(57)【要約】本発明は、肝臓を標的にすることができる分子に関する。これらの肝臓標的化分子（例えば、融合体および結合体）は、タンパク質、抗体もしくは抗体フラグメント、例えば免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、およびインターフェロンなどの肝臓へ送達することが望まれている１種または複数の追加の分子も含む。本発明は、さらにこのような肝臓標的化分子を含む使用、製剤、組成物および装置に関する。本発明はまた、肝細胞に結合する免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）肝臓の肝細胞に結合するタンパク質リガンドと、（ｂ）肝臓へ送達するための少なくとも１種の治療用分子とを含む、肝臓標的化組成物。
【請求項２】
前記タンパク質リガンド（ａ）および前記少なくとも１種の治療用分子（ｂ）が、単一融合体または結合体として共に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に結合する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体フラグメントが、単一免疫グロブリン可変ドメイン（ｄＡｂ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｄＡｂが、ヒトＶｈ配列およびヒトＶκ配列から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｄＡｂが、ヒトおよび／またはマウスＡＳＧＰＲ受容体から選択される少なくとも１種のＡＳＧＰＲ受容体に結合することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｂ）前記肝臓へ送達するための少なくとも１種の治療用分子が、タンパク質またはペプチド分子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
（ｂ）前記肝臓へ送達するための少なくとも１種の治療用分子が、インターフェロン分子またはインターフェロン活性を保持するその変異体、類似体もしくは誘導体を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記インターフェロン分子が、インターフェロンα２、インターフェロンα５、インターフェロンα６およびコンセンサスインターフェロンからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｄＡｂが、１ｐＭと約１０ｎＭとの間のＢｉａｃｏｒｅにより測定される親和性でヒトおよび／またはマウスＡＳＧＰＲ受容体に結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｄＡｂの親和性が、１ｐＭと約１ｎＭとの間である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、ＤＯＭ２６ｈ−１（配列番号１５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１０（配列番号１５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１００（配列番号１５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１０１（配列番号１６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１０２（配列番号１６３）；ＤＯＭ２６ｈ−１０３（配列番号１６５）；ＤＯＭ２６ｈ−１０４（配列番号１６７）；ＤＯＭ２６ｈ−１０５（配列番号１６９）；ＤＯＭ２６ｈ−１０６（配列番号１７１）；ＤＯＭ２６ｈ−１０７（配列番号１７３）；ＤＯＭ２６ｈ−１０８（配列番号１７５）；ＤＯＭ２６ｈ−１０９（配列番号１７７）；ＤＯＭ２６ｈ−１１（配列番号１７９）；ＤＯＭ２６ｈ−１１０（配列番号１８１）；ＤＯＭ２６ｈ−１１１（配列番号１８３）；ＤＯＭ２６ｈ−１１２（配列番号１８５）；ＤＯＭ２６ｈ−１１３（配列番号１８７）；ＤＯＭ２６ｈ−１１４（配列番号１８９）；ＤＯＭ２６ｈ−１１５（配列番号１９１）；ＤＯＭ２６ｈ−１１６（配列番号１９３）；ＤＯＭ２６ｈ−１１７（配列番号１９５）；ＤＯＭ２６ｈ−１１８（配列番号１９７）；ＤＯＭ２６ｈ−１１９（配列番号１９９）；ＤＯＭ２６ｈ−１２（配列番号２０１）；ＤＯＭ２６ｈ−１２０（配列番号２０３）；ＤＯＭ２６ｈ−１２１（配列番号２０５）；ＤＯＭ２６ｈ−１２２（配列番号２０７）；ＤＯＭ２６ｈ−１２３（配列番号２０９）；ＤＯＭ２６ｈ−１２４（配列番号２１１）；ＤＯＭ２６ｈ−１２５（配列番号２１３）；ＤＯＭ２６ｈ−１２６（配列番号２１５）；ＤＯＭ２６ｈ−１２７（配列番号２１７）；ＤＯＭ２６ｈ−１２８（配列番号２１９）；ＤＯＭ２６ｈ−１２９（配列番号２２１）；ＤＯＭ２６ｈ−１３０（配列番号２２３）；ＤＯＭ２６ｈ−１３１（配列番号２２５）；ＤＯＭ２６ｈ−１３２（配列番号２２７）；ＤＯＭ２６ｈ−１３３（配列番号２２９）；ＤＯＭ２６ｈ−１３４（配列番号２３１）；ＤＯＭ２６ｈ−１３５（配列番号２３３）；ＤＯＭ２６ｈ−１３６（配列番号２３５）；ＤＯＭ２６ｈ−１３７（配列番号２３７）；ＤＯＭ２６ｈ−１３８（配列番号２３９）；ＤＯＭ２６ｈ−１３９（配列番号２４１）；ＤＯＭ２６ｈ−１４０（配列番号２４３）；ＤＯＭ２６ｈ−１４１（配列番号２４５）；ＤＯＭ２６ｈ−１４２（配列番号２４７）；ＤＯＭ２６ｈ−１４３（配列番号２４９）；ＤＯＭ２６ｈ−１４４（配列番号２５１）；ＤＯＭ２６ｈ−１４５（配列番号２５３）；ＤＯＭ２６ｈ−１４６（配列番号２５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１４７（配列番号２５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１４８（配列番号２５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１４９（配列番号２６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５（配列番号２６３）；ＤＯＭ２６ｈ−１５０（配列番号２６５）；ＤＯＭ２６ｈ−１５１（配列番号２６７）；ＤＯＭ２６ｈ−１５２（配列番号２６９）；ＤＯＭ２６ｈ−１５３（配列番号２７１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５４（配列番号２７３）；ＤＯＭ２６ｈ−１５５（配列番号２７５）；ＤＯＭ２６ｈ−１５６（配列番号２７７）；ＤＯＭ２６ｈ−１５７（配列番号２７９）；ＤＯＭ２６ｈ−１５８（配列番号２８１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９（配列番号２８３）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−１（配列番号２８５）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−２（配列番号２８７）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−３（配列番号２８９）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−４（配列番号２９１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−５（配列番号２９３）；ＤＯＭ２６ｈ−１６０（配列番号２９５）；ＤＯＭ２６ｈ−１６８（配列番号２９７）；ＤＯＭ２６ｈ−１６９（配列番号２９９）；ＤＯＭ２６ｈ−１７（配列番号３０１）；ＤＯＭ２６ｈ−１７０（配列番号３０３）；ＤＯＭ２６ｈ−１７１（配列番号３０５）；ＤＯＭ２６ｈ−１７２（配列番号３０７）；ＤＯＭ２６ｈ−１７３（配列番号３０９）；ＤＯＭ２６ｈ−１７４（配列番号３１１）；ＤＯＭ２６ｈ−１７５（配列番号３１３）；ＤＯＭ２６ｈ−１７６（配列番号３１５）；ＤＯＭ２６ｈ−１７７（配列番号３１７）；ＤＯＭ２６ｈ−１７８（配列番号３１９）；ＤＯＭ２６ｈ−１７９（配列番号３２１）；ＤＯＭ２６ｈ−１８０（配列番号３２３）；ＤＯＭ２６ｈ−１８１（配列番号３２５）；ＤＯＭ２６ｈ−１８２（配列番号３２７）；ＤＯＭ２６ｈ−１８３（配列番号３２９）；ＤＯＭ２６ｈ−１８４（配列番号３３１）；ＤＯＭ２６ｈ−１８５（配列番号３３３）；ＤＯＭ２６ｈ−１８６（配列番号３３５）；ＤＯＭ２６ｈ−１８７（配列番号３３７）；ＤＯＭ２６ｈ−１８８（配列番号３３９）；ＤＯＭ２６ｈ−１８９（配列番号３４１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９（配列番号３４３）；ＤＯＭ２６ｈ−１９０（配列番号３４５）；ＤＯＭ２６ｈ−１９１（配列番号３４７）；ＤＯＭ２６ｈ−１９２（配列番号３４９）；ＤＯＭ２６ｈ−１９３（配列番号３５１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９４（配列番号３５３）；ＤＯＭ２６ｈ−１９５（配列番号３５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１９６（配列番号３５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１９７（配列番号３５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１９８（配列番号３６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９９（配列番号３６３）；ＤＯＭ２６ｈ−２（配列番号３６５）；ＤＯＭ２６ｈ−２０（配列番号３６７）；ＤＯＭ２６ｈ−２００（配列番号３６９）；ＤＯＭ２６ｈ−２０１（配列番号３７１）；ＤＯＭ２６ｈ−２０２（配列番号３７３）；ＤＯＭ２６ｈ−２０３（配列番号３７５）；ＤＯＭ２６ｈ−２０４（配列番号３７７）；ＤＯＭ２６ｈ−２０５（配列番号３７９）；ＤＯＭ２６ｈ−２０６（配列番号３８１）；ＤＯＭ２６ｈ−２０７（配列番号３８３）；ＤＯＭ２６ｈ−２０８（配列番号３８５）；ＤＯＭ２６ｈ−２０９（配列番号３８７）；ＤＯＭ２６ｈ−２１（配列番号３８９）；ＤＯＭ２６ｈ−２１０（配列番号３９１）；ＤＯＭ２６ｈ−２１１（配列番号３９３）；ＤＯＭ２６ｈ−２１２（配列番号３９５）；ＤＯＭ２６ｈ−２１３（配列番号３９７）；ＤＯＭ２６ｈ−２１４（配列番号３９９）；ＤＯＭ２６ｈ−２１５（配列番号４０１）；ＤＯＭ２６ｈ−２１６（配列番号４０３）；ＤＯＭ２６ｈ−２１７（配列番号４０５）；ＤＯＭ２６ｈ−２１８（配列番号４０７）；ＤＯＭ２６ｈ−２１９（配列番号４０９）；ＤＯＭ２６ｈ−２２（配列番号４１１）；ＤＯＭ２６ｈ−２２０（配列番号４１３）；ＤＯＭ２６ｈ−２２１（配列番号４１５）；ＤＯＭ２６ｈ−２２２（配列番号４１７）；ＤＯＭ２６ｈ−２２３（配列番号４１９）；ＤＯＭ２６ｈ−２３（配列番号４２１）；ＤＯＭ２６ｈ−２４（配列番号４２３）；ＤＯＭ２６ｈ−２９−１（配列番号４２５）；ＤＯＭ２６ｈ−４（配列番号４２７）；ＤＯＭ２６ｈ−４１（配列番号４２９）；ＤＯＭ２６ｈ−４２（配列番号４３１）；ＤＯＭ２６ｈ−４３（配列番号４３３）；ＤＯＭ２６ｈ−４４（配列番号４３５）；ＤＯＭ２６ｈ−４５（配列番号４３７）；ＤＯＭ２６ｈ−４６（配列番号４３９）；ＤＯＭ２６ｈ−４７（配列番号４４１）；ＤＯＭ２６ｈ−４８（配列番号４４３）；ＤＯＭ２６ｈ−４９（配列番号４４５）；ＤＯＭ２６ｈ−５０（配列番号４４７）；ＤＯＭ２６ｈ−５１（配列番号４４９）；ＤＯＭ２６ｈ−５２（配列番号４５１）；ＤＯＭ２６ｈ−５３（配列番号４５３）；ＤＯＭ２６ｈ−５４（配列番号４５５）；ＤＯＭ２６ｈ−５５（配列番号４５７）；ＤＯＭ２６ｈ−５６（配列番号４５９）；ＤＯＭ２６ｈ−５７（配列番号４６１）；ＤＯＭ２６ｈ−５８（配列番号４６３）；ＤＯＭ２６ｈ−５９（配列番号４６５）；ＤＯＭ２６ｈ−６０（配列番号４６７）；ＤＯＭ２６ｈ−６１（配列番号４６９）；ＤＯＭ２６ｈ−６２（配列番号４７１）；ＤＯＭ２６ｈ−６３（配列番号４７３）；ＤＯＭ２６ｈ−６４（配列番号４７５）；ＤＯＭ２６ｈ−６５（配列番号４７７）；ＤＯＭ２６ｈ−６６（配列番号４７９）；ＤＯＭ２６ｈ−６７（配列番号４８１）；ＤＯＭ２６ｈ−６８（配列番号４８３）；ＤＯＭ２６ｈ−６９（配列番号４８５）；ＤＯＭ２６ｈ−７０（配列番号４８７）；ＤＯＭ２６ｈ−７１（配列番号４８９）；ＤＯＭ２６ｈ−７２（配列番号４９１）；ＤＯＭ２６ｈ−７３（配列番号４９３）；ＤＯＭ２６ｈ−７４（配列番号４９５）；ＤＯＭ２６ｈ−７５（配列番号４９７）；ＤＯＭ２６ｈ−７６（配列番号４９９）；ＤＯＭ２６ｈ−７７（配列番号５０１）；ＤＯＭ２６ｈ−７８（配列番号５０３）；ＤＯＭ２６ｈ−７９（配列番号５０５）；ＤＯＭ２６ｈ−８０（配列番号５０７）；ＤＯＭ２６ｈ−８１（配列番号５０９）；ＤＯＭ２６ｈ−８２（配列番号５１１）；ＤＯＭ２６ｈ−８３（配列番号５１３）；ＤＯＭ２６ｈ−８４（配列番号５１５）；ＤＯＭ２６ｈ−８５（配列番号５１７）；ＤＯＭ２６ｈ−８６（配列番号５１９）；ＤＯＭ２６ｈ−８７（配列番号５２１）；ＤＯＭ２６ｈ−８８（配列番号５２３）；ＤＯＭ２６ｈ−８９（配列番号５２５）；ＤＯＭ２６ｈ−９０（配列番号５２７）；ＤＯＭ２６ｈ−９１（配列番号５２９）；ＤＯＭ２６ｈ−９２（配列番号５３１）；ＤＯＭ２６ｈ−９３（配列番号５３３）；ＤＯＭ２６ｈ−９４（配列番号５３５）；ＤＯＭ２６ｈ−９５（配列番号５３７）；ＤＯＭ２６ｈ−９６（配列番号５３９）；ＤＯＭ２６ｈ−９７（配列番号５４１）；ＤＯＭ２６ｈ−９８（配列番号５４３）；ＤＯＭ２６ｈ−９９（配列番号５４５）；ＤＯＭ２６ｈ−９９−１（配列番号５４７）；ＤＯＭ２６ｈ−９９−２（配列番号５４９）；ＤＯＭ２６ｈ−１６１（配列番号５５１）；ＤＯＭ２６ｈ−１６２（配列番号５５３）；ＤＯＭ２６ｈ−１６３（配列番号５５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１６４（配列番号５５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１６５（配列番号５５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１６６（配列番号５６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１６７（配列番号５６３）；ＤＯＭ２６ｈ−２２４（配列番号５６５）；ＤＯＭ２６ｈ−２５（配列番号５６７）；ＤＯＭ２６ｈ−２６（配列番号５６９）；ＤＯＭ２６ｈ−２７（配列番号５７１）；ＤＯＭ２６ｈ−２８（配列番号５７３）；ＤＯＭ２６ｈ−２９（配列番号５７５）；ＤＯＭ２６ｈ−３０（配列番号５７７）；ＤＯＭ２６ｈ−３１（配列番号５７９）；ＤＯＭ２６ｈ−３２（配列番号５８１）；ＤＯＭ２６ｈ−３３（配列番号５８３）；ＤＯＭ２６ｈ−３４（配列番号５８５）；ＤＯＭ２６ｈ−３５（配列番号５８７）；ＤＯＭ２６ｈ−３６（配列番号５８９）；ＤＯＭ２６ｈ−３７（配列番号５９１）；ＤＯＭ２６ｈ−３８（配列番号５９３）；ＤＯＭ２６ｈ−３９（配列番号５９５）；ＤＯＭ２６ｈ−４０（配列番号５９７）；ＤＯＭ２６ｈ−６（配列番号５９９）；ＤＯＭ２６ｈ−８（配列番号６０１）；ＤＯＭ２６ｈ−９（配列番号６０３）として同定されるアミノ酸配列のいずれか１つと１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される、ヒトＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４（配列番号８６７）；ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８６（配列番号８６９）；ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８７（配列番号８７１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１（配列番号８７３）；ＤＯＭ２６ｈ−２１０−２（配列番号８７５）；ＤＯＭ２６ｈ−２２０−１（配列番号８７７）；またはＤＯＭ２６ｈ−２２０−４３（配列番号８７９）として同定されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸と１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される、ヒトＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、ヒトＡＳＧＰＲとの結合について請求項１３または１４のアミノ酸配列のいずれか１つと競合するｄＡｂアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、ＤＯＭ２６ｍ−１０（配列番号６０５）；ＤＯＭ２６ｍ−１３（配列番号６０７）；ＤＯＭ２６ｍ−１６（配列番号６０９）；ＤＯＭ２６ｍ−１６５（配列番号６１１）；ＤＯＭ２６ｍ−１７（配列番号６１３）；ＤＯＭ２６ｍ−２７（配列番号６１５）；ＤＯＭ２６ｍ−２８（配列番号６１７）；ＤＯＭ２６ｍ−２９（配列番号６１９）；ＤＯＭ２６ｍ−３０（配列番号６２１）；ＤＯＭ２６ｍ−３１（配列番号６２３）；ＤＯＭ２６ｍ−３２（配列番号６２５）；ＤＯＭ２６ｍ−３３（配列番号６２７）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１（配列番号６２９）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１０（配列番号６３１）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１１（配列番号６３３）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１２（配列番号６３５）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−２（配列番号６３７）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−３（配列番号６３９）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−４（配列番号６４１）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−５（配列番号６４３）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−６（配列番号６４５）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−７（配列番号６４７）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−８（配列番号６４９）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−９（配列番号６５１）；ＤＯＭ２６ｍ−３４（配列番号６５３）；ＤＯＭ２６ｍ−３５（配列番号６５５）；ＤＯＭ２６ｍ−３６（配列番号６５７）；ＤＯＭ２６ｍ−３７（配列番号６５９）；ＤＯＭ２６ｍ−３８（配列番号６６１）；ＤＯＭ２６ｍ−３９（配列番号６６３）；ＤＯＭ２６ｍ−４（配列番号６６５）；ＤＯＭ２６ｍ−４０（配列番号６６７）；ＤＯＭ２６ｍ−４１（配列番号６６９）；ＤＯＭ２６ｍ−４２（配列番号６７１）；ＤＯＭ２６ｍ−４３（配列番号６７３）；ＤＯＭ２６ｍ−４４（配列番号６７５）；ＤＯＭ２６ｍ−４５（配列番号６７７）；ＤＯＭ２６ｍ−４６（配列番号６７９）；ＤＯＭ２６ｍ−４７（配列番号６８１）；ＤＯＭ２６ｍ−４８（配列番号６８３）；ＤＯＭ２６ｍ−５２（配列番号６８５）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−１（配列番号６８７）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−２（配列番号６８９）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−３（配列番号６９１）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−４（配列番号６９３）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−５（配列番号６９５）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−６（配列番号６９７）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−７（配列番号６９９）；ＤＯＭ２６ｍ−６（配列番号７０１）；ＤＯＭ２６ｍ−６０（配列番号７０３）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−１（配列番号７０５）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−２（配列番号７０７）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−３（配列番号７０９）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−４（配列番号７１１）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−５（配列番号７１３）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−６（配列番号７１５）；ＤＯＭ２６ｍ−７（配列番号７１７）；ＤＯＭ２６ｍ−７３（配列番号７１９）；ＤＯＭ２６ｍ−７４（配列番号７２１）；ＤＯＭ２６ｍ−７５（配列番号７２３）；ＤＯＭ２６ｍ−７６（配列番号７２５）；ＤＯＭ２６ｍ−７７（配列番号７２７）；ＤＯＭ２６ｍ−７８（配列番号７２９）；ＤＯＭ２６ｍ−７９（配列番号７３１）；ＤＯＭ２６ｍ−８（配列番号７３３）；ＤＯＭ２６ｍ−８０（配列番号７３５）；ＤＯＭ２６ｍ−８１（配列番号７３７）；ＤＯＭ２６ｍ−８２（配列番号７３９）；ＤＯＭ２６ｍ−８３（配列番号７４１）；ＤＯＭ２６ｍ−９（配列番号７４３）；ＤＯＭ２６ｍ−１（配列番号７４５）；ＤＯＭ２６ｍ−１００（配列番号７４７）；ＤＯＭ２６ｍ−１０１（配列番号７４９）；ＤＯＭ２６ｍ−１０２（配列番号７５１）；ＤＯＭ２６ｍ−１０３（配列番号７５３）；ＤＯＭ２６ｍ−１０６（配列番号７５５）；ＤＯＭ２６ｍ−１０８（配列番号７５７）；ＤＯＭ２６ｍ−１０９（配列番号７５９）；ＤＯＭ２６ｍ−１０９−１（配列番号７６１）；ＤＯＭ２６ｍ−１０９−２（配列番号７６３）；ＤＯＭ２６ｍ−１２（配列番号７６５）；ＤＯＭ２６ｍ−１８（配列番号７６７）；ＤＯＭ２６ｍ−１９（配列番号７６９）；ＤＯＭ２６ｍ−２（配列番号７７１）；ＤＯＭ２６ｍ−２０（配列番号７７３）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−１（配列番号７７５）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−２（配列番号７７７）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−３（配列番号７７９）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−４（配列番号７８１）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−５（配列番号７８３）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−６（配列番号７８５）；ＤＯＭ２６ｍ−２２（配列番号７８７）；ＤＯＭ２６ｍ−２３（配列番号７８９）；ＤＯＭ２６ｍ−２４（配列番号７９１）；ＤＯＭ２６ｍ−２５（配列番号７９３）；ＤＯＭ２６ｍ−２６（配列番号７９５）；ＤＯＭ２６ｍ−３（配列番号７９７）；ＤＯＭ２６ｍ−５０（配列番号７９９）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−１（配列番号８０１）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−２（配列番号８０３）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−３（配列番号８０５）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−４（配列番号８０７）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−５（配列番号８０９）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−６（配列番号８１１）；ＤＯＭ２６ｍ−５１（配列番号８１３）；ＤＯＭ２６ｍ−５３（配列番号８１５）；ＤＯＭ２６ｍ−５４（配列番号８１７）；ＤＯＭ２６ｍ−５５（配列番号８１９）；ＤＯＭ２６ｍ−５６（配列番号８２１）；ＤＯＭ２６ｍ−５７（配列番号８２３）；ＤＯＭ２６ｍ−５８（配列番号８２５）；ＤＯＭ２６ｍ−５９（配列番号８２７）；ＤＯＭ２６ｍ−６１（配列番号８２９）；ＤＯＭ２６ｍ−６３（配列番号８３１）；ＤＯＭ２６ｍ−６４（配列番号８３３）；ＤＯＭ２６ｍ−６６（配列番号８３５）；ＤＯＭ２６ｍ−６９（配列番号８３７）；ＤＯＭ２６ｍ−８５（配列番号８３９）；ＤＯＭ２６ｍ−８６（配列番号８４１）；ＤＯＭ２６ｍ−８７（配列番号８４３）；ＤＯＭ２６ｍ−８９（配列番号８４５）；ＤＯＭ２６ｍ−９０（配列番号８４７）；ＤＯＭ２６ｍ−９１（配列番号８４９）；ＤＯＭ２６ｍ−９２（配列番号８５１）；ＤＯＭ２６ｍ−９３（配列番号８５３）；ＤＯＭ２６ｍ−９４（配列番号８５５）；ＤＯＭ２６ｍ−９５（配列番号８５７）；ＤＯＭ２６ｍ−９６（配列番号８５９）；ＤＯＭ２６ｍ−９７（配列番号８６１）；ＤＯＭ２６ｍ−９８（配列番号８６３）；ＤＯＭ２６ｍ−９９（配列番号８６５）として同定されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される、マウスＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、ヒトＡＳＧＰＲとの結合について請求項１６のアミノ酸配列のいずれか１つと競合するｄＡｂアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記タンパク質リガンド（ａ）が、請求項１３、１４もしくは１６の配列のいずれか１つにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列と少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含むｄＡｂアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
アミノ酸または化学リンカーが存在する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記リンカーが、ＴＶＡＡＰＳリンカー、ＴＶＡＡＰＲリンカー、らせん状リンカー、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーおよびＰＥＧリンカーから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の治療用分子（ｂ）が、前記ｄＡｂのＮ末端に存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
薬学的もしくは生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて請求項１〜２１のいずれか一項に記載の肝臓標的化組成物を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
さらなる治療剤または活性剤を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
被験体に別々、連続または同時投与するための、（ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の肝臓標的化組成物と、（ｂ）さらなる治療剤または活性剤とを含む、組成物。
【請求項２５】
ＤＯＭ２６ｈ−１；ＤＯＭ２６ｈ−１０；ＤＯＭ２６ｈ−１００；ＤＯＭ２６ｈ−１０１；ＤＯＭ２６ｈ−１０２；ＤＯＭ２６ｈ−１０３；ＤＯＭ２６ｈ−１０４；ＤＯＭ２６ｈ−１０５；ＤＯＭ２６ｈ−１０６；ＤＯＭ２６ｈ−１０７；ＤＯＭ２６ｈ−１０８；ＤＯＭ２６ｈ−１０９；ＤＯＭ２６ｈ−１１；ＤＯＭ２６ｈ−１１０；ＤＯＭ２６ｈ−１１１；ＤＯＭ２６ｈ−１１２；ＤＯＭ２６ｈ−１１３；ＤＯＭ２６ｈ−１１４；ＤＯＭ２６ｈ−１１５；ＤＯＭ２６ｈ−１１６；ＤＯＭ２６ｈ−１１７；ＤＯＭ２６ｈ−１１８；ＤＯＭ２６ｈ−１１９；ＤＯＭ２６ｈ−１２；ＤＯＭ２６ｈ−１２０；ＤＯＭ２６ｈ−１２１；ＤＯＭ２６ｈ−１２２；ＤＯＭ２６ｈ−１２３；ＤＯＭ２６ｈ−１２４；ＤＯＭ２６ｈ−１２５；ＤＯＭ２６ｈ−１２６；ＤＯＭ２６ｈ−１２７；ＤＯＭ２６ｈ−１２８；ＤＯＭ２６ｈ−１２９；ＤＯＭ２６ｈ−１３０；ＤＯＭ２６ｈ−１３１；ＤＯＭ２６ｈ−１３２；ＤＯＭ２６ｈ−１３３；ＤＯＭ２６ｈ−１３４；ＤＯＭ２６ｈ−１３５；ＤＯＭ２６ｈ−１３６；ＤＯＭ２６ｈ−１３７；ＤＯＭ２６ｈ−１３８；ＤＯＭ２６ｈ−１３９；ＤＯＭ２６ｈ−１４０；ＤＯＭ２６ｈ−１４１；ＤＯＭ２６ｈ−１４２；ＤＯＭ２６ｈ−１４３；ＤＯＭ２６ｈ−１４４；ＤＯＭ２６ｈ−１４５；ＤＯＭ２６ｈ−１４６；ＤＯＭ２６ｈ−１４７；ＤＯＭ２６ｈ−１４８；ＤＯＭ２６ｈ−１４９；ＤＯＭ２６ｈ−１５；ＤＯＭ２６ｈ−１５０；ＤＯＭ２６ｈ−１５１；ＤＯＭ２６ｈ−１５２；ＤＯＭ２６ｈ−１５３；ＤＯＭ２６ｈ−１５４；ＤＯＭ２６ｈ−１５５；ＤＯＭ２６ｈ−１５６；ＤＯＭ２６ｈ−１５７；ＤＯＭ２６ｈ−１５８；ＤＯＭ２６ｈ−１５９；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−１；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−２；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−３；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−４；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−５；ＤＯＭ２６ｈ−１６０；ＤＯＭ２６ｈ−１６８；ＤＯＭ２６ｈ−１６９；ＤＯＭ２６ｈ−１７；ＤＯＭ２６ｈ−１７０；ＤＯＭ２６ｈ−１７１；ＤＯＭ２６ｈ−１７２；ＤＯＭ２６ｈ−１７３；ＤＯＭ２６ｈ−１７４；ＤＯＭ２６ｈ−１７５；ＤＯＭ２６ｈ−１７６；ＤＯＭ２６ｈ−１７７；ＤＯＭ２６ｈ−１７８；ＤＯＭ２６ｈ−１７９；ＤＯＭ２６ｈ−１８０；ＤＯＭ２６ｈ−１８１；ＤＯＭ２６ｈ−１８２；ＤＯＭ２６ｈ−１８３；ＤＯＭ２６ｈ−１８４；ＤＯＭ２６ｈ−１８５；ＤＯＭ２６ｈ−１８６；ＤＯＭ２６ｈ−１８７；ＤＯＭ２６ｈ−１８８；ＤＯＭ２６ｈ−１８９；ＤＯＭ２６ｈ−１９；ＤＯＭ２６ｈ−１９０；ＤＯＭ２６ｈ−１９１；ＤＯＭ２６ｈ−１９２；ＤＯＭ２６ｈ−１９３；ＤＯＭ２６ｈ−１９４；ＤＯＭ２６ｈ−１９５；ＤＯＭ２６ｈ−１９６；ＤＯＭ２６ｈ−１９７；ＤＯＭ２６ｈ−１９８；ＤＯＭ２６ｈ−１９９；ＤＯＭ２６ｈ−２；ＤＯＭ２６ｈ−２０；ＤＯＭ２６ｈ−２００；ＤＯＭ２６ｈ−２０１；ＤＯＭ２６ｈ−２０２；ＤＯＭ２６ｈ−２０３；ＤＯＭ２６ｈ−２０４；ＤＯＭ２６ｈ−２０５；ＤＯＭ２６ｈ−２０６；ＤＯＭ２６ｈ−２０７；ＤＯＭ２６ｈ−２０８；ＤＯＭ２６ｈ−２０９；ＤＯＭ２６ｈ−２１；ＤＯＭ２６ｈ−２１０；ＤＯＭ２６ｈ−２１１；ＤＯＭ２６ｈ−２１２；ＤＯＭ２６ｈ−２１３；ＤＯＭ２６ｈ−２１４；ＤＯＭ２６ｈ−２１５；ＤＯＭ２６ｈ−２１６；ＤＯＭ２６ｈ−２１７；ＤＯＭ２６ｈ−２１８；ＤＯＭ２６ｈ−２１９；ＤＯＭ２６ｈ−２２；ＤＯＭ２６ｈ−２２０；ＤＯＭ２６ｈ−２２１；ＤＯＭ２６ｈ−２２２；ＤＯＭ２６ｈ−２２３；ＤＯＭ２６ｈ−２３；ＤＯＭ２６ｈ−２４；ＤＯＭ２６ｈ−２９−１；ＤＯＭ２６ｈ−４；ＤＯＭ２６ｈ−４１；ＤＯＭ２６ｈ−４２；ＤＯＭ２６ｈ−４３；ＤＯＭ２６ｈ−４４；ＤＯＭ２６ｈ−４５；ＤＯＭ２６ｈ−４６；ＤＯＭ２６ｈ−４７；ＤＯＭ２６ｈ−４８；ＤＯＭ２６ｈ−４９；ＤＯＭ２６ｈ−５０；ＤＯＭ２６ｈ−５１；ＤＯＭ２６ｈ−５２；ＤＯＭ２６ｈ−５３；ＤＯＭ２６ｈ−５４；ＤＯＭ２６ｈ−５５；ＤＯＭ２６ｈ−５６；ＤＯＭ２６ｈ−５７；ＤＯＭ２６ｈ−５８；ＤＯＭ２６ｈ−５９；ＤＯＭ２６ｈ−６０；ＤＯＭ２６ｈ−６１；ＤＯＭ２６ｈ−６２；ＤＯＭ２６ｈ−６３；ＤＯＭ２６ｈ−６４；ＤＯＭ２６ｈ−６５；ＤＯＭ２６ｈ−６６；ＤＯＭ２６ｈ−６７；ＤＯＭ２６ｈ−６８；ＤＯＭ２６ｈ−６９；ＤＯＭ２６ｈ−７０；ＤＯＭ２６ｈ−７１；ＤＯＭ２６ｈ−７２；ＤＯＭ２６ｈ−７３；ＤＯＭ２６ｈ−７４；ＤＯＭ２６ｈ−７５；ＤＯＭ２６ｈ−７６；ＤＯＭ２６ｈ−７７；ＤＯＭ２６ｈ−７８；ＤＯＭ２６ｈ−７９；ＤＯＭ２６ｈ−８０；ＤＯＭ２６ｈ−８１；ＤＯＭ２６ｈ−８２；ＤＯＭ２６ｈ−８３；ＤＯＭ２６ｈ−８４；ＤＯＭ２６ｈ−８５；ＤＯＭ２６ｈ−８６；ＤＯＭ２６ｈ−８７；ＤＯＭ２６ｈ−８８；ＤＯＭ２６ｈ−８９；ＤＯＭ２６ｈ−９０；ＤＯＭ２６ｈ−９１；ＤＯＭ２６ｈ−９２；ＤＯＭ２６ｈ−９３；ＤＯＭ２６ｈ−９４；ＤＯＭ２６ｈ−９５；ＤＯＭ２６ｈ−９６；ＤＯＭ２６ｈ−９７；ＤＯＭ２６ｈ−９８；ＤＯＭ２６ｈ−９９；ＤＯＭ２６ｈ−９９−１；ＤＯＭ２６ｈ−９９−２；ＤＯＭ２６ｈ−１６１；ＤＯＭ２６ｈ−１６２；ＤＯＭ２６ｈ−１６３；ＤＯＭ２６ｈ−１６４；ＤＯＭ２６ｈ−１６５；ＤＯＭ２６ｈ−１６６；ＤＯＭ２６ｈ−１６７；ＤＯＭ２６ｈ−２２４；ＤＯＭ２６ｈ−２５；ＤＯＭ２６ｈ−２６；ＤＯＭ２６ｈ−２７；ＤＯＭ２６ｈ−２８；ＤＯＭ２６ｈ−２９；ＤＯＭ２６ｈ−３０；ＤＯＭ２６ｈ−３１；ＤＯＭ２６ｈ−３２；ＤＯＭ２６ｈ−３３；ＤＯＭ２６ｈ−３４；ＤＯＭ２６ｈ−３５；ＤＯＭ２６ｈ−３６；ＤＯＭ２６ｈ−３７；ＤＯＭ２６ｈ−３８；ＤＯＭ２６ｈ−３９；ＤＯＭ２６ｈ−４０；ＤＯＭ２６ｈ−６；ＤＯＭ２６ｈ−８；ＤＯＭ２６ｈ−９として同定されるアミノ酸配列のいずれか１つと１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される、ヒトＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項２６】
ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４；ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８６；ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８７；ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１；ＤＯＭ２６ｈ−２１０−２；ＤＯＭ２６ｈ−２２０−１；またはＤＯＭ２６ｈ−２２０−４３として同定されるアミノ酸配列と１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される、ヒトＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項２７】
ヒトＡＳＧＰＲとの結合について請求項２５または２６のアミノ酸配列のいずれか１つと競合するｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項２８】
ＤＯＭ２６ｍ−１０；ＤＯＭ２６ｍ−１３；ＤＯＭ２６ｍ−１６；ＤＯＭ２６ｍ−１６５；ＤＯＭ２６ｍ−１７；ＤＯＭ２６ｍ−２７；ＤＯＭ２６ｍ−２８；ＤＯＭ２６ｍ−２９；ＤＯＭ２６ｍ−３０；ＤＯＭ２６ｍ−３１；ＤＯＭ２６ｍ−３２；ＤＯＭ２６ｍ−３３；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１０；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１１；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１２；ＤＯＭ２６ｍ−３３−２；ＤＯＭ２６ｍ−３３−３；ＤＯＭ２６ｍ−３３−４；ＤＯＭ２６ｍ−３３−５；ＤＯＭ２６ｍ−３３−６；ＤＯＭ２６ｍ−３３−７；ＤＯＭ２６ｍ−３３−８；ＤＯＭ２６ｍ−３３−９；ＤＯＭ２６ｍ−３４；ＤＯＭ２６ｍ−３５；ＤＯＭ２６ｍ−３６；ＤＯＭ２６ｍ−３７；ＤＯＭ２６ｍ−３８；ＤＯＭ２６ｍ−３９；ＤＯＭ２６ｍ−４；ＤＯＭ２６ｍ−４０；ＤＯＭ２６ｍ−４１；ＤＯＭ２６ｍ−４２；ＤＯＭ２６ｍ−４３；ＤＯＭ２６ｍ−４４；ＤＯＭ２６ｍ−４５；ＤＯＭ２６ｍ−４６；ＤＯＭ２６ｍ−４７；ＤＯＭ２６ｍ−４８；ＤＯＭ２６ｍ−５２；ＤＯＭ２６ｍ−５２−１；ＤＯＭ２６ｍ−５２−２；ＤＯＭ２６ｍ−５２−３；ＤＯＭ２６ｍ−５２−４；ＤＯＭ２６ｍ−５２−５；ＤＯＭ２６ｍ−５２−６；ＤＯＭ２６ｍ−５２−７；ＤＯＭ２６ｍ−６；ＤＯＭ２６ｍ−６０；ＤＯＭ２６ｍ−６１−１；ＤＯＭ２６ｍ−６１−２；ＤＯＭ２６ｍ−６１−３；ＤＯＭ２６ｍ−６１−４；ＤＯＭ２６ｍ−６１−５；ＤＯＭ２６ｍ−６１−６；ＤＯＭ２６ｍ−７；ＤＯＭ２６ｍ−７３；ＤＯＭ２６ｍ−７４；ＤＯＭ２６ｍ−７５；ＤＯＭ２６ｍ−７６；ＤＯＭ２６ｍ−７７；ＤＯＭ２６ｍ−７８；ＤＯＭ２６ｍ−７９；ＤＯＭ２６ｍ−８；ＤＯＭ２６ｍ−８０；ＤＯＭ２６ｍ−８１；ＤＯＭ２６ｍ−８２；ＤＯＭ２６ｍ−８３；ＤＯＭ２６ｍ−９；ＤＯＭ２６ｍ−１；ＤＯＭ２６ｍ−１００；ＤＯＭ２６ｍ−１０１；ＤＯＭ２６ｍ−１０２；ＤＯＭ２６ｍ−１０３；ＤＯＭ２６ｍ−１０６；ＤＯＭ２６ｍ−１０８；ＤＯＭ２６ｍ−１０９；ＤＯＭ２６ｍ−１０９−１；ＤＯＭ２６ｍ−１０９−２；ＤＯＭ２６ｍ−１２；ＤＯＭ２６ｍ−１８；ＤＯＭ２６ｍ−１９；ＤＯＭ２６ｍ−２０；ＤＯＭ２６ｍ−２０−１；ＤＯＭ２６ｍ−２０−２；ＤＯＭ２６ｍ−２０−３；ＤＯＭ２６ｍ−２０−４；ＤＯＭ２６ｍ−２０−５；ＤＯＭ２６ｍ−２０−６；ＤＯＭ２６ｍ−２２；ＤＯＭ２６ｍ−２３；ＤＯＭ２６ｍ−２４；ＤＯＭ２６ｍ−２５；ＤＯＭ２６ｍ−２６；ＤＯＭ２６ｍ−３；ＤＯＭ２６ｍ−５０；ＤＯＭ２６ｍ−５０−１；ＤＯＭ２６ｍ−５０−２；ＤＯＭ２６ｍ−５０−３；ＤＯＭ２６ｍ−５０−４；ＤＯＭ２６ｍ−５０−５；ＤＯＭ２６ｍ−５０−６；ＤＯＭ２６ｍ−５１；ＤＯＭ２６ｍ−５３；ＤＯＭ２６ｍ−５４；ＤＯＭ２６ｍ−５５；ＤＯＭ２６ｍ−５６；ＤＯＭ２６ｍ−５７；ＤＯＭ２６ｍ−５８；ＤＯＭ２６ｍ−５９；ＤＯＭ２６ｍ−６１；ＤＯＭ２６ｍ−６３；ＤＯＭ２６ｍ−６４；ＤＯＭ２６ｍ−６６；ＤＯＭ２６ｍ−６９；ＤＯＭ２６ｍ−８５；ＤＯＭ２６ｍ−８６；ＤＯＭ２６ｍ−８７；ＤＯＭ２６ｍ−８９；ＤＯＭ２６ｍ−９０；ＤＯＭ２６ｍ−９１；ＤＯＭ２６ｍ−９２；ＤＯＭ２６ｍ−９３；ＤＯＭ２６ｍ−９４；ＤＯＭ２６ｍ−９５；ＤＯＭ２６ｍ−９６；ＤＯＭ２６ｍ−９７；ＤＯＭ２６ｍ−９８；ＤＯＭ２６ｍ−９９として同定されるアミノ酸配列のいずれか１つと１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される、マウスＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項２９】
マウスＡＳＧＰＲとの結合について請求項２８のアミノ酸配列のいずれか１つと競合するｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項３０】
マウスおよびヒトＡＳＧＰＲと交差反応する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項３１】
前記ｄＡｂアミノ酸配列が、請求項２５〜３０の配列のいずれか１つにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３配列と１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のｄＡｂアミノ酸配列。
【請求項３２】
医薬品に使用するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
治療上または予防上有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物を被験体に投与することにより、少なくとも１種の肝疾患もしくは障害もしくは状態を治療または予防する方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の肝疾患もしくは障害もしくは状態が、炎症性肝疾患、ウイルス性肝疾患、肝硬変および肝がんから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の肝疾患が、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎から選択され、前記炎症性肝疾患が、線維症である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
治療上または予防上有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物を被験体に投与することにより、少なくとも１種の肝疾患もしくは障害もしくは状態を治療または予防する方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種の肝疾患もしくは障害もしくは状態が、ウイルス性肝疾患、肝硬変および肝がんから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１種のウイルス性肝疾患が、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、皮下、静脈内または筋肉内注射により被験体に送達される、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、非経口、経口、直腸、経粘膜、眼、肺またはＧＩ管送達により被験体に送達される、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物を含む、注射可能、経口、吸入可能または噴霧可能製剤。
【請求項４２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物を含む、徐放製剤。
【請求項４３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結乾燥製剤。
【請求項４４】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物を含む、送達装置。
【請求項４５】
肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に結合するｄＡｂをコードする単離または組換え核酸であって、ヌクレオチド配列が図１３、１４、１７、１８または３２に示すＤＯＭ２６核酸配列のいずれか１つと１００％、９５％、９０％、８５％または８０％同一である配列から選択される核酸。
【請求項４６】
請求項４５の核酸を含むベクター。
【請求項４７】
請求項４５の核酸または請求項４６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４８】
前記核酸またはベクターの発現に適した条件下で請求項４７の宿主細胞を維持し、それによって融合ポリペプチドを産生するステップを含む、（ａ）肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に結合するｄＡｂと、（ｂ）肝臓へ送達するための少なくとも１種の治療用分子とを含む融合ポリペプチドを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓を標的にすることができる分子に関する。これらの肝臓標的化分子（例えば、融合体および結合体）は、タンパク質、抗体もしくは抗体フラグメント、例えば免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、およびインターフェロンなどの肝臓へ送達することが望まれている１種または複数の追加の分子も含む。本発明は、さらにこのような肝臓標的化分子を含む使用、製剤、組成物および装置に関する。本発明はまた、肝細胞に結合する免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝疾患は、（それだけに限らないが）以下を含むいくつかの疾患状態を説明する用語である：
１）肝炎、多くの場合、ウイルス感染により引き起こされる肝臓の炎症；
２）典型的にはウイルス感染またはアルコールなどの肝毒性剤への暴露後の肝臓における組織リモデリング後の繊維性沈着を伴う肝硬変；および
３）原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）および肝臓外部位における腫瘍の転移後の続発性腫瘍形成を含む肝がん。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の慢性感染症は、肝硬変およびＨＣＣの主な原因の１つである。ＨＣＶ関連疾患の世界負荷は、多くの国々において地方性感染症と共に高い。ＷＨＯ統計によると、推定１億７０００万人（世界人口の３％）が感染しており、毎年推定３００〜４００万人が新たなケースである（例えば、Ｓｏｒｉａｎｏ、ＰｅｔｅｒｓおよびＺｅｕｚｅｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２００９；４８：３１３〜２０により概説される）。感染した個体の約７０％は、慢性感染症を発症しており、この群の２０％は、２０年以内に肝硬変に進行する。ＨＣＶ感染後の肝硬変はまた、肝がんを発症する高い危険性と関連しており、毎年ＨＣＶに誘発された肝硬変の患者の３〜４％がＨＣＣの発症へと進む（例えば、Ｗｅｂｓｔｅｒ等  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００９；９：１０８〜１７により概説される）。
【０００４】
ＨＣＶ療法の現行基準は、ペグ化インターフェロンα（ＰＥＧ−ＩＦＮ−α）およびヌクレオシド類似体リバビリン（ＲＢＶ）の組み合わせレジメンからなる。抗ＨＣＶ療法の主な目的は、治療終了２４週間後、高感度ＰＣＲ検出法を使用して、末梢血中にＨＣＶ  ＲＮＡを検出することができないこととして現在定義されている、持続性ウイルス陰性化（ＳＶＲ）をもたらすことである。ＳＶＲは、現在の標準的な療法を使用して、ＨＣＶ遺伝子型２および３に感染しているかなりの割合の患者で現在達成可能であるが、一部はＰＥＧ−ＩＦＮ−α治療に伴う副作用の結果としてのコンプライアンスの問題のために、ＳＶＲを達成する遺伝子型１および４に感染している患者の割合は、典型的にははるかに低い（例えば、ＤｅｕｔｓｃｈおよびＨａｄｚｉｙａｎｎｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ２００８；１５：２〜１１に概説されている）。ＩＦＮ療法の代替が現在開発されており、典型的には、低分子化合物によるウイルス標的（プロテアーゼ、ポリメラーゼおよびヘリカーゼタンパク質）の阻害を伴う。
【０００５】
しかしながら、多くの場合、ウイルス耐性および副作用の問題が、これらの化合物の開発および広範な使用を妨げてきた。他方、ＩＦＮ療法は、ウイルス耐性を伴わないので、より優れた効果および耐容性プロファイルを有する新規なＩＦＮに基づく療法は、ＨＣＶ療法の現行基準の有意な改善の機会となることができるだろう。
【０００６】
ＩＦＮに関連する副作用は、一部は、ＩＦＮ−αへの全身暴露後のＩＦＮ応答遺伝子の誘導が原因であると考えられている（例えば、Ｍｙｉｎｔ等．Ｍｅｔａｂ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｉｓ  ２００９；２４：５５〜（６８）に概説されている）。ＨＣＶ感染の原発部位は肝臓（特に肝細胞）にあるので、末梢血のＩＦＮへの暴露を避け、それによってＩＦＮ療法に伴う副作用を潜在的に減少させることが潜在的利点となり得るだろう。肝臓を特異的に標的にするＩＦＮ−αはまた、ＨＣＶ感染部位に治療用分子を向ける双産物（ｂｉｐｒｏｄｕｃｔ）として抗ウイルス効果の改善を示すので、肝細胞での濃度を増加させることができ、今度は用量強化を可能にするＩＦＮのより低い総用量での治療を可能にするだろう。ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の動物モデルにおいて、肝臓特異的抗原アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に向けられたＩＦＮ−βは、生体内での抗ウイルス効果の有意な改善を示した（Ｅｔｏ＆Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９９；５：５７７〜５８１）。
【０００７】
アシアロ糖タンパク質受容体は、アシアロ糖タンパク質、すなわち、シアル酸残基が除去されて１個または複数の（典型的には）ガラクトース残基が露出した糖タンパク質と結合する。ＡＳＧＰＲは、循環から標的糖タンパク質を除去する肝臓細胞で発現している。ＡＳＧＰＲ分子は、２種の異なるサブユニット：Ｈ１およびＨ２を含むヘテロオリゴマーである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｏｒｉａｎｏ、ＰｅｔｅｒｓおよびＺｅｕｚｅｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２００９；４８：３１３〜２０
【非特許文献２】Ｗｅｂｓｔｅｒ等  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００９；９：１０８〜１７
【非特許文献３】ＤｅｕｔｓｃｈおよびＨａｄｚｉｙａｎｎｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ２００８；１５：２〜１１
【非特許文献４】Ｍｙｉｎｔ等．Ｍｅｔａｂ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｉｓ  ２００９；２４：５５〜（６８）
【非特許文献５】Ｅｔｏ＆Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９９；５：５７７〜５８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、肝疾患を治療および／または予防するために、ＩＦＮを含む分子を肝臓に向ける新たな治療用組成物を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そのため、ＨＣＶ治療のためのＩＦＮを含む分子を標的にする抗体に基づくアプローチは、一定範囲の肝疾患の治療に使用するための効果および耐容性プロファイルが改善された新規の治療法を開発する方法を提供することができる。
【００１１】
本発明は、分子を肝臓の肝細胞に向ける組成物および方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、（ａ）肝臓細胞、例えば、肝臓の肝細胞（例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体）に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））などのリガンドと、（ｂ）肝臓へ送達するための１種または複数の治療用分子とを含む単一分子（例えば、単一融合体または結合体）を含む肝臓標的化組成物を提供する。特に、本発明は、ＡＳＧＰＲのＨ１サブユニットに結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ドメイン抗体）などのリガンドを含む単一分子（融合体または結合体など）を含む肝臓標的化組成物を提供する。
【００１３】
これらの肝臓標的化組成物はまた、さらなるタンパク質もしくはポリペプチド、例えば、半減期延長タンパク質もしくはポリペプチド、例えば、さらなるｄＡｂ、例えば血清アルブミンに結合するｄＡｂ、または例えばポリエチレングリコールＰＥＧを含むことができる。これらは、単一分子に融合または結合していてもよく、リガンドもしくは治療用分子に、またはリガンドおよび治療用分子の両方に融合または結合していてもよい。分子の生体内半減期を延長および／または測定する方法は、当業者に既知であり、例えば、ＷＯ２００６／０５９１１０およびＷＯ２００８／０９６１５８に詳細に記載されている。
【００１４】
一実施形態では、肝臓標的化組成物は、肝細胞、例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体、特にそのＨ１サブユニットに特異的に結合する単一免疫グロブリン可変ドメイン（ドメイン抗体（ｄＡｂ））である抗体フラグメント（ａ）を含む。ｄＡｂは、ヒトＶｈまたはヒトＶκであり得る。ｄＡｂはまた、ヒトおよび／またはマウスＡＳＧＰＲ受容体に結合することもできる。
【００１５】
本発明の組成物はまた、リガンド、例えば、肝細胞、例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に特異的に結合する単一免疫グロブリン可変ドメイン（ｄＡｂ）を含む。例えば、本発明により提供されるｄＡｂは、ヒトＶｈまたはヒトＶκであり得る。ｄＡｂはまた、ヒトおよび／またはマウスＡＳＧＰＲ受容体ならびに／あるいは他の動物のＡＳＧＰＲ受容体に結合することもできる。
【００１６】
一実施形態では、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に結合するｄＡｂは、１ｐＭ〜約１００ｎＭ、例えば約１ｐＭ〜約１０ｎＭまたは例えば約１ｐＭ〜約１ｎＭの領域で、［ＨＢＳ−Ｐ緩衝系（０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用して］Ｂｉａｃｏｒｅにより測定されるように、高親和性で、ヒトおよび／またはマウスＡＳＧＰＲに結合する。一実施形態では、ｄＡｂは、上記のように、高親和性で、ヒトおよびマウスＡＳＧＰＲの両方に結合するだろう。
【００１７】
例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に特異的に結合する本発明により提供されるｄＡｂは、（抗ヒトＡＳＧＰＲ  ＶＨ  ｄＡｂ）ＤＯＭ２６ｈ−１（配列番号１５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１０（配列番号１５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１００（配列番号１５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１０１（配列番号１６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１０２（配列番号１６３）；ＤＯＭ２６ｈ−１０３（配列番号１６５）；ＤＯＭ２６ｈ−１０４（配列番号１６７）；ＤＯＭ２６ｈ−１０５（配列番号１６９）；ＤＯＭ２６ｈ−１０６（配列番号１７１）；ＤＯＭ２６ｈ−１０７（配列番号１７３）；ＤＯＭ２６ｈ−１０８（配列番号１７５）；ＤＯＭ２６ｈ−１０９（配列番号１７７）；ＤＯＭ２６ｈ−１１（配列番号１７９）；ＤＯＭ２６ｈ−１１０（配列番号１８１）；ＤＯＭ２６ｈ−１１１（配列番号１８３）；ＤＯＭ２６ｈ−１１２（配列番号１８５）；ＤＯＭ２６ｈ−１１３（配列番号１８７）；ＤＯＭ２６ｈ−１１４（配列番号１８９）；ＤＯＭ２６ｈ−１１５（配列番号１９１）；ＤＯＭ２６ｈ−１１６（配列番号１９３）；ＤＯＭ２６ｈ−１１７（配列番号１９５）；ＤＯＭ２６ｈ−１１８（配列番号１９７）；ＤＯＭ２６ｈ−１１９（配列番号１９９）；ＤＯＭ２６ｈ−１２（配列番号２０１）；ＤＯＭ２６ｈ−１２０（配列番号２０３）；ＤＯＭ２６ｈ−１２１（配列番号２０５）；ＤＯＭ２６ｈ−１２２（配列番号２０７）；ＤＯＭ２６ｈ−１２３（配列番号２０９）；ＤＯＭ２６ｈ−１２４（配列番号２１１）；ＤＯＭ２６ｈ−１２５（配列番号２１３）；ＤＯＭ２６ｈ−１２６（配列番号２１５）；ＤＯＭ２６ｈ−１２７（配列番号２１７）；ＤＯＭ２６ｈ−１２８（配列番号２１９）；ＤＯＭ２６ｈ−１２９（配列番号２２１）；ＤＯＭ２６ｈ−１３０（配列番号２２３）；ＤＯＭ２６ｈ−１３１（配列番号２２５）；ＤＯＭ２６ｈ−１３２（配列番号２２７）；ＤＯＭ２６ｈ−１３３（配列番号２２９）；ＤＯＭ２６ｈ−１３４（配列番号２３１）；ＤＯＭ２６ｈ−１３５（配列番号２３３）；ＤＯＭ２６ｈ−１３６（配列番号２３５）；ＤＯＭ２６ｈ−１３７（配列番号２３７）；ＤＯＭ２６ｈ−１３８（配列番号２３９）；ＤＯＭ２６ｈ−１３９（配列番号２４１）；ＤＯＭ２６ｈ−１４０（配列番号２４３）；ＤＯＭ２６ｈ−１４１（配列番号２４５）；ＤＯＭ２６ｈ−１４２（配列番号２４７）；ＤＯＭ２６ｈ−１４３（配列番号２４９）；ＤＯＭ２６ｈ−１４４（配列番号２５１）；ＤＯＭ２６ｈ−１４５（配列番号２５３）；ＤＯＭ２６ｈ−１４６（配列番号２５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１４７（配列番号２５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１４８（配列番号２５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１４９（配列番号２６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５（配列番号２６３）；ＤＯＭ２６ｈ−１５０（配列番号２６５）；ＤＯＭ２６ｈ−１５１（配列番号２６７）；ＤＯＭ２６ｈ−１５２（配列番号２６９）；ＤＯＭ２６ｈ−１５３（配列番号２７１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５４（配列番号２７３）；ＤＯＭ２６ｈ−１５５（配列番号２７５）；ＤＯＭ２６ｈ−１５６（配列番号２７７）；ＤＯＭ２６ｈ−１５７（配列番号２７９）；ＤＯＭ２６ｈ−１５８（配列番号２８１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９（配列番号２８３）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−１��配列番号２８５）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−２（配列番号２８７）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−３（配列番号２８９）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−４（配列番号２９１）；ＤＯＭ２６ｈ−１５９−５（配列番号２９３）；ＤＯＭ２６ｈ−１６０（配列番号２９５）；ＤＯＭ２６ｈ−１６８（配列番号２９７）；ＤＯＭ２６ｈ−１６９（配列番号２９９）；ＤＯＭ２６ｈ−１７（配列番号３０１）；ＤＯＭ２６ｈ−１７０（配列番号３０３）；ＤＯＭ２６ｈ−１７１（配列番号３０５）；ＤＯＭ２６ｈ−１７２（配列番号３０７）；ＤＯＭ２６ｈ−１７３（配列番号３０９）；ＤＯＭ２６ｈ−１７４（配列番号３１１）；ＤＯＭ２６ｈ−１７５（配列番号３１３）；ＤＯＭ２６ｈ−１７６（配列番号３１５）；ＤＯＭ２６ｈ−１７７（配列番号３１７）；ＤＯＭ２６ｈ−１７８（配列番号３１９）；ＤＯＭ２６ｈ−１７９（配列番号３２１）；ＤＯＭ２６ｈ−１８０（配列番号３２３）；ＤＯＭ２６ｈ−１８１（配列番号３２５）；ＤＯＭ２６ｈ−１８２（配列番号３２７）；ＤＯＭ２６ｈ−１８３（配列番号３２９）；ＤＯＭ２６ｈ−１８４（配列番号３３１）；ＤＯＭ２６ｈ−１８５（配列番号３３３）；ＤＯＭ２６ｈ−１８６（配列番号３３５）；ＤＯＭ２６ｈ−１８７（配列番号３３７）；ＤＯＭ２６ｈ−１８８（配列番号３３９）；ＤＯＭ２６ｈ−１８９（配列番号３４１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９（配列番号３４３）；ＤＯＭ２６ｈ−１９０（配列番号３４５）；ＤＯＭ２６ｈ−１９１（配列番号３４７）；ＤＯＭ２６ｈ−１９２（配列番号３４９）；ＤＯＭ２６ｈ−１９３（配列番号３５１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９４（配列番号３５３）；ＤＯＭ２６ｈ−１９５（配列番号３５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１９６（配列番号３５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１９７（配列番号３５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１９８（配列番号３６１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９９（配列番号３６３）；ＤＯＭ２６ｈ−２（配列番号３６５）；ＤＯＭ２６ｈ−２０（配列番号３６７）；ＤＯＭ２６ｈ−２００（配列番号３６９）；ＤＯＭ２６ｈ−２０１（配列番号３７１）；ＤＯＭ２６ｈ−２０２（配列番号３７３）；ＤＯＭ２６ｈ−２０３（配列番号３７５）；ＤＯＭ２６ｈ−２０４（配列番号３７７）；ＤＯＭ２６ｈ−２０５（配列番号３７９）；ＤＯＭ２６ｈ−２０６（配列番号３８１）；ＤＯＭ２６ｈ−２０７（配列番号３８３）；ＤＯＭ２６ｈ−２０８（配列番号３８５）；ＤＯＭ２６ｈ−２０９（配列番号３８７）；ＤＯＭ２６ｈ−２１（配列番号３８９）；ＤＯＭ２６ｈ−２１０（配列番号３９１）；ＤＯＭ２６ｈ−２１１（配列番号３９３）；ＤＯＭ２６ｈ−２１２（配列番号３９５）；ＤＯＭ２６ｈ−２１３（配列番号３９７）；ＤＯＭ２６ｈ−２１４（配列番号３９９）；ＤＯＭ２６ｈ−２１５（配列番号４０１）；ＤＯＭ２６ｈ−２１６（配列番号４０３）；ＤＯＭ２６ｈ−２１７（配列番号４０５）；ＤＯＭ２６ｈ−２１８（配列番号４０７）；ＤＯＭ２６ｈ−２１９（配列番号４０９）；ＤＯＭ２６ｈ−２２（配列番号４１１）；ＤＯＭ２６ｈ−２２０（配列番号４１３）；ＤＯＭ２６ｈ−２２１（配列番号４１５）；ＤＯＭ２６ｈ−２２２（配列番号４１７）；ＤＯＭ２６ｈ−２２３（配列番号４１９）；ＤＯＭ２６ｈ−２３（配列番号��２１）；ＤＯＭ２６ｈ−２４（配列番号４２３）；ＤＯＭ２６ｈ−２９−１（配列番号４２５）；ＤＯＭ２６ｈ−４（配列番号４２７）；ＤＯＭ２６ｈ−４１（配列番号４２９）；ＤＯＭ２６ｈ−４２（配列番号４３１）；ＤＯＭ２６ｈ−４３（配列番号４３３）；ＤＯＭ２６ｈ−４４（配列番号４３５）；ＤＯＭ２６ｈ−４５（配列番号４３７）；ＤＯＭ２６ｈ−４６（配列番号４３９）；ＤＯＭ２６ｈ−４７（配列番号４４１）；ＤＯＭ２６ｈ−４８（配列番号４４３）；ＤＯＭ２６ｈ−４９（配列番号４４５）；ＤＯＭ２６ｈ−５０（配列番号４４７）；ＤＯＭ２６ｈ−５１（配列番号４４９）；ＤＯＭ２６ｈ−５２（配列番号４５１）；ＤＯＭ２６ｈ−５３（配列番号４５３）；ＤＯＭ２６ｈ−５４（配列番号４５５）；ＤＯＭ２６ｈ−５５（配列番号４５７）；ＤＯＭ２６ｈ−５６（配列番号４５９）；ＤＯＭ２６ｈ−５７（配列番号４６１）；ＤＯＭ２６ｈ−５８（配列番号４６３）；ＤＯＭ２６ｈ−５９（配列番号４６５）；ＤＯＭ２６ｈ−６０（配列番号４６７）；ＤＯＭ２６ｈ−６１（配列番号４６９）；ＤＯＭ２６ｈ−６２（配列番号４７１）；ＤＯＭ２６ｈ−６３（配列番号４７３）；ＤＯＭ２６ｈ−６４（配列番号４７５）；ＤＯＭ２６ｈ−６５（配列番号４７７）；ＤＯＭ２６ｈ−６６（配列番号４７９）；ＤＯＭ２６ｈ−６７（配列番号４８１）；ＤＯＭ２６ｈ−６８（配列番号４８３）；ＤＯＭ２６ｈ−６９（配列番号４８５）；ＤＯＭ２６ｈ−７０（配列番号４８７）；ＤＯＭ２６ｈ−７１（配列番号４８９）；ＤＯＭ２６ｈ−７２（配列番号４９１）；ＤＯＭ２６ｈ−７３（配列番号４９３）；ＤＯＭ２６ｈ−７４（配列番号４９５）；ＤＯＭ２６ｈ−７５（配列番号４９７）；ＤＯＭ２６ｈ−７６（配列番号４９９）；ＤＯＭ２６ｈ−７７（配列番号５０１）；ＤＯＭ２６ｈ−７８（配列番号５０３）；ＤＯＭ２６ｈ−７９（配列番号５０５）；ＤＯＭ２６ｈ−８０（配列番号５０７）；ＤＯＭ２６ｈ−８１（配列番号５０９）；ＤＯＭ２６ｈ−８２（配列番号５１１）；ＤＯＭ２６ｈ−８３（配列番号５１３）；ＤＯＭ２６ｈ−８４（配列番号５１５）；ＤＯＭ２６ｈ−８５（配列番号５１７）；ＤＯＭ２６ｈ−８６（配列番号５１９）；ＤＯＭ２６ｈ−８７（配列番号５２１）；ＤＯＭ２６ｈ−８８（配列番号５２３）；ＤＯＭ２６ｈ−８９（配列番号５２５）；ＤＯＭ２６ｈ−９０（配列番号５２７）；ＤＯＭ２６ｈ−９１（配列番号５２９）；ＤＯＭ２６ｈ−９２（配列番号５３１）；ＤＯＭ２６ｈ−９３（配列番号５３３）；ＤＯＭ２６ｈ−９４（配列番号５３５）；ＤＯＭ２６ｈ−９５（配列番号５３７）；ＤＯＭ２６ｈ−９６（配列番号５３９）；ＤＯＭ２６ｈ−９７（配列番号５４１）；ＤＯＭ２６ｈ−９８（配列番号５４３）；ＤＯＭ２６ｈ−９９（配列番号５４５）；ＤＯＭ２６ｈ−９９−１（配列番号５４７）；ＤＯＭ２６ｈ−９９−２（配列番号５４９）；（抗ヒトＡＳＧＰＲ  Ｖκクローン）ＤＯＭ２６ｈ−１６１（配列番号５５１）；ＤＯＭ２６ｈ−１６２（配列番号５５３）；ＤＯＭ２６ｈ−１６３（配列番号５５５）；ＤＯＭ２６ｈ−１６４（配列番号５５７）；ＤＯＭ２６ｈ−１６５（配列番号５５９）；ＤＯＭ２６ｈ−１６６（配列番号５６１）；ＤＯＭ���６ｈ−１６７（配列番号５６３）；ＤＯＭ２６ｈ−２２４（配列番号５６５）；ＤＯＭ２６ｈ−２５（配列番号５６７）；ＤＯＭ２６ｈ−２６（配列番号５６９）；ＤＯＭ２６ｈ−２７（配列番号５７１）；ＤＯＭ２６ｈ−２８（配列番号５７３）；ＤＯＭ２６ｈ−２９（配列番号５７５）；ＤＯＭ２６ｈ−３０（配列番号５７７）；ＤＯＭ２６ｈ−３１（配列番号５７９）；ＤＯＭ２６ｈ−３２（配列番号５８１）；ＤＯＭ２６ｈ−３３（配列番号５８３）；ＤＯＭ２６ｈ−３４（配列番号５８５）；ＤＯＭ２６ｈ−３５（配列番号５８７）；ＤＯＭ２６ｈ−３６（配列番号５８９）；ＤＯＭ２６ｈ−３７（配列番号５９１）；ＤＯＭ２６ｈ−３８（配列番号５９３）；ＤＯＭ２６ｈ−３９（配列番号５９５）；ＤＯＭ２６ｈ−４０（配列番号５９７）；ＤＯＭ２６ｈ−６（配列番号５９９）；ＤＯＭ２６ｈ−８（配列番号６０１）；ＤＯＭ２６ｈ−９（配列番号６０３）として同定されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８５％、９０％、９５％または１００％同一である）アミノ酸配列を含むものであり得る。
【００１８】
別の実施形態では、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に特異的に結合する本発明により提供されるｄＡｂは、ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４（配列番号８６７）；ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８６（配列番号８６９）；ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８７（配列番号８７１）；ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１（配列番号８７３）；ＤＯＭ２６ｈ−２１０−２（配列番号８７５）；ＤＯＭ２６ｈ−２２０−１（配列番号８７７）；またはＤＯＭ２６ｈ−２２０−４３（配列番号８７９）として図３２で同定されるヌクレオチド配列によりコードされる親和性成熟ｄＡｂクローン配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８５％、９０％、９５％または１００％同一である）アミノ酸配列を含むものであり得る。
【００１９】
別の例では、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に結合するｄＡｂは、（抗マウスＡＳＧＰＲ  ＶＨ  ｄＡｂ）ＤＯＭ２６ｍ−１０（配列番号６０５）；ＤＯＭ２６ｍ−１３（配列番号６０７）；ＤＯＭ２６ｍ−１６（配列番号６０９）；ＤＯＭ２６ｍ−１６５（配列番号６１１）；ＤＯＭ２６ｍ−１７（配列番号６１３）；ＤＯＭ２６ｍ−２７（配列番号６１５）；ＤＯＭ２６ｍ−２８（配列番号６１７）；ＤＯＭ２６ｍ−２９（配列番号６１９）；ＤＯＭ２６ｍ−３０（配列番号６２１）；ＤＯＭ２６ｍ−３１（配列番号６２３）；ＤＯＭ２６ｍ−３２（配列番号６２５）；ＤＯＭ２６ｍ−３３（配列番号６２７）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１（配列番号６２９）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１０（配列番号６３１）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１１（配列番号６３３）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−１２（配列番号６３５）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−２（配列番号６３７）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−３（配列番号６３９）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−４（配列番号６４１）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−５（配列番号６４３）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−６（配列番号６４５）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−７（配列番号６４７）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−８（配列番号６４９）；ＤＯＭ２６ｍ−３３−９（配列番号６５１）；ＤＯＭ２６ｍ−３４（配列番号６５３）；ＤＯＭ２６ｍ−３５（配列番号６５５）；ＤＯＭ２６ｍ−３６（配列番号６５７）；ＤＯＭ２６ｍ−３７（配列番号６５９）；ＤＯＭ２６ｍ−３８（配列番号６６１）；ＤＯＭ２６ｍ−３９（配列番号６６３）；ＤＯＭ２６ｍ−４（配列番号６６５）；ＤＯＭ２６ｍ−４０（配列番号６６７）；ＤＯＭ２６ｍ−４１（配列番号６６９）；ＤＯＭ２６ｍ−４２（配列番号６７１）；ＤＯＭ２６ｍ−４３（配列番号６７３）；ＤＯＭ２６ｍ−４４（配列番号６７５）；ＤＯＭ２６ｍ−４５（配列番号６７７）；ＤＯＭ２６ｍ−４６（配列番号６７９）；ＤＯＭ２６ｍ−４７（配列番号６８１）；ＤＯＭ２６ｍ−４８（配列番号６８３）；ＤＯＭ２６ｍ−５２（配列番号６８５）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−１（配列番号６８７）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−２（配列番号６８９）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−３（配列番号６９１）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−４（配列番号６９３）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−５（配列番号６９５）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−６（配列番号６９７）；ＤＯＭ２６ｍ−５２−７（配列番号６９９）；ＤＯＭ２６ｍ−６（配列番号７０１）；ＤＯＭ２６ｍ−６０（配列番号７０３）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−１（配列番号７０５）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−２（配列番号７０７）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−３（配列番号７０９）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−４（配列番号７１１）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−５（配列番号７１３）；ＤＯＭ２６ｍ−６１−６（配列番号７１５）；ＤＯＭ２６ｍ−７（配列番号７１７）；ＤＯＭ２６ｍ−７３（配列番号７１９）；ＤＯＭ２６ｍ−７４（配列番号７２１）；ＤＯＭ２６ｍ−７５（配列番号７２３）；ＤＯＭ２６ｍ−７６（配列番号７２５）；ＤＯＭ２６ｍ−７７（配列番号７２７）；ＤＯＭ２６ｍ−７８（配列番号７２９）；ＤＯＭ２６ｍ−７９（配列番号７３１）；ＤＯＭ２６ｍ−８（配列番号７３３）；ＤＯＭ２６ｍ−８０（配列番号７３５）；ＤＯＭ２６ｍ−８１（配列番号��３７）；ＤＯＭ２６ｍ−８２（配列番号７３９）；ＤＯＭ２６ｍ−８３（配列番号７４１）；ＤＯＭ２６ｍ−９（配列番号７４３）；（抗マウスＡＳＧＰＲ  Ｖκ  ｄＡｂ）ＤＯＭ２６ｍ−１（配列番号７４５）；ＤＯＭ２６ｍ−１００（配列番号７４７）；ＤＯＭ２６ｍ−１０１（配列番号７４９）；ＤＯＭ２６ｍ−１０２（配列番号７５１）；ＤＯＭ２６ｍ−１０３（配列番号７５３）；ＤＯＭ２６ｍ−１０６（配列番号７５５）；ＤＯＭ２６ｍ−１０８（配列番号７５７）；ＤＯＭ２６ｍ−１０９（配列番号７５９）；ＤＯＭ２６ｍ−１０９−１（配列番号７６１）；ＤＯＭ２６ｍ−１０９−２（配列番号７６３）；ＤＯＭ２６ｍ−１２（配列番号７６５）；ＤＯＭ２６ｍ−１８（配列番号７６７）；ＤＯＭ２６ｍ−１９（配列番号７６９）；ＤＯＭ２６ｍ−２（配列番号７７１）；ＤＯＭ２６ｍ−２０（配列番号７７３）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−１（配列番号７７５）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−２（配列番号７７７）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−３（配列番号７７９）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−４（配列番号７８１）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−５（配列番号７８３）；ＤＯＭ２６ｍ−２０−６（配列番号７８５）；ＤＯＭ２６ｍ−２２（配列番号７８７）；ＤＯＭ２６ｍ−２３（配列番号７８９）；ＤＯＭ２６ｍ−２４（配列番号７９１）；ＤＯＭ２６ｍ−２５（配列番号７９３）；ＤＯＭ２６ｍ−２６（配列番号７９５）；ＤＯＭ２６ｍ−３（配列番号７９７）；ＤＯＭ２６ｍ−５０（配列番号７９９）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−１（配列番号８０１）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−２（配列番号８０３）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−３（配列番号８０５）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−４（配列番号８０７）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−５（配列番号８０９）；ＤＯＭ２６ｍ−５０−６（配列番号８１１）；ＤＯＭ２６ｍ−５１（配列番号８１３）；ＤＯＭ２６ｍ−５３（配列番号８１５）；ＤＯＭ２６ｍ−５４（配列番号８１７）；ＤＯＭ２６ｍ−５５（配列番号８１９）；ＤＯＭ２６ｍ−５６（配列番号８２１）；ＤＯＭ２６ｍ−５７（配列番号８２３）；ＤＯＭ２６ｍ−５８（配列番号８２５）；ＤＯＭ２６ｍ−５９（配列番号８２７）；ＤＯＭ２６ｍ−６１（配列番号８２９）；ＤＯＭ２６ｍ−６３（配列番号８３１）；ＤＯＭ２６ｍ−６４（配列番号８３３）；ＤＯＭ２６ｍ−６６（配列番号８３５）；ＤＯＭ２６ｍ−６９（配列番号８３７）；ＤＯＭ２６ｍ−８５（配列番号８３９）；ＤＯＭ２６ｍ−８６（配列番号８４１）；ＤＯＭ２６ｍ−８７（配列番号８４３）；ＤＯＭ２６ｍ−８９（配列番号８４５）；ＤＯＭ２６ｍ−９０（配列番号８４７）；ＤＯＭ２６ｍ−９１（配列番号８４９）；ＤＯＭ２６ｍ−９２（配列番号８５１）；ＤＯＭ２６ｍ−９３（配列番号８５３）；ＤＯＭ２６ｍ−９４（配列番号８５５）；ＤＯＭ２６ｍ−９５（配列番号８５７）；ＤＯＭ２６ｍ−９６（配列番号８５９）；ＤＯＭ２６ｍ−９７（配列番号８６１）；ＤＯＭ２６ｍ−９８（配列番号８６３）；ＤＯＭ２６ｍ−９９（配列番号８６５）として同定されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８５％、９０％、９５％または１００％同一である）アミノ酸配列を含むものである。
【００２０】
一実施形態では、リガンド、例えばｄＡｂは、ＡＳＧＰＲ受容体との結合について（図１５、１６、１９および２０に示すアミノ酸配列を有する）本明細書に記載するＤＯＭ２６ｄＡｂのいずれか１つと競合するものであり得る。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載するＤＯＭ２６アミノ酸配列のいずれか１つにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８５％、９０％、９５％または１００％同一である）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含むＡＳＧＰＲに結合するｄＡｂが提供される。ＣＤＲは、以下のようにアミノ酸配列中に同定され得る：Ｖκ配列：ＣＤＲ１は残基２４〜３４であり、ＣＤＲ２は残基５０〜５６であり、ＣＤＲ３は残基８９〜９７である；ＶＨ配列に関して：ＣＤＲ１は残基３１〜３５であり、ＣＤＲ２は残基５０〜６５であり、ＣＤＲ３は残基９５〜１０２である。
【００２２】
一実施形態では、本発明のｄＡｂは、ヒトＡＳＧＰＲとマウス、イヌまたはカニクイザルなどの別の種からのＡＳＧＰＲとの間で交差反応性を示す。一実施形態では、本発明のｄＡｂは、ヒトＡＳＧＰＲとマウスＡＳＧＰＲとの間で交差反応性を示す。この実施形態では、可変ドメインがヒトおよびマウスＡＳＧＰＲと特異的に結合する。一実施形態では、本発明は、ヒトおよびマウスＡＳＧＰＲに交差反応性であり、かつ、ＤＯＭ２６ｍ−５２、ＤＯＭ２６ｈ−９９、ＤＯＭ２６ｈ−１６１、ＤＯＭ２６ｈ−１６３、ＤＯＭ２６ｈ−１８６、ＤＯＭ２６ｈ−１９６、ＤＯＭ２６ｈ−２１０およびＤＯＭ２６ｈ−２２０から選択されるアミノ酸配列、またはＤＯＭ２６ｍ−５２、ＤＯＭ２６ｈ−９９、ＤＯＭ２６ｈ−１６１、ＤＯＭ２６ｈ−１６３、ＤＯＭ２６ｈ−１８６、ＤＯＭ２６ｈ−１９６、ＤＯＭ２６ｈ−２１０およびＤＯＭ２６ｈ−２２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８５％、９０％、９５％または１００％同一である）アミノ酸配列である可変ドメインを提供する。
【００２３】
上記のように、薬物開発は、典型的には、薬物をヒトで試験する前にマウスモデルなどの動物系でのリード薬物候補の試験を要するので、交差反応性は特に有用である。ヒトタンパク質ならびに相当するマウスタンパク質などの種相同体に結合することができる薬物の供給は、これらの系における結果を試験し、同一薬物を使用したデータの並列比較をすることを可能にする。これにより、例えば、マウスＡＳＧＰＲに対して作用する薬物およびヒトＡＳＧＰＲに対して作用する別の薬物を見つけることを必要とする面倒が回避され、非同一または代用薬物を使用してヒトおよびマウスにおける結果を比較する必要性も回避される。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に結合するｄＡｂ、例えば、本明細書に記載するＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのいずれか１つと、（ｂ）肝臓へ送達するための１種または複数の治療用分子とを含む単一分子（例えば、単一融合体または結合体として存在する）を含む肝臓標的化組成物を提供する。
【００２５】
上記の一実施形態では、肝臓へ送達することが望まれている分子（ｂ）はインターフェロンであってよく、例えば、これはインターフェロンα２、インターフェロンα５、インターフェロンα６もしくはコンセンサスインターフェロンであってよく、またはこれはいくつかのインターフェロン活性を保持するこれらのいずれかの変異体もしくは誘導体であってよい。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する肝臓標的化組成物のいずれか１つと、肝臓へ送達するためのさらなる薬物、例えば、リバビリンおよび／または全身送達のための薬物とを含む組成物を提供する。このような組成物は、例えば、炎症性肝疾患、例えば線維症もしくはウイルス性肝疾患、例えば肝炎（例えば、Ｃ型肝炎）もしくは肝硬変もしくは肝がんを治療または予防するための療法に、同時、別々または連続使用するための複合製剤であり得る。
【００２７】
一実施形態では、肝臓へ送達することが望まれている薬物は、以下の１種または複数を含み得る：ネクサバール（登録商標）（ソラフェニブとしても知られている）−原発性肝細胞癌の治療に使用される低分子；アービタックス（登録商標）（セツキシマブとしても知られている）−原発性肝がんまたは肝臓における腸がん転移の治療に使用されるモノクローナル抗体；それぞれ肝臓における腸がんまたは乳がん転移を治療するために使用されるアバスチン（登録商標）（ベバシズマブとしても知られている）およびハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブとしても知られている）。
【００２８】
ネクサバール（登録商標）は、例えば、ＡＳＧＰＲ受容体に結合する抗体またはｄＡｂなどに好都合に化学的に結合させることができるだろう。アービタックス（登録商標）、アバスチン（登録商標）またはハーセプチン（登録商標）抗体をコードするヌクレオチド配列を、ＡＳＧＰＲ受容体に結合する抗体、ｄＡｂなどをコードするヌクレオチド配列と融合させることにより、アービタックス（登録商標）、アバスチン（登録商標）またはハーセプチン（登録商標）を含む融合体を好都合に調製することができるだろう。
【００２９】
肝臓標的化ｄＡｂとの融合体（または結合体）として存在する場合、肝臓へ送達するための治療用分子（例えば、インターフェロン）を、ｄＡｂのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかと、またはｄＡｂ配列内の点で連結することができる。一実施形態では、１種または複数のインターフェロン分子、例えば、インターフェロンα２は、ｄＡｂのＮ末端での融合体（または結合体）として存在する。
【００３０】
肝臓へ送達するための治療用分子（例えば、インターフェロン）とｄＡｂを連結する際にアミノ酸または化学リンカーを任意選択により存在させることができる。リンカーは、例えば、ＴＶＡＡＰＲもしくはＴＶＡＡＰＳリンカー配列、らせん状リンカーであってよく、またはリンカーはｇｌｙ−ｓｅｒリンカーであってもよい。
【００３１】
あるいは、リンカーは、例えば、ＰＥＧリンカーであってもよい。リンカーはまた、ペプチドリンカー、プロテアーゼ切断部位などの機能性、または例えば、放射性同位体もしくは他のイメージング剤を付着させるためのキレート基を含むリンカーであってもよい。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明のｄＡｂ、融合体（または結合体）は、さらなる分子、例えば、半減期延長ポリペプチド（例えば、血清アルブミンに結合するｄＡｂもしくは抗体フラグメント）などのさらなるペプチドもしくはポリペプチド、または１種もしくは複数のＰＥＧ分子を含むことができる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「融合体」とは、１つの成分として肝細胞（例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ）に結合するｄＡｂと、肝臓へ送達することが望まれている治療用分子である１種または複数のさらなる分子（例えば、インターフェロン）とを含む融合タンパク質を指す。肝細胞（例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ）に結合するｄＡｂおよび治療用分子は、単一の連続的ポリペプチド鎖の別々の部分（成分）として存在する。ｄＡｂおよび治療用分子は、ペプチド結合を通して互いに直接結合してもよいし、適当なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを通して連結してもよい。必要に応じて、追加の成分、例えば、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、第３、第４）および／またはリンカー配列を存在させることができる。ｄＡｂは、Ｎ末端位置、Ｃ末端位置に存在してもよいし、治療用分子に対して内側にあってもよい。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「結合体」とは、肝臓へ送達するための１種または複数の治療用分子が共有結合または非共有結合している、肝細胞（例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ）に結合するｄＡｂを含む組成物を指す。治療用分子は、直接的にまたは適当なリンカー成分を通して間接的にｄＡｂと共有結合することができる。治療用分子は、アミノ末端、カルボキシル末端などの任意の適当な位置で、または適当なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基もしくはシステインのチオール基）を通して、ｄＡｂと結合することができる。あるいは、治療用分子は、直接的に（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用）または間接的に（例えば、一方のパートナーがインスリン分泌性／インクレチン分子に共有結合し、相補的結合パートナーがｄＡｂに共有結合している相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合を通して）、ｄＡｂと非共有結合することができる。ｄＡｂは、Ｎ末端位置、Ｃ末端位置にあってもよいし、治療用分子に対して内側にあってもよい。
【００３５】
本発明はまた、例えば、図１３〜１４および１７〜１８に示すＤＯＭ２６ｄＡｂをコードする核酸のいずれか１つを含む、本明細書に記載する融合体をコードする核酸を含む組成物を提供する。
【００３６】
これらの核酸を含む宿主細胞、例えば、非胚性宿主細胞、例えば、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）もしくは酵母宿主細胞もしくは哺乳動物細胞などの原核または真核宿主細胞も提供する。
【００３７】
本発明は、本発明の融合体をコードする組換え核酸および／またはコンストラクトを含む上記の宿主細胞などの宿主細胞を、前記組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって融合タンパク質を産生するステップを含む、本発明の融合タンパク質を産生する方法をさらに提供する。
【００３８】
本発明はまた、本発明の組成物を含む医薬組成物も提供する。
【００３９】
本発明は、例えば、ウイルス性肝疾患（例えば、肝炎、例えば、Ｃ型肝炎）、肝硬変もしくは肝がんなどの肝疾患または状態または障害の治療または予防に使用するための医薬品に使用するための本発明の組成物をさらに提供し、治療上有効量の本発明の組成物を前記個体に投与することを含む。
【００４０】
本発明はまた、本明細書に記載する疾患または障害、例えば、ウイルス性肝疾患（例えば、肝炎、例えば、Ｃ型肝炎）、肝硬変もしくは肝がんなどの肝疾患または状態または障害などの疾患または障害を有する患者または被験体を処置（治療的にまたは予防的に）する方法であって、治療上有効量の本発明の組成物を前記個体に投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
本発明の組成物、例えば、医薬組成物は、単独で、あるいは他の分子または成分、例えば、ポリペプチド、治療用タンパク質および／または分子（例えば、他のタンパク質（抗体を含む）、ペプチドもしくは低分子薬）と組み合わせて投与することができる。
【００４２】
本発明はまた、ウイルス性肝疾患（例えば、肝炎、例えば、Ｃ型肝炎）、肝硬変もしくは肝がんなどの肝疾患または状態または障害の治療に使用するための本発明の組成物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、ウイルス性肝疾患（例えば、肝炎、例えば、Ｃ型肝炎）、肝硬変もしくは肝がんなどの肝疾患または状態または障害を治療するための薬剤の製造における本発明の組成物の使用を提供する。
【００４４】
本発明はまた、ウイルス性肝疾患（例えば、肝炎、例えば、Ｃ型肝炎）、肝硬変もしくは肝がん疾患もしくは障害などの肝疾患または状態の治療、診断または予防に使用するための本明細書に記載する組成物のいずれかの使用に関する。本発明はまた、肝臓感染血液媒介病原菌への感染後の本明細書に記載する組成物のいずれかの予防的使用に関する。
【００４５】
本発明の組成物、例えば、組成物のｄＡｂ成分は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、あるいは抗体ドメインとの結合により、より大きな流体力学的サイズを有して半減期をさらに延長するようさらに形式化することができる。例えば、血清アルブミンに結合するｄＡｂは、抗体のより大きな抗原結合フラグメントとして形式化（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ）として形式化）することができる。
【００４６】
本開示中に記載する本発明の他の実施形態では、本発明の融合体への「ｄＡｂ」の使用の代わりに、当業者は、肝細胞、例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体に特異的に結合するｄＡｂのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲを、適当なタンパク質足場または骨格、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインもしくはＥＧＦドメインに移植することができる）を含むドメインを使用することができると考えられる。したがって、本開示は、全体として、ｄＡｂの代わりにこのようなドメインの開示を提供していると解釈されるべきである。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明は、肝細胞（例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体）に結合する本発明による第１ｄＡｂと、第１ｄＡｂと同一または異なる結合特異性を有する第２ｄＡｂと、任意選択により、多重特異性リガンドの場合にはさらにｄＡｂとを含む、二重特異性リガンドまたは多重特異性リガンドを含む、本発明による組成物を提供する。第２ｄＡｂ（またはさらなるｄＡｂ）は、任意選択により、異なる標的に結合することができる。
【００４８】
したがって、一態様では、本発明は、非経口投与により、例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射、吸入、経鼻送達、経粘膜送達、経口送達、患者のＧＩ管への送達、直腸送達または眼送達により送達するための本発明の組成物を提供する。一態様では、本発明は、皮下注射、吸入、静脈内送達、経鼻送達、経粘膜送達、経口送達、患者のＧＩ管への送達、直腸送達、経皮送達または眼送達により送達するための薬剤の製造における本発明の組成物の使用を提供する。
【００４９】
一態様では、本発明は、薬学的有効量の本発明の融合体または結合体を患者に投与するステップを含む、皮下注射、肺送達、静脈内送達、経鼻送達、経粘膜送達、経口送達、患者のＧＩ管への送達、直腸送達または眼送達により患者に送達する方法を提供する。
【００５０】
一態様では、本発明は、本発明の融合体もしくは結合体を含む経口、注射可能、吸入可能または噴霧可能製剤を提供する。
【００５１】
製剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤またはシロップ剤の形状であり得る。
【００５２】
用語「被験体」または「個体」は、本明細書中、それだけに限らないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類もしくはマウス種を含む哺乳動物などの動物を含むよう定義される。
【００５３】
本発明はまた、本発明の組成物と、薬物送達装置と、任意選択により取扱説明書とを含む、本発明による組成物の被験体（例えば、ヒト患者）への投与に使用するためのキットを提供する。組成物は、凍結乾燥製剤または遅延放出製剤などの製剤として提供することができる。特定の実施形態では、薬物送達装置は、注射器、吸入器、鼻腔内もしくは経眼投与装置（例えば、噴霧器、眼もしくは鼻点滴器）、および無針注射装置からなる群から選択される。
【００５４】
本発明の組成物（例えば、ｄＡｂおよび肝臓標的化組成物）は、保管のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体に再構成することができる。任意の適当な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーク乾燥）および／または再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成は異なる程度の抗体活性消失をもたらし得ること、および埋め合わせるために使用レベルを調整しなければならないことがあることが当業者により認識されよう。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する凍結乾燥した組成物を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥した組成物は、再水和した場合に、その活性（例えば、血清アルブミンについての結合活性）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を失う。活性は、凍結乾燥する前の組成物の効果をもたらすために必要とされる組成物の量である。凍結乾燥前に任意の適当な方法を使用して組成物の活性を測定することができ、再水和後に同じ方法を使用して活性を測定して失われた活性の量を測定することができる。
【００５５】
本発明はまた、本発明の組成物を含む徐放または遅延放出製剤を提供し、このような徐放製剤は、例えば、ヒアルロン酸、マイクロスフェアまたはリポソーム、ならびに他の薬学的もしくは薬理学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて本発明の組成物を含むことができる。
【００５６】
一態様では、本発明は、本発明の組成物と、薬学的もしくは生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】β−ＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡ−ビオチンとヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１
【００５８】
2013516967.tif 000002
、マウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１（．．．．．）およびヒト（Ｈｉｓ）６−ＧＰ６無関係対照抗原
【００５９】
2013516967.tif 000003
との結合を示す図である。抗原をｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ表面に固定化し、１００ｎＭリガンドを１０μｌ分−１の流速で流した。センサーグラムは、リガンドがヒトおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１抗原に結合するが、（Ｈｉｓ）６−ＧＰ６無関係対照抗原には結合しないことを示している。
【図２】ＨＥＫ２９３Ｅで発現させた、２μｇのＮｉ−ＮＴＡ精製ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１（２レーン）またはマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１（３レーン）を担持した４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す図である。１０μｌのＭａｒｋ１２分子量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１レーンにロードし、個々のマーカーバンドの分子質量（キロダルトン）を１レーンの左に与える。ゲルを１ｘＳｕｒｅＢｌｕｅで染色した。ゲルは、ヒトおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１が、アミノ酸配列に基づいて予想された分子質量の近くに移動していることを示している。
【図３】標的抗原に特異的に結合する組換えヒトおよびマウスＡＳＧＰＲタンパク質に対して選択されたＶκおよびＶＨｄＡｂを示す図である。抗原をＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップの表面上にコーティングし、タンパク質Ｌ精製ＶκｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｍ−２０（上のパネル）またはタンパク質Ａ精製ＶＨｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−６１（下のパネル）を、１秒当たり１０μｌの流速を使用して２．５μＭの濃度でチップ表面に流した。上のパネルでは、ｄＡｂと（Ｈｉｓ）６−マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１
【００６０】
2013516967.tif 000004
またはヒトｃ−キット（Ｈｉｓ）６陰性対照抗原
【００６１】
2013516967.tif 000005
の結合が示されている。下のパネルでは、（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１
【００６２】
2013516967.tif 000006
またはヒトｃ−キット（Ｈｉｓ）６陰性対照抗原
【００６３】
2013516967.tif 000007
に結合するｄＡｂが示されている。
【図４】フローサイトメトリー細胞結合アッセイにおいて、マウス肝細胞株に特異的に結合する組換え（Ｈｉｓ）６−マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１抗原に対して選択されたｄＡｂクローンを示す図である。このアッセイで、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体と架橋したＣ末端ＦＬＡＧエピトープタグを有するｄＡｂとマウスヘパトーマ細胞株Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７（上のパネル）またはマウス線維芽細胞陰性対照細胞株Ｌ９２９（下のパネル）の結合を試験した。マウスＩｇＧに特異的なヤギポリクローナル抗体（ＧａＭ−ＦＩＴＣ）を二次検出試薬として使用した。ＶκＤ（Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを有するヒト生殖系Ｖκ配列）を、非特異的ｄＡｂ結合対照として使用した。ｄＡｂがない場合（ＦＬＡＧのみ）の抗ＦＬＡＧ  Ｍ２およびｄＡｂもしくは抗ＦＬＡＧ  Ｍ２がない場合の二次検出試薬（ＧａＭ−ＦＩＴＣ）により得られた結果も、未染色細胞と共に示す。このアッセイでは、各ｄＡｂについて、１０μＭの最終濃度で始めて、ハーフログ希釈系を試験した（各系で右手のバー）。
【図５】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７マウス肝臓細胞株とのインキュベーション後の抗マウスＡＳＧＰＲ  ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｍ−３３の結合および局在を示す図である。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを有する５μＭ  ＤＯＭ２６ｍ−３３の存在下での３０分間のインキュベーション後、細胞を４％パラホルムアルデヒド／０．２％サポニンで固定し、ｄＡｂ局在を測定するためにモノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｃｙ３結合体または初期エンドソームもしくはリソソームの局在をそれぞれ測定するためにＥＥＡ１もしくはＬＡＭＰ１のいずれかに特異的なウサギポリクローナル抗体で染色した。上のパネルは、観察される染色パターン中のいくつかの重複によりＤＯＭ２６ｍ−３３およびＥＥＡ１についての局在パターン間の類似性を示している。下のパネルは、観察される染色パターン中に重複がないことによりＤＯＭ２６ｍ−３３およびＬＡＭＰ１についての局在パターンが異なることを示している。
【図６】マウスＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｍ−３３およびＤＯＭ２６ｍ−５２が抗原内の異なるエピトープに結合するかどうかを決定するためのエピトープマッピング実験からのＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムを示す図である。１秒当たり１０μｌの流速を使用して、１μＭ  ｄＡｂの濃度で、（Ｈｉｓ）６マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１でコーティングしたＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ表面にｄＡｂを流した。注射事象を以下のようにする：１＝ｄＡｂ１の注射２＝ｄＡｂ２の注射３＝ｄＡｂ１に続いてｄＡｂ２の同時注射４＝ｄＡｂ２に続いてｄＡｂ１の同時注射*＝０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０の１５秒パルスによるチップ表面の再生この実験では、ＤＯＭ２６ｍ−３３およびＤＯＭ２６ｍ−５２の同時注射は、（単独で注射したｄＡｂと比較して）２０％超結合を阻害するので、ＤＯＭ２６ｍ−３３およびＤＯＭ２６ｍ−５２は、マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１サブユニット内の部分重複エピトープに結合する。これらの実験では、マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１の抗体結合は、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０による再生により影響されなかった。
【図７】注射３時間後のｂａｌｂ／ｃマウス中の１１１Ｉｎ標識ｄＡｂの局在を示す図である。尾静脈注射による１２ＭＢｑの放射標識ｄＡｂの静脈内投与後に、ナノスペクトカメラを使用してマウスを画像化した。画像は、３時間で、３ｄＡｂ分子全てで腎臓および膀胱にシグナルが観察される一方で、肝臓の局在は、抗マウスＡＳＧＰＲ  ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｍ−３３で観察されるのみであることを示している。
【図８】尾静脈を通したｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内投与３時間後の１１１Ｉｎ標識ｄＡｂの生体内分布を示す図である。各場合について、約０．５ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを注射した。結果は、マウス肝臓中の放射標識ｄＡｂの蓄積が、Ｖκダミーを注射したマウスよりもＤＯＭ２６ｍ−３３を注射したマウスで１２．４倍高く、ＶＨダミーを注射したマウスよりも４．９倍高いことを示している。
【図９】１レーン当たり２μｇの１０ｍＭ  ＤＴＴで還元したタンパク質Ｌ精製ｍＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体を担持した４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す図である。レーンの指定は以下の通りである：ｍＩＦＮａ２−Ｖκダミー（２レーン）Ｃ末端システイン点突然変異を有するｍＩＦＮａ２−Ｖκダミー（３レーン）ｍＩＦＮａ２−ＶＨダミー（４レーン）Ｃ末端システイン点突然変異を有するｍＩＦＮａ２−ＶＨダミー（５レーン）ｍＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｍ−３３（６レーン）Ｃ末端システイン点突然変異を有するｍＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｍ−３３（７レーン）１０μｌのＭａｒｋ１２分子量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１レーンにロードし、個々のマーカーバンドの分子質量（キロダルトン）を１レーンの左に与える。ゲルを１ｘＳｕｒｅＢｌｕｅで染色した。ゲルは、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体が、約３３ＫＤａの予想された分子質量の近くに移動していることを示している。
【図１０】ＣＨＯ  ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ一過性形質移入アッセイにおけるマウスＩＦＮ−ｄＡｂ融合体の活性を示す図である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、示された濃度のマウスＩＦＮ−α標準またはマウスＩＦＮ−ｄＡｂ融合タンパク質とインキュベートした。上のパネルは、マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｍ−３３融合タンパク質で得られた結果を示し、中央のパネルは、マウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２融合タンパク質で得られた結果を示し、下のパネルは、マウスＩＦＮａ２−Ｖκダミー融合タンパク質で得られた結果を示している。記号は、以下を表す：▲＝マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体■＝Ｃ末端システイン突然変異を有するマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体▼＝マウスＩＦＮ−α標準。
【図１１ａ】マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｍ−３３融合体とＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップの表面上にコーティングした（Ｈｉｓ）６マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１の結合を示す図である。
【００６４】
トレースは、比較のために全パネルに示すＤＯＭ２６ｍ−３３のみ
【００６５】
2013516967.tif 000008
、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体
【００６６】
2013516967.tif 000009
およびＣ末端システイン突然変異を有するマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体
【００６７】
2013516967.tif 000010
の結合を表す。
【図１１ｂ】マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｍ−３３融合体とＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップの表面上にコーティングした（Ｈｉｓ）６マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１の結合を示す図である。
【００６８】
トレースは、比較のために全パネルに示すＤＯＭ２６ｍ−３３のみ
【００６９】
2013516967.tif 000011
、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体
【００７０】
2013516967.tif 000012
およびＣ末端システイン突然変異を有するマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体
【００７１】
2013516967.tif 000013
の結合を表す。
【図１１ｃ】マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｍ−３３融合体とＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップの表面上にコーティングした（Ｈｉｓ）６マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１の結合を示す図である。
【００７２】
トレースは、比較のために全パネルに示すＤＯＭ２６ｍ−３３のみ
【００７３】
2013516967.tif 000014
、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体
【００７４】
2013516967.tif 000015
およびＣ末端システイン突然変異を有するマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体
【００７５】
2013516967.tif 000016
の結合を表す。
【図１２】抗原内に結合したエピトープによりグループ化したマウスＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂクローンを示す図である。
【図１３−１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−１９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−２９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−３０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−３１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１３−３２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１５５〜５４９；奇数のみ）。
【図１４−１】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号５５１〜６０３；奇数のみ）。
【図１４−２】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号５５１〜６０３；奇数のみ）。
【図１４−３】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号５５１〜６０３；奇数のみ）。
【図１４−４】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号５５１〜６０３；奇数のみ）。
【図１５−１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−１９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−２９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３３】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３４】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３５】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３６】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３７】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３８】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−３９】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−４０】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−４１】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１５−４２】抗ヒトＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５６〜５５０；偶数のみ）。
【図１６−１】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号５５２〜６０４；偶数のみ）。
【図１６−２】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号５５２〜６０４；偶数のみ）。
【図１６−３】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号５５２〜６０４；偶数のみ）。
【図１６−４】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号５５２〜６０４；偶数のみ）。
【図１６−５】抗ヒトＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号５５２〜６０４；偶数のみ）。
【図１７−１】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−２】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−３】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−４】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−５】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−６】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−７】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−８】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−９】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１０】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１１】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１２】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１３】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１４】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１５】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１７−１６】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６０５〜７４３；奇数のみ）。
【図１８−１】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−２】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−３】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−４】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−５】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−６】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−７】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−８】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−９】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−１０】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−１１】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−１２】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−１３】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１８−１４】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号７４５〜８６５；奇数のみ）。
【図１９−１】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−２】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−３】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−４】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−５】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−６】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−７】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−８】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−９】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−１０】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−１１】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−１２】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−１３】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−１４】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図１９−１５】抗マウスＶｈ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号６０６〜７４４；偶数のみ）。
【図２０−１】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−２】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−３】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−４】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−５】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−６】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−７】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２０−８】抗マウスＶκ  ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である（配列番号７４６〜８６６；偶数のみ）。
【図２１】ＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１９６
【００７６】
2013516967.tif 000017
およびＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１
【００７７】
2013516967.tif 000018
とヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１の結合を示す図である。ビオチン化（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１をＢｉａｃｏｒｅストレプトアビジンチップ表面に固定化し、６２ｎＭ  ｄＡｂを４０μｌ分−１の流速で流した。センサーグラムは、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１が、ＤＯＭ２６ｈ−１９６親クローンよりも高い親和性でヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１抗原に結合することを示している。
【図２２】２μｇのＮｉ−ＮＴＡ精製ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎（ｓｔａｌｋ）ドメイン（２レーン）、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理したヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメイン（３レーン）、ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメイン（４レーン）、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理したヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメイン（５レーン）を担持した４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す図である。１０μｌのＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ染色済分子量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１レーンにロードし、個々のマーカーバンドの分子質量（キロダルトン）を１レーンの左に与える。ゲルを１ｘＳｕｒｅＢｌｕｅで染色した。ゲルは、タンパク質がＰＮＧａｓｅ  Ｆによる処理後に予想された分子質量に達するのみであるので、茎ドメインは広範にグリコシル化されている一方で、レクチンドメインは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化の存在または不存在下で、予想された分子質量に達することを示している。
【図２３】ＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１と、ビオチン化（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメイン残基システイン１５４−ロイシン２９１
【００７８】
2013516967.tif 000019
、（Ｈｉｓ）６−マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１完全細胞外ドメイン残基セリン６０−アスパラギン２８４
【００７９】
2013516967.tif 000020
および（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメイン残基グルタミン６２−システイン１５３
【００８０】
2013516967.tif 000021
の結合を示す図である。ビオチン化抗原をＢｉａｃｏｒｅストレプトアビジンチップ表面に固定化し、６０ｎＭの濃度および４０μｌ分−１の流速でｄＡｂを流した。センサーグラムは、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１が、ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインおよびマウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１細胞外ドメインに結合するが、ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメインには結合しないことを示している。
【図２４】注射３時間後のｂａｌｂ／ｃマウス中の１１１Ｉｎ標識ｄＡｂの局在を示す図である。尾静脈注射による１２ＭＢｑの放射標識ｄＡｂの静脈内投与後に、ナノスペクトカメラを使用してマウスを画像化した。画像は、３時間で、全ｄＡｂ分子で腎臓および膀胱にシグナルが観察される一方で、肝臓の局在は、抗ＡＳＧＰＲ  ＶＨｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１および抗ＡＳＧＰＲ  ＶκｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４で観察されるのみであることを示している。
【図２５ａ】尾静脈を通したｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内投与３時間後の１１１Ｉｎ標識ｄＡｂの生体内分布を示す図である。各場合について、約０．５ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを注射した。結果は、マウス肝臓中の放射標識ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂの蓄積が、Ｖκ／ＶＨダミー２ｄＡｂいずれかで観察されるものよりもかなり高いことを示している。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「インターフェロン活性」とは、本明細書（実施例１２）に記載するように行われるＢ１６−Ｂｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定されるように、当量の組換えマウスインターフェロンα（例えば、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）のインターフェロン活性の量の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％さえ有する分子を指す。
【図２５ｂ】尾静脈を通したｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内投与３時間後の１１１Ｉｎ標識ｄＡｂの生体内分布を示す図である。各場合について、約０．５ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを注射した。結果は、マウス肝臓中の放射標識ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂの蓄積が、Ｖκ／ＶＨダミー２ｄＡｂいずれかで観察されるものよりもかなり高いことを示している。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「インターフェロン活性」とは、本明細書（実施例１２）に記載するように行われるＢ１６−Ｂｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定されるように、当量の組換えマウスインターフェロンα（例えば、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）のインターフェロン活性の量の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％さえ有する分子を指す。
【図２６】１レーン当たり２μｇの１０ｍＭ  ＤＴＴで還元したタンパク質Ｌ精製ｍＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体を担持した４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す図である。レーンの指定は以下の通りである：ｍＩＦＮａ２−Ｖκダミー（２レーン）ｍＩＦＮａ２−ＶＨダミー２（３レーン）ｍＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４（４レーン）ｍＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１（５レーン）１０μｌのＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ染色済分子量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１レーンにロードし、個々のマーカーバンドの分子質量（キロダルトン）を１レーンの左に与える。ゲルを１ｘＳｕｒｅＢｌｕｅで染色した。ゲルは、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体が、約３３ＫＤａの予想された分子質量の近くに移動していることを示している。
【図２７】Ｂ１６マウスＩＦＮα／βレポーター細胞株中のマウスＩＦＮ−ｄＡｂ融合体（＋／−ＤＯＴＡ結合）の活性を示す図である。Ｂ１６細胞を、示された濃度のマウスＩＦＮ−α標準またはマウスＩＦＮ−ｄＡｂ融合タンパク質とインキュベートし、６４０ｎｍで測定される吸光度に正比例するレポーター遺伝子発現のレベルを測定することによりインターフェロン活性を分析した。上のパネルは、マウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２融合タンパク質で得られた結果を示し、下のパネルは、マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１融合タンパク質で得られた結果を示している。記号は、以下を表す：▲＝マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体■＝ＮＨＳ：ＤＯＴＡと結合したマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体●＝マウスＩＦＮ−α標準。
【図２８】マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体とＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンチップの表面上にコーティングしたビオチン化（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインおよび（Ｈｉｓ）６−マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１の結合を示す図である。１μＭの濃度および４０μｌ分−１の流速で融合タンパク質をチップ表面に流した。
【００８３】
上のパネルは、マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ３６ｈ−１９６−６１融合タンパク質
【００８４】
2013516967.tif 000022
およびマウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２融合タンパク質
【００８５】
2013516967.tif 000023
と（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインの結合を示す。下のパネルは、マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ３６ｈ−１９６−６１融合タンパク質
【００８６】
2013516967.tif 000024
およびマウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２融合タンパク質
【００８７】
2013516967.tif 000025
と（Ｈｉｓ）６−マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１の結合を示す。
【図２９】注射３時間後のｂａｌｂ／ｃマウス中の１１１Ｉｎ標識マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体の局在を示す図である。尾静脈注射による１２ＭＢｑの放射標識ｄＡｂの静脈内投与後に、ナノスペクトカメラを使用してマウスを画像化した。画像は、３時間で、マウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２およびマウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１融合タンパク質で肝臓、腎臓および膀胱にシグナルが観察されるが、右手パネルの画像中で肝臓がより明るく見えることを示しており、マウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２に比べてマウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１の肝臓取り込みのレベルが大きいことを示している。
【図３０】尾静脈を通したｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内投与３時間後の１１１Ｉｎ標識マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合タンパク質の生体内分布を示す図である。各場合について、約０．５ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを注射した。結果は、マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１（黒色棒）およびマウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２（灰色棒）の両方が肝臓および腎臓中に蓄積していることを示しているが、マウスＩＦＮａ２−ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１の肝臓／腎臓比率は、マウスＩＦＮａ２−ＶＨダミー２の肝臓／腎臓比率よりも約２．２倍高く、ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１との遺伝的融合によりマウスＩＦＮａ２の肝臓標的化が成功したことを示している。
【図３１−１】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのアミノ酸（配列番号８６８〜８８０；偶数のみ）配列を示す図である。
【図３１−２】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのアミノ酸（配列番号８６８〜８８０；偶数のみ）配列を示す図である。
【図３１−３】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのアミノ酸（配列番号８６８〜８８０；偶数のみ）配列を示す図である。
【図３１−４】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのアミノ酸（配列番号８６８〜８８０；偶数のみ）配列を示す図である。
【図３１−５】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのアミノ酸（配列番号８６８〜８８０；偶数のみ）配列を示す図である。
【図３１−６】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのアミノ酸（配列番号８６８〜８８０；偶数のみ）配列を示す図である。
【図３２−１】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのヌクレオチド（配列番号８６７〜８７９；奇数のみ）配列を示す図である。
【図３２−２】種々の親和性成熟ＤＯＭ２６ｈクローンのヌクレオチド（配列番号８６７〜８７９；奇数のみ）
【発明を実施するための形態】
【００８８】
本明細書中、明確かつ簡潔な明細が書かれることを可能にするように、実施形態を参照して本発明を記載してきた。実施形態は、本発明を逸脱することなく、多様に組み合わせるまたは分離することができることが意図されており、認識されるべきである。誤解を避けるために、本発明の一実施形態に関して本明細書に開示される本発明の特徴は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、本発明の他の実施形態に関して開示される本発明の任意の１つまたは複数の他の特徴と組み合わせることができることをはっきりと述べておく。
【００８９】
別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子学的、遺伝子学的および生化学的方法（一般的に、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）ならびに化学的方法について標準的な技術が使用される。
【００９０】
ポリペプチドに関連して本明細書で使用する用語「類似体」とは、ペプチドの１個もしくは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換された、および／または１個もしくは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失した、および／または１個もしくは複数のアミノ酸残基がペプチドに付加した、修飾ペプチドを意味する。アミノ酸残基のこのような付加または欠失は、ペプチドのＮ末端および／またはペプチドのＣ末端で起こり得る、あるいはこれらはペプチド内部で起こり得る。
【００９１】
本明細書で使用する用語ＡＳＧＰＲ受容体とは、肝細胞表面上に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（Ｍｅｉｅｒ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００、３００、８５７〜８６５頁参照）、より具体的にはそのＨ１サブユニットを指す。
【００９２】
ポリペプチドに関連して使用する際、本明細書で使用する「フラグメント」は、天然ポリペプチド全体のアミノ酸配列の全てではないが一部と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。フラグメントは、独立して存在（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）しているか、または大型のポリペプチド内に含まれていてもよく、その中でフラグメントは単一の大型ポリペプチド内の単一の連続した領域として一部分もしくは領域を形成している。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」とは、ペプチド結合を通して結合している約２個〜約５０個のアミノ酸を指す。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により結合している少なくとも約５０個のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、一般的に、三次構造を含み、機能ドメインに折りたたまれている。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「ディスプレイシステム」とは、ポリペプチドまたはペプチドの収集物が物理的、化学的または機能的特性などの所望の特性に基づく選択に利用できるシステムを指す。ディスプレイシステムは、ポリペプチドまたはペプチドの適当なレパートリーであり得る（例えば、溶液中、適当な担体上に固定化されている）。ディスプレイシステムはまた、細胞発現系（例えば、形質転換、感染、形質移入もしくは形質導入細胞中の核酸のライブラリーの発現および細胞の表面上のコードされたポリペプチドのディスプレイ）または無細胞発現系（例えば、エマルジョン区画化およびディスプレイ）を使用するシステムであり得る。代表的なディスプレイシステムは、核酸のコーディング機能と核酸によりコードされるポリペプチドもしくはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性を連結する。このようなディスプレイシステムを使用すると、所望の物理的、化学的および／または機能的特性を有するポリペプチドまたはペプチドを選択することができ、選択されたポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を、容易に単離または回収することができる。例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えば、ファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルジョン区画化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミドディスプレイ、共有結合ディスプレイなど、核酸のコーディング機能とポリペプチドもしくはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性を連結するいくつかのディスプレイシステムが当技術分野で既知である（例えば、ＥＰ０４３６５９７（Ｄｙａｘ）、米国特許第６１７２１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等）、米国特許第６４８９１０３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等）参照）。
【００９６】
本明細書で使用する場合、「機能性」とは、特異的結合活性などの生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドを説明する。例えば、用語「機能性ポリペプチド」は、その抗原結合部位を通して標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「標的リガンド」とは、ポリペプチドもしくはペプチドが特異的または選択的に結合するリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合、標的リガンドは、任意の所望の抗原またはエピトープであり得る。標的抗原への結合は、機能性であるポリペプチドまたはペプチドに依存する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、抗体とは、抗体を自然に産生する任意の種から得られた、または組換えＤＮＡ技術により作られた；血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、形質移入体、酵母または細菌から単離された、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥまたはフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体など）を指す。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「抗体フォーマット」とは、抗原についての結合特異性を構造に与えるために１つまたは複数の抗体可変ドメインが組み込まれ得る、任意の適当なポリペプチド構造を指す。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモダイマーとヘテロダイマー、前記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前記のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の適当なポリマーまたはヒト化ＶＨＨの共有結合により修飾された）などの種々の適当な抗体フォーマットが当技術分野で既知である。
【０１００】
句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のＶ領域もしくはドメインと独立に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域もしくは可変ドメインと共にフォーマット（例えば、ホモもしくはヘテロ多量体）で存在することができ、ここで他の領域もしくはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の可変ドメインと独立に抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書で使用する場合には「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書で使用する場合には「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」は、本明細書で使用する場合には「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、齧歯類（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ００／２９００４に開示されている）、子守鮫およびラクダ科ＶＨＨ  ｄＡｂなどの他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科ＶＨＨは、元来軽鎖がない重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種から得られる免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。ＶＨＨは、ヒト化されていてもよい。
【０１０１】
「ドメイン」は、タンパク質の残りから独立した三次構造を有する折りたたまれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能的特性の原因であり、多くの場合、タンパク質の残部および／またはドメインの機能を喪失することなく、付加、除去または他のタンパク質に移すことができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの配列特性を含む折りたたまれたポリペプチドドメインである。そのため、これは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン、例えば、その中で１個または複数のループが、抗体可変ドメインに特有でない配列により置換されたもの、あるいは切り詰められたまたはＮもしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折りたたまれたフラグメントを含む。
【０１０２】
用語「ライブラリー」とは、異種性ポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、その各々が単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成されている。この点で、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間の配列差異は、ライブラリー中に存在する多様性の原因である。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形をとってもよいし、あるいは核酸のライブラリーで形質転換された、生物または細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの形であってもよい。一実施形態では、個々の生物または細胞の各々は、１つのみまたは限られた数のライブラリーメンバーを含む。一実施形態では、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、核酸は発現ベクターに組み込まれる。そのため、一態様では、ライブラリーは、各生物が、その対応するポリペプチドメンバーを産生するよう発現させることができる核酸の形でライブラリーの単一のメンバーを含む発現ベクターの１個または複数のコピーを含む、宿主生物の集団の形をとり得る。したがって、宿主生物の集団は、大きなレパートリーの多様なポリペプチドをコードする可能性を有する。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「用量」は、一度に全て（単位用量）もしくは一定の時間間隔にわたって２回以上の投与で被験体に投与される融合体または結合体の量を指す。例えば、用量は、１日（２４時間）（１日量）、２日、１週間、２週間、３週間または１ヶ月もしくは複数月のクールにわたって（例えば、単回投与により、または２回以上の投与により）被験体に投与される融合体または結合体の量を指し得る。投与間隔は、任意の所望の時間量とすることができる。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「インターフェロン活性」とは、本明細書（実施例１２）に記載するように行われるＢ１６−Ｂｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定されるように、当量の組換えマウスインターフェロンα（例えば、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）のインターフェロン活性の量の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％さえ有する分子を指す。
【０１０５】
句「半減期」とは、例えば、自然の機構による分解および／またはクリアランスもしくは隔離により、融合体もしくは結合体の血清または血漿濃度が生体内で５０％減少するのにかかる時間を指す。本発明の組成物は、生体内で安定化しており、その半減期は、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する血清アルブミン分子、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合により増加する。これらの血清アルブミン分子は、それ自体生体内で長い半減期を有する天然タンパク質である。その機能活性が半減期を増加させる分子に特異的でない類似の分子よりも長い期間生体内で持続する場合に、分子の半減期が増加する。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「流体力学的サイズ」とは、水溶液を通した分子の拡散に基づく分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけのサイズを指す。拡散、または溶液を通したタンパク質の運動を処理してタンパク質の見かけの大きさを引き出すことができ、ここでサイズはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学半径」により与えられる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量および形状（高次構造）の両方に依存するので、結果として同じ分子質量を有する２種のタンパク質は、タンパク質の全体的高次構造に基づく異なる流体力学的サイズを有し得る。
【０１０７】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」または「類似性」（これらの用語は本明細書で互換的に使用される）の計算は、以下のように行われる。配列を、最適比較のためにアラインメントする（例えば、最適アラインメントのために第１および第２アミノ酸または核酸配列の一方あるいは両方にギャップを導入してもよいし、比較のために非相同配列を無視してもよい）。一実施形態では、比較のために整列させる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列中の位置が、第２配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていれば、分子はその位置で同一である（本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」に相当する）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一位置の数の関数である。本明細書で定義するアミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメントならびに相同性、類似性または同一性は、デフォルトパラメータを使用して、アルゴリズムＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを使用して調製および決定することができる（Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔ．Ａ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、１７４：１８７〜１８８（１９９９））。
【０１０８】
核酸、宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載される本発明の組成物をコードする単離および／または組換え核酸に関する。
【０１０９】
本明細書で「単離」と呼ばれる核酸は、その本来の環境（例えば、細胞中またはライブラリーなどの核酸の混合物中）において他の物質（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの他の核酸）から分離された核酸である。単離核酸は、ベクター（例えば、プラスミド）の一部として単離することができる。
【０１１０】
本明細書で「組換え」と呼ばれる核酸は、例えば、制限酵素、相同組換え、ウイルスなどを使用したベクターまたは染色体へのクローニングなどの人工組換えに頼る方法を含む組換えＤＮＡ方法論により産生された核酸、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して調製された核酸である。
【０１１１】
本発明はまた、本明細書に記載する本発明の組成物、例えば、融合体をコードする核酸を含む（１種または複数の）組換え核酸または発現コンストラクトを含む、例えば、哺乳動物または微生物の組換え宿主細胞に関する。本発明の例えば、哺乳動物または微生物の組換え宿主細胞を、融合ポリペプチドの発現に適した条件下で維持するステップを含む、本明細書に記載する本発明の組成物、例えば、融合体を調製する方法も提供される。本方法は、必要に応じて、融合体を単離または回収するステップをさらに含むことができる。
【０１１２】
例えば、本発明の組成物、例えば、本発明の肝臓標的化組成物をコードする核酸分子（すなわち、１種もしくは複数の核酸分子）またはこのような核酸分子を含む発現コンストラクト（すなわち、１種もしくは複数のコンストラクト）を、核酸分子が、１種または複数の発現調節要素（例えば、細胞中での処理により作成され、宿主細胞ゲノムに組み込まれたベクター中、コンストラクト中）に作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）ように、選択された宿主細胞に適した任意の方法（例えば、形質転換、形質移入、電気穿孔、感染）を使用して、適当な宿主細胞に導入して組換え宿主細胞を作成することができる。得られた組換え宿主細胞を、発現に適した条件下（例えば、誘導物質の存在下、適当な非ヒト動物中、適当な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助剤等を補充した適当な培地中）で維持し、それによって、コードされたペプチドまたはポリペプチドを産生することができる。必要に応じて、コードされたペプチドまたはポリペプチドを、単離または回収（例えば、動物、宿主細胞、培地、乳から）することができる。この方法は、トランスジェニック動物（例えば、ＷＯ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ参照）、特にトランスジェニック非ヒト動物の宿主細胞中での発現を包含する。
【０１１３】
本明細書に記載する本発明の組成物、例えば、融合ポリペプチドはまた、例えば、化学合成により、または任意の他の適当な方法により、適当な試験管内発現系で産生することができる。
【０１１４】
本明細書に記載および例示するように、本発明の組成物、例えば、融合体および結合体は、一般的に、高い親和性でＡＳＧＰＲに結合する。
【０１１５】
例えば、融合体または結合体は、約５μＭ〜約１ｐＭ、例えば、約１０ｎＭ〜約１ｐＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１ｐＭの親和性（ＫＤ；ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ）［表面プラズモン共鳴により測定される］でヒトＡＳＧＰＲに結合することができる。
【０１１６】
本発明の組成物、例えば、ｄＡｂおよび／または肝臓標的化組成物を、大腸菌またはピキア属の種（例えば、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））中で発現させることができる。一実施形態では、肝臓標的化融合体は、大腸菌もしくはピキア属の種（例えば、ピキア・パストリス）または哺乳動物細胞培養液（例えば、ＣＨＯもしくはＨＥＫ２９３細胞）中に分泌される。本明細書に記載する融合体または結合体は、大腸菌もしくはピキア属の種または哺乳動物細胞中で発現すると分泌可能であり得るが、これらは、大腸菌もしくはピキア属の種を使用しない合成化学法または生物学的産生法などの任意の適当な方法を使用して産生することができる。
【０１１７】
一般的に、本発明の組成物は、薬理学的または生理学的に適当な担体と共に精製形で利用されるだろう。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含む、水性もしくはアルコール性／水溶液、乳濁液または懸濁液が含まれ得る。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンガー液が含まれ得る。必要に応じてポリペプチド複合体を懸濁した状態に保つための適当な生理学的に許容される補助剤を、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択することができる。
【０１１８】
静脈内ビヒクルには、液体、および栄養補充薬、およびリンガーデキストロースに基づくものなどの電解質補給液が含まれる。保存剤、ならびに抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの他の添加剤も存在することができる（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版）。持続放出製剤を含む、種々の適当な製剤を使用することができる。
【０１１９】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののいずれかとすることができる。治療のために、本発明の組成物を、標準的技術にしたがって任意の患者に投与することができる。
【０１２０】
投与は、皮下注射、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、経皮、肺経路を通して、または適当に、カテーテルによる直接注入を含む任意の適当な様式によることができる。投与の投与量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌、ならびに臨床医により考慮されるべき他のパラメータに依存するだろう。投与は、示されるように局所性または全身性であり得る。
【０１２１】
本発明の組成物は、保管のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体に再構成することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野で既知の凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成は異なる程度の抗体活性消失をもたらし得ること（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性消失が大きい傾向がある）、および埋め合わせるために使用レベルを上方調整しなければならないことが当業者により認識されるだろう。
【０１２２】
本明細書に記載する組成物を使用して行われる治療または療法は、１つもしくは複数の症状または徴候が、治療前に存在したこのような症状に比べて、またはこのような組成物もしくは他の適当な対照により治療されていない個体（ヒトまたはモデル動物）のこのような症状に比べて、減少または緩和している（例えば、少なくとも１０％または臨床評価尺度に基づく少なくとも１点）場合に、「有効である」とみなされる。症状は、標的とする疾患もしくは障害の詳細な性質に応じて明らかに変化するであろうが、当業者としての臨床医または技術者により測定することができる。
【０１２３】
同様に、本明細書に記載する組成物を使用して行われる予防は、１つもしくは複数の症状または徴候の開始あるいは重症度が、組成物により治療されていない同様の個体（ヒトまたは動物モデル）のこのような症状に比べて、遅延している、減少しているまたは消滅している場合に、「有効である」とみなされる。
【０１２４】
本発明の組成物は、他の治療剤または活性剤、例えば、他のポリペプチドまたはペプチドまたは低分子と合わせて投与することができる。このようなさらなる剤には、例えば、リバビリンなどの種々の薬物が含まれ得る。
【０１２５】
本発明の組成物は、１種もしくは複数の追加の治療剤または活性剤と共に、投与および／または製剤化することができる。本発明の組成物を追加の治療剤と共に投与する場合、例えば、肝臓標的化組成物（例えば、融合体または結合体）を、追加の剤、例えば、リバビリンの投与の前、同時または後に投与することができる。一般的に、本発明の組成物および追加の剤は、治療効果の重複をもたらすように投与される。
【０１２６】
ｄＡｂを含む本発明の組成物は、さらなるいくつかの利点を提供する。ドメイン抗体成分は、非常に安定であり、抗体および抗体の他の抗原結合フラグメントに比べて小さく、大腸菌または酵母（例えば、ピキア・パストリス）中での発現により高収率で産生することができる。したがって、肝細胞（例えば、肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体）に結合するｄＡｂを含む本発明の組成物は、一般的に哺乳動物細胞中で産生される治療剤（例えば、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体）よりも容易に産生することができ、免疫原性でないｄＡｂを使用することができる（例えば、ヒトの疾患を治療または診断するためにヒトｄＡｂを使用することができる）。
【０１２７】
さらに、本明細書に記載する組成物は、肝臓の特異的標的化の結果として、治療用分子、例えば、インターフェロン単独よりも安全性プロファイルが高く、副作用が少なくなり得る。同様に、治療用分子の投与が他の器官および組織への毒性があるような場合に、本発明の組成物の投与は、治療用分子単独の投与よりも肝臓の外側の特定の器官および／または身体組織に対する毒性を減少させることができ、例えば、全身送達についての有効量で治療用分子を肝臓に特異的に向ける結果として、有効性を改善することもできた。
【実施例１】
【０１２８】
ヒトおよびマウスアシアロ糖タンパク質Ｈ１受容体サブユニットのクローニングおよび発現
ＤＮＡ２．０（Ｍｅａｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ、ＵＳＡ）により、全長ヒトおよびマウスアシアロ糖タンパク質Ｈ１受容体サブユニット（ＡＳＧＰＲ  Ｈ１）ｃＤＮＡをカスタム合成した。プライマーＤＬＴ００７およびＤＬＴ００８（ヒト）、またはＤＬＴ００９およびＤＬＴ０１０（マウス）を使用してＰＣＲにより、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグを有する細胞外ドメイン（ヒトについてはＱ６２〜Ｌ２９１およびマウスについてはＳ６０〜Ｎ２８４）をコードするＤＮＡを増幅した。配列を以下の表１に示す。
【表１】
2013516967.tif 000026
【０１２９】
トポイソメラーゼクローニングによりＰＣＲフラグメントを保持ベクターｐＣＲ−Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、Ｍ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを使用して配列決定してエラーを含まないクローンを得た。挿入を含むｐＣＲ−Ｚｅｒｏ  ＢｌｕｎｔのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、ゲル精製により（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１コードＤＮＡを得て、細胞培養液中の発現を促進するためにＮ末端Ｖ−Ｊ２−ＣマウスＩｇＧ分泌リーダー配列を含むｐＴＴ５誘導体であるｐＤＯＭ５０、哺乳動物発現ベクター中の対応する部位の中に挿入を連結した。
【０１３０】
リーダー配列（アミノ酸）：
METDTLLLWVLLLWVPGSTG (配列番号５)
リーダー配列（ヌクレオチド）：
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGGC (配列番号６)
ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｇａｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。２９３−Ｆｅｃｔｉｎを使用して、１μｇ  ＤＮＡ／ｍｌをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に形質移入し、無血清培地で培養した。タンパク質を５日間培養液中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して培養液上清から精製し、ＰＢＳ＋０．５Ｍイミダゾールで溶離した。タンパク質を、ＰＢＳに緩衝液交換した。
【０１３１】
エドマン分解法により受容体サブユニットのＮ末端を決定した。ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１サブユニットのＮ末端は、切断産物に相当するLRGLREFTS (配列番号８) として同定された追加配列とともに、HHHHHHQNSQLQEEL (配列番号７)として同定された。しかしながら、完全な受容体に相当する配列は、切断産物に相当する配列に比べて約５倍モル過剰で存在していた。マウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１サブユニットのＮ末端は、HHHHHHSQNXQLRED (配列番号９)として同定され、追加配列は同定されなかった。潜在的なリガンド結合活性を分析するために、受容体サブユニットをｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ表面に固定化し、合成リガンドβ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡ−ビオチン（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）との結合を解析した（図１）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＮｉ−ＮＴＡから溶離したＨＥＫ２９３Ｅ受容体の純度も解析した（図２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、ヒトおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１サブユニットが、アミノ酸配列に基づいて予想された分子質量の近くに移動していることを示している（ヒトについては２７．２ＫＤａおよびマウスについては２６．５ＫＤａ）。ヒトおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１試料の両方で、グリコシル化タンパク質試料に特有の、予想された分子質量の近くに移動する２以上の種が観察された。
【０１３２】
配列：
（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１
HHHHHHQNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL (配列番号１０)
CATCATCATCATCATCACCAGAACTCCCAACTCCAGGAAGAACTTCGAGGACTGAGGGAGACTTTCTCCAATTTCACCGCAAGCACGGAGGCTCAAGTGAAGGGCCTCAGCACCCAGGGCGGGAATGTGGGCAGGAAAATGAAATCCCTGGAGAGCCAGCTCGAAAAGCAGCAGAAAGATCTGTCCGAGGACCACTCTAGCCTGTTGTTGCACGTGAAACAGTTTGTTTCCGACCTTAGGAGTCTTTCTTGCCAAATGGCCGCCCTCCAGGGAAACGGGTCCGAGAGAACTTGCTGCCCCGTCAATTGGGTGGAGCACGAGCGGTCTTGTTATTGGTTTAGCCGAAGCGGAAAAGCCTGGGCCGATGCAGATAACTACTGCCGGCTTGAGGACGCCCATCTGGTCGTGGTGACCAGTTGGGAGGAACAGAAATTCGTACAGCATCATATCGGGCCTGTTAACACATGGATGGGCCTTCATGACCAGAATGGTCCTTGGAAGTGGGTTGACGGAACCGATTACGAAACCGGATTCAAGAACTGGCGGCCTGAACAGCCAGACGACTGGTATGGACACGGCCTCGGAGGCGGGGAGGACTGCGCGCATTTCACAGACGATGGCCGGTGGAATGATGATGTGTGCCAAAGGCCTTACAGATGGGTCTGCGAGACAGAGCTGGATAAGGCTTCACAAGAGCCTCCACTCCTG (配列番号１１)
（Ｈｉｓ）６−マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１
HHHHHHSQNSQLREDLLALRQNFSNLTVSTEDQVKALSTQGSSVGRKMKLVESKLEKQQKDLTEDHSSLLLHVKQLVSDVRSLSCQMAAFRGNGSERTCCPINWVEYEGSCYWFSSSVRPWTEADKYCQLENAHLVVVTSRDEQNFLQRHMGPLNTWIGLTDQNGPWKWVDGTDYETGFQNWRPEQPDNWYGHGLGGGEDCAHFTTDGRWNDDVCRRPYRWVCETKLDKAN (配列番号１２)
CATCATCATCATCATCACAGTCAAAATTCCCAATTGCGCGAGGATCTGCTCGCACTGCGACAGAACTTTAGCAACCTTACCGTGTCTACGGAAGACCAGGTGAAGGCATTGTCAACTCAGGGGTCATCTGTGGGAAGAAAAATGAAGCTCGTGGAGTCAAAGCTGGAGAAGCAGCAAAAGGACCTCACCGAAGACCATTCCTCTCTCCTGCTGCACGTGAAGCAGCTGGTTTCTGACGTAAGGAGCCTGAGCTGCCAGATGGCTGCTTTTCGAGGTAACGGCTCTGAGCGCACATGCTGTCCTATTAATTGGGTGGAGTATGAGGGAAGTTGTTACTGGTTCTCAAGCTCCGTGAGGCCATGGACCGAAGCTGACAAATATTGCCAGCTCGAAAATGCTCACCTCGTGGTAGTGACCTCTAGGGATGAGCAAAATTTCCTGCAGCGACACATGGGGCCGCTTAATACCTGGATCGGGCTGACGGACCAGAACGGACCCTGGAAGTGGGTTGACGGTACCGATTATGAAACTGGATTCCAAAACTGGCGGCCAGAGCAGCCGGACAACTGGTATGGCCACGGCCTCGGAGGGGGCGAGGACTGTGCTCATTTTACAACGGATGGCCGGTGGAACGACGATGTGTGCAGAAGGCCATATCGGTGGGTCTGCGAGACAAAGCTGGACAAAGCCAAT (配列番号１３)
【実施例２】
【０１３３】
ｄＡｂを選択する方法
４ＧについてはＧＡＳ１リーダー配列（ＷＯ２００５／０９３０７４参照）からおよびさらに６Ｇについては加熱／冷却前選択（ＷＯ０４／１０１７９０参照）を使用して発現させた抗体単一可変ドメインを表示するファージライブラリーであるＤｏｍａｎｔｉｓ社の４Ｇおよび６Ｇナイーブファージライブラリーを４つのプールに分けた。プール１は、ライブラリー４ＶＨ１１〜１３および６ＶＨ２を含み、プール２は、ライブラリー４ＶＨ１４〜１６および６ＶＨ３を含み、プール３は、ライブラリー４ＶＨ１７〜１９および６ＶＨ４を含み、プール４は、ライブラリー４Ｋおよび６Ｋを含んでいた。ライブラリーの一定分量は、各ライブラリーの１０倍の過剰表示（１０−ｆｏｌｄ  ｏｖｅｒ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を可能にするのに十分なサイズとした。受動的コーティングされたビオチン化ヒトおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１抗原を使用して選択を行った。受動的コーティングされた抗原を使用した選択を以下のように行った。５ｍＭ  Ｃａ２＋を補充したＴＢＳ（ＴＢＳ／Ｃａ２＋）中でイムノチューブ（Ｎｕｎｃ）上に抗原をコーティングした後、ＴＢＳ／Ｃａ２＋中２％Ｍａｒｖｅｌ（ＭＴＢＳ／Ｃａ２＋）でチューブをブロッキングした。ライブラリーの一定分量をＭＴＢＳ／Ｃａ２＋中抗原コーティングイムノチューブとインキュベートした後、ＴＢＳ／Ｃａ２＋でチューブを洗浄した。次いで、結合したファージを１ｍｇ／ｍｌトリプシンで溶離した。ラウンドが進行するにつれて、コーティング中の抗原濃度は、１ｍｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌまで減少し、ラウンドが進行するにつれて、力価は増加した。ビオチン化抗原を使用した選択を以下のように行った。ライブラリーの一定分量をＭＴＢＳ／Ｃａ２＋中抗原と１時間インキュベートした後、ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはニュートラアビジン（Ｐｅｒｂｉｏ）でコーティングしたトシル活性化ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に捕捉させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ／Ｃａ２＋およびＴＢＳ／Ｃａ２＋で洗浄し、次いで、１ｍｇ／ｍｌトリプシンで溶離した。ラウンドが進行するにつれて、抗原濃度は、１００ｎＭから１ｎＭまで減少し、ラウンドが進行するにつれて、力価は増加した。両タイプの選択後、溶離したファージを使用して、対数期のＴＧ１細胞に感染させ（Ｇｉｂｓｏｎ、１９８４）、次いで、感染細胞をテトラサイクリンプレート（１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン）に蒔いた。次いで、ファージに感染した細胞を、３７℃で一晩テトラサイクリンとともに２ｘＴＹで培養した後、ＰＥＧ−ＮａＣｌを使用して培養液上清からファージを沈殿させ、その後の選択のラウンドに使用した。
【実施例３】
【０１３４】
肝臓細胞特異的ｄＡｂのスクリーニング選択結果
３ラウンドの選択後、各ライブラリープールからのｄＡｂ遺伝子を、ｐＤＯＭ４ファージベクターからｐＤＯＭ１０可溶性発現ベクターにサブクローニングした。ｐＤＯＭ４は、遺伝子ＩＩＩシグナルペプチド配列が、酵母糖脂質アンカー表面タンパク質（ＧＡＳ）シグナルペプチドに置換された、ｆｄファージベクターの誘導体である。これはまた、リーダー配列と遺伝子ＩＩＩとの間にｃ−Ｍｙｃタグを含む。各場合で、選択後、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、適当な選択のラウンドからのファージＤＮＡのプールを調製し、制限酵素Ｓａｌ１およびＮｏｔ１を使用してＤＮＡを消化し、豊富なｄＡｂ遺伝子を、ｐＤＯＭ１０中の対応する部位の中に連結する。
【０１３５】
ｐＤＯＭ１０ベクターは、ｐＵＣ１１９に基づくベクターである。タンパク質の発現は、ＬａｃＺプロモーターにより駆動する。ＧＡＳ１リーダー配列（ＷＯ２００５／０９３０７４参照）が、単離された可溶性ｄＡｂの、大腸菌の周辺質および培養液上清中への分泌を保証する。ｄＡｂは、ｄＡｂのＣ末端にＦＬＡＧエピトープタグを付加する、このベクター中のＳａｌＩ／ＮｏｔＩにクローニングされる。
【０１３６】
連結したＤＮＡを使用して、大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、次いでこれを、抗生物質カルベニシリンを含む寒天平板上で一晩培養した。得られたコロニーの抗原結合を個々に評価した。
【０１３７】
個々のｄＡｂクローンの抗原結合を、ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅのいずれかにより評価した。ＥＬＩＳＡアッセイは、以下のフォーマットをとった。ヒトまたはマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１を、１μｇ／ｍｌで、４℃で一晩Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ＮＵＮＣ）プレート上にコーティングした。次いで、プレートを、２％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ／Ｃａ２＋でブロッキングし、引き続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ／Ｃａ２＋で１：１希釈したｄＡｂ上清とインキュベートし、引き続いて１：５０００抗ｆｌａｇ（Ｍ２）−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ）で検出した。ブロッキング後の全ステップを室温で行った。ｄＡｂ上清と対照抗原（ヒトｃ−キット−（Ｈｉｓ）６）の結合も同時に解析した。いくつかの場合、ヒト抗原を使用した選択からのｄＡｂ上清も、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイを使用してＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞との結合についてスクリーニングした。ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ９６ウェル、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  Ｐｌａｔｅｓ（Ｍｅｓｏ−ｓｃａｌ）を使用して、１ウェル当たり細胞１ｘ１０５個の密度で細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートさせた。翌日、ＭＳＤアッセイ緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％ウシ胎児血清および１％ＢＳＡを含む１ｘＰＢＳ）中へのｄＡｂおよびビオチン化抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）の希釈により、ｄＡｂ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２複合体を２ｘ最終濃度で調製した。ｄＡｂ−抗ＦＬＡＧ複合体を、室温で１時間、１：１のモル比でインキュベートした。次いで、細胞を２００μｌ  ＰＢＳで３回洗浄した後、１ウェル当たり２５μｌのｄＡｂ−抗ＦＬＡＧ複合体を添加し、穏やかに攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、上記のように細胞を洗浄し、アッセイ緩衝液中に１μｇ／ｍｌに希釈した１ウェル当たり２５μｌのストレプトアビジン−Ｓｕｌｆｏｔａｇ（Ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ）を添加した。次いで、細胞を、穏やかに攪拌しながら、暗中室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を上記のように洗浄した後、１ウェル当たり１５０μｌの界面活性剤を含まない１ｘＭＳＤリード緩衝液（Ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ）に再懸濁し、６２０ｎｍ放射でＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ）で読み取った。このアッセイで、クローンＤＯＭ２６ｈ−２５、ＤＯＭ２６ｈ−３４、ＤＯＭ２６ｈ−１６１、ＤＯＭ２６ｈ−１６２、ＤＯＭ２６ｈ−１６３、ＤＯＭ２６ｈ−１６４、ＤＯＭ２６ｈ−１６５、ＤＯＭ２６ｈ−１６６およびＤＯＭ２６ｈ−１６７ならびにＤＯＭ２６ｈ−１６８〜ＤＯＭ２６ｈ−２２４をスクリーニングした。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡまたはＭＳＤアッセイにより（Ｈｉｓ）６ＡＳＧＰＲ  Ｈ１との特異的結合を示したｄＡｂを、ＢＩＡｃｏｒｅによりスクリーニングした。ＢＩＡｃｏｒｅによるスクリーニングは、ＨＢＳ−Ｐ  ＢＩＡｃｏｒｅ泳動用緩衝液で１：２希釈した上記のようなｄＡｂ上清を使用して行った。次いで、各ｄＡｂを、ＣＭ５チップ上のブランクフローセルおよびヒトもしくはマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１でコーティングしたフローセルに注入した。（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１との特異的結合を示したｄＡｂクローンを画線接種（ｓｔｒｅａｋ  ｏｕｔ）し、配列決定した。
【０１３９】
全ユニークｄＡｂクローンを３７℃で、一晩５０ｍｌ培養液（ＯｎＥＸとカルベニシリン）中で発現させ、タンパク質Ａ（ＶＨｄＡｂ）またはタンパク質Ｌ（ＶκｄＡｂ）で精製した。精製ｄＡｂを、２０μｇ／ｍｌでヒトまたはマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１のいずれかでコーティングしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップに流した（図３）。次いで、（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１に特異的に結合したｄＡｂを、フローサイトメトリー細胞結合アッセイで解析した（図４）。
【０１４０】
ヒトＡＳＧＰＲ陽性細胞株として２種の細胞株を使用し（ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３ｂ）、陰性対照ヒト細胞株として１種の細胞株を使用した（ＨｅＬａ）。マウスＡＳＧＰＲ陽性細胞株として２種の細胞株を使用し（Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＮＭｕＬｉ）、陰性対照マウス細胞株として１種の細胞株を使用した（Ｌ９２９）。フローサイトメトリー細胞結合アッセイを以下のように行った。細胞を収集し、５％ＦＣＳおよび０．５％ＢＳＡを補充したＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄した。細胞を、１ウェル当たり細胞１ｘ１０５個の濃度で適当な数のウェルに分け、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、４℃で３０分間５μｇ／ｍｌ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）とのインキュベートにより予め架橋させた適当な濃度のｄＡｂと１時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に１：１００希釈したヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）と４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを使用）により解析した。ヒト肝臓細胞株ＨｅｐＧ２に特異的なクローンのＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔの方法を使用して決定した）を、以下の表２に記載する。
【表２】
2013516967.tif 000027
【０１４１】
マウス肝臓細胞株Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７に特異的なクローンのＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔの方法を使用して決定した）を、以下の表３に記載する。
【表３】
2013516967.tif 000028
【０１４２】
リードｄＡｂを、多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより解析して、それらが溶液中で単量体であるか、形成された高次オリゴマーであるかを決定した。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを以下のように行った。サイズ排除クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００；Ｓ２００）により、その流体力学的性質にしたがって、タンパク質（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳまたは０．１Ｍトリスグリシン、ｐＨ８．０中１ｍｇ／ｍＬの濃度で）を分離した。分離後、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を使用してタンパク質が光を散乱する傾向を測定する。タンパク質が検出器を通過する間に散乱された光の強度を、角度の関数として測定する。屈折率（ＲＩ）検出器を使用して測定したタンパク質濃度とまとめたこの測定値は、適当な方程式を使用したモル質量の計算を可能にする（解析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１２の必須部分）。結果を以下の表４に示す。
【表４】
2013516967.tif 000029
【０１４３】
リードｄＡｂを、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によっても解析して、見かけの融解温度を測定した。ＤＳＣを以下のように行った。タンパク質を１８０℃／時間の一定速度で加熱し（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで）、熱変性に関連する検出可能な熱変化を測定した。転移中点（ａｐｐＴｍ）を測定し、これをタンパク質の５０％がその自然な高次構造にあり、他の５０％が変性している温度として記載する。ここで、ＤＳＣは、試験したタンパク質の大半が完全には再び折りたたまれていない見かけの転移中点（ａｐｐＴｍ）を決定した。Ｔｍが高いほど、分子はより安定である。使用したソフトウェアパッケージは、ＯｒｉｇｉｎＲ  ｖ７．０３８３．であった。結果を以下の表５に示す。
【表５】
2013516967.tif 000030
【０１４４】
いくつかの場合では、ＡｐｐＴｍ１の測定後のタンパク質の再折りたたみが不十分であるため（例えば、ＤＯＭ２６ｍ−２９、ＤＯＭ２６ｍ−５０およびＤＯＭ２６ｈ−１６１）、または１回の転移により分子がほどけるため（ＤＯＭ２６ｈ−１６１、ＤＯＭ２６ｈ−１６５、ＤＯＭ２６ｈ−１６６およびＤＯＭ２６ｈ−１６７の場合のように）、ＡｐｐＴｍ２を測定することができなかった。
【実施例４】
【０１４５】
共焦点免疫蛍光顕微鏡法によるマウス肝臓細胞株に結合するＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂの解析
ＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂの細胞表面結合、内部移行および細胞内局在を調べるために、共焦点顕微鏡アッセイを開発した。手短に言えば、細胞をガラスチャンバースライド上で培養し、３７℃で４５分間Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含む５μＭ  ＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂとインキュベートした。次いで、細胞を室温で、１０分間２％ホルムアルデヒドで固定した。次いで、５％ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄した後、細胞を初期エンドソームマーカーとしての初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）に特異的なウサギポリクローナル抗体またはリソソームマーカーとしてのリソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）に特異的なウサギポリクローナル抗体のいずれかで共染色した。抗体を、０．２％の最終濃度でサポニンを含む５％ＦＣＳ／ＰＢＳに希釈し、細胞と室温で１時間インキュベートした。洗浄ステップ後、それぞれ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ｃｙ３結合モノクローナル抗体および抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体を使用して、ｄＡｂおよびポリクローナル抗体を検出した。細胞を、ＤＮＡについてのマーカーとしての４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）でも共染色した。細胞を画像化のために調製し、共焦点顕微鏡法を使用して可視化した。
【０１４６】
結果は、抗ＦＬＡＧおよび抗ＥＥＡ１染色の部分的共局在により示されるように、マウス肝臓細胞株Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７に結合したマウスＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂクローンＤＯＭ２６ｍ−３３が、初期エンドソーム中に内部移行していることを示した（図５）。しかしながら、染色パターンは、主に細胞表面であり、有意な内部移行が起こっていないことを示している。抗ＦＬＡＧおよびＬＡＭＰ１染色の共局在が観察される状況でなかったので、ＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂクローンＤＯＭ２６ｍ−３３は、リソソーム中の分解の標的にされないようである。
【０１４７】
ＤＯＭ２６ｍ−３３についてＬ９２９マウス線維芽細胞陰性対照細胞の染色は観察されず、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞株を使用した実験においてこのｄＡｂで観察された染色パターンは、肝臓細胞特異的であることを示している。同様に、ＶＨ生殖細胞系配列ＶＨＤ２についてＨｅｐａ１ｃ１ｃ７の染色も観察されなかった。
【実施例５】
【０１４８】
表面プラズモン共鳴によるエピトープマッピング
（Ｈｉｓ）６マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１でＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップをコーティングした後、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌ精製ｄＡｂタンパク質を次々に、組み合わせて、同一抗原表面上に注入した。１個のｄＡｂ分子によるチップの最大結合能が、同一抗原表面上に第２ｄＡｂを同時注入することにより超えられるのかどうかを調べるために、得られた結合ＲＵを測定した。そうである場合、第２ｄＡｂは、明らかに第１ｄＡｂと比べて異なるエピトープに結合する。単一注入および同時注入実験の両方で、１μＭ濃度の各ｄＡｂを、１秒当たり１０μｌの流速で注入した。第１ｄＡｂの存在下での第２ｄＡｂの注入が、チップ表面との観察される結合を２０％超（第１ｄＡｂの不存在下での第２ｄＡｂとチップ表面の観察される結合と比較して）減少させた場合は、両ｄＡｂは、抗原内の重複エピトープに結合すると考えられた（図６）。これらの実験で得られた結果に基づいて、マウスＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂクローンを、図１２に示すように抗原内に結合したエピトープによりグループ化することができた。
【０１４９】
ＢＩＡｃｏｒｅによるエピトープマッピングは、（Ｈｉｓ）６マウスＡＳＧＰＲ  Ｈ１抗原内のいくつかの異なるエピトープに、これらの８種のクローンが結合していることを示している。エピトープマッピングデータはまた、いくつかの場合にＶκおよびＶＨクローンが重複エピトープに結合することを示しているので、８種全てのクローンを使用して親和性成熟についてのさらなるライブラリーを作成した。
【実施例６】
【０１５０】
生体内でのＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂとマウス肝臓の結合
抗マウスＡＳＧＰＲ  ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｍ−３３およびＶκダミー／ＶＨダミー２生殖細胞系対照ｄＡｂを使用して、ＶκクローンのＣ末端のアルギニン残基およびＶＨクローンのＣ末端のセリン残基がシステインに突然変異するように点突然変異をもたらした。そのため、Ｖκダミーは点突然変異Ｒ１０８Ｃを保有し、ＶＨダミー２は点突然変異Ｓ１２７Ｃを保有し、ＤＯＭ２６ｍ−３３は点突然変異Ｓ１１６Ｃを保有していた。ＶＨｄＡｂについてはプライマーＤＯＭ００８およびＰＢＳ−ＥＣＶＨ２ならびにＶκクローンについてはプライマーＤＯＭ００８およびＰＢＳ−ＥＣＶＫ２を使用して、ＰＣＲにより、ｐＤＯＭ１０からｄＡｂを増幅した。オリゴヌクレオチド配列を以下の表６に示す。
【表６】
2013516967.tif 000031
【０１５１】
次いで、ｄＡｂ挿入を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐＤＯＭ１０中の対応する部位にクローンニングした。ｄＡｂを、３０℃で３日間、５００ｍｌ培養液（ＯｎＥＸとカルベニシリン）中で発現させ、タンパク質Ａ（ＶＨｄＡｂ）またはタンパク質Ｌ（ＶκｄＡｂ）で精製した。次いで、ｄＡｂをＤＯＴＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅと結合させ、１１１Ｉｎで標識した。手短に言えば、ｄＡｂ溶液（および結合法で使用する全ての緩衝液）を、Ｃｈｅｌｅｘ１００樹脂に通して、カチオンを除去した。次いで、Ｃｈｅｌｅｘ処理ｄＡｂ溶液を、０．５Ｍ  ＴＣＥＰ、１％（ｖ／ｖ）の添加により還元した。３０分後、ＰＤ１０カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーにより還元剤を除去した。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７に溶解した３０倍モル過剰のＤＯＴＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを添加することにより、室温で一晩、結合を行った。ＤＯＴＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ結合ｄＡｂを、タンパク質Ａストリームライン樹脂を使用して反応混合物から精製し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２に溶離した。１／１０容積の１Ｍトリス、ｐＨ８．０を添加して溶離液を中和した。次いで、１／３容積の２Ｍ酢酸アンモニウムを中和した溶離液に添加してｐＨを５．５に調整し、２８０ｎｍで吸光度を測定することによりタンパク質濃度を計算した。質量分光分析により結合度を測定した。次いで、５〜２０μｌの１１１ＩｎＣｌ３（０．０５Ｍ  ＨＣｌに溶解している）および１〜４μｌの１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５を２５μｇ  ＤＯＴＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ結合ｄＡｂに添加することにより、精製ＤＯＴＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ結合ｄＡｂ溶液を３５μｌの反応容積で放射標識した。３７℃で１〜３時間反応を進行させた後、薄層クロマトグラフィーを使用して放射標識効率を解析した。放射標識が成功した後、０．００１％（ｖ／ｖ）０．１Ｍ  ＥＤＴＡを使用して反応混合物をクエンチした。約１２ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを、イソフルラン麻酔したｂａｌｂ／ｃマウスに尾静脈を通して静脈内注射した後、Ｎａｎｏｓｐｅｃｔ／ＣＴ前臨床生体内画像化システムを使用して７日間にわたって画像化した。画像の解析は、１１１Ｉｎ標識ＤＯＭ２６ｍ−３３を注射したマウスでは、３時間後に腎臓、膀胱および肝臓でシグナルが観察されることを示した（図７）。しかしながら、１１１Ｉｎ標識ＶκダミーまたはＶＨダミー２を注射したマウスでは、注射後７日間にわたって肝臓でシグナルが観察されなかったので、生体内でのＤＯＭ２６ｍ−３３の肝臓特異的結合は、ＡＳＧＰＲ結合の直接的な結果である。この経路を通した排出のために、全ての場合で腎臓および膀胱でシグナルが観察された。１１１Ｉｎ標識ｄＡｂの生体内分布を定量的に決定するために、全身オートラジオグラフィー実験を行った。ｂａｌｂ／ｃマウスに、上記のように約０．５ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを投与した。次いで、注射３時間後にマウスを屠殺した後、器官を取り出し、ガンマカウンターでカウントした。種々の器官で検出されたカウントを、注射した用量のパーセントとして表した。これらの実験の結果は、ＤＯＭ２６ｍ−３３を注射したマウスの肝臓のカウントが、Ｖκダミーを注射したマウスの肝臓のカウントに比べて１２．４倍高く、ＶＨダミー２を注射したマウスの肝臓のカウントに比べて４．９倍高かったことを示している（図８）。
【実施例７】
【０１５２】
ＡＳＧＰＲ特異的ｄＡｂに融合したマウスインターフェロンαのクローニングおよび発現
マウスインターフェロンα２ｃＤＮＡをＤＮＡ２．０．によりカスタム合成した。Ｃ末端に付加した部分リンカー配列（以下に記載）およびＡｖｒＩＩ制限部位を含む全長タンパク質（シグナルペプチド配列を含まない）をコードするＤＮＡを、プライマーＤＸ１３２およびＤＸ１３３を使用してＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチド配列を以下の表７に示す。
【表７】
2013516967.tif 000032
【０１５３】
トポイソメラーゼクローニングによりＰＣＲフラグメントを保持ベクターｐＣＲ−Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、Ｍ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを使用して、配列決定してエラーを含まないクローンを得た。挿入を含むｐＣＲ−Ｚｅｒｏ  ＢｌｕｎｔのＢａｍＨＩ／ＡｖｒＩＩ消化後、ゲル精製によりマウスＩＦＮａ２コードＤＮＡを得て、挿入をｐＤＯＭ５０中の対応する部位に連結して、ベクターｐＤＯＭ３８ｍＩＦＮ−Ｎ１を作成した。
【０１５４】
次いで、以下に記載のように、抗マウスＡＳＧＰＲ  ｄＡｂ（または生殖細胞系対照ｄＡｂ  ＶκダミーおよびＶＨダミー２）を、ｐＤＯＭ３８ｍＩＦＮ−Ｎ１にクローニングして、介在性リンカー配列ＴＶＡＡＰＳによりｄＡｂ配列とＣ末端で融合したマウスＩＦＮａ２を作成した。
【０１５５】
ＶκクローンについてはプライマーＤＸ００８およびＤＸ０１８ならびにＶＨクローンについてはプライマーＤＸ００９およびＤＸ０１９を使用したｄＡｂヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅後、ＰＣＲフラグメントを保持ベクターに挿入し、配列決定して上記のようにエラーを含まないクローンを得た。挿入を含むｐＣＲ−Ｚｅｒｏ  ＢｌｕｎｔのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、ゲル精製によりｄＡｂ配列をコードするＤＮＡを得て、挿入をＡｖｒＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＤＯＭ３８ｍＩＦＮ−Ｎ１中に連結した。
【０１５６】
ＤＸ０１８およびＤＸ０１９の代わりに使用したアンチセンスプライマーを、ＶκクローンについてはＤＬＴ０４８およびＶＨクローンについてはＤＬＴ０４９としたことを除いては、上記のように、ｄＡｂのＣ末端残基がシステインに突然変異したコンストラクトも作成した。オリゴヌクレオチド配列を以下の表８に示す。
【表８】
2013516967.tif 000033
【０１５７】
リンカー配列（アミノ酸）：
TVAAPS (配列番号９１)
リンカー配列（ヌクレオチド）：
ACCGTCGCCGCTCCTAGC (配列番号９２)
ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｇａｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。２９３−Ｆｅｃｔｉｎを使用して、１μｇ  ＤＮＡ／ｍｌをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に形質移入し、無血清培地中で培養した。タンパク質を５日間培養液中で発現させ、タンパク質Ｌストリームライン樹脂を使用して培養液上清から精製し、０．１ＭグリシンｐＨ２．０で溶離し、１ＭトリスｐＨ８．０で中和した。タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換した。上記のように還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を評価した（図９）。
【０１５８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＣＨＯ−ＩＳＲＥ  Ｌｕｃアッセイ）を使用してマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体のインターフェロン活性を分析した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞にルシフェラーゼレポーターコンストラクトｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃを一過性形質移入した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；http://www.clontech.com/images/pt/PT3372-5.pdf）。一晩のインキュベーション後、形質移入した細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート上に蒔き、３７℃で４時間インキュベートした後、１時間マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体で処理した。次いで、ＩＦＮ−刺激細胞を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（http://www.promega.com/tbs/tm052/tm052.pdf）で処理し、Ｗａｌｌａｃマイクロプレートリーダーで読み取った。大腸菌中で発現させた組換えマウスインターフェロンα（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を標準として使用した。結果は、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体がこのアッセイで活性であることを示している（図１０）。
【０１５９】
マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体のＡＳＧＰＲ結合活性も、上記のようにｂｉａｃｏｒｅにより試験した。ＤＯＭ２６ｍ−３３結合活性は、マウスＩＦＮａ２とのインライン融合体という面で保持された（図１１）。
【０１６０】
配列：
マウスＩＦＮａ２
CDLPHTYNLRNKRALKVLAQMRRLPFLSCLKDRQDFGFPLEKVDNQQIQKAQAIPVLRDLTQQTLNLFTSKASSAAWNTTLLDSFCNDLHQQLNDLQTCLMQQVGVQEPPLTQEDALLAVRKYFHRITVYLREKKHSPCAWEVVRAEVWRALSSSVNLLPRLSEEKE (配列番号９３)
TGCGATCTGCCTCACACTTATAACCTCAGGAACAAGAGGGCCTTGAAGGTCCTGGCACAGATGAGGAGGCTCCCCTTTCTCTCCTGCCTGAAGGACAGGCAGGACTTTGGATTCCCCCTGGAGAAGGTGGATAACCAGCAGATCCAGAAGGCTCAAGCCATCCCTGTGCTGCGAGATCTTACTCAGCAGACCTTGAACCTCTTCACATCAAAGGCTTCATCTGCTGCTTGGAATACAACCCTCCTAGACTCATTCTGCAATGACCTCCACCAGCAGCTCAATGACCTGCAAACCTGTCTGATGCAGCAGGTGGGGGTGCAGGAACCTCCTCTGACCCAGGAAGACGCCCTGCTGGCTGTGAGGAAATATTTCCACAGGATCACTGTGTACCTGAGAGAGAAGAAACACAGCCCCTGTGCCTGGGAGGTGGTCAGAGCAGAAGTCTGGAGAGCCCTGTCTTCCTCAGTCAACTTGCTGCCAAGACTGAGTGAAGAGAAGGAG (配列番号９４)
【実施例８】
【０１６１】
ＤＯＭ２６ｍおよびＤＯＭ２６ｈリードの親和性成熟
クローンＤＯＭ２６ｍ−２０、−５０、−２９、−３３、−５２ならびにＤＯＭ２６ｈ−６１、−９９、−１０４、−１１０および−１５９についてエラープローンＰＣＲライブラリーを構築した。ｐＤＯＭ５ベクター中の親クローンを、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して２ラウンドのエラープローンＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応では、製造業者のプロトコルにしたがって、プライマーＡＳ９およびＡＳ３３９を使用して０．７５μｇのベクターを３０サイクル増幅した。増幅の第２ラウンドでは、プライマーＡＳ６３９およびＡＳ６５を使用して０．１μｌの第１増幅反応産物を３５サイクルで１００μｌ容積に再増幅した。２％Ｅ−Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して電気泳動により反応産物を精製した。１００μｌ容積中、３７℃、１８時間で、精製した反応産物を２００ユニットのＳａｌＩ（高濃度、ＮＥＢ）および１００ユニットのＮｏｔＩ（高濃度、ＮＥＢ）で切断した。２％Ｅ−ｇｅｌｓを使用して消化したＤＯＭ２６ｍおよびＤＯＭ２６ｈ挿入断片をゲル精製し、２０μｌの水に溶離した。
【０１６２】
１６℃、２５μｌ容積中で一晩の反応において、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を使用して、各ライブラリー挿入断片を１μｌの３０ｎＭ  ｐＩＥ２ａ２Ａベクター（ＷＯ２００６０１８６５０参照）中に連結した。０．１μｌの一定分量の連結されたライブラリーを使用して、連結されたベクター分子の数を定量化した。プライマーＡＳ７９およびＡＳ８０（ｐ１７４、Ｒ１７０５８）を使用したｑＰＣＲ（Ｍｉｎｉ−Ｏｐｔｉｃｏｎ、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｐｒｅ−ｍｉｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１７０−８８８０）により、環状化したベクターの形の反応収率を測定した。増幅サイクルは、２分９４℃、引き続いて４０サイクルの１５秒９４℃、３０秒６０℃および３０秒７２℃とした。ＤＮＡの量をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｏｐｔｉｃｏｎ  リアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）で定量化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給されるＯｐｔｉｃｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒバージョン３．１．３２（２００５）ソフトウェアを使用して解析した。既知のＤＮＡ濃度の試料からの標準曲線は、１反応当たり５００〜５ｘ１０８個の分子の範囲を網羅した。（ライブラリー多様性に等しい独立した連結の）典型的な反応収率は、１反応当たり環状化ベクターコピー２ｘ１０８個と２ｘ１０９個の間で変化した。
【０１６３】
０．５μｌの連結混合物を使用して、１０μｌのＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。プライマーＡＳ７９およびＡＳ８０、ＳｕｐｅｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、コロニーからの挿入断片を増幅した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレートを使用して、反応産物を精製し、Ｔ７プライマーを使用して、各ライブラリーについて８種のクローンを配列決定した。平均で、ライブラリーは、１遺伝子当たり１．８〜２．８個のアミノ酸突然変異を含んでいた（ｐ１７９、Ｒ１７０５８）。
【０１６４】
プライマーＡＳ１１およびＡＳ１７とともにＳｕｐｅｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、連結混合物の残りを１５μｌ容積にＰＣＲ増幅して、選択に必要とされるＰＣＲフラグメントを作成した。
【０１６５】
選択
プロセスを通してＫＯＤ  Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を使用したことを除いては、ＷＯ２００６０１８６５０に記載されている方法にしたがって、全ライブラリーを別々にしておき、一連のネステッドプライマーセットＡＳ１２＋ＡＳ１８、ＡＳ１３＋ＡＳ１９、ＡＳ１４＋ＡＳ２０、ＡＳ１５＋ＡＳ２１、ＡＳ１６＋ＡＳ２２、ＡＳ２９＋ＡＳ１５３、ＡＳ１０６＋ＡＳ１５４、ＡＳ１０９＋ＡＳ１５５およびＡＳ９８＋ＡＳ１５６を使用して、合計で９ラウンドの選択を行った。選択の第１ラウンドでは、ライブラリーの５ｘ１０９個の分子を１ｍｌのエマルジョンに乳化し、その後の８ラウンドでは、１反応当たり５ｘ１０８個の分子を使用した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、製造業者のプロトコルによる）によりビオチン化したマウスＡＳＧＰＲを使用して、タンパク質ＤＮＡ複合体の親和性捕捉を行った。１反応当たりビーズ３ｘ１０７個でＭ２８０ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終始使用して、リガンド−ｄＡｂ−ＤＮＡ複合体を捕捉した。４〜６ｆｍｏｌのマウスＡＳＧＰＲを、ビーズ上にプレコートし（１ラウンド中）、または捕捉期（２〜９ラウンド）中に溶液２００μｌ容積中で使用した。
【０１６６】
選択の最終ラウンド後、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ酵素で増幅ＤＮＡを切断し、ｄＡｂ挿入断片を２％Ｅ−Ｇｅｌでゲル精製した。精製した挿入断片を、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ−切断ｐＤＯＭ１０ベクターにクローニングし、Ｍａｃｈ１ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。各ライブラリーについて９６個のコロニーを採った。細菌コロニーを使用してＰＣＲ反応を行い、１００μｌストックＬＢおよび６００μｌ  ＴＢ／ＯｎＥＸ（Ｍｅｒｃｋ）培養液を接種した。２．２ｍｌ  ＤｅｅｐＷｅｌｌプレート中、３００Ｃ、７５０ＲＰＭでの７２時間のインキュベーション中、自己誘導発現のためにＴＢ／ＯｎＥＸ培養液を使用した。ＨＢＳ−Ｐ緩衝液、ならびにビオチン化タンパク質、２チャンネルはヒトＡＳＧＰＲ、３チャンネルはマウスＡＳＧＰＲおよび４チャンネルはタンパク質Ａもしくはタンパク質ＬでコーティングしたＳＡチップ（全てＢＩＡｃｏｒｅ）を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅで発現産物をスクリーニングした。１チャンネルは、コーティングしないままとした。プライマーＡＳ９およびＡＳ６５とともにＳｕｐｅｒＴａｑを使用して、コロニーＰＣＲを行った。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＣＲ反応産物を精製し、Ｍ１３逆方向プライマーを使用して配列決定した。
【０１６７】
結果
配列エンリッチメント（ＤＯＭ２６ｍ−２０およびＤＯＭ２６ｈ−６１ライブラリー）または上清のＢＩＡｃｏｒｅスクリーニング（ＤＯＭ２６ｍ−５２ライブラリー）により、いくつかのクローンを同定した。ライブラリーの残りについては、改善されたクローンまたは配列エンリッチメントは観察されなかった。
【０１６８】
ドープライブラリーを使用して、ＤＯＭ２６ｍおよびＤＯＭ２６ｈリードのさらなる親和性成熟を行った。ＳｕｐｅｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｐＤＯＭ５ベクター中の標的化ｄＡｂ遺伝子を使用してＰＣＲによりライブラリーを構築した。ドープされたオリゴヌクレオチドは、定位置（大文字により示され、その場合、オリゴヌクレオチドの１００％はその位置で示されたヌクレオチドを有する）およびオリゴヌクレオチドの８５％がこの位置に優位なヌクレオチドを有し、１５％が残っている３個のヌクレオチド間での等しい分割を有する小文字により示される混合ヌクレオチド組成からなっていた。
【０１６９】
ＤＯＭ２６ｍ−２０：第１反応において、オリゴヌクレオチドＡＳ９およびＡＳ１２５３を使用してＤＯＭ２６ｍ−２０のＣＤＲ１をランダム化し、オリゴヌクレオチドＡＳ１２５７およびＡＳ３３９を使用してＣＤＲ２をランダム化した。反応産物をゲル精製し、混合し、第２ネステッドプライマーとしてプライマーＡＳ６５およびＡＳ６３９を使用してＳＯＥ−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ等  Ｇｅｎｅ、７７、ｐ６１（１９８９））によりスプライスし、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の両方をランダム化したライブラリーを用意した。プライマーＡＳ９およびＡＳ１２５９を使用して、ＣＤＲ３をランダム化した。
【０１７０】
ＤＯＭ２６ｍ−５０：第１反応において、オリゴヌクレオチドＡＳ９およびＡＳ１２５４を使用してＤＯＭ２６ｍ−２０のＣＤＲ１をランダム化し、オリゴヌクレオチドＡＳ１２５８およびＡＳ３３９を使用してＣＤＲ２をランダム化した。反応産物をゲル精製し、混合し、第２ネステッドプライマーとしてプライマーＡＳ６５およびＡＳ６３９を使用してＳＯＥ−ＰＣＲによりスプライスし、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の両方をランダム化したライブラリーを用意した。プライマーＡＳ９およびＡＳ１２６０を使用して、ＣＤＲ３をランダム化した。
【０１７１】
ＤＯＭ２６ｍ−２９：第１反応において、オリゴヌクレオチドＡＳ９およびＡＳ１２６１を使用してＤＯＭ２６ｍ−２０のＣＤＲ１をランダム化し、オリゴヌクレオチドＡＳ１２６７およびＡＳ３３９を使用してＣＤＲ２をランダム化した。反応産物をゲル精製し、混合し、第２ネステッドプライマーとしてプライマーＡＳ６５およびＡＳ６３９を使用してＳＯＥ−ＰＣＲによりスプライスし、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の両方をランダム化したライブラリーを用意した。プライマーＡＳ９およびＡＳ１２７０を使用して、ＣＤＲ３をランダム化した。
【０１７２】
ＤＯＭ２６ｍ−３３：第１反応において、オリゴヌクレオチドＡＳ９およびＡＳ１２６２を使用してＤＯＭ２６ｍ−２０のＣＤＲ１をランダム化し、オリゴヌクレオチドＡＳ１２６８およびＡＳ３３９を使用してＣＤＲ２をランダム化した。反応産物をゲル精製し、混合し、第２ネステッドプライマーとしてプライマーＡＳ６５およびＡＳ６３９を使用してＳＯＥ−ＰＣＲによりスプライスし、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の両方をランダム化したライブラリーを用意した。プライマーＡＳ９およびＡＳ１２７１を使用して、ＣＤＲ３をランダム化した。
【０１７３】
ＤＯＭ２６ｈ−９９：ＳＯＥ−ＰＣＲにより、各ＣＤＲについて別々のライブラリーを構築した。ＣＤＲ１：ＣＤＲ１についてはプライマー対ＡＳ１２９０＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１３１０、ＣＤＲ２についてはＡＳ１２９４＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１２７８、ならびにＣＤＲ３についてはＡＳ１２９８＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１３０４を使用した第１増幅。個々のＣＤＲについての増幅産物を混合し、ＳＯＥ  ＰＣＲによりスプライスし、プライマーＡＳ６３９およびＡＳ６５を使用して再増幅した。
【０１７４】
ＤＯＭ２６ｈ−１５９：ＳＯＥ−ＰＣＲにより、各ＣＤＲについて別々のライブラリーを構築した。ＣＤＲ１：ＣＤＲ１についてはプライマー対ＡＳ１３２２＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１３１０、ＣＤＲ２についてはＡＳ１３２３＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１２７８、ならびにＣＤＲ３についてはＡＳ１３２４＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１３０４を使用した第１増幅。個々のＣＤＲについての増幅産物を混合し、ＳＯＥ  ＰＣＲによりスプライスし、プライマーＡＳ６３９およびＡＳ６５を使用して再増幅した。
【０１７５】
ＤＯＭ２６ｍ−５２−３：ＣＤＲ１についてはプライマー対ＡＳ１２８７＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１２６３、ＣＤＲ２（第１ライブラリー）についてはＡＳ１３２５＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１３２７、ＣＤＲ２（第２ライブラリー）についてはＡＳ１３２６＋ＡＳ３３９およびＡＳ９＋ＡＳ１３２７、ならびにＣＤＲ３についてはＡＳ９＋ＡＳ１２７２を使用して、第１増幅を行った。個々のＣＤＲ１〜２についての増幅産物を混合し、ＳＯＥ  ＰＣＲによりスプライスし、プライマーＡＳ６３９およびＡＳ６５を使用して再増幅した。
【０１７６】
構築したライブラリーフラグメント全てを、上記のようにゲル精製し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ切断し、ｐＩＥ２ａ２Ａベクター中に連結したところ、上記のようにｑＰＣＲにより測定されるように、連結収率は１反応当たり１０９を超える独立連結であった（２３、２７、２８  Ｒ１７４７９）。
【０１７７】
選択
上記のように、全ライブラリーを別々にしておき、一連のネステッドプライマーセットＡＳ１２＋ＡＳ１８、ＡＳ１３＋ＡＳ１９、ＡＳ１４＋ＡＳ２０、ＡＳ１５＋ＡＳ２１、ＡＳ１６＋ＡＳ２２、ＡＳ２９＋ＡＳ１５３、ＡＳ１０６＋ＡＳ１５４、ＡＳ１０９＋ＡＳ１５５およびＡＳ９８＋ＡＳ１５６を使用して、合計で９ラウンドの選択を行った。選択の第１ラウンドでは、ライブラリーの２．５ｘ１０９個の分子を１ｍｌのエマルジョンに乳化し、その後の８ラウンドでは、１反応当たり５ｘ１０８個の分子を使用した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、製造業者のプロトコルによる）によりビオチン化したマウスまたはヒトＡＳＧＰＲを使用して、タンパク質ＤＮＡ複合体の親和性捕捉を行った。１反応当たりビーズ３ｘ１０７個でＭ２８０ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終始使用して、リガンド−ｄＡｂ−ＤＮＡ複合体を捕捉した。２〜６ｆｍｏｌのマウスＡＳＧＰＲを、ビーズ上にプレコートし（１ラウンド中）、または捕捉期（２〜９ラウンド）中に溶液２００μｌ容積中で使用した。
【０１７８】
選択の最終ラウンド後、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ酵素で増幅ＤＮＡを切断し、ｄＡｂ挿入断片を２％Ｅ−Ｇｅｌでゲル精製した。精製した挿入断片を、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ−切断ｐＤＯＭ１０ベクターにクローニングし、Ｍａｃｈ１ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。エラープローンＰＣＲライブラリーのために、各ライブラリーについて９６個のコロニーを採り、上記のように処理した。
【０１７９】
結果
配列エンリッチメント（ＤＯＭ２６ｍ−２０およびＤＯＭ２６ｈ−６１ライブラリー）または上清のＢＩＡｃｏｒｅスクリーニング（ＤＯＭ２６ｍ−５２ライブラリー）により、いくつかのクローンを同定した。ライブラリーの残りについては、改善されたクローンまたは配列エンリッチメントは観察されなかった。
【０１８０】
オリゴヌクレオチド配列を以下の表９に示す。
【表９】
2013516967.tif 000034
【０１８１】
2013516967.tif 000035
【実施例９】
【０１８２】
ヒトアシアロ糖タンパク質Ｈ１受容体レクチンおよび茎ドメインのクローニングならびに発現
ＤＮＡ２．０により、全長ヒトアシアロ糖タンパク質受容体Ｈ１サブユニット（ＡＳＧＰＲ  Ｈ１）ｃＤＮＡを合成した（実施例１参照）。製造業者の指示にしたがってＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｐＤＯＭ５０発現ベクター（実施例１参照）中のヒト（Ｈｉｓ）６ＡＳＧＰＲ  Ｈ１  Ｑ６２〜Ｌ２９１の部位特異的突然変異誘発により、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグを有する茎ドメイン（Ｑ６２〜Ｃ１５３）をコードするＤＮＡを作成した。ｐＤＯＭ５０中のヒト（Ｈｉｓ）６ＡＳＧＰＲ  Ｈ１  Ｑ６２〜Ｌ２９１の翻訳が残基Ｃ１５３の直後で終結するように、プライマーＬＴ０２０およびＬＴ０２１を使用して、このコンストラクトに二重終止コドンを導入した。プライマーＬＴ０１３およびＬＴ０１４を使用して、ＰＣＲによりＮ末端（Ｈｉｓ）６タグを有するレクチンドメイン（Ｃ１５４〜Ｌ２９１）をコードするＤＮＡを増幅した。
【表１０】
2013516967.tif 000036
【０１８３】
ＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製し、ｐＤＯＭ５０中の対応する部位中に連結した（実施例１参照）。
【０１８４】
リーダー配列（アミノ酸）：
METDTLLLWVLLLWVPGSTG (配列番号５)
リーダー配列（ヌクレオチド）：
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGGC (配列番号６)
ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｇａｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。２９３−Ｆｅｃｔｉｎを使用して、１μｇ  ＤＮＡ／ｍｌをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に形質移入し、無血清培地中で培養した。タンパク質を５日間培養液中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して培養液上清から精製し、ＰＢＳ＋０．５Ｍイミダゾールで溶離した。タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換した。
【０１８５】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｎｉ−ＮＴＡから溶離したレクチンおよび茎ドメインの純度を解析した（図１４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、３７℃で２時間５００ユニットのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した場合のみ、ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメインが、予想された分子質量（アミノ酸配列に基づいて１０ＫＤａ）の近くに移動していることを示し、茎ドメイン中の残基のＮ結合グリコシル化と合致する。ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理と関係なく１７．２ＫＤａの予想された分子質量の近くに移動し、ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１のレクチンドメインはＮ結合グリコシル化により広く修飾されていないことを示している。
【０１８６】
配列：
（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメイン
HHHHHHQNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTC (配列番号１５１)
CATCATCATCATCATCACCAGAACTCCCAACTCCAGGAAGAACTTCGAGGACTGAGGGAGACTTTCTCCAATTTCACCGCAAGCACGGAGGCTCAAGTGAAGGGCCTCAGCACCCAGGGCGGGAATGTGGGCAGGAAAATGAAATCCCTGGAGAGCCAGCTCGAAAAGCAGCAGAAAGATCTGTCCGAGGACCACTCTAGCCTGTTGTTGCACGTGAAACAGTTTGTTTCCGACCTTAGGAGTCTTTCTTGCCAAATGGCCGCCCTCCAGGGAAACGGGTCCGAGAGAACTTGC (配列番号１５２)
（Ｈｉｓ）６−ヒトＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメイン
HHHHHHGSCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL (配列番号１５３)
CATCATCATCATCATCACGGGTCGTGCCCCGTCAATTGGGTGGAGCACGAGCGGTCTTGTTATTGGTTTAGCCGAAGCGGAAAAGCCTGGGCCGATGCAGATAACTACTGCCGGCTTGAGGACGCCCATCTGGTCGTGGTGACCAGTTGGGAGGAACAGAAATTCGTACAGCATCATATCGGGCCTGTTAACACATGGATGGGCCTTCATGACCAGAATGGTCCTTGGAAGTGGGTTGACGGAACCGATTACGAAACCGGATTCAAGAACTGGCGGCCTGAACAGCCAGACGACTGGTATGGACACGGCCTCGGAGGCGGGGAGGACTGCGCGCATTTCACAGACGATGGCCGGTGGAATGATGATGTGTGCCAAAGGCCTTACAGATGGGTCTGCGAGACAGAGCTGGATAAGGCTTCACAAGAGCCTCCACTCCTG   (配列番号１５４)
【実施例１０】
【０１８７】
ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂとヒトＡＳＧＰＲ茎ドメイン、ヒトＡＳＧＰＲレクチンドメインおよびマウスＡＳＧＰＲ細胞外ドメインの結合を測定するための表面プラズモン共鳴
潜在的ｄＡｂ結合活性を分析するために、ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメイン、ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１細胞外ドメインを、ビオチン化し、ｂｉａｃｏｒｅストレプトアビジンチップ表面に固定化した。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを有するＡＳＧＰＲ  ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４、ＤＯＭ２６ｈ−２１０−２、ＤＯＭ２６ｈ−２２０−１およびＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１（実施例６のようにｐＤＯＭ１０から発現および精製した）を、４０μｌ分−１の流速でチップ表面に流したところ、ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１細胞外ドメインに結合することが示された。これらのクローンのいずれでもヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメインとの結合が観察されなかった（図１５は、（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１茎ドメイン、ヒト（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１レクチンドメインおよびマウス（Ｈｉｓ）６−ＡＳＧＰＲ  Ｈ１細胞外ドメインに結合するＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１の例を示している）。
【実施例１１】
【０１８８】
生体内でのＡＳＧＰＲレクチンドメイン特異的ｄＡｂとマウス肝臓の結合
ＡＳＧＰＲ  ｄＡｂを３０℃で３日間、５００ｍｌ培養液（ＯｎＥＸとカルベニシリン）中で発現させ、タンパク質Ａ（ＶＨｄＡｂ）またはタンパク質Ｌ（ＶκｄＡｂ）で精製した。次いで、ｄＡｂをＤＯＴＡ−ＮＨＳと結合させ、１１１Ｉｎで標識した。手短に言えば、ｄＡｂ溶液（および結合法で使用する全ての緩衝液）を、Ｃｈｅｌｅｘ１００樹脂に通してカチオンを除去した。１ｘＰＢＳ中２０ｍＭに溶解した４倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳを添加することにより、室温で一晩、結合を行った。ＤＯＴＡ−ＮＨＳ結合ｄＡｂを、タンパク質Ａ（ＶＨｄＡｂ）またはタンパク質Ｌ（ＶκｄＡｂ）ストリームライン樹脂を使用して反応混合物から精製し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２に溶離した。１／１０容積の１Ｍ  トリス、ｐＨ８．０を添加して溶離液を中和した。次いで、１／３容積の２Ｍ酢酸アンモニウムを中和した溶離液に添加してｐＨを５．５に調整し、２８０ｎｍで吸光度を測定することによりタンパク質濃度を計算した。質量分光分析により結合度を測定した。次いで、５〜２０μｌの１１１ＩｎＣｌ３（０．０５Ｍ  ＨＣｌに溶解している）および１〜４μｌの１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５を２５μｇ  ＤＯＴＡ−ＮＨＳ結合ｄＡｂに添加することにより、精製ＤＯＴＡ−ＮＨＳ結合ｄＡｂ溶液を３５μｌ反応容積で放射標識した。３７℃で１〜３時間反応を進行させた後、薄層クロマトグラフィーを使用して放射標識効率を解析した。放射標識反応が成功した後、０．００１％（ｖ／ｖ）０．１Ｍ  ＥＤＴＡを使用して反応混合物をクエンチした。
【０１８９】
約１２ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを、イソフルラン麻酔したｂａｌｂ／ｃマウスに尾静脈を通して静脈内注射した後、Ｎａｎｏｓｐｅｃｔ／ＣＴ前臨床生体内画像化システムを使用して７２時間にわたって画像化した。画像の解析は、１１１Ｉｎ標識ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４およびＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１を注射したマウスでは、３時間後に腎臓、膀胱および肝臓でシグナルが観察されることを示した（図１６）。比較すると１１１Ｉｎ標識ＶκダミーまたはＶＨダミー２を注射したマウスでは、注射後７日間にわたって肝臓でシグナルが観察されなかったので（図８）、生体内でのＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４およびＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１の肝臓特異的結合は、ＡＳＧＰＲレクチンドメイン結合の直接的な結果である。この経路を通した排出のために、全ての場合で腎臓および膀胱でシグナルが観察された。１１１Ｉｎ標識ＡＳＧＰＲレクチンドメイン特異的ｄＡｂの生体内分布を定量的に決定するために、全身オートラジオグラフィー実験を行った。ｂａｌｂ／ｃマウスに、上記のように約０．５ＭＢｑの放射標識ｄＡｂを注射した。次いで、注射３時間後にマウスを屠殺し、器官を取り出し、ガンマカウンターでカウントした。種々の器官で検出されたカウントを、注射した用量のパーセントとして表した。これらの実験の結果は、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１を注射したマウスの肝臓のカウントが、ＶＨダミー２を注射したマウスの肝臓のカウントに比べて約３５倍高かったことを示している。同様に、ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４を注射したマウスの肝臓のカウントは、Ｖκダミーを注射したマウスの肝臓のカウントに比べて４６倍高かった（図１７）。
【実施例１２】
【０１９０】
ＡＳＧＰＲレクチンドメイン特異的ｄＡｂに融合したマウスインターフェロンαのクローニングおよび発現
実施例７に記載のように、ＡＳＧＰＲレクチンドメイン特異的ｄＡｂＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４およびＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１を、ベクターｐＤＯＭ３８ｍＩＦＮａ２−Ｎ１にクローニングした。ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｇａｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。２９３−Ｆｅｃｔｉｎを使用して、１μｇ  ＤＮＡ／ｍｌをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に形質移入し、無血清培地中で培養した。タンパク質を５日間培養液中で発現させ、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌストリームライン樹脂を使用して培養液上清から精製し、２５ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ３．０で溶離し、１Ｍ酢酸Ｎａ  ｐＨ６．０で中和して、ＮａＣｌを添加して１５０ｍＭの最終濃度にした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を評価した（図１８）。
【０１９１】
インターフェロン誘導要素の制御下で、アルカリホスファターゼレポーター遺伝子を安定的に形質移入したＢ１６マウスへパトーマ細胞からなるレポーター細胞アッセイ（以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイと呼ぶ）を使用して、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体のインターフェロン活性を分析した。マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体を、増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌノルモシン、１００μｇ／ｍｌゼオシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ）に希釈し、２０μｌ容積を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。細胞を、細胞４２００００個／ｍｌの濃度で増殖培地に懸濁し、１ウェル当たり１８０μｌを希釈したマウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体に添加した後、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。製造業者の指示にしたがってＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ検出基質を懸濁し、１ウェル当たり１８０μｌを新しいマイクロタイタープレートに添加した。次いで、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体とインキュベートした細胞からの上清１ウェル当たり２０μｌを添加し、プレートを１〜５時間インキュベートした後、Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、６４０ｎｍで吸光度を測定した。大腸菌で発現させた組換えマウスインターフェロンα（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を標準として使用した。結果は、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体がこのアッセイで活性であることを示している（図１９）。
【０１９２】
ＢＩＡｃｏｒｅ（実施例１０に記載の方法）により、マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体とヒト（Ｈｉｓ）６レクチンドメインおよびマウス（Ｈｉｓ）６細胞外ドメインの結合を試験した。ＤＯＭ２６ｈ−１６１−８４、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１およびＤＯＭ２６ｈ−２１０−２とヒト（Ｈｉｓ）６レクチンドメインおよびマウス（Ｈｉｓ）６細胞外ドメインの結合は、マウスＩＦＮａ２とのインライン融合体という面で保持された（ヒト（Ｈｉｓ）６レクチンドメインおよびマウス（Ｈｉｓ）６細胞外ドメインに結合するＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１に融合したマウスＩＦＮａ２の例を図２０に示す）。
【０１９３】
マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体を、多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより解析して、それらが溶液中で単量体であるか、形成された高次オリゴマーであるかを決定した。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを以下のように行った。サイズ排除クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００）によりその流体力学的性質にしたがって、タンパク質（２５ｍＭ酢酸Ｎａ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．５中１ｍｇ／ｍＬの濃度で）を分離した。分離後、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を使用してタンパク質が光を散乱する傾向を測定する。タンパク質が検出器を通過する間に散乱された光の強度を、角度の関数として測定する。屈折率（ＲＩ）検出器を使用して測定したタンパク質濃度とまとめたこの測定値は、適当な方程式を使用したモル質量の計算を可能にする（解析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１２の必須部分）。
【表１１】
2013516967.tif 000037
【０１９４】
リードｄＡｂを、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によっても解析して、見かけの融解温度を測定した。ＤＳＣを以下のように行った。タンパク質を１８０℃／時間の一定速度で加熱し（酢酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５中１ｍｇ／ｍＬで）、熱変性に関連する検出可能な熱変化を測定した。転移中点（ａｐｐＴｍ）を測定し、これをタンパク質の５０％がその自然な高次構造にあり、他の５０％が変性している温度として記載する。ここで、ＤＳＣは、試験したタンパク質の大半が完全には再び折りたたまれていない見かけの転移中点（ａｐｐＴｍ）を決定した。Ｔｍが高いほど、分子はより安定である。使用したソフトウェアパッケージは、ＯｒｉｇｉｎＲ  ｖ７．０３８３であった。
【表１２】
2013516967.tif 000038
【実施例１３】
【０１９５】
生体内でのマウスＡＳＧＰＲ−ｄＡｂ融合タンパク質とマウス肝臓の結合
ＶＨダミー２またはＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１のいずれかと融合したマウスＩＦＮａ２からなる融合タンパク質（実施例１２に記載）を、実施例１１に記載のように１１１Ｉｎ標識した。全ステップの１ｘＰＢＳを２５ｍＭ酢酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に置換することにより、ＮＨＳ：ＤＯＴＡ結合プロトコルをわずかに修正した。
【０１９６】
約１２ＭＢｑの放射標識ＩＦＮ−ｄＡｂ融合体を、イソフルラン麻酔したｂａｌｂ／ｃマウスに尾静脈を通して静脈内注射した後、Ｎａｎｏｓｐｅｃｔ／ＣＴ前臨床生体内画像化システムを使用して７２時間にわたって画像化した。画像の解析は、ＶＨダミー２またはＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１のいずれかと融合した１１１Ｉｎ標識マウスＩＦＮａ２を注射したマウスでは、３時間後に腎臓、膀胱および肝臓でシグナルが観察されることを示した（図２１）。しかしながら、両タイプの融合タンパク質を注射したマウスから集めた画像は、肝臓および腎臓での取り込みの程度が、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスと等しいようにみえることを示している。ＶＨダミー２に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスでもいくらかの肝臓取り込みが観察されるが、シグナルの大部分は腎臓で観察された（図２１）。これらの画像は、ＶＨダミー２に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスに比べて、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスでより高いレベルの肝臓取り込みが観察されることを示しているが、１１１Ｉｎ標識マウスＩＦＮａ２−ｄＡｂ融合体の生体内分布を定量的に決定するために、全身オートラジオグラフィー実験を行った。ｂａｌｂ／ｃマウスに、上記のように約０．５ＭＢｑの放射標識タンパク質を注射した。次いで、注射３時間後にマウスを屠殺した後、器官を取り出し、ガンマカウンターでカウントした。種々の器官で検出されたカウントを、注射した用量のパーセントとして表した。これらの実験の結果は、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスの肝臓のカウントが、ＶＨダミー２に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスの肝臓のカウントに比べて約１．５倍高かったことを示している（図２２）。肝臓対腎臓の取り込みの比率の比較も、２つの投与群の差異を明らかにした。ＶＨダミー２に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスでは、比率は１．２と計算されたが、ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１に融合したマウスＩＦＮａ２を注射したマウスでは、この比率は２．６に増加し、ＡＳＧＰＲレクチンドメイン特異的ｄＡｂ  ＤＯＭ２６ｈ−１９６−６１のＮ末端への融合によるマウスＩＦＮａ２の肝臓取り込みの増加のさらなる証拠となっている。
【図１】
2013516967.tif 000039
【図２】
2013516967.tif 000040
【図３】
2013516967.tif 000041
【図４】
2013516967.tif 000042
【図５】
2013516967.tif 000043
【図６】
2013516967.tif 000044
【図７】
2013516967.tif 000045
【図８】
2013516967.tif 000046
【図９】
2013516967.tif 000047
【図１０】
2013516967.tif 000048
【図１１ａ】
2013516967.tif 000049
【図１１ｂ】
2013516967.tif 000050
【図１１ｃ】
2013516967.tif 000051
【図１２】
2013516967.tif 000052
【図１３−１】
2013516967.tif 000053
【図１３−２】
2013516967.tif 000054
【図１３−３】
2013516967.tif 000055
【図１３−４】
2013516967.tif 000056
【図１３−５】
2013516967.tif 000057
【図１３−６】
2013516967.tif 000058
【図１３−７】
2013516967.tif 000059
【図１３−８】
2013516967.tif 000060
【図１３−９】
2013516967.tif 000061
【図１３−１０】
2013516967.tif 000062
【図１３−１１】
2013516967.tif 000063
【図１３−１２】
2013516967.tif 000064
【図１３−１３】
2013516967.tif 000065
【図１３−１４】
2013516967.tif 000066
【図１３−１５】
2013516967.tif 000067
【図１３−１６】
2013516967.tif 000068
【図１３−１７】
2013516967.tif 000069
【図１３−１８】
2013516967.tif 000070
【図１３−１９】
2013516967.tif 000071
【図１３−２０】
2013516967.tif 000072
【図１３−２１】
2013516967.tif 000073
【図１３−２２】
2013516967.tif 000074
【図１３−２３】
2013516967.tif 000075
【図１３−２４】
2013516967.tif 000076
【図１３−２５】
2013516967.tif 000077
【図１３−２６】
2013516967.tif 000078
【図１３−２７】
2013516967.tif 000079
【図１３−２８】
2013516967.tif 000080
【図１３−２９】
2013516967.tif 000081
【図１３−３０】
2013516967.tif 000082
【図１３−３１】
2013516967.tif 000083
【図１３−３２】
2013516967.tif 000084
【図１４−１】
2013516967.tif 000085
【図１４−２】
2013516967.tif 000086
【図１４−３】
2013516967.tif 000087
【図１４−４】
2013516967.tif 000088
【図１５−１】
2013516967.tif 000089
【図１５−２】
2013516967.tif 000090
【図１５−３】
2013516967.tif 000091
【図１５−４】
2013516967.tif 000092
【図１５−５】
2013516967.tif 000093
【図１５−６】
2013516967.tif 000094
【図１５−７】
2013516967.tif 000095
【図１５−８】
2013516967.tif 000096
【図１５−９】
2013516967.tif 000097
【図１５−１０】
2013516967.tif 000098
【図１５−１１】
2013516967.tif 000099
【図１５−１２】
2013516967.tif 000100
【図１５−１３】
2013516967.tif 000101
【図１５−１４】
2013516967.tif 000102
【図１５−１５】
2013516967.tif 000103
【図１５−１６】
2013516967.tif 000104
【図１５−１７】
2013516967.tif 000105
【図１５−１８】
2013516967.tif 000106
【図１５−１９】
2013516967.tif 000107
【図１５−２０】
2013516967.tif 000108
【図１５−２１】
2013516967.tif 000109
【図１５−２２】
2013516967.tif 000110
【図１５−２３】
2013516967.tif 000111
【図１５−２４】
2013516967.tif 000112
【図１５−２５】
2013516967.tif 000113
【図１５−２６】
2013516967.tif 000114
【図１５−２７】
2013516967.tif 000115
【図１５−２８】
2013516967.tif 000116
【図１５−２９】
2013516967.tif 000117
【図１５−３０】
2013516967.tif 000118
【図１５−３１】
2013516967.tif 000119
【図１５−３２】
2013516967.tif 000120
【図１５−３３】
2013516967.tif 000121
【図１５−３４】
2013516967.tif 000122
【図１５−３５】
2013516967.tif 000123
【図１５−３６】
2013516967.tif 000124
【図１５−３７】
2013516967.tif 000125
【図１５−３８】
2013516967.tif 000126
【図１５−３９】
2013516967.tif 000127
【図１５−４０】
2013516967.tif 000128
【図１５−４１】
2013516967.tif 000129
【図１５−４２】
2013516967.tif 000130
【図１６−１】
2013516967.tif 000131
【図１６−２】
2013516967.tif 000132
【図１６−３】
2013516967.tif 000133
【図１６−４】
2013516967.tif 000134
【図１６−５】
2013516967.tif 000135
【図１７−１】
2013516967.tif 000136
【図１７−２】
2013516967.tif 000137
【図１７−３】
2013516967.tif 000138
【図１７−４】
2013516967.tif 000139
【図１７−５】
2013516967.tif 000140
【図１７−６】
2013516967.tif 000141
【図１７−７】
2013516967.tif 000142
【図１７−８】
2013516967.tif 000143
【図１７−９】
2013516967.tif 000144
【図１７−１０】
2013516967.tif 000145
【図１７−１１】
2013516967.tif 000146
【図１７−１２】
2013516967.tif 000147
【図１７−１３】
2013516967.tif 000148
【図１７−１４】
2013516967.tif 000149
【図１７−１５】
2013516967.tif 000150
【図１７−１６】
2013516967.tif 000151
【図１８−１】
2013516967.tif 000152
【図１８−２】
2013516967.tif 000153
【図１８−３】
2013516967.tif 000154
【図１８−４】
2013516967.tif 000155
【図１８−５】
2013516967.tif 000156
【図１８−６】
2013516967.tif 000157
【図１８−７】
2013516967.tif 000158
【図１８−８】
2013516967.tif 000159
【図１８−９】
2013516967.tif 000160
【図１８−１０】
2013516967.tif 000161
【図１８−１１】
2013516967.tif 000162
【図１８−１２】
2013516967.tif 000163
【図１８−１３】
2013516967.tif 000164
【図１８−１４】
2013516967.tif 000165
【図１９−１】
2013516967.tif 000166
【図１９−２】
2013516967.tif 000167
【図１９−３】
2013516967.tif 000168
【図１９−４】
2013516967.tif 000169
【図１９−５】
2013516967.tif 000170
【図１９−６】
2013516967.tif 000171
【図１９−７】
2013516967.tif 000172
【図１９−８】
2013516967.tif 000173
【図１９−９】
2013516967.tif 000174
【図１９−１０】
2013516967.tif 000175
【図１９−１１】
2013516967.tif 000176
【図１９−１２】
2013516967.tif 000177
【図１９−１３】
2013516967.tif 000178
【図１９−１４】
2013516967.tif 000179
【図１９−１５】
2013516967.tif 000180
【図２０−１】
2013516967.tif 000181
【図２０−２】
2013516967.tif 000182
【図２０−３】
2013516967.tif 000183
【図２０−４】
2013516967.tif 000184
【図２０−５】
2013516967.tif 000185
【図２０−６】
2013516967.tif 000186
【図２０−７】
2013516967.tif 000187
【図２０−８】
2013516967.tif 000188
【図２１】
2013516967.tif 000189
【図２２】
2013516967.tif 000190
【図２３】
2013516967.tif 000191
【図２４】
2013516967.tif 000192
【図２５ａ】
2013516967.tif 000193
【図２５ｂ】
2013516967.tif 000194
【図２６】
2013516967.tif 000195
【図２７】
2013516967.tif 000196
【図２８】
2013516967.tif 000197
【図２９】
2013516967.tif 000198
【図３０】
2013516967.tif 000199
【図３１−１】
2013516967.tif 000200
【図３１−２】
2013516967.tif 000201
【図３１−３】
2013516967.tif 000202
【図３１−４】
2013516967.tif 000203
【図３１−５】
2013516967.tif 000204
【図３１−６】
2013516967.tif 000205
【図３２−１】
2013516967.tif 000206
【図３２−２】
2013516967.tif 000207
【配列表】
2013516967000001.app
【国際調査報告】
2013516967.tif 000208
2013516967.tif 000209
2013516967.tif 000210