(57)【要約】ＣＤ４４拮抗薬を用いた医薬組成物及び癌の治療方法を開示する。特定の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭部癌、頸部癌、膵癌、又は黒色腫などの癌を有する哺乳動物を、ＣＤ４４融合タンパク質を用いて治療する工程を含む。これらＣＤ４４融合タンパク質はＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含み、かつ、ヒアルロン酸の検出に用いることができる。【選択図】なし
2013502421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
該ＣＤ４４融合タンパク質を、該ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルスを介して投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該神経膠腫が星細胞腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ４４の細胞外ドメインが、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａからなる群より選択されるドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ６−ｖ１０である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａからなる群より選択されるＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質；及び
ｂ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤；
を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ６−ｖ１０である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓＲ４１Ａである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の請求項１０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
該神経膠腫が星細胞腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物の癌の治療方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質、及び１種類以上のさらなる抗癌治療を投与するか又は施す工程を含む治療方法。
【請求項２２】
該抗癌治療が、外科的治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫治療からなる群より選択される治療である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該抗癌治療が化学療法である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該化学療法が、テモゾロミド、カルムスチン、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、及びトポテカンからなる群より選択される化学療法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該化学療法がテモゾロミド又はカルムスチンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該抗癌治療が放射線治療である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
該抗癌治療が外科的治療である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
該抗癌治療が標的治療である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
該標的治療が、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＡＭＧ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＧＸ−５２３、ＧＳＫ１３６３０８９、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、ＢＩＢＦ１１２０、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、Ｅ７０８０、ペリホシン、ＭＫ−２２０６、テムシロリムス、ラパマイシン、ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ−０９４１、ＰＬＸ−４０３２、イマチニブ、ＡＺＤ０５３０、ボルテゾミブ、ＸＡＶ−９３９、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）、Genentech−化合物８／ｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤、及びAbbott Laboratories−化合物１１からなる群より選択される標的治療である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−Ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａからなる群より選択されるＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質；
ｂ）癌細胞で細胞毒性又は細胞増殖抑制ストレスを生じる、少なくとも１種類の治療薬；及び
ｃ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤；
を含む医薬組成物。
【請求項３１】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ６−ｖ１０である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓＲ４１Ａである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の請求項３０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
該神経膠腫が星細胞腫である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
該哺乳動物がヒトである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、及びＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−Ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａからなる群より選択されるＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質；
ｂ）癌細胞中のＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２／ｅｒｂＢ−３／ｅｒｂＢ−４／ｃ−ＭｅｔＲＴＫ又はＩＡＰの阻害剤である、少なくとも１種類の治療薬；及び
ｃ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤；
を含む医薬組成物。
【請求項４３】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ６−ｖ１０である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓＲ４１Ａである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
該阻害剤が、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＡＭＧ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＧＸ−５２３、ＧＳＫ１３６３０８９、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、ＢＩＢＦ１１２０、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、Ｅ７０８０、ペリホシン、ＭＫ−２２０６、テムシロリムス、ラパマイシン、ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ−０９４１、ＰＬＸ−４０３２、イマチニブ、ＡＺＤ０５３０、ボルテゾミブ、ＸＡＶ−９３９、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）、Genentech−化合物８／ｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤、及びAbbott Laboratories−化合物１１からなる群より選択される阻害剤である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
ａ）ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａからなる群より選択されるＣＤ４４の細胞外ドメインの融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルス；及び
ｂ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤；
を含む医薬組成物。
【請求項５２】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ６−ｖ１０である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓである、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａである、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ＣＤ４４の細胞外ドメインがＣＤ４４ｓＲ４１Ａである、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の請求項５１に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項６０】
該神経膠腫が星細胞腫である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
該哺乳動物がヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
試料を、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む標識したＣＤ４４融合タンパク質と接触させる工程を含む、該試料中のヒアルロン酸を検出する方法。
【請求項６４】
該試料が癌生検又は癌切片である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
該試料が、血液、血清、血漿及び尿からなる群より選択される患者の体液試料である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
該標識が、ビオチン、蛍光標識、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、磁気ビーズ、及び放射性標識からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
該標識がビオチンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
該試料中の標識したＣＤ４４融合タンパク質をインキュベートする工程、及びヒアルロン酸に結合した該標識を定量する工程をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＤ４４の細胞外ドメインが、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、及びＣＤ４４ｖ３からなる群より選択されるドメインである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
哺乳動物から得た試料中のヒアルロン酸を、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法に従って検出する工程を含む哺乳動物の癌を診断する方法であって、該試料中のヒアルロン酸の量が正常な対照試料中の量よりも多いことが、癌の存在の指標となる、哺乳動物の癌を診断する方法。
【請求項７１】
該癌が、神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される癌である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
該試料中のＣＤ４４を検出する工程をさらに含み、該試料中のヒアルロン酸及びＣＤ４４の量が正常な対照試料中の量よりも多いことが癌の存在の指標となる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
哺乳動物における癌の状態の変化を決定する方法であって、
（ａ）該哺乳動物から第１の試料を採取する工程と、
（ｂ）該哺乳動物由来の第１の試料中のヒアルロン酸を、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法に従って検出する工程と、
（ｃ）該哺乳動物から第２の試料を採取する工程と、
（ｄ）該哺乳動物由来の第２の試料中のヒアルロン酸を、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法に従って検出する工程、
を含み、該第１試料中のヒアルロン酸の量と該第２試料中のヒアルロン酸の量の差が、該哺乳動物の癌の状態の変化の指標となる癌の状態を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
[0001]本出願は２００９年８月２１日に出願の米国仮特許出願第６１／２７４，８１３号の優先権を主張し、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（政府後援研究に関する説明）
[0002]国防総省、陸軍感染症研究所からの助成金Ｗ８１ＸＷＨ−０６−１−０２４６及び国立衛生研究所、国立癌研究所からの助成金Ｒ０１ＣＡ１３５１５８−０１Ａ１による資金援助を受けたことに基づき、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
[0003]本発明は、ＣＤ４４融合タンパク質及びこれら融合タンパク質の誘導体を含む医薬組成物、並びにＣＤ４４融合タンパク質及びこれら融合タンパク質の誘導体を用いる癌の治療法に関する。特定の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫を含む癌を治療するための、及び癌の外科的切除を含む様々な治療介入後の癌再発を防止するための、単剤としてのＣＤ４４融合タンパク質の使用、及びその他の抗癌治療との併用におけるＣＤ４４融合タンパク質の使用を含む。その他の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫及びその他の癌型を治療するためのその他の抗癌治療と併用するための、又はその他の抗癌治療の前若しくは後における、ＣＤ４４融合タンパク質の使用を含む。その他の治療介入を行った後に、癌幹細胞の拡大を阻止するため、及び癌の再発及び転移を遅らせる又は停止させるための維持療法としてＣＤ４４融合タンパク質を用いることができる。別の側面では、その他の抗癌治療と並行して投与される医薬組成物又は方法の組み合わせは、神経膠腫及びその他の癌型の治療に相乗効果をもたらす。その他の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、早期の癌診断及び予後、並びに抗癌治療に対する患者の反応を評価するための、ＨＡを含むＣＤ４４リガンドを検出するためのＣＤ４４融合タンパク質の使用を含む。
【背景技術】
【０００４】
[0004]標準的な抗癌治療は主に、正常な細胞と腫瘍細胞とを区別する腫瘍細胞の特性、一般的にはより高い増殖速度及び明確に異なる代謝性要求を標的とするものである。標準的な化学療法は特定の群の悪性腫瘍にとっては有効であるが、重篤な毒性を有することから、大部分の固形腫瘍に対する効果は限定的である。より近年の標的治療法は、特定の過剰に活性化した癌遺伝子及び癌細胞中のキナーゼを標的とするように設計されている。それらは通常、化学療法よりも毒性の低いものであるが、それらの効果は、腫瘍細胞の不均一性、それらの依存度を異常なシグナル伝達経路から別の経路へと切り替える能力、及び新しい変異を獲得した抵抗性クローンの出現により制限されている。従って、単に癌細胞を標的としても、大部分の固形悪性腫瘍は治癒できそうにないことが次第に明らかとなってきている（Araujo et al., 2007; Zhang et al., 2009）。最近の数多くの観察から蓄積されたデータは、宿主の微小環境が癌の進行に本質的に寄与し、癌幹細胞ニッチの維持を補助し、そして治療に対する癌細胞の反応を調節することを示しており、このことは、腫瘍微小環境の要素が抗癌治療の重要な標的となり得ることを意味している（Gilbertson and Rich, 2007；Hideshima et al., 2007；Hoelzinger et al., 2007；Mantovani et al., 2008；Mishra et al., 2009；Podar et al., 2009）。
【０００５】
[0005]腫瘍微小環境には、内皮細胞、周細胞、白血球、及び線維芽細胞を含む浸潤宿主細胞、並びに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素が含まれる。腫瘍細胞間及びそれらの微小環境間における重要な相互作用及びクロストークは、細胞間接着を含むそれらの表面受容体、及び潜在的な治療標的であるＥＣＭ受容体によって仲介されている。例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞のＥＣＭへの接着が細胞接着依存性薬剤耐性（ＣＡＭＤＲ）を付与していることが、上手く示されている（Hideshima et al., 2007）。ＭＭのＣＡＭＤＲの根底をなす分子基盤については現在も研究が行われているが、宿主微小環境間の相互作用及びその相互作用によって活性化されるシグナル伝達経路の下流にある数多くのその他の癌型についての研究はあまり行われていない。腫瘍細胞−ＥＣＭ間相互作用において重要な調節物質、並びにそれに対応し、癌の進行及び治療への耐性を促進する下流のシグナル伝達経路を同定することは、癌細胞及びそれらの微小環境を同時に標的とする、新規で、かつ、より効果的な治療法の開発に役立つと考えられる。
【０００６】
[0006]神経膠腫は原発性脳腫瘍の最も一般的な型であり、かつ、神経前駆細胞の形質転換から生じ得る様々な度合いの分化及び悪性度を有する一群の腫瘍を構成する（Giese et al., 2003；Maher et al., 2001）。これらの腫瘍の内で最も悪性なものは多形性膠芽腫（ＧＢＭ）としても知られる星細胞腫のグレード４であり、これは高い浸潤特性及び非常に高い化学療法剤耐性を示す。積極的で多様な治療にも関わらず、ＧＢＭは不治であり、予測される平均生存期間は１年未満であり、５年を超えて生存する患者の割合は５％未満である（Davis et al., 1998）。そのため、化学療法剤及び現存する標的治療に対するＧＢＭの耐性を低減させるための新規治療標的の同定、新しい薬剤及び新規併用療法を開発する必要に迫られている。
【０００７】
[0007]中枢神経系には、ヒアルロン酸又はヒアルロナンとしても知られている、高レベルで広範囲に分布したグリコサミノグリカン  ヒアルロン酸（ＨＡ）が含まれている（Park et al, 2008）。神経膠腫では、主要な細胞表面ＨＡ受容体であり、細胞間接着及び細胞−マトリックス間接着に介在し、細胞移動及びシグナル伝達を促進するＣＤ４４が発現される（Stamenkovic and Yu, 2009）。ＣＤ４４は多形性細胞表面受容体であり、様々な細胞機能に関与する（Sherman et al., 1994；Stamenkovic, 2000；Stamenkovic I, 2009；Toole, 2004）。ＣＤ４４は様々な悪性腫瘍において亢進され、その発現の上昇は、いくつかの癌型の予後不良とも関連している（Lim et al., 2008；Matsumura and Tarin, 1992；Pals et al., 1989；Yang et al., 2008）。ＣＤ４４は黒色腫（Ahrens et al, 2001；Guo et al., 1994）及び乳癌（Yu and Stamenkovic, 1999, 2000；Yu et al., 1997）の成長及び進行において重要な役割を担っていると考えられている。しかし悪性神経膠腫の進行、並びにＧＢＭ細胞及びその他の型の癌細胞の化学療法及び標的治療に対する反応においてＣＤ４４がどの程度寄与しているかについてはほとんど分かっていない。
【０００８】
[0008]ＣＤ４４が複数のシグナル伝達構成要素を関連があり、複数の受容体チロシンキナーゼ（ＴＫ）のコレセプターとして役立つことが示されてきているが（Sherman et al., 1994；Stamenkovic, 2000；Toole, 2004）、これまでのところ、ＣＤ４４によって制御されるシグナル伝達経路の全体は１つも明らかになっていない。ＣＤ４４の細胞質ドメインは、エズリン−ラジキシン−モエシン（ＥＲＭ）ファミリータンパク質（Tsukita and Yonemura, 1997）及びマーリン（Morrison et al., 2001；Sainio et al., 1997）を含むBand 4.1スーパーファミリーのメンバーと相互作用して皮質アクチンフィラメントと原形質膜との間のリンカーとなり、そしてアクチン細胞骨格の編成及び細胞運動を制御する（McClatchey and Giovannini, 2005；Okada et al., 2007）。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）においてマーリンは、細胞増殖の抑制及び分化段階にある上皮細胞のアポトーシスの促進に重要な役割を担うヒッポ（Ｈｐｏ）シグナル伝達経路の上流で機能する（Hamaratoglu et al., 2006；Huang et al., 2005；Pellock et al., 2007）。ショウジョウバエのｈｐｏ遺伝子は、セリン／トレオニンキナーゼであるワーツ（Ｗｔｓ）をリン酸化して活性化させる、セリン／トレオニンキナーゼをコードしている。ワーツは、転写コアクチベーターであるヨーキー（Ｙｋｉ）をリン酸化して不活性化し、その結果、ｄＩＡＰ及びサイクリンＥを含む、共通した一連の下流標的遺伝子が抑制される（Hamaratoglu et al., 2006；Huang et al., 2005；Matallanas et al., 2008；Pellock et al., 2007）。まだ完全には解明されていないが、ヒッポ経路は哺乳類に保存されていると考えられており、そのいくつかの構成要素は腫瘍のサプレッサーであると予想されている（Lau et al., 2008；Zeng and Hong, 2008）。Ｈｐｏ、Ｗｔｓ、Ｙｋｉ、及びｄＩＡＰの哺乳類ホモログはそれぞれ、Mammalian Sterile Twenty様（ＭＳＴ）キナーゼ１及び２（ＭＳＴ１／２）（Lehtinen et al., 2006；Ling et al., 2008；Matallanas et al., 2008）、Large tumor suppressorホモログ１及び２（Ｌａｔｓ１及び２）（Hao et al., 2008；Takahashi et al., 2005）、Ｙｅｓ−関連タンパク質（ＹＡＰ）（Overholtzer et al., 2006）、及びcellular Inhibitor of Apoptosis（ｃＩＡＰ１／２）（Srinivasula and Ashwell, 2008）である。哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の上流にある構成要素は同定されていない。
【０００９】
[0009]神経膠腫を含む多くの悪性腫瘍に対して現在使用可能な治療の効果は相対的に低く、かつ、これらの疾患を有する患者の予後は不良であり、診断後の予測余命が短い。そのため、治療のための新しい標的、薬剤、及び併用療法が必要である。加えて、神経膠腫及びそれらの幹細胞を含む腫瘍細胞全体、並びにそれらの微小環境を同時に標的とすることができるものは特に有効となるだろう。本発明はそのような方法を提供するものである。
【発明の概要】
【００１０】
[0010]本発明の特定の態様では、治療介入のため又は哺乳動物の癌の再発を阻害するための方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む有効量のＣＤ４４融合タンパク質を投与する工程を含み、ここで癌は神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、黒色腫、腎細胞癌、胃癌、食道癌、膵癌、肝臓癌、又は頭頸部癌である。
【００１１】
[0011]本発明の特定の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む有効量のＣＤ４４融合タンパク質、及び任意に薬学上許容可能な担体又は希釈剤を投与する工程を含み、ここでＣＤ４４融合タンパク質は、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルスを介して投与される。
【００１２】
[0012]本発明の特定の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む有効量のＣＤ４４融合タンパク質、及びｂ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤を投与する工程を含み、ここでＣＤ４４融合タンパク質は精製タンパク質として投与される。
【００１３】
[0013]本発明の特定の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む有効量のＣＤ４４融合タンパク質を投与する工程を含み、ここでＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ４−ｖｌ０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａである。
【００１４】
[0014]本発明のその他の態様では、ａ）ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質、ここでＣＤ４４の細胞外ドメインはＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａであり、及びｂ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
[0015]本発明のその他の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む有効量のＣＤ４４融合タンパク質を、１つ以上のさらなる抗癌治療と共に投与する工程を含む。
【００１６】
[0016]本発明の特定の側面において、さらなる抗癌治療とは、外科的な治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫療法である。本発明の特定の側面においてさらなる抗癌治療とは、放射線治療である。本発明のその他の側面においてさらなる抗癌治療とは、外科的な治療である。
【００１７】
[0017]本発明の特定の側面において、さらなる抗癌治療とは、化学療法である。本発明の特定の側面において化学療法とは、テモゾロミド、カルムスチン、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル（ｐａｃｉｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、又はトポテカンである。本発明の別の側面において化学療法とは、テモゾロミド又はカルムスチンである。
【００１８】
[0018]本発明の特定の側面において、さらなる抗癌治療とは、標的治療である。本発明の特定の側面において標的治療とは、受容体チロシン阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、ｅｒｂＢ受容体の阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、ｃ−Ｍｅｔの阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、ＶＥＧＦＲの阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、アポトーシス及びストレス応答を促進する薬剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤である。本発明の特定の態様において標的治療とは、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＡＭＧ  ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＧＸ−５２３、ＧＳＫ１３６３０８９、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、ＢＩＢＦ１１２０、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、Ｅ７０８０、ペリホシン、ＭＫ−２２０６、テムシロリムス、ラパマイシン、ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ−０９４１、ＰＬＸ−４０３２、イマチニブ、ＡＺＤ０５３０、ボルテゾミブ、ＸＡＶ−９３９、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−化合物８／ｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤、又はＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−化合物１１である。
【００１９】
[0019]本発明のその他の態様では、ａ）ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質、ここでＣＤ４４の細胞外ドメインはＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａであり、及びｂ）癌細胞において細胞毒性又は細胞増殖抑制性ストレスを誘導する少なくとも１つの治療薬、及びｃ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
[0020]本発明の別の態様では、ａ）ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質、ここでＣＤ４４の細胞外ドメインはＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａであり、ｂ）癌細胞中のＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２／ｅｒｂＢ−３／ｅｒｂＢ−４／ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦＲＲＴＫを阻害する少なくとも１つの治療薬、及びｃ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の特定の側面では、ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２／ｅｒｂＢ−４／ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦＲ  ＲＴＫの阻害剤としては、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＡＭＧ  ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＧＸ−５２３、ＧＳＫ１３６３０８９、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、ＢＩＢＦ１１２０、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、及びＥ７０８０が挙げられる。
【００２１】
[0021]本発明の別の態様では、ａ）ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質、ここでＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖｌ０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａであり、ｂ）癌細胞中のＩＡＰを阻害する又はストレスを促進する少なくとも１つの治療薬、及びｃ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の特定の側面では、ＩＡＰ阻害剤又はストレス促進剤としては、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−化合物８／ｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−化合物１１、ペリホシン、ＭＫ−２２０６、テムシロリムス、ラパマイシン、ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ−０９４１、ＰＬＸ−４０３２、イマチニブ、ＡＺＤ０５３０、ボルテゾミブ、又はＡＶ−９３９が挙げられる。
【００２２】
[0022]本発明のその他の態様では、ａ）ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルス、ここでＣＤ４４の細胞外ドメインはＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａであり、及びｂ）薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
[0023]上記態様の特定の側面では、癌は神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、黒色腫、腎細胞癌、胃癌、食道癌、膵癌、肝臓癌又は頭頸部癌である。本発明の特定の態様において神経膠腫は、星細胞腫である。本発明のその他の態様において神経膠腫は、多形性膠芽腫である。本発明の特定の態様において哺乳動物はヒトである。
【００２４】
[0024]上記態様の特定の側面においてＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０である。上記態様のその他の側面においてＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０である。上記態様の別の側面においてＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｓである。上記態様の別の側面においてＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０である。
【００２５】
[0025]本発明のその他の態様では、試料中のヒアルロン酸を検出する方法を提供し、この方法は、試料をＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む、標識したＣＤ４４融合タンパク質に接触させる工程を含む。特定の態様において試料は癌生検又は癌切片である。その他の態様において試料は患者の体液試料であり、血液、血清、血漿、又は尿である。その他の態様において標識は、ビオチン、蛍光標識、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、磁気ビーズ、又は放射性標識である。一層さらに別の側面においてこの方法は、試料中で標識したＣＤ４４融合タンパク質をインキュベートする工程及びヒアルロン酸に結合した標識を定量する工程を含む。一層さらに別の側面においてＣＤ４４の細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖｌ０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、又はＣＤ４４ｖ３である。
【００２６】
[0026]本発明のその他の態様では、哺乳動物における癌の診断方法を提供する。この方法は、ヒアルロン酸の検出について記載した任意の方法に従って、哺乳動物から得た試料中のヒアルロン酸を検出する工程を含み、そして試料中のヒアルロン酸の量が正常な対照試料よりも高いことが癌の存在を示すものとなる。特定の態様において癌は、神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、又は黒色腫である。特定のその他の態様においてこの方法は、試料中のＣＤ４４を検出する工程からさらになり、ここで試料中のヒアルロン酸及びＣＤ４４の量が正常な対照試料よりも高いことが癌の存在を示すものとなる。
【００２７】
[0027]本発明のその他の態様では、哺乳動物における癌の状態の変化を決定する方法を提供する。この方法は、哺乳動物から第１の試料を回収する工程、ヒアルロン酸の検出について記載した任意の方法に従って、哺乳動物から得られた第１の試料中のヒアルロン酸を検出する工程、哺乳動物から第２の試料を回収する工程、ヒアルロン酸の検出について記載した任意の方法に従って、哺乳動物から得られた第２の試料中のヒアルロン酸を検出する工程を含み、ここで第２の試料中のヒアルロン酸量と第１の試料におけるヒアルロン酸量の差が、この哺乳動物における癌の状態の変化を示すものとなる。
【００２８】
[0028]本発明のこれら及びその他の側面は、本明細書、請求項及び図表を考慮することにより、当業者に明かとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】[0029]一連のマイクロアレイデータ（http://www.oncomine.org/から取得）におけるＣＤ４４の発現の亢進を示す棒グラフ。多形性神経膠腫組織におけるＣＤ４４の発現を、正常なヒトの脳組織（試験１、２、及び４）又は正常な白質（試験３）と比較した。てんかん患者由来の脳若しくは白質（各試験の左側のバー）、又はＧＢＭ（各試験の右側のバー）におけるＣＤ４４の発現を示す。
【図１Ｂ】[0030]ＣＤ４４について行った免疫組織化学染色の代表図。抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いて、１４のＧＢＭ組織（Ｂ−ａ）及び８つの正常なヒトの脳試料（Ｂ−ｂ）について免疫組織化学染色を行った。バーは５０μｍ。
【図１Ｃ】[0031]抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロットによる、ヒト神経膠腫細胞パネルにおける内生ＣＤ４４の発現。正常なヒトの星状細胞(NHA、ALLCELLS, Inc.)から得たタンパク質をレーン１及び２０にロードした。泳動における内部対照としてはアクチンを用いた（下段）。分子量を示すバーは、１９７ｋＤａ、１１０ｋＤａ、及び７２ｋＤａに相当する。
【図２Ａ】[0032]レンチウイルスベースのｓｈＲＮＡによりノックダウンした、Ｕ２５１（Ａ−ａ）又はＵ８７ＭＧ（Ａ−ｂ）におけるＣＤ４４の発現。抗ＣＤ４４ｍＡｂ(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。
【図２Ｂ】[0033]抗ＣＤ４４ｍＡｂ（Santa Cruz）を用いて行った免疫細胞化学。標的をもたない（ＴＲＣ−ＮＴ）対照ｓｈＲＮＡ（ａ）を感染させたＵ８７ＭＧと比較して、それぞれのＣＤ４４ノックダウンｓｈＲＮＡレンチウイルスベクター（ｂ〜ｃ）を感染させたＵ８７ＭＧでは、内生のＣＤ４４レベルが低下したことが示されている。
【図２Ｃ】[0034]各図中に示したように、野生型Ｕ８７ＭＧ細胞（Ｃ−ａ）、ＴＲＣ−ＮＴ対照ｓｈＲＮＡを感染させたＵ８７ＭＧ細胞（Ｃ−ｃ）、及び別々のＣＤ４４ノックダウンｓｈＲＮＡレンチウイルスベクター（Ｃ−ｂ、−ｄ）を感染させたＵ８７ＭＧ細胞を用いて行った、蛍光−ＨＡ（ＦＬ−ＨＡ）結合アッセイ。
【図２Ｄ】[0035]異なるＣＤ４４ノックダウンｓｈＲＮＡレンチウイルス（ａ〜ｄ）又はＴＲＣ−ＮＴ対照ｓｈＲＮＡレンチウイルス（ｅ）を感染させたＵ２５１細胞における、内生ＣＤ４４のレベル。抗ＣＤ４４ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫細胞化学。
【図３Ａ】[0036]ＣＤ４４発現をノックダウンすると、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞のインビボでの皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。
【図３Ｂ】[0037]ＣＤ４４発現をノックダウンすると、Ｕ２５１神経膠腫細胞のインビボでの皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。
【図３Ｃ】[0038]別々のｓｈＲＮＡコンストラクトを感染させたＵ８７ＭＧ細胞由来の皮下腫瘍のインビボでの成長速度を示す線グラフ。
【図３Ｄ】[0039]異なるｓｈＲＮＡコンストラクトを感染させたＵ２５１細胞由来の皮下腫瘍のインビボでの成長速度を示す線グラフ。
【図３Ｅ】[0040]皮下移植した神経膠腫腫瘍の形態（Ｈ＆Ｅ）、増殖（Ｂｒｄｕ及びＫｉ６７）及びアポトーシス（Ａｐｏｐｔａｇ）の状態。
【図４Ａ】[0041]Ｕ８７ＭＧ−ＴＲＣ−ＮＴ、Ｕ８７ＭＧｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴ（標的をもたないｓｈＲＮＡ対照、上段）、並びにＵ８７ＭＧ−ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びＵ８７ＭＧｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃ｌ（ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、下段）を頭蓋内に注入後、３、６、９、及び１３日目のマウスの生物発光画像解析。
【図４Ｂ】[0042]導入したＵ８７ＭＧ（Ｂ−ａ）及びＵ２５１（Ｂ−ｂ）細胞を頭蓋内注入した後の、マウスの生存率を示す線グラフ。詳細は図中に示す。
【図４Ｃ】[0043]Ｕ８７ＭＧ−ＮＴ（標的をもたないＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴコンストラクトを含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞）、Ｕ８７ＭＧｓｈＲＮＡ−ＣＤ４４（ＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンする、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃１コンストラクトを含む、レンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞）を頭蓋内に注入後、６、９、１３、及び１７日目のマウスの生物発光画像解析。図中に詳細を示したように、これらのマウスは化学療法薬（ＢＣＮＵ又はＴＭＺ）による治療を受けた又は受けなかったものである。
【図４Ｄ】[0044]導入したＵ８７ＭＧ（Ｄ−ａ）及びＵ２５１（Ｄ−ｂ）細胞を頭蓋内注入後、ＣＤ４４がノックダウンされた又はされなかったマウスの生存率を示す線グラフ。図中に詳細を示したように、これらのマウスは化学療法薬（ＢＣＮＵ又はＴＭＺ）による治療を受けた又は受けなかったものである。
【図５Ａ】[0045]標的をもたないＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴコンストラクトを含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞において酸化ストレス（Ｈ２Ｏ２）により誘導された、リン酸化及び／又は全マーリン、ＭＳＴ１／２、Ｌａｔｓ１／２、ＹＡＰ、ｃＩＡＰ１／２、及び切断型カスパーゼ３レベルのウェスタンブロット解析。
【図５Ｂ】[0046]Ｕ８７ＭＧ細胞中のＣＤ４４を効果的にノックダウンする、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃１を含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞において酸化ストレス（Ｈ２Ｏ２）により誘導された、リン酸化及び／又は全マーリン、ＭＳＴ１／２、Ｌａｔｓ１／２、ＹＡＰ、ｃＩＡＰ１／２、及び切断型カスパーゼ３レベルのウェスタンブロット解析。
【図５Ｃ】[0047]標的をもたないＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴコンストラクトを含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞における、酸化ストレスにより誘導された、リン酸化及び／又は全ＪＮＫ及びｐ３８ストレスキナーゼ、ｐ５３、ｐ２１、及びｐｕｍａレベルのウェスタンブロット解析。
【図５Ｄ】[0048]ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃１を含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞における、リン酸化及び／又は全ＪＮＫ及びｐ３８ストレスキナーゼ、ｐ５３、ｐ２１、及びｐｕｍａレベルのウェスタンブロット解析。
【図６Ａ】[0049]標的をもたないＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴコンストラクトを含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞において化学療法薬ＴＭＺにより誘導された、リン酸化及び／又は全ＭＳＴ１／２、ＹＡＰ、ｃＩＡＰ１／２、ＪＮＫ及びｐ３８ストレスキナーゼ、ｐ５３、及びｐ２１レベルのウェスタンブロット解析。
【図６Ｂ】[0050]ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃１を含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞において化学療法薬ＴＭＺにより誘導された、リン酸化及び／又は全ＭＳＴ１／２、ＹＡＰ、ｃＩＡＰ１／２、ＪＮＫ及びｐ３８ストレスキナーゼ、ｐ５３、及びｐ２１レベルのウェスタンブロット解析。
【図７Ａ】[0051]標的をもたないＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴコンストラクトを含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞においてｅｒｂＢ及びｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のリガンドにより誘導された、Ｅｒｋ１／２キナーゼの活性化に関するウェスタンブロット。
【図７Ｂ】[0052]ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃１を含むレンチウイルス混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞においてｅｒｂＢ及びｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のリガンドにより誘導された、Ｅｒｋ１／２キナーゼの活性化に関するウェスタンブロット。
【図８】[0053]Ｕ８７ＭＧヒト神経膠腫及びＷＭ７９３ヒト黒色腫細胞における、マーリンの発現の上昇により有意に影響を受けたシグナル伝達経路。マーリンはＣＤ４４によって負に制御される、ＣＤ４４の下流のエフェクターである。マイクロアレイ実験によって得られた一連のデータについて機能解析した結果を示す。このデータは、マーリンの発現の上昇がヒッポシグナル伝達経路を活性化し、Ｗｎｔ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を阻害することを示している。
【図９】[0054]マーリンはヒト神経膠腫細胞における標準的なＷｎｔシグナル伝達を阻害する。Ａ−Ｂ、Ｕ８７ＭＧｗｔ、Ｕ８７ＭＧマーリン、Ｕ８７ＭＧマーリンＳ５１８Ｄ、及びＵ８７ＭＧマーリンＳ５１８Ａ細胞にＴｏｐＦｌａｓｈ（Ａ）又はＦｏｐＦｌａｓｈ（Ｂ）を感染させ、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。実験は３回行った。
【図１０】[0055]マーリン介在性シグナル伝達イベント及びそれらのクロスロークの可能性を示すモデル。ショウジョウバエにおけるヒッポシグナル伝達経路の構成要素を下線で示す。マーリンは、哺乳類のヒッポ（マーリン−ＭＳＴ１／２−ＬＡＴＳ１／２−ＹＡＰ）及びＪＮＫ／ｐ３８シグナル伝達経路の上流で機能し、かつ、ストレス及びストレス誘導性アポトーシスに対する、並びに増殖生存シグナルに対する細胞反応の制御に必須の役割を担う。ＣＤ４４は、マーリン及びヒッポシグナル伝達経路の上流で機能する。マーリン及びＣＤ４４の機能は互いに拮抗するものである。マーリンは、ＲＴＫの活性及びＲＴＫ誘導性成長、並びに生存シグナルを阻害する。ＣＤ４４は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の上流で機能し、かつ、ＲＴＫ活性及びＷｎｔシグナル伝達を増強する。
【図１１】[0056]ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ及びｈｓＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の生化学的及び機能特性。Ａ、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ、又は空の発現ベクターを有する発現コンストラクトを含むレトロウイルスを導入したＵ２５１細胞から得た、無血清細胞培養上清のウェスタンブロット解析。融合タンパク質の検出には抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いた。分子量のバーは、１９９ｋＤａ及び１１６ｋＤａに相当する。Ｂ、ＦＬ−ＨＡ結合アッセイを行った。ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃを発現しているＵ２５１細胞、又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを感染させたＵ２５１細胞を２日間培養した。ＦＬ−ＨＡ（２０μｇ／ｍｌ）を培地に加え、細胞をさらに１２時間培養し、その後細胞を固定した。バーは４０μｍ。Ｃ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）によりｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃタンパク質を変性させた。精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質をへパリナーゼＩ／ＩＩＩで処理し又は処理せず、その後プロテインＡカラムから溶出した。これらのタンパク質を３枚のＥｌｉａｓプレートに結合させた。ＢＳＡでブロッキングした後、塗布したタンパク質を抗ＨＳ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と反応させた。比色反応の強度をＥｌｉｓａリーダーで測定し、抗ＣＤ４４抗体の反応性により正規化した。これにより、プレートに塗布した融合タンパク質の相対量が示された。
【図１２】[0057]ＣＤ４４のアンタゴニストは、マウスモデルにおけるヒトＧＢＭに対する有効な治療薬である。Ａ、空の発現ベクター及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０を有する発現コンストラクトを含むレトロウイルスにＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞を感染させ、それらの無血清培地上清を回収し、抗ＣＤ４４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）又は抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットにより解析した。分子量のバーは１９９ｋＤａ及び１１６ｋＤａに相当する。Ｂ、マウス１匹当たり２ｘ１０６個の感染させたＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞を皮下に注入した。皮下腫瘍の成長速度を決定し、腫瘍容積（ｍｍ３）＋／−ＳＤの平均として表した。各コンストラクトにつき、６匹のマウスを使用した。Ｃ、図に示すように、空の発現ベクター、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃ、又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃコンストラクトを含むレトロウイルスを感染させたＵ８７ＭＧ（Ｃ−ａ）及びＵ２５１（Ｃ−ｂ−ｃ）細胞を頭蓋内注入した後のマウスの生存率。各型の感染させた神経膠腫細胞（ａ−ｂ）につき１５匹のマウスを、図Ｃについては１０匹のマウスを使用した。
【図１３】[0058]精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質はＲａｇ−１マウスにおける頭蓋内の神経膠腫の成長を阻害し、明らかな毒性の見られない腫瘍内分布パターンを示す。Ａ−Ｂ、予め準備しておいた頭蓋内のＵ８７ＭＧ（Ａ）及びＵ２５１（Ｂ）神経膠腫を３日おきに、５ｍｇ／ｋｇの精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質又はヒトＩｇＧを静脈内に送達することにより治療した。結果は、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃが実験マウスの生存を有意に延長したが、ヒトＩｇＧは延長しなかったことを示している（ｐ＜０．００１）。各治療には６匹のＲａｇ−１マウスを用いた。Ｃ、頭蓋内の神経膠腫（Ｃ−ｂ及びＣ−ｄ）及び正常な、隣接した脳組織（Ｃ−ａ、及びＣ−ｃ）におけるｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質の分布。抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて融合タンパク質を検出した。バーは図ａ及びｂでは１００μｍであり、図ｃ及びｄでは５０μｍである。Ｄ、精製したＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質は、正常な宿主組織に対しては明らかな毒性を示さなかった。５ｍｇ／ｋｇのｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質（右）又はヒトＩｇＧ（左）を３日おきに注入により投与したＲａｇ−１マウス由来正常組織のＨ＆Ｅ染色像。バーは５０μｍ。
【図１４】[0059]Ａ．神経膠腫細胞の生死判別試験：ヒトＣＤ４４をノックダウンすると、ＧＢＭ細胞の二重ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２阻害剤、ＢＩＢＷ２９９２に対する反応が敏感になる。Ｂ．神経膠腫細胞の生死判別試験：ヒトＣＤ４４をノックダウンすると、ＧＢＭ細胞のｐａｎ  ＥＧＦＲ  ｅｒｂＢ−２／ｅｒｂＢ−４阻害剤、ＣＩ−１０３３に対する反応が敏感になる。Ｃ．神経膠腫細胞の生死判別試験：ヒトＣＤ４４をノックダウンすると、ＧＢＭ細胞のｃ−Ｍｅｔ阻害剤、ＳＵ１１２７４に対する反応が敏感になる。
【図１５】[0060]ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＢＭ細胞の化学療法及び標的剤に対する反応を敏感にする。Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability kit(Promega)を用い、製造業者の説明の説明に従って、神経膠腫細胞の生死判別試験を行った。１ウェル当たり１×１０５個のＵ８７ＭＧ細胞を３つのウェルにプレーティングした。図中に詳細を示したように、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質又はヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）を加えて又は加えずに、細胞を異なる濃度のＴＭＺ（Ａ）、ゲフィチニブ（Ｂ）、ＢＩＢＷ２９９２（Ｃ）、ＣＩ−１０３３（Ｄ）、又はＰＦ−２３４１０６６（Ｅ）で４８時間処理し、その後細胞の生存率を測定した。
【図１６】[0061]ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質は正常な細胞パネルに対して低い細胞毒性を示した。細胞の生死判別試験を図１５に記載したように行った。１ウェル当たり１×１０５個のＮＨＡ、正常なヒトシュワン細胞、ＨＵＶＥＣ、正常な線維芽細胞、及びＵ２５１ＧＢＭ細胞を、９６ウェルプレートの３つのウェルにプレーティングし、異なる濃度の精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質で４８時間処理し、その後細胞の生存率を測定した。
【図１７】[0062]新鮮なＧＢＭ組織からの初代ヒト神経膠腫瘍様塊（ＧＢＭ幹細胞、ＧＢＭＣＳＣ）の確立及び解析。Ａ、神経膠腫瘍様塊の自己再生能。Ａ−ａ、単一の初代ＧＢＭＣＳＣを無血清幹細胞培地中で維持した（ＳＣＣＭ）。ＳＣＣＭ中において、小さい（ｂ）、中位の（ｃ）、及び大きい（ｄ）ＧＢＭ細胞塊が、２〜３、４〜５、及び６〜７日間培養した後に形成された。Ｂ、神経膠腫瘍様塊を分離させ、ＳＣＣＭ中で１２時間培養し、そして神経膠腫幹細胞マーカー、ネスチン（Ｂ−ａ）又はＳｏｘ２（Ｂ−ｂ）陽性細胞を染色した。別のセットの細胞を星状細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で６日間培養し、その後分化した星状細胞特的マーカー、神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、Ｂ−ｃ）陽性細胞を染色した。図Ｂ−ｄ、非特異的な染色が生じなかったことを示す対照としては、二次抗体のみを用いた。バー、１５０μｍ。Ｃ、ヒト神経膠腫瘍様塊（ＨＧＳ）、ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１、を分離させ、支持細胞層無しで胚性幹細胞を維持及び増殖させるために設計されたＢＤバイオコートＴＭマトリゲルＴＭマトリックス６−ウェルプレート上にプレーティングした。これらの細胞にＧＦＰを含むレトロウイルスを導入した。ピューロマイシンを用いて選抜した後、薬剤耐性のプールした集団をばらばらの細胞になるまで懸濁し、超低接着性プレートに入れたＳＣＣＭ中で細胞塊を再形成させた。これら細胞塊における、再形成させた細胞塊におけるＧＦＰの発現（Ｃ−ａ）、形態（Ｃ−ｂ）及び合成図（Ｃ−ｃ）を示した。バーは３００μｍ。Ｄ、ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１細胞は、５×ｌ０４個の細胞を注入してから２５日後までに浸潤性頭蓋内腫瘍を形成し（Ｄ−ａ）、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質の過剰発現はＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１細胞の頭蓋内での成長を阻害する（Ｄ−ｂ）。
【図１８】[0063]ＧＢＭ患者由来の神経膠腫瘍様塊細胞であるＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１の形態は、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃ｌを含むレンチウイルス混合物を用いてＣＤ４４の発現をノックダウンすると、神経膠腫瘍様塊の形成が阻害されることを示している。
【図１９Ａ】[0064]ＣＤ４４の発現。Ａ：正常な結腸（各試験の左側）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ／より取得したデータ）と比較して、ヒト結腸癌（各試験の右側）ではＣＤ４４ｍＲＮＡの発現レベルが亢進されていることを示す棒グラフ。
【図１９Ｂ】[0064]ＣＤ４４の発現。Ｂ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いて、６つの正常な結腸組織試料（Ｂ−ａ）、６つの悪性結腸癌試料（Ｂ−ｂ）、及び６つの肝臓に転移した結腸癌（Ｂ−ｃ）について行ったＣＤ４４の免疫組織化学染色の代表図。
【図１９Ｃ】[0064]ＣＤ４４の発現。Ｃ：正常な結腸（各試験の左側）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ／より取得したデータ）と比較して、ヒト結腸癌（各試験の右側）ではＣＤ４４ｍＲＮＡの発現レベルが亢進されていることを示すもう１つの棒グラフ。
【図２０】[0065]Ａ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞におけるＣＤ４４の発現をノックダウンした。Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＨＣＴ１１６細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図２１】[0066]抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＫＭ２０Ｌ２ヒト結腸癌細胞におけるＣＤ４４の発現をノックダウンした。２１Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＫＭ２０Ｌ２ヒト結腸癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＫＭ２０Ｌ２細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図２２】[0067]抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いて、６つの正常な前立腺組織試料（Ａ）及び６つの悪性前立腺癌試料（Ｂ）について行ったＣＤ４４の免疫組織化学染色の代表図。悪性前立腺癌においてはＣＤ４４が亢進されていることを示している。
【図２３】[0068]Ａ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＰＣ３／Ｍヒト前立腺癌腫細胞におけるＣＤ４４の発現をノックダウンした。２３Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＰＣ３／Ｍヒト前立腺癌腫細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＰＣ３／Ｍ細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図２４】[0069]ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒト前立腺癌細胞に対する生体における有効な治療薬である。Ａ、ヒト前立腺癌細胞によるＣＤ４４の発現を、抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロットにより評価した。Ｂ、５×ｌ０６個のＰＣ３／Ｍ細胞を各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜１５０ｍｍ３に達するまで、腫瘍を〜２週間生育させた。形成された腫瘍の大きさの類似性によってマウスを６群に分け（６マウス／群）、そして注入量５μｌで、１０ｍｇ／ｍｌのｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、若しくはヒトＩｇＧ、又は０．９％ＮａＣｌを１日おきに４回腫瘍内に注入することにより治療した。対照群（ヒトＩｇＧ又は０．９％ＮａＣｌでの治療群）の腫瘍の最も長い径が〜１ｃｍに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとしてデータを表す。
【図２５】[0070]宿主の間質に浸潤したヒト悪性乳癌細胞は高レベルのＣＤ４４を発現し、乳癌の間質には高レベルのヒアルロン酸（ＨＡ）が蓄積される。ＣＤ４４タンパク質（Ａ〜Ｃ）の発現を、抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いた免疫組織化学染色により評価した。正常なヒト乳房上皮（Ａ）よりも、間質に浸潤した悪性乳癌細胞（Ｂ〜Ｃ）においてＣＤ４４タンパク質の発現が亢進された。さらに、正常な乳房の間質においてよりも（Ｄ）、乳癌の間質（Ｅ）において非常に高レベルのＨＡが蓄積された。ＨＡをビオチン化ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて検出した。６つの正常な乳房組織及び６つの悪性乳癌組織を用いた実験からの代表図を示す。バーは図Ａ、Ｃ〜Ｅでは５０μｍであり、図Ｂでは２００μｍである。
【図２６Ａ】[0071]抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ＭＸ−２ヒト乳癌細胞に、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＣＤ４４の発現をノックダウンした。２６Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＭＸ−２ヒト乳癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＭＸ−２細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図２７】[0072]Ａ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ＳＷ６１３ヒト乳癌細胞に、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＣＤ４４の発現をノックダウンした。Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＳＷ６１３ヒト乳癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＳＷ６１３細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図２８】[0073]ヒト乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）及び生体内異種稙片乳癌モデルの確立及び解析。Ａ、正常なヒト乳房上皮細胞（レーン１）、ＭＳＳＭ−ＢＣＳＣ−１、−２、及び−３（レーン２〜４）におけるＣＤ４４の発現を、抗ＣＤ４４ｍＡｂを用いたウェスタンブロットにより決定した。アクチンレベルをローディングコントロールとして用いた（下段）。Ｂ、ＣＤ４４、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、及びＳＳＥＡ１に対する抗体を用いた免疫細胞化学染色によって評価したように、ＢＣＳＣは高レベルの幹細胞マーカー及び低レベルのＣＤ２４を発現する。バーは１００μｍ。Ｃ−ａ〜ｃ、腫瘍様塊の自己再生能。Ｃ−ａ、単一の初代ＢＣＳＣを無血清幹細胞培地（ＳＣＣＭ）中で維持した。ＳＣＣＭでの培養４〜５、及び６〜７日後に、中位（Ｃ−ｂ）及び大きい（Ｃ−ｃ）腫瘍様塊が形成された。Ｃ−ｄ〜ｆ、腫瘍様塊の形態を親ＢＣＳＣ（ｄ）と比較すると、ＢＣＳＣにおいてＣＤ４４の発現をノックダウンすると細胞塊形成が阻害される（ｆ）が、標的をもたないｓｈＲＮＡはそのような効果をもたない（ｅ）ことを示している。バーは２００μｍ。Ｄ、定量解析により、細胞塊形成に及ぼすＣＤ４４ノックダウンの阻害効果を明かにした。無作為に選択した１０の、１００×の顕微鏡視野での細胞塊数を計測し、平均を計算して、平均＋／−ＳＤとして表した。Ｅ、ＭＳＳＭ−ＢＣＳＣ由来の皮下腫瘍の生物発光画像。
【図２９】[0074]ＣＤ４４の拮抗薬である、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒト乳癌幹細胞に対する生体内での有効な治療薬である。Ａ、精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の、抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット解析。Ｂ、ｌ×１０６ＭＳＳＭ−ＢＣＳＣ−１細胞を各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜２００ｍｍ３に達するまで、腫瘍を〜３週間生育させた。形成された腫瘍の大きさの類似性によってマウスを６群に分け（６マウス／群）、そして注入量５μｌで、１０ｍｇ／ｍｌのｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、若しくはヒトＩｇＧ、又は０．９％ＮａＣｌを１日おきに４回腫瘍内に注入することにより治療した。対照群（ヒトＩｇＧ又は０．９％ＮａＣｌでの治療群）の腫瘍の最も長い径が〜１ｃｍに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとしてデータを表す。
【図３０】[0075]Ａ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ＮＣＩ−Ｈ１２５ヒト肺癌細胞に、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＣＤ４４の発現をノックダウンした。Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＮＣＩ−Ｈ１２５ヒト肺癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＮＣＩ−Ｈ１２５細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図３１】[0076]Ａ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌細胞に、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＣＤ４４の発現をノックダウンした。Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図３２】[0077]Ａ：正常な卵巣（各試験の左側）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ／より取得したデータ）と比較して、ヒト卵巣癌（各試験の右側）ではＣＤ４４ｍＲＮＡの発現レベルが亢進されていることを示す棒グラフ。Ｂ〜Ｄ．ステージＩＩＩ／ＩＶ卵巣癌組織の間質は正常な卵巣（Ｂ）と比較して、高レベルのＣＤ４４（Ｃ）及び／又はヒアルロン酸（ＨＡ、Ｄ）を発現する。ＣＤ４４タンパク質及びＨＡのレベルを抗ＣＤ４４抗体（Santa Cruz、Ｂ及びＣ）及びビオチン化ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ（Ｄ）をそれぞれ用いた免疫組織化学染色により評価した。ＯＳＥ：卵巣表面上皮細胞。バーは図Ｃでは５０μｍ、図Ａ〜Ｂでは１００μｍ。
【図３３】[0078]Ａ：抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロット。ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞に、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入し、ＣＤ４４の発現をノックダウンした。Ｂ：ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞の生体での皮下成長が阻害されることを示す棒グラフ。ＯＶＣＡＲ−３細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを導入した（ｎ＝６）。
【図３４】[0079]卵巣癌幹細胞（ＯＣＳＣ、Ｂ〜Ｃ、Ｅ）及び生体内腹水腫瘍モデル（Ａ）の確立。Ｂ、ＣＤ４４（Ｂ−ａ）、Ｓｏｘ−２（Ｂ−ｂ）、Ｏｃｔ３／４（Ｂ−ｃ）、及びＮａｎｏｇ（Ｂ−ｄ）に対する抗体を用いた免疫細胞化学染色によって評価した、幹細胞マーカーの陽性発現を示す。バーは５０μｍ。Ｃ、ＭＳＳＭ−ＯＣＳＣ１細胞によるＲａｇ−１マウスでの腹水腫瘍の形成：ＭＳＳＭ−ＯＣＳＣ１細胞により、腹膜壁（Ｃ−ａ）、肝臓（Ｃ−ｂ）、及び腸間膜（Ｃ−ｃ）に付着した腫瘍が形成された。バーは１５０μｍ。Ｄ、ＣＤ４４（レーン３）又は標的をもたないｓｈＲＮＡ（レーン２）に対するｓｈＫＮＡを導入したＭＳＳＭ−ＯＣＳＣ１細胞でのＣＤ４４発現のウェスタンブロット解析。親細胞におけるＣＤ４４のレベルをレーン１に示す。ＭＳＳＭ−ＯＣＳＣはいくつかのＣＤ４４変異体及び標準的な形態のＣＤ４４であるＣＤ４４ｓ（下側のバンド）を発現する。Ｅ−ａ〜ｃ、ＭＳＳＭ−ＯＣＳＣ−１細胞塊の自己再生能。懸濁したＯＣＳＣを無血清幹細胞培地中で、２〜３（ａ）、４〜５（ｂ）、及び６〜７（ｃ）日間維持した。Ｅ−ｄ〜ｆ、ＣＤ４４はＯＣＳＣの自己再生に必要である：ＣＤ４４をノックダウンすると（Ｄ−ｆ）ＯＣＳＣ細胞塊の形成が阻害されるが、親（Ｄ−ｄ）又は標的をもたないｓｈＲＮＡ（Ｄ−ｅ）では阻害されない。Ｆ、Ｄ−ｄ〜ｆの定量解析を示す。２０の無作為に選択した１００×の顕微鏡視野での細胞塊数を計測し、平均を算出し、そして平均＋／−ＳＤで表した。
【図３５】[0080]ヒトの黒色腫（Ａ〜Ｂ）及び黒色腫細胞（Ｃ）においてはＣＤ４４の発現が亢進される。Ａ−Ｂ、タラントフ（Ｔａｌａｎｔｏｖ）黒色腫データセット（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）におけるＣＤ４４のｍＲＮＡレベル。Ｃ、ヒトメラニン細胞及び黒色腫細胞でのＣＤ４４の発現を、抗ＣＤ４４抗体を用いたウェスタンブロットにより評価した。
【図３６】[0081]ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は生体内で、ヒト黒色腫の成長を阻害する。Ａ、ヒトＭ１４黒色腫細胞による、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質の過剰発現（レーン１〜３）。Ｂ、５×１０６個の、それぞれ異なるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を発現している、又は空の発現ベクターを導入したＭ１４細胞を各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。〜４週間、腫瘍を生育させた。実験の終了時に全腫瘍を摘出し、重量を測定した。データは、腫瘍重量の平均（グラム）＋／−ＳＤとして表す。
【図３７】[0082]ヒト明細胞肉腫及び腎細胞癌（試験右側）では、正常な胎児腎臓（試験左側）よりもＣＤ４４のｍＲＮＡレベルが亢進される。データはｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）より取得した。
【図３８】[0083]ヒト頭頸部扁平上皮癌（Ａ、試験の右側）及び腎細胞癌（Ｂ、試験の右側）では、正常な口腔粘膜（Ａの左側）又は正常な腎組織（Ｂの左側）と比較して、ＣＤ４４のｍＲＮＡレベルが亢進されている。データはｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）より取得した。
【図３９】[0084]ヒト口腔癌（左図）、頭頸部扁平上皮癌（中央の図）、及び舌扁平上皮癌では、それらの正常な対応部と比較して、ＣＤ４４のｍＲＮＡレベルが亢進されている。データはｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）より取得した。
【図４０】[0085]ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃは生体内において、ヒト頭頸部癌細胞の皮下成長を阻害する。Ａ、ヒト頭頸部癌腫細胞でのＣＤ４４の発現を、抗ＣＤ４４抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロットにより評価した。これら癌細胞におけるＣＤ４４の発現レベルは、それらの生体内での腫瘍原性と相関する。Ｂ、ＳＣＣ−４頭頸部癌腫細胞での、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質の過剰発現。Ｃ、それぞれ異なるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を発現している、又は空の発現ベクターを導入したＳＣＣ−４細胞５×１０６個を、各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜２ヶ月の間生育させた。実験終了時に全腫瘍を摘出し、重量を測定した。データは、腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとして表す。
【図４１】[0086]Ａ、ヒト膵癌細胞（ＢＸＰＣ−３、ＰＡＮ−０８−１３、ＰＡＮ−０８−２７、及びＰＡＮ−１０−０５）並びにヒト肝細胞の癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）におけるＣＤ４４の発現。Ｂ、ヒトＢＸＰＣ−３膵臓細胞（レーン１〜３）又はヒトＳＫ−Ｈｅｐ−１肝細胞の癌細胞（レーン４〜６）での、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質の過剰発現。Ｃ、それぞれ異なるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を発現している又は空の発現ベクターを導入したＢＸＰＣ−３（Ｃ−ａ）又はＳＨ−Ｈｅｐ−１（Ｃ−ｂ）細胞５×１０６個を、各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。５〜６週間までの期間、腫瘍を生育させた。実験終了時に全腫瘍を摘出し、重量を測定した。データは、腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとして表す。
【図４２】[0087]びまん性胃腺癌（左図）、混合型胃腺癌（中央図）、及び腸型胃腺癌（右図）では、正常な胃粘膜と比較して、ＣＤ４４のｍＲＮＡが亢進されている。データはｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）より取得した。
【図４３】[0088]食道と比較した場合、食道腺癌ではＣＤ４４のｍＲＮＡが亢進されている。データはｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）より取得した。
【図４４】[0089]乳癌を有するマウス（ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ−６３４Ｍｕｌ／Ｊ及びＦＶＢ−Ｔｇ−ＭＭＴＶ−Ｅｒｂｂ２−ＮＫ１Ｍｕｌ／Ｊマウス）又は神経膠腫（ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１及びＧ１２６１細胞）を移植したマウス由来の血漿試料では、腫瘍を有なさい対照マウスよりも高レベルのヒアルロン酸（ＨＡ）が検出された。血漿におけるＨＡレベルを、ＥＬＩＳＡ及びビオチン化したｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて測定した。
【図４５】[0090]ｖ−５エピトープタグを付けた可溶性ＣＤ４４ｓのウェスタンブロットによる発現。Ｃｏｓ−７（レーン１、２、３）及び２９３細胞（レーン４、５）に、空の発現ベクター（レーン３）及びＣＤ４４ｓｖ５発現コンストラクト（レーン１、２、４、５）を含むレトロウイルスを導入した。ピューロマイシン耐性のプールしたＣｏｓ−７及び２９３細胞集団を、４８時間培養し、そして無血清細胞培養上清を回収し、抗ｖ５  ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットにより解析した。
【図４６】[0091]ＣＤ４４のエクソン構成。ＣＤ４４の２０個のエクソンと、ＣＤ４４変異体の１０個のエクソンを示す。ＣＤ４４ｓはエクソン１〜５、エクソン１６〜１８、及びエクソン２０を含む。ＴＭは膜貫通を、ＬＣＴは長い細胞質尾部(long cytoplasmic tail)を表す。エクソン１９は短い細胞質尾部(short cytoplasmic tail)をコードする。ＣＤ４４のＮＨ２−末端に共通の細胞外ドメイン（配列番号７）はエクソン１〜５にコードされている。大部分のＣＤ４４アイソフォームはエクソン１〜５、エクソン１６〜１８、及びエクソン２０を含み、そして異なる変異型エクソン（ｖ１−ｖ１０）を含む場合も又は含まない場合もある。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
[0092]本発明は、哺乳動物の癌を治療、予防、又は診断するための医薬組成物及び方法を提供する。本発明はさらに、哺乳動物の神経膠腫を治療又は予防するための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は、哺乳動物の多形性膠芽腫及びその他の癌型を治療又は予防するための医薬組成物及び方法を提供する。本発明はさらに、神経膠腫細胞及びその他の癌型の細胞の、神経膠腫及びその他の癌型への治療による酸化、細胞毒性及び標的治療ストレスに対する感受性を高めるための医薬組成物及び方法を対象とする。酸化ストレスは、化学療法又は放射線治療を含むがこれらには限定されない治療によって誘導される。一側面では、ＣＤ４４拮抗薬として作用するＣＤ４４融合タンパク質を、神経膠腫又は結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、黒色腫、腎細胞癌、胃癌、食道癌、膵癌、肝臓癌、及び頭頸部癌を含むその他の癌型の治療、予防、又は診断のために哺乳動物に投与する。別の側面では、癌幹細胞を除去及び／又は抑制するために、ＣＤ４４融合タンパク質を単独で及び／又はその他の治療介入と併用して投与する。標的治療はＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３、ｅｒｂＢ−４及びｃ−Ｍｅｔ受容体キナーゼ又はその他の受容体チロシンキナーゼの阻害剤であってもよい。別の側面では、標的治療はｃＩＡＰ、ＸＩＡＰ、及びサバイビンを含むＩＡＰの阻害剤であってもよい。一層さらに別の側面では、標的治療はｐ５３、ｐ２１、プーマ、及びｐ３８／ＪＮＫキナーゼのエンハンサー／刺激剤／安定化剤である。別の側面において標的治療は、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、プロテアソーム阻害剤、及び血管形成阻害剤の阻害剤を含む、癌細胞に対するアポトーシスストレスを促進する又は誘導する薬剤である。一層さらに別の側面において標的治療は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤である。
【００３１】
神経膠腫
[0093]神経膠腫は原発性脳腫瘍の最も一般的な型であり、かつ、神経前駆細胞の形質転換から生じ得る様々な度合いの分化及び悪性度を有する一群の腫瘍を構成する（Giese et al., 2003; Maher et al., 2001）。これらの腫瘍の内で最も悪性なものは多形性膠芽腫（ＧＢＭ）としても知られる星細胞腫の悪性度４であり、化学療法、放射線治療、及び現存する標的治療に対するその耐性から、星細胞腫の悪性度４は不治である（Davis et al., 1998）。本実施例において示したように神経膠腫は、高レベルの、主要な細胞表面ＨＡ受容体であるＣＤ４４を発現している。
【００３２】
[0094]細胞毒性薬、放射線及び標的治療への耐性が、ＧＢＭ及びその他の悪性癌の治療を成功させるための主な障害となっている。増加している証拠は、神経膠腫ＣＳＣを含む、化学療法及び放射線治療に対する高い耐性をもつ癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在、及びこれらが治療介入後の、ＧＢＭを含む悪性癌の再発の原因であることを示唆している（Hambardzumyan et al., 2008; Reya et al., 2001）。膠芽腫ＣＳＣの形成及び維持におけるＣＤ４４の役割を明らかにする試みは始まったばかりであるが、ＣＤ４４は白血病及び乳、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、及び頭頸部癌を含む数多くの腫瘍における主要な細胞表面ＣＳＣマーカーとして確立されている（Croker and Allan, 2008; Reya et al. 2001; Stamenkovic and Yu, 2009）。ＣＤ４４が骨髄における白血病ＣＳＣの生着に必要であること（Jin et al., 2006; Krause et al., 2006）、及び結腸直腸癌ＣＳＣと機能的に関連していること（Du et al., 2008）が示されてきた。これらの観察は、ＣＳＣの維持及び／又は機能においてＣＤ４４が重要な役割を担っている可能性を示唆している。本実施例は、ＣＤ４４がＧＢＭ細胞でのヒッポストレス／アポトーシスシグナル伝達経路の活性化を弱め、生体外ではＧＢＭ細胞をテモゾロミド（ＴＭＺ）及び酸化ストレスから保護し、そして生体内では化学的予防機能をもたらすことを示すものである。さらに、ＣＤ４４の発現をノックダウンすると神経膠腫瘍様塊の自己再生能が阻害され、ＣＤ４４の拮抗剤であるｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させるとＧＢＭＣＳＣの生体での成長が阻害される。これらは、ＣＤ４４が癌幹細胞の維持において重要な役割を担っていることを示唆している。
【００３３】
乳癌
[0095]乳癌は米国女性で最も多く見られる癌であり、女性における、癌による死亡の第二原因である。早期検出及び治療の改善により、乳癌死亡率は徐々に低下している。しかしながら、２００９年の乳癌による死亡は、未だに４０，１７０例あったと予測されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｔｙｐｅｓ／ｂｒｅａｓｔ）。死亡の大部分は乳癌細胞の転移能、及び現行の治療に対する耐性を生じる能力によって引き起こされている。この事実により、悪性乳癌のこれら致死の能力に対抗する、より有効な及び新規の標的治療が早急に必要とされている。癌幹細胞（ＣＳＣ）の分野における近年の進歩により、治療耐性及び乳癌を含む悪性癌の再発は、治療介入に対して高い耐性をもつ、乳房ＣＳＣ（ＢＣＳＣ）を含むごく少量のＣＳＣの存在による可能性があることが示された（Al-Hajj et al., 2003; Dean et al., 2005; Reya et al., 2001）。ＣＳＣは、それらの自己再生能、様々な細胞系統に分化することができる能力、及び腫瘍細胞の組織を再構成することのできる能力によって特徴付けられる（Al-Hajj et al., 2003; Reya et al., 2001）。
【００３４】
[0096]乳癌には、腫瘍細胞及び宿主の間質を含む、不均一な細胞集団が含まれる。多くの癌研究は癌細胞に焦点を当ててきた。増加している証拠により、微小環境が乳癌の進行及びそれらの治療に対する反応の制御において必須の役割を担っていることが示されてきた（Al-Hajj et al., 2003; Liu et al., 2007）。さらに、ＢＣＳＣの維持には十分な宿主微小環境が必要である。そのため、この致死的な疾患を根絶するためには、ＢＣＳＣ及びそれらの微小環境を標的とする新しい治療薬の開発が必須である。腫瘍細胞及びそれらの微小環境との間の物理的な相互作用及び機能的なクロストークは主に、細胞間及び細胞−ＥＣＭ（細胞外マトリックス）間の接着に関与する、細胞表面受容体によって仲介される。ＣＤ４４は、ＥＣＭに構成要素として豊富に含まれるヒアルロン酸（ＨＡ）の主要な細胞表面受容体であり、かつ、ＢＣＳＣを含むＣＳＣの重要なマーカーである（Collins et al, 2005; Patrawala et al., 2006; Ponti et al., 2005; Reya et al., 2001）。ＣＤ４４＋／ＣＤ２４-ＢＣＳＣは高い腫瘍原性、転移可能性、及び化学耐性を示す（Collins et al., 2005; Reim et al, 2009; Shipitsin et al., 2007）。ＣＤ４４のリガンドであるＨＡの乳癌間質における蓄積は、予後不良と相関している（Tammi et al., 2008）。
【００３５】
前立腺癌
[0097]前立腺癌は米国人男性の癌による死亡の第二原因である。ホルモン非依存性／難治性転移性前立腺癌（ＨＲＰＣ）の予後は非常に悪く、後期疾患のための治療の選択肢は限られている。そのため、この致死的な疾患に対抗するためのより効果的な治療及び新規標的治療が早急に必要とされている。これを達成するためには、まず、前立腺癌の進行、転移、及び化学療法に対する耐性に重要な役割を担っている新規標的を同定することが必須である。ＣＳＣ研究における近年の進歩により、ＣＳＣが化学療法及び放射線治療に対して高い耐性をもち、治療介入後の腫瘍再発の原因であると考えられることが示された（Dean et al., 2005; Reya et al., 2003）。ＣＤ４４は、前立腺癌を含む様々なヒト癌の、幹細胞又は始原細胞の主要な細胞表面マーカーである（Collins et al., 2005; Hurt et al., 2008; Maitland and Collins, 2008）。
【００３６】
[0098]現在の抗癌治療及び標的選択は、その活性が癌細胞を弱めると考えられる（Sharma et al., 2007）、高頻度で変異したキナーゼに特に集中している。これらの手法は概念的には有効であり、そして著明な効果に支持されているが、それらは、耐性をもつ腫瘍細胞の出現により妨害される。これらの腫瘍細胞は、標的そのものの変異特性に関係している可能性のある機序を介して標的としたシグナル伝達経路をバイパスすることができる。現在では主に、そのシグナル伝達経路が見たところいかに重要であっても、１つのシグナル伝達経路のみを標的としている治療介入は、癌細胞が新しい遺伝的及び後成的な変化を獲得するにつれて比較的容易に回避されると考えられている。そのため、代替手法は、腫瘍形成に重要な誘因とは異なり、単一の機能的な腫瘍細胞特性のいずれにおいても中心的なものではないが、異なるシグナル伝達経路の共受容体としての調節、腫瘍細胞と宿主組織の微小環境との間の相互作用、及び様々な形態のストレスに対する腫瘍細胞の反応を含む、複数の機能に関与する多機能分子を同定するものになるかも知れない。腫瘍の成長及び進行におけるそれらの明かな有効性から、そのような分子は悪性腫瘍で亢進されているが、高頻度には変異を生じないと考えられる。腫瘍−宿主間相互作用の仲介及びいくつかの重要なシグナル伝達経路活性の調節に必須な、これら多機能型の標的を選択的に阻害すると、特に化学療法及び放射線治療、並びにこれらの必須なシグナル伝達経路に対する、及び／又は癌細胞に対するストレスを促進・誘導する標的治療との併用で阻害すると、その結果、現在の治療を阻む薬剤耐性が克服され、より高い効果及び／又は臨床的有益性の持続が達成される可能性がある。本発明は、ＣＤ４４が複数の癌に対するそのような標的の１つであり、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質などの可溶性ヒトＣＤ４４融合タンパク質を含むＣＤ４４の拮抗薬が抗癌剤として有効であることを示すものである。我々の前臨床試験の結果は、悪性神経膠腫、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膵癌、肝臓癌、及び頭頸部癌、結腸癌、卵巣癌、及び肺癌においてＣＤ４４を標的とする治療の可能性を強く支持するものである。例えば、図３〜４、２３、２６〜２７、３０〜３１、及び３３は、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡが、動物モデル中のヒト膠芽腫（Xu et al., 2010）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、及び卵巣癌の生体での成長を阻害することを示している。図１２、１７、３６、４０、及び４１は、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の発現が、動物モデル中のヒト膠芽腫、黒色腫、頭頸部癌腫、膵癌、及び肝臓癌の生体での成長を阻害することを示している。図１３、２４、及び２９は、精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質が、動物モデル中のヒト膠芽腫、乳癌、及び前立腺癌を生体内で阻害することを示している。さらに、これらの包括的なデータから、これらの癌型ではＣＤ４４が主要な治療標的であり、そしてＣＤ４４融合タンパク質及びＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを含むＣＤ４４の拮抗薬が、ヒト膠芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌腫、膵癌、及び肝臓癌に対する有効な薬剤であることが確立された。
【００３７】
[0099]多様な癌型でＣＤ４４が亢進されている、及び／又は重要な役割を担っているという事実に基づき、ヒト神経膠腫結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫（Stamenkovic and Yu, 2009）、頭頸部癌腫（Aillles and Prince, 2009; Nelson and Grandis, 2007）、膵癌（Hong et al., 2009; Klingbeil et al., 2009; Lee et al., 2008）、及び肝臓癌（Barbour et al., 2003; Yang et al., 2008）、に加えて、以下の癌、すなわち悪性中皮腫（Ramos-Nino et al., 2007; Tajima et al., 2010）、肉腫（Yoshida et al., 2008）、腎細胞癌（図３７〜３８、）（Lim et al, 2008; Lucin et al., 2004; Yildiz et al., 2004）、食道癌（図４３）（Li et al., 2005; Nozoe et al., 2004）、ウィルムス腫瘍（Ghanem et al, 2002）、膀胱癌（Stavropoulos et al., 2001）、多発性骨髄腫（Mitsiades, 2005; Ohwada et al., 2008）、胃癌（図４２）、及び神経鞘腫（Bai et al., 2007）においてもＣＤ４４が治療標的となる可能性がある。
【００３８】
ＣＤ４４及び細胞のシグナル伝達
[00100]ＣＤ４４はいくつかのシグナル伝達経路の調節に関与してきた。ＣＤ４４はｃ−Ｍｅｔの共受容体として機能し（Matzke et al., 2007）、そしてＲＴＫのＥｒｂＢファミリーからのシグナルを調節する（Turley et al., 2002）。ＣＤ４４はｃ−Ｓｒｃ及び焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）（Turley et al., 2002）を活性化し、そしてＲａｃ１の活性化を介して細胞運動を促進する（Murai et al., 2004）。しかしながらこれまでのところ、ＣＤ４４由来のシグナルを仲介する、核となる単一の完全な経路は確立されていない。ＣＤ４４は、ＥＲＭファミリータンパク質（Tsukita and Yonemura, 1997）及び、神経線維腫症２型（ＮＦ２）遺伝子の産物であるマーリン（Morrison et al., 2001; Sainio et al., 1997）と相互作用する。マーリン突然変異又はマーリン発現の欠損は、神経鞘腫、髄膜腫、及び上衣腫の発症によって特徴付けられるＮＦ２疾患を引き起こす（Gutmann et al., 1997; Kluwe et al., 1996）。ショウジョウバエでは、マーリンはヒッポシグナル伝達経路の上流で機能するが、マーリンと哺乳類のヒッポ経路オルソログとの間のはっきりとした関係については完全には明らかになっていない。近年我々は、マーリンがヒトＧＢＭの強力な阻害剤であること、及び神経膠腫細胞ではＭＳＴ１／２−Ｌａｔｓ２のシグナル伝達を活性化することにより、マーリンがＭＳＴ１／２の上流で機能することを示した（Lau et al., 2008）。これらの観察は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路がＧＢＭの進行において重要な役割を担っている可能性を示唆している。本発明は、酸化及び細胞毒性に反応して内生ＣＤ４４が枯渇すると、癌細胞では、ＭＳＴ１／２及びＬａｔｓ１／２の強固かつ持続したリン酸化／活性化、ＹＡＰのリン酸化／不活性化、及びｃＩＡＰ１／２の発現の低下が生じることを示すものである。これらの効果は、マーリンのリン酸化／不活性化及び切断型カスパーゼ−３レベルの上昇と関係している。一方、より高レベルの内生ＣＤ４４はマーリンのリン酸化／不活性化を促進し、哺乳類でのヒッポシグナル伝達経路に同等な経路のストレス誘導性の活性化を阻害し、そしてｃＩＡＰ１／２を亢進し、これらにより、アポトーシスの指標であるカスパーゼ−３の開裂の阻害を引き起こす。これらの結果は、ＣＤ４４が哺乳類のヒッポシグナル伝達経路（マーリン−ＭＳＴ１／２−Ｌａｔｓ１／２−ＹＡＰ−ｃＩＡＰ１／２）の上流に位置することを示し、そしてＣＤ４４が、ストレス及びストレス誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の応答を弱める機能を有することを示唆している。
【００３９】
[00101]さらに本発明は、ＣＤ４４をノックダウンすると、酸化及び細胞毒性ストレスに曝露した神経膠腫細胞において、ＭＳＴ１／２キナーゼのエフェクターとして既知の、ｐ３８／ＪＮＫストレスキナーゼの活性化が上昇及び持続することを示している。加えて酸化ストレスはＣＤ４４欠損神経膠腫細胞において、ＪＮＫ／ｐ３８の下流エフェクターとして既知のｐ５３、及びその標的遺伝子であるｐ２１及びプーマの持続した上向き調節を誘導したが、高レベルの内生ＣＤ４４を含むＧＢＭ細胞はＪＮＫ／ｐ３８の活性化を弱め、そしてｐ５３、ｐ２１、及びプーマの誘導を阻害した。これらの機械論的な結果は、より良い臨床転帰を達成するためにＣＤ４４融合タンパク質を含むＣＤ４４拮抗薬を、ｐ５３、ｐ２１、プーマ、及びｐ３８／ＪＮＫキナーゼの薬理学的エンハンサー／刺激剤／安定剤並びにｃＩＡＰ及びＸＩＡＰを含むＩＡＰの阻害剤との相乗効果において使用できることを示唆している。
【００４０】
[00102]受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は様々な正常な細胞機能、形質転換、及び腫瘍の進行において中心的な役割を果たしている。肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及びその受容体であるｃ−Ｍｅｔが脳腫瘍の成長及び進行を促進することが知られている（Abounader and Laterra, 2005）。ＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの発現の上昇はしばしば、神経膠腫の悪性度、血管密度、及び予後不良と関連している。さらに、ＨＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔの過剰発現は、それらの阻害とは対照的に、神経膠腫形成を遮断する（Abounader and Laterra, 2005）。加えて、ＥＧＦＲの増幅がＧＢＭ症例のおよそ４０％において生じ、予後不良の予測因子となっている（Voelzke et al., 2008）。本発明は、ＣＤ４４を枯渇させると、ＮＧＦ又はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ではなく、ＥＧＦＲリガンド及びＨＧＦを用いて誘導したＥｒｋ１／２の活性化が阻害されることを示しており（図７）、このことはＣＤ４４がこれらＲＴＫの共受容体／刺激剤として機能しており、かつ、悪性神経膠腫細胞及びその他の癌型におけるそれらのシグナル伝達活性を強めることを示唆している。ＲＴＫのシグナル伝達を制御するＣＤ４４の詳細な機序についてはさらなる研究が必要であるが、ＨＡ受容体としてのその機能により説明できる可能性がある。ＣＤ４４は細胞表面において、その多価リガンドであるＨＡによる結合によって、大きな塊を形成している。これらの凝集体はしばしば、複数のシグナル伝達イベントの開始が起こる、脂質ラフト又はその他の特定の膜ドメイン中に存在する。加えて、ＣＤ４４は、ＨＢ−ＥＧＦ及び塩基性ＦＧＦを含む多数のヘパリン結合成長因子と結合する、細胞表面プロテオグリカンとして発現する場合もある。ＲＴＫ共受容体としてＣＤ４４は、そのため、ＲＴＫの多量体化を促進することにより及び／又は対応するＲＴＫの適切なリガンドを提示することにより、シグナル伝達を高めることができる。これらの機械論的な結果は、より良い臨床転帰を達成するために、ＣＤ４４融合タンパク質を含むＣＤ４４拮抗薬を、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−４及びｃ−Ｍｅｔ受容体キナーゼの薬理学的な阻害剤との相乗効果において使用することが可能であることを示唆している。
【００４１】
ＣＤ４４融合タンパク質
[00103]ＣＤ４４は複数のリガンドの受容体であるため、ＣＤ４４の細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）のような非ＣＤ４４分子との融合タンパク質を用いた手法は、ＣＤ４４に対する機能遮断抗体よりも優れたものである。ＣＤ４４の各遮断抗体は１つ又はいくつかのリガンドの相互作用のみを遮断することしができないが、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ４４の細胞外ドメイン介在性の、ＣＤ４４とそのリガンドとの間の全ての相互作用を遮断する。加えて、ＣＤ４４はプロテアーゼによって細胞表面から遊離されるが、このことはシグナル伝達経路及びＣＤ４４介在性機能を誘引するものとして機能的に重要な過程だと考えられている（Stamenkovic and Yu, 2009）。可溶性ＣＤ４４融合タンパク質は、ＣＤ４４シェダーゼと相互作用するドメインを含む。そのためＣＤ４４融合タンパク質は、全ＣＤ４４リガンドを遊離させ、そして捕捉することができる。ＣＤ４４融合タンパク質のこれらの特徴は、ＣＤ４４の機能に拮抗するための長所となる。
【００４２】
[00104]それぞれ異なるＣＤ４４細胞外ドメインのセグメントとヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）との融合タンパク質であるＣＤ４４−Ｆｃタンパク質は、多機能性膜貫通受容体の「トラップ」型融合タンパク質として作用する。これは腫瘍全体や癌幹細胞を標的とするだけでなく、腫瘍微小環境（内皮細胞、周細胞、白血球、炎症性細胞、及び線維芽細胞、を含むがこれらには限定されない浸潤宿主細胞、腫瘍−宿主細胞間相互作用、並びに腫瘍−宿主ＥＣＭ間相互作用など）もまた標的とする。鍵となる、腫瘍細胞とその微小環境との間の相互作用及びクロストークは、細胞間接着及び、有力な治療標的となる可能性のあるＥＣＭ受容体により仲介される（Marastoni et al., 2008）。ＣＤ４４の発現はしばしば、腫瘍細胞、癌幹細胞、及び腫瘍微小環境においてより高く、正常な組織においてより低い。そのため、ＣＤ４４は癌治療の理想的な標的である。
【００４３】
[00105]ＣＤ４４タンパク質は、ＮＨ−末端ＨＡ−結合領域及び膜に近い領域をもつ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及びＣＯＯＨ−末端細胞質尾部（ＣＴ）を含む（Peach et al., 1993; Stamenkovic et al, 1989）。１つのＣＤ４４遺伝子は２０のエクソンを含んでいる。数多くのＣＤ４４変異体を生じさせるために、これらのうちの少なくとも１０のエクソン、すなわちエクソン６〜１５又は変異体エクソンｖ１〜ｖ１０を選択的スプライシングすることができる（Screaton et al., 1993; Screaton et al., 1992）。ＣＤ４４の標準的な形態（ＣＤ４４ｓ）は、転写産物の選択的スプライシングによる産物であり、基本的なエクソンの全て、すなわちエクソン１〜５、１６〜１８及び２０を含む。
【００４４】
[00106]本発明の一側面では、Ｄ４４拮抗薬として作用するＣＤ４４融合タンパク質を、神経膠腫又はその他の癌型の治療又は予防のために哺乳動物に投与する。一側面では、ＣＤ４４融合タンパク質を、さらなる抗癌治療又は神経膠腫を含む腫瘍の外科的切除の前に、外科的切除と同時に、又は後に投与する。ＣＤ４４の枯渇が神経膠腫瘍様塊（図１８）、腫瘍様塊（図２８Ｃ）、及び卵巣ＣＳＣ細胞塊（図３４Ｅ）の形成を阻害すること、及びＣＤ４４の過剰発現がＧＢＭＣＳＣの生体での成長を阻害すること（図１７Ｄ）、及び精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質がＢＣＳＣの生体での成長を阻害すること（図２９）を我々が示してきたように、ＣＤ４４は癌幹細胞にとって重要である。ＣＳＣはしばしば癌治療後も生き残るため、目に見える疾患がなかったとしても、これら治療後のＣＤ４４融合タンパク質による治療は癌の再発及び転移の阻害に重要である。別の側面では、細胞毒性ストレス又はその他の形のストレスを誘導する治療の前に、それら治療と同時に、又は後に、ＣＤ４４融合タンパク質を投与する。一層さらに別の側面では、ＣＤ４４融合タンパク質を単剤として、又は神経膠腫及びその他の癌型の外科的治療の前若しくは後に、その他の抗癌治療と併用して投与する。この場合、ＣＤ４４融合タンパク質とさらなる治療薬との投与は相乗効果をもたらす。一側面では、ＣＤ４４融合タンパク質を精製タンパク質として投与する。別の側面では、ＣＤ４４融合タンパク質を、ウイルス粒子中にパッケージングした若しくはパッケージングしていないウイルス発現ベクターの形態で、又は担体としてナノ粒子を用いて投与する。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。一側面においてアデノウイルスは、複製しない、遺伝子を挿入しない、血清型２、５、６、７、又は８アデノウイルスベクターである。一側面においてＣＤ４４融合タンパク質は、ＣＤ４４の細胞外ドメインのそれぞれのセグメントに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含む、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質である。別の側面においてＣＤ４４細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ由来である。さらに別の側面においてＣＤ４４細胞外ドメインは、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ１０、又はＲ４１Ａ変異を含む上記ＣＤ４４のアイソフォームに由来するものである。さらに別の側面において細胞外ドメインは、エクソン１〜１７の異なる組み合わせ、又はＣＤ４４の細胞外ドメインの異なる欠損、変異、重複、若しくは倍加に由来する。
【００４５】
[00107]ＣＤ４４の細胞外ドメインはエクソン１〜５、ｖ１〜ｖ１０（又はエクソン６〜１０）、エクソン１６、及びエクソン１７によりコードされている。ＣＤ４４ｓの細胞外ドメインは、エクソン１〜５、１６、及び１７を含む。ＣＤ４４変異体（ＣＤ４４ｖ２−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、及びＣＤ４４ｖ２）は、エクソン１〜５、それぞれ異なる組み合わせの変異体エクソン（ｖ２〜ｖ１０）、エクソン１６、及びエクソン１７を含む（図４６）。
【００４６】
表１：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ）免疫グロブリン重鎖定常領域ガンマ１の定常領域（Ｆｃ）、ヒトＣＤ４４の野生型細胞外ドメイン、Ｒ４１Ａ変異を含むヒトＣＤ４４の細胞外ドメイン、及びＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【００４７】
【表１Ａ】
2013502421.tif 000003
【００４８】
【表１Ｂ】
2013502421.tif 000004
【００４９】
【表１Ｃ】
2013502421.tif 000005
【００５０】
【表１Ｄ】
2013502421.tif 000006
【００５１】
【表１Ｅ】
2013502421.tif 000007
【００５２】
【表１Ｆ】
2013502421.tif 000008
【００５３】
【表１Ｇ】
2013502421.tif 000009
【００５４】
【表１Ｈ】
2013502421.tif 000010
【００５５】
【表１Ｉ】
2013502421.tif 000011
【００５６】
【表１Ｊ】
2013502421.tif 000012
【００５７】
【表１Ｋ】
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【００５８】
【表１Ｌ】
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【００５９】
【表１Ｍ】
2013502421.tif 000015
【００６０】
【表１Ｎ】
2013502421.tif 000016
【００６１】
【表１Ｏ】
2013502421.tif 000017
【００６２】
[00108]免疫グロブリン重鎖定常領域ガンマ１の定常領域（Ｆｃ）（配列番号１）及びＣＤ４４シグナルペプチド（配列番号２）からなる融合タンパク質（配列番号３）を、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の抗腫瘍活性の陰性対照として用いることができる。いくつかの態様では、ＣＤ４４融合タンパク質のＣＤ４４細胞外ドメインは、ヒトＣＤ４４遺伝子のエクソン１〜１７（図４６）のそれぞれ異なる組み合わせによってコードされるＣＤ４４細胞外ドメインの断片を含む。いくつかの態様では、ＣＤ４４の細胞外ドメインは任意の長さであってよく、それらは細胞外ドメインの約５０〜約１００、約１００〜約１５０、約１００〜約２００、約１００〜約３００、約１００〜約４００、約１００〜約５００、約１００〜約６００、又は約１００〜約６５１アミノ酸残基を含む。いくつかの態様においてＣＤ４４の細胞外ドメインは、ポリペプチド配列の修飾を含む。修飾は、変異、挿入、置換、欠損などのいずれの修飾であってもよいが、これらには限定されるものではない。いくつかの態様において断片は、ＡｒｇからＡｌａへの変異を含む。いくつかの態様においてＡｒｇからＡｌａへの変異は、完全長ＣＤ４４タンパク質の４１番目の位置に対応する位置に生じる（一例を配列番号６に示す）。当業者は、単剤として及び／又はその他の抗癌治療との併用のいずれかにおいて投与する場合に、どの修飾がＣＤ４４融合タンパク質の抗癌効果を高めるかを決定することができる。当業者はこれを、例えば、修飾されたＣＤ４４融合タンパク質を単剤として及び／又はその他の抗癌治療と併用する場合の抗癌効果を決定するための、腫瘍成長実験及び転移実験を生体で実施することにより、行うことができる。
【００６３】
[00109]別の側面においてＣＤ４４融合タンパク質は、別の非ＣＤ４４分子に融合させた野生型ＣＤ４４又はＲ４１ＡＣＤ４４変異体の細胞外ドメインの、それぞれ異なるセグメントを含む。いくつかの態様において非ＣＤ４４分子は、毒素、ペプチド、ポリペプチド、小分子、薬剤などである。いくつかの態様において非ＣＤ４４分子は、６−Ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴポリペプチド、ＨＡ−タグ、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）、又はｖ５−タグである。いくつかの態様では、精製後にこれらのタグをタンパク分解による切断によって除去できるように、タンパク質分解酵素開裂部位をタグ配列の前に挿入する。
【００６４】
[00110]ヒト可溶性ＣＤ４４−Ｆｃ（ｈｓＣＤ４４）融合タンパク質を、実施例の材料及び方法の部分に記載したように、ヒトＣＤ４４ｓの細胞外ドメイン（配列番号４）、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（配列番号７＋配列番号８）、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０（配列番号７＋配列番号９）、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０（配列番号７＋配列番号２０）、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ（配列番号６＋配列番号８）、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ（配列番号６＋配列番号９）、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ（配列番号５）をヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）に融合することにより生成する。例えば、完全長ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０変異体は、エクソン１〜５、ｖ３〜ｖ１０、１６〜１８、及び２０を含む。ＣＤ４４−ｖ８−ｖ１０は、エクソン１〜５、ｖ８〜ｖ１０、１６〜１８、及び２０を含む。Ｒ４１Ａ変異は、ＣＤ４４がその主要なリガンドのうちの１つであるヒアルロン酸に結合する能力を阻害し（Peach et al, 1993）、そして全てのＣＤ４４イソ型はこの残基を含む。
【００６５】
[00111]その他のＣＤ４４変異体とヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）との融合タンパク質は、実施例において使用したものと同様の方法で、強力な抗癌剤として効果的に作用する。これらの融合タンパク質は、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０−、ＣＤ４４−５−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ３−、ＣＤ４４ｖ４−、ＣＤ４４ｖ５−、ＣＤ４４ｖ６−、ＣＤ４４ｖ７−、ＣＤ４４ｖ８−、及びＣＤ４４ｖ９−Ｆｃ又はＲ４１Ａ変異を有する上記ＣＤ４４のイソ型（Peach et al., 1993）、及びヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）に融合させた、それぞれ異なるＣＤ４４細胞外ドメイン／エクソンのそれぞれ異なる組み合わせ及び／又は修飾を含むが、これらには限定されない。修飾は、変異、挿入、置換、欠損など任意の修飾であってよいが、これらに限定されるものではない、。ＣＤ４４細胞外ドメインはまた、エクソン１〜１７のそれぞれ異なる組み合わせ、又は、ＣＤ４４の細胞外ドメインのそれぞれのセグメントの異なる欠損、変異、重複、若しくは倍加に由来するものであってもよい。
【００６６】
[00112]いくつかの態様では、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている核酸分子をプロモーターに操作可能に連結する。いくつかの態様においてプロモーターは、原核細胞及び／又は、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、２９３、ヒト膠芽腫細胞、及びその他のヒト癌細胞を含む真核細胞での発現を促進することができる。プロモーターは、核酸分子の発現を誘導することができるいずれのプロモーターであってよい。プロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ｐＥＦ、アクチンプロモーター、などが挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの態様において核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの態様において核酸分子は、ウイルス、ベクター、又はプラスミドである。いくつかの態様では、制御物質の有無により、その発現が開始又は停止することができるように、核酸分子の発現が制御される。そのようなシステムの例としては、テトラサイクリン−ＯＮ／ＯＦＦシステムが挙げられるがこれには限定されない。
【００６７】
[00113]可溶性組換えＣＤ４４ＨＡ−結合ドメイン（ＣＤ４４−ＨＡＢＤ）が、ニワトリ及びマウス生体での血管形成を妨げることが発見されており、また、黒色腫及び膵臓腺癌の成長を阻害する（Pall et al., 2004）。可溶性ＣＤ４４は、細胞表面ＣＤ４４のヒアルロン酸への結合を妨げることにより、黒色腫の成長を阻害する（Ahrens et al., 2001）。ＣＤ４４−受容体グロブリンはＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫転移の肺転移を阻害し、かつ、ＣＤ４４−受容体グロブリンは、免疫グロブリンカッパ軽鎖の定常領域に結合した、ＣＤ４４ｓ又はＣＤ４４ｖ１０の細胞外部分を含む（Zawadzki et al., 1998）。可溶性ＣＤ４４ｓ−免疫グロブリン融合タンパク質は、ヒトリンパ腫細胞、ナマルバの生体での成長を阻害する（Sy et al., 1992）。
【００６８】
[00114]効果を改善するために、これらのＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を修飾することができる。これらの修飾には、分子を多量体化することが知られているアンギオポエチンのコイルドコイルドメインのようなその他のタンパク質の一部分に、ＣＤ４４細胞外ドメインを融合させることにより、異なるリガンド結合部位を含む複数の反復ドメインを挿入することが含まれる
ＣＤ４４Ｒ４１Ａ変異体対野生型ＣＤ４４融合体
[00115]ＣＤ４４の主要なリガンドはヒアルロン酸（ＨＡ）である。ＣＤ４４は、オステオポンチン（Verhulst et al., 2003; Zhu et al., 2004）、フィブロネクチン、Ｉ及びＩＶ型コラーゲン（Ponta et al., 1998）、セリグリシン、ラミニン（Naor et al., 1997）、ＭＭＰ−９（Yu and Stamenkovic, 1999, 2000）、ＭＭＰ−７（Yu et al, 2002）、及びフィブリン（Alves et al., 2008）などのその他リガンドも有する。ＣＤ４４はまた、複数の受容体チロシンキナーゼ（Orian-Rousseau and Ponta, 2008; Ponta et al., 2003）、Ｐ−セレクチン（Alves et al., 2008）、Ｅ−セレクチン（Dimitroff et al., 2001; Hidalgo et al., 2007; Katayama et al., 2005）、デス受容体（ＤＲ）（Hauptschein et al., 2005）、及び膜型マトリックスメタプロテアーゼ１（ＭＴ１ＭＭＰ）（Kajita et al., 2001）とも関係する。
【００６９】
[00116]ＣＤ４４のＨＡ結合部位はＮＨ２−末端（残基２１〜１７８）に位置する。Ｒ４１をＡに変換することによるＣＤ４４の修飾は、ＣＤ４４がＨＡに結合する能力を阻害する（Banerji et al., 2007; Peach et al., 1993）。そのため、Ｒ４１をＡに変換することによるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の修飾は、ＨＡ以外のＣＤ４４リガンドを効果的に捕捉することができるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を生じることができる。これらの突然変異はまた、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でのＨＡによるこれら融合タンパク質の捕捉を低下させることにより、融合タンパク質のバイオアベイラビリティを高めると考えられる。これらのＲ４１Ａ突然変異はまた、ＣＤ４４  ４１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質のバイオアベイラビリティの上昇により、その他のＣＤ４４リガンド及びＣＤ４４シェダーゼを捕捉する能力がより高い融合タンパク質を生じ得る。このことは、ＣＤ４４及びこれらのその他リガンド又はＣＤ４４の遊離との間の相互作用が、特定のステージ及び／又は特定の治療の後で、特定の型の癌の進行を引き起こしている場合に特に重要となるだろう。我々は、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質が十分なレベルの抗ＧＢＭ活性を保持していることを示し（図１２Ｃ−ｃ）、このことは、癌におけるＣＤ４４のＨＡ依存性及びＨＡ非依存性の機能の概念を支持している。
【００７０】
ＣＤ４４融合タンパク質の発現及び精製
[00117]本発明は、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている、単離した核酸分子（ポリヌクレオチド）を提供する。
【００７１】
[00118]いくつかの態様において核酸分子は、組換えウイルスベクターである。「組換えウイルスベクター」とは、目的のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードしている核酸を送達する場合に、媒体として使用可能なウイルスゲノムを用いて構築したコンストラクトを指す。組換えウイルスベクターは当該分野において周知であり、広く報告されている。組換えウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらは慣習的な方法及び出発材料を用いて調製される。
【００７２】
[00119]標準的な技術及び容易に入手可能な出発材料を用いて、核酸分子を調製することができる。核酸分子を発現ベクター中に組み込んで、次にこれを宿主細胞に組み込んでもよい。タンパク質の生産に周知の組換え発現系に使用される宿主細胞は周知であり、かつ、容易に入手可能である。宿主細胞の例としては、細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、非ヒト哺乳類の組織培養細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣｏｓ−７細胞）、ヒト組織培養細胞（例えば、２９３細胞及びヒーラ細胞）、膠芽腫細胞、及びその他のヒト癌細胞が挙げられる。ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含む、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている核酸を含んでいる全ての発現コンストラクトは、ＣＤ４４のＮＨ２−末端シグナルペプチドをコードしている核酸を含む。その結果、これらのＣＤ４４融合タンパク質は細胞培養培地中に分泌される（図１２Ａ、図２９Ａ、図３６Ａ、図４０Ｂ、及び図４１Ｂ）。
【００７３】
[00120]いくつかの態様は、周知の発現系において使用するための市販の発現ベクター中に、ＤＮＡ分子を挿入する工程を含む。これは当該分野において既知の技術により達成することができる。例えば、市販のプラスミドであるｐＳＥ４２０（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）を大腸菌内でタンパク質を生産させるために使用してもよい。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）を、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株中でタンパク質を生産させるために使用してもよい。市販のMAXBACTM complete baculovirus expression system（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）を、例えば、昆虫細胞中でタンパク質を生産させるために使用してもよい。市販のプラスミドであるｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡ３、又はＰＥＦ６／ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）を、例えば、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、及び２９３細胞などの哺乳類の細胞中でタンパク質を生産させるために使用してもよい。慣習的な技術及び容易に入手可能な出発材料を用いてタンパク質を生産するために、当業者はこれら市販の発現ベクター及びシステム又はその他を使用することができる（例えば、Sambrook et al., eds., 2001、前記を参照のこと）。従って、所望のタンパク質又は断片を、プロセッシングされた形の多様なタンパク質又は断片を生じる、原核及び真核システムの両方で調製することができる。
【００７４】
[00121]当業者は、周知の方法及び容易に入手可能な出発材料を用いて、その他の市販の発現ベクター及びシステム又は生産ベクターを使用してもよい。プロモーター及びポリアデニル化シグナル、及び好ましくはエンハンサーのような必須の制御配列を含む、様々な宿主細胞のための発現系は容易に入手可能であり、かつ当該分野において知られている（例えば、Sambrook et al., eds., 2001を参照のこと）。
【００７５】
[00122]いくつかの態様では、核酸分子を遺伝子コンストラクトとして調製することもできる。「遺伝子コンストラクト」は、核酸分子の遺伝子発現に必要な制御配列を含む。エレメントには、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、タンパク質又は断片をコードしている配列の遺伝子発現のために、エンハンサーを使用することができる。これらのエレメントを所望のポリペプチドをコードしている配列に操作可能に連結すること、及び投与した患者又は細胞中でその制御エレメントを操作できることが必要である。開始コドン及び終止コドンは通常、所望のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の一部分であると考えられる。しかしながら、この遺伝子コンストラクトを投与した患者又は細胞中で、これらのエレメントが機能することが必要である。開始及び終止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。使用するプロモーター及びポリアデニル化シグナルは細胞中で機能するものでなければならない。本発明の実施に有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ最初期などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子のプロモーターが挙げられるがこれらには限定されない。本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの態様では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを指す、ｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）中のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いた。ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ発現に必要な制御エレメントに加えて、その他のエレメントもまた含んでいてもよい。そのようなさらなるエレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーを、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及び、ＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のエンハンサーのようなウイルスエンハンサーを含むがこれらには限定されない群より選択してもよい。コンストラクトを染色体外で維持するため、及び細胞中で多コピーのコンストラクトを生産するために、哺乳類の複製起点をもつ遺伝子コンストラクトを提供することができる。Invitrogen（サンディエゴ、カリフォルニア）のｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４プラスミドはエプスタイン−バーウイルスの複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域を含む。これらにより、多コピーのエピソーム複製が生じるが、挿入は起こらない。いくつかの態様において核酸分子は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及びレンチウイルスを含むがこれらには限定されない、感染性のウイルス粒子中にパッケージングされる。いくつかの態様において核酸分子は、感染性粒子を含まない。いくつかの態様において核酸分子は、ナノ粒子により担体と混合される。
【００７６】
[00123]ＣＤ４４融合タンパク質は、ＣＤ４４融合ｃＤＮＡコンストラクトを含む発現ウイルスコンストラクトを感染させた細胞によって生産され、そしてＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質用の血清を含まない細胞培養培地中で又はその他全てのＣＤ４４融合タンパク質用の１０％ＦＢＳを含む培地中で発現される。ＣＤ４４融合タンパク質はアフィニティカラムを用いて精製する。例えばＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、記述されているように（Sy et al., 1992）プロテインＡカラムを用いて精製し、異なるエピトープタグにより標識されている可溶性ＣＤ４４は、適切な抗体を結合させたアフィニティカラムを用いて精製する。
【００７７】
その他のＣＤ４４拮抗薬
[00124]一側面においてＣＤ４４拮抗薬は、ＣＤ４４融合タンパク質である。別の側面においてＣＤ４４拮抗薬は小分子である。さらに別の側面においてＣＤ４４拮抗薬は、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである（配列番号３１〜３８）。別の側面では、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡを、ウイルス粒子にパッケージングした又はパッケージングしていないウイルスベクターの形で投与する。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。別の側面においてアデノウイルスは、複製していなく、遺伝子を挿入しない、血清型２、５、６、７、又は８アデノウイルスベクターである。別の側面では、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを、ナノ粒子を含むその他の担体と共に投与する。別の側面では、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを単独で又はその他の治療と併用して投与する。別の側面では、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを、腫瘍の外科的切除を含むその他の抗癌治療の前又は後に投与する。
【００７８】
定義
[00125]以下の定義は、本発明を明瞭にする及び説明する目的のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００７９】
癌
[00126]「癌」とは、上皮細胞組織（癌腫）、血液細胞（白血病、リンパ球腫、及び骨髄腫）、結合組織（肉腫）由来細胞の、又は神経膠の若しくは支持細胞（神経膠腫）の、異常な悪性増殖を指す。例えば、本明細書に記載した本発明を、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば結腸）、及び尿生殖路、前立腺、卵巣、咽頭、及び神経系などの系に影響を及ぼす様々な器官系の悪性腫瘍、並びに、多くの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌などの悪性腫瘍を含むがこれらには限定されない腺癌を治療する又は予防するために使用してもよい。治療可能な固形腫瘍の例としては、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫、などが挙げられる。一側面において本発明は、腎細胞癌、中皮腫、肉腫、又は多発性骨髄腫の治療に関する。一側面において本発明は、結腸癌に治療に関する。別の側面において本発明は、肺癌の治療に関する。別の側面において本発明は、卵巣癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、乳癌の治療に関する。別の側面において本発明は、前立腺癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、肝癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、頭頸部の扁平上皮癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、黒色腫の治療に関する。さらなる側面において本発明は、膵癌の治療に関する。さらに別の側面において本発明は、星細胞腫の治療に関する。特定の側面において本発明は、多形性膠芽腫を含む神経膠腫の治療に関する。
【００８０】
癌幹細胞
[00127]癌幹細胞（ＣＳＣ）又は癌始原細胞（ＣＩＣ）は、自己再生能及びさまざま系統の細胞に分化する能力を有する、ごく少数の癌細胞である。これらの細胞は、治療介入後の腫瘍の維持及び再増殖の原因である（Reya et al., 2001）。ＣＳＣもまた、化学療法及び放射線治療、並びにその他の形態の癌治療に対して高い耐性をもつ。ＣＤ４４は、多くの種類のＣＳＣに対する主要な細胞表面マーカーである（Stamenkovic and Yu, 2009）。
【００８１】
抗癌治療
[00128]用語「抗癌治療」とは、外科的治療、化学療法、放射線治療、標的剤治療、遺伝子治療、免疫治療及び、癌及び悪性腫瘍を治療するための少なくとも２つの単独療法を組み合わせた併用療法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
放射線治療
[00129]用語「放射線療法」又は「放射線治療」とは、癌を治療するために高エネルギーの放射線を使用することを指す。放射線治療には、外部から当てる放射線、例えば線形加速器を用いた外部ビーム放射線治療、及び、放射線源を体表面近く又は体腔内中に設置する小線源治療が含まれる。使用される一般的な放射性同位元素にはセシウム（１３７Ｃｓ）、コバルト（６０Ｃｏ）、ヨウ素（１３ＩＩ）、リン−３２（３２Ｐ）、金−１９８（１９８Ａｕ）、イリジウム−１９２（１９２Ｉｒ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、及びパラジウム−１０９（１０９Ｐｄ）が含まれるがこれらには限定されない。放射線は通常、グレイ（Ｇｙ）の単位で測定され、１Ｇｙは１００ラドである。
【００８３】
化学療法及び標的治療
[00130]「化学療法」とは抗癌剤を用いた治療を指す。この用語は、白金系薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、抗微小管剤、植物アルカロイドを含む、多数のクラスの薬剤、及び抗主要抗生物質、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ二量体化阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、抗体、並びにアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡを包含する。そのような化学療法剤には、アドリアマイシン、メルファラン、ａｒａ−Ｃ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、テモゾロミド、イリノテカン、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、ペントスタチン、プラチナベースの薬剤であるカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、エピルビシン、ダカーバジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、アルトレタミン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブチル、ミトキサントロン、シタラビン、ナイトロジェンマスタード、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル、トポテカン、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、チオグアニン、チオテパ、ポロフィドトキシン、フィルグラスチム、ポルフィマーナトリウム、レトロゾール、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、エピタロン（ｅｐｉｔｈａｌｏｎｅ）Ａ及びＢ、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｉｏｉｎ）、ロイスタチン、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、ゲムシタビン、サトラプラチン、イクサベピロン、ヘキサメチルアミン、及びサリドマイドが含まれるがこれらには限定されない。
【００８４】
[00131]標的治療薬は、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、ゼヴァリン（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、アービタックス（登録商標）（セツキシマブ）、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（登録商標））、ゲムツズマブ（マイロターグ（登録商標））などのモノクローナル抗体を含むがこれらには限定されない。その他の標的治療薬は、タモキシフェン、イリノテカン、ボルテゾミブ、ＳＴＩ−５７１（グリベック（登録商標）、イマチニブメシル酸塩）、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、ＢＩＢＦ１１２０、パゾパニブ、ネラチニブ、ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＡＭＧ  ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＧＸ−５２３、ＧＳＫ１３６３０８９、アキシチニブ、バタラニブ、Ｅ７０８０、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ（Ｔｏｃｅｒａｎｉｂ）、レスタウルチニブ、セマクサニブ、セジラニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ペリホシン、ＭＫ−２２０６、テムシロリムス、ラパマイシン、ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ−０９４１、ＰＬＸ−４０３２、イマチニブ、ＡＺＤ０５３０、ボルテゾミブ、ＸＡＶ−９３９、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）、Genentech−化合物８／ｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤、Abbott Laboratories−化合物１１、インターロイキン（例えば、２及び１２）並びにインターフェロン、例えばアルファ及びガンマ、ｈｕＢｒ−Ｅ３、ジーナセンス（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）、ガナイト（Ｇａｎｉｔｅ）、ＦＩＴ−３リガンド、ＭＬＮ４９１ＲＬ、ＭＬＮ２７０４、ＭＬＮ５７６、及びＭＬＮ５１８を含むがこれらには限定されない。抗血管形成剤には、ＢＭＳ−２７５２９１、ダルテパリン（フラグミン（登録商標））２−メトキシエストラジオール（２−ＭＥ）、サリドマイド、ＣＣ−５０１３（サリドマイドアナログ）、マスピン、コンブレタスタチンＡ４リン酸塩、ＬＹ３１７６１５、ダイズイソフラボン（ゲニステイン；ダイズタンパク質単離物）、ＡＥ−９４１（ネオバスタット（Ｎｅｏｖａｓｔａｔ）ＴＭ；ＧＷ７８６０３４）、抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ；アバスチンＴＭ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４、ＶＥＧＦ−トラップ、ＺＤ６４７４、ＥＭＤ  １２１９７４、抗αｖγ３インテグリン抗体（Ｍｅｄｉ−５２２；ビタキシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）ＴＭ）、カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）、セレコキシブ（セレブレックス（登録商標））、ハロフジノン臭化水素酸塩（テンポスタチンＴＭ）、及びロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（登録商標））が含まれるがこれらには限定されない。
【００８５】
[00132]用語「遺伝子治療」は、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしているベクターの投与を含む。いくつかの態様においてベクターは、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ（配列番号３１〜３８）を有する。いくつかの態様においてベクターは、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。そのような感染性ウイルス粒子には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様においてベクターは、感染性粒子を含まない。いくつかの態様においてベクターは、ナノ粒子と混合され、そしてナノ粒子によって送達される。遺伝子治療は、ＣＤ４４−Ｆｃ融合体をコードしているヌクレオチド、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを含む場合もある。
【００８６】
発現コンストラクト
[00133]用語「発現コンストラクト」は、標的核酸配列又はその発現が所望される配列、及び、選択した宿主細胞中での標的核酸の正しい転写及び翻訳をもたらす操作可能に連結した発現制御配列エレメントを含む核酸配列を意味する。そのような配列エレメントは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。加えて、タンパク質又は断片をコードしている配列の遺伝子を発現させるために、エンハンサーを用いることができる。「発現コンストラクト」はさらに、「ベクター配列」からなっていてもよい。「ベクター配列」とは、本発明の組換えＤＮＡ技術において、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、及び酵母人工染色体を含む（がこれらには限定されない）発現コンストラクトのクローニング及び増殖を促進する効果を有する、当該分野において確立された任意の複数の核酸配列を意味する。
【００８７】
[00134]本発明の発現コンストラクトは、発現コンストラクトのクローニング及び増殖を促進するベクター配列を含む場合がある。様々な真核及び原核宿主細胞中での複製及び／又は発現のための数多くのベクター、プラスミド、真菌、ウイルスベクターを含む、が記述されてきた。本発明に有用な標準的なベクターは当該分野において周知であり、これらには、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、及び酵母人工染色体が含まれる（がこれらに限定されるものではない）。ベクター配列は、大腸菌（Escherichia coli）中で増殖するための複製起点；ＳＶ４０の複製起点；宿主細胞中で選抜するためのアンピシリン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、及びブラストサイジン耐性遺伝子；及び／又は、優勢な選択マーカーと目的の遺伝子を増幅させる遺伝子（例えば、ＣＤ４４−Ｆｃ融合遺伝子）を含んでいてもよい。プラスミドベクター及び、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、セムリキ森林ウイルス及びアデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターを含む好適なベクターは周知であり、そして商業的供給源（Promega、マジソン、ウィスコンシン；Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア；GIBCO/BRL、ゲーサーズバーグ、メリーランド）から購入可能であり、又は、当業者は構築することができる（例えば、Sambrook et al., eds., 2001, Meth. EnzymoL, Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Cane. Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25:37-42, 1993; Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest. 92:381-387, 1993を参照のこと）。
【００８８】
発現させる及び発現
[00135]用語「発現させる」及び「発現」は、遺伝子又はＤＮＡ配列の情報が顕在化することを許容する又は誘導すること、例えば、対応する遺伝子又はＤＮＡ配列の転写、翻訳及び翻訳後修飾に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を生産すること、を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中又は細胞によって、タンパク質などの「発現産物」を形成するように発現される。発現産物そのもの、例えば生じたタンパク質は、細胞により「発現された」ということもできる。発現産物を、細胞内、細胞外又は分泌と特徴付けることができる。用語「細胞内」とは、細胞の中にあるもの、を意味する。用語「細胞外」とは、細胞の外にあるもの、を意味する。一定量の物質が、細胞上又は細胞内のどこかから細胞の外に表れる場合、この物質は細胞により「分泌」される。
【００８９】
導入
[00136]用語「導入」とは、レトロウイルス又はレンチウイルス中にパッケージングした、ウイルス発現ベクター中の「外生」核酸（すなわち、外因性又は細胞外遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列）を、細胞中に導入することを意味する。分子生物学で一般的な技術を用いて、適切な細胞へのウイルスの導入を行う。一側面において細胞は、Ｃｏｓ−７及び２９３細胞である。別の側面において細胞は、ヒトＧＢＭ細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト前立腺癌細胞、ヒト乳癌細胞、ヒト黒色腫細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト卵巣癌細胞、ヒト悪性中皮腫細胞、ヒト肉腫細胞、ヒト膵癌細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌細胞、及びヒト多発性骨髄腫細胞である。
【００９０】
遺伝子
[00137]用語「遺伝子」とは、１つ以上のタンパク質又な酵素の全部又は一部分、及び任意に、例えばその遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター及びエンハンサー配列などの制御ＤＮＡ配列を含む、特定のアミノ酸配列をコードしている又はそれに対応するＤＮＡ配列を意味する。
【００９１】
[00138]
コード配列は細胞中において、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡ、特にｍＲＮＡに転写する場合に発現制御配列の「制御下にある」又は制御配列と「操作可能に連結して」いる。その後、トランス−ＲＮＡはスプライシングされ（イントロンを含む場合）、このコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
【００９２】
[00139]用語「発現制御配列」とは、コード配列の転写を制御するために連結させたプロモーター及び任意にエンハンサー又は抑制エレメントを指す。好ましい側面においてこのエレメントは、複製起点である。
【００９３】
アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡ
[00140]アンチセンスヌクレオチドは、「センス」鎖のヌクレオチドに相補的なＲＮＡ又はＤＮＡの鎖である。アンチセンスヌクレオチドはこれらセンス鎖に結合し、これらを不活性化させる。ｓｈＲＮＡは遺伝子発現を抑制させるために用いられる。アンチセンスヌクレオチドを遺伝子治療に用いることができる。
【００９４】
[00141]低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、どちらか一方の末端に２ヌクレオチドの３’突出を有する、長さ２０〜２５ヌクレオチドの、ある種の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、特定の遺伝子の発現を干渉する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の経路で機能する。
【００９５】
[00142]低分子又は短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子の発現を抑制することができる、緊密なヘアピン構造を形成するＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは一般に、センス及びアンチセンス鎖をヘアピン構造にする、その標的遺伝子由来の２本の逆方向反復配列を含む。センス及びアンチセンス鎖は、ｓｈＲＮＡ中でループを形成する短いスペーサー配列によって離されており、そして末端には、転写終止位置として機能する複数個のＴの鎖がある。この配置が、短いヘアピン型ＲＮＡとして折り畳まれることが予想されるＲＮＡ転写物を生産する。ｓｈＲＮＡを、ウイルスベクターを含むベクターを用いて細胞内に導入する。ベクターをウイルス粒子中にパッケージングすることもできる。ｓｈＲＮＡを有するベクターは、Ｕ６、ＨＩ、又はＣＭＶ（Open BiosystemsのｓｈＲＮＡｍｉｒ用ｐＧＩＰＺ）プロモーターにより、それらの転写を引き起こす。ｓｈＲＮＡｍｉｒは、ｍｉｃｒｏＲＮＡに適したｓｈＲＮＡである。このベクターは一般に娘細胞に受け継がれ、それにより遺伝子サイレンシングが遺伝するものとなる。ｓｈＲＮＡヘアピンは、細胞により機械的にｓｉＲＮＡへと分解され、これはその後ＲＮＡ誘導性のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体が標的ｍＲＮＡに結合して標的ｍＲＮＡを分解し、サイレンシング効果をもたらす。ベクター又はウイルス中にパッケージングされたｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを、ＣＤ４４遺伝子を含む遺伝子の発現をノックダウンさせるために、遺伝子治療に用いることができる。
【００９６】
約又はおよそ
[00143]用語「約」又は「およそ」は、当業者により決定された特定の値が許容範囲内にあることを意味する。この値は、部分的には、どのようにして値を測定又は決定したか、例えば測定システムの限界、により異なる。例えば「約」は、特定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、その上さらにより好ましくは１％までの範囲を意味する可能性がある。あるいは、特に生物系又は過程に関してこの用語は、量の範囲が、値の好ましくは５倍以内、及びより好ましくは２倍以内にあることを意味する可能性がある。特にことわりがない限り、用語「約」は、特定の値が許容できる誤差範囲内にあることを意味する。
【００９７】
Ｉｎｃｌｕｄｅ又はＣｏｍｐｒｉｓｅ
[00144]本明細書で用いられる場合、「ｉｎｃｌｕｄｅ」と「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」との用語は、同意語として用いられる。本明細書で使用する場合、用語「１つ」及び「１種」は、「１つ（１種）以上」の列挙した構成要素を指すものと理解されるべきである。代替表現（例えば、「又は」）の使用は、１つ、又はその代替表現の任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されるべきである。
【００９８】
単離した
[00145]本明細書で使用する場合、用語「単離した」は、該当する物質を、それが通常見い出される環境から除去することを意味する。従って、単離した生物材料は、細胞要素、すなわちその材料が見いだされる又は生産される細胞の構成要素、を含まない場合がある。単離した核酸分子には、例えば、ＰＣＲ産物、単離したｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は制限断片が含まれる。単離した核酸分子には、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入した配列もまた含まれる。単離核酸分子は、好ましくは、それらを含み得るゲノムから切り出され、そして、非制御配列、非コード配列、又はゲノム中に含まれる場合にその核酸分子の上流又は下流に位置するその他の遺伝子に、任意に結合させることができる。単離したタンパク質は、それらが細胞中で関連しているその他のタンパク質若しくは核酸、又は両方と任意に関係していてもよく、あるいは膜関連タンパク質の場合には、細胞膜と細胞膜と任意に関係していてもよい。
【００９９】
精製した
[00146]用語「精製した」は、本明細書で使用する場合、無関係の物質、すなわち、得られる材料由来の天然の物質を含む、汚染物質を減少させる又は除去する条件下において単離した材料を指す。単離した材料は好ましくは、実質的に、細胞、又は、組織培養要素、汚染物質などを含む培養要素を含まない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、材料の分析試験の文脈において、操作に関する用語として用いられる。好ましくは、実質的に汚染物質を含まない精製した材料は、少なくとも純度が５０％であり、又は純度６０％、７０％、８０％であり、より好ましくは、純度９０％であり、そしてより好ましくは、その上さらに少なくとも純度９９％である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫検定、組成分析、生物学的検定、及びその他の当該分野において既知の方法により評価することができる。
【０１００】
核酸分子
[00147]「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖ヘリックスいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）リン酸エステルの多量体形態、又は、チオリン酸エステル及びチオエステルなどの任意のそのリン酸エステル類似物を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスであってもよい。用語核酸分子、具体的にはＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、その分子の一次及び二次構造のみを指し、それらのいずれか特定の３次構造を限定するものではない。従って、この用語は、二本鎖ＤＮＡの中でも、とりわけ、直鎖状（例えば、制限断片）又は環状ＤＮＡ分子、プラスミド、及び染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について議論する場合、本明細書においては、配列を一般的な記載習慣に従って、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って配列を５’から３’方向でのみ記述してもよい。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的な操作を行ったＤＮＡ分子である。
【０１０１】
[00148]本発明では、標準的な分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、免疫学、細胞生物学及びその他の当該分野の中で関連する技術を用いることができる。例えば、特に、Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4th ed. Wiley-Liss；を参照のこと。上に列挙した現在のプロトコールは、毎年、複数回更新される。
【０１０２】
ＣＤ４４融合組成物
[00149]特定の態様において、本発明は、哺乳動物の神経膠腫又はその他の癌型を治療する又は予防するための医薬組成物に関する。さらに別の側面において本発明は、哺乳動物の様々な癌幹細胞を標的とする医薬組成物に関する。別の側面では、本発明はさらに、神経膠腫又はその他の癌型の治療による、放射線、細胞毒性、及び標的治療ストレスに対する、神経膠腫細胞を含む様々な癌細胞及び癌幹細胞の感受性を高める医薬組成物を指向する。別の側面において医薬組成物は、神経膠腫又はその他の癌型の治療又は予防のためのＣＤ４４拮抗薬として作用するＣＤ４４融合タンパク質を含む。別の側面において医薬組成物は、ＣＤ４４の細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含む。別の側面において医薬組成物は、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ２−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ１０、ＣＤ４４ｖ９、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ２、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ２−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３−Ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａ、及びＣＤ４４ｖ２Ｒ４１ＡのＣＤ４４細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域を含むＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含む。別の側面においてＣＤ４４融合タンパク質は、別の非ＣＤ４４分子に融合させた、野生型ＣＤ４４又はＲ４１ＡＣＤ４４変異体の、上述した細胞外ドメインのそれぞれ異なるセグメントを含む。いくつかの態様において非ＣＤ４４分子は、毒素、ペプチド、ポリペプチド、小分子、薬剤などである。いくつかの態様において非ＣＤ４４分子は、６−Ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴポリペプチド、ＨＡ−タグ、又はｖ５−タグである。いくつかの態様では、精製後にこれらのタグをタンパク分解による切断によって除去できるように、プロテアーゼ開裂部位をタグ配列の前に挿入するだろう。例えば、ＨＲＶ３Ｃ（１４  ３Ｃ型ヒトライノウイルス）プロテアーゼ開裂部位（ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）を、ｖ５及びＨｉｓエピトープタグのＣＯＯＨ−末端の前に配置することができる。ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Novagen）は、配列ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰを４０℃で特異的に切断するので、ＣＯＯＨ末端タグを効果的に除去するために用いた。
【０１０３】
[00150]
一側面において、ＣＤ４４拮抗薬の医薬組成物は、精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含む精製したＣＤ４４融合タンパク質である。別の側面においてこの医薬組成物は、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含むＣＤ４４融合タンパク質を有するウイルスである。さらに別の側面において医薬組成物は、ヒトＣＤ４４（例えば、配列番号．３４、３５、及び３６）に対するｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡである。さらなる側面において医薬組成物は、ＣＤ４４の機能に拮抗する小分子である。
【０１０４】
[00151]いくつかの態様にでは、神経膠腫は星細胞腫である。その他の態様では、神経膠腫は多形性膠芽腫である。その他の態様では、癌型は、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、黒色腫、悪性中皮腫、肉腫、腎臓癌、ＧＩ管癌、膵癌、肝癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、及び多発性骨髄腫である。
【０１０５】
[00152]医薬組成物として処方する場合、本発明の治療用化合物を薬学上許容可能な担体又は賦形剤と混合してもよい。本明細書で使用する場合、句「薬学上許容可能な」とは、ヒトに投与した場合に、生理学的に耐容でき、及び通常はアレルギー反応又は急性胃蠕動、めまいなどの同様の副作用を引き起こさないと考えられる化学物質及び組成物を指す
[00153]本発明により提供される組成物をそのまま治療に用いることが可能であるが、これを医薬製剤として、例えば、使用する予定の投与経路及び標準的な薬務に関連して選択した、好適な医薬賦形剤、希釈剤、又は担体と混合して投与することが好ましい場合もある。従って、一側面において本発明は、少なくとも１つの活性組成物又は薬学上許容可能なその誘導体、及び薬学上許容可能な賦形剤、希釈剤、及び／又は担体を含む医薬組成物又は製剤を提供する。賦形剤、希釈剤及び／又は担体は、製剤のその他の成分と混合可能であるという意味において「許容できる」ものでなければならず、そしてその受容者にとって有害であってはならない。
【０１０６】
[00154]本発明の組成物を、ヒトのための医学又は獣医学において用いる、任意の適した投与経路用に処方することができる。
[00155]用語「担体」とは、化合物と共に投与する、希釈剤、佐剤、賦形剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、食塩水、水、及び石油、動物油、植物油又は落花生油、大豆油、鉱油、ごま油のような合成したものなどを含む油、などの無菌的な液体であってもよい。好ましくは、水又は食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が担体として、特に注射剤として用いられる。あるいは、担体は１つ以上の結合剤（圧縮丸薬用）、流動促進剤、カプセル化剤、香料、及び着色料を含むがこれらには限定されない、固体剤形の担体であってもよい。好適な医薬担体は、E.W. Martinによる、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)に記載されている。
【０１０７】
[00156]本発明の非経口投与用調整物は、無菌的な水性又は非水性溶液、懸濁液、又は乳濁液を含む。非水性溶媒又は媒体の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン並びに、オレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。そのような剤形はまた、佐剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含んでいてもよい。医薬組成物を例えば、細菌保持フィルターを用いたろ過、組成物への滅菌剤の添加、放射線の組成物への照射、又は組成物を加熱することにより、無菌的にすることができる。それらをまた、滅菌水又はその他の無菌的な注入可能な媒体を用いて、使用する直前に調製することもできる。
【０１０８】
[00157]一側面では、医薬組成物を液体の経口製剤として投与する。その他の経口剤形は当該分野において周知であり、錠剤、カプレット、ジェルキャップ、カプセル、丸薬、及び医療食品を含む。錠剤を、例えば、乾式又は流動層造粒法を用いた周知の打錠技術により製造することができる。
【０１０９】
[00158]そのような経口製剤を、１つ以上の好適な賦形剤、希釈剤、及び担体と共に、標準的な方法で使用するための製剤として提示してもよい。薬学上許容可能な賦形剤は、生理活性物質と、希釈剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、着色剤を含むその他の成分とを特定の剤形に形成することを補助又は可能にする。保存剤、安定剤、色素及び香味剤さえも、医薬組成物中に添加することができる。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤及び沈殿防止剤もまた使用することができる。賦形剤は、その所望される機能に加えて、毒性がなく、摂取に当たり耐容性が良好であり、かつ生理活性物質の吸収を干渉しない場合に薬学上許容可能である。
【０１１０】
[00159]治療上使用される許容可能な賦形剤、希釈剤、及び担体は医薬分野において周知であり、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)に記載されている。医薬賦形剤、希釈剤、及び担体は、使用する予定の投与経路及び標準的な薬務により、選択することができる。
【０１１１】
[00160]一側面においてＣＤ４４拮抗薬の医薬組成物は、ＣＤ４４融合タンパク質である。別の側面においてＣＤ４４拮抗薬の医薬組成物は、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルスである。別の側面において医薬組成物は、ウイルス粒子にパッケージングした又はパッケージングしていない、ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを有するベクターである。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連初する（ＡＡＶ）である。別の側面においてアデノウイルスは、複製しない、遺伝子を挿入しない、血清型２、５、６、７、又は８アデノウイルスベクターである。
【０１１２】
[00161]別の側面では、医薬組成物を静脈内に又は腹腔内に投与する。さらに別の側面では、腫瘍を除去した後に残った腔／空間に医薬組成物を混合したゲルマトリックス−ガロシアニン製剤を充填することにより、医薬組成物を投与する。
【０１１３】
[00162]特定の態様において、本発明は、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、ＨＡを含むＣＤ４４リガンドを検出する方法に関する。これらの方法は、癌の診断及び予後並びに患者の治療反応の評価に有用である。
【０１１４】
治療方法
[00163]本明細書に記載した本発明を、癌又は悪性腫瘍の治療に用いることができる。一側面において本発明は、ＣＤ４４融合組成物を単独で使用するか、本明細書で定義した放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、前立腺癌、結腸癌、乳癌、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、膵癌、及び卵巣癌の治療に関する。別の側面において本発明は、ＣＤ４４融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、星細胞腫の治療に関する。さらに別の側面において本発明は、ＣＤ４４融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、悪性中皮腫、肉腫、及び多発性骨髄腫の治療に関する。特定の側面において本発明は、ＣＤ４４融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療の併用する、多形性膠芽腫の治療に関する。別の特異的側面において本発明は、ＣＤ４４融合組成物を単独で使用するか、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、テモゾロミド、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイコボリン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、トポテカン、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、アービタックス（登録商標）（セツキシマブ）、パニツムマブ（ベクチビックス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、ネラチニブ、ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＡＭＧ  ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＭＧＣＤ−２６５、ＳＧＸ−５２３、ＧＳＫ１３６３０８９、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、ＢＩＢＦ１１２０、パゾパニブ、バタラニブ、アキシチニブ、Ｅ７０８０、ペリホシン、ＭＫ−２２０６、テムシロリムス、ラパマイシン、ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ−０９４１、ＰＬＸ−４０３２、イマチニブ、ＡＺＤ０５３０、ボルテゾミブ、ＸＡＶ−９３９、化合物８（Genentech）（Zobel et al., 2006）及び化合物１１（Abbott Laboratories）（Oost et al., 2004）などのｃＩＡＰ／ＸＩＡＰ阻害剤、又はアドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）と併用する、多形性膠芽腫及びその他の癌型の治療に関する。
【０１１５】
[00164]状態、障害又は症状を「治療（する）」には、（１）その状態、障害又は症状に罹患している又は素因があると考えられるが、まだその状態、障害又は症状の臨床症状若しくは準臨床的症状を経験していない又は呈していないヒト若しくはその他の哺乳動物で進行している、その状態、障害又は症状の臨床症状の発現を予防する又は遅延させること、（２）その状態、障害又は症状を阻害すること、すなわち、疾患若しくはその再発（維持療法の症例においては）、又は少なくとも１つの臨床症状若しくはその準臨床的症状を停止させる、低減させる又は遅延させること、及び／又は（３）疾患を軽減すること、すなわち、その状態、障害又は症状又は少なくとも１つのその臨床症状若しくは準臨床的症状の退行を引き起こすこと、が含まれる。
【０１１６】
[00165]癌の治療に関連して本明細書において定義する「有効量」とは、癌細胞又は腫瘍の成長を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、減少させる、縮小する、阻害する、又はさもなければ、無効にするであろう量である。従って、「有効量」は、癌を有する対象に、その化合物の投与した場合に、有益な臨床転帰がもたらされる、化合物の量である。「有益な臨床転帰」には、例えば、腫瘍容積の減少、転移の減少、癌に関連した症状の重篤度の低下及び／又は、治療を行わなかった場合と比較した、哺乳動物の寿命の増加が挙げられる。当然のことながら、単独及び／又は化学療法若しくは標的治療との併用治療に必要とされる本発明のＣＤ４４融合タンパク質の量は、投与経路、治療を必要とする状態の性質、並びに患者の年齢、体重及び症状により多様になり、最終的には不随する医師又は獣医師の判断によることになる。これらの組成物は通常、有効量の本発明組成物を単独で、又は任意の放射線治療、化学療法、若しくはその他の標的治療との並行における有効量を含む予備的な用量は動物試験によって決定することができ、また、ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当該分野において周知の方法により行うことができる。
【０１１７】
[00166]治療を受ける患者に対する利益は、統計学的に有意又は、少なくとも患者若しくは医師が知覚できるもののいずれかである。
[00167]本発明は、癌及び悪性腫瘍を治療するための外科治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫治療などを含むがこれらには限定されないその他の抗癌治療と併用する、ＣＤ４４融合タンパク質などのＣＤ４４拮抗薬を含む医薬組成物の使用を提供する。本発明は、その他の抗癌治療と併用した場合に、癌治療の相乗効果をもたらす。
【０１１８】
[00168]本発明はさらに、神経膠腫及びその他の癌細胞の、神経膠腫又はその他の癌型の治療に起因する細胞毒性及び標的治療ストレスに対する感受性を高める医薬組成物を指向する。一側面では、本発明の組成物をその他の抗癌治療の前、その他の抗癌治療と同時に、又は後に投与する。別の側面では、本発明の組成物を、酸化又は細胞毒性ストレスを引き起こす治療の前、又はそれら治療と同時に、又はその後に投与する。本発明の特定の一側面では、ストレスは放射線治療によって引き起こされる。本発明の別の特定の側面では、ストレスは化学療法によって引き起こされる。別の側面では、本発明の組成物を、腫瘍の外科的切除の後に投与する。
【０１１９】
[00169]一側面では、単独で又は放射線、化学療法、又はその他の標的治療と併用して使用する、ＣＤ４４融合タンパク質のようなＣＤ４４拮抗薬の医薬組成物を、ゲルマトリックス−ガロシニアン製剤と混合し、そして神経膠腫を含む腫瘍を除去した後に残った腔／空間に充填することにより投与する。別の側面では、ＣＤ４４融合タンパク質のウイルス発現コンストラクト又はヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを含むウイルスをゲルマトリックス−ガロシニアン製剤と混合し、単独で又は放射線、化学療法又はその他の標的治療と併用して、神経膠腫を含む腫瘍を除去した後に残った腔／空間に充填することにより哺乳動物に投与する。
【０１２０】
[00170]一側面では医薬組成物を、腫瘍病変、残存腫瘍病変、又は外科的手術後の手術の縁に隣接した正常な組織への経皮注射又は病巣内注射により投与する。別の側面では、医薬組成物の初回の腫瘍内定位注入を、１日目に１０分間かけて投与する。患者は次に腫瘍の切除を受け、そして４日目に、切除した腫瘍腔壁への医薬組成物の一連の１分間注入を受ける。一側面では、医薬組成物を、外科的に除去できない癌組織の周辺又は近傍に、病巣内注射によって投与する。
【０１２１】
[00171]肺癌には、医薬組成物を、気管支肺胞洗浄により、又は気管支鏡を介して気管支内病変に直接注入することにより、又は、蛍光透視鏡、超音波、若しくはＣＴスキャンを用いた複数回の経皮的穿刺を介して局所腫瘍に投与する。一側面では、医薬組成物を、医薬組成物を発現するように導入した、ＣＤ３４＋骨髄前駆細胞、間葉幹細胞、又はその他の成熟幹細胞又は誘導性多能性幹細胞を用いて癌病変に送達する。一側面においては、医薬組成物を、化学療法、放射線治療、及びその他の標的治療の前に、それらの治療と同時に、又は後に投与する。
【０１２２】
投与及び用量
[00172]ＣＤ４４融合タンパク質及び本発明の製剤を、局所的に、非経口的に、経口的に、吸入により、座剤として、又はその他の当該分野において既知の方法により、投与することができる。用語「非経口」には、注入（例えば、静脈内、腹腔内、硬膜外、鞘内、筋内、管腔内、気管内、皮下、病巣内、又は腫瘍内の）が含まれる。
【０１２３】
[00173]本発明の組成物の投与は、１日１回、１日２回、又はより高頻度になり得るが、疾患又は障害の維持段階においては、頻度を、例えば、１日１回若しくは１日２回の代わりに、２日若しくは３日毎に１回に減少させてもよい。用量及び投与頻度は、当業者には既知の急性段階の臨床徴候の少なくとも１つ以上、好ましくは２つ以上が減少又はなくなるという、寛解期の維持を決定する臨床徴候によって多様になり得る。より一般的には、用量及び頻度は、部分的には、本化合物を用いた治療が検討される疾患又は障害の病理学的な徴候並びに臨床及び準臨床的症状の退行によって異なるだろう。例えば本発明を、静脈内又は腹膜内に、約１〜３週間毎、１５ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０１２４】
[00174]上述した詳細を考慮すると、ＣＤ４４融合タンパク質の一般的な用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲となるだろう。好ましい用量範囲は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ程度になる。特定の態様では、患者は、例えば、１日１回の静脈内又は腹膜内投与を１ヶ月当たり８日間、１週間に２回、又は１週間に１回、受ける場合がある。
【０１２５】
[00175]上述した詳細を考慮すると、ＣＤ４４融合タンパク質をコードしている発現ベクター又はヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを含むウイルスの用量は通常、約５×１０ｅ９ｃｆｕ〜約１０×１０ｅ１０ｃｆｕの範囲となるだろう。特定の態様において患者は、単位用量のウイルスを、例えば、静脈内、腫瘍内、又は腫瘍周辺への注入を介して、１週間に１回若しくは２回受ける場合がある。
【０１２６】
[00176]上述した詳細を考慮すると、静脈により３日連続で投与されるＢＣＮＵの用量は、通常、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２の範囲となり、そしてこの工程を６週間間隔で繰り返してもよい（Pinkerton and Rana, 1976）。静脈により３日連続で投与する、好ましい用量の範囲は約１００ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２程度であり、この工程を６週間間隔で繰り返す。
【０１２７】
[00177]上述した詳細を考慮すると、１日１回、静脈内注入により９０分間かけて、又は経口用カプセル剤により投与するＴＭＺの用量は通常、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２でよい。好ましい用量の範囲は、１日１回、約７５ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２程度である。特定の態では、患者は例えば、１日１回、静脈内に、１ヶ月当たり５日、ＴＭＺの投与を受ける場合がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｄｒｕｇｉｎｆｏ／ｆｄａ−ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）。
【０１２８】
[00178]上述した詳細を考慮すると、ドセタキセルの用量は通常、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約６０ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２程度である。特定の態様では、患者は例えば、ｉｖ注入により、３週間毎にドセタキセルの投与を受ける場合がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ／ｐｐａ／ｄｏｃｅｔａｘｅｌ．ｈｔｍｌ）。
【０１２９】
[00179]上述した詳細を考慮すると、カルボプラチンの用量は通常、約２００ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約３００ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２程度である。特定の態様では、患者は例えば、４週間に１回、静脈内に、カルボプラチンの投与を受ける場合がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｅｏｍ／ｐｒｏ／ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ．ｈｔｍｌ＃ＤＡ）。
【０１３０】
[00180]上述した詳細を考慮すると、シスプラチンの用量は通常、約２０ｍｇ／ｍ２〜約１２０ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、静脈内に１日１回、３週間当たり５日、シスプラチンの投与を受け、それを３回繰り返すだろう。
【０１３１】
[00181]上述した詳細を考慮すると、シクロホスファミドの用量は通常、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２ｍｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日１回、静脈内又は経口的にシクロホスファミドの投与を受ける場合がある。
【０１３２】
[00182]上述した詳細を考慮すると、フルオロウラシルの用量は通常、約１２ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１５ｍｇ〜約１００ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日１回、連続して４日間、静脈内にフルオロウラシルの投与を受ける場合がある。
【０１３３】
[00183]上述した詳細を考慮すると、短時間のｉｖ注入により投与されるミトキサントロンの用量は通常、約１０ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１２ｍｇ／ｍ２〜約１４ｍｇ／ｍ２程度である。特定の態様では、患者は例えば、２１日に１回、静脈内に、ミトキサントロンの投与を受ける場合がある。
【０１３４】
[00184]上述した詳細を考慮すると、パシタキセルの用量は通常、約３時間で、用量１００ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約３時間で、用量が１７５ｍｇ／ｍ２程度である。特定の態様では、患者は例えば、３ヶ月毎に１回、静脈内に、パシタキセルの投与を受ける場合がある。
【０１３５】
[00185]上述した詳細を考慮すると、トポテカンの用量は通常、毎日、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。トポテカンを、ｉｖ注入により、３０分間かけて、又は経口剤の摂取により投与することができる。好ましい用量の範囲は、約０．７５ｍｇ／ｍ２〜ｍｇ／ｍ２／日程度である。
【０１３６】
[00186]上述した詳細を考慮すると、トラスツズマブの用量は通常、約２ｍｇ／ｋｇ／週〜約８ｍｇ／ｋｇ／週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、１週間に１回、若しくは３週間おきに、静脈内に、トラスツズマブの投与を受ける場合がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ／ｐｐａ／ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ｈｔｍｌ）。
【０１３７】
[00187]上述した詳細を考慮すると、セツキシマブの用量は通常、約２００ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２５０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２程度である。特定の態様では、患者は例えば、１週間に１回、静脈内に、セツキシマブの投与を受ける場合がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ／ｐｐａ／ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．ｈｔｍｌ）。
【０１３８】
[00188]上述した詳細を考慮すると、パニツムマブの用量は通常、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、１４日に１回、静脈内に、パニツムマブの投与を受ける場合がある。
【０１３９】
[00189]上述した詳細を考慮すると、ゲフィチニブの用量は通常、約１００ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２５０ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、毎日１つ、２５０ｍｇの錠剤でゲフィチニブの投与を受ける場合がある。
【０１４０】
[00190]上述した詳細を考慮すると、エルロチニブの用量は通常、約２５ｍｇ〜約３００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日１錠、経口的に、エルロチニブの投与を受ける場合がある。
【０１４１】
[00191]上述した詳細を考慮すると、ラパチニブの用量は通常、約１０００ｍｇ／日〜約３０００ｍｇ／日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１２５０ｍｇ／日〜約１５００ｍｇ／日程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日１錠、経口的に、ラパチニブの投与を受ける場合がある。
【０１４２】
[00192]上述した詳細を考慮すると、ＢＩＢＷ２９９２の用量は通常、約２０ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約５０ｍｇ／日〜約７０ｍｇ／日程度である。特定の態様では、患者は例えば、４週間のうちの１４日間、１日１回、経口的にＢＩＢＷ２９９２の投与を受け、その後１４日間は投与を受けないだろう（Eskens et al., 2008）。
【０１４３】
[00193]上述した詳細を考慮すると、ＣＩ−１０３３の用量は通常、約５０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ／日〜約１５０ｍｇ／日程度である。特定の態様では、患者は例えば、２８日の期間の内、連続した２１日の間、経口的にＣＩ−１０３３の投与を受ける場合がある（Campos et al., 2005; Nemunaitis et al., 2005）。
【０１４４】
[00194]上述した詳細を考慮すると、ＰＦ−２３４１０６６の用量は通常、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２０ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日１回、経口的に）、ＰＦ−２３４１０６６の投与を受ける場合がある（Zou et al., 2007）。
【０１４５】
[00195]上述した詳細を考慮すると、スニチニブの用量は通常、約１２ｍｇ〜約８０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約４０ｍｇ〜約５０ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、投与計画に基づいて１日１回、４週間スニチニブの投与を受け、その後２週間は投与を受けないだろう。
【０１４６】
[00196]上述した詳細を考慮すると、ソラフェニブの用量は通常、約２００ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日２回、経口的に、ソラフェニブの投与を受ける場合がある。
【０１４７】
[00197]上述した詳細を考慮すると、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）の用量は通常、卵巣癌については、約１日１回の腹腔内注入を３週間当たり５日間の範囲でよい。治療を２１日毎に繰り返してもよい。肝臓癌については、アドベキシンの用量は通常、１日目に、最大２つまでの病巣に約１回の経皮注入を行う。治療を、最大６工程まで、２８日毎に繰り返す。乳癌については、アドベキシン（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）の用量は通常、１日目及び２日目の病巣内注入である。治療を最大６工程、３週間毎に繰り返す。神経膠腫については、１日目に、アデノウイルスｐ５３（Ａｄ−ｐ５３）の初回の腫瘍内定位注入を１０分間かけて行う。次に患者は腫瘍の切除受け、そして４日目に、切除した腫瘍腔壁へのＡｄ−ｐ５３の一連の１分注入を受ける。特定の態様では、アドベキシンを、化学療法又は放射線治療と同時に、又はそれらの後に投与する。
【０１４８】
[00198]上述した詳細を考慮すると、Genentech−化合物８、すなわちｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤（Zobel et al, 2006）の用量は通常、約５０ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は、例えば８／ｃＩＡＰ−ＸＩＡＰ阻害剤を、１日１回、静脈内に投与をされてもよい。
【０１４９】
[00199]上述した詳細を考慮すると、Abbott Laboratories−化合物１１（Oost et al., 2004）の用量は通常、約５０ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は、例えば化合物１１を、１日１回、静脈内に、投与されてもよい。
【０１５０】
[00200]上述した詳細を考慮すると、エピルビシンの初回用量は通常、静脈注入で、約１００〜１２０ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、１日目にエピルビシンの静脈内投与を受け、その後２１日毎に６回の工程が繰り返されてもよい。
【０１５１】
[00201]上述した詳細を考慮すると、オキサリプラチンの用量は通常、静脈内注入を介して、約５０ｍｇ〜２００ｍｇ／処置の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約７５ｍｇ〜約１５０ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は例えば、２週間毎に、５−ＦＵ／ＬＶと併用してオキサリプラチンの投与を受ける場合がある。佐剤の使用については、合計６ヶ月間（１２工程）の治療が推奨される。一般的な治療計画は以下の通りである：１日目、２５０〜５００ｍＬの５％デキストロース注射剤に溶解したオキサリプラチン８５ｍｇ／ｍ２を静脈注入する。Ｄ５Ｗに溶解し、別々の輸液バッグに入れたＵＳＰ（Ｄ５Ｗ）及びロイコボリン２００ｍｇ／ｍ２を同時に、Ｙラインを用いて１２０分間かけて静脈注入する。その後、４００ｍｇ／ｍ２の５−ＦＵを２〜４分間かけて静脈ボーラス投与し、さらに５００ｍＬのＤ５Ｗ（推奨）に溶解した５−ＦＵ、６００ｍｇ／ｍ２を２２時間の持続注入で静脈注入する。２日目、ロイコボリン２００ｍｇ／ｍ２を１２０分間かけて静脈注入し、その後４００ｍｇ／ｍ２の５−ＦＵを２〜４分間かけて静脈ボーラス投与し、さらに５００ｍＬのＤ５Ｗ（推奨）に溶解した５−ＦＵ、６００ｍｇ／ｍ２を２２時間の持続注入で静脈注入する。
【０１５２】
[00202]上述した詳細を考慮すると、メトトレキサートの用量は通常、毎日の経口投与又は５日間の工程の筋内投与で、約１５〜３０ｍｇの範囲でよい。そのような工程を３〜５回繰り返すことが、通常必要とされる。好ましい用量の範囲は、約２０ｍｇ程度である。特定の態様では、患者は、その他の抗癌剤と併用して、メトトレキサートの投与を受ける場合がある。
【０１５３】
[00203]上述した詳細を考慮すると、ビンブラスチンの用量は通常、以下の通りである。成人に対する治療は、体表面積（ｂｓａ）当たり３．７ｍｇ／ｍ２の単回静脈内投与により開始する。成人に対する単純化した、保守的な１週間間隔の用量漸増法の概要は以下のようになるだろう：初回用量は３．７ｍｇ／ｍ２ｂｓａ、２回目の用量は５．５ｍｇ／ｍ２ｂｓａ、３回目の用量は７．４ｍｇ／ｍ２ｂｓａ、４回目の用量は９．２５ｍｇ／ｍ２ｂｓａ、そして５回目の用量は１１．１ｍｇ／ｍ２ｂｓａである。成人に対する最大投与量が１８．５ｍｇ／ｍ２ｂｓａに達し、それを超えない間は、上述した漸増法を用いることができる。この薬剤の投与については、７日に１回の頻度を超えないようにすることが推奨される。
【０１５４】
[00204]上述した詳細を考慮すると、ビンクリスチンは、１週間に１回、静脈内に投与される。ビンクリスチンの初期用量は通常、小児患者に対しては１．５〜２ｍｇ／ｍ２であり、成人に対しては１．４ｍｇ／ｍ２である。
【０１５５】
[00205]上述した詳細を考慮すると、サトラプラチンの初期用量は通常、５週間おきに連続して５日間、１日１回、約１００〜１２０ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約８０ｍｇ／ｍ２程度である。
【０１５６】
[00206]上述した詳細を考慮すると、イクサベピロンの初期用量は通常、３週間毎に、約４０ｍｇ／ｍ２を３時間の静脈投与とする範囲でよい。体表面積が２．２ｍ２を超える患者については、２．２ｍ２に基づいて算出する。イクサベピロンをカペシタビンと併用して用いることができる。
【０１５７】
[00207]上述した詳細を考慮すると、ゲムシタビンの用量は通常、２１日間の各工程の１日目及び８日目に、約１０００ｍｇ／ｍ２を３０分の静脈投与とする範囲でよい。特定の態様では、ゲムシタビンをパクリタキセル（乳癌）及びシスプラチン（肺癌）と併用して用いることができる。
【０１５８】
[00208]上述した詳細を考慮すると、ゲムシタビンの用量は通常、２１日間の各工程の１日目及び８日目に、約１０００ｍｇ／ｍ２を３０分の静脈投与とする範囲でよい。特定の態様では、ゲムシタビンをパクリタキセル（乳癌）及びシスプラチン（肺癌）と併用してもよい。上述した詳細を考慮すると、単回静脈投与として２１日間隔で投与するドキソルビシンの用量は通常、単剤として用いる場合には６０〜７５ｍｇ／ｍ２である。加齢、又は前治療、又は新生骨髄浸潤により、十分な骨髄予備能をもたない患者には、より低用量で投与すべきである。特定の態様では、ドキソルビシンを、その他の認可された化学療法と同時に用いてもよい。その他の化学療法剤と併用して用いる場合、２１〜２８日毎に単回静脈内注入で投与される、最も一般的に用いられるドキソルビシンの用量は４０〜６０ｍｇ／ｍ２である。
【０１５９】
[00209]上述した詳細を考慮すると、通常用量のドキシル（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム製剤）を、注入反応のリスクを最小限に抑えるために、用量３０〜５０ｍｇ／ｍ２を、１ｍｇ／分の初期速度で、静脈内に投与する。多発性骨髄腫の患者には、３週間の工程の第１、４、８及び１１日目に、１．３ｍｇ／ｍ２のボルテゾミブを静脈内に最初に投与する。４日目のボルテゾミブ投与の後、ドキシル３０ｍｇ／ｍ２を１時間の静脈投与により投与する。
【０１６０】
[00210]上述した詳細を考慮すると、通常用量のエトポシド（エトホホス）を、用量３５ｍｇ／ｍ２／日で４日間、から用量５０ｍｇ／ｍ２／日で５日間、の範囲で静脈内に投与する。特定の態様では、エトポシドをその他の抗癌剤と併用してもよい。
【０１６１】
[00211]上述した詳細を考慮すると、通常用量のメルファラン（アルケラン錠剤）を１日１回、約６ｍｇ（３錠剤）用量で、経口投与する。治療を２〜３週間続けた後、投薬を最大４週間まで停止する。特定の態様では、メルファランを、ボルテゾミブを含むその他の抗癌剤と併用してもよい。
【０１６２】
[00212]上述した詳細を考慮すると、ヘキサレン（登録商標）カプセルとしてのヘキサメチルアミン（ヘキサレン、アルトレタミン、ヘキサスタット）は、経口投与する。用量は、体表面積に基づいて計算する。ヘキサレン（登録商標）カプセルを、２６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、２８日間の工程のうちの連続して１４日又は２１日間のいずれかで投与することができる。１日当たりの総量を、４回に分けて食後及び就寝前に投与する。ヘキサレン（登録商標）カプセルを一時的に中止し（１４日以上）、そしてその後、２００ｍｇ／ｍ２／日の用量で再開する。
【０１６３】
[00213]上述した詳細を考慮すると、イリノテカン（カンプト）を単剤として、若しくはフルオロウラシル及びロイコボリンと併用して、１週間に１回、４週間、１２５ｍｇ／ｍ２の用量で、９０分の静脈投与により用いることができる。又は、単剤として３５０ｍｇ／ｍ２の用量で、３週間毎、９０分の静脈投与により、若しくはフルオロウラシル及びロイコボリンと併用して、１８０ｍｇ／ｍ２の用量で、１週間おきに３回、９０分の静脈投与により用いることができる。
【０１６４】
[00214]上述した詳細を考慮すると、ＰＦ−０４２１７９０３の用量は通常、１日２回の経口投与で、約５０ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲でよい。治療工程は２１日間になると考えられる。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ程度である。
【０１６５】
[00215]上述した詳細を考慮すると、ＡＭＧ２０８の用量は通常、１日２回の経口投与で、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ程度である。
【０１６６】
[00216]上述した詳細を考慮すると、ＪＮＪ−３８８７７６０５の用量は通常、１日１回若しくは２回の経口投与で、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲でよい。治療期間は２１日間になると考えられる。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ程度である。
【０１６７】
[00217]上述した詳細を考慮すると、ＭＧＣＤ−２６５の用量は通常１日１回７日間経口投与し、その後７日間投与を停止する、２８日間の工程で、約２４ｍｇ／ｍ２〜約３４０ｍｇ／ｍ２の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ程度である。
【０１６８】
[00218]上述した詳細を考慮すると、ＳＧＸ−５２３の用量は通常、１日２回１４日間経口投与し、その後７日間投与を停止する、という治療を２１日毎に繰り返す計画で、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。
【０１６９】
[00219]上述した詳細を考慮すると、ＧＳＫ１３６３０８９の用量は通常、を１日目から５日目まで投与し、その後９日間投与を停止する１４日間の投与計画では約２４０ｍｇ／日の範囲でよく、１日１回の投与計画では約８０ｍｇ／日の範囲でよい。この薬剤は経口的に投与される。好ましい用量の範囲は、約８０ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。
【０１７０】
[00220]上述した詳細を考慮すると、バンデタニブの用量は通常、１日１回の経口投与で約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約３００ｍｇ程度である。
【０１７１】
[00221]上述した詳細を考慮すると、ＢＩＢＦ１１２０の用量は通常、１日２回、２０日間連続して投与する投与計画で、約１００ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。
【０１７２】
[00222]上述した詳細を考慮すると、ボトリエント（パゾパニブ）の推奨用量は、食事の前後に（食事の少なくとも１時間前若しくは２時間後）、１日１回の経口投与で、約２００ｍｇ〜約８００ｍｇの範囲でよい。
【０１７３】
[00223]上述した詳細を考慮すると、ベバシズマブの用量は通常、２週間おきに約５ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ；５−ＦＵ系化学療法剤の静脈投与と併用する場合には２週間おきに５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ；カルボプラチン及びパクリタキセルと併用する場合には３週間おきに約１５ｍｇ／ｋｇ；インターフェロンアルファと併用する場合には２週間おきに約１０ｍｇ／ｋｇ；及びパクリタキセルと併用する場合には２週間おきに約１０ｍｇ／ｋｇ、の範囲でよい。２０日間連続して投与する治療計画では、ベバシズマブを９０分間の静脈内注入により投与する。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ程度である。
【０１７４】
[00224]上述した詳細を考慮すると、バタラニブの用量は通常、１日１回経口的に、２８日間連続して投与する治療計画で、約２５０ｍｇ〜約２０００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１０００ｍｇ〜約１５００ｍｇ程度である。
【０１７５】
[00225]上述した詳細を考慮すると、アキシチニブの用量は通常、１日２回の経口投与で、約５ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ程度である。
【０１７６】
[00226]上述した詳細を考慮すると、Ｅ７０８０の用量は通常、２８日間の工程のうちの２〜６日間に１日２回、経口で継続的に投与する計画で、約０．１ｍｇ〜１２ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ程度である。
【０１７７】
[00227]上述した詳細を考慮すると、ペリホシンの用量は通常、経口投与で、約１００〜６００ｍｇ／週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２００ｍｇ〜約４００ｍｇ程度である。
【０１７８】
[00228]上述した詳細を考慮すると、ＭＫ−２２０６の用量は通常、隔日で２８日間、経口投与する工程で、約３０ｍｇ〜６０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約３０ｍｇ〜約５０ｍｇ程度である。
【０１７９】
[00229]上述した詳細を考慮すると、テムシロリムスの用量は通常、１週間に１回、３０〜６０分間の注入による投与で、約２５ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約３０ｍｇ程度である。
【０１８０】
[00230]上述した詳細を考慮すると、ラパマイシンの用量は通常、１日１回の経口投与で、約１０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ程度である。
【０１８１】
[00231]上述した詳細を考慮すると、ＢＥＺ２３５の用量は通常、第一工程の１〜２８日目には、１日１回の経口投与で、約１０ｍｇ〜４５ｍｇの範囲でよい。工程を２８日毎に繰り返す。好ましい用量の範囲は、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ程度である。
【０１８２】
[00232]上述した詳細を考慮すると、ＧＤＣ−０９４１の用量は通常、１日１回又は１日２回の経口投与で、約６０ｍｇ〜８０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約４０ｍｇ〜約５０ｍｇ程度である。
【０１８３】
[00233]上述した詳細を考慮すると、ＰＬＸ−４０３２の用量は通常、１日２回の経口投与で、約２００ｍｇ〜９６０ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇ程度である。
【０１８４】
[00234]上述した詳細を考慮すると、イマチニブの用量は通常、１日１回又は１日２回の経口投与で、約４００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約４００ｍｇ〜約５００ｍｇ程度である。
【０１８５】
[00235]上述した詳細を考慮すると、ＡＺＤ０５３０の用量は通常、経口投与で、約１００ｍｇ〜５００ｍｇ／週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２５０ｍｇ程度である。
【０１８６】
[00236]上述した詳細を考慮すると、ベルケード（ボルテゾミブ）の用量は通常、メルファラン及びプレドニゾンの経口投与と併用し、６週間の工程を９回繰り返す計画では、３〜５回のボーラス２回静脈注射で１．３ｍｇ／ｍ２である。第１工程から第４工程では、ボルテゾミブを１週間に２回投与する（第１、４、８、１１、２２、２５、２９及び３２日目）。第５から第９工程では、ボルテゾミブを１週間に１回投与する（第１、８、２２及び２９日目）。ボルテゾミブの連続投与の間隔は、少なくとも７２時間空けなくてはならない。
【０１８７】
[00237]上述した詳細を考慮すると、ＸＡＶ−９３９の用量は通常、経口投与で、約１００ｍｇ〜５００ｍｇ／週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約１００ｍｇ〜約２５０ｍｇ程度である。
【０１８８】
[00238]上述した詳細を考慮すると、本明細書で記載したようにＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は癌細胞の細胞毒性薬に対する感受性を高めるため、これら融合タンパク質と併用する場合、化学療法薬又は細胞毒性薬の用量は通常使用する用量よりも少なくなるだろう。
【実施例】
【０１８９】
[00239]本発明を下記の実際の実施例を用いてさらに記載するが、これらは本発明をさらに説明することを目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
材料及び方法
[00240]下記の実施例においては、以下の材料と方法を用いた。
【０１９０】
患者の神経膠腫試料
[00241]ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network（ＣＨＴＮ）から神経膠腫組織を得た。ヒト組織研究に関する認可されたプロトコールに従ってヒト組織を使用した。
【０１９１】
発現データ検索
[00242]Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベース（www.oncomine.org、Compendia Bioscience、Ann Arbor、MI）を使用して、ヒト神経膠腫組織及びその他のヒト癌型における、それらの正常な対応物と比較した場合の、ＣＤ４４のｍＲＮＡの発現レベルを検索した。
【０１９２】
発現プロファイリング及びリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
[00243]遺伝子発現プロファイルを比較するために、ヒトＵ１３３ｖ２ジーンチップ（Affymetrix）を用いた。プローブとしては、標準的なプロトコールに従って感染させてプールした、３つの独立したプローブである、ピューロマイシン耐性Ｕ８７ＭＧ又はマーリンを再発現するＷＭ７９３細胞（Ｕ８７ＭＧ／Ｗｍ７９３マーリン）又は空のレトロウイルスで感染させた（Ｕ８７ＭＧ／ＷＭ７９３ｗｔ）を用いた。
【０１９３】
細胞株及び試薬
[00244]ヒト神経膠腫細胞、Ｕ１３８ＭＧ、ＬＮ１１８、ＬＮ２２９、及びＡ１７２細胞（ＡＴＣＣ）；ＳＮＢ１９、ＳＮＢ７５、ＳＮＢ７８、Ｕ１１８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｕ３７３ＭＧ、ＳＦ７６３、ＳＦ７６７、ＳＦ２６８、ＳＦ５３９、ＳＦ１８８、ＳＦ２９５、及びＳＦ２４２（ＵＣＳＦ及びＮＣＩ）、及び正常なヒト星状細胞（ＮＨＡ、ALLCELLAS,Inc）を提供者及び製造業者の説明に従って維持した。抗−ＭＳＴ１／２、−Ｌａｔｓ１／２（Bethy lLab）、−ＣＤ４４、−Ｅｒｋ１／２、−ＡＫＴ、−ＪＮＫ、−ｐ２１、−ｐ３８、−ｐ５３、−ｃＩＡＰ１／２、及び−マーリン（Santa Cruz）、−アクチン（Sigma）、−ネスチン（Millipore）、−ｓｏｘ−２（R&Dsystems）、−ｖ５エピトープ、−リン酸化マーリン、−プーマ（Invitrogen）、−切断型カスパーゼ３、−リン酸化Ｅｒｋ１／２、−リン酸化ＡＫＴ、−リン酸化ＪＮＫ、−リン酸化ｐ３８、−リン酸化ＭＳＴ１／２、−リン酸化Ｌａｔｓ１、−リン酸化ＹＡＰ（Cell signaling）、−ＹＡＰ、−リン酸化Ｌａｔｓ２（Abnova）及び−ヘパラン硫酸（ＨＳ、CalBiochem）抗体を実施例において使用した。ＣｈｅｍｉｃｏｎのＡｐｏｐｔａｇキット、及びＲｏｃｈｅの抗Ｂｒｄｕを使用した。
【０１９４】
初代ヒト神経膠腫、肺、乳、及び卵巣癌細胞塊の確立
[00245]新鮮なヒト神経膠芽腫、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、及び黒色腫組織を、ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network（ＣＨＴＮ）より得た。組織を０．４％のＩ型コラゲナーゼ（Sigma、Ｃ０１３０）を用いてばらばらの細胞になるまで分離し、そしてＢ２７（Invitrogen）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、BD Biosciences）、及びＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ、BD Biosciences）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２である、無血清癌幹細胞培地を入れた超低接着性プレートにプレーティングした。最初の細胞塊が形成された後、腫瘍様塊を含む癌細胞塊を、０．０５％トリプシン−エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて細胞塊を分離することにより、およそ２週間おきに継代した。
【０１９５】
ＣＤ４４−Ｆｃ融合発現ベクター及びノックダウンコンストラクトの構築
[00246]ヒト脾臓のトータルＲＮＡをClontechから得た。ヒト皮膚組織（ＣＨＴＮ−ペンシルバニア大学）及びＴ４７Ｄヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ）のトータルＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて製造業者の説明に従って単離した。５μｇのトータルＲＮＡから、Superscript II RNaseH-逆転写酵素（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成した。ヒト脾臓のｃＤＮＡを鋳型とし、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）、及び以下のプライマーセット：フォワードプライマー、５’−ｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇ−３’（配列番号７１）及びリバースプライマー、５’ｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇａｇ−３’（配列番号７２）を用いたＰＣＲにより、ヒトＦｃ断片を得た。ヒトＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、及びＣＤ４４を含む、多くのＣＤ４４アイソフォームを発現しているヒトの皮膚及びＴ４７Ｄヒト乳癌細胞が得られた。ヒトの皮膚及びＴ４７ＤｃＤＮＡの混合物を鋳型とし、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）、以下のプライマーセット：フォワードプライマー、５’−ａｃｃａｔｇｇａｃａａｇｔｔｔｔｇｇｔｇｇｃａｃ−３’（配列番号７３）及びリバースプライマー、５’−ｔｔｃｔｇｇａａｔｔｔｇｇｇｇｔｇｔｃｃｔｔａｔ−３’（配列番号７４）を用いたＰＣＲにより、ヒトの可溶性ＣＤ４４アイソフォームを得た。得られた全てのＰＣＲ産物をｐＥＦ６／ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ発現ベクター（Invitrogen）中にクローニングした。正しいヒトＦｃ断片及び可溶性ＣＤ４４を含むクローンを同定した。次にこれらの断片をレトロウイルス発現ベクターであるｐＱＣＸＩＰ（BD Bioscience）中にサブクローニングし、ヒト可溶性ＣＤ４４−Ｆｃ（ｈｓＣＤ４４）融合発現コンストラクトを生成した。Ｍｆｅ１制限酵素部位（ＣＡＡＴＴＧ）を用いて、可溶性ヒトＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ｖ８−ｖ１０、又は可溶性ＣＤ４４を、ヒトＦｃ断片にインフレームで融合させた。これらの発現コンストラクト及び２９３細胞中のｐＶＳＶＧ／ＧＰ２Ｒを用い、製造業者の説明（ＢＤ）に従ってレトロウイルスを生成した。全ての発現コンストラクトをＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
【０１９６】
欠損及び点突然変異生成
[00247]可溶性ヒトＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクトであるＣＤ４４ｓ−、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ４−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ７−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０−、及びＣＤ４４ｖ１０−Ｆｃを生成した。可溶性ヒトＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクトであるＣＤ４４ｖ５−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ９−、ＣＤ４４ｖ８−、ＣＤ４４ｖ７−、ＣＤ４４ｖ６−、ＣＤ４４ｖ５−、ＣＤ４４ｖ４−、及びＣＤ４４ｖ３−Ｆｃを、欠損突然変異生成により生成した。欠損突然変異生成は、レトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＰ（BD Bioscience）に導入した可溶性ヒトＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃを鋳型として、ExSite突然変異生成キット（Stratagene）及び、欠損させるセグメントの前後２４ヌクレオチド配列に相当する適切なプライマーを用いて行う（Bai et al., 2007）。
[00248]可溶性ヒトＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃ変異型融合タンパク質コンストラクトである、ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ−、及びＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃを生成した。可溶性ヒトＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃ変異型融合タンパク質コンストラクトであるＣＤ４４ｖ４−ｖ１０Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ５−ｖ１０Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ７−Ｖ１０Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ９−ｖ１０Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ１０Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ９Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ８Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ７Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ６Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ５Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ４Ｒ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ３Ｒ４１Ａ−Ｆｃを、点突然変異により生成してもよい。ＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ−、及びＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ中の点突然変異を、レトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＰ（BD Bioscience）に導入した可溶性ヒトＣＤ４４ｓ−、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃを鋳型として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ部位特異的突然変異生成キット（Stratagene）、及び適切なプライマー対：フォワード、5’-gtg gag aaa aat ggt gcc tac agc atc tct cgg-3’（配列番号７５）及びリバース、5’-ccg aga gat gct gta ggc acc att ttt ctc cac-3’（配列番号７６）を用いて生成した。これらの発現コンストラクト及びｐＶＳＶＧ／ＧＰ２−２９３細胞を用い、製造業者の説明に従って（BD Bioscience）、レトロウイルスを生成した。さらなるＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃコンストラクトを生成するために、同様の方法を用いてもよい。
【０１９７】
可溶性ＣＤ４４−Ｆｃ及び可溶性ＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の生産及び精製
[00249]ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−ＦＣ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃコンストラクトを含むレトロウイルスを感染させたＣｏｓ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ中で、コンフルエンスに達するまで培養した。その後培地を無血清ＲＰＭＩ培地（ＳＦＭ）に交換し、さらに３日間培養した。ＳＦＭを回収し、プロテインＡカラム（GE Healthcare Biosciences）を用いて精製した。プロテインＡカラムから溶出する前に、結合させたＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質調整物のいくらかを、へパリナーゼＩ（１０単位／ｍｌ）及びへパリナーゼＩＩＩ（２単位／ｍｌ）を用いて、３７℃で４時間処理した。
【０１９８】
ルシフェラーゼレポーター検定
[00250]Ｕ８７ＭＧｗｔ及びＵ８７ＭＧマーリンＳ５１８Ｄ、Ｕ８７ＭＧマーリン、及びＵ８７ＭＧマーリンＳ５１８Ａ細胞での標準的なＷｎｔシグナル伝達を測定するために、ＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位及び陰性対照コンストラクトであるＦｏｐＦｌａｓｈを含む、ベータ−カテニン応答性ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ＴｏｐＦｌａｓｈ、Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いた。ＦｏｐＦｌａｓｈは変異型ＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位を含む。これらの、導入した神経膠腫細胞に、これらのレポーターを一過的に導入した。同じ実験を３回行った。Modulus Microplate Luminometer/Fluorometer（Turner Biosystems）を用い、製造業者の説明に従って（Promega）、これら導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を、感染の２４時間後に測定した。
【０１９９】
[00251]ヒトＣＤ４４の発現をノックダウンするために、ヒトＣＤ４４に対する複数のｓｈＲＮＡｍｉｒ（expression Arrest（商標）microRNA-adapted shRNA）及びＴＲＣ（ＲＮＡｉコンソーシアム）コンストラクト、並びに標的をもたないｓｈＲＮＡｍｉｒ及び標的をもたないＴＲＣ対照コンストラクトをOpen Biosystems及びAddgene（非営利プラスミド保存団体、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）から得た。これらのｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスを製造業者の説明に従って生成した。Expression Arrest（商標）microRNA-adapted shRNA（ｓｈＲＮＡｍｉｒ）は、天然のｍｉｃｒｏＲＮＡ一次転写産物を模倣するように設計されており、このため、内生ＲＮＡｉ経路による特定のプロセッシング及びより有効なノックダウンが可能になっている。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０用の設計には、ｍｉｒ−３０ループ及びコンテクスト配列（Silva et al., 2005）が含まれている。
【０２００】
表２：ＣＤ４４アンチセンスコンストラクトの配列表
【０２０１】
【表２Ａ】
2013502421.tif 000018
【０２０２】
【表２Ｂ】
2013502421.tif 000019
【０２０３】
【表２Ｃ】
2013502421.tif 000020
【０２０４】
レンチウイルス及びレトロウイルスの導入（transduction）
[00252]Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ヒト神経膠腫細胞を６−ウェルプレートに播種し、一晩生育させた。サブコンフルエンスに達したＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞に、まず、ルシフェラーゼとハイグロマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスを導入し、次に、ピューロマイシン耐性遺伝子を有する空のレトロウイルス発現ベクター又はヒト可溶性（ｈｓ）ＣＤ４４−Ｆｃ融合コンストラクトを含むレトロウイルスを導入した。集めた薬剤耐性細胞の集団を増殖させ、それら導入した遺伝子産物の発現を評価するために、その細胞の一部を用いた。ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルを検出するために、抗ＣＤ４４及び抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。
【０２０５】
[00253]ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は標的をもたない対照ｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスを用い、製造業者の説明に従ってＣＤ４４をノックダウンした。感染細胞をそれらのハイグロマイシン及びピューロマイシン耐性能により選抜した。集めた薬剤耐性細胞集団を増殖させ、その細胞の一部を用いて内生ＣＤ４４の発現レベルを評価した。抗ＣＤ４４抗体（Santa Cruz）を用いて内生ＣＤ４４レベルを評価した。
【０２０６】
腫瘍様塊への遺伝子導入
[00254]ヒト腫瘍様塊（ＨＧＳ）を０．０５％トリプシン−エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ、Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標））を用いて分離させ、支持細胞層無しで胚性幹細胞を維持及び増殖させるために設計されたBD BioCoat（商標）マトリゲル（商標）マトリックス６−ウェルプレート上に播種した。これらの細胞にヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスを感染させた。ピューロマイシンを用いて選抜した後、集めた薬剤耐性細胞の集団を単一の細胞になるまで懸濁し、超低接着性プレートに入れた無血清癌幹細胞培地（Ｂ２７（Invitrogen）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、BD Biosciences）、及びＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ、BD Biosciences）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養し、細胞塊を再形成させた。
【０２０７】
ＣＤ４４発現のウェスタンブロット解析
[00255]ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トライトン、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌロイペプチン、及び０．０５Ｕ／ｍｌアプロチニンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））、又は色素を含まない４×ＳＤＳレムリー試料緩衝液のいずれかを用いて細胞を抽出し、Ｂｉｏ−ＲａｄＤｃタンパク質検定試薬を用いてタンパク質濃度を決定した。抽出したタンパク質５０〜１００ｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。電気泳動の後、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（Amersham、アーリントンハイツ、ＩＬ）上にブロッティングした。抗ＣＤ４４抗体（Santa Cruz）を用いてＣＤ４４を検出した。
【０２０８】
ＣＤ４４発現の免疫細胞化学
[00256]ＣＤ４４をノックダウンした又はノックダウンしていない神経膠腫細胞を、１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩを入れた３５ｍｍシャーレ中で２４時間培養した。細胞を３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、その後２％脱脂粉乳を用いてブロッキングした。抗ＣＤ４４抗体（Santa Cruz）及びＦＩＴＣ結合抗マウス二次抗体（Sigma）を用いて細胞表面上のＣＤ４４を検出した。
【０２０９】
フルオレセイン標識ＨＡ（ＦＬ−ＨＡ）結合検定
[00257]ＦＬ−ＨＡ結合検定を、既に記載されているように行った（Xu and Yu, 2003； Yu and Stamenkovic, 1999）。簡単に説明すると、全量５×１０５個の、遺伝子を導入した神経膠腫細胞を、ＰＲＭＩ／１０％ＦＢＳ及びピューロマイシンを入れた３５ｍｍシャーレ中に播種した。翌日、培地を２０μｇ／ｍｌのＦｌ−ＨＡを含む新しいＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳと交換した。２４時間後、ＰＢＳを用いて細胞をしっかりと洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、包埋し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０２１０】
腫瘍の皮下成長実験
[00258]認可されたＩＡＣＵＣプロトコールに従ってマウスを用いた。伝子を導入したＵ８７ＭＧ及びＵ２５１神経膠腫細胞の集団を集め、腫瘍の皮下成長実験に用いた。２×ｌ０６又は５×ｌ０６個の神経膠腫細胞又は５×１０６個の神経膠腫細胞を各免疫不全Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍｍｏｍ（Ｒａｇ１、Jackson Lab）マウスの皮下に注入した。感染させた神経膠腫それぞれについて６匹のマウスを用いた。固形腫瘍が観察できるようになってきたら（注入の１０〜１５日後）、５〜７週間、３日おきに、神経膠腫由来の固形腫瘍の最長径と最短径をデジタル測径器で測定した。腫瘍容積は以下の式から算出した：腫瘍容積＝１／２×（最短の径）２×最長の径（ｍｍ３）。実験の終了時に腫瘍を固定し、組織学的及び免疫組織学的解析用に切片を作成した。
【０２１１】
腫瘍の頭蓋内成長実験
[00259]認可されたＩＡＣＵＣプロトコールに従ってマウスを用いた。遺伝子を導入したＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞の集団を集め、腫瘍の頭蓋内成長実験に用いた。Ｕ８７ＭＧ（１０μｌのＨＢＳＳ中に４×ｌ０５細胞／Ｒａｇ１マウス）又はＵ２５１細胞（１０μｌのＨＢＳＳ中に２×１０５細胞／Ｒａｇ１マウス）を、ブレグマに、すなわち矢状抱合の２ｍｍ右側、かつ、頭蓋表面から３ｍｍ下に注入した。注入後、マウスをしっかりと観察し、生存期間を記録した。窮迫及び罹病の徴候が見られたマウス安楽死させ、その日に死亡したものと見なした。生存しているマウスの数を記録した。生存率は以下の式から算出した：生存率（％）＝（現在生存しているマウスの数／実験に用いたマウスの総数）×１００％。頭蓋内注入から４０又は６０日後も症状を呈さなかったマウスは安楽死させ、その組織を解析した。
【０２１２】
頭蓋内神経膠腫の生物発光画像解析
[00260]生きている動物の頭蓋内での神経膠腫の成長を観察するために、生物発光画像法を用いた。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、レトロウイルスを用いたルシフェラーゼ発現ベクターをＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞に感染させた。ハイグロマイシン耐性Ｕ８７ＭＧ−Ｌｕｃ及びＵ２５１−Ｌｕｃ細胞は高レベルのルシフェラーゼを発現する。これらの細胞に、次に標的をもたないｓｈＲＮＡｓ又はヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスを感染させた。これらの２重薬剤耐性細胞を、Ｒａｇ−１マウス頭蓋内のブレグマに、すなわち矢状縫合の２ｍｍ右側、かつ、頭蓋表面から３ｍｍ下に注入した。注入の３、６、９、１３、１７日後、Ｄ−ルシフェリンを注入し、その１２分後に頭蓋内腫瘍の生物発光画像を取得した。実験はマウントサイナイ医科大学（Mount Sinai School of Medicine）のInvivo Molecular Imaging Shared Facilityで行い、画像はＩＶＩＳ−２００画像処理装置（Xenogen）を用いて、同じ強度スケーリングで取得した。
【０２１３】
組織学的解析及び免疫組織学的解析
[00261]生体内での神経膠腫細胞の増殖率を決定するために、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）をマウスの腹膜内（ｉ．ｐ．）に注入し、その４時間後に安楽死させた。神経膠腫を含む腫瘍を実験動物から摘出してホルマリン（フィッシャー）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、３０％、７０％、９５％、及び１００％エタノール並びにキシレンを通して脱水し、その後パラフィンワックス（フィッシャー）で包埋した。５〜１０μｍの切片を作成してスライドグラス上に乗せ、そして組織学的解析用に、ヘマトキシリン及びエオシン（フィッシャー）で染色した。切片を、増殖している細胞を検出するためには抗ＢｒｄＵ又は抗Ｋｉ６７抗体と、アポトーシスを起こしている細胞をその位置で検出するためにはＡｐｏｐｔａｇキットと共にインキュベートした（Lau et al. 2008）。
【０２１４】
シグナル伝達経路タンパク質のウェスタンブロット解析
[00262]Ｕ８７ＭＧ−ＮＴ細胞（標的をもたないＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴコンストラクトを含むレンチウイルスの混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞）及びＵ８７ＭＧｓｈＲＮＡ−ＣＤ４４細胞（ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃ｌを含むレンチウイルスの混合物を感染させたＵ８７ＭＧ細胞）を、媒体、６０μｍのＨ２Ｏ２、又は４０μｇ／ｍｌのＴＭＺで３０分、２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間処理した。細胞を、色素を含まない４ｘＳＤＳレムリー試料緩衝液を用いて溶解した。タンパク質濃度をＢｉｏ−ＲａｄＤｃタンパク質検定試薬を用いて決定した。全タンパク質１００μｇを各レーンにローディングした。タンパク質泳動の内部対照としてはアクチンを用いた。異なるシグナル伝達調節物質に対して用いた抗体を図中に示す。
【０２１５】
[00263]異なる成長因子で処理したＵ８７ＭＧ−ＴＮ及びＵ８７ＭＧｓｈＲＮＡ−ＣＤ４４細胞由来の細胞溶解物を用いてもまた、ウェスタンブロットを行った。２×１０５個の神経膠腫細胞を６−ウェルプレートに２４時間播種し、無血清培地に交換し、さらに７２時間培養した。血清飢餓Ｕ８７ＭＧ細胞をＦＢＳ、ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、ＨＢ−ＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ベータセルリン（ＢＴＣ、５ｎｇ／ｍｌ）、エピレグリン（Ｅｐｒ、５ｎｇ／ｍｌ）、アンフィレグリン（ＡＲ、５ｎｇ／ｍｌ）、又はＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１２時間処理した、あるいは処理しなかった。細胞を、色素を含まない４×ＳＤＳレムリー試料緩衝液を用いて溶解し、タンパク質濃度をＢｉｏ−ＲａｄＤｃタンパク質検定試薬を用いて決定した。全タンパク質１００μｇを各レーンに充填した。タンパク質負荷の内部対照としてはアクチンを用いた。異なるシグナル伝達調節物質に対して用いた抗体を図中に示す。
【０２１６】
酸化ストレスの投与
[00264]Ｈ２Ｏ２を無血清神経膠腫培地（ＲＰＭＩ）中に、最終濃度が６０μΜになるように添加した。６０μｍのＨ２Ｏ２存在下で、神経膠腫細胞を３０分、２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間培養した。
【０２１７】
化学療法剤の投与
[00265]ＴＭＺを無血清神経膠腫培地（ＲＰＭＩ）中に、最終濃度が４０ｇ／ｍｌになるように添加した。４０μｇ／ｍｌのＴＭＺ存在下で、神経膠腫細胞を３０分、２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間培養した。
【０２１８】
ビオチンで標識したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を用いたＨＡの検出方法及びＨＡの検出による癌の診断方法
[00266]精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ）を、ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン化キット（Thermo Scientific）を用い、製造業者の説明に従ってビオチンで標識した。ヒト腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィンし、水和した。２％ＢＳＡでブロッキングした後、切片をビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍｌ）と共に、４度で一晩インキュベートした。VECTASTAIN ABCキットを用いてビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を検出した。
【０２１９】
[00267]血漿ＨＡレベルを検出するために、乳癌を有する各トランスジェニックマウス（ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ及びＭＭＴＶ−ＡｃｔＥｒｂｂ２、Jackson Lab）、ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１又は神経膠腫２６１細胞由来の神経膠腫を有するＲａｇ−１マウス、又は正常な対照マウスから、少なくとも２００μｌの血液を採取した。各型のマウスそれぞれ６匹から血液試料を採取し、すぐに血漿試料を調整した。各試料から調整した５０μｌの血漿をそれぞれ、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を予め塗布しておいたエライサプレートの３つのウェルにローディングした。ビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質及びＡＰ−結合型アビジンを用いて、ＨＡに結合したＣＤ４４−Ｆｃを検出した。発色を、エライサ測定器を用いて４０５ｎｍで測定した。
【０２２０】
前立腺、結腸、乳、肺、卵巣、肝臓、膵臓、及び頭頸部癌モデル、並びに黒色腫モデル
[00268]ＰＣ３／Ｍヒト前立腺癌細胞、ＨＣＴ１１６及びＫＭ２０Ｌ２ヒト結腸癌細胞、ＭＸ−２及びＳＷ６１３ヒト乳癌細胞、ＮＣＩ−Ｈ１２５ヒト非小細胞肺癌細胞、ＮＣＩＨ４６０、ヒト大細胞肺癌細胞、及びＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞に、ルシフェラーゼ及びヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ又は対照である標的をもたないｓｈＲＮＡを導入し、それらのハイグロマイシン及びピューロマイシン耐性能により選抜した。Ｍｌ４ヒト黒色腫細胞、ＳＣＣ−４ヒト頭頸部癌腫細胞、ＢＸＰＣ−３ヒト膵癌細胞、及びＳＫ−Ｈｅｐ−１ヒト肝臓癌細胞に、ＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、及びＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃコンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを導入した。集めた、薬剤耐性癌細胞の集団を、腫瘍の皮下成長実験に用いた。これらの癌細胞５×１０６個を、各免疫不全Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍＭｏｍ（Ｒａｇ１、Jackson Lab）マウスの皮下に注入した。感染させた癌細胞それぞれの型につき、６匹のマウスを用いた。実験の終了時に、最長径と最短径をデジタル測径器で測定した。腫瘍容積は以下の式から算出した：腫瘍容積＝１／２×（最短の径）２×最長の径（ｍｍ３）。実験の終了時に腫瘍を固定し、組織学的及び免疫組織学的解析用に切片を作成した。
【０２２１】
さらなる癌モデル
[00269]Ｒａｇ−１マウスでの異種稙片及び同所性中皮腫腫瘍モデル：５×ｌ０６個のヒト悪性中皮腫細胞、すなわちＨ−ＭＥＳＯ−１、Ｈ−ＭＥＳＯ−１Ａ、及び／又はＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＡＴＣＣ及びフレデリックにあるＮＣＩ−ＤＣＴＤ腫瘍／細胞株保存所）を、免疫不全Ｒａｇ１マウスの右胸腔に、皮下的及び同所的に注入する。
【０２２２】
[00270]異種稙片黒色腫モデル：５×１０６個のヒト黒色腫細胞、ＭＥＷＯ、ＳＫＭＥＬ５、ＳＫＭＥＬ２、及び／又はＡ３７５（ＡＴＣＣ及びフレデリックにあるＮＣＩ−ＤＣＴＤ腫瘍／細胞株保存所）を、免疫不全Ｒａｇ１マウスの皮下に注入する。
【０２２３】
[00271]異種稙片肉腫モデル：５×１０６個のヒト肉腫細胞、すなわちＳＫＮ−ＭＣ及びＡ６７３細胞（ＡＴＣＣ）を、免疫不全Ｒａｇ１マウスの皮下に注入する。
[00272]異種稙片膵癌モデル：５×１０６個のヒト膵癌細胞、すなわちＰａｎｃ−１、ＨＰＡＣ、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、及び／又はＡｓＰＣ−１膵癌細胞を、免疫不全Ｒａｇ１マウスの皮下に注入する。
【０２２４】
[00273]異種稙片肝癌モデル：５×１０６個のヒト肝癌細胞、すなわちＨｅｐ ３Ｂ２．１−７肝癌細胞を、免疫不全Ｒａｇ１マウスの皮下に注入する。
[00274]異種稙片多発性骨髄腫モデル：５×１０６個のヒト多発性骨髄腫細胞、すなわちＵ２６６及びＭＣ／ＣＡＲ細胞を、免疫不全Ｒａｇ１マウスの皮下に注入する。
【０２２５】
[00275]Ｒａｇ−１マウスでの腹水卵巣癌モデル：５×１０６個のヒトＳＫＯＶ３ｉｐ及びＯＶＣＡＲ−３ｉｐヒト卵巣癌細胞を、免疫不全Ｒａｇ−１マウスの腹膜内（ｉｐ）に注入する。
【０２２６】
[00276]異種稙片及び／又は骨転移性前立腺癌モデル：５×１０６個のヒト前立腺癌細胞、すなわち２２Ｒｖｌを、Ｒａｇ−１マウスの皮下に又は各Ｒａｇ−１マウスの心臓内に、それぞれ注入する。
【０２２７】
[00277]異種稙片及び／又は転移性肺癌モデル：５×１０６個のヒト肺癌細胞、すなわちＡ５４９及びＬＸ５２９を、Ｒａｇ−１マウスの皮下に又はＲａｇ−１マウスの静脈内に、それぞれ注入する。
【０２２８】
[00278]異種稙片及び同所性乳癌モデル：５×１０６個のヒト乳癌細胞、すなわちＭＸ−２及びＳＷ６１３を、Ｒａｇ−１マウスの皮下に又はＲａｇ−１マウスの乳房脂肪体に、それぞれ注入する。
【０２２９】
[00279]癌幹細胞モデル：新しいヒト膠芽腫、ヒト黒色腫、肺、乳、前立腺、卵巣、頭頸部、腎臓、及び結腸癌組織を、ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network（ＣＨＴＮ）から得た。０．４％のＩ型コラゲナーゼ（Sigma、Ｃ０１３０）を用いて、組織を単一の細胞になるまで分離させ、その後、Ｂ２７（Invitrogen）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、BD Biosciences）、及びＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ、BD Biosciences）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２である無血清癌幹細胞培地を入れた超低接着性プレート中にプレーティングした。最初の細胞塊が形成された後、およそ１週間に１回の頻度で、腫瘍細胞塊を０．０５％トリプシン−エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）で分離することにより継代した。腫瘍細胞塊をＲａｇ−１マウスの皮下に埋め込んだ。
【０２３０】
統計分析
[00280]対照及び実験群間の腫瘍容積及び成長速度の統計的な差異を解析するために、一元配置型ＡＮＯＶＡによる統計分析を行った。生存実験についてはログランク検定を行った。ｐ＜０．０５の場合の差を統計的に有意であると見なした。
【０２３１】
実施例１
ヒト多形性膠芽腫（ＧＢＭ）ではＣＤ４４は亢進されている
[00281]ＧＢＭでのＣＤ４４の発現レベルを決定するために、ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。４つの独立したデータセットにおいてＣＤ４４転写産物は、正常な脳と比較して（図１Ａ、試験１、２、及び４）（Bredel et al., 2005; Liang et al., 2005; Sun et al., 2006）又は正常な白質と比較して（図１Ａ、試験３）（Shai et al., 2003）、ヒトＧＢＭで一貫して亢進されていた。初期腫瘍から作成したパラフィン切片の免疫組織化学染色より、８例の正常なヒトの脳と比較して、解析した１４例全てのＧＢＭでＣＤ４４が亢進されていることが示された（図ＩＢ）。
【０２３２】
[00282]神経膠腫の成長及び進行におけるＣＤ４４の機能を解析するために、様々なヒト神経膠腫細胞株でのＣＤ４４タンパク質の発現レベルを決定した。ＡＴＣＣ、ＵＣＳＦ、及びフレデリックにあるＮＣＩ−ＤＣＴＤ腫瘍／細胞株保存所より入手したヒト神経膠腫細胞株を用いた。試験したヒト神経膠腫細胞の大部分が、正常なヒト星状細胞（ＮＨＡ）に比べて高レベルのＣＤ４４を発現しており、発現されたイソ型の大部分は、標準的な８５−９０ｋＤａの形態のものであった（ＣＤ４４ｓ、図１Ｃ）。それらの高いＣＤ４４発現レベル及び免疫不全マウスでの腫瘍原性に基づいて、神経膠腫の成長及び進行におけるＣＤ４４の機能、並びに、それによりＣＤ４４がその過程に貢献している可能性のある機序を研究するために、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ヒト神経膠腫細胞を選択した。
【０２３３】
実施例２
レンチウイルスを用いたｓｈＲＮＡは、ヒト多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞でのＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンする
[00283]Ｕ２５１及びＵ８７ＭＧ細胞での内生ＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンするために、一連のヒトＣＤ４４−特異的ＴＲＣ−ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＣＤ４４＃ｌ−＃５）及びｓｈＲＮＡｍｉｒ（ｓｈＲＮＡｒｎｉｒ−ＣＤ４４＃ｌ−＃３）コンストラクト（Open Biosystems）をスクリーニングした。陰性対照として、標的をもたない対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴ）を加えた。これらのｓｈＲＮＡベクターはレンチウイルスを用いたものであり、かつ、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）／ＧＦＰ及び／又はｓｈＲＮＡ挿入断片の３’末端に位置するピューロマイシン耐性遺伝子を含む。ｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクト中の要素であるＩＲＥＳは、全てのピューロマイシン耐性細胞が、挿入されたｓｈＲＮＡを発現させることを保証し、また、ｓｈＲＮＡの発現の指標として、ＧＦＰの発現を用いることを効果的に可能にする。ルシフェラーゼを導入し、ルシフェラーゼを発現しているＵ８７ＭＧ−Ｌｕｃ及びＵ２５１−Ｌｕｃ細胞に、これらのｓｈＲＮＡコンストラクトを含むレンチウイルスを感染させた。ルシフェラーゼ活性により、これらの細胞の頭蓋内での成長が効率的に観察できるようになった（Lau et al., 2008）。ピューロマイシンを用いて感染した細胞を選抜した後、集めたピューロマイシン耐性ＧＢＭ細胞集団における内生ＣＤ４４の発現レベルを評価した。リアルタイムｑＰＣＲ（データは示さない）、ウェスタンブロット解析（図２Ａ）及び免疫細胞化学（図２Ｂ、Ｄ）によって評価したように、これら２種類の神経膠腫細胞株では、３つのｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクトのうちの２つ（ｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃ｌ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃３）及び１−２ＴＲＣ−ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及び／又はｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＣＤ４４＃４）で、ＣＤ４４の発現が効果的にノックダウンされた。その他のＣＤ４４−特異的ｓｈＲＮＡにおいても、ＣＤ４４の発現は多様な程度で減少したが、標的をもたない対照は、効果を示さなかった。ＣＤ４４はＨＡの主要な細胞表面受容体であるので、ＣＤ４４を発現していない細胞の、フルオレセイン標識ＨＡ（ＦＬ−ＨＡ）への結合能を評価した。ＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンすると、神経膠腫細胞のＦＬ−ＨＡへの結合能及びＦＬ−ＨＡの取り込みが劇的に減少したが、標的をもたないｓｈＲＮＡはいずれの効果も示さなかった（図２Ｃ、及びデータは示さない）。
【０２３４】
実施例３
ＣＤ４４の発現を抑制すると、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞の増殖阻害、及び生体内でのアポトーシス促進が生じ、これによりこれら細胞の皮下成長が阻害される
[00284]ＣＤ４４の発現の低下が、どのように生体内での神経膠腫成長に影響を及ぼすのかを決定するために、まず、異なる程度のＣＤ４４の抑制を示す、遺伝子を導入し、集めたＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞集団を腫瘍の皮下（ｓ．ｃ．）成長実験に用いた。これらの細胞でのＣＤ４４発現の低下は、ＧＢＭ細胞注入から５週間後の腫瘍容積の減少と相関している（図３Ａ−Ｂ）。さらに、対照である標的をもたないｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴ、又はＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンする２つのＣＤ４４−特異的ｓｈＲＮＡ、すなわちｓｈＲＮＡＴＲＣ−ＣＤ４４＃３及びｓｈＲＮＡｍｉｒＣＤ４４＃ｌを感染させた神経膠腫細胞から得られた成長曲線は、ＣＤ４４の抑制が有意に神経膠腫の皮下成長を阻害することを示した（図３Ｃ−Ｄ）。ＣＤ４４のノックダウンによる成長阻害効果の根底をなす機序の解析を始めるために、導入したＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞のその位置での増殖及び生存を解析した。ＣＤ４４の発現をノックダウンするｓｈＲＮＡは、神経膠腫細胞の増殖を阻害し（図３Ｅ−ｅ−ｈ）、生体内でのアポトーシスを促進したが（図３Ε−ｉ−１）、対照である標的をもたないｓｈＲＮＡはそのような効果を示さなかった。
【０２３５】
実施例４
ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１神経膠腫の頭蓋内での成長が阻害される
[00285]神経膠腫の頭蓋内成長に及ぼすＣＤ４４ノックダウンの効果を決定するために、高レベルのルシフェラーゼを発現し、かつ、十分にＣＤ４４が抑制されている、二重の薬剤耐性神経膠腫細胞集団のプールを、免疫不全Ｒａｇ−１マウスの頭蓋内に注入した。注入から３、６、９、及び１３日後に、ＩＶＩＳ−２００画像処理装置（Xenogen）を用いて、頭蓋内腫瘍の生物発光画像を取得した（図４Ａ及びデータは示さない）。材料と方法に記載したように、試験期間の間、その生存についてマウスをしっかりと観察した。ＣＤ４４の発現を抑制すると腫瘍の頭蓋内成長は有意に阻害され、標的をもたないｓｈＲＮＡを導入したＵ８７ＭＧ／Ｕ２５１−Ｌｕｃ細胞を注入したマウスと比較して、実験動物の生存期間は長くなった（図４Ｂ）。
【０２３６】
[00286]ＣＤ４４の発現の低下が神経膠腫の頭蓋内成長に及ぼす効果を検討するために、Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ及びＵ２５１−Ｌｕｃ細胞を用い、ＣＤ４４に対する２つの有効なｓｈＲＮＡを含む（ｓｈＲＭＡｍｉｒ＃１及び＃３、図２及びデータは示さない）ＴＲＩＰＺレンチウイルスＴｅｔ−ＯｎｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクト（Open Biosystems）により、誘導可能なＣＤ４４ノックダウンの系を構築した。これらのＴＲＩＰＺコンストラクトは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）存在下でｓｈＲＮＡを発現し、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞中のＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンするが、対照である標的をもたないＴＲＩＰＺ ｓｈＲＮＡはＣＤ４４の発現にはいずれの効果も示さない（データは示さない）。神経膠腫細胞を頭蓋内注入前に３日間、免疫不全Ｒａｇ−１マウスに、通常の又はドキシサイクリンを染みこませた（６２５ｐｐｍ；Harlan-Teklad）固形飼料を与えた。実験期間を通じて実験マウスには、継続して、通常の又はドキシサイクリンを染みこませた固形飼料を与えた。ＣＤ４４の誘導性ノックダウンは、神経膠腫の頭蓋内成長を阻害し、かつ、マウスの生存期間を延長させ（データは示さない）、これらの結果は最初の観察を支持するものである。
【０２３７】
実施例５
ＣＤ４４の発現を低下させると、神経膠腫細胞の生体内での細胞毒性薬に対する感受性が高まる
[00287]ＧＢＭに対する第一の細胞毒性薬は、テモゾロミド（ＴＭＺ）及びカルムスチン（ＢＣＮＵ）である。ＣＤ４４が転移性乳癌細胞に必須の生存シグナルを提供するというこれまでの観察に基づき（Yu et al., 1997）、ＣＤ４４の発現を低下させると、生存シグナルの伝達が阻害される可能性、並びに神経膠腫細胞のＢＣＮＵ及びＴＭＺ処理への生体内での感受性が高められる可能性について検討した。内生ＣＤ４４が低下した、又はそうではないＵ８７ＭＧ−Ｌｕｃ及びＵ２５１−Ｌｕｃ細胞を、マウスの頭蓋内に注入し、その後連続して、単回用量のＢＣＮＵ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）又はＴＭＺ（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を処理した。ＢＣＮＵ及びＴＭＺは単剤として用いた場合、神経膠腫の成長に対して、弱い及び中程度の阻害効果を示す（図４Ｃ−Ｄ）。しかしながら、ＣＤ４４のノックダウンとＢＣＮＵ又はＴＭＺの併用が神経膠腫の頭蓋内形成の阻害に対して相乗効果をもたらし、マウスの生存期間の中間値の著明な増大によって決定されるように、ＣＤ４４を抑制すると神経膠腫細胞のＢＣＮＵ及びＴＭＺへの反応の感受性が上がる（図４Ｄ）。
【０２３８】
実施例６
ＣＤ４４は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路に同等な経路の活性化を弱め、ヒトＧＢＭ細胞でのストレス制御及びアポトーシス反応で重要な役割を果たした
[00288]放射線治療はＧＢＭ患者に別の選択肢を提供する。放射線治療及びいくつかの細胞毒性薬は、それらの抗神経膠腫効果を生じる、主要な細胞死誘導物質である活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。神経膠腫細胞に対するＣＤ４４ノックダウンの化学感作効果の根底をなす分子機構を解析するために、Ｈ２Ｏ２で誘導した酸化ストレス及びＴＭＺで誘導した細胞毒性ストレスへのＧＢＭ細胞の反応に、ＣＤ４４発現の低下がどのように影響するかを観察した。対照である標的をもたないｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴ及びＴＲＣ−ＮＴ、又はＣＤ４４に対する２つの最も有効なｓｈＲＮＡの混合物（ｓｈＲＮＡｍｉｒＣＤ４４＃ｌ及びＴＲＣ−ＣＤ４４＃３、図２）を含むウイルス混合物をＵ８７ＭＧ細胞に導入し、これらの実験に用いた。ヒトＧＢＭ細胞で内生ＣＤ４４の発現を低下させると、細胞の酸化及び細胞毒性ストレスへの反応が高まり、維持され、そしてこれら細胞の生存能力が低下した（図５及びデータは示さない）。
【０２３９】
[00289]ＭＳＴｌ／２は、酸化ストレス誘導性アポトーシスの仲介において重要な役割を果たしており（Lehtinen et al., 2006）、また、我々はＭＳＴ１／２がヒトＧＢＭ細胞ではマーリンの下流で機能することを示してきた（Lau et al., 2008）。高レベルの内生ＣＤ４４を発現しているＧＢＭ細胞と比較すると、内生ＣＤ４４が抑制された細胞では酸化ストレスに反応して、ＭＳＴ１／２及びＬａｔｓ１／２の強固かつ持続したリン酸化／活性化、ＹＡＰのリン酸化／不活性化、及びｃＩＡＰ１／２の発現の低下が生じる（図５Ａ−Ｂ）。これらの効果は、マーリンのリン酸化／不活性化、切断型カスパーゼ−３レベルの上昇、及び細胞の生存能力の低下と関連している（図５Ｂ及び３Ｅ、及びデータは示さない）。一方、より高レベルの内生ＣＤ４４はマーリンのリン酸化／不活性化を促進し、哺乳類でのヒッポシグナル伝達経路に同等な経路のストレス誘導性の活性化を阻害し、そしてｃＩＡＰ１／２をアップレギュレートし、これらにより、カスパーゼ−３の開裂阻害及びアポトーシスを引き起こす（図５Ａ、３Ｅ、データは示さない）。これらの結果は、ＣＤ４４が哺乳類のヒッポシグナル伝達経路（マーリン−ＭＳＴ１／２−Ｌａｔｓ１／２−ＹＡＰ−ｃＩＡＰ１／２）の上流に位置することを示し、そしてＣＤ４４が、ストレス及びストレス誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の応答を弱めることに機能していることを示唆している。
【０２４０】
[00290]ＭＳＴ１／２キナーゼが複数の下流エフェクターをもつこと、及び複数のシグナル伝達経路に関与していることから、ＭＳＴ１／２の既知のエフェクターもまた、ここで新しく確立したＣＤ４４−ＭＳＴ１／２シグナル伝達軸の下流で機能しているのがどうかについて解析した。これらの結果は、示すＣＤ４４をノックダウンすると、酸化ストレスに曝露させた神経膠腫細胞でのＪＮＫ及びｐ３８ストレスキナーゼの活性化が上昇し、維持されることを示している（図５Ｄ）。加えて酸化ストレスはＣＤ４４欠損神経膠腫細胞において、ＪＮＫ／ｐ３８の下流エフェクターとして既知のｐ５３、及びその標的遺伝子であるｐ２１及びプーマの持続した上向き調節を誘導したが（図５Ｄ）、高レベルの内生ＣＤ４４を含むＧＢＭ細胞はＪＮＫ／ｐ３８の活性化を弱め、そしてｐ５３、ｐ２１、及びプーマの誘導を阻害した（図５Ｃ）。
【０２４１】
[00291]カスパーゼ−３の開裂は、細胞のアポトーシスの指標となる。Ｈ２Ｏ２処理を用いた生体外でのデータはカスパーゼ−３の開裂を示しており（図５Ｂ）、このことは、ヒトＧＢＭ細胞での内生ＣＤ４４の発現の低下と酸化ストレスの併用により、ＧＢＭの腫瘍サイズが減少する可能性を示唆している。
【０２４２】
[00292]生体にＨ２Ｏ２を投与してはいないが、化学療法及び放射線治療はＨ２Ｏ２を生じる作用をもつ。図４（Ｃ−Ｄ）は、ヒトＧＢＭ細胞での内生ＣＤ４４の発現の低下と化学療法薬の併用により、腫瘍サイズが減少し、生存期間が延長したことを示している。そのため、両方の型の治療がＨ２Ｏ２の生産を生じる可能性があることから、ヒトＧＢＭ細胞の内生ＣＤ４４の発現の低下と放射線治療の併用が、ＧＢＭの腫瘍サイズの減少及び生存期間の延長をもたらすと予測される。
【０２４３】
[00293]ＣＤ４４の抑制が、神経膠腫細胞の生体内での生物毒性薬に対する感受性をどのように高めるのかを解析するために（図４Ｃ〜Ｄ）、図５で記載した実験と同様の実験を行った。この実験では、高い又は低いＣＤ４４を発現している神経膠腫細胞の細胞毒性ストレスを誘導するために、Ｈ２Ｏ２ではなくＴＭＺを用いた。それらの酸化ストレスに対する反応と同様に、ごく低レベルのＣＤ４４を発現している神経膠腫細胞では、ＴＭＺに曝露すると、ＭＳＴ１／２の強固かつ持続したリン酸化／活性化、並びに、ｃＩＡＰレベルの低下、ＪＮＫではなくｐ３８の活性化、及びｐ５３及びその標的遺伝子であるｐ２１の亢進と関係するＹＡＰのリン酸化／不活性化が起こる（図６）。これらの結果は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の活性化を弱めることによって腫瘍細胞のストレス／アポトーシス反応を阻害におけるＣＤ４４の新規役割を確立し、そして、宿主防御及び治療介入を含む多様な原因による腫瘍細胞のストレス耐性において、どのようにＣＤ４４の亢進が重要な役割を果たしているかの最初の分子的解釈を提供するものである。
【０２４４】
実施例７
ＣＤ４４は、神経膠腫細胞中のＥｒｂＢ及びｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）介在性成長−シグナル伝達経路を調節した
[00294]生体内での結果は、ＣＤ４４のノックダウンがＧＢＭ細胞の生体内での増殖を阻害することを示す（図３Ｅ）。ＲＴＫシグナル伝達経路が神経膠腫の進行に強く関与するというこれまでの試験から、ＣＤ４４が、ＣＤ４４を抑制した神経膠腫細胞の生体内での増殖の低下に関与する可能性のあるＥｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫシグナル伝達経路の共刺激因子であることがわかってきた（Orian-Rousseau et al., 2002; Toole, 2004; van der Voort et al., 1999）。ＣＤ４４のノックダウンが、ＥＧＦファミリーリガンド誘導性及びＨＧＦ誘導性の下流のシグナル伝達経路の活性化を弱めるかどうかを決定するために、高レベル又は低レベルのＣＤ４４を発現している血清飢餓Ｕ８７ＭＧ細胞を、ＥＧＦファミリーリガンド、ヘパリン−結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、アンフィレグリン（ＡＲ）及びエピレグリン（Ｅｐｒ）、ＨＧＦ、ＮＧＦ、を含む異なるＲＴＫリガンド、及び１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で処理した。ＣＤ４４発現の低下により、ＥＧＦファミリーリガンド−及びＨＧＦ−誘導性のＥｒｋ１／２キナーゼのリン酸化は低減したが、ＡＫＴキナーゼのリン酸化は低減しなかった。また、ＮＧＦ−及びＦＢＳ−誘導性のＥｒｋ１／２のリン酸化は低減しなかった（図７）。これらは、ＣＤ４４は増殖を優先的に調節するが、これら成長因子によって活性化された生存シグナル伝達経路を調節するものではなく、ＣＤ４４がヒッポ経路を介して生存シグナル伝達経路を制御することを示唆している。
【０２４５】
実施例８
Ｕ８７ＭＧマーリン及びＷＭ７９３マーリン細胞の転写産物プロファイリングは、ＣＤ４４によって負に調節されるＣＤ４４の下流エフェクターであるマーリンが、複数の重要なシグナル伝達経路における重要な制御因子の調節因子であることを示唆している
[00295]ＣＤ４４及びマーリンは、その他の各機能を負に制御する（Bai et al., 2007 及び Xu et al., 2010）。Ｕ８７ＭＧ細胞は、マーリンの成長阻害効果に対して劇的な反応を示し（Lau et al., 2008）、このことは、マーリンの発現が負に調節され、かつ、ＣＤ４４の発現が正に調節されていても、マーリンの下流のシグナル伝達経路がこれらの細胞において完全であることを示唆している。この細胞モデルは、差次的に発現する遺伝子、及びマーリンの再発現に反応して変化したシグナル伝達経路を同定するための非常に良い機会を提供する。これら差次的に発現する遺伝子は、ヒト神経膠腫中でマーリンの機能が欠損又は抑制され、そしてＣＤ４４が正に調節された場合に、過活性又は低下すると考えられるマーリン及びＣＤ４４の必須の下流エフェクターのいずれかを表す可能性がある。これらシグナル伝達経路の再制御は、神経膠腫原性及び／又はこの疾患の進行の停止を引き起こす可能性がある。
【０２４６】
[00296]マーリンの強力な抗神経膠腫効果を調節する下流エフェクターを同定するために、高レベルのマーリンを発現している、それぞれ独立して遺伝子を導入した３種類のＵ８７ＭＧマーリン及びＵ８７ＭＧＷＴ細胞の集団それぞれの遺伝子発現プロファイルを、ヒトＵ１３３ｖ２ジーンチップ（Affymetrix）を用いて比較した。マイクロアレイの結果は、Ｕ８７ＭＧマーリンでのマーリンの発現はＵ８７ＭＧＷＴ細胞での発現よりも〜３倍高いことを示した。Ｕ８７ＭＧＷＴと比較して、Ｕ８７ＭＧマーリン細胞で発現が上昇した３６２の遺伝子と、発現が低下した３６４の遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、接着、移動、アクチン−細胞骨格構成、細胞周期、生存、及びシグナル伝達に関与する遺伝子として分類が可能である。これらの遺伝子を、機能的に関連する遺伝子群として分類するために、David Functional Annotation Bioinformatics Microarray解析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐ、ＮＩＡＩＤ／ＮＩＨ）にデータを移した。これらの転写産物を機能経路に基づいて分類した後我々は、マーリンの再発現が、ヒッポシグナル伝達経路を活性化する転写産物の発現、及びＷｎｔシグナル伝達経路を阻害する分子のを上昇させ、並びに、Ｗｎｔ及びＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ及びプレイオトロフィン（ＰＴＮ）／未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）シグナル伝達経路を活性化する転写産物の発現を低下させることを見いだした（図８）。
【０２４７】
[00297]マーリンによって誘導される、異なる腫瘍型間で共通した発現プロファイルの変化を見いだすために、ヒト黒色腫の成長に及ぼすマーリンの効果について解析した。マーリンの発現がヒト黒色腫細胞株では負に調節され、野生型マーリンの発現の上昇がＷＭ７９３ヒト黒色腫細胞の生体内での皮下成長を有意に阻害することが明らかになった（データは示さない）。ＷＭ７９３ＷＴ及びＷＭ７９３マーリン細胞の発現産物プロファイルをさらに評価した結果、マーリンの発現が、その多くが抗腫瘍特性を示す６９７の遺伝子の発現を上昇させ、その多くが腫瘍促進活性を示す７３６の遺伝子を負に調節することが示された（データは示さない）。これら有意に正及び負に調節された遺伝子を、機能的な関連に基づいて分類し、マーリン発現の上昇が有意に影響を及ぼしたシグナル伝達経路を生成するために、David Functional Annotation Bioinformatics Microarray解析ソフトウェアにデータを移した。これらの出力データを次に、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞由来のデータと比較し、マーリンにより誘導された共通の変化を同定した。これらのデータにより、マーリンの発現の上昇がヒッポを活性化し、そしてＷｎｔ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を阻害することが示された（図８）。
【０２４８】
実施例９
マーリンはＷｎｔシグナル伝達を阻害する
[00298]次に、これらのマーリンに誘導される発現の変化を機能レベルで解析した。標準的なＷｎｔシグナル伝達が、Ｔ−細胞因子／リンパ球エンハンサー因子（ＴＣＦＬＥＦ）転写因子のコアクチベーターである、ベータ−カテニンの発現レベルを調節することによって遺伝子の発現を制御していることから、ベータ−カテニン反応性ルシフェラーゼレポーターコンストラクトであるＴｏｐＦｌａｓｈ（Addgene）を用いてレポーター検定を行った。変異型ＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位を含むＦｏｐＦｌａｓｈを陰性対照として用いた。ベータ−カテニンの転写活性が、野生型マーリン及びマーリンＳ５１８Ａによって阻害されるが、マーリンＳ５１８Ｄによっては阻害されないことが見いだされた（図９）（Lau et al., 2008）。
【０２４９】
実施例１０
ＣＤ４４及びマーリン介在性シグナル伝達イベント、並びにそれらのクロストークの可能性
[00299]ＣＤ４４及びマーリン介在性シグナル伝達イベント及びそれらのクロストークの可能性の実用モデル（ショウジョウバエのヒッポシグナル伝達経路の構成要素を下線で表す）：マーリンは哺乳類のヒッポ（マーリン−ＭＳＴ１／２−ＬＡＴＳ１／２−ＹＡＰ）及びＪＮＫ／ｐ３８シグナル伝達経路の上流において機能し、かつ、ストレス、ストレス誘導性アポトーシス、及び増殖／生存シグナルに対する細胞反応の制御において必須の機能をもつ。マーリンはＣＤ４４の機能に拮抗し、そしてＲＴＫ活性、並びに、ＲＴＫによる成長及び生存シグナルを阻害する。ＣＤ４４は哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の上流で機能し、そしてＲＴＫの活性を亢進する。
【０２５０】
実施例１１
ＣＤ４４の拮抗薬であるｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、マウスモデルでのヒトＧＢＭに対する有効な治療薬として役立つ
[00300]前臨床マウスモデルでの神経膠腫の進行を阻害するために、ＣＤ４４の拮抗薬が使用可能かどうかを決定するために、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ、又はＣＤ４４ｓＲ４１Ａの細胞外ドメインに融合させたヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）（Holash et al., 2002; Kim et al., 2002; Sy et al., 1992）で構成される、複数の融合タンパク質を開発した（図１１）。これら融合タンパク質の抗体様特性は、生体外での生産及び精製の相対的な簡便性に加えて、それらに生体内での有利な薬物動態学的及び生体内分布プロファイルを与えるものである。リガンドを捕捉すること、及び／又は内生受容体の機能を干渉することにより、受容体−Ｆｃ融合タンパク質は機能していると考えられる。
【０２５１】
[00301]Ｒ４１をＡに変異させると、ＣＤ４４のＨＡに結合する能力が消失する。しかしながら、変異型ＣＤ４４のその他全てのリガンド及びＣＤ４４シェダーゼに結合する能力は保存されるようであり、このことは、ＣＤ４４が腫瘍促進活性を示すためにＨＡ以外のリガンド及びＣＤ４４シェダーゼが非常に重要であると考えられることから、重要である。ＨＡ結合の消失が特定の癌に対するＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃ活性のいくらかを低減する可能性があることから、この修飾が生体内分布及び生物学的利用率を改善する可能性がある。
【０２５２】
[00302]ＣＤ４４のｖ３エクソンは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）側鎖への共有結合に必要なＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙモチーフを含む（Bennett et al., 1995）。ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃタンパク質はＨＳにより修飾されるかどうかを評価するために、精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質をへパリナーゼＩ／ＩＩＩで処理して又は処理せずに、プロテインＡカラムから溶出した。次にこれらのタンパク質を３枚のエライサプレートに塗布した。ＢＳＡでブロッキングした後、塗布したタンパク質の抗ＨＳ抗体との反応性を試験した。呈色検定により評価した反応の強度を、プレート上に塗布した融合タンパク質の相対量を表す抗ＣＤ４４抗体との反応性を用いて正規化した。これらの結果は、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−ＦｃのみがＨＳによって修飾され、抗ＨＳ抗体により染色されたことを示した。観察された反応性は、へパリナーゼＩ又はＩＩＩへの処理にたいして感受性であった（図１１Ｃ）。
【０２５３】
[00303]Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞に、これらのＣＤ４４−Ｆｃ及びＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質をコードしている発現コンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを導入した。集めたピューロマイシン耐性細胞は、高レベルのｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を発現した（図１１Ａ、図１２Ａ）。可溶性ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質が、ＦＬ−ＨＡの内生ＧＢＭ細胞表面ＣＤ４４への結合を変化させることができるかどうかについて評価した。ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の発現がＦＬ−ＨＡのＧＢＭ細胞への結合を低減させることを見いだした（図１１Ｂ）。次にこれらの細胞のＲａｇ−１マウスでの皮下及び頭蓋内成長を、空のベクターを感染させた細胞の成長と比較した。ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃの発現はＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞の皮下及び頭蓋内成長を著明に阻害し、そして頭蓋内腫瘍をもつマウスの生存期間を有意に延長させた。ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質が最も著明な阻害効果を示した（図１２Ｂ及びＣ）。
【０２５４】
[00304]ＣＤ４４は、ＨＡ、オステオポンチン、ヘパリン結合成長因子、フィブロネクチン、セリグリシン、ラミニン、ＭＭＰ−９、及びフィブリンを含む複数のリガンドをもち（Bennett et al., 1995; Ponta et al., 2003; Stamenkovic, 2000; Stamenkovic and Yu, 2009; Toole, 2004）、そして複数のＲＴＫ及びその他の細胞表面受容体と共同する（Orian-Rousseau et al., 2002; Stamenkovic, 2000; Stamenkovic and Yu, 2009）。ＣＤ４４の機能の多くは、ＨＡとの相互作用により仲介されており（Toole, 2004）、この機能はＲ４１Ａ単一突然変異により消失する（Peach et al., 1993）。ＣＤ４４−ＨＡ相互作用のみがＣＤ４４のＧＢＭ促進活性の原因かどうかを決定するために、ｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃ又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃを発現しているＵ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞の集団を準備し、それらの抗ＧＢＭ効果を、それらの野生型対応物への効果と比較した。野生型ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質とは異なり、ＣＤ４４Ｒ４１Ａ−Ｆｃタンパク質はＦＬ−ＨＡのＧＢＭ細胞への結合を阻害することはできない（図１１Ｂ及びデータは示さない）。しかしながら、ｈｓＣＤ４４ｓＲ４１Ａ−Ｆｃが弱い抗ＧＢＭ効果を示す一方で、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０Ｒ４１Ａ−Ｆｃは十分なレベルの抗ＧＢＭ活性を保持し（図１２Ｃ−ｃ及びデータは示さない）、このことは、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ融合タンパク質が試験した３種類のＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の内で最も強力な抗ＧＢＭ効果を有するという知見と一致し、ＨＡの捕捉に追加した作用機序を示唆している。さらにこれらの結果は、ＣＤ４４、特にＣＤ４４変異体がＨＡ依存性及びＨＡ非依存性両方の系で腫瘍の進行を促進することを示唆している。
【０２５５】
[00305]最後に、５×１０５個のＵ８７ＭＧ又はＵ２５１細胞をＲａｇ−１マウス注入することより、予め準備しておいた頭蓋内神経膠腫での、精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質の抗ＧＢＭ効力を評価した。頭蓋内腫瘍を５日間生育させ、その後、５ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ又は精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質を含む０．９％ＮａＣｌを、３日毎に静脈内に注入することにより、実験終了までマウスを治療した。ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質を全身に送達すると、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞の頭蓋内成長が著明に阻害され、実験マウスの生存期間の中央値が有意に（ｐ＜０．００１）延長されたが、ヒトＩｇＧの全身送達ではそのような結果は起こらなかった（図１３Ａ−Ｂ）。マウスを安楽死させる時点でＧＢＭ及び脳組織を回収して切片を作成し、そしてｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の生体内分布を評価するために抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。結果から、ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は腫瘍血管を容易に貫通して顕著な神経膠腫内分布パターンを示し、その大部分が完全な血液脳関門の存在によると考えられる、隣接した正常な脳組織にある融合タンパク質はごくわずかであることがわかった（図１３Ｃ）。これらの結果は、ＣＤ４４−Ｆｃタンパク質が、出血している血管を含む腫瘍組織で優先的に蓄積されることを示している。さらにこの結果は、ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質がＧＢＭに対する有効な治療薬である可能性を示している。加えて、融合タンパク質の全身性送達による毒性の可能性を評価するために、正常な宿主組織をＨ＆Ｅ染色した。全体的及び組織学的な検査を注意深く行ったが、明らかな毒性及び正常な組織の壊死は観察されなかった（図１３Ｄ）。
【０２５６】
実施例１２
ＣＤ４４をノックダウンすると、癌細胞のｅｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫ阻害薬への反応の感受性が高まる
[00306]図７に示すように、ＣＤ４４はＥｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫ由来成長シグナルの増強に重要な役割を果たしている。ＣＤ４４のノックダウンがＧＢＭ細胞のｅｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫの薬理学的阻害剤に対する反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、神経膠腫細胞の生死判別試験を、さまざまな濃度のｅｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫ阻害剤の存在下で、ＣＤ４４をノックダウンして又はノックダウンせずに行った。結果から、ＣＤ４４の発現をノックダウンしたｓｈＲＮＡにより、二重阻害剤であるＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２（ＢＩＢＷ２９９２）、ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２／４のｐａｎ阻害剤（ＣＩ−１０３３）及びｃ−Ｍｅｔ阻害剤（ＳＵ１１２７４；LC Laboratories、Selleck Chemicals Co.）へのＵ８７ＭＧ細胞の反応の感受性が高まることが示された（図１４）。このことは、ＣＤ４４及びｅｒｂＢ又はｃ−Ｍｅｔを共に標的とすることにより、これらの分子が重要な役割を果たしている癌への相乗的な阻害効果が達成できるという証拠をもたらすものである。
【０２５７】
実施例１３
ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＢＭ細胞の化学療法及び標的治療に対する反応の感受性を高める
[00307]ＣＤ４４拮抗薬であるｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質が、化学療法薬及びｅｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫの薬理学的阻害剤に対するＧＢＭ細胞の反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、神経膠腫細胞の生死判別試験を様々な濃度のＴＭＺ、すなわちｅｒｂＢ及びｃ−ＭｅｔＲＴＫの阻害剤、の存在下又は非存在下で、精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質又はヒトＩｇＧを加えて又は加えずに行った。結果から、ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質が二重阻害剤であるＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２（ＢＩＢＷ２９９２）、ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２／４のｐａｎ阻害剤（ＣＩ−１０３３）、及びｃ−Ｍｅｔ阻害剤のＴＭＺ（ＰＦ−２３４１０６６、Selleck Chemicals Co.）へのＵ８７ＭＧ細胞の反応の感受性が高まったが、ヒトＩｇＧではそのような効果が見られなかったことが示された（図１５）。
【０２５８】
実施例１４
ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質は、正常細胞パネルに対する弱い細胞毒性を示す
[00308]良い癌の治療標的を定義するために用いられる２つの重要な特徴は、腫瘍細胞中での標的の発現が高く、正常な細胞ではその発現が低いかないこと、及び腫瘍細胞の標的機能への高い依存性である。ＣＤ４４はこれらの基準を満たしている。正常な細胞に対してＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質が毒性を有する可能性を評価するために、正常細胞パネルを用い、様々な量の精製したｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質の存在下又は非存在下で細胞の生死判別試験を行った。この結果は、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、正常なヒト星状細胞（ＮＨＡ）、シュワン細胞、繊維芽細胞（ＨＧＦ−１）及び内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対しては、Ｕ２５１ＧＢＭ細胞に対してよりも低い毒性を有することが示された（図１６）。
【０２５９】
実施例１５
ＣＤ４４はＧＢＭＣＳＣの自己再生及び生体内での成長に必要である
[00309]幹細胞は自己再生する特徴を示す。神経膠腫ＣＳＣ細胞塊の自己再生能にＣＤ４４が寄与しているかどうかを決定するために、新しいＧＢＭ組織（ＣＨＴＮ）由来の初代ヒト腫瘍様塊（ＨＧＳ）を調整した。新しいＧＢＭ組織由来のヒトＧＢＭＣＳＣ細胞塊、ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１及び−２は自己再生能を有し、幹細胞マーカー（Ｓｏｘ−２及びネスチン）を発現し、及び、目的の遺伝子を発現させるために又は発現をノックダウンするためにレトロウイルス及びレンチウイルスを用いて容易に形質転換することが可能である（図１７Ａ〜Ｃ）。これらＧＢＭＣＳＣ中のＣＤ４４の発現するｓｈＲＮＡは細胞塊の形成を阻害し（図１８）、このことは、ＣＤ４４が神経膠腫幹細胞の維持に重要であること、及びその標的化は癌幹細胞の除去及び悪性癌再発の停止を助けることを示している。加えて、ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１及び−２が容易にＲａｇ−１マウスに侵襲性頭蓋内腫瘍を形成すること（図１７Ｄ及びデータは示さない）、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ融合タンパク質の過剰発現がＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１細胞の頭蓋内成長を阻害することが見いだされた（図１７Ｄ−ｂ）。
【０２６０】
実施例１６
ＣＤ４４は様々なヒト癌型において正に調節されている
[00310]結腸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌、黒色腫、胃癌、及び食道癌でのＣＤ４４の発現レベルを決定するために、ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。我々は、ＣＤ４４の転写産物がヒト結腸（図１９Ａ、１９Ｃ）（Graudens et al., 2006; Notterman et al., 2001）、卵巣（図３２Ａ）（Hendrix et al., 2006）、頭頸部扁平上皮細胞癌腫（図３８Ａ、図３９）（Ginos et al., 2004）、腎細胞癌（図３７、図３８Ｂ）（Gumz et al, 2007）、黒色腫（図３５Ａ〜Ｂ）、胃癌（図４２）、及び食道癌（図４３）において、それらの正常な対応物と比較して亢進されていることを見いだした。データはｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）より取得した。
【０２６１】
[00311]加えて、初代ヒト腫瘍のパラフィン切片の免疫組織化学的解析により、ＣＤ４４が悪性／転移性結腸癌（図１９Ｂ）、前立腺癌（図２２）、悪性乳癌（図２５）、及び転移性卵巣癌（図３２Ｂ〜Ｃ）において、それらの正常な対応組織又は初代腫瘍と比較して亢進されていることを示した。
【０２６２】
実施例１７
ＣＤ４４の発現をノックダウンすると、様々なヒト癌細胞の生体内での成長が阻害された
[00312]ＨＣＴ１１６及びＫＭ２０Ｌ２ヒト結腸癌細胞、ＰＣ３／Ｍヒト前立腺癌細胞、ＭＸ−２及びＳＷ６１３ヒト乳癌細胞、ＮＣＩ−Ｈ１２５及びＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌細胞、及びＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞での内生ＣＤ４４発現をノックダウンするために、一連のヒトＣＤ４４−特異的ＴＲＣ−ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＣＤ４４＃１〜＃５）及びｓｈＲＮＡｍｉｒ（ｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＣＤ４４＃１〜＃３）コンストラクト（Open Biosystems）をスクリーニングした。スクリーニングでの陰性対照として、標的をもたない対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＴＲＣ−ＮＴ及びｓｈＲＮＡｍｉｒ−ＮＴ）を加えた。これらのｓｈＲＮＡコンストラクトを含むレンチウイルスを癌細胞に感染させた。感染した細胞を、ピューロマイシンを用いて選抜した後、集めたピューロマイシン耐性癌細胞中の内生ＣＤ４４の発現レベルを評価した。ウェスタンブロット解析によって評価したように、少なくとも２つのｓｈＲＮＡが、これらの癌細胞でのＣＤ４４の発現を効果的にノックダウンした（図２０Ａ、２１Ａ、２３Ａ、２６Ａ、２７Ａ、３０〜３１Ａ、及び３３Ａ）。その他のＣＤ４４に特異的なｓｈＲＮＡは様々な程度でＣＤ４４の発現を低下させたが、標的をもたない対照は効果を示さなかった。それぞれの度合いでＣＤ４４の抑制を示している、これら遺伝子を導入した癌細胞の集団を、ＣＤ４４の発現の低下がどのようにそれらの生体内での皮下成長に影響を及ぼしているかを決定するための、腫瘍の皮下（ｓ．ｃ．）成長実験に用いた。この結果から、これらの細胞を注入して６週間後の腫瘍容積の低下と、これら細胞でのＣＤ４４の発現の低下には相関があることが示された（図２０〜２１Ｂ、２３Ｂ、２６〜２７Ｂ、３０〜３１Ｂ、及び３３Ｂ）。このことは、ＣＤ４４がこれらの型の癌細胞の生体内での成長に必要であり、そのため、ＣＤ４４がこれらの癌型の治療介入の最初の標的であることを示している。
【０２６３】
実施例１８
精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質はヒト前立腺癌の生体内での成長を阻害する
[00313]３種類のヒト前立腺癌細胞株におけるＣＤ４４の発現を評価した。最も攻撃的な前立腺細胞株であるＰＣ３／Ｍ細胞が最も高レベルのＣＤ４４を発現していることが明らかになった（図２４Ａ）。ＰＣ３／Ｍ細胞の生体内での成長に及ぼす精製したｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の効果を評価するために、５×１０６個のＰＣ３／Ｍ細胞を各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜１５０ｍｍ３に達するまで、腫瘍を〜２週間生育させた。腫瘍サイズによりマウスを６群に分け（６匹／群）、そして１０ｍｇ／ｍｌのｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、又はヒトＩｇＧ、又は０．９％ＮａＣｌを、５μｌの注入量で４回腫瘍内注入することにより処理した（図２４Ｂ）。対照群（ヒトＩｇＧ又は０．９％ＮａＣｌでの治療群）の腫瘍の最も長い径が１ｃｍに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとしてデータを表す。この結果から、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質がＰＣ３／Ｍ細胞の生体内での成長を有意に阻害したが、０．９％ＮａＣｌは阻害しなかったことが示された（図２４Ｂ）。
【０２６４】
実施例１９
ヒトの悪性乳癌細胞が浸潤した宿主の間質は高レベルのＣＤ４４を発現し、侵襲性乳癌の間質は高レベルのＨＡを蓄積する
[00314]乳癌の進行及び乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）の維持におけるＣＤ４４の機能を決定するために、ヒト悪性乳癌組織（ペンシルバニア大学のＣＨＴＮから得た）中のＣＤ４４タンパク質及びＨＡレベルを測定した。正常な乳房組織と比較すると（図２５Ａ）、宿主の間質に浸潤した乳癌細胞でＣＤ４４は高度に正に調節されている（図２５Ｂ〜Ｃ）。加えて、ＨＡは、正常な乳房間質（図２５Ｄ）と比較して、悪性乳癌間質において蓄積される（図２５Ｅ）。ビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を用いてパラフィン切片中のＨＡを検出した。
【０２６５】
実施例２０
ヒトＢＣＳＣ及び生体内での乳癌モデルの確立；ＢＣＳＣの自己再生及び維持、並びにＢＣＳＣの生体内での成長にＣＤ４４が必要であることを示している
[00315]研究から、腫瘍原性のＢＣＳＣには腫瘍様塊が多く含まれていることが示されてきた（Al-Hajj et al., 2003; Reya et al., 2001）。新しい悪性ヒト乳癌組織由来の、３種類の異なる初代腫瘍様塊の調整物（ＭＳＳＭ−ＢＣＳＣ−１、−２、及び−３）を確立した。これらのＭＳＳＭ−ＢＣＳＣは、癌幹細胞マーカーであるＣＤ４４を高レベルで、ＣＤ２４を低レベルで発現している（図２８）。これらはまた、幹細胞マーカーであるＳｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及び／又はＳＳＥＡ−１も発現しており（図２８Ｂ及びデータは示さない）、かつ、腫瘍様塊形成検定では自己再生能を（図２８Ｃ−ａ〜ｃ）、そして免疫不全Ｒａｇ−１マウスに移植した場合には腫瘍原性を示す（図２８Ｅ）。図２８Ａに示したようにＭＳＳＭ−ＢＣＳＣでは、ＣＤ４４の複数のイソ型、並びに標準形態のＣＤ４４（ＣＤ４４ｓ、下側のバンド）が発現している。我々は、目的の遺伝子を発現させるため又はその発現をノックダウンするために、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いてＢＣＳＣに遺伝子を導入するプロトコールを確立した。ルシフェラーゼを含むレトロウイルスをこれらのＭＳＳＭ−ＢＣＳＣに導入した。Ｇ４１８により選抜した後の細胞は、それらの生体内での成長を追跡することを可能にするルシフェラーゼを高レベルで発現している薬剤耐性のＭＳＳＭ−ＢＣＳＣ−Ｌｕｃ細胞集団である（図２８Ｅ）。さらに、ＣＤ４４の発現を標的としたｓｈＲＮＡは腫瘍様塊の形成を阻害したが、標的をもたないｓｈＲＮＡは腫瘍様塊の形成にはいずれの効果も示さなかったことが見いだされた（図２８Ｃ−ｄ〜ｆ、Ｄ）。この結果は、ＢＣＳＣの自己再生及び維持にＣＤ４４が重要であること、並びにその標的及び機能不全が乳癌幹細胞の除去及び悪性疾患の再発防止に関わる可能性を示すものである。
【０２６６】
実施例２１
精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＣＳＣの生体内での成長を阻害する
[00316]ＢＣＳＣの生体内での成長に及ぼす精製したｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の効果を評価するために、１×１０６個のＭＳＳＭ−ＢＣＳＣ−１細胞を各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜２００ｍｍ３に達するまで、腫瘍を約３週間生育させた。腫瘍サイズによりマウスを６群に分け（６匹／群）、そして１０ｍｇ／ｍｌのｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、若しくはヒトＩｇＧ、又は０．９％ＮａＣｌを注入量５μｌで４回、腫瘍内に注入することにより治療した（図２９）。対照群（ヒトＩｇＧ又は０．９％ＮａＣｌでの治療群）の腫瘍の最も長い径が１ｃｍに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。この結果から、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質がＢＣＳＣの生体内での成長を有意に阻害したが、０．９％ＮａＣｌは阻害しなかったことが示された（図２９）。
【０２６７】
実施例２２
ＣＤ４４は、ヒト卵巣癌の間質では正に調節されている
[00317]ヒト卵巣癌の進行にＣＤ４４が寄与しているかどうかを評価するために、ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、正常な卵巣と比較して、ヒト卵巣癌ではＣＤ４４の転写産物が亢進していることが見いだされた（図３２Ａ）。免疫組織化学的解析により、ＣＤ４４及びそのリガンドであるＨＡが、正常な卵巣と比較して、第ＩＩＩ期及び第ＩＶ期のヒト卵巣癌において亢進されていることがわかった（図３２Ｂ〜Ｄ及びデータは示さない）。
【０２６８】
実施例２３
ＣＤ４４は、卵巣癌幹細胞（ＯＣＳＣ）の自己再生及び維持に重要である
[00318]腹水卵巣癌モデルを確立するために、Ｒａｇ−１免疫不全マウスにＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲ−３親細胞を腹腔内（ｉｐ）移植し、一連の生体内選抜を行った。これらの選抜から得られたＳＫＯＶ３ｉｐ及びＯＶＣＡＲ−３ｉｐ細胞は、Ｒａｇ−１マウスの皮下並びに腹水に腫瘍を形成する（図３４Ａ及びデータは示さない）。さらに、新しい転移性卵巣癌組織由来のＣＤ４４＋ＯＣＳＣ細胞塊（ＭＳＳＭ−ＯＣＳＣ−１及び−２）を生成した。これらのＭＳＳＭ−ＣＳＣ細胞は、癌幹細胞マーカーであるＣＤ４４を高レベルで、及び幹細胞マーカーであるＳｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、及びＮａｎｏｇをも発現している（図３４Ｂ）。さらに、腫瘍様塊形成検定においては自己再生能を（図３４Ｅ−ａ〜ｃ）、そしてＲａｇ−１マウスに移植した場合には腫瘍原性を示す（図３４Ｃ及びデータは示さない）。我々は、目的の遺伝子を発現させるため又はその発現をノックダウンするために、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いてＯＣＳＣに効率的に遺伝子を導入するプロトコールを確立した。ＣＤ４４の発現をノックダウンするｓｈＲＮＡは細胞塊の形成を阻害したが、標的をもたないｓｈＲＮＡは細胞塊の形成にはいずれの効果も示さなかったことが見いだされ（図３４Ｅ−ｄ−ｆ、３４Ｆ）、このことは、ＣＤ４４がＯＣＳＣ自己再生及び維持に重要であり、その標的が卵巣癌幹細胞の除去及び疾患の再発防止に関わる可能性を示している。
【０２６９】
実施例２４
ＣＤ４４はヒト黒色腫で正に調節されている：
[00319]ヒト黒色腫の進行にＣＤ４４が寄与しているかどうかを評価するために、ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、正常な皮膚と比較して、ヒト黒色腫ではＣＤ４４転写産物が亢進していることが見いだされた（図３５Ｂ）。ウェスタンブロット解析によってもまた、正常なメラニン細胞と比較して、ヒト悪性黒色腫細胞においてＣＤ４４が亢進されていることが示された（図３５Ｃ）。
【０２７０】
実施例２５
ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃはヒト黒色腫細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00320]ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の発現が黒色腫の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ）を発現しているＭ１４細胞、又は空の発現ベクターを導入したＭ１４細胞２×１０６個を各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜４週間生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとしてデータを表す。この結果から、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質、特にｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃが、Ｍ１４細胞黒色腫の生体内での成長を有意に阻害したことが示された（図３６Ｂ）。
【０２７１】
実施例２６
ＣＤ４４はヒト頭頸部癌では正に調節されている
[00321]ヒト頭頸部癌の進行にＣＤ４４が寄与しているかどうかを評価するために、ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、それらの正常な対応部分と比較して、ヒト頭頸部癌ではＣＤ４４の転写産物が亢進していることが見いだされた（図３８Ａ、図３９）。さらに、抗ＣＤ４４抗体（Santa Cruz）を用いてヒト頭頸部癌腫細胞でのＣＤ４４の発現をウェスタンブロットにより評価した。これらの癌細胞でのＣＤ４４の発現レベルは、それらの生体内での腫瘍原性と関連している（図４０Ａ）。
【０２７２】
実施例２７
ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃは、ヒト頭頸部癌細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00322]ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の発現が頭頸部癌細胞の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ）を発現しているＳＣＣ−４細胞、又は空の発現ベクターを導入したＳＣＣ−４細胞５ｘ１０６個を、各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜２ヶ月生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとしてデータを表す。この結果から、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質、特にｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ及びｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃが、ＳＣＣ−４細胞の生体内での成長を有意に阻害したことが示された（図４０Ｃ）。
【０２７３】
実施例２８
ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃは、ヒト膵臓及び肝臓癌細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00323]ヒト膵臓及び肝臓癌腫細胞でのＣＤ４４の発現を、抗ＣＤ４４抗体（Santa Cruz）を用いたウェスタンブロットにより評価した。結果から、ＢＸＰＣ−３、ＰＡＮ−０８−１３、ＰＡＮ−０８−２７、ＰＡＮ−１０−０５膵癌細胞及びＳＫ−ＨＥＰ−１肝臓癌細胞では、複数のＣＤ４４イソ型が発現していることがわかった（図４１Ａ）。
【０２７４】
[00324]ｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の発現が、膵臓及び肝臓癌細胞の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ）を発現しているＢＸＰＣ−３及びＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、又は空の発現ベクターを導入したＢＸＰＣ−３及びＳＫ−ＨＥＰ−１細胞５×１０６個を、各Ｒａｇ−１マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜５週間生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均＋／−ＳＤとしてデータを表した。この結果から、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質がＢＸＰＣ−３及びＳＫ−ＨＥＰ−１の生体内での成長を有意に阻害したことが示された（図４１Ｃ〜Ｄ）。
【０２７５】
実施例２９
ビオチンで標識したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を用いたＨＡの検出方法及びＨＡの検出による癌の診断方法
[00325]精製したＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖｌ０−Ｆｃ）を、ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン化キット（Thermo Scientific）を用い、製造業者の説明に従ってビオチンで標識した。ヒト腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィンし、水和した。２％のＢＳＡでブロッキングした後、切片をビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質（ｂＣＤ４４−Ｆｃ、１μｇ／ｍｌ）と共に、４度で一晩インキュベートした。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮＡＢＣキットを用いてビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を検出した。我々の結果は、正常な乳房又は卵巣の間質（図２５Ｄ及びデータは示さない）と比較して、悪性乳癌及び転移性卵巣癌の間質では（図２５Ｅ、図３２Ｄ）、ＨＡが亢進されていることを示した。ｂＣＤ４４−Ｆｃの陽性染色はＨＡに特異的なものであり、この組織切片をヒアルロニダーゼで前処理すると切片は染色されない（データは示さない）。
【０２７６】
[00326]乳、卵巣、膀胱癌、及び前立腺癌を含む多くの癌において、ＨＡが亢進されていることがよく知られている（Simpson and Lokeshwar, 2008; Tammi et al., 2008; Toole, 2004の総説、及びGolshani et al., 2008を参照のこと）。ＨＡレベルは腫瘍の進行及び転移と関係している（Toole and Hascall, 2002）。ＨＡの上昇は、胃腸管、乳及び卵巣癌の予後不良、疾患進行、並びに全生存及び疾患特異的生存の短縮と関係している（Anttila et al., 2000; Tammi et al., 2008）。尿中のＨＡを測定することが膀胱癌の診断の正確なマーカーとなることが示されている（Lokeshwar et al., 2000）。
【０２７７】
[00327]ＨＡの血漿レベルを検出するために、乳癌を有する各トランスジェニックマウス（ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ及びＭＭＴＶ−ＡｃｔＥｒｂｂ２、Jackson Lab）、ＭＳＳＭ−ＧＢＭＣＳＣ−１又は神経膠腫２６１細胞由来の神経膠腫を有する各Ｒａｇ−１マウス、又は対照となる各正常マウスから、血液２００μｌを採取した。各型につき６匹のマウスから血液試料を採取し、ただちに血漿を調整した。各試料から調整した５０μｌの血漿をそれぞれ、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質予め塗布しておいたエライザプレートの３つのウェルに充填した。ビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質及びＡＰ−結合型アビジンを用いて、ＨＡに結合したＣＤ４４−Ｆｃを検出した。発色を、エライサ測定器を用いて４０５ｎｍで測定した。この結果から、正常なマウス由来の試料と比較して、腫瘍をもつマウス由来の血漿試料ではＨＡが亢進されていることが示され（図４４）、このことは、ビオチン化ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質が、癌患者の血漿、血清、及び尿中のＨＡレベルの検出に使用可能であり、また、診断的及び予後試薬として有効であることを示している。
【０２７８】
実施例３０
ＣＤ４４の発現の低下は、細胞毒性薬に対する前立腺細胞の生体内で感受性を高める
[00328]前立腺癌に対する第一選択及び第二選択細胞毒性薬は、ドセタキセル、ミトキサントロン、サトラプラチン、及びイクサベピロンである。内生ＣＤ４４が抑制されている又は抑制されていないＰＣ３／Ｍ−Ｌｕｃ及び２２Ｒｖｌ−Ｌｕｃ細胞をマウスの皮下に注入し、そしてドセタキセル又はミトキサントロンを用いて継続的に治療する。
【０２７９】
実施例３１
ＣＤ４４の拮抗薬、すなわちｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃは、マウスモデルでの様々な癌に対する有効な治療薬として役立つ
[00329]ＣＤ４４の拮抗薬が、前臨床マウスモデルでの様々なヒト癌の進行を阻害するかどうかを決定するために、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、ＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、又はＣＤ４４ｓなどの可溶性ＣＤ４４融合タンパク質を、それぞれ異なる癌マウスモデルを用いて試験する。
【０２８０】
[00330]これらのＣＤ４４−Ｆｃ融合ｃＤＮＡをレトロウイルスベクター（Clontech）中に挿入した。このレトロウイルスベクターは、全てのピューロマイシン耐性細胞が挿入した融合遺伝子を発現するように、ｃＤＮＡ断片とピューロマイシン耐性遺伝子の間に配置したＩＲＥＳ要素を含む。これらの融合タンパク質をコードしている発現コンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを、ヒト癌細胞、ＭＥＷＯ及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞；Ｌｏｖｏヒト結腸癌細胞；Ｐａｎｃ−１、ＨＰＡＣ、ＭＩＡＰａＣａ−２、及び／又はＡｓＰＣ−１ヒト膵癌細胞；Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７ヒト肝癌細胞；ＳＣＣ、−９、−１５、及び／又は−２５、ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌腫細胞；Ｕ２６６及びＭＣ／ＣＡＲヒト多発性骨髄腫細胞；ＳＫＯＶ３ｉｐ及びＯＶＣＡＲ−３ｉｐヒト卵巣癌細胞；及び２２Ｒｖｌヒト前立腺癌細胞；Ａ５４９、ＬＸ５２９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、及び／又はＮＣＩ−Ｈ１２５ヒト肺癌細胞；ＭＸ−２及び／又はＳＷ６１３ヒト乳癌細胞；ＳＫＮ−ＭＣ及びＡ６７３ヒト肉腫；Ｈ−ＭＥＳＯ−１、Ｈ−ＭＥＳＯ−１Ａ、又はＭＳＴＯ−２１１Ｈヒト悪性中皮腫細胞；及び／又は様々な細胞由来のヒト癌幹細胞に導入する。ピューロマイシンを用いて感染した細胞を選抜した後の薬剤耐性癌細胞の集団は、ｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、及びｈｓＣＤ４４ｓ−ＦｃなどのＣＤ４４融合タンパク質を高レベルで発現すると考えられる。これらの細胞を用いて、それらのＲａｇ−１マウスでの成長、並びに化学療法及びその他の標的治療に対するそれらの反応を評価する。
【０２８１】
[00331]さらに、ＣＤ４４拮抗薬が化学療法及びその他の標的治療に対する様々な腫瘍細胞の反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、ＣＤ４４の抑制及び／又はｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を単独で、又は化学療法薬であるＲＴＫ阻害薬／ＩＡＰ阻害薬／ｐ５３活性分子と併用して用い、生体外での腫瘍細胞の生存試験を行う。
【０２８２】
考察
[00332]要約すると、本実施例及び図は、ＣＤ４４がヒト膠芽腫、結腸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、黒色腫、及び食道癌を含む複数のヒト癌型において亢進されていることを示すものである。ヒトＣＤ４４に対するｓｈＲＮＡ及び／又は様々なＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質を含むＣＤ４４の拮抗薬は、ヒト膠芽腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、膵臓、及び卵巣のマウスモデル生体内での成長を阻害する。さらに、実施例は、ＣＤ４４はヒトＧＢＭで正に調節されており、ＣＤ４４をノックダウンすると、神経膠腫細胞の増殖が阻害され、アポトーシス促進されるため、ＧＢＭの生体内での成長が阻害されることを示している。加えて実施例は、ＣＤ４４又はＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の抑制が、化学療法及び標的治療薬に対するＧＢＭ細胞の生体内での感受性を高めることを始めて示し、このことは、ＣＤ４４が神経膠腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、及び卵巣癌に対する有効な治療標的である可能性を示している。ｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ６−ｖ１０−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−ＦＣなどの、ヒト可溶性ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質の形態でのＣＤ４４拮抗薬及びＣＤ４４−特異的ｓｈＲＮＡが、ヒト膠芽腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、及び卵巣癌のマウスモデルでの有効な治療薬であることが明らかになった。ＣＤ４４のｓｈＲＮＡは、遺伝子治療に使用すること、及びナノ粒子として送達することもまた可能である。
【０２８３】
[00333]本実施例は、ＣＤ４４が哺乳類のヒッポストレス及びアポトーシスシグナル伝達経路（マーリン−ＭＳＴ１／２−Ｌａｔｓ１／２−ＹＡＰ−ｃＩＡＰ１／２）の上流で、また他の２つの下流のストレスキナーゼであるＪＮＫ及び／又はｐ３８の上流で、それらのエフェクターであるｐ５３及びカスパーゼと共に機能していることを始めて示すものである（図５及び図６）。それらはまた、ＣＤ４４が、化学療法薬及び活性酸素種（ＲＯＳ）によって誘導されるストレス及びアポトーシスシグナル伝達経路の活性化の抑制に必須の役割を果たし、ＣＤ４４の機能が欠損すると、それらシグナル伝達経路の持続した活性化が引き起こされ、そしてＧＢＭ細胞及びその他の癌細胞のアポトーシスが促進されることの証拠を提供するものである（図１０の実用モデルを参照のこと）。
【０２８４】
[00334]これらの実施例は、ＣＤ４４を抑制すると、ＥＧＦＲリガンド及びＨＧＦによって誘導されるＥｒｋ１／２の活性化が阻害されるが、ＮＧＦ又はＦＢＳによって誘導される活性化は阻害されないことを示しており（図７）、このことは、ＣＤ４４がこれらＲＴＫの共受容体として機能し、そしてそれらの悪性神経膠腫細胞及びその他の癌細胞などにおけるシグナル伝達活性を増強することを示唆している。ＣＤ４４がＲＴＫのシグナル伝達を制御している機序の解明にはさらなる研究が必要であるが、ＨＡ受容体としてのその機能により説明することができるであろう。ＣＤ４４は、その多価リガンドであるＨＡとの結合に際して、細胞表面に大きな凝集体を形成する。これらの凝集体はしばしば、複数のシグナル伝達イベントが生じる脂質ラフト又はその他の特定の膜ドメイン中に含まれる。加えてＣＤ４４は、ＨＢ−ＥＧＦ及び塩基性ＦＧＦを含む多数のヘパリン結合成長因子と結合する細胞表面プロテオグリカンとして発現する場合もある。ＲＴＫ共受容体としてのＣＤ４４は、そのため、ＲＴＫの多量体化を促進することにより、及び／又は対応するＲＴＫの適切なリガンドを提示することにより、シグナル伝達を高めることができる。ＣＤ４４ｖ３−ｖ１−Ｆｃ融合タンパク質が、ＥＧＦファミリーリガンド、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦなどの腫瘍血管新生因子、及びアンギオポエチンを含むヘパリン結合成長因子の生理活性を調節する能力から、これらのリガンド、それらに対応するＲＴＫ、及びそれらの下流のシグナル伝達経路を標的とする数多くの併用療法においてＣＤ４４拮抗薬が使用可能であることが示唆される。
【０２８５】
[00335]ＣＤ４４拮抗薬、すなわちｈｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質、具体的にはｈｓＣＤ４４ｓ−Ｆｃ、ｈｓＣＤ４４ｖ８−ｖ１０−Ｆｃ、又はｈｓＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃコンストラクトはマウスモデルにおいて、ＧＢＭ、乳癌、前立腺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、及び膵癌に対抗する強い活性を示し、そして乳及び卵巣癌幹細胞の自己再生を阻害した。これらの結果から、これら致命的な癌が将来根絶されることが期待される。ヒトｓＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＢＭ細胞及びその他の癌細胞において発現しているＣＤ４４の機能を干渉するだけでなく、腫瘍が浸潤している宿主細胞で発現しているＣＤ４４の機能もまた干渉する可能性がある。これらの宿主細胞は、癌におけるその他の分子による効果と同様に、これら癌型の進行に必須の役割を果たしていると考えられる（Budhu et al., 2006; Orimo et al., 2005）。
【０２８６】
[00336]ヒトＧＢＭに対して現在使用可能な治療の第一選択肢は化学療法及び放射線治療であるが、両方ともその場しのぎの手段である（Chamberlain, 2006）。悪性黒色腫、肺癌、及び膵癌に対する有効な治療はほぼ皆無である。肝臓癌、頭頸部癌、後期結腸癌、後期／薬剤耐性乳及び前立腺癌に対する有効な治療もない。よりよい臨床転帰をもたらす１つの手段は、微小環境由来の生存シグナル及び薬剤耐性の仲介に必須の役割を果たす標的、並びにそれらの拮抗薬が、放射線、化学療法及び標的治療薬対するこれら腫瘍細胞の反応の感受性を高める可能性がある標的を同定することである。実施例は、ＣＤ４４が、酸化及び細胞毒性ストレス誘導性アポトーシスシグナル伝達から、癌細胞を保護するのに重要な役割を果たし、ＲＴＫシグナル伝達を増強することを示している。これらは、ＣＤ４４が、放射線、化学療法、及び標的治療に対する悪性神経膠腫及びその他の型の癌細胞の感受性を高めるための理想的な治療標的となる可能性を示唆している。
【０２８７】
[00337]これらの実施例及び図は、ＣＤ４４が、ヒト膠芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、膵癌、及び卵巣癌を含むがこれらに限定されるものではない様々なヒト癌型に対する第一の標的であること、並びに、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質及びｓｈＲＮＡを含むＣＤ４４拮抗薬を単剤として使用した場合及び、化学療法及び／又は放射線治療、及びｅｒｂＢ受容体、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＡＰ、及び活性型ｐ５３に対する標的治療と併用した場合に、強力な抗癌剤となることを示した。これらの実施例及び図はまた、ＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質が、化学療法及び／又は放射線治療などの細胞毒性薬に対する癌細胞の感受性を高めることを示している。そのため、これら融合タンパク質は特に、腫瘍細胞のストレスを誘導する及び／又は促進する、それらの薬剤と併用することが可能である。
【０２８８】
[00338]
これらの実施例及び図はまた、を示している。これらＣＤ４４−Ｆｃ融合タンパク質がＨＡに特異的に結合するため、例えば癌組織の組織切片及び体液中（血液、血漿、血清、及び尿）のＨＡの検出に使用可能である。そのため、これら融合タンパク質を、ＨＡレベルが上昇している癌の診断に使用することが可能であり、このことは現在使用可能な方法よりも初期において癌を検出すること、及び生命の救済をもたらす可能性がある。これらの融合タンパク質をまた、ＨＡレベルの上昇を検出するために使用することが可能であり、このことは、予後及び治療効果の早期評価において重要であり、患者の全生存を改善させる、各個人により有効な治療計画をもたらすと考えられる。より正確に予測するために、ＨＡレベルと並行して、これら腫瘍試料及び体液試料中のＣＤ４４のレベルを評価することができる。ＨＡ及びＣＤ４４レベルの測定は、標準的な免疫学的手法及び検出法により行うことができる。
【０２８９】
[00339]本発明の範囲は、本明細書において記載した特定の態様によって制限されるものではない。実際に、前述した詳細及び添付の図から、本明細書に記載した修正に加えて、様々な修正が当業者には明かであろう。そのような修正は添付の請求項の範囲内であると見なされる。
【０２９０】
[00340]当然のことながら、全ての値はおおよその値であり、また説明のために示されるものである。
[00341]本出願を通して、特許、特許出願、出版物、製品の説明、及びプロトコールが引用される。それらの全体を参照することにより、その開示は本明細書に組み込まれるものとする。
【０２９１】
参考文献
【０２９２】
【表３Ａ】
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【０２９３】
【表３Ｂ】
2013502421.tif 000022
【０２９４】
【表３Ｃ】
2013502421.tif 000023
【０２９５】
【表３Ｄ】
2013502421.tif 000024
【０２９６】
【表３Ｅ】
2013502421.tif 000025
【０２９７】
【表３Ｆ】
2013502421.tif 000026
【０２９８】
【表３Ｇ】
2013502421.tif 000027
【０２９９】
【表３Ｈ】
2013502421.tif 000028
【０３００】
【表３Ｉ】
2013502421.tif 000029
【０３０１】
【表３Ｊ】
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【０３０２】
【表３Ｋ】
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【０３０３】
【表３Ｌ】
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【０３０４】
【表３Ｍ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
2013502421.tif 000052
【図２８Ｄ】
2013502421.tif 000053
【図２８Ｅ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2013502421.tif 000069
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
2013502421.tif 000109
【国際調査報告】
2013502421.tif 000110
2013502421.tif 000111