(57)【要約】本発明は、遺伝学的に規定されたがんに感作されたモデル系において、生物学的証拠の相対的重さを高確率ドライバー遺伝エレメントのライブラリーに体系的に割り当てるように設計された、状況特異的フォワード遺伝子スクリーニングに関し、ここで、操作された変異の群は、所与の腫瘍種の特定の臨床上関連する遺伝子サブクラスを反映する。スクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成されても、ｅｘ  ｖｉｖｏで形成されてもよい。スクリーニングによって、ドライバー遺伝エレメントを標的とするためのクリニカルパス仮説の形成、および同時に、がんにおけるドライバー遺伝エレメント（複数可）の役割の迅速な機能確認が可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の腫瘍形成と関連している機能または表現型を調節する遺伝子を同定する方法であって、以下のステップ：
ａ．所与の表現型または組織型を代表する細胞を含む細胞培養物に、
ｉ．目的の遺伝エレメントの収集物を含む核酸ライブラリー、ならびに
ｉｉ．がん遺伝子および／またはがん化プロセスと関連しているその他の遺伝エレメント
を導入して、がん細胞遺伝子型を有する遺伝的に操作された標的細胞を作製するステップと、
ｂ．非ヒト哺乳動物に該標的細胞を移植して、該哺乳動物において腫瘍を生じさせるステップと、
ｃ．該目的の遺伝エレメントの１つまたは複数の発現を該腫瘍において同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記所与の表現型または組織型を代表する細胞が、初代細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記移植が同所性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記初代細胞が不死化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記所与の表現型または組織型を代表する細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記所与の表現型または組織型を代表する細胞が、始原細胞または幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記所与の表現型または組織型を代表する細胞において、１つまたは複数の腫瘍抑制タンパク質経路を不活化または抑制するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍抑制タンパク質経路が、ＲＢおよび／またはｐ５３である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸ライブラリーが、前記目的の遺伝エレメントに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸ライブラリーが、前記目的の遺伝エレメントの不活性バージョンまたはドミナントネガティブバージョンをコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的細胞が、ＴＥＲＴを発現するように遺伝的に操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記がん遺伝子が、ＢＲＡＦがん遺伝子、ＮＲＡＳがん遺伝子、ＫＲＡＳがん遺伝子、ＰＩ３Ｋがん遺伝子、ＰＫＣｉがん遺伝子、ＨＥＲ２がん遺伝子、ＡＰＣがん遺伝子、ＥＧＦＲがん遺伝子、ＰＴＥＮ  ＫＤがん遺伝子、ＮＦ１  ＫＤがん遺伝子、Ｍｙｒ−ＡＫＴがん遺伝子、Ｍｙｒ−Ｐ１１０ａがん遺伝子、β−カテニンがん遺伝子、ＥＧＦＲｖＩＩＩがん遺伝子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
目的の候補遺伝子または遺伝エレメントが、キナーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記キナーゼが、野生型キナーゼまたは活性化変異体キナーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
目的の候補遺伝子または遺伝エレメントが、ホスファターゼ遺伝子および／または遺伝エレメントを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
目的の候補遺伝子または遺伝エレメントが、メチルトランスフェラーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
目的の候補遺伝子または遺伝エレメントが、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に関与している遺伝子および／または遺伝エレメントを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
目的の候補遺伝子または遺伝エレメントが、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達経路に関与している遺伝子および／または遺伝エレメントを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
目的の候補遺伝子または遺伝エレメントが、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達経路に関与している遺伝子および／または遺伝エレメントを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍形成と関連している前記機能または表現型が、転移、細胞遊走、血管新生、細胞外マトリックス分解、足場非依存性増殖またはアノイキスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ｄ．ステップ（ａ）において作製された前記標的細胞に、ステップ（ｃ）において同定された前記遺伝エレメントの発現を調節できる核酸を導入して、改変された標的細胞を作製するステップと、
ｅ．非ヒト哺乳動物に、該改変された標的細胞を同所性に移植するステップと、
ｆ．該改変された標的細胞が、対照と比較して、該哺乳動物において腫瘍形成を低減するか否かを決定するステップと
を含む確認ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
操作された腫瘍形成経路と相互作用する生物活性作用物質をスクリーニングするための方法であって、
ａ．所与の表現型または組織型を代表する細胞を含む細胞培養物に、がん遺伝子および該がん遺伝子と関連しているがん化プロセスと結びついている１つまたは複数の目的の遺伝子または遺伝エレメントを導入することを含む、がん細胞遺伝子型を有する遺伝的に操作された標的細胞を作製するステップと、
ｂ．該遺伝的に操作された標的細胞を、候補生物活性作用物質と接触させるステップと、
ｃ．該生物活性作用物質が、腫瘍形成表現型に影響を及ぼすか否かを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記腫瘍形成表現型が、転移、細胞遊走、血管新生、細胞外マトリックス分解、足場非依存性増殖またはアノイキスである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年１月２１日に出願されたＵＳＳＮ６１／２９７，１４３の利益を主張する。ＵＳＳＮ６１／２９７，１４３の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本開示内容の実施形態は、遺伝子発見および標的確認において補助するための状況特異的遺伝子スクリーニングプラットフォームを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
がんは、遺伝学的に不均一であり、がん遺伝子機能は、高度に状況依存的である。がんは、ゲノム中の遺伝子のＤＮＡ配列の異常（例えば、変異、コピー数の変化など）によって導かれる。体細胞性に変化しており、ひいてはがん化を導く遺伝子を同定することが、組換えＤＮＡ技術の出現以来のがん研究の主要な目的であった。
【０００４】
がんのための標的療法の開発は、特定の腫瘍が生存力のために非常に依存している特定のがん化病変があることを要求するがん遺伝子依存（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）および腫瘍維持というパラダイムによって形作られてきた。同時に、これらの腫瘍維持の標的の相対的な重要度は、各腫瘍における関連遺伝的変化の特定の群に応じて変わり、臨床における可変性の治療反応の可能性ある基盤を提供すると思われる。したがって、標的が、腫瘍維持において重要な協力的役割および律速的役割を果たす遺伝的状況についての知識が、このような標的療法の可能性ある臨床開発経路を明らかにするであろう。
【０００５】
前述の関連技術の記載を含めた本記載を通じて、ありとあらゆる米国特許を含めた本明細書に記載されるありとあらゆる公的に入手可能な文書は、その全文が参照によって本明細書に具体的に援用される。前述の関連技術の記載は、決して、係属中米国特許出願を含めたそれに記載される文書のいずれかが、本開示内容の実施形態の先行技術であるということの承認として意図されるものではない。さらに、記載される生成物、方法および／または装置と関連する何らかの不利点の本明細書における記載は、開示される実施形態を制限することを意図するものではない。実際、本開示内容の実施形態は、記載される生成物、方法および／または装置の特定の特徴を、記載される不利点を受けることなく含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細胞の腫瘍形成と関連している機能または表現型を調節する遺伝子および／または遺伝エレメントの同定に関する。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、所与の表現型または組織型を代表する細胞に、目的の遺伝エレメントの収集物を含む核酸ライブラリーならびにがん遺伝子および／またはがん化プロセスと関連しているその他の遺伝エレメントを導入して、がん細胞遺伝子型を有する遺伝的に操作された標的細胞を作製するステップ、非ヒト哺乳動物に標的細胞を、例えば同所性に、移植して、哺乳動物において腫瘍を生じさせるステップ、ならびに腫瘍における、目的の遺伝エレメントの１つまたは複数の発現を同定するステップのうち１つまたは複数を含む、細胞の腫瘍化と関連している機能または表現型を調節する遺伝子を同定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、所与の表現型または組織型を代表する細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、不死化されている。いくつかの実施形態では、所与の表現型または組織型を代表する細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、所与の表現型または組織型を代表する細胞は、始原細胞または幹細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＴＥＲＴを発現するように遺伝的に操作されている。
【０００８】
本実施形態に従う方法は、所与の表現型または組織型を代表する細胞において、１種または複数の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）腫瘍抑制タンパク質経路を不活化または抑制するステップをさらに含み得る。腫瘍抑制タンパク質経路は、ＲＢおよび／またはｐ５３であり得る。
【０００９】
本実施形態に従う方法は、確認ステップ（複数可）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、確認ステップ（複数可）は、ステップ（ａ）において作製された標的細胞に、ステップ（ｃ）において同定された遺伝エレメントの発現を調節（すなわち、増大または減少）できる核酸を導入して、改変された標的細胞を作製するステップと、非ヒト哺乳動物に、改変された標的細胞を同所性に移植するステップと、改変された標的細胞が、対照と比較して、哺乳動物において腫瘍形成を低減するか否かを決定するステップとを含み得る。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、核酸ライブラリーは、目的の遺伝エレメントに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、目的の遺伝エレメントの不活性バージョンまたは不活ドミナントネガティブバージョンをコードする核酸を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、本実施形態の方法において使用されるがん遺伝子は、ＢＲＡＦがん遺伝子、ＮＲＡＳがん遺伝子、ＫＲＡＳがん遺伝子、ＰＩ３Ｋがん遺伝子、ＰＫＣｉがん遺伝子、ＨＥＲ２がん遺伝子、ＡＰＣがん遺伝子、ＥＧＦＲがん遺伝子、ＰＴＥＮ  ＫＤがん遺伝子、ＮＦ１  ＫＤがん遺伝子、Ｍｙｒ−ＡＫＴがん遺伝子、Ｍｙｒ−Ｐ１１０ａがん遺伝子、β−カテニンがん遺伝子、ＥＧＦＲｖＩＩＩがん遺伝子のうち１つまたは複数から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、１種または複数の候補遺伝子または目的の遺伝エレメントは、キナーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントから選択される。キナーゼは、野生型キナーゼまたは活性化変異体キナーゼである。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、１種または複数の候補遺伝子または目的の遺伝エレメントは、ホスファターゼ遺伝子および／または遺伝エレメントから選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、１種または複数の候補遺伝子または目的の遺伝エレメントは、メチルトランスフェラーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントから選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、１種または複数の候補遺伝子または目的の遺伝エレメントは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に関与している遺伝子および／または遺伝エレメントから選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、１種または複数の候補遺伝子または目的の遺伝エレメントは、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達経路に関与している遺伝子および／または遺伝エレメントから選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、１種または複数の候補遺伝子または目的の遺伝エレメントは、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達経路に関与している遺伝子および／または遺伝エレメントから選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍形成と関連している機能または表現型とは、転移、細胞遊走、血管新生、細胞外マトリックス分解、足場非依存性増殖またはアノイキスである。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、操作された腫瘍形成経路と相互作用する生物活性作用物質を求めてスクリーニングするための方法が提供される。いくつかの実施形態は、所与の表現型または組織型を代表する細胞に、がん遺伝子およびがん遺伝子と関連しているがん化プロセスと結びついている１種または複数の遺伝子または目的の遺伝エレメントを導入することを含む、がん細胞遺伝子型を有する遺伝的に操作された標的細胞を作製するステップ；遺伝的に操作された標的細胞を、候補の生物活性作用物質と接触させるステップ；ならびに生物活性作用物質が腫瘍形成表現型に影響を及ぼすか否かを決定するステップのうち１つまたは複数を含む。腫瘍形成表現型は、例えば、転移、細胞遊走、血管新生、細胞外マトリックス分解、足場非依存性増殖またはアノイキスであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、状況特異的遺伝子スクリーニングを示す図である。
【図２】図２Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるスクリーニングのための実験デザインを示す図である。図２Ｂは、基準のＪＮＫシグナル伝達経路を示す図である。実施例１の実験において記録し、確認したキナーゼを丸で囲んだ。
【図３】図３は、いくつかの実施形態による方法を用いた結果の概要を示す図である。個々のＪＮＫシグナル伝達成分での２次確認スクリーニングの間、ＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイト中に形質導入した場合に、ＭＡＰ２Ｋ４およびＭＡＰＫ９／ＪＮＫ２の両方によって個々に頑強ながん遺伝子の活性が観察され、１６週以内に腫瘍形成がもたらされ、それぞれ３０％および５０％の浸透度であった。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、免疫組織化学によるヒト黒色腫検体における核（活性化）ホスホ−ｃＪＵＮを示す図である。図４Ｂは、ホスホ−ＪＮＫ抗体でプローブしたヒト黒色腫検体９６個の、逆相タンパク質アレイ分析を示す。赤色の点線は、ヒトメラノサイトにおけるｐ−ＪＮＫのベースラインレベルを表す。
【図５】図５Ａから５Ｄは、ウエスタンブロットによる誘導性ｓｈＲＮＡでのＪＮＫ発現のノックダウンを示す図である。図５Ｂは、２つの独立したｓｈＲＮＡでＪＮＫ２をノックダウンしたときのヒト黒色腫細胞系（Ｍ６１９）における足場非依存性の増殖の阻害を示す代表的な実験である。図５Ｃは、４つのヒト黒色腫細胞系における軟寒天アッセイの編集データを示す。図５Ｄは、全体およびホスホ−ｃＪＵＮでプローブしたヒト黒色腫細胞系１０個のウエスタンブロットを示す。
【図６】図６Ａから６Ｄは、２つの独立のｓｈＲＮＡ標的化ＪＮＫ２が発現された場合のＨＭＥＬ異種移植片系統Ｔ１およびＴ２の腫瘍浸透度を詳述する表を示す図である。図６Ｂは、対照群（−ＤＯＸ）および実験群（＋ＤＯＸ）からの腫瘍サイズの代表的な画像である。下のパネルは、好適な腫瘍試料中で発現されたＲＦＰ−ｓｈＲＮＡ標的化ＪＮＫ２を示す蛍光画像を示す。図６Ｃは、腫瘍開始時のＪＮＫ２ノックダウン（＋ＤＯＸ）の効果を示す。データを、経時のｍｍ３における腫瘍体積としてグラフ化する。図６Ｄは、実験完了時の腫瘍体積の比較である。
【図７】図７ＡおよびＢは、確立された腫瘍増殖に対するＪＮＫ２ノックダウンの効果を示す図である。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に到達したらＤＯＸをマウスの水に加え、次いで経時的に腫瘍体積を測定した。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏで確立された腫瘍の増殖を維持するのにＪＮＫ２が必要とされることを示唆している。
【図８】図８Ａから８Ｄは、ＢＲＡＦ、ＵＶ、およびＪＮＫ間の協同を示す図である。図８Ａは、増大するフルエンスのＵＶＢで処理した細胞におけるＪＮＫおよびｃＪＵＮの発現を測定するウエスタンブロットである。図８Ｂは、マウスメラノサイトに野生型（ＷＴ）または変異体ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）を形質導入し、ＵＶＢ処理し、次いで軟寒天に接種して形質転換を測定した、軟寒天におけるコロニー形成の測定を表す。これらのデータは、ＵＶの形質転換効果は状況依存的であることを示唆している。図８Ｃは、１日目の新生仔に対して＋／−ＵＶＢ処理した誘導性のＢＲＡＦトランスジェニックマウスの腫瘍フリー生存のカプラン−マイヤープロットである。ＵＶＢで処理すると、誘導性のＢＲＡＦトランスジェニックマウスに、高悪性度の黒色腫がより高い浸透度で形成された。図８Ｄは、ＵＶで処理したｉＢＲＡＦマウスに形成された黒色腫における、核の（活性化された）ｐ−ｃＪＵＮ染色を示す。
【図９】図９Ａから９Ｄは、ＪＮＫ２のノックダウンは、確立されたヒト黒色腫異種移植片の増殖を阻害することを示す図である。Ａ．）Ｍ６１９（ＢＲＡＦ−ｍｕｔ）ヒト黒色腫細胞を操作して２つの独立したドキシサイクリン誘導性ＪＮＫ２  ｓｈＲＮＡを発現させ、ヌードマウス中に注射した。腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３に到達したらマウスを無作為に２群に分割し、ドキシサイクリンを飲料水中に加えるとｓｈＲＮＡが誘発された。腫瘍サイズを測定し、経時的にグラフ化した。対照の腫瘍が２ｃｍ３に接近したら実験を終了した。Ｂ．）試験のエンドポイントの腫瘍のグラムにおける重量。Ｃ．）ドキシサイクリン処理動物におけるＪＮＫ２ノックダウンを示すウエスタン分析。Ｄ．）腫瘍ＲＮＡのＱＰＣＲ。＊はドキシサイクリン処理した腫瘍を意味する。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、遺伝的状況および細胞の状況がトランスフォーミングキナーゼの選択を決定することを示す図である。Ａ．）実験デザインの模式図。状況特異的スクリーニングを行って、集中的なキナーゼライブラリーによってヒトメラノサイト（ｈＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）およびマウスアストロ細胞（ｍＡｓｔ−ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ−／−；ＰＴＥＮ−／−）の形質転換を比べた。Ｂ．）ｉｎ  ｖｉｖｏでｈＭＥＬおよびｍＡＳＴ細胞系に腫瘍原性を付与するキナーゼを列挙する表。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の原理の理解を促進することを目的として、ここで、図面に示される実施形態を参照し、特定の言語を使用してそれを説明する。それにもかかわらず、本発明の範囲の制限は、それによって意図されず、示されるデバイスにおけるこのような変更およびさらなる改変ならびにそれに例示されるような本発明の原理のさらなる適用は、本発明が関する技術分野における当業者にとって通常想到されるものと考えられるということは理解されなければならない。
【００２２】
状況特異的機能的遺伝子スクリーニングプラットフォーム
いくつかの実施形態によれば、機能または表現型の状況における目立つ生物学的関連および臨床的関連を、特定の臨床的に定義できる遺伝的状況のＧＥＯＩ（目的の遺伝エレメント）のライブラリーに体系的に割り当てることができる遺伝子スクリーニングプラットフォームが提供される。遺伝子スクリーニングプラットフォームによって、新規薬物標的の同定、並行して、所定の遺伝的状況において変更される経路と協調的に作用するさらなる新規経路を教示し、ひいては、新規のがん経路および／または公知のがん経路に対する単一または組み合わせた標的療法の使用の情報を提供する新規クリニカルパスの仮説の同定が可能となる。新規薬物標的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングし、同定してもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングし、同定してもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、状況特異的スクリーニングは、以下の３つの要素：標的細胞の集団；腫瘍形成または転移表現型モデルおよびＧＥＯＩライブラリーから構成される。
【００２４】
本明細書の実施例１は、黒色腫化においてがん化ＢＲＡＦと協力し得るプロテインキナーゼの同定に焦点を当てる本実施形態に従う１種の状況特異的機能的遺伝子スクリーニングの説明を提供する。その実施例は、高度に関連する遺伝的状況（すなわち、ＢＲＡＦは、ヒト黒色腫の６０％超で変異している）を有する標的細胞として、がん化ＢＲＡＦ（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）で形質導入された、ｐ５３およびＲＢが不活性化されたヒトＴＥＲＴ−不死化メラノサイト（ＨＭＥＬ）を使用する。このＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトは、弱くしか腫瘍形成性でなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでは容易には腫瘍を形成しない。１１０のヒトがんにおいて最も頻繁に変異されるキナーゼの、配列決定され確認されたＯＲＦを含有する注目されるドライバーキナーゼライブラリーを、ユニバーサルなレンチウイルスベクターに入れた。次いで、これらのキナーゼを発現するレンチウイルスを、感染がプールされた標的細胞に形質導入し、続いて、皮膚、黒色腫の同所性部位（例えば、適当な微小環境）に移植した。
【００２５】
ライブラリーを形質導入された細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより迅速に（相対潜伏期１０〜１８週）腫瘍を発生し、これはＢＲＡＦ＊と協力して、ＴＥＲＴ不死化されたメラノサイトの形質転換を導くことのできるキナーゼがライブラリー中に存在することを示した。次いで、ゲノムＰＣＲ配列決定によって得られた腫瘍から候補協力キナーゼを回収した。このようにして、本発明者らは、１４の再発性「ヒット」（２種以上のｉｎ  ｖｉｖｏで得られた腫瘍について陽性に選択されると定義される）を同定し、これは、１１０種のドライバーキナーゼのうち１４種が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＲＡＦ変異メラノサイトにおける真のがん化ドライバーである可能性があることを示した。さらに、機能活性の相対強度は、再発によって推測できる。すなわち、シングルヒットは、あまり強くないと考えられる。本発明者らは、経路の知識に重ね合わせると、さらに、豊富であり得る経路（複数可）中のヒットに優先順位をつけることができる。例えば、ＪＮＫ経路の４種のコアシグナル伝達メディエーターの全て（ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫレベルの両方）がスコアした（図２）。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成の際にＢＲＡＦ変異メラノサイトにおけるＪＮＫ活性化の強い優先（または必要性）を指し示す遺伝子プロファイルである。結果から、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫においては、ＪＮＫ不活性化が治療上有効であり、ＪＮＫおよびＢＲＡＦシグナル伝達の同時阻害が合理的な組合せ戦略であるというクリニカルパスの仮説−確認および薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験における患者選択／層別化をも導く明確なクリニカルパスの仮説の情報が直ちに提供される。
【００２６】
上記のスクリーニングにおいて、合計２３のヒットがあり、そのうち９がシングルヒットであることは注目に値する。より深いスクリーニングが、これらの遺伝子をＢＲＡＦ＊黒色腫における重要な標的と同定し、ならびにこれらのがんにおいて同様に標的とするＪＮＫを超える新規経路を同定する可能性があるので、これらのシングルヒットは破棄されない。これらのシングルヒットとして、ＣＡＭＫＶ、ＨＳＰＢ８、ＭＡＲＫ１、ＰＲＫＣＨ、ＳＮＲＫおよびＴＢＣＫが挙げられる。
【００２７】
標的細胞
いくつかの実施形態によれば、標的細胞は、対応するヒトまたはマウスがんの種類について定義される特徴的な遺伝的変化（すなわち、遺伝的状況）を有するように操作されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）である。この遺伝的状況によって、治療薬の適応症、例えば、遺伝学的に定義された亜集団における疾患の種類につながり得るクリニカルパスアプローチが規定される。したがって、標的細胞は、特定の腫瘍の種類の分子およびゲノム知識に従って操作される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、１種または複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９種など）のがん遺伝子を発現および／または過剰発現するように操作され、それによって細胞の遺伝的状況を定義する。がん遺伝子は、任意のがん遺伝子またはその変異ががんと関係している遺伝子であり得る。例えば、がん遺伝子は、ＤＮＡ配列異常および／または正常遺伝子の過剰発現につながる変異に起因する任意のがん遺伝子であり得る。がん遺伝子の好ましい例として、それだけには限定されないが、ＡＰＣ、ＡＢＬ１、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＡＦ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ−３、ＦＯＳ、ｒａｓ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＤＲ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＬＣＫ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ｐ７３、Ｒｂ−１、Ｒｂ−２、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＳＲＣ、Ｓｍａｄ４、ＴＣＦ３、ＴＰ５３（ｐ５３としても知られる）、ＶＨＬ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣｉ、ＨＥＲ２、ＰＴＥＮ（第１０染色体で欠失しているホスファターゼおよびテンシンホモログ）、ＮＦ１  ＫＤ、Ｍｙｒ−ＡＫＴ、Ｍｙｒ−Ｐ１１０ａ、β−カテニンからなる群より選択される遺伝子のがん化形態が挙げられる。以下の表は、がん遺伝子の好ましいカテゴリーの一覧を示す。
【００２９】
【数１】
2013517772.tif 000003
いくつかの実施形態では、がん遺伝子は、ｐ５３（ＴＰ５３）、ｐ７３、ｒａｓ、ＢＲＡＦ、ＡＰＣ（大腸腺腫症）、ｍｙｃ、ＶＨＬ（フォンヒッペル・リンダウタンパク質）、Ｒｂ−１（網膜芽細胞腫）、Ｒｂ−２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１およびＦｌｔ−３の変異がん化形態から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、標的細胞を、一群の（例えば、１つまたは複数の）がん関連遺伝的変化で操作する。標的細胞を、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、１種または複数のがん遺伝子を発現および／または過剰発現するように操作してもよい。例えば、標的細胞に、がん遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む任意の適したベクターを一時的にまたは安定にトランスフェクトまたは形質導入してもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞に、がん遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列と、がん遺伝子の過剰発現を指示する適したプロモーターおよびエンハンサー配列とを含む任意の適したベクターを一時的にまたは安定にトランスフェクトまたは形質導入してもよい。明細書および添付の特許請求の範囲において、本明細書において使用される用語「過剰発現」とは、その他の点では同一の条件下で所与の細胞を通常特徴付ける発現の基礎レベルより高い発現のレベルを指す。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、標的細胞を、１種または複数の腫瘍抑制タンパク質経路を不活化または抑制するようにさらに操作してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制タンパク質経路は、ＲＢおよびｐ５３経路である。したがって、例えば、ＲＢ経路を、細胞をｐ５３ＤＤを発現するようにさらに操作することによって、抑制または不活化してもよい。ｐ５３経路を、細胞をＣＤＫ４−Ｒ２４Ｃを発現するようにさらに操作することによって抑制または不活化してもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、非腫瘍細胞である。非腫瘍細胞として、それだけには限定されないが、初代細胞（例えば、マウス、ヒトまたはその他の哺乳動物初代細胞）、幹細胞または始原細胞（例えば、一次組織供給源から得られた幹細胞または始原細胞）が挙げられる。場合により、標的細胞は、細胞培養物を含む。細胞培養物とは、２種以上の細胞の収集物を意味する。培養物中の細胞は、均一であり得る。あるいは、培養物中の細胞は、不均一である。標的細胞は、特定の細胞系統を代表する確立された細胞株であり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、特定の細胞系統を代表する初代細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、特定の細胞系統を代表する腫瘍ナイーブの初代細胞である。したがって、標的細胞集団は、組織または臓器に由来する初代細胞の集団であり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒトがんが発生する組織から得られた初代細胞である。したがって、初代細胞および細胞株は、それだけには限定されないが、乳房（例えば、乳房組織の管）、卵巣、精巣、肺、膀胱、子宮頸部、頭頸部、皮膚、骨、前立腺、肝臓、肺、脳、喉頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、甲状腺、神経組織、結腸、胃、内皮、上皮、脂肪、筋肉、骨髄、心臓、リンパ系、気管支、腎臓および血液を含む組織または臓器から得てもよい。細胞は、当技術分野で公知の任意の方法を使用してｅｘ  ｖｉｖｏ培養のために組織から単離してもよい。
【００３３】
ほとんどの初代ヒト細胞培養物には、限られた寿命しかない。特定数の集団倍加の後、細胞は、老化のプロセスを経て、分裂を停止するが、一般に、生存力は保持する。したがって、いくつかの実施形態では、細胞株を確立または不死化することが望ましい場合がある。不死化細胞株の確立は、例えば、テロメラーゼ遺伝子（例えば、ＴＥＲＴ）の人工発現など、当技術分野で公知の任意の方法を使用して達成してもよい。
【００３４】
【表１】
2013517772.tif 000004
以下の表は、いくつかの実施形態に従うがん遺伝子および変異を同定する。
【００３５】
【数２】
2013517772.tif 000005
対応するヒトがんの種類について定義された特徴的な遺伝的変化を有するように標的細胞を操作することによって意味することを示すために、または特定の遺伝的状況を作製するように標的細胞を操作するために以下の例を提供する。例えば、ヒトバーキットリンパ腫では、Ｃ−ＭＹＣがん遺伝子を、免疫グロブリン重鎖遺伝子のエンハンサーの下流に転座させ、その結果、Ｃ−ＭＹＣが過剰発現し、これが、細胞分裂の速度と染色体の不安定性の両方を増大させる。したがって、いくつかの実施形態では、標的細胞を、Ｃ−ＭＹＣがん遺伝子を発現および／またはＣ−ＭＹＣを過剰発現するように設計してもよい。細胞は、リンパ組織に由来する原発腫瘍ナイーブの細胞であり得る。
【００３６】
ＨＥＲ２過剰発現が、進行卵巣がんにおいて観察されている。したがって、いくつかの実施形態では、非腫瘍卵巣組織に由来する初代細胞を、ＨＥＲ２がん遺伝子を発現および／またはＨＥＲ２を過剰発現するように操作してもよい。
【００３７】
ＨＥＲ２の過剰発現はまた、非浸潤性乳がんを浸潤性疾患に変換することと結びついている。したがって、いくつかの実施形態では、乳房組織に由来する腫瘍ナイーブの初代細胞を、ＨＥＲ２がん遺伝子を発現および／またはＨＥＲ２を過剰発現するように操作してもよい。
【００３８】
ｐ５３過剰発現が、ヒト乳がんにおいて観察されている。したがって、いくつかの実施形態では、乳房組織（例えば、乳管）に由来する腫瘍ナイーブの初代細胞を、ｐ５３がん遺伝子を発現し、ドミナントネガティブ変異を有するｐ５３対立遺伝子を過剰発現し、ならびに／または例えば、ＭＤＭ２および／もしくはＭＤＭ４がん遺伝子を過剰発現するように操作してもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞を、ｐ５３のノックダウンまたはＡＲＦ腫瘍抑制物質のノックダウンとして操作してもよい。
【００３９】
Ｒａｓ変異は、ヒト、マウス、ラットおよびハムスターの肺腺がんではよく見られる。したがって、いくつかの実施形態では、肺組織に由来する腫瘍ナイーブの初代細胞を、ｒａｓがん遺伝子を発現および／またはがん化変異を有するｒａｓを過剰発現するように操作してもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞を、Ｒａｓ調節タンパク質の遺伝的変化（例えば、ＮＦ−１のノックダウン）を用いて操作してもよい。
【００４０】
以下の表は、その変異が本実施形態とともに使用するのに適したがんと関係している遺伝子の一覧を示す。
【００４１】
【表２−１】
2013517772.tif 000006
【００４２】
【表２−２】
2013517772.tif 000007
【００４３】
【表２−３】
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【００４４】
【表２−４】
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【００４５】
【表２−５】
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【００４６】
【表２−６】
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【００４７】
【表２−７】
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【００４８】
【表２−８】
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【００４９】
【表２−９】
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【００５０】
【表２−１０】
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【００５１】
【表２−１１】
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【００５２】
【表２−１２】
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【００５３】
【表２−１３】
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【００５４】
【表２−１４】
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【００５５】
【表２−１５】
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【００５６】
【表２−１６】
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【００５７】
【表２−１７】
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【００５８】
【表２−１８】
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【００５９】
【表２−１９】
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【００６０】
【表２−２０】
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【００６１】
【表２−２１】
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【００６２】
【表２−２２】
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【００６３】
【表２−２３】
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【００６４】
【表２−２４】
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【００６５】
【表２−２５】
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【００６６】
【表２−２６】
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【００６７】
【表２−２７】
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【００６８】
【表２−２８】
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【００６９】
【表２−２９】
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【００７０】
【表２−３０】
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【００７１】
【表２−３１】
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【００７２】
【表２−３２】
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【００７３】
【表２−３３】
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【００７４】
【表２−３４】
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【００７５】
【表２−３５】
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【００７６】
【表２−３６】
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【００７７】
【表２−３７】
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【００７８】
【表２−３８】
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【００７９】
【表２−３９】
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【００８０】
【表２−４０】
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【００８１】
【表２−４１】
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【００８２】
【表２−４２】
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Ａ、増幅；ＡＥＬ、急性好酸球性白血病；ＡＬ、急性白血病；ＡＬＣＬ、未分化大細胞リンパ腫；ＡＬＬ、急性リンパ性白血病；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ＡＭＬ＊、急性骨髄性白血病（主に、治療関連）；ＡＰＬ、急性前骨髄球性白血病；Ｂ−ＡＬＬ、Ｂ細胞急性リンパ性白血病；Ｂ−ＣＬＬ、Ｂ細胞リンパ性白血病；Ｂ−ＮＨＬ、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫；ＣＬＬ、慢性リンパ性白血病；ＣＭＬ、慢性骨髄性白血病；ＣＭＭＬ、慢性骨髄単球性白血病；ＣＮＳ、中枢神経系；Ｄ、大欠落；ＤＦＳＰ、隆起性皮膚線維肉腫；ＤＬＢＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；ＤＬＣＬ、びまん性大細胞型リンパ腫；Ｄｏｍ、ドミナント；Ｅ、上皮；Ｆ、フレームシフト；ＧＩＳＴ、消化管間葉性腫瘍；ＪＭＭＬ、若年性骨髄単球性白血病；Ｌ、白血病／リンパ腫；Ｍ、間葉；ＭＡＬＴ、粘膜関連リンパ組織リンパ腫；ＭＤＳ、骨髄異形成症候群；Ｍｉｓ、ミスセンス；ＭＬＣＬＳ、硬化を伴う縦隔大細胞リンパ腫；ＭＭ、多発性骨髄腫；ＭＰＤ、骨髄増殖性障害；Ｎ、ナンセンス；ＮＨＬ、非ホジキンリンパ腫；ＮＫ／Ｔ、ナチュラルキラーＴ細胞；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺がん；Ｏ、その他；ＰＭＢＬ、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫；プレＢ  Ａｌｌ、プレＢ細胞急性リンパ芽球性白血病；Ｒｅｃ、劣性（ｒｅｃｃｅｓｓｉｖｅ）；Ｓ、スプライシング部位；Ｔ、転座；Ｔ−ＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病；Ｔ−ＣＬＬ、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病；ＴＧＣＴ、精巣生殖細胞腫瘍；Ｔ−ＰＬＬ、Ｔ細胞プロリンパ性白血病；Ｇｅｒｍ．、生殖系列。
【００８３】
ＧＥＯＩのライブラリー（目的の遺伝エレメント）：
用語「ＧＥＯＩ」の「目的の遺伝エレメント」とは、がんと結びついているか、もしくは関連している、またはがんの増殖および転移を導く遺伝子の生物学的経路と関連している遺伝エレメント（例えば、遺伝子）を指す。目的の遺伝エレメントのライブラリーとは、ヒトがんまたは腫瘍形成表現型または転移表現型と結びついている、複数の特定の目的の遺伝エレメントまたはその変種（例えば、体細胞または生殖系列変異）を指す。
【００８４】
ゲノム増幅の領域中にあるものなどのゲノム的に変更されたＧＥＯＩを含めた、種々の手段によって定義される遺伝エレメントの収集物（ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ）；さまざまなヒトがんにおいて統計上有意な変異を有することが示されている、「ドライバーキナーゼ」などの体細胞性の変異遺伝子；代謝経路酵素もしくはＧＰＣＲなど、規定の経路または生物学的プロセスまたは分子のクラスの成分。
【００８５】
ＧＥＯＩは、ゲノミクス主導ライブラリーとして、クラスベースのライブラリーとして、新薬の開発につながるようなゲノムライブラリーとして、または細胞プロセスライブラリーとして分類してもよく、これらは以下にさらに詳細に説明する。
【００８６】
ＧＥＯＩのライブラリーは、核酸ライブラリーである。これは、目的の遺伝子または遺伝エレメントをコードする核酸を含む核酸ライブラリーを含む。核酸ライブラリーは、また、目的の遺伝子または遺伝エレメントに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンス核酸で構成されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、目的の遺伝子または遺伝エレメントの不活性バージョンまたはドミナントネガティブバージョンをコードする核酸を含む。
【００８７】
新薬の開発につながるようなゲノムライブラリー
新薬の開発につながるようなゲノムライブラリーとは、ヒトがんに関与している、既知の新薬の開発につながるような酵素である遺伝子を含むライブラリーである。例えば、ヒトキナーゼは、増幅、過剰発現または変異のいずれかによって、ヒトがんでは変更されることが多く、小分子阻害剤（すなわち、グリベック）を用いて成功裏に阻害されている。新薬の開発につながるようなゲノムライブラリーの例として、それだけには限定されないが、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱メチル化酵素およびヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子のライブラリーが挙げられる。
【００８８】
キナーゼ
本明細書において、用語「プロテインキナーゼ」は、その自身のリン酸化状態または別のタンパク質もしくはポリペプチドのリン酸化状態を調節できるタンパク質またはポリペプチドを含む。プロテインキナーゼは、セリン／トレオニン残基、チロシン残基またはセリン／トレオニンおよびチロシン残基の両方に対する特異性（すなわち、リン酸化する特異性）を有し得る。例えば、二重特異性キナーゼ。本明細書におけるように、プロテインキナーゼは、保存が低下したまたは最小のアミノ酸の配列によって分離される、好ましくは、５〜２０個、より好ましくは、５〜１５個または好ましくは、１１個の高度に保存されたモチーフまたはサブドメインを含む、約１５０〜４００個のアミノ酸残基の長さ、好ましくは、約１７０〜３００個のアミノ酸残基の長さ、またはより好ましくは、約１９０〜３００個のアミノ酸残基の長さの触媒ドメインを含み得る。チロシンまたはセリン／トレオニンのいずれかのリン酸化に対するプロテインキナーゼの特異性は、各クラスにおいて異なる残基が保存されているサブドメイン（ＶＩｂおよびＶＩＩＩ）の２つの配列によって予測できる（例えば、参照によってその内容が本明細書に援用されるＨａｎｋｓら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４２〜５２頁）に記載のとおり）。これらのサブドメインもまた本明細書にさらに詳細に記載する。
【００８９】
プロテインキナーゼは、細胞増殖と関連するシグナル伝達経路において役割を果たす。例えば、プロテインキナーゼは、細胞受容体、例えば、増殖因子受容体からのシグナル伝達の調節；細胞が有糸分裂に入ること；および細胞骨格機能、例えば、アクチンバンドリングの調節に関与している。したがって、本発明の分子は、１）細胞受容体、例えば、心臓細胞増殖因子受容体からのシグナルの伝達の調節；２）細胞、例えば、心臓始原細胞が有糸分裂に入ることの調節；３）細胞分化の調節；４）細胞死の調節および５）細胞骨格機能、例えば、アクチンバンドリングの調節に関与している可能性がある。
【００９０】
細胞周期シグナル伝達経路に関与しているプロテインキナーゼの活性の阻害または過剰刺激は、腫瘍形成および転移につながり得る。例えば、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ａｂｌ、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ＡＫＴなどのキナーゼおよび上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体は、がん細胞において活性化されることが多く、腫瘍形成の一因となることがわかっている。これらの多くは、同一のシグナル伝達経路−例えば、細胞増殖を促進するためのＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３キナーゼによるＨＥＲ−キナーゼファミリーメンバー（ＨＥＲ１［ＥＧＦＲ］、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）伝達シグナルにおいて起こる。
【００９１】
１つのクラスとして、体細胞性に変異されたキナーゼが、ヒトがんにおける主要な治療標的であると証明し、これは、特定のがんの種類において重要ながん化の役割を果たす可能性があるよく変異されるキナーゼを同定しようとする多大な努力の動機付けになった。１つのこのようなキノームを配列決定する努力によって、さまざまなヒトがんにおいて、ヒト黒色腫（Ｄａｖｉｅｓ）の相当な割合におけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を含む統計的に有意な体細胞ドライバー変異を有する１２０種のキナーゼが同定された。それ自体が強力な出発点でありながら、これらのゲノムデータを、有効な薬物の開発エンドポイントに効率的に翻訳するには、これらのがんキナーゼが重要な腫瘍維持の役割を果たす遺伝的状況および生物学的状況の理解、すなわち、薬物開発のクリニカルパス仮説が必要である。
【００９２】
目的の好ましいキナーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【００９３】
【数３−１】
2013517772.tif 000048
【００９４】
【数３−２】
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【００９５】
【数３−３】
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【００９６】
【数３−４】
2013517772.tif 000051
【００９７】
【数３−５】
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【００９８】
【数３−６】
2013517772.tif 000053
【００９９】
【数３−７】
2013517772.tif 000054
【０１００】
【数３−８】
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【０１０１】
【数３−９】
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【０１０２】
【数３−１０】
2013517772.tif 000057
【０１０３】
【数３−１１】
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【０１０４】
【数３−１２】
2013517772.tif 000059
【０１０５】
【数３−１３】
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【０１０６】
【数３−１４】
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【０１０７】
【数３−１５】
2013517772.tif 000062
【０１０８】
【数３−１６】
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【０１０９】
【数３−１７】
2013517772.tif 000064
ホスファターゼ
ホスファターゼは、脱リン酸化、すなわち、基質からのホスフェート基（複数可）の除去を触媒する酵素である。多数の生物におけるよくあるホスファターゼとして、アルカリホスファターゼがある。タンパク質ホスファターゼは、タンパク質脱リン酸化、プロテインキナーゼによって触媒されるタンパク質リン酸化の反対のプロセスを触媒する。タンパク質リン酸化は、主に、セリン、トレオニンまたはチロシンで起こる。したがって、タンパク質ホスファターゼの主なクラスとして、セリン／トレオニンホスファターゼおよびチロシンホスファターゼが挙げられる。さらに、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスホスフェート３−ホスファターゼなどの脂質ホスファターゼがある。
【０１１０】
目的の好ましいホスファターゼ遺伝子および／または遺伝エレメントとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる。
【０１１１】
【数４−１】
2013517772.tif 000065
【０１１２】
【数４−２】
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【０１１３】
【数４−３】
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【０１１４】
【数４−４】
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【０１１５】
【数４−５】
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【０１１６】
【数４−６】
2013517772.tif 000070
ヒストンメチルトランスフェラーゼ
ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）は、酵素、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼおよびヒストン−アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼであり、これらは補因子Ｓ−アデノシルメチオニンから、ヒストンタンパク質のリシンおよびアルギニン残基への１から３個のメチル基の移動を触媒する。これらのタンパク質は、ＳＥＴ（Ｓｕ（ｖａｒ）３−９、Ｚｅｓｔｅ、トライソラクスのエンハンサー）ドメインを含有することが多い。ヒストンメチル化は、エピジェネティック遺伝子調節において役立つ。メチル化されたヒストンは、ＤＮＡとより強固に結合し、転写を阻害する。
【０１１７】
ヒストンメチル化は、ヒストンメチルトランスフェラーゼによって触媒され、特に、発達および分化の際に、クロマチン状態および全体的な遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。ヒストンメチル化は、がんならびに炎症、代謝障害および神経障害を含むその他の重要な疾患では、調節不全であり得る。
【０１１８】
種々のヒトがんにおいて、ヒストンメチルトランスフェラーゼのゲノムコピー数異常、変異、ｍＲＮＡ発現調節不全が同定されている。ヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害によって、細胞がより分化した状態に再プログラミングされ、したがって、このクラスの酵素は、魅力的ながん治療標的として役立つ。
【０１１９】
目的の好ましいヒストンメチルトランスフェラーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１２０】
【数５】
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ヒストン脱メチル化酵素
目的の好ましいヒストン脱メチル化酵素遺伝子および／または遺伝エレメントとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１２１】
【数６】
2013517772.tif 000072
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）は、アセチルＣｏＡからアセチル基を移動して、ε−Ｎ−アセチルリシンを形成することによって、ヒストンタンパク質上の保存されたリシンアミノ酸をアセチル化する酵素である。
【０１２２】
目的の好ましいヒストンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子および／または遺伝エレメントとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１２３】
【数７】
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ヒストン脱アセチル化酵素
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、ヒストン上のε−Ｎ−アセチルリシンアミノ酸からアセチル基を除去する酵素のクラスである。その作用は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのものと反対である。
【０１２４】
目的の好ましいヒストン脱アセチル化酵素遺伝子および／または遺伝エレメントとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１２５】
【数８】
2013517772.tif 000074
ゲノミクス主導ライブラリー
ゲノミクス主導ライブラリーは、ヒトのがんにおいてゲノム的に変更されたことが分かっている遺伝子を含むライブラリーである。がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）によって生成されたものなどのデータセットおよび他のゲノムプロファイリングライブラリーを用いて、ｉ）染色体増幅の領域に存在し、またはｉｉ）ヒトのがんにおいて体細胞変異された遺伝子を代表するものが開発されている。
【０１２６】
がんにおいて増幅される好ましいがん遺伝子および／または目的の遺伝エレメントとして、以下が挙げられる：
【０１２７】
【数９】
2013517772.tif 000075
以下の表は、がんの遺伝子および／または体細胞変異された目的の遺伝エレメントの一覧を示す：
【０１２８】
【数１０−１】
2013517772.tif 000076
【０１２９】
【数１０−２】
2013517772.tif 000077
【０１３０】
【数１０−３】
2013517772.tif 000078
【０１３１】
【数１０−４】
2013517772.tif 000079
【０１３２】
【数１０−５】
2013517772.tif 000080
【０１３３】
【数１０−６】
2013517772.tif 000081
【０１３４】
【数１０−７】
2013517772.tif 000082
【０１３５】
【数１０−８】
2013517772.tif 000083
【０１３６】
【数１０−９】
2013517772.tif 000084
細胞プロセスライブラリー
細胞プロセスライブラリーは、特定の細胞プロセスに関与する遺伝子を含むライブラリーである。例えば、細胞の代謝およびクロマチンの改変に関与する遺伝子のライブラリーである。基本原理は、これらのプロセスのがんにおける関与および調節解除を示唆する最近の文献に基づく。
【０１３７】
クラスベースライブラリー
クラスベースライブラリーは、特定のクラスの分子を代表する遺伝子を含むライブラリーである。例えば、本発明者らは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のクラスを含むｃＤＮＡライブラリーを開発している。他の開発中のライブラリーとして、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＰＩ３Ｋシグナル伝達に関与する遺伝子、および膜結合タンパク質が挙げられる。
【０１３８】
受容体チロシンキナーゼ
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、ポリペプチド増殖因子、サイトカイン、およびホルモンに対する高親和性の細胞表面受容体である。受容体チロシンキナーゼは、正常の細胞プロセスの主要な調節因子であるだけでなく、多くのタイプのがんの発生および進行において決定的な役割を有することも示されている。異なるＲＴＫのクラスがいくつか存在し、ＲＴＫのクラスとして、それだけには限定されないが、ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＩＩ（ＰＤＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶ（ＶＥＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩＩ（Ｔｒｋ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸ（ＬＴＫ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＩ（ＲＯＲ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶ（ＫＬＧ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）、およびＲＴＫクラスＸＶＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファミリー）が挙げられる。
【０１３９】
ＥｒｂＢタンパク質ファミリーまたは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、４つの構造的に関連する受容体チロシンキナーゼのファミリーである。ヒトにおける不十分なＥｒｂＢシグナル伝達は、多発性硬化症およびアルツハイマー病などの神経変性疾患の発生に関連する。マウスにおいて、ＥｒｂＢファミリーのあらゆるメンバーによってシグナル伝達が喪失すると、肺、皮膚、心臓、および脳を含めた器官が欠陥して胎児は死亡する。ＥｒｂＢシグナル伝達の過剰は、多種多様なタイプの固形腫瘍の発生に関連する。ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２はヒトのがんの多くにおいて見出されており、これらのシグナル伝達の過剰は、これらの腫瘍の発生および悪性度における重大な因子であり得る。ＥｒｂＢタンパク質のファミリーとして、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とも呼ばれるＥｒｂＢ−１；ヒトおよび齧歯動物におけるｎｅｕにおいてＨＥＲ２とも呼ばれるＥｒｂＢ−２；ＨＥＲ３とも呼ばれるＥｒｂＢ−３、およびＨＥＲ４とも呼ばれるＥｒｂＢ−４が挙げられる。
【０１４０】
血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂは、細胞の増殖、細胞の分化、細胞の成長、発生、およびがんを含めた多くの疾患を調節する重要な因子として認められている。ＰＤＧＦファミリーは、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、およびＰＤＧＦ−Ｄからなり、これらはホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれか（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤ）を形成する。４つのＰＤＧＦはその単量体型において不活性である。ＰＤＧＦは、タンパク質チロシンキナーゼ受容体のＰＤＧＦ受容体−αおよび−βに結合する。これら２つの受容体のイソ型は、ＰＤＧＦ二量体に結合すると二量体化し、３つの可能な受容体の組合せ、すなわち−αα、−ββ、および−αβをもたらす。受容体の細胞外領域は５つの免疫グロブリン様ドメインからなり、細胞内部分はチロシンキナーゼドメインである。受容体のリガンド結合部位は３つの最初の免疫グロブリン様ドメインに対して位置する。ＰＤＧＦ−ＣＣは、ＰＤＧＦＲ−ααおよび−αβと特異的に相互作用するが、−ββとは相互作用せず、ゆえにＰＤＧＦ−ＡＢに似ている。ＰＤＧＦ−ＤＤはＰＤＧＦＲ−ββに高親和性で結合し、ＰＤＧＦＲ−αβに著しく低い程度で結合し、ゆえにＰＤＧＦＲ−ββ特異的であるとみなされる。ＰＤＧＦ−ＡＡはＰＤＧＦＲ−ααのみに結合し、ＰＤＧＦ−ＢＢは３つ全ての受容体の組み合わせに高親和性で結合することができる唯一のＰＤＧＦである。
【０１４１】
線維芽細胞増殖因子受容体は、その名称が示す通り、線維芽細胞増殖因子ファミリーのタンパク質のメンバーに結合する受容体である。ＦＧＦＲの５つの異なるメンバーが脊椎動物において同定されており、その全てがチロシンキナーゼスーパーファミリー（ＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４）に属する。
【０１４２】
ＶＥＧＦ受容体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する受容体である。これらの受容体として、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、およびＶＥＧＦＲ−３が挙げられる。
【０１４３】
ＭＥＴ（間葉上皮転移因子）は、ｃ−Ｍｅｔまたは肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）としても知られている、タンパク質ＭＥＴをコードするプロトオンコジーンである。がんにおけるＭＥＴの異常な活性化は悪い予後に相関し、異常に活性なＭＥＴは腫瘍の増殖、腫瘍に栄養を供給する新たな血管の形成（血管新生）、および他の器官へのがんの拡散（転移）を誘発する。ＭＥＴは、腎臓、肝臓、胃、乳房、および脳のがんを含めた多くの型のヒトの悪性腫瘍において調節解除される。ＭＥＴ遺伝子における様々な変異が乳頭状腎細胞がんに関連する。
【０１４４】
ｔｒｋ受容体は、哺乳動物の神経系におけるシナプスの強度および可塑性を調節するチロシンキナーゼのファミリーである。ｔｒｋ受容体の３つの最も一般的なタイプはｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣである。
【０１４５】
アンジオポエチン受容体は、アンジオポエチンに結合する受容体である。同定されているアンジオポエチンは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、Ａｎｇ４の４種存在する。
【０１４６】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＹＫ）遺伝子に関連するものは、タンパク質Ｒｙｋをコードする。この遺伝子がコードするタンパク質は、増殖因子受容体型タンパク質チロシンキナーゼのファミリーの非定型的なメンバーであり、他のメンバーと活性化ドメインおよびヌクレオチド結合ドメインにおける保存残基の数が異なる。
【０１４７】
好ましいＲＴＫライブラリーとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１４８】
【数１１−１】
2013517772.tif 000085
【０１４９】
【数１１−２】
2013517772.tif 000086
Ｇタンパク質共役受容体
ヒトゲノムは、ホルモン、増殖因子、および他の内因性のリガンドに結合する、およそ３５０種のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードしている。ヒトゲノム中に見出されるおよそ１５０種類のＧＰＣＲが未知の機能を有する。ＧＰＣＲは、配列相同性および機能的類似性に基づいて６つのクラスにグループ分けすることができる。これらはクラスＡ（または１）（ロドプシン様）、クラスＢ（または２）（セクレチン受容体ファミリー）、クラスＣ（または３）（代謝調節型グルタミン酸／フェロモン）、クラスＤ（または４）（真菌接合フェロモン受容体）、クラスＥ（または５）（サイクリックＡＭＰ受容体）、およびクラスＦ（または６）（フリズルド／スムーズンド）である。
【０１５０】
好ましいＧＰＣＲライブラリーとして、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１５１】
【数１２−１】
2013517772.tif 000087
【０１５２】
【数１２−２】
2013517772.tif 000088
【０１５３】
【数１２−３】
2013517772.tif 000089
【０１５４】
【数１２−４】
2013517772.tif 000090
【０１５５】
【数１２−５】
2013517772.tif 000091
【０１５６】
【数１２−６】
2013517772.tif 000092
【０１５７】
【数１２−７】
2013517772.tif 000093
クラスＡ（または１）（ロドプシン様）
ロドプシン様受容体は、Ｇタンパク質共役受容体の最大のグループを含むタンパク質のファミリーである。ロドプシンＡグループは、１９のサブグループ（Ａ１〜Ａ１９）にさらに細分割されている。
【０１５８】
サブファミリーＡ１は以下を含む：ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＣＲ１、ＣＫＲ１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ２）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体３（ＣＣＲ３、ＣＫＲ３）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＣＲ４、ＣＫＲ４）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５、ＣＫＲ５）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８、ＣＫＲ８）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体−様２（ＣＣＲＬ２、ＣＫＲＸ）；ケモカイン（Ｃモチーフ）受容体１（ＸＣＲ１、ＣＸＣ１）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸ３ＣＲ１、Ｃ３Ｘ１）；ＧＰＲ１３７Ｂ（ＧＰＲ１３７Ｂ、ＴＭ７ＳＦ１）。
【０１５９】
サブファミリーＡ２は以下を含む：ケモカイン受容体；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体−様１（ＣＣＲＬ１  ＣＣＲＬ１、ＣＣＲ１１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６（ＣＣＲ６、ＣＫＲ６）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（ＣＣＲ７、ＣＫＲ７）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体９（ＣＣＲ９、ＣＫＲ９）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１０（ＣＣＲ１０、ＣＫＲＡ）；ＣＸＣケモカイン受容体ＩＰＲ００１０５３；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体６（ＣＸＣＲ６、ＢＯＮＺＯ）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体７（ＣＸＣＲ７、ＲＤＣ１）；インターロイキン８  ＩＰＲ０００１７４（ＩＬ８Ｒ）；ＩＬ８Ｒ−α（ＩＬ８ＲＡ、ＣＸＣＲ１）；ＩＬ８Ｒ−β（ＩＬ８ＲＢ、ＣＸＣＲ２）；アドレノメデュリン受容体（ＧＰＲ１８２）；ダフィー式血液型、ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ、ＤＵＦＦ）；Ｇタンパク質共役受容体３０（ＧＰＥＲ、ＣＭＬ２、ＧＰＣＲエストロゲン受容体）。
【０１６０】
サブファミリーＡ３は以下を含む：アンジオテンシンＩＩ受容体；アンジオテンシンＩＩ受容体、１型（ＡＧＴＲ１、ＡＧ２Ｓ）；アンジオテンシンＩＩ受容体、２型（ＡＧＴＲ２、ＡＧ２２）；アペリン（Ａｐｅｌｉｎ）受容体（ＡＧＴＲＬ１、ＡＰＪ）；ブラジキニン受容体ＩＰＲ０００４９６；ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１、ＢＲＢ１）；ブラジキニン受容体Ｂ２（ＢＤＫＲＢ２、ＢＲＢ２）；ＧＰＲ１５（ＧＰＲ１５、ＧＰＲＦ）；ＧＰＲ２５（ＧＰＲ２５）。
【０１６１】
サブファミリーＡ４は以下を含む：オピオイド受容体ＩＰＲ００１４１８；デルタオピオイド受容体（ＯＰＲＤ１、ＯＰＲＤ）；カッパオピオイド受容体（ＯＰＲＫ１、ＯＰＲＫ）；ミューオピオイド受容体（ＯＰＲＭ１、ＯＰＲＭ）；ノシセプチン受容体（ＯＰＲＬ１、ＯＰＲＸ）；ソマトスタチン受容体ＩＰＲ０００５８６；ソマトスタチン受容体１（ＳＳＴＲ１、ＳＳＲ１）；ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２、ＳＳＲ２）；ソマトスタチン受容体３（ＳＳＴＲ３、ＳＳＲ３）；ソマトスタチン受容体４（ＳＳＴＲ４、ＳＳＲ４）；ソマトスタチン受容体５（ＳＳＴＲ５、ＳＳＲ５）；ＧＰＣＲニューロペプチド受容体ＩＰＲ００９１５０；ニューロペプチドＢ／Ｗ受容体１（ＮＰＢＷＲ１、ＧＰＲ７）；ニューロペプチドＢ／Ｗ受容体２（ＮＰＢＷＲ２、ＧＰＲ８）；ＧＰＲ１オーファン受容体（ＧＰＲ１）ＩＰＲ００２２７５。
【０１６２】
サブファミリーＡ５は以下を含む：ガラニン受容体ＩＰＲ０００４０５；ガラニン受容体１（ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ）；ガラニン受容体２（ＧＡＬＲ２、ＧＡＬＳ）；ガラニン受容体３（ＧＡＬＲ３、ＧＡＬＴ）；システイニルロイコトリエン受容体ＩＰＲ００４０７１；システイニルロイコトリエン受容体１（ＣＹＳＬＴＲ１）；システイニルロイコトリエン受容体２（ＣＹＳＬＴＲ２）；ロイコトリエンＢ４受容体ＩＰＲ００３９８１；ロイコトリエンＢ４受容体（ＬＴＢ４Ｒ、Ｐ２Ｙ７）；ロイコトリエンＢ４受容体２（ＬＴＢ４Ｒ２）；リラキシン受容体ＩＰＲ００８１１２；リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体１（ＲＸＦＰ１、ＬＧＲ７）；リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体２（ＲＸＦＰ２、ＧＰＲ１０６）；リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体３（ＲＸＦＰ３、ＳＡＬＰＲ）；リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体４（ＲＸＦＰ４、ＧＰＲ１００／ＧＰＲ１４２）；ＫｉＳＳ１由来ペプチド受容体（ＧＰＲ５４）（ＫＩＳＳ１Ｒ）ＩＰＲ００８１０３；メラニン凝集ホルモン受容体１（ＭＣＨＲ１、ＧＰＲＯ）ＩＰＲ００８３６１；ウロテンシンＩＩ受容体（ＵＴＳ２Ｒ、ＵＲ２Ｒ）ＩＰＲ０００６７０。
【０１６３】
サブファミリーＡ６は以下を含む：コレシストキニン受容体ＩＰＲ００９１２６；コレシストキニンＡ受容体（ＣＣＫＡＲ、ＣＣＫＲ）；コレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫＢＲ、ＧＡＳＲ）；ニューロペプチドＦＦ受容体ＩＰＲ００５３９５；ニューロペプチドＦＦ受容体１（ＮＰＦＦＲ１、ＦＦ１Ｒ）；ニューロペプチドＦＦ受容体２（ＮＰＦＦＲ２、ＦＦ２Ｒ）；オレキシン受容体ＩＰＲ０００２０４；ヒポクレチン（オレキシン）受容体１（ＨＣＲＴＲ１、ＯＸ１Ｒ）；ヒポクレチン（オレキシン）受容体２（ＨＣＲＴＲ２、ＯＸ２Ｒ）；バソプレシン受容体ＩＰＲ００１８１７；アルギニンバソプレシン受容体１Ａ（ＡＶＰＲ１Ａ、Ｖ１ＡＲ）；アルギニンバソプレシン受容体１Ｂ（ＡＶＰＲ１Ｂ、Ｖ１ＢＲ）；アルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２、Ｖ２Ｒ）；生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＮＲＨＲ、ＧＲＨＲ）ＩＰＲ００１６５８；ＧＰＲ２２（ＧＰＲ２２、ＧＰＲＭ）；ＧＰＲ１０３（ＧＰＲ１０３）；ＧＰＲ１７６（ＧＰＲ１７６、ＧＰＲ）。
【０１６４】
サブファミリーＡ７は以下を含む：ボンベシン受容体ＩＰＲ００１５５６；ボンベシン様受容体３（ＢＲＳ３）；ニューロメディンＢ受容体（ＮＭＢＲ）；ガストリン放出ペプチド受容体（ＧＲＰＲ）；エンドセリン受容体ＩＰＲ０００４９９；エンドセリン受容体Ａ型（ＥＤＮＲＡ、ＥＴ１Ｒ）；エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ、ＥＴＢＲ）；ＧＰＲ３７（ＧＰＲ３７、ＥＴＢＲ−ＬＰ２）ＩＰＲ００３９０９；ニューロメディンＵ受容体ＩＰＲ００５３９０；ニューロメディンＵ受容体１（ＮＭＵＲ１）；ニューロメディンＵ受容体２（ＮＭＵ２Ｒ）；ニューロテンシン受容体ＩＰＲ００３９８４；ニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１、ＮＴＲ１）；ニューロテンシン受容体２（ＮＴＳＲ２、ＮＴＲ２）；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＴＲＨＲ、ＴＲＦＲ）ＩＰＲ００９１４４；成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳＲ）ＩＰＲ００３９０５；ＧＰＲ３９（ＧＰＲ３９）；モチリン受容体（ＭＬＮＲ、ＧＰＲ３８）。
【０１６５】
サブファミリーＡ８は以下を含む：アナフィラトキシン受容体ＩＰＲ００２２３４；Ｃ３ａ受容体（Ｃ３ＡＲ１、Ｃ３ＡＲ）；Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ＡＲ１、Ｃ５ＡＲ）；ケモカイン様受容体１（ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＬ１）ＩＰＲ００２２５８；ホルミルペプチド受容体ＩＰＲ０００８２６；ホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１、ＦＭＬＲ）；ホルミルペプチド受容体様１（ＦＰＲＬ１、ＦＭＬ２）；ホルミルペプチド受容体様２（ＦＰＲＬ２、ＦＭＬ１）；ＭＡＳ１がん遺伝子ＩＰＲ０００８２０；ＭＡＳ１（ＭＡＳ１、ＭＡＳ）；ＭＡＳ１Ｌ（ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧ）；ＧＰＲ１（ＧＰＲ１）；ＧＰＲ３２（ＧＰＲ３２、ＧＰＲＷ）；ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）；ＧＰＲ７７（ＧＰＲ７７、Ｃ５Ｌ２）。
【０１６６】
サブファミリーＡ９は以下を含む：メラトニン受容体ＩＰＲ００００２５；メラトニン受容体１Ａ（ＭＴＮＲ１Ａ、ＭＬ１Ａ）；メラトニン受容体１Ｂ（ＭＴＮＲ１Ｂ、ＭＬ１Ｂ）；ニューロキニン受容体ＩＰＲ００１６８１；タキキニン受容体１（ＴＡＣＲ１、ＮＫ１Ｒ）；タキキニン受容体２（ＴＡＣＲ２、ＮＫ２Ｒ）；タキキニン受容体３（ＴＡＣＲ３、ＮＫ３Ｒ）；ニューロペプチドＹ受容体ＩＰＲ０００６１１；ニューロペプチドＹ受容体Ｙ１（ＮＰＹ１Ｒ、ＮＹ１Ｒ）；ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ、ＮＹ２Ｒ）；膵臓ポリペプチド受容体１（ＰＰＹＲ１、ＮＹ４Ｒ）；ニューロペプチドＹ受容体Ｙ５（ＮＰＹ５Ｒ、ＮＹ５Ｒ）；プロラクチン放出ペプチド受容体（ＰＲＬＨＲ、ＧＰＲＡ）ＩＰＲ００１４０２；プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１、ＧＰＲ７３）；ＧＰＲ１９（ＧＰＲ１９、ＧＰＲＪ）；ＧＰＲ５０（ＧＰＲ５０、ＭＬ１Ｘ）；ＧＰＲ７５（ＧＰＲ７５）；ＧＰＲ８３（ＧＰＲ８３、ＧＰＲ７２）。
【０１６７】
サブファミリーＡ１０は以下を含む：糖タンパク質ホルモン受容体ＩＰＲ００２１３１；ＦＳＨ受容体（ＦＳＨＲ）；黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン受容体（ＬＨＣＧＲ、ＬＳＨＲ）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４（ＬＧＲ４、ＧＰＲ４８）；ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５、ＧＰＲ４９）。
【０１６８】
サブファミリーＡ１１は以下を含む：ＧＰＲ４０関連受容体ＩＰＲ０１３３１２；遊離脂肪酸受容体１（ＦＦＡＲ１、ＧＰＲ４０）；遊離脂肪酸受容体２（ＦＦＡＲ２、ＧＰＲ４３）；遊離脂肪酸受容体３（ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４１）；ＧＰＲ４２（ＧＰＲ４２、ＦＦＡＲ１Ｌ）；Ｐ２プリン受容体ＩＰＲ００２２８６；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１（Ｐ２ＲＹ１）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２（Ｐ２ＲＹ２）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ４（Ｐ２ＲＹ４）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ６（Ｐ２ＲＹ６）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１１（Ｐ２ＲＹ１１）；ＧＰＲ３１（ＧＰＲ３１、ＧＰＲＶ）；ＧＰＲ８１（ＧＰＲ８１）；ＧＰＲ８２（ＧＰＲ８２）；ＧＰＲ１０９Ｂ（ＧＰＲ１０９Ｂ、ＨＭ７４）；オキソグルタレート（アルファケトグルタル酸）受容体１（ＯＸＧＲ１、ＧＰＲ８０）；スクシネート受容体１（ＳＵＣＮＲ１、ＧＰＲ９１）。
【０１６９】
サブファミリーＡ１２は以下を含む：Ｐ２プリン受容体ＩＰＲ００２２８６；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１２（Ｐ２ＲＹ１２）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１３（Ｐ２ＲＹ１３、ＧＰＲ８６）ＩＰＲ００８１０９；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１４（Ｐ２ＲＹ１４、ＵＤＰ−グルコース受容体、ＫＩ０１）ＩＰＲ００５４６６；ＧＰＲ３４（ＧＰＲ３４）；ＧＰＲ８７（ＧＰＲ８７）；ＧＰＲ１７１（ＧＰＲ１７１、Ｈ９６３）；血小板活性化因子受容体（ＰＴＡＦＲ、ＰＡＦＲ）ＩＰＲ００２２８２。
【０１７０】
サブファミリーＡ１３は以下を含む：カンナビノイド受容体ＩＰＲ００２２３０；カンナビノイド受容体１（脳）（ＣＮＲ１、ＣＢ１Ｒ）；カンナビノイド受容体２（マクロファージ）（ＣＮＲ２、ＣＢ２Ｒ）；リゾホスファチジン酸受容体ＩＰＲ００４０６５；内皮分化遺伝子２（ＥＤＧ２）；内皮分化遺伝子４（ＥＤＧ４）；内皮分化遺伝子７（ＥＤＧ７）；スフィンゴシン１リン酸受容体ＩＰＲ００４０６１；内皮分化遺伝子１（ＥＤＧ１）；内皮分化遺伝子３（ＥＤＧ３）；内皮分化遺伝子５（ＥＤＧ５）；内皮分化遺伝子６（ＥＤＧ６）；内皮分化遺伝子８（ＥＤＧ８）；メラノコルチン／ＡＣＴＨ受容体ＩＰＲ００１６７１；メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ、ＭＳＨＲ）；メラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）；メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）；メラノコルチン５受容体（ＭＣ５Ｒ）；ＡＣＴＨ受容体（ＭＣ２Ｒ）、ＡＣＴＲ）；ＧＰＲ３（ＧＰＲ３）；ＧＰＲ６（ＧＰＲ６）；ＧＰＲ１２（ＧＰＲ１２、ＧＰＲＣ）。
【０１７１】
サブファミリーＡ１４は以下を含む：エイコサノイド受容体ＩＰＲ００８３６５；プロスタグランジンＤ２受容体（ＰＴＧＤＲ、ＰＤ２Ｒ）；プロスタグランジンＥ１受容体（ＰＴＧＥＲ１、ＰＥ２１）；プロスタグランジンＥ２受容体（ＰＴＧＥＲ２、ＰＥ２２）；プロスタグランジンＥ３受容体（ＰＴＧＥＲ３、ＰＥ２３）；プロスタグランジンＥ４受容体（ＰＴＧＥＲ４、ＰＥ２４）；プロスタグランジンＦ受容体（ＰＴＧＦＲ、ＰＦ２Ｒ）；プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）受容体（ＰＴＧＩＲ、ＰＩ２Ｒ）；トロンボキサンＡ２受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ、ＴＡ２Ｒ）。
【０１７２】
サブファミリーＡ１５は以下を含む：Ｐ２プリン受容体ＩＰＲ００２２８６；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ５（Ｐ２ＲＹ５、Ｐ２Ｙ５）ＩＰＲ００２１８８；プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１０（Ｐ２ＲＹ１０、Ｐ２Ｙ１０）；プロテアーゼ活性化受容体ＩＰＲ００３９１２；凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体様１（Ｆ２ＲＬ１、ＰＡＲ２）；凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体様２（Ｆ２ＲＬ２、ＰＡＲ３）；エプスタインバーウイルス誘導遺伝子２（リンパ球特異的Ｇタンパク質共役受容体）（ＥＢＩ２）；プロトン感知性（Ｐｒｏｔｏｎ−ｓｅｎｓｉｎｇ）Ｇタンパク質共役受容体；ＧＰＲ４（ＧＰＲ４）ＩＰＲ００２２７６；ＧＰＲ６５（ＧＰＲ６５）ＩＰＲ００５４６４；ＧＰＲ６８（ＧＰＲ６８）ＩＰＲ００５３８９；ＧＰＲ１３２（ＧＰＲ１３２、Ｇ２Ａ）ＩＰＲ００５３８８；ＧＰＲ１７（ＧＰＲ１７、ＧＰＲＨ）；ＧＰＲ１８（ＧＰＲ１８、ＧＰＲＩ）；ＧＰＲ２０（ＧＰＲ２０、ＧＰＲＫ）；ＧＰＲ２３（ＧＰＲ２３、Ｐ２ＲＹ９、Ｐ２Ｙ９）；ＧＰＲ３５（ＧＰＲ３５）；ＧＰＲ５５（ＧＰＲ５５）；ＧＰＲ９２（ＧＰＲ９２）；凝固因子ＩＩ受容体（Ｆ２Ｒ、ＴＨＲＲ）。
【０１７３】
サブファミリーＡ１６は以下を含む：オプシンＩＰＲ００１７６０［７］；ロドプシン（ＲＨＯ、ＯＰＳＤ）；オプシン１（錐体視物質）、短波感受性（ｓｈｏｒｔ−ｗａｖｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）（色覚異常、第３色覚異常）（ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＳＢ）（青色感受性オプシン）；オプシン１（錐体視物質）、中波感受性（ｍｅｄｉｕｍ−ｗａｖｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）（色覚異常、第２色覚異常）（ＯＰＮ１ＭＷ、ＯＰＳＧ）（緑色感受性オプシン）；オプシン１（錐体視物質）、長波感受性（ｌｏｎｇ−ｗａｖｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）（色覚異常、第１色覚異常）（ＯＰＮ１ＬＷ、ＯＰＳＲ）（赤色感受性オプシン）；網膜Ｇタンパク質共役受容体（ＲＧＲ）；網膜色素上皮由来ロドプシンホモログ（ＲＲＨ、ＯＰＳＸ）（視物質様受容体オプシン）ＩＰＲ００１７９３。
【０１７４】
サブファミリーＡ１７は以下を含む：５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）受容体ＩＰＲ００２２３１；５−ＨＴ２Ａ（ＨＴＲ２Ａ、５Ｈ２Ａ）；５−ＨＴ２Ｂ（ＨＴＲ２Ｂ、５Ｈ２Ｂ）；５−ＨＴ２Ｃ（ＨＴＲ２Ｃ、５Ｈ２Ｃ）；５−ＨＴ６（ＨＴＲ６、５Ｈ６）ＩＰＲ００２２３２；アドレナリン作動性受容体ＩＰＲ００２２３３；アルファ１Ａ（ＡＤＲＡ１Ａ、Ａ１ＡＡ）；アルファ１Ｂ（ＡＤＲＡ１Ｂ、Ａ１ＡＢ）；アルファ１Ｄ（ＡＤＲＡ１Ｄ、Ａ１ＡＤ）；アルファ２Ａ（ＡＤＲＡ２Ａ、Ａ２ＡＡ）；アルファ２Ｂ（ＡＤＲＡ２Ｂ、Ａ２ＡＢ）；アルファ２Ｃ（ＡＤＲＡ２Ｃ、Ａ２ＡＣ）；ベータ１（ＡＤＲＢ１、Ｂ１ＡＲ）；ベータ２（ＡＤＲＢ２、Ｂ２ＡＲ）；ベータ３（ＡＤＲＢ３、Ｂ３ＡＲ）；ドパミン受容体ＩＰＲ０００９２９；Ｄ１（ＤＲＤ１、ＤＡＤＲ）；Ｄ２（ＤＲＤ２、Ｄ２ＤＲ）；Ｄ３（ＤＲＤ３、Ｄ３ＤＲ）；Ｄ４（ＤＲＤ４、Ｄ４ＤＲ）；Ｄ５（ＤＲＤ５、ＤＢＤＲ）；オクトパミン受容体ＩＰＲ００２００２；微量アミン受容体ＩＰＲ００９１３２；ＴＡＡＲ２（ＴＡＡＲ２、ＧＰＲ５８）；ＴＡＡＲ３（ＴＡＡＲ３、ＧＰＲ５７）；ＴＡＡＲ５（ＴＡＡＲ５、ＰＮＲ）；ＴＡＡＲ８（ＴＡＡＲ８、ＧＰＲ１０２）；ヒスタミンＨ２受容体（ＨＲＨ２、ＨＨ２Ｒ）ＩＰＲ０００５０３。
【０１７５】
サブファミリーＡ１８は以下を含む：ヒスタミンＨ１受容体（ＨＲＨ１、ＨＨ１Ｒ）ＩＰＲ０００９２１；ヒスタミンＨ３受容体（ＨＲＨ３）ＩＰＲ００３９８０；ヒスタミンＨ４受容体（ＨＲＨ４）ＩＰＲ００８１０２；アデノシン受容体ＩＰＲ００１６３４；Ａ１（ＡＤＯＲＡ１、ＡＡ１Ｒ）；Ａ２ａ（ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＡ２Ａ）；Ａ２ｂ（ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＡＡ２Ｂ）；Ａ３（ＡＤＯＲＡ３、ＡＡ３Ｒ）；ムスカリン性アセチルコリン受容体ＩＰＲ０００９９５；Ｍ１（ＣＨＲＭ１、ＡＣＭ１）；Ｍ２（ＣＨＲＭ２、ＡＣＭ２）；Ｍ３（ＣＨＲＭ３、ＡＣＭ３）；Ｍ４（ＣＨＲＭ４、ＡＣＭ４）；Ｍ５（ＣＨＲＭ５、ＡＣＭ５）；ＧＰＲ２１（ＧＰＲ２１、ＧＰＲＬ）；ＧＰＲ２７（ＧＰＲ２７）；ＧＰＲ４５（ＧＰＲ４５、ＰＳＰ２４）；ＧＰＲ５２（ＧＰＲ５２）；ＧＰＲ６１（ＧＰＲ６１）；ＧＰＲ６２（ＧＰＲ６２）；ＧＰＲ６３（ＧＰＲ６３）；ＧＰＲ７８（ＧＰＲ７８）；ＧＰＲ８４（ＧＰＲ８４）；ＧＰＲ８５（ＧＰＲ８５）；ＧＰＲ８８（ＧＰＲ８８）；ＧＰＲ１０１（ＧＰＲ１０１）；ＧＰＲ１６１（ＧＰＲ１６１、ＲＥ２）；ＧＰＲ１７３（ＧＰＲ１７３、ＳＲＥＢ３）。
【０１７６】
サブファミリーＡ１９は以下を含む：５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）受容体ＩＰＲ００２２３１；５−ＨＴ１Ａ（ＨＴＲ１Ａ、５Ｈ１Ａ）；５−ＨＴ１Ｂ（ＨＴＲ１Ｂ、５Ｈ１Ｂ）；５−ＨＴ１Ｄ（ＨＴＲ１Ｄ、５Ｈ１Ｄ）；５−ＨＴ１Ｅ（ＨＴＲ１Ｅ、５Ｈ１Ｅ）；５−ＨＴ１Ｆ（ＨＴＲ１Ｆ、５Ｈ１Ｆ）；５−ＨＴ４（ＨＴＲ４）ＩＰＲ００１５２０；５−ＨＴ５Ａ（ＨＴＲ５Ａ、５Ｈ５Ａ）；５−ＨＴ７（ＨＴＲ７、５Ｈ７）ＩＰＲ００１０６９。
【０１７７】
クラスＢ（または２）（セクレチン受容体ファミリー）
セクレチン受容体ファミリーの７回膜貫通型受容体は、進化上関連のあるタンパク質のファミリーである。３つの異なるサブファミリー（Ｂ１〜Ｂ３）が認められている。セクレチン様ＧＰＣＲとして、セクレチン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連ペプチド、および血管作動性腸ペプチド受容体が挙げられる。
【０１７８】
サブファミリーＢ１は、セクレチンおよびグルカゴンに対する受容体など、全てｃＡＭＰ媒介性シグナル伝達経路に関与する古典的なホルモン受容体を含む。サブファミリーＢ１は以下を含む：脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１型受容体ＩＰＲ００２２８５；ＰＡＣＲ；ＰＡＣＡＰＲ；カルシトニン受容体ＩＰＲ００３２８７；ＣＡＬＣＲ；副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体ＩＰＲ００３０５１；ＣＲＨＲ１；ＣＲＨＲ２；グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド受容体／胃抑制ポリペプチド受容体ＩＰＲ００１７４９；ＧＩＰＲグルカゴン受容体関連ＩＰＲ００３２９０；ＧＬＰ１Ｒ；ＧＬＰ２Ｒ；；成長ホルモン放出ホルモン受容体ＩＰＲ００３２８８；ＧＨＲＨＲ；副甲状腺ホルモン受容体ＩＰＲ００２１７０；ＰＴＨＲ１；ＰＴＨＲ２；セクレチン受容体ＩＰＲ００２１４４；ＳＣＴＲ；血管作動性腸ペプチド受容体ＩＰＲ００１５７１；ＶＩＰＲ１；ＶＩＰＲ２。
【０１７９】
サブファミリーＢ２は、長い細胞外Ｎ末端を有する受容体、例えば、数ある中で、白血球細胞表面抗原ＣＤ９７；ラトロトキシンに対するカルシウム非依存性受容体（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＯ９４９１０、および脳特異的血管新生阻害物質受容体（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＯ１４５１４）を含む。サブファミリーＢ２は以下を含む：脳特異的血管新生阻害物質ＩＰＲ００８０７７；ＢＡＩ１；ＢＡＩ２；ＢＡＩ３；ＣＤ９７抗原ＩＰＲ００３０５６；ＣＤ９７；ＥＭＲホルモン受容体ＩＰＲ００１７４０；ＣＥＬＳＲ１；ＣＥＬＳＲ２；ＣＥＬＳＲ３；ＥＭＲ１；ＥＭＲ２；ＥＭＲ３；ＥＭＲ４；ＧＰＲ５６オーファン受容体ＩＰＲ００３９１０；ＧＰＲ５６；ＧＰＲ６４；ＧＰＲ９７；ＧＰＲ１１０；ＧＰＲ１１１；ＧＰＲ１１２；ＧＰＲ１１３；ＧＰＲ１１４；ＧＰＲ１１５；ＧＰＲ１２３；ＧＰＲ１２５；ＧＰＲ１２６；ＧＰＲ１２８；ＧＰＲ１３３；ＧＰＲ１４４；ＧＰＲ１５７；ラトロフィリン受容体ＩＰＲ００３９２４；ＥＬＴＤ１；ＬＰＨＮ１；ＬＰＨＮ２；ＬＰＨＮ３。
【０１８０】
サブファミリーＢ３は、メトセラ（Ｍｅｔｈｕｓｅｌａｈ）および他のショウジョウバエのタンパク質を含む。典型的な７回膜貫通領域の他に、特徴的な構造の特徴として、リガンド結合に関与するアミノ末端細胞外ドメイン、および特異的なＧタンパク質共役に必要とされる細胞内ループ（ＩＣ３）が挙げられる。サブファミリーＢ３は利尿ホルモン受容体ＩＰＲ００２００１を含む。
【０１８１】
未分類のセクレチンファミリーのサブファミリーとして、Ｉｇ−ヘプタ（Ｉｇ−ｈｅｐｔａ）受容体ＩＰＲ００８０７８；ＧＰＲ１１６；ＤＲＥＧ；ＨＣＴＲ−５；ＨＣＴＲ−６；ＫＰＧ＿００３；ＫＰＧ＿００６；ＫＰＧ＿００８；ＫＰＧ＿００９；ＲＥＳＤＡ１が挙げられる。
【０１８２】
クラスＣ（または３）（代謝調節型グルタミン酸／フェロモン）
代謝調節型グルタミン酸受容体、すなわちｍＧｌｕＲは、間接的な代謝調節型のプロセスによって活性である１タイプのグルタミン酸受容体の一種である。ｍＧｌｕＲ１からｍＧｌｕＲ８（ＧＲＭ１からＧＲＭ８）と名付けられた８つの異なるタイプのｍＧｌｕＲが、グループＩ、ＩＩ、およびＩＩＩに分割される。ｍＧｌｕＲは、ｍＧｌｕＲ７ａおよびｍＧｌｕＲ７ｂなどのサブタイプにさらに分割される。グループＩにおけるｍＧｌｕＲはｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５を含む。グループＩＩにおける受容体はｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ３を含み、グループＩＩＩはｍＧｌｕＲ４、６、７、および８を含む。
【０１８３】
クラスＦ（または６）（フリズルド／スムーズンド）
スムーズンドは、ハエからヒトまでに保存されているヘッジホッグ経路のＳＭＯ遺伝子がコードするＧタンパク質共役受容体タンパク質である。ＳＭＯはがん遺伝子として機能することができる。ＳＭＯ変異の活性化は、ヘッジホッグ経路およびがんの非調節な活性化をもたらし得る。
【０１８４】
フリズルドは、Ｗｎｔシグナル伝達経路および他のシグナル伝達経路における受容体として働くＧタンパク質共役受容体タンパク質のファミリーである。フリズルドは活性化されるとサイトゾルにおけるほつれの活性化をもたらす。以下に１０個の公知のヒトフリズルド受容体を列挙する：ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０。
【０１８５】
Ｐ１３Ｋシグナル伝達経路
ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼまたはＰＩ３Ｋ）は、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎ）のイノシトール環の３位のヒドロキシル基をリン酸化することができる、関連する細胞内シグナル伝達物質酵素のファミリーである。これらはホスファチジルイノシトール３キナーゼとしても知られている。この経路は、がん遺伝子ＰＩ３ＫＣＡおよび腫瘍抑制物質ＰＴＥＮ（遺伝子）とともに、カロリー制限におけるインスリンおよびＩＧＦ１に対するがん腫瘍の非感受性に関係する。
【０１８６】
ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路ライブラリーとして、好ましくは、以下のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ・・・全て）が挙げられる：
【０１８７】
【数１３−１】
2013517772.tif 000094
【０１８８】
【数１３−２】
2013517772.tif 000095
【０１８９】
【数１３−３】
2013517772.tif 000096
腫瘍形成または転移の表現型モデル
本実施形態によるＧＥＯＩライブラリーを含む標的細胞を、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのモデルにおいて腫瘍形成または転移の表現型を求めてスクリーニングする。本発明の標的細胞を、選択されるがん遺伝子を発現および／または過剰発現するように操作し、それによって細胞の遺伝的状況を規定する。次いで、標的細胞を用いて、腫瘍形成および／または転移を誘発するように標的細胞の選択された遺伝的状況と協同的に相互作用するがん遺伝子のエレメントを求めてスクリーニングする。例えば、選択された遺伝的状況を有する標的細胞のアレイを調製してもよく、それによってアレイ内に位置する各々の個々の標的細胞または標的細胞の集団を、ＧＥＯＩライブラリーのメンバーを発現するように操作する。このようなＧＥＯＩ標的化細胞を、次いで、腫瘍形成または転移の表現型に対してモニタリングする。腫瘍形成および転移の表現型を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのモデルは、当技術分野において周知である。例えば、腫瘍形成は、異種移植片モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏのマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ／ベージュ、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）を用いて測定することができる。
【０１９０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルは３次元のマトリクスの使用を含む。ＧＥＯＩ標的細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ状態と同様の形態を示す３次元支持体中で増殖させる。このような３次元のゲルの一例は、その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される米国特許第５，５８０，７８１号に開示されている。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、腫瘍形成および／または自発的な転移を、腫瘍細胞の同所性の注射の後に決定することができる。ここでは、ＧＥＯＩ標的細胞を、起源の器官または組織中に直接移植する。同所性に移植した腫瘍の利点は、例えば、悪性黒色腫、前立腺腫瘍、または骨肉腫などに対して、実証されている。例えば、その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、Ｋｅｒｂｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ  ＆  Ｍｅｔａｓｔ．  Ｒｅｖ．、１０巻、２０１〜２１５頁、１９９１年；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎら、Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８４巻、９５１〜９５７頁、１９９２年；Ｂｅｒｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、４８９０〜４８９５頁、１９９３年を参照されたい。腫瘍細胞の同所性の注射の方法およびモデルは当技術分野において周知であり、その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，８３７，４６２号などにおいて以前に記載されている。さらに、同所性の腫瘍モデルは抗腫瘍薬のルーチンのスクリーニングに利用できる。個々のがんに特異的な同所性の注射の方法およびモデルは当技術分野において周知である。例えば、Ｆｒｅｙｔａｇら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ」、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．、５４巻、８７３〜８８６頁、２００２年を参照されたい。
【０１９２】
標的細胞（例えば、特定のがんに関与することが知られているがん遺伝子を発現するように操作する一次組織細胞）の好適な同所性の移植の例として、それだけには限定されないが、ａ）グリオーマ−頭蓋内；ｂ）乳がん−乳房脂肪体内；ｃ）肺がん−肺内（肺の胸膜腔または気管内）；ｄ）前立腺−前立腺内注射；ｅ）ミエローマ−骨髄内に直接；ｆ）脳−頭蓋内が挙げられる。
【０１９３】
いくつかの実施形態によると、腫瘍形成に関連する機能または表現型は、転移、細胞遊走、血管新生、細胞外マトリックス分解、足場非依存的増殖（例えば、軟寒天における増殖）、またはアノイキスの１つまたは複数である。
【０１９４】
転移の表現型は、転移巣の測定によるなど、当技術分野において公知のあらゆる方法を用いて評価することができる。
【０１９５】
候補ＧＥＯＩの確認
腫瘍形成および転移を測定するためのあらゆるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてポジティブな結果を示す候補ＧＥＯＩの重要性は、ＲＮＡｉ技術を用いた発現のノックダウンによって確認し、かつ／またはさらに評価することができる。例えば、候補ＧＥＯＩは、ＲＮＡｉ技術およびその後の腫瘍形成および／または転移のマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ／ベージュ、もしくはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）における同所性の注射を用いた発現のノックダウンによって、確認し、かつ／またはさらに評価することができる。ＲＮＡｉ技術を用いた候補ＧＥＯＩの発現のノックダウンは、腫瘍形成および転移のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて行うことができる。ＲＮＡｉ技術が腫瘍形成または転移の表現型の発生を阻害し、遅らせ、または妨げる場合に、候補ＧＥＯＩが確認される。このような確認のスクリーニング／アッセイは、１）候補ＧＥＯＩが適切な薬物標的であるか否かの決定、２）潜在的な新規な治療上の標的として働く特異的なＧＥＯＩの同定（インタクトな、または破壊された候補ＧＥＯＩ発現を有する細胞を発現プロファイリングすることによって）、３）候補ＧＥＯＩのプロテオミクスシグネチャ（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の決定を可能にする。シグネチャの発現プロファイルおよびプロテオミクスプロファイルの有用性により、薬物の有効性および候補ＧＥＯＩに対する特異性の評価における強力な方策が得られる。
【０１９６】
スクリーニング方法
いくつかの実施形態によると、本発明のＧＥＯＩライブラリーを含む標的細胞を、操作された経路と相互作用する化合物（例えば、薬物、生物活性物質、小分子など）を求めてスクリーニングするための方法において用いることができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ａ．所与の表現型または組織型を代表する細胞に、がん遺伝子およびがん遺伝子と関連しているがん化プロセスと結びついている１種もしくは複数の遺伝子または目的の遺伝エレメントを導入することを含む、がん細胞遺伝子型を有する遺伝的に操作された標的細胞を作製するステップと、ｂ．遺伝的に操作された標的細胞を、候補生物活性作用物質と接触させるステップと、ｃ．生物活性作用物質が、腫瘍形成表現型に影響を及ぼすか否かを決定するステップとを含む、操作された腫瘍形成経路と相互作用する生物活性作用物質を求めてスクリーニングするための方法を提供する。腫瘍形成の表現型は、転移、細胞遊走、血管新生、細胞外マトリックス分解、足場非依存的増殖、またはアノイキスの１つまたは複数であってよい。
【０１９８】
定義
別段の規定がなければ、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野における通常の技術者の一人が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載するのと同様または等価の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。刊行物、特許出願、特許、および本明細書で言及する他の参考は全て、その全文が参照によって援用される。抵触の場合には、定義を含めた本明細書によって規制される。さらに、材料、方法、および実施例は説明にすぎず、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１９９】
本明細書に記載する実施形態の理解を促す目的で、好ましい実施形態に対して言及し、好ましい実施形態を記載するのに特定の言語を用いる。本明細書において用いられる専門用語は特定の実施形態を記載する目的にすぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。本開示を通して用いられる単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他のものを指示しなければ複数の指示内容を含む。このように、例えば、「１つの組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」に対する言及は、単一の組成物同様、複数のこのような組成物を含み、「１つの治療物質（ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」に対する言及は、１つまたは複数の治療物質および／または薬剤、ならびに当業者には公知のこれらの同等物に対する言及である、などである。このように、例えば、「１つの宿主細胞（ａ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」に対する言及は複数のこのような宿主細胞を含んでおり、「１つの抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、１つまたは複数の抗体、および当技術分野業者には公知のこれらの同等物に対する指示内容である、などである。さらに、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語と組み合わせて用いる場合「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つ以上」の意味とも一致する。
【０２００】
本開示を通して「約」の語は、値が、値を決定するのに用いられる装置または方法に対する誤差の標準偏差を含むことを示すのに用いられる。
【０２０１】
特許請求の範囲における「または」の語の使用は、代替物に言及するにすぎないことを明らかに指摘しなければ、または代替物が相互に排他的でなければ、「および／または」を意味するのに用いられるが、本開示は代替物および「および／または」のみに言及する定義を支持するものである。
【０２０２】
本明細書および特許請求の範囲（複数可）において用いられる、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに含むのあらゆる形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに有するのあらゆる形、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに含むのあらゆる形、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに含むのあらゆる形、例えば、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は包括的であり、または制限がなく、さらなる列挙されていないエレメントまたは方法のステップを除外するものではない。
【０２０３】
「腫瘍」または「がん」の語は、発がん性の（ｃａｎｃｅｒ−ｃａｕｓｉｎｇ）細胞に典型的な特徴、例えば、非制御の増殖、不死性、転移の可能性、速い成長および増殖速度、ならびにある種の特徴的な形態学的特徴を有する細胞の存在を意味する。がん細胞は腫瘍の形態におけることが多いが、このような細胞は動物内に単独で存在することがあり、または白血病細胞など、非腫瘍形成性のがん細胞であることもある。本明細書で用いられる「がん」の語は、前がん性および悪性のがんを含む。がんとして、それだけには限定されないが、膵臓がん、例えば、膵臓腺がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、直腸結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、食道がん、子宮頸がん、子宮がんまたは子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂のがん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的な組織のがんなどが挙げられる。
【０２０４】
本明細書で用いられる「プロモーター／調節配列」の語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結した遺伝子生成物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。いくつかの場合において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合において、この配列はエンハンサー配列および遺伝子生成物の発現に必要とされる他の調節エレメントも含むことができる。プロモーター／調節配列は、例えば、空間的に、または一時的に制限するやり方で遺伝子生成物を発現するものであってよい。
【０２０５】
「構成的」プロモーターは、遺伝子生成物をコードし、または特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、ほとんどまたは全ての細胞の生理学的条件下で、生存するヒト細胞における遺伝子生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【０２０６】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子生成物をコードし、または特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、実質的に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞中に存在する場合のみに、生存するヒト細胞における遺伝子生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【０２０７】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子生成物をコードし、または特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、遺伝子生成物をもたらすヌクレオチド配列である。本発明は、アンチセンスの核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸に相補的である分子（例えば、本発明のマーカーに対応する二重鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的である分子、または本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡ配列に相補的である分子）を包含する。したがって、本発明のアンチセンス核酸分子は、本発明のセンス核酸に水素結合（すなわちアニール）することができる。アンチセンス核酸は、タンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）の全部または部分など、コード鎖全体、またはその部分のみに対して相補的であってよい。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全部または部分に対してアンチセンスであってもよい。非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接し、アミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。
【０２０８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０、またはそれを超えるヌクレオチドであってよい。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野において公知の手順を用いて、化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大し、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大するようにデザインされた様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換したヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる改変されたヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、その中に核酸がアンチセンス配向においてサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションにおいてさらに記載する、目的の標的の核酸のアンチセンス配向となる）。
【０２０９】
本発明のアンチセンス核酸分子を、細胞のｍＲＮＡ、および／または本発明の選択されたマーカーに対応するポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、または結合するように、被験体に投与し、またはインサイチューで生成させ、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、マーカーの発現を阻害するのが典型的である。ハイブリダイゼーションは安定な二本鎖を形成するように相補的である従来のヌクレオチドによるものであってもよく、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主溝における特異的な相互作用によってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位における直接注射、または好適に関連している体液（例えば、脳脊髄液）中へのアンチセンス核酸の注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を、選択された細胞を標的とするように改変し、次いで全身投与してもよい。例えば、全身投与に対して、例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、アンチセンス分子を、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように改変してもよい。アンチセンス核酸分子を、本明細書に記載するベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、その中にアンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下で配置されるベクター構築物が好ましい。
【０２１０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であってよい。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成し、その場合通常のαユニットとは対照的に鎖は互いに並行に伸びている（Ｇａｕｌｔｉｅｒら、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５巻、６６２５〜６６４１頁）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５巻、６１３１〜６１４８頁）またはキメラのＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら、１９８７年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２１５巻、３２７〜３３０頁）も含むことができる。
【０２１１】
本明細書で用いられる「ＲＮＡ干渉物質」は、本発明のバイオマーカーなど、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、標的遺伝子の発現に干渉し、または阻害するあらゆる物質と定義される。このようなＲＮＡ干渉物質として、それだけには限定されないが、標的の遺伝子に相同であるＲＮＡ分子を含む核酸分子、例えば、本発明のバイオマーカー、またはこれらのフラグメント、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現に干渉し、または阻害する小分子が挙げられる。
【０２１２】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、標的遺伝子と同一または極めて類似する配列のＲＮＡの発現または導入が、その標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をもたらし（Ｃｏｂｕｒｎ，  Ｇ．およびＣｕｌｌｅｎ，  Ｂ．（２００２年）Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６巻（１８）、９２２５頁を参照されたい）、それによって標的遺伝子の発現を阻害する進化上保存されているプロセスである。一実施形態では、ＲＮＡは二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物の細胞において記載されている。天然において、ＲＮＡｉはｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼダイサーによって開始され、ダイサーは長いｄｓＲＮＡの、ｓｉＲＮＡと呼ばれる二重鎖フラグメント中への連続移動的な切断を促進する。ｓｉＲＮＡは標的のｍＲＮＡを認識し、切断するタンパク質複合体中に組み入れられる。ＲＮＡｉは、合成のｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉物質など、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングする核酸分子を導入することによって開始することもできる。本明細書で用いられる「標的遺伝子発現の阻害」または「バイオマーカー遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子（例えば、本発明のバイオマーカー遺伝子）の発現もしくはタンパク質活性もしくはレベルにおける、または標的遺伝子によってコードされるタンパク質（例えば、本発明のバイオマーカータンパク質）におけるあらゆる低減を含む。低減は、ＲＮＡ干渉物質によって標的にされない標的遺伝子によってコードされるタンパク質の標的遺伝子の発現もしくは活性もしくはレベルに比べて、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％、またはそれを超えてよい。
【０２１３】
本明細書において「小型干渉ＲＮＡ」とも呼ぶ「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、例えば、ＲＮＡｉによって、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する物質と定義される。ｓｉＲＮＡは化学合成することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写によって生成することができ、または宿主細胞内で生成することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さ約１５から約４０ヌクレオチド、好ましくは約１５から約２８ヌクレオチド、より好ましくは長さ約１９から約２５ヌクレオチド、より好ましくは長さ約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチドの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、各鎖上に長さ約０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドを有する３’および／または５’オーバーハングを含むことができる。オーバーハングの長さは２本の鎖間で独立であり、すなわち１本の鎖状のオーバーハングの長さは第２の鎖状のオーバーハングの長さに依存しない。ｓｉＲＮＡが、標的のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によってＲＮＡ干渉を促進することができるのが好ましい。
【０２１４】
別の一実施形態では、ｓｉＲＮＡは小型ヘアピン（ステムループとも呼ばれる）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは低分子の（例えば、１９〜２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖から構成され、その後に５〜９ヌクレオチドのループ、および類似のセンス鎖が続く。あるいは、センス鎖の後にヌクレオチドループ構造があってよく、アンチセンス鎖が続いてよい。これらのｓｈＲＮＡはプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含まれていてよく、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩ  Ｕ６プロモーター、または別のプロモーターから発現されてよい（例えば、本明細書に参照によって援用されるＳｔｅｗａｒｔら、（２００３年）ＲＮＡ  Ａｐｒｉｌ、９巻（４）、４９３〜５０１頁を参照されたい）。
【０２１５】
ＲＮＡ干渉物質、例えば、ｓｉＲＮＡ分子を、がんを有し、またはがんを有する危険のある被験体に投与して、がんにおいて過剰発現されるバイオマーカー遺伝子（例えば、表２に列挙するバイオマーカー）など、本発明のバイオマーカー遺伝子の発現を阻害し、それによって、被験体におけるがんを処置し、予防し、または阻害してもよい。
【０２１６】
方法と材料
変異ががんにおいて関係付けられているＧＥＯＩ、がん遺伝子（複数可）、または遺伝子（複数可）の発現
変異ががんにおいて関係付けられているＧＥＯＩ、がん遺伝子（複数可）、または遺伝子（複数可）、および本明細書に記載する本発明の他の遺伝子または配列を含む核酸は、本明細書にさらに記載する通り、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、および終止シグナルに連結していてよい。当業者であれば、本明細書に記載する核酸を、これらの遺伝子を発現する核酸を有する発現ベクターによって発現させることができ、これらの発現ベクターを数々の方法において改変することができることを容易に理解されよう。
【０２１７】
「ベクター」の語は、それが連結している別の核酸を運搬することができる核酸を意味する。本発明に従って用いることができるベクターの一タイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製の可能な核酸である。他のベクターとして、これらが連結している核酸の自己複製および発現ができるものが挙げられる。これらが作動可能に連結した遺伝子の発現を指示することができるベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。
【０２１８】
本明細書で用いられる「作動可能に連結した」の語は、機能的な関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼすのであれば、コード配列に作動可能に連結している。より正確に述べると、２つのＤＮＡ分子（例えば、プロモーター領域を含むポリヌクレオチド、および所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド）は２つのポリヌクレオチド間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、または（２）コードポリヌクレオチドの転写を指示するプロモーターを含むポリヌクレオチドの能力を妨害しないのであれば「作動可能に連結した」と言われる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用である発現ベクターは、環状の二重鎖ＤＮＡ分子を意味する「プラスミド」の形態におけることが多く、このＤＮＡ分子はベクターの形態において染色体に結合していない。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、交換可能に用いられる。しかし、本発明は、同等の機能を果たし、当技術分野においてこの点に関して引き続き知られるようになるこのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図するものである。
【０２１９】
好適なベクターを、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、電気穿孔、および形質転換などの周知の技術を用いて標的の宿主細胞中に導入してもよく、細胞中に組成物を導入するのに添付の試薬を用いるのが典型的である。一般的に、プラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈殿などの沈殿物において、または荷電した脂質との複合体において導入する。ベクターがウイルスである場合、好適なパッケージング細胞系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングし、次いで細胞中に導入してもよい。一実施形態では、ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであってよい。例示のウイルスおよびレトロウイルスのベクターとして、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などが挙げられる。レトロウイルスベクターは、複製可能でも、または複製欠損でもよい。複製欠損の場合、ウイルスの繁殖は、標的の宿主細胞を補足する上でのみ生じるのが一般的である。好ましい一実施形態では、ベクターは組換えレトロウイルスベクターである。遺伝子送達ビヒクルは、任意選択によって、ウイルスの複製開始点またはパッケージングシグナルなどのウイルス配列を含むことができる。これらのウイルス配列は、アストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、オルソミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）、またはアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）などのウイルスから選択することができる。組換えレトロウイルスおよびその様々な使用は、例えば、その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、Ｍａｎｎら、（Ｃｅｌｌ、３３巻、１５３頁、１９８３年）、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻、６３４９頁、１９８４年）、Ｍｉｌｌｅｒら、（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻、５〜１４頁、１９９０年）、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、および同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２，４６８、ＷＯ８９／０５，３４９、ならびにＷＯ９０／０２，８０６を含めた多くの参考文献に記載されている。多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；  ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、３８６０〜３８６４頁、１９９３年）；Ｖｉｌｅ  およびＨａｒｔ、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、９６２〜９６７頁、１９９３年）；Ｒａｍら、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、８３〜８８頁、１９９３年）；Ｔａｋａｍｉｙａら、（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  、３３巻、４９３〜５０３頁、１９９２年）；Ｂａｂａら、（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７９巻、７２９〜７３５頁、１９９３年）；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；およびＷＯ９１／０２８０５に記載されているものを含めて本発明において利用することができる。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチドを送達するのに用いることができる他のウイルスベクター系は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（例えば、その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、ＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎおよびＬａｎｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８巻、３５８７〜３５９６頁、１９９０年）；ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）（例えば、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ）（その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、１９９７年５月２０日発行の、Ｗｏｏらによる米国特許第５，６３１，２３６号、およびＮｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）；ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（その内容全体が全文において参照によって本明細書に援用される、Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８年）Ｒｉｄｇｅｗａｙ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ  Ｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ  Ｔ編集、Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、ならびにＳｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｂａｉｃｈｗａｌ、およびＳｕｇｄｅｎ（１９８６年）「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ編集、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｏｕｐａｒら（１９８８年）Ｇｅｎｅ、６８巻、１〜１０頁）、ならびにいくつかのＲＮＡウイルスに由来している。
【０２２１】
改変は、構成的に調節されているベクターに対する個々のヌクレオチドの置換、またはベクター配列における１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失を含むことができる。配列の合間（例えば、代替のプロモーター）の発現を変更（すなわち、増大または低減）し、より大きなクローニングの柔軟性（例えば、代替の複数のクローニング部位）をもたらし、より大きな実験効率（例えば、代替のレポーター遺伝子）をもたらし、かつ／またはベクターの安定性を増大する構成的に調節されているベクターに対する改変または作動可能な連結が、本明細書において企図される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、標準的なライゲーションによって潜在的なエンハンサーを挿入するための制限酵素部位を含む、マルチクローニング配列を有するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングカセットを置き換えるように改変されてよい。
【０２２２】
本明細書における「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成的な機構によって認識されるＤＮＡ配列を意味する。別の一実施形態では、本発明の発現ベクターは、エンハンサープロモーターの組合せの試験をできるようにするように、内在性の遺伝子プロモーター、誘導プロモーター、細胞型特異的プロモーター、最小プロモーター、または当業者には公知である他の代替のエンハンサープロモーター配列を含めた、強力なＣＭＶプロモーター配列を排除するように改変されてよい。キナーゼなどの多くのタンパク質は、所与の細胞中で過剰発現されることによって単純に活性化することができる。一実施形態では、野生型または調節可能なタンパク質の発現の増大をもたらすために、強力なＣＭＶプロモーター配列を、さらに強力なプロモーターで置き換えてもよく、または改善されたエンハンサーなどとカップリングしてもよい。別の一実施形態では、野生型または調節可能なタンパク質の発現の増大は、標準的なプロモーターを有する遺伝子の複数のコピーの同時発現によって達成することができる。
【０２２３】
一実施形態では、発現ベクターは転写開始、終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される成熟した転写物のコード部分が、翻訳されるポリペプチドの終端に適切に位置する開始コドンおよび終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）の翻訳開始部位を含むことが好ましい。
【０２２４】
一実施形態では、本発明のベクターを、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの蛍光タンパク質または酵素をコードする遺伝子を含めたレポーター遺伝子を含むように改変してもよい。ある実施形態では、蛍光レポーターを、調節コントロールのタイミングのより正確な評価を可能にする、より短い、またはより長いタンパク質半減期を有する交代性の蛍光レポーターで置き換えることができる。レポーターは、例えば、潜在的な治療上の化学標的／リード（ｌｅａｄ）を同定するための化学的ライブラリーのスクリーニングにおいて、細胞／生化学活性に基づいて応答の観察（直接的または間接的）を可能にするタンパク質基質をコードするカセットによってやはり置換することができる。
【０２２５】
組換えベクターを、本発明の哺乳動物のヌクレオチド配列がベクター配列において調節エレメント（例えば、プロモーター配列、ポリアデニレーションシグナルなど）の制御下におかれるように、操作することができる。このような調節エレメントは、宿主細胞において、ヌクレオチド転写物、および／または本発明の哺乳動物のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の発現および／またはプロセシングを指示するように機能することができる。
【０２２６】
ベクター中に導入されるＤＮＡのクローニングされた配列に相補的な多量のｍＲＮＡを生成する強力なプロモーターを含む多数のベクターが構築されている。例えば、限定的なものではないが、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける真核生物のヌクレオチド配列の発現を、ｌａｃ、ｔｒｐ、ラムダ、およびｒｅｃＡプロモーターを用いて遂行することができる。例えば、参照によって本明細書に援用される、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、セクションＩＩ、１１〜１９５頁、１８５巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（上掲）を参照されたく、また、上述のＨａｗｌｅｙ，  Ｄ．  Ｋ．およびＭｃＣｌｕｒｅ，  Ｗ．  Ｒ．、「Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１巻、４８９１〜４９０６頁（１９８３年）も参照されたい。本発明の哺乳動物のヌクレオチド配列の発現、およびこれらがコードするポリペプチドは、組換え細菌の発現系において、容易に遂行することができる。
【０２２７】
適切な発現系として、一過性に、または安定して発現されるＤＮＡ、ならびにサルウイルス４０（ＳＶ−４０）、レトロウイルス、およびバキュロウイルスに由来するウイルスの発現ベクターを伴うものが挙げられる。これらのベクターは、プロモーター、および他のエレメント、例えば、エンハンサー、スプライスアクセプター、および／またはドナー配列、およびポリアデニル化シグナルを通常供給する。可能なベクターとして、それだけには限定されないが、コスミド、プラスミド、または改変されたウイルスが挙げられるが、ベクター系は用いる宿主細胞と適合性でなければならない。ウイルスのベクターとして、それだけには限定されないが、ワクシニアウイルス、またはラムダ誘導体が挙げられる。プラスミドとして、それだけには限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ７（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミド誘導体が挙げられる。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔などによって標的の宿主細胞内に導入することができる。一般的に、宿主におけるタンパク質の発現は、宿主細胞において機能する調節領域の制御下で、そのタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて遂行される。
【０２２８】
標的の宿主細胞中に導入されている本発明の真核生物のヌクレオチド配列は、染色体外配列として存在することができ、または相同的組換え、ウイルス組込み、または他の手段によって宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。ノーザンブロットおよびウエスタンブロットなどの標準的な技術を用いて、導入された配列が実際に標的の宿主細胞において発現されることを決定することができる。
【０２２９】
本発明の核酸を、標的細胞によって目的の遺伝子の取り込みおよび発現をもたらすあらゆる方法によって、宿主（標的）細胞中に導入することができる。これらの方法として、ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバント補助された（ａｄｊｕｖａｎｔ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）ＤＮＡ、カテーテルなどが挙げられる。ベクターとして、標的化部分（例えば、細胞の表面受容体に対するリガンド）、および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）を含む融合タンパク質であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載されているものなどの融合タンパク質、および核酸結合部分（例えば、プロタミン）、プラスミド、ファージなどを有する、ＷＯ９３／０４７０１において記載されているものなどの化学的コンジュゲートが挙げられる。ベクターは染色体、非染色体、または合成であってもよい。
【０２３０】
好ましいベクターとして、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学的コンジュゲートが挙げられる。レトロウイルスベクターとして、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルスが挙げられる。好ましい一つのＨＩＶベースのウイルスベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルス由来である少なくとも２つのベクターを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターとして、オルソポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．ら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、６４巻、４８７頁（１９９５年）；Ｌｉｍ，  Ｆ．ら、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編集、（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）（１９９５年）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．：  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０巻、７６０３頁（１９９３年）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７巻、１１４９頁（１９９０年）］、アデノウイルスベクター［ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、９８８頁（１９９３年）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ、３巻、２１９頁（１９９３年）；Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６９巻、２００４頁（１９９５年）］、およびアデノ随伴ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，  Ｍ．  Ｇ．ら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、８巻、１４８頁（１９９４年）］が挙げられる。
【０２３１】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質中に導入する。アビポックスウイルスベクターは、ＭＳＨ５遺伝子の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、ＭＳＨ５遺伝子を神経細胞中に導入するのに好ましい。アデノウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（約４カ月）よりも短期間の発現（約２カ月）をもたらし、アデノ随伴ウイルスはＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは標的細胞および処理される条件に依存する。導入は、感染、トランスフェクション、形質導入、または形質転換など、標準の技術によるものであってよい。遺伝子輸送の様式の例として、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、ウイルスベクターなどが挙げられる。
【０２３２】
このような導入される配列を有する標的の宿主細胞を分析して、配列の導入が標的の宿主細胞に対して有する効果を決定してもよい。特に、細胞を、自然変異の蓄積の速度における（例えば、薬物耐性に対する自然変異の速度によって）、変異の復帰の速度における、相同組換えの頻度における、多岐にわたる配列間の組換えの頻度における、または短い繰返し配列のゲノムの安定性における変更に対してアッセイしてもよい。特に、本発明の導入された配列を有する哺乳動物細胞を、Ｓｃｈａｌｌｉｎｇら（参照によって本明細書に援用される、Ｓｃｈａｌｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４巻、１３５頁、１９９３年）の方法によって、ジヌクレオチドおよびトリヌクレオチドの繰返しの安定性に対して、またはＵＶ光線、ヌクレオチドアナログなどのＤＮＡ損傷を誘発する物質に対する感受性に対して試験してもよい。
【０２３３】
特定の実施形態では、本発明のヌクレオチド配列を用いて、相同組換えによって内在性遺伝子を不活化し、それによってＧＥＯＩ欠損細胞、組織、または動物を作り出してもよい。例えば、限定的なものではないが、本発明の組換えヒトヌクレオチド配列を、挿入された場合に内在性ＧＥＯＩの転写を不活化する挿入変異（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を含むように操作してもよい。このような構築物を、本発明のヌクレオチド配列に作動可能に連結した適切なプロモーターの制御下で、形質転換、トランスフェクション、形質導入、注射などの技術によって細胞中に導入することができる。
【０２３４】
特定の一実施形態では、細胞における内在性ＧＥＯＩは、変異体ＧＥＯＩとの相同組換えによって不活化され、それによって細胞からトランスジェニック動物の発生を可能にすることがあり、トランスジェニック動物はコードされたミスマッチの修復遺伝子ポリペプチドを発現する能力がない。別の一実施形態では、転写されると「アンチセンス」核酸配列を生成する構築物を提供することができ、この核酸配列は翻訳時に必要とされるミスマッチの修復遺伝子ポリペプチドを生成しない。
【実施例】
【０２３５】
実施例１：状況特異的遺伝子スクリーニングはＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫における治療ターゲットとしてのＪＮＫ阻害を同定する
本実施例は、遺伝的に規定されたがん増感性のモデル系において、高確率ドライバー遺伝エレメントのライブラリーに相対的重量の生物学的エビデンスを系統的に割り当てるようにデザインされ、開発された状況特異的なｉｎ  ｖｉｖｏのフォワード遺伝子スクリーニングを記載するものである。このスクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける黒色腫発生における、好ましくは、強力な協同的イベントとしてＪＮＫ経路の活性化を同定するＢＲＡＦＶ６００Ｅの状況において開発された。ＢＲＡＦＶ６００ＥのＪＮＫ活性との協同は、紫外線照射（ＵＶ）が、ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトの形質転換を引き起こす内因性ＪＮＫシグナル伝達を強力に活性化し得ることを実証する、疫学的および生化学的データと一致する。ＪＮＫ活性のＲＮＡｉ媒介性ノックダウンは、高度な内因性ホスホロ−ｃＪＵＮ活性を有するヒト黒色腫細胞において腫瘍の退行をもたらした。このように、ＢＲＡＦＶ６００Ｅの状況特異的遺伝子スクリーニングは、ＪＮＫ経路の成分を、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫における主要な腫瘍維持ターゲットとして同定しており、特定の黒色腫患者におけるＪＮＫ経路を標的化する薬剤の開発を導くクリニカルパス仮説を提示するものである。
【０２３６】
「がん−キナーゼ」ライブラリーは、多様なヒトのがんにおいて体細胞性ドライバー変異を維持すると報告されている１２０個のキナーゼのうち１１０個に対するレンチウイルスのベクターにおける配列確認されたＯＲＦを含んで構築された。このライブラリーを、ＲＢおよびｐ５３経路を活性化するためのそれぞれＢＲＡＦＶ６００ＥおよびＴＥＲＴならびにｐ５３ＤＤおよびＣＤＫ４−Ｒ２４Ｃと一緒に操作したヒトＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトモデル系中にプールし、導入した。ＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトのプロファイルは、ヒト黒色腫における最も一般的な臨床的に規定できる遺伝子プロファイルを代表しており、皮膚における同所性の移植後の効率的な黒色腫形成を導くのに不十分である（浸透度１０％および潜伏期２６週間）。これとは対照的に、がんキナーゼのプールと形質導入したＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトの４０％は、平均潜伏期１３週で腫瘍を発生した（１０〜１８週の範囲）。
【０２３７】
腫瘍の浸透度および加速度の増大は、腫瘍形成を導く上でＢＲＡＦＶ６００Ｅと協同するがんキナーゼに対する選択を反映することがあることから、本発明者らはがんキナーゼと協同的なカタログ候補に対してゲノムＰＣＲ配列決定およびウエスタンブロットを行った（方法を参照されたい）。
【０２３８】
２３の腫瘍の分析により、単独または組み合わせで少なくとも２つの腫瘍においてポジティブに選択される１４のキナーゼが回収され、１１０のドライバーキナーゼのうち１４が、ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトモデル系における候補がん遺伝子ドライバーであることを示していた。意外なことに、これら１４のキナーゼのうち、ヒットしたのは、両方のＭＡＰ２Ｋ（ＭＡＰ２Ｋ４およびＭＡＰ２Ｋ７）ならびに２つのＭＡＰＫ（ＭＡＰＫ８／ＪＮＫ１およびＭＡＰＫ９／ＪＮＫ２）を含む、ＪＮＫ経路の４つのコアシグナル伝達メディエーターであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトの形質転換の間の、ＪＮＫ経路活性化に対する強力な遺伝子選択圧を反映するパターンである。個々のＪＮＫシグナル伝達成分での２次確認スクリーニングの間、本発明者らは、１６週以内にそれぞれ３０％および５０％の浸透度で腫瘍形成をもたらす、ＨＭＥＬ−ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイト中に形質導入した場合、個々にＭＡＰ２Ｋ４およびＭＡＰＫ９／ＪＮＫ２の両方による頑強ながん遺伝子活性を観察した（図３）。直行性の確認系として遺伝子操作したマウスを用いて、ＭＡＰ２Ｋ４およびＭＡＰＫ９はＢＲＡＦＶ６００Ｅ発現性Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−メラノサイトを形質転換することができることがさらに示され、一方、強化したＢＲＡＦＶ６００Ｅ発現単独ではメラニン形成を導くのに不十分であった。１次スクリーニングにおいてヒットした第２のキナーゼを含む腫瘍におけるこれらの回収と一致して（データは示さず）、ＭＡＰ２Ｋ７およびＭＡＰＫ８は２次ＨＭＥＬスクリーニングにおいて個々に腫瘍を生成せず、これら２つのキナーゼはＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトを形質転換する上で他の遺伝エレメントとの協同を必要とすることを示唆していた。
【０２３９】
ＪＮＫシグナル伝達は、アポトーシス促進性かつ腫瘍抑制性と一般的に見られており（ｒｅｆ）、それゆえＪＮＫ経路の成分はヒトのがんにおける治療上の発展を目標にしていなかった。しかし、１次スクリーニングにおけるこの経路の複数の成分に対する強力な遺伝子選択は、マウスおよびヒトのシステムにおける２次確認によって強化され、ＪＮＫ経路の活性化はＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトにおける強力な腫瘍原性イベントであり、ＪＮＫ経路の阻害はＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫における合理的な治療戦略であることを明白に確立している。後者に対処するために、本発明者らは、ＪＮＫ経路の活性化がヒト黒色腫において観察されるか否かを試験した。ＪＮＫ経路活性のレポーターとしてホスホ−ｃＪＵＮを用いて、組織マイクロアレイ上でヒト黒色腫検体の２５〜３０％において高レベルのＪＮＫ活性が観察される［６０個の核が６０の独立した患者検体に対応する］。さらに、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ、方法を参照されたい）による新たに凍結させたＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異ヒト黒色腫の３９のコホートにおけるＪＮＫ発現の定量的測定は、これらの黒色腫の３１個（７９％）が、１次メラノサイトよりも高いレベルのリン酸化ＪＮＫを発現したことを示していた（図４、ｐ＝０．０４）。
【０２４０】
これらの腫瘍データと一致して、本発明者らは、ＪＮＫ活性は４０の確立されたヒト黒色腫細胞系のパネルにおいて可変性であり、頑強なＪＮＫ活性を有する細胞におけるＪＮＫ２のＲＮＡｉ媒介性のノックダウンは腫瘍原性の損傷をもたらすことを見出した（図３）。ここで、ドキシサイクリン誘導ベクター系における２つの独立したｓｈＲＮＡ標的化ＪＮＫ２を用いて、本発明者らは、高レベルのホスホ−ｃＪＵＮを有する１０系統のヒト黒色腫細胞のうち５系統における足場非依存性の増殖の劇的な阻害を観察した（図５）。免疫不全の宿主中に移植すると、ｓｈＲＮＡの発現は、ドキシサイクリン投与時、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍原性を完全に阻害した（図６）。
【０２４１】
次に、黒色腫におけるＪＮＫ活性の腫瘍維持の要件に取り組むために、本発明者は、異種移植腫瘍が免疫低下動物において完全に確立された後、ドキシサイクリン投与によってＪＮＫ２に対するｓｈＲＮＡの発現を誘発した。図７に示す通り、ＪＮＫ２が消失すると、確立された腫瘍が退行する。
【０２４２】
ヒト黒色腫におけるＪＮＫ活性化に対する分子ベースを次に調査した。同定された核のＪＮＫメディエーターに対する１６の体細胞性ドライバー変異の中で、１つを除く全ての単一のＭＡＰ２Ｋ４変異が黒色腫以外の腫瘍型において発見された。このようなプロファイルと一致して、７６対の黒色腫および適合する正常のＤＮＡにおける４つ全てのＪＮＫシグナル伝達成分の標的化した再配列決定により、この経路には、非サイレントの体細胞性変異がないことが明らかになった（データは示さず）。さらに、キナーゼ活性（方法を参照されたい）およびｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍原性に対して評価する場合、ＭＡＰ２Ｋ４に対して規定した５つの体細胞性ドライバー変異３つがキナーゼ活性の増大（ｃＪＵＮリン酸化のレベルによって報告される通り）およびｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍原性を示したが、黒色腫において同定された体細胞変異は示さなかった。下記の表１−１を参照されたい。これと一緒に、これらのデータは、変異上の活性化はヒト黒色腫におけるＪＮＫ活性化の主要な機序ではないことを示唆している。
【０２４３】
【表１−１】
2013517772.tif 000097
ＪＮＫシグナル伝達は、黒色腫に対するよく認識された環境発がん物質であるＵＶＢによって誘発されることが知られている。興味深いことに、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異は、断続的なＵＶ曝露に関連するサブタイプである表在拡大型黒色腫の間で最も蔓延している。黒色腫におけるＪＮＫ活性化の関連のある様式はこのように、特にＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異で始まるメラノサイトにおいて、ＵＶ曝露であり得る。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−マウスからのＢＲＡＦＶ６００Ｅ発現性原発性メラノサイトを用いて、本発明者らは、頑強なホスホ−ｃＪＵＮ発現によって反映される通り、ＵＶＢ曝露が実際にＪＮＫを活性化することを確証した。これらのＵＶ処理したＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイトを軟寒天において接種する場合、ＵＶＢに１回曝露するとｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける強力な足場非依存性の増殖をもたらし、腫瘍原性の強力な代理であることを本発明者らは見出した。これとは対照的に、野生型ＢＲＡＦを発現するＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−メラノサイトにおける同様のＵＶＢ曝露は細胞死およびコロニー形成の低減をもたらし、状況依存的のＪＮＫ活性化の発がん性の明白な証拠であった（図８Ｂ）。最後に、ＵＶＢとＢＲＡＦＶ６００Ｅとの間のこの協同はｉｎ  ｖｉｖｏでも明白であった。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−メラノサイトにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅの発現は、ドキシサイクリン誘導性ＢＲＡＦＶ６００Ｅトランスジェニックモデル（遺伝子型Ｔｙｒ−ｒｔＴＡ／Ｔｅｔ−ＢＲＡＦＶ６００ＥＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−、以後「ｉＢＲＡＦ＊」と呼ぶ、新生児期（生後１〜３日）の１回の非発赤性の照射量のＵＶＢに暴露すると、浸透度の増大した黒色腫の著しく早期の発症をもたらした（図８Ｃ））における黒色腫発生を導くのに十分ではなかった。これらのＵＶ誘発性ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫は、ＩＨＣ上のホスホロ−ｃＪｕｎ染色によって測定して高レベルの活性化ＪＮＫ活性を有していた（図８Ｄ）。
【０２４４】
結論として、ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノサイト標的細胞における状況特異的遺伝子スクリーニングは、遺伝子レベル上、ＪＮＫ経路の強力ながん遺伝子活性を明白に証明するものであった。確立された黒色腫におけるＪＮＫシグナル伝達の遺伝子阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍原性を損なうものであった。機構的に、疫学的および分子上のデータ、ならびに機能上のデータは、ＪＮＫ活性化が、黒色腫発生においてＵＶ曝露によって優勢に媒介される論文を支持している。ＢＲＡＦＶ６００Ｅのバックグラウンドにおけるその形質転換活性とは対照的に、ＢＲＡＦ野生型メラノサイトにおけるＵＶによるＪＮＫ活性化がアポトーシスを誘発するという実証は、標的療法の臨床開発における遺伝的状況の重要性を強化するものである。
【０２４５】
材料と方法
細胞系およびプラスミド：ヒト細胞系は全て、１０％熱不活化したＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。ｈＴＥＲＴ／ＣＤＫ４（Ｒ２４Ｃ）／ｐ５３ＤＤ／ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）メラノサイト（ＨＭＥＬ）は先に記載されている。マウスメラノサイトを、標準のプロトコールに従ってＩｎｋ４Ａ／Ａｒｆ−／−マウスから単離し、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｎＭ  ＴＰＡ（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎＭコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。マウスメラノサイトを、加湿雰囲気中３７℃および１０％ＣＯ２で増殖させた。初代マウスＩｎｋ４Ａ／Ａｒｆ−／−、ＰＴＥＮ−／−アストロサイトを標準のプロトコールに従って５日齢の仔から単離し、１０％熱不活化したＦＢＳを補ったＤＭＥＭ培地中に維持した。
【０２４６】
集中的なヒトがんキナーゼｃＤＮＡライブラリー：１１０のヒトキナーゼを代表するＯＲＦを、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ｔｈｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）、またはＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＯＲＦを、ユニバーサルなｐＤＯＮＯＲ２２３エントリーベクター中にクローニングし、次いで、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴ中に移した。全てのクローンの配列および発現は確認されていた。
【０２４７】
ヒトがんキナーゼｃＤＮＡライブラリーとして、以下の遺伝子が挙げられた：
【０２４８】
【数１４−１】
2013517772.tif 000098
【０２４９】
【数１４−２】
2013517772.tif 000099
【０２５０】
【数１４−３】
2013517772.tif 000100
ｉｎ  ｖｉｖｏ機能的遺伝子スクリーニング：
レンチウイルスを、２９３Ｔ細胞に、個々のベクターバックボーンおよび引き続きウイルス上清液を収集するための標準のウイルスパッケージング系を同時トランスフェクトすることによって調製した。次いで、ウイルス上清を無作為にプールして、高力価のレンチウイルスストックのプールを８個生成した。ＨＭＥＬ細胞に、ポリブレン（Ｃｏｍｐａｎｙ）８ｕｇ／ｍｌの存在下、ＧＦＰ対照レンチウイルスまたは各々の代表的なレンチウイルスのプールのいずれかを形質導入した。感染した細胞を拡大し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と１：１混合し、次いで両側腹上、１部位あたり１×１０６細胞でメスヌード動物（Ｔａｃｏｎｉｃ）中に皮下的に埋め込んだ。１次ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ−／−、ＰＴＥＭ−／−マウスアストロサイトに、ポリブレン（Ｃｏｍｐａｎｙ）８ｕｇ／ｍｌの存在下、ＧＦＰ対照レンチウイルスまたは各々の代表的なレンチウイルスのプールのいずれかを形質導入した。感染させた細胞を拡大し、ＳＣＩＤメスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の脳実質中に埋め込んだ。簡潔に述べると、ＳＣＩＤマウスを麻酔し、Ｚ軸を装備した定位脳固定装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）中に配置した。歯科用ドリルを用いて頭蓋の十字縫合の０．５ｍｍ前側および３．０ｍｍ外側に小さな孔をあけた。ハンクス緩衝塩溶液中２万個の細胞を、先の平らな３０ゲージ針つき１０ｕｌＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、脳の表面下２ｍｍの右尾状核中に注射した。９ｍｍＡｕｔｏｃｌｉｐ  Ａｐｐｌｉｅｒを用いて頭皮を閉じた。皮下（ｓｕｂＱ）腫瘍または神経学的欠損の発生に対して動物を毎日追跡した。動物を屠殺し、腫瘍を収集し、ゲノムＤＮＡを調製し、各腫瘍中で発現したキナーゼを、プラスミド特異的ＣＭＶおよびＶ５プライマーを用いたＰＣＲ配列決定を用いて同定した。各キナーゼの発現を、ウエスタンブロット分析によってさらに確認した。次いで、各腫瘍中で発現されたキナーゼを、各キナーゼを個々に発現する安定なＨＭＥＬまたはマウスアストロサイト系統を生成する２次確認スクリーニングに確保した。細胞を再び拡大し、次いでメスヌード動物またはＳＣＩＤ動物に埋め込んだ。マウスは全て収容し、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物実験のための施設のケアおよび使用の委員会によって認可されたプロトコールに従って処置した。
【０２５１】
足場非依存性増殖：
６ウエルプレート上３個ずつ軟寒天アッセイを行った。各ウエルに対して、１×１０４細胞を、ＲＰＭＩプラス１０％ＦＢＳ中０．４％ＳｅａＫｅｍＬＥアガロース（Ｆｉｓｈｅｒ）を含む細胞増殖培地中、完全に混合し、その後、ＲＰＭＩおよび１０％ＦＢＳ中０．６５％アガロースと調製した底のアガロース上に塗抹した。各ウエルを固形化させ、引き続き１ｍｌ  ＲＰＭＩおよび１０％ＦＢＳ中に覆い、これを４日毎に交換した。必要に応じて、アガロースおよび増殖培地に、最終濃度２ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンを加えた。コロニーを０．０５％（ｗ／ｖ）ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ）で染色し、平面スキャナーを用いて１インチあたり１２００ドット（ｄ．ｐ．ｉ）でスキャンし、計数した。
【０２５２】
免疫組織化学染色：
黒色腫組織マイクロアレイ（Ｂｉｏｍａｘ）を、確立されたプロトコールを用いてｐ−ｃＪＵＮ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で染色した。
【０２５３】
異種移植片試験：
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に対して、誘導性のＪＮＫ２  ｓｈＲＮＡを安定して発現する黒色腫異種移植片細胞を、両側腹上１部位あたり１×１０６細胞で、メスヌード動物（Ｔａｃｏｎｉｃ）中に皮下的に埋め込んだ。腫瘍の増殖を分析するために、マウスに通常のＨ２Ｏ、または２ｍｇ／ｍｌドキシサイクリンおよび２％ショ糖を含むＨ２Ｏを与えた。ＪＮＫ発現が腫瘍の維持に必要とされるか否かを決定するために、細胞を埋め込み、腫瘍をおよそ２００ｍｍ３に到達させ、その後動物を、Ｈ２Ｏ、または２ｍｇ／ｍｌドキシサイクリンおよび２％ショ糖を含むＨ２Ｏで処置するための別々のコホートに無作為化した。ドキシサイクリン投与後に腫瘍体積を測定した。ノギスで２方向を測定し、腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２と公式化することによって腫瘍体積を決定した。増殖曲線およびエンドポイント散布図を、各群に対する腫瘍体積としてプロットした。腫瘍増殖阻害のパーセント値を、（１−（Ｔ／Ｎ））×１００として決定した（Ｔは処置群の腫瘍体積における変化の平均であり、Ｎはアッセイエンドポイント時の対照群の腫瘍体積における変化の平均である）。Ｐｒｉｓｍ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて両側のｔ検定計算を行った。
【０２５４】
ＵＶ照射：
ＵＶＢで処理する前に、培地を除去し、確保した。培養物を温ＰＢＳで１回洗浄し、次いで４つのＵＶＢ電球（ＲＰＲ−３０００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）のパネル下に覆いをせずに配置した（ＵＶＢ範囲におけるピークエミッタンス、３１１ｎｍ）。ＵＶ照射量を、ＳＥＬ２４０／ＵＶＢ検出器（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を装着したＰｈｏｔｏｌｉｇｈｔ  ＩＬ１４００Ａ放射計でモニタリングした。照射後、確保した培地を戻し、培養物を示された期間インキュベートした。偽処理した培養物を、ＵＶＢに曝露しなかった以外、厳密に同じ方法で扱った。
【０２５５】
トランスジェニックマウスの維持およびＵＶ処理：
ＢＲＡＦＶ６００Ｅトランスジェニックマウス（遺伝子型Ｔｙｒ−ｒｔＴＡ／Ｔｅｔ−ＢＲＡＦＶ６００ＥＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−を有する）は以前に記載されている（Ｊｅｏｎｇ）。以前に記載されている通り（ＳｈａｒｐｌｅｓｓおよびＣｈｉｎ）、ＵＶ処理に対して新生仔マウス（１日齢から３日齢の仔）を、ＦＳ２０Ｔ１２ＵＶランプ（ＵＶＢ範囲におけるピークエミッタンス、３１０ｎｍ）を用いることによって、単一線量の全身ＵＶ照射（９ｋｊ／Ｍ２）で処置した。
【０２５６】
ウエスタンイムノブロット分析：
トリプシン処理によって細胞を回収し、ＰＢＳ中１回洗浄し、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ）および１Ｘホスファターゼ阻害物質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補ったＲＩＰＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸Ｎａ）中に再懸濁した。遠心分離によって抽出物を透明にした後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。同量のタンパク質を含む試料を、５％β−メルカプトエタノールを含む４ｘＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブランに写し、ｃＪＵＮ、ｐ−ｃＪＵＮ、ＪＮＫ、ｐ−ＪＮＫ、ＨＳＰ９０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体でプローブした。
【０２５７】
ＪＮＫキナーゼアッセイ：
ＷＴおよび変異体のＪＮＫキナーゼを、抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＭＥＬ細胞から免疫沈降した。非放射性のＪＮＫキナーゼアッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、製造元の指示に従ってキナーゼ活性を測定した。ＭＡＰＫ４／７活性の測定には、免疫沈降したキナーゼを、不活性のＪＮＫ２（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に最初にインキュベートした。
【０２５８】
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書に提供する本発明の定義の範囲内で提供されることが理解される。したがって、上記の実施例は説明を意図するものであって、本発明を限定しようとするものではない。本発明を詳細に、その特定の実施形態を参照して記載してきたが、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱せずに本発明に対して様々な変更および改変を行うことができることは明らかであろう。したがって、例えば、当業者であれば、ルーチンの実験だけを用いて、本明細書に記載する特定の物質および手順に対する多くの同等物を認識し、または確かめることができるであろう。このような同等物は本発明の範囲内であるとみなされ、以下の特許請求の範囲によって網羅されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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