(57)【要約】  本発明は、メチオニンを生産するための微生物であって、ＰｎｔＡＢのトランスヒドロゲナーゼ活性を増強するように改変されている、前記微生物に関する。本発明の好ましい態様では、トランスヒドロゲナーゼＵｄｈＡの活性は前記微生物では減衰される。本発明は、発酵によるメチオニンの製造方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニンの生産のための微生物であって、ＰｎｔＡＢのトランスヒドロゲナーゼ活性を増強するように改変されている、微生物。
【請求項２】
ＰｎｔＡＢをコードする遺伝子が過剰発現する、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
トランスヒドロゲナーゼＵｄｈＡの活性を減衰させるように改変されている、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
ＵｄｈＡをコードする遺伝子が欠失している、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
一炭素代謝を増加させるように改変されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
下記の活性：
ａ．メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ, ＭｅｔＦの活性、
ｂ．グリシン開裂複合体, ＧｃｖＴＨＰおよびＬｐｄの活性、
ｃ．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ, ＧｌｙＡの活性、
ｄ．メチルトランスフェラーゼ, ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥの活性
の少なくとも１つが増強される、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
ＭｅｔＦの活性が、ｍｅｔＦ遺伝子の過剰発現および／またはその翻訳の最適化によって増強される、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
ｍｅｔＦ遺伝子が、Ｐｔｒｃファミリープロモーターに属する強力なプロモーターの制御下にある、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
下記の遺伝子：ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＥ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、フィードバック感受性が低減されたｍｅｔＡ対立遺伝子、フィードバック感受性が低減されたｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ対立遺伝子
の少なくとも一つの発現が増加する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記遺伝子の少なくとも一つが誘導性プロモーターの制御下にある、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現が増強される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
微生物の下記の遺伝子：
ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、ｙｎｃＡまたはｍｅｔＪ
の少なくとも一つの発現が減衰される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、腸内細菌科またはコリネバクテリウム科の中から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、エシェリキア属、クレブシェラ属またはコリネバクテリウム属から選択される、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
下記工程：
−  炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地において改変されたメチオニン生産微生物を培養する工程、および
−  メチオニンまたはその誘導体の一つを培養培地から回収する工程
を含んでなり、
該微生物が、ＰｎｔＡＢの増強されたトランスヒドロゲナーゼ活性を示すように改変されている、メチオニンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、メチオニン生産を増強するためにＮＡＤＨから生産される細胞内ＮＡＤＰＨの供給を増加させる方法に関する。有利には、ＮＡＤＰＨレベルを増加させる方法は、メチオニン生産を向上させるための一炭素代謝の増加に関連している。
【０００２】
発明の背景
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンのような含硫化合物は細胞代謝に重要であり、食物または飼料添加剤および医薬品として用いる目的で工業生産されている。特に、動物が合成することができない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たしている。タンパク質生合成におけるその役割は別として、メチオニンはメチル基転移、およびセレンおよび亜鉛のバイオアベイラビリティーに関与している。メチオニンは、アレルギーやリウマチ熱のような疾患の治療薬としても直接使用される。製造されるメチオニンのほとんどは、動物飼料に添加される。
【０００３】
ＢＳＥやトリインフルエンザの結果として動物由来タンパク質の使用が減少したため、純粋なメチオニンの需要が増加してきている。化学的には、Ｄ，Ｌ−メチオニンは一般にはアクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素から製造されている。しかしながら、このラセミ混合物は、例えばニワトリの飼料添加物におけるように純粋なＬ−メチオニンと同様には機能しない(Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633)。純粋なＬ−メチオニンは、ラセミメチオニンから、例えばＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって製造することができるが、生産コストは劇的に増加する。環境問題と結びついた純粋なＬ−メチオニンの需要増加により、微生物によるメチオニンの生産が魅力的なものとなっている。
【０００４】
コファクター対ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋は、総ての生体系にとって極めて重要である。それらは、生細胞における多くの酸化−還元反応における還元当量の供与体および/または受容体である。酸化還元コファクターＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、化学的には極めて類似しているが、別個の生化学的機能を果たし、１００を上回る酵素反応に関与している(Ouzonis, C. A., and Karp, P. Ｄ. (2000) Genome Res. 10, 568-576)。異化反応は、通常はＮＡＤ＋／ＮＡＤＨに関連しており、同化反応は、通常はＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに関連している。全体として、これらのヌクレオチドは、細胞における実質的にあらゆる酸化−還元代謝経路に直接的影響を与える。
【０００５】
多くの産業上有用な化合物は、それらの生合成、例えば、酵母中キシロースでのエタノールの生産(Verho et al., (2003) Applied and Environmental Microbiology) 69, 5892-5897)、（＋）−カテキンの高収率生産(Chemler et al., (2007) Applied and Environmental Microbiology 77, 797-807)、大腸菌(E. coli)におけるリコピン生合成(Alper, H. et al., (2005) Metab. Eng. 7, 155-164)、またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)におけるリジン生産(Kelle T et al., (2005) Ｌ−リジン生産; 「Eggeling L, Bott M (監修) 「コリネバクテリウム・グルタミクム(corynebacterium glutamicum)ハンドブック」 CRC, Boca Raton, pp467-490)についてコファクターＮＡＤＰＨを必要としている。
【０００６】
大腸菌(Escherichia coli)を用いるバイオテクノロジーによるＬ−メチオニンの生産には、ＮＡＤＰＨの十分なプールが必要である。メチオニンはアミノ酸であるアスパラギン酸から誘導されるが、その合成には２つの追加経路であるシステイン生合成およびＣＩ代謝(Ｎ−メチルテトラヒドロ葉酸)の収束が必要である。アスパラギン酸は、連続した３つの反応によってホモセリンに転換される。ホモセリンは、次いでトレオニン／イソロイシンまたはメチオニン生合成経路に入ることができる。
【０００７】
Ｌ−メチオニン１分子の生産には、８．５モルのＮＡＤＰＨが必要である。最少培地での大腸菌の成長とＬ−メチオニン生産のＮＡＤＰＨ要件を満たすため、本発明者らは、本発明において、細胞におけるＮＡＤＰＨのプールを増加させる目的でトランスヒドロゲナーゼ活性の増加を提案する。
【０００８】
トランスヒドロゲナーゼ反応(下記)は、膜に結合したプロトン転位酵素（ＰｎｔＡＢ）または可溶性のエネルギー非依存性(energy-independent)アイソフォーム酵素（ＳｔｈＡ）によって触媒されることができる。
【数１】
2013539987.tif 000002
【０００９】
大腸菌は、遺伝子ｓｔｈＡ（ｕｄｈＡとも呼ばれる）およびｐｎｔＡＢによってコードされる２つのニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを有する(Sauer U. et al., 2004, JBC, 279:6613-6619)。微生物におけるトランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢおよびＳｔｈＡの生理学的機能は、それぞれＮＡＤＰＨの生成および再酸化である (Sauer U. et al., 2004, JBC, 279:6613-6619)。膜に結合したトランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢは、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への酸化によるＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへの還元の駆動力として電気化学的プロトングラディエントを用いる(Jackson JB, 2003, FEBS Lett 545: 18-24)。
【００１０】
幾つかの方法が、全細胞におけるＮＡＤＰＨの供給を向上させる目的で用いられてきた。Moreira dos Santos ら (2004)は、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)中のＮＡＤＰＨのサイトゾルレベルを増加させるためのＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素の使用を報告している。Weckbecker および Hummel (2004)は、アセトフェノンの（Ｒ）−フェニルエタノールへのＮＡＤＰＨ依存性転換を向上させる目的での大腸菌におけるｐｎｔＡＢの過剰発現を報告している。Sanchez ら (2006)は、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）のＮＡＤＰＨ依存性生産を向上させる目的で大腸菌における可溶性トランスヒドロゲナーゼＳｔｈＡの過剰発現を報告している。
【発明の開示】
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことには、細菌においてＰｎｔＡＢ活性を増加させ、かつＳｔｈＡによって触媒される反応を減少させることによって、メチオニン生産が有意に増加することを見出した。
【００１２】
更に、細胞における一炭素代謝を高めるために高トランスヒドロゲナーゼ活性とメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）活性の増加を組み合わせると、改変微生物の発酵によるＬ−メチオニンの生産が大きく向上する。
【００１３】
発明の概要
本発明は、メチオニンを生産する微生物であって、そのＮＡＤＰＨの生産が増加する微生物に関する。ＮＡＤＰＨ生産の増加は、唯一の改変としてのＰｎｔＡＢのトランスヒドロゲナーゼ活性を増加することによって、またはＵｄｈＡトランスヒドロゲナーゼの活性の減衰と組み合わせて達成される。本発明の特定の実施態様では、ＮＡＤＰＨ生産の増加は、一炭素代謝の増加と対になっている。
【００１４】
本発明は、
−  炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地で、改変されたメチオニン生産微生物を培養する工程、および
−  メチオニンまたはその誘導体を培養培地から回収する工程
を含んでなる発酵プロセスにおいて、該微生物においてＰｎｔＡＢのトランスヒドロゲナーゼ活性を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の生産が増加するように増強することを特徴とする、メチオニンの製造方法にも関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、メチオニンを生産する微生物であって、ＰｎｔＡＢのトランスヒドロゲナーゼ活性を増強するように改変されている微生物に関する。
【００１６】
本発明は、発酵プロセスにおけるメチオニンの製造方法にも関する。
【００１７】
定義
本発明は、遺伝子改変(genetics modifications)を含み、遺伝子発現またはタンパク質生産もしくは活性を増強する微生物に関する。
【００１８】
本発明の説明において、遺伝子とタンパク質は、大腸菌における対応遺伝子の名称を用いて同定される。しかしながら、特に断らない限り、これらの名称の使用は本発明によればより一般的意味を有し、他の生物、更に詳細には微生物における総ての対応する遺伝子およびタンパク質を包含する。
【００１９】
ＰＦＡＭ（アライメントおよび隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーアライメント; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アライメントの膨大なコレクションである。各々のＰＦＡＭによって、多数から成るアライメントを視覚化したり、タンパク質ドメインを見たり、生物での分布を評価したり、他のデータベースへのアクセスを獲得したり、既知のタンパク質の構造を視覚化することが可能になる。
【００２０】
ＣＯＧｓ（タンパク質の相同分子種グループのクラスター、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、配列が完全に解読された６６のゲノムのタンパク質配列を比較することによって得られ、３８の主要な系統学的系列を表している。各々のＣＯＧは、少なくとも三つの系統から定義され、前に保存されているドメインの同定を可能にする。
【００２１】
相同配列およびその相同性パーセント割合を同定する手段は当業者に周知であり、特に、ＢＬＡＳＴプログラムを包含する。該プログラムは、そのウェブサイトで示された初期パラメータを用いて、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から利用することができる。得られた配列は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）またはＭＵＬＴＡＬＩＮ（http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl）といったプログラムを使い、それらウェブサイトで示された初期パラメータを用いて、利用される（例えば、配列される）。
【００２２】
既知遺伝子についてGenBankに示されている参考文献を用いて、当業者は、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物等における同等な遺伝子を決定することができる。この日常作業は、他の微生物由来の遺伝子により配列アライメントを行うことによって決定することができるコンセンサス配列を用い、他の生物における対応遺伝子をクローニングするための縮重プローブ(degenerate probes)をデザインして好都合に行われる。これらの分子生物学の常法は当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al. (1989 「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: a Laboratory Manual). 第２版、Cold Spring Harbor Lab., コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク)に記載されている。
【００２３】
本発明による「活性の減衰」という用語は、酵素または遺伝子について用いることができ、それぞれの場合に、対応する遺伝子の発現の部分的または完全な抑制を表し、次いでこれは「減衰される」といわれる。この発現の抑制は、遺伝子の発現の阻害、遺伝子発現に必要なプロモーター領域の総てまたは一部の欠失、遺伝子のコード領域の欠失、または弱めの天然または合成プロモーターによる野生型プロモーターの交換のいずれかであることができる。好適には、遺伝子の減衰は、本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、これは、本発明による株の同定、単離および精製を容易にする選択マーカー遺伝子に交換することができる。遺伝子は、相同性組換えの技術によって好適に不活性化される(Datsenko, K.A. & Ｗanner, B.L. (2000) 「ＰＣＲ生成物を用いる大腸菌Ｋ−１２における染色体遺伝子の一段階不活性化(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)。
【００２４】
「増強されたトランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢ活性」という用語は、改変されていない微生物の酵素活性より優れている酵素活性を表す。当業者は、前記酵素の酵素活性の測定方法を知っている。本発明の好ましい実施態様では、ＰｎｔＡＢ活性は、改変されていない微生物で見られる活性と比較して１０％増加し、好適には、前記活性は２０％、更に好適には３０％、更に一層好適には５０％増加し、または６０％を上回る。
【００２５】
酵素活性を増強するには、当業者は、様々な手段、すなわち、タンパク質の触媒部位の改変、タンパク質の安定性の増加、メッセンジャーＲＮＡの安定性増加、タンパク質をコードする遺伝子の発現増加を知っている。
【００２６】
タンパク質を安定化する要素は、当該技術分野で知られており（例えば、ＧＳＴタグ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、並びにメッセンジャーＲＮＡを安定化する要素も知られている (Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)。
【００２７】
「遺伝子の増加発現」、「遺伝子の増強された発現」または「遺伝子の過剰発現」という用語は、本文では互換的に用いられかつ同様の意味を有する。
【００２８】
遺伝子の発現を増加させるため、当業者は様々な手法、すなわち微生物における遺伝子のコピー数の増加、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーターの使用、遺伝子の直接的または間接的転写リプレッサーの活性および／または発現の減衰を知っている。
【００２９】
遺伝子は、染色体または染色体外でコードされる。遺伝子が染色体上に位置しているときには、遺伝子の幾つかのコピーを当業者に知られている組換えの方法（遺伝子置換など）によって染色体上に導入することができる。遺伝子が染色体外に位置しているときには、遺伝子は、細胞における複製起源、従ってコピー数に関して異なっている様々な種類のプラスミドに担持されている。これらのプラスミドは、このプラスミドの性質、すなわち、複製が厳密な(tight replication)低コピー数のプラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数のプラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数のプラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ）に応じて微生物中に１〜５つのコピー、または約２０のコピー、または５００以下のコピーで存在する。
【００３０】
本発明の特定の実施態様では、遺伝子は、様々な強度のプロモーターを用いて発現させる。本発明の一つの実施態様では、これらのプロモーターは誘導可能である。これらのプロモーターは同種または異種である。当業者は、どのプロモーターが最も好都合であるかを知っており、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられる。
【００３１】
メチオニンの誘導体：
本発明によれば、メチオニンは培養培地から回収される。しかしながら、培養培地からメチオニンの幾つかの誘導体を回収することも可能であり、これらは、簡単な反応でメチオニンに転換することができる。メチオニンの誘導体は、Ｓ−アシルメチオニンおよびＮ−アシルメチオニン経路のようなメチオニン転換および／または減成経路から生じる。詳細には、これらの生成物は、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）およびＮ−アセチル−メチオニン（ＮＡＭ）である。特に、 ＮＡＭは、脱アシル化によって単離してメチオニンに転換することができる容易に回収可能なメチオニン誘導体である。
【００３２】
微生物
「メチオニンの生産のための微生物」または「メチオニン生産微生物」という用語は、内因的要求によってのみメチオニンを生産する、非生産微生物より高レベルのメチオニンを生産する微生物を表す。メチオニン生産について「至適化された」微生物は、当該技術分野で周知であり、特に特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１、およびＷＯ２００９／０４３８０３に開示されている。
【００３３】
「改変微生物」という用語は、メチオニン生産を向上させるために改変された微生物に関する。本発明によれば、微生物によって生産されるメチオニンの量、および特にメチオニン収率（炭素源グラム／モル当たり生産されるメチオニングラム／モルの比）は、対応する非改変微生物と比較して改変微生物での方が高い。通常の改変は、形質転換および組換えによる遺伝子の欠失、遺伝子置換、および異種遺伝子の発現のためのベクターの導入を含む。
【００３４】
本発明で用いられる微生物は、細菌、酵母または真菌である。好適には、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) の種のいずれかである。
【００３５】
ＮＡＤＰＨの増加
本発明によれば、改変微生物は、一方では、メチオニン生産を向上させるための改変と、他方では、ＰｎｔＡＢのトランスヒドロゲナーゼ活性の増加による利用可能なＮＡＤＰＨの生産を向上させるための改変を含んでなる。
【００３６】
ＰｎｔＡＢは、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化によるＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの還元を触媒しかつｐｎｔＡおよびｐｎｔＢ遺伝子によってそれぞれコードされる２つのサブユニットαおよびβから構成されている膜貫通ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。
【００３７】
ＰｎｔＡＢ活性が増加すると、細胞における利用可能なＮＡＤＰＨの生産が高まる。これは、利用可能なＮＡＤＰＨがＮＡＤＰＨ依存性酵素によって直接消費されることがあるので、細胞における濃度増加を自動的にもたらすものではない。本文における「ＰｎｔＡＢ活性が増加」という用語は、例えば、より強いプロモーターを使用するか、または活性が増強された対立遺伝子を使用し、また、おそらくはこれらの手段を組み合わせて、遺伝子のコピー数を増やすことにより、対応するｐｎｔＡおよびｐｎｔＢによってコードされるトランスヒドロゲナーゼの細胞内活性を増大させることを表す。
【００３８】
本発明の特定の実施態様では、ｐｎｔＡＢをコードする遺伝子は過剰発現される。
【００３９】
本発明の特定の実施態様では、ｐｎｔＡＢ遺伝子は高強度を示すプロモーターを用いて過剰発現される。このようなプロモーターは、例えば、それぞれ特定の強度を示すＰｔｒｃファミリーに属するものである。Ｐｔｒｃプロモーターは、典型的な大腸菌(E. coli)プロモーターＰｌａｃおよびＰｔｒｐ、特にＰｌａｃの−３５ボックスおよびＰｔｒｐの−１０ボックスのコンセンサス配列を示す人工のハイブリッドプロモーターである(Amann et al., 1983, Geneおよび Amann et al., 1988, Gene)。本発明者らは、様々な強度のプロモーターのシリーズを得るためのHawleyの研究(Hawley & McClure, 1983, Nucleic Acids Research)におけるプロモーター比較により−１０または−３５ボックスのコンセンサス配列を改変することによってこの人工プロモーターを改変した。これらの配列がコンセンサス−１０および−３５ボックスから異なれば異なるほど、プロモーターの強度は低くなる。本発明で用いられるＰｔｒｃプロモーターは、数により重りを付けたＰｔｒｃと命名され、数が大きくなればなるほど、人工プロモーター配列とコンセンサス配列との差は大きくなる。
【００４０】
本発明の特定の実施態様では、利用可能なＮＡＤＰＨの増加は、ＰｎｔＡＢの活性をＵｄｈＡ活性の減衰と組み合わせて増加させることによって得られる。ＵｄｈＡは、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元によるＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への酸化を本質的に触媒する可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。
【００４１】
前述のように、ＵｄｈＡ活性の減衰は、対応するｕｄｈＡ遺伝子を部分的にまたは完全に抑制することによって、ｕｄｈＡ遺伝子の発現を阻害することによって、遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全部または一部を欠失することによって、遺伝子のコード領域における欠失によって、または野生型プロモーターの、より弱い天然もしくは合成プロモーターとの交換によって行うことができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様では、ＵｄｈＡ活性の減衰は、相同組換えによるｕｄｈＡ遺伝子の完全な欠失によって行われる。
【００４３】
Ｃ１代謝
本発明の好ましい実施態様では、ＮＡＤＰＨの生産増加は、メチオニン生産微生物における一炭素代謝（Ｃ１代謝と呼ばれる）の増加と結びつけられている。Ｃ１代謝は当業者に周知であり、葉酸代謝に基づいている。葉酸は、葉酸還元酵素によってジヒドロ葉酸に還元され、次いでジヒドロ葉酸還元酵素によってテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦと呼ばれる）に還元される。ＴＨＦは、ＤＮＡ塩基およびアミノ酸の生合成に関与する化合物である。
【００４４】
ＴＨＦは、グリシンまたはセリンから生じるメチレン基を受け取り、メチレン−ＴＨＦを形成する。セリンの場合には、メチレン基のＴＨＦへの移動はセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）によって触媒され、またはグリシンの場合には、グリシン開裂複合体（ＧｃｖＴＨＰ）によって触媒される。グリシン開裂複合体（ＧＣＶ）は、グリシンの酸化を触媒し、二酸化炭素、アンモニア、メチレン−ＴＨＦおよび還元型ピリジンヌクレオチドを生成する多酵素複合体である。ＧＣＶ複合体は、Ｐ−タンパク質と呼ばれるグリシンデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＰ）、Ｈ−タンパク質と呼ばれるリポイル−ＧｃｖＨ−タンパク質（ＧｃｖＨ）、Ｔ−タンパク質と呼ばれるアミノメチルトランスフェラーゼ（ＧｃｖＴ）、およびＬ−タンパク質と呼ばれるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＬまたはＬｐｄ）からなっている。Ｐ−タンパク質は、グリシンからＣＯ２のピリドキサールリン酸依存性放出を触媒し、メチルアミン残基を残す。メチルアミン残基は、Ｈ−タンパク質のリポ酸に移動し、これはＰ−タンパク質に結合した後グリシンを脱炭酸する。Ｔ−タンパク質は、メチルアミン基からのＮＨ３の放出を触媒し、残っているＣ１単位をＴＨＦに移動させ、メチレン−ＴＨＦを形成する。次に、Ｌ−タンパク質はＨ−タンパク質のリポ酸成分を酸化し、電子をＮＡＤ＋に移動させ、ＮＡＤＨを形成する。
【００４５】
メチオニン生合成では、メチレン−ＴＨＦは、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）によって還元されメチル−ＴＨＦを形成することができる。メチル−ＴＨＦは、メチオニンを形成するためのメチルトランスフェラーゼＭｅｔＥまたはＭｅｔＨによるホモシステインのメチル化の際のメチルの供与体である。
【００４６】
Ｃ１代謝の増加は、メチオニン生産の向上をもたらす。
【００４７】
本発明によれば、「Ｃ１代謝の増加」は、ＭｅｔＦ、ＧｃｖＴＨＦ、Ｌｐｄ、ＧｌｙＡ、ＭｅｔＥまたはＭｅｔＨから選択されるＣ１代謝に関与する少なくとも一つの酵素の活性の増加に関する。酵素活性を増加させるため、これらの様々な酵素の対応する遺伝子を、それらの核酸配列において過剰発現または改変させ、活性の向上した発現酵素とすることができ、またはフィードバック調節に対するそれらの感受性を低減させることができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施態様では、 一炭素代謝は、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼＭｅｔＦの活性および／またはグリシン開裂複合体ＧｃｖＴＨＰの活性および／またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡの活性を増強することによって増加する。
【００４９】
本発明の特定の実施態様では、ＭｅｔＦの活性は遺伝子ｍｅｔＦの過剰発現によっておよび／または翻訳の至適化によって増強される。
【００５０】
本発明の特定の実施態様では、ｍｅｔＦ遺伝子の過剰発現は、Ｐｔｒｃファミリープロモーターに属する強力なプロモーターの制御下でまたはＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載の温度誘導性プロモーターＰＲのような誘導性プロモーターの制御下で遺伝子を発現させることによって達成される。
【００５１】
本発明の別の実施態様によれば、タンパク質ＭｅｔＦの翻訳の至適化は、ＲＮＡ安定剤を用いることによって達成される。遺伝子の過剰発現のための他の手段は当業者に知られており、ＭｅｔＦ遺伝子の過剰発現に用いることができる。
【００５２】
メチオニン生合成経路の至適化
上述のように、本発明で用いられる改変微生物は、利用可能なＮＡＤＰＨ生産およびＣ１代謝における改変、メチオニン生産を向上させるための改変を更に含んでなることができる。
【００５３】
微生物においてメチオニンに関与する遺伝子は当該技術分野で周知であり、メチオニンに特異的な生合成経路に関与する遺伝子、並びに前駆体供給経路に関与する遺伝子およびメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含んでなる。
【００５４】
メチオニンの効率的生産には、メチオニンに特異的経路および幾つかの前駆体供給経路の至適化が必要とされる。メチオニン産生株は、特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１、およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている。これらの出願は、本出願に参考として組込まれる。
【００５５】
その阻害剤ＳＡＭとメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ対立遺伝子を過剰発現するメチオニン生産株がＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。この出願にはまた、メチオニンレギュロンのダウンレギュレーションを担うメチオニンレプレッサーＭｅｔＪの欠失を有するこれらの対立遺伝子の組合せも記載されている。さらに、アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現を伴う２つの改変の組合せが出願に記載されている。
【００５６】
メチオニンの生産を向上させるため、この微生物は、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載の、周辺質硫酸結合タンパク質をコードするｃｙｓＰ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載の、硫酸ＡＢＣ輸送体の成分をコードするｃｙｓＵ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載の膜に結合した硫酸輸送タンパク質をコードするｃｙｓＷ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載の硫酸パーミアーゼをコードするｃｙｓＡ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のＯ−アセチルセリンスルフヒドラーゼをコードするｃｙｓＭ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載の亜硫酸レダクターゼのαおよびβサブユニットをそれぞれコードしたｃｙｓＩおよびｃｙｓＪ。好ましくは、ｃｙｓＩおよびｃｙｓＪは同時に過剰発現される。
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のアデニリルスルフェートレダクターゼをコードするｃｙｓＨ、
ＷＯ２００７／０７７０４１に記載のセリンアシルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のホスホセリンホスファターゼをコードするｓｅｒＢ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするｓｅｒＣ、
ＷＯ２００５／１１１２０２に記載のＳ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ対立遺伝子、
ＷＯ２００９／０４３８０３およびＷＯ２００５／１１１２０２に記載のトレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ対立遺伝子
からなる群において選択される少なくとも一つの遺伝子の発現増加、または下記の遺伝子：
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のピルベートキナーゼをコードするｐｙｋＡ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のピルベートキナーゼをコードするｐｙｋＦ、
ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載のホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードするｐｕｒＵ、
ＷＯ２０１０／０２０６８１に記載のＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｙｎｃＡ、
ＷＯ２００５／１１１２０２に記載のメチオニン生合成経路のリプレッサーをコードするｍｅｔＪ
の少なくとも一つの発現の阻害
を示す。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあることができる。ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０には、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたｔｈｒＡ対立遺伝子と誘導性プロモーターの制御下にあるｃｙｓＥを発現したメチオニン生産株が記載されている。この出願は、本出願に参考として組込まれる。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様では、ｔｈｒＡ遺伝子または対立遺伝子は、温度誘導性プロモーターの制御下にある。最も好ましい実施態様では、用いられる温度誘導性プロモーターはＰＲプロモーターのファミリーに属している。
【００５９】
本発明の別の態様では、ピルベートカルボキシラーゼの活性が増強される。ピルベートカルボキシラーゼの活性増加は、対応する遺伝子を過剰発現し、または活性が向上した酵素を発現させるためにこの遺伝子の核酸配列を改変することによって得られる。本発明の別の実施態様では、ｐｙｃ遺伝子は組換えによって１または数コピーで染色体に導入されるか、または改変された微生物に少なくとも１コピーで存在するプラスミドによって担持されている。ｐｙｃ遺伝子は、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、シュドモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)またはコリネバクテリウム種(Corynebacterium species)に由来する。
【００６０】
本発明の特定の実施態様では、過剰発現した遺伝子は染色体上のそれらの天然の位置にあるか、または非天然の位置に組込まれている。至適メチオニン生産のためには、遺伝子の幾つかのコピーが必要とされることがあり、これらの複数コピーは特異的遺伝子座に組込まれるが、その改変はメチオニン生産に負の影響を与えるものではない。
【００６１】
細胞の代謝を妨げることなく遺伝子を組込むことができる遺伝子座の例は、下記の通りである。
2013539987.tif 000003
2013539987.tif 000004
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【００６２】
本発明は、メチオニンを生産するための方法であって、下記の工程
炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地において改変メチオニン生産微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンまたはその誘導体の一つを回収する工程
を含んでなり、
前記微生物がＰｎｔＡＢの増強されたトランスヒドロゲナーゼ活性を示すように改変される方法にも関する。
【００６３】
培養条件
「発酵プロセス」、「培養」または「発酵」という用語は、単純な炭素源、硫黄源および窒素源を含む適切な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
【００６４】
適切な培養培地は、微生物の培養および増殖に適切な培地である。このような培地は、微生物の発酵の技術分野で周知であり、培養される微生物によって変化する。
【００６５】
本発明による「炭素源」という用語は、微生物の正常な成長を支えるために当業者によって用いられることができ、グルコース、ガラクトースまたはラクトースのようなヘキソース; ペントース; 単糖類; スクロース、セロビオースまたはマルトースのような二糖類; オリゴ糖類; 糖蜜; 澱粉またはその誘導体; ヘミセルロース; グリセロールおよびそれらの組合せであり得る炭素源を表す。特に好ましい炭素源は、グルコースである。別の好ましい炭素源は、スクロースである。
【００６６】
本発明の特定の実施態様では、炭素源は、再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短い遅滞内で、目的産物へのその変換を可能とするのに十分な量で再生することができる、ある特定の工業プロセスに必要な原料として定義される。処理されたまたは処理されていない植物バイオマスは、興味深い再生可能な炭素源である。
【００６７】
本発明による「硫黄源」という用語は、硫酸、チオ硫酸、硫化水素、ジチオン酸、亜ジチオン酸、亜硫酸、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィドおよび他のメチルキャップスルフィド(methyl capped sulphides)、または様々な供給源の組合せを指す。更に好適には、培養培地における硫黄源は、硫酸またはチオ硫酸あるいはそれらの混合物である。
【００６８】
「窒素源」という用語は、アンモニウム塩またはアンモニアガスのいずれかに相当する。窒素源はアンモニウムまたはアンモニアの形態で供給される。
【００６９】
本発明の特定の態様では、培養は、微生物が無機基質、特にリン酸および／またはカリウムについて制限されまたは飢餓状態にされるような条件で行われる。生物が無機基質の制限を受けるとは、その微生物の増殖が、なお弱い増殖を許容しつつ、供給された無機化学物質の量により支配される条件を定義する。ある無機基質に対して微生物を飢餓状態にするとは、その無機基質が存在しないために微生物の増殖が完全に停止する条件を定義する。
【００７０】
発酵は一般に、使用する微生物に適合した、少なくとも１つの単純炭素源、および必要であれば代謝産物の生産のための補助基質を含有する適切な培養培地を用いる発酵槽で行う。
【００７１】
当業者ならば、本発明による微生物の培養条件を定義することができる。特に、細菌を２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクムでは約３０℃、大腸菌では約３７℃の温度で発酵させる。
【００７２】
大腸菌の既知の培養培地の例として、培養培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer ら (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)によって定義されているような培地と同じまたは類似の組成のものであり得る。
【００７３】
Ｃ．グルタミクムの既知の培養培地の例として、培養培地は、ＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedelら (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)によって記載されているような培地と同じまたは類似の組成のものであり得る。
【００７４】
メチオニンの回収
「培養培地からメチオニンを回収する」行為とは、メチオニンまたはその誘導体の一つ、特にＳＡＭおよびＮＡＭ並びに有用であり得る他の全ての誘導体を回収する行為を表す。
【００７５】
本発明は、任意に最終産物の一部または全量（０〜１００％）に留まっている、発酵液および／またはバイオマスからメチオニン、その前駆体または誘導体を単離する工程を含んでなる、メチオニンの生産方法にも関する。
【００７６】
発酵後、Ｌ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物を回収し、必要であれば精製する。培養培地におけるメチオニン、Ｓ−アデノシル−メチオニンおよびＮ−アセチル−メチオニンなどの生産された化合物の回収および精製のための方法は当業者によく知られている（ＷＯ ２００５／００７８６２，ＷＯ ２００５／０５９１５５）。
【００７７】
場合により、発酵産物の精製の際には、０〜１００％、好適には少なくとも９０％、より好適には９５％、いっそうより好適には少なくとも９９％のバイオマスが除去され得る。
【００７８】
場合により、メチオニン誘導体であるＮ−アセチル−メチオニンは脱アシル化によってメチオニンに転換された後、メチオニンが回収される。
【実施例】
【００７９】
プロトコル
幾つかのプロトコルを用いてメチオニン生産株を構築し、下記の実施例に記載する。
【００８０】
プロトコル１：相同組換えおよび組換体の選択による染色体改変 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))
ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００）によって記載された相同組換えによって、特定の染色体上の座における対立遺伝子交換または遺伝子破壊を行った。Ｆｌｐ認識部位によって挟まれたクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性ｃａｔ、カナマイシン（Ｋｍ）耐性ｋａｎ、またはゲンタマイシン（Ｇｔ）耐性ｇｍ遺伝子を、ｐＫＤ３またはｐＫＤ４あるいはｐ３４Ｓ−Ｇｍ (Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)プラスミドをそれぞれ鋳型として用いることによってＰＣＲによって増幅した。生成するＰＣＲ産物を用いて、λRed（γ、β、ｅｘｏ）リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を含む宿主大腸菌株を形質転換した。次に、抗生物質耐性の形質転換体を選択して、突然変異した座の染色体構造を表２に示される適切なプライマーを用いるＰＣＲ分析によって検証した。
【００８１】
ｐＣＰ２０プラスミドを含むクローンをＬＢ上で３７℃で培養した後、抗生物質耐性の喪失を３０℃で試験したことを除き、ｃａｔ、ｋａｎおよびｇｍ耐性遺伝子を、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００）によって記載されたプラスミドｐＣＰ２０を用いて除去した。次に、抗生物質感受性クローンを、表２に示されるプライマーを用いるＰＣＲによって検証した。
【００８２】
プロトコル２：ファージＰ１の形質導入
染色体修飾を、Ｐ１形質導入によって所定の大腸菌宿主株に移した。このプロトコルは、（ｉ）耐性関連染色体修飾を含む供与体株でのファージ溶解液の調製、および（ｉｉ）このファージ溶解液による宿主株の感染の２工程から構成されている。
【００８３】
ファージ溶解液Ｐ１の調製：
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）またはＫｍ（５０μｇ／ｍｌ）またはＧｔ（１０μｇ／ｍｌ）＋グルコース（０．２％）＋ＣａＣｌ２（５ｍＭ）において、対象の染色体修飾を有する株ＭＧ１６５５の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・準備したＰ１ファージ溶解液１００μｌをドナー株ＭＧ１６５５に加える（約１×１０９ファージ／ｍｌ）
・細胞が完全に溶解するまで３７℃で３０分間振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移す。
・溶解液を４℃で保存する。
【００８４】
形質導入：
・ＬＢ培地中で培養した大腸菌宿主株の一晩培養物５ｍｌを、１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・細胞ペレットを２．５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁させる。
・１００μｌの細胞を、染色体修飾を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌに感染させ（供試試験管）、対照試験管としてＰ１ファージを含まない１００μｌ細胞および細胞を含まない１００μｌのＰ１ファージを用いる。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
・ＬＢ＋Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）またはＫｍ（５０μｇ／ｍｌ）またはＧｔ（１０μｇ／ｍｌ）上で培養する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００８５】
次に、抗生物質耐性形質導入体を選択し、突然変異した座の染色体構造を表２に示されるプライマーを用いるＰＣＲ分析によって検証した。
【００８６】
【表１】
2013539987.tif 000013
2013539987.tif 000014
2013539987.tif 000015
2013539987.tif 000016
【００８７】
【表２】
2013539987.tif 000017
【００８８】
Ｉ．実施例１：  株７、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔの構築
【００８９】
Ｉ．１．株１の構築
メチオニン生産株１は、特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されており、この出願は、本出願に参考として組込まれる。
【００９０】
Ｉ．２．株２の構築
ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ断片を、二工程で挿入した。最初に、プラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍを構築し、二番目にｍａｌＳ座に相同性の上流および下流配列を含むＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ断片を染色体に導入した。その後、耐性カセットをプロトコル１に従って除去した。
【００９１】
以下に示される染色体上の様々な座における組込みは、１）対象の座の上流および下流の相同配列、ＤＮＡ断片および耐性カセットを含む複製ベクターの構築、２）対象の染色体修飾を含む最小株（ＭＧ１６５５）の構築、および３）複合株（幾つかの修飾を既に含むＭＧ１６５５）への形質導入の同じ方法に従っている。
【００９２】
Ｉ．２．１．ｐＵＣ１８−ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍプラスミドの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥは、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載されているプラスミドｐＳＣＢ−ＴＴａｄｃ−ｃＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥに由来する。簡単に言えば、ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩで消化したＴＴａｄｃ−ｃＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ断片を、ｐＵＣ１８−ΔｍａｌＳ：：ＭＣＳ−ＫｍのＡｐａＩとＢａｍＨＩ部位の間でクローニングさせた。生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって確認され、ｐＵＣ１８−ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍと命名した。
【００９３】
Ｉ．２．２．株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ（ｐＫＤ４６）の構築
ｍａｌＳ遺伝子をＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：ＫｍＤＮＡ断片によって交換するため、ｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：ＫｍをＳｃａＩおよびＥｃｏＲＶによって消化し、ｍａｌＳ座に相同性の上流および下流配列を含む残りの消化断片ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍをプロトコル１に従って株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６に導入した。カナマイシン耐性組換体を選択し、ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ染色体修飾の存在をプライマーＯｍｅ０８２６−ｍａｌＳ−Ｆ （配列番号１）およびＯｍｅ０８２７−ｍａｌＳ−Ｒ（配列番号２）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。確認されかつ選択された株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍと命名した。
【００９４】
Ｉ．２．３．ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍの株１への形質導入および耐性カセットの除去
ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ染色体修飾を、上記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ由来のＰ１ファージ溶解液を用いてプロトコル２に従って株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡに形質導入した。
カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ染色体修飾の存在をプライマーＯｍｅ０８２６−ｍａｌＳ−Ｆ （配列番号１）およびＯｍｅ０８２７−ｍａｌＳ−Ｒ （配列番号２）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株は、遺伝子型 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍを有する。最後に、上記株のカナマイシン耐性を、プロトコル１に従って除去した。カナマイシン耐性カセットプライマーＯｍｅ０８２６−ｍａｌＳ−Ｆ（配列番号１）およびＯｍｅ０８２７−ｍａｌＳ−Ｒ（配列番号２）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥを、株２と命名した。
【００９５】
Ｉ．３．株３の構築
Ｉ．３．１．プラスミド ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの構築 
プラスミドｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍは、下記のプラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１およびｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍに由来する。
【００９６】
プラスミド ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１の構築
プラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１は、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載のプラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１に由来する。
【００９７】
プラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を構築するため、プラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１をプライマーＰＲ−ＲＢＳ０１＿Ｆ （配列番号３）およびＴＴａｄｃ−ｐＣＬ１９２０＿Ｒ（配列番号４）で増幅した。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩによって消化して、親ＤＮＡ鋳型を削除した。残りの粘着性オーバーハングをリン酸化して、大腸菌株に導入し、プラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を形成させた。ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１インサートおよび特にｔｈｒＡ遺伝子の上流のＲＢＳ０１配列の存在を、下記のプライマーを用いるＤＮＡ配列決定法によって検証した。
【００９８】
ＰＲ−ＲＢＳ０１＿Ｆ （配列番号３）
【化１】
2013539987.tif 000018
・大文字の配列はバクテリオファージＰＲプロモーター（ＰλＲ＊（−３５）に相同性 (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148; Tsurimoto T, Hase T, Matsubara H, Matsubara K, Mol Gen Genet. 1982;187(1):79-86)。
・ 下線を施した大文字の配列は、ＰｓｉＩ制限部位を有するＲＢＳ０１配列に相当する。
・ 太字の大文字の配列は、ｔｈｒＡ（１−２０）の５‘末端に相同性。
【００９９】
ＴＴａｄｃ−ｐＣＬ１９２０＿Ｒ（配列番号４）
【化２】
2013539987.tif 000019
・大文字の配列は、ＴＴａｄｃ転写ターミネーター配列（クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)由来のａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター、ｐＳＬＯ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７に相同性）
・ 太字の大文字の配列は、ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１プラスミドに相同性。
【０１００】
ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍプラスミドの構築
ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍ断片を構築するため、ｐｇａＡ (ｕｐｐｇａＡ)の上流領域、ＴＴ０２転写ターミネーター、 マルチプル・クローニング部位（ＭＣＳ）およびｐｇａＤの下流領域（ｄｏｗｎｐｇａＤ）をＰＣＲによって連結した。その後、クロラムフェニコールカセット（Ｃｍ）を増幅して前記の構築物に添加した。
【０１０１】
最初に、ｕｐｐｇａＡ−ＴＴ０２を、プライマーＯｍｅ １６８７−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｍｏｎｔ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｆ（配列番号５）およびＯｍｅ１６８８−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｍｏｎｔ＿ＴＴ０２＿ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｒ（配列番号６）を用いてＰＣＲによって大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。次に、ＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎ−ｐｇａＤ断片を、プライマー Ｏｍｅ１６８９−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｖａｌ＿ＭＣＳ＿ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｆ（配列番号７）およびＯｍｅ１６９０−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｖａｌ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒ（配列番号８）を用いてＰＣＲによって大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。プライマー Ｏｍｅ１６８８−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｍｏｎｔ＿ＴＴ０２＿ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｒ（配列番号６）およびＯｍｅ１６８９−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｖａｌ＿ＭＣＳ＿ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｆ（配列番号７）は、３６ヌクレオチド長の領域をオーバーラップするようにデザインされていた。最後に、ｕｐｐｇａＡ−ＴＴ０２-ＭＣＳ−ｄｏｗｎｐｇａＤ断片を、プライマー Ｏｍｅ１６８７−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｍｏｎｔ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｆ（配列番号５）とＯｍｅ１６９０−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｖａｌ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒ（配列番号８）を用いてｕｐｐｇａＡ−ＴＴ０２とＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎ−ｐｇａＤ増幅産物を混合することによって増幅した。生成する融合ＰＣＲ産物をＨｐａＩによって消化して、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大（ＫＬｅｎｏｗ）断片によって処理されたｐＵＣ１８プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩの間にクローニングした。生成するプラスミドをＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳと命名した。
【０１０２】
Ｏｍｅ１６８７−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｍｏｎｔ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｆ （配列番号５）
【化３】
2013539987.tif 000020
・太字の大文字の配列は、ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位および エキストラベース(extrabases)についてのもの、
・大文字の配列は、ｐｇａＡ遺伝子の上流の配列（１０９２６０９−１０９２５７６，ウェブサイトhttp://ecogene.org/上のリファレンス配列）
【０１０３】
Ｏｍｅ１６８８−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｍｏｎｔ＿ＴＴ０２＿ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｒ （配列番号６）
【化４】
2013539987.tif 000021
・太字の大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位およびエキストラベース、
・下線を施した 大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１に相当(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
・大文字の配列は、ｐｇａＡ遺伝子の上流の配列と相同性（１０９１８２９−１０９１８５１、ウェブサイトhttp://ecogene.org/)上のリファレンス配列）
【０１０４】
Ｏｍｅ１６８９−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｖａｌ＿ＭＣＳ＿ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｆ （配列番号７）
【化５】
2013539987.tif 000022
・太字の大文字の配列は、大腸菌 ｒｒｎＢの転写ターミネーター Ｔ１の３‘末端配列と相補性 (Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)、
・下線を施した大文字の配列は、ＭＣＳ マルチプル・クローニング部位: ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩを含む、
・大文字の配列は、ｐｇａＤ遺伝子の上流の配列と相同性 （１０８５３２５−１０８５３０４、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上のリファレンス配列）。
【０１０５】
Ｏｍｅ１６９０−ΔｐｇａＡＢＣＤ＿ａｖａｌ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒ （配列番号８）
【化６】
2013539987.tif 000023
・太字の大文字の配列は、ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・大文字の配列は、ｐｇａＤ遺伝子の上流の配列と相同性（１０８４７１４−１０８４７３３、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上のリファレンス配列）。
【０１０６】
最後に、プライマーＯｍｅ１６０３−Ｋ７_Ｃｍ_ａｍｐｌ＿ＳｍａＩ_ＢｓｔＺ１７Ｉ＿Ｆ（配列番号９）およびＯｍｅ１６０４−Ｋ７_Ｃｍ_ａｍｐｌ_ＨｉｎｄＩＩＩ_Ｒ（配列番号１０）を用いてクロラムフェニコールカセットおよびプラスミドｐＫＤ３由来のＦＲＴ配列を増幅し、この断片をプラスミド ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳのＢｓｔＺ１７ＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でクローニングした。生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍと命名した。
【０１０７】
Ｏｍｅ１６０３−Ｋ７_Ｃｍ_ａｍｐｌ＿ＳｍａＩ_ＢｓｔＺ１７Ｉ_Ｆ（配列番号９）
【化７】
2013539987.tif 000024
・下線を施した大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７ＩとＳｍａＩの制限部位およびエキストラベースについてもの、
・大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ３の部位プライマー１に相当する (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１０８】
Ｏｍｅ１６０４−Ｋ７_Ｃｍ_ａｍｐ１_ＨｉｎｄＩＩＩ_Ｒ（配列番号１０）
【化８】
2013539987.tif 000025
・下線を施した大文字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびエキストラベース。
・大文字の配列は、ｐＫＤ３プラスミドの部位プライマーに相当 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１０９】
ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの構築
ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍを構築するため、前記のｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１から単離したＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ断片ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を前記のプラスミドｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：ＣｍのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングした。 生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍと命名した。
【０１１０】
Ｉ．３．２．  株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ (ｐＫＤ４６)の構築
ｐｇａＡＢＣＤオペロンをＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ領域によって交換するため、ｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍをＳａｍＩおよびＡａｔＩＩ制限酵素によって消化し、残りの消化断片ΔｐｇａＡＢＣＤ：： ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍをプロトコル１に従って株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６に導入した。
【０１１１】
クロラムフェニコール耐性組換体を選択し、ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ 染色体修飾の存在をプライマー Ｏｍｅ１６９１−ＤｐｇａＡＢＣＤ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号１１）およびＯｍｅ１６９２−ＤｐｇａＡＢＣＤ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号１２）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。確認されて選択された株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ （ｐＫＤ４６）と命名した。
【０１１２】
１．３．３．  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの株２への形質導入
ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ染色体修飾を、プロトコル２に従って上述の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ由来のＰ１ファージ溶解液を用いて上述の株２（表１）に形質導入した。
【０１１３】
クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ染色体修飾の存在をＯｍｅ１６９１−ＤｐｇａＡＢＣＤ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ （配列番号１１）およびＯｍｅ１６９２−ＤｐｇａＡＢＣＤ_ｖｉｒｉｆ_Ｒ（配列番号１２）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍを株３と命名した。
【０１１４】
Ｉ．４．株４の構築
Ｉ．４．１．ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍプラスミドの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍを構築するため、ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍ断片を大腸菌ＭＧ１６５５ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−ＫｍゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって得て、ｐＵＣ１８にクローニングした (Norrander et al., 1983, Gene 26,101-106)。
【０１１５】
株 ＭＧ１６５５ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍ ｐＫＤ４６の構築
ｕｘａＣＡ領域をＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍ断片によって交換するため、プライマー Ｏｍｅ  １５０６−ＤｕｘａＣＡ−ＭＣＳ−Ｆ（配列番号１３）およびＯｍｅ  １５０７−ＤｕｘａＣＡ−ＭＣＳ−Ｒ（配列番号１４）を用いてｐＫＤ４プラスミド由来のカナマイシン耐性カセットを増幅したことを除いて、プロトコル１を用いた。
【０１１６】
Ｏｍｅ１５０６−ＤｕｘａＣＡ−ＭＣＳ−Ｆ（配列番号１３）
【化９】
2013539987.tif 000026
・大文字の斜体配列は、ｕｘａＣＡ座の上流の配列と相同性である（３２４２７９７−３２４２７２４，ウェブサイトhttp://ecogene.org/上のリファレンス配列）。
・下線を施した大文字の配列は、ファージＴ７由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列 (Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ４のプライマー部位２に相当する (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１１７】
Ｏｍｅ１５０７−ＤｕｘａＣＡ−ＭＣＳ−Ｒ（配列番号１４）
【化１０】
2013539987.tif 000027
・大文字の斜体配列は、 ｕｘａＣＡ座の下流の配列と相同性である（３２３９８３０−３２３９８７９、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上のリファレンス配列）。
・（下線を施した大文字の）領域は、制限部位ＡｐａＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの配列を含むＭＣＳについてのもの、
・大文字は、プラスミドｐＫＤ４のプライマー部位１に相当する (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１１８】
カナマイシン耐性組換体を選択し、耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ １６１２−ｕｘａＣＡ_Ｒ３（配列番号１５）およびＯｍｅ １７７４−ＤｕｘａＣＡ_Ｆ（配列番号１６）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。検証して選択した株を、ＭＧ１６５５ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍ ｐＫＤ４６と命名した。
【０１１９】
プラスミド ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ：：Ｋｍの構築
ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍ領域は、鋳型として上記大腸菌 ＭＧ１６５５ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−ＫｍゲノムＤＮＡからプライマー Ｏｍｅ１５１５−ｕｘａＣＡ−Ｒ２ （配列番号１７）およびＯｍｅ１５１６−ｕｘａＣＡ−Ｆ２（配列番号１８）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【０１２０】
Ｏｍｅ１５１５−ｕｘａＣＡ Ｒ２（配列番号１７）
【化１１】
2013539987.tif 000028
・ｕｘａＣＡ座の下流の配列に相同性（３２３９０２１−３２３９０４４）
【０１２１】
Ｏｍｅ１５１６−ｕｘａＣＡ Ｆ２ （配列番号１８）
【化１２】
2013539987.tif 000029
・下線を施した大文字の配列は、制限部位ＥｃｏＲＶおよびエキストラベースについてのもの、
・大文字の斜体配列は、ｕｘａＣＡ座の上流の配列に相同性（３２４３４２５−３２４３４０２）。
【０１２２】
次に、生成するＰＣＲ産物（平滑末端ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られる）を制限酵素ＥｃｏＲＶによって消化し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングした。生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−Ｋｍと命名した。
【０１２３】
ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ−ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍの構築
ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ−ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍを構築するため、上記のｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１からのＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ消化断片を、上記ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＭＣＳ−ＫｍのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ−ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍと命名した。
【０１２４】
Ｉ．４．２．  株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ (ｐＫＤ４６)の構築
ｕｘａＣＡオペロンをＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ領域に交換するため、ｐＵＣ１８−ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＫｍをＢａｍＨＩおよびＡｈｄＩで消化し、残りの消化断片ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍをプロトコル１に従って株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６に導入した。
【０１２５】
カナマイシン耐性組換体を選択し、ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ染色体修飾の存在をプライマー Ｏｍｅ１６１２−ｕｘａＣＡ_Ｒ３（配列番号１５）およびＯｍｅ１７７４−ＤｕｘａＣＡ_Ｆ（配列番号１６）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株は、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ (ｐＫＤ４６)と命名した。
【０１２６】
Ｉ．４．３．  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍの株３への形質導入
ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ染色体修飾を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＫｍからのＰ１ファージ溶解液を用いてプロトコル２に従って前記の株３（表１）に形質導入した。
【０１２７】
ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ染色体修飾は、Ｏｍｅ１６１２−ｕｘａＣＡ_Ｒ３ （配列番号１５）およびＯｍｅ１７７４−ＤｕｘａＣＡ_Ｆ （配列番号１６）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株は、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍと命名した。
【０１２８】
最後に、前記株のクロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットを、プロトコル１に従って除去した。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットの喪失は、プライマーＯｍｅ１６９１−ＤｐｇａＡＢＣＤ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号１１）、Ｏｍｅ１６９２−ＤｐｇａＡＢＣＤ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号１２）、 Ｏｍｅ１６１２−ｕｘａＣＡ_Ｒ３（配列番号１５）およびＯｍｅ１７７４−ＤｕｘａＣＡ_Ｆ（配列番号１６）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を、株４と命名した。
【０１２９】
Ｉ．５．  株５の構築
Ｉ．５．１．  プラスミド ｐＭＡ−ＤＣＰ４−６：：ＴＴ０２ＴＴａｄｃ−ＰｇａｐＡ−λＲ＊(-35)-ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍの構築
プラスミド ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍは、前記のｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１および下記のｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｋｍに由来する。
【０１３０】
プラスミドｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｋｍの構築
最初に、GeneArt (http://www.geneart.com/)によってｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳを合成した。ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ断片を、GeneArtからのプラスミドｐＭＡのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位にクローニングし、配列番号１９として同定される下記の配列を含んでいる：
【化１３】
2013539987.tif 000030
2013539987.tif 000031
・小文字は、ＡｓｃＩ、ＳｔｕＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位に相当。
・下線を施した小文字は、ＣＰ４−６座の上流の配列と相同性（２６０９５５−２６１９８０，http://ecogene.org/）、
・太字の大文字は、大腸菌ｒｒｎＢ遺伝子のＴ１由来のＴＴ０２転写ターミネーター配列に相当(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)、
・斜体大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐａＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨ１制限部位を含むＭＣＳに相当、
・大文字は、 ＣＰ４−６座の下流の配列と相同性（２９６５１１−２９７５８１, http://ecogene.org/）
・下線を施した小文字は、ＫｐｎＩおよびＰａｃＩ制限部位に相当。
【０１３１】
二番目に、プライマーＯｍｅ１６０５−Ｋ７_Ｋｍ_ａｍｐｌ＿ＳｍａＩ_ＢｓｔＺ１７Ｉ_Ｆ（配列番号２０）およびＯｍｅ１６０６−Ｋ７_Ｋｍ_ａｍｐ１_ＨｉｎｄＩＩＩ_Ｒ（配列番号２１）を用いてプラスミド ｐＫＤ４由来のカナマイシンカセットを増幅し、これを次にｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳのＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−Ｋｍと命名した。
【０１３２】
Ｏｍｅ１６０５−Ｋ７_Ｋｍ_ａｍｐｌ＿ＳｍａＩ_ＢｓｔＺ１７Ｉ_Ｆ（配列番号２０）
【化１４】
2013539987.tif 000032
・下線を施した大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７ＩおよびＳｍａＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・大文字の配列は、プラスミド ｐＫＤ４の部位 プライマー１に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
【０１３３】
Ｏｍｅ１６０６−Ｋ７_Ｋｍ_ａｍｐ１_ＨｉｎｄＩＩＩ_Ｒ（配列番号２１）
【化１５】
2013539987.tif 000033
・下線を施した大文字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびエキストラベースに対するもの、
・大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ４の部位プライマー２に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１３４】
ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍを構築するため、前記のｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１からのＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ消化断片を、前記のｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−ＫｍのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。生成するプラスミドをＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍと命名した。
【０１３５】
Ｉ．５．２．  株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ＤＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ （ｐＫＤ４６)の構築
ＣＰ４−６オペロンをＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ断片に交換するため、プラスミド ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＫｍをＫｐｎＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、残りの消化断片 ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍをプロトコル１に従って株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６に導入した。
【０１３６】
カナマイシン耐性組換体を選択して、ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ染色体修飾の存在を、プライマー Ｏｍｅ１７７５−ＤＣＰ４−６_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号２２）およびＯｍｅ１７７６−ＤＣＰ４−６_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号２３）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ （ｐＫＤ４６）と命名した。
【０１３７】
１．５．３．  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍの株４への形質導入および耐性カセットの除去
ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ 染色体修飾を、前記の株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＫｍからのＰ１ファージ溶解液を用いてプロトコル２に従って前記の株４（表１）に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択して、ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍ 染色体修飾の存在をＯｍｅ１７７５−ＤＣＰ４−６_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号２２）およびＯｍｅ１７７６−ＤＣＰ４−６_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号２２）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｋｍと命名した。
【０１３８】
最後に、前記株のカナマイシン耐性カセットを、プロトコル１を用いて除去した。カナマイシン耐性カセットの喪失は、プライマーＯｍｅ１７７５−ＤＣＰ４−６_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号２２）およびＯｍｅ１７７６−ＤＣＰ４−６_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号２３）（表２）を用いることによりＰＣＲによって検証した。生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を、株５と命名した。
【０１３９】
Ｉ．６．  株６の構築
ｔｒｅＢＣ座でそれぞれ大腸菌ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼおよびホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ領域を挿入するため、二工程法を用いた。最初に、プラスミドｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔを構築し、二番目に、ｔｒｅＢＣ座に相同性の上流および下流領域を含むΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ断片を、プロトコル１に従って染色体に組み換えた。
【０１４０】
Ｉ．６．１．  プラスミド ｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔの構築
プラスミド ｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔは、下記のｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｇｔ、ｐ３４Ｓ−Ｇｍ (Ｄennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)、および特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載のｐＵＣ１８−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣから誘導される。最初に、プラスミドｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ＭＣＳを、GeneArt (http://www.geneart.com/)によって合成した。ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ断片を、GeneArtから得られかつ配列番号２４として同定された下記の配列を含むプラスミドｐＭＡのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位にクローニングした。
【化１６】
2013539987.tif 000034
・小文字は、ＡｓｃＩ制限部位に相当、
・下線を施した大文字は、ｔｒｅＢＣ座 （４４６０４７７−４４６１０３４）の上流の配列と相同性、
・太字の大文字は、大腸菌ｒｒｎＢ遺伝子のＴ１ターミネーター由来のＴＴ０２転写ターミネーター配列に相当(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)、
・斜体大文字は、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐａＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨ１制限部位を含むマルチプル・クローニング部位に相当、
・大文字は、ｔｒｅＢＣ座の下流の配列に相当（４４６４２９４−４４６４７８７）、
・斜体の小文字は、ＰａｃＩ制限部位に相当。
【０１４１】
プラスミドｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｇｔを構築するため、ＦＲＴ−Ｇｔ−ＦＲＴ耐性カセットを、ｐ３４Ｓ−Ｇｍを鋳型として用い、プライマーＢｓｔＺ１７Ｉ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｆ（配列番号２５）およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｒ （配列番号２６）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【０１４２】
ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｆ （配列番号２５）
【化１７】
2013539987.tif 000035
・下線を施した大文字の配列は、ＳｍａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位およびエキストラベースに対するもの、
・太字の大文字の配列は、ＦＲＴ配列に相当 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)、
・大文字の配列は、ｐ３４Ｓ−Ｇｍに配置されたゲンタマイシン遺伝子の配列に相同性(Ｄennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715)。
【０１４３】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｒ（配列番号２６）
【化１８】
2013539987.tif 000036
・下線を施した大文字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびエキストラベースに対するもの、
・太字の大文字の配列は、ＦＲＴ配列に相当 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)、
・大文字の配列は、ｐ３４Ｓ−Ｇｍに配置されたゲンタマイシン遺伝子の配列に相同性(Ｄennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715)。
【０１４４】
ＦＲＴ−Ｇｔ−ＦＲＴ ＰＣＲ産物を、ｐＭＡ−ΔtreB：：ＴＴ０２−ＭＣＳ
のＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした。生成するプラスミドは、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−Ｇｔと命名した。
【０１４５】
最終的なプラスミドｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔを構築するため、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣをＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ消化断片をＨｉｎｄＩＩＩによってリニアライズしたｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−Ｇｔにクローニングした。生成するプラスミドを、消化およびＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔと命名した。
【０１４６】
Ｉ．６．２．  株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔの構築
ｔｒｅＢＣ遺伝子をＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ断片に交換するため、ｐＭＡ−ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：ＧｔをＡｐａＩおよびＳａｌＩによって消化し、残りの消化断片ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔを株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６にプロトコル１に従って導入した。
【０１４７】
ゲンタマイシン耐性組換体を選択し、ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ断片の存在を、プライマー Ｏｍｅ１５９５−ＤｔｒｅＢ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ （配列番号２７）およびＯｍｅ１５９６−ＤｔｒｅＢ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ （配列番号２８）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔと命名した。
【０１４８】
Ｉ．６．３．  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔの株５への形質導入
ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ染色体修飾を、次にプロトコル２に従って前記の株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：ＧｔからのＰ１ファージ溶解液を用いて、株５（表１）に形質導入した。
【０１４９】
ゲンタマイシン耐性形質導入体 を選択し、ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ染色体修飾の存在をＯｍｅ１５９５−ＤｔｒｅＢ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ （配列番号２７）およびＯｍｅ１５９６−ＤｔｒｅＢ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号２８）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔを株６と命名した。
【０１５０】
Ｉ．７．  Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍの株６への形質導入による株７の構築
ｍｅｔＦ座で染色体、株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍに組込まれた人工プロモーター由来のｍｅｔＦ遺伝子の過剰発現は、特許出願ＷＯ ２００７／０７７０４１に記載されている。
【０１５１】
Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍプロモーター構築物を、株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：ＫｍからのＰ１ファージ溶解液を用いてプロトコル２に従って株６（表１）に形質導入した。
【０１５２】
カナマイシン耐性形質導入体を選択し、Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍプロモーター構築物をプライマー Ｏｍｅ０７２６−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｆ（配列番号２９）およびＯｍｅ０７２７−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｒ （配列番号３０）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍを株７と命名した。
【０１５３】
ＩＩ．  実施例２：  株９ ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの構築
【０１５４】
ＩＩ．１．  株８の構築 
ＩＩ．１．１．  カナマイシン耐性カセットの除去によるＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦの構築
特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１に記載の株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ：：Ｋｍのカナマイシン耐性をプロトコル１に従って除去した。カナマイシン耐性カセットの喪失は、プライマー Ｏｍｅ０７２６−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｆ （配列番号２９）およびＯｍｅ０７２７−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｒ（配列番号３０）（表２）を用いることによってＰＣＲによって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦと命名した。
【０１５５】
ＩＩ．１．２．  ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＫＤ４６の構築
株 ＭＧ１６５５ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦにおけるｕｄｈＡ遺伝子を欠失するため、プライマー Ｏｍｅ００３２−ＤＵｄｈＡＦ（配列番号３１）およびＯｍｅ００３４−ＤＵｄｈＡＲ（配列番号３２）を用いてカナマイシン耐性カセットをプラスミド ｐＫＤ４から増幅させることを除き、プロトコル１を用いた。
【０１５６】
カナマイシン耐性組換体を選択した。耐性カセットの挿入は、プライマー Ｏａｇ００５５−ｕｄｈＡＦ２（配列番号３３）およびＯａｇ００５６−ｕｄｈＡＲ２（配列番号３４）（表２）を用いるＰＣＲとＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株は、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＫＤ４６と命名した。
【０１５７】
Ｏｍｅ００３２−ＤＵｄｈＡＦ（配列番号３１）
【化１９】
2013539987.tif 000037
・大文字の配列ｕｄｈＡ遺伝子の上流の配列と相同性（４１５８７２９−４１５８６５０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/の対照配列）、
・下線を施した大文字の配列は、プラスミド ｐＫＤ４のプライマー部位１に相当 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１５８】
Ｏｍｅ００３４−ＤＵｄｈＡＲ（配列番号３２）
【化２０】
2013539987.tif 000038
・大文字の配列は、ｕｄｈＡ遺伝子の下流の配列と相同性（４１５７５８８−４１５７６６７、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）、
・下線を施した大文字の配列は、プラスミド ｐＫＤ４のプライマー部位２に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１５９】
ＩＩ．１．３．  Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの株６への同時形質導入
遺伝子ｕｄｈＡおよびｍｅｔＦは、大腸菌染色体上でそれぞれ８９．６１分および８９．０３分と近接しており、ファージ Ｐ１は大腸菌染色体の２分をパッケージすることができるので、遺伝子ｕｄｈＡおよびｍｅｔＦは同時形質導入することができる。そのため、前記のＰｔｒｃ３６−ｍｅｔＦプロモーター修飾およびΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失を、前記の株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＫＤ４６からのＰ１ファージ溶解液を用いることによってプロトコル２に従って株６（表１）に同時形質導入した。
【０１６０】
カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦプロモーター 修飾の存在を、プライマー Ｏｍｅ０７２６−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｆ（配列番号２９）およびＯｍｅ０７２７−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｒ（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって検証した後、ＤＮＡ配列決定法によって検証した。ＤｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失の存在を、プライマー Ｏａｇ００５５−ｕｄｈＡＦ２（配列番号３３）およびＯａｇ００５６−ｕｄｈＡＲ２（配列番号３４）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍを、株８と命名した。
【０１６１】
ＩＩ．２．  株９の構築
ＩＩ．２．１．  株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの構築
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットＰｎｔＡおよびＰｎｔＢの発現レベルを増加させるため、構成的人工ｔｒｃ０１プロモーターを、プライマーＯｍｅ１１４９−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＦ（配列番号３５）およびＯｍｅ１１５０−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＲ（配列番号３６）を用いてプラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル１に従って株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６中にｐｎｔＡＢオペロンの上流に加えた。
【０１６２】
クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターＰｔｒｃ０１の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによっておよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍと命名した。
【０１６３】
Ｏｍｅ１１４９−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＦ（配列番号３５）
【化２１】
2013539987.tif 000039
・大文字の配列は、ｐｎｔＡ遺伝子の上流の配列と相同性（１６７６００２−１６７５９４、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）、
・下線を施した大文字の配列は、ファージＴ７由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列 (Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・斜体大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ３のプライマー部位１に相当 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１６４】
Ｏｍｅ１１５０−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＲ（配列番号３６）
【化２２】
2013539987.tif 000040
・大文字の配列は、配列 upstream of the ｐｎｔＡ遺伝子の上流の配列と相同性（１６７５８７５−１６７５９４０，ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）
・下線を施した大文字の配列は、ｔｒｃプロモーター配列についてのもの、
・斜体大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ３のプライマー部位２に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)。
【０１６５】
ＩＩ．２．２．  Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの株８への形質導入
Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍプロモーター修飾を、プロトコル２に従って、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ由来のＰ１ファージ溶解液を用いることによって株８（表１）に形質導入した。
【０１６６】
クロラムフェニコール耐性形質導入体 を選択し、Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ染色体修飾の存在を、Ｏｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いてＰＣＲによって検証した。 生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍを、株９と命名した。
【０１６７】
ＩＩＩ．  実施例３：  株１０ ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣの構築
【０１６８】
ＩＩＩ．１．  プラスミド ｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍは、前記のプラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１および前記のプラスミドｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍから誘導される。
【０１６９】
ＩＩＩ．１．１．  プラスミドｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍの構築
ＤｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｃｍ断片を構築するため、ｗｃａＭ （ｕｐｗｃａＭ）の上流領域、ＴＴ０２転写ターミネーター、マルチプル・クローニング部位（ＭＣＳ）およびｗｃａＭ（ｄｏｗｎｗｃａＭ）の下流領域の間のオーバーラップＰＣＲを行い、その後、クロラムフェニコールカセット（Ｃｍ）を増幅してクローニングした。
【０１７０】
最初に、断片ｕｐｗｃａＭ−ＴＴ０２を、プライマー Ｏｍｅ１７０３−ＤｗｃａＭ−ＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ （配列番号３９）およびＯｍｅ１７０４−ＤｗｃａＭ−ＴＴ０２−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｒ（配列番号４０）を用いてＰＣＲによって大腸菌 ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。次いで、ＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｗｃａＭ断片を、プライマー Ｏｍｅ１７０５−ＤｗｃａＭ-ＭＣＳ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｆ（配列番号４１）およびＯｍｅ１７０６−ＤｗｃａＭ-ＥｃｏＲＩ−Ｒ（配列番号４２）を用いてＰＣＲによって大腸菌 ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。プライマー Ｏｍｅ１７０４−ＤｗｃａＭ−ＴＴ０２−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｒ（配列番号４０）およびＯｍｅ１７０５−ＤｗｃａＭ−ＭＣＳ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｆ（配列番号４１）は、３６ヌクレオチド長の領域をオーバーラップするようにデザインされていた。最後に、ｕｐｗｃａＭ−ＴＴ０２-ＭＣＳ−ｄｏｗｎｗｃａＭ断片を、ｕｐｗｃａＭ−ＴＴ０２とＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｗｃａＭ アンプリコンを混合して、プライマーＯｍｅ１７０３−ＤｗｃａＭ−ＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ（配列番号３９）およびＯｍｅ１７０６−ＤｗｃａＭ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ（配列番号４２）を用いることによって増幅した。生成する融合ＰＣＲ産物をＨｐａＩによって消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大（ＫＬｅｎｏｗ）断片によって処理されたｐＵＣ１８プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングした。生成するプラスミドをＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳと命名した。
【０１７１】
Ｏｍｅ１７０３−ＤｗｃａＭ−ＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ（配列番号３９）
【化２３】
2013539987.tif 000041
下線を施した大文字の配列は、ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・大文字の配列は、ｗｃａＭ遺伝子の下流の配列に相同性（２１１４９０９−２１１４９３８、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）。
【０１７２】
Ｏｍｅ１７０４−ＤｗｃａＭ−ＴＴ０２-ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｒ（配列番号４０）
【化２４】
2013539987.tif 000042
・太字の大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・下線を施した大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１に相当(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
・大文字の配列は、 ｗｃａＭ遺伝子の下流の配列と相同性（２１１３９２１−２１１３９５０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）。
【０１７３】
Ｏｍｅ１７０５（ＤｗｃａＭ−ＭＣＳ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｆ）（配列番号４１）
【化２５】
2013539987.tif 000043
・太字の大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１の３‘末端配列に相補性 (Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)、
・下線を施した大文字の配列は、マルチプル・クローニング部位: ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩを含む、
・大文字の配列は、ｗｃａＭ遺伝子の上流の配列と相同性（２１１２４９６−２１１２５２５、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）。
【０１７４】
Ｏｍｅ１７０６（ＤｗｃａＭ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ）（配列番号４２）
【化２６】
2013539987.tif 000044
・太字の大文字の配列は、ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・大文字の配列は、ｗｃａＭ遺伝子の上流の配列と相同性（２１１１４９７−２１１１５２７、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）。
【０１７５】
最後に、前記のプライマーＯｍｅ１６０３−Ｋ７_Ｃｍ_ａｍｐｌ_ＳｍａＩ_ＢｓｔＺ１７Ｉ_Ｆ（配列番号９）およびＯｍｅ１６０４−Ｋ７_Ｃｍ_ａｍｐ１_ＨｉｎｄＩＩＩ_Ｒ（配列番号１０）を用いて、プラスミド ｐＫＤ３からのクロラムフェニコールカセットを増幅した。このカセットを、次にプラスミドｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳのＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした。生成するプラスミドをＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−Ｃｍと命名した。
【０１７６】
ＩＩＩ．１．２．  プラスミドｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの構築
ｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍを構築するため、前記のｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１からのＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ消化断片を、ｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−ＣｍのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドを、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍと命名した。
【０１７７】
ＩＩＩ．２．  株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ ｐＫＤ４６の構築
ｗｃａＭ遺伝子をＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ領域に交換するため、プラスミドｐＵＣ１８−ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍをＢｓｐＨＩによって消化し、残りの消化断片ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍをプロトコル１に従って株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６に導入した。
【０１７８】
クロラムフェニコール耐性組換体を選択し、ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ染色体修飾の存在をプライマー Ｏｍｅ１７０７−ＤｗｃａＭ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号４３）およびＯｍｅ１７０８−ＤｗｃａＭ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号４４）（表２）を用いるＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。検証し選択した株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ (ｐＫＤ４６)と命名した。
【０１７９】
ＩＩＩ．３．  ＤｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの株６への形質導入および耐性カセットの除去
ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ 染色体修飾を、前記の株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍからのＰ１ファージ溶解液を用いてプロトコル２に従って株６（表１）に形質導入した。
【０１８０】
クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ染色体修飾の存在をＯｍｅ１７０７−ＤｗｃａＭ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号４３）およびＯｍｅ１７０８−ＤｗｃａＭ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号４４）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍと命名した。
【０１８１】
前記株のゲンタマイシンおよびクロラムフェニコールカセットを、次にプロトコル１に従って除去した。ゲンタマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットを、それぞれプライマーＯｍｅ１５９５−ＤｔｒｅＢ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号２７）およびＯｍｅ１５９６−ＤｔｒｅＢ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号２８）、およびプライマーＯｍｅ１７０７−ＤｗｃａＭ_ｖｅｒｉｆ_Ｆ（配列番号４３）およびＯｍｅ１７０８−ＤｗｃａＭ_ｖｅｒｉｆ_Ｒ（配列番号４４）（表２）を用いてＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを、株１０と命名した。
【０１８２】
ＩＶ．  実施例４：  株１２，ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の構築
【０１８３】
ＩＶ．１．  Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの株１０への形質導入による株１１の構築
前記のＰｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍプロモーター修飾を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：ＣｍからのＰ１ファージ溶解液を用いることによって株１０（表１）に形質導入した。
【０１８４】
クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ染色体修飾を、プライマーＯｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍを、株１１と命名した。
【０１８５】
ＩＶ．２．  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の構築および株１１への導入
リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるために、プラスミドｐＣＬ１９２０から誘導されるプラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を構築した(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)。
【０１８６】
ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７インサートを構築するため、ｇａｐＡプロモーター、そのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびリゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)のｐｙｃＲｅ遺伝子の間のオーバーラップＰＣＲを用いた。 
【０１８７】
最初に、ｇａｐＡプロモーターとＲＢＳ領域（ｇａｐＡ開始コドンの上流の−１５６〜−１領域に相当）を、プライマーＰｇａｐＡ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号４５）とＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−Ｒ（配列番号４６）を用いるＰＣＲによって大腸菌 ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。次に、ｐｙｃＲｅ遺伝子を、プライマー ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ Ｆ（配列番号４７）およびｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７−ＳｍａＩ−Ｒ（配列番号４８）を用いてリゾビウム・エトリＣＦＮ  ４２ゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−Ｒ（配列番号４６）およびＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ Ｆ（配列番号４７）は、４２ヌクレオチド長の領域をオーバーラップするようにデザインされている。最後に、ＰｇａｐＡ−ＲＢＳｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７断片を、プライマーＰｇａｐＡ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号４５）およびｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７−ＳｍａＩ−Ｒ（配列番号４８）を用いてｇａｐＡプロモーター−ＲＢＳとｐｙｃＲｅアンプリコンを混合することによって増幅した。生成する融合ＰＣＲ産物を、プラスミド ｐＣＬ１９２０のＳａｌＩとＳｍａＩ部位の間でクローニングした。生成するプラスミドを、ＤＮＡ配列決定法によって検証し、ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７と命名した。
【０１８８】
ＰｇａｐＡ−ＳａｌＩ−Ｆ （配列番号４５）
【化２７】
2013539987.tif 000045
・下線を施した大文字の配列は、ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｍｅＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・太字の大文字の配列は、ｇａｐＡプロモーター配列と相同性（１８６０６４０−１８６０６５８、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）。
【０１８９】
ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−Ｒ（配列番号４６）
【化２８】
2013539987.tif 000046
・太字の大文字の配列は、ｇａｐＡ遺伝子のプロモーターと相同性（１８６０７７２−１８６０７９１、http://ecogene.org/上の対照配列）、
・大文字の配列は、ｐｙｃＲｅ遺伝子のＧＴＧ開始コドンをＡＴＧに交換したことを除き、ｐｙｃＲｅ遺伝子と相同性（４２３６８８９−４２３６９０６、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/上の対照配列）。
【０１９０】
ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ Ｆ（配列番号４７）
【化２９】
2013539987.tif 000047
・太字の大文字の配列は、ｇａｐＡ遺伝子のプロモーターと相同性（１８６０７７２−１８６０７９１、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）。
・大文字の配列は、ｐｙｃＲｅ遺伝子のＧＴＧ開始コドンをＡＴＧに交換したことを除き、ｐｙｃＲｅ遺伝子と相同性（４２３６８８９−４２３６９０６、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/上の対照配列）。
【０１９１】
ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７−ＳｍａＩ−Ｒ（配列番号４８）
【化３０】
2013539987.tif 000048
・下線を施した大文字の配列は、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・大文字の配列は、Ｔ７ファージ由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列に相当 (Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・斜体大文字の配列は、ＸｈｏＩ制限部位およびエキストラベースについてのもの、
・太字の大文字の配列は、ｐｙｃＲｅ遺伝子の下流の配列と相同性（４２４０３３２−４２４０３８８、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/上の対照配列）。
【０１９２】
次に、ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株１１（表１）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を検証し、生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株１２と命名した。
【０１９３】
Ｖ．  実施例５：  株１３、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの構築
【０１９４】
前記のΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＫＤ４６からのＰ１ファージ溶解液を用いることによってプロトコル２に従って株１１（表１）に形質導入した。
【０１９５】
カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦプロモーター修飾の存在を、プライマーＯｍｅ０７２６−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｆ（配列番号２９）およびＯｍｅ０７２７−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｒ（配列番号３０）を用いるＰＣＲに続いてＤＮＡ配列決定法によって検証し、ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失の存在は、プライマーＯａｇ００５５−ｕｄｈＡＦ２（配列番号３３）およびＯａｇ００５６−ｕｄｈＡＲ２（配列番号３４）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍを、株１３と命名した。
【０１９６】
ＶＩ．実施例６：  株１４ ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの構築
【０１９７】
遺伝子ｕｄｈＡおよびｍｅｔＦは大腸菌染色体上でそれぞれ８９．６１分および８９．０３分と近接しており、ファージ Ｐ１は大腸菌染色体の２分をパッケージすることができるので、遺伝子ｕｄｈＡおよびｍｅｔＦは同時形質導入することができる。そのため、前記のＰｔｒｃ３６−ｍｅｔＦプロモーター修飾およびΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失を、前記の株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＫＤ４６からのＰ１ファージ溶解液を用いることによってプロトコル２に従って株１１（表１）に同時形質導入した。
【０１９８】
カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦプロモーター 修飾の存在を、プライマー Ｏｍｅ０７２６−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｆ（配列番号２９）およびＯｍｅ０７２７−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｒ（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって検証した後、ＤＮＡ配列決定法によって検証した。ＤｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失の存在を、プライマー Ｏａｇ００５５−ｕｄｈＡＦ２（配列番号３３）およびＯａｇ００５６−ｕｄｈＡＲ２（配列番号３４）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍを、株１４と命名した。
【０１９９】
ＶＩＩ．  実施例７：  株１５、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の構築
【０２００】
前記のｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株１３（表１）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を検証し、生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を、株１５と命名した。
【０２０１】
ＶＩＩＩ．  実施例８：  株１８、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の構築
【０２０２】
ＶＩＩＩ．１．  株１３の耐性カセットの除去による株１６の構築
前記の株１３のカナマイシンおよびクロラムフェニコールの耐性カセットを、プロトコル１に従って除去した。カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットの喪失は、プライマーＯａｇ００５５−ｕｄｈＡＦ２（配列番号３３）、Ｏａｇ００５６−ｕｄｈＡＲ２（配列番号３４）、Ｏｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ ΔｕｄｈＡ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を株１６と命名した。
【０２０３】
ＶＩＩＩ．２．  株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの構築
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットＰｎｔＡおよびＰｎｔＢの発現レベルを増加させるため、構成的人工ｔｒｃ３０プロモーターを、プライマーＯｍｅ２１０４ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＲ（配列番号４９）およびＯｍｅ１１５０−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＦ（配列番号３６）を用いてプラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル１に従って株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６中にｐｎｔＡ−ｐｎｔＢオペロンの上流に加えた。
【０２０４】
クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターｔｒｃ３０の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによっておよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍと命名した。
【０２０５】
Ｏｍｅ２１０４ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡ Ｒ（配列番号４９）
【化３１】
2013539987.tif 000049
・大文字の配列は、ｐｎｔＡ遺伝子の上流の配列と相同性（１６７５８７５−１６７５９４０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）、
・下線を施した大文字の配列は、ｔｒｃ３０プロモーター配列
・斜体大文字の配列は、ｐＫＤ３プラスミドのプライマー部位に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
【０２０６】
ＶＩＩＩ．３．  株１６へのＰｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの形質導入による株１７の構築
Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍプロモーター修飾を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：ＣｍからのＰ１ファージ溶解液を用いてプロトコル２に従って株１６に形質導入した。
【０２０７】
クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ｐｔｒｃ０１−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ染色体修飾を、プライマーＯｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。検証し選択した株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍを、株１７と命名した。
【０２０８】
ＶＩＩＩ．４．  株１７へのｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の形質導入による株１８の構築
前記のｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株１７（表１）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を検証し、生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を、株１８と命名した。
【０２０９】
ＩＸ．  実施例９：  株２０、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の構築
【０２１０】
ＩＸ．１．  株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの構築
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットＰｎｔＡおよびＰｎｔＢの発現レベルを増加させるため、構成的人工ｔｒｃ９７プロモーターを、プライマーＯｍｅ２１０５ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＲ（配列番号５０）およびＯｍｅ１１５０−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＦ（配列番号３６）を用いてプラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル１に従って株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６中にｐｎｔＡ−ｐｎｔＢオペロンの上流に加えた。
【０２１１】
クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターｔｒｃ９７の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによっておよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。生成する株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍと命名した。
【０２１２】
Ｏｍｅ２１０５ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＲ（配列番号５０）
【化３２】
2013539987.tif 000050
・大文字の配列は、ｐｎｔＡ遺伝子の上流の配列と相同性（１６７５８７５−１６７５９４０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）、
・下線を施した大文字の配列は、ｔｒｃ９７プロモーター配列
・斜体大文字の配列は、ｐＫＤ３プラスミドのプライマー部位２に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
【０２１３】
ＩＸ．２．  Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの株１６への形質導入による株１９の構築
Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍプロモーター修飾を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ由来のＰ１ファージ溶解液を用いることによってプロトコル２に従って株１６（表１）に導入した。
【０２１４】
クロラムフェニコール耐性形質導入体 を選択し、Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ染色体修飾の存在を、Ｏｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。検証して選択した株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡを株１９と命名した。
【０２１５】
ＩＸ．３．  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の株１９への導入による株２０の構築
前記のｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株１９（表１）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を検証し、生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を、株２０と命名した。
【０２１６】
Ｘ．  実施例１０：株２２，ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の構築
【０２１７】
Ｘ．１．  株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍの構築
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットＰｎｔＡおよびＰｎｔＢの発現レベルを増加させるため、構成的人工ｔｒｃ５５プロモーターを、プライマーＯａｇ  ０６９９−Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ  Ｒ（配列番号５１）およびＯｍｅ１１５０−Ｐｔｒｃ−ｐｎｔＡＦ（配列番号３６）を用いてプラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル１に従って株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６中にｐｎｔＡ−ｐｎｔＢオペロンの上流に加えた。
【０２１８】
クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターｔｒｃ５５の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによっておよびＤＮＡ配列決定法によって検証した。検証し選択した株を、ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍと命名した。
【０２１９】
Ｏａｇ  ０６９９−Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＲ（配列番号５１）
【化３３】
2013539987.tif 000051
・大文字の配列は、ｐｎｔＡ遺伝子の上流の配列と相同性（１６７５８７５−１６７５９４０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上の対照配列）、
・下線を施した大文字の配列は、ｔｒｃ５５プロモーター配列
・斜体大文字の配列は、ｐＫＤ３プラスミドのプライマー部位２に相当(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
【０２２０】
Ｘ．２．  Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ株１６への形質導入
Ｐｔｒｃ９７−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍプロモーター修飾を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ｐＫＤ４６ Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ由来のＰ１ファージ溶解液を用いることによってプロトコル２に従って株１６（表１）に導入した。
【０２２１】
クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ染色体修飾の存在を、Ｏｍｅ１１５１−ｐｎｔＡＦ（配列番号３７）およびＯｍｅ１１５２−ｐｎｔＡＲ（配列番号３８）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。検証して選択した株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＦ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ：：Ｇｔ Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡを株２１と命名した。
【０２２２】
Ｘ．３．  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の株２１への導入による株２２の構築
前記のｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株２１（表１）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を検証し、生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ５５−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を、株２２と命名した。
【０２２３】
ＸＩ．  実施例１１：  株２４，ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ   ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の構築
【０２２４】
ＸＩ．１．  ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍの株１０への形質導入による株２３の構築
前記のΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失を、前記の株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ Ｐｔｒｃ３６−ｍｅｔＦ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＫＤ４６からのＰ１ファージ溶解液を用いることによってプロトコル２に従って株１０（表１）に形質導入した。
【０２２５】
カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦプロモーター修飾の存在を、プライマーＯｍｅ０７２６−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｆ（配列番号２９）およびＯｍｅ０７２７−ＰｔｒｃｍｅｔＦ−Ｒ（配列番号３０）を用いるＰＣＲに続いてＤＮＡ配列決定法によって検証し、ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ欠失の存在は、プライマーＯａｇ００５５−ｕｄｈＡＦ２（配列番号３３）およびＯａｇ００５６−ｕｄｈＡＲ２（配列番号３４）（表２）を用いるＰＣＲによって検証した。生成する株 ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍを、株２３と命名した。
【０２２６】
ＸＩ．２．  株２４：  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の株２３への導入
前記のｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、株２３（表１）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を検証し、生成する株ＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を、株２４と命名した。
【０２２７】
ＸＩＩ．  実施例１２：振盪フラスコでの発酵によるＬ−メチオニンの生産
生産株を小型の三角フラスコ中で評価した。５．５ｍｌの前培養物を、混合培地（２．５ｇ／ｌグルコースおよび９０％最少培地ＰＣ１を含む１０％ＬＢ培地（ＬＢブロス，ミラー  ２５ｇ／ｌ））で３０℃で２１時間増殖させた。これを用いて、ＰＣ１培地の５０ｍｌ培養をＯＤ６００が０．２となるまで植菌した。必要であれば、抗生物質を、カナマイシンおよびスペクチノマイシンについては５０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコールについては３０ｍｇ／ｌ、およびゲンタマイシンについては１０ｍｇ／ｌの濃度で加えた。培養の温度は、３７℃に２時間、４２℃に２時間、および次に３７℃に培養の終了まで維持した。培養物のＯＤ６００が５〜７に達したところで、細胞外アミノ酸をＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化の後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物を、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。それぞれの株について、数回反復した。
【０２２８】
【表３】
2013539987.tif 000052
【０２２９】
【表４】
2013539987.tif 000053
【０２３０】
細胞外メチオニン濃度は、ＯＰＡ／ＨＰＬＣ誘導体化の後にＨＰＬＣによって定量した。残留グルコース濃度は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収率は、下記のように表された：
【０２３１】
【数２】
2013539987.tif 000054
【０２３２】
表４に見られるように、メチオニン/グルコース収率（Ｙｍｅｔ）は、ｐｎｔＡＢ過剰発現および／またはｕｄｈＡ欠失によって増加する（株７に比較して株９および１４、および株１０に比較して株１２、１３、１５および２４）。
【０２３３】
収率の向上は、ｍｅｔＦ遺伝子の過剰発現が強いときには更に良好である。ｍｅｔＦ遺伝子の前にｍＲＮＡ安定化配列とｐｎｔＡＢ過剰発現およびｕｄｈＡ欠失とを両方とも含む株１３は、Ｃ１経路の強力な過剰発現のない株１４より高い収率を示す。
【０２３４】
ＸＩＩＩ．  実施例１３： トランスヒドロゲナーゼおよび５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性
実施例１２の表４に記載の結果を、それぞれＰｎｔＡＢおよびＭｅｔＦ（表５）によって行ったトランスヒドロゲナーゼおよび５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性の分析によって確かめる。小型の三角フラスコでの培養では、いずれの活性も過剰発現によって増加する。
【０２３５】
【表５】
2013539987.tif 000055
【０２３６】
酵素活性のイン・ビトロ測定のために、大腸菌株を前記の最少培地で培養した。抽出法に先立って、細胞を遠心分離によって培養液から回収した。ペレットを低温の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁し、細胞をＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（Bertin Technologies; ５０００ｒｐｍで２ｘ１０秒間、２つの工程の間に氷上に２分間）を用いるビーズ破砕によってリーシスした後、１２０００ｇ（４℃）で３０分間遠心分離した。上清を脱塩し、分析に用いた。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析試薬を用いて測定した。
【０２３７】
トランスヒドロゲナーゼ活性（ＴＨ）は、前記したように分析した (Yamagushi and Stout, 2003)。サイクリック・トランスヒドロゲナーゼ活性は、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、１０μＭ ＮＡＤＰＨを含むまたは含まない０．２ｍＭ ＡｃＰｙＡＤ、および６μｇの粗細胞抽出物を含む３７℃反応混合物で３７５ｎｍで３０分間分光光度法により分析した。総ての結果は、少なくとも３回の測定の平均値である。
【０２３８】
５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性（ＭＴＨＦＲ）は、幾らかの改変を加えた前記の方法で分析した(Matthews, 1986)。この方法は、式（１）に示されている。
(1)       メチル−ＴＨＦ+ メナジオン→メチレン−ＴＨＦ+メナジオール
【０２３９】
メチル−ＴＨＦは基質として用いられ、メチレン−ＴＨＦの形成は、ホルムアルデヒドを生成するメチレン−ＴＨＦの酸分解によって測定される。生成したホルムアルデヒドは指示薬ＮＢＤＨと反応して、５３０ｎｍでの蛍光性の強いヒドラゾン誘導体を形成する。５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性は、 was assayed for 30 minutes at 37°C in a reaction mixture containing ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．７）、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、２０％メタノール／８０％Ｈ２Ｏ中のメナジオンの飽和溶液、および粗細胞抽出物２０μｇを含む反応混合物中で３７℃で３０分間分析を行った。インキュベーションの後、反応を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）を加え、試験管を１００℃のヒーターブロックに２分間置くことによって終結させる。１００００ｇで５分間遠心分離を行った後、生成したホルムアルデヒドを、９５％エタノール／６％リン酸中０．００１％  ＮＢＤＨを加えることによって、ＦＬｘ８００蛍光マイクロプレートリーダー(Biotek)を用いて分析する。
【０２４０】
ＸＩＶ．  実施例１４： バイオリアクターでの発酵によるＬ−メチオニンの生産
実質的量の対象の代謝物を生産した株を、次にフェドバッチ法を用いて２．５Ｌ発酵装置 (Pierre Guerin) 中で生産条件下にて試験した。
【０２４１】
簡単に言えば、２．５ｇ／ｌのグルコースを加えた１０ｍｌ  ＬＢ配置で増殖した２４時間培養物を用いて、最少培地（Ｂ１ａ）に２４時間前培養を植菌した。これらのインキュベーションは、回転式振盪機（２００ＲＰＭ）中５０ｍｌの最少培地を含む５００ｍｌジャマ板付きフラスコで行った。最初の前培養は３０℃の温度で行い、第二の前培養は３４℃の温度で行った。
【０２４２】
第三の前培養工程は、１．２ｇ／ｌのバイオマス濃度に５ｍｌの濃縮前培養を植菌した２００ｍｌの最少培地（Ｂ１ｂ）を満たしたバイオリアクター(Sixfors)で行った。前培養温度は３４℃の一定に維持し、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて６．８の値に自動的に調整した。溶存酸素濃度は、空気供給および／または撹拌により３０％の値の空気分圧飽和に連続的に調整した。バッチ培地からグルコースが枯渇した後、フェドバッチを初期流速０．７ｍｌ／時で開始し、約１８ｇ／ｌの最終細胞濃度を得るため、０．１３／時の増殖速度で２４時間指数的に増加させた。
【０２４３】
【表６】
2013539987.tif 000056
【０２４４】
【表７】
2013539987.tif 000057
【０２４５】
【表８】
2013539987.tif 000058
【０２４６】
【表９】
2013539987.tif 000059
【０２４７】
次に、２．５Ｌ発酵装置 (Pierre Guerin)に６００ｍｌの最少培地（Ｂ２）を満たし、２．１ｇ／ｌのバイオマス濃度に５５〜７０ｍｌの前培養容積を植菌した。
【０２４８】
培養温度は３７℃の一定に維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液（１０％ＮＨ４ＯＨを９時間、および２８％ＮＨ４ＯＨを培養終了まで）の自動添加によって作業値に維持した。初期撹拌速度は、バッチ期中は２００ＲＰＭに設定し、フェドバッチ期中は１０００ＲＰＭまで増加させた。初期気流速度は、バッチ期は４０ＮＬ／時に設定し、フェドバッチ期の開始時には１００ＮＬ／時まで増加させた。溶存酸素濃度は、２０〜４０％、好適には撹拌を増加させることによって３０％の値に維持した。
【０２４９】
細胞質量が５ｇ／ｌ付近の濃度に到達したときに、フェドバッチを５ｍｌ／時の初期流速で開始した。供給溶液を、増殖の２６時間後に２４ｍｌ／時に達した増加流速と共にシグモイド曲線に従って注入した。正確な供給条件は、式：
【数３】
2013539987.tif 000060
（式中、Ｑ（ｔ）は、バッチ容積６００ｍｌについてｍｌ／時での供給流速であり、ｐ１＝１．８０、ｐ２＝２２．４０、ｐ３＝０．２７０、ｐ４＝６．５である）
に従って計算した。
【０２５０】
２６時間後、フェドバッチ供給溶液ポンプを停止し、培養をグルコースの枯渇後に終了した。
【０２５１】
細胞外アミノ酸は、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化の後に定量し、他の関連代謝物は、屈折率測定検出（有機酸およびグルコース）を用いるＨＰＬＣおよびシリル化後にＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０２５２】
【表１０】
2013539987.tif 000061
* 株１０および１３は、それぞれ４９．１および５５．５ｇ／ｌのチオ硫酸アンモニウム、およびフェドバッチ培地ではチオ硫酸マグネシウムの代わりに５ｇ／ｌの硫酸マグネシウムを用いて培養した。バッチ培地は、この２つの株についてチオ硫酸マグネシウムの代わりに１ｇ／ｌの硫酸マグネシウムを含んでいた。
【０２５３】
フラスコ実験で前記したように、同様にバイオリアクターでは、メチオニン／グルコース収率（Ymet max）は、ｐｎｔＡＢ過剰発現および／またはｕｄｈＡ欠失によって増加する（表１０の株１０および１３を比較されたい）。
【０２５４】
更に、本発明者らは、ｐｎｔＡＢ過剰発現のファイン・テューンド・レギュレーション(fine tuned regulation)が、上表１０の株１２、１５、１８、２０および２２で見られるようにメチオニン生産を向上させたことを示している。メチオニン生産は、ｐｎｔＡＢ遺伝子の発現レベルによって調節され、本発明者らは、それがｐｎｔＡＢの中位の過剰発現で一層良好であることを示している。
【０２５５】
発酵槽容積は、初期容積に、ｐＨを調節しかつ培養物を供給するために加えた溶液の量を加え、試料採取に用いおよび蒸発によって失われた容積を差し引くことによって計算した。
【０２５６】
フェドバッチ容積に続いて、供給ストックの計量を行った。次いで、注入したグルコースの量を、注入重量、溶液の密度およびＢｒｉｘの方法によって測定したグルコース濃度に基づいて計算した（［グルコース］）。メチオニン収率は、下記のように表された:
【数４】
2013539987.tif 000062
培養中に得られた最大収率を、ここではそれぞれの株について示した。
【０２５７】
メチオニン0およびメチオニンtについては、それぞれ、初期および最終メチオニン濃度であり、V0およびVtは初期およびｔ時点での容積である。
【０２５８】
消費されたグルコースは、下記のようにして計算した:
【数５】
2013539987.tif 000063
注入したグルコースt = フェド容積t(fed volumet ) * [グルコース]
消費されたグルコースt = [グルコース]0 * V0 + 注入したグルコース - [グルコース]残留 * Vt
[グルコース]0、[グルコース]、[グルコース]残留は、それぞれ初期、フェドおよび残留グルコース濃度である。
【０２５９】
ＸＶ．  実施例１５： トランスヒドロゲナーゼ活性
実施例１４の表１０に記載の結果は、ＰｎｔＡＢ（表１１）によって行ったトランスヒドロゲナーゼ活性の分析によって確かめられる。フラスコ実験で以前に観察されたように、
トランスヒドロゲナーゼ活性はｐｎｔＡＢの過剰発現によって増加する（表１１の株１０および１３参照）。更に、ｐｎｔＡＢ過剰発現のファイン・テューンド・レギュレーションは、表１１の株１８で見ることができるようにトランスヒドロゲナーゼ活性を約１０倍減少させた。
【０２６０】
【表１１】
2013539987.tif 000064
【０２６１】
トランスヒドロゲナーゼ活性（ＴＨ）は、実施例１３で前記した方法で分析した。総ての結果は、少なくとも３回の測定の平均値である。
【０２６２】
参考文献
2013539987.tif 000065
2013539987.tif 000066
【配列表】
2013539987000001.app
【国際調査報告】
2013539987.tif 000067
2013539987.tif 000068
2013539987.tif 000069