(57)【要約】  本発明は、特に蛍光標識化されたヌクレオチドを用いるＤＮＡシークエンシングのために、複数の別個の蛍光信号を監視する装置及び方法に関する。複数の蛍光信号源１０４からの前記蛍光信号を個別に検出する複数のピクセル１３０を有する特定の検出器１１８が、提案される。各ピクセル１３０は、受け取られた蛍光信号を検出し、検出信号を生成するために、予め決められた数の少なくとも２つの検出素子Ｄ１、Ｄｎを有する。更に、前記少なくとも２つの検出素子Ｄ１、Ｄｎから前記検出信号を受け取り、前記少なくとも２つの検出素子Ｄ１、Ｄｎのうちどれが最も強い検出信号を生成したかを示すピクセル出力信号を生成する信号変換回路１４０が、設けられる。
2013508718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識化されたヌクレオチドを用いるＤＮＡシークエンシングのために、複数の別個の蛍光信号を監視する装置であって、
複数の別個の蛍光信号源をその上に有する基板と、
励起照明源と、
前記複数の蛍光信号源からの蛍光信号を検出する検出器と、
前記励起照明源からの励起照明を、前記基板上の前記複数の別個の蛍光信号源に同時に導くとともに、前記複数の蛍光信号源からの蛍光信号を前記検出器に導くように位置付けられる光学トレインと、
を有し、前記検出器が、
前記複数の蛍光信号源からの前記蛍光信号を個別に検出する複数のピクセルであって、各ピクセルが、受け取られた前記蛍光信号を検出し、検出信号を生成するために、予め決められた数の少なくとも２つの検出素子を有する、複数のピクセルと、
前記少なくとも２つの検出素子から前記検出信号を受け取り、前記少なくとも２つの検出素子のうちどれが最も強い検出信号を生成したかを示すピクセル出力信号を生成する信号変換回路と、
を有する装置。
【請求項２】
各ピクセルが、少なくとも４の、特に８乃至１６の検出素子を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記信号変換回路がデジタルのピクセル出力信号を生成する、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記複数のピクセルが、列及び行に沿ったアレイとして配され、前記検出器が更に、前記ピクセルを個別にアドレッシングし、前記ピクセルから前記ピクセル出力信号を読み出すアドレッシング及び読み出し手段を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記アドレッシング及び読み出し手段が、各検出素子ごとに、特にＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタである選択スイッチを有し、前記選択スイッチは、当該検出素子によって生成された出力信号を、関連する信号変換回路に送ることを可能にするために、選択スイッチアドレッシング信号を用いてオン及びオフを切り替えられることができる、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記アドレッシング及び読み出し手段が、各検出素子ごとに、特にＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタであるリセットスイッチを有し、前記リセットスイッチは、各検出期間の後に当該検出素子をリセットするために、リセット信号を用いてオン及びオフを切り替えられることができる、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記アドレッシング及び読み出し手段が、各検出素子ごとに、当該検出素子の検出信号を検出器電流信号に変換する電圧電流変換素子を有する、請求項４に記載の装置。
【請求項８】
前記電圧電流変換素子は、そのゲートが当該検出素子の出力に結合されるＰ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタを有する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記信号変換回路がウィナーテイクオール回路を有する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記ウィナーテイクオール回路は、接続される各検出素子ごとに、
ドレイン端子が、当該検出素子によって検出される検出信号を表す検出器電流信号を供給され、ソース端子が、特にグランド電位である基準電位に結合され、ゲート端子が、予め決められたバイアス電流を供給される、第１のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタと、
ゲート端子が、前記第１のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタのドレイン端子に結合され、ソース端子が、前記第１のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタのゲート端子に結合されて、前記予め決められたバイアス電流を供給され、ドレイン端子が、検出器素子出力信号を出力する、第２のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタと、
を有する、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記ウィナーテイクオール回路が、前記複数のピクセルのエリア外に配される、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記ウィナーテイクオール回路が、前記複数のピクセルのエリア内に、特に関連するピクセルのエリア内に配される、請求項９に記載の装置。
【請求項１３】
各ピクセルごとに、２つのウィナーテイクオール回路が関連付けられ、
第１のウィナーテイクオール回路が、前記複数のピクセルのエリア外に配され、第２のウィナーテイクオール回路が、前記複数のピクセルのエリア内に、特に関連するピクセルのエリア内に配される、請求項９に記載の装置。
【請求項１４】
前記光学トレインが、
前記基板上の前記複数の蛍光信号源からの蛍光信号を同時に収集するために、前記基板の第１の焦点面に焦点をあわせられる対物レンズと、
前記蛍光信号のスペクトル成分を空間的に分離するスペクトル分離手段と、
前記蛍光信号の空間的に分離されたスペクトル成分を受け取り、それらを前記検出器に集束させる集束レンズと、
を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
複数の蛍光信号源からの蛍光信号を検出する検出器であって、特に蛍光標識化されたヌクレオチドを用いるＤＮＡシークエンシングのために複数の別個の蛍光信号を監視する装置において使用される検出器であって、
前記装置が、
複数の別個の蛍光信号源をその上に有する基板と、
励起照明源と、
前記励起照明源からの励起照明を、前記基板上の前記複数の別個の蛍光信号源に同時に導き、前記複数の蛍光信号源からの蛍光信号を前記検出器に導くように位置付けられる光学トレインと、
を有し、
前記検出器が、
前記複数の蛍光信号源からの前記蛍光信号を個別に検出する複数のピクセルであって、各ピクセルが、受け取られた前記蛍光信号を検出し、検出信号を生成するために、予め決められた数の少なくとも２つの検出素子を有する、複数のピクセルと、
前記少なくとも２つの検出素子から前記検出信号を受け取り、前記少なくとも２つの検出素子のうちどれが最も強い検出信号を生成したかを示すピクセル出力信号を生成する信号変換回路と、
を有する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に蛍光標識化されたヌクレオチドを用いるＤＮＡシークエンシングのために、複数の別個の蛍光信号を監視する装置に関する。
【０００２】
本発明は更に、このような複数の別個の蛍光信号を監視する装置において用いられる、複数の蛍光信号源からの蛍光信号を検出する検出器に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）シークエンシングは、長年にわたり知られている。すべての知られている生体の成長及び機能に使われる遺伝的命令を含む核酸のビルディングブロックを識別する基本的概念は、コードの発見から、遺伝学的情報を使用して疾患に取り組みたいという要望にまで拡張されている。
【０００４】
ＤＮＡ分子の主な役割は、情報の長期の記憶である。他の機能の中でもとりわけ、ＤＮＡ分子は、遺伝子と呼ばれるセグメントに、細胞のコンポーネントの構築のために必要な命令を含む。化学的に、ＤＮＡはヌクレオチドと呼ばれる単一ユニットの２本の長いポリマーを含み、これら２本の鎖は、互いに逆方向を向いている。２本の鎖の間のバックボーンは、エステル結合によって結合される糖及びリン酸基からなる。タイプＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの、塩基と呼ばれる４つの分子タイプの１つが、各々の糖にアタッチされる。バックボーンに沿ったこれらの４つの塩基の配列が、情報を符号化する。これらの塩基及びそれらの配列の識別によって、多くの情報が導き出されることができる。
【０００５】
新しい技法の多くは、ベースコーリングとして知られる、塩基を識別するための蛍光イメージングに基づく。蛍光モイエティは、１つの特定の種類の塩基にアタッチされる。ヌクレオチドの蛍光は、知られている波長の光の吸収によってもたらされる。蛍光は、別の僅かに異なる知られている波長で発生する。蛍光発光の検出は、特定の塩基の存在を示す。単色蛍光システムが存在し、シークエンシング試薬を含む異なる流体が、連続的にサンプル上に流され、蛍光が、ＤＮＡサンプル中の異なるＤＮＡ塩基の存在を示す。別の蛍光イメージング技法は、４色蛍光として知られるものであり、これは、光の４つの異なる波長が使用されることにより、（シークエンシング反応のために必要な）４つのタイプのヌクレオチドが、シークエンシング装置に同時に存在することを可能にする。これにより、装置の（非常にゆっくりした）流体交換が、低減されることができ又は最小限に保たれることできる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ベースコーリングのための蛍光イメージングに基づく蛍光物質の解析方法及びシステムは、Pacific Biosciencesによって、特にPacific Biosciences technology backgrounder の「Pacific Biosciences develops transformative DNA sequencing technology」( February 2, 2008)に記述され、また、それらの国際公開第２００８／１４０７５８Ａ１号及び国際公開第２００９／０８９０５６Ａ１号パンフレットに記述されている。フルオロフォアによって発せられる光は、高い開口数の対物レンズによって収集され、単光子感光ＣＣＤアレイ上にフォーカスされる。アレイに到達する前に、光は、プリズム分散素子を通過し、プリズム分散素子は、その色に従って蛍光光を屈折させ、各々のゼロモード導波路ごとに個別の虹を生成する。これは、屈折光の位置が、信号を生成した塩基のアイデンティティを符号化することを可能にする。このようにして、単一の高感度検出器が、ＣＣＤアレイにパルスが当たる位置に従ってそれらのパルスを識別し、区別するために使用されることができる。このプロセスは、ＣＣＤアレイのエリア上で数千回繰り返され、それにより、単分子リアルタイムチップ上の各々のゼロモード導波路においてリアルタイムにＤＮＡ配列が読み取られることを可能にする。最適化されたアルゴリズムの組が、光学系によって捕らえられる情報を翻訳するために使用される。記録されたスペクトル情報及びパルス特性を使用することにより、信号は、関連する品質メトリックをもつベースコールに変換される。
【０００７】
しかしながら、この技術に関して、使用される検出器の種類に主に基づく制約がある。ＥＭＣＣＤ（電子増倍電荷結合デバイス）検出器が使用される場合、高いフィールドレートは、ピクセルの数が少ない場合にのみ得られることができる。しかしながら、実際には、非常に多数のシークエンシング部位を読み出すために、多数のピクセルが必要とされ、例えば１００万のシークエンシング部位又はそれ以上が読み出される必要がある。更に、高いフィールドレートは、反応レートについていく必要があり、将来は１ｋＨｚまで増大することが期待されうる。このような性能は、ＣＣＤ技術能力をはるかに超えるものである。
【０００８】
本発明の目的は、既知の装置と比較して改善された、複数の別個の蛍光信号を監視する装置であって、特に、より高いフィールドレートで多数のピクセルを同時に読み出すことが可能な装置を提供することである。本発明の他の目的は、このような装置において使用される検出器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の見地において、特に蛍光標識化されたヌクレオチドを用いるＤＮＡシークエンシングのために、複数の別個の蛍光信号を監視する装置であって、複数の別個の蛍光信号源をその上に有する基板と、励起照明源と、複数の蛍光信号源からの蛍光信号を検出する検出器と、励起照明源からの励起照明を、基板上の前記複数の別個の蛍光信号源に同時に導き、複数の蛍光信号源からの蛍光信号を検出器に導くように位置付けられる光学トレインと、を有し、前記検出器が、複数の蛍光信号源からの前記蛍光信号を個別に検出する複数のピクセルであって、各ピクセルが、受け取られた蛍光信号を検出し、検出信号を生成するための、予め決められた数の少なくとも２つの検出素子を有する、複数のピクセルと、前記少なくとも２つの検出素子からの前記検出信号を受け取り、前記少なくとも２つの検出素子のうちどれが最も強い検出信号を生成したかを示すピクセル出力信号を生成する信号変換回路と、を有する、装置が提供される。
【００１０】
本発明の他の見地において、このような装置において用いられる検出器であって、複数の蛍光信号源からの前記蛍光信号を個別に検出する複数のピクセルであって、各ピクセルが、受け取られた蛍光信号を検出し、検出信号を生成するために、予め決められた数の少なくとも２つの検出素子を有する、複数のピクセルと、前記少なくとも２つの検出素子からの前記検出信号を受け取り、前記少なくとも２つの検出素子のうちどれが最も強い検出信号を生成したかを示すピクセル出力信号を生成する信号変換回路と、を有する検出器が提供される。
【００１１】
本発明の好適な実施形態は、従属請求項に規定される。請求項に記載の検出器は、請求項に記載の装置及び従属請求項に記載のものと同様の及び／又は同一の好適な実施形態を有することが理解されるべきである。
【００１２】
本発明は、特に基板、励起照明源、検出器及び光学トレインを有する、Pacific Biosciencesにより提案されるものと同じシステムレイアウトを概して適用し、蛍光検出のための分散ベースの方法を使用するが、多数のピクセルが高いフィールドレートで読み出されることを可能にする独特の検出器を使用するという考えに基づく。ＤＮＡへの塩基の組み込みを判定する既知の分散方法は、例えば、ＣＣＤアレイの約１５の検出素子（例えばフォトダイオード）を必要とする。シークエンシング反応の間の分離を可能にするために、約１６ｘ４検出素子の最小のＣＣＤエリアが必要とされる。本発明によれば、検出器の１つのピクセルを表す検出素子から６４（又は少なくとも１５）のすべてのアナログ値を読み出す代わりに、組み込まれた塩基を表す単一のピクセル出力信号が生成される。
【００１３】
特に、本発明にれば、単一ピクセルを表すとともに単一の蛍光信号源からの蛍光信号を受け取る複数の検出素子から検出信号が供給される信号変換回路が提供され、信号変換回路は、前記複数の検出信号を、前記単一のピクセル出力信号に変換する。前記ピクセル出力信号は、それが、単一の信号変換回路に結合された少なくとも２つの検出素子のうちどれが最も強い検出信号を生成したかを示すように、入力された検出信号から生成される。
【００１４】
それゆえ、１つのピクセル内の最も強い検出信号を生成した検出素子の位置が知られ、その位置は、本質的に、蛍光信号源のアイデンティティに関する情報を含む。例えば、蛍光標識化されたヌクレオチドを用いるＤＮＡシークエンシングに適用される場合、様々なタイプの塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）がそれぞれ異なって標識化され、最も強い検出信号を生成した検出素子の位置が、蛍光標識と相関し、それゆえ塩基と相関するので、蛍光信号を生成した塩基のアイデンティティは、ピクセル出力信号に含まれる。
【００１５】
本発明によれば、例えば既知の装置の場合のように１５又はそれ以上の値ではなく、ただ１つの値が、各ピクセルから読み出されればよいので、読み出しレートが大幅に高められることができ、よって、例えばヌクレオチドの増大された濃度及びより高い温度によってシークエンシング反応がより速く行われることが可能になり、より多くの反応が、並行に実施されることができる。これは、装置のスループットを大きく改善し、全ゲノム及び遺伝子のリシークエンシングアプリケーションが非常に速く実施されることを可能にする。
【００１６】
特にＤＮＡシークエンシングに用いられる場合、各ピクセルは、どの塩基が蛍光信号を生じさせたかを検出するためにより高い解像度及び精度を得る目的で、少なくとも４の、特に８乃至１６の検出素子を有する。検出素子の数、例えばＣＣＤアレイ内のフォトダイオードの数は、所望の解像度及び精度に依存して、より多くてもよい。
【００１７】
好適には、信号変換回路は、容易に且つ速く読み出されることができるデジタルピクセル出力信号を生成するように適応される。好適には、複数のピクセルが、他の実施形態において提案されるように、列及び行に沿ったアレイとして配置される場合、検出器は更に、ピクセルを個別にアドレッシングし、前記ピクセルから前記ピクセル出力信号を個別に読み出すアドレッシング及び読み出し手段を有する。
【００１８】
デジタルピクセル出力信号の使用が好ましい。このようなアレイ構造は、例えば半導体メモリ装置から知られており、半導体メモリ技術から知られている同様の行及び列アドレシング及び読み出し手段が、ここで適用されることができる。例えば、デジタルピクセル出力信号はバイナリ４ビット信号でありえ、前記４ビットは、（１ピクセルの１６検出素子のうち）最も強い検出信号を有する検出素子の位置を符号化する。
【００１９】
本発明は、好適にはＣＭＯＳ技術を使用し、信号変換回路は、ＣＭＯＳ技術によって、検出器上に有利に実現されることが可能になる。各々の検出素子を個別にアドレッシングするために、好適には、Ｎ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタによって特に実現される選択スイッチが、検出素子ごとに、設けられる。前記選択スイッチは、当該検出素子によって生成された出力信号を、関連する信号変換回路に送ることを可能にするために、選択スイッチアドレッシング信号を用いてオン及びオフを切り替えられることができる。検出中、この選択スイッチは、概して、オフに切り替えられているが、検出期間の終了時、ピクセルのすべての検出素子の選択スイッチは、オンに切り替えられ、それにより、ピクセルのすべての検出素子の検出信号が、同時に信号変換回路に提供される。信号変換回路は、更なる処理を行い、どの検出素子が最も強い検出信号を生成したかを見つけ、対応するピクセル出力信号を生成する。
【００２０】
別の実施形態によれば、アドレッシング及び読み出し手段は、各検出素子ごとに、リセットスイッチ、特にＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタを有する。リセットスイッチは、各検出期間の後、検出素子をリセットするために、リセット信号を用いてオン及びオフを切り替えられることができる。
【００２１】
更に別の実施形態によれば、アドレッシング及び読み出し手段は、各々の検出素子ごとに、前記検出素子の検出信号を検出電流信号に変換する電圧電流変換素子を有する。前記電圧電流変換素子は、好適には、当該検出素子の出力にゲートが結合されるＰ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタによって実現される。それゆえ、検出素子から出力された検出信号は、電圧電流変換素子を制御し、検出素子の出力が大きくなる場合、電圧電流変換素子は、より多くの電流を出力する。これは、電圧電流変換を実現するシンプルであるが効果的な方法を提供する。
【００２２】
入力された検出信号からピクセル出力信号を生成するために、信号変換回路は、好適にはウィナーテイクオール回路を含む。このようなウィナーテイクオール回路は、概して当分野において知られており、例えばMoses他の「A "winner take all" IC for Determining the Crystal Interaction in PIT Detectors」(IEEE Trans. Nuclear Science, vol. 43, pp. 1615, 1996)又はOki, Nの「Winner-Take-All Circuit Using CMOS Technology」(Circuits and Systems, 1998, Proceedings, 1998, Midwest Symposium on Volume, issue 9-12 August 1998, pp. 568 - 570)から知られている。このようなウィナーテイクオール回路のさまざまな実施形態が存在し、それらはすべて、信号変換のために概して適用されることができる。このような回路は、単一ピクセルのすべての結合された検出素子から並行に検出信号を受け取り、対応する数の中間出力線を有し、すなわち各検出素子ごとに１の中間出力線を有する。しかしながら、このようなウィナーテイクオール回路は、ただ１つの単一中間出力線上での連鎖反応により、最も強い検出信号を放出した検出信号に対応する高い信号出力、特に高い電流が得られ、他の中間出力線上では、低い出力信号、特に小さい出力電流が検出されるように、適応される。これらの中間出力線は、共通出力線に結合され、共通出力線は、所望の、好適にはデジタルのピクセル出力信号を得るために、例えば逐次に又は並行して読み出される。
【００２３】
好適な実施形態によれば、ウィナーテイクオール回路は、各々の接続された検出素子ごとに、ドレイン端子が、前記検出素子によって検出された検出信号を表す検出器電流信号を供給され、ソース端子が、基準電位、特にグランド電位に結合され、ゲート端子が、予め決められたバイアス電流を供給される、第１のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタと、ゲート端子が、第１のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタのドレイン端子に結合され、ソース端子が、第１のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタのゲート端子に結合されて、前記予め決められたバイアス電流を供給され、ドレイン端子が、検出器素子出力信号を出力する、第２のＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタと、を有する。
【００２４】
ウィナーテイクオール回路は、複数のピクセルのエリア外に、又は複数のピクセルのエリア内に、特に関連するピクセルのエリア内に、配置されることができる。しかしながら、各ピクセルごとに、２のウィナーテイクオール回路がありえ、その場合、第１のウィナーテイクオール回路は、複数のピクセルのエリア外に配置され、第２のウィナーテイクオール回路は、複数のピクセルのエリア（１３０）内に、特に関連するピクセルのエリア内に、配置される。
【００２５】
上述したように、装置の概略のレイアウトは、励起照明源、その上に配置された複数の別個の蛍光信号源を有する基板及び光学トレインに関して、Pacific Biosciencesによって記述されるものでありうる。それゆえ、好適な実施形態によれば、光学トレインは、基板上の複数の蛍光信号源からの蛍光信号を同時に収集するために、基板の第１の焦点面にフォーカスされる対物レンズと、蛍光信号のスペクトル成分を空間的に分離するスペクトル分離手段と、蛍光信号の空間的に分離されたスペクトル成分を受け取り、それらを検出器に集束させる集束レンズと、を有する。
【００２６】
本発明のこれらの及び他の見地は、以下に記述される実施形態から明らかであり、それらを参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による蛍光検出装置の概略図。
【図２】経時的な一般の検出信号及び対応するスペクトルを示す図。
【図３】本発明による検出器の概略のレイアウトを示す図。
【図４】本発明による検出器の例示のレイアウトの更なる詳細を示す図。
【図５Ａ】本発明による検出器の単一ピクセルの回路構成の一実施形態を示す図。
【図５Ｂ】本発明によるウィナーテイクオール回路の回路構成の一実施形態を示す図。
【図６】本発明によるウィナーテイクオール回路を有する単一ピクセルの回路構成の別の実施形態を示す図。
【図７】本発明による外部ウィナーテイクオール回路に結合されたウィナーテイクオール回路を有する単一ピクセルの回路構成の別の実施形態を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＤＮＡシークエンシングに関して、さまざまなシステム及び方法が知られている。特定の例示のシステムにおいて、固体担体に不動化される個別のＤＮＡポリメラーゼ／テンプレート／プライマー複合体は、それらが蛍光標識化されたヌクレオチド類似体を組み込みながら、励起光によって照明される。これらの個別の複合体から発する特徴的な蛍光信号は、所与のヌクレオチドが複合体によって組み込まれているかどうかを示す。ある方法では、標識化されたヌクレオチドが、蛍光標識基をなお担持しながら、実際に組み込まれる。組み込まれなかった標識化されたヌクレオチドは、不動化された複合体から洗い流され、複合体が照明され、蛍光信号が、組み込まれた蛍光ヌクレオチドの存在を判定するために監視される。次いで、蛍光標識が、組み込まれたヌクレオチドから除去され、システムから洗浄される。第２のヌクレオチドが、複合体と接触され、その組み込み又はその欠如が、同じ態様で監視される。ある態様において、これらのシステムは、各ステップにおいて単一タイプのヌクレオチドを用いるので、４タイプのヌクレオチドの各々について複合体にインタロゲートする循環プロセスを必要とする。
【００２９】
別のシステムにおいて、ポリメラーゼ／テンプレート／プライマー複合体が、閉じられた照明ボリューム内に提供され、かかるボリュームは、単一の複合体を含むエリアに照明を局所化し、それ以上は照明されない。標識化されたヌクレオチドは、複合体によって組み込まれるので、それらは、組み込まれないヌクレオチドの平均拡散時間より長い期間、照明ボリューム内に維持され、従って、当該組み込みに関連する特徴的な光学信号を与える。ヌクレオシドポリリン酸塩のβ、γ又はより遠いリン酸基上に蛍光標識を担持するヌクレオチドを用いることによって、標識基は、組み込みの最中に自己開裂される。その結果、特徴的な組み込み蛍光信号に続いて、標識基が解放されて、ランダムに拡散するヌクレオチドのように振る舞う。更なる結果として、ヌクレオチドの組み込みが生じる場合、ヌクレオチドの組み込みをリアルタイムに監視することが可能である。スペクトル的に識別可能な蛍光標識又は染料により、ヌクレオチドの各タイプ（例えばＡ、Ｇ、Ｃ及びＴ）を標識化し、それぞれ異なる蛍光信号の反応を監視することによって、組み込みイベントを識別することが可能であるのみならず、組み込まれたヌクレオチドのタイプを識別することも可能である。
【００３０】
本発明が適用可能である例示の蛍光検出装置が、図１に概略的に示される。図示されるように、装置１００は、１又は複数の励起照明源、すなわちレーザ１０６を有する。レーザ１０６からの励起光は、光学トレイン１０８によって反応領域へ、例えば基板１０２上の反応領域又はウェル１０４へ、向けられる。光学トレインは、図示されるように、所望のアプリケーションに依存して変更されることができるが、レーザ１０６からの励起ビームは、ダイクロイックミラー１１０に向けられ、ダイクロイックミラー１１０によって反射され、対物レンズ１１２に向けられる。対物レンズ１１２は、励起ビームを、基板１０２の反応領域／ウェル１０４へ集束させる。励起ビームに応じて反応領域から放出される蛍光信号は、対物レンズ１１２によって収集され、励起ビームに対してシフトされたそれらの波長によって、ダイクロイックミラー１１０を通過される。蛍光信号は、集束レンズ１１６によって検出器１１８上に集束され、検出器１１８は、そこに入射信号を記録する。
【００３１】
図示されるように、蛍光信号は、それぞれ異なる反応から生じる又は同じ反応のそれぞれ異なるイベントから生じるスペクトル的に異なる信号成分を分離するために、スペクトル分離を施されることができる。図示されるように、スペクトル分離は、蛍光信号を、例えばウェッジプリズム１１４のような分散光学素子に通過させて、スペクトル的に異なる信号又は信号成分を検出器１１８のそれぞれの領域に導くことによって達成される。
【００３２】
検出器１１８によって受け取られた信号は、例えばコンピュータ１２０のようなプロセッサによって記録され、処理され、例えばディスプレイ１２２又はプリンタ１２４からの印刷出力１２６のような、便利でユーザフレンドリな形で表示される。
【００３３】
このような装置の概略のレイアウト、実現及び機能並びにＤＮＡシークエンシングのための蛍光ベースの検出に関する更なる詳細は、国際公開第２００８／１４０７５８８Ａ１号パンフレット、国際公開第２００９／０８９０５６Ａ１号パンフレット及びPacific Biosciencesの上述のtechnology backgrounderに見出されることができる。これらの文献はここで参照され、それらの詳細は、参照によって本明細書に盛り込まれるものとする。
【００３４】
それぞれ別の時間に１つの観察ボリュームから収集された、経時的な一般の検出信号及びそれらのスペクトルが、図２に示されている。各時間に記録される４つの時間信号は、観察ボリュームから収集される分散光のマルチ成分解析の異なるスペクトルチャネルから取得される。スペクトルプロットにおいて、実線は、較正プロセスの４つのフルオロフォアの各々から収集された基準スペクトルを表す。各プロットにおいて、エラーバーを有する信号曲線（Ｓ１乃至Ｓ４に示される）は、相対スペクトル位置の関数として、バーストの持続時間にわたって積分された光子束を表す。図示される蛍光バーストは、２０乃至３５の積分バーストＳＮＲ比率を表す。それゆえ、測定された信号のスペクトルをそれらの基準スペクトルと比較することによって、ヌクレオチドを標識化し、蛍光信号を引き起こしたフルオロフォアが、容易に見つけられることができる。
【００３５】
特に図１に示されるシステムにおいて検出器１１８として示される、本発明により使用される検出器の概略のレイアウトが、図３に示されている。検出器１１８は、例えばＤＲＡＭメモリ装置のような半導体メモリ装置のメモリ素子から知られているような、行及び列に沿って配置される複数のピクセル１３０のアレイ１２８を含む。アドレッシング、スイッチング及びリセットの目的で、すなわち、個別のピクセル及び／又はピクセルの個別の検出素子を個別にアドレッシングし、リセットし及び／又はスイッチングするために、半導体メモリ技術からも一般に知られているような適当なアドレッシング及び読み出し手段が設けられる。特に、図３に示される実施形態において、前記アドレッシング及び読み出し手段は、行ドライバユニット１３２及び列ドライバユニット１３４を有する。行ドライバユニット１３２は特に、行選択の機能を果たし、すなわち、アレイ１２８内の特定の行のピクセル及び／又は検出素子を個別にアドレッシングし、特定の行の中のピクセル及び／又は検出素子をリセットする。列ドライバユニット１３４は、特に、或る列の中のピクセルの個別の検出素子から検出信号を個別に読み出し、ピクセルの検出素子の検出信号を単一のピクセル出力信号に変換するように機能する。必要に応じて、このピクセル出力信号は、更に処理され、又は直接出力されることができる。
【００３６】
特に列ドライバユニット１３４の一実施形態の更なる詳細が図４に示される。例示の実施形態として、ピクセル１３０が、１６の検出素子を含み、それにより、１６の検出信号が、前記検出素子から出力されるものとする。（前記特定のピクセルが、接続された行バス１３８を通じて適当なアドレッシング信号によってアドレスされるという条件で、）これらの検出信号は、後述される前処理の後に最終的に、１６ラインの列バス１３６を通じて、列ドライバユニット１３４に出力される。列ドライバユニット１３４は、各列ごとに（又はより高度な実施形態では各ピクセルごとに、）信号変換回路１４０を有する。信号変換回路１４０は、（行バス１３８を通じて制御されるとき）現在読み出されているピクセル１３０のすべての検出素子からの検出信号を受け取り、ピクセル出力信号を生成する。
【００３７】
信号変換回路１４０は、この例示の実施形態において、ウィナーテイクオール回路１４２、デジタル変換回路１４４及びレジスタ１４６を含む。ウィナーテイクオール回路１４２は、（この例では１６の）検出信号を受け取り、同じ数の中間出力信号を出力する。詳しく後述されるように、連鎖反応により、前記中間出力信号のただ１つが、高い出力振幅をもつ信号になり、他の中間出力信号は、低い出力振幅をもつ。これらの中間出力信号は、デジタル変換回路１４４に供給され、デジタル変換回路１４４は、前記中間出力信号を、デジタル信号に変換する。例えば、１６の出力信号の場合、バイナリ４ビットデジタルピクセル出力信号が生成され、その信号には、前記１６の中間出力信号のうちどれが高い振幅を有したかを示す情報が符号化され、従って、情報は、ピクセル１３０の前記１６の検出素子のうちどれが最も強い検出信号を出力したかをも示す。前記ピクセル出力信号は、それがデータ出力バス１４８に出力されることができるまで、記憶のためにレジスタ１４６に送られる。
【００３８】
列ドライバユニット１３４内には、デジタルデータを保持するＮレジスタ１４６がある（Ｎ列の場合）。しかしながら、概して、一度にただ１つのレジスタ１４６のみを読み出すことができる。それゆえ、好適な実施形態において、どのレジスタ１４６を読み出すべきかを選択する付加のシフトレジスタ１５０が、提供される。このレジスタ１５０は、クロックサイクルごとに選択ポイントを１位置シフトさせるので、シフトレジスタと呼ばれる。
【００３９】
図５Ａは、本発明による検出器１１８内の単一のピクセル１３０の主な回路構成の例示の実施形態を示す。例示として、前述したように単一の蛍光信号源から発するスペクトル的に異なる信号又は信号成分を受け取るために、行に沿って好適に配置された全部でｎ（例えば１６）の検出素子をもつピクセル１３０について、３の検出素子Ｄ１、Ｄ２、Ｄｎが、図示されている。それらの検出素子Ｄ１、Ｄ２、Ｄｎは、光検出器でありうる。
【００４０】
更なる説明のために光検出器Ｄ１に注目して、光検出器Ｄ１は、フィールド期間中、その自己容量を放電する。Ｎ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ１は、リセットライン１５２を通るリセット信号ＲＳによってフィールド期間ごとにパルスされるリセットスイッチである。リセットライン１５２は、好適には、列ドライバユニット１３２（図３を参照）に接続される。従って、リセットスイッチＴ１は、フォトダイオードＤ１の容量を充電し直すために、フィールド期間ごとにパルスされる。
【００４１】
フォトダイオードＴ１のカソードの電圧Ｖ１は、電圧電流変換器として動作するＰ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ２のゲートに接続される。光検出器Ｄ１が多くの光子を受け取る場合、より多くの放電があり、従って、トランジスタＴ２のゲート−ソース電圧が大きくなる。従って、トランジスタＴは、それが飽和領域にバイアスされるので、より多くの電流を出力する。
【００４２】
トランジスタＴ２の出力電流Ｉ１は、選択スイッチとして動作するＮ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ３によって、ウィナーテイクオール回路１４２に供給される。前記選択スイッチＴ３は、選択ライン１５４による選択信号ＳＳを通じてパルスされ、すなわち、選択スイッチＴ３は、ピクセルの当該行及び前記行のピクセル内のすべての検出素子についてフィールド期間の終わりにパルスされる。従って、前記光検出器Ｄ１乃至Ｄｎによって生成された検出信号（すなわち電圧Ｖ１乃至Ｖｎ）から得られた電流Ｉ１乃至Ｉｎは、列バス１３６を通じて並行にウィナーテイクオール回路１４２に供給される。列バス１３６のバスラインは、個々のバスラインスイッチ１３７によってオン及びオフを別々に切り替えられることができ、バスラインスイッチ１３７は、バスラインアドレスバス１３９を通じて制御される。
【００４３】
リセットライン１５２及び選択ライン１５４が、図４に示される行アドレスバス１３８に対応することに注意すべきである。
【００４４】
図５Ｂには、ピクセルのこの列に関するウィナーテイクオール回路１４２の回路構成の実施形態が示されており、ウィナーテイクオール回路１４２には、前記電流Ｉ１乃至Ｉ０が、列バス１３６を通じて供給される。ウィナーテイクオール回路１４２は、この例示の実施形態において、Ｎ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ４、Ｔ５のｎペアを含む。更には、バイアス電流ＩＢを生成し、トランジスタＴ４、Ｔ５、のすべてのｎペアのトランジスタＴ４を通じて流すためのバイアス電流源１５６が提供される。このバイアス電流ＩＢは更に、トランジスタＴ５のゲート電圧を設定し、これは更に、トランジスタＴ５を流れることができる電流を固定値に設定する。
【００４５】
ウィナーテイクオール回路１４２の（トランジスタのｎペアのうち）最も高い入力電流を有するトランジスタのペア、すなわち最も高い電流Ｉ１乃至Ｉｎ（すなわち最も高い輝度）が供給されるトランジスタのペアが、そのトランジスタＴ５に最大のドレイン電圧を生成し、当該ドレインには、関連するフォトダイオードＤ１からの電流Ｉ１が供給される。トランジスタＴ５のドレインは、トランジスタＴ４のゲートにも接続されている。より高いドレイン電圧が最大の入力電流によって生じることに続いて、トランジスタＴ４上のより高いゲート電圧が、トランジスタＴ４により多くの電流を流す。しかしながら、トランジスタＴ４を通る電流は、バイアス電流ＩＢによって固定されているので、この追加の電流は、トランジスタＴ４、Ｔ５の他のペアの他のトランジスタＴ４を犠牲にして得られる。従って、他のペアのトランジスタＴ４のゲート電圧は低下し、連鎖反応はオフにされ、それによって、全バイアス電流ＩＢは、トランジスタＴ４のうちわずか１つ、すなわちその対応するトランジスタＴ５を流れる最大電流を有する１つのトランジスタＴ４、を流れなければならない。それゆえ、このペアは、その中間出力線１６０−１に高い中間出力信号Ｉ１ｏｕｔ（検出器素子出力信号とも呼ばれる）を供給する「ウィナー（勝者）」であり、他方、他の中間出力線１６０−ｎ上の他の中間出力信号Ｉｎｏｕｔは、低い振幅を有する。
【００４６】
中間出力信号Ｉ１ｏｕｔ−Ｉｎｏｕｔは、抵抗器Ｒによって電圧に変換され、その出力は、インバータＫによってデジタルで示される。結果的に得られる信号は、並列のｎラインを有することができる又は多重化バスでありうるピクセル出力バス１６２を通じて、ビット（デジタル）変換ユニット装置１４４に出力される。その中で、出力信号は、前述したようにデジタルピクセル出力信号に変換される。
【００４７】
図６は、ピクセル１３０の回路構成の別の実施形態を示し、この実施形態によれば、ウィナーテイクオール回路は、図４及び図５に示される実施形態のように列ドライバユニット１３４の一部ではなく、ピクセル自身の一部である。ピクセルの回路構成及びウィナーテイクオール回路の概略のレイアウトは、図４及び図５に示される実施形態と同じである。勝利を得た(winning)電流は、ここでも、高い又は低い電圧を生成する抵抗器Ｒに供給される。抵抗器Ｒの後に、高く又は低く規定されるウェルを与えるインバータＫが続く。この信号は、列バス１３６上の列を駆動する。
【００４８】
それゆえ、この実施形態によれば、ウィナーテイクオール回路は、列ドライバユニット１３４内にない。データは、ビット変換ユニット１４４へ直接供給される。これは、迅速なピクセル読み出しをもたらすべきであるが、ピクセルは、図４及び図５に示される実施形態と比較して、より複雑になっている。
【００４９】
図７は、更に別の実施形態を示しており、この実施形態によれば、ピクセル１３０及び列ドライバ回路１３４は両方とも、ウィナーテイクオール回路を有し、これは、すなわち図４及び図５並びに図６に示される実施形態の混成である。しかしながら、列ドライバユニット１３４のウィナーテイクオール回路１４２'は、ここではＰ型であり、すなわち、Ｎ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ４及びＴ５を有するピクセル内のｎ型ウィナーテイクオール回路と整合するように、Ｐ型ＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ４'及びＴ５'を有する。従って、この実施形態は、シンプルなピクセル回路を与えながらも、高速の読み出しを提供するある種のトレードオフである。ウィナーテイクオール回路１４２'の出力は、ビット変換ユニット１４４に進む。
【００５０】
列が大きい容量を有するので、小さい電流差は、列ドライバユニット１３４内のウィナーテイクオール回路１４２'へ、直ちには送られない。従って、図５Ａ及び図５Ｂに示される実施形態は、理想的な速さほどではないことがある。図６に示される実施形態において提供されるピクセル内ウィナーテイクオール回路は、大きい電流差を速くピクセルに生成する。電流差は、列全体で列ドライバユニット１３４内のウィナーテイクオール回路１４２'に送られる場合、最初は小さい電流差である。しかしながら、このウィナーテイクオール回路１４２'は、図５Ａ及び図５Ｂに示される回路より速く判定を行うために、この少ない電流差を増幅する。
【００５１】
本発明によれば、高いフィールドレートが得られることができ、多数のピクセルが同時に読み出し可能である。特に、複数の別個の蛍光信号源が監視されることができる。従って、本発明は、ＣＣＤ技術に基づく電流検出器の制限を克服し、それらは、ＤＮＡシークエンシングシステムに適用される場合、動作スピードに関して、それらの動作限界に迅速に採用される。本発明は、別個の蛍光信号を非常に高速に監視するために、このようなＤＮＡシークエンシングシステムに適用されることができる。例えば、単一鎖ＤＮＡの１つの分子は、１秒につき１０乃至１００のレートでそれらのポリメラーゼによって組み込まれる塩基を潜在的に有することができる。時間的にランダムに生じるこれらのイベントは、例えば１ｋＨｚの十分に高い読み出しレートを有する本発明の検出器によって、捕らえられることができる。各々のシークエンシング部位は、処理されるＤＮＡの１つの分子を有し、３０００部位の現在使用されている数が増大されることができる。提案されるピクセル内データ圧縮及びアナログデジタル変換は、ピクセルの数が多く（すなわち多くのシークエンシング部位をイメージングすることができる）且つ非常に高速な検出器が構築されることを可能にする。この場合、大きいアレイ上の１つのピクセルからのデジタル値の読み出しは、アナログデータよりも非常に速く実施されることができる。
【００５２】
本発明及びその実施形態のコンテクストにおいて、シークエンシングはＤＮＡに制限されず、最終的な目的が核酸の塩基ペアを検出することである例えばＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡのようなシークエンシングにも関することに注意すべきである。
【００５３】
本発明は、図面及び上述の説明において詳しく図示される記述されているが、このような図示及び記述は、制限的ではなく、説明的又は例示的なものであると考えられることができる。本発明は、開示される実施形態に制限されない。開示される実施形態の他の変更例は、図面、開示及び添付の請求項の検討に基づいて、請求項に記載の本発明を実施する際に当業者によって理解され実現されることができる。
【００５４】
請求項において、「含む、有する(comprising)」という語は、他の構成要素又はステップを除外せず、不定冠詞「a」又は「an」は、複数性を除外しない。単一の構成要素又は他のユニットが、請求項に列挙されるいくつかのアイテムの機能を果たすことができる。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示さない。
【００５５】
請求項における参照符号は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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