(57)【要約】  本発明は、重水素化されたＮ−エチル−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド、その塩および使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体を治療するのに効果的な下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化１】
2013535437.tif 000068
（ここで、Ｒ1〜Ｒ10の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ1〜Ｒ10の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩を、１日あたり0.2 mg〜2.0 mg、ヒト被検体に投与することを含む、自己免疫疾患に罹患したヒト被検体を治療する方法。
【請求項２】
前記重水素リッチな化合物が、
【化２】
2013535437.tif 000069
またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記重水素リッチな化合物が、
【化３】
2013535437.tif 000070
またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記重水素リッチな化合物が、
【化４】
2013535437.tif 000071
またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス関節炎、クローン病または関節リウマチである、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記重水素リッチな化合物の投与が、等モル量の非重水素リッチなラキニモドの投与より、自己免疫疾患の治療に効果的である、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記重水素リッチな化合物の投与によりヒト被検体に形成される任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルが、等モル量の非重水素リッチなラキニモドがヒト被検体に投与されたときに形成される５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルと比較して低下している、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルが、少なくとも５０％低下している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルが、少なくとも９０％低下している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト被検体において、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの形成の低下を誘導する方法であって、治療に効果的な量の下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化５】
2013535437.tif 000072
（ここで、Ｒ1〜Ｒ10の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ1〜Ｒ10の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩をヒト被検体に投与することを含み、
前記形成の低下が、等モル量の非重水素リッチなラキニモドの投与による５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの形成に対して相対的なものである方法。
【請求項１２】
任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルが、等モル量の非重水素リッチなラキニモドがヒト被検体に投与されたときに形成される５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルと比較して、少なくとも５０％低下している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルが、少なくとも９０％低下している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２種の重水素リッチな化合物の混合物であって、各化合物が、下記構造：
【化６】
2013535437.tif 000073
（ここで、Ｒ1〜Ｒ10の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の各々は、異なるＲ1〜Ｒ10においてＤを含有する）を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である混合物、。
【請求項１５】
前記少なくとも２種の重水素リッチな化合物の一つが、下記構造：
【化７】
2013535437.tif 000074
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１４に記載の混合物。
【請求項１６】
前記少なくとも２種の重水素リッチな化合物の一つが、下記構造：
【化８】
2013535437.tif 000075
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１４に記載の混合物。
【請求項１７】
前記少なくとも２種の重水素リッチな化合物の一つが、下記構造：
【化９】
2013535437.tif 000076
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１４に記載の混合物。
【請求項１８】
請求項１４〜１７の何れか１項に記載の混合物またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１９】
ａ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩；
ｂ）少なくとも１種の薬学的に許容可能なキャリア；および
ｃ）下記構造を有する化合物であって、当該化合物および重水素リッチなラキニモドの合計重量に基づいて０．１％未満の量で存在する化合物：
【化１０】
2013535437.tif 000077
の混合物を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
前記化合物が、当該化合物および重水素リッチなラキニモドの合計重量に基づいて３ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記化合物が、当該化合物および重水素リッチなラキニモドの合計重量に基づいて２ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記重水素リッチなラキニモドが、下記構造：
【化１１】
2013535437.tif 000078
（ここで、Ｒ1〜Ｒ10の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ1〜Ｒ10の少なくとも一つは、Ｄである）を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１９〜２１の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記重水素リッチなラキニモドにおいて、Ｒ1〜Ｒ5の各々はＤであり、Ｒ6〜Ｒ10の各々はＨであるか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記重水素リッチなラキニモドにおいて、Ｒ1〜Ｒ5の各々はＨであり、Ｒ6〜Ｒ10の各々はＤであるか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記重水素リッチなラキニモドにおいて、Ｒ1〜Ｒ10の各々はＤであるか、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
錠剤の形態である、請求項１８〜２５の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
等モル量の非重水素リッチなラキニモドがヒト被検体により摂取されたときに形成される５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルに対して、ヒト被検体により摂取されたときに、ヒト被検体で形成される任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルの低下を提供する、請求項１８〜２６の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
ａ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩のバッチを得ること；
ｂ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩の前記バッチに存在する、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの総量を装置により決定すること；および
ｃ）前記バッチが、０．１重量％未満の任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを有すると決定された場合に限り、前記バッチを用いて薬学的組成物を調製すること
を含む、請求項１８〜２７の何れか１項に記載の薬学的組成物の調製方法。
【請求項２９】
ａ）薬学的組成物のバッチを得ること；
ｂ）前記バッチのサンプルにおける任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの総量を装置により決定すること；および
ｃ）前記バッチのサンプルが、ラキニモドと任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドとの合計重量に対して、０．１重量％未満の任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを含有すると決定された場合に限り、分配用の前記バッチを認可すること
を含む、分配用の請求項１８〜２７の何れか１項に記載の薬学的組成物の認可されたバッチを製造するための方法。
【請求項３０】
ヒト被検体における自己免疫疾患を治療する際に１日あたり0.2 mg〜2 mgの量で使用するための、下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化１２】
2013535437.tif 000079
（ここで、Ｒ1〜Ｒ10の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ1〜Ｒ10の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、２０１０年７月９日に出願された米国仮出願番号第６１／３９９，２９７号の優先権を主張し、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本出願を通して種々の出版物、公開特許出願および特許を参照する。本発明が属する技術の水準をより十分に説明するために、これらの文献の開示の全体を参照により本明細書に組み込む。
【発明の背景】
【０００３】
ラキニモドは、急性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ａＥＡＥ）モデルにおいて効果的であることが示されている化合物である（米国特許第６，０７７，８５１号）。その化学名はＮ−エチル−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミドであり、化学登録番号は２４８２８１−８４−７である。ラキニモドの合成方法およびそのナトリウム塩の調製は、米国特許第６，０７７，８５１号に開示される。ラキニモドの合成の追加的な方法は、米国特許第６，８７５，８６９号に開示される。
【０００４】
ラキニモドナトリウムを含む薬学的組成物は、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２００５／０７４８９９号に開示される。
【０００５】
ラキニモドナトリウムは、高い経口バイオアベイラビリティを有する新規な合成化合物であり、これは多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための経口処方物として提案されている（Polman, C. et al., (2005)“Treatment with laquinimod reduces development of active MRI lesions in relapsing MS”, Neurology. 64:987-991; Sandberg-Wollheim M, et al. (2005)“48-week open safety study with high-dose oral laquinimod in patients”, Mult Scler. 11:S154）。研究により、ラキニモドは、再発ＭＳにおける活性ＭＲＩ病変の発現を低下させることができることも示されている（Polman, C. et al., (2005)“Treatment with laquinimod reduces development of active MRI lesions in relapsing MS”, Neurology. 64:987-991）。
【０００６】
ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２０１０／０２８０１５は、ラキニモドの重水素リッチな変異体を提案する。しかし、ＷＯ２０１０／０２８０１５は、「代謝スイッチング（[m]etabolic switching）は、異なる割合の公知代謝産物ならびに新規代謝産物をもたらす恐れがあり」、かかる「新規な代謝プロフィールは、程度の差はあるが毒性を付与する可能性があり」、これは「どの薬剤クラスについても先験的には予測可能でない」と警告している。したがって、ＷＯ２０１０／０２８０１５は、少なくとも、ラキニモドの重水素リッチな変異体の投与のための投薬量を提供しておらず、代謝プロフィールを開示していない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、被検体を治療するのに効果的な下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化１】
2013535437.tif 000002
【０００８】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩を、１日あたり０．２ｍｇ〜２．０ｍｇ、ヒト被検体に投与することを含む、自己免疫疾患に罹患したヒト被検体を治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、ヒト被検体において、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの形成の低下を誘導する方法であって、治療に効果的な量の下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化２】
2013535437.tif 000003
【００１０】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩をヒト被検体に投与することを含み、
形成の低下が、等モル量の非重水素リッチなラキニモドの投与による５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの形成に対して相対的なものである方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の混合物であって、各化合物が、下記構造：
【化３】
2013535437.tif 000004
【００１２】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の各々は、異なるＲ１〜Ｒ１０においてＤを含有する）を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である混合物を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、本明細書で説明される混合物またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに：
ａ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩；
ｂ）少なくとも１種の薬学的に許容可能なキャリア；および
ｃ）下記構造を有する化合物であって、当該化合物および重水素リッチなラキニモドの合計重量に基づいて０．１％未満の量で存在する化合物：
【化４】
2013535437.tif 000005
【００１５】
の混合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本明細書で説明される薬学的組成物の調製方法であって：
ａ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩のバッチを得ること；
ｂ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩のバッチに存在する、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの総量を装置により決定すること；および
ｃ）そのバッチが、０．１重量％未満の任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを有すると決定された場合に限り、このバッチを用いて薬学的組成物を調製すること
を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、分配用の、本明細書で説明される薬学的組成物の認可されたバッチを製造するための方法であって：
ａ）薬学的組成物のバッチを得ること；
ｂ）そのバッチのサンプルにおける任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの総量を装置により決定すること；および
ｃ）そのバッチのサンプルが、ラキニモドと５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドとの合計重量に対して、０．１重量％未満の任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを含有すると決定された場合に限り、分配用のバッチを認可すること
を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ヒト被検体における自己免疫疾患を治療する際に１日あたり０．２ｍｇ〜２ｍｇの量で使用するための、下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化５】
2013535437.tif 000006
【００１９】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ラットへの０．２ｍｇ／ｋｇでの経口投与後の、ラキニモドから形成されたＤＥＬＡＱ対化合物２から形成されたＤＥＬＡＱについての平均血漿濃度−時間プロフィールを示す。
【図２】図２は、ラットへの０．２ｍｇ／ｋｇでの経口投与後の、ラキニモド対化合物２についての平均血漿濃度−時間プロフィールを示す。
【図３】図３は、二つの用量のラキニモドならびに種々の用量の化合物１、２および３で処置されたマウスでのＭＯＧ誘導ＥＡＥにおける群平均の点数比較を示す。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明は、自己免疫疾患に罹患したヒト被検体を治療する方法であって、被検体を治療するのに効果的な下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化６】
2013535437.tif 000007
【００２２】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩を、１日あたり０．２ｍｇ〜２．０ｍｇ、ヒト被検体に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
本方法の態様では、重水素リッチな化合物は、
【化７】
2013535437.tif 000008
【００２４】
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２５】
本方法の別の態様では、重水素リッチな化合物は、
【化８】
2013535437.tif 000009
【００２６】
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２７】
本方法のさらに別の態様では、重水素リッチな化合物は、
【化９】
2013535437.tif 000010
【００２８】
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２９】
本方法のさらに別の態様では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス関節炎、クローン病または関節リウマチである。
【００３０】
本方法のさらに別の態様では、自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【００３１】
本方法のさらに別の態様では、重水素リッチな化合物の投与は、等モル量の非重水素リッチなラキニモドの投与より、自己免疫疾患の治療に効果的である。
【００３２】
本方法のさらに別の態様では、重水素リッチな化合物の投与によりヒト被検体に形成される任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルは、等モル量の非重水素リッチなラキニモドがヒト被検体に投与されたときに形成される５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルと比較して低下している。
【００３３】
本方法のさらに別の態様では、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルは、少なくとも５０％低下している。
【００３４】
本方法のさらに別の態様では、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルは、少なくとも９０％低下している。
【００３５】
本発明はまた、ヒト被検体において、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの形成の低下を誘導する方法であって、治療に効果的な量の下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化１０】
2013535437.tif 000011
【００３６】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩をヒト被検体に投与することを含み、
形成の低下が、等モル量の非重水素リッチなラキニモドの投与による５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの形成に対して相対的なものである方法を提供する。
【００３７】
本方法の態様では、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルは、等モル量の非重水素リッチなラキニモドがヒト被検体に投与されたときに形成される５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルと比較して、少なくとも５０％低下している。
【００３８】
本方法の別の態様では、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルは、少なくとも９０％低下している。
【００３９】
本発明はさらに、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の混合物であって、各化合物が、下記構造：
【化１１】
2013535437.tif 000012
【００４０】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の各々は、異なるＲ１〜Ｒ１０においてＤを含有する）を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である混合物を提供する。
【００４１】
この混合物の態様では、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の一つは、下記構造：
【化１２】
2013535437.tif 000013
【００４２】
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００４３】
この混合物の別の態様では、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の一つは、下記構造：
【化１３】
2013535437.tif 000014
【００４４】
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００４５】
この混合物のさらに別の態様では、少なくとも２種の重水素リッチな化合物の一つは、下記構造：
【化１４】
2013535437.tif 000015
【００４６】
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００４７】
本発明はさらに、本明細書で説明される混合物またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに：
ａ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩；
ｂ）少なくとも１種の薬学的に許容可能なキャリア；および
ｃ）下記構造を有する化合物であって、当該化合物および重水素リッチなラキニモドの合計重量に基づいて０．１％未満の量で存在する化合物：
【化１５】
2013535437.tif 000016
【００４９】
の混合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００５０】
この薬学的組成物の態様では、化合物は、その化合物および重水素リッチなラキニモドの合計重量に基づいて３ｐｐｍ未満または２ｐｐｍ未満の量で存在する。
【００５１】
この薬学的組成物の別の態様では、重水素リッチなラキニモドは、下記構造：
【化１６】
2013535437.tif 000017
【００５２】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００５３】
この薬学的組成物のさらに別の態様では、重水素リッチなラキニモドにおいて、Ｒ１〜Ｒ５の各々がＤであり、Ｒ６〜Ｒ１０の各々がＨであるか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００５４】
この薬学的組成物のさらに別の態様では、重水素リッチなラキニモドにおいて、Ｒ１〜Ｒ５の各々がＨであり、Ｒ６〜Ｒ１０の各々がＤであるか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００５５】
この薬学的組成物のさらに別の態様では、重水素リッチなラキニモドにおいて、Ｒ１〜Ｒ１０の各々がＤであるか、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００５６】
この薬学的組成物のさらに別の態様では、薬学的組成物は錠剤の形態である。
【００５７】
この薬学的組成物のさらに別の態様では、薬学的組成物は、等モル量の非重水素リッチなラキニモドがヒト被検体により摂取されたときに形成される５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルに対して、ヒト被検体により摂取されたときに、ヒト被検体で形成される任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドのレベルの低下を提供する。
【００５８】
本発明はさらに、本明細書で説明される薬学的組成物の調製方法であって：
ａ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩のバッチを得ること；
ｂ）重水素リッチなラキニモドまたはその薬学的に許容可能な塩のバッチに存在する、任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの総量を装置により決定すること；および
ｃ）そのバッチが、０．１重量％未満の任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを有すると決定された場合に限り、このバッチを用いて薬学的組成物を調製すること
を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、分配用の、本明細書で説明される薬学的組成物の認可されたバッチを製造するための方法であって：
ａ）薬学的組成物のバッチを得ること；
ｂ）そのバッチのサンプルにおける任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの総量を装置により決定すること；および
ｃ）そのバッチのサンプルが、ラキニモドと任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドとの合計重量に対して、０．１重量％未満の任意に重水素化された５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを含有すると決定された場合に限り、分配用のバッチを認可すること
を含む方法を提供する。
【００６０】
本発明はさらに、ヒト被検体における自己免疫疾患を治療する際に１日あたり０．２ｍｇ〜２ｍｇの量で使用するための、下記構造を有する重水素リッチな化合物：
【化１７】
2013535437.tif 000018
【００６１】
（ここで、Ｒ１〜Ｒ１０の各々は、独立に、ＨまたはＤであり、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも一つは、Ｄである）またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００６２】
本明細書で開示される任意の範囲により、この範囲内の１００分の１、１０分の１および整数のあらゆる単位量が、本発明の一部として具体的に開示されていることを意味する。したがって、例えば０．０１ｍｇ〜５０ｍｇは、０．０２、０．０３．．．０．０９；０．１、０．２．．．０．９；および１、２．．．４９ｍｇの単位量が、本発明の態様として含まれることを意味する。
【００６３】
重水素（Ｄまたは２Ｈ）は、水素の安定な非放射性同位体であり、２．０１４４の原子量を有する。化合物中の水素原子は、同位体１Ｈ（水素またはプロチウム）、Ｄ（２Ｈまたは重水素）およびＴ（３Ｈまたは三重水素）の混合物として天然に存在する。重水素の天然存在度は０．０１５６％である。したがって、化合物中の任意の部位の水素原子においてその天然存在度の０．０１５６％より大きくなるようにリッチにしたレベルの重水素を有する化合物は、リッチでない対応物に対して新規である。
【００６４】
本明細書で使用される「重水素リッチな」化合物は、ある量の化合物中で、化合物の任意の関連部位での重水素の存在度が、その部位で天然に存在する重水素の存在度より高いことを意味する。上記で使用される化合物における関連部位は、重水素リッチでない場合、化合物の化学構造表示で「Ｈ」と表示される部位である。上記で使用される天然に存在するとは、その化合物が、重水素の存在度を高める積極的なステップなしで調製された場合における、化合物中の関連部位に存在する重水素の存在度をいう。したがって、「重水素リッチな」化合物において、その関連部位のいずれかでの重水素の存在度は、０．０１５６％超から１００％の範囲であり得る。重水素リッチな化合物を得る方法の例は、水素を重水素と交換するか、または重水素リッチな出発原料で化合物を合成する方法である。
【００６５】
ミリグラムまたはそれ以上の量の化合物の任意の関連部位において１００％の重水素化を得ることは困難なことがある。したがって、化学構造において重水素原子が具体的に示されていても、ある割合の水素がなお存在しているかもしれないことが理解される。したがって、化学構造が「Ｄ」を含有する場合、その構造で表される化合物は、「Ｄ」で表される部位において重水素リッチである。
【００６６】
化合物の特性は、例えば、１Ｈ核磁気共鳴分光法、質量分析、赤外、紫外または蛍光分光光度法、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、元素分析、エイムス試験、溶解性、安定性で決定されるような、化合物が示す任意の品質（例えば、ピークまたは保持時間）、および分析方法で決定され得る他の任意の品質を指す。化合物の特性が分かったら、その情報を用いて、例えば、サンプル中の化合物の存在についてスクリーニングまたはテストすることができる。
【００６７】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」キャリアまたは賦形剤は、妥当な利益／リスク比と釣り合って、過度に有害な副作用（例えば、毒性、炎症およびアレルギー応答）を伴うことなくヒトおよび／または動物で用いるのに適しているものである。
【００６８】
本明細書で使用される「薬剤物質（drug substance）」は、疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防において薬理学的活性または他の直接的効果を提供する、あるいは、ヒトまたは動物の体の構造または任意の機能に影響を及ぼす、製剤中の活性成分を指す。
【００６９】
本明細書で使用される「製剤（drug product）」は、薬剤物質ならびに少なくとも１種の薬学的に許容可能なキャリアを含有する最終剤形を指す。
【００７０】
本明細書で使用される「単離された（isolated）」化合物は、単離の積極的行為に従って、粗製反応混合物から単離された化合物である。単離の行為は、必然的に粗製反応混合物の他の公知成分から化合物を分離することを伴うが、若干の不純物、不明の副生成物、および粗製反応混合物の残留量の他の公知成分が残ることは許容される。精製は、単離の積極的行為の一例である。
【００７１】
本明細書で使用される、ある化学的物体（chemical entity）を「含まない（free）」組成物とは、その組成物が、あったとしても、組成物中での化学的物体の存在を排除しようとする積極的行為に従って回避することができない量の化学的物体を含有することを意味する。
【００７２】
本明細書で使用される「安定性試験」は、特定の時間間隔および種々の環境条件（例えば、温度および湿度）で、ある製剤がその指定された寿命期間にわたって分解するか、また、どの程度分解するかを見るために実施される試験を指す。その試験の具体的な条件および時間は、製剤がその寿命期間にわたって遭遇すると予想される条件を加速するようなものである。最終医薬品のための安定性試験の詳細な要件は、例えば、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ§２１１．１６６に体系化され、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。
【００７３】
本明細書で使用される、数値または範囲の文脈における「約（about）」は、表示されるかまたは特許請求された数値または範囲の±１０％を意味する。
【００７４】
ラキニモドは以下の化学構造を有する小分子である：
【化１８】
2013535437.tif 000019
【００７５】
これは、種々の実験的炎症／自己免疫動物モデル、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデル、炎症性腸疾患のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）の非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス、ギランバレー症候群の実験的自己免疫性神経炎（ＥＡＮ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ループス関節炎、クローン病および関節リウマチにおいて、治療効果が実証されている経口免疫調節剤である。これらのモデルにおけるラキニモドの治療活性は、種々の機構的効果、例えば、ケモカイン媒介性Ｔ細胞接着の調節による標的組織への白血球浸潤の減少、サイトカイン平衡の調節、抗原提示の変更をもたらすＭＨＣクラスＩＩのダウンレギュレーション、および樹状細胞亜集団（subpopulation）に対する効果などによってもたらされる。
【００７６】
本明細書において、ラキニモドならびに重水素化化合物の薬学的に許容可能な塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛、アルミニウムおよび鉄が含まれる。ラキニモドの塩処方物およびその調製方法は、例えば米国特許出願公開第２００５／０１９２３１５号およびＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２００５／０７４８９９に記載され、これらを参照により本出願に組み込む。
【００７７】
投薬単位は、単一化合物またはその化合物の混合物を含んでいてもよい。投薬単位は、経口剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤および顆粒剤などに調製することができる。
【００７８】
本明細書において、ラキニモドならびに重水素化化合物のラキニモドは、意図した投与形態に対して慣用的な薬学的実務に合致するように適切に選択された適切な薬学的希釈剤、増量剤、賦形剤またはキャリア（本明細書では集合的に薬学的に許容可能なキャリアと称する）と混合して投与することができる。この単位は、好ましくは、経口投与に適した形態である。本明細書において、ラキニモドならびに重水素化化合物のラキニモドは、単独で投与することができるが、一般的には薬学的に許容可能なキャリアと混合され、錠剤もしくはカプセル剤の形態、リポソームまたは凝集粉末として共投与される。適切な固体キャリアの例には、ラクトース、スクロース、ゼラチンおよび寒天が含まれる。カプセル剤または錠剤は、容易に処方することができ、飲み込みやすくしたり噛みやすくしたりすることができる。他の固体形態には、顆粒剤およびバルク散剤が含まれる。錠剤は、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤、流動性誘発剤および溶融剤を含んでいてもよい。例えば、錠剤またはカプセル剤の投薬単位形態での経口投与のためには、活性薬剤成分を、経口用の非毒性の薬学的に許容可能な不活性キャリア、例えばラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロースなどと混合することができる。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはβ−ラクトース、トウモロコシデンプン、天然および合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウム、ポビドン、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの剤形で用いられる滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ステアリン酸、ステアリルフマル酸ナトリウム、タルクなどが含まれる。崩壊剤には、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴム、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムなどが含まれる。
【００７９】
本発明の経口剤形を処方するのに使用できる技術、薬学的に許容可能なキャリアおよび賦形剤の具体的な例は、例えば米国特許出願公開第２００５／０１９２３１５号、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２００５／０７４８９９、ＷＯ２００７／０４７８６３およびＷＯ２００７／１４６２４８に記載される。
【００８０】
本発明において有用な剤形を作製するための一般的技術および組成物は、以下の文献に記載される：7 Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, Editors, 1979); Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Lieberman et al., 1981); Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition (1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985); Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995); Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989); Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61 (Alain Rolland, Ed., 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.); Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.)。これらの文献の全体を参照により本出願に組み込む。
【００８１】
化合物に由来する代謝産物は、内在性あっても薬学的であっても、化合物の分解および排除の天然の生化学的過程の一部として形成される。化合物の分解速度は、その作用の期間および強度の重要な決定因子である。薬学的化合物の代謝産物のプロファイリング、薬剤代謝は、薬剤発見の重要な部分であり、これは、望ましくない副作用の理解につながる。
【００８２】
ラキニモドの代謝
ラキニモドは、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０  ３Ａ４）によってゆっくり代謝されて幾つかのマイナーな代謝産物を形成することが示されており、その一部は、フェーズ２代謝反応によって更なる代謝を受けることがある。例えば、Tuvesson et al.“Cytochrome P450 3A4 is the major enzyme responsible for the metabolism of laquinimod, a novel immunomodulator”, Drug Metabolism and Disposition, Vol. 33, No. 6, pages 866-872を参照されたい。以下の化学構造を有するＤＥＬＡＱ（デス−エチル−ラキニモド；５−クロロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド）は、ラキニモドの酸化的代謝産物の一つである。
【化１９】
2013535437.tif 000020
【００８３】
さらに、臨床データは、人体におけるＤＥＬＡＱレベルが、ＣｍａｘまたはＡＵＣに関して、ラキニモドレベルに対してある一定の割合であることを示している。かかる挙動は、代謝産物ＤＥＬＡＱの形成が、ＰＫ「形成律速（formation rate limited）」であることを示唆している。
【００８４】
以下で説明するのは、重水素化された形態のラキニモドが、代謝変化、特にシトクロムＰ４５０系によって媒介される代謝変化に対して、より耐性があることを示す実験である。酸化されるＣ−Ｈ結合の重水素化は、薬剤代謝の経路を変える可能性がある（代謝スイッチング）。以下の代謝スキームは、重水素化ラキニモドを用いた、より遅いＣＹＰ３Ａ４媒介性ＤＥＬＡＱ形成を示す：
【化２０】
2013535437.tif 000021
【００８５】
フェニル部分の重水素化は、エチル基のα−炭素の酸化に先行して、ＣＹＰ触媒中心に対するアミド結合の位置に影響を及ぼす可能性がある。これによって、何故、エチルおよび／またはフェニル部分における種々の重水素化により重水素化されたラキニモドが、例えば、任意に重水素化されたＤＥＬＡＱの形成の低下をもたらすかが説明され得る。
【００８６】
不純物としてのＤＥＬＡＱ
ＤＥＬＡＱも、ラキニモド合成の望ましくない合成副生成物である。ＤＥＬＡＱの活性は、完全には特徴づけられていない。薬剤物質および最終製剤中の不純物の量を最少化することも一般に好ましい。
【００８７】
ラキニモドナトリウム薬剤物質中の不純物としてのＤＥＬＡＱは、ＨＰＬＣ法によって試験され、この不純物についての規格は０．１％以下と規定される。ラキニモドナトリウムのＧＭＰ薬剤物質バッチが試験されており、これらバッチ中のＤＥＬＡＱのレベルは、３ｐｐｍ未満であることが分かっている。したがって、同様のパラメーターが、本発明の化合物を含有する製剤に対して規定される。
【００８８】
いくつかの分析およびバイオ分析方法が、任意に重水素化されたＤＥＬＡＱ濃度の測定のために開発された。種々のマトリックスにおける任意に重水素化されたＤＥＬＡＱ分析のための現在のバイオ分析方法は、ＬＣ−ＭＳに基づくものであり、低いｐｇ／ｍＬ血漿レベルで感度を有している。
【００８９】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによって、よりよく理解されるが、当業者であれば、詳述される特定の実験が、以下の特許請求の範囲で更に完全に説明される本発明の例示に過ぎないことを容易に認識するでしょう。
【実験の詳細】
【００９０】
例１：重水素化ラキニモドの調製
ステップ１：重水素化Ｎ−エチル−アニリンの合成
【化２１】
2013535437.tif 000022
【化２２】
2013535437.tif 000023
【００９１】
アニリン（０．０１ｍｏｌｅ）をトルエン（１０ｍｌ）に溶解し、窒素下で０℃に冷却し、無水酢酸（０．０２ｍｏｌｅ）を一度に加えた。冷却浴を取り外し、混合物を９０分間撹拌し、次いでロータリーエバポレーターで蒸発させた。中間体アセトアニリドを真空下で乾燥し、次いでＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し、窒素下で０℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム（０．０２５ｍｏｌｅ）を２５分間かけて加えた。混合物を２時間還流させ、次いで冷却した。シリカゲル（３ｇｒ）を加え、続いて１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（１．８ｇｒ）を加えた。混合物を３０分間撹拌し、次いで硫酸ナトリウムのパッドでろ過した。ろ過ケーキをジエチルエーテルで洗浄し、有機相をロータリーエバポレーターで濃縮して表題化合物を得た。
【００９２】
ステップ２：重水素化ラキニモドの合成
【化２３】
2013535437.tif 000024
【００９３】
Ｎ−エチル−アニリン（０．０１ｍｏｌｅ）およびＭＣＱＣＡ（１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−キノリン−３−カルボン酸）（２．０３ｇｒ、０．００８ｍｏｌｅ）をジクロロメタン（３２ｍｌ）中で撹拌し、トリエチルアミン（４．２ｍｌ）を加えた。混合物を窒素下、氷／水浴中で冷却し、塩化チオニル（１．３３ｇｒ）を３０分間かけて滴下した。混合物を０℃でさらに３時間撹拌し、次いで１Ｍの冷却硫酸水溶液で抽出した。有機相を１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で抽出し、水相をロータリーエバポレーターで少量濃縮して微量の有機溶媒を除去した。５Ｍ  ＨＣｌを加えてｐＨ１〜１．５にし、得られた懸濁液を３０分間撹拌した。沈澱生成物をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた。その後、重水素化ラキニモドを得た（８６〜９３％収率）。
【００９４】
ステップ３：重水素化ラキニモドナトリウム塩の調製
ステップ２で調製した重水素化ラキニモドをエタノールに懸濁し、２０％ＮａＯＨ水溶液で処理した。沈澱したナトリウム塩を３時間撹拌し、ろ過し、エタノールで洗浄した。真空下で乾燥させて、重水素化ラキニモドナトリウム塩を得た（９２〜９４％収率）。同定および純度は、ＮＭＲ、ＭＳおよびＨＰＬＣにより証明された。
【表Ａ】
2013535437.tif 000025
【００９５】
例２：ＤＥＬＡＱの分析
ＤＥＬＡＱは、齧歯動物ならびに人体においてラキニモドを投与した際に代謝産物として形成される。代表的な代謝産物としてのＤＥＬＡＱ濃度の測定のためにいくつかの分析およびバイオ分析方法が開発された。種々のマトリックスにおけるＤＥＬＡＱ分析のための現在のバイオ分析方法は、ＬＣ−ＭＳに基づくものであり、低いｐｇ／ｍＬ血漿レベルで感度を有している。
【００９６】
以下の条件を、ヒトの血漿におけるＤＥＬＡＱの測定において使用した。血漿は、ＬＵＤＯＸ  ＡＳ−４０コロイドシリカ溶液で沈澱させた後、オンラインＳＰＥで精製し、続いてＭＳ／ＭＳ検出を備えたＨＰＬＣで分析する。
【表Ｂ】
2013535437.tif 000026
【表Ｃ】
2013535437.tif 000027
【００９７】
ラットの血漿におけるＤＥＬＡＱも以下の条件下で測定した。血漿は、ＬＵＤＯＸ  ＡＳ−４０コロイドシリカ溶液で沈澱させた後、オンラインＳＰＥで精製し、続いてＭＳ／ＭＳ検出を備えたＨＰＬＣで分析した。
【表Ｄ】
2013535437.tif 000028
【００９８】
例３：薬物動態学的および部分代謝的評価
この例の主目的は、以下のとおりである：
・  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳバイオ分析方法を用いた、ラット血漿における化合物１、化合物２、化合物３およびラキニモドの定量化。
【００９９】
・  ０．２ｍｇ／ｋｇの用量での経口（ＰＯ）投与後の、化合物１、化合物２、化合物３およびラキニモドの薬物動態学的プロフィールの特性評価。
【０１００】
・  収集した血漿サンプルにおける測定ＤＥＬＡＱ濃度。
【０１０１】
この例で選択された用量レベルは、ラキニモドで予め実施された薬理学的試験において用いられたものである。
【０１０２】
全体設計
ポリエチレン管により右総頸静脈でカニューレを挿入されたラットを使用した。生きている部分において（in-life part）、３匹のカニューレ挿入雌ラットを、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で四つのテスト品目の各々で処理した。
【０１０３】
血液を、血漿の調製用に、五つの異なる時点でラットから抜き取った。これらの血漿サンプルにおける化合物１、化合物２、化合物３、ラキニモドおよびＤＥＬＡＱの濃度を、適用可能なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて測定した。
【０１０４】
材料
テスト化合物
ａ．例１で調製したＮ−エチル−Ｎ−Ｄ５−フェニル−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミドナトリウム塩（化合物１）：
分子量：３８３．８
外観：白色粉末
貯蔵：２〜８℃、光から保護された状態で
純度：１００％純度と仮定した。
【０１０５】
ｂ．例１で調製したＮ−Ｄ５−エチル−Ｎ−フェニル−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミドナトリウム塩（化合物２）：
分子量：３８３．８
外観：白色粉末
貯蔵：２〜８℃、光から保護された状態で
純度：１００％純度と仮定した。
【０１０６】
ｃ．例１で調製したＮ−Ｄ５−エチル−Ｎ−Ｄ５−フェニル−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミドナトリウム塩（化合物３）：
分子量：３８８．８
外観：白色粉末
貯蔵：２〜８℃、光から保護された状態で
純度：１００％純度と仮定した。
【０１０７】
ｄ．ラキニモドナトリウム塩
分子量：３７８．８
外観：白色粉末
貯蔵：室温を制御し（１５〜２５℃）、光から保護された状態で
ＨＰＬＣによるアッセイ：１００．８％
純度：１００％純度と仮定した。
【０１０８】
媒体
水、高純度（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｑ、実験室において作製）。
【０１０９】
他の材料
麻酔用イソフルラン（ＦＯＲＡＮＥ（登録商標）、ＡＢＢＯＴＴ）
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号：Ｅ４８８４−１００ｇ）
ヘパリンナトリウム塩（ブタ腸粘膜由来、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号：Ｈ９３９９−２５ＫＵ）。
【０１１０】
テスト系
動物の詳述
種：ラット
系統：ＳＤ（スプラーグドーリーＣＤラット）
健康状態：ＳＰＦ
注文した年齢：８週
動物数：２０匹のカニューレ挿入された雌
注文した重量範囲：２００〜２２５ｇ
順化：少なくとも３日間
処置の開始で：
動物数：１２匹のカニューレ挿入された雌
おおよその年齢：９週。
【０１１１】
テスト系の選択の正当性
ＳＤラットは、薬物動態学的試験に適した齧歯動物種および系統であり、行政当局に承認されているものである。さらに、スプラーグドーリーラットにおけるラキニモドの薬物動態学的プロフィールは、十分特性評価されている。
【０１１２】
同定システム
消えない印を体に付けて各動物を特定した。ケージには、系統、動物コード、群コード、薬剤投与の日付および時間、テスト品目および研究コードを特定する個別カードで印を付けた。
【０１１３】
具体的な維持スケジュール
用量投与前後での動物のハウジング
動物を、施設到着後に群でケージに入れて環境的に管理された部屋に収容した。ラットを、床用の敷物としてソーチップ（saw chip）を備えた個別のポリカーボネートまたはポリスルホネートケージに収容した。
【０１１４】
環境条件
２１±３℃の温度および３０〜７０％の相対湿度を維持するように制御設定した。１２時間明／１２時間暗という明／暗サイクルを自動的に維持した。
【０１１５】
飲料水
０．２μｍフィルターでろ過した水道水を自由に与えた。水は、総微生物数について、ならびに緑膿菌（Pseudomonas aeruginos）、大腸菌（Escherichia coli）およびクロストリジウム属種（Clostridium sps）が存在しないことについて、定期的に（３カ月に１回）分析した。
【０１１６】
給餌
研究を通して、齧歯動物用の加圧滅菌済のＡｌｔｒｏｍｉｎ  ＶＲＦ１餌を、自由に提供した。食餌を定期的に分析した。
【０１１７】
床敷
加圧滅菌済のＬＩＧＮＯＣＥＬ（ＳＡＷＩ、かんなくず（wood-shaving））床敷を使用した。床敷材料の品質は、製造業者によって保証されたものである。
【０１１８】
汚染物質が、研究目的を妨げるレベルで食餌、水または床敷中に存在しないことが分かった。
【０１１９】
実験設計
順化
各動物は、有資格者による検査を受け、カニューレの開通性は、動物が受領した時に、血液サンプルを抜き取る能力により証明された。良好な健康状態にあると判定された動物を少なくとも３日間順化させた。すべての動物に、順化期間の末日に、担当獣医による詳細な身体検査を施した。
【０１２０】
ランダム化
順化期間の後、良好な健康状態にあり試験に適していると判定された動物を、その体重に基づいて研究に割り当てた。ランダム化の時点で、動物の体重は、全体平均の±２０％内に入っていた。
【０１２１】
動物投薬レベルおよび処置レジメンの構成
【表１−１】
2013535437.tif 000029
【表１−２】
2013535437.tif 000030
【０１２２】
テスト品目分子量比は、化合物１および化合物２について１．０７５７である。テスト品目分子量比は、化合物３について１．０８９８である。テスト品目分子量比は、ラキニモドナトリウムについて１．０６１６である。これらの補正係数を適用して、非重水素化ラキニモド遊離酸に相当する濃度を調節した。
【０１２３】
経口投与を、とがっていない給餌用ステンレス製針（Ｐｏｐｐｅｒ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＵＳＡ）を用いて、５ｍｌ／ｋｇの投薬容積で経口胃管栄養法により実施した。用量投与の前に体重を測定し、個々の体重をもとにして用量を計算した。
【０１２４】
投与の用量および経路の選択の正当性
この研究で選択した用量レベルは、ラキニモドで予め実施した薬理学的研究ですでに用いられたものである。投与経路は、目的とするヒト曝露の経路であるので、経口とする。
【０１２５】
処方物の調製および得られた濃度の測定
投薬溶液の調製
適量のテスト品目を計量し、所要濃度が得られるように水（媒体）に溶解し、これは、各々の場合、０．０４ｍｇ／ｍＬの非重水素化ラキニモド遊離酸に相当した。
【０１２６】
テスト品目の溶解は、緩やかな振とう、撹拌、低速ボルテックスまたは超音波処理器により実施した。純度を調整するのに補正係数は適用しなかった。
【０１２７】
処方物の貯蔵および安定性
すべての投薬溶液は、密封したアンバーガラス容器中に２〜８℃で、光から保護された状態で貯蔵した。使用する前に、処方物を冷蔵庫から取り出し、次いで環境室温（１５〜２５℃）に到達させた。投薬溶液は、類似のラキニモド投薬溶液の安定性データに基づいて、少なくとも４８ｈ安定であると仮定した。
【０１２８】
投薬溶液について得られた濃度
処置前に、投薬溶液中のラキニモド濃度を、溶液から採取された重複サンプルで、ＵＶ検出を備えた認可されたＨＰＬＣ法で測定した。得られた濃度は、公称濃度の±１０％以内であった。
【０１２９】
臨床的観察
処置に対する死亡率、疾病の兆候または重篤な反応を記録した。
【０１３０】
血液サンプリング、血漿調製
血液を、以下の表に詳細に示すように、次の時間点：投与後１、２、４、８および２４時間で、動物から抜き取った。実際のサンプリング時間を記録した。
【表２】
2013535437.tif 000031
【０１３１】
カニューレ挿入ラットからの血液採取
各動物をきつく固定した。シールを取り外した後、カニューレのポートに、ＰＢＳを含有する注射器に装着した適切なとがっていない針でアクセスした。約１００μＬの血液を抜き取った後、注射器を、クリーンなヘパリン化注射器に変えた。約２５０μＬの血液を、血漿の調製用に収集した。血液の最初の１００μＬ画分を戻し、２５０μＬのＰＢＳをカテーテルで動物に与えた。カテーテルを、１０ｍｌのストックヘパリン（２００ＩＵ／ｍｌ）と１０ｍｌの滅菌グリセロール（ｄ＝１．２６ｇ／ｍＬ）を混合して調製したヘパリン化グリセロール（１００ＩＵ／ｍｌ）溶液で充満させた。血液検体を直ちに混合し、水氷上に置いた。
【０１３２】
血漿の調製
採取から４０分以内にできる限り速やかに遠心分離を実施した。
【０１３３】
全血を４℃、２５００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離にかけ、分離した血漿を、予めラベル表示したポリプロピレン管に移し、その管を採取から７０分以内に−７０℃で冷凍した。
【０１３４】
凍結サンプルを、ラキニモド濃度の測定のためのバイオ分析実験室に移し、これらを分析の時まで公称−７０℃で貯蔵した。
【０１３５】
血漿サンプルのバイオ分析
テスト品目（化合物１、化合物２、化合物３およびラキニモド）の濃度およびＤＥＬＡＱの濃度を、信頼性の高いＬＣ／ＭＳ／ＭＳアッセイを用いて血漿サンプルで測定した。
【０１３６】
薬物動態学的データ分析
薬物動態学的パラメーターを計算し、時間に対する平均血漿レベル曲線を評価した。
【０１３７】
以下の薬物動態学的パラメーターを、化合物１、化合物２、化合物３およびラキニモドの平均血漿濃度−時間データ（各々の時間点で３匹の動物の平均）から決定した。
【表Ｅ】
2013535437.tif 000032
【０１３８】
結果のまとめ
以下の表３〜６および図２に示すように、重水素リッチなラキニモドの平均血漿濃度は、非重水素リッチなラキニモドの平均血漿濃度に匹敵する。
【０１３９】
テスト品目の濃度−時間プロフィールには有意な差はなかった。最大平均濃度は、投与後１または２時間で到達し、７０３〜７９８ｎｇ／ｍＬの範囲で変動した。平均濃度は、投与後２４時間で１９４〜２２７ｎｇ／ｍＬに低下した。ラキニモド、化合物１、化合物２および化合物３についてのＡＵＣ値は、それぞれ、１５５０６．０、１３７８３．４、１２２８９．８および１５７５０．２であり、これも、曝露において有意差がないことを示す。
【表３】
2013535437.tif 000033
【表４】
2013535437.tif 000034
【表５】
2013535437.tif 000035
【表６】
2013535437.tif 000036
【０１４０】
以下の表７および８ならびに図１に示すように、重水素リッチなラキニモドの経口投与に続いて形成されたＤＥＬＡＱの量は、非重水素リッチなラキニモドの投与後に形成されたＤＥＬＡＱの量より低い。化合物２で処置された動物の血漿において測定されたＤＥＬＡＱ濃度においては、ラキニモドで処置された動物の血漿と比べて、平均でおおよそ１／１０の低下（ten-fold reduction）を観察することができた。前者の群では、平均ＤＥＬＡＱ濃度は、１８．３〜７５．４ｐｇ／ｍＬの範囲で変動し、ラキニモドを受領した群では、１４２〜８７８ｐｇ／ｍＬの範囲で変動した。両方の群において、最も低いＤＥＬＡＱ濃度は、投与後１時間で測定され、ＤＥＬＡＱ濃度は、投与後２４時間に最後のサンプルが採取されるまで上昇した。
【表７】
2013535437.tif 000037
【表８】
2013535437.tif 000038
【０１４１】
テスト結果は、重水素リッチなラキニモドが、非重水素化ラキニモドのものと類似した血漿濃度−時間プロフィール保持しながら、ＤＥＬＡＱの形成を低下させることを示す。
【０１４２】
例４：ＭＯＧ誘導（ミエリン−オリゴデンドロサイト−糖タンパク質）ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）における、重水素化ラキニモド（化合物１、２および３）の効力の評価
この研究の目的は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ誘導ＥＡＥを用いて、三つの重水素化された形態のラキニモド、化合物１、２および３の効力をラキニモドと比較して評価することであった。
【０１４３】
ＥＡＥは、多発性硬化症のための承認された動物モデルであり、Ｃ５７ＢＬ／６におけるＭＯＧでの誘導は、十分確立されたモデルである。
【０１４４】
全体設計
マウスに脳炎誘発性エマルジョンを注射して疾患を誘導した。
【０１４５】
１０ｍｇ／ｋｇの化合物１、２および３、１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのラキニモドまたは媒体を、研究の開始（０日目）から終わり（３０日目）まで投与した。すべての群を毎日経口で処置した。
【０１４６】
材料：
化合物１、２および３は、例１に記載したようにして調製した。  
ラキニモドは、Ｔｅｖａ製のものである。  
精製水（Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。  
百日咳毒素：Ｓｉｇｍａ、コード番号２９８０、ロット０４４Ｋ１４４９。  
ＭＯＧ  ３５−５５：Ｍｎｆ  Ｎｏｖａｔｉｄｅ、ロット番号９００１６−７１−１。  
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）：Ｓｉｇｍａ、コード：Ｆ−５８８１、ロット１０４Ｋ８９３０。  
生理食塩水：Ｍｎｆ−  ＤＥＭＯ  Ｓ．Ａ、Ｃｏｄｅ  ０５０２９、ロット番号０１０１６１０。  
ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７  ＲＡ（ＭＴ）：Ｍｎｆ−  Ｄｉｆｃｏ。
【０１４７】
種、系統および供給業者
２０１０年１月２６日にHarlan Animal Breeding Center、Israelから入手したＣ５７ＢＬ／６系統の健康な未経産の非妊娠の雌マウスを、研究で使用した。これらの動物は、到着時、体重が１５〜２２ｇで約７〜８週齢であった。動物の体重をデリバリーの日に記録した。明らかに健康な動物を、処置開始前に、任意に研究群に割り当てた。マウスは、耳タグを用いて個別に特定した。各ケージに付けた色分けカードによって、ケージ番号、群番号および同定を含む情報を示した。動物のハウジングおよびケア状態を維持した。
【０１４８】
ＥＡＥ誘導
ＭＯＧ（１５０．０μｇ／マウス）およびヒト型結核菌（M.tuberculosis）（１ｍｇ／ｍＬ  ＣＦＡ）リッチなＣＦＡからなる脳炎誘発性混合物（エマルジョン）を注射して、ＥＡＥを誘導した。
【０１４９】
０．２ｍｌの容積のエマルジョンをマウスの側腹部に皮下注射した。
【０１５０】
百日咳毒素を、誘導日とその４８時間後に腹腔内注射した（合計量は、０．２ｍｌ投薬容積中、０．１＋０．１＝０．２００μｇ／マウスであった）。
【０１５１】
マウスを、六つの処置群：媒体、ラキニモド（２５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）ならびに化合物１、２および３（各々１０ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。
【０１５２】
脳炎誘発性エマルジョンの調製および投与
油部分：ＣＦＡ（１ｍｇ／ｍｌ  ＭＴを含有する）
液体部分：１５．０ｍｇのＭＯＧを１０．０ｍｌの標準生理食塩水（Normal saline）に希釈して、１．５ｍｇ／ｍｌのＭＯＧストック溶液を得た。エマルジョンは、ルアーロックで互いに連結された二つの注射器中の等量部の油と液体部分（１：１）から作製し、インスリン注射器に移し、０．２ｍｌを各マウスの右側腹部に注射した。
【０１５３】
百日咳毒素の調製および投与
５５μＬの百日咳毒素（２００μｇ／ｍｌ）を、２１．９４５ｍｌの生理食塩水に加えて、５００ｎｇ／ｍｌを得た。百日咳毒素を、脳炎誘導物質注射の日とその４８時間後に腹腔内投与した（１００．０ｎｇ／０．２ｍｌ／マウス×２＝２００．０ｎｇ／マウス）。
【０１５４】
テスト処方物の調製および投与
２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のラキニモドを、用量レベル２５．０ｍｇ／ｋｇのために精製水で調製した。テスト処方物は、使用するまで２〜８℃で琥珀色の瓶に貯蔵した。２５ｍｇ／ｋｇラキニモド群のマウスに、ラキニモドを、経口胃管栄養法により２００μｌ／マウスの容積用量レベルで１日１回投与した（表４ｂに示すように）。
【０１５５】
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のラキニモドを、用量レベル１０．０ｍｇ／ｋｇのために、慣用的なラキニモドまたは化合物１、２および３について、精製水で調製した。テスト処方物は、使用するまで２〜８℃で琥珀色の瓶に貯蔵した。
【０１５６】
マウスに、慣用的なラキニモドを、ラキニモド１０ｍｇ／ｋｇ群に経口胃管栄養法により２００μｌ／マウスの容積用量レベルで１日１回投与した。テスト化合物の投与を同様の仕方で実施した。媒体（２回蒸留水）を、陰性対照群（群＃１）に同様の仕方で投与した。
【０１５７】
罹患率および死亡率
すべての動物を、瀕死状態にあるどうかを見るために１日１回チェックした。マウスを週に１回計量した。
【０１５８】
ＥＡＥ臨床的兆候
マウスを、ＥＡＥ誘導後１０日目から毎日観察し、ＥＡＥ臨床的兆候を点数付けした。点数を、以下の表４ａに記載される等級に従って観察カードに記録した。
【表４ａ】
2013535437.tif 000039
【０１５９】
１以上の点数を有するすべてのマウスを罹患しているとみなした。最初の臨床的兆候が現れたとき、すべてのマウスに、ケージの床敷上の様々な場所に広げた水に浸した餌を与えた。計算の目的のために、屠殺されるかまたは死亡した動物の点数（６）は、繰り越した。
【０１６０】
結果の解釈
疾患の罹患率（疾患指数）の計算
各群における病気の動物の数を合計した。疾患の罹患率を以下のとおり算出した。
【数１】
2013535437.tif 000040
【０１６１】
罹患の阻止率％を以下のとおり算出した。
【数２】
2013535437.tif 000041
【０１６２】
死亡率／瀕死率（死亡指数）の計算
各群における死亡または瀕死動物の数を合計した。疾患による死亡率を以下のとおり算出した。
【数３】
2013535437.tif 000042
【０１６３】
死亡の阻止率％を以下のとおり算出した。
【数４】
2013535437.tif 000043
【０１６４】
罹病期間の計算
日数で表した平均罹病期間を以下のとおり算出した。
【数５】
2013535437.tif 000044
【０１６５】
疾患の発現の平均遅れの計算
日数で表した疾患の平均発現を以下のとおり算出した。
【数６】
2013535437.tif 000045
【０１６６】
日数で表した疾患の発現の平均遅れを、対照群における疾患平均発現をテスト群から減じて算出した。
【０１６７】
平均最大点数および阻止率％の計算
各群の平均最大点数（ＭＭＳ）を以下のとおり算出した。
【数７】
2013535437.tif 000046
【０１６８】
ＭＭＳによる阻止率％を以下のとおり算出した。
【数８】
2013535437.tif 000047
【０１６９】
群平均点数および阻止率％の計算
テスト群における各マウスの毎日の点数を合計し、個別の平均の毎日の点数（ＩＭＳ）を以下のとおり算出した。
【数９】
2013535437.tif 000048
【０１７０】
平均群点数（ＧＭＳ）を以下のとおり算出した。
【数１０】
2013535437.tif 000049
【０１７１】
阻止率％を以下のとおり算出した。
【数１１】
2013535437.tif 000050
【０１７２】
各群の罹患率、死亡率、ＭＭＳ、ＧＭＳ、罹病期間、疾病の発現および活性のまとめを以下の表４ｂに示す。
【表４ｂ】
2013535437.tif 000051
【０１７３】
罹患率および死亡率
媒体処置された対照群において、１４／１５のマウスが、ＥＡＥが原因で病気であった。ラキニモド（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置された群では、化合物２、３および１で処置された群における１３／１５、１０／１５および８／１５と比較して、９／１５のマウスが病気であった。２５ｍｇ／ｋｇラキニモドで処置された陽性対照群では、４／１５のマウスが病気であった。処置群のいずれにおいても死亡は観察されなかった。
【０１７４】
ラキニモド（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたすべての群において、対照群（発現１１．９±５．５日）と比較して、臨床的兆候の出現の遅れがみられ、１５．３〜２２．１日で発現した。媒体処置された対照群と比較したこれらの処置群におけるＥＡＥ臨床的兆候の期間は、対照群における１９．１±５．５日と比較して、７．９〜１３．２日であった。
【０１７５】
平均最大点数（ＭＭＳ）および群平均点数（ＧＭＳ）
媒体処置された陰性対照群のＭＭＳおよびＧＭＳは、それぞれ３．２±１．３および２．２±１．０であった。陽性ラキニモド（２５ｍｇ／ｋｇ）対照群は、それぞれＭＭＳ（点数１．３±１．８）およびＧＭＳ（点数０．５±０．１）により、ＥＡＥの阻止率５９．４％および９７．７％を示した。
【０１７６】
化合物１、２および３で処置された群をラキニモドと比較した場合、活性に有意差は認められなかった。しかし、化合物１、２および３で処置された群が、ラキニモド群より活性であることを示す傾向があった。
【０１７７】
図３に示すように、ＧＭＳスケールで、ラキニモド（１０ｍｇ／ｋｇ）群は、化合物２、３および１で処置された群の６４．３％、５９．７％および６６．５％の活性と比較して、４８．４％の活性を示した。
【０１７８】
考察
テスト結果は、重水素リッチなラキニモドが、非重水素化ラキニモドと類似した血漿濃度−時間プロフィールを維持しながら、代謝産物、特に任意に重水素化されたＤＥＬＡＱの形成を低下させることを示す。
【０１７９】
テスト結果は、重水素リッチなラキニモドが、ＥＡＥ臨床的兆候の阻止において、ラキニモドと同等かまたはそれ以上に活性であることも示す。この研究の結果は、重水素リッチなラキニモドのための用量パラメーターの開発を可能にするものである。
【０１８０】
例５：培養ヒト肝細胞におけるシトクロムＰ４５０発現の誘導物質としてのラキニモドおよび化合物２のインビトロでの評価
１．イントロダクション
本研究の目的は、ＣＹＰ酵素の発現に対する、新鮮なヒト肝細胞の初代培養物をラキニモドまたは化合物２で処置することの効果を調査することであった。
【０１８１】
培養肝細胞は、ＮＣＥの誘導効果を評価するための信頼性の高いテスト系であることが証明されている。肝細胞は、移植不可能なヒト肝臓から単離し（Bjornsson et al., (2003), The conduct of in vitro and in vivo drug-drug interaction studies: a Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA) perspective. Drug Metab Dispos 31:815-832; Mudra and Parkinson, (2001), Preparation of hepatocytes, in Current Protocols in Toxicology, Volume 2 (Maines MD ed) unit 14.2, 13 p, John Wiley and Sons, Inc., New York, New York）、集密な単層で培養することができる（LeCluyse et al., (1994), Formation of extensive canalicular networks by rat hepatocytes cultured in collagen-sandwich configuration. Am J Physiol 266 (Cell Physiol. 35): C1764-C1774）。培養の２〜３日後、これらの細胞は、その形態学的完全性を回復し、プロトタイプのインデューサーでの処置は、適切なＣＹＰ酵素の誘導につながる（LeCluyse et al., (1996), Cultured rat hepatocytes, in Pharmaceutical Biotechnology. Vol. 8, Models for Assessing Drug Absorption and Metabolism. (Borchardt RT, Wilson G and Smith P eds) pp 121-159, Plenum Press, New York; Robertson et al., (2000), In vitro inhibition and induction of human hepatic cytochrome P450 enzymes by modafinil. Drug Metab Dispos 28:664-671; Madan et al., (2003), Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome P450 expression in cultured human hepatocytes. Drug Metab Dispos 31:421-431）。このため、ＣＹＰ酵素の誘導を引き起こすＮＣＥの潜在能力を決定するために培養ヒト肝細胞を用いることは、許容可能である。
【０１８２】
この研究は、テスト品目の誘導効果を、二つのメカニズム的に異なるが臨床的に関係するＣＹＰインデューサー、すなわちオメプラゾール（ＡｈＲ活性化剤およびＣＹＰ１Ａ２インデューサー）およびリファムピン（ＰＸＲアゴニストおよびＣＹＰ３Ａ４のインデューサー）に対して分類され得るように設計された（Parkinson and Ogilvie, (2008), Biotransformation of xenobiotics, in Casarett & Doull’s Toxicology, The Basic Science of Poisons. Seventh Edition, (Klaassen CD ed) pp 161-304, The McGraw Hill Companies, Inc., New York）。このために、一つの肝臓に由来する培養ヒト肝細胞の一つの調製物を、ＤＭＳＯ（０．１％ｖ／ｖ、媒体対照）、ラキニモド（０．０１、０．０５、０．１、１または１０μＭ）または化合物２（０．０１、０．０５、０．１または１０μＭ）の５つの濃度のうちの一つで、３日間連続して１日１回処置した。
【０１８３】
処置後、細胞を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるフェナセチンＯ−脱アルキル化（ＣＹＰ１Ａ２用のマーカー）およびミダゾラム１’−ヒドロキシル化（ＣＹＰ３Ａ４／５用のマーカー）の分析のためのマーカー基質と、インサイチュでインキュベートした。インサイチュでのインキュベーションに続いて、同じ処置群からの同じ肝細胞を、ＴＲＩｚｏｌで収集してＲＮＡを単離し、これをｑＲＴ−ＰＣＲで分析して、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡレベルに対するラキニモドおよび化合物２の効果を評価した。この研究で用いた研究設計、テスト系ならびにプローブ基質の選択および濃度は、薬物相互作用研究−研究設計、データ分析、および投薬とラベリングについての関係に関するＦＤＡのドラフト指針文書、ならびに現在のＦＤＡレビュー論文（FDA's Draft Guidance Document on Drug Interaction Studies-Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling and current FDA review articles）の推薦に基づくものである（Food and Drug Administration, (2006), Draft Guidance for Industry: Drug Interaction Studies-Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling, pp 55, U.S. Department of Health and Human Services, Rockville, MD; Huang et al., (2008), New Era in Drug Interactions Evaluation: US Food and Drug Administration Update on CYP Enzymes, Transporters, and the Guidance Process. J Clin Pharmacol 48: 662-670; Zhang et al., (2009), Predicting Drug-Drug Interactions: An FDA Perspective. The AAPS Journal 11:300-306) and the PhRMA perspective on enzyme induction (Chu et al., (2009), In vitro and in vivo induction of cytochrome P450: a survey of the current practices and recommendations: a Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA) perspectice. Drug Metab Dispos 27029 (87pp) doi: 10.1124/dmd.109.0270）。
【０１８４】
２．材料および方法
２．１材料
２．１．１酵素活性アッセイ
【表Ｆ】
2013535437.tif 000052
【０１８５】
２．１．２  他のアッセイ
【表Ｇ】
2013535437.tif 000053
【０１８６】
２．１．３  他の試薬
【表Ｈ】
2013535437.tif 000054
【表Ｉ】
2013535437.tif 000055
【０１８７】
２．２  テスト系
16825 West 116th Street, LenexaのXenoTech, LLC, KS66219により供給された新規に単離されたヒト肝細胞の一つの調製物（以下、Ｈ９７１と称する）を、この研究で処理した。
【０１８８】
２．２．１  培養ヒト肝細胞の処理
肝細胞培養物を、３日間連続して毎日処理し、ＳＯＰ  Ｌ５０２１．０１（XenoTech, LLC）および以前に説明した方法に従って培養した（Robertson et al., (2000), In vitro inhibition and induction of human hepatic cytochrome P450 enzymes by modafinil. Drug Metab Dispos 28:664-671;  Madan et al., (2003), Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome P450 expression in cultured human hepatocytes. Drug Metab Dispos 31:421-431;  Paris et al., (2009), In vitro inhibition and induction of human liver cytochrome P450 (CYP) enzymes by milnacipran. Drug Metab Dispos 37:2045-2054）。培養物を、０．１％ＤＭＳＯ（媒体、陰性対照）、五つの濃度のラキニモド（０．０１、０．０５、０．１、１または１０μＭ）もしくは化合物２（０．０１、０．０５、０．１、１または１０μＭ）の一つ、ミベフラジル（１０μＭ）、または二つの公知のヒトＣＹＰ酵素インデューサー、すなわちオメプラゾール（１００μＭ）およびリファムピン（１０μＭ）の一つ（陽性対照）を含有する補充ＭＣＭで処理した（各ウェルを０．２ｍＬで処理した）。
【０１８９】
２．２．２  培養ヒト肝細胞からのＲＮＡの単離、精製および定量化
最後の処理の約２４時間後、インサイチュでマーカー基質とインキュベーションした後に、肝細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬に溶解させ、細胞溶解物を−７５±５℃で貯蔵した。ヒト肝細胞調製物Ｈ９７１のために、処置群あたり六つのウェル由来の培養液を吸引し、約１３２μＬのＴＲＩｚｏｌを各ウェルに加えた。細胞溶解物を、ピペッティングを反復して混合した。全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌプロトコル（Invitrogen）を用いて細胞溶解物から単離し、ＳＯＰ  Ｌ６１６１．０２に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen Inc.）を用いて精製した。ＲＮＡの品質および濃度を、ＳＯＰ  Ｌ６１６２．０２に従って、ＫＣ４  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅソフトウェア（バージョン３．４  Ｒｅｖ２１、BioTek Instruments、Inc.）を備えたＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（BioTek Instruments、Inc.）で、２６０および２８０ｎｍの吸光度を測定することにより決定した。ＲＮＡ完全性の分析を、ＳＯＰ  Ｌ６１６２．０２に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーによるＲＮＡ６０００ナノアッセイキット（Agilent Technologies、Inc.）で実施した。一本鎖ｃＤＮＡを、ＳＯＰ  Ｌ６１６０．０４に従って、ＡＢ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムサーモサイクリングプログラムまたはＡＢ  ７９００ＨＴファーストリアルタイムＰＣＲシステムサーモサイクリングプログラム（Applied Biosystems）を用いてＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘでＲＮＡから調製した。ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、１０×ＲＴ緩衝剤、２５×デオキシＮＴＰ、１０×ランダム六量体、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（５０Ｕ／μＬ）およびＲＮａｓｅフリー水を含む。ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを各ＲＮＡサンプルに加えて、反応の成分を完了させた。テンプレートなしの対照（No template control）（ＮＴＣ）を分析に含めた。ＮＴＣ反応については、ＲＮａｓｅフリー水を、ＲＮＡサンプルの代わりに加えた。ｃＤＮＡ調製サンプルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで分析するときまで−２０±５℃で貯蔵した。
【０１９０】
２．３  テスト品目
ラキニモドナトリウムを米国特許第６，０７７，８５１号に記載されている手順に従って調製し、化合物２を例１に記載した手順に従って調製した。
【表Ｊ】
2013535437.tif 000056
【０１９１】
ラキニモドまたは化合物２の溶液（高純度滅菌水中に１０ｍＭ）を、適切な量のラキニモドまたは化合物２のいずれかを高純度滅菌水に溶解して調製した。ラキニモドについては、１０ｍＭストック溶液を高純度滅菌水で希釈して２、１および０．１μＭにした。さらに、１μＭ溶液を高純度滅菌水で希釈して０．０５および０．０１ｍＭにした。化合物２については、次いで１０ｍＭストック溶液を高純度滅菌水で希釈して１および０．１μＭにした。さらに、１μＭ溶液を高純度滅菌水で希釈して０．０５および０．０１ｍＭにした。ラキニモドおよび化合物２の溶液（すべてのｍＭ濃度）を、研究において個別に使用するのに十分な数の一定分量に分割し、アンバーガラス製品またはアルミニウムホイルで光から保護し、２か月の有効期限で凍結保存した（−２０±５℃）。
【０１９２】
各々の日に処置する前に、一定分量のラキニモドおよび化合物２のストック溶液を室温に調整し、緩やかに振とうするかまたは低いセッティングでボルテックスで撹拌した。次いでラキニモド（０．０１、０．０５、０．１、１および１０ｍＭ）および化合物２（０．０１、０．０５、０．１、１および１０ｍＭ）のストック溶液を、細胞培地（１：１０００希釈）中に希釈し、得られた作業投与溶液（working dose solution）を肝細胞培養物に加えて、希釈の２時間以内（約１５分〜６５分以内）に最終濃度のラキニモド（０．０１、０．０５、０．１、１および１０μＭ）および化合物２（０．０１、０．０５、０．１、１および１０μＭ）を得た。テスト系での溶解性を判定するために、ストックおよび投薬溶液の定性的な目視検査を、肝細胞へ適用する前に実施した。
【０１９３】
処置の直前、各処置日、およびマーカー基質のインキュベーションの直前に、使用済み培地（使用済み投与培地）を、媒体、ラキニモドおよび化合物２の処置群から回収した。約１５０μＬを、上記の各処置群に由来する三つのウェルの各々から回収し、各サンプルについて約４５０μＬの最終容積になるまでプールした。これらの使用済み培地サンプルを、残留ラキニモド、化合物２、および脱エチル化代謝産物（ＤＥＬＡＱ）について分析した。
【０１９４】
２．４  陽性対照および媒体
以下の化学品または媒体を、肝細胞を投与するために使用した。
【表Ｋ】
2013535437.tif 000057
【０１９５】
オメプラゾールおよびリファムピンを、培地中でのＤＭＳＯの最終濃度が０．１％ｖ／ｖとなるようにＤＭＳＯに希釈した。ミベフラジルを高純度滅菌水中で調製した。ＳＯＰ  Ｌ５０２１．０１（XenoTech, LLC）に従って、媒体および陽性対照の作業溶液を、各処置日の処置の２時間未満（約１５分〜６５分）前に、ストック溶液から新たに調製した。
【０１９６】
２．５  アッセイ条件
２．５．１  培養ヒト肝細胞とプローブ基質のインサイチュでのインキュベーション
プローブ基質と肝細胞のインキュベーションを、ＳＯＰ  Ｌ５０４１．０２に従って実施した。最後の処置の約２４時間後、使用済み培地をウェルから吸引し、各ウェルを、予め加温した（３７±２℃）新鮮な培地で２回濯いだ。培地をウェルから吸引し、プローブ基質を含有する２００μＬの予め加温した培地を各ウェルに加えることにより、反応を開始させた。培養マルチウェルプレートを、加湿した培養チャンバー（９５％相対湿度で３７±１℃、９５／５％  空気／ＣＯ2）中に置き、インキュベーションを３０分間実施した（表１）。３０分間で、一定分量（１５０μＬ）のインキュベーション混合物を取り出し、３００μＬの停止試薬（アセトニトリル）および内部標準（表２）を含有する９６ウェルプレートのウェルに加えた。混合物を十分に混合し、２〜８℃で少なくとも１５分間静置した。サンプルを２〜８℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、上清分画をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。各アッセイについて、インキュベーションを表１に示す条件下で実施した。
【表Ｌ】
2013535437.tif 000058
【表Ｍ】
2013535437.tif 000059
【０１９７】
標準品および品質管理サンプルを、真正な代謝産物標準品を加えて同様に調製した。
【０１９８】
２．６  分析方法
２．６．１  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法
すべての分析を、認可されたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法で実施した。各代謝産物の分析のために使用される手順は、適用可能なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法ＳＯＰに従い、表２にまとめられる。ＭＳ装置は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣポンプおよびオートサンプラーシステムを備えたＡＢＩ  Ｓｃｉｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ）ＡＰＩ４０００またはＡＰＩ３０００機器のいずれかであった。
【表Ｎ】
2013535437.tif 000060
【０１９９】
真正な代謝産物標準品を使用し、重水素化された代謝産物を、すべてのアッセイにおける内部標準として使用した。ゼロ時間インキュベーションをブランクとして用いた。サンプル分析、積分および報告を、それぞれＳＯＰ  Ｌ８０１３．０２、Ｌ８０２０．０２およびＬ８０１１．０２（XenoTech, LLC）に従って実施した。
【０２００】
代謝産物を、加重（１／ｘ）線形最小二乗回帰の逆算をもとにして標準較正曲線を参照して定量化した。回帰フィットは、真正な代謝産物標準品から調製した較正標準サンプルから計算した内部標準に対する検体のピーク比をもとにした。ピーク面積を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ  Ａｎａｌｙｓｔデータシステム、バージョン１．４．２で積分した。
【０２０１】
２．６．２  ｍＲＮＡ分析
定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＳＯＰ  Ｌ６１６０．０４（XenoTech, LLC）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプロトコルに従って実施した。各ＰＣＲを、３通りずつ実施した。プライマーミックスを、各遺伝子発現アッセイのために調製した。典型的なプライマーミックスは、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックス（１×）、遺伝子発現アッセイ（１×、９００ｎＭ  フォーワードおよびリバースプライマー）およびＲＮａｓｅフリー水を含有していた。反応ミックスを、ｃＤＮＡにプライマーミックスを加えることにより調製した。サンプルのパーセンテージ（１０％以上）は、ＮＡＣを含んでいた（ＮＡＣは、逆転写されないＲＮＡサンプルであり、ゲノムＤＮＡではなくｍＲＮＡがＰＣＲの蛍光シグナル源であることを示すために使用される）。反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲシーケンス検出システム（ＡＢ７３００またはＡＢ７９００ＨＴ）で分析した。対照ｃＤＮＡ（ＧＡＰＤＨ）と比較した標的ｃＤＮＡの相対量を、ΔΔＣｔ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）で決定した。相対的定量化は、対照サンプル（例えば、ＤＭＳＯ）に対するテストサンプル中のｍＲＮＡ発現の変化を測定する。この方法は、標的の増幅の効率と内在性対照の増幅の効率が、おおよそ等しいと仮定する。
【０２０２】
２．７  データ処理
データを、コンピュータープログラムＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２００３（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｉｎｃ．）で処理しグラフ化した。同様の処置群から個々の反応速度の平均をとり、ｎ≧３のそれらの群について、標準偏差を決定した。倍数増加（fold increase）を、各処置群についての酵素的速度を媒体対照の値で除して決定した。陽性対照パーセントを以下の式で算出した：
【数１２】
2013535437.tif 000061
【０２０３】
ｑＲＴ−ＰＣＲについて、データを、相対的定量化のためにＳｅｑｕｅｎｃｅ検出システム（ＳＤＳ）ソフトウェアバージョン１．４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理した。このソフトウェアは、標的転写物のＰＣＲシグナルを非処理対照における標的のＰＣＲシグナルと関係づける比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ）を用いて、相対的遺伝子発現を分析する。処置によって発現が影響を受けず、組織がテストされている間ずっと発現が一定している内在性対照（ＧＡＰＤＨ）に対して、処理サンプルと非処理対照の両方のシグナルを正規化する。この方法の結果を、非処理対照における標的転写物発現に対する発現の倍数変化として表す。計算は以下の通りである：
１．ΔＣｔ＝Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（内在的対照）
２．ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ（処理サンプル）−ΔＣｔ（非処理対照）
３．発現の倍数変化＝２−ΔΔＣｔ。
【０２０４】
異常値は、ソフトウェア内のアルゴリズムによって分析から自動的に除外された。データ受け入れの基準は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに所有される。異常値は、関連した複製ウェルと著しく異なるＣｔ値を有するウェルであり、典型的には、増幅したとしても十分に増幅しなかったウェルであると考えられる。陽性対照に対するｍＲＮＡ発現のレベルは、以下のとおり算出した：
【数１３】
2013535437.tif 000062
【０２０５】
３．結果と考察
ＣＹＰ酵素活性およびｍＲＮＡレベルに対する、ラキニモドおよび化合物２でヒト肝細胞を処置することの効果を、表３〜７に示す。特段の記載のない限り、図および表のデータは、一つのヒト調製物に由来する３通りのインキュベーションによるデータの平均±標準偏差として表示され、有効数字３桁に四捨五入される。平均倍数増加を、表４および表６にまとめる。倍数増加は、対照の比率または対照に対する倍数増加のいずれかとして表され、ここで対照は、対応する媒体処置サンプルを指す。倍数増加は、有効数字３桁に四捨五入した。プロトタイプのインデューサーに対するテスト品目の比較（陽性対照パーセント）を、表５および表７に示し、有効数字３桁に四捨五入した。
【表Ｏ】
2013535437.tif 000063
【表Ｐ】
2013535437.tif 000064
【表Ｑ】
2013535437.tif 000065
【表Ｒ】
2013535437.tif 000066
【表Ｓ】
2013535437.tif 000067
【０２０６】
３．１  培養ヒト肝細胞の生存率および形態
単離の時点で、ヒト肝細胞調製物の生存率は７０．９％であった。７２時間の適応期間の間およびその後に、培養物を光学顕微鏡で毎日観察し、テストおよび対照品目で処置するのに十分な集密度で形態学的に正常であると判断した。最終処置後２４時間以内に、肝細胞を撮影して、その形態学的完全性およびテスト品目の明らかな毒性の兆候を記録した。代表的な顕微鏡写真を試験施設に保持する。これらの顕微鏡写真は、一般的に、媒体（ＤＭＳＯ）、ラキニモドおよび化合物２または公知のＣＹＰインデューサーで処置されたヒト肝細胞が、正常な肝細胞形態をしていることを示す。処置の前およびその間に、ヒト肝細胞培養物は、細胞間隙を殆んど持たない集密な単層を形成しており；これらは立方状であり、完全な細胞膜および一つまたは二つの中央に位置した核を有する顆粒細胞質を含有していた。ラキニモド、化合物２またはラキニモドおよびミベフラジルでのヒト肝細胞培養物Ｈ９７１の処置は、細胞形態に変化をもたらさなかった。
【０２０７】
３．２  ヒトＣＹＰ１Ａ２活性およびｍＲＮＡレベルに対するラキニモドおよび化合物２の効果
フェナセチンＯ−デアルキラーゼ（ＣＹＰ１Ａ２）活性の測定
培養ヒト肝細胞において、フェナセチンＯ−脱アルキル化は、主要なオメプラゾール誘導性ＣＹＰ酵素であるＣＹＰ１Ａ２によって触媒される。インサイチュでのフェナセチンＯ−デアルキラーゼ（ＣＹＰ１Ａ２）活性に対する、培養ヒト肝細胞をラキニモドまたは化合物２で処置することの効果を、表３に示し、表４にまとめる。培養ヒト肝細胞をオメプラゾールで１日１回３日間連続して処置すると、平均で、フェナセチンＯ−デアルキラーゼ（ＣＹＰ１Ａ２）活性の２８．４倍の増加が引き起こされた。
【０２０８】
肝細胞培養物Ｈ９７１をラキニモド（最大で１０μＭ）で処置すると、媒体対照と比較して、ＣＹＰ１Ａ２活性において最大で６１．０倍の濃度依存性増加が引き起こされた。テストした濃度（０．０１μＭ〜１０μＭ）で、ＣＹＰ１Ａ２活性の誘導において、ラキニモドは、陽性対照オメプラゾールに対して２１．７％〜２９１％の効果であった。さらに、１日１回３日間連続したミベフラジルだけを用いた処理により、ＣＹＰ１Ａ２活性において３．７６倍の増加がもたらされた。
【０２０９】
さらに、化合物２（最大で１０μＭ）での肝細胞培養物Ｈ９７１の処置によって、媒体対照と比較して、ＣＹＰ１Ａ２活性において最大で６０．２倍の濃度依存性増加が引き起こされた。テストした濃度（０．０１μＭ〜１０μＭ）で、ＣＹＰ１Ａ２活性の誘導において、化合物２は、陽性対照オメプラゾールに対して２３．３％〜２１６％の効果であった。
【０２１０】
ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルの測定
ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡ発現に対する、培養ヒト肝細胞をラキニモドおよび化合物２で処理することの効果を、表６に示す。培養ヒト肝細胞を１日１回３日間連続してオメプラゾールで処置すると、平均で、ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルの８．５８倍の増加が引き起こされた。
【０２１１】
ＣＹＰ１Ａ２活性と同様に、肝細胞培養物Ｈ９７１をラキニモド（最大で１０μＭ）で処置すると、媒体対照と比較して、ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルにおいて最大で２０．５倍の濃度依存性増加が引き起こされた。テストした濃度（０．０１μＭ〜１０μＭ）で、ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルの誘導において、ラキニモドは、陽性対照オメプラゾールに対して４２．５％〜２５７％の効果であった。ＣＹＰ１Ａ２活性に反して、１日１回３日間連続したミベフラジルだけを用いた処理により、ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルにおいて、媒体対照と比較して５７．７％の低下が引き起こされた。
【０２１２】
さらに、肝細胞培養物Ｈ９７１を化合物２（最大で１０μＭ）で処置すると、媒体対照と比較して、ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルにおいて最大で２４．３倍の濃度依存性増加が引き起こされた。テストした濃度（０．０１μＭ〜１０μＭ）で、ＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡレベルの誘導において、化合物２は、陽性対照オメプラゾールに対して２４．２％〜３０７％の効果であった。
【０２１３】
３．３  ラキニモドおよび化合物２のヒトＣＹＰ３Ａ４／５活性およびＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルに対する効果
ミダゾラム１’−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ３Ａ４／５）活性の測定
培養ヒト肝細胞において、ミダゾラム１’−ヒドロキシル化は、ＣＹＰ３Ａ４／５によって触媒される。ＣＹＰ３Ａ４は、主要なリファンピン誘導性ＣＹＰ酵素である。インサイチュでのミダゾラム１’−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ３Ａ４／５）活性に対する、培養ヒト肝細胞をラキニモドおよび化合物２で処置することの効果を、表３に示し、表４にまとめる。培養ヒト肝細胞をリファムピンで１日１回３日間連続して処置すると、ミダゾラム１’−ヒドロキシラーゼ活性の増加（４．８２倍）が引き起こされた。
【０２１４】
肝細胞培養物Ｈ９７１をラキニモド（最大で１０μＭ）または化合物２（最大で１０μＭ）のいずれかで処置すると、媒体対照と比較して、ＣＹＰ３Ａ４／５活性において、それぞれ５０．９％および４８．２％だけ濃度依存性低下が引き起こされた。
【０２１５】
ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルの測定
ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡ発現に対する、培養ヒト肝細胞をラキニモドおよび化合物２で処理することの効果を、表６に示す。培養ヒト肝細胞を１日１回３日間連続してリファムピンで処置すると、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルの４．６３倍の増加が引き起こされた。
【０２１６】
ＣＹＰ３Ａ４／５活性と同様に、肝細胞培養物Ｈ９７１をラキニモド（最大で１０μＭ）または化合物２（最大で１０μＭ）のいずれかで処置すると、媒体対照と比較して、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルにおいて、それぞれ３６．４％および３１．１％だけ濃度依存性低下が引き起こされた。
【０２１７】
化合物２またはラキニモドとＤＥＬＡＱとの比の測定
化合物２、ラキニモドおよびＤＥＬＡＱの濃度を、処置の直前、各処置日、およびマーカー基質のインキュベーションの直前に回収した培地からの使用済み培地の一定分量で測定した。形成されたＤＥＬＡＱの濃度は、化合物２培地と比較してラキニモド培地において約２倍高かった。化合物２またはラキニモドのいずれかの１０μＭの処置濃度で、化合物２：ＤＥＬＡＱの比は平均で４０．９であり、ラキニモド：ＤＥＬＡＱの比は平均で１５．７であった。これは、化合物２と比較してラキニモドからのＤＥＬＡＱの形成が約３倍増加していることを表しており、これは、より遅いＮ−脱エチル化をもたらすエチル部分での重水素の存在によって説明される。
【０２１８】
４．結論
結論として、プロトタイプのインデューサーがＣＹＰ活性およびｍＲＮＡレベルの、予想されかつ妥当な増大を引き起こす条件下で、最大で１０μＭのラキニモドまたは化合物２（ラキニモドの重水素化された類似体）で処置すると、ＣＹＰ１Ａ２活性およびｍＲＮＡレベルにおいて、同様の濃度依存性増加が引き起こされ、ＣＹＰ３Ａ４／５活性およびＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルにおいて、濃度依存性低下が引き起こされたが、化合物２：ＤＥＬＡＱ比とラキニモド：ＤＥＬＡＱ比において約３倍の差が観察された。
【図１】
2013535437.tif 000080
【図２】
2013535437.tif 000081
【図３】
2013535437.tif 000082
【国際調査報告】
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2013535437.tif 000084