(57)【要約】改変された伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）およびそれを使用する方法を本明細書に提供する。例えば、弱毒化ＩＬＴＶが提供される。弱毒化ＩＬＴＶは、トリ種において免疫応答を誘発するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ＩＬＴＶは、トリ対象またはトリ対象の集団にワクチン接種するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ＩＬＴＶは、鳥卵に卵内投与される。１回以上のそのような卵内投与を使用して、トリ集団の免疫を高めることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質Ｊの変異を含む弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含む組成物であって、前記変異は、糖タンパク質Ｊの発現を阻害する、組成物。
【請求項２】
前記弱毒化ＩＬＴＶは、ＵＳＤＡチャレンジ株ＵＳＤＡ−ｃｈを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記変異は、糖タンパク質Ｊのタンパク質の発現を阻害する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記変異は、糖タンパク質Ｊのプロモーターエレメントの変異を含み、前記変異は、前記プロモーターエレメントの機能を阻害する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記変異は、配列番号１の完全なまたは部分的な欠失を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２１８８の欠失を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ウイルスタンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウイルスタンパク質発現カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記変異は、配列番号１の少なくともヌクレオチド１〜１４５の欠失を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
前記欠失は、配列番号１のヌクレオチド２１８５〜２１９０を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１７】
前記変異は、前記糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の置換を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記置換は、再編成されたＩＬＴＶ配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
対象または集団における伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の感染を予防する方法であって、１羽以上の対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を投与することを含み、前記弱毒化ＩＬＴＶが卵内投与される、方法。
【請求項２０】
前記弱毒化ＩＬＴＶは、ＵＳＤＡチャレンジ株ＵＳＤＡ−ｃｈを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記弱毒化ＩＬＴＶは、糖タンパク質Ｊの変異を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異は、糖タンパク質Ｊのタンパク質の発現を阻害する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異は、糖タンパク質Ｊのプロモーターエレメントの変異を含み、前記変異は、前記プロモーターエレメントの機能を阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異は、配列番号１の完全なまたは部分的な欠失を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ウイルスタンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスタンパク質発現カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２１８８の欠失を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記変異は、配列番号１の少なくともヌクレオチド１〜１４５の欠失を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記欠失は、配列番号１のヌクレオチド２１８５〜２１９０を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記変異は、前記糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の置換を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記置換は、再編成されたＩＬＴＶ配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象において免疫応答を誘発する方法であって、前記対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を投与することを含み、前記弱毒化ＩＬＴＶが卵内投与される、方法。
【請求項３９】
糖タンパク質Ｊの変異を含む弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含むワクチンであって、卵内ワクチンである、ワクチン。
【請求項４０】
弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含むワクチンであって、卵内ワクチンである、ワクチン。
【請求項４１】
トリ対象の集団の伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）に対する集団免疫を高める方法であって、前記集団の１羽以上の対象を生じる１つ以上の卵に弱毒化ＩＬＴＶを卵内投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記弱毒化ＩＬＴＶは、糖タンパク質Ｊの変異を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
糖タンパク質Ｊの変異を含む組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムであって、前記変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失である、ゲノム。
【請求項４４】
配列番号１の少なくともヌクレオチド１〜１４５の欠失を含む、組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノム。
【請求項４５】
配列番号１のヌクレオチド２１８５〜２１９０を含まない、組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノム。
【請求項４６】
糖タンパク質Ｊの遺伝子に部分的または完全な欠失を有する組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む卵内ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年８月２日に出願された米国仮出願第６１／３６９，９８６号の利益を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）は、家禽産業に深刻な生産性の損失を引き起こす、伝染性の高いニワトリの呼吸器疾患である。ＩＬＴの病原体は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。
【０００２】
ＩＬＴＶの主な複製部位は、喉頭、気管、および結膜である。あえぎ、咳、血痰の喀出、および窒息等の呼吸症状として重度の臨床徴候が観察される。他の臨床徴候は、結膜炎および体重減少、ならびに産卵率の低下である。
【発明の概要】
【０００３】
改変された伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）およびそれを使用する方法を本明細書に提供する。例えば、弱毒化ＩＬＴＶが提供される。弱毒化ＩＬＴＶは、トリ種において免疫応答を誘発するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ＩＬＴＶは、トリ対象またはトリ対象の集団にワクチン接種するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ＩＬＴＶは、鳥卵に卵内投与される。１回以上のそのような卵内投与を使用して、トリ集団の免疫を高めることができる。
【０００４】
例示的な組成物は、糖タンパク質Ｊの変異を含む弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含む。任意選択的に、変異は、糖タンパク質Ｊのタンパク質の発現を阻害する。例えば、変異は、糖タンパク質Ｊのプロモーターエレメントの変異を含み得、変異は、プロモーターエレメントの機能を阻害する。また、例示的な変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の部分的または完全な欠失、例えば、配列番号１の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む。欠失にはレポータータンパク質発現カセットを挿入することができる。レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質であってもよい。欠失にはウイルスタンパク質発現カセットを挿入することができる。ウイルスタンパク質カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）であってもよい。任意選択的に、糖タンパク質Ｊの変異は、糖タンパク質Ｊの置換を含み得る。置換は、例えば、再編成されたＩＬＴＶ配列を含み得る。
【０００５】
また、卵内での使用のために構成される弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含むワクチンも提供される。例えば、糖タンパク質Ｊの変異を有する弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含むワクチンが提供される。任意選択的に、糖タンパク質Ｊの遺伝子に欠失を有する組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む卵内ワクチン製剤が提供される。また、弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、孵化卵に弱毒化ＩＬＴＶを投与するための手段、および鳥卵に弱毒化ＩＬＴＶを卵内投与するための指示を含み得るキットも提供される。
【０００６】
改変された伝染性喉頭気管炎ウイルスを使用する方法は、対象または集団における伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の感染を予防する方法であって、１羽以上の対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を投与することを含み、弱毒化ＩＬＴＶが卵内投与される、方法を含む。弱毒化ＩＬＴＶは、任意選択的に、糖タンパク質Ｊの変異を含み得る。例えば、変異は、糖タンパク質Ｊのタンパク質の発現を阻害することができる。また、変異は、糖タンパク質Ｊのプロモーターエレメントの変異を含み得、変異は、プロモーターエレメントの機能を阻害する。また、例示的な変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の欠失、例えば、配列番号１の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む。欠失にはレポータータンパク質発現カセットを挿入することができる。レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質であってもよい。欠失にはウイルスタンパク質発現カセットを挿入することができる。ウイルスタンパク質カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）であってもよい。任意選択的に、糖タンパク質Ｊの変異は、糖タンパク質Ｊの置換を含み得る。置換は、例えば、再編成されたＩＬＴＶ配列を含み得る。
【０００７】
対象において免疫応答を誘発する方法は、対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を投与することを含み、弱毒化ＩＬＴＶが卵内投与される。また、トリ対象の集団の伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）に対する集団免疫を高める方法であって、集団の１羽以上の対象を生じる１つ以上の卵に弱毒化ＩＬＴＶを卵内投与することを含む方法も提供される。弱毒化ＩＬＴＶは、糖タンパク質Ｊの変異を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−Ｈ】ＩＬＴＶ変異体の略図。ａ）１５０キロベース（ｋｂ）のＩＬＴＶゲノムの略図。ｂ）逆向き反復配列に隣接する短いセグメント。関連遺伝子の転写の位置および方向を示す。ｃ）ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、およびＵＳ７のＯＲＦを包含するＵS領域からの７９５８塩基対（ｂｐ）のＳｐｈＩ断片。ｄ）ｇＪをコードするＵＳ５の２２９１ｂｐの部分欠失を破線で示す。ｅ）ＵＳ５の最初の２２９１ｂｐを置換する、ＧＦＰ−発現カセットを有するｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１の構造。ｆ）２１８８ｂｐ断片をＵＳ５の５’末端から欠失させてｇＪ欠失変異体ＢＤｇＪ３．２を作製した。ｇ）ＢＤｇＪ３．２の構造。ｈ）レスキュー変異体ｇＪＲの作製に使用した５４９８ｂｐゲノム断片。
【図２】バキュロウイルスの発現および糖タンパク質Ｊの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す写真。精製ｇＪのクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン１）および抗ＲＧＳ−６ｘＨｉｓ  ＭＡｂを用いたウエスタンブロット（レーン２）。抗ＩＬＴＶ  ｇＪ  ＭＡｂ（レーン３）またはＩＬＴＶに感染させたニワトリの回復期血清（レーン４）のいずれかで検査した精製ｇＪのウエスタンブロット。タンパク質の分子量のマーカー（Ｍ）を図の左側に示す。
【図３Ａ−Ｅ】ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪのウイルスゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片によって遺伝子型が確認されたことを示すゲルの写真。（Ａ）プライマー対ｇＧｕｐｆ／ＣＭＶｐｒｅｖを用いて行ったレーン１および２上のＰＣＲ増幅、ならびにプライマー対ＥＧＦＰ５７８ｆｅ／ＣｌａＩｇＩｒｅｖを用いて行ったレーン３および４上の増幅。レーン１および３：水対照、レーン２および４：ＡＤｇＪ４．１ＤＮＡ。（Ｂ）プライマー対ＢａｍＨＩｇＧｆｗ／ｇＪ２３８１ｒｅｖを用いて行ったＰＣＲ増幅。レーン１および３：水対照、レーン２：ＡＤｇＪ４．１、レーン４：ＵＳＤＡ−ｃｈ。（Ｃ）ＢａｍＨＩを用いた（Ｂ）のＰＣＲ断片のインキュベーション。レーン１：ＡＤｇＪ４．１およびレーン２：ＵＳＤＡ−ｃｈ。（Ｄ）プライマー対ＢａｍＨＩｇＧｆｗ／ｇＪ２３８１ｒｅｖを用いて行ったＰＣＲ増幅。レーン１：ＢＤｇＪ１．１、レーン２：ＢＤｇＪ３．１、レーン３：ＢＤｇＪ３．２、およびレーン４：ＵＳＤＡ−ｃｈ。（Ｅ）プライマー対ＢａｍＨＩｇＧｆｗ／ｇＪ２３８１ｒｅｖを用いてＰＣＲ増幅を行った。レーン１および５：水対照、レーン２：ｇＪＲ１．３、レーン３：ｇＪＲ２．４、レーン４：ｇＪＲ４．３、レーン６：ＵＳＤＡ−ｃｈ。反応産物を０．７％ゲル上で分析した。ＤＮＡマーカーを左側の各ゲル上に示す。
【図４Ａ−Ｃ】ＩＬＴＶの野生型ウイルスＵＳＤＡ−ｃｈ、ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１、およびレスキュー変異体ｇＪＲ４．３に感染させたＬＭＨ細胞の二重免疫蛍光を示す写真。感染後（ｐ．ｉ．）７２時間目に細胞を固定し、免疫蛍光のために処理した。（Ａ）ｇＪまたはｇＣのいずれかを標的とするモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いたインキュベーション後に陽性シグナルを示す、野生型ウイルスＵＳＤＡ−ｃｈ（ｗｔ）に感染させた細胞。反応の特異性は、ニワトリのポリクローナル抗ＩＬＴＶ血清を使用して確認した。（Ｂ）ＧＦＰを発現するＡＤｇＪ４．１を使用してＬＭＨ細胞を感染させた。感染細胞は、抗ｇＣ  ＭＡｂを用いたインキュベーション後に陽性シグナルを示したのに対し、抗ｇＪ  ＭＡｂを用いたインキュベーション後にはシグナルが観察されなかった。検査した細胞の感染の成功は、抗ＩＬＴＶニワトリ血清を使用して確認した。（Ｃ）ＬＭＨ細胞をレスキュー変異体ｇＪＲ４．３に感染させた後でｇＪの発現の回復を調べた。ｇＣの発現の存在によって示されるように、感染細胞は、ポリクローナルウサギ抗ｇＪ血清とも反応した。ＭＡｂおよびポリクローナル血清は、全てのアッセイにおいてそれぞれ１：１００および１：５００で希釈した。ヤギ抗マウスＣｙ５コンジュゲート抗体を使用してＭＡｂの結合を可視化した。ヤギ種特異的ＦＩＴＣコンジュゲート抗体を使用してニワトリ抗体およびウサギ抗体の存在を検出した。ヨウ化プロピジウム（ＡおよびＢ）または４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｃ）のいずれかを使用して細胞核を可視化した。共焦点レーザー走査顕微鏡ＬＳＭ５１０を使用して写真を撮影した。
【図５Ａ−Ｅ】ビリオン、ならびにＩＬＴＶ変異体および野生型ＵＳＤＡ−ｃｈ株の感染細胞におけるｇＪおよびｇＣの検出のためのウエスタンブロット分析を示す写真（ＡおよびＢ）。抗ｇＪ  ＭＡｂ（Ａ）および抗ｇＣ  ＭＡｂ（Ｂ）を使用して、ｇＪ−欠失変異体ＡＤｇＪ４．１（レーン１）および野生型ＵＳＤＡ−ｃｈ株の精製したビリオンを検査した。（Ｃ）ＵＳＤＡ−ｃｈのビリオン（レーン１および３）ならびにｇＪ−欠失変異体ＡＤｇＪ４．１のビリオン（レーン２および４）を、ウサギ免疫前血清（レーン１および２）またはウサギ抗ｇＪ血清（レーン３および４）のいずれかとともにインキュベートした。（Ｄ）ＵＳＤＡ−ｃｈのビリオン（レーン１）、未感染ＣＫ細胞（レーン２）、ＵＳＤＡ−ｃｈ野生型ウイルス（レーン３）またはウイルス変異体ｇＪＲ４．３（レーン４）のいずれかに感染させたＣＫ細胞、ＢＤｇＪ３．２（レーン５）、およびＡＤｇＪ４１（レーン６）を抗ｇＪ  ＭＡｂとともにインキュベートした。（Ｅ）５Ｄに示すのと同じビリオン調製物およびＣＫ細胞調製物を抗ｇＣ  ＭＡｂとともにインキュベートした。４つ全てのゲル中のタンパク質試料をＳＤＳ−７．５％ＰＡＧＥ上で分離した。抗種ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用した化学発光により、適切な抗体の結合を可視化した。
【図６Ａ−Ｂ】ＩＬＴＶのｇＪ欠失変異体において、ウイルス侵入ではなくウイルス複製が妨げられたことを示すグラフ。（Ａ）感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）０．０１でＵＳＤＡ−ｃｈ、ＡＤｇＪ４．１、ＢＤｇＪ３．２、およびｇＪＲ４．３に感染させたＣＫ細胞の複製動態。上清のウイルス力価ＴＣＩＤ50）は感染後０、２４、４８、および７２時間目に決定した。（Ｂ）ウイルス侵入動態のために、ウイルスの５００プラーク形成単位（ｐｆｕ）を、氷上で６０分間、ＬＭＨ細胞に吸着させた。異なる時点（Ｘ軸）で温度を３９℃に推移させ、吸着したウイルス粒子の侵入を可能にした。細胞の外に残っているウイルスを不活化し、プラークアッセイのために半流動性培地で細胞表面を覆った。感染後５日目に、プラークを数えた。６０分の時点でのプラークの数を１００％として設定し、ウイルスのプラークの数を６０分の価のパーセントとして表した。侵入のパーセンテージを侵入時間に対してプロットした。３つの異なる実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７Ａ−Ｂ】ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪおよびＢＤｇＪを接種し、後にＵＳＤＡ−ｃｈ株をチャレンジしたニワトリの臨床徴候スコアを示すグラフ。（Ａ）４週齢で、経鼻／結膜経路を介してｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２をニワトリに接種した。１つの対照群には偽接種を行った。接種から３週間後、ニワトリにＵＳＤＡ−ｃｈ株をチャレンジし、感染後１〜６日目まで臨床徴候をスコア化した。（Ｂ）１８日齢ＳＰＦ胚にｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２を卵内接種した。１つの対照群には偽接種を行った。３５日齢で、ニワトリにＵＳＤＡ−ｃｈ株をチャレンジし、チャレンジ後１〜７日目まで臨床徴候をスコア化した。両方の実験とも（ＡおよびＢ）、１〜５のスケール上で臨床徴候をスコア化した。各日の平均臨床スコアをＹ軸に示す。
【図８】新規ｇＪ欠失ＩＬＴＶ構築物（ＮΔｄＪ  ＩＬＴＶ）の作製のための略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）は、ニワトリ、キジ、およびクジャクの気道のウイルス感染症である。鳥類の間で急速に広まり、感受性家禽に高い死亡損失率をもたらし得る。シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウは、この疾患には罹患しないが、それらはウイルスを伝播し得る。
【００１０】
この疾患の病原体は、体系的にトリヘルペスウイルス１型と称される伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。ＩＬＴＶの主な複製部位は、喉頭、気管、および結膜である。あえぎ、咳、血痰の喀出、および窒息等の呼吸症状として重度の臨床徴候が観察される。他の臨床徴候は、結膜炎および体重減少、ならびに産卵率の低下である。
【００１１】
ＩＬＴＶは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科のイルトウイルス属のプロトタイプメンバーとして分類されている。過去５０年間、この疾患は、バイオセキュリティ、およびニワトリ胚（ニワトリ胚由来、ＣＥＯワクチン）または組織培養物（組織培養物由来、ＴＣＯワクチン）のいずれかにおける連続継代により弱毒化した生ワクチンを用いたワクチン接種によって主に制御されていた。
【００１２】
ＣＥＯワクチンは、現場での大流行を制限するのに効果的であることが証明されているが、ニワトリにおける継代の間に増加し得る残留毒性を保有する。現場において、ＣＥＯワクチンの無制限な使用、および粗雑な噴霧によるまたは飲料水を介した不良な集団ワクチン接種が、ワクチン株に毒性を回復させ、ＩＬＴの深刻な大流行を引き起こしてきた。
【００１３】
より最近では、それらが伝染しないことおよび毒性復帰がないことから、ＩＬＴＶの糖タンパク質遺伝子を担持するシチメンチョウのヘルペスウイルスおよび弱毒化鶏痘ウイルス等のウイルスベクターの使用が、より安全なワクチン接種の代替手段を提供してきた。しかしながら、１つまたは２つのＩＬＴＶ遺伝子の発現は、極度のチャレンジに耐えるために必要とされる完全な免疫を提供しない可能性がある。さらに、これらの組換えウイルスのいずれも、ＩＬＴＶの主な感染部位である気道上皮内では複製しない。ウイルス感染の原発部位における粘膜免疫が、この疾患からの保護において重要な役割を果たす可能性が高い。
【００１４】
より効果的なＩＬＴＶワクチンの開発のための別のストラテジーは、非必須遺伝子の所定の欠失によって生の弱毒化ＩＬＴＶワクチンを操作することである。構造糖タンパク質をコードするウイルス遺伝子は、免疫原性タンパク質であり、かつウイルスの付着、侵入、形態形成、および細胞間移行のプロセスに関与しているため、欠失の標的であり、そのため、それらの欠失は弱毒化をもたらす可能性が高い。
【００１５】
また、１つ以上の糖タンパク質が不足する弱毒化ＩＬＴＶ変異体は、ワクチン接種した動物からの感染の血清学的鑑別を可能にするマーカーワクチンとして用いることができる。ＩＬＴＶのｇＥおよびｇＩ相同体をコードする遺伝子の欠失は、複製を行わない組換えウイルスを生じさせるため、ＩＬＴＶの複製には２つの糖タンパク質が必須であることが示唆される。しかしながら、ｇＣ、ｇＧ、ｇＪ、ｇＭ、およびｇＮをコードするＩＬＴＶ遺伝子は、ウイルスゲノムから良好に欠失され、ニワトリにおける様々な程度のインビトロ複製欠損および異なるレベルの弱毒化を伴う変異体をもたらした。
【００１６】
予測された１２のＩＬＴＶの糖タンパク質のうち、ｇＣおよびｇＪのみがＩＬＴＶ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって認識された。ＭＡｂの１つのグループが、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）糖タンパク質ＣのＩＬＴＶ相同体であることが示された６０ｋＤａのタンパク質を認識した。ＭＡｂの別のグループは、ＩＬＴＶゲノムの固有の短いゲノム領域内に位置するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）５によってコードされ、したがってＵＳ５と称される、ＨＳＶ−１のｇＪの位置的な相同体を認識した。
【００１７】
ＩＬＴＶのｇＪは、スプライスおよび非スプライスｍＲＮＡから、８５、１１５、１６０〜２００ｋＤａの分子量に及ぶいくつかの形態で発現される。実験的感染の間、糖タンパク質ＪおよびＣに対する抗体は、早期に、ｇＢおよびｇＥに対する抗体よりも相対的に多い量で検出された。ｇＪおよびｇＣをコードする遺伝子を持たない組換えウイルスが構築されており、これらの２つの主要な抗体誘導性の糖タンパク質は、ウイルスのインビトロ複製に不可欠ではないことが示唆される。
【００１８】
ｇＣ変異体のインビトロ複製は、野生型親株およびｇＣレスキューウイルスに相当するものであった。インビボでのｇＣ変異体ウイルスは、いくらかの毒性を保持し、疾患からの効果的な保護を誘発し、チャレンジ後のウイルス排出量を有意に減少させた。毒性ＩＬＴＶ株から構築したｇＪ変異体（Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（２）：７０５−７１６）は、野生型ウイルス（ｌｏｇ10  ６．５ｐｆｕ／ｍｌ）およびｇＪレスキューウイルス（ｌｏｇ10  ６．８ｐｆｕ／ｍｌ）と比較して、力価（ｌｏｇ10  ５．７ｐｆｕ／ｍｌ）の有意な低下を示した。ニワトリにおいて、ｇＪ変異体は有意に弱毒化され、チャレンジウイルスを排出することなく完全な保護を誘発した。しかしながら、完全な保護を誘発するためには、ｇＪ欠失変異体が高用量で気管内に接種されなければならなかった。
【００１９】
改変された伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）およびそれを使用する方法を本明細書に提供する。例えば、弱毒化ＩＬＴＶが提供される。弱毒化ＩＬＴＶは、トリ種において免疫応答を誘発するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ＩＬＴＶは、トリ対象またはトリ対象の集団にワクチン接種するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ＩＬＴＶは、トリ集団の個体へと孵化する鳥卵に卵内投与される。１回以上のそのような卵内投与を使用して、トリ集団の免疫を高めることができる。
【００２０】
トリ対象は、いずれのトリ種であってもよい。例えば、対象は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、キジ、ウズラ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ、ダチョウ、エミュー、またはクジャク、ならびにいずれの他の商業的に加工されるトリおよび／あるいはいずれのトリまたはそれらの卵（単数もしくは複数）であってもよい。
【００２１】
弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）は、糖タンパク質Ｊの変異を含み得、変異は、糖タンパク質Ｊの発現を阻害する。任意選択的に、変異は、糖タンパク質Ｊのタンパク質の発現を阻害することができる。例えば、変異は、糖タンパク質Ｊのプロモーターエレメントの変異を含み、変異は、プロモーターエレメントの機能を阻害する。また、例示的な変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の完全なまたは部分的な欠失、例えば、配列番号１の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２１８８の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１の少なくともヌクレオチド１〜１４５の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド２１８５〜２１９０を含まない。欠失にはレポータータンパク質発現カセットを挿入することができる。レポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質であってもよい。欠失にはウイルスタンパク質発現カセットを挿入することができる。ウイルスタンパク質カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）であってもよい。任意選択的に、糖タンパク質Ｊの変異は、糖タンパク質Ｊの置換を含み得る。置換は、例えば、再編成されたＩＬＴＶ配列を含み得る。再編成されたＩＬＴＶ配列とは、野生型と同じ数のヌクレオチドが存在し、したがって、ヌクレオチドが野生型ＩＬＴＶ配列と異なる順序でちょうど編成されるように、置換が、ゲノムの一部を移動させるための当該技術分野で既知の方法によって操作されたＩＬＴＶ配列のみを含有することを意味する。これにより、糖タンパク質Ｊの発現の欠如がもたらされ、外来ＤＮＡは、弱毒化ＩＬＴＶ内に導入されない。
【００２２】
また、卵内での使用のために構成される、弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含むワクチンも提供される。卵内投与が使用される場合、限定されないが、気胞、卵白、絨毛尿膜、卵黄嚢、卵黄尿膜、羊膜を含む鳥卵の任意の領域に、またはトリの胎仔に直接的に組成物を導入することができる。
【００２３】
例示的なワクチンは、糖タンパク質Ｊの変異を有する弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を含む。任意選択的に、糖タンパク質Ｊの遺伝子に欠失を有する組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む卵内ワクチン製剤が提供される。また、弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、孵化卵に弱毒化ＩＬＴＶを投与するための手段、および鳥卵に弱毒化ＩＬＴＶを卵内投与するための指示を含み得るキットも提供される。
【００２４】
改変された伝染性喉頭気管炎ウイルスを使用する方法は、対象または集団における伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の感染を予防する方法であって、１羽以上の対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を投与することを含み、弱毒化ＩＬＴＶが卵内投与される、方法を含む。弱毒化ＩＬＴＶは、任意選択的に、部分的または完全な糖タンパク質Ｊの変異を含み得る。例えば、変異は、糖タンパク質Ｊのタンパク質の発現を阻害することができる。また、変異は、糖タンパク質Ｊのプロモーターエレメントの変異も含み得、変異は、プロモーターエレメントの機能を阻害する。また、例示的な変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の欠失、例えば、配列番号１の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２１８８の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１の少なくともヌクレオチド１〜１４５の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド２１８５〜２１９０を含まない。欠失点にはレポータータンパク質発現カセットを挿入することができる。レポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質であってもよい。欠失にはウイルスタンパク質発現カセットを挿入することができる。ウイルスタンパク質カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）であってもよい。任意選択的に、糖タンパク質Ｊの変異は、糖タンパク質Ｊの置換を含み得る。置換は、例えば、再編成されたＩＬＴＶ配列を含み得る。
【００２５】
対象において免疫応答を誘発する方法は、対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）を投与することを含み、弱毒化ＩＬＴＶが卵内投与される。また、トリ対象の集団の伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）に対する集団免疫を高める方法であって、集団の１羽以上の対象を生じる１つ以上の卵に弱毒化ＩＬＴＶを卵内投与することを含む方法も提供される。弱毒化ＩＬＴＶは、糖タンパク質Ｊの変異を含み得る。また、例示的な変異は、糖タンパク質Ｊのヌクレオチド配列の部分的または完全な欠失、例えば、配列番号１の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２２９１の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド１〜２１８８の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１の少なくともヌクレオチド１〜１４５の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号１のヌクレオチド２１８５〜２１９０を含まない。
【００２６】
また、ＣＫ細胞およびニワトリ胚において好適な力価まで成長し、１８日齢の発育ＳＰＦ卵の卵内接種後のチャレンジからの完全な保護を誘発する、糖タンパク質Ｊの欠失変異体も提供される。
【００２７】
記載される組成物およびワクチンは、好適な担体と、有効量の記載される改変された（例えば、組換え）伝染性喉頭気管炎ウイルスのうちのいずれかとを含み得る。化合物およびワクチンは、不活化組換えウイルスまたは生の組換えウイルスのいずれかを含有してもよい。組換えウイルスに好適な担体は、当該技術分野において周知であり、タンパク質、糖類等を含む。そのような好適な担体の一例は、タンパク質加水分解物、乳糖等の１つ以上の安定化剤を含有する生理学的に平衡な培養培地である。また、アジュバントがワクチンの担体の一部であってもよい。
【００２８】
生ワクチンは、組織培養液を用いて、安定化作用のあるタンパク質加水分解物等の安定化剤を加えることによって作製することができる。不活化ワクチンは、ウイルスの不活化直後に組織培養液を使用することができる。
【００２９】
本明細書に記載される組成物およびワクチンは、いずれの好適な経路によって投与されてもよい。例えば、組成物およびワクチンは、卵内に、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、器官への直接的な注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に（局所鼻腔内を含む）等、および気管内に投与することができる。ワクチンおよび組成物は、呼吸器系または眼等のいずれの器官系に適用されてもよい。
【００３０】
卵内での投与またはワクチン接種は、卵の殻を貫通する任意の手段を用いて免疫原性組成物を導入することにより、生きた発育中の胚を含有する鳥卵に免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を投与することを含む。そのような投与の手段は、限定されないが、免疫原性組成物の卵内注射を含む。
【００３１】
記載される組成物を卵内に導入するために、卵内注射、卵の殻を通した高圧噴霧、および組成物を担持する微粒子を用いた卵の弾道衝撃を含む任意の好適な方法を使用することができる。いくつかの例において、記載される組成物は、筋肉等のトリの組織内に水溶性の薬学的に許容される溶液（溶液は沈着される組成物を含有する）を沈着させることによって投与することができる。
【００３２】
卵内注射が使用される場合、注射の機序は重要ではないが、その方法は、処置が孵化率を低下させないように、胚またはそれを取り囲む胚体外膜の組織および器官を過度に損傷しないことが好ましい。卵内投与には、任意選択的に改変されたＩＬＴＶを収容する注射器を備える好適なデバイスを使用することができ、注射器は、卵にＩＬＴＶを注射するように位置付けられる。さらに、必要に応じて、卵に注射した後でその穴を密封するために、注射装置と動作可能に関連する密封装置が提供されてもよい。
【００３３】
投与される改変されたＩＬＴＶを含む組成物の適切な体積および投与量は、当業者によって容易に決定され得る。ワクチン接種等の治療的処置は、対象に治療的有効量の本明細書に記載される組成物を投与することを含む。有効量および有効投与量という用語は交換可能に使用される。有効量という用語は、所望の生理学的反応（例えば、感染性喉頭気管炎からの部分的もしくは完全な保護、または対象における免疫応答の誘発）を生じさせるために必要な任意の量として定義される。組成物を投与するための有効量およびスケジュールは、経験的に決定されてもよい。投与のための用量域は、所望の効果を生じさせるために十分に大きい用量域である。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど大量であるべきではない。卵内投与が使用される場合、卵のサイズ等の要因に応じて、投与量を調節することができる、一般的に、大きな卵には、小さい卵に対するよりも大きい体積および投与量が投与される。卵内または他の投与経路のための投与量または体積に影響を及ぼし得る他の要因は、限定されないが、ワクチン接種されるトリ種を含む。
【００３４】
伝染性喉頭気管炎を予防する方法およびワクチン接種方法は、トリまたはトリの集団において伝染性喉頭気管炎の影響または感染性喉頭気管炎の１つ以上の症状（例えば、１つ以上の呼吸器症状、またはトリ間でのＩＬＴＶの伝染）を減少させることを含む。有効性は、確立された伝染性喉頭気管炎の重症度または伝染性喉頭気管炎の１つ以上の症状における、または個々のトリもしくはトリの集団がＩＬＴＶに感染するかもしくはＩＬＴＶへの曝露後に伝染性喉頭気管炎の症状が現れる速度における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を意味し得る。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、本明細書において請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が、どのように作製され、評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、純粋に本発明の例示であることが意図され、それらが添付の特許請求の範囲に含まれる場合を除いて、またその程度まで、発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【００３６】
２つのｇＪ陰性組換えＩＬＴＶを作製した。これらのウイルスを野生型ウイルスＵＳＤＡ−ｃｈおよび対応するｇＪレスキュー変異体と比較してインビトロおよびインビボで分析した。ｇＪの発現の分析のために、バキュロウイルスに発現させたｇＪに対する抗ｇＪウサギ過免疫血清を作製した。ＩＬＴＶのｇＪは、ゲノムの短いセグメントに位置するＵＳ５によってコードされ、ＨＳＶ−１ゲノム内のその位置的な相同体にちなんで名付けられた。ＩＬＴＶのＵＳ５の推定アミノ酸配列は、オウムヘルペスウイルス１（ＰｓＨＶ−１）のそれぞれの相同遺伝子ＯＲＦ２と１８％の同一性を共有する。
【００３７】
ＩＬＴＶおよびＰｓＨＶ−１は密接に関連しており、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科のイルトウイルス属の２つの種を意味する。ＩＬＴＶのｇＪは、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）−１およびＥＨＶ−４におけるその対応物（ｇＪはｇｐ−２と称される）と限定された配列相同性を共有する。ｇｐ−２は、ＥＨＶ−１の毒性において重要な役割を果たすことが示された。ＩＬＴＶのｇＪは、スプライスおよび非スプライスｍＲＮＡから翻訳される後期糖タンパク質として同定されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４つの高分子量タンパク質として現れる。ｇＪは、感染ＣＫ細胞において４つの形態（約８５、１１５、１６０、および２００ｋＤａ）で発現される。ｇＪは、毒性株Ａ４８９の複製には不要であり、そのＡ４８９株由来のｇＪ陰性変異体は、高用量で気管内に接種されるとニワトリを感染させることができた。ニワトリは、軽度の疾患の徴候のみを示し、チャレンジ感染から保護された。ｇＪがＩＬＴＶの主要な抗体誘導性抗原であることを意味するという観察の観点から見ると、これは重要な発見であった。
【００３８】
ＩＬＴＶのｇＪは、ＩＬＴに対する遺伝子欠失マーカーワクチンの開発を標的とした。２つのｇＪ欠失変異体を作製した：一方は、ＣＭＶ前初期プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現し、他方には、いずれの外来ＤＮＡも挿入されていなかった。組換えウイルス変異体の対照として、再構成したｇＪ遺伝子を有するｇＪレスキュー変異体も作製した。ＵＳ５の部分欠失は、両方の欠失変異体（ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２）におけるｇＪの発現を完全に無効にし、変異体ＡＤｇＪ４．１のゲノムへの野生型ＵＳ５の再導入は、レスキュー変異体ｇＪＲ４．３におけるｇＪの発現を再構成した。抗ｇＪ  ＭＡｂおよびウサギ抗ｇＪ血清の両方の蛍光免疫検査法およびウエスタンブロットにおける反応性の欠如から、これらの変異体に保持されたＵＳ５の６６８ｂｐレムナントからのｇＪの切断形態の発現は除外された。変異体ウイルス中のｇＪ以外のウイルス糖タンパクの発現の存在をモニターするための対照として、ｇＣの発現を測定した。図５Ｅに観察されるように、変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２のいずれかから発現されたｇＣ（図５Ｅ、レーン５および６）は、ｇＪＲ４．３およびＵＳＤＡ−ｃｈに感染させた細胞によって発現されたｇＣ（図５Ｅ、レーン３および４）と比較して、電気泳動の移動性に若干の低下を示した。ｇＪＲ４．３はＡＤｇＪ４．１に由来し、ｇＣはゲノムの大きなセグメントに位置するＵＬ４４によってコードされるため、ｇＪ欠失変異体におけるｇＣの移動性の変化が、ゲノムの固有の短いセグメントにおける相同組換え事象の間に引き起こされた可能性は低い。
【００３９】
複製動態実験により、ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２は、ｇＪを発現するウイルス（ＵＳＤＡ−ｃｈ株、レスキュー変異体ｇＪＲ４．３）よりも複製効率が低かったことが示された。複製動態実験中のいずれの時点においても、ｇＪ欠失変異体に感染させた細胞の上清には、親ウイルスＵＳＤＡ−ｃｈおよびレスキュー変異体ｇＪＲよりも１００倍低い力価の感染性ウイルスが検出された。ｇＪレスキュー変異体と比較して、ｇＪ欠失変異体は、細胞侵入動態の障害を示さなかったため、糖タンパク質ＪがＩＬＴＶのウイルス侵入に関与していないことが示唆された。ｇＪ欠失変異体の平均プラークサイズは、ＵＳＤＡ−ｃｈまたはｇＪＲウイルスの平均プラークサイズよりも大きかったため、ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪおよびＢＤｇＪが細胞間に広がる能力は損なわれなかった。
【００４０】
細胞培養物中のＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２の複製と同様に、ＵＳＤＡ−ｃｈおよびレスキュー変異体ｇＪＲ４．３と比較すると、発育鶏卵におけるｇＪ欠失変異体の複製が妨げられた。ｇＪＲ４．３は、ＣＫ細胞よりも１０〜５０倍高い力価に達し、ＡＤｇＪ４．１の複製は、最初は効率が悪かったが４継代後には向上し、レスキュー変異体ｇＪＲ４．３（１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌ）よりもわずか１０倍低い力価（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ）に達した。一方、ＣＡＭにおけるＢＤｇＪ３．２の複製は、非常に非効率的であった。
【００４１】
結膜／経鼻経路により３週齢のニワトリに投与された時、結膜および気管内のウイルスＤＮＡの欠如によって示唆されたように、ｇＪ欠失変異体は強い弱毒化を示した。ニワトリ胚におけるＡＤｇＪ４．１の効率的な複製にもかかわらず、偽接種対照と比較した場合に、どちらのｇＪ欠失変異体も孵化率を低下させなかった。重度のＩＬＴＶチャレンジ後の臨床徴候の有意な減少によって示唆されるように、両方の変異体が、卵内投与された時に疾患から保護することができた。
実施例１：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の糖タンパク質Ｊ欠失変異体の作製：卵内投与後のインビトロ成長特性および保護効率
材料および方法
【００４２】
細胞およびウイルス    以前に記載されたように（Ｔｒｉｐａｔｈｙ  （１９９８），Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，４th  ｅｄ．）初代ニワトリ腎（ＣＫ）細胞を調製し、ウイルスの増殖および組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ50）として力価を決定するために使用した。１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ基礎培地（ＤＭＥＭ）にてニワトリ肝細胞癌細胞株ＬＭＨ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７，４４６０−４４６４）を培養し、トランスフェクションおよびプラーク精製に使用した。
【００４３】
２％ＦＢＳおよび抗生物質／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭにて、感染またはトランスフェクトしたＬＭＨ細胞をインキュベートした。細胞は、加湿インキュベーター内で３９℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。使用したウイルス株は、ＵＳＤＡ標準株（ＵＳＤＡ−ｃｈ）と、以前に遺伝子型Ｖとして特徴付けられた（Ｏｌｄｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．５２：５９−６３）野外分離株６３１４０／Ｃ／０８／ＢＲであった。組換えバキュロウイルスの作製および組換えタンパク質の生成にはヨトウガ卵巣細胞株Ｓｆ−９を使用した。ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＸ（登録商標）培地（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）にて、Ｓｆ−９細胞を２８℃で培養した。
【００４４】
組換え糖タンパク質Ｊの作製および精製    使用した全てのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）によって合成されたものであり、表１に列挙される。
【表１】
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Ａ  クローニング手順に使用した制限酵素
Ｂ  下線部は制限酵素切断配列である。ＲＧＳ−６ｘＨｉｓ配列をコードする配列を小文字で示す。ｇＪのＯＲＦの開始コドンおよび終止コドンは太字で記載する。
【００４５】
Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびプライマーｇＪｆｗ（配列番号２）／ｇＪｒｅｖ（配列番号３）（表１）を使用した高忠実度ＰＣＲにより、ｇＪ（配列番号１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＵＳ５をＩＬＴＶ６３１４０の精製したウイルスＤＮＡから増幅した。
【００４６】
ＩＬＴＶのＵＳ５オープンリーディングフレーム（糖タンパク質Ｊをコードする）は、配列番号１である。
【００４７】
Ｃ末端に位置するＲＧＳ−６ｘＨｉｓタグ配列をコードするＰＣＲ産物を、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびバキュロウイルス転移ベクターｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。製造者の推奨に従ってＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、組換えバキュロウイルスを作製した。端的に述べると、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からバキュロウイルスバクミドＤＮＡに発現カセットを転位させるために必要なシャトルベクターおよびヘルパープラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂａｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、組換えｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（登録商標）プラスミドを形質転換した。
【００４８】
製造者から推奨されるように組換えバキュロウイルスバクミドを選択し、ＧｏＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用したＰＣＲによって同定した。一旦選択してから、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ−Ｉｎｓｅｃｔａトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ，ＳＥ）を使用して、組換えバキュロウイルスバクミドのＤＮＡをＳｆ−９細胞にトランスフェクトした。
【００４９】
組換えバキュロウイルスを、レスキューし、プラーク精製し、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）ならびにＲＧＳ−６ｘＨｉｓに対するモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）およびＦＩＴＣコンジュゲート抗マウス抗体（ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用したウエスタンブロットにより分析した。組換えバキュロウイルスの増殖のために、Ｓｆ−９細胞を振盪培養器で成長させ、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１および細胞密度４ｘ１０6細胞／ｍｌで、７２時間２８℃で感染させた。製造者によって提供された指示に従って、Ｔａｌｏｎ（登録商標）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、ＩＬＴＶの感染Ｓｆ−９培養物から糖タンパク質Ｊを精製した。端的に述べると、３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離することにより細胞を沈降させ、上清を廃棄し、１ｘ完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ，ＳＥ）を含有する平衡化バッファー（ｐＨ８．０、Ｔａｌｏｎ（登録商標）キット）中、２％（ｗ／ｖ）Ｉｇｅｐａｌ６３０（ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する溶解バッファーに細胞ペレットを再懸濁した。氷上にて１５分間のインキュベーション後、可溶化液を上述のように遠心分離した。予め洗浄したＴａｌｏｎ（登録商標）樹脂を上清に加え、ロッカープラットフォーム上で、室温で１時間インキュベートした。製造者によって推奨されるようにＨｉｓタグ化タンパク質の洗浄および溶出を行った。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して溶出したタンパク質のタンパク質濃度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより調製物の同一性および純度を分析した。
【００５０】
組換え糖タンパク質Ｊの過免疫血清の作製    Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）のＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙユニットで過免疫血清を生成した。端的に述べると、ＰＢＳ５００ｕｌおよび等しい体積の完全フロイントアジュバントに再懸濁した精製糖タンパク質Ｊ４００μｇをニュージーランド白ウサギ（ＳＰＦ）に注射した。不完全フロイントアジュバントを用いて追加免疫注射を行った。２回の追加免疫注射の後でウサギを失血させ、血清を−２０℃で保存した。
【００５１】
相同組換えプラスミドおよび発現プラスミドの構築    糖タンパク質Ｊ（ｇＪ）の発現を不活性化するために、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた高忠実度ＰＣＲによりウイルスＤＮＡ断片を増幅した。それぞれＥｃｏＲＩおよびＸｍａＩ制限酵素（ＲＥ）切断部位を含有するプライマーｇＪｄｅｌ５’ＦＷ／ｇＪｄｅｌ５’ＲＥＶ（表１、図１ｃ）を使用して、ＵＳ５の上流に位置する１３７５ｂｐ断片を増幅した。ｇＪの３’コード領域は、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の下流コード領域ＵＳ６と部分的に重複しているため、ｇＤの発現の不活性化を避けるようにｇＪのコード配列は完全には欠失させなかった（図１）。
【００５２】
ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＥ切断部位を含有するプライマーｇＪｄｅｌ３’ＦＷ／ｇＪｄｅｌ３’ＲＥＶ（表１、図１ｃ）を使用して、ＵＳ５（２９５８ｂｐ）の３’末端からの６５８ｂｐおよびＵＳ６（１３０５ｂｐ）の５’末端からの１１９１ｂｐを含有する１８４４ｂｐ断片を増幅した。ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いた制限酵素消化によりＥＧＦＰのＯＲＦをプラスミドｐＥＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）から切除し、適切に消化されたｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローン化してｐｃＥＧＦＰを得た。ＬＭＨ細胞中の一過性トランスフェクションおよび蛍光顕微鏡法によりｐｃＥＧＦＰの機能性を検査した。
【００５３】
ＸｍａＩ  ＲＥ切断部位（表１）を含有するプライマーＥＧＦＰｅｘＦＷ／ＥＧＦＰｅｘＲＥＶを使用して、ＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰのＯＲＦ、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列からなるＥＧＦＰ発現カセットを、Ｐｆｘポリメラーゼとともに増幅した。１３７５ｂｐの５’ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｍａＩで切断し、ＥＧＦＰ発現カセットをＸｍａＩおよびＳｐｈＩで切断し、１８４４ｂｐの３’末端ＰＣＲ産物をＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。断片をゲル精製し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１９ＤＮＡに連結した。この組み合わされた４８９８ｂｐインサートを含有する組換えプラスミドｐＵ−ＥＧＦＰｄｅｌｔａｇＪをクローン化し、制限消化、一過性トランスフェクション、および蛍光顕微鏡法により分析した。
【００５４】
ｇＪレスキュー変異体を作製するために、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ならびにプライマーｇＪｒｅｓｃＦＷおよびｇＪｒｅｓｃＲＥＶ（表１、図１ｃ）を使用した高忠実度ＰＣＲにより、ＵＳ４、ＵＳ５、およびＵＳ６を包含するＵＳ領域の５４８３ｂｐ断片（図１）をウイルスＤＮＡから増幅し、ＸｍａＩを用いた制限消化およびアガロースゲル精製後に、ＸｍａＩで切断したｐＵＣ１９にクローン化した。制限酵素分析により組換えプラスミドを分析し、配列を確認した（ｐＵ−ｇＪｒｅｓｃ）。
【００５５】
挿入された外来ＤＮＡ配列を持たないｇＪ欠失変異体を作製するために、それぞれＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩ  ＲＥ断部位を有するｇＪｒｅｓｃＦＷおよびｇＧｒｅｖプライマー（表１、図１ｆ）を使用した高忠実度ＰＣＲにより、ＵＳ４を含む上流ＵＳ５の１３８４ｂｐ断片を増幅した。次に、ＥｃｏＲＩおよびＸｍａＩを含有するプライマーｇＤｐｆｗおよびｇＪｒｅｓｃＲＥＶ（表１、図１ｆ）を使用して、ＵＳ５の３’部分およびＵＳ６の一部を包含する１９３７ｂｐ断片を増幅した。
【００５６】
ＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩで２つのＰＣＲ断片を切断し、ＸｍａＩで切断したｐＵＣ１９に連結し、大腸菌ＮＥＢ５−α（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に形質転換した。制限消化および配列決定により組換えプラスミドを分析し、１つのプラスミド（ｐＵ−ｄｅｌｔａｇＪ）を選択した。
【００５７】
ウイルスＤＮＡとのコトランスフェクション後にウイルスレスキューにおけるヘルパータンパク質として使用するために、それぞれＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を特定するプライマーＵＬ４８ｆｗおよびＵＬ４８ｒｅｖ（表１）を使用した高忠実度ＰＣＲにより、精製したウイルスＤＮＡからＩＬＴＶのＵＬ４８相同体をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。１２１１ｂｐのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩとともにインキュベートし、適切に切断したｐｃＤＮＡ３にクローン化した。制限消化および配列決定により組換えプラスミドｐｃＵＬ４８を分析した。ＩＬＴＶのＩＣＰ４（ｐＲｃＩＣＰ４）をコードする真核生物発現プラスミドを使用した。
【００５８】
ＩＬＴＶのｇＪ欠失変異体の作製    ８２６６７ｘｇ、４℃で１時間遠心分離することにより、感染ＣＫ細胞培養物の上清からＵＳＤＡチャレンジ株（ＵＳＤＡ−ｃｈ）からのビリオンを沈降させた。標準的なフェノールクロロホルム抽出法によりウイルスＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩを使用した酵素消化により分析した。Ｍｉｒｕｓ（登録商標）ｍＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ，ＳＥ）を使用して、１、２、３、４、５、または６μｇのウイルスＤＮＡ、０．５μｇの各ヘルパープラスミド（ｐＲｃＩＣＰ４、ｐｃＵＬ４８）、および１μｇの組換えプラスミド（ｐＵ−ＥＧＦＰｄｅｌｔａ  ｇＪ、ｐＵ−ｇＪｒｅｓｃ、またはｐＵ−ｄｅｌｔａｇＪのいずれか）とともにＬＭＨ細胞にコトランスフェクトした。
【００５９】
細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すトランスフェクト培養物を培地に掻き入れ、異なる希釈度でＬＭＨ細胞を感染させるために使用した。倒立型蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ（登録商標）４０ＣＦＬ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して培養物を検査し、観察下で１００μｌピペットを使用して緑色蛍光プラークを吸引した。採取したプラークを１００μｌのＤＭＥＭ／２％ＦＢＳに再懸濁し、ＬＭＨ細胞の感染に使用した。２回の連続継代で蛍光を示さないプラークが観察されなくなるまでプラーク精製を繰り返した。ＱｉＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）を使用して、感染細胞培養物からＰＣＲによる分析のためのＤＮＡを調製した。
【００６０】
間接免疫蛍光法    モノクローナル抗体、ニワトリおよび／またはウサギ血清を用いて感染ＬＭＨ細胞の二重免疫蛍光を行い、レスキュー変異体において、欠失変異体によるｇＪの発現の欠如およびｇＪの発現の再構成を確認した。端的に述べると、チャンバースライドにＬＭＨ細胞を播種し、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）０．０５で、ＵＳＤＡ−ｃｈ、ＡＤｇＪ４．１、およびｇＪＲ４．３に感染させた。７２時間後、感染後細胞を氷冷エタノールで固定し、ｇＪ（ｍａｂ２５−５）またはｇＣ（ｍａｂ２８−５）に特異的なモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光のために処理した。
【００６１】
ＩＬＴＶに感染させたニワトリの回復期血清またはｇＪウサギ過免疫血清を２種抗体として使用して二重免疫蛍光を行った。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、抗ｇＪおよびｇＣ  ＭＡｂを１：１００に希釈し、ポリクローナル血清（ＩＬＴＶニワトリ回復期血清、ｇＪウサギ過免疫血清）を１：２００に希釈した。
【００６２】
一次抗体とともにインキュベートした後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、二次ヤギ抗マウスＣｙ５コンジュゲート抗体を使用してＭＡｂの結合を可視化し、ヤギ抗種ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（ＳＩＧＭＡ）とのインキュベーションにより、結合したニワトリおよび／またはウサギ抗体を可視化した。０．００１％のエバンスブルーを含有するＰＢＳ中で二次抗種抗体を希釈し、１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、蒸留水で手早くすすいでから空気乾燥し、２．５％の１，４ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）／９０％グリセロール中で免疫応答を開始させた。Ａｘｉｏｖｅｒｔ（登録商標）４０ＣＦＬ蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した従来の蛍光顕微鏡法、または共焦点レーザー走査顕微鏡ＬＳＭ５１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡法のいずれかによりスライドを調べた。
【００６３】
ウエスタンブロット    ＣＫ細胞をＵＳＤＡ−ｃｈ株またはＡＤｇＪ４．１変異体にｍ．ｏ．ｉ．０．０１で感染させた。感染後３〜４日目に、大半の細胞が剥離した時に、低速遠心分離（２０００ｘｇ、１０分、４℃）により培地から細胞片を除去した。８２６６７ｘｇ、４℃で６０分の超遠心分離法により上清からビリオンを沈降させた。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してタンパク質濃度を決定した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｘ完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ，ＳＥ）および０．５ｖｏｌ  ３％Ｎ−ラウリルサルコシネートを含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８．０）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に沈降物を溶解した。１レーン当たり３０μｇのタンパク質をローディングし、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により還元条件下で分離し、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を２２Ｖで８０分間使用して、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭグリシン、１０％メタノール中、半乾燥エレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。
【００６４】
ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ３．０ｇ、ＮａＣｌ８．８ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）中の５％脱脂粉乳中、一晩４℃で膜をブロックした。ＴＢＳ−ＴにＭＡｂを１：５００に希釈し、ウサギ抗ｇＪ過免疫血清を１：１０００に希釈し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回膜を洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳で再びブロッキングしてから、ＴＢＳ−Ｔに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗種抗体（ＳＩＧＭＡ）とともに室温で２時間インキュベートした。
【００６５】
ＴＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した化学発光により固定化ＨＲＰを検出した。Ｋｏｄａｋ  Ｇｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を使用して化学発光を可視化した。ウエスタンブロットにより、変異体に感染させた細胞におけるｇＪの欠如、およびレスキュー変異体に感染させた細胞におけるｇＪの発現の再構成も検査した。端的に述べると、ＣＫ細胞をｍ．ｏ．ｉ．０．１でＵＳＤＡ−ｃｈ、ｇＪＲ４．３、ＢＤｇＪ３．２、およびＡＤｇＪ４．１に感染させた。感染細胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに感染後４８時間溶解させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｇＣは１０％ポリアクリルアミド、ｇＪは７．５％）により同様の量を分離し、エレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。ウサギ抗ｇＪ過免疫血清、またはｇＪおよびｇＣに特異的なＭａｂのいずれかでブロットをプローブした。
【００６６】
変異体ウイルスおよび野生型ウイルスの複製および侵入動態    ２段階複製動態試験を行って、ｇＪの発現の欠如がウイルス変異体のインビトロ複製に影響を与えたかどうかを決定した。端的に述べると、ＣＫ細胞をＵＳＤＡ−ｃｈ、ＡＤｇＪ４．１、ＢＤｇＪ３．２、およびｇＪＲ４．３にｍ．ｏ．ｉ．０．０１で感染させた。６０分間３９℃で吸着後、細胞から接種材料を除去し、培養液で洗浄し、ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ／抗生物質で細胞の表面を覆い、３９℃でインキュベートした。感染後０、２４、４８、および７２時間目に上清を回収し、ＣＫ細胞上のＴＣＩＤ50としてウイルス力価を決定した。ＵＳＤＡ−ｃｈおよびｇＪレスキュー変異体と比較してｇＪ欠失変異体のウイルス侵入に異常があるかどうかを評価するために、３つの変異体ウイルスおよび親ウイルスＵＳＤＡ−ｃｈの各々の５００プラーク形成単位（ｐｆｕ）を、氷上で６０分間、６ウェルプレート内のＬＭＨ細胞に吸着させた。接種材料を除去し、加温した培養液で細胞の表面を覆い、３９℃でインキュベートした。５、１０、２０、４０、および６０分後、ｐＨ３．０のクエン酸バッファー（４０ｍＭクエン酸、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ）とともに室温で１分間インキュベートすることにより細胞外ウイルスを不活化し、ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ／抗生物質で１回洗浄し、最後に０．５％メチルセルロース、２％ＦＢＳ、および抗生物質を含有するＭＥＭで表面を覆った。感染後５日目に、ＰＢＳ中の５％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、５０％エタノール中の１％クリスタルバイオレットで染色した。プラークを数え、異なる時点での数を６０分の時点でのそれぞれのプラーク数のパーセンテージとして表し、異なる時間に対してプロットした。
【００６７】
ニワトリ胚における変異体および野生型ウイルスの増殖    発育卵におけるｇＪ変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２の複製を評価するために、９日齢ニワトリ胚のＣＡＭに、１０4ＴＣＩＤ50を含有するＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２をそれぞれ１００μｌ接種した。３７℃で５日間卵をインキュベートし、ＣＡＭを回収し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を使用して細胞培養培地にてホモジナイズした。上清の力価を初代ＣＫ細胞上のＴＣＩＤ50として決定した。上清の残りは、上述のように、９日齢ニワトリ胚のＣＡＭ上で連続継代のために使用した。
【００６８】
変異体の結膜／経鼻接種およびチャレンジ実験    ４週齢ＳＰＦ白色レグホン種ニワトリに、結膜／経鼻経路を介して１０4ＴＣＩＤ50の変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２、ならびにＵＳＤＡ野生型株（ＵＳＤＡ−ｃｈ）を接種して、ウイルス変異体の毒性を評価した。同時期に孵化した雛（ｈａｔｃｈｍａｔｅ）の１グループには、対照として細胞培養培地を偽接種した。臨床徴候を毎日モニターし、接種後１〜６日目まで、以前に記載されたように０〜５のスケール上で（Ｏｌｄｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．５２：５９−６３）スコア化した。ＩＬＴＶ変異体を接種したニワトリがチャレンジ感染から保護されたかどうかを決定するために、接種から３週間後に、感染ニワトリおよび対照ニワトリに、生まれたトリ当たり１０4ＴＣＩＤ50のＵＳＤＡ株を結膜および経鼻経路を介してチャレンジした。チャレンジ後６日目まで臨床徴候をモニターし、上述のようにスコア化した。
【００６９】
定量ＰＣＲ    最初の接種から４日目に拭き取り検体を回収し、ＱｉＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）を使用して処理した。記載されるように（Ｃａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．５０：５０−５４）、リアルタイムＰＣＲによりウイルスゲノムのコピーを定量化した。
【００７０】
変異体の卵内接種およびチャレンジ実験    発育卵におけるｇＪ変異体の弱毒化レベルを決定するために、２５個の１８日齢ＳＰＦ胚（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｆａｒｍｓ、Ｃａｔｓｋｉｌｌ，ＮＹ，ＵＳＡ）にＡＤｇＪ４．１またはＢＤｇＪ３．２のいずれかを接種した。第３のグループの胚には、滅菌細胞培養培地を偽接種した。接種した卵をさらにインキュベートし、孵化率を決定した。孵化から３５日後、結膜および経鼻経路により、接種されるニワトリ当たり１０5ＴＣＩＤ50の用量でＵＳＤＡ−ｃｈ株をニワトリにチャレンジした。チャレンジ後７日目まで、Ｏｌｄｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．５２：５９−６３によって以前に記載されたように０〜５のスケール上で臨床徴候をスコア化した。
結果
【００７１】
組換え糖タンパク質Ｊの発現    Ｓｆ−９細胞中の組換えバキュロウイルスから発現された精製ｇＪをＳＤＳ−７．５％ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブルー染色およびウエスタンブロット（図２）により分析した。クマシーブルーで染色したゲルに複数の高分子量タンパク質が観察された（図２、レーン１）。並行して行ったウエスタンブロットでは、抗ＲＧＳ−６ｘＨｉｓ  Ｍａｂが同様のタンパク質に結合し、ＲＧＳ−６ｘＨｉｓ配列（レーン２）の存在が確認された。抗ｇＪ  ＭＡｂ（レーン３）およびＩＬＴＶに感染させたニワトリ（レーン４）の回復期血清は、どちらも約８０、１００、１４０、および１８０ｋＤａの４つのタンパク質に結合した。また、ニワトリ血清は、約６０ｋＤａおよび４０ｋＤａのタンパク質を認識した。組換え糖タンパク質Ｊは、精製プロセスの間に著しく濃縮されたものの、ゲルのクマシー染色により、なおも細胞タンパク質が検出された（レーン１）。しかしながら、組換えｇＪタンパク質調製物を用いた３回の免疫付与により特異的なウサギ過免疫血清が生じたため、ｇＪ欠失変異体を特徴付けるために免疫蛍光およびウエスタンブロットに使用した（図２）。
【００７２】
ｇＪ欠失変異体の作製    ＵＳＤＡチャレンジ株（ＵＳＤＡ−ｃｈ）からのＤＮＡをプラスミドｐＵ−ＥＧＦＰｄｅｌｔａｇＪならびにヘルパープラスミドｐＲｃＩＣＰ４およびｐｃＵＬ４８とともにコトランスフェクトした。トランスフェクションから５日後、緑色蛍光を示したいくつかの個別のプラークを、倒立型蛍光顕微鏡を使用して単離した。ＬＭＨ細胞において３つのプラークを連続的に２回プラーク精製した。緑色蛍光プラークのみの子孫を生成したプラークだけを選択し、その後増殖させた。ＥＧＦＰをコードするクローンＡＤｇＪ４．１に感染させた細胞からのウイルスＤＮＡをＰＣＲにより分析し、相同組換えの正確性を確認した（図３）。ＩＬＴＶの野生型ＤＮＡを対照として使用した。
【００７３】
ＣＭＶ（ＣＭＶｐｒｅｖ）プロモーターに結合する逆方向プライマーおよびｇＧのＯＲＦであるＵＳ４の上流に位置する配列に相補的な順方向プライマー（ｇＧｕｐｆｗ）は、予想された２３７８ｂｐ産物を生成し（図１および図３Ａ）、ＥＧＦＰのＯＲＦ（ＥＧＦＰ５７８ｆｗ）に相補的な順方向プライマーおよびＵＳ７の下方領域に相補的な逆方向プライマー（ＣｌａＩｇＩｒｅｖ）（図１および図３Ａ）は、予想されたように２４８０ｂｐ産物を増幅した。この結果から、ゲノムの標的領域にＥＧＦＰ発現カセットの挿入が起こったことが示唆された。
【００７４】
変異体ウイルスＡＤｇＪ４．１調製物中に野生型ウイルスＤＮＡが存在しないことを検証するために、両方のウイルスゲノムに結合するが、組換え配列の外側にあるプライマーを用いてＰＣＲ分析を行った。ＵＳＤＡ−ｃｈおよびＡＤｇＪ４．１ＤＮＡを鋳型として使用した時に、ＢａｍＨＩｇＧｆｗおよびｇＪ２３８１ｒｅｖプライマー（図１、表１）は、それぞれ３０１５ｂｐおよび２２１５ｂｐ断片を増幅した（図３Ｂ）。この結果から、短いＰＣＲ断片によって示唆されるように、標的部位に短いＤＮＡ配列が存在していたことが示された。標的インサートの同一性を検証するために、両方のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩで消化した。ＡＤｇＪ４．１から得られた２２１５ｂｐのＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーターとＥＧＦＰのＯＲＦとの間に位置するＢａｍＨＩ部位で切断して１３４６および８６９ｂｐの２つの断片を得た一方で、ＵＳＤＡ−ｃｈのＤＮＡからのＰＣＲ産物はインタクトな状態のままにした（図３Ｃ）。
【００７５】
変異体および野生型ＤＮＡの配列を確認するために、ＰＣＲに使用したプライマーを、ＡＤｇＪ４．１および野生型ＤＮＡからのＰＣＲ産物を部分的に配列決定するためにも使用した。いずれの外来ＤＮＡも担持しない不活性なｇＪ遺伝子を有するＩＬＴＶ変異体を作製するために、ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１を発現するＥＧＦＰをＣＫ細胞上で増殖させ、ビリオンを精製し、ウイルスゲノムＤＮＡを調製した。ヘルパープラスミドおよび組換えプラスミドｐＵ−ｄｅｌｔａｇＪとのＬＭＨ細胞のコトランスフェクション後、いくつかの非蛍光プラークを単離し、プラーク精製して増殖させた。この場合、選択基準は、緑色蛍光が存在しないことであった。これらのウイルスプラークのうち３つを精製し、ＢＤｇＪ１．１、ＢＤｇＪ３．１、またはＢＤｇＪ３．２と名付けた。ＢＤｇＪクローンからウイルスＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより分析した。プライマーＢａｍＨＩｇＧｆｗおよびｇＪ２３８１ｒｅｖは、ＢＤｇＪウイルスＤＮＡでは８３０ｂｐ断片、およびＵＳＤＡ−ｃｈ野生型ＤＮＡでは３０１５ｂｐ断片を生成した（図１Ｇおよび図３Ｄ）。ＰＣＲプライマーを使用して両方のＤＮＡ断片から得られた配列から、両方の断片の同一性が確認された。
【００７６】
次に、ｇＪの発現が回復されたレスキュー変異体を作製した。ＡＤｇＪ４．１からのウイルスＤＮＡをｐＵ−ｇＪｒｅｓｃおよびヘルパープラスミドとのコトランスフェクションに使用した。ｐＵ−ｇＪｒｅｓｃのインサートを用いた変異体ウイルスＤＮＡの組換えにより、ＵSセグメント内の変異部分を修復してＵＳ５を完全に回復し、野生型ウイルスと同一の変異体がもたらされることが予想された。ここでも同様に非蛍光プラークを選択し、ウイルスをプラーク精製して増殖させた。
【００７７】
ｇＪＲ１．３、ｇＪＲ２．４、またはｇＪＲ４．３と名付けられた３つのプラークからウイルスＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより分析した。プライマーＢａｍＨＩｇＧｆｗおよびｇＪ２３８１ｒｅｖを使用した増殖により、予想されたようにｇＪＲクローン４．３およびＵＳＤＡ−ｃｈのＤＮＡから３０１５ｂｐ断片が生成されたことから（図１Ｇおよび図３Ｅ）、組換えプラスミドｐＵ−ｇＪｒｅｓｃの正しい挿入が示唆された。クローン１．３および２．４からのＤＮＡからはＰＣＲ産物は得られず、その後これらのウイルスは破棄された。
【００７８】
ＵＳ５の部分欠失はｇＪの発現を無効にする    ＡＤｇＪ４．１変異体によるｇＪの発現の欠如およびレスキュー変異体ｇＪＲ４．３におけるｇＪの発現の再構成を、二重免疫蛍光および共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡法により測定した（図４）。陽性対照としてＬＭＨ細胞をＵＳＤＡ−ｃｈに感染させた。
【００７９】
感染細胞は、抗ｇＣ  ＭＡｂおよび抗ｇＪ  ＭＡｂに陽性シグナル（Ｃｙ５−蛍光）を示した。Ｃｙ５−蛍光は、ポリクローナルニワトリ抗ＩＬＴＶ血清（ＦＩＴＣ−蛍光）と反応した細胞にのみ存在したことから、蛍光の特異性が確認された（図４Ａ）。また、ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１に感染させた細胞は、ＩＬＴＶ感染ニワトリからの抗体およびｇＣ  ｍａｂとも結合したが、ｇＪ  ｍａｂとは結合しなかった（図４Ｂ）ことから、ｇＪを発現することができない組換えＩＬＴＶの存在が示唆された。次に、ＬＭＨ細胞をレスキュー変異体ｇＪＲ４．３に感染させた後、ｇＪの発現の有無について調べた。
【００８０】
感染細胞における抗ｇＣ  ＭＡｂ（Ｃｙ−５蛍光）およびウサギ抗ｇＪ抗血清（ＦＩＴＣ−蛍光）を使用した二重免疫蛍光により、ｇＪの発現の再構成が確認された（図４Ｃ）。さらに、ウエスタンブロットによりＡＤｇＪ４．１ビリオン中にｇＪが存在しないことが測定された（図５）。抗ｇＪ  ＭＡｂは、約８５、１１５、および１６０ｋＤａのＵＳＤＡ−ｃｈビリオンからの高分子量タンパク質と反応した（図５Ａ）。約８５、１１５、および２００ｋＤａのタンパク質が４８９ＩＬＴＶ株のビリオンにおいてｇＪとして同定された前回の報告とは対照的に、ｇＪの２００ｋＤａ形態は、ＵＳＤＡ−ｃｈ株の精製ビリオンにおいて最初は検出されなかった。
【００８１】
抗ｇＪ  ＭＡｂは、ＡＤｇＪ４．１ビリオンタンパク質のうちのいずれとも反応しなかった。対照的に、抗ｇＣ  ＭＡｂは、ＵＳＤＡ−ｃｈ株およびｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１の両方のビリオン調製物において約６５ｋＤａのタンパク質と反応した（図５Ｂ）。抗ｇＪ  ＭＡｂがＡＤｇＪ４．１のビリオン調製物と結合しなかったことは、対応するエピトープが存在しなかったことを示すものである。したがって、ＵＳＤＡ−ｃｈおよびＡＤｇＪ４．１のビリオン調製物のウエスタンブロットも、ポリクローナル血清、抗ｇＪウサギ過免疫血清でプローブした。ＡＤｇＪ４．１のビリオンタンパク質との結合は検出されなかったが、反対に、ＵＳＤＡ−ｃｈビリオン調製物において８５、１１５、および１６０ｋＤａの３つのｇＪ種との強い反応が観察された（図５Ｃ）。特異性対照としての役割を果たす同じウサギからの免疫前血清を用いたインキュベーションは、非常にかすかな非特異的反応をもたらした。ＵＳＤＡ−ｃｈのビリオン調製物、ならびにＵＳＤＡ−ｃｈ、ＡＤｇＪ４．１、ＢＤｇＪ３．２、およびｇＪ−レスキューウイルスｇＪＲ４．３に感染させたＣＫ細胞培養物のウエスタンブロットも、ポリクローナルウサギ抗ｇＪ血清を用いてｇＪの存在について検査した（図５Ｄ）。未感染ＣＫ細胞は、陰性対照としての役割を果たした。高分子量タンパク質の検出に有利なように電気泳動および導入条件を調節することにより、異なる形態のｇＪの外観の解像に成功した。
【００８２】
ポリクローナルウサギ血清は、ＵＳＤＡ−ｃｈの精製ビリオン中（図５Ｄ、レーン１）、ならびにＵＳＤＡ−ｃｈおよびレスキュー変異体ｇＪＲ４．３に感染させた細胞培養物中（図５Ｄ、レーン３および４）で、約８５、１１５、１６０、および２００ｋＤａの分子量のタンパク質を認識した。未感染細胞培養物および感染細胞培養物において、約４５ｋＤａでバンドが観察され（図５Ｄ、レーン２〜６）、ウサギ血清の細胞タンパク質との反応性が示唆された。
【００８３】
ブロットをウサギ免疫前血清とともにインキュベートして同時にウエスタンブロットを行ったところ、このブロットは非常にかすかな反応をもたらし、ｇＪポリクローナルウサギ血清によって認識されたタンパク質が、実際にＩＬＴＶのｇＪに特異的であることが示唆された。これらの結果から、ｇＪ欠失変異体におけるｇＪの発現の欠如が確認された。対照として、全ての試料を抗ｇＣ  ＭＡｂで並行してプローブした（図５Ｅ）。感染細胞（図５Ｅ、レーン３〜６）またはビリオン（図５Ｅ、レーン１）のいずれかを含有する全ての試料に、抗ｇＣ  ＭＡｂにより未感染細胞（図５Ｅ、レーン２）には存在しなかった６５ｋＤａタンパク質が検出され、感染細胞の試料中に相当量のウイルスタンパク質が存在することが示された。
【００８４】
細胞培養物およびニワトリ胚におけるＩＬＴＶのｇＪ欠失変異体の複製    感染後２４、４８、および７２時間目には、ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２に感染させたＣＫ細胞の上清のウイルス力価は、ＵＳＤＡ−ｃｈおよびレスキュー変異体ｇＪＲ４．３と比較して１．５〜２ｌｏｇ10低かった（図６Ａ）。ウイルスレスキュー変異体ｇＪＲ４．３における複製効率は完全に回復していたため、観察された表現型は、ｇＪの発現の欠如によるものであり得る（図６Ａ）。ｇＪの発現の欠如によるウイルス複製の障害は、侵入から放出までのプロセスの間のいずれの段階でも引き起こされ得る。ウイルス侵入が妨げられるかどうかを調べるための実験において、ＵＳＤＡ−ｃｈ、ｇＪ欠失変異体（ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２）、ならびにレスキュー変異体（ｇＪＲ４．３）がＬＭＨ細胞に侵入する能力に有意差は示されなかった（図６Ｂ）。このことは、ウイルス侵入が、ｇＪの発現の欠如によって検出可能な程度には影響されなかったことを示唆する。
【００８５】
ＩＬＴＶを増殖させる標準的な方法の１つは、ニワトリ胚（ＣＥ）の絨毛尿膜（ＣＡＭ）で増殖させることである。ｇＪ欠失変異体がＣＡＭ中で複製する能力を評価し、ＣＫ細胞において得られたウイルス力価と比較した。レスキュー変異体ｇＪＲ４．３（ＴＣＩＤ５０  ７．４ｌｏｇ10）および野生型ＵＳＤＡ−ｃｈ（ＴＣＩＤ５０  ８．０ｌｏｇ10）のウイルス力価は、それぞれ、ＣＥのＣＡＭ（表２）においてＣＫ細胞（図６Ａ）よりも１０〜５０倍高かった。ｇＪ−欠失変異体であるＡＤｇＪ４．１変異体を発現するＥＧＦＰは、ＣＡＭにおける４回の連続継代後に６．４０ｌｏｇ10の力価に達したのに対し、ＣＡＭにおけるｇＪ変異体ＢＤｇＪ３．２の力価は、３回の連続継代後に２．５０〜１．７５の範囲であった（表２）。
【表２】
2013535214.tif 000004
A.ニワトリ腎細胞においてＴＣＩＤ５０  ｌｏｇ１０として表した力価
B.実行せず
【００８６】
ニワトリにおけるｇＪ変異体の弱毒化およびそれらの保護効率    予想されたように、４週齢ＳＰＦニワトリの感染後３〜６日目に、野生型ＵＳＤＡ−ｃｈ株およびｇＪＲを接種したニワトリが疾患の特徴的な徴候を現した。最も顕著な疾患の徴候は、重度の結膜炎および鬱症状であった。対照的に、ＡＤｇＪ４．１を接種した少数のニワトリは、感染後４日目および５日目に非常に軽度の結膜炎を示し、ＢＤｇＪを接種したニワトリは、対照群と同様に臨床徴候を示さなかった。
【００８７】
感染後４日目に回収された結膜および気管の拭き取り検体の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によりウイルス複製を測定した（表３）。
【表３】
2013535214.tif 000005
A  ｑＰＣＲを使用して拭き取り検体の試料を調べた（Ｃａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  （２００３）  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．  ５０：５０−５４。B  ＤＮＡコピーの数
【００８８】
ｑＰＣＲアッセイの検出限界がウイルスＤＮＡの２５コピーであったため、偽感染させたニワトリおよびｇＪ欠失変異体に感染させたニワトリの試料は、ウイルスＤＮＡの存在について陰性と見なした。対照的に、野生型ＵＳＤＡ−ｃｈまたはレスキュー変異体ｇＪＲ４．３に感染させたニワトリからの試料において、相当量のウイルスＤＮＡが検出された。
【００８９】
ｇＪ−欠失変異体を接種したトリおよび未感染対照のトリにＵＳＤＡ−ｃｈ野生型ウイルスをチャレンジした。ｇＪ欠失変異体ＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２に感染させたトリ、ならびに未感染対照のトリに疾患の臨床徴候が観察された。チャレンジ感染後４日目と５日目の間に臨床徴候のピークが観察された。結膜炎および鬱症状が、最も顕著な疾患の徴候であった。ワクチン未接種／チャレンジ群のニワトリとＡＤｇＪ４．１およびＢＤｇＪ３．２を接種したニワトリとの間に検出された臨床徴候の重症度に有意差は観察されなかった（図７Ａ）。
【００９０】
ｇＪ変異体は卵内ワクチン接種後に保護を提供する    孵化時には、偽接種胚と比較してＡＤｇＪ４．１接種群とＢＤｇＪ３．２接種群との間で孵化率に有意差は観察されず、卵内接種によるｇＪ欠失変異体の十分な弱毒化が示唆された。飼育期間中、偽接種群に有意差は観察されなかった。
【００９１】
３５日目に、結膜的および経鼻的に１０5ＴＣＩＤ５０／ニワトリを接種することによりニワトリにチャレンジした。チャレンジ後、臨床徴候が１〜７日目まで観察され、ワクチン未接種のニワトリの１００％が重度の臨床徴候を示したことから、妥当なチャレンジが示唆された。ＢＤｇＪ変異体を接種したニワトリのうち、３９％が臨床徴候を示したのに対し、残りのニワトリは、いずれの時点でも臨床徴候を示さなかった。ＡＤｇＪ４．１を卵内接種したニワトリの１４％が臨床徴候を示したのに対し、８６％は実験を通じて健康な状態を維持した（図７Ｂ）。これらのデータは、ｇＪ欠失変異体、特にＡＤｇＪ４．１が卵内接種された時に、高用量チャレンジ感染後にＩＬＴからの保護を誘発することができたことを示している。
実施例２：  ＩＬＴＶ−ΔｇＪｇｒｅｅｎ中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）カセットのＩＬＴＶタンパク質をコードしない配列との置換
新規ｇＪ欠失ＩＬＴＶ作製のための組換えＤＮＡの設計
【００９２】
Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００６６２３．１に保管されたＩＬＴＶのゲノムヌクレオチド配列から、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）のＵＳ６のコード配列（ＣＤＳ）がヌクレオチド１３２６７５〜１３３８０８であり、１２のヌクレオチドが糖タンパク質ＪのＵＳ５のＣＤＳ（１２９７３９〜１３２６９６）と重複していることを予測した。ＩＬＴＶのｇＤの転写開始部位がマッピングされていなかったため、ヌクレオチド１３２５０４から始まる長いＣＤＳを検討した。その場合、ＵＳ６は、ＵＳ５と１９２ｂｐ重複する。新規ΔｇＪ変異体ＩＬＴＶの設計では、ＵＳ６の発現を確実にするためにＵＳ６の上流のプロモーター配列は改変しなかった。ｇＪのＯＲＦ（ＵＳ５）を修飾するために、約１０ｂｐのセクションを切除して１０ｂｐ下流にそれらを挿入することにより、ＵＳ５の５’末端配列（２３５７ｂｐ）を著しく改変した。これらを５０回行うことにより、ＧＣの内容を変化させることなくナンセンス配列を生じさせた。また、約５０のＣＧおよびＡＴの交換をランダムに導入した。ＵＳ６の考えられる一番最初の開始コドンを含むＵＳ５の３’末端からの３２１ヌクレオチド断片、および潜在的プロモーター領域の１３０ヌクレオチド上流は変更しなかった。ウイルスゲノムへの相同組換えのために、操作したＵＳ５の５’および３’末端に標準配列を加えた。５’末端には、ＵＳ４の３’末端の２７０ヌクレオチドと、ＵＳ４の終止コドンとＵＳ５の元の開始コドンとの間の２０９ヌクレオチド配列とからなる、破壊したＵＳ５開始コドンの上流の４７９ｂｐ断片を加えた。３’末端には、ＵＳ６の非重複部からの４５０ｂｐ断片を加えた。結果として得られた３８７６ｂｐのＤＮＡ断片を合成し、細菌プラスミドｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にクローン化した。
組換えＮΔｇＪ  ＩＬＴＶの作製
【００９３】
組換えＤＮＡ配列（３８７６ｂｐ）を含有する組換えプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化してインサートを放出させ、アガロースゲル電気泳動により分離した。３８７６ｂｐインサートをゲルから溶出し、緑色蛍光ｇＪ欠失変異体ＧΔｇＪからのウイルスＤＮＡとのコトランスフェクションに使用した。ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、培養密度８０％でＬＭＨ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから５日後、細胞を上清中にすすぎ入れ、−８０℃で保存した。段階希釈法を使用して６ウェルプレート内のＬＭＨ細胞を感染させた。生体蛍光顕微鏡法により非蛍光プラークを同定し、観察下で非蛍光プラークを吸引して、新しいＬＭＨ細胞培養物に接種した。プラーク精製を１度繰り返し、親緑色蛍光ウイルスの混入を排除した。プラーク精製したＮΔｇｊの分離株を、初代ニワトリ腎細胞培養物に接種し、３日間３９℃でインキュベートした。感染細胞を上清中にすすぎ入れ、アリコートを−８０℃で保存した。ＱｉＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、各プラーク分離株のうちの１つのアリコートを用いてＤＮＡを調製した。ＰＣＲによりプラーク分離株の遺伝子型を分析した。プライマー２５ｕｐＵＳ４ＦＷ／ＣｌａＩｇＩｒｅｖを使用して（図８）、ＮΔｇＪの３つの異なるプラーク分離株およびＵＳＤＡ対照ウイルスＤＮＡから５５９１ｂｐのＰＣＲ産物を得、親ウイルスＧＤｇＪからのウイルスＤＮＡを使用して４９０１ｂｐ断片を得た。プライマーは、組換え領域の外側に位置するウイルスゲノム内の領域に結合する。変異体ＮΔｇＪの結合部位は、野生型ウイルスＵＳＤＡと同一でなければならず、また、本来ＵＳＤＡに由来する親ウイルスＧＤｇＪにおいても同一でなければならない。５５９１ｂｐ断片の増幅は、プライマー結合部位が存在すること、そして、それらの間にあるゲノム領域は、ＵＳＤＡとは異ならないが、親ＧＤｇＪとは異なる、予想された長さの領域であることを示した。ＮΔｇＪ分離株からのＰＣＲ産物をクローニングおよび配列決定のためにアガロースゲルから溶出した。プラーク分離株中の人工ナンセンスｇＪ配列の存在を確認するために、ナンセンスｇＪ配列には排他的に結合するが、ＵＳＤＡまたはＧΔｇＪウイルスＤＮＡには結合しないプライマーＮｇＪ１３９０ｆｗ／ＮｇＪ２４８３ｒｅｖを使用して別のＰＣＲを行った。予想されたように、１１１２ｂｐ産物（図８）は、ＮΔｇＪプラーク分離株からのみ増幅され、ＵＳＤＡウイルスＤＮＡを鋳型として使用しても産物は得られなかった。
【００９４】
次に、ＮＤｇＪプラーク分離株のＵＳ４、ナンセンスＵＳ５、およびＵＳ６を包含する５５９１ｂｐのＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定した。緑色蛍光タンパク質を発現せず、いずれの外来ＤＮＡも持たない新規ΔｇＪウイルス（ＮΔｇＪ）ウイルスを２回プラーク精製し、親または野生型ＩＬＴＶからの鑑別を可能にするプライマーを使用した異なるＰＣＲにより、３つの個別の分離株の遺伝子型を確認した。ＮΔｇＪをニワトリ腎細胞に増殖させた。３つの継代を通してＣＫ細胞中に３つのプラーク精製ウイルスを得た：プラーク精製したウイルスは、ｌｏｇ10  ５．５〜ｌｏｇ10  ６．４の範囲の力価を有する。この力価は、ＧΔｇＪで得られた力価よりも高い。
【００９５】
ＮΔｇＪ株の無細胞ウイルス調製物の弱毒化および保護能力を、ブロイラーおよびレイヤーにおいて検査する。最初に、２週齢および６週齢で、点眼薬によりＮΔｇＪ株を適用する。その後、このウイルスが噴霧により１日齢のニワトリに適用された場合および卵内を介した場合の保護の有効性を検査する。
ＦΔＧｊの作製および増殖
【００９６】
以前に作製したＧＦＰを発現するｇＪ欠失変異体（ＧΔｇＪ）に基づいて、ニューカッスル病ウイルスＬａＳｏｔａ株の融合タンパク質（Ｆ）を担持する組換えｇＪ欠失変異体を作製した。ＧＦＰ発現カセットを除去し、ＮＤＶ  ＬａＳｏｔａ株の融合遺伝子と置換した。ウイルスＤＮＡとのコトランスフェクション後に、ＧΔｇＪ、ヘルパープラスミドｐＲｃＩＣＰ４およびｐｃＵＬ４８、ならびに組換えＤＮＡ断片からＦΔｇＪをレスキューした。ＧＦＰを発現していないウイルスを２回プラーク精製し、親または野生型ＩＬＴＶからの鑑別を可能にするプライマーを使用したＰＣＲにより、３つの個別の分離株の遺伝子型を確認した。プラーク精製したウイルスのうちの２つをニワトリ腎細胞で２回継代し、ｌｏｇ10  ４．６およびｌｏｇ10  ５．１２ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価に達するようにした。
【００９７】
開示される方法および組成物のために使用することができるか、それらとともに使用することができるか、それらの調製において使用することができるか、またはそれらの生成物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示されるが、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物の各々の種々の個別および集合的な組み合わせおよび順序に関する具体的な言及が明白に開示されていないかもしれないが、各々が本明細書において具体的に企図され、説明されることを理解されたい。例えば、ある方法が開示および議論され、その方法を含む分子の数に対して行われ得る多くの変更が議論される場合、そうではないと具体的に指定のない限り、その方法のあらゆる組み合わせおよび順序、ならびに考えられる変更が具体的に企図される。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組み合わせも、具体的に企図され、開示される。この概念は、限定されないが、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含む、本開示の全ての態様に適用される。よって、行うことのできる多様な追加ステップが存在する場合、これらの追加ステップの各々は、開示される方法のいずれの特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせとともに行われてもよく、各々のそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットは、具体的に企図され、開示されると見なされるべきであることを理解されたい。
【００９８】
本明細書に引用される出版物およびそれらが引用される材料は、参照により、それらの全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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