アルミニウム製クリンプを使用してボトルを密閉する。Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス等の培地を従来の方法で作製し、適切にサイズ分けした血清ボトルに分注する。ボトルには適度なバブリングで約３０分間窒素をスパージする。これにより培地から酸素の大部分が除去される。この工程の後、各ボトルにゴム栓で蓋をし（Ｂｅｌｌｃｏ  ２０ｍｍセプタムストッパー；Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ等）、クリンプで密閉する（Ｂｅｌｌｃｏ  ２０ｍｍ）。次いで、培地のボトルを、緩徐な（液体）排出サイクルを使用してオートクレーブにかける。少なくとも時折、ストッパーを介して針を突き刺し、オートクレーブ中に排気してもよい；オートクレーブから取り出す際に針は直ちに除去する必要がある。滅菌培地は、シリンジ及び針を介して添加される残りの培地成分、例えばバッファー又は抗生物質を有する。還元剤を添加する前に、窒素（又は用途に応じてＣＯ）を用いて３０〜６０分間ボトルを平衡化する。１００×１５０ｍＭの硫化ナトリウム、２００ｍＭのシステイン−ＨＣｌ等の還元剤を添加する。これは、硫化ナトリウムを乾燥ビーカーに、そしてシステインを血清ボトルに量り入れ、両方を嫌気性チャンバーに入れ、硫化ナトリウムを嫌気水に溶解させ、次いでこれを血清ボトル中のシステインに添加することによって作製される。硫化ナトリウム溶液は、システインと接触すると硫化水素ガスを発生するので、ボトルは直ちに密閉する。培養物に注入するとき、シリンジフィルターを使用して溶液を滅菌する。Ｂ１２（１０μＭのシアノコバラミン）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２、チャンバー内の嫌気水中で作製した４０ｍＭ原液から最終濃度２０マイクロモルにした、オートクレーブ処理によって又は培養物への注入時にシリンジフィルターを使用することによって滅菌した）、及び硫酸第一鉄アンモニウム（必要とされる最終濃度は１００μＭである−チャンバー内の嫌気水中で１００〜１０００倍原液として作製した、オートクレーブ処理によって又は培養物への注入時にシリンジフィルターを使用することによって滅菌した）等の他の成分は、注射針を介して添加する。嫌気的条件下でのより迅速な増殖を容易にするために、１リットルのボトルに、嫌気的に増殖させた前培養物５０ｍＬを接種した。ベクター中のｐＡ１−ｌａｃＯ１プロモーターの誘導は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．２ｍＭになるまで添加することによって実施し、約３時間実施した。
【０５５９】
バブリングしながら連続的に気体を添加することにより、より大きなボトル中で多量の培養物を増殖させることができる。金属製バブラーを備えるゴム栓を培地添加後にボトルに配置し、ボトルの残り部分をセットアップする前に３０分間以上窒素をスパージする。滅菌フィルターがボトルに吹き込まれる気体を滅菌し、ボトル上のホースを小型Ｃクランプで圧縮可能であるように、各ボトルを一緒に置く。培地及び細胞は、磁気攪拌子を用いて攪拌する。全ての培地成分及び細胞を添加したら、ボトルを、大気中であるが、連続的にボトルに窒素をスパージしながら、インキュベータ内でインキュベートする。
実施例ＸＩ
ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイ
この実施例では、ＣＯ酸化（ＣＯデヒドロゲナーゼ；ＣＯＤＨ）を測定するためのアッセイ法について記載する。
【０５６０】
ムーレラ・サーモアセチカの７つの遺伝子のＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを大腸菌発現ベクターにクローニングした。インタクトな約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片をクローニングしたが、この領域中の遺伝子の一部は自身の内因性プロモーターにより発現され、全てが内因性リボソーム結合部位を含有する可能性がある。これらクローンを、ＣＯＤＨ活性を定量的に測定するアッセイを用いてＣＯ酸化についてアッセイした。Ｍ．サーモアセチカの遺伝子産物に対する抗血清をウエスタンブロットに用いて、比活性を推定した。Ｍ．サーモアセチカはグラム陽性菌であり、リボソーム結合部位のエレメントは大腸菌において良好に機能すると予測される。以下でより詳細に記載するこの活性は、Ｍ．サーモアセチカの比活性の約５０分の１であると推定された。Ｍ．サーモアセチカの酵素の至適温度が５５℃付近であるという事実によって、組換え大腸菌細胞のＣＯＤＨ活性が制限される可能性がある。したがって、中温性であり且つ明らかにインタクトなＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロン及びＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有するムーレラ属に近縁なデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）等の中温性ＣＯＤＨ／ＡＣＳ経路が有利である可能性がある。考えられるホスト生物としての酢酸生成菌としては、ロドスピリラム・ラブラム、ムーレラ・サーモアセチカ及びデスルフィトバクテリウム・ハフニエンスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６１】
ＣＯ酸化は、最も感度が高く且つ最も確実なＣＯＤＨ／ＡＣＳアッセイである。大腸菌に基づく合成ガス使用系は、最終的に、特に最大活性に関して、クロストリジウム属（すなわち、ムーレラ属）の系とほぼ同程度に嫌気的であることを必要とする。ＣＯＤＨの改善は可能であるはずであるが、最終的には水に対するＣＯガスの溶解度によって制限される。
【０５６２】
ます、各遺伝子を発現ベクターに個別にクローニングした。複数のサブユニット／１複合体の組合せ発現ユニットを作製した。タンパク質レベルでの大腸菌における発現を決定した。組合せたＭ．サーモアセチカＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンと個別の発現クローンとを両方作製した。
【０５６３】
ＣＯ酸化アッセイ。このアッセイはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路内の酵素活性のアッセイのうち最も簡潔で、信頼性が高く、且つ汎用性の高いアッセイの１つであり、ＣＯＤＨについて試験する（Ｓｅｒａｖａｌｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：３９４４−３９５５（２００４年））。Ｍ．サーモアセチカのＣＯＤＨの比活性の典型的な活性は、５５℃において５００Ｕ又は２５℃において約６０Ｕである。このアッセイは、ＣＯの存在下におけるメチルビオローゲンの還元を利用する。これは密閉された嫌気的ガラス製キュベット内において５７８ｎｍで測定される。
【０５６４】
より詳細には、最初に脱イオン水で４回及びアセトンで１回キュベットを洗浄した後、ガラス製のゴム栓付きキュベットを準備した。少量の真空グリースをゴムガスケットの上に広げた。キュベットにＣＯガスを供給し、２２Ｇａの針及び排気用針で１０分間乾燥させた。体積０．９８ｍＬの反応バッファ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））を、排気用針とともに２２Ｇａの針を使用して添加し、そして１００％ＣＯを添加した。メチルビオローゲン（ＣＨ３ビオローゲン）原液は水中１Ｍであった。２０ｍＭの最終濃度で２０マイクロリットルを各アッセイに使用した。メチルビオローゲンを加えたとき、ハミルトンシリンジの使用を容易にするためにジャケットとして１８Ｇａの針（一部）を使用し、ＣＨ３ビオローゲンを引き出した。４〜５のアリコートを調製し、廃棄して洗浄し、ガスでシリンジを平衡化した。ＣＨ３ビオローゲン原液を作製するとき少量の亜ジチオン酸ナトリウム（０．１Ｍ原液）を添加して、ＣＨ３ビオローゲンをわずかに還元させた。温度は、加熱したＯｌｉｓ分光光度計（Ｂｏｇａｒｔ  ＧＡ）内で５５℃に平衡化した。ブランク反応（ＣＨ３ビオローゲン＋バッファ）を最初に実施して、ＣＨ３ビオローゲン還元のベース速度を測定した。ＡＣＳ９０及びＡＣＳ９１（それぞれ最初のｃｏｏＣを有する及び有しないＭ．サーモアセチカのＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン）の大腸菌細胞粗抽出物。１０マイクロリットルの抽出物を一度に添加し、混合し、アッセイした。還元型ＣＨ３ビオローゲンは紫色になる。アッセイの結果を表Ｉに示す。
【０５６５】
【表１３０】
2013535203.tif 000132
【０５６６】
Ｍｔａ９８／Ｍｔａ９９は、Ｍ．サーモアセチカ由来のメタノールメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する大腸菌のＭＧ１６５５株であり、したがって、Ｍ．サーモアセチカのＣＯＤＨオペロンを含有するＡＣＳ９０  ＡＣＳ９１大腸菌株のネガティブコントロールである。
【０５６７】
細胞タンパク質の約１％がＣＯＤＨである場合、これらの数字は、純粋なＭ．サーモアセチカのＣＯＤＨの５００Ｕ／ｍｇ活性よりも約１００倍低いことになる。ウエスタンブロットに基づく実際の推定値では細胞タンパク質の０．５％であり、したがって活性は、Ｍ．サーモアセチカのＣＯＤＨの活性よりも約５０倍低い。それにもかかわらず、この実験は、ネガティブコントロールにおいて、組換え大腸菌よりもはるかに少ないＣＯ酸化活性を示す。ネガティブコントロールにおいてみられる少量のＣＯ酸化（ＣＨ３ビオローゲンの還元）は、大腸菌のＣＨ３ビオローゲンを還元する能力が限られている可能性があることを示す。
【０５６８】
ＣＯＤＨ及びＭｔｒタンパク質の最終濃度を推定するために、ＣＯ酸化、ＡＣＳ、メチルトランスフェラーゼ、及びコリノイドＦｅ−Ｓアッセイにおいて使用したのと同じ細胞抽出物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にウエスタンブロット分析を実施した。使用した抗血清は、精製されたＭ．サーモアセチカのＣＯＤＨ−ＡＣＳ及びＭｔｒタンパク質に対するポリクローナル抗血清であり、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して可視化した。ウエスタンブロット分析を実施し、結果を図２４に示す。ＡＣＳ９０及びＡＣＳ９１中のＣＯＤＨの量は、対照レーンとの比較によって５０ｎｇであると推定された。２つのＣＯＤＨサブユニット及びメチルトランスフェラーゼを含むＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン遺伝子の発現を、ウエスタンブロット分析によって確認した。したがって、組換え大腸菌細胞は、７つの遺伝子のオペロンの複数の構成要素を発現する。更に、メチルトランスフェラーゼ及びコリノイド鉄硫黄タンパク質の両方が同じ組換え大腸菌細胞中で活性を有していた。これらタンパク質は、同じ細胞にクローニングされた同じオペロンの一部である。
【０５６９】
ポジティブコントロールとしてムーレラ・サーモアセチカ細胞の抽出物を使用して、ＣＯ酸化アッセイを繰り返した。大腸菌ＡＣＳ９０及びＡＣＳ９１中のＣＯＤＨ活性は測定可能であったが、Ｍ．サーモアセチカ対照よりも約１３０〜１５０倍低かった。アッセイの結果を図２５に示す。簡潔に述べると、細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを有するＭ．サーモアセチカ又は大腸菌、ＡＣＳ９０又はＡＣＳ９１又は空ベクター：ｐＺＡ３３Ｓ）を増殖させ、抽出物を上記の通り調製した。抽出物を調製した日の様々な時点で５５℃において上記の通りアッセイを実施した。メチルビオローゲンの還元を１２０秒間にわたるタイムコースで５７８ｎｍにおいて追跡した。
【０５７０】
これらの結果は、ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイ及び結果について記載する。メチルビオローゲン還元アッセイにより測定したとき、組換え大腸菌細胞はＣＯ酸化活性を発現した。
実施例ＸＩＩ
大腸菌のＣＯ耐性実験及びＣＯ濃縮アッセイ（ミオグロビンアッセイ）
この実施例では、高濃度のＣＯに対する大腸菌の耐性について記載する。
【０５７１】
飽和量のＣＯの存在下で大腸菌が嫌気的に増殖することができるかどうか試験するために、少体積の嫌気性微生物学において上記した通り、５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス培地（還元溶液、ＮｉＣｌ２、Ｆｅ（ＩＩ）ＮＨ４ＳＯ４、シアノコバラミン、ＩＰＴＧ、及びクロラムフェニコールを加えた）を含む１２０ｍＬの血清ボトル中に培養物を配置した。これらボトルのうちの半分は窒素ガスで３０分間平衡化し、半分はＣＯガスで３０分間平衡化した。空ベクター（ｐＺＡ３３）を対照として使用し、ｐＺＡ３３空ベクターを含有する培養物及びＡＣＳ９０とＡＣＳ９１との両方を含有する培養物をＮ２及びＣＯの両方で試験した。全てを接種し、３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３６時間増殖させた。３６時間の期間の最後に、フラスコの検査によって全てにおいて多量の増殖が示された。観察した増殖の大部分は一晩で長いラグを伴って生じた。
【０５７２】
全ての培養物がＣＯの存在下で十分増殖したと考えられると仮定して、最終ＣＯ濃度を確認した。これは、ＣＯに曝露したときのミオグロビンのスペクトルシフトのアッセイを使用して実施された。亜ジチオン酸ナトリウムで還元されたミオグロビンの吸収ピークは４３５ｎｍであり、ＣＯで還元されるとこのピークは４２３ｎｍにシフトする。低波長のため及び３００ｎｍ以降の全スペクトルを記録することが必要になるため、石英製キュベットを使用しなければならない。ＣＯ濃度は標準曲線に対して測定し、ＣＯの最大水溶解度に関するヘンリーの法則の定数＝２０℃及び１ａｔｍで９７０マイクロモルに依存する。
【０５７３】
ＣＯ濃度のミオグロビン試験用に、キュベットを水で１０回、アセトンで１回洗浄し、次いで、ＣＯＤＨアッセイと同様にストッパーで密閉した。Ｎ２をキュベットに約１０分間吹き込んだ。体積１ｍＬの嫌気性バッファ（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＤＴＴ）を、ハミルトンシリンジを用いてブランク（ＣＯで平衡化せず）に添加した。１０マイクロリットルの体積のミオグロビン（約１ｍＭ、変動があり得、非常に多くの量がまさに必要となる）及び１マイクロリットルの亜ジチオン酸塩（２０ｍＭ原液）を添加した。ＣＯの標準曲線は、１マイクロリットルずつ増加させながら添加したＣＯ飽和バッファを使用して作製した。それぞれの増分に関してピーク高さ及びシフトを記録した。試験した培養物はｐＺＡ３３／ＣＯ、ＡＣＳ９０／ＣＯ、及びＡＣＳ９１／ＣＯであった。これらのそれぞれを同じキュベットに１マイクロリットルずつ増加させながら添加した。実験の途中で、第２のキュベットをセットアップし使用した。結果を表ＩＩに示す。
【０５７４】
【表１３１】
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【０５７５】
表ＩＩに示す結果は、ＣＯの存在又は不在下のいずれにおいて株を培養したかとは無関係に培養物が増殖したことを示す。これら結果は、大腸菌が嫌気条件下でＣＯへの曝露に対して耐性であり得ること、及びＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロンを発現する大腸菌細胞がいくらかのＣＯを代謝し得ることを示す。
【０５７６】
これら結果は、大腸菌細胞が、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現しようとしまいと、飽和量のＣＯの存在下で増殖することができたことを実証する。更に、これらはＣＯの代わりに窒素中でも、対照と同程度に十分増殖した。この実験は、大腸菌の研究室株が、標準大気圧で実施した合成ガスプロジェクトにおいて到達可能な濃度のＣＯに対して非感受性であることを実証した。更に、予備実験は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現する組換え大腸菌細胞が、おそらく二酸化炭素への酸化によって、いくらかのＣＯを実際に消費したことを示した。
実施例ＸＩＩＩ
１，３−ブタジエン及び３−ブテン−１−オールを形成するための３−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼ酵素
３−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼ酵素は、３−ヒドロキシ酸のアルケン誘導体へのＡＴＰ駆動脱炭酸を触媒する。イソブチレン、プロピレン及びエチレンの形成を触媒する３−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼ酵素が最近報告された（国際公開第２０１０／００１０７８号、並びにＧｏｇｅｒｔｙ及びＢｏｂｉｋ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐ．８００４−８０１０，Ｖｏｌ．７６，Ｎｏ．２４（２０１０年））。本発明者らは、本明細書において、図１６に示す３−ヒドロキシペンタ−４−エノエート（３ＨＰ４）の１，３−ブタジエンへの変換、及び図１７に示す３，５−ジヒドロキシペンタン酸の３−ブテン−１−オールへの変換を触媒する類似の酵素の適用を提案する。３−ブテン−１−オール生成物は、次いで、化学的脱水を介して、又は３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ酵素による生物学的脱水を介してブタジエンに変換することができる。
【０５７７】
３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートのブタジエンへの変換は、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートデカルボキシラーゼによって行われる。同様に、３，５−ジヒドロキシペンタン酸の３−ブテン−１−オールへの変換は、３，５−ジヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼによって行われる。このような酵素は、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ酵素に対する類似性を共有し得る。１つの可能な３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートデカルボキシラーゼは、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（３−ＨＭＢ）をイソブテンに変換することが示された出芽酵母のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＳｃＭＤＤ又はＥＲＧ１９）である（Ｇｏｇｅｒｔｙ及びＢｏｂｉｋ，２０１０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐ．８００４−８０１０，Ｖｏｌ．７６，Ｎｏ．２４）。この酵素の２つの改善された変異体ＳｃＭＤＤ１（Ｉ１４５Ｆ）及びＳｃＭＤＤ２（Ｒ７４Ｈ）は、野性型のＨｉｓタグ付酵素と比較して、１９倍及び３８倍の増加を実現することが実証された。ＥＲＧ１９及び更なる酵素候補を以下に提供する。
【０５７８】
【表１３２】
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【０５７９】
実施例ＸＩＶ
３−ブテン−１−オールのブタジエンへの化学的脱水
アルコールは、適切な条件下で適切な脱水触媒を用いる反応によってオレフィンに変換することができる。ブタノール及びペンタノール等のアルコールをオレフィンに変換する典型的な脱水触媒としては、様々な酸で処理されたアルミナ及び未処理のアルミナ（例えば、γ−アルミナ）、並びにシリカ触媒、並びにゼオライト（例えば、β型ゼオライト触媒、ＺＳＭ−５又はＹ型ゼオライト、フッ素処理β−ゼオライト触媒、フッ素処理クレー触媒）を含むクレー、スルホン酸樹脂（例えば、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）１５等のスルホン化スチレン樹脂）、リン酸及び硫酸等の強酸、三フッ化ホウ素及び三塩化アルミニウム等のルイス酸、並びに金属酸化物（例えば、酸化ジルコニウム又は二酸化チタン）及び金属塩化物を含む様々な種類の金属塩が挙げられる（例えば、Ｌａｔｓｈａｗ  Ｂ  Ｅ，Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ  ｔｏ  Ｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｓｌｕｒｒｙ  Ｒｅａｃｔｏｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，１９９４年２月）。
【０５８０】
脱水反応は、様々な反応器構成において不均質及び均質な触媒系の両方を用いて、気体及び液相の両方において行うことができる。典型的には、使用される触媒は、反応によって生成される水に対して安定である。水は、生成物とともに反応域から通常除去される。生じるアルケンは、（例えば、反応器の条件に依存して）気体中又は液相中のいずれかで反応器を出て、下流の精製プロセスにより捕捉されるか又は本明細書に記載する通り反応器内で他の化合物（ブタジエン又はイソプレン等）に更に変換される。脱水反応によって生成される水は、未反応のアルコール及びアルケン生成物とともに反応器を出て、蒸留又は相分離によって分離される。脱水工程で水が多量に生成されるので、使用される脱水触媒は一般に水に対して耐性であり、基質及び生成物から水を除去するプロセスは、脱水工程を含有する任意のプロセスの一部であってもよい。この理由のために、脱水反応の基質として湿潤アルコール（すなわち、約９５重量％又は９８重量％以下が水）を使用し、脱水反応によって生成された水とともにこの水を除去することが可能である（例えば、米国特許第４，６９８，４５２号及び同第４，８７３，３９２号に記載の通りゼオライト触媒を用いて）。更に、中性のアルミナ及びゼオライトは、アルコールをアルケンに脱水するが、一般的にこれら触媒の酸性型よりも高い温度及び圧力で行われる。
【０５８１】
３−ブテン−１−オールのブタジエンへの脱水は、当技術分野において周知である（Ｇｕｓｔａｖ．Ｅｇｌｏｆｆ及びＧｅｏｒｇｅ．Ｈｕｌｌａ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９４５，３６（１），ｐｐ  ６３−１４１）。例えば、３−ブテン−１−オールは、１，４−ブタンジオールの１，３−ブタジエンへの脱水における中間体として形成される（Ｓａｔｏら，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５（８），２００４，ｐ．３９７−４００）。
実施例ＸＶ
２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、及び１，３−ブタジエンへの経路
この実施例は、２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オール、及び１，３−ブタジエンへの経路について記載する。中間体３ＨＰ４、３，５−ジヒドロキシペンタン酸及び３−ブテン−１−オールへの新規経路を図１８〜２１に示す。３ＨＰ４への経路を、図１８、１９及び２０（新規）に示す。３，５−ジヒドロキシペンタン酸及び３−ブテン−１−オールへの経路を、図１９及び２１（新規）に示す。ブタジエン前駆体２，４−ペンタジエノエートへの更なる経路を図１９、２０及び２１（新規）に示す。
【０５８２】
２，４−ペンタジエノエートへの幾つかの経路は、上記実施例に開示されている（例えば、図４、１２、１３、１４及び１５を参照されたい）。図１８（新規）に示す通り、２，４−ペンタジエノエートの水和により３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートが得られる。３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートは、次いで、下記の通り３−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼによりブタジエンに脱炭酸され得る。
【０５８３】
アクリリル−ＣｏＡ及び３−ＨＰ−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの更なる経路を図１９に示す。また、３ＨＰ４、３−ブテン−１−オール及びブタジエンへの経路も示す。
【０５８４】
アクリリル−ＣｏＡから３ＨＰ４への経路は：工程Ｍ／Ｏ／Ｐ、工程Ｍ／Ｎ／Ｔを含む。
【０５８５】
３−ＨＰ−ＣｏＡから３ＨＰ４への経路は：工程Ａ／Ｌ／Ｏ／Ｐ、工程Ａ／Ｌ／Ｎ／Ｔを含む。
【０５８６】
スクシニル−ＣｏＡから３ＨＰ４及び２４ＰＤへの経路を図２０に示す。スクシニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡは、まず、３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼによって結合されて、３−オキソアジピル−ＣｏＡを形成する（工程Ａ）。１つの経路では、３−オキソアジピル−ＣｏＡの３−オキソ基が還元されて、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを形成する（工程Ｇ）。次いで、ＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ又はトランスフェラーゼによって、ＣｏＡ部分が酸基に変換される。次いで、３−ヒドロキシアジピン酸が酸化されて、３−ヒドロキシヘキサ−４−エンジオエートを形成する（工程Ｉ）。次いで、この生成物が脱カルボキシルされて３ＨＰ４を形成する。別の経路では、工程Ｂにおいて、ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼ又はヒドロラーゼによって、３−オキソアジピル−ＣｏＡが３−オキソアジピン酸に変換される。次いで、３−オキソアジピン酸が３−ヒドロキシアジピン酸に還元され（工程Ｋ）、これが、上記の通り３ＨＰ４に変換される。あるいは、３−オキソアジピン酸は、工程Ｃにおいて２−フマリル酢酸に変換される。次いで、２−フマリル酢酸の３−オキソ基が３−ヒドロキシヘキサ−４−エンジオエートに還元され、これが３ＨＰ４に脱カルボキシルされる。更に別の実施形態では、２−フマリル酢酸が脱炭酸されて３−オキソペンタ−４−エノエートを形成し（工程Ｄ）、これが、次いで、３ＨＰ４に還元される（工程Ｅ）。次いで、３ＨＰ４は、３ＨＰ４デカルボキシラーゼによって１段階でブタジエンに変換されるか（工程Ｍ）、又は２段階で２，４−ペンタジエンに脱水され、次いで、脱炭酸される（工程Ｆ、及びＮ）。
【０５８７】
マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡから３−ブテン−１−オール、ブタジエン及び２，４−ペンタジエノエートへの経路を図２１に示す。これら経路では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡがチオラーゼによって結合されて、３−オキソグルタリル−ＣｏＡを形成する。次いで、この中間体は、幾つかの異なる経路（工程Ｂ／Ｃ／Ｄ、工程Ｂ／Ｇ、工程Ｈ／Ｉ／Ｊ、工程Ｈ／Ｌ／Ｄ、Ｋ／Ｊ）によって３，５−ジヒドロキシペンタン酸に変換することができる。形成されると、３，５−ジヒドロキシペンタン酸は、３−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼによって脱炭酸されて、３−ブテン−１−オールを形成し得る（工程Ｍ）。次いで、３−ブテン−１−オールデヒドロゲナーゼ又は化学触媒による脱水により、ブタジエンが生じる（工程Ｏ）。あるいは、３，５−ジヒドロキシペンタン酸は、工程Ｅに示す通り、５−ヒドロキシペンタ−２−エノエートに脱水されてもよい。次いで、この中間体は、３−ブテン−１−オールに脱炭酸されてもよく（工程Ｎ）、又は更に２，４−ペンタジエノエートに脱水されてもよい（工程Ｆ）。
【０５８８】
図１８〜２１に示す転換を触媒するための酵素をＥＣ番号により分類し（表１）、更に以下に記載する。
【０５８９】
【表１３３】
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【０５９０】
図１９〜２１に示す幾つかの反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。これら反応としては、図１９の工程Ｂ、Ｉ、Ｎ及びＰ、図２０の工程Ｅ、Ｇ、Ｋ及びＬ、並びに図２１の工程Ｂ、Ｄ、Ｉ、Ｊ及びＬが挙げられる。
【０５９１】
アルデヒドのアルコールへの還元を触媒する酵素（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ、換言すればアルデヒドリダクターゼ）をコードする例示的な遺伝子としては、Ｃ２〜Ｃ１４の中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｌｒＡ（Ｔａｎｉら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５２３１−５２３５（２０００年））、大腸菌由来のｙｑｈＤ及びｆｕｃＯ（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら，３４２：４８９−５０２（２００４年））、ブチリルアルデヒドをブタノールに変換するＣ．アセトブチリカム由来のｂｄｈＩ及びｂｄｈＩＩ（Ｗａｌｔｅｒら，１７４：７１４９−７１５８（１９９２年））が挙げられる。ＹｑｈＤは、補因子としてＮＡＤＰＨを使用して広範なアルデヒドの還元を触媒し、Ｃ（３）よりも長い鎖長を好む（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら，３４２：４８９−５０２（２００４年）；Ｐｅｒｅｚら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：７３４６−７３５３（２００８年））。ザイモモナス・モビリスＥ由来のａｄｈＡ遺伝子産物は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド及びアクロレインを含む多くのアルデヒドに対する活性を有することが実証されている（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：２４９−２５４（１９８５年））。更なるアルデヒドリダクターゼ候補は、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカムにおけるｂｄｈ、並びにＣ．ベイジェリンキにおけるＣｂｅｉ＿１７２２、Ｃｂｅｉ＿２１８１及びＣｂｅｉ＿２４２１によってコードされる。出芽酵母における更なるアルデヒドリダクターゼ遺伝子候補としては、アルデヒドリダクターゼＧＲＥ３、ＡＬＤ２−６及びＨＦＤ１、グリオキシル酸レダクターゼＧＯＲ１及びＹＰＬ１１３Ｃ、並びにグリセロールデヒドロゲナーゼＧＣＹ１が挙げられる（国際公開第２０１１／０２２６５１Ａ１号；Ａｔｓｕｍｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：８６−８９（２００８年））。メチルグリオキサールのアセトール又はラクトアルデヒドへの還元を触媒するための既に記載されている酵素候補は、適切なラクトアルデヒドレダクターゼ酵素候補でもある。
【０５９２】
【表１３４】
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【０５９３】
４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素（ＥＣ１．１．１．６１）もこのカテゴリに分類される。このような酵素は、ラルストニア・ユートロファ（Ｂｒａｖｏら，Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓ  Ｓｃｉ，４９：３７９−３８７（２００４年））、クロストリジウム・クルイベリ（Ｗｏｌｆｆら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６：２０６−２１２（１９９５年））及びシロイヌナズナ（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８：４１５５２−４１５５６（２００３年））において特性評価されている。シロイヌナズナ酵素は、酵母においてクローニングされ、特性評価された（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１５５２−４１５５６（２００３年））。更に別の遺伝子は、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼａｄｈＩである（Ｊｅｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３５：１２７−１３３（２００８年））。
【０５９４】
【表１３５】
2013535203.tif 000137
【０５９５】
別の例示的なアルデヒドリダクターゼは、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３１）としても知られているメチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼである。この酵素は、バリン、ロイシン及びイソロイシン分解に関与し、細菌、真核生物及び哺乳類において同定されている。サーマス・サーモフィラスＨＢ８由来のＰ８４０６７によってコードされる酵素は、構造的に特性評価されている（Ｌｏｋａｎａｔｈら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３５２：９０５−１７（２００５年））。ヒトの３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼの可逆性は、アイソトープで標識された基質を使用して実証された（Ｍａｎｎｉｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２３１：４８１−４（１９８５年））。この酵素をコードする更なる遺伝子としては、ヒト（Ｈａｗｅｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２４：２１８−２２８（２０００年））及びウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（Ｈａｗｅｓら，上記；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：２０４３−２０４７（１９９６年））における３ｈｉｎｄｈ、緑膿菌及びシュードモナス・プチダにおけるｍｍｓＢ、並びにシュードモナス・プチダにおけるｄｈａｔ（Ａｂｅｒｈａｒｔら，Ｊ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｐｅｒｋｉｎ１］  ６：１４０４−１４０６（１９７９年）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：２０４３−２０４７（１９９６年）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４３８−４４１（２００３年））が挙げられる。緑膿菌由来のｍｍｓＢ（Ｇｏｋａｒｎら，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ７３９６７６，（２００８年））及びシュードモナス・プチダ由来のｍｍｓＢを含む幾つかの３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素は、還元方向において特性評価されている。
【０５９６】
【表１３６】
2013535203.tif 000138
【０５９７】
ケトンをヒドロキシル官能基に還元する幾つかの例示的なアルコールデヒドロゲナーゼが存在する。大腸菌由来のこのような２つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）によりコードされている。更に、ラルストニア・ユートロファに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、２−オキソ酪酸、２−オキソペンタン酸及び２−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の２−ケト酸に対して高い活性を示すことが実証されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：３２９−３３４（１９８３年））。α−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である２−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒され得る（Ｓｕｄａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６年）；Ｓｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７年））。更なるオキシドレダクターゼは、既にクローニングされ、特性評価されている、ヒトの心臓由来のミトコンドリアの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）である（Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３（１９９２年））。Ｃ．ベエイジェリンキー（Ｉｓｍａｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５０９７−５１０５（１９９３年））及びＴ．ブロッキイ（Ｌａｍｅｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５：１８３−１９０（１９８１年）；Ｐｅｒｅｔｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：６５４９−６５５５（１９８９年））のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼは、ＭＥＫの２−ブタノールへの還元を触媒する。例示的なＭＥＫレダクターゼ酵素は、ロドコッカス・ルーバー（Ｋｏｓｊｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８６：５５−６２（２００４年））及びパイロコッカス・フリオサス（ｖａｎ  ｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３０６２−３０６８（２００１年））において見出すことができる。
【０５９８】
【表１３７】
2013535203.tif 000139
【０５９９】
Ｍａｔｓｕｙａｍａら（（１９９５年））によって記載されている通り、特にバチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属及びクレブシエラ属に属するものを含む多くの生物は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンの１，３−ブタンジオールへの還元を触媒することができる。突然変異型のロドコッカス属のフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（Ｓａｒ２６８）及びレイフソニア属のアルコールデヒドロゲナーゼも、高収率でこの転換を触媒することが示されている（Ｉｔｏｈら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：１２４９−１２５６（２００７年））。
【０６００】
また、３−オキソアシル−ＣｏＡ基質を対応する３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ生成物に還元するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、図１９〜２１に図示される経路に関連する。３−オキソアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３５）は、３−オキソアシル−ＣｏＡ分子を３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ分子に変換し、多くの場合、脂肪酸ベータ酸化又はフェニル酢酸異化作用に関与する。例えば、ｆａｄＢ及びｆａｄＪによりコードされている大腸菌における２つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとして機能する（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７１  Ｐｔ  Ｃ：４０３−４１１（１９８１年））。フェニル酢酸分解オペロンにおける他の遺伝子に対する大腸菌のｐａａＨの近縁性（Ｎｏｇａｌｅｓら，１５３：３５７−３６５（２００７年））及びｐａａＨ突然変異体がフェニル酢酸上では増殖できないという事実（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３年））を考慮して、大腸菌のｐａａＨ遺伝子も３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードすると予測される。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、クロストリジウム属の幾つかの種における酪酸へのアセチル−ＣｏＡ発酵経路に関与し、詳細に研究されている（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４（１９８６年））。ｈｂｄによってコードされているクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素は、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現している（Ｙｏｕｎｇｌｅｓｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：６８００−６８０７（１９８９年））。アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに還元することが実証されている更に他の遺伝子は、ズーグレア・ラミゲラ由来のｐｈｂＢ（Ｐｌｏｕｘら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１７７−１８２（１９８８年））及びロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のｐｈａＢ（Ａｌｂｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１：２９７−３０９（２００６年））である。前者の遺伝子はＮＡＤＰＨ依存性であり、そのヌクレオチド配列は決定されており（Ｐｅｏｐｌｅｓら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：３４９−３５７（１９８９年））、遺伝子は、大腸菌において発現している。前記遺伝子に対する基質特異性研究から、アセトアセチル−ＣｏＡに加えて基質として３−オキソプロピオニル−ＣｏＡも受容できるという結論が導かれた（Ｐｌｏｕｘら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１７７−１８２（１９８８年））。更なる遺伝子としては、パラコッカス・デニトリフィカンスにおけるｐｈａＢ、クロストリジウム・クルイベリにおけるＨｂｄ１（Ｃ末端ドメイン）及びＨｂｄ２（Ｎ−末端ドメイン）（Ｈｉｌｌｍｅｒ及びＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３３３４：１２−２３（１９７４年））、並びにウシにおけるＨＳＤ１７Ｂ１０（Ｗａｋｉｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０７：６３１−６３８（１９５４年））が挙げられる。パラコッカス・デニトリフィカンス由来の酵���は機能的に発現しており、大腸菌において特性評価されている（Ｙａｂｕｔａｎｉら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１３３：８５−９０（１９９５年））。多くの類似する酵素が、クロストリジウム属の他の種及びメタッロスパエラ・セデュラで見出されている（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１７８２−１７８６（２００７年））。カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来の酵素は、ペルオキシゾームの脂肪酸ベータ酸化多機能酵素２型（ＭＦＥ−２）の構成要素である。このタンパク質のデヒドロゲナーゼＢドメインは、アセトアセチル−ＣｏＡに対して触媒的に活性を有する。前記ドメインは、大腸菌において機能的に発現しており、結晶構造が利用可能であり、触媒機構は十分に理解されている（Ｙｌｉａｎｔｔｉｌａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２４：２５−３０（２００４年）；Ｙｌｉａｎｔｔｉｌａら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５８：１２８６−１２９５（２００６年））。
【０６０１】
【表１３８】
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【０６０２】
二機能オキシドレダクターゼは、アシル−ＣｏＡを対応するアルコールに変換する。この活性を有する酵素は、３−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡの３，５−ジヒドロキシオキシペンタン酸（図２１、工程Ｇ）への変換、及び３−オキソグルタリル−ＣｏＡの５−ヒドロキシ−３−オキソペンタン酸（図２１、工程Ｋ）への変換に必要とされる。
【０６０３】
アシル−ＣｏＡをアルコールに変換する例示的な二機能オキシドレダクターゼとしては、アセチル−ＣｏＡ等の基質をエタノールに（例えば、大腸菌由来のａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら，ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．２８１：５９−６３（１９９１年）））、及びブチリル−ＣｏＡをブタノールに（例えば、Ｃ．アセトブチリカム由来のａｄｈＥ２（Ｆｏｎｔａｉｎｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：８２１−８３０（２００２年）））に転換するものが挙げられる。ｂｄｈＩ及びｂｄｈＩＩによってコードされるＣ．アセトブチリカム酵素（Ｗａｌｔｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７１４９−７１５８（１９９２年））は、アセチル−ＣｏＡ及びブチリル−ＣｏＡをエタノール及びブタノールにそれぞれ還元する。アセチル−ＣｏＡのエタノールへの還元に加えて、リゥコノストック・メゼンテロイデスにおけるａｄｈＥによってコードされる酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：４３−５５（１９７２年）；Ｋｏｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，２７：５０５−５１０（２００５年））。別の例示的な酵素は、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換することができる。この活性を有するＮＡＤＰＨ依存性酵素は、クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）において特性評価されており、そこでは３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関与している（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：２４０４−２４１０（２００２年）；Ｓｔｒａｕｓｓら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１５：６３３−６４３（１９９３年））。３００ｋＤａの質量を有するこの酵素は、高度に基質特異的であり、他の公知オキシドレダクターゼに対して配列相同性をほとんど示さない（Ｈｕｇｌｅｒら，上記）。他の生物において、この特異的な反応を触媒することが示されている酵素は存在しないが；他の生物が類似する経路を有する可能性があるという生物情報学的証拠は存在する（Ｋｌａｔｔら，Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：２０６７−２０７８（２００７年））。配列相同性によって、ロセイフレキサス・カステンホルジイ（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ）、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）の種ＮＡＰ１及び海洋性ガンマプロテオバクテリアのＨＴＣＣ２０８０を含む他の生物における酵素候補を推測することができる。
【０６０４】
【表１３９】
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【０６０５】
長鎖アシル−ＣｏＡ分子は、アルコール形成脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードするホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＦＡＲ等の酵素により、対応するアルコールに還元され得る。それが大腸菌において過剰発現することにより、ＦＡＲ活性及び脂肪族アルコールの蓄積が生じた（Ｍｅｔｚら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：６３５−６４４（２０００年））。
【０６０６】
【表１４０】
2013535203.tif 000142
【０６０７】
これら工程を触媒するための別の候補は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（すなわち、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）である。この酵素は、自然界では、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡにおけるＣｏＡ基をアルコール形成メバロン酸に還元する。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードするスルホロブス・ソルファタリカスのｈｍｇＡ遺伝子は、大腸菌においてクローニングされ、配列決定され、発現している（Ｂｏｃｈａｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３６３２−３６３８（１９９７年））。また、出芽酵母は、その中に２つのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを有する（Ｂａｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８３：５５６３−５５６７（１９８６年））。また、シロイヌナズナから遺伝子が単離され、出芽酵母におけるＨＭＧ−ＣＯＡレダクターゼ活性を補足することが示されている（Ｌｅａｒｎｅｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８６：２７７９−２７８３（１９８９年））。
【０６０８】
【表１４１】
2013535203.tif 000143
【０６０９】
１．２．１ファミリーにおけるアシル−ＣｏＡレダクターゼは、アシル−ＣｏＡを対応するアルデヒドに還元する。このような変換は、図２１の工程Ｃ及びＨにおいて必要とされる。幾つかのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。これらを以下に記載する。
【０６１０】
例示的なアシル−ＣｏＡレダクターゼ酵素としては、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７６）、アセチル−ＣｏＡレダクターゼ及びブチリル−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。例示的な脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７９：２９６９−２９７５（１９９７年））及びアシネトバクター属の種Ｍ−１（Ｉｓｈｉｇｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１１９２−１１９５（２００２年））のａｃｒ１によってコードされる。スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・クルイベリのｓｕｃＤ（Ｓｏｈｌｉｎｇ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６年））及びＰ．ジンジバリスのｓｕｃＤ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８２：４７０４−４７１０（２０００年））によってコードされる。更なるスクシニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、メタッロスパエラ・セデュラ（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１７８２−１７８６（２００７年））及びサーモプロテウス・ニュートロフィラス（Ｒａｍｏｓ−Ｖｅｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：４２８６−４２９７（２００９年））を含む好熱性古細菌の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路に関与している。Ｍｓｅｄ＿０７０９によってコードされているＭ．セデュラ酵素は、厳密にＮＡＤＰＨ依存性であり、またマロニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する。Ｔ．ニュートロフィラス酵素は、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨの両方に対して活性を有する。ｂｐｈＧによってコードされるシュードモナス属の種におけるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びホルムアルデヒドを酸化及びアシル化することが示されているので、また別のものである（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３７７−３８５（１９９３年））。アセチル−ＣｏＡのエタノールへの還元に加えて、リゥコノストック・メゼンテロイデスにおいてａｄｈＥによってコードされている酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：４３−５５（１９７２年）；及びＫｏｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，２７：５０５−５１０（２００５年））。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム等の溶媒生成生物において、類似の反応、ブチリル−ＣｏＡのブチルアルデヒドへの変換を触媒する（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））。
【０６１１】
【表１４２】
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【０６１２】
アシル−ＣｏＡを対応するアルデヒドに変換する更なる酵素の種類は、マロニル−ＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに転換するマロニル−ＣｏＡレダクターゼである。マロニル−ＣｏＡレダクターゼは、好熱好酸性古細菌における３−ヒドロキシプロピオン酸回路を介する自己栄養性炭素固定において鍵となる酵素である（Ｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７８２−１７８６（２００７年）；及びＴｈａｕｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７３２−１７３３（２００７年））。この酵素は、補因子としてＮＡＤＰＨを利用し、メタッロスパエラ属及びスルホロブス属の種において特性評価されている（Ａｌｂｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：８５５１−８５５９（２００６年）；及びＨｕｇｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２４０４−２４１０（２００２年））。この酵素は、メタッロスパエラ・セデュラにおいてＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされている（Ａｌｂｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：８５５１−８５５９（２００６年）；及びＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７８２−１７８６（２００７年））。スルホロブス・トコダイイ由来のマロニル−ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、大腸菌でクローニングされ、異種発現した（Ａｌｂｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：８５５１−８５５９（２００６年）。この酵素も、メチルマロニル−ＣｏＡの対応するアルデヒドへの変換を触媒することが示されている（国際公開第２００７１４１２０８号（２００７年））。これら酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼ機能は、クロロフレクサス・アウランティアカス由来の二機能デヒドロゲナーゼに類似しているが、配列相同性はほとんど存在しない。両方のマロニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素の候補は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルチル−４−リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元と同時に脱リン酸化を触媒する酵素と高い配列相同性を有する。タンパク質に対する配列相同性により、スルホロブス・ソルファタリカス及びスルホロブス・アシドカルダリウスを含む他の生物で更なる遺伝子酵素を見出すことができ、それを以下に列挙する。ＣｏＡアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼに関する更に別の候補は、クロストリジウム・ベエイジェリンキー由来のａｌｄ遺伝子である（Ｔｏｔｈ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４９７３−４９８０（１９９９年）。この酵素は、アセチル−ＣｏＡ及びブチリル−ＣｏＡを対応するアルデヒドに還元することが報告されている。この遺伝子は、ネズミチフス菌及び大腸菌のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｅｕｔＥに非常に類似している（Ｔｏｔｈ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４９７３−４９８０（１９９９年）。
【０６１３】
【表１４３】
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【０６１４】
一部が可逆性である２−エノエートレダクターゼ酵素は、広範なα，β−不飽和カルボン酸及びアルデヒドのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を触媒することが知られている（Ｒｏｈｄｉｃｈら，２７６：５７７９−５７８７（２００１年））。これら酵素は、図２０の工程Ｉ及びＣに図示される転換を実施するのに適切な候補を表す。幾つかの例を以下に提供する。
【０６１５】
Ｃ．クルイベリの最近公開されたゲノム配列では、エノエートレダクターゼについて９つのコード配列が報告され、そのうちの１つが特性評価されている（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０５：２１２８−２１３３（２００８年））。Ｃ．チロブチリカム（Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）及びＭ．サーモアセチカム（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）の両方に由来するｅｎｒ遺伝子は、クローニングされ、配列決定されており、互いに５９％の同一性を示す。また、前者の遺伝子は、Ｃ．クライベリにおいて特性評価されている遺伝子に対して約７５％の類似性を有することが見出されている（Ｇｉｅｓｅｌら，１３５：５１−５７（１９８３年））。これらの配列結果に基いて、ｅｎｒが大腸菌におけるジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ｆａｄＨ）に非常に類似していることが報告されている（Ｒｏｈｄｉｃｈら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５７７９−５７８７（２００１年））。また、Ｃ．サーモアセチカムのｅｎｒ遺伝子は、大腸菌において触媒的活性型で発現している（Ｒｏｈｄｉｃｈら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５７７９−５７８７（２００１年））。この酵素は、広範囲のα，β−不飽和カルボニル化合物に対する活性を示す。
【０６１６】
【表１４４】
2013535203.tif 000146
【０６１７】
別の候補である２−エノエートレダクターゼは、２−マレイル酢酸（４−オキソヘキサ−２−エンジオエート）の３−オキソアジピン酸への還元を触媒する酵素であるマレイル酢酸レダクターゼ（ＭＡＲ、ＥＣ１．３．１．３２）である。ＭＡＲ酵素は、自然界では、芳香族分解経路に関与する（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：６０７５−６０８１（１９９３年）；Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３２０−３２５（１９９５年）；Ｃａｍａｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００９年）；Ｈｕａｎｇら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：７２３８−７２４５（２００６年））。酵素活性は、シュードモナス属の種の株Ｂ１３において同定され、特性評価されており（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，１７５：６０７５−６０８１（１９９３年）；Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，１７７：３２０−３２５（１９９５年））、それをコードしている遺伝子は、クローニングされ、配列決定された（Ｋａｓｂｅｒｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３８０１−３８０３（１９９７年））。更なるＭＡＲ遺伝子候補としては、シュードモナス属の種の株Ｂ１３由来のｃｌｃＥ遺伝子（Ｋａｓｂｅｒｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３８０１−３８０３（１９９７年））、ロドコッカス・オーパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）由来のｍａｃＡ遺伝子（Ｓｅｉｂｅｒｔら，１８０：３５０３−３５０８（１９９８年））、ラルストニア・ユートロファ（カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）としても知られている）由来のｍａｃＡ遺伝子（Ｓｅｉｂｅｒｔら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：４６３−４７２（２００４年））、ラルストニア・ユートロファ由来のｔｆｄＦＩＩ（Ｓｅｉｂｅｒｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：６７４５−６７５４（１９９３年））、及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＮＣｇｌ１１１２（Ｈｕａｎｇら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：７２３８−７２４５（２００６年））が挙げられる。ｃｃａＤによってコードされるシュードモナス・レイネケイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｅｋｅｉ）ＭＴ１におけるＭＡＲが最近同定された（Ｃａｍａｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００９年））。
【０６１８】
【表１４５】
2013535203.tif 000147
【０６１９】
図１９〜２１の工程Ａ及び図１９の工程Ｍは、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ又はマロニル−ＣｏＡのいずれかとアセチル−ＣｏＡとの縮合を必要とする。幾つかの  −ケトチオラーゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。これらを以下に記載する。
【０６２０】
例えば、３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼは、前述の工程に適するβ−ケトチオラーゼ酵素の１種を表す。３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１７４）は、自然界では、β−ケトアジピル−ＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡに変換し、芳香族化合物を分解するためのβ−ケトアジピン酸経路の鍵となる酵素である。この酵素は、シュードモナス・プチダ（Ｈａｒｗｏｏｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：６４７９−６４８８（１９９４年））及びアシネトバクター・カルコアセティカス（Ｄｏｔｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３１６８−３１７４（１９８７年））を含む土壌細菌及び真菌に広く存在する。シュードモナス属の株Ｂ１３におけるｐｃａＦ（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２年））、シュードモナス・プチダＵにおけるｐｈａＤ（Ｏｌｉｖｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８年））、シュードモナス・フルオレッセンスＳＴにおけるｐａａＥ（Ｄｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８８：１１７−１２５（２００７年））及び大腸菌由来のｐａａＪ（Ｎｏｇａｌｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５３：３５７−３６５（２００７年））によってコードされている遺伝子産物もこの転換を触媒する。幾つかのβ−ケトチオラーゼは、シュードモナス・プチダ由来のｂｋｔ、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｐｃａＦ及びｂｋｔ、バークホルデリア・アンビファリアＡＭＭＤ由来のｂｋｔ、大腸菌由来のｐａａＪ、及びＰ．プチダ由来のｐｈａＤを含むオキソアジピル−ＣｏＡ形成方向に著しく且つ選択的な活性を示す。
【０６２１】
【表１４６】
2013535203.tif 000148
【０６２２】
グルタリル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡは、縮合されて、オキソピメロイル−ＣｏＡ：グルタリル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）によって３−オキソピメロイル−ＣｏＡを形成する。この転換を触媒する酵素は、遺伝子ｂｋｔＢ及びｂｋｔＣによりコードされるラルストニア・ユートロファ（以前はアルカリゲネス・ユートロファとして知られていた）にみられる（Ｓｌａｔｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１９７９−１９８７（１９９８年）；Ｈａｙｗｏｏｄら，５２：９１−９６（１９８８年））。ＢｋｔＢタンパク質の配列は、公知であるが；ＢｋｔＣタンパク質の配列は報告されていない。また、ロドシュードモナス・パルストリスのｐｉｍオペロンは、ｐｉｍＢによってコードされているβ−ケトチオラーゼもコードし、ベンゾイル−ＣｏＡ分解中に分解方向にこの転換を触媒すると予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎら，１５１：７２７−７３６（２００５年））。Ｓ．アシジトロフィカスにおけるβ−ケトチオラーゼ酵素候補は、ｂｋｔＢに対する配列相同性により同定された（４３％の同一性、ｅ値＝１ｅ−９３）。
【０６２３】
【表１４７】
2013535203.tif 000149
【０６２４】
また、アセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡ由来のベータケト吉草酸の形成を触媒するβ−ケトチオラーゼ酵素は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ又はマロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡとの縮合を触媒することができる。ズーグレア・ラミゲラは、プロピオニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡから  −ケトバレリル−ＣｏＡを形成することができる２つのケトチオラーゼを有し、Ｒ．ユートロファは、同じ転換を触媒することができる  −酸化ケトチオラーゼを有する（Ｇｒｕｙｓら，米国特許第５，９５８，７４５号（１９９９年））。これら遺伝子又はそｒれが翻訳されたタンパク質の配列は報告されていないが、Ｒ．ユートロファ由来のｂｋｔＢに対する配列相同性に基いて、Ｒ．ユートロファ、Ｚ．ラミゲラ、又は他の生物における幾つかの候補を同定することができる。これらは、以下を含む：
【０６２５】
【表１４８】
2013535203.tif 000150
【０６２６】
更なる候補としては、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換することが知られているβ−ケトチオラーゼ（ＥＣ２．１．３．９）が挙げられる。例示的なアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ酵素としては、大腸菌由来のａｔｏＢ（Ｍａｒｔｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７９６−８０２（２００３年））、Ｃ．アセトブチリカム由来のｔｈｌＡ及びｔｈｌＢ（Ｈａｎａｉら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：７８１４−７８１８（２００７年）；Ｗｉｎｚｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：５３１−５４１（２０００年））、出芽酵母由来のＥＲＧ１０（Ｈｉｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１３８３−３１３８９（１９９４年））の遺伝子産物が挙げられる。
【０６２７】
【表１４９】
2013535203.tif 000151
【０６２８】
２．８．３ファミリーにおける酵素は、ある分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的転移を触媒する。このような転換は、図１９の工程Ｆ、Ｏ、Ｇ、Ｔ、Ｈ及びＥ、並びに図２０の工程Ｂ及びＨによって必要とされる。幾つかのＣｏＡトランスフェラーゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。これらを以下に記載する。
【０６２９】
多くのトランスフェラーゼが広い特異性を有し、したがって、特に、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、２−アセト酢酸メチル、３−ケトヘキサン酸、３−ケトペンタン酸、吉草酸、クロトン酸、３−メルカプトプロピオン酸、プロピオン酸、酢酸ビニル及び酪酸もの多様なＣｏＡアクセプターを利用することができる。例えば、ロゼブリア属の種Ａ２−１８３由来の酵素は、ブチリル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼ及びプロピオニル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有することが示された（Ｃｈａｒｒｉｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２，１７９−１８５（２００６年））。近縁なホモログは、例えばロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）Ｌ１−８２、ロゼブリア・イヌリニボランスＤＳＭ１６８４１、ユーバクテリウム・レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）ＡＴＣＣ  ３３６５６において見出すことができる。プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する別の酵素は、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）において見出すことができる（Ｓｅｌｍｅｒら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９，３７２−３８０（２００２年））。この酵素は、ＣｏＡアクセプターとして酢酸、（Ｒ）−乳酸、（Ｓ）−乳酸、アクリレート、及び酪酸を用いることができる（Ｓｅｌｍｅｒら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９，３７２−３８０（２００２年）；Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ及びＢｕｃｋｅｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７１（１）７９−８４（１９８４年））。近いホモログは、例えば、ノーヴィ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）ＮＴ、クロストリジウム・ベエイジェリンキーＮＣＩＭＢ８０５２及びクロストリジウム・ボツリナムＣ株エークルンド（Ｅｋｌｕｎｄ）において見出すことができる。ＹｇｆＨは、大腸菌においてプロピオニルＣｏＡコハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする（Ｈａｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（１６）４６２２−４６２９）。近いホモログは、例えば、シトロバクター・ヤンガエＡＴＣＣ２９２２０、サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾナエ血清型、及びエルシニア・インターメディアＡＴＣＣ２９９０９で見出すことができる。これらのタンパク質は、以下の通り同定される：
【０６３０】
【表１５０】
2013535203.tif 000152
【０６３１】
更なる候補酵素は、シュードモナス属におけるｐｃａＩ及びｐｃａＪによってコードされている２ユニットの酵素であり、これは、３−オキソアジピル−ＣｏＡ／コハク酸トランスフェラーゼ活性を有することが示されている（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，上記）。相同性に基いて類似する酵素は、アシネトバクター属の種ＡＤＰ１（Ｋｏｗａｌｃｈｕｋら，Ｇｅｎｅ  １４６：２３−３０（１９９４年））及びストレプトミセス・セリカラーに存在する。更なる例示的なスクシニル−ＣｏＡ：３：オキソ酸−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５６５９−２５６６７（１９９７年））及び枯草菌（Ｓｔｏｌｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５３：３９６−４０３（２００７年））に存在する。これらのタンパク質は、以下の通り同定される：
【０６３２】
【表１５１】
2013535203.tif 000153
【０６３３】
ＣｏＡアクセプターとして酢酸を利用することができるＣｏＡトランスフェラーゼは、大腸菌ａｔｏＡ（アルファサブユニット）及びａｔｏＤ（ベータサブユニット）遺伝子によってコードされるアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８年）；Ｋｏｒｏｌｅｖら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８：２１１６−２１２１（２００２年））。この酵素もイソ酪酸（Ｍａｔｔｈｉｅｓら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８：１４３５−１４３９（１９９２年））、吉草酸（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，上記）及びブタン酸（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，上記）を含む様々な分岐鎖及び直鎖のアシル−ＣｏＡ基質から酢酸にＣｏＡ部分を転移することが示されている。類似する酵素は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（Ｄｕｎｃａｎら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５１８６−５１９０（２００２年））、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０年））及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７年））に存在する。これらのタンパク質は、以下の通り同定される：
【０６３４】
【表１５２】
2013535203.tif 000154
【０６３５】
更なる例示的なトランスフェラーゼ候補は、それぞれスクシニル−ＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ及びブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されているクロストリジウム・クルイベリのｃａｔ１、ｃａｔ２及びｃａｔ３の遺伝子産物により触媒される（Ｓｅｅｄｏｒｆら，上記；Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：１２１−１２７（１９９３年）；Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６年））。また、同様のＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１４１１−１４１８（２００８年））及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｒｉｖｉｅｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４５３３７−４５３４６（２００４年））にも存在する。これらタンパク質は、以下の通り同定される：
【０６３６】
【表１５３】
2013535203.tif 000155
【０６３７】
嫌気性細菌アシドアミノコックス・ファーメンタンス由来のグルタコネート−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）酵素は、二酸グルタコニル−ＣｏＡ及び３−ブテノイル−ＣｏＡと反応する（Ｍａｃｋら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０５：２０９−２１２（１９９７年））。この酵素をコードする遺伝子は、ｇｃｔＡ及びｇｃｔＢである。この酵素は、グルタリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ及びアクリリル−ＣｏＡを含む他のＣｏＡ誘導体に対して、低いが検出可能な活性を示す（Ｂｕｃｋｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：３１５−３２１（１９８１年））。この酵素は、大腸菌でクローニングされ、発現している（Ｍａｃｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：４１−５１（１９９４年））。これらタンパク質は、以下の通り同定される：
【０６３８】
【表１５４】
2013535203.tif 000156
【０６３９】
３．１．２ファミリーにおける酵素は、アシル−ＣｏＡ分子を対応する酸に加水分解する。このような転換は、図１９の工程Ｆ、Ｏ、Ｇ、Ｔ、Ｈ及びＥ、並びに図２０の工程Ｂ及びＨによって必要とされる。幾つかのこのような酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。
【０６４０】
例えば、ラットの脳に由来するａｃｏｔ１２によってコードされる酵素（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７１：９５９−９６５（１９７６年））は、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡと反応することができる。ａｃｏｔ８によってコードされているヒトのジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、スベリル−ＣｏＡ、セバシル−ＣｏＡ及びドデカンジオイル−ＣｏＡに対する活性を示す（Ｗｅｓｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８１２５−３８１３２（２００５年））。また、この酵素に最も近い大腸菌ホモログｔｅｓＢも、様々なＣｏＡチオールエステルを加水分解することができる（Ｎａｇｇｅｒｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１１０４４−１１０５０（１９９１年））。類似の酵素が、ラットの肝臓において特性評価されている（Ｄｅａｎａ  Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ２６：７６７−７７３（１９９２年））。大腸菌においてヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素としては、ｙｂｇＣ、ｐａａＩ及びｙｂｄＢが挙げられる（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，２００５年，２９（２）：２６３−２７９；Ｓｏｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００６年，２８１（１６）：１１０２８−３８）。その配列は報告されていないが、エンドウの葉のミトコンドリア由来の酵素は、広い基質特異性を有し、アセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、オレオイル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ及びクロトニル−ＣｏＡに対する活性が実証されている（Ｚｅｉｈｅｒら，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２０−２７（１９９０年））。出芽酵母由来のアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼであるＡＣＨ１は、別の候補ヒドロラーゼを表す（Ｂｕｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１７２０３−１７２０９（２００３年））。
【０６４１】
【表１５５】
2013535203.tif 000157
【０６４２】
更に別の候補ヒドロラーゼは、アシドアミノコックス・ファーメンタンス由来のグルタコネートＣｏＡトランスフェラーゼである。この酵素は、部位特異的変異誘発によって、グルタリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ及び３−ブテノイル−ＣｏＡに対する活性を有するアシル−ＣｏＡヒドロラーゼに転換された（Ｍａｃｋら，ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．４０５：２０９−２１２（１９９７年））。これは、スクシニル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素もこの反応工程に対する候補として機能する可能性があるが、その機能を変化させる特定の突然変異を必要とすることを示唆する。
【０６４３】
【表１５６】
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【０６４４】
更なるヒドロラーゼ酵素としては、バリン分解中の３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ酪酸への変換を効率的に触媒すると記載されている３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼが挙げられる（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１４２４８−１４２５３（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子としては、ラット（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２４：２２９−２４０（２０００年））及びヒト（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，上記）のｈｉｂｃｈが挙げられる。また、配列相同性によって、出芽酵母のｈｉｂｃｈ及びセレウス菌のＢＣ＿２２９２を含む類似の遺伝子候補を同定することができる。
【０６４５】
【表１５７】
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【０６４６】
ＥＣクラス４．１．１におけるデカルボキシラーゼ酵素は、図１９の工程Ｕ、Ｙ、Ｖ及びＸ、図２０の工程Ｄ、Ｊ、Ｍ及びＮ、並びに図２１の工程Ｍ、Ｎ及びＰを触媒するために必要とされる。候補デカルボキシラーゼ酵素は、本願に既に記載されている。
【０６４７】
二重結合の水和は、４．２．１酵素ファミリーにおけるヒドラターゼ酵素によって触媒することができる。二重結合を形成するための水の除去は、４．２．１酵素ファミリーにおけるデヒドラターゼ酵素によって触媒される。ヒドラターゼ酵素は、時に可逆的であり、また脱水も触媒する。デヒドラターゼ酵素は、時に可逆的であり、また水和も触媒する。水の付加又は所与の基質からの除去は、図１９における工程Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｊ、Ｑ及びＷ、図２０における工程Ｆ、並びに図２１における工程Ｅ、Ｆ及びＯによって必要とされる。幾つかのヒドラターゼ及びデヒドラターゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。
【０６４８】
例えば、多くのデヒドラターゼ酵素が、電子求引性のカルボニル、カルボン酸又はＣｏＡチオールエステル基によるアルファ水素の活性化、並びにベータ位からのヒドロキシル基の除去を含む水のα，β−脱離を触媒する（Ｂｕｃｋｅｌら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１７：１２４８−６０（１９７４）；Ｍａｒｔｉｎｓら，ＰＮＡＳ  １０１：１５６４５−９（２００４））。例示的な酵素としては、２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１０）、シクロヘキサノンヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）及び２−ケト−４−ペンテン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８０）、シトラマル酸ヒドロリアーゼ及びジメチルマレイン酸ヒドラターゼが挙げられる。
【０６４９】
２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドロゲナーゼは、２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸を２−メチレン−グルタル酸に脱水する［４Ｆｅ−４Ｓ］含有酵素であり、ユーバクテリウム・バーケリ（旧クロストリジウム・バルケリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ））におけるニコチン酸異化作用における役割について研究されている（Ａｌｈａｐｅｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０３：１２３４１−６（２００６年））。高い配列相同性を有する類似の酵素は、バクテロイデス・カピローサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）及びナトラネロビウス・サーモフィラス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ）でみられる。これら酵素は、［４Ｆｅ−４Ｓ］含有細菌のセリンデヒドラターゼ（例えばｔｄｃＧ、ｓｄｈＢ及びｓｄａＡによってコードされる大腸菌酵素）のアルファサブユニット及びベータサブユニットに対して相同である。Ｅ．バーケリにおいて類似の機能を有する酵素は、ジメチルマレイン酸を水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける可逆的なＦｅ２＋依存性且つ酸素感受性酵素であるジメチルマレイン酸ヒドラターゼである。この酵素は、ｄｍｄＡＢによってコードされる（Ａｌｈａｐｅｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：１２３４１−６（２００６年）；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６５：８４７−８５７（１９８４年））。
【０６５０】
【表１５８】
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【０６５１】
フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２）酵素は、自然界では、フマル酸のリンゴ酸への可逆的な水和を触媒する。基質としての３−オキソブタノールと反応するフマル酸ヒドラターゼの能力は、文献には記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造情報が利用可能であり、また、他の研究者が、活性、阻害及び局在を変化させるための酵素の改変に成功している（Ｗｅａｖｅｒ，６１：１３９５−１４０１（２００５年））。大腸菌は、３つのフマラーゼ：増殖条件により調節されるＦｕｍＡ、ＦｕｍＢ及びＦｕｍＣを有する。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気条件下でのみ活性を有する。ＦｕｍＡは、微小嫌気条件下で活性を有し、ＦｕｍＣは、好気増殖において活性を有する唯一の酵素である（Ｔｓｅｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３：４６１−４６７（２００１年）；Ｗｏｏｄｓら，９５４：１４−２６（１９８８年）；Ｇｕｅｓｔら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３１：２９７１−２９８４（１９８５年））。更なる酵素候補は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：９６１−９７５（１９９９年））、サーマス・サーモフィラス（Ｍｉｚｏｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５：４９−５５（１９９８年））及びラット（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，８９：１９２３−１９３１（１９８１年））でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のｆｕｍ１及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｆｕｍＣが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム由来のＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別のクラスのフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，２７０：２０７−２１  ３（２００７年））。
【０６５２】
【表１５９】
2013535203.tif 000161
【０６５３】
４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸の２−オキソペンテン酸への脱水は、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８０）によって触媒される。この酵素は芳香族分解経路に関与し、典型的に、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子と共転写される。例示的な遺伝子産物は、大腸菌のｍｈｐＤ（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２５７３−２５８１（１９９７年）；Ｐｏｌｌａｒｄら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：９８−１０６（１９９８年））、シュードモナス・プチダのｔｏｄＧ及びｃｍｔＦ（Ｌａｕら，Ｇｅｎｅ  １４６：７−１３（１９９４年）；Ｅａｔｏｎ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１３５１−１３６２（１９９６年））、コマモナス属の種ＣＮＢ−１のｃｎｂＥ（Ｍａら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：４４７７−４４８３（２００７年））、及びバークホルデリア・キセノボランスのｍｈｐＤ（Ｗａｎｇら，ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７２：９６６−９７４（２００５年））によってコードされる。緊密に関連する酵素である２−オキソヘプタ−４−エン−１，７−ジオエートヒドラターゼは、４−ヒドロキシフェニル酢酸分解に関与し、そこで補因子としてマグネシウムを使用して、２−オキソ−ヘプタ−４−エン−１，７−ジオエート（ＯＨＥＤ）を２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘプタ−１，７−ジオエートに変換する（Ｂｕｒｋｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：（１９９８年））。ＯＨＥＤヒドラターゼ酵素の候補は、大腸菌Ｃ（Ｒｏｐｅｒら，Ｇｅｎｅ  １５６：４７−５１（１９９５年）；Ｉｚｕｍｉら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７０：８９９−９１１（２００７年））及び大腸菌Ｗ（Ｐｒｉｅｔｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１１１−１２０（１９９６年））で同定され、特性評価されている。配列比較により、広範囲の細菌、植物、及び動物におけるホモログが明らかになっている。中でも、非常に類似する配列を有する酵素は、肺炎杆菌（９１％の同一性、ｅ値＝２ｅ−１３８）及びサルモネラ・エンテリカ（９１％の同一性、ｅ値＝４ｅ−１３８）に含有されている。
【０６５４】
【表１６０】
2013535203.tif 000162
【０６５５】
別の酵素候補は、自然界では２−メチルリンゴ酸をメサコン酸に脱水する酵素であるシトラマル酸ヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．１．３４）である。この酵素は、広い基質特異性を有することが示されているメタノカルドコッカス・ジャナスキイの２−オキソブタン酸へのピルビン酸経路において研究されている（Ｄｒｅｖｌａｎｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：４３９１−４４００（２００７年））。この酵素活性は、破傷風様菌、モルガネラ・モルガニー、シトロバクター・アマロナティカスでも検出され、これらではグルタミン酸分解に関与していると考えられる（Ｋａｔｏら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７年））。メタノカルドコッカス・ジャナスキイのタンパク質配列は、これらの生物における遺伝子に対してそれほど高い相同性を有する訳ではない。
【０６５６】
【表１６１】
2013535203.tif 000163
【０６５７】
ジメチルマレイン酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８５）は、ジメチルマレイン酸を水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける可逆的なＦｅ２＋依存性且つ酸素感受性酵素である。この酵素は、ユーバクテリウム・バーケリにおけるｄｍｄＡＢによってコードされている（Ａｌｈａｐｅｌら，上記；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６５：８４７−８５７（１９８４年））。
【０６５８】
【表１６２】
2013535203.tif 000164
【０６５９】
オレイン酸ヒドラターゼは、国際公開第２０１１０７６６９１号に提案されているような更なる適切な候補を表す。これらは、図１９の工程Ｗ及び図２１の工程Ｏに特に有用である。例としては、以下のタンパク質が挙げられる。
【０６６０】
【表１６３】
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【０６６１】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）は、様々な３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡ基質の脱水を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１７：９９−１０８（１９７８年）；Ａｇｎｉｈｏｔｒｉら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：９−２０（２００３年）；Ｃｏｎｒａｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１８：１０３−１１１（１９７４年））。ｅｃｈによってコードされるシュードモナス・プチダのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１７：９９−１０８（１９７８年））。この転換は、クロストリジウム・アセトブチリカムのｃｒｔ遺伝子産物、Ｃ．クライベリのｃｒｔ１遺伝子産物、及び他のクロストリジウム属の生物によっても触媒される（Ａｔｓｕｍｉら，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  １０：３０５−３１１（２００８年）；Ｂｏｙｎｔｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５−３０２４（１９９６年）；Ｈｉｌｌｍｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１：３５１−３５４（１９７２年））。更なるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ候補は、Ｐ．プチダのｐｈａＡ及びｐｈａＢ、並びにＰ．フルオレッセンス由来のｐａａＡ及びｐａａＢである（Ｏｌｉｖｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８年））。ロドシュードモナス・パルストリスにおけるｐｉｍＦの遺伝子産物は、ピメロイル−ＣｏＡ分解に関与するエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードすると予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：７２７−７３６（２００５年））。最後に、ｍａｏＣ（Ｐａｒｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：５３９１−５３９７（２００３年））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３年）；Ｐａｒｋら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１３−１１６：３３５−３４６（２００４年）；Ｐａｒｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８６：６８１−６８６（２００４年））及びｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３年）；Ｐａｒｋ及びＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１３−１１６：３３５−３４６（２００４年）；Ｐａｒｋ及びＹｕｐ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８６：６８１−６８６（２００４年））を含む多くの大腸菌遺伝子は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ機能を示すことが示されている。
【０６６２】
【表１６４】
2013535203.tif 000166
【０６６３】
あるいは、ｆａｄＡ及びｆａｄＢの大腸菌遺伝子産物は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を示す脂肪酸酸化に関与する多酵素複合体をコードする（Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：６７８８−６７９５（１９９１年）；Ｙａｎｇ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：７４０５−７４０６（１９９１年）；Ｎａｋａｈｉｇａｓｈｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４９３７（１９９０年））。ｆａｄＲによってコードされるネガティブレギュレーターのノックアウトを利用して、ｆａｄＢ遺伝子産物を活性化することができる（Ｓａｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ  １０３：３８−４４（２００７年））。ｆａｄＩ及びｆａｄＪの遺伝子は類似する機能をコードし、自然界では嫌気条件下で発現する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：７９３−８０５（２００３年））。
【０６６４】
【表１６５】
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【０６６５】
アシル−ＣｏＡ基質のその酸生成物への変換は、一部が可逆性である６．２．１酵素ファミリーにおけるＣｏＡ酸−チオールリガーゼ又はＣｏＡシンテターゼによって触媒され得る。図１９〜２０に示す幾つかの反応は、酸−チオールリガーゼ酵素によって触媒される。これら反応としては、図１９の工程Ｆ、Ｏ、Ｇ、Ｔ、Ｈ及びＥ、並びに図２０の工程Ｂ及びＨが挙げられる。ＣｏＡ酸−チオールリガーゼ又はＣｏＡシンテターゼ活性を触媒する幾つかの酵素は、文献に記載されており、これらの工程に対する適切な候補を表す。
【０６６６】
例えば、ＡＤＰ形成アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、ＡＴＰを合成すると同時に、アシル−ＣｏＡエステルを対応する酸に変換する酵素である。ＡＦ１２１１によってコードされているアーケオグロブス・フルギダス由来のＡＤＣ  Ｉは、イソ酪酸、イソペンタン酸及びフマル酸を含む様々な直鎖及び分岐鎖の基質に対して作用することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。ＡＦ１９８３によってコードされているアーケオグロブス・フルギダスにおける第２の可逆的なＡＣＤも、環状化合物フェニル酢酸及びインドール酢酸に対する活性が高く、広い基質範囲を有することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。（スクシニル−ＣｏＡシンテターゼであるとアノテーションされた）ハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素は、基質としてプロピオン酸、酪酸及び分枝鎖酸（イソ吉草酸及びイソ酪酸）を受容し、順方向及び逆方向に作用することが示された（Ｂｒａｓｅｎら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４年））。超好熱性古細菌であるピロバキュラム・アエロフィラム由来のＰＡＥ３２５０によってコードされているＡＣＤは、全ての特性評価されているＡＣＤのうち最も広い基質範囲を示し、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）、及びフェニルアセチル−ＣｏＡと反応する（Ｂｒａｓｅｎら，上記）。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理学的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。Ａ．フルギダス、Ｈ．マリスモルツイ及びＰ．アエロフィラム由来の酵素は全て、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている（Ｂｒａｓｅｎ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，上記；Ｍｕｓｆｅｌｄｔ及びＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２年））。更なる候補は、大腸菌のｓｕｃＣＤ、並びに出芽酵母のＬＳＣ１及びＬＳＣ２遺伝子によってコードされるスクシニル−ＣｏＡシンテターゼである。これら酵素は、自然界では、インビボにおいて可逆的である反応において、１つのＡＴＰを消費すると同時にコハク酸からスクシニル−ＣｏＡへの形成を触媒する（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５年））。シュードモナス・プチダ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが実証されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３年））。関連する酵素であるリゾビウム・レグミノサルム由来のマロニル−ＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができる（Ｐｏｈｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５８２２−５８２３（２００１年））。
【０６６７】
【表１６６】
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【０６６８】
これら工程の別の候補酵素は、ピメロイル−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１４）としても知られている６−カルボキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、これは、自然界では、グラム陽性菌におけるビオチン生合成中にピメリン酸をピメロイル−ＣｏＡに活性化する。大腸菌にクローニングされているクローンシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来の酵素は、代替基質ヘキサンジオエート及びノナンジオエートを受容することが示された（Ｂｉｎｉｅｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３４０（Ｐｔ３）：７９３−８０１（１９９９年））。他の候補は、枯草菌（Ｂｏｗｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４１２２−４１３０（１９９６年））及びリシニバチルス・スパエリクス（旧バチルス・スパエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ））（Ｐｌｏｕｘら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ２８７（Ｐｔ３）：６８５−６９０（１９９２年））でみられる。
【０６６９】
【表１６７】
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【０６７０】
更なるＣｏＡリガーゼとしては、配列が未だ特性評価されていないラットのジカルボン酸−ＣｏＡ（Ｖａｍｅｃｑら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ２３０：６８３−６９３（１９８５年））、Ｐ．クリソゲナム由来の２つの特性評価されているフェニル酢酸−ＣｏＡリガーゼのいずれか（Ｌａｍａｓ−Ｍａｃｅｉｒａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３９５：１４７−１５５（２００６年）；Ｗａｎｇら，３６０：４５３−４５８（２００７年））、シュードモナス・プチダ由来のフェニル酢酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｃｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：７０８４−７０９０（１９９０年））、及び枯草菌由来の６−カルボキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｂｏｗｅｒら．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８（１４）：４１２２−４１３０（１９９６年））が挙げられる。マウス（Ｈａｓｅｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７７９：４１４−４１９（２００８年））及びヒト（Ｏｈｇａｍｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：９８９−９９４（２００３年））由来のアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、自然界では、アセト酢酸のアセトアセチル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性変換を触媒する。
【０６７１】
【表１６８】
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【０６７２】
他のクラスにおける酵素のように、ＥＣクラス６．２．１における特定の酵素は広い基質特異性を有することが見出されている。シュードモナス・プチダ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが実証されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：１１４９−１１５４（１９９３年））。関連する酵素であるリゾビウム・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）由来のマロニル−ＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができる（Ｐｏｈｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５８２２−５８２３（２００１年））。
【０６７３】
本願全体にわたって、様々な刊行物を参照してきた。ＧｅｎＢａｎｋ及びＧＩ番号の公開を含むこれら刊行物の開示は、本発明が関係する当技術分野の現況をより完全に記載するために、参照することにより全文が本願に組み込まれる。上に提供した実施例を参照して本発明について説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な変更を行うことができることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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