(57)【要約】  本発明は、変異体リゾチームに関する。本発明はまた、変異体リゾチームをコードするポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された親リゾチームの変異体であって、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１１３、１１９、３５、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸改変を含み、配列番号２の成熟ポリペプチドに対応するポリペプチド又は配列番号３に示されるポリペプチドと、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有し、且つ抗微生物活性を有する、変異体。
【請求項２】
前記変異体リゾチームが、配列番号２の成熟ポリペプチドに対応するポリペプチド、又は配列番号３に示されるポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体が、位置番号９５、１８６、６５、１２２、１３９、１４１、及び１７６からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸改変を更に含む、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び／又は２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較してアルカリｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｇ１０２Ｐ；Ｙ１３４Ｖ；Ｇ１０２Ｐ；Ｔ１０８Ｗ；Ｔ１９６Ｇ；Ｋ１９７Ｇ；Ｙ１９６Ｇ；Ｋ１９７Ｐ；Ｙ５６Ｗ；Ｎ１９Ｄ；Ｈ１２０Ｑ；Ｈ１９８Ｎ；Ｈ１９８Ｆ；Ｈ２０Ｗ；Ｈ２０Ｙ；及び／又はＨ１３５Ｎに対応する改変を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｇ１０２Ｐ＋Ｙ１３４Ｖ及び／又はＹ１９６Ｇ＋Ｋ１９７Ｐに対応する改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、及び／又は２０６からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して酸性ｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｆ１６１Ｙ；Ｈ１２８Ｒ；Ｖ１３１Ｃ；Ｄ９５Ｇ；Ｄ２０３Ｎ；Ｒ９８Ｇ；Ｇ１１２Ｓ；Ｈ５５Ｎ；Ｄ３２Ｓ；Ｎ８９Ｔ；Ｎ２０６Ａ；及び／又はＮ２０６Ｓに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）Ｄ２０３Ｎに対応する改変を含む、請求項１〜４、７、及び８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号５６、１１３及び／又は１６１からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、胃のプロテアーゼの存在下の酸性ｐＨ条件において向上した安定性を有する、請求項１〜３、及び７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体が、１又は２以上の以下の改変（番号付けに配列番号３を用いて）：Ｙ５６Ｗ、Ｖ１３１Ｃ及び／又はＦ１６１Ｃに対応する改変を含む、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５及び／又は１９３からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して低温において改良された活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｙ４７Ｆ；Ｙ１１１Ｆ；Ｙ１０８Ｆ；Ｔ４５Ｇ；Ｋ２２Ｇ；Ｐ１１０Ｇ；Ｈ１２０Ａ；Ｔ１４７Ｇ；Ｙ１９６Ｇ；Ｄ４９Ａ；Ｈ５５Ａ；及び／又はＳ１９３Ａに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７及び／又は１９７からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して低温において改良された熱安定性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１５】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｓ１２１Ａ；Ｈ１２０Ｐ；Ｔ１８６Ｔ；Ａ１１３Ｐ；Ｋ１８５Ｐ；Ｐ１７６Ｖ；Ｑ１２２Ａ；Ｓ１１９Ｎ；Ｑ３５Ｒ；Ｌ６５Ｉ；Ｓ１３９Ｇ；Ｗ１４１Ｙ；Ｒ１５３Ｔ；Ａ１５８Ｓ；Ａ１７１Ｒ；Ｋ１９５Ｓ；Ｋ７６Ｓ；Ｋ１６４Ｔ；Ｋ３０Ｙ；Ｆ８５Ｙ；Ｋ１７８Ｃ；Ｄ１８３Ｇ；Ｙ１８６Ｙ；Ｇ１１２Ｓ；Ｓ１７４Ｔ；Ｗ１８７Ｙ及び／又はＫ１９７Ｐに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記変異体中の改変の総数が、２個、好ましくは３個、より一層好ましくは４個、より一層好ましくは５個、より一層好ましくは６個、より一層好ましくは７個、より一層好ましくは８個、より一層好ましくは９個、最も好ましくは１０個である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列に対応する親ポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチドの変異誘発により調製される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
親リゾチームの変異体を生産する方法であって、前記変異体が抗微生物活性を有し、前記方法が、以下：
ａ）変異体の発現に好適な条件下で細胞を培養すること、ここで前記細胞は、親リゾチームの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記変異体は、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸位置で改変されており、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１の親ポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６５％の同一性を有する親ポリヌクレオチドの変異誘発により調製される、及び
ｂ）培養培地からリゾチーム変異体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２１】
親リゾチームの変異体を生産する方法であって、前記変異体が抗微生物活性を有し、前記方法が、以下：
ａ）変異体の発現に好適な条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養すること、及び
ｂ）培養培地から変異体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチーム、及び界面活性剤を含む、洗剤組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチーム及び飼料成分を含む、飼料組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチームを用いて、微生物汚染された表面を処理することを含む、微生物汚染を減少させるための方法。
【請求項２５】
抗微生物剤としての、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチームの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リゾチームの変異体、該変異体をコードするポリヌクレオチド、及び変異体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ムラミダーゼ又はＮ−アセチルムラミドグリカンヒドラーゼ（N-acetylmuramide glycanhydrolase）としても知られるリゾチーム（ＥＣ  ３．２．１．１７）は、ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間、及びキトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合の加水分解を触媒する。
【０００３】
リゾチームは、典型的に、多くの生物、例えばウイルス、植物、昆虫、鳥、爬虫類、及び哺乳動物により、細菌に対する防御機構として産生される。酵素は、ペプチドグリカン；細菌における重要な構造的分子のグリコシド結合を切断することにより、細菌の細胞壁の加水分解を引き起こす。リゾチーム作用によりそれらの細胞壁が弱くなった後、細菌細胞は、浸透圧により溶解する。抗微生物剤としてのリゾチーム酵素の可能性における、増加する興味は存在する。例えば、リゾチーム活性は、病原菌、例えばストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、バシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム・チロブチリクム（Clostridium tyrobutyricum）、及びリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に対して示されている。
【０００４】
リゾチームは、５つの異なるグリコシドヒドラーゼ（ＧＨ）ファミリー（CAZy, www.cazy.org）：メンドリ卵白リゾチーム（ＧＨ２２）、ガチョウ卵白リゾチーム（ＧＨ２３）、バクテリオファージＴ４リゾチーム（ＧＨ２４）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）鞭毛タンパク質（ＧＨ７３）、及びキャラロプシス属（Chalaropsis）リゾチーム（ＧＨ２５）に分類されている。リゾチームファミリーＧＨ２５は、他のリゾチームファミリーと構造的に関連が無いことが分かっている。
【０００５】
リゾチームの使用は、動物飼料（例えば国際公開第００／２１３８１号、及び国際公開第０４／０２６３３４号を参照のこと）、チーズ製造（例えば国際公開第０５／０８０５５９号を参照のこと）、食品保存（Hughey and Johnson (1987）Appl Environ Microbiol 53:2165）、洗剤（例えば米国特許第５，０４１，２３６号明細書、及び欧州特許第０４２５０１６号明細書参照のこと）、口腔ケア（例えば米国特許第４，３５５，０２２号明細書、国際公開第０４／０１７９８８号、及び国際公開第０８／１２４７６４号を参照のこと）、美容術及び皮膚科学、避妊学、泌尿器学、及び婦人科学（例えば国際公開第０８／１２４７６４号を参照のこと）において提案されている。
【０００６】
メンドリ卵白リゾチームは、市販のリゾチーム製品である。微生物源から単離されたリゾチームはまた知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、リゾチーム変異体及びリゾチーム変異体をコードするヌクレオチド配列に関する。一つの側面では、本発明は、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１１３、１１９、３５、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸配列の改変を含む（前記位置は、配列番号３のアミノ酸配列の位置に対応する）、グリコシルヒドラーゼファミリー２５（ＧＨ２５）に属するリゾチーム変異体であって、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有する、リゾチーム変異体に関する。一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、真菌性リゾチームの変異体である。別の実施形態では、リゾチーム変異体は、配列番号３と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ゾチーム変異体は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの変異体である。
【０００８】
本発明の変異体は、親のリゾチームと比較して、改変された特性、例えば改変された温度依存活性プロファイル、例えば改良された温度活性、又は低温若しくは中程度の温度における改良された活性（好冷性又は中等温度好性活性）、改良された温度安定性、改良されたｐＨ活性、改良されたｐＨ安定性、及び／又はプロテアーゼ分解に対する増加した耐性を有する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のリゾチーム変異体を含む抗微生物組成物、及び抗微生物的方法に関する。実施形態では、本発明はまた、動物飼料、チーズ製造、食品保存、洗剤、口腔ケア、美容術及び皮膚科学における、本発明の変異体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１は、以下の多数の成熟ファミリー２５リゾチームアミノ酸配列のアライメントである：  アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号３）；  アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号４）；  アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号５）；  アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）リゾチーム（配列番号６）；  アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）リゾチーム（配列番号７）；  アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）リゾチーム（配列番号８）；  アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号９）；  アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号１０）；  アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）リゾチーム（配列番号１１）；  アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）リゾチーム（配列番号１２）；及び  ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillum marneffei）リゾチーム（配列番号１３）。  シグナルペプチドは、プログラムSignal P version 3.0.を用いて予測される。シグナルペプチドは、アライメント中にない。
【００１１】
【図１−２】図１は、以下の多数の成熟ファミリー２５リゾチームアミノ酸配列のアライメントである：  アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号３）；  アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号４）；  アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号５）；  アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）リゾチーム（配列番号６）；  アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）リゾチーム（配列番号７）；  アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）リゾチーム（配列番号８）；  アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号９）；  アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号１０）；  アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）リゾチーム（配列番号１１）；  アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）リゾチーム（配列番号１２）；及び  ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillum marneffei）リゾチーム（配列番号１３）。  シグナルペプチドは、プログラムSignal P version 3.0.を用いて予測される。シグナルペプチドは、アライメント中にない。
【００１２】
【図２−１】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−２】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−３】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−４】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−５】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−６】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−７】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−８】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−９】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１０】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１１】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１２】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１３】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１４】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１５】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１６】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１７】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１８】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−１９】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−２０】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−２１】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−２２】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−２３】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【図２−２４】図２は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームの３次元構造の原子座標を載せる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、リゾチーム変異体、特に、１又は２以上の（数個の）位置において、改変、好ましくは置換及び／又は挿入及び／又は欠失の形態で含む、グリコシルヒドラーゼファミリー２５（ＧＨ２５）に属するリゾチームの変異体に関する（位置の番号付けは、配列番号３の位置の番号付けに対応する）。本発明の変異体は、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有する。
【００１４】
定義
抗微生物活性：本明細書で用語「抗微生物活性」（antimicrobial activity）とは、微生物、例えば藻類、古細菌、細菌、真菌、又は原生動物を死滅させる、又はその増殖を阻害する活性であるとして定義される。抗微生物活性は、例えば、細菌を死滅させることを意味する殺菌剤、細菌増殖の予防又は胞子形成の予防を意味する静菌剤であり得る。本発明の目的において、抗微生物活性は、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイに従って測定される。
【００１５】
リゾチーム活性：本明細書で用語「リゾチーム活性」（lysozyme activity）とは、ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間、及びキトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合の加水分解を触媒する、ペプチドグリカンＮ−アセチルムラモイルヒドラーゼ活性（ＥＣ  ３．２．１．１７）として定義される。本発明の目的において、リゾチーム活性は、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイに従って測定される。
【００１６】
変異体：本明細書で用語「変異体」（variant）とは、１又は２以上の（数個の）特定位置（前記位置は、配列番号３のアミノ酸位置に対応する）において、１又は２以上の（数個の）アミノ酸残基の改変、例えば置換、挿入、及び／又は欠失を含む、抗微生物活性及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドとして定義される。改変されたポリペプチド（変異体）は、親酵素をコードするポリヌクレオチド配列の修飾により、ヒト介入を通じて得られてもよい。親酵素は、配列番号１、又はこれらの配列のうちの一つと少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であり、それは、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドをコードする配列によりコードされてもよい。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは天然に発見される物ではない。
【００１７】
野生型酵素：用語「野生型」（wild-type）リゾチームとは、天然の生物により、好ましくは天然の微生物、例えば天然に発見される藻類、古細菌、細菌、酵母、糸状菌、又は原生動物（protzoans）から発現されるリゾチームを表す。野生型なる用語は、用語「天然の」（naturally occurring）と互換的に用いられてもよい。
【００１８】
親酵素：本明細書で用いられる用語「親」（parent）リゾチーム、又は「親の」（parental）リゾチームとは、本発明の酵素変異体を生産するために、修飾、例えば（１又は２以上の）置換、（１又は２以上の）挿入、（１又は２以上の）欠失、及び／又は（１又は２以上の）切断が行われるリゾチームを意味する。この用語はまた、変異体が比較され、アライメントされるポリペプチドを意味する。親は、天然の（野生型）ポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３の酵素、又はこれらの配列の一つと少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチドでもよい。親ポリペプチドはまた、アミノ酸配列が修飾された、又は改変された天然のポリペプチドの変異体でもよい。親はまた、同一の染色体座を占める遺伝子の二つ又はそれ以上のいずれかの代替の形態によりコードされるポリペプチドである対立遺伝子の変異体でもよい。
【００１９】
単離された変異体又はポリペプチド：本明細書で用いられる用語「単離された変異体」（isolated variant）又は「単離されたポリペプチド」（isolated polypeptide）とは、起源、例えばそれが発現される宿主細胞、又はそれが通常存在する酵素複合体から単離された変異体又はポリペプチドを意味する。好ましくは、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された場合、少なくとも４０％純粋、例えば少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である。
【００２０】
実質的に純粋な変異体又はポリペプチド：本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）又は「実質的に純粋なポリペプチド」（substantially pure polypeptide）は、最大１０重量％、例えば、最大８重量％、最大６重量％、最大５重量％、最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％、又は最大０．５重量％の天然に、又は組み換え的に結合した他のポリペプチド材料を含むポリペプチド調製物を表す。それ故、実質的に純粋な変異体又はポリペプチドは、調製物中に存在する合計ポリペプチド材料の重量で、少なくとも９２％純粋、例えば、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９６％純粋、より少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％純粋、又は１００％純粋であることは好ましい。本発明の変異体及びポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態である。これは、例えば、よく知られている組み換え方法により、又は古典的精製方法により、変異体又はポリペプチドを調製することにより、達成され得る。
【００２１】
成熟ポリペプチド：本明細書で用いられる用語「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）とは、翻訳、及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ−末端処理、Ｃ−末端切断、グリコシル化、リン酸化等後のその最終形態において抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドとして定義される。配列番号２により定義されるポリペプチドについて、成熟リゾチームの例は、配列番号２の位置１８において開始し、配列番号２の位置２３５において終了する。この成熟リゾチーム配列はまた、配列番号３に示される。別の例は、リゾチームがアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）において発現される場合、成熟ポリペプチドは、配列番号２の位置２６において開始し、配列番号２の位置２３５において終了する。しかしながら、発現系に依存して、実際の成熟ポリペプチドの長さは、例えば、予測される成熟ポリペプチドから、Ｎ末端及び／又はＣ末端において１〜１０アミノ酸長（長く、又は短く）変化してもよい。
【００２２】
成熟ポリペプチドコーディング配列：本明細書で用いられる用語「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）とは、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。一つの側面では、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド５１〜７０５である。成熟ポリペプチドコーディング配列は、発現系に依存して、３〜３０ヌクレオチド長変化してもよい。アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）において発現される場合、成熟ポリペプチドコーディング配列は、例えば、配列番号１のヌクレオチド７５〜７０５に対応する。
【００２３】
同一性：本明細書で用いられるパラメータ「同一性」（identidy）とは、二つのアミノ酸配列間、又は二つのヌクレオチド配列間の関係性を表す。本発明の目的において、二つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org）のNeedleプログラム、好ましくはバージョン３．０．０以降により実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleのアウトプット（−nobriefオプションを用いて得られる）は、％同一性として用いられ、以下の式に従い計算される。
（同一の残基×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００２４】
本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上; http://emboss.org）のNeedleプログラム、好ましくはバージョン３．０．０以降、により実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を用いて決定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティー、及びEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されたNeedleのアウトプット（−nobriefオプションを用いて得られる）は、％同一性として用いられ、以下の式に従い計算される。
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００２５】
相同配列：本明細書で用いられる用語「相同配列」（homologous sequence）とは、tfastyサーチ（Pearson, W.R., 1999, Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219）において、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）（UniProt登録番号  Ａ４ＤＡ２９）リゾチームと、０．００１未満のＥ値（又は予測スコア）を与える予測されたポリペプチドとして、定義される。
【００２６】
ポリペプチドの機能性フラグメント：用語「ポリペプチドの機能性フラグメント」（functional ffragment of a polypeptide）とは、長いポリペプチド、例えば、成熟ポリペプチドに由来し、親ポリペプチドのフラグメントを生成するために、Ｎ−末端領域若しくはＣ−末端領域において、又は双方の領域において先端を切り取られているポリペプチドを表すために用いられる。機能性ポリペプチドであるためには、フラグメントは、少なくとも２０％の全長／成熟ポリペプチドの抗微生物及び／又はリゾチーム活性、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の全長／成熟ポリペプチドの抗微生物及び／又はリゾチーム活性を維持しなければならない。
【００２７】
対立遺伝子の変異体：本明細書で用いられる用語「対立遺伝子の変異体」（allelic variant）とは、同一の染色体座を占める遺伝子の二つ又はそれ以上のいずれかの代替の形態を表す。対立遺伝子の変異体は、変異によって自然に発生し、集団内で多様性をもたらし得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）であり得、又は改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子の変異体は、遺伝子の対立遺伝子の変異体によりコードされるポリペプチドである。
【００２８】
単離されたポリヌクレオチド：本明細書で用いられる用語「単離されたポリヌクレオチド」（isolated polynucleotide）とは、起源から単離されたポリヌクレオチドを意味する。一つの側面では、アガロース電気泳動により決定された場合、少なくとも４０％純粋、例えば、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である。
【００２９】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書で用いられる用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」（substantially pure polynucleotide）とは、他の無関係な、又は望ましくないヌクレオチドが除かれており、遺伝子操作されたポリペプチド生成システム内での使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、最大１０重量％、例えば、最大８重量％、最大６重量％、最大５重量％、最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％、又は最大０．５重量％の天然に、又は組み換え的に結合した他のポリヌクレオチド材料を含む。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、しかしながら、天然の５’及び３’非翻訳領域、例えば、プロモーター及びターミネーターを含む。実質的に純粋なポリヌクレオチドが、重量に対して、少なくとも９０％純粋、例えば、少なくとも９２％純粋、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、より少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％純粋であることは好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋な形態、即ち、ポリヌクレオチド調製物が本質的に、天然に、又は組み換え的に結合した他のポリヌクレオチド材料が除かれている形態である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成の、合成起源、又はそれらの任意の組み合わせのものでもよい。
【００３０】
コーディング配列：本明細書で用いられる場合、用語「コーディング配列」（coding sequence）とは、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は、一般的に、ＡＴＧ開始コドンで開始し、又は代替の開始コドン、例えばＧＴＧ及びＴＴＧで開始し、終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡで停止する、オープンリーディングフレームにより決定される。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は組み換えポリヌクレオチドでもよい。
【００３１】
操作可能に連結された：「操作可能に連結された」（operably linked）とは、本明細書で、制御配列がポリペプチドのコーディング配列の発現を指示するように、制御配列がポリヌクレオチド配列のコーディング配列に対して適切な位置に置かれる配置を意味する。
【００３２】
宿主細胞：本明細書で用いられる用語「宿主細胞」（host cell）とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構成物又はベクターにより、形質転換、トランスフェクション、及び形質導入等されやすい任意の細胞種を含む。用語「宿主細胞」（host cell）は、複製の間に生じる変異による、親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。
【００３３】
改変された特性：用語「改変された特性」（altered property）とは、本明細書で、別の参照リゾチームに特に指定のない限り、改変された変異体に関連する特徴として定義され、それは親リゾチームと比較して改変される。斯かる改変された特性としては、これらに限定されるものではないが、改変された温度依存性活性プロファイル、改変された温度安定性、改変されたｐＨ活性、改変されたｐＨ安定性、及び／又は改変されたプロテアーゼ分解に対する耐性が挙げられる。
【００３４】
改良された特性：用語「改良された特性」（improved property）とは、本明細書で、別の参照リゾチームに特に指定のない限り、改良された変異体に関連する特徴として定義され、それは親リゾチームと比較して改良される。斯かる改良された特性としては、これらに限定されるものではないが、改良された温度依存性活性プロファイル、例えば、改良された温度活性、又は低温における改良された活性、改良された温度安定性、改良されたｐＨ活性、改良されたｐＨ安定性、及び／又は増加したプロテアーゼ分解に対する耐性が挙げられる。
【００３５】
改変された温度依存性活性プロファイル：本明細書で用いられる用語「改変された温度依存性活性プロファイル」（altered temperature-dependent activity profile）とは、親リゾチームの温度依存性活性プロファイルと比較した場合、温度依存性活性プロファイルの改変を示す変異体酵素を表す。温度依存性活性プロファイルは、所定の条件、例えばｐＨ、及び溶媒組成物において、温度の範囲に亘り、微生物増殖の防止、微生物細胞の除去、及び／又は加水分解反応の触媒作用における酵素の効率の基準を提供する。リゾチームは、ポリペプチドが安定で有り、その酵素活性を保持する特定の温度範囲を有し、この範囲以外では、リゾチームは、活性が低くなり、潜在的に安定性も低くなる。最適温度は、一般的に、リゾチームが最も高い活性を示す温度範囲内に存在する。
【００３６】
温度依存性活性プロファイルの改変がより高い温度に向かう場合、より熱に活性な又は好熱性のリゾチームが生成される。より高い温度においてリゾチームの活性を改良することにより、それは、例えば消毒、又は殺菌プロセスのための、より高い温度（例えば４５℃〜１１０℃、好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜９０℃、より一層好ましくは７０℃〜８０℃）を要求する条件下で機能することができる。さらに、リゾチームにより触媒される反応の初速度は、変異体の熱活性を決定することにより測定される温度の上昇により加速し得る。より熱に活性な変異体は、親リゾチームの最適温度よりも高い温度において用いられる場合、生物増殖の防止、微生物細胞の除去及び／又は加水分解のために要求される時間及び／又は酵素濃度を減少させる、加水分解の速度の増加を導く。
【００３７】
温度依存性活性プロファイルの改変がより低い温度又は中程度の温度に向かう場合、より低い温度（例えば０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜１８℃、好ましくは５℃〜１５℃、より好ましくは８℃〜１２℃、さらに最も好ましくは１０℃〜１５℃）又は中程度の温度（例えば１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃、好ましくは２２℃〜３５℃、最も好ましくは２５℃〜３０℃）において改良された活性を有するリゾチームが生成される。より低い温度又は中程度の温度において増加した活性を有するリゾチームは、親の温度依存性活性プロファイルにより定義される親酵素の最適温度よりも低い温度において親酵素よりも早く、微生物増殖を防止し、微生物細胞を除去し、加水分解反応を触媒する。斯かる酵素は、例えば、減少した温度、例えば、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３０℃、より好ましくは１５℃〜２５℃、より一層好ましくは１８℃〜２０℃における洗浄条件において、有利であってもよい。それはまた、熱に弱い食品の処理、例えば乳製品、果汁製品、若しくはワイン、又は温帯の国における冬の間の土壌及び排水のバイオメディエーションに有利であり得る。低温において増加した活性を有するリゾチームの有用性の別の例としては、冷水魚の種、例えばサケ（salmon）、及びサケスズキ（trout）の処理；魚の養殖プラントにおける斯かる水処理が挙げられる。
【００３８】
本発明の一つの側面では、リゾチーム変異体の温度依存性活性プロファイルの改変は、より低い温度又は中程度の温度における変異体の活性を改良する。好ましくは、リゾチーム変異体の活性は、変異体が親酵素の活性よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い活性を有する条件下で、親酵素の最適温度の５℃未満、好ましくは１０℃、より好ましくは１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、より一層好ましくは４５℃、及び最も好ましくは５０℃未満の温度において、親リゾチームの活性と比較される。好ましくは、リゾチーム変異体は、同時に、その最適温度において親リゾチームが示す活性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも１００％の活性を維持する。好ましくは、活性は、所望の減少した温度に対する温度の偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００３９】
本発明の一つの側面では、リゾチーム変異体の温度依存性活性プロファイルの改変は、高温における変異体の活性を改良する。好ましくは、リゾチーム変異体の活性は、変異体が、親酵素の活性よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い活性を有する条件下で、親酵素の最適温度の５℃未満、好ましくは１０℃、より好ましくは１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃、より一層好ましくは４５℃、及び最も好ましくは５０℃未満の温度において、親リゾチームの活性と比較される。好ましくは、リゾチーム変異体は、同時に、その最適温度において親リゾチームが示す活性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも１００％の活性を維持する。好ましくは、活性は、所望の減少した温度に対する温度の偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００４０】
改良された温度安定性：用語「温度安定性」（temperature stability）又は「改良された熱安定性」（improved thermostability）とは、本明細書で、上昇した温度においてインキュベーションの期間後、親酵素と比較して酵素活性の保持を示す変異体酵素として定義される。斯かる変異体は、親と比較して改変された温度活性プロファイルを示しても示さなくてもよい。例えば、変異体は、上昇した温度において活性でなくてもよいが、その三次元構造を維持することができ、一度低温に戻されると、その後、活性を取り戻すことができる。或いは、変異体は、親酵素と比較して、上昇した温度でのインキュベーション後、改良されたリフォールドする能力を有してもよい。
【００４１】
一つの側面では、リゾチーム変異体の熱安定性は、変異体が、高温、例えば４５℃〜１１０℃、好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜９０℃、より一層好ましくは７０℃〜８０℃の温度において、維持し得るように、改良される。好ましくは、変異体リゾチームは、同時間室温で維持された変異体と比較した場合、所定の高温において１時間インキュベーション後に、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の残存活性を維持する。好ましくは、変異体リゾチームの残存活性が、同一条件下で処理された親リゾチームの残存活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い。好ましくは、活性は、所望の増加した温度に対する温度の偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００４２】
改良されたｐＨ活性：用語「改良されたｐＨ活性」（improved pH activity）とは、本明細書で、親リゾチームのｐＨ活性プロファイルと比較した場合、ｐＨ依存性活性プロファイルの改変を示す変異体酵素として定義される。ｐＨ依存性活性プロファイルは、所定の条件、例えば、ｐＨ、及び溶媒組成物において、ｐＨ範囲に亘り、微生物増殖の防止、微生物細胞の除去、及び／又は加水分解反応の触媒作用における酵素の効率の基準を提供する。リゾチームは、ポリペプチドが安定で有り、その酵素活性を保持する特定のｐＨ範囲を有し、この範囲以外では、リゾチームは、活性が低くなり、潜在的に安定性も低くなる。最適ｐＨは、一般的に、リゾチームが最も高い活性を示すｐＨ範囲内に存在する。
【００４３】
アルカリｐＨ（例えばｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において改良された活性を有するリゾチーム変異体は、よりアルカリ性の環境、例えば洗剤中において機能し得る。
【００４４】
酸性ｐＨ（例えばｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において改良された活性を有する変異体は、より酸性条件下で、例えば特定の食品の保存剤として、又は飼料における摂生法（eubiotic）分子として、機能し得る。
【００４５】
一つの側面では、ｐＨ活性プロファイルは、リゾチーム変異体がアルカリ性ｐＨにおいて改良された活性を有するように、改変される。好ましくは、リゾチーム変異体の活性は、変異体が、親酵素の活性よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い活性を有する条件下で、親酵素の最適ｐＨの０．５単位超、好ましくは親酵素の最適ｐＨの１、１．５、２、２．５、又は３ｐＨ単位超、最も好ましくは親酵素の最適ｐＨの少なくとも３．５ｐＨ単位超、及び最も好ましくは親酵素の最適ｐＨの少なくとも４ｐＨ単位超において、親リゾチームの活性と比較される。好ましくは、リゾチーム変異体は、同時に、その最適ｐＨにおいて親リゾチームが示す活性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも１００％の活性を維持する。好ましくは、活性は、所望の増加したｐＨに対するｐＨの偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００４６】
一つの側面では、ｐＨ活性プロファイルは、酸性ｐＨにおいて、リゾチーム変異体が改良された活性を有するように、改変される。好ましくは、リゾチーム変異体の活性は、変異体が、親酵素の活性よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い活性を有する条件下で、親酵素の最適ｐＨの０．５単位未満、好ましくは親酵素の最適ｐＨの１、１．５、２、２．５、又は３ｐＨ単位未満、最も好ましくは親酵素の最適ｐＨの少なくとも３．５ｐＨ単位未満、及び最も好ましくは親酵素の最適ｐＨの少なくとも４ｐＨ単位未満において、親リゾチームの活性と比較される。好ましくは、リゾチーム変異体は、同時に、その最適ｐＨにおいて親リゾチームが示す活性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも１００％の活性を維持する。好ましくは、活性は、所望の減少したｐＨに対するｐＨの偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００４７】
改良されたｐＨ安定性：用語「改良されたｐＨ安定性」（improved pH stability）とは、本明細書で、酵素が活性であるｐＨ範囲（ｐＨ活性範囲）外であるｐＨにおけるインキュベーションの期間後、親酵素と比較して構造的安定性を示す変異体酵素として定義される。斯かる変異体は、親と比較して改変されたｐＨ活性プロファイルを示しても示さなくてもよい。例えば、変異体は、上昇した又は減少したｐＨにおいて活性でなくてもよいが、その三次元構造を維持することができ、一度ｐＨ活性範囲に戻されると、その後活性を取り戻すことができる。或いは、変異体は、上昇した又は減少したｐＨにおいて、インキュベーション後、親酵素と比較して、改良されたリフォールドする能力を有してもよい。
【００４８】
一つの側面では、ｐＨ安定性プロファイルは、酸性ｐＨ（例えばｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において、リゾチーム変異体が改良された安定性を有するように、改変される。好ましくは、変異体リゾチームは、同時間ｐＨ６．５で維持された変異体と比較した場合、所定のｐＨにおいて１時間インキュベーション後、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の残存活性を維持する。好ましくは、変異体リゾチームの残存活性は、同一条件下で処理された親リゾチームの残存活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い。好ましくは、活性は、所望の減少したｐＨに対するｐＨの偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００４９】
一つの側面では、ｐＨ安定性プロファイルは、アルカリ性ｐＨ（例えばｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において、リゾチーム変異体が改良された安定性を有するように、改変される。好ましくは、変異体リゾチームは、同時間ｐＨ６．５で維持された変異体と比較した場合、所定のｐＨにおいて１時間インキュベーション後、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％残存活性を維持する。好ましくは、変異体リゾチームの残存活性は、同一条件下で処理された親リゾチームの残存活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い。好ましくは、活性は、所望の増加したｐＨに対するｐＨの偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００５０】
改良されたプロテアーゼ安定性：用語「改良されたプロテアーゼ安定性」（improved protease stubility）とは、本明細書で、プロテアーゼ（例えばペプシン、又はセリン−プロテアーゼ、例えば、動物又はヒトの消化系からのトリプシン、又はキモトリプシン）及び／又は胆汁酸とインキュベーションの期間後、親酵素と比較して構造的安定性を示す変異体酵素として定義される。好ましくは、プロテアーゼ安定性変異体はまた、酸性ｐＨ（例えばｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において安定である。斯かる変異体は、親と比較して改変された活性プロファイルを示しても示さなくてもよい。変異体は、例えば、プロテアーゼとインキュベーション後、及び／又は減少したｐＨにおいてインキュベーション後、親酵素と比較して、リフォールドする改良された能力を有してもよい。減少したｐＨに関して、変異体は、減少したｐＨでインキュベーションの間活性でなくてもよいが、その三次元構造を維持することができ、一度ｐＨ活性範囲に戻されると、その後、活性を取り戻スことができる。
【００５１】
一つの側面では、プロテアーゼ安定性は、リゾチーム変異体がプロテアーゼ及び／又は胆汁酸とインキュベーション後、改良された安定性を有するように、改変される。好ましくは、変異体リゾチームは、セリン−プロテアーゼ及び／又は胆汁酸と１時間インキュベーション後、同時間プロテアーゼ及び／又は胆汁酸なしでインキュベーションされた変異体と比較した場合、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の残存活性を維持する。好ましくは、変異体リゾチームの残存活性が、同一条件下で処理された親リゾチームの残存活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い。好ましくは、活性は、セリン−プロテアーゼ、ペプシン、及び／又は胆汁酸が添加される偏差と共に、「材料及び方法」の欄に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
【００５２】
更なる側面では、プロテアーゼ安定性は上述のように改良され、ｐＨ安定性プロファイルは、リゾチーム変異体が、酸性ｐＨ（例えばｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において、改良された安定性を有するように、改変される。好ましくは、変異体リゾチームは、所定のｐＨにおいて、セリン−プロテアーゼ及び／又は胆汁酸と１時間インキュベーション後、ｐＨ６．５において、同時間プロテアーゼ及び／又は胆汁酸なしでインキュベーションされた変異体と比較した場合、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の残存活性を維持する。好ましくは、変異体リゾチームの残存活性が、同一条件下で処理された親リゾチームの残存活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、及びさらに最も好ましくは少なくとも２０倍高い。好ましくは、活性は、所望の減少したｐＨに対するｐＨの偏差と共に、「材料及び方法」部分に記載されるリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験され、セリン−プロテアーゼ、ペプシン、及び／又は胆汁酸は添加される。
【００５３】
変異体の命名についての規約
本発明の目的において、配列番号３に開示されるリゾチームのアミノ酸配列は、別のリゾチームの対応するアミノ酸残基を決定するために用いられる。別のリゾチームのアミノ酸配列は、配列番号３に開示されるリゾチームのアミノ酸配列とアライメントされ、そのアライメントに基づいて、配列番号３に開示されるリゾチームのアミノ酸配列の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号は、決定され得る。
【００５４】
ポリペプチド配列のアライメントは、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org）のNeedleプログラム、好ましくはバージョン３．０．０以降、により実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch， 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて行なわれてもよい。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。
【００５５】
本発明の様々なリゾチーム変異体を記述するにあたり、参照の便宜のため、以下に説明する命名法を採用する。いずれの場合も、認められているＩＵＰＡＣの１文字又は３文字のアミノ酸の略称を用いる。
【００５６】
（１又は２以上の）改変は、該位置を占めるアミノ酸の挿入及び／又は欠失、及び／又は該位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置換である。
【００５７】
置換  アミノ酸置換について、以下の命名法：元のアミノ酸／位置／置換されたアミノ酸、が用いられる。従って、位置２２６におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」として表される。多重変異は、加算記号（「＋」）により分けられ、例えば、「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、それぞれ、グリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）で、及びセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）で置換した位置２０５及び４１１における変異を表す。元のアミノ酸が群から選択されるアミノ酸により置換されてもよい場合、それは、「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」として表され、位置１２９におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択されるアミノ酸による置換を表す。或いは、「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」は、Ｋ１２９Ｒ、又はＫ１２９Ｓ、又はＫ１２９Ａ、又はＫ１２９Ｉ、又はＫ１２９Ｆ、又はＫ１２９Ｑと書くことができる。
【００５８】
欠失  アミノ酸置換について、以下の命名法：元のアミノ酸／位置／アスタリスク（*）、が用いられる。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５*」又は「Ｇ１９５*」として表される。多重欠失は、加算記号（「＋」）により分けられる（例えばＧ１９５*＋Ｓ４１１*）。
【００５９】
挿入  アミノ酸挿入について、以下の命名法：アスタリスク（*）／位置／小文字／挿入されたアミノ酸、が用いられ、小文字は、位置番号の下流のアミノ酸の付加を示す。従って位置１０の下流のグルタミン酸（Ｅ）の挿入は、「*１０ａＥ」として表される。第二のアミノ酸、例えばバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）の後に、位置１０の下流に挿入される場合、それは、「*１０ａＥ＋*１０ｂＶ」として表される。ポリペプチドのＮ末端への付加は、０（ゼロ）で表される。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸へのグルタミン酸（Ｅ）及びバリン（Ｖ）の付加は、「*０ａＥ＋*０ｂＶ」として表される。「下流の」（downstream）挿入はまた、指定された位置と指定された位置の直後の位置の間の１又は２以上のアミノ酸の付加として表され、例えば、位置１９５の下流の挿入は、位置１９５と１９６の間の１又は２以上のアミノ酸の付加をもたらし、それ故、新しい位置*１９５ａ、*１９５ｂ等は生成する。
【００６０】
親リゾチーム
本発明では、親リゾチームは、「ファミリー２５リゾチーム」とも称されるグリコシルヒドラーゼのファミリー２５、好ましくは真菌性ファミリー２５リゾチームに属するリゾチームのいずれかである。グリコシルヒドラーゼ又はリゾチームのファミリー２５は、Henrissat B. (1991)Biochem. J. 280:309-316; and Henrissat B., and Bairoch A. (1996)Biochem. J. 316:695-696に従って、グリコシドヒドラーゼファミリー２５に分類されるポリペプチドとして本明細書で定義される。
【００６１】
親リゾチームの例としては、アスペルギルス属（Aspergillus）、又はペニシリウム属（Penicillum）、例えばアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus)、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspgerillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillum marneffei）由来のリゾチームが挙げられる。リゾチームの特定の例としては、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号３）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号４）；アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号５）；アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）リゾチーム（配列番号６）；アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）リゾチーム（配列番号７）；アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）リゾチーム（配列番号８）；アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号９）；（配列番号１０）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム；アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavtus）リゾチーム（配列番号１１）；アスペルギルス・テラス（Aspergillus terrus）リゾチーム（配列番号１２）；及びペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillum marneffei）リゾチーム（配列番号１３）が挙げられる。これらのリゾチームアミノ酸配列のアライメントは、図１に示される。
【００６２】
ファミリー２５リゾチームの代表的な構造は、配列番号３のアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチームについて、図２として添付される原子座標に提供される。
【００６３】
一つの実施形態では、ＧＨ２５リゾチームは、以下のモチーフ：
［ＧＡ］−Ｘ−Ｙ−［ＨＦ］−［ＦＹ］−Ｘ（６，１５）−［ＱＥＤ］−［ＡＶ］−Ｘ（２，５）−［ＦＹＷ］−Ｘ（８，１７）−［ＰＫＭＹＡＳＲＶＬＩ］−Ｘ（２）−［ＶＬＩ］−Ｄ−Ｘ−Ｅ、
を含むポリペプチドとして定義される（アミノ酸について標準ＩＵＰＡＣの１文字コードが用いられる）。記号「Ｘ」は、任意のアミノ酸が認められる位置に用いられる。曖昧さは、大括弧「［］」の間で、所定の位置に認められるアミノ酸の列挙により示される。例えば、［ＱＥＤ］は、Ｇｌｎ又はＧｌｕ又はＡｓｐについて示す。パターンにおけるギャップ（「Ｘ」）は、括弧の間の数字範囲により示される。例えば、「Ｘ（２）」は、２個の隣接する位置における任意のアミノ酸に対応し（例えばＸ−Ｘ）、Ｘ（２，５）は、２〜５個の隣接する位置の任意のアミノ酸に対応する（例えばＸ−Ｘ、又はＸ−Ｘ−Ｘ、又はＸ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、又はＸ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）。
【００６４】
別の実施形態では、親のリゾチームは、（ａ）配列番号２の成熟ペプチドに対応するポリペプチド；又は（ｂ）配列番号２の成熟ペプチドと少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は（ｃ）少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の配列によりコードされる成熟ポリペプチド、（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；又は（ｄ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
【００６５】
親リゾチームはまた、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３のポリペプチドと少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を含んでもよく、そのアミノ酸配列は、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有する（以下、「相同ポリペプチド」）。一つの側面では、相同ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドと、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸のみ異なるアミノ酸配列を有する。
【００６６】
実質的に相同な親リゾチームは、１又は２以上の（数個の）アミノ酸改変、例えば置換、欠失、及び／又は挿入を有してもよい。これらの変化は軽微なものであることが好ましい。すなわち、保存的アミノ酸置換、及びタンパク質又はポリペプチドの三次元折り畳み又は活性に著しい影響を与えない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約９個のアミノ酸、１〜約１５個のアミノ酸、又は１〜約３０個のアミノ酸；及び小さなアミノ末端又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基、最大約５〜１０残基、１０〜１５残基、若しくは２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチド、又は精製を容易にする小さい伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジンタグ、又はプロテインＡ（Nilsson et al. (1985)EMBO J. 4:1075; Nilsson et al. (1991)Methods Enzymol. 198:3）である。また、概説として、Ford et al. (1991)Protein Expression and Purification 2:95-107を参照のこと。
【００６７】
上述の変化は軽微なものであることが好ましいが、斯かる変化は実質的なものであってもよい。例えば、最大３００又はそれ以上のアミノ酸からなる大きいポリペプチドの融合による、アミノ末端又はカルボキシル末端の双方の伸長等であってもよい。融合ポリペプチドの例としては、本発明のリゾチームへの結合ドメイン及び／又はリンカーセグメントの付加が挙げられる。
【００６８】
保存的置換の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン），芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の各群内で行なわれる修飾が挙げられる。比活性を大きく改変しないアミノ酸置換は、本技術分野では周知であり、例えば、Neurath and Hill (1979)The proteins,Academic Press,New Yorkに記載されている。最も一般的に行われる変換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ，及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００６９】
本発明のリゾチームポリペプチドにおいて必要不可欠なアミノ酸は、本技術分野において知られている手順、例えば、部位特異的変異誘発、又はアラニン−スキャニング変異誘発（Cunningham and Wells (1989)Science 244:1081-1085）に従って、特定され得る。後者の技術では、一つのアラニン変異が分子中の全ての残基において導入され、得られる変異体分子は、分子の活性に重要なアミノ酸残基を特定するために、生物学的活性（即ち、抗微生物及び／又はリゾチーム活性）について試験される。また、Hilton et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4699-4708を参照のこと。酵素の活性部位、又は他の生物学的な相互作用はまた、推定の接触部位アミノ酸の変異と合わせて、各磁気共鳴、結晶学、電子線回折又は光親和性標識のような技術により決定されるような、構造の物理的な分析により決定され得る。例えば、de Vos et al. (1992)Science 255:306-312; Smith et al. (1992)J. Mol. Biol. 224:899-904; Wlodaver et al. (1992)FEBS Lett. 309:59-64を参照のこと。必要不可欠なアミノ酸の同定はまた、本発明のポリペプチドに関するポリペプチドとの相同性の分析から推測され得る。１．８Åの解像度における、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）（親リゾチーム）からの真菌性ＧＨ２５の結晶構造は、本発明に含まれる。これは、真核生物の代表的なリゾチームＧＨ２５ファミリーの最初の結晶構造である。構造は、その二次構造を計算するための、Dictionary of Protein Secondary Structure（Dictionary of Protein Secondary Structure）（ＤＳＳＰ）プログラムへのインプットとして用いられる。ＤＳＳＰプログラムは、二次構造帰属を標準化するために、Wolfgang Kabsch and Chris Sanderにより設計された。ＤＳＳＰは、Protein Data Bankにおける全てのタンパク質エントリーについての二次構造帰属のデータベースである。ＤＳＳＰはまた、ＰＤＢエントリーからＤＳＳＰエントリーを計算するプログラムである。ＤＳＳＰは、Kabsch W. and Sander C. (1983) "Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features," Biopolymers Dec, 22(12):2577-637に記載される。
【００７０】
以下は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）ＧＨ２５リゾチームの二次構造の要素である。
【００７１】
【表１】
2013520189.tif 000002
【００７２】
アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）ＧＨ２５リゾチームの構造は、５０Å×３９Å×３６Åの大きさを有する平坦な楕円の形状を有する一つのドメインを含む。酵素は、β／α−バレルフォールドを有し、それは、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）及び多くの他の酵素において見られる（β／α）8−バレルと異なる（詳細については、Rau A., Hogg T., Marquardt R. and Hilgenfeld R., A new lysozyme fold. Crystal structure of the muramidase from Streptomyces coelicolor at 1.65 A resolution, Journal of Biological Chemistry 2001, volume 276, pp. 31994-9による論文を参照のこと）。それは、バレルの横桟を形成するストランドとその周りに位置するヘリックスを含む、８つのβ−ストランド及び６つのα−ヘリックスからなる。通常のＴＩＭバレルにおいては、最初の５つのβ−ストランドとα−ヘリックスは、互い違いになる。しかしながら、５つ目のヘリックスの後にストランドβ６〜β８は続き、それはヘリックスの欠落したループにより繋がれる。ヘリックスα６は、ポリペプチド鎖のＣ末端に位置し、バレルの底部（Ｎ末端側終端）に位置する。全てのβ−ストランドは、他のストランドに対して逆平行の向きに位置する大変珍しいストランドβ８を除いて、互いに平行に配列する。
【００７３】
構造残基に基づいて、配列番号３のＤ１０５及びＥ１０７は、触媒残基として同定されている。好ましい実施形態では、本発明の変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）１０５においてアスパラギン酸位置を含み、（番号付けに配列番号３を用いて）１０７においてグルタミン酸位置を含む。さらに、構造に基づいて、配列番号３の以下の残基、Ｄ１６、Ｑ１９１、Ｙ１４５、Ｙ６９、Ｄ２０１、Ｇ２００、Ｇ４４、Ｇ６７、Ｇ１４、及びＨ７０は、活性部位に密接に関係するとして同定されている。さらに好ましい実施形態では、本発明の変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１６においてアスパラギン酸、位置１９１においてグルタミン、位置１４５においてチロシン、位置６９においてチロシン、位置２０１においてアスパラギン酸、位置２００においてグリシン、位置４４においてグリシン、位置っっっｓ６７においてグリシン、位置１４においてグリシン、及び／又は位置７０においてヒスチジンを含む。
【００７４】
親リゾチームは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体、又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントを含む。一つの側面では、親リゾチームは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号２の成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号３のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号４のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号５のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号６のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号７のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号８のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号９のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１０のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１１のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１２のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１３のポリペプチド又はそれらの成熟ポリペプチドを含む。別の側面では、親リゾチームは、配列番号３のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号４のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号５のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号６のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号７のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号８のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号９のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１０のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１１のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１２のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号１３のアミノ酸配列若しくは又はそれらの対立遺伝子の変異体；又は抗微生物及びリゾチーム活性を有するそれらのフラグメントからなる。別の側面では、親リゾチームは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドのフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端から欠失した１又は２以上の（数個の）アミノ酸を有し、なおも抗微生物及び／又はリゾチーム活性を維持しているポリペプチドである。
【００７５】
親リゾチームは、別の側面では、極めて低いストリンジェンシー条件、好ましくは低いストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件、より一層好ましくは高いストリンジェンシー条件、最も好ましくは極めて高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のサブ配列、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の完全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてもよい（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989）Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor, New York）。サブ配列は、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしてもよい。一つの側面では、相補鎖は、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列の完全長相補鎖である。
【００７６】
配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列、又はそれらのホモログは、ポリペプチドが抗微生物及び／又はリゾチーム活性を保有するサブ配列によりコードされる、１又は２以上の（数個の）ヌクレオチドが５’末端及び／又は３’末端から欠失している、ヌクレオチド配列である。
【００７７】
親酵素はまた、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドの対立遺伝子の変異体でもよい。
【００７８】
配列番号１のポリヌクレオチド又はそれらのサブ配列、及び配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２若しくは配列番号１３のアミノ酸配列又はそれらのフラグメントは、本技術分野においてよく知られている方法に従って、様々な属又は種の株から親リゾチームをコードするＤＮＡを同定及びクローン化するための核酸プローブを設計するために用いられてもよい。特に、斯かるプローブは、対象の属又は種の中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準的なサザンブロッティング手順後、対象の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられ得る。斯かるプローブは、全体の配列よりも大幅に短くてもよいが、少なくとも１４、少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチド長であるべきである。しかしながら、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長であることが好ましい。例えば、核酸プローブは、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、又は少なくとも５００ヌクレオチド長でもよい。さらに長いプローブ、例えば少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド長、少なくとも１０００ヌクレオチド長、少なくとも１１００ヌクレオチド長、少なくとも１２００ヌクレオチド長、少なくとも１３００ヌクレオチド長、少なくとも１４００ヌクレオチド長、少なくとも１５００ヌクレオチド長、又は少なくとも１６００ヌクレオチド長である核酸プローブは、用いられてもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの双方が用いられ得る。プローブは、対応する遺伝子を検出するために（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンを用いて）典型的に標識される。斯かるプローブは、本発明により包含される。
【００７９】
他の生物から調製されるゲノムＤＮＡライブラリーは、上述のプローブとハイブリダイズし、親リゾチームをコードするＤＮＡのためにスクリーニングされる。他の生物からのゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術により分離されてもよい。ライブラリーからのＤＮＡ、又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移され、その上に固定化されてもよい。配列番号１又はそれらのサブ配列と相同性を有するクローン又はＤＮＡを同定するために、担体材料は、サザンブロットに用いられる。本発明の目的において、ハイブリダイゼーションとは、低い〜極めて高いストリンジェンシー条件下で、ポリヌクレオチドが、配列番号１に示されるポリヌクレオチド、その相補鎖、又はそれらのサブ配列と対応する標識されたヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを指す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルム、又は本技術分野において知られている他の検出手段を用いて検出され得る。
【００８０】
一つの側面では、核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の側面では、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド５１〜７０５、又は配列番号１のヌクレオチド７５〜７０５である。別の側面では、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそれらのサブ配列である。別の側面では、核酸プローブは、配列番号１である。
【００８１】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低い〜極めて高いストリンジェンシー条件は、任意で１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順後、４２℃において、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ、及び極めて低い及び低いストリンジェンシーについては２５％ホルムアミド、中程度及び中−高ストリンジェンシーについては３５％ホルムアミド、又は高い及び極めて高いストリンジェンシーについては５０％ホルムアミドのいずれか中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
【００８２】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、担体材料は、最終的に、好ましくは４５℃で（極めて低いストリンジェンシー）、より好ましくは５０℃で（低いストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃で（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６０℃で（中程度〜高いストリンジェンシー）、より一層好ましくは６５℃で（高いストリンジェンシー）、及び最も好ましくは７０℃で（極めて高いストリンジェンシー）、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて各１５分間、３回洗浄される。
【００８３】
約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブについて、ストリンジェンシー条件は、任意で１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順後、Bolton及びMcCarthy (Bolton and McCarthy (1962）Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390を参照のこと）による計算を用いた、計算されたＴmより約５℃〜約１０℃低い温度において、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、及び１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーション後の洗浄として定義される。
【００８４】
約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブについて、担体材料は、計算されたＴmより約５℃〜約１０℃低い温度において、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、１５分間、６×ＳＳＣを用いて２回、各１５分間洗浄される。
【００８５】
第三の側面では、親リゾチームは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び更に最も好ましくは９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含む、又はからなるポリヌクレオチドによりコードされ、それは活性ポリペプチドをコードする。一つの側面では、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３、又は配列番号１のヌクレオチド９７〜１６５３である。
【００８６】
親リゾチームは、任意の属の微生物から得られてもよい。一つの側面では、親リゾチームは、細胞外に分泌される。
【００８７】
一つの実施形態では、親リゾチームは、真菌性リゾチームである。親真菌性リゾチームの例としては、アスペルギルス属（Aspergillus）又はペニシリウム属（Penicillum）、例えばアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspgerillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillum marneffei）由来のリゾチームが挙げられる。親真菌性リゾチームの特定の例としては、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号３）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム（配列番号４）；アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号５）；アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）リゾチーム（配列番号６）；アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）リゾチーム（配列番号７）；アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）リゾチーム（配列番号８）；アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）リゾチーム（配列番号９）；（配列番号１０）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）リゾチーム；アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavtus）リゾチーム（配列番号１１）；アスペルギルス・テラス（Aspergillus terrus）リゾチーム（配列番号１２）；及びペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillum marneffei）リゾチーム（配列番号１３）が挙げられる。
【００８８】
更なる側面では、親リゾチームは、細菌性リゾチームでもよい。例えば、リゾチームは、グラム陽性細菌由来のポリペプチドとしては、例えばバシラス属（Bacillus）、好ましくはバシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）ＢＡ＿ＧＨ２５Ｃでもよい（Martinez-Fleites et al. (2009)Carbohydr Res, 344(13):1753-1757）。他の親細菌性リゾチームとしては、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）セロシル（cellosyl）（Rau et al. (2001)J Biol Chem, 276(34):31994-31999）、バクテリオファージリシンＰｌｙＢ（Porter et al. (2007)J Mol Biol, 366(2):540-550）、又はストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）ファージからのＣｌｐ−１リゾチーム（Perez-Dorado et al. (2007)J Biol Chem, 282(34):24990-24999）でもよい。
【００８９】
変異体の生成
親リゾチームの変異体は、本技術分野において知られている任意の変異誘発手順、例えば、ランダム及び／又は部位特異的変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異誘発、シャッフリング等に従って、調製され得る。
【００９０】
合成遺伝子構築は、対象のポリペプチド分子をコードするために設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、多数の技術、例えばTian et al.（Tian et al., Nature 432:1050-1054）により記載されるマルチプレックスマイクロチップ型技術、及びオリゴヌクレオチドが光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で合成及び組み立てられる同様の技術を用いて実行され得る。
【００９１】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、及び／又は部位特異的変異誘発、及び／又はランダム変異誘発、及び／又はシャッフリングの側面を組み合わせることにより完成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わせて、合成されるポリヌクレオチドフラグメントを用いるプロセスにより代表される。遺伝子の一定の領域は、従って、新たに合成されてもよい一方で、他の領域は部位特異的変異誘発プライマーを用いて他の領域が増幅されてもよく、更に他の領域はエラープローンＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅に供されてもよい。ポリヌクレオチドフラグメントは、その後シャッフルされてもよい。
【００９２】
部位特異的変異誘発は、１又は数個の変異を、親リゾチームをコードするポリヌクレオチド分子における定義された部位に作製する技術である。該技術は、インビトロ又はインビボで行なわれ得る。
【００９３】
部位特異的変異誘発は、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むＰＣＲによりインビトロで完成され得る。部位特異的変異誘発はまた、親リゾチームをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中の部位における制限酵素による切断を含むカセット変異誘発、続くポリヌクレオチド中に変異を含むオリゴヌクレオチドのライゲーションにより、インビトロで行なわれ得る。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドにおいて消化する制限酵素は同じであり、プラスミド及び挿入物の接着性の（sticky）末端が互いにライゲートすることを可能にする。好適な技術の更なる詳細については、以下は参照される： Sambrook et al. (1989）Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.）Current protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1995); Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.）Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley and Sons (1990); 国際公開第96／34946号; Scherer and Davis (1979）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4949-4955; 及びBarton et al. (1990）Nucleic Acids Research 18:7349-4966。
【００９４】
リガーゼ反応後、ライゲーション混合物は、宿主細胞を形質転換するために用いられてもよく、クローニング目的のために、大腸菌（E. coli）細胞は、Ausubel, F. M.らの記載に従って、しばしば用いられる。形質転換された大腸菌細胞（E. coli）は液体培地中又は固体アガープレート上で増殖され、プラスミドは形質転換された細胞から回収され、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）細胞に形質転換するために用いられ得る。好適なコンピテントバシラス属（Bacillus）細胞、例えばＭＢ１５１０、１６８−誘導体（例えば登録番号  １Ａ１  １６８  ｔｒｐＣ２で、ＢＧＳＣから入手可能）は、国際公開第０３／０９５６５８号の記載に従って、形質転換されてもよい。ライブラリー構築のための大腸菌（E. coli）プラスミド−産生統合カセット（plasmid-borne integration cassette）は、バシラス属（Bacillus）の形質転換に用いられてもよい。この方法は、国際公開第０３／０９５６５８号に詳細に記載される。或いは、インビトロで増幅されたＰＣＲ−ＳＯＥ産物（Melnikov and Youngman, Nucleic Acid Research 27:1056）が用いられてもよい。
【００９５】
部位特異的変異誘発は、本技術分野において知られている方法により、インビボで達成される（例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Storici et al. (2001) Nature Biotechnology 19: 773-776; Kren et al. (1998) Nat. Med. 4: 285-290;及びCalissano and Macino (1996) Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16を参照のこと）。
【００９６】
任意の部位特異的変異誘発手順は、本発明に用いられ得る。親リゾチームの変異体を調製するために用いられることのできる多くの市販されているキットが存在する。
【００９７】
１又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入は、変異誘発、組み換え、及び／又はシャッフリングの既知の方法に続いて、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer (1988) Science 241:53-57; Bowie and Sauer (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号により開示される関連するスクリーニング手順を用いて、行なわれ、試験され得る。用いられ得る他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレー（例えばLowman et al. (1991) Biochem. 30:10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的変異誘発（Derbyshire et al. (1986) Gene 46:145; Ner et al. (1988) DNA 7:127）が挙げられる。
【００９８】
上述の変異誘発／シャッフリング方法は、上述の宿主細胞、例えばバシラス属（Bacillus）により発現されたクローン化され且つ変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するための、ハイスループットで且つ自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子は、本技術分野において標準的な方法を用いて、宿主細胞から回収され、迅速に配列解析され得る。
【００９９】
変異体
本発明の単離された変異体は、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の（数個の）位置にアミノ酸の改変を含み、前記変異体は、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有する。位置の番号付けは、配列番号３のアミノ酸配列に対応する。
【０１００】
本発明の単離された変異体は、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１１３、１１９、３５、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の（数個の）位置にアミノ酸の改変を含み、前記変異体は、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有する。位置の番号付けは、配列番号３のアミノ酸配列に対応する。
【０１０１】
一つの実施形態では、上述の変異体は、位置番号９５、１８６、６５、１２２、１３９、１４１、及び１７６からなる群から選択される１又は２以上の位置に更なるアミノ酸改変を含む。
【０１０２】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１９の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１９のアミノ酸のＡｓｎによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｎ１９Ｄの改変を含む、又はからなる。
【０１０３】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置２０の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置２０のアミノ酸のＨｉｓ又はＴｙｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｈ２０Ｗ又はＨ２０Ｙの改変を含む、又はからなる。
【０１０４】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置２２の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置２２のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ２２Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１０５】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置３０の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置３０のアミノ酸のＴｙｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ３０Ｙの改変を含む、又はからなる。
【０１０６】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置３２の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置３２のアミノ酸のＳｅｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｄ３２Ｓの改変を含む、又はからなる。
【０１０７】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置３５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置３５のアミノ酸のＡｒｇによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｑ３５Ｒの改変を含む、又はからなる。
【０１０８】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置４５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置４５のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｔ４５Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１０９】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置４７の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置４７のアミノ酸のＰｈｅによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｙ４７Ｆの改変を含む、又はからなる。
【０１１０】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置４９の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置４９のアミノ酸のＡｌａによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｄ４９Ａの改変を含む、又はからなる。
【０１１１】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置５５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置５５のアミノ酸のＡｌａ又はＡｓｎによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｈ５５Ａ又はＨ５５Ｎの改変を含む、又はからなる。
【０１１２】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置５６の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置５６のアミノ酸のＴｒｐによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｙ５６Ｗの改変を含む、又はからなる。
【０１１３】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置６５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置６５のアミノ酸のＩＬｅによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｌ６５Ｉの改変を含む、又はからなる。
【０１１４】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置７６の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置７６のアミノ酸のＳｅｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ７６Ｓの改変を含む、又はからなる。
【０１１５】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置８５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置８５のアミノ酸のＴｙｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ８５Ｙの改変を含む、又はからなる。
【０１１６】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置８９の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置８９のアミノ酸のＴｈｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｎ８９Ｔの改変を含む、又はからなる。
【０１１７】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置９５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置９５のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｄ９５Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１１８】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置９８の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置９８のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｒ９８Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１１９】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１０２の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１０２のアミノ酸のＰｒｏによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｇ１０２Ｐの改変を含む、又はからなる。変異体はまた、更にＹ１３４Ｖの改変を含む。
【０１２０】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１０８の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１０８のアミノ酸のＰｈｅ又はＴｒｐによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｙ１０８Ｆ又はＹ１０８Ｗの改変を含む、又はからなる。
【０１２１】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１１０の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１１０のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｐ１１０Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１２２】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１１１の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１１１のアミノ酸のＰｈｅによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｙ１１１Ｆの改変を含む、又はからなる。
【０１２３】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１１２の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１１２のアミノ酸のＳｅｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｇ１１２Ｓの改変を含む、又はからなる。
【０１２４】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１１３の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１１３のアミノ酸のＰｒｏによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ａ１１３Ｐの改変を含む、又はからなる。
【０１２５】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１１９の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１１９のアミノ酸のＡｓｎによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｓ１１９Ｎの改変を含む、又はからなる。
【０１２６】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１２０の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１２０のアミノ酸のＡｌａ、Ｇｌｎ又はＰｒｏによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｈ１２０Ａ、Ｈ１２０Ｑ又はＨ１２０Ｐの改変を含む、又はからなる。
【０１２７】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１２１の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１２１のアミノ酸のＡｌａによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｓ１２１Ａの改変を含む、又はからなる。
【０１２８】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１２２の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１２２のアミノ酸のＡｌａによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｑ１２２Ａの改変を含む、又はからなる。
【０１２９】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１２８の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１２８のアミノ酸のＡｒｇによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｈ１２８Ｒの改変を含む、又はからなる。
【０１３０】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１３１の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１３１のアミノ酸のＣｙｓによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｖ１３１Ｃの改変を含む、又はからなる。
【０１３１】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１３４の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１３４のアミノ酸のＶａｌによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｙ１３４Ｖの改変を含む、又はからなる。変異体はまた、更にＧ１０２Ｇの改変を含む。
【０１３２】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１３５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１３５のアミノ酸のＡｓｎによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｈ１３５Ｎの改変を含む、又はからなる。
【０１３３】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１３９の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１３９のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｓ１３９Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１３４】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１４１の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１４１のアミノ酸のＴｙｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｗ１４１Ｙの改変を含む、又はからなる。
【０１３５】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１４７の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１４７のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｔ１４７Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１３６】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１５３の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１５３のアミノ酸のＴｈｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｒ１５３Ｔの改変を含む、又はからなる。
【０１３７】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１５８の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１５８のアミノ酸のＳｅｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ａ１５８Ｓの改変を含む、又はからなる。
【０１３８】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１６１の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１６１のアミノ酸のＴｙｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｆ１６１Ｙの改変を含む、又はからなる。
【０１３９】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１６４の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１６４のアミノ酸のＴｈｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ１６４Ｔの改変を含む、又はからなる。
【０１４０】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１７１の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１７１のアミノ酸のＡｒｇによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ａ１７１Ｒの改変を含む、又はからなる。
【０１４１】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１７６の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１７６のアミノ酸のＶａｌによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｐ１７６Ｖの改変を含む、又はからなる。
【０１４２】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１７８の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１７８のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ１７８Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１４３】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１８３の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１８３のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｄ１８３Ｇの改変を含む、又はからなる。
【０１４４】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１８５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１８５のアミノ酸のＰｒｏによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ１８５Ｐの改変を含む、又はからなる。
【０１４５】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１８６の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１８６のアミノ酸のＴｙｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｔ１８６Ｙの改変を含む、又はからなる。
【０１４６】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１９３の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１９３のアミノ酸のＡｌａによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｓ１９３Ａの改変を含む、又はからなる。
【０１４７】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１９５の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１９５のアミノ酸のＳｅｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ１９５Ｓの改変を含む、又はからなる。
【０１４８】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１９６の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１９６のアミノ酸のＧｌｙによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｙ１９６Ｇの改変を含む、又はからなる。変異体は更に、Ｋ１９７Ｐの改変を含み得る。
【０１４９】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１９７の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１９７のアミノ酸のＰｒｏによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｋ１９７Ｐの改変を含む、又はからなる。変異体は更に、Ｙ１９６Ｇの改変を含み得る。
【０１５０】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１９８の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置１９８のアミノ酸のＡｓｎ又はＰｈｅによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｈ１９８Ｎ又はＨ１９８Ｆの改変を含む、又はからなる。
【０１５１】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置２０３の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置２０３のアミノ酸のＡｓｎによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｄ２０３Ｎの改変を含む、又はからなる。
【０１５２】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、（番号付けに配列番号３を用いて）位置２０６の改変を含む、又はからなる。一つの実施形態では、改変は位置２０６のアミノ酸のＡｌａ又はＳｅｒによる置換である。例えば、本発明の単離された変異体は、Ｎ２０６Ａ又はＮ２０６Ｓの改変を含む、又はからなる。
【０１５３】
一つの実施形態では、本発明の単離された変異体は、グリコシルヒドラーゼのファミリー２５に属するリゾチーム、好ましくは真菌性ファミリー２５リゾチームのアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明の単離された変異体は、配列番号２の成熟ペプチドに対応するポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
別の実施形態では、変異体は、配列番号３と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明の単離された変異体は、少なくとも中ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の配列によりコードされた成熟ポリペプチド、（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明の単離された変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを含む。
【０１５８】
一つの実施形態では、単離された変異体は、更に、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１０５にアスパラギン酸、及び位置１０７にグルタミン酸を含む。別の実施形態では、単離された変異体は、更に、（番号付けに配列番号３を用いて）位置１６にアスパラギン酸、位置１９１にグルタミン、位置１４５にチロシン、位置６９にチロシン、位置２０１にアスパラギン酸、位置２００にグリシン、位置４４にグリシン、位置６７にグリシン、位置１４にグリシン、及び／又は位置７０にヒスチジンを含む。
【０１５９】
一つの実施形態では、本発明は、親リゾチームと比較して改変された特性を有するリゾチーム変異体を提供する。一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、親リゾチームと比較して、アルカリｐＨ条件下（例えば、ｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において改良されたｐＨ安定性及び／又は活性を有する。従って、本発明は、親リゾチームの変異体であって、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び／又は２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置の改変を含み、又はからなり、親リゾチームと比較してアルカリｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、変異体を提供する。以下のリゾチーム変異体は、親酵素と比較して、アルカリｐＨ条件下（例えば、ｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において改良されたｐＨ安定性及び／又は活性を有するために構築される（番号付けに配列番号３を用いて）：
Ｇ１０２Ｐ；              Ｙ１３４Ｖ；
Ｇ１０２Ｐ；              Ｔ１０８Ｗ；
Ｔ１９６Ｇ；              Ｋ１９７Ｇ；
Ｙ１９６Ｇ；              Ｋ１９７Ｐ；
Ｙ５６Ｗ；                Ｎ１９Ｄ；
Ｈ１２０Ｑ；              Ｈ１９８Ｎ；
Ｈ１９８Ｆ；              Ｈ２０Ｗ；
Ｈ２０Ｙ；及び／又は      Ｈ１３５Ｎ。
【０１６０】
改変の以下の組み合わせは、親酵素と比較して、アルカリｐＨ条件下（例えば、ｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において改良されたｐＨ安定性及び／又は活性を有するために構築される（番号付けに配列番号３を用いて）：Ｇ１０２Ｐ及びＹ１３４Ｖ並びに／又はＹ１９６Ｇ及びＫ１９７Ｐ。
【０１６１】
一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、親リゾチームと比較して、アルカリｐＨ条件下（例えば、ｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において改良された活性を有する。親酵素と比較して、アルカリｐＨ条件下（例えば、ｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、より一層好ましくは９〜９．５）において改良された活性を有するために構築されたリゾチーム変異体の例としては、（番号付けに配列番号３を用いて）Ｄ２０３Ｎが挙げられる。
【０１６２】
一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、親リゾチームと比較して、酸性ｐＨ条件下（例えば、ｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において改良されたｐＨ安定性を有する。従って、本発明は、親リゾチームの変異体であって、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、及び／又は２０６からなる群から選択される１又は２以上の位置の改変を含み、又はからなり、親リゾチームと比較して酸性ｐＨにおいて向上した活性を有する、変異体を提供する。以下のリゾチーム変異体は、親酵素と比較して、酸性ｐＨ条件下（例えば、ｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において改良されたｐＨ安定性を有するために構築される（番号付けに配列番号３を用いて）：
Ｆ１６１Ｙ；              Ｈ１２８Ｒ；
Ｖ１３１Ｃ；              Ｄ９５Ｇ；
Ｄ２０３Ｎ；              Ｒ９８Ｇ；
Ｇ１１２Ｓ；              Ｈ５５Ｎ；
Ｄ３２Ｓ；                Ｎ８９Ｔ；
Ｎ２０６Ａ；及び／又は    Ｎ２０６Ｓ。
【０１６３】
一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、酸性ｐＨ条件下（例えば、ｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）、及び胃のプロテアーゼの存在下で、親リゾチームと比較して、改良されたｐＨ安定性を有する。本明細書において、胃のプロテアーゼは、生物により消化の際に胃腸管に分泌されるプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、及びペプシン；又は外部から添加されるプロテアーゼ、例えば飼料に添加されるプロテアーゼ、例えばＰｒｏＡｃｔ（著作権）（Novozymes A/S）の名称の下で市販されているプロテアーゼ、又はそれらの任意の混合物を意味することが意図される。従って、本発明は、親（patent）リゾチームの変異体であって、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号５６、１３１及び／又は１６１からなる群から選択される１又は２以上の位置の改変を含み、又はからなり、親リゾチームと比較して、１又は２以上の胃のプロテアーゼの存在下の酸性ｐＨ条件下において、向上した安定性を有する、変異体を提供する。親酵素と比較して、１又は２以上の胃のプロテアーゼ（例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、及びそれらの任意の混合物）の存在下の、酸性ｐＨ（例えば２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、より一層好ましくは３．５〜４）において、改良された安定性を有するために構築されたリゾチーム変異体は、以下の置換を含む変異体を含む（番号付けに配列番号３を用いて）：
Ｙ５６Ｗ；                Ｖ１３１Ｃ及び／又は
Ｆ１６１Ｃ。
【０１６４】
一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、親リゾチームと比較して、低温（例えば０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜１８℃、好ましくは５℃〜１５℃、より好ましくは８℃〜１２℃、より一層好ましくは１０℃〜１５℃）、又は中程度の温度（例えば１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃、好ましくは２２℃〜３５℃、最も好ましくは２５℃〜３０℃）において、改良された活性を有する。従って、本発明は、親リゾチームの変異体であって、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５及び／又は１９３からなる群から選択される１又は２以上の位置の改変を含み、又はからなり、親リゾチームと比較して、低温において改良された活性を有する、変異体を提供する。以下の変異体は、親リゾチームと比較して、低温（例えば０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜１８℃、好ましくは５℃〜１５℃、より好ましくは８℃〜１２℃、より一層好ましくは１０℃〜１５℃）、又は中程度の温度（例えば１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃、好ましくは２２℃〜３５℃、最も好ましくは２５℃〜３０℃）において、改良された活性を有するために構築される（番号付けに配列番号３を用いて）：
Ｙ４７Ｆ；                Ｙ１１１Ｆ；
Ｙ１０８Ｆ；              Ｔ４５Ｇ；
Ｋ２２Ｇ；                Ｐ１１０Ｇ；
Ｈ１２０Ａ；              Ｔ１４７Ｇ；
Ｙ１９６Ｇ；              Ｄ４９Ａ；
Ｈ５５Ａ；及び／又は      Ｓ１９３Ａ。
【０１６５】
一つの実施形態では、リゾチーム変異体は、親リゾチームと比較して、改良された熱安定性（例えば、温度４５℃〜１１０℃、好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜９０℃、より一層好ましくは７０℃〜８０℃）を有する。従って、本発明は、親リゾチームの変異体であって、位置番号１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、及び／又は１９７からなる群から選択される１又は２以上の位置の改変を含み、又はからなり、親リゾチームと比較して改良された熱安定性を有する、変異体を提供する。以下の変異体は、親リゾチームと比較して、改良された熱安定性（例えば、温度４５℃〜１１０℃、好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜９０℃、より一層好ましくは７０℃〜８０℃）を有するために構築される（番号付けに配列番号３を用いて）：
Ｓ１２１Ａ；        Ｈ１２０Ｐ；
Ｔ１８６Ｔ；        Ａ１１３Ｐ；
Ｋ１８５Ｐ；        Ｐ１７６Ｖ；
Ｑ１２２Ａ；        Ｓ１１９Ｎ；
Ｑ３５Ｒ；          Ｌ６５Ｉ；
Ｓ１３９Ｇ；        Ｗ１４１Ｙ；
Ｒ１５３Ｔ；        Ａ１５８Ｓ；
Ａ１７１Ｒ；        Ｋ１９５Ｓ；
Ｋ７６Ｓ；          Ｋ１６４Ｔ；
Ｋ３０Ｙ；          Ｆ８５Ｙ；
Ｋ１７８Ｃ；        Ｄ１８３Ｇ；
Ｙ１８６Ｙ；        Ｇ１１２Ｓ；及び／又は
Ｋ１９７Ｐ。
【０１６６】
親リゾチームと比較して改良された熱安定性を有する好ましい変異体は、以下の置換を含む変異体を含む（番号付けに配列番号を用いて）：
Ｎ１９Ｄ；                Ｈ２０Ｙ；
Ｋ２２Ｇ；                Ｔ４５Ｇ；
Ｙ４７Ｆ；                Ｄ４９Ｇ；
Ｈ５５Ａ；                Ｒ９８Ｇ；
Ａ１５８Ｓ及び／又は      Ｋ１６４Ｔ。
【０１６７】
１又は２以上の上記で指定された位置の改変を含む変異体は、親リゾチームと比較して、洗剤中、好ましくは液体洗剤中で、向上した安定性を有する。
【０１６８】
本発明のリゾチーム変異体は、抗微生物活性及び／又はリゾチーム活性を有する。ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間、及びキトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合の加水分解を触媒することのできないリゾチーム変異体は、斯かる不活性なリゾチーム変異体が微生物の表面に結合し得、潜在的にその増殖を阻害するので、抗微生物効果を未だ有する場合がある。斯かるリゾチーム変異体は、「静菌剤」とも称されてもよい。
【０１６９】
上述の実施形態は、必要であれば、組み合わせられ、特に、指定された位置、及び特定の置換は、変異体の配列同一性と組み合わせられてもよいことは理解される。
【０１７０】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の親リゾチームの変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。特に、上記の変異体の欄に記載されるように、リゾチーム変異体をコードするポリヌクレオチドは、本発明により包含される。本発明のポリヌクレオチドは、変異体中に実際のアミノ酸改変に対応する適切な配列改変を含む、配列番号１の位置１〜７０５、又は配列番号１の位置５１〜７０５、又は配列番号１の位置７５〜７０５に対応する完全長変異体配列含む変性した二重鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００塩基対の長さを有するそれらの変異体配列を含む任意のプローブと、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件、しかし好ましくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。本発明の変異体ポリヌクレオチドはまた、上記の変異体の欄に記載されるように、アミノ酸改変を生じる変異に加えて、サイレント変異を含み得る。サイレント変異は、アミノ酸に変化を生じさせない三文字コード、例えばＧＴＴからＧＡＴ（それは双方共にバリンをコードする）における変異である。
【０１７１】
本発明のリゾチーム変異体をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡ及びＲＮＡを単離する方法は、本技術分野においてよく知られている。対象の遺伝子をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、本技術分野において知られている方法の手段により、Gene Banks又はＤＮＡライブラリーにクローン化され得る。本発明の抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、従って、例えば、ハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより同定及び単離される。
【０１７２】
発現ベクター
本発明はまた、発現ベクター、特に本発明の核酸コンストラクトを含む組み換え発現ベクターに関する。本発明の核酸コンストラクトは、好ましくは、制御配列に適合する条件下で、好適な宿主細胞中で、コーディング配列の発現を指示する１又は２以上の制御配列と操作可能に連結された、本発明の変異体リゾチームをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。発現ベクターの作製では、コーディング配列が発現のための適切な制御配列と操作可能に連結されるように、コーディング配列は、ベクター中に位置する。制御配列は、ベクターにより、又はベクターに挿入された核酸コンストラクトにより提供されてもよい。
【０１７３】
制御配列とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列である、適切なプロモーター配列でもよい。プロモーターは、変異体の、不完全な、及びハイブリッドのプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列でもよく、宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。斯かるプロモーターは、本技術分野においてよく知られている。制御配列はまた、転写を終結するために宿主細胞により認識される配列である、好適な転写ターミネーター配列でもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に操作可能に連結される。最適な宿主細胞において機能する任意のターミネーターは、本発明に用いられてもよく；斯かるターミネーターは、本技術分野においてよく知られている。制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、好適なリーダー配列でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に連結される。最適な宿主細胞において機能する任意のリーダー配列はまた、本発明に用いられてもよく；斯かるリーダー配列は、本技術分野においてよく知られている。制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結するアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナルペプチドコーディング領域でもよい。ヌクレオチド配列のコーディング配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントを含む翻訳リーディングフレームに天然に連結したシグナルペプチドコーディング領域を本質的に含んでもよい。或いは、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列とは異なるシグナルペプチドコーディング領域を含んでもよい。異なるシグナルペプチドコーディング領域は、コーディング配列がシグナルペプチドコーディング領域を天然に含まない場合、要求されてもよい。或いは、異なるシグナルペプチドコーディング領域は、ポリペプチドの分泌を増大させるために、単純に、天然のシグナルペプチドコーディング領域と交換してもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に向かわせる任意のシグナルペプチドコーディング領域は、本発明に用いられてもよい。制御配列はまた、ヌクレオチド配列の３’末端に操作可能に連結される配列であるポリアデニル化配列でもよく、それは転写される場合、宿主細胞により転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。最適な宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明に用いられてもよい。宿主細胞の増殖に関連して、ポリペプチドの発現の制御を可能にする制御配列を付加することはまた、望ましい。制御システムの例としては、制御化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現のオン又はオフを引き起こすものが挙げられる。
【０１７４】
本発明の変異体リゾチームをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するための様々な方法で操作されてもよい。ベクターに挿入する前のポリヌクレオチド配列の操作は、発現ベクターに応じて、望ましい、又は必要であってもよい。組み換えＤＮＡ手法を用いるポリヌクレオチド配列を修飾するための技術は、本技術分野において知られている。さらに、ポリペプチドの精製又は固定化を助け得るタグは、ポリペプチドに付加されてもよい。斯かるタグは、例えばポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）でもよい。好ましくは、タグは、ポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端に位置し、ベクターによりコードされてもよい。或いは、タグは、ポリペプチドの機能性に影響与えない限りは、ポリペプチドの内部に位置してもよい。
【０１７５】
組み換え発現ベクターは、都合よく組み換えＤＮＡ手順に供され得、ヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る任意のベクター（例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。
【０１７６】
ベクターは、線形、又は閉環状プラスミドでもよい。ベクターは、自立複製ベクター（autonomously replicating vector）、即ち染色体外物質（extracheomosomal entity）として存在し、その複製が、染色体の複製と独立しているベクターであってもよい。その例としては、プラスミド、細胞外染色体エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体が挙げられる。
【０１７７】
ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含んでもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、ゲノムに統合され、それが統合された（１又は２以上の）染色体と一緒に複製されるものでもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む、一つのベクター若しくはプラスミド、又は２若しくはそれ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンは用いられてもよい。
【０１７８】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする、１又は２以上の選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、遺伝子産物が殺生物剤、又はウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。細菌の選択可能マーカーの例としては、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）若しくはバシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）からのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン耐性を与えるマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞についての好適マーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３が挙げられる。糸状菌宿主細胞に使用のための好適マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、及びそれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス属（Aspergillus）細胞における使用に好まれるものとしては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子が挙げられる。
【０１７９】
本発明のベクターは、ベクターの宿主細胞のゲノムへの安定的な統合、又はゲノムから独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にする（１又は２以上の）エレメントを含んでもよい。
【０１８０】
本発明のヌクレオチド配列の２以上のコピーは、遺伝子産物の生産を増加するために、宿主細胞に挿入されてもよい。ヌクレオチド配列のコピー数の増加は、少なくとも一つの配列の更なるコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、又は選択可能マーカーの遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞、及びそれによりヌクレオチド配列の更なるコピーが、適切な選択可能な薬剤の存在下で細胞を培養することにより選択され得る場合、ヌクレオチド配列とともに増幅可能な選択可能マーカーの遺伝子を含むことにより、得られ得る。
【０１８１】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するための、上述のエレメントをライゲートするために用いられる手順は、当業者に知られている（例えば、Sambrook et al.(1989)上記を参照のこと）。
【０１８２】
本発明の一つの実施形態では、プラスミドベクターは、以下のエレメントを含んでもよい。
ｉ）シグナルペプチドコーディング領域（例えば、バシラス属（Bacillus）ＮＣＩＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）α−アミラーゼ、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）サブチリシン、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）ｐｒｓＡの遺伝子から得られる）に続く、成熟リゾチーム変異体をコードするポリヌクレオチド配列。この配列は、以下の配列により先行されても、操作可能に連結されてもよい。
ｉｉ）ｍＲＮＡ安定化セグメントを含むＤＮＡ配列（例えばＣｒｙＩＩＩａ遺伝子由来、国際公開第９９／０４３８３５号に示される）；
ｉｉｉ）マーカー遺伝子（例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子）；及び
ｉｖ）フランキングセグメントとバシラス属（Bacillus）ゲノムの間の相同組み換えによるゲノム統合を可能にするための、それぞれポリヌクレオチドの上流及び下流の５’及び３’フランキングセグメントとしての、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来のゲノムＤＮＡ。
【０１８３】
上述のベクターはまた、上述の変異誘発手順を用いる変異体の生成及びスクリーニングに有用であり得る。
【０１８４】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体リゾチームをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関し、それはポリペプチドの組み換え生産に有利に用いられる。本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターは、ベクターが、上述のように、染色体統合、又は自己複製する染色体外ベクターを維持するように、宿主細胞に導入される。
【０１８５】
宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、古細菌、又は真核細胞、例えば真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞でもよい。
【０１８６】
有用な原核細胞としては、細菌細胞、例えば、これらに限定されるものではないが、バシラス属（Bacillus）細胞、例えばバシラス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウジ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バシラス・ロータス（Bacillus lautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）；又はストレプトマイセス属（Streptomyces）細胞、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、若しくはストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus）を含むグラム陽性細菌；又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌（E. coli）及びシュードモナス属種（Pseudomonas sp.）が挙げられる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、又はバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）細胞である。別の好ましい実施形態では、バシラス属（Bacillus）細胞は、好アルカリ性バシラス属（Bacillus）である。
【０１８７】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen (1979)Molecular General Genetics 168:111-115を参照のこと）により、コンピテント細胞（例えば、Young and Spizizin (1961)Journal of Bacteriology 81:823-829；若しくはDubnau and Davidoff-Abelson (1971)Journal of Molecular Biology 56:209-221を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Shigekawa and Dower (1988)Biotechniques 6:742-751を参照のこと）、又はコンジュゲーション（例えば、Koehler and Thorne (1987)Journal of Bacteriology 169:5771-5278を参照のこと）を用いて、達成される。
【０１８８】
好ましい実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書で用いられる「真菌」（fungi）とは、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ菌門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al. (1995)Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi (8th edition), CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及び卵菌門（Oomycota）（Hawksworth et al. (1995)Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi (8th edition), CAB International, University Press, Cambridge, UK, page 171により引用される）、並びに全ての栄養胞子形成菌（Hawksworth et al. (1995)Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi (8th edition), CAB International, University Press, Cambridge, UK）を含む。より好ましい実施形態では、真菌性宿主細胞は、酵母細胞である。本明細書で用いられる「酵母」（yeast）とは、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Endomycetales））、担子胞子酵母、及び不完全真菌に属する酵母（不完全酵母菌類（Blastomycetes））を含む。酵母の分類は、本発明の目的において、将来変更されてもよいので、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport (eds)(1980)Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9）の記載に従って定義されるべきである。
【０１８９】
より一層好ましい実施形態では、酵母宿主細胞は、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア属（Yarrowia）細胞である。最も好ましい実施形態では、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。別の最も好ましい実施形態では、酵母宿主細胞は、クルイウェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）細胞である。別の最も好ましい実施形態では、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【０１９０】
別のより好ましい実施形態では、真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。糸状菌としては、真菌類（Eumycota）の亜門及び卵菌門（Oomycota）（Hawksworth et al. (1995)Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi (8th edition), CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）の全ての糸状形態が挙げられる。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖からなる菌糸壁により特性決定される。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性でもよい。さらにより好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フザリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、ムコール属（Mucor）、マイセリオフトーラ属（Myceliophthora）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペニシリウム属（Penicillium）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、又はトリコデルマ属（Trichoderma）の細胞が挙げられる。最も好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である。別の最も好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブキヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・ザルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）細胞である。さらに最も好ましい実施形態では、糸状菌親細胞は、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）（Nirenberg sp. nov.）細胞である。別の最も好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・パルロゼラム（Penicillium purpurogenum）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【０１９１】
真菌細胞は、本質的に知られている方法において、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換されてもよい。アスペルギルス属（Aspergillus）宿主細胞の形質転換の好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、及びYelton et al. (1984)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474に記載される。フザリウム属（Fusarium）種を形質転換するための好適な方法は、Malardier et al. (1989)Gene 78:147-156及び国際公開第９６／００７８７号により記載される。酵母は、Becker and Guarente, Abelson and Simon (editors)  Guide toYeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194:182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al. (1983) Journal of Bacteriology 153:163；及びHinnen et al. (1978) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920により記載される手順を用いて形質転換されてもよい。
【０１９２】
本発明の特定の実施形態は、本発明の変異体リゾチームをコードするポリヌクレオチドで形質転換された組み換え宿主細胞である。好ましくは、斯かる宿主細胞は、内在するリゾチームをコードする遺伝子を含まない、又は斯かる遺伝子は、妨害しない。それ故、組み換え変異体リゾチームは、本発明の組み換え宿主細胞により生産されるリゾチームのみである。
【０１９３】
生産の方法
本発明はまた、（ａ）変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；及び（ｂ）培養培地から変異体を回収することを含む、リゾチーム変異体を生産する方法に関する。
【０１９４】
本発明の生産方法では、宿主細胞は、本技術分野において知られている方法を用いてリゾチーム変異体の生産に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、実験室において、振盪フラスコ発酵、又は小スケール若しくは大スケールの発酵（連続的な、バッチ、フェド−バッチ、又は固体状態発酵を含む）、又は好適な培地並びにポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で行なわれる工業用ファーメンターにより培養されてもよい。培養は、本技術分野において知られている手順を用いて、炭素及び窒素源、並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行なわれる。好適な培地は、供給者により市販されており、公開されている組成物（例えばthe American Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製されてもよい。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは、直接的に培地から回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
【０１９５】
本発明の一つの実施形態は、親リゾチームの変異体の生産の方法であって、ここで前記変異体は、抗微生物及び／又はリゾチーム活性を有し、前記方法は、ａ）変異体の発現に好適な条件下で細胞を培養すること、ここで前記細胞は、親リゾチームの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記変異体が位置４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５，及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の（数個の）アミノ酸位置において改変され、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１の親ポリヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する親ポリヌクレオチド配列の変異誘発により調製される；及びｂ）培養培地からリゾチーム変異体を回収すること、を含む。代替の側面では、リゾチーム変異体は回収されないず、むしろ変異体を発現する本発明の宿主細胞は、変異体の供給源として用いられる。
【０１９６】
リゾチーム変異体は、発現されたポリペプチドに特異的である本技術分野において知られている方法を用いて検出されてもよい。これらの検出方法は、特異的な抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失を含んでもよい。例えば、酵素アッセイは、本明細書の実施例の記載に従って、変異体リゾチームの活性を決定するために用いられてもよい。
【０１９７】
得られるリゾチーム変異体は、本技術分野において知られている方法により回収されてもよい。例えば、ポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、回収、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿を含む従来の手順により、栄養培地から回収されてもよい。
【０１９８】
本発明のリゾチーム変異体は、実質的に純粋なリゾチーム変異体を得るために、これらに限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマト分画法、及びサイズ排除）、電気泳動手法（例えば調製用等電点分画法）、異なる溶解性（例えば硫酸アンモニウム沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えばJ.-C. Janson and Lars Ryden (editors)(1989)Protein Purification VCH Publishers, New Yorkを参照のこと）を含む本技術分野において知られている様々な手順により精製されてもよい。
【０１９９】
組成物
本発明はまた、本発明の抗微生物及び／若しくはリゾチーム活性を有する変異体リゾチーム又はポリペプチド、並びに担体及び／若しくは賦形剤を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は斯かる変異体又はポリペプチドに富む（enriched）。用語「富む」（enriched）とは、組成物の抗微生物及び／又はリゾチーム活性が、例えば１．１以上の濃縮係数を有して増加していることを指す。好ましくは、組成物は、所望の特性、例えば、薄い色、少ない臭い、及び許容される保存安定性を提供するために、製剤化される。
【０２００】
組成物は、主な酵素成分（例えば単一成分組成物）として、本発明の変異体又はポリペプチドを含んでもよい。或いは、組成物は、複数の酵素活性、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼを含んでもよい。
【０２０１】
ポリペプチド組成物は、本技術分野において知られている方法に従って調製されてもよく、液体、ペースト、ゲル、又は乾燥製剤の形態でもよい。例えば、ポリペプチドは、顆粒、又はマイクロ顆粒の形態で製剤化されてもよい。組成物に含まれる変異体又はポリペプチドは、本技術分野において知られている方法に従って、安定化されてもよい。好ましい実施形態では、変異体リゾチームは、液体組成物において製剤化される。
【０２０２】
本発明の好ましい実施形態は、本発明のリゾチーム変異体を含む飼料組成物である。特に、酸性ｐＨにおいて改良された安定性、及び／又は増加したプロテアーゼ安定性を有する変異体は、好ましい。
【０２０３】
洗剤組成物
本発明はまた、本発明のリゾチーム変異体を含む洗剤組成物を含む。特に、アルカリｐＨにおいて改良された安定性及び／又は活性を有する変異体、及び／又は低温若しくは中程度の温度において改良された活性を有する変異体は、好ましい。洗剤組成物は、特定の用途、例えば洗濯、特に、家庭用洗濯、食器洗浄、又は硬表面清浄に適合されてもよい。
【０２０４】
洗剤組成物は、典型的に従来の洗剤成分、例えば界面活性剤、助剤、漂白剤、酵素、及び他の成分を含む。
【０２０５】
好ましい実施形態では、洗剤組成物は、リゾチーム及びプロテアーゼを含む。
【０２０６】
洗剤組成物は、任意の形態、例えば固体、液体、ペースト、ゲル、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。組成物は、錠剤、バー、又はパウチ（複数に区画されたパウチを含む）の形態でもよい。組成物は、粉末、例えば自由に流れる（free-flowing）粉末、例えば凝集物、噴霧乾燥粉末、カプセル化物、押出物、針状、麺状、フレーク、又はそれらの任意の組み合わせの形態でであり得る。
【０２０７】
酵素
一つの側面では、本発明は、本発明のリゾチーム変異体を含む洗剤添加物を提供する。洗剤添加物及び洗剤組成物は、１又は２以上の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼを含んでもよい。
【０２０８】
一般的に、選択される（１又は２以上の）酵素の特性は、選択される洗剤（即ち、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合させるべきであり、（１又は２以上の）酵素は有効量で存在するべきである。
【０２０９】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物、植物、又は微生物起源のものが挙げられる。微生物起源は、好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質工学的に操作された変異体は含まれる。プロテアーゼは、例えばメタロプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．１７又はＥＣ  ３．４．２４）、又はセリンプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ、又はトリプシン様プロテアーゼでもよい。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）、特にバシラス属（Bacillus）由来のもの、例えばサブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号に記載される）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えばブタ、又はウシ起源）、及び国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号に記載されるフザリウム属（Fusarium）プロテアーゼが挙げられる。
【０２１０】
有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載される変異体、特に、１又は２以上の以下の位置：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５、及び２７４に置換を含む変異体が挙げられる。
【０２１１】
好ましい市販されているプロテアーゼ酵素としては、Alcalase（登録商標）、Savinase（登録商標）、Primase（登録商標）、Duralase（登録商標）、Esperase（登録商標）、及びKannase（登録商標）（Novozymes A/S）、Maxatase（登録商標）、Maxacal（登録商標）、Maxapem（登録商標）、Properase（登録商標）、Purafect（登録商標）、Purafect OxP（登録商標）、FN2（商標）、及びFN3（商標）（Genencor International Inc.）が挙げられる。
【０２１２】
プロテアーゼ酵素は、本発明に従って、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物に組み込まれる。
【０２１３】
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。斯かるリパーゼの化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、これに関連して含まれる。リパーゼは、例えば、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ  ３．１．１．４）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．５）、モノグリセリドリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．２３）、ガラクトリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．２６）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ  ３．１．１．３２）、リポタンパク質リパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．３４）でもよい。有用なリパーゼの例としては、フミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、例えば欧州特許第２５８０６８号明細書及び欧州特許第３０５２１６号明細書に記載される；リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、例えば欧州特許第２３８０２３号明細書に記載される、又は国際公開第９６／１３５８０号に記載されるＨ．インソレンス（H. insolens）由来のもの；カンジダ属（Candida）リパーゼ、例えば欧州特許第２１４７６１号明細書に記載されるＣ．アンタルクティカ（C. antarctica）リパーゼＡ又はＢ；シュードモナス属（Pseudomonas）リパーゼ、例えば欧州特許第７２１９８１号明細書（例えば寄託登録番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７７２を有するシュードモナス属種（Pseudomonas sp.）ＳＤ７０５株から得られるリパーゼ）、ＰＣＴ／ＪＰ９６／００４２６、ＰＣＴ／ＪＰ９６／００４５４（例えばＰ．ソラナセアラム（P. solanacearum）リパーゼ）、欧州特許第５７１９８２号明細書、又は国際公開第９５／１４７８３号（例えばＰ．メンドシナ（P. mendocina）リパーゼ）に記載されるもの、例えば欧州特許第２１８２７２号明細書に記載されるＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）若しくはＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）リパーゼ、例えば欧州特許第３３１３７６号明細書に記載されるＰ．セパシア（P. cepacia）リパーゼ、例えば英国特許第１，３７２，０３４号明細書に記載されるＰ．スタッツェリ（P. stutzeri）リパーゼ、又はＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）リパーゼ；バシラス属（Bacillus）リパーゼ、例えばＢ．サブチリス（B. subtilis）リパーゼ（Dartois et al. (1993)Biochemica et Biophysica Acta 1131:253-260）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）リパーゼ（ＪＰ  ６４／７４４９９２）、及びＢ．プミルス（B. pumilus）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）が挙げられる。
【０２１４】
他の例としては、例えば国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、欧州特許第４０７２２５号明細書、欧州特許第２６０１０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号、及び国際公開第９７／０７２０２号に記載されるリパーゼ変異体が挙げられる。好ましいリパーゼ変異体は、国際公開第００／６００６３号に記載のフミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）ＤＳＭ  ４１０９由来のものである。改良された一番の洗浄性能を有する国際公開第００／６００６３号の実施例に開示される変異体、即ち、
Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；Ｇ９１Ａ＋Ｄ９６Ｗ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｇ２６３Ｑ＋Ｌ２６４Ａ＋Ｉ２６５Ｔ＋Ｇ２６６Ｄ＋Ｔ２６７Ａ＋Ｌ２６９Ｎ＋Ｒ２０９Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；Ｎ３３Ｑ＋Ｄ９６Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ；Ｅ９９Ｎ＋Ｎ１０１Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ；Ｅ９９Ｎ＋Ｎ１０１Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ
は特に好ましい。
【０２１５】
好適な市販されているリパーゼとしては、Lipex（登録商標）、Lipolase（登録商標）及びLipolase Ultra（登録商標）、Lipolex（登録商標）、Lipoclean（登録商標）（Novozymes A/Sから入手可能）、M1  Lipase（商標）、及びLipomax（商標）（Genencor Inc. から入手可能）、及びLipase P "Amano"（Amano Pharmaceutical Co. Ltd.から入手可能）が挙げられる。市販されているクチナーゼとしては、Genencor Inc.製のLumafast（商標）が挙げられる。
【０２１６】
リパーゼは、通常、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物に組み込まれる。
【０２１７】
クチナーゼ：クチナーゼ（ＥＣ  ３．１．１．７４）の潜在的に有用な種類としては、例えば、国際公開第８８／０９３６７号に記載されるシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ、又はフザリウム・ソラニ  ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（例えば国際公開第９０／０９４４６号に記載される）が挙げられる。クチナーゼの脂肪分解活性のために、それらは、リパーゼとして同様の株に対して有効でもよい。市販されているクチナーゼとしては、Genencor Inc.製のLumafast（商標）が挙げられる。
【０２１８】
クチナーゼは、通常、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物に組み込まれる。
【０２１９】
カルボヒドラーゼ：カルボヒドラーゼは、グリコシドヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）及び多糖リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．−）を含む。グリコシドヒドラーゼは、二つ又はそれ以上の糖質間、又は糖質と非糖質部分間のグリコシド結合の加水分解を触媒する。多糖リアーゼは、新しく形成される還元末端の二重結合をもたらすβ脱離機構により多糖鎖の切断を触媒する。カルボヒドラーゼとしては、例えば、下記に詳細に記載されるアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、及びセルラーゼが挙げられる。他のカルボヒドラーゼは、キサンタナーゼ、又はプルラナーゼでもよい。
【０２２０】
好適なキサンタナーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、含まれる。キサンタナーゼの供給源は、例えば、Cadmus et al. (1988) J of Industrial Microbiology and Biotechnology 4:127-133；欧州特許第００３０３９３号明細書；及びHashimoto et al. (1998) Appl Environ Microbiol. 64:3765-3768に記載される。
【０２２１】
好適なプルラナーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、含まれる。プルラナーゼの供給源としては、例えば、Dextrozyme（登録商標）及びPromozyme（登録商標）D2（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２２２】
アミラーゼ：アミラーゼとしては、例えば細菌又は真菌起源のα−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２）、及び／又はグルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）を含む。斯かるアミラーゼの化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、この関連において、含まれる。α−アミラーゼは、本発明に関連して好ましい。関連するα−アミラーゼとしては、例えば、バシラス属（Bacillus）種、特にＢ．リケニホルミス（B. licheniformis）の特定の株から得ることのできるα−アミラーゼが挙げられ、英国特許第１２９６８３９号明細書により詳細に記載される。
【０２２３】
有用なアミラーゼの例としては、国際公開第９４／０２５９７号、国際公開第９４／１８３１４号、国際公開第９６／２３８７３号、及び国際公開第９７／４３４２４号に記載される変異体、特に以下の１又は２以上の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４に置換を有する変異体が挙げられる。
【０２２４】
有用なアミラーゼの更なる例としては、バシラス属種（Bacillus sp.）株、ＮＣＩＢ  １２２８９、ＮＣＩＢ  １２５１２、ＮＣＩＢ  １２５１３及びＤＳＭ  ９３７５由来のα−アミラーゼ；国際公開第９５／２６３９７号（参照により本明細書に援用される）の配列番号１及び２に示されるα−アミラーゼ；国際公開第００／６００６０号（参照により本明細書に援用される）の配列番号２に開示されるバシラス属種（Bacillus sp.）ＤＳＭ  １２６４９株由来のＡＡ５６０α−アミラーゼ；並びに実施例７及び８（参照により本明細書に援用される）に開示されるＡＡ５６０変異体を含むＡＡ５６０α−アミラーゼの変異体が挙げられる。
【０２２５】
関連する市販されているアミラーゼとしては、Natalase（登録商標）、Stainzyme（登録商標）、Duramyl（登録商標）、Termamyl（登録商標）、Termamyl（商標）Ultra、Fungamyl（登録商標）及びBAN（登録商標）（全てNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkから入手可能）、並びにRapidase（登録商標）及びMaxamyl（登録商標）P（DSM, Hollandから入手可能）並びにPurastar（登録商標）、Purastar OxAm and Powerase（商標）（Danisco A/Sから入手可能）が挙げられる。
【０２２６】
他の有用なアミラーゼとしては、ＣＧＴａｓｅｓ（シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．４．１．１９）、例えば、バシラス属（Bacillus）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobactor）、又はサーモアナエロバクテリウム属（Thermoanaerobacterium）の種から得られるものが挙げられる。
【０２２７】
アミラーゼは、通常、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物に組み込まれる。
【０２２８】
ヘミセルラーゼ：好適なヘミセルラーゼとしては、キシラン分解活性、アラビノース分解（arabinolytic）活性、ガラクトース分解（galactolytic）活性、及び／又はマンノース分解（mannolytic）活性を有する酵素が挙げられる。本発明のヘミセルラーゼは、例えば、キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８、ＥＣ  ３．２．１．３２、及びＥＣ  ３．２．１．１３６）、キシログルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４、及びＥＣ  ３．２．１．１５１）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）、アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ  ＥＣ  ３．１．１．７２）、グルクノニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１、ＥＣ  ３．２．１．５６、３．２．１．１２８、及び３．２．１．１３９）、グルカノヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１、ＥＣ  ３．２．１．８３、及びＥＣ  ３．２．１．７３）、フェルラ酸エステラーゼ（ＥＣ  ３．１．１．７３）、クマル酸エステラーゼ（ＥＣ  ３．１．１．７３）、マンナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２５；ＥＣ  ３．２．１．７８、及びＥＣ  ３．２．１．１０１）、アラビノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８８）、アラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）、ガラクタナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８９、ＥＣ  ３．２．１．２３、及び３．２．１．１６４）、及びリケナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７３）から選択されてもよい。しかしながら、これは、列挙し尽くした一覧であることを意図しない。
【０２２９】
マンナナーゼは、本発明に関連して好ましいヘミセルラーゼである。好適なマンナナーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、含まれる。好ましい実施形態では、マンナナーゼは、バシラス属（Bacillus）株、特に国際公開第９９／６４６１９号（参照により本明細書に援用される）の配列番号２の位置３１−３３０、若しくは配列番号５に開示されるバシラス属種（Bacillus sp.）Ｉ６３３、又はバシラス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）、例えばＤＳＭ  ８７２１型株由来である。好適な市販されているマンナナーゼとしては、Novozymes A/Sにより製造されるMannaway（登録商標）、又はGenencor a Danisco divisionにより製造されるPurabrite（商標）が挙げられる。
【０２３０】
キシラナーゼは、本発明に関連して好ましいヘミセルラーゼである。好適な市販されているキシラナーゼは、Pulpzyme（登録商標）HC（Novozymes A/Sから入手可能）である。
【０２３１】
ヘミセルラーゼは、通常、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物に組み込まれる。
【０２３２】
ペクチナーゼ：好適なペクチン分解酵素は、国際公開第９９／２７０８３号、国際公開第９９／２７０８４号、国際公開第００／５５３０９号、及び国際公開第０２／０９２７４１号に記載されるものを含む。
【０２３３】
好適なペクチン酸リアーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、含まれる。好ましい実施形態では、ペクチン酸リアーゼは、バシラス属（Bacillus）の株、特にバシラス・サブチリス（Bacillus substilis）の株、特に配列番号２に開示されるバシラス・サブチリス（Bacillus substilis）ＤＳＭ１４２１８の株由来、又は国際公開第０２／０９２７４１号（参照により本明細書に援用される）の実施例６に開示されるそれらの変異体、又は国際公開第０３／０９５６３８号（参照により本明細書に援用される）に開示される変異体である。或いは、ペクチン酸リアーゼは、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）の株由来、特に国際公開第９９／２７０８３号（参照により本明細書に援用される）の配列番号８として開示されるペクチン酸リアーゼ、又は国際公開第０２／０６４４２号に記載されるそれらの変異体である。
【０２３４】
好適な市販されているペクチン酸リアーゼは、Novozymes A/Sにより製造されるPectaway（登録商標）又はPectawash（登録商標）である。
【０２３５】
ペクチン分解酵素は、通常、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで洗剤組成物に組み込まれる。
【０２３６】
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌又は真菌起源の完全なセルラーゼ、又はモノコンポーネント（mono-component）エンドグルカナーゼが挙げられる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体は、含まれる。セルラーゼは、例えば、モノコンポーネント、又はモノコンポーネントのエンド−１，４−β−グルカナーゼ（しばしば、単に「エンドグルカナーゼ」（ＥＣ  ３．２．１．４）と称される）の混合物でもよい。いくつかのキシログルカナーゼはまた、エンドグルカナーゼ活性を有してもよく、本発明において好適なセルラーゼとして意図される。好適なセルラーゼは、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から製造される真菌性セルラーゼを開示する米国特許第４，４３５，３０７号明細書に開示される。特に好適なセルラーゼとしては、織物ケア利益（textile care benefits）を有するセルラーゼが挙げられる。斯かるセルラーゼの例としては、欧州特許出願公開第０４９５２５７号明細書に記載のセルラーゼが挙げられる。
【０２３７】
好適なモノコンポーネントエンドグルカナーゼは、１又は２以上の以下の種、エクシディア・グランドゥロサ（Exidia glandulosa）、クリニペリス・スカベラ（Crinipellis scabella）、ホーメス・ホメンタリウス（Fomes fomentarius）、スポンジペリス属種（Spongipellis sp.）、リゾフリクティス・ローセア（Rhizophlyctis rosea）、リゾムコール・プシルス（Rhizomucor pusillus）、フィコマイセス・ニテンス（Phycomyces nitens）、及びケトスティラム・フレセニ（Chaetostylum fresenii）、ジプロジア・ゴシピナ（Diplodia gossypina）、ミクロスフェロプシス属種（Microsphaeropsis sp.）、ウロスポラ・ビルグラミ（Ulospora bilgramii）、アウレオバシジウム属種（Aureobasidium sp.）、マクロフォミア・ファセオリナ（Macrophomina phaseolina）、アスコボラス・スティクトイデス（Ascobolus stictoides）、サコボラス・ディルテルス（Saccobolus dilutellus）、ペジザ（Peziza）、ペニシリウム・ベルクロサム（Penicillium verruculosum）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）、及びサーモミセス・ベルコサス（Thermomyces verrucosus）、トリコデルマ・リーセイ  アカ（Trichoderma reesei aka）、ハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）、ジアポルテ・シンゲネシア（Diaporthe syngenesia）、コレトトリウム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、キラリア・ヒポキシロン（Xylaria hypoxylon）、ニグロスポラ属種（Nigrospora sp.）、ノデュリオスポリウム属種（Nodulisporum sp.）、及びポロニア・プンクタータ（Poronia punctata）、シリンドロカルポン属種（Cylindrocarpon sp.）、ネクトリア・ピネア（Nectria pinea）、ボルテラ・コレトトリコイデス（Volutella colletotrichoides）、ソルダリア・フィミコーラ（Sordaria fimicola）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、シスパストスポラ・ボニネンシス（Syspastospora boninensis）、クラドリナム・フェクンジシマム（Cladorrhinum foecundissimum）、ケトミウム・ムロルム（Chaetomium murorum）、ケトミウム・ビレッセンス（Chaetomium virescens）、ケトミウム・ブラシリエンシス（Chaetomium brasiliensis）、ケトミウム・クニコロラム（Chaetomium cunicolorum）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、グリオクラジウム・カテヌラタム（Gliocladium catenulatum）、シタリディウム・サーモフィラ（Scytalidium thermophila）、アクレモニウム種（Acremonium sp.）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・アングイオイデス（Fusarium anguioides）、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）、フザリウム・オキシスポラム亜種リコペルシシ（Fusarium oxysporum ssp. lycopersici）、フザリウム・オキシスポラム亜種パッシフローラ（Fusarium oxysporum ssp. passiflora）、フミコラ・ニグレッセンス（Humicola nigrescens）、フミコラ・グリセア（Humicola grisea）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、又はフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から得られてもよい。一つの好ましいエンドグルカナーゼは、配列番号９として国際公開第９６／２９３９７号（参照により本明細書に援用される）に開示されるもの、又は国際公開第９８／１２３０７号の実施例１に開示されるものと少なくとも７０％の同一性を有する酵素及びそれらの変異体である。別の好ましいエンドグルカナーゼは、国際公開第９１／０１７２４３号（配列番号２）に開示されるもの、又は国際公開第９４／００７９９８号に開示されるようなエンドグルカナーゼ変異体である。
【０２３８】
再付着防止効果を有するエンドグルカナーゼは、多数の細菌供給源から糖結合モジュール（ＣＢＭ）を欠損した真菌性エンドグルカナーゼから得られてもよい。いくつかの供給源は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ＤＳＭ  １２６４８として寄託されたバシラス属種（Bacillus sp.）、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０６７として寄託されたバシラス属種（Bacillus sp.）ＫＳＭＳ２３７、パニバチルス・ポリミキサ（Panibacillus polymyxa）、及びパニバチルス・パブリ（Panibacillus pabuli）である。特定の抗−再付着エンドグルカナーゼは、国際公開第９１／１７２４４号（図１４）（参照により本明細書に援用される）、国際公開第０４／０５３０３９号（配列番号２）（参照により本明細書に援用される）、特開２０００−２１００８１（配列番号１の位置１〜８２４）（参照により本明細書に援用される）に開示される。
【０２３９】
再付着防止効果を有するキシログルカナーゼは、多数の細菌供給源から得られてもよい。いくつかの供給源としては、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）（国際公開第９９／０２６６３号）、パニバチルス・ポリミキサ（Panibacillus polymyxa）、及びパニバチルス・パブリ（Panibacillus pabuli）（国際公開第０１／６２９０３号）が挙げられる。キシログルカナーゼの好適な変異体はまた、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６８７５に記載される。市販されているキシログルカナーゼは、Whitezyme（登録商標）（Novozymes A/S）である。
【０２４０】
市販されているセルラーゼとしては、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）から製造されるCelluclast（登録商標）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から製造されるCelluzyme（登録商標）が挙げられる。市販されているエンドグルカナーゼとしては、Carezyme（登録商標）、Renozyme（登録商標）、Endolase（登録商標）、及びCelluclean（登録商標）（Novozymes A/S）、並びにKAC-500(B)（商標）（Kao Corporation）、並びにClazinase（商標）、Puradax（商標）EG L及びPuradax HA（Danisco A/S）が挙げられる。
【０２４１】
セルラーゼは、通常、組成物の重量に対して０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは組成物の重量に対して０．００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは組成物の重量に対して０．０００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは組成物の重量に対して０．００１％〜０．２％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物に組み込まれる。
【０２４２】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に修飾された、又はタンパク質工学的に操作された変異体は、含まれる。有用なオキシダーゼの例としては、ラッカーゼ（ＥＣ  １．１０．３．２）が挙げられる。有用なペルオキシダーゼの例としては、カタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）、及びコプリナス属（Coprinus）由来、例えばＣ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、並びに国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記載されるものが挙げられる。
【０２４３】
市販されているペルオキシダーゼとしては、Guardzyme（商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２４４】
アリールエステラーゼ：好適なアリールエステラーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に修飾された、又はタンパク質工学的に操作された変異体は、含まれる。有用なアリールエステラーゼの例としては、例えば国際公開第０５／０５６７８２号の記載に従って、Ｍ．スメグマチス（M. Smegmatis）から得られる。
【０２４５】
界面活性剤
典型的に、洗剤組成物は、（組成物の重量に対して）０％〜５０％、好ましくは２％〜４０％、より好ましくは５％〜３５％、より好ましくは７％〜３０％、最も好ましくは１０％〜２５％、さらに最も好ましくは１５％〜２０％の範囲で、１又は２以上の界面活性剤を含む。好ましい界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、双性界面活性剤、両性界面活性剤、及びそれらの混合物である。好ましくは、界面活性剤の大部分は、陰イオン性である。好適な陰イオン性界面活性剤は、本技術分野においてよく知られており、脂肪酸カルボキシレート（石鹸）、分岐鎖、直鎖、及びランダム鎖アルキルサルフェート、又は脂肪アルコールサルフェート、又は第一級アルコールサルフェート、又はアルキルベンゼンスルホネート、例えばＬＡＳ及びＬＡＢ、又はフェニルアルケンスルホネート、又はアルケニルスルホネート、又はアルケニルベンゼンスルホネート、又はアルキルエトキシサルフェート、又は脂肪アルコールエーテルサルフェート、又はα−オレフィンスルホネート、又はドデシニル／テトラドデシニルコハク酸を含んでもよい。陰イオン性界面活性剤は、アルコキシル化されてもよい。洗剤組成物はまた、１重量％〜１０重量％の非イオン性界面活性剤、好ましくは２重量％〜８重量％、より好ましくは３重量％〜７重量％、さらにより好ましくは５重量％未満の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。好適な非イオン性界面活性剤は、本技術分野においてよく知られており、アルコールエトキシレート、及び／又はアルキルエトキシレート、及び／又はアルキルフェノールエトキシレート、及び／又はグルカミド、例えば脂肪酸Ｎ−グルコシルＮ−メチルアミド、及び／又はアルキルポリグルコシド及び／又はモノ−又はジエタノールアミド、又は脂肪酸アミドを含んでもよい。洗剤組成物はまた、０重量％〜１０重量％の陽イオン性界面活性剤、好ましく０．１重量％〜８重量％、より好ましくは０．５重量％〜７重量％、より一層好ましくは５重量％未満の陽イオン性界面活性剤を含んでもよい。好適な陽イオン性界面活性剤は、本技術分野においてよく知られており、アルキル第４級アンモニウム化合物、及び／又はアルキルピリジニウム化合物、及び／又はアルキル第４級ホスホニウム化合物、及び／又はアルキル第３級スルホニウム化合物を含んでもよい。組成物は、好ましくは、洗濯プロセスの間、洗浄液体中に１００ｐｐｍ〜５，０００ｐｐｍの界面活性剤を提供する量で界面活性剤を含む。組成物は、水と接触する場合、典型的に０．５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの洗剤組成物を含む洗浄液体を形成する。多くの好適な界面活性化合物は、入手可能で有り、文献、例えば"Surface- Active Agents and Detergents", Volumes I and 11, by Schwartz, Perry and Berchに十分に記載されている。
【０２４６】
助剤
助剤の主な役割は、界面活性剤システムとさもなければマイナスの相互作用をする二価金属イオン（例えばカルシウム及びマグネシウムイオン）を洗浄溶液から隔離することである。助剤はまた、布地表面からの金属イオン及び無機汚れの除去において効果的であり、粒子及び飲料染みの改良された除去をもたらす。助剤は又、アルカリ性の供給源であり、洗浄水のｐＨを９．５〜１１のレベルに緩衝する。緩衝能はまた、「アルカリ性保持能」（reserve alkalinity）と称され、好ましくは４超であるべきである。
【０２４７】
本発明の洗剤組成物は、１又は２以上の洗剤助剤、又は助剤システムを含んでもよい。多くの好適な助剤システムは、文献、例えばPowdered Detergents, Durfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.に記載される。助剤は、対象組成物の重量に対して０％〜６０％、好ましくは５％〜４５％、より好ましくは１０％〜４０％、最も好ましくは１５％〜３５％、より一層好ましくは２０％〜３０％の助剤を含んでもよい。助剤は、これらに限定されるものではないが、ポリホスフェートのアルカリ金属塩、アンモニウム塩、及びアルカノールアンモニウム塩（例えばトリポリホスフェート  ＳＴＰＰ）、ケイ酸アルカリ金属塩、炭酸アルカリ土類塩及びアルカリ金属塩、アルミノケイ酸塩助剤（例えばゼオライト）、及びポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、マレイン酸無水物とエチレン又はビニルメチルエーテル、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸のコポリマー、ポリ酢酸、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸、及びニトリロトリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換されたアンモニウム塩、及びポリカルボン酸塩、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びそれら可溶性の塩。エタノールアミン（ＭＥＡ、ＤＥＡ、及びＴＥＡ）はまた、液体洗剤において緩衝能に寄与してもよい。
【０２４８】
漂白剤
本発明の洗剤組成物は、１又は２以上の漂白剤を含んでもよい。特に、粉末洗剤は、１又は２以上の漂白剤を含んでもよい。好適な漂白剤は、他の光退色剤、予調製過酸、過酸化水素源、漂白活性化剤、過酸化水素、漂白触媒、及びそれらの混合物を含む。一般的に、漂白剤が用いられる場合、本発明の組成物は、対象清浄組成物の重量に対して、約０．１％〜約５０％、又はさらには約０．１％〜約２５％の漂白剤を含んでもよい。一般的に、好適な漂白剤の例としては、
（１）他の光退色剤、例えばビタミンＫ３；
（２）予調製過酸：好適に予調製される過酸としては、これらに限定されるものではないが、過カルボン酸及び過カルボン酸塩、過炭酸及び過炭酸塩、過イミド酸及び過イミド酸塩、過オキソ硫酸及び過オキソ硫酸塩、例えばオキソン、及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物が挙げられる。好適な過カルボン酸は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｏ−Ｍを有する疎水性及び親水性過酸（Ｒは、過酸が疎水性である場合は、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子、過酸が親水性である場合、６個未満の炭素原子、又はさらに４個未満の炭素原子を有する、任意で分岐しているアルキル基であり；Ｍは、対イオン、例えばナトリウム、カリウム、又は水素である）を含む；
（３）過酸化水素源、例えばアルカリ金属塩、例えば、過ホウ素酸（通常モノ−又はテトラ水和物）、過カルボン酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩を含む無機過酸化水素化物塩、及びそれらの混合物。本発明の一つの側面では、無機過酸化水素化物塩は、過ホウ素酸、過カルボン酸のナトリウム塩、及びそれらの混合物からなる群から選択される。用いられる場合、無機過酸化水素化物塩は、典型的に、組成物全体の０．０５〜４０重量％、又は１〜３０重量％の量で存在し、典型的に、コートされてもよい結晶性固体として斯かる組成物に組み込まれる。好適なコーティングとしては、無機塩、例えばケイ酸アルカリ金属塩、炭酸塩、若しくはホウ酸塩、又はそれらの混合物、又は有機材料、例えば水溶性若しくは分散性ポリマー、ワックス、オイル、又は脂肪性石鹸が挙げられる。有用な漂白組成物は、米国特許第５，５７６，２８２号明細書、及び同第６，３０６，８１２号明細書に記載される；
（４）Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌを有する漂白活性化剤（Ｒは、漂白活性化剤が疎水性である場合は、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子、漂白活性化剤が親水性である場合、６個未満の炭素原子、又はさらに４個未満の炭素原子を有する、任意で分岐しているアルキル基であり；Ｌは、離脱基である）。好適な離脱基の例としては、安息香酸、及びそれらの誘導体、特にベンゼンスルホネートが挙げられる。好適な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸又はそれらの塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、及びノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）が挙げられる。好適な漂白活性化剤はまた、国際公開第９８／１７７６７号に開示される。任意の好適な漂白活性化剤が用いられる一方で、本発明の一つの側面では、対象の清浄組成物は、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤ、又はそれらの混合物を含んでもよい；及び
（５）ペルオキシ酸から酸素原子を受け取り、酸化され得る基質に酸素原子を移動し得る漂白触媒は、国際公開第ＷＯ２００８／００７３１９号（参照により本明細書に援用される）に記載される。好適な漂白触媒としては、これらに限定されるものではないが、イミニウム陽イオン及びポリイオン；イミニウム双性イオン；修飾アミン；修飾アミンオキシド；Ｎ−スルホニルイミン；Ｎ−ホスホニルイミン；Ｎ−アシルイミン；チアジアゾールジオキシド；過フルオロイミン；環状糖ケトン、及びそれらの混合物が挙げられる。漂白触媒は、典型的に、０．０００５重量％〜０．２重量％、０．００１重量％〜０．１重量％、又はさらに０．００５重量％〜０．０５重量％のレベルで洗剤組成物に含まれる、
が挙げられる。
【０２４９】
存在する場合、過酸及び／又は漂白活性化剤は、一般的に、組成物に基づいて、約０．１〜約６０重量％、約０．５〜約４０重量％、又はさらに約０．６〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。１又は２以上の疎水性過酸又はそれらの前駆体は、１又は２以上の親水性過酸又はそれらの前駆体と組み合わせて用いられてもよい。
【０２５０】
過酸化水素源及び過酸又は漂白活性化剤の量は、有効酸素（過酸化源からの）対過酸のモル比が１：１〜３５：１、又は２：１〜１０：１であるように選択されてもよい。
【０２５１】
添加物材料
分散剤：本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含み得る。特に粉末洗剤は、分散剤を含んでもよい。好適な水溶性有機材料は、ホモ−又はコ−ポリマー酸、又はそれらの塩を含み、ここでポリカルボン酸は、多くて二個の炭素原子により、互いから分散された、少なくとも二つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.に記載される。
【０２５２】
染料移動阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、１又は２以上の染料移動阻害剤を含んでもよい。好適なポリマー染料移動阻害剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、及びポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はそれらの混合物が挙げられる。対象組成物中に存在する場合、染料移動阻害剤は、組成物の重量に対して、約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、又はさらに約０．１％〜約３％のレベルで存在してもよい。
【０２５３】
蛍光増白剤：本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは、物に清浄された色をつける更なる成分、例えば蛍光増白剤又は光学光沢剤を含んでもよい。洗濯洗剤組成物に使用のための好適な任意の蛍光増白剤は、本発明の組成物に用いられてもよい。最も一般的に用いられる蛍光増白剤は、ジアミノスチルベンスルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体、及びビスフェニルジスチリル誘導体の分類に属するものである。蛍光増白剤のジアミノスチルベンスルホン酸誘導体の種類の例としては、以下：
４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、
４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−ジスルホネート、
４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、
４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、
４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、及び
２−（スチルビル−４”−ナフト−１．，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”−スルホネート、
のナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光増白剤は、Ciba-Geigy AG, Basel, Switzerlandから入手可能なTinopal DMS及びTinopal CBSである。Tinopal DMSは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートの二ナトリウム塩である。Tinopal CBSは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートの二ナトリウム塩である。
【０２５４】
蛍光増白剤が、Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Indiaにより供給される、市販されているParawhite KXであることはまた、好ましい。本発明に使用のために好適な他の蛍光剤は、１−３−ジアリールピラゾリン、及び７−アルキルアミノクマリンを含む。好適な蛍光増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１、又はさらに約０．２重量％の下限レベルから、０．５又はさらには０．７５重量％の上限レベルで含む。
【０２５５】
布地色調剤（Fabric hueing agents）：本発明の洗剤組成物はまた、布地色調剤、例えば洗剤組成物に製剤化される場合、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液体と接触すると、布地に付着し得、従って、可視光の吸収を通して前記布地の色合いを変化させる染料又は顔料を含んでもよい。蛍光増白剤は少なくとも幾らかの可視光を放射する。対照的に、布地色調剤は、それらが可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収するので、表面の色合いを変更する。好適な布地色調剤としては、染料、及び染料−粘土コンジュゲートを含み、顔料を含んでもよい。好適な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙られる。好適な小分子染料としては、例えば、国際公開第０５／０３２７４号、国際公開第０５／０３２７５号、国際公開第０５／０３２７６号、及び欧州特許第１８７６２２６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるような、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、及びベーシックレッドの色指数（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料、又はそれらの混合物からなる群より選択される小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、又はさらに約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含む。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含んでもよく、これは、組成物が単位用量パウチの形態である場合、特に好ましい。
【０２５６】
汚れ放出ポリマー：本発明の洗剤組成物はまた、布地、例えば綿及びポリエステル製布地から汚れの除去、特にポリエステル製布地からの疎水性汚れの除去を助ける、１又は２以上の汚れ放出ポリマーを含んでもよい。汚れ放出ポリマーは、例えば非イオン性、又は陰イオン性テレフタラート型ポリマー、ポリビニルカプロラクタム、及び関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドでもよい（例えばChapter 7 in Powdered Dtergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.を参照のこと）。別の種類の汚れ放出ポリマーは、コア構造及びそのコア構造に付着された複数のアルコキシル化された基を含む、両親媒性アルコキシル化グリース清浄ポリマーである。コア構造は、国際公開第０９／０８７５２３号（参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されるように、ポリアルキレンイミン構造、又はポリアルカノールアミン構造を含んでもよい。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚れ放出ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第０７／１３８０５４号、国際公開第０６／１０８８５６号、及び国際公開第０６／１１３３１４号（参照により本明細書に援用される）に詳細に記載される。他の汚れ放出ポリマーは、置換された多糖構造、特に置換されたセルロース様の構造、例えば修飾されたセルロース誘導体、例えば欧州特許第１８６７８０８号明細書、又は国際公開第０３／０４０２７９号（双方とも参照により本明細書に援用される）に記載されるものである。好適なセルロース様ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド、及びそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース様ポリマーとしては、陰イオン的に修飾されたセルロース、非イオン的に修飾されたセルロース、陽イオン的に修飾されたセルロース、双性イオン的に修飾されたセルロース、及びそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース様ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース、及びそれらの混合物が挙げられる。
【０２５７】
再付着防止剤：本発明の洗剤組成物はまた、１又は２以上の再付着防止剤、例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレン、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸のコポリマー、及びエトキシ化されたポリエチレンイミンを含む。上記の汚れ放出ポリマーに記載されるセルロース型ポリマーはまた、再付着防止剤として機能してもよい。
【０２５８】
他の好適な添加物材料としては、これらに限定されるものではないが、縮み防止剤、皺防止剤、殺菌剤、助剤、担体、染料、酵素安定化剤、柔軟剤、充填剤、泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、消泡剤、溶媒、液体洗剤のための構造体、及び／又は構造弾性化剤が挙げられる。
【０２５９】
一つの側面では、洗剤は、コンパクト液体洗濯洗剤組成物であって、以下：ａ）組成物の重量に対して、少なくとも約１０％、好ましくは２０〜８０％の、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、石鹸、及びそれらの混合物から選択される界面活性剤；ｂ）組成物の重量に対して、約１％〜約３０％、好ましくは５〜３０％の水；ｃ）組成物の重量に対して、約１％〜約１５％、好ましくは３〜１０％の非アミノ官能性溶媒；並びにｄ）組成物の重量に対して、約５％〜約２０％の、キレート剤、汚れ放出ポリマー、酵素、及びそれらの混合物から選択される性能添加物を含み、さらに以下：（ｉ）界面活性剤は、約１．５：１〜約５：１の陰イオン性界面活性剤対非イオン性界面活性剤の重量比を有し、界面活性剤が、組成物の重量に対して、約１５％〜約４０％の陰イオン界面活性剤を含み、組成物の重量に対して、約５％〜約４０％の石鹸を含む、（ｉｉ）組成物の重量に対して、約０．１％〜約１０％の、泡増強ポリマー、陽イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、アミンオキシド界面活性剤、両性界面活性剤、及びそれらの混合物から選択される泡増強剤、並びに（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方、の少なくとも一つを含む、コンパクト液体洗濯洗剤組成物である。全ての成分は、国際公開第０７／１３０５６２号（その全体において参照により本明細書に援用される）に記載され、洗剤製剤に有用な更なるポリマーは、国際公開第０７／１４９８０６号に記載される（その全体において参照により本明細書に援用される）。
【０２６０】
別の側面では、洗剤は、コンパクト顆粒（粉末）洗剤であって、ａ）組成物の重量に対して、少なくとも約１０％、好ましくは１５〜６０％の、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、石鹸、及びそれらの混合物から選択される界面活性剤；ｂ）組成物の重量に対して、約１０％〜約８０％、好ましくは２０〜６０％の助剤、ここで助剤は、ｉ）ホスフェート助剤、全助剤の好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、より一層好ましくは５％未満がホスフェート助剤である；ｉｉ）ゼオライト助剤、全助剤の好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、より一層好ましくは５％未満がゼオライト助剤である；ｉｉｉ）シトラート、全助剤の好ましくは０〜５％がシトラート助剤である；ｉｖ）ポリカルボキシレート、全助剤の好ましくは０〜５％がポリカルボキシレート助剤である；ｖ）カルボネート、全助剤の好ましくは０〜３０％がカルボネート助剤である；並びにｖｉ）ケイ酸ナトリウム、全助剤の好ましくは０〜２０％がケイ酸ナトリウム助剤である、から選択される助剤の混合物でもよい；ｃ）組成物の重量に対して、約０％〜２５％の充填剤、例えば硫酸塩、好ましくは組成物の重量に対して、１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％、より好ましくは３％〜５％の充填剤；並びにｄ）組成物の重量に対して、約０．１％〜２０％の酵素、組成物の重量に対して、好ましくは１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％の酵素、を含むコンパクト顆粒（粉末）洗剤である。
【０２６１】
用途
本発明のリゾチーム変異体又はそれらの組成物は、ポリペプチド又はそれらの組成物でペプチドグリカン又はキトデキストリンを含む材料を処理することにより、前記材料を分解するための、いくつかの適用に用いられてもよい（例えば、Proctor and Cunningham, (1988)Critical Reviews in Food Science and Nutrition 26:359-395; Carini et al. (1985)Microbiol. Alimen. Nutr. 3:299-320; Hughey and Johnson (1987)Appl. Environ. Microbiol. 53:2165-2170; Cunningham et al. (1991)World' s Poultry Science Journal 47:141-163を参照のこと）。
【０２６２】
本発明のリゾチーム変異体又はそれらの組成物の好ましい使用の例としては以下が挙げられる。リゾチーム変異体の用量、及びリゾチーム変異体が使用される他の条件は、本技術分野において知られている方法に基づいて決定されてもよい。
【０２６３】
本発明の変異体リゾチームは、抗微生物剤として用いられてもよい。本発明の一つの側面は、本発明の変異体リゾチームを用いて微生物汚染された表面を処理することを含む、微生物汚染を減少させるための方法である。
【０２６４】
本発明のリゾチーム変異体が抗微生物剤として作用し得るかどうかを評価するために、それは濁度アッセイにおいて試験され得る。このアッセイでは、リゾチームが微生物細胞、例えばエグジゴバクテリウム・アンダエ（Exiguobacterium undae）細胞（臭い靴下から単離された）の乾燥基質、又はバッファ若しくは洗剤に溶解されたクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）細胞を分解し、それによりバッファでのみ処理された微生物抑制と比較した場合、例えば５４０ｎｍにおいて光学密度（ＯＤ）を減少し得るかどうか試験される。
【０２６５】
変異体リゾチームは、好ましくは、上述のように、洗剤組成物に組み込まれ、及び／又は洗剤組成物と一緒に用いられる。
【０２６６】
洗浄が６０℃未満の温度において繰り返し行なわれる場合、洗浄機械（洗濯及び食器洗浄）において、及び機械で洗浄された織物に関して、悪臭が増加するリスクが存在する。この悪臭は、微生物、例えば細菌、真菌、藻類、又は洗浄装置内で増殖する他の単細胞生物が原因である可能性が高い。本発明は、本発明のリゾチーム変異体又はリゾチーム変異体組成物を用いて微生物で汚染された表面を処理することにより、表面上、例えば、織物衣料品、又は硬表面、例えば、洗浄機械の金属、プラスチック、ゴム部分、風呂場のタイル、床、テーブルトップ、排水溝、シンク、及び洗面台の微生物汚染を減少させる方法を提供する。斯かる処理はまた、微生物汚染を含む織物及び硬表面上の悪臭を減少することが期待される。
【０２６７】
微生物汚染の減少は、いくつかの方法、例えば、臭いが減少したかどうかパネルに評価させることにより評価され得、或いは、サンプルは、表面から採取され、微生物カウントが、リゾチームを用いない処理と比較して、処理の結果として減少したかどうか評価するために培養される。
【０２６８】
さらに、本発明は、洗剤組成物及び本発明のリゾチーム変異体又はリゾチーム変異体組成物を含む洗浄溶液で布地を処理することを含む、布地の洗濯のためのプロセスに関する。洗濯処理は、例えば、機械洗浄プロセス又は手作業の洗浄プロセスにおいて行なわれ得る。洗浄溶液は、例えば、洗剤組成物を含み、ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ７〜１２、より好ましくはｐＨ８〜１０である水性洗浄溶液であり得る。
【０２６９】
本発明の方法に供される布地は、従来の洗濯可能な洗濯物、例えば、例えば家庭の洗濯物でもよい。好ましくは、主な洗濯物は、綿、綿との混紡、天然若しくは人工のセルロース誘導体（例えば木材パルプ由来のもの）、又はそれらの混紡から作られた、衣料品、及びニット、織物（wovens）、デニム、毛糸（yarns）、及びタオル地（towelling）を含む布地である。混紡の例としては、綿又はレーヨン／ビスコースと１又は２以上のコンパニオン材料、例えば、ウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及びセルロースを含む繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、フラックス／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リヨセル）の混紡が挙げられる。
【０２７０】
本発明のリゾチーム変異体はまた、動物飼料に用いられてもよい。一つの実施形態では、本発明は、１又は２以上の動物飼料成分に本発明のリゾチーム変異体を添加することを含む、動物飼料組成物を調製するための方法を提供する。好ましくは、動物飼料は抗生物質を含まない。
【０２７１】
本発明のリゾチーム変異体は、例えば、病原体、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、エシュリキア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ属（Salmonella）、例えばサルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）及びサルモネラ・ムバンダカ（Salmonella Mbandaka）、並びにカンピロバクター属種（Camplylobacter sp.）の増殖／腸管定着を抑制することにより、動物、特に家畜、例えばこれらに限定されるものではないが、畜牛、シカ、ヤギ、ブタ、家禽、ウサギ、及びヒツジ、また魚の健康的な微生物相を安定化させるために用いられてもよい。好ましい実施形態では、リゾチーム変異体は、動物の食事において抗生物質に置き換わる。特に、酸性ｐＨにおいて向上した安定性、及びプロテアーゼに対して改良された安定性を有する変異体は、それらが消化管を通過して生き残るので、飼料適用に好適である。好ましい実施形態では、リゾチーム変異体は、鶏に適用され、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に対して抗微生物活性を有する。更なる実施形態では、本発明のリゾチーム変異体は、鶏の消化管の微生物バランスに好ましい影響を提供し得、動物のパフォーマンス（performance）をこのように改良する場合、飼料添加物として用いられる。
【０２７２】
リゾチーム変異体はまた、国際公開第００／２１３８１号、及び国際公開第０４／０２６３３４号に従って、その利用の効率性を増加させるために、飼料消化性を改良する飼料増幅酵素をとして、動物飼料に用いられてもよい。
【０２７３】
リゾチーム変異体はまた、米国特許第６，７７７，２２３号明細書に従って、表面を消毒するために、及び表面上のバイオフィルムを防ぐ又は除去するために用いられてもよい。
【０２７４】
リゾチーム変異体はまた、チーズ、特に、圧搾された及び加熱されたカード（curds）から作られるもの、例えばスイスチーズ、パルメザン、エダム、ゴーダ、チェダー等の熟成の間、クロストリジウム・チロブチリクム（Clostridium tyrobutyricum）の制御されていない増殖を選択的に阻害するために用いられてもよい。
【０２７５】
リゾチーム変異体はまた、口腔ケアに用いられてもよい。例えば、リゾチームは、練り歯磨き、又は他の口腔ケア製品中に単独で、又は他の酵素若しくはさらに抗微生物ペプチドと組み合わせて、用いられ得る。ポリペプチドは、口腔に導入され、又は口腔に導入される製品に適用されてもよい。例えば、国際公開第０８／１２４７６４号を参照のこと。
【０２７６】
リゾチーム変異体はまた、皮膚及び軟組織のジストロフィー性及び炎症性病変の局所治療に用いられてもよい。例えば、Palmieri and Boraldi (1977)Arch. Sci. Med. (Torino)134:481-485を参照のこと。
【０２７７】
リゾチーム変異体はまた、スキンケアに用いられてもよい。例えば、ポリペプチドは皮膚感染、例えばにきびに罹患する患者の皮膚に塗布される。リゾチーム変異体はまた、例えば、傷の治癒を助けるために、負傷した皮膚に適用される創傷被覆材に用いられてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００８０２５４０７９号明細書を参照のこと。
【０２７８】
リゾチーム変異体はまた、リップスティック、リップバーム、リップゲル、又はリップグロスに用いられてもよい。例えば、斯かる製品は、局所唇感染、例えば、ヘルペスの治療のために用いられ得る。例えば、米国特許出願公開第２００８０２５４０７９号明細書を参照のこと。
【０２７９】
リゾチーム変異体はまた、気管支肺疾患の治療に用いられ得る。
【０２８０】
本発明は以下の実施例により更に記述され、それは発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２８１】
材料及び方法
濁度アッセイ
リゾチームの活性は、５４０ｎｍにおいて分光光度計において測定された、エキシグオバクテリウム・ウンダエ（Exiguobacterium undae）の再懸濁された乾燥細胞の溶液の吸光度／光学密度の減少（降下）を測定することにより決定された。
【０２８２】
エキシグオバクテリウム・ウンダエ（Exiguobacterium undae）（基質）の乾燥細胞の調製
Ｅ．ウンダエ（E.undae）（ＤＳＭ１４４８１）の培養菌は、５００ｍＬ振盪フラスコ中の１００ｍＬ  ＬＢ培地（Fluka 51208、２５ｇ／Ｌ）中で、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養された。一晩培養された培養物は、その後、２０℃、５０００ｇで１０分間遠心分離され、ペレットは、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水で２回洗浄され、ｍｉｌｌｉＱに再懸濁された。洗浄された細胞は、１分間１３０００ｒｐｍで遠心分離され、可能な限り上清は移された。洗浄された細胞は、細胞の重量が測定される前に、１時間真空遠心分離で乾燥された。乾燥された細胞は−２０℃で保存された。使用の前に、細胞は、０．５ｍｇ細胞／ｍＬの濃度までｐＨ６のユニバーサルバッファに再懸濁され、光学密度（ＯＤ）は５４０ｎｍにおいて測定された。細胞懸濁液は、その後、細胞濃度がＯＤ５４０＝１．０に等しくなるように調整された。調整された細胞懸濁液は、その後、使用の前に冷却して保存された。再懸濁された細胞は、４時間以内に使用されるべきである。
【０２８３】
濁度アッセイにおけるリゾチーム抗微生物活性の測定
測定されるリゾチームサンプルは、ｐＨ６のユニバーサルバッファ（下記を参照のこと）に１００〜２００ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度で希釈され、使用まで氷上に維持された。９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）中で、２００μＬの基質は各ウェルに添加され、プレートは、PowerWaveX分光光度計（Bio-Tek Instruments INC.）において、３７℃で５分間インキュベートされた。インキュベーションに続いて、各ウェルの吸光度は５４０ｎｍにおいて測定された（開始値）。活性測定を開始するために、２０μＬの希釈されたリゾチームサンプルは各ウェル中の２００μＬの基質に添加され、５４０ｎｍにおける吸光度の反応速度測定は、最低３０分から最大２４時間、３７℃で開始された。５４０ｎｍにおける測定された吸光度は、各ウェルについて観察され、リゾチームが抗微生物活性を有する場合、時間に伴う吸光度の低下は、見られた。吸光度の低下が大きいほど、リゾチーム抗微生物活性は大きかった。
【０２８４】
ユニバーサルバッファストックの調製
ストック：
１００ｍＭ  コハク酸          １１８．０９ｇ／ｍｏｌ      ５.９０ｇ
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ        ２３８．３ｇ／ｍｏｌ      １１．９ｇ
１００ｍＭ  ＣＨＥＳ          ２０７．２９ｇ／ｍｏｌ    １０．４ｇ
１００ｍＭ  ＣＡＰＳ          ２２１．３１ｇ／ｍｏｌ    １１．１ｇ
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ            ５８．４４ｇ／ｍｏｌ      ４．３８ｇ
【０２８５】
５００ｍＬの水に混合する。ｐＨをＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ６に調整する。使用の前に、バッファを１０倍に希釈する。
【０２８６】
濁度アッセイの結果を比較するために、比較されるサンプルは、好ましくは同一のバッファ及び基質バッチを用いて同一の実験の遂行において試験されるべきである。
【０２８７】
濁度アッセイにおけるリゾチーム抗微生物活性のバリエーション
上述のアッセイは、本発明のための好ましい標準的な微生物活性試験である。しかしながら、改良された特性を達成するために生成されるリゾチーム変異体のために、アッセイを適合させてもよい。
【０２８８】
改良された温度活性を試験するために、インキュベーション温度は、所望の温度、例えば４５℃〜１１０℃に上昇され得る。温度が５０℃を超える場合、サンプルは、分光光度計中で直接インキュベートされる代わりに、外部加熱源中でインキュベートされなければならず、測定は、開始値及び終了値を測定することにより行われる。
【０２８９】
低い又は中程度の温度における改良された活性を試験するために、インキュベーション温度は、所望の温度、例えば０℃〜４０℃に変更され得る。
【０２９０】
改良された温度安定性を試験するために、リゾチームサンプルは、所望の温度、例えば４５℃〜１１０℃で３０分〜２４時間事前にインキュベートされ、その後、活性を測定する前に、上述のアッセイの温度まで冷却され得る。
【０２９１】
改良されたｐＨ活性を試験するために、ｐＨは、例えば７．５〜１２まで上昇され、又は例えば２〜５．５まで減少され得る。
【０２９２】
改良されたｐＨ安定性を試験するために、リゾチームサンプルは、所望のｐＨで３０分〜２４時間、事前にインキュベートされ、その後、活性を測定する前に、上述のアッセイのｐＨは戻され得る。
【０２９３】
プロテアーゼ分解に対する向上した耐性を試験するために、上述のアッセイを行う前に、リゾチームサンプルは、０．５〜２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１．５ｍｇ／ｍｌでペプシンと、又はセリン−プロテアーゼ、例えば１０ｍｇ／Ｌのサビナーゼと、２５〜４０℃で、３０分〜２４時間、事前にインキュベートされ得る。
【０２９４】
リゾチームの最適温度及びｐＨはまた、濁度アッセイを用いて評価され得る。温度最適評価のために、ｐＨが６に維持される一方で、アッセイは、例えば５℃〜８０℃の温度の範囲において行われる。最適ｐＨのために、温度は３７℃に維持される一方で、アッセイのｐＨは、例えばｐＨ２〜１２の範囲に亘り変更される。
【０２９５】
実施例１
変異体の生成
上述の方法を用いて、フミガーツス属（fumigates）リゾチーム（配列番号２）の以下の変異体、
Ｎ１９Ｄ，                      Ｈ２０Ｗ，
Ｈ２０Ｙ，                      Ｋ２２Ｇ，
Ｋ３０Ｙ，                      Ｑ３５Ｒ，
Ｔ４５Ｇ，                      Ｙ４７Ｆ，
Ｄ４９Ｇ，                      Ｈ５５Ａ，
Ｙ５６Ｗ，                      Ｌ６５Ｉ，
Ｋ７６Ｓ，                      Ｆ８５Ｙ，
Ｎ８９Ｓ，                      Ｄ９５Ｇ，
Ｒ９８Ｇ，                      Ｇ１０２Ｐ＋Ｙ１３４Ｖ，
Ｙ１０８Ｆ，                    Ｙ１１１Ｆ，
Ｈ１２０Ｑ，                    Ｖ１３１Ｃ，
Ｈ１３６Ｎ，                    Ｓ１３９Ｇ，
Ｗ１４１Ｙ，                    Ｔ１４７Ｇ，
Ｒ１５３Ｔ，                    Ａ１５８Ｓ，
Ｆ１６１Ｙ，                    Ｋ１６４Ｔ，
Ａ１７１Ｒ，                    Ｋ１７８Ｇ，
Ｄ１８３Ｇ，                    Ｔ１８６Ｙ＋Ｗ１８７Ｙ，
Ｓ１９３Ａ，                    Ｋ１９５Ｓ，
Ｙ１９６Ｇ＋Ｋ１９７Ｐ，        Ｈ１９８Ｆ，
Ｄ２０３Ｎ，                    Ｎ２０６Ａ，
Ｎ２０６Ｓ，                    Ｅ１０７Ａ，
Ｄ１０５Ａ
は調製された。
【０２９６】
実施例２
胃液中の低ｐＨにおける安定性
ｐＨ２及びペプシンインキュベーションに対するリゾチーム安定性の測定
疑似胃条件下でリゾチーム安定性を測定するために、我々は、ｗｔリゾチーム、及び選択された変異体を人工胃液（０．０１Ｍ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌペプシン）中でインキュベートした。リゾチームサンプルは、ｍｉｌｌｉＱ水に５０ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度に希釈された。９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）において、１６２μＬの人工胃液はｔ＝０分において、１８μＬのリゾチームサンプルとともに各ウェルに添加された。サンプルは、Eppendorf termomixerにおいて、３５０ｒｐｍで、３７℃で１時間インキュベートされた。各リゾチームは、三重に試験された。ｔ＝６０分において、胃のインキュベーションを停止するために、２０μＬのクエン酸  Ｎａ2ＰＯ4バッファ溶液ｐＨ６．８（２２．７５ｍｌの０．１Ｍクエン酸と７７．２５ｍｌの０．２Ｍ  Ｎａ2ＰＯ4を混合することにより調製された）は各ウェルに添加された。リゾチームを含まないマイクロタイターウェルは、ネガティブ対照として用いられ、リゾチームの添加前にｔ＝０分において添加されたクエン酸  Ｎａ2ＰＯ4バッファ溶液ｐＨ６．８を含むウェルは、ポジティブ対照として用いられた。
【０２９７】
残存リゾチーム活性を測定するために、２０μＬのＥ．ウンダエ（E. undae）懸濁液は、各ウェルに添加され、ＯＤ５４０ｎｍは、Sunrise分光光度計（Tecan）において３７℃で１時間、毎分測定された。ｔ＝６０分におけるＯＤ５４０ｎｍ測定は、計算のために用いられた。％でのリゾチーム残存活性は、リゾチーム残存活性＝（（ＯＤ（５４０ｎｍ）ネガディブ対照−ＯＤ（５４０ｎｍ）胃の試験）／ＯＤ（５４０ｎｍ）ポジディブ対照）*１００％として計算された。
【０２９８】
結果
リゾチームｗｔ及び選択された変異体は、人工胃液中のインキュベーションに対して、安定性について試験された。試験された変異体の残存活性は、表１に示される。７つの変異体のうち３つは、ｗｔと比較して改良された安定性を有した。
【０２９９】
【表２】
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【０３００】
実施例３
変異体の熱安定性
リゾチーム熱安定性の測定
リゾチーム及び変異体の精製されたサンプルは、元は１Ｌあたり１１．８ｇコハク酸；２３．８ｇＨＥＰＥＳ；２０．８ｇＣＨＥＳ；２２．２ｇＣＡＰＳ及び８．７６ｇＮａＣｌからなる４０×に希釈されたバッファに１０ｐｐｍの濃度に懸濁された。バッファｐＨは、使用の前にＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ６に調整された。リゾチーム熱安定性は、Veritiサーマルサイクラー（Applied Biosystems）中で、９０℃で１０分間、精製されたリゾチーム及びそれらの変異体のインキュベーションにより試験された。同時に、対照サンプルは氷上でインキュベートされた。インキュベーションの直後、サンプルは氷上に置かれ、基質は添加された（基質は、上述のように調製された）。残存活性は、活性が２０分間測定されたことを除いて、本質的に上述のように評価された。
【０３０１】
熱安定性の結果
リゾチームｗｔ及び選択された変異体は、熱安定性について試験された。ＷＴと比較した試験された変異体の残存活性を、表２に示す。１０個の変異体は、５％超の比残存活性を有し、それ故、ＷＴと比較して増大した熱安定性を有すると考えられ得る。
【０３０２】
【表３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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【図２−２３】
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【図２−２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013520189.tif 000032
2013520189.tif 000033
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