(57)【要約】  本発明は、運搬表面１２上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズ１０を運搬する装置２４に関する。装置は、流体２８内に磁性ビーズ又は磁化可能なビーズ１０を含むチャンバ２６と、前記ビーズ１０がその上で運搬される前記運搬表面１２を、前記チャンバ２６内に含む運搬素子１４と、前記運搬素子１４の前記運搬表面１２と反対の側に配置されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも２つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃを含む電流ワイヤ構造２０であって、前記少なくとも２つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃが少なくとも２方向において互いにずらされている、電流ワイヤ構造と、前記運搬表面１２上での前記ビーズ１０の運搬を引き起こすように、電流駆動スキームに従って前記電流ワイヤの前記組に個別に印加される電流Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃを個別に切り替える切り替えユニット３２と、を有する。好適な実施形態において、運搬表面１２とほぼ平行な方向のほぼ一様な静磁界３０が付加的に提供される。
2013504753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置であって、
流体中に磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを含むチャンバと、
前記ビーズがその上で運搬される前記運搬表面を、前記チャンバ内に含む運搬素子と、
前記運搬素子の前記運搬表面と反対の側に配されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも２つの組を含む電流ワイヤ構造であって、前記少なくとも２つの組は、少なくとも２方向において互いにずらされている、電流ワイヤ構造と、
前記運搬表面上での前記ビーズの運搬を引き起こすように、電流駆動スキームに従って前記電流ワイヤの前記組に個別に印加される電流を個別に切り替える切り替えユニットと、
を有する装置。
【請求項２】
前記ミアンダ状の電流ワイヤの前記組は、前記運搬表面と平行なワイヤ面内に実質的に配され、特に前記運搬表面と反対側の前記運搬素子の表面上に実質的に配される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ミアンダ状の電流ワイヤの前記組は、前記ワイヤ面内の直交する２方向においてずらされる、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記電流ワイヤ構造は、前記運搬素子の前記運搬表面と反対の側に配されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも３つの組を含み、前記少なくとも３つの組は、少なくとも２方向において互いにずらされている、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記運搬表面とほぼ平行な方向にほぼ一様な静磁界を生成する静磁界生成手段を更に有し、前記電流ワイヤ構造は、ミアンダ状の電流ワイヤの２つの組を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記切り替えユニットは、前記電流ワイヤの前記組が非ゼロの電流をもつフェーズ及びゼロ電流をもつフェーズを含む周期的な電流信号を個別に供給されるように、前記電流ワイヤの前記組に個別に印加される前記電流を切り替え、前記個別の組に対する電流信号は、非負の電流が一度に１つの電流信号にのみ存在するように、時間的にずらされる、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記個別の組に供給される電流信号は、同一であるが、時間的にずらされ、前記時間的なずれは、前記時間的なずれが最も遠くにずらされた前記組に供給される電流信号に関して最も大きくなるように、前記電流ワイヤの前記組の前記運搬方向におけるずれと相関する、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記切り替えユニットは、前記ビーズの前記運搬方向を選択するように前記電流信号の極性を選択する、請求項５又は６に記載の装置。
【請求項９】
前記切り替えユニットは、前記ビーズの運搬方向を変更するために、少なくとも１つの電流信号の極性を切り替える、請求項５又は６に記載の装置。
【請求項１０】
前記電流ワイヤ構造は、
前記運搬素子の前記運搬表面と反対の側に配されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも２つの第１の組の第１のグループであって、前記少なくとも２つの第１の組は、少なくとも２方向において互いにずらされている、電流ワイヤの第１のグループと、
前記運搬素子の同じ側に配されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも２つの第２の組の第２のグループであって、前記少なくとも２つの組は、少なくとも２方向において互いにずらされている、電流ワイヤの第２のグループと、
を有し、前記電流ワイヤの前記第１のグループ及び前記第２のグループは、特に前記運搬表面に対し垂直な回転軸を中心に互いに９０°回転されて配される、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記切り替えユニットは、前記電流ワイヤの前記組に個別に印加される前記電流を切り替え、それにより、前記組は、正の電流をもつフェーズ及び負の電流をもつフェーズを含む周期的な電流信号を個別に供給され、前記個別の組に対する電流信号は、それぞれ異なる電流信号の、特に隣り合う電流ワイヤに供給される電流信号の正及び／又は負のフェーズが互いに重なり合うように、時間的にずらされる、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記運搬表面とほぼ平行な方向にほぼ一様な磁界を生成するコイルの組と、
前記運搬表面と平行な面内で前記磁界の方向を変えるように前記コイルの組を制御するコイル制御手段であって、特に２つの逆の方向の間で前記磁界の方向を反転させるコイル制御手段と、
を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する方法であって、
流体中に磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを提供するステップと、
前記運搬素子の前記運搬表面と反対の側に配されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも２つの組を含む電流ワイヤ構造に電流を印加するステップであって、前記電流ワイヤの前記少なくとも２つの組は、少なくとも２方向において互いにずらされており、前記運搬素子は、前記ビーズがその上を運搬される前記運搬表面を前記チャンバ内に有する、ステップと、
前記運搬表面上での前記ビーズの運搬を引き起こすように、電流駆動スキームに従って前記電流ワイヤの前記組に個別に印加される電流を個別に切り替えるステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
特にシークエンシング又は核酸テスティングのために磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを含むサンプルを操作する、特にＤＮＡシークエンシング装置又は免疫測定装置であるマイクロフルイディック装置であって、請求項１に記載の装置を有するマイクロフルイディック装置。
【請求項１５】
請求項１に記載の装置に駆動電流を供給する駆動ユニットであって、
前記駆動ユニットは、前記運搬表面上での前記ビーズの運搬を引き起こすように、電流駆動スキームに従って前記電流ワイヤの前記組に個別に印加される電流を個別に切り替え、前記駆動ユニットは、前記電流ワイヤの前記組が非ゼロの電流をもつフェーズ及びゼロ電流をもつフェーズを含む周期的な電流信号を個別に供給されるように、前記電流を切り替える、駆動ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置及び対応する方法に関する。
【０００２】
更に、本発明は、特にシークエンシング又は核酸テスティングのために磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを含むサンプルを操作する、特にＤＮＡシーケンス装置のようなマイクロフルイディック装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体に埋め込まれる磁性粒子（「ビーズ」）は、それらの表面上に、相補的な標的分子と特異的に相互作用するプローブ分子（例えば相補標的ＤＮＡと相互作用する一本鎖プローブＤＮＡ）を保持するために使用されることができることが知られている。プローブされるべき分子と反応するとき、例えば光学的又は電気化学的測定を使用して、ビーズ上の又はビーズを含む特定のボリューム内の標的分子の量が決定されることができる。磁性ビーズを使用する際の関心は、それらが流体運動に関係なく磁界を使用して操作可能であることである。このようにして、流体に対するビーズの重要な相対運動、及びゆえに標的分子をビーズ表面上に固定されたプローブ分子に結合する大きい可能性が与えられることができる。検出／収集の場所にビーズを磁気的に抽出することが可能である。歴史的に、ビーズは、外部磁石を使用することによって局所的に固定され、又は機械的に移動する外部磁石を使用して運搬されている。後者のプロシージャは、例えば、混合装置を製造するために及び免疫測定方法において使用されることができる。
【０００４】
ここで及び以下において、１００ミクロンより小さい粒子が検討され、それらは、多くの場合ビーズとも呼ばれる。ビーズは、一般に、０．１乃至５０ミクロンのレンジのサイズを有し、例えば１ミクロンのレンジのサイズを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
磁性ビーズの「分離(separation)」は、ビーズを含む液体フローが、大きい磁界（勾配）を有するゾーンを通り過ぎ、磁性ビーズが、磁界によってフィルタ抽出される（分離される）ことを意味する。ビーズの磁気的運搬は、マイクロフルイディック回路内の良好に規定された位置に、例えば磁性ビーズ検出装置の近くに、ビーズを持ってくるために重要である。「運搬(transport)」は、ビーズが、通過する液体溶液から磁界によって保持されるだけでなく（＝分離(separation)）、磁気力（すなわち磁界を使用すること）によって効果的に移動されることをも意味する。それにもかかわらず、（超）常磁性ビーズの有効相対磁化率はかなり弱く（多くは球状である粒子の消磁効果により一般に＜＜１である）、粒子の磁気ボリュームが小さいので、これらのビーズの操作及び特に運搬は、困難な作業である。これは、（機械的に移動する）永久磁石又は大きい電磁石の大きい磁界が磁性ビーズの分離、運搬及び位置付けのために多く使用されている理由を説明する。他の研究において、大きい電流によって作動されるマイクロパターン化された導体が、磁性ビーズの捕捉及び運搬のための有用なソリューションを提示するために説明されている。これらの装置は、正確な位置付け、及び単一の作動イベントで１０−１００μｍの距離の運搬を可能にする。
【０００６】
米国特許第２００５／２８４８１７Ａ１号明細書は、毛管チャンバ内で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置であって、永久的な磁気モーメントをビーズに与えるために、毛管チャンバをほぼ一様な磁界に曝露させるための永久磁石又は電磁石を有する装置を開示している。少なくとも１つの平面コイル及び好適には重なり合うコイルのアレイが、前記ほぼ一様な磁界に平行な又は逆平行な相補的な磁界をビーズに印加して、ビーズを駆動するために、毛管チャンバに隣り合って位置する。生成される磁界を反転させて、ビーズに対し駆動のための引力又は斥力を選択的に与えるために、コイルに印加される電流を切り替える装置が提供される。装置は、例えば医療診断目的の臨床的な化学アッセイにおいて行われているような化学及び生化学反応又はアッセイを実施するためにビーズを運搬するために使用可能である。
【０００７】
１９９０年代の終わり、全ヒトゲノムのシークエンシングを開始するＮＩＨ（National Health Institute）プロジェクト以来、シークエンシング技術の技術開発は非常に急速に進んでいる。特に２００５年、454 Life Sciences社（現ロシュ）によるシークエンシングマシンの第２の世代の導入（M. Margulies, M. Egholm et al., Nature, 437 (2005) 376-380を参照）以来、開発が強化されている。今日、複数の他の会社が、第２世代のシークエンシングマシンを発売しているが、例えばＤＮＡシークエンシングが癌の解析の臨床ツールになるように、ＤＮＡシークエンシングの費用を一層低減したいという要望がある。
【０００８】
費用を一層低減するための一般的な戦略の１つは、特にマイクロフルイディクス装置におけるシークエンシングに必要な工程の集積化によって、シークエンシング装置を小型化することである。このようなアプローチにおいては、シークエンスされるべきＤＮＡ及びシークエンシング反応に関係する試薬が、サブミリメートル寸法のマイクロチャネル及びチャンバ内で操作される。操作は、さまざまなやり方で行われることができ、例えばマイクロポンプ及びバルブ、集積化されたマイクロアクチュエータ、動電学的駆動力若しくは磁気駆動力を用いて、又は表面張力を利用することによって、行われることができる。
【０００９】
次世代のシークエンシングアプローチのあるものにおいて、磁性マイクロビーズは、シークエンスされるべきＤＮＡ鎖のための基板として使用される。特に、理想的には、各々の単一ビーズが、当該ビーズにアタッチされる１つのユニークなＤＮＡ鎖を有し、かかるＤＮＡ鎖は、（ＰＣＲを使用して）同じビーズ上で何百万倍にも複製される。一般に、信号対雑音比を高めるために、単一ビーズ上で同じ鎖を何倍にも増殖するために、エマルジョンビーズＰＣＲ増殖（ｅｍＰＣＲ）が使用される。このようなアプローチを小型化する場合、装置内で局所的に生成される磁界を使用して、制御されるやり方でビーズを操作することが可能であることが、非常に有利である。これは、当該ビーズにアタッチされる特異的な鎖をもつビーズを、それらの正確な位置を監視しながら、装置内の特定のロケーションに運搬する機会を提供する。
【００１０】
本発明の目的は、運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置及び方法であって、力の生成のために必要とされる電気信号及び接続の数が最小限にされながらも、ビーズ操作の大きな柔軟性を提供する装置及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の見地において、運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置であって、
−流体中に磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを含むチャンバと、
−前記ビーズがその上で運搬される前記運搬表面を前記チャンバ内に含む運搬素子と、
−前記運搬素子の前記運搬表面と反対側に配置される少なくとも２つの組のミアンダ状の電流ワイヤを含む電流ワイヤ構造であって、前記少なくとも２つの組が少なくとも２方向において互いにずらされている、電流ワイヤ構造と、
−前記運搬表面上で前記ビーズの運搬を引き起こすように、電流駆動スキームに従って電流ワイヤの前記組に個別に印加される電流を個別に切り替える切り替えユニットと、
を有する装置が提示される。
【００１２】
本発明の別の見地において、対応する方法が提示される。
【００１３】
本発明の更に別の見地において、特にシークエンシング又は核酸テスティングのために磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを含むサンプルを操作する、特にＤＮＡシークエンチング装置のようなマイクロフルイディック装置であって、本発明による、運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置を有するマイクロフルイディック装置が提示される。
【００１４】
本発明の好適な実施形態は従属請求項に規定される。請求項に記載の方法及び請求項に記載のマイクロフルイディック装置は、請求項に記載の装置及び依存請求項に記載のものと同様の及び／又は同一の好適な実施形態を有することが理解されるべきである。
【００１５】
本発明は、互いに空間的にずらされており、装置によって制御された態様でビーズを駆動する磁気力を生成するために特定の駆動スキームを使用して駆動される、ミアンダ状の電流ワイヤの電流ワイヤ構造を使用するという考えに基づく。ミアンダ状の電流ワイヤの空間的なずれ、及び駆動電流の適当な供給すなわち個別のミアンダ状の電流ワイヤに供給される電流の適当な切り替えを用いることによって、ビーズの移動の方向及びスピードが達成されることができる。このようにして、電気信号の数及び力の生成に必要とされる接続が最小限にされ、それにもかかわらずビーズ操作の大きな柔軟性が達成される。
【００１６】
本発明は、特に、所望の軌道に沿って、運搬表面上で超常磁性ビーズを集合的に操作することを可能にする。構造は、ミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも２つのペアを有し、ビーズ移動の完全な自由度を実現するために４つの電気的接続のみを必要とする。好適な実施形態に従って提案されるような適切な駆動スキームを適用する場合、ビーズは、任意のパスに沿って移動されることができるだけでなく、運搬表面上で「ホップ」し又は運搬表面上の（マイクロ）ウェルの間でジャンプするようにされることもできる。
【００１７】
本発明は、制御された態様でビーズが表面上で集合的に操作される必要がある任意の（マイクロフルイディック）システムにとって有用である。特に、本発明は、関係するシークエンシングステップ及び核酸テスティングのための試料調製のステップを制御するために、ＤＮＡシークエンシング装置に適用されることができる。更に、本発明による装置、システム又は方法は、例えばバインディング／アンバインディングアッセイ、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、移動アッセイ、酵素アッセイ、免疫測定法等の幾つかの生化学アッセイタイプに関して使用される磁気バイオセンサにおいて、使用されることができる。このような磁気バイオセンサシステム又は装置は、分子生物学的標的を検出することができる。分子標的は、多くの場合、例えばセル、ウィルス、セル又はウィルスの断片、組織抽出物等のより大きいモイエティの濃度及び／又は存在を決定することに注意されたい。
【００１８】
運搬素子は、チャンバ内の別個の素子でありうるが、それは、チャンバ壁の一部であってもよく、すなわち、運搬表面が、チャンバ壁の内部表面であってもよい。更に、特に運搬表面がチャンバ壁の内部表面である場合、電流ワイヤ構造は、チャンバ内に又はチャンバ外に配置されることができる。
【００１９】
好適な実施形態によれば、ミアンダ状の電流ワイヤの前記組は、前記運搬表面と平行なワイヤ面内に実質的に配置され、特に前記運搬素子の前記運搬表面と反対側の表面に配置される。それゆえ、電流ワイヤは、運搬表面及び運搬されるべきビーズのできるだけ近くに位置する。概して、ミアンダ状の電流ワイヤの組は、すべての３つの空間方向においてずらされることが可能であるが、更に好適には、ミアンダ状の電流ワイヤの組は、前記ワイヤ面内の直交する２方向においてずらされる。当然ながら、異なる組のワイヤの間の短絡は、回避されなければならず、それゆえ、異なる組のワイヤとの交差箇所に、このような短絡を回避するための適当な手段が提供される。例えば、絶縁材料が、それらの交差箇所の、ワイヤ間に配置され、又はワイヤの１つが、短絡を回避するために交差箇所において第３の方向に局所的にずらされる。
【００２０】
ずれ（displacement）のサイズは、ビーズのサイズ、ワイヤのサイズ及び電流強度（電流ワイヤを流れる電流によってそれぞれ生成されるべき力）に依存する。１ミクロンの一般的なサイズのビーズの場合、ずれの典型的な値は、１０乃至５０ミクロンである。概して、典型的なずれは、ビーズサイズより１桁大きい。
【００２１】
ビーズ運搬を最適化するためのさまざまな実施形態がある。例えば、一実施形態において、電流ワイヤ構造は、前記運搬素子の前記運搬表面と反対の側に配置されるミアンダ状の電流ワイヤの少なくとも３つの組を含み、前記少なくとも３つの組は、少なくとも２方向において互いにずらされる。このようにして、ビーズに対する力の良好に規定された方向が達成されることができる。
【００２２】
別の実施形態によれば、装置は、運搬表面とほぼ平行な方向にほぼ一様な静磁界を生成する静磁界生成手段を有し、前記電流ワイヤ構造は、ミアンダ状の電流ワイヤの２つの組を有する。一様な外部静磁界は、例えば外部の永久磁石又は電磁石構造（例えばコイル構造）によって生成されることができる。
【００２３】
３組構造の利点は、ビーズの動き制御の完全な柔軟性を達成するために付加の外部磁界が生成される必要がないことである。２組構造の利点は、駆動スキーム及び駆動エレクトロニクスがより簡素であることである。付加の外部磁界の利点は、それがビーズの磁化を増大させ、それにより、達成可能なビーズ速度が、外部磁界なしの場合よりも約１桁大きくなることである。
【００２４】
ビーズのそのような移動に依存して、又はビーズが運搬表面上で操作されるべき態様に依存して、電流ワイヤの組に個別に供給される電流を切り替えるための適当な切り替えスキームが適応される。スキームは、例えば、ユーザにより選択可能なそれぞれ異なる固定の切り替えスキームでありうるが、一実施形態において、ユーザが、切り替えスキームの設定を個別に変更し、電流ワイヤのさまざまな組に供給される電流を個別に制御するための自由度及びオプションを有することも可能である。付加の外部磁界を使用する実施形態において、例えば電磁石が外部磁界を生成するために使用される場合、ユーザが外部磁界の強度及び／又は方向を操作する付加の自由度を有することも可能である。
【００２５】
運搬表面上におけるビーズの一方向の運搬は、一実施形態に従って達成される。その実施形態によれば、切り替えユニットは、電流ワイヤの前記組が非ゼロの電流をもつフェーズ及びゼロ電流をもつフェーズを含む周期的な電流信号を個別に供給されるように、電流ワイヤの前記組に個別に印加される前記電流を切り替えるように適応され、この場合、電流ワイヤの個別の組に対する電流信号は、非負の電流が一度に１つの電流信号にのみ存在するように、時間的にずらされる。電流信号の形状は、概して方形波であるが、正弦、三角又は鋸波形状もまた可能である。非ゼロ電流の極性は、以下に説明される特定の実施形態に依存して正又は負のいずれかでありうる。
【００２６】
好適には、前記個別の組に供給される電流信号は、同一であるが、時間的にずらされ、時間的なずれは、その時間的なずれが、最も遠くにずらされている組に供給される電流信号に関して最も大きくなるように、運搬方向における電流ワイヤの組のずれと相関する。
【００２７】
ビーズは、特定の切り替え周波数まで所望の方向をたどることが分かった。個別の電流ワイヤに供給される電流の切り替え周波数があまりに高すぎる場合、ビーズは、磁気力及び粘性ドラッグの均衡によってもたらされるそれらが達成可能な制限された速度により、もはやついていくことができない。この臨界のスピード／周波数は、一般には実験的に決定されるが、例えば、デフォルトとして、さまざまなビーズについて使用されるべき事前設定が提供されることもできる。実際、最も効果的な運搬のために、可能な最高運搬スピードを達成するようにこの臨界の切り替え周波数（又はそのやや下）での駆動が望ましい。
【００２８】
概して、外部磁界は静的である。しかしながら、外部磁界を生成するために電磁コイルが使用される場合、電磁コイルを制御するための自由度が存在する。これは、ワイヤの電流の方向が切り替えられる状況において、外部磁界の方向が、同じ効果を達成するために、（電流ワイヤ方向に代わって）反転されてもよいことを意味する。その場合、外部磁界の切り替えは、ワイヤ電流の間の切り替えにあわせて適切にタイミングを調節されなければならない。
【００２９】
この場合、すなわち、外部磁界が電磁石によって提供される場合、ビーズの運搬が必要であるときのみ外部磁界をオンに切り替えることも可能である。ビーズの運搬が必要でない場合、外部磁界は、エネルギーを節約するために、オフに切り替えられることができる。運搬中、外部磁界は、オンに切り替えられ、（ほぼ一様な）静的な状態にされることができるが、ある時間にわたって（すなわち外部磁界がオン及びオフに切り替えられる時間の間）、外部磁界は、その時間において完全に静的であると考えられないことがある。
【００３０】
他の好適な実施形態において、対話的に、ビーズの運搬方向を選択し及び／又はビーズの運搬方向を変更することが可能である。これを達成するために、切り替えユニットは、電流信号の極性を選択し及び／又は少なくとも１つの電流信号の極性を切り替えることにより、ビーズの運搬の方向の所望の選択又は変更を与えるように適応される。
【００３１】
ビーズの１次元の運搬を達成するだけでなく、運搬表面上で任意の所望の２次元の方向にビーズを運搬する自由度を有するように、前記電流ワイヤ構造は、前記運搬素子の前記運搬表面と反対の側に配置される少なくとも２つの第１の組のミアンダ状の電流ワイヤの第１のグループであって、前記少なくとも２つの第１の組が、少なくとも２方向において互いにずらされる、第１のグループと、前記運搬素子の同じ側に配置される少なくとも２つの第２の組のミアンダ状の電流ワイヤの第２のグループであって、前記少なくとも２つの第２の組が、少なくとも２方向において互いにずらされる、第２のグループと、を有し、電流ワイヤの前記第１のグループ及び前記第２のグループは、前記運搬表面に対して垂直な回転軸を中心に具体的には９０°互いに対して回転されて配置される。
【００３２】
他のアプリケーションにおいて、運搬表面上でビーズを「ホップ」させ又は「ジャンプ」させて小さいウェルに入る又はそこから出るようにすることが望ましいことがある。これを達成するために、切り替えユニットは、好適には、電流ワイヤの組が、正の電流をもつフェーズ及び負の電流をもつフェーズを含む周期的な電流信号を個別に供給されるように、電流ワイヤの前記組に個別に印加される前記電流を切り替えるように適応され、この場合、異なる電流信号の、特に隣り合う電流ワイヤに供給される電流信号の正及び／又は負のフェーズが互いに重なり合うように、個別の組に対する電流信号が、時間的にずらされる。電流信号の形状は、概して方形波であるが、正弦、三角又は鋸波形状もまた可能である。
【００３３】
別の実施形態によれば、運搬表面とほぼ平行な方向に、ほぼ一様な磁界を生成するコイルの組と、運搬表面に平行な面内で磁界の方向を変えるようにコイルの組を制御するコイル制御手段であって、特に２つの逆の方向の間で磁界の方向を反転させるコイル制御手段と、が提供される。それゆえ、他の実施形態において提供されるようにワイヤを駆動する電流ではなく、外部磁界の極性が切り替えられることができる。
【００３４】
別の見地によれば、本発明は、本発明による運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置に駆動電流を供給するための駆動ユニットに関する。前記駆動ユニットは、前記運搬表面上での前記ビーズの運搬を引き起こすように、電流駆動スキームに従って電流ワイヤの前記組に個別に印加される電流を個別に切り替えるように適応され、この場合、前記駆動ユニットは、前記電流ワイヤの組が、非ゼロの電流をもつフェーズ及びゼロ電流をもつフェーズを含む周期的な電流信号を個別に供給されるように、前記電流を切り替えるように適応される。上記で説明され、添付の図面を参照して後述されるように、さまざまな実施形態が、駆動電流を制御する、特に電流ワイヤに供給される電流を切り替える駆動ユニットに関して存在する。
【００３５】
本発明のこれら及び他の見地は、以下に記述される（複数の）実施形態から明らかであり、それらを参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１Ｂと共に、電流ワイヤを用いることによる運搬表面上でのビーズの運搬を示す図。
【図１Ｂ】図１Ａと共に、電流ワイヤを用いることによる運搬表面上でのビーズの運搬を示す図。
【図２Ａ】図２Ｂと共に、３組の電流ワイヤを示す図。
【図２Ｂ】図２Ａと共に、３組の電流ワイヤを示す図。
【図２Ｃ】図２Ａ及び図２Ｂに示される３組の電流ワイヤの電流に関する適当な駆動スキームを示す図。
【図３Ａ】付加の外部磁界の効果を示す図。
【図３Ｂ】付加の外部磁界の効果を示す図。
【図４Ａ】３組のミアンダ状の電流ワイヤを含む本発明による装置の第１の実施形態の断面図。
【図４Ｂ】図４Ａに示される本発明の第１の実施形態において用いられる電流ワイヤ構造を示す図。
【図４Ｃ】図４Ａ及び図４Ｂに示される本発明の第１の実施形態による適当な電流駆動スキームを示す図。
【図５Ａ】２組のミアンダ状の電流ワイヤを含む本発明による装置の第２の実施形態の断面図。
【図５Ｂ】図５Ａに示される本発明による装置の第２の実施形態において用いられる電流ワイヤ構造を示す図。
【図５Ｃ】図５Ａ及び図５Ｂに示される本発明の第２の実施形態による適当な電流駆動スキームを示す図。
【図６】本発明の第３の実施形態による電流駆動スキームを示す図。
【図７】本発明の第４の実施形態による電流駆動スキームを示す図。
【図８】本発明の第５の実施形態による２組のミアンダ状の電流ワイヤの２つのペアの組み合わせを示す図。
【図９】本発明の第５の実施形態による電流駆動スキームを示す図。
【図１０】本発明によるＤＮＡシークエンシングのためのマイクロフルイディックシステムの一実施形態を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
単一の電流ワイヤは、ワイヤの方へ超常磁性ビーズを引き寄せる磁界を生成することが良く知られている。従って、図１Ａに示されるように、基板１７上に堆積された複数の集積化された電流ワイヤ１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄを使用して、運搬素子１４の運搬表面１２上で磁性ビーズ１０を運搬することが可能である。
【００３８】
電流ワイヤ１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄを順次にアドレスすることによって、局所的な磁界Ｂ１が生成され、それにより、ビーズ１０が、個々の電流ワイヤ１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄによって引き寄せられる。従って、ビーズは、運搬表面１２上を左から右に移動する。図１Ａに示されるように、ワイヤ１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄは、運搬素子１４として働く絶縁フィルムによって覆われることができる。フィルムの最上部が、運搬表面１２である。
【００３９】
ビーズ１０に対する磁気力は、図１Ｂに示されるように、電流ワイヤ１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄによって生成される局所的な磁界Ｂ１に加えて、例えば永久磁石のような外部ソース１８を使用して一様な磁界Ｈｅを印加することによって、増大されることができる。この外部磁界Ｈｅの利点は、（一様な）外部磁界Ｈｅが、超常磁性ビーズ１０の磁化を増大し、それによって、ビーズ１０のスピードを大幅に、具体的には一桁増大させることである。表面上で磁性ビーズ１０を運搬するこのやり方は知られており、マイクロフルイディック装置において磁性ビーズ１０を操作するために使用されている。
【００４０】
この原理を知ることは、磁性ビーズの集合的な運搬を実現するための以下の提案をトリガする。図２Ａ及び図２Ｂは、運搬表面上に堆積されたミアンダ状の電流ワイヤの３つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃを示している。図２Ａは、概略図を示し、図２Ｂは、実現されるワイヤ（一例として、ワイヤが５μｍの幅及び１μｍの間隔を有する）の光学的顕微鏡写真を示す。例えば曲り角２２のような曲り角において、ワイヤは、電気短絡を回避するために「ブリッジ」を通じて交差する。
【００４１】
図２Ｃに示すような適当な電流駆動スキームによりワイヤの３つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃを順次に且つ個別にアドレスすることによって、ビーズが運搬表面上で左から右へ運搬される。時間ｔに関して図示されている電流Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃが、ミアンダ状の電流ワイヤの３つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃにそれぞれ供給され、一度に、電流Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃのただ１つが非ゼロであり、他の２つの電流がゼロであるように、制御される、このアプローチの利点は、たった３つの電気ワイヤ（すなわちミアンダ状の電流ワイヤの３組２０ａ、２０ｂ、２０ｃ）のみが外界に接続される必要があることである。
【００４２】
このアプローチは、付加の外部磁界が印加されない場合に有効であり、これは実験的に証明された。しかしながら、外部磁界が印加される場合、状況は異なる。その場合、すなわち、磁気力の性質は、外部磁界の方向に対するワイヤ内の電流の向きに依存する。これは、図３を参照して説明されることができる。図３Ａは、電流Ｉがページに入っていく方向である電流ワイヤ２２の断面を示す；すなわち、ワイヤ２２によって生成される局所的な磁界Ｂ１は、時計回りである。更に、外部磁界Ｈｅは、左から右へ向いている。全体の磁界（外部磁界プラス局所的な磁界）の結果として、表面に（この場合は例えばワイヤ２２より１μｍ上に）位置する超常磁性ビーズは、水平位置ｘの関数として、図３Ａの図に示されるような磁気力Ｆｘを受ける。ここで、位置０はワイヤ２２の中心にある。ここで、正の力Ｆｘは、（正の）ｘ方向の力を意味する。従って、ビーズは、ワイヤ２２の方へ引き寄せられる。
【００４３】
図３Ｂに示すように、電流Ｉがページから出てくる方向にある場合、状況は異なる。局所的な磁界Ｂ１は、ここでは、反時計回りの向きであり、力は、実際、ワイヤ２２から離れるほうへビーズを追いやる。
【００４４】
この効果は、図２に示される装置の動作の結果を有する。ワイヤ２０ａ、２０ｂ、２０ｃのミアンダ状の構造により、電流（及びゆえに局所的な磁界の向き）は、各々の曲り角で変化し、従って、一様な外部静磁界に対してその方向を変える。従って、外部磁界に加えて、各々曲り角において、状況は、図３Ａに示されるものと図３Ｂに示されるものとで異なる。すなわち、状況は引力から斥力へ変わり、その逆も同様である。これは、図２Ｃに示される駆動スキームの使用が左から右へのビーズの移動を生じさせないことを意味する。むしろ、各サイクルで生じることは、ビーズが右へ２ステップ（組２０ａのワイヤから隣りの組２０ｂのワイヤまで、及び該組２０ｂのワイヤから隣りの組２０ｃのワイヤまで）進み、次に、より大きいステップ戻るほうへ進み、組２０ａの元のワイヤまで戻るということである。これは、実験的にも認められた。
【００４５】
それゆえ、本発明の更なる認識は、電流方向が適時に変えられる場合、ビーズを、運搬表面と平行な一方向へ、例えば図２Ａの左から右へ移動させることが可能なことである。これは、図４を参照してより詳しく説明される。図４は、本発明による装置２４の第１の実施形態の断面図（図４Ａ）と、この実施形態に用いられる電流ワイヤ構造２０（図４Ｂ）及び電流駆動スキーム（図４Ｃ）とを示している。
【００４６】
図４Ａに示される装置２４は、流体２８の磁性ビーズ又は磁化可能なビーズ１０を含むチャンバ２６を有する。前記ビーズ１０がその上を運搬される前記運搬表面１２を含む運搬素子１４が、前記チャンバ２６内に配置される。前記運搬素子１４の前記運搬表面１２と反対の側に、ミアンダ状の電流ワイヤの３組２０ａ、２０ｂ、２０ｃを含む電流ワイヤ構造２０が配置される。図４Ｂに見られるように、前記３つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃは、少なくとも２方向において、特に、運搬表面１２に平行なワイヤ平面３０を形成するｘ及びｙ方向において、互いにずらされている。
【００４７】
基板１７が、チャンバ２６の内部側壁と置き換えられることができ、電流ワイヤが内部側壁上に直接堆積されることも可能であることに注意すべきである。更に、電流ワイヤが、チャンバ２６の外部側壁上に堆積されることができ、チャンバ２６の対向する内部側壁が運搬表面の役目を果たすことも可能である。
【００４８】
電流駆動スキームに従って電流ワイヤの前記組２０ａ、２０ｂ、２０ｃに個別に印加される電流Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃを生成し、個別に切り替えるために、切り替えユニット３２が提供される。前記切り替えユニット３２は、電流ワイヤに駆動電流を供給する駆動ユニットと考えられることもできる。
【００４９】
対応する駆動スキームが、電流ワイヤの３つの組２０ａ、２０ｂ、２０ｃに印加される３つの電流Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃに関して図４Ｃに示されている。電流Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃを正から負に切り替えることによって、特定のワイヤセグメントの磁気力の性質は、斥力から引力に反転され、前記運搬表面１２上で前記ビーズ１０のｘ方向の運搬を生じさせる。
【００５０】
従って、磁気力の性質の、電流の相対的な向きへの依存及び付加的に提供される実施形態における一様な外部静磁界が、電流を適切に駆動することによって有利に使用されることができる。
【００５１】
例示的に、本発明によって使用される構成要素の幾つかの寸法が与えられる：
【００５２】
磁性ビーズは、磁化可能なビーズ又は磁性ビーズ、特に超常磁性ビーズでありうる。好適な実施形態において、マグネタイトナノ粒子をその中に有するポリマビーズが使用される。サイズの一般的なレンジは、０．５μｍ乃至５０μｍであり、特に１μｍ乃至２０μｍである。
【００５３】
ワイヤは、使用される相対的に大きい電流（密度）の理由で、導電性材料で、好適には金属（例えばＣｕ又はＡｌ）で作られる。ワイヤの一般的な幅は、１μｍ乃至１０μｍである。一般的な間隔は、１μｍ乃至１０μｍである。一般的な厚さは、０．５μｍ乃至５μｍである。ワイヤは、既存の薄膜堆積及び構造化技術を用いて、それぞれ異なる層により基板（ガラス又はシリコン）上に生成されることができる。
【００５４】
使用される一般的な電流は、５ｍＡ乃至１００ｍＡ（例えば１０乃至３０ｍＡ）であり、これは、ワイヤ周囲に局所的に生成される一様でない円形磁界をもたらす。ワイヤ間の切り替えの一般的な周波数は、０．１乃至１０Ｈｚである。
【００５５】
外部磁界は、一般に５００乃至５０００Ｏｅ（１Ｏｅ＝（１０００／（４ｐｉ））Ａ／ｍ）のレンジの磁界強度、又は５０乃至５００ｍＴの磁束Ｂを有する。
【００５６】
図５に示される別の実施形態によれば、ミアンダ状の電流ワイヤのただ２つの組３６ａ、３６ｂが、運搬表面１２上でラインに沿った任意の方向にビーズ１０を移動させるために使用される。しかし、更に、外部静磁界Ｈｅは、例えば永久磁石、電磁石又はコイル構造のような外部磁気ソース１８によって印加される。図５Ａは、装置３４のこの実施形態の断面図を示し、図５Ｂは、２つのミアンダ状のワイヤ３６ａ、３６ｂを含む電流ワイヤ構造３６、及びこの装置３４において使用されるビーズ１０の初期位置を示す。図５Ｃは、この実施形態において使用される電流駆動スキームを示し、すなわちワイヤに印加される時間ｔの関数としての駆動電流Ｉａ、Ｉｂを示す。
【００５７】
時間ゼロにおいて、ワイヤ３６ａは、「オンに切り替えられ」、ビーズ１０は、図３を参照して説明される原理に従って、正電流＋Ｉａによって引き起こされる局所的な磁界Ｈｅ及び外部静磁界の組み合わせにより、ビーズが位置付けられるワイヤ３６ａによって引き寄せられる。その後、ワイヤ３６ａは、「オフに切り替えられ」、ワイヤ３６ｂが、（正電流＋Ｉｂによって）オンに切り替えられる。電流Ｉｂ及び外部磁界Ｈｅが向けられる態様によって、ビーズ１０は、ワイヤ３６ｂのワイヤセグメント３６ｂ１によってその左へ反発される一方、ビーズ１０は、ワイヤ３６ｂのワイヤセグメント３６ｂ２によって右へ引き寄せられる。従って、ビーズ１０は右へ移動する。次に、ワイヤ３６ｂは、「オフに切り替えられ」、ワイヤ３６ａが再び「オンに切り替えられる」が、電流−Ｉａは、第１のステップと比較して逆の方向に流れる。これは、再び、ビーズ１０を右へ移動させる。図５Ｃに示される駆動スキームによって規定される次のステップは、常にビーズ１０を右へ駆動させる。これは実験的にも証明された。
【００５８】
同じようにして、ビーズ１０は、図６に示されるように、駆動スキームの変化によって、左へ移動するようにされることができる。この駆動スキームは、図５Ｂに示される電流ワイヤ構造３６に適用されることができる。図５Ｃに示される駆動スキームとの違いは、単に電流信号Ｉａ、Ｉｂの極性である。
【００５９】
上述の図に示される駆動スキームの組み合わせは、図７に示されるように、電流ワイヤ方向に対し垂直なラインに沿った任意の方向において、ビーズの水平移動を可能にする。時間ゼロから始まって、駆動スキームは、ビーズ１０が左から右へまず移動するものである。しかしながら、時間ｔ１において、駆動信号Ｉａ、Ｉｂの両方の極性が反転され、ビーズ１０は、左へ移動し始める。事実、任意の時点に、ビーズ１０の移動方向は、駆動スキームの適切な調整によって変更されることができる。
【００６０】
ビーズの平均スピードは、ワイヤの切り替え期間を変えることによって及びワイヤを通る電流の大きさを変えることによって、変更されることができる。例えば電磁コイルのような調整可能な手段が外部磁界を生成するために使用される場合、ビーズの移動は、印加される外部磁界の変化によって変更されることもできる。
【００６１】
電流ワイヤ構造３８の別の実施形態が図８に示されている。これは、電流ワイヤの２組４０ａ、４０ｂ及び４２ａ、４２ｂの２つのペア４０、４２と、一様な外部静磁界Ｈｅとの組み合わせを含む。２つのペア４０、４２は、互いに垂直に指向されている（しかし、２つのペアの平面に対し垂直な回転軸を中心に９０°より大きい別の角度変位が可能でもある）。これは、運搬表面上でビーズ１０の移動の完全な自由度を与える。ワイヤの駆動スキームの適切な切り替えによって、ビーズ１０は、任意の軌道に沿って運搬表面上で移動されることができる。
【００６２】
図９は、図５Ｂに示される電流ワイヤ構造３６の実施形態によって使用されることができる駆動スキームの一実施形態を示す。この実施形態では、ビーズ１０を、表面上で「ホップ」させ、又はウェルに入りウェルから出るようにジャンプさせることも可能であり、これは、後述されるシークエンシングアプリケーションにとって重要である。その理由は、図３Ｂに示される状況において、斥力が、垂直方向だけでなく、水平方向にも働き、すなわち、ビーズが、電流ワイヤがその下に組み込まれている運搬表面から離れるほうへ「揚力」を受けるからである。図９に示される駆動スキームは、運搬表面上でビーズ１０をホップさせる。
【００６３】
時間ゼロ（ｔ０）に、ワイヤ３６ａは、オンに切り替えられ、図示される磁性ビーズ１０は、それが位置するワイヤセグメントによって引き寄せられる。時間ｔ１に、ワイヤ３６ａを通る電流方向が変更され、すなわち、その結果、ビーズ１０が反発されるようにし、すなわちそれが位置するワイヤ３６ａから離れ、表面から離れて上方へ押しやられるようにする。同時に、ワイヤ３６ｂが、（正電流＋Ｉｂによって）オンに切り替えられ、それによってビーズ１０を右へ引き寄せる。つまり、ビーズ１０は、それがワイヤ３６ｂに最も近いワイヤセグメントに到達するまで、右へ「ホップする」。次に、時間ｔ２に、ワイヤ３６ｂの電流方向が反転され、それにより、ビーズ１０が、ワイヤ３６ｂから反発される。ワイヤ３６ａの電流Ｉａがなおオンに切り替えられ、その結果、この例では同時に右に働く力を引き起こす。それゆえ、ビーズ１０は再び右へホップする。
【００６４】
それゆえ、図９に示される駆動スキームによって、ビーズ１０は、右へホップし続ける。ホッピングの方向は、切り替えの時点にビーズが位置していないワイヤを通る電流の極性を変えることによって、適時に変更されることができる。電流ワイヤ３６ａ、３６ｂがマイクロウェルの中又は下に位置している場合、ビーズを１つのウェルから隣りのウェルまでジャンプさせることが可能でありうる。
【００６５】
上述の実施形態の全てにおいて、外部磁界は静的であるものとする。しかしながら外部磁界を生成するために電磁コイルが使用される場合、電磁コイルを適時に制御するための自由度が存在する。つまり、例えば図４、５、６、７、９の実施形態のようにワイヤの電流の方向が切り替えられる状況において、外部磁界の方向は、（電流ワイヤ方向に代わって、）同じ効果を達成するように反転されることができる。この場合、外部磁界の切り替えは、ワイヤ電流間の切り替えに合わせて適切にタイミングを調整されなければならない。
【００６６】
上述の概念は、磁性ビーズが制御されたやり方で表面上で集合的に操作される必要がある任意のアプリケーションにとって有用である。特に、ビーズがＤＮＡ鎖の基板である場合、図１０に示されるように、シークエンシングステップのために必要とされる試薬が規則的なパターンで表面上に準備されるように、表面がパターン化されることができる。図１０は、特にシークエンシング又は核酸テスティングのために磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを含むサンプルを操作するためのマイクロフルイディック装置４４、特にＤＮＡシークエンシング装置を示し、マイクロフルイディック装置４４は、運搬表面上で磁性ビーズ又は磁化可能なビーズを運搬する装置を含む。
【００６７】
図１０に示される装置４４の実施形態は、任意の２次元方向におけるビーズ１０の移動を可能にする図８に示されるようなワイヤ構造３８を有する。更に、ミアンダ状の電流ワイヤのすべての組４０ａ、４０ｂ、４２ａ、４２ｂのための電流を生成し、切り替えるための切り替えユニット３２、及び外部磁界Ｈｅを生成する（及び好適には変更する）ための磁界生成手段１８が、図示されている。
【００６８】
磁界生成手段１８は概して永久磁石でありうるが、本実施例において、好適には、磁界生成手段が電磁コイルによって実現され、それにより、磁界Ｈｅが変更されることができる。この目的のために、コイル制御ユニット４６が更に提供され、コイル制御ユニット４６によって、コイルの制御電流が制御されることができる。従って、好適には、磁界Ｈｅの方向（及び／又は強度）が、ユーザによって変更可能である。代替として又は付加的に、ミアンダ状の電流ワイヤに対する電流が、好適には、インタフェース（図示せず）を通じてユーザによって設定され又は変更されることができる。
【００６９】
このようなコイル及びコイル制御手段が他の実施形態においても提供されることができ、外部磁界Ｈｅの方向（及び／又は強度）が変更されることが注意されるべきである。
【００７０】
このような装置によれば、試薬は、表面（すなわち疎水性−親水性エリア）の表面エネルギーパターニングによって、表面上に配置される液滴に包含されることができ、又はそれらは、表面に存在するマイクロウェルに存在してもよい。ビーズ及びゆえにシークエンスされるべきＤＮＡ鎖は、あるシークエンシング位置から他のシークエンシング位置へ運搬されることができ、シークエンシング反応が行われることができる。シークエンシングアプローチは、ヌクレオチドの成功裏の包含が蛍光信号を生成する「パイロシークエンシング」でありうる。（光学的）検出によって、プロセスが記録されることができ、ＤＮＡシークエンスが推定される。代替として、シークエンシングプロセスは、蛍光標識化されたヌクレオチドの取り込みを必要としうる。更に、シークエンシングプロセスは、ナノポアシークエンシングによって行われることができる。この例のシークエンシングプロセスでは、ビーズがナノポアを通過するには大きすぎるので、ＤＮＡが、ビーズから分離されるべきである。それでも、ビーズによる運搬は、ナノポアシークエンシングユニットに個別の鎖を運ぶために、装置にある態様で含まれることができる。
【００７１】
従って、本発明は、制御される態様でビーズが表面上で集合的に操作される必要がある任意の（マイクロフルイディック）システムにおいて広く適用されることができる。特に、本発明は、関係するシークエンシングステップ及び例えば核酸テスティングのＤＮＡ抽出ステップのような試料調製ステップを制御するために、ＤＮＡシークエンシング装置において適用されることができる。更に、本発明は、幾つかの生化学アッセイタイプに使用される磁気バイオセンサに適用されることができる。
【００７２】
本発明は、図面及び上述の説明において詳しく図示され記述されているが、このような図示及び記述は、制限的でなく、説明的又は例示的なものであると考えられるべきである。本発明は、開示された実施形態に制限されない。開示された実施形態に対する他の変更は、図面、開示及び添付の請求項の検討から、当業者によって、請求項に記載の本発明を実施する際に理解され達成されることができる。
【００７３】
請求項において、「含む、有する」という語は、他の構成要素又はステップを除外せず、不定冠詞「a」又は「an」は複数性を除外しない。単一の構成要素又は他のユニットが、請求項に列挙される幾つかのアイテムの機能を果たすことができる。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示さない。
【００７４】
請求項における参照符号は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【図１Ａ】
2013504753.tif 000003
【図１Ｂ】
2013504753.tif 000004
【図２Ａ】
2013504753.tif 000005
【図２Ｂ】
2013504753.tif 000006
【図２Ｃ】
2013504753.tif 000007
【図３Ａ】
2013504753.tif 000008
【図３Ｂ】
2013504753.tif 000009
【図４Ａ】
2013504753.tif 000010
【図４Ｂ】
2013504753.tif 000011
【図４Ｃ】
2013504753.tif 000012
【図５Ａ】
2013504753.tif 000013
【図５Ｂ】
2013504753.tif 000014
【図５Ｃ】
2013504753.tif 000015
【図６】
2013504753.tif 000016
【図７】
2013504753.tif 000017
【図８】
2013504753.tif 000018
【図９】
2013504753.tif 000019
【図１０】
2013504753.tif 000020
【国際調査報告】
2013504753.tif 000021
2013504753.tif 000022
2013504753.tif 000023
2013504753.tif 000024
2013504753.tif 000025