(57)【要約】  本発明は、Ｄ因子および抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合性フラグメントの共結晶構造に関する。【選択図】図１
2013509866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列Ｄ因子ポリペプチドまたはその機能性断片またはその保存アミノ酸置換変異体によって形成される結晶体。
【請求項２】
前記天然配列Ｄ因子ポリペプチドがヒトＤ因子またはカニクイザルＤ因子である、請求項１に記載の結晶体。
【請求項３】
前記天然配列Ｄ因子ポリペプチドが配列番号１のヒトＤ因子である、請求項２に記載の結晶体。
【請求項４】
以下の格子サイズ；ａ＝１３２．０４８；ｂ＝１３２．０４８；ｃ＝１８０．２８８；空間群Ｐ４３２１２、結晶定数：２．４Å、およびＲ／Ｒｆｒｅｅ＝２１．２％・２７．２にほぼ等しい単位胞パラメータによって特徴づけられる請求項３に記載の結晶体。
【請求項５】
前記天然配列Ｄ因子ポリペプチドが配列番号２のカニクイザルＤ因子である、請求項２に記載の結晶体。
【請求項６】
以下のａ＝１８２．２０５；ｂ＝８０．６７３；ｃ＝１４２．５７５；空間群Ｃ２、結晶定数：２．１Å；およびＲ／Ｒｆｒｅｅ＝２１．１％／２６．９とほぼ等しい単位胞パラメータによって特徴づけられる、請求項５に記載の結晶体。
【請求項７】
組成物であって、請求項１、請求項４または請求項６に記載の結晶体を含む組成物。
【請求項８】
結晶化可能な組成物であって、抗Ｄ因子抗体または前記抗体の抗原結合性フラグメントと複合体を形成したＤ因子ポリペプチドを含む、結晶化可能な組成物。
【請求項９】
前記抗Ｄ因子抗体がモノクローナル抗体である、請求項８に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１０】
前記フラグメントがＦａｂ断片である、請求項９に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１１】
前記Ｄ因子ポリペプチドが配列番号１のヒトＤ因子である、請求項９に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１２】
別表１Ａに記載される構造座標を有する、請求項１１に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１３】
前記Ｄ因子ポリペプチドが配列番号２のカニクイザルＤ因子である、請求項９に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１４】
別表１Ｂに記載される構造座標を有する、請求項１３に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１５】
前記Ｄ因子ポリペプチドが触媒三残基を含む、請求項８に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１６】
結晶体であって、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合性フラグメントと複合体を形成したＤ因子ポリペプチドを含む結晶体。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の結晶体。
【請求項１８】
前記フラグメントがＦａｂ断片である、請求項１７に記載の結晶体。
【請求項１９】
前記Ｄ因子ポリペプチドが配列番号１のヒトＤ因子である、請求項１７に記載の結晶体。
【請求項２０】
別表１Ａの構造座標を有する、請求項１９に記載の結晶体。
【請求項２１】
前記Ｄ因子ポリペプチドが配列番号２のカニクイザルＤ因子である、請求項１７に記載の結晶体。
【請求項２２】
別表１Ｂの構造座標を有する、請求項２１に記載の結晶体。
【請求項２３】
前記Ｄ因子ポリペプチドが触媒三残基を含む、請求項１６に記載の結晶体。
【請求項２４】
配列番号１の前記ヒトＤ因子ポリペプチド、またはその抗原結合性フラグメントにおいて、アミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３のうちの１つまたは複数が、前記抗Ｄ因子抗体との複合体の形成に関与する、請求項１９に記載の結晶体。
【請求項２５】
配列番号１の前記ヒトＤ因子ポリペプチド、またはその抗原結合性フラグメントにおいて、アミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３のすべてが、前記抗Ｄ因子抗体との複合体の形成に関与する、請求項２４に記載の結晶体。
【請求項２６】
配列番号１の前記ヒトＤ因子ポリペプチド、またはその抗原結合性フラグメントにおいて、アミノ酸残基Ｒ１７２が、前記抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖および軽鎖と水素結合を形成する、請求項１９に記載の結晶体。
【請求項２７】
配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標によって形成される結合部位を含む分子複合体の三次元表示を生成するためのコンピュータであって、前記コンピュータが、（ｉ）機械可読データによってコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、前記データが配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標を含む機械可読データ記憶媒体と、（ｉｉ）前記機械可読データを前記三次元表示に処理するための使用説明書とを含む、コンピュータ。
【請求項２８】
前記構造座標を表示するためのディスプレーをさらに含む、請求項２７に記載のコンピュータ。
【請求項２９】
配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標によって形成される結合部位を含む分子複合体と会合する化学物質の潜在力を評価する方法であって、該方法が（ｉ）前記化学物質と、前記分子複合体の前記結合部位との間のフィッティング操作を実行するための計算方法を用いるステップと；（ｉｉ）前記化学物質と前記結合部位との間の会合を定量化するための前記フィッティング操作の結果を分析するステップとを含む、方法。
【請求項３０】
前記化学物質が、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、またはペプチドもしくは前記抗体もしくは抗体断片の小分子模倣体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントが、前記残基のうちの１つまたは複数と水素結合を形成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体、またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｒ１７２と水素結合を形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求２９から３２に記載の方法のいずれかによって同定可能な化学物質。
【請求項３４】
分子複合体のＸ線回折パターンに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータであって、前記コンピュータが：ａ）機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、前記データが、図６および７または別表１Ａもしくは１Ｂによる構造座標のうちの少なくとも一部を含む機械可読データ記憶媒体と；ｂ）機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、前記データが、前記分子複合体のＸ線回折パターンを含む機械可読データ記憶媒体と；ｃ）前記ａ）およびｂ）の前記機械可読データを処理するための使用説明書を保存するための作業メモリと；ｄ）（ａ）の機械可読データのＦｏｕｒｉｅｒ変換を行うため、および（ｂ）の前記機械可読データを構造座標に処理するために、前記作業メモリと、ａ）およびｂ）の前記機械可読データとに連結された中央演算処理装置と；ｅ）前記分子複合体の前記構造座標を表示するための前記中央演算処理装置に連結されたディスプレーとを含む、コンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ因子および抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合性フラグメントの共結晶構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ因子は、補体第二経路の活性化の律速酵素である非常に特異的なキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。Ｄ因子の基質は、別の第二経路セリンプロテアーゼ、すなわちＢ因子である。Ｄ因子による切断に続いて、Ｂ因子はタンパク分解活性を有するＢｂ因子に転換して、補体第二経路を開始する。補体第二経路の活性化の増大は、ドルーゼンに見られる。ドルーゼンは、Ｂｒｕｃｈ膜上に存在する細胞傷害性補体を含有する沈殿物であり、該沈澱物は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の発症に関連している。ＡＭＤにおいて第二補体活性化経路の役割は、遺伝分析によってさらに裏付けられており、第二補体経路活性化の負の制御因子であるＨ因子における変異体がＡＭＤを発症する危険性の増加と強く相関していることを示している。
【０００３】
抗Ｄ因子抗体は、２００８年５月２２日に公開された米国特許出願公開第２００８０１１８５０６号、２００９年７月１６日に公開された同第２００９０１８１０１７号、２００９年１０月２９日に公開された同第２００９０２６９３３８号に開示されている。抗Ｄ因子抗体は、過剰な補体活性または制御されない補体活性に関連する疾患および障害の防止と処置に有用性を見出されており、かつ疾患の診断、予防および処置に有用である。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、抗Ｄ因子抗体断片と複合体を形成したヒトおよびカニクイザルのＤ因子の結晶構造を提示する。本発明はまた、抗Ｄ因子抗体Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖と相互作用するヒトおよびカニクザルのＤ因子上の残基についての情報を提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は天然配列Ｄ因子ポリペプチドまたはその機能的断片またはその保存的アミノ酸置換変異体によって形成された結晶体に関する。
【０００６】
一実施形態では、該天然配列Ｄ因子ポリペプチドは、ヒトまたはカニクイザルのＤ因子である。
【０００７】
別の実施形態では、該天然配列Ｄ因子ポリペプチドは、配列番号１のヒトＤ因子である。
【０００８】
さらに別の実施形態では、該ヒトＤ因子の結晶体は、以下とほぼ等しい単位胞パラメータによって特徴づけられる：格子寸法ａ＝１３２．０４８；ｂ＝１３２．０４８；ｃ＝１８０．２８８；;空間群  Ｐ４３２１２、結晶定数：２．４Å、およびＲ／Ｒｆｒｅｅ＝２１．２％／２７．２。
【０００９】
さらなる一実施形態では、該天然配列Ｄ因子ポリペプチドは、配列番号２のカニクイザルＤ因子である。
【００１０】
さらにさらなる一実施形態では、該カニクザルＤ因子の結晶体は、以下とほぼ等しい単位胞によって特徴づけられる：ａ＝１８２．２０５；ｂ＝８０．６７３；ｃ＝１４２．５７５、空間群Ｃ２、水晶定数：２．１Å、およびＲ／Ｒｆｒｅｅ＝２１．１％／２６．９。
【００１１】
別の態様では、本発明は別表１Ａおよび１Ｂに示す構造座標を有するＤ因子結晶体に関する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は前述の結晶体のいずれかを含む組成物に関する。
【００１３】
異なる一態様では、本発明は、抗Ｄ因子抗体または前述の抗体の抗原結合性フラグメントと複合体を形成したＤ因子ポリペプチドを含む結晶化可能な組成物に関する。
【００１４】
一実施形態では、該結晶化可能な組成物において該抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１５】
別の実施形態では、該フラグメントはＦａｂ断片である。
【００１６】
さらに別の実施形態では、該結晶化可能な組成物において該Ｄ因子ポリペプチドは、配列番号１のヒトＤ因子である。
【００１７】
さらなる一実施形態では、該結晶化可能な組成物において該Ｄ因子ポリペプチドは、配列番号２のカニクイザルＤ因子である。
【００１８】
さらにさらなる一実施形態では、該Ｄ因子ポリペプチドは、触媒三残基を含む。
【００１９】
さらなる一態様では、本発明は、抗Ｄ因子ポリペプチド抗体またはその抗原結合性フラグメントと複合体を形成したＤ因子ポリペプチドを含む結晶体に関する。
【００２０】
一実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００２１】
別の実施形態では、該フラグメントはＦａｂ断片である。
【００２２】
さらに別の実施形態では、該Ｄ因子ポリペプチドは配列番号１のヒトＤ因子である。
【００２３】
さらなる一実施形態では、該Ｄ因子ポリペプチドは配列番号２のカニクザルＤ因子である。
【００２４】
さらにさらなる一実施形態では、該Ｄ因子ポリペプチドは、触媒三残基を含む。
【００２５】
別の実施形態では、配列番号１のヒトＤ因子ポリペプチドまたはその抗原結合性フラグメントにおいで、アミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３のうちの１つまたは複数は、抗Ｄ因子抗体との複合体形成に関与する。
【００２６】
さらに別の実施形態では、配列番号１のヒトＤ因子ポリペプチドまたはその抗原結合性フラグメントにおいで、アミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３のすべては、抗Ｄ因子抗体との複合体形成に関与する。
【００２７】
異なる一実施形態では、配列番号１のヒトＤ因子ポリペプチドまたはその抗原結合性フラグメントにおいで、アミノ酸残基Ｒ１７２は、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖および軽鎖と水素結合を形成する。
【００２８】
異なる一態様では、本発明は、配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標によって形成される結合部位を含む分子複合体の三次元表示を生成するためのコンピュータに関し、該コンピュータが、（ｉ）機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、該データが配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標を含む機械可読記憶媒体と、（ｉｉ）機械可読データを前述の三次元表示に処理するための使用説明書とを含む。
【００２９】
一実施形態では、該コンピュータは、前述の構造座標を表示するためのディスプレーをさらに含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標によって形成される結合部位を含む分子複合体と会合するための化学物質の潜在力を評価するための方法に関し、該方法は、（ｉ）該化学物質と該分子複合体のそのような結合部位との間のフィッティング操作を実行するための計算方法を用いるステップと、（ｉｉ）該化学物質と前述の結合部位との間の会合を定量化するためのフィッティング操作の結果を分析するステップとを含む。
【００３１】
一実施形態では、該化学物質は、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または該抗体もしくは抗体断片のペプチド模倣体もしくは小分子模倣体である。
【００３２】
別の実施形態では、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、記載された残基のうちの１つまたは複数と水素結合を形成する。
【００３３】
さらに別の実施形態では、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１のヒドＤ因子のアミノ酸残基Ｒ１７２と水素結合を形成する。
【００３４】
さらなる一態様では、本発明は、請求の範囲に記載されている方法によって同定可能なまたは同定される抗体、抗体断片、ペプチド模倣体および小分子模倣体などの化学物質に関する。
【００３５】
さらにさらなる一態様では、本発明は、分子複合体のＸ線回折パターンに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータに関し、該コンピュータが、ａ）機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、前述のデータが、図６および７または別表１Ａまたは１Ｂによる構造座標の少なくとも一部を含む機械可読データ記憶媒体；ｂ）機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、前述のデータが、前述の分子複合体のＸ線回折パターンを含む機械可読データ記憶媒体；ｃ）前述のａ）およびｂ）の機械可読データを処理するための使用説明書を保存するための作業メモリ；ｄ）（ａ）の機械可読データのフーリエ変換を行うためおよび（ｂ）の前述の機械可読データを構造座標に処理するために、前述の作業メモリと、ａ）およびｂ）の前述の機械可読データとに連結された中央演算処理装置；およびｅ）前述の分子複合体の前述の構造座標を表示するために、前述の中央演算処理装置に連結されたディスプレーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】抗Ｄ因子Ｆａｂ断片（橙色：重鎖、黄色：軽鎖）との複合体におけるヒトおよびカニクザルのＤ因子（両方とも緑色で示す）の結晶構造を示す。
【図２】抗Ｄ因子抗体Ｆａｂ断片（橙色：重鎖、黄色：軽鎖）との複合体におけるヒトおよびカニクザルのＤ因子（両方とも緑色で示す）の結晶構造を示す。重ね合わせは、Ｄ因子（各非対称ユニットからの２つのそれぞれの分子）に基づく。これは、２つのカニクイザル複合体が互いにどの程度類似しているか、および２つのヒト複合体が互いにどの程度類似しているかを図示す。
【図３】４つのＤ因子：Ｆａｂ複合体（２×カニクイザル複合体（青色）および２×ヒト複合体（緑色））のすべての重ね合わせを示す。すべての構造は、１つの領域を除いて極めて類似している。右図内の円は、カニクザルおよびヒトのＤ因子構造がわずかに分岐したことを示す。
【図４】（ａ）４つのＤ因子：Ｆａｂ複合体（２×カニクイザル複合体（青色）および２×ヒト複合体（緑色））のすべての重ね合わせを示す。すべての構造の結合面は、同一である。活性部位の一部（右図内の円）を形成するヒスチジンは、高次構造（ヒト基準、カニクイザル不活性）が異なる。
【図５】抗Ｄ因子抗体分子上の残基と相互作用するＤ因子（ヒト）上の残基を簡潔に収載する。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、抗Ｄ因子Ｆａｂの軽鎖および重鎖と相互作用するＤ因子上の残基を示す。赤で示したのは、Ｆａｂ重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖状の残基であり、ヒトＤ因子上で主要残基ＡＲＧ−１７２と複数の水素結合を形成する。３つのアスタリスク（「＊＊＊」）は、ＯＨが水素結合を形成することを示す。  これらの図は、Ｆａｂ（軽鎖および重鎖に対してＬ鎖およびＨ鎖として標識した）のいずれの原子に対して４．５Åより近いＤ因子の各原子（Ａ鎖として標識した）の距離を示す。たとえば：  Ａｓｐ  １３１Ａ  ＯＤ２    ．．．ＴＹＲ  ５４Ｈ  ＣＥ１．．．３．３４                              ．．．ＴＹＲ  ５４Ｈ  ＣＺ  ．．．３．４９                              ．．．ＴＹＲ  ５４Ｈ  ＯＨ  ．．．２．７８＊＊＊  Ｄ因子中のＡｓｐ１３１のＯＤ２原子は、Ｆａｂ断片の３つの原子に近いことを意味する。これらの３つの原子は、重鎖におけるＴｙｒ５４のＣＥ１原子（距離３．３４）、Ｔｒｙ５４のＣＺ原子、およびＤ因子のＡｓｐ１３１が水素結合を形成するチロシンのヒドロキシル基である。
【図７Ａ】ヒトＤ因子上の主要残基ＡＲＧ−１７２は、抗体の重鎖および軽鎖の残基と６つ以上の水素結合を潜在的に形成することができる。
【図７Ｂ】触媒三残基から離れた抗Ｄ因子Ｆａｂ結合を示す。
【図８】ヒトＤ因子のアミノ酸およびヌクレオチドの配列（配列番号１および３）を示す。
【図９】カニクイザルＤ因子のアミノ酸およびヌクレオチドの配列（配列番号２および４）を示す。
【図１０】各ヒト化抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０、および＃４１６の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号５、６、７、および８）。
【図１１】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２８３の軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の軽鎖をコードする。図１１において第１のアミノ酸（配列番号１０）に対応するコドンは、ボールドのイタリック体で示す。
【図１２】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。該アミノ酸配列には、図１１に示す配列番号９によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列は、ボールドのイタリック体で示す。可変領域は下線を引いてない領域であり、第１の定常領域ＣＬ１は下線で示す。フレームワーク（ＲＦ）領域およびＨＶＲ領域を示す。
【図１３】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の重鎖のヌクレオチド配列を表す（配列番号１８）。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の重鎖をコードする。図１４において第１のアミノ酸（配列番号１９）に対応するコドンをボールドのイタリック体で示す。
【図１４】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。該アミノ酸配列には、図１３に示す配列番号１８によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列はボールドのイタリック体で示す。可変領域は下線を引いてない領域であり、第１の定常領域ＣＨ１は下線で示す。フレームワーク（ＦＲ）領域およびＨＶＲ領域を示す。
【図１５】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の軽鎖をコードする。図１６の第１のアミノ酸（配列番号２９）に対応するコドンは、ボールドのイタリック体で示す。
【図１６】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。該アミノ酸配列には、図１５に示す配列番号２８によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列は、ボールドのイタリック体で示す。可変領域は下線を引いてない領域であり、第１の定常領域ＣＬ１は下線で示す。フレームワーク（ＦＲ）領域およびＨＶＲ領域を示す。
【図１７】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の重鎖のヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の重鎖をコードする。図１８において第１のアミノ酸（配列番号３１）に対応するコドンはボールドのイタリック体で示す。
【図１８】ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。該アミノ酸配列には、図１８に示す配列番号３０によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＲＶ配列は、ボールドのイタリック体で示す。可変領域は下線を引いてない領域であり、第１の定常領域ＣＨ１は下線で示す。フレームワーク（ＲＦ）領域およびＨＶＲ領域を示す。
【図１９】抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−２の軽鎖のアミノ酸配列を示す(配列)番号４０）。
【図２０】抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−２の重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号４１）。
【図２１】Ｂ因子切断は、抗Ｄ因子抗体によってブロックされるが、８Ｅ２（液相アッセイ）によってはブロックされない。
【図２２】Ｄ因子（Ｓ２０８Ａ）は、７７２ｎＭの親和性を有するＣ３ｂＢプロコンバターゼに結合する（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）。
【図２３】Ｄ因子（Ｓ２０８Ａ）は、７７２ｎＭの親和性を有するＣ３ｂＢプロコンバターゼに結合する（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）。
【図２４】抗Ｄ因子抗体はＤ因子結合をブロックする。
【図２５】抗Ｄ因子抗体はＤ因子結合をブロックする。
【図２６】抗Ｄ因子抗体は触媒的切断に影響を及ぼさない。
【図２７】抗Ｄ因子抗体は触媒的切断に影響を及ぼさない。
【図２８】抗Ｄ因子抗体がＢ因子活性化をいかに抑制するかを表す仮説モデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．定義
用語「Ｄ因子」および「補体Ｄ因子」とは、互換的に使用することが可能であり、天然配列および変異体Ｄ因子のポリペプチドを指す。
【００３８】
「天然配列」Ｄ因子は、その調製様式に関係なく、天然由来のＤ因子ポリペプチドとして同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このように、天然配列Ｄ因子は、天然から単離されることができるか、または組換え方法および／または合成方法によって生成されるこができる。配列番号１のヒトＤ因子タンパク質、または該列番号２のカニクイザルＤ因子タンパク質などの成熟したＤ因子タンパク質に加えて、用語「天然配列Ｄ因子」とは、具体的に、天然に存在するＤ因子の前躯体の形（たとえば、タンパク質分解性切断されて活性型を生成する不活性タンパク質前躯体）、天然に存在する変異体の形（たとえば、代替スプライス型）およびＤ因子の天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに天然由来のＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するＤ因子分子の構造上の高次構造変異体を包含する。高等霊長類および非ヒト哺乳類を含む非ヒト動物のＤ因子ポリペプチドは、具体的には、本定義の範囲内で、配列番号２のカニクイザルＤ因子ポリペプチドを含むがこれに限定されるものではない。
【００３９】
「Ｄ因子変異体」または「補体Ｄ因子変異体」とは、配列番号１の天然配列ヒトＤ因子ポリペプチド、または配列番号２の天然配列カニクイザルＤ因子ポリペプチドなどの天然配列Ｄ因子ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、以下に定義した活性Ｄ因子ポリペプチドを意味する。通常、Ｄ因子変異体は、配列番号１の成熟ヒトアミノ酸配列または配列番号２の成熟カニクイザルＤ因子ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、もしくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、もしくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、もしくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、もしくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、もしくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。好ましくは、最高度の配列同一性は、Ｄ因子の活性部位内に生じる。
【００４０】
Ｄ因子の「活性部位」は、ヒトＤ因子配列においてＨｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２、およびＳｅｒ−１９５（キモトリプシノーゲン番号付け）で定義される。Ｄ因子は、第一特異性ポケットの底にＡｓｐ１８９（キモトリプシン番号付け）を有し、Ａｒｇペプチド結合を切断する。触媒三残基は、Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２およびＳｅｒ−１９５からなる。Ａｓｐ−１０２およびＨｉｓ−５７は、他のセリンプロテアーゼと比較すると、非定型の高次構造を示す（Ｎａｒａｙａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（１９９４）、６９５−７０８）。ユニークなｓａｌ架橋は、Ｓ１ポケットの底でＡｓｐ１８９とＡｒｇ２１８との間で観察される。該架橋はループ２１４〜２１８を上昇させて、深くて狭いＳ１ポケットを生成した（Ｊｉｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２（１９９８）１０６１−１０８１）。活性部位の周りのこのループおよび他のいくつかの残基は、変異解析によってＤ因子エステル分解活性の主要な構造決定因子であることが示された（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）２４３９９−２４４０５）。これらの結果に基づいて、Ｄ因子はＣ３ｂ結合Ｂ因子と結合すると、高次構造変化を受けて、タンパク質分解活性の発現をもたらし得ることが提唱された（ＶｏｌａｎａｋｉｓおよびＮａｒａｙａｎａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５（１９９６）５５３−５６４）。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「溶媒露出位置」とは、ソース抗体または抗原結合性フラグメントの重鎖および軽鎖の可変領域内のアミノ酸残基の位置を指し、構造、構造のアンサンブルおよび／または抗体もしくは抗原結合性フラグメントのモデル構造に基づいて、溶媒接近および／または抗体特異的抗原などの分子との接触に潜在的に利用できるように決定される。これらの位置は、典型的には、ＣＤＲ内およびタンパク質の外部上に見出せる。本明細書で定義される抗体または抗原結合性フラグメントの溶媒露出位置は、当技術分野で知られているいくつかのアルゴリズムのいずれかを使用して決定されることができる。好ましくは、溶媒露出位置は、抗体の三次元モデルからの座標を用いて、好ましくは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのコンピュータプログラムを使用して決定される。溶媒露出位置はまた、当技術分野で知られているアルゴリズム（たとえば、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５、３７９、ならびにＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６、５４８）を使用して決定されることもできる。溶媒露出位置の決定は、タンパク質モデリングおよび抗体から得られる三次元構造情報に適したソフトウェアを使用して行われることができる。これらの目的のために利用されることができるソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。通常、および好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がユーザ入力サイズパラメータを必要とする場合、計算で使用されるプローブの「サイズ」は、半径約１．４オングストロームまたはそれ未満に設定される。加えて、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用する溶媒露出領域および面積の決定方法は、Ｐａｃｉｏｓ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６に記述されている。
【００４２】
用語「結合ポケット」とは、分子または分子複合体の領域を指し、その形状の結果、別の化学物質と有利に会合する。用語「ポケット」とは、間隙、チャネルまたは部位を含むが、これらに限定されるものではない。結合ポケットの形状は、化学物質の結合の前に、概して予備形成され得、それに化学物質が結合することで同時に形成され得るか、または別の化学物質のそれへの、分子の異なる結合ポケットとの結合によって形成され得る。それによって次に結合ポケットの形状に変化が引き起こされる。
【００４３】
用語「三次元構造を生成する」または「三次元表示を生成する」とは、構造座標のリストを三次元空間での構造モデルまたはグラフ表現に変換することを指す。これは、市販されている、または公開され利用できるソフトウェアによって達成されることができる。分子または分子複合体の三次元構造のモデルは、このように、構造座標を与えられ、かつ校正ソフトウェアを含むコンピュータによって、コンピュータ画面上に構築されることができる。三次元構造を表示して、または用いて、コンピュータモデリングまたはフィッティングの操作を実行し得る。加えて、表示モデルを用いずに、構造座標それ自体を用いて、コンピュータベースのモデリングおよびフィッティングの操作を実行し得る。
【００４４】
用語「結晶化溶液」とは、緩衝液、１つまたは複数の塩類、沈殿剤、１つまたは複数の界面活性剤、糖または有機化合物、ランタニドイオン、ポリイオン化合物および／または安定剤を含む、少なくとも１つの薬剤を含んでいる結晶化を促進する溶液を指す。
【００４５】
「パーセント（%）アミノ酸配列同一性」とは、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させて、必要に応じて、ギャップを先導した後に、参照Ｄ因子配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での配列比較は、当技術分野での技術の範囲内であり、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開され、利用できるコンピュータソフトウェアを使用することによって種々の方法で達成されることができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたり最大配列比較を達成するために必要とされるいずれのアルゴリズムを含む、配列比較を測定するための適切なパラメータを決定することができる。次いで、配列同一性は、より長い配列と比べて算出される、すなわち短い配列が長い配列の一部と１００％配列同一性を示す場合でも、全体の配列同一性は１００％未満となる。
【００４６】
「パーセント（%）核酸配列同一性」とは、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要に応じて、ギャップを導入した後に参照Ｄ因子をコードする配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的での配列比較は、当分野での技術の範囲内であり、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開され、利用できるコンピュータソフトウェアを使用することによって種々の方法で達成されることができる。当業者は、比較される完全長の配列にわたり最大配列比較を達成するために必要とされるいずれのアルゴリズムを含む、配列比較を測定するための適切なパラメータを決定することができる。次いで、長い配列と比べて配列同一性が算定される、すなわち短い配列が長い配列の一部と１００％配列同一性を示す場合でも、全体の配列同一性は１００％未満になる。
【００４７】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源中で通常会合された少なくとも１種の混入物核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。単離核酸分子は、天然で見られる形または配列以外のものある。したがって、単離核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子と区別される。しかしながら、単離核酸分子は、通常、コードされたポリペプチドを発現する細胞中に含まれる核酸分子を含み、たとえば、該核酸分子は、天然の細胞のものとは異なる染色体位にある。
【００４８】
「単離された」Ｄ因子ポリペプチドコード核酸分子は、Ｄ因子コード核酸の天然供給源中で通常会合される少なくとも１種の混入物核酸分子から同定され、分離される核酸分子である。単離Ｄ因子ポリペプチドコード核酸分子は、天然で見られる形または配列以外のものである。したがって、単離Ｄ因子ポリペプチドコード核酸分子は、天然の細胞中に存在するコード核酸分子（単数または複数の）と区別される。しかしながら、単離Ｄ因子コード核酸分子は、通常、Ｄ因子を発現する細胞中に含まれるＤ因子コード核酸分子を含み、たとえば、該核酸分子は、天然の細胞のものとは異なる染色体位にある。 
【００４９】
用語「アンタゴニスト」とは、最も広範な意味で用いられ、かつＤ因子生物活性を中和する、ブロックする、部分的または完全に阻害する、抑制する、減少させる、または妨害することができるいずれの分子を含む。Ｄ因子アンタゴニストとしては、これらに限定されることはないが、Ｄ因子に結合して、補体関連の眼の状態の症状に関与するＤ因子の能力などのＤ因子活性を中和する、ブロックする、部分的または完全に阻害する、抑制する、減少させる、または妨害することができる、抗Ｄ因子抗体およびその抗原結合性フラグメント、他の結合ポリペプチド、ペプチド、ならびに非ペプチド小分子が挙げられる。
【００５０】
「小分子」は、本明細書では約６００以下、好ましくは約１０００ダルトン以下の分子量を有すると定義される。
【００５１】
本発明のＤ因子アンタゴニストと関連して「活性の」または「活性」または「生物活性」とは、Ｄ因子の生物活性を拮抗する（部分的または完全に阻害する）能力である。Ｄ因子アンタゴニストの好ましい生物活性は、たとえば補体関連の眼の状態などのＤ因子関連疾患のたとえば症状の状態において測定可能な改善を達成する能力である。活性は、関連した動物モデル、またはヒト臨床試験を使用して、結合アッセイを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの試験において、決定されることができる。
【００５２】
用語「補体関連の眼の状態」とは、最も広範な意味で用いられ、すべての眼の状態、古典経路および第二経路を含む補体、特に補体第二経路に関連する症状を含む。補体関連の眼の状態としては、これらに限定されるものではないが、乾性型および湿性型（非滲出性および滲出性）を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のすべての段階の黄斑変性症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性および他の虚血に関係する網膜症、並びにたとえば糖尿病黄斑浮腫、病的近視、ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ症、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生などの他の眼球内血管新生病が挙げられる。補体関連の眼の状態の好ましい群としては、滲出性（湿性）および非滲出性（乾性または萎縮性）ＡＭＤを含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎が挙げられる。
【００５３】
「処置」は、発症を防止する、または障害の症状を変化させる意図で行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置および予防的処置または防止的処置の両方を指す。処置が必要なものとしては、すでに障害を有しているもの、ならびに障害が防止されることになるものが含まれる。免疫関連疾患の処置において、治療薬は免疫応答の成分の応答の大きさを直接変え得る、または他の治療薬、たとえば抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬などによって、疾患を処置に対してさらに感受性にし得る。
【００５４】
補体関連の眼の状態などの疾患の「症状」は、患者の健康を損なうすべての現象を含む。これには、異常なまたは制御不能の細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）増殖、抗体産生、自己抗体産生、補体産生、隣接する細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、任意の炎症応答または免疫学的応答の抑制または増悪、細胞空間などへの炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の浸潤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本明細書で用いる場合、用語「哺乳類」とは、哺乳動物として分類されるいずれの動物を指し、ヒト、高等霊長類、家畜動物、および動物園の動物、運動競技用動物、またはペット動物、たとえば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびフェレットなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００５６】
１つまたは複数のさらなる治療薬と「組み合わせ」での投与は、同時（併用）投与および任意の順序での連続投与を含む。
【００５７】
「治療有効量」は、状態、例えば、標的疾患の病状または症状（たとえば、補体関連の眼の状態）の測定可能な改善を達成するために必要な、「Ｄ因子アンタゴニスト」の量である。
【００５８】
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物中で作用可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。たとえば、原核生物に適している制御配列には、プロモーター、随意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグンル、およびエンハンサーを利用することが、知られている。
【００５９】
核酸は別の核酸配列との機能的関係に配置されるとき、該核酸は「作用可能に連結される」。たとえば、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドのＤＮＡと作用可能に連結される；それが配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作用可能に連結される；またはそれが翻訳を促進するために配置される場合、リボソーム結合部位はコード配列に作用可能に連結される。通常、「作用可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、および分泌リーダーの場合、隣接してリーディング相内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位でライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーが従来の実施方法で用いられる。
【００６０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者が容易に決定することができ、通常、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に応じて経験的に計算される。一般的には、より長いプローブには、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、より短いプローブはより低い温度を必要とする。通常、ハイブリダイゼーションは、相補鎖がそれらの融点より低い環境で存在するとき、変性ＤＮＡの再アニーリングする能力を利用する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用できる相対的な温度は高くなる。結果として、相対温度が高ければ高いほど反応条件はよりストリンジェントになる傾向があるが、温度が低ければ低いほど、そのような傾向は小さくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｔら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照されたい。
【００６１】
本明細書で定義する場合、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシーの条件」は、以下のように認識され得る：（１）たとえば、５０℃での０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと、洗浄に低イオン強度および高温とを用いる；（２）たとえば４２℃での５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドに０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５リン酸ナトリウム緩衝液、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと、ホルムアミドなどの変性剤とをハイブリダイゼーションの間に用いる；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン溶液を４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリム／ク塩酸ナトリウム）中４２℃での洗浄と、５０％のホルムアミドで５５℃での洗浄に続いて、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いる。
【００６２】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記述されるように同定され、かつ上述の条件を下回る洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（たとえば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含み得る。中程度にストリンジェントな条件の一例は、３７℃で、以下を含む溶液中での一晩のインキュベーションである：２０%のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性、剪断したサーモン精子ＤＮＡ。続いて該フィルターを約３７〜５０℃で１×ＳＳＣで洗浄する。当業者は、プローブ長などのような諸要因に適応するために必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を認識するであろう。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「エピトータグ付き」とは、「タグポリペプチド」に融合された本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、それに対して抗体が作られることができるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、融合されるポリペプチドの活性を妨げないように十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に少なくとも６個のアミノ酸残基、通常約８個から５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０個から２０個の間のアミノ酸残基）を有する。
【００６４】
用語「抗体」とは、最も広範な意味で使用され、具体的には、単一の抗Ｄ因子モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗Ｄ因子抗体組成物を網羅するが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、その集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する変異体の可能性を除いて同一である）から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対して作られる。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対して作られる様々な抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作られる。修飾語句「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、かついずれか特定の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈されないものとする。たとえば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、最初に、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって記述されたハイブリドーマ方法で作製されてもよく、または組換えＤＮＡ方法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）で作製されてもよい。また、「モノクローナル抗体」は、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記述される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００６６】
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、その重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中で対応する配列と同一または相同であるが、それらの鎖の残りの部分は、別の種に由来するまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片中で対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が、所望の生物活性を示す限り含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００６７】
非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」形状は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基と置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基と置き換えられる。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内で、またはドナー抗体内で見られない残基を含むこともある。これらの修飾は、さらに抗体の能力を洗練するよう行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的には含む。可変ドメインの高頻度可変ループのすべてまたは実質的にはすべては、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、およびＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を随意に含むことになる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照されたい。
【００６８】
「種依存性抗体」は、第１の哺乳類種由来の抗原に対して、第２の哺乳類種由来のその抗原の相同体に対して有するよりもより強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に対して「特異的に結合する」（すなわち、わずか約１×１０−７Ｍ、好ましくはわずか約１×１０−８Ｍおよび最も好ましくはわずか約１×１０−９Ｍの結合親和値（Ｋｄ）を有する）が、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い、第２の非ヒト哺乳類種に由来する抗原の相同体に対して結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義された種々の種類の抗体のいずれでもあり得るが、好ましくはヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「抗体突然変異体」または「抗体変異体」とは、種依存性抗体の１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾されている種依存性抗体のアミノ酸配列の変異体を指す。そのような突然変異体は、必然的に１００％未満の種依存性抗体との配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態では、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書では、最大パーセント配列同一性を得るために、候補配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、アミノ酸残基が、種依存性抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）であるか、または類似（すなわち、共通の側鎖特徴に基づく同じ基由来のアミノ酸残基、以下を参照されたい）している、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義する。可変ドメインの外側の抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列同一性または類似性に影響を及ぼすものとして解釈されないものとする。
【００７０】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その自然環境の混入物成分は、抗体の診断用途または治療用途を妨げる物質であって、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施例では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって決定された抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを用いることにより、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー、または好ましくは銀染色を用いる、還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離抗体には、該抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップで調製される。
【００７１】
本明細書で用いる場合、「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のアミノ酸配列と、フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される方法によれば、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，１９８７および１９９１））によって定義され得る。抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸番号付けも、Ｋａｂａｔの番号付けによる。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とは、抗原結合に必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として同定された３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義された「相補性決定領域」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変領域において約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域において約３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）の残基；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．（１９９１））および／または「高頻度可変ループ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変領域において約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域において約２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）の残基；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含み得る。場合によっては、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔおよび高頻度可変ループによって定義される両方のＣＤＲ領域由来のアミノ酸を含むことができる。たとえば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、２６〜３５のアミノ酸を含む。
【００７３】
「フレームワーク領域」（以下ＦＲという）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定された４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）の残基に位置し、ならびに重鎖ＦＲ残基は重鎖残基内の約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）の残基に位置する。ＣＤＲが高頻度可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖内の約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）の残基に位置し、ならびに重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基内の約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）の残基に位置する、場合によっては、ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲと高頻度可変ループのそれらの両方に由来するアミノ酸を含むとき、ＦＲ残基はそれに応じて調整される。たとえば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は１〜２５位にあり、およびＦＲ２残基は３６〜４９位にある。
【００７４】
本明細書で用いる場合、「コドンセット」は、所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、たとえば、固相合成によって合成されることができ、コドンセットによって示されるヌクレオチドトリプレットの可能なすべての組み合わせを表し、およびアミノ酸の所望の基をコードする配列を含む。コドン命名の標準形は、ＩＵＢコードのそれであり、当技術分野で知られおり、本明細書に記述される。コドンセットは、典型的には、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどイタリック体の３つの大文字で表される。このように本明細書で用いる場合、「非ランダムのコドンセット」とは、本明細書に記述するアミノ酸選択の判定基準を部分的に、好ましくは完全に満たす、選ばれたアミノ酸をコードするコドンセットを指す。特定の位置で選択されたヌクレオチドの「縮重」によるオリゴヌクレオチドの合成は、その分野で周知であり、たとえば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６；ＧａｒｒａｒｄおよびＨｅｎｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８：１０３）がある。特定のコドンセットを有するオリゴヌクレオチドのそのようなセットは、市販の核酸シンセサイザーを使用して合成されることができる（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）、または市販品を入手することができる（たとえばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成された一組のオリゴヌクレオチドは、典型的には異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、差異は全配列内のコドンセットによって確立される。本発明によって用いられるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にし、必要に応じて、たとえば、クローニングの目的に有用な制限酵素部位を含むことができる。
【００７５】
用語「抗体断片」とは、本明細書では最も広範な意味で用いられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、二重特異性抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
「Ｆｖ」断片は、完全抗原認識と結合部位とを含む抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが密接に結合した二量体からなり、たとえばｓｃＦｖでは実際には共有結合であり得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲまたはそのサブセットは、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または１つの抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、通常は全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７７】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインと定常ドメインおよび重鎖の可変ドメインと第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、通常、それらのカルボキシ末端近くでそれらの間をヒンジシステインによって共有結合される一対のＦａｂ断片を含む。抗体断片の他の化学的結合も、当技術分野で知られている。
【００７８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」の抗体断片は、抗体のＶHおよびＶＬのドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在している。通常、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓｃＦＶが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする。ｓｃＦＶの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））を参照されたい。
【００７９】
用語「二重特異性抗体」とは、２つの抗原結合部位を有する抗体小断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上で２つのドメインの間に対を形成させには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を形成せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を生成する。たとえば、二重特異性抗体は、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８において十分に記述されている。
【００８０】
「線状抗体」の表現は、Ｚａｐａｔａら（１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）に記述される抗体を指す。簡単に言うと、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデム型Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【００８１】
本明細書で用いる場合、「ライブラリー」は、複数の抗体もしくは抗体断片の配列（たとえば本発明のポリペプチド）、またはこれらの配列をコードする核酸を指し、該配列は本発明の方法によってこれらの配列に導入される変異体アミノ酸の組み合わせにおいて異なっている。
【００８２】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドを、ファージ表面（たとえば、繊維状ファージ、すなわち粒子）のコートタンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質として表示する手法である。ファージディスプレイの有用性は、ランダムタンパク質変異体の大きいライブラリーから、高親和性で標的抗原と結合する配列を迅速かつ効率的に選別することができることにある。ファージ上でのペプチドおよびタンパク質ライブラリーの表示は、特定の結合特性を有するものを数百万のポリペプチドからスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかとの融合体を介して、小さいランダムペプチドおよび小さいタンパク質を表示させるために、使用されてきた。ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：３５５−３６２およびそその引用文献。一価ファージディスプレイにおいて、タンパク質またはペプチドライブラリーは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の１コピーを表示するか、または何も表示しないように、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。多価ファージに比べて結合活性効果が低下しているので、選別は内因性リガンドの親和性に基づいており、かつファージミドベクターが使われる。このためＤＮＡ操作が単純化される。ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３：２０５−０２１６。
【００８３】
「ファージミド」とは、細菌の複製起点（たとえばＣｏ１Ｅ１）、およびバクテリオファージの遺伝子間領域の１コピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、線状のバクテリオファージおよびラムダ形バクテリオファージを含む既知のいずれかのバクテリオファージ上で使われ得る。また、プラスミドは通常、抗生物質耐性の選択マーカーを含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを保持する細胞がファージ粒子の産生のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製の様式は、プラスミドＤＮＡの１本鎖のコピーおよびファージ粒子のパッケージを生成するローリングサークル型複製に変化する。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成し得る。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面に提示されるように、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子に連結したファージコートタンパク質遺伝子またはその断片を含むファージミドが含まれる。
【００８４】
用語「ファージベクター」とは、異種伝子を含みかつ複製ができるバクテリオファージ２本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製起点を有し、ファージ複製およびファージ粒子形成が可能である。ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３のファージもしくはその誘導体などの繊維状バクテリオファージ、またはλ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など、もしくはその誘導体などのラムダ形ファージである。
【００８５】
用語「ペプチド模倣物」および「ペプチド模倣体」とは、互換的に用いられ、かつ本明細書の抗Ｄ因子抗体のＤ因子認識領域（エピトープ）の構造および結合特性を模倣する、高次構造的に明確なペプチド分子を指す。本明細書の結晶構造は、そのようなペプチド模倣物の同定および調製を可能にする。
【００８６】
発明の詳細な説明
結晶構造および分子モデリング
出願者らは、高解像度Ｘ線結晶解析を用いて、Ｄ因子／抗Ｄ因子抗体複合体の三次元構造を解析した。本研究は、抗Ｄ因子抗体のためのＤ因子の結合部位に関する情報、およびＤ因子との結合に関与する抗Ｄ因子抗体重鎖および軽鎖の残基の情報を最初に提供した。
【００８７】
一態様では、本発明は、抗Ｄ因子抗体またはそのような抗体の抗原結合性フラグメントと複合体を形成したＤ因子ポリペプチドを含む結晶化可能な組成物に関する。
【００８８】
本発明によって提供される結晶化可能な組成物は、Ｘ線結晶解析で処理することができる。したがって、本発明も、結晶化可能な組成物の結晶体を包含する。
【００８９】
本発明は、高解像度（たとえば、２．１Åまたは２．４Åの解像度、図１を参照されたい）でのＤ因子／抗Ｄ因子抗体複合体の三次元構造をさらに提供する。
【００９０】
Ｘ線結晶解析技術は、当技術分野で知られている。Ｄ因子／抗Ｄ因子抗体複合体の三次元構造は、別表１Ａおよび１Ｂに記載する１組の構造座標によって形成される。用語「構造座標」とは、結晶形におけるＤ因子／抗Ｄ因子抗体複合体の細胞外ドメインの原子によってＸ線の単色ビームの回折で得られるパターンに関連した数式から導かれるデカルト原子座標を指す。
【００９１】
図５、６Ａおよび６Ｂに示すように、配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３は抗Ｂ因子抗体Ｆａｂ断片との結合に関与することが決定されている。結合目的で、ヒトＤ因子アミノ酸配列における重要な残基はＲ１７２であることがさらに見出されている。この残基は、抗Ｄ因子抗体重鎖および軽鎖と６以上の水素結合を潜在的に形成することができる。また、図６Ａおよび６Ｂは、ヒトＤ因子分子の近くにあって、ヒトＤ因子分子と相互作用すること（たとえば、水素結合を形成することで）が可能である、抗Ｄ因子抗体の重鎖および軽鎖における残基を示す。
【００９２】
関連分野における当業者は、ポリペプチド複合体のための一組の構造座標が、三次元で形を形成する点の相対的な一組であると理解する。したがって、座標の異なる一組が類似または同じ形を形成することは可能である。さらに、個々の座標における多少の変化が、全体の形状に影響することはほとんどない。
【００９３】
本発明によれば、Ｄ因子および抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合性フラグメント、たとえば抗Ｄ因子モノクローナル抗体を含む複合体の構造座標は、機械可読記憶媒体に保存されることができ、該機械はコンピュータであり得る。作成されたデータは、たとえば、創薬、Ｄ因子への特異的結合の改善などの改善された特性を有する抗Ｄ因子抗体の変異体の発見、および他のタンパク質結晶体のＸ線結晶分析などの種々の目的で利用されることができる。Ｄ因子／抗因子抗体複合体用に作成された構造座標を使用するために、構造座標を３次元形状に変換する必要がある。これは、一組の構造座標から分子複合体またはその部分の三次元グラフ表示を作成することができる市販のソフトウェアを用いることで容易に達成されることができる。そのような三次元表示も、本発明の範囲内である。
【００９４】
このように、本発明は、配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標によって形成される結合部位を含む分子複合体の三次元表示を生成するためのコンピュータを含み、該コンピュータが、（ｉ）機械可読データによってコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、そのようなデータは配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標を含む機械可読データ記憶媒体、および（ｉｉ）機械可読データを前述の三次元表示に処理するための使用説明書を含む。
【００９５】
特定の実施形態では、該コンピュータは構造座標を表示するためのディスプレーを含む。
【００９６】
別の態様では、本発明は、配列番号１のヒトＤ因子のアミノ酸残基Ｄ１３１、Ｖ１３２、Ｐ１３４、Ｄ１６５、Ｒ１６６、Ａ１６７、Ｔ１６８、Ｎ１７０、Ｒ１７１、Ｒ１７２、Ｔ１７３、Ｄ１７６、Ｇ１７７、Ｉ１７９、Ｅ１８１、Ｒ２２２、およびＫ２２３の構造座標によって形成される結合部位を含む分子複合体と会合する化学物質の潜在力を評価する方法に関し、該方法が（ｉ）化学物質と分子複合体のそのような結合部位との間のフィッティング操作を実行するための計算方法を用いるステップと；（ｉｉ）化学物質と前述の結合部位との間の会合を定量化するためのフィッティング操作の結果を分析するステップとを含む。該化学物質は、たとえば、Ｄ因子のアゴニストまたはアンタゴニストであり得、本明細書の抗Ｄ因子抗体との複合体を形成するＤ因子の結晶構造および三次元立体構造を決定するために用いられるアゴニスト抗体とアンタゴニスト抗体および抗Ｄ因子抗体の変異体が含まれる。また、該化学物質は、アゴニストまたはアンタゴニストのＤ因子抗体もしくは抗体断片のペプチド模倣体であり得る。
【００９７】
潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストは、合成されることもあり、Ｄ因子と相互作用する（たとえば、結合する）その能力を決定するために、Ｄ因子と接触させることもある。潜在的なアンタゴニストがＤ因子／抗Ｄ因子抗体の相互作用を妨害するかどうかを決定することもさらに可能である。潜在的なアンタゴニストのＤ因子との結合を実際に試験する前に、本発明によって提供される分子座標および三次元モデルを用いて、コンピュータモデリング技術によってそのような化合物の構造を分析することが可能である。コンピュータモデリングが強い相互作用または結合を示す場合は、該化合物は生成されて（たとえば、合成および／または組換え方法によって）、Ｄ因子と結合するその能力を試験されてもよい。
【００９８】
抗Ｄ因子抗体
抗Ｄ因子抗体は、哺乳類種に由来するＤ因子を用いて選択される。好ましくは、抗原はヒトＤ因子である。しかしながら、カニクイザルまたはマウスのＤ因子などの他の種に由来するＤ因子が標的抗原として使用されることもできる。種々の哺乳類種由来のＤ因子抗原は、天然供給源から分離されてもよい。別の実施形態では、抗原は、組換えで生成されるか、または当技術分野で既知の他の合成方法を用いて作製される。
【００９９】
本発明の方法に従って選択される抗体は、通常、Ｄ因子抗原への十分に強い結合親和性を有することになる。たとえば、抗体は、わずか約５ｎＭ、好ましくはわずか約２ｎＭ、より好ましくはわずか約５００ｐＭのＫｄ値でヒトＤ因子に結合し得る。抗体親和性は、たとえば、表面プラズモン共鳴法ベースアッセイ（たとえば、実施例に記述されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（たとえばＲＩＡ）によって決定され得る。
【０１００】
また、抗体は、たとえば、治療抗体としてその有効性を評価するために、他の生物活性アッセイを受けることもある。そのようなアッセイは、当技術分野で既知であり、かつ標的抗原および抗体の目的の用途に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ抑制アッセイ；腫瘍細胞増殖抑制アッセイ（たとえば、国際公開第ＷＯ８９／０６６９２号に記載される）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；およびＤ因子アンタゴニストを同定するための、以下に記述するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが挙げられる。
【０１０１】
目的の抗原上で特定のエピトープと結合する抗体を求めてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，編集ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉ  Ｌａｎｅ  （１９８８）に記述されているなどの、ルーチンのクロスブロッキングアッセイを実行することができる。あるいは、たとえばＣｈａｍｐｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記述されているエピトープマッピングを実行して、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定することができる。
【０１０２】
好ましい一実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、固有のファージディスプレイアプローチを用いて選択される。該アプローチは、単一のフレームワークのテンプレートに基づく合成抗体ファージライブラリーの生成、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドの提示、標的Ｄ因子抗原に対して高親和性を有する候補抗体の選択、および選択した抗体の単離を含む。
【０１０３】
ファージディスプレイ方法の詳細は、たとえば、国際公開第ＷＯ９０／０５１４４号；国際公開第ＷＯ９０／１４４２４号；国際公開第ＷＯ９０／１４４３０号、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、国際公開第９３／１１２３６号；国際公開第ＷＯ９１／０５０５８号；国際公開第ＷＯ０３／１０２１５７号；国際公開第ＷＯ９１／０５０５８号；米国特許第６，２９１，１５８号；米国特許第６，２９１，１５９号、米国特許６，２９１，１６０号、米国特許第６，２９１，１６１号；米国特許第５，９６９，１０８号、米国特許第５，８８５，７９３号；および米国特許第５，６４３，７６８号に見出すことができる。
【０１０４】
Ｄ因子抗体は、米国特許公開第２００２００８１２９３号、第２００８０１１８５０６号、第２００９０１８１０１７号、および第２００９０２６９３３８号に開示されており、その全開示を参照によって本明細書に明示的に組み入れる。
【０１０５】
好ましい抗体には、抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０、および＃４１６があり、その可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列を、図１０（それぞれ配列番号５、６、７および８）に示す。
【０１０６】
さらに好ましい抗Ｄ因子抗体は、抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８である。ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号９）を図１１（配列番号９）に示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の軽鎖をコードする。図１１（配列番号１０）において第１のアミノ酸に対応するコドンをボールドのイタリック体で示す。図１２は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。該アミノ酸配列には、図１１に示す配列番号９によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列はボールドのイタリック体である。可変領域は下線を引いた領域ではないが、第１の定常ドメインＣＬ１は下線で示す。フレームワーク（ＦＲ）領域およびＨＶＲ領域を示す。図１３は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の重鎖ヌクレオチド配列をコードする。図１４（配列番号１９）の第１のアミノ酸に対応するコドンは、ボールドのイタリック体で示す。図１４は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。該アミノ酸配列には、図１３に示した配列番号１８によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列は、ボールドのイタリック体である。可変領域は下線を引いた領域ではないが、第１の定常ドメインＣＨ１は下線で示す。フレームワーク（ＦＲ）領域およびＨＶＲ領域を示す。
【０１０７】
さらに好ましい抗Ｄ因子抗体は、抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１である。図１５は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の軽鎖をコードする。図１６（配列番号２９）の第１のアミノ酸に対応するコドンは、ボールドのイタリック体で示す。図１６は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。該アミノ酸配列には、図１５に示した配列番号２８によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列はボールドのイタリック体で示す。可変領域は、下線を引いた領域ではないが、第１の定常ドメインＣＬ１は下線で示す。フレームワーク（ＦＲ）領域およびＨＶＲ領域を示す。図１７は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の重鎖のヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。該ヌクレオチド配列は、ボールド体および下線で示した開始コドンおよび終止コドンを有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の重鎖をコードする。図１８（配列番号３１）の第１のアミノ酸に対応するコドンは、ボールドのイタリック体で示す。図１８は、ヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。該アミノ酸配列には、図１８に示した配列番号３０によってコードされるポリペプチドのＮ末端シグナル配列がない。ＨＶＲ配列は、ボールドのイタリック体で示す。可変領域は、下線を引いた領域ではないが、第１の定常ドメインＣＨ１は下線で示す。フレームワーク（ＦＲ）領域およびＨＶＲ領域を示す。
【０１０８】
別の好ましい抗Ｄ因子抗体は、図１９（配列番号４０）に示す軽鎖アミノ酸配列と、図２０（配列番号４１）に示す重鎖アミノ酸配列とを有する抗Ｄ因子Ｆａｂ２３８−２である。
【０１０９】
好ましい模倣体、たとえばペプチド模倣体は、本明細書の好ましい抗体または抗体断片の結合特性および／または生物学的特性を模倣する。
【０１１０】
Ｄ因子抗体および他のＤ因子アンタゴニストの用途
本発明は、本明細書において、抗Ｄ因子抗体およびその変異体、およびその断片（たとえば、抗原結合性フラグメント）を含む、眼の状態（すべての眼の状態および疾患、その症状は古典経路および第二経路を含む補体、特に補体の第二経路を含む）、たとえば、黄斑変性疾患、たとえば乾式型および湿式型（非滲出性および滲出性）を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のすべての段階の黄斑変性症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性および他の虚血に関係する網膜症、眼内炎、ならびにたとえば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ症、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生などの他の眼内血管新生病を含む補体関連の状態の防止および処置に有用なＤ因子アンタゴニストを提供する。補体関連の眼の状態の一群としては、非滲出性（たとえば、中間体の乾式ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））および滲出性（たとえば湿式ＡＭＤ（脈絡膜新生血管（ＣＮＶ））ＡＭＤを含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎およびブドウ膜炎が挙げられる。一例では、補体関連の眼の状態は、中間体の乾式ＡＭＤである。一例では、補体関連の眼の状態は、地図状萎縮である。一例では、補体関連の眼の状態は、湿式ＡＭＤ（脈絡膜新生血管（ＣＮＶ））である。
【０１１１】
ＡＭＤは、黄斑の加齢変性であり、６０歳を超えた個体における不可逆的な視力障害の主原因である。ＡＭＤには、非滲出性（乾式）および滲出性（湿式）の２つの型がある。乾式、すなわち非滲出性型は、中心網膜（黄斑）の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性変化および肥大性変化ならびにＲＰＥ上の沈着物（ドルーゼン）を伴う。非滲出性ＡＭＤの患者は、ＡＭＤの湿式、すなわち滲出性型に進行する可能性があり、滲出性型は、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる血管異常が網膜の下に発生して、体液および血液が漏出し、最終的に網膜内および網膜下に失明する円板状の瘢痕を引き起こす。通常、滲出性ＡＭＤの前兆である非滲出性ＡＭＤは、より一般的である。非滲出性ＡＭＤの症状は様々である：硬いドルーゼン、柔らかいドルーゼン、ＲＰＥ地図状萎縮、および色素凝集が存在し得る。補体成分は、ＡＭＤの初期にＲＰＥ上に沈着して、ドルーゼンの主成分になる。
【０１１２】
Ｄ因子アンタゴニストは、補体関連疾患または障害について種々の細胞ベースアッセイおよび動物モデルで評価されることができる。
【０１１３】
このように、たとえば、組換え（トランスジェニック）動物のモデルは、トランスジェニック動物を生成するための標準技術を用いて、目的の遺伝子の翻訳領域部分を目的の動物のゲノムに導入することによって操作されることができる。トランスジェニック操作のための標的として用いられることができる動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および非ヒト霊長類（たとえばヒヒ、チンパンジーおよび他のサル）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。導入遺伝子をそのような動物に導入するための当技術分野で既知の技術としては、前核マイクロインジェクション法（ＨｏｐｐｅおよびＷａｎｇｅｒ、米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入法（たとえば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６１４８−６１５［１９８５］）；胚幹細胞での遺伝子ターゲティング法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１［１９８９］）；胚の電気穿孔法（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４［１９８３］）；精子媒介遺伝子導入法（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ  ５７，７１７−７３［１９８９］）が挙げられる。概説については、たとえば米国特許第４，７３６，８６６号を参照されたい。
【０１１４】
本発明の目的で、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部だけに導入遺伝子を保有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー中（たとえばヘッドトゥ−ヘッドまたはヘッドトゥ−テールのタンデム）のいずれかで組み込まれ得る。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的な導入も、たとえば、Ｌａｓｋｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，６２３−６３６（１９９２）の技術に従って行うことが可能である。
【０１１５】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現を標準的な技法によってモニターすることができる。たとえば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅を用いて、導入遺伝子の組込みを確認することができる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学などの技法を用いて分析することができる。
【０１１６】
トランスジェニック動物は、特定組織への免疫細胞の浸潤を決定するために、たとえば、組織学的検査によって免疫疾患の病態の兆候をさらに検査され得る。また、ブロッキング実験を行って、トランスジェニック動物を候補Ｄ因子アンタゴニストで処置して、古典経路および第二経路を含む補体および補体活性、またはＴ細胞増殖への効果の程度を決定することができる。これらの実験では、本発明のポリペプチドと結合するブロッキング抗体が動物に投与されて、目的の生物学的効果をモニターされる。
【０１１７】
あるいは、Ｄ因子ポリペプチドをコードする内在性遺伝子と、動物の胚細胞に導入された同じポリペプチドをコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果としてＤ因子をコードする遺伝子が欠損したまたは改変した「ノックアウト」動物を構築することができる。たとえば、Ｄ因子をコードするｃＤＮＡを用いて、確立した技術に従って、Ｄ因子をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。Ｄ因子をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させる、または組込みをモニターするために用いられ得る選択マーカーをコードする遺伝子などの別の遺伝子と置き換えることができる。典型的に、数キロベースの隣接する非改変ＤＮＡ（５’および３’の両末端で）がベクター中に含まれる（相同組換えベクターに関しては、たとえば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照されたい）。ベクターは、胚幹細胞系に導入され（たとえば、電気穿孔法によって）、次いで導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組み換えられた細胞が選択される（たとえば、Ｌｉら，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照されたい）。次いで、凝集キメラを形成するために、選択された細胞は、動物（たとえば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入される（たとえば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５３を参照されたい）。次いで、「ノックアウト」動物をつくるために、キメラ胚は、適切な偽妊娠の雌の里親動物に移植され、該胚は出産にいたることができる。その胚細胞内に相同組換えされたＤＮＡを保持する子孫は、標準的な技術で同定され、次いでそれを用いて、動物のすべての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、たとえば、特定の病的状態から防御するその能力に関して、およびＤ因子ポリペプチドの非存在に起因する病的状態のそれらの発症に関して特徴づけられることができる。
【０１１８】
このように、有望なＤ因子アンタゴニストの生物活性は、ネズミＤ因子ノックアウトマウスでさらに試験されることができる。
【０１１９】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の動物モデルは、Ｃｃｌ−２またはＣｃｒ−２遺伝子において無発現変異を有するマウスから構成される。これらのマウスは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）中のリポフスチンの蓄積および該上皮下のドルーゼン、光受容体の萎縮および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を含むＡＭＤの主要な特徴を発症する。これらの特徴は、６ヶ月齢を超えてから発症する。候補Ｄ因子アンタゴニストは、ドルーゼンの形成、光受容体の萎縮および脈絡膜新生血管に対して検査されることができる。
【０１２０】
医薬組成物
ポリペプチドまたは抗体、もしくはその抗体断片（たとえば抗原結合性フラグメント）、もしくはその抗体変異体を含む治療用製剤は、所望の純度を有するポリペプチドと、当技術分野で典型的に使用される、随意の「薬学的に許容される」担体、賦形剤または安定剤（これらすべてを「賦形剤」と称する）とを混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液剤としての保存のために調製され得る。たとえば、緩衝剤、安定剤、保存料、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および他の種々の添加剤。（Ｒｅｍｉｎｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，Ａ．Ｏｓｏｌ．編（１９８０）を参照されたい）。そのような添加剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒でなければならない。
【０１２１】
緩衝剤は、生理的状態に近似する範囲でｐＨを維持するのに役立つ。緩衝剤は、好ましくは約２ｍＭから約５０ｍＭにわたる濃度で存在する。本発明で用いる適切な緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方およびその塩類、たとえばクエン酸緩衝剤（たとえば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸ニナトトリウムの混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウムの混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウムの混合物など）、コハク酸緩衝剤（たとえば、コハク酸−コハク酸一ナトリウムの混合物、コハク酸−水酸化ナトリウムの混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウムの混合物など）、酒石酸緩衝剤（たとえば、酒石酸−酒石酸ナトリウムの混合物、酒石酸−酒石酸カリウムの混合物、酒石酸−水酸化ナトリウムの混合物など）、フマル酸緩衝剤（たとえばフマル酸−フマル酸一ナトリウムの混合物など）、フマル酸緩衝剤（たとえば、フマル酸−フマル酸一ナトリウムの混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウムの混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウムの混合物など）、グルコン酸緩衝剤（たとえば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウムの混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウムの混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウムの混合物など）、シュウ酸緩衝剤（たとえば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウムの混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウムの混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウムの混合物など）、乳酸緩衝剤（たとえば、乳酸−乳酸ナトリウムの混合物、乳酸−水酸化ナトリウムの混合物、乳酸−乳酸カリウムの混合物など）、および酢酸緩衝剤（たとえば、酢酸−酢酸ナトリウムの混合物、酢酸−水酸化ナトリウムの混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤およびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩類を記載し得る。
【０１２２】
保存料を加えて、微生物増殖を遅らせることもでき、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）にわたる量で加えてもよい。本発明で用いられる適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハロゲン化物（たとえば塩化物、臭化物、ヨウ化物)、塩化ヘキサメトニウム、メチルパラベンまたはプピルパラベンなどのアルキルパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および３-ペンタノールが挙げられる。
【０１２３】
時には「安定剤」として知られている等張剤は、本発明の液体組成物の等張性を確保するために添加されることもあり、多価糖アルコール類、好ましくは三価アルコールまたはより高級の糖アルコール類、たとえばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。
【０１２４】
安定剤は、賦形剤の広義のカテゴリーを指し、機能において充填剤から、治療薬を可溶化するまたは変性もしくは容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤までにわたることができる。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上で列挙した）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸類、イノシトールなどのシクリトールを含み、たとえばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖類または糖アルコール類：ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量のポリペプチド(すなわち＜１０残基)；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フラクトース、グルコースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類、およびラフィノースなどの三糖類；デキストランなどの多糖類であり得る。安定剤は、活性タンパク質の１重量部当たり０．１から１０，０００重量部の範囲で存在し得る。
【０１２５】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られている）は、治療薬の可溶化を促進するため、ならびに治療用タンパク質を攪拌に誘発された凝集から保護するために添加されることもあり、それによってタンパク質の変性を引き起こすことなく、製剤が、応力が加わったせん断面にさらされることが可能となる。適切な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０など）を含む。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在し得る。
【０１２６】
さらなる種々の賦形剤には、充填剤（たとえばデンプン）、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（たとえばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が含まれる。また、本明細書の製剤は、治療される特定の兆候の必要に応じて、複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。たとえば、免疫抑制剤をさらに含んでいることが望ましい。このような分子は、意図した目的に有効な量での組み合わせで適切に存在する。また、活性成分は、たとえば、コアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、たとえばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，Ａ．Ｏｓａｌ編（１９８０）に開示されている。
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与で用いられる製剤は、無菌でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を介して濾過することによって、容易に達成される。徐放性製剤を調製し得る。徐放性製剤の適切な例として、抗体、またはその抗体変異体もしくは断片（たとえば、抗原結合性フラグメント）を含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。該マトリックスは、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形状である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間を超えて分子を放出することができるが、特定のハイドロゲルはより短い期間の間タンパク質を放出する。カプセル抗体は、体内に長時間残存する場合、３７℃の水分に曝される結果、変性または凝集することがあり、生物活性の喪失および免疫原生の変化を生じる可能性がある。関与する機構に応じて安定化のために合理的な戦略を考案することができる。たとえば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かったならば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的ポリマーマトリックス組成物を開発することで安定化を達成することができる。
【０１２８】
眼疾患もしくは状態の防止または処置のための本発明の方法によって同定されることができる化合物は、典型的には、眼、眼内、および／または硝子体内注射、および／または強膜近傍注射、および／またはテノン嚢下注射、および／または脈絡膜上注射および／または点眼剤および／もしくは軟膏の形態での局所投与によって投与される。本発明のこのような化合物は、種々の方法、たとえばＩｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，およびＰｅａｒｓｎ，編集者，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ  ２００６）のような参考文献に記載されているものを含む、化合物の硝子体中への持続放出を可能にする装置および／またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例では、装置は、ミニポンプおよび／またはマトリックスおよび／または受動拡散システムおよび／または長期間の間、化合物を放出するカプセル化セルの形態であり得る（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，およびＰｅａｒｓｏｎ編集者，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  （Ｍａｒｃｈ  ２００６）。他の投与方法としては、局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および病巣内の投与が用いられ得るが、これらに限定されるものではない。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下の投与を含む。
【０１２９】
眼、眼内または硝子体内の投与のための製剤は、当技術分野で既知の方法によって、既知の成分を使用して調製されることができる。効果的な治療の主要な要件は、眼からの適切な浸透である。薬剤が局所的に送達され得る眼球前面の疾患と異なり、網膜疾患はより部位特異的なアプローチを必要とする。点眼剤および軟膏が眼底まで浸透することはまれであり、血液−眼関門が全身投与された薬物の眼組織中への浸透を妨害する。したがって、通常、ＡＭＤおよびＣＮＶのような網膜疾患を治療するための薬物送達のために選択される方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の状態、および送達される薬物の特性および半減期に依存する間隔で繰り返される。眼内（たとえば硝子体内）浸透の場合、通常、より小さいサイズの分子が好ましい。
【０１３０】
ＡＭＤまたはＣＮＶなどの補体関連の眼の状態の治療の効果は、眼内疾患を評価するのに一般的に使用される種々のエンドポイントによって測定することができる。例えば、視力喪失を評価することができる。視力喪失は、これらに限定されないが、たとえば、ベースラインから所望の時点までの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化を測定することによって（たとえば、ＢＣＶＡが糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）に基づく場合、視力表および４メートルの検査距離での判定）、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字より少ない視力を失う患者の割合を測定することによって、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字以上を獲得する患者の割合を測定することによって、所望の時点で２０／２０００より悪いＳｎｅｌｌｅｎ等価視力を有する患者の割合を測定することによって、ＮＥＩ視覚機能質問表を測定することによって、所望の時点でのＣＮＶのサイズおよびＣＮＶの漏出量を、例えば、蛍光眼底観察法などによって測定することによって、評価することができる。視覚判定は、これらに限定されないが、たとえば、眼の検査を行うこと、眼内圧を測定すること、視力を判定すること、スリットランプ圧を測定すること、眼内炎症を判定することなどによって行うことができる。
【０１３１】
特定の障害または状態の処置に有効である治療用ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片（たとえば、抗原結合性フラグメント）の量は、障害または状態の性質に依存し、かつ標準的な臨床技術によって決定することができる。可能な場合、本発明の医薬組成物の用量応答曲線を最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、次いでヒトにおける試験の前に有用な動物モデル系において決定することが望ましい。
【０１３２】
一実施形態では、治療用ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片（例えば抗原結合性フラグメント）の水溶液は、皮下注射によって投与される。別の実施形態では、治療用ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片（例えば抗原結合性フラグメント）の水溶液は硝子体内注射によって投与される。各用量は、約０．５μｇから約５０μｇ／ｋｇ体重、またはより好ましくは約３μｇから約３０μｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【０１３３】
皮下投与のための投与計画は、疾患の種類、疾患の重篤度、および治療薬に対する患者の感受性を含むいくつかの臨床学的因子に依存して月一回から毎日まで変わり得る。 
【０１３４】
下記の実施例は、例示目的だけに提供され、本発明の範囲を限定することを何ら目的としていない。
【０１３５】
本明細書において引用される特許および文献のすべては、その全体を参照によって本明細書に明示的に組み入れる。
【０１３６】
実施例１
Ｄ因子および抗Ｄ因子抗体の共結晶構造の決定
ヒトおよびカニクイザルの両Ｄ因子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。ＣＨＯ細胞上清を、抗Ｄ因子アフィニティーカラムに通すことによって精製を行った。０．１Ｍの酸性緩衝液で、次いで４％ｖ／ｖの１．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８，６でタンパク質を溶出し、次いで１０ｍＭのｐＨ７．２のＨｅｐｅｓを含む緩衝液中で１４０ｍＭのＮａＣｌとともに透析した。凍結乾燥製剤中の抗Ｄ因子Ｆａｂを用意して、水でもどした。結果として得た溶液は、４０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、２０ｍＭの塩化ナトリウム、１８０ｍＭのショ糖、０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、ｐＨ５．４中の５０ｍｇ／ｍＬタンパク質である。
【０１３７】
ヒトＤ因子タンパク質と抗Ｄ因子Ｆａｂを１：１の割合で混合し、次いで２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２および２００ｍＭのＮａＣｌで前平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上で精製した。該複合体を含んでいるピークフラクションをプールして、３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで結晶化臨床試験で使用した。液滴下での蒸気拡散法を用いて、４℃で結晶体を増殖させた。０．１ＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．５、０．２Ｍのリン酸アンモニウム、５０％のＭＰＤおよび０．０１Ｍのヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）塩化物を含んでいる結晶化緩衝液をタンパク質溶液と等容量で混合した。６日後、結晶体が出現し、空間群Ｐ４３２１２に属した。結晶体を液体窒素中で急速冷凍させた。２．４Åデータセットをビームライン９−２上でＳＳＲＬ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅで収集した。
【０１３８】
カニクイザルＤ因子／抗Ｄ因子Ｆａｂの複合体を上述と同じプロトコールに従って精製した。構造決定で用いた結晶体は、１９℃で以下の条件から増殖させた：等容量のタンパク質溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）および母液を含む液滴下での蒸気拡散法を用いて、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、２５％のＰＥＧ  ５５０ＭＭＥ、０．０１Ｍの硫酸亜鉛および３％の６−アミノヘキサン酸。１日後に結晶体が出現し、ヒトＤ因子：Ｆａｂ複合体の場合ａ＝１３２．０４８；ｂ＝１３２．０４８；ｃ＝１８０．２８８Å、およびカニクイザルＤ因子：Ｆａｂ複合体の場合ａ＝１８２．２０５；ｂ＝８０．６７３；ｃ＝１４２．５７５Åの格子サイズを有する空間群Ｃ２に属した。１０％グリセロールを含む人工母液中に結晶体を浸漬し、次いで液体窒素中で急速冷凍させた。２．１Åデータセットをビームライン９−２上でＳＳＲＬ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅで収集した。
【０１３９】
実施例２
触媒的に不活性のＤ因子タンパク質の調製
完全長のＤ因子ｃＤＮＡをｐＲＫ発現ベクター中にクローン化した。触媒三残基の一部である、残基Ｓ２０８（メチオニン出発由来；トリプシン番号付けを用いてＳ１９５）をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ），Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用し、製造業者の使用説明書に従ってアラニンに変異導入した。タンパク質をＣＨＯ細胞中で発現させ、次いで２６ｍｇ／ｍＬの抗Ｄ因子抗体と共役させたＡｆｆ−Ｇｅｌ  １０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に上清を複数回通すことで精製し、次いでｐＨ３．０で溶出させた。１０／１０  ＭｏｎｏＳ、ｐＨ６．０の２次カラムを用いて、タンパク質をさらに精製し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１０ｋＤ遠心フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濃縮し、次いでＰＢＳ中で透析した。ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いるＮ末端配列決定によって、タンパク質配列を確認した。
【０１４０】
実施例３
液相の第２経路Ｃ３コンバターゼアッセイにおいて抗Ｄ因子抗体によるＢ因子切断のブロッキング
このアッセイ緩衝液は、０．１％のセラチンベロナール緩衝液／１０ｍＭのＭｇＣｌ２であり、成分の最終濃度は、０．１２５μＭのＤ因子、０．５μＭのＢ因子、０．５μＭのＣ３ｂおよび５μＭのＦａｂ抗体（抗Ｄ因子、８Ｅ２、対照ヒトＦａｂ）であった。１０μＬのＤ因子（０．５μＭ）と１０μＬのＦａｂ（２０μＭ）とを１５分間混合させた。１０μＬのＢ因子（２μＭ）および１０μＬのＣ３ｂ（２μＭ）をＤ因子−Ｆａｂ混合物に加えて、３７℃で３０分間、インキュベートした。４０μＬのレムリ緩衝液を加えて、反応を停止させた。試料を５分間沸騰させて、１２５ｍＶで、１．５時間、Ｎｏｖｅｘ  ４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル上を移動させた。ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎで１時間染色して、再蒸留水で一晩洗浄し、次いでＣｅｌｌｏｐｈａｎｅの間で乾燥させた。図２１に示すように、Ｂ因子切断は抗Ｄ因子抗体でブロックされたが、８Ｅ２ではブロックされなかった。抗Ｄ因子抗体は液相第２経路Ｃ３コンバターゼアッセイでＢ因子の切断をブロックすることをこの結果が示している。
【０１４１】
実施例４
Ｄ因子（Ｓ２０８Ａ）は７７２ｎＭの親和性でプロコンバターゼに結合する（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）
結合分析をＢｉａｃｏｒｅ３０００上で行った。Ｃ３ｂは、製造業者の推奨に従ってＣＭ５チップに連結させたアミンであった。ＣＭ５チップを、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、流速５μＬ／分、３０μＬで活性化した。Ｃ３ｂ（５０μｇ／ｍＬ）を５μＬ／分で流動させ、２０μＬで７３００ＲＵの最終を達成した。Ｂ因子、Ｄ因子、抗Ｄ因子抗体および８Ｅ２  Ｆａｂ断片のタンパク質ならびに抗体を、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡを用いて、アッセイ緩衝液：ベロナール緩衝液／１ｍＭのＮｉＣｌ２／０．０５％界面活性剤Ｐ−２０中で緩衝液交換をした。結合アッセイは「Ｃｏｉｎｊｅｃｔ」プログラムを使用した。１μＭのＢ因子を注入し（流速３０μＬ／分、９０μＬ）、続いて１μＭのＢ因子およびＤ因子の希釈物の混合物を同時注入し（流速３０μＬ／分、９０μＬ）、次いでアッセイ緩衝液中で５分間解離させた。チップを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の３ＭのＮａＣｌでの１分間の洗浄を３回行い、次いで緩衝液で５分間洗浄して、再生させた。図２２および２３に示すように、このＢｉａｃｏｒｅ分析によって決定したように、因子（Ｓ２０８Ａ）は７７２ｍＭの親和性でＣ３ｂＢプロコンバターゼに結合する。
【０１４２】
実施例５
抗Ｄ因子抗体はＤ因子結合をブロックする
結合分析をＢｉａｃｏｒｅ３０００上で行った。Ｃ３ｂは、製造業者の推奨に従ってＣＭ５チップに連結させたアミンであった。ＣＭ５チップを、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、流速５μＬ／分、３０μＬで活性化した。Ｃ３ｂ（５０μｇ／ｍＬ）を５μＬ／分で流動させ、２０μＬで６０２０ＲＵの最終を達成した。Ｂ因子、Ｄ因子、抗Ｄ因子抗体および８Ｅ２  Ｆａｂ断片のタンパク質ならびに抗体を、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡを用いて、アッセイ緩衝液：ベロナール緩衝液／１ｍＭのＮｉＣｌ２／０．０５％界面活性剤Ｐ−２０中で緩衝液交換をした。結合アッセイは「Ｃｏｉｎｊｅｃｔ」プログラムを使用した。１μＭのＢ因子を注入し（流速３０μＬ／分、９０μＬ）、続いて１μＭのＢ因子、１μＭのＤ因子、およびＦａｂ抗体の希釈物の混合物を同時注入し（流速３０μＬ／分、９０μＬ）、次いでアッセイ緩衝液中で５分間解離させた。チップを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の３ＭのＮａＣｌでの１分間の洗浄を３回行い、次いで緩衝液で５分間洗浄して再生させた。図２４および２５に示すように、抗Ｄ因子抗体は、Ｃ３ｂＢプロコンバターゼに結合する因子（Ｓ２０８Ａ）をブロックした。
【０１４３】
実施例５
抗Ｄ因子抗体は触媒的切断に影響を及ぼさない
小さい基質を、抗Ｄ因子抗体に結合したＤ因子活性部位で効率的に切断して、Ｄ因子活性部位における主要な立体構造変化の非存在を確認する。チオエステルベンジル基質Ｚ−Ｌｙｓ−ＳＢｚｌのＤ因子加水分解を、５０ｍＭのアッセイ緩衝液ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／２００ｍＭのＮａＣｌ中のＤＴＮＢ（Ｅｌｌｍａｎ試薬）５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸））を用いて測定した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中の３．２ｍＭのＺ−Ｌｙｓ−ＳＢｚｌ、３２０ｎＭのＤ因子タンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アッセイ緩衝液中３．２μＭの抗原と８ｍＭのＤＴＮＢ、およびイソプロパノール中２００ｍＭのＤＩＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル）を含む原液を生成した。アッセイ量は、２ｍＭのＤＴＮＢ、８００ｎＭのＺ−Ｌｙｓ−ＳＢｚｌ、８０ｎＭのＤ因子、８００μＭの抗体または２０ｍＭのＤＩＦＰの最終濃度を含むアッセイ緩衝液中の２００μＬであった。加水分解速度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４分光光度計で、４５０ｎｍで１．５時間測定し、１５秒ごとに測定値を読み取り、次いでＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．２ソフトウェアを使用してＶｍａｘを算出した。
【０１４４】
図２６および２７は、抗Ｄ因子抗体が触媒的切断に影響を及ぼさないことを示す。
【０１４５】
図２８は、抗Ｄ因子抗体がいかにＢ因子の活性化を阻害するかを表す仮説モデルである。抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子のＢ因子へのドッキングを立体的に阻害し、Ｂ因子の活性化およびＣ３コンバターゼの形成を阻止する。
【０１４６】
2013509866.tif 000003
2013509866.tif 000004
2013509866.tif 000005
2013509866.tif 000006
2013509866.tif 000007
2013509866.tif 000008
2013509866.tif 000009
2013509866.tif 000010
2013509866.tif 000011
2013509866.tif 000012
2013509866.tif 000013
2013509866.tif 000014
2013509866.tif 000015
2013509866.tif 000016
2013509866.tif 000017
2013509866.tif 000018
2013509866.tif 000019
2013509866.tif 000020
2013509866.tif 000021
2013509866.tif 000022
2013509866.tif 000023
2013509866.tif 000024
2013509866.tif 000025
2013509866.tif 000026
2013509866.tif 000027
2013509866.tif 000028
2013509866.tif 000029
2013509866.tif 000030
2013509866.tif 000031
2013509866.tif 000032
2013509866.tif 000033
2013509866.tif 000034
2013509866.tif 000035
2013509866.tif 000036
2013509866.tif 000037
2013509866.tif 000038
2013509866.tif 000039
2013509866.tif 000040
2013509866.tif 000041
2013509866.tif 000042
2013509866.tif 000043
2013509866.tif 000044
2013509866.tif 000045
2013509866.tif 000046
2013509866.tif 000047
2013509866.tif 000048
2013509866.tif 000049
2013509866.tif 000050
2013509866.tif 000051
2013509866.tif 000052
2013509866.tif 000053
2013509866.tif 000054
2013509866.tif 000055
2013509866.tif 000056
2013509866.tif 000057
2013509866.tif 000058
2013509866.tif 000059
2013509866.tif 000060
2013509866.tif 000061
2013509866.tif 000062
2013509866.tif 000063
2013509866.tif 000064
2013509866.tif 000065
2013509866.tif 000066
2013509866.tif 000067
2013509866.tif 000068
2013509866.tif 000069
2013509866.tif 000070
2013509866.tif 000071
2013509866.tif 000072
2013509866.tif 000073
2013509866.tif 000074
2013509866.tif 000075
2013509866.tif 000076
2013509866.tif 000077
2013509866.tif 000078
2013509866.tif 000079
2013509866.tif 000080
2013509866.tif 000081
2013509866.tif 000082
2013509866.tif 000083
2013509866.tif 000084
2013509866.tif 000085
2013509866.tif 000086
2013509866.tif 000087
2013509866.tif 000088
2013509866.tif 000089
2013509866.tif 000090
2013509866.tif 000091
2013509866.tif 000092
2013509866.tif 000093
2013509866.tif 000094
2013509866.tif 000095
2013509866.tif 000096
2013509866.tif 000097
2013509866.tif 000098
2013509866.tif 000099
2013509866.tif 000100
2013509866.tif 000101
2013509866.tif 000102
2013509866.tif 000103
2013509866.tif 000104
2013509866.tif 000105
2013509866.tif 000106
2013509866.tif 000107
2013509866.tif 000108
2013509866.tif 000109
2013509866.tif 000110
2013509866.tif 000111
2013509866.tif 000112
2013509866.tif 000113
2013509866.tif 000114
2013509866.tif 000115
2013509866.tif 000116
2013509866.tif 000117
2013509866.tif 000118
2013509866.tif 000119
2013509866.tif 000120
2013509866.tif 000121
2013509866.tif 000122
2013509866.tif 000123
2013509866.tif 000124
2013509866.tif 000125
2013509866.tif 000126
2013509866.tif 000127
2013509866.tif 000128
2013509866.tif 000129
2013509866.tif 000130
2013509866.tif 000131
2013509866.tif 000132
2013509866.tif 000133
2013509866.tif 000134
2013509866.tif 000135
2013509866.tif 000136
2013509866.tif 000137
2013509866.tif 000138
2013509866.tif 000139
2013509866.tif 000140
2013509866.tif 000141
2013509866.tif 000142
2013509866.tif 000143
2013509866.tif 000144
2013509866.tif 000145
2013509866.tif 000146
2013509866.tif 000147
2013509866.tif 000148
2013509866.tif 000149
2013509866.tif 000150
2013509866.tif 000151
2013509866.tif 000152
2013509866.tif 000153
2013509866.tif 000154
2013509866.tif 000155
2013509866.tif 000156
2013509866.tif 000157
2013509866.tif 000158
2013509866.tif 000159
2013509866.tif 000160
2013509866.tif 000161
2013509866.tif 000162
2013509866.tif 000163
2013509866.tif 000164
2013509866.tif 000165
2013509866.tif 000166
2013509866.tif 000167
2013509866.tif 000168
2013509866.tif 000169
2013509866.tif 000170
2013509866.tif 000171
2013509866.tif 000172
2013509866.tif 000173
2013509866.tif 000174
2013509866.tif 000175
2013509866.tif 000176
2013509866.tif 000177
2013509866.tif 000178
2013509866.tif 000179
2013509866.tif 000180
2013509866.tif 000181
2013509866.tif 000182
2013509866.tif 000183
2013509866.tif 000184
2013509866.tif 000185
2013509866.tif 000186
2013509866.tif 000187
2013509866.tif 000188
2013509866.tif 000189
2013509866.tif 000190
2013509866.tif 000191
2013509866.tif 000192
2013509866.tif 000193
2013509866.tif 000194
2013509866.tif 000195
2013509866.tif 000196
2013509866.tif 000197
2013509866.tif 000198
2013509866.tif 000199
2013509866.tif 000200
2013509866.tif 000201
2013509866.tif 000202
2013509866.tif 000203
2013509866.tif 000204
2013509866.tif 000205
2013509866.tif 000206
2013509866.tif 000207
2013509866.tif 000208
2013509866.tif 000209
2013509866.tif 000210
2013509866.tif 000211
2013509866.tif 000212
2013509866.tif 000213
2013509866.tif 000214
2013509866.tif 000215
2013509866.tif 000216
2013509866.tif 000217
2013509866.tif 000218
2013509866.tif 000219
2013509866.tif 000220
2013509866.tif 000221
2013509866.tif 000222
2013509866.tif 000223
2013509866.tif 000224
2013509866.tif 000225
2013509866.tif 000226
2013509866.tif 000227
2013509866.tif 000228
2013509866.tif 000229
2013509866.tif 000230
2013509866.tif 000231
2013509866.tif 000232
2013509866.tif 000233
2013509866.tif 000234
2013509866.tif 000235
2013509866.tif 000236
2013509866.tif 000237
2013509866.tif 000238
2013509866.tif 000239
2013509866.tif 000240
2013509866.tif 000241
2013509866.tif 000242
2013509866.tif 000243
2013509866.tif 000244
2013509866.tif 000245
2013509866.tif 000246
2013509866.tif 000247
2013509866.tif 000248
2013509866.tif 000249
2013509866.tif 000250
2013509866.tif 000251
2013509866.tif 000252
2013509866.tif 000253
2013509866.tif 000254
2013509866.tif 000255
2013509866.tif 000256
2013509866.tif 000257
2013509866.tif 000258
2013509866.tif 000259
2013509866.tif 000260
2013509866.tif 000261
2013509866.tif 000262
2013509866.tif 000263
2013509866.tif 000264
2013509866.tif 000265
2013509866.tif 000266
2013509866.tif 000267
2013509866.tif 000268
2013509866.tif 000269
2013509866.tif 000270
2013509866.tif 000271
2013509866.tif 000272
2013509866.tif 000273
2013509866.tif 000274
2013509866.tif 000275
2013509866.tif 000276
2013509866.tif 000277
2013509866.tif 000278
2013509866.tif 000279
2013509866.tif 000280
2013509866.tif 000281
2013509866.tif 000282
2013509866.tif 000283
2013509866.tif 000284
2013509866.tif 000285
2013509866.tif 000286
2013509866.tif 000287
2013509866.tif 000288
2013509866.tif 000289
2013509866.tif 000290
2013509866.tif 000291
2013509866.tif 000292
2013509866.tif 000293
2013509866.tif 000294
2013509866.tif 000295
2013509866.tif 000296
2013509866.tif 000297
2013509866.tif 000298
2013509866.tif 000299
2013509866.tif 000300
2013509866.tif 000301
2013509866.tif 000302
2013509866.tif 000303
2013509866.tif 000304
2013509866.tif 000305
2013509866.tif 000306
2013509866.tif 000307
2013509866.tif 000308
2013509866.tif 000309
2013509866.tif 000310
2013509866.tif 000311
2013509866.tif 000312
2013509866.tif 000313
2013509866.tif 000314
2013509866.tif 000315
2013509866.tif 000316
2013509866.tif 000317
2013509866.tif 000318
2013509866.tif 000319
2013509866.tif 000320
2013509866.tif 000321
2013509866.tif 000322
2013509866.tif 000323
2013509866.tif 000324
2013509866.tif 000325
2013509866.tif 000326
2013509866.tif 000327
2013509866.tif 000328
2013509866.tif 000329
2013509866.tif 000330
2013509866.tif 000331
2013509866.tif 000332
2013509866.tif 000333
2013509866.tif 000334
2013509866.tif 000335
2013509866.tif 000336
2013509866.tif 000337
2013509866.tif 000338
2013509866.tif 000339
2013509866.tif 000340
2013509866.tif 000341
2013509866.tif 000342
2013509866.tif 000343
2013509866.tif 000344
2013509866.tif 000345
2013509866.tif 000346
2013509866.tif 000347
2013509866.tif 000348
2013509866.tif 000349
2013509866.tif 000350
2013509866.tif 000351
2013509866.tif 000352
2013509866.tif 000353
2013509866.tif 000354
2013509866.tif 000355
2013509866.tif 000356
2013509866.tif 000357
2013509866.tif 000358
2013509866.tif 000359
2013509866.tif 000360
2013509866.tif 000361
2013509866.tif 000362
2013509866.tif 000363
2013509866.tif 000364
2013509866.tif 000365
2013509866.tif 000366
2013509866.tif 000367
2013509866.tif 000368
2013509866.tif 000369
2013509866.tif 000370
2013509866.tif 000371
2013509866.tif 000372
2013509866.tif 000373
2013509866.tif 000374
2013509866.tif 000375
2013509866.tif 000376
2013509866.tif 000377
2013509866.tif 000378
2013509866.tif 000379
2013509866.tif 000380
2013509866.tif 000381
2013509866.tif 000382
2013509866.tif 000383
2013509866.tif 000384
2013509866.tif 000385
2013509866.tif 000386
2013509866.tif 000387
2013509866.tif 000388
2013509866.tif 000389
2013509866.tif 000390
2013509866.tif 000391
2013509866.tif 000392
2013509866.tif 000393
2013509866.tif 000394
2013509866.tif 000395
2013509866.tif 000396
2013509866.tif 000397
2013509866.tif 000398
2013509866.tif 000399
2013509866.tif 000400
2013509866.tif 000401
2013509866.tif 000402
2013509866.tif 000403
2013509866.tif 000404
2013509866.tif 000405
2013509866.tif 000406
2013509866.tif 000407
2013509866.tif 000408
2013509866.tif 000409
2013509866.tif 000410
2013509866.tif 000411
2013509866.tif 000412
2013509866.tif 000413
2013509866.tif 000414
2013509866.tif 000415
2013509866.tif 000416
2013509866.tif 000417
2013509866.tif 000418
2013509866.tif 000419
2013509866.tif 000420
2013509866.tif 000421
2013509866.tif 000422
2013509866.tif 000423
2013509866.tif 000424
2013509866.tif 000425
2013509866.tif 000426
2013509866.tif 000427
2013509866.tif 000428
2013509866.tif 000429
2013509866.tif 000430
2013509866.tif 000431
2013509866.tif 000432
2013509866.tif 000433
2013509866.tif 000434
2013509866.tif 000435
2013509866.tif 000436
2013509866.tif 000437
2013509866.tif 000438
2013509866.tif 000439
2013509866.tif 000440
2013509866.tif 000441
2013509866.tif 000442
2013509866.tif 000443
2013509866.tif 000444
2013509866.tif 000445
2013509866.tif 000446
2013509866.tif 000447
2013509866.tif 000448
2013509866.tif 000449
2013509866.tif 000450
2013509866.tif 000451
2013509866.tif 000452
2013509866.tif 000453
2013509866.tif 000454
2013509866.tif 000455
2013509866.tif 000456
2013509866.tif 000457
2013509866.tif 000458
2013509866.tif 000459
2013509866.tif 000460
2013509866.tif 000461
2013509866.tif 000462
2013509866.tif 000463
2013509866.tif 000464
2013509866.tif 000465
2013509866.tif 000466
2013509866.tif 000467
2013509866.tif 000468
2013509866.tif 000469
2013509866.tif 000470
2013509866.tif 000471
2013509866.tif 000472
2013509866.tif 000473
2013509866.tif 000474
2013509866.tif 000475
2013509866.tif 000476
2013509866.tif 000477
2013509866.tif 000478
2013509866.tif 000479
【図１】
2013509866.tif 000480
【図２】
2013509866.tif 000481
【図３】
2013509866.tif 000482
【図４】
2013509866.tif 000483
【図５】
2013509866.tif 000484
【図６Ａ】
2013509866.tif 000485
【図６Ｂ】
2013509866.tif 000486
【図７Ａ】
2013509866.tif 000487
【図７Ｂ】
2013509866.tif 000488
【図８】
2013509866.tif 000489
【図９】
2013509866.tif 000490
【図１０】
2013509866.tif 000491
【図１１】
2013509866.tif 000492
【図１２】
2013509866.tif 000493
【図１３】
2013509866.tif 000494
【図１４】
2013509866.tif 000495
【図１５】
2013509866.tif 000496
【図１６】
2013509866.tif 000497
【図１７】
2013509866.tif 000498
【図１８】
2013509866.tif 000499
【図１９】
2013509866.tif 000500
【図２０】
2013509866.tif 000501
【図２１】
2013509866.tif 000502
【図２２】
2013509866.tif 000503
【図２３】
2013509866.tif 000504
【図２４】
2013509866.tif 000505
【図２５】
2013509866.tif 000506
【図２６】
2013509866.tif 000507
【図２７】
2013509866.tif 000508
【図２８】
2013509866.tif 000509
【配列表】
2013509866000001.app
【国際調査報告】
2013509866.tif 000510
2013509866.tif 000511
2013509866.tif 000512
2013509866.tif 000513
2013509866.tif 000514
2013509866.tif 000515
2013509866.tif 000516