(57)【要約】本発明は、一般的に使用される尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞から得られる組換えＦＳＨよりもはるかに低い濃度で性ステロイドの放出を刺激することができ、かつｃＡＭＰシグナル伝達に依存しないで機能する改良型ＦＳＨ調製物に関する。これらの改良型ＦＳＨ調製物は、不妊症の処置に使用することができる。一実施形態において、組換えＦＳＨ調製物が提供され、該調製物中の組換えＦＳＨが、以下の特徴：（ｉ）少なくとも２０％のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；（ｉｉ）少なくとも３０％のフコースを有するグリカンの相対量；および／または（ｉｉｉ）少なくとも３０％の２，６−結合シアル酸の相対量；および／または（ｉｖ）グリコシル化パターンが、多様なグリコシル化パターンである、のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＦＳＨ調製物であって、該調製物中の組換えＦＳＨが、以下の特徴：
（ｉ）少なくとも２０％のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）少なくとも３０％のフコースを有するグリカンの相対量；および／または
（ｉｉｉ）少なくとも３０％の２，６−結合シアル酸の相対量；および／または
（ｉｖ）グリコシル化パターンが、多様なグリコシル化パターンである、
のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する、組換えＦＳＨ調製物。
【請求項２】
前記グリコシル化パターンが、前記特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つを含み、好ましくは、該特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの全てを含む、請求項１に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項３】
ヒト細胞株ＧＴ−５ｓ、または該ヒト細胞株ＧＴ−５ｓ由来の細胞株、またはこれらと同種の細胞株での産生によって得ることができる組換えＦＳＨ調製物。
【請求項４】
以下の特徴：
（ａ）前記グリコシル化パターンが、少なくとも８５％の１つ以上のシアル酸残基を有するグリカンの相対量を含む；
（ｂ）該グリコシル化パターンが、少なくとも１８％の少なくともテトラアンテナ型のグリカンの相対量を含む；
（ｃ）少なくとも２００のＺ数；
（ｄ）前記組換えＦＳＨ調製物が、ヒト組換えＦＳＨである；および／または
（ｅ）該組換えＦＳＨ調製物が、ヒト細胞株またはヒト細胞によって産生される、
のうちの１つ以上を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項５】
前記グリコシル化パターンが、以下の特徴：
（ｉ）約２５％〜約５０％の範囲のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型のグリカンの相対量；
（ｉｉｉ）少なくとも３５％のフコースを有するグリカンの相対量；
（ｉｖ）少なくとも５３％の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｖ）少なくとも８８％の１つ以上のシアル酸残基を有するグリカンの相対量；
（ｖｉ）少なくとも２２０のＺ数；
（ｖｉｉ）少なくとも９５％のガラクトースを有するグリカンの相対量；
（ｖｉｉｉ）少なくとも６０％のシアル酸残基によって任意選択で修飾された末端ガラクトース単位を有するグリカン分岐の相対量；
（ｉｘ）少なくとも３％の硫酸基を有するグリカンの相対量；
（ｘ）該グリコシル化パターンが、少なくとも４５の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれが、該調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％の相対量を有する；
（ｘｉ）該グリコシル化パターンが、少なくとも３５の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれが、該調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．１％の相対量を有する；
（ｘｉｉｉ）該グリコシル化パターンが、少なくとも２０の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれが、該調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．５％の相対量を有する；
（ｘｉｖ）該グリコシル化パターンが、対応する調製物中のＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨとは少なくとも４０％異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれが、それぞれの調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％の相対量を有する、
のうちの１つ以上を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項６】
前記グリコシル化パターンが、以下の特徴：
（ｉ）約２５％〜約５０％の範囲のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型のグリカンの相対量；
（ｉｉｉ）少なくとも３５％のフコースを有するグリカンの相対量；
（ｉｖ）約５３％〜約９９％の範囲の２，６−結合シアル酸の相対量；および
（ｖ）少なくとも８８％の１つ以上のシアル酸残基を有するグリカンの相対量、
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項７】
前記調製物中の組換えＦＳＨが、表１に列記されている実施形態のいずれか１つに従ったグリコシル化パターンを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項８】
前記ＦＳＨが、
（ａ）有意な量のｃＡＭＰが放出されない濃度で；かつ／または
（ｂ）ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しないシグナル伝達経路を誘発することによって、
顆粒膜細胞でのプロゲステロンの放出を刺激することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項９】
前記ＦＳＨが、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激または共刺激することができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項１０】
前記ＦＳＨが、顆粒膜細胞アッセイで決定され得る、以下の特徴：
（ａ）該ＦＳＨが、顆粒膜細胞によるｃＡＭＰの放出を誘発するのに必要な最低濃度よりも低い濃度で顆粒膜細胞でのプロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｂ）該ＦＳＨが、ｃＡＭＰの放出を誘発しない、または１０ｐｍｏｌ／ｍｌ未満のｃＡＭＰの放出を誘発するＦＳＨ濃度で、約５＊１０４〜約１＊１０５の顆粒膜細胞／ｍｌにおいて少なくとも２００ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンの放出を刺激することができる：
（ｃ）該ＦＳＨが、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）によって必要とされる濃度よりも低い濃度で、約５＊１０４〜約１＊１０５の顆粒膜細胞／ｍｌにおいて少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンの放出を刺激することができる：および／または
（ｄ）ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）が、対応するプロゲステロンの放出をもたらさない濃度で、約５＊１０４〜約１＊１０５の顆粒膜細胞／ｍｌにおいて少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンの放出を刺激することができる、
のうちの１つ以上を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項１１】
前記ＦＳＨが、単回用量の投与後にヒト女性の卵胞の成長を誘発することができ、該単回用量が、好ましくは、２５〜５００ＩＵ  ＦＳＨを含み、好ましくは、特に皮下注射によって非経口投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
不妊症の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
患者に投与される用量が、該患者の循環中で約０．０５〜約２ＩＵ／Ｌ、好ましくは約０．１〜約１ＩＵ／Ｌの範囲のＦＳＨ濃度をもたらす、請求項１３に記載の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物。
【請求項１５】
同様にｃＡＭＰに依存しない性ステロイドの分泌を誘発および／または刺激するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ｃＡＭＰのシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟を刺激または共刺激するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
有意なｃＡＭＰの放出が誘発されないＦＳＨ濃度で性ステロイドの分泌を誘発および／または刺激するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
補助的生殖技術、排卵誘発、体外受精、例えば、細胞質内精子注入法による体外受精、卵管内配偶子移植法、子宮内受精法、女性の無排卵障害の処置、女性の卵成熟の重度ホルモン欠乏症の処置、男性の精子産生不全の処置、ならびに／または、例えば、体外受精刺激プロトコル中、および／または無排卵障害の処置における生殖細胞成熟、例えば、卵胞形成および精子形成、特に女性の卵胞成熟の促進または改善を含む、不妊症の処置に使用するための、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物。
【請求項１９】
前記組換えＦＳＨ調製物または前記医薬組成物が、以下の特徴：
（ｉ）該組換えＦＳＨ調製物または該医薬組成物が、単回用量のみの投与後に卵胞の成長および／または卵子の成熟を誘発することができる；および／または
（ｉｉ）該組換えＦＳＨ調製物または該医薬組成物が、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物よりも短い循環半減期を有する；および／または
（ｉｉｉ）該組換えＦＳＨ調製物または該医薬組成物が、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物よりも低いバイオアベイラビリティを有する；および／または
（ｉｖ）該組換えＦＳＨ調製物または該医薬組成物が、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物と同様またはそれよりも高い治療上の効能を有する、
のうちの１つ以上を有する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物。
【請求項２０】
卵胞の成長および／または卵子の成熟を誘発するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＦＳＨ調製物または請求項１２に記載の医薬組成物の使用、および／または請求項１３〜１９のいずれか１項に規定されるような使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性腺刺激ホルモンの分野に関する。詳細には、改良型組換えヒト卵胞刺激ホルモン（ｒｈＦＳＨ）が提供される。この改良型ｒｈＦＳＨは、特にヒト患者の不妊症の処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
性腺刺激ホルモンは、男性および女性における性腺機能を調節し、これによりヒト受胎能に重要な役割を果たすタンパク質ホルモン群である。性腺刺激ホルモンは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）による刺激後に脊椎動物の下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞によって分泌される。性腺刺激ホルモンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）を含むヘテロ二量体糖タンパク質である。性腺刺激ホルモンは、同一のαサブユニットを共有するが、受容体結合特異性を保証する異なるβサブユニットを含む。
【０００３】
ＦＳＨは、９２個のアミノ酸αサブユニット、およびＦＳＨ受容体に対する特異的結合を付与する１１１個のアミノ酸βサブユニットを含む。天然タンパク質の両方のサブユニットは、グリコシル化によって修飾されている。αサブユニットは、Ａｓｎ５２およびＡｓｎ７８で自然にグリコシル化され、βサブユニットは、Ａｓｎ７およびＡｓｎ２４で自然にグリコシル化されている。両方のサブユニットは、前駆タンパク質として細胞で産生され、次いで処理されて分泌される。ＦＳＨは、体の発生、成長、思春期の成熟、および生殖プロセスを調節する。特に、ＦＳＨは、生殖細胞の成熟を刺激し、従って精子形成および卵子形成に関与する。
【０００４】
卵胞形成は、ＦＳＨによって、例えば、顆粒膜細胞の表面のＦＳＨ受容体へのＦＳＨの結合によって誘発される。ＦＳＨ受容体は、ＦＳＨの結合時に共役Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体である。次いで、Ｇタンパク質が、アデニリルシクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰ、セカンドメッセンジャー分子の産生が起こる。細胞中のｃＡＭＰ濃度の上昇により、いくつかの下流の標的、特にｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを活性化し、次いでプロゲステロンおよびエストラジオールの合成が起こる。プロゲステロンおよびエストラジオールは、顆粒膜細胞によって分泌され、卵胞形成を誘発する。ＦＳＨによって顆粒膜細胞が刺激されると、顆粒膜細胞は、負のフィードバックループを形成するインヒビン−Ｂも放出し、下垂体におけるＦＳＨの産生および分泌を阻害する。インヒビン−Ｂは、ＦＳＨによる卵巣刺激の良好な代理マーカーであることが示された。
【０００５】
ＦＳＨは、単独または他の薬剤、特にＬＨと併用して不妊症の処置に広く使用されている。当技術分野では、一般的に、閉経後のヒト尿から精製されたＦＳＨ（尿ＦＳＨ）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって組換え的に産生されたＦＳＨが、ヒトの処置のために使用されてきた。しかしながら、異なるアイソフォームの存在によるＦＳＨ調製物に関連した相当な不均一性が存在する。個々のＦＳＨアイソフォームは、同一のアミノ酸配列を示すが、それらのグリコシル化の程度および性質が異なっている。特定のアイソフォームは、糖側鎖構造の不均一性および取り込まれるシアル酸（負の電荷を帯びた末端単糖ユニット）の量の相違によって特徴付けられ、これらは共に、アイソフォームの特定の生物活性に影響を与える。従って、ＦＳＨのグリコシル化パターンは、その生物学的活性に対して有意な影響を有する。
【０００６】
しかしながら、異なるドナーおよび異なる標本からの尿ＦＳＨは、その糖構造が著しく異なる恐れがあり、バッチごとの大きなばらつきとなる。また、尿製品におけるウイルスの存在に関する安全状の懸念も存在する。さらに、ＣＨＯ細胞から得られるＦＳＨは、ヒトグリコシル化パターンとは同一ではないこれらのハムスター細胞に特異的なグリコシル化パターンを示す。これらの相違により、得られるＦＳＨ、従って患者に投与されることになる医薬品の生物学的活性および有害作用が様々となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この点から見て、本発明の１つの目的は、改良型ＦＳＨ調製物を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明の目的は、新規な治療的または薬理学的特徴を有するＦＳＨ調製物を提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、改良型グリコシル化パターンを有するＦＳＨ調製物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、好ましくは最適化グリコシル化について選択されたヒト細胞から得られる改良型ＦＳＨ調製物が、ヒト尿またはＣＨＯ細胞から得られる対応するＦＳＨ調製物よりも低い濃度において、性ステロイド、例えば、エストラジオールおよびプロゲステロンの分泌を誘発することができることを見出した。従って、本発明によるＦＳＨ調製物は、治療に有用である驚くべき特徴を有する。
【００１１】
本発明は、第１の態様において、組換えＦＳＨ調製物を提供し、この調製物中の組換えＦＳＨが、１つ以上の以下の特徴を含むグリコシル化パターンを有する：
（ｉ）少なくとも２０％のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）；
（ｉｉ）少なくとも３０％のフコースを有するグリカンの相対量；および／または
（ｉｉｉ）少なくとも３０％の２，６−結合シアル酸の相対量；および／または
（ｉｖ）グリコシル化パターンが、多様なグリコシル化パターンである。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、ヒト細胞またはヒト細胞株、好ましくは細胞株ＧＴ−５ｓ（ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７８、２０１０年７月２８日に受託）での産生によって得ることができる組換えＦＳＨ調製物を提供する。各細胞株で産生されるＦＳＨは、前述および後述の改良型グリコシル化プロフィールとなることが分かった。
【００１３】
また、本発明による組換えＦＳＨを含む医薬組成物も提供される。
【００１４】
さらに、本発明は、不妊症の処置に使用するための、本発明による組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、同様にｃＡＭＰに依存しない性ステロイドの分泌を誘発および／または刺激するための、本発明による組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物に関する。
【００１６】
一部の実験は、本発明によるＦＳＨの低濃度の効果が、特定の場合に、標的細胞におけるｃＡＭＰシグナル伝達に依存しないことを示した。従って、これらの実験は、本発明による改良型ＦＳＨ調製物が、ｃＡＭＰの分泌が増加しない濃度で、性ステロイド、例えば、プロゲステロンの分泌を誘発することができることを示唆している。従って、本発明による改良型ＦＳＨ調製物の特定の実施形態は、一般的に使用されるＦＳＨ調製物で説明されるセカンドメッセンジャーとしてｃＡＭＰを用いる公知のシグナル伝達経路とは異なる、性ステロイドの分泌をもたらすシグナル伝達経路を誘発することができると考えられる。
【００１７】
さらに、本発明は、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟を刺激または共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）するための、本発明による組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、有意なｃＡＭＰの放出が全く誘発されないＦＳＨ濃度で性ステロイドの分泌を誘発および／または刺激するための、本発明による組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明の他の目的、特色、利点、および態様は、当業者であれば、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。しかしながら、本願の好ましい実施態様を説明する以下の説明、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例が、単なる例示目的で示されることを理解されたい。開示される本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改良が、以下を読めば当業者には明らかになるであろう。
【００２０】
（発明の詳細の説明）
（定義）
本明細書で使用される以下の表現は、一般に、それらの表現が使用される文脈が他の意味を示す場合を除き、好ましくは以下に説明する意味を有することを意図する。
【００２１】
本明細書で使用される表現「含む」は、その通常の意味の他に、表現「〜から本質的になる」および「〜からなる」も含み、特にこれらの表現を指す。従って、表現「含む」は、具体的に列記された要素を「含む」主題が、さらなる要素を含まない実施形態、および具体的に列記された要素を「含む」主題が、さらなる要素を包含し得、かつ／または実際に包含する実施形態を指す。
【００２２】
用語「ＦＳＨ」は、卵胞刺激ホルモン、性腺刺激ホルモンを指す。ＦＳＨは、αサブユニットおよびβサブユニットと名付けられた２つのサブユニットから構成される糖タンパク質である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒトＦＳＨ、特に、配列番号：１のアミノ酸配列を有するαサブユニットおよび配列番号：２のアミノ酸配列を有するβサブユニットから構成されるヒトＦＳＨである。しかしながら、１つ以上、例えば、１つ、１つまたは２つ、最大３つ、最大５つ、最大１０、または最大２０のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失が、一方または両方のサブユニットに存在し得る。好ましくは、αサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号：１に一致するアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の全体的な相同性または同一性を共有する。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号：２に一致するアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の全体的な相同性または同一性を共有する。ＦＳＨのサブユニットは、好ましくは、２つの別個のポリペプチド鎖であるが、本明細書で使用される用語「ＦＳＨ」は、２つのサブユニットが、例えば、架橋剤またはポリペプチド鎖の結合によって互いに共有結合している実施形態、および一方または両方のサブユニットが、いくつかのポリペプチド鎖にさらに分類される実施形態も包含する。好ましくは、本発明によるＦＳＨは、ＦＳＨ受容体、好ましくはヒトＦＳＨ受容体に結合し、かつ／または活性化することができる。本明細書で使用される用語「ＦＳＨ」は、特に、調製物中の全てのＦＳＨタンパク質を指す。従って、用語「ＦＳＨ」は、特に、ＦＳＨ調製物または組成物中の全てのＦＳＨタンパク質全体を指す。
【００２３】
好ましくは、ＦＳＨタンパク質の両方のサブユニットは、ポリペプチド鎖に付着した１つ以上の糖構造を含む。より好ましくは、糖構造は、サブユニットのアスパラギン残基に付着している。特に好ましい実施形態では、αサブユニットは、Ａｓｎ５２およびＡｓｎ７８に付着した２つの糖構造を含み、かつ／またはβサブユニットは、Ａｓｎ７およびＡｓｎ２４に付着した２つの糖構造を含む。糖構造を有するアミノ酸残基は、配列番号：１および２のそれぞれに一致するαサブユニットおよびβサブユニットのヒトアミノ酸配列に指定される。ヒトＦＳＨの糖部分は、好ましくは、フコース、ガラクトース、マンノース、ガラクトサミン、グルコサミン、および／またはシアル酸から構成される。
【００２４】
本発明に従って使用されるＦＳＨは、好ましくは組換えＦＳＨ、より好ましくは組換えヒトＦＳＨである。用語「組換えＦＳＨ」は、生きているヒトまたは動物の体によって自然に産生されず、ヒトもしくは動物の体から得られるサンプル、例えば、尿、血液もしくは他の体液、便、またはヒトもしくは動物の体の組織から得られるＦＳＨを指す。好ましくは、組換えＦＳＨは、バイオテクノロジーによって操作された細胞、特に、ＦＳＨまたはＦＳＨのαサブユニットもしくはβサブユニットをコードする核酸で形質転換された、またはこの核酸が形質移入された細胞から得られる。好ましい実施形態によると、組換えＦＳＨは、ＦＳＨをコードする外来性核酸を含むヒト細胞から得られる。それぞれの外来性核酸は、例えば、形質移入などによって宿主細胞に導入することができる１つ以上の発現ベクターを用いることによって導入することができる。タンパク質およびＦＳＨを組換え的に作製するためのそれぞれの方法は、当分野で周知であるため、さらなる説明は必要ない。
【００２５】
本発明によるＦＳＨは、好ましくはＦＳＨであり、より好ましくは、ヒト細胞、好ましくはヒト細胞株での産生により得ることができるヒトＦＳＨである。ヒト細胞株は、好ましくは、ヒト血液細胞に由来し、特に、ヒト細胞株は、骨髄細胞株、好ましくは骨髄性白血病細胞株である。細胞株は、好ましくは不死化されている。好ましい実施形態では、本発明によるＦＳＨの産生用の細胞株は、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０，１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によるＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）におけるブダペスト条約の要件に従ったアセッション番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７８として２０１０年７月２８日に受託された細胞株ＧＴ−５ｓ、またはこの細胞株ＧＴ−５ｓ由来の細胞株、あるいは同種細胞株である。ＧＴ−５ｓは、本明細書に記載される特定のグリコシル化パターンを提供することができる不死化ヒト骨髄性白血病細胞株である。本発明によると、用語「ＧＴ−５ｓ」および「ＧＴ−５ｓ細胞株」は、ＧＴ−５ｓに由来する細胞または細胞株も含む。ＧＴ−５ｓに由来する細胞株は、例えば、突然変異率を高めるために任意にＧＴ−５ｓ細胞を処置した後にＧＴ−５ｓ培養物から単一クローンまたは細胞群を無作為または特別に選択することによって、あるいはＧＴ−５ｓ細胞株を遺伝子改変することによって得ることができる。選択されたクローンまたは細胞群を、上記のようにさらに処置することができ、かつ／またはさらなる選択サイクルを行うことができる。ＧＴ−５ｓに相同である細胞株は、特に不死化ヒト骨髄細胞株である。好ましくは、ＧＴ−５ｓに由来する細胞株またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株は、ＧＴ−５ｓから得られるグリコシル化パターンに類似したグリコシル化パターンを有するＦＳＨを提供することができる。好ましくは、ＧＴ−５ｓに由来する細胞株またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株によって産生されるＦＳＨは、本明細書に記載される１つ以上のグリコシル化の特徴、特に少なくとも２０％のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；および／または少なくとも３０％のフコースを有するグリカンの相対量；および／または少なくとも３０％の２，６−結合シアル酸の相対量；および／または多様なグリコシル化パターンを有する。一実施形態によると、ＧＴ−５ｓに由来する細胞株またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株は、本明細書で好ましいとして説明されたグリコシル化パターン、特に表１から選択されるグリコシル化パターンを有するＦＳＨを発現することができる。ＧＴ−５ｓに由来する細胞株またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株によって産生されるＦＳＨの同様のグリコシル化パターンは、ＧＴ−５ｓから得られるＦＳＨのグリコシル化パターンとは、特に、ｂｉｓＧｌｃＮＡｃの相対量、シアル化グリカンの相対量、硫酸化グリカンの相対量、２，６−結合シアル酸の相対量、フコースの相対量、テトラアンテナ型グリカンの相対量、ガラクトースを有するグリカン分岐の相対量���およびＺ数からなる群から選択されるグリコシル化特性の１つ以上、好ましくは全てにおいて、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは、１５％以下、１０％以下、または５％以下異なる。さらに、本発明によるＦＳＨは、好ましくは、本明細書に開示される１つ以上の特定のグリコシル化特性、好ましくは表１から選択されるグリコシル化パターンを有するＦＳＨ、より好ましくはヒトＦＳＨである。細胞株ＧＴ−５ｓおよび細胞株ＧＴ−５ｓに由来する細胞株、およびこれらと同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）細胞株は、特にＦＳＨタンパク質に対して、非常に安定して均一にタンパク質を産生するため特に有利である。これらの細胞株は、非常に良好なバッチ毎の一貫性を有する、すなわち産生されるタンパク質およびそのグリコシル化パターンが、異なる産生工程から得た場合、または異なる規模で産生された場合、および／または異なる培養手順の場合に同様である。特に、本明細書に開示される多様なグリコシル化パターンは、ＦＳＨ発現用のこれらの細胞株を用いた異なる産生工程において再現性が高い。
【００２６】
本発明によるＦＳＨは、グリコシル化されている、すなわちこのＦＳＨは、ポリペプチド鎖に付着した１つ以上、好ましくは４つのオリゴ糖によって修飾されている。これらのオリゴ糖は、グリカンまたは炭水化物とも呼ばれ、直線または分岐した糖鎖であり得、好ましくは複合型Ｎ結合型オリゴ糖鎖である。分岐の数によって、オリゴ糖は、モノアンテナ型、バイアンテナ型、トリアンテナ型、またはテトラアンテナ型（さらにはペンタアンテナ型）と呼ばれる。モノアンテナ型オリゴ糖は、分岐していないが、バイアンテナ型、トリアンテナ型、またはテトラアンテナ型オリゴ糖はそれぞれ、１つ、２つ、または３つの分岐を有する。従って、高次アンテナ性を有するオリゴ糖は、より多くのオリゴ糖終点を有し、より多くの機能性末端糖単位、例えば、シアル酸などを有することができる。本明細書で使用される「少なくともトリアンテナ型」は、トリアンテナ型オリゴ糖、テトラアンテナ型オリゴ糖、およびペンタアンテナ型オリゴ糖を含む、少なくとも３つのアンテナ性を有するオリゴ糖を指す。本明細書で使用される「少なくともテトラアンテナ型」は、テトラアンテナ型オリゴ糖およびペンタアンテナ型オリゴ糖を含む、少なくとも４つのアンテナ性を有するオリゴ糖を指す。複合型Ｎ−グリカンに関して、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃ残基は、好ましくは、分岐またはアンテナとは見なされないため、ＦＳＨのアンテナ性には加えられない。
【００２７】
本明細書で言及されるＦＳＨのグリコシル化パターンは、特に、本発明によるＦＳＨ調製物中の全てのＦＳＨタンパク質の全体的なグリコシル化パターンを指す。特に、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従ってＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した、あらゆるグリカン構造が、考慮されてグリコシル化パターンに反映される。
【００２８】
用語「アシル酸」は、特に、ノイラミン酸のあらゆるＮ−置換またはＯ−置換誘導体を指す。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸および５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸の両方を指すが、好ましくは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸のみを指す。シアル酸、特に５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、好ましくは、２，３−結合または２，６−結合によって炭水化物鎖に付着する。好ましくは、本明細書に記載されるＦＳＨ調製物中に、２，３−結合シアル酸および２，６−結合シアル酸が存在する。
【００２９】
ＦＳＨのシアル化の程度は、通常はＺ数として表される。Ｚ数は、糖タンパク質のグリカン構造の相対的な負の電荷を示す。Ｚ数は、次の式によって計算される：
【００３０】
【化１】
2013535481.tif 000002
式中、Ａ１％は、−１の電荷を有するグリカンのパーセンテージであり、Ａ２％は、−２の電荷を有するグリカンのパーセンテージであり、Ａ３％は、−３の電荷を有するグリカンのパーセンテージであり、そしてＡ４％は、−４の電荷を有するグリカンのパーセンテージである。これらのパーセンテージは、電荷を帯びたグリカンおよび電荷を帯びていないグリカンを含む、ＦＳＨに付着した全てのグリカンに対して計算される。グリカンの電荷は、グリカンに含まれるあらゆる電荷を帯びた単糖単位または置換基、特にシアル酸残基および／または硫酸基（ｓｕｌｆａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）および／またはリン酸基によって付与することができる。ＦＳＨのグリカンの電荷が、一般に、それらのシアル酸残基によってのみ決定され、かつＦＳＨが、一般に４つのグリカン構造を有するため、Ｚ数は、ＦＳＨのシアル酸の量またはＦＳＨの酸性度の指標である。しかしながら、ＦＳＨが、有意な量の硫酸化グリカンも含む場合は、Ｚ数は、シアル酸と硫酸基の合計量の指標である。
【００３１】
本発明による「グリカンの相対量」は、ＦＳＨ調製物のＦＳＨ糖タンパク質に付着した、またはＦＳＨを含む組成物中のグリカンのそれぞれの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。特に、グリカンの相対量は、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従ってＦＳＨ調製物中またはＦＳＨを含む組成物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した全てのグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。１００％のグリカンは、ＦＳＨ調製物のＦＳＨ糖タンパク質に付着した、またはＦＳＨを含む組成物中の全てのグリカンのそれぞれを指す。例えば、６０％のバイセクト型ＧｌｃＮＡｃを有するグリカンの相対量は、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従って前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した全てのグリカンの６０％が、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃ残基を含む一方、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従って前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した全てのグリカンの４０％が、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃ残基を含まないＦＳＨ調製物を指す。
【００３２】
本明細書に示される数値、特に、特定のグリコシル化特性の相対量は、好ましくは、概数として理解されるべきである。特に、概数は、好ましくは、最大１０％高い、かつ／または低い、特に最大９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％高い、かつ／または低くても良い。
【００３３】
「ＦＳＨ調製物」は、ＦＳＨを含む、またはＦＳＨからなるあらゆる組成物または物質とすることができる。ＦＳＨ調製物は、固体または液体の形態とすることができ、かつＦＳＨに加えて他の成分を含むことができる。特に、ＦＳＨ調製物は、ＦＳＨおよび適切な溶媒、例えば、水および／またはアルコールを含む溶液、または、例えば、ＦＳＨを含む溶液の凍結乾燥後に得られる粉末とすることができる。ＦＳＨ調製物の適切な例は、細胞でのＦＳＨの発現後、特にＦＳＨの精製後に得られる組成物、またはＦＳＨを含む医薬組成物である。ＦＳＨ調製物は、ＦＳＨに加えて、例えば、溶媒、希釈剤、賦形剤、安定剤、防腐剤、塩、アジュバント、および／または界面活性剤を含むことができる。用語「ＦＳＨ調製物」は、本明細書では、特に、「ＦＳＨを含む組成物」の意味で使用される。これらの用語は、好ましくは、本明細書では同義的に使用される。
【００３４】
「２，６−結合シアル酸の相対量」は、２，６−結合シアル酸であるシアル酸の総量の特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。従って、１００％の２，６−結合シアル酸の相対量は、全てのシアル酸が２，６−結合シアル酸であることを意味する。例えば、６０％の２，６−結合シアル酸の相対量は、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従って前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨタンパク質のオリゴ糖鎖に付着した全てのシアル酸の６０％が、２，６−結合を介して付着している一方、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従って前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨタンパク質のオリゴ糖鎖に付着した全てのシアル酸の４０％が、２，６−結合を介して付着していないが、例えば、２，３−結合または２，８−結合を介して付着しているＦＳＨ調製物を指す。
【００３５】
用語「多様なグリコシル化パターン」は、特に、グリコシル化パターンが複数の異なるグリカン構造を含む調製物または組成物中のＦＳＨタンパク質のグリコシル化パターンを指す。異なるグリカン構造は、少なくとも１つの単糖単位および／または少なくとも１つの化学修飾、例えば、硫酸残基、もしくはアセチル残基などの存在／非存在、量、および／または位置が異なるオリゴ糖構造である。特定の「異なるグリカン構造」は、好ましくは、その相対量が、グリコシル化パターンにおけるグリカン構造の総量の少なくとも０．０２％、より好ましくは、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．１％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．２％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、または少なくとも０．５％である場合にのみ、これに関して考慮される。多様なグリコシル化パターンは、特に、少なくとも５つの異なるグリカン構造を含むグリコシル化パターンである。好ましくは、多様なグリコシル化パターンは、少なくとも７つ、より好ましくは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、そして最も好ましくは、少なくとも６０の異なるグリカン構造を含む。多様なグリコシル化パターンは、特に、グリコシル化パターンが、それぞれの調製物または組成物におけるＣＨＯ細胞から得られるＦＳＨとは異なるグリカン構造を含む調製物または組成物中のＦＳＨのグリコシル化パターンも指す。特に、グリコシル化パターンは、ＣＨＯ細胞から得られるＦＳＨとは、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも１００％異なるグリカン構造を含む。
【００３６】
用語「核酸」は、一本鎖および二本鎖の核酸およびリボ核酸ならびにデオキシリボ核酸を含む。核酸は、自然発生および合成のヌクレオチドを含むことができ、例えば、メチル化、５’キャッピング、および／または３’キャッピングによって自然にまたは合成的に修飾することができる。
【００３７】
用語「ベクター」は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、核酸を、例えば、原核生物および／または真核生物宿主細胞に導入することができ、必要に応じてこの宿主細胞のゲノムに組み込むことができる前記核酸のあらゆる中間媒体を含む。この種のベクターは、好ましくは、宿主細胞で複製され、かつ／または発現される。ベクターは、好ましくは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための１つ以上の選択マーカーを含む。適切な選択マーカーは、例えば、特定の抗生物質に対して耐性を有する宿主細胞を提供する耐性遺伝子である。さらに、適切な選択マーカーは、例えば、酵素、例えば、ＤＨＦＲまたはＧＳの遺伝子である。ＦＳＨならびに宿主細胞での高収率の組換えタンパク質の発現を可能にする適切な発現カセットおよび発現要素を含む、組換えタンパク質の発現を可能にするベクターは、当分野で周知であり、市販されているため、ここでは詳細に説明する必要がない。
【００３８】
互換的に使用される用語「細胞」および「複数の細胞」および「細胞株」は、好ましくは、１つ以上の哺乳動物細胞、特にヒト細胞を指す。この用語は、細胞または細胞集団の子孫を含む。当業者であれば、「細胞」が、単一細胞の子孫を含み、この子孫が、自然、偶然、または意図的な突然変異および／または変化により、元の親細胞と（形態または全ＤＮＡ相補体が）必ずしも完全に同一でなくても良いことを容認するであろう。「細胞」は、好ましくは、生きているヒトまたは動物の体に組み込まれていない単離細胞および／または培養細胞を指す。
【００３９】
用語「患者」は、本発明によると、ヒト、非ヒト霊長類、または別の動物、特に、哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類、例えば、マウスおよびラットを意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。ヒト患者の場合、ＦＳＨは、好ましくはヒトＦＳＨである。患者は、男性でも女性でも良く、好ましくは、女性である。
【００４０】
用語「医薬組成物」は、特に、ヒトまたは動物に投与するのに適した組成物、すなわち薬学的に許容され得る成分を含む組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤、または薬学的賦形剤、例えば、緩衝剤、防腐剤、および張性調節剤と共に、活性化合物またはその塩もしくはプロドラッグを含む。
【００４１】
ＦＳＨの国際単位（ＩＵ）は、ヒト尿ＦＳＨおよびＬＨの第４次国際標準（Ｓｔｏｒｒｉｎｇ，Ｐ．Ｌ．＆Ｇａｉｎｅｓ  Ｄａｓ，Ｒ．Ｅ．（２００１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １７１，１１９−１２９）を指し、増強卵巣増量法（Ｓｔｅｅｌｍａｎ，Ｓ．Ｌ．＆Ｐｏｈｌｅｙ，Ｆ．Ｍ．（１９５３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ５３，６０４−６１６）に従って決定される。
【００４２】
本発明による用語「不妊症の処置」は、ヒトまたは動物対象の生殖または受胎能に関連する機能障害または疾患の処置を意味する。特に、不妊症の処置は、補助的生殖技術（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、排卵誘発、体外受精、子宮内受精法、および生殖細胞の成熟の実現または改善、例えば、卵胞形成および精子形成を含む。
【００４３】
本発明によると、用語「有意な量のｃＡＭＰが放出されない」または同様の表現はそれぞれ、特に、ｃＡＭＰの最大放出となる濃度のＦＳＨによる刺激後に細胞または組織によって得られるｃＡＭＰの放出量の２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは、１５％未満、１０％未満、７．５％未満、５％未満、または２．５％未満である、細胞または組織によるｃＡＭＰの放出量を指す。これらの細胞、例えば、顆粒膜細胞もしくはセルトリ細胞、または組織は、ＦＳＨによる刺激を受けやすい、またはこの刺激に応答する。ＦＳＨに依存しないｃＡＭＰの放出、すなわちＦＳＨが存在しなくても起こるｃＡＭＰの放出は、これに関して考慮されるべきではない。好ましくは、「有意な量のｃＡＭＰの放出」または「ｃＡＭＰの有意な放出」とは、ＦＳＨの非存在下でのｃＡＭＰの放出を超えるｃＡＭＰのあらゆる放出、特に、測定誤差を超えるｃＡＭＰのあらゆる検出可能な放出のことである。ｃＡＭＰの放出を測定する標準的な手順が、実施例で説明され、ｃＡＭＰの有意な放出または有意でない放出の決定に使用することができる。「ｃＡＭＰの放出」は、ｃＡＭＰの細胞内放出および／またはｃＡＭＰの細胞外放出もしくは分泌を指し、好ましくは、ｃＡＭＰの分泌のみを指す。ｃＡＭＰは、細胞シグナル伝達においてセカンドメッセンジャーとして機能する環状アデノシン一リン酸を指す。ｃＡＭＰは、アデニリルシクラーゼによってＡＴＰから細胞内で合成される。「ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない」生物学的プロセスまたはシグナル伝達経路は、好ましくは、アデニリルシクラーゼの活性化に関与しない。
【００４４】
「性ステロイド」は、性腺ステロイドまたは性ホルモンとしても知られており、特に、脊椎動物のアンドロゲン受容体またはエストロゲン受容体と相互作用するステロイドホルモンを指す。用語「性ステロイド」は、アンドロゲン、例えば、アナボリックステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、およびテストステロン；エストロゲン、例えば、エストラジオール、エストリオール、およびエストロン；およびプロゲステロンを含む。好ましくは、性ステロイドは、自然発生の性ステロイド、より好ましくは天然のヒト性ステロイドを指す。
【００４５】
本発明による好ましい性ステロイドは、エストラジオールおよびプロゲステロン、特にプロゲステロンである。
【００４６】
本発明は、最適なグリコシル化パターンを有する改良型組換えＦＳＨ調製物が、有意なｃＡＭＰの放出が誘発されない低いＦＳＨ濃度での性ステロイド、例えば、プロゲステロンの分泌を誘発することができるという発見に基づいた一態様によるものである。特に、この特定の態様では、本発明による改良型ＦＳＨは、一般的に使用される尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞から得られる組換えＦＳＨよりもはるかに低い濃度で性ステロイドの分泌を誘発する。従って、改良型ＦＳＨは、はるかに少ない用量で投与することができ、有害作用のリスクを低減し、生産コストをさらに削減する。さらに、同等の用量で投与されると、この実施形態では、改良型ＦＳＨは、一般的に使用されるＦＳＨと比較して患者の体により長く活性を提供する。なぜなら、投与から長時間が経過しても、非常に低い濃度のＦＳＨが循環中に残っていると、本発明のこの実施形態によるＦＳＨが、なおその生物学的活性を与える、好ましくは、生殖細胞の成熟および／または性ステロイドの放出を刺激または共刺激するためである。さらに、高濃度では、本発明による改良型ＦＳＨおよび一般的に使用される尿ＦＳＨまたはＣＨＯ由来ＦＳＨは、同等の効果を示す。従って、一般的に使用されるＦＳＨと比較して、過量摂取のさらなるリスクが存在しない。
【００４７】
さらに、本発明者らは、本発明による改良型ＦＳＨが、一般的に使用される尿ＦＳＨまたはＣＨＯ由来ＦＳＨと比較すると、同様またはさらに高い薬理効果を有することをカニクイザルで実証した。これは、本発明によるＦＳＨが、ラットおよびサルにおいて、尿またはＣＨＯ細胞から得られる一般的なＦＳＨ調製物よりも低い最大血清濃度（Ｃｍａｘ）および循環半減期を示すため、特に驚くべきことである。より低いバイオアベイラビリティにもかかわらず、改良型ＦＳＨは、同様またはより高い薬理効果を有するため、本発明による改良型ＦＳＨは、尿ＦＳＨまたはＣＨＯ由来ＦＳＨよりも高い特定の治療活性を有すると結論付けることができる。得られた臨床データによると、ヒトにおいて、本発明による改良型ＦＳＨは、一般的なＦＳＨ調製物よりも有意に高いＣｍａｘを有する；しかしながら、循環半減期は、改良型ＦＳＨでは、やや低いが同等である。最も驚くべきことに、本発明による改良型ＦＳＨ調製物は、わずか単回投与後であっても、ヒトにおける治療上の効能、特に卵胞の成長を示した。対照的に、一般的に使用されるＦＳＨ調製物の単回投与後には、一切の効果を観察することができなかった。従って、改良型ＦＳＨでは、患者のはるかに正確な治療が可能になると期待される。特に、正確に時間を決めて適切な用量を使用して処置、特に患者の不妊症を改善することが可能であり、長期の連続的な処置の必要がない可能性がある。従って、多胎妊娠のリスクも低減される。
【００４８】
要約すると、本発明による改良型ＦＳＨ調製物は、より効果的である。従って、より少ない用量を患者に投与することができ、これにより、有害作用が起きにくく、患者にとってより便利であり、それほど高コストではない。さらに、改良型ＦＳＨでは、より具体的かつ詳細な投与計画が可能である。さらに、半減期の減少は、望ましくない副作用を低減し、治療終了後のヒトの体からＦＳＨを迅速に排除する。
【００４９】
理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、本発明によるＦＳＨ調製物のより高い特定の治療活性が、改良型グリコシル化パターンに基づいていると考えている。特に、多量のバイセクト型ＧｌｃＮＡｃ残基および／または多量の２，６−結合シアル酸ならびに多量の硫酸化グリカンが、高い活性に関与し得る。さらに、本発明によるＦＳＨ調製物はまた、はるかに多様で複雑なグリコシル化パターン、すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞から得られる従来のＦＳＨ調製物と比較して、より多くの異なるグリカン構造が調製物中に存在することも示す。ＣＨＯ由来ＦＳＨは、標的細胞における１つの経路しか活性化することができないが、本発明による改良型ＦＳＨは、そのユニークなグリコシル化パターンにより、明らかに複数の異なる経路を介してその生物学的活性を与え、結果として生物学的応答の増加をもたらすと考えられる。本明細書の実験データによって示されるように、一部のこれらの経路は、ｃＡＭＰシグナル伝達を伴うが、他の新規な経路は、ｃＡＭＰに依存しない。
【００５０】
これらの知見から、本発明は、第１の態様において、ＦＳＨ調製物を提供し、この調製物中のＦＳＨは、１つ以上の以下の特徴を含むグリコシル化パターンを有する：
（ｉ）少なくとも２０％のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）少なくとも３０％のフコースを有するグリカンの相対量；および／または
（ｉｉｉ）少なくとも３０％の２，６−結合シアル酸の相対量；および／または
（ｉｖ）グリコシル化パターンが、多様なグリコシル化パターンである。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明は、ＦＳＨ調製物を提供し、この調製物中のＦＳＨが、１つ以上の以下の特徴を含むグリコシル化パターンを有する：
（ｉ）少なくとも３５％のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）少なくとも６０％のフコースを有するグリカンの相対量；および
（ｉｉｉ）少なくとも３０％の２，６−結合シアル酸の相対量。
【００５２】
好ましくは、前記ＦＳＨは、組換えＦＳＨであるため、好ましくはヒト宿主細胞である宿主細胞での組換え産生によって得られる。それぞれのグリコシル化パターンを提供する適切なヒト宿主細胞は、後に説明される。
【００５３】
好ましくは、グリコシル化パターンは、特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の少なくとも２つ（特に、特徴（ｉ）および（ｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉｉ）、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ））、より好ましくは特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の全てを含む。さらに、グリコシル化パターンは、少なくとも１５％の少なくともテトラアンテナ型のグリカンの相対量、および／または少なくとも８０％の１つ以上のシアル酸残基を有するグリカンの相対量、および／または少なくとも９５％のガラクトースを有するグリカンの相対量、および／または少なくとも６０％の末端ガラクトース単位を有するグリカン分岐の相対量、および／または少なくとも１％、好ましくは少なくとも２．５％の硫酸基を有するグリカンの相対量をさらに含むことができる。末端ガラクトース単位は、任意選択で、シアル酸残基をさらに有することができる。組成物中の組換えＦＳＨは、好ましくは、少なくとも２００のＺ数を有する。
【００５４】
ｂｉｓＧｌｃＮＡｃを有するグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２５％、少なくとも２７％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％である。より好ましくは、ｂｉｓＧｌｃＮＡｃを有するグリカンの相対量は、約２５％〜約６０％の範囲、特に約３５％〜約６０％の範囲、または約３８％〜約５０％の範囲、または約４０％〜約４５％の範囲である。一実施形態によると、ｂｉｓＧｌｃＮＡｃを有するグリカンの相対量は、約４２％である。１つ以上のシアル酸残基を有するグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも８３％、少なくとも８５％、または少なくとも８８％、より好ましくは、約８５％〜約９８％の範囲、または約８８％〜約９５％の範囲、最も好ましくは、約９０％である。Ｚ数は、好ましくは、少なくとも２１０、より好ましくは、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２３０、または少なくとも２４０である。より高いＺ数は、例えば、酸性および／または負に帯電したＦＳＨタンパク質についてＦＳＨ調製物を濃縮することによって得ることが可能である。好ましくは、少なくともテトラアンテナ型のグリカンの相対量は、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、または少なくとも１９％、より好ましくは、少なくとも２０％、または少なくとも２１％である。少なくともテトラアンテナ型のグリカン、特にトリアンテナ型およびテトラアンテナ型のグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％である。好ましくは、フコースを有するグリカンの相対量は、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、または少なくとも７８％である。フコースを有するグリカンの相対量は、約７０％〜約９０％の範囲、特に約７５％〜約８５％の範囲である。好ましくは、２，６−結合シアル酸の相対量は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５３％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％、特に約４０％〜約９９％、好ましくは、約４０％〜約８０％、約５０％〜約６０％、または約５３％〜約７０％の範囲である。好ましくは、２，３−結合シアル酸の２，６−結合シアル酸に対する比率は、約１：１０〜約７：３、より好ましくは約１：５〜約３：２または約１：２〜約１：１、最も好ましくは約２：３〜約１：１の範囲である。好ましい実施形態では、２，６−結合シアル酸の相対量は、２，３−結合シアル酸の相対量を上回る。ガラクトースを有するグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも９７％、最も好ましくは約９８％である。好ましくは、任意選択でシアル酸残基によって修飾されたガラクトース単位を有するグリカン分岐の相対量は、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％または少なくとも７３％である。ガラクトース単位を有するグリカン分岐の相対量は、好ましくは約６０％〜約９５％の範囲、より好ましくは約７０％〜約８０％の範囲である。好ましくは、硫酸基（硫酸化グリカン）を有するグリカンの相対量は、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、または少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも７％、少なくとも１０％、または少なくとも１２％である。一実施形態によると、硫酸基を有するグリカンの相対量は、５０％を超えない、好ましくは、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％を超えない。
【００５５】
好ましい実施形態では、調製物中のＦＳＨは、多様なグリコシル化パターンを有し、この調製物中のＦＳＨは、少なくとも４５、または好ましくは少なくとも５０の異なるグリカン構造を含み、この異なるグリカン構造のそれぞれが、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％の相対量を有する。一実施形態によると、調製物中のＦＳＨは、少なくとも３５、または好ましくは少なくとも４０の異なるグリカン構造を含み、この異なるグリカン構造のそれぞれが、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．１％の相対量を有し；かつ／または調製物中のＦＳＨは、少なくとも２０、または好ましくは少なくとも２５の異なるグリカン構造を含み、この異なるグリカン構造のそれぞれが、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．５％の相対量を有する。さらなる実施形態では、調製物中のＦＳＨは、対応する調製物中のＣＨＯ細胞から得られるＦＳＨとは、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％異なるグリカン構造を含み、この異なるグリカン構造のそれぞれが、それぞれの調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％、０．１％、または０．５％の相対量を有する。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を含まない、または検出可能な量のＮｅｕＧｃを含まない。さらに、本発明による組換えＦＳＨ調製物はまた、Ｇａｌｉｌｉエピトープ（Ｇａｌα１，３−Ｇａｌ構造）を含まない、または検出可能な量のＧａｌｉｌｉエピトープを含まない。
【００５７】
本発明は、特に、ヒトグリコシル化パターンを有するＦＳＨを提供する。これらのグリコシル化特性により、副作用を誘発する外来免疫原性非ヒト構造が存在しない、すなわち、特定の外来糖構造、例えば、共にげっ歯類産生系で知られている免疫原性非ヒトシアル酸（ＮｅｕＧｃ）またはＧａｌｉｌｉエピトープ（Ｇａｌ−Ｇａｌ構造）、または、例えば、酵母系から知られているような免疫原性高マンノース構造のような他の構造によって引き起こされることが知られている望ましくない副作用または不都合が回避されることを意味する。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明による調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、１つ以上、好ましくは以下の全ての特徴を含む：
（ｉ）約２５％〜約５０％の範囲のバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）少なくとも３５％のフコースを有するグリカンの相対量；
（ｉｉｉ）少なくとも５３％の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｉｖ）少なくとも８８％の１つ以上のシアル酸残基を有するグリカンの相対量；および
（ｖ）少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型のグリカンの相対量。
【００５９】
特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、以下の表１に列記されているグリコシル化パターンの１つを有する。
【００６０】
【表１】
2013535481.tif 000003
表１に列記されている実施形態１〜１２では、好ましくは、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃの相対量は、少なくとも２０％ではなく、少なくとも２５％であり；かつ／または２，６−結合シアル酸の相対量は、好ましくは、少なくとも５３％ではなく、少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％であり；かつ／または硫酸化グリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２．５％ではなく、少なくとも３％、より好ましくは少なくとも１０％である。表１に列記されているグリコシル化パターンは、好ましくは、ヒトグリコシル化パターンであり、かつ／またはＮｅｕＧｃおよびＧａｌｉｌｉエピトープを含まない。
【００６１】
さらに、本発明は、ヒト宿主細胞またはヒト細胞株での産生によって得ることができる組換えＦＳＨ調製物を提供する。好ましくは、組換えＦＳＨは、ヒト骨髄性細胞株、好ましくは不死化ヒト骨髄性白血病細胞株、特に細胞株ＧＴ−５ｓまたはこの細胞株ＧＴ−５ｓに由来する細胞株、またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株から得ることができる。前記細胞株で産生されるＦＳＨが、上記のグリコシル化パターンを示す、特に、本明細書に記載される有利な治療的効果および薬理効果を示すことが見出された。従って、本発明はまた、適切な細胞株、特に上記の細胞株、好ましくは細胞株ＧＴ−５ｓ、ＧＴ−５ｓに由来する細胞株、またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株でＦＳＨを組換え的に発現することによって組換えＦＳＨ調製物を生産する方法に関する。それぞれ生産される組換えＦＳＨは、単離することができ、任意選択で精製することができる。
【００６２】
従って、組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、以下のステップを含むプロセスによって得ることができる：
（ｉ）ＦＳＨの発現に適した条件下でＦＳＨαサブユニットおよびβサブユニットをコードする核酸を含む、好ましくは細胞株ＧＴ−５ｓまたは同種の細胞株に由来するヒト宿主細胞を培養するステップ；および
（ｉｉ）ＦＳＨを単離するステップ。
【００６３】
発現に使用されるヒト宿主細胞は、好ましくは骨髄性細胞、特に不死化骨髄性白血病細胞であり、好ましくは、細胞株ＧＴ−５ｓであるかまたは細胞株ＧＴ−５ｓに由来する、またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株である。ヒト宿主細胞は、ＦＳＨを発現するように培養される。適切な培養条件は、当業者には公知である。
【００６４】
ＦＳＨの単離は、好ましくは、以下のさらなるステップを含む：
（ａ）ＦＳＨがヒト細胞によって分泌される培養上清を得る、またはＦＳＨが分泌されないヒト細胞を溶解するステップ；
（ｂ）クロマトグラフステップ、例えば、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィを用いてＦＳＨを培養上清または細胞溶解物から単離するステップ；および
（ｃ）好ましくは、塩基性ＦＳＨアイソフォームを除去する洗浄ステップ、例えば、約ｐＨ５．０、または約ｐＨ４．５、または約ｐＨ４．０での洗浄ステップを含むアニオン交換クロマトグラフィを用いて、塩基性ＦＳＨアイソフォームを除去することによって、任意選択でＦＳＨの酸性画分を得るステップ。
【００６５】
好ましくは、ＦＳＨαサブユニットをコードする核酸およびＦＳＨβサブユニットをコードする核酸が、ヒト宿主細胞での発現を可能にする適切な発現ベクターに含まれる発現カセットに含められる。ＦＳＨαサブユニットをコードする核酸およびＦＳＨβサブユニットをコードする核酸は、同じベクター内に含めることができるが、好ましくは、別個のベクターに含められる。さらに、これらの核酸は、適切な要素、例えば、ＩＲＥＳ要素を用いて１つの発現カセットから発現させることもできる。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞によって分泌される。好ましい実施形態では、ヒト細胞の培養は、発酵槽で、かつ／または無血清条件下で行われる。
【００６６】
組換えＦＳＨの適切な精製プロセスは、例えば、米国特許出願第６１／２６３，９３１号、欧州特許出願第０９０１４５８５．５号、およびＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１１／０６３９４３号に記載されている。
【００６７】
ヒト宿主細胞またはヒト細胞株での産生によって得ることができる組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、本発明による組換えＦＳＨ調製物に関して本明細書に記載される特徴を示す。特に、そのグリコシル化パターンは、上記の１つ以上の特徴、好ましくは表１および／または請求項１〜６に記載されている少なくとも１つのグリコシル化パターンを含む。
【００６８】
本発明の態様の好ましい実施形態では、本発明による組換えＦＳＨは、好ましくは、ヒトＦＳＨサブユニットをコードする１つ以上の核酸および宿主細胞で前記１つ以上の核酸を発現する要素を含むヒト細胞株、例えば、細胞株ＧＴ−５ｓでの産生によって得ることができる、組換えヒトＦＳＨ（ｒｈＦＳＨ）である。好ましくは、ｒｈＦＳＨのαサブユニットは、配列番号：１に一致するアミノ酸配列、または全長の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％にわたって配列番号：１に対して相同性、または好ましくは同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ｒｈＦＳＨのαサブユニットは、位置５２および７８にアスパラギン残基を含み、アミノ酸Ａｓｎ５２およびＡｓｎ７８でグリコシル化している。ｒｈＦＳＨのβサブユニットは、好ましくは、配列番号：２に一致するアミノ酸配列、または全長の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％にわたって配列番号：２に対して相同性、または好ましくは同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ｒｈＦＳＨのβサブユニットは、位置７および２４にアスパラギン残基を含み、アミノ酸Ａｓｎ７およびＡｓｎ２４でグリコシル化している。
【００６９】
一実施形態によると、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、
（ａ）有意な量のｃＡＭＰが放出されない濃度で；かつ／または
（ｂ）ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しないシグナル伝達経路を誘発することによって、
顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる。
【００７０】
一実施形態によると、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激または共刺激することができる。驚くべきことに、上記のグリコシル化パターンが、本明細書に記載される薬理学的および治療上の利点を示す、組換えＦＳＨのそれぞれの新規な薬理学的プロフィールとなることを実験で見出した。
【００７１】
本発明による組換えＦＳＨ調製物は、顆粒膜細胞アッセイ（例えば、実施例２に記載されているような）で決定できる、後に記載される１つ以上の特徴を有することができる。実施例によって実証されるように、上記のグリコシル化パターンを有する組換えＦＳＨ、特に、細胞株ＧＴ−５ｓでの産生によって得ることができる組換えＦＳＨは、本明細書に記載される薬理学的および治療上の利点となる後に記載される特徴を示す。
【００７２】
組換えＦＳＨ調製物は、一実施形態によると、顆粒膜細胞によるｃＡＭＰの放出の誘発に必要な最小濃度よりも低い濃度において、顆粒膜細胞でのプロゲステロンの放出を刺激することができる。後述するプロゲステロン、エストラジオール、および／またはｃＡＭＰの放出とは、特に以下の実施例２に記載される条件下での、約１＊１０４〜約１＊１０６の顆粒膜細胞／ｍｌ、好ましくは約５＊１０４〜約１＊１０５の顆粒膜細胞／ｍｌのインビトロでの放出を指す。
【００７３】
好ましくは、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ｃＡＭＰの放出を誘発しない濃度、または２０ｐｍｏｌ／ｍｌ未満、１５ｐｍｏｌ／ｍｌ未満、１０ｐｍｏｌ／ｍｌ未満、５ｐｍｏｌ／ｍｌ未満のｃＡＭＰの放出を誘発する濃度において、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンを放出することができる。
【００７４】
さらに、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）に必要な濃度よりも低いＦＳＨ濃度において、好ましくは、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも３００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンを放出することができる。従って、組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）がそれぞれ、対応する等しいプロゲステロンの高い放出をもたらさない濃度において、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも３００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンを放出することができる。実施例によって実証されるように、本発明による組換えＦＳＨは、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）よりも強くプロゲステロンの産生をそれぞれ刺激し、誘発する。
【００７５】
さらに、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、ｃＡＭＰの放出を誘発しない、または２０ｐｍｏｌ／ｍｌ未満、１５ｐｍｏｌ／ｍｌ未満、１０ｐｍｏｌ／ｍｌ未満、５ｐｍｏｌ／ｍｌ未満のｃＡＭＰの放出を誘発するＦＳＨ濃度において、少なくとも５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、少なくとも７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、少なくとも１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、少なくとも１２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｎｍｏｌ／ｍｌのエストラジオールを放出することができる。
【００７６】
さらに、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）に必要な濃度よりも低いＦＳＨ濃度において、少なくとも５０ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも７５ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも１００ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも１２５ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも１５０ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも２００ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも２５０ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも３００ｎｍｏｌ／ｌ、または少なくとも３５０ｎｍｏｌ／ｌのエストラジオールを放出することができる。従って、組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）がそれぞれ、対応する等しいエストラジオールの高い放出をもたらさない濃度において、少なくとも５０ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも７５ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも１００ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも１２５ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも１５０ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも２００ｎｍｏｌ／ｌ、少なくとも２５０ｎｍｏｌ／ｌ、３００ｎｍｏｌ／ｌ、または少なくとも３５０ｎｍｏｌ／ｌのエストラジオールを放出することができる。実施例によって実証されるように、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ヒト尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞で産生される組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）よりも強くエストラジオールの産生をそれぞれ刺激し、誘発する。
【００７７】
ｃＡＭＰの放出および性ステロイドの発現について本明細書に記載されるそれぞれの特徴は、例えば、実施例２に記載されるように、顆粒膜細胞アッセイを用いることによって分析して決定することができる。
【００７８】
本発明による組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは医薬組成物中に存在する。従って、本発明の別の態様は、本明細書で定義される不妊症の処置に使用される、本発明による組換えＦＳＨ調製物を含む医薬組成物である。この医薬組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤、特に、不妊症の処置に有用なさらなる薬剤、例えば、他の性腺刺激ホルモン、特にＬＨおよび／またはＣＧ、好ましくは、組換えＬＨもしくはＣＧおよび／またはヒトＬＨもしくはＣＧを含むことができる。あるいは、組換えＦＳＨを含む医薬組成物は、このようなさらなる薬学的に活性な薬剤と併用するように設計することができる。
【００７９】
さらに、本発明は、不妊症の処置に使用するための、本発明による組換えＦＳＨ調製物または本発明による医薬組成物、ならびに本発明による組換えＦＳＨ調製物または本発明による医薬組成物を患者に投与するステップを含む不妊症の処置方法を提供する。
【００８０】
上記のように、特定の実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、既に有意な量のｃＡＭＰが放出されない濃度において、性ステロイド、例えば、プロゲステロンの放出、特に顆粒膜細胞でのプロゲステロンの放出を刺激または共刺激することができる。特に、本発明による組換えＦＳＨは、顆粒膜細胞によるｃＡＭＰの放出を誘発するのに必要な最小濃度よりも低い濃度において、顆粒膜細胞での性ステロイド、例えば、プロゲステロンの放出を刺激することができる。
【００８１】
さらに、特定の実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しないシグナル伝達経路を誘発することによって、プロゲステロンの放出、特に顆粒膜細胞でのプロゲステロンの放出を刺激することができる。好ましくは、不妊症の処置は、プロゲステロンの放出の刺激を招く、本発明による組換えＦＳＨによる、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しないシグナル伝達経路の誘発を含む。しかしながら、ｃＡＭＰシグナル伝達を含む他のシグナル伝達経路は、組換えＦＳＨによって追加的に活性化することができる。他の実施形態では、不妊症の処置は、本発明による組換えＦＳＨによるｃＡＭＰの有意な放出の誘発を含まない。
【００８２】
さらなる実施形態では、上記のように、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟を刺激または共刺激することができる。
【００８３】
従って、本発明は、同様にｃＡＭＰに依存しない性ステロイドの分泌を誘発および／または刺激するための上記の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物にも関する。さらに、本発明は、ｃＡＭＰのシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激または共刺激するための上記の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物にも関する。加えて、本発明はまた、有意なｃＡＭＰの放出が誘発されないＦＳＨ濃度で性ステロイドの分泌を誘発および／または刺激するための上記の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物に関する。さらに、本発明、一般的に使用される尿ＦＳＨまたはＣＨＯ細胞から得られる組換えＦＳＨよりもはるかに低い濃度で性ステロイドの分泌を誘発するための上記の組換えＦＳＨ調製物または医薬組成物にも関する。特に不妊症の処置におけるそれぞれの使用の薬学的および治療上の利点は、詳細に上記説明した。
【００８４】
特に、不妊症の処置は、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟の刺激または共刺激を含むことができる。しかしながら、不妊症の処置は、ｃＡＭＰシグナル伝達を伴う１つ以上の他の生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟の刺激をさらに含むことができる。他の実施形態では、不妊症の処置は、そのような他の生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟の刺激を伴わない。
【００８５】
生殖細胞の成熟は、好ましくは卵胞の成長および／または精子形成を含む。さらに、ＦＳＨが生殖細胞の成熟を刺激する生物学的プロセスは、好ましくは顆粒膜細胞による、性ステロイド、特にプロゲステロンの分泌を含むことができる。好ましくは、ｃＡＭＰシグナル伝達に依存しない生物学的プロセスとは、メッセンジャー分子としてｃＡＭＰを伴わないシグナル伝達経路によって誘発される、好ましくは顆粒膜細胞による性ステロイド、特にプロゲステロンの分泌を指す。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、わずか単回投与後であっても、生物学的効果を引き出すことができる。特に、本発明によるＦＳＨ調製物または本発明による医薬組成物は、このＦＳＨ調製物または医薬組成物のわずか単回投与後に、患者、特にヒト患者における卵胞の成長および／または卵子の成熟を誘発することができる。好ましくは、わずか単回投与後に達成される生物学的効果は、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物と比較して、特に、卵胞の成長および／または卵子の成熟で高く、より明白であり、かつ／または処置された患者のより高い割合で達成される。前記単回投与は、特に、少なくとも１０ＩＵ  ＦＳＨ、好ましくは、少なくとも１５ＩＵ  ＦＳＨ、少なくとも２０ＩＵ  ＦＳＨ、または少なくとも２５ＩＵ  ＦＳＨ、および／または１０００ＩＵ  ＦＳＨ以下、好ましくは、７５０ＩＵ  ＦＳＨ以下、５００ＩＵ  ＦＳＨ以下、３００ＩＵ  ＦＳＨ以下、２００ＩＵ  ＦＳＨ以下、１５０ＩＵ  ＦＳＨ以下、１００ＩＵ  ＦＳＨ以下、または５０ＩＵ  ＦＳＨ以下を含む。好ましくは、前記単回投与は、約１０ＩＵ〜約５００ＩＵ  ＦＳＨ、より好ましくは、約２０ＩＵ〜約３００ＩＵ  ＦＳＨ、例えば、約２５ＩＵ  ＦＳＨ、約７５ＩＵ  ＦＳＨ、または約１００ＩＵ  ＦＳＨを含む。
【００８７】
さらなる実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物よりも短い循環半減期を有する。特に、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのうちの１つ以上において短い循環半減期を有する。好ましくは、循環半減期は、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物の半減期よりも少なくとも５％短い、より好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％短い。特定の実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、特に、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物よりも低いバイオアベイラビリティを有する。好ましくは、このバイオアベイラビリティは、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物のバイオアベイラビリティよりも少なくとも５％低い、より好ましくは、少なくとも１０％低い、少なくとも１５％低い、または少なくとも２０％低い。これに関するバイオアベイラビリティは、好ましくは、血清ＦＳＨ濃度が、指定された量のＦＳＨの投与後の異なる時点で決定される薬物動態試験で得られる曲線（ＡＵＣ）値の下側の面積を指す。循環半減期およびバイオアベイラビリティは、好ましくは、皮下注射によるＦＳＨの投与後、特に単回投与後に決定され、この単回投与は、好ましくは、約１０〜約１０００ＩＵ  ＦＳＨ、より好ましくは、約２５ＩＵ〜約５００ＩＵ  ＦＳＨ、または約５０ＩＵ〜約３００ＩＵ  ＦＳＨ、特に約１００ＩＵ  ＦＳＨを含む。特に、循環半減期およびバイオアベイラビリティは、以下の実施例６に開示されるように決定される。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、特に、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物および／またはＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物の治療上の効能と同様またはそれよりも高い治療上の効能を有する。用語「治療上の効能」は、好ましくは、対象に投与されたときにエストラジオールおよび／またはインヒビン−Ｂの放出を刺激する能力を指す。治療上の効能は、好ましくは、皮下注射によるＦＳＨの投与後、特に、単回投与後に１以上の対象の血液または血清におけるエストラジオールおよび／またはインヒビン−Ｂの濃度を測定することによって決定し、この単回投与は、好ましくは、約１０〜約１０００ＩＵ  ＦＳＨ、好ましくは、約２５ＩＵ〜約５００ＩＵ  ＦＳＨ、または約５０ＩＵ〜約３００ＩＵ  ＦＳＨ、特に約１００ＩＵ  ＦＳＨを含む。特に、治療上の効能は、以下の実施例５に開示されているように決定される。同様の治療上の効能は、特に、それぞれのＦＳＨ調製物によるエストラジオールおよび／またはインヒビン−Ｂの放出の刺激であって、エストラジオールおよび／またはインヒビン−Ｂの血清濃度が、互いに２５％以下、好ましくは、２０％以下、１５％以下、または１０％以下異なる、該刺激を指す。
【００８９】
ヒト尿素から得られるＦＳＨ調製物は、特に、閉経後の女性の尿から得られる。ＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物は、例えば、ＣＨＯ細胞株ＣＨＯｄｈｆｒ−［ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６］で発現される。ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物およびＣＨＯ細胞で発現されるＦＳＨ調製物は、好ましくは市販され、承認された医薬調製物、特に、それぞれＢｒａｖｅｌｌｅおよびＧｏｎａｌ−ｆである。異なるＦＳＨ調製物の効果、特にそれらの循環半減期、バイオアベイラビリティ、および治療上の効能を比較する場合は、ＦＳＨ調製物を、同じ投与経路および同様または同じさらなる条件を用いて、同じ投与計画により類似の対象群にＦＳＨ調製物を投与することによって分析する。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、患者の循環中のＦＳＨ濃度が５ＩＵ／Ｌ未満となる用量で患者に投与される。特定の実施形態では、患者に投与される用量は、患者の循環中のＦＳＨ濃度を、約４ＩＵ／Ｌ未満、特に、約３ＩＵ／Ｌ未満、約２ＩＵ／Ｌ未満、約１ＩＵ／Ｌ未満、または約０．５ＩＵ／Ｌ未満にする。患者の循環中のＦＳＨの濃度は、例えば、約０．０１〜約５ＩＵ／Ｌ、特に約０．０５〜約２ＩＵ／Ｌ、約０．１〜約１．５ＩＵ／Ｌ、または約０．２〜約１ＩＵ／Ｌである。特に、ＦＳＨは、ｃＡＭＰの有意な放出を誘発しない用量で患者に投与される。実施例で実証されるように、特定の実施形態における本発明による組換えＦＳＨ調製物は、これらの濃度で治療上の効能を引き出す。しかしながら、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、患者の循環中でより高いＦＳＨ濃度となる用量で投与することもできる。
【００９１】
好ましい実施形態では、不妊症の処置は、補助的生殖技術、排卵誘発、体外受精、例えば、細胞質内精子注入法による体外受精、卵管内配偶子移植法、子宮内受精法、女性の無排卵障害（ａｎｏｖｕｌａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の処置、女性の卵成熟の重度ホルモン欠乏症の処置、男性の精子産生不全（ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）の処置、ならびに／または例えば、体外受精刺激プロトコル中、および／または無排卵障害の処置における、生殖細胞成熟、例えば、卵胞形成（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）および精子形成、特に女性の卵胞成熟の促進（ｅｎａｂｌｅｍｅｎｔ）または改善を含む。
【００９２】
好ましくは、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、患者に非経口投与される。特に、組換えＦＳＨは、注射または注入、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下に投与されるべきである。本発明の特定の実施形態では、組換えＦＳＨは、医薬組成物中に存在する。適切な投与計画は、当業者によって決定することができ、当技術分野の一般的な知識から得ることができる。
【００９３】
本発明による医薬組成物は、単一単位の投与量または複数単位の投与量の形態にすることができる。好ましくは、医薬組成物は、本発明による組換えＦＳＨ調製物を含み、溶媒、例えば、水、緩衝物質、安定剤、防腐剤、賦形剤、界面活性剤、および塩からなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む滅菌溶液である。単一単位の投与量は、好ましくは、約１０ＩＵ〜約７５０ＩＵ  ＦＳＨ、より好ましくは、約２５ＩＵ〜約５００ＩＵ  ＦＳＨ、約５０ＩＵ〜約４００ＩＵ  ＦＳＨ、または約１００ＩＵ〜約３００ＩＵ  ＦＳＨを含む。複数単位の投与量は、複数の単回投与、特に、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも５０の単回投与を提供するのに十分なＦＳＨを含む。医薬組成物は、例えば、ペン型注射器の形態にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、異なる濃度の改良型組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；調製物１：空白の四角形、調製物２：黒塗りの三角形）またはＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ；黒塗りの菱形）で刺激された単離顆粒膜細胞のｃＡＭＰの放出を示している。
【図２】図２は、異なる濃度の改良型組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；調製物１：空白の四角形、調製物２：黒塗りの三角形）またはＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ；黒塗りの菱形）で刺激された単離顆粒膜細胞のエストラジオール合成を示している。
【図３】図３は、異なる濃度の改良型組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；調製物１：空白の四角形、調製物２：黒塗りの三角形）またはＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ；黒塗りの菱形）で刺激された単離顆粒膜細胞のプロゲステロン合成を示している。
【図４】図４は、異なる濃度の改良型組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；空白の四角形）または尿ＦＳＨ（Ｆｏｓｔｉｍｏｎ；黒塗りの菱形）で刺激された単離顆粒膜細胞のｃＡＭＰの放出を示している。
【図５】図５は、異なる濃度の改良型組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；空白の四角形）または尿ＦＳＨ（Ｆｏｓｔｉｍｏｎ；黒塗りの菱形）で刺激された単離顆粒膜細胞のエストラジオールの合成を示している。
【図６】図６は、異なる濃度の改良型組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；空白の四角形）または尿ＦＳＨ（Ｆｏｓｔｉｍｏｎ；黒塗りの菱形）で刺激された単離顆粒膜細胞のプロゲステロンの合成を示している。
【図７】図７は、標準的な尿ＦＳＨおよびＣＨＯ細胞から得られた標準的な組換えＦＳＨと比較した、改良型組換えヒトＦＳＨを用いたＳｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイの結果を示している。３日間の連日投与後の未成熟雌ラットにおける卵巣重量増加が、使用されたＦＳＨ濃度に対してプロットされている。
【図８】図８は、ＦＳＨ（本発明）、尿ＦＳＨ  Ｂｒａｖｅｌｌｅ、またはＣＨＯ細胞で発現された組換えＦＳＨ  Ｇｏｎａｌ−ｆの単回（Ａ）および反復（Ｂ）皮下注射後のカニクイザルで観察されたエストラジオール（Ｅ２）およびインヒビン−Ｂの血清濃度を示している。それぞれのバーは、４頭の動物の平均および標準偏差を示している。
【図９】図９は、単回静脈注射または皮下注射後の雌カニクイザルにおけるＦＳＨの血清濃度を示している。それぞれの記号は、４頭の動物群の平均値を表している。
【図１０】図１０は、ＦＳＨグリコシル化部位に付着することができる複合型グリカン構造の模式図を示している。（ａ）バイアンテナ型構造、（ｂ）トリアンテナ型構造、および（ｃ）テトラアンテナ型構造が示されている。１つ以上のシアル酸残基およびガラクトース残基も、これらの構造にも存在し得ず、これらの構造は、例えば、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃ残基、フコース残基、および／または硫酸残基をさらに含むことができる。Ｓｉａ：シアル酸；Ｇａｌ：ガラクトース、本明細書では末端ガラクトースとも呼ばれる；ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍａｎ：マンノース。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
（実施例１：ＦＳＨ（本発明）の調製）
ＦＳＨは、ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖（α鎖アセッション番号ＮＴ＿００７２９９．１３；β鎖アセッション番号ＮＴ＿００９２３７．１８）を有する２つの発現構築物が安定に形質移入されたＧＴ−５ｓ細胞の培養によって産生される。ＦＳＨα鎖の発現用のプラスミドは、天然型よりも酵素阻害剤メトトレキセートに対する耐性が高いマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）の突然変異型の遺伝子を有し、ＦＳＨα鎖の発現用の第２のプラスミドは、ピューロマイシン耐性遺伝子を有している。
【００９６】
ＦＳＨ（本発明）発現用の細胞株の形質移入を、上記の２つの発現プラスミドを用いてヌクレオフェクションによって行った。安定した抗体産生細胞クローンの選択および増幅のために、ピューロマイシンおよびメトトレキセートを漸増濃度で添加した。増幅した細胞プールを、Ｃｌｏｎｅ  ＰｉｘＦＬ技術による単一細胞クローニングまたは限定希釈による単一細胞クローニング用の半固体マトリックスに播種した。クローンを、高分泌の無傷ＦＳＨ分子についてスクリーニングした。
【００９７】
ＦＳＨを、無血清条件下でのバッチプロセス、フェドバッチプロセス、または灌流プロセスでの最終ＦＳＨ産生ＧＴ−５ｓクローンの発酵によって産生させた。この発酵は、通常は２〜３週間行う。
【００９８】
発酵後、０．２μｍのフィルタを用いた滅菌ろ過ステップの前に、上清を２μｍのフィルタに通して細胞および細胞デブリスを除去する。ろ過プロセスは、捕捉ステップとしての逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）、続く濃縮ステップ、およびこれに続くサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を利用する。次いで、任意選択で、溶出物をアニオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）にかけて、酸性度の低いＦＳＨ成分を除去する。これは、望ましいＦＳＨ画分の溶出の前に、ｐＨ５．０（「ｐＨ５．０で濃縮」）またはｐＨ４．５（「ｐＨ４．５で濃縮」）の洗浄緩衝液で結合ＦＳＨを洗浄して、酸性度の低いＦＳＨアイソフォームを溶出させることによって行う。仕上げステップとして、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を用いて高純度のＦＳＨを得る。
【００９９】
（実施例２：顆粒膜細胞アッセイ）
顆粒膜細胞アッセイを行うために、初代細胞を、卵母細胞の収集中にＩＶＦ患者の卵胞液から単離する。例えば、赤血球などのような他の細胞型を除去するフィコール勾配遠心分離の後、顆粒膜細胞を、アンドロステンジオン（ａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）またはテストステロンを含む培養培地中に５〜７日間、２４〜９６ウェルプレート型に播種する。この期間が過ぎたら、細胞（２〜４＊１０４細胞／ウェル）を、図に示されているステップで１ｐｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲のＦＳＨで刺激する（４００μｌ培地／ウェル）。３〜４時間のインキュベーションの後、ｃＡＭＰアッセイを行うために上清の半分を収集する。さらに２４時間後、細胞を、残りの上清中での凍結融解によって溶解する。この溶解物を、プロゲステロンアッセイおよびエストラジオールアッセイに適用する。
【０１００】
（ＦＳＨ（本発明）とＧｏｎａｌ  Ｆとの比較）
第１の組の実験では、ＦＳＨ（本発明）をＧｏｎａｌ  Ｆ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ  ＳＡ）と比較した。Ｇｏｎａｌ  Ｆは、ＣＨＯ細胞で組換え的に産生されたＦＳＨである。結果が、図１〜図３に示されている。セカンドメッセンジャーｃＡＭＰは、同等のＦＳＨ濃度のＧｏｎａｌ  ＦおよびＦＳＨ（本発明）製品で同等量産生されるが、ステロイドプロゲステロンおよびエストラジオールは、ＣＨＯ細胞で組換え的に産生されたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）と比較して、ＦＳＨ（本発明）製品では、はるかに低いＦＳＨ濃度で放出される。
【０１０１】
（ＦＳＨ（本発明）とＦｏｓｔｉｍｏｎとの比較）
別の組の実験では、ＦＳＨ（本発明）を、Ｆｏｓｔｉｍｏｎ（ＩＢＳＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｑｕｅ  ＳＡ）、ヒト尿から単離されたＦＳＨ製品と比較した。結果が、図４〜図６に示されている。ｃＡＭＰのレベルは、両方の製品において同等の用量範囲のＦＳＨで同様に上昇しているが、性ステロイドは、Ｆｏｓｔｉｍｏｎと比較して有意に低い濃度のＦＳＨ（本発明）で産生される。
【０１０２】
注：アッセイが、異なるドナーを用いて行われるため、刺激プロフィールの差異は、各アッセイで使用されたドナーが原因であり得る。
【０１０３】
（実施例３：Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイ）
また、ＦＳＨの活性も、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイにより決定した。このアッセイは、薬局方に従って行った。特に、未成熟雌ラットの卵巣重量の増加を、３日間毎日３つの異なるＦＳＨ濃度で投与した後に測定した。効力を、平行評価を用いて計算した。この結果は、図７に示されている。
【０１０４】
【表２】
2013535481.tif 000004
Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイによって実証されたように、ＦＳＨ（本発明）ならびに尿標準ＦＳＨ及び組換え標準ＦＳＨのインビボ活性は、ラットにおいて同様である。
【０１０５】
（実施例４：糖プロファイリング）
異なるＦＳＨ調製物の糖プロフィールを、グリコシル化の構造的分析によって決定した。糖プロファイリングが、グリコシル化部位の複合グリカン構造についての情報を生成する。糖プロファイリングのために、無傷Ｎ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを利用してタンパクコアから放出させる。この消化は、明確な精密検査のためにゲルまたはゲルブロックで行う。遊離Ｎ−グリカンを、蛍光マーカー２−アミノベンズアミドで標識する。Ｎ−グリカンの精製サンプルを、蛍光検出による親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）によって分離する。この分析により、以下の結果が得られる：
【０１０６】
【表３】
2013535481.tif 000005
指示された単位を有するＦＳＨにおけるＮ−グリカンの相対量が示されている。Ｐｕｒｅｇｏｎは、ＣＨＯ細胞で産生される別の組換えヒトＦＳＨである。
【０１０７】
さらに、ＦＳＨのグリカン中の２，３−結合シアル酸と２，６−結合シアル酸の比率を、シアリダーゼＡ（２，３−結合シアル酸および２，６−結合シアル酸を切断する）およびシアリダーゼＳ（２，３−結合シアル酸のみを切断する）により放出されるシアル酸の量を比較することによって分析した。
【０１０８】
【表４】
2013535481.tif 000006
ＦＳＨ（本発明）では、シアル酸残基は、２，６−結合シアル酸を２，３−結合シアル酸よりも多く含む約１：１の比率で２，３−結合および２，６−結合によってグリカンに結合される一方、尿ＦＳＨ  Ｂｒａｖｅｌｌｅ（Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）では、約３：１の比率で２，３−結合シアル酸の方が多い。これらの組換え体がＣＨＯ細胞で産生されるため、Ｐｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ／ＥｓｓｅｘＰｈａｒｍａ）およびＧｏｎａｌ  Ｆ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）は、バイセクト型Ｎ−アセチルガラクトサミンを一切含まず、２，３−結合シアル酸のみを含む。
【０１０９】
あるいは、末端ガラクトース単位およびＺ数を、上記の測定値から、そしてＦＳＨから放出された後のグリカンの電荷分布の決定によって計算した。
【０１１０】
【表５】
2013535481.tif 000007
ＦＳＨにおけるバイアンテナ型Ｎ−グリカン、トリアンテナ型Ｎ−グリカン、およびテトラアンテナ型Ｎ−グリカンの相対量が示されている。
【０１１１】
【表６】
2013535481.tif 000008
末端にガラクトース単位を有するＦＳＨにおけるＮ−グリカン分岐の相対量が示されている。
【０１１２】
【表７】
2013535481.tif 000009
ＦＳＨ調製物のＺ数、すなわち相対活性が示されている。Ｚ数が高いほど、酸性度の高いＦＳＨ調製物を表す。
【０１１３】
結果として、本発明によるＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明））は、特に酸性アイソフォームの濃縮後における高いバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミンの割合、高いアンテナ性、および高いシアル化率、ならびに高い硫酸化の割合を有する。これら３つのグリコシル化パラメータの１つ以上から、ＦＳＨ（本発明）は、一般的な組換えＦＳＨ調製物または尿ＦＳＨ調製物と比較して優れた活性を有すると思われる。
【０１１４】
さらに、ＦＳＨ（本発明）はまた、高度にフコシル化され、約１：１の２，３−シアル化と２，６−シアル化の比率を有する、または２，６−シアル化の量がさらに多い。
【０１１５】
さらに、ＦＳＨ調製物のグリカン構造も、放出されたグリカンの質量分析によって測定した。以下の結果が得られた：
【０１１６】
【表８】
2013535481.tif 000010
【０１１７】
【表９】
2013535481.tif 000011
【０１１８】
【表１０】
2013535481.tif 000012
硫酸基を有するＦＳＨにおけるＮ−グリカンの相対量が示されている。
【０１１９】
（実施例５：薬理効果）
ＦＳＨ（本発明）の薬理学的プロフィールを、雌ラットおよび雌サルにおける異なるインビボ薬理学的試験および毒性試験、ならびにインビボバイオアッセイで調べた。分子マーカーとして、エストラジオールおよびインヒビン−Ｂを使用した。これらのマーカーは、ＦＳＨで刺激されると卵巣から放出される。エストラジオールは、卵胞の成長および成熟に関与する一方、インヒビン−Ｂは、天然の負のフィードバック機構の一部である。さらに、インヒビン−Ｂは、ＦＳＨによる卵巣刺激の良好な代理マーカーであることが以前に示された。
【０１２０】
（５．１  成熟ラットのＦＳＨ処置）
１００ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）／ｋｇ体重の皮下単回投与により成熟雌ラットが処置されると、血清インヒビン−Ｂレベルが、投与後２〜３日間増加し、再びベースラインレベルに低下した。発情周期に従ったラットへの１００ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）の反復投与により、血清プロゲステロンおよびインヒビン−Ｂが顕著に増加し、これにより複数回の排卵が起こり、続いて黄体細胞でホルモンが産生された。同様の知見が、１２００ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）／ｋｇが７日間反復投与される用量範囲設定試験で観察された。同じ試験で調べた参考製品（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｂｒａｖｅｌｌｅ）を含むＦＳＨと比較したＦＳＨ（本発明）の薬力学的活性の差異は観察できなかった。
【０１２１】
雌ラットで実施した２８日間の反復投与毒性試験では、投与に関連した卵巣の増大およびグラーフ卵胞数の増加が、全ての投与群（３０、１００、３００ＩＵ／ｋｇ体重）で観察された。これらの知見に関連して、コントロールと比較したインヒビン−Ｂレベルの上昇が、処置期間中に観察された。処置した動物のインヒビン−Ｂレベルは、３０ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）／ｋｇ体重／日の低用量レベルで始まる用量依存的な方法で増加した。全ての知見は、完全に可逆的であった。
【０１２２】
（５．２  成熟サルのＦＳＨ処置）
ＦＳＨ（本発明）の単回投与後および反復投与後の薬理学的プロフィールをカニクイザルで評価した。カニクイザルは、ヒトに対するかなりの類似性に基づいて最も関連のある動物モデルと考えられる。この試験は、定期的な月経周期を示す性的に成熟した雌の動物へのＦＳＨの単回投与からなっていた。これらの動物を、それらの発情周期の段階に基づいて各試験群に無作為に割り当てた。動物への試験項目の投与は、月経の開始から１〜３日後に開始した。この試験は、４つの群を含み、各群は、１００ＩＵ／ｋｇ体重のＦＳＨ（本発明）、尿ＦＳＨ  Ｂｒａｖｅｌｌｅ、またはＣＨＯ細胞で発現された組換えＦＳＨ  Ｇｏｎａｌ−ｆの単回皮下ボーラス注射によって処置された４頭動物を含んでいた。エストラジオールおよびインヒビン−Ｂレベルの分析のための採血を、投与前、および投与後の指示された時点で全ての動物で行った。投与後の時点は、発情周期の異なる段階を反映するように選択した。この結果は、図８Ａに示されている。
【０１２３】
全ての試験されたＦＳＨ物質では、処置された動物のエストラジオールおよびインヒビン−Ｂレベルは、試験物質の単回投与後、５日間上昇し、再びベースラインレベルに低下した。通常の中間周期のエストラジオールのサージが、試験の１４日目〜２２日目にほぼ全ての動物で観察された。ＦＳＨ（本発明）は、エストラジオールレベルの最大の増加を示した。この実験は、より低いＡＵＣレベルでのＦＳＨ（本発明）の少なくとも同等の薬理効果を実証し（実施例６を参照）、受容体刺激でのより高い活性を示唆している。
【０１２４】
加えて、サルにＦＳＨを反復投与する同様の試験を行った。この反復投与試験は、３つの群を含み、各群は、１００ＩＵ／ｋｇ体重のＦＳＨ（本発明）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ、またはＧｏｎａｌ−ｆの連続７日間毎日繰り返される皮下ボーラス注射によって処置された４頭の動物を含んでいた。採血を、単回投与試験で記載されたように行った。１００ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）／ｋｇ体重、１００ＩＵ  Ｂｒａｖｅｌｌｅ／ｋｇ体重、または１００ＩＵ  Ｇｏｎａｌ−ｆ／ｋｇ体重で反復皮下注射により処置された動物のエストラジオールおよびインヒビン−Ｂレベルは、７日間の全処置期間にわたって増加した（図８Ｂを参照）。処置の終了後、ホルモンレベルが、ゆっくりと低下し、５〜７日後に正常レベルに達した。ＦＳＨ（本発明）の反復投与後に観察されたエストラジオールおよびインヒビン−Ｂの最大濃度は、単回投与後に観察された濃度と比較して、また正常な発情周期のレベルと比較してもはるかに高かった。ＦＳＨ（本発明）の反復皮下投与後に観察された薬力学的効果は、この製品クラスでは期待通りであり、同じ試験の参考製品で観察された薬力学的効果と同等であった。
【０１２５】
（卵胞成長の誘発）
薬力学的パラメータの分析を含む４週間の亜慢性毒性試験をカニクイザルで行った。それぞれが４頭の性的に成熟した雌カニクイザルを含む４つの群を、２８日間、１日１回の反復皮下注射によりＦＳＨ（本発明）で処置した。用量レベルは、低投与群の３０ＩＵ／ｋｇ体重／日、中間投与群の１００ＩＵ／ｋｇ体重／日、および高投与群の３００ＩＵ／ｋｇ体重／日とした。この主要な試験に加えて、各群に付き２頭の雌の動物を、コントロール群および高投与群として６週間の回復期間の計画に入れた。エストラジオールおよびインヒビン−Ｂの分析用の血液サンプルを、処置期間の前および終了時（投与前の１日目および２８日目）、１７日目の６時間後、および回復期間の終了時（７０日目）に採取した。
【０１２６】
４週間の３０、１００、または３００ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）／ｋｇ体重／日での反復処置により、最終屠殺時に、卵巣の絶対重量及び相対重量が増加し、グラーフ卵胞数が増加した。加えて、全ての投与群の２、３頭の動物は、黄体数のわずかな減少を示した。この知見に関連して、エストラジオールおよびインヒビン−Ｂの血清レベルの増加が、全ての投与群で観察された。
【０１２７】
（５．３  有害作用の分析）
ＦＳＨ（本発明）のあらゆる予想外の有害作用のリスクを分析するために、主要な安全性薬理学的パラメータ（ＥＣＧ、心拍数、血圧、呼吸数）を、ラットおよびカニクイザルの４週間の主毒性試験に含めた。これらの試験は、主要な系に対するＦＳＨ（本発明）の一般作用についての証拠を全く示さなかったため、ＦＳＨ（本発明）は、安全と見なすことができ、有害な副作用を示さない。
【０１２８】
（実施例６：薬物動態）
試験の目的は、カニクイザルへの皮下投与または静脈内投与によってＢｒａｖｅｌｌｅおよびＧｏｎａｌ−ｆと比較したＦＳＨ（本発明）のバイオアベイラビリティおよび薬理を調べることであった。この試験は、定期的な月経周期を示す性的に成熟した雌の動物を用いて行った。これらの動物を、発情周期の段階に基づいて試験群に無作為に割り当てた。動物への試験項目の投与は、月経の開始から１〜３日後に開始した。この試験は、４つの群を含み、各群は、１００ＩＵ／ｋｇ体重のＦＳＨ（本発明）の単回静脈内ボーラス注射によって、あるいは１００ＩＵ／ｋｇ体重のＦＳＨ（本発明）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ（登録商標）、またはＧｏｎａｌ−ｆ（登録商標）の単回皮下ボーラス注射によって処置された４頭の動物を含んでいた。ＦＳＨレベルの分析のための採血を、発情周期の異なる段階を反映する投与後の異なる時点で全ての動物で行った。
【０１２９】
試験中に早死にした動物はいなかったし、または全身毒性の臨床的徴候も示さなかった。試験項目または参考項目に関連した影響または局所的な不耐性は観察されなかった。
【０１３０】
Ｃｍａｘ−レベルの１８６．１３ｍＩＵ  ＦＳＨ／ｍｌは、１００ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）／ｋｇ体重による単回皮下処置の８時間経過後に観察された。ＦＳＨ（本発明）の計算上の平均血清排出半減期は、１６．８５時間であった。血清レベルは、図９に示されている。単回曝露後のサル血清中の毒物動態パラメータの平均値が、表１１に示されている。
【０１３１】
【表１１】
2013535481.tif 000013
７２．７７％の相対バイオアベイラビリティ（Ｆ）を、静脈内投与されたＦＳＨ（本発明）と比較される皮下投与後のＦＳＨ（本発明）について計算した。以下のＦＳＨ−曝露比は、単回曝露の後に観察された：ＦＳＨ（本発明）（皮下）＜ＦＳＨ（本発明）（静脈内）＜Ｂｒａｖｅｌｌｅ＜Ｇｏｎａｌ−ｆ。
【０１３２】
また、同様のデータを、カニクイザルでの複数回投与試験から、ならびにラットおよびヌードマウスでの試験から得た。
【０１３３】
カニクイザルでの反復投与試験を、単回投与試験と同様に行った。この試験は、３つの群を含み、各群は、１００ＩＵ／ｋｇ体重のＦＳＨ（本発明）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ、またはＧｏｎａｌ−ｆの連続７日間の毎日繰り返される皮下ボーラス注射によって処置された４頭の動物を含んでいた。投与量は、１０〜１０００ＩＵ／ｋｇ体重のＧｏｎａｌ−ｆの用量を使用したサルでの薬物動態試験および毒性試験を参照して選択した。試験中に早死にした動物はいなかったし、または全身毒性の臨床的徴候も示さなかった。試験項目または参考項目に関連した影響または局所的な不耐性は観察されなかった。この結果、基準製品（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｂｒａｖｅｌｌｅ）を含むＦＳＨと比較されるサルでのＦＳＨ（本発明）のＣｍａｘ−値およびＡＵＣ−値が低下し、結果としてＦＳＨ（本発明）で処置された動物の薬物曝露の低下が起こることが分かった。しかしながら、同じ試験で得られた薬理学データは、ＦＳＨ受容体のエフェクタとしてエストラジオールおよびインヒビン−Ｂの産生を刺激する能力に関して、ＦＳＨ製品間で差異がないことを示した（実施例５を参照）。
【０１３４】
雌ヌードマウスに、皮下注射により５μｇのＦＳＨを投与して血中のＦＳＨ濃度を監視した。ＦＳＨ（本発明）、Ｇｏｎａｌ−ｆ、およびＢｒａｖｅｌｌｅの薬物動態プロフィールは、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０−ｔ  ｌａｓｔ−値に関してほぼ同等である。ＦＳＨ（本発明）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ、およびＧｏｎａｌ−ｆの単回皮下注射後に、それぞれ５．１±１．９％ＩＤ、６．７±０．４％ＩＤ、および５．５±０．４％ＩＤのＣｍａｘレベルが観察された。ＦＳＨ（本発明）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ、およびＧｏｎａｌ−ｆに対してそれぞれ、７１．６±２５．４％ＩＤ、９９．１±１２．９％ＩＤ、および７９．７±９．７％ＩＤのＡＵＣ０−ｔ  ｌａｓｔ−値が観察された。概して、血液および相対薬物曝露からのクリアランスは、調べた全ての物質で同等である；統計的に関連のある差異は、測定されなかった。投与されたＦＳＨの生体内分布を調べた結果、卵巣および子宮におけるＦＳＨの蓄積が観察された（加えて、ＦＳＨを体から除去する腎臓の役割により、腎臓での高い蓄積も観察された）。
【０１３５】
成熟雌ラットに、皮下注射による１００ＩＵ／ｋｇ体重のＦＳＨ（本発明）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ、またはＧｏｎａｌ−ｆの単回投与または複数回投与を行い、ＦＳＨの血清濃度を監視した。この結果、参考製品（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｂｒａｖｅｌｌｅ）を含むＦＳＨと比較したラットでのＦＳＨの血清半減期およびＡＵＣ−値が低下し、ＦＳＨ（本発明）で処置された動物の薬物曝露の低下が起こることが分かった。しかしながら、同じ試験で得られた薬理学データは、ＦＳＨ受容体のエフェクタとしてエストラジオールおよびインヒビン−Ｂの産生を刺激する能力に関して、ＦＳＨ製品間で差異がないことを示した（実施例５を参照）。
【０１３６】
（実施例７：ヒトにおける薬物動態および薬力学）
臨床試験で、ＦＳＨ（本発明）をボランティアに投与し、薬物動態および薬力学的パラメータを決定した。健常な女性ボランティアに、２５ＩＵ、７５ＩＵ、または１５０ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）を単回皮下投与し、循環中のＦＳＨ濃度を監視した。加えて、卵胞の数および大きさを、薬物投与の前後で調べた。
【０１３７】
予備段階の結果として、異なる研究室によって測定された尿ＦＳＨおよび組換えＦＳＨの公表データと比較してほぼ２倍のＦＳＨ（本発明）（Ｃｍａｘ）の最大血清濃度が観察された。皮下投与後の循環半減期（ｔ１／２）は、ＦＳＨ（本発明）（〜３３時間±３時間）、組換えＣＨＯ細胞由来ＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−ｆ：３７時間±２８時間（ｌｅ  Ｃｏｔｏｎｎｅｃら  （１９９４）  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ６１，６７９−６８６））、および尿ＦＳＨ（ＭｅｔｒｏｄｉｎＨＰ：４５時間±２１時間（ｌｅ  Ｃｏｔｏｎｎｅｃら  （１９９３）  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ８，１６０４−１６１１）で同等である。薬力学的データは、既に２５ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）が単回投与された一部の患者で卵胞の成長が見られることを示した。これは、比較対象であるＢｒａｖｅｌｌｅおよびＧｏｎａｌ−ｆの場合には観察できなかった。７５および１５０ＩＵ  ＦＳＨ（本発明）の場合には、すべての対象が、卵胞の増大を示し、１人の患者は、２倍の大きさの卵胞を有していた。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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