(57)【要約】本発明は、癌（特に血液悪性疾患、特にＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）が含まれる）に関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ならびに癌の処置および管理におけるその評価および調整に関する。本発明は、ｍｉＲＮＡの調整による癌（特にＴ−ＡＬＬ）の診断および処置のための方法および組成物、アンタゴニスト（ａｎｔａｇｉｓｔ）の単離および選択のためのアッセイにおける処置に対する応答の予想および評価のためのｍｉＲＮＡおよびそのアンタゴニスト（特にアンタゴミア）の使用、ならびに癌の処置および管理のための組成物としての使用に関する。ｍｉＲＮＡ（特に、１つ以上のｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ２６、ｍｉＲ９２、ｍｉＲ１４８、およびｍｉＲ２２３）のアンタゴニスト／アンタゴミアを使用した癌（特にＴ−ＡＬＬ）の処置または緩和のための方法および組成物を提供する。
2013520197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液学的悪性疾患の処置または予防のための化合物の同定するための方法であって、該化合物は、該悪性疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現または活性をアンタゴナイズするかまたは阻害し、該方法は：
（ａ）化合物と、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞とを接触させる工程、および
（ｂ）１つ以上の該ｍｉＲＮＡの発現または活性を決定する工程
を包含し、
ここで、該ｍｉＲＮＡの発現または活性が阻害または軽減される、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を、該ｍｉＲＮＡの量、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的である腫瘍抑制遺伝子の活性もしくは発現、または該ｍｉＲＮＡを発現する白血病細胞もしくはリンパ腫細胞の成長もしくは生存度を決定することによって評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的である腫瘍抑制遺伝子が、Ｐｔｅｎ、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１、Ｐｈｆ６、Ｉｋｚｆ１、Ｎｆ１、およびＦｂｘｗ７から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記白血病細胞または前記リンパ腫細胞がＴ−ＡＬＬ患者の細胞サンプルまたはＴ−ＡＬＬ細胞株である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物における血液学的悪性疾患を検出または評価するための方法であって、該方法は：
（ａ）該哺乳動物由来の血液または血球のサンプルを得る工程、
（ｂ）ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｃ）該１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、該１つ以上のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１つの発現または活性が該参照サンプルと比較して増加する、方法。
【請求項６】
２つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、該発現または活性が増加する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記血液学的悪性疾患が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物における癌を検出または評価するための方法であって、該方法は：
（ｄ）該哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
（ｅ）該サンプル中のｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｆ）該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、該ｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２つの発現または活性が、該参照サンプルと比較して増加する、方法。
【請求項９】
３つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、該発現または活性が増加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、胃癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物における癌をモニタリングするか癌治療に対する応答を評価するための方法であって、該方法は：
（ｇ）該哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
（ｈ）該サンプル中のｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｉ）該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、該ｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２つの発現または活性が、該参照サンプルと比較して変化する、方法。
【請求項１２】
３つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、該発現または活性が変化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、胃癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
血液学的悪性疾患の処置に使用するための組成物であって、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに相補的な１つ以上のアンタゴミアを含む、組成物。
【請求項１５】
血液学的悪性疾患の処置に使用するための、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに実質的に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１６】
前記血液学的悪性疾患が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫から選択される、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
癌の処置に使用するための組成物であって、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも２つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１８】
前記アンタゴミアまたは前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１４、１５、または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ２６、およびｍｉＲ−９２から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも２つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４、１５、または１７に記載の組成物。
【請求項２０】
抗癌剤または治療薬、有糸分裂阻害剤、アポトーシス剤もしくは抗体、または免疫調節剤から選択される１つ以上のさらなる化合物をさらに含む、請求項１４、１５、または１７に記載の組成物。
【請求項２１】
治療有効量の、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに実質的に相補的なアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチド、ならびに薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
Ｐｔｅｎ、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１、Ｐｈｆ６、Ｉｋｚｆ１、Ｎｆ１、およびＦｂｘｗ７から選択される腫瘍抑制遺伝子の発現を増強または増加させる方法であって、該腫瘍抑制遺伝子のうちの１つ以上を発現することができる細胞と、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに実質的に相補的な１つ以上のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、方法。
【請求項２３】
細胞と、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ２６、およびｍｉＲ−９２から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに実質的に相補的な少なくとも２つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｍｉＲ１７〜９２クラスターが増幅または過剰発現される癌を処置または緩和する方法であって、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を阻害する１つ以上の化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２５】
ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２６、およびｍｉＲ−９２を阻害する１つ以上の化合物を投与する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌（血液悪性疾患、特にＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）が含まれる）の診断、管理、および処置、ならびに処置に対する応答の予測および評価に関する。本発明は、癌（血液学的悪性疾患（Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）など）が含まれる）に関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ならびに癌の処置および管理におけるその評価および調整に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌（血液悪性疾患が含まれる）の処置ならびに特定の処置レジメンに対する癌および癌細胞の応答の予測および評価への従来のアプローチは、存在する腫瘍型の適切な分類に依る。適切な分類は、今度は、臨床的特徴、腫瘍細胞の形態学、腫瘍細胞の免疫表現型に主に依存し、より少ない程度に、腫瘍細胞の染色体異常に依存する。しかし、所与の腫瘍型の範囲内でさえ、特定の処置レジメンに対する応答は、しばしば、非常に多様であり、分子レベルでの分析により、従来の分類スキームによって定義された腫瘍型がしばしば非常に不均一であることが明らかである。
【０００３】
したがって、腫瘍（血液悪性疾患が含まれる）を分類するための最近の試みは、特定の腫瘍型の成長または病理学を駆動する特異的遺伝子異常または分子誘発因子の同定に集中している。次いで、かかる遺伝子異常または分子誘発因子は、疾患のマーカーおよび／または治療の標的として役立ち得る。全てではないがほとんどのヒト悪性疾患におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の異常な発現が関連していると見なされる証拠が増大しており、これらが実際に腫瘍抑制因子または癌遺伝子のいずれか／両方として作用することができ、共通の経路を有し得る多数の癌または特定のｍｉＲＮＡイニシエーターまたはモジュレーターを有する特異的癌で効果があり得ることを示唆している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、正常な発生、分化、および疾患（癌が含まれる）に関与する生物学的過程の遍在性制御因子である。これらは、転写レベルおよび翻訳レベルでの遺伝子発現の調節によって作用する（Ｂａｒｔｅｌら、（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７）。ｍｉＲＮＡは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいて発達欠損を引き起こす変異の分析によって最初に発見され（Ｌｅｅ  Ｒ．Ｃ．ら、（１９９３）Ｃｅｌｌ，７５，８４３−８５４）、ｍｉＲＮＡ発現の変化がヒト癌（白血病が含まれる）でさらに証明されている（Ｃａｌｉｎ  Ｇ．Ａ．ら、（２００４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１：１  １７５５５−１１７６０；ＨａｙａｓｈｉｔａＹら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：９６２８−９６３２；Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ．Ｍ．ら、（２００５）Ｃｅｌｌ  １２０：６３５−６４７；Ｌｕ  Ｊら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３４−８３８；Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ  Ｌら、（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：４３９９−４４０５）。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、相補的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的配列への多タンパク質複合体のハイブリッド形成および動員による配列特異的様式で遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡ機能を、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）（個別のｍｉＲＮＡに相補的な化学修飾したオリゴヌクレオチド）によって一過性にアンタゴナイズすることができる。
【０００５】
単一のｍｉＲＮＡは数百のメッセンジャーＲＮＡをターゲティングすることができ、それにより、その各遺伝子由来のタンパク質産物を調整することができる（Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ（２００９）Ｃｅｌｌ  １３６：２１５−２３３）。したがって、単一または特定のｍｉＲＮＡ組は、単一または相関する細胞事象（例えば、細胞増殖）と調和する少数の重要なタンパク質の産生の調節によって個別の生理学的過程を調節することができる（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄら、（２００８）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：８３９−８４５；Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ（２００９）Ｃｅｌｌ  １３６：２１５−２３３）。
【０００６】
ｍｉＲＮＡの１７〜９２クラスターが造血系癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）中で高発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリンパ球増殖およびｃ−Ｍｙｃ誘導白血病誘発／リンパ腫誘発を増強する（Ｈｅら、２００５）（Ｘｉａｏら、２００８）。１７〜９２クラスターおよびそのパラログも多様な固形腫瘍（乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺、胃由来の腫瘍が含まれる）で発現する（Ｖｏｌｉｎｉａら、２００６）（Ｐｅｔｒｏｃｃａら、２００８）。しかし、これまでのところ、個別のｍｉＲＮＡ（特に、ポリシストロニック転写物（１７〜９２クラスターなど）上にコードされるもの）によって調節される標的の機能はほとんど知られていない。
【０００７】
多数のｍｉＲＮＡが公知であり、且つ同定されているにも関わらず（公知のｍｉＲＮＡは、公開データベース（ｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：１２９−１３８）が含まれる）による配列の情報および特徴を有する名称によってアクセス可能であり、疾患の開始および／または進行におけるその特異的役割ならびに治療のための標的または疾患（癌が含まれる）のモジュレーターとしてのその特定の価値の大部分が依然として明確に定義されていない。したがって、癌（特定の癌が含まれる）における個別または集合的なｍｉＲＮＡの関連についての具体的な解明、疾患の診断および管理、ならびに癌の個別または集合的なｍｉＲＮＡに対する特定の治療の開発が当該分野で依然として必要であることが明らかなはずである。
【０００８】
本明細書中の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の先行技術であることを承認すると解釈されないものとする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖｉｓｏｎｅ  ＲおよびＣｒｏｃｅ  ＣＭ、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００９）１７４（４）：１１３１〜１１３８
【非特許文献２】Ｇａｒｚｏｎ  Ｒら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ（２００９）６０：１６７〜１７９
【非特許文献３】Ｌｕｉ  Ｗ−Ｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００７）６７（１３）：６０３１〜６０４３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
その最も広い態様では、本発明は、癌（血液悪性疾患が含まれる）の診断および処置ならびに処置に対する応答の予測および評価のための方法および組成物に及ぶ。特異的ｍｉＲＮＡを、癌（特に、血液学的悪性疾患、特に、白血病およびリンパ腫）の病原における関与因子として提供し、疾患の予防、処置、または緩和における有効な標的として証明されている。
【００１１】
本明細書中に示したデータは、ｍｉＲＮＡ（特にｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３）が癌（Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ））におけるｍｉＲＮＡ発現の大部分を占めることを証明している。まとめると、新規のｍｉＲＮＡ組（ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３）は、種々の癌の病原に関与する腫瘍抑制遺伝子の共通する組（ＰＴＥＮ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＮＦ１、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、およびＰＨＦ６が含まれる）の活性を下方制御する。これらのｍｉＲＮＡは、現在、その発現に及ぼす重複し且つ協同的な影響によって腫瘍抑制遺伝子を（特に、Ｔ−ＡＬＬにおいて）調整することが証明されており、動物モデルにおいてＴ−ＡＬＬを促進することができる。
【００１２】
本発明によれば、１つ以上のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３）の発現を、血液悪性疾患（Ｔ−ＡＬＬが含まれる）の診断、特定の治療レジメンに対する応答の予想、および／または治療に対する応答のモニタリングのために使用することができる。ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３（特にｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−９２、および／またはｍｉＲ−２２３）のアンタゴニスト／アンタゴミアは、単独または特に組み合わせて、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３の発現の変化または過剰発現を示す癌（血液悪性疾患および任意の癌または状態が含まれる）に対する候補治療薬である。
【００１３】
本発明は、特異的ｍｉＲＮＡ（特に、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、または全て）の特異的阻害のための方法および組成物を介した癌の調整方法に関する。本発明の組成物および方法は、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３の発現および／または活性を阻害する。特に、本発明は、１つ以上のｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３の特異的阻害のための遺伝子アプローチおよび核酸を提供する。１つ以上の本発明のｍｉＲＮＡの特異的阻害の際に発癌および白血病誘発が破壊され、腫瘍細胞または癌細胞の増殖が阻害されることを本明細書中に証明する。
【００１４】
本発明は、ｍｉＲＮＡ（特に、１つ以上のｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３が含まれる）の発現および活性を特異的に阻害または遮断するオリゴヌクレオチドおよび核酸を提供する。ｍｉＲＮＡのアンタゴミアを本明細書中に提供して評価し、抗発癌活性および抗白血病誘発活性が証明された。本発明の１つの態様では、１つ以上のｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３に相補的な核酸のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび発現は、１つ以上のｍｉＲの発現および／または活性を特異的に阻害し、ｍｉＲＮＡ媒介性の腫瘍発生および癌細胞増殖を遮断する。
【００１５】
ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに相補的な１つ以上のアンタゴミアを含む血液学的悪性疾患の処置用の組成物を本明細書中に提供する。本発明は、さらに、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに実質的に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む血液学的悪性疾患の処置用の組成物を提供する。本発明の１つの態様では、血液学的悪性疾患は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫から選択される。特定の態様では、悪性疾患は、白血病、特にＴ−ＡＬＬである。
【００１６】
本発明は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも２つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを含む癌の処置用の組成物を含む。組成物は、特に、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ２６、およびｍｉＲ−９２から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも２つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される本明細書中に提供した少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアを含む。アンタゴニストまたはアンタゴミアは、表１に示すｍｉＲＮＡ標的配列に実質的に相補的であり得る。特に、本発明のアンタゴミア、アンタゴニスト、またはオリゴヌクレオチドは、表１に示す配列番号１〜１０の群から選択されるヌクレオチドまたは１つ以上の配列番号１〜１０のｍｉＲＮＡ配列の発現または活性を阻害するのに十分なそのヌクレオチドのサブセットに実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、表２に示すか配列番号１１〜１５に示す配列群から選択される１つ以上の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアを含む。
【００１８】
本発明の組成物の１つの態様では、１つ以上のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の態様では、本発明のアンタゴミア、核酸、およびオリゴヌクレオチドを、核酸の化学的骨格の操作または他の部分の共有結合または非共有結合のいずれかによって修飾することができる。各場合または任意の場合では、かかる操作または結合は、安定性、細胞、組織、または器官の取り込みを修飾するか、そうでなければ、核酸およびオリゴヌクレオチドの有効性を増強するのに役立ち得る。本発明のさらなる態様では、アンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの取り込み、安定性を増強するか、ターゲティングするのに役立ち得る他の分子（ポリペプチド、炭水化物、脂質または脂質様部分、リガンド、化学物質または化合物が含まれるが、これらに限定されない）に共有結合させることができる。
【００１９】
本発明の組成物は、さらに、抗癌剤または治療薬、有糸分裂阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、アポトーシス剤（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）または抗体、または免疫調節薬から選択される１つ以上のさらなる化合物を含むことができる。本発明の組成物を、単独または他の処置、治療薬、または薬剤と組み合わせて、処置すべき状態に応じて同時または逐次的に投与することができる。さらに、本発明は、１つ以上の本明細書中に記載の特異的ｍｉＲアンタゴニスト／アンタゴミアおよび他の薬剤または治療薬（抗癌剤または治療薬、有糸分裂阻害剤、アポトーシス剤または抗体、または免疫調節薬など）を含む組成物を意図し、且つ含む。より一般的には、これらの抗癌剤は、チロシンキナーゼインヒビターまたはリン酸化カスケードインヒビター、翻訳後調節因子、細胞成長インヒビターまたは細胞分裂インヒビター（例えば、有糸分裂阻害薬）、インヒビター、またはシグナル伝達インヒビターであり得る。他の処置または治療は、適切な用量の鎮痛薬（非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、またはケトプロフェン）またはアヘン薬（モルヒネなど）など）、または制吐薬の投与を含むことができる。さらに、組成物を、免疫応答を刺激し、癌細胞または腫瘍を減少または消失させる免疫調節薬（インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または他の成長因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、またはホルモン（デキサメタゾンなど）など）と共に投与することができる。組成物を、抗腫瘍抗原抗体と共に投与することもできる。
【００２０】
本発明は、治療有効量のｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに実質的に相補的なアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は、一定の治療方法に関し、この治療方法は、ｍｉＲＮＡの活性およびその調整（特に、発癌または白血病誘発に関連する１つ以上のｍｉＲＮＡの活性および／または発現の阻害）に基づくであろう。例えば、薬物またはｍｉＲＮＡへの他の結合パートナー（アンタゴミア（ａｎａｇｏｍｉｒ）またはオリゴヌクレオチドなど）を、例えば、ｍｉＲＮＡ発現または活性を阻害する（例えば、抗癌治療を増強する）ために投与することができる。
【００２２】
ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から特に選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現を阻害するための方法を提供する。特に、１つ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞を有効量の本発明のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性が阻害される工程を含む、本発明で関連することが示された１つ以上のｍｉＲＮＡの発現を阻害する方法を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに、ｍｉＲＮＡ（特に、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３）の発現または活性を阻害する治療有効量の化合物または薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における本発明のｍｉＲＮＡの発現またはそのｍｉＲＮＡの増大した発現に関連する状態（癌または他の過剰増殖障害など）を処置または予防する方法を含む。この方法の１つの態様では、この化合物または薬剤は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３の１つ以上のｍｉＲＮＡと特異的にハイブリッド形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアである。
【００２４】
さらなる態様では、ｍｉＲＮＡ（特に、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３）の発現または活性を阻害する治療有効量の化合物または薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における癌を処置するか、その進行を阻害する方法を含む。本発明の方法に感受性を示す癌には、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、および前立腺癌の群から選択される癌が含まれる。特定の態様では、癌は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫から特に選択される血液学的悪性疾患である。特定の態様では、癌は、白血病（特に、Ｔ−ＡＬＬ）である。
【００２５】
本発明は、Ｐｔｅｎ、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１、Ｐｈｆ６、Ｉｋｚｆ１、Ｎｆ１、およびＦｂｘｗ７から選択される腫瘍抑制遺伝子の発現を増強または増大させる方法を提供し、この方法は、上記腫瘍抑制遺伝子のうちの１つ以上を発現することができる細胞をｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに実質的に相補的な１つ以上のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む。１つの態様では、上記方法は、細胞をｍｉＲ−１９、ｍｉＲ２６、およびｍｉＲ−９２から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに実質的に相補的な少なくとも２つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む。
【００２６】
本発明は、さらに、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を阻害する１つ以上の化合物を投与する工程を含む、ｍｉＲ１７〜９２クラスターが増幅または過剰発現される癌を処置または緩和する方法を提供する。１つの態様では、方法は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２６、およびｍｉＲ−９２を阻害する１つ以上の化合物を投与することを含む。
【００２７】
本発明の診断上および医学上の有用性は、哺乳動物（特に、ヒト患者）における癌、悪性疾患、リンパ腫、および／または白血病をスクリーニングするか評価するためのアッセイにおける本発明の使用に及ぶ。したがって、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を評価する、癌のモニタリング方法および／または処置に対する応答の評価方法を提供する。１つのかかる態様では、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される癌に関連する少なくとも２つのｍｉＲＮＡの活性を決定および評価し、癌または癌処置に対する応答を分子レベルなどでモニタリングまたは評価する。例えば、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現および／または活性の減少は、予後の改善または癌処置もしくは治療薬に対する正の応答に関連し得る。本発明は、さらに、ｍｉＲＮＡの存在程度の定量分析またはその活性を模倣または遮断することができる薬物または他の薬剤の同定のための試験キットの形態で調製することができるアッセイ系を含む。
【００２８】
本発明の１つの態様では、哺乳動物における癌をモニタリングするための、または癌治療に対する応答を評価するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）上記哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
（ｂ）上記サンプル中のｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｃ）少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を、参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性が参照サンプルと比較して変化する。本方法の１つの態様では、３つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、発現または活性が変化する。さらなる態様では、癌は、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される。特定の態様では、癌は血液学的悪性疾患である。
【００２９】
さらに、癌に関連する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現を阻害する化合物または薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡを発現する細胞をインキュベートする工程、および
（ｂ）候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される上記ｍｉＲＮＡの発現または活性を検出または測定する工程
を含み、それにより、
上記候補化合物または薬剤の存在下  対  上記候補化合物または薬剤の非存在下でのｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される上記ｍｉＲＮＡの発現の減少が、上記化合物または薬剤がｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡの発現を阻害することを示す。
【００３０】
したがって、本発明は、血液学的悪性疾患の処置または予防のための化合物を同定するための方法を提供し、ここで、上記化合物が上記悪性疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現または活性をアンタゴナイズするかまたは阻害し、上記方法は：
（ａ）化合物をｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞と接触させる工程、および
（ｂ）上記ｍｉＲＮＡのうちの１つ以上の発現または活性を決定する工程
を含み、
ここで、上記ｍｉＲＮＡの発現または活性が阻害されるか減少する。
【００３１】
方法の１つの態様では、上記１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を、上記ｍｉＲＮＡの量、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的である腫瘍抑制遺伝子の活性または発現、または上記ｍｉＲＮＡを発現する白血病細胞またはリンパ腫細胞の成長または生存度の決定によって評価する。方法のさらなる態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的である腫瘍抑制遺伝子は、Ｐｔｅｎ、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１、Ｐｈｆ６、Ｉｋｚｆ１、Ｎｆ１、およびＦｂｘｗ７から選択される。さらなる態様では、白血病細胞またはリンパ腫細胞がＴ−ＡＬＬ患者の細胞サンプルまたはＴ−ＡＬＬ細胞株である方法を提供する。
【００３２】
本発明は、哺乳動物における血液学的悪性疾患を検出または評価するための方法を含み、この方法は：
（ａ）上記哺乳動物から血液または血球のサンプルを得る工程、
（ｂ）ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｃ）１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程を含み、
１つ以上のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１つの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する。
【００３３】
本発明は、哺乳動物における癌を検出または評価するための方法を含み、この方法は：
（ａ）上記哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
（ｂ）上記サンプル中のｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｃ）少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
上記ｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２つの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する。
【００３４】
上記方法の１つの態様では、２つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、発現または活性が増加する。上記方法の１つの態様では、３つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、発現または活性が増加する。さらなる態様では、癌は、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される。特定の態様では、癌は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫から特に選択される血液学的悪性疾患である。特定の態様では、癌は、白血病（特に、Ｔ−ＡＬＬ）である。
【００３５】
本発明のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを、検出可能な標識で標識することができる。特定の態様では、標識を、酵素、リガンド、蛍光を発する化学物質、および放射性元素から選択することができる。放射性標識（同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅなど）を使用する場合、公知の現在利用可能な計数手順を使用することができる。標識が酵素である場合、当該分野で公知の現在使用されている比色分析技術、分光光度的技術、蛍光分光光度的技術、電流測定技術、または気体定量技術のうちのいずれかによって検出することができる。
【００３６】
他の目的および利点が、以下の例示的な図面を参照して進行する以下の説明の再検討から当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ｍｉＲ−１９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン依存性生存を増強する。（ａ）１７〜９２クラスター（「オンコミア−１」が含まれる）およびそのパラログのゲノム構成。同色で示したｍｉＲＮＡは、共通のシード配列を有する。（ｂ）不死化ＦＬ５−１２リンパ球のサイトカイン依存性生存についての競合アッセイの略図。（ｃ）ｍｉＲ−１９で形質導入したＦＬ５−１２細胞がＩＬ３枯渇の際に拡大し、一方、空のベクターまたは他の１７〜９２ｍｉＲＮＡで形質導入した集団では拡大しないことを示すＦＡＣＳプロフィール。
【図２】ｍｉＲ−１９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリンパ球生存を増強する。（ａ）１日目の細胞数に対して正規化した空のベクター（ベクター）またはｍｉＲ−１９（ｍｉＲ−１９）を発現する完全培地中のＦＬ５−１２細胞の成長曲線（ｐ＜０．００９）。（ｂ）放出２４時間後の同調ＦＬ５−１２細胞におけるＳ期分画（ベクター：２４％±３％；ｍｉＲ−１９：２４．５％±０．５；ｐ＝０．８）。（ｃ）ベクターまたはｍｉＲ−１９で形質導入し、ＩＬ３を除去した４８時間後のＦＬ５−１２細胞の生存率（ベクター：平均４９％±１％；ｍｉＲ−１９：８２％±１．５％；ｐ＜６ｅｘｐ−０６）。（ｄ）ＦＬ５−１２／ｍｉＲ−１９と比較したＦＬ５−１２／ベクター細胞の細胞生存度を測定した代表的なＦＡＣＳプロフィール。ＩＬ３枯渇後の生細胞の比率を示す。
【図３】ｍｉＲ−１９は、Ｔ−ＡＬＬにおけるヒト癌遺伝子および新規の転座の標的である。（ａ）一連のヒトリンパ性悪性疾患（（Ｔ−／Ｂ−ＡＬＬ）ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病；（ＦＬ）濾胞性リンパ腫；（ＤＬＢＣＬ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；（ＢＬ）バーキットリンパ腫；（ＨＤ）ホジキン病；（扁桃腺）反応性扁桃腺由来のリンパ球；（Ｆ）ＦＬ５−１２細胞（親（黒色バー）またはｍｉＲ−１９での形質導入（赤色バー）））におけるｍｉＲ−１９発現のｑＲＴ−ＰＣＲ測定（示した値は平均±ＳＤである）。（ｂ）１３ｑ１４においてＲＢ１プローブ（緑色）ならびに１３ｑ３２において１７〜９２遺伝子座が重複するゲノムクローンＲＰ１１−９７Ｐ７およびＲＰ１１−９８０Ｄ６（赤色）を使用したｔ（１３；１４）（ｑ３２；ｑ１１）の二色ＦＩＳＨ分析。（ｃ）ＦＩＳＨの結果の図的表現。（ｄ）ノッチ誘導性Ｔ−ＡＬＬのマウスモデル。（ｅ）ノッチ−ＩＣＮ＋ｍｉＲ−１９（赤色；ｎ＝６）またはノッチ−ＩＣＮ＋ベクター（黒色；ｎ＝９）での造血前駆細胞（ＨＰＣ）移植後の無白血病生存のカプラン・マイヤー分析。（ｆ）〜（ｈ）ノッチ／ｍｉＲ−１９誘導性ＡＬＬの代表的な顕微鏡写真。（ｆ）血液塗抹標本上の白血病性芽球。（ｇ）ｍｉＲ−１９／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現白血病細胞による骨髄の消失。（ｈ）脾腫およびリンパ腫。ノッチ１誘導性白血病の病理的外観は同一である（示さず）。
【図４】Ｔ−ＡＬＬにおける新規のｔ（１３；１４）（ｑ３２；ｑ１１）転座の細胞遺伝学的特徴。１７〜９２クラスターに局在するＴ−ＡＬＬ癌遺伝子の存在を強調したより高解像度の二色ＦＩＳＨ分析（図３と同一）。１３ｑ１４においてＲＢ１プローブ（緑色）ならびに１３ｑ３２において１７〜９２遺伝子座が重複するゲノムクローンＲＰ１１−９７Ｐ７およびＲＰ１１−９８０Ｄ６（赤色）を使用した分析。プローブＲＰ１１−９７Ｐ７は、１３番染色体中のクローンの半分および誘導１４番染色体に対してマッピングした他の半分を保持する分割シグナルを示す。プローブＲ１１−９８０Ｄ６は、１３番染色体中に幾らかのシグナルが保持され、誘導１４番染色体にマッピングした大部分のクローンを伴う。
【図５】ｔ（９；１４）ノッチ１転写物の分子特徴付け。（ａ）全長ノッチ１転写物に対応するノッチ１遺伝子の構造およびタンパク質ドメイン。（ｂ）白血病リンパ芽球中で発現したノッチ１短縮転写物の５’ＲＡＣＥ配列。キメラノッチ１−１４番染色体配列は、ノッチ１エクソン２８中に存在するブレイクポイントに対して遠位のノッチ１配列を含む。このｍＲＮＡの第１のＡＴＧコドンは、ノッチ１エクソン２９中に存在する。ノッチ１エクソン２９中に存在する５’ＲＡＣＥプライマーに対応する配列を、太字で示す。（ｃ）ｔ（９；１４）によって生成された短縮ノッチ１ｍＲＮＡの構造。
【図６】ｍｉＲ−１９／ノッチ−１誘導性Ｔ−ＡＬＬの特徴付け。（ａ）低倍率（１０倍）での白血病動物由来の血液塗抹標本の代表的な顕微鏡写真。（ｂ）高倍率（４０倍）の白血病性芽球。（ｃ）未染色の骨髄塗抹標本。（ｄ）ＧＦＰ蛍光により、白血病細胞による骨髄の広範な浸潤が同定される。（ｅ）表示の表面マーカーに対するＰＥ標識抗体を使用したＧＦＰ陽性ＡＬＬ細胞の免疫表現型検査。ノッチ１形質導入ＨＰＣで発症した白血病は、同一の特徴（示さず）を示したが、潜伏期がより長かった。
【図７】ｍｉＲ−１９はｃ−Ｍｙｃと協力し、ΕμΜｙｃリンパ腫におけるｐ５３依存性アポトーシスを遮断する。（ａ）ΕμΜｙｃ／ｐ５３＋／−ＨＰＣ由来のｍｉＲ−１９発現リンパ腫を生成するための実験デザインの略図。（ｂ）ｍｉＲ−１９発現ＨＰＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭｙｃ駆動リンパ腫誘発中に急速に富化する。（ｃ）ΕμΜｙｃ／ｐ５３＋／−ＨＰＣ由来のベクターおよびｍｉＲ−１９発現リンパ腫中のｐ５３遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を評価するためのＰＣＲ（ＮｅｏおよびＷＴは、ｐ５３のノックアウトおよび野生型対立遺伝子を示す）。
【図８】親細胞およびｍｉＲ−１９形質導入ＦＬ５−１２細胞の遺伝子発現分析。（ａ）教師なしクラスタリング分析のヒートマップ表示により、親細胞（ＦＬ／ベクター）とｍｉＲ−１９発現ＦＬ５−１２細胞（ＦＬ／ｍｉＲ−１９）との間の遺伝子発現の相違が明らかとなる。（ｂ）アレイ上に示した予想されるｍｉＲ−１９標的（３３６遺伝子、赤線）対全ての表示遺伝子（８０６５遺伝子、黒線）の発現の変化の比較（ｐ＜２ｅ−０４；ＫＳ試験）。（ｃ）その発現が親細胞と比較してＦＬ５−１２／ｍｉＲ−１９細胞で１ＳＤを超えて下方制御される遺伝子のヒストグラム。包括的に、ｍｉＲ−１９標的は、他の遺伝子より有意に大きく下方制御される。しかし、発現のより顕著な（１．５または２ＳＤ）減少を示す遺伝子間でｍｉＲ−１９標的は有意に富化されない。
【図９】ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）スクリーニングのための最適化研究。（ａ）ベクターと比較してＢｉｍに対するｓｈＲＮＡによるＢ１Ｍ／ＢＣ１２Ｌ１１タンパク質（短期および長期の曝露）のノックダウンを示すＦＬ５−１２細胞の免疫ブロット。（ｂ）Ｂｉｍ  ｓｈＲＮＡおよびＧＦＰを発現するＦＬ５−１２細胞は、その後のＩＬ３枯渇およびレスキューサイクルで富化される。Ｔ０は未処置である。Ｔ１はＩＬ３枯渇およびＩＬ３レスキューの１サイクルである。Ｔ２は２サイクルである。（ｃ）ＧＦＰに連結したポジティブコントロールｓｈＲＮＡを空のベクターで１０倍から１０，０００倍まで希釈したライブラリー再構築実験。ｓｈＲＮＡ発現細胞およびＧＦＰ発現細胞の富化は、１，０００倍希釈で容易に検出され、おそらく１０，０００倍でさえも検出される。（ｄ）（ｃ）のように実施し、スクリーニングアッセイにおいてｍｉＲ−１９を詳細に特徴づけるためのｍｉＲ−１９の連続希釈物を使用したライブラリー再構築実験。これらの所見に基づいて、ライブラリーを、プールあたりの複雑度約１，０００ｓｈＲＮＡに構築した。
【図１０】リンパ球生存におけるｍｉＲ−１９を表現型模写するｓｈＲＮＡの遺伝子スクリーニング。（ａ）プールしたｓｈＲＮＡのスクリーニングデザインの略図。（ｂ）ハーフヘアピンアレイの結果の教師なしクラスタリング分析のヒートマップ。Ｔ１およびＴ２は、ＩＬ３枯渇の１または２サイクル後の時点を示す。−ＩＬ３および＋ＩＬ３は、ＩＬ３の非存在下または存在下の培養を示す。Ａ、Ｂ、およびＣはレプリケートを示す（Ｔ２／＋ＩＬ３でのレプリケートＢを技術上の理由から除去した）。（ｃ）各ｓｈＲＮＡの倍率変化（ｌｏｇ２）および確認研究のための閾値（赤線）を示すマイクロアレイデータの統計分析（ＳＡＭ）。（ｄ）遺伝子組富化分析（ＧＳＡ）により、１４遺伝子をターゲティングするｓｈＲＮＡ組の富化が同定される（赤円）。（ｅ）ＩＬ３枯渇の際に表示のｓｈＲＮＡおよびＧＦＰを発現するＦＬ５−１２細胞の富化を示す代表的な検証実験。８つの検証された「ヒット」のうちの５つは、直接的なｍｉＲ−１９標的である。ベクターのみでは変化が示されなかった（示さず）。
【図１１】ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果の図表によるまとめ。（ａ）約１２，０００のｓｈＲＮＡおよび７，８５３の固有の標的の大規模ｓｈＲＮＡライブラリーから、８遺伝子に対するｓｈＲＮＡはｍｉＲ−１９を表現型模写することを示した。８遺伝子のうちの５遺伝子は、９３８個の予想ｍｉＲ−１９標的と比較してｍｉＲ−１９シードマッチを含んでいた。それ故、遺伝スクリーニングにより、ｍｉＲ−１９標的遺伝子が非常に有意に富化する（ｐ＜７．２  ｅｘｐ−０７、フィッシャーの正確検定）。（ｂ）７４４個の予想ｍｉＲ−１９標的遺伝子を含むマウスゲノムについての同一の分析（マウスＤｏｃｋ５遺伝子は標的ではない）。フィッシャーの正確検定により、マウスゲノム中のｍｉＲ−１９標的の富化が確認される（ｐ＜３．２  ｅｘｐ−０５）。
【図１２】同定された遺伝子は、実際のおよび関連するｍｉＲ−１９の標的である。（ａ）ベクター（黒色バー）またはｍｉＲ−１９形質導入された（影付きバー）ＦＬ５−１２細胞から調製したｃＤＮＡ上の表示の遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲ。発現レベル（平均±ＳＤ）を、ベクターコントロールに対して正規化する（相対発現）。（ｂ）上記のように分析したベクター（黒色バー）およびｍｉＲ−１９のアンタゴミア（影付きバー）で形質導入したＦＬ５−１２細胞を比較したｑＲＴ−ＰＣＲ。（ｃ）および（ｄ）表示のタンパク質について探索したベクター、ｍｉＲ−１９（ｃ）またはアンタゴミア−１９（ｄ）で形質導入したＦＬ５−１２細胞由来の溶解物の免疫ブロット。（ｅ）Ｂｃｌ２（ＦＬ５−１２／Ｂｃｌ２）を同時発現するＦＬ５−１２細胞ならびにＧＦＰおよび表示のｓｈＲＮＡまたはｍｉＲ−１９のＦＡＣＳプロフィール。リンパ球生存に及ぼすＢｃｌ２依存性の影響を評価するために、細胞を完全培地（＋ＩＬ３）からＩＬ３欠損培地（−ＩＬ３）にシフトさせる。（ｆ）ＧＦＰおよびアンタゴミア（抗１９）またはベクターで形質導入し、完全培地で成長させたＦＬ５−１２／Ｂｃｌ２細胞のＦＡＣＳ分析。（ｇ）ｍｉＲ−１９によるＰＩ３Ｋ生存シグナルのマルチレベルコントロールを示す図。
【図１３】マウスＴ−ＡＬＬにおけるｍｉＲ−１９および標的遺伝子の発現。（ａ）ｍｉＲ−１９発現は、ノッチ１のみと比較してノッチ１およびｍｉＲ−１９で形質導入したＨＰＣ由来のＴ−ＡＬＬで増加する。（ｂ）いくつかの標的遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ノッチ１のみと比較してノッチ１およびｍｉＲ−１９によって駆動されるマウスＴ−ＡＬＬで減少する（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．１；＊＊＊ｐ＞０．１）。
【図１４】ｍｉＲ−１９による３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）抑制についてのレポーターアッセイ。表示の遺伝子の３’ＵＴＲを二重ルシフェラーゼレポーター構築物（ｐＳｉＣｈｅｃｋ２）にサブクローニングし、ｍｉＲ−１９による３’ＵＴＲの阻害を、ウミシイタケルシフェラーゼ活性のホタルルシフェラーゼ活性に対する平均±ＳＤ比（ＲＬｕｃ／Ｌｕｃ）として示す。ＷＴは野生型３’ＵＴＲを示す。ＭはｍｉＲ−１９結合部位が変異した３’ＵＴＲを示す。Ｐｔｅｎの場合、一方の部位（Ｍ１）または両方の部位（Ｍ１＋Ｍ２）を変異させた（＊は、有意な（ｐ＜０．０５）変化を示す。＊＊は、有意でない（ｐ＞０．０５）変化を示す）。
【図１５】ｍｉＲ−１９は、ＡｋｔおよびリボゾームＳ６リン酸化の活性化を誘導する。ベクターまたはｍｉＲ−１９で形質導入し、ＩＬ３を１２時間除去し、表示の抗体で探索したＦＬ５−１２細胞の免疫ブロット。
【図１６】相補性実験−ｃＤＮＡ発現。ｍｉＲ−１９／ＧＦＰおよび表示のｃＤＮＡまたは空のベクターまたはＡＭＰキナーゼ活性を活性化するために１μΜメトホルミンで処置した空のベクターを同時発現する細胞の富化についてのＦＡＣＳの結果のまとめ。ＩＬ３の存在下でのＴ０、Ｉｌ３枯渇後の時点Ｔ１およびＴ２。標準誤差（ＳＥＭ）を示す（全ての場合、ｐ（Ｔ２対Ｔ０について）＜０．０５）。アポトーシス促進性ＢＩＭタンパク質の発現は、ＦＬ５−１２細胞の細胞死を迅速に誘導した。他のｃＤＮＡやメトホルミン処置のいずれも、ｍｉＲ−１９の防御機能を抑制しなかった。
【図１７】ｓｈＲＮＡ構築物によってノックダウンされたタンパク質。（ａ）〜（ｇ）表示のｓｈＲＮＡ構築物または空のベクターで形質導入し、表示のタンパク質について探索した細胞の免疫ブロット。いずれの場合も、試験した少なくとも３つのｓｈＲＮＡの最も有効なｓｈＲＮＡを示す。
【図１８】レトロウイルスｓｈＲＮＡライブラリーベクター。（ａ）ｓｈＲＮＡライブラリースクリーニングで使用したＭＳＣＶベースのＭＲＰレトロウイルスライブラリーベクターの図。検証実験においてこの構築物（ＭＬＰ）のＧＦＰ発現バージョンを各検出のために使用したことに留意のこと。（ｂ）ｐ５３を誘導するためにドキソルビシンで処置したか未処置であり、ｐ５３に対するｓｈＲＮＡを有するか持たない表示のベクター構築物で形質導入した初代線維芽細胞由来の溶解物の免疫ブロット。ｐ５３ｓｈＲＮＡを発現するＭＲＰベクターおよびＭＬＰベクターの両方は、有効にタンパク質をノックダウンする。（ｃ）シグナル／バックグラウンド比を決定するためのライブラリー中に存在するｓｈＲＮＡ（ライブラリープローブ）またはネガティブコントロールのいずれかに適合する配列したハーフヘアピン由来のシグナル強度の比較。
【図１９】Ｔ−ＡＬＬにおける発癌性ｍｉＲＮＡの包括的研究。ａ．実験ストラテジーの略図。ｂ．所与のサンプルにおける全ての発現したｍｉＲＮＡの平均発現値（平均および標準偏差（ＳＤ））に正規化し、発現レベルによって順序付けた定量的ＲＴ−ＰＣＲによる５０のＴ−ＡＬＬサンプルにわたる平均ｍｉＲＮＡ発現。最も豊富に発現された「上位１０」のｍｉＲＮＡを示した。ｃ．数値的に順序付けたＴ−ＡＬＬの異なる細胞遺伝学的亜群におけるｍｉＲＮＡ発現（平均およびＳＤ）。最も豊富なｍｉＲＮＡを示した。
【図２０】ＭｉＲＮＡ発現分析。ａ．１８種のヒトＴ−ＡＬＬ細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定（平均およびＳＤ）。ｂ．ＦＡＣＳ選別した正常な細胞集団におけるｍｉＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定（サンプルあたり２レプリケートの平均およびＳＤ）。ｃ．全ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにわたる平均値（Ｌ）と表示の正常細胞集団（Ｎ）を比較した差次的ｍｉＲＮＡ発現。正常サンプルまたは白血病サンプルのいずれかにおける倍率変化が５を超え、且つ検出可能に発現する（相対値＞５０）ｍｉＲＮＡのみを示す。黒色の数値は白血病細胞におけるより高い発現を示し、赤色の数値は正常細胞におけるより高い発現を示す。
【図２１】発癌性ｍｉＲＮＡについてのプールライブラリースクリーニング。ａ．スクリーニングプロトコールの略図：一次スクリーニングによって、癌遺伝子誘導性アポトーシスのバイパスを選択し、二次スクリーニングによってＩＬ−３の非存在下でのリンパ球増殖をスクリーニングする。ｂ．一次スクリーニング：ＭＥＦにおけるｃ−ＭＹＣ誘導性アポトーシスを示す顕微鏡写真（挿入図）および生存／接着細胞から取り出したｍｉＲＮＡ配列の比率（下）。簡潔に述べれば、ＤＮＡを単離し、組み込んだｍｉＲＮＡをＰＣＲによって増幅し、サブクローニングし、約１００クローンを選別し、組み込んだｍｉＲＮＡを配列決定した。ｃ．二次スクリーニング：ＩＬ−３枯渇の際に二次ｍｉＲＮＡライブラリーおよびＧＦＰを発現するＦＬ５−１２細胞の富化（挿入図）およびＩＬ−３枯渇後にＦＬ５−１２細胞から回収したｍｉＲＮＡ配列の比率（下）。ｄ．スクリーニングの検証：ＩＬ−３枯渇前および枯渇後のｍｉＲＮＡ／ＧＦＰ発現ＦＬ５−１２細胞の平均倍率変化およびＳＤ（３つの独立した実験の結果）。ｅ．中間結果のまとめ：ヒトＴ−ＡＬＬにおいて１０種の最高に発現したｍｉＲＮＡ（赤色円）、ｍｉＲＮＡスクリーニングにおける有効な「ヒット」（青色円）、およびＴ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子に結合するｍｉＲＮＡ（緑色円）。
【図２２】候補ｍｉＲＮＡはマウスＴ−ＡＬＬモデルにおいて癌遺伝子として作用する。ａ．ノッチ１駆動Ｔ−ＡＬＬの養子移入モデルの略図。ｂ．ノッチ１−ＩＣＮおよびいずれかのベクター（黒色、ｎ＝１３）、ｍｉＲ−１９ｂ（赤色、ｎ＝７）、ｍｉＲ−２０ａ（橙色、ｎ＝４）、ｍｉＲ−２６ａ（紫紅色、ｎ＝５）、ｍｉＲ−３０（灰色、ｎ＝５）、ｍｉＲ−９２（緑色、ｎ＝５）、またはｍｉＲ−２２３（青色、ｎ＝７）を発現するＨＰＣの移植後の無白血病生存のカプラン・マイヤー分析。ｃ．ノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬの代表的な顕微鏡写真。異なるｍｉＲＮＡを発現する白血病の病理学的外観は同一である（示さず）。
【図２３】候補ｍｉＲＮＡはマウスＴ−ＡＬＬモデルにおいて癌遺伝子として作用する。ａ．ノッチ１−ＩＣＮおよびベクター（黒色、ｎ＝１３）またはｍｉＲ−２７（赤色、ｎ＝５；ベクターと比較してｐ＜０．０５）、ｍｉＲ−２４（紫紅色、ｎ＝５；ｐ＝０．５）、ｍｉＲ−２３ａ（緑色、ｎ＝５；ｐ＜０．０５）、もしくはｍｉＲ−１４８ａ（青色、ｎ＝７；ｐ＜０．０５）を発現するＨＰＣの移植後の無白血病生存のカプラン・マイヤー分析。ｂ．表示のマーカーについてポジティブ染色された細胞の比率を用いたマウスＴ−ＡＬＬ上の表面マーカー発現の分析。ｃ．ベクターコントロールにおいて生じた白血病と比較した表示のｍｉＲＮＡを発現するマウス白血病細胞におけるｍｉＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定。
【図２４】ｍｉＲＮＡは、マウスＴ−ＡＬＬにおいて腫瘍抑制遺伝子の発現を調節する。ａ．表示の遺伝子の３’ＵＴＲに及ぼすｍｉＲＮＡの影響を試験するルシフェラーゼレポーターアッセイ（三連の実験の平均およびＳＤ）。Ｖ＝ベクター、数値はｍｉＲＮＡ名を示す。＊は、ベクターと比較した有意な（ｐ＜０．０５）影響を示す。ｂ．ノッチ１および表示のｍｉＲＮＡを発現するマウスＴ−ＡＬＬにおける遺伝子発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定。倍率変化対コントロールベクターを発現するＴ−ＡＬＬとして示した範囲および平均。＊は有意性を示す（ｐ＜０．０５）。ｃ〜ｇ．ノッチ１およびベクターまたは表示のｍｉＲＮＡを発現し、表示の抗体で探索したマウスＴ−ＡＬＬ由来の溶解物の免疫ブロット。
【図２５】ｍｉＲＮＡはマウスＦＬ５−１２細胞におけるいくつかの腫瘍抑制遺伝子の発現に影響を及ぼす。ａ〜ｄ．空のベクターまたは表示のｍｉＲＮＡのいずれかを発現するＧＦＰ選別したＦＬ５−１２細胞の溶解物を、表示のタンパク質について探索した。
【図２６】ｓｈＲＮＡによってノックダウンされたタンパク質。ａ〜ｃ．空のベクターまたは表示のｓｈＲＮＡのいずれかを発現するＧＦＰ選別したＦＬ５−１２細胞の溶解物を、表示のタンパク質について探索した。
【図２７】Ｔ−ＡＬＬ抑制遺伝子に及ぼす個別および協同的なｍｉＲＮＡの影響。ａ．ＨＰＣ移植後の無白血病生存のカプラン・マイヤー分析。ＨＰＣは全てノッチ１−ＩＣＮおよびベクター（黒色、ｎ＝１３）またはｓｈＮＦｌ（赤色、ｎ＝６）、ｓｈＢＣＬ２Ｌ１１（橙色、ｎ＝６）、ｓｈＰＴＥＮ（紫紅色、ｎ＝３）、ｓｈＦＢＷＸ７（緑色、ｎ＝４）、ｄｎ−Ｉｋｚｆ１（青色、ｎ＝１０）、もしくはｓｈＰＨＦ６（紫色、ｎ＝３）を発現する。ｂ．表示のアンタゴミアを発現するＴ−ＡＬＬ１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中の細胞数（各時点についての平均およびＳＤ；ｄ６時点＊および６ｄ期＊＊にわたる有意差（ｐ＜０．０５）を示す）およびＴ−ＡＬＬ１細胞におけるｍｉＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定（挿入図）。ｃ．表示のアンタゴミアで形質導入したＴ−ＡＬＬ１細胞の生存度（平均およびＳＤ、＊ｐ＜０．０５）。ｄおよびｅ．表示のアンタゴミアを発現するＴ−ＡＬＬ１細胞におけるＢＣＬ２Ｌ１１（ｄ）およびＰＴＥＮ（ｅ）ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（平均およびＳＤ、＊ベクターと比較してｐ＜０．０５）。ｆおよびｇ．表示のｍｉＲＮＡで形質導入した細胞におけるＢＣＬ２Ｌ１１（ｆ）およびＰＴＥＮ（ｇ）の３’ＵＴＲルシフェラーゼレポーターアッセイ（平均およびＳＤ、＊三連の測定においてｐ＜０．０５）。ｈ．本研究で同定したｍｉＲＮＡによる６つの腫瘍抑制遺伝子の重複調節の図表によるまとめ：太字はヒトＴ−ＡＬＬで高発現するｍｉＲＮＡを示す。各線の幅は、ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の強度および保存の計算値に比例する。
【図２８】ヒトＫｏｐｔｋ１  Ｔ−ＡＬＬ細胞株におけるアンタゴミア研究。ａ．表示のアンタゴミアを発現するＫｏｐｔｋ１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中の細胞数（各時点についての平均およびＳＤ。＊は有意な（ｐ＜０．０５）成長遅延を示す）。ｂおよびｃ．表示のアンタゴミアを発現するＫｏｐｔｋ１細胞におけるＢＣＬ２Ｌ１１（ｂ）およびＰＴＥＮ（ｃ）のｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（平均およびＳＤ。＊はベクターと比較してｐ＜０．０５である）。
【図２９】ｍｉＲ−２２３に対するアンタゴミアはＴ−ＡＬＬ細胞株において抗増殖効果を示す。競合アッセイの結果。Ｔ−ＡＬＬ株（Ｋｏｐｔｋ１、Ｔ−ＡＬＬ１、およびＪｕｒｋａｔ）を、ｍｉＲ−２２３アンタゴミアおよびＧＦＰをコードするレンチウイルス構築物で形質導入した。ＧＦＰの発現を、４８時間毎にＦＡＣＳによって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
本発明によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照のこと。
【００３９】
したがって、本明細書中に出現する場合、以下の用語は、以下に記載の定義を有するものとする。
【００４０】
用語「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ標的」、および具体的に列挙していない任意のバリアントを、本明細書中で交換可能に使用することができ、本出願および特許請求の範囲を通して使用されるように、核酸材料（リボ核酸、ＲＮＡ（単一または複数のＲＮＡが含まれる）が含まれる）をいい、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡ、ならびに本明細書中に記載され、且つ表１に示す核酸配列データ（配列番号１〜１０）および本明細書中および特許請求の範囲に記載の活性プロフィールを有するｍｉＲＮＡが含まれる）に及ぶ。したがって、実質的に等価な活性または変化した活性を示す配列も同様に意図する。これらの修飾は、意図的であり得るか（例えば、部位特異的変異誘発によって得た修飾など）、偶発的であり得る（宿主またはそのバリアントの変異によって得た修飾など）。また、用語「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、「マイクロＲＮＡ」、および「ｍｉＲＮＡ標的」は、本明細書中に具体的に引用した核酸ならびに全ての実質的に類似のアナログおよび対立遺伝子バリエーションをその範囲内に含むことを意図する。
【００４１】
用語「オリゴヌクレオチド」、「アンチセンス」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンタゴミア」、「ｍｉＲＮＡアンタゴミア」、および具体的に列挙していない任意のバリアントを、本明細書中で交換可能に使用することができ、本出願および特許請求の範囲を通して使用されるように、核酸材料（単一または複数の核酸が含まれる）をいい、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡ核酸配列（表１に記載のものが含まれる）に相補的なオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアおよび表２の相補配列、および本明細書中および特許請求の範囲に記載の活性プロフィール（特に、１つ以上のそのｍｉＲＮＡの発現の阻害、特に、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの阻害が可能なこと）を有するものに及ぶ。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１１〜１５に提供するｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡまたはその一部に特異的な核酸配列に実質的に相補的であり得る（例えば、表２に提供）。したがって、実質的に等価であるか変化した活性を示す核酸またはそのアナログも同様に意図する。これらの修飾は、意図的であり得るか（例えば、部位特異的変異誘発によって得た修飾など）、偶発的であり得る（核酸またはアンタゴミア／オリゴヌクレオチドの産生者である宿主中でバリアントとしてか変異によって得た修飾など）。本発明のアンタゴニストの言及において本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」を、２つ以上、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドから構成される分子と定義する。その正確なサイズは、多数の要因、同様に、オリゴヌクレオチドの根本的な機能および使用に依存するであろう。
【００４２】
用語「薬剤」は、任意の分子（ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化学化合物、および小分子が含まれる）を意味する。特に、用語「薬剤」には、化合物（試験化合物または薬物候補化合物など）が含まれる。
【００４３】
用語「アゴニスト」は、その最も広い意味でリガンドが結合する受容体を刺激するリガンドをいう。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「アンタゴニスト」を、受容体への結合の際に生物学的応答自体を誘発しないが、アゴニスト媒介性応答を遮断または弱める化合物を説明するために使用する。
【００４５】
用語「アッセイ」は、化合物の特異的性質を測定するために使用される任意の過程を意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物の収集物に由来するその活性に基づいて化合物を特徴づけるか選択するために使用される過程を意味する。
【００４６】
用語「結合親和性」は、非共有結合性の関係において２つ以上の化合物がどの程度強く相互に結合するのかを説明する性質である。結合親和性を、定性的に（「強い」、「弱い」、「高い」、「低い」など）または定量的に（ＫＤの測定など）特徴づけることができる。
【００４７】
用語「キャリア」は、薬学的組成物を中間の（ｍｅｄｉｕｍ）、嵩高い、および／または有用な形態にする薬学的組成物の処方で使用される無毒の材料を意味する。キャリアは、１つ以上のかかる材料（賦形剤、安定剤、または水性ｐＨ緩衝化溶液など）を含むことができる。生理学的に許容され得るキャリアの例には、水性または固体の緩衝液成分（リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸が含まれる）；抗酸化剤（アスコルビン酸が含まれる）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ツウィーン（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびプルロニック（登録商標）など）が含まれる。
【００４８】
用語「複合体」は、２つ以上の化合物が相互に結合、接触、または会合する場合に作製される実体を意味する。
【００４９】
用語「化合物」を、本明細書中で、本発明のアッセイに関連して記載される「試験化合物」または「薬物候補化合物」の文脈で使用する。そのようなものとして、これらの化合物は、合成、組換え、または天然供給源から誘導される有機化合物または無機化合物を含む。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチドのフラグメント」は、完全な配列と実質的に類似するが、必ずしも同一ではない活性を示すひと続きの連続する核酸残基を含むオリゴヌクレオチドに関する。特定の態様では、「フラグメント」は、完全な配列の核酸配列の少なくとも５核酸残基（好ましくは、少なくとも１０核酸残基、少なくとも１５核酸残基、少なくとも２０核酸残基、少なくとも２５核酸残基、少なくとも４０核酸残基、少なくとも５０核酸残基、少なくとも６０核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）残基、少なくとも７０核酸残基、少なくとも８０核酸残基、少なくとも９０核酸残基、少なくとも１００核酸残基、少なくとも１２５核酸残基、少なくとも１５０核酸残基、少なくとも１７５核酸残基、少なくとも２００核酸残基、または少なくとも２５０核酸残基）の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドをいうことができる。
【００５１】
用語「ポリペプチドのフラグメント」は、完全な配列と機能活性または発現活性が実質的に類似するが、必ずしも同一ではないひと続きの連続するアミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、単量体、サブユニット、および酵素に関する。特定の態様では、「フラグメント」は、完全な配列のアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸（ａｍｉｎｏ）残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、少なくとも１５０アミノ酸残基、少なくとも１７５アミノ酸残基、少なくとも２００アミノ酸残基、または少なくとも２５０アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドをいうことができる。
【００５２】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態且つセンス方向またはアンチセンス方向のポリ核酸、ストリンジェントな条件下で特定のポリ核酸とハイブリッド形成する相補ポリ核酸、およびその塩基対の少なくとも約６０％が相同であり、より具体的にはその塩基対の７０％、最も具体的には９０％、特定の実施形態では、その塩基対の１００％が共通するポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドには、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸、およびその合成アナログが含まれる。修飾骨格を有する核酸（ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、および２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオアートなど）も含まれる。ポリヌクレオチドを、約１０〜約５０００塩基、詳細には約１００〜約４０００塩基、より詳細には約２５０〜約２５００塩基の範囲の種々の長さの配列によって記載する。１つのポリヌクレオチド実施形態は、約１０〜約３０塩基長を含む。ポリヌクレオチドの特定の実施形態は、約１７〜約２２ヌクレオチドのポリリボヌクレオチドであり、より一般的には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−二本鎖ｓｉＲＮＡ分子および自己相補的な一本鎖ｓｉＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）の両方）と記載される。別の特定の実施形態は、修飾骨格を有する核酸（ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、および２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオアートなど）、天然に存在しない核酸残基を含むもの、１つ以上の核酸置換物（メチル−、チオ−、スルフェート、ベンゾイル−、フェニル−、アミノ−、プロピル−、クロロ−、およびメタノカルバヌクレオシドなど）、またはその検出を容易にするためのレポーター分子である。本明細書中のポリヌクレオチドを、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。これは、ポリヌクレオチドがその各鎖とハイブリッド形成するのに十分に相補的でなければならないということを意味する。したがって、ポリヌクレオチド配列は、標的配列の配列を正確に反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントを、ポリヌクレオチドの５’末端に付着させることができ、残りのポリヌクレオチド配列は鎖に相補的である。あるいは、ポリヌクレオチド配列がストリンジェントな条件下でハイブリッド形成か伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するのに十分な鎖の配列との相補性を有することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列をポリヌクレオチド内に分散させることができる。
【００５３】
用語「癌」は、血液、皮膚、または身体の器官中の悪性または良性の細胞成長（例えば、血液学的悪性疾患、乳房、前立腺、肺、胃腸管、肝臓、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、腎臓、膵臓、胃、または腸であるが、これらに限定されない）をいう。癌は、隣接組織に浸潤し、遠隔器官（例えば、骨、肝臓、肺、または脳）に拡大する（転移する）傾向がある。本明細書中で使用する場合、用語「癌」には、転移性腫瘍細胞型（黒色腫、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、および肥満細胞腫などであるが、これらに限定されない）および組織癌腫型（結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、膠芽細胞腫、原発性肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌などであるが、これらに限定されない）の両方が含まれる。
【００５４】
「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの自律性ＤＮＡ複製単位として機能する（すなわち、それ自体の調節下で複製することができる）任意の遺伝的構成要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００５５】
「ベクター」は、付着したセグメントが複製するように別のＤＮＡセグメントを付着させることができるレプリコン（プラスミド、ファージ、またはコスミドなど）である。
【００５６】
「ＤＮＡ分子」は、その一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の多量体形態をいう。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをいい、いかなる特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語には、とりわけ線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体で見い出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察するなかで、配列を、本明細書中で、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’→３’方向の配列のみを与える通常の慣習にしたがって記載することができる。
【００５７】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列をいう。
【００５８】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下においた場合にｉｎ  ｖｉｖｏで転写されてポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって画定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に存在するであろう。
【００５９】
転写調節配列および翻訳調節配列は、宿主細胞中のコード配列を発現させるＤＮＡ調節配列（プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびターミネーターなど）である。
【００６０】
発現調節配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を調節および制御する場合、そのＤＮＡ配列は発現調節配列に「作動可能に連結」される。用語「作動可能に連結された」には、発現すべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有することならびに発現調節配列の調節下でのＤＮＡ配列の発現およびＤＮＡ配列によってコードされる所望の産物の産生が可能なように正しい読み取り枠を維持することが含まれる。組換えＤＮＡ分子に挿入することが望まれる遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、かかる開始シグナルをその遺伝子の前に挿入することができる。
【００６１】
用語「標準的なハイブリッド形成条件」は、ハイブリッド形成および洗浄の両方について５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に等価な塩および温度の条件をいう。しかし、当業者は、かかる「標準的なハイブリッド形成条件」が特定の条件（緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチ率、およびホルムアミドの比率などが含まれる）に依存することを認識するであろう。ハイブリッド形成する２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡのいずれであるかどうかも「標準的なハイブリッド形成条件」の決定に重要である。かかる標準的なハイブリッド形成条件は、周知の式にしたがって当業者によって容易に決定され、所望される場合、ハイブリッド形成は、より高いストリンジェンシーの洗浄での予想されるか決定されたＴｍより典型的には１０〜２０ＮＣ低い。
【００６２】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位と接し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含めるために上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内に転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって都合良く定義される）およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見い出されるであろう。真核生物プロモーターは、しばしば、しかし常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むであろう。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルガルノ配列を含む。
【００６３】
「発現調節配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を調節および制御するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞中の転写調節配列および翻訳調節配列の「調節下に」ある。
【００６４】
「シグナル配列」をコード配列の前に含めることができる。この配列は、ポリペプチドのＮ末端側に存在し、ポリペプチドを細胞表面に誘導するかポリペプチドを培地に分泌するように宿主細胞に伝達するシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって切り取られる。原核生物および真核生物由来の種々のタンパク質に会合したシグナル配列が見い出され得る。
【００６５】
用語「プライマー」は、本明細書中で使用する場合、精製された制限消化物のように天然に存在するか合成で産生されるかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよび誘発剤（ＤＮＡポリメラーゼなど）の存在下および適切な温度およびｐＨ）におかれた場合に合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、一本鎖または二本鎖であってよく、誘発剤の存在下で所望の伸長産物の合成を刺激するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、多数の要因（温度、プライマー供給源、および方法の使用が含まれる）に依存するであろう。例えば、診断への適用のために、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、より少数のヌクレオチドを含むことができるが、典型的には、１５〜２５またはそれを超えるヌクレオチドを含む。
【００６６】
本明細書中のプライマーを、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。これは、プライマーがその各鎖とハイブリッド形成するのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、正確なテンプレートの配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントを、プライマーの５’末端に付着させることができ、残りのプライマー配列は鎖に相補的である。あるいは、プライマー配列が、ハイブリッド形成し、それにより、伸長産物の合成用のテンプレートを形成するのに十分な鎖の配列との相補性を有することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー内に分散させることができる。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は細菌酵素をいい、その各酵素は特異的ヌクレオチド配列またはその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する。
【００６８】
ＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞は、外因性または異種のＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合して）ても組み込まれなくてもよい。原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡを、エピソームエレメント（プラスミドなど）上に維持することができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、娘細胞によって染色体複製を介して遺伝するように形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれるようになった細胞である。この安定性は、真核細胞が形質転換ＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンを樹立する能力によって証明される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は、多世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定に成長することができる初代細胞のクローンである。
【００６９】
少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドがＤＮＡ配列の定義した長さにわたって一致する場合、２つのＤＮＡ配列は、「実質的に相同」である。実質的に相同な配列を、配列データバンクで利用可能な標準的ソフトウェアを使用した配列の比較によるか、例えば、特定の系について定義したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリッド形成実験で同定することができる。適切なハイブリッド形成条件の定義は当業者の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、．，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ＆  ＩＩ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
【００７０】
本明細書中に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体であることが好ましい。しかし、免疫グロブリン結合の所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体での残基を任意のＬ−アミノ酸残基の代わりに使用することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９））を順守して、アミノ酸残基の略称を、以下の対応表中に示す。
【００７１】
【表１】
2013520197.tif 000003
全アミノ酸残基配列を、本明細書中でその左方向および右方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって示すことに留意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の始まりおよび終りのダッシュが１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意すべきである。本明細書中に交互に出現し得る三文字表記および一文字表記を相関させるために上記の表を示す。
【００７２】
特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるように、変異を、これに関する配列においてなすことができる。かかる変異を、一般に、可能な限りヌクレオチドの変化を少数にして作製する。非保存的様式（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸群に属するアミノ酸から別の群に属するアミノ酸へのコドンの変化による）または保存的様式（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸群に属するアミノ酸から同一の群に属するアミノ酸へのコドンの変化による）で得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるようにこの種の置換変異を行うことができる。かかる保存的変化により、一般に、得られたタンパク質の構造および機能があまり変化しない。非保存的変化は、得られたタンパク質の構造、活性、または機能が変化する可能性がより高い。本発明には得られたタンパク質の活性または結合特性が有意に変化しない保存的変化を含む配列が含まれると見なすべきである。
【００７３】
以下は、種々のアミノ酸群の例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（Ｐｈ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）。別の群は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
別の群は、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）に従い得る：
グリシン（７５）、アラニン（８９）、セリン（１０５）、プロリン（１１５）、バリン（１１７）、トレオニン（１１９）、システイン（１２１）、ロイシン（１３１）、イソロイシン（１３１）、アスパラギン（１３２）、アスパラギン酸（１３３）、グルタミン（１４６）、リジン（１４６）、グルタミン酸（１４７）、メチオニン（１４９）、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）（１５５）、フェニルアラニン（１６５）、アルギニン（１７４）、チロシン（１８１）、トリプトファン（２０４）。特に好ましい置換は以下である：正電荷を保持することができるようなＬｙｓへのＡｒｇの置換またはその逆；負電荷を保持することができるようなＧｌｕへのＡｓｐの置換またはその逆；遊離−ＯＨを保持することができるようなＳｅｒへのＴｈｒの置換；遊離ＮＨ２を保持することができるようなＧｉｎへのＡｓｎの置換。
【００７４】
特定の好ましい特性を有するアミノ酸に置換するためにアミノ酸置換を導入することもできる。例えば、Ｃｙｓを、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的部位として導入することができる。Ｈｉｓを、特定の「触媒」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、生化学的触媒において最も一般的なアミノ酸である）。タンパク質構造中に−ターンを誘導するその特定の平面構造のために、Ｐｒｏを導入することができる。
【００７５】
少なくとも約７０％のアミノ酸残基（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が同一であるか保存的置換を示す場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」である。
【００７６】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、本来はより大きな分子と関連して見出されないより大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントである。したがって、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、遺伝子は、通常、供給元の生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接するであろう。異種コード配列の別の例は、本来はコード配列自体が見出されない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡまたは未変性遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または天然に存在する変異事象は、本明細書中に定義のＤＮＡの異種領域を生じない。
【００７７】
「抗体」は、特異的エピトープに結合する任意の免疫グロブリン（抗体およびそのフラグメントが含まれる）である。本用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を含み、最後のものは米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号にさらに詳述されている。例示的な抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、およびパラトープを含む免疫グロブリン分子の一部（当該分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ｖ）として公知の部分（この部分は本明細書中に記載の治療方法での使用に好ましい）が含まれる）である。抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分を、周知の方法による実質的にインタクトな抗体分子に対するパパインおよびペプシンの各タンパク質分解反応によって調製する。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓら、の米国特許第４，３４２，５６６号を参照のこと。Ｆａｂ’抗体分子部分も周知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から産生され、その後に２つの重鎖部分を連結しているジスルフィド結合をメルカプトエタノールで還元し、その後に得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化する。インタクトな抗体分子を含む抗体が本明細書中で好ましい。
【００７８】
「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。本明細書中で使用されるその種々の文法上の形態における句「抗体分子」は、インタクトな免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意図する。その種々の文法上の形態における句「モノクローナル抗体」は、特定の抗原と免疫反応することができるたった１種の抗体結合部位を有する抗体をいう。したがって、モノクローナル抗体は、典型的には、免疫反応する任意の抗原に対して単一の結合親和性を示す。したがって、モノクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原に対して免疫特異性を示す複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含むことができる（例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体）。
【００７９】
用語「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、疾患を引き起こす作用物質に曝露され得るか、疾患発症前に疾患への素因を有し得る被験体における疾患または障害の獲得または発症のリスクの軽減（すなわち、疾患の少なくとも１つの臨床症状を発症させない）をいう。
【００８０】
用語「予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、用語「予防」に関連するか含まれ、その目的が疾患を処置または治癒させることよりもむしろ予防することである措置または手順をいう。予防措置の非限定的な例には、ワクチンの投与、例えば、不動に起因する血栓症リスクのある入院患者への低分子量ヘパリンの投与、およびマラリアが風土病であるか、マラリア接触リスクが高い地理的領域を訪問する前の抗マラリア薬（クロロキンなど）の投与が含まれ得る。
【００８１】
「治療有効量」は、医師または他の臨床医によって探求されている被験体の生物学的または医学的な応答を誘発する薬物、化合物、抗菌薬、抗体、または医薬品の量を意味する。特に、グラム陽性菌感染およびグラム陽性菌の成長に関して、用語「有効量」には、グラム陽性菌の感染量または感染範囲を生物学的に有意義に減少させる（殺菌効果および／または静菌効果が含まれる）のに有効な化合物または薬剤の量が含まれることを意図する。句「治療有効量」を、本明細書中で、伝染性細菌の成長もしくは量またはその存在および活性に伴い得る他の病理学的特徴（例えば、発熱または白血球数など）の臨床的に有意な変化を予防するか、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％軽減させるのに十分な量を意味するために使用する。
【００８２】
任意の疾患または感染の、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、１つの実施形態では、疾患または感染の改善（すなわち、感染性因子または細菌の疾患または成長の停止、または少なくとも１つのその臨床症状の発現、範囲、または重症度の軽減）をいう。別の実施形態では、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、被験体によって識別可能でないかもしれない少なくとも１つの身体的パラメーターの改善をいう。さらに別の実施形態では、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または感染の物理的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）、またはその両方の調整をいう。さらなる実施形態では、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患の進行の遅延または感染の軽減に関する。
【００８３】
句「薬学的に許容され得る」は、ヒトに投与した場合に生理学的に容認され、且つ典型的にはアレルギー反応や類似の有害反応（胃の不調および眩暈など）を起こさない分子的実体および組成物をいう。
【００８４】
その第１の態様では、本発明は、発癌および白血病誘発に関連するｍｉＲＮＡの同定ならびに癌の管理および処置におけるその調整またはモニタリングに関する。したがって、本発明は、本明細書中に開示のｍｉＲＮＡ標的（ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３のうちの１つ以上（以下の表１に記載のものなどが含まれる）が含まれる）の発現および／または活性を阻害する薬剤が癌の進行を阻害し（動物モデルにおける白血病誘発の予防が含まれる）、腫瘍抑制遺伝子（特に、腫瘍抑制遺伝子Ｐｔｅｎ、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１、Ｐｈｆ６、Ｉｋｚｆ１、Ｎｆ１、および／またはＦｂｚｗ７）に及ぼすｍｉＲＮＡ標的の阻害効果を抑制することができるという発見に基づく。したがって、本発明は、癌または発癌（ｏｎｇｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するか関連するｍｉＲＮＡ標的、ｍｉＲＮＡ標的の活性または発現を阻害することができる薬剤のスクリーニング方法、およびｍｉＲＮＡ標的発現の上昇に関連する癌および疾患（ｍｉＲ１７〜９２転座に関連する癌、血液癌、乳癌、膠芽細胞腫、および黒色腫など）の予防および／または処置におけるこれらの薬剤の使用を提供する。
【００８５】
【表２】
2013520197.tif 000004
本発明は、特に発癌または白血病誘発に関連する１つ以上のｍｉＲＮＡ（組み合わせが含まれる）（ｍｉＲ１９、ｍｉＲ２０、ｍｉＲ２６、ｍｉＲ９２、ｍｉＲ１４８、およびｍｉＲ２２３から選択されるｍｉＲＮＡ（上の表に記載のものが含まれる）など）の発現および／または活性の特異的阻害のための方法および組成物に関する。一定のｍｉＲが実質的に等価な重複する活性および配列を有する（例えば、ｍｉＲ１９はｍｉＲ１９ａおよびｍｉＲ１９ｂの各々および両方を含むことができること、ｍｉＲ２０はｍｉＲ２０ａおよびｍｉＲ２０ｂの各々および両方を含むことができることなど）ことに注目すべきである。特に、本発明は、ｍｉＲＮＡ標的の特異的阻害のための遺伝学的アプローチおよび核酸を提供する。１つ以上のｍｉＲＮＡ標的の特異的阻害の際に発癌／白血病誘発経路が破壊され、特に、白血病誘発、白血病細胞増殖が阻害されるか遮断されることを本明細書中で証明している。特に、アンタゴミア、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および１つ以上のｍｉＲＮＡ標的に相補的な核酸の発現が１つ以上のｍｉＲＮＡ標的の発現または活性を特異的に阻害し、ｍｉＲ媒介性腫瘍発生を遮断する。
【００８６】
アンタゴミア
本発明は、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的（特に、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２６、ｍｉＲ９２、ｍｉＲ１４８、およびｍｉＲ２２３から選択されるｍｉＲＮＡ）に実質的に相補的なアンタゴミア、オリゴヌクレオチド、核酸を提供する。前述のオリゴヌクレオチドは１つ以上のｍｉＲＮＡ標的の発現または活性を阻害する。例示的なアンタゴミアを以下の表２に提供する。以下の例示的な配列を使用し、本明細書中に提供した実施例中でその活性を証明した。
【００８７】
【表３】
2013520197.tif 000005
上記の例示的アンタゴミアは、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；ｓｙｓｔｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ）からｍｉＲＺＩＰｓ（商標）として市販されている。
【００８８】
Ｓｔｏｆｆｅｌらは、２００５年に「アンタゴミア」を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉＲＮＡのサイレンシングを最初に記載した（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｊら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３８（７０６８）：６８５−６８９）。特異的ｍｉＲＮＡに対するアンタゴミアの静脈内投与により、特異的器官における対応するｍｉＲＮＡレベルが顕著に減少した。特異的ｍｉＲＮＡに相補的な化学修飾された一本鎖ＲＮＡアナログは、アンタゴミアとして有効である。オリゴヌクレオチドは、コレステロール分子と連結して標的の取り込みを増強して標的分解を改善し、ホスホロチオアート修飾を有することが記載されている（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄ  Ｊら、（２００７）Ｎｕｃｌ  Ａｄｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５（９）：２８８５−２８９２）。短縮および修飾したオリゴヌクレオチドアンタゴミアの薬学的組成物が記載されている（ＵＳ２０１０／０２８６２３４号およびＷＯ２０１０／１４４４８５Ａ１号が含まれる）。Ｓｃｈｅｒｒらは、ｍｉＲＮＡ機能の特異的阻害のためのレンチウイルス媒介性アンタゴミア発現系を記載している（Ｓｃｈｅｒｒ  Ｍら、（２００７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５（２２）：ｅｌ４９（ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｑｋｍ９７１）。レンチウイルスアンタゴミアは市販されている（Ｓｙｓｔｅｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのｍｉＲＺＩＰｓ（商標）およびＤｈａｒｍａｃｏｎ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉｍｉｃｓ  ｍｅｒｉｄｉａｎが含まれる）。ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉｒＢａｓｅなどのデータベースから公的に入手可能な配列が含まれる）の知識ならびにアンタゴミア、レンチウイルス構築物、および合成オリゴヌクレオチドの商業的および公的利用可能性により、試験、判定、および評価のために利用可能な例示的なｍｉＲＮＡ標的インヒビターとしてアンタゴミア／オリゴヌクレオチドが作製される。したがって、当業者は、本発明の使用および適用に適切なアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを容易にデザイン、作製、または獲得することができる。
【００８９】
本発明は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される本明細書中に提供したｍｉＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つに実質的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアを含む。アンタゴニストまたはアンタゴミアは、表１に記載のｍｉＲＮＡ標的配列に実質的に相補的であり得る。特に、本発明のアンタゴミア、アンタゴニスト、またはオリゴヌクレオチドには、表１に記載の配列番号１〜１０の群から選択されるヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡ配列である配列番号１〜１０のうちの１つ以上の発現または活性を阻害するのに十分なそのヌクレオチドのサブセットに実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明は、表２に記載されるか配列番号１１〜１５に記載の配列群から選択される１つ以上の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアを含む。
【００９０】
１つ以上の本発明のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。特定の態様では、本発明のアンタゴミア、核酸、およびオリゴヌクレオチドを、核酸の化学的骨格の操作または他の部分の共有結合または非共有結合のいずれかによって修飾することができる。それぞれまたは任意の場合、かかる操作または結合は、安定性、細胞、組織、または器官の取り込みを改変するか、そうでなければ核酸およびオリゴヌクレオチドの有効性を増強するために役立ち得る。本発明のさらなる態様では、アンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを、取り込み、安定性を増強するかオリゴヌクレオチドをターゲティングするのに役立ち得る他の分子（ポリペプチド、炭水化物、脂質、または脂質様部分、リガンド、化学物質、または化合物が含まれるが、これらに限定されない）に共有結合することができる。本発明のオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアを、混合または非共有結合もしくは共有結合によって他の標的に指向するオリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。
【００９１】
当業者は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ標的の阻害で有効な核酸およびオリゴヌクレオチドの選択過程を容易にするか簡潔にするためのいくつかのストラテジーのうちのいずれかを容易に使用することができる。オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ分子中の相補配列との間の結合エネルギーの予想または熱力学的指標の計算を使用することができる（Ｃｈｉａｎｇら、．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８１６２−１８１７１；Ｓｔｕｌｌら、．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３５０１−３５０８）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、二次構造に基づいて選択することができる（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、（１９９１）ｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７−２４；Ｌｉｍａら、．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０５５−１２０６１）。Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（米国特許第６４１６，９５１号）は、ＲＮＡをオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程および挿入色素の存在下でのハイブリッド形成または標識の組み込みおよび非標識オリゴヌクレオチドの存在下での色素の分光学的特性または標識のシグナルの測定によってハイブリッド形成の動態をリアルタイムで測定する工程を含む、機能的アンチセンス薬の同定方法を記載している。さらに、当業者によって認識される種々の基準（例えば、自己相補性が存在しないこと、ヘアピンループが存在しないこと、安定なホモ二量体および二重鎖が形成されないこと（安定を予想されるエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）によって評価する）が含まれる）を使用して適切なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列またはアンタゴミア配列またはアンチセンス標的を予想する種々のコンピュータプログラムのいずれかを使用することができる。かかるコンピュータプログラムの例を容易に使用することができ、これらは当業者に公知であり、ＯＬＩＧＯ４またはＯＬＩＧＯ６プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）およびＯｌｉｇｏＴｅｃｈプログラム（Ｏｌｉｇｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）が含まれる。
【００９２】
さらに、本発明で適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成条件下でのオリゴヌクレオチドライブラリーまたは核酸分子のライブラリーのスクリーニングおよび標的ＲＮＡまたは核酸とハイブリッド形成するものの選択によって同定することができる（例えば、米国特許第６，５００，６１５号を参照のこと）。Ｍｉｓｈｒａ  ａｎｄ  Ｔｏｕｌｍｅは、標的に結合するオリゴヌクレオチドの選択的増幅に基づいた選択手順も開発していた（Ｍｉｓｈｒａら、（１９９４）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３  １７：９７７−９８２）。オリゴヌクレオチドを、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの切断を媒介する能力、切断フラグメントの選択および特徴付けによって選択することもできる（Ｈｏら、（１９９６）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：１９０１−１９０７；Ｈｏら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５９−６３０）。ＲＮＡ分子のＧＧＧＡモチーフに対するオリゴヌクレオチドの生成およびそれへのオリゴヌクレオチドのターゲティングも記載されている（米国特許第６，２７７，９８１号）。
【００９３】
ｍｉＲＮＡ標的発現の阻害を、当該分野において日常的な方法（例えば、当業者に周知の（例えば、腫瘍抑制遺伝子配列の）ＲＴ−ＰＣＲ分析、ＲＮＡ発現のノーザンブロットアッセイ、またはタンパク質発現のウェスタンブロットアッセイによる）で測定することができる。細胞増殖または腫瘍細胞成長に及ぼす影響を、当業者に周知の方法（本願の実施例で教示した方法が含まれる）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ、細胞、腫瘍、または動物のモデル系で測定することもできる。同様に、ｍｉＲＮＡ標的活性（特に腫瘍抑制遺伝子発現活性）の阻害を測定することができる。
【００９４】
「実質的に相補的な」を、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドまたは核酸との間で安定且つ特異的な結合が起こるのに十分な程度の相補性を示すために使用する。オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリッド形成可能であるべきその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないと理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的への結合が標的分子の通常の機能を妨害して有用性または発現を喪失させる場合に特異的にハイブリッド形成可能であり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合のアッセイの実施条件下でオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。
【００９５】
本発明の文脈では、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）の結合からなるヌクレオチドモノマーまたはヌクレオシドモノマーのオリゴマーまたはポリマーをいう。オリゴヌクレオチドには、天然に存在しないモノマーまたは同様に機能するその一部を含むオリゴマーが含まれ、かかる修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強およびヌクレアーゼに対する安定性の増加により、未変性形態よりも好まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチドから作製される２つ以上の化学的に異なる領域（例えば、１つ以上の有利な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞取り込みの増加、ＲＮＡ標的に対する結合親和性の増加）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素（例えば、ＲＮアーゼＨ−ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼ）の基質である領域）を含むことができる。
【００９６】
好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合親和性が増大するように修飾されるオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアの領域は、糖の２’位が修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。かかる修飾はオリゴヌクレオチドに日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ耐性が増強されるように修飾する。細胞は、核酸を分解することができる種々のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。多数のヌクレオチドおよびヌクレオシドの修飾は、ヌクレアーゼ消化に対して比較的より高い耐性が付与されることが示されている。少なくとも１つのホスホロチオアート修飾を含むオリゴヌクレオチドが現在より好まれている（Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．ら、（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １２：３８３−９３；Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｐ．ら、（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １２：３９５−４０８；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｄ．（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２：５７４−８０）。いくつかの場合、標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾はまた、独立して、ヌクレアーゼ耐性を増強することができる。
【００９７】
本発明で想定されるいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの具体例には、修飾骨格（例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子または複素環の糖間結合）を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。ホスホロチオアート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドが最も好ましい。Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、．（１９９５）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：３６６−３７４）によって開示されたアミド骨格も好ましい。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，米国特許第５，０３４，５０６号）。他の好ましい実施形態（ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格など）では、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格をポリアミド骨格に置換し、核酸塩基はポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１  ，２５４，１４９７）。オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換された糖部分を含むことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および類似の性質を有する他の置換基。オリゴヌクレオチド上の他の位置（特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位）に類似の修飾を行うこともできる。
【００９８】
オリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアはまた、塩基の修飾または置換を付加的または代替的に含むことができる。本明細書中で使用する場合、「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、天然の核酸で稀または一過性にしか見出されない核酸塩基（例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−ｍｅピリミジン（特に５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ））（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ）ならびに合成核酸塩基（２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ら、１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４５１３）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。当該分野で公知の「ユニバーサル」塩基（例えば、イノシン）を含めることができる。
【００９９】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアの別の修飾は、オリゴヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する１つ以上の部分または結合体の化学結合を含む。かかる部分には、脂質部分（コレステロール部分、コレステリル部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．４：１０５３）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、．（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５３３）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１１１；ａｂａｎｏｖら、．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：４９）、リン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４：９６９）など）が含まれるが、これらに限定されない。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよびかかるオリゴヌクレオチドの調製方法は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，１３８，０４５号、同第５，２１８，１０５号、および同第５，４５９，２５５号）。Ｆａｒｒｅｌ  ａｎｄ  Ｋｌｏｓｔｅｒ（米国特許第６，３１０，０４７号）は、高親和性ＤＮＡ結合多核白金化合物を使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達およびｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ耐性の増強を記載している。所与のオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミア中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、１つを超える上記修飾を、単一のオリゴヌクレオチド中に組み込むことができるか、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドでさえも組み込むことができる。
【０１００】
本発明のオリゴヌクレオチドおよびアンタゴミアは、好ましくは、約８〜約５０ヌクレオチド長である。特に好ましいオリゴヌクレオチドは１０〜３０ヌクレオチド長であり、１５〜２５ヌクレオチドが特に好ましい。本発明の文脈では、これは８〜５０単量体を有する前述の天然に存在しないオリゴマーを含むと理解される。
【０１０１】
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドを、周知の固相合成技術によって簡便かつ日常的に作製することができる。かかる合成のための装置は、いくつかの供給元（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが含まれる）から販売されている。かかる合成のための任意の他の手段も使用することができ、実際のオリゴヌクレオチド合成は十分に当業者の能力の範囲内である。他のオリゴヌクレオチド（ホスホロチオアートおよびアルキル化誘導体など）の調製のために類似の技術を使用することも周知である。
【０１０２】
発癌および白血病誘発におけるｍｉＲＮＡ標的の役割および活性ならびに腫瘍／癌細胞中でのその集合的発現の認識および理解によって生じる診断および治療の可能性は、ｍｉＲＮＡが癌関連遺伝子（腫瘍抑制遺伝子が含まれる）との直接的で且つ原因となる相互作用に関与し、癌細胞の増殖または維持を誘導または促進する活性を有するようであるという事実に由来する。前に示唆されており、本明細書にさらに詳述されているように、本発明は、ｍｉＲＮＡによって開始される活性を調整するためのｍｉＲＮＡ標的が関与するか関係する一連の反応における薬学的介入を意図する。
【０１０３】
したがって、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から特に選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現の阻害方法を提供する。特に、１つ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞を有効量の本発明のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性が阻害される工程を含む、本発明で関連することが示された１つ以上のｍｉＲＮＡの発現を阻害する方法を提供する。
【０１０４】
本発明は、さらに、ｍｉＲＮＡ（特に、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３）の発現または活性を阻害する治療有効量の化合物または薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における本発明のｍｉＲＮＡの発現またはｍｉＲＮＡの増大した発現に関連する状態（癌または他の過剰増殖障害など）を処置または予防する方法を含む。この方法の１つの態様では、化合物または薬剤は、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３の１つ以上のｍｉＲＮＡと特異的にハイブリッド形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴミアである。
【０１０５】
アッセイ
本発明の診断的および医学的な有用性は、哺乳動物（特に、ヒト患者）における癌、悪性疾患、リンパ腫、および／または白血病をスクリーニングするか評価するためのアッセイにおける本発明のｍｉＲＮＡ標的の使用にまで及ぶ。したがって、本発明は、そのｍｉＲＮＡの存在範囲の定量的分析またはその活性を模倣または遮断することができる薬物または他の薬剤の同定のための試験キットの形態で調製することができるアッセイ系を含む。
【０１０６】
さらに、
（ａ）候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡを発現する細胞をインキュベートする工程、および
（ｂ）候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡの発現または活性を検出または測定する工程
を含み、それにより、
候補化合物または薬剤の存在下対候補化合物または薬剤の非存在下でのｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡの発現の減少が、化合物または薬剤がｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択されるｍｉＲＮＡの発現を阻害することを示す、癌に関連する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現を阻害する化合物または薬剤の同定方法を提供する。
【０１０７】
方法の１つの態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を、ｍｉＲＮＡの量、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的である腫瘍抑制遺伝子の活性または発現、またはｍｉＲＮＡを発現する白血病細胞またはリンパ腫細胞の成長または生存度の決定によって評価する。例示的なかかる方法を本明細書中に提供するか（実施例中の方法が含まれる）、そうでなければ当業者に公知であり、そして／または当業者の能力の範囲内である。ｍｉＲＮＡ発現を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して決定することができる。例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的である腫瘍抑制遺伝子（例えば、Ｐｔｅｎ、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１、Ｐｈｆ６、Ｉｋｚｆ１、Ｎｆ１、およびＦｂｘｗ７から選択される）をモニタリングして、ｍｉＲＮＡの発現または活性を決定し、評価することができる。あるいは、白血病細胞またはリンパ腫細胞（Ｔ−ＡＬＬ患者の細胞サンプルまたはＴ−ＡＬＬ細胞株など）を、ｍｉＲＮＡの活性または発現の決定において成長について評価することができる。動物モデルも使用することができる。
【０１０８】
癌（リンパ腫または白血病が含まれる）を、１つ以上のｍｉＲＮＡ（特に、ｍｉＲ１９、ｍｉＲ２０、ｍｉＲ２６、ｍｉＲ９２、ｍｉＲ１４８、および／またはｍｉＲ２２３から選択される）の発現の決定によって評価またはモニタリングすることができる。したがって、本発明は、
（ａ）哺乳動物から血液または血球のサンプルを得る工程、
（ｂ）ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｃ）１つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
１つ以上のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１つの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する、哺乳動物における悪性疾患（血液学的悪性疾患が含まれる）の検出または評価方法を含む。
（ａ）哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
（ｂ）サンプル中のｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を測定する工程、および
（ｃ）少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する、哺乳動物における癌を検出または評価する方法を意図し、提供する。
【０１０９】
上記方法の１つの態様では、２つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、発現または活性が増加する。上記方法の１つの態様では、３つ以上のｍｉＲＮＡの発現または活性を測定し、比較し、発現または活性が増加する。さらなる態様では、癌は、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される。特定の態様では、癌は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫から特に選択される血液学的悪性疾患である。特定の態様では、癌は、白血病（特に、Ｔ−ＡＬＬ）である。
【０１１０】
当業者は、癌のｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルまたは動物異種移植研究を使用して、本発明のｍｉＲＮＡの役割をさらにまたは付加的にスクリーニング、評価、および／または検証し、本発明のｍｉＲＮＡのモジュレーター（アンタゴミアが含まれる）を評価、同定、および特徴づける（ｍｉＲＮＡ発現の調整、ｍｉＲＮＡ標的遺伝子またはタンパク質の調整、ならびに腫瘍の進行、成長、耐性、および／または浸潤の阻害のさらなる評価が含まれる）ことができる。例示的な癌または腫瘍モデル（ノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬのマウスモデルが含まれる）を提供し、本明細書中の実施例で使用する。（Ｐｅａｒ  ＷＳら、（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３（５）：２２８３−２２９１；Ｗｅｎｄｅｌ  ＮＨＧら、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４２８（６９８０）：３３２−３３７）。適切な動物モデルには、種々の癌および過剰増殖状態のモデルが含まれるが、これらに限定されない。任意の適切な癌モデルを使用することができる。例示的且つ有用な血液学的悪性疾患の動物モデルには、Ｖａｖ遺伝子調節配列（ＶａｖＰ）によって調節されるＢｃｌ２導入遺伝子を使用した濾胞性リンパ腫モデル（Ｅｇｌｅ  Ａら、（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３（６）：２２７６−２２８３）；免疫グロブリンμまたはκエンハンサーにカップリングさせたｃ−ｍｙｃ癌遺伝子を使用したリンパ性悪性疾患トランスジェニックマウスモデル（Ａｄａｍｓ  ＪＭら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１８（６０４６）：５３３−３８）が含まれる。
【０１１１】
多数の蛍光物質が公知であり、標識として使用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシファーイエローが含まれる。特定の検出物質は、ヤギ中で調製され、イソチオシアナートを介してフルオレセインと結合体化させた抗ウサギ抗体である。ｍｉＲＮＡ標的またはその結合パートナーを、放射性元素または酵素で標識することもできる。放射性標識を、任意の現在利用可能な計数手順によって検出することができる。好ましい同位体を、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択することができる。
【０１１２】
酵素標識が同様に有用であり、現在使用されている比色分析技術、分光光度的技術、蛍光分光光度的技術、電流測定技術、または気体定量技術のうちのいずれかによって検出することができる。酵素を、架橋分子（カルボジイミド、ジイソシアナート、およびグルタルアルデヒドなど）との反応によって選択された粒子に結合体化させる。これらの手順で使用することができる多数の酵素は公知であり、使用することができる。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが好ましい。代わりの標識物質および方法のその開示の例として米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号、および同第４，０１６，０４３号が参照される。
【０１１３】
本発明のさらなる実施形態では、疑われる標的または癌細胞における所定のｍｉＲＮＡの活性または能力の有無を決定するための専門医による使用に適切な市販の試験キットを調製することができる。上で考察した試験技術によれば、かかるキットの１つのクラスは、勿論、選択される方法（例えば、「競合的方法」など）に応じて、少なくとも標識されたｍｉＲＮＡまたはその結合パートナー（例えば、腫瘍抑制遺伝子）および説明書を含むであろう。キットはまた、その他の試薬（緩衝液、安定剤など）を含むこともできる。
【０１１４】
組成物
本発明は、さらに、本発明の治療方法の実施で有用な治療組成物を意図する。本治療組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤（キャリア）および有効成分としての本明細書中に記載のアンタゴミア、オリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ標的アンタゴニストのうちの１つ以上を混合物で含む。好ましい実施形態では、組成物は、本発明のｍｉＲＮＡの標的細胞（特に、癌細胞または前癌細胞）内のその標的への特異的結合を調整することができる薬剤を含む。
【０１１５】
有効成分としてアンタゴミア、オリゴヌクレオチド、またはｍｉＲＮＡアンタゴニストを含む治療組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。典型的には、かかる組成物を、注射液（溶液または懸濁物のいずれか）として調製するが、注射前の液体での溶液、または懸濁物に適切な固体形態も調製することができる。調製物を乳化することもできる。治療有効成分を、しばしば、薬学的に許容可能であり、且つ有効成分と適合する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなどおよびその組み合わせである。さらに、必要に応じて、組成物は、有効成分の有効性を増強する少量の補助剤（湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）を含むことができる。
【０１１６】
アンタゴミア、オリゴヌクレオチド、またはｍｉＲＮＡアンタゴニストを、薬学的に許容され得る塩の中和形態として治療組成物に処方することができる。薬学的に許容され得る塩には酸付加塩が含まれ、この塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸など）または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマンデル酸など）を使用して形成される。遊離カルボキシル基から形成された塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄など）および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなど）から誘導することができる。
【０１１７】
治療用アンタゴミア、オリゴヌクレオチド、またはｍｉＲＮＡアンタゴニスト含有組成物を、例えば、単位用量の注射によって慣習的に静脈内投与する。用語「単位用量」は、本発明の治療組成物に関連して使用する場合、ヒトのための単位投薬量として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は、必要な希釈剤（すなわち、キャリアまたはビヒクル）と関連して所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性物質を含む。
【０１１８】
組成物を、投薬処方物に適合する様式および治療有効量で投与する。投与量は、処置すべき被験体、被験体の免疫系が有効成分を使用する能力、および所望のｍｉＲＮＡ能力の阻害または中和の程度に依存する。必要な有効成分の正確な投与量は、施術者の判断に依存し、各個体に特有である。
【０１１９】
本明細書中で使用する場合、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味する。
【０１２０】
治療組成物は、さらに、有効量の核酸またはオリゴヌクレオチド、および１つ以上の以下の有効成分または活性薬剤を含むことができる：化学療法薬、放射線治療薬、免疫調節薬、有糸分裂阻害剤。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物を、局所処置または全身処置のいずれが望ましいかおよび処置すべき領域に応じて多数の方法で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮が含まれる）、経口、または非経口であり得る。非経口投与には、点滴または注入、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射、肺投与（例えば、吸入またはガス注入による）、または髄腔内もしくは脳室内投与が含まれる。経口投与のために、その吸収および分布特性のために少なくとも１つの２’置換リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが特に有用であることが見出されている。米国特許第５，５９１，７２１号（Ａｇｒａｗａｌら、．）は、経口投与に適切であり得る。局所投与用処方物には、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、および増粘剤などが必要であり得るか望ましいかもしれない。コーティングしたコンドームおよびグローブなども有用であり得る。経口投与用組成物には、粉末または顆粒、水または非水性媒質の懸濁物または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。非経口、髄腔内、または脳室内投与用の組成物には、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物も含むことができる滅菌水溶液が含まれ得る。かかる薬学的キャリアに加えて、オリゴヌクレオチド取り込みを容易にするためにカチオン性脂質を処方物中に含めることができる。取り込みを容易にすることが示されている１つのかかる組成物は、リポフェクチン（ＢＲＬ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）である。
【０１２２】
投与は、処置される状態の重症度および応答性に依存し、一連の処置は数日から数ヵ月または治癒するか病状が軽減するまで継続する。最適な投与計画を、体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、至適投薬量、投与方法、および反復速度を容易に決定することができる。至適投薬量は、個別のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて変化し得、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの動物研究におけるＩＣ５０またはＥＣ５０に基づいて計算することができる。例えば、化合物の分子量（オリゴヌクレオチド配列および化学構造から得られる）および有効用量（ＩＣ５０など）（例えば、実験的に得られる）を考慮して、用量（ｍｇ／ｋｇ）を日常的に計算する。
【０１２３】
当該分野で周知のように、ＤＮＡ配列を、適切な発現ベクター中での発現調節配列への作動可能な連結およびこの発現ベクターの適切な単細胞宿主の形質転換のための使用によって発現することができる。本発明のＤＮＡ配列の発現調節配列へのかかる作動可能な連結には、勿論、依然としてＤＮＡ配列の一部ではない場合、ＤＮＡ配列の上流の正確な読み取り枠での開始コドン（ＡＴＧ）の提供が含まれる。
【０１２４】
広範な種々の宿主／発現ベクター組み合わせを、本発明の核酸配列の発現で使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体配列、非染色体配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターには、ＳＶ４０および公知の細菌プラスミドの誘導体（例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびその誘導体、プラスミド（ＲＰ４など）；ファージＤＮＡＳ（例えば、λファージの多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９））および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および一本鎖繊維状ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（２μプラスミドまたはその誘導体）；真核細胞に有用なベクター（昆虫細胞または哺乳動物細胞で有用なベクターなど）；およびプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせ由来のベクター（ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列が使用されるように改変されたプラスミドなど）などが含まれる。広範な種々の単細胞宿主細胞はまた、本発明のＤＮＡ配列の発現で有用である。これらの宿主には、周知の真核生物宿主および原核生物宿主（大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌（酵母など）、および動物細胞（ＣＨＯ細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、およびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）など）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、ならびに組織培養のヒト細胞および植物細胞の株など）が含まれ得る。
【０１２５】
全てのベクターではないが、発現調節配列および宿主が本発明の核酸配列を発現するように等しく十分に機能すると理解されるであろう。全ての宿主が同一の発現系を用いて十分に等しく機能するわけではないであろう。しかし、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく所望の発現を達成するために過度の実験を行うことなく適切なベクター、発現調節配列、および宿主を選択することができるであろう。例えば、ベクターの選択では、ベクターが宿主中で機能しなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も考慮されるであろう。
【０１２６】
発現調節配列の選択では、通常、種々の要因が考慮されるであろう。これらには、特に潜在的な二次構造に関して、例えば、系の相対強度、その調節性、および発現すべき特定の核酸配列または遺伝子との適合性が含まれる。適切な単細胞宿主を、例えば、選択したベクターとのその適合性、その分泌特性、そのタンパク質を正確に折り畳む能力、およびその発酵要件、ならびに発現すべきＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製の容易さを考慮して選択するであろう。
【０１２７】
合成ＤＮＡ／ＲＮＡ配列により、ｍｉＲＮＡアナログまたは「ムテイン」を発現する遺伝子を都合良く構築可能である。あるいは、ムテインをコードするＤＮＡを、未変性のＲＮＡ、遺伝子、またはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作製することができ、ムテインを、従来のポリペプチド合成を使用して直接作製することができる。タンパク質への非天然アミノ酸の一般的な部位特異的組み込み方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（Ａｐｒｉｌ  １９８９）に記載されている。本方法を使用して、非天然アミノ酸を有するアナログを作製することができる。
【０１２８】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼにいくらか類似する様式で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、一定のｍＲＮＡがそれ自体のイントロンを切り出す能力を有するという所見から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列の修飾により、研究者は、ＲＮＡ分子中の特異的なヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を操作することができた（Ｃｅｃｈ，１９８８．）。これらは配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活化される。研究者は、２つのリボザイム型（テトラヒメナ型および「ハンマーヘッド」型）を同定している（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８）。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基配列を認識する一方で、「ハンマーヘッド」型は、１１〜１８塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、標的ｍＲＮＡ種中で排他的に起こる可能性がより高い。したがって、ハンマーヘッド型リボザイムは、テトラヒメナ型リボザイムよりも特異的ｍＲＮＡ種の不活化に好ましく、１８塩基認識配列はより短い認識配列より好ましい。
【０１２９】
本発明を、本発明の例として提供した以下の非限定的な実施例を参照してより深く理解することができる。以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために示すが、これらの実施例は、本発明の範囲を制限すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【０１３０】
実施例１
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、正常な発生、分化、および疾患（癌が含まれる）に関与する生物学的過程の遍在性制御因子である。これらは、転写レベルおよび翻訳レベルでの遺伝子発現の制御によって作用する（Ｂａｒｔｅｌ，２００４）。ｍｉＲＮＡの１７〜９２クラスターは造血系癌で高発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリンパ球増殖およびｃ−Ｍｙｃ誘導性白血病誘発／リンパ腫誘発を増強する（Ｈｅら、２００５）（Ｘｉａｏら、２００８）。１７〜９２クラスターおよびそのパラログはまた、多様な固形腫瘍（乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺、および胃由来の固形腫瘍が含まれる）で発現される（Ｖｏｌｉｎｉａら、２００６）（Ｐｅｔｒｏｃｃａら、２００８）。
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ造血形質転換アッセイを使用して、本発明者らは、驚いたことに、１７〜９２クラスター中のｍｉＲＮＡのうちでｍｉＲ−１９のみの過剰発現がインターロイキン−３（ＩＬ３）枯渇ＦＬ５−１２リンパ球をアポトーシス死から防御することを決定した。本発明者らはまた、：（１）ｍｉＲ−１９が浸潤性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）白血病およびリンパ腫（Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびバーキットリンパ腫が含まれる）で高度に過剰発現されるが、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫ではそうではないことを証明し、（２）ｍｉＲ−１７〜９２クラスターがＴ細胞受容体遺伝子座［ｔ（１３；１４）（ｑ３２；ｑ１１）］と並列して第２の転座と共に生じ、それにより、構成的に活性化／短縮された（エクソン２９〜３４）ノッチ１形態を発現するＴ−ＡＬＬに関連する新規の（しかし、おそらく稀な）染色体再配列を同定し、そして（３）ｍｉＲ−１９がノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬおよびｃ−Ｍｙｃ誘導性バーキットリンパ腫の両方を促進することを証明した。
【０１３２】
造血形質転換アッセイにおいてｍｉＲ−１９の活性を再利用するｓｈＲＮＡの不偏性遺伝子スクリーニングを使用して、本発明者らは、リンパ球生存に関与するｍｉＲ−１９標的として以下の８つの遺伝子（５つがｍｉＲ−１９シード配列を有する）を同定した：Ｂｉｍ（アポトーシス促進性）、Ｐｔｅｎ（腫瘍抑制因子）、Ｐｒｋａａ１（ＡＭＰ活性化キナーゼのαサブユニット）、Ｐｐｐ２ｒ５ｅ（ＰＰ２Ａのεイソ型）、およびＤｏｃｋ５（細胞質分裂−５のデディケーター（ｄｅｄｉｃａｔｏｒ））（その全てが直接のｍｉＲ−１９標的である）、ならびにＦｏｘＯｌおよびＦｏｘＯ３（Ｆｏｘ転写因子）およびＢｎｉｐ３（Ｒｈｅｂ／ｍＴＯＲおよびＢｃｌ２結合タンパク質の制御因子）（これらはそうではない）。
【０１３３】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（ｍｉＲ−１９結合部位およびｍｉＲ−１９アンタゴミアの変異分析と組み合わせたレポーターアッセイ）を使用して、本発明者らは、Ｂｉｍ、Ｐｔｅｎ、Ｐｒｋａａ１、およびＰｐｐｐ２ｒ５ｅの発現がリンパ球中でｍｉＲ−１９によって直接制御されること、および造血形質転換アッセイにおいて各遺伝子がリンパ球生存に寄与することを確認した。さらに、ｍｉＲ−１９は、ＰＴＥＮではそうでなかったが、タンパク質レベルでＰＰＰ２Ｒ５Ｅ、ＰＲＫＡＡ１、およびＢＩＭを明確に減少させた一方で、ｍｉｒＲ−１９アンタゴミアはｍｉＲ−１９標的タンパク質ＰＰＰ２Ｒ５Ｅ、ＰＲＫＡＡ１、ＢＩＭ、およびＰＴＥＮのレベルを増加させた（マウスＤｏｃｋ５遺伝子はヒト遺伝子中に存在するｍｉＲ−１９シードマッチを含まず、ＦＬ５−１２細胞におけるｍｉＲ−１９の標的ではない）。
【０１３４】
これらのデータは、ｍｉＲ−１９が細胞生存のＰＩ−３Ｋ関連プログラムと協調し、特異的治療レジメンに対する応答の予想および／または治療に対する応答のモニタリングのための白血病およびリンパ腫の診断のためにｍｉＲ−１９発現の測定を使用することができることを証明している。これらは、さらに、癌（ｍｉＲ−１９が過剰発現した血液悪性疾患が含まれる）に対して有効な治療薬としてのｍｉＲ−１９のアンタゴニスト／アンタゴミアを示す。
【０１３５】
ｍｉＲ−１９の発癌活性は、１７〜２９クラスターのｍｉＲＮＡとそのパラログとの間で固有である
確立された造血形質転換のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（Ｐｌａｓ，Ｔａｌａｐａｔｒａ，Ｅｄｉｎｇｅｒ，Ｒａｔｈｍｅｌｌ，＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００１）を使用して、１７〜９２クラスターおよびそのパラログ内の重要な発癌活性を同定した。固有のシード配列ファミリーを示す全てのｍｉＲＮＡ（具体的には、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ｂ−１（ｍｉＲ−１９）、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、およびｍｉＲ−２５）を試験した（図１ａ）。アッセイは、ＩＬ３から除去した場合にアポトーシスを受けるＦＬ５−１２リンパ球のＩＬ３依存性に基く。競合実験では、ＦＬ５−１２細胞を、ＧＦＰ＋個別のｍｉＲＮＡまたは空のベクターで部分的に形質導入し、これらの混合した集団を、その相対的比率の変化について蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によってモニタリングした（図１ｂ）。ｍｉＲ−１９を発現するＦＬ５−１２細胞はＩＬ３枯渇の際に親細胞を超えて迅速に富化され、他のｍｉＲＮＡはこの防御効果に関連しなかった（ｔ検定によってｍｉＲ−１９：ｐ＜０．００２、全ての他のｍｉＲＮＡおよびベクターｐ＞０．０５）（図１ｃ）。この効果は、主に、アポトーシスからの防御に起因し、細胞周期動態を有意に変化させなかった（図２）。それ故、１７〜９２クラスターおよびそのパラログ内で、ｍｉＲ−１９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリンパ球生存を増強する異なる能力を有する。
【０１３６】
ｍｉＲ−１９は一定の白血病およびリンパ腫で高発現され、Ｔ細胞白血病における新規の染色体再配列の標的である
ヒトリンパ悪性疾患におけるｍｉＲ−１９の発現を評価した。扁桃腺由来の非悪性リンパ球と比較して、Ｔ−ＡＬＬにおいてｍｉＲ−１９発現が５〜１７倍増加し、Ｂ−ＡＬＬではいくらかより少なく増加した（図３ａ）。さらに、新規の再配列がＴ−ＡＬＬにおいて認められた−ｍｉＲ−１７〜９２クラスターがＴ細胞受容体遺伝子座（ＴＣＲＡ／Ｄ）と並列する転座（ｔ（１３；１４）（ｑ３２；ｑ１１））（図３ｂおよびｃならびに図４）。この変化は、第２の転座ｔ（９；１４）（ｑ３４；ｑ１１）（他のＴＣＲＡ／Ｄ対立遺伝子に影響を及ぼし、構成的に活性な短縮形態のノッチ１（エクソン２９〜３４）を発現させる）と共に起こる（図５）（Ｐａｌｅｒｍｏ、ら、．，２００６），（Ｅｌｌｉｓｅｎら、１９９１）。ｍｉＲ−１９はまた浸潤性Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬおよびバーキットリンパ腫など）で高発現されたが、無痛性濾胞性リンパ腫ではあまり豊富でなかった。特に、ＦＬ５−１２細胞中のｍｉＲ−１９のレトロウイルス発現は、いくつかの腫瘍標本における発現に匹敵するレベルであった（図３ａ）。したがって、ｍｉＲ−１９は浸潤性のリンパ性癌で高発現し、Ｔ細胞白血病における新規の染色体再配列の標的である。
【０１３７】
ｍｉＲ−１９はｉｎ  ｖｉｖｏで浸潤性のＴ細胞系統悪性疾患およびＢ細胞系統悪性疾患の発症を駆動する
ｍｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ悪性疾患の発症を駆動することができるだろうか？ｍｉＲ−１９発現および転座データに基づいて、ｍｉＲ−１９をＴ−ＡＬＬマウスモデルにおいて評価した（Ｐｅａｒら、１９９６）。簡潔に述べれば、ほとんどのＴ−ＡＬＬ症例はノッチ１遺伝子中に変異を有し、ｔ（９；１４）（ｑ３４；ｑ１１）転座のように、これらはノッチ１の構成的に活性な細胞内ドメイン（ノッチ−ＩＣＮ）を生成する（Ｗｅｎｇら、２００４）。ｍｉＲ−１９のｉｎ  ｖｉｖｏでノッチ−ＩＣＮ誘導性Ｔ−ＡＬＬを促進する能力を試験するために、ＨＰＣを照射レシピエントに養子導入した（図３ｄ）。ノッチ−ＩＣＮおよびｍｉＲ−１９を発現するＨＰＣを投与したマウスはＴ−ＡＬＬをすぐに発症し、これらの全動物は２ヵ月以内に瀕死の状態であった。同時に、ノッチ−ＩＣＮのみを発現するＨＰＣを投与した８０％のマウスは無疾患のままであった（ｐ＝０．０００３）（図３ｅ）。病理学により、血液塗抹標本上の豊富な芽球、骨髄、脾臓、およびリンパ節の浸潤、ならびにＴ細胞マーカーの排他的発現を用いてＴ−ＡＬＬの診断を確認した（図３ｆ〜ｈおよび図６）。ｍｉＲ−１９は、バーキットリンパ腫のΕμΜｙｃモデルで類似の効果を示した。これは、全クラスターについて報告されるように（Ｈｅら、２００５）、ｐ５３依存性アポトーシスの遮断によってｃ−Ｍｙｃと協力する能力を示した（図７）。それ故、ｍｉＲ−１９は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ細胞系統およびＴ細胞系統から生じる浸潤性悪性疾患における癌遺伝子として作用する。
【０１３８】
ｍｉＲ−１９の発癌活性を担う標的の同定
標的予想および遺伝子発現分析。ｍｉＲ−１９の発癌活性を担う分子標的を決定した。最初に、コンピュータ標的同定および遺伝子発現分析を組み合わせた。Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎにより、９３８種のヒトおよび７４４種のマウスの潜在的ｍｉＲ−１９標的を検索した。ｍｉＲ−１９またはベクターで形質導入したＦＬ５−１２細胞における遺伝子発現プロフィールは、中程度の発現の変化しか示さなかった（平均倍率変化０．２±標準偏差（ＳＤ）０．３９］（図８）。全体的にみて、予想される全ｍｉＲ−１９標的（Ｐｔｅｎ腫瘍抑制遺伝子が含まれる）の発現レベルは、他の遺伝子よりも減少した（ｐ＜２ｅ−０４、コルモゴロフ・スミルノフ検定による）。しかし、より明白な（１．５または２ＳＤ）発現の減少を示す遺伝子のうちでｍｉＲ−１９標的の有意な富化は認められなかった（２ＳＤでｐ＞０．４６；１．５ＳＤでｐ＞０．０７７、フィッシャーの正確検定）（図８）。
【０１３９】
ｍｉＲ−１９標的のための不偏機能アッセイとしてのショートヘアピンＲＮＡ遺伝子スクリーニング。不偏遺伝子スクリーニングがリンパ球生存に関与するｍｉＲ−１９標的を同定するための代替法であり得ると仮定した。具体的には、そのノックダウンが、リンパ球中のｍｉＲ−１９を表現型模写する遺伝子のｓｈＲＮＡスクリーニング（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００４）がｍｉＲ−１９の活性を担う遺伝子を同定すると仮定した。対照実験を、Ｂｉｍ（Ｂｃｌ２Ｌ１１）（公知の１７〜９２クラスターの標的）に対するｓｈＲＮＡを使用して行った（図９ａ〜ｃ）。約１，０００個のｓｈＲＮＡプールでのＦＬ５−１２細胞の形質導入および２サイクルのＩＬ３枯渇または完全培地中での継代を含むスクリーニングプロトコール（図１０ａ）を考案した。カスタムハーフヘアピンアレイ（Ｃｈａｎｇ，Ｅｌｌｅｄｇｅ，＆  Ｈａｎｎｏｎ，２００６）を使用して、１または２ラウンドの選択（Ｔ１およびＴ２）後の処理（ＩＬ３−）サンプル対未処理（ＩＬ３＋）サンプルにおけるｓｈＲＮＡの存在量の変化を測定した。教師なしクラスタリングは、生物学的レプリケート間で良好な再現性を示し（Ａ−Ｃ；平均相関ｒ＝０．６０±０．１７）、その後のＩＬ３枯渇サイクルを使用したｓｈＲＮＡにおいて進行性のシフトを示した（図１０ｂ）。統計ツールを使用して、生物学的に有意なシグナルを同定した。マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）により、個別のｓｈＲＮＡの変化を同定し（図１０ｃ）、一方で、遺伝子組分析（ＧＳＡ）により、同一の遺伝子をターゲティングするｓｈＲＮＡ群を定義した。ＧＳＡにより、少なくとも２つ且つ５つまでの異なるｓｈＲＮＡによってそれぞれターゲティングされる１４遺伝子が同定された。最上位の「ヒット」は、５つの独立したｓｈＲＮＡによってターゲティングされたＡＭＰ活性化キナーゼのαサブユニット（Ｐｒｋａａ１）であった（図１０ｄ）。
【０１４０】
ショートヘアピンＲＮＡを使用した推定ｍｉＲ−１９標的の検証。候補遺伝子を、同一のｓｈＲＮＡ実験系を使用して最初に検証した。ＧＳＡ分析から同定されたほぼ全ての遺伝子および任意の閾値を超える（１．６５倍超の増加、ｐ＜０．０５）ＳＡＭ分析由来のタンパク質コード遺伝子が含まれていた。全体で、７０超の遺伝子および典型的にはそれぞれをターゲティングする３つのｓｈＲＮＡを再試験した。最終的に、８つの遺伝子をターゲティングするｓｈＲＮＡにより、ＩＬ３を枯渇したＦＬ５−１２細胞において生存上の利点が得られた（三連の実験、ベクター（示さず）に関してｐ＞０．２および８つ全てのｓｈＲＮＡに関してｐ＜０．０５、ｔ検定）（図１０ｅ）。顕著には、これらの遺伝子のうちの５つはｍｉＲ−１９シード配列を保有していた。アポトーシス促進性Ｂｉｍに加えて、これらは、腫瘍抑制遺伝子Ｐｔｅｎ、ＡＭＰ活性化キナーゼのαサブユニット（Ｐｒｋａａ１）、ＰＰ２Ａのεイソ型（Ｐｐｐ２ｒ５ｅ）、および細胞質分裂−５遺伝子のデディケーター（Ｄｏｃｋ５）であった。さらに、直接的なｍｉＲ−１９標的ではなかった３つの遺伝子（すなわち、ＦｏｘＯ転写因子であるＦｏｘＯ１およびＦｏｘＯ３およびＢｎｉｐ３（Ｒｈｅｂ／ｍＴＯＲおよびＢｃｌ２結合タンパク質の制御因子））も、ｍｉＲ−１９の標的として本アッセイで検証した。まとめると、ｍｉＲ−１９のように挙動するｓｈＲＮＡの不偏遺伝子スクリーニングの結果は、ｍｉＲ−１９結合部位を含む遺伝子の非常に有意な富化を示す（ｐ＜７．１７ｅ−０７フィッシャーの正確検定）（図１１ａ）。ヒトＤｏｃｋ５遺伝子と異なり、マウス遺伝子はｍｉＲ−１９標的であると予想されないが、マウスゲノムについての富化統計の計算により高有意水準が確認された（ｐ＜３．２  ｅｘｐ−０５、フィッシャーの正確検定による）（図１１ｂ）。同様に、同定された遺伝子は、造血細胞生存におけるｍｉＲ−１９の機能的に関連する標的である。結果的に、これらは、癌（具体的には、血液悪性疾患）処置のための潜在的な治療標的を示す。
【０１４１】
ｍｉＲ−１９がｍｉＲ−１９標的として同定された遺伝子の発現を制御することの確認。ｍｉＲ−１９はｍｉＲ−１９の標的として同定された遺伝子の発現を実際に制御するのであろうか？ｑＲＴ−ＰＣＲは、ｍｉＲ−１９がＦＬ５−１２細胞およびマウスＴ−ＡＬＬサンプルにおけるＰｔｅｎ、Ｐｐｐ２ｒ５ｒ、Ｐｒｋａａ１、およびＢｉｍのｍＲＮＡレベルを１／２まで減少させたことを証明した（図１２ａおよび図１３）。レポーターアッセイおよびｍｉＲ−１９結合部位の変異誘発により、これらの遺伝子のｍｉＲ−１９結合部位を介した３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の直接的な阻害が確認された（図１４）。逆に、ｍｉＲ−１９に対するアンタゴミアがｍＲＮＡレベルを増加させ（図１２ｂ）、ｍｉＲ−１９およびアンタゴミアの両方がタンパク質レベルに測定可能な影響を及ぼした。例えば、ｍｉＲ−１９は、ＰＰＰ２Ｒ５Ｅ、ＰＲＫＡＡ１、およびＢＩＭを明確に減少させ（図１２ｃ）、リボゾームＳ６リン酸化（ＰＩ３Ｋ活性の下流読み出し）を直接活性化した（図１５）。ｍｉＲ−１９がＰＴＥＮタンパク質に検出可能な影響を及ぼさなかった一方で、そのｍＲＮＡは明確に減少した。アンタゴミアは、全ｍｉＲ−１９標的タンパク質（ＰＴＥＮが含まれる）増加させた（図１２ｄ）。予想通り、ｍｉＲ−１９もアンタゴミアもＢｎｉｐ３に影響を及ぼさなかった（図１２ｃおよびｄ）。また、マウスＤｏｃｋ５遺伝子はヒト遺伝子中に存在するシードマッチを含まず、したがって、ＦＬ５−１２細胞における標的ではない。ｍｉＲ−１９発現と比較したアンタゴミアのより大きな影響は、これらの遺伝子が増殖細胞中で内因性ｍｉＲ−１９によって強力に（ｔｏｎｉｃａｌｌｙ）抑制されることを示し得る。これらの所見により、Ｂｉｍ、Ｐｒｋａａ１、Ｐｔｅｎ、およびＰｐｐ２ｒ５ｅの発現がリンパ球中のｍｉＲ−１９によって制御されることが確認される。
【０１４２】
ｍｉＲ−１９の発癌活性へのｍｉＲ−１９標的の相対的寄与の評価。新規のｍｉＲ−１９標的の相対的寄与を評価した。アポトーシス促進性ＢＩＭタンパク質はＢＣＬ２と対立し、リンパ球生存の重要な制御因子である（Ｂｏｕｉｌｌｅｔら、１９９９）。ｍｉＲ−１９がＢｉｍ非依存性効果を有するかどうかを評価するために、Ｂｃｌ２を安定に発現するように操作したＦＬ５−１２細胞（ＦＬ５−１２／Ｂｃｌ２細胞）を使用して相補性研究を行った。予想通り、Ｂｉｍ  ｓｈＲＮＡはさらなる利点を付与しなかったのに対して、ＰｔｅｎおよびＰｐ２ｒ５ｅに対するｍｉＲ１９およびｓｈＲＮＡは、Ｂｃｌ２の存在下で持続的な富化を示した（図１２ｅ）。逆に、ｍｉＲ−１９に対するアンタゴミアは、抗増殖効果を示さなかった。アンタゴミアを発現するＦＬ５−１２／Ｂｃｌ２細胞は継代の際に喪失した（図１２ｆ）。同様に、ｍｉＲ−１９の発現は、メトホルミン活性化ＡＭＰキナーゼまたはＰｔｅｎもしくはＰｐ２ｒ５ｅの発現の存在下で、連続的増殖に関連していた（図１６）。それ故、ｍｉＲ−１９は、複数の標的遺伝子（リンパ球におけるＰＩ３関連生存シグナルの制御因子が含まれる）を通して作用する（図１２ｇ）。
【０１４３】
材料と方法
細胞培養、生存度、増殖アッセイ、およびベクター構築物。ＦＬ５−１２マウスリンパ球、ＩＬ３枯渇研究、およびウイルス形質導入は記載の通りであった（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）（Ｐｌａｓ，Ｔａｌａｐａｔｒａ，Ｅｄｉｎｇｅｒ，Ｒａｔｈｍｅｌｌ，＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００１）。細胞周期およびＧｕａｖａ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＶｉａｃｏｕｎｔアッセイを使用したＤＮＡ染色色素（ＬＤＳ７５１）の取り込みに基づいた細胞周期および細胞死アッセイを、報告されているように行った（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）。レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に基づき、ｍｉＲ  １７、ｍｉＲ  １８ａ、ｍｉＲ  １９ｂ−１（ｍｉＲ−１９）、ｍｉＲ  １０６ａ、ｍｉＲ  １０６ｂ、ｍｉＲ  ２５をコードするｍｉＲＮＡ発現ベクター（Ｈｅら、２００５）、ノッチ−ＩＣＮ（Ｗ．Ｐｅａｒからの提供）（Ｐｅａｒら、１９９６）およびＢｃｌ２（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）をコードするベクター、各ｓｈＲＮＡベクター（図１７）、およびライブラリーベクター（ＭＲＰ）（図１８ａおよびｂ）が含まれる。ｍｉＲＮＡインヒビターオリゴヌクレオチド（アンタゴミア）ＭＺＩＰ  １９ａ−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ  １９ｂ−ＰＡ−１、およびスクランブルドコントロール（ＭＺＩＰ０００−ＰＡ−１）はＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【０１４４】
マウスの生成
レトロウイルスで形質導入したＨＰＣの養子移入に基づいたノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬおよびＥμＭｙｃリンパ種のマウスモデルが報告されている（Ｐｅａｒら、１９９６）、（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）。データを、統計的有意性についてのログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用してカプラン・マイヤー形式で分析した。ヘテロ接合性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＯＨ  ＰＣＲ）のｐ５３喪失および表面マーカー分析による免疫表現型検査は記載の通りであった（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）。
【０１４５】
ウェスタンブロット分析
全細胞溶解物由来の免疫ブロットを記載のように行った（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）。簡潔に述べれば、５０μｇのタンパク質／サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。抗体は以下に対する抗体であった：Ｐｒｋａａ１（２５３２、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２Ｌ１１（ＡＡＰ−３３０、１：１０００，Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）、ＦｏｘＯ１（９４５４５、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＦｏｘＯ３ａ（９４６７、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦｏｘＯ３ａ（９４６６５、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐｐｐ２ｒ５ｅ（ＮＢ  １００−８４５、ＮＯＶＵＳ）、Ｐｔｅｎ（９５５９、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、チューブリン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、Ｂ−５−１−２）、アクチン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、ＡＣ−１５）、Ｂｎｉｐ３（３７６９、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、リン酸化Ｓ６（２２１５、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、リン酸化Ａｋｔ（４０５８、１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、およびＤｏｃｋ５（Ａｌａｎ  Ｈａｌｌ（ＭＳＫＣＣ）からの提供）。増強型化学発光を検出のために使用した（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）。
【０１４６】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
総ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ富化ＲＮＡを、Ａｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）およびｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）をそれぞれ使用して細胞および腫瘍サンプルから抽出した。病理学的診断を、Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅの熟達した血液病理学者が行った。ｃＤＮＡ合成およびｑＲＴ−ＰＣＲおよびΔΔＣｔ法による分析は記載の通りであった（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを、以下のために使用した：Ｂｃｌ２Ｌ１１（Ｍｍ００４３７７９６＿ｍ１）、Ｄｏｃｋ５（Ｍｍ００５５５７５７＿ｍ１）、ＦｏｘＯ１（Ｍｍ００４９０６７２＿ｍ１）、ＦｏｘＯ３（Ｍｍ０１１８５７２２＿ｍ１）、Ｐｐｐ２ｒ５ｅ（Ｍｍ００８０３７５９＿ｍ１）、Ｐｒｋａａ１（Ｍｍ０１２９６６９５＿ｍ１）、およびＰｔｅｎ（Ｍｍ０１２１２５３２＿ｍ１）。マウスＧＡＰＤ（ＧＡＰＤＨ）（４３５２９３２）およびｍｉＲ−１９ｂ（０００３９６）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。発現を、ＲＮＵ６Ｂ（００１０９３，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して正規化した。
【０１４７】
ルシフェラーゼアッセイ
Ｄｏｃｋ５、Ｐｐｐ２ｒ５ｅ、Ｐｒｋａａ１、およびＢｉｍの３’−ＵＴＲフラグメントをＰＣＲによって生成し、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。記載のようにアッセイを行った（Ｘｉａｏら、２００８）。部位特異的変異誘発によって結合部位変異体を生成した。
【０１４８】
核型および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）分析
患者の初代リンパ芽球から作製した中期染色体調製物を、標準的手順にしたがって核型分析に供した。１３ｑ３２に存在するゲノムクローンＲＰ１１−９７Ｐ７およびＲＰ１１−９８０Ｄ６をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ＤＮＡを、ニック翻訳によってスペクトラムオレンジｄＵＴＰ蛍光色素（Ｖｙｓｉｓ，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して標識した。スペクトラムグリーン標識したＲＢ１プローブを、染色体１３ｑハイブリッド形成のコントロールとして使用した。細胞遺伝学的分析のために使用される細胞に対して標準的な方法によってＦＩＳＨを行った。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ６００顕微鏡に取りつけられたＣｙｔｏｖｉｓｉｏｎイメージングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ハイブリッド形成シグナルを、ＤＡＰＩ染色スライド上の少なくとも２０の中期スプレッドに関してスコアリングした。
【０１４９】
異常ノッチ１転写物の５’ＲＡＣＥ増幅
ＣｌｏｎｔｅｃｈのＮｕｃｌｅｏｔｒａｐ  ｍＲＮＡ抽出キットを用いて患者の初代リンパ芽球からｍＲＮＡを抽出し、ノッチ１遺伝子のエクソン２９配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＴＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＧ−３’）を使用してＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にて５’ＲＡＣＥを行った。
【０１５０】
プールｓｈＲＮＡライブラリースクリーニング
このプールｓｈＲＮＡスクリーニングの根底にあるテクノロジーが記載されており、ハーフヘアピンアレイ検出の使用も記載されている（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）、（Ｓｉｌｖａら、２００８）、（Ｃｈａｎｇ，Ｅｌｌｅｄｇｅ，＆  Ｈａｒｍｏｎ，２００６）。簡潔に述べれば、ｓｈＲＮＡライブラリーをＭＲＰベクターにクローニングし、ｐ５３  ｓｈＲＮＡについてタンパク質ノックダウンを確認した。ＦＬ５−１２細胞を、低感染多重度にて１，０００個のｓｈＲＮＡを含むライブラリープールで形質導入し、３つに分割し、それぞれを２サイクルのＩＬ３枯渇およびレスキューに供した。ＤＮＡ単離、組み込まれたｓｈＲＮＡまたは基準としてのライブラリーのＰＣＲ増幅のために生存度が回復した後にサンプルを回収し、標識し、ハイブリッド形成した。画像スキャン（Ａｘｏｎ  ４０００Ｂスキャナ）から作成したデータ（Ｎｉｍｂｌｅｓｃａｎソフトウェア）を、処理および分析のためにＲバージョン２．４にインポートした。各Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  １２−ｐｌｅｘカスタムアレイは、１２，０３３個のハーフヘアピンプローブからなる。ほとんどがライブラリー中でｓｈＲＮＡによって示され、残りをバックグラウンドの見積もりのために使用した。予想通り、これらのネガティブコントロールスポットは、各アレイ上の実験プローブよりも低い強度を示した。バックグラウンドより低いシグナル値をバックグラウンド概算値と置換して、低シグナルに起因する比率の高さを小さくした。次いで、各アレイについての２つのチャネルを、ＬＯＥＳＳ正規化を使用して正規化した。正規化された強度のｌｏｇ比を、さらなる分析で使用した。
【０１５１】
プールｓｈＲＮＡスクリーニングのためのデータ分析
分析を、Ｒ中、マイクロアレイ用Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ線形モデル（ＬＩＭＭＡ）（Ｙａｎｇ，Ｐａｑｕｅｔ，＆  Ｄｕｄｏｉｔ，２００６）、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，＆  Ｃｈｕ，２００１）、および遺伝子組分析（ＧＳＡ）（Ｅｆｒｏｎ  ＆  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，２００７）ライブラリーを使用して行った。生物学的レプリケート間の相関を、各時点について主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＰＣＡ）によって計算して実験効果および生物学的レプリケートの大きさを決定した。生物学的レプリケートは、実験におけるばらつきの主な原因を構成していなかった。生物学的レプリケートの平均相関は０．６０（±０．１７）であり、おそらく、集団が培養中に変動した確率変動を反映していた。生物学的に有意なシグナルをＳＡＭソフトウェアを使用して同定して、ｓｈＲＮＡの相対存在量の相違を反映するプローブを選択した。条件にわたる各特徴の独立したサンプルを想定する対応のない２クラスのアルゴリズムを使用した。Ｑ値を経験的に計算し、有意な特徴の同定のために使用した。全体的にみて、そのｓｈＲＮＡプローブが以下のこれらの基準を満たすことが見出された場合、遺伝子を潜在的候補とスコアリングした：倍率変化（ＦＣ）１．６５超、ｐ＜０．０５、および対応するタンパク質を伴う現在の遺伝子バンク注釈づけ。ＧＳＡを使用してさらなる試験を行って、同一遺伝子をターゲティングする複数のヘアピン由来のデータに基づいて候補を同定し（各遺伝子が２〜４つのヘアピンによってターゲティングされる場合）、その倍率変化をまとめている。この統計値を包括的順列由来の同一の統計値と比較して、各遺伝子の経験的ｐ値に到達させた。ＧＳＡ分析において正の倍率変化を示す全ての遺伝子組を検証に含めた（嗅覚受容体４８１を除く）。これらのカットオフは比較的任意であり、偽陽性を最小にするための控えめな基準として選択した。
【０１５２】
ｓｈＲＮＡオフターゲット効果のコンピュータ分析
いくつかのコンピュータ分析を行って、スクリーニングの結果がオフターゲット効果に寄与し得るかどうかを調査した。以下の２つの仮説を考慮した：（１）スクリーニングで過剰に出現したｓｈＲＮＡがｍｉＲ−１９自体と配列が類似し、したがって、３’ＵＴＲ中の部位を介してｍｉＲ−１９活性を模倣すること；（２）スクリーニングの結果が、少数の重要な遺伝子に及ぼすマイクロＲＮＡ様オフターゲット効果によって説明可能であること。
【０１５３】
第１の仮説のために、全ｓｈＲＮＡを、（ａ）ｍｉＲ−１９シード領域に対するｓｈＲＮＡ「シード」（２〜８位）および（ｂ）全長ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ配列に対するｓｈＲＮＡの非ギャップ配列類似性によってランク付けた。ライブラリー中のｓｈＲＮＡはｍｉＲ−１９と同一の７ｍｅｒシード領域を持たなかった；そのシード領域がｍｉＲ−１９の７ｍｅｒシードと６つの位置で適合したｓｈＲＮＡのうち（６ｍｅｒシード適合位置３〜８を有する１２のｓｈＲＮＡ、６ｍｅｒシード適合位置２〜７を有する２つのｓｈＲＮＡ）、スクリーニング中で過剰に出現した上位１００個のｓｈＲＮＡ中に存在したものはなかった。ライブラリー中のｓｈＲＮＡと全長ｍｉＲ−１９ａ／ｂ配列との間の最大配列類似性は、１３塩基非ギャップマッチであった；２３個のｓｈＲＮＡはｍｉＲ−１９ａおよび／またはｍｉＲ−１９ｂに対してこの程度の類似性を有していたが、スクリーニング由来の上位１００個の過剰に出現したｓｈＲＮＡ中に存在したものはなかった。さらに、スクリーニング中の過剰出現によるｓｈＲＮＡのランク付けとｍｉＲ−１９とのこれらの類似性比較との間のスピアマン順位相関（｜ｒｈｏ｜＜．０１）は低かった。
【０１５４】
次に、スクリーニング中で上位にランク付けられたｓｈＲＮＡが完全なライブラリーと比較してＰＴＥＮ、ＰＲＫＡＡ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｅ、ＤＯＣＫ５、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、およびＢＮＩＰ３に対する予想されるオフターゲット効果を有する可能性が高いかどうかを考慮した。これが正しかったならば、スクリーニング中のｓｈＲＮＡの過剰出現がこれらの重要な遺伝子のオフターゲットサイレンシングによって説明可能である。ｓｈＲＮＡの潜在的なマイクロＲＮＡ様オフターゲット効果を予想するために、全マウスゲノム中の３’ＵＴＲを、ライブラリー中のｓｈＲＮＡの７ｍｅｒシード配列に対する適合（２〜８位、保存フィルタなし）をスキャニングした。所与のｓｈＲＮＡについて７ｍｅｒシードマッチを有する遺伝子を、このｓｈＲＮＡの予想されるオフターゲットであると見なした。次いで、本発明者らは、８遺伝子のうちのいずれかについて、遺伝子を「オフターゲット」すると予想されるｓｈＲＮＡ組が、完全なｓｈＲＮＡライブラリーと比較してスクリーニング由来の上位Ｋまでの過剰に出現したｓｈＲＮＡ中で富化されるかどうかを試験した。２から２５０までの範囲のＫ値を使用し、任意のＫ値についてのフィッシャーの正確検定による統計的有意性（全ての場合において各遺伝子についてｐ＞０．０５）は認められなかった。これらのコントロールは、ｓｈＲＮＡがｍｉＲ−１９自体に類似しないこと、およびスクリーニングの結果を重要な遺伝子に対する上位にランク付けられたｓｈＲＮＡのオフターゲット効果によって説明できることを示す。
【０１５５】
ライブラリー中の約１２０００個のｓｈＲＮＡの固有の標的の数およびｍｉＲ−１９標的も予想されるこれらの標的のサブセットに関する富化統計値（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）を、少数の「ヒット」数を説明するためのフィッシャーの正確検定を使用して計算した。ヒトゲノムおよびマウスゲノムの両方についてこの分析を行った。標的予想を、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ５．１によって行った。
【０１５６】
発現アレイ分析
総ＲＮＡを上記のように単離し、ＲＮＡ  ６０００  ＮａｎｏＡｓｓａｙおよびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して品質について分析した。２ｍｇの総ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために使用した。ｃＲＮＡの合成、線形増幅、および標識を、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ）およびビオチン化ヌクレオチド（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって行った。次いで、１０マイクログラムの標識し、断片化したｃＲＮＡを、製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の説明書にしたがってＧｅｎｅＣｈｉｐとハイブリッド形成させた。チップを、ＧＳ３０００スキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）内でスキャニングし、ＧＣＯＳ１．４（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して定量し、Ｐａｒｔｅｋソフトウェア（Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ（商標）６．４）を使用して分析した。「Ｒ」ソフトウェアパッケージ中の「ａｆｆｙ」および「ｇｃｒｍａ」ライブラリーを使用して、マイクロアレイプローブレベルデータのロバストマルチアレイ分析（ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＭＡ）正規化を行った。さらに、「ｍａｓ５」関数を使用して、プローブのｐｒｅｓｅｎｔ／ａｂｓｅｎｔコールを同定した。１つを超えるプローブが技術的レプリケート中に存在しない場合、プローブをさらなる分析から除外した。プローブの正確な標的遺伝子を同定するために、ＲｅｆＳｅｑリリース３５由来のマウス転写物に対する「Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ４３０Ａ＿２  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」について「ｂｌａｓｔｎ」プログラムを使用してＢＬＡＳＴ検索を行った。パラメーター−ｖ１−ｂｌ−ｅ．０５−Ｓ１をＢＬＡＳＴ検索で使用した。遺伝子発現のｌｏｇ比を計算するために、プローブレベルデータにわたるメジアン分散分析（ｍｅｄｉａｎ  ｐｏｌｉｓｈ）を行って遺伝子発現値（すなわち、レプリケートにわたるプローブ強度のメジアンを算出し、同一遺伝子をターゲティングするプローブにわたるこれらのプローブ値のメジアンを使用した）を得、実験対コントロールのｌｏｇの相違を計算した。統計分析のために、遺伝子の平均ｌｏｇ２（発現の変化）を使用してデータを中心におき、全遺伝子にわたってｌｏｇ２の単位分散（発現変化）を有するように正規化した。この正規化により、データの拡張Ｚ変換（ｍｏｄｉｆｉｄ  Ｚ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（Ｚスコア）が得られる。
【０１５７】
コルモゴロフ・スミルノフ（ＫＳ）統計
ｍｉＲ−１９標的対全遺伝子の発現の変化を比較するために、そのｌｏｇ（発現変化）値の分布を、片側ＫＳ統計を使用して比較した。片側ＫＳ統計は、一方の組についての発現変化の分布が他の組の分布と比較して有意に下向きにシフトする（下方制御される）かどうかを評価する。ＫＳ統計は、経験的累積分布関数（ｃｄｆ）：
【０１５８】
【数１】
2013520197.tif 000006
は、ｎｊ（Ｚ変換後）ｌｏｇ（発現変化）値に基づいた遺伝子組ｊ＝１、２の経験的ｃｄｆである）の値の最大差を算出する。Ｍａｔｌａｂ関数ｋｓｔｅｓｔ２を使用して、ＫＳ試験統計量および漸近ｐ値を計算した。
【０１５９】
参考文献
【０１６０】
【化１】
2013520197.tif 000007
【０１６１】
【化２】
2013520197.tif 000008
【０１６２】
【化３】
2013520197.tif 000009
実施例２
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、正常な発生、分化、および疾患（癌が含まれる）に関与する生物学的過程の遍在性制御因子である。これらは、転写レベルおよび翻訳レベルでの遺伝子発現の調節によって作用する（Ｂａｒｔｅｌ，２００４）。ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現の制御は複雑である。多数のｍＲＮＡはその３’ＵＴＲ内に複数のｍｉＲＮＡのための結合部位を含み、ほとんどのｍｉＲＮＡは多数の遺伝子を潜在的にターゲティングすることができる（Ｂａｒｔｅｌ，２００４）。配列分析によって予想されるあらゆるｍｉＲＮＡ結合部位が表現型に寄与するわけではないことが明らかである。逆に、複数のｍｉＲＮＡが単一の細胞経路に影響を及ぼし得る（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）、（Ｌｉら、２００７）。
【０１６３】
Ｔ−ＡＬＬは、いくつかの協同する遺伝子病変の結果として生じる（Ａｉｆａｎｔｉｓ，Ｒａｅｔｚ，＆  Ｂｕ，２００８）。例えば、ほとんどの症例でノッチ１の活性化病変を保有し（Ｗｅｎｇら、２００４）、腫瘍抑制遺伝子（ＰＴＥＮ（Ｐａｌｏｍｅｒｏら、２００７）；ＮＦ１（Ｂａｌｇｏｂｉｎｄら、２００８）；ＰＨＦ６（Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅら、２０１０）；ＰＴＰＮ２（Ｋｅｐｐｅら、２０１０）；ＩＫＺＦ１（Ｄａｉｌら、２０１０）、（Ｗｉｎａｎｄｙ，Ｗｕ，＆  Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，１９９５）、（Ｍａｒｃａｉｓら、２０１０）、（Ｓｕｎら、１９９９）、（Ｍｕｌｌｉｇｈａｎら、２００７）；およびＦＢＸＷ７（Ｏ’Ｎｅｉｌら、２００７）、（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００７）が含まれる）はＴ−ＡＬＬにおける不活化体細胞変異または欠失の標的である。発癌性ｍｉＲ−１７〜９２クラスターは、Ｔ−ＡＬＬにおいてｔ（１３；１４）（ｑ３２；ｑｌ  １）転座によってターゲティングされる（Ｌａｎｄａｉｓ，Ｌａｎｄｒｙ，Ｌｅｇａｕｌｔ，＆  Ｒａｓｓａｒｔ，２００７）。各ｍｉＲＮＡは、現在、Ｔ−ＡＬＬに関与している（例えば、実施例１に記載のｍｉＲ−１９ｂ）（Ｍａｖｒａｋｉｓら、，２０１０）。ｍｉＲ１９ｂは発癌性ｍｉＲ−１７〜９２クラスターのメンバーである（図１ａも参照のこと）。種々の癌におけるｍｉＲＮＡ発現分析は、少数のｍｉＲＮＡのみが癌細胞中で高発現され、起源の組織を連想させるパターンを維持することを示している（Ｌｕら、２００５）、（Ｌａｎｄｇｒａｆら、２００７）。
【０１６４】
これらの研究では、本発明者らは、Ｔ−ＡＬＬおよび潜在的に他の癌に関連するｍｉＲＮＡを評価および決定するための３つの別個のアプローチを使用した。３つのアプローチ−ｍｉＲＮＡ発現分析、公知の腫瘍抑制遺伝子中の潜在的なｍｉＲＮＡ結合部位の分析、および発癌性ｍｉＲＮＡについての不偏スクリーニング−を使用して、Ｔ−ＡＬＬで潜在的に重要なｍｉＲＮＡを同定した。一定のこれらのｍｉＲＮＡのＴ−ＡＬＬの病原への寄与を、白血病誘発マウスモデルにおけるｍｉＲＮＡ自体の活性の評価およびヒトＴ−ＡＬＬ細胞株におけるｍｉＲＮＡに対するアンタゴミア活性の評価の両方によって確認した。
【０１６５】
ｍｉＲＮＡ発現分析。定量的ＰＣＲを使用して、５０種の臨床Ｔ−ＡＬＬ標本および１８種のＴ−ＡＬＬ細胞株における４３０個のｍｉＲＮＡの発現を測定した。ｍｉＲＮＡ発現パターンは、Ｔ−ＡＬＬ細胞および細胞株で高発現された１０種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−３４２）と非常に一致することが見出され、残りの４２０種のｍｉＲＮＡは有意により低いレベルで検出された。Ｔ−ＡＬＬ細胞および細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現パターンと精製前駆体（ＣＤ３４＋およびＣＤ３−ＣＤ４＋ＣＤ８＋）細胞および正常な（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−、およびＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）Ｔ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現パターンとの比較により、ｍｉＲ−２２３発現のＴ−ＡＬＬ特異的増加およびより少ない程度でのｍｉＲ−３７６およびｍｉＲ−６６２の発現のＴ−ＡＬＬ特異的増加が証明された。
【０１６６】
Ｔ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子中の潜在的なｍｉＲＮＡ結合部位の分析。潜在的なｍｉＲＮＡ結合部位についてのＴ−ＡＬＬの病原に関与する１２種の腫瘍抑制遺伝子の３’ＵＴＲの分析により、Ｔ−ＡＬＬに潜在的に関与するｍｉＲＮＡの体系が得られた。Ｔ−ＡＬＬ中で最も高度に発現する１０種のｍｉＲＮＡのうちの５種（具体的には、ｍｉＲ−２５／９２、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２２３、およびｍｉＲ−２０／９３／１０６）も、本分析において最高位にランク付けされた（同一の３’ＵＴＲ結合「シード」配列を有するｍｉＲＮＡを本分析およびその後の分析において共にグループ化し、同一のシード配列を有するｍｉＲＮＡが取り換え可能であり得ると理解すべきである）。
【０１６７】
発癌性ｍｉＲＮＡの不偏遺伝子スクリーニング。ｃ−ＭＹＣ形質導入マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のレトロウイルスｍｉＲＮＡライブラリーでの感染および１０％から０．１％への血清濃度の減少後に接着性を保持していた細胞を選択して、細胞をアポトーシス死から防御するｍｉＲＮＡを同定した。この最初のスクリーニングで同定されたｍｉＲＮＡが真に白血病誘発に関連し、単に成長停止に関連するのではないことを確実にするために、一次スクリーニングで同定されたＧＦＰタグ付きｍｉＲＮＡのライブラリーを使用して、インターロイキン−３（ＩＬ−３）依存性ＦＬ５−１２マウスプロＢ細胞に感染させた。ＩＬ−３枯渇後のＧＦＰ発現細胞の富化により、ＩＬ−３非依存性成長に関連するｍｉＲＮＡが同定された。ＦＬ５−１２細胞にＩＬ−３非依存性を付与することが確認された６つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０／９３／１０６、およびｍｉＲ−２５／９２（ｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬ細胞中で最も高度に発現し、且つｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子と潜在的に相互作用すると最も高位にランク付けされる）、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−２２３（ｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬ細胞中で最も高度に発現する）、およびｍｉＲ−１４８／１５２（ｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子と潜在的に相互作用すると最も高度にランク付けされる）であった。
【０１６８】
Ｔ−ＡＬＬに関与するｍｉＲＮＡの白血病誘発活性。次いで、Ｔ−ＡＬＬ白血病誘発で潜在的に重要であると同定された６つのｍｉＲＮＡの発癌潜在性をｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ＨＰＣをノッチ１＋ｍｉＲＮＡまたは空のベクターコントロールで形質導入し、ＨＰＣを照射した同系レシピエントに移植し、定期的に血球を計数してＴ−ＡＬＬの発症を検出した。レトロウイルスによって送達されたｍｉＲＮＡが白血病コントロールより２〜６倍高いレベルで発現したこのアッセイでは、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３はそれぞれＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ−ＡＬＬの発症を有意に促進した（一方で、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４およびｍｉＲ−３０はそうではなかった）。
【０１６９】
Ｔ−ＡＬＬに関与するｍｉＲＮＡに対するアンタゴミアの抗白血病誘発活性。最後に、ヒトＴ−ＡＬＬ細胞株（Ｔ−ＡＬＬ１、ＫＯＰＴＫ１、およびＪＵＲＫＡＴが含まれる）の成長速度および生存度に及ぼすｍｉＲＮＡアンタゴミアの影響を評価した。ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２６、およびｍｉＲ−９２に対するアンタゴミアは、成長速度を低下させ、細胞生存度を有意に低下させ、腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮおよびＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）を脱抑制（ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓ）させた（ｍｉＲ−１４８および無作為に選択したｍｉＲ−１８２に対するアンタゴミアはそうではなかった）。ｍｉＲ−２２３に対するアンタゴミアは、同様に、成長速度および細胞生存度を減少させた。各アンタゴミアの発現と比較して、Ｔ−ＡＬＬ細胞株におけるｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−９２に対するアンタゴミアまたはｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、およびｍｉＲ−２６ａに対するアンタゴミアの同時発現は、成長速度をより明確に減少させ、アポトーシス細胞の比率を２倍超にし、ＰＴＥＮおよびＢＣＬ２Ｌ１１の発現をより増加させ、ＰＴＥＮおよびＢＣＬ２Ｌ１１の３’ＵＴＲレポーター活性に付加的な影響を及ぼした。
【０１７０】
これらのデータは、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、およびｍｉＲ−２２３がヒトＴ−ＡＬＬにおける大部分のｍｉＲＮＡ発現を占め、その発現に対する重複しかつ協同する効果によってＴ−ＡＬＬの病原に関与する共通の腫瘍抑制遺伝子組（ＰＴＥＮ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＮＦＩ、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、およびＰＨＦ６が含まれる）の活性を下方制御し、動物モデルにおいてＴ−ＡＬＬを促進することができることを証明している。
【０１７１】
ミエロイド特異的ｍｉＲＮＡであると考えられたｍｉＲ−２２３（Ｆａｚｉら、２００５）、（Ｃｈｅｎ，Ｌｉ，Ｌｏｄｉｓｈ，＆  Ｂａｒｒｅｌ，２００４）、（Ｊｏｈｎｎｉｄｉｓら、２００８）は、ヒトＴ−ＡＬＬ中で選択的に上方制御される。ｍｉＲ−２２３は、ＮＯＴＣＨ１およびｃ−ＭＹＣのＥ３ユビキチンリガーゼとして作用するＦＢＸＷ７（ＣＤＣ４）の強力な制御因子であり、Ｔ−ＡＬＬの症例および他の癌の約２０％で変異している（Ｏ’Ｎｅｉｌら、２００７）、（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００７）、（Ｍａｓｅｒら、２００７）。他のｍｉＲＮＡも正常な前駆体および／または分化Ｔ細胞で見出されており、おそらく、さらなる変異の状況においてのみその発癌潜在性を達成する。
【０１７２】
ｍｉＲ−１４８は、消化管癌（特に胃癌および結腸直腸癌）に関与している（Ｃｈｅｎ  Ｙら、（２０１０）Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １４（７）：ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１６０５−０１０−１２０２−２）。ｍｉＲ−１４８のＲＴ−ＰＣＲ分析を使用したさらなる細胞株発現研究では、いくつかの肝細胞株（ＨＬＦ、ＨＬＥ、およびＨｅｐＧ２細胞）でｍｉＲ１４８発現の増加が認められており（データ示さず）、肝臓癌におけるｍｉＲ−１４８のさらなる役割を意味付けている。
【０１７３】
本データは、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３の発現の測定を血液悪性疾患（Ｔ−ＡＬＬが含まれる）の診断、特異的治療レジメンに対する応答の予測、および／または治療に対する応答のモニタリングのために使用することができることを示す。これらのデータは、さらに、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３（特に、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−９２、および／またはｍｉＲ−２２３）のアンタゴニスト／アンタゴミアが単独または特に組み合わせて、癌（血液悪性疾患が含まれる）およびｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４８、および／またはｍｉＲ−２２３を過剰発現する任意の癌または状態に対する候補治療薬であるという証拠を提供する。
【０１７４】
結果
Ｔ−ＡＬＬ細胞および細胞株で高発現したｍｉＲＮＡの同定
不偏ｍｉＲＮＡライブラリースクリーニングを使用して、ヒトＴ−ＡＬＬ中のｍｉＲＮＡ発現パターンを決定した（図１９ａ）。定量的ＰＣＲ（Ｍｅｓｔｄａｇｈら、２００９）を使用して、異なる細胞遺伝学的群を代表する５０種の臨床Ｔ−ＡＬＬ標本（Ａｉｆａｎｔｉｓ，Ｒａｅｔｚ，＆  Ｂｕ，２００８）（ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＨＯＸＡ、およびＴＡＬ１／ＬＭＯ２が含まれる）および一連の１８種のヒトＴ−ＡＬＬ細胞株中の４３０種のｍｉＲＮＡの発現を測定した。１０種のｍｉＲＮＡが高発現されたのに対して、ほとんどの他のｍｉＲＮＡは辛うじて検出可能であった。これらの「上位１０」ｍｉＲＮＡは以下であった（発現レベルに関して降順）：ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−３４２（図１ｂ）。全体的なｍｉＲＮＡ発現パターンは細胞遺伝学的群の間で酷似しており、ヒトＴ−ＡＬＬ細胞株においても保存されていた（図１９ｃ、図２０ａ）。精製前駆体（ＣＤ３４＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３−）細胞集団および正常な（ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋ダブルポジティブ、ＣＤ４＋シングルポジティブ、またはＣＤ８＋シングルポジティブ）Ｔ細胞集団との比較により、ｍｉＲ−２２３発現は白血病特異的に増加し、ｍｉＲ−３７６およびｍｉＲ−６６２の発現の白血病特異的増加は遥かに小さかったことが明らかとなった（図２０ｂおよびｃ）。それ故、少数のｍｉＲＮＡがヒトＴ−ＡＬＬで高発現する。
【０１７５】
Ｔ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子中の潜在的なｍｉＲＮＡ結合部位の分析。次に、コンピュータによるアプローチを使用して、Ｔ−ＡＬＬの病原に潜在的に重要なｍｉＲＮＡを同定した。Ｔ−ＡＬＬの病原に関与する１２種の腫瘍抑制遺伝子（具体的には、ＦＢＸＷ７（Ｏ’Ｎｅｉｌら、２００７）、（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００７）；ＰＴＥＮ（Ｐａｌｏｍｅｒｏら、２００７）；ＰＨＦ６（Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅら、２０１０）；ＰＴＰＮ２（Ｋｌｅｐｐｅら、２０１０）；ＩＫＺＦ１（Ｄａｉｌら、２０１０）、（Ｗｉｎａｎｄｙ，Ｗｕ，＆  Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，１９９５）、（Ｍａｒｃａｉｓら、２０１０）、（Ｓｕｎら、１９９９）、（Ｍｕｌｌｉｇｈａｎら、２００７）；ＮＦ１（Ｂａｌｇｏｂｉｎｄら、２００８）；ＢＣＬ２Ｌ１１（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）；ＣＤＫ８；サイクリンＣ；ＮＬＫ；ＲＢＩ；およびｐ５３）の３’ＵＴＲを、潜在的なｍｉＲＮＡ結合部位について分析した（Ｌｅｗｉｓ，Ｓｈｉｈ，Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｂａｒｔｅｌ，＆  Ｂｕｒｇｅ，２００３）、（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｆａｒｈ，Ｂｕｒｇｅ，＆  Ｂａｒｔｅｌ，２００９）。予想通り、多数のｍｉＲＮＡがこれらの遺伝子に結合したので、累積状況スコア（表３）の計算または保存された７ｍｅｒ部位および８ｍｅｒ部位（共に広範に保存されたｍｉＲＮＡシードファミリーに制限される）の数の加算によって順位を作成した。顕著には、最も高発現した１０種のｍｉＲＮＡのうちの５種も、本分析で最も高くランク付けされたｍｉＲＮＡに含まれた（ｐ＜ｌ  ｅ−４（富化についてウィルコクソンを使用））。したがって、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ／９３、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−９２、およびｍｉＲ−２２３はＴ−ＡＬＬ中で高発現され、Ｔ−ＡＬＬにおいて腫瘍抑制遺伝子をターゲティングすると予想された。故に、Ｔ−ＡＬＬ標的腫瘍抑制遺伝子において１０種の最も豊富に発現したｍｉＲＮＡのうちの５種がこの癌に関与していた。
【０１７６】
【表４】
2013520197.tif 000010
ａ状況スコアを、予想される部位での状況の特徴（局所ＡＵ含量、ｍｉＲＮＡの３’末端の予想される結合、３’ＵＴＲ中の位置）のｍｉＲＮＡトランスフェクション実験における下方制御の程度と相関させて計算し、このスコアはｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の強度を示す。負の値が大きいほど有効な部位に相当する。−０．１未満の値のみを示す。スコアを、０．１単位まで四捨五入する。
ｂ分析に含まれる１２の全遺伝子の和を計算する。
ｃ同一のシード配列を有する相同ｍｉＲＮＡを示す。
【０１７７】
白血病誘発性ｍｉＲＮＡの不偏遺伝子スクリーニング。最後に、白血病誘発性ｍｉＲＮＡの不偏ｍｉＲＮＡライブラリースクリーニングを行った。２工程の同胞選択プロトコールを使用した。簡潔に述べれば、ｍｉＲＮＡを、ｃ−ＭＹＣ（Ｅｖａｎら、１９９２）（Ｔ−ＡＬＬにおけるノッチ１の重要な下流エフェクターである）によって誘導されるアポトーシスからマウスＭＥＦ細胞を防御する能力について最初にスクリーニングした（Ｐａｌｏｍｅｒｏら、２００６）、（Ｗｅｎｇら、２００６）、（Ｋｌｉｎａｋｉｓ，Ｓｚａｂｏｌｃｓ，Ｐｏｌｉｔｉ，Ｋｉａｒｉｓ，Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ，＆  Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，２００６）。ｃ−ＭＹＣ形質導入ＭＥＦにレトロウイルスｍｉＲＮＡライブラリーを感染させ、１０％から０．１％への血清濃度の減少後に接着性を保持する細胞を回収し、これらの接着細胞が保有する形質導入ｍｉＲＮＡを同定した。この最初のスクリーニングで同定されたｍｉＲＮＡ（高発現したｍｉＲ−２５／９２、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−２２３（図２１ｂ）が含まれる）が真に白血病誘発に関連し、単に成長停止に関連するのではないことを確実にするために（Ｓｅｏａｎｅ，Ｌｅ，＆  Ｍａｓｓａｇｕｅ，２００２）、次いで、ｍｉＲＮＡを、リンパ球におけるサイトカイン非依存性成長を促進する能力についてスクリーニングした（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）（図２１ａ）。二次ライブラリーを生成するために、一次スクリーニング由来の全ｍｉＲＮＡをサブクローニングし、ＦＬ５−１２リンパ球を、ＧＦＰレポーターと共に各ｍｉＲＮＡを発現するプールしたベクターで部分的に形質導入した。ＩＬ−３枯渇およびＧＦＰ発現細胞の富化後、配列分析によって最も豊富なｍｉＲＮＡを同定した（図２１ｃ）。同一のＦＬ５−１２リンパ球アッセイにおける最も豊富な各ｍｉＲＮＡの再試験により、ｍｉＲ−１４８ａ／１５２、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−２５／９２、およびｍｉＲ−２０ａ／１０６がＦＬ５−１２細胞にＩＬ−３非依存性を付与することが確認された（図２１ｄ）。
【０１７８】
相補アプローチにより、Ｔ−ＡＬＬにおける複数の潜在的な白血病誘発性ｍｉＲＮＡを同定する。これらの結果を図２１ｅにまとめている。簡潔に述べれば、ＦＬ５−１２細胞にＩＬ−３非依存性を付与することが確認された６種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０／９２／１０６、およびｍｉＲ−２５／９２（ｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬ細胞および細胞株中で最も高度に発現し、且つｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子と潜在的に相互作用すると最も高度にランク付けされる）、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−２２３（ｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬ細胞中で最も高度に発現する）、およびｍｉＲ−１４８／１５２（ｍｉＲＮＡのうちでＴ−ＡＬＬに関与する腫瘍抑制遺伝子と潜在的に相互作用すると最も高度にランク付けされる）であった。故に、相補アプローチは、Ｔ−ＡＬＬにおける一連の潜在的に発癌性のｍｉＲＮＡを定義する。
【０１７９】
Ｔ−ＡＬＬに関与するｍｉＲＮＡの白血病誘発活性。ノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬのマウスモデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで最も有望なｍｉＲＮＡの発癌潜在性を直接試験した。簡潔に述べれば、ＨＰＣを、空のベクターまたはｍｉＲＮＡのいずれかと共にノッチ１で形質導入し、照射した同系レシピエントに移植した。定期的な血球計数によって動物を白血病発症についてモニタリングした（図２２ａ）。第１に、空のベクター（ｎ＝１３）と比較したｍｉＲ−１９ｂ（ｎ＝７、ｐ＜０．０１）による疾患の促進を確認した（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）。類似の疾患の促進が、ｍｉＲ−２０ａ（ｎ＝４、ｐ＜０．００１）、ｍｉＲ−２６ａ（ｎ＝５、ｐ＜０．００１）、ｍｉＲ−９２（ｎ＝５、ｐ＝０．０２）、およびｍｉＲ−２２３（ｎ＝７、ｐ＜０．０１）を用いて見出された。典型的には、これらのｍｉＲＮＡで形質導入したＨＰＣを投与した動物が７５日目までに急性白血病を発症する一方で、ｍｉＲ−３０を投与したベクターコントロールまたは動物（ｎ＝５、ｐ＝０．１５）の８０％超がこの時点で無疾患のままである（図２２ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニングおよび予想に基づいて、さらなるｍｉＲＮＡを試験した。具体的には、ｍｉＲ−１４８は有意な疾患の促進に関連し（ｎ＝７、ｐ＜０．０１）、ｍｉＲ−２７は疾患促進の強い傾向を示した一方で（ｎ＝５、ｐ＝０．０５）、ｍｉＲ−２３（ｎ＝５、ｐ＞０．０５）やｍｉＲ−２４（ｎ＝５、ｐ＞０．０５）はいかなる影響も示さなかった（図２３ａ）。病理学的分析により、全白血病がＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ−ＡＬＬであり（図２１ｂ）、Ｋｉ６７によって高増殖性を示し、ＴＵＮＥＬによるアポトーシスを欠き、白血病動物の肺、肝臓、および脳に広く浸潤したことが明らかとなった（図２２ｃ）。定量的ＰＣＲは、コントロール由来の白血病細胞と比較してレトロウイルスで送達されたｍｉＲＮＡによって駆動された白血病細胞における２倍および６倍のｍｉＲＮＡの発現の増加を証明した（図２３ｃ）。したがって、マウスＴ−ＡＬＬモデルにおける癌遺伝子としてｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２３が挙動し、より少ないｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−１４８／１５２も挙動する。
【０１８０】
Ｔ−ＡＬＬに関与するｍｉＲＮＡによってターゲティングされる遺伝子。ノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬの発症を促進するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ標的遺伝子のコンピュータ分析で最高位にランク付けされたｍｉＲＮＡのうちで有意に富化されるようである（シード数または状況スコアについての経験的ｐ値はｐ＜１  ｅ−４）（表３）。この所見を、不偏機械学習アプローチを使用して試験した。簡潔に述べれば、ｌａｓｓｏ回帰を使用して、白血病誘発性ｍｉＲＮＡとノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬの発症を促進しなかった無作為選択したｍｉＲＮＡの群との間を区別する標的遺伝子を同定した。少数のポジティブトレーニング例（白血病誘発性ｍｉＲＮＡ）のみが利用可能であったので、異なるネガティブトレーニング組を使用して学習手順を５０回反復することによって安定性分析を行った。ＦＢＸＷ７（４６／５０ランで同定）、ＢＣＬ２Ｌ１１（２１／５０ラン）、およびＰＴＥＮ（１１／５０ラン）は、１５種の遺伝子のうちでこの分析で最も頻繁に同定された。
【０１８１】
これらの標的遺伝子予測を、マウス白血病の３’ＵＴＲレポーターアッセイ（図２４ａ）の使用、定量的ＰＣＲ（図２４ｂ）、および免疫ブロット（図２４ｃ〜ｇ）アッセイによって実験的に試験した。ｍｉＲ−１９ｂは、ＰＴＥＮおよびＢＣＬ２Ｌ１１発現を制御する（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）。ｍｉＲ−２０ａはＢＣＬ２Ｌ１１に類似の影響を及ぼし、ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−２６ａの両方は白血病細胞中のＰＴＥＮおよびＰＨＦ６タンパク質ならびにｍＲＮＡのレベルを減少させる。ｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−１４８ａは、ＩＫＺＦ１、ＮＦ１、およびＦＢＸＷ７を制御する。同様に、ｍｉＲ−９２はＩＫＺＦ１およびＦＢＷＸ７に影響を及ぼすが、マウスＮＦ１をターゲティングしない。予想通り、ｍｉＲ−２２３は、ＦＢＸＷ７レポーター活性およびタンパク質レベルを強力に制御する。ｍｉＲＮＡ形質導入ＦＬ５−１２細胞における所見により、これらの結果が強く確認された（図２５）。それ故、白血病誘発性ｍｉＲＮＡは、Ｔ−ＡＬＬにおいて６種の腫瘍抑制遺伝子に部分的に重複する影響を及ぼす。
【０１８２】
これらの腫瘍抑制遺伝子の生理学的有意性を確実にするために、同一のマウスノッチ１誘導性Ｔ−ＡＬＬモデルを使用してノックダウン分析を行った。簡潔に述べれば、ＰＴＥＮ（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）、ＢＣＬ２Ｌ１１（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）、ＮＦ１、ＰＨＦ６、およびＦＢＸＷ７（図２６）、ならびにドミナントネガティブＩＫＺＦ１対立遺伝子（Ｄｎ−Ｉｋｚｆ１）（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＆  Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ、２００３）に対するｓｈＲＮＡを、上記の同一の養子移入モデルで使用した。これらの実験により、ＰＴＥＮ（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）およびＢＣＬ２Ｌ１１（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）ならびにＮＦ１（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）、ＰＨＦ６（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）、およびＤｎ−Ｉｋｚｆ１（ｎ＝１０、ｐ＜０．０１）に対するｓｈＲＮＡによるノッチ１誘発白血病の発症の促進が確認された。ＦＢＸＷ７は傾向を示したが、有意性には到達しなかった（ｎ＝４、ｐ＝０．１）（図２７ａ）。ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡはその機構およびおそらくその標的ノックダウン効率が異なり得るが、これらの結果はノッチ１誘発性Ｔ−ＡＬＬにおけるこれらの遺伝子の腫瘍抑制機能を示す。
【０１８３】
Ｔ−ＡＬＬに関与するｍｉＲＮＡに対するアンタゴミアの抗白血病活性。複数のｍｉＲＮＡによる腫瘍抑制遺伝子制御の多面性および部分的に重複するパターンを考慮して、２つのヒトＴ−ＡＬＬ細胞株（Ｔ−ＡＬＬ１およびＫｏｐｔｋ１）の成長速度および生存度に及ぼすｍｉＲＮＡアンタゴミアの影響を評価した。ヒトＴ−ＡＬＬ１細胞株は、高レベルのｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−９２を発現するが、他のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１４８ａおよび無作為選択したｍｉＲ−１８２は低レベルでしか発現されない（図２７ｂ挿入図）。ｍｉＲ−１９ａ／ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−９２に対するアンタゴミアは、成長速度を低下させ（図２７ｂ）、細胞生存度を有意に減少させ（ｐ＜０．０５；ベクターと比較した各アンタゴミア）（図２７ｃ）、腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮおよびＢＣＬ２Ｌ１１を脱抑制する（図２７ｄおよびｅ）。対照的に、ｍｉＲ−１４８ａおよびｍｉＲ−１８２に対するアンタゴミアは、ＰＴＥＮまたはＢＣＬ２Ｌ１１の増殖、生存度、発現に有意な影響を示さなかった（ｐ＞０．０５）。Ｋｏｐｔｋ１細胞株における結果は、Ｔ−ＡＬＬ１細胞株における結果と類似していた（図２８）。同様に、ｍｉＲ−２２３に対するアンタゴミアは、Ｔ−ＡＬＬ１、Ｋｏｐｔｋ１、およびＪｕｒｋａｔＴ−ＡＬＬ細胞株における細胞増殖を減少させる（図２９）。それ故、各ｍｉＲＮＡは、Ｔ−ＡＬＬにおける生存度および腫瘍抑制遺伝子発現に寄与して影響を及ぼし、したがって、これらのｍｉＲＮＡをターゲティングするアンタゴニストまたはアンタゴミアはＴ−ＡＬＬ患者の処置における有用な薬剤であること予想される。
【０１８４】
共通の標的遺伝子に結合するｍｉＲＮＡは協同的抗白血病効果を示す。ｍｉＲ−１９ａ／ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−９２に対するアンタゴミアの同時発現は、個別のアンタゴミアよりもＴ−ＡＬＬ１細胞の成長に強い影響を及ぼした（ｐ＜０．００１、組み合わせアンタゴミア対ベクター）（図２７ｂ）。細胞生存度に及ぼす影響はさらにより明白であり、短期アッセイにおいて３つのアンタゴミアのアポトーシスが個別のアンタゴミアにおけるものの２倍であった（図２７ｃ）。したがって、併用処置により、個別のアンタゴミアと比較してＢＣＬ２Ｌ１１およびＰＴＥＮ発現がより大幅に増加した（図２７ｄおよびｅ）。同様に、ｍｉＲ１９ｂおよびｍｉＲ−９２またはｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−９２の同時発現は、ＢＣＬ２Ｌ１１およびＰＴＥＮの３’ＵＴＲレポーター活性にそれぞれさらなる影響を及ぼした（図２７ｆおよびｇ）。したがって、高発現ｍｉＲＮＡ群は、ヒトＴ−ＡＬＬ細胞において協同的効果を示す。したがって、これらのｍｉＲＮＡ群をターゲティングするアンタゴニストまたはアンタゴミアの投与は、Ｔ−ＡＬＬ患者の処置において付加的または相乗的利点を有すると予想される。
【０１８５】
材料と方法
Ｔ−ＡＬＬ患者サンプル。５０人のＴ−ＡＬＬ患者の診断用骨髄サンプルを、異なる欧州の施設から得た（ＵＺ  Ｇｈｅｎｔ，Ｇｈｅｎｔ；ＵＺ  Ｌｅｕｖｅｎ，Ｌｅｕｖｅｎ；Ｈｏｐｉｔａｌ  Ｐｕｒｐａｎ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ；ＣＨＵ  ｄｅ  Ｎａｎｃｙ−Ｂｒａｂｏｉｓ，Ｖａｎｄｏｅｕｖｒｅ−Ｌｅｓ−Ｎａｎｃｙ）。得られたＴ−ＡＬＬ患者のコホートは、１５人のＴＡＬ／ＬＭＯ（７人のＬＭＯ２再配列および８人のＳＩＬ−ＴＡＬ）、１２人のＨＯＸＡ（４人のＭＬＬ再配列、６人のｉｎｖ（７）（ｐ１５ｑ３５）、および２人のＣＡＬＭ−ＡＦ１０）、１０人のＴＬＸ３および５人のＴＬＸ１再配列患者のサンプルからなる。残りの８人のＴ−ＡＬＬ患者を、既知のＴ−ＡＬＬ亜群に分類することができない。白血病サンプル由来の総ＲＮＡを、以前に記載のように（Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅら、２００６）ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して単離した。本研究（２００８／５３１）は、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって承認された。
【０１８６】
Ｔ−ＡＬＬ細胞株。１８種のＴ−ＡＬＬ細胞株（ＤＮＤ−４１、ＭＯＬＴ−１６、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＲＰＭ１−８４０２、ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＫＥ−３７、ＢＥ−１３、ＨＳＢ−２、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＬＯＵＣＹ、ＰＦ−３８２、ＰＥＥＲ、ＭＯＬＴ−３、ＣＵＴＬＬ１、ＣＴＶ−１、Ｐ１２−ＩＣＨＩＫＡＷＡ、Ｔ−ＡＬＬ１、およびＫＯＰＴＫ１）およびＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を、１５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％カナマイシン、および１％グルタミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で培養した。白血病細胞株由来の総ＲＮＡを、製造者のプロトコールにしたがってｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して単離した。
【０１８７】
正常なＴ細胞集団のサブセット。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）のガイドラインにしたがって、小児胸腺を入手し、使用した。５つの正常なＴ細胞集団のサブセット（ＣＤ３４＋、ＣＤ３−ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−、およびＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用したＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）での細胞の分取またはＭＡＣＳおよびマイクロビーズの使用によって得た（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｌｌｅ、ら、．、２００９）。ＣＤ３４＋胸腺細胞を、ＣＤ３４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したＭＡＣＳの使用によって小児胸腺から得た。ダブルポジティブ（ＤＰ）ＣＤ３−ＣＤ４＋ＣＤ８＋およびＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３−フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８−フィコエリトリン（ＰＥ）、およびＣＤ４−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）での総胸腺懸濁物の染色によって分取した。シングルポジティブＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−およびＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を分取するために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の使用によって未熟なＣＤ１＋胸腺細胞の枯渇を最初に行い、より成熟した細胞が豊富な得られた集団を、その後にＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、およびＣＤ４−ＡＰＣで標識した。正常なＴ細胞集団の異なるサブセットの純度は、常に少なくとも９８％であった。総ＲＮＡを、製造者のプロトコールにしたがってｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して単離した。
【０１８８】
マイクロＲＮＡプロファイリング。ｍｉＲＮＡの高処理リアルタイム定量を、ｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡ合成のためのステムループ逆転写酵素（ＲＴ）プライマーの使用によって行い、その後に予備増幅工程およびＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を行った（Ｃｈｅｎら、２００５）。簡潔に述べれば、白血病患者サンプル、白血病細胞株、または正常なＴ細胞サブセット由来の２０ｎｇの総ＲＮＡを、４４８種のスモールＲＮＡ（４３０種のｍｉＲＮＡおよび１８種のスモールＲＮＡコントロールを含む）のｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡ合成のためのｍｅｇａｐｌｅｘＲＴステムループプライマープールの使用によって逆転写した。次に、ｃＤＮＡの予備増幅を、Ｔａｑｍａｎ  ＰｒｅＡｍｐマスターミックス（２ｘ）およびＰｒｅＡｍｐプライマーミックス（５×）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーおよびユニバーサル逆方向プライマーからなる）の使用による１４サイクルＰＣＲ反応にて行った（Ｍｅｓｔｄａｇｈら、２００８）。最後に、４４８種のスモールＲＮＡを、４０サイクルＰＣＲプロトコールを使用して各サンプルについてプロファイリングした。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を、全て、遺伝子最大化ストラテジーを使用して７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にて行った（Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ，Ｍｏｒｔｉｅｒ，Ｄｅ  Ｐａｅｐｅ，Ｆｒａｎｋ  Ｓｐｅｌｅｍａｎ，＆  Ｊｏ  Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，２００７）。ＳＤＳソフトウェアバージョン２．１を使用して、自動ベースライン設定および閾値０．０５にてｒａｗ  Ｃｑ値を計算した。本発明者らは、定量的ＰＣＲデータの正規化のための正規化因子として所与のサンプル中の全発現ｍｉＲＮＡの平均発現値を使用した。Ｃｑ値３５超のｍｉＲＮＡを、非発現と見なした（Ｍｅｓｔｄａｇｈら、２００９）。
【０１８９】
細胞培養、生存度、増殖アッセイ、およびベクター構築物。ＦＬ５−１２マウスプロＢリンパ球、細胞周期およびアポトーシス研究、ならびにウイルス形質導入は記載の通りであった（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）、（Ｐｌａｓ，Ｔａｌａｐａｔｒａ，Ｅｄｉｎｇｅｒ，Ｒａｔｈｍｅｌｌ，＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００１）。Ｔ−ＡＬＬ細胞株（Ｊｕｒｋａｔが含まれる）を、１０〜２０％ウシ胎児血清，１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯ２下の加湿環境にて３７℃で培養した。全ベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に基づき、記載の全ｍｉＲＮＡをコードするｍｉＲＮＡ発現ベクター（Ｈｅら、２００５）、ノッチ１−ＩＣＮ（Ｐｅａｒら、１９９６）、および各ｓｈＲＮＡベクター（ｓｈＲＮＡによるタンパク質ノックダウン；図１０）が含まれる。ｍｉＲＮＡプールライブラリー（Ｈｅら、２００５）はＧ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎから惜しみなく提供され、約３００個のｍｉＲＮＡを含むようにＰＣＲクローニングによって拡大されている。アンタゴミアＭＺＩＰ１９ａ−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ１９ｂ−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ２６ａ−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ９２ａ−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ１４８ａ−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ１８２−ＰＡ−１、ＭＺＩＰ２２３−ＰＡ−１、およびスクランブルドコントロール（ＭＺＩＰ０００−ＰＡ−１）は、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【０１９０】
ライブラリースクリーニング。一次スクリーニングは、ＭＥＦにおけるｃ−ＭＫＣ誘導性アポトーシスに基づく（Ｅｖａｎら、１９９２）。ＭＥＦを、ｃ−ＭＹＣおよびｍｉＲＮＡライブラリーで形質導入し、均一なｃ−ＭＹＣ発現を選択するためにピューロマイシン中で培養し、アポトーシスを、１０％から０．１％への血清希釈によって誘発した。生存細胞は接着性を示したままであり、これらをＤＮＡ単離、組み込んだｍｉＲＮＡライブラリー構築物のＰＣＲ増幅、ｐＧＥＭ−Ｔベクターへのサブクローニング、細菌形質転換、および約１００コロニーの配列同定のために回収した。二次ライブラリーを、一次スクリーニング由来の全ｍｉＲＮＡのＭＳＣＶ構築物へのサブクローニングによって構築した。二次スクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦＬ５−１２リンパ球のＩＬ−３依存性に基づく（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）、（Ｐｌａｓ，Ｔａｌａｐａｔｒａ，Ｅｄｉｎｇｅｒ，Ｒａｔｈｍｅｌｌ，＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００１）。ＦＬ５−１２細胞をプールしたＧＦＰタグ付きライブラリーで部分的に形質導入し、ＩＬ−３枯渇によって選択した。ｍｉＲＮＡを上記のように同定した。各ｍｉＲＮＡを、その後に同一のＦＬ５−１２アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏで検証した。
【０１９１】
マウスの生成。マウスＴ−ＡＬＬモデルが報告されている（Ｐｅａｒら、１９９６）、（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）。データを、統計的有意性についてのログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用してカプラン・マイヤー形式で分析した。表面マーカー分析は記載の通りであった（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）。
【０１９２】
ウェスタンブロット分析。全細胞溶解物の免疫ブロットを記載のように行った（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）。抗体は以下に対する抗体であった：Ｂｉｍ／Ｂｃｌ２１１１（ＡＡＰ−３３０、１：１０００、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）、Ｎｆ１（ｓｃ６７、１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｃｄｃ４／Ｆｂｘｗ７（ａｂ７４０５、１：５００、Ａｂｅａｍ）、Ｉｋｚｆ１（ｓｃ−１３０３９、１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｐｈｆ６（ＮＢ１００−７９８６１、１：１０００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｐｔｅｎ（９５５９，１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、チューブリン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、Ｂ−５−１−２）、およびアクチン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、ＡＣ−１５）。
【０１９３】
遺伝子発現についてのリアルタイム定量的ＰＣＲ。総ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ富化ＲＮＡを、Ａｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰｒｏｔｅｉｎおよびｍｉＲＮｅａｓｙミニキットを使用して抽出した。病理学的診断を、Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの熟達した血液病理学者が行った。ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、およびΔΔＣｔ法による分析は記載の通りであり（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを使用した：Ｂｃｌ２１１１（Ｍｍ００４３７７９６＿ｍ１）、ＢＣＬ２Ｌ１１（Ｈｓ００１９７９８２＿ｍ１）、Ｐｔｅｎ（Ｍｍ０１２１２５３２＿ｍ１）、ＰＴＥＮ（Ｈｓ０２６２１２３０＿ｓ１）、  Ｎｆ１（Ｍｍ００８１２４３０＿ｍｌ）、ＮＦ１（Ｈｓ０１０３５１０４＿ｍ１）、Ｉｋｚｆ１（Ｍｍ０１  １８７８７８＿ｍｌ）、ＩＫＺＦ１（Ｈｓ００１７２９９１＿ｍ１）、Ｆｂｘｗ７（Ｍｍ００５０４４５２＿ｍ１）、ＦＢＸＷ７（Ｈｓ００２１  ７７９４＿ｍ１）、Ｐｈｆ６（Ｍｍ００８０４４１５＿ｍ１）、およびマウスＧＡＰＤ（ＧＡＰＤＨ）（４３５２９３２，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。発現を、ＲＮＵ６Ｂ（００１０９３，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して正規化した。
【０１９４】
ｍｉＲＮＡ−標的遺伝子相互作用のコンピュータ分析。
【０１９５】
トレーニングデータ。教師つき学習アプローチを行って、全スクリーニングを通過したｍｉＲＮＡ（＋１クラス）と通過しなかったｍｉＲＮＡ（−１クラス）とを区別することができる小さな標的遺伝子組を不偏的方法で同定するように試みた。ポジティブｍｉＲＮＡに共通の標的遺伝子組を同定するためにデザインしたが、本アプローチはまた、ネガティブｍｉＲＮＡによって共通にターゲティングされる遺伝子を同定することができる。スクリーニングによって検証されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０／９３、ｍｉＲ−２５／９２、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２７ａｂ）を、ポジティブトレーニングデータ（＋１クラス）として使用した。最終段階で検証できなかった３種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２４）およびＴ−ＡＬＬ中で高発現されたが、最初のスクリーニングで検証できなかった５種のさらなるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１６）を、ネガティブトレーニングデータ（−１クラス）として使用した。
【０１９６】
標的の予想。各ｍｉＲＮＡのシード配列（位置２：８）を使用して、保存ｍＲＮＡ標的を、相補配列がマウスおよびヒトオルソログの両方の３’ＵＴＲで生じる標的と定義した。両ＵＴＲ由来の最小数のシードマッチを、各ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ対の保存された７ｍｅｒ計数（ｃｏｕｎｔ）として使用した。Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎを使用して、Ｒｅｆｓｅｑ（リリース４２）を使用してマウスおよびヒトの３’ＵＴＲ配列を抽出した。複数のＲｅｆＳｅｑ転写物が単一の遺伝子に認められる場合、最長の３’ＵＴＲを使用した。
【０１９７】
ｌａｓｓｏ回帰。ｌａｓｓｏ回帰を使用して、ポジティブｍｉＲＮＡとネガティブｍｉＲＮＡを区別する遺伝子組を同定した。このアプローチでは、各ｍｉＲＮＡ（ポジティブまたはネガティブ）を、全ての可能な遺伝子にわたって保存された７ｍｅｒのシード計数のそのベクトルＸｍｉＲによって示す。この回帰は、ポジティブ（ｒｅｓｐ．ネガティブ）ｍｉＲＮＡの保存された７ｍｅｒのシード計数の加重和が＋１（ｒｅｓｐ．−１）に近いように、遺伝子にわたる重みベクトルｗを学習する。回帰モデルにおけるｌａｓｓｏ拘束によって散在を促す（すなわち、ほとんどの遺伝子は０に等しい重み（回帰係数）を有する）。この方法では、ｌａｓｓｏ回帰は、２クラス間を区別することができる少数の標的遺伝子を同定する。以下の式により、最適化問題は解決される。
【０１９８】
【数２】
2013520197.tif 000011
（式中、ｙｍｉＲは有効なｍｉＲＮＡについては＋１であり、有効でないｍｉＲＮＡについは−１であり、ΧｍｉＲは保存された７ｍｅｒ計数のベクトルであり、λは１０の非ゼロ重みを与えた正則化パラメーターである）。ｌａｓｓｏ回帰を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｇｌｍｎｅｔパッケージを使用して行った。
【０１９９】
ｍｉＲＮＡの富化。表３中のｍｉＲＮＡの富化の経験的ｐ値を、ヒト遺伝子の全リスト（３’ＵＴＲおよび標的の予想が可能であった）由来の（腫瘍抑制遺伝子組と等しいサイズの）遺伝子の１０，０００個のランダムサンプルの選択によって決定した。これらのランダム遺伝子組のそれぞれの各ｍｉＲＮＡファミリーのスコアの和を計算した。次いで、ｍｉＲＮＡファミリーを、これらのスコアにしたがってランク付けし、これらのランク付けについての富化スコアを、ポジティブｍｉＲＮＡ（全スクリーニングを通過）と全ての他のｍｉＲＮＡとを比較するウィルコクソン順位和検定によって決定した。この手順を、（ｉ）保存シードマッチ数および（ｉｉ）ＴａｒｇｅｔＳｃａｎによって定義された３つの異なるｍｉＲＮＡシードファミリー組（（ａ）全ファミリー；（ｂ）保存ファミリー；（ｃ）広く保存されたファミリー）を使用したＴａｒｇｅｔＳｃａｎ由来の状況スコアについて繰り返した。
【０２００】
ｍｉＲＮＡ−３’ＵＴＲ相互作用の分析。Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ５．１ソフトウェアを使用した腫瘍抑制遺伝子組にわたる所与のｍｉＲＮＡの予想される結合部位の状況スコアの和による部位有効性の累積的測定に基づいて順位を決定した（Ｌｅｗｉｓ，Ｓｈｉｈ，Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｂａｒｔｅｌ，＆  Ｂｕｒｇｅ，２００３）、（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｆａｒｈ，Ｂｕｒｇｅ，＆  Ｂａｒｔｅｌ，２００９）。
【０２０１】
ルシフェラーゼアッセイ。マウスＦＢＸＷ７（ｂｐ２７９３−４１３９；受入番号ＮＭ＿００１  １７７７７３）、ヒトＮＦ１（ｂｐ１００３３−１０６６６；受入番号ＮＭ＿０００２６７）、ヒトＰＨＦ６（ｂｐの位置３２７１−４２９９；受入番号ＮＭ＿００１０１５８７７）、およびＢｉｍ（ｂｐ．３１５５−４７７３；受入番号ＮＭ＿００９７５４）３’ＵＴＲフラグメントをＰＣＲによって生成し、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから購入したＩＫＺＦ１  ３’ＵＴＲ（カタログ番号ＨｍｉＴ０００３９７ｂ，ＵＴＲのｂｐ２３４３−４４７１）以外をｐｓｉ−ＣＨＥＣ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。アッセイを記載のように行った（Ｘｉａｏら、２００８）。
【０２０２】
参考文献
【０２０３】
【化４】
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【０２０４】
【化５】
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【０２０５】
【化６】
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【０２０６】
【化７】
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本発明を、その精神または本質的特質から逸脱することなく、他の形態で具体化するか、他の方法で実施することができる。したがって、本開示は、全ての態様において例示であって本発明を制限しないと見なされ、発明の範囲が添付の特許請求の範囲によって示され、等価の意図および範囲内に含まれる全ての変更形態が本発明内に含まれることが意図される。したがって、概要、説明、材料と方法、および図面は、制限よりもむしろ例示とみなされる。
【０２０７】
種々の参考文献（特許および公開された刊行物が含まれる）が本明細書を通して引用されており、その各々の全体が本明細書中で参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年10月24日(2012.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2013520197.tif 000053
2013520197.tif 000054
2013520197.tif 000055
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