(57)【要約】本発明は薬化学分野に属し、詳しくは以下の一般式Ｉに示される２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物及びその調製方法、ならびに該化合物を含む医薬組成物に関する。当該化合物は、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性と抗Ｃ型肝炎ウイルス活性とを同時に有し、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の治療に用いられ、且つ、薬物動力学試験により該化合物が良い生体利用効率を有することを示した。2013522328.tif 000073
2013522328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式Ｉに示される２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物。
【化１】
2013522328.tif 000056
Ｉ
（上記式において、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立にＨ若しくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基であり；
Ｒ３は、少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキル基、少なくとも一つのＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキル基、少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されたＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、若しくは少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたＣ２〜Ｃ６のアルケニル基であり；
Ｘは、ハロゲン原子である。）
【請求項２】
前記Ｒ１は、Ｈ、メチル基若しくはエチル基であり、Ｒ２はＨであることを特徴とする請求項１に記載の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物。
【請求項３】
前記Ｒ３は、１つまたは２つのヒドロキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基、１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基、１つのフッ素原子、塩素原子若しくは臭素原子で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基、メチルプロペニル基、メトキシプロペニル基、若しくはフッ化メチルプロペニル基であることを特徴とする請求項１または２に記載の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物。
【請求項４】
前記Ｒ３は、１つまたは２つのヒドロキシ基で置換された４つの炭素原子を含むアルキル基、１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換された４つの炭素原子を含むアルキル基、４つの炭素原子を含むフッ化アルキル基、２−メチルプロペニル基、２−メトキシプロペニル基、若しくは２−フッ化メチルプロペニル基であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物。
【請求項５】
前記ＸはＦであり、または４位Ｆ置換基であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物。
【請求項６】
前記２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物は、以下の化合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物。
【化２】
2013522328.tif 000057
【化３】
2013522328.tif 000058
【化４】
2013522328.tif 000059
【化５】
2013522328.tif 000060
【化６】
2013522328.tif 000061
【化７】
2013522328.tif 000062
【化８】
2013522328.tif 000063
【化９】
2013522328.tif 000064
【化１０】
2013522328.tif 000065
【化１１】
2013522328.tif 000066
【化１２】
2013522328.tif 000067
【化１３】
2013522328.tif 000068
及び
【化１４】
2013522328.tif 000069
【請求項７】
以下のルート３、ルート４、若しくはルート５により調製することを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の調製方法。
【化１５】
2013522328.tif 000070
ルート３
（ここで、２’，２−ビスチアゾール蟻酸メチルが、溶媒であるエチレングリコールと高い温度で、親核試薬であるハロゲン化ベンジルアミンと反応して、２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を得る。）；
若しくは、
【化１６】
2013522328.tif 000071
ルート４
（ここで、２’，２−ビスチアゾール蟻酸メチルが加水分解されて対応する酸に転化され、当該酸が塩化オキサリルと反応して酸クロリドに転化された後、当該酸クロリドがハロゲン化ベンジルアミンと反応して２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を得る。）；
若しくは、
【化１７】
2013522328.tif 000072
ルート５
（ここで、２’，２−ビスチアゾール蟻酸メチルが加水分解されて対応する酸に転化され、当該酸が凝縮剤であるＥＤＣＩ（１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）の存在下で、ハロゲン化ベンジルアミンと反応して、２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を得る。）；
（なお、前記反応式におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸの定義は、引用された請求項におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸの定義と同じである。）
【請求項８】
活性成分として請求項１〜６のいずれか１項に記載された２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物中の一種若しくは多種を含み，さらに一般の医薬用添加剤を含む、抗Ｂ型及び／またはＣ型ウイルス肝炎の医薬組成物。
【請求項９】
Ｂ型及び／またはＣ型ウイルス肝炎の治療薬物の調製における、請求項１〜６のいずれか１項に記載された前記２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の使用。
【請求項１０】
Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の患者に、治療有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載された前記２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を投与することを含む、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬化学分野に属し、詳しくは２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物及びその調製方法、ならびに該化合物を含む医薬組成物に関する。該化合物は、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性と抗Ｃ型肝炎ウイルス活性とを同時に有し、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の治療に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染性肝炎は、現在国際公認の治療学の難題で、最も普通且つ危害性が最も大きい肝炎であり、強い伝染性を有する。通常、肝炎を誘発するウイルスは、主にＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型の５つの型がある。Ａ型とＥ型肝炎ウイルスは、腸管を介して感染し、水源あるいは食べ物を汚染すると疾患の大流行を起こすが、慢性病に移行することもないし、肝硬変を起こることもなく、且つ、患者が該型の肝炎を患った後に永久免疫となる。Ｂ型、Ｃ型及びＤ型の肝炎ウイルスはいずれも血液を介して感染し、少数の場合には、患者の唾液、精液または乳汁などと緊密に接触することにより感染を誘発することができ、例えば、夫婦間感染、母子間感染することがある。肝炎ウイルスのうちのＢ型（ＨＢＶ）、Ｃ型（ＨＣＶ）とＤ型（ＨＤＶ）に急性感染した後、慢性肝炎に移行する比率が８０％以上であり、このうち、２０％の慢性肝炎は感染が持続すると肝硬変に移行する可能性があり、１％〜５％の肝硬変が肝臓癌になる。
【０００３】
中国はウイルス性肝炎の高発生区域であり、Ｂ型肝炎ウイルスのキャリアが１．２億であり、毎年ウイルス肝炎による直接な経済損失は３００〜５００億人民元程になる。Ｃ型肝炎はグローバル化流行の傾向を呈し、欧米及び日本等の国の末期肝臓病の最も主な要因となっている。世界保健機構（ＷＨＯ）の統計データによると、世界におけるＨＣＶの感染率が約３％であり、約１．７億人がＨＣＶを感染しており、毎年Ｃ型肝炎の初発病例が約３．５万例である。国立血清疫学の調査資料により、中国の通常人のＨＶ抗体陽性率は３．２％である。
【０００４】
ＨＢＶとＨＣＶは、いずれも肝炎ウイルスであって、近似の感染ルートを有しているが、異なるウイルス属に属する。ＨＢＶはヘパドナウイルス科（hepadnaviridae）に属し、部分二重鎖環状ＤＮＡウイルスであるが、ＨＣＶはフラビウイルス科（flaviviridae）に属し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。現在、臨床的に、抗ＨＢＶ薬は多くあり、且つ主にヌクレオシド系薬であり、例えば、ラミブジン（lamivudine）、ファムシクロビル（famciclovir）、ロブカビル（lobucavir）、アデフォビルピボキシル（adefovir dipivoxiil）、ＦＴＣ（２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン）、ＦＭＡＵ（フルオロ−メチル−アラビノフラノシルウリジ）、ＦＤＤＣ（ジデオキシペントフラノシルフルオロシトシン）、ＢＭＳ  ２００４７５（炭素環状２'−デオキシグアノシンヌクレオシド）及びエンテカビル（enticavir）等がある。ＨＢＶウイルスとＨＣＶウイルスの類型が異なるため、従来のＨＢＶの治療薬物はＨＣＶの治療に用いることができない。ＨＣＶに対しては、臨床的有効な低分子薬物がなく、現在最も有効なＨＣＶ治療案は、インターフェロン−広域抗ウイルス製剤の併用、例えば、インターフェロンとリバビリンの併用であるが、当該治療案の持続効果が４０％未満であり、且つ副作用が大きい。
【０００５】
そのため、ウイルス肝炎の治療薬物の探索と開発は、ずっと国内外医薬学者の重要な課題である。
【０００６】
国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２００７／００１８６１（国際公開番号ＷＯ２００７／１４７３３６）は、本発明者による過去の国際特許出願であり、具体的には、複素環非ヌクレオシド系化合物およびその抗Ｂ型肝炎ウイルスの生物活性が開示され、且つ，該化合物がＢ型肝炎の治療に用いられることが開示される。しかし、本発明者は、さらに研究を行った結果、該化合物のある薬物代謝パラメータ、特に生体利用効率が低いことが発見された。例えば、雄性ラット（１０ｍｇ／ｋｇ）において、化合物Ｗ２８Ｆの経口投与の場合の生体利用効率が２．８０％である。そのため、これらの化合物に強い抗ウイルス活性を保持させるとともに、これらの生体利用効率を改善させるように、該化合物構造をさらに改良することが必要となる。
【０００７】
本発明者は、そのうちの２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の元の化合物構造を基礎とし、チアゾール環の５位の側鎖にヒドロキシ基、ハロゲン原子若しくは二重結合を導入して得られた化合物は、原化合物の抗Ｂ型肝炎ウイルスの生物活性を保持するとともに、原化合物の生体利用効率を有効的に改善した。本発明者は、さらに鋭意研究を重ねた結果、この新規な２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物は、抗Ｂ型肝炎ウイルスの活性を有するとともに、抗Ｃ型肝炎ウイルスの生物活性も有することを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１４７３３６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのため、本発明は、新規な２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を提供することを目的としている。
【００１０】
また、本発明は、本発明に係る２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の調製方法を提供することを目的としている。
【００１１】
また、本発明は、活性成分として本発明に係る２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を含む、抗Ｂ型及び／またはＣ型肝炎ウイルス阻害剤である医薬組成物を提供することを目的としている。
【００１２】
また、本発明は、Ｂ型及び／またはＣ型ウイルス性肝炎の治療用薬物の調製における、本発明に係る２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の用途を提供することを目的としている。
【００１３】
また、本発明は、Ｂ型若しくはＣ型ウイルス肝炎の治療方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一形態によれば，本発明は、下記の一般式Ｉに示される２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を提供する。
【化１】
2013522328.tif 000003
Ｉ
上記式において、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立にＨ若しくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基であり、より好ましくは、前記Ｒ１はＨ、メチル基またはエチル基であり、Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は、少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキル基、少なくとも一つのＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキル基、少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されたＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、若しくは少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたＣ２〜Ｃ６のアルケニル基であり、好ましくは、前記Ｒ３は、１つまたは２つのヒドロキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基、１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基、１つのフッ素原子、塩素原子または臭素原子で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基、メチルプロペニル基、メトキシプロペニル（methylolpropenyl）基、若しくはフッ化メチルプロペニル（fluomethylolpropenyl）基であり、最も好ましくは、前記Ｒ３は、１つまたは２つのヒドロキシ基で置換された４つの炭素原子を含むアルキル基、１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換された４つの炭素原子を含むアルキル基、４つの炭素原子を含むフッ化アルキル基、２−メチルプロペニル基、２−メトキシプロペニル（2-methylolpropenyl）基、若しくは２−フッ化メチルプロペニル（2-fluomethylolpropenyl）基であり；
Ｘはハロゲン原子であり、Ｆであることが好ましく、４位Ｆ置換基であることが最も好ましい。
【００１５】
本発明において、以下のように定義する。即ち、前記アルキル基は直鎖または分岐鎖アルキル基を含み、前記アルケニル基は直鎖または分岐鎖のアルケニル基を含み、前記ハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩを含む。
【００１６】
本発明に係る２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物は、以下の化合物からなる群より選択されるものであることが最も好ましい。
【００１７】
【化２】
2013522328.tif 000004
【化３】
2013522328.tif 000005
【化４】
2013522328.tif 000006
【化５】
2013522328.tif 000007
【化６】
2013522328.tif 000008
【化７】
2013522328.tif 000009
【化８】
2013522328.tif 000010
【化９】
2013522328.tif 000011
【化１０】
2013522328.tif 000012
【化１１】
2013522328.tif 000013
【化１２】
2013522328.tif 000014
【化１３】
2013522328.tif 000015
及び
【化１４】
2013522328.tif 000016
【００１８】
本発明に係る２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物は、中間体４を原料として合成を行って得られることができる。中間体４の合成は、国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２００７／００１８６１（国際公開番号ＷＯ２００７／１４７３３６）の方法を参照することができ、若しくは以下のルートにより実現することができる（ルート１）。
【００１９】
【化１５】
2013522328.tif 000017
ルート１
【００２０】
反応式において、Ｒ１とＲ２の定義は、上記のとおりであり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。
【００２１】
具体的に、中間体２−ブロムチアゾール１と活性化亜鉛粉によって亜鉛試薬が得られた後、得られた亜鉛試薬と他の中間体２−ブロムチアゾール中間体３が、酢酸パラジウムの触媒作用下で、Ｎｅｇｉｓｈｉカップリング反応を介して、中間体２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４が得られた。
【００２２】
中間体２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４を原料として、側鎖に対して一連の官能基の転化を行うことにより、側鎖がヒドロキシ基、アルコキシ基またはハロゲン原子（例えば、フッ素原子）で置換された複数種の中間体、即ち２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４ａ〜４ｉを調製することができる（Ｒ４がイソブチル基であることを例として説明したが、この限りではない）（ルート２）。
【００２３】
例えば、溶媒である四塩化炭素で、５−イソブチル−２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４とＮＢＳ（Ｎ−ブロムスクシンイミド）と反応させて臭化物が得られ、該臭化物を硝酸銀で処理した後、ヒドロキシ置換中間体４ａが得られ；得られた中間体４ａをＤＡＳＴ（三フッ化ジエチルアミノ硫黄）で処理した後、フッ化中間体４ｂを得る。
【００２４】
トルエン中で、上記臭化物をアルカリＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）で処理した後、中間体アルケニル４ｃが得られ；中間体アルケニル４ｃがｍ−ＣＰＢＡと作用した後、更にエポキシ化合物に転化し、該エポキシ化合物がＰｄ−Ｃの水素化により、選択的にエポキシ環を開環し、ヒドロキシ置換中間体４ｄが得られ；中間体４ｄをＤＡＳＴで処理した後、フッ化中間体４ｅを得る。
【００２５】
中間体アルケニル４ｃが、混合溶媒であるイソプロパノール・水中で、オスミン酸カリウムの触媒作用を介して、ジヒドロキシル化反応を起こし、中間体ジヒドロキシ化合物４ｆを得る。
【００２６】
中間体アルケニル４ｃが、溶媒であるジオキサンで二酸化セレンと反応した後、中間体アルデヒドを得ることもでき、該中間体アルデヒドが、水素化硼素ナトリウムにより還元された後、中間体ヒドロキシ化合物４ｇが得られ；化合物４ｇをさらにＤＡＳＴで処理した後、フッ化中間体４ｈを得る。
【００２７】
ヒドロキシ置換中間体４ａが、ＮａＨの作用下で、ハロゲン化炭化水素Ｒ５Ｘ（Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基である）とアルキル化し、アルコキシ置換中間体４ｉを得ることもできる。
【００２８】
【化１６】
2013522328.tif 000018
ルート２
【００２９】
中間体４から、以下のルートを通じて本発明に係る２'，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の合成を実現することができる。（ルート３，ルート４とルート５）：
【００３０】
【化１７】
2013522328.tif 000019
ルート３
【００３１】
【化１８】
2013522328.tif 000020
ルート４
【００３２】
【化１９】
2013522328.tif 000021
ルート５
【００３３】
その中、上記反応式におけるＲ１、Ｒ２及びＲ３の定義は上記の通りである。
【００３４】
具体的に、中間体２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４は、加水分解を通じなく、直接に溶媒であるエチレングリコールと高い温度で、親核試薬であるハロゲン化ベンジルアミンと反応して、本発明に係る２'，２−ビスチアゾール複素環化合物を得ることもできる。
【００３５】
若しくは、中間体２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４が加水分解されて対応する酸に転化され、当該酸が塩化オキサリルと反応して酸クロリドに転化された後、当該酸クロリドがハロゲン化ベンジルアミンと反応して本発明に係る２'，２−ビスチアゾール系複素環化合物を得ることもできる。
【００３６】
若しくは、中間体２'，２−ビスチアゾール蟻酸メチル４が加水分解を介して対応する酸に転化され、当該酸が凝縮剤である、例えばＥＤＣＩ（１−エチル基−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）の存在下で、ハロゲン化ベンジルアミンと反応して、本発明に係る２'，２−ビスチアゾール系複素環化合物を得ることもできる。
【００３７】
本発明に係る新規な２'，２−ビスチアゾール系複素環非ヌクレオシド系化合物は、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスに対抗する活性を同時に有し、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の治療に用いられ、且つ、薬物動力学試験により該化合物が良い生体利用効率を有することを示しており、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の治療薬物の調製に用いられる。
【００３８】
本発明は、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の患者に治療有効量の本発明の２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を投与することを含む、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の治療方法を提供する。
【００３９】
本発明は、抗Ｂ型ウイルス性肝炎及び／またはＣ型ウイルス性肝炎の医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、活性成分として本発明に係る２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物中の一種若しくは多種を治療有効量で含み，さらに一般の医薬用添加剤、例えば分散剤、賦形剤、崩壊剤、酸化防止剤、甘味剤、コーティング剤などを含む。当該組成物は、薬学分野の慣用の調製方法により調製することができ、且つ各種の慣用の剤形、例えば錠剤、コーティング錠、カプセル及び粉末製剤などに製造されることができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、新規な２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物を設計及び合成した。当該化合物は、Ｂ型とＣ型肝炎ウイルスの複製を有効的に抑制でき、Ｂ型とＣ型ウイルス性肝炎の治療に用いることが可能である。発明者による過去の国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２００７／００１８６１（国際公開番号のＷＯ２００７／１４７３３６）に開示された類似的な化合物と比べて、本発明に係る新規な２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物は、その抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を保持するとともに、当該の化合物は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性も更に有し、且つ、側鎖に二重結合、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びハロゲン原子などの極性基を導入するので、原化合物の生体利用効率低下の欠点を克服し、より良い開発見通しが表れる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、本発明に対して、具体的な実施例を挙げて詳しい説明を行う。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
＜化合物の調製実施例＞
以下の調製実施例において、ＮＭＲは、Ｖａｒｉａｎ製造Ｍｅｒｃｕｒｙ−Ｖｘ  ３００Ｍ型機器により測定した。ＮＭＲ校正：δＨ  ７．２６ｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）；質量分析器として、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳを使用し；試薬は、主に上海化学試剤公司から提供され、ＴＬＣ薄層クロマトグラフィシリカゲル平板は、山東烟台会友硅膠開発有限公司（Huiyou silica development company, Yantai, Shandong）から提供され、タイプはＨＳＧＦ  ２５４であり；化合物の精製に使用される順相カラムクロマトグラフィシリカゲルは、山東青島海洋化工工場の子工場から提供され、タイプはｚｃｘ−１１、２００〜３００目である。
【００４３】
［調製実施例１  中間体２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチルの合成］
（１）５−イソブチル−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２０】
2013522328.tif 000022
活性化Ｚｎ粉末（８４ｇ）を２Ｌの三口フラスコに添加して、新鮮なＴＨＦ（６００ｍＬ）を添加した。内部温度を６０℃程度まで加熱し、２−ブロムチアゾール（２００ｇ）の乾燥ＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液を滴下し始め、約３〜４時間にわたって滴下を完成させ、その後還流反応を１．５時間続けた。得られた亜鉛試薬を、２−ブロム−５−イソブチルチアゾール−４−蟻酸メチル（２３３ｇ）、酢酸パラジウム（９．４ｇ）及びトリフェニルホスフィン（２２ｇ）が溶解されている乾操トルエン（１．２Ｌ）溶液に移し、８０℃〜８５℃まで加熱して、１〜１．５時間保温反応を行う。室温まで冷却した後、この反応混合物中に５％ＨＣｌ（２Ｌ）を添加し、有機相を抽出し、水相を酢酸エチルで抽出する。有機相を合併して、５％ＨＣｌで洗浄し、濃縮してオフブラックの油状物を得て、メタノールにおいて再結晶して浅黄色固体（１６２ｇ）である５−イソブチル−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチルを得た。そのモル収率は６９％である。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．００（ｓ，３Ｈ）、１．０２（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｍ，１Ｈ）、３．１７−３．１９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．９６（ｓ，３Ｈ），７．４６−７．４７（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．８７−７．８８（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０５．１（Ｍ＋Ｎａ）+（Ｃ１２Ｈ１４Ｎ２ＮａＯ２Ｓ２理論値：３０５．０４）。
【００４４】
（２）５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２１】
2013522328.tif 000023
５−イソブチル−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（２．２ｇ）を四塩化炭素（６０ｍＬ）とジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、ＮＢＳ（Ｎ−ブロムスクシンイミド、１．８ｇ）とＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル、O．２ｇ）を添加した後、加熱しながら３時間還流し、ＴＬＣで反応終了を確認し、濃縮した後、得られた残余物を酢酸エチルで希釈し、水で有機相を洗浄し、乾操して濃縮し、得られた残余物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して浅黄色固体である５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（８ｇ）を得た。その収率は定量に近づいた。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．２４（ｍ，１Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）、６．１１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００４５】
（３）５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２２】
2013522328.tif 000024
５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（２３５ｍｇ）をメタノール（７ｍＬ）に溶解し、水（３ｍＬ）とＡｇＮＯ３（４３５ｍｇ）を添加して、室温下で４８時間反応させ、ＴＬＣで検査して大部分の原料が消滅していることを確認した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して得た残余物を水で希釈し、酢酸エチルで十分に抽出し、有機相を合併し、乾操して濃縮した後、得られた粗い製品をカラムクロマトグラフィで分離して白色に近い固体である５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（８１ｍｇ）を得た。そのモル収率は４２％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．００（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．２１（ｍ，１Ｈ）、３．９６（ｓ，３Ｈ）、５．３２（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００４６】
（４）５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２３】
2013522328.tif 000025
５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（１．２ｇ）をトルエン（５０ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１．５ｇ）を添加し、加熱しながら３時間還流反応させ、ＴＬＣで反応終了を確認した。反応混合物を酢酸エチルで希釈した後、水、５％塩酸及び飽和食塩水のそれぞれで洗浄し、乾操して濃縮し、残余物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した後、浅黄色固体である５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（０．７３ｇ）得た。そのモル収率は７９％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．０６（ｓ，６Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００４７】
（５）５−［２−（３，３−ジメチルエポキシエチル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２４】
2013522328.tif 000026
５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（４２６ｍｇ）をクロロホルム（２５ｍＬ）に溶解し、ｍ−ＣＰＢＡ（３−メタクロロ過安息香酸，６００ｍｇ）を添加し、室温で３時間反応させ、ＴＬＣで反応終了を確認した。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と飽和重亜硫酸ナトリウム水溶液のそれぞれで洗浄し、有機層を抽出し、乾操して濃縮し、得られた粗い製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色結晶性粉末である５−［２−（３，３−ジメチルエポキシエチル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（３００ｍｇ）を得た。そのモル収率は６７％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．２３（ｓ，３Ｈ）、１．５６（ｓ，３Ｈ）、３．９９（ｓ，３Ｈ）、４．４２（ｓ，１Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００４８】
（６）５−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２５】
2013522328.tif 000027
５−［２−（３，３−ジメチルエポキシエチル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（２００ｍｇ）をメタノール（１５０ｍＬ）に溶解し、触媒であるＰｄ−Ｃ（１０％，１０ｍｇ）を添加し、水素で十分に置換した後、室温で５時間反応し、ＴＬＣで反応終了を確認した。Ｎ２で置換した後、反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、残余物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで処理して、白色に近い固体である５−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（２００ｍｇ）を得た。その収率は定量に近づいた。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．３４（ｓ，６Ｈ）、３．５１（ｓ，２Ｈ）、３．９７（ｓ，３Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００４９】
（７）５−（１，２−ジヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２６】
2013522328.tif 000028
５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（５００ｍｇ）をイソプロパノール（２０ｍＬ）と水（１５ｍＬ）の混合溶媒中に溶解し、上記反応混合物にオスミン酸カリウム（２５ｍｇ）、Ｎ−メチル−Ｎ−酸化モルホリン（ＮＭＯ、５０％）（５５０ｍｇ）を添加し、室温で一晩反応させ、翌日にＴＬＣで反応終了を確認した。混合物を飽和重亜硫酸ナトリウム水溶液で急冷し、酢酸エチルで抽出し、有機相を合併し、飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濾過及び濃縮を行って、ベージュ油状物である５−（１，２−ジヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（４９４ｍｇ）を得た。そのモル収率は８７％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．２１（ｓ，３Ｈ）、１．５３（ｓ，３Ｈ）、３．８９（ｓ，３Ｈ）、４．３２（ｓ，１Ｈ）、７．４９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００５０】
（８）５−［１−（２−ホルミルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２７】
2013522328.tif 000029
５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（５０ｍｇ）をジオキサン（５ｍＬ）に溶解し、二酸化セレン（３０ｍｇ）を添加して、３時間還流反応させ、ＴＬＣで検査して原料が実質的に消滅していることを確認した。反応混合物を濃縮して、残余物をジクロロメタンで溶解した後、シリカゲルカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝５／１（体積比）で溶出する）に移して精製し、黄色固体である５−［１−（２−ホルミルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（３lｍｇ）を得た。そのモル収率は６０％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１０（ｓ，３Ｈ）、３．９７（ｓ，３Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．４９（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）、９．６９（ｓ，１Ｈ）。
【００５１】
（９）５−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２８】
2013522328.tif 000030
５−［１−（２−ホルミルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（１２２ｍｇ）をメタノール（８０ｍＬ）とＤＭＦ（１０ｍＬ）の混合溶媒に添加し、触媒であるＰｄ−Ｃ（１０％、１０ｍｇ）を添加し、水素で十分に置換した後、室温で一晩反応した。翌日にＴＬＣで反応終了を確認し、Ｎ２で置換した後、反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、残余物を酢酸エチルで希釈した後、水で三回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濾過及び濃縮を行って無色に近い油状物である５−（２−ホルミルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（１２３ｍｇ）を得た。その収率は定量に近づいた。
【００５２】
上記ステップの産物（１２３ｍｇ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解し、氷浴冷却下で水素化硼素ナトリウム（３００ｍｇ）を添加し、１５分間保温反応させた後、氷浴を除き、室温で３時間反応させ、ＴＬＣで反応終了を確認した。反応混合物を濃縮した後、残余物を水で希釈し、酢酸エチルで十分に抽出し、有機相を合併して、飽和食塩水で洗浄後に、乾燥、濾過及び濃縮を行って、無色に近い油状物である５−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（３２ｍｇ）を得た。そのモル収率は２６％であり、精製せずに、後の反応に直接使用する。
【００５３】
（１０）５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化２９】
2013522328.tif 000031
５−［１−（２−ホルミルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（３００ｍｇ）をメタノール（３００ｍＬ）に溶解し、氷浴冷却下で、水素化硼素ナトリウム（２００ｍｇ）を添加して、１５分間保温反応させた後、氷浴を除き、室温で１．５時間反応させて、ＴＬＣで反応終了を確認した。反応混合物を濃縮した後、残余物を水で希釈し、酢酸エチルで十分に抽出し、有機相を合併して、飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濾過及び濃縮を行って、浅黄色の油状物である５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（１９８ｍｇ）を得た。そのモル収率は６６％であり、精製せずに、後の反応に直接使用する。
【００５４】
（１１）５−（２−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化３０】
2013522328.tif 000032
５−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（６３ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、氷浴冷却下で上記溶液に三フッ化ジエチルアミノ硫黄（ＤＡＳＴ、O．１ｍＬ）を滴下して添加し、１時間保温反応をさせ、ＴＬＣで反応が大体終了したことを確認した。反応を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で急冷し、酢酸エチルで抽出し、有機相を合併して，乾燥、濾過及び濃縮を行って、残余物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、浅黄色の固体である５−（２−フルオロ−２−メチルプロピル）−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（２０ｍｇ）を得た。そのモル収率は３３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．３９（ｓ，３Ｈ）、１．４６（ｓ，３Ｈ）、３．６９〜３．７７（ｄ，Ｊ＝２３．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．９７（ｓ，３Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００５５】
（１２）５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化３１】
2013522328.tif 000033
調製実施例１（１１）の方法により、５−（１−ヒドロキシ基−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチルを原料として、５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチルを得た。そのモル収率は４２％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）、２．２４（ｍ，１Ｈ）、３．９９（ｓ，３Ｈ）、６．２１〜６．３９（２d，Ｊ＝５．４，１７．lＨｚ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２３．１（Ｍ＋Ｎａ）＋（Ｃ１２Ｈ１３ＦＮ２ＮａＯ２Ｓ２，理論値：３２３．０３）。
【００５６】
（１３）５−［１−（３−フルオロ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化３２】
2013522328.tif 000034
調製実施例１（１１）の方法により、５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチルを原料として、５−［１−（３−フルオロ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチルを得た。そのモル収率は８３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．０７（ｓ，３Ｈ）、２．２４（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｓ，３Ｈ）、４．８９〜５．０５（ｄ，Ｊ＝４６．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．６１（ｓ，１Ｈ）、７．９２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２１．０（Ｍ＋Ｎａ）＋（Ｃ１２Ｈ１１ＦＮ２ＮａＯ２Ｓ２，理論値：３２１．０１）。
【００５７】
（１４）５−（１−メトキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル
【化３３】
2013522328.tif 000035
５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（５５ｍｇ）とヨードメタン（０．３ｍＬ）とをＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、氷浴冷却下で上記溶液中にＮａＨ（６０％、５０ｍｇ）を添加し、自然に６時間昇温反応をさせて、ＴＬＣで反応終了を確認した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液で急冷し、酢酸エチルで抽出し、有機相を合併して、水、飽和食塩水のそれぞれで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗い製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（石油エーテル／酢酸エチル＝５／１）で処理した後、無色の油状物である５−（１−メトキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（５２ｍｇ）を得た。そのモル収率は８６％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．０２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．０５（ｍ，１Ｈ）、３．４０（ｓ，３Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）、５．０７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．４９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００５８】
（１５）５'−メチル−５−イソブチル−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピル
【化３４】
2013522328.tif 000036
調製実施例１（１）の方法により、２−ブロム−５−メチルチアゾールと２−ブロム−５−イソブチルチアゾール４−蟻酸イソプロピルを原料として、浅黄色の固体である５'−メチル基−５−イソブチル−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを得た。そのモル収率は６６％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）、１．４１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）、１．９８（ｍ，１Ｈ）、２．５３（ｓ，３Ｈ）、３．１０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、５．２８（ｍ，１Ｈ）、７．５１（ｓ，１Ｈ）。
【００５９】
（１６）５'−メチル基−５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピル
【化３５】
2013522328.tif 000037
調製実施例１（２）の方法により、５'−メチル−５−イソブチル−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを原料として、浅黄色の油状物である５'−メチル−５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを得た。その収率は定量に近づいた。次のステップの反応に直接使用する。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．４４（ｍ，６Ｈ）、２．２４（ｍ，１Ｈ）、２．５４（ｓ，３Ｈ）、５．２８（ｍ，１Ｈ）、６．０４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、７．５４（ｓ，１Ｈ）。
【００６０】
（１７）５'−メチル−５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピル
【化３６】
2013522328.tif 000038
調製実施例１（３）の方法により、５'−メチル−５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを原料として、浅黄色の固体である５'−メチル−５−（１-ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを得た。そのモル収率は１３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．４４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）、２．１０（ｍ，１Ｈ）、２．５４（ｓ，３Ｈ）、３．２８（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．２６（ｍ，１Ｈ）、７．５３（ｓ，１Ｈ）。
【００６１】
（１８）５'−メチル基−５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピル
【化３７】
2013522328.tif 000039
調製実施例１（１１）の方法により、浅黄色の固体である５'−メチル−５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを得た。その収率は定量的であった。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）、１．２５（ｍ，６Ｈ）、２．２０（ｍ，１Ｈ）、２．５５（ｓ，３Ｈ）、５．２８（ｍ，１Ｈ）、６．１５〜６．３３（２d，Ｊ＝５．４，１７．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．５５（ｓ，１Ｈ）。
【００６２】
（１９）５'−メチル−５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピル
【化３８】
2013522328.tif 000040
調製実施例１（４）の方法により、５’−メチル−５−（１−ブロム−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを原料として、黄色の固体である５'−メチル−５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを得た。そのモル収率は４０％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．５５（ｓ，６Ｈ）、２．０３（ｓ，６Ｈ）、２．５４（ｓ，３Ｈ）、５．２７（ｍ，１Ｈ）、７．２０（ｓ，１Ｈ）、７．５４（ｓ，１Ｈ）。
【００６３】
＜調製実施例２  ２’，２−ビスチアゾール非ヌクレオシド系化合物の合成＞
（１）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３９１−１）
【化３９】
2013522328.tif 000041
５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（３０ｍｇ）をエチレングリコール（３ｍＬ）に溶解し、ｐ−フルオロベンジルアミン（１２５ｍｇ）を添加し、Ｎ２の保護下、１５０℃で一晩反応させ、ＴＬＣで反応終了を確認した。反応混合物を水で希釈した後に、酢酸エチルで抽出し、有機相を合併して、水、５％塩酸及び飽和食塩水のそれぞれで洗浄した後、乾燥して濃縮し、粗い製品をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、浅黄色の油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（１７ｍｇ）を得た。そのモル収率は５０％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．２０（ｍ，１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．８９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．４６（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４（ｍ，１Ｈ）。
【００６４】
（２）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３９１−２）
【化４０】
2013522328.tif 000042
上記調製実施例２（１）と同じ方法により、浅黄色の油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。そのモル収率は５５％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．２８（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｓ，２Ｈ）、３．９７（ｓ，１Ｈ）、４．６１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．０４（ｍ，２Ｈ）、７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．４５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｓ，１Ｈ）。
【００６５】
（３）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３９１−３）
【化４１】
2013522328.tif 000043
上記調製実施例２（１）と同じ方法により、浅黄色の油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。そのモル収率は１６％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．１０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、２．０４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．２４（ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．３４（ｍ，１Ｈ）、３．５４（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１４．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．６７（ｍ，２Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．４６（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．８７（ｓ，１Ｈ）、７．８８（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００６６】
（４）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１，２−ジヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（４０７）
【化４２】
2013522328.tif 000044
上記調製実施例２（１）と同じ方法により、浅黄色の油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１，２−ジヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。そのモル収率は２６％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．３２（ｓ，６Ｈ）、４．６１（ｄ，Ｊ＝６．OＨｚ，１Ｈ）、５．６９（ｓ，１Ｈ）、７．０７（ｍ，２Ｈ）、７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．４５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｓ，１Ｈ）。
【００６７】
（５）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３８９）
【化４３】
2013522328.tif 000045
５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（１２０ｍｇ）をメタノール（２０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）中に溶解し、水酸化リチウム一水和物（５０ｍｇ）を添加し、室温で一晩反応させた。反応終了後、混合物を減圧濃縮して、大部分のメタノールを除き、得られた水相を５％塩酸で酸性に調整すると、濁りが現れた。水相をジクロロメタンで十分に抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して濃縮し、浅黄色の固体である５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸（１１０ｍｇ）を得た。その収率は定量的であり、次のステップの反応に直接使用する。
【００６８】
上記ステップで得られた５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２'，２−ビスチアゾール−４−蟻酸（６２ｍｇ）をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）（２０ｍＬ）に溶解し、この溶液にフルオロベンジルアミン（１４０ｍｇ）、ＥＤＣＩ（３００ｍｇ）とｐ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３０ｍｇ）を添加し、室温で一晩反応させた。反応終了後、混合物を水で希釈し、酢酸エチルで十分に抽出して、得られた有機相を水、５％塩酸及び飽和食塩水のそれぞれで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して濃縮し，シリカゲルカラムクロマトグラフィ（石油エーテル／アセトン＝４／１溶出）で浅黄色の固体であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−［１−（３−ヒドロキシ−２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。そのモル収率は３２％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．０５（ｓ，３Ｈ）、４．２８（ｓ，２Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．OＨｚ，２Ｈ）、７．０４（ｍ，２Ｈ）、７．３８（ｍ，２Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８３（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．９３（ｓ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１２．０（Ｍ＋Ｎａ）＋（Ｃ１８Ｈ１６ＦＮ３ＮａＯ２Ｓ２，理論値：４１２．０６）。
【００６９】
（６）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５'−メチル−５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（Ｍｅ−３９１−１）
【化４４】
2013522328.tif 000046
上記調製実施例２（５）と同じ方法により、５'−メチル−５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸イソプロピルを原料として、加水分解、縮合を介して、カラムクロマトグラフィ（石油エーテル／アセトン＝５／１）で無色に近い油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５'−メチル−５−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２'，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。そのモル収率は４３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．０１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．１７（ｍ，１Ｈ）、２．５３（ｓ，３Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．８３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．５４（ｓ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．９３（ｍ，１Ｈ）。
【００７０】
（７）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３７３）
【化４５】
2013522328.tif 000047
５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸メチル（２７６ｍｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、水（１０ｍＬ）と水酸化リチウム一水和物（１００ｍｇ）を添加して、混合物を室温で一晩反応させた。翌日にＴＬＣで反応終了を確認し、減圧下で濃縮して大部分のメタノールを除き、得られた水相を５％塩酸で酸性に調整し、ジクロロメタンで十分に抽出し、有機相を合併して、水で洗浄した後、乾燥、濾過及び濃縮を行って、浅黄色の固体である５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸（２５７ｍｇ）を得た。その収率は定量的であり、直接次のステップの反応を行う。
【００７１】
得られた５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−蟻酸（２５７ｍｇ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）中に溶解し、１滴のＤＭＦ、塩化オキサリル（０．１５ｍＬ）を添加して、室温で３時間反応させて、濃縮後浅黄色の固体を得た。得られた固体を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解し、且つ氷浴冷却下でｐ−フルオロベンジルアミン（１８０ｍｇ）の酢酸エチル（１５ｍＬ）溶液と重炭酸ナトリウム（２００ｍｇ）、水（１０ｍＬ）との混合混合物に滴下して添加し、自然に室温まで昇温しながら一晩反応させた。翌日にＴＬＣで反応終了を確認し、有機層を抽出して、水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合併し、且つ５％塩酸と飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濾過及び濃縮を行って、残余物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、黄色の固体であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（２８４ｍｇ）を得た。２段階反応のモル収率は７７％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．０６（ｓ，６Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．OＨｚ，２Ｈ）、７．０４（ｍ，２Ｈ）、７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．４５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．６８（ｓ，１Ｈ）、７．８５（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００７２】
（８）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（２−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３９３−２）
【化４６】
2013522328.tif 000048
上記調製実施例２（７）の方法により、黄色の油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（２−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。２段階反応の収率は定量に近づいた。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．４０（ｓ，３Ｈ）、l．４７（ｓ，３Ｈ）、３．９０（ｄ，Ｊ＝２４．OＨｚ，２Ｈ）、４．６０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．０７（ｍ，２Ｈ）、７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．４４（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８７（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１６．１（Ｍ＋Ｎａ）+（Ｃ１８Ｈ１７Ｆ２Ｎ３ＮａＯＳ２、理論値：４１６．０７）。
【００７３】
（９）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３９３−１）
【化４７】
2013522328.tif 000049
上記調製実施例２（７）の方法により、無色に近い油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。その収率は定量的であった。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）、２．２６（ｍ，１Ｈ）、４．６３（ｍ，２Ｈ）、６．４７〜６．６５（２d，Ｊ＝５．４，４６．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．７７（ｍ，１Ｈ）、７．９１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１６．１（Ｍ＋Ｎａ）+（Ｃ１８Ｈ１７Ｆ２Ｎ３ＮａＯＳ２，理論値：４１６．０７）。
【００７４】
（１０）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５'−メチル−５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（Ｍｅ−３７３）
【化４８】
2013522328.tif 000050
上記調製実施例２（７）の方法により、浅黄色の固体であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５'−メチル−５−［１−（２−メチルプロペニル）］−２'，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。２段階反応の収率は９３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．０４（ｓ，６Ｈ）、２．５３（ｓ，３Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．０４（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．５３（ｓ，１Ｈ）、７．６６（ｓ，１Ｈ）、７．８４（ｍ，１Ｈ）。
【００７５】
（１１）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５'−メチル−５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（Ｍｅ−３９３−１）
【化４９】
2013522328.tif 000051
上記調製実施例２（７）の方法により、無色に近い油状物であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５’−メチル基−５−（１−フルオロ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。２段階反応の収率は８３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０５（ｍ，６Ｈ）、２．２５（ｍ，１Ｈ）、２．５４（ｓ，３Ｈ）、４．６１（ｍ，２Ｈ）、６．４６〜６．６４（２d，Ｊ＝５．４，４６．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３３（ｍ，２Ｈ）、７．５５（ｓ，１Ｈ）、７．７６（ｍ，１Ｈ）。
【００７６】
（１２）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−［１−（２−フルオロメチルプロペニル）］−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（３９１−Ｆ）
【化５０】
2013522328.tif 000052
上記調製実施例２（７）の方法により、白色に近い固体であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−［１−（２−フルオロメチルプロペニル）］−２'，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。２段階反応の収率は６８％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．０９（ｓ，３Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝６．OＨｚ，２Ｈ）、４．８９（ｓ，１Ｈ）、５．０５（ｓ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３６（ｍ，２Ｈ）、７．５０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８８（ｍ，１Ｈ）、７．９２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．００（ｓ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１４．０（Ｍ＋Ｎａ）＋（Ｃ１８Ｈ１５Ｆ２Ｎ３ＮａＯＳ２，理論値：４１４．０５）。
【００７７】
（１３）Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１−メトキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド（４０５−１）
【化５１】
2013522328.tif 000053
上記調製実施例２（７）の方法により、浅黄色の固体であるＮ−ｐ−フルオロベンジル−５−（１−メトキシ−２−メチルプロピル）−２’，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミドを得た。２段階反応の収率は７３％である。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．９７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．０２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．０７（ｍ，１Ｈ）、３．４２（ｓ，３Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、５．３６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．９０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００７８】
＜抗肝炎ウイルス試験実施例＞
［抗ウイルス試験実施例１  抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）活性テスト試験］
１．実験目的：
ＨＢＶ全ゲノムが安定的に導入されたＨｅｐＧ  ２．２．１５の細胞において、サンプル化合物の抗ＨＢＶ活性の測定を行う。測定は、サンプル化合物の細胞毒性（ＣＣ５０）、及びＨＢＶ−ＤＮＡの複製レベルに対する影響（ＩＣ５０）を含む。
【００７９】
２．実験原理：
ＨＢＶ全ゲノムが安定的に導入されたヒト肝癌細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞株は、培養の際に、Ｂ型肝炎ウイルス粒子（ＤＮＡを含む）を培養上清へ分泌する。抗ウイルス薬物の介入で、細胞が培養上清中へ分泌したウイルスＤＮＡの含有量を検出し、薬物添加なしの対照グループにおける含有量と参照することによってサンプル薬物の抗ウイルス活性を検出できる共に、サンプル薬物の細胞毒性作用を検出できる。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ法を用いてＨＢＶ−ＤＮＡ複製量の５０％を阻害した場合の所要濃度（ＩＣ５０）を測定し、ＭＴＴ法を用いて５０％の細胞毒性になるまでのサンプル薬物の所要濃度（ＣＣ５０）を測定した。
【００８０】
３．実験サンプル：
一時的に実験に必要なサンプル薬物濃度（４００μＭ）に調整して、サンプル薬物毎に対して６種類の希釈濃度の試験を行い、且つ、臨床的な抗Ｂ型肝炎ウイルス薬物であるラミブジン（lamivudine）を試験の陽性対照薬とし、毎回の試験反応が正常かどうかを検査した。
【００８１】
４．実験方法：
ａ）実験方法及び培養上清の収集：
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（５×１０５／穴）を９６穴プレート中に接種し、翌日にサンプル薬物を添加し、定期的に培養液及び同濃度のサンプル薬物を取り換えた。八日目に培養上清を収集して測定に準備した。９６穴プレート中の細胞へＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、４時間後にＭＴＴ溶解液（１００μｌ／穴）を添加して、翌日にマイクロプレートリーダーでＯＤ５７０を測定した。ＯＤ値を基づいて、サンプル薬物のＨｅｐＧ２．２．１５細胞に対する毒性作用と細胞成長に対する影響の状况、および半数細胞死亡に必要な濃度（ＣＣ５０）を計算した。
【００８２】
ｂ）蛍光定量ＰＣＲ法による培養上清中のＨＢＶ−ＤＮＡ含有量の測定
適量の培養上清を取って同体積のウイルス分離液に添加し、均一に混合した後に沸騰させ、室温で１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、適量の上清を取ってＰＣＲ増幅に用い、同時にＨＢＶ−ＤＮＡ標準サンプルを４つ設置して標準曲線を作った。そして、測定により得られたウイルスＤＮＡ複製値により、サンプル薬物毎の各濃度に対応するＨＢＶ−ＤＮＡ複製の阻害率を算出し、その後サンプル薬物の半数阻害率を計算して、その（ＩＣ５０）を得た。
【００８３】
実験用ＰＣＲプライマーは：
Ｐ１：5'ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3'
Ｐ２：5'ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3'
【００８４】
実験用ＰＣＲプローブは：
5'TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3'
【００８５】
４．実験結果：
【表１】
2013522328.tif 000054
【００８６】
注：
ＣＣ５０は、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞の成長に対するサンプル薬物の影響であり、５０％死亡濃度を示す。
ＩＣ５０は、サンプルがＨＢＶ−ＤＮＡ複製の半数５０％を阻害する時の濃度である。
ＳＩは、サンプルの生物活性選択係数である。ＳＩ値＞２の場合有効であり、且つ大きいほど良い。
【００８７】
５．結果と討論：
陽性対照であるラミブジン（lamivudine）の結果により、本テスト方法と試験結果は信頼性があると分かっている。上記細胞レベルのテスト結果によると、本発明に係る化合物は、当該化合物のＨＢＶ−ＤＮＡ複製阻害である生物活性をよく保持し、Ｗ２８Ｆの（Ｎ−ｐ−フルオロベンジル−５−イソブチル−２'，２−ビスチアゾール−４−ホルムアミド）の抗ＨＢＶ複製活性とほぼ相当し、半数有効阻害係数ＩＣ５０が０．２〜３３．３μΜである。
【００８８】
［抗ウイルス試験実施例２  抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製活性の測定］
１．実験方法
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を導入したＨＣＶウイルス（Ｊ３９９Ｅ）で感染されたＨｕｈ７．５．１細胞（武漢ウイルス所提供）により、抗ＨＣＶ活性の測定を行う。マイクロプレートリーダーで緑色蛍光の変化状況を検査すると共に、細胞毒性を測定して、ＨＣＶ複製活性に対する化合物の影響を判断した。
【００８９】
実験の前に、被験化合物をＤＭＳＯに溶解させて母液を調製し、得られた母液を使用する場合に、ＦＢＳ（牛胎児血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）Hyclone会社（Logan，Utah，USA）から購入）を１０％含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Media，GibcoBRL会社（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）から購入）培養液を所要の濃度に希釈して使用する。細胞培養を行う時、ＤＭＳＯの最終濃度を０．２５％（Ｖ／Ｖ，Ｖｏｌｕｍｅ  ｔｏ  Ｖｏｌｕｍｅ）以下とし、当該濃度のＤＭＳＯは細胞成長に対して影響がない。
【００９０】
陽性対照薬物：ＤＭＳＯでリバビリン（ビラゾール、ribavirin、sigma／Aldrichから購入）から母液を調製した後，−２０℃で保存して予備とし、使用する前に所要の濃度まで希釈する。
【００９１】
穴毎に１００μｌの条件で、Ｈｕｈ７．５．l細胞（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）を１０５個／ｍｌの濃度で９６穴プレート中（Costar  ３９０４）に添加し；２４時間後、培養上清を吸出し、ＭＯＩ＝０．１のウイルス上清５０μｌを添加し；８時間後、５０μｌの被験薬を添加し、１００μｌの培養液を補充添加して、７２時間培養し；上清を吸出して、蛍光マイクロプレートリーダーの値を読み（Ｅｘ＝４８８ｎｍ，Ｅｍ＝５１６ｎｍ）；各穴に２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、５０μｌの培養液を補充添加して、４時間後に１００μｌのＭＴＴ溶解液を添加し、６時間後に５７０ｎｍの周波数で数値を読取る。
【００９２】
２．実験結果：
【表２】
2013522328.tif 000055
【００９３】
注：
ＣＣ５０は、Ｈｕｈ７．５．１細胞の成長に対するサンプル薬物の影響であり、５０％死亡濃度を示す。
ＩＣ５０は、サンプルがＨＣＶ複製の半数５０％を阻害する時の濃度である。
ＳＩは、サンプルの生物活性選択係数である。ＳＩ値＞２の場合有効であり、且つ大きいほど良い。
【００９４】
３．結果と討論
結果によれば、上記選択された部分の代表的な化合物は、体外投与を行う場合に、ＨＣＶに感染されたＨｕｈ７．５．１細胞におけるＨＣＶウイルス複製活性に対して、全部顕著な阻害作用を有し、ＩＣ５０が１．５〜２１．３μＭであり、全てのテスト化合物の抗ＨＣＶ活性が、陽性対照薬物であるリバビリンより良かった。
【００９５】
［薬物動力学実験実施例３  ラット体内の薬物動力学実験研究］
研究案
胃内投与：健康なＳＤラット３匹、雄性、体重２００〜２５０ｇ、投与量が２０ｍｇ／ｋｇ、投与容積が１０ｍｌ／ｋｇである。投与する前に、１２時間絶食させ、水を自由に飲ませて、投与後の０．２５ｈ、０．５ｈ、１．０ｈ、２．０ｈ、３．０ｈ、４．０ｈ、５．０ｈ、７．０ｈ、９．０ｈ、及び２４ｈ後、ラット眼球後の静脈叢から静脈血０．３ｍｌを取って、ヘパリン化試験管に置いて、３５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、血漿を分離し、−２０℃で保存し予備とする。
【００９６】
静脈注射：健康なＳＤラット３匹、雄性、体重が２００〜２５０ｇである。投与量は１０ｍｇ／ｋｇであり、投与容積が５．０ｍｌ／ｋｇである。投与する前に、１２時間絶食させ、水を自由に飲ませて、投与後の５分間、１５分間、０．５ｈ、１．０ｈ、２．０ｈ、３．０ｈ、４．０ｈ、５．０ｈ、７．０ｈ、９．０ｈ、及び２４ｈ後、ラット眼球後静脈叢から静脈血を０．３ｔ取って、ヘパリン化試験管に置いて、３５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、血漿を分離し、−２０℃で保存し予備とする。
【００９７】
研究結果
分量を標準化させた後、ＡＵＣ０−tでＷ２８Ｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与の生体利用効率の平均値は２．８０％であり；同じ条件下で、化合物３７３（２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与の生体利用効率の平均値は６．９％であり、化合物３９１−２（２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与の生体利用効率平均値は７６．５％であり、いずれも側鎖未置換化合物であるＷ２８Ｆより良かった。
【国際調査報告】
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