(57)【要約】  少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗体の少なくとも一部とを含むフラジェリン／抗原タンパク質を含む組成物と、該組成物を少なくとも４９才の人間に投与する方法。前記組成物は、高齢者のような人間における、前記抗原に対する免疫応答、特に、前記抗原対する保護免疫応答を刺激する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を人間に投与するステップを含み、前記融合タンパク質は約０．５μｇを超える用量で前記人間に投与され、前記人間は少なくとも４９才である、人間における免疫応答を刺激する方法。
【請求項２】
前記組成物の前記人間への投与は、抗原の出所に前記人間が曝露された結果の感染に対する保護免疫を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記人間は４９才と約６４才との間の年齢である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記人間は少なくとも６５才の年齢である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記用量は、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ及び３０μｇからなる群より選択される少なくとも１種類の用量である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記用量は、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ及び８μｇからなる群より選択される少なくとも１種類の用量である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記用量は、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ及び３０μｇからなる群より選択される少なくとも１種類の用量である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記用量は、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ及び３０μｇからなる群より選択される少なくとも１種類の用量である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原はインフルエンザ抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インフルエンザ抗原はヘマグルチニンインフルエンザ抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インフルエンザ抗原はＡ型インフルエンザ抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記インフルエンザ抗原はＢ型インフルエンザ抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記インフルエンザ抗原はＣ型インフルエンザ抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記融合タンパク質は前記人間に筋注により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質の少なくとも１回の次の投与を行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は配列番号１を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を高齢者に投与するステップを含み、抗体応答率が少なくとも７５％である、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項１８】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を高齢者に投与するステップを含み、抗体保持率が少なくとも９５％である、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項１９】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を高齢者に投与するステップを含み、抗体陽転率が少なくとも５０％である、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項２０】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類のインフルエンザ抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を高齢者に投与するステップを含む、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項２１】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、粒子と会合する、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を人間に投与するステップを含み、前記人間は少なくとも４９才である、人間における免疫応答を刺激する方法。
【請求項２２】
前記粒子は、ビロソーム、リポソーム、生分解性マイクロスフィア、自己集合性ペプチドナノ粒子、ウイルス様粒子又はこれらの組合せである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記粒子は自己集合性ペプチドナノ粒子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子はビロソームである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物の前記人間への投与は、抗原の出所に前記人間が曝露された結果の感染に対する保護免疫を提供する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記人間は４９才と約６４才との間の年齢である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記人間は少なくとも６５才の年齢である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記用量は、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ及び３０μｇからなる群より選択される少なくとも１種類の用量である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原はインフルエンザ抗原である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記インフルエンザ抗原はヘマグルチニンインフルエンザ抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記インフルエンザ抗原はＡ型インフルエンザ抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記インフルエンザ抗原はＢ型インフルエンザ抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記インフルエンザ抗原はＣ型インフルエンザ抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む組成物を高齢者に投与するステップを含み、抗体応答率が少なくとも７５％である、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項３５】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む組成物を高齢者に投与するステップを含み、抗体保持率が少なくとも９５％である、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項３６】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む組成物を高齢者に投与するステップを含み、抗体陽転率が少なくとも５０％である、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項３７】
少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類のインフルエンザ抗原の少なくとも一部とを含む組成物を高齢者に投与するステップを含む、高齢者における免疫応答を刺激する方法。
【請求項３８】
配列番号２に列挙される核酸配列。
【請求項３９】
配列番号４に列挙される核酸配列。
【請求項４０】
配列番号６に列挙される核酸配列。
【請求項４１】
配列番号３に列挙されるポリペプチド配列。
【請求項４２】
配列番号５に列挙されるポリペプチド配列。
【請求項４３】
配列番号７に列挙されるポリペプチド配列。
【請求項４４】
高齢者集団における免疫応答を刺激する方法であって、前記高齢者集団に少なくとも３μｇの配列番号１を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物の高齢者集団への投与によって生じる免疫応答は、
抗体陽転率が、５０％を超えるか、６０％を超えるか、７０％を超えるか、８０％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９９％を超えるかであること、
抗体保持率が、５０％を超えるか、６０％を超えるか、７０％を超えるか、８０％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９９％を超えるかであること、又は、
ワクチン接種後の中和抗体力価が平均４倍以上上昇することの基準のうち１つに該当するか、あるいは、超える、高齢者集団における免疫応答を刺激する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本件出願は引用によって本明細書に取り込まれる２０１０年１月６日出願の米国仮出願第６１／２９２，５９３号を基礎とする優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は高齢者に保護免疫を提供するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（６５才を超える）多くの高齢者はインフルエンザのような多くの疾患に対する免疫感作を受けているか、あるいは、暴露されているが、多くの者は健康を保つために免疫感作を受けることが必要な場合がある。
【０００４】
インフルエンザワクチンへの応答性を向上させることは１９７０年代からの大きな課題である（非特許文献１）。数多くの研究者が、標準的な１５μｇの用量を超える用量のヘマグルチニン（ＨＡ）の効果を探索してきた。高齢者に薬効のあるインフルエンザワクチンを提供するための最も徹底的で、かつ、記録がそろった治験はＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）に関するものである。３回の成功した治験（非特許文献２（表１）、非特許文献３（表２）及び非特許文献４（表３））が、ＨＡの用量を１５μｇから６０μｇまで増加させ、ＨＡ成分に焦点を当てることで、ＨＡＩの力価を約１．６ないし１．７倍に改善できることを証明した。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【０００５】
４０５μｇまでの用量のより積極的な研究（非特許文献５（表４）、非特許文献６（表５））の結果、約２．１倍のＨＡＩ力価改善がみられた。
【表４】
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【表５】
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【０００６】
高齢者におけるインフルエンザワクチンの効果を実証するその他の研究は以下の表に示される。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０００７】
一般に、高齢者はインフルエンザワクチン接種が困難な集団である。ワクチン用量を増加するといくらか役立つが、比例増加ではない。アジュバントも免疫原性の増大に役立つが、副作用の可能性も増大する。したがって、ＨＡの用量を増大することによる高齢者におけるインフルエンザに対する免疫応答の増強改善には限度がある。高齢者の免疫を強化する高齢者用改良ワクチン製剤の需要はまだ存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mostow SR,ら、(1973)、Inactivate vaccines in Volunteer studies with very high doses of influenza vaccine purified by zonal centrifugation Postgrad Med. J. 49: 152-158
【非特許文献２】Keitelら、(2006) Safety of high doses of influenza vaccine and effect on antibody responses in elderly persons. Arch. Intern. Med. 166: 1121-1127
【非特許文献３】Couchら、(2007) Safety and immunogenicity of a high dose trivalent influenza vaccine among elderly subjects Vaccine 25: 7656-7663
【非特許文献４】Falseyら、(2009) Randomized, double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years and older. J. Infect Dis. 200: 172-180
【非特許文献５】Keitelら、(1994) High doses of purified influenza A virus hemagglutinin significantly augment serum and nasal secretion antibody responses in healthy young adults. J Clin Microbiol 32: 2468-2473
【非特許文献６】Keitelら、(1996) Increased doses of purified influenza hemagglutinin and subvirion vaccines enhance antibody responses in the elderly Clin Diagn Lab immunol 3: 507-510
【非特許文献７】Keitel, Couch, J. Clin. Microbiol. 1994
【非特許文献８】Keitel, Clin. Diag. Lab. 1996
【非特許文献９】Cools et al. J. Med. Virol. 2009
【非特許文献１０】Squarcione, Sgricia, Biasio, Pernetti Vaccine 2003
【非特許文献１１】Frey, Poland, Vaccine 2003
【非特許文献１２】Treanor, JID 2006
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は一般的に高齢者の免疫応答を刺激する方法に関する。本発明は、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む組成物をヒトに投与するステップを含む、人間の免疫応答を刺激する組成物及び方法を含み、前記組成物は免疫応答を惹起するのに十分な用量で前記人間に投与され、前記人間は高齢者であり、該高齢者は４９才を超える年齢である。一部の実施態様では、前記組成物は、５５才か、６０才か、６５才か、７０才か、７５才か、８０才かを超える年齢の人に投与される。
【００１０】
本発明の組成物は、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む。前記フラジェリンと前記抗原とは、異なるやり方で会合する場合がある。例えば、前記フラジェリンと前記抗原とは融合タンパク質の一部であって、発現時にタンパク質の一部としてフラジェリン及び抗原の両方を含むタンパク質が産生されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列を構築することによって、前記融合タンパク質内で前記フラジェリン部分が前記抗原と会合する場合がある。前記フラジェリン部分と抗原部分とは他のやり方で会合する場合もあり、例えば前記フラジェリン部分と抗原部分とがそれぞれ粒子又はなんらかのタイプの担体と会合して、前記フラジェリン部分と前記抗原部分とが前記担体又は粒子と結合してもかまわない。
【００１１】
本発明は、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を人間の集団に投与するステップを含む、高齢者集団における免疫応答を刺激する組成物及び方法であって、抗体陽転率（seroconversion rate）は、少なくとも５０％か、少なくとも６０％か、少なくとも７０％か、少なくとも８０％か、少なくとも９０％か、少なくとも９５％か、少なくとも９９％かである、組成物及び方法にも関する。
【００１２】
本発明は、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を人間の集団に投与するステップを含む、高齢者集団における免疫応答を刺激する組成物及び方法であって、抗体応答率（seroresponse rate）は、少なくとも５０％か、少なくとも６０％か、少なくとも７０％か、少なくとも８０％か、少なくとも９０％か、少なくとも９５％か、少なくとも９９％かである、組成物及び方法にも関する。
【００１３】
本発明は、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む融合タンパク質を含む組成物を人間の集団に投与するステップを含む、高齢者集団における免疫応答を刺激する組成物及び方法であって、抗体保持率（seroprotection rate）は、少なくとも５０％か、少なくとも６０％か、少なくとも７０％か、少なくとも８０％か、少なくとも９０％か、少なくとも９５％か、少なくとも９９％かである、組成物及び方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＶＡＸ１２５）のアミノ酸配列
【図２Ａ】６５才以上の被験者でのＶＡＸ１２５を用いるワクチン接種第１４日の測定されたピークＧＭＨＡＩ応答のグラフ
【図２Ｂ】６５才以上の被験者での０．５μｇから８μｇまでの範囲のＶＡＸ１２５を単回投与後０日から２８日までに測定されたピークＧＭＨＡＩ力価のグラフ
【図３】Ｖａｘ１２８Ａ、Ｖａｘ１２８Ｂ及びＶａｘ１２８Ｃのプラスミドマップ
【図４】Ｖａｘ１２８Ａ（ＨＬ１８４  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７（ＣＡ０７  Ｈ１Ｎ１））のヌクレオチド配列
【図５】Ｖａｘ１２８Ａ（ＨＬ１８４  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７（ＣＡ０７  Ｈ１Ｎ１））のアミノ酸配列
【図６】Ｖａｘ１２８Ｂ（ＨＬ１８５  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７（ＣＡ０７  Ｈ１Ｎ１））のヌクレオチド配列
【図７】Ｖａｘ１２８Ｂ（ＨＬ１８５  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７（ＣＡ０７  Ｈ１Ｎ１））のアミノ酸配列
【図８】Ｖａｘ１２８Ｃ（ＨＬ１８６  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７（ＣＡ０７  Ｈ１Ｎ１））のヌクレオチド配列
【図９】Ｖａｘ１２８Ｃ（ＨＬ１８６  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７（ＣＡ０７  Ｈ１Ｎ１））のアミノ酸配列
【図１０】ＶＡＸ１２８（ＣＡ０７）を単回筋注投与された１８−４９才の被験者１１２名と、６５才以上の被験者１００名との免疫応答を用量ごとに比較したグラフ（備考：ＶＡＸ１２８のＡ−Ｃに対する応答がプールされた）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の特徴その他の詳細は、本発明のステップ又は本発明の部分の組合せのいずれであっても、以下に具体的に説明され、特許請求の範囲に記載される。本発明の特定の実施態様は図面により示されるが、本発明を限定するものとしてでなないことが理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、さまざまな実施態様に用いることができる。
【００１６】
１の実施態様では、本発明は人間の免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部と、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部とを含む組成物を前記人間に投与するステップを含み、前記組成物は、少なくとも４９才の人間に投与される。前記組成物の前記人間への投与は、前記抗原の出所に前記人間が暴露された結果起こる感染に対する保護免疫を提供することができる。
【００１７】
本発明の組成物は、少なくとも１種類のフラジェリンの少なくとも一部と、少なくとも１種類の抗原の少なくとも一部とを含む。前記フラジェリン及び前記抗原は異なるやり方で会合される場合がある。例えば、前記フラジェリンと前記抗原とは、融合タンパク質の一部となって、発現するとフラジェリン及び抗原の両方を含むタンパク質を産生する、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列を構築することによって、前記融合タンパク質中で前記フラジェリン部分が前記抗原と会合する場合がある。前記フラジェリンの一部と抗原の一部とは他のやり方で会合する場合があり、例えば、これらの部分のそれぞれが粒子又は担体と会合し、タンパク質、リポタンパク質、糖類、多糖類及び／又は脂質を含むがこれらに限定されない前記抗原の一部と、前記フラジェリンの一部との両方が前記担体又は粒子に結合する場合がある。前記粒子又は担体は、前記フラジェリンの一部と、前記抗原の一部とが、人体に導入されるとき免疫応答を起こすように会合する場合がある。粒子製剤は脂質、タンパク質、ワックス又はアミノ酸類、多糖類、ポリアクリル物質又は有機酸類を含むが、これらに限定されない、さまざまな材料でできる場合がある。１の実施態様では、前記フラジェリンの一部と抗原の一部とは、例えば、引用によって本明細書に取り込まれる米国特許出願公開第２０１０／１３６０５３号明細書に説明されるビロソームに会合する場合がある。前記抗原及びフラジェリンが結合する可能性がある粒子は、ウイルス様粒子と、生分解性ミクロスフェアと、リポソームと、ペプチドナノ粒子と、ナノ粒子と、引用によって本明細書に取り込まれる国際公開第２０１０／００２８１８号パンフレットに説明される自己集合型ウイルス様粒子とを含むが、これらに限定されない。１の実施態様では、フラジェリン及び抗原は自己集合型ペプチドナノ粒子（self-assembling peptide nanoparticles、以下、「ＳＡＰＮ」という）と会合する。ＳＡＰＮは国際公開第２００９／１０９４２８号パンフレットに説明され、引用によって本明細書に取り込まれる。これらのナノ粒子は、リンカーセグメントによって連結された２個のオリゴマ化ドメインを含む、連続したペプチド鎖の凝集体でできていて、一方又は両方のオリゴマ化ドメインはそのペプチド配列内にＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを取り込んでいる。本発明の組成物及び方法においてフラジェリンと組み合わせて使用可能な抗原は、人間に免疫応答を惹起させるいかなる抗原であってもよい。本発明の組成物に使用される抗原は、インフルエンザウイルス抗原（例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、マトリックス２（Ｍ２）タンパク質、ノイラミニダーゼ）と、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原（例えば、融合タンパク質、結合糖タンパク質）と、パピローマウイルス抗原（例えば、Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、Ｌ１タンパク質及びＬ２タンパク質のようなヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原）と、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス及び（例えばデング熱ウイルス抗原、西ナイルウイルス抗原のような）フラビウイルスの抗原と、ＨＢＶ及びＨＣ由来の抗原を含む肝炎ウイルス抗原とのようなウイルス抗原を含む。本発明の組成物に使用される抗原は、肺炎��菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）と、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）と、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）と、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）を含む腸内グラム陰性病原体とを含む細菌抗原を含む。本発明の組成物に使用される抗原は、カンジダ属菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）と、アスペルギルス属菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）と、クリプトコックス・ネオフォルマンス菌（Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）と、コクシジオイデス属菌（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）と、ヒストプラスマ・カプスラーツム菌（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）と、ニューモシスチス・カリニ菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）と、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）と、熱帯マラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）と、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）と、卵型マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）と、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）とを含む真菌抗原を含む。
【００１８】
本発明の組成物におけるフラジェリン対抗原の比は、約１００：１から約１：１００までの場合がある。他の実施態様では、フラジェリン対抗原の比は、約１：２０から約２０：１までの場合がある。フラジェリン及びインフルエンザ抗原の好ましい実施態様では、フラジェリン対インフルエンザ抗原の比は、約１：２０から約１：５までである。特にフラジェリンとインフルエンザ抗原とが融合タンパク質で連結される一部の実施態様では、フラジェリン対インフルエンザ抗原の比は、５：１から１：５までの場合がある。
【００１９】
本発明の組成物は、１種類または２種類以上の抗原が会合した１種類または２種類以上のフラジェリンを含む場合がある。粒子担体については、複数種類の異なるフラジェリンが同一粒子か異なる粒子かの上の１種類または２種類以上の抗原と会合する場合がある。
【００２０】
好ましい実施態様では、本発明の組成物に含まれる抗原はインフルエンザウイルス由来の抗原である。好ましい抗原はヘマグルチニン（ＨＡ）である。好ましい実施態様ではＨＡ配列は、フラジェリンか、引用によって本明細書に取り込まれる国際公開第２００９／１２８９５０号パンフレットに説明される改変フラジェリンかにコンジュゲーションされる。ＨＡを抗原として用いる本発明の好ましい実施態様は、ＶＡＸ１２５、ＶＡＸ１２８Ａ、ＶＡＸ１２８Ｂ及びＶＡＸ１２８Ｃである。ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＳＩ）としても知られるＶＡＸ１２５は、Ａ型インフルエンザ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）のＨＡのＨＡ１ドメインの球状頭部（第６２−２８４アミノ酸残基）にカルボキシル末端で融合した、ＴＬＲ５リガンドであるネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の２型フラジェリン（ＳＴＦ２）からなる組換え融合タンパク質であり、分子量は７７，５５９ｋＤａである。前記ワクチン組成物の分子量の約３分の２はフラジェリンで、３分の１はインフルエンザＨＡ球状頭部である。したがって用量３μｇは、２μｇのフラジェリンと、１μｇのインフルエンザＨＡとからなる。ＶＡＸ１２５のアミノ酸配列（配列番号１）は図１に示される。ＨＬ１８４  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７としても知られるＶＡＸ１２８Ａは、インフルエンザの汎発流行性株Ａ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡのＨＡ１ドメインの球状頭部にカルボキシル末端で融合した、ＴＬＲ５リガンドであるネズミチフス菌の２型フラジェリン（ＳＴＦ２）からなる組換え融合タンパク質である。ＶＡＸ１２８Ａのヌクレオチド配列（配列番号２）及びアミノ酸配列（配列番号３）はそれぞれ図４及び図５に示される。ＨＬ１８５  ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ７としても知られるＶＡＸ１２８Ｂは、前記フラジェリンのＤ３ドメインが除去され、Ａ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡのＨＡ１ドメインの球状頭部に置換されたＲ３融合体である。ＶＡＸ１２８Ｂのヌクレオチド配列（配列番号４）及びアミノ酸配列（配列番号５）はそれぞれ図６及び図７に示される。ＨＬ１８６  ＳＴＦ．２．ＨＡ１−２  ＣＡ７としても知られるＶＡＸ１２８Ｃは、前記フラジェリンのＤ３ドメインが除去され、Ａ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡ１ドメインの球状頭部に置換され、本フラジェリンのカルボキシル末端がＡ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡのＨＡ１ドメインの球状頭部に置換され、本フラジェリンのカルボキシル末端がＡ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡのＨＡ１ドメインの球状頭部に融合される、Ｒ３２ｘ融合体である。したがって、前記融合タンパク質は、フラジェリン単位あたり２個のコピーのＨＡ抗原を含む。ＶＡＸ１２８Ｃのヌクレオチド配列（配列番号６）及びアミノ酸配列（配列番号７）はそれぞれ図８及び図９に示される。ＶＡＸ１２８Ｃでは、前記ＨＡの球状頭部のコピーが２個あり、ワクチン組成物中のＨＡの割合がＶＡＸ１２８Ａコンストラクトの３３％から５４％に増大している。
【００２１】
本件の出願人の出願に係る方法の利点は、感染性病原体（例えばインフルエンザ）に対する抗原の比較的低用量を用いて高齢者集団で保護免疫を起こさせることができる点を含む。高齢者は、感染性病原体抗原に対する適切かつ持続的な免疫応答を行うことができないことが部分的には理由となって、インフルエンザ抗原のような感染性病原体に暴露された後の疾患リスクが高いことが典型的である。高齢者の抗原に対する応答を増大させるために提案されるアプローチは、抗原用量及び投与頻度を増やすことである。しかし、かかる代替的な治療プロトコールは、高齢者集団において、抗原への暴露後、最適値より低い抗原に対する免疫応答をもたらし、疾患に対する保護免疫を提供する能力を減退させた（先行技術の製品及び研究に関して本明細書中に提供される表を参照せよ。）。本明細書で用いられる方法は、高齢者集団での免疫応答を改善し、前記高齢者集団の４０％を超える人が比較的低用量で投与される抗原に対して適切でかつ持続的な免疫応答を起こしたが、該適切でかつ持続的な免疫応答はまた、副作用を最小限にするという利点もある。本発明の組成物は、先行技術のワクチンよりも、免疫原性が強く、副作用を起こしにくい。
【００２２】
ある実施態様では、本発明の組成物及び方法で治療される人間は、４９才と、約６４才との間である。別の実施態様では、前記人間は６４才より高齢の場合がある。一部の実施態様では、前記組成物は、６０才を超える年齢か、６５才を超える年齢か、７０才を超える年齢か、７５才を超える年齢か、８０才を超える年齢かの人間に投与される。本発明の組成物の用量は、いかなる予期せぬ副作用をも低減させることを求めて高齢者での効果を最適化するために選択される場合がある。例えば、（ＶＡＸ１２５、ＶＡＸ１２８Ａ、ｖＸ１２８Ｂ及びＶＡＸ１２８Ｃの場合に説明されたとおり、）フラジェリン及びＨＡを含む融合タンパク質組成物において、用量は、副作用発症性を低く保つことを試みて、免疫応答を最適化するために選択される場合がある。０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ及び３０μｇからなる群より選択される少なくとも１種類の用量が、高齢者の人間で免疫応答を誘導するのに十分な場合がある。前記融合タンパク質の用量は、約０．１μｇから約５００μｇまでと、１μｇから約１００μｇまでと、１μｇから約５０μｇまでと、約１μｇから約３０μｇまでと、約１μｇから約２５μｇまでと、約１μｇから約２０μｇまでと、約１μｇから約１５μｇまでと、約１μｇから約１０μｇまでと、約２μｇから約５０μｇまでと、２μｇから約３０μｇまでと、約２μｇから約２０μｇまでと、約２μｇから約１０μｇまでと、約２μｇから約８μｇまでと、約３μｇから約５０μｇまでと、３μｇから約３０μｇまでと、約３μｇから約２０μｇまでと、約３μｇから約１０μｇまでと、約３μｇから約８μｇまでと、約３μｇから約５μｇまでと、約４μｇから約５０μｇまでと、４μｇから約３０μｇまでと、約４μｇから約２０μｇまでと、約４μｇから約１０μｇまでと、約４μｇから約８μｇまでと、約５μｇから約５０μｇまでと、５μｇから約３０μｇまでと、約５μｇから約２０μｇまでと、約５μｇから約１０μｇまでと、約５μｇから約９μｇまでと、約５μｇから約８μｇまでとを含む用量範囲内で前記人間に投与される場合がある。フラジェリン及びインフルエンザ抗原を含む融合タンパク質組成物に関して、用量とは、前記人間に与えられるワクチンに存在するタンパク質の量をいう。前記タンパク質の量の一部は前記抗原に関し、前記タンパク質量の一部は前記フラジェリンに関する。例えば、ＶＡＸ１２５、ＶＡＸ１２８Ａ及びＶＡｘ１２８ＢではＨＡ１抗原はコンストラクトの分子量の約３３％を構成する。ＶＡＸ１２８Ｃでは、ＨＡの球状の頭部のコピー数が２個あり、ワクチン中のＨＡの割合はＶＡＸ１２８コンストラクトの３３％から５４％に増大する。ＨＡ以外の抗原を用いる実施態様、特に抗原が非タンパク質起源の実施態様では、抗原の量によって用量を特徴づけることがより有用かもしれない。いかなる場合でも、本発明のフラジェリン／抗原組成物は、高齢者の治療において先行技術の組成物よりも優れた特性を提供する。
【００２３】
前記フラジェリン及び抗原が粒子を介して送達される組成物について、用量は使用される粒子のタイプと組成物中に存在するフラジェリン対抗原の比とに依存するであろう。フラジェリン及び前記抗原が１：１以外の比で存在する組成物について、用量は成分の比に依存するであろう。インフルエンザ抗原以外の抗原について、用量は使用される抗原とフラジェリン対抗原の比とに依存するであろう。当業者は、担体、抗原及びフラジェリン対抗原の比に基づいて、フラジェリン組成物の最適用量を決定することが容易にできるかもしれない。
【００２４】
本発明の融合タンパク質組成物の抗原成分は、インフルエンザ抗原（インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣ抗原）であることが好ましい。本組成物の好ましい実施態様では、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原（例えば、融合タンパク質が配列番号１（図１）を含む）と、マトリックス２（以下で「Ｍ２ｅ」というＭ２のエクトドメイン（ｅｘｔｏｄｏｍａｉｎ）のようなＭ２）と、ノイラミニダーゼインフルエンザ抗原とからなる群より選択される少なくとも１種類のメンバーである。前記インフルエンザ抗原は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ抗原を含む場合がある。好ましい実施態様では前記抗原は、引用によって本明細書に取り込まれる国際公開第２００９／１２８９５０号パンフレットに説明されるようなフラジェリン分子の配列に融合される。本発明の組成物は、各融合タンパク質に含まれる１種類または２種類以上の抗原配列を有する１種類または２種類以上の融合タンパク質を含む場合がある。
【００２５】
前記組成物は、単回又は複数回投与で人間に筋注投与される場合がある。前記方法は、前記フラジェリン／抗原組成物をその後に少なくとも１回前記人間に投与するステップをさらに含む場合がある。
【００２６】
本発明に従って使用するための免疫原性のある組成物は、標準として０．５ｍＬの注射可能な用量で送達され、約０．１μｇから約５０μｇの抗原を含む場合がある。本発明に従って使用するための免疫原性のある組成物の好ましい実施態様では、標準の０．５ｍＬの注射可能な用量で、約３μｇから約２０μｇの抗原を含む。ワクチンの体積は、０．２５ｍＬと１．０ｍＬとの間の場合があり、０．５ｍＬと１．０ｍＬとの間が適当で、特に０．５ｍＬが標準的である。本発明に従うワクチン用量は、従来の投与法よりも小さい体積で提供される場合がある。本発明に従う小体積用量は、０．５ｍＬ未満が適当で、０，３ｍＬ未満が典型的で、通常は０．１ｍＬ以上である。
【００２７】
したがって本発明の１の局面では、本件に係る組成物、方法又は使用について提供されるのは、前記組成物の投与によって人間の集団において生じる免疫応答であって、前記人間は約４９才から約６４才までか、あるいは、前記人間は５５才を超える年齢か、６０才を超える年齢か、６５才を超える年齢か、７０才を超える年齢か、７５才を超える年齢か、８０才を超える年齢かであり、抗体陽転率は、５０％を超えるか、６０％を超えるか、６５％を超えるか、７０％を超えるか、７５％を超えるか、８０％を超えるか、８５％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９９％を超えるかの免疫応答である。
【００２８】
したがって本発明のある局面では、本件に係る組成物、方法又は使用について提供されるのは、前記組成物の投与によって人間の集団において生じる免疫応答であって、前記人間は約４９才から約６４才までか、あるいは、前記人間は５５才を超える年齢か、６０才を超える年齢か、６５才を超える年齢か、７０才を超える年齢か、７５才を超える年齢か、８０才を超える年齢かであり、抗体保持率は、５０％を超えるか、６０％を超えるか、６５％を超えるか、７０％を超えるか、７５％を超えるか、８０％を超えるか、８５％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９９％を超えるかの免疫応答である。
【００２９】
抗体応答とは、ＨＡＩ抗体力価が少なくとも４倍高くなり、ワクチン接種後の力価が最低限４０であることをいう。
【００３０】
抗体保持とは、ワクチン接種前のＨＡＩ力価が４０未満の被験者の間で、ワクチン接種後のＨＡＩ力価が最低限４０に達することをいう。
【００３１】
抗ＨＡ抗体応答について抗体陽転率とは、各グループにおいてワクチン接種後の力価が１：４０以上である被験者の割合をいう。抗体保持率とは、ワクチン接種前のＨＡＩ力価が１：１０未満で、かつ、ワクチン接種後の力価が１：４０以上である被験者の百分率をいう。しかし、初期力価が１：１０以上の場合には、ワクチン接種後の抗体量が少なくとも４倍増大する必要がある。
【００３２】
本発明の別の局面では、本件に係る組成物、方法又は使用について提供されるのは、本発明の組成物の投与によって生じる免疫応答が、高齢者の被接種者の大半において機能的な（ＨＡＩ）抗体を用量依存的に誘導することである。一部の実施態様では前記組成物は、第７日、第１４日又は第２８日に約５０を超える力価の中和抗体応答を誘導するであろう。別の実施態様では前記組成物は、第７日、第１４日又は第２８日に約１００を超える力価の中和抗体応答を誘導するであろう。別の実施態様では前記組成物は、第７日、第１４日又は第２８日に約１５０を超える力価の中和抗体応答を誘導するであろう。別の実施態様では前記組成物は、第７日、第１４日又は第２８日に約２００を超える力価の中和抗体応答を誘導するであろう。
【００３３】
したがって本発明の１の局面では、本件に係る組成物、方法又は使用について提供されるのは、本発明の組成物の高齢者集団への投与によって生じる免疫応答が、以下の基準の１つに該当するか、あるいは、超えることである。
【００３４】
抗体陽転率が、５０％を超えるか、６０％を超えるか、７０％を超えるか、８０％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９９％を超えること。
【００３５】
抗体保持率が、５０％を超えるか、６０％を超えるか、７０％を超えるか、８０％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９９％を超えること。
【００３６】
ワクチン接種後に中和抗体力価が平均４倍以上増大すること。
【００３７】
人間に投与される組成物及び融合タンパク質の量について「有効量」とは、前記被験者に投与されると治療上の薬効に十分な量（例えば、被験者における免疫応答を刺激するのに十分な量、被験者における保護免疫を提供するのに十分な量）の組成物の量又は用量をいう。
【００３８】
本発明の方法は、経腸的又は非経口的手段で本発明の組成物及び融合タンパク質を投与することにより達成できる。具体的には、投与経路は前記組成物及び融合タンパク質の筋注である。本発明の投与経路には、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、鼻内、経皮、坐薬又は皮下の経路も含まれる。
【００３９】
前記融合タンパク質を含む組成物は、単独で、あるいは、従来技術の添加剤との配合剤、例えば、前記組成物と有害な反応を行わず、経腸的又は非経口的用途に適する、薬学的又は生理学的に許容できる有機又は無機担体物質との配合剤として投与される場合がある。薬学的に許容できる適切な担体は、（リンゲル液のような）塩類溶液と、アルコールと、油類と、ゼラチン類と、ラクトース、アミロース又はデンプンのような糖類と、脂肪酸エステルと、ヒドロキシメチルセルロースと、ポリビニルピロリジンとを含む。かかる製剤は、消毒され、必要なら、人間に投与する組成物と有害な反応を行わない、滑剤、保存料、安定剤、助剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、バッファー、着色物質及び／又は香料その他のような助剤と混合される場合がある。本発明のワクチンを希釈するために好ましい希釈剤は、ヒスチジン及びトレハロースを含む１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むが、これに限定されない。
【００４０】
本発明の組成物、融合タンパク質及びタンパク質は、被験者において免疫応答を起こすために該被験者の免疫系に本発明の組成物、タンパク質及び融合タンパク質を提示する支持体表面に付着した状態で前記被験者に投与される場合がある。本発明の組成物、タンパク質及び融合タンパク質の提示は、抗体産生のために前記融合タンパク質の抗原性のある部分を曝露することを含むのが好ましい。前記支持体は生体適合性がある。ここで「生体適合性がある」とは、前記サポートが被験者において（例えば抗体産生のような）免疫応答を惹起しないことをいう。
【００４１】
被験者に投与する用量及び頻度（単回又は複数回）は、例えば、抗原への曝露につながる感染への事前曝露、被験者の健康状態、体重、ボディマスインデックス及び食事又は健康に関する問題を含むさまざまな要因に依存して異なる場合がある。その他の治療処方又は薬剤が、本発明の方法と、組成物、タンパク質又はポリペプチドとともに使われる場合がある。
【００４２】
本組成物は、単回投与か、少なくとも２回のような複数回投与かで人間に投与される場合がある。人間に複数回投与されるとき、第２回目又は第３回目の投与は、初回投与の後、日単位（例えば、１、２、３、４、５、６、７日）か、週単位（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週）か、月単位（例えば、１、２、３、３、５、６、７、８、９、１０月）か、年単位（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年）かの期間をおいて投与される場合がある。例えば前記組成物の第２回目の投与は、前記融合タンパク質を含む組成物の第１回目の投与の約第７日、約第１４日又は約第２８日に行われる場合がある。
【００４３】
本明細書において範囲は、およその特定の数値から、及び／又は、別のおよその特定の数値までとして表される。かかる範囲が表記されるとき、別の局面は、前記一方の特定の数値から及び／又は他方の特定の数値までを含む。同様に、数値が先行詞ａｂｏｕｔを用いて近似値として表されるとき、該特定の数値が別の局面を形成することが理解されるであろう。各範囲の端点は、他方の端点との関係で有意であり、同時に、他方の端点と独立に有意である。
【００４４】
融合タンパク質の投与は、マイクログラム単位の用量を基準に行われる。本発明は、一般的には、抗原に対する免疫応答、特に、保護免疫応答を刺激して、人間の高齢者集団を治療する方法であって、抗原を含む抗原性組成物の比較的低用量を用いる方法に向けられる。本発明の実施例実施態様の説明は以下のとおりである。
【実施例】
【００４５】
実施例１
第II相非盲倹用量漸増用量範囲探索試験
ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＳＩ）（ＶＡＸ１２５）は、Ａ型インフルエンザ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）のＨＡのＨＡ１ドメインの球状頭部（第６２−２８４アミノ酸残基）にカルボキシル末端で融合した、ＴＬＲ５リガンドであるネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の２型フラジェリン（ＳＴＦ２）からなる組換え融合タンパク質であり、分子量は７７，５５９ｋＤａ（配列番号１）である。ワクチンは２０μｇ／ｍＬ又は２μｇ／ｍＬのいずれかでガラスバイアル入りで供給され、投与日に最終濃度に希釈バッファー（ヒスチジン及びトレハロースを含む１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で希釈された。試験材料は非盲倹の薬剤師により調製され、盲倹の臨床スタッフに提供された。ワクチンは三角筋に深部筋注により最終体積０．５ｍＬで投与された。
【００４６】
地域で生活している  ６５才以上の成人１２０名（平均年齢７２才、範囲６４−８４才）が６つの用量グループに分かれて登録された。被検者は健康で、受診歴、身体所見及び臨床検査で確認された。治療中、臨床検査異常（全血球及び個別血球の計測値、及び、ＡＳＴ及びＡＬＴ）、ワクチン成分に対するアレルギー既往歴、過去半年以内のインフルエンザワクチン接種、又は、過去３０日以内の他のワクチン接種の被検者は治験参加から除かれた。
【００４７】
前記試験は、非盲倹用量漸増式で実行された。被検者２０名が３カ所以内の試験機関で各用量グループに登録された。被検者は、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、３．０μｇ、５μｇ及び８μｇの用量レベルで単回投与を受けた（表１０）。被検者は、ワクチン接種の３０分後、４時間後及び第１日に治験機関で、そして、第３日に電話面談で評価された。前記５μｇ及び８μｇのグループに登録された被検者は、ワクチン接種後４時間治験機関に残して観察された。さらに被検者は、ワクチン接種後第７日、第１４日及び第２８日の治験機関での診察の際に評価された。電話での接触による安全性の経過観察は、ワクチン接種の６ヶ月後及び１２ヶ月後にも行われた。
【表１０】
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【００４８】
免疫原性
大腸菌由来ヘマグルチニン抗原に応答して産生された抗体が卵で増殖されたインフルエンザウイルスによる血球凝集を阻害する能力は表１１及び表１２に示される。単回投与の第２８日のＨＡＩ抗体の幾何学的平均力価（ＧＭＴ）は用量依存的に増大し、ワクチン接種後ＧＭＴの最高値は５μｇされた被検者で検出された（表１１）。４倍以上の抗体応答が５又は８μｇの用量を投与された被検者の大半で検出された。５又は８μｇされた被検者の間では、被検者４０名中合計３０名（７５％）が４倍以上の血清ＨＡＩ抗体応答を示した。前記５μｇ及び８μｇのグループでは、１８名（４５％）の被検者はワクチン接種開始前に１：４０以上の力価があった。ワクチン接種前の血清ＨＡＩ抗体が１：４０以下の被検者２２名の間では、２１名（９８％）がワクチン接種第２８日までに少なくとも１：４０の力価に達した（表１２）。本試験におけるグループごとの抗体力価の動態は図２に示される。
【００４９】
ＩｇＧのＥＬＩＳＡ法により評価された抗フラジェリン応答は表１３に示される。ワクチン接種前の被検者における抗フラジェリンＩｇＧのレベルは低い。ワクチン接種前に検出された抗フラジェリン抗体のレベルと、副作用の頻度又は重篤度か、インフルエンザヘマグルチニンに対する血清抗体応答かのいずれかとの間には明確な相関は存在しなかった。
【００５０】
ＶＡＸ１２５によって生じる免疫応答が、Ｆａｌｓｅｙらにより報告されたＦｌｕｚｏｎｅ標準用量（１５μｇ）及び高用量（６０μｇ）のＨ１Ｎ１成分と比較された（表１４）。６５才以上の被検者における標準用量Ｆｌｕｚｏｎｅ投与後のＧＭＴの増大は約２倍で、高用量投与後は約４倍であった。これに対し、６５才以上の被検者における５μｇ用量のＶＡＸ１２５投与後のＧＭＴの増大は１０倍を超えた。これは、ＶＡＸ１２５グループでの抗体陽転率及び抗体保持率の高さにつながる。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【００５１】
反応原性
ワクチンは全ての用量グループで十分に許容された（表１５）。重篤（グレード３）又は生命の危険あり（グレード４）と判定されるいかなる副作用も認められず、重篤な副作用事象もなかった。中等度の腕の痛みが２μｇ以上の用量を投与された被験者の約２０％で観察された。全身的な副作用事象は通常軽度で、用量依存性は認められなかった。Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルが基準線及び第１日に測定された（表１６）。ＣＲＰの平均上昇倍数は用量依存性を示し、最高から２番目までの用量を投与された被験者では平均上昇倍数が５倍未満であった。３μｇ以上の用量では、被験者６０名の５６％が少なくとも２倍のＣＲＰを経験した。しかし、ＣＲＰが増大した者の大半（又は全員）が中等度の重篤性を超える局所又は全身の症状を伴うことはなかったか、あるいは、ステージ１の被験者についてＩＬ−６、ＩＬ−８又はＩＬ−１０の上昇を伴うことはなかった。
【表１５】
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【表１６】
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【００５２】
考察
ＶＡＸ１２５は、試験を行った用量の範囲では安全で、かつ、免疫原性が認められたが、免疫応答及びサイトカイン応答の点で、高齢者はＶＡＸ１２５に対してあまり鋭敏に反応しないようである。高齢者の３μｇグループでのＧＭＴ  ＨＡＩ力価のピーク値は１６０で、これは若年成人の０．１μｇグループと同様の値である。前記若年成人の０．３μｇ及び０．５μｇでのピーク力価は前記高齢者グループより高かった（表１７）。０．５μｇから２μｇまでの用量を投与された被験者７２名中４６名を含めて、０．５μｇ以上の用量を投与された被験者９６名中６１名（６４％）で、血清ＨＡＩ応答が４倍以上であった。ＶＡＸ１２５の０．５μｇ単回投与後のＧＭＨＡＩ力価は、６５才を超える被験者で５μｇ投与されたときに観察された力価と同様であったので、高齢者では、同じ力価を得るには１０倍近く用量を増やす必要があることが示唆された。
【表１７】
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【００５３】
表１８は、約６５才を超える健常な被験者と、１８−４９才の被験者とについてＣＲＰの平均値及び最大値の比較である。幾何学的平均値は３μｇグループまでは違いがないが、若年成人は３μｇで前記平均値がほぼ２倍になる。９５％信頼区間上限及び最大値はともに高齢者のほうが低い。
【表１８】
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【００５４】
これらのデータは高齢者での最適用量は３μｇを超えることを示唆するともいえるが、これほど低い用量でも、ＦｌｕｚｏｎｅＴＩＶ標準用量よりも優れたＨ１Ｎ１抗原に対するＨＡＩ応答であって、高用量Ｆｌｕｚｏｎｅ製剤で観察される応答と同程度のＨＡＩ応答を起こさせる（表１９）。
【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【００５５】
ＶＡＸ１２５は機能的な（ＨＡＩ）抗体を用量依存的に大半の高齢接種者で誘導する。５．０μｇ及び８．０μｇの用量は、高いＨＡＩ  ＧＭＴ値（それぞれ２２６及び２３４）と、高いＧＭＴ倍数応答（それぞれ１２．６及び７．７）とを惹起した。５．０μｇ用量が最も免疫原性が高かった。５．０μｇ及び８．０μｇの用量は、高い抗体陽転率（それぞれ８０％及び６５％）と、高い抗体保持率（それぞれ９５％及び１００％）とをもたらした。６５才以上の健常成人でのピークＧＭＴ値は、若年成人での０．５μｇ用量で観察される値と同様であった。これは、高齢者には高用量の製剤が必要であることを示唆する。高齢者用に大腸菌で高用量のインフルエンザワクチンを製造する能力は本製品に特有である。
【００５６】
実施例２
Ｖａｘ１２８Ａ、Ｖａｘ１２８Ｂ及びＶａｘ１２８Ｃの構築及び発現
クローニング及び発現
３種類のワクチン候補Ｖａｘ１２８Ａ、Ｖａｘ１２８Ｂ及びＶａｘ１２８Ｃのそれぞれを産生する大腸菌クローンは、各コンストラクトに特異的なプラスミド調製法の相違はあるが、類似した手法で作出された。ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）及びＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）は、ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０４）及びＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０４）をコード化するプラスミドからの突然変異体である。ＳＴＦ２Ｒ３．２ｘＨＡ１（ＣＡ０７)をコード化するプラスミドはＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）及びＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）から作出された。プラスミド構築及びクローン選択の詳細は以下に説明する。前記ワクチン候補のプラスミドマップが図３に示される。
【００５７】
Ｖａｘ１２８Ａ（ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７））のプラスミド構築
ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）をコード化するプラスミドを作出するために複数ステップＰＣＲ法が実施された。ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０４）をコード化するプラスミドが最初に作出され、それから、ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）をコードするように突然変異が導入された。ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０４）を作るためには、ＳＴＦ２をコード化するＤＮＡが（ＣＡ０４）ＨＡタンパク質のＨＡ１球状頭部ドメインをコード化するＤＮＡと融合された。ＳＴＦ２をコード化するＤＮＡはｐＥＴ２４ａ−ＳＴＦ２．ＨＡ１  ＦＬプラスミドから増幅された。ＨＡ球状頭部ドメインをコード化するＤＮＡは外部の業者（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州、メンロパーク）により合成され、ＰＣＲにより増幅された。ＳＦＴ２及びＨＡ１（ＣＡ０７）の両方のＤＮＡのゲル精製後、断片がいっしょに融合された。最終的なＰＣＲ産物（ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０４）融合タンパク質をコード化するＤＮＡ）は制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化され、前記ｐＥＴ２４ａプラスミドに連結された。ＳＴＦ２．ＨＡ１−２（ＣＡ０４）及びＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）のＨＡ部分の間には残基１個だけしか相違がないため、ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）は、ＳＴＦ２．ＨＡ１−２（ＣＡ０４）の部位特異的変異誘発によって作られた。組換えＤＮＡ配列は外部の業者（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．社）によって確認された。
【００５８】
Ｖａｘ１２８Ｂ（ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７））のプラスミド構築
ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）と同様に、ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１  ＣＡ４をコード化するプラスミドが最初に作成され、それから、ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）をコードするように突然変異が導入された。ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０４）を作るために、ＳＴＦ２のアミノ末端及びカルボキシル末端セクションの部分をコード化するＤＮＡが、ＣＡ４ＨＡタンパク質のＨＡ１球状頭部ドメインをコード化するＤＮＡと融合された。これは、ＳＴＦ２のＤ３ドメインを前記融合タンパク質のＨＡ１−２（ＣＡ０４）で置換される効果がある。ＳＴＦ２のアミノ末端及びカルボキシル末端のセクションの部分をコード化するＤＮＡがｐＥＴ２４ａ−ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０４）プラスミドからＰＣＲ増幅された。ＨＡ１（ＣＡ０４）をコード化するＤＮＡは同じプラスミドからＰＣＲ増幅された。ゲル精製されたＳＴＦ２及びＨＡ１（ＣＡ０４）断片が融合され、最終ＰＣＲ産物は制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化され、前記ｐＥＴ２４ａプラスミドに連結された。ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０４）及びＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）のＨＡ部分の間には残基１個だけしか相違がないため、ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）はＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０４）の部位特異的変異誘発により作られた。組換えＤＮＡ配列は外部の業者（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．社）によって確認された。
【００５９】
Ｖａｘ１２８Ｃ（ＳＴＦ２Ｒ３．２×ＨＡ１（ＣＡ０７））のプラスミド構築
ＳＴＦ２Ｒ３．２×ＨＡ１（ＣＡ０７）をコード化するプラスミドは、ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）プラスミド及びＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）プラスミドに由来するＤＮＡの融合から作られた。両方のプラスミドが別々にＮｄｅＩ及びＭｆｅＩ酵素で消化された。（インサートとしての）ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１（ＣＡ０７）及び（ベクターとしての）ＳＴＦ２．ＨＡ１（ＣＡ０７）の特定の断片がゲル精製され、ＳＴＦ２Ｒ３．２×ＨＡ１（ＣＡ０７）をコード化する完全なＤＮＡ配列を形成するように連結された。共通の制限酵素部位はＳＴＦ２のカルボキシル末端セクションにある。前記組換えＤＮＡ配列は外部の業者（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．社）によって確認された。
【００６０】
クローニング
前記ＤＮＡは商業的に入手可能な大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９０５３）を形質転換するのに用いられた。Ｎｏｖａｇｅｎ由来の大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞は、プラスミド単量体の収率を向上させて菌体内のプラスミドを安定化するのに役立つかもしれない、大腸菌のＢＬ２１株のｒｅｃＡ分離株である。前記細胞は、Ｉｏｎ及びｏｍｐＴプロテアーゼが欠損し、ＩＰＴＧで誘導可能なＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含むラムダプロファージが溶原化している。得られたＢＬＲ（ＤＥ３）クローンは、各ワクチン候補について研究用細胞バンク（a research cell bank）を作成するために用いられた。前記バンクを作成するためには、選択されたクローンが、０．５％グルコース及び２５μｇ／ｍＬカナマイシンが添加されたＬＢ培地中で増殖された。細胞は、グリセロールを最終濃度７％に添加された後、１ｍＬ凍結バイアル中で−６０ないし−８０℃で凍結された。タンパク質発現の研究では、前記ワクチン候補の予想分子量に対応するタンパク質は、クーマジー・ブルー染色と、抗フラジェリンモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティング解析とにより容易に可視化された。
【００６１】
タンパク質産生
以下に説明するコンストラクトは全て、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｆｌｊＢフラジェリン（ＳＴＦ２）と、２００９年に出現した新規なＨ１Ｎ１株（Ａ／カリフォルニア  ０７／２００９）由来の保護ヘマグルチニン抗原の球状頭部ドメインの一部との組合せを含む。
【００６２】
ＶＡＸ１２８Ａ
ＳＴＦ２．ＨＡ１−２  ＣＡ０７をコード化するｐＥＴ２４ａプラスミドが商業的に入手可能な大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞を形質転換するために用いられる。これらの細胞は研究細胞バンクとｃＧＭＰマスター細胞バンクとの両方を製造するために大量培養される。標的タンパク質を産生するために、バンクの細胞は、合成培地を用いて旋回フラスコ中で大量培養され、特定の光学密度になるまで増殖された。その後特定の量の細胞が、異なる合成培地を含むバイオリアクタ中に移された。前記バイオリアクタは、グルコースが消費しつくされるまでバッチモードで自動制御条件（Ｔ＝３０Ｃ、ｐＨ＝７、ＤＯ＞＝３０％）下で運転された。その時点で、合成フィード培地が前記バイオリアクタに特定の流速で添加される。３時間後、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度まで添加することによって、標的タンパク質の産生が開始された。前記細胞は誘導の４時間後に回収され、細胞のペーストが条件付けられた培地から遠心により分離された。凍結及び解凍の後、前記細胞は、トリス酢酸バッファー中で再懸濁され、高圧ホモジナイズ処理により溶解された。細胞溶解液の上清は遠心後回収された。タンパク質は、１４％ＰＥＧを用いて沈澱されてから、ｐＨ４の６Ｍ尿素中で再懸濁された。溶液のｐＨを８に調整した後、前記バッファーはＴＦＦによりトリス／酢酸バッファーに交換された。トリトンＸ−１１４及びＰＥＧが添加され、得られた溶液は遠心により界面活性剤相と水相とに分離された。前記水相は保持され濾過された。タンパク質は尿素の添加により変性され、ｐＨ８の６モル尿素溶液中タンパク質２ｇ／Ｌの濃度に希釈された。標的タンパク質はリフォールディングバッファーでの１０倍希釈によりバッチモードでリフォールディングされた。活性のある単量体ワクチンの初期精製はアニオン交換クロマトグラフィへの結合及び溶出により実施され、標的タンパク質及び不純物の溶出は塩濃度の段階的上昇による効果で行われた。濾過され、ＡＥＸ溶出液のｐＨが６．８に調整された後、活性のある単量体ワクチンは、ヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィ媒質を結合モードで利用することによってさらに精製された。不純物及び標的タンパク質の溶出はリン酸濃度を段階的に上昇させることにより行われた。濾過後、材料はＴＦＦ及び希釈により製剤バッファーにバッファー交換され、濾過され、分注されて、−７０℃で保存された。得られたバルクの医薬物質は同じ製剤バッファーで標的薬剤製品濃度に希釈され、投与前は−７０℃で保存された。
【００６３】
ＶＡＸ１２８Ｂの製造
ＳＴＦ２Ｒ３．ＨＡ１−２  ＣＡ０７をコード化するｐＥＴ２４ａプラスミドが商業的に入手可能な大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞を形質転換するために用いられた。これらの細胞は、研究細胞バンクとｃＧＭＰマスター細胞バンクとの両方を製造するために大量培養された。標的タンパク質を産生するために、バンクの細胞は、合成培地を用いて旋回フラスコ中で大量培養され、特定の光学密度になるまで増殖された。その後、特定の量の細胞が異なる合成培地を含むバイオリアクタ中に移された。前記バイオリアクタは、グルコースが消費しつくされるまでバッチモードで自動制御条件（Ｔ＝３０Ｃ、ｐＨ＝７、ＤＯ＞＝３０％）下で運転された。その時点で、合成フィード培地が前記バイオリアクタに特定の流速で添加された。３時間後、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度まで添加することによって、標的タンパク質の産生が開始された。前記細胞は誘導の４時間後に回収され、細胞のペーストが条件付けられた培地から遠心により分離された。凍結及び解凍の後、前記細胞は、トリス酢酸バッファー中で再懸濁され、高圧ホモジナイズ処理により溶解された。細胞溶解液の上清は遠心後回収され、リン酸バッファー中に再懸濁され、その次の遠心によって再度回収された。ペレットの再懸濁及び回収の過程は繰り返され、洗浄されたペレットはｐＨ８で６Ｍ尿素に可溶化された。攪拌後、可溶化されたタンパク質が遠心により回収され、溶液で２ｇ／Ｌに希釈された。流動中の９倍過剰のリフォールディングバッファー中に変性タンパク質を急速希釈することにより、標的タンパク質は適切なコンフォメーションにリフォールディングされた。前記変性タンパク質の溶液及びリフォールディングバッファーは管路内で１対９の流速比で混合され、アニオン交換クロマトグラフィカラムに装架される前に平均３０分間保持された。活性のある単量体ワクチンは前記ＡＥＸ媒質に結合され、標的タンパク質及び不純物の溶出は段階的な塩濃度の上昇による効果で行われた。濾過後、アニオン交換溶出液は水で１０％希釈され、さらなる精製のために別のアニオン交換クロマトグラフィカラムに装架された。不純物及び標的タンパク質の溶出は、トリス／酢酸の濃度を段階的に上昇させることによる効果で行われた。濾過後、材料はＴＦＦ及び希釈によって製剤バッファーにバッファー交換され、濾過され、分注されて、−７０℃で保存された。得られるバルクの医薬物質は同じ製剤バッファーで標的薬剤製品濃度に希釈され、投与前は−７０℃で保存された。
【００６４】
ＶＡＸ１２８Ｃの製造
ＳＴＦ２Ｒ３．２ｘＨＡ１−２  ＣＡ０７をコード化するｐＥＴ２４ａプラスミドが商業的に入手可能な大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞を形質転換するのに用いられた。これらの細胞は、研究細胞バンクとｃＧＭＰマスター細胞バンクとの両方を製造するために大量培養された。標的タンパク質を産生するために、バンクの細胞は、合成培地を用いて旋回フラスコ中で大量培養され、特定の光学密度になるまで増殖された。その後、特定の量の細胞が異なる合成培地を含むバイオリアクタ中に移された。前記バイオリアクタは、グルコースが消費しつくされるまでバッチモードで自動制御条件（Ｔ＝３０Ｃ、ｐＨ＝７、ＤＯ＞＝３０％）下で運転された。その時点で、合成フィード培地が前記バイオリアクタに特定の流速で添加された。３時間後、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度まで添加することによって、標的タンパク質の産生が開始された。前記細胞は誘導の４時間後に回収され、細胞のペーストが条件付けられた培地から遠心により分離された。凍結及び解凍の後、前記細胞は、トリス酢酸バッファー中で再懸濁され、高圧ホモジナイズ処理により溶解された。細胞溶解液の上清は遠心後回収され、リン酸バッファー中に再懸濁され、その次の遠心によって再度回収された。ペレットの再懸濁及び回収の過程が繰り返され、洗浄されたペレットはｐＨ８で６Ｍ尿素に可溶化された。攪拌後、可溶化されたタンパク質が遠心により回収され、溶液で２ｇ／Ｌに希釈された。標的タンパク質はリフォールディングバッファーに１０倍希釈されることによってバッチモードでリフォールディングされた。活性のある単量体ワクチンの初期精製はアニオン交換クロマトグラフィの結合及び溶出により実施され、標的タンパク質及び不純物の溶出は段階的な塩濃度の上昇による効果で行われた。濾過され、ＡＥＸ溶出液のｐＨが６．８に調整された後、活性のある単量体ワクチンは、ヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィ媒質を結合モードで利用することによってさらに精製された。不純物及び標的タンパク質の溶出はリン酸濃度を段階的に上昇させることにより行われた。濾過後、材料はＴＦＦ及び希釈により製剤バッファーにバッファー交換され、濾過され、分注されて、−７０℃で保存された。得られるバルクの医薬物質は同じ製剤バッファーで標的薬剤製品濃度に希釈され、投与前は−７０℃で保存された。
【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
実施例３
Ｖａｘ１２８Ａ、Ｂ、Ｃの第Ｉ相用量漸増用量範囲探索試験
１８−４９才の健常な成人と６５才以上の成人とにおけるＶＡＸ１２８Ａ、Ｂ及びＣのＨ１Ｎ１インフルエンザワクチンコンストラクトの安全性及び免疫原性を評価するための第Ｉ相用量漸増用量範囲探索試験が実施された。これらの３種類の新規インフルエンザワクチンコンストラクトは、ＴＬＲ５リガンドであるフラジェリンと融合された、新規Ｈ１Ｎ１（ＶＡＸ１２８）であるＡ／カリフォルニア／０７のＨＡ１ドメインの球状頭部を含み、大腸菌で産生される。Ｖａｘ１２８Ａでは前記ＨＡ１はフラジェリンのカルボキシル末端に融合されるが、ＶＡＸ１２８ＢではＨＡ１はフラジェリンのＤ３ドメインを置換し、ＶＡＸ１２８ＣではＨＡ１は前記Ｄ３ドメインを置換し、かつ、前記カルボキシル末端に融合される。ワクチンは２０μｇ／ｍＬ又は２μｇ／ｍＬのいずれかでガラスバイアル入りで供給され、投与日に最終濃度まで希釈バッファー（ヒスチジン及びトレハロースを含む１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で希釈された。試験材料は非盲倹状態の薬剤師によって調製され、盲倹状態の臨床スタッフに提供された。ワクチンは三角筋へ深部筋注により最終体積０．５ｍＬが投与された。
【００７１】
１８−４９才の健常成人被検者１１６名と６５才以上の健常成人１００名とが、２カ所のセンターで実施された二重盲倹偽薬対照臨床治験に参加した。用量漸増試験において被検者は、３種類のＶＡＸ１２８ワクチンコンストラクトの１つか、偽薬かを３：３：３：１の割合で投与された。ワクチンは０．５μｇから２０μｇまでの範囲の用量で筋注投与された。被検者は安全のため追跡され、第０日、第７日、第１４日及び第２８日に血清が卵で増殖されたウイルスに対する血球凝集−阻害（ＨＡＩ）試験に供された。血清のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、サイトカインレベル及び抗フラジェリン抗体も評価された。
【表２２】
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【表２３】
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【表２４ａ】
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【表２４ｂ】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７−１】
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【表２７−２】
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【表２７−３】
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【表２８】
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【００７２】
若年成人では、ＶＡＸ１２８Ａの最大許容用量（ＭＴＤ）は８μｇで、ＶＡＸ１２８ＢのＭＴＤはは１６μｇであった。ＶＡＸ１２８Ｃは２０μｇで安全で、これは試験されたなかで最高用量であった（表２２）。血清抗体応答は０．５μｇまで低い用量でもＨＡＩによって検出された。１．２５μｇないし２．５μｇの用量は１：２５０のＧＭＴを誘導し、抗体陽転率及び抗体保持率は９０％を超えた（表２４ａ及び２４ｂ）。６５才以上の成人では、３種類のワクチン全てが、ＶＡＸ１２８Ａ、Ｂ及びＣでそれぞれ８μｇ、１２μｇ及び２０μｇという試験された最高用量で安全であった（表２３）。２．５ないし４μｇの用量は７０−１８０の相互的な（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）なＨＡＩ力価と相関があり、８−１６μｇの用量は６０ないし３７０のＨＡＩ力価と相関があった（表２５）。表２６は年齢コホートによる免疫応答を示し、表２７は６５才以上の各個人についての応答を示す。
【００７３】
ＨＡ１及びフラジェリンの配置を改変することが広い治療可能用量範囲があり安全なインフルエンザワクチンを作成するために利用された。ＨＡ１球状頭部のコピーを２個有するＶＡＸ１２８ＣはＭＴＤが最高で免疫原性が最も高かった。原核生物の系で発現されたインフルエンザＨＡの球状頭部は機能的な抗体応答を誘導できた。活発な応答が比較的低い用量のＨＡ抗原で認められ、フラジェリンの添加が実質的なアジュバント効果を提供したことを示した。
【００７４】
本明細書内では、ある特徴が任意的であるといういかなる指摘も、当該任意的特徴に関するクローズド又は排他的又は否定的な文言を含む特許請求の範囲について（例えば、米国特許法第１１２条又は欧州特許条約第８３及び８４条に規定される）適切なサポートを提供することを意図する。排他的な文言は、いかなる追加の特許発明の対象を含むことからその特定の列挙された特徴を特異的に排除する。例えば、Ａが薬Ｘの場合があると指摘された場合には、かかる文言は、ＡがＸのみからなること、あるいは、ＡはＸ以外のいかなる他の薬も含まないことを明示的に指定するクレームについてサポートを提供する意図がある。「否定的な」文言は、前記任意的特徴そのものを特許請求の範囲から明示的に排除する。例えば、要素ＡがＸを含む場合があると指摘される場合には、かかる文言は、ＡはＸを含まないということを明示的に指定するクレームについてサポートを提供する意図がある。排他的又は否定的な用語の非限定的な例は、「のみ（ｏｎｌｙ）」、「だけ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、「単独で（ａｌｏｎｅ）」、「〜なしで（ｗｉｔｈｏｕｔ）」、「（例えば、同じタイプ、構造及び／又は機能の他のもの）〜が存在しない状態で（ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ）」、「〜を除く（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含まない（ｎｏｔ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜しない（ｎｏｔ）」、「できない（ｃａｎｎｏｔ）」又はかかる文言のいずれかの組合せ及び／又は変形を含む。
【００７５】
同様に、「ある（ａ、ａｎ）」、「前記、該（ｓａｉｄ）」又は「前記、該（ｔｈｅ）」のような単語が指示する対象は、文脈が反対の指摘をする場合を除いて、単数及び／又は複数の出来事の両方をサポートする意図である。例えば、「犬（ａ  ｄｏｇ）」は、１匹の犬、犬１匹いるかいないか、少なくとも１匹の犬、複数匹の犬、等についてサポートを含む意図がある。単数を示す修飾語の非限定的な例は、「単一の（ｓｉｎｇｌｅ）」、「１つの（ｏｎｅ）」、「単独で（ａｌｏｎｅ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ）」、「あっても１つだけ（ｎｏｔ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」等である。（潜在的又は現実的な）複数を示す修飾語の非限定的な例は、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」、「１以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「１を超える（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」、「２以上（ｔｗｏ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「多数の（ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）」、「複数（ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」、「いずれかの組合せ（ａｎｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ）」、「いずれかの順列（ａｎｙ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ）」、「１以上のいずれかの（ａｎｙ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｏｆ）」等を含む。あるグループのメンバーの１つまたは２つ以上の間に「又は（ｏｒ）」を含むクレーム又は明細書の記載は、反対の指摘をされるか、あるいは、その他文脈から明かであると指摘される場合を除いて、前記グループのメンバーの１つか、２つ以上か、全てかが、ある製品又は方法に存在するか、用いられるか、あるいは、その他関連する場合に満たすと考えられる。
【００７６】
本明細書において範囲が示されるときには端点は含まれる。さらに、特記されるか、あるいは、その他文脈及び当業者の理解から明らかであるかの場合を除いて、範囲として表現される数値は、文脈が明確に異なるとの指示がある場合を除いて、当該発明の異なる実施態様において表明された範囲内のいずれかの特定の数値又は下位の範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅ）を、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで当然含むことができると理解されるべきである。
【００７７】
本明細書において引用された全ての刊行物及び特許は、あたかも個々の刊行物又は特許のそれぞれが特に個別に引用により取り込まれることが指摘されたかのごとく、引用により本明細書に取り込まれる。いかなる刊行物の引用も、本件特許出願日前の開示のためであり、本発明が先発明を理由としてかかる刊行物より先になされたと主張する資格がないことの承認として解釈されるべきではない。
【００７８】
本発明は、実施例及びその実施態様を参照して具体的に示され、説明されたが、添付する特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形式及び詳細のさまざまな変更が行われる場合があることは当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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