(57)【要約】  本発明は、β−ラクタムを用いた、クラミジア科細菌の感染を治療する方法に関する。本発明は、β−ラクタムを用いた、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる疾患を治療するための方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア科細菌の感染を治療するために使用される、β−ラクタム。
【請求項２】
クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するために使用される、β−ラクタム。
【請求項３】
前記β−ラクタムがアモキシシリンではない、請求項１又は２記載のβ−ラクタム。
【請求項４】
前記β−ラクタムが、アモキシシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、クロキサシリン、セファドロキシル、セフィキシム、イミペネム、イミペネムとセフィキシムとの組合せ、メシリナム、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタムからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項５】
前記β−ラクタムがペニシリンＧである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項６】
前記細菌が持続型である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項７】
前記治療が、前記細菌において、感染性の不可逆的な喪失を導く、請求項１〜６のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項８】
前記治療が、前記細菌の分解を導く、請求項１〜７のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項９】
前記治療が、リソソームと前記細菌との融合を導く、請求項１〜８のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項１０】
前記クラミジア科細菌が、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミドフィラ・キャビエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｃａｖｉａｅ）、クラミドフィラ・ペコルム（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｅｃｏｒｕｍ）、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ）及びクラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から選択される種の細菌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項１１】
前記クラミジア科細菌が、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項１２】
病態が、眼の病態、生殖器の病態、呼吸器の病態、心血管機能障害又は循環機能障害である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項１３】
眼の病態がトラコーマである、請求項１２記載のβ−ラクタム。
【請求項１４】
心血管機能障害がアテロームである、請求項１２記載のβ−ラクタム。
【請求項１５】
循環機能障害がアテロームである、請求項１２記載のβ−ラクタム。
【請求項１６】
生殖器の病態が、鼠径リンパ肉芽腫、尿道炎、睾丸副睾丸炎、子宮頚膣炎、子宮頚炎、子宮頚内膜炎、子宮内膜炎、肝周囲炎及び卵管炎からなる群から選択される、請求項１２記載のβ−ラクタム。
【請求項１７】
前記生殖器の病態が卵管炎である、請求項１６記載のβ−ラクタム。
【請求項１８】
β−ラクタムが別の治療剤とともに投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【請求項１９】
前記別の治療剤が、別の感染性因子により引き起こされる感染症及び／又は病態を治療するための治療剤である、請求項１８記載のβ−ラクタム。
【請求項２０】
前記別の感染性因子が、原生動物（とりわけ、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ））；真菌（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））；嫌気性細菌（バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ））；ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）などの他の細菌；及びウイルス、特に単純ヘルペスウイルスの感染から選択される、請求項１９記載のβ−ラクタム。
【請求項２１】
前記別の感染性因子が、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）又はトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である、請求項２０記載のβ−ラクタム。
【請求項２２】
前記別の治療剤が、セフトリアキソン、セフィキシム、スピラマイシン、スペクチノマイシン、アジスロマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、メトロニダゾール、チニダゾール及びニモラゾールからなる群から選択される、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のβ−ラクタム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（導入）
クラミジア科は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）の２つの属を含み、各々の属は、複数の種を含む；各々の種は、種々の生物型及び血清型からなる。これらの種は各々、ヒト及び動物において、一連の重篤な病態を引き起こす。
【背景技術】
【０００２】
クラミジア科の細菌は、グラム陰性である。これらは、感染した真核細胞内の寄生体胞中のみで成長し、増殖するので、「偏性細胞内寄生性（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｉｒｅｓ  ｓｔｒｉｃｔｅｓ）」として知られる。成長の間、クラミジア科の細菌は２つの形態をとる：
−  感染形態であり分裂しない、基本小体（ＥＢ）、及び
−  非感染性、偏性細胞内寄生性であり、二分裂により分裂する、網様体（ＲＢ）。
【０００３】
ＥＢは、小胞内で宿主細胞に侵入する。複数のＥＢが同一細胞に感染する場合には、中心体で小胞が会合し、融合して封入体を形成する。感染から５〜１２時間後に、ＥＢはＲＢに分化し、活発に増殖する。３０〜４０時間後、ＲＢはＥＢに変換する；次いで、封入体及び宿主細胞は溶解し、子孫の細菌を放出して、隣接する細胞に感染する。これらパラメーターは全て、実験条件に従って、１つの血清型及び細菌種と次のものとで異なり得る（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋ．Ａ．＆Ｔ．Ｈａｃｋｓｔａｄｔ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １８：２２１−４５，２００２）。
【０００４】
その成長サイクルの間、細菌は、宿主細胞で生存するために多数の戦略を展開する。クラミジア科の細菌は、とりわけ、細胞外シグナルにより誘起されるアポトーシスを阻害し、細菌封入体とリソソームとの融合を阻害し、空胞（ｖａｃｕｏｌｅ）を小胞輸送させてその増殖を可能にし、且つ免疫系への抗原提示に関与する、主要組織適合性複合体分子に対する転写因子を含む多数の真核生物タンパク質の分解に関与するキープロテアーゼであるクラミジアプロテアーゼ／プロテアソーム様活性因子（ＣＰＡＦ）を細胞質に注入する。
【０００５】
連続した細菌サイクルの間に展開されるこれらメカニズムには、持続性（ｐｅｒｓｉｓｔａｎｃｅ）の現象が付加される。ある種の抗生物質又はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の存在などの、細胞環境における特定のストレスに応答して、細菌は、自己の細菌サイクル及び増殖メカニズムを停止し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養できない持続的な生存体になる。持続性により、病原体と宿主との高レベルの相互作用が説明され、細菌が数ヶ月間、生物中で生存し続けることが可能となる。Ｉｎ  ｖｉｖｏで持続性を実証することは非常に困難であるが、複数の研究により、クラミジア科の細菌が、生殖管、結膜、血管組織などの組織内で数年間存在でき、それ故、反復性の感染及び慢性炎症が引き起こされることが示唆されている（Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５８（４）：６８６−９９，１９９４；Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５（２）：１３１−９，２００９）。
【０００６】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、２つの生物型（トラコーマ及びリンパ肉芽腫）及び１８の血清型（Ａ〜Ｌ）にさらに分割され、世界中における広範な疾患にとりわけ関与している。
【０００７】
例えば、発展途上国において、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｄ〜Ｋは、細菌起源の性感染症の圧倒的な主因である。生物型ＬＧＶは、もう一つの性感染症である鼠径リンパ肉芽腫（デュランドニコラファブル病（Ｄｕｒａｎｄ−Ｎｉｃｏｌａｓ−Ｆａｖｒｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）としても知られる）に関与することから、その名が付けられている。
【０００８】
女性において、生殖器のクラミジアは、多くの場合、無症状性であり、結果として、未治療のままとなる。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、全てのレベルの生殖器に影響を及ぼし、子宮頸内膜炎を引き起こし得、そこで感染の貯蔵庫となる。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、尿道炎及び子宮内膜炎も引き起こし得る。感染に起因する慢性炎症は、卵管の全体的又は部分的な閉塞の原因である（卵管炎）。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、典型的又は非典型的な卵管炎の最も一般的な原因である。卵管炎は、女性において、卵管性不妊症及び子宮外妊娠の主要なリスクファクターである。卵管への攻撃は、女性の生殖能力に関して、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の感染後数ヶ月間、影響をもたらすことに留意すべきである。従って、受精及び受精卵の通過が可能な期間が存在する。その後、卵子は、汚染された子宮腔に到達する。この場合、絨毛膜の炎症に起因する、着床不全、子宮内での成長遅延及び早産が観察される。
【０００９】
さらに、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ａ〜Ｃは、後天盲に関与する、眼感染症トラコーマを引き起こす。一次感染は、最初は後遺症のない粘液膿性結膜炎の原因である。反復性又は持続性の感染エピソードは、上皮下の濾胞の存在及びその後の上眼瞼の瞼結膜の乳頭肥大により特徴付けられる慢性炎症の原因である。この結膜組織の感染は、数年間にわたって進行し得、眼の方向へと睫が偏位し、角膜の刺激（逆睫）を引き起こし、延いては失明の原因となる混濁を導く。現在まで、再感染後又は持続後の細菌の存在に起因する慢性炎症が、クラミジア後遺症の原因である。持続性は、結膜と直接接触する細胞、角膜上皮細胞又は角膜輪部幹細胞が感染することにより説明がつく。しかし、角膜は完全に無血管であるため、免疫細胞にアクセスすることができず、持続性が促進され得る。この古典的な疾患には、８４００万人が罹患しており（世界の最貧国における大多数）、このうち８００万人が視覚欠損を有しており、この疾患は、２００７年、世界において、最も予防可能な失明原因であった。この疾患は、世界保健機関による絶滅プログラムの対象である。
【００１０】
代謝的に活性で、それ故、治療感受性の最も高いＲＢに、脂溶性細胞膜を通って達することができる抗生物質で、クラミジア科感染症は一般に治療される。テトラサイクリン（ドキシサイクリン及びテトラサイクリン）、キノロン（オフロキサシン及びレボフロキサシン）及びマクロライド（エリスロマイシン及びアジスロマイシン）は、クラミジア科感染症において最も一般的に使用される抗生物質ファミリーの３種である。それらは、とりわけ単純性生殖器感染症の場合に、感染組織におけるクラミジア科細菌の排除に非常に効果的である。それにも関わらず、患者が再感染しない場合又は抗生物質治療を止めない場合の有効な治癒率は、わずか７０％〜８０％である。これは、現在の抗クラミジア科抗生物質療法が、完全に効果的でないことを実証する傾向にある。特定の患者内でのこれらの治療の無効性は、少なくとも部分的には、持続型（ｆｏｒｍｅｓ  ｐｅｒｓｉｓｔａｎｔｅｓ）の細菌の存在に起因することが示唆される。
【００１１】
現在提案されている治療に対して持続型の細菌が非感受性であるという仮説は、殺菌性抗生物質を使用した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施された複数の研究により支持される。これらの研究において、アジスロマイシンのみが、持続型のクラミジアの絶滅に有効であるようだ。それにも関わらず、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施された研究では、持続型のクラミジアに対するアジスロマイシンの破壊効果に反して、アジスロマイシンで治療された患者の子宮頸及び男性尿管の生検での電子顕微鏡検査法により、持続性の細菌体を想起させる、異常な形態の細菌が実証された（Ｂｒａｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｕｒ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．１５（５）：４０５−９，２００１；Ｋａｔｚ＆Ｆｏｒｔｅｎｂｅｒｒｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｉｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１９９８）。
【００１２】
現在、ワクチン接種が、クラミジア科感染症を制御する最良の手段と目されている。それにも関わらず、抗クラミジアワクチンの研究は、効果的な保護的免疫と、この反応と関連する病態とのバランスを必要とする複雑な作業である。さらに、持続型のクラミジア科は、免疫系により検出され得ないので、ワクチンによりこれを絶滅できる可能性は極めて低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、クラミジア科感染症、特に持続性のクラミジア科感染症に対する効果的な治療が必要とされている。
【００１４】
本発明者らは、驚くべき方法により、持続型のクラミジア科が、β−ラクタムに感受性を示し、それ故、β−ラクタムをクラミジア症の治療に使用できることを発見した。
【００１５】
（発明の説明）
現在まで、β−ラクタム、特にペニシリンＧが、クラミジア科の持続性を誘起することが通説となっている。ペニシリンＧでの治療は、研究所において、持続性を誘導するために使用される好ましい手段の一つでさえあった（Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８（４）：６８６−６９９，１９９４；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１９０，２００６；Ｇｏｅｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７４（８）：４８０１−８，２００６；Ｓｋｉｌｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７７２３，２００９）。１９７０年代、ペニシリンＧで感染細胞を治療すると、ＲＢ分裂に影響を及ぼし、見かけ上持続性の細菌表現型の生成が導かれることが観察され、このモデルが開発された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｍａｎｉｒｅ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １０１：２７８−２８５，１９７０；Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆ．Ｂ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ３：３３３−３４１，１９７１；Ｈｏｗ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １５：３９９−４０４，１９８５；Ｋｕｏ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １２：８０−８３，１９７７；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：１９０，２００８；Ｓｋｉｌｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７７２３，２００９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｗ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈｏｂｓｏｎ，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３：４９−５６，１９７７；Ｌａｍｂｄｅｎ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：２５７３−２５７８，２００６）。しかし、同一の研究では、β−ラクタムでの治療は、細菌封入体の増殖動態に影響を及ぼさないが、「古典的な」持続性細菌よりも大きな（５〜１０μｍ）異常な細菌の形成を導くことも多くの場合示された。さらに、他の研究では、ペニシリンＧの除去は、感染性を回復しないことが示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｗ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈｏｂｓｏｎ，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３：４９−５６，１９７７；Ｗｏｌｆ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：２３７９−２３８５，２０００；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：１０９９−１１０８，２００５）。このような特徴は、持続性の定義と一致していないが、それにも関わらず、β−ラクタムでの抗生物質療法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細菌の持続性を導き得ると想定されている。結果として、β−ラクタムを用いた、この抗生物質療法は推奨されなかった。
【００１６】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）において持続性を誘起するペニシリンＧの役割と一致して、実施された臨床試験では、β−ラクタム治療活性が実証されなかった。著者らは、ペニシリンＧ及び他のβ−ラクタムは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に対して何ら効果を有さないとさえ結論付けた（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ  ６２：２３５−２３９，１９８６；Ｒｉｄｇｗａｙ  Ｇ．Ｌ．，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４０（３）：３１１−４，１９９７）。これは、今日まで一般に受け入れられている見解である。
【００１７】
しかし、本発明者らは、ペニシリンＧが、クラミジア科に持続性を誘起させることなく、実際にその分解を導くことを初めて実証する。特に、ペニシリンＧで治療されたクラミジア科の細菌は、その抗生物質が培地から除去された後でさえ、いずれの感染性も失う。この治療効果は、ペニシリンＧに限定されず、少なくとも１つのβ−ラクタムグループで観察され得る。この治療効果は、特定の細菌種に制限されず、クラミジア科のいずれの細菌でも観察され得る。
【００１８】
従って、本発明は、クラミジア科細菌の感染をβ−ラクタムで治療する方法に関する。本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態をβ−ラクタムで治療する方法にも関する。本発明の好ましい側面では、前記細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）種又はクラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）種の細菌である。本発明の特に好ましい側面では、前記細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種の細菌である。
【００１９】
別の側面では、本発明は、クラミジア科細菌による感染を治療するための薬剤を製造するためのβ−ラクタムの使用に関する。さらに別の側面では、本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するための薬剤を製造するためのβ−ラクタムの使用に関する。本発明の好ましい側面では、前記細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）種又はクラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）種の細菌である。本発明の特に好ましい側面では、前記細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種の細菌である。
【００２０】
本発明は、クラミジア科細菌による感染の治療に使用するためのβ−ラクタムにも関する。本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態の治療に使用するためのβ−ラクタムにも関する。本発明の好ましい側面では、前記細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）種又はクラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）種の細菌である。本発明の特に好ましい側面では、前記細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種の細菌である。
【００２１】
本発明との関連で、「β−ラクタム」とは、分子構造中にβ−ラクタム環を含む抗生物質のいずれをも意味する。従って、本発明のβ−ラクタムには、ペニシリン誘導体、並びにセファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、及びβ−ラクタマーゼ阻害剤が含まれる。特に、本発明のβ−ラクタムは、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、アンピシリン（ペニシリンＡ）、ベンザチンベンジルペニシリン、メチシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、コ−アモキシクラブ（アモキシシリン＋クラブラン酸）、ピペラシリン、チカルシリン、アズロシリン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、クロキサシリン、セファドロキシル、セフィキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフピロム、イミペネム、シラスタチンとイミペネムとの組合せ、イミペネムとセフィキシムとの組合せ、メロペネム、メシリナム、エルタペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、タゾバクタム又はスルバクタムであってよい。本発明の好ましい側面において、前記β−ラクタムは、アモキシシリンではない。本発明のさらに好ましい側面では、前記β−ラクタムは、アモキシシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、クロキサシリン、セファドロキシル、セフィキシム、イミペネム、イミペネムとセフィキシムとの組合せ、メシリナム、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタムからなる群から選択される。さらにより好ましい側面において、前記β−ラクタムは、ペニシリンＧである。
【００２２】
従来技術は、ペニシリンＧが持続性を引き起こす因子であると教示するが、本発明者らは、ペニシリンＧでの治療により、細菌感染性の不可逆的な喪失が導かれることを示す。特に、ペニシリンＧでの治療により、クラミジア科の分解が導かれる。感染細胞をペニシリンＧで治療した場合には、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現が検出されず、感染細胞が外部のアポトーシス刺激に対して感受性を示すようになる。
【００２３】
従って、さらに特定の側面では、本発明は、クラミジア科細菌による感染を治療するため、又はクラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するための薬剤を製造するためのペニシリンＧの使用であって、前記治療が、前記細菌における感染性の不可逆的な喪失を導くことを特徴とする、使用に関する。この感染性は、当業者が発揮することのできる全ての適切な方法により測定され得る。これらの方法は、既に、従来技術で記載されており（例えば、Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２：ｅ４５，２００６を参照されたい）、従って、本明細書において前記方法を詳述する必要はない；このような方法の一例を実施例で提供する。
【００２４】
さらに、本発明のペニシリンＧでの治療は、リソソームとの融合を介した細菌の分解を導く。従って、本発明の別の特定の側面は、クラミジア科細菌による感染を治療するため、又はクラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するための薬剤を製造するためのペニシリンＧの使用であって、前記治療が、前記細菌の分解を導くことを特徴とする、使用に関する。本発明のさらなる特定の側面では、前記細菌の分解は、細菌とリソソームとの融合に起因する。
【００２５】
本発明者らは、ペニシリンＧが、クラミジア科細菌の分解を誘起できることを示す。本発明との関連で、「クラミジア科」とは、Ｂｕｓｈ＆Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１（Ｐｔ  １）：２０３−２０，２００１で定義されるように、クラミジア属及びクラミドフィラ属の２つの属から構成される分類単位を意味する。同様に、本発明との関連で、「クラミジア属」とは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種、クラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ）種及びクラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）種を含む分類単位を意味し、「クラミドフィラ属」とは、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）種、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）種、クラミドフィラ・キャビエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｃａｖｉａｅ）種、クラミドフィラ・ペコルム（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｅｃｏｒｕｍ）種、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ）種及びクラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）種を含む分類単位を意味する（Ｂｕｓｈ＆Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１（Ｐｔ  １）：２０３−２０，２００１）。これらの種が、別個の宿主スペクトルを有することは当業者に周知である：例えば、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）及びクラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はヒト感染に関与し、クラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ）はブタ感染に、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）は反芻動物感染に関与する。本発明は、特定の細菌種に制限されるものではなく、クラミジア科のいずれの種にも適用でき、特に、上記のものに適用できる。
【００２６】
より具体的には、本発明者らは、ペニシリンＧが、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の分解を、その生物型又はさらにはその血清型に関わらず、誘起できることを示す。本発明との関連で、「クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）」とは、トラコーマ生物型の細菌、並びに鼠径リンパ肉芽腫生物型の細菌を意味する。従って、同様に、本発明は、特定の血清型に制限されず、１８の公知の血清型（Ａ〜Ｌ）のいずれかによる感染を治療するために使用され得る。特に、本発明は、血清型Ａ〜Ｃ、並びに血清型Ｄ〜Ｋ及びＬ１〜Ｌ３の１つによる感染を治療するために使用され得る。
【００２７】
「クラミジア科細菌の感染」及び「クラミジア科感染症」という表現は、患者又は動物の体の少なくとも１つの細胞における、前記クラミジア科細菌の存在を意味する。感染は、生殖器感染、眼感染又は肺感染であってよい；内皮細胞又は関節などの他の部位に影響を及ぼすこともあり得る。前記細菌は、ＥＢ又はＲＢ形態で存在し得る；持続型でも存在し得る。本発明のさらに特定の側面において、細菌は、患者体内で持続型で存在する。
【００２８】
クラミジア科細菌に感染しても、必ずしも、症状は現れないことが公知である。例えば、大半の子宮頚部の感染は無症状性であるか、又は軽度の症状が現れるに過ぎないと推定されている（Ｐａａｖｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｅｇｇｅｒｔ−Ｋｒｕｓｅ，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  ５（５）：４３３−４７，１９９９）。それにも関わらず、クラミジア科細菌の存在は、本明細書中で説明の必要がない当業者に周知の全ての手段により検出され得る。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの核酸増幅に基づく診断試験の使用は、間違いなくクラミジア科細菌に感染した人と感染していない人とを区別できると言及すれば足りる。さらに、１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡ発現の測定は、細菌が代謝的に活性であり、それ故生存することを立証する。クラミジア科感染症を研究するためのこれらの試験は、研究所で一般に使用されており、それ故、本明細書中で詳述することはない（Ｍｐｉｇａ  ａｎｄ  Ｒａｖａｏａｒｉｎｏｒｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．１６１（１）：９−１９，２００６）。
【００２９】
従って、本発明は、特定の側面において、クラミジア科を検出する工程を含む、クラミジア科感染症又はクラミジア科感染症により引き起こされる病態をβ−ラクタムで治療する方法に関する。とりわけ、前記検出工程は、細菌の核酸をＰＣＲ、ＬＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより増幅することを含む。
【００３０】
クラミジア科細菌種が、別個の宿主スペクトルを有することは当業者に周知である。同様に、生物は、前記種の各々に感染することも当業者に公知である：例えば、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）及びクラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はヒト感染に関与し、クラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ）はブタ感染に、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）は反芻動物感染に関与する。従って、本発明は、ヒト及び動物における、クラミジア科により引き起こされる感染に適用され得る。同様に、本発明では、ヒト及び動物において、クラミジア科感染症をβ−ラクタムで治療することが可能である。
【００３１】
クラミジア科により引き起こされる感染症の大多数は無症状性であるが、それにも関わらず、前記感染は、患者又は動物において重篤な病態を引き起こす。本発明の関連で、「クラミジア科感染症により引き起こされる病態」という表現は、クラミジア科細菌の感染により直接的に又は間接的に誘発される病態のいずれをも意味する。
【００３２】
本発明の関連で、クラミジア科感染症により引き起こされる病態には、クラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミドフィラ・キャビエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｃａｖｉａｅ）、クラミドフィラ・ペコルム（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｅｃｏｒｕｍ）及びクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ）により動物において引き起こされる病態が含まれる。従って、本発明の関連で、クラミジア科感染症により引き起こされる前記病態には、とりわけ、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）により引き起こされる流産及び新生児死亡、並びにクラミジア・スイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ）により引き起こされる結膜炎、角結膜炎、化膿性鼻炎、腸炎、気管支肺炎及び肺炎が含まれる。
【００３３】
ヒトにおいて、これらの病態は、特に、生殖器の病態又は眼の病態であり得るが、これらはまた、呼吸器の病態でもあり得る。それ故、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染は、肺炎の形態を引き起こし、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）は、オウム病に関与することが公知である。また、クラミジア科細菌による感染は生物全体に広がっており、心血管機能障害及び循環機能障害（アテローム）などの多数の非定型感染症及び病態を引き起こすことが公知である。クラミジア科細菌により引き起こされる心血管機能障害及び循環機能障害のうち、それぞれ、弁狭窄及びアテロームを挙げてよい。さらに、前記クラミジア科細菌は、重度の関節炎も引き起こし得る。
【００３４】
しかし、本発明の好ましい側面において、クラミジアの感染により引き起こされる病態は、眼の病態又は生殖器の病態である。本発明のさらに特に好ましい側面では、クラミジアの感染により引き起こされる眼の病態としてトラコーマが挙げられる。さらに特に好ましい別の側面では、クラミジアにより引き起こされる生殖器の病態として、鼠径リンパ肉芽腫（デュランドニコラファブル病）が挙げられる。本発明のさらに特に好ましい別の側面では、クラミジアにより引き起こされるヒト生殖器の病態として、男性の妊性の低下を導き得る、尿道炎及び睾丸副睾丸炎などの病態が挙げられる。本発明のさらに特に好ましいさらに別の側面では、女性におけるクラミジアの感染は、数ある中でも、卵管を全体的に閉塞する卵管留膿腫及び卵管留水腫の形成へと進行し得る上部生殖管感染症（特に卵管炎）などの合併症を引き起こし得る、生殖器の病態（子宮頚膣炎（ｃｅｒｖｉｃｏ−ｖａｇｉｎｉｔｅｓ）、子宮頚炎、子宮頚内膜炎、尿道炎、子宮内膜炎又は肝周囲炎など）を引き起こす。従って、卵管炎は、女性において、卵管性不妊症及び子宮外妊娠の主要なリスクファクターである。
【００３５】
ドキシサイクリンのみが、卵管炎の部分的な改善を提供するのに対し、本発明のペニシリンＧでの治療は、生殖器のクラミジア感染により引き起こされる卵管留水腫の発現を予防する。本発明のペニシリンＧでの治療は、クラミジア感染に起因する組織ダメージを予防することができる。従って、本発明のペニシリンＧでの前記治療は、ヒトにおける現在の標準治療であるドキシサイクリンでの治療と比較して、非常に効果的であることを実証する。
【００３６】
生殖器の病態は、クラミジア感染単独により引き起こされ得る；しかし、それらはまた、クラミジア感染と、別の感染性生物の感染との組合せによっても引き起こされ得る。特に、前記病態を引き起こす可能性のある感染性生物は、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を含む原生動物；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を含む真菌；例えば、細菌性膣炎の間に増殖する嫌気性細菌［バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）］；ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）などの他の細菌；及び単純ヘルペスウイルスなどのウイルス感染である。本発明のより特定の側面では、上記のような生殖器の病態を引き起こし得る感染性生物は、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）である。本発明のより特定の別の側面では、上記のような生殖器の病態を引き起こし得る感染性生物は、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である。
【００３７】
従って、本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる生殖器の病態をβ−ラクタムで治療する方法であって、前記β−ラクタムが、別の治療剤とともに投与されることを特徴とする、方法にも関する。本発明の特定の側面では、前記の別の治療剤は、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）による感染の治療剤から選択される。本発明の特定の別の側面では、前記の別の治療剤は、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）による感染の治療剤から選択される。前記の別の治療剤は、セフトリアキソン、セフィキシム、スピラマイシン、スペクチノマイシン、アジスロマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、メトロニダゾール、チニダゾール及びニモラゾールからなる群から特に選択される。
【００３８】
本発明は、活性成分としてβ−ラクタムを含む医薬組成物にも関する。前記β−ラクタムは、単独で、又は上記のような別の治療剤と組み合わせて使用され得る。
【００３９】
これらの組成物は、経口、経直腸若しくは非経口経路により、又は皮膚及び粘膜上への局所適用により局所的に投与され得るが、好ましい投与経路は経口である。
【００４０】
それらは、固体又は液体であってよく、ヒト用の薬で一般に使用される剤形、例えば、錠剤、コーティングされたもの又は非コーティングのもの、ゼラチンカプセル剤、顆粒剤、坐剤、注射製剤、点眼薬、ポマード、クリーム及びゲルなどで提供され得、これらは常法に従って調製される。活性成分は、これらの医薬組成物で一般に使用される賦形剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性のビヒクル、動物性又は植物性の油、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤及び乳化剤、並びに保存料とともに組み込まれてよい。これらの組成物は、適切なビヒクル、例えば、非発熱性滅菌水に使用直前に溶解することを意図した粉末形態で提供されてもよい。
【００４１】
投与量は、治療される疾患、問題の対象、投与経路及び検討される化合物に応じて変動し得る。投与量は、例えば、成体において、経口投与により１日当たり５０μｇと３００ｍｇとの間であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ペニシリンＧでの治療は、異常な形態のクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を含む封入体の成長を停止させない。ＨｅＬａ細胞にクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｌ２を感染させ、ＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）又はゲンタマイシン（２５μｇ／Ｌ）で処理した。感染後、種々の時間において［感染後の時間：ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｈｐｉ）］、細胞を固定し、クラミジアｓｐ．に対する抗体（オリジナル図面では緑色）及びヘキスト（オリジナル図面では青色）で染色した。ペニシリンＧで処理したＨｅＬａ感染細胞は、ＩＦＮ−γ処理の間に形成されるものとは表現型の上でかなり異なって増殖する、異常な細菌体を有する。ペニシリンＧで形成される細菌体は、「古典的な」持続性細菌体とはかなり異なる。スケール：１０μｍ。各実験は、少なくとも３回再現した。
【図２】ペニシリンＧでの治療は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）において、感染性の不可逆的な喪失を導く。ＨｅＬａ細胞にクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）Ｌ２血清型を１封入体形成単位（ＩＦＵ）で感染させた。３ｈｐｉにおいて、３つの同一バッチに区別し、「ペニシリンＧ」のバッチ（黒色棒グラフ）及び「復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）」バッチ（灰色棒グラフ）には、ペニシリンＧを１００Ｕ／ｍＬの濃度で添加したが、コントロールバッチ（白色棒グラフ）には添加しなかった。２４ｈｐｉにおいて、復帰グループの培地からペニシリンＧを除去した。４８ｈｐｉ又は１００ｈｐｉにおいて、上清及び細胞を集め、−８０℃で保存した。次いで、新鮮なＨｅＬａ細胞培養物を細胞抽出物とともに（左）又は上清とともに（右）１時間インキュベートし、シクロヘキシミドとともにインキュベートし、２４時間後に固定した。核及び封入体を染色し、１ｍＬ当たりのＩＦＵ数を計算するために計測した。コントロール条件下では、有意な感染能が検出されたのに対し、ペニシリンＧでの処理後には、復帰段階にあるか否かに関わらず、いずれの感染能も示されなかった。この結果は、ペニシリンＧが持続性を誘起しないことを強力に証明する。また、この結果は、クラミジアの致死性を始めて指摘するものでもある。＊：他の条件と有意に異なる（ｐ＜０．０５）■：０と有意に異なる（ｐ＜０．０５）●：０と有意に異ならない
【図３】ペニシリンＧでの治療は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の宿主細胞アポトーシスに対する制御の喪失を導く。Ａ：ＨｅＬａ細胞にクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を感染させ、３ｈｐｉにおいて、ペニシリンＧで処理するか、又は処理しなかった。２１ｈｐｉにおいて、スタウロスポリンを培地に添加した。４８ｈｐｉにおいて細胞を固定し、クラミジアｓｐ．に対する抗体（オリジナル図面では緑色）及びヘキスト（オリジナル図面では青色）で染色した。Ｂ：封入体と関連する、正常核又はアポトーシス核を計測し、アポトーシス感染細胞率を計算した。スケール：１０μｍ。＊：有意に異なる（ｐ＝０．０１）
【図４】ペニシリンＧでの治療は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ発現の欠如を導く。ＨｅＬａ細胞にクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）Ｌ２血清型を感染させ、３ｈｐｉにおいて、ペニシリンＧで処理するか、又は処理しなかった。１００ｈｐｉにおいて、細胞を集め、ＤＮＡの汚染を避けるためにＲＮＡを慎重に抽出した。単離したＲＮＡの半分を逆転写に使用した。細菌の活性を調査し、ｃＤＮＡの質及び量を検証するために、１６Ｓ（細菌）及び１８Ｓ（真核生物）ｒＲＮＡに対するプライマーを用いてＰＣＲによりＲＮＡ及びｃＤＮＡを増幅した。ＲＮＡのＰＣＲは、ＤＮＡ汚染がないことを検証するために使用する。それはまた、ＰＣＲにおいて汚染がないことも示す。ペニシリンＧで処理した感染細胞は、１８Ｓ  ＲＮＡを発現するが、１６Ｓ  ＲＮＡを発現しておらず、これにより、異常な細菌形態は、生存していないことが示される。
【図５】ペニシリンＧでの治療は、異常な封入体へのリソソームの侵入を導く。ＨｅＬａ細胞にクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を感染させ、２４ｈｐｉにおいて、固定及び染色するか（Ａ）、又はすぐに観察するか（Ｂ及びＣ）のいずれかを行った。Ａ：ヘキスト染色（オリジナル図面では青色）、抗クラミジアｓｐ．（オリジナル図面では緑色）及び抗カテプシンＤ（オリジナル図面では赤色）。カテプシンＤは、異常な細菌体に顕著に存在する。スケール：１０μｍ。Ｂ：細胞をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブとともに３０分間インキュベートした。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブは、複雑な膜ネットワークで異常な封入体に特に局在する。詳細な検査により、異常な封入体中に非常に明るい点が示され、これにより、異常な封入体にリソソームが侵入したことが示唆される。鏃：封入体膜、矢印：ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブを多く含むコンパートメント。ＤＩＣ：微分干渉コントラスト。スケール：１０μｍ。Ｃ：高速スキャナを備えた共焦点顕微鏡を有するビデオ顕微鏡（タイムラプス）。灰色は微分干渉コントラスト；赤色（オリジナル図面）はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブ。封入体近傍のリソソーム（矢印）がこの異常な構造に侵入し、内部に留まっているようである。
【図６】クラミジアに対するペニシリンＧの効果は、クラミジアの宿主細胞タイプ、血清型、生物型又は種とは無関係である。単球／マクロファージ腫瘍細胞株ＴＨＰ−１、子宮内膜腫瘍細胞株ＲＬ９５−２、及び子宮頚部腫瘍細胞株ＨｅＬａに、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＬＧＶ生物型の血清型Ｌ２、トラコーマ生物型の血清型Ｄ又はクラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）を感染させ、ペニシリンＧで処理したところ（３ｈｐｉ）、異常な封入体を呈した。オリジナル図面で青色；ヘキスト、オリジナル図面で緑色；抗クラミジアｓｐ．。２４ｈｐｉ（ＲＬ９５−２／クラミジアＬ２；ＨｅＬａ／クラミジア−Ｄ；ＨｅＬａ／Ｃ．ムリダルム）又は４８ｈｐｉ（ＴＨＰ−１／クラミジア−Ｌ２；ＴＨＰ−１／クラミジア−Ｄ）において画像を得た。スケール：１０μｍ。
【図７】ペニシリンＧでの治療は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による宿主細胞アポトーシスに対する制御の非常に急速な喪失を導く。ＨｅＬａ細胞を、ペニシリンＧの不在下（白色棒グラフ）、又は２ｈｐｉ（淡灰色棒グラフ）若しくは２９ｈｐｉ（濃灰色棒グラフ）で添加されるペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）の存在下、感染させた。３１ｈｐｉにおいてスタウロスポリンを添加した。以下に記載のように、細胞を固定し観察した。封入体と関連する、アポトーシス核又は正常核を計測し、アポトーシス感染細胞率を測定した。２時間、ペニシリンＧで処理することにより、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による宿主細胞アポトーシスに対する制御の喪失が誘起される。＊：有意に異なる（ｐ＜０．０５）
【図８】低濃度のペニシリンＧは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）非感染状態と同一の状態を誘起する。ＨｅＬａ細胞にクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｌ２を１ＩＦＵで感染させた。３ｈｐｉにおいて、ペニシリンＧ（−）サンプル及び復帰（＋）サンプルに、ペニシリンＧを１、１０又は１００Ｕ／ｍＬの濃度で添加した。２４ｈｐｉにおいて、復帰グループ（＋）の培地からペニシリンＧを除去した。４８ｈｐｉ又は１００ｈｐｉにおいて、上清及び細胞を集め、−８０℃で保存した。スライド上で増殖させたＨｅＬａ細胞を細胞抽出物（左）又は上清（右）とともに１時間インキュベートし、シクロヘキシミドで処理し、２４時間後に固定した。核及び封入体を染色し、１ｍＬ当たりのＩＦＵ数を決定するために計測した。コントロール条件下（未処理の細胞由来の子孫細菌）では、有意な感染が検出されたのに対し、持続的又は一時的な方法でペニシリンＧ処理した細胞から集めた細菌ではいずれの再感染も観察されなかった。＊：他の条件と有意に異なる（ｐ＜０．０５）■：０と有意に異なる（ｐ＜０．０５）●：０と有意に異ならない
【図９】カテプシンＤは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の生物型及び宿主細胞タイプとは無関係に、異常形態のクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に局在する。細胞を感染させ、３ｈｐｉにおいてペニシリンＧで処理した。２４ｈｐｉにおいて、細胞を固定し、抗クラミジアｓｐ．抗体（オリジナル図面では緑色）、及び抗カテプシンＤ抗体（オリジナル図面では赤色）、並びにヘキスト（オリジナル図面では青色）で染色した。
【図１０】クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）でのＣ５７Ｂ１／６マウスの感染後における、卵管留水腫の進行に対するペニシリンＧの治療効果。マウスを経膣経路により１０７ＩＦＵのクラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）に感染させた。１０日後、マウスグループの１つには抗生物質を受けさせず（未処理）、別のグループには経口により５ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンで処理し、最後のグループには経口により５ｍｇ／ｍＬのペニシリンＧを受けさせた。２０日後に抗生物質での処理を止め、さらに６０日間マウスを隔離した。次いで、マウスを屠殺し、生殖管の外観を分析し、卵管留水腫の存在（矢印）を探索した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４３】
１．材料
１．１．抗体及び試薬
培地（ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ、ＲＰＭＩ−１６４０）、ＦＣＳ及びゲンタマイシン溶液はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。
【００４４】
組換えヒトＩＦＮ−γ、シクロヘキシミド、３−メチル−アデニン（３−ＭＡ）、スタウロスポリン及びペニシリンＧは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から得た。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。クラミジア属に対する２つのＦＩＴＣ標識マウスモノクローナル抗体混合物はＡｒｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｏｆｔ（Ｖａｒｉｌｈｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。カテプシンＤに対するウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）及びテキサスレッド標識ヤギ抗ウサギ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。コントロールウサギＩｇＧは、プロテインＡ−セファロースを用いて、ウサギ血清から精製した。
【００４５】
１．２．細胞培養及び細菌株
全ての細胞タイプ（ＨｅＬａ、ＲＬ−９５．２、ＴＨＰ−１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）の推奨に従って、維持のために７５ｃｍ２培養フラスコ中で培養し、実験のために、カバーのある１２若しくは２４ウェルプレート、又はＬａｂ−Ｔｅｋ（商標）培養チャンバ中で培養した。培地中、０．２５μＭのＰＭＡを使用して、ＴＨＰ−１細胞のマクロファージへの分化を達成させた。
【００４６】
細菌感染性に対するペニシリンＧの効果が、細菌株又は血清型に依存するかどうかを検証するために、ＡＴＣＣ血清型Ｌ２及びＣ．トラコマチス血清型Ｄ［Ｄｒ．ｄｅ  Ｂａｒｂｅｙｒａｃ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅａｕｘ  ＩＩ，Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）によりご提供頂いたもの］を使用した。Ｃ．ムリダルムは、Ｄｒ．Ｒｏｇｅｒ  Ｒａｎｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｋａｎｓａｓ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｒｏｃｋ，ＡＲ，ＵＳＡ）から得た。細菌は、上記のように、ＨｅＬａ細胞においてルーチンにより増殖させ、使用前まで−８０℃で保存した（Ｓｃｉｄｍｏｒｅ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１：Ｕｎｉｔ  １１Ａ  １１，２００５））。封入体形成単位（ＩＦＵ）数は、上記のように（Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２：ｅ４５，２００６）、免疫蛍光検査により測定した。
【００４７】
２．方法
２．１．感染及びペニシリンＧでの処理
クラミジア感染細胞に対するペニシリンＧの効果を調べるために、宿主細胞を最大７０％コンフルエントまで抗生物質を添加せずに培養し、次いで、Ｃ．トラコマチス株Ｌ２若しくはＤ、又はＣ．ムリダルム（１ＩＦＵ）に感染させた。感染は、遠心分離しながら、３７℃で９０分間実施し、それに続いて、細胞外の細菌を洗浄した。３ｈｐｉにおいて、洗浄後、２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン又は１〜１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧのいずれかを含む培地に培地交換した。ペニシリンＧでの処理後一定の間隔で、共焦点顕微鏡検査のために調製するために４％中性緩衝ＰＦＡ中で培養物を３０分間固定するか、又は以前に記載された方法（Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２：ｅ４５，２００６）に従って子孫細菌の感染性を測定するために培養物を集めるかのいずれかを行った。
【００４８】
２．２．ＩＦＮ−γでの処理により誘起される持続性
上記のように（Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２：ｅ４５，２００６）、スライド上に単層で培養したＨｅＬａ細胞に、１ＩＦＵで血清型Ｌ２を感染させた。感染３時間後に、培地を除去し、５００ＩＵ／ｍＬ（最終濃度）の組換えヒトＩＦＮ−γを含む培地に交換した。ＩＦＮ−γの存在下、感染細胞をさらに１００時間インキュベートし、その後、以下に記載のように共焦点顕微鏡検査のために調製した。
【００４９】
２．３．再活性化試験
上記のように、スライド上に単層で培養したＨｅＬａ細胞を、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｌ２に感染させ、ペニシリンＧで処理した。感染２０時間後に、培養物を洗浄し、ペニシリンＧを含まない培地に培地交換した。４８ｈｐｉと１００ｈｐｉとの間に、様々な間隔で細胞及び培地を集め、従来技術の方法（Ｓｃｉｄｍｏｒｅ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１：Ｕｎｉｔ  １１Ａ  １１，２００５）に従って、力価試験を実施した。ペニシリンＧでの処理が、細菌持続性に影響を及ぼし得るかどうかを調べるために、ＨｅＬａ細胞をＬ２に感染させ、ＩＦＮ−γ及びペニシリンＧ（５００ＩＵ／ｍＬ）で、４８ｈｐｉ（すなわち、ＩＦＮ−γでの処理後２４時間）から７２ｈｐｉ（すなわち、ＩＦＮ−γでの処理後４８時間）まで処理した。次いで、スライドを固定し、２セットの検出フィルター（ヘキスト  ３６０／４０ｎｍＢＰ−４２５ｎｍＬＰ；ＦＩＴＣ  ４８０／４０ｎｍＢＰ−５２７／３０ｎｍＢＰ）を備え、ＣＣＤカメラＣＣＣと連結した落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ，Ｌｅｉｃａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
【００５０】
２．４．アポトーシスに対する感受性
クラミジアの抗アポトーシス活性に対するペニシリンＧ処理効果を測定した。スライド上に単層で培養したＨｅＬａ細胞に血清型Ｌ２を感染させ、３ｈｐｉ又は２９ｈｐｉにおいて、ペニシリンＧで処理した。２５ｈｐｉ又は３２ｈｐｉにおいて、それぞれ、細胞を１μＭのスタウロスポリンとともにインキュベートし、４０ｈｐｉ又は４８ｈｐｉにおいて固定し、落射蛍光顕微鏡検査のために調製した。アポトーシス核を含む感染細胞の割合を計測した。
【００５１】
２．５．共焦点顕微鏡検査
スライド上に単層で培養したＨｅＬａ細胞を血清型Ｌ２に感染させた。３ｈｐｉにおいて、細胞をペニシリンＧで処理するか、又は処理しなかった。次に、２４ｈｐｉにおいて細胞を固定し、透過処理し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の抗カテプシンＤ抗体（１／５０）とともにインキュベートした（２時間、室温）。数回洗浄後、テキサスレッド標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２００）をスライドに添加した（１時間、室温）。次に、細胞をＦＩＴＣ標識抗クラミジア抗体（１／８００）で１時間、ヘキスト（１／２０００）で５分間、対比染色した。次いで、スライドをマウントし、２つのダイオードレーザー（１ｍＷ及び２５ｍＷ：それぞれ４０５ｎｍ及び５６１ｎｍで放射）及びアルゴンレーザー（１００ｍＷ：４８８ｎｍで放射）を備えた共焦点顕微鏡を用いて観察した（ＴＣＳ  Ｓｐ５  ＡＯＢＳ  Ｔａｎｄｅｍ，Ｌｅｉｃａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ヘキストについては４１１〜４８１ｎｍで放射シグナルを回収し、ＦＩＴＣについては４９３〜５５５ｎｍ、テキサスレッドについては５９１〜７０３ｎｍで放射シグナルを回収した。各実験は、同様の方法で実施、取得及び分析し、３回繰り返した。
【００５２】
２．６．ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄでの細胞培養物の標識
Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）培養チャンバ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で増殖させた細胞を感染させ、３ｈｐｉにおいて、ペニシリンＧで処理するか、又は処理しなかった。２２ｈｐｉにおいて、ＤＭＥＭで希釈した１０μＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄとともに細胞をインキュベートした（３０分間、３７℃）。タンデムスキャナを備えたＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡を用いて、ビデオ顕微鏡（タイムラプス）により、５％ＣＯ２下、３７℃でスライドを観察した。励起は、レーザーダイオード（１ｍＷ）で５６１ｎｍであり、５６５ｎｍと６４１ｎｍとの間の放射シグナルを回収した。最大４時間までの間、２分間ごとに画像を得た。
【００５３】
２．７．ＲＮＡ調製及び遺伝子発現分析
上記のように、およそ１×１０５のＨｅＬａ細胞を感染させ、ペニシリンＧに曝露するか、又は曝露しなかった。１００ｈｐｉにおいて、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。３７℃で１時間、サンプルをＤＮａｓｅ  Ｉで処理した。次いで、７０℃で１０分間、酵素を変性させた。ＲＴ−ＰＣＲのために、製造者の指示に従って、ランダムヘキサマープライマー及びＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡ及びＲＮＡを増幅して、ＤＮＡ汚染がないことを確認した。
【００５４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅するために使用したプライマーは、
配列番号１：ＣＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＣＴＣＧＣ
配列番号２：ＣＣＡＡＣＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＧＡＣ
である。
【００５５】
真核生物１８Ｓ  ｒＲＮＡを増幅するために使用したプライマーは、
配列番号３：ＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＧ
配列番号４：ＣＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧ
である。
【００５６】
ＰＣＲ産物の半定量分析は、アガロースゲル電気泳動及びＵＶ検出により実施した。
【００５７】
２．８．統計分析
データは、「ｎ」回の実験の平均±標準偏差として示す。平均±標準偏差は、図面に示す；ｐ値は、スチューデントのペアｔ検定を用いて計算する。０．０５未満のｐ値を統計的に有意であると見なす。
【００５８】
２．９．Ｉｎ  ｖｉｖｏモデル
マウス及びモルモットに感染するクラミジア種であり、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）と遺伝的に近縁なクラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）をＣ５７Ｂ１／６マウスに感染させた。プロゲステロン注射によりマウス発情周期を開始させ、次いで、３日後、経膣的にマウスに感染させた（１０７ＩＦＵ）。感染１０日後、マウスを３つのグループに分け、ネガティブコントロールグループにはいずれの抗生物質も受けさせず、ポジティブコントロールグループには、ドキシサイクリン（５ｍｇ／ｍＬ）を受けさせ、試験グループにはペニシリンＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を受けさせた。処理期間は２０日間であった；抗生物質であるドキシサイクリン及びペニシリンＧをマウスの飲用水に添加した。処理後、持続性細菌に自己のサイクルを再開させ、後遺症（ｓｅｑｕｅｌｌｅｓ）を発症させるために、マウスを６０日間隔離した。次いで、マウスを屠殺し、生殖管の外観を分析し、卵管留水腫の存在を探索した。各種臓器も採取した。
【００５９】
３．結果
３．１．クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｌ２に感染した細胞のペニシリンＧでの処理は、持続性ではない異常な封入体の形成を導く
従来技術の研究では、クラミジア持続性モデルとして、培養宿主細胞をペニシリンＧで処理することを示していた。しかし、この抗生物質での処理によりもたらされる細菌形態の特徴、及び培地からペニシリンＧを除去した後に感染性の子孫が得られることをめぐる議論により、本発明者らはこの疑問を再度検証することにした。
【００６０】
クラミジア感染細胞をゲンタマイシン、ペニシリンＧ又はＩＦＮ−γで処理した。後者は持続性誘導剤として周知である。ＩＦＮ−γでの処理により生成される細菌封入体の大きさは、細胞を４日間培養した場合に一定のままである（図１）。この増殖の欠如は、２週間を超える期間、観察された。前記封入体の持続型の平均直径は、２〜３μｍであった。これらの２つの特徴（封入体が増殖しないこと、及び中規模のサイズであること）は、持続性クラミジアの典型である。他方、ペニシリンＧで処理した感染細胞の封入体は、ゲンタマイシン処理細胞のものと同程度に急速に増殖することがビデオ顕微鏡により観察された。感染後１２０時間（ｈｐｉ）において、ペニシリンＧで処理した感染細胞は溶解し、それらの構造物を培地に放出した。封入体に存在するこれらの構造物の直径（５〜１０μｍ）は、ＩＦＮ−γでの処理により得られる持続性細菌体のもの（２〜３μｍ）よりも非常に大きかった。
【００６１】
第２の一連の実験において、異常な細菌粒子を含むこのような封入体の生成及び成長は、使用するクラミジア細菌の宿主細胞タイプ、血清型、生物型、又はさらにはクラミジアの種とも無関係であることが示された（図６）。さらに、感染後の様々な時間で感染細胞をペニシリンＧで処理した。細菌サイクルの第１段階でペニシリンＧを添加した場合のみ（２４ｈｐｉ前）、封入体における異常に拡張した構造の出現をペニシリンＧが導くことが観察された。これは、ペニシリンＧがＲＢの成長に影響を及ぼすが、ＥＢの成長には影響を及ぼさないことを示す。全体として、これらの結果は、ペニシリンＧでの処理が、非持続性封入体における拡張した細菌形態の形成を導くことを示す。
【００６２】
３．２．ペニシリンＧでの宿主細胞の処理は、細菌感染性の不可逆的な喪失を引き起こす
細胞を連続して１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンＧで処理した場合、４８ｈｐｉで集めた細菌は、ゲンタマイシンで処理した細胞から集めた細菌よりも、数百倍低い感染性であった（図２）。同一条件下、１００ｈｐｉにおいては、ペニシリンＧで処理した宿主細胞により放出される細菌は、完全に非感染性であった。
【００６３】
持続性の別の特徴によれば、持続性の刺激が培地から除去された場合に、封入体は、再び増殖できる。同時に、持続性の細菌体は、網様体（ＲＢ）に変換される。
【００６４】
従って、２４ｈｐｉ（又はペニシリンＧでの処理開始から２１時間後）においてペニシリンＧを除去することにより、感染性細菌が回復し得るかどうかを検証した。この実験において、感染細胞での正常な成長サイクルは、ビデオ顕微鏡により、いずれも観察されなかった。さらに、いずれの感染性の向上も実証されなかった（図２）。最大１ＩＵ／ｍＬの濃度のペニシリンＧを用いた場合でも、同じ感染性の不可逆的な喪失が観察された（図７）。これらの結果は、感染細胞をペニシリンＧとともに一時的に又は連続的にインキュベートすることにより、クラミジアの感染性が完全に失われることを示す。
【００６５】
３．３．ペニシリンＧでの処理は、感染細胞にアポトーシスを起こしやすくさせる
細胞外刺激により誘起される宿主細胞アポトーシスを制御及び阻害する能力は、クラミジアサイクルの主な特性である。従って、ペニシリンＧで処理した感染細胞の、アポトーシス誘発経路を阻害する能力を試験した。
【００６６】
２１ｈｐｉにおいて、感染細胞を４μＭのスタウロスポリンで処理した場合、非感染コントロール細胞が全てアポトーシスを起こす一方、４８ｈｐｉにおいて、１１．８３％のみが、アポトーシス細胞の典型的な特徴を呈するという結果を示す（図３）。他方、同一条件下、ペニシリンＧで処理した感染細胞では７０．３９％がアポトーシスシグナルを示した。アポトーシスに対する耐性の喪失についてペニシリンＧ効果のスピードを評価するために、２ｈｐｉ又は２９ｈｐｉのいずれかで、感染細胞をペニシリンＧで処理した。次いで、３１ｈｐｉで、処理細胞をスタウロスポリンとともにインキュベートした。８時間後に細胞を観察した（図８）。おおよそ３８％の細胞が、両方の条件下でアポトーシスを起こしたことから、ペニシリンＧが非常に急速な効果を有することが示される。この結果は、ペニシリンＧで処理した細菌が、宿主細胞アポトーシス開始に対する制御を非常に急速に喪失することを示す。
【００６７】
３．４．ペニシリンＧでの処理は、１６ＳリボソームＲＮＡ発現の喪失を導く
クラミジアの網様体及び持続型はともに、細菌にとって必須の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を発現することが公知である。１６Ｓ  ｒＲＮＡの発現を、ペニシリンＧにより誘起される異常な細菌形態で調べた。１００ｈｐｉにおいて、ペニシリンＧ、ゲンタマイシン又はＩＦＮ−γで処理した感染細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡの発現を調べた。その結果、ゲンタマイシン（図４）又はＩＦＮ−γで処理した感染細胞からは１６Ｓ  ｒＲＮＡに特異的な配列が増幅された。他方、ペニシリンＧで処理した感染細胞は、細菌ＲＮＡを生成しない。しかし、全ての感染細胞は、真核生物の１８Ｓ  ｒＲＮＡを同一レベルで発現しており、これにより、ＲＮＡの抽出及びＲＴ−ＰＣＴが有効であることが示された。さらに、抽出されたＲＮＡのＰＣＲにより、いずれのＤＮＡの汚染も観察されなかった。全体として、これらの結果は、クラミジアのＲＢ及び持続型が１６Ｓ  ｒＲＮＡを生成することを示す。他方、ペニシリンＧで処理した細菌は、この必須のＲＮＡを発現する能力を失っていた。
【００６８】
３．５．感染細胞のペニシリンＧでの処理は、リソソームと異常な封入体との融合を導く
宿主細胞におけるアポトーシス機能に対する制御の喪失と、必須の細菌遺伝子の発現の欠如を伴う、ペニシリンＧで処理した細菌の異常な表現型は、ペニシリンＧが、クラミジアの分解を導くことを示唆する。小胞内に閉じ込められた細胞内粒子は、リソソームへと送られ、崩壊される。従って、異常な封入体とリソソームとの融合の可能性を調べた。
【００６９】
カテプシンは、リソソームによるタンパク質分解において重要な役割を担うプロテアーゼである。特に、カテプシンＤは、リソソームのアスパラギン酸プロテアーゼである。ＩＦＮ−γ及びペニシリンＧで処理するか、又は未処理の感染細胞において、カテプシンＤの局在を調べた。２４ｈｐｉにおいて、異常な細菌形態の大半がカテプシンＤを有した（図５Ａ）。予期されたとおり、このマーカーは、正常及び持続性の封入体からは排除されていた。コントロールアイソタイプを用いた実験において、いずれの印も観察されなかった。これらの結果は、ペニシリンＧで処理するか、又は未処理の感染細胞のＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ染色研究により確認した（図５Ｂ）。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒは、リソソームなどの酸性コンパートメントを検出するために使用されるプローブである。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの保持メカニズムは、そのプロトン化を使用しており、それにより、オルガネラ膜におけるその局在化が導かれる（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００５．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓｐｅｎｃｅ  Ｍ．Ｔ．Ｚ．ｅｄ．ｐｐ５８０−５８８）。このプローブでの感染細胞の標識は、異常な封入体における複雑な管状ネットワーク（ｒｅｓｅａｕ  ｔｕｂｕｌａｉｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅ）を明らかにし、それは、異常な封入体のみであった。さらに、これらの異常な封入体の大部分で、非常に高強度の点が観察された（図５Ｂ、囲み）。これらの点は、異常な封入体に侵入したリソソームであり得た。この仮説を調べるために、感染細胞におけるリソソームの挙動を共焦点ビデオ顕微鏡により調べた。その結果、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブで染色されたコンパートメントが異常な封入体に侵入することが実証された（図５Ｃ）。さらに、血清型Ｌ２に感染させたＲＬ９５−２細胞、又は血清型Ｄに感染させたＨｅＬａ細胞において生成される異常な封入体は、カテプシンＤも含む（図９）。全体として、これらの結果は、ペニシリンＧが、リソソームと異常なクラミジア封入体との融合を誘起することを示す。
【００７０】
３．６．持続性細菌のペニシリンＧでの処理は、クラミジア封入体とリソソームとの融合、及びそれらの子孫の破壊を誘起する
ペニシリンＧの効果を持続性の感染について試験した。細胞を感染させ、次いで、３ｈｐｉにおいてＩＦＮ−γで処理した。顕微鏡下で持続性封入体の出現が観察された時点で、ＩＦＮ−γの存在下で培養した感染細胞にペニシリンＧを添加した。その結果、封入体増殖の急速な再開が観察され、同時に、前記封入体における細菌粒子の異常な拡張が観察された。ペニシリンＧの添加から２４時間後、異常な細菌形態の大部分がカテプシンＤを有した。最終的に、ペニシリンＧでの処理開始から７０時間後に細胞は溶解し、溶解は、非感染性細菌の放出を伴った。この結果は、ペニシリンＧでの処理が、持続型のクラミジアの分解を導くことを示す。
【００７１】
３．７．感染マウスのペニシリンＧでの処理は、卵管留水腫の欠如を導く
ペニシリンＧの効果を、生殖器感染マウスモデルにおいて試験した。このモデルでは、子宮角に卵管留水腫の形成が観察される。これらの炎症性嚢胞は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の骨盤内感染症と関連して哺乳動物で高い頻度で観察され、壁の結合及び液体の貯留によって生じる。
【００７２】
未処理マウス（ネガティブコントロール）が、子宮角の長さを超える非常に大きな卵管留水腫を有するのに対し、ドキシサイクリンで処理した感染マウス（ポジティブコントロール）は、卵管中に小さな卵管留水腫を有する（図１０）。ペニシリンＧで処理したマウスの生殖管は、とりわけ、正常な外観を有しており、ペニシリンＧでの処理が、クラミジア感染に起因する組織ダメージを予防できることが示唆された。これらのデータは、現在ヒトでの標準治療であるドキシサイクリン治療と比較して、ペニシリンＧ治療によるより高い有効性を初めて示すものである。
【００７３】
３．８．クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｌ２感染細胞の他のβ−ラクタムでの処理は、ペニシリンＧ処理と同一の異常形態及び感染性の喪失を導く
β−ラクタムファミリーの他の分子が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ペニシリンＧの存在下で生成されたものと同一のクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）異常形態及び非感染性形態を誘起し得るかどうかの検証を初めて試みた。異なるβ−ラクタムで処理した感染細胞由来の細菌の感染能について力価実験を実施した。これら分子の各々について、細胞毒性及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を測定した。これらのβ−ラクタムの全てが、ＩＦＮ−γの影響下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の持続型に対して、殺菌作用を有するかどうかも検証した。これらの実験結果を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
2013517252.tif 000002
【００７５】
結論として、全てのβ−ラクタムは、ペニシリンＧと同一の効果を発揮する。
【図１】
2013517252.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
2013517252.tif 000013
2013517252.tif 000014
2013517252.tif 000015
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