(57)【要約】  本発明は、α−ケトピメリン酸を調製するための方法であって、２−ヒドロキシヘプタン二酸をα−ケトピメリン酸に変換することを含み、この変換が、生体触媒を用いて触媒される、方法に関する。さらに、本発明は、２−ヒドロキシヘプタン二酸からα−ケトピメリン酸への変換において触媒活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む異種細胞に関する。さらに、本発明は、カプロラクタム、ジアミノヘキサンまたはアジピン酸の調製における本発明による異種細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ケトピメリン酸を調製するための方法であって、２−ヒドロキシヘプタン二酸をα−ケトピメリン酸に変換する工程を含み、この変換が生体触媒を用いて触媒される、方法。
【請求項２】
前記生体触媒が、「供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１）」、「供与体のアルデヒドまたはオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２）」、２−ヒドロキシピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、２−ヒドロキシピメリン酸オキシダーゼ活性を有する酵素、ＥＣ  １．９７に分類されるオキシドレダクターゼ、およびＥＣ  １．９８に分類されるオキシドレダクターゼの群から選択される酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、
−  酸素を受容体とするオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１．３）、例えば、乳酸オキシダーゼまたは別のヒドロキシ酸オキシダーゼ；
−  Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２７）；
−  ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、β−ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ；ＮＡＤＨ：ヒドロキシピルビン酸レダクターゼおよびＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．８１）；
−  リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ＋］、ＮＡＤＰ＋−リンゴ酸酵素、ＮＡＤＰ＋−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）；リンゴ酸ＮＡＤＰデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰ＋リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰ＋−関連リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ  １．１．１．８２）；
−  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、β−イソプロピルリンゴ酸酵素；β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；トレオ−Ｄｓ−３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−  ４−メチルペンタン酸：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．８５）；
−  酒石酸デヒドロゲナーゼ、メソ酒石酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．９３）；
−  （Ｒ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．９８）；
−  （Ｓ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．９９）；
−  ２−オキソアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１７２）、２−ケトアジピン酸レダクターゼ、α−ケトアジピン酸レダクターゼ、２−ケトアジピン酸レダクターゼ
−  ２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．２）；ならびに
−  Ｄ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．６）
の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、ヒト科（Ｈｏｍｉｎｉｄａｅ）およびアエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の群から；特に、ヒト亜科（Ｈｏｍｉｎｉｎａｅ）の群から、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）から、およびアエロコッカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）から選択される生物に由来する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
２−ヒドロキシヘプタン二酸がヘプタン二酸から調製される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒドロキシヘプタン二酸の調製が、
（Ｏ２を酸化体として）対供与体に作用し、酸素を取り込むかまたは還元するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１４）、
ＣＨまたはＣＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１７）
ピメリン酸ヒドロラーゼ活性を有するヒドロラーゼ（ＥＣ  ３）ならびに
ピメリン酸−２−モノオキシゲナーゼ活性有するヒドロラーゼ（ＥＣ  ３）
の群から選択される酵素を含む生体触媒によって触媒される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生体触媒が、配列番号１８６、配列番号１８９による配列またはそれらのホモログを含む酵素を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘプタン二酸が、ピメレート合成経路の１つ以上の酵素を含む生体触媒を用いて調製され、前記ピメレート合成経路の１つ以上の酵素が、特に、ＢｉｏＩ、ＢｉｏＺ、ＢｉｏＨ、ＢｉｏＷ、ＢｉｏＣなどの、ピメリル−ＣｏＡの生合成に関与する酵素の群から選択され得る、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酵素系が、細菌の群から、特に、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の群から、より具体的には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）およびバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）から選択される生物に由来するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
６−アミノカプロン酸を調製するための方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法で調製されるα−ケトピメリン酸を６−アミノカプロン酸に変換することを含む、方法。
【請求項１１】
アジピン酸を調製するための方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で調製されるα−ケトピメリン酸を生体触媒的に脱カルボキシル化し、それにより、５−ホルミルペンタン酸を形成させることと、
好ましくはアルデヒド還元によって、前記５−ホルミルペンタン酸をアジピン酸に変換することと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記方法が発酵条件下で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
２−ヒドロキシヘプタン二酸からα−ケトピメリン酸への変換において触媒活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む、異種細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への変換において触媒活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載の異種細胞。
【請求項１５】
ピメレートを合成することができる生物のピメレート合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１３または１４に記載の異種細胞。
【請求項１６】
α−ケトピメリン酸からの６−アミノカプロン酸の調製における反応工程を触媒することに関する触媒活性を有する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列、またはα−ケトピメリン酸からのアジピン酸の調製における反応工程を触媒することに関する触媒活性を有する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の異種細胞。
【請求項１７】
配列番号：１８６、１８９のいずれかによって表される酵素およびそれらのホモログをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の異種細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アナベナ属の種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・ゲオテルマリス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・メタノリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）、ペシロミセス・カルネウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｎｅｕｓ）、セファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｒｕｓｅｉ）、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の群から選択される生物に由来するものである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の異種細胞。
【請求項１９】
カプロラクタム、ジアミノヘキサンまたはアジピン酸の調製における請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の異種細胞の使用。
【請求項２０】
配列番号：１８７、配列番号：１９０によって表されるような配列を含む核酸またはその非野生型機能類似体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、α−ケトピメリン酸（以下、「ＡＫＰ」とも呼ばれる；ＡＫＰは２−オキソ−ヘプタン二酸としても知られている）を調製するための方法に関する。本発明はさらに、６−アミノカプロン酸（以下、「６−ＡＣＡ」とも呼ばれる）を調製するための方法に関する。本発明はまた、アジピン酸の調製のための方法、５−ホルミルペンタン酸（以下、「５−ＦＶＡ」とも呼ばれる）を調製するための方法、αアミノ−ピメリン酸（ＡＡＰ）を調製するための方法、およびジアミノヘキサン（１，６−ヘキサンジアミンとしても知られる）の調製のための方法に関する。本発明はさらに、本発明による方法で使用し得る異種細胞に関する。本発明はさらに、ε−カプロラクタム（以下、「カプロラクタム」と呼ばれる）、アジピン酸、またはジアミノヘキサンの調製における異種細胞の使用に関する。
【０００２】
アジピン酸（ヘキサン二酸）は、とりわけ、ポリアミドの産生に用いられる。さらに、アジピン酸のエステルは、可塑剤、潤滑剤、溶媒中に、および種々のポリウレタン樹脂中に用いることができる。アジピン酸の他の用途には、食品酸味料としてのもの、接着剤、殺虫剤、なめしおよび染色での適用がある。既知の調製方法としては、シクロヘキサノールもしくはシクロヘキサノンまたはそれらの混合物（ＫＡ油）の硝酸による酸化が挙げられる。
【０００３】
ジアミノヘキサンは、とりわけ、ナイロン６，６などのポリアミドの産生に用いられる。他の用途としては、他のビルディングブロック（例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート）の出発材料としての用途およびエポキシドの架橋剤としての用途が挙げられる。既知の調製方法は、アクリロニトリルからアジポニトリルを経て進行する。
【０００４】
カプロラクタムは、ポリアミド、例えば、ナイロン−６またはナイロン−６，１２（カプロラクタムとラウロラクタムのコポリマー）の産生に使用し得るラクタムである。大量の化学物質からカプロラクタムを調製する様々な方法が当技術分野で知られており、これには、シクロヘキサノン、トルエン、フェノール、シクロヘキサノール、ベンゼンまたはシクロヘキサンからのカプロラクタムの調製が含まれる。これらの中間体化合物は、通常、鉱油から得られる。
【０００５】
より持続可能な技術を用いて材料を調製する意欲の高まりを考慮すれば、カプロラクタム、アジピン酸またはジアミノヘキサンを、生物学的に再生可能な供給源から入手することができる中間体化合物からまたは少なくとも生化学的な方法を用いてカプロラクタムに変換される中間体化合物から調製する方法を提供することが望ましいであろう。さらに、石油化学源由来の大量の化学物質を利用する従来の化学的プロセスよりもエネルギーのかからない方法を提供することが望ましいであろう。
【０００６】
例えば、米国特許第Ａ６，１９４，５７２号明細書に記載されているように、６−ＡＣＡからカプロラクタムを調製することが知られている。国際公開第２００５／０６８６４３号パンフレットに開示されているように、６−ＡＣＡは、α，β−エン酸レダクターゼ活性を有する酵素の存在下で６−アミノヘキス−２−エン酸（６−ＡＨＥＡ）を変換することによって生化学的に調製し得る。６−ＡＨＥＡは、例えば、生化学的にまたは純粋な化学合成によってリジンから調製し得る。６−ＡＨＥＡの還元を介する６−ＡＣＡの調製は、国際公開第２００５／０６８６４３号パンフレットに開示されている方法によって実現可能であるものの、本発明者らは、還元反応条件下では、６−ＡＨＥＡが自然にかつ実質的に不可逆的に環化して、望ましくない副産物、特に、β−ホモプロリンを形成する場合があることを見出した。この環化は、６−ＡＣＡの産生の障害となる場合があり、かつ産生量のかなりの損失をもたらすこともある。
【０００７】
本発明者らは、ＡＫＰから６−ＡＣＡを調製することが可能であることに気づいた。ＡＫＰは、例えば、Ｈ．Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９５９，９２，２４９２−２４９９によって記載されているような方法に基づいて、化学的に調製することができる。ＡＫＰは、ナトリウムエトキシドを塩基として用いてシクロペンタノンをシュウ酸ジエチルでアルキル化し、得られた産物を強酸（２Ｍ  ＨＣｌ）中で還流させ、産物を、例えば、トルエンからの結晶化によって回収することによって調製することができる。しかしながら、上で示したように、より持続可能な技術を用いて材料を調製する意欲が高まっている。このため、本発明者らは、生物学的に再生可能な供給源から入手することができる中間体化合物からＡＫＰを調製する方法を提供することが望ましいことに気づいた。
【０００８】
特に、６−ＡＣＡ、アジピン酸、ジアミノヘキサンまたは別の化合物の調製のために使用し得るＡＫＰを調製するための新規の方法を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
さらに、ＡＫＰを調製するための方法における１つ以上の反応工程を触媒するのに好適な新規の生体触媒を提供することが目的である。
【００１０】
本発明によって解決され得る１つ以上のさらなる目的は、以下の説明から理解されるであろう。
【００１１】
本発明者らは、特定の生体触媒を用いてＡＫＰを調製することが可能であることに気づいた。
【００１２】
したがって、本発明は、α−ケトピメリン酸（ＡＫＰ）を調製するための方法であって、２−ヒドロキシヘプタン二酸をα−ケトピメリン酸（ＡＫＰ）に変換することを含み、この変換が、生体触媒、特に、異種生体触媒を用いて触媒される、方法に関する。
【００１３】
本発明の方法で調製されるＡＫＰはさらに、別の化合物の調製で用いることができるか、またはそれ自体として、例えば、生化学研究用の化学物質として、もしくは例えば、液体クロマトグラフィーもしくはキャピラリー電気泳動などの分取または分析的分離技術で使用されるｐＨ緩衝化合物として用いることができる。特に、必要に応じて、ＡＫＰは、５−ＦＶＡ、ＡＡＰ（２−アミノヘプタン二酸、α−アミノピメリン酸としても知られている）、６−ＡＣＡ、またはアジピン酸の調製のために用いることができる。ＦＶＡ、ＡＡＰまたは６−ＡＣＡの生体触媒的調製のための好適な生体触媒は、例えば、国際公開第２００９／１１３８５５号パンフレットに見られる。
【００１４】
したがって、本発明はさらに、５−ＦＶＡを調製するための方法であって、本発明による方法で調製されるＡＫＰを生体触媒的に脱カルボキシル化し、それによって、５−ＦＶＡを形成させることを含む、方法に関する。
【００１５】
５−ＦＶＡは、例えば、６−ＡＣＡ、カプロラクタム、ジアミノヘキサンまたはアジピン酸を調製するための好適な中間体化合物である。
【００１６】
ＡＫＰは、例えば、ＡＡＰの調製における中間体として用いることができる。
【００１７】
したがって、本発明はさらに、ＡＡＰを調製するための方法であって、本発明による方法で調製されるＡＫＰを生体触媒的に転移させ、それによって、ＡＡＰを形成させることを含む、方法に関する。
【００１８】
ＡＡＰは、例えば、６−ＡＣＡ、ジ−アミノヘキサンまたはカプロラクタムを調製するための好適な中間体化合物である。
【００１９】
６−ＡＣＡは、例えば、カプロラクタムまたはジアミノヘキサンに変換することができる。
【００２０】
本発明はさらに、２−ヒドロキシヘプタン二酸からα−ケトピメリン酸への変換において触媒活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む異種細胞に関する。この核酸配列およびコードされた酵素は、通常、細胞にとって異種のものである。
【００２１】
本発明による細胞は、特に、ＡＫＰ、５−ＦＶＡ、６−ＡＣＡ、ＡＡＰ、アジピン酸、ジアミノヘキサンおよびカプロラクタムの群から選択される少なくとも１つの化合物を調製するための方法における生体触媒として用いることができる。
【００２２】
本発明によれば、６−ＡＣＡおよび場合によりカプロラクタムを形成したときに収率の損失をもたらす、中間生成物の望ましくない環化に関して、全く問題は見られない。
【００２３】
本発明の方法は、国際公開第２００５／６８６４３号パンフレットに記載の方法と同程度のまたはそれよりもさらに良好な収率を可能にすることが予想される。本発明の方法は、生きた生物を、特に、その生物の増殖および維持を考慮に入れた方法で利用する場合に、特に有利であり得ることが予想される。
【００２４】
本発明の実施形態では、本発明の方法における６−ＡＣＡの生産性（形成されるｇ／ｌ．ｈ）が改善され得ることがさらに予想される。
【００２５】
本明細書で使用する場合の「または」という用語は、別途規定がない限り、「および／または」と定義される。
【００２６】
本明細書で使用する場合の「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語は、別途規定がない限り、「少なくとも１つの」と定義される。
【００２７】
単数形の名詞（例えば、化合物、添加物など）に言及する場合、複数形を含むことが意図される。したがって、特定の部分、例えば、「化合物」に言及する場合、これは、別途規定がない限り、その部分の「少なくとも１つ」、例えば、「少なくとも１つの化合物」を意味する。
【００２８】
本明細書でカルボン酸またはカルボキシレート、例えば、６−ＡＣＡ、別のアミノ酸、５−ＦＶＡ、アジピン酸／アジペート、コハク酸／スクシネート、酢酸／アセテートに言及する場合、これらの用語は、別途規定がない限り、プロトン化されたカルボン酸（遊離酸）、対応するカルボキシレート（その共役塩基）およびそれらの塩を含むことが意図される。本明細書でアミノ酸、例えば、６−ＡＣＡに言及する場合、この用語は、（アミノ基がプロトン化されたものであり、カルボキシレート基が脱プロトン化形態である）両性イオン形態のアミノ酸、アミノ基がプロトン化され、カルボン酸基が中性形態であるアミノ酸、およびアミノ基が中性形態であり、カルボキシレート基が脱プロトン化形態であるアミノ酸、ならびにそれらの塩を含むことが意図される。
【００２９】
そのいくつかの異性体が存在する化合物（例えば、シス異性体およびトランス異性体、ＲエナンチオマーおよびＳエナンチオマー）に言及する場合、化合物は、原則として、本発明の特定の方法で使用し得るその化合物の全てのエナンチオマー、ジアステレオマーおよびシス／トランス異性体を含む。
【００３０】
酵素が括弧内の酵素クラス（ＥＣ）に関して言及されている場合、その酵素クラスは、その酵素が、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によって提供されている酵素命名法を基にして分類されているかまたは分類され得るクラスである。この命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／で見ることができる。特定のクラスに（まだ）分類されていないが、そのようなものに分類され得る他の好適な酵素を含むことが意図される。
【００３１】
受託番号を参照して本明細書でタンパク質または遺伝子に言及する場合、この番号は、特に、別途規定しない限り、２００９年９月１１日にＵｎｉｐｒｏｔで見られるような配列を有するタンパク質または遺伝子を指すために用いられる。
【００３２】
「ホモログ」という用語は、本明細書では特に、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して用いられる。
【００３３】
さらに、ホモログは一般に、通常３０％を上回る顕著な配列類似性、特に、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列類似性を有する。
【００３４】
ホモログは、通常それぞれ、そのポリペプチドがホモログとなるポリヌクレオチドと共通の意図される機能を有し、例えば、それぞれ、同じ反応（通常、同じ基質から同じ化合物への変換）または類似反応を触媒することができる同じペプチドをコードする。「類似反応」は、通常、同じタイプの反応、例えば、脱カルボキシル化またはアミノ基転移である。したがって、大まかに言うと、相同な酵素は、ＥＣクラスの最初の３つの数字（ｘ．ｙ．ｚ）を共有するＥＣクラス、例えば、カルボキシラーゼを表すＥＣ  ４．１．１に分類することができる。通常、類似反応では、類似反応が類似する反応の基質と同じクラスの基質（例えば、アミン、カルボン酸、アミノ酸）が、類似反応が類似する反応の産物と同じクラスの産物に変換される。類似反応には、特に、同じＫＥＧＧ  ＲＤＭパターンによって規定されるのと同じ化学変換によって規定される反応が含まれ、このパターンでは、Ｒ−原子とＤ−原子によって化学変換が説明される（ＫＥＧＧ  ＲＤＭパターン：Ｏｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．，４７，１７０２−１７１２）。
【００３５】
ホモログという用語は、遺伝暗号の縮重または実験的適合のために別の核酸配列とは異なっており、かつ同じポリペプチド配列をコードしている核酸配列（ポリヌクレオチド配列）を含むことも意図される。
【００３６】
「機能的類似体」という用語は、本明細書では、前記類似体がその類似体となる所与の配列とは異なるが、同じアミノ酸配列を有するペプチド（タンパク質、酵素）をコードするかまたはそのようなペプチドのホモログをコードする核酸配列に対して用いられる。特に、好ましい機能的類似体は、機能的類似体であると言及されているヌクレオチド配列と同様の、同一のまたはそれよりも良好なレベルの目的の宿主細胞における発現を有するヌクレオチド配列である。この点において、当業者が理解するように、ペプチド（タンパク質、酵素）の発現が望ましい場合、発現レベルが良好であるほど、通常、発現レベルがより高いことが認められる。しかしながら、特定の実施形態では、発現レベルが良好であるほど、発現レベルがより低いことがあるが、それは、前記宿主細胞における代謝経路との関連で、より低い発現レベルが望ましいことがあるからである。機能的類似体は、天然の配列、すなわち、野生型の機能的類似体、または遺伝子改変された配列、すなわち、非野生型の機能的類似体であることができる。特定のペプチドをコードするコドン最適化された配列は、通常、所望の発現レベルを達成することを目的とした、野生型配列の非野生型の機能的類似体である。
【００３７】
配列同一性または類似性は、本明細書では、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上の核酸配列を比較することによって決定されるような、これらの配列間の関係性として定義される。通常、配列同一性または類似性は、配列の全長にわたって比較されるが、互いに整列させて配列の一部のみについて比較することもできる。当技術分野では、「同一性」または「類似性」は、場合によっては、ポリペプチド配列または核酸配列間の一致によって決定されるような、配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性または類似性を決定するための好ましい方法は、検討される配列間で最大の一致を生じさせることを目的としている。本発明との関連で、２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３−４１０、ＮＣＢＩおよび他の供給元（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）から一般に入手可能である）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを用いたポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを用いた核酸配列比較のための好ましいパラメータは、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００３８】
本明細書で使用する場合の、異種生体触媒、特に、異種細胞は、異種タンパク質または（通常、細胞のＤＮＡもしくはＲＮＡの一部としての）異種核酸を含む生体触媒である。核酸配列（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、またはタンパク質に関して使用するときの、「異種」という用語は、それが存在する生物、細胞、ゲノムもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部として天然には生じないか、またはそれが天然に見られる細胞もしくはゲノム中の１つもしくは複数の場所もしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列とは異なる細胞もしくはゲノム中の１つもしくは複数の場所もしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列に見られる核酸またはタンパク質を指す。異種生物内の異種ＤＮＡは、その異種生物のゲノムの一部であることが理解される。異種核酸またはタンパク質は、それらが導入される細胞にとって内在性のものではなく、別の細胞から得られたものまたは合成もしくは組換えによって産生されたものである。通常、そのような核酸は、そのＤＮＡが転写または発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質をコードするが、必ずしもそうとは限らない。同様に、異種ＲＮＡは、異種ＲＮＡが存在する細胞内で通常は発現されないタンパク質をコードする。異種核酸およびタンパク質は、外来核酸またはタンパク質と呼ぶこともできる。当業者が、任意の核酸またはタンパク質が発現される細胞にとって異種または外来であると認識する、当該核酸またはタンパク質は、本明細書では、異種核酸またはタンパク質という用語によって包含される。
【００３９】
特定の供給源由来の酵素または別の生体触媒部分に言及する場合、第１の生物に由来するが、実際には（遺伝子改変された）第２の生物で産生される組換え酵素または他の組換え生体触媒部分は、その第１の生物由来の酵素または他の生体触媒部分として含まれることが特に意図される。
【００４０】
本発明の方法では、生体触媒が用いられる、すなわち、本方法における少なくとも１つの反応工程は、生物学的供給源に由来する生物学的材料または部分、例えば、生物またはそれに由来する生体分子によって触媒される。生体触媒は、特に、１つ以上の酵素を含むことができる。生体触媒反応は、１つ以上の化学的変換を含むことができ、その少なくとも１つは、生体触媒的に触媒される。したがって、「生体触媒」は、ＡＫＰの調製における少なくとも１つの反応工程、ＡＫＰからの５−ＦＶＡもしくはＡＡＰの調製における少なくとも１つの反応工程、５−ＦＶＡからの６−ＡＣＡもしくはアジピン酸の調製における少なくとも１つの反応工程、ＡＡＰからの６−ＡＣＡの調製における少なくとも１つの反応工程、ジアミノヘキサンの調製における少なくとも１つの反応工程、または６−ＡＣＡからのカプロラクタムの調製における少なくとも１つの反応工程における化学反応を加速させることができる。
【００４１】
生体触媒は任意の形態で用いることができる。一実施形態では、１つ以上の酵素は、生物（例えば、生きた全細胞）の一部を形成する。酵素は、細胞内部で触媒機能を果たすことができる。細胞が存在する培地中に酵素が分泌される可能性もある。一実施形態では、天然の環境から単離された（それが産生された生物から単離された）１つ以上の酵素は、例えば、溶液、エマルジョン、分散液、フリーズドライした細胞（の懸濁液）、ライセート、または支持体表面に固相化されたものとして用いられる。由来する生物から単離された酵素の使用は、反応平衡を所望の側に移動させるように反応条件を調整する際の柔軟性の増加を考慮すると、特に有用であり得る。
【００４２】
生きた細胞は、増殖する細胞、休止もしくは休眠細胞（例えば、胞子）または静止期の細胞であることができる。透過処理された（すなわち、酵素の基質または１つもしくは複数の酵素の基質の前駆体に対して透過性になった）細胞の部分を形成する酵素を用いることも可能である。
【００４３】
（本発明の方法で用いられる）生体触媒は、原則として、任意の生物であってもよく、または任意の生物から得られるものもしくは任意の生物に由来するものであってもよい。この生物は、天然の生物または異種生物であってもよい。異種生物は、通常、本発明の方法における少なくとも１つの反応工程を触媒することができる異種酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む宿主細胞である。異種核酸配列が由来する生物は、真核生物または原核生物であってもよい。特に、前記生物は、動物（ヒトを含む）、植物、細菌、古細菌、酵母および真菌から独立して選択することができる。
【００４４】
宿主細胞は、真核生物または原核生物であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、真菌、酵母、ユーグレナ、古細菌および細菌の群から選択される。宿主細胞は、特に、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、トリコフィツム属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、フランキア属（Ｆｒａｎｋｉａ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラッディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、ミクロシスティス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびグルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）からなる属から選択することができる。
【００４５】
特に、本発明の方法で用いられる宿主株、ひいては宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アナベナ属の種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、デイノコッカス・ラディオウランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・ゲオテルマリス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・メタノリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）、ペシロミセス・カルネウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｎｅｕｓ）、セファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｒｕｃｅｉ）、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞の群から選択することができる。特に、ＡＫＰをさらなる産物、例えば、５−ＦＶＡ、ＡＡＰ、アジペート、ジアミノヘキサンまたは６−ＡＣＡに変換しようとする実施形態では、宿主細胞は、ＡＫＰを天然にそのような産物に変換することができるか、または少なくとも必要な反応の１つを触媒することができる生物であることが有利であると考えられる。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、アミノトランスフェラーゼ活性を有しており、それにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＫＰからのＡＡＰの形成（下記も参照）または５−ＦＶＡ（これは、細胞が好適なデカルボキシラーゼも含有する場合、細胞内で形成され得る、下記も参照）から６−ＡＣＡへの変換を触媒することができる。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、（ＡＫＰを５−ＦＶＡに変換するのに好適な）ＡＫＰデカルボキシラーゼ活性および／または（５−ＦＶＡからのアジペートの調製を触媒する）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する場合がある。
【００４６】
さらに、宿主細胞がピメレートを合成するための酵素系（ピメレート合成経路）またはその一部を含むことは有利であると考えられる。ピメレートは、ビオチン生合成における中間体として知られており、そのため、本発明者らは、ビオチンのデノボ合成が可能な生物は、ピメレートの合成経路も含有することが予想されると考えている。ピメレートは、脂肪酸から（その酸化を介して）産生されると記載されている。これによって炭素鎖の破壊が起こり、第２のカルボン酸機能性が生じる（Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｅｉｔ，Ｐ．Ｅｎｔｃｈｅｖａ．Ｂｉｏｔｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｔｓ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）６１：２１−３１；Ｍａｘ  Ｊ．Ｃｒｙｌｅ，Ｉlｍｅ  Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｐ４５０  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｖｅａｌ  ｈｏｗ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐ４５０  Ｂｉｏｌ  ＡＣＰ  ｃｏｍｐｌｅｘ．ＰＮＡＳ（２００８）１０５（４１）：１５６９６−１５７０１）。
【００４７】
ピメレート合成の酵素系を提供するさらなる生物は、バチルス・センス・ラト（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ）群、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）などの属から選択することができる（Ｚｅｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎｓ，２００８，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，第２版（Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，編），ｐｐ３０１−３２９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬの表１を参照されたい）。特に、バチルス・センス・ストリクト（（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ）群、特に、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・レンティモルブス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・パントテンティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）（Ｚｅｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎｓ，２００８，同書）によって代表されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から。より具体的には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８およびその株派生物から。さらに、ピメレート合成の酵素系を提供する生物は、例えば、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）といった属から選択することもできる。特に、ピメレートを合成するための酵素系を含む宿主細胞は、グラム陽性細菌の群から選択することができる（Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｅｎｔｃｈｅｖａ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）６１：２１−３１）。例えば、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）は、ピメレートを合成するための酵素系を含むと報告されている（Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ８７：６３−７０，１９９０）。さらに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、ピメレート合成経路の酵素を含む生物の一例である（例えば、欧州特許出願公開第Ａ６３５５７２号明細書を参照されたい）。
【００４８】
グラム陰性細菌もピメリン酸を提供することができる。これらの微生物は、通常、ピメロイル−ＣｏＡを調製するための酵素系も含む、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）については、Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９５７７−１９５８５（１９８８）；Ｏ’Ｒｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：８００４（１９８９）を参照されたい））。これらの細菌の野生型株が、ピメロイル−ＣｏＡを調製するその能力によってピメリン酸を産生することができない場合でも、それらは、ピメロイル−ＣｏＡの加水分解のときに、ピメレートが形成されるという点において、ピメレートの供給源を提供することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、ピメレートを合成するための酵素系を含む本発明による宿主細胞は、ピメレートの前駆体として機能することができる１つ以上の脂質を高収率で産生することができる。宿主細胞は、天然に前記脂質産生を可能とするか、またはその野生型が天然に前記脂質産生を可能とする生物から前記脂質産生に関与する１つ以上の遺伝子を組み入れることによって遺伝子改変されている。そのような生物の例としては、油性酵母、微細藻類、真菌および細菌が挙げられる。
【００５０】
好適な微細藻類は、ドナリエラ・バーダウィル（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ  ｂａｒｄａｗｉｌ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ハプト藻（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、パリエトクロリス・インシサ（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｉｎｃｉｓａ）、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）の群から選択することができる。
【００５１】
好適な細菌は、グラム陽性細菌、特に、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）のグラム陽性細菌、例えば、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア・コラリーナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ノカルジア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルジア・レストリクタ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）、ロドコッカス・エリスポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、ロドコッカス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、ロドコッカス属の種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）の株２０、トリ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ラティスボネンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｔｉｓｂｏｎｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ディエジア・マリス（Ｄｉｅｔｚｉａ  ｍａｒｉｓ）、およびスカム原因菌（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ａｍａｒａｅ）；グラム陰性細菌、例えば、アシネトバクター・カルコアセティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ルオフィイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉ）、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ）Ｈ０１−Ｎ、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）２１１、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；ならびにシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、トリコデスミウム・エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）およびイシクラゲ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｃｏｍｍｕｎｅ）の群から選択することができる。
【００５２】
好適な酵母および真菌は、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、リポミセス・スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ピキア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｉｉ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、エントモルフトラ・コロナータ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｏｒａ  ｃｏｒｏｎａｔａ）、クンニングアメラ・ジャポニカ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ピシウム・ウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、およびトラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）の群から選ぶことができる（好適な酵母および真菌については、Ｒａｔｌｅｄｇｅ  Ｃ，Ｗｙｎｎ  ＪＰ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）５１：１−５１を参照されたく、さらに、Ｑｉａｎｇ  Ｈｕ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄ，Ｅｒｉｃ  Ｊａｒｖｉｓ，Ｍａｒｉａ  Ｇｈｉｒａｒｄｉ，Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｐｏｓｅｗｉｔｚ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｅｉｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ａｌ  Ｄａｒｚｉｎｓ．Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ａｓ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００８）５４，６２１−６３９；およびＨ．Ｍ．Ａｌｖａｒｅｚ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ．Ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００２）６０：３６７−３７６も参照されたい。これらの文献は、その内容が、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
カルボン酸のエステルまたはチオエステル、例えば、ピメレートエステルまたはピメレートチオエステル、アジペートエステルまたはチオエステル、チオエステルのアセテートエステル、スクシネートエステルまたはチオエステルに言及するとき、これらの用語は、任意の活性化基、特に、任意の生物学的活性化基を含むことが意図され、それには、補酵素Ａ（ＣｏＡとも呼ばれる）、ホスホ−パンテテイン（これは、アシルまたはペプチジル担体タンパク質（それぞれ、ＡＣＰまたはＰＣＰ）に結合し得る）、Ｎ−アセチル−システアミン、メチル−チオ−グリコレート、メチル−メルカプト−プロピオネート、エチル−メルカプト−プロピオネート、メチル−メルカプト−ブチレート、メチル−メルカプト−ブチレート、メルカプトプロピオネートおよび同一または同様の機能を与える他のエステルまたはチオエステルが含まれる。生きた細胞を生体触媒として使用する場合、エステルまたはチオエステル、特に、ＣｏＡは、使用された生体触媒によって産生されるか、または反応を触媒するための好適な酵素を産生することもできる生物に由来してもよい。ＣｏＡ−リガーゼおよびＣｏＡ−トランスフェラーゼは多くの生物で同定されており、所望の活性化エステルまたはチオエステルを提供し得る。
【００５４】
一実施形態では、宿主細胞は、動物、特に、その一部、例えば、肝臓、膵臓、脳、腎臓、心臓または他の器官に由来する異種核酸配列を含む。動物は、特に、哺乳動物の群から選択してもよく、より具体的には、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）、ウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）、およびヒト科（Ｈｏｍｉｎｉｄａｅ）の群から選択してもよい。ヒト科（Ｈｏｍｉｎｉｄａｅ）に由来する配列は、特に、ヒト亜科（Ｈｏｍｉｎｉｎａｅ）の群から選択される哺乳動物、より具体的には、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）から選択してもよい。特に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に由来する配列を用いる場合、それをヒトの体から単離して用いる。
【００５５】
一実施形態では、宿主細胞は、植物に由来する異種核酸配列を含む。好適な植物としては、特に、チャセンシダ属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、特に、カボチャ属（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａ）、例えば、カボチャ（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）））、またはキュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）；アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、特に、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、例えば、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）；メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、例えば、メルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）；ヒドノカルプス属（Ｈｙｄｎｏｃａｒｐｕｓ）；およびセラトニア属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）の群から選択される植物が挙げられる。
【００５６】
一実施形態では、宿主細胞は、細菌に由来する異種核酸配列を含む。好適な細菌は、特に、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、ミクロシスティス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラッディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノボスフィンゴビウム属（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の群の中から選択することができる。
【００５７】
一実施形態では、宿主細胞は、真菌に由来する異種核酸配列を含む。好適な真菌は、特に、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、白癬菌属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の群の中から選択することができる。
【００５８】
一実施形態では、宿主細胞は、酵母に由来する異種核酸配列を含む。好適な酵母は、特に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の群の中から選択することができる。
【００５９】
天然の生体触媒部分（例えば、酵素）を発現する生体触媒（野生型）または本発明による方法で好適な活性を有する天然の生体触媒部分の突然変異体を利用することができることが当業者には明白であろう。天然の生体触媒部分の特性は、当業者に公知の生物学的技術によって、例えば、分子進化または合理的設計によって改善し得る。野生型生体触媒部分の突然変異体は、例えば、当業者に公知の突然変異誘発技術を用いて、生体触媒部分（例えば、酵素）を産生することができる生物のコードＤＮＡを改変することによって作製することができる。これらには、ランダムな突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、定向進化、および遺伝子組換えが含まれる。特に、野生型酵素と少なくともアミノ酸１つだけ異なる酵素をコードし、その結果、野生型と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／もしくは挿入を含む酵素をコードするように、または突然変異体が２つ以上の親酵素の配列を組み合わせるように、またはこのように改変されたＤＮＡの発現を好適な（宿主）細胞で行うことによって、ＤＮＡを改変し得る。後者は、例えば、国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載されているような方法に基づくコドン最適化またはコドン対最適化などの当業者に公知の方法によって達成し得る。
【００６０】
突然変異体生体触媒は、例えば、以下の側面：基質に対する選択性、活性、安定性、溶媒耐性、ｐＨプロファイル、温度プロファイル、基質プロファイル、阻害に対する感受性、補因子の利用および基質親和性のうちの１つまたは複数に関して改善された特性を有し得る。改善された特性を有する突然変異体は、例えば、当業者に公知の方法に基づく好適なハイスループットスクリーニング法または選択法を適用することによって同定することができる。
【００６１】
本発明の方法によって、ＡＫＰは２−ヒドロキシヘプタン二酸から調製される。２−ヒドロキシヘプタン二酸は、原則として、任意の方法で得てもよい。例えば、２−ヒドロキシヘプタン二酸は、２−オキソヘプタン二酸またはヘプタン二酸から調製してもよい。
【００６２】
特定の実施形態では、２−ヒドロキシヘプタン二酸は、２−ヒドロキシヘプタン二酸のジエステルの加水分解によって調製される。このエステルは、例えば、以下の反応に従って調製することができる。
【化１】
2013504320.tif 000002
【００６３】
特定の実施形態では、２−ヒドロキシヘプタン二酸は、生体触媒的に得ることができる。より具体的には、２−ヒドロキシヘプタン二酸は、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する生体触媒を用いて、ヘプタン二酸から調製することができる。前記生体触媒は、一般に、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する酵素を含む。
【００６４】
一実施形態では、この酸化を触媒する酵素は、（Ｏ２を酸化体として）対供与体に作用し、酸素を取り込むかまたは還元するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１４）である。
【００６５】
特に、そのような酵素は、ＥＣ  １．１４．１１（２−オキソグルタレートを一方の供与体とし、一方の酸素原子を他方の供与体または各々の供与体に取り込む）に分類可能な酵素、より具体的には、ＥＣ  １．１４．１１．１（γ−ブチロベタインジオキシゲナーゼ）、ＥＣ  １．１４．１２（ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを一方の供与体とし、２つの酸素原子を他方の供与体に取り込む）、ＥＣ  １．１４．１３（ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを一方の供与体とし、一方酸素原子を他方の供与体に取り込む）、ＥＣ  １．１４．１４（還元型のフラビンまたはフラボタンパク質を一方の供与体とし、１つの酸素原子を他方の供与体に取り込む）またはＥＣ  １．１４．１５（還元型の鉄−硫黄タンパク質を一方の供与体とし、１つの酸素原子を他方供与体に取り込む）に分類可能な酵素の群から選択することができる。
【００６６】
ＥＣ  １．１４．１３に分類可能な酵素を、特に、ヒドロキシフェニルアセトニトリル−２−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１４．１３．４２）の群から選択してもよい。
【００６７】
さらなる実施形態では、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する酵素は、ＣＨまたはＣＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１７）である。細胞内のまたは本発明に従って用いられるＥＣ  １．１７の酵素は、特に、ＥＣ  １．１７．１（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を受容体とする）、ＥＣ  １．１７．３（酸素を受容体とする）、ＥＣ  １．１７．４（ジスルフィドを受容体とする）、ＥＣ  １．１７．５（キノンまたは同様の化合物を受容体とする）、ＥＣ  １．１７．７（鉄−硫黄タンパク質を受容体とする）、およびＥＣ  １．１７．９９（その他の受容体）の群から選択してもよい。
【００６８】
さらなる実施形態では、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する酵素は、ピメリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するヒドロキシラーゼである。
【００６９】
さらなる実施形態では、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する酵素は、ピメリン酸−２−モノオキシゲナーゼ活性を有するヒドロキシラーゼである。
【００７０】
特定の酵素に応じて、当業者は、好適な供与体／受容体系、好適な補因子などを選択することができる。
【００７１】
ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する酵素は、原則として、そのような酵素をコードする核酸配列を有する任意の生物から選択することができる。特に、酵素は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、ＥＣ  １．１．３．３−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のリンゴ酸オキシダーゼまたは本明細書中の以下の配列表で言及される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の酵素活性）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ザイモナス属（Ｚｙｍｏｎａｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ）（例えば、ラット腎臓由来のＥＣ  １．１．１．９８：（Ｒ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼまたはＥＣ  １．１．１．９９：（Ｓ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ）、霊長類（例えば、ＥＣ  １．１．１．１７２：ヒト胎盤由来の２−オキソアジピン酸レダクターゼ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、ＥＣ  １．１．９９．６：Ｄ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼまたは本明細書中の以下の配列表で言及されるサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来の酵素活性）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、ＥＣ  １．１．３．３−単球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のリンゴ酸オキシダーゼ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、カエノラブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）（例えば、ＥＣ  １．１．９９．６：ウサギ腎臓由来のＤ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ）の群から選択される生物に由来し得る。
【００７２】
特定の実施形態では、ヘプタン二酸から２−ヒドロキシヘプタン二酸への酸化を触媒する酵素は、配列番号：１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０に示されるようなアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれかのホモログを含む酵素の群から選択される。
【００７３】
ヘプタン二酸は、任意の方法で得ることができ、例えば、ヘプタン二酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができるか、シクロヘキサノンから化学的に調製することができるか（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｃｏｌｌ．第２巻，ｐ．５３１；第１１巻，ｐ４２（１９３１）、またはピメレートを合成することができる生物から得ることができる。そのような生物は、例えば、ビオチンへのピメロイル−ＣｏＡ経路を介してビオチンを産生することができる生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＢ．スファエリクス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）またはピメレートを合成することができる本明細書に言及した他の生物から得ることができる。未修飾タンパク質または遺伝子産物は、バチルス・センス・ラト（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ）群、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）などの属から（Ｚｅｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎｓ，２００８，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇｒｅｅｎ編），ｐｐ  ３０１−３２９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬの表１を参照されたい）、さらにはコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（ストレプトミセス・リディクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｙｄｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの属から得ることができる。より好ましくは、未修飾タンパク質は、バチルス・センス・ストリクト（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ）群、特に、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・レンティモルブス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・パントテンティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）（Ｚｅｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎｓ，２００８，同書）によって代表されるバチルス属（Ｂａｃ���ｌｌｕｓ）種から選択され得る。最も好ましくは、未修飾タンパク質は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８およびその株派生物から選択される。
【００７４】
有利な実施形態では、本発明による（使用されている）生体触媒は、例えば、炭素源の発酵によって、ピメレートに変換することができる好適な炭素源からピメレートを調製するための酵素系を含む。有利な方法では、ピメレートは、炭素源の全細胞生体内変換を利用してピメレートを形成させて調製される。ピメレートは、酸化的切断を介して長鎖脂肪酸から形成されることが知られている。したがって、そのような脂肪酸は、例えば、本発明の方法で、植物油、脂肪酸エステル（バイオディーゼル）などを生体触媒（特に、宿主細胞の場合）に供給することによって、炭素源として提供し得る。例えば、そのような系を天然に含む宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはバチルス・スファエリクス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、を選択してもよく、または宿主細胞を遺伝子改変によって得てもよい。例えば、宿主細胞に（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の）ｂｉｏＣおよびｂｉｏＨから選択される少なくとも１つの遺伝子またはｂｉｏＩ、ｂｉｏＷ、ｂｉｏＸおよびｂｉｏＨから選択される少なくとも１つの遺伝子を提供し得る（Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｅｉｔ，Ｐ．Ｅｎｔｃｈｅｖａ．Ｂｉｏｔｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｔｓ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）６１：２１−３１も参照されたい）。
【００７５】
炭素源は、特に、一価アルコール、多価アルコール、カルボン酸、二酸化炭素、脂肪酸、グリセリド、トリアシルグリセリドおよびジアシルグリセリドの群から選択される少なくとも１つの化合物を、前記化合物のいずれかを含む混合物を含めて、含有し得る。好適な一価アルコールとしては、メタノールおよびエタノールが挙げられる、好適なポリオールとしては、グリセロールおよび炭水化物が挙げられる。好適な脂肪酸またはグリセリドは特に、好ましくは植物起源の食用油の形態で提供することができる。
【００７６】
特に、炭水化物を用いることができるが、それは一般に、炭水化物を生物学的に再生可能な供給源、例えば、農産物、好ましくは農業廃棄物から大量に得ることができるからである。グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、サッカロース、デンプン、セルロースおよびヘミセルロースの群から選択される炭水化物を用いることが好ましい。グルコース、グルコースを含むオリゴ糖およびグルコースを含む多糖ならびに前記オリゴ糖または前記多糖の加水分解物が特に好ましい。
【００７７】
本発明の方法に従って、２−ヒドロキシヘプタン二酸は、生体触媒的にＡＫＰに変換される。生体触媒は、特に、
−  供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１）、特に、例えば、ＥＣ  １．１．１（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を受容体とする）、ＥＣ  １．１．２（チトクロムを受容体とする）、ＥＣ  １．１．３（酸素を受容体とする）、ＥＣ  １．１．４（ジスルフィドを受容体とする）、ＥＣ  １．１．５（キノンまたは同様の化合物を受容体とする）、ＥＣ  １．１．７（鉄硫黄タンパク質を受容体とする）、およびＥＣ  １．１．９９（その他の受容体）の群から選択されるオキシドレダクターゼ；
−  供与体のアルデヒドまたはオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２）；
−  ２−ヒドロキシピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、２−ヒドロキシピメリン酸オキシダーゼ活性を有する酵素；
−  ＥＣ  １．９７に分類されるオキシドレダクターゼ；ならびに
−  ＥＣ  １．９８に分類されるオキシドレダクターゼの群から選択される、ヒドロキシヘプタン二酸からＡＫＰへの変換を触媒するための酵素を含み得る。
【００７８】
ヒドロキシヘプタン二酸からＡＫＰへの変換を触媒するＥＣ  １．１．１に分類可能なオキシドレダクターゼは、特に、ＮＡＤ＋を受容体とするＥＣ  １．１．１．１のアルコールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰ＋を受容体とするＥＣ  １．１．１．２のアルコールデヒドロゲナーゼ；ＥＣ  １．１．１．２６のグリオキシル酸レダクターゼ、ＥＣ  １．１．１．２７のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．２８のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．２９のグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．３０の３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．３１の３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．３７のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．５９の３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．６０の２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、ＥＣ  １．１．１．７１のアルコールデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］、ＥＣ  １．１．１．７９のグリオキシル酸レダクターゼ［ＮＡＤＰ＋］、ＥＣ  １．１．１．８１のヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、ＥＣ  １．１．１．８２のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ＋］、ＥＣ  １．１．１．８５の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．９３の酒石酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．９８の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．９９の（Ｓ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．１６７のヒドロキシマロン酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ  １．１．１．１７２の２−オキソアジピン酸レダクターゼ、ＥＣ  １．１．１．２３７のヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ、およびＥＣ  １．１．１．２５９の３−ヒドロキシピメロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼから選択することができる。
【００７９】
ヒドロキシヘプタン二酸からＡＫＰへの変換を触媒するＥＣ  １．１．２に分類可能な酵素は、特に、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．２．４およびＥＣ  １．１．２．５）から選択することができる。
【００８０】
ヒドロキシヘプタン二酸からＡＫＰへの変換を触媒するＥＣ  １．１．３に分類可能な酵素は、特に、乳酸オキシダーゼおよび他のヒドロキシ酸オキシダーゼ；リンゴ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．３）、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１５）；二級アルコールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１８）；ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２７）の群から選択することができる。
【００８１】
ヒドロキシヘプタン二酸からＡＫＰへの変換を触媒するＥＣ  １．１．９９に分類可能な酵素は、特に、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．２）；Ｄ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．６）；グリコール酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．１４）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．１６）、および２−オキソ−酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．９９．３０）から選択することができる。
【００８２】
特に好ましい方法では、ＡＫＰの調製を触媒する酵素は、
−酸素を受容体とするオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１．３）、例えば、乳酸オキシダーゼまたは別のヒドロキシ酸オキシダーゼ；例えば、ヒト科（Ｈｏｍｉｎｉｄａｅ）由来、特に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のヒドロキシ酸オキシダーゼＨＡＯ１（ＥＣ  １．１．３．１５）またはアエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｉ）由来、特に、アエロコッカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）由来の乳酸オキシダーゼ；
−  Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２７）；
−  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２８）；
−  リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ＋］（ＥＣ  １．１．１．３７）；
−  ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．８１）；
−  リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ＋］（ＥＣ  １．１．１．８２）；
−  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．８５）；
−  酒石酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．９３）；
−  （Ｒ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．９８）；
−  （Ｓ）−２−ヒドロキシ−脂肪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．９９）；
−  ２−オキソアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１７２）；
−  ２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．２）；ならびに
−  Ｄ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．６）
の群から選択される。
【００８３】
ＡＫＰの調製を触媒する酵素は、２−オキソアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１７２）の群から選択されることが最も好ましい。
【００８４】
特に好ましい方法では、酵素は、配列番号：１８６、配列番号：１８９によるアミノ酸配列、またはこれらの配列のいずれかのホモログを含む。ＡＫＰの調製を触媒する酵素をコードする好適な核酸は、特に、配列番号：１８５、配列番号：１８７、配列番号：１８８、配列番号：１９０およびそれらの機能的類似体によって表される核酸配列を含み得る。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明によって調製されるＡＫＰは、６−ＡＣＡの調製に用いられる。本発明者らは、第１のＡＫＰを脱カルボキシル化して、５−ＦＶＡを形成させ、その後、アミノ基転移反応を用いて５−ＦＶＡから６−ＡＣＡを調製することができる方法または第１のＡＫＰをアミノ基転移反応にかけて、ＡＡＰを形成させ、その後、脱カルボキシル化反応によってＡＡＰから６−ＡＣＡを調製することができる方法によって、ＡＫＰを６−ＡＣＡに変換することができることに気づいた。
【００８６】
６−ＡＣＡを調製するための好ましい方法では、調製は、α−ケト酸またはアミノ酸（すなわち、少なくとも１つのカルボン酸基と少なくとも１つのアミノ基を含む化合物）の脱カルボキシル化を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。したがって、そのような触媒活性を有する酵素は、それぞれ、α−ケト酸デカルボキシラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼと呼ぶことができる。
【００８７】
前記酸は、二酸であることが好ましく、その場合、前記生体触媒は、ケト基またはアミノ基に隣接する酸基に対して選択的である。
【００８８】
一般に、好適なデカルボキシラーゼは、ＡＫＰから５−ＦＶＡへの変換を触媒することができるα−ケトピメリン酸デカルボキシラーゼ活性またはＡＡＰから６−ＡＣＡへの変換を触媒することができるα−アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。
【００８９】
α−ケト酸またはアミノ酸を脱カルボキシル化することができる酵素は、特に、デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．１）の群から、好ましくは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１５）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．２０）、アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１１）、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、およびピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１）の群から選択することができる。
【００９０】
１つ以上の他の好適なデカルボキシラーゼは、特に、シュウ酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．２）、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３）、アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４）、バリンデカルボキシラーゼ／ロイシンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１４）、３−ヒドロキシグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１６）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１７）、リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１８）、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１９）、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７１）、およびジアミノ酪酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．８６）の群の中から選択することができる。
【００９１】
デカルボキシラーゼは、特に、カボチャ；キュウリ；酵母；真菌、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌａｒｅｒｉ）、ハンセヌラ属の種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、クルイベロミセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、リゾープス・ジャバニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、より具体的には、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ突然変異体Ｉ４７２Ａ、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；哺乳動物（特に、哺乳動物の脳由来のもの）；ならびに細菌の群から選択される生物のデカルボキシラーゼであることができる。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼおよび分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼを用いることができるか、またはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、乳酸短杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）またはラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いることができる。グルタミン酸デカルボキシラーゼが由来し得るラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｏｕｓ）の種の例としては、特に、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）株Ｂ１１５７、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＩＦＰＬ７３０、より具体的には、ラクトコッカス・ラクチス変種マルチゲネス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｖａｒ．ｍａｌｔｉｇｅｎｅｓ）（旧名、ストレプトコッカス・ラクチス変種マルチゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｖａｒ．ｍａｌｔｉｇｅｎｅｓ）が挙げられる。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを特に用いることができる。
【００９２】
使用し得るデカルボキシラーゼおよびそのようなデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の具体例は、配列番号：１０５〜１２２に示されている。
【００９３】
本発明の好ましい方法では、６−ＡＣＡの調製は、アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１）の群から選択される、アミノ供与体の存在下でアミノ基転移反応を触媒することができる酵素の存在下での酵素反応を含む。
【００９４】
一般に、好適なアミノトランスフェラーゼは、５−ＦＶＡから６−ＡＣＡへの変換を触媒することができる６−アミノカプロン酸６−アミノトランスフェラーゼ活性またはＡＫＰからＡＡＰへの変換を触媒することができるα−アミノピメリン酸２−アミノトランスフェラーゼ活性を有する。
【００９５】
アミノトランスフェラーゼは、特に、β−アミノイソ酪酸：α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、４−アミノ−酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｌ−リジン６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３６）、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）、５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４８）、２−アミノヘキサン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．６７）およびリジン：ピルビン酸６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．７１）の群の中から選択することができる。
【００９６】
一実施形態では、アミノトランスフェラーゼは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２）、ロイシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．６）、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１２）、β−アラニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１８）、（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２２）、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．８３）の群の中から選択することができる。
【００９７】
アミノトランスフェラーゼは、特に、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、特に、ビブリオ・フルビアーリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、特に、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）；メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、特に、メルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、より具体的には、メルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）のシュート；チャセンシダ属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）、より具体的には、ホウビシダ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｅ）もしくはアスプレニウム・セプテントリオナーレ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ  ｓｅｐｔｅｎｔｒｉｏｎａｌｅ）；セラトニア属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）、より具体的には、イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）；哺乳動物；または酵母、特に、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアミノトランスフェラーゼの中から選択することができる。酵素が哺乳動物起源である場合、それは特に、哺乳動物の腎臓、哺乳動物の肝臓、哺乳動物の心臓または哺乳動物の脳由来のものであってもよい。例えば、好適な酵素は、哺乳動物の腎臓由来のβ−アミノイソ酪酸：α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、特に、イノシシの腎臓由来のβ−アミノイソ酪酸：α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ；哺乳動物の肝臓由来のβ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、特に、ウサギの肝臓由来のβ−アラニンアミノトランスフェラーゼ；哺乳動物の心臓由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；特に、ブタの心臓由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；哺乳動物の肝臓由来の４−アミノ−酪酸アミノトランスフェラーゼ、特に、ブタの肝臓由来の４−アミノ−酪酸アミノトランスフェラーゼ；哺乳動物の脳由来の４−アミノ−酪酸アミノトランスフェラーゼ、特に、ヒト、ブタ、またはラットの脳由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの群の中から選択することができる。
【００９８】
一実施形態では、アミノトランスフェラーゼは、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）由来のα−ケトアジピン酸−グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ、特に、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）由来のα−ケトアジピン酸：グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ−酪酸アミノトランスフェラーゼ、またはサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、特に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、特に、クロストリジウム・アミノワレリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）由来の５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼの群から選択することができる。好適な２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼは、例えば、ピロバクルム・イスランディクム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）により提供してもよい。
【００９９】
特定の実施形態では、配列番号：２、８３、８６、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４によるアミノ酸配列、またはこの配列のホモログを含むアミノトランスフェラーゼを用いる。そのようなアミノトランスフェラーゼをコードする好適な核酸配列としては、配列番号：１、８２、８４、８５、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、および１０３の配列が挙げられる。さらに、配列番号：３は、配列番号：２によるアミノ酸配列のコドン最適化核酸配列を表す。
【０１００】
特に、アミノ供与体は、アンモニア、アンモニウムイオン、アミンまたはアミノ酸であることができる。好適なアミンは、一級アミンおよび二級アミンである。
【０１０１】
アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−立体配置を有してもよい。アミノ供与体の例は、アラニン、グルタメート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、２−アミノヘプタン、フェニルメタンアミン、１−フェニル−１−アミノエタン、グルタミン、チロシン、フェニルアラニン、アスパルテート、β−アミノイソブチレート、β−アラニン、４−アミノブチレート、およびα−アミノアジペートである。
【０１０２】
さらに好ましい実施形態では、６−ＡＣＡを調製するための方法は、供与体のＣＨ−ＮＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．４）の群から、特に、アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１）の群から選択される、アンモニア源の存在下で還元アミノ化反応を触媒することができる酵素の存在下での生体触媒反応を含む。一般に、好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、５−ＦＶＡから６−ＡＣＡへの変換を触媒する６−アミノカプロン酸６−デヒドロゲナーゼ活性を有するかまたはＡＫＰからＡＡＰへの変換を触媒するα−アミノピメリン酸２−デヒドロゲナーゼ活性を有する。特に、好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）、リジン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１８）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．３；ＥＣ  １．４．１．４）、およびロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．９）の群の中から選択される。
【０１０３】
一実施形態では、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを受容体として作用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．３）、ＮＡＤＰを受容体として作用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．９）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）、およびリジン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１８）に分類されるアミノ酸デヒドロゲナーゼの中から選択することができる。
【０１０４】
アミノ酸デヒドロゲナーゼは、特に、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特に、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、特に、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）；ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、特に、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＤＰ１；ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、特に、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、特に、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特に、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特に、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の群から選択される生物に由来してもよい。例えば、好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ；ブレビバクテリウム属の種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、特に、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、特に、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼ、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補因子として作用する、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．３）、特に、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＤＰ１由来のグルタミン酸デヒドロ��ナーゼ；ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．３）、特に、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰＨを補因子として作用する、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）、特に、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）、特に、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）、特に、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、特に、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼの中から選択することができる。
【０１０５】
特定の実施形態では、ＡＫＰは、デカルボキシラーゼまたは変換を触媒する他の生体触媒の存在下で、生体触媒的に５−ホルミルペンタノエート（５−ＦＶＡ）に変換される。本発明に従って用いられるデカルボキシラーゼは、特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス変種マルチゲネス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｖａｒ．ｍａｌｔｉｇｅｎｅｓ）またはラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）由来のα−ケト酸デカルボキシラーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）株Ｂ１１５７またはラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＩＦＰＬ７３０由来の分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ；出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌａｒｅｒｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ハンセヌラ属の種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、リゾープス・ジャワニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、またはクルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ；ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のα−ケトグルタレートデカルボキシラーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、乳酸短杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）またはウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼの群から選択することができる。
【０１０６】
その後、５−ＦＶＡは６−ＡＣＡに変換し得る。これは、化学的に行なうことができる：６−ＡＣＡは、欧州特許出願公開第Ａ−６２８５３５号明細書または独国特許第４３２２０６５号明細書において、９−アミノノナン酸（９−アミノペラルゴン酸）および１２−アミノドデカン酸（１２−アミノラウリン酸）について記載されているように、水素化触媒、例えば、ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３支持体表面のＮｉの上でアンモニアを用いる５−ＦＶＡの還元アミノ化によって高収率で調製することができる。
【０１０７】
あるいは、６−ＡＣＡは、５−ＦＶＡとヒドロキシルアミンの反応によって調製される６−オキシモカプロン酸のＰｔＯ２上での水素化によって得ることができる（例えば、同族の１２−アミノドデカン酸の合成に関する、Ｆ．Ｏ．Ａｙｏｒｉｎｄｅ，Ｅ．Ｙ．Ｎａｎａ，Ｐ．Ｄ．Ｎｉｃｅｌｙ，Ａ．Ｓ．Ｗｏｏｄｓ，Ｅ．Ｏ．Ｐｒｉｃｅ，ＣＰ．Ｎｗａｏｎｉｃｈａ  Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，７４，５３１−５３８を参照されたい）。
【０１０８】
一実施形態では、５−ＦＶＡから６−ＡＣＡへの変換は、（ｉ）アミノ供与体および（ｉｉ）アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはそのような変換を触媒することができる別の生体触媒の存在下で生体触媒的に行なってもよい。特に、そのような実施形態では、アミノトランスフェラーゼは、ビブリオ・フルビアーリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）またはバチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ；イノシシの腎臓由来のβ−アミノイソ酪酸：αλπηα−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ；ウサギの肝臓由来のβ−アラニンアミノトランスフェラーゼ；メルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）のシュート由来のアミノトランスフェラーゼ；ブタの肝臓由来またはヒト、ラット、もしくはブタの脳由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ；ウサギの肝臓由来のβ−アラニンアミノトランスフェラーゼ；およびＬ−リジン：α−ケトグルタレート−ε−アミノトランスフェラーゼの群から選択することができる。アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いる場合、そのようなアミノ酸デヒドロゲナーゼは、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼの群から選択することができる。別の好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属の種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、もしくはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの群から；ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを補因子として作用する、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＤＰ１もしくは青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．３）の群から；ＮＡＤＰＨを補因子として作用する、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）の群から；出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）の群から；またはセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼの群から選択することができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、ＡＫＰは化学的に５−ＦＶＡに変換される。２−ケトカルボン酸から対応するアルデヒドへの効率的な化学的脱カルボキシル化は、例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８２，２３（４），４５９−４６２に記載されているような方法に基づく、共沸による水除去およびＣＯ２の同時消失下での、二級アミン、例えば、モルホリンを用いた中間体エナミン形成によって行なうことができる。中間体の末端エナミドは、次に、対応するアルデヒドに加水分解される。５−ＦＶＡは、その後、アミノトランスフェラーゼの存在下でのアミノ基転移によるか、またはアミノ酸デヒドロゲナーゼもしくはそのような変換を触媒することができる別の生体触媒による酵素的還元アミノ化によって、生体触媒的に６−ＡＣＡに変換することができる。そのようなアミノトランスフェラーゼまたはアミノ酸デヒドロゲナーゼは、特に、５−ＦＶＡから６−ＡＣＡへの変換を説明するときに上で述べた生体触媒から選択することができる。
【０１１０】
あるいは、５−ＦＶＡから６−ＡＣＡへの変換は、例えば、上で述べたような化学的方法によって行なうことができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＡＫＰは、（ｉ）アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、またはそのような変換を触媒することができる別の生体触媒および（ｉｉ）アミノ供与体の存在下で生体触媒的にＡＡＰに変換される。ＡＫＰからＡＡＰへの変換のために本発明に従って用いられるアミノトランスフェラーゼは、特に、ブタの心臓由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）または酵母由来のα−ケトアジピン酸：グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ；メルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）のシュート由来のアミノトランスフェラーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ；サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ；アスプレニウム・セプテントリオナール（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ  ｓｅｐｔｅｎｔｒｉｏｎａｌｅ）またはホウビシダ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ）由来のアミノトランスフェラーゼ；およびイナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）由来のアミノトランスフェラーゼの群から選択することができる。
【０１１２】
好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、特に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補因子として作用する、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＤＰ１または青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．３）；ＮＡＤＰＨを補因子として作用する、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．４）；バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属の種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、またはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの群の中から選択することができる。別の好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）もしくはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼの群から；またはセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼの群から選択することができる。
【０１１３】
その後、ＡＡＰは、脱カルボキシル化によって化学的に６−ＡＣＡに変換し得る。これは、ケトンまたはアルデヒド触媒の存在下、高沸騰溶媒中で加熱することによって行うことができる。例えば、アミノ酸は、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９８６，８９３−８９６の中で、Ｍ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．Ｅｄａ，Ｙ．Ｏｓａｎａｉ，Ｔ．Ｉｗａｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ａｏｋｉによって記載されているように、１〜２ｖ／ｖ％のシクロヘキセノンを含む１５０〜１６０℃のシクロヘキサノールにて高収率で脱カルボキシル化される。同様の方法は、Ｄａｉｓｏ著、Ｅｕｒ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．１５８６５５３，２００５に、およびＳ．Ｄ．Ｂｒａｎｄｔ，Ｄ．Ｍａｎｓｅｌｌ，Ｓ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｉ．Ａ．Ｆｌｅｅｔ，Ｊ．Ｆ．Ａｌｄｅｒ著、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２００６，４１，８７２−８８２に記載されている。
【０１１４】
あるいは、ＡＡＰから６−ＡＣＡへの脱カルボキシル化は、デカルボキシラーゼまたはそのような脱カルボキシル化を触媒することができる他の生体触媒の存在下で生体触媒的に行なってもよい。デカルボキシラーゼは、α−アミノ酸の脱カルボキシル化を触媒することができるデカルボキシラーゼの中から選択することができる。特に、デカルボキシラーゼは、カボチャ（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）、キュウリ、酵母、またはウシの脳由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ；およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．２０）の群から選択することができる。ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは、例えば、ジアミノピメレートからリジンを合成することができる生物由来のものであってもよい。そのような生物は、特に、細菌、古細菌および植物の中に見出すことができる。特に、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは、グラム陰性細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものであってもよい。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＡＫＰは化学的にＡＡＰに変換される。ＡＡＰは、同様の化合物について記載されているような触媒的ロイカート・ヴァラッハ反応（Ｌｅｕｃｋａｒｔ−Ｗａｌｌａｃｈ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、２−オキソピメリン酸から調製することができる。この反応は、メタノール中のギ酸アンモニウムと均質触媒としての［ＲｈＣｐ＊Ｃｌ２］２とを用いて行なわれる（Ｍ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｄ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，８６８５−８６８７）。あるいは、ロイカート・ヴァラッハ反応を、Ｓ．Ｏｇｏ，Ｋ．Ｕｅｈａｒａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｆｕｋｕｚｕｍｉ  ｉｎ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，３０２０−３０２１によって記載されているように［ＩｒＩＩＩＣｐ＊（ｂｐｙ）Ｈ２Ｏ］ＳＯ４を触媒として用いて、ギ酸アンモニウム水溶液を用いて行なうことができる。（キラル）ベンジルアミンを用いる反応およびその後のＰｄ／ＣまたはＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ上での中間体イミンの水素化によって、αλπηα−ケト酸から（エナンチオマーが濃縮された）アミノ酸への転換も可能である。例えば、Ｒ．Ｇ．Ｈｉｓｋｅｙ，Ｒ．Ｃ．Ｎｏｒｔｈｒｏｐ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６１，８３，４７９８を参照されたい。
【０１１６】
その後、ＡＡＰは、デカルボキシラーゼまたはそのような脱カルボキシル化を行なうことができる別の生体触媒の存在下で生体触媒的に６−ＡＣＡに変換することができる。そのようなデカルボキシラーゼは、特に、ＡＡＰから６−ＡＣＡへの変換のための生体触媒を説明するときに上で言及した生体触媒の中から選択してもよい。 
【０１１７】
あるいは、ＡＡＰから６−ＡＣＡへの変換は、例えば、上で述べたような化学的な方法によって行なってもよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、ＡＫＰは、デカルボキシラーゼまたは変換を触媒することができる他の生体触媒の存在下で生体触媒的に５−ＦＶＡに変換され、５−ＦＶＡは、その後、アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、またはそのような変換を触媒することができる他の生体触媒の存在下で６−ＡＣＡに変換される。これらの反応に好適なデカルボキシラーゼは、特に、ＡＫＰから５−ＦＶＡへの生体触媒変換を説明するときに上で述べたデカルボキシラーゼの群から選択することができる。５−ＦＶＡの変換のための好適なアミノトランスフェラーゼまたはアミノ酸デヒドロゲナーゼは、特に、５−ＦＶＡから６−ＡＣＡへの生体触媒変換を説明するときに上で述べたものから選択してもよい。
【０１１９】
特定の実施形態では、ＡＫＰは、アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、またはそのような変換を触媒することができる他の生体触媒の存在下で生体触媒的にＡＡＰに変換され、ＡＡＰは、その後、デカルボキシラーゼの存在下で６−ＡＣＡに変換される。これらの反応に好適な酵素は、特に、アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ならびにそれぞれ、ＡＫＰからＡＡＰへの生体触媒変換およびＡＡＰから６−ＡＣＡへの生体触媒変換を説明するときに上で記載したデカルボキシラーゼの群から選択することができる。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、本発明による方法で作製されるＡＫＰから調製される５−ＦＶＡは、アルデヒド基の酸化によってアジピン酸に変換される。これは、化学的に（例えば、選択的な化学的酸化によって）または生体触媒的に達成され得る。本発明の好ましい方法では、調製は、アルデヒド基の酸化を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。生体触媒は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを補因子として用いてもよい。
【０１２１】
アルデヒド基の酸化において触媒活性を有する酵素は、特に、オキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１）の群から、好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３、ＥＣ  １．２．１．４およびＥＣ  １．２．１．５）、マロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１５）、コハク酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１６およびＥＣ  １．２．１．２４）；グルタル酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２０）、アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）、アジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．６３）の群から選択してもよい。アジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ＫＥＧＧデータベース中のカプロラクタム分解経路に記載されている。
【０１２２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、原則として、任意の生物から得ることができるか、または任意の生物に由来することができる。生物は、原核生物または真核生物であってもよい。特に、生物は、細菌、古細菌、酵母、真菌、原生生物、植物および動物（ヒトを含む）から選択してもよい。
【０１２３】
一実施形態では、細菌は、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（特に、アシネトバクター・バウマニー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）およびアシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ９８７１）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）（特に、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ））、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キサントバクター属（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ニトロバクター属（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（特に、Ｂ．メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の群から選択される。
【０１２４】
一実施形態では、生物は、酵母および真菌の群から、特に、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特に、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））ならびにアオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（特に、Ｐ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））の群から選択される。
【０１２５】
一実施形態では、生物は植物、特に、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、より具体的には、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【０１２６】
特定の実施形態では、生体触媒は、配列番号７８〜８１によって表されているような（アルデヒド基の酸化において触媒活性を有する）酵素またはそのホモログを含む。
【０１２７】
本発明の別の実施形態では、本発明による方法で作製されるＡＫＰから調製される６−ＡＣＡは、ジアミノヘキサンに変換される。これは、酸基を還元してアルデヒド基を形成させ、このようにして形成されたアルデヒド基のアミノ基を転移させ、それによりアミノ基を生じさせて、ジアミノヘキサンを生じさせることによって達成することができる。これは、化学的にまたは生体触媒的に達成することができる。本発明の好ましい方法では、調製は、酸の還元を触媒して、アルデヒド基を形成させることができる生体触媒の存在下での生体触媒反応および／またはアミノ供与体、例えば、本明細書の別の場所に記載されているようなアミノ供与体の存在下で前記アミノ基転移を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。
【０１２８】
酸基の還元を触媒して、アルデヒド基を形成させることができる生体触媒は、特に、オキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１）の群から、好ましくは、例えば、本明細書の別の場所に記載されているような生物に見られるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３、ＥＣ  １．２．１．４およびＥＣ  １．２．１．５）の群から選択される酵素を含むことができる。前記アミノ基転移を触媒することができる生体触媒は、特に、例えば、本明細書の別の場所に記載されているような生物に見られるアミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１）の群から選択される酵素を含むことができる。
【０１２９】
本発明による方法で得られる産物（例えば、ＡＫＰ、６−ＡＣＡ）は、必要に応じて、生体触媒から単離してもよい。好適な単離方法は、当技術分野でよく知られている方法論に基づくものであってもよい。
【０１３０】
本発明の方法における反応条件は、生体触媒、特に、酵素に関する既知の条件、本明細書に開示されている情報、および場合により、いくつかのルーチンの実験によって選ぶことができる。
【０１３１】
原則として、使用される反応媒体のｐＨは、生体触媒がそのｐＨ条件下で活性を有する限り、広い限度内で選ぶことができる。生体触媒および他の因子に応じて、アルカリ性条件、中性条件または酸性条件を用いることができる。本方法が、例えば、本発明の方法を触媒する酵素を発現するための微生物の使用を含む場合、ｐＨは、その微生物がその意図される１つまたは複数の機能を果たすことができるように選択される。本質的に２５℃の水溶液系の場合、ｐＨは、特に、中性ｐＨよりも４単位低いｐＨと中性ｐＨよりも２単位高いｐＨ、すなわち、ｐＨ３〜ｐＨ９の範囲内で選ぶことができる。水が唯一の溶媒または主な溶媒（全液体ベースで、＞５０重量％、特に、＞９０重量％）である場合、系は水性であると考えられ、この場合、例えば、存在し得る微生物に活性があり続けるような濃度で、微量（全液体ベースで、＜５０重量％、特に、＜１０重量％）のアルコールまたは別の溶媒が（例えば、炭素源として）溶解していてもよい。特に、酵母および／または真菌を用いる場合、酸性条件が好ましい場合があり、特に、ｐＨは、本質的に２５℃の水溶液系をベースにして、ｐＨ３〜ｐＨ８の範囲であってもよい。必要に応じて、ｐＨは、酸および／もしくは塩基を用いて調整するか、または酸と塩基の好適な組合せを用いて緩衝化してもよい。
【０１３２】
原則として、インキュベーション条件は、生体触媒が十分な活性および／または増殖を示す限り、広い限度内で選ぶことができる。これには、好気条件、微好気条件、酸素制限条件および嫌気条件が含まれる。
【０１３３】
嫌気条件は、本明細書では、酸素を全く含まないか、または生体触媒、特に、微生物によって酸素が実質的に消費されない条件であると定義され、通常、５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満の酸素消費、特に、２．５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、または１ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満の酸素消費に相当する。
【０１３４】
好気条件は、無制限な増殖に十分なレベルの酸素が培地中に溶解しており、少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈを上回る、さらにより好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈを上回る、および最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ．ｈを上回る酸素消費速度を支持することができる条件である。
【０１３５】
酸素制限条件は、酸素消費が気体から液体への酸素転移によって制限される条件であると定義される。酸素制限条件の下限は、嫌気条件の上限、すなわち、通常少なくとも１ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ、および特に、少なくとも２．５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ、または少なくとも５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈによって決定される。酸素制限条件の上限は、好気条件の下限、すなわち、１００ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、５０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、２０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、または１０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満によって決定される。
【０１３６】
条件が、好気的であるか、嫌気的であるか、または酸素制限的であるかは、その方法が実施される条件、特に、流入する気体流の量および組成、使用される機器の実際の混合／物質移動特性、使用される微生物の種類ならびに微生物密度によって決まる。
【０１３７】
本発明の好ましい方法では、少なくともＡＫＰの調製は発酵条件下で行なわれる。発酵条件という用語は、本明細書では、当技術分野で一般的であるような広い意味で用いられる。すなわち、この用語は、微生物を用いて目的の産物を調製する工業的方法を指すために用いられる。発酵条件下のそのような方法は、好気的、嫌気的または酸素制限的環境で実施することができる。この用語は、ある方法を、酵素が発現されている生物から単離された１つ以上の酵素を用いる生体触媒的方法と区別するために用いることができる。
【０１３８】
原則として、生体触媒、特に、酵素が実質的な活性を示す限り、使用される温度は重要ではない。通常、温度は、少なくとも０℃、特に、少なくとも１５℃、より具体的には、少なくとも２０℃であってもよい。望ましい最高温度は、生体触媒によって決まる。一般に、そのような最高温度は当技術分野で公知であり、例えば、市販の生体触媒の場合は製品データシートに示されており、またはそのような最高温度は、共通の一般知識および本明細書に開示されている情報に基づいてごく一般的に決定することができる。温度は通常、９０℃以下、好ましくは７０℃以下、特に５０℃以下、またはより具体的には４０℃以下である。
【０１３９】
特に、生体触媒反応を宿主生物の外で行なう場合、有機溶媒を含む反応媒体中で十分な活性を保持する酵素を用いるときには、そのような媒体を高濃度（例えば、５０％超、または９０重量％超）で用いることができる。
【０１４０】
本発明の方法における反応工程を触媒するための１つ以上の酵素を含む異種細胞は、当技術分野でそれ自体公知の分子生物学的技術を用いて構築することができる。例えば、そのような技術を用いて、前記生体触媒の１つまたは複数をコードする１つ以上の遺伝子を含むベクターを提供することができる。そのような遺伝子の１つまたは複数を含むベクターは、１つ以上の調節エレメント、例えば、生体触媒をコードする遺伝子に機能的に連結され得る１つ以上のプロモーターを含むことができる。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、「機能的に連結されている」という用語は、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメント（またはコード配列もしくは核酸配列）の連結を指す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、「機能的に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する、１つ以上の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位ならびに、限定するものではないが、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を直接的にまたは間接的に調節するように作用することが当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列を含む、任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下で活性のあるプロモーターである。所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞との関係を示すために用いる場合の「相同な」という用語は、本来は、核酸またはポリペプチド分子が、同じ種、好ましくは同じ品種または株の宿主細胞または生物によって産生されることを意味するものと理解される。
【０１４３】
本発明の方法で用いられる酵素、特に、本明細書で上に記載したようなアミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために用いることができるプロモーターは、発現されるべき酵素をコードするヌクレオチド配列にとって天然のものであってもよいし、または機能的に連結されているヌクレオチド配列（コード配列）にとって異種のものであってもよい。プロモーターは、宿主細胞にとって相同なもの、すなわち、内在性のものであることが好ましい。
【０１４４】
（目的の酵素をコードするヌクレオチド配列にとっての）異種プロモーターを用いる場合、その異種プロモーターは、コード配列にとって天然のプロモーターよりも高い定常レベルの、コード配列を含む転写産物を産生することができる（または単位時間当たりに、より多くの転写産物分子、すなわち、ｍＲＮＡ分子を産生することができる）ことが好ましい。この文脈での好適なプロモーターには、構成的と誘導性の両方の天然プロモーターならびに当業者に周知の人工改変プロモーターが含まれる。
【０１４５】
「強力な構成的プロモーター」は、ｍＲＮＡを天然の宿主細胞と比較して高い頻度でイニシエートさせるプロモーターである。グラム陽性微生物のそのような強力な構成的プロモーターの例としては、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター）、およびａｍｙＥが挙げられる。
【０１４６】
グラム陽性微生物の誘導性プロモーターの例としては、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｓｐａｃプロモーター、キシロース誘導性ＰｘｙｌＡプロモーターが挙げられる。
【０１４７】
グラム陰性微生物の構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの例としては、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ（ＰＢＡＤ）、ＳＰ６、λ−ＰＲおよびλ−ＰＬが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
（糸状）真菌細胞のプロモーターは当技術分野で公知であり、例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター、プロテアーゼプロモーター（例えば、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣ）、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、キシラナーゼプロモーター（例えば、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤ）、セルラーゼプロモーター（例えば、ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡ）、転写調節因子のプロモーター（例えば、ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｆＴなど）または任意の他のものであってもよく、特に、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）で見ることができる。
【０１４９】
本発明はまた、ＡＫＰの調製、および場合により、ＡＫＰからのさらなる化合物、例えば、５−ＦＶＡ、ＡＡＰ、６−ＡＣＡ、アジピン酸、ジアミノヘキサンまたはカプロラクタムの調製における少なくとも１つの反応工程を触媒することができる１つ以上の生体触媒を提供し得る新規の異種細胞に関する。本発明はまた、ＡＫＰの調製、および場合により、ＡＫＰからのさらなる化合物、例えば、５−ＦＶＡ、ＡＡＰ、６−ＡＣＡ、アジピン酸、ジアミノヘキサンまたはカプロラクタムの調製における少なくとも１つの反応工程を触媒することができる１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む新規のベクターに関する。１つ以上の好適な遺伝子は、特に、本明細書において上で述べた酵素をコードする遺伝子の中から選択することができる。
【０１５０】
異種細胞は、特に、生体触媒を説明するときに上で述べたような細胞であることができる。
【０１５１】
特に、本発明による異種細胞は、２−ヒドロキシヘプタン二酸からのＡＫＰの調製における反応工程を触媒することができる異種酵素をコードする（１つ以上のベクターの一部であってもよい）１つ以上の異種核酸配列を含む。
【０１５２】
さらなる実施形態では、細胞は、ヘプタン二酸からの２−ヒドロキシヘプタン二酸の調製を触媒する酵素をコードする核酸配列を含む。さらに、そのような細胞は、炭素源からのヘプタン二酸の調製を触媒するための酵素系をさらに含むことができる。
【０１５３】
さらなる実施形態では、本発明による異種細胞は、ＡＫＰからＡＡＰ、６−ＡＣＡ、５−ＦＶＡ、カプロラクタム、ジアミノヘキサン、またはアジピン酸への変換を触媒するための酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。そのような酵素をコードする核酸配列の存在は、細胞が、ＡＫＰからのさらなる産物、例えば、６−ＡＣＡ、カプロラクタム、ジアミノヘキサンまたはアジピン酸へとさらに変換され得る５−ＦＶＡまたはＡＡＰを調製するために用いられることが意図される場合に特に望ましい。
【０１５４】
異種細胞は、ＡＫＰ、５−ＦＶＡ、ＡＡＰ、６−ＡＣＡ、カプロラクタム、ジアミノヘキサン、またはアジピン酸を何らかの望ましくない副産物に分解または変換することができるいかなる酵素も含まないことが望ましい。例えば、カプロラクタムまたはアジペート分解経路の一部としての何らかのそのような活性が同定された場合は、この活性を、本明細書において上で記載したように除去するか、低下させるかまたは改変することができる。
【０１５５】
望ましくない活性をコードする遺伝子の不活化は、いくつかの方法によって達成することができる。１つの手法は、アンチセンス分子またはＲＮＡｉ分子を用いる一過性の手法（例えば、Ｋａｍａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：２３１−２３７に基づくもの）である。別の手法は、テトラサイクリンのような外部トリガーを用いてスイッチを切ることができる調節可能なプロモーター系を用いるもの（例えば、Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ，２００５，Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ．４：１３２８−１３４２に基づくもの）である。また別の手法は、化学的阻害剤またはタンパク質阻害剤または物理的阻害剤を適用すること（例えば、Ｔｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１：１５０５−１５０８に基づくもの）である。非常に好ましい方法は、望ましくない活性をコードする遺伝子全体またはその一部を除去することである。細胞に望ましくない活性を発揮させないようにそのゲノムを改変するさらに好適な方法は、トランスポゾン挿入によって遺伝子を不活化することである。そのような突然変異体を得るために、単一交差組換えまたは二重相同組換えのような最先端の方法を適用することができる。このためには、宿主細胞の染色体の所定の標的遺伝子座に組み込まれ得る組込み型クローニングベクターを構築する必要がある。本発明の好ましい実施形態では、組込み型クローニングベクターは、この所定の遺伝子座へのクローニングベクターの組込みを標的化するために、宿主細胞のゲノムの所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ断片を含む。標的化組込みを促進するために、宿主細胞の形質転換前に、クローニングベクターを線状化することが好ましい。線状化は、クローニングベクターの少なくとも１つの、しかし、好ましくは両方の末端に、標的遺伝子座に相同な配列が隣接するように行なわれることが好ましい。標的遺伝子座に隣接する相同な配列の長さは、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。最終的に実験で最も好適な長さは、生物、標的ＤＮＡの配列および長さによって決まる。
【０１５６】
好ましくは宿主細胞の細胞質コンパートメントにおけるピメレートの供給は、前駆体分子からピメレートへの変換を触媒する酵素をコードする相同遺伝子および／または異種遺伝子を過剰発現させることによって増大させ得る。
【０１５７】
別の態様では、本発明は、本発明による前記化合物を産生することができる細胞（これは、真核細胞あっても別の細胞であってもよい）におけるＡＫＰまたは６−ＡＣＡまたはそれらの中間体（例えば、ピメレートもしくはヒドロキシピメレート）の産生を増大させるためのプロセスであって、前記化合物を産生することができる真核細胞の集団に突然変異を誘発させることおよび突然変異体真核細胞の集団を増大した産生について選択することを含む、プロセスに関する。例えば、少なくとも１％のわずかな改善で、既に興味深い。突然変異誘発は、突然変異体真核細胞の集団の少なくとも１０％が、真核細胞の出発集団と比較して増大した産生を示すように行なわれることが好ましい。
【０１５８】
突然変異誘発は、当技術分野で公知の様々な方法、例えば、紫外線（ＵＶ）突然変異誘発、電離放射または突然変異原とのインキュベーションによって行なうことができる。好適な突然変異原（ｍｕｔａｇｅｎｔｉａ）は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、硫酸ジメチル（ＤＭＳ）、ニトロキノリンオキシド（ＮＱＯ）、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ナイトロジェンマスタード（ＨＮ２）、β−プロピオラクトン、亜硝酸、ニトロソイミダゾリドン（ＮＩＬ）およびトリチウム化ウリジンである。好適な突然変異誘発時間は、共通の一般知識に基づいて、例えば、突然変異原（ｍｕｔａｇｅｎｔ）および生物に応じて、決定することができる。上限は、死滅曲線によって決定することができる。曝露させすぎると、細胞が全て死滅する可能性がある。これを前提に、当業者は、好適な上限を決定することができ、それは、例えば、３時間以下、または１時間以下であることができる。突然変異誘発後、産生が増大した突然変異体真核細胞の集団を選択する。細胞の突然変異誘発および産生が増大した突然変異体真核細胞の集団の選択を１回以上繰り返す。
【０１５９】
さらに好ましい実施形態では、本発明による異種細胞は、配列番号：１８６、配列番号：１８６またはそれらのホモログによって表される酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、この核酸配列は、特に、配列番号：１８５、配列番号：１８７、配列番号：１８８、配列番号：１９０およびそれらの機能的類似体の群から選択することができる。それに加えてまたはその代わりに、好ましい異種細胞は、配列番号：１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８に示されるようなアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれかのホモログを含む酵素を含む。
【０１６０】
一実施形態では、異種細胞は、α−ケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列および／またはα−アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列（を含む組換えベクター）を含む。
【０１６１】
一実施形態では、本発明による異種細胞は、ＡＫＰデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列および／または５−ＦＶＡアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、本発明による異種細胞は、α−アミノピメリン酸２−デヒドロゲナーゼもしくはＡＫＰアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列および／またはα−アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む。
【０１６２】
一実施形態では、本発明による異種細胞は、６−アミノカプロン酸６−デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列および場合により、α−ケトピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む。
【０１６３】
一実施形態では、本発明による異種細胞は、ＡＫＰ−デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列および／またはアジピン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む。
【０１６４】
本発明はさらに、配列番号：１８７、配列番号：１９０によって表されるような配列を含む核酸またはそれらの非野生型機能類似体に関する。
【０１６５】
次に、本発明を以下の実施例によって説明する。
【０１６６】
［実施例］
［パートＡ：ＡＫＰの調製に関する実施例］
［一般的方法］
［分子および遺伝学的技術］
標準的な遺伝学および分子生物学の技術は、一般に、当技術分野で公知であり、かつ以前に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２  “  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒ  １９７２  “Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００１  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，編，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７）。
【０１６７】
［プラスミドおよび株］
ｐＭＳ４７０（Ｂａｌｚｅｒ，Ｄ．；Ｚｉｅｇｅｌｉｎ，Ｇ．；Ｐａｎｓｅｇｒａｕ，Ｗ．；Ｋｒｕｆｔ，Ｖ．；Ｌａｎｋａ，Ｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９２，２０（８），１８５１−１８５８．）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ（Ｋｏｖａｃｈ  ＭＥ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＲＷ，Ｅｌｚｅｒ  ＰＨ，Ｒｏｏｐ  ＲＭ  ２ｎｄ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＫＭ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９４  Ｍａｙ；１６（５）：８００−２．ｐＢＢＲ１ＭＣＳ：宿主範囲の広いクローニングベクター）は、以前に記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０およびＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を全てのクローニング手順に用いた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１  Ａ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ），Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）をタンパク質発現に用いた。
【０１６８】
ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５およびｐＲＳ４１６（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２（１），１９−２７（１９８９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．，Ｄａｎｔｅ，Ｍ．，ＳｈｅｒｏＪ．Ｈ．ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｙｅａｓｔ  ｈｉｇｈ−ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  １１０（１），１１９−１２２（１９９２））を出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に用いた。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−６Ｂ（ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ＭＡＴａ）、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ｕｒａ３、ＭＡＴａ）、ＣＥＮ．ＰＫ１０２−３Ａ（ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ＭＡＴａ）およびＣＥＮ．ＰＫ１１３−９Ｄ（ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ＭＡＴａ）をタンパク質発現に用いた。
【０１６９】
［培地］
２×ＴＹ培地（１６ｇ／ｌのトリプトペプトン、１０ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖に用いた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でプラスミドを維持するために、抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０〜１００μｇ／ｍｌのネオマイシン）を補充した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での遺伝子発現の誘導のために、アラビノース（ＢＬ２１−ＡＩ派生物の場合）およびＩＰＴＧ（ｐＭＳ４７０、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ派生物の場合）を０．０２％（アラビノース）および０．２ｍＭ（ＩＰＴＧ）の最終濃度で用いた。
【０１７０】
４％のガラクトースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地を出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の増殖に用いた。
【０１７１】
［プラスミドの同定］
異なる遺伝子を有するプラスミドを、当技術分野で一般に知られている遺伝学的、生化学的、および／または表現型による手段、例えば、形質転換体の抗生物質に対する耐性、形質転換体のＰＣＲ診断解析またはプラスミドＤＮＡの精製、精製プラスミドＤＮＡの制限解析またはＤＮＡ配列解析によって同定した。記載した全ての新しいコンストラクトの完全性を制限消化によって確認し、ＰＣＲ工程を含む場合は、さらにシークエンシングによって確認した。
【０１７２】
［α−ケト酸の測定のためのＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法］
表１に示すような勾配溶出によるα−ケト酸の分離のために、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＳＳ  Ｔ３カラム１．８μｍ、１００ｍｍ＊２．１ｍｍを用いた。溶離液Ａは、０．１％のギ酸を含有するＬＣ／ＭＳ等級の水からなり、溶離液Ｂは、０．１％のギ酸を含有するアセトニトリルからなる。流速は０．２５ｍｌ／分とし、カラムは４０℃の温度に温度調節された。
【０１７３】
【表１】
2013504320.tif 000003
【０１７４】
Ｗａｔｅｒｓ  ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  ＡＰＩを、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、分析しようとする化合物に応じて、ポジティブイオン化モードまたはネガティブイオン化モードのいずれかのエレクトロスプレーで用いた。イオン源温度を１３０℃に保持したのに対し、脱溶媒和温度は、流速５００Ｌ／ｈｒで、３５０℃とする。
【０１７５】
ＡＫＰについては、脱プロトン化分子を１０〜１４ｅＶでフラグメント化して、例えば、Ｈ２Ｏ、ＣＯおよびＣＯ２の損失から特定のフラグメントが得られた。
【０１７６】
濃度を決定するために、合成によって調製した化合物の標準曲線を作成して、それぞれのイオンの応答係数を算出した。これを用いて、未知サンプルの濃度を算出した。
【０１７７】
［２−ヒドロキシヘプタン二酸の合成］
本方法は、ＡＫＰから２−ヒドロキシヘプタン二酸（ＨＰＤＡ）を作製する方法を例示する（ＨＰＤＡは、実験目的で用いるために合成された）。
【０１７８】
ＡＫＰの生体触媒的産生のための基質として用いるための２−ヒドロキシヘプタン二酸は、ＡＫＰ（Ｓｙｎｃｏｍによって提供された）の水素化によって合成された。ＡＫＰ（２．２ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、これに３０ｍｇのパラジウム炭を添加し（Ｐｄ／Ｃ、５％）、３０バールの水素圧下、５０℃で４８時間、オートクレーブに入れた。反応混合物を室温に到達させておき、その後、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）上で濾過し、真空中で濃縮すると、表題化合物が油（２．２ｇ、９９％）として得られた。
【０１７９】
生成物を１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０１８０】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ４．０２−３．９８および３．９２−３．８９（ｄｄ，３Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２８および２．１８（ｔ，３Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．２８（ｍ，６Ｈ）  １３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１７４．９，１７３．６，７０．０，５１．６，３４．０，３３．６，２４．６。
【０１８１】
［実施例１：異種ヒドロキシ酸オキシダーゼを用いたｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ  Ｔｏｐ１０細胞の調製］
ＨＡＯＸ５Ｂ（配列番号：１８７）およびＬＡＯＸ８Ｃ（配列番号：１９０）をＤＮＡ合成によって得た。Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いるクローニングを容易にするために、ａｔｔＢ部位を、リボソーム結合部位および開始コドンの上流と終止コドンの下流とで全ての遺伝子に付加した。これらの遺伝子コンストラクトを、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、導入されたａｔｔＢ部位および製造元のプロトコル（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に記載されているようなエントリーベクターとしてのｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介してｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ発現ベクターにクローニングした。このようにして、それぞれ、発現ベクターｐＢＡＤ−Ｖｆｌ＿ＡＴおよびｐＢＡＤ−Ｂｗｅ＿ＡＴを得た。それぞれのｐＢＡＤ発現ベクターによる化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の形質転換によって、対応する発現株を得た。
【０１８２】
［実施例２：タンパク質発現のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖］
実施例１で調製された細胞の小規模な増殖を、０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノースを含有する９４０μｌの培地を含む９６ディープウェル中で行なった。９６ウェルスタンプ（Ｋｕｅｈｎｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて凍結ストック培養物から細胞を移すことにより、播種を行なった。プレートをオービタルシェーカー（３００ｒｐｍ、５ｃｍ振幅）上にて２５℃で４８時間インキュベートした。通常、２〜４のＯＤ６２０ｎｍに到達させた。
【０１８３】
［実施例３：細胞ライセートの調製］
溶解バッファーは以下の成分を含有していた：
【０１８４】
【表２】
2013504320.tif 000004
【０１８５】
この溶液を使用直前に新たに調製した。
【０１８６】
小規模増殖（実施例２参照）からの細胞を遠心分離で回収し、上清を捨てた。遠心分離の間に形成された細胞ペレットを−２０℃で少なくとも１６時間凍結させ、その後、氷上で融解させた。５００μｌの新たに調製された溶解バッファーを各ウェルに添加し、プレートを２〜５分間激しくボルテックス処理することによって細胞を再懸濁した。溶解を達成するために、プレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞破片を除去するために、プレートを４℃および６０００ｇで２０分間遠心分離した。上清（ＨＡＯＸ  ５ＢまたはＬＡＯＸ  ８Ｃのいずれかのヒドロキシ酸オキシダーゼを含む）を新しいプレートに移し、さらに使用するまで氷上で保持した。
【０１８７】
［実施例４：ＡＫＰの酵素的調製］
２−ヒドロキシヘプタン二酸（最終濃度５０ｍＭ、純度＞９５％、上記のように得られたもの）を、実施例３に記載されたように得られたヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＨＡＯＸ  ５ＢまたはＬＡＯＸ  ８Ｃのいずれか）と、以下のものを含有するバッファー溶液中で接触させた。
−  ４−アミノアンチピリン（１ｍＭ）
−  ３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＤＣＨＢＳ）（１０ｍＭ）
−  ５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５
−  西洋ワサビペルオキシダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）
【０１８８】
反応液を３７℃で２０時間インキュベートした。サンプルを凍結させ、解析の前に、２分間加熱して９５℃にし、タンパク質を沈殿させた。遠心分離後、上清をＵＰＬＣ−ＭＳで分析した。ＨＡＯＸ  ５Ｂを含む試験由来のサンプル中のＡＫＰ濃度は、５９ｍｇ／ｌであり、ＬＡＯＸ  ８Ｃを含む試験由来のサンプル中のＡＫＰ濃度は、５８ｍｇ／ｌであった。
【０１８９】
［実施例５：ＡＫＰからの５−ＦＶＡの酵素的調製］
５−ＦＶＡは、国際公開第２００９／１１３８５５号パンフレットの実施例に記載されているように、ＡＫＰから調製することができる。
【０１９０】
１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．５中に５０ｍＭのＡＫＰ、５ｍＭの塩化マグネシウム、１００μΜのピリドキサル５’−リン酸（ＬｙｓＡ用）または１ｍＭのチアミン二リン酸（他の全ての酵素用）を含む反応混合物を調製した。４ｍｌの反応混合物を反応容器に分注した。反応を開始させるために、超音波処理（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で得られた１ｍｌの無細胞抽出物を各々のウェルに添加した。市販のオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号０４８７８）の場合、５０Ｕを用いた。反応混合物を磁気撹拌子を用いて３７℃で４８時間インキュベートした。さらに、化学的ブランク混合物（無細胞抽出物を含まない）および生物学的ブランク（ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０）を同じ条件下でインキュベートした。反応の間の異なる時点からのサンプルをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。結果を以下の表にまとめる。
【０１９１】
【表３】
2013504320.tif 000005
【０１９２】
５−ＦＶＡがデカルボキシラーゼの存在下でＡＫＰから形成されることが示されている。
【０１９３】
［実施例６：ＡＫＰからの６−ＡＣＡの酵素的調製］
６−ＡＣＡは、国際公開第２００９／１１３８５５号パンフレットの実施例に記載されているように、ＡＫＰから調製することができる。
【０１９４】
１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．５中に５０ｍＭのＡＫＰ、５ｍＭの塩化マグネシウム、１００μΜのピリドキサル５’−リン酸（ＬｙｓＡ用）または１ｍＭのチアミン二リン酸（他の全ての試験された生体触媒用）を含む反応混合物を調製した。４ｍｌの反応混合液を反応容器に分注した。反応を開始させるために、１ｍｌの無細胞抽出物を各々のウェルに添加した。反応混合物を磁気撹拌子を用いて３７℃で４８時間インキュベートした。さらに、化学的ブランク混合物（無細胞抽出物を含まない）および生物学的ブランク（ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０）を同じ条件下でインキュベートした。反応の間の異なる時点からのサンプルをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。結果を以下の表にまとめる。
【０１９５】
【表４】
2013504320.tif 000006
【０１９６】
６−ＡＣＡがデカルボキシラーゼの存在下でＡＫＰから形成されることが示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が天然の５−ＦＶＡアミノトランスフェラーゼ活性を含有していたと考えられる。
【０１９７】
［実施例７  組換えデカルボキシラーゼおよび組換えアミノトランスフェラーゼの存在下でのＡＫＰからの６−ＡＣＡの酵素的調製］
１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．５中に５０ｍＭのＡＫＰ、５ｍＭの塩化マグネシウム、１００μΜのピリドキサル５’−リン酸、１ｍＭのチアミン二リン酸および５０ｍＭのラセミ型αメチルベンジルアミンを含む反応混合物を調製した。１．６ｍｌの反応混合物を反応容器に分注した。反応を開始させるために、０．２ｍｌのデカルボキシラーゼ含有無細胞抽出物および０．２ｍｌのアミノトランスフェラーゼ含有無細胞抽出物を各々の反応容器に添加した。反応混合物を磁気撹拌子を用いて３７℃で４８時間インキュベートした。さらに、化学的ブランク混合物（無細胞抽出物を含まない）および生物学的ブランク（ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０）を同じ条件下でインキュベートした。反応の間の異なる時点からのサンプルをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。結果を以下の表にまとめる。
【０１９８】
【表５】
2013504320.tif 000007
【０１９９】
化学的ブランクおよび生物学的ブランクでは、６−ＡＣＡは検出されなかった。
【０２００】
さらに、この結果は、組換えデカルボキシラーゼのみを有する（組換えアミノトランスフェラーゼは含まない）宿主細胞の例と比べて、６−ＡＣＡへの変換が改善されたことを示している。
【０２０１】
［実施例８  出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で共発現されたデカルボキシラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの存在下におけるＡＫＰから６−ＡＣＡへの変換の酵素的反応］
１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．５中に５０ｍＭのＡＫＰ、５ｍＭの塩化マグネシウム、１００μΜのピリドキサル５’−リン酸、１ｍＭのチアミン二リン酸および５０ｍＭのラセミ型α−メチルベンジルアミンを含む反応混合物を調製した。１．６ｍｌの反応混合物を反応容器に分注した。反応を開始させるために、デカルボキシラーゼおよびアミノトランスフェラーゼを含有する出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の０．４ｍｌの無細胞抽出物を、各々の反応容器に添加した。反応混合物を磁気撹拌子を用いて３７℃でインキュベートした。さらに、化学的ブランク混合物（無細胞抽出物を含まない）および生物学的ブランク（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を同じ条件下でインキュベートした。インキュベーションしてから１９時間後に採取したサンプルをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。結果を以下の表にまとめる。
【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
［実施例９  α−ケトピメリン酸からα−アミノピメリン酸への変換の酵素的反応］
５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０中に１０ｍＭのα−ケトピメリン酸、２０ｍＭのＬ−アラニン、および５０μΜのピリドキサル５’−リン酸を含む反応混合物を調製した。８００μｌの反応混合物をウェルプレートの各ウェルに分注した。反応を開始させるために、２００μｌの細胞ライセートを各々のウェルに添加した。反応混合物をシェーカー上にて３７℃で２４時間インキュベートした。さらに、化学的ブランク混合物（無細胞抽出物を含まない）および生物学的ブランク（ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０）を同じ条件下でインキュベートした。サンプルをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。結果を以下の表にまとめる。
【０２０４】
【表７】
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【０２０５】
ＡＫＰからのＡＡＰの形成が生体触媒的に触媒されることが示されている。
【０２０６】
［実施例１０  ＡＡＰからカプロラクタムへの化学的変換］
Ｄ，Ｌ−２−アミノピメリン酸１．５グラムのシクロヘキサノン懸濁液２１ｍｌに、シクロヘキサノン０．５ｍｌを添加した。この混合物を油浴にて還流しながら２０時間加熱した（約１６０℃）。室温に冷却した後、反応混合物をデカントで移し、透明な溶液を減圧下で蒸発させた。残りの２グラムの褐色の油を１Ｈ−ＮＭＲおよびＨＰＬＣで分析したところ、これは、０．８ｗｔ％のカプロラクタムおよび６ｗｔ％のカプロラクタム環状オリゴマーを含有していた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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