(57)【要約】  本発明は、薬理シャペロンを用いて、ガングリオシド異化に関与するガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼ酵素の活性を増大させることによってアルツハイマー病を有する個体を治療するための方法に関する。
2013508371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるアルツハイマー病の治療のための方法であって、前記個体に有効量の薬理シャペロンを投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記個体が、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼＳ、ノイラミニダーゼ−１、ノイラミニダーゼ−２、ノイラミニダーゼ−３、ノイラミニダーゼ−４およびグルコセレブロシダーゼからなる群から選択される酵素活性を欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬理シャペロンが、ガングリオシダーゼ、シアリダーゼおよびグルコセレブロシダーゼからなる群から選択される酵素に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ガングリオシダーゼが、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼＳ、ノイラミニダーゼ−２、ノイラミニダーゼ−３、およびノイラミニダーゼ−４からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記シアリダーゼが、ノイラミニダーゼ−１およびノイラミニダーゼ４からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ガングリオシダーゼがβ−ヘキソサミニダーゼＢである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記薬理シャペロンがグルコセレブロシダーゼに結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記薬理シャペロンが、ガングリオシダーゼ、シアリダーゼおよびグルコセレブロシダーゼからなる群から選択される酵素の、小胞体からリソソームおよびミトコンドリアへの、小胞体から細胞質へのまたは小胞体からエンドソームおよび形質膜への輸送を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬理シャペロンが、ガングリオシダーゼ、シアリダーゼおよびグルコセレブロシダーゼからなる群から選択される酵素の突然変異体および／または野生型活性を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガングリオシダーゼまたはシアリダーゼがガングリオシドを異化する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
グルコセレブロシダーゼがグルコシルセラミドを異化する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガングリオシダーゼがβ−ヘキソサミニダーゼＢであり、前記ガングリオシドがＧＡ２およびＧＭ２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬理シャペロンが２−アセトアミド−１，２−ジデオキシノジリマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬理シャペロンが４−エピ−イソファゴミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アルツハイマー病が早発性の家族性アルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
アルツハイマー病がダウン症によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
個体におけるタウタンパク質の病的凝集に起因する状態の治療のための方法であって、前記個体に有効量の薬理シャペロンを投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記状態が、前頭側頭認知症、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および前頭側頭葉変性症からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
個体における脳アミロイド血管症の治療のための方法であって、前記個体に有効量の薬理シャペロンを投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記薬理シャペロンが２−アセトアミド−１，２−ジデオキシノジリマイシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脳アミロイド血管症が家族性脳アミロイド血管症である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／２５２，７９９号明細書の恩典を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、薬理シャペロンを用いて、ガングリオシド異化に関与するガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼ酵素の活性を増大させることによってアルツハイマー病を有する個体を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病は、最も大きい社会経済的な医療負担の１つである。アルツハイマー病は進行性認知症を特徴とし、組織病理学的には神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）および老人（ｎｅｕｒｉｔｉｃ）（老人（ｓｅｎｉｌｅ））斑の存在を特徴とする。斑はアミロイド（Ａβ）と呼ばれるタンパク質からなり、もつれはタウと呼ばれるタンパク質でできている。
【０００４】
アミロイド斑とＮＦＴは両方ともアルツハイマー病の顕著な特徴である。ＡＰＰおよびプレセニリンの突然変異は早発性形態のアルツハイマー病を引き起こし、ＡＰＰのプロセッシングが孤発性ＡＤの発病に重要な役割も果たし得るという仮説を裏付けている。さらに、「アミロイド仮説」では、ある毒性形態のＡβの蓄積が脳に害を及ぼすと予想されている。ＡＰＰは、α−およびβ−セクレターゼ経路によってプロセッシングされ得る。これまで、この疾患の進行を遅延させるＡＤ治療を開発しようとするほとんどの研究努力は、Ａβペプチドを形成させるγ−セクレターゼおよびβ−セクレターゼの阻害ならびにＡＰＰ代謝の阻害または神経保護的ｓＡＰＰαペプチドの産生を増大させると同時にＡβ産生を低下させるα−セクレターゼプロセッシングの活性化に焦点を当てている。インビボでのβ−セクレターゼ活性の減少と、脳でのＡβペプチドの低下との間には非線形の関係性があるように見えることも一因となって、特異的なβ−セクレターゼ阻害剤の開発は困難である。さらなる困難は、ほとんどの阻害剤がわずかしか脳に透過しないことである。γ−セクレターゼ阻害剤はさらに、ｎｏｔｃｈ阻害と関連する重篤なＧＩ副作用に悩まされる。なぜなら、γ−セクレターゼは、ＡＰＰの他に、ｎｏｔｃｈ受容体をはじめとする他の多くの基質をプロセッシングするからである。さらに、γ−セクレターゼ活性の欠損は、神経変性を引き起こすことが示されており、プレセニリン１（γ−セクレターゼ複合体の活性部位を含むγ−セクレターゼ複合体の構成要素）の突然変異によって引き起こされる常染色体優性の早発性アルツハイマー病と関連する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ）の治療を目的とした努力の大半は、ＡＤの症状を軽減することに焦点をあてている。特に、ＡＤ患者の前脳の罹患したニューロンにおける低濃度のコリンアセチルトランスフェラーゼの同定は、シナプス間隙でのアセチルコリンの加水分解を阻害し、シナプスにおけるアセチルコリンのレベルを延長することを目的とした治療につながった。この戦略は、神経伝達物質レベルの少なくとも一部の修正をもたらすが、治療的利益は少ない。
【０００６】
さらに、ＡＤはタウオパシーに分類される。タウオパシーは、その凝集および神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）の形成を促進するタウの異常な過剰リン酸化によって引き起こされる。タウおよびＡＰＰの突然変異は両方とも認知症を引き起こすので、一方または両方がＡＤの疾患進行の一因となり得る。ＡＰＰのプロセッシングの変化をもたらす突然変異がＡＤを引き起こすことが十分に理解されている。現在、アルツハイマー病の進行を遅らせるための認可された治療法はない。したがって、より有益なＡＤ治療が今も必要とされている。開発中のほとんどの治療法は、ＡＰＰ代謝を変化させること（例えば、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ阻害）またはタウ凝集を阻止することに焦点を当てているが、本発明は、１種以上のガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼに結合し、それにより、ｓＡＰＰαの産生を増大させ、Ａβおよび過剰リン酸化タウの産生を低下させる薬理シャペロンを用いる治療を提供するものである。
【０００７】
本明細書における引用は全て、その全体が参照により組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特定のガングリオシドの異化に関与する１種以上のガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼ酵素の活性を増大させることによってガングリオシドレベルを低下させる薬理シャペロンを投与することにより、アルツハイマー病を治療するための方法に関する。
【０００９】
一実施形態によれば、個体のアルツハイマー病を治療するための方法であって、個体に有効量の薬理シャペロンを投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、薬理シャペロンは、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ酵素またはグルコセレブロシダーゼに結合する。さらなる実施形態では、薬理シャペロンは、突然変異体および／または野生型ガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼ活性を増大させる。
【００１０】
一実施形態では、脳アミロイド血管症を治療するための方法を提供する。別の実施形態では、ＣＡＡは、ＡＰＰの突然変異によって引き起こされる家族性ＣＡＡである。
【００１１】
本発明はまた、特定のガングリオシドの異化に関与する１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ酵素の活性を増大させるかまたはグルコセレブロシダーゼの活性を増大させる薬理シャペロンを投与することにより、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および前頭側頭葉変性症などの疾患を含む、タウタンパク質の病的凝集に起因する状態を治療するための方法に関する。
【００１２】
本発明は、薬理シャペロンとして知られる化合物と、これらの化合物を用いて、アルツハイマー病を発症するリスクがあるかまたはアルツハイマー病であると診断された患者のアルツハイマー病を予防および／または治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に示すような式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩから選択される化合物、ならびに実施例で特定される化合物を投与することを含む方法とを提供する。
【００１３】
一実施形態では、薬理シャペロンは、２−アセトアミド−１，２−ジデオキシノジリマイシンまたは医薬として許容されるその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグである。一実施形態では、薬理シャペロンは、５−（フルオロメチル）ピペルジン−３，４−ジオールまたは医薬として許容されるその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグである。一実施形態では、薬理シャペロンは、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（フルオロメチル）ピペルジン−３，４−ジオールまたは医薬として許容されるその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを含む。一実施形態では、薬理シャペロンは、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（フルオロメチル）ピペルジン−３，４−ジオール塩酸塩を含む。一実施形態では、本方法は、５−（クロロメチル）ピペルジン−３，４−ジオールまたは医薬として許容されるその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペルジン−３，４−ジオールまたは医薬として許容されるその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペルジン−３，４−ジオールを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＡＰＰプロセッシングの概略図を示す。
【図２】β−ヘキソサミニダーゼ活性が欠損したマウスの脳におけるＡＰＰ代謝およびタウリン酸化の変化の証拠を示す。
【図３】サンドホフ患者由来の線維芽細胞が、対照線維芽細胞と比べて、より多いｓＡＰＰβおよびＡβとより少ないｓＡＰＰαとを分泌し、かつタウ過剰リン酸化を示すことを示す。
【図４】薬理シャペロンのＮＧＴおよびＡｄＤＮＪで処理したＮ２Ａマウス神経芽細胞腫における内在性の野生型β−ヘキソサミニダーゼレベルおよびｓＡＰＰα切断の増加を示す。
【図５】薬理シャペロンＮＧＴで処理したＣ５７ＢＬ６マウスの脳における内在性の野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性に対する用量およびウォッシュアウトの効果ならびに脳および血漿における対応する薬物レベルを示す。
【図６】Ｃ５７ＢＬ６マウスの脳における内在性の野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性レベルおよびｓＡＰＰαレベルに対する薬理シャペロンＮＧＴの効果の経時変化を示す。
【図７】薬理シャペロンＮＢ−ＤＡＮＡによる線維芽細胞におけるノイラミニダーゼ１レベルの増強を示す。
【図８】薬理シャペロンのザナミビルによるＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞種におけるノイラミニダーゼ３レベルの増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ａβは、全ての生体液中に見られ、より大きなＩ型膜タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の酵素的切断によって生じる３８〜４３アミノ酸の疎水性ペプチドである。ＡＰＰプロセッシングを示している図１を参照されたい。家族性ＡＤ患者の連鎖研究によって、ＡＰＰとＡＰＰの異常代謝および凝集型のＡβの産生増大に関連するプレセニリンという２つの遺伝子にいくつかの突然変異が同定された。Ａβが、アルツハイマー病の病理に大きな役割を果たし得る毒性のあるオリゴマーを形成すると考えられている（Ｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００１６】
ガングリオシドは、脳の神経毒性型Ａβ（すなわち、オリゴマー）の生成を促進する。ガングリオシドは、細胞膜の外葉に見られるシアル酸含有スフィンゴ糖脂質であり、ニューロンの細胞表面に特に多く存在する。ガングリオシドは、クラスターとなって存在することや、形質膜の表面でマイクロドメインを形成することが知られている。この特殊な局在のために、ガングリオシドは、糖タンパク質、ペプチドホルモン、および増殖因子をはじめとする種々のバイオエフェクターと相互作用することができる。さらに、ガングリオシド（例えば、ＧＭ１ガングリオシド）は、細胞分化を促進し、ニューロン発生の損失を防止し、かつニューロン損傷のインビトロおよびインビボのモデルで神経保護的役割を果たすことができる。
【００１７】
ガングリオシドは神経系に最も多く存在し、シグナル伝達の仲介、細胞接着および細胞分化をはじめとする種々の機能に関与する。２００を超えるガングリオシドが同定されているが、ニューロンのガングリオシドの大部分は、１種以上のガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼによって異化される。
【００１８】
α−セクレターゼ活性の産物である可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）とβ−セクレターゼ活性の産物である可溶性ＡＰＰβ（ｓＡＰＰβ）は、ｓＡＰＰαにＡβの最初の１６残基が含まれることが異なっている。α−セクレターゼによるＡＰＰの切断はＡβドメインを２つに切断するので、この反応の産物はアミロイドを生じさせることができない。したがって、α−セクレターゼ活性の活性化または上方調節は、毒性のあるＡβオリゴマーおよびアミロイド斑の形成を妨げるかまたは低下させると同時に、神経栄養性でかつ神経保護的なｓＡＰＰαの切断を増大させると仮定されている。興味深いことに、スフィンゴ糖脂質およびガングリオシドの合成を阻害することによって、ｓＡＰＰαの切断が活性化されることが示されている（Ｓａｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１９】
ＡＰＰの突然変異は、家族性アルツハイマー病および／または脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）も引き起こす。ガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３およびＧＤ３は、脳で部位特異的に発現するので、局所的なＡβ沈着を調節することができる。（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）は、オランダ型およびイタリア型Ａβの遺伝性変異体の会合とフラマン型Ａβの遺伝性変異体の会合が、それぞれ、ＧＭ３ガングリオシドとＧＤ３ガングリオシドによって加速されることを示した。特に、オランダ型およびイタリア型Ａβが沈着する脳の血管壁を構成する脳血管平滑筋細胞は、主にＧＭ２およびＧＭ３を発現する（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。したがって、遺伝性Ａβ変異体の会合は、脳における特定のガングリオシドの存在などの、局所的な環境因子によって加速される可能性がある。
【００２０】
本発明は、薬理シャペロンとして知られる化合物と、これらの化合物を用いて、アルツハイマー病を発症する危険性があるかまたはアルツハイマー病であると診断された患者のアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする患者に、式Ｉ：
【化１】
2013508371.tif 000003
（式中：
Ｒ１はＣ（Ｒ２）（Ｒ３）（Ｒ４）であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＨまたはハロゲンであり；
Ｒ３は、水素、−ＯＨ、ハロゲンまたはＣ１−８アルキルであり；
Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１−８アルキル、置換Ｃ１−８アルキル、アリール、置換アリール、アルキルシクロアルキルまたは置換アルキルシクロアルキルであり；
Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している炭素と結合して、好ましくはハロゲンと、より好ましくは１以上のフッ素原子と任意に置換し得るシクロアルキル環を形成することができ；
Ｒ６は、水素、Ｃ１−８アルキル、置換Ｃ１−８アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、または置換アルキルアリールであり；
Ｚは任意であり、存在するとき、Ｚは−（ＣＨ２）１−８−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ３、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ９Ｒ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−８アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３であり；
Ｒ９は、水素、Ｃ１−８アルキルまたは置換Ｃ１−８アルキルであり；
Ｒ１０は、水素、Ｃ１−８アルキルまたは置換Ｃ１−８アルキルであり；
Ｒ５は、水素、Ｃ１−８アルキル、置換Ｃ１−８アルキル、アリール、置換アリール、Ｃ１−８アルケニル、置換Ｃ１−８アルケニル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アミノアリールアルキルまたは置換アミノアリールアルキルであり；
Ｒ７は、−ＯＨまたはハロゲンであり；かつ
Ｒ８は、水素、ハロゲンまたはＣ１−８アルキルであり、
ただし、Ｒ４がハロゲンであり、Ｚが存在せず、Ｒ７が−ＯＨであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８が水素であるとき、Ｒ２とＲ３は両方とも、水素であることはできない）
の化合物を含む有効量の薬理シャペロンを投与することを含む方法とを提供する。
【００２１】
本発明は、薬理シャペロンとして知られる化合物と、これらの化合物を用いて、アルツハイマー病を発症する危険性があるかまたはアルツハイマー病であると診断された患者のアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする患者に、式ＩＩ：
【化２】
2013508371.tif 000004
（式中：
Ｒ１はＣ（Ｒ２）（Ｒ３）（Ｒ４）であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＨまたはハロゲンであり；
Ｒ３は、水素、−ＯＨ、ハロゲンまたは−ＣＨ３であり；
Ｒ４は、ハロゲン、−ＣＨ３、フェニル、フルオロフェニル、メチルフェニル、シクロヘキシルメチルであり、ここで、Ｒ４がハロゲンであるとき、Ｒ２とＲ３は両方とも、水素であることはできず；
Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している炭素と結合して、１以上のハロゲン原子と任意に置換し得るシクロアルキル環を形成することができ；
Ｒ６は、水素、フェニルアルキルまたは置換フェニルアルキルであり；
Ｚは任意であり、存在するとき、Ｚは、−（ＣＨ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ３、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ９Ｒ１０、−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−または−Ｃ（＝Ｏ）２−ＣＨ３であり；
Ｒ９は、水素またはＣＨ３であり；
Ｒ１０は、水素またはＣＨ３であり；
Ｒ５は、水素またはアミノフェニルアルキルであり；
Ｒ７は、−ＯＨまたはハロゲンであり；かつ
Ｒ８は水素、ハロゲンまたは−ＣＨ３であり、
ただし、Ｒ４がハロゲンであり、Ｚが存在せず、Ｒ７が−ＯＨであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８が水素であるとき、Ｒ２とＲ３は両方とも、水素であることはできない）
の化合物を含む有効量の薬理シャペロンを投与することを含む方法とを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、薬理シャペロンとして知られる化合物と、これらの化合物を用いて、アルツハイマー病を発症する危険性があるかまたはアルツハイマー病であると診断された患者のアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする患者に、式ＩＩＩ：
【化３】
2013508371.tif 000005
（式中：
Ｒ１はＣ（Ｒ２）（Ｒ３）（Ｒ４）であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＨまたはハロゲンであり；
Ｒ３は、水素、−ＯＨ、ハロゲンまたは−ＣＨ３であり；
Ｒ４は、ハロゲン、−ＣＨ３、フェニル、フルオロフェニル、メチルフェニル、シクロヘキシルメチルであり、ここで、Ｒ４がハロゲンであるとき、Ｒ２とＲ３は両方とも、水素であることはできず；
Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している炭素と結合して、１以上のハロゲン原子と任意に置換し得るシクロアルキル環を形成することができ；
Ｒ７は、−ＯＨまたはハロゲンであり；かつ
Ｒ８は水素、ハロゲンまたは−ＣＨ３であり、
ただし、Ｒ４がハロゲンであり、Ｒ７が−ＯＨであり、かつＲ５、Ｒ６およびＲ８が水素であるとき、Ｒ２およびＲ３は両方とも、水素であることはできない）
の化合物を含む有効量の薬理シャペロンを投与することを含む方法とを提供する。
【００２３】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、不安定な分子が生じるようには選択されないことが当業者によって理解される。
【００２４】
本発明を説明するために用いられる様々な用語の定義を以下に記載する。これらの定義は、特定の例で別途限定されない限り、これらの用語が、個別にまたはより大きい群の一部として本明細書の全体を通して用いられるように、これらの用語に適用される。
【００２５】
「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子の直鎖または分枝鎖の非置換炭化水素基を指す。「低級アルキル」という表現は、１〜４個の炭素原子の非置換アルキル基を指す。
【００２６】
「置換アルキル」という用語は、例えば、１〜４個の置換基、例えば、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、アルカノイル、アリールオキシ、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、２つのアミノ置換基が、アルキル、アリールもしくはアラルキルから選択される二置換アミン；アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換アルカノイルアミノ、置換アリールアミノ、置換アラルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルチオノ、アリールチオノ、アラルキルチオノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、スルホンアミド、例えば、ＳＯ２ＮＨ２、置換スルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバミル、例えば、ＣＯＮＨ２、置換カルバミル、例えば、ＣＯＮＨアルキル、ＣＯＮＨアリール、ＣＯＮＨアラルキルまたはアルキル、アリールもしくはアラルキルから選択される２つの置換基が窒素上にある場合；アルコキシカルボニル、アリール、置換アリール、グアニジノおよびヘテロシクロ、例えば、インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなどで置換されたアルキル基を指す。上に記載されている場合、置換基がさらに置換されている場合、それは、アルキル、アルコキシ、アリールまたはアラルキルと置換されている。
【００２７】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００２８】
「アリール」という用語は、環部分に６〜１２個の炭素原子を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基、例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニルおよびジフェニル基を指し、これらの基は各々、置換されていてもよい。
【００２９】
「アラルキル」という用語は、アルキル基を介して直接結合したアリール基、例えば、ベンジルを指す。同様に、「アルキルアリール」という用語は、アリール基を介して直接結合したアルキル基、例えば、メチルベンジルを指す。
【００３０】
「置換アリール」という用語は、例えば、１〜４個の置換基、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、ウレイド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、アルコキシカルボニル、アルキルチオノ、アリールチオノ、アリールスルホニルアミン、スルホン酸、アルキスルホニル、スルホンアミド、アリールオキシなどで置換されたアリール基を指す。置換基は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、置換アリール、置換アルキルまたはアラルキルでさらに置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、置換アリールは、フェニルアルキルまたは置換フェニルアルキルである。いくつかの実施形態では、置換フェニルアルキルは、ハロゲン、アルコキシまたはアルキルと置換されていることが好ましい。
【００３１】
「ヘテロアリール」という用語は、例えば、少なくとも１つのヘテロ原子と、少なくとも１つの炭素原子含有環、例えば、ピリジン、テトラゾール、インダゾールとを有する４〜７員単環式、７〜１１員二環式、または１０〜１５員三環式環系である、任意に置換された芳香族基を指す。
【００３２】
「アルケニル」という用語は、１〜４個の二重結合を有する、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１５個の炭素原子、および最も好ましくは２〜８個の炭素原子の直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。
【００３３】
「置換アルケニル」という用語は、例えば、１個または２個の置換基、例えば、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、アルキルチオノ、アルキルスルホニル、スルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバミル、置換カルバミル、グアニジノ、インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなどで置換されたアルケニル基を指す。
【００３４】
「アルキニル」という用語は、１〜４個の三重結合を有する、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１５個の炭素原子、および最も好ましくは２〜８個の炭素原子の直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。
【００３５】
「置換アルキニル」という用語は、例えば、置換基、例えば、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、アルキルチオノ、アルキルスルホニル、スルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバミル、置換カルバミル、グアニジノおよびヘテロシクロ、例えば、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなどで置換されたアルキニル基を指す。
【００３６】
「シクロアルキル」という用語は、不飽和Ｃ３−Ｃ７炭素環式環とさらに縮合し得る、１〜３個の環および環１個当たり３〜７個の炭素を含有することが好ましい任意に置換された飽和環式炭化水素環系を指す。例示的な基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロクチル、シクロデシル、シクロドデシル、およびアダマンチルが挙げられる。例示的な置換基としては、上で記載したような１以上のアルキル基、または上でアルキル置換基として記載した１以上の基が挙げられる。
【００３７】
「複素環」、「複素環式」および「ヘテロシクロ」という用語は、例えば、少なくとも１つの炭素原子含有環に少なくとも１つのヘテロ原子を有する４〜７員単環式、７〜１１員二環式、または１０〜１５員三環式環系である、任意に置換された完全飽和または不飽和の芳香族または非芳香族環式基を指す。ヘテロ原子を含有する複素環式基の各々の環は、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される１個、２個または３個のヘテロ原子を有していてもよく、その場合、窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、かつ窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてもよい。複素環式基は、任意のヘテロ原子または炭素原子に結合していてもよい。
【００３８】
例示的な単環式複素環式基としては、ピロリジニル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、オキセタニル、ピラゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、オキサジアゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、２−オキサアゼピニル、アゼピニル、４−ピペリドニル、ピリジル、Ｎ−オキソ−ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソランおよびテトラヒドロ−１，１−ジオキソチエニル、ジオキサニル、イソチアゾリジニル、チエタニル、チイラニル、トリアジニル、ならびにトリアゾリルなどが挙げられる。
【００３９】
例示的な二環式複素環式基としては、２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キヌクリジニル、キノリニル、キノリニル−Ｎ−オキシド、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフリル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、ピロロピリジル、フロピリジニル（例えば、フロ［２，３−ｃ］ピリジニル、フロ［３，１−ｂ］ピリジニル］またはフロ［２，３−ｂ］ピリジニル）、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロキナゾリニル（例えば、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−キナゾリニル）、ベンズイソチアゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンゾジアジニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズピラゾリル、ジヒドロベンゾフリル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾチオピラニル、ジヒドロベンゾチオピラニルスルホン、ジヒドロベンゾピラニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、ナフチリジニル、フタルアジニル、ピペロニル、プリニル、ピリドピリジル、キナゾリニル、テトラヒドロキノリニル、チエノフリル、チエノピリジル、チエノチエニルなどが挙げられる。
【００４０】
例示的な置換基としては、上で記載したような１以上のアルキルまたはアラルキル基または上でアルキル置換基として記載した１以上の基が挙げられる。
【００４１】
より小さいヘテロシクロ、例えば、エポキシドおよびアジリジンも挙げられる。
【００４２】
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄および窒素を含むものとする。
【００４３】
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物は、同じく本発明の範囲内にある塩を形成することができる。医薬として許容される（すなわち、無毒で、生理的に許容される）塩が好ましいが、例えば、本発明の化合物を単離または精製する際に他の塩も有用である。
【００４４】
本発明は、個体に有効量の薬理シャペロンを投与することによって、個体のアルツハイマー病を治療するための方法に関する。表１もしくは２に記載のシャペロンまたはそれらの任意の変異体、誘導体もしくは類似体を含むが、これらに限定されない、多くの薬理シャペロンをアルツハイマー病の治療に用いることができる。
【００４５】
本発明はまた、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼＳ、ノイラミニダーゼ−１、ノイラミニダーゼ−２、ノイラミニダーゼ−３、ノイラミニダーゼ−４およびグルコセレブロシダーゼの酵素活性を含むが、これらに限定されない、アルツハイマー病と関連する酵素活性に欠損がある個体を治療することに関する。
【００４６】
本発明の一実施形態では、薬理シャペロンは、１種以上のガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼ酵素に結合する。薬理シャペロンは、アルツハイマー病と関連するかまたはアルツハイマー病もしくはタウタンパク質の蓄積と関連する任意の疾患の顕著な特徴と関連する、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ酵素、またはグルコセレブロシダーゼに結合することができる。ガングリオシダーゼとしては、例えば、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ノイラミニダーゼ−２、ノイラミニダーゼ−３、ノイラミニダーゼ−４およびグルコセレブロシダーゼまたはアルツハイマー病もしくはタウタンパク質の蓄積と関連する任意の疾患と関連する任意の他のガングリオシダーゼを挙げることができる。シアリダーゼとしては、ノイラミニダーゼ−１およびノイラミニダーゼ−４またはアルツハイマー病もしくはタウタンパク質の蓄積と関連する任意の疾患と関連する任意の他のシアリダーゼを挙げることができる。
【００４７】
別の実施形態では、薬理シャペロンは、小胞体（ＥＲ）から酵素がその酵素機能を果たす細胞内の酵素最終地へのガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼの輸送を増大させる。ノイラミニダーゼ１、β−ヘキソサミニダーゼＡおよびβ−ヘキソサミニダーゼＢの場合、薬理シャペロンは、ＥＲからリソソームへの酵素の輸送を増大させる。ノイラミニダーゼ２の場合、薬理シャペロンは、ＥＲから細胞質への酵素の輸送を増大させる。ノイラミニダーゼ３の場合、薬理シャペロンは、ＥＲからエンドソームおよび形質膜への酵素の輸送を増大させる。ノイラミニダーゼ４の場合、薬理シャペロンは、ＥＲからリソソームおよびミトコンドリアへの酵素の輸送を増大させる。グルコセレブロシダーゼの場合、薬理シャペロンは、ＥＲからリソソームへの酵素の輸送を増大させる。薬理シャペロンは、突然変異体および／または野生型ガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼの活性を増大させることができる。さらに、ガングリオシダーゼまたはシアリダーゼは、１種以上のガングリオシドを異化することができる。酵素の活性は、最大５％増大させることができる。酵素の活性は、最大１０％、２０％、４０％、５０％よりも大きく、ほぼ１００％または１００％よりもさらに大きく増大させることもできる。
【００４８】
一実施形態では、酵素はβ−ヘキソサミニダーゼＡであり、異化されるガングリオシドはＧＭ２である。別の実施形態では、酵素はβ−ヘキソサミニダーゼＢであり、異化されるガングリオシドはＧＡ２およびＧＭ２である。別の実施形態では、酵素はβ−ヘキサミニダーゼＳであり、異化される産物は硫酸化ガングリオシド、硫酸化スフィンゴ糖脂質、硫酸化グリコシルアミノグリカン、硫酸化オリゴ糖およびデルマタン硫酸である。別の実施形態では、酵素は、ノイラミニダーゼ２、ノイラミニダーゼ３およびノイラミニダーゼ４であり、異化されるガングリオシドはシアル酸含有ガングリオシドである。別の実施形態では、酵素はノイラミニダーゼ１であり、異化される基質は、末端シアル酸を有する糖タンパク質およびオリゴ糖である。別の実施形態では、酵素はグルコセレブロシダーゼであり、異化されるスフィンゴ糖脂質はグルコシルセラミドである。グルコセレブロシドは、ガングリオシド合成の文脈ではガングリオシドの前駆体であり、ガングリオシド異化の文脈ではガングリオシドの産物である。グルコセレブロシドは、ガングリオシドをはじめとする全スフィンゴ糖脂質の合成の第一段階であり、かつそれは、ガングリオシドおよび他のスフィンゴ糖脂質の異化の最終段階である。
【００４９】
本発明の一態様では、薬理シャペロンは、Ｎ−アセチルグルコサミンチアゾリン（ＮＧＴ）である。別の態様では、薬理シャペロンは、Ｎ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）である。別の態様では、薬理シャペロンは、４−エピ−イソファゴミン（４−エピ−ＩＦＧ）である。別の態様では、薬理シャペロンは、２−アセトアミド−２−デオキシノジリマイシン（ＡｄＤＮＪ）である。別の態様では、薬理シャペロンは、ザナミビル、５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノン酸である。
【００５０】
本発明の一態様では、薬理シャペロンＮＢ−ＤＧＪは、スフィンゴ糖脂質およびガングリオシドの合成の第一段階を触媒する酵素であるグルコシルセラミドシンターゼを阻害することによってガングリオシドの合成を低下させるようにも機能する。ＮＢ−ＤＧＪは、ＳＲＴとしても機能することができる薬理シャペロンである。他の薬理シャペロンもこの二重の機能を有する。
【００５１】
本発明の別の態様では、薬理シャペロンは、グルコシルセラミドシンターゼの阻害剤であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）と組み合わせることができる。薬理シャペロンとＮＢ−ＤＮＪは、毎日、週に１回、週に２回、週に３回、週に４日、週に５日、もしくはそれよりもさらに少ないもしくは多い頻度で、または必要なときに、同時に投与することができる。１種以上の薬理シャペロンとＮＢ−ＤＮＪとを、別々に投与するか、または同時にかつ各々週に１回、週に２回、週に３回、もしくは週に４回、もしくは週にそれより多くの回数、もしくは必要なときに、投与することもできる。
【００５２】
限定するものではないが、表１および２に記載されているものを含む、多くの異なる薬理シャペロンを用いて、アルツハイマー病を治療することができる。１種以上のガングリオシダーゼまたはシアリダーゼ酵素の活性を増大させるさらなる薬理シャペロン、ならびに表１および２に記載されている化合物の多くについての化学構造は、Ｔｒｏｐａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１４），１３４７８−１３４８７（２００４）に見ることができる。
【００５３】
【表１】
2013508371.tif 000006
【００５４】
【表２】
2013508371.tif 000007
【００５５】
【表３】
2013508371.tif 000008
【００５６】
【表４】
2013508371.tif 000009
【００５７】
【表５】
2013508371.tif 000010
【００５８】
【表６】
2013508371.tif 000011
【００５９】
【表７】
2013508371.tif 000012
【００６０】
【表８】
2013508371.tif 000013
【００６１】
【表９】
2013508371.tif 000014
【００６２】
【表１０】
2013508371.tif 000015
【００６３】
【表１１】
2013508371.tif 000016
【００６４】
【表１２】
2013508371.tif 000017
【００６５】
【表１３】
2013508371.tif 000018
【００６６】
【表１４】
2013508371.tif 000019
【００６７】
化学的プロセス
本発明の組成物は、以下のスキームの１つまたは複数に従って作製することができる。
【００６８】
プロセススキーム１：
【化４】
2013508371.tif 000020
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）メタノール塩酸塩（２）。１（２０．０ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５００ｍＬ）溶液をＰｄ（ＯＨ）２（４〜６ｇ）およびギ酸アンモニウム（１４ｇ、２２０ｍｍｏｌ）と合わせ、混合物を５０〜５５℃で加熱した。さらなる量（３×１００．０ｍｍｏｌ）のギ酸アンモニウムを次の８時間かけて添加した。最後の添加の後、反応混合物をさらに撹拌し、５０〜５５℃でさらに１６時間加熱した。触媒を濾過により除去し、濾液を真空中で蒸発させた。粗生成物をアセトン（１５０ｍＬ）に溶解させ、濾過し、２−ＰｒＯＨ中のＨＣｌを添加した。氷浴にてシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、次いで、冷却した後、生成物を白色の結晶固体として回収した（１１．０ｇ、７１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）９．４５（ｓ，２Ｈ），４．８０（ｔ，１Ｈ，ｅｘ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．０−３．７５（ｍ，１１Ｈ），２．８（ｑ，２Ｈ），１．９５（ｍ，１Ｈ），１．２（２，６Ｈ）。
【００６９】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）メタノール（３）。２（１４．８５ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１７．２５ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４０℃で約４時間撹拌した。この時点で、ＢｎＣｌ（５．７ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応液を４０℃で一晩撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を水（６００ｍＬ）に懸濁し、ＨＣｌを添加して、残渣を溶解させた。溶液をＥｔ２Ｏで洗浄した後、Ｎａ２ＣＯ３で塩基性化した。溶液をＥｔＯＡｃで抽出し（２回）、合わせた抽出物を水、次にブラインで洗浄し、その後、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液を濾過し、濾液を真空中で蒸発させると、表題化合物（１７．２ｇ、＞９５％）が無色から非常に淡い黄色の粘性油として得られた。これをさらに精製することなく用いた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３（ｍ，５Ｈ），３．６−３．８（ｍ，２Ｈ），３．５（ｓ，３Ｈ），３．４（ｔ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２６８（ｓ，３Ｈ），２．９（ｍ，２Ｈ），２．２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｔ，１Ｈ），１．２８（ｓ，３Ｈ），１．２６（ｓ，３Ｈ）。
【００７０】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）カルボキシアルデヒド（一般的手順Ａ）（４）。−７８℃に冷却したＤＭＳＯ（７．３ｇ、９６．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）溶液に、塩化オキサリル（６．１ｍＬ、７２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を少しずつ添加した。添加が終了した後、反応混合物をさらに３０分間撹拌し、その時点で３（１７．０ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を少しずつ添加した。添加が終了した後、反応液を−７８℃で１時間撹拌し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（３４．４ｍＬ、１９３ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。この添加が終了した後、冷却浴を除去し、飽和ＮａＨＣＯ３を添加してから反応混合物を０℃まで温めておいた。混合物を少量のさらなるＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過後、溶媒を真空中で蒸発させ、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）で精製すると、表題化合物（１２．７ｇ、７５％）が粘性油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）９．７３（ｓ，１Ｈ），７．２（ｍ，５Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．５（ｑ，２Ｈ），３．２（２ｓ，６Ｈ），２．７−３．０（ｍ，３Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ），１．２５（２ｓ，６Ｈ）。
【００７１】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ベンジル−８，８−ジフルオロメチル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン塩酸塩（一般的手順Ｂ）（５）。−１５℃に冷却したＤＡＳＴ（１．４ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液に、４（２．４ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の溶液を少しずつ添加した。１０分後、氷浴を除去し、反応液を室温で一晩撹拌した。この時点で反応混合物を氷浴にて再び冷却し、反応液を飽和ＮａＨＣＯ３の添加（これによってわずかに発熱するので最初は少しずつ）によってクエンチした。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させると、黄色い油が得られた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）で精製すると、表題化合物（１．６ｇ、６２％）が無色の油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２（ｍ，５Ｈ），６．０（ｄｔ，１Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，３Ｈ），３．２（２ｓ，６Ｈ），２．９５（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．３（ｍ，２Ｈ），１．５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１．２（２ｓ，６Ｈ）。
【００７２】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）ピペルジン３，４−ジオール塩酸塩（一般的手順Ｃ）（６）。化合物５（１．６ｇ、４．３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＨＣｌ（４０ｍＬ／４０ｍＬ／５ｍＬ）の混合物中で還流加熱し、出発材料がもはや検出できなくなるまで反応をＨＰＬＣでモニタリングした。溶媒を真空中で蒸発させた後、ＥｔＯＨで２回共蒸発させた。残渣をＭｅＯＨに溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２上で水素添加した。終了したら、触媒を濾過により除去し、濾液を真空中で蒸発させた。残渣をＥｔＯＨ（５０ｍＬ）から再結晶化させると、表題化合物（０．５５ｇ、６６％）が白色の固体として得られた（ｍｐ  １６８〜１７０℃）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）６．１５（ｄｔ，１Ｈ），４．３−４．８（ｍ，２Ｈ），３．０（ｔ，１Ｈ），２．８５（ｔ，１Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ）。
【００７３】
【化５】
2013508371.tif 000021
（Ｒ）および（Ｓ）−１−（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）エタノール  一般的手順Ｄ（１５／１６）。４（７．０ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に、ＭｅＭｇＢｒ（２０．０ｍＬ、３：１のＴＨＦ／トルエン中１．４Ｍ）を添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。反応液を飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した（２回）。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾液を真空中で蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／２−ＰｒＯＨ）で精製すると、主要異性体（１５）（１．６ｇ、２４．６％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）．７．３（ｍ，５Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），３．５−３．９（ｍ，３Ｈ），３．３（２ｓ，６Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），２．０（２ｍ，４Ｈ），１．３（２ｓ，６Ｈ），１．２（ｄ，３Ｈ）。少量異性体（１６）も単離した（０．５５ｇ、７．５％）７．３（ｍ，５Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．５（ｍ，２Ｈ），３．２（２ｓ，６Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），２．０（ｔ，１Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），１．２（２ｓ，６Ｈ），１．０（ｄ，３Ｈ）。
【００７４】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５（（Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）ピペルジン３，４−ジオール（１７）。化合物１５（０．５５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、出発材料がＨＰＬＣでもはや検出できなくなるまで、９／１のＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）の混合物中で撹拌した。揮発性物質を除去し、残渣をＥｔＯＨで２〜３回共蒸発させた後、ＥｔＯＨに溶解させ、固体Ｋ２ＣＯ３で処理した。固体を濾過した後、濾液を真空中で蒸発させ、残渣をＨＣｌ塩に変換し、Ｐｄ（ＯＨ）２上で水素添加した。触媒を濾過し、濾液を真空中で蒸発させた。粗生成物を、０．１ＮのＮＨ４ＯＨで溶出するイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８−２００）を用いて精製した。適当な画分を合わせ、凍結乾燥させると、表題化合物（０．１２ｇ、５０％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）４．２（ｑ，１Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｍ，３Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｍ，１Ｈ），１．１５（ｄ，３Ｈ）。
【００７５】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５（（Ｓ）−１−ヒドロキシエチル）ピペルジン３，４−ジオール（１０）。化合物１６（０．３４ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を上記のように脱保護すると、表題化合物（０．１１ｇ、７５％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）４．１５（ｍ，２Ｈ），３．５（ｍ，１Ｈ），３．３５（ｔ，１Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），１．８（ｍ，１Ｈ），１．１（ｄ，３Ｈ）。
【００７６】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−８（Ｓ）−（１フルオロエチル）−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン（１１）。化合物１５（１．８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を一般的手順Ｂを用いてフッ素化した。シリカゲルクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）によって、表題化合物（０．４２ｇ、２３％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２５（ｍ，５Ｈ），４．７−４．９（ｄｑ，１Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．４（ｍ，２Ｈ），３．２（２ｓ，６Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），２．０（ｍ，３Ｈ），１．３５（ｄｄ，３Ｈ），１．２（２ｓ，６Ｈ）。
【００７７】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５（（Ｓ）−１−フルオロエチル）ピペルジン３，４−ジオール塩酸塩（１３）。化合物１１（０．４２ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を一般的手順Ｃに記載したように脱保護した。触媒を除去した後、濾液を真空中で蒸発させ、その後、ＥｔＯＨで共蒸発させた（２回）。得られた残渣をアセトンで粉砕すると、表題化合物（０．２０ｇ、８８％）が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）９．０（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），５．６（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），５．４（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），５．０−５．２（ｄｑ，１Ｈ），３．５５（ｍ，１Ｈ），３．２（ｍ，２Ｈ），２．９（ｔ，１Ｈ），２．７（ｔ，１Ｈ），２．２（ｍ，１Ｈ），１．３（ｄｄ，３Ｈ）。
【００７８】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−８（Ｒ）−（１フルオロエチル）２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン（１２）。化合物１６（０．５５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を一般的手順Ｂを用いてフッ素化すると、表題化合物（０．２２ｇ、４０％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３（ｍ，５Ｈ），５．０（ｄｑ，１Ｈ），３．８（ｍ，１Ｈ），３．５−３．７５（ｍ，３Ｈ），３．３（２ｓ，６Ｈ），３．０（ｄ，１Ｈ），２．９（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｍ，１Ｈ），１．３（２ｓ，６Ｈ）。
【００７９】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５（（Ｒ）−（１−フルオロエチル）ピペルジン３，４−ジオール塩酸塩（１４）。化合物１２（０．２２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）一般的手順Ｃに記載したように脱保護した。触媒を除去した後、濾液を真空中で蒸発させ、その後、ＥｔＯＨで共蒸発させた（２回）。得られた残渣をアセトンで粉砕すると、表題化合物（０．０８ｇ、６７％）が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）５．１（ｄｑ，１Ｈ），３．５（ｍ，４Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），１．８（ｍ，１Ｈ），１．３（ｄｄ，３Ｈ）。
【００８０】
プロセススキーム２：
【化６】
2013508371.tif 000022
（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）メタノール塩酸塩（２）。１（２０．０ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５００ｍＬ）溶液をＰｄ（ＯＨ）２（４〜６ｇ）およびギ酸アンモニウム（１４ｇ、２２０ｍｍｏｌ）と合わせ、混合物を５０〜５５℃で加熱した。さらなる量（３×１００．０ｍｍｏｌ）のギ酸アンモニウムを次の８時間かけて添加した。最後の添加の後、反応混合物をさらに撹拌し、５０〜５５℃でさらに１６時間加熱した。触媒を濾過により除去し、濾液を真空中で蒸発させた。粗生成物をアセトン（１５０ｍＬ）に溶解させ、濾過し、２−ＰｒＯＨ中のＨＣｌを添加した。氷浴にてシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、次いで、冷却した後、生成物を白色の結晶固体（１１．０ｇ、７１％）として回収した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）９．４５（ｓ，２Ｈ），４．８０（ｔ，１Ｈ，ｅｘ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．０−３．７５（ｍ，１１Ｈ），２．８（ｑ，２Ｈ），１．９５（ｍ，１Ｈ），１．２（２，６Ｈ）。
【００８１】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）メタノール（３）。２（１４．８５ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１７．２５ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４０℃で約４時間撹拌した。この時点で、ＢｎＣｌ（５．７ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応液を４０℃で一晩撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を水（６００ｍＬ）に懸濁し、ＨＣｌを添加して、残渣を溶解させた。溶液をＥｔ２Ｏで洗浄した後、Ｎａ２ＣＯ３で塩基性化した。溶液をＥｔＯＡｃで抽出し（２回）、合わせた抽出物を水、次にブラインで洗浄し、その後、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液を濾過し、濾液を真空中で蒸発させると、表題化合物（１７．２ｇ、＞９５％）が無色から非常に淡い黄色の粘性油として得られた。これをさらに精製することなく用いた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３（ｍ，５Ｈ），３．６−３．８（ｍ，２Ｈ），３．５（ｓ，３Ｈ），３．４（ｔ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２６８（ｓ，３Ｈ），２．９（ｍ，２Ｈ），２．２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｔ，１Ｈ），１．２８（ｓ，３Ｈ），１．２６（ｓ，３Ｈ）。
【００８２】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）カルボキシアルデヒド（一般的手順Ａ）（４）。−７８℃に冷却したＤＭＳＯ（７．３ｇ、９６．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）溶液を塩化オキサリル（６．１ｍＬ、７２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に少しずつ添加した。添加が終了した後、反応混合物をさらに３０分間撹拌し、その時点で、３（１７．０ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を少しずつ添加した。添加が終了した後、反応液を−７８℃で１時間撹拌し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（３４．４ｍＬ、１９３ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。この添加が終了した後、冷却浴を除去し、飽和ＮａＨＣＯ３を添加してから反応混合物を０℃まで温めておいた。混合物を少量のさらなるＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過後、溶媒を真空中で蒸発させ、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）で精製すると、表題化合物（１２．７ｇ、７５％）が粘性油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）９．７３（ｓ，１Ｈ），７．２（ｍ，５Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．５（ｑ，２Ｈ），３．２（２ｓ，６Ｈ），２．７−３．０（ｍ，３Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ），１．２５（２ｓ，６Ｈ）。
【００８３】
（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ベンジル−８，８−ジフルオロメチル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン塩酸塩（一般的手順Ｂ）（５）。−１５℃に冷却したＤＡＳＴ（１．４ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液に、４（２．４ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の溶液を少しずつ添加した。１０分後、氷浴を除去し、反応液を室温で一晩撹拌した。この時点で反応混合物を氷浴にて再び冷却し、反応液を飽和ＮａＨＣＯ３の添加（これによってわずかに発熱するので最初は少しずつ）によってクエンチした。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させると、黄色い油が得られた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）で精製すると、表題化合物（１．６ｇ、６２％）が無色の油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２（ｍ，５Ｈ），６．０（ｄｔ，１Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，３Ｈ），３．２（２ｓ，６Ｈ），２．９５（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．３（ｍ，２Ｈ），１．５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１．２（２ｓ，６Ｈ）。
【００８４】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）ピペルジン３，４−ジオール塩酸塩（一般的手順Ｃ）（６）。化合物５（１．６ｇ、４．３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＨＣｌ（４０ｍＬ／４０ｍＬ／５ｍＬ）の混合物中で還流加熱した。出発材料がもはや検出できなくなるまで反応をＨＰＬＣでモニタリングした。溶媒を真空中で蒸発させた後、ＥｔＯＨで２回共蒸発させた。残渣をＭｅＯＨに溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２上で水素添加した。終了したら、触媒を濾過により除去し、濾液を真空中で蒸発させた。残渣をＥｔＯＨ（５０ｍＬ）から再結晶化させると、表題化合物（０．５５ｇ、６６％）が白色の固体として得られた（ｍｐ  １６８〜１７０℃）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）６．１５（ｄｔ，１Ｈ），４．３−４．８（ｍ，２Ｈ），３．０（ｔ，１Ｈ），２．８５（ｔ，１Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ）。
【００８５】
【化７】
2013508371.tif 000023
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１．ブチル−５−（ジフルオロメチル）ピペルジン３，４−ジオール（一般的手順Ｄ）（７ａ；Ｒ５＝Ｂｕ）。６（０．３０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（０．４８ｇ、３．５ｍｍｏｌ）およびＢｕＢｒ（０．２０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の混合物をＤＭＦ（１０ｍＬ）中で合わせ、６０℃で一晩加熱した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃに溶解させ、水、次にブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。濾過後、濾液を真空中で蒸発させると、粗生成物が得られた。これをクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／（９：１）ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）で精製すると、表題化合物（０．２５ｇ、８０％）が無色のシロップとして得られた。ＭＨ＋＝２２４。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５７Ｈｚ），５．１３（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），４．９１（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），３．３（ｍ，１Ｈ），３．１（ｍ，１Ｈ），２．９（ｍ，２Ｈ），２．３（ｍ，２Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｔ，１Ｈ），１．２−１．５（２ｍ，４Ｈ），０．９（ｔ，３Ｈ）。
【００８６】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１．アリル−５−（ジフルオロメチル）ピペルジン３，４−ジオール（７ｂ；Ｒ５＝アリル）。一般的手順Ｄに従い、臭化アリル（０．１７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を用いると、表題化合物が白色の固体（０．２２ｇ、７６％）として得られた。ＭＨ＋＝２０８。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５７Ｈｚ），５．８（ｍ，１Ｈ），５．２（ｍ，３Ｈ），４．９２（ｄ，１Ｈ），３．３（ｍ，１Ｈ），３．１（１Ｈ），２．９５（ｄ，２Ｈ），２．８５（ｄ，２Ｈ），１．９（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），１．７５（ｔ，１Ｈ）。
【００８７】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）−１−（４−フルオロベンジル）ピペルジン３，４−ジオール（７ｃ；Ｒ５＝４−フルオロベンジル）。反応を室温で行ない、４−フルオロベンジルブロミド（０．２６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を用いることを除いて一般的手順Ｄに従うと、表題化合物が白色の固体（０．２２ｇ、５６％）として得られた。ＭＨ＋＝２７６。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）７．４（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５７Ｈｚ），５．２（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），４．９（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），３．５（ｑ，２Ｈ），３．３（ｍ，１Ｈ），３．１（ｍ，１Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），２．０（ｍ，２Ｈ），１．８（ｔ，１Ｈ）。
【００８８】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）−１−（４−メチルベンジル）ピペルジン３，４−ジオール（７ｄ；Ｒ５＝４−メチルベンジル）。反応を室温で行ない、４−メチルベンジルブロミド（０．２６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を用いることを除いて一般的手順Ｄに従うと、表題化合物が白色の固体（０．３０，８１％）として得られた。ＭＨ＋＝２７２。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）７．２（ｍ，４Ｈ），６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５７Ｈｚ），５．２（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），４．９（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），３．５（ｑ，２Ｈ），３．３（１Ｈ），３．０５（ｍ，１Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），２．５（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），１．８（ｔ，１Ｈ）。
【００８９】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）−１−（４−メトキシベンジル）ピペルジン３，４−ジオール（７ｅ；Ｒ５＝４−メトキシベンジル）。反応を室温で行ない、４−メトキシベンジルクロリド（０．２６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を用いることを除いて一般的手順Ｄに従うと、表題化合物が無色のシロップ（０．１９ｇ、４９％）として得られた。ＭＨ＋＝２８８。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）７．３（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，３Ｈ）６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５７Ｈｚ），５．２（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），４．９（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．５（ｑ，２Ｈ），３．４（ｍ，１Ｈ），３．１（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），１．８（ｔ，１Ｈ）。
【００９０】
【化８】
2013508371.tif 000024
１−（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロキシピペルジン−１−イル）ペンタン−１−オン（８ａ；Ｚ＝ＣＯ；Ｒ５＝ブチル）。反応を室温で行ない、塩化ペンタノイル（０．１７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を用いることを除いて一般的手順Ｄに従うと、表題化合物が白色の固体（０．２６ｇ、７１％）として得られた。ＭＨ＋＝２５２。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）５．９−６．５（ｄｔ，１Ｈ），５．３５（ｍ，１Ｈ，ｅｘ），５．２５（ｍ，１Ｈ），ｅｘ），４．２（ｄｄ，１Ｈ），３．７５（ｄｄ，１Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．３（ｔ，２Ｈ），１．９ｂｒ  ｍ，１Ｈ），１．４（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｍ，２Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｈ）。
【００９１】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）−１−（メタンスルホニル）ピペルジン３，４−ジオール（８ｂ；Ｚ＝ＳＯ２；Ｒ５＝Ｍｅ）。反応を室温で行ない、塩化メタンスルホニル（０．１６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を用いることを除いて一般的手順Ｄに従うと、表題化合物が白色の固体（０．１７ｇ、５１％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５３Ｈｚ），５．４３（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），５．３８（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），３．２−３．７（ｍ，４Ｈ），２．９５（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．７（ｔ，１Ｈ），２．１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（ジフルオロメチル）−１−トシルピペルジン３，４−ジオール（８ｂ；Ｚ＝ＳＯ２；Ｒ５＝Ｐｈ）。反応を室温で行ない、塩化トルエンスルホニル（０．２６、１．４ｍｍｏｌ）を用いることを除いて一般的手順Ｄに従うと、表題化合物が白色の固体（０．３５ｇ、６７％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）７．６（ｄ，２Ｈ），７．４５（ｄ，２Ｈ），６．２５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５３Ｈｚ），５．４（２ｄ，２Ｈ，ｅｘ），３．３−３．５５（ｍ，４Ｈ），３．２（ｍ，１Ｈ），２．５（ｍ，３Ｈ），２．４（ｔ，１Ｈ），２．１（ｍ，１Ｈ）。
【００９２】
【化９】
2013508371.tif 000025
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロキシ−Ｎ−プロピルピペルジン−１−カルボキサミド（一般的手順Ｅ）（９ａ；Ｘ＝Ｏ；Ｒ５＝プロピル）。６（フリーベース）（０．２９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、プロピルイソシアネート（０．１０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）で精製すると、表題化合物が白色の固体（０．１４ｇ、４８％）として得られた。ＭＨ＋＝２５３。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）６．７（ｔ，１Ｈ），６．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５３Ｈｚ），５．２５（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），５．１５（ｄ，１Ｈ，ｅｘ），４．０５（ｄ，１Ｈ），３．９（ｄ，１Ｈ），３．３（ｍ，２Ｈ），３．０（ｑ，２Ｈ），２．５（ｍ，１Ｈ），１．８（ｂｒ  ｄ，１Ｈ），１．４（ｍ，２Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｈ）。
【００９３】
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロキシ−Ｎ−フェニルピペルジン−１−カルボキサミド（９ｂ；Ｘ＝Ｏ；Ｒ５＝フェニル）。一般的手順Ｅに従い、フェニルイソシアネート（０．１４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を用いると、表題化合物が白色の固体（０．２１ｇ、６２％）として得られた。ＭＨ＋＝２８７。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）８．７（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，２Ｈ），７．３（ｔ，２Ｈ），６．９５（ｔ，１Ｈ），６．３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５３Ｈｚ），５．３５（ｄ，１Ｈ），５．２５（ｄ，１Ｈ），４．１（ｔ，２Ｈ），３．３（ｍ，２Ｈ），２．８５（ｔ，１Ｈ），２．７５（ｔ，１Ｈ），１．９５（ｂｒ  ｄ，１Ｈ）。
【００９４】
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロキシ−Ｎ−ブチルピペルジン−１−カルボキサミド（９ｃ；Ｘ＝Ｏ；Ｒ５＝ブチル）。一般的手順Ｅに従い、ブチルイソシアネート（０．１２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を用いると、表題化合物が白色の固体（０．２４ｇ、７６％）として得られた。ＭＨ＋＝２６７。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）６．６（ｔ，１Ｈ），６．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５３Ｈｚ），５．２５（ｄ，１Ｈ），５．１（ｄ，１Ｈ），４．０５（ｄ，１Ｈ），３．９（ｄ，１Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｑ，２Ｈ），２．６５（ｔ，１Ｈ），２．４５（ｍ，１Ｈ），１．８（ｂｒ  ｄ，１Ｈ），１．２−１．４（２ｍ，４Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｈ）。
【００９５】
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロキシ−Ｎ−ブチルピペルジン−１−カルブチオアミド（９ｄ；Ｘ＝Ｓ；Ｒ５＝ブチル）。一般的手順Ｅに従い、ブチルイソチオシアネート（０．１４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を用いると、表題化合物が無色のシロップ（０．２１ｇ、６３％）として得られた。ＭＨ＋＝２８３。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）７．８５（ｔ，１Ｈ），６．２５（ｔ，１Ｈ），５．３５（２ｄ，２Ｈ），４．８（ｄ，１Ｈ），４．４５（ｄ，１Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｔ，１Ｈ），２．８（ｔ，１Ｈ），１．８５（ｂｒ  ｄ，１Ｈ），１．４（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．１（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｔ，３Ｈ）。
【００９６】
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロキシ−Ｎ−フェニルピペルジン−１−カルブチオアミド（９ｅ；Ｘ＝Ｓ；Ｒ５＝フェニル）。一般的手順Ｅに従い、フェニルイソチオシアネート（０．１６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を用いると、表題化合物が白色の固体（０．３１ｇ、８６％）として得られた。ＭＨ＋＝３０３。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）９．５（ｓ，１Ｈ），７．３（ｍ，４Ｈ），７．１（ｔ，１Ｈ），６．３５（ｔ，１Ｈ），５．３５（２ｄ，２Ｈ），４．８５（ｄ，１Ｈ），４．５５（ｄ，１Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．２（ｔ，１Ｈ），３．０（ｔ，１Ｈ），２．０５（ｂｒ  ｄ，１Ｈ）。
【００９７】
本発明の化合物は、以下の一般スキームを用いて当業者が作製することもできる：
【化１０】
2013508371.tif 000026
【化１１】
2013508371.tif 000027
【化１２】
2013508371.tif 000028
【化１３】
2013508371.tif 000029
【化１４】
2013508371.tif 000030
【００９８】
本発明によれば、治療されるべき個体は、早発性の家族性アルツハイマー病を含む、任意の形態のアルツハイマー病を有していてもよい。個体は、アルツハイマー病のリスク因子を有していてもよく、またはアルツハイマー病を発症するリスクがあってもよい。個体は、既にアルツハイマー病であると診断されていてもよい。さらに、個体は、診断されてはいないが、本疾患の顕著な特徴を示していてもよい。個体は、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および／もしくは前頭側頭葉変性症（ピック病）を有していてもよく、またはこれらを発症するリスクがあってもよい。さらなる実施形態では、アルツハイマー病は、ダウン症によって引き起こされるか、またはダウン症と関連がある。
【００９９】
さらに、特許請求された治療は、１種以上の薬理シャペロンの組合せを含むことができ、かつ他の既知のアルツハイマー治療またはタウタンパク質の病的凝集に関連するかもしくはそれに起因する任意の状態と組み合わせることもできる。治療は、１種、２種、３種もしくはそれより多くの薬理シャペロンの組合せまたは１種、２種、３種もしくはそれより多くのシャペロンと１種以上のグルコシルセラミドシンターゼ阻害剤との組合せを含むこともできる。併用療法は、１種以上のシャペロンと１種以上のグルコシルセラミドシンターゼ阻害剤とを含み、ガングリオシド活性を増大させ、かつグルコシルセラミドシンターゼ活性を減少させることができる。治療は、１種、２種、３種またはそれより多くの理学的シャペロンと１種以上のＯ−ＧｌｃＮＡｃアーゼ（ＯＧＡ）阻害剤との組合せを含むこともできる。薬理シャペロンの組合せの例としては、例えば、以下のものを挙げることができる：
ＮＧＴ、ザナミビル
ＡｄＤＮＪ、ザナミビル
【０１００】
薬理シャペロンと基質補充療法（ＳＲＴ）の組合せの例としては、例えば、以下のものを挙げることができる：
ＮＧＴ、ＮＢ−ＤＮＪ
ＮＧＴ、ＮＢ−ＤＧＪ
ＮＧＴ、ザナミビル、ＮＢ−ＤＧＪ
ＮＧＴ、ザナミビル、ＮＢ−ＤＮＪ
ＮＢ−ＤＮＪ、ザマミビル
ＮＢ−ＤＧＪ、ザナミビル
ＡｄＤＮＪ、ＮＢ−ＤＮＪ
ＡｄＤＮＪ、ＮＢ−ＤＧＪ
ＡｄＤＮＪ、ザナミビル、ＮＢ−ＤＮＪ
ＡｄＤＮＪ、ザナミビル、ＮＢ−ＤＧＪ
【０１０１】
本発明はまた、前頭側頭認知症、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および前頭側頭葉変性症などの、タウタンパク質の病的凝集に起因する状態の治療のための方法に関する。
【０１０２】
ＮＧＴは、表１に記載されている薬理シャペロンのうちの１つである。ＮＧＴは、患者由来細胞の突然変異体β−ヘキソサミニダーゼ活性およびＣ５７ＢＬ６マウスの内在性の野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性を増大させる。ＮＧＴは、血液脳関門透過を含む優れたインビボＰＫ特性を有し、β−ヘキソサミニダーゼに選択的で、かつ良好な忍容性を示す。ＮＧＴは、安定で、水溶性で、かつ経口バイオアベイラビリティが良好である。それは、選択的に、Ｃ５７ＢＬ６マウスの脳の野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性のレベルを増大させ、かつ神経栄養性ｓＡＰＰαのレベルを増大させる（図５および６）。
【０１０３】
ｎ−ブチル−２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸もまた、表１に記載されている薬理シャペロンである。ｎ−ブチル−２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、健康対照に由来する線維芽細胞の野生型ノイラミニダーゼ１活性を選択的に増大させる（図７）。
【０１０４】
研究により、β−ヘキソサミニダーゼ欠損マウスにはアミロイド様沈着とｐＴｈｒ２３１−タウ免疫反応性があることが示されている。インビトロ研究により、精製ガングリオシドがＡβオリゴマー化および原線維形成を誘導することができることが示されている。ＧＬＢ１  ＫＯマウスは、脳全体にＧＭ１およびＧＡ１ガングリオシドを蓄積する。Ｓａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１（２）：１７０−１７６（１９９５）。一方、ＨＥＸＢ  ＫＯマウスは、脳および脊髄全体のニューロンにＧＭ２およびＧＡ２ガングリオシドを蓄積する。Ｈａｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６（２）：２０５−２１１（１９９７）。４カ月齢のＨＥＸＢ  ＫＯマウスの脳および脊髄の予備的なＩＨＣ解析によって、抗齧歯類Ａβと免疫反応する沈着の存在が明らかになった。そのようなＡβ免疫反応性沈着は、年齢をマッチさせた野生型対照マウスの脳および脊髄には見られなかった。
【０１０５】
ＮＧＴは、細胞培養物およびＣ５７ＢＬ６マウスの脳の内在性の野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性を増大させることができる。酵素β−ヘキソサミニダーゼは、ガングリオシドの異化に必要とされるいくつかの酵素のうちの１つであり、その欠損は、サンドホフ病として知られる貯蔵障害を引き起こす。脳全体のニューロンにＧＡ２およびＧＭ２ガングリオシドを蓄積するサンドホフ病のマウスモデル（ＨＥＸＢ  ＫＯ）もまた、ｐＴｈｒ２３１−タウ（ＮＦＴの主要成分）免疫反応性と、マウスＡβエピトープに対する抗体と免疫反応性がある沈着とを蓄積する。サンドホフ病患者に由来する線維芽細胞におけるｐＴｈｒ２３１−タウ蓄積、ならびにｓＡＰＰβおよびＡβ４０分泌の増大は、β−ヘキソサミニダーゼ活性の欠損が、インビボとインビトロの両方でＡＰＰプロセッシングの変化をもたらし得ることを示している。
【０１０６】
脳のガングリオシドの構造および代謝は、Ａｒｉｇａ，ｅｔ  ａｌ．ＡＳＢＭＢ，２００８，４９：１１５７−１１７５に見ることができる。
【化１５】
2013508371.tif 000031
【０１０７】
定義
本明細書で用いられる用語は一般に、本発明の文脈の中でおよび各用語が使用される具体的文脈の中で当技術分野におけるその通常の意味を有する。一部の用語は、本発明ならびに本発明の作製および使用方法を説明する上で実施者に対するさらなる指針を提供するために、以下でまたは本明細書の他の箇所で論じられる。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「薬理シャペロン」または場合により「特異的薬理シャペロン」（「ＳＰＣ」）という用語は、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ、またはグルコセレブロシダーゼに特異的に結合し、（ｉ）タンパク質の安定な分子構造の形成を増強する；（ｉｉ）ＥＲから別の細胞位置、好ましくは本来の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を増強する、すなわち、タンパク質のＥＲ関連分解を防止する；（ｉｉｉ）構造的に不安定な、すなわち、ミスフォールディングしたタンパク質の凝集を防止する；（ｉｖ）タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性、および／もしくは活性を回復させるかもしくは増強する；ならびに／または（ｖ）細胞の表現型もしくは機能を改善する、という効果のうちの１つ以上を有する分子を指す。したがって、ガングリオシダーゼまたはシアリダーゼの薬理シャペロンとは、１種以上のガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼに結合し、適切なフォールディング、輸送、非凝集、ならびにガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼの活性の増大をもたらす分子である。これには、タンパク質の安定性を増強する特異的結合分子、例えば、活性部位特異的シャペロン、阻害剤、アロステリックバインダー、非活性部位バインダーが含まれる。グルコセレブロシダーゼの薬理シャペロンは、同じ効果を有する。
【０１０９】
「薬理シャペロン」（ＰＣ）という用語は、標的タンパク質に選択的に結合し、それを安定化して適切なフォールディングを促進し、早期分解を低下させ、ＥＲ輸出の効率を増大させる小分子を指す。これらの小分子は、タンパク質が合成される場所（ＥＲ）からその意図される場所（例えば、リソソームまたは細胞表面）に至るのを助けるので「シャペロン」と呼ばれる。これらの分子は、タンパク質標的に結合して、それを安定化し、適切な輸送の回復を助けた後、解離する可逆的バインダーであり、そのため、タンパク質はその適切な機能を実行することができる。「薬理学的」修飾因子は、分子の特異性を意味する。これらの分子は、意図される単一のタンパク質標的のみと相互作用して、それのみを安定化するように設計され、ＰＣは、通常、複数のタンパク質または細胞プロセス、例えば、タンパク質輸送、ＥＲ品質管理、プロテアソーム機能、もしくは生物学的シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質）の活性に影響を及ぼさない。このアプローチは、特定のタンパク質（突然変異体または野生型）の機能を増大させることによって治療的利益がもたらされると予想される疾患に広く適用できる。
【０１１０】
不正確にフォールディングしたタンパク質の保持および早期分解は、突然変異体タンパク質に限られたものではない。全ての新たに合成されるタンパク質の大部分（最大３０％）は、プロテアソームによる早期分解の標的とされることが示されている。その後の研究により、薬理シャペロンは、タンパク質のフォールディング、安定性およびＥＲ輸出を促進することによって、多くの野生型タンパク質の細胞レベルを増大させることができることが示されている。
【０１１１】
分子シャペロンはタンパク質の構造を安定化する。ヒトの体内で、タンパク質は、細胞機能のほとんど全ての局面に関与している。ある種のヒト疾患は、その安定性を低下させ、それが適切にフォールディングするのを妨げ得るタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こす突然変異に起因する。安定性が低いまたはミスフォールディングしたタンパク質の産生をもたらす遺伝子突然変異の大部分は、ミスセンス突然変異と呼ばれる。これらの突然変異は、タンパク質中の単一アミノ酸の、別のアミノ酸への置換をもたらす。こうしたエラーのために、ミスセンス突然変異は、生物学的活性のレベルが低下したタンパク質を生じさせることが多い。ミスセンス突然変異の他に、生物学的活性が低下したタンパク質を生じさせ得る他の種類の突然変異もある。
【０１１２】
タンパク質は、通常、小胞体、またはＥＲとして知られる細胞の特定の領域でフォールディングする。細胞は、タンパク質が、その正確な３次元形状にフォールディングした後、一般にタンパク質輸送と呼ばれるプロセスである、ＥＲから細胞内の適切な目的地への移動を可能にすることを保証する品質管理機構を有する。ミスフォールドしたおよび／または不安定なタンパク質は、最初にＥＲに保持された後、品質管理機構によって排除されることが多い。場合によっては、ミスフォールドしたタンパク質は、排除される前にＥＲに蓄積することがある。
【０１１３】
ＥＲでのミスフォールドしたタンパク質の保持は、その適切な輸送を妨害し、その結果として生じる生物学的活性の低下は、細胞機能の障害、そして最終的には、疾患を引き起こすことがある。さらに、ＥＲでのミスフォールドしたタンパク質の蓄積は、細胞機能不全や疾患の一因ともなり得る、細胞に対する様々な種類のストレスをもたらす可能性がある。
【０１１４】
内在性分子シャペロンは、ほとんど全ての種類の細胞および大半の細胞コンパートメントに存在する。タンパク質の輸送に関与し、細胞が熱ショックやグルコース飢餓などのストレス下で生存するのを可能にするものもある。内在性シャペロン（分子シャペロン）の中で、ＢｉＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、Ｇｒｐ７８）は最も良く特徴付けられているＥＲシャペロンである。他のシャペロンと同様に、ＢｉＰは、その成熟を通してずっとＥＲ内で多くの分泌タンパク質および膜タンパク質と相互作用する。新たに始まったタンパク質フォールディングが順調に進行する場合、この相互作用は、通常弱く、長続きしない。ひとたび本来のタンパク質構造が達成されれば、分子シャペロンはもはやタンパク質と相互作用しない。フォールディングできないか、会合できないか、または適切にグリコシル化できないタンパク質へのＢｉＰ結合は安定したものとなり、通常、ＥＲ関連分解経路によるタンパク質の分解をもたらす。このプロセスは、ＥＲでの「品質管理」システムとしての機能を果たし、適切にフォールディングおよび会合したタンパク質だけがＥＲから外へ輸送されてさらに成熟し、不適切にフォールディングしたタンパク質、または不安定なタンパク質は保持されて、後に分解されることを保証している。熱力学的タンパク質フォールディングプロセスとＥＲ品質管理システムの効率の悪さの複合作用のために、いくつかの野生型タンパク質のごく一部だけが安定な構造へとフォールディングされるようになって、ＥＲから脱出するのに成功する。
【０１１５】
特異的な酵素阻害剤に由来する薬理シャペロンは突然変異体酵素を救済し、野生型酵素を増強する。リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）と関連する酵素の低分子阻害剤の結合は、例えば、突然変異体酵素と対応する野生型酵素の両方の安定性を増大させることができる（全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２７４，５９７号明細書；同第６，５８３，１５８号明細書；同第６，５８９，９６４号明細書；同第６，５９９，９１９号明細書；同第６，９１６，８２９号明細書；および同第７，１４１，５８２号明細書を参照されたい）。特に、いくつかの標的リソソーム酵素の特異的で、選択的な競合阻害剤である、グルコースおよびガラクトースの低分子誘導体の投与が、インビトロで細胞の酵素の安定性を効果的に増大させ、それにより、酵素のリソソームへの輸送を増大させることが発見された。したがって、リソソームの酵素の量を増大させることにより、酵素基質の加水分解が増大すると考えられる。突然変異体酵素タンパク質はＥＲ中で不安定であるので、酵素タンパク質は、通常の輸送経路（ＥＲ→ゴルジ装置→エンドソーム→リソソーム）の中で遅延し、早期に分解される。したがって、突然変異体酵素に結合し、その安定性を増大させる特定の化合物は、その酵素の「シャペロン」としての役割を果たし、ＥＲから脱出してリソソームに移ることができる量を増大させることができる。
【０１１６】
いくつかの酵素阻害剤は、酵素の触媒中心（「活性部位」）に特異的に結合し、インビトロでの酵素構造の安定化をもたらすことが知られているので、これらの阻害剤は、いささか逆説的ではあるが、ＥＲからの脱出、リソソームへの輸送、加水分解活性の回復を助けることができる効果的なシャペロンであると提案された。これらの特異的薬理シャペロンは、酵素の活性部位に特異的に結合するので、「活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）」または「特異的薬理シャペロン」と命名された。低分子は経口投与することができ、かつタンパク質ベースの治療と比べて優れた生体分布を有し得るので、薬理シャペロン療法は、酵素補充療法（ＥＲＴ）に優る潜在的な利点を有する。
【０１１７】
突然変異体酵素を救済するのに加えて、薬理シャペロンは、野生型酵素のＥＲ分泌および活性を増強する。したがって、フォールディング時に酵素の安定な分子構造を誘導する化合物は、酵素を適切な構造に安定化して、ＥＲから脱出させる「シャペロン」としての役割を果たす。ガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼの薬理シャペロンとしては、表１および２に示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語に対するさらなる指針を以下に示す。
【０１１８】
「ガングリオシド」または「シアロガングリシド」という用語は、Ｎ−アシルスフィンゴシンと１以上のＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮｅｕＡｃ）残基を有するオリゴ糖鎖とからなるスフィンゴ糖脂質を指す。
【０１１９】
「アシアロガングリオシド」という用語は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮｅｕＡｃ）残基を含まないガングリオシドを指し、これには、ＬａｃＣｅｒ、ＧＡ２およびＧＡ１（Ａｒｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．）が含まれる。
【０１２０】
「ガングリオシダーゼ」という用語は、ガングリオシドおよびアシアロガングリオシドの非還元末端単位から順次、個々のＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮｅｕＡｃ）および糖残基を除去するシアリダーゼおよびエキソグリコヒドロラーゼを指す。この分解は、主に、エンドサイトーシス−エンドソーム−リソソーム経路を通じて起こる。ガングリオシダーゼの例としては、シアリダーゼ２（ノイラミニダーゼ２；ＮＥＵ２）、シアリダーゼ３（ノイラミニダーゼ３；ＮＥＵ３）、シアリダーゼ４（ノイラミニダーゼ４；ＮＥＵ４）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨＥＸＡ／ＨＥＸＢ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨＥＸＢ）、およびβ−ヘキソサミニダーゼＳ（ＨＥＸＳ）が挙げられる。
【０１２１】
「シアリダーゼ」という用語は、ガングリオシド、オリゴ糖および糖タンパク質の非還元末端単位から個々のＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮｅｕＡｃ）残基を除去する酵素を指す。「シアリダーゼ」という用語は、エンドソーム−リソソーム経路でガングリオシドから個々のＮ−アセチルノイラミン酸残基を除去する酵素シアリダーゼ２（ノイラミニダーゼ２）、シアリダーゼ３（ノイラミニダーゼ３）およびシアリダーゼ４（ノイラミニダーゼ４）、ならびにオリゴ糖および糖タンパク質から個々のＮ−アセチルノイラミン酸残基を除去するシアリダーゼ１を含む。ガングリオシド上のＮ−アセチルノイラミン酸残基は、Ａβ結合親和性を増大させ、β−シート構造を誘導する傾向を高めることが示されている。最近、ＡＰＰ／ＰＳＥＮマウス（ＡＰＰｓｗｅ＋ＰＳＥＮ１ΔＥ９）でジシアロガングリオシドシンターゼ（ＧＤ３Ｓ）をノックアウトすると、Ａβの蓄積とその後のＡＰＰ／ＰＳＥＮマウスに特有の記憶障害の発症の両方が抑制されることが報告された。Ｂｅｒｎａｒｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ｐｒｏｏｆ，“Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＤ３  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｍｙｌｏｉｄ−［ｂｅｔａ］  ｐｌａｑｕｅ  ｌｏａｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．”ＧＤ３Ｓは、α−２，８結合を介してシアル酸とシアル酸を連結し、ｂ系列およびｃ系列のガングリオシド（表３）の合成に必要とされる。これらの結果は、ガングリオシド上のシアル酸含有量を減少させることが、ＡＤを治療する上で有益であり得ることを示唆している。
【０１２２】
リソソーム酵素「β−ガラクトシダーゼ」は、アシアロガングリオシドおよびシアロガングリオシドの非還元末端からβ１，３−ガラクトースを除去するエキソヒドロラーゼである。β−ガラクトシダーゼＧＬＢ１をコードする遺伝子の突然変異は、β−ガラクトシダーゼ活性の欠損ならびにＧＡ１およびＧＭ１ガングリオシドの蓄積が原因で生じるリソソーム貯蔵障害のＧＭ１ガングリオシドーシスを引き起こす。Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７（２２）：７１９５−２００（１９７２）。ＧＭ１ガングリオシドは、細胞培養物でのＡβの生成および会合を促進するマイクロドメインの主要構成要素であり、ＧＭ１（ＧＡβ）に結合したＡβは、ＡＤ病理の初期段階を示す脳に見出されている。
【０１２３】
リソソーム酵素β−ヘキソサミニダーゼＡおよびＢは、アシアロガングリオシドおよびシアロガングリオシドの非還元末端からβ結合Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を加水分解する。ＧＭ１ガングリオシドが最も注目を集めているが、他のａ系列ガングリオシド（ＧＤ１Ａ、ＧＭ２およびＧＭ３）もインビトロでＡβに結合し、その会合を促進する。
【０１２４】
β−ヘキソサミニダーゼの２つのアイソザイム、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢが存在する。ＨＥＸＡがα−サブユニットとβ−サブユニット（αβ）からなるのに対し、ＨＥＸＢは２つのβ−サブユニット（ββ）からなる。ＨＥＸＡは、ＨＥＸＡのα−サブユニットをコードし、ＨＥＸＢはＨＥＸＡおよびＨＥＸＢのβ−サブユニットをコードする。ＨＥＸＡの突然変異は、ＨＥＸＡ活性の欠損およびＧＭ２の蓄積が原因で生じるリソソーム貯蔵障害のテイ・サックス病を引き起こす。ＨＥＸＢの突然変異は、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ活性の欠損ならびにＧＭ２およびＧＡ２の蓄積が原因で生じるリソソーム貯蔵障害のサンドホフ病を引き起こす。
【０１２５】
β−ガラクトシダーゼ活性が欠損したマウス（ＧＬＢ１  ＫＯ）およびβ−ヘキソサミニダーゼ活性が欠損したマウス（ＨＥＸＢ  ＫＯ）は、脳全体のニューロンにガングリオシドを蓄積する。ｐＴｈｒ２３１−タウと特異的ｍＡｂとの免疫反応性の蓄積、およびβ−ヘキソサミニダーゼ欠損マウスにおける、マウスＡβエピトープに対する抗体と免疫反応性がある物質の沈着。
【０１２６】
ＨＥＸＢ  ＫＯマウスは、抗齧歯類Ａβと免疫反応するアミロイド様沈着の存在を明らかにした。同様の免疫反応性はＮＥＵ１  ＫＯマウスの脳全体で認められたが（表３）、そのようなＡβ免疫反応性沈着は、年齢をマッチさせた野生型対照マウスの脳および脊髄では見られなかった（表３）。ＨＥＸＢ  ＫＯマウスもまた、脳および脊髄全体で、Ｔｈｒ２３１でリン酸化されたタウに特異的な抗血清ＡＴ１８０との免疫反応性の増大を示した。顕著なＡＴ１８０免疫反応性は、年齢をマッチさせた野生型マウスの脳または脊髄では認められなかった。Ｐ（Ｔｈｒ２３１）−タウ蓄積、ｓＡＰＰαの減少、ならびにｓＡＰＰβおよびＡβ分泌の増加は、サンドホフ病患者に由来する線維芽細胞でも認められ（図３）、β−ヘキソサミニダーゼ活性の欠陥が、インビボとインビトロの両方でＡＰＰプロセッシングおよびタウリン酸化の変化をもたらし得ることが示された。
【０１２７】
表３．ノイラミニダーゼ１またはβ−ヘキソサミニダーゼが欠損したマウスの脳でのスフィンゴ糖脂質およびタンパク質の一次的および二次的蓄積。免疫反応性は年齢をマッチさせた対照では検出されなかった。
【０１２８】
【表１５】
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【０１２９】
表３にまとめたデータの作成方法：４カ月齢のＨＥＸＢ−／−マウスおよび年齢をマッチさせた対照の脳をパラフィンブロックに包埋し、５μｍのスライス厚にして冠状面で連続的に切断した。４カ月齢のＮＥＵ１−／−および年齢をマッチさせた対照マウスに生理的（０．９％）食塩水を経心的に灌流させ、脳を速やかに摘出し、半分に切断した。全てのマウスの右半球を新たに作製した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて室温で１時間浸漬固定した。次に、凍結保護を保証するために、脳をＰＢＳ溶液中の１５％スクロースに２４時間移した。翌日、脳を液体イソペンタン中で凍結させ、組織学的検査に使用するまで−８０℃で保存した。組織学的検査用に右半球を選び、５つの異なる矢状層から得られる脳半球当たり５つのスライスを凍結切断し、免疫組織化学的に染色した。抗齧歯類Ａβ（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ１４２２０）または抗ｐＴｈｒ２３１−タウ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＴ１８０）（ＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ（Ｌｉｎａｒｉｓ（登録商標）を用いて発色させる）を用いたＩＨＣの後に、アミロイド様およびｐＴｈｒ２３１−タウ様免疫反応性を定性的に評価した。齧歯類アミロイド検出スライスを、スチーマーにて９５℃で１５分間、クエン酸塩バッファーで前処理して、抗原を脱マスキング（ｄｅｍａｓｋ）し、その後、１：５００のポリクローナルウサギ抗β−アミロイド一次（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ１４２２０）とともに室温で１時間インキュベートし、次に、ビオチン化ウサギＩｇＧ検出抗体を用いて標的化した後、ＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ（Ｌｉｎａｒｉｓ（登録商標））で発色させた。ＰＨＦ−ＴＡＵ（ＡＴ１８０）の検出のために、パラフィンスライスを、スチーマーにて９５℃で１５分間、クエン酸塩バッファーで前処理して、抗原を脱マスキングし、その後、抗ヒトＰＨＦ−タウモノクローナル抗体（ＭＯＭ希釈剤；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号ＭＮ１０４０に１：１００希釈）とともに室温で１時間インキュベートし、次に、ビオチン化マウスＩｇＧ検出抗体を用いて標的化した後、ＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ（Ｌｉｎａｒｉｓ（登録商標））で発色させた。クエン酸塩バッファーによる凍結切断スライスの前処理は省略した。
【０１３０】
【表１６】
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【０１３１】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という用語は、薬理シャペロンと、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ、またはグルコセレブロシダーゼとの相互作用、特に、薬理シャペロンと接触するときに直接関与する、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ、またはグルコセレブロシダーゼのアミノ酸残基との相互作用を指す。薬理シャペロンは、標的タンパク質、例えば、β−ヘキソサミニダーゼＢと特異的に結合して、この酵素に対するシャペロン効果を発揮し、かつ関連タンパク質または無関係なタンパク質の一般群に対するシャペロン効果を発揮しない。任意の所与の薬理シャペロンと相互作用するβ−ヘキソサミニダーゼのアミノ酸残基は、タンパク質の「活性部位」にある場合もあるし、タンパク質の「活性部位」にない場合もある。特異的結合は、ルーチンの結合アッセイ（例えば、阻害、熱安定性）によって、または構造研究、例えば、共結晶化、ＮＭＲなどによって評価することができる。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「安定性を増強する」または「安定性を増大させる」という用語は、インビトロで、または薬理シャペロンと接触していないガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ（好ましくは、例えば、それより前の同じ細胞型または同じ細胞のもの）、もしくはグルコセレブロシダーゼと比べて、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ、もしくはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触した細胞内で、不可逆的な不活化に対する酵素耐性を増大させることを指す。タンパク質安定性を増大させると、ＥＲでのタンパク質の半減期およびＥＲから輸送される機能的タンパク質の量が増大する。本発明の一態様では、野生型ガングリオシダーゼもしくはシアリダーゼ、またはグルコセレブロシダーゼの安定性を増強するかまたは増大させる。本発明の別の態様では、突然変異体ガングリオシダーゼもしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの構造安定性を増強するかまたは増大させる。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「輸送を増強する」または「輸送を増大させる」という用語は、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触していない（好ましくは、例えば、それより前の同じ細胞型または同じ細胞）の細胞におけるガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの輸送効率と比べて、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触した細胞の細胞質（シアリダーゼ ２）またはエンドソームおよびリソソームへのガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの輸送効率を増大させることを指す。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「活性を増強する」または「活性を増大させる」という用語は、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触していない（好ましくは、例えば、それより前の同じ細胞型または同じ細胞）の細胞におけるガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの活性と比べて、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触した細胞における、本明細書に記載されているような、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの活性を増大させることを指す。本発明の薬理シャペロンは、細胞内の酵素の総量を増大させることによって、および／または酵素の比活性を増大させることによって酵素活性を増大させることもできる。
【０１３５】
「比活性」という用語は、酵素が、単位時間で、酵素調製中のタンパク質１ミリグラム当たりに変換する基質の量を指す。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、「レベルを増強する」または「レベルを増大させる」という用語は、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触していない（好ましくは、例えば、それより前の同じ細胞型または同じ細胞）の細胞におけるガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼのレベルと比べて、１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼに特異的な薬理シャペロンと接触した細胞における１種以上のガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼのレベルを増大させることを指す。
【０１３７】
「適切な構造を安定化する」という用語は、その意図される機能を果たす野生型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの構造と機能的に同一の突然変異型または野生型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ酵素の構造を誘導または安定化するガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの薬理シャペロンの能力を指す。
【０１３８】
「機能的に同一の」という用語は、構造にわずかなばらつきはあり得るが（ほとんど全てのタンパク質はその生理的状態において若干の構造的柔軟性を示す）、構造的柔軟性が、野生型タンパク質よりも大きい程度にまたは小さい程度に、（１）タンパク質凝集、（２）小胞体関連分解経路による排除、（３）タンパク質機能の障害、例えば、ＡＰＰ代謝活性、および／または（４）細胞内での不適切な輸送、例えば、細胞質への局在化を生じさせないことを指す。
【０１３９】
「安定な分子構造」という用語は、細胞内の少なくとも一部の野生型機能を提供するかまたは野生型機能を増強する薬理シャペロンによって誘導される、タンパク質、すなわち、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの構造を指す。例えば、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの安定な分子構造は、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼが、ミスフォールドして分解されることなく、かつ／またはその意図される機能を発揮せずに終わることなく、ＥＲを離れ、細胞質に輸送される場合の構造である。さらに、突然変異型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの安定な分子構造は、完全なまたは部分的な活性を有することもできる。しかしながら、安定な分子構造が野生型タンパク質の機能的属性の全てを有する必要はない。
【０１４０】
「活性」という用語は、細胞内の野生型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの通常の意図される生理機能を指す。例えば、ガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼ活性にはガングリオシドの異化が含まれ、グルコセレブロシダーゼ活性にはスフィンゴ糖脂質グルコシルセラミドの異化が含まれる。そのような機能性は、機能性を立証することが知られている任意の手段によって試験することができる。
【０１４１】
「ガングリオシド異化」という用語は、シアリダーゼおよびエキソグリコヒドロラーゼによってアシアロガングリオシドおよびシアロガングリオシドの非還元末端単位から順次、個々のシアル酸および糖残基を除去して、セラミドを形成させることを指す。この分解は、細胞質に局在するシアリダーゼ２を除いて、主にエンドサイトーシス−エンドソーム−リソソーム経路を通じて起こる。
【０１４２】
１つの非限定的な実施形態では、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ、またはグルコセレブロシダーゼポリペプチドは、野生型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼをコードする核酸分子との５０％、６０％、７０％、８０％および最大１００％の相同性を示す任意の核酸分子、ならびにこれらの配列に標準的な条件の下でハイブリダイズする任意の配列によってコードされていてもよい。別の非限定的な実施形態では、ＥＲでの機能的な構造を達成し、細胞内での適切な局在化を達成し、かつ野生型活性を示す能力を有する（前述のポリペプチド配列と同じ機能特性および結合親和性を有する）ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼポリペプチドをコードする任意の他のヌクレオチド配列、例えば、正常個体のアレル変異体。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、「突然変異体」ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼという用語は、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼアミノ酸配列の変化を生じさせる遺伝子突然変異を含む遺伝子から翻訳されるガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼポリペプチドを指す。一実施形態では、突然変異は、野生型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼもしくはグルコセレブロシダーゼと比較したとき、ＥＲに通常存在する条件下で本来の構造を達成しないか、または野生型ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼもしくはグルコセレブロシダーゼと比較したときに、安定性もしくは活性の低下を示すガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼタンパク質を生じさせる。この種の突然変異は、本明細書では「構造突然変異」呼ばれ、そのような突然変異を有するタンパク質は、「構造突然変異体」と呼ばれる。この構造の達成がうまく行かないと、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼタンパク質は分解されるか、または凝集し、タンパク質輸送系の通常の経路を通した、細胞内のその本来の位置へのまたは細胞外環境への輸送は行なわれない。いくつかの実施形態では、突然変異は、あまり効率的でないタンパク質発現をもたらす、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子の非コード部分に生じる場合があり、これには、例えば、転写効率、スプライシング効率、ｍＲＮＡ安定性などに影響を及ぼす突然変異がある。ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの野生型および構造突然変異体変異体の発現レベルを増強することにより、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの薬理シャペロンの投与は、そのような非効率なタンパク質発現に起因する欠損を改善することができる。
【０１４４】
ある種の試験は、その実際のインビボ活性に相当したり、相当しなかったりするが、それでもタンパク質機能性の適切な代替物となるタンパク質の属性を評価することができ、そのような試験での野生型の挙動は、本発明のタンパク質フォールディング救済または増強技術を裏付ける証拠を示す。本発明によるそのような活性の一つは、機能的ガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼの、小胞体から細胞質への適切な輸送である。
【０１４５】
「内在性発現」および「内在性に発現される」という用語は、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ欠損、ドミナントネガティブ突然変異体の過剰発現、または他の欠陥、例えば、その発現、活性、もしくは安定性を変化させる、例えば、阻害するガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼもしくはグルコセレブロシダーゼ核酸もしくはポリペプチド配列の突然変異と関連する疾患もしくは障害を有さないかまたはそれらを有することが疑われない個体の細胞におけるガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの通常の生理的発現を指す。この用語はまた、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼが健康個体で通常発現される細胞または細胞型におけるそれらの発現を指し、ガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼが健康個体で発現されない細胞または細胞型、例えば、腫瘍細胞におけるガングリオシダーゼおよび／もしくはシアリダーゼまたはグルコセレブロシダーゼの発現を含まない。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、「上昇したガングリオシド」は、脳のガングリオシドレベルが増大している個体、患者または患者集団を指す。ガングリオシドレベルは、細胞全体の膜、また同様にマイクロドメイン内で上昇していてもよい。「マイクロドメイン」または「脂質ラフト」という用語は、コレステロール、スフィンゴ糖脂質およびガングリオシドが濃縮された、細胞膜に見られる洗剤耐性領域を指す。本発明の一態様では、薬理シャペロンは、脳のガングリオシドを異化することが知られている酵素の活性を増大させることによって、マイクロドメインまたは脂質ラフトのガングリオシドレベルを減少させるために用いられる。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、「輸送効率」という用語は、小胞体から外に出て、細胞内、細胞膜内のその本来の位置へ、または細胞外環境へと輸送されるタンパク質の能力を指す。
【０１４８】
酵素の「競合的阻害剤」は、酵素基質の化学構造および分子形状が構造的に類似していて、基質とほぼ同じ部位で酵素と結合する化合物を指すことができる。したがって、この阻害剤は、基質分子と同じ活性部位を競合し、それによりＫｍを増大させる。競合的阻害は一般に、阻害剤を追いやるほどの十分な基質分子が利用可能な場合は可逆的である、すなわち、競合的阻害剤は可逆的に結合することができる。したがって、酵素阻害の量は、阻害剤濃度、基質濃度、および阻害剤と基質の活性部位に対する相対的親和性によって決まる。
【０１４９】
非古典的な競合的阻害は、阻害剤が酵素の活性部位から離れたところで結合し、基質がもはやそれに結合することができないような酵素の構造変化を起こす場合に起こる。非古典的な競合的阻害では、活性部位での基質の結合によって、離れた部位での阻害剤の結合が妨げられるし、逆もまた同様である。これには、アロステリック阻害が含まれる。
【０１５０】
酵素の「線形混合型阻害剤」は、基質が結合するのを可能にするが、その親和性を低下させ、その結果、Ｋｍを増大させ、Ｖｍａｘを低下させるタイプの競合阻害剤である。
【０１５１】
「非競合的阻害剤」は、酵素との強い結合を形成し、過剰な基質の添加によって追いやることができない化合物を指す。すなわち、非競合的阻害剤は、不可逆的であることができる。非競合的阻害剤は、酵素またはタンパク質の活性部位、その近く、またはそこから離れた部位で結合することができ、酵素に関して、Ｋｍに対する効果はないが、Ｖｍａｘを減少させる。非競合的阻害は、阻害剤が酵素−基質（ＥＳ）複合体だけに結合する状況を指す。酵素は阻害剤が結合すると不活性になる。これは、基質の非存在下で酵素に結合することができる非古典的競合的阻害剤とは異なる。
【０１５２】
「Ｖｍａｘ」という用語は、酵素触媒反応の最大初期速度、すなわち、飽和基質レベルでの速度を指す。「Ｋｍ」という用語は、Ｖｍａｘの二分の一を達成するのに必要な基質濃度である。
【０１５３】
酵素「エンハンサー」は、ガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼに結合し、酵素反応速度を増大させる化合物である。
【０１５４】
「治療有効用量」および「有効量」という用語は、適切な細胞位置で既に発現されたタンパク質を阻害することなく（アンタゴニストの場合）、または適切な細胞位置からのタンパク質のリガンド媒介性受容体内在化を誘発することなく（アゴニストの場合）、ＥＲでの（機能的構造を可能にする）タンパク質プロセッシングを増強し、標的タンパク質の活性を増強し、それにより、対象における治療応答を生じさせるのに十分な量を指す。治療応答は、使用者（例えば、臨床医）が有効な治療応答と認識する任意の応答であることができ、これには、前述の症状および代用臨床マーカーが含まれる。したがって、治療応答は、一般に、疾患または障害、例えば、アルツハイマー病の１以上の症状の改善または阻害である。
【０１５５】
「医薬として許容される」という語句は、ヒトに投与したときに、生理的に耐えられ、かつ通常は有害反応を起こさない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、「医薬として許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって認可されているか、または動物、より具体的にはヒトでの使用について米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに化合物を投与する希釈剤、補助剤、賦形剤、または任意のビヒクルを指す。そのような医薬担体は、例えば、水および油などの滅菌液であることができる。水または水溶液の生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射溶液用の担体として利用されることが好ましい。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、または他の版に記載されている。
【０１５６】
「約」および「およそ」という用語は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量についての許容される誤差の程度を意味するものとする。通常、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、およびより好ましくは５％以内である。あるいは、および特に生物系では、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内の値を意味することができる。本明細書に示される数量は、特に記載されない限り、近似であり、明示的に記載されていない場合に「約」または「およそ」という用語が暗示され得ることを意味する。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、言及された材料が、それが通常見られる環境から取り除かれていることを意味する。したがって、単離された生物学的材料は、細胞成分、すなわち、その材料が見られるかまたは産生される細胞の成分を含まないことがあり得る。核酸分子の場合、単離された核酸には、ＰＣＲ産物、ゲル上のｍＲＮＡバンド、ｃＤＮＡ、または制限断片が含まれる。別の実施形態では、単離された核酸は、それが見られる染色体から切り出されていることが好ましく、かつ染色体に見られるとき、単離された核酸分子によって含まれる遺伝子の上流または下流に位置する、非調節性、非コード領域、または他の遺伝子に、もはや接続していないことがより好ましい。また別の実施形態では、単離された核酸は、１以上のイントロンを欠く。単離された核酸には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれる。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、それが細胞内で会合している他のタンパク質もしくは核酸、もしくは両方と、またはそれが膜結合型タンパク質である場合、細胞膜と会合していてもよい。単離されたオルガネラ、細胞、または組織は、生物内でそれが見られる解剖学的部位から取り除かれている。単離された材料は、精製されていてもよいが、そうである必要はない。
【０１５８】
本明細書で使用される「精製された」という用語は、無関係な材料、すなわち、夾雑物を減少させるかまたは排除する条件下で単離されたガングリオシダーゼおよび／またはシアリダーゼの核酸またはポリペプチドなどの材料を指す。例えば、精製されたタンパク質は、それが細胞内で会合している他のタンパク質または核酸を実質的に含まないことが好ましい。本明細書で使用する場合、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析的実験の文脈で、操作上用いられる。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された材料は、少なくとも５０％純粋であり、より好ましくは、少なくとも９０％純粋であり、より好ましくは、さらに少なくとも９９％純粋である。純度は、従来の手段、例えば、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当技術分野で公知の他の方法によって評価することができる。
【０１５９】
「タウオパシー」という用語は、ヒトの脳で神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）を形成させるタウタンパク質の病的凝集によって生じる任意の状態を指し、これには、（限定するものではないが）前頭側頭認知症、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および前頭側頭葉変性症（ピック病）などの疾患が含まれる。
【０１６０】
「アルツハイマー病」または「ＡＤ」という用語は、緩徐進行性認知症や肉眼的皮質性小脳萎縮症を特徴とする状態を指す。β−アミロイド老人斑、ニューロン内の神経原線維のもつれ、およびアミロイド血管症の存在は、ＡＤの顕著な特徴であり、死体の検死時に観察される。ＡＤは、家族性発現する遺伝性のものである場合もあるし、孤発性のものである場合もある。本明細書では、ＡＤは、表現型発現に基づいて、家族性、孤発性、ならびにそれらの中間およびサブグループを含む。家族性ＡＤが一般に早発性（６５歳より前）であるのに対し、孤発性ＡＤは一般に遅発性（６５歳以降）である。非限定的な実施形態では、家族性ＡＤは、プレセニリン１（ヒトプレセニリン１、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００００２１、ＮＭ＿００７３１８、およびＮＭ＿００７３１９；マウスプレセニリン１、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００８９４３；ならびにラットプレセニリン１、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０１９１６３）、プレセニリン２（ヒトプレセニリン２、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００４４７、およびＮＭ＿０１２４８６；マウスプレセニリン２、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０１１１８３；ならびにラットプレセニリン２、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０３１０８７）、およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（ヒトＡＰＰ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿２０１４１４、ＮＭ＿２０１４１３、およびＮＭ＿０００４８４；マウスＡＰＰ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００７４７１；ならびにラットＡＰＰ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０１９２８８）を含む群から選択される１以上の遺伝子の突然変異と関連することができる。孤発性ＡＤは、直接試験することはできないが、特定のリスク因子が、孤発性ＡＤの発症に対する個体の感受性を増大させる可能性がある。１つの非限定的な実施形態では、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）（ヒトＡＰＯＥ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００００４１；マウスＡＰＯＥ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００９６９６；およびラットＡＰＯＥ、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿１３８８２８）の少なくとも１コピーのｅ４アレルを有する個体は、遅発性の孤発性ＡＤを発症するリスクがある。
【０１６１】
この用語は、２１トリソミー、すなわち、ダウン症（ＤＳ）を有し、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴的病変である、脳アミロイド（Ａβ）斑および神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）をはじめとする、ＡＤの臨床的および神経病理学的な特徴と同一の認知症を（２０代または３０代で）発症する個体も含む。最近の研究により、Ａβ４２は、ダウン症脳に沈着するこのタンパク質の最初期の形態であり、１２歳ぐらいの対象に見ることができること、および可溶性Ａβは、Ａβ斑の形成のずっと前、早くも妊娠２１週にはＤＳ対象の脳で検出することができることが示されている。Ｇｙｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２５：４８９−４９２（２０００）。
【０１６２】
本発明の目的のために、「神経学的障害」は、アミロイド前駆体タンパク質のβ−アミロイド原性プロセッシングと関連する任意の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）疾患を指す。これは、ニューロンの損失、ニューロンの変性、ニューロンの脱髄、グリオーシス（すなわち、アストログリオーシス）、またはニューロンもしくはニューロン外への異常タンパク質もしくは毒素（例えば、アミロイド−β）の蓄積を含むが、これらに限定されない、ニューロンまたはグリア細胞の欠陥を引き起こすことができる。
【０１６３】
１つの例示的な神経学的障害は、コンゴーレッド親和性血管障害とも呼ばれる脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）である。この障害は、アルツハイマー病に関連するのと同じアミロイドタンパク質であるアミロイド−β（Ａβ）が、脳の軟髄膜および浅大脳皮質血管の壁に沈着する血管障害の形態である。アミロイド沈着によって、これらの血管に障害が生じやすくなり、出血性脳卒中のリスクが増大する。それは、アルツハイマー病の認知症に関連するのと同じアミロイドタンパク質であるので、そのような脳出血は、アルツハイマー病に罹患している人に多く見られるが、これは、認知症の既往歴のない人にも起こることがある。脳内の出血は、通常、特定の葉に限定され、これは、出血性脳卒中（または脳出血）のより一般的な原因である高血圧（高血圧症）の結果として起こる脳出血と比較すると、若干異なっている。ＣＡＡは、一過性脳虚血発作、くも膜下出血、ダウン症、照射後壊死、多発性硬化症、白質脳症、海綿状脳症、およびボクサー認知症とも関連する。
【０１６４】
「個体」、「患者」または「患者集団」という用語は、アルツハイマー病を有するか、またはアルツハイマー病を発症するリスクがあると診断された人を指す。例えば、個体は、家族性ＡＤであるか、またはそれを発症するリスクがあると診断される。別の例では、個体は、孤発性ＡＤを有するか、またはそれを発症するリスクがあると診断される。ＡＤの診断は、個体が示す遺伝型または表現型の特徴に基づいて行なうことができる。例えば、プレセニリン１、プレセニリン２、またはＡＰＰの突然変異体変異体を有する個体は、家族性ＡＤを発症するリスクがある。別の非限定的な例では、ＡＰＯＥのＥ４変異体を有する個体は、孤発性ＡＤを発症するリスクがある。
【０１６５】
個体は、ＡＤと関連する表現型を示すことによって、ＡＤを有するか、またはＡＤを発症するリスクがあると診断され得る。ＡＤと関連する表現型は、認知に関するものであっても、精神医学的なものであってもよい。認知に関する表現型の例としては、記憶喪失、失語、失行および失認が挙げられるが、これらに限定されない。精神医学的症状の例としては、人格変化、鬱状態、幻覚および妄想が挙げられるが、これらに限定されない。１つの非限定的な例として、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，第４版（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎにより出版）は、アルツハイマー病型の認知症に関する以下の基準の組を含んでいる：
Ａ．複数の認知障害の発症が、記憶障害と失語、失行、失認および実行機能障害の１つまたは複数の両方によって明らかになること；
Ｂ．認知障害が、病前の機能からの低下を示し、社会的または職業的機能の著しい障害を引き起こすこと；
Ｃ．その経過が、緩やかな発症と持続的な低下を特徴とすること；
Ｄ．認知障害が、記憶や認知に進行性の障害を引き起こす他の中枢神経系疾患、全身性疾患、または物質誘発性の疾患によるものでないこと；および
Ｅ．障害が、別の精神障害ではうまく説明されないこと。
【０１６６】
別の非限定的な例は、以下のような、アルツハイマー病に関する国立神経障害・脳卒中研究所−アルツハイマー病・関連障害協会（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＩＮＤＳ−ＡＤＲＤＡ）基準である：
Ａ．確実なアルツハイマー病：ほぼ確実なアルツハイマー病の基準を満たし、剖検または生検によるアルツハイマー病の組織病理学的な証拠がある
Ｂ．ほぼ確実なアルツハイマー病：臨床的および神経心理学的検査で確認され、かつ以下を含む認知症
（ａ）記憶を含む認知の２以上の領域で進行性の障害がある
（ｂ）４０〜９０歳で発症する
（ｃ）せん妄を含む認知症症候群を生じさせることができる全身疾患または他の脳疾患が存在しない
Ｃ．疑いのあるアルツハイマー病：発症、提示、または進行が非定型であり、原因が不明の認知症症候群；認知症を生じさせることができる任意の合併疾患が原因であるとは考えられない
Ｄ．可能性の低いアルツハイマー病：以下のいずれかを有する認知症症候群：突然発症、局所的な神経学的兆候、または病気の早い段階での発作もしくは歩行困難。
【０１６７】
ＡＤの表現型発現は、例えば、アミロイド−β斑の直接的（イメージング）検出または間接的（生化学的）検出による、物理的なものであることもできる。末梢血中のアミロイド−β（１−４０）の定量は、線形イオントラップタンデム質量分析法と併用する高速液体クロマトグラフィーを用いて実証されている（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ．１６（４）：３５６−６３（２００５）。蛍光相関分光法によるアルツハイマー病患者の脳脊髄液中での単一のβ−アミロイドタンパク質凝集の検出も記載されている（Ｐｉｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：８３２−８３４（１９９８）。米国特許第５，５９３，８４６号明細書には、可溶性アミロイド−βを検出するための方法が記載されている。抗体を用いるアミロイド−βペプチドおよび終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の間接的な検出も記載されている。最近、発色性基質を用いた脳脊髄液中のＢＡＣＥ−１活性の増大の生化学的検出も、ＡＤの診断または予後指標であると仮定されている（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ａｐｒ  １３［Ｅｐｕｂ．］（２００６）。
【０１６８】
β−アミロイドのインビボイメージングは、放射性ヨウ素標識フラボン誘導体を造影剤として用いて（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４８（２３）：７２５３−６０（２００５））、および（１２５Ｉ−ＰＵＴ−Ａ  １−４０を生じる）４０残基の放射性ヨウ素標識Ａペプチドにコンジュゲートされたプトレセイン（これは、血液脳関門を越えて、αβ斑に結合することが示された）などのアミロイド結合色素を用いて達成することができる（Ｗｅｎｇｅｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１８（８）：８６８−７２（２０００））。β−アミロイドのイメージングは、スチルベンＳＢ−１３および（ＰＩＢとしても知られる）ベンゾチアゾール６−ＯＨ−ＢＴＡ−１を用いても示された。Ｎｉｃｈｏｌａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１２：５８４−５９５（２００４）。
【実施例】
【０１６９】
図１は、ＡＰＰのプロセッシングを表し、成熟ＡＰＰが、ｓＡＰＰαおよびＣ８３を生成させるα−セクレターゼ経路（左）ならびにｓＡＰＰβおよびＣ９９を生成させるβ−セクレターゼ経路（右）という２つの競合する経路によってどのように代謝されるかを示している。カルボキシ末端断片のＣ８３およびＣ９９は、ＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）ならびに分泌ペプチドｐ３（左）およびＡβ（右）を生成させるγ−セクレターゼの基質である。Ａβペプチドは、オリゴマー化し、斑を形成し、タウ過剰リン酸化を促進することができるのに対し、ｓＡＰＰαは、神経突起伸長、シナプス形成を促進し、ＣＤＫ５活性化と関連するタウ過剰リン酸化を抑制する。
【０１７０】
図２に示すデータは以下のように作成された。ＨＥＸＢ＋／＋マウス（約４．５カ月齢）、ＨＥＸＢ＋／−マウス（約４．５カ月齢）およびＨＥＸＢ−／−マウス（約４．５カ月齢）由来の脳組織を細かく刻み、１０×容量（１ｍｌ／１００ｍｇ組織）の冷たい組織ホモジナイゼーションバッファー（ＴＨＢ：２５０ｍＭのスクロース、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ＋プロテアーゼ阻害剤）とともに混合した。次に、脳組織をローターステーターホモジナイザーを用いてホモジナイズした。脳ホモジネートをきれいな超遠心分離チューブに移し、予め冷却したＲＰ７０−ＡＴローターに入れ、５０，０００ｒｐｍ（約１００，０００ｇ）にて４℃で１時間遠心分離した。可溶性画分（上清）を、２２Ｃ１１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いるイムノブロットによってｓＡＰＰのレベルを決定するために用いた。Ａβ４０およびＡβ４２レベルの測定のために、可溶性画分（上清）をジエチルアミン（ＤＥＡ）で抽出した。ＤＥＡホモジネートを５０，０００ｒｐｍ（約１００，０００ｇ）にて４℃で１時間遠心分離し、０．１×容量の０．５ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７を添加して、上清を中和した。次に、中和したＤＥＡ抽出物をＥＬＩＳＡキット（Ｗａｋｏ）によるＡβ４０およびＡβ４２レベルの測定に用いた。膜画分を得るために、ＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を超遠心分離チューブ中の膜ペレットに添加した。膜を氷上で３０分間インキュベートしてＲＩＰＡバッファー中で可溶化した。ＲＩＰＡで可溶化した膜を２５，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間の遠心分離によって得た。ＡＰＰ、α−ＣＴＦおよびβ−ＣＴＦのレベルを決定するために、膜画分をポリクローナルＡＰＰ−ＣＴ抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を用いてイムノブロットした。タウレベルの解析のために、膜画分を上記のように調製し、ｐ−タウ（Ｔｈｒ２３１）のレベルを決定するためにＡＴ１８０抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、ｐ−タウ（Ｓｅｒ  ２０２）のレベルを決定するためにＡＴ８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、総タウのレベルを決定するために総タウ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてイムノブロットした。膜画分中のｐ−タウ（Ｔｈｒ１８１）のレベルは、製造元の奨励するプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）アッセイを行なうことにより決定した。組織学的解析のために、ＨＥＸＢ  ＫＯマウス由来の脳の皮質をパラフィンブロックに包埋した。Ａβ４２を特異的に認識する抗体ＦＣ３５４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いるかまたはｐ−タウ（Ｔｈｒ２０２）を特異的に認識するＡＴ８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるＩＨＣの後に、アミロイドおよびｐＴｈｒ２３１−タウ様免疫反応性を定性的に評価した。
【０１７１】
図２に示すように、サンドホフＨＥＸＢノックアウトマウス（ＨＥＸＢ−／−）およびサンドホフＨＥＸＢヘテロ接合マウス（ＨＥＸＢ＋／−）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来のＣ末端断片（ＣＴＦ）およびＡβペプチドを蓄積し、リン酸化タウのレベルが増大している。図２Ａ）は、ウェスタンブロットの正規化したデンシトメトリーにより、４カ月齢のＨＥＸＢ−／−およびＨＥＸＢ＋／−マウス（ｎ＝４）由来の全脳ホモジネートにおけるＣＴＦおよびＡβレベルの増大が示されることを表す。図２Ｂ）は、組織学的解析により、ＨＥＸＢ−／−マウスの皮質におけるニューロン内Ａβ４２の蓄積が示されることを示す。図２Ｃ）は、ＥＬＩＳＡ（ｐ−タウ［Ｔｈｒ１８１］）とウェスタンブロット（ｐ−タウ［Ｔｈｒ２３１］およびｐ−タウ［Ｓｅｒ２０２］、総タウ）の正規化したデンシトメトリーとにより、年齢をマッチさせたＨＥＸＢ＋／＋マウスと比べて、ＨＥＸＢ−／−およびＨＥＸＢ＋／−マウスにおけるｐ−タウレベルの上昇は示されるが、総タウレベルに有意差が示されないことを表す。図２Ｄ）は、組織学的解析により、ＨＥＸＢ−／−マウスの髄質および脊髄におけるｐ−タウ（２０２）の蓄積（データは示さない）が示されることを示す。
【０１７２】
図３に示すデータは以下のように作成された。野生型（健康）線維芽細胞株（ＣＲＬ２０７６；Ｃｏｒｉｅｌｌ）およびサンドホフ患者由来の線維芽細胞株（ＧＭ１１７０７；Ｃｏｒｉｅｌｌ）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で一晩培養し、その後、無血清培地中で一晩インキュベートした。分泌タンパク質を増殖培地のＴＣＡ沈殿（１２．５％）により回収し、６Ｅ１０抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を用いるイムノブロッティングにより解析して、ｓＡＰＰαのレベルを決定した。分泌されたｓＡＰＰβのレベルを決定するために、線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６＆ＧＭ１１７０７）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で５日間培養し、その後、ＡＰＰ（１Ｇ６；Ｃｏｖａｎｃｅ）に対するビオチン化モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、ｓＡＰＰβ（Ｃｏｖａｎｃｅ）に対する親和性精製したポリクローナル抗体を用いてイムノブロットした。培地中に分泌されたＡβ４０のレベルを測定するために、線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６＆ＧＭ１１７０７）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で一晩培養し（３ウェル／試料；１ｍｌ培地／ウェル）、その後、無血清培地中で一晩インキュベートした。３ウェル／試料を合わせ、０．３ｍｌのメタノール、３０μｌの１０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）と混合した。Ｓｅｐａｋ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて試料を予め濃縮し、その後、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｖａｎｃｅ）で用いて、Ａβ４０のレベルを決定した。全長ＡＰＰのレベルを決定するために、線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６＆ＧＭ１１７０７）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で一晩培養した。細胞を剥離し、遠心分離で回収し、細胞ペレットをＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を用いて可溶化した。細胞ライセートをＡＰＰ−ＣＴ抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を用いてイムノブロットして、全長ＡＰＰのレベルを決定した。ＡＤＡＭ１０のレベルを決定するために、線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６＆ＧＭ１１７０７）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で一晩培養した。細胞を剥離し、遠心分離で回収し、細胞ペレットをＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を用いて可溶化した。細胞ライセートをＡＤＡＭ１０に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてイムノブロットした。ＢＡＣＥ１のレベルを決定するために、線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６＆ＧＭ１１７０７）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で一晩培養した。細胞を剥離し、遠心分離で回収し、細胞ペレットをＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を用いて可溶化した。細胞ライセートをＢＡＣＥ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてイムノブロットした。ｐＴｈｒ２３１−タウのレベルを決定するために、線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６＆ＧＭ１１７０７）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）増殖培地中で一晩培養した。細胞を剥離し、遠心分離で回収し、���胞ペレットをＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を用いて可溶化した。細胞ライセートをｐＴｈｒ２３１−タウに特異的なマウスモノクローナル抗体（ＡＴ１８０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてイムノブロットした。健康な線維芽細胞（ＣＲＬ２０７６；Ｃｏｒｉｅｌｌ）を０、１００または１０００μＭのＮ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）で５日間処理し、その後、無血清培地中で一晩インキュベートした。分泌タンパク質を増殖培地のＴＣＡ沈殿（１２．５％）により回収し、６Ｅ１０抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を用いるイムノブロッティングにより解析して、ｓＡＰＰαのレベルを決定した。
【０１７３】
図３に示すように、サンドホフ患者由来の線維芽細胞は、対照線維芽細胞と比較してより多くのｓＡＰＰβおよびＡβと、より少ないｓＡＰＰαとを分泌し、かつタウ過剰リン酸化を示す。以下の抗体：ｓＡＰＰαおよび全長ＡＰＰの検出用の６Ｅ１０；全長ＡＰＰの検出用のＡＰＰ（ＣＴ）ポリクローナル（ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃ．）；ウサギポリクローナル抗ＡＤＡＭ１０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；ウサギポリクローナル抗ＢＡＣＥ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ２３７９６）；ｐＴｈｒ２３１−タウに特異的なｍＡｂであるＡＴ１８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ならびにヒトタウに特異的なｍＡｂであるＨＴ７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた、健康対照およびサンドホフ患者に由来する線維芽細胞におけるｓＡＰＰα（Ａ）、ｓＡＰＰβ（Ｂ）、Ａβ（Ｃ）、ＡＤＡＭ１０（Ｄ）、ＢＡＣＥ１（Ｅ）、全長ＡＰＰ（Ｆ）およびｐＴｈｒ２３１−タウ（Ｇ）のレベルを比較するウェスタンブロット。薬理シャペロンのＮ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシンによるサンドホフ線維芽細胞（５日）の処理は、ｓＡＰＰαの産生を３５〜４０％増大させ（Ｈ）、ガングリオシドレベルの低下が、正常なＡＰＰプロセッシングを少なくとも一部回復させることができることを示している。サンドホフ線維芽細胞は、対照線維芽細胞と比較してより少ないｓＡＰＰαを培地中に分泌したが、ＡＤＡＭ１０およびＢＡＣＥ１レベルは対照と同様であった。線維芽細胞を無血清ＤＭＥＭ中で２０時間増殖させ、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を用いて濃縮した後、上清Ａβ４０の濃度をＥＬＩＳＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＢｅｔａＭａｒｋ  ｘ−４０）で測定した。Ａβ４０の濃度を、上清が得られた線維芽細胞ライセート由来の総タンパク質に対して正規化する（ＢＣＡ，Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０１７４】
図４に示すデータは以下のように作成された。Ｎ２Ａマウス神経芽細胞腫を化合物なしまたは１０μＭのＡｄＤＮＪ、１０μＭのＮＧＴもしくは１０μＭのＤＧＪのいずれかで３日間処理した。細胞を剥離し、遠心分離で回収し、細胞ペレットをＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を用いて可溶化した。細胞ライセートをＨｅｘＢに特異的なウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてイムノブロットした。ｓＡＰＰαのレベルを、２２Ｃ１１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、増殖培地のごく一部（３０μｌ）をイムノブロットすることにより決定した。
【０１７５】
図４に示すように、β−ヘキソサミニダーゼ（β−Ｈｅｘ）標的化薬理シャペロンのＮ−アセチル−グルコサミン−チアゾリン（ＮＧＴ）および２−アセトアミド−１，２−ジデオキシノジリマイシン（ＡｄＤＮＪ）は、野生型β−Ｈｅｘの細胞レベルを増大させ、かつ神経栄養性ｓＡＰＰαの切断を増大させる。図４Ａ）１０μＭのＮＧＴおよびＡｄＤＮＪによるＮ２Ａマウス神経芽細胞腫の処理は、野生型β−Ｈｅｘの細胞レベルを増大させたが、酸α−ガラクトシダーゼというリソソーム酵素の薬理シャペロンであるデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）は、β−Ｈｅｘレベルに影響がなかった。図４Ｂ）１０μＭのＮＧＴおよびＡｄＤＮＪによるＮ２Ａマウス神経芽細胞腫の処理は、神経栄養性ｓＡＰＰαの切断も増大させた。
【０１７６】
図５に示すデータは以下のように作成された。用量応答研究のために、Ｃ５７ＢＬ６マウスを０、３ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍｇ／Ｋｇ、３０ｍｇ／Ｋｇ、１００ｍｇ／Ｋｇまたは３００ｍｇ／ＫｇのＮＧＴ（飲用水）で７日間処置した。投与後、マウスを屠殺し、酵素活性測定用に脳組織を回収した。脳組織をスライスして２０〜３０ｍｇのアリコートにし、各アリコートを溶解バッファー（８２．４ｍＭの第二リン酸ナトリウム、５８．８ｍＭのクエン酸、０．２５％のタウロコール酸ナトリウム塩水和物、０．５％のＴＸ−１００）中でホモジナイズした。脳組織ホモジネートを２５，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。得られた上清（脳ライセート）は、蛍光基質４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、総β−ヘキソサミニダーゼ活性を測定するために用いた。ウォッシュアウト研究のために、Ｃ５７ＢＬ６マウスを１００ｍｇ／ＫｇのＮＧＴ（飲用水）で７日間処置し、その後、１、２、３、５および７日のウォッシュアウト（薬物投与なし）を置いた。ウォッシュアウト段階の後、マウスを屠殺し、酵素活性測定のために脳組織を回収した。脳組織をスライスして２０〜３０ｍｇのアリコートにし、各アリコートを溶解バッファー（８２．４ｍＭの第二リン酸ナトリウム、５８．８ｍＭのクエン酸、０．２５％のタウロコール酸ナトリウム塩水和物、０．５％のＴＸ−１００）中でホモジナイズした。脳組織ホモジネートを２５，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。得られた上清（脳ライセート）は、蛍光基質４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、総β−ヘキソサミニダーゼ活性を測定するために用いた。ＮＧＴの脳および血漿レベルをＬＣ−ＭＳＭＳで測定した。
【０１７７】
図５に示すように、薬理シャペロンのＮ−アセチル−グルコサミン−チアゾリン（ＮＧＴ）は、Ｃ５７ＢＬ６マウスで野生型の内在性β−ヘキソサミニダーゼ活性を選択的に増大させる。シャペロンのＮ−アセチル−グルコサミン−チアゾリンは経口的に利用可能であり、脳を透過し、Ｃ５７ＢＬ６マウスの脳で内在性β−ヘキソサミニダーゼ活性を選択的に増大させる。ＮＧＴ処置（Ａ）は、Ｃ５７ＢＬ６の脳で野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性の用量依存的増加を示し、β−ヘキソサミニダーゼ活性は、薬物を中止した後、最大１週間、未処置レベルを超えて上昇し続けた（Ｂ）。３、１０、３０、１００または３００ｍｇ／ｋｇのＮ−アセチル−グルコサミン−チアゾリンの不断投与後の血漿レベル（Ｃ）および脳レベル（Ｄ）。
【０１７８】
図６に示すデータは以下のように作成された。ＮＧＴを飲用水を介して野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスに３０および１００ｍｇ／Ｋｇで毎日投与した。２日目、４日目、６日目、８日目および１５日目（それぞれ、１日間、３日間、５日間、７日間および１４日間の投与に相当する）に動物を屠殺した。このタイムコース実験の各時点について、ＮＧＴが投与されないマウスの群（未処置対照）もあった。投与後、マウスを屠殺し、酵素活性測定用に脳組織を回収した。脳組織をスライスして２０〜３０ｍｇのアリコートにし、各アリコートを溶解バッファー（８２．４ｍＭの第二リン酸ナトリウム、５８．８ｍＭのクエン酸、０．２５％のタウロコール酸ナトリウム塩水和物、０．５％のＴＸ−１００）中でホモジナイズした。脳組織ホモジネートを２５，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。得られた上清（脳ライセート）は、蛍光基質４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、総β−ヘキソサミニダーゼ活性を測定するために用いた。タイムコース実験からの脳試料中のｓＡＰＰのレベルを決定するために、４０〜５０ｍｇの脳組織を細かく刻み、１０×容量（１ｍｌ／１００ｍｇ組織）の冷たい組織ホモジナイゼーションバッファー（ＴＨＢ：２５０ｍＭのスクロース、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ＋プロテアーゼ阻害剤）とともに混合した。次に、脳組織をローターステーターホモジナイザーを用いてホモジナイズした。脳ホモジネートをきれいな超遠心分離チューブに移し、予め冷却したＲＰ７０−ＡＴローターに入れ、５０，０００ｒｐｍ（約１００，０００ｇ）にて４℃で１時間遠心分離した。可溶性画分（上清）を、２２Ｃ１１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いるイムノブロットによってｓＡＰＰのレベルを決定するために用いた。
【０１７９】
図６に示すように、薬理シャペロンのＮ−アセチル−グルコサミン−チアゾリン（ＮＧＴ）は、Ｃ５７ＢＬ６マウスで野生型の内在性β−ヘキソサミニダーゼ活性を選択的に増大させる。シャペロンのＮ−アセチル−グルコサミン−チアゾリンは経口的に利用可能であり、脳を透過し、Ｃ５７ＢＬ６マウスの脳で内在性β−ヘキソサミニダーゼ活性を選択的に増大させる。ＮＧＴ処置は、処置して７日以内に、Ｃ５７ＢＬ６マウスの脳で野生型β−ヘキソサミニダーゼ活性（Ａ）および神経栄養性ｓＡＰＰαレベル（Ｂ）を約３倍増大させた。ＮＧＴによる処置は、全長ＡＰＰレベルまたは遺伝子発現には影響がなかった（図示せず）。
【０１８０】
図７に示すデータは以下のように作成された。健康対照線維芽細胞をＮＢ−ＤＡＮＡまたはＩＦＧのいずれかで５日間処理した。細胞を剥離し、遠心分離で回収し、細胞ペレットをＲＩＰＡバッファー（１％のＴＸ１００、０．５％のタウロデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳを含むＴＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）を用いて可溶化した。細胞ライセートをＮｅｕ１に特異的なポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ）を用いてイムノブロットした。
【０１８１】
図７に示すように、薬理シャペロンのｎ−ブチル−２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＢ−ＤＡＮＡ）は、健康個体に由来する線維芽細胞で野生型の内在性ノイラミニダーゼ−１レベルを選択的に増大させる。（Ａ）薬理シャペロンのＮＢ−ＤＡＮＡは、野生型の内在性ノイラミニダーゼ１レベルを最大２倍増大させた。（Ｂ）グルコセレブロシダーゼの薬理シャペロンであるイソファゴミン（ＩＦＧ）は、線維芽細胞で野生型ノイラミニダーゼ１レベルを増大させない。健康個体に由来する線維芽細胞をＮＢ−ＤＡＮＡまたはＩＦＧで５日間処理し、基質のＮＡＮＡ−４−ＭＵを用いて細胞ライセートで酵素活性を測定した。酵素活性は、１時間でタンパク質１ｍｇ当たりに産生された４−ＭＵのｎｍｏｌとして表した。
【０１８２】
図８に示すように、薬理シャペロンのザナミビルは、ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞で野生型の内在性ノイラミニダーゼ３（Ｎｅｕ３）レベルを増大させる。図８に示すデータは以下のように作成された。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を表示したような増加用量のザナミビルまたはビヒクル（ＰＢＳ）で７２時間処理した。処理して７２時間後に細胞を回収し、ＴＢＳ＋２％ＣＨＡＰＳ中で溶解させ、不溶性物質を４０Ｃ（２０，０００×ｒｐｍ、１０分；エッペンドルフ遠心分離機）での遠心分離によって除去した。上清を取り除き、タンパク質をＢＣＡで測定した。等量のタンパク質を４−１２％のＮｕＰａｇｅゲルに充填し、電気泳動で分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、このメンブレンをＮｅｕ３に対するポリクローナル抗体でプロービングした。Ｎｅｕ３陽性バンドをデンシトメトリーで定量した。ブロットをストリッピングし、タンパク質量対照としてのチューブリンに対するモノクローナル抗体でリプロービングした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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