(57)【要約】  本発明の実施形態は、３次元の構造化照明による顕微鏡法のための照明を提供および制御することを対象とする。平面のビームスプリッタによって、「ビームトリプレット」と呼ばれる３つの位相一貫ビームが作られる。これらのビームの相対位相は、圧電結合されたミラーまたは他の手段によって制御される。ビームは顕微鏡対物レンズを通過して干渉し、３Ｄの構造化照明パターンを作り出す。パターンの空間的な向きおよび位置は、ビームの相対位相を調整することによって操作される。【選択図】図２１
2013513823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄ構造化照明に基づく蛍光顕微鏡内に含まれる構造化照明モジュールであって、
構造化照明モジュールフレームと、
前記構造化照明モジュールフレームの上部水平板の下面に結合された中心の傾斜ミラーを含むビーム位置合わせモジュールと、
１組の誘導ミラーであり、前記誘導ミラーの１つが、前記中心の傾斜ミラーから反射された、偏光された可干渉性の入力光を所与の時点で受け取る、１組の誘導ミラーと、
前記構造化照明モジュールフレームの３つのアーム上の３組のビームスプリッタであり、前記ビームスプリッタがそれぞれ、前記１組の誘導ミラーの１つの誘導ミラーから前記各組のビームスプリッタへリエレクト（ｒｅｅｌｅｃｔｅｄ）された入射する照明ビームを可干渉性ビームトリプレットに分割する、３組のビームスプリッタと、
前記組のビームスプリッタの１つによって生成されて前記ビーム位置合わせモジュールから反射されたビームトリプレットを所与の時点で受け取り、前記ビームトリプレットの前記ビーム間に所望の相対位相関係を導入する位相シフトモジュールとを備える構造化照明モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年１２月９日出願の仮出願第６１／２８５，１６６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、蛍光顕微鏡法に関し、詳細には、３Ｄ−ＳＩＭ撮像のための高速画像収集の光学電気機械的な方法およびサブシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
３次元の構造化照明による顕微鏡法（「３Ｄ−ＳＩＭ」）は、細胞生物学で使用される従来の広視野の蛍光顕微鏡と比較すると、横方向および軸方向の解像度において２倍の改善を実現する。３Ｄ−ＳＩＭは、特定の競合する超解像技法とは異なり、特殊な蛍光性染料または蛋白質を必要としない。生物学者は、３Ｄ−ＳＩＭによって高い解像度を実現するだけでなく、便利でよく知られている蛍光標識付け技法を保持する。移動および回転する照明パターンを用いて、対象の複数の画像が作られる。より高い解像は、普通なら回折によってぼやける空間の細部を復元するための連立方程式を解くことによって実現される。
【０００４】
現在利用可能な市販の３Ｄ−ＳＩＭ機器は、直線偏光されたレーザビームを使用し、このビームは、２値位相格子によって３つの次数に分割される。回折された３つの次数（それぞれ第０および±第１）は、顕微鏡対物レンズの後方焦点面上へ集束され、組み合わさって試料体積内に３次元の干渉縞パターンを形成する。３Ｄ−ＳＩＭデータは、この縞パターンによって励起された蛍光画像を取得し、格子を周期の５分の１、約５マイクロメートルだけ動かし、次いで別の画像を取得し、合計５つの画像に対してこれらのステップを繰り返すことによって獲得される。次いで、この格子は６０度回転され、５つの画像のプロセスが繰り返され、それに続いて別の回転が行われ、１つのｚステップ当たり合計１５個の画像の場合、別の５つの画像が、対物レンズを通過する光軸と一致する。ここで、ｚステップは軸内の固定の点である。通常、１スタック当たり合計１２０個の画像の場合、少なくとも８つのｚステップが望ましい。これらの画像は、従来の広視野顕微鏡法によって得られる解像度の約２倍で光学的に分割された３Ｄ画像を回復するための連立１次方程式を解くために使用される。これに伴う画像取得時間は、かなりの量である。レーザ露出は、５〜１００ｍｓに及ぶことがあり、カメラの読出しは、１つのフレーム当たり約５０ｍｓに及ぶことがあり、格子の運動および整定は、数十ミリ秒に及ぶことがあり、また格子／偏光子アセンブリの回転は、ほぼ１秒に及ぶことがあり、３Ｄ−ＳＩＭスタックの取得時間は１０〜２０秒になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態は、３次元の構造化照明による顕微鏡法のための照明を提供および制御することを対象とする。平面のビームスプリッタによって、「ビームトリプレット（ｂｅａｍ  ｔｒｉｐｌｅｔ）」と呼ばれる３つの位相一貫ビームが作られる。これらのビームの相対位相は、圧電結合されたミラーまたは他の手段によって制御される。ビームは顕微鏡対物レンズを通過して干渉し、３Ｄの構造化照明パターンを作り出す。パターンの空間的な向きおよび位置は、ビームの相対位相を調整することによって操作される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】標準的な光学顕微鏡または蛍光顕微鏡などの光学系の抽象的な図である。
【図２】光学撮像に対する数学的モデルを示す図である。
【図３】光学撮像に対する数学的モデルを示す図である。
【図４】光学撮像に対する数学的モデルを示す図である。
【図５】図４を参照して上記で論じたインパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；ｘ’，ｙ’）の特性を示す図である。
【図６】図４を参照して上記で論じたインパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；ｘ’，ｙ’）の特性を示す図である。
【図７】図４を参照して上記で論じたインパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；ｘ’，ｙ’）の特性を示す図である。
【図８】図４を参照して上記で論じたインパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；ｘ’，ｙ’）の特性を示す図である。
【図９】光学系へ入力される画像およびその光学系に対するインパルス応答関数から光学系の出力画像を算出するための、図４を参照して上記で論じた畳み込みに基づく数学的モデルを示す図である。
【図１０】光学系へ入力される画像およびその光学系に対するインパルス応答関数から光学系の出力画像を算出するための、図４を参照して上記で論じた畳み込みに基づく数学的モデルを示す図である。
【図１１】光学顕微鏡法に関連する回折限界を示す図である。
【図１２】図１２Ａは、超解像の顕微鏡法の基本を示す図である。図１２Ｂは、超解像の顕微鏡法の基本を示す図である。
【図１３】空間領域と空間周波数領域の関係を示す図である。
【図１４】図１３と同じ図示規則を使用する、蛍光顕微鏡の解像度を増大させる１つの手法を示す図である。
【図１５】従来の顕微鏡法を使用する３次元撮像に関連する第２の問題を示す図である。
【図１６】実空間の試料体積を撮像しようとする従来の光学系がアクセス可能な空間周波数領域または逆空間の体積を示す図である。
【図１７】図１７Ａは、３つの可干渉性の照明ビームを使用する３次元の構造化照明パターンまたはグリッドの生成を示す図である。図１７Ｂは、３つの可干渉性の照明ビームを使用する３次元の構造化照明パターンまたはグリッドの生成を示す図である。
【図１８】従来の３Ｄ−ＳＩＭ装置を示す図である。
【図１９】典型的な３Ｄ−ＳＩＭ強度パターンの模擬横断面を示す図である。
【図２０Ａ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｂ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｃ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｄ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｅ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｆ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｇ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｈ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２０Ｉ】上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す図である。
【図２１】本発明の一実施形態の多くの特徴を示す概略図である。
【図２２】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２３】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２４】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２５】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２６】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２７】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２８】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図２９】本発明の一実施形態をさらに示す図である。
【図３０】本発明の一実施形態による３Ｄ−ＳＩＭを調節する際に使用されるＭａｔＬａｂ表示の更新を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の実施形態は、３次元照明パターンを作り出すために３Ｄ−ＳＩＭ機器内に含まれ、または３Ｄ−ＳＩＭ機器に追加された構造化照明モジュール（「ＳＩＭ」）を含む、高速の３Ｄ−ＳＩＭ撮像を実現するデバイスおよび装置を対象とし、３次元照明パターンの位置および向きは、下記で論じるＳＩＭの電気光学機械的な制御特徴によって制御される。以下に提供する最初の小段落では、フーリエ光学系の簡単な概要を提供する。フーリエ光学系に精通していれば、本発明の実施形態について説明する次の小段落へ直接進みたいと考えるかもしれない。
フーリエ光学系の概要
図１は、標準的な光学顕微鏡または蛍光顕微鏡などの光学系の抽象的な図を提供する。通常、光学系１０２は、物体平面１０４内の入力画像１０４を集束および拡大させて、画像平面１１０上に拡大画像１０８を形成する。顕微鏡法では、物体平面は通常、試料内の光軸に対して垂直な平面であり、同じく光軸に対して垂直な画像平面は通常、ＣＣＤ検出器、人間の目の網膜、または別のタイプの検出器内の画像平面である。
【０００８】
図２〜４は、光学撮像に対する数学的モデルを示す。図２〜４は、図１で使用したのと同じ図示規則または類似の図示規則を使用する。図２に示すように、物体平面２０２の入力画像は、関数Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ＝０）として説明することができる。上式で、ｘおよびｙは、画像平面内の直交する次元であり、ｚは、画像平面および光学系構成要素に対して垂直な光軸に対応する。関数Ｉ（ｘ，ｙ）の値は、物体平面内の各点の光の強度を表し、表面２０４と考えることができる。入力画像Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ＝０）は、波動関数の２乗の大きさとして数学的にモデル化することができる。
【０００９】
【数１】
2013513823.tif 000003
【００１０】
この波動関数は、周波数νの単色光に対してベクトル形式で表すことができる。
【００１１】
【数２】
2013513823.tif 000004
【００１２】
関数Ｕ（ｒ，ｔ）は、「波動方程式」
【００１３】
【数３】
2013513823.tif 000005
【００１４】
として知られている微分方程式、および「ヘルムホルツ方程式」
【００１５】
【数４】
2013513823.tif 000006
【００１６】
として知られている微分方程式を満たす関数である。Ｕ（ｒ）は、光波に対する時不変の複素振幅であり、Ｕ（ｒ，ｔ）は、光波の時間依存型モデルである。画像Ｉ（ｘ，ｙ）は時不変であり、複素振幅Ｕ（ｒ）のみに依存する。この波動関数は、位置および時間のスカラー関数であり、したがって、光に対する完全な数値ではないが、多くの光学的現象について説明するには十分である。
【００１７】
図３に示すように、レンズ３０２は、入力関数ｆ（ｘ，ｙ）＝Ｕ（ｘ，ｙ，０）を出力関数ｇ（ｘ，ｙ）＝Ｕ（ｘ，ｙ，ｆ）に変換する光学系としてモデル化することができる。入力関数ｆ（ｘ，ｙ）および出力関数ｇ（ｘ，ｙ）は、それぞれ物体平面および画像平面における光波に対する時間非依存型の波動関数と同等である。入力関数ｆ（ｘ，ｙ）は、空間次元ｘおよびｙの調和関数の重ね合わせとしてモデル化することができる。
【００１８】
【数５】
2013513823.tif 000007
【００１９】
これらの係数Ｆ（ｖｘ，ｕｙ）は、次のフーリエ変換によって得られる。
【００２０】
【数６】
2013513823.tif 000008
【００２１】
入力関数ｆ（ｘ，ｙ）に関してレンズを操作して出力関数ｇ（ｘ，ｙ）を生じさせることは、次のように表すことができる。
【００２２】
【数７】
2013513823.tif 000009
【００２３】
言い換えれば、出力画像は、入力画像ｆ（ｘ，ｙ）の調和成分を出力画像ｇ（ｘ，ｙ）内の異なる点に集束させることによって生成される周波数領域画像である。出力画像ｇ（ｘ，ｙ）は、入力画像ｆ（ｘ，ｙ）のフーリエ変換である。
【００２４】
図４は、撮像光学系に対する数学的モデルを示す。入力画像４０２は、上記で論じたように、第１のレンズ４０４によって周波数領域画像４０６に変換され、第２のレンズ４０８は、第２の逆フーリエ変換としてモデル化されたプロセスによって、周波数領域画像４０６を最終の空間領域出力画像ｇ（ｘ，ｙ）４１０に変換する。プロセス全体は、次の畳み込みとして、より数学的にモデル化することができる。
【００２５】
【数８】
2013513823.tif 000010
【００２６】
上式で、ｈ（ｘ，ｙ；ｘ’，ｙ’）は、光学系に対するインパルス応答関数である。以下でより詳細に論じるように、出力画像は、入力画像によるインパルス応答関数の畳み込みとして算出することができる。入力画像を拡大する光学系の場合、入力画像座標ｘ’およびｙ’は、出力画像座標ｘ＝ｘ’Ｍおよびｙ＝ｙ’Ｍに対応することに留意されたい。上式で、Ｍは拡大係数である。
【００２７】
図５〜８は、図４を参照して上記で論じたインパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；ｘ’，ｙ’）の特性を示す。図５に示すように、物体平面５０４上の点（０，０）５０２に対応するインパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；０，０）は、画像平面内に円形の横断面５０８を有する２つの裂片がある強度分布５０６であり、２つの裂片がある分布の第１の裂片５１０は、ｚ軸の周りで円筒状に対称であり、画像平面から物体平面の方へ後ろに突出しており、同じく光軸の周りで円筒状に対称である第２の裂片５１２は、画像平面内の円形の横断面５０８から、物体平面から離れる方へ外側に突出する。図５および後の図では、インパルス応答関数の図示の表面は、一定の強度の表面である。概念化されたインパルス応答関数は、実空間に縛られることなく延びる。しかし、出力画像空間内の点（０，０）から任意の方向に特定の距離だけ離れると、入力応答関数の強度は、任意に低い値まで低下し、したがってたとえば、下回ると強度を検出できない強度レベルに対するインパルス応答関数について説明するために、一定の強度の表面を構築することができる。インパルス応答関数は、物体平面内の点源を出力画像空間内の強度分布に写像し、または別法として、点源の画像として写像する関数と見なすことができる。出力画像は、ｚ方向に画像平面からの距離とともにますます焦点が合わなくなる。距離とともに点源の画像がぼやけることは、出力画像平面からの距離が増大するとともにインパルス応答関数の円形の横断面の半径が最初に増大することに反映される。その後、画像平面からの距離がより大きくなるとともに円形の横断面の半径が低減することは、画像平面内の原点（０，０）からの距離とともに強度が低減することに関係する。
【００２８】
図６は、３次元出力画像空間内のインパルス応答関数の一定の強度の表面を示す。図６に示すように、蛍光顕微鏡使用者は一般に、対物レンズに対して固定の位置で一連の画像の各画像を獲得した後、試料と対物レンズの間の距離を変化させることによって、試料内の一連の物体平面６０２〜６０７を撮像する。これにより、対応する１組の出力画像６１０〜６１６を作り出す。３次元入力画像空間内の点（０，０，０）に関する１組の入力画像が光学系によって撮像されるとき、点（０，０，０）に対応する３次元のインパルス応答関数は、３次元の出力画像空間内で円筒状に対称な楕円体６２０である。ｘ、ｙ、およびｚ方向の連続撮像を行う収差のない光学系では、インパルス応答関数ｈ（ｘ，ｙ；０，０）は、出力画像空間内の点（０，０，０）の周りで球面状に対称である。この場合も、インパルス応答関数は、出力画像空間内の点（０，０，０）から実空間全体にわたって外側に延びる。しかし、強度は、点（０，０，０）からの距離が増大するとともに低減し、したがって一定の強度の楕円体または球を構築して、インパルス応答関数を表すことができる。
【００２９】
図７は、出力画像平面内の１つの次元におけるインパルス応答関数を示す。水平軸７０２は、原点（０，０）を通過する出力画像平面内の線である。理論上のインパルス応答関数は、高くて比較的狭い中心ピーク７０４を有し、高さが低減する２次ピーク７０５〜７１４は、中心ピークから離れて両方向に延びる。インパルス応答曲線の高さは、強度に対応し、水平軸７０２は、出力画像平面内の原点からの直線距離に対応する。理論上のインパルス応答関数は、Ｊ１ベッセル関数の２乗に比例する。図８は、３次元空間におけるインパルス応答関数の図を提供し、２つの水平軸８０２および８０４は、出力画像平面の平面内に位置して原点（０，０）で交差し、インパルス応答関数の表面上の任意の点における高さは、画像平面上の対応する位置で観察される強度に対応する。光学系によって作られるインパルス応答関数の画像は、インパルス応答関数の中心ピークに対応して、明るい中心の円板のように見え、半径が増大する同心円状の輪は、中心ピークを取り囲む輪または稜線に対応する。
【００３０】
図９〜１０は、光学系へ入力される画像および光学系に対するインパルス応答関数から光学系の出力画像を算出するための、図４を参照して上記で論じた畳み込みに基づく数学的モデルを示す。図５〜８に示すインパルス応答関数は、収差のない光学系の理論上のインパルス応答関数であることに留意されたい。しかし、光学系のすべての実際の実装形態では、多くの複雑な収差を数学的にモデル化するのは困難であるため、光学系に対するインパルス応答関数を算出することはできない。インパルス応答関数は、物体平面内の非常に小さい光源を撮像することによって、実験的に求められる。実際の光学系では、インパルス応答関数は、入力画像平面内の点源の位置に対して変動しうることにも留意されたい。しかし、以下の議論では、インパルス応答関数は通常、位置に依存しないものとする。
【００３１】
図９は、図４を参照して上記で論じた畳み込み方法によって出力画像を算出するために入力画像平面の面積全体にわたって繰り返される基本操作を示す。波動関数振幅ｆ（ｘ，ｙ）９０４が対応する入力画像平面内の所与の点（ｘ，ｙ）９０２は、振幅ｆ（ｘ，ｙ）の点光源と見なされ、この点光源から放射される光は、光学系９０６を通過し、この光学系によって、振幅ｆ（ｘ，ｙ）９１０をかけた対応するインパルス応答関数９０８に変換される。図１０に示すように、図９に示す基本操作が入力画像平面１００２内のすべての点に対して繰り返されるとき、各点の光源によって生成されるすべての入力応答関数の和が表面１００４を形成し、出力画像平面内の対応する点（ｘ，ｙ）より上の表面ｇ（ｘ，ｙ）の高さは、その点における出力画像の強度である。したがって、表記を変化させると、出力画像ｉ（ｘ，ｙ）は、入力画像ｏ（ｘ’，ｙ’）によるインパルス応答関数または点拡がり関数（「ＰＳＦ」）ｓ（ｘ−ｘ’，ｙ−ｙ’）の畳み込みとして算出される。数学的な表記では、
【００３２】
【数９】
2013513823.tif 000011
【００３３】
この畳み込み操作は、周波数領域では乗算操作になる。
【００３４】
【数１０】
2013513823.tif 000012
【００３５】
上式で、Ｉ（ｕ，ｖ）は、出力画像ｉ（ｘ，ｙ）の周波数領域変換であり、τ（ｕ，ｖ）は、ＰＳＦのフーリエ変換である光伝達関数であり、Ｏ（ｕ，ｖ）は、入力画像ｏ（ｘ，ｙ）の周波数領域変換である。３次元撮像について考慮すると、これらの関係を次のように表すことができる。
【００３６】
【数１１】
2013513823.tif 000013
【００３７】
逆畳み込み顕微鏡法では、入力画像ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）の推定
【００３８】
【数１２】
2013513823.tif 000014
【００３９】
をＰＳＦで畳み込んで、対応する算出された画像
【００４０】
【数１３】
2013513823.tif 000015
【００４１】
を作り出す。
【００４２】
【数１４】
2013513823.tif 000016
【００４３】
通常、畳み込みは、乗算操作によって周波数領域内で実施され、次いで、対応する周波数領域の実体が、逆フーリエ変換によって再び空間領域の均等物に変換される。Ｒ係数または残差は、算出された画像と観察された画像の差を反映するように算出することができる。
【００４４】
【数１５】
2013513823.tif 000017
【００４５】
次いで、推定された入力画像を、入力画像の後のより良好な推定を作り出すように、ニュートン系の最適化技法などの様々な技法のいずれかによって変えることができ、この推定から、対応する出力画像を算出し、新しいＲ係数を生成することができる。このプロセスは、Ｒ係数が閾値を下回るまで反復される。Ｒ係数が閾値を下回ると、推定された入力画像が、光学系へ入力される実際の画像を十分に忠実に表すことを示す。
【００４６】
図１１は、光学顕微鏡法に関連する回折限界を示す。距離ｄ１’１１０６によって分離された物体平面内の２つの点
【００４７】
【数１６】
2013513823.tif 000018
【００４８】
１１０２および
【００４９】
【数１７】
2013513823.tif 000019
【００５０】
１１０４について考察する。光学系から出力されるこれらの２つの点の画像は、点
【００５１】
【数１８】
2013513823.tif 000020
【００５２】
に対応する出力画像点（ｘ１，ｙ１）および（ｘ２，ｙ２）を中心とする２つの点拡がり関数１１１０および１１１２である。入力画像の点源から出力画像の点拡がり関数画像へ光が拡がることは、回折に関連する現象である。ｄ１’が十分に大きく、出力画像内の点拡がり関数ｄ１の中心間の対応する距離が点拡がり関数分布を分離し、したがって図１１に曲線１１１４で表す２つの点拡がり関数の和がはっきりと双峰形のままになるとき、出力画像内の点１１０２および１１０４の画像を互いに区別することができる。しかし、入力画像内の２つの点１１２０および１１２２が、かなり小さい距離ｄ１’１１２４によって分離され、したがって出力画像内の２つの点１１２６および１１２８の画像が重複し、図１１に曲線１１３０で表す２つの点拡がり関数の和が合わさって単一のピークになるとき、出力画像では２つの点１１２０および１１２２を互いに区別することができない。従来の光学顕微鏡法に対する最小の間隔または最大の解像度は通常、次のように見なされる。
【００５３】
【数１９】
2013513823.tif 000021
【００５４】
上式で、λは光の波長であり、
ＮＡは、光学系に対する開口数である。
入力画像内の最小の間隔は、出力される点拡がり関数間の間隔に対応し、この間隔では、右側の点拡がり関数の第１の左側のゼロの点は、左側の点拡がり関数の第１の右側のゼロの点と一致する。撮像できる特徴の最小の離隔距離は、光学顕微鏡システムの場合、約２００ｎｍに対応する。最小の間隔または最大の解像度は、出力画像内の点源の点拡がり関数画像が回折の結果として得られるため、「回折限界」と呼ばれる。
【００５５】
１９９０年代まで、図１１を参照して論じた回折限界は、光学顕微鏡法に対する絶対的な解像限界であると見なされていた。しかし、過去２０年間、様々な超解像の蛍光顕微鏡技法が開発されてきた。図１２Ａ〜Ｂは、超解像の顕微鏡法の基本を示す。図１２Ａは、物体平面上の点１２０４からｚ軸の方向に放射される光に対する光学系１２０２の影響を示す。上記で論じたように、光学系は、画像平面内の円板状の点拡がり関数１２０６にわたって光の強度を拡げる。したがって、点拡がり関数は、出力画像空間内の光学系による点源のリアルタイムの不鮮明化または拡散と見なされる。点状源の光のこの不鮮明化は、複数の異なる理由のために発生する。１つの重要な理由は、レンズなどの光学構成要素が有限の開口を有し、したがって点源から放射される非干渉性の光のうち、より低角度の部分しか受け取らないことである。より高角度で放射される光線は、レンズの円板から外れ、したがって光路から外れる。光学構成要素に入らなかったより高角度の光線は、周波数領域内のより高い周波数に対応する。したがって、光学構成要素は、空間周波数フィルタとして作用する。逆フーリエ変換としてモデル化される第２のレンズによる光の集束は、光学構成要素によって高周波数の周波数領域信号が除去されるため、幾分ぼやけた空間領域画像を作り出す。光学構成要素に固有の様々なタイプの収差および他の要因を含めて、多くの追加の要因が、点拡がり関数によって表される出力画像内の光の分散に寄与する。
【００５６】
図１２Ｂに示すように、点拡がり関数について考察する第２の方法は、点拡がり関数が確率分布を表し、点拡がり関数によって点に関連付けられる強度が、個々の光子が光学系によってその点へ偏向される確率に対応することである。このように考えると、物体平面内の点状源が連続して撮像され、連続する画像がＣＣＤ検出器などの電子検出器によって時間とともに蓄積されると、出力画像内の蓄積された強度は、点拡がり関数に従って分散される。出力画像内で蓄積された強度が最も高い点は、画像平面内の蓄積された強度の分布をうまく形成するのに十分な期間にわたって出力光が収集されたとき、光学系の拡大係数を相殺した後の検出器の解像度の精度に等しい精度のところに位置することができる。この点は、画像平面内のＰＳＦに対応する点源の物体平面の位置に対応する。理論的には、出力画像内の対応するＰＳＦ分布の質量中心を使用して、点源の位置を１ｎｍ以上の解像度まで求めることは可能である。しかし、そのような精度を実現するには、出力画像における点拡がり関数画像が明らかに重複しないように、光を放射する点源を十分な距離だけ分離しなければならない。したがって、まばらに分散された蛍光体の位置は、回折限界以下の解像度まで求めることができるが、これらの蛍光体は、現在実施されている超解像の撮像技法に従って、任意の２つの蛍光体間の距離が１８０〜２００ｎｍの回折限界距離より大きくなるように、試料内に位置決めしなければならない。
本発明の実施形態
図１３は、空間領域と空間周波数領域の関係を示す。図１〜１２で使用したのと類似の図示規則を使用する図１３では、蛍光顕微鏡によって撮像されている物体または試料は、実空間領域１３０２内にあると考えられる。物体または試料内の蛍光体によって蛍光性の光が放射されるとき、放射された蛍光性の光は、光学レンズ１３０４を通過して、空間周波数領域１３０６内で画像のフーリエ変換を行う。光学系の制限、および空間領域における試料の特徴の撮像に関連する回折限界のため、空間周波数領域１３０６内でレンズによって作られる信号は、半径ｒ１３１０を有する円板状領域１３０８に制限される。ここでは、光学系によって解像できる２つの特徴間の最も小さい距離であるｄに反比例する。言い換えれば、光軸と空間周波数領域平面１３１２の交点からの空間周波数領域信号の位置の距離は、空間領域における蛍光放射パターン内の特徴間の間隔に反比例し、またはその逆数である。図１３と同じ図示規則を使用する図１４は、蛍光顕微鏡の解像度を増大させる１つの手法を示す。図１３に示す半径ｒより大きい半径ｒ’を有する図１４に示す空間周波数領域１４０２のより大きい領域にアクセスすることが可能な場合、拡大された空間周波数領域のフーリエ変換は、従来の技法を使用する光学系によって撮像できるものに比べて、試料内でより密接に隔置された特徴に関する空間領域情報を提供するはずである。たとえば、異なる向きの明暗ラインのパターンを有する図１３および１４に示す試料は、図１４に破線で示す１組の線１４０４〜１４０８を含むことができる。これらの線１４０４〜１４０８は、図１３に示す光学系によって撮像すべき実線１４１０などの隣接する実線に対してあまりに密接して隔置される。しかし、空間周波数領域１４０２のより大きい領域に光学系がアクセス可能である場合、そのより大きい領域内に含まれる情報を逆フーリエ変換によって変換して、照明パターン特徴１４０４〜１４０８が解像された試料の画像を作り出すことができる。
【００５７】
図１５は、従来の顕微鏡法を使用する３次元撮像に関連する第２の問題を示す。３次元撮像では、ｚ軸または光軸に対して垂直な試料体積内の複数の密接に隔置された平面１５０２〜１５０９のそれぞれに対して、密接に隔置された複数の平面画像が記録される。特定の場合、３次元の情報は、密接に隔置された画像のスタックの中心平面を表す単一のより高解像度の２次元画像１５１０を作り出すように処理される。しかし残念ながら、ｚ方向では、近傍の画像平面からの集束されていない蛍光放射が、特定の画像平面からの集束された照明とともに記録される。たとえば、図１５に示すように、中心の試料平面１５０６が撮像されるとき、特に中心の試料平面１５０６内の陰影付きの円板１５１２で表す特定の特徴からの蛍光放射が撮像されるとき、検出器は通常、画像試料平面より上の陰影のない円板１５１４〜１５１７および試料平面より下の陰影のない円板１５１８〜１５２０で図１５に表す近傍の試料平面からの集束されていない蛍光放射を受け取る。この集束されていない照明は、当該の特徴１５１２からの集束された照明とともに検出器に当たり、光軸と試料平面の交点を取り囲む試料画像の領域内の画像情報を記録することができなくなり、周囲の領域にぼけが生じる。
【００５８】
図１６は、実空間の試料体積を撮像しようとする従来の光学系がアクセス可能な空間周波数領域または逆空間の体積を示す。実空間の試料体積１６０２は通常、実空間試料内でマイクロスケールおよびナノスケールの寸法で分散する蛍光体からの放射パターンを含む。しかし、図１３〜１５を参照して上記で論じた光学系の制限のため、光学系は空間周波数領域の環状領域１６０４にしかアクセスできない。アクセス可能な空間周波数領域情報がなく、円環面の外部表面より原点からの距離が大きいことで、撮像できる試料内の特徴の解像度が制限され、また「ミッシングコーン（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｎｅ）」と呼ばれる光軸と同軸の環状形内の陥入部１６０６に空間周波数領域信号がない状態により、試料領域のうち光軸付近の部分を撮像することができない。
【００５９】
３Ｄ−ＳＩＭは、空間周波数領域のより高解像度の領域、ならびに空間周波数領域のアクセスできない軸方向の領域の両方に光学系がアクセスできる方法を提供する。図１７Ａ〜Ｂは、３つの可干渉性の照明ビームを使用する３次元の構造化照明パターンまたはグリッドの生成を示す。図１７Ａに示すように、高倍率で高開口数の対物レンズ１７０５の後方焦点面上へ、３つの可干渉性ビーム１７０２〜１７０４が導入される。３つの可干渉性ビーム１７０２〜１７０４は平面波であり、各ビームのすべての成分波の位相は、ビーム方向に対して垂直な平面１７０６などの任意の平面の両端で同一である。３つの入射する照明ビームは可干渉性であるが、各照明ビームは、他の２つの照明ビームとは異なる位相変位を有することができる。対物レンズ１７０２によって入射ビームを焦点１７１０に集束させると、図１７Ａに示すように、軸方向でない２つの照明ビーム１７０２および１７０４の方向を変化させ、その結果、３つの平面波の波動ベクトルｋが平行ではなくなる。その結果、３組の平面波は交差して、建設的干渉による明るいスポットからなるグリッド状のパターンと、相殺的干渉による暗い周囲領域とを形成する。言い換えれば、図１７Ｂに示すように、格子点に位置する円筒状に楕円形の明るい領域が暗い領域によって分離される３次元の格子を特徴とする、静止した３次元の複合波１７２０が得られる。本発明の実施形態であるＳＩＭでは、グリッド点の位置および格子軸の向きは、入射する照明ビーム１７０２〜１７０４の位相関係を変動させることによって選択することができる。以下に説明するように、試料体積に対する３次元の画像を再構築するために、構造化照明パターンの多数の異なる位置および向きに対してデータが記録される。
【００６０】
図１８は、従来の３Ｄ−ＳＩＭ装置を示す。多モードファイバ１８０２からのレーザ光が、直線位相グレーディング（ｇｒａｄｉｎｇ）１８０４上へ視準される。直線位相グレーディングは、直線位相グレーディングからの−１、０、および＋１次の回折ビームとして、３つの異なる照明ビーム１８０６〜１８０８を生成する。これらの３つの照明ビームは、対物レンズ１８１０の後方焦点面上へ再び集束される。これらのビームは互いに干渉し、対物レンズ１８１２の焦点面における試料の体積内で構造化照明パターンを生成する。照らされた蛍光体からの蛍光放射は、再び対物レンズを通過し、データ収集のために２色性ミラー１８１６を介してＣＣＤカメラ１８１４内へ反射される。
【００６１】
次に、構造化照明に基づくデータ収集および画像の再構築の概要を提供する。点拡がり関数がＨ（ｒ）である光学系について考察する。前述の小段落で論じたように、蛍光体標識付きおよび蛍光発光性の試料または物体に対してこの光学系によって観察されるデータＤ（ｒ）は、
【００６２】
【数２０】
2013513823.tif 000022
【００６３】
という点拡がり関数による蛍光放射Ｅ（ｒ）の空間分布の畳み込みである。観察されたデータのフーリエ変換は、
【００６４】
【数２１】
2013513823.tif 000023
【００６５】
である。上式で、ティルデ（〜）は、対応する実空間量のフーリエ変換を示し、
【００６６】
【数２２】
2013513823.tif 000024
【００６７】
は、光伝達関数であり、ｋは、空間周波数領域内の位置ベクトルである。
蛍光顕微鏡法では、所望の情報は、試料Ｓ（ｒ）内の蛍光体の密度分布である。試料が照明強度Ｉ（ｒ）によって照らされるとき、蛍光放射の分布は次のように求められる。
【００６８】
【数２３】
2013513823.tif 000025
【００６９】
上式および以下の式は、構造化照明に基づくデータ収集および画像の再構築のより詳細な理論上の処理の簡略化を表すことに留意されたい。蛍光放射の分布のフーリエ変換はまた、
【００７０】
【数２４】
2013513823.tif 000026
【００７１】
という畳み込みである。照明Ｉ（ｒ）が空間的に変動するとき、
【００７２】
【数２５】
2013513823.tif 000027
【００７３】
は自明ではなく、畳み込み操作は非局所的である。具体的には、この畳み込みにより、
【００７４】
【数２６】
2013513823.tif 000028
【００７５】
の観察可能領域内に観察されたデータを、逆空間の他の部分からの
【００７６】
【数２７】
2013513823.tif 000029
【００７７】
の普通なら観察できない成分に依存させることができる。このとき、その情報は原則的に観察可能であるが、画像データから演算的に抽出しなければならない。構造化照明パターンが有限数の成分の和であり、それぞれの有限数が軸方向および横方向の関数に分離される場合、
【００７８】
【数２８】
2013513823.tif 000030
【００７９】
である。上式で、ｒｘｙは、横方向の座標（ｘ，ｙ）を示し、それぞれの横方向成分の関数Ｊｍは、簡単な調波であり、軸方向の関数Ｉｍが調和し、または構造化照明パターンが複数の２次元画像のデータ収集中に顕微鏡の焦点面に対して軸方向に固定されるとき、
【００８０】
【数２９】
2013513823.tif 000031
【００８１】
の普通なら観察できない成分の抽出が容易になる。このとき観察されたデータは、次のように表すことができる。
【００８２】
【数３０】
2013513823.tif 000032
【００８３】
上式で、素数のベクトルは、試料の基準系を指し、素数でないベクトルは、機器の基準系を指す。上式では、ｍは、周期的な構造化照明パターンから生じる様々な成分高調波の指数を示す。この和の第ｍの項をＤｍと呼ぶと、Ｄｍのフーリエ変換は、
【００８４】
【数３１】
2013513823.tif 000033
【００８５】
である。上式で、
【００８６】
【数３２】
2013513823.tif 000034
【００８７】
は、ＨＩｍのフーリエ変換である。
上記では、Ｊｍは簡単な高調波、
【００８８】
【数３３】
2013513823.tif 000035
【００８９】
とした。上式で、ｐｍは、成分ｍの横方向の波動ベクトルであり、φｍは、成分ｍに対する位相変位であり、
【００９０】
【数３４】
2013513823.tif 000036
【００９１】
であることを示す。式６内へ代入すると、これは、獲得されたＤ（ｒ）の各画像から得られる各データセット、獲得されたＤ（ｒ）の画像のフーリエ変換を次のように書けることを示す。
【００９２】
【数３５】
2013513823.tif 000037
【００９３】
これは、物体情報
【００９４】
【数３６】
2013513823.tif 000038
【００９５】
の有限数のコピーの和であり、コピーはそれぞれ、距離ｐｍだけ逆空間内で横方向に動かされ、伝達関数Ｏｍによってフィルタリング（および帯域制限）され、位相φｍだけ位相シフトされる。要約すると、照明構造内の横方向の各周波数成分ｍは、第ｍのパターン成分の軸方向の照明構造による従来の検出ＯＴＦの畳み込みによって求められる別個の光伝達関数Ｏｍに対応し、そのパターン成分の横方向の波動ベクトルｐｍによって逆空間内で変換された物体情報の成分に該当する。
【００９６】
式８に見られるように、単一の生データ画像は、各指数ｍに対して１つずつ存在するいくつかの異なる情報成分の和である。データを復元するために、これらの情報成分は分離される。これは、異なる既知の位相φｍの値を有する追加のデータセットを獲得することによって行うことができる。位相値を位相シフトδφｍだけ変化させることで、式８内の係数
【００９７】
【数３７】
2013513823.tif 000039
【００９８】
を、
【００９９】
【数３８】
2013513823.tif 000040
【０１００】
から
【０１０１】
【数３９】
2013513823.tif 000041
【０１０２】
に変え、未知の情報成分の１次独立の組合せが得られる。したがって、それぞれの位相シフトされた画像は、Ｎ個の未知数における１つの独立１次方程式を供給する（上式でＮは、式８内の周波数成分の数である）。少なくともＮ個の異なる位相でデータが獲得された場合、方程式の数は少なくとも、未知数の数に等しく、行列反転を介してこれらの連立方程式を解くことによって、Ｎ個の情報成分を分離することができる。
【０１０３】
実際には、この状況は通常、いくつかの方法でさらに簡略化される。物理的な光の強度が実数値の関数であるため、横方向の関数Ｊｍ内の指数項は、逆空間の対称に位置する領域からの情報に対応する相対するｐｍとともに、対になって生じる。任意の実数値の関数ａ（ｒ）のフーリエ変換
【０１０４】
【数４０】
2013513823.tif 000042
【０１０５】
は、
【０１０６】
【数４１】
2013513823.tif 000043
【０１０７】
が
【０１０８】
【数４２】
2013513823.tif 000044
【０１０９】
の複素共役であるという対称性を有するため、そのような各対から１つの情報成分を計算するだけでよい。この照明パターンの異なる横方向の空間周波数ｐｍの組が、実際には、周期パターンの基本周波数および高調波であるとき、空間周波数はすべて、基本波の倍数であり、ｐｍ＝ｍｐである。さらに、照明の位相シフトが、固定のパターンを空間的に変換することによって行われるとき、位相シフトδφｍはまた、基本の位相シフトの倍数であり、δφｍ＝ｍδφである。鏡映対称を有するパターンの場合、開始位相φｍ０＝ｍφ０にも同じことが当てはまり、したがって全体的な位相に対して、φｍ＝ｍφである。この状況では、観察されたデータは、次のように書くことができる。
【０１１０】
【数４３】
2013513823.tif 000045
【０１１１】
測定されたデータでは、（１）各伝達関数Ｏｍの台を、軸方向の関数
【０１１２】
【数４４】
2013513823.tif 000046
【０１１３】
による畳み込みによって、従来のＯＴＦ、Ｏと比較して軸方向に拡大すること、そして（２）ｍｐによる変換で新しい情報を横方向に動かしてＯｍの台にすることという２つの方法で、普通なら観察できない空間周波数領域情報を得る。
【０１１４】
Ｏｍおよびｐｍは既知であるため、分離された情報成分を距離ｐｍだけ逆空間内の本当の位置へ演算的に戻して再結合し、解像度が拡大された単一のデータセットにし、実空間に再変換することができる。この方法による全体的に効果的で観察可能な領域は、全体的な照明構造
【０１１５】
【数４５】
2013513823.tif 000047
【０１１６】
による従来のＯＴＦ、Ｏの畳み込みの台によって得ることができる。したがって、所与の次元における極大解像度の増大は、その次元における最大の照明空間周波数に等しい。この照明内で生成できる空間周波数の組は、観察できる周波数の組とちょうど同じように回折によって制限されるため、同じ光学系を通じて照明および観察が行われるとき、照明内の可能な最大空間周波数は、従来の検出の解像限界を放射波長と励起波長の比によって拡大縮小した値に等しい。したがって、この点で可能な最大解像度の拡大は、（１／λｅｘｅ＋１／λｅｍ）／（１／λｅｍ）＝１＋λｅｍ／λｅｘｅ倍であり、各次元において２よりわずかに大きい。これは、軸方向ならびに横方向に当てはまる。
【０１１７】
従来の３Ｄ−ＳＩＭ機器では、蛍光性の試料は、励起光の３つの相互に可干渉性ビーン（ｂｅａｎｓ）で照らされる。通常、平面波と波動ベクトルｋｊの可干渉性の重ね合わせは、全体的な光強度
【０１１８】
【数４６】
2013513823.tif 000048
【０１１９】
をもたらす。これは、任意の２つの平面波の伝搬ベクトル間の各対の差分ベクトルｋｑ−ｋｊの１つの空間成分からなる。したがって、３つの照明ビーム間の干渉は、７つのフーリエ成分を、３つの照明波動ベクトル間の各差分ベクトルに対して１つずつ含む、図１７Ｂの３次元の励起強度パターン１７２０を作り出す。この照明パターンによってアクセス可能になる観察可能な領域は、従来のＯＴＦの台による７つのドットの照明構造の畳み込みであり、その結果、アクセス可能な領域にはアクセスできないミッシングコーンがなくなり、１つの方向に沿って延びて、その方向に対応する実空間方向に対して解像度を倍にする。この手順は、空間周波数領域にわたって全体の解像度を倍にするように、照明パターンを他の方向に回転させた状態で繰り返される。
【０１２０】
光学機器類に対するパラメータは、単一の蛍光性の微小球からなる試料からデータを収集することによって判定される。これにより、光学機器に対する点拡がり関数を直接判定することができる。試料内のデータ収集は、後述するように、構造化照明パターンの向きおよび位置の体系的に変動する変化の数に対して試料の画像を記録することによって実施される。獲得された画像のフーリエ変換は、観察可能な
【０１２１】
【数４７】
2013513823.tif 000049
【０１２２】
を与える。これは、項
【０１２３】
【数４８】
2013513823.tif 000050
【０１２４】
の和である。パターン波動ベクトルｐおよび他のパラメータの判定を含むデータのさらなる分析により、蛍光体の密度分布のフーリエ変換に対する強度の推定が得られる。
【０１２５】
【数４９】
2013513823.tif 000051
【０１２６】
これにより、逆フーリエ変換によって、再構築された蛍光体の分布、または再構築された画像を得ることができる。
図１８を参照して説明した従来のＳＩＭ機器などの従来の３Ｄ−ＳＩＭ機器に関して、複数の欠陥が存在する。第１に、回折グレーディングを使用して３つの可干渉性の照明ビームを生成することは、極めて非効率的であり、元のレーザ光強度の数パーセントしか、対物レンズの後方焦点面に入射する３つの可干渉性の照明ビームにならない。第２に、現在利用可能な３Ｄ−ＳＩＭ機器は、データ収集中に構造化照明パターンの位置および／または向きを変化させるために、比較的長々とした調整期間を必要とする。これらの調整期間は、特定の試料からデータを収集するために行われる動作の間ずっと蓄積し、任意の特定の試料に対するデータ収集時間が比較的長くなる。これらの長々としたデータ収集時間は、生細胞の撮像や、蛍光発光体の空間分布および放射強度がデータ収集時間間隔を実質上変化させうる試料の撮像にはあまり適していない。さらなる欠陥は、現在利用可能な３Ｄ−ＳＩＭ機器類の構成および幾何形状が、狭い範囲の照明波長向けであることである。異なる波長の照明源を使用できるようにするには、複雑で時間のかかる機器の再構成および再調整が必要である。本発明の実施形態では、前述の欠陥の３つすべてに対処し、ならびにさらなる所望の特徴および特性を提供する。
【０１２７】
最近まで、適した科学カメラの読出し速度は、３Ｄ−ＳＩＭの光機械的プロセスを速くするための相当な努力に見合わなかった。しかし現在、高い量子効率、低い雑音、および高い画素数を特徴とする科学級のＣＭＯＳカメラの出現により、ゆっくりと変化するＳＩＭパターンおよび長い露出は、生細胞の撮像に適した３Ｄ−ＳＩＭ機器類を実現するには回避または除去する必要のある障害と見なされる可能性がある。
【０１２８】
本発明の実施形態では、レーザ光を効率的に使用して、３Ｄ−ＳＩＭのデータ収集に対する時間効率を大いに増大させる。現在の３Ｄ−ＳＩＭ顕微鏡は、１００ｍＷより大きい比較的強力なレーザを必要とし、これは高価であるが、十分な画像の信号対雑音比を得るにはやはり長い露出を伴う。実際には、既存の設計で、レーザ光のうち顕微鏡対物レンズの背面に到達する部分は、ほんの数パーセントである。本発明の実施形態では、レーザ光の使用効率を１桁以上増大させ、高コントラストの干渉縞を作り出す高品質のビーム波面を送達する。これは、移動および回転式の非効率的な格子をビームスプリッタおよび位相シフト式のミラーのシステムと交換することによって実現される。精度圧電アクチュエータに取り付けられたミラーは、部分的な波長変位とともに急速に動き、数ミリ秒からミリ秒未満で整定する。本発明の実施形態で用いられるビーム偏光形状は、通常９９パーセントを超える効率を発揮する誘電体ミラーの使用を可能にする。
【０１２９】
前述のように、３Ｄ−ＳＩＭでは、３つの集束された位相一貫ビームが、高倍率で高開口数（ＮＡ）の対物レンズの後方焦点面内へ導入される。６０倍でＮＡが１．４２の油浸対物レンズが典型的であろう。１つのビームは、背面開口の中心に位置し、他の２つは、周辺部近傍に位置する。所与の波長に対する最大解像度は、周辺ビームが背面開口内の実際の最大量だけ分離されたときに実現され、その波長で可能な最も細かいピッチの縞パターンを作り出す。３つすべてのビームが平面波として試料に到達し、２つの波面は高い角度で入射する。顕微鏡の試料平面では、隣接する縞の最大値間の横方向のずれは、約４２５ｎｍである。
【０１３０】
図１９は、典型的な３Ｄ−ＳＩＭ強度パターンの模擬横断面を示す。このパターンは、高い強度の光の楕円形の円筒がより弱い強度の光の行列内に位置することを特徴とする。図１９では、楕円形の円筒を横断面で示し、楕円１９０２などのそれぞれの軽い陰影付きの楕円は、楕円形の円筒の断面を表す。３つのビームの干渉によって生成される強度パターンが、図１９に水平線１９０４で表す試料平面上へ投射されるとき、試料平面上で干渉パターンは、固定の距離で隔置された１組の平行な高い強度の線として見える。
【０１３１】
構造化照明パターンの形状および寸法は、レーザ波長ならびにそれぞれの波面の角度および振幅に左右される。本発明の実施形態では、試料に対する構造化照明パターンの位置は、３つの照明ビーム間の位相関係によって決まる。パターンは、中心ビームの相対位相を前進および後退させることによって、軸方向に上下に変位させることができる。πラジアンの位相変化で、パターンを垂直方向に半周期分動かす。２πの変化で、元のパターンを再現する。同様に、周辺ビームの位相を等しい逆の量だけ前進および後退させると、パターンを横方向に変位させる。本発明の一実施形態では、単一の３Ｄ−ＳＩＭパターンの横方向の変位ステップは、２つのミラーをそれぞれ±λ／１０、約±５０ｎｍ変位させることによって実行される。
【０１３２】
試料では、３つのビームはそれぞれ、複素振幅Ｅｍｍ＝１、２、３を有する平面波として表すことができる。
【０１３３】
【数５０】
2013513823.tif 000052
【０１３４】
上式で、Ａｍは、ビームｍの振幅であり、ｋｍおよびｘは、それぞれ試料平面内のベクトル波数および位置であり、φｍは、本発明者らの直接制御下にある位相であり、時間依存要因は抑制されている。ｋｍの方向に伝搬するビームは、その方向に沿った変位の各レーザ波長に対して２πラジアンの位相を蓄積する。Ｅ（ｘ）は、試料内の点ｘにおける３つのフィールド振幅の（干渉する）和である。光強度Ｉは、フィールドの２乗の大きさに比例する。
【０１３５】
【数５１】
2013513823.tif 000053
【０１３６】
上式で、＊は複素共役を示す。実際には、適正に位置合わせされた光学系では、試料平面内の理想的でない湾曲した波面の影響は無視できるほどである。
レーザビームは、直線偏光される。最大の縞のコントラストまたは縞の視認性は、３つのビームが相対的なｓ偏光状態であるときに得られる。ｓ偏光は、３つのビームが対物レンズの背面に入射する平面に対して各ビーム内の電界が垂直であるときに発生する。この条件は、従来の格子体系において、元のレーザビームの偏光状態を混合し、次いで格子とともに回転する直線偏光子を通過させ、それによって光の半分を失うことによって得られる。他のＳＩＭ機器は、液晶デバイスなどの能動型の位相回転子を用いるが、ビーム効率ならびに波面の品質およびコスト上の問題が生じる。電気光学およびファラデー回転デバイスも同様に、これらの問題をもたらし、通常、波長に強く依存する。本発明の実施形態では、入力照明ビームの直線偏光は、ビームが分割されてＳＩＭ光学構成要素を通って誘導される間も維持され、Ｓ偏光されていない光が普通なら吸収されるはずの各光学界面で適正なＳ偏光を有するため、偏光子の使用を回避する。
【０１３７】
建設的および相殺的干渉は、ビームが互いに位相一貫性であるときにしか生じない。格子の実装形態では、この条件は、むしろ本質的に固有である。複数のビームスプリッタを有する本発明の実施形態では、３つのビームの光路は、設計者によって制御される。３つのビームの光路の長さは、３つの角度の向きのそれぞれに対するレーザの可干渉性の長さ内で等しい。蛍光顕微鏡法に適した多くの固体レーザは、数ミリメートルの可干渉性の長さを有する。全体的な経路の長さが１メートルを超過するビームスプリッタおよび複数のミラーを備える光学台上の３つのビームの配置は、そのようなレーザで優れた安定した縞コントラストを実現する。本発明を実施する３Ｄ−ＳＩＭ顕微鏡は、１ミリメートル以下のビーム経路差に対応するように設計または調整される。ビーム経路構成要素からの不可避の反射間の寄生干渉を防止するために、長い可干渉性の長さを有するレーザは回避される。
【０１３８】
本発明の一実施形態である記載のＳＩＭ内で使用される位相シフトミラーが数十ナノメートル動くことを考えると、熱膨張、振動、および他の要因に向き合って対処しなければならないことは明らかである。光学系は、振動を分離する浮遊型の台または均等物によって支持された、熱的に安定した空気流のない小型の環境内に密閉しなければならない。光路にまたがる構成要素は、インバーから機械加工される。干渉縞の追跡を介して密閉された顕微鏡の原型を用いて行った測定は、熱的に誘導された位相のずれおよび残留する空気流は、１０秒の時間尺度では無視できるほどであることを示した（実効値で２度未満）。アウトテストエンクロージャ（ｏｕｔ  ｔｅｓｔ  ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）を含む室内の通常の音および振動レベルでは、障害を引き起こさないが、床の上で跳ぶと、気付くほどの影響を引き起こす。縞のコントラストを不鮮明にする傾向のある機器の振動は、ファンで冷却する代わりに液体で冷却されたカメラを使用するようなステップによって最小にすることができる。位相ミラーの運動による機器の機械的な励起は、存在する場合でも小さい。
【０１３９】
通常、３Ｄ画像スタックの取得には、１秒以下しかかからないと考えられ、したがって、実質上瞬時の熱安定性が実現される。しかし、数分および数時間にわたって生じる環境の変化は、３つのビームの位相関係を変え、したがって試料平面の干渉パターンを横方向およびｚ方向に変位させる。開示のＳＩＭには、ビームの位置合わせ／集束（「ＢＡＦ」）レンズと対物レンズの間の試料をビームから抜き取り、これらのビームをレンズを介してＣＣＤまたは他のピクセル化光学検出器の面上へ視準および横断させることによって、３つのビームの位相関係を測定する方法が組み込まれる。理論上は、異なる重複ビームの組合せを含む３つのインタフェログラム、たとえば中央−左、中央−右、および３つすべては、同時に捕獲される。ビーム対は、焦点面内のマスクで不要なビームを阻止することによって選択される。これらは、機器の３つすべてのアームにおいて、各ビームトリプレットに対して獲得される。データから算出された位相は、位相ミラーに発行される補正を介してフィードバックループを光学的に閉じるために使用されるはずである。温度安定性のＣＣＤによってうまく実行されると、そのような体系では、高価な静電容量センサなど、位相ミラーに対する現場での位置決めフィードバック機構の必要がなくなる。
【０１４０】
３つのビームの相対位相に対する明示的な制御は、格子ベースその他の３ＤのＳＩＭアーキテクチャに勝る別の顕著な利点を提供する。格子の横方向の変位は、外側ビームの位相をそれぞれ前進および後退させるが、格子を通過する０次の（中心）ビームには影響を与えない。したがって、光学列内で固定のｚ位置を有する格子の場合、試料における３Ｄ干渉パターンの深さ（ｚ方向）は固定される。３Ｄパターンの深さは、調節しなければならない。パターンと試料平面の関係は、単一の回折以下（たとえば、１００ｎｍ）の蛍光性ビードの３ＤのＳＩＭ画像スタックを獲得し、主な縞の空間周波数だけでなく、２つの外側ビームの角度から導出されるより高い空間周波数でも変調深さを測定することによって調査される。格子ベースのシステムでは、測定が行われ、次いで格子アセンブリは、視準レンズに対してｚ方向にわずかな量、１００マイクロメートル程度だけ前後に動かされ、この測定が繰り返される。このプロセスは、最適の結果が実現されるまで反復される。格子の位置調整は、１つの向きに１つの波長だけの冗長な手動タスクである。したがって、すべての波長に対して、または完全な３つの対称を欠く格子システムの場合、すべての角度に対して、Ｂのパターン深さが最適化される可能性は極めて低い。本発明のＳＩＭの３つのビームの相対位相に対する容易な制御により、各波長および向きに対して、変調深さでミラー位相のパラメータ空間を急速かつ自動的に写像することができる。位相ミラーを最適の変調位置に設定すると、位相フィードバックシステムによって捕獲される位相は、ミラー位相ルックアップテーブル内へ記録される。位相フィードバックシステムと対物レンズの密接な光機械的結合および近接、ならびに材料の賢明な選択を考えると、ミラー位相テーブルは、妥当な温度範囲、たとえば摂氏数度にわたって正確なままである。
【０１４１】
図２０Ａ〜Ｉは、上記で論じた試料平面の３Ｄ−ＳＩＭ撮像に対するデータ収集を示す。図２０Ａは、撮像技法の幾何形状を示す。上記で論じたように、対物レンズ２００４の後ろの焦点面に干渉パターン２００２が集束され、対物レンズを通じて干渉パターンを投射し、撮像すべき試料２００６の平面上に集束させる。上記で論じたように、試料平面２００６に対するより高解像度の画像を再構築するために、３Ｄ−ＳＩＭデータ処理の数学的な技法は、図２０Ａに破線２００８で示す試料体積から収集されたデータから、試料平面に対するより高解像度の画像を再構築する。試料体積は、試料平面の上下両方に試料平面および体積を含む。第１に、図２０Ｂに示すように、干渉パターンは、試料体積（図２０Ａでは２００８）の上部へ集束される。干渉パターンが図２０Ｂに示すように位置決めされた状態で、第１の画像が記録される。次いで、図２０Ｃに示すように、干渉パターンは、干渉パターン２０１０のラインに直交する方向に移動され、第２の画像が収集される。本発明の一実施形態では、図２０Ｃに示すものなどの５回の横方向の移動が実施されて、横方向に移動された５つの異なる干渉パターンが作られ、これらの干渉パターンから、５つの画像が収集される。言い換えれば、干渉パターンライン間の間隔を６で割ってより細かい間隔距離を生成し、これらのより細かい間隔距離を採取するには、５回の移動が必要とされる。次いで、図２０Ｄに示すように、干渉パターンは６０度回転２０１２され、次の画像が記録される。図２０Ｅに示すように、次いで干渉パターンは、干渉パターンのラインに対して垂直の方向へ横方向に移動２０１４され、別の画像が記録される。図２０Ｂに示す干渉パターンの第１の向きと同様に、第２の向きでも、５回の異なる移動が実施される。次いで、図２０Ｆに示すように、干渉パターンは再び６０度移動され、次の画像が記録される。図２０Ｇに示すように、干渉パターンは、図２０Ｆに示す位置から横方向に移動２０１８され、別の画像が記録される。上記で論じた最初の２つの向きと同様に、図２０ＦおよびＧに示す第３の向きでも、５回の横方向の移動が実施される。第１の平面から１５個の画像が、３つの向きそれぞれに対して５個ずつ記録された後、干渉パターンは、図２０Ｈの第２の平面２０２０上に集束され、図２０Ｂ〜Ｇに示すように第１の平面から収集された１５個の画像と同じように、この第２の平面に１５個の画像が記録される。試料体積にわたってｚ方向に規則的に隔置された合計８つの平面が採取される。したがって、図２０Ｉに示すように、試料平面を密閉する体積は、１２０個の異なる記録画像を、各平面内の干渉パターンの３つの異なる向きから生成されたｚ方向に１平面当たり１５個ずつ生成する。
【０１４２】
図２１は、本発明の一実施形態の多くの特徴を示す概略図を提供する。拡大されて視準されたレーザビーム２１０２は、図の上部に入射する。通常、複数のレーザからのビームは、異なる波長の画像を捕獲するために、２色性要素と組み合わせることができる。高いコントラストの干渉縞を作り出すには、高品質の光学構成要素の使用および注意深い計量を必要とする。本発明の一実施形態で用いるレーザは、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ製のＳａｐｐｈｉｒｅ−４８８（２０ｍＷ）である。この光は、両端に視準レンズを有する偏光維持式の単一モードファイバ内へ放射される。本発明の本実施形態では、２重ミラー式の４倍反射ビーム拡大器（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を使用してビームをさらに拡大するＱｉｏｐｔｉｑ（旧Ｐｏｉｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ）製の「Ｋｉｎｅｆｌｅｘ」システムが使用される。
【０１４３】
高速傾斜ミラー２１０４が、３つの光学列２１０６〜２１０８の１つへビームを誘導する。このミラーは、位相シフタほど速い必要はない。用いられた溶融石英の誘電体ミラーは、λ／１０の平坦性、５〜１０のスクラッチディグ（ｓｃｒａｔｃｈ−ｄｉｇ）であった（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）。３つの列のそれぞれにおいて、ビームは、誘導ミラー２１１０などの誘導ミラーによって、１組のビームスプリッタ２１１６〜２１２１内へ誘導される。高速傾斜ミラーは本質的に、３つの構造化照明パターンの向きの１つを選択し、各向きは、他の２つの向きのそれぞれに対して１２０°の回転を表す。
【０１４４】
３つのビーム２１２０〜２１２２、「トリプレット」は、ミラーを介して共通のビーム位置合わせモジュール２１３０へ誘導される。３つのビームの相対強度は、当該レーザ波長のビームスプリッタ比の注意深い設計によって、３Ｄ−ＳＩＭの再構築効率が最大になるように最適化することができる。ビーム位置合わせモジュールは、７つの小さいミラーを備え、６つのミラー２１４０〜２１４５は円をなし、１つのミラー２１４６は中心に位置する。６つの外側ミラーが調整され、次いで固定される。所与のトリプレットは、平面内に位置し、中心ミラーおよび２つの外側ミラーから反射する。トリプレットは、角度１、２１５０、角度２、２１５１、および角度３、２１５２として概略的に示す３つの異なる向きに生成することができる。外側の２つのミラーは、トリプレットを含む３つのビームがＢＡＦレンズ２１５４の背面開口で重複するように照準を合わせる。外側ミラーはそれぞれ、約２０ｍＲの角度θに対するように分離される。中心ミラーは、中心ビームを光軸からまっすぐ誘導するように照準を合わせる。各トリプレットからの中心ビームは、異なる角度から中心ミラーに到達しなければならないため、中心ミラーは、各トリプレットに対して１回ずつ調整される高速傾斜ミラーとする必要がある。別法として、単一の傾斜ミラーを使用して、最初の照準合わせタスクとトリプレットの照準合わせタスクを同時に実現することもできる。
【０１４５】
位相シフトモジュール２１６０は、３つの独立した圧電変位モジュールに取り付けられた３つの小さいミラーを備える。このモジュールは、ビームトリプレット間に相対位相シフトを導入して、構造化照明パターンの位置を変化させる。パターンは、ｘおよびｙ方向へ横方向に、またｚ方向へ垂直方向に移動させることができる。ここで方向ｘ、ｙ、およびｚは、機器フレームの方向である。市販の閉ループ圧電アクチュエータは、２μｍの行程、０．０３ｎｍの解像度、および２５ｋＨｚの自然共振周波数を有する。これらのミラーは、概略的に示すように、各トリプレットに対して、１つのミラーが中心ビームの位相を制御し、他のミラーが外側ビームの位相を制御するような形状である。３つのミラーは、全体的なビーム経路の長さが守られる限り、平面内に位置する必要はない。ミラー上の入射角は、ビーム位置合わせモジュールの方へ後方反射するのを回避するために、垂直（直角）ではない。しかし、この入射角は、結合されたビームの平行移動を回避するために、そして有効な誘電体ミラーの使用を可能にするために、ほぼ直角に保たれる。これは、ｓ偏光とｐ偏光の混合物であるビームに望ましくない楕円偏光を引き起こす傾向がある。好ましい場合、２つの外側ミラーだけの圧電制御で、３つのビームの相対位相を制御するのに十分な可能性がある。トリプレットの３つのビームは、焦点距離ｆのＢＡＦレンズの背面開口で重複する。３つのビームは、距離ｆのところで焦点が合い、外側の焦点は、距離ｄ＝ｆθだけ変位される。ｆ＝１８０ｍｍを有するＢＡＦレンズおよびθ＝２０ｍＲの場合、変位ｄ＝３．６ｍｍである。外側ミラーの分離は、選択された顕微鏡対物レンズに対して変位ｄが最適化されるように設計される。ＢＡＦレンズの焦点距離の選択は、ビームの直径、試料における必要な照明スポット寸法、およびミラー取付け部に対する機械設計上の考慮すべき点によって決まる。３つのビームは、対物レンズ２１７０に入射し、３Ｄ−ＳＩＭパターンを生じさせる。格子ベースの体系とは異なり、このシステムはほぼ無彩色であり、外側ビームの位置は、各波長に対して自然に最適化される。
【０１４６】
図２２〜２９は、本発明の一実施形態をさらに示す。これらの図は、本発明の一実施形態であるＳＩＭの機械的な説明を提供する。図２２は、３Ｄ−ＳＩＭ蛍光顕微鏡の光学台内のＳＩＭを示す。光学台２２０２は、広角対物レンズ２２０６を含む中心の光学系ステージ２２０４を支持する。本発明の一実施形態であるＳＩＭ２２０８は、構造化照明パターンを作り出す３つの入射ビームを、開口２２１０を通って対物レンズの焦点面の背面へ、上方へ垂直に誘導するように、光学台の下に取り付けられる。
【０１４７】
図２３は、ＳＩＭを示す。偏光されたレーザ光は、ビーム拡大器２３０４へ入力される位相維持式の光ケーブル２３０２を介して受け取られる。ＳＩＭの上部の垂直板２３０６の下には、傾斜ミラー（図２１では２１０４）が位置する。傾斜ミラーは、同じく板２３０６の下に位置するビーム位置合わせモジュールの中心ミラー（図２１では２１４６）として働く。図２４は、傾斜ミラー２４０４（図２１では２１０４）に当たり、３つの異なる誘導ミラー２４０６（図２１では２１０６）の１つの方へ反射される、拡大されて偏光された光２４０２（図２１では２１０２）を示す。傾斜ミラー２４０４は本質的に、３つの誘導ミラー（図２３では２３１０〜２３１２）の中から、入射して偏光されて拡大された入力ビームを誘導すべき誘導ミラーを選択する。３つの誘導ミラーはそれぞれ、構造化照明パターンの３つの異なる回転の向きの１つを提供する光路の開始点であり、それぞれの向きは、他の２つの向きに対して１２０°回転される。
【０１４８】
中心の水平板（図２３では２３８０）は、３つのアーム２３８２〜２３８４を含み、軸は、互いに１２０度の角度に向けられていることに留意されたい。したがって、誘導ミラー（図２３では２３１０〜２３１２）はそれぞれ、これらの３つのアームの異なる１つへ光を誘導し、これらのアームにはそれぞれ、一連のビームスプリッタ（図２１では２１１６〜２１１８）が取り付けられる。
【０１４９】
図２５は、ステム（ｓｔｅｍ）の中心の水平板の１つのアームに関連する３つのビームスプリッタによる偏光されて拡大されたビームの分割を示す。３つのビームスプリッタ２５１６〜２５１８は、入射ビーム２５１２を分割し、３つの可干渉性ビーム２５１３〜２５１５のトリプレットを形成し、可干渉性ビーム２５１３〜２５１５は、３つの対応する誘導ミラー２５３２〜２５３４へ誘導され、誘導ミラー２５３２〜２５３４は、３つの可干渉性ビームを上方へ、ＳＩＭの上部の水平板（図２３では２３０６）の下に接するビーム位置合わせモジュールへ誘導する。図２５の誘導ミラーアセンブリ２５３６などの３つの異なる誘導ミラーアセンブリは、図２３のＳＩＭの底部に２３３６〜２３３８で見られる。図２６は、ビームトリプレットが図２５の誘導ミラー２５３２〜２５３４から反射され、ビーム位置合わせモジュールに当たって位相シフトモジュール（図２１では２１６０）の方へ反射されるところを示す。図２３では、位相シフトモジュールをＳＩＭ２３３９の底部に取り付けたところが見られる。図２７は、位相シフトモジュールをより詳細に示す。それぞれの異なる向きに対して、トリプレットは、中心ミラー２７８８および側部ミラー２７８９および２７９０に当たる。上記で論じたように、位相シフトミラーは、トリプレットビームの入射ビーム間に相対位相シフトを導入して、機器の基準系に対する構造化照明パターンの位置を変化させる。最終的に、図２８に示すように、位相シフトされたビームトリプレットは、位相シフトされたモジュール２３３９から、ＳＩＭの上部の水平板２３０６内の開口を通って反射され、図２９に示すように、適正な向きおよび離隔距離で対物レンズ２２０６の後方焦点面へ誘導される。
【０１５０】
図３０は、本発明の一実施形態による３Ｄ−ＳＩＭを調節する際に使用されるＭａｔＬａｂ表示の更新を示す。試料における３Ｄ干渉パターンのピッチおよび向きは、光軸上でうまく中心に位置合わせされた中心ビームに対する外側ビームの角度を変えることによって調節される。蛍光標的は、光脱色にかけられ、この目的でやや低いＳＮＲをもたらし、したがってビームは、画像平面に対して共役であるビームの交差点で干渉パターンを測定することによって位置合わせされる。カメラの画像平面は、ＢＡＦレンズ前の交差点に配置することができ、または動作中の場合、位相フィードバックシステムを使用することができる。交差点では、１２８０×９６０で３．７５μｍの画素を有する小型のＦｉｒｅＷｉｒｅ−８００カメラが使用された（Ｆｌｅａ  ２，Ｐｏｉｎｔ  Ｇｒｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）。ＭａｔＬａｂ表示の上部パネル３００２は、１０画素だけ分離された３つの列に対する適合性を重ね合わせた（オフセット）データである。中央のパネル３００４は、３つの列に対する位相オフセットを表示し、下部は、カメラの水平位置に対する推論される縞の角度および縞のピッチを表示する。初めに、左のビームが阻止され、右のビームが、中心ビームに対して十分な角度に設定され、干渉パターンの角度およびピッチが記録される。ビーム阻止部が交換され、次いで左のビームが注意深く調節され、記録された値に整合するように複数のミラーを調整する。これらのミラーは、屈曲または運動学的にばねに取り付けられた専用のミラー固定具内の１００ＴＰＩのねじを回すことによって、ピッチおよび偏揺れの点で照準を合わせることができる。このプロセスは、他のアームに対しても繰り返される。３つのアーム間で、かなり良好なピッチの一致を得ることができる。所与のアーム上の左−中心と中心−右のピッチが釣り合っていない場合、その結果、干渉平面が試料平面に対して傾斜する。ミラーの調節精度は、この傾斜を無視できるほどにできる精度である。角度が釣り合っていない場合、３Ｄ干渉パターンを複雑にする可能性がある。ビームは、視野全体にわたって角度の不整合が縞のピッチのわずかな部分に対するように照準が合わせられる。
【０１５１】
本発明について特定の実施形態の点から説明したが、本発明をこれらの実施形態に限定しようとするものではない。修正形態は、当業者には明らかであろう。たとえば、ＳＩＭの様々な代替実施形態は、段落２１〜２９に示すＳＩＭの機能性を提供するように設計および構築することができる。たとえば、図２１〜２９に示すＳＩＭの実施形態では、傾斜ミラー（図２１では２１０４）はまた、ビーム位置合わせモジュール（図２１では２１５０）の中心ミラーとして使用される。代替実施形態では、傾斜ミラー２１０４に対して別個の傾斜ミラーを用いることができる。図２１〜２９に示す様々な構成要素に対して、多くの異なる製造業者からの多くの異なる電気光学機械的な構成要素を使用することができる。ＳＩＭの寸法、幾何形状、および構成は、代替のタイプの光学構成要素ならびに代替の光路および光路形状に対応するように修正することができる。３Ｄ−ＳＩＭ蛍光顕微鏡では、３Ｄ−ＳＩＭ蛍光顕微鏡に結合されたコンピュータシステム上で実行されるソフトウェア構成要素を含めて、様々な追加の較正および制御の構成要素および機能性を用いて、ＳＩＭの動作を較正および制御することができる。較正および制御のシステムおよび機能性は、多くの異なる物理的構成要素およびコンピュータソフトウェア構成要素を使用することによって実施することができる。
【０１５２】
上記の記載では、本発明の徹底的な理解を提供するために、説明の目的で特有の命名法を使用した。しかし、本発明を実施するのに特有の詳細は必須ではないことが、当業者には明らかであろう。本発明の特有の実施形態の上記の記載は、図示および説明の目的で提示される。これらの記載は、排他的なものではなく、または開示した正確な形態に本発明を限定しようとするものではない。上記の教示の点から、多くの修正形態および変形形態が可能である。これらの実施形態は、本発明の原理およびその実際の応用例について最もよく説明するために図示および記載され、それによって当業者は、企図する特定の用途に適した様々な修正形態を用いて、本発明および様々な実施形態を最もうまく利用することができる。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲およびその均等物によって定義されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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