(57)【要約】  本発明は、特に生物細胞構造の測定を行なうためのハイブリッド型３次元センサアレイに関する。このセンサアレイは、マイクロパターン化された複数のセンサ板（１）を有し、センサ板（１）のそれぞれが、複数の電極面（４）を有する複数のセンサ針（３）が櫛状に配置された、一つの支持体部分（２）を備える。更に、多数のスペーサー（１１）が設けられ、これらのスペーサーは、隣り合うセンサ板（１）の支持体部分（２）及びセンサ針（３）が、いずれも、互いに距離を有するように、センサ板（１）の間に固定されている。本発明は、また、生物細胞構造の電気的活性を測定するための、このようなセンサアレイを有する測定装置に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ支持体部分（２）を有し、該支持体部分に複数のセンサ針（３）が第１方向（Ｘ）において互いに距離を有するように櫛状に配置されており、ここで、各センサ針（３）が長手方向（Ｚ）にセンサ針（３）上に分布した複数の電極面（４）を有し、これらの電極面（４）がそれぞれ専用の導電路（６）に電気接触し、ここで、これらの導電路（６）が当該支持体部分（２）の上を渡って電気接触部（７）へ向かって延在している、複数のマイクロパターン化されたセンサ板（１）；及び
センサ板（１）の間に、それぞれ隣接するセンサ板（１）同士の支持体部分（２）及びセンサ針（３）が互いに第２方向（Ｙ）において距離を有するように、固定されており、ここで、複数のスペーサー（１１）と支持体部分（２）との間に、センサアレイを通って流れる、複数のセンサ板（１）間のセンサ針（３）の長手方向（Ｚ）の流体の、流れを可能にする複数の通路（１２）が形成されている、複数のスペーサー（１１）
を備えてなる生物の細胞構造における電気信号を測定するための３次元センサアレイ。
【請求項２】
スペーサー（１１）がセンサ板（１）の支持体部分（２）の間にのみ延在し、複数のセンサ針（３）の間に自由空間が残されていることを特徴とする請求項１に記載のセンサアレイ。
【請求項３】
センサ針（３）の表面が生物学的に不動態化されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のセンサアレイ。
【請求項４】
電極面（４）が、電気的絶縁性を有し生物学的に不動態化された皮膜で覆われていることを特徴とする請求項１乃至３の１つに記載のセンサアレイ。
【請求項５】
導電路（６）が電磁的に有効なシールドを有することを特徴とする請求項１乃至４の１つに記載のセンサアレイ。
【請求項６】
センサ針（３）が表面に逆鉤状のナノ構造を有することを特徴とする請求項１乃至５の１つに記載のセンサアレイ。
【請求項７】
請求項１乃至６の１つに記載のセンサアレイを備え、そのセンサアレイが、センサアレイの複数の電極面（４）から供給される信号を時間的及び位置的に分解して検出し処理する評価ユニットに接続されていることを特徴とする生物細胞構造の電気的活性を測定するための測定装置。
【請求項８】
前記評価ユニットが電極面（４）において静電容量変化を検出して評価し、ここで、個々の電極面（４）がそれぞれ１つの測定コンデンサの一方の電極を構成し、ここで、当該測定コンデンサの対向電極がそれぞれ１つのセンサ針（２）における１つの対向する電極面（４）又は１つの共通なコンデンサ板によって構成されていることを特徴とする請求項７に記載の測定装置。
【請求項９】
前記測定装置が、活性化の際に、電気的な刺激信号を１つ又は複数の電極面（４）に供給する信号発生器を備えることを特徴とする請求項７又は８に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然の細胞化合物において発生する電気信号を収集するために特に適した３次元センサアレイに関する。測定すべき細胞構造は、例えば動物又は人の生体内組織部分である。特に、本発明は、神経細胞によって発生されて周辺の神経細胞又は筋肉細胞に伝達される電気的又は電磁的な信号を収集することを可能にする。同様に、本発明によるセンサアレイは、生体外部で、例えば培養システムにおいて、培養される細胞組織を検査する際に使用される。
【背景技術】
【０００２】
生物組織内で発生する電気信号を検出するために、過去において、２つの基本的に異なる２つの解決法が試みられた。久しい以前から、例えば心電図を取る際に患者の皮膚表面に平面的に装着した電極により、生物組織表面において発生する合成信号を、記録することができる。生物組織内におけるこの種の信号の発生及び伝達の正確な位置は、この方法では検査することができない。最近では、信号を個々の点から収集することを可能にするために、３次元組織体内の個々の位置に測定電極を配置することによって、生物組織内で発生した信号及びそこで進行する生物学的イオン伝導プロセスを更に詳細に検査する努力がなされている。ここで、問題は、もちろん、正確な信号発生位置及び信号伝達経路が既知でないこと、そして、そのために、電極の位置決めが非常に難しいことにある。このような測定電極では、空間内の信号分布も同様に決定することができない。基本的に、生物組織内で信号を検出する際には、更に、確立されている電気化学的電位列に基づいて電極の腐食が生じ及び／又は中期的には組織変化が生じ、それによって検出信号が誤差を含む結果となるという問題が存在する。刺激目的のために、電極を介して、電気信号を生物組織内に供給しなければならない場合にも、同様の問題がある。
【０００３】
最近、組織内における電極の正確な位置決めの問題を緩和しようとするセンサが提案された。例えば、所謂「ユタ電極アレイ」が発表された。これは、先端に、それぞれ、１つの電極を有する多数のセンサ針を１つの支持体上に備えた小型のセンサアレイである。深さの異なる組織層において信号検出を可能にするために（Ｚ方向）、センサ針が組織内に突き入る際に組織内の異なった深さに入り込むように、センサ針が異なった長さを持つとよい（非特許文献１）。しかし、このセンサアレイを用いても、生物組織内での電気信号の空間的分布は、非常に限定的にしか検出することができない。何故ならば、アレイの各センサ針が組織内の特定の深さにおいてしか信号を検出しないからである。更に、センサアレイの構造に基づいて、アレイを通る流体の円滑な流れが途切れのない支持体板によって妨げられ、それによって、培養システムにおける細胞培養の栄養素供給が著しく阻害されるという問題が生じる。
【０００４】
特許文献１により、櫛状に配置され、ｘ方向及びｙ方向において相互に隔てられたセンサ針を有する３次元センサアレイが公知である。各センサ針は、センサ針の長手方向に分布した複数の電極面を有する。
【０００５】
特許文献２は、櫛状に配置された複数のセンサ針を有する３次元センサアレイを開示している。各センサ針は、センサ針の長手方向に分布して配列された複数の電極面を有する。
【０００６】
特許文献３は、生物細胞構造における電気信号を測定するための３次元センサアレイを開示している。この文献によって公知となったセンサアレイでは、各センサ針がただ１個の電極面を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２３７０７７号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１００８２３号明細書
【特許文献３】国際特許出願公開第２０１０／００５４７９号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】“Ｕｔａｈ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｉｏｎｉｃ  Ａｒｍ”；２４．０５．２００６；ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｍｅｄｇａｄｇｅｔ．ｃｏｍ／ａｒｃｈｉｖｅｓ／ｐｒｉｎｔ／００２０７６ｐｒｉｎｔ．ｈｔｍｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、３次元の生物細胞複合体における電気信号を、特にこれらの信号の発生の時間及び位置を、正確に検出するのに使用することができる改善された３次元センサアレイを提供することにある。副次的課題は、電極腐食及び組織変化を防止すべく組織構造内で無電流測定が可能になるようにセンサアレイを改良することにある。更に、他の副次的課題は、生きた生物体における使用だけでなくバイオリアクター内で培養された細胞複合体の測定のためにも適するように、且つ培養細胞への栄養素供給を阻害しないように、センサアレイを改良することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記主課題は、添付の特許請求の範囲の請求項１による３次元センサアレイによって解決される。上記副次的課題は、特に従属請求項による好ましい実施形態によって解決される。
【００１１】
本発明によるセンサアレイは、マイクロパターン化された複数のセンサ板から構成され、これらのセンサ板がそれぞれ１つの支持体部分を有し、各支持体部分にそれぞれ複数のセンサ針が櫛状に配置されている。これらのセンサ針は、第１方向（Ｘ方向）において、互いに距離を有してしており、それぞれセンサ針の長手方向（Ｚ方向）に分布する複数の電極面を支持している。各電極面は、専用の導電路を介して接触し、全ての導電路が、支持体部分の上を渡って電気接触部に向かって、延在している。複数のセンサ板の間にはスペーサーが存在し、これらのスペーサーは、センサ板間の距離を保つと同時に、特にこれらの板の固定に役立つ。このようにして、これらの支持体部分及び当該支持体部分に形成された複数のセンサ針が、第１方向とセンサ針の長手方向（Ｚ）とに対して直交する第２方向（Ｙ方向）において、それぞれ隣接するセンサ板から互いに離間させられている。複数のスペーサーと支持体部分との間に複数の通路が形成されていて、この通路により、センサアレイを通って流れる、複数のセンサ板間の、センサ針の長手方向の流体の流れが可能になる。
【００１２】
本発明によるセンサアレイの構成によって、空間内に格子状に分布させられた多数の電極面が形成されている。センサアレイを生物組織内に挿入した場合に、センサ針が伸びている空間内において発生する電気信号の位置を正確に決定することができる。全ての電極の電気接触が個別に行なわれ、これにより、それぞれ検出された信号が評価ユニットに転送できるので、発生した信号群を時間的及び位置的に分解することができ、従って、組織複合体における信号の発生点及び伝達様式を記録することができる。
【００１３】
センサアレイ内のセンサ針は、とりわけシリコン又は金属核付きのガラス状の二酸化ケイ素表面からなる針構造として、公知のナノ技術の方法によって、製造することができる。例えば、自己組織性のエッチング、成長及び成形工程を用いることができる。その際に、センサ針に、生物組織内でのその定着を容易にする幾何学的な表面構造を形成することも可能である。このように形成されたナノ構造化された表面を有するマイクロパターン要素は、例えば、このような表面構造の生成を開示する国際特許出願公開第２００７／０１７４５８号明細書により公知である。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態によれば、スペーサーがセンサ板の支持体部分の間にのみ延在する。これにより、隣接するセンサ板同士のセンサ針の間に、検査すべき生物組織によって充填され得る自由空間が残されている。スペーサーと支持体部分との間に形成された通路によって、センサアレイを通るＺ方向の流体の流れが可能になる。従って、センサアレイは、非常に簡単に培養システムの一構成要素として形成することができ、これによって、個々の組織層への栄養素供給がセンサアレイの位置決めによって阻害されず、それどころか、容易にされる。
【００１５】
有利な点は、センサ針表面における針状の草のようなナノ構造によって、本質的に電気測定の感度が向上することにある。同時に、このナノ構造は、隣のセンサ板への接合面に設けることができ、間隔保持用のプラスチックに押し込まれることによって、実際の３次元多電極アレイ（３Ｄ−ＭＥＡ）のための新式の組立・接続技術に貢献することができる。このような新式の組立・接続技術は、付加的に静電容量的に有効な材料に適用されると、上述のセンサの３次元化を可能にする。
【００１６】
有利な実施形態は、センサ針の表面が生物学的に不動態化されていることを特徴とする。相応の皮膜を設けることによって電気化学的電位列の発生を防止することができる。基本的には、センサ針の形成のために使用可能であるような半導体材料の生物学的な不動態化のための手法は、当業者にとって既知であるので、詳細な説明は省略する。しかし、これに関連して、電極表面も、電気絶縁性を有する、特に生物学的に不動態化された、皮膜で覆われているならば格別に有利である。この場合には、信号検出が静電容量式の測定法によって行なわれ、これによって、個々の電極面がそれぞれ１つの測定コンデンサの一方の電極を形成する。必要な対向電極は、センサ針において対向する電極面によって実現でき又はセンサアレイの独立の構成部材である１つの共通なコンデンサ板によっても実現できる。信号検出時のクロストーク低減のために、センサアレイ内の導電路が電磁的に有効なシールドを有するとよい。
【００１７】
前記課題は、本発明によれば、独立請求項７による測定装置によって解決される。この測定装置は、既述のセンサアレイと、それに接続された評価ユニットとを備え、この評価ユニットは、センサアレイの複数の電極面から供給される信号を時間的及び位置的に分解して検出し処理する。評価ユニット又はその一部は、オンチップ信号処理回路として構成し、センサアレイの電極面の直近に配置することができる。それによって、オンチップデータの圧縮が行なわれるので、圧縮されたデータ量を、例えば無線の通信リンクによって、外部のデータ処理ユニットに伝送することができる。測定装置が、更に、センサアレイの１つ又は複数の電極面に電気的な刺激信号を供給することができる信号発生器を備えるのが好ましい。それにより、生物組織内において、そこで自然発生する信号を検出できるだけでなく、例えば筋肉細胞を活性化させるべく又は組織複合体における他のプロセスを模擬すべく、目的に合わせた刺激を与えることも可能である。
【００１８】
本発明の他の利点、詳細及び発展形態は、図面を参照する好ましい実施形態についての以下の説明により明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、複数のセンサ針を有するセンサ板の概略平面図を示す。
【図２】図２は、製造工程におけるウエハー上の複数のセンサ板の配置を示す。
【図３】図３は、スペーサーの斜視図を示す。
【図４】図４は、３次元センサアレイの第１の実施形態の斜視図を示す。
【図５】図５は、センサアレイの構成部分の変形実施形態を有する組立図を示す。
【図６】図６は、センサアレイを組み込んだ細胞培養システムの斜視図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１には、本発明によるセンサアレイの第１の構成要素が、平面図で簡略化されて図示されている。これはマイクロパターン化によって作られたセンサ板０１であり、１つの支持体部分０２及び多数のセンサ針０３を有する。センサ針０３は、支持体部分０２に櫛状に配置され、互いにＸ方向において距離を有している。個々のセンサ針の間の間隔は、例えば５０〜１，０００μｍである。各センサ針０３には、複数の電極面０４が配置されており、これらの電極面は、Ｚ方向（センサアレイの長手方向）において互いに距離を有している。各電極面は、専用の導電路０６に接続されており、従って、センサ板上には多数の導電路０６が延在し、これらの導電路０６が支持体部分０２を通って接触部０７に向かって案内されている。
【００２１】
図２は、製造工程中のウエハー０８上の複数のセンサ板０１の配置を示す。製造のこの段階において、センサ針０３は、当初は、まだ、パターン化領域０９によって取り囲まれており、このパターン化領域は、後でセンサ針の櫛状構造を露出させるために、例えばエッチング又はサンドブラストによって除去されなければならない。個々のセンサ板０１上における先ずは２次元パターンの発生が、好ましくは標準ＭＥＭＳ技術により、行なわれる。例えばウエハーの形の絶縁基板（ガラス、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ３３）が出発材料として使用される。薄膜技術（スパッタリング、蒸着）により金属膜を付着させ、その後、この金属膜をリソグラフィ及びエッチングによってパターン化することができる。後で検査すべき細胞培養へのセンサアレイによる影響を僅かに保つために、絶縁性で生体適合性を有する不動態皮膜（とりわけ、Ｓｉ3Ｎ4又はＳｉＯ2）が低温蒸着法（ＰＥＣＶＤ）によりパターン全体に付着させられる。定量的測定が優先されない限り、後で、更なるエッチング工程によって電極面０４が再露出させられる。センサ針の両側に電極面を設けるためには、ウエハー両面において相応のパターン化工程を実施するとよい。導電路０６が付加的にシールドを備えなければならない場合には、異なった製造工程が必要である。
【００２２】
電極表面及び導電路を形成した後に、個々のセンサ針のための櫛状構造を作製しなければならず、このためには、ウエハー全体のパターン化が必要である。そのために、湿式及び乾式化学エッチングを使用することができる。同様に、予めパターン化されたマスクを使用する場合には、マイクロサンドブラストが可能であり、それによって、加工時間が極端に低減される。このようにして作製された複数のセンサ板が、後で、ウエハーソーによって個別に切り分けられ、複数のセンサ板が作られる。
【００２３】
図３は、本発明によるセンサアレイの他の構成要素をなすスペーサー１１の好ましい実施形態を斜視図で示す。スペーサー１１は、プラスチック、特にポリカーボネート、からなるとよい。幅及び長さに関するスペーサーの寸法は、センサ板の支持体部分０２の寸法に、ほぼ、対応する。スペーサーの厚さは、後におけるＹ方向の個々のセンサ板の間隔を決定し、例えば５０〜１，０００μｍである。スペーサー１１は、両面に、複数の通路１２が溝状の凹みとして、形成されているとよい。組み立てられたセンサアレイにおいて、これらの通路１２は、流体、例えば栄養素液、を通流可能とし、これにより、流体を個々のセンサ板間で保持させる。
【００２４】
図４は、センサアレイの第１の実施形態の斜視図を示す。このセンサアレイは、図から明らかなように、間挿されたスペーサー１１によってＹ方向において互いに離間させられた複数のセンサ板０１からなり、複数のセンサ針０３がマトリックス状に配置されている。センサ針０３上に設けられた電極面０４が、センサ針によって定められた空間に亘って分布している。センサアレイのハイブリッド型の３次元構成は、特に熱圧着によって行なわれる。そのために、スペーサー１１がセンサ板０１と交互に積み重ねられ、サーモプレスにおいて、スペーサーの材料軟化温度の約９０％に加熱され、例えば５ＭＰａの圧力をかけられる。
【００２５】
スペーサーとセンサ板との接触表面は、前もってプラズマ活性化によって前処理されるとよい。必要な熱接着時間は約３分である。
【００２６】
別の実施形態において、スペーサーがプラスチックからではなくシリコンからなる場合には、スペーサーとセンサ板との間の接続が陽極ボンディングによって形成されるとよい。この場合には、スペーサーとセンサ板とからなる積層体が順次ボンディングされなければならない。
【００２７】
本発明による構造によって複数のセンサ針０３間に十分な空間が残り、従って、そこに生物細胞が住みつくことができることが明らかである。センサ針を組織内に押し入れることによって、センサアレイを自然の細胞環境に持ち込むことができる。他のマトリックス状のセンサアレイとは違い、Ｚ方向にも流体の流れが可能である。何故ならば、個々のセンサ板間において、支持体部分における多数の導電路を導くことが必要であるにもかかわらず、流路が通路１２によって形成されているからである。この種の通流は、特に生物細胞を培養する際に、３次元の複合体内の全ての細胞に十分な栄養素液を導くために、必要である。
【００２８】
図５は、センサアレイの構成要素の一部変更された実施形態を組立図で示す。この実施形態では、センサ板０１もスペーサー１１も、Ｚ方向においてほぼセンサ針０３の長さを持つ仕切り部１３を有する。Ｘ方向において、これらの仕切り部１３は、一様に配置されているので、板積層体の組立後に、これらの仕切り部１３は、隣接する板（センサ板又はスペーサー）の各仕切り部において密着する。更に、板積層体の縁部にカバー板１４が設けられ、これらのカバー板１４は、その間にあるセンサ針の空間を取り囲んでいる。
【００２９】
図６は、この例では細胞培養システムの統合的な構成部材である、センサアレイの一部変更された実施形態の殆ど組み立てられた状態を斜視図で示す。外側の仕切り部１３及びカバー板１４によって、複数のセンサ針０３が配置された培養空間を生じさせ、これらの培養空間の間で細胞培養を行なうことができる。図示の実施形態では、培養空間が、中間の仕切り部１３によって分離された２つのチャンバに分けられている。両チャンバ間は、中間仕切り部に設けられた通路を介して、流体が流れることができるように及び／又は細胞転移が行なわれ得るように、連通している。例えば、一方のチャンバで神経細胞を培養し、他方のチャンバで筋肉細胞を成長させることができる。神経細胞の軸索は、中間の仕切り部における通路を通して伸び、筋肉細胞にドッキングすることができる。センサアレイの助けにより、両チャンバにおいて、発生する信号群及びそれらの伝搬を、位置的及び時間的に分解して求めることができる。
【符号の説明】
【００３０】
０１        センサ板
０２        支持体部分
０３        センサ針
０４        電極面
０５        −
０６        導電路
０７        接触部
０８        ウエハー
０９        パターン化領域
１０        −
１１        スペーサー
１２        通路
１３        仕切り部
１４        カバー板
【図１】
2013520259.tif 000003
【図２】
2013520259.tif 000004
【図３】
2013520259.tif 000005
【図４】
2013520259.tif 000006
【図５】
2013520259.tif 000007
【図６】
2013520259.tif 000008
【国際調査報告】
2013520259.tif 000009
2013520259.tif 000010
2013520259.tif 000011
2013520259.tif 000012