(57)【要約】  植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）細胞遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、ウイルス由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物である。これらのポリヌクレオチド構築物を含む発現カセット、ベクター、ならびにトランスジェニック植物および植物の部分もまた提供する。本発明のポリヌクレオチド構築物および発現カセットを用いて、植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、ウイルス由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドと、を含む、ポリヌクレオチド構築物。
【請求項２】
前記ウイルスは植物ウイルスである、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項３】
前記ウイルスはＲＮＡウイルスである、請求項２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項４】
前記ウイルスは、第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのメンバーであり、前記ウイルス由来の前記翻訳エンハンサー要素は、前記ウイルスのリーダー配列（５’ＵＴＲ）を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項５】
前記ウイルスは、トバモウイルス属のメンバーであるか、またはポティウイルス科、ブロモウイルス科、およびトンブスウイルス科からなる群から選択されるファミリーのメンバーである、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項６】
前記ウイルスは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）、およびトウモロコシえそ条斑病ウイルス（ＭＮｅＳＶ）からなる群から選択される、請求項５に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項７】
前記ウイルスはＴＭＶであり、前記ＴＭＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号１に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項８】
前記ウイルスはＴＥＶであり、前記ＴＥＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号２または配列番号１８に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号２または配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項９】
前記ウイルスはＡＭＶまたはＭＮｅＳＶであり、前記ＡＭＶまたは前記ＭＮｅＳＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、それぞれ配列番号３または配列番号１９に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号３または配列番号１９に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０】
細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１１】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、単子葉植物または双子葉植物に由来する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、タバコ、イネ、シロイヌナズナ、大豆、またはトウモロコシに由来する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号７に記載のトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、発現カセット。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、発現カセット。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結され、前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結され、前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、植物。
【請求項２０】
請求項１７に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、植物。
【請求項２１】
請求項１８に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、植物。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットは、前記植物のゲノムに安定に組み込まれ、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項１９に記載の植物。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットは、前記植物のゲノムに安定に組み込まれ、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２０に記載の植物。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットは、前記植物のゲノムに安定に組み込まれ、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２１に記載の植物。
【請求項２５】
前記細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２２に記載の植物の細胞。
【請求項２６】
前記細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２３に記載の植物の細胞。
【請求項２７】
前記細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２４に記載の植物の細胞。
【請求項２８】
ゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２２に記載の植物の種子。
【請求項２９】
ゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２３に記載の植物の種子。
【請求項３０】
ゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項２４に記載の植物の種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して植物分子生物学、特に植物における導入遺伝子の発現を増加させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年９月４日に出願された米国特許仮出願第６１／２４０，１１８号の利益を主張するものである。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式なコピーは、２０１０年９月２日に作成されたファイル名「４２４７３  ＳＥＱ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（サイズ１７ｋｂ）のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、明細書と同時に提出された。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は明細書の一部であり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
背景
植物遺伝子工学の進歩により、農学的に望ましい形質、および生存可能な組換えタンパク質の発現系としての役割を果たす能力を有する植物の生産が可能となった。これらの進歩は、それらが導入されるトランスジェニック植物において１つ以上の目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド構築物の適切な発現によるものである。先行研究は、トランスジェニック植物におけるそのような組換えポリヌクレオチド構築物の発現をもたらすのに有用なプロモーター、イントロン、および翻訳リーダー等の多くの調節要素を提供する。しかしながら、以前に特定された多くの調節要素は、選択した遺伝子の発現をトランスジェニック植物に導入したことによる本来の利益を完全に実現するために必要な組換えタンパク質の発現レベルを提供することができない。したがって、植物において所望のポリペプチドの高レベルの発現を誘導することができる新規調節要素および調節要素の組み合わせの必要性が、依然として高い。
【発明の概要】
【０００５】
植物またはその植物の部分において、目的のポリペプチドの発現を増加させるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）細胞遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、ウイルス由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物である。これらのポリヌクレオチド構築物を含む発現カセット、ベクター、ならびにトランスジェニック植物および植物の部分もまた提供する。翻訳エンハンサー要素のうちの１つ以上は、目的のポリペプチドとは異種であってもよい。異種とは、発現された目的のポリペプチドのリーダー配列（５’ＵＴＲ）に由来しない配列を指す。
【０００６】
本発明の方法は、植物またはその植物の部分に、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド構築物を導入することを含む。本発明のポリヌクレオチド構築物の発現に好適な条件下で培養した場合、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、関連するｍＲＮＡ転写物の翻訳においてより高い効率を提供する。したがって、本発明の方法は、植物またはその植物の部分において、目的のポリペプチドの発現の増加をもたらす。
【０００７】
以下の実施形態が、本発明に包含される。
１．（ａ）細胞遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、ウイルス由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドと、を含む、ポリヌクレオチド構築物。
２．前記ウイルスは植物ウイルスである、実施形態１に記載のポリヌクレオチド構築物。
３．前記ウイルスはＲＮＡウイルスである、実施形態２に記載のポリヌクレオチド構築物。
４．前記ウイルスは、第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのメンバーであり、前記ウイルス由来の前記翻訳エンハンサー要素は、前記ウイルスのリーダー配列（５’ＵＴＲ）を含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド構築物。
５．前記ウイルスは、トバモウイルス属のメンバーであるか、またはポティウイルス科、ブロモウイルス科、およびトンブスウイルス科からなる群から選択されるファミリーのメンバーである、実施形態４に記載のポリヌクレオチド構築物。
６．前記ウイルスは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）、およびトウモロコシえそ条斑病ウイルス（ＭＮｅＳＶ）からなる群から選択される、実施形態５に記載のポリヌクレオチド構築物。
７．前記ウイルスはＴＭＶであり、前記ＴＭＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号１に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態６に記載のポリヌクレオチド構築物。
８．前記ウイルスはＴＥＶであり、前記ＴＥＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号２または配列番号１８に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号２または配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態６に記載のポリヌクレオチド構築物。
９．前記ウイルスはＡＭＶまたはＭＮｅＳＶであり、前記ＡＭＶまたは前記ＭＮｅＳＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、それぞれ配列番号３または配列番号１９に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号３または配列番号１９に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態６に記載のポリヌクレオチド構築物。
１０．前記細胞遺伝子はストレス応答遺伝子である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１１．前記細胞のストレス応答遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および熱ショックタンパク質遺伝子からなる群から選択される、実施形態１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
１２．前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、単子葉植物または双子葉植物に由来する、実施形態１１に記載のポリヌクレオチド構築物。
１３．前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、タバコ、イネ、シロイヌナズナ、大豆、またはトウモロコシに由来する、実施形態１２に記載のポリヌクレオチド構築物。
１４．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
１５．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号５に記載のイネアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
１６．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号６に記載のシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号６に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
１７．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号７に記載のトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
１８．前記熱ショックタンパク質遺伝子は、単子葉植物または双子葉植物に由来する、実施形態１１に記載のポリヌクレオチド構築物。
１９．前記熱ショックタンパク質遺伝子は、トウモロコシ、大豆、またはペチュニアに由来する、実施形態１８に記載のポリヌクレオチド構築物。
２０．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号５に記載のトウモロコシ熱ショックタンパク質１０１のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１９に記載のポリヌクレオチド構築物。
２１．前記作動可能に連結されたポリヌクレオチドは、昆虫抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、非生物的ストレス耐性、酵素発現プロファイルの改変、油含有量の改変、および栄養含有量の改変からなる群から選択される表現型を付与するポリペプチドをコードする、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
２２．実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を含む、発現カセット。
２３．前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結され、前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態２２に記載の発現カセット。
２４．実施形態１のポリヌクレオチド構築物または実施形態２２の発現カセットを含む、植物。
２５．前記植物は、単子葉植物または双子葉植物である、実施形態２４に記載の植物。
２６．前記植物は、イネ、オオムギ、ジャガイモ、サツマイモ、キャノーラ、ヒマワリ、ライムギ、カラスムギ、コムギ、トウモロコシ、大豆、テンサイ、タバコ、ススキ、スイッチグラス、ベニバナ、樹木、ワタ、キャッサバ、トマト、モロコシ、アルファルファ、およびサトウキビからなる群から選択される、実施形態２５に記載の植物。
２７．前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットは、植物のゲノムに安定に組み込まれ、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、実施形態２４〜２６のいずれか１つに記載の植物。
２８．前記細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、実施形態２４〜２７のいずれか１つに記載の植物の細胞。
２９．そのゲノムに安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチド構築物または前記発現カセットを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、実施形態２４〜２８のいずれか１つに記載の種子。
３０．植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法であって、前記方法は、前記植物または前記植物の部分に、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチド構築物は、（ａ）細胞遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、ウイルス由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドと、を含む、方法。
３１．前記ウイルスは植物ウイルスである、実施形態３０に記載の方法。
３２．前記ウイルスはＲＮＡウイルスである、実施形態３１の方法。
３３．前記ウイルスは、第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのメンバーであり、前記ウイルス由来の前記翻訳エンハンサー要素は、前記ウイルスのリーダー配列（５’ＵＴＲ）を含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．前記ウイルスは、トバモウイルス属のメンバーであるか、またはポティウイルス科、ブロモウイルス科、およびトンブスウイルス科からなる群から選択されるファミリーのメンバーである、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記ウイルスは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）、およびトウモロコシえそ条斑病ウイルス（ＭＮｅＳＶ）からなる群から選択される、実施形態３４に記載の方法。
３６．前記ウイルスはＴＭＶであり、前記ＴＭＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号１に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記ウイルスはＴＥＶであり、前記ＴＥＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号２または配列番号１８に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号２または配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３５に記載の方法。
３８．前記ウイルスはＡＭＶまたはＭＮｅＳＶであり、前記ＡＭＶまたは前記ＭＮｅＳＶ由来の前記翻訳エンハンサー要素は、それぞれ配列番号３または配列番号１９に記載のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号３または配列番号１９に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３５に記載の方法。
３９．前記細胞遺伝子はストレス応答遺伝子である、実施形態３０〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記細胞のストレス応答遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および熱ショックタンパク質遺伝子からなる群から選択される、実施形態３９に記載の方法。
４１．前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、単子葉植物または双子葉植物に由来する、実施形態４０に記載の方法。
４２．前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、タバコ、イネ、シロイヌナズナ、大豆、またはトウモロコシに由来する、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４２に記載の方法。
４４．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号５に記載のイネアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４２に記載の方法。
４５．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号６に記載のシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号６に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４２に記載の方法。
４６．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号７に記載のトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼのリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４２に記載の方法。
４７．前記熱ショックタンパク質遺伝子は、トウモロコシ、大豆、またはペチュニアに由来する、実施形態４０に記載の方法。
４８．前記細胞遺伝子由来の前記翻訳エンハンサー要素は、配列番号５に記載のトウモロコシ熱ショックタンパク質１０１のリーダー配列またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記変異体は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４７に記載の方法。
４９．前記作動可能に連結されたポリヌクレオチドは、昆虫抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、非生物的ストレス耐性、酵素発現プロファイルの改変、油含有量の改変、および栄養含有量の改変からなる群から選択される表現型を付与するポリペプチドをコードする、実施形態３８〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記ポリヌクレオチド構築物は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結される、実施形態３０〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記植物は、単子葉植物または双子葉植物である、実施形態３０〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記植物は、イネ、オオムギ、ジャガイモ、サツマイモ、キャノーラ、ヒマワリ、ライムギ、カラスムギ、コムギ、トウモロコシ、大豆、テンサイ、タバコ、ススキ、スイッチグラス、ベニバナ、樹木、ワタ、キャッサバ、トマト、モロコシ、アルファルファ、およびサトウキビからなる群から選択される、実施形態５１に記載の方法。
５３．前記ポリヌクレオチド構築物は、植物またはその植物の部分のゲノムに安定に組み込まれる、実施形態３０〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記植物またはその植物の部分における前記目的のポリペプチドの発現は、野生型植物もしくはその植物の部分における、または対照植物もしくはその植物の部分における、前記目的のポリペプチドの発現と比較して、少なくとも２倍増加する、実施形態３０〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前記植物またはその植物の部分における前記目的のポリペプチドの発現は、野生型植物もしくはその植物の部分における、または対照植物もしくはその植物の部分における、前記目的のポリペプチドの発現と比較して、少なくとも４倍増加する、実施形態５４に記載の方法。
５６．（ａ）配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号１に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、ポリヌクレオチド構築物。
５７．植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法であって、前記方法は、（ａ）配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号１に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、方法。
５９．（ａ）配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号３に記載のアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、ポリヌクレオチド構築物。
６０．植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法であって、前記方法は、（ａ）配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号３に記載のアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、方法。
６１．（ａ）配列番号７に記載のトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号１に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、ポリヌクレオチド構築物。
６２．植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法であって、前記方法は、配列番号７に記載のトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号１に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、方法。
６３．（ａ）配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号１８に記載のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結される、ポリヌクレオチド構築物。
６４．植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法であって、前記方法は、（ａ）配列番号４に記載のタバコアルコールデヒドロゲナーゼの５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした、配列番号１８に記載のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲに由来する翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物であって、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ５’リーダーおよびタバコアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’リーダーが、単独で、また発現カセットとタンデムにスタッキングして、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）の発現に与える影響を示す。ウイルスの５’リーダー（すなわちΩ）を細胞の５’リーダー（すなわち５’−ＡＤＨ）の上流に配置したときに、発現の増強が観察された。テストした５つの構築物（対照ベクターは含まない）の各々について４つの植物を調べた：各バーは、個々の植物からの平均活性を表す（Ｘ軸はＥＧの活性（μｍｏｌ／分／全可溶性タンパク質のｍｇ）、Ｙ軸は各個々の植物）。
【図２Ａ】図２Ａはまた、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ５’リーダー（「Ω」とも称される）、およびタバコアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’リーダーが、単独で、また発現カセットとタンデムにスタッキングして、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）の発現に与える影響を示す。図２Ａは、生葉重ベースのエンドグルカナーゼの発現を示し、図２Ｂは、全可溶性タンパク質ベースのエンドグルカナーゼの発現を示す。ウイルスの５’リーダー配列（すなわちΩ）を細胞の５’リーダー配列（すなわち５’−ＡＤＨ）の上流に配置したときに、発現の増強が観察された。テストした５つの構築物の各々について３つ〜４つの植物を調べた（Ｘ軸はＥＧの活性（μｍｏｌ／分／ｇまたはｍｇ）、Ｙ軸は各構築物）。
【図２Ｂ】図２Ｂはまた、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ５’リーダー（「Ω」とも称される）、およびタバコアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’リーダーが、単独で、また発現カセットとタンデムにスタッキングして、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）の発現に与える影響を示す。図２Ａは、生葉重ベースのエンドグルカナーゼの発現を示し、図２Ｂは、全可溶性タンパク質ベースのエンドグルカナーゼの発現を示す。ウイルスの５’リーダー配列（すなわちΩ）を細胞の５’リーダー配列（すなわち５’−ＡＤＨ）の上流に配置したときに、発現の増強が観察された。テストした５つの構築物の各々について３つ〜４つの植物を調べた（Ｘ軸はＥＧの活性（μｍｏｌ／分／ｇまたはｍｇ）、Ｙ軸は各構築物）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための組成物および方法を対象とする。組成物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流（すなわち５’末端）に配置され、かつそれに作動可能に連結された、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素を含むポリヌクレオチド構築物を含む。作動可能に連結された目的のプロモーターとともに発現カセットに組み入れられると、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素は、関連するｍＲＮＡ転写物の翻訳効率の増加をもたらし、それによって、作動可能に連結された、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素を含まないポリヌクレオチド構築物からのポリペプチドの発現レベルと比較して、コードされた目的のポリペプチドの発現を増加させる。このように、目的のポリペプチドの増加した発現を有するトランスジェニック植物を作製および使用するための組成物および方法が本明細書に記載され、トランスジェニック植物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、少なくとも２つのタンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素を有するポリヌクレオチド構築物を含む発現カセットを含み、少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素はウイルス起源であり、少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素は細胞起源である。本発明は、異種のエンハンサーの使用を含む。
【００１０】
本明細書に記載される組成物および方法は、植物またはその植物の部分におけるタンパク質生産量の増加が必要とされる用途において使用される。そのような用途は、植物の農学的能力を向上するため、例えば、病害抵抗性、除草剤抵抗性、栄養利用、および環境ストレス耐性の増加；農学的特性を改善するため、例えば、動物およびヒトの栄養を強化するため、消化性を向上させるため、および／または処理特性を向上させるためのデンプン、油、脂肪酸、またはタンパク質含有量／組成の変更；男性不妊症、老化等の改善を開発するため；ならびに医薬品、産業酵素等の導入遺伝子発現を導入するための、代謝経路の遺伝子操作を含むが、これらに限定されない。
【００１１】
ポリヌクレオチド構築物
本発明は、植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現の増加をもたらすポリヌクレオチド構築物を対象とする。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド構築物」とは、個々の断片の形態であるか、または単鎖もしくは二重鎖形態のより大きな構築物の構成要素としての、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその修飾された形態等の、ヌクレオチドのポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、本発明にしたがって実施される方法の目標に応じて適切にＤＮＡまたはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、もしくはそのハイブリッド、または非翻訳領域および翻訳領域を含むｍＲＮＡ等のＲＮＡ分子であってもよい。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ構築物」、「遺伝子構築物」、「ポリヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド構築物」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方を意味する。
【００１２】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。第２の核酸配列と作動可能に連結された第１の核酸配列を言及する場合、本明細書で使用される「作動可能に連結される」とは、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に配置された状態を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写をもたらす場合、プロモーターはそのコード配列に作動可能に連結している。同様に、シグナルペプチドがポリペプチドの細胞外分泌をもたらす場合、シグナルペプチドのコード配列は、そのポリペプチドのコード配列に作動可能に連結している。通常、作動可能に連結された核酸配列は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合は、読み取り枠を整合させる。本発明のポリヌクレオチド構築物に関連して、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、したがって、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素が、関連するｍＲＮＡ転写物の翻訳を増加させ、それによってコードされた目的のポリペプチドの発現を増加させるという点において機能的関連性がある。いずれか特定の理論に拘束されるものではないが、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素が、ｍＲＮＡへの一次転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率、またはこれらの任意の組み合わせの処理に与える影響により、翻訳が増加され得る。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「翻訳エンハンサー要素」とは、翻訳を増強し（すなわち増加させ）、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流（すなわち、同じ核酸配列上の５’方向）に配置される、ポリヌクレオチドを意味する。翻訳エンハンサー要素は、完全に処理されたｍＲＮＡ転写物の一部としてＲＮＡに転写されるが、翻訳はされず、下流のｍＲＮＡ転写物の翻訳を容易にし（すなわち促進し）、それによってコードされた目的のポリペプチドの発現を増加させる。本発明の翻訳エンハンサー要素は、異種配列を含んでもよい。異種配列は、発現された目的の遺伝子のリーダー配列に由来しない配列である。
【００１４】
いずれか特定の理論に拘束されるものではないが、翻訳エンハンサー要素は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、熱ショックタンパク質および他の翻訳阻害因子、例えば、真核生物翻訳開始因子（ｅＩＦ−１〜４）、リボソームサブユニット、翻訳伸長因子（例えば、真核生物伸長因子（ｅＥＦ−１または−２）等の転写作用因子を補充し、最終的にｍＲＮＡ転写物の翻訳を増強すると考えられる。用語「翻訳エンハンサー要素」は、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス等のｃｉｓ作用性転写促進要素を明示的に除外する。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物内でタンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、当該技術分野において既知であるタンデムにスタッキングしたｃｉｓ作用性転写要素とは対比するものであり、後者は、作動可能に連結された、転写可能な目的のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ヘアピンＲＮＡｉ等のＲＮＡに干渉する）の転写を増加させるために、ポリヌクレオチド構築物において使用される。
【００１５】
翻訳エンハンサー要素は、得られたｍＲＮＡ転写物の翻訳を増強するそれらの能力によって、作動可能に連結されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの発現を増加させることができる翻訳リーダー配列（すなわち５’ＵＴＲ）、およびその中に位置する要素またはドメインを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「翻訳リーダー配列」、「５’ＵＴＲ」、「リーダー配列」、または「５’リーダー」とは、コード配列の転写開始部位から始まり、第１の翻訳開始コドン（通常は、ＤＮＡ配列のＡＴＧ、ｍＲＮＡ転写物のＡＵＧ）のすぐ前で終了するゲノムＤＮＡ（すなわち遺伝子）またはｍＲＮＡの上流調節領域に由来するかまたはそこから単離されたポリヌクレオチドを意味する。当業者は、翻訳リーダー配列のことを、「５’非翻訳リーダー配列（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「５’非翻訳リーダー配列（５’ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とも称する。
【００１６】
本発明の目的のために、用語「翻訳エンハンサー要素」は、Ｋｏｚａｋ配列のみを意味すると解釈されるべきではない。「Ｋｏｚａｋ配列」、「Ｋｏｚａｋコンセンサス配列」、または「Ｋｏｚａｋコンセンサス」とは、ｍＲＮＡ内の開始コドン（ＡＵＧ）を取り囲む短いコンセンサス配列を意味する。Ｋｏｚａｋは、６９９個の脊椎ｍＲＮＡに基づいて、（ＧＣＣ）ＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧがｍＲＮＡ内の機能的ＡＵＧコドンのコンテキストのためのコンセンサス配列であると提案した（コンセンサス配列は下線部）（例えば、Ｋｏｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−８１４８）を参照のこと。Ｋｏｚａｋ配列は、リボソームによって翻訳開始部位として認識され、そこからタンパク質がそのｍＲＮＡ分子によってコードされ、翻訳プロセスの開始において重要な役割を果たす（例えば、Ｄｅ  Ａｎｇｉｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２４（２）：２２４−２３１；Ｋｏｚａｋ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：２４１−２４６；Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４（２）：２８３−２９２）を参照のこと）。ウイルスのｍＲＮＡの場合、開始ＡＵＧを取り囲むＫｏｚａｋ配列は、通常ＡＣＣＡＵＧＧであり、最も一致した位置が開始コドン（ＡＵＧ）の３つ前のヌクレオチドに位置し、ほぼいつもアデニン（Ａ）ヌクレオチドに位置する。高等植物のｍＲＮＡは、ＡＣリッチコンセンサス配列ＣＡＡ（Ａ／Ｃ）ＡＡＵＧＧＣＧを有する。被子植物の２つの主要グループ間では、双子葉植物のｍＲＮＡにおけるＡＵＧコドンの内容はＡＡＡ（Ａ／Ｃ）ＡＡＵＧＧＣＵであり、これは高等植物のコンセンサスに類似するが、単子葉植物のｍＲＮＡはＣ（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）ＣＡＵＧＧＣＧをコンセンサスとして有し、これは、Ｋｏｚａｋによって提案された脊椎コンセンサスとの全体的な類似性を呈する（例えば、Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：９９３−１００１）を参照のこと。リボソームは、翻訳を開始するためにＫｏｚａｋ配列またはこの配列の変種を必要とするが、Ｋｏｚａｋ配列は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）（すなわち、メッセンジャーＲＮＡの５’キャップまたは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ））と識別可能である。したがって、５’ＵＴＲの一部分または断片が本明細書において使用するための翻訳エンハンサー要素としての役割を果たす場合、その一部分は、好適なＫｏｚａｋ配列を含んでもよいが、そのＫｏｚａｋ配列のみからなるものではない。
【００１７】
翻訳エンハンサー要素は、遺伝子のゲノムコピーから単離することができる。したがって、例えば、翻訳リーダー配列またはその中の要素もしくはドメインが、非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から単離されてもよい。代替として、翻訳を増強する翻訳リーダー配列およびその中の機能的要素またはドメイン等の翻訳エンハンサー要素は、合成的に生成された、または操作された非コードＤＮＡ要素であってもよい。本発明を実施するために有用な翻訳エンハンサー要素は、ウイルス起源または細胞起源の要素である。任意の所与の翻訳エンハンサー要素の長さは異なるが、典型的には、約２５０塩基対長（ｂｐ）未満、約２２５ｂｐ長未満、約２００ｂｐ長未満、約１７５ｂｐ長未満、または約１５０ｂｐ長未満、約１２５ｂｐ長未満、約１００ｂｐ長未満、約７５ｂｐ長未満、約５０ｂｐ長未満、または約２５ｂｐ長未満、また典型的には約１０ｂｐ長未満である。いくつかの実施形態において、任意の所与の翻訳エンハンサー要素の長さは、約１０ｂｐ〜約２５０ｂｐであり、それは例えば、約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１０５ｂｐ、１１０ｂｐ、１１５ｂｐ、１２０ｂｐ、１２５ｂｐ、１３０ｂｐ、１３５ｂｐ、１４０ｂｐ、１４５ｂｐ、１５０ｂｐ、１５５ｂｐ、１６０ｂｐ、１６５ｂｐ、１７０ｂｐ、１７５ｂｐ、１８０ｂｐ、１８５ｂｐ、１９０ｂｐ、１９５ｂｐ、２００ｂｐ、２０５ｂｐ、２１０ｂｐ、２１５ｂｐ、２２０ｂｐ、２２５ｂｐ、２３０ｂｐ、２３５ｂｐ、２４０ｂｐ、２４５ｂｐ、２５０ｂｐ、または約１０ｂｐ〜約２５０ｂｐの間の任意のそのような長さを含む。１つ以上の追加の翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングされる各翻訳エンハンサー要素が同じ長さである必要はなく、実際のことろ、典型的に翻訳エンハンサー要素は、本発明のポリヌクレオチド構築物内に含まれる天然の翻訳エンハンサー要素またはその断片の長さに応じて長さが異なる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「タンデムにスタッキングした」とは、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素および少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素が、本発明のポリヌクレオチド構築物において順次または連続的に配置されること（すなわち、一方が他方の後ろになる順序）を意味する。これは、ポリヌクレオチド構築物内に単独で（すなわち１つずつ）配置される、またはポリヌクレオチド構築物内で互いに対してランダムに配置されるウイルス性または細胞性の翻訳エンハンサー要素とは対照的である（例えば、ランダムな配置は、ウイルス性翻訳エンハンサー要素がポリペプチドコード配列の上流に位置する場合、ならびに細胞性翻訳エンハンサー要素がコード配列の下流および／またはコード配列内に位置する場合に例示される）。さらに、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素が、少なくとも１つの細胞性エンハンサー要素の上流（すなわち５’末端）に配置される。
【００１９】
ウイルス性エンハンサー要素と翻訳性エンハンサー要素とは、互いに直接隣接していること（すなわち、ウイルス性翻訳エンハンサー要素の３’末端と細胞性翻訳エンハンサー要素の５’末端の間に介在するヌクレオチドが存在しないこと）が好ましいが、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、ポリヌクレオチド構築物内で、それぞれの３’末端と５’末端の間に位置するリンカー配列を含むことができることを認識されたい。存在する場合、リンカー配列は、最大３０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長の単一ヌクレオチドであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、１〜約３０ヌクレオチド長、１〜約２５ヌクレオチド長、１〜約２０ヌクレオチド長、１〜約１５ヌクレオチド長、１〜約１０ヌクレオチド長、または１〜約５ヌクレオチド長のリンカー配列を含むことができる。他の実施形態において、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、少なくとも２ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド〜最大約２５ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド〜最大約２０ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド〜最大約１５ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド〜最大約１０ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド〜最大約５ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド〜最大約２５ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド〜最大約２０ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド〜最大約１５ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド〜最大約１０ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド〜最大約２５ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド〜最大約２０ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド〜最大約１５ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド〜最大約３０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド〜最大約２５ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド〜最大約２０ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド〜最大約２５ヌクレオチド長のリンカー配列を含むことができる。
【００２０】
本発明に特に関連するのは、ウイルス起源および細胞起源の翻訳エンハンサー要素である。いくつかの実施形態において、細胞性翻訳エンハンサー要素は、例えば動物または植物の細胞起源を含む、真核生物の細胞起源の要素である。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、（ａ）細胞遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、ウイルス由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。本明細書で使用される場合、「由来する」とは、翻訳エンハンサー配列が、ウイルスもしくは細胞遺伝子の自然発生型核酸配列から得られる（例えば単離される）こと、またはウイルスもしくは細胞遺伝子の自然発生型核酸配列から設計される（すなわち遺伝子操作される）ことのいずれかを意味する。
【００２１】
任意の既知のウイルスが、本発明の実施において使用するための翻訳エンハンサー要素の源としての役割を果たすことができる。したがって、例えばウイルスは、例えば、細菌、真菌、植物、動物、および昆虫等を含む、様々な範囲の宿主に由来し得る。ウイルスは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスであってもよい。「ＤＮＡウイルス」とは、その遺伝子材料としてＤＮＡを有し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して複製するウイルスを意味する。ＤＮＡウイルスの核酸は、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。「ＲＮＡウイルス」とは、その遺伝子材料としてＲＮＡを有するウイルスを意味する。ＲＮＡウイルスの核酸は、単鎖（ｓｓＲＮＡ）または二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡウイルスは、それらのＲＮＡのセンスまたは極性に従って、マイナスセンス（−）およびプラスセンス（＋）、またはアンビセンスのＲＮＡウイルスにさらに分類される。プラスセンスのウイルスＲＮＡはウイルスｍＲＮＡと同一であり、したがって宿主細胞により直に翻訳され得る。マイナスセンスのウイルスＲＮＡは、ｍＲＮＡに相補的であり、したがって、翻訳の前にＲＮＡポリメラーゼによりプラスセンスのＲＮＡに変換されなければならない。アンビセンスＲＮＡウイルスは、プラス鎖からの遺伝子も翻訳すること以外は、マイナスセンスのＲＮＡウイルスに類似する。したがって、ウイルス性翻訳エンハンサー要素は、いずれのウイルス源に由来してもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ウイルス性翻訳エンハンサー要素は植物ウイルスに由来する、すなわち、ウイルスの宿主生物は植物である。これらの実施形態のいくつかにおいて、翻訳エンハンサー要素はＲＮＡ植物ウイルスに由来する。任意のＲＮＡ植物ウイルスが、ウイルス性翻訳エンハンサー要素の起源としての役割を果たすことができる。
【００２３】
目的のＲＮＡ植物ウイルスは、ウイルスのボルティモア分類システムによる第ＩＶ群のウイルスのメンバーを含むが、これに限定されない。ボルティモア分類システムは、ウイルスの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、鎖の数（単鎖または二重鎖）、センス（すなわち極性）、および複製の方法の組み合わせに応じて、ウイルスを７群のうちの１つに分類する。ボルティモア第ＩＶ群ウイルスは、プラスセンス（＋）単鎖（ｓｓ）ＲＮＡゲノムを保有する（第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡウイルスと称される）。第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡ植物ウイルスの例として、ブロモウイルス科、ポティウイルス科、およびトンブスウイルス科の植物ウイルス、ならびにトバモウイルス属の植物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ブロモウイルス科の例示的なメンバーとして、アルファモウイルス属、アニュラウイルス（Ａｎｕｌａｖｒｉｕｓ）属、イラルウイルス属、ブロモウイルス属、ククモウイルス属、およびオレアウイルス属のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ポティウイルス科の例示的なメンバーとして、ポティウイルス属、ライモウイルス属、バイモウイルス属、マクルラウイルス属、イポモウイルス属、およびトリティモウイルス属のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。トンブスウイルス科の例示的なメンバーとして、トンブスウイルス属、カーモウイルス属、ネクロウイルス属、ダイアントウイルス属、マクロモウイルス属、アベナウイルス属、およびパニコウイルス属のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、植物ウイルスの分類については目下検討中であり、このウイルスの科および属のメンバーのリストは、本発明の実施において使用するためのウイルス性翻訳エンハンサー要素の植物ウイルス源の範囲を制限することを意図するものではなく、ＲＮＡ植物ウイルス由来の任意の好適な翻訳エンハンサー要素が、本明細書に記載される様式で本発明を実施するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、ウイルス性翻訳エンハンサー要素は、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ：ブロモウイルス科）、タバコ条斑病ウイルス（ＴＳＶ：ブロモウイルス科）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ：ブロモウイルス科）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：ブロモウイルス科）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ：ポティウイルス科）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ：ポティウイルス科）、ドクムギモザイクウイルス（ポティウイルス科）、オオムギ縞萎縮病（ポティウイルス科）、ハリグワモザイクウイルス（ポティウイルス科）、サツマイモ微斑ウイルス（ＳＰＭＭＶ：ポティウイルス科）、コムギ条斑モザイクウイルス（ＷＳＭＶ：ポティウイルス科）、トウモロコシえそ条斑病ウイルス（ＭＮｅＳＶ；トンブスウイルス科）、トマト矮化病ウイルス（ＴＢＳＶ；トンブスウイルス科）；カーネーション輪点ウイルス（ＣＲＳＶ：トンブスウイルス科）；アカツメクサ壊死モザイクウイルス（トンブスウイルス科）、スイートクローバー壊死モザイクウイルス（トンブスウイルス科）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ：トバモウイルス属）、Ｕ２−タバコモザイクウイルス（Ｔ２ＭＶ：トバモウイルス属）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ；トバモウイルス属）、キュウリ緑斑モザイクウィルス（ＣＧＭＭＶ：トバモウイルス属）、キュウリウイルス４（ＣＶ４：トバモウイルス属）、フランジパニウイルス（ＦＶ：トバモウイルス属）、オドントグロッサム輪点ウイルス（ＯＲＳＶ：トバモウイルス属）、ヘラオオバコモザイクウイルス（ＨＲＶ：トバモウイルス属）、サンヘンプモザイクウイルス（ＳＨＭＶ：トバモウイルス属）、テンサイそう根病（ＢＮＹＶＶ：暫定的にトバモウイルス属に割り当てられる）、ニコチアナ・ベルチナモザイクウイルス（ＮＶＭＶ：暫定的にトバモウイルス属に割り当てられる）、ラッカセイクランプウイルス（ＰＣＶ：暫定的にトバモウイルス属に割り当てられる）、ジャガイモモップトップウイルス（ＰＭＴＶ：暫定的にトバモウイルス属に割り当てられる）、土壌感染性ムギ類萎縮ウイルス（ＳＢＷＭＶ：暫定的にトバモウイルス属に割り当てる）からなる群から選択される、第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡウイルスに由来する。上記の第ＩＶ群（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのリストは、本発明において使用するための翻訳エンハンサー要素が由来し得るウイルス源の例に過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００２４】
ウイルス起源の翻訳エンハンサー要素は、当該技術分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素を含んでもよく、ウイルス性翻訳エンハンサー要素は、ピコルナウイルスの翻訳リーダー配列、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の５’リーダー（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルスの翻訳リーダー配列、例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’リーダー（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０、およびＧａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５：２３３−２３８）；トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）の５’リーダー（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）；ジャガイモエッチウイルス（ＰＥＶ）の５’リーダー（Ｔｏｍａｓｈｅｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２７１７−２７２４）；ジャガイモウイルスＳのゲノムＲＮＡ由来の翻訳リーダー（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｖｉｒｏｌ．１４４（７）：１４５１−１４６１）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の翻訳リーダー配列（ＡＭＶ  ＲＮＡ４の５’リーダー）（Ｊｏｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５；米国特許第６，０３７，５２７号）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’リーダー（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３２５７−３２７３；Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８８３−８９３；Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４６３１−４６３８；米国特許第５，４８９，５２７号）；トウモロコシえそ条斑病ウイルス（ＭＮｅＳｖ）の５’リーダー（Ｌｏｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓ．８４：１１３３−１１３９；配列番号１９）；およびトウモロコシ退緑斑紋（ＭＣＭＶ）の５’リーダー（Ｌｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８１：３８２−３８５）を含んでもよい。
【００２５】
ＲＮＡウイルス起源の翻訳エンハンサー要素（例えば、ＴＭＶの５’リーダー）は、例えば、Ｔ4ＲＮＡリガーゼを使用して、細胞性翻訳エンハンサー要素と、目的のポリペプチドをコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドに相補的な、適切なｍＲＮＡ転写物の上流にそれらを連結することにより、本発明のポリヌクレオチド構築物を調製するためにそのように使用することができることを認識されたい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド構築物は、発現カセットまたは発現ベクターにおいて使用するために設計され、その場合、ＲＮＡウイルス起源の翻訳エンハンサー要素は、相補的ＤＮＡの形態で使用される。ＲＮＡウイルス性翻訳エンハンサー要素のｃＤＮＡは、当業者に既知の従来方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡウイルス性翻訳エンハンサー要素のｃＤＮＡは、発現カセットまたは発現ベクターに組み込むために化学的に合成される。したがって、本発明の目的のために、ウイルス起源の翻訳エンハンサー要素を含むポリヌクレオチド構築物は、その翻訳エンハンサー要素のＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列の存在を包含する。
【００２６】
細胞遺伝子の翻訳エンハンサー要素もまた、当該技術分野において既知であり、いずれの細胞遺伝子に由来してもよい。本明細書において特に関連するのは、特定の宿主細胞内で高度に発現される細胞遺伝子の翻訳エンハンサー要素である。いずれかの理論または作用機序に拘束されるものではないが、高度に発現される遺伝子由来の翻訳エンハンサー要素は、より高いレベルで機能し得る。高度に発現される遺伝子は、発現されたときに、細胞のｍＲＮＡの少なくとも１０％を占める遺伝子として定義されてもよい。代替として、高度に発現される遺伝子は、発現されたときに、特定の細胞または組織型の全可溶性タンパク質の１％より多くを占めるタンパク質をコードしてもよい。いくつかの実施形態において、高度に発現される遺伝子は、発現されたときに、特定の細胞または組織型の全可溶性タンパク質の１％より多くを占めるタンパク質をコードしてもよく、細胞のｍＲＮＡの少なくとも１０％を占めなくてもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、翻訳エンハンサー要素は、例えば、動物または植物細胞のストレス応答遺伝子を含む、細胞のストレス応答遺伝子に由来する。本明細書で使用される場合、「ストレス応答遺伝子」とは、生物の成長、発達、または生産性に有害な影響を及ぼす外的条件によって上方制御される遺伝子を意味する。そのようなストレスは、生物的（他の生物によって課せられる）または非生物的（物理的または化学的環境における過剰もしくは不足から生じる）のいずれかであり得、例えば、太陽エネルギーの不足または過剰、栄養不足、土壌の塩分、高温（暑さおよび乾燥）および低温（寒さおよび凍結）、酸化ストレス、または汚染（例えば重金）であり得る。ストレス応答遺伝子の例として、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アブシジン酸（ＡＢＡ）遺伝子、および熱ショックタンパク質遺伝子を含むが、これらに限定されない（例えば、米国特許第７，１０９，０３３号；Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：６１−７２；Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｆｕｎｃｔ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃ．２：２８２−２９１；およびＳｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３１：２７９−２９２を参照のこと（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる））。
【００２８】
このように、本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素を含むことができ、細胞性翻訳エンハンサー要素は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）由来の翻訳リーダー配列、例えば、タバコＡＤＨ遺伝子の翻訳リーダー配列（ＮｔＡＤＨの５’リーダー；Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９８（１）：１−８）、イネＡＤＨ２遺伝子の翻訳リーダー配列（ＯｓＡＤＨ２の５’リーダー；Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０５（３）：３００−３０２）、シロイヌナズナＡＤＨ遺伝子の翻訳リーダー配列（ＡｔＡＤＨの５’リーダー；Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０５（３）：３００−３０２）、およびトウモロコシＡＤＨ１遺伝子の翻訳リーダー配列（ＡＤＨ１の５’リーダー）；ならびに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）遺伝子由来の翻訳リーダー配列、例えば、トウモロコシＨＳＰ１０１遺伝子の翻訳リーダー配列（ＨＳＰ１０１の５’リーダー；Ｎｉｅｔｏ−Ｓｏｔｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ  ２３０：１８７−１９５）、およびペチュニアＨＳＰ７０、大豆ＨＳＰ１７．９、トウモロコシＨＳＰ７０遺伝子の翻訳リーダー配列を含んでもよい（例えば、参照により、本明細書にその全体が組み込まれる米国特許第５，６５９，１２２号および５，３６２，８６５号を参照のこと）。他の好適な細胞性翻訳エンハンサー要素は、タバコ光化学系Ｉ遺伝子ｐｓａＤｂの翻訳リーダー配列（ｐｓａＤｂの５’リーダー；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２１）：１２４６６−１２４７０）、Ｆｅｄ−１の５’リーダー（Ｄｉｃｋｅｙ（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：２３１１−２３１７）、およびリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＲｂｃＳ）の５’リーダー（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９−５８）を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、翻訳エンハンサー要素は、上記翻訳リーダー配列を含むが、これらに限定されない翻訳リーダー配列である。本発明のポリヌクレオチド構築物において使用するための翻訳リーダー配列は、完全長の天然の（すなわち自然発生型の）５’ＵＴＲ配列であってもよいが、これらのリーダー配列の機能的断片および変種が、請求される発明を実施するために使用されてもよいことを認識されたい。したがって、本明細書に記載される天然の翻訳リーダー配列は、少なくとも１つの他の翻訳エンハンサー要素とタンデムに使用されたときに、その機能が破壊されず、変異体または切断された配列が目的のポリペプチドの発現を増加させる能力を保持する限り、翻訳エンハンサーとしてのそれらの機能が修飾される（すなわち、増加されるかまたは減少される）ように、（例えば、置換、挿入、または欠質により）変異されてもよいか、または（５’末端および／または３’末端で）切断されてもよい。変化（すなわち、置換、挿入、欠失、または切断）を受け易い天然の翻訳リーダー配列内のこれらの領域、または機能的断片を意味する天然の翻訳リーダーのこれら部分の特定は、例えば、標準的な突然変異分析を用いて当業者により容易に決定される。例えば、Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（３）：８８３−８９３を参照のこと。したがって、以下の考察は、完全長の天然の翻訳リーダー配列を翻訳エンハンサー要素として含むポリヌクレオチド構築物に言及するが、開示される各実施形態は、これらの翻訳リーダー配列の機能的変異体および断片の使用を企図し、これらの変異体および断片は、本明細書の他の箇所に記載されるように定義される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、タバコモザイクウイルスの翻訳リーダー配列（ＴＭＶの５’リーダー）の少なくとも１つのコピーと、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。Ωとも称されるＴＭＶの５’リーダーは、ＴＭＶのゲノムＲＮＡ由来の６８塩基対（ｂｐ）配列である（例えば、Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１；Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：３２５７−３２７３を参照のこと）。ΩのｃＤＮＡ配列は、配列番号１に記載される。Ωリーダー配列は、高度に構造化されている：８塩基（５’−ＡＣＡＡＵＵＡＣ−３’）直列反復配列の３つのコピーおよび２７塩基ポリ（ＣＡＡ）領域の１つのコピー（５’の８塩基直列反復配列と、この反復配列の他の２つのコピーとの間に位置する）が、このリーダーの７２％を占める（Ｇａｌｌｉｅ（１９９６）”Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，”ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒｓ１−３，ｅｄ．Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎ（Ｗｉｌｅｙ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）。４つの異なるＴＭＶ株由来の５’非翻訳リーダー配列は長さが異なるが、それらは全て、ほぼ等しい反復配列およびポリ（ＣＡＡ）配列を含有する（Ｋｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９８：６１−６６；およびＧｏｅｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５８１８−５８２２）。
【００３１】
本明細書の他の箇所に記載されるように、ＴＭＶの５’リーダーの機能的変異体および断片は、本発明のポリヌクレオチド構築物に使用されてもよく、細胞遺伝子の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングしたときに、なおも目的のポリペプチドの発現増加をもたらす。Ωの機能分析により、作動可能に連結された読み取り枠のインビボでの翻訳の増強に寄与する主な要素として、ポリ（ＣＡＡ）領域が同定された（Ｇａｌｌｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｌｂｏｔ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４６３１−４６３８；およびＧａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８８３−８９３）。Ωリーダー配列の機能的変異体および断片は、当該技術において既知であり、例えば、欠失変異体ΩΔ１（配列番号１のｎｔ２〜９を欠損する１）、ΩΔ２（配列番号１のｎｔ１２〜１９に対応する最初の８塩基直列反復配列を欠損する１）、ΩΔ３（配列番号１のｎｔ２０〜４２に対応する２７ｂｐポリ（ＣＡＡ）領域のｎｔ１〜２３を欠損する１）、ΩΔ４（配列番号１のｎｔ４７〜５４に対応する２番目の８塩基直列反復配列を欠損する１）、ΩΔ５（（配列番号１のｎｔ６０〜６７に対応する３番目の８塩基直列反復配列を欠損する１）、ならびにΩＡ，Ｃ→Ｕ（ポリ（ＣＡＡ）領域のポリ（Ｕ）による置換）およびΩＡ→Ｃ（５’の８塩基直列反復配列のＡＵＵ配列における単一塩基置換、ＡＵＵをＣＵＵで置換）として表される変異体配列を含むが、これらに限定されない。ΩΔ３欠質変異体および変異ΩＡ、Ｃ→Ｕ配列は機能的であるが、この翻訳エンハンサー要素によって提供される翻訳効率の増加を最大化するために、好ましくは、ポリ（ＣＡＡ）領域がΩリーダー配列の断片または変異体内に保持される。例えば、Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）（上記参照）を参照のこと。
【００３２】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、タバコエッチウイルスの翻訳リーダー配列（ＴＥＶの５’リーダー）の少なくとも１つのコピーと、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）はポティウイルスであり、植物に感染するプラス鎖ＲＮＡウイルスのピコルナウイルススーパーグループのメンバーである。ＴＥＶのゲノムＲＮＡは、５’キャップ構造を自然に欠損するポリアデニル化ｍＲＮＡであるが、それにもかかわらず効率的に翻訳される。１４３塩基対（ｂｐ）のＴＥＶの５’リーダー（配列番号２に示されるは、ｍＲＮＡにキャップ非依存性翻訳をもたらすのに十分であり（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄ（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４：１５９０−１５９７；Ｇａｌｌｉｅ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：１２１４１−１２１５２）、ポリ（Ａ）テールと相互作用して翻訳を促進するという点において、キャップと機能的に類似する（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５：２３３−２３８）。１４３−ｂｐ  ＴＥＶの５’リーダー内で中央に位置する２つのキャップ非依存性調節要素（ＣＩＲＥ）は、キャップ非依存性翻訳を誘導するために必要であり、単一の翻訳リーダーとして使用される場合、その両方ともが、ポリ（Ａ）テールと機能的に相互作用して最適な翻訳を促進することが必要である（Ｎｉｅｐｅｌ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｅ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９０８０−９０８８）。これらのＣＩＲＥは、配列番号２のｎｔ２８〜６５（ＣＩＲＥ−１）およびｎｔ６６〜１１８（ＣＲＩＥ−２）内に配置される。
【００３３】
機能的なＴＥＶの５’リーダーは、１４４−ｂｐ長であると報告されており（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄ（１９９０）（上記参照）を参照）、該配列は配列番号２に示されるものと同一であるが、配列番号２の１位の前に挿入されたチミン（ｔ）ヌクレオチドを含む（配列番号１８に記載の１４４ｂｐ配列を参照のこと）。１８）．したがって、１４４−ｂｐ  ＴＥＶの５’リーダーは、配列番号２に示される１４３−ｂｐ  ＴＥＶの５’リーダーの最初の５つのヌクレオチド（すなわち、５’−ａａａｔａ−３’）とは対照的に、その５’末端に以下の５つのヌクレオチドを有する：５’−ｔａａａｔ−３’。ＣＩＲＥの位置についての上記説明およびＴＥＶのリーダーの変異体および断片に関する以下の考察は、配列番号２に示される１４３−ｂｐ配列に関するものである。上記ＣＩＲＥならびに以下の変異体および断片について記載されるように、１４３−ｂｐ配列におけるヌクレオチド（ｎｔ）の位置は、配列番号２に示される１４３−ｂｐ配列の５’末端に単一ヌクレオチドを挿入するように位置を調節することにより、１４４−ｂｐ配列において特定することができることを認識されたい。したがって、例えば、ＣＩＲＥ−１が配列番号２のｎｔ２８〜６５内に配置される場合、１４４−ｂｐ  ＴＥＶの５’リーダー内の対応する位置は、配列番号１８のｎｔ２９〜６６である。１４４−ｂｐ  ＴＥＶの５’リーダーはまた、本発明のポリヌクレオチド構築物内でウイルス性翻訳エンハンサー要素の源としても使用できることを理解されたい。
【００３４】
したがって、ＴＥＶリーダーの変異体および断片は、これらのＣＩＲＥのうちの少なくとも１つ、好ましくはこれらのＣＩＲＥの両方を含む限り、本発明のポリヌクレオチド構築物に使用されてもよい。ＴＥＶリーダーの機能的断片は、当該技術分野において既知であり、欠失変異体ＴＥＶ28-143（配列番号２のｎｔ１〜２７を欠損する２）、ＴＥＶ1-118（配列番号２のｎｔ１１９〜１４３を欠損する、ＴＥＶ28-118（配列番号２のｎｔ１〜２７および１１９〜１４３を欠損する）、ＴＥＶ1-65（配列番号２の６６〜１４３を欠損する、ＴＥＶ66-143（配列番号２のｎｔ１〜６５を欠損する、ＴＥＶ28-65（配列番号２のｎｔ１〜２７および６６〜１４３を欠損する）、ならびにＴＥＶ66-118（配列番号２のｎｔ１〜６５を欠損する）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｎｉｅｐｅｌ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｅ（１９９９）（上記参照）を参照のこと。
【００３５】
さらに他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質（ＣＰ）ｍＲＮＡ由来の翻訳リーダー配列（ＡＭＶ  ＲＮＡ４の５’リーダー）の少なくとも１つのコピーと、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。３６塩基対のＡＭＶ  ＲＮＡ４の５’リーダーは、配列番号３に記載される。他の翻訳エンハンサー要素の場合、本発明のポリヌクレオチド構築物は、本明細書の他の箇所に定義されるように、ＡＭＶ  ＲＮＡ４の５’リーダーの機能的変異体および断片を含んでもよい。
【００３６】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、トウモロコシえそ条斑病ウイルス由来の翻訳リーダー配列（ＭＮｅＳＶの５’リーダー）の少なくとも１つのコピーと、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。１２２塩基対のＭＮｅＳＶの５’リーダーは、配列番号１９に記載される。他の翻訳エンハンサー要素の場合、本発明のポリヌクレオチド構築物は、本明細書の他の箇所に定義されるように、ＭＮｅＳＶの５’リーダーの機能的変異体および断片を含んでもよい。
【００３７】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の翻訳エンハンサー要素は、当該技術分野において既知であり、配列番号４に記載のタバコＡＤＨ遺伝子の８４−ｂｐ翻訳リーダー配列（ＮｔＡＤＨの５’リーダー）、配列番号５に記載のイネＡＤＨ２遺伝子の翻訳リーダー配列（ＯｓＡＤＨ２の５’リーダー）、配列番号６に記載のシロイヌナズナＡＤＨ遺伝子の翻訳リーダー配列（ＡｔＡＤＨの５’リーダー）、配列番号７に記載のトウモロコシＡＤＨ遺伝子の翻訳リーダー配列（ＡＤＨの５’リーダー）、またはそれらの機能的変異体または断片を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
さらに他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、（ａ）熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）遺伝子由来の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。熱ショックタンパク質遺伝子由来の翻訳エンハンサー要素は、当該技術分野において既知であり、配列番号８に記載のトウモロコシＨＳＰ１０１遺伝子の翻訳リーダー配列（ＨＳＰ１０１の５’リーダー）、ならびに、それぞれ配列番号９，１０、および１１に記載のトウモロコシＨＳＰ７０、ペチュニアＨＳＰ７０、および大豆ＨＳＰ１７．９遺伝子の翻訳リーダー配列（例えば、米国特許第５，６５９，１２２号および第５，３６２，８６５号を参照のこと（参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる））、またはその機能的変異体もしくは断片を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号４、５、６、および７に記載のタバコ、イネ、シロイヌナズナ、およびトウモロコシＡＤＨの５’リーダーからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、それぞれ、配列番号１、２（または１８）、３、および１９に記載のＴＭＶ、ＴＥＶ、ＡＭＶ  ＲＮＡ４およびＭＮｅＳＶの５’リーダー配列から選択される少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物を提供する。これらの実施形態のいくつかにおいて、本発明のポリヌクレオチド構築物は、配列番号４に記載のタバコＡＤＨの５’リーダー（または、本明細書において後に定義される、その機能的断片もしくは変異体）とタンデムにスタッキングした、配列番号１に記載のＴＭＶのΩ５’リーダー（または、本明細書において後に定義される、その機能的断片もしくは変異体）と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。
【００４０】
他の実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号８、９、１０および１１に記載のトウモロコシＨＳＰ１０１遺伝子、トウモロコシＨＳＰ７０遺伝子、ペチュニアＨＳＰ７０遺伝子、および大豆ＨＳＰ１７．９遺伝子の５’リーダーからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、それぞれ、配列番号１、２（または１８）、３および１９に記載のＴＭＶ、ＴＥＶ、ＡＭＶ、およびＭＮｅＳＶの５’リーダーから選択される少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチド構築物を提供する。これらの実施形態のいくつかにおいて、本発明のポリヌクレオチド構築物は、配列番号８に記載のトウモロコシＨＳＰ１０１の５’リーダー（または、本明細書において後に定義される、その機能的断片もしくは変異体）とタンデムにスタッキングした、配列番号１に記載のＴＭＶのΩ５’リーダー（または、本明細書において後に定義される、その機能的断片もしくは変異体）と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む。
【００４１】
上記の通り、ウイルスまたは細胞の５’ＵＴＲの機能的断片および変異体は、本発明のポリヌクレオチド構築物内で翻訳エンハンサー要素として用いることができる。本明細書で使用される場合、「機能的」とは、本発明のポリヌクレオチド構築物内で他の翻訳エンハンサー要素（同様に完全長の５’ＵＴＲの断片または変異体であってもよい）とタンデムにスタッキングしたときに、断片または変異核酸配列が目的のポリペプチドの発現増加をもたらすことができることを意味する。本明細書で使用される場合、「断片」とは、目的の５’ＵＴＲの任意の部分を意味する。５’ＵＴＲの断片は、少なくとも約１０個の隣接するヌクレオチドから完全長の５’ＵＴＲに存在するヌクレオチドの数までの範囲であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲの断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０個の隣接するヌクレオチドの長さであるか、または約５個の隣接するヌクレオチドから完全長の５’ＵＴＲよりも１つ少ないヌクレオチドまでの間の任意のそのような値である。
【００４２】
したがって、例えば、ウイルス性翻訳エンハンサー要素が、ＴＭＶの５’ＵＴＲ（Ω；配列番号１）、ＴＥＶの５’ＵＴＲ（配列番号２もしくは配列番号１８を参照）、ＡＭＶの５’ＵＴＲ（配列番号３）またはＭＮｅＳＶの５’ＵＴＲである場合、この配列の断片は、本発明のポリヌクレオチド構築物内で少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングしたときに機能的である限り、すなわち、目的のポリペプチドの発現を増加させることが可能である限り、細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムに連結することができる。Ωの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５個、または完全長のΩ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号１に記載される６８個のヌクレオチドのうちの６７個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。ＴＥＶの５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０個、または完全長のＴＥＶの５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号２に記載される１４３個のヌクレオチドのうちの１４２個までの隣接するヌクレオチド、または配列番号１８に記載される１４４個のヌクレオチドのうちの１４３個の隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。ＡＭＶの５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０個、または完全長のＴＥＶの５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号３に記載される３６個のヌクレオチドのうちの３５個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。ＭＮｅＳＶの５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、または完全長のＭＮｅＳＶの５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号１９に記載される１２２個のヌクレオチドのうちの１２１個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。
同様に、細胞性翻訳エンハンサー要素が、例えば、タバコＡＤＨの５’ＵＴＲ（配列番号４を参照）、イネＡＤＨ２の５’ＵＴＲ（配列番号５を参照）、シロイヌナズナＡＤＨの５’ＵＴＲ（配列番号６を参照）、トウモロコシＡＤＨの５’ＵＴＲ（配列番号７を参照）、トウモロコシ熱ショックタンパク質１０１（ＨＳＰ１０１）の５’ＵＴＲ（配列番号８を参照）、トウモロコシ熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の５’ＵＴＲ（配列番号９を参照）、ペチュニア熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の５’ＵＴＲ（配列番号１０を参照）、または大豆熱ショックタンパク質１７．９（ＨＳＰ１７．９）の５’ＵＴＲ（配列番号１１を参照）である場合、この配列の断片は、本発明のポリヌクレオチド構築物内で少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングしたときに機能的である限り、すなわち、目的のポリペプチドの発現を増加させることが可能である限り、ウイルス性翻訳エンハンサー要素とタンデムに連結することができる。タバコＡＤＨの５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０個、または完全長のタバコＡＤＨの５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号４に記載される８４個のヌクレオチドのうちの８３個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。イネＡＤＨ２の５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５個、または完全長のイネＡＤＨ２の５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号５に記載される１０１個のヌクレオチドのうちの１００個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。シロイヌナズナＡＤＨの５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５個、または完全長のシロイヌナズナＡＤＨの５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号６に記載される５８個のヌクレオチドのうちの５７個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。トウモロコシＡＤＨの５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５個、または完全長のトウモロコシＡＤＨの５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号７に記載される１０７個のヌクレオチドのうちの１０６個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。トウモロコシＨＳＰ１０１の５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００個、または完全長のトウモロコシＨＳＰ１０１の５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号８に記載される２０６個のヌクレオチドのうちの２０５個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。トウモロコシＨＳＰ７０の５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５個、または完全長のトウモロコシＨＳＰ７０の５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号９に記載の１０７個のヌクレオチドのうちの１０６個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。ペチュニアＨＳＰ７０の５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個、または完全長のペチュニアＨＳＰ７０の５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号１０に記載される９６個のヌクレオチドのうちの９５個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。大豆ＨＳＰ１７．９の５’ＵＴＲの場合、そのような断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０個、または完全長の大豆ＨＳＰ１７．９の５’ＵＴＲ配列に存在するよりも１つ少ないヌクレオチド（すなわち、配列番号１１に記載される７２個のヌクレオチドのうちの７１個までの隣接するヌクレオチド）を含んでもよい。
【００４３】
本明細書で使用される場合、５’ＵＴＲの「変異体」とは、その５’ＵＴＲ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１８、または１９に記載の５’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列またはその断片との実質的な類似性を有する配列を意味する。５’ＵＴＲの場合、これらのような自然発生型の変異体は、例えば、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション技術を用いた周知の分子生物学的技術の使用により特定することができる。変異ヌクレオチド配列は、例えば部位特異的変異誘発（その技術もまた、当業者に周知である）を使用することにより産生されるような、合成的に誘導されたヌクレオチド配列を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５）を参照のこと（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４４】
通常、配列番号１〜１１、１８、および１９のうちのいずれかの変異体を含む特定の５’ＵＴＲの変異体は、デフォルトのパラメータを使用して本明細書において後述する配列アラインメントプログラムにより決定されるように、その特定のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、通常、少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。目的の５’ＵＴＲの変異体は機能的である、つまり、本発明のポリヌクレオチド構築物内で他の翻訳エンハンサー要素（同様に完全長の５’ＵＴＲの断片または変異体であってもよい）とタンデムにスタッキングしたときに、変異体は目的のポリペプチドの発現増加をもたらすことができる。生物学的に活性な変異体は、例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を有する天然のまたは自然発生型の５’ＵＴＲを含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、２つの核酸配列に関連して「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較ウィンドウ上で最大一致のために整合させたときに同じである２つの配列のヌクレオチドを言及する。本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、ポリヌクレオチド配列の隣接する特定のセグメントであり、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。通常、比較ウィンドウは、少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドの長さであり、任意選択的に３０、４０、５０、１００ヌクレオチドまたはそれより長くてもよい。
【００４６】
比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。したがって、任意の２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．のローカルアラインメントアルゴリズム（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズム（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎのローカルアラインメント検索法（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７において改変）である。
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータへの実装は、配列同一性を決定するための配列の比較に利用することができる。そのような実装は、限定されないが、以下を含む：ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより入手可能）のＣＬＵＳＴＡＬ；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手可能）のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォルトのパラメータを使用して実行することができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド構築物の構築、およびそれらの目的の発現カセットへの挿入は、当該技術分野において周知の遺伝子操作技術を使用して行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）（上記参照）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）を参照のこと。さらに、ポリヌクレオチド構築物を植物に導入するのに好適な組換えベクターを調製するための手段は、当該技術分野において周知である。本明細書で使用される場合、「ベクター」、「構築物」、または「ベクター構築物」とは、植物形質転換の目的で、すなわち、宿主植物細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入する目的で使用され得る、任意の組換えポリヌクレオチド構築物を意味する。例えば、米国特許  第４，９７１，９０８号、第４，９４０，８３５号、第４，７６９，０６１号、および第４，７５７，０１１；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  １９８８）；Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、（上記参照）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、（上記参照）に記載されるベクターを参照のこと。核酸を植物に導入するために有用な典型的な構築物は、当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド由来のベクターを含む（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２５３−２７７）。
本発明のポリヌクレオチド構築物は、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素が目的のポリペプチドの発現に与える影響を評価するための一過性アッセイにおいて用いることができる。目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物に作動可能に連結された、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素を含むｍＲＮＡは、当業者に既知の標準的な方法を使用して、例えば、対応するｃＤＮＡのインビトロ転写によって構築することができ、得られたｍＲＮＡを目的の植物細胞に導入してｍＲＮＡの翻訳をモニタリングすることができる。例えば、Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１、およびＪｏｂｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｈｒｋｅ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５に記載される一過性アッセイを参照のこと。
【００４８】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、発現カセット内に組み入れられ、コードされた目的のポリペプチドの一過性または安定したインビボ転写および翻訳のために目的の植物に導入される。
【００４９】
発現カセット
本発明のポリヌクレオチド構築物は、目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現をもたらす調節要素に作動可能に連結することができる。このように、本発明は、（ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素と、（ｂ）目的のポリペプチドをコードする、作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む本発明のポリヌクレオチド構築物を含む、発現カセットおよび発現ベクターを提供する。本明細書で使用される「発現カセット」とは、適切な宿主細胞において目的のポリヌクレオチド配列の発現を誘導することができる核酸分子を意味し、したがって、目的のポリヌクレオチド配列（すなわち、本発明のポリヌクレオチド構築物）と作動可能に連結された５’および３’調節配列を含む。発現カセット内の作動可能に連結された要素は、それらの間に機能的関連性があり、したがって、発現カセット内の各要素が、その本来の機能を実行することができるように構成される。作動可能に連結された要素は、隣接していてもよいか、または隣接していなくてもよい。
【００５０】
本発明の発現カセットは、本発明のポリヌクレオチド構築物を含み、したがってキメラ構築物である、すなわち、それらの構成要素のうちの少なくとも１つの核酸配列は、それらの他の構成要素のうちの少なくとも１つの核酸配列に対して異種である（すなわち、外来性であるか、または一緒に自然発生したものではない）。したがって、例えば、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素は、異なる源（すなわち、ウイルスと細胞）に由来するため、それらは互いに異種である。同様に、調節領域、例えばプロモーターは、目的のポリペプチドのコード配列とは異種であり得る。また、本発明の発現カセット内の個々の構成要素のうちの１つ以上は、発現カセット内の別の構成要素に天然に存在し得ることも認識されたい。例えば、プロモーターは、コードされた目的のポリペプチドの自然発生型プロモーターであり得るが、２つの構成要素は、それらの天然の構成においては見出されない。
【００５１】
本発明の発現カセットは、それらが導入される植物細胞とは異種である、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は宿主植物細胞内で自然に発生しないため、形質転換事象により宿主植物細胞または宿主植物細胞の祖先に導入されていなくてはならない。いずれの場合でも、発現カセット内の個々の構成要素のうちのいずれか１つ以上は、植物宿主に天然に存在し得るか（すなわち、構成要素自体のヌクレオチド配列が、その植物宿主のゲノム内で自然発生する配列として見出され得る）、または植物宿主とは異種でり得る（すなわち、異なる生物に由来するため、または、例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、欠失、および／もしくは切断によってその元の形態から遺伝子組換えされているためのいずれかにより、構成要素自体のヌクレオチド配列が植物宿主に対して外来性である）。
【００５２】
本発明の発現カセットにおいて使用するための例示的な調節配列として、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起源、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、他の翻訳エンハンサー（例えば３’ＵＴＲ）等が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、目的の受容植物細胞において、作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドの複製および転写、ならびにその中の任意のコード配列の翻訳を集合的にもたらす。目的のポリヌクレオチドが、受容植物細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、必ずしもこれらの制御配列の全てが存在する必要はない。したがって、調節配列は、通常、特定のコード配列の適切な転写開始部位でＲＮＡの合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導することができるＴＡＴＡボックスを含むＤＮＡの調節領域であり得る。発現制御配列は、通常、ＴＡＴＡボックスの上流または５’に配置され、転写開始速度に影響を与える（例えば増強する）他の認識配列をさらに含むことができる。さらに、発現制御配列は、通常、ＴＡＴＡボックスの下流または３’に配置され、転写開始速度に影響を与える他の配列をさらに含んでもよい。
【００５３】
本発明の発現カセットは、典型的には、５’−３’の転写方向に、植物において機能的なプロモーター、作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド構築物、および作動可能に連結された、植物において機能的な翻訳終結領域を含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、安定した転換体の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含む。代替として、選択マーカーは、同じベクター上または異なるベクター上の追加の発現カセット内に提供されてもよい。発現カセットにおけるポリヌクレオチド構築物の発現は、宿主細胞がある特定の外的刺激に曝露された場合にのみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。さらに、プロモーターは、特定の組織または器官または発達段階に特異的であり得る。カセットはまた、目的の植物内に同時形質転換される、少なくとも１つの追加の目的のポリヌクレオチド（例えば、別の目的のポリペプチドのコード配列）を含有してもよい。代替として、同じベクター上または異なるベクター上の複数の発現カセットに、追加の目的のポリヌクレオチド（複数可）が提供されてもよい。本発明の発現カセットは、調節領域の転写調節下となる本発明のポリヌクレオチド構築物の挿入のための複数の制限部位および／または組換え部位とともに提供される。
【００５４】
植物細胞において機能的な（すなわち、植物細胞において、作動可能に連結した転写可能なポリヌクレオチドの発現を駆動することができる）いずれのプロモーターが、本発明のポリヌクレオチド構築物に作動可能に連結されてもよい。プロモーターは、ポリヌクレオチド構築物のコード領域の天然の（すなわち、自然発生型）プロモーターであってもよいか、またはポリヌクレオチド構築物のコード領域とは異種（すなわち、外来性または非自然発生型）のプロモーターであってもよい。プロモーターがポリヌクレオチド構築物のコード領域の自然発生型プロモーターではない場合、それは自然発生型プロモーター配列ならびに／または自然発生型コード配列の遺伝子操作のために（例えば、自然発生型プロモーター配列ならびに／またはコード配列内のヌクレオチドの置換、挿入、欠失、および／もしくは切断によって）異種であり得るか、あるいはその遺伝子の起源（例えば、別の遺伝子および／または別の生物由来のプロモーター）のために異種であり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ポリヌクレオチド構築物のコード領域の天然のプロモーターであり、両方の配列は、発現カセットが導入される植物宿主に天然に存在する（すなわち、プロモーターとコード配列は、植物宿主内で天然に見出される同じ遺伝子に由来する）。代替として、プロモーターは、ポリヌクレオチド構築物のコード領域の天然のプロモーターであるが、両方の配列は、発現カセットが導入される植物宿主とは異種である（すなわち、外来性であるか、または自然発生したものではない）（すなわち、プロモーターとポリヌクレオチド構築物のコード配列は、例えば、それらの元の配列の遺伝子操作によるため、または別の遺伝子源に由来するためのいずれかにより、両方とも植物宿主に対して外来性である）。さらに他の実施形態において、プロモーターは、コード配列とは異種であり、植物宿主に天然に存在するか（すなわち、プロモーターは植物宿主の遺伝子に由来する）、または植物宿主に対して外来性であるか（すなわち、その元の配列が遺伝子操作されているか、もしくは他の遺伝子源に由来する）のいずれかである。プロモーター、コード配列、および本発明の発現カセットが導入される植物宿主の間の上記関係（すなわち、異種対天然）は、限定的であることを意図するものではなく、実際は単なる例である。
【００５５】
本発明の発現カセットに導入されるべきプロモーターの選択は、有効性、選択可能性、誘導性、目的のポリペプチドの所望の発現レベル、およびポリペプチドの細胞または組織選択的発現を含むが、これらに限定されない、いくつかの要因に依存する。その配列に関連するプロモーターおよび他の調節領域を適切に選択して配置することにより、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的なことである。植物のゲノムＤＮＡにおいてプロモーター領域を特定して特徴付けるための方法は、例えば、Ｊｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８５５−８６６；Ｂｕｓｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８３９−８５４；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：４０３５−４０４４；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：３０９−３１６；およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１０：１０６９−１０７９に記載されるものを含む。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチド構築物の発現のために使用されるプロモーターは、以下のような要素からなる強い植物プロモーター、ウイルス性プロモーター、またはキメラプロモーターであってもよい：任意選択的に１つ以上のエンハンサー（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓエンハンサー、ＦＭＶエンハンサー、ＣＭＰエンハンサー、ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットエンハンサー、プラストシアニンエンハンサー等）に融合した、任意選択的に植物プロモーターのＴＡＴＡボックスの領域５’（組織および時間的に適切な遺伝子発現をを誘導する）に融合した、任意の遺伝子由来の（または、植物遺伝子ＴＡＴＡボックスの分析に基づく合成の）ＴＡＴＡボックス（例えば、Ｃｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５（６）：１４６８−１４７９を参照）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子由来の活性化要素（米国特許第５，９５５，６４６号を参照）。
【００５７】
代替として、目的の植物宿主細胞における遺伝子スライシングの効果を改変するために、弱い植物プロモーターを使用することができる。したがって、例えば、アンチセンスまたはヘアピンＲＮＡ干渉等の遺伝子抑制技術によって、例えば、宿主植物細胞内で目的の標的ポリペプチドの発現が阻害された場合、標的ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結された、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素を含む本発明のポリヌクレオチド構築物は、弱いプロモーターに作動可能に連結されてもよく、標的ポリペプチドの低レベル発現をもたらすための当該技術分野において既知である任意の方法によって植物宿主細胞に導入されてもよい。
【００５８】
本発明のそのような実施形態において、「弱いプロモーター」は、標的ポリペプチドの作動可能に連結されたコード配列の低レベルの発現を提供するプロモーターである。しかしながら、弱いプロモーターは、他の細胞においてではなく数個の細胞においてのみ、植物宿主内の標的ポリペプチドの全体的な低レベルの発現を生じる、作動可能に連結されたコード配列の発現をもたらすプロモーターであり得ることを認識されたい。弱い植物プロモーターは、自然発生型であり得るか、または作動可能に連結されたコード配列の発現レベルを減少するように修飾された、標的ポリペプチドの自然発生型プロモーター配列の変異体であり得るか、または標的ポリペプチドの発現の減少をもたらす自然発生型プロモーター配列の切断型であり得る。弱いプロモーターの例として、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター（ＷＯ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号）、コア３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター等が挙げられる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物の構成的発現が望ましい。構成的プロモーターは未制御であり、したがって連続的な、作動可能に連結されたポリヌクレオチド構築物の発現をもたらす。例示的な構成的プロモーターとして、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター、ならびにＷＯ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号に開示される他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２；およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）等が挙げられる。他の構成的プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号、５，６０８，１４４号、５，６０４，１２１号、５，５６９，５９７号、５，４６６，７８５号、５，３９９，６８０号、５，２６８，４６３号、５，６０８，１４２号、および６，１７７，６１１号、７，２５６，２７６号、７，５５０，５７８号に開示されるものを含み、それらの開示は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００６０】
適切な植物プロモーターまたはキメラプロモーターは、特定の組織における本発明のポリヌクレオチド構築物の発現等の用途に有用である一方で、種子または生殖組織等の他の組織における発現を最小限に抑える。例示的な細胞型選択的または組織選択的プロモーターは、標的組織において選択的に発現を駆動するが、他の細胞型または組織においてもいくらかの発現をもたらし得る。したがって、組織特異的な発現を生じるプロモーター（例えば、根、葉、および花に特異的なプロモーター）を選択することができる。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５−５０５に開示されるプロモーターを参照のこと。また、米国特許第７，２９７，８３９号および７，１２９，３９７号に記載される、色素体における選択的発現をもたらすプロモーターも参照のこと。
【００６１】
葉および茎等の緑色組織における転写を駆動するために光合成組織において活性なプロモーターもまた、本発明に包含される。最も好適なのは、そのような組織においてのみまたは優先的に発現を駆動するプロモーターである。プロモーターは、緑色組織全体にわたって構成的に、または緑色組織ごとに異なって、または発現が起こる緑色組織の発達段階ごとに異なって、または外的刺激に反応して、そのような発現をもたらし得る。
【００６２】
そのようなプロモーターの例として、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｂｃＳ）プロモーター、例えば、カラマツ由来のＲｂｃＳプロモーター（Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ）、マツｃａｂ６プロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：７７３−７７８）、コムギ由来のＣａｂ−１遺伝子プロモーター（Ｆｅｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９２１−９３２）、ホウレンソウ由来のＣＡＢ−１プロモーター（Ｌｕｂｂｅｒｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：９９７−１００６）、イネ由来のｃａｂ１Ｒプロモーター（Ｌｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：９７１−９８１）、トウモロコシ由来のピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター（Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９５８６−９５９０）、タバコＬｈｃｂ１＊２プロモーター（Ｃｅｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：２４５−２５５）、シロイヌナズナＳＵＣ２スクロース−Ｈ＋シンポータープロモーター（Ｔｒｕｅｒｎｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔａ  １９６：５６４−５７０）、およびホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質プロモーター（ｐｓａＤ、ｐｓａＦ、ｐｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ、ｃａｂ、ｒｂｃＳ）等が挙げられる。茎、葉、および緑色組織において転写を駆動する他のプロモーターは、米国特許公開第００７／０００６３４６号に記載される（参照により、本明細書にその全体が組み込まれる）。同様に、ホスフェノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードするトウモロコシ遺伝子が、当該技術分野において記載されている（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ  およびＧｒｕｌａ（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９−５８９）。標準的な分子生物学的技術を用いて、植物において緑色組織特異的な様式で本発明のポリヌクレオチド構築物の発現を駆動するために、この遺伝子のプロモーターを使用することができる。
【００６３】
本発明の他の実施形態において、誘導性プロモーターが望ましい可能性がある。誘導性プロモーターは、化学物質または環境的刺激等の外的刺激に反応して転写を駆動する。例えば、誘導性プロモーターは、環境的刺激（例えば、熱ショック遺伝子プロモーター、乾燥誘導性遺伝子プロモーター、病原体誘導性遺伝子プロモーター、傷害誘導性遺伝子プロモーター、および明期／暗期誘導性遺伝子プロモーター）、または植物成長調節物質（例えば、アブシジン酸、オーキシン、サイトカイニン、およびジベレリン酸によって誘導される遺伝子由来のプロモーター）に反応して、転写をもたらすことができる。例えば、米国特許第７，１９９，２８６号および７，２３０，１５９号を参照のこと。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチド構築物の発現を駆動するために使用することのできる他のプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オパインシンセターゼプロモーター（例えば、ｎｏｓ、ｍａｓ、ｏｃｓ等）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロース二リン酸（ＲｕｂＰ）カルボキシラーゼの小サブユニットプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、発生プロモーター（例えば、６，９５３，８４８および６，４３７，２２１を参照）、ならびに米国特許第６，９８７，１７９号に記載されるキメラプロモーターを含むが、これらに限定されない。ＲｕｂＰカルボキシラーゼの小サブユニットプロモーターは、当該技術分野において既知である（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９−５８）。植物に感染するウイルス由来の他のプロモーターも好適であり、それには、サトイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えば、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５−９３）、トマト黄化えそ病ウイルス、タバコ茎えそウイルス、タバコ壊死ウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ラッカセイクランプウイルス、アルファルファモザイクウイルス、サトウキビ桿菌状バドナウイルス等から単離されたプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００６５】
様々な転写ターミネーターが、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む発現カセットにおける使用に利用可能である。これらは、発現カセット内のポリヌクレオチド構築物のコード領域を超えた転写の終結および正しいｍＲＮＡポリアデニル化に寄与する。終結領域は、プロモーターとともに天然に存在してもよいか（すなわち自然発生型）、ポリヌクレオチド構築物内で作動可能に連結されたコード配列とともに天然に存在してもよいか、発現カセットが導入される植物とともに天然に存在してもよいか、または別の源に由来してもよいか（すなわち、プロモーター、コード配列、もしくは植物に対して外来性または異種である）、あるいはそれらの任意の組み合わせであってもよい。適切な転写ターミネーターは、植物において機能的であることが分かっているものであり、例えば、ＣＡＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、およびエンドウマメｒｂｃｓ  Ｅ９ターミネーターを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、発現カセットは、形質転換された細胞の選択のための選択マーカー遺伝子を含む。他の実施形態において、選択マーカー遺伝子は、同じベクター上または異なるベクター上の別の発現カセット内に構築され、本発明のポリヌクレオチド構築物と選択マーカー遺伝子は、目的の植物内に同時形質転換される。形質転換において日常的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔｌｌ遺伝子（Ｍｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｖｉｅｒｒａ（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８；Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：１８４−１８７）；除草剤ホスフィノスリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１０６２；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：６２５−６３１）；抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２９２９−２９３１）；メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１０９９−１１０４）；グリホサートに対する耐性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第４，９４０，９３５号および５，１８８，６４２号）；マンノースを代謝する能力を提供するホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（ＰＭＩ）（米国特許第５，７６７，３７８号および５，９９４，６２９号）を含む。他の好適な選択マーカーが当該技術分野において既知であり、いずれのそのようなマーカーが本発明の実施に用いられてもよい。
【００６７】
さらに、所望される場合、発現カセットは、発現された目的のポリペプチドが、植物細胞の特定の細胞小器官（例えば、ミトコンドリアもしくは葉緑体等の色素体）を標的にするように、またはポリペプチドが細胞外分泌を標的にするように、設計することができる。遺伝子産物を標的にするための種々の機序が植物に存在することが分かっており、これらの機序の機能を制御する配列が詳細に特徴付けられている。
【００６８】
例えば、遺伝子産物を葉緑体に標的化することは、種々のタンパク質のアミノ末端に見出される輸送ペプチド（成熟タンパク質を産生するように葉緑体移行の間に切断される）によって制御される（Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１０４−１５１０９）。これらの輸送ペプチドは、これらの産物の葉緑体内への移行を生じるように、異種ポリペプチド産物と融合させることができる（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：３５８−３６３）。ＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質、および局在する葉緑体であることが分かっている他の多くのタンパク質をコードするｃＤＮＡの５’末端から、適切な輸送ペプチドをコードするＤＮＡを単離することができる。米国特許第５，６３９，９４９号の実施例３７、標題「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」も参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００６９】
細胞標的化のための上記機序は、標的とする輸送ペプチドが由来するプロモーターのものとは異なる発現パターンを有するプロモーターの転写調節下で特異的な細胞標的化の目標を達成するように、それらの天然のプロモーターと組み合わせるだけではなく、異種のプロモーターとも組み合わせて用いることができる。
【００７０】
したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物が葉緑体に標的化されるポリペプチドをコードする場合、構築物内のコード配列は、目的のポリペプチドをコードする配列と一緒のフレーム内に融合された、適切な葉緑体−標的化輸送ペプチドをコードする配列を含む融合ポリヌクレオチドであってもよい。色素体における局在化を確実にするために、例えば、Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３：５１７−５２２に開示されるホウレンソウのフェレドキシンＮＡＤＰ＋酸化還元酵素（ＦＮＲ）のための輸送ペプチド配列を使用することが考えられる。別の例は、成熟Ｗｘタンパク質の最初の３４個のアミノ酸残基を含むトウモロコシのＷｘタンパク質の輸送ペプチド配列である（Ｋｌｏｓｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１７：１５５−１６１）。また、３４個のアミノ酸を含まないこの成熟タンパク質の輸送ペプチドを使用することも可能である。さらに、リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（Ｗｏｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８４６−８５０；Ｎａｗｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２７６０−１２７６４）、ＮＡＤＰリンゴ酸脱水素酵素（Ｇａｌｉａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔａ  １９７：３２４−３３２）、グルタチオン還元酵素（Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８：１６７−１７５）、またはＲ１タンパク質（Ｌｏｒｂｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４７３−４７７）の輸送ペプチド配列を使用することができる。
【００７１】
例えば、細胞壁または培養培地内に、目的のポリペプチドが分泌されることが望ましい場合、本発明のポリヌクレオチド構築物は、構築物内のコード配列が、目的のポリペプチドをコードする配列と一緒のフレーム内に融合された適切なシグナルペプチドをコードする配列を含む融合ポリヌクレオチドであるように設計することができる。本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」または「シグナル配列」とは、小胞体（ＥＲ）膜上で受容体タンパク質と相互作用し、細胞からの分泌のために、膜を横切ってＥＲ内への成長ポリペプチド鎖の移動を誘導するポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。このシグナルペプチドは、シグナルペプチドを持たない「成熟」ポリペプチドを生成するために、前駆体ポリペプチドから切断されることが多い。このように、発現カセット内のポリヌクレオチド構築物は、コードされたポリペプチドが細胞壁内に分泌されるか、または植物から（例えば、培養培地内に）分泌されるように設計することができる。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、当該技術分野において既知である任意の好適なシグナル配列（細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳類、および植物のシグナル配列を含む）を使用することができる。例えば、米国特許第６，０２０，１６９号を参照のこと。シグナルペプチドは、目的のポリペプチドのシグナルペプチドに対応し得る。好適なシグナルペプチドは、当業者に周知である。
【００７３】
本明細書に記載される発現カセットは、その中に含有されるポリヌクレオチド構築物の発現を増加させるために、発現カセット内から遺伝子発現を増強させることが分かっている他の調節配列を含むことができる。例えば、種々のイントロン配列が、特に単子葉細胞において発現を増加させることが示されている。イントロン１は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む融合構築物において、特に効果的であり、発現を増強させたことが示された（Ｃａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１：１１８３−１２００）。また、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロンの使用について記載する米国特許第６，３４２，６６０号も参照のこと。イントロン配列は、植物形質転換ベクター、典型的には非翻訳リーダー内に、日常的に組み入れられてきた。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む発現カセットは、その中に作動可能に連結されたイントロン配列を含み得る。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素のうちの１つ以上の中に挿入される。
【００７４】
異なる生物の翻訳開始コドンには、最適な翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列間に既知の相違があり、これらの翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列の組成が翻訳開始の効率に影響を与え得ることを認識されたい。例えば、Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５４：８９−９８；およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：９９３−１００１を参照のこと。本明細書で使用される場合、「翻訳開始コドン」とは、目的の核酸分子から転写されたｍＲＮＡ内でコード領域の翻訳を開始するコドンを意味する。翻訳開始コドンは、通常、ＤＮＡ配列のＡＴＧ、およびＡＵＧ  ｍＲＮＡ転写物のＡＵＧである。本明細書で使用される場合、「翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列」とは、翻訳開始コドンのすぐ５’の３つのヌクレオチドの同一性を意味する。このように、本発明のポリヌクレオチド構築物内のコード配列の翻訳開始コドンの翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列は、植物に好ましい翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列を選択することにより、植物における発現を増強するように修飾されてもよい。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、特に植物に由来する、当該技術分野において既知である任意の好適な翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列を使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチド構築物は、目的のポリヌクレオチド構築物内のコード配列の翻訳開始コドンのすぐ上流の３つのヌクレオチドが「ＡＣＣ」、「ＡＣＡ」、または「ＡＡＡＡＡＡ」になるように修飾することができる。
【００７５】
さらに、本明細書に記載される発現カセット内に含有される任意のコード配列は、それが導入される植物における発現のために最適化することができる。つまり、ヌクレオチド配列は、発現を向上させるための植物に好ましいコドンを使用して合成することができるか、または植物に好ましいコドン使用頻度でコドンを使用して合成されてもよい。通常、遺伝子のＧＣ含有量は増加する。宿主に好ましいコドン使用の考察については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照のこと。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法は、当該技術分野において利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号、および５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照（参照により、本明細書に組み込まれる）。ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）リリースに含まれる配列に基づく、コドン使用頻度を示す表は、Ｃｈｉｂａ，ＪａｐａｎのＫａｚｕｓａ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト上で見ることができる。このデータベースは、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２に記載される。
【００７６】
本明細書に記載される発現カセットを構築した後、それは、本明細書で後述するものを含む、当該技術分野において既知である任意の好適な形質転換方法によって、目的の植物に導入される。
【００７７】
目的のポリペプチド
本発明のポリヌクレオチド構築物でタンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素は、任意の目的のポリペプチドの発現を増強するために使用することができる。このように、本発明のポリヌクレオチド構築物内で作動可能に連結されたコード配列は、植物の農学的能力を向上するため、例えば、病害抵抗性、除草剤抵抗性、栄養利用、および環境ストレス耐性の増加；農学的特性を改善するため、例えば、動物およびヒトの栄養を強化するため、消化性を向上させるため、および／または処理特性を向上させるためのデンプン、油、脂肪酸、またはタンパク質含有量／組成の変更；男性不妊症、老化等の改善を開発するため；ならびに医薬品、産業酵素等の導入遺伝子発現を導入するための、代謝経路の遺伝子操作に有用なポリペプチドをコードすることができる。
【００７８】
したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、植物の形態、生理機能、成長および発達、収穫量、栄養強化、病害もしくは害虫耐性、または環境もしくは薬剤耐性に関連する望ましい特徴を提供するポリペプチドのコード配列を含むことができる。そのようなポリペプチドの発現は、農学的に重要な形質を付与するために望ましい。作物に有益な農学的形質を提供するポリペプチドの例は、例えば以下を付与するポリペプチドであり得る：害虫駆除（米国特許第７，２４４，８２０号、７，２３０，１６７号、６，８０９，０７８号、６，７８０，４０８号、６，７２０，４８８号、６，７１３，０６３号、６，６８６，４５２号、６，６５７，０４６号、６，６４５，４９７号、６，６４２，０３０号、６，６３９，０５４号、６，６２０，９８８号、６，５９３，２９３号、６，５５５，６５５号、６，５３８，１０９号、６，５３７，７５６号、６，５２１，４４２号、６，５０１，００９号、６，４６８，５２３号、６，３４２，６６０号、６，３２６，３５１号、６，３２０，１００号、６，３１３，３７８号、６，３００，５４４号、６，２８４，９４９号、６，２８１，４１３号、６，２８１，０１６号、６，２７８，０４１号、６，２７７，８２３号、６，２４８，５３６号、６，２４２，２４１号、６，２２１，６４９号、６，１７７，６１５号、６，１５６，５７３号、６，１５３，８１４号、６，１１０，４６４号、６，０９３，６９５号、６，０６３，７５６号、６，０６３，５９７号、６，０２３，０１３号、５，９５９，０９１号、５，９４２，６６４号、５，９４２，６５８，５，８８０，２７５号、５，７６３，２４５号、および５，７６３，２４１号）；真菌病抵抗性（米国特許第７，０９８，３７８号、６，８６４，０７６号、６，８６４，０６８号、６，６５３，２８０号、６，５７３，３６１号、６，５０６，９６２号、６，３１６，４０７号、６，３００，１０３号、６，２１５，０４８号、５，５１６，６７１号、５，７７３，６９６号、６，１２１，４３６号、６，３１６，４０７号、および６，２９１，６４７号）；ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号、６，６０８，２４１号、６，０１５，９４０号、６，０１３，８６４号、５，８５０，０２３号、および５，３０４，７３０号）；線虫抵抗性（米国特許第６，７８４，３３７号および６，２２８，９９２号）；細菌病抵抗性（米国特許第７，０９８，３７８号、６，９５６，１１５号、６，５２８，７０２号、および５，５１６，６７１号）；除草剤抵抗性（米国特許第７，３１２，３７９号、７，０５６，７１５号、６，８０３，５０１号、６，４４８，４７６号、６，３０７，１２９号、６，２９４，３４５号、６，２４８，８７６号、６，２２５，１１４号、６，１０７，５４９号、５，８６６，７７５号、５，８０４，４２５号、５，６３３，４３５号、および５，４６３，１７５号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１３５８７９号および２００３／０１１５６２６号）；植物の成長および発達（米国特許第６，７２３，８９７号、６，６０３，０６４号、および６，５１８，４８８号）；デンプン生産（米国特許第．６，５３８，１８１号、６，５３８，１７９号、６，５３８，１７８号、５，７５０，８７６号、および６，４７６，２９５号）；収穫量増加（米国再発行特許第３８，４４６号、米国特許第６，７１６，４７４号、６，６６３，９０６号、６，４７６，２９５号、６，４４１，２７７号、６，４２３，８２８号、６，３９９，３３０号、６，３７２，２１１号、６，２３５，９７１号、６，２２２，０９８号、および５，７１６，８３７号）；遺伝子組換え油の生産（米国特許第６，４４４，８７６号、６，４２６，４４７号、および６，３８０，４６２号）；高油の生産（米国特許第６，４９５，７３９号、５，６０８，１４９号、６，４８３，００８号、および６，４７６，２９５号）；脂肪酸含有量の変更（米国特許第６，８２８，４７５号、６，８２２，１４１号、６，７７０，４６５号、６，７０６，９５０号、６，６６０，８４９号、６，５９６，５３８号、６，５８９，７６７号、６，５３７，７５０号、６，４８９，４６１号、および６，４５９，０１８号）；高タンパク質の生産（米国特許第６，３８０，４６６号）；果実の熟成（米国特許第５，５１２，４６６号）；動物およびヒトの栄養強化（米国特許第６，７２３，８３７号、６，６５３，５３０号、６，５４１２，５９号、５，９８５，６０５号、および６，１７１，６４０号）；バイオポリマー（米国再発行特許第３７，５４３号、米国特許第６，２２８，６２３号、５，９５８，７４５号、および米国特許出願公開第２００３／００２８９１７）；環境ストレス耐性（米国特許第６，０７２，１０３号）；製薬ペプチドおよび分泌型ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号、６，７７４，２８３号、および６，１４０，０７５号、６，０８０，５６０号）；処理特性の向上（米国特許第６，４７６，２９５号）；消化性の向上（米国特許第６，５３１，６４８号）；低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）；産業用酵素の生産（米国特許第５，５４３，５７６号）；風味の向上（米国特許第６，０１１，１９９）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）；ハイブリッド種子の生産（米国特許第５，６８９，０４１号）；繊維の生産（米国特許第６，５７６，８１８号、６，２７１，４４３号、５，９８１，８３４号、および５，８６９，７２０号）；ならびにバイオ燃料の生産（米国特許第５，９９８，７００号）（これらの特許および特許出願公開の各々の内容は、参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
上記のように、また当てはまる場合は、目的のポリペプチドは、融合ポリペプチドの一部として発現されてもよい。
【００８０】
したがって、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素を含む本発明のポリヌクレオチド構築物は、任意の目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。これらの構築物は、農学的能力を向上するため、農学的特性を改変するため、および医薬品、産業酵素等の発現をもたらすために、任意の目的の植物に導入することができる。
【００８１】
目的の植物
このように、本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む形質転換された（すなわちトランスジェニック）植物およびその植物の部分を提供し、該構築物は、ａ）少なくとも１つの細胞性翻訳エンハンサー要素とタンデムにスタッキングした、少なくとも１つのウイルス性翻訳エンハンサー要素と、ｂ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む。本明細書で使用される場合、「植物の部分」とは、植物の器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、および植物細胞を意味する。植物の部分は、プロトプラスト、組織、根粒、カルス、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、胚、および植物またはそれらの子孫に由来する花、胚珠、葯、花粉、茎、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、柄、葉、分げつ、根、根端等を制限なく含む。植物細胞はまた、種子の細胞、胚、成長領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を制限なく含む。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「形質転換された」または「トランスジェニック」とは、本発明のポリヌクレオチド構築物等の外来性ポリヌクレオチド分子が導入された植物またはその植物の部分を意味する。導入されたポリヌクレオチド分子は、導入されたポリヌクレオチド分子が次の子孫によって受け継がれるように、受容植物または植物の部分のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換された」植物またはその植物の部分（例えば細胞または組織）は、植物または植物の部分の子孫、およびそのようなトランスジェニック植物または植物の部分を交配において親として用いる育種プログラムから生成され、外来性ポリヌクレオチド分子、例えば本発明のポリヌクレオチド構築物の存在に起因する表現型の変更を示す子孫も含む。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物および植物細胞内で機能する作動可能に連結されたプロモーターは、植物またはその植物の部分のゲノムに安定に組み込まれるため、そうすることによりコードされるポリペプチドによって提供される所望の特徴または形質は、その子孫によって、より具体的には、複数継代の子孫によって受け継がれることが可能となる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、本発明の発現カセットの一部として植物またはその植物の部分のゲノムに安定に組み込まれ、したがって、この発現カセットを植物またはその植物の部分の１つ以上の細胞に導入することにより、植物またはその植物の部分は遺伝子操作されている。
【００８４】
本発明による植物は、産業、医薬、または商業プロセスにおける経口摂取または利用のいずれかのために、ヒトまたは動物によって求められる植物材料を生産する目的で栽培される任意の植物を含む。本発明は、多様な植物のうちのいずれに適用されてもよく、それには、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、大豆、ワタ、モロコシ、一般に豆類、ナタネ／キャノーラ、アルファルファ、亜麻、ヒマワリ、ベニバナ、アワ、ベニバナ、サトウキビ、テンサイ、カカオ、茶、アブラナ、ワタ、タバコ、コーヒー、サツマイモ、亜麻、ラッカセイ、クローバー；レタス、トマト、ウリ科植物、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、ダイコン、エンドウマメ、レンズマメ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、芽キャベツ、ピーマン、およびパイナップル等の野菜；柑橘類、リンゴ、ナシ、モモ、杏、クルミ、アボカド、バナナ、およびココナッツ等の果樹；ならびにラン、カーネーション、およびバラ等の花を含むが、これらに限定されない。本発明の実施において有用な他の植物は、スイッチグラス、プレーリーグラス、インディアングラス、ビッグブルーステムグラス等の多年草を含む。
【００８５】
本発明の方法
本発明のポリヌクレオチド構築物は、植物またはその植物の部分における目的のポリペプチドの発現を増加させるための方法に使用される。本発明の方法は、植物またはその植物の部分に、植物細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド構築物を導入することを含む。本発明のポリヌクレオチド構築物の発現に好適な条件下で培養した場合、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、関連するｍＲＮＡ転写物の翻訳においてより高い効率を提供する。したがって、本発明の方法は、植物またはその植物の部分において目的のポリペプチドの発現の増加をもたらす。本明細書で使用される場合、「発現」とは、転写、翻訳、およびコードされたポリペプチドの構築を含む、コードされたポリペプチドの合成を意味する。ポリペプチドの発現の増加は、任意の２つの植物または植物の部分の間の比較に関連し、例えば、本発明のポリヌクレオチド構築物の導入によって遺伝子組換えされた植物または植物の部分におけるポリペプチドの発現に対する、対応する野生型植物または野生型植物の部分におけるポリペプチドの発現である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、発現の増加は、本発明のポリヌクレオチド構築物の導入によって遺伝子組み換えされた植物または植物の部分と、対応する対照植物または対照植物の部分におけるそのポリペプチドの発現との間の比較に関連する。本明細書で使用される場合、「対照植物」または「対照植物の部分」とは、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素が存在しないことのみが本発明のポリヌクレオチド構築物と異なるポリヌクレオチド構築物から、同じポリペプチドを発現するように遺伝子組み換えされた植物または植物の部分を意味する。このように、対照植物または植物の部分は、ポリペプチドの同じ転写調節領域（すなわち同じプロモーター）、同じコード配列、および以下のうちのいずれかを含有するポリヌクレオチド構築物を含む：作動可能に連結されていない翻訳エンハンサー要素、または作動可能に連結された単一の翻訳エンハンサー要素のみであって、その要素は、本発明のポリヌクレオチド構築物に存在するものと同じウイルス性翻訳エンハンサー要素であるか、または本発明のポリヌクレオチド構築物に存在するものと同じ細胞性翻訳エンハンサー要素である。
【００８７】
本発明の特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック植物または植物の部分における目的のポリペプチドの発現レベルは、野生型植物もしくは植物の部分、または対照植物もしくは植物の部分と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または少なくとも約５００％増加する。本発明の他の実施形態において、本発明のトランスジェニック植物または植物の部分における目的のポリペプチドの発現レベルは、野生型植物もしくは植物の部分、または対照植物もしくは植物の部分と比較して、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または少なくとも約５倍増加する。目的のポリペプチドの発現レベルは、例えば、植物または植物の部分において発現されるポリペプチドのレベルをアッセイすることにより、例えば、植物または植物の部分におけるポリペプチドの活性を測定することで、直接測定することができる。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチド構築物および発現カセットは、電気穿孔法（米国特許第５，３８４，２５３号に示されるように）；微粒子衝突法（米国特許第６，４０３，８６５号、５，０１５，５８０号、５，５５０，３１８号、５，５３８，８８０号、６，１６０，２０８号、６，３９９，８６１号、および６，４０３，８６５号に示されるように）；アグロバクテリウムによる形質転換（米国特許第７，０２９，９０８；５，８２４，８７７号、５，５９１，６１６号、５，９８１，８４０号、および６，３８４，３０１号に示されるように）、およびプロトプラスト形質転換（米国特許第５，５０８，１８４号に示されるように）（これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）を含むが、これらに限定されない、当業者に既知である任意の植物形質転換技術を用いて、目的の植物または植物の部分に導入することができる。これらの構築物および発現カセットはまた、育種プロトコルを用いて目的の植物または植物の部分に導入することもできる。以下の植物形質転換技術に関する記載は、ガイダンスとして提供されるのであって、限定的であることを意図するものではない。
【００８９】
植物の形質転換および育種
本発明のポリヌクレオチド構築物および発現カセットは、単独で、または１つ以上の追加の目的の核酸分子と組み合わせて、目的の標的植物の細胞に形質転換される。これらの構築物および発現カセットは、当該技術において認識される多数の方法で細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドに関連して「導入する」とは、ポリヌクレオチドが植物の細胞内部へのアクセスを得る様式で、本発明のポリヌクレオチド構築物または発現カセットが植物に提示されることを意味する。１つより多くのポリヌクレオチドが導入される場合、これらのポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド構築物の一部として、または別個のヌクレオチド構築物として構築されてもよく、同じかまたは異なる形質転換ベクター上に位置し得る。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象において、別個の形質転換事象において、または例えば育種プロトコルの一部として、目的の植物細胞に導入することができる。本発明の方法は、１つ以上のポリヌクレオチドを植物に導入するための特定の方法にのみ依存せず、ポリヌクレオチド（複数可）が植物の少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを得る。ポリヌクレオチドを植物に導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、一過性形質転換法、安定形質転換法、およびウイルスによる方法を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドに関連して「一過性形質転換」または「一過性発現」とは、ポリヌクレオチドが植物に導入されるが、植物のゲノムには組み込まれないことを意味する。一過性形質転換および一過性発現は、当該技術分野において既知である任意の好適な方法を用いて達成することができる。例えば、一過性発現は、植物細胞の培養により、または組換えアグロバクテリウム株を植物の葉に浸潤させることにより行うことができる。一過性発現は、その植物の子孫には受け継がれない。
【００９１】
本明細書で使用される場合、植物に導入されるポリヌクレオチドに関連して「安定に導入する」または「安定に導入される」とは、導入されたポリヌクレオチドが植物のゲノムに安定に組み入れられ、したがって、その植物がポリヌクレオチドによって安定に形質転換されることを意味する。「安定した形質転換」または「安定に形質転換される」とは、植物に導入されたポリヌクレオチド、例えば、本発明のポリヌクレオチド構築物または発現カセットが、その植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって、より具体的には複数世代の子孫によって、受け継がれることが可能であることを意味する。
【００９２】
植物形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターは、植物形質転換技術分野の当業者に既知であり、本発明のポリヌクレオチド構築物および発現カセットは、任意のそのようなベクターと組み合わせて使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的植物種に依存する。特定の標的種には、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい可能性がある。形質転換において日常的に使用される選択マーカーは、本明細書で上述した選択マーカーを含む。
【００９３】
植物を形質転換するための方法およびベクターは、当該技術分野において周知である。例えば、Ｔｉプラスミドベクターが、外来性ＤＮＡの送達、ならびに直接ＤＮＡ取り込み、リボソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、および微粒子のために用いられてきた。また、アグロバクテリウム属由来の細菌を利用して植物細胞を形質転換することができる。以下は、双子葉類および単子葉類の両方を形質転換するための代表的な技術、ならびに代表的な色素体形質転換技術である。
【００９４】
多くのベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用する形質転換に利用可能である。これらは、典型的には少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を保持し、ｐＢＩＮ１９等のベクターを含む（Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）。アグロバクテリウムの形質転換に有用なベクターについては、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２６００１１号および米国特許第７，０２９，９０８号を参照のこと（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、結果として、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する上記のようなベクターに加えて、これらの配列を欠損するベクターを利用することができる。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技術は、微粒子衝突法による形質転換、プロトプラストによる取り込み（例えば、ＰＥＧおよび電気穿孔法）、ならびにマイクロインジェクションを含む。ベクターの選択は、形質転換される植物種の好ましい選択に大きく依存する。そのようなベクターの構築については、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２６００１１号を参照のこと（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチド構築物または発現カセットを植物の色素体に導入することが望ましい場合は、色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１号の実施例３６を参照）が使用される。発現カセットはｐＰＨ１４３に挿入され、それによってＰＲＯＴＯＸコード配列が置換される。このベクターは、その後、色素体形質転換、およびスペクチノマイシン耐性のための転換体の選択に使用される。代替として、発現カセットは、ａａｄＨ遺伝子を置換するようにｐＰＨ１４３に挿入される。この場合、転換体は、ＰＲＯＴＯＸ阻害剤に対する抵抗性のために選択される。米国特許第７，２３５，７１１号に開示される色素体形質転換技術も参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９７】
双子葉類のための形質転換技術は当該技術分野において既知であり、アグロバクテリウムに基づく技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。非アグロバクテリウム技術は、プロトプラストまたは細胞による直接的な外来性遺伝子材料の取り込みに関与する。これは、ＰＥＧまたは電気穿孔法による取り込み、微粒子衝突法による送達、またはマイクロインジェクションにより達成することができる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９−１７７；Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１００１−１００４；およびＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３に記載されている。各々の場合において、形質転換された細胞は、当該技術分野において既知である標準的な方法を使用して全植物に再生される。
【００９８】
アグロバクテリウムによる形質転換は、その高い形質転換効率および多くの異なる種に対する幅広い有用性のために、双子葉類の形質転換に好ましい技術である。アグロバクテリウムによる形質転換は、典型的には、目的の外来性ＤＮＡを保持するバイナリーベクター（例えば、ｐＣＩＢ２００またはｐＣＩＢ２００１）を、共存するＴｉプラスミドまたは染色体のいずれかに宿主アグロバクテリウム（例えば、ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１のための株ＣＩＢ５４２株）が保持するｖｉｒ遺伝子の補完に依存し得る適切なアグロバクテリウム株（Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５９−１６９）に移入することに関与する。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウムへの移入は、組換えバイナリーベクターを保持する大腸菌であって、ｐＲＫ２０１３等のプラスミドを保持し、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム株に移動させることができるヘルパー大腸菌株を使用した、三親交配手順により達成される。代替として、組換えバイナリーベクターは、ＤＮＡの形質転換によってアグロバクテリウムに移入することができる（Ｈｏｆｇｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：９８７７）。
【００９９】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、アグロバクテリウムをその植物由来の外植片と共培養することに関与し、当該技術分野で周知のプロトコルに従う。形質転換された組織は、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡ境界間に存在する抗生物質耐性マーカーまたは除草剤抵抗性マーカーを保持する選択培地上で再生される。
【０１００】
目的のポリヌクレオチドを用いて植物細胞を形質転換するための別の手法は、不活性または生物学的に活性な粒子を植物の組織および細胞において推進することに関与する。この技術は、米国特許第４，９４５，０５０号、５，０３６，００６号、および５，１００，７９２号に開示されており、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。通常、この手順は、細胞の外表面を通過し、その内部への組み入れを可能にするのに効果的な条件下で、不活性または生物学的に活性な粒子を細胞において推進することを伴う。不活性粒子が用いられる場合、所望の遺伝子を含有するベクターとともに粒子をコーティングすることにより、植物細胞にベクターを導入することができる。代替として、粒子の活性化によってベクターが細胞内に運ばれるように、ベクターで標的細胞を囲むことができる。生物学的に活性な粒子（例えば、導入したいＤＮＡを各々が含有する乾燥酵母細胞、乾燥細菌、またはバクテリオファージ）もまた、植物細胞組織中に推進することができる。ほとんどの単子葉植物種の形質転換もまた、今ではルーチンとなっている。好ましい技術は、ＰＥＧまたは電気穿孔法技術を使用したプロトプラスト内への直接遺伝子導入、およびカルス組織内への微粒子衝突を含む。形質転換は、単一のＤＮＡ種または複数のＤＮＡ種（すなわち同時形質転換）を用いて行われてもよく、これらの技術はどちらも本発明とともに使用するのに好適である。同時形質転換は、完全なベクター構築を回避し、目的の遺伝子および選択マーカーのための非連鎖遺伝子座を有するトランスジェニック植物を作製するという利点を有し得、望ましいと見なされる場合には、後の世代において選択マーカーを除去することが可能である。しかしながら、同時形質転換を用いることの不利な点は、別々のＤＮＡ種がゲノムに組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１０９３−１０９６）。
【０１０１】
欧州特許出願第０  ２９２  ４３５号、同０  ３９２  ２２５号、およびＷＯ９３／０７２７８号は、トウモロコシの優良な同系交配系統からのカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧまたは電気穿孔法を用いたプロトプラストの形質転換、ならびに形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技術について記載している。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８（１９９０））およびＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（１９９０））は、微粒子衝突法を用いたＡ１８８由来トウモロコシ系統の形質転換のための技術を発表した。さらに、ＷＯ９３／０７２７８号およびＫｏｚｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１９４−２００（１９９３））は、微粒子衝突法によるトウモロコシの優良な同系交配系統の形質転換のための技術について記載している。この技術は、受粉から１４〜１５日後のトウモロコシの穂から切り出した１．５〜２．５ｍｍの長さの未成熟なトウモロコシ胚と、衝突用のＰＤＳ−１０００Ｈｅ微粒子銃デバイスを利用する。また、米国特許第６，４０３，８６５号に開示される微粒子銃形質転換の方法も参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０２】
イネの形質転換も、プロトプラストまたは微粒子衝突法を用いた直接遺伝子導入技術により行うことができる。プロトプラストによる形質転換は、ジャポニカ型およびインディカ型について記載されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ７：３７９−３８４；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４−２７７；およびＤａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０）。どちらの型も、微粒子衝突法を用いて日常的に形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−９６２）。さらに、ＷＯ９３／２１３３５号は、電気穿孔法によるイネの形質転換のための技術について記載している。
【０１０３】
欧州特許出願第０  ３３２  ５８１号は、イチゴツナギ亜科プロトプラストの生成、形質転換、および再生のための技術について記載している。これらの技術により、カモガヤ属およびコムギの形質転換が可能となる。さらに、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４（１９９２））（長期再生可能なＣ型カルス細胞内への微粒子衝突を使用）、またＶａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１５５３−１５５８（１９９３））およびＷｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７−１０８４（１９９３））（未成熟胚および未成熟胚由来カルスの微粒子衝突を使用）によるコムギの形質転換が記載されている。しかしながら、コムギの形質転換のための好ましい技術は、未成熟胚の微粒子衝突によるコムギの形質転換を伴い、遺伝子送達の前に高スクロースまたは高マルトースのいずれかの段階を含む。衝突の前に、体細胞胚の誘導のために、３％スクロース（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５：４７３−４９７）および３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ培地に、任意の数の胚（０．７５〜１ｍｍの長さ）をプレーティングし、暗所で進行させる。選択された衝突の日に、誘導培地から胚を取り出し、浸透圧調節物質（すなわち、所望の濃度、典型的には１５％のスクロースまたはマルトースを加えた誘導培地）上に置く。胚を２〜３時間原形質分離させ、次いで衝突させる。決定的ではないが、標的プレート当たり胚２０個が典型的である。標準的な手順を用いて、適切な遺伝子を保持するプラスミド（ｐＣＩＢ３０６４またはｐＳＯＧ３５等）をマイクロメーターサイズの金粒子上に沈殿させる。標準的な８０メッシュスクリーンを使用するＤｕＰｏｎｔ  ＢＩＯＬＩＳＴＩＣＳ（登録商標）ヘリウムデバイスを用いて、約１０００ｐｓｉの破裂圧で胚の各プレートに打ち込む。衝突後、胚を暗所に戻し、約２４時間（さらに浸透圧調節物質上で）回復させる。２４時間後、浸透圧調節物質から胚を取り出し、誘導培地上に戻し、再生まで約１ヶ月静置する。約１ヵ月後、発達中の胚形成カルスを有する胚外植片を、適切な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合は１０ｍｇ／Ｌバスタ、ｐＳＯＧ３５の場合は２ｍｇ／Ｌメトトレキサート）をさらに含有する再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、５ｍｇ／Ｌ  ＧＡ）に移す。約１ヵ月後、半強度のＭＳ、２％スクロース、および同濃度の選択剤を含有する、「ＧＡ７」として知られるより大きな滅菌容器に、発達した苗条を移す。
【０１０４】
アグロバクテリウムを使用した単子葉植物の形質転換もまた、記載されている。ＷＯ９４／００９７７号および米国特許第５，５９１，６１６号を参照のこと（その両方が、参照により本明細書に組み込まれる）；また、Ｎｅｇｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：７９８−８０３を参照のこと（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０５】
例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）を使用してトランスジェニック植物を作製することができる。種々のイネ栽培品種を使用することができる（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ２：２６７−２７６；およびＨｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：２０５−２１８）。また、以下に記載する種々の培地成分は、量を変更されるかまたは交換されるかのいずれかであってもよい。ＭＳ−ＣＩＭ培地（ＭＳ基礎塩、４．３ｇ／リットル；ビタミンＢ５（２００Ｘ）、５ｍｌ／Ｌ；スクロース、３０ｇ／Ｌ；プロリン、５００ｍｇ／Ｌ；グルタミン、５００ｍｇ／Ｌｒ；カゼイン加水分解産物、３００ｍｇ／Ｌ；２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｍｌ）、２ｍｌ／Ｌ；１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調整；Ｐｈｙｔａｇｅｌ、３ｇ／Ｌ）上で培養することにより、胚形成反応を開始するか、および／または成熟胚から培養を確立する。培養反応の初期段階にある成熟胚または確立された培養系統のいずれかを接種し、所望のベクター構築物を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４（アグロバクテリウム）とともに共培養する。固形ＹＰＣ培地上（１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび任意の他の適切な抗生物質）上で、グリセロールストックからアグロバクテリウムを約２日間２８℃で培養する。液体ＭＳ−ＣＩＭ培地にアグロバクテリウムを再懸濁する。アグロバクテリウム培養物を光学密度（ＯＤ）６００で０．２〜０．３になるように希釈し、最終濃度２００μＭまでアセトシリンゴンを加える。溶液をイネ培養物と混合する前にアセトシリンゴンを加え、植物細胞へのＤＮＡ移入のためにアグロバクテリウムを誘導する。接種のために、植物の培養物を細菌懸濁液中に浸漬する。細菌懸濁液を除去し、接種した培養物を共培養培地上に置き、２２℃で２日間インキュベートする。次いで、培養物をチカルシリン（４００ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ−ＣＩＭ培地に移してアグロバクテリウムの成長を阻害する。ＰＭＩ選択マーカー遺伝子（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ  ３７：１２７−１３２）を用いた構築物については、７日後、炭水化物源としてマンノースを含有する選択培地（２％マンノース、３００ｍｇ／Ｌチカルシリンを含むＭＳ）に培養物を移し、暗所で３〜４週間培養する。次いで、耐性コロニーを再生誘導培地（２，４−Ｄ非含有、０．５ｍｇ／リットルＩＡＡ、１ｍｇ／Ｌゼアチン、２００ｍｇ／Ｌチメンチン２％マンノースおよび３％ソルビトールを含むＭＳ）に移し、暗所で１４日間成長させる。次いで、増殖コロニーを別ラウンドの再生誘導培地に移し、明るい成長用の部屋に移動する。再生した苗条をＧＡ７−１培地（ホルモン非含有、２％ソルビトールを含むＭＳ）を含むＧＡ７容器に２週間移動し、その後、それらが十分に大きくなり、適当な根を有するようになったら温室に移動する。植物を温室内の土壌に移植し（Ｔ0世代）、成熟するまで成長させ、Ｔ1種子を採取する。
【０１０６】
本発明のポリヌクレオチド構築物または発現カセットを用いて形質転換させた細胞は、従来様式にしたがって植物に成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ５：８１−８４を参照のこと。これらの植物は、成長させて、同じ形質転換株または異なる株のいずれかで受粉することができ、得られた子孫は、所望の表現型特性の発現を有することが特定される。所望の表現型特性の発現が安定して維持および受け継がれることを確実にするために、２世代以上を成長させてもよく、所望の表現型特性の発現が達成されていることを確実にするために、次いで種子を採取してもよい。このように、本発明は、それらのゲノムに安定に組み入れられた本発明のポリヌクレオチド構築物または発現カセットを有する形質転換された種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチド構築物または発現カセットを用いた形質転換によって得られた植物は、単子葉および双子葉種、ならびに本明細書の他の箇所に記載される農学的に重要な作物のリストを含む多様な植物種のうちのいずれであってもよい。本発明のポリヌクレオチド構築物および発現カセットは、生産量および品質にとって重要な他の特徴と組み合わせて、育種により植物系統に組み入れることができる。育種の手法および技術は当該技術分野において既知である。例えば、Ｗｅｌｓｈ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  １９８１）；Ｃｒｏｐ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ｗｏｏｄ  ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  １９８３）；Ｍａｙｏ，Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（２ndｅｄ．；Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９８７）；Ｓｉｎｇｈ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｅｓｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ  １９８６）；およびＷｒｉｃｋｅ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｂｅｒｌｉｎ  １９８６）を参照のこと。
【０１０８】
上記トランスジェニック種子および植物に遺伝子工学的に付与された遺伝的特性は、有性生殖または栄養生長により継代され、したがって、子孫植物において維持および伝播され得る。一般に、維持および伝播は、耕耘、種蒔き、または収穫等の特定の目的に適合するように開発された機知の農業方法を利用する。
【０１０９】
目的のポリペプチドの安定した組み込みおよび発現の検出
上記条件は、光合成能を有する緑色植物体および植物の再生をもたらす。上述のように、目的の核酸分子が目的の植物またはその植物の部分のゲノムに安定に組み込まれていることを確認するために使用されるテストは、必ずその植物に付与される特性に依存する。例えば、特性が除草剤抵抗性である場合、形質転換プロセスに供されていない対照植物にとって致死濃度の除草剤を葉に噴霧または塗布して成長中の葉を処理することにより、確認が達成されてもよい。
【０１１０】
形質転換された植物またはその部分における目的のポリペプチドの発現は、免疫学的方法を使用して検出することができる。使用することのできる免疫学的方法は、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、多重ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ等の免疫に基づく技術を使用する競合および非競合アッセイ系を含むが、これらに限定されない。そのようなアッセイはルーチンであり、当該技術分野において既知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）（上記参照）を参照）。
【０１１１】
発現は、イムノアッセイの他に、目的のポリペプチドまたはレポーター遺伝子またはその両方をコードするポリヌクレオチドの発現パターンを評価することによっても測定することができる。例えば、発現パターンは、ノーザン分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＦＲＥＴ検出、１つ以上の分子ビーコンのモニタリング、オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、液体マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、マイクロエレクトロニックアレイへのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ断片フィンガープリント法等によって評価することができる。選択される特定の方法は、回収されるＲＮＡの数、技術者の好み、利用可能な試薬および機器、検出器等の要因に依存する。
【０１１２】
以下の実施例は、例示目的で提供されるのであって、限定する目的のものではない。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：ベクター
二重エンハンサーの概念を検証するために２０個のベクターを構築した。タバコまたはトウモロコシの発現のために９個のベクターを２セット作製した。トウモロコシおよびタバコの両方において、各エンハンサーおよびエンハンサーの組み合わせをテストした。２つの追加のベクターは、タバコにおいてのみテストした。タバコの発現にはケストルムプロモーターおよび３５Ｓターミネーターを使用し、トウモロコシの発現にはＰＥＰＣプロモーターおよびＰＥＰＣターミネーターを使用した。ＥＲを標的とするエンドグルカナーゼをレポーター遺伝子として使用した。エンドグルカナーゼ遺伝子を発現宿主にコドン最適化した：トウモロコシの発現のためのトウモロコシ最適化およびタバコの発現のための大豆最適化。トウモロコシまたはタバコにおける全ての構築物について、プロモーターとエンハンサーの間、およびエンハンサーと開始コドン（Ｋｏｚａｋ）の間のコンテキストを同じに維持するよう注意した。二重エンハンサーを使用した場合、エンハンサーの間に干渉する配列はなく、配列は隣接していた。
【０１１４】
タバコ：プロモーター-ＴＧＣＧＧＡＴＣＣ-エンハンサー挿入-ＡＡＡＡＡＡ-レポーター
トウモロコシ：プロモーター-ＧＧＡＴＣＣ-エンハンサー挿入-ＴＡＡＡＣＣ-レポーター
【０１１５】
ベクター構築物については、後により詳細に記載する。
【０１１６】
実施例２：タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、タバコの一過性系における発現を増加させる
タバコの一過性系において得られた結果は、対照構築物と比較して、２つの翻訳エンハンサー要素（ウイルス性＋細胞性５’ＵＴＲ）が互いに対してタンデムに配置されたポリヌクレオチド構築物で形質転換したタバコ植物の葉において、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）の発現が有意に増加したことを示している。ウイルス性翻訳エンハンサー要素が細胞性翻訳エンハンサー要素の上流に（すなわち５’末端に）配置されたときに、発現の増加が観察された。
【０１１７】
方法
植物材料：ＴＥＶ−Ｂタバコ転換体を使用した一過性発現アッセイを用いて、種々のポリヌクレオチド構築物によってもたらされたＥＧの発現レベルをモニタリングした。
ポリヌクレオチド構築物：６つの異なるポリヌクレオチド構築物を使用した。ウイルス性および細胞性の５’ＵＴＲの種々の組み合わせを含有する構築物を、ＥＧをコードする配列の上流に配置した。その構築物をタバコの一過性系および安定系に使用した。
【０１１８】
１．タンデム構築物：
Ω−ＮｔＡＤＨ構築物：この構築物では、「Ω」とも示されるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のウイルス性翻訳エンハンサー要素（５’ＵＴＲ（５’リーダー）（配列番号１）を、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔＡＤＨ）遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号４）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）Ωエンハンサー（配列番号１）；（３）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１１９】
ＮｔＡＤＨ−Ω構築物：この構築物では、細胞性翻訳エンハンサー要素（ＮｔＡＤＨ遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号４）をウイルス性翻訳エンハンサー要素（ＴＭＶの５’ＵＴＲ（配列番号１）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）ＮｔＡＤＨエンハンサー要素（配列番号４）；（３）Ωエンハンサー要素（配列番号１）；（４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１２０】
２．単一構築物：
Ω構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）Ω翻訳エンハンサー要素（配列番号１）；（３）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（４）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（５）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１２１】
ＮｔＡＤＨ構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（３）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（４）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（５）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１２２】
一過性形質転換プロトコル：発現カセットをバイナリーベクターにクローニングした。冷凍解凍法を用いてバイナリーベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４に移入した（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）”Ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ，”Ａ３  １−１９，ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｅｌｖｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｐｒｏｏｔ（Ｋｌｕｗａｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。
【０１２３】
ＴＥＶ−Ｂ幼植物（４週齢）の葉を酵素の一過性発現に使用した。転写後遺伝子スライシングを抑制するＴＥＶ由来の突然変異Ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子を含有するトランスジェニックＴＥＶ−Ｂタバコ植物（タバコ栽培品種Ｘａｎｔｈｉ中に作製）（Ｍａｌｌｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６２２−６２５）を、タバコ葉における選択された酵素の一過性発現のために使用した。アグロバクテリウム培養物の調製およびタバコの浸潤は、Ａｚｈａｋａｎａｎｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３：３９３−４０４に記載されるように行った。
【０１２４】
簡単に述べると、遺伝子組み換えされたアグロバクテリアを１００μＭアセトシリンゴンおよび１０μＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）を含有する５０ｍｌのＬＢ培地で一晩増殖させ、その後、４０００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレットをＯＤ600＝１．０まで感染培地（ビタミンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ塩、２％スクロース、５００μＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、１０μＭ  ＭｇＳＯ4、および１００μＭアセトシリンゴン）に再懸濁し、次いで２８℃で３時間維持した。個々の葉の浸潤は、５ｍｌシリンジを使用して、シリンジの先端（針は付いていない）を葉の背軸面に押し当てることにより、約４週齢のＴＥＶ−Ｂタバコ植物に対して行った。浸潤させた植物を２２〜２５℃で、明期１６時間および暗期８時間の光周期で維持した。浸潤の５日後、その後の分析のために植物組織を採取した。
【０１２５】
活性アッセイ：４０℃、ｐＨ４．７５で、ＣＭ−セルロース上で生成された遊離グルコースの観点から、本方法によりｎｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇでＥＧを測定した。グルコースオキシダーゼ／ペロキシダーゼ（ＧＯＰＯＤ）化学を用いて、標準曲線に対してグルコースを測定した。グルコースに基づくアッセイ法は比色アッセイであり、４０℃でＧＯＰＯＤがグルコースと反応し、淡いピンクから濃いピンクがかった発色団を生じる。このアッセイは４つの基本的ステップからなる：（１）トランスジェニック組織の粉砕／製粉；（２）粉砕組織サンプルの計量；（３）酢酸ナトリウム緩衝液中における酵素の抽出；および（４）酵素活性／タンパク質定量のためのアッセイ。
【０１２６】
１．材料：
酢酸ナトリウム緩衝液：１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７５）、０．０２％ＮａＮ3、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、および緩衝液５０ｍｌ当たり１錠の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤。緩衝液を調製し、４℃で３ヶ月まで保存することができるが、カクテル錠剤の添加後、緩衝液は４℃で１週間の有効期間を有する。約８００ｍｌのＨ2Ｏ中で５０ｍｌの酢酸ナトリウム（１Ｍ）、５０ｍｌの酢酸（１Ｍ）を混合し、ｐＨを４．７５に調整することにより、溶液を調製した。次いで、１０ｍｌのアジ化ナトリウム（２％）および１０ｍｌのＴｗｅｅｎ（２％）を加え、Ｈ2Ｏで１Ｌに希釈した。
【０１２７】
基質溶液：乾燥した１０００ｍｌメスフラスコに５ｇのＣＭＣ−４Ｍを計り入れることにより、０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ−４Ｍ；Ｍｅｇａｚｙｍｅロット番号８１１０１；Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）溶液を調製した。２５ｍｌの９５％エタノールでサンプルを十分に湿らせ、そこに６００ｍｌのＨ2Ｏを加えながら撹拌した。溶液を１００℃まで加熱し、１０分間撹拌して基質が確実に溶解するようにした。次いで、溶液を２５℃まで冷却し、次いで、５０ｍｌの酢酸ナトリウム（１Ｍ）、５０ｍｌの酢酸（１Ｍ）、および１０ｍｌのアジ化ナトリウム（２％）を加え、体積が１０００ｍｌになるようにＨ2Ｏで調整した。この基質溶液を４℃で保存した。
【０１２８】
β−グルコシダーゼ溶液：基質１ｍｌ当たり２０μｌのクロコウジカビ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）由来β−グルコシダーゼを混合し、最終濃度を０．８μｌ／ｍｌとした。この溶液は、毎日新しく作製した。
【０１２９】
グルコース標準物質：酢酸ナトリウム中で、無水グルコース（純度９９．５％）から濃縮グルコース（１００ｍＭ）を調製した。酢酸ナトリウム緩衝液中で希釈を行い、０、１、２、３、４および５ｍＭグルコースの溶液を作製した。ＧＯＰＯＤアッセイにおいて、各標準物質を２０μｌずつ加え、０、１、２０、４０、６０、８０および１００ｎｍｏｌの標準曲線を作成した。
【０１３０】
グルコース試薬緩衝液（濃縮：１Ｍオルトリン酸二水素カリウム；２００ｍＭパラヒドロキシ安息香酸；および０．４％アジ化ナトリウム
グルコース測定試薬（バイアル当たり）：＞１２，０００Ｕグルコース酸化酵素；＞６５０Ｕペルオキシダーゼ；および０．４ｍｍｏｌ４−アミノアンチピリン
グルコース標準物質：１．０ｍｇ／ｍｌグルコース；および０．２％ｗ／ｖ安息香酸
【０１３１】
色素原試薬（ＧＯＰＯＤ）：５０．０ｍｌのグルコース試薬緩衝液を蒸留Ｈ2Ｏで１Ｌに希釈した。１バイアルのグルコース測定試薬の内容物をグルコース試薬緩衝液に溶解した。得られたＧＯＰＰＯＤ試薬は、茶色の試薬瓶に保存した場合、２〜５℃で３ヶ月まで安定しているか、または冷凍した状態で保存した場合、１２ヶ月以上安定している。この試薬を新たに調製すると、淡黄色または淡いピンク色であり得る。４℃で２〜３ヶ月経過すると、より濃いピンク色を発色する。この溶液の吸光度は、蒸留水に対して読み取った場合に０．０５未満であるべきである。
【０１３２】
２．サンプルの調製および抽出：
緑葉サンプル／２４ウェルブロック形式：ドライアイス上に維持した２４ウェルブロックの各ウェルに、４つのボールベアリングを加えた。各サンプルにつき、およそ０．５ｇの緑葉をブロックの各ウェルに入れ、ブロックをゴムの覆いで密封し、−８０℃で最低３時間静置した。アッセイ当日、Ｋｌｅｃｏ（登録商標）Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ／Ｍｉｃｒｏ  Ｔｕｂｅ  Ｇｒｉｎｄｉｎｇ  Ｍｉｌｌ（Ｋｌｅｃｏ、Ｖｉｓａｌｉａ，ＣＡ）を使用してサンプルを２分間粉砕し、次いで３０００ｒｐｍで３０秒という短時間遠心分離した。ブロックからゴムの覆いを取り外し、１〜３ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液を加えた。次いで、２４ウェルブロックをプレートシーラーで２回（各方向に１回）密閉し、ボルテックスした。次いで、ベンチトップローテーター上で、室温で２０分間かけてサンプルを抽出した。２４ウェルブロックを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清をアーカイブプレート（すなわち、９６ウェル平底リーディングプレートまたは深い９６ウェルブロック）に移し、下の列を標準物質のために空けておいた。
【０１３３】
３．アッセイ：氷上の９６ウェルＰＣＲプレートを２組調製した。１２０時間（Ｔ１２０）プレートには、５０μｌのβ−グルコシダーゼと基質の混合物をプレートの各ウェルに加えた。次いで、２０μｌのサンプル抽出液を加えた。プレートを密閉し、ボルテックスし、短時間遠心分離した（３０００ｒｐｍで１５秒）。次に、ＰＣＲ機に４０℃で２時間プレートを入れた。
【０１３４】
２時間のインキュベーション後、９６ウェル平底リーディングプレートの各ウェルに２００μｌのＧＯＰＯＤを加え、そこに２０μｌのＴ１２０サンプルまたはグルコース標準物質を加えた。プレートを密閉し、ボルテックスし、短時間遠心分離した（３０００ｒｐｍで１５秒）。次に、４０℃のホットプレート上に２０分間プレートを置き、次いで５１０ｎｍ（１ｃｍの光路）で吸収度を測定した。
【０１３５】
０時間（Ｔ０）対照プレートには、５０μｌのβ−グルコシダーゼと基質の混合物をプレートの各ウェルに加えた。次いで、２０μｌのサンプル抽出液を加えた。プレートを密閉し、ボルテックスし、短時間遠心分離した。次に、ＰＣＲ機に９０℃で１０分間プレートを入れた。
【０１３６】
１０分間のインキュベーション後、９６ウェル平底プレートの各ウェルに２００μｌのＧＯＰＯＤを加え、そこに２０μｌのＴ０サンプルまたはグルコース標準物質を加えた。プレートを密閉し、ボルテックスし、短時間遠心分離した。次に、プレートを４０℃で２０分間置き、５１０ｎｍ（１ｃｍの光路）で吸収度を測定した。
【０１３７】
全タンパク質：製造者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、全タンパク質を測定した。
【０１３８】
計算のための式：酵素活性＝μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ＝（ｎｍｏｌグルコースＴ１２０サンプル-ｎｍｏｌグルコースＴ０サンプル）×（１／１２０分）×（酵素ｒｘｎ中で１／０．０２ｍｌ添加）＝（ｎｍｏｌ／分／ｍｌ）／（ｍｇ／ｍｌ全タンパク質）＝ｎｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ
【０１３９】
結果
図１に示すように、翻訳エンハンサー要素が存在しない構築物は、ベースラインのエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性（８μｍｏｌ／分／全可溶性タンパク質ｍｇ）を有し、ベクター対照構築物はベースライン未満であった。単一要素構築物では、ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素は、ベースラインの約１．５倍活性を増加させた。対照的に、Ω翻訳エンハンサー要素は、活性に負の影響を与えた。タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素構築物では、細胞性およびウイルス性の翻訳エンハンサー要素が配置された順序が、ＥＧの発現、そして最終的にはＥＧの活性に有意に影響を及ぼした。つまり、Ω翻訳エンハンサー要素がＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素の上流に配置されたとき、活性はベースラインの約２．０倍増加した。対照的に、ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素がΩ翻訳エンハンサー要素の上流に配置されたとき、活性はベースライン未満であった。したがって、エンドグルカナーゼの発現は、翻訳エンハンサー要素のタンデム構成による影響を受けた。ウイルス性翻訳エンハンサー要素を細胞性翻訳要素の上流に配置することにより、ＥＧの発現は、単一の細胞性エンハンサー要素で観察された発現をさらに約２５％を上回って増強された。
【０１４０】
細胞性翻訳エンハンサー要素に対するウイルス性翻訳エンハンサー要素の順序が発現ひいては活性に影響すると考えられたため、上述の５つの構築物（翻訳エンハンサー要素を含まないベクター；Ω構築物；ＮｔＡＤＨ構築物；Ω−ＮｔＡＤＨ構築物；およびＮｔＡＤＨ−Ω構築物）を使用して第２セットの実験を行った。最初の実験では、５つの構築物からの発現を生葉重ベースで比較し（図２Ａ）、第２の実験では、５つの構築物からの発現を全可溶性タンパク質ベースで比較した（図２Ｂ）。上記のように、ウイルス性翻訳エンハンサー要素と細胞性翻訳エンハンサー要素の順序が、ＥＧの活性に有意に影響を及ぼした。そのため、ＥＧの活性は、ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素によりベースラインを超えて増加し、ウイルス性翻訳エンハンサー要素を細胞性翻訳エンハンサー要素の上流に配置したときにのみ、さらに増加した。
【０１４１】
エンハンサー要素が存在しないベクター構築物と比較して、Ω−ＮｔＡＤＨ構築物がＥＧの活性を増強させた程度を表１にまとめた。
【０１４２】
【表１】
2013503640.tif 000002
【０１４３】
実施例３：タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、安定したタバコ事象における発現を増強させる。
【０１４４】
１．タンデム構築物
Ω−ＮｔＡＤＨ構築物：この構築物では、「Ω」とも示されるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号１）を、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔＡＤＨ）遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号４）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２；（２）Ωエンハンサー（配列番号１）；（３）ＮｔＡＤＨ  翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１４５】
ＮｔＡＤＨ−Ω構築物：この構築物では、細胞性翻訳エンハンサー要素（ＮｔＡＤＨ遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号４）をウイルス性翻訳エンハンサー要素（ＴＭＶの５’ＵＴＲ（配列番号１）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）ＮｔＡＤＨエンハンサー要素（配列番号４）；（３）Ωエンハンサー要素（配列番号１）；（４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１４６】
ＡＭＶ−ＮｔＡＤＨ：この構築物では、ＡＭＶのウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号３）を、ＮｔＡＤＨ遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号４）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２；（２）ＡＭＶエンハンサー要素（配列番号３）；（３）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列を含むレポーター（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１４７】
ＴＥＶ−ＮｔＡＤＨ：この構築物では、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号２）を、ＮｔＡＤＨ遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号４）とタンデムにスタッキングさせた。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２；（２）ＴＥＶエンハンサー要素（配列番号２）；（３）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列を含むレポーター（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１４８】
Ω−ＺｍＡＤＨ：この構築物では、ＴＭＶのウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号１）を、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（ＺｍＡＤＨ）遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号７）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２；（２）Ω（配列番号１）；（３）ＺｍＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号７）；（４）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（６）エンドグルカナーゼコード配列を含むレポーター（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１４９】
２．単一構築物
Ω構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）Ωエンハンサー要素（配列番号１）；（３）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（４）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（５）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１５０】
ＮｔＡＤＨ構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（３）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（４）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（５）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１５１】
ＺｍＡＤＨ構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）黄化葉巻ウイルス由来のケストルムプロモーター（配列番号１２）；（２）ＺｍＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号７）；（３）６ｂｐ大豆Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（４）大豆種子タンパク質グリシニン由来のシグナル配列（配列番号１４）；（５）エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ｔ３５ｓ転写ターミネーター（配列番号１７）。
【０１５２】
Ｔ０タバコの形質転換およびサンプリング
タバコの形質転換は、構築物当たりの回収された事象の合計およびコピー数の分布の点において非常にばらつきがあった。さらに、いくつかの事象は、一貫してコピー数の混在を示しており、例えば、選択マーカーは一貫して２コピーであり、ＥＧは一貫して１コピーであった。
【０１５３】
形質転換培養容器から温室内の土壌に移植した日に対する２つの時点で、タバコ植物のサンプリングを行った。移植から１３日後および３４日後にサンプル（パンチ穴約３つ分）を採取した。１３日目の植物には２〜４枚の葉があった。最も若い葉からサンプルを収集した。最も若い葉が小さ過ぎる場合は、２番目に若い葉のサンプルを採取した。３４日目の植物は、開花が始まっていた。この段階で、一番下にある（最も成熟した）緑葉をサンプリングのために選択した。ＥＬＩＳＡおよびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）により組織サンプルを分析した。
【０１５４】
ほとんどの事象は、１３日目および３４日目の両方にサンプリングを行った。しかしながら、一方の日には事象のスクリーニングを行ったが、他方の日には行わなかった場合もいくつかあった。１３日目のサンプルに発現が見られなかった事象については廃棄した。１３日目に低い発現を生じたが、３４日目には発現が見られなかった事象は、３４日目のデータセットには含めなかった。最終的に、１３日間のスクリーニングの間には、いくつかの植物の発現が見られなかった。これらの植物は、１３日目にはアッセイを行わなかったが、３４日目にはアッセイを行った。１３日と３４日のデータセットの間で、いくつかの構築物について事象数に若干の違いがあるのはこのためである。
【０１５５】
Ｔ０タバコ幼葉の結果
Ω＋ＺｍＨＳＰ１０１を例外として、二重エンハンサー５つのうちの４つは、エンハンサーを含まない対照よりも平均発現が高かった。一過性データに基づいて予想されたように、エンハンサーを含まない対照と比較して、Ω単独およびＮｔＡＤＨ＋Ωの成果は不良であった。
【０１５６】
【表２】
2013503640.tif 000003
【０１５７】
Ｔ０タバコ成葉の結果
予想されたように、成葉サンプルでは、全構築物にわたってより高い平均発現が見られた。２つの例外はあったが、幼葉サンプルに観察されたのと同じ傾向が成葉サンプルにも観察された。ＮｔＡＤＨを用いた事象は、以前に観察されたよりも有意に低い発現レベルを示した。この結果は、２回目のサンプリングにおいて確認された。なぜ発現レベルが低下したのかは不明である。２つ目の例外は、Ω＋ＺｍＡＤＨが、単一エンハンサー対照（ＺｍＡＤＨ単独）よりもはるかに良好な成果を出したことあった。
【０１５８】
【表３】
2013503640.tif 000004
【０１５９】
Ｔ１タバコ
各構築物から最大１１事象をＴ１分析のために選択した。以前にスクリーニングされた事象に加えて、ＴＥＶ＋ＮｔＡＤＨのためにさらなる事象が加えられた。Ｔ０分析の間に発現が見られなかったＴＥＶ＋ＮｔＡＤＨの２事象からのＴ１種子を分析した。各事象からのＴ１種子を成長チャンバ内で発芽させた。植え付けから２３日後、最も大きな葉からサンプル（パンチ穴約３つ分）を採取した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いて子孫のコピー数について分析した。各Ｔ０事象からの１コピーおよび２コピーのＴ１植物のみをＥＬＩＳＡにより分析した。所与の事象について全ての１コピー同胞の平均を、その事象の代表値と見なした。２コピー植物についても同様の平均を取った。各結果を構築物ごとに平均化して、エンハンサーの組み合わせに基づく成績データを得た。
【０１６０】
Ｔ１タバコ幼葉の結果
単一コピー植物のみまたは二重コピー植物のみを比較した場合、構築物の成績は同様であった。データの入手が不可能であったΩ＋ＺｍＨＳＰ１０１を例外として、二重エンハンサー５つのうちの４つは、エンハンサーを含まない対照よりも平均発現が高かった。Ｔ０幼葉のスクリーニングで観察されたように、エンハンサーを含まない対照と比較して、Ω単独の成果は不良であった。この実験において、ＮｔＡＤＨ＋Ωは、エンハンサーを含まない対照よりも良好な成績であった。このＴ１のスクリーニングの結果は、ＮｔＡＤＨおよびΩ＋ＮｔＡＤＨについての一過性の観察と同様であった。単一エンハンサーは発現を増加させ、第２の翻訳エンハンサーの付加によりさらに発現が強化された。これは、ＮｔＡＤＨと組み合わせたＡＭＶおよびＴＥＶにおいても観察された。ＺｍＡＤＨおよびΩ＋ＺｍＡＤＨの場合、これには該当しなかったようである。
【０１６１】
【表４】
2013503640.tif 000005
【０１６２】
実施例４：タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素は、トウモロコシＴ０安定発現系において発現を増強する。
１．タンデム構築物：
Ω−ＮｔＡＤＨ構築物：この構築物では、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号１）を、ＮｔＡＤＨ遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号４）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）トウモロコシ由来のＰＥＰＣプロモーター（配列番号２０；（２）Ωエンハンサー要素（配列番号１）；（３）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（４）６ｂｐトウモロコシＫｏｚａｋ配列（配列番号１３）；（５）トウモロコシ由来のγ‐ゼインシグナル配列（配列番号２１）；（６）単子葉最適化エンドグルカナーゼコード配列（配列番号２３）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）トウモロコシ由来のＰＥＰＣ  転写ターミネーター（配列番号２５）。
【０１６３】
ＡＭＶ−ＮｔＡＤＨ：この構築物では、ＡＭＶ遺伝子のウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号２）を、ＮｔＡＤＨ遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号４）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）トウモロコシ由来のＰＥＰＣプロモーター（配列番号２０）；（２）ＡＭＶエンハンサー要素（配列番号２）；（３）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（４）６ｂｐトウモロコシＫｏｚａｋ配列（配列番号２２）；（５）γ‐ゼインシグナル（配列番号２１）；（６）単子葉最適化エンドグルカナーゼコード配列を含むレポーター（配列番号２３）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ＰＥＰＣ転写ターミネーター（配列番号２５）。
【０１６４】
ＴＥＶ−ＮｔＡＤＨ：この構築物では、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号２）を、ＮｔＡＤＨ遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素（配列番号４）５’ＵＴＲとタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）ＰＥＰＣプロモーター（配列番号２０）；（２）ＴＥＶエンハンサー要素（配列番号２）；（３）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（４）６ｂｐトウモロコシＫｏｚａｋ配列（配列番号２２）；（５）γ‐ゼインシグナル配列（配列番号２１）；（６）単子葉最適化エンドグルカナーゼコード配列を含むレポーター（配列番号２４）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（８）ＰＥＰＣ転写ターミネーター（配列番号２５）。
【０１６５】
Ω−ＺｍＡＤＨ：この構築物では、ＴＭＶ（Ω）のウイルス性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号１）を、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（ＺｍＡＤＨ）遺伝子の細胞性翻訳エンハンサー要素５’ＵＴＲ（配列番号７）とタンデムにスタッキングした。この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）ＰＥＰＣプロモーター（配列番号２０）；（２）Ω（配列番号１）；（３）ＺｍＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号７）；（４）６ｂｐトウモロコシＫｏｚａｋ配列（配列番号２２）；（５）γ‐ゼインシグナル配列（配列番号２１）；（６）単子葉エンドグルカナーゼコード配列を含むレポーター（配列番号１５）；（７）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；（８）ＰＥＰＣ転写ターミネーター（配列番号２５）。
【０１６６】
２．単一構築物：
ＮｔＡＤＨ構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）ＰＥＰＣプロモーター（配列番号２０）；（２）ＮｔＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号４）；（３）６ｂｐトウモロコシＫｏｚａｋ配列（配列番号２２）；（４）γ‐ゼインシグナル配列（配列番号２１）；（５）単子葉最適化エンドグルカナーゼコード配列（配列番号１５）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ＰＥＰＣ転写ターミネーター（配列番号２５）。
【０１６７】
ＺｍＡＤＨ構築物：この構築物の要素を以下のように５’−３’の順に配置した：（１）ＰＥＰＣ（配列番号２０）；（２）ＺｍＡＤＨ翻訳エンハンサー要素（配列番号７）；（３）６ｂｐトウモロコシＫｏｚａｋ配列（配列番号２２）；（４）γ‐ゼインシグナル配列（配列番号２１）；（５）トウモロコシ最適化エンドグルカナーゼコード配列（配列番号２３）；（６）小胞体保留シグナル（配列番号１６）；および（７）ＰＥＰＣ転写ターミネーター（配列番号２５）。
【０１６８】
Ｔ０トウモロコシのサンプリング
形質転換培養容器から土壌に移植してから６日後に、トウモロコシ幼植物のサンプリングを行った。この段階の植物には、平均２〜４枚の葉があった。目に見える最も若い葉先からサンプル（パンチ穴約３つ分）を収集した。目に見える最も若い葉先が小さ過ぎる場合は、２番目に若い葉先のサンプルを採取した。形質転換からスクリーニングされた全ての事象は、選択マーカーの単一コピーおよび目的の遺伝子を含有し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によりアッセイしたところバックボーンはなかった。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いて２回目に事象を単一コピーとして確認した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて発現を定量した。
【０１６９】
Ｔ０トウモロコシ幼葉の結果
全ての二重エンハンサーの組み合わせが、エンハンサーを含まない対照よりも優れていた。全ての二重エンハンサーの組み合わせはまた、それらの関連する単一エンハンサー対照よりも優れていた。ＺｍＡＤＨは、エンハンサーを含まない対照を超えて発現を増加させ、第２の翻訳エンハンサーの付加によりさらに発現が増加した。
【０１７０】
【表５】
2013503640.tif 000006
【０１７１】
実施例５：Ｔ１トウモロコシの結果
Ｔ１トウモロコシのデータは、Ｔ０幼葉のデータを反映するものではなかった。Ｔ１トウモロコシ植物において実行した１つの実験では、エンハンサー構築物のレポーター遺伝子（目的の遺伝子）の発現が、エンハンサーを含まない対照よりも低いか、またはそれと等しかったという結果を示した。これは、サンプルを採取したときに植物が若すぎたためであると考えられる。使用した光合成プロモーター（ＰＥＰＣ）が、非常に若い葉において完全に活性ではなかった可能性がある。この若い段階では、葉の出現におけるわずかな変動がプロモーターの機能性に多大な影響を及ぼした可能性があり、それによってエンハンサーの効果が顕在化しなかった可能性がある。
【０１７２】
これらの実験は、タンデムにスタッキングしたウイルス性および細胞性の翻訳エンハンサー要素を有するポリヌクレオチド構築物を利用することによる、植物におけるポリペプチド生産の増強の最初の既知の例を実証するものである。ウイルス性翻訳エンハンサー要素が細胞性翻訳エンハンサー要素の上流に配置されたときに発現が増加したことから、タンデムにスタッキングした翻訳エンハンサー要素の順序は重要であった。この配向は、典型的には、任意の翻訳エンハンサー要素の非存在下で達成される発現を少なくとも２倍上回って、また、単一の細胞性翻訳エンハンサー要素の使用により達成され得る発現レベルを少なくとも２５％上回って、ＥＧの発現を増加させた。
【０１７３】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つ以上の（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法的対象物を意味する。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つ以上の要素を意味する。本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を暗示するものであって、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の排除を暗示するものではないことを理解されたい。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「約」とは、統計的に有意な範囲内の値、例えば、記載される濃度、長さ、分子量、純度、時間、または温度を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、またより典型的にはさらに５％以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容偏差は、検討される特定のシステムに依存し、また当業者に容易に理解され得る。
【０１７５】
本明細書に記載される全ての刊行物および特許出願は、この発明が関連する技術分野の当業者の技術レベルを示唆するものである。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参照によって具体的かつ個別に組み込まれた場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
上記発明についての理解を明確にする目的で、説明および例を用いて詳細に記載してきたが、上記実施形態および添付の特許請求の範囲のリストの範囲内で、特定の変更例および修正例が行われ得ることは明白であろう。
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’ＵＴＲである。
配列番号２は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲである。
配列番号３は、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）の５’ＵＴＲである。
配列番号４は、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’ＵＴＲである。
配列番号５は、イネアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’ＵＴＲである。
配列番号６は、シロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’ＵＴＲである。
配列番号７は、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の５’ＵＴＲである。
配列番号８は、トウモロコシ熱ショックタンパク質１０１（ＨＳＰ１０１）の５’ＵＴＲである。
配列番号９は、トウモロコシ熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の５’ＵＴＲである。
配列番号１０は、ペチュニア熱ショックタンパク質１０１（ＨＳＰ１０１）の５’ＵＴＲである。
配列番号１１は、大豆熱ショックタンパク質１７．９（ＨＳＰ１７．９）の５’ＵＴＲである。
配列番号１２は、ケストルム黄化葉巻ウイルスプロモーターである。
配列番号１３は、大豆Ｋｏｚａｋ配列である。
配列番号１４は、大豆種子タンパク質グリシニンＣＤＳである。
配列番号１５は、大豆最適化エンドグルカナーゼＣＤＳである。
配列番号１６は、大豆に最適化した小胞体保留シグナルである。
配列番号１７は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）ターミネーターである。
配列番号１８は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲである。
配列番号１９は、トウモロコシえそ条斑病ウイルスの５’ＵＴＲである。
配列番号２０は、トウモロコシＰＥＰＣプロモーターである。
配列番号２１は、トウモロコシガンマゼインのシグナル配列である。
配列番号２２は、トウモロコシＫｏｚａｋ配列である。
配列番号２３は、トウモロコシに最適化したエンドグルカナーゼＣＤＳである。
配列番号２４は、トウモロコシに最適化した小胞体保留シグナルである。
配列番号２５は、トウモロコシＰＥＰＣターミネーターである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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