(57)【要約】  ラベルフリーバイオセンサーデータについてクラスター分析を実行する方法及び装置が開示される。
2013522800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ラベルフリーバイオセンサーデータセットを得ること、及び
ｂ）前記データセットについてクラスター分析を実行すること、
を含む、ラベルフリーバイオセンサーデータセットの類似度を測定する方法。
【請求項２】
ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ること、及び、
クラスター分析を実行すること、
を含む、ラベルフリーバイオセンサーデータセットを分析する方法であって、
前記記録は、バイオセンサー応答を測定するバイオセンサーデータと、前記クラスター分析からの出力結果とを含み、前記方法はコンピュータで実施される方法であり、
任意的に、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットを受け取ることは保存媒体から前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることを含むか、任意的に、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットを受け取ることはコンピュータシステムから前記記録を受け取ることを含むか、任意的に、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることはバイオセンサーシステムから前記記録を受け取ることを含むか、及び／又は、任意的に、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることはコンピュータネットワークを介して前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることを含む、ラベルフリーバイオセンサーデータセットを分析する方法。
【請求項３】
１種類以上のコンピュータシステムによって実行されるとき、該コンピュータシステムに請求項１又は２のいずれか１つの方法を実行させる、１種類以上のコンピュータで読み取り可能な媒体に保存されるプログラムコード。
【請求項４】
コンピュータで読み取り可能なプログラムコードが格納されたコンピュータで利用可能な媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、
前記コンピュータで読み取り可能なプログラムコードは、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のクラスター分析を生成するための方法を実行するように適合され、前記方法は、システムを提供することをさらに含み、該システムは区別できるソフトウェアモジュールを含み、前記区別できるソフトウェアモジュールは、論理処理モジュールと、構成ファイル処理モジュールと、データ編制モジュールと、データ表示編制モジュールとを含み、
任意的に、前記方法を実行するように構成されたコンピュータ化されたシステムをさらに含むか、任意的に、前記クラスター分析からの結果を出力することをさらに含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項５】
ラベルフリーバイオセンサーデータセットを保存可能なデータ保存器と、１台又は２台以上の処理要素を含むシステムプロセッサとを含む、クラスター分析システムであって、
前記１台又は２台以上の処理要素は、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットを受け取り、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットを前記データ保存器に保存し、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットについてクラスター分析を実行し、該クラスター分析からの結果を出力するようにプログラムされるか、適合され、
任意的に、前記システムは前記ラベルフリーバイオセンサーデータをバイオセンサーシステムから受け取るか、任意的に、前記システムは前記ラベルフリーバイオセンサーデータをコンピュータネットワークを介して受け取るか、及び／又は、任意的に、バイオセンサーシステムをさらに含む、クラスター分析システム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本件出願は２０１０年３月１９日出願の米国仮特許出願第６１／３１５，６２５号を基礎とする優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ラベルフリー統合的薬理学を用いる分子薬理学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは、刺激に対する細胞内の細胞応答を検出するためにラベルフリーバイオセンサーを使用するのが一般的である。得られたバイオセンサーシグナルは、細胞に作用する分子薬理学の複雑さを反映する統合的な応答であることが典型的である。従来、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイはある分子で刺激された細胞の反応速度論的応答を直接監視して、前記細胞に作用する当該分子の１次プロフィールをもたらす。代替的には、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは、あるマーカーで誘発された細胞内バイオセンサーシグナルへの前記分子の影響を調べるのにも用いられる場合があり、細胞内での前記マーカーが引き金となる経路に対する前記分子の２次プロフィールをもたらす。前記マーカーは、細胞内で再現可能なバイオセンサーシグナルの引き金となりうる既知分子をいう。
【０００４】
最近、われわれは分子を特徴づけるためのラベルフリー統合薬理学的アプローチを提唱した（特許文献１、出願日２００９年１１月２３日、Ｆａｎｇ、Ｙ．ら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”、特許文献２、出願日２００９年１１月２３日、Ｆａｎｇ、Ｙ．ら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｄｅｘ”）。本ラベルフリー統合薬理学的アプローチでは、ヒトの生理学及び病理生理学を代表する異なるタイプの細胞のパネルに対する薬剤候補分子の直接的な作用を監視することにより、該薬剤候補分子のシステム細胞薬理学を測定するためと、独立に、あるいは、集団として、マーカー分子のパネルを用いる刺激に対する各細胞のバイオセンサーシグナルを変調できる前記薬剤候補分子の能力を測定するためとに、ラベルフリーバイオセンサーが用いられる。ある細胞に対するある分子の直接的作用は当該細胞における１次プロフィールをもたらす一方、あるマーカーで誘発されるバイオセンサーシグナルに対する当該分子の変調が当該マーカー−細胞システムに関する２次プロフィールをもたらす。両方のタイプのプロフィールはリアルタイムの速度論的な細胞応答として記録されるのが一般的である。ある分子が存在しない条件での１次プロフィールを、マーカーのパネルが作用する多数の細胞にわたって当該分子が存在する条件での２次プロフィールと比較することは、これらのマーカーに対する当該分子の変調プロフィールのパネルをもたらす。例えば、プロフィールのパネルの全体又一部が組み合わされてあるインデックスを作成する場合がある。例えば、細胞のパネルに作用するある分子の全ての１次プロフィールの組合せは分子バイオセンサー１次インデックスとなり、対応する細胞に作用するマーカーのパネルに対するある分子の変調プロフィールの組合せは分子バイオセンサー変調インデックスとなり、分子バイオセンサー１次インデックスと分子バイオセンサー変調インデックスとの組合せが分子バイオセンサーインデックスとなる。前記分子インデックスを薬理学的に知られた変調剤のパネルの確立されたインデックスと比較することで、前記分子が介入する細胞受容体、標的又は経路を決定することが可能になる。
【０００５】
このラベルフリー統合薬理学的アプローチは、いずれかの分子の作用モード（例えば、標的、経路、作動作用、拮抗作用又は毒性）に関する情報を提供するだけでなく、これらの分子の活性と、選択性と、複合薬理学（ｐｏｌｙｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）及び表現型薬理学（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）を含むシステム細胞薬理学との測定を可能にする。ラベルフリー統合薬理学にとって決定的に重要なことは、分子バイオセンサーインデックス及び／又は分子バイオセンサー１次インデックス及び／又は分子バイオセンサー変調インデックスに基づいて、その薬理学が少なくとも部分的に知られた既知の参照分子と未知分子との類似度を効果的に測定する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願第１２／６２３，６９３号出願明細書、
【特許文献２】米国特許出願第１２／６２３，７０８号出願明細書、
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に開示されるのは、分子のいずれかのペア又はグループの間の類似度を測定するためのラベルフリー統合薬理学に関する効果的な方法である。類似度解析は、特定の細胞におけるか、特定のマーカーのパネルでかの分子バイオセンサーインデックス、分子バイオセンサー１次インデックス、分子バイオセンサー変調インデックス及び分子バイオセンサーインデックスを含む、異なるレベルで行われる場合がある。開示される方法は、いずれかの分子の複合薬理学、表現型薬理学及び機能的選択性を測定することを可能にする。
【０００８】
開示されるのは、ラベルフリー統合薬理学を用いて分子薬理学を同定する方法である。前記方法は、薬理学が少なくとも部分的には知られている既知参照分子と未知分子との類似度を測定して、該未知分子の薬理学を測定するためのクラスター分析の利用に関する。本明細書に開示されるのは、ある未知マーカーと参照分子とのバイオセンサーインデックスの類似度を比較するためにクラスターアルゴリズムを利用する方法である。好ましいクラスターアルゴリズム及び方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】いずれかの分子の薬理学を測定するための類似度解析に基づくクラスターアルゴリズムの手順。
【図１Ｂ】いずれかの分子の薬理学を測定するための類似度解析に基づくクラスターアルゴリズムの別の手順。
【図２Ａ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＵＴＰのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＵＴＰで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｂ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＡＴＰのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＡＴＰで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｃ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ブラジキニンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのブラジキニンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｄ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬アドレノメデュリンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのアドレノメデュリンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｅ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＳＰのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＳＰで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｆ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＳＬＩＧＫＶのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＳＬＩＧＫＶで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｇ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＳＦＬＬＲのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＳＦＬＬＲで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｈ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬Ｃ５ＡのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＣ５Ａで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｉ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＬＰＡのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＬＰＡで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｊ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ヒスタミンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのヒスタミンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｋ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ニコチン酸のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのニコチン酸で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｌ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬Ｒｏ６００１７５のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＲｏ６００１７５で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｍ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＰＧ−Ｅ２のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＰＧ−Ｅ２で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｎ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬カルシトニンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのカルシトニンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｏ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬Ａ６１６０３のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＡ６１６０３で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図２Ｐ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＧＲＦのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＧＲＦで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ａ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＣＧＲＰのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＣＧＲＰで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｂ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＬＹ３３４３７０のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＬＹ３３４３７０で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｃ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬アナダミドのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのアナダミドで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｄ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬オレキシンＡのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのオレキシンＡで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｅ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬Ｓ１ＰのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＳ１Ｐで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｆ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＶＩＰのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＶＩＰで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｇ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬アデノシンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのアデノシンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｈ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬（Ｒ）−（−）フェニレフリンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭの（Ｒ）−（−）フェニレフリンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｉ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＳＢ  ２０５６０７のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＳＢ  ２０５６０７で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｊ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＩＢ−ＭＥＣＡのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＩＢ−ＭＥＣＡで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｋ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬セクレチンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのセクレチンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｌ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＣＣＰＡのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＣＣＰＡで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｍ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＳＫＦ  ９７５４１のＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＳＫＦ  ９７５４１で刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｎ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ドーパミンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのドーパミンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｏ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬ＮＰＰＢのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのＮＰＰＢで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図３Ｐ】既知Ｇタンパク質共役受容体作動薬フォルスコリンのＡ４３１細胞中での代表的なＤＭＲ１次プロフィール。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴細胞培養適合マイクロプレート上に単層培養された。終夜饑餓処理後、休止期のＡ４３１細胞は１０μＭのフォルスコリンで刺激された。リアルタイム反応速度論応答が提示された。各グラフに示される作動薬はアッセイの再現性を示すために２回のレプリケートが使われた。各グラフに表される数字は前記３８４穴マイクロプレートのウェルの位置を示す。
【図４】１次ＤＭＲプロフィールに基づく、調べられたＡ４３１細胞における既知ＧＰＣＲ作動薬のパネルのクラスターを示すヒートマップ。全ての作動薬について、（表示される）各時点での（刺激された細胞単層を有するバイオセンサーの共鳴波長のシフトに関するピコメートル単位の）絶対応答値が類似度解析を行うために利用された。
【図５】１次ＤＭＲプロフィールに基づく、調べられたＡ４３１細胞における既知ＧＰＣＲ作動薬のパネルのクラスターを示すヒートマップ。全ての作動薬について、（表示される）予め定められた４つの時点での（刺激された細胞単層を有するバイオセンサーの共鳴波長のシフトに関するピコメートル単位の）絶対応答値が類似度解析を行うために利用された。
【図６】１５種類のマーカー及び４種類（詳細は本文を参照せよ。）のパネルに対する変調インデックスに基づく、既知の抗ヒスタミン薬レボカバスティンにと類似する化合物のクラスターを示すヒートマップ。
【図７Ａ】図７Ｅのクラスター分析に用いられた、休止期Ａ４３１細胞に作用するベータ２アドレナリン作動性受容体リガンドカテコールの１次ＤＭＲシグナルの反応速度論的パラメーター。
【図７Ｂ】図７Ｅのクラスター分析に用いられた、休止期Ａ４３１細胞に作用するベータ２アドレナリン作動性受容体リガンドドーパミンの１次ＤＭＲシグナルの反応速度論的パラメーター。
【図７Ｃ】図７Ｅのクラスター分析に用いられた、休止期Ａ４３１細胞に作用するベータ２アドレナリン作動性受容体リガンドノルエピネフリンの１次ＤＭＲシグナルの反応速度論的パラメーター。
【図７Ｄ】図７Ｅのクラスター分析に用いられた、休止期Ａ４３１細胞に作用するベータ２アドレナリン作動性受容体リガンド（−）−エピネフリンの１次ＤＭＲシグナルの反応速度論的パラメーター。
【図７Ｅ】図７Ａ−Ｄのベータ２アドレナリン作動性受容体リガンドの機能的選択性を測定するため、休止期Ａ４３１細胞に作用する前記リガンドのパネルのクラスターを示すヒートマップ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ａ．クラスター分析及びクラスター分析アルゴリズム
開示されるのは、ラベルフリー統合薬理学と、分子をクラスター分析するための１次元及び２次元クラスター分析アルゴリズムに基づくアプローチとに関する方法である。図１に示すとおり、本開示の方法は、例えば、分子バイオセンサー１次インデックスか、分子バイオセンサー変調インデックスか、これらの両方かのラベルフリーバイオセンサー細胞データを利用して、分子のクラスターを発生する２次元クラスター分析アルゴリズムを使用する場合がある。代表的なクラスター分析アルゴリズムは、階層的クラスター分析法、Ｋ−平均クラスター分析法、ＦＯＲＣＥクラスター分析法及びＭＣＬクラスター分析法を含むが、これらに限定されない。
【００１１】
クラスター分析は、統計学、コンピューター科学、生物学、社会科学又は心理学で応用される、探索的データ解析のための広く確立された技術である。本方法は、構造的な類似度の最初の印象を得るために多くの科学分野で経験的なデータに応用される。この目的のため、広範囲のデータタイプに普遍的に応用可能な効率的で使い易いツールを有することは非常に有利である。しかし、ラベルフリー細胞アッセイ及びラベルフリー統合薬理学的アッセイでのクラスター分析の応用は試みられたことがなく、本明細書に開示されるとおり、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ及びラベルフリー統合薬理学的アッセイの独特な局面には独特な形のクラスター分析がある。
【００１２】
クラスター分析は、データセット中の各非順序ペアについて類似度（又は距離）を測定し、類似度マトリックスを導くために、従来のペアワイズ類似度関数（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）用いて実行されることが一般的である。従来のペアワイズ類似度関数は、階層法及びｋ−平均法を含むが、これらに限定されない。階層法及びＫ−平均法は両方ともクラスター発現又は遺伝だに応用されてきた。階層法及びｋ−平均法のクラスターは、ノードの階層的グループか、ヒートマップかとして表示される場合がある。ＭＣＬ及びＦＯＲＣＥ法のような他の既知の方法も使用される場合がある。
【００１３】
Ｂ．方法
本明細書に開示される方法と、該方法に使用される場合がある組成物及び化合物とは、材料、物質、分子及びリガンドのような多数の異なるクラスから生じる場合がある。例えばＥＧＦＲ活性化のマーカーとしてのＥＧＦのように、マーカーとよばれる、ラベルフリーバイオセンサーアッセイに特有なこれらのクラスの特定のサブセットも開示される。
【００１４】
分子混合物のようなこれらのクラスの混合も、開示され、本開示の方法に使用される場合があると理解される。
【００１５】
一部の方法では、未知分子、参照分子、テスト分子、薬物候補分子が、既知分子とともに使用される場合がある。
【００１６】
一部の方法又は状況では、変調又は変調剤が役割を果たす。同様に、既知変調剤が使用される場合がある。
【００１７】
一部の方法及び組成物では、細胞が関与し、細胞は培養される場合があり、細胞培養よが本明細書に説明されるとおり利用される場合がある。
【００１８】
本明細書に開示される方法は、バイオセンサーを使用するアッセイを含む。一部のアッセイでは、これらは、作動作用又は拮抗作用モードのいずれかで実行される。しばしば、前記アッセイは、材料、物質又は分子のような１種類以上のクラスで細胞を処理することを伴う。本明細書に説明されるとおり、被検者が治療される場合もあることも理解される。
【００１９】
一部の方法では、分子と、例えば、細胞との間の接触が起こる場合がある。本開示の方法では、ＤＭＲ応答のようなバイオセンサー応答として現れる、細胞応答のような応答が検出される場合がある。これらその他の応答はアッセイされる場合がある。一部の方法では、バイオセンサー由来のシグナルは、ロバストなバイオセンサーシグナルか、ロバストなＤＭＲシグナルかの場合がある。
【００２０】
ラベルフリーバイオセンサーを使用する本開示の方法は、１次プロフィール、２次プロフィール及び変調プロフィールのような、プロフィールを生成する場合がある。これらのプロフィールその他は、例えば分子についての測定を行うために使用される場合があり、本明細書で説明されるいずれかのクラスとともに使用される場合がある。
【００２１】
本明細書に開示される分子、細胞、材料又は物質のような、化合物又は組成物のライブラリ及びパネルも開示される。マーカーパネル及び細胞パネルのようんば特別なパネルも開示される。
【００２２】
本開示の方法は、バイオセンサーシグナル、ＤＭＲシグナル、正規化、対照、陽性対照、変調比較、インデックス、バイオセンサーインデックス、ＤＭＲインデックス、分子バイオセンサーインデックス、分子ＤＭＲインデックス、分子インデックス、変調剤バイオセンサーインデックス、変調剤ＤＭＲインデックス、分子変調インデックス、既知変調剤バイオセンサーインデックス、既知変調剤ＤＭＲインデックス、マーカーバイオセンサーインデックス、マーカーＤＭＲインデックス、マーカーのバイオセンサーシグナルを変調すること、ＤＭＲシグナルを変調すること、強化すること、及び、インデックスの類似度のような、さまざまな局面を利用する場合がある。
【００２３】
本明細書に開示される、組成物、化合物又はその他のいずれかが、本明細書に開示されるいずれかの方法で特徴づけられる場合がある。
【００２４】
より高い、阻害する、その他これらに類する文言のような特徴づけに依存する方法が開示される。
【００２５】
一部の方法では、受容体又は細胞標的が使用される。一部の方法では、シグナル伝達経路と、分子で処理された細胞その他の細胞プロセスとについての情報を提供する場合がある。
【００２６】
一部の実施態様では、ある種の効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）又は有効性（ｅｆｆｉｃａｃｙ）が特徴となり、（例えば薬剤候補分子の）直接的作用がアッセイされる場合がある。
【００２７】
１．方法
ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは、経路バイアスはないが経路感受性があるやり方で生細胞又は全細胞の統合された読み取り値をしばしば提供する。結果として、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは、受容体生物学及び薬剤の薬理学の複雑さを反映することがしばしばある。ラベルフリーバイオセンサーが非特異的な性質であることと、細胞生物学の複雑さ（例えば、シグナル伝達要素の重複及びフィードバックループの補償）とを加えると、単一の標的に基づくラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは高率の偽陽性をもたらすのが典型的である。
【００２８】
２．具体的な実施態様
ａ）ラベルフリーバイオセンサーデータセットを得ること、ｂ）該データセットに基づいてクラスター分析を実行することを含む、ラベルフリーバイオセンサーデータセットの類似度を測定する方法が開示される。
【００２９】
前記クラスター分析は階層的クラスタリング法を実行することを含み、該階層的クラスタリング法は凝集型法を含み、前記階層的クラスタリング法は、観察のセット間の非類似度の尺度を含む分枝型法を含み、該非類似度の尺度は距離計測法及び連関基準法を含む、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物（ａｒｔｉｃｌｅ）のいずれかの組合せかで開示される。
【００３０】
前記距離測定は、ユークリッド距離法、平方ユークリッド距離法、都市ブロック距離法、マンハッタン距離法、ピアソン相関法、ピアソン相関絶対値法、非中心化（Ｕｎｃｅｎｔｅｒｅｄ）相関法、中心化相関法、スピアマン順位相関法、ケンダールタウ法、最大距離法、マハラノビス距離法又はコサイン類似度法を含む、方法が開示される。
【００３１】
前記データセットが分子の１次インデックス由来のデータを含むとき、前記距離計測法は絶対値を用いる非中心化相関を含み、前記データセットが分子変調インデックス由来のデータを含むとき、前記距離測定は、絶対値を用いる非中心化相関法か、絶対値を用いる中心化法かのいずれかを含み、前記距離計測法はユークリッド距離法を含み、前記連関基準法はペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）平均連関、ペアワイズ単一連関、ペアワイズ最大連関又はペアワイズ重心連関を含み、前記連関基準法は距離マトリックスを含むペアワイズ最大連関法を含み、前記距離マトリックスは該マトリックスの２行の間の距離からなり、前記行は前記距離マトリックスのノードを表す、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。。
【００３２】
密度パラメーター又は類似度閾値のような予め定義されたクラスタリング閾値をさらに含む方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００３３】
前記予め定義されたクラスタリング閾値はバイオセンサーパラメーターである、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００３４】
クラスター分析の実行が類似度マトリックスを生成し、前記ノードは前記バイオセンサーアッセイで使われる分子を含み、エッジ属性は前記分子に対する細胞応答のパラメーターか、変調インデックスのパラメーター（すなわち、あるマーカーに対する前記分子の変調率）かを含み、エッジ属性は選択され、多重ノード属性が選択され、前記ノードのあるサブセットだけが選択される、方法も、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００３５】
正規化又はデータ前処理をさらに含む方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００３６】
前記データ前処理ステップはデータのフィルタリングを含み、データセットが１次インデックス由来のデータを含むとき、前記データのフィルタリングは最大−最小差分計算を含み、前記最大−最小差分計算は刺激の１時間以内に少なくとも４０ピコメートルの最大−最小差分を有するデータポイントを選択し、前記データセットが変調インデックスを含むとき、前記データのフィルタリングを行うステップは、そのバイオセンサー変調インデックスが全マーカー又は特定のマーカーのセットに対して１５％以下の変調を含む分子を除去することを含み、前記クラスター分析は２次元クラスター分析を含み、クラスタリングアルゴリズムは、エッジ属性値を与えられるノードの階層的クラスタリングを生成するマトリックスのモードとともに最初に演算され、次に、前記マトリックスの属性とともに演算され、あるノードについての属性の階層的クラスタリングを生成し、前記クラスタリングアルゴリズムは前記マトリックスのエッジ属性とともに最初に演算され、次に、前記マトリックスのノードとともに演算される、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００３７】
ヒートマップを作成するステップをさらに含む方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物）のいずれかの組合せかで開示される。
【００３８】
前記ヒートマップはクラスター化されたマップを含み、該クラスター化されたマップはＨｅａｔＭａｐＶｉｅｗを含み、前記ヒートマップはＥｉｓｅｎのＴｒｅｅＶｉｅｗ又はＥｉｓｅｎのＫｎｎＶｉｅｗを含み、エッジ属性は、バイオセンサー応答の絶対値応答か、予め測定された反応速度論パラメーターか、変調率かを含み、前記方法はコンピューターで実行される方法であり、クラスター分析の結果を出力するステップをさらに含む方法も、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００３９】
ラベルフリーバイオセンサーデータセットを分析する方法であって、ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ること、及び、クラスター分析を実行することを含み、前記記録は、バイオセンサー応答を測定するバイオセンサーのデータと含み、前記クラスター分析の結果を出力することを含む、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００４０】
コンピュータで実行される方法であって、ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることは、保存媒体からラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることを含み、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることは、該記録をコンピュータシステムから受け取ることを含み、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることは、該記録をバイオセンサーシステムから受け取ることを含み、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることは、コンピュータネットワークを介して該ラベルフリーバイオセンサーデータセットの記録を受け取ることを含む、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せかで開示される。
【００４１】
１種類以上のコンピュータで読み取り可能な媒体に保存されるプログラムコードであって、１台又は２台以上のコンピュータシステムで実行される際に、本明細書に記載のいずれかの方法を前記コンピュータシステムに実行させる、プログラムコードが、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４２】
本明細書に記載のいずれかの方法を実行するために演算されるように適合される、コンピュータで使用可能なメモリが、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４３】
論理処理モジュールと、構成ファイル処理モジュールと、データ編制モジュールと、データ表示編制モジュールとを含む、コンピュータプログラムが、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４４】
コンピュータで読み取り可能なプログラムコードが具体化されたコンピュータで使用可能な媒体を含み、前記コンピュータで読み取り可能なプログラムコードは、本明細書に開示されるいずれかの方法のクラスター分析を生成する方法を実行するために演算されるように適合され、前記方法は、区別できるソフトウェアモジュールを含み、かつ、該区別できるソフトウェアモジュールは、論理処理モジュールと、構成ファイル処理モジュールと、データ編制モジュールと、データ表示モジュールとを含むシステムを提供することを含む、コンピュータプログラム製品が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４５】
方法を実行するために構成されるコンピュータ化されたシステムをさらに含み、前記クラスター分析の結果を出力することを含む、方法が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４６】
プログラムされたプロセッサ上で演算されるとき、前記方法のいずれかを実行する指令が保存された、コンピュータで読み取り可能な媒体が、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４７】
ラベルフリーバイオセンサーデータセットを保存可能なデータ保存器と、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットを受け取り、該ラベルフリーバイオセンサーデータセットを前記データ保存器に保存し、前記ラベルフリーバイオセンサーデータセットについてクラスター分析を実行し、該クラスター分析の結果を出力するようにプログラムされるか、適合される、１種類以上処理要素を含むシステムプロセッサとを含む、クラスター分析システムが、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４８】
バイオセンサーシステムからラベルフリーバイオセンサーデータを受け取り、コンピュータネットワークを介してラベルフリーバイオセンサーデータを受け取るシステムであって、バイオセンサーシステムをさらに含む、システムが、単独か、本明細書に記載のいずれかのステップ、機器又は品物のいずれかの組合せで開示される。
【００４９】
Ｃ．バイオセンサー及びバイオセンサー細胞アッセイ
ラベルフリー細胞利用アッセイは、分子で誘発される生細胞中の応答を監視するためにバイオセンサーを使うのが一般的である。前記分子は、天然又は合成の場合があり、精製又は未精製の混合物の場合がある。バイオセンサーは、光学的、電気的、熱量測定的、音響的、磁気的等のトランスデューサーのようなトランスデューサーを、前記バイオセンサーと接触する細胞内の分子識別事象か、分子で誘発される変化かを定量可能なシグナルに変換するために利用することが典型的である。これらのラベルフリーバイオセンサーは、分子相互作用解析又は細胞応答に使用される場合があるが、該分子相互作用解析は、いかに分子複合体が形成し、解離するかを経時的に特徴づけることを伴い、前記細胞応答はいかに細胞が刺激に応答するかを特徴づけることを伴う。本方法に適用可能なバイオセンサーは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び共鳴導波路回折格子（ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ、ＲＷＧ）バイオセンサーのような光学的バイオセンサーと、共鳴ミラーと、エリプソメーターと、バイオインピーダンスシステムのような電気的バイオセンサーと、これらのバイオセンサーの変形とを含む場合がある。
【００５０】
１．音響的バイオセンサー
水晶共振子のような音響バイオセンサーは、細胞応答を特徴づけるために音波を利用する。音波は圧電素子を使って発生及び受信されるのが一般的である。音響バイオセンサーは、共鳴型センサー構成で作動するように設計されることがしばしばある。典型的なセットアップでは、薄い水晶のディスクが２個の電極の間に挟まれる。電極間に交流シグナルを印加することにより、水晶の励起及び発振がもたらされ、該水晶が敏感な発振回路として作用する。出力センサーシグナルが共振周波数及び動抵抗（ｍｏｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である。バイオセンサー表面が剛体のとき、共鳴周波数は概して吸収される材料の全質量の線形関数である。液体環境の下では、音響センサー応答は結合分子の質量だけでなく、形成された分子複合体又は生細胞の粘弾性及び荷電の変化にも敏感である。前記水晶と結びついた細胞の共振周波数及び動抵抗を測定することにより、細胞接着及び細胞毒性を含む細胞の諸プロセスがリアルタイムで研究できる。
【００５１】
２．電気的バイオセンサー
電気的バイオセンサーは、細胞接着を含む細胞応答を特徴づけるためにインピーダンスを用いる。典型的なセットアップでは、生細胞は、統合型電極アレイが包埋されたバイオセンサー表面と接触させられる。定電圧高周波の小さい交流パルスが電極間に電場を発生させるために使われ、該電場が細胞の存在により妨げられる。電気パルスは統合型電気回路を用いてその場で（ｏｎｓｉｔｅ）発生され、前記回路を通る電流が経時的に追跡される。得られるインピーダンスは、細胞層の導電性の変化の尺度である。細胞の原形質膜は、細胞間又は細胞の下を電流が流れるように強いる絶縁体として作用し、インピーダンスのきわめてロバストな変化をもたらす。インピーダンスを利用する測定は、細胞接着及び伸展と、細胞の微小運動と、細胞の形態変化と、細胞死と、細胞のシグナル伝達とを含む、広範な細胞の事象を研究するために応用されてきた。
【００５２】
３．光学的バイオセンサー
光学的バイオセンサーは、細胞応答を特徴づけるために表面に結合する電磁波を主に利用する。前記表面に結合する波は、光で励起される表面プラズモン（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）を使う金基質上か、回折グレーティング共役導波モード（共鳴共鳴導波路回折格子、ＲＷＧ）を使う誘電性基質上かで達成できる。中間赤外ＳＰＲを含むＳＰＲについては、読み取り値は、反射光強度が最小となる共鳴角度である。同様に、光子結晶バイオセンサーを含むＲＷＧについては、読み取り値は最大インカップリング効率が達成される共鳴角又は波長である。前記共鳴角又は波長は、センサー表面又はその近傍での局所的屈折率の関数である。アッセイ用フローチャンネルの数がわずかに限られるＳＰＲと異なり、機器開発及びアッセイの最近の進歩のため、ＲＷＧバイオセンサーはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）及び細胞アッセイに向いている。典型的なＲＷＧでは、細胞は、屈折率の高い材料からなるバイオセンサーが包埋されたマイクロタイタープレートのウェルに直接配置される。屈折率の局所的変化が、刺激の際の生細胞の動的な質量再分配（ＤＭＲ）シグナル伝達をもたらす。これらのバイオセンサーは、受容体生物学、リガンド薬理学及び細胞接着を含む多様な細胞の諸プロセスを研究するために使用されてきた。
【００５３】
本発明は、コーニングＥｐｉｃ（登録商標）システムのような共鳴導波路回折格子バイオセンサーを使うのが好ましい。Ｅｐｉｃ（登録商標）システムは、商業的に入手可能な波長尋問（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）システム、角度尋問システム又は掃引波長画像化システム（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．社、ニューヨーク州、コーニング）を含む。前記商業的システムは、内蔵ロボット液体ハンドリングユニットか、外部のロボット液体補助システムかとともに、温度制御ユニットと、光学的検出ユニットとからなる。前記検出ユニットは、集積光ファイバー光学系を中心とし、約７又は１５秒の時間間隔で細胞応答の反応速度論的測定を可能にする。化合物溶液は、内蔵液体ハンドリングユニット又は外部液体補助システムのいずれかを用いることにより導入されたが、両方とも従来の液体ハンドリングシステムを利用する。高取得速度（ｈｉｇｈ  ａｃｑｕｉｓｉｔｏｎ）光学的バイオセンサーシステムとともに高解像度画像化システムを含む、異なるＲＷＧバイオセンサーも使用可能である。
【００５４】
４．ＳＰＲバイオセンサー及びシステム
ＳＰＲは、入射光の範囲をカバーして、導電性金属フィルム（例えば金）を貼った平らなガラス基質に偏光のくさびを導いて表面プラズモンを励起するためにプリズムに頼る。得られるエバネセント波は金層の自由電子雲と相互作用し、該自由電子雲に吸収されて、荷電密度波（すなわち、表面プラズモン）を発生させ、反射光の強度の低減を起こす。この強度が最小となる共鳴角は、前記金層のセンサー表面とは反対側の面の近傍の溶液の屈折率の関数である。
【００５５】
５．ＲＷＧバイオセンサー及びシステム
ＲＷＧバイオセンサーは、例えば、基質（例えばガラス）と、グレーティング又は周期的構造が包埋された薄い導波フィルムと、細胞層とを含む場合がある。前記ＲＷＧバイオセンサーは、回折格子による導波路への光の共振結合（ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を利用して、溶液―表面界面での完全な内部反射をもたらし、これが今度は前記界面で電磁場を生成する。この電磁場は、前記センサー表面から指数的に減衰するという意味で本来エバネッセントである。元の値の１／▲ｅの斜字体▼まで減衰する距離は、侵入深さ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｔｈ）として知られ、特定のＲＷＧバイオセンサーの設計の関数であるが、約２００ｎｍのオーダーであるのが典型的である。このタイプのバイオセンサーは、前記センサー表面又はその近傍での細胞層のリガンドで誘発される変化を特徴づけるために、かかるエバネッセント波を利用する。
【００５６】
ＲＷＧ装置は、角シフト測定を利用するシステムか、波長シフト測定を利用するシステムかに細分できる。波長シフト測定では、一定角度の入射波長の範囲をカバーする偏光が前記導波路を照射するために使われる。特定の波長の光が前記導波路に結合され、前記導波路にそって伝搬する。代替的に、角シフト機器では、前記センサーは単色光で照射され、該光が共振結合される角度が測定される。共振条件は、バイオセンサーの表面に直接接触する細胞層（例えば細胞のコンフルエント状態、接着及びステータス）に影響される。リガンド又は被分析物が生細胞中の細胞標的（例えばＣＫ２）と相互作用するとき、前記細胞層内の局所的屈折率のいかなる変化も共振角（又は波長）のシフトとして検出できる。
【００５７】
コーニング（登録商標）Ｅｐｉｃ（登録商標）システムは、ラベルフリー生化学又は細胞に基づくアッセイ用にＲＷＧバイオセンサーを使用する（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州、コーニング）。Ｅｐｉｃ（登録商標）システムは、ＲＷＧプレートリーダーと、ＳＢＳ（生体分子スクリーニング協会）標準マイクロタイタープレートとからなる。前記プレートリーダー内の検出器システムは、リガンドで誘発される細胞内変化の結果として入射光の波長のシフトを測定するために集積光ファイバー技術を利用する。一連の照射−検出ヘッドは直線状に配置されるので、反射スペクトルが３８４穴マイクロプレートの１つのコラムの各ウェルから同時に集光される。各センサーが複数回問いかけられるようにプレート全体がスキャンされ、各コラムが順次問いかけられる。入射光の波長が集められ、分析に用いられる。温度変動による入射波長の疑似シフトを最小にするために温度制御ユニットが前記装置に含まれる場合がある。測定された応答は、細胞集団の平均化された応答を表す。サンプル装架のような前記システムのさまざまな特徴が自動化でき、９６穴又は３８６穴マイクロタイタープレートのように多重化できる。液体処理は、装置内蔵の液体ハンドリング装置か、外部の液体ハンドリング補助装置かのいずれかによって実行される。具体的には、各ウェルの底に細胞が培養されている細胞アッセイプレートのウェルに分子溶液が直接添加又はピペット操作される。前記細胞アッセイプレートは、前記細胞を覆う一定体積のアッセイバッファー溶液を含む。一定回数ピペットを上下することによる単純な混合ステップも、前記分子添加ステップに取り込まれる場合がある。
【００５８】
６．電気的バイオセンサー及びシステム
電気的バイオセンサーは、基質（例えばプラスチック）と、電極と、細胞層とからなる。この電気的検出法では、基質上にアレイ配置された小さな金電極の上に細胞が培養され、システムの電気インピーダンスが経時的に追跡される。インピーダンスは前記細胞層の導電性の変化の尺度である。典型的には、一定周波数又は変動する周波数での低い一定電圧が電極又は電極アレイに印加され、回路を流れる電流が経時的に監視される。リガンドで誘発される電流の変化が細胞応答の尺度を提供する。前記細胞感知用インピーダンス測定は、１９８４年に初めて実現した。その時以来、インピーダンスに基づく測定は、細胞の接着及び伸展、細胞の微細運動、細胞の形態変化及び細胞死を含む、広範な細胞事象を研究するために応用されてきた。古典的なインピーダンスシステムは、小さい検出電極と大きな参照電極との使用によるアッセイのばらつきの高さの問題がある。このばらつきを解消するために、ＣｅｌｌＫｅｙシステム（ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、カリフォルニア州、南サンフランシスコ）及びＲＴ−ＣＥＳ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンジエゴ）のような最新世代のシステムは、微小電極アレイを有する集積回路を利用する。
【００５９】
７．高空間分解能バイオセンサー画像システム
ＳＰＲ画像システム、エリプソメトリ画像システム及びＲＷＧ画像システムを含む光学的バイオセンサー画像システムは、高い空間分解能を提供し、本開示の実施態様に使用される場合がある。例えばＳＰＲイメージャー（登録商標）ＩＩ（ＧＷＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は、プリズム結合ＳＰＲを利用し、固定された入射角でのＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラで反射光を集光する。。表面での変化は反射率の変化として記録される。したがって、ＳＰＲ画像は、アレイの全てのエレメントについての測定値を同時に回収する。
【００６０】
ＲＷＧバイオセンサーを利用する画像に基づく用途のための掃引波長光学尋問システム（ｓｗｅｐｔ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が利用される場合がある。本システムでは、高速可変波長レーザー光源が、マイクロプレート形式のＲＷＧバイオセンサーのセンサー又はアレイを照射するのに用いられる。センサーのスペクトルは、レーザー波長がスキャニングされる際に前記センサーから反射した光量（ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｏｗｅｒ）を時間の関数として検出することによって構築でき、コンピューターによる共振波長尋問測定モデルを用いるデータの解析は、不動化された受容体又は細胞の層を有するバイオセンサーの空間的分解能がある画像の構築をもたらす。画像センサーの使用は、画像に基づく尋問スキームに自然に導く。２次元ラベルフリー画像は、可動パーツなしで得ることができる。
【００６１】
代替的には、横断磁気又は▲ｐの斜字体▼−偏光ＴＭ０モードを用いる角尋問システムも利用できる。本システムは、それぞれが約２００μｍ×３０００μｍ又は２００μｍ×２０００μｍの寸法のＲＷＧセンサーを照射する、光束アレイを発生させるローンチシステムと、これらのセンサーから反射した光束の角度変化を記録するためのＣＣＤカメラを利用する受光システムとからなる。アレイ状の光束は、回折光学レンズと併用する光束分割器によって得られる。本システムは、（７×７穴センサーアレイ状の）最大４９個のセンサーの３秒毎の同時サンプリングか、最大３８４穴マイクロプレート全体の１０秒毎の同時サンプリングかを可能にする。
【００６２】
代替的には、走査波長尋問システムも利用できる。本システムでは、角度一定の入射波長の範囲をカバーする偏光が、導波グレーティングバイオセンサーを照射及び走査するために利用され、場所ごとの反射光は同時に記録できる。スキャニングを通じてバイオセンサー全体の高分解能画像も達成できる。
【００６３】
８．生細胞における動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナル
細胞標的を通じた刺激への細胞応答は、下流シグナル伝達ネットワークの空間的及び時間的動態によってコード化される場合がある。この理由のため、細胞シグナル伝達の統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）をリアルタイムで監視することが、細胞生物学及び生理学を理解するうえで有用な生理学的に関係のある情報を提供できる。
【００６４】
共鳴導波路回折格子（ＲＷＧ）バイオセンサーを含む光学的バイオセンサーは、細胞の物質の動的再分配に関係する統合された細胞応答を検出でき、細胞シグナル伝達を研究するための非侵襲的手段を提供する。全ての光学的バイオセンサーは、前記センサー表面又はその近傍の局所的屈折率の変化を測定できる点で共通する。ほとんど全ての光学的バイオセンサーはリガンドで誘発される細胞内変化を特徴づけるためにエバネッセント波を利用できるので、原理的に細胞感知に応用可能である。エバネッセント波は液体−表面界面での全内部反射によって発生する電磁場であり、侵入深さ又は検知体積として知られる特徴的な深さの前記溶液内に短距離（約数百ナノメートル）延びるのが典型的である。
【００６５】
最近、リガンド刺激に応答する生細胞内で測定される光学的シグナルのパラメーター及び特性を説明する理論的数学的モデルが開発された。これらのモデルは、既知の細胞生物物理学を組み合わせた３層導波システムに基づき、前記リガンドで誘発される光学的シグナルを受容体を介して媒介される特異的な細胞プロセスにリンクする。
【００６６】
バイオセンサーは入射光により照射される領域に位置する細胞の平均的応答を測定するので、最適なアッセイ結果を達成するために高度にコンフルエントな細胞層が用いられる場合がある。高解像度ラベルフリー画像化システムのためには、コンフルエントの程度が低い細胞が用いられる場合がある。代替的には、濃度を変化できる細胞の懸濁液も使用可能である。バイオセンサーの短い侵入深さと比較して細胞の寸法が大きいため、センサーの配置は、基質と、グレーティング構造を有する導波フィルムと、細胞層という従来にない３層システムであると考えられる。したがって、リガンドで誘発される有効な屈折率の変化（すなわち、検出されるシグナル）は、一次的には、前記細胞層の底部の屈折率の変化に直接比例する場合がある。
【００６７】
2013522800.tif 000003
Ｓ（Ｃ）は細胞層への感度で、Δｎｃはバイオセンサーによって感知される前記細胞層の局所屈折率のリガンドで誘発される変化である。細胞内の特定の体積の屈折率はタンパク質のような生物分子の濃度によってだいたい決定されるため、Δｎｃは前記感知体積内の細胞標的又は分子集合体の局所濃度のリガンドで誘発される変化に直接比例する場合がある。前記センサー表面から延びるエバネッセント波の指数的に減衰する特性を考慮すると、前記リガンドで誘発される光学的シグナルは以下の式で規定される。
【００６８】
2013522800.tif 000004
ここで、ΔＺｃは細胞層への侵入深さで、αは特異屈折率増分（タンパク質について約０．１８／ｍＬ／ｇ）で、ｚｉは質量再分配が発生する距離で、ｄは細胞層内のスライスの想像上の厚さである。ここで前記細胞層は垂直方向に等間隔のスライスに分割される。上記の式は、リガンドで誘発される光学的シグナルはセンサー表面からある距離の場所で発生する質量再分配の総和で、それぞれの質量再分配の応答全体への寄与は不平等であることを示す。さらに、波長又は角シフトの単位でみると検出されるシグナルは前記センサー表面に垂直に発生する質量再分配に主に敏感である。その動的な性質のため、前記シグナルは、動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナルともよばれる。
【００６９】
９．細胞及びバイオセンサー
細胞は受け取った情報を加工し、コード化し、統合するために複数の細胞経路又はメカニズムに依存する。タンパク質標的への被分析物の結合を特異的に測定する光学的バイオセンサーを用いる親和性解析とは異なり、生細胞ははるかに複雑で動的である。
【００７０】
細胞シグナル伝達を研究するために、細胞はバイオセンサーの表面と接触させられる場合があるが、これは細胞培養を通じて達成できる。これらの培養細胞は、接着斑、クロースコンタクト（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｔａｃｔ）及び細胞外マトリクスコンタクトという、それぞれの表面からの距離が独特で特徴的な、３つのタイプのコンタクトを通じてバイオセンサー上に付着できる。その結果、細胞の基底膜は前記表面から約１０−１００ｎｍ離れているのが一般的である。懸濁細胞では、細胞は細胞表面受容体の共有結合か、細胞膜受容体の特異的結合か、重力による単なる沈降かのいずれかを通じてバイオセンサー表面と接触できる。この理由でバイオセンサーは細胞の底の部分を感知できる。
【００７１】
多くの場合、細胞は表面に依存する接着及び増殖を示す。ロバストな細胞アッセイを達成するために、バイオセンサー表面は細胞接着及び増殖を増強するためのコーティングを必要とする場合がある。しかし、表面特性は細胞生物学的性質に直接的な影響を与える場合がある。例えば、表面に結合したリガンドは細胞の応答に影響を与えることができるし、該細胞によって加えられる力の下で如何に変形するかを決定する、基質材料の機械的コンプライアンスも細胞の応答に影響を与えることができる。培養条件（時間、血清濃度、コンフルエント状態等）が違うため、得られる細胞のステータスは、ある表面を別の表面から、そして、ある条件を別の条件から区別できる。したがって、細胞のステータスを制御する特別な努力が、バイオセンサーを利用する細胞アッセイを開発するために必要な場合がある。
【００７２】
細胞は、比較的大きい寸法―典型的には数十マイクロメートルの範囲の寸法を有する動的な物体である。顕微鏡微速度撮影と、ナノメートルレベルの生体インピーダンス測定とにより組織培養で観察されるとおり、刺激なしでも、細胞は微小運動（ｍｉｃｒｏｍｏｔｉｏｎ）―動的な動き及び細胞構造のリモデリングを常に行っている。
【００７３】
無刺激条件下で、ＲＷＧバイオセンサーを用いて調べられるとおり、細胞はほとんど差し引きゼロのＤＭＲ応答を発生するのが一般的である。これは、レーザースポットのサイズが大きいことと、結合光の伝搬距離が長いことから決定されるとおり、光学的バイオセンサーの空間分離能が低いのが一因である。レーザースポットのサイズは調べられる領域のサイズを決定し、通常一度にたった１カ所の分析ポイントだけが追跡できる。したがって、バイオセンサーは、光が入射する領域に位置する細胞の大集団の平均化された応答を測定するのが典型的である。細胞は単細胞レベルで微小運動を行うが、前記細胞の大集団は、平均差し引きゼロのＤＭＲ応答を発生する。さらに、細胞内高分子は高度に編制され、哺乳類細胞内の適切な部位に空間的に限定される。細胞の表面及び内部のタンパク質の局在の緊密な制御は特異的な細胞機能及び応答を決定するが、それは、細胞がタンパク質の特異性及び効率を調節し、タンパク質とその適切なパートナーとの相互作用の活性化及び脱活性化のメカニズムを空間的に分離することを前記局在が可能にするためである。この制御のため、無刺激条件下では、感知する体積内の細胞の局所的質量密度は平衡状態に到達でき、差し引きゼロの光学的応答につながる。一貫性のある光学的応答を達成するために、調べられる細胞は、たいていの細胞が１回の分裂を終了したばかりとなるような期間、従来技術の培養条件下で培養される場合がある。
【００７４】
生細胞は、外部シグナルを感知し応答する精妙な能力がある。細胞のシグナル伝達は、環境からの合図が単一のはっきりとした応答をもたらす直線的な連鎖反応の引き金を引く、直線状の経路で機能すると以前は考えられていた。しかし、外部刺激に対する細胞応答ははるかに複雑であることを研究が証明した。細胞が受け取る情報は、処理されて、リン酸化とシグナル伝達タンパク質の局所形態学的（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）再配置との複雑な時間的空間的パターンにコード化できることが明らかになっている。タンパク質の適切な部位への空間的時間的なターゲッティングは、タンパク質―タンパク質相互作用の特異性及び効率を調節して、細胞のシグナル伝達及び応答のタイミング及び程度を指図するうえで決定的な場合がある。細胞骨格の再編制、細胞周期チェックポイント及びアポトーシスのような極めて重要な細胞の決定は、活性化されたシグナル伝達因子の正確な時間的制御及び相対的な空間分配に左右される。したがって、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のような細胞標的を通じて媒介される細胞のシグナル伝達は、秩序立って調節されたやり方で進行するのが典型的で、その多くが細胞の局所的質量密度の変化又は局所的な細胞物質の再分配につながる、一連の空間的時間的事象からなる。これらの変化又は再分配は、感知する体積内で起こるとき、光学的バイオセンサーを使ってリアルタイムで直接追跡できる。
【００７５】
１０．ＤＭＲシグナルは生細胞の生理的応答である
受容体の生物学研究の従来の薬理学的アプローチとの比較を通じて、細胞システムで発現する受容体にリガンドが特異的なとき、リガンドで誘発されるＤＭＲシグナルは、受容体に特異的で、用量依存性があり、飽和可能である。大多数のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）リガンドについて、（ＥＣ５０値で測定される）有効性は、従来の方法を利用して測定される有効性とほとんど同じであることがわかっている。また、脱感作及び再感作は全てのＧＰＣＲｓに共通なので、ＤＭＲシグナルは予想される脱感作パターンを示す。さらに、ＤＭＲシグナルは、従来技術を用いて得られるのと同様にＧＰＣＲリガンドの忠実性も保持する。また、バイオセンサーは、完全アゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、拮抗物質及びアロステリック変調剤を区別できる。これらを合わせると、これらの成果はＤＭＲが生細胞の生理学的応答を監視できることを示す。
【００７６】
１１．ＤＭＲシグナルは、生細胞中のリガンド−受容体のペアのシステム細胞生物学的情報を含む
リガンドで細胞を刺激することは、一連の空間的時間的な事象をもたらすが、その非限定的な例は、リガンド結合、受容体活性化、タンパク質動員、受容体の細胞内移行及びリサイクリング、セコンドメッセンジャー変動、細胞骨格再構成、遺伝子発現及び細胞接着の変化を含む。細胞の事象のそれぞれは独自の特徴（例えば、反応速度論、持続期間、振幅、質量運動）があり、バイオセンサーは感知する体積内での質量の再分配を伴う細胞の事象に主に敏感であり、これらの細胞の事象は全体的なＤＭＲシグナルに異なる形で寄与できる。近年、特定の細胞シグナル伝達コンポーネントへの介入に化学物質を直接利用する化学的生物学が、生物学的な疑問に答えるために用いられてきた。細胞標的の多くの異なるタイプの活性を特異的に制御する非常に多数の変調剤が同定されたのでこれが可能になった。このアプローチは、上皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体と、Ｇｑ−及びＧｓ−共役型受容体とを含む、受容体を介在するシグナル伝達及びネットワーク相互作用をマップするために適合された。
【００７７】
ＥＧＦＲは、受容体チロシンキナーゼのファミリーに属する。ＥＧＦはＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲの内在性タンパク質−チロシンキナーゼ活性を刺激し、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びＪＮＫ経路が主に関与するシグナル伝達カスケードを開始する。ＥＧＦ刺激の際、ＥＧＦＲを内因的に過剰発現する細胞株である、Ａ４３１細胞において質量再分配をもたらす多くの事象がある。ＥＧＦＲシグナル伝達は細胞のステータスに依存することが知られている。その結果、ＥＧＦで誘発されるＤＭＲシグナルも細胞のステータスに依存する。０．１％ウシ胎仔血清中で２０時間培養して得られる休止期細胞ではＥＧＦ刺激は、（i）シグナル伝達が増大する陽性相（Ｐ−ＤＭＲ）と、（ii）移行相と、（iii）崩壊相（Ｎ−ＤＭＲ）という、区別でき順に起こる３種類の相があるＤＭＲシグナルをもたらす。化学的生物学及び細胞生物学の研究は、ＥＧＦで誘発されるＤＭＲシグナルが、主にＲａｓ／ＭＡＰＫ経路とリンクし、該経路がＭＥＫを介して進行し、細胞の脱離につながることを示す。２本の証拠が、Ｐ−ＤＭＲは主に細胞表面での活性化された受容体に細胞内標的が動員されるためであることを示す。第１に、ダイナミン又はクラスリン活性のいずれかの遮断はＰ−ＤＭＲ事象の振幅にはほとんど影響がない。ダイナミン及びクラスリンという２種類のＥＧＦＲ活性化の下流コンポーネントは、ＥＧＦＲの細胞内移行及びシグナル伝達に決定的な役割を果たす。第２に、ＭＥＫ活性の遮断は、前記Ｐ−ＤＭＲ事象を部分的に減弱させる。ＭＥＫはＭＡＰＫ経路の重要なコンポーネントで、最初に細胞質から細胞膜に移動し、ＥＧＦ刺激後に受容体とともに細胞膜に細胞内に移行する。
【００７８】
これに対して、ＥＧＦのＮ−ＤＭＲ事象は細胞の脱離及び受容体の細胞内移行のためである。蛍光画像は、ＥＧＦ刺激が顕著な数の受容体が細胞内に移行して細胞の脱離をもたらすことを示す。受容体の細胞内移行か、ＭＥＫ活性かの遮断が細胞の脱離を阻止し、受容体の細胞内移行はダイナミン及びクラスリンの両方が必要であることが知られている。これは、ダイナミン又はクラスリンの活性のいずれかの遮断が、受容体の細胞内移行と細胞の脱離との両方を阻害するはずの一方、ＭＥＫ活性の遮断は細胞の脱離は阻害するが受容体の細胞内移行は阻害しないはずであることを示す。予想どおり、ダイナミン又はクラスリンの阻害剤のいずれかでＥＧＦで誘発されるＮ−ＤＭＲは完全に阻害される（約１００％）一方、ＭＥＫ阻害剤は部分的にしかＮ−ＤＭＲを低減しない（約８０％）。蛍光画像は、ダイナミン活性の遮断は受容体の細胞内移行を損なうが、ＭＥＫ活性の遮断は損なわないことも確認する。
【００７９】
１２．ＤＭＲシグナルは、生細胞で作用するリガンドのシステム細胞薬理学的情報を含む
ＤＭＲシグナルは、細胞内底部の細胞物質の動的再分配を伴う多くの細胞事象の寄与からなる統合された細胞応答なので、ＤＭＲシグナルのようなリガンドで誘発されるバイオセンサーシグナルは、システム細胞薬理学的情報を含む。ＧＰＣＲｓは細胞内で手の込んだ挙動をみせ、多くのリガンドが、細胞メカニズムの特定の部分に有利な操作的バイアスを誘導し、経路的にバイアスのある（ｐａｔｈｗａｙ−ｂｉａｓｅｄ）有効性を示すことができる。したがって、受容体下流の細胞事象が如何に測定され、リガンド薬理学のための読み取りとして利用されるかに依存して、１つのリガンドが多数の有効性を有する場合がある可能性は高い。実際には従来技術の細胞アッセイがＧＰＣＲリガンドのシグナル伝達能力を体系的に表すことは困難であるが、それは、前記従来技術の細胞アッセイはたいていが経路的にバイアスがあり、たった１つのシグナル伝達事象しかアッセイしないからである。しかし、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは細胞シグナル伝達の事前の知識を必要とせず、経路的にバイアスがなく、経路に敏感（ｐａｔｈｗａｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）なため、これらのバイオセンサー細胞アッセイはリガンド選択的なシグナル伝達と、いずれかのリガンドのシステム細胞薬理学とを研究するのにも適している。
【００８０】
１３．バイオセンサーパラメーター
ＲＷＧバイオセンサー又はバイオインピーダンスバイオセンサーのようなラベルフリーバイオセンサーは、リガンドで誘発された細胞応答をリアルタイムで追跡できる。被侵襲的で操作不要なバイオセンサー細胞アッセイは、細胞のシグナル伝達の事前の知識を必要としない。得られるバイオセンサーシグナルは、受容体シグナル伝達及びリガンド薬理学に関する高度な情報を含む。多数のパラメーターが刺激に際しての細胞の反応速度論的なバイオセンサー応答から抽出できる。これらのパラメーターは、全体的な動態（例えば、形状、振動パターン及び持続期間）、位相、シグナル振幅と、ある位相から別の位相への移行時間と、各位相の反応速度論とを含む反応速度論的パラメーターを含むが、これらに限定されない（Ｆａｎｇ，  Ｙ．及びＦｅｒｒｉｅ，  Ａ．Ｍ．  （２００８）  “ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  β２  ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”．    ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．    ５８２，  ５５８−５６４；  Ｆａｎｇ，  Ｙ．ら、（２００５）  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌａｂｅｌ  ｆｒｅｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”．    Ａｎａｌ．    Ｃｈｅｍ．，  ７７，  ５７２０−５７２５；  Ｆａｎｇ，  Ｙ．ら、（２００６）  “Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ”．    Ｂｉｏｐｈｙｓ．    Ｊ．，  ９１，  １９２５−１９４０を参照せよ）。
【００８１】
クラスター分析又は類似度分析のためには、ノード（すなわち分子）ごとのエッジ属性（すなわち、バイオセンサー細胞応答データ）は異なる場合がある。例えば、細胞内のある分子のプロフィール（１次、２次）について、エッジ属性は、特異的反応速度論的パラメーター（例えば、あるＤＭＲシグナル中のＤＭＲ事象の振幅又は反応速度論）か、刺激後ある時点でのバイオセンサーシグナルの実際の値か、刺激後の複数の時点又は全ての時点でのバイオセンサーシグナルの実際の値かの場合がある。ある分子のバイオセンサー２次プロフィールについて、あるエッジ属性は、それぞれのマーカーの１次プロフィールに対して正規化された後の特異的マーカーに対する、バイオセンサーシグナル出力パラメーターの変調率の場合もある。その結果、集合的なエッジ属性は、あるノード分子のラベルフリー薬理学を表示するための有効な手段で、本開示の方法に基づいて既知分子と前記分子との類似度が比較され、測定できる。
【００８２】
Ｄ．定義
開示されるさまざまな実施態様は、図面があればこれを参照して詳細に説明されるであろう。さまざまな実施態様への言及は開示の範囲を限定せず、該開示の範囲は本明細書に添付される特許請求の範囲のみにより限定される。さらに、本明細書に列挙されるいかなる実施例も、限定的であることを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載の発明について多くの可能な実施態様の一部を列挙するにすぎない。
【００８３】
１．Ａ（冠詞）
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるところの、単数形の“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”及びこれらに類する用語は、文脈が明確にそうでないと指示するのでない限り、複数形を含む。したがって例えば、“ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ（医薬品担体）”への言及は、かかる担体の２種類または３種類以上の混合物等を含む。
【００８４】
２．省略形
当業者に周知の省略形が使用される場合がある（例えば、単数又は複数の時間について“ｈ”又は“ｈｒ”、単数又は複数のグラムについて“ｇ”又は“ｇｍ”、ミリリットルについて“ｍＬ”、室温について“ｒｔ”、ナノメートルについて“ｎｍ”、モルについて“Ｍ”、その他これらに類する省略形）
３．Ａｂｏｕｔ（約）
例えば、開示される実施態様を説明する際に用いられる、組成物中の成分の量、濃度、体積、処理温度、処理時間、収率、流速、圧力等の数値と、これらの範囲とを修飾する約（Ａｂｏｕｔ）の語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物又は使用処方を作るための典型的な測定及び取り扱い手順と、これらの手順での故意でないエラーと、本方法を実行するために使用される出発材料又は成分の製法、出所又は純度の違いと、これらに類する検討とを通じて発生しうる数量変動を意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度又は混合を有する組成物又は処方のエージングのために異なる量と、特定の初期濃度又は混合を有する組成物又は処方を混合又は処理するために異なる量とをも含む。約という用語で修飾されるか否かに関わらず、本明細書に添付される特許請求の範囲は、これらの量の均等物を含む。
【００８５】
４．アッセイすること（Ａｓｓａｙｉｎｇ）
アッセイすること、アッセイ、その他これらに類する用語は、例えば分子又は細胞のような物の特性、例えば、有無、量、程度、反応速度論、動態か、リガンド又はマーカーのような１種類以上の外部刺激を用いる刺激に対する細胞の光学的又は生体インピーダンス応答のタイプかを測定するための分析を指す。ある刺激に対する細胞の応答のバイオセンサーシグナルを作成することはアッセイの場合がある。
【００８６】
５．応答をアッセイすること（Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）
「応答をアッセイすること」、その他これに類する用語は、応答を特徴づけるための手段を使うことを意味する。例えば、ある分子がある細胞と接触される場合に、該分子に曝露された際の該細胞の応答をアッセイするためにバイオセンサーが使用されることがある。
【００８７】
６．アゴニズム及びアンタゴニズムモード
アゴニズムモード等の用語は、細胞がある分子に曝露されて該分子がＤＭＲシグナルのようなバイオセンサーシグナルの引き金を引く能力があるかどうかを測定するアッセイであるのに対し、アンタゴニズムモードは、ある分子の存在下であるマーカーに曝露されて、該分子が前記マーカーに対応する細胞のバイオセンサーシグナルを変調する能力があるかどうかを測定するアッセイである。
【００８８】
７．バイオセンサー
バイオセンサー又はこれに類する用語は、生物学的なコンポーネントを物理化学的検出器コンポーネントと組み合わせる被分析物の検出装置を指す。バイオセンサーは、（組織、微生物、病原体、細胞又はこれらの組合せのような）生物学的コンポーネント又はエレメントと、（光学的、圧電式、電気化学的、熱量測定式又は磁気的手法のような物理化学的手法で作動する）検出器エレメントと、両方のコンポーネントと関係する変換器という３つの部分からなるのが典型的である。前記生物学的コンポーネント又はエレメントは、例えば、生細胞、病原体又はこれらの組合せの場合がある。実施態様では、光学的バイオセンサーは、生細胞、病原体又はこれらの組合せにおける分子識別又は分子刺激事象を定量可能なシグナルに変換するための光学的変換器を含む場合がある。
【００８９】
８．バイオセンサー応答
「バイオセンサー応答」、「バイオセンサー出力シグナル」、「バイオセンサーシグナル」又はこれらに類する用語は、細胞を有するセンサーシステムの細胞応答に対するいずれかの反応である。バイオセンサーは、細胞応答を定量可能なセンサー応答に変換する。バイオセンサー応答は、ＲＷＧ又はＳＰＲのような光学的バイオセンサーによって測定される刺激の際の光学的応答であるか、電気的バイオセンサーによって測定される、刺激の際の細胞の生体インピーダンス応答である。バイオセンサー応答は、刺激の際の細胞応答に直接関連するため、バイオセンサー応答及び細胞応答は、開示される実施態様では相互に交換可能なように使用される場合がある。
【００９０】
９．バイオセンサーシグナル
「バイオセンサーシグナル」又はこれに類する用語は、刺激の際の応答によって発生し、バイオセンサーで測定される細胞のシグナルを指す。
【００９１】
１０．細胞
細胞又はこれに類する用語は、半透性膜で外側が結合された原形質の小さな、通常は、微視的な物質を指し、任意的に、１個又は２個以上の核と、さまざまな他のオルガネラとを含み、単独で、あるいは、他の同類の物質と相互作用しながら、生命の全ての基礎的機能を実行でき、かつ、合成細胞コンストラクト、細胞モデルシステムその他の人工細胞システムを含む独立して機能できる生物の最小構造単位を形成することができる。
【００９２】
細胞は、特定の疾患と関係する細胞、特定の起源由来の細胞タイプ、特異的標的と関係する細胞タイプ又は特定の生理学的機能と関係する細胞タイプのような、異なる細胞タイプを含む場合がある。細胞は、天然のままの細胞、加工された細胞、形質転換された細胞、不死化された細胞、初代細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、癌幹細胞又は幹細胞由来細胞の場合もある。少なくとも２つのタイプの細胞を含む細胞システムも用いられる場合がある。前記細胞システムは自然に形成される場合もあるし、共培養によって形成される場合もある。
【００９３】
ヒトは約２１０種類の既知の区別できる細胞タイプからなる。細胞がいかに調製されるか（例えば、加工されるか、形質転換されるか、不死化されるか、人体から新鮮に単離されるか）、及び、どこから細胞が得られるか（例えば、異なる年齢の人体又は異なる疾患ステージ等）を考慮すると、細胞タイプの数はほとんど無限である。
【００９４】
１１．細胞培養
「細胞培養」又は「細胞を培養すること」は、制御された条件下で原核細胞又は真核細胞のいずれかが増殖するプロセスを指す。「細胞培養」は、多細胞真核生物、特に、動物細胞由来の細胞を培養することだけでなく、複雑な組織及び器官を培養することも指す。
【００９５】
１２．細胞パネル
「細胞パネル」又はこれに類する用語は、少なくとも２つのタイプの細胞を含むパネルである。細胞は、本明細書に開示されるいかなるタイプ又は組合せであってもかまわない。
【００９６】
１３．細胞応答
「細胞応答」又はこれに類する用語は、刺激に対する細胞によるいずれかの反応である。
【００９７】
１４．細胞プロセス
細胞プロセス又はこれに類する用語は、細胞において、又は、細胞によって起こるプロセスである。細胞プロセスの例は、増殖、アポトーシス、ネクロシス、分化、細胞シグナル伝達、極性変化、遊走又は形質転換を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
１５．細胞標的
「細胞標的」又はこれに類する用語は、外部刺激でその活性が修飾される場合のあるタンパク質又は核酸のような生体高分子である。細胞標的は、酵素、キナーゼ、イオンチャンネル及び受容体のようなタンパク質であることが最も一般的である。
【００９９】
１６．クラスター
本明細書で用いられるところのクラスターは、事例を関連のあるグループ又はセットに分けるための変数を使う手段である。
【０１００】
１７．コンピュータ関連用語
入力を受け取り、保存し、データを操作し、出力を有用なフォーマットで提供するプログラム可能な機械である。
【０１０１】
１８．特徴づけること（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ）
特徴づけること又はこれに類する用語は、リガンド、分子、マーカー又は細胞のような物質について、該リガンド、分子、マーカー又は細胞のプロフィールを得ることのように、前記物質のいずれかの特性についての情報を収集することを指す。
【０１０２】
１９．含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、「含む」という語と、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”及び“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”のようなその変形とは、「含むが、限定されない」ことを意味し、例えば他の追加物、コンポーネント、整数又はステップを排除することを意図しない。
【０１０３】
２０．〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ  〜）
実施態様における「〜から実質的になる」とは、例えば、バイオセンサー表面上の表面組成物と、表面組成物、処方又は組成物を作成又は使用する方法と、本開示の品物（ａｒｔｉｃｌｅ）、機器又は装置とを指し、特許請求の範囲に掲げたコンポーネント又はステップと、さまざまに選択される、特定の反応剤、特定の添加物又は成分、特定の薬剤、特定の細胞又は細胞株、特定の表面修飾剤又は条件、特定のリガンド候補又はこれらに類する構造、材料又はプロセスのように、開示された組成物、品物、装置及び製造使用方法の基本的で新規な特性に実質的に影響のない、他のコンポーネント又はステップとを含む場合がある。開示されたコンポーネント又はステップの基本的特性に実質的に影響を与える場合があるか、本開示に望ましくない特徴を授与する場合がある事項は、例えば、細胞のバイオセンサー表面への親和性の低下と、刺激の細胞表面受容体又は細胞内細胞への異常な親和性と、リガンド候補又はこれに類する刺激への応答における変則的又は逆方向の細胞活性とを含む。
【０１０４】
２１．コンポーネント
開示された組成物を調製するために用いられるコンポーネントと、本明細書に開示される方法に使用される組成物とが開示される。これら及びその他の材料は本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されるとき、これらの分子のそれぞれさまざまな個別及び集団の組合せ及び順列は明示的に開示されない場合があっても、それぞれは具体的に企図され本明細書に説明されることが理解される。したがって、分子Ａ、Ｂ及びＣのクラスが、分子Ｄ、Ｅ及びＦのクラスとともに開示され、組合せ分子の実施例であるＡ−Ｄが開示される場合には、個別に列挙されない場合であっても、それぞれが個別的かつ集団的に企図された意味の組合せである、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆが開示されたと考えられる。同様に、いずれかのサブセット又は組合せも開示されたと考えられる。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループが開示されたと考えられるであろう。このコンセプトは、開示される組成物の製造使用方法におけるステップを含むが、限定されない、本件出願の全ての局面に適用される。したがって、実行可能なさまざまな追加のステップがある場合には、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の実施態様のいずれかの具体的な実施態様か、実施態様の組合せかとともに実行される場合がある。
【０１０５】
２２．接触させる（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）
接触させる又はこれに類する用語は、分子相互作用が、分子か、細胞か、マーカーか、少なくとも１種類の化合物又は組成物か、少なくとも２種類の組成物か、品物又は機械とこれらのいずれかとのような、少なくとも２つの事物（ｔｈｉｎｇ）の間で可能な場合に、分子相互作用が起こりうるように近傍に運ぶことを意味する。例えば、接触することは、混ぜたり触れたりするために近くにいるように、少なくとも２種類の組成物、分子、品物又は事物を接触させることを指す。例えば、組成物Ａの溶液と培養細胞Ｂとがあって、組成物Ａの溶液を培養細胞Ｂに注ぐことは、組成物Ａの溶液を培養細胞Ｂと接触させるであろう。細胞をリガンドに接触させることは、該細胞が該リガンドにアクセスできることを確実にするために前記リガンドを前記細胞に運ぶことであろう。
【０１０６】
本明細書に開示されるいかなるものも他のいずれかのものと接触させられる場合があることが理解される。例えば、細胞は、マーカー又は分子、バイオセンサー等と接触させられる場合がある。
【０１０７】
２３．化合物及び組成物
化合物及び組成物は本発明の技術分野における標準的な意味がある。分子、物質、マーカー、細胞又は試薬のような特定の指示対象（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）の用いられる場所がどこであれ、これらの指示対象を含む、これらの指示対象からなる、及び、これらの指示対象から実質的になる組成物が開示されることを理解すべきである。したがって、特定の指示対象としてマーカーが用いられるところでは、そのマーカーを含む組成物か、そのマーカーからなる組成物か、そのマーカーから実質的になる組成物かも開示されるであろうことが理解される。適切な場合には、特定の指示対象が示されるところでは、その指示対象の化合物も開示されるものと理解される。例えば、ＥＧＦのような具体的な生物学的材料が開示される場合には、化合物形状のＥＧＦも開示される。
【０１０８】
２４．対照
対照又は「対照レベル」又は「対照細胞」という用語その他これらに類する用語は、これによって変化が測定される基準として定義され、例えば、対照は実験に従属するのではなく、定義されたパラメーターのセットに従属する、あるいは、対照は処理前又は処理後のレベルに基づく。対照は、試験対象の実験作業と平行してか、試行の前又は後かに実験作業が進められるか、あるいは、対照は予め定められた標準かの場合がある。例えば対照は、被検者又は対象又は試薬等が、試される手順又は薬剤又は変数等が省略される点を除いて、平行する実験と同じように処理され、実験の効果を判定するうえで比較の基準として利用される、実験の結果を指す場合がある。したがって、対照は、手順、試薬又は変数等に関する効果を測定するために使用される場合がある。例えば、あるテスト分子のある細胞への効果が問題となる場合には、ａ）前記分子の存在下での前記細胞の特性を単に記録し、ｂ）ａ）を実行し、その後、活性があることが知られた対照分子か、活性がないことが知られた対照分子か、対照組成物（例えば、アッセイバッファー溶液（ビヒクル））かを添加した効果が記録され、その後、前記テスト分子の効果を前記対照と比較するかもしれない。ある種の状況では、いったん対照が実行されると、該対照が、対照実験が再度実行する必要がない基準として用いられる場合があり、別の状況では、比較されるとき毎に平行して対照実験が行われるべきである。
【０１０９】
２５．検出
検出又はこれに類する用語は、分子又はマーカーで誘発される細胞応答を発見又は感知して、感知された応答を異なる分子ごとに区別できる本開示の装置及び方法の能力を指す。
【０１１０】
２６．（薬物候補分子の）直接作用
「直接作用」又はこれに類する用語は、（薬物候補分子が）細胞に独立に作用する結果である。
【０１１１】
２７．ＤＭＲシグナル
「ＤＭＲシグナル」又はこれに類する用語は、刺激に対する細胞の応答によって発生し、光学的バイオセンサーで測定される、細胞のシグナルを指す。
【０１１２】
２８．ＤＭＲ応答
「ＤＭＲ応答」又はこれに類する用語は、光学的バイオセンサーを用いるバイオセンサー応答である。ＤＭＲは、動的質量再分配又は動的細胞物質再分配を指す。Ｐ−ＤＭＲは陽性ＤＭＲ応答であり、Ｎ−ＤＭＲは陰性ＤＭＲ応答で、ＲＰ−ＤＭＲは回復Ｐ−ＤＭＲ応答である。
【０１１３】
２９．薬物候補分子
薬物候補分子又はこれに類する用語は、薬物又はファーマコフォアとして機能できる能力についてテストされるテスト分子である。この分子はリード分子と考えられる場合がある。
【０１１４】
３０．有効性
有効性又はこれに類する用語は、理想的又は最適な条件下で所望のサイズの効果を起こす能力である。関連する概念である有効性から有効性を区別するのはこれらの条件である。有効性は現実の条件下での変化に関係する。有効性は、受容体占有率と、分子、細胞、組織又は全身レベルで応答を開始する能力との間の関係性である。
【０１１５】
３１．より高い、阻害これらに類する語
より高い、増大する、上昇する又は上昇又はこれらに類する用語か、これらの用語の変形かは、基底レベルから上に、すなわち、対照と比較して、増大することを指す。低い、より低い、減少させる。低減する又は減少又はこれらに類する用語か、これらの用語の変形かは、基底レベルより下に、例えば、対照と比較して、低減することを指す。例えば基底レベルは、アゴニスト又は拮抗物質のような分子の添加の前か、該分子の非存在下かでの正常なｉｎ  ｖｉｖｏのレベルである。阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）又は動詞ｉｎｈｉｂｉｔの諸語形又はこれらに類する用語は、減少又は抑制することを指す。
【０１１６】
３２．階層的クラスタリング
階層的クラスタリング法は、連関に基づいてクラスターの階層を構築することをめざすクラスター分析の方法である。
【０１１７】
階層的クラスタリングは、クラスターの階層を構築することをめざすクラスター分析の方法である（Ｈａｓｔｉｅ，  Ｔ．，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ｒ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．  （２００９）“１４．３．１２  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ”  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  （２ｎｄ  ｅｄ．）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．  ｐｐ．  ５２０−５２８と、当該文献に引用された文献とを参照せよ。）。階層的クラスタリングは、クラスターの数を予め設定する必要がない。階層的クラスタリングは、「ツリー」を構築するが、ツリーにおいて、葉のそれぞれは個々のデータ事項を表し、内部ノード又は分岐点はデータ事項のクラスターを表す。
【０１１８】
階層的クラスタリングの戦略は、凝集型及び分枝型という２つのタイプに該当することが一般的である。凝集型クラスタリングは「ボトムアップ」アプローチで、各観察はそれ自体のクラスターに始まり、階層を上昇するにつれてクラスターのペアが融合する。分枝型クラスタリングは、「トップダウン」アプローチで、全ての観察が単一のクラスターで始まり、階層を下降するにつれて分割が再帰的に実行される。（凝集型では）どのクラスターが組み合わされるか、あるいは、（分枝型では）どこであるクラスターが分離されるか、を決めるために、観察のセットの間での非類似度の尺度が必要である。階層的クラスタリングのたいていの方法では、これは、適切な距離計測法（観察のペアの間の距離を特定する）と、前記セットにおける観察のペアワイズな距離の関数としてセットの非類似度を特定する連関基準との利用により達成される。ある距離によると一部の要素はたがいに近い場合がああり、別の距離によると離れているので、適切な測定の選択はクラスターの形状に影響を与えるであろう。
【０１１９】
普及している距離計測法は、ユークリッド距離法、平方ユークリッド距離法、マンハッタン距離法、最大距離法、マハラノビス距離法及びコサイン類似度法を含む。ユークリッド距離法は、ラベルフリー統合薬理学の用途には最も好ましいことがわかっており、本会時の実験の実施例を通じて使用される。類似度及び非類似度は２つのノード間の２つの距離関数である。類似度及び非類似度は、ノードのエッジ属性間の距離に基づいて計測される。
【０１２０】
階層的クラスタリングは、より類似するノードがツリー内でより近く接続する可能性が高いような樹形図（二値ツリー）を構築する。階層的クラスタリングは、データ値間及びクラスター間のペアワイズな関係の感覚を得るためにデータを編成するために有用である。樹形図は連関基準を用いて生成される。連関は２つのグループ間の「近縁性」の尺度とされる。連関基準は、観察間のペアワイズ距離の関数として観察のセットの間の距離を測定する。４種類の異なるタイプの連関がある。階層的クラスタリングのような凝集型クラスタリング技術ではアルゴリズムに各ステップで、最も近縁の２つのグループが選択されて融合される。連関方法は、（１）ペアワイズ平均連関（すなわち、２つのグループの要素の全てのペアの間の平均距離）と、（２）ペアワイズ単一連関（すなわち、２つのグループの要素の全てのペアの間の最小距離）と、（３）ペアワイズ最大連関（すなわち、２つのグループの要素の全てのペアの間の最大距離）と、（４）ペアワイズ重心連関（すなわち、２つのグループの要素の全てのペアの重心の間の距離）とを含む。ペアワイズ最大連関がラベルフリー統合薬理学の用途には最も好ましいことがわかっている。
【０１２１】
階層的クラスタリングについては、クラスターを構築するために使われる距離マトリックスを計算するやり方が複数ある。典型的には距離は、マトリックス内の２本の行（通常ノードを表す）の間の距離を表す。用いられる距離計測法は以下を含むが、これらに限定されない。（１）値間の差の平方和の平方根として計算される２本の行の間の単純２次元ユークリッド距離である、ユークリッド距離法。（２）２本の行の値の間の差の絶対値の和である、都市ブロック距離法。（３）比較される２本の行の値のピアソン積率相関係数であるピアソン相関。この値は、２本の行の共分散をその標準偏差の積で除算することにより計算される。（４）ピアソン相関、絶対値。（３）で示される値と類似するが、２本の行の共分散の絶対値を用いる。（５）ゼロの周りの平方和を中心にする条件を含む標準的ピアソン相関である、非中心化相関。この計測法は、平方和を中心にする試みは行わない。（６）中心化相関、絶対値。（５）に示される値と類似するが、２本の行の共分散の絶対値用いる。（７）２本の行の間の相関のノンパラメトリックな尺度であるスピアマン相関（ρ）である、スピアマンの順位相関。（８）２本の行の間の相関係数（τ）を順位付けするケンダールタウ法。ラベルフリー統合薬理学用の距離計測法の選択は、データのタイプに依存することがわかっている。分子バイオセンサーインデックスに基づく類似度分析には、絶対値を用いる非中心化相関が好ましい。しかし、分子変調インデックスに基づく類似度分析には、絶対値を用いる非中心化相関と、絶対値を用いる中心化相関とが使用可能である。
【０１２２】
類似度分析は、類似度マトリックスを計算するために予め定義されたクラスタリング閾値（類似度閾値ともよばれる密度パラメーター）をさらに用いることができる。かかる閾値は、類似のオブジェクトと非類似のオブジェクトとの間の境界を定めるので、クラスター分析の密度を制御するために用いられる。高い（制限的な）値は、たいていのエッジを追加することをより高価にして、小さなクラスターが多数できるようにする。これに対し、より低い値は、エッジを追加することは安価だが、エッジを除去することは高価にして、大きなクラスターが少数できるようにする（より低い解像度を意味する）。ラベルフリー統合薬理学には、クラスタリングの閾値は可変でよく、（例えば、細胞タイプのレベル、特定の経路のレベル又は特定の標的のレベルでの）クラスタリングの所望の解像度に依存することがしばしばある。
【０１２３】
ラベルフリー統合薬理学について、データは階層的クラスタリングに利用可能な全ての数量的ノード及びエッジ属性のリストを含む。ノードはしばしば分子である。エッジ属性は、前記分子の応答を単独で表す（すなわち、細胞内の分子１次プロフィールについて特定の時刻▲ｉの斜字体▼での応答）か、マーカーに対する前記分子の変調率（すなわち、特定の濃度の前記分子により、Ｐ−ＤＭＲ又はＮ−ＤＭＲのようなマーカーバイオセンサー応答の変調率）を表すかのいずれかである。クラスタリングを実行するために、少なくとも１種類のエッジ属性か、１種類以上のノード属性かが選択されなければならない。あるエッジ属性が選択される場合には、得られるマトリックスは対角線に対して対称で、ノードが行及び列の両方にある。複数のノード属性が選択される場合には、前記属性は列を定義し、ノードは行であろう。ある種の状況下では、ネットワーク内のノードのサブセットだけをクラスター化することが望ましい場合がある。例えば、特定の作用モードを共有する分子を同定するためには、かかる作用モードを示すノードのサブセットだけが調べられる（図６の例を参照せよ）。
【０１２４】
ラベルフリー統合薬理学のアプローチについて、ある種の正規化又はデータ前処理が効果的なクラスタリングのために必要である。例えば、データのフィルタリングが必要な場合がある。分子バイオセンサー１次インデックスに基づく類似度分析について、効果的なデータのフィルタリング手段は、最大−最小差を用いることである（例えば、異なる時点の間での最大−最小差が刺激後１時間以内では４０ピコメートルを超えるＤＭＲシグナルの分子だけが類似度分析に供される）。これに対し、分子バイオセンサー変調インデックスに基づく類似度分析については、有効なデータのフィルタリング手段は、全てのマーカーか、マーカーの特定のセットかに対して１５％未満の変調を含むバイオセンサー変調インデックスの分子を無視することである。
【０１２５】
ラベルフリー統合薬理学のアプローチについて、２次元（ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｏｒ  ｔｗｏ−ｗａｙ）クラスター分析が好ましい。２次元クラスタリング、コクラスタリング又はバイクラスタリングは、ノード（すなわち、オブジェクト、分子）だけでなく、該ノードの特徴（すなわち、エッジ属性）もクラスタリングされる、すなわち、データがデータマトリックスに表される場合に行及び列が同時にクラスター化される。かかる分析は、属性及びのでの両方のクラスタリングを含む。かかる方法では、クラスタリングアルゴリズムは２回実行され、最初はノードを表すマトリックスの行と、属性を表す列とについて実行される。得られる樹形図は、属性の値が与えられたノードの階層的クラスタリングを提供する。２回目は、前記マトリックスが転置され、行が属性値を表す。これは属性をクラスター化する樹形図を提供する。ノードに基づく樹形図と属性に基づく樹形図との両方が視覚化できる。本開示の実施例に示されるとおり、第１のクラスタリングは分子を類似度及び非類似度の観点でクラスター化することを可能にする。第２のクラスタリングは、ラベルフリー統合薬理学的解析のタイプに依存して、異なる目的に役立つであろう。分子バイオセンサー１次インデックスに基づく分析について、このクラスタリングは、有効に分子をクラスタリングするのに必要な反応速度論パラメーターの最小数を同定すること、及び、反応速度論的応答（すなわち、細胞に作用する分子の初期応答に関与する経路に対する、後期応答に関与する経路）の調節メカニズムの研究を可能にする。分子バイオセンサー変調インデックスに基づく分析について、このクラスタリングは、ある分子の複合薬理学及び表現型薬理学の同定だけでなく、特定の細胞又は細胞のパネルに作用する異なるマーカーの間の経路の相互作用の研究をも可能にする。
【０１２６】
典型的には類似度分析は、相互に連結するか、あるいは、独立な分子のクラスターであって、分子のクラスターのそれぞれが類似の作用モード（すなわち薬理学）を共有する、分子のクラスターからなる樹形図をもたらす。クラスターはヒートマップとしても視覚化できる。ヒートマップは、２次元のマップ中の変数の値が色で表されるデータの図示である。非常に類似する発表形式はツリーマップである。ヒートマップはデータマトリックス内の値の２次元表示から始まった。正の値は赤色の四角で表され、負の値は緑色の四角で表される。大きい値はより濃い色の四角で表され、小さい値はより薄い色の四角で表される（図４、５、６及び７はその例である）。クラスター結果は、クラスタリングにしたがって、類似の値を互いに近くに配置するようにマトリックスの行及び列を並び替えることがしばしばある。遺伝子発現解析及びタンパク質ネットワーク解析のための類似度分析の結果は、ＨｅａｔＭａｐＶｉｅｗ（クラスター化されない）、ＥｉｓｅｎのＴｒｅｅＶｉｅｗ及びＥｉｓｅｎのＫｎｎＶｉｅｗを含む３つのタイプの人気のあるヒートマップ表示で示される。これらのヒートマップ表示のアプローチは、分子のクラスター及び関係をラベルフリー統合薬理学の観点で視覚化するために直接利用できる。遺伝子発現解析は、ノード（すなわち遺伝子）と、多数のノード属性（典型的には、異なる実験条件下での発現データ）との階層的クラスタリングの結果を示すことがしばしばある。ラベルフリー統合薬理学に基づくクラスタリングは、ノード（すなわち分子）と、多数のノード属性との階層的クラスタリングの結果も表示する。しかし、用いられるノード属性は分析のタイプに依存する。分子バイオセンサー１次インデックスに基づく類似度分析にとって、ノード属性は分子による細胞刺激後の多数の時点での分子バイオセンサーシグナルの実際の値である。代替的には、分子バイオセンサー１次インデックスに基づく機能的選択性分析にとって、ノード属性は、予め定められた反応速度論的パラメーター（例えば、振幅、Ｐ−ＤＭＲ及び／又はＮ−ＤＭＲ事象の反応速度論及び持続時間）の場合もある。これに反し、分子バイオセンサー変調インデックスに基づく類似度分析にとって、ノード属性は細胞内の各マーカーに対する分子の変調率の場合がある。変調率は、分子非存在下でのマーカーバイオセンサー応答に対して、分子存在下でのマーカーバイオセンサー応答を正規化することによって計算されることがしばしばある。かかる正規化は、（例えば、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ又はＲＰ−ＤＭＲのような）特定のバイオセンサー事象に基づくのであって、それぞれの事象の反応速度論に基づくのではないことがしばしばあるが、それは、分子の有効性（分子がある経路又は細胞プロセスについて作動薬又は活性化剤のとき）か、効力（分子がある経路又は細胞プロセスについて拮抗薬又は阻害剤のとく）かと関連するのはシグナル振幅であって、反応速度論ではないからである。
【０１２７】
今日までに開発されたヒートマップ表示アプローチのなかで、ＥｉｓｅｎのＴｒｅｅＶｉｅｗは最も汎用されるアプローチである。ここでは階層的クラスタリングの結果は通常、データ値の色でコード化された「ヒートマップ」と、クラスタリングに由来する樹形図とで表示される。代替的には、ｋ−平均クラスタリングが用いられるとき、結果はＥｉｓｅｎのＫｎｎＶｉｅｗで示される場合がある。
【０１２８】
３３．分子の存在下
「分子の存在下」又はこれに類する用語は、培養細胞に分子を接触又は曝露させることを指す。前記接触又は曝露は、刺激が細胞と接触される前又はその最中に起こる場合がある。
【０１２９】
３４．インデックス
インデックス又はこれに類する用語は、データのコレクションである。例えばインデックスは、１個又は２個以上の変調プロフィールを含むリスト、表、ファイル又はカタログの場合がある。指標は、データのいずれかの組合せから作成できることが理解される。例えばＤＭＲプロフィールは、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ及びＲＰ−ＤＭＲを有する場合がある。インデックスは、前記プロフィールが完成したデータか、前記Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、ＲＰ−ＤＭＲ又はこれらのうちのいずれかのポイントか、これら又はその他のデータの組合せかを用いて作成できる。インデックスはかかる情報のいずれかのコレクションである。典型的には、インデックスを比較するとき、前記インデックスは同種のデータ、すなわち、Ｐ−ＤＭＲに対しＰ−ＤＭＲである。
【０１３０】
ｉ．バイオセンサーインデックス
「バイオセンサーインデックス」又はこれに類する用語は、バイオセンサーデータのコレクションでできたインデックスである。バイオセンサーインデックスは、１次プロフィール又は２次プロフィールのようなバイオセンサープロフィールのコレクションの場合がある。前記インデックスはいずれかのタイプのデータを含む場合がある。例えば、プロフィールのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータポイントだけを含むか、Ｐ−ＤＭＲデータポイントの場合があるか、両方か、あるいは、インピーダンスデータポイントの場合があるかもしれない。プロフィール曲線と関連する全てのデータポイントの場合があるかもしれない。
【０１３１】
ｉｉ．ＤＭＲインデックス
「ＤＭＲインデックス」又はこれに類する用語は、ＤＭＲデータのコレクションでできたバイオセンサーインデックスである。
【０１３２】
３５．Ｋ−平均
Ｋ−平均クラスタリングは、データをｋ個の重複しなクラスターに分割する分配アルゴリズムであり、ここでｋは入力パラメーターで、かつ、クラスターの数でもある（Ｈａｓｔｉｅ，  Ｔ．，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ｒ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．  （２００９）．  Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  （２ｎｄ  ｅｄ．）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．  ｐｐ．  ５０９−５１３及び当該文献に引用される文献を参照せよ。）。ｋ−平均クラスタリングの課題は、クラスター数が事前に選択されなければならないことであり、一般にノードの数の２分の１の平方根に近い。
【０１３３】
３６．既知の分子
既知の分子又はこれに類する用語は、正確な作用メカニズムは既知又は未知の場合があるが、薬理学／生物学／生理学／病理生理学的活性が既知である分子である。
【０１３４】
３７．既知の変調剤
既知の変調剤又はこれに類する用語は、少なくとも１種類の標的が既知で、親和性も既知である、変調剤である。例えば、既知の変調剤は、ＣＫ２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＡ阻害剤、ＰＫＡ阻害剤、ＧＰＣＲ拮抗薬、ＧＰＣＲ作動薬、ＲＴＫ阻害剤、上皮増殖因子受容体を中和する抗体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤又は活性化剤等の場合があるかもしれない。
【０１３５】
３８．既知変調剤バイオセンサーインデックス
「既知変調剤バイオセンサーインデックス」又はこれに類する用語は、既知変調剤について収集されたデータによって作成された変調剤バイオセンサーインデックスである。例えば、既知の変調剤バイオセンサーインデックスは、前記既知変調剤が細胞パネルに作用するプロフィールと、マーカーのパネルに作用する変調プロフィールとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネル中のある細胞についてのものである。
【０１３６】
３９．既知変調剤ＤＭＲ指標
「既知変調剤ＤＭＲインデックス」又はこれに類する用語は、既知変調剤について収集されたデータにより作成される変調剤ＤＭＲインデックスである。例えば既知変調剤ＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用する既知変調剤のプロフィールと、マーカーのパネルに対する既知変調剤の変調剤プロフィールとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネル中の細胞についてのものである。
【０１３７】
４０．リガンド
リガンド又はこれに類する用語は、生物学的な目的に役立てるために、生体分子と結合して複合体を形成する物質又は組成物又は分子である。リガンドとその標的分子との間の実際に不可逆的な共有結合は生物学的システムではまれである。受容体へのリガンド結合は受容体タンパク質の化学的コンフォメーション、すなわち、３次元形状を変化させる。受容体タンパク質のコンフォメーション状態は該受容体の機能状態を決定する。結合の傾向又は強度は親和性とよばれる。リガンドは、基質、遮断薬、阻害剤、活性化剤及び神経伝達物質を含む。放射性リガンドは、放射性同位元素で標識されたリガンドで、蛍光リガンドは蛍光タグが付いたリガンドで、両方は、受容体生物学及び生化学研究用のトレーサーとしてしばしば利用されるリガンドと考えられる場合がある。リガンドと変調剤とは互いに交換可能に用いられる。
【０１３８】
４１．ライブラリ
ライブラリ又はこれに類する用語はコレクションである。ライブラリは本明細書に開示されるいずれかのもののコレクションの場合がある。例えば、インデックスのコレクションはインデックスライブラリであり、プロフィールのコレクションはプロフィールライブラリであり、ＤＭＲインデックスのコレクションはＤＭＲインデックスライブラリである。また、分子のコレクションは分子ライブラリで、細胞のコレクションは細胞ライブラリで、マーカーのコレクションはマーカーライブラリである。ライブラリは例えば、ランダム的又は非ランダム的の場合があり、決定又は未決定の場合がある。例えば、既知変調剤のＤＭＲインデックス又はバイオセンサーインデックスのライブラリが開示される。
【０１３９】
４２．マーカー
マーカー又はこれに類する用語は、バイオセンサー細胞アッセイにおけるシグナルを発生するリガンドである。前記シグナルは、少なくとも１種類の特異的標的を通じて媒介される、少なくとも１種類の特異的細胞シグナル伝達経路及び／又は少なくとも１種類の特異的細胞プロセスの特性であり、でなければならない。前記シグナルは陽性又は陰性又はいずれかの組合せ（例えば振動）の場合がある。
【０１４０】
４３．マーカーパネル
「マーカーパネル」又はこれに類する用語は、少なくとも２種類のマーカーを含むパネルである。前記マーカーは、異なる経路のものであってもよく、同じ経路のものであってもよく、異なる標的のものであってもよく、同じ標的のものであってすらよい。
【０１４１】
４４．マーカーバイオセンサーインデックス
「マーカーバイオセンサーインデックス」又はこれに類する用語は、あるマーカーについて収集されたデータによって作成されるバイオセンサー指標である。例えば、バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用するマーカーのプロフィールと、マーカーのパネルに対するマーカーの変調プロフィールとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネルの細胞についてのものである。
【０１４２】
４５．マーカーＤＭＲインデックス
「マーカーＤＭＲインデックス」又はこれに類する用語は、あるマーカーについて収集されたデータによって作成されるバイオセンサーＤＭＲインデックスである。例えば、マーカーＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用するマーカーのプロフィールと、マーカーのパネルに多雨する前記マーカーの変調プロフィールとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネルの細胞についてのものである。
【０１４３】
４６．マルコフクラスタリングアルゴリズム
マルコフクラスタリングアルゴリズム（ＭＣＬ）は、グラフ中のフローのシミュレーションに基づくグラフのための高速な分枝型クラスタリングアルゴリズムである。たいていの階層的クラスタリング手順とは異なり、このアルゴリズムは、その下の層のネットワークの連結性特性を考慮する。本アルゴリズムはタンパク質相互作用データから複合体を導出するための用いられてきた。ＭＣＬは、分子複合体検出（ＭＣＯＤＥ）、ＦＯＲＣＥ及びスーパーパラメーターマグネチッククラスタリング（ＳＰＣ）のような他のアルゴリズムと比較して、高度なノイズ許容性を有するという点で、タンパク質相互作用をクラスタリングするために特に有効であることが示された。これらのアルゴリズムの全てが、推定されるファミリー関連性を相互作用型探索することを可能にする折り畳み可能な「メタノード」を生成し、これによって、類似度ネットワークをクラスタリングして、タンパク質ファミリー（及び推定される機能的類似度）を探索するためにしばしば用いられる。
【０１４４】
４７．材料
材料は物理的対象の構成（ｍａｋｅｕｐ）に含まれるなにものか（化学的、生化学的、生物学的、又はこれらの混合）の有体部分である。
【０１４５】
４８．模倣（ｍｉｍｉｃ）
本明細書で用いられるところの「模倣」又はこれに類する用語は、参照対象の１つまたは２つ以上の機能を実行することを指す。例えば、分子模倣体はある分子の１つまたは２つ以上の機能を実行する。
【０１４６】
４９．変調する
変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）又は動詞ｍｏｄｕｌａｔｅの諸語形は、細胞標的を通じて媒介される細胞活性の増大、減少又は維持のいずれかを意味する。これらの語のうち１つが用いられるところでは、対照から、１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％又は１０００％の増大か、１％、５％、１０％、２０％、５０％又は１００％の減少かの場合があるかもしれない。
【０１４７】
５０．変調剤
変調剤又はこれに類する用語は、細胞標的の活性を制御するリガンドである。標的タンパク質のような細胞標的と結合するシグナル変調分子である。
【０１４８】
５１．変調比較
「変調比較」又はこれに類する用語は、１次プロフィール及び２次プロフィールを正規化した結果である。
【０１４９】
５２．変調剤バイオセンサーインデックス
「変調剤バイオセンサーインデックス」又はこれに類する用語は、変調剤について収集されたデータによって作成されるバイオセンサーインデックスである。例えば、変調剤バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用する変調剤のプロフィールと、マーカーのパネルに対する前記変調剤のプロフィールとでできる場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０１５０】
５３．変調剤ＤＭＲインデックス
「変調剤ＤＭＲインデックス」又はこれに類する用語は、変調剤について収集されたデータによって作成されるＤＭＲインデックスである。例えば、変調剤ＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用する変調剤のプロフィールと、マーカーのパネルに対する前記変調剤の変調プロフィールとでできる場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０１５１】
５４．マーカーのバイオセンサーシグナルを変調する
「バイオセンサーシグナルを変調する」又はこれに類する用語は、マーカーでの刺激に応答してバイオセンサーシグナル又は細胞のプロフィールの変化を起こすことである。
【０１５２】
５５．ＤＭＲシグナルを変調する
「ＤＭＲシグナルを変調する」又はこれに類する用語は、マーカーでの刺激に応答してＤＭＲシグナル又は細胞のプロフィールの変化を起こすことである。
【０１５３】
５６．分子
本明細書で用いられるところの用語「分子」又はこれに類する用語は、化学的分子か、明確な分子量を有する分子かの形状で存在する、生物学的又は生化学的又は化学的存在を指す。分子又はこれに類する用語は、サイズに関係なく、化学的、生化学的又は生物学的な分子を指す。
【０１５４】
多くの分子は有機分子（とりわけ共有結合で連結された炭素原子を含む分子）として言及されるタイプであるが、（分子酸素のような単純な分子気体と、一部のイオウに基づくポリマーのようなより複雑な分子とを含む）一部の分子は炭素を含まない。一般的な用語「分子」は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド類、有機医薬品、低分子、受容体、抗体及び脂質のような多数の記述クラス又はグループの分子を含む。適切なときは、サブグループへの本方法の分子の適用のため、一般的なクラスである「分子」と、タンパク質のような指名されたサブクラスとの両方をかかる分子に代表させる意図を損なうことなく、これらのより説明的な用語（「タンパク質」のような該用語の多くは、重複するグループの分子を説明する）の１個又は２個以上が本明細書で用いられるであろう。具体的に示されない限り、「分子」という語は、特定の分子と、薬学的に許容可能な塩のような前記特定の分子の塩とを含むであろう。
【０１５５】
５７．分子混合物（ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）
分子混合物又はこれに類する用語は、少なくとも２種類の分子を含む混合物である。前記２種類の分子は、構造的に異なる（すなわち、エナンチオマー）か、組成的に異なる（例えば、タンパク質のアイソフォームか、グリコフォームか、異なるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）修飾を有する抗体か）か、構造的かつ組成的に異なる（例えば、未精製天然抽出物又は未精製合成化合物）かの場合があるが、これらに限定されない。
【０１５６】
５８．分子バイオセンサーインデックス
「分子バイオセンサーインデックス」又はこれに類する用語は、分子について収集されたデータによって作成されるバイオセンサーインデックスである。例えば、分子バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用する分子のプロフィールと、マーカーのパネルに対する前記分子の変調プロフィールとでできている場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０１５７】
５９．分子ＤＭＲインデックス
「分子ＤＭＲインデックス」又はこれに類する用語は、分子について収集されたデータによって作成されるＤＭＲインデックスである。例えば、分子バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用する分子のプロフィールと、マーカーのパネルに対する前記分子の変調プロフィールとでできている場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０１５８】
６０．分子インデックス
「分子インデックス」又はこれに類する用語は、分子に関するインデックスである。
【０１５９】
６１．分子で処理される細胞
分子で処理される細胞又はこれに類する用語は、分子に曝露されてきた細胞である。
【０１６０】
６２．分子変調インデックス
「分子変調インデックス」又はこれに類する用語は、細胞のパネルに作用するマーカーのパネルのバイオセンサー出力シグナルを変調できる分子の能力を示すインデックスである。前記変調インデックスは、分子の存在下でのマーカー刺激に対する細胞の応答の特異的バイオセンサー出力シグナルパラメーターをいかなる分子も存在しないときのマーカー刺激に対する細胞の応答の特異的バイオセンサー出力シグナルパラメーターに対して正規化することによって生成される。
【０１６１】
６３．分子薬理学
分子薬理学又はこれに類する用語は、システム細胞生物学か、システム細胞薬理学か、細胞に作用する分子の作用モードかを指す。分子薬理学は、毒性か、特定の細胞プロセス（例えば、増殖、分化、活性酸素種シグナル伝達）に影響を与える能力か、特定の細胞標的（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＪＡＫ２、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ２又はアクチン）を変調できる能力かによって特徴づけられることがしばしばあるが、これらに限定されない。
【０１６２】
６４．正規化
正規化又はこれに類する用語は、例えば少なくとも１個の共通変数を除去するように、データ、プロフィール又は応答を調整することを意味する。例えば、細胞に作用するマーカーの応答と、該細胞に作用するマーカー及び分子の応答という２個の応答が発生する場合に、正規化は、前記分子非存在下で前記マーカーで誘発される応答と、前記分子存在下での応答とを比較すること、正規化された応答が前記マーカーに対する前記分子の変調に起因する応答を表すように、前記マーカーに起因する応答を除去することという動作を指すかもしれない。変調比較は、分子の存在下（変調プロフィール）での前記マーカーの１次プロフィール及び２次プロフィールを正規化することにより作成される。
【０１６３】
６５．任意的（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）
「任意的」、「任意的に」又はこれらに類する用語は、その後の記述の事象又は状況が起こりうるものも起こりえないものもあること、及び、前記記述は前記事象又は状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。例えば、「任意的に組成物は組合せを含む」という文言は、当該組成物が異なる分子の組合せを含むか、組合せを含まないかの場合があり、前記記述は、前記組合せと、前記組合せの非存在（すなわち、前記組合せの個々のメンバー）との両方を含むことを意味する。
【０１６４】
６６．又は
「又は」又はこれに類する用語は、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーのいずれかの組合せも含む。
【０１６５】
６７．プロフィール
プロフィール又はこれに類する用語は、細胞のような組成物について収集されたデータを指す。プロフィールは本明細書に説明されるラベルフリーバイオセンサーから収集される場合がある。
【０１６６】
ｉ．１次プロフィール
「１次プロフィール」又はこれに類する用語は、分子が細胞と接触するときに発生するバイオセンサー応答、バイオセンサー出力シグナル又はプロフィールを指す。典型的には、１次プロフィールは、初期細胞応答を差し引きゼロのバイオセンサーシグナル（すなわち基線）に対して正規化した後に得られる。
【０１６７】
ｉｉ．２次プロフィール
「２次プロフィール」又はこれに類する用語は、分子の存在下でのマーカーに対する細胞のバイオセンサー応答又はバイオセンサー出力シグナルである。２次プロフィールは、分子がマーカーで誘発される細胞応答又はバイオセンサー応答を変調できる能力の指示として使用される場合がある。
【０１６８】
ｉｉｉ．変調プロフィール
「変調プロフィール」又はこれに類する用語は、分子の存在下でのマーカーの２次プロフィールと、いかなる分子も存在しないときのマーカーの１次プロフィールとの間の比較である。前記比較は、例えば前記２次プロフィールから前記１次プロフィールを減算するか、前記１次プロフィールから前記２次プロフィールを減算するか、前記１次プロフィールに対して前記２次プロフィールを正規化するかによって行われる場合がある。
【０１６９】
６８．パネル
パネル又はこれに類する用語は、予め定められた被検体（例えば、マーカー、細胞又は経路）のセットである。パネルは、ライブラリから被検体を選定することから作成される場合がある。
【０１７０】
６９．陽性対照
「陽性対照」又はこれに類する用語は、データ収集のための条件がデータ収集につなげられることを示す対照である。
【０１７１】
７０．強化する（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）
強化する、強化された又はこれらに類する用語は、分子によって起こった、細胞でのマーカーのバイオセンサー応答の特定のパラメーターの増大を指す。マーカーの１次プロフィールを、分子の存在下での同一細胞における同一マーカーの２次プロフィールと比較することによって、マーカーで誘発される細胞のバイオセンサー応答の前記分子による変調を計算することができる。陽性の変調は、前記分子がマーカーによって誘発されるバイオセンサーシグナルの増大を起こすことを意味する。
【０１７２】
７１．効力
効力又はこれに類する用語は、所定の程度の効果を発生するために必要な量という観点から表現された、分子活性の尺度である。例えば、非常に効力が強い薬剤は、低濃度で大きい反応を起こす。効力は親和性及び有効性に比例する。親和性は、薬剤分子が受容体と結合する能力である。
【０１７３】
７２．刊行物
本件出願を通じて、さまざまな刊行物が引用される。本件出願に関する技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示内容は、それらの全体が引用により本件出願に取り込まれる。開示される引用文献は、引用文献を参照する文中で説明される材料であって、前記引用文献に含まれる材料についても、引用により本明細書に個別具体的に取り込まれる。
【０１７４】
７３．受容体
受容体又はこれに類する用語は、移動可能なシグナル伝達（又は「シグナル」）分子が会合することがある、細胞の原形質膜又は細胞質のいずれかに包埋されるタンパク質分子である。受容体に結合する分子は「リガンド」とよばれ、（神経伝達物質のような）ペプチド、ホルモン、医薬品又は毒素の場合があり、かかる結合が起こるとき受容体は、細胞応答を通常は開始するコンフォメーション変化を起こす。しかし、一部のリガンドは、いかなる応答も誘発することなく受容体を遮断するにすぎない（例えば、拮抗薬）。リガンドで誘発される受容体の変化は、該リガンドの生物活性を構成する生理学的変化をもたらす。
【０１７５】
７４．「ロバストなバイオセンサーシグナル」
「ロバストなバイオセンサーシグナル」は、その振幅がノイズレベル又は陰性対照応答のいずれかより（３倍、１０倍、２０倍、１００倍又は１０００倍のように）顕著に上回るバイオセンサーシグナルである。しばしば陰性対照応答は、アッセイバッファー溶液（すなわちビヒクル）の添加後のバイオセンサー応答である。前記ノイズレベルは、いかなる溶液をさらに添加しないときの細胞のバイオセンサーシグナルである。細胞はいかなる溶液を添加する前でもいつも溶液に覆われることは特記に値する。
【０１７６】
７５．「ロバストなＤＭＲシグナル」
「ロバストなＤＭＲシグナル」又はこれに類する用語は、「ロバストなバイオセンサーシグナル」のＤＭＲ形状である。
【０１７７】
７６．範囲
範囲は、「約（ａｂｏｕｔ）」ある特定の数値から、及び／又は、「約」別の特定の数値までとして本明細書で表現される場合がある。かかる範囲が表現されるとき、別の実施態様は、前記ある特定の数値から、及び／又は、前記別の特定の数値までを含む。同様に、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」の使用により数値が近似値として表現されるとき、前記特定の数値は別の実施態様を形成することが理解されるべきであろう。前記範囲のそれぞれの端点は、他の端点との関係で、及び、該他の端点とは無関係に、の両方で意義がある。本明細書には多数の数値が開示されること、及び、それぞれの数値は、該数値自体に加えて、「約」その特定数値としても本明細書に開示されることも理解される。例えば、「１０」という数値が開示される場合、「約１０」も開示される。ある数値「以下」が開示されるとき、当業者により適切に理解されるとおり、「当該数値以上」と、数値間の可能な範囲とがともに開示される。例えば、数値「１０」が開示される場合、「１０以下」及び「１０以上」も開示される。本件出願を通じて、データは多数の異なるフォーマットで提供されること、及び、このデータは、終点及び始点と、該データの点のいずれかの組合せの範囲とを表すことも理解される。例えば、特定のデータの点「１０」と、特定のデータの点「１５」とが開示される場合、１０と１５の間とともに、１０及び１５を超える、１０及び１５以上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、及び１０及び１５ちょうども開示されると考えられることが理解される。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３及び１４も開示される。
【０１７８】
７７．応答
応答又はこれに類する用語は、いずれかの刺激に対するいずれかの反応である。
【０１７９】
７８．サンプル
サンプル又はこれに類する用語により意味されるのは、動物、植物、菌類等か、天然産物、天然産物の抽出物等か、動物由来の組織又は器官か、（被検者の体内か、被検者から直接取り出されるか、培養で維持される細胞か、培養細胞株由来かのいずれかの）細胞か、細胞溶解液（又は溶解液の分画）又は細胞抽出物か、（例えばポリペプチド又は核酸のような）細胞又は細胞材料由来の１種類以上の分子を含む溶液かであって、本明細書に説明されるとおりアッセイされるものである。サンプルは、細胞又は細胞のコンポーネントを含む、（例えば、血液、尿、糞便、唾液、涙、胆汁であるが、これらに限定されない）いずれかの体液又は分泌物の場合もある。
【０１８０】
７９．物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）
物質又はこれに類する用語は、いずれかの物理的対象である。材料は物質である。分子、リガンド、マーカー、細胞、タンパク質及びＤＮＡは物質と考えられる場合がある。機械又は品物は物質自体であると考えられるよりもむしろ、物質でできていると考えられるであろう。
【０１８１】
８０．被検者（ｓｕｂｊｅｃｔ）
本明細書を通じて用いられるところの被検者又はこれに類する用語は、個体を意味する。したがって、「被検者」は、例えば、ネコ、イヌ等の家畜化された動物と、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）と、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）と、哺乳類、非ヒト哺乳類、霊長類、非ヒト霊長類、齧歯類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類及び他のいずれかの動物とを含む場合がある。１つの局面では、被検者は霊長類又はヒトのような哺乳類である。被検者は非ヒトの場合がある。
【０１８２】
８１．テスト分子
テスト分子又はこれに類する用語は、該テスト分子についてのなんらかの情報を得る方法に用いられる分子である。テスト分子は、未知又は既知の分子の場合がある。
【０１８３】
８２．処理（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）
処理、処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）又はこれらに類する用語は、少なくとも２種類のやり方で用いられる場合がある。第１に、処理、処置又はこれらに類する用語は、被検者に対して取られる投与又は動作を指す場合がある。第２に、処理、処置又はこれらに類する用語は、いずれか２種類または３種類以上の物質を一緒に、又は、ある分子とある細胞とのように、いずれか２つのものを一緒に混合することを指す場合がある。この混合により、前記少なくとも２種類の物質の間の接触が起こるようにこれらの物質が一緒にされるであろう。
【０１８４】
処理、処置又はこれらに類する用語が疾患を有する被検者の文脈で用いられるとき、例えば、治癒か、徴候の低減かを暗示することはない。治療的又はこれに類する用語が、処理、処置又はこれらに類する用語と併用されるとき、原因となる疾患の徴候が低減すること、及び／又は、前記徴候を起こす原因となる細胞的、生理学的又は生化学的原因又はメカニズムが低減することを意味する。この文脈で用いられる低減は、疾患の生理学的状態だけでなく、疾患の分子的状態を含む、疾患の状態と比較する意味であると理解される。
【０１８５】
８３．引き金を引く（Ｔｒｉｇｇｅｒ）
引き金又はこれに類する用語は、応答のような事象を開始又は起動する動作を指す。
【０１８６】
８４．値（Ｖａｌｕｅｓ）
コンポーネント、成分、添加物、細胞タイプ、マーカー及びこれらに類する局面と、これらの範囲とについて開示される具体的又は好ましい値は、例示のためだけである。これらの値は、他の明示された値や明示された範囲内の他の値を排除するものではない。本開示の組成物、装置及び方法は、本明細書に説明される値と、具体的な値と、より具体的な値と、好ましい値のうち、いずれかの値又はいずれかの組合せを有するものを含む。
【０１８７】
したがって、開示された方法、組成物、品物及び機械は、本明細書に説明されるさまざまなステップ、分子、組成物その他これらに類するものを、含むか、からなるか、から実質的になるやり方で組み合わされる場合がある。例えば、これらは、本明細書で定義されるとおりのリガンドを含む分子を特徴づけるための方法か、本明細書で定義されるとおりの指標を作成する方法か、本明細書で定義されるとおりの薬剤送達の方法かにおいて使用される場合がある。
【０１８８】
８５．未知分子
未知分子又はこれに類する用語は、既知又は未知の化学構造を有し、未知の生物学的／薬理学的／生理学的／病理生理学的活性を有する分子である。
【０１８９】
８６．データ出力
データ出力は、ラベルフリーバイオセンサーのような、分析機器を使うアッセイを実行した後に得られる回収された結果を指す。例えば、ラベルフリーバイオセンサーのデータ出力はＤＭＲシグナルの場合があるかもしれない。データ出力は、操作されて、例えば、インデックスになる場合があることが理解されるべきである。分子、マーカー、阻害剤、マーカー分子等のような、アッセイが実行されるいずれかの種類のデータ出力の場合があることも理解されるべきである。分子データ出力と、比較を形成するデータ出力とのような、いずれかの２種類の出力でも比較される場合があることが理解されるべきである。典型的には、かかる比較は、ＤＭＲデータ出力に対してＤＭＲデータ出力を、のように、類縁性のあるデータ出力について実行されるであろう。
【実施例】
【０１９０】
Ｅ．実施例
１．実験の手順
ｉ．試薬
ＬＹ３３４３７０、Ｒｏ６００１７５、アデノシン、ＣＣＰＡ、ＣＧＳ  ２１６８０、ＩＢ−ＭＥＣＡ、（−）エピネフリン、Ａ  ６１６０３、（Ｒ）−（−）−フェニレフリン、アナダミド、ドーパミン、Ｒ（＋）ＳＫＦ３８３９３、ＳＫＦ  ９７５４１、ヒスタミン、ニコチン酸（ＮＡ）、ＮＰＰＢ、フォルスコリン、ＡＴＰ、ＵＴＰ、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、ＳＢ  ２０５６０７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（ミズーリ州、セントルイス）から入手された。ポリ（Ｉ：Ｃ）、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）及びピナシジルは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）から入手された。ＯＤＮ２００６はＩｍｇｅｎｅｘ（カリフォルニア州、サンジエゴ）から入手された。
【０１９１】
Ｃ５ａ、ブラディキニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、アドレノメデュリン、セクレチン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ（オビン））、オレキシン−Ａ、血管作動性小腸ポリペプチド（ＶＩＰ）、ＳＦＬＬＲ及びＳＬＩＧＫＶ、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びニューロテンシン（ＮＴ）はＢａＣｈｅｍ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、トーランス）から入手された。ＢｉｏＭｏｌキナーゼ阻害剤ライブラリ及びイオンチャンネル変調剤ライブラリを含む複数のＢｉｏＭｏｌライブラリはＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｌ．Ｐ．（ペンシルバニア州、プリマスミーティング）から購入された。細胞培養試薬は全てＧＩＢＣＯ細胞培養製品から購入された。
【０１９２】
マロトキシン（ＭＴＸ）はＢｉｏＭｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州、プリマスミーティング）から入手された。Ｅｐｉｃ（登録商標）３８４バイオセンサーマイクロプレート細胞培養適合はＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州、コーニング）から入手された。
【０１９３】
ｉｉ．細胞培養
細胞は、対応する培地５０μＬに懸濁された継代３ないし１５代でバイオセンサーマイクロプレートのウェルあたり約１ないし２×１０４個を用いて増殖され、約１日間３７℃で空気／５％ＣＯ２の下で培養されるのが典型的であった。全ての細胞についてアッセイ時のコンフルエントの程度は約１００％であった。１日間（少なくとも１４時間）培養後無血清培地中で１日間（少なくとも１４時間）飢餓状態に置かれるＡ４３１細胞を除いて、他の全ての細胞は飢餓に置かれることなく直接アッセイされた。アッセイ時のコンフルエントの程度は約９５％ないし１００％であった。
【０１９４】
ｉｉｉ．光学的バイオセンサーシステム及び細胞アッセイ
Ｅｐｉｃ（登録商標）ベータ版波長尋問システム（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．社、ニューヨーク州、コーニング）が全細胞感知に使用された。本システムは、温度制御ユニットと、光学的検出ユニットと、内臓ロボット液体処理ユニットとからなる。前記検出ユニットは集積光ファイバー光学系を中心とし、約１５秒の時間間隔で細胞応答の反応速度論的測定が実施可能である。
【０１９５】
ＲＷＧバイオセンサーは、センサー表面近傍の局所的な屈折率の微妙な変化を検出できる。細胞内の局所的な屈折率は、密度と、その生体質量（ｂｉｏｍａｓｓ、例えば、タンパク質、分子複合体）の分配との関数であるため、天然のままの細胞内でのリガンドで誘発される動的質量再分配を非侵襲的に検出するために前記バイオセンサーはエバネッセント波を利用する。前記エバネッセント波は細胞内に延び、距離とともに指数的に減衰して、特徴的な感知体積である約１５０ｎｍに至る。このことは、受容体活性化を通じて媒介されるいかなる光学的応答でも、前記エバネッセント波がサンプリングする細胞の一部の平均だけしか代表しないことを意味する。受容体活性化の下流の多くの細胞の事象の集積が、リガンドで誘発されるＤＭＲの化学反応論及び振幅を測定する。
【０１９６】
バイオセンサー細胞アッセイ用の分子溶液は、保存濃縮溶液をＨＢＳＳ（１×ハンクス平衡塩溶液に２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．１を添加）で希釈して作成され、３８４穴ポリプロピレン分子保存プレートに移されて、分子ソースプレートが調製された。２段階アッセイが実行されるときには、分子及びマーカーソースプレートの両方が別々に作られた。平行して、細胞はＨＢＳＳで２回洗浄され、ＨＢＳＳ３０μＬ中に保持されて、細胞アッセイプレートが調製された。それから、細胞アッセイプレートと、分子及びマーカーソースプレートとの両方が読み取り機システムのホテル内でインキュベーションされた。約１時間のインキュベーション後、細胞アッセイマイクロプレート内の全てのバイオセンサーの基準線波長が記録され、ゼロに対して正規化された。その後、基準線を確立し、細胞が定常状態に達したことを担保するため、２分ないし１０分間の連続記録が実行された。その後、内蔵液体処理装置を用いて、前記マーカー溶液の１０μＬが前記細胞アッセイプレートにピペッティングされることにより、細胞応答の引き金が引かれた。
【０１９７】
マーカーで誘発される応答への分子の影響を研究するために、固定された投与量（典型的にはＥＣ８０又はＥＣ１００）のマーカーを用いる第２の刺激が適用された。全てのバイオセンサーの共鳴波長は、第２の刺激の直前に第２の基準線を確立するために再び正規化された。前記２回の刺激は通常約１時間の間隔が置かれた。
【０１９８】
全ての研究は調節された温度（２８℃）で実行された。少なくとも３個のレプリケートを各セットに含む、少なくとも２セットの独立の実験が実行された。アッセイの変動係数は１０％未満であった。Ｅｐｉｃシステムを用いて測定される典型的な細胞のＤＭＲシグナルは、基準線前刺激（しばしばゼロに正規化される）と、細胞応答後刺激とからなるリアルタイム反応速度論応答である。
【０１９９】
２．実施例２：ヒト上皮様癌腫Ａ４３１の受容体パンニング
ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイで機能する内在性Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）を選り出すために、既知ＧＰＣＲ作動薬のライブラリが作られた。Ａ４３１細胞はＥｐｉｃ（登録商標）３８４穴バイオセンサー細胞培養適合マイクロプレート上で単層になるように増殖され、終夜飢餓に供された。前記細胞培地を１×ＨＢＳＳに置換し、Ｅｐｉｃ（登録商標）システム内で平衡に達した後、細胞は既知のＧＰＣＲ作動薬各１０マイクロモルで刺激された。既知のアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリンもｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路の陽性対照として含められた。代表的な動的質量分配（ＤＭＲ）シグナルは、図２及び３に示された。結果は、Ａ４３１細胞が広範な既知ＧＰＣＲ作動薬に応答し、異なるＧＰＣＲ作動薬が細かな特徴（例えば、反応速度論、振幅、形状）の異なるＤＭＲシグナルの引き金を引いた。
【０２００】
３．実施例３：Ａ４３１細胞における既知ＧＰＣＲ作動薬で誘発されるＤＭＲシグナルのクラスタリング
図２及び３に示されるとおり、これらの既知ＧＰＣＲ作動薬は、Ａ４３１細胞で顕著なＤＭＲシグナルの引き金を引くことが示された。これらのＤＭＲシグナルは、形状、反応速度論及び振幅が大きく異なるが、これらは２、３種類のタイプとして視覚化できる。パターン認識及びパターンマッチングがこれらの関係を視覚化するために用いられる場合がある。しかし、分子バイオセンサー１次プロフィールの数が劇的に増えるとき、教師つき学習（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）のような従来のパターン認識方法を用いて分子１次インデックスの関係を研究することはより困難になる。クラスター分析は、大量のデータセットを扱うことがしばしば起こる遺伝子発現及びタンパク質ネットワーク分析に広く利用されて成功してきた。したがって、クラスター分析及びそのパラメーターが分子１次インデックスをカテゴリー分類するために本明細書では同定された。階層的及びｋ−平均クラスター法の両方が調べられた。結果は、分子１次インデックスのためには、階層的クラスタリングが異なるレベルでのＤＭＲシグナルのタイプをより効果的に同定することにつながった。ユークリッド距離法は、ラベルフリーバイオセンサー法で最もよく機能して異なるクラスターを分離する計測法であった。非中心化法及び絶対値法は、分子バイオセンサー１次インデックスを用いて選られたクラスター間の連関を構築するためにうまく適合することがわかった。ＥｉｓｅｎのＴｒｅｅＶｉｅｗを用いるヒートマップは、クラスター分析結果を視覚化するのに効果的であることがわかった。図４は、Ａ４３１細胞における既知ＧＰＣＲ作動薬で誘発されるＤＭＲシグナルのヒートマップを示した。ここで、４０ピコメートルの最大−最小法が原データをフィルタリングするためのカットオフ値として用いられた。このヒートマップは、１分の時間間隔で刺激後の各ＧＰＣＲ作動薬の実際の応答を用いて生成された。ユークリッド距離法を用いる２次元階層的クラスタリングは、これらの既知ＧＰＣＲ作動薬で誘発されるＤＭＲシグナルは最も低い解像度で２つのカテゴリーに分類できるが、これらは中間的な解像度では４つのカテゴリーに分類され、各カテゴリーは多くのサブクラスターからなることが示された。既知のＧｓ−共役β２−アドレナリン受容体（β２ＡＲ）作動薬のエピネフリン、ドーパミン及びフェニレフリンは、フォルスコリンと類似のＤＭＲシグナルの引き金を引いた。同様に、Ｇｓ−共役アデノシンＡ２Ｂ受容体作動薬のアデノシン、ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＣＣＰＡ及びＣＧＳ２１６８０も、同一のクラスターに属するＤＭＲシグナルをもたらした。これに反して、Ｇｑ−共役Ｐ２Ｙ２受容体作動薬のＡＴＰ及びＵＴＰは、同一のクラスターに属するＤＭＲシグナルの引き金を引いた。このクラスターは、Ｇｑ−共役ブラディキニンＢ２受容体作動薬のブラディキニンと、Ｇｑ−共役Ｓ１Ｐ２及びＳ１Ｐ５受容体作動薬のスフィノシン−１−リン酸と、プロテアーゼで活性化される受容体ＰＡＲ１作動薬のＳＦＬＬＲと、ＰＡＲ作動薬のＳＬＩＧＫＶとをも含む。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により確認されるとおり（データ図示されない）、これらの受容体全てがＡ４３１細胞で内在的に発現された。さらに２次元クラスター分析は、異なる時点での実際の応答が相互に連結され、初期応答（刺激後１２分間未満）と、後期応答（１２分間を超える）という、２つのカテゴリーに該当することが一般的であると示された。これらの時点の間の関係のさらなる検討が、時点の４つのサブクラスター（刺激後、１−６分間、７−１２分間、１２−１８分間、１９−５０分間）をもたらし、それぞれが１つの期間に属する４つの時点での実際の応答を用いるＡ４３１細胞でのＧＰＣＲ作動薬１次ＤＭＲプロフィールを有効にクラスター分類するために十分なもしれないことが示唆される。図５は、４つの予め選択された刺激後の時点（３分、１０分、２０分及び５０分）での実際の応答を用いる、同一のセットのＧＰＣＲ作動薬１次ＤＭＲシグナルのヒートマップを示す。ここでは、４０ピコメートルの最大−最小差が原データをフィルタリングするためにも用いられた。結果は、連関において差があるものの、かかる４つの時点に基づくクラスター分析はほとんど全てのＧＰＣＲ作動薬を正しくカテゴリー分類した。
【０２０１】
４．実施例４：バイオセンサー変調インデックスに基づく抗ヒスタミン分子のライブラリからの同定
ラベルフリー統合薬理学のためのクラスター分析の可能性をさらに探るために、約２０００種類の化合物のライブラリが、１５種類のマーカー／４種類の細胞株のパネルに対するラベルフリー統合薬理学分析に供された。細胞／マーカーのパネルは、Ａ５４９細胞（ミトコンドリアＫＡＴＰ開放剤ピナシジル、ＴＬＲ作動薬ポリ（Ｉ：Ｃ）、タンパク質キナーゼＣ活性化剤ＰＭＡ、アデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリン、ＰＡＲ２作動薬ＳＬＩＧＫＶ及び、ヒスタミンＨ１受容体作動薬ヒスタミン）と、Ａ４３１細胞（β２ＡＲ作動薬エピネフリン、ＥＧＦＲ作動薬ＥＧＦ、ＧＰＲ１０９Ａ作動薬ニコチン酸及びヒスタミンＨ１受容体作動薬ヒスタミン）と、ＨＴ２９細胞（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２作動薬ＥＧＦ、ニューロテンシン受容体ＮＴＳ１／ＮＴＳ３作動薬ニューロテンシン、ＩＧＦ１受容体ＩＧＦ１及びｈＥＲＧ活性化剤マロトキシン）と、ＨｅｐＧ２細胞（ＴＬ９作動薬ＯＤＮ２００６）とからなる。バイオセンサー１次インデックスのライブラリを作成するために、前記ライブラリ中の全ての分子が４種類の細胞株でスクリーニングされた。さらに、バイオセンサー変調インデックスのライブラリを作成するために、前記ライブラリ中の全ての分子が、ＥＣ１００でのそれぞれのマーカーに対して前記４種類の細胞株でスクリーニングされた。変調インデックスは、分子存在下でのマーカーＤＭＲシグナルを分子非存在下でのマーカーＤＭＲに対して正規化することによって生成された。各マーカーについて、１種類または２種類の特異的なＤＭＲ事象が正規化に用いられた。Ａ５４９細胞については、ピナシジル（３０分でのＮ−ＤＭＲ；▲ピナシジルの太字▼）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ポリ（Ｉ：Ｃ）の太字▼）、ＰＭＡ（５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＰＭＡの太字▼）、ＳＬＩＧＫＶ（２０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＳＬＩＧＫＶの太字▼）、フォルスコリン（５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲フォルスコリンの太字▼）、ヒスタミン（１０分でのＰ−ＤＭＲ、▲Ｈｉｓ１の太字▼；３０分でのＰ−ＤＭＲ、▲Ｈｉｓ２の太字▼）である。（太字は図６に示される。以下同様。）Ａ４３１細胞については、エピネフリン（５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲Ｅｐｉの太字▼）、ニコチン酸（３分でのＮ−ＤＭＲ、▲ＮＡの太字▼）、ＥＧＦ（５分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＥＧＦ１の太字▼；４０分でのＮ−ＤＭＲ、▲ＥＧＦ２の太字▼）及びヒスタミン（３分でのＰ−ＤＭＲ、▲Ｈｉｓ３の太字▼）である。ＨＴ２９細胞については、ＥＧＦ（８分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＥＧＦ３の太字▼；５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＥＧＦ４の太字▼）、ＩＧＦ−１（５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＩＧＦ１の太字▼）、マロトキシン（５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＭＴＸの太字▼）及びニューロテンシン（５分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＮＴ１の太字▼；５０分でのＰ−ＤＭＲ、▲ＮＴ２の太字▼）である。ＨｅｐＧ２細胞については、ＯＤＮ２００６（５０分でのＮ−ＤＭＲ、▲ＯＤＮ２００６の太字▼）である。
【０２０２】
ＥｉｓｅｎのＴｒｅｅＶｉｅｗを用いて生成されたヒートマップ（図６）に示されるとおり、階層的ユークリッド距離法をを用いるクラスター分析は、３種類の既知の抗ヒスタミン剤である、レボカバスチン、フルナリジン及びケトチフェンを含む８種類の化合物からなる特定のノードクラスターを同定した。既知のアルファ遮断薬フェノキシベンザミンもこれらの抗ヒスタミン剤と類似することがわかった。文献のマイニングは、フェノキシベンザミンがヒスタミン（Ｈ１）、アセチルコリン及びセロトニンの受容体も遮断することを確認した。クロルプロマジンも、ドーパミン受容体（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４サブタイプ）と、セロトニン受容体（５−ＨＴ１及び５−ＨＴ２）と、ヒスタミン受容体（Ｈ１受容体）と、α１−及びα２−アドレナリン受容体と、Ｍ１及びＭ２ムスカリンアセチルコリン受容体とを含む、異なる後シナプス性受容体に対する拮抗薬であることが知られている。抗うつ薬イミプラミンもヒスタミンＨ１受容体の拮抗薬であることが知られている。抗精神病薬リスペリドンは中枢神経系におけるセロトニン２及びドーパミン２受容体の拮抗作用を有し、アルファ１−及びアルファ２−アドレナリン受容体とヒスタミンＨ１受容体とに結合することが知られている。これらの結果は、ラベルフリー統合薬理学的アプローチが既知の薬剤及び分子の隠された表現型を同定するために提供され、薬剤及び分子の複合薬理学の研究を可能にする。これらの抗ヒスタミン剤とＬＹ３０３５１１との類似度は、この化合物もヒスタミンＨ１Ｒ又はＨ１Ｒ経路の拮抗薬の場合があることを示し、ある標的についてラベルフリー統合薬理学が分子を同定できることを示す。
【０２０３】
５．実施例５：受容体に作用するＧＰＣＲリガンドの機能的選択性についてのクラスター分析
薬剤分子の薬理学的活性を広いスペクトルの接点及び表現型アッセイで完全に特徴づける挑戦は、どんどん増えていく数のＧＰＣＲｓについて多くのリガンドの新規な経路に基づく活性の発見につながってきた。古典的な例は、ベータ遮断薬のプロプラノロールである。プロプラノロールは、Ｇｓ経路の逆作動薬及びβ−アレスチチン依存性細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）作動薬として最近同定された。これらの経路バイアスのある活性は、薬剤分子の複雑な治療プロフィールに寄与するかもしれない。
【０２０４】
ラベルフリー受容体アッセイは、検出されるべき受容体におけるより大きな変化のアレイを可能にする。ＤＭＲアッセイを用いて、β２−ＡＲリガンドのパネルが休止期のＡ４３１細胞で特徴づけられた（Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｅ，  Ａ．Ｍ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２００８，  ５８２，  ５５８−５６４）。多重パラメーター分析は、これらの対応するＤＭＲシグナルの特徴で独特なパターンを明らかにした（図７に実例が示される）。エピネフリン及びイソプロテレノールのような完全作動薬は、Ｐ−ＤＭＲ事象について、振幅が最大で、移行時間が速いが、反応速度論は遅いＤＭＲを与える。これと比較すると、カテコール及びハロスタチンのような部分的作動薬は、Ｐ−ＤＭＲ事象について、振幅がより小さく、移行時間が少し遅いが、反応速度論はより速いＤＭＲシグナルをもたらす。類似度分析は、これらのパラメーターがこれらの分子の作動作用活性をカテゴリー分類するために使用できることを示す。図７は、以下のβ２−ＡＲ作動薬のパネルの代表的なＤＭＲシグナル及び構造を示す。（ａ）５００μＭのカテコール、（ｂ）３２μＭのドーパミン、（ｃ）１００ｎＭのノルエピネフリン、（ｄ）８ｎＭの（−）エピネフリン、ともに飽和濃度、（ｅ）これらの対応するＤＭＲシグナルの特徴に基づくβ２−ＡＲ作動薬の薬理学のヒートマップ分類。前記ヒートマップは、全てのＤＭＲパラメーターがエピネフリンの応答に対して正規化された後で、ユークリッド階層的クラスター分析を用いて生成された。データは、第１のサブグループが、イソプロテレノール、エピネフリン、ノルエピネフリン及びサルブタモールを含む完全作動薬及び強力な部分作動薬からなるが、第２のグループは、ハロスタチン及びドーパミンを含む部分作動薬からなることを示唆する。第３のグループは、ラベタロールと、ピンドロールと、Ｓ（−）ピンドロールと、アルプレノロールと、ＣＧＰ１２１７７と、ある程度は、１００ｎＭのサルメテロールとを含む、弱い部分作動作用を示すベータ遮断薬からなる。弱い作動薬のカテコールと、部分作動薬のキサモテロールとは、第２及び第３のグループの間にある。１０μＭのサルメテロールは、完全作動薬に類似するが同一ではない、非常に独特なＤＭＲをもたらす。
【０２０５】
Ｆ．文献
１．国際公開第２００６１０８１８３号パンフレット。Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｆｅｒｒｉｅ，  Ａ．Ｍ．，  Ｆｏｎｔａｉｎｅ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｙｕｅｎ，  Ｐ．Ｋ．  及びＬａｈｉｒｉ，  Ｊ．    “Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ”
２．米国特許出願第１２／６２３，６９３号明細書。Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｆｅｒｒｉｅ，  Ａ．Ｍ．，  Ｌａｈｉｒｉ，  Ｊ．，及びＴｒａｎ，  Ｅ．  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”、２００９年１１月２３日出願。
【０２０６】
３．米国特許出願第１２／６２３，７０８号明細書。Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｆｅｒｒｉｅ，  Ａ．Ｍ．，  Ｌａｈｉｒｉ，  Ｊ．，及びＴｒａｎ，  Ｅ．    “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｄｅｘ”、２００９年１１月２３日出願。
【０２０７】
４．Ｍ．  Ｂ．  Ｅｉｓｅｎ，  Ｐ．  Ｔ．  Ｓｐｅｌｌｍａｎ，  Ｐ．  Ｏ．  Ｂｒｏｗｎ，及びＤａｖｉｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ：  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．  ＰＮＡＳ，  ９５（２５）：１４８６３−８  （１９９８）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2013522800.tif 000006
【図２Ａ】
2013522800.tif 000007
【図２Ｂ】
2013522800.tif 000008
【図２Ｃ】
2013522800.tif 000009
【図２Ｄ】
2013522800.tif 000010
【図２Ｅ】
2013522800.tif 000011
【図２Ｆ】
2013522800.tif 000012
【図２Ｇ】
2013522800.tif 000013
【図２Ｈ】
2013522800.tif 000014
【図２Ｉ】
2013522800.tif 000015
【図２Ｊ】
2013522800.tif 000016
【図２Ｋ】
2013522800.tif 000017
【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
2013522800.tif 000020
【図２Ｏ】
2013522800.tif 000021
【図２Ｐ】
2013522800.tif 000022
【図３Ａ】
2013522800.tif 000023
【図３Ｂ】
2013522800.tif 000024
【図３Ｃ】
2013522800.tif 000025
【図３Ｄ】
2013522800.tif 000026
【図３Ｅ】
2013522800.tif 000027
【図３Ｆ】
2013522800.tif 000028
【図３Ｇ】
2013522800.tif 000029
【図３Ｈ】
2013522800.tif 000030
【図３Ｉ】
2013522800.tif 000031
【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図４】
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【図５】
2013522800.tif 000040
【図６】
2013522800.tif 000041
【図７Ａ】
2013522800.tif 000042
【図７Ｂ】
2013522800.tif 000043
【図７Ｃ】
2013522800.tif 000044
【図７Ｄ】
2013522800.tif 000045
【図７Ｅ】
2013522800.tif 000046
【国際調査報告】
2013522800.tif 000047
2013522800.tif 000048
2013522800.tif 000049
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2013522800.tif 000051
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