(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患を処置する方法を提供する。本方法は、本発明に記載されている化合物を治療上有効量投与するステップを含む。本発明の一部の態様において、本方法は、免疫抑制剤を必要とする対象の少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患を処置するための少なくとも１種類の免疫抑制剤を更に含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ若しくは式Ｂ
【化１】
2013509433.tif 000068
［式中、
Ｍは、
【化２】
2013509433.tif 000069
であり、
Ｑは、存在する場合、
【化３】
2013509433.tif 000070
であり、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、ハロゲン、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＮＨＲｉ又は−ＮＲｉＲｉｉであり、Ｒｉ及びＲｉｉは、独立して、水素又は脂肪族部分であり、
ｍは、０〜６の整数であり、
Ｂは、水素、−ＣＨ３、Ｆ、ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｎ３からなる群から選択され、
Ｘは、セレン、イオウ又は酸素から選択され、
Ｒ３は、ヒドロキシ、−ＯＲ２ａ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、Ｃ１−８ヘテロアルキル、Ｃ２−８ヘテロアルケニル、Ｃ２−８ヘテロアルキニル又は−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｒ２ａは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、Ｃ１−８ヘテロアルキル、Ｃ２−８ヘテロアルケニル、Ｃ２−８ヘテロアルキニル、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、Ｃ１−８ヘテロアルキル、Ｃ２−８ヘテロアルキニル、Ｃ２−８ヘテロアルケニル及びＣ６−１０アリールからなる群から選択され、又は、
ＮＲ’Ｒ’’は、置換又は非置換アミノ酸残基であり、
Ｚは、少なくとも１個のＮを含むヘテロ環部分を含み、
記号＊は、式（Ａ）又は（Ｂ）におけるメチレンとＺとの結合ポイントが、ヘテロ環部分の利用可能な窒素を介することを示す］
の化合物、それらの立体異性体、ジアステレオマー、エナンチオマー若しくはラセミ体又はそれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩の治療上有効量を対象に投与するステップを含む、対象における少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患を処置する方法。
【請求項２】
前記対象が免疫低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患が、腎症、出血性膀胱炎及び進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が、ポリオーマウイルス又はアデノウイルスである少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
疾患が、ＢＫ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩＶ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が、ＢＫウイルス又はＪＣＶである少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、少なくとも１種類のｄｓＤＮＡウイルスに感染している、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種類のウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡、ワクシニア、天然痘、牛痘、ラクダ痘、サル痘、エボラウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス又はＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＳＶ４０等のポリオーマウイルス並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象がＨＩＶに感染している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、ウイルス感染細胞及び／又はウイルスの複製を特異的に標的として、ウイルスに関連する疾患を処置する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、免疫抑制薬を投薬中の移植患者である、請求項１〜９のいずれかの方法。
【請求項１２】
移植患者が、腎臓、骨髄、肝臓、肺、胃、骨、精巣、心臓、膵臓、腸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の移植臓器を有するレシピエントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、原発性又は後天性免疫不全症である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、免疫抑制療法の結果免疫低下している、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、化学療法の結果免疫低下している、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｘが酸素である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ３がヒドロキシルである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒｘ及びＲｙが、独立して、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｏ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−Ｏ（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｓ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−Ｓ（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−ＮＨ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−ＮＨ（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アシル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルケニル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルケニル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキニル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アシル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）及び−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アシル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
Ｍが、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ１−２４アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−Ｃ１−２４アルキル、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ１−２４アルキル及び−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ１−２４アルキルからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
Ｍが、−Ｏ−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＨ３（式中、ａは２〜４、ｔは１１〜１９である）である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
Ｍが、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）１７ＣＨ３である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
Ｍが、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３又は−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）１７ＣＨ３である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
Ｂが−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＨである、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
式Ａの化合物が、式Ｃ
【化４】
2013509433.tif 000071
［式中、
ａは２〜４、
ｔは１１〜１９、
Ｂは水素、−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＨである］
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ａが２又は３である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
ｔが１５又は１７である、請求項２４又は２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｂが−ＣＨ３又はＣＨ２ＯＨである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｚが、
【化５】
2013509433.tif 000072
［式中、式１、２、３又は４における記号＊は、Ｎと式Ａ又はＢにおけるメチレンとの結合ポイントを示す］
である、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物が、
【化６Ａ】
2013509433.tif 000073
【化６Ｂ】
2013509433.tif 000074
又はその医薬的に許容可能な塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が免疫抑制剤を必要とする、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象に、１又は複数の免疫抑制剤を式Ａ又はＢの前記化合物と組み合わせて投与するステップを更に含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫抑制剤が、対象に同時的又は逐次的に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種類の免疫抑制剤が、ダクリズマブ、バシリキシマブ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸塩（ミコフェノール酸ナトリウム又はミコフェノール酸モフェチルとして）、シクロスポリンＡ、グルココルチコイド、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ５２モノクローナル抗体（キャンパス１−Ｈ）、アザチオプリン、エベロリムス、ダクチノマイシン、シクロホスファミド、白金、ニトロソウレア、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ムロモナブ、ＩＦＮガンマ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、タイサブリ（ナタリズマブ）、フィンゴリモド、シクロホスファミド、メトトレキサート、レフルノミド及びリツキシマブ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種類の免疫抑制剤が、タイサブリ（ナタリズマブ）である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が、構造、
【化７】
2013509433.tif 000075
又はその医薬的に許容可能な塩を有し、少なくとも１種類の免疫抑制剤がタイサブリ（ナタリズマブ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患がアデノウイルスに関連する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が、以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患がヘルペスウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患がサイトメガロウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患がアデノウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が、少なくとも１種類のアデノウイルスに関連し、方法が、構造
【化８】
2013509433.tif 000076
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物を、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル及びバラシクロビルからなる群から選択される少なくとも１種類の抗ウイルス剤と組み合わせて投与するステップを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が、少なくとも１種類のヘルペスウイルスに関連し、方法が、構造
【化９】
2013509433.tif 000077
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物を、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル及びバラシクロビルからなる群から選択される少なくとも１種類の抗ウイルス剤と組み合わせて投与するステップを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患が、少なくとも１種類のサイトメガロウイルスに関連し、方法が、構造
【化１０】
2013509433.tif 000078
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物を、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル及びバラシクロビルからなる群から選択される少なくとも１種類の抗ウイルス剤と組み合わせて投与するステップを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
構造
【化１１】
2013509433.tif 000079
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物の治療上有効量を対象に、投与するステップを含む、免疫低下した対象における腎症又は出血性膀胱炎を処置する方法。
【請求項４５】
前記腎症又は出血性膀胱炎が、ＢＫウイルス又はＪＣウイルスである少なくとも１種類のポリオーマウイルスに関連する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫低下した対象が、腎移植患者又は骨髄移植患者である、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の原因となる１又は複数の薬物と組み合わせた投与を受けた対象に、構造
【化１２】
2013509433.tif 000080
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物の治療上有効量を投与するステップを含む、ＰＭＬを処置する方法。
【請求項４８】
前記薬物が、リツキサン、ラプティバ、タイサブリ（ナタリズマブ）、マイフォーティック、アボネックス、レミケード、エンブレル、ヒュミラ及びセルセプトからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
構造
【化１３】
2013509433.tif 000081
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物の治療上有効量を、タイサブリ（ナタリズマブ）と組み合わせて、対象に投与するステップを含む、多発性硬化症及び／又は進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）を処置する方法。
【請求項５０】
対象に、構造
【化１４】
2013509433.tif 000082
又はそのいずれかの医薬的に許容可能な塩を有する化合物の治療上有効量を、構造
【化１５】
2013509433.tif 000083
又はそのいずれかの医薬的に許容可能な塩を有する化合物と組み合わせて投与するステップを含む、対象におけるＨＩＶ及び／又は少なくとも１種類のウイルスに関連する障害を処置する方法。
【請求項５１】
疾患が、腎症、出血性膀胱炎及び進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）からなる群から選択される、少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が、ポリオーマウイルス又はアデノウイルスである少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患が、ＢＫ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩＶ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記疾患が、ＢＫウイルス又はＪＣＶである少なくとも１種類のウイルスに関連する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体中に、構造
【化１６】
2013509433.tif 000084
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物と、ＰＭＬの原因となる１又は複数の薬物とを含む医薬組成物。
【請求項５６】
他の薬物が、少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体中のリツキサン、ラプティバ、タイサブリ（ナタリズマブ）、マイフォーティック、アボネックス、レミケード、エンブレル、ヒュミラ及びセルセプトからなる群から選択される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体中に、構造
【化１７】
2013509433.tif 000085
又はその医薬的に許容可能な塩を有する化合物と、タイサブリ（ナタリズマブ）とを含む医薬組成物。
【請求項５８】
少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体中に、構造
【化１８】
2013509433.tif 000086
又はそのいずれかの医薬的に許容可能な塩を有する化合物と、構造
【化１９】
2013509433.tif 000087
又はそのいずれかの医薬的に許容可能な塩を有する化合物とを組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項５９】
請求項１〜５４のいずれかに記載の処置方法を行うための、請求項１〜５４のいずれか一項に定義されている式Ａ若しくはＢ又はそれらの組み合わせの化合物。
【請求項６０】
請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法を行うための薬剤の調製のための、請求項１〜５５のいずれか一項に定義されている式Ａ若しくはＢ又はそれらの組み合わせの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その開示全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２００９年１０月３０日に出願された米国特許仮出願番号第６１／２５６，７０１号明細書、２０１０年４月２２日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２６，９９１号明細書、２０１０年４月２２日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２６，９８９号明細書、２０１０年４月２２日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２６，９８２号明細書、２０１０年４月２２日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２６，９８６号明細書、２０１０年４月２３日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２７，４７４号明細書、２０１０年４月２６日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２７，９１４号明細書、２０１０年４月２７日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３２８，４９１号明細書、２０１０年５月３日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３３０，６２４号明細書、２０１０年５月５日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３３１，７０４号明細書、２０１０年６月１６日に出願された米国特許仮出願番号第６１／３５５，４３０号明細書、２０１０年１０月２０日に出願された米国特許仮出願番号第６１／４０５，０７３号明細書、２０１０年１０月２０日に出願された米国特許仮出願番号第６１／４０５，０８０号明細書、２０１０年１０月２０日に出願された米国特許仮出願番号第６１／４０５，０７５号明細書及び２０１０年１０月２０日に出願された米国特許仮出願番号第６１／４０５，０８４号明細書の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。
【０００２】
本発明は、少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患、特にポリオーマウイルスに関連する疾患をヌクレオシドホスホネートにより処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＢＫ及びＪＣウイルスは、健常な成人集団の３分の２超に明らかな臨床症状なく感染するポリオーマウイルスである。ＢＫウイルスは、小児期に感染し、断続的な周期で尿中に無症候性排出しつつ腎尿路（renourinary tract）において潜伏感染の状態で持続することが知られている（Ｅｇｌｉ  Ａら（２００９）Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＢＫ  ａｎｄ  ＪＣ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ４００  ｈｅａｌｔｈｙ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎｏｒｓ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９（６）：８３７〜８４６；Ｈｉｒｓｃｈ、ＨＨら（２００３）、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＢＫ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３、６１１〜６２３を参照）。ＢＫウイルスとは対照的に、ＪＣウイルス血清有病率はより後期に生じ、成人期において上昇し続ける。これらウイルスの感染は、健常個体においては一般に無症候性であるが、移植患者等、免疫不全患者はリスクを有する。ＢＫウイルス疾患は、腎移植患者の１〜１０％に発症するポリオーマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）及び同種造血幹細胞移植後の患者の５〜１５％に発症するポリオーマウイルス関連出血性膀胱炎（ＰＶＨＣ）を含む（Ｈｉｒｓｃｈ、ＨＨ（２００５）、ＢＫ  ｖｉｒｕｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ  ｍａｋｅｓ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４１、３５４〜３６０を参照）。ＪＣウイルスが原因の重要な疾患は、ポリオーマウイルス関連多巣性白質脳症（ＰＶＭＬ）（Ｐａｄｇｅｔｔ  ＢＬら、（１９７１）Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｐｏｖａ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｃｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、Ｌａｎｃｅｔ．Ｊｕｎ  １９；１（７７１２）；１２５７〜６０を参照）及び発生頻度は低いがポリオーマウイルス関連腎症（Ｄｒａｃｈｅｎｂｅｒｇ  ＣＢら（２００７）Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＢＫ  ｖｅｒｓｕｓ  ＪＣ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．８４：３２３〜３０を参照）である。現在、それぞれ腎及び骨髄移植患者におけるポリオーマウイルス関連腎症又は出血性膀胱炎に対する効力が証明された抗ウイルス薬はない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第一の態様は、対象における少なくとも１種類のウイルスに関連する状態／疾患を処置する方法である。該方法は、対象に治療上有効量の本明細書に記載されている化合物を投与するステップを含む。本明細書に記載されている化合物は、ウイルスの複製及び／又はウイルスに感染／形質転換した細胞を特異的に標的とする。一実施形態において、対象は免疫低下している。
【０００５】
一部の実施形態において、ウイルスに関連する疾患は、腎症、出血性膀胱炎又は進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）から選択される。別の実施形態において、腎症又は出血性膀胱炎は、少なくとも１種類のポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルス又はＪＣウイルス）に関連する。更に、一実施形態において、出血性膀胱炎は、少なくとも１種類のアデノウイルス（例えば、サブグループＢの血清型１１及び１２）に関連する。一実施形態において、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）は、少なくとも１種類のＪＣウイルスに関連する。
【０００６】
一部の実施形態において、疾患は、ポリオーマウイルス（ＢＫ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩＶ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等）、パピローマウイルス（ヒトパピローマウイルス、ワタウサギパピローマウイルス、ウマパピローマウイルス及びウシパピローマウイルス等）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）又はそれらの組み合わせから選択された少なくとも１種類のウイルスに関連する。
【０００７】
一実施形態において、化合物は、
【化１】
2013509433.tif 000002
又はその医薬的に許容可能な塩である。
【０００８】
本発明の更なる態様は、免疫抑制剤を必要とする対象における、少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患を処置するための方法を提供する。該方法は、対象に１又は複数の免疫抑制剤と組み合わせた、治療上有効量の本明細書に記載されている化合物を投与するステップを含む。
【０００９】
一部の実施形態において、少なくとも１種類の免疫抑制剤は、ダクリズマブ、バシリキシマブ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸塩（ナトリウム若しくはモフェチルの）、シクロスポリンＡ、グルココルチコイド、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ５２モノクローナル抗体（キャンパス１−Ｈ）、アザチオプリン、エベロリムス、ダクチノマイシン、シクロホスファミド、白金、ニトロソウレア、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ムロモナブ、ＩＦＮガンマ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、タイサブリ（ナタリズマブ）、フィンゴリモド又はそれらの組み合わせから選択される。
【００１０】
一実施形態において、少なくとも１種類の免疫抑制剤はタイサブリ（ナタリズマブ）である。
【００１１】
次の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様を更に明示するよう含まれている。本発明は、これら図面のうち１又は複数を本明細書に記されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、更に良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＢＫＶ負荷量及びＢＫＶタンパク質の発現における、ＣＭＸ００１濃度増加の効果を説明する図である。図１（ａ）は、ＣＭＸ００１濃度と細胞外ＢＫＶ負荷量低下との間の関係性を説明する。図１（ｂ）は、７２ｈｐ．ｉ．におけるＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの免疫蛍光染色像を示す。  図１（ａ）に関して、７２ｈｐ．ｉ、即ち、表示のＣＭＸ００１濃度による処置開始後７０時間目にＲＰＴＥＣ上清を回収した。ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲによって測定し、インプットウイルスを差し引いた。無処置細胞（１．０５Ｅ＋０９Ｇｅｑ／ｍｌ）におけるＤＮＡ負荷量を１００％と設定した。  図１（ｂ）に関して、無処置及びＣＭＸ００１処置したＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの間接免疫蛍光は、７２ｈｐ．ｉにメタノール固定し、後期アグノプロテイン視覚化のためにウサギ抗アグノプロテイン血清（緑色）で、またＢＫＶ  ＬＴａｇ視覚化のためにＳＶ４０  ＬＴａｇモノクローナルＰａｂ４１６（赤色）で染色した。Ｄｒａｃ５染色によって細胞密度を青色で示す。
【図２】図２（ａ）は、ＣＭＸ００１濃度と非感染ＲＰＴＥＣのＤＮＡ複製との間の関係を説明する。図２（ｂ）は、ＣＭＸ００１濃度と非感染ＲＰＴＥＣの代謝活性との間の関係を説明する。  図２（ａ）に関して、細胞ＤＮＡ複製をＢｒｄＵ取り込みにより検査した。表示のＣＭＸ００１濃度を有する培地を２ｈｐ．ｉ．にて添加し、吸光度を７２ｈｐ．ｉ．にて測定した。無処置細胞の吸光度を１００％として設定した。  図２（ｂ）に関して、ＷＳＴ−１開裂として代謝活性を検査した。表示のＣＭＸ００１濃度を有する培地を２ｈｐ．ｉにて添加し、吸光度を７２ｈｐ．ｉ．にて測定した。無処置細胞の吸光度を１００％として設定した。
【図３】ＢＫＶゲノム複製におけるＣＭＸ００１、０．３１μＭの影響を説明する図である。図３に関して、ＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣを表示の時点において回収し、細胞当たりの細胞内ＢＫＶ  ＤＮＡ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。
【図４】ＢＫＶ初期及び後期発現におけるＣＭＸ００１、０．３１μＭの影響を説明する図である。図４（ａ）は、無処置及びＣＭＸ００１処置したＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの間接免疫蛍光像を示す。図４（ｂ）は、４８及び７２ｈｐ．ｉ．に回収したＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの細胞抽出物並びにウサギ抗ＢＫＶ  ＶＰ１、抗アグノプロテイン血清及びハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨに対して作製されたモノクローナル抗体を用いて行ったウエスタンブロットを示す。  図４（ａ）に関して、無処置及びＣＭＸ００１処置したＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの間接免疫蛍光は、４８及び７２ｈｐ．ｉにメタノール固定し、後期アグノプロテイン視覚化のためにウサギ抗アグノプロテイン血清（緑色）で、ＢＫＶ  ＬＴａｇ視覚化のためにＳＶ４０  ＬＴａｇモノクローナルＰａｂ４１６（赤色）で染色した。図４（ｂ）に関して、４８及び７２ｈｐ．ｉにＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの細胞抽出物を回収し、ウサギ抗ＢＫＶ  ＶＰ１、抗アグノプロテイン血清及びハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨに対して産生されたモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
【図５】ＢＫＶ細胞外ＢＫＶ負荷量におけるＣＭＸ００１、０．３１μＭの影響を説明する図である。図５は、ＢＫＶ細胞外ＢＫＶ負荷量におけるＣＭＸ００１、０．３１μＭの影響を示す。ＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの上清を感染後の表示の時点において回収し、ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。データは、Ｇｅｑ／ｍｌ単位のＢＫＶ負荷量として提示する。
【図６】感染前のＲＰＴＥＣの前処置に対するＣＭＸ００１の影響を示す図である。図６に関して、ＲＰＴＥＣは、新しい完全成長培地を添加する時点である感染２０時間前まで４時間処置され、或いは感染前に完全成長培地で１時間洗浄する時点である感染１時間前まで２４時間処置される。上清を７２ｈｐ．ｉ．に回収し、細胞外ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。データは、１００％に設定した無処置細胞のパーセントで提示する。
【図７】ＣＭＸ００１の安定性を説明する図である。図７に関して、新たに調製したＣＭＸ００１又は１週間４℃若しくは−２０℃で保存した１ｍｇ／ｍｌ原液から作製したＣＭＸ００１により、ＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣを処置した。上清を７２ｈｐ．ｉ．に回収し、細胞外ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。データは、１００％に設定した無処置細胞のパーセントのＢＫＶ負荷量として提示する。
【図８】ＣＯＳ−７細胞におけるＪＣＶ  Ｍａｄ−４の複製を示す図である。図８に関して、ＪＣＶ感染ＣＯＳ−７細胞の間接免疫蛍光は、７ｄ．ｐ．ｉ．に固定し、後期カプシドタンパク質ＶＰ１の視覚化のためにウサギ抗ＶＰ１血清（赤色）で、またＤＮＡ（青色）を示すためヘキスト３３３４２色素で染色した。重ね合わせ写真を右パネルに示す。
【図９】アストロサイト細胞におけるＪＣＶ  Ｍａｄ−４の複製及びＪＣＶ感染アストロサイト細胞の間接免疫蛍光像を示す図である。固定及び染色は図８と同一である。
【図１０】アストロサイト細胞におけるＪＣＶ複製過程を示す図である。図１０（ａ）は、７ｄ．ｐ．ｉ．に固定し、後期カプシドタンパク質ＶＰ１視覚化のためにウサギ抗ＶＰ１血清（赤色）で、またＤＮＡ（青色）を示すためにヘキスト３３３４２色素で染色したＪＣＶ感染アストロサイト細胞の間接免疫蛍光を示す。重ね合わせ写真を右パネルに示す。図１０（ｂ）は、１４ｄ．ｐ．ｉ．に固定したＪＣＶ感染アストロサイト細胞の間接免疫蛍光像を示す。固定及び染色はａ）と同様である。図１０（ｃ）は、１４ｄ．ｐ．ｉ．に固定した偽（mock）感染アストロサイト細胞の間接免疫蛍光像を示す。固定及び染色は１０（ａ）と同様である。
【図１１】ＣＯＳ−７細胞における再連結したＪＣＶ  Ｍａｄ−４  ＤＮＡの複製及び７ｄ．ｐ．ｔ．に固定し、後期カプシドタンパク質ＶＰ１視覚化のためにウサギ抗ＶＰ１血清（赤色）で、またＤＮＡ（青色）を示すためにヘキスト３３３４２色素で染色した、ＪＣＶ  ＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の間接免疫蛍光像を示す図である。重ね合わせ写真を右パネルに示す。
【図１２】ＣＭＸ００１  ＩＣ−５０及びＩＣ−９０決定を示す図である。５ｄ．ｐ．ｉ．即ち、表示のＣＭＸ００１濃度による処置開始１１８時間後にＣＯＳ−７上清を回収した。ＪＣＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定し、インプットウイルスを差し引いた。無処置細胞（５．０４×１０Ｅ＋９ｇｅｑ／ｍｌ）におけるＤＮＡ負荷量を１００％として設定した。ＪＣＶの複製は、無処置細胞のパーセンテージとして示し、ＩＣ−５０及びＩＣ−９０を決定する。
【図１３】ＣＯＳ−７細胞の代謝活性におけるＣＭＸ００１濃度増加の効果を示す図である。ＷＳＴ−１開裂として代謝活性を検査した。表示のＣＭＸ００１濃度を有する培地をＣＯＳ−７細胞に添加し、播種７２時間後に吸光度を測定した。無処置細胞の吸光度を１００％として設定した。
【図１４】ＣＯＳ−７細胞の複製におけるＣＭＸ００１濃度増加の効果を説明する図である。ＢｒｄＵ取り込みによりＤＮＡ複製を決定した。表示のＣＭＸ００１濃度を有する培地をＣＯＳ−７細胞に添加し、播種７２時間後に吸光度を測定した。無処置細胞の吸光度を１００％として設定した。
【図１５】細胞外ウイルス負荷量におけるＣＭＸ００１濃度増加の効果を示す図である。ＣＭＸ００１処置及び無処置のＪＣＶ感染ＣＯＳ−７細胞の上清を感染後の表示の時点で回収し、ＪＣＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。データは、ｌｏｇ  ｇｅｑ／ｍｌのＪＣＶ負荷量として提示する。
【図１６】ＪＣＶタンパク質の発現におけるＣＭＸ００１濃度増加の効果を説明する図である。表示の濃度のＣＭＸ００１で処置したＪＣＶ感染ＣＯＳ−７細胞の間接免疫蛍光は、７ｄ．ｐ．ｉ．で固定し、後期カプシドタンパク質ＶＰ１視覚化のためにウサギ抗ＶＰ１血清（赤色）で、ＤＮＡ（青色）を示すためにヘキスト３３３４２色素で染色した。重ね合わせ写真を右パネルに示す。
【図１７】アストロサイトにおける細胞外ウイルス負荷量におけるＣＭＸ００１濃度増加の効果を説明する図である。表示の濃度のＣＭＸ００１で処置したＪＣＶ感染ＰＤＡ細胞の上清を感染後の表示の時点で回収し、ＪＣＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。データは、ｌｏｇ  ｇｅｑ／ｍｌのＪＣＶ負荷量として提示する。
【図１８】単一用量の投与後のＣＭＸ００１の血漿濃度曲線を説明する図である。
【図１９】単一用量のＣＭＸ００１の後のシドホビルの血漿濃度曲線を説明する図である。
【図２０】ＣＭＸ００１による処置の直前及びその間の血漿アデノウイルスを説明する図である。２ｍｇ／ｋｇ投与を１週間に２回で処置を開始し、第６の用量の後に３ｍｇ／ｋｇに増加した。ウイルスが検出不能（＜１０２）となった後、ＣＭＸ００１の投与を３ｍｇ／ｋｇで継続したが、維持するためにスケジュールを１週間に１回へと低減させた。挿入図は、単一用量を投与した健常な志願者（ＨＶＴ）と比較した、第１、第１０及び第２０の用量の後の用量正規化した最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）及びＣＭＸ００１の全身性曝露（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）を示す。
【図２１】図２１ａ〜２１ｅは、ｌｏｇ１０ウイルス負荷量（ｙ軸）対ＡＬＣ（ｘ軸）のベースラインからの変化の散布図を説明する。プロットは、０週目からそれぞれ１、２、４、６及び８週目までの差異を示す。スピアマン相関係数及びｐ値が含まれている。
【図２２】ＣＭＸ００１及びＧＣＶが、ウイルスＤＮＡの蓄積を阻害することを説明する図である。９６ウエルプレート中のＨＦＦ細胞単層を、０．００１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＨＣＭＶに感染させた。化合物希釈液を添加し、感染細胞を７日間インキュベートした。全ＤＮＡを精製し、リアルタイムＰＣＲにより定量化し、培養物のｌｏｇ１０ゲノム当量／ｍｌ（ｌｏｇ１０  ｇｅ／ｍｌ）として得た。値は４ウエルの平均を表し、バーはデータの標準偏差を表す。点線は、感染の惹起に用いた接種菌液に関連するインプットＤＮＡを表す。
【図２３】ＣＭＸ００１及びＧＣＶが、ＨＣＭＶの複製を相乗的に阻害することを説明する図である。示されている濃度の化合物を感染細胞に添加した。データは、４回複製試料から決定したゲノムコピー数に由来する。相乗作用プロットは、９５％信頼レベルで各濃度組み合わせにおいて予想されたウイルス複製阻害より大きいことを表す。相乗作用の量は比較的低かったが（２．２  ｌｏｇ１０ゲノム当量／ｍｌ（ｌｏｇ１０  ｇｅ／ｍｌ）、広範囲の濃度で発生した。
【図２４】ＨＦＦ細胞におけるＣＭＸ００１及びＧＣＶの複合細胞毒性を説明する図である。薬物組み合わせの添加に続き、細胞生存率を７日目に決定した。示されているデータは、ＣＭＸ００１の各濃度（ｎＭ）における生存率であり、ＧＣＶは図中の説明文に示す濃度（μＭ）で添加する。エラーバーは、２回複製決定の標準偏差を表す。
【図２５】ＧＣＶ、ＣＤＶ及びＣＭＸ００１が、ＨＣＭＶ転写産物の量を低下させることを説明する図である。
【図２６】ＣＤＶ及びＣＭＸ００１に対する転写応答が同様であることを説明する図である。
【図２７】ＣＭＸ００１とＡＣＶの組み合わせのｉｎ  ｖｉｔｒｏの相乗作用プロットを説明する図である。
【図２８】ＢＫＶ負荷量及びＢＫＶタンパク質の発現におけるＣＭＸ００１濃度増加の効果を説明する図である。図２８（ａ）：７２ｈｐｉ、即ち表示のＣＭＸ００１濃度による処置開始７０時間後にＲＰＴＥＣ上清を回収し、ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。無処置細胞（１．１９Ｅ＋０９Ｇｅｑ／ｍｌ）におけるＤＮＡ負荷量を１００％として設定した。  図２８（ｂ）：無処置或いは表示のＣＭＸ００１濃度により処置したＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの間接免疫蛍光。細胞を７２ｈｐｉでメタノール固定し、一次抗体ポリクローナルとして、後期アグノ視覚化のためにウサギ抗アグノ（agno）血清（緑色）で、ＢＫＶ  ＬＴ−ａｇ視覚化のためにＳＶ４０  ＬＴ−ａｇモノクローナルＰａｂ４１６（赤色）で染色した。細胞核（青色）をＤｒａｃ５で染色した。
【図２９】ＢＫＶ−Ｄｕｎｌｏｐ初期発現及びＲＰＴＥＣ内のＤＮＡ複製における０．３１μＭのＣＭＸ００１の影響を説明する図である。図２９（ａ）：初期ｍＲＮＡ発現。表示の時点におけるＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣからＲＮＡを抽出した。ＬＴ−ａｇ  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、ｈｕＨＰＲＴ転写産物に対して正規化した。結果をＬＴ−ａｇ  ｍＲＮＡレベルの変化として提示し、２４ｈｐ．ｉの無処置試料におけるレベルを任意に１と設定する。図２９（ｂ）：初期タンパク質発現。ＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの細胞抽出物を２４、４８及び７２ｈｐｉに回収し、ポリクローナルウサギ抗ＬＴ−ａｇ血清及びハウスキーピングタンパク質グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して産生されたモノクローナル抗体でウエスタンブロットを行った。抗ＬＴ−ａｇ血清は、起源が不明の細胞タンパク質も認識する。図２９（ｃ）：ＢＫＶ  ＤＮＡ複製。ＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣを表示の時点で回収し、ＤＮＡを抽出した。細胞内ＢＫＶ  ＤＮＡ負荷量をｑＰＣＲにより測定し、アスパルトアシラーゼ（aspartoacyclase）（ＡＣＹ）ｑＰＣＲを用いた細胞ＤＮＡに対し正規化した。データをＧｅｑ／細胞として提示する。
【図３０】ＲＰＴＥＣ後期ｍＲＮＡ発現におけるＢＫＶ−Ｄｕｎｌｏｐ後期発現における０．３１μＭのＣＭＸ００１の影響を説明する図である。図３０（ａ）：後期ｍＲＮＡ発現。ＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣからＲＮＡを表示の時点で抽出した。ＶＰ１  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、ｈｕＨＰＲＴ転写産物に対して正規化した。結果は、ＶＰ１  ｍＲＮＡレベルの変化として提示し、２４ｈｐｉにおける無処置試料のレベルを任意に１に設定する。図３０（ｂ）：後期タンパク質発現。ＣＭＸ００１処置及び無処置のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの細胞抽出物を２４、４８及び７２ｈｐｉで回収し、ポリクローナルウサギ抗アグノ及び抗ＶＰ１血清並びにモノクローナル抗体の抗ＧＡＰＤＨによりウエスタンブロットを行った。図３０（ｃ）：初期及び後期タンパク質発現。無処置又はＣＭＸ００１で処置したＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの間接免疫蛍光。細胞を４８及び７２ｈｐｉでメタノール固定し、一次抗体として、後期アグノ視覚化のためにポリクローナルウサギ抗アグノ血清（緑色）で、ＢＫＶ  ＬＴ−ａｇ視覚化のためにＳＶ４０  ＬＴ−ａｇモノクローナルＰａｂ４１６（赤色）で染色した。細胞核（青色）をＤｒａｃ５で染色した。
【図３１】ＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの０．３１μＭ処置におけるＣＭＸ００１の動態を説明する図である。図３１（ａ）：細胞外ＢＫＶ負荷量。感染２時間後にＣＭＸ００１を添加し、処置をそれぞれ２４、４８、７２又は９６時間継続した。表示の時間において、上清を除去し、細胞を洗浄し、新しい培地を添加した。９６ｈｐｉにおいて全上清を回収し、ｑＰＣＲを行った。データは、Ｇｅｑ／ｍｌのＢＫＶ負荷量として提示する。図３１（ｂ）：上述の細胞から９６ｈｐｉに収集した上清を１：１０希釈し、新しいＲＰＴＥＣ細胞に接種した。７２ｈｐｉ細胞をメタノール固定し、ポリクローナルウサギ抗アグノ血清（緑色）及びＳＶ４０  ＬＴ−ａｇモノクローナルＰａｂ４１６（赤色）による免疫蛍光染色を行った。細胞核（青色）をＤｒａｃ５で染色した。
【図３２】非感染及びＢＫＶ感染したＲＰＴＥＣのＤＮＡ複製、代謝活性、細胞接着及び増殖におけるＣＭＸ００１の影響を説明する図である。図３２（ａ）：ＢｒｄＵ取り込みをモニタリングするための細胞増殖の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により細胞ＤＮＡ複製を検査し、ＷＳＴ−１開裂を測定する細胞増殖試薬ＷＳＴ−１により代謝活性を検査した。表示のＣＭＸ００１濃度を有する培地を２ｈｐｉに添加し、吸光度を７２ｈｐｉに測定した。無処置非感染細胞の吸光度を１００％として設定した。図３２（ｂ）：ＲＰＴＥＣの細胞接着及び増殖の動的モニタリングのため、ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた。２０００細胞／ウエル及び１２，０００細胞／ウエル密度のＲＰＴＥＣをＥ−Ｐｌａｔｅに播種した。播種２７時間後に、各ウエル（合計２００μｌ）における１５０μｌの培地を、精製ＢＫＶ−Ｄｕｎｌｏｐ（ＭＯＩ５）あり又はなし及びＣＭＸ００１（合計濃度０．３１μＭ）あり又はなしの新鮮培地と交換し、細胞播種９６時間後まで細胞を放置した。
【図３３】ＳＶＧ細胞の増殖動態を説明する図である。培養物中で増殖するＳＶＧ細胞を微分干渉顕微鏡（図３３（ａ））により、またヘマトキシリン染色した後に位相差顕微鏡（図３３（ｂ））により１００×拡大率で解析した。ＭＴＳ解析及びトリパンブルー染色を用いて、ＭＴＳアッセイによる細胞生存率が総細胞数と相関するように検量線を作成した（図３３（ｃ））。培養物中のＳＶＧ増殖動態を７日間にわたってＭＴＳアッセイにより測定し、検量線を用いて総細胞数に変換した（図３３（ｄ））。
【図３４】Ａｒａ−Ｃ処置がＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ感染を抑制することを説明する図である。ＳＶＧ細胞を５×１０４細胞当たり１０ＨＡＵのＭａｄ−４  ＪＣＶに一晩曝露した。次に、１ｍＬ当たり０、５又は２０μｇのＡｒａ−Ｃで細胞を処置した。Ａｒａ−Ｃで処置したＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ  ＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出した（図３４（ａ））。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞の全数を試験した各Ａｒａ−Ｃ濃度毎に定量化し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３４（ｂ））。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションのために処置したＳＶＧ細胞の細胞密度をヘマトキシリン強度の半定量化によって決定し、無処置対照のパーセンテージとして表す（図３４（ｃ））。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞の全数を細胞密度に対して正規化し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３４（ｄ））。エラーバーは標準偏差を表す。アスタリスク１個はｐ＜０．０５を表し、アスタリスク２個はｐ＜０．０１を表す。
【図３５】ＳＶＧ細胞に対するＣＭＸ００１の限定的な細胞毒性を説明する図である。培養物中で増殖するＳＶＧ細胞を、薬物希釈液又は０．０１、０．１及び１μＭ  ＣＭＸ００１若しくはＣＤＶで処置した。ＣＭＸ００１又はＣＤＶ処置細胞を位相差顕微鏡によって１００×拡大率で解析した（図３５（ａ））。ＣＭＸ００１又はＣＤＶ処置細胞の細胞生存率をアラマーブルー染色によって決定し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３５（ｂ））。エラーバーは標準偏差を表す。アスタリスク２個はｐ＜０．０１を表す。
【図３６】ＣＭＸ００１が、ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ複製を抑制することを説明する図である。ＳＶＧ細胞を５×１０４細胞当たり１０ＨＡＵのＭａｄ−４  ＪＣＶに一晩曝露した。次に、薬物希釈液又は０．０１、０．０３、０．０７若しくは０．１μＭ  ＣＭＸ００１若しくはＣＤＶで細胞を処置した。感染ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ  ＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出した（図３６（ａ））。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞の全数を試験した各濃度の薬物に対して定量化し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３６（ｂ））。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションのために処置したＳＶＧ細胞の総細胞数をヘマトキシリン強度の半定量化によって決定し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３６（ｃ））。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞数を総細胞数に対して正規化し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３６（ｄ））。エラーバーは標準偏差を表す。星印１個はｐ＜０．０５を表し、アスタリスク２個はｐ＜０．０１を表す。
【図３７】ＣＭＸ００１が、ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ  ＤＮＡ複製を低下させることを説明する図である。ＳＶＧ細胞を５×１０４細胞当たり１０ＨＡＵのＭａｄ−４  ＪＣＶに一晩曝露した。次に、０、０．０１、０．０３、０．０７及び０．１μＭのＣＭＸ００１又はＣＤＶで細胞を処置した。薬物処置の４日後に全ＤＮＡを単離し、ＪＣＶ  ＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲにより検出した。ＪＣＶゲノムコピー数は、無処置対照のパーセンテージとして表示する。エラーバーは標準偏差を表す。アスタリスク２個はｐ＜０．０１を表す。
【図３８】ＳＶＧ細胞の確立されたＪＣＶ感染におけるＣＭＸ００１の限定的な細胞毒性を説明する図である。ＳＶＧ細胞においてＪＣＶ感染を惹起し、培養１２継代にわたって維持した。その後に細胞を培養において０、０．０１、０．１及び１μＭのＣＭＸ００１で４日間処置した。細胞生存率をＭＴＳアッセイによって測定した。細胞生存率は、無処置対照のパーセンテージとして表示する。エラーバーは標準偏差を表す。アスタリスク２個はｐ＜０．０１を表す。
【図３９】ＣＭＸ００１処置がＪＣＶ感染細胞を確立された感染から除去することを説明する図である。ＳＶＧ細胞においてＪＣＶ感染を惹起し、培養８継代にわたって維持した。その後、細胞を培養において０又は０．１μＭ  ＣＭＸ００１で４日間処置した。ＣＭＸ００１処置細胞を位相差顕微鏡によって１００×拡大率で解析した（図３９（ａ））。ＣＭＸ００１で処置した感染ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ  ＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出した（図３９（ｂ））。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞の全数を定量化し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３９（ｃ））。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションのために処置したＳＶＧ細胞の細胞全数をヘマトキシリン強度の半定量化により決定し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３９（ｄ））。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞の全数を細胞密度に対して正規化し、無処置対照のパーセンテージとして表示する（図３９（ｅ））。エラーバーは標準偏差を表す。アスタリスク１個はｐ＜０．０５を表し、アスタリスク２個はｐ＜０．０１を表す。
【図４０】ＣＭＸ００１が、シドホビルよりも１０倍少ない薬物で８０倍多量のＣＤＶ−ＰＰを生じることを説明する図である。
【図４１】ＣＭＸ００１と４８時間インキュベーションした後のヒトＰＢＭＣにおけるＣＤＶ−ＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞内レベルを説明する図である。
【図４２】ＣＭＸ００１と１時間インキュベーションした後のヒトＰＢＭＣにおけるＣＤＶ−ＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルを説明する図である。
【図４３】４時間にわたるシドホビル又はＣＭＸ００１のマウス腎臓からのクリアランスを説明する図である。
【図４４】経口投与量５ｍｇ／ｋｇの［Ｃ２−１４Ｃ］ＣＭＸ００１の４時間後におけるＣＭＸ００１の臓器分布を説明する図である。
【図４５】ＩＶシドホビル又は経口ＣＭＸ００１の後の血漿シドホビル濃度の比較を説明する図である。
【図４６】ＣＭＸ００１処置に対する患者のアデノウイルスのウイルス血症反応を説明する図である。
【図４７】患者におけるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のウイルス血症のＣＭＸ００１による処置を説明する図である。
【図４８】ＰＣＲプロットによるＣＭＸ００１用量及び血漿ＣＭＶを説明する図である。
【図４９】ＣＮＳにおける単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）複製におけるＣＭＸ００１の効果を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本明細書における記述及び手順に関して、本発明の前述及び他の態様をより詳細に説明する。本発明は、様々な形態に具体化でき、本明細書に説明されている実施形態に限定されるものと解釈してはならないことを理解するべきである。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧且つ完全となり、本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供されている。
【００１４】
本明細書における本発明の説明に用いられている専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の限定を目的とするものではない。本発明の実施形態及び添付の特許請求の範囲の記述に用いられている単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかにそれ以外を示唆しているのでなければ、複数形も同様に包含することを目的とする。また、本明細書において、「及び／又は」は、関連する列挙した品目の１又は複数のありとあらゆる可能な組み合わせを意味し、これを包含する。更に、本明細書における用語「約」は、化合物の量、用量、時間、温度その他等、測定可能な値に言及する場合、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％又は更には０．１％の変動を包含するものと企図されている。用語「含む（comprises）」及び／又は「含む（comprising）」は、本明細書に用いられている場合、記述されている特性、整数、ステップ、操作、要素及び／又は成分の存在を特定するが、１又は複数の他の特性、整数、ステップ、操作、要素、成分及び／又はそれらの群の存在又は追加を除外しないことが更に理解されるであろう。他に規定がなければ、本明細書に用いられている技術及び科学用語を含むあらゆる用語は、本発明が属す技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意義を有する。
【００１５】
本明細書に参照されているあらゆる特許、特許出願及び刊行物は、その全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。専門用語において矛盾がある場合、本明細書が効力を持つものとする。
【００１６】
Ａ．定義
本明細書において、「アルキル」は、１〜３０個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味する。一部の実施形態において、アルキル基は、１〜２４、２〜２５、２〜２４、１〜１０又は１〜８個の炭素原子を含有する。一実施形態において、アルキル基は、１５、１６、１７、１８又は１９個〜２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルキル基は、１６又は１７個〜２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルキル基は、ｌ５、１６、１７、１８、１９又は２０個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アルキル基は１〜５個の炭素原子を含有し、更にまた他の実施形態において、アルキル基は１〜４又は１〜３個の炭素原子を含有する。アルキルの代表例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
【００１７】
本明細書において、「アルケニル」は、２〜３０個の炭素を含有し、水素２個の除去により形成された少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味する。一部の実施形態において、アルケニル基は、２〜２５、２〜２４、２〜１０、２〜８個の炭素原子を含有する。一実施形態において、アルケニル基は、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルケニル基は、１６又は１７個〜２０個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アルケニル基は１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の炭素原子を含有し、更にまた他の実施形態において、アルケニル基は２〜５、２〜４又は２〜３個の炭素原子を含有する。「アルケニル」の代表例として、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、３−デセニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
【００１８】
本明細書において、「アルキニル」は、２〜３０個の炭素原子を含有し、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素基を意味する。一部の実施形態において、アルキニル基は、２〜２５、２〜２４、２〜１０又は２〜８個の炭素原子を含有する。一実施形態において、アルキニル基は、１５、１６、１７、１８又は１９個〜２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルキニル基は、１６又は１７個〜２０個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アルキニル基は、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の炭素原子を含有し、更にまた他の実施形態において、アルキニル基は、２〜５、２〜４又は２〜３個の炭素原子を含有する。アルキニルの代表例として、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニル、１−ブチニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
【００１９】
本明細書において、「アシル」は、２〜３０個の炭素を含有し、炭化水素鎖の少なくとも１個の炭素がオキソ（＝Ｏ）に置換された直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味する。一部の実施形態において、アシル基は、２〜２５、２〜２４、１７〜２０、２〜１０、２〜８個の炭素原子を含有する。一実施形態において、アシル基は、１５、１６、１７、１８又は１９個〜２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アシル基は、１６又は１７個〜２０個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アシル基は１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の炭素原子を含有し、更にまた他の実施形態において、アシル基は２〜５、２〜４又は２〜３個の炭素原子を含有する。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
【００２０】
本明細書において、用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分と結合した上に定義されているアルキル基を意味する。一部の実施形態において、アルコキシ基は、１〜３０個の炭素原子を含有する。他の実施形態において、アルコキシ基は、１〜２０、１〜１０又は１〜５個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルコキシ基は、２〜２５、２〜２４、１５〜２０、２〜１０、２〜８個の炭素原子を含有する。一実施形態において、アルコキシ基は、１５、１６、１７、１８又は１９個〜２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルコキシ基は、１５〜２０個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アルコキシ基は１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルコキシル基は１〜８個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルコキシル基は、１〜６個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルコキシル基は、１〜４個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アルコキシル基は１〜５個の炭素原子を含有し、更にまた他の実施形態において、アルコキシル基は１〜４又は１〜３個の炭素原子を含有する。アルコキシルの代表例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ及びｎ−ペントキシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
【００２１】
本明細書における用語「脂肪族部分」は、任意選択により１又は複数の官能基に置換された、飽和、不飽和、直鎖（即ち、非分岐鎖）又は分岐鎖炭化水素を含む。一部の実施形態において、脂肪族は、二重結合、三重結合カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又はそれらの組み合わせから選択された１又は複数の官能基を含有することができる。当業者であれば理解できるであろうが、「脂肪族部分」は、本明細書において、アルキル、アルケニル、アルキニル、エステル又はアシル部分を含むよう企図されているが、これらに限定されるものではない。よって、本明細書において、用語「アルキル」は、直鎖、分岐鎖飽和基を含む。同様の慣例は、「アルケニル」、「アルキニル」、「アシル」、「エステル」その他等、他の一般名に適用される。更に、本明細書において、用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アシル」、「エステル」等は、置換及び非置換基の両方を包含する。一部の実施形態において、用語「脂肪族部分」は、−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２４）アルケニル、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ２４）アルケニル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキニル又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキニルを意味する。当業者であれば理解できるように、上に示す炭素数の範囲は、範囲内の個々の数値を包含する。
【００２２】
本明細書において、「シクロアルキル」は、水素原子１個の除去によりシクロアルカンから得られる炭素３〜１２個の一価飽和環状又は二環性炭化水素基を意味する。一部の実施形態において、シクロアルキルは、３〜８個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、シクロアルキルは、３〜６個の炭素原子を含有する。シクロアルキル基は、任意選択により、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミノ、チオール又はヒドロキシ置換基で置換されていてよい。シクロアルキルの代表例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般に適用できる置換基の追加的な例は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
【００２３】
本明細書において、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」又は「ヘテロアルキニル」は、例えば、炭素原子の代わりに１又は複数の酸素、イオウ、窒素、リン又はケイ素原子を含有するアルキル、アルケニル又はアルキニル基を意味する。一部の実施形態において、ヘテロアルキル基は、１〜８個の炭素原子を含有する。特定の実施形態において、ヘテロアルケニル及びヘテロアルキニル基は、２〜８個の炭素原子を独立して、含有する。更に他の実施形態において、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル及びヘテロアルキニルは２〜５個の炭素原子を独立して、含有し、更にまた他の実施形態において、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル及びヘテロアルキニルは２〜４又は２〜３個の炭素原子を独立して、含有する。
【００２４】
本明細書における用語「ヘテロシクロアルキル」又は「ヘテロ環」は、環の一部として酸素、イオウ及び窒素から独立して、選択された１又は複数のヘテロ原子間を有する二環又は三環を含むが、これらに限定されない非芳香族、飽和又は不飽和５、６若しくは７員環又は多環基を意味し、（ｉ）各５員環は０〜１個の二重結合を有し、各６員環は０〜２個の二重結合を有し、（ｉｉ）窒素及びイオウヘテロ原子は、任意選択により酸化されていてよく、（ｉｉｉ）窒素ヘテロ原子は、任意選択により四級化されていてよく、及び／又は（ｉｖ）上述のヘテロ環のいずれかはベンゼン環と融合されていてよい。例示的なヘテロ環として、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル及びテトラヒドロフリルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本明細書において、用語「ハロゲン」は、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）又はヨウ素（Ｉ）を意味し、用語「ハロ」は、ハロゲンラジカルであるフルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）及びヨード（−Ｉ）を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語「ハロアルキル」は、本明細書に定義されている少なくとも１個のハロ基に置換された少なくとも１個の炭素原子を含有する、本明細書に定義されている直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味する。一部の実施形態において、ハロアルキルは、１〜３０個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、ハロアルキル（halkalkyl）は、１〜８又は１〜６個の炭素原子を含有する。他の実施形態において、ハロアルキルは、１〜４個の炭素原子を含有する。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている実施例に示す特定の実施形態によって説明される。
【００２７】
本明細書において、用語「アリール」は、１又は複数の芳香環を有する単環性炭素環系又は二環性炭素環融合環系を意味する。アリールの代表例として、アズレニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、テトラヒドロナフチル等が挙げられる。用語「アリール」は、他に断りがなければ置換及び非置換アリールの両方を含むよう企図される。例えば、アリールは、１又は複数のヘテロ原子（例えば、酸素、イオウ及び／又は窒素）に置換されていてよい。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている実施例に示す特定の実施形態によって説明される。
【００２８】
一部の実施形態において、本明細書に記載されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アシルは、置換及び非置換部分の両方を含む。例示的な置換基として、ハロ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、−ＳＨ、シアノ、ニトロ、チオアルキル、カルボン酸、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、中でもアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルが更に置換されていてよい。
【００２９】
本明細書において、用語「アミノ酸」は、一級アミノ（−ＮＨ２）基及びカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を含む化合物を意味する。本発明に用いられるアミノ酸は、自然発生並びに合成のα、β、γ又はδアミノ酸及びＬ、Ｄアミノ酸を含み、タンパク質中に見出されるアミノ酸が挙げられるがこれに限定されない。例示的なアミノ酸として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、アミノ酸は、アラニル、バリニル（valinyl）、ロイシニル（leucinyl）、イソロイシニル、プロリニル（prolinyl）、フェニルアラニニル（phenylalaninyl）、トリプトファニル、メチオニニル（methioninyl）、グリシニル（glycinyl）、セリニル（serinyl）、スレオニル（threoninyl）、システイニル、チロシニル（tyrosinyl）、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル（aspartoyl）、グルタロイル（glutaroyl）、リシニル（lysinyl）、アルギニニル（argininyl）、ヒスチジニル（histidinyl）、β−アラニル、β−バリニル、β−ロイシニル、β−イソロイシニル、β−プロリニル、β−フェニルアラニニル、β−トリプトファニル、β−メチオニニル、β−グリシニル、β−セリニル、β−スレオニル、β−システイニル、β−チロシニル、β−アスパラギニル、β−グルタミニル、β−アスパルトイル、β−グルタロイル（glutaroyl）、β−リシニル、β−アルギニニル又はβ−ヒスチジニルの誘導体となることができる。更に、本明細書において、「アミノ酸」は、エステル、アミド及び塩等、アミノ酸の誘導体並びに代謝により活性型となる薬理特性を有する誘導体等、他の誘導体も含む。
【００３０】
本明細書において、用語「天然αアミノ酸」は、一級アミノ（−ＮＨ２）基、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）基、側鎖及び水素原子と結合した炭素原子を含む自然発生のα−アミノ酸を意味する。例示的な天然αアミノ酸として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の方法によって処置される対象は、一般に、哺乳類及び霊長類の対象である（例えば、ヒト、サル、類人猿、チンパンジー）。対象は、雌雄いずれであってもよく、出生前（即ち、子宮内）、新生児、乳児、若年、青年、成人及び老齢対象を含むいかなる年齢であってもよい。よって、一部の事例では、対象は妊婦対象となり得る。処置は、以前に感染した対象の治療上の処置や、非感染対象（例えば、感染リスクが高いと認定された対象）の予防的処置を含むいかなる目的のものであってもよい。
【００３２】
本明細書において、本明細書における「ヒト免疫不全ウイルス」（即ち、「ＨＩＶ」）は、ＨＩＶサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＯ並びにＨＩＶ−２等、そのあらゆるサブタイプを含むよう企図されている。
【００３３】
本明細書において、本明細書における「Ｂ型肝炎ウイルス」（即ち、「ＨＢＶ」）は、そのあらゆるサブタイプ（ａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ及びａｙｒ）及び／又は遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）を含むよう企図されている。
【００３４】
本明細書において、「治療上有効量」は、対象における少なくとも１種類の臨床症状のある程度の軽減、緩和及び／又は低下をもたらす量を意味する。当業者であれば、ある程度の利益が対象にもたらされるのであれば、治療効果が完全又は根治的である必要はないことを理解できるであろう。
【００３５】
本明細書において、「特異性」又は「に対して特異的に」は、特定の種類のウイルス感染細胞の代謝活性及び／又はＤＮＡ複製を選択的に阻害することのできる化合物を意味する。特異性は、当業者にとって公知のいずれかの方法を用いることによって、例えば、ＩＣ９０及び／又はＩＣ５０の試験によって試験することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、正常（非感染）細胞に対するＩＣ９０及び／又はＩＣ５０よりも少なくとも約３倍低い、ウイルス感染細胞に対するＩＣ９０及び／又はＩＣ５０を有することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、正常（非感染）細胞に対するＩＣ９０及び／又はＩＣ５０よりも約３倍〜１０倍低い、ウイルス感染細胞に対するＩＣ９０及び／又はＩＣ５０を有することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、正常（非感染）細胞に対するＩＣ９０及び／又はＩＣ５０よりも少なくとも１０倍低いウイルス感染細胞に対するＩＣ９０及び／又はＩＣ５０を有することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、ウイルス感染及び／又は形質転換細胞に対し特異的な細胞毒性を有することができる。細胞毒性は、当業者にとって公知のいずれかの方法によって測定することができる。
【００３６】
他に記述がなければ、本明細書に示されている構造は、該構造のあらゆる異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー及び幾何（又は配座））型、例えば、各不斉中心のＲ及びＳ立体配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体並びに（Ｚ）及び（Ｅ）配座異性体を含むよう意図されている。従って、本化合物の単一の立体化学異性体と共に、エナンチオマー、ジアステレオマー及び幾何（又は配座）混合物は、本発明の範囲内のものである。他に記述がなければ、本発明の化合物のあらゆる互変異性型は、本発明の範囲内のものである。
【００３７】
本明細書において、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」及び「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対策がなされていない場合と比較して、本明細書に記載されている疾患若しくは障害の進行の回復、軽減、阻害又は本明細書に記載されている障害若しくは疾患の発生若しくは発症の遅延、除去若しくは低下を意味する。一部の実施形態において、処置は１又は複数の症状が発症した後に施すことができる。他の実施形態において、処置は症状なしで施すことができる。例えば、処置は、感受性の高い個体に症状の発症に先立ち（例えば、症状の病歴を踏まえて及び／又は遺伝的若しくは他の感受性要因を踏まえて）施すことができる。例えば、その再発を予防又は遅延させるため、処置は症状が消えた後も継続することができる。
【００３８】
本発明の活性化合物は、任意選択により、本明細書に記載されているウイルス感染症の処置に有用な他の活性化合物及び／又は薬剤と組み合わせて（又は併用して）投与することができる。「組み合わせた」又は「併用した」２種以上の化合物の投与は、２種の化合物が、併用効果、例えば、相加及び／又は相乗効果が得られるよう十分に近接した時間で投与されることを指す。２種の化合物は、同時に（同時的）又は逐次的に投与することができる、或いは短期間のうちに互いに前後して発生する２以上のイベントとなることができる。同時投与は、投与前に化合物を混合することによって、或いは同一時点だが異なる解剖学的部位に、又は異なる投与経路を用いて化合物を投与することによって行うことができる。一部の実施形態において、他の抗ウイルス剤は、任意選択により同時的に投与することができる。
【００３９】
本明細書における「非経口的」は、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内若しくは硝子体内注射又は注入技法を意味する。
【００４０】
本明細書における「局所的」は、直腸内投与及び吸入スプレーによる投与と共に、口及び鼻の皮膚及び粘膜のより一般的な経路並びに歯磨き粉における投与を包含する。
【００４１】
Ｂ．化合物
本発明の一部の態様において、多様な生物学的特性を有する化合物が提供される。本明細書に記載されている化合物は、少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患の処置に関係する生物活性を有する。
【００４２】
（１）本発明の一態様において、化合物は、次式Ａ、Ａ’、Ｂ若しくはＢ’
【化２】
2013509433.tif 000003
［式中、
Ｍは、
【化３】
2013509433.tif 000004
であり、Ｍの酸素は、−Ｐ（＝Ｘ）（Ｒ３）−と結合し、
Ｑは、存在する場合、
【化４】
2013509433.tif 000005
であり、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＮＨＲｉ又は−ＮＲｉＲｉｉであり、
Ｒｉ及びＲｉｉは、独立して、水素又は脂肪族部分であり、
ｍは、０〜６の整数であり、
Ｂは、水素、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｎ３からなる群から選択され、
Ｘは、セレン、イオウ又は酸素であり（一部の実施形態において、Ｘは酸素である）、
Ｒ３は、ヒドロキシ、−ＯＲ２ａ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、Ｃ１−８ヘテロアルキル、Ｃ２−８ヘテロアルケニル、Ｃ２−８ヘテロアルキニル又は−ＮＲ’Ｒ’’であり（一部の実施形態において、Ｒ３はヒドロキシルである）、
Ｒ２ａは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、Ｃ１−８ヘテロアルキル、Ｃ２−８ヘテロアルケニル、Ｃ２−８ヘテロアルキニル、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、Ｃ１−８ヘテロアルキル、Ｃ２−８ヘテロアルキニル、Ｃ２−８ヘテロアルケニル及びＣ６−１０アリールからなる群から選択され、又は、
ＮＲ’Ｒ’’は、置換又は非置換アミノ酸残基であり、
Ｚは、少なくとも１個のＮを含むヘテロ環部分を含み（一部の実施形態において、ヘテロ環部分はプリン又はピリミジンである）、
記号＊は、式Ａ、Ａ’、Ｂ又はＢ’におけるメチレン部分のＺとの結合ポイントが、ヘテロ環部分の利用可能な窒素を介することを示す］
又はそれらの医薬的に許容可能な塩
の構造を有する。
【００４３】
一部の実施形態において、化合物は、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、立体異性体、互変異性体、回転異性体又はそれらの混合物の形態である。
【００４４】
別の実施形態において、Ｂは、−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＨである。
【００４５】
一部の実施形態において、Ｒ３はヒドロキシルである。
【００４６】
一部の実施形態において、Ｍは、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ１−２４アルキル（alky）、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−Ｃ１−２４アルキル、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ１−２４アルキル及び−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ１−２４アルキルから選択される。別の実施形態において、Ｍは、−Ｏ−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＨ３（式中、ａは２〜４であり、ｔは１１〜１９である）である。一部の実施形態において、ａは２又は３であり、ｔは１５又は１７である。一部の実施形態において、Ｍは−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）１７ＣＨ３である。一実施形態において、Ｍは−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３又は−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）１７ＣＨ３である。
【００４７】
一実施形態において、化合物は、次式Ｃ
【化５】
2013509433.tif 000006
［式中、
ａは２〜４であり（一実施形態において、ａは２又は３である）、
ｔは１１〜１９であり（一実施形態において、ｔは１５、１６又は１７である）、
Ｂは水素、−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＨである（一実施形態において、Ｂは−ＣＨ３である）］
又はその医薬的に許容可能な塩
の構造を有する。
【００４８】
一実施形態において、Ｍは、次式ａ、ｂ又はｃ
【化６】
2013509433.tif 000007
［式中、Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＮＨＲｉ又は−ＮＲｉＲｉｉであり、Ｒｉ及びＲｉｉは、独立して、水素又は脂肪族部分である］
から選択される。一部の実施形態において、Ｒｉ及びＲｉｉは、独立して、−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル又は−（Ｃ１−Ｃ２４）アシルである。
【００４９】
一部の実施形態において、Ｒａ又はＲｂの少なくとも一方は水素ではない。一部の実施形態において、Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ、任意選択により置換された−Ｏ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｏ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｓ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル及び−Ｓ（Ｃ１−Ｃ２４）アシルからなる群から選択される。
【００５０】
一部の実施形態において、Ｍに関して、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｏ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−Ｏ（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−Ｓ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−Ｓ（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−ＮＨ（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、−ＮＨ（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ２４）アシル、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アシル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）、−Ｎ（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）、−Ｎ（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）、−Ｎ（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）、−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アシル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル）又は−Ｎ（（Ｃ１−Ｃ２４）アシル）（（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）から選択される。
【００５１】
一実施形態において、Ｚは、少なくとも１個の置換基によって任意選択により置換され得るプリン又はピリミジンを含む（或いは、それである）。一部の実施形態において、少なくとも１個の置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、置換アミノ、二置換アミノ、イオウ、ニトロ、シアノ、アセチル、アシル、アザ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ６−１０アリールと、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル又はＣ６−１０アリールに置換されたカルボニルと、ハロアルキル及びアミノアルキルからなる群から選択することができる。
【００５２】
一部の実施形態において、Ｚは、アデニン、６−クロロプリン、キサンチン、ヒポキサンチン、グアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−ヒドラジノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、チミン、シトシン、５−フルオロシトシン、ウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピルウラシル、５−ビニルウラシル又は５−ブロモビニルウラシルから選択することができる。一部の実施形態において、Ｚは、グアニン−９−イル、アデニン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル若しくはそれらの１−デアザ、３−デアザ、８−アザ化合物又はシトシン−１−イルから選択される。一部の実施形態において、Ｚは、グアニン−９−イル又は２，６−ジアミノプリン−９−イルである。
【００５３】
別の実施形態において、Ｚは、６−アルキルプリン及びＮ６−アルキルプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、６−ハロプリン、Ｎ６−アセチレンプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、６−チオアルキルプリン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ４−アルキルピリミジン、Ｎ４−アシルピリミジン、４−ハロピリミジン、Ｎ４−アセチレンピリミジン、４−アミノ及びＮ４−アシルピリミジン、４−ヒドロキシアルキルピリミジン、４−チオアルキルピリミジン、チミン、シトシン、６−アザシトシン等の６−アザピリミジン、２−及び／又は４−メルカプトピリミジン、ウラシル、Ｃ５−アルキルピリミジン、Ｃ５−ベンジルピリミジン、Ｃ５−ハロピリミジン、Ｃ５−ビニルピリミジン、Ｃ５−アセチレンピリミジン、Ｃ５−アシルピリミジン、Ｃ５−ヒドロキシアルキルプリン、Ｃ５−アミドピリミジン、Ｃ５−シアノピリミジン、Ｃ５−ニトロピリミジン、Ｃ５−アミノピリミジン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、５−アザシチジニル、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル並びにピラゾロピリミジニルから選択される。塩基における酸素及び窒素官能基は、必要又は要求に応じて保護することができる。適切な保護基は当業者に周知であるように、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル及びｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、アルキル基、アセチル及びプロピオニル等のアシル基、メタンスルホニル並びにｐ−トルエンスルホニルを含む。好ましい塩基として、シトシン、５−フルオロシトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、キサンチン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノプリン、６−クロロプリン及び２，６−ジクロロプリンが挙げられる。
【００５４】
一実施形態において、Ｚは、
【化７】
2013509433.tif 000008
（式１〜４における記号＊は、式Ａ、Ａ’、Ｂ又はＢ’におけるメチレンとＮの結合ポイントを示す）である。
【００５５】
Ｚの例は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第６，５８３，１４９号明細書に更に記載されている。
【００５６】
Ｚの追加的な例として、一般式、
【化８】
2013509433.tif 000009
［式中、
Ｙは、Ｎ又はＣＸであり、
Ｘは、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＣＮ、ＣＦ３、Ｎ３、ＮＯ２、Ｃ６−１０アリール、Ｃ６−１０ヘテロアリール及びＣＯＲｂからなる群から選択され、
Ｒｂは、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アミノアルキル、Ｃ１−６アルコキシ及びＣ１−６チオアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−１０シクロアルキル及びＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル又はＣ６−１０アリールに置換されたカルボニルからなる群から選択される］
の部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
Ｚの追加的な例として、一般式、
【化９】
2013509433.tif 000010
［式中、
Ｚ’は、−ＮＲａＲｂ、−ＳＲａ又は−ＯＲａであり、
Ｌ２は、共有結合である、或いは−Ｎ（−Ｒ１５）−、Ｎ（−Ｒ１５）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−又は−Ｓ（＝Ｏ）２−であり、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ７−１６アリールアルキル、Ｃ３−１０カルボシクリル、Ｃ６−１０ヘテロシクリル又はＣ７−１６ヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ１４は、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、−Ｏ（ＣＨ２）ｘＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ１５若しくはＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ１５（式中、ｘは２又は３から１０、１５又は２０である）又はΝＲｉＲｉｉ（式中、Ｒｉ及びＲｉｉの各出現は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−６シクロアルキル及びＣ３−８ヘテロシクリルからなる群から選択される）であり、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ７−１６アリールアルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１０ヘテロシクリル又はＣ７−１６ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アシル又はＣ３−６シクロアルキル及びＣ３−８ヘテロシクリル（Ｃ３−６シクロアルキル及びＣ３−８ヘテロシクリルは、１又は複数のＣ１−５アルキルに任意選択により置換されていてよい）からなる群から選択される］
の化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
Ｚの追加的な例として、一般式、
【化１０】
2013509433.tif 000011
（Ｒ１６及びＲ１７は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アシル若しくはＣ３−６シクロアルキル又はＣ３−８ヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｃ３−６シクロアルキル及びＣ３−８ヘテロシクリルは、１又は複数のＣ１−５アルキルに任意選択により置換されていてよい）
の部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本発明の例示的な化合物として、
【化１１Ａ】
2013509433.tif 000012
【化１１Ｂ】
2013509433.tif 000013
【化１１Ｃ】
2013509433.tif 000014
又はそれらの医薬的に許容可能な塩
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
更に例示的な化合物を次の、
【化１２Ａ】
2013509433.tif 000015
【化１２Ｂ】
2013509433.tif 000016
【化１２Ｃ】
2013509433.tif 000017
（式中、各ｎの出現は独立して、２又は３であり、各ｍの出現は独立して、１５、１６又は１７である）に示す。
【００６１】
（２）本発明の一部の態様において、本発明の化合物は、式Ｉ、
【化１３】
2013509433.tif 000018
［式中、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２及びＲ２’は独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＮＨＲｉ、−ＮＲｉＲｉｉであり、Ｒｉ及びＲｉｉは独立して、水素又は脂肪族であり、
Ｒ３は、医薬的に有効なホスホネート、ビスホスホネート又は薬理学的に有効な化合物のホスホネート誘導体であり、
Ｘは、存在する場合、
【化１４】
2013509433.tif 000019
であり、ｍは、０〜６の整数である］
の構造を有する。
【００６２】
一部の実施形態において、前記アルキル、アルケニル、アルキニル又はアシル部分は、１〜６個の二重結合を任意選択により有する。
【００６３】
一部の実施形態において、Ｒ１及びＲ１’の少なくとも一方は、−Ｈではない。
【００６４】
一部の実施形態において、ｍは、０、１又は２である。一実施形態において、Ｒ２及びＲ２’は、Ｈである。別の実施形態において、化合物は、治療用ホスホネートのエタンジオール、プロパンジオール又はブタンジオール誘導体である。一実施形態において、本発明の化合物は、構造、
【化１５】
2013509433.tif 000020
（式中、Ｒ１、Ｒ１’及びＲ３は、上に定義された通りのものである）
を有するエタンジオールホスホネート種である。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明の化合物は、構造、
【化１６】
2013509433.tif 000021
（式中、ｍは１であり、Ｒ１、Ｒ１’及びＲ３は上の一般式に定義されている通りのものである）
を有するプロパンジオール種である。
【００６６】
一実施形態において、本発明の化合物は、構造、
【化１７】
2013509433.tif 000022
（式中、ｍは１であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ２’はＯＨであり、ＣαにおけるＲ２及びＲ２’は、両者ともに−Ｈである）
を有するグリセロール種である。グリセロールは光学活性分子である。グリセロールの立体特異的ナンバリングの慣例を用いると、ｓｎ−３位は、グリセロールキナーゼによってリン酸化される位置である。グリセロール残基を有する本発明の化合物において、Ｒ３部分は、グリセロールのｓｎ−３又はｓｎ−１位のいずれかにおいて連結することができる。
【００６７】
一部の実施形態において、Ｒ１は、式、−Ｏ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＨ３（式中、ｔは０〜２４である）を有するアルコキシ基である。一実施形態において、ｔは１１〜１９である。別の一実施形態において、ｔは１５又は１７である。
【００６８】
更に、シドホビル、環状シドホビル、アデホビル、テノホビルその他等、抗ウイルスホスホネートは、本発明においてＲ３基として用いることができる。
【００６９】
（３）本発明の実施に用いることのできる対象を処置する化合物、組成物、製剤及び方法として、ここに本明細書の開示全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第６，７１６，８２５号、第７，０３４，０１４号、第７，０９４，７７２号、第７，０９８，１９７号、第７，４５２，８９８号及び第７，６８７，４８０号明細書に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
一部の実施形態において、活性化合物は、次式Ｃ、
【化１８】
2013509433.tif 000023
［式中、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２及びＲ２’は独立して、−Ｈ、オキソ、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＯＨ若しくは−ＳＨ又は任意選択により置換された−ＸＲｉであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、−ＮＨ又は−ＮＲｉｉであり、Ｒｉ及びＲｉｉは独立して、−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２４）アルケニル、−（Ｃ１−Ｃ２４）アルキニル又は−（Ｃ１−Ｃ２４）アシルである］
の構造を有する。
【００７１】
一部の実施形態において、Ｒ１及びＲ１’の少なくとも一方は−Ｈではない。一部の実施形態において、前記アルケニル又はアシル部分は、１〜６個の二重結合を任意選択により有し、
Ｒ３は、必要に応じたリンカーＬにおける官能基又はＣαにおける利用可能な酸素原子と結合した医薬的に有効なホスホネート、ビスホスホネート又は薬理学的に有効な化合物のホスホネート誘導体であり、
Ｘは、存在する場合、
【化１９】
2013509433.tif 000024
であり、
Ｌは、式、−Ｊ−（ＣＲ２）ｔ−Ｇ−（式中、ｔは、１〜２４の整数であり、Ｊ及びＧは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒは、−Ｈ、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである）の原子価結合又は二官能性結合分子であり、
ｍは、０〜６の整数であり、
ｎは、０又は１である。
【００７２】
一部の実施形態において、ｍ＝０、１又は２である。一部の実施形態において、Ｒ２及びＲ２’はＨであり、よってプロドラッグは、治療用ホスホネートのエタンジオール、プロパンジオール又はブタンジオール誘導体である。例示的なエタンジオールホスホネート種は、構造、
【化２０】
2013509433.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ３、Ｌ及びｎは、上に定義された通りのものである）
を有する。
【００７３】
一部の実施形態において、プロパンジオール種は、構造、
【化２１】
2013509433.tif 000026
（式中、ｍ＝ｌであり、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ３、Ｌ及びｎは、上の一般式に定義された通りのものである）
を有する。
【化２２】
2013509433.tif 000027
（式中、ｍ＝ｌ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ２’＝ＯＨであり、ＣαにおけるＲ２及びＲ２’は両者共に−Ｈである）。グリセロールは、光学活性分子である。グリセロールの立体特異的ナンバリングの慣例を用いると、ｓｎ−３位は、グリセロールキナーゼによってリン酸化される位置である。グリセロール残基を有する本発明の化合物において、−（Ｌ）ｎ−Ｒ３部分は、グリセロールのｓｎ−３又はｓｎ−１位のいずれかにおいて連結することができる。
【００７４】
別の実施形態において、Ｒ１は、式、−Ｏ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＨ３（式中、ｔは０〜２４である）を有するアルコキシ基である。より好ましくは、ｔは１１〜１９である。最も好ましくは、ｔは１５又は１７である。
【００７５】
例示的なＲ３基は、臨床的に有用であることが知られているビスホスホネートを含み、例えば、化合物、
エチドロン酸：１−ヒドロキシエチリデンビスホスホン酸（ＥＤＨＰ）、
クロドロン酸：ジクロロメチレンビスホスホン酸（Ｃｌ２ＭＤＰ）、
チルドロン酸：クロロ−４−フェニルチオメチレンビスホスホン酸、
パミドロン酸：３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸（ＡＤＰ）、
アレンドロン酸：４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデンビスホスホン酸、
オルパドロン酸：３ジメチルアミノ−１−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸（ジメチル−ＡＰＤ）、
イバンドロン酸：３−メチルペンチルアミノ−１−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸（ＢＭ２１．０９５５）、
ＥＢ−１０５３：３−（１−ピロリジニル）−１−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸、
リセドロン酸：２−（３−ピリジニル）−１−ヒドロキシ−エチリデンビスホスホン酸、
アミノ−オルパドロン酸：３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−１−アミノプロピリデン）ビスホスホネート（ＩＧ９４０２）等である。
【００７６】
Ｒ３は、同様に本明細書における使用のために企図されている様々なホスホネート含有ヌクレオチド（又はその対応するホスホネートに誘導体化され得るヌクレオシド）から選択することもできる。好ましいヌクレオシドとして、２−クロロ−デオキシアデノシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−シチジン（シタラビン、ａｒａ−Ｃ）、フルオロウリジン、フルオロデオキシウリジン（フロクスウリジン）、ゲムシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン及び置換又は非置換１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−グアニン（ａｒａ−Ｇ）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−アデノシン（ａｒａ−Ａ）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ウリジン（ａｒａ−Ｕ）その他等、不適切な細胞増殖に起因する障害の処置に有用なヌクレオシドが挙げられる。
【００７７】
ウイルス感染症の処置に有用なヌクレオシドは、Ｒ３基として用いるためのその対応する５’−ホスホネートへと変換することもできる。このようなホスホネートアナログは通常、抗ウイルスヌクレオシドの５’−ヒドロキシルが置換されたホスホネート（−ΡＯ３Η２）又はメチレンホスホネート（−ＣＨ２−ＰＯ３Ｈ２）基のいずれかを含有する。５’−ヒドロキシルを−ＰＯ３Ｈ２に置換することによって得られた抗ウイルスホスホネートの例の一部を次に示す。
【表１】
2013509433.tif 000028
【００７８】
５’−ヒドロキシルを−ＣＨ２−ＰＯ３Ｈ２に置換することによって得られた抗ウイルスホスホネートの例の一部を次に示す。
【表２】
2013509433.tif 000029
【００７９】
他の例示的な抗ウイルスヌクレオチドホスホネートは、同様に、ｄｄＡ、ｄｄＩ、ｄｄＧ、Ｌ−ＦＭＡＵ、ＤＸＧ、ＤＡＰＤ、Ｌ−ｄＡ、Ｌ−ｄＩ，Ｌ−（ｄ）Ｔ、Ｌ−ｄＣ、Ｌ−ｄＧ、ＦＴＣ、ペンシクロビル等を含む抗ウイルスヌクレオシドに由来する。
【００８０】
更に、シドホビル、環状シドホビル、アデホビル、テノホビルその他等、抗ウイルスホスホネートは、本発明においてＲ３基として用いることができる。
【００８１】
例えば、それぞれが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、次の特許に開示されている化合物等、その薬理学的活性を改善するため、或いはその経口吸収を増加させるために、本発明において誘導体化され得る多くのホスホネート化合物が存在する。米国特許第３，４６８，９３５号明細書（エチドロン酸）、米国特許第４，３２７，０３９号明細書（パミドロン酸）、米国特許第４，７０５，６５１号明細書（アレンドロン酸）、米国特許第４，８７０，０６３号明細書（ビスホスホン酸誘導体）、米国特許第４，９２７，８１４号明細書（ジホスホネート）、米国特許第５，０４３，４３７号明細書（アジドジデオキシヌクレオシドのホスホネート）、米国特許第５，０４７，５３３号明細書（非環式プリンホスホネートヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，１４２，０５１号明細書（ピリミジン及びプリン塩基のＮ−ホスホニルメトキシアルキル誘導体）、米国特許第５，１８３，８１５号明細書（骨作用薬（Bone acting agent））、米国特許第５，１９６，４０９号明細書（ビスホスホネート）、米国特許第５，２４７，０８５号明細書（抗ウイルスプリン化合物）、米国特許第５，３００，６７１号明細書（Ｇｅｍ−ジホスホン酸）、米国特許第５，３００，６８７号明細書（トリフルオロメチルベンジルホスホネート）、米国特許第５，３１２，９５４号明細書（ビス−及びテトラキス−ホスホネート）、米国特許第５，３９５，８２６号明細書（グアニジンアルキル−１，１−ビスホスホン酸誘導体）、米国特許第５，４２８，１８１号明細書（ビスホスホネート誘導体）、米国特許第５，４４２，１０１号明細書（メチレンビスホスホン酸誘導体）、米国特許第５，５３２，２２６号明細書（トリフルオロメチルベンジルホスホネート（Trifluoromethybenzylphosphonate））、米国特許第５，６５６，７４５号明細書（ヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，６７２，６９７号明細書（ヌクレオシド−５’−メチレンホスホネート）、米国特許第５，７１７，０９５号明細書（ヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，７６０，０１３号明細書（チミジル酸アナログ）、米国特許第５，７９８，３４０号明細書（ヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，８４０，７１６号明細書（ホスホネートヌクレオチド化合物）、米国特許第５，８５６，３１４号明細書（チオ置換された窒素含有ヘテロ環ホスホネート化合物）、米国特許第５，８８５，９７３号明細書（オルパドロン酸）、米国特許第５，８８６，１７９号明細書（ヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，８７７，１６６号明細書（エナンチオマー的に純粋な２−アミノプリンホスホネートヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，９２２，６９５号明細書（抗ウイルスホスホノメトキシヌクレオチドアナログ）、米国特許第５，９２２，６９６号明細書（プリンのエチレン及びアレンホスホネート誘導体）、米国特許第５，９７７，０８９号明細書（抗ウイルスホスホノメトキシヌクレオチドアナログ）、米国特許第６，０４３，２３０号明細書（抗ウイルスホスホノメトキシヌクレオチドアナログ）、米国特許第６，０６９，２４９号明細書（抗ウイルスホスホノメトキシヌクレオチドアナログ）、ベルギー特許第６７２２０５号明細書（クロドロン酸）、欧州特許第７５３５２３号明細書（アミノ置換されたビスホスホン酸）、欧州特許出願第１８６４０５号明細書（ジェミナルジホスホネート）等。
【００８２】
一部のビスホスホネート化合物は、ヒト等、哺乳類におけるスクアレン合成酵素を阻害し、血清コレステロールレベルを低下させる能力を有する。このようなビスホスホネートの例は、例えば、両者共にその開示全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第５，４４１，９４６号及び第５，５６３，１２８号明細書のＰａｕｌｓら、Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ａｍｉｎｅｓに開示されている。本発明に係るこのようなスクアレン合成酵素阻害化合物アナログ及びヒトの脂質障害の処置におけるその使用は、本発明の範囲内に含まれる。本発明のビスホスホネートは、その開示全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第５，２７０，３６５号明細書に開示されている通り、歯周病の処置に経口的又は局所的に用いることができる。
【００８３】
一部の実施形態において、活性化合物は、シドホビル、アデホビル、環状シドホビル及びテノホビルからなる群から選択された抗ウイルス化合物と、アルキルグリセロール、アルキルプロパンジオール、１−Ｓ−アルキルチオグリセロール、アルコキシアルカノール若しくはアルキルエタンジオール又はそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択されたアルコールとの共有結合によって生成されたホスホネートエステルを有する。
【００８４】
一部の実施形態において、活性化合物は、アルキルエタンジオールと共有結合したホスホネート又はメチルホスホネートに対して５’−ヒドロキシル基が置換された抗ウイルスヌクレオシド化合物を含む。
【００８５】
本発明の一部の化合物は、例えば非環部分に１又は複数のキラル中心を保有し、従って光学活性型で存在し得る。同様に、化合物が、アルケニル基又は不飽和アルキル若しくはアシル部分を含有する場合、化合物のシス及びトランス異性体型である可能性がある。アルキル基等、置換基に追加的な不斉炭素原子が存在し得る。Ｒ−及びＳ−異性体と共に、ラセミ混合物並びにシス及びトランス異性体の混合物を含むそれらの混合物が本発明によって企図される。あらゆるこのような異性体及びそれらの混合物が本発明に含まれることを目的とする。特定の立体異性体が望ましい場合、これは、不斉中心を含有し既に分割されている出発物質を用いた立体特異的反応を用いることによる本技術分野において周知の方法によって、或いは立体異性体の混合物を生じる方法及び公知の方法により行われる分割によって調製することができる。
【００８６】
化合物が、安定した無毒性の酸性又は塩基性塩を生成するのに十分に塩基性又は酸性である場合、化合物の医薬的に許容可能な塩としての投与が適切となり得る。医薬的に許容可能な塩は、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を付与しない塩である。医薬的に許容可能な塩は、医薬的に許容可能な無機又は有機塩基及び酸に由来する塩を含む。適切な塩は、カリウム、リチウム若しくはナトリウム等のアルカリ金属；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属；又は例えばアンモニウム、モノ、ジ、トリ若しくはテトラ置換されたアミノ基を含むアミノ基を含有する部分又は少なくとも１個の窒素を含有する任意の適用可能な有機塩基、例えばアニリン、インドール、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン等の任意の医薬的に許容可能なアミン塩に由来する塩を含む。
【００８７】
一部の実施形態において、医薬的に許容可能な塩は、生理学的に許容可能な陰イオンを生じる酸によって生成される有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、ジシレート（disylate）、エシレート、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩（naphthylate）、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素／リン酸二水素、ピログルタミン酸塩、サッカラート、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシレート、トリフルオロ酢酸塩及びキシナホ酸塩から選択される。
【００８８】
塩の生成に用いることのできる例示的な薬剤として、（１）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸；又は有機酸、例えば、酢酸、クエン酸、フマル酸、アルギン酸、グルコン酸、ゲンチシン酸、馬尿酸、安息香酸、マレイン酸、タンニン酸、Ｌ−マンデル酸、オロチン酸、シュウ酸、サッカリン、コハク酸、Ｌ−酒石酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、ポリグルタミン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロ酸等、酸、（２）アンモニア、モノ、ジ、トリ又はテトラ置換されたアンモニア、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属塩基；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類塩基；Ｌ−アルギニン、ジエチルアミン、ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、イミダゾール、Ｌ−リシン、２−ヒドロキシエチルモルホリン、Ｎ−メチル−グルカミン、カリウムメタノラート、亜鉛ｔｅｒｔ−ブトキシド等の有機塩基等、塩基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
本発明の一態様は、次式Ｄ
【化２３】
2013509433.tif 000030
［式中、Ｍ＋は、カリウム（Ｋ＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）又は少なくとも１個の窒素を含有する任意の医薬的に許容可能な陽イオンである］
の化合物を提供する。少なくとも１個の窒素を含有する例示的な陽イオンとして、種々のアンモニウム、モノ、ジ、トリ又はテトラ置換されたアミノ陽イオンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、少なくとも１個の窒素を含有する陽イオンは、式、［ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４］＋によって表すことができ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立して、水素又は脂肪族部分である。一実施形態において、脂肪族部分は、Ｃ１−５アルキル（例えば、ＮＨ４＋、ＮＨ３ＣＨ３＋、ＮＨ３ＣＨ２ＣＨ３＋等）、Ｃ１−５アルケニル又はＣ１−５アルキニル等から選択される。一部の実施形態において、Ｍ＋は、カリウム（Ｋ＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）又はリチウム（Ｌｉ＋）である。一実施形態において、Ｍ＋はＫ＋である。式Ｉの化合物に関して、Ｍ＋が複数の電荷を有する陽イオンである場合、陽イオン−陰イオンバランスを満たすよう複数の陰イオン等価物が提示される。例えば，陽イオンがＣａ２＋又はＭｇ２＋である場合、陽イオン−陰イオンバランスの要件を満たすよう２個の陰イオン等価物が提示される。
【００９０】
一実施形態において、化合物は、構造、
【化２４】
2013509433.tif 000031
を有する。塩は様々な形態をとることができ、その全てが本発明の範囲内に含まれる。これらの形態は、無水型又は溶媒和化合物を含み。一実施形態において、Ｍ＋はＫ＋、Ｎａ＋又はＬｉ＋である。他の実施形態において、塩は、様々な結晶化度の結晶型となることができる。一実施形態において、化合物は、無水型、溶媒和化合物又は結晶型である。
【００９１】
本明細書に記載されている活性化合物は、当業者であれば明らかな公知の手順又はその変法に従って調製することができる。例えば、Ｐａｉｎｔｅｒら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−９−Ｒ−［２−（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ）Ｐｒｏｐｙｌ］−Ａｄｅｎｉｎｅ、ＣＭＸ１５７，  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５１、３５０５〜３５０９（２００７）及び米国特許出願公開第２００７／０００３５１６号明細書、Ａｌｍｏｎｄらを参照されたい。
【００９２】
医薬的に許容可能な塩は、本技術分野において周知の標準的な手順を用いて、例えば、アミン等、十分に塩基性の化合物を生理学的に許容可能な陰イオンを生じる適切な酸で反応させることにより得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム若しくはリチウム）又はアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩を生成することもできる。
【００９３】
Ｂ．活性化合物の合成
本明細書に記載されている化合物の調製において利用されるプロセスは、所望の特定の化合物に依存する。特定の置換基の選択要因及び特定の置換基の様々な位置候補は全て、本発明の特定の化合物の調製経路の採用における役割を果たす。これらの要因は当業者によって容易に認識される。
【００９４】
一般に、本発明の化合物は、本技術分野において公知の標準技法及びそれと類似の公知のプロセスによって調製することができる。本発明の化合物を調製するための一般的な方法を下に記す。
【００９５】
次の記述において、他に記述がなければ、あらゆる変数は、本明細書に記載されている式に定義されている通りのものである。次の非限定的な記述は、本明細書に記載されている化合物を得るために利用できる一般的な手順を説明する。
【００９６】
本発明において有用な化合物（又は「プロドラッグ」）は、米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＩ〜ＶＩ及び実施例に概略的にに表されるような様々な仕方で調製することができる。下に記載されている一般的なホスホネートエステル化方法は、単に説明を目的とするものであり、決して本発明を限定するものと解釈するべきではない。実際に、アルコールによるホスホン酸の直接的な縮合のために数通りの方法が開発されてきた（例えば、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、９６６頁及びそこに引用されている参考文献を参照）。この例に記載されている化合物及び中間体の単離及び精製は、例えば、濾過、抽出、結晶化、フラッシュカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、蒸留又はこれら手順の組み合わせ等、所望ならば任意の適切な分離又は精製手順により達成され得る。適切な分離及び単離手順の特定の実例を下の実施例に示す。当然ながら、他の均等な分離及び単離手順を用いることもできる。
【００９７】
米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＩは、パミドロン酸又はアレンドロン酸等、一級アミノ基を含有するビスホスホネートプロドラッグ合成の概略を説明する。その実施例１は、１−Ｏ−ヘキサデシルオキシプロピル−アレンドロン酸（ＨＤＰ−アレンドロン酸）又は１−Ｏ−ヘキサデシルオキシプロピル−パミドロン酸（ＨＤＰ−パミドロン酸）の合成のための条件を提示する。このプロセスにおいて、ピリジン溶液におけるジメチル４−フタルイミドブタノイルホスホネート（１ｂ、米国特許第５，０３９，８１９号明細書に記載されている通りに調製））及び亜リン酸ヘキサデシルオキシプロピルメチル（２）の混合物をトリエチルアミンで処置し、ビスホスホネートテトラエステル３ｂを得て、これをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。中間体２は、Ｋｅｒｓ、Ａ．、Ｋｅｒｓ、Ｉ．、Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ、Ｊ．、Ｓｏｂｋｏｗｓｋｉ、Ｍ．、Ｋｒａｓｚｅｗｓｋｉ、Ａ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９９５年４月、４２７  ４３０に記載されている通り、亜リン酸ジフェニルのエステル転移反応によって得られる。よって、ピリジン溶液における亜リン酸ジフェニルが、先ずヘキサデシルオキシプロパン−１−オールで、次にメタノールで処置され、化合物２が得られる。
【００９８】
本プロセスの重要な態様は、ヘキサデシルオキシプロパン−１−オールの代わりに他の長鎖アルコールを用いて、本発明の様々な化合物を生成できることである。アセトニトリルにおけるブロモトリメチルシランによる中間体３ｂの処置は、メチルエステルを選択的に開裂させてモノエステル４ｂを生じる。混合溶媒系（２０％メタノール／８０％  １，４−ジオキサン）におけるヒドラジンによる４ｂの処置は、示されている通り、フタルイミド保護基の除去をもたらす。所望のアレンドロン酸プロドラッグは濾過によって収集され、メタノール性アンモニアで処置することによってトリアンモニウム塩に変換される。
【００９９】
米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＩＩは、一級アミノ基を欠くビスホスホネートアナログの合成を説明し、この事例において、工程段階は、フタルイミド基による保護と、その後のヒドラジン分解による脱保護が不要である以外はスキーム１の工程段階と同様のものである。アミノ−オルパドロン酸等、１−アミノ基を有するビスホスホネートは、米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＩＩＩに示されているプロセスを若干改変して用いることにより、本発明に係るアナログのプロドラッグへと変換され得る。乾燥ＨＣｌによる化合物２及び３−（ジメチルアミノ）プロピオニトリルの混合物の処置と、続く亜リン酸ジメチルの添加はテトラエステル３を生成し、これは、ブロモトリメチルシランによる脱メチル化の後、ヘキサデシルオキシプロピル−アミノ−オルパドロン酸を生じる。
【０１００】
米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＩＶは、脂質基が、ホスホネートエステルとしてではなく、親化合物の一級アミノ基と結合したビスホスホネートアナログの合成を説明する。
【０１０１】
米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＶは、シドホビル、環状シドホビル及び他のホスホネートのアルキルグリセロール又はアルキルプロパンジオールアナログの一般的合成を説明する。ジメチルホルムアミドにおける２，３−イソプロピリデングリセロール、１のＮａＨによる処置と、続くメタンスルホン酸アルキルとの反応は、アルキルエーテル、２を生じる。酢酸処置によるイソプロピリデン基の除去と、続くピリジンにおける塩化トリチルとの反応は、中間体３を生じる。ハロゲン化アルキルによる中間体３のアルキル化は、化合物４をもたらす。８０％酢酸水溶液によるトリチル基の除去は、Ｏ，Ｏ−ジアルキルグリセロール、５を生成する。化合物５の臭素付加と、続く環状シドホビル又は他のホスホネート含有ヌクレオチドのナトリウム塩との反応は、所望のホスホネート付加体、７を生じる。環状付加体の開環は、水酸化ナトリウム水溶液との反応によって達成される。プロパンジオール種の化合物は、スキームＶにおける化合物５を１−Ｏ−アルキルプロパン−３−オールで置換することによって合成することができる。テノホビル及びアデホビルアナログは、スキームＶの反応（ｆ）におけるｃＣＤＶをこれらのヌクレオチドホスホネートで置換することによって合成することができる。同様に、本発明の他のヌクレオチドホスホネートは、この仕方で生成することができる。
【０１０２】
米国特許第６，７１６，８２５号明細書のスキームＶＩは、例として１−Ｏ−ヘキサデシルオキシプロピル−アデホビルを用いた本発明のヌクレオチドホスホネート合成の一般的な方法を説明する。ヌクレオチドホスホネート（５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン中に懸濁し、アルコキシアルカノール又はアルキルグリセロール誘導体（６ｍｍｏｌ）及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を加熱還流し、薄層クロマトグラフィーによりモニターしつつ縮合反応が完了するまで激しく撹拌する。次に、混合物を冷却し、濾過する。濾液を減圧下にて濃縮し、残渣をシリカゲル上に吸着し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（およそ９：１ジクロロメタン／メタノールにより溶出）によって精製し、対応するホスホネートモノエステルを得る。
【０１０３】
スキームＶＩＩ（Ｋｅｒｎら、ＡＡＣ４６（４）：９９１の図１として参照される）は、シドホビル（ＣＤＶ）及び環状シドホビル（ｃＣＤＶ）のアルコキシアルキルアナログの合成を説明する。図１において、矢印は次の試薬を示す。（ａ）Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルモルホリノカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ピリジン、１００℃；（ｂ）１−ブロモ−３−オクタデシルオキシエタン（ＯＤＥ）又は１−ブロモ−３−ヘキサデシルオキシプロパン（ＨＤＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、８０℃；（ｃ）０．５Ｍ  ＮａＯＨ。
【化２５】
2013509433.tif 000032
【０１０４】
本明細書に記載されている通り、本発明の化合物は、上に概略的に説明されている、或いは本発明の特定のクラス、サブクラス及び種によって例示されている置換基等、１又は複数の置換基に任意選択により置換され得る。一般に、用語「置換された」は、所定の構造における水素ラジカルの、特定の置換基のラジカルとの置き換えを意味する。他に断りがなければ、置換された基は、該基の置換可能な位置それぞれに置換基を有することができ、任意の所定の構造における２以上の位置が、特定の基から選択された２以上の置換基に置換され得る場合、置換基は、各位置で同一であっても異なっていてもよい。本発明が想定する置換基の組み合わせは、安定的な又は化学的に実現可能な化合物の生成をもたらす組み合わせとなることができる。
【０１０５】
化合物が、安定的で無毒性の酸性又は塩基性塩の生成に十分なほど塩基性又は酸性である場合、化合物の医薬的に許容可能な塩としての投与が適切となるであろう。医薬的に許容可能な塩は、医薬的に許容可能な無機又は有機塩基及び酸に由来する塩を含む。適切な塩は、製薬技術分野で周知の数多くの他の酸の中でも、カリウム及びナトリウム等のアルカリ金属、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ土類金属に由来する塩を含む。特に、医薬的に許容可能な塩の例は、生理学的に許容可能な陰イオン、例えば、トシレート、メタンスルホン酸、酢酸、クエン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、安息香酸、アスコルビン酸、α−ケトグルタル酸及びα−グリセロリン酸を生成する酸により生成された有機酸付加塩である。硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩等、適切な無機塩も生成され得る。
【０１０６】
医薬的に許容可能な塩は、本技術分野において周知の標準的な手順を用いて、例えば、アミン等の十分に塩基性な化合物を生理学的に許容可能な陰イオンを生じる適切な酸と反応させることによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム若しくはリチウム）又はアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩を生成することもできる。
【０１０７】
本明細書に記載されている活性化合物は、当業者であれば明らかである公知の手順又はその変法に従って調製することもできる。例えば、Ｐａｉｎｔｅｒら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−９−Ｒ−［２−（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ）Ｐｒｏｐｙｌ］−Ａｄｅｎｉｎｅ，  ＣＭＸ１５７，  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５１、３５０５〜３５０９（２００７）及び米国特許出願公開第２００７／０００３５１６号明細書、Ａｌｍｏｎｄら、を参照されたい。
【０１０８】
ＣＭＸ１５７は、当業者であれば明らかである公知の手順又はその変法に従って調製することができる。例えば、Ｐａｉｎｔｅｒら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−９−Ｒ−［２−（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ）Ｐｒｏｐｙｌ］−Ａｄｅｎｉｎｅ，  ＣＭＸ１５７，  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５１、３５０５〜３５０９（２００７）及び米国特許出願公開第２００７／０００３５１６号明細書、Ａｌｍｏｎｄら、を参照されたい。
【化２６】
2013509433.tif 000033
【０１０９】
一実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、化合物１、
【化２７】
2013509433.tif 000034
を適切な溶媒に溶解し、溶媒及び化合物１の混合物に適切な塩基を添加し、溶媒を除去して式Ｉの塩を生成することによって調製することができる。
【０１１０】
調製に用いられる溶媒は、満足な生成物収量が得られる当業者にとって公知のいずれかの適切な溶媒又は溶媒の組み合わせとなることができる。一実施形態において、溶媒は、少なくとも２種の溶媒の混合物である。溶媒の例示的な組み合わせとして、ジクロロメタンとメタノール、ジクロロメタンとエタノールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ジクロロメタンとメタノールのモル比は、約１：１から９：１の範囲である。一実施形態において、ジクロロメタンとメタノールのモル比は、約７：３から９：１の範囲である。更なる実施形態において、ジクロロメタンとメタノールのモル比は、約９：１である。
【０１１１】
調製に用いられる塩基は、満足な生成物収量が得られる当業者にとって公知のいずれかの適切な塩基又は塩基の組み合わせとなることができる。一部の実施形態において、塩基は、アルカリ金属アルコラート塩基である。例示的な塩基として、カリウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、リチウムｔｅｒ−ブトキシド、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
本明細書に記載されているプロセスは、不純物、副産物及び未反応の出発物質を除去するための再結晶化ステップを更に含むことができる。再結晶化ステップは、生成物を適切な温度で適切な溶媒に溶解し、適切な温度へと十分な時間冷却して式Ｉの化合物を沈殿させ、濾過して式Ｉの化合物を得るステップを含む。一部の実施形態において、溶解ステップの温度は、約５０℃〜８０℃の範囲である。
【０１１３】
Ｃ．医薬品製剤及び投与
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている化合物を含む医薬組成物である。別の実施形態において、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体を更に含む。本明細書における用語「医薬的に許容可能な担体」は、それ自体は治療薬ではなく、治療薬を対象へと送達するための溶剤として用いられる任意の物質を意味する。医薬的に許容可能な担体及び様々な組成物のための製造方法の例として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０）（米国特許出願公開第２００７／００７２８３１号明細書も参照）における記載が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１４】
一部の実施形態において、医薬組成物は、Ｅ節に記載の１又は複数の免疫抑制剤を更に含む。
【０１１５】
有効成分を単独で投与することもできるが、医薬品製剤として提供することが好ましい。本発明の動物用とヒト用の両方のための製剤は、その１又は複数の医薬的に許容可能な担体（賦形剤、希釈液等）及び任意選択により他の治療用成分と共に、上に定義した少なくとも１種類の有効成分を含む。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して有害でないという意味において「許容可能な」必要がある。
【０１１６】
本発明の化合物は、慣例に従って選択される従来の担体、希釈液及び賦形剤を用いて処方することができる。錠剤は、賦形剤、流動促進剤、注入剤、結合剤、希釈液等を含有するであろう。水性製剤は滅菌形態で調製され、経口投与以外による送達を目的とする場合、一般に等張性となるであろう。製剤は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（１９８６）に記されている賦形剤等、賦形剤を任意選択により含有し、アスコルビン酸及びその他の抗酸化剤、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、ステアリン酸その他等の炭水化物を含む。
【０１１７】
哺乳類、特にヒトに本発明の化合物の有効投薬量を与えるために、任意の適切な投与経路を用いることができる。例えば、本発明の組成物は、経口、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内及び硬膜外等）、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、舌下、頬側、腟内又は埋め込み式リザーバー投与等のための製剤に適切となることができる。一部の実施形態において、組成物は、経口により、局所的に、腹腔内に又は静脈内に投与される。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、本技術分野における公知の技法に従って処方することができる。許容可能な溶剤及び溶媒の中でも、水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液を用いることができる。加えて、滅菌した固定油は、溶媒又は懸濁媒体として従来から用いられている。
【０１１８】
本発明の化合物及びその生理学的に許容可能な塩（以下、まとめて有効成分という）は、処置する状態に適切な任意の経路により投与することができ、適切な経路として、経口、直腸、経鼻、局所（点眼、頬側及び舌下等）、腟内並びに非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内及び硬膜外等）が挙げられる。好ましい投与経路は、例えばレシピエントの状態により変動し得る。
【０１１９】
医薬的に許容可能な油は、本発明の組成物において溶媒又は懸濁媒体として用いることができる。オレイン酸やそのグリセリド誘導体等、脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油等の天然の医薬的に許容可能な油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンとして、注射用製剤中に適切に含まれる。本発明の組成物を含有する油は、エマルジョン及び懸濁液等の医薬的に許容可能な剤形の製剤に一般に用いられるカルボキシメチルセルロースや類似の分散剤等、長鎖アルコール希釈液又は分散剤も含有することができる。組成物は、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）若しくはＳｐａｎ（登録商標）等を含む非イオン性洗浄剤）、他の乳化剤又はバイオアベイラビリティ賦活薬を適切に更に含む。
【０１２０】
本発明の組成物は、カプセル、錠剤、懸濁液又は溶液を含むがこれらに限定されない、経口として許容可能な剤形の形態となることができる。経口剤形は、少なくとも１種類の賦形剤を含むことができる。本発明の経口製剤に用いられる賦形剤は、希釈液、不快な味や匂い、風味、色素、芳香をマスク又は相殺するために加える物質及び組成物の外観を改善するために加える物質を含むことができる。本発明の一部の経口剤形は、組成物の用量単位を経口投与に適切なカプセル又は錠剤等の個々に分かれた物品に形成するのを可能にする又は促進する崩壊剤、結合剤、粘着剤、湿潤剤、ポリマー、潤滑剤又は流動促進剤等、賦形剤を適切に含む。本発明の賦形剤含有錠剤組成物は、１又は複数の賦形剤を、その溶解、懸濁、ナノ粒子、マイクロ粒子又は制御放出、徐放、プログラム放出（programmed-release）、時限放出（timed-release）、パルス放出（pulse-release）、持続放出若しくは延長放出（extended-release）型と組み合わせて本発明の化合物と会合させるステップを含む、任意の適切な薬学的方法によって調製することができる。
【０１２１】
経口投与に適切な本発明の製剤は、それぞれ所定量の有効成分を含有するカプセル、カシェー（cachet）若しくは錠剤等の個々の単位として；粉末若しくは顆粒として；水性液体若しくは非水液体中の溶液若しくは懸濁液として；又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして提供することができる。有効成分は、ボーラス、舐剤又はペーストとして提供することもできる。
【０１２２】
錠剤は、任意選択により１又は複数のアクセサリー成分と共に圧縮又は鋳型成形によって作製することができる。圧縮された錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈液、保存料、表面活性又は分散剤と任意選択により混合して、適切な装置において圧縮することによって粉末又は顆粒等、フリーフロー型に有効成分を調製することができる。鋳型成形した錠剤は、不活性液体の希釈液で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な装置において鋳型成形することにより作製することができる。錠剤は、任意選択によりコーティングすることができ、又は分割錠とすることができ、それに含まれる有効成分の徐放又は制御放出がなされるように処方することができる。
【０１２３】
口腔内における局所投与に適切な製剤は、風味付けした基礎原料、通常はショ糖及びアカシア又はトラガント中に有効成分を含むトローチ剤（lozenge）；ゼラチン及びグリセリン、或いはショ糖及びアカシア等の不活性基礎原料中に有効成分を含む芳香錠（pastille）；並びに適切な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄剤を含む。
【０１２４】
直腸投与のための製剤は、例えばココアバター又はサリチル酸塩を含む適切な基剤を含む坐剤として提示することができる。
【０１２５】
担体が固体である経鼻投与に適切な製剤は、例えば、２０〜５００ミクロン（３０ミクロン、３５ミクロン等、５ミクロン増分（increment）で２０〜５００ミクロンの間の範囲の粒径等）の範囲の粒径を有する粗い粉末を含み、これは、嗅ぎ薬（snuff）で行われる仕方で、即ち、鼻の近くに保持した粉末容器を通した経鼻的な迅速な吸入によって投与される。担体が液体である、例えば、経鼻スプレー又は経鼻点滴としての投与に適切な製剤は、有効成分の水性又は油性溶液を含む。エアロゾル投与に適切な製剤は、従来の方法に従って調製することができ、ニューモシスチス肺炎処置のためのペンタミジン等、他の治療薬と共に送達することができる。
【０１２６】
腟内投与に適切な製剤は、適切であることが本技術分野において公知の担体を有効成分と共に含有するペッサリー、リング、タンポン、クリーム、ジェル（gel）、ペースト、泡又はスプレー製剤として提供することができる。
【０１２７】
非経口的投与に適切な製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬及び対象レシピエントの血液に対する等張性を製剤に付与する溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位用量又は複数回用量の容器、例えば密封したアンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用の水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時使用のための注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。好ましい単位投薬量製剤は、本明細書上述の有効成分の一日量若しくは単位サブ一日量又はその適切な一部を含有する製剤である。
【０１２８】
上に特に言及されている成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類を考慮した本技術分野における従来の他の薬剤を含むことができ、例えば経口投与に適切な製剤は、香味料を含むことができることを理解するべきである。
【０１２９】
本発明の医薬的に許容可能な組成物は、有効成分が１又は複数の担体に懸濁又は溶解された局所溶液、軟膏又はクリームの形態となることができる。本発明の化合物の局所投与のための担体として、ミネラルオイル、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。局所製剤が、軟膏又はクリームの形態である場合、適切な担体として、ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、本発明の局所組成物は、スプレーの形態である。
【０１３０】
本発明の医薬的に許容可能な組成物は、経鼻、エアロゾル又は吸入投与経路によって投与することもできる。このような組成物は、本技術分野において周知の医薬品製剤の技法に従って調製され、ベンジルアルコール又は他の適切な保存料、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン及び／又は他の従来の溶解補助剤若しくは分散剤を用いた生理食塩水中の溶液として調製することができる。一部の実施形態において、本発明の組成物の経鼻投与は、スプレーの形態である。スプレー適用のための任意の適切な担体を本発明に用いることができる。
【０１３１】
或いは、本発明の医薬的に許容可能な組成物は、直腸投与のための坐剤の形態となることができる。坐剤は、室温では固体だが直腸温度では液体になる、従って直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって調製することができる。このような材料は、ココアバター、蜜ろう及びポリエチレングリコールを含む。
【０１３２】
更に、本発明の化合物を含む医薬品製剤は、非経口的製剤の形態となることができる。本明細書における用語「非経口的」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技法を含む。
【０１３３】
特定の実施形態において、本発明の医薬品組成物は、経口投与のために処方される。ヒトへの経口投与に関して、投薬量範囲は、分割投与において０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態において、投薬量範囲は、分割投与において０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。別の実施形態において、投薬量範囲は、分割投与において０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。経口投与に関して、組成物は、処置する患者の症状による投薬量調整のため、１．０〜１０００ミリグラムの有効成分、特に、１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７５０、８００、９００及び１０００ミリグラムの有効成分を含有する錠剤又はカプセルの形態で提供することができる。
【０１３４】
ある特定の患者に対する特定の投薬量及び治療計画が、用いた特定の化合物の活性、投与方法、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、排せつ率、薬物の組み合わせ、臨床医の判断、処置されている状態及び状態の重症度等、様々な要因に依存するであろうことも理解するべきである。このような投薬量は、当業者であれば容易に確認することができる。この投薬計画は、最適な治療反応をもたらすよう調整することができる。
【０１３５】
本発明は、上に定義した少なくとも１種類の有効成分を動物用担体と共に含む動物用組成物を更に提供する。動物用担体は、組成物の投与のために有用な材料であり、さもなければ不活性又は獣医学分野において許容され、有効成分と適合性である固体、液体又は気体材料となることができる。これらの動物用組成物は、経口により、非経口的に、或いは任意のその他の所望の経路により投与することができる。
【０１３６】
本発明の化合物は、有効成分の放出が制御及び調節でき、低頻度の投薬を可能にし、所定の本発明の化合物の薬物動態又は毒性プロファイルを改善する、有効成分として１又は複数の本発明の化合物を含有する制御放出型医薬品製剤（「制御放出製剤」）を提供するために用いることができる。経口投与に適応した制御放出製剤において、１又は複数の本発明の化合物を含む個々の単位は、従来の方法に従って調製することができる。制御放出製剤は、ウイルスに関連する様々なウイルス感染症及び／又は疾患を処置するために用いることができる。ウイルスに関連する例示的な疾患として、ポリオーマウイルス（ＢＫ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩＶ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）等）、パピローマウイルス（ヒトパピローマウイルス、ワタウサギパピローマウイルス、ウマパピローマウイルス及びウシパピローマウイルス等）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）又はそれらの組み合わせから選択された少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。制御放出製剤は、結核、マラリア、ニューモシスチス肺炎、ＣＭＶ網膜炎、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）及び進行性全身性リンパ節腫大（ＰＧＬ）、並びに多発性硬化症及び熱帯性痙性不全対麻痺症等のＡＩＤＳ関連神経学的状態等、ＨＩＶ感染症及びその関連状態の処置に用いることもできる。本発明に係る制御放出製剤で処置することのできる他のヒトレトロウイルス感染症として、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス及びＨＩＶ−２感染症が挙げられる。従って、本発明は、上述のヒト又は動物の状態を処置するための医薬品製剤を提供する。
【０１３７】
薬物動態賦活薬。本発明の化合物は、薬物動態賦活薬（「ブースター（booster）剤」と言うこともある）と組み合わせて用いることができる。本発明の一態様は、本発明の化合物の薬物動態を増強又は「ブースト」するための有効量の賦活薬の使用を提供する。有効量の賦活薬、例えば、本発明の活性化合物又は追加的な活性化合物の増強に要求される量は、単独で用いた場合、そのプロファイルと比較した化合物の薬物動態プロファイル又は活性の改善に必要な量である。化合物は、賦活薬の添加なしの場合よりも有効な薬物動態プロファイルを保有する。化合物の効力増強に用いた薬物動態賦活薬の量は、好ましくは治療量以下である（例えば、患者における感染症の治療上の処置のために従来用いられているブースター剤の量より少ない投薬量）。本発明の化合物の賦活用量は、患者におけるその曝露が、バイオアベイラビリティ増加、血液レベル増加、半減期増加、血漿濃度ピークに達するまでの時間の増加、ＨＩＶインテグラーゼ、ＲＴ若しくはプロテアーゼ阻害の増加／高速化及び／又は全身（systematic）クリアランス低下によってブーストされるように、本発明の化合物の代謝調節に影響を与えるには十分に高いが、感染症を処置するために治療量以下である。薬物動態賦活薬の一例は、ＲＩＴＯＮＡＶＩＲ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。
【０１３８】
組み合わせ。上に記す通り、本発明の組成物は、本技術分野において公知の類似の仕方で、後述のＥ節に記載されているような１又は複数（例えば、１、２、３）種の免疫抑制剤と組み合わせた、上述のＡ節に記載されている活性化合物を含むことができる。
【０１３９】
このような組み合わせの特定の例として、少なくとも１種類の免疫抑制剤と組み合わせたＣＭＸ００１又はその医薬的に許容可能な塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的な免疫抑制剤として、ダクリズマブ、バシリキシマブ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸塩（ナトリウム又はモフェチルの）、シクロスポリンＡ、グルココルチコイド、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ５２モノクローナル抗体（キャンパス１−Ｈ）、アザチオプリン、エベロリムス、ダクチノマイシン、シクロホスファミド、白金、ニトロソウレア、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ムロモナブ、ＩＦＮガンマ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、タイサブリ（ナタリズマブ）、フィンゴリモド及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、医薬組成物は、ＣＭＸ００１、タイサブリ（ナタリズマブ）及び医薬的に許容可能な担体を含む。
【０１４０】
一実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体中に、ＣＭＸ００１又はその医薬的に許容可能な塩及びＰＭＬの原因となる１又は複数の薬物を含む。一実施形態において、１又は複数の薬物は、少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体におけるリツキサン、ラプティバ、タイサブリ（ナタリズマブ）、マイフォーティック、アボネックス、レミケード、エンブレル、ヒュミラ、セルセプト及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１４１】
別の実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体におけるＣＭＸ００１及びＣＭＸ１５７又はそれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩を含む。
【０１４２】
Ｄ．使用方法
本発明の一態様は、本明細書に記載されている化合物を対象に治療上有効量投与するステップを含む、対象における少なくとも１種類のウイルスに関連する状態／疾患を処置する方法を提供する。
【０１４３】
一実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、ウイルス複製及び／又はウイルス感染／形質転換細胞を特異的に標的とする。例えば、ＣＭＸ００１は、ＢＫウイルス及びＪＣウイルス感染細胞等、ポリオーマウイルス感染細胞に対する特異性を立証する。一実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、正常（非感染細胞）と比較して、ウイルス感染及び／又は形質転換細胞に対してより高い細胞毒性を有する。
【０１４４】
一部の実施形態において、ウイルスに関連する疾患は、腎症、出血性膀胱炎又は進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）から選択される。別の実施形態において、腎症、出血性膀胱炎は、少なくとも１種類のポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルス又はＪＣウイルス）に関連する。更に、一実施形態において、出血性膀胱炎は、少なくとも１種類のアデノウイルス（例えば、サブグループＢの血清型１１及び１２）に関連する。一実施形態において、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）は、少なくともＪＣウイルスに関連する。
【０１４５】
一部の実施形態において、疾患は、ポリオーマウイルス（ＢＫ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩＶ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等）、パピローマウイルス（ヒトパピローマウイルス、ワタウサギパピローマウイルス、ウマパピローマウイルス及びウシパピローマウイルス等）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス又はそれらの組み合わせから選択された少なくとも１種類のウイルスに関連する。
【０１４６】
別の実施形態において、疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡、ワクシニア、天然痘、牛痘、ラクダ痘、サル痘、エボラウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス又はＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＳＶ４０等のポリオーマウイルス並びにそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１種類のウイルスに関連する。
【０１４７】
一部の実施形態において、疾患は、ＢＫウイルス又はＪＣＶである少なくとも１種類のウイルスに関連する。
【０１４８】
一実施形態において、対象はヒトである。一実施形態において、対象は免疫低下した対象である。一実施形態において、対象は化学療法剤を必要としている。
【０１４９】
一部の実施形態において、対象は、以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いられた抗ウイルス剤は、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態において、本発明は、シドホビル単独による処置が失敗した場合に対象における少なくとも１種類のウイルスに関連する状態／疾患を処置する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ガンシクロビル単独による処置が失敗した場合に対象における少なくとも１種類のウイルスに関連する状態／疾患を処置する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、シドホビル及び／又はガンシクロビル単独又は組み合わせによる処置が失敗した場合に対象における少なくとも１種類のウイルスに関連する状態／疾患を処置する方法を提供する。
【０１５０】
別の実施形態において、疾患はヘルペスウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤は、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態において、本発明は、アシクロビル単独による処置が失敗した場合にヘルペスウイルス感染症を処置する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、バラシクロビル単独による処置が失敗した場合にヘルペスウイルス感染症を処置する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、アシクロビル及び／又はバラシクロビル単独又は組み合わせによる処置が失敗した場合にヘルペスウイルス感染症を処置するための方法を提供する。
【０１５１】
別の実施形態において、疾患は、アデノウイルスのウイルスに関連し、対象は以前に少なくとも１種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤は、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１５２】
別の実施形態において、疾患は、少なくとも１種類のヘルペスウイルスに関連し、方法は、構造、
【化２８】
2013509433.tif 000035
を有する化合物（ＣＭＸ００１）若しくはその医薬的に許容可能な塩及び／又はガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１種類の抗ウイルス剤との組み合わせを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、ＣＭＸ００１及びアシクロビルの組み合わせによりヘルペスウイルス感染症を処置する方法を提供する。
【０１５３】
更に、一実施形態において、疾患は、少なくとも１種類のサイトメガロウイルスに関連し、方法は、構造、
【化２９】
2013509433.tif 000036
を有する化合物（ＣＭＸ００１）若しくはその医薬的に許容可能な塩及び／又はガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１種類の抗ウイルス剤との組み合わせを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、ＣＭＸ００１及びガンシクロビルの組み合わせによりサイトメガロウイルス感染症を処置する方法を提供する。
【０１５４】
一実施形態において、疾患は、少なくとも１種類のアデノウイルスに関連し、方法は、構造、
【化３０】
2013509433.tif 000037
を有する化合物（ＣＭＸ００１）若しくはその医薬的に許容可能な塩及び／又はガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１種類の抗ウイルス剤との組み合わせを投与するステップを含む。
【０１５５】
別の実施形態において、本発明は、ＣＭＸ００１によりアデノウイルス感染症を処置する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、アデノウイルス感染症をｉｎ  ｖｉｖｏで処置する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、アデノウイルス感染症をｉｎ  ｖｉｖｏでＣＭＸ００１により処置する方法を提供する。
【０１５６】
本明細書において、免疫不全症（即ち免疫欠損症）とは、感染症と戦う免疫系の能力が損なわれた、或いは完全に失われた状態である。免疫低下対象は、任意の種類又は任意のレベルの免疫不全症の対象である。免疫低下した人は、通常の感染に加えて日和見感染に対して特に脆弱となり得る。例示的な免疫低下対象として、原発性免疫不全症の対象（免疫系に欠陥を持って産まれた対象）及び続発性（後天性）免疫不全症の対象が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その上、続発性免疫不全症の他の共通原因として、栄養不良、加齢及び特定の薬物（例えば、化学療法、疾患修飾性抗リウマチ薬、臓器移植後の免疫抑制薬、グルココルチコイド等、免疫抑制療法）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。免疫系を直接的又は間接的に損なう他の例示的な疾患として、様々な種類の癌（例えば、骨髄及び血液細胞の（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫））、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が原因の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性感染症及び自己免疫疾患（例えば、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚筋炎、１型真性糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、川崎病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、混合性結合組織疾患、モルフェア、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても公知）、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５７】
一部の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、前記対象に、１ｍｇ／Ｋｇ未満の投薬量で投与され、一部の実施形態において、コンジュゲート化合物は、前記対象に、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３又は０．５から５、１０、１５又は２０ｍｇ／Ｋｇの投薬量で投与される。
【０１５８】
一部の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、互いを相乗的に活性化する少なくとも２種類の異なるｄｓＤＮＡ（例えば、ＣＭＶ及びＨＩＶウイルスの組み合わせ、ＣＭＶ及びＢＫウイルスの組み合わせ等）に苦しむ対象の処置に有用となり得る。例えば、ＬＴ  Ｆｅｌｄｍａｎら、ＰＮＡＳ、１９８２年８月１５日、４９５２〜４９５６；Ｂ．Ｂｉｅｌｏｒａら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００１年９月；２８（６）：６１３〜４を参照されたい。
【０１５９】
一実施形態において、対象は、免疫抑制剤を投与された移植患者（腎移植患者、骨髄移植患者、肝移植患者、肝臓移植患者、幹細胞移植患者、肺移植患者、膵臓移植患者及び／又は心臓移植患者を含むが、これらに限定されない）である。
【０１６０】
一部の実施形態において、本発明は、免疫抑制薬物を投与された対象（例えば、過活動の免疫系に苦しむ移植患者又は対象）、特定の種類の化学療法を受けている対象又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した対象に適用される。一実施形態において、本発明は、少なくとも１種類の化学療法薬を投与された対象に適用される。
【０１６１】
本発明の別の態様は、ＰＭＬの原因となる少なくとも別の薬物と組み合わせて投与された対象に、
【化３１】
2013509433.tif 000038
の構造を有する治療上有効量の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を投与するステップを含む、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）を処置する方法を提供する。一実施形態において、薬物は、リツキサン、ラプティバ、タイサブリ（ナタリズマブ）、マイフォーティック、アボネックス、レミケード、エンブレル、ヒュミラ及びセルセプトからなる群から選択される。
【０１６２】
本発明の一態様において、本発明は、多発性硬化症及び／又は進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）を処置する方法を提供する。方法は、対象に、
【化３２】
2013509433.tif 000039
の構造を有する治療上有効量の化合物又はその医薬的に許容可能な塩をタイサブリ（ナタリズマブ）と組み合わせて投与するステップを含む。
【０１６３】
本発明の別の実施形態において、本発明は、対象に治療上有効量の化合物、
【化３３】
2013509433.tif 000040
又は任意のその医薬的に許容可能な塩を、
【化３４】
2013509433.tif 000041
又は任意のその医薬的に許容可能な塩と組み合わせて投与するステップを含む、対象におけるＨＩＶ及び／又は少なくとも１種類のウイルスに関連する障害を処置する方法を提供する。
【０１６４】
一部の実施形態において、少なくとも１種類のウイルスに関連する疾患は、腎症、出血性膀胱炎及び進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）からなる群から選択される。別の実施形態において、疾患は、ポリオーマウイルス又はアデノウイルスである少なくとも１種類のウイルスに関連する。一実施形態において、疾患は、ＢＫ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩＶ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１種類のウイルスに関連する。一実施形態において、疾患は、ＢＫウイルス又はＪＣＶである少なくとも１種類のウイルスに関連する。
【０１６５】
Ｅ．ウイルスに関連する疾患を処置するための免疫抑制剤との組み合わせ
本明細書に記載されている化合物は、追加的な免疫抑制剤と組み合わせて（同時的又は逐次的に）用いて、免疫抑制薬を必要とする対象のウイルスに関連する疾患を処置することができる。いずれかの適切な免疫抑制剤は、本明細書に記載されている化合物と組み合わせて用いることができる。本明細書において、免疫抑制薬は、上述のＥ節に記載されており、免疫抑制効果をもたらすために有効な量が用いられる。
【０１６６】
当業者にとって公知のいずれかの免疫抑制剤は、本明細書に記載されている化合物と組み合わせて用いることができる。例示的な免疫抑制剤として、エクリズマブ（aclizumab）、バシリキシマブ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸塩（ナトリウム若しくはモフェチルの）、シクロスポリンＡ、グルココルチコイド、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ５２モノクローナル抗体（キャンパス１−Ｈ）、アザチオプリン、エベロリムス、ダクチノマイシン、シクロホスファミド、白金、ニトロソウレア、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ムロモナブ、ＩＦＮガンマ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、タイサブリ（ナタリズマブ）、フィンゴリモド又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ＣＭＸ００１又はその医薬的に許容可能な塩は、ウイルスに関連する疾患を処置するためのタイサブリ（ナタリズマブ）である少なくとも１種類の免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる。
【０１６７】
追加的な例示的な免疫抑制剤は、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ｖｏｌ．２００９、ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７０１４６４及びＷｏｏｄｒｏｆｆｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｅｗｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ、Ｈｅａｌｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、ｖｏｌ．９、Ｎｏ．２１（２００５）に更に記載されている。
【０１６８】
Ｆ．実施例
次の非限定的な実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。
【０１６９】
次に、後述の実施例を参照しつつ本発明をより詳細に記載する。しかし、これら実施例は説明のために記載されており、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【０１７０】
次の実施例において、ＣＭＸ００１は、
【化３５】
2013509433.tif 000042
又はその医薬的に許容可能な塩である。
【０１７１】
次の実施例において、シドホビル（「ＣＭＸ０２１」とも言う）は、
【化３６】
2013509433.tif 000043
又はその医薬的に許容可能な塩である。
【０１７２】
次の実施例において、ＣＭＸ０６４は、
【化３７】
2013509433.tif 000044
又はその医薬的に許容可能な塩の構造を有する。
【０１７３】
［本明細書に記載されている化合物調製の実施例］
（１）環状シドホビルのヘキサデシルオキシプロピル、オクタデシルオキシプロピル、オクタデシルオキシエチル及びヘキサデシルエステルの合成
Ｎ，Ｎ−ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のシドホビル（１．０ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）懸濁液に撹拌下、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−４−モルホリンカルボキサミジン（ＤＣＭＣ、１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を一晩撹拌して、シドホビルを溶解した。次に、この清澄な溶液を付加漏斗（addition funnel）に充填し、高温の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６４ｇ、７．９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２５ｍＬ、６０℃）に撹拌下、時間をかけて加えた（３０分間）。この反応混合液をセ氏１００度で１６時間撹拌し、続いて室温へと冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をシリカゲルに吸着し、勾配溶出（ＣＨ２Ｃｌ２＋ＭｅＯＨ）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。最後に、５：５：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２ＯによりＵＶ活性生成物を溶出した。溶媒の蒸発により、８６０ｍｇの白色の固体を得た。１Ｈ及び３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、これが環状シドホビルのＤＣＭＣ塩であることを示した（収率＝４４％）。
【０１７４】
乾燥ＤＭＦ（３５ｍＬ）中の環状シドホビル（ＤＣＭＣ塩）（０．５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）溶液に、１−ブロモ−３−ヘキサデシルオキシプロパン（１．４５ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、混合液を撹拌して８０℃で６時間加熱した。次に、溶液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルに吸着し、勾配溶出（ＣＨ２Ｃｌ２＋ＥｔＯＨ）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。９０：１０のＣＨ２Ｃ１２／ＥｔＯＨによりアルキル化生成物を溶出した。純粋生成物を含有する画分を蒸発し、２６０ｍｇのＨＤＰ−環状シドホビルを得た（５５％収率）。
【０１７５】
乾燥ＤＭＦ（３５ｍＬ）中の環状シドホビル（ＤＣＭＣ塩）（１．０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）溶液に、１−ブロモ−３−オクタデシルオキシプロパン（２．８２ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合液を撹拌して、８５℃で５時間加熱した。次に、溶液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルに吸着し、勾配溶出（ＣＨ２Ｃｌ２＋ＭｅＯＨ）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。９：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨによりアルキル化生成物を溶出した。純粋生成物を含有する画分を蒸発し、４５０ｍｇのＯＤＰ−環状シドホビルを得た。
【０１７６】
乾燥ＤＭＦ（３５ｍＬ）中のｃＣＤＶ（ＤＣＭＣ塩）（１．０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）溶液に、１−ブロモ−３−オクタデシルオキシエタン（３．０ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を添加し、混合液を撹拌して、８０℃で４時間加熱した。次に、溶液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルに吸着し、勾配溶出（ＣＨ２Ｃｌ２＋ＭｅＯＨ）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。９：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨによりアルキル化生成物を溶出した。純粋生成物を含有する画分を蒸発し、３２０ｍｇのオクタデシルオキシエチル−ｃＣＤＶを得た。
【０１７７】
乾燥ＤＭＦ（３５ｍＬ）中の環状シドホビル（ＤＣＭＣ塩）（０．５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）溶液に、１−ブロモ−ヘキサデカン（１．２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、混合液を撹拌して、８０℃で６時間加熱した。次に、溶液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルに吸着し、勾配溶出（ＣＨ２Ｃｌ２＋ＭｅＯＨ）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。９：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨによりアルキル化生成物を溶出した。純粋生成物を含有する画分を蒸発し、１６０ｍｇのヘキサデシル−ｃＣＤＶを得た。
【０１７８】
（２）シドホビルのヘキサデシルオキシプロピル、オクタデシルオキシプロピル、オクタデシルオキシエチル及びヘキサデシルエステルの合成
上述において得られたヘキサデシルオキシプロピル−環状ＣＤＶを０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、室温で１．５時間撹拌した。次に、５０％酢酸水を滴下し、ｐＨを約９に調整した。沈殿したＨＤＰ−ＣＤＶを濾過により単離し、水でリンスし、乾燥し、次に再結晶化し（３：１のｐ−ジオキサン／水）、ＨＤＰ−ＣＤＶを得た。
【０１７９】
同様に、オクタデシルオキシプロピル−、オクタデシルオキシエチル−及びヘキサデシル−ｃＣＤＶエステルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて加水分解し、精製し、対応するシドホビルジエステルを得た。
【０１８０】
（３）ＣＭＸ１５７の塩の調製
遊離酸型ＣＭＸ１５７は、当業者にとって公知の方法により調製することができる（例えば、Ｐａｉｎｔｅｒら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｘａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−９−Ｒ−［２−（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−ａｄｅｎｉｎｅ、ＣＭＸ１５７，  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５１：３５０５〜９（２００７）及びＰａｉｎｔｅｒら、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：４２３〜７（２００４）を参照）。
【０１８１】
ＣＭＸ１５７ナトリウム塩。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１、５５０ｍＬ）の溶液に遊離酸型ＣＭＸ１５７（５５．０グラム、９６．５ｍｍｏｌ）を室温で溶解する。溶液にナトリウムメトキシド（メタノール中の０．５Ｍ溶液、１９３．１ｍＬ、９６．５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌する。反応混合液を真空中で濃縮乾固する（５０℃ウオーターバス）。その結果得られたオフホワイトの泡をエタノール（２００ｍＬ）に６０℃で溶解し、アセトン（２００ｍＬ）で希釈し、室温に冷却し、１８時間熟成する。懸濁液を５℃で４８時間維持し、濾過し、アセトン（２００ｍＬ）で洗浄し、真空中３５℃で４８時間乾燥し、ＣＭＸ１５７−ナトリウム塩、５４．４ｇ（９５．２％）を白色の固体で得る。ＨＰＬＣ（ＡＵＣ）純度９９．６％。
【０１８２】
ＣＭＸ１５７カリウム塩。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１、５５０ｍＬ）の溶液に遊離酸型ＣＭＸ１５７（５５．０グラム、９６．５ｍｍｏｌ）を室温で溶解する。溶液にカリウムメトキシド（メタノール中の２５％溶液、２８．５ｍＬ、９６．５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌する。反応混合液を真空中で濃縮乾固する（５０℃ウオーターバス）。その結果得られたオフホワイトの泡をエタノール（２００ｍＬ）に６０℃で溶解し、アセトン（２００ｍＬ）で希釈し、室温に冷却し、１８時間熟成する。懸濁液を５℃で４８時間維持し、濾過し、アセトン（２００ｍＬ）で洗浄し、真空中３５℃で４８時間乾燥し、ＣＭＸ１５７−カリウム塩、４８．４ｇ（８２．４％）を白色の固体で得る。ＨＰＬＣ（ＡＵＣ）純度９７．４％。
【０１８３】
ＣＭＸ１５７リチウム塩。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１、５５０ｍＬ）の溶液に遊離酸型ＣＭＸ１５７（５５．０グラム、９６．５ｍｍｏｌ）を室温で溶解する。溶液にリチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（７．７３ｇ、９６．５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌する。反応混合液を真空中で濃縮乾固する（５０℃ウオーターバス）。その結果得られたオフホワイトの固体をエタノール（８００ｍＬ）に７０℃で溶解し、室温に冷却し、１６時間熟成する。高純度の懸濁液を濾過し、アセトン（２００ｍＬ）で洗浄し、真空中３５℃で４８時間乾燥し、ＣＭＸ１５７−リチウム塩、５１．２ｇ（９２．１％）を白色の固体で得る。ＨＰＬＣ（ＡＵＣ）純度９５．７％。
【０１８４】
ＣＭＸ１５７アンモニウム塩。２−プロパノール（２２０ｍＬ）に遊離酸型ＣＭＸ１５７（５５．０グラム、９６．５ｍｍｏｌ）を水酸化アンモニウム（２８〜３０％溶液１３．５４ｍＬ、９６．５ｍｍｏｌ）の存在下７８℃で溶解する。反応混合液を室温に冷却し、１８時間熟成する。懸濁液を５℃で４８時間維持し、濾過し、およそ４８時間風乾し、ＣＭＸ１５７−アンモニウム塩、５１．７ｇ（９１．３％）を白色の固体で得る。ＨＰＬＣ（ＡＵＣ）純度９８．７％。
【０１８５】
実施例ＩＩ  ＣＭＸ００１の前臨床試験
【実施例１】
【０１８６】
下記の表１〜２にまとめた通り、ＣＭＸ００１の前臨床試験は、これが、マウス及びウサギにおいて致死性オルソポックスウイルス感染に対し基本的に完全な保護作用があることを示す。これらの動物モデルにおける有効用量は、低力価接種で１日１〜２ｍｇ／ｋｇの範囲を５日間であるが、後期では単一用量として２０〜３０ｍｇ／ｋｇを必要とする。
【表３】
2013509433.tif 000045
【表４】
2013509433.tif 000046
【０１８７】
加えて、マウス、ラット、ウサギ及びサルにおいて、ＣＭＸ００１を経口経路により送達して、２１種にわたる毒物学的試験を行った。これらの試験において（有効用量のシドホビルのｉ．ｖ．による送達とは反対に）、腎毒性の徴候はなかった（例えば、下記の実施例２を参照）。
【実施例２】
【０１８８】
ＢＫウイルスの複製を阻害するＣＭＸ００１の能力を試験するため、ＨＦＦ細胞においてＢＫウイルスのストックを調製し、ウイルスストックの希釈液を用いて初代ヒト腎尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を感染させた。次に、感染細胞を含有するウエルに薬物希釈液を添加し、プレートを５日間インキュベートした。プレートから全ＤＮＡを調製し、ウイルスのＤＮＡをｑＰＣＲにより定量化した。ＣＭＸ００１は、ＲＰＴＥＣにおいてＢＫウイルスに対し良好な活性を提示し、シドホビルよりも効果があった（表３（ａ））。陰性対照薬物であるガンシクロビルは、基本的に不活性であった。細胞株におけるアッセイ最適化も、感染多重度が、シドホビル及びＣＭＸ００１の効力に影響すると思われることを明らかにした。
【表５】
2013509433.tif 000047
【０１８９】
ＪＣウイルスを阻害するＣＭＸ００１の能力を試験するため、ＣＯＳ−７細胞を推定ＴＣＩＤ５０  ０．２のＪＣＶ（Ｍａｄ−４）に感染させた。２時間の３７℃でのインキュベーションの後、上清を増加量のＣＭＸ００１を含む又は含まない新しい培地に交換し、５日間インキュベートした。ＤＮＡ抽出後、ＪＣウイルスをｑＰＣＲにより定量化した。表３（ｂ）に示す通り、ＣＭＸ００１は、ＪＣウイルスに対し活性であった。
【表６】
2013509433.tif 000048
【実施例３】
【０１９０】
ＲＰＴＥＣをＢＫＶ（Ｄｕｎｌｏｐ）に感染させた。感染前及び感染２時間後（ｈｐｉ）にＣＭＸ００１を添加した。２４〜７２ｈｐｉに細胞及び上清を回収した。ＴａｑＭａｎアッセイ、ウエスタンブロッティング、ＩＦ染色によりＢＫＶ複製を検査し、ＷＳＴ−１アッセイ、ＢｒｄＵ取り込み及びＴａｑＭａｎアッセイによりＲＰＴＥＣの生存率を検査した。
【０１９１】
ＣＭＸ００１、０．３１μＭは、７２ｈｐｉにおける細胞外ＢＫＶ負荷量を９０％低下させた。この濃度において、ＢｒｄＵ取り込みの３０％低下が観察されたが、ＷＳＴ−１活性は変化しなかった。ＢＫＶ侵入及び初期発現は影響を受けなかったが、ＢＫＶ  ＤＮＡ複製は４８ｈｐｉにおいて９４％低下した。後期タンパク質発現は約７０％低下した。
【０１９２】
ＣＭＸ００１は、ＢＫＶ複製をＤＮＡ複製レベルで阻害する。ＣＭＸ００１、０．３１ｕＭは、細胞外ＢＫＶ負荷量の９０％低下をもたらす。ＣＭＸ００１は、４００×低レベルでＣＤＶよりも持続的な効果を有し、代謝活性及び細胞のＤＮＡ複製における効果は低い。
【実施例４】
【０１９３】
［ＣＭＸ００１は、初代ヒト腎尿細管細胞におけるポリオーマウイルスＢＫ複製を阻害する］
Ａ．材料と方法
初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、ＢＫＶ（Ｄｕｎｌｏｐ）及びあらゆる方法は、以前にＢｅｒｎｈｏｆｆら（Ｂｅｒｎｈｏｆｆら、Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＢＫ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８、１４１３〜１４２２（２００８）を参照）によって記載された通りのものである。唯一の例外として、細胞内又は細胞外ＢＫＶ  ＤＮＡ負荷量を定量化するための定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＬＴａｇ遺伝子も標的とする異なるプライマー／プローブセットを用いて行った（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｊ．  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ＢＫ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３４７、４８８〜４９６（２００２）を参照）。各実験の前に、ＣＭＸ００１を１ｍｇ／ｍｌとなるようメタノール／水／水酸化アンモニウム（５０／５０／２）に新しく溶解した。これをＲＰＴＥＣ成長培地で更に希釈した。
【０１９４】
Ｂ．実験と結果
（１）阻害濃度ＩＣ９０の決定
ＢＫＶの後代におけるＣＭＸ００１の効果を調べるため、２ｈｐ．ｉ．に濃度増加のＣＭＸ００１を添加し、７２ｈｐ．ｉ．に上清を回収した。ＣＭＸ００１が、濃度依存的様式で細胞外ＢＫＶ負荷量を低下させることが観察された（図１ａを参照）。ウイルスのインプットを差し引くと、ＣＭＸ００１、０．３１μＭは、ＢＫＶ負荷量を平均９０％低下させ、これにより阻害濃度ＩＣ９０を画定した。７２ｈｐ．ｉ．のＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの免疫蛍光染色は、ＣＭＸ００１濃度が増加するにつれＢＫＶ感染細胞の数がより少なくなることを立証した（図１ｂ）。ＣＭＸ００１、０．３１ｕＭにより、ＢＫＶアグノプロテイン発現細胞のおよそ６０％の減少が観察された。ＬＴａｇを発現する細胞数はあまり低下しなかったが、シグナル強度は無処置細胞よりも低かった。２．５ｕＭ  ＣＭＸ００１では、ごく一部の細胞がアグノプロテイン及びＬＴａｇ発現に関して陽性であったが、ウエル内の細胞全数は減少の様相を呈した。５ｕＭ  ＣＭＸ００１では、弱くＬＴａｇ染色された細胞がごく一部観察されたが、アグノプロテイン発現細胞は観察されず、総細胞数に対してより顕著な効果があった。１０ｕＭ  ＣＭＸ００１では、ＢＫＶ感染細胞は観察されず、総細胞数は更に減少した。結論として、ＣＭＸ００１は、初期及び後期ＢＫＶタンパク質の発現並びに細胞外への後代の産生を低下させるが、より高濃度ではＲＰＴＥＣの増殖速度にも影響を及ぼすと思われる。
【０１９５】
（２）ＲＰＴＥＣにおけるＣＭＸ００１の効果（ＤＮＡ複製及び代謝活性）
位相差顕微鏡によるＲＰＴＥＣの検査は、ＣＭＸ００１、０．３１μＭへの曝露３日間の間に生存率が損なわれたいかなる兆候も明らかにしなかった。より高感度のアッセイを用いるため、非感染ＲＰＴＥＣにおけるＢｒｄＵ取り込み及びＷＳＴ−１アッセイを用いて宿主細胞ＤＮＡ複製及び代謝活性を用いた。ＣＭＸ００１の添加は、非感染ＲＰＴＥＣのＤＮＡ複製（図２ａ）及び代謝活性（図２ｂ）の両方を濃度依存的様式で低下させた。無処置ＲＰＴＥＣと比較すると、０．０８〜１０μＭのＣＭＸ００１は、それぞれＤＮＡ複製を１５％〜９３％、代謝活性を４１％〜８８％減少させた。ＢＫＶ複製の９０％阻害をもたらす０．３１μＭ濃度において、ＢｒｄＵ取り込み及びＷＳＴ−１活性のおよそ２０％の低下が観察される。
【０１９６】
（３）ＢＫＶゲノム複製におけるＣＭＸ００１の効果
ＢＫＶゲノム複製がＣＭＸ００１の影響を受けるか否かを調べるため、２４〜７２ｈｐ．ｉ．における細胞内ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲにより測定した。記載されている通り（Ｂｅｒｎｈｏｆｆら、２００８；Ｒａｎｄｈａｗａら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ＢＫ  ａｎｄ  ＪＣ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、１９２、５０４〜５０９（２００５）を参照）、アスパルトアシラーゼ（ＡＣＹ）遺伝子を用いて細胞内ＢＫＶ負荷量を細胞数に対し正規化した。無処置ＲＰＴＥＣと比較すると、ＣＭＸ００１、０．３１μＭは、細胞内ＢＫＶ負荷量を４８ｈで９４％、７２ｈｐ．ｉ．で６３％低下させた（図３）。このように、ＢＫＶ生活環の第二のステップである細胞内ＢＫＶゲノム複製におけるＣＭＸ００１の有意な阻害効果が同定できた。このステップは、２種の機序、１．後期遺伝子転写のためのＤＮＡ鋳型の増加及び２．後期プロモーターからの転写の活性化（Ｃｏｌｅ、Ｃ．Ｎ．、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｎ、１９９７〜２０４３頁、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ＆Ｐ．Ｈ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ（１９９６））によってウイルスの後期遺伝子発現も増加させる、ＬＴａｇ発現を必要とすることが公知である。
【０１９７】
（４）ＢＫＶ初期及び後期遺伝子発現におけるＣＭＸ００１の効果
単細胞レベルのＬＴａｇの発現を調べるため、４８及び７２ｈｐ．ｉにおいて免疫蛍光染色を行った。４８ｈｐ．ｉ．において、ＢＫＶ陽性細胞の数は、ＣＭＸ００１及び無処置ウエルでほぼ同じであった。７２ｈｐ．ｉ．において、ＣＭＸ００１処置細胞は、細胞当たりのＬＴａｇ発現がより低いと思われる（図４ａ）。４８及び７２ｈｐ．ｉにおける後期タンパク質発現を免疫蛍光染色により検査すると、ＣＭＸ００１処置ＲＰＴＥＣにおいてアグノプロテイン（図４ａ）及びＶＰ１（データ図示せず）の有意な低下が観察された。ウエスタンブロッティングにより、ＶＰ１の減少が４８及び７２ｈｐ．ｉ．においてそれぞれ８６％及び６３％であると判明し（図４ｂ）、一方、ＬＴａｇ染色は、４８及び７２ｈｐ．ｉ．においてそれぞれ３３％及び３０％減少したことが判明した。興味深いことに、免疫蛍光は、最大２．５μＭのＣＭＸ００１濃度であっても無処置細胞に匹敵するレベルでアグノプロテインを発現する、ＣＭＸ００１処置培養物における一部の不応性細胞も明らかにした。ＣＭＸ００１は、後期タンパク質発現を有意に低下させるが、感染後期の時点において初期タンパク質発現も阻害すると結論された。
【０１９８】
（５）細胞外ＢＫＶ負荷量におけるＣＭＸ００１の経時変化
ＢＫＶ後代におけるＣＭＸ００１の経時的な効果を検査するため、処置及び無処置細胞の上清を表示の時点で回収した。以前に記載した通り（Ｂｅｒｎｈｏｆｆら、２００８）、無処置ＲＰＴＥＣにおけるＢＫＶ（Ｄｕｎｌｏｐ）の第一の生活環の完了は、４８〜７２時間の間に起こる。無処置細胞４８ｈｐ．ｉ由来の上清においてＢＫＶ負荷量増加が観察されたが、ＣＭＸ００１処置細胞４８ｈｐ．ｉ．においてはインプットウイルスしか検出できなかった。７２時間目に、無処置及びＣＭＸ００１処置細胞の両方においてウイルス負荷量の増加が観察されたが、ＣＭＸ００１処置細胞由来の上清におけるＢＫＶ負荷量は、無処置細胞よりも８４％低かった（１．１３×１０８Ｇｅｑ／ｍｌ）（図５）。ＣＭＸ００１処置ＲＰＴＥＣにおける後代の産生は遅延され得ると結論された。
【０１９９】
（６）感染前のＲＰＴＥＣの処置
ウイルス接種前の細胞の前処置がＢＫＶ感染を阻害し得るか否か調べるため、ＲＰＴＥＣを４時間処置し、感染２０時間前にＣＭＸ００１を完全成長培地に交換した、或いは、感染２４時間前に細胞を２３時間処置し、感染１時間前にＣＭＸ００１を完全成長培地に交換した。処置４時間、感染２０時間前終了は、ＢＫＶ負荷量７２ｈｐ．ｉ．においてほとんど何の効果もなかったが、感染１時間前まで処置２３時間は、ウイルス負荷量を約５０％低下させた（図６）。このように、ＣＭＸ００１前処置は、ＢＫＶ複製を低下させはしたが、抑制はしなかった。
【０２００】
（７）ＣＭＸ００１の安定性
ＣＭＸ００１原液の安定性を検査するため、１ｍｇ／ｍｌを４又は−２０℃に１週間置き、続いて０．３１ｕＭになるよう希釈し、ＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣ、３ｄｐ．ｉにおける細胞外ＢＫＶ負荷量を測定することによってその抗ウイルス効果を試験した。４℃で保存した薬物は新たに調製した薬物と比較して６０％未満の活性を有していたが、−２０℃で保存した薬物はおよそ９０％の活性を有していた（図７）。
【０２０１】
Ｃ．考察
ＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣのＣＭＸ００１による処置から得られた予備段階の結果を、図１〜７と共に図１〜７に関する上述の考察に示す。ＣＭＸ００１は、ＣＤＶよりも約４００倍低い濃度で（ＣＤＶ  ４０ｕｇ／ｍｌ＝１２７ｕＭ対ＣＭＸ００１  ０．３１ｕＭ）、ＢＫＶゲノム複製のレベルでＢＫＶ感染を阻害する。０．３１ｕＭ濃度のＣＭＸ００１は、細胞外ＢＫＶ負荷量をおよそ９０％低下させ、これによりＩＣ９０を画定した。このＣＭＸ００１濃度は、非感染細胞における細胞ＤＮＡ複製を２２％、代謝活性を２０％減少させた。しかし、以前の一部の研究（Ｂｅｒｎｈｏｆｆら、２００８）において、ＢＫＶ感染が、細胞ＤＮＡ複製を約４０％、代謝活性を２０％前後増加させることが示され、従って仮説として、ＣＭＸ００１、０．３１ｕＭを用いてＢＫＶ感染細胞を処置すると、ＤＮＡ複製及び代謝活性の両方が非感染細胞レベルとなるであろう。
【０２０２】
０．３１ｕＭのＣＭＸ００１は、４８ｈｐ．ｉ．においてＢＫＶ  ＤＮＡ複製を９４％低下させる。同一時点において、ＶＰ１発現は８６％低下した。しかし、７２ｈｐ．ｉ．において、ＤＮＡ複製の減少は僅か６３％である。この矛盾の解明には、感染性の上清における効果を含む更なる研究を必要とする。
【０２０３】
２４、４８及び７２ｈｐ．ｉ．にて細胞外ＢＫＶ負荷量を測定すると、４８ｈｐ．ｉ．のＣＭＸ００１処置細胞においてインプットのみが検出可能であったが、これは、４８ｈｐ．ｉより前に放出されるウイルスが非常に少量又は全くないことを示唆し、７２ｈｐ．ｉにおいて、ＢＫＶ負荷量のごく僅かな増加が観察されたが、これは無処置細胞と比較して８４％低下となる。
【０２０４】
感染に先立つＲＰＴＥＣのＣＭＸ００１による前処置の効果がＢＫＶ複製を抑制することができるか検査するための実験を行い、その結果は上に示されている。感染２４時間前の前処置４時間は、ＢＫＶ複製を阻害しなかった。しかし、感染１時間前まで前処置２４時間は、ウイルス負荷量を約５０％低下させた。このように、細胞の前処置は、ＢＫＶ複製を部分的に阻害するであろう。
【０２０５】
７２ｈｐ．ｉのＣＭＸ００１  ＩＣ９０処置細胞とＣＤＶ  ＩＣ９０処置細胞の免疫蛍光染色を比較すると（Ｂｅｒｎｈｏｆｆら、２００８）、７２ｈｐ．ｉ．のＬＴａｇ発現は、ＣＤＶよりもＣＭＸ００１の方が更に低下していると考えられる。ＣＤＶに関して、処置不応性細胞は、ＩＣ９０よりも８倍高いＣＭＸ００１濃度で存在する。ＣＭＸ００１は有機陰イオン輸送体に依存しないため、細胞におけるこの輸送体の選択的発現は、この現象を説明できない。
【０２０６】
ＣＭＸ００１実験毎に新鮮な原液を調製した。この操作は、実験間で微量の濃度変動を生じ得る。従って、ＣＭＸ００１原液保存の効果を試験した。１週間４℃又は−２０℃におけるＣＭＸ００１の保存は、抗ウイルス活性を減少させた。しかし、保存した及び新しく調製したＣＭＸ００１の異なる活性が、ストックにおける僅かな濃度の差異に起因し得る可能性は除外できない。
【０２０７】
結論として、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞におけるＢＫウイルス複製に対するＣＭＸ００１のＩＣ９０は、０．３１μＭであった。非感染細胞において、０．３１μＭのＣＭＸ００１は、代謝活性及びＤＮＡ複製をおよそ２０％阻害した。
【０２０８】
その上、ＣＤＶと同様にＣＭＸ００１は、初代ヒトＲＰＴＥＣにおいて初期のＬＴａｇ発現の下流であるＢＫＶ複製を阻害する。恐らく取り込みがより有利なため、ＲＰＴＥＲＣにおけるＣＭＸ００１のＩＣ９０は、ＣＤＶよりも４１０倍低い。宿主細胞毒性はＣＤＶに匹敵すると思われる。ＢＫＶ処置におけるＣＭＸ００１の明らかな利点は、経口投与の可能性である。
【実施例５】
【０２０９】
［ＣＭＸ００１によるポリオーマウイルスＪＣ複製の阻害］
Ａ．材料と方法
（１）細胞培養
ＣＯＳ−７細胞をＤＭＥＭ−５％において増殖させる。前駆細胞に由来するアストロサイトを、ゲンタマイシンで補充したＭＥＭ−Ｅ−１０％において維持した。ＴＣＩＤ５０が１ｍｌ当たり１０４．５の感染ＣＯＳ−７細胞由来のＪＣＶ  Ｍａｄ−４（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５８３）上清を培養細胞の感染に用いた。
【０２１０】
（２）感染及びＣＤＶ処置
６０〜７０％コンフルエンスのＣＯＳ−７又はアストロサイト細胞を推定ＴＣＩＤ５０  ０．２のＪＣＶ（Ｍａｄ−４）に感染させた。２時間３７℃のインキュベーションの後、上清を濃度増加のＣＭＸ００１を含まない又は含む新しい培地に交換した。ＣＭＸ００１を１ｍｇ／ｍｌになるようメタノール／水／水酸化アンモニウム（５０／５０／２）に新たに溶解し、続いて各成長培地で更に希釈した。
【０２１１】
（３）ＪＣＶゲノムのトランスフェクション
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの説明書に従い、再連結したＪＣＶ  Ｍａｄ−４  ＤＮＡを５０％〜７０％コンフルエントのＣＯＳ−７細胞にＤＮＡ：脂質比、０．８：１でトランスフェクトした。
【０２１２】
（４）免疫蛍光
細胞をリン酸緩衝食塩水ｐＨ６．８（ＰＢＳ）中の４％ｐ−ホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温にて２０分間固定し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により室温で１０分間透過処理した。室温にて５分間ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の０．５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌで室温にて７分間処理することによりＰＦＡを反応停止し、続いて室温にて５分間ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ中の３％ミルクにより非特異的結合部位のブロッキングを３７℃で１５分間行った。一次抗体（ウサギ抗ＶＰ１、３％ミルク／ＰＢＳで１：３００）を３７℃で４５〜６０分間インキュベートした。振盪機において室温で５分間、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体（ニワトリ抗ウサギＣｙ３、１：２０００）及びＤＮＡを染色する５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２色素を細胞に添加し、続いて３７℃で４５〜６０分間インキュベートした。細胞を先に述べた通りＰＢＳで２回洗浄した。カバーガラスをＮ−没食子酸プロピル（NPropylgallat）中にマウントした。
【０２１３】
（５）リアルタイムＰＣＲ
１００ｕｌの細胞培養上清からＤＮＡを抽出した後、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｘ−ｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｅ及びＣｏｒｂｅｔｔ  ＶＸ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、スイス、ホンブレヒティコン）によりＪＣＶ負荷量を定量化した。ＪＣＶ  ＤＮＡ試料の検出のためのリアルタイムＰＣＲプロトコールはＪＣＶラージＴコード配列を標的とし、これについては他に記載されている（５）。
【０２１４】
（６）ＷＳＴ−１アッセイ
生細胞におけるミトコンドリアの脱水素酵素の比色ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）により、代謝活性をモニターした。９６ウエルプレートにＣＯＳ−７細胞を播種し、表示濃度のＣＭＸ００１を添加した。４５０ｎｍ（試料）及び６５０ｎｍ（バックグラウンド）にてＷＳＴ−１開裂産物を測定した。ＷＳＴ−１プラス培地単独をブランク値とした。
【０２１５】
（７）ＢｒｄＵアッセイ
「細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ」キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた増殖細胞におけるＤＮＡへのＢｒｄＵ取り込みの比色測定によってＤＮＡ合成を定量化した。ＣＯＳ−７細胞を９６ウエルプレートに播種し、表示濃度のＣＭＸ００１を添加した。基質添加２時間後に４５０ｎｍ（試料）及び６５０ｎｍ（バックグラウンド）の吸光度を決定した。
【０２１６】
Ｂ．実験と結果
（１）細胞培養におけるＪＣＶ  Ｍａｄ−４の複製
先ず、ＣＯＳ−７及びアストロサイト細胞培養物におけるＪＣＶ  Ｍａｄ−４複製の特徴を調べた。感染後７日目に（ｄ．ｐ．ｉ．）ＪＣＶ感染ＣＯＳ−７細胞を固定し、間接免疫蛍光法により染色した。図８に示す通り、ＪＣＶ後期ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１を赤色シグナルとして検出でき、これは、ＪＣＶが、ＣＯＳ−７細胞においてウイルスの生活環を完了しつつあることを示唆する（図８、左パネル）。ヘキスト３３３４２によるＤＮＡの対比染色は、核を青色にマークした（図８、中央パネル）。両方の写真の重ね合わせ（図８、右パネル）は、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４  ＶＰ１が、感染ＣＯＳ−７細胞の核に存在することを示す。更に拡大すると、ＶＰ１シグナルが核小体を除く核内全体にわたって分散していた（図８、左パネル）。核に強いＶＰ１シグナルを示す細胞は、同様に細胞質にも拡散した染色パターンを有していた。ＪＣＶ感染細胞は、同一細胞培養物中に存在する非感染細胞（図８、右パネル）と比較して拡張した核（図８、中央パネル）を示した。データは、ＣＯＳ−７細胞がＪＣＶ  Ｍａｄ−４感染に対し感受性であること、また、細胞の約３０％が７ｄ．ｐ．ｉ．にＪＣＶ生活環後期に入ったことを立証する。
【０２１７】
アストロサイト細胞をＪＣＶ  Ｍａｄ−４に感染させる同様の実験を行った。７ｄ．ｐ．ｉにおいて、ＪＣＶ  ＶＰ１の細胞内分布は、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４感染ＣＯＳ−７細胞と同様のものであると思われる（図９、左パネル、赤色）。ヘキスト３３３４２によるＤＮＡの対比染色は、アストロサイト細胞核を青色にマークした（図９、中央パネル）。両方の写真の重ね合わせは、ＪＣＶ−Ｍａｄ４  ＶＰ１が、感染アストロサイト細胞の核に存在することを示す。ＣＯＳ−７細胞のＪＣＶ  Ｍａｄ−４感染との比較において、有意により少ないアストロサイト細胞が、後期タンパク質ＶＰ１に関して陽性であった（図９、右パネル）。更に拡大すると、ＶＰ１シグナルは、主として核小体を除く核に見られ、アストロサイト細胞の細胞質において幾分拡散したパターンで見られた（図９、左パネル）。ＤＮＡの染色は、大型の核が培養物に存在することを示し（図９、中央パネル）、これはＪＣＶ感染細胞に属する（図９、右パネル）。アストロサイト細胞のウイルス初期タンパク質ラージＴ抗原（ＬＴ）も染色したところ、予想通り、ＬＴは感染細胞の核に位置していた（データ図示せず）。後期タンパク質ＶＰ１陽性の全細胞はＬＴも発現したが、ＬＴのみ陽性のアストロサイト細胞は殆どなかった。この観察は、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４は、予想通りポリオーマウイルス生活環を進行することを示した。ｐ．ｉ．７日目の培養密度は、アストロサイトが増殖の遅い細胞であることを示し、そのため、ヒト腎近位尿細管上皮細胞におけるＪＣＶ複製はＢＫＶ複製と比較して延長される。本出願人らの観察は、７日間の増殖期間は効率的なＪＣＶ複製に最適ではないことを示唆する。
【０２１８】
アストロサイト細胞におけるＪＣＶ  Ｍａｄ−４のより遅い複製速度を考慮し、１４ｄ．ｐ．ｉ．における感染状態を検査した。この結果は、初期ＬＴａｇ陽性の細胞数（データ図示せず）及び後期ＶＰ１が、およそ４倍増加した（図１０）ことを示す。よって、アストロサイト細胞は、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４複製を支持したが、生活環は、ＣＯＳ−７細胞において観察されたものと比較して相当に延長されたと思われる。
【０２１９】
次に、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした再連結したＪＣＶ  Ｍａｄ−４  ＤＮＡの複製コンピテンスを試験した。このアプローチは、ＪＣＶ変種においてＣＭＸ００１効力を試験する逆遺伝学を行うのに有用なツールとなり得る。図１１に示す通り、ＪＣＶ後期ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１は、赤色シグナルとして検出できるが、これは、ＪＣＶが、トランスフェクション７日後（ｄ．ｐ．ｔ．）にＣＯＳ−７細胞において複製コンピテントであることを示す（図１１、左パネル）。ヘキスト３３３４２色素によるＤＮＡの対比染色は、核を青色にマークした（図１１、中央パネル）。両方の写真の重ね合わせ（図１１、右パネル）は、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４  ＶＰ１は、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の核に存在することを示した。更に拡大すると、ＶＰ１シグナルは、核小体を除く核全体にわたって分散していた（図１１、左パネル）。核に強いＶＰ１シグナルを示す細胞は、同様に細胞質にも拡散した染色パターンを有していた。ＪＣＶトランスフェクト細胞は、同一細胞培養物中に存在する正常細胞（図１１、右パネル）と比較して拡張した核を示した（図１１、中央パネル）。データは、ＣＯＳ−７細胞が、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４  ＤＮＡトランスフェクションに対し感受性であること、また、約１５％の細胞が、ｐ．ｉ．７日目までにＪＣＶ生活環の後期に入ったことを立証する。トランスフェクション後、後期タンパク質ＶＰ１の細胞内染色パターンは、ＪＣＶ  Ｍａｄ−４感染後のＶＰ１染色と同一であった。
【０２２０】
（２）阻害濃度ＩＣ９０の決定
ＪＣＶ後代におけるＣＭＸ００１の効果を調べるため、２ｈｐ．ｉ．に濃度増加のＣＭＸ００１を添加し、５ｄ．ｐ．ｉ．に上清を回収した。ＣＭＸ００１が、濃度依存的様式で細胞外ＪＣＶ負荷量を低下させることが観察された（図１２）。ｐ．ｉ．１日目から５日目の間に、ウイルス負荷量は、無処置細胞において約２．５ｌｏｇ（１．２４×１０７対５．０９×１０９）増加した。それに対し、２．５μＭ  ＣＭＸ００１で処置した細胞において、同じ期間内にほんの２と１／２倍の増加が観察された（９．６９×１０６対２．４４×１０７）。ｐ．ｉ．１日目のウイルス負荷量として定義されたウイルスインプットを差し引くと、０．１５μＭのＣＭＸ００１はＪＣＶウイルス負荷量を＞５０％低下させ、０．６μＭはＪＣＶを＞９０％低下させ、これにより、それぞれｄ．ｐ．ｉ．５日目の阻害濃度ＩＣ−５０及びＩＣ−９０を画定した。
【０２２１】
（３）ＣＯＳ−７細胞の代謝活性におけるＣＭＸ００１の効果
位相差顕微鏡によるＣＯＳ−７の検査は、ＣＭＸ００１、０．６μＭに７日間曝露している間、生存率を損なういかなる兆候も明らかにしなかった。より高感度のアッセイを用いるため、非感染ＣＯＳ−７細胞におけるＷＳＴ−１アッセイ及びＢｒｄＵ取り込みを用いた細胞代謝活性における効果を調べた。ＣＭＸ００１の添加は、非感染ＣＯＳ−７細胞の代謝活性（図１３）及びＤＮＡ複製（図１４）を濃度依存的様式で低下させた。無処置ＣＯＳ−７細胞と比較すると、０．０８から１０μＭへのＣＭＸ００１濃度の増加は、それぞれ代謝活性を３％から５２％へと、ＤＮＡ複製を８３％から１０％へと減少させた。０．６μＭにおいて、ＣＯＳ−７細胞は、代謝活性の１７％の中程度の減少、およそ５０％低下したＢｒｄＵ取り込みを示した。総合すると、ＣＭＸ００１は、より高濃度で宿主細胞の代謝活性及びＤＮＡ複製を有意に低下させた。ＣＭＸ００１濃度０．０８〜５μＭにおけるアストロサイト細胞を用いて類似の実験も行った。非感染アストロサイトにおけるＤＮＡ複製は、最高ＣＭＸ００１濃度で２５％〜９２％減少した（データ図示せず）。両方の細胞型のＤＮＡ複製のＣＭＸ００１関連阻害を比較すると、ＣＯＳ−７は僅かに感受性が低い（それぞれ８３％対９２％）と思われた。しかし、アストロサイト細胞に関して、アッセイの２時間の基質インキュベーション期間は、光学密度がＣＯＳ−７の読み取り値と比較して低かったため、最適ではないと思われる。これは、アストロサイト細胞の代謝が、ＣＯＳ−７細胞と比較して遅いという本出願人らの観察と一致する。
【０２２２】
（４）ＣＭＸ００１はＣＯＳ−７における細胞外ＪＣＶ負荷量に影響する
ＪＣＶ後代レベルにおけるＣＭＸ００１の経時的な効果を検査するため、処置及び無処置細胞の上清を表示時点で回収した。ｐ．ｉ．１日目における上清をインプットウイルスの測定値とした。無処置細胞において、細胞外ＪＣＶ負荷量は、７日間の観察期間にわたって３ｌｏｇを超えて増加した（１．２４×１０７対５．６７×１０１０ｇｅｑ／ｍｌ）。５μＭ  ＣＭＸ００１の存在下、ＪＣＶ負荷量において１ｌｏｇ未満の中程度の変化しか観察されない（１．３４×１０７対８．８５×１０７ｇｅｑ／ｍｌ）（図１５）。７ｄ．ｐ．ｉ．のＣＭＸ００１、５ｕＭ処置細胞に関するＪＣウイルス負荷量を３ｄ．ｐ．ｉ．の無処置細胞におけるウイルス後代と比較すると、ＣＭＸ００１処置細胞におけるウイルス負荷量は、僅か９１％に達する（９．７２×１０７対８．８５×１０７ｇｅｑ／ｍｌ）。ＣＭＸ００１処置ＣＯＳ−７細胞における後代の産生が遅延し得ることが結論された。
【０２２３】
（５）ＣＭＸ００１はＪＣＶ後期遺伝子発現を低下させる
後期遺伝子発現におけるＣＭＸ００１の効果を調べるため、ＪＣＶ  ＶＰ１の免疫蛍光染色を行った。７ｄ．ｐ．ｉ．において、比較として無処置ＣＯＳ−７細胞におけるＪＣＶ  ＶＰ１を染色した（図１６、上パネル）。１．２５μＭのＣＭＸ００１の添加は、ＪＣＶ  ＶＰ１シグナルの有意な低下に関連した（図１６、中央パネル）。５μＭの最高ＣＭＸ００１濃度において、基本的にＶＰ１陽性細胞は免疫蛍光によって観察できなかった（図１６、下パネル）。ＣＭＸ００１は、ＪＣＶ後期タンパク質発現を１．２５μＭ〜５μＭの間で有意に低下させたと結論された。
【０２２４】
（６）ＣＭＸ００１は、アストロサイト細胞における細胞外ＪＣＶ負荷量に影響する
ＪＣＶ後代レベルにおけるＣＭＸ００１の効果を経時的に検査するため、処置及び無処置細胞の上清を表示時点で回収した。インプットウイルスを決定するため、試料を１ｄ．ｐ．ｉ．にて採取した。無処置細胞の感染の過程において、細胞外ＪＣＶ負荷量は、７日間の期間にわたっておよそ１ｌｏｇ変化する（３．２２×１０７対２．３０×１０８ｇｅｑ／ｍｌ）。ＣＭＸ００１の存在下、１ｌｏｇ未満のＪＣＶ負荷量が観察された（１．３４×１０７対８．８５×１０７ｇｅｑ／ｍｌ）（図１７）。ＪＣＶ複製は、アストロサイト細胞においてＣＯＳ−７よりも有意に遅かったと結論された。低濃度のＣＭＸ００１が後代の産生を阻害する傾向にもかかわらず、７日間の観察期間ではＣＭＸ００１の阻害効果を測定できなかった。
【０２２５】
Ｃ  考察
予備段階の結果は、ＣＭＸ００１が、ＣＯＳ−７細胞におけるＪＣＶ複製を阻害することを示唆する。０．６μＭのＣＭＸ００１濃度は、細胞外ＪＣＶ負荷量をおよそ９０％低下させた。この濃度は、ＣＤＶ阻害において報告された濃度よりも２桁低いが、ＢＫＶに観察されたものと同じ範囲である。これにより、初代尿細管上皮細胞におけるＢＫＶ複製のＣＭＸ００１  ＩＣ−９０を０．３１μＭと決定した（３４）。ＣＭＸ００１が、宿主細胞の代謝活性を１７％、ＤＮＡ複製を約５０％減少させることが観察された。１から７ｄ．ｐ．ｉ．に細胞外ＪＣＶ負荷量を測定すると、最高濃度のＣＭＸ００１（５μＭ）で処置した細胞からのＪＣＶ負荷量は、１ｄ．ｐ．ｉ．のインプットウイルスよりも５ｄ．ｐ．ｉ．において僅かに高かっただけであり、４日以内に放出されたウイルスは殆どない又は全くないことを示す。７ｄ．ｐ．ｉにおいて、この濃度におけるＪＣＶ負荷量がごく僅かに増加し、後代ウイルスのレベルが、無処置細胞の３ｄ．ｐ．ｉ．に測定されたウイルス負荷量を下回った。アストロサイト細胞において、低濃度のＣＭＸ００１が、後代ウイルスの蓄積を遅延し得る傾向がある。しかし、無処置アストロサイト細胞の７ｄ．ｐ．ｉ．における非効率的な後代ウイルス産生は、ＪＣＶ複製サイクルが有意により遅いことを立証する。
【０２２６】
ＣＯＳ−７とアストロサイト細胞との間の差異は、ＪＣＶのより効率的な複製サイクルを支持するＳＶ４０ラージＴ抗原の発現等、ＣＯＳ−７細胞の形質転換された表現型に起因し得る。アストロサイト細胞において、これは相当に更に遅い。
【０２２７】
結論として、ＣＯＳ−７細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＪＣウイルス複製に対するＣＭＸ００１のＩＣ５０及びＩＣ９０値は、それぞれ０．１５及び０．６μＭであった。非感染ＣＯＳ−７細胞において、代謝活性及びＤＮＡ複製に対するＣＭＸ００１のＩＣ５０は、それぞれおよそ５及び０．６μＭであった。特に、これらの細胞は、ポリオーマウイルスＴ抗原を発現し、ＣＭＸ００１の効果に対し特異的に感受性となり得る。
【実施例６】
【０２２８】
［ＣＭＸ００１によるポリオーマウイルスＪＣ複製の阻害］
化合物：
Ｃｈｉｍｅｒｉｘ、Ｉｎｃ．によって提供された試験材料ＣＭＸ０２１（シドホビル）を４０ｍＭで水に可溶化し、ＣＭＸ００１をＤＭＳＯに２０ｍＭで可溶化した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルスアッセイのため、ＣＭＸ−０２１に対し１００μＭの高試験濃度及びＣＭＸ００１に対し５００ｎＭの高試験濃度を半ｌｏｇ（half-log）増分で段階希釈し、これを用いて試験材料を評価した。ＣＭＸ−０２１に関して、１０μＭに低めた高試験濃度を用いて第二のアッセイを行った。
【０２２９】
抗ＪＣポリオーマウイルスアッセイ：
［細胞調製］
抗ウイルスアッセイにおける使用前に、１５μｇ／ｍＬポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたＴ−７５フラスコ内のアストロサイト培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌカタログ＃１８０１；２％ＦＢＳ、アストロサイト増殖サプリメント及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した基本培地）において、ヒトアストロサイト（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌカタログ＃１８００）を継代した。血球計数器及びトリパンブルー色素排除試験を用いて全細胞及び生存率の定量化を行った。アッセイに利用する細胞の細胞生存率は、９５％より高かった。細胞を１ｍｌ当たり１×１０６細胞になるようポリ−Ｌ−リジンコーティングしたマイクロタイタープレートに１００μＬの容量でアストロサイト培地に再懸濁し、一晩３７℃で接着させた。
【０２３０】
［ウイルス調製］
アッセイに用いたウイルスは、ＡＴＣＣ（カタログ＃ＶＲ−１５８３）から入手したＪＣＶＭＡＤ−４であり、ストックウイルスプールの作製のためにＣＯＳ−７細胞においてこれを増殖させた。予め力価測定したウイルスアリコートをフリーザー（−８０℃）から取り出し、生物学的安全キャビネット内で徐々に室温へと解凍した。ウイルスを組織培養培地に再懸濁し、１００μＬ容量の各ウエルに添加したウイルスの量が感染７日後に定量的ＰＣＲによって最適化された量となるように希釈した。
【０２３１】
［プレート形式］
各プレートは、実験ウエル（薬物と細胞とウイルス）に加えて、細胞対照ウエル（細胞のみ）、ウイルス対照ウエル（細胞とウイルス）、薬物毒性ウエル（細胞と薬物のみ）、薬物比色対照ウエル（薬物のみ）を含有する。化合物毎に５通りの半ｌｏｇ希釈を用いて試料を３回反復して試験した。
【０２３２】
［毒性評価］
５％ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃のインキュベーションの後、試験プレートをテトラゾリウム色素ＸＴＴ（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−水酸化テトラゾリウム）で染色した。ＸＴＴ−テトラゾリウムは、代謝的に活性な細胞のミトコンドリア酵素によって可溶性ホルマザン生成物に代謝される。ＲＰＭＩ１６４０中の１ｍｇ／ｍＬストックとしてＸＴＴ溶液を毎日調製した。フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）溶液をＰＢＳ中に０．１５ｍｇ／ｍＬになるよう調製し、暗所で−２０℃にて保存した。ＸＴＴ溶液１ｍｌ当たり４０μＬのＰＭＳを添加することによって、ＸＴＴ／ＰＭＳストックを使用直前に調製した。５０マイクロリットルのＸＴＴ／ＰＭＳをプレートの各ウエルに添加し、プレートを４時間３７℃で再度インキュベートした。プレートを粘着プレートシーラーで封じ、穏やかに振盪又は数回反転して可溶性ホルマザン生成物を混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘプレートリーダーを用いてプレートを４５０／６５０ｎｍで分光光度的に読み取った。
【０２３３】
定量的ＰＣＲによるウイルス複製の測定：
ウイルスの力価測定の際に抽出したウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅により、定量標準として用いるためのＪＣウイルスＤＮＡ産物を作製した。簡単に言うと、ＴａｑＰｒｏ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＰＣＲミックス（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）並びにＤＮＡオリゴヌクレオチドＪＣＶ３８２７Ｆ（５’−ＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＣＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＡＣ−３’）及びＪＴ−２（５’−ＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴ−３’）を用いて、７日目の力価測定標本１００μｌから得られた５μｌのウイルスＤＮＡを増幅した。その結果得られた５３２塩基対の産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム及び試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、２６０ｎｍの吸光度に基づいて定量化した。自動ジデオキシ配列決定及びＮＣＢＩ非重複データベースに対するｂｌａｓｔ解析により、産物の配列をＪＣウイルスとして立証した。
【０２３４】
ＭａｇＭａｘ  ＡＩ／ＮＤウイルスＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、メーカーの推奨する手順に従って５０μＬの細胞培養上清からウイルスＤＮＡを抽出した。単離されたウイルスＤＮＡをキットに供給されている５０μＬの溶出バッファーに溶出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ配列検出システムにおいてＲＯＸ試薬を含むＳＹＢＲＧｒｅｅｎ−ＥＲ  ｑＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーＪＣＶ３８２７Ｆ及びＪＴ−２を用いたｑＰＣＲによって５μＬの抽出ＤＮＡを解析した。１×１０６コピー／μＬから１０コピー／μＬに及ぶ定量標準の段階的１０倍希釈液５マイクロリットル（５μＬ）を検量線を確立するための２回反復したｑＰＣＲ解析に付した（図１）。７９００ＨＴ配列検出システムで統合したＳＤＳ２．１ソフトウエアによって、検量線から標本毎のウイルスＤＮＡの量を推定した。結果を無処置ウイルス対照上清に存在するウイルスＤＮＡの相対パーセンテージとして表す。
【０２３５】
［データ解析］
Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ４．６ソフトウエアから生データを収集し、線形曲線適合計算による解析のためのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３表計算ソフトにインポートした。
【０２３６】
［結果］
抗ＪＣポリオーマウイルスの評価：２実験において、ヒトアストロサイトにおけるＪＣＶのＭＡＤ４株に対しＣＭＸ００１及びＣＭＸ０２１（ＣＤＶ）を評価した。２実験において、異なるロットの凍結アストロサイトを用いた。
【０２３７】
ＣＭＸ００１−０４４と並行してシドホビル（ＣＭＸ０２１−００９）を評価し、ヒトアストロサイトにおける３５８．５及び３．２の算出治療指数のため、ヒトアストロサイトにおける６８．１１及び１．８２μＭのＴＣ５０値により０．１９及び０．５７μＭのＥＣ５０値を得た。ヒトアストロサイトにおける１６．４及び５．５の算出治療指数のため、ヒトアストロサイトにおける１３４．４及び１６５．８μＭのＴＣ５０値によりＣＭＸ００１−０４４は、８．２１及び３０．３６ｎＭのＥＣ５０値を得た。
【０２３８】
［考察］
２ロットのヒトアストロサイトを用いてＩｍＱｕｅｓｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．によって標準化されたマイクロタイターｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイシステムを用いて、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）に対する抗ウイルス活性に関して２種の試料を評価した。化合物ＣＭＸ０２１−００９は、ＨＡ細胞においてＪＣＶＭＡＤ−４に対する抗ウイルス活性を立証し、これは独立したアッセイにおいて、類似のＥＣ５０値だが有意に異なるＴＣ５０値から得られた治療指数３５８．５及び３．２を得た。ＣＭＸ−００１−０４４は、異なるＨＡ細胞ロットのＪＣＶ感染から一貫した抗ウイルス活性を立証し、これは治療指数１６．４及び５．５を得た。
【実施例７】
【０２３９】
［ＥＢＶ関連頭蓋内移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）のヒト患者におけるＣＭＸ００１の使用］
第一の患者は、ＥＢＶ関連頭蓋内移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）を発症した鎌状赤血球貧血症の病歴を有する１１歳の患者である。血漿においてＥＢＶが陽性であり（２０１０年１２月７日及び１２月１４日）、脳生検はＰＴＬＤと一致した。１２月初旬に、患者は、３日間の持続性の頭痛、嘔気、嘔吐及び下痢の病歴を呈した。患者は入院し、発作活動の可能性のある重篤な頭痛の急性発作を起こした。脳のＣＴは、右前頭葉にリング状に増強された腫瘤を示し、脳生検はＥＢＶ関連ＰＴＬＤと一致した。患者はＰＩＣＵに入れられた。高い頭蓋内圧、無呼吸に関連する反復性発作のため、挿管（intubtion）及びＣＭＸ００１の緊急要請を行った。このＥＢＶ関連ＰＴＬＤ患者におけるＣＭＸ００１の使用は、２００９年１２月２６日から進行中である。患者は、ＣＭＸ００１に十分な耐容性を示し、４ｍｇ／ｋｇを１週間に２回の投与を継続した。彼女（患者）は、疾患の兆候及び症状に臨床上の改善を得、頭蓋内腫瘤の減少がなければ安定化を得た。血漿中のＥＢＶは、陰性を維持した。
【０２４０】
第二の患者は、ＥＢＶ関連ＰＴＬＤを発症した６月齢の心臓移植レシピエントであった。この患者は、手術後に原発性ＥＢＶ感染症となった。ＰＥＴスキャンは、ＰＴＬＤと一致する肝臓、肺及び骨（腸骨稜）における病変を示した。臨床状態は、ＣＳＦに検出されるＥＢＶ、臨床及びＥＥＧ相関の発作活動並びに精神状態の反応性及び変化の減少を呈すＥＢＶ関連脳炎と推定される症状により不安定化し続けた。ＣＭＸ００１が要求される時点において、患者は機械的人工呼吸に置かれ、肺炎及び肺のＰＴＬＤ両方のエビデンス並びに脳症発症の臨床判断基準を有する発作活動のエビデンスを有していた。彼（患者）は、ＣＭＸ００１の第一の用量、２０ｍｇ（およそ３．３ｍｇ／ｋｇ）の投与を２０１０年３月３日に、第二の用量の投与を２０１０年３月７日にＮＧチューブを介して受けた。患者は、２６７，３３８コピー／ｍＬ（２０１０年３月３日）から４７，４２７（２０１０年３月７日）へとＥＢＶウイルス負荷量が有意に減退した。患者は、進行性神経傷害のエビデンスを示し続けた。両親は、ＣＭＸ００１第二の用量投与の翌日にサポートを中止した。
【０２４１】
［臨床試験］
【実施例８】
【０２４２】
最初の試験は、健常な志願者においてＣＭＸ００１の安全性及び薬物動態を評価するために行った。本試験は、単一用量群（ＳＤ）及び複数回用量群（ＭＤ）からなる。単一用量群において、６対象７コホートを処置した（４対象は活性薬物投与、２対象はプラセボ）。登録を２対象（１活性、１プラセボ）、続いて４対象（Ａ及びＢ群）として調整した。７５ｋｇの対象の処置のための２種の最高用量の推定単一用量は、４０ｍｇ（０．６ｍｇ／ｋｇ、コホート６）及び７０ｍｇ（１ｍｇ／ｋｇ、コホート７）であった。複数回用量群において、コホート６ＭＤは、０、６及び１２日目に０．１ｍｇ／ｋｇの投与を受け、コホート７ＭＤは、０、６及び１２日目に０．２ｍｇ／ｋｇの投与を受けた。試験過程における対象の血中及び尿中シドホビル、ＣＭＸ００１及びＣＭＸ０６４（主要代謝産物）のレベルを測定した。対象の消化管（ＧＩ）モニタリングは、（ａ）ＧＩ有害事象の臨床兆候のモニタリング、（ｂ）視覚的アナログ尺度（visual Analog Scale）を用いた臨床症状のモニタリング、（ｃ）食欲減退／食欲不振、嘔気、嘔吐、下痢、便秘及び腸内ガス／膨満感のモニタリング、（ｄ）便潜血、血清電解質、尿比重、ＢＵＮ／クレアチニン比、血清アルブミン及び脂質の実験室における試験並びに（ｅ）診断検査（ワイヤレスカプセル内視鏡検査（ＰｉｌｌＣａｍ（登録商標）、Ｇｉｖｅｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ））を含んだ。
【０２４３】
コホート６（６００μｇ／ｋｇ）の試験が完了すると（依然として盲検）、次のことが観察された。
薬物に起因し得る投与後の臨床上有意な消化管カプセル内視鏡検査による知見なし。
腎機能不全を示す値等、臨床検査値への薬物に関連する臨床上有意な変化なし。
重大な有害事象（ＳＡＥ）なし、有意な有害事象（ＡＥ）（即ち、≧グレード２）なし、薬物に直接的に起因し得るＡＥなし。
【０２４４】
単一用量投与後のＣＭＸ００１の血漿濃度曲線を図１８に示し、ＣＭＸ００１の単一用量後のシドホビルの血漿濃度曲線を図１９に示す。
【０２４５】
表４は、マウス、ウサギ及びヒトにおけるＣＭＸ００１とＣＭＸ０２１及びＣＭＸ０６４とのＰＫ比較を説明する。
【表７】
2013509433.tif 000049
【実施例９】
【０２４６】
様々なＪＣウイルス感染症及びＪＣウイルスに関連する疾患の患者において試験を行った。下記の表５（ａ）に試験の詳細をまとめる。これらの患者をＣＭＸ００１で処置した後、患者は有意な改善を示した。
【表８】
2013509433.tif 000050
【実施例１０】
【０２４７】
様々なウイルス感染症及びウイルスに関連する疾患の患者において更なる試験を行った。試験の詳細を下記の表５にまとめる。
【０２４８】
表５（ｂ）に示す通り、他の抗ウイルス剤、例えばシドホビルで以前に処置した全患者を示す。しかし、患者（patent）はこれらの薬物に十分に応答していない。これらの患者をＣＭＸ００１で処置した後、患者は有意な改善を示す。
【表９Ａ】
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【表９Ｂ】
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【実施例１１】
【０２４９】
［ＣＭＸ００１及びアデノウイルス感染症］
アデノウイルス感染症は、免疫低下患者における重篤な罹患率及び死亡率の原因となる。現在、米国においてアデノウイルス感染症処置のためのＦＤＡに認可された治療法は存在せず、様々な抗ウイルス剤又はＩＶＩＧ若しくはドナーリンパ細胞注入等の免疫療法に関して逸話的な適応外使用しか記載されていない。これら薬剤の多くの使用は、毒性があり効力のエビデンスが殆どないことによって限定されている。本出願人らは、小児骨髄移植レシピエントにおける重篤な播種性アデノウイルス感染症の症例の処置における新規の抗ウイルス剤としてのＣＭＸ００１の使用の成功を報告する。移植片対宿主疾患による重篤なＧＩ機能不全の存在下における経口投与及び結腸のウイルス感染を立証した生検にもかかわらず、患者は、薬物吸収と、その後の処置に対する臨床及びウイルス学的（ウイルス負荷量の８ｌｏｇ減少）反応を立証した。
【０２５０】
感染症は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の罹患率及び死亡率の主要な原因である。細菌及び真菌感染症の処置に利用できる薬剤の増大並びにリンパ細胞標的前処置、幹細胞源としての臍帯血及びＴ細胞除去同種移植片の使用等、ＨＳＣＴに対するアプローチの変化のため、この分野における主要な課題の一つとしてウイルス感染症が出現している。ＰＣＲによる高感度モニタリング及び有効な抗ウイルス剤の予防的使用を用いたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）再活性化の管理は、ＣＭＶ疾患の発生率を低下させた。しかし、アデノウイルス等、他のウイルス病原体は、一部には有効な薬剤がないため、依然として罹患率及び死亡率の主要な原因であり続けた。ビスタイド（登録商標）（シドホビル注射）は、アデノウイルス感染症の処置に用いられるが、腎毒性を起こす可能性があるため、その臨床有用性は限定的である。
【０２５１】
ＣＭＸ００１は、ヌクレオシドアナログ、シドホビルの経口利用できる脂質コンジュゲートである。脂質コンジュゲートは、経口投与を可能にし、ＣＭＸ００１の細胞への急速な取り込みを可能にし、そこで開裂されて、その結果生じたシドホビルはリン酸化されて活性抗ウイルス剤となる。ＣＭＸ００１は、広範囲の活性を有し、オルソポックスウイルス［痘瘡、サル痘（ＭＰＸＶ）、ワクシニア（ＶＡＣＶ）、牛痘（ＣＰＸＶ）及びエクトロメリア（ＥＣＴＶ）ウイルス］、ヘルペスウイルス［サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー（ＥＢＶ）並びにヒトヘルペス（ＨＨＶ−６及びＨＨＶ−８）ウイルス］、アデノウイルス（ＡｄＶ）、ポリオーマウイルス［ＢＫウイルス］並びにパピローマウイルス等、二本鎖ＤＮＡウイルスの全５ファミリーに対し有効である。アデノウイルスに対するＣＭＸ００１の抗ウイルス活性は、細胞培養系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、また動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで特性評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ＣＭＸ００１がアデノウイルスの複数の血清型に対し有効であることを立証した。血清型の大部分は、ＥＣ５０＜５０ｎＭを有するが、例外としてＡｄＶ３１（０．２８μＭのＥＣ５０）がある。シドホビルと比較すると、ＣＭＸ００１は、ＡｄＶ３、５、７及び８型に対し３３〜２００倍強力であり、ＡｄＶ３１に対し５倍活性がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＣＭＸ００１は、肝臓壊死を伴う重篤な全身性疾患によって特徴付けられる免疫低下したＡｄＶ５シリアンハムスターモデルにおけるアデノウイルスに対し非常に有効であった。ＣＭＸ００１（２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）は、感染２日後に投与された場合、ＡｄＶ５感染したハムスターにおける死亡率を抑制した。肝臓における感染性ＡｄＶ５の力価は、感染７日後までに大部分の動物において６ｌｏｇからほぼ検出不能レベルへと低下した。本明細書において、本出願人らは、シドホビルに対して応答しなかった後、重篤に免疫低下した小児レシピエントにおいてＣＭＸ００１により播種性アデノウイルスの根絶に成功した第一の症例を報告する。
【０２５２】
［臨床経過］
重篤な再生不良性貧血の１２歳女児は、アレムツズマブ／フルダラビン／メルファラン前処置の後、９／１０ＨＬＡ適合（Ｂがアレル不適合）同種骨髄移植を受けた。シクロスポリンＡ、メトトレキサート及び抗胸腺細胞グロブリンによる予防にもかかわらず、彼女は腸及び皮膚のグレード４移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を発症し、これは高用量ステロイド及びモノクローナル抗体に対し抵抗性であった。彼女はその後、救済使用実験プロトコールにより間葉系幹細胞の投与を受け、経腸栄養に耐容性を示すように徐々に改善した。彼女は、市販の検証されたアッセイ（Ｖｉｒａｃｏｒ）を用いた定量的血漿アデノウイルスＤＮＡ  ＰＣＲ解析値の上昇を伴いつつ反復性の下痢を発症した。結腸生検及び便培養によりアデノウイルス腸炎が確認され、肺標本も培養され疾患経過後期において陽性であった。免疫抑制（タクロリムス、ミコフェノール酸塩及びプレドニゾン）の漸減及びＩＶシドホビル１ｍｇ／ｋｇ、１週間に３回による処置にもかかわらず、血漿アデノウイルス血症は、６億８０００万コピー／ｍｌに増加した。シドホビルを５ｍｇ／ｋｇ、１週間に１回に増加し、静脈内免疫グロブリンを投与したにもかかわらず、彼女の臨床状態は、重篤な消化管（ＧＩ）出血、肝炎及び最終的な呼吸不全を発症して悪化した。
【０２５３】
彼女の腎機能は、ビスタイド（登録商標）投与の間に悪化し、最終的に静静脈血液透析を必要とした。この設定における播種性アデノウイルス感染症に対し極度に低い予後を仮定すると、ＩＲＢ承認及び親への適切なインフォームドコンセントの後、ＦＤＡに認可された緊急用新薬治験開始申請（Emergency Investigational New Drug Application）（ＥＩＮＤ）に従ってＣＭＸ００１を投与した。ＣＭＸ００１による処置の時点において、患者は挿管して鎮静させられ、代謝性アシドーシス及び１．６〜１．９の間のクレアチニンレベルの腎機能不全症であった。患者は、濃縮ＲＢＣ及び血小板の毎日の輸注を必要とする間断のない消化管出血をしていた。ＣＭＸ００１は、２ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回の用量で開始し、処置開始後、顕著な血漿アデノウイルス負荷量の迅速且つ継続的な低下を伴った（図２０）。ＣＭＸ００１療法の最初の５週間の間に、輸注必要量は劇的に減少し、腎機能及び肝機能は改善され、患者を抜管し、ウイルス負荷量が検出不能となった。８週間以内に血液透析を中断し、患者をＩＣＵから移し、ＧＩ出血及び腎機能障害が回復した。患者は、処置コースを通じて３００未満の持続性リンパ球絶対数（ＡＬＣ）を有していた。ＡＬＣは正常範囲をはるかに下回り続けたという事実にもかかわらず、ウイルス負荷量は治療において顕著な低下を示した。その後、ウイルス負荷量が検出不能近くまで減少した後にＡＬＣは回復した。ＡｄＶウイルス血症並びに疾患の臨床兆候及び症状の回復後、患者は、ＣＭＸ００１投与を１週間に３ｍｇ／ｋｇの用量で維持した。ＣＭＸ００１は十分に耐容性であり、薬物の関係する重大な有害事象は観察されなかった。
【０２５４】
［ＣＭＸ００１投与及び薬物動態］
当初、患者は、重篤なＧＩ出血のため持続的鼻腔胃（ＮＧ）吸引を必要とし、よって、耐容性を示す限り（一般に、１〜３時間）吸引を中断しつつＮＧチューブを介してＣＭＸ００１を投与した。検証された分析手法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いてＣＭＸ００１及びシドホビル濃度を解析するため、患者の処置コースを通じて定期的な間隔で血漿試料を得た。興味深いことに、ＡｄＶウイルス血症は、処置の最初の５週間（約１０回目の用量の間）に、ＣＭＸ００１の推定血漿曝露よりも低いにもかかわらず回復した（図２０、挿入図）。吸収と最終的なＣＭＸ００１への全身性曝露における患者ＧＩ出血及び鼻腔胃吸引の使用の潜在的な影響は不確実であるが、患者のＧＩ出血が回復し、ＣＭＸ００１のより高い全身性曝露が観察されたため、曝露を減少させた可能性がある。先行するビスタイド（登録商標）投与から残存シドホビルを除去した後、ＣＭＸ００１に由来するシドホビルの最大血漿濃度は、８０ｎｇ／ｍＬを超えなかった。それに対し、ビスタイド（５ｍｇ／ｋｇ、プロベネシド含有）投与後のシドホビルのピーク血漿濃度は、１９，６００ｎｇ／ｍＬ（ビスタイド（登録商標）添付文書）の範囲である。
【０２５５】
播種性アデノウイルスは、ＨＳＣＴの重大で多くの場合致死的な合併症である。臨床症状は、呼吸疾患、肝炎、腎炎、膀胱炎、出血性大腸炎及び腸炎等の消化管疾患、脳炎並びに多臓器不全を含む。疾患のリスク因子は、幼齢、同種移植、Ｔ細胞除去前処置療法、非血縁又はＨＬＡ不適合移植片、リンパ球減少症及びＧｖＨＤを含む。播種性アデノウイルス疾患の患者において予想される死亡率は、関与する臓器系に応じて最大８０％である。現在、アデノウイルス感染症のためにＦＤＡに認可された治療法はない。多くの場合シドホビルはこの設定に用いられるが、ウイルスの病原性、可変的な薬物動態／力学及び延長したシドホビル療法に不可避な毒性のため、効力は十分には確立されなかった。よって、ＨＳＣＴ後にアデノウイルスを処置するための新しい薬剤が明らかに必要とされる。更に、高感度ＰＣＲに基づくモニタリングの有効性は、モニターする機会及び先制療法によるアプローチを利用する播種性アデノウイルス感染症を予防する可能性を提供する。この患者集団におけるＣＭＶ感染症と同様に、毒性の低い薬剤、特にバイオアベイラビリティの優れた経口薬剤が同定されたため、先制療法がより実用的且つ有効となる可能性がある。この極度に高リスクの患者は、間葉系幹細胞注入及び継続的免疫抑制と組み合わせて、ＣＭＸ００１による処置に対し完全寛解を呈した。血漿解析は最初、おそらく広範なＧＩ疾患により、予想濃度よりも低いＣＭＸ００１を立証したが、完全なウイルス学的及び臨床的反応が観察され、ＧＩ疾患が回復するにつれ血漿濃度は増加した。この患者において同様に注目すべきは、ＣＭＸ００１による処置を受ける間の腎機能の改善であり、これはＣＭＸ００１に関連する腎毒性のエビデンスを明らかにしなかった動物及びヒトのデータと一致した。これは、ビスタイドと比較してＣＭＸ００１の投与の後に観察されたシドホビルの大幅に低いピーク血漿濃度のためと思われる。この患者において、シドホビルのピーク濃度は、５ｍｇ／ｋｇビスタイド（登録商標）の投与ラベルに報告された濃度よりも１００倍超低かった。血漿中シドホビルは、ＣＭＸ００１の効力と関連性があるとは考えられず、むしろ、除去産物であると推定される。従って、低血漿濃度のシドホビルは、効力に関連性のない腎毒性の可能性を低下するＣＭＸ００１の望ましい形質である。
【実施例１２】
【０２５６】
［免疫低下患者におけるＣＭＸ００１及びアデノウイルス感染症］
免疫低下患者におけるアデノウイルス（ＡｄＶ）感染症の有病率は増加しており、現在同種ＢＭＴレシピエントの８．５％〜３０％、特に、重篤な移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）及び＜３００細胞／ｍｍ３のリンパ球絶対数（ＡＬＣ）の患者で発生している。死亡率は、７０％もの高さである。シドホビル（ＣＤＶ）は、前向き又は対照治験からの支持的データなしでＡｄＶ疾患の処置に用いられる。ＣＤＶは、有意な腎毒性及び不定期の好中球減少症に関連する。ＡｄＶ感染症のための確定的処置として確立された治療薬はない。シドホビルの脂質コンジュゲートであるＣＭＸ００１は、細胞によって取り込まれ、細胞内で開裂されて遊離型ＣＤＶを生じ、これは、リン酸化されて活性抗ウイルス剤、シドホビル二リン酸塩（ＣＤＶ−ＰＰ）を生成する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＣＭＸ００１は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、等モルのＣＤＶよりも更に高い細胞内レベルのＣＤＶ−ＰＰを生じる。このことは、下記の表６に示すアデノウイルスに対する効力の増加を説明する。静脈内に投与する必要のあるＣＤＶとは異なり、ＣＭＸ００１は、経口投与される。また、ＣＭＸ００１は、おそらく腎有機アニオン輸送体がＣＭＸ００１を認識できないため、腎毒性の可能性が低い。
【表１０】
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【０２５７】
方法
ＡｄＶ処置のためにＣＭＸ００１の緊急用新薬治験承認を与えられた患者の記録を遡及的に解析した。ＣＭＸ００１で処置した１６名のＡｄＶ疾患患者のうち、１３名が、ＣＭＸ００１開始後≧４週間の利用できるデータを有していた。ＣＭＸ００１の用量は、およそ１ｍｇ／ｋｇを１週間に１回から４ｍｇ／ｋｇを１週間に２回までの範囲であった。ＶｉｒｅＣｏｒ（９症例）、Ｆｏｃｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（２）及びワシントン大学分子ウイルス学研究室（Molecular Virology Laboratory）（２）においてアデノウイルスｑＰＣＲを行った。播種性ＡｄＶ疾患は、血液等、２以上の部位からのウイルスの単離によって定義した。ＣＭＸ００１処置の最後に、ウイルス学的反応（ＶＲ）は、血漿ＶＬにおけるベースラインからの≧９９％下落又は検出不能な血漿ウイルスのいずれかとして定義した。ウィルコクソン符号順位検定を用いて、ベースラインから１、２、４、６及び８週目にＶＬが変化したか否か評価した。ロジスティック回帰分析モデルを用いて、共変数とＶＲの間の関連性の可能性を評価した。
【表１１】
2013509433.tif 000054
【０２５８】
［結果］
［ベースライン］
群の年齢中央値は、１２歳（範囲０．９２〜６６）であった。男性５名及び女性８名、小児患者８名及び成人５名であった。１名の患者は重篤な複合免疫不全症であり、１名は実質臓器移植レシピエントであり、１１名は造血細胞移植レシピエント（そのうち１０名はＧＶＨＤ）であった。１３名の患者全員が、≧１の追加的な部位からＡｄＶが単離されたウイルス血症であった。ＧＩ  ７（５３．８％）；ＧＵ  ４（３０．８％）；肺３（２３．１％）；脳１（３．８５％）；及び骨髄１（３．８５％）。移植後、中央値６８（１５〜７２０）日で疾患を診断した。診断におけるＡＬＣ中央値は、３００細胞／μＬ（範囲５０〜１５００）であった。全患者は、前ＣＤＶ投与を受け、ＡｄＶ感染症不応性又は腎毒性のため中央値２１（範囲７〜９０）日後にＣＭＸ００１に切り替えた。患者を中央値６８（範囲１５〜２０８）日間ＣＭＸ００１で処置した。
【０２５９】
［治療終了］
ベースラインと比較した１、２、４、６及び８週目のＡＬＣ及びＶＬの関係性を図２１ａ〜２１ｅに示す。ＶＲは、年齢、性別、投与されたＣＭＸ００１の合計ｍｇ数、ＣＭＸ００１のＡＵＣ又はＣｍａｘに関連しなかった。ＣＭＸ００１のＶＬにおける薬力学的効果を表７に示す。ＶＲは、１３名の患者のうち８名（６１．５％）で達成された。重大な有害事象、消化管、腎又は骨髄毒性は、報告されなかった。ＣＭＸ００１は、アデノウイルスに対して強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有しており、免疫低下患者におけるアデノウイルス疾患の処置に対し将来的なオプションとなり得る。この重篤疾患の集団においてＣＭＸ００１で有意な安全性問題は生じなかった。
【実施例１３】
【０２６０】
幹細胞移植患者におけるサイトメガロウイルス感染症のためのＣＭＸ００１
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症は、幹細胞移植設定における有意な罹患率及び死亡率に関連する。シドホビルの脂質コンジュゲートであるＣＭＸ００１は、経口により投与され、血漿中を脂質コンジュゲートとして循環する。これは標的細胞により効率的に取り込まれ、細胞内で高濃度の活性抗ウイルスが達成される。ＣＭＸ００１の投与を受けた、ＣＭＶに感染した幹細胞移植患者における第一の臨床経験を説明する。患者は、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病、３患者）、不応性リンパ腫、多発性骨髄腫、重篤な再生不良性貧血及び鎌状赤血球貧血の病歴を有した。７名の患者のうち６名は、幹細胞移植（ＳＣＴ）を受け、残り１名はＳＣＴを待っていた。ＣＭＸ００１による処置は、１名の患者において移植前に開始し、６名の患者においては２１日間から２年間超（中央値６１日間）であった。
【０２６１】
他の妥当な治療オプションがないため緊急用ＩＮＤの定めるところに従って処置したＣＭＶウイルス血症の７名の患者を処置した。７名の患者全員、従来の抗ウイルス療法が奏功しなかった。全患者がガンシクロビル及び／又はバルガンシクロビルの投与を受け、６名はホスカルネットの投与を受け、４名はＣＭＶ  ＩＧの投与を受けた。これらの患者におけるＣＭＸ００１の用量は、８０ｍｇ〜３００ｍｇ（およそ２〜４ｍｇ／ｋｇ）の範囲であった。追跡調査データは、全患者で少なくとも４週間分利用できる。ウイルス学的反応は、ウイルス負荷量（ＶＬ）の９０％を超える低下（１ｌｏｇ１０）として定義され、完全寛解は、検出不能なウイルス負荷量として定義された。
【０２６２】
処置した男性４名及び女性３名は、年齢中央値が５５歳（範囲１１〜６９歳）であった。患者を中央値８８日間（範囲２９〜１３１日間）ＣＭＸ００１で処置した。ＶＬの中央値低下は、４週目に１．２ｌｏｇ１０を超えた。ＣＭＶポリメラーゼＵＬ５４遺伝子に変異を持たない患者の３／５（６０％）で完全寛解が観察され、２／５は、ＰＣＲによるＣＭＶ低下が平均して１．２ｌｏｇ１０であった。ＵＬ５４に関連変異（Ｌ５０１Ｆ及びＡ９８７Ｇ）を有する２名の患者のどちらも、最終時点においてウイルス血症が１ｌｏｇ低下していなかった。
【０２６３】
２名の患者は、既存の腎機能不全症であった。腎臓機能に基づく用量調整は必要なかった。これは、腎毒性があることが公知であるシドホビルによる処置とは対照的である。ＣＭＸ００１による処置の間に、１名の患者はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ結腸炎を経験し、１名は移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）及び敗血症と共に汎血球減少症を経験し、発作障害の１名は発作を経験し、１名は重篤なＧＶＨＤを経験した。重大な有害事象の傾向は観察されなかった。
【実施例１４】
【０２６４】
［ヒトサイトメガロウイルス感染症の処置のためのＣＭＸ００１及びガンシクロビル併用療法］
ＣＭＸ００１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の複製を阻害することが以前に報告された。ＣＭＸ００１は、一リン酸塩アナログであるため、ＨＣＭＶ  ＵＬ９７キナーゼによる最初のリン酸化を必要としない。従って、これは、多くのガンシクロビル（ＧＣＶ）耐性株に対し非常に活性が高く、耐性ウイルス感染症の処置に有用となる筈である。本出願人らは、ＧＣＶと組み合わせたＣＭＸ００１のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ウイルス活性を調べて、この組み合わせの効力及び安全性を評価した。ヒト包皮線維芽細胞を感染多重度０．０１ＰＦＵ／細胞でＨＣＭＶに感染させ、非感染又は感染細胞のいずれかに段階濃度のＣＭＸ００１及びＧＣＶ単独又は組み合わせを添加した。７日間のインキュベーション後に全ＤＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲによりウイルスＤＮＡのコピー数を決定した。予想通り、ＣＭＸ００１は、ＨＣＭＶに対し非常に活性が高く、ウイルスＤＮＡの量を１ナノモル濃度未満の濃度で１０倍、１０ナノモル濃度で１０００倍低下させた。ＧＣＶの効力は、比較的中程度であり、１０μＭでウイルスＤＮＡの蓄積を１０倍未満低下させた。ＣＭＸ００１及びＧＣＶの組み合わせは、３ピコモル濃度の低濃度のＣＭＸ００１がＧＣＶに添加された場合相乗的であった。試験したいずれの濃度に関しても細胞毒性における有意な変化は観察されず、これにより、この組み合わせに毒性がないことを確認した。これらのアッセイにおいて観察されたＣＭＸ００１の例外的な効力は、全ウイルス転写産物のレベルを決定した定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに基づくアレイにおいて確認された。ウイルス転写産物レベルの低下は、ゲノムコピー数の低下と一致し、ＧＣＶに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウイルス複製の顕著な阻害を反映した。これらの結果は、最適以下の濃度のＣＭＸ００１とＧＣＶを用いた組み合わせが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて相乗的であることを明らかに示す。
【０２６５】
ガンシクロビル（ＧＣＶ）による先制及び予防的療法は、ＨＣＭＶに感染した免疫低下個体にある程度の臨床的有用性をもたらすと思われるが、この集団において薬物耐性が頻繁に生じ、ＧＣＶ療法しているにもかかわらず起こるウイルス複製のレベルに関係すると思われる（Ｇｉｌｂｅｒｔら、２００２）。ＰＦＡ及びＣＤＶは、耐性感染症の処置に利用できるが、それらの関連する腎毒性により有用性が限定されている（Ｔｏｒｒｅｓ−Ｍａｄｒｉｚ  ａｎｄ  Ｂｏｕｃｈｅｒ  ２００８）。
【０２６６】
ヘキサデシルオキシプロピル−ＣＤＶ（ＣＭＸ００１）等、ヌクレオシドアナログエステルのアルコキシアルキル及びアルキルエステルも、このウイルスに対し非常に高い活性を示しており、ウイルスの薬物耐性分離株に対し有効である（Ｗａｎら、２００５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ａｚｉｚら、２００５）。この化合物は、ＨＣＭＶに対するＣＤＶの効力よりも千倍高い、ＨＣＭＶに対し優れた抗ウイルス効力を提示する。これはまた、アデノウイルス等、他のＤＮＡウイルスに対する効力を非常に改善した（Ｈａｒｔｌｉｎｅら、２００５）。この化合物の広範囲の抗ウイルス活性は、これが、多くの場合複数のウイルスに感染する移植レシピエントの治療法において有用となり得ることを示唆する。
【０２６７】
本出願人らは、この薬物に対し耐性を有する患者において用いられる可能性があるため、本化合物のＧＣＶと組み合わせたＨＣＭＶに対する効力及び細胞毒性を評価した。
【０２６８】
［ＣＭＸ００１及びＧＣＶによる組み合わせ試験］
以前に記載した方法（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ、１９９０）と同様の方法により、複合効力を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗ウイルスアッセイを用いてＣＭＸ００１及びＧＣＶの組み合わせを評価した。簡単に言うと、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞単層を含有する９６ウエルプレート内に直接的にＢｉｏＭｅｋ２０００を用いて、薬物希釈液のチェッカーボードマトリックス（checkerboard matrix）を用意した。０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）にて４複製プレートを感染させ、７日間インキュベートし、リアルタイムＰＣＲによってウイルス負荷量を定量化した。２複製プレートは非感染のままであり、７日目にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて細胞毒性を評価した。
【０２６９】
［定量的ＰＣＲアッセイ］
０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＨＣＭＶのＡＤ１６９株に感染させた９６ウエルプレート内のＨＦＦ細胞単層において、ウイルスＤＮＡ合成の阻害を決定した。感染させた単層に化合物希釈液を添加し、これを７日間インキュベートした。９６ウエルＷｉｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイプレートからＤＮＡを単離し、プライマー５’−ＡＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＧＣＡＡＧＡ−３’及び５’−ＣＧＧＣＡＡＴＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡ−３’並びにプローブ５’−（６ＦＡＭ）ＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＧＣＴＡＭＲＡ−３’を用いたリアルタイムＰＣＲにより定量化した。増幅断片と相同の配列を含有するプラスミドＤＮＡ（ｐＭＰ２１７）の希釈による検量線を用いて、ウイルスコピー数の絶対量測定を行った。
【０２７０】
［ＨＣＭＶリアルタイムアレイ］
ＨＣＭＶ遺伝子発現の網羅的解析を可能にするリアルタイムアレイを開発した。この技法は、リアルタイムＰＣＲにより１３９種のウイルス遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量化する。ウイルス遺伝子のプライマー並びに実験データの正規化及びΔΔＣｔ法によるウイルス転写産物の定量化に用いられる２種の細胞ハウスキーピング遺伝子を含有する２種のアッセイプレートにおいて解析を行った。
【０２７１】
初代肺線維芽細胞（ＨＥＬ２９９、ＡＴＣＣ）の単層を６ウエルプレート内に用意し、感染に先立ち３日間インキュベートした。次に、ＨＣＭＶのＡＤ１６９株（ＨＢ５  ＢＡＣ株として）に１．０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで細胞単層を感染させた。１時間の吸着期間の後、３回複製したウエルに化合物を添加した。これらの試験に用いた濃度は次の通りである。ＣＤＶ  ５０μＭ、ＧＣＶ  １５μＭ及びＣＭＸ００１  ０．５μＭ。３回複製したウエルから全ＲＮＡを回収し、Ｒｎｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅにより残存ＤＮＡを分解した。ＭｕＬＶ逆転写酵素及びオリゴｄＴによりｃＤＮＡを調製した。３回複製ウエルから得られたウイルスｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにより定量化した。データをハウスキーピング遺伝子に対し正規化し、ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．０５）により統計学的に有意な変化を決定した。
【０２７２】
［薬物組み合わせ試験］
本出願人らの研究室で行われた以前の試験は、ヘルペスウイルス及びオルソポックスウイルスに対するＣＭＸ００１の効力を立証した。ＧＣＶに耐性のある分離株等、ＨＣＭＶに対する特に優れた効力は、化合物が、耐性感染症の処置において有用となり得ることを示唆した。ＣＭＸ００１及びＧＣＶの組み合わせを評価して、ＨＣＭＶに対するそれらの複合効力を評価した。複合細胞毒性の評価を同時に行ったところ、相乗的な細胞毒性は観察されなかった（データ含まれず）。ＣＭＸ００１及びＧＣＶの両方は、ウイルスＤＮＡ蓄積の低下に有効であった（図２２）。リアルタイムＰＣＲによって測定された通り、ＣＭＸ００１は、より強力なウイルス複製阻害剤である。１０ｎＭを超えるＣＭＸ００１の濃度は、ウイルスＤＮＡの増幅を基本的に除去し、これはインプットＤＮＡレベルを維持、或いはそれを下回った。
【０２７３】
以前に報告された方法（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ、１９９０）によってＣＭＸ００１及びＧＣＶの組み合わせの効力を評価及び解析した。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウエアは、次のウエブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕ／Ｐｅｄｓ／６９０１１／からフリーダウンロードが可能である。相互作用の解析は、この組み合わせがウイルスＤＮＡの蓄積を相乗的に阻害したことを示した（図２３）。相乗作用の量は比較的低かったが（２．２ｌｏｇ１０ｇｅ／ｍｌ）、このことは、どちらの化合物もＤＮＡポリメラーゼを阻害することから予想されていた。
【０２７４】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞毒性も同時的に評価した。両方の薬剤の組み合わせは十分に耐容性であり、相乗的細胞毒性を生じなかった（図２４）。
【０２７５】
ＣＭＸ００１及びＧＣＶは、多くのＨＣＭＶオープンリーディングフレームの発現を低下させた
この化合物で処置した培養物におけるウイルス遺伝子の転写プロファイルを検査することによって、ＣＭＸ００１による特に優れたウイルスＤＮＡ合成阻害を更に調べた（図２５）。異なる作用機序による化合物への反応は、異なる転写プロファイルを生じる。
【０２７６】
ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．０５）によってｍＲＮＡレベルの統計学的に有意な低下を同定した。多くのウイルス転写産物レベルの有意な低下が、ＧＣＶ、ＣＤＶ及びＣＭＸ００１に応答して観察された。これは初期及び後期ウイルス遺伝子の両方を含んでおり、これは予想外のことであった。一般的な阻害パターンは、これら３種のＤＮＡ合成阻害剤で類似しており、このパターンが、この作用機序を有する薬物の特徴であることを示唆した。
【０２７７】
ＣＭＸ００１による強力なＤＮＡ蓄積阻害は、影響を受けるウイルス転写産物の数を増加させないと思われたが、転写産物量のより大幅の低下をもたらした。ＣＤＶ及びＣＭＸに応答したウイルス転写産物の低下は、十分に相関した（図２６）。
【０２７８】
３種のＤＮＡ合成阻害剤によって誘導された転写プロファイルは類似しており、この作用機序の特徴であると思われる。ＣＤＶ及びＣＭＸ００１（ＣＤＶのプロドラッグ）に関連するＣｔ値の変化は、十分に相関した。これらの反応は、ＧＣＶに観察されたものとも十分に相関し、この転写プロファイルが、ウイルスＤＮＡ合成阻害剤に関連することを示唆する。
【０２７９】
ＣＭＸ００１は、ＨＣＭＶ複製の非常に強力な阻害剤であり、ウイルスＤＮＡ合成の蓄積を少なくとも３桁低下させることができる。ＣＭＸ００１及びＧＣＶの組み合わせは、ウイルス複製を相乗的に阻害し、更なるｉｎ  ｖｉｖｏ試験が保証されることを示唆する。相乗的細胞毒性は観察されなかった。ＣＭＸ００１によって誘導された転写の変化は、ＣＤＶ及びＧＣＶによって誘導された変化に酷似しており、これは、このウイルスＤＮＡ合成阻害剤に対し予測されるものであろう。ＣＭＸ００１によって誘導されたゲノムコピー数の大幅な減少は、影響を受ける転写産物の数を変化させると思われるが、むしろ、その蓄積減少の程度に影響する。
【実施例１５】
【０２８０】
単純ヘルペスウイルス感染症の処置のためのＣＭＸ００１及びアシクロビル併用療法
以前の試験は、ＣＭＸ００１又はアシクロビル（ＡＣＶ）のいずれかが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）分離株に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、また、ＨＳＶ−１又は２に鼻腔内感染したマウスの死亡率抑制において有効であることを示した。組み合わせたこれら２種の薬剤の最適以下の用量を用いた効力の評価は、これまでに報告されていない。細胞培養において、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の野生型及びＡＣＶ耐性分離株の両方のパネルに対してＣＭＸ００１を評価し、０．００８〜０．０３μＭの範囲のＥＣ５０値で非常に有効であることが判明した。これらのウイルス分離株は、２．０から＞１００μＭの範囲のＡＣＶ濃度によっても阻害する。組織培養細胞における様々な濃度のＣＭＸ００１及びＡＣＶの組み合わせの使用は、毒性を増加させず相乗的効力を生じた。この組み合わせが動物モデルにおいて増強された効力を生じるかを決定するため、ＨＳＶ−２に鼻腔内感染したマウスにＡＣＶあり又はなしで、１日１回、１．２５、０．４２又は０．１２５ｍｇ／ｋｇにてＣＭＸ００１を投与した。１日２回、３０、１０又は３ｍｇ／ｋｇにてＡＣＶを投与した。７日間の経口経管栄養によりウイルス感染７２時間後に処置を開始した。このモデルにおいて５ｍｇ／ｋｇがＣＭＸ００１の最適用量であるとする以前の研究から予想された通り、単独療法としての１．２５、０．４２又は０．１２５ｍｇ／ｋｇのＣＭＸ００１は、生存又は死亡までの平均日数（mean day to death）（ＭＤＤ）増加を有意に改善しなかった。ＡＣＶは、３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０６）で生存を単独で改善し、３０又は１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）で死亡までの平均日数を有意に増加させたが、３ｍｇ／ｋｇでは増加させなかった。ＣＭＸ００１及びＡＣＶ両方の最適以下の用量は、死亡率からの保護を有意に増強、或いは組み合わせた９群のうち８群におけるいずれかの薬物単独と比較してＭＤＤを増加させた。相加的な毒性は検出されなかった。これらの結果は、これら２種の薬剤の低用量の組み合わせが、相乗的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで作用し、ヒトのヘルペスウイルス感染症における使用を検討するべきであることを示した。
【０２８１】
［材料と方法］
ＨＦＦにおけるプラーク減少アッセイを用いた確認によるヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞におけるＣＰＥアッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
動物：ＢＡＬＢ／ｃ、雌のマウス、３〜４週齢。
ウイルス接種：鼻腔内、１．１×１０５ｐｆｕ／マウスを用いた０．０４ｍｌ、ほぼＬＤ９０。
ウイルスストック：単純ヘルペスウイルス、１型、株Ｅ−３７７、Ｆ、ＨＬ−３、ＤＭ２．１、Ｂ−２００６、ＰＡＡｒ５及びＳＣ１６−Ｓ１；又はＨＳＶ、２型、株ＭＳ、Ｇ、ＳＲ、ＡＧ−３、１２２４７、１１６８０又は１１５７２。
抗ウイルス化合物：ＣＭＸ００１（ヘキサデシルオキシプロピル−ＣＤＶ若しくはＨＤＰ−ＣＤＶ）、シドホビル（ＣＤＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）。
【０２８２】
０．２ｍｌ容量を用いた経口経管栄養によりウイルス接種７２時間後に開始し、マウスに７日連続で処置を施与した。ＣＭＸ００１は１日１回投与し、ＡＣＶは１日２回、およそ１２時間間隔で投与した。
【０２８３】
フィッシャー直接確率法により解析した死亡率；マンホイットニーのＵ検定による死亡までの平均日数（Mean day of death）（ＭＤＤ）。
【０２８４】
組み合わせ試験のため、低継代ＨＦＦを用いて、単一又は複合抗ウイルス薬の２４時間のインキュベーションを行った。リアルタイムＰＣＲによりＨＳＶ−２、ＭＳ複製に対する効果を決定するため、０〜２０μＭの濃度を用いたＡＣＶあり又はなしで０〜５００ｎＭの濃度を用いてＣＭＸ００１を添加した。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙプログラムによって９５％信頼レベルの統計的有意性を決定した。
【０２８５】
［結果］
ＨＳＶ−１又は−２の野生株に対するＣＭＸ００１、ＣＤＶ又はＡＣＶの単剤としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を表８に示す。ＨＳＶ−１又は−２のＡＣＶ耐性株に対するＣＭＸ００１及びＡＣＶの効力を表９に示す。ＥＣ５０値は、ＣＭＸ００１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＶよりも有効であることを示す。ＣＭＸ００１とＡＣＶとの組み合わせは、図２７に示す通り、毒性を増すことなく相乗作用を生じた。
【０２８６】
ＨＳＶ−２に感染したマウスに、１．２５、０．４２又は０．１２５ｍｇ／ｋｇの最適以下の用量を１日１回、７日間を用いてＣＭＸ００１を経口により（ｐ．ｏ．）投与すると、ウイルス接種７２時間後に処置を開始した場合、ＭＳ死亡率は有意に低下せず、死亡までの平均日数も延長しなかった。３０、１０又は３ｍｇ／ｋｇの最適以下の用量を用いたＡＣＶによる１日２回の処置をウイルス接種７２時間後に開始した場合、死亡率は有意に低下しなかったが、３０及び１０ｍｇ／ｋｇ用量において死亡までの平均日数は有意に延長した。しかし、ＣＭＸ００１のＡＣＶとの組み合わせは、単一の単独療法と比較すると、大多数の群において生存又は死亡までの時間のいずれかを改善した（表１０）。
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０２８７】
ＣＭＸ００１とＡＣＶとの組み合わせのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、ナノモル濃度のＣＭＸ００１と、２０μＭ以下の濃度のＡＣＶを用いることにより、ＨＳＶ−２、ＭＳ株に対する相乗的な活性が生じたことが示された。最適以下の用量のＣＭＸ００１又はＡＣＶをｉｎ  ｖｉｖｏで単剤として用いると、より高用量のＡＣＶに対してＭＤＤの増加をもたらすが、マウスにおいてウイルス接種７２時間後に処置を開始した場合、ＣＭＸ００１又はＡＣＶを用いても死亡率は低下しなかった。ＨＳＶ−２に感染したマウスにおいて、溶剤処置群又は単独療法処置群と比較すると、併用療法は生存又は死亡までの平均日数を有意に増加させた。
【実施例１６】
【０２８８】
［ＣＭＸ００１及びポリオーマウイルスＢＫ］
ポリオーマウイルス関連腎症又は出血性膀胱炎におけるポリオーマウイルスＢＫ（ＢＫＶ）複製を処置するための有効な抗ウイルス薬は、相当に臨床的な関心の高い対象である。シドホビルとは異なり、脂質コンジュゲート、１−Ｏ−ヘキサデシルオキシプロピル−シドホビル（ＣＭＸ００１）は、齧歯類モデル及びヒトの試験において経口利用でき、限定的な腎毒性を有する。初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞をＢＫＶ−Ｄｕｎｌｏｐに感染させ、感染２時間後（ｈｐｉ）にＣＭＸ００１を添加した。細胞内及び細胞外ＢＫＶ  ＤＮＡ負荷量を定量的ＰＣＲにより決定し、ウイルス初期及び後期遺伝子発現を逆転写ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング及び免疫蛍光顕微鏡観察により決定した。生存率、代謝活性、ＤＮＡ複製及びリアルタイム増殖に関して宿主細胞も検査した。細胞外ＢＫＶ負荷量を７２ｈｐｉにおいて９０％低下させる阻害濃度（ＩＣ−９０）として、ＣＭＸ００１の力価０．３１μＭを同定した。本出願人らは、２４ｈｐｉにおいてＢＫＶラージＴ抗原ｍＲＮＡ及びタンパク質発現における効果はないが、細胞内負荷量によって測定されるその後のＢＫＶゲノム複製が、４８ｈｐｉにおいて９０％低下したことを見出した。後期遺伝子発現は、４８及び７２ｈｐｉにおいて７０〜９０％低下した。９６ｈｐｉのＢＫＶ負荷量において２４、４８、７２及び９６時間からの曝露を比較すると、ＣＭＸ００１  ＩＣ−９０阻害は迅速であり、シドホビルＩＣ−９０よりも永続的であることが判明した。ＣＭＸ００１、０．３１μＭは、全体的な細胞代謝にはほとんど効果がなかったが、ＢｒｄＵ取り込み及び宿主細胞増殖を２０〜３０％低下させ、一方、ＢＫＶ感染は、対数期及びほぼコンフルエントな培養物の両方で細胞増殖速度を増加させた。ＣＭＸ００１が、４００×低レベルにてシドホビルよりも長く続く効果で、関連宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏの副作用が少なくＢＫＶ複製を阻害すると結論される。
【０２８９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＷＩ−３８）及び初代ヒト腎尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）におけるＢＫＶ複製におけるＣＤＶの効果を示した。ＲＰＴＥＣにおいて、ＣＤＶは、用量依存的様式でＢＫＶ複製を阻害し、９０％阻害濃度（ＩＣ−９０）は４０ｕｇ／ｍＬであった。阻害は、ＢＫＶ  ＤＮＡ複製のステップにおいて媒介されたが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腎毒性と相関するように、宿主細胞のＤＮＡ複製及び代謝活性も減少させた。ＣＤＶの別の注意（caveat）としては、これは静脈内投与しなければならず、従って患者は入院する必要があることである。近年、ＣＭＸ００１と表示されるＣＤＶの１−Ｏ−ヘキサデシル−オキシプロピル脂質コンジュゲート（ＨＤＰ−ＣＤＶ）が開発された。ＣＤＶとは異なり、このコンジュゲートは、リゾホスファチジルコリンと同様に細胞に取り込まれ、そこで活性化合物としてのＣＤＶがホスホリパーゼ開裂によって遊離すると考えられる。動物及びヒト志願者における、０．１ｍｇ／ｋｇから４．０ｍｇ／ｋｇの範囲の単回及び反復投与試験は、腎毒性のエビデンスを示さなかった。以前の試験において、ＣＭＸ００１は、ヒト胎児線維芽細胞におけるＢＫＶ複製を阻害することが報告されたが、機構的な詳細は報告されていない。本明細書において、ＲＰＴＥＣにおけるＢＫＶ複製に対するＣＭＸ００１の効果を報告するが、これは、ＰｙＶＡＮにおけるＢＫＶの第一の標的である。
【０２９０】
［材料と方法］
［細胞及びウイルス］
初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）（Ｌｏｎｚａ、ｗｗｗ．ｌｏｎｚａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）をメーカー記載の通りに増殖させた。全実験は、ＲＰＴＥＣ継代４及びＢＫＶ−Ｄｕｎｌｏｐ上清又はＶｅｒｏ細胞から勾配精製したウイルスを用いて行った。
【０２９１】
［感染及びＣＭＸ００１処置］
各実験の前に、ＣＭＸ００１を１ｍｇ／ｍｌとなるようメタノール／水／水酸化アンモニウム（５０／５０／２）に新たに溶解し、ＲＰＴＥＣ成長培地で更に希釈した。約５０％コンフルエントのＲＰＴＥＣをＢＫＶ（Ｄｕｎｌｏｐ）にＭＯＩ１で感染させた。３７℃２時間のインキュベーションの後、他に記述がなければＣＭＸ００１を含有する又は含有しない新鮮な培地にウイルスを交換した。
【０２９２】
［細胞毒性及び細胞増殖アッセイ］
ミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩、ＷＳＴ−１の低減を測定する比色ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、スイス、ロートクロイツ）により、ミトコンドリアの代謝活性をモニターした。「細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ」キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＤＮＡへのＢｒｄＵ取り込みの比色測定によって、ＤＮＡ合成を定量化した。Ｅ−ｐｌａｔｅ及びｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細胞の付着及び増殖をインピーダンスとして測定した。ＲＰＴＥＣがＥ−ｐｌａｔｅに付着し増殖するように、プレートを先ずフィブロネクチンでコーティングした。次に、プレートをシステムに接続して細胞培養インキュベーター内で固有の電気接点をチェックする前に、各ウエルに１００μｌの培地を添加することによってプレートのバックグラウンドインピーダンスをモニターした。その後、表示の細胞数を含有する１００μｌの細胞懸濁液を播種した。ＢＫＶ感染及びＣＭＸ００１処置の効果を決定するため、播種約２４時間後、１５０μｌの培地を、ＣＭＸ００１（最終濃度０．３１μＭ）の存在下又は不在下で精製ＢＫＶ−Ｄｕｎｌｏｐを含有する又は含有しない新鮮な培地に交換した。細胞を９６時間培養し、最初の６時間は１５分間毎に、その後は３０分間毎にインピーダンスを測定した。インピーダンスは、細胞指数（Cell Index）と称する任意の単位として表す。
【０２９３】
［ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成］
２４、４８及び７２ｈｐｉにおいて、ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて細胞を溶解し、全ＲＮＡを抽出した。アガロースゲル電気泳動によってＲＮＡ品質をチェックしてＲＮＡ濃度を決定する前に、ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅ  ｔｕｒｂｏ（Ａｍｂｉｏｎ）で処置して残存ＤＮＡを除去した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、試料当たり２５０ｎｇのＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
【０２９４】
［ＤＮＡ抽出］
細胞外ＢＫＶ負荷量をアッセイするため、２４、４８及び７２ｈｐｉに細胞培養上清を回収し、ロボット（ＧｅｎｏＭ−４８、Ｑｉａｇｅｎ、ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）により自動抽出するまで−７０℃で凍結した。細胞内ＢＫＶ負荷量に関しては、細胞を洗浄し、トリプシン処置し、２２０ｇを１０分間によりペレット化し、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｍ４８キット（Ｑｉａｇｅｎ）のＧ２バッファーに再懸濁し、同ロボットにより抽出するまで−７０℃で凍結した。
【０２９５】
［ＢＫＶ  ＤＮＡ及び細胞遺伝子の検出のための定量的ＰＣＲ］
細胞内又は細胞外ＢＫＶ  ＤＮＡ負荷量を定量化するため、ラージＴ抗原（ＬＴ−ａｇ）遺伝子を標的とするプライマー及びプローブによる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた。細胞内ＢＫＶ  ＤＮＡを正規化するため、細胞ＤＮＡを補正するためのアスパルトアシラーゼ（ＡＣＹ）遺伝子のｑＰＣＲにより各試料を並行して解析した。
【０２９６】
［ウエスタンブロッティング］
細胞を２４、４８及び７２ｈｐｉにてＣｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎバッファー（ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳキット、Ａｍｂｉｏｎ）に溶解し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離してＰＶＤＦ（登録商標）メンブレン上にブロッティングするまで−７０℃で保存した。Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ検出システムによる検出に先立ち、ＬＴ−ａｇ（１：２０００）、ＶＰ１（１：１００００）又はアグノ（１：１００００）（１、２７）に対して作製されたポリクローナルウサギ抗血清及びＧＡＰＤＨ（Ａｂ８２４５；１：５０００、Ａｂｃａｍ、ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ）に対して作製されたモノクローナルマウス抗体、続いて両者共に１：５０００の抗ウサギ及び抗マウス赤外色素標識二次抗体（ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ｗｗｗ．ｒｏｃｋｌａｎｄ−ｉｎｃ．ｃｏｍ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を用いてＢＫＶ及び細胞タンパク質の検出を行った。
【０２９７】
［免疫蛍光染色、顕微鏡及びデジタル画像処置］
細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノール固定し、ＰＢＳ中の３％ヤギ血清で３０分間ブロッキングし、続いてその後、一次（３７℃）及び二次（ｒ．ｔ．）抗体により３０分間のインキュベーションを行った。一次抗体は、モノクローナル抗ＳＶ４０  ＬＴ−ａｇ抗体（Ａｂ−２  Ｐａｂ４１６；１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｃｏｎ．ｃｏｍ）及びアグノ又はＶＰ１（共に１：１０００）に対して作製されたポリクローナルウサギ抗血清であった。二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８とコンジュゲートした抗マウス抗体及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８とコンジュゲートした抗ウサギ抗体（１：５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）であった。核は、ＤＲＡＱ５（商標）（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｔａｔｕｓ．ｃｏｍ）で標識した。ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウエア、バージョン２．２（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を備え、これにより処置を行うＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００顕微鏡を用いて画像を収集した。
【０２９８】
［結果］
［阻害濃度ＩＣ−９０の決定］
ＢＫＶ後代におけるＣＭＸ００１の効果を調べるため、増加濃度のＣＭＸ００１を２ｈｐｉに添加し、上清を７２ｈｐｉに回収した。本出願人らは、ＣＭＸ００１が、細胞外ＢＫＶ負荷量を濃度依存的様式で低下させることを観察した（図２８ａ）。ウイルスインプットを差し引くと、ＣＭＸ００１、０．３１μＭは、ＢＫＶ負荷量を平均して９０％低下させ、これにより阻害濃度ＩＣ−９０を画定した。この結果と一致して、７２ｈｐｉのＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの免疫蛍光染色は、ラージＴ抗原（ＬＴ−ａｇ）及びアグノ発現細胞の数及び強度における濃度依存的減少を立証した（図２８ｂ）。１０μＭもの高ＣＭＸ００１濃度において、ＢＫＶ感染細胞は観察されなかったが、総細胞数は有意に減少した（データ図示せず；後述も参照）。ＣＭＸ００１は、初期及び後期ＢＫＶタンパク質の発現及び細胞外後代の産生を低下させるが、ＲＰＴＥＣの増殖にも濃度依存的効果を有すると思われると結論された。
【０２９９】
［ＣＭＸ００１とＢＫＶ初期遺伝子発現］
ＢＫＶ初期遺伝子発現におけるＣＭＸ００１  ＩＣ−９０の効果を試験するため、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により２４、４８及び７２ｈｐｉの処置及び無処置ＲＰＴＥＣにおけるＬＴ−ａｇ  ｍＲＮＡレベルを比較した。結果は、ハウスキーピング遺伝子ｈｕＨＰＲＴに対し正規化し、２４ｈｐｉの無処置試料と比べた変化として提示した。２４ｈｐｉの初期遺伝子発現において差異は見出されなかったが、４８ｈｐｉ及び７２ｈｐｉにそれぞれ３３％及び６４％の低下が観察された（図２９ａ）。ウエスタンブロッティングによるＬＴ−ａｇ発現の解析は、２４ｈｐｉに殆ど差異を示さないが、より後期の時点にて２０％〜３０％低下を示す一致した結果を明らかにした（図２９ｂ）。ＣＭＸ００１は、ウイルス生活環初期においてＢＫＶ初期タンパク質発現を阻害しないが、より後期の４８及び７２ｈｐｉに阻害すると結論された。
【０３００】
［ＣＭＸ００１とＢＫＶゲノム複製］
ＢＫＶエピソーム複製は３６ｈｐｉ前後に起こることが公知であるため、ＢＫＶゲノム複製が、ＣＭＸ００１によって影響を受けるか否か調べた。２４、４８及び７２ｈｐｉにおける細胞内ＢＫＶ負荷量をｑＰＣＲによって測定し、細胞参照遺伝子としてアスパルトアシラーゼ（ＡＣＹ）を用いて細胞数に対し正規化した。無処置ＲＰＴＥＣと比較すると、０．３１μＭのＣＭＸ００１は、４８時間目に細胞内ＢＫＶ負荷量を９４％、７２ｈｐｉに９１％低下させた（図２９ｃ）。これにより、細胞内ＢＫＶゲノム複製におけるＣＭＸ００１の有意な阻害効果を同定した。このステップは、２種の相乗的機序により、即ち、ＤＮＡ鋳型を増加させ、これにより、後期遺伝子転写のための細胞当たりの遺伝子量（gene dosis）を増加させること、また、後期プロモーターからの転写を活性化させることにより、ウイルス後期遺伝子発現を増加させるＬＴ−ａｇ機能を必要とすることが公知である。
【０３０１】
［ＣＭＸ００１とＢＫＶ後期遺伝子発現］
ＢＫＶ後期遺伝子発現におけるＣＭＸ００１の効果を試験するため、ＲＴ−ｑＰＣＲにより２４、４８及び７２ｈｐｉのＣＭＸ００１処置及び無処置ＲＰＴＥＣにおけるＶＰ１及びアグノｍＲＮＡレベルを比較した。後期ｍＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子ｈｕＨＰＲＴに対し正規化し、２４ｈｐｉの無処置試料と比べた変化として提示した。４８及び７２ｈｐｉにおいて、それぞれ９３％及び８２％の低下が見出された（図３０ａ）。ウエスタンブロッティングにより、それぞれ８５及び９６％のＶＰ１減少が見出され、一方、アグノは９７及び９６％低下した（図３０ｂ）。
【０３０２】
ＢＫＶ遺伝子発現におけるＣＭＸ００１の効果を単細胞レベルで調べるため、４８ｈｐｉ及び７２ｈｐｉにおける初期ＬＴ−ａｇ及び後期アグノの免疫蛍光を行った。４８ｈｐｉにおいて、核ＬＴ−ａｇシグナルの数及び強度が僅かに減少したことが判明した。減少は、後期アグノ発現に関してより顕著であった。ＬＴ−ａｇ及びアグノ発現は、７２ｈｐｉのＣＭＸ００１処置ウエルにおいて増加したが、これは無処置ウエルよりも少ない程度であった（図３０ｃ）。興味深いことに、免疫蛍光は、ＣＭＸ００１処置培養物におけるいくつかの不応性細胞が、最大２．５μＭのＣＭＸ００１濃度であっても無処置細胞に匹敵するレベルでアグノを発現していることも明らかにした（図２８ｂ）。ＣＭＸ００１は、後期タンパク質発現を有意に低下させるが、ＢＫＶゲノム複製後のより後期の時点で初期タンパク質発現も阻害すると結論された。
【０３０３】
［ＣＭＸ００１阻害の動態］
ＢＫＶ複製におけるＣＭＸ００１阻害の動態を検査するため、ＲＰＴＥＣを感染後に２４時間、４８時間、７２時間又は９６時間処置し、９６ｈｐｉの上清におけるＢＫＶ負荷量を決定した。表示の時間において、上清を回収し、細胞を１回洗浄し、新しい完全培地を添加した。９６ｈｐｉにおいて、上清におけるＢＫＶ負荷量を測定した。図示する通り、０．３１μＭ、２４時間のＣＭＸ００１処置は、９６ｈｐｉにＢＫＶ負荷量をおよそ９０％低下させるのに十分であった（図３１ａ）。より長い曝露時間は、限界効果しかなかった。これらの条件下において、細胞外ＢＫＶ負荷量をこのレベルまで低下させるには、４０μｇ／ｍＬで少なくとも４８時間のＣＤＶ処置が必要とされた。観察されたＢＫＶ負荷量の低下が、感染単位数の減少に対応するか否か調べるため、異なる時点で回収した上清を１０倍希釈し、新しいＲＰＴＥＣに播種した。ｐ．ｉ．３日目に細胞を固定し、ＬＴ−ａｇ及びアグノに対する抗体により免疫蛍光染色を行った。結果は、感染性ウイルスが、細胞をＣＭＸ００１で僅か２４時間処置した後にほとんど検出不能になったが、同様の結果を得るには７２時間のＣＤＶ処置が必要であったことを立証した（図３１ｂ）。ＣＭＸ００１が、ＣＤＶよりも迅速且つ永続的な阻害効果を有することが結論された。
【０３０４】
［ＲＰＴＥＣにおけるＣＭＸ００１の効果］
位相差顕微鏡は、０．３１μＭのＣＭＸ００１への３日間の曝露の間、宿主細胞生存率低下のいかなる大まかな兆候も明らかにしなかった。より高感度のアッセイを用いるため、非感染及び感染ＲＰＴＥＣにおけるＢｒｄＵ取り込み及びＷＳＴ−１アッセイを用いて宿主細胞ＤＮＡ複製及び代謝活性を調べた。ＣＭＸ００１が、濃度依存的様式で感染ＲＰＴＥＣのＤＮＡ複製及び代謝活性の両方を低下させることが判明した（図３２ａ）。とりわけ、ＢＫＶ複製のＩＣ−９０である０．３１μＭのＣＭＸ００１は、ＢｒｄＵ取り込みの２５％低下を誘導したが、代謝活性を有意に変化させなかった。
【０３０５】
非感染及びＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの増殖における０．３１μＭのＣＭＸ００１の影響をリアルタイムで調べるため、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅシステムを用いて任意の細胞指数単位におけるインピーダンスを測定した。細胞を２種の異なる密度とし、一方は最大７２時間指数増殖でき（２０００細胞／ウエル、下）、もう一方は播種後の最初の２４時間以内に培養密度になる準培養密度（subconfluency）（１２０００細胞／ウエル、上）とした。播種後１日目に培地を交換し、次の４条件を検査した。ｉ）非感染及び無処置、ｉｉ）非感染だがＣＭＸ００１処置、ｉｉｉ）ＢＫＶ感染だが無処置又はｉｖ）ＢＫＶ感染及びＣＭＸ００１処置。３０分間隔で最大９６時間まで細胞指数を測定した。データは、ＢＫＶ感染が、指数増殖及び準コンフルエント細胞培養における細胞増殖を増加させることを示した（図３２ｂ）。指数増殖細胞において、ＣＭＸ００１は、曝露後４８時間目（播種後７２時間目）にＲＰＴＥＣ増殖速度を非感染細胞においておよそ２５％、ＢＫＶ感染細胞においておよそ３５％低下させた。準コンフルエント細胞において、ＣＭＸ００１は、感染及び非感染細胞において同様に最小限の阻害効果しか持たなかった。ＩＣ−９０の０．３１μＭ  ＣＭＸ００１は、ＲＰＴＥＣ増殖において細胞密度に反比例する特定の阻害効果を有するが、この濃度では毒性があるとは思われないと結論された。
【０３０６】
［考察］
腎移植後のＢＫＶの媒介するポリオーマウイルス関連腎症及び同種造血幹細胞移植後の出血性膀胱炎の現在の治療成績の改善には、より高い効力及び特異性を有する抗ウイルス薬が必要とされる。本試験において、ヒト初代近位尿細管上皮細胞におけるＢＫＶ複製に関与するその阻害活性に関してＣＭＸ００１を特徴づけた。結果は、０．３１μＭのＣＭＸ００１が、７２ｈｐｉにおいて細胞外後代ＢＫＶの負荷量を９０％低下するのに十分であることを立証する。ＢＫＶ生活環の調査は、ＣＭＸ００１阻害が、ＢＫＶゲノム複製のレベルで２４ｈｐｉにおける最初の初期遺伝子発現の後に起こることを示した。無処置対照と比較すると、細胞内ＢＫＶゲノム負荷量は、２４から４８ｈｐｉの間で増加していなかった。更に、その後の４８及び７２ｈｐｉにおける爆発的な後期遺伝子発現が有意に低下したが、無処置細胞においてこれはＬＴ−ａｇの媒介する活性化及びＤＮＡ鋳型のより多数の遺伝子コピー数の相乗作用によって生じる。ＣＭＸ００１は、同一試験システムにおけるＣＤＶのＩＣ−９０よりも約４００倍低濃度で活性であった（ＣＤＶ  ＩＣ−９０  ４０ｕｇ／ｍｌ＝１２７ｕＭ対、ＣＭＸ００１  ＩＣ−９０  ０．３１ｕＭ）。ＣＭＸ００１の阻害活性は、９６ｈｐｉにおけるＢＫＶ後代負荷量ＩＣ−９０のＣＤＶの４８時間から７２時間と比較すると、２４時間の曝露時間を必要とするＣＤＶと比較して、より速効性且つ永続的であった。阻害動態におけるこの差異は、希釈した上清を新しいＲＰＴＥＣに播種する場合の感染単位においても明らかであり、取り込みが改善され、細胞内濃度が高いリゾホスファチジル様修飾によってもたらされると考えられる。総合すると、データは、親化合物ＣＤＶを上回るリゾホスファチジル様誘導体ＣＭＸ００１の有意に増強されたＢＫＶ阻害効力を示す。
【０３０７】
ＣＤＶに関する以前の研究は、ＣＤＶの阻害活性が、宿主細胞の阻害効果と密接に関連することを示した。ＣＤＶ  ＩＣ−９０は、ＢｒｄＵ取り込みによるとＲＰＴＥＣの増殖を３０％〜４０％低下させたが、全体的な代謝活性は２０％〜３０％低下した（１）。ＢＫＶ複製におけるＣＭＸ００１の効力増加を仮定すると、宿主細胞における効果をモニターすることは相当に興味深い。結果は、ＣＭＸ００１  ＩＣ−９０が、ＢＫＶ感染ＲＰＴＥＣの全体的な代謝活性において殆ど効果がなく、全体的な増殖活性を最大２５％低下させることを示した。以前に報告された通り、ＢＫＶ感染は単独で、非感染細胞を上回ってＲＰＴＥＣの代謝活性を増加させ、ＢｒｄＵ取り込みによって測定される増殖活性を増加させた。新規のリアルタイム増殖アッセイにおけるＲＰＴＥＣ増殖の比較において、細胞増殖におけるＢＫＶ感染の刺激効果は、指数増殖している細胞培養物及び培養密度に達した細胞培養物において明らかに立証された。ＢｒｄＵの結果に一致して、このアッセイは、ＣＭＸ００１  ＢＫＶ  ＩＣ−９０が、指数増殖しているＲＰＴＥＣの増殖速度をおよそ２５％低下させたことを示した。この効果は、より高い細胞密度ではより不明確であり、これは、コンフルエント細胞に感染させた場合、ＢＫＶ感染におけるＣＭＸ００１の特異性が増加することを示唆する。特に、ポリオーマウイルス関連腎症等、限局性疾患を処置する場合、この特性が全体的な腎毒性低下に寄与し得ると想定することができる。２４時間のＣＭＸ００１前処置もＢＫＶ後代負荷量の低下に有効であったため、これは、過剰な毒性のない有効な抗ウイルス状態に寄与し、Ｒ０を１未満に更に低下させることによる有意なクリアランス速度に寄与し得る。
【０３０８】
ＣＭＸ００１は、ＣＤＶに観察された１１５．１μＭと比較して８００倍を超えて増加した０．１３μＭの有効濃度（ＥＣ）−５０により、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＷＩ−３８）におけるＢＫＶ複製を阻害することが判明した。これらの結果は、感染後７日目に回収した細胞のＢＫＶ負荷量を決定し、細胞毒性濃度（ＣＣ）−５０のためにハウスキーピング遺伝子を用いて宿主細胞負荷量に対し正規化することによって得られ、１１３の選択指数（selectivity index）（ＳＩ）−５０を示した。結果は、腎移植におけるポリオーマウイルス関連腎症の詳細な感染モデルに従ってウイルス血症及びウイルス尿症をそれぞれ３及び１０週までに除去するのに必要とされる、ＲＰＴＥＣにおけるＩＣ−９０の決定を目的とする。ＣＭＸ００１濃度１０μＭにおけるＢｒｄＵ取り込みは、無処置感染細胞のおよそ１０％まで低下したため（ＣＣ−９０）、ＳＩ−９０を６２．５と評価することができる。このＳＩは、前臨床及び臨床試験に対し非常に有利なものとして考慮しなければならず、より初期の観察を初代ヒト尿細管上皮細胞の臨床関連の宿主細胞モデルに拡大適用する。
【０３０９】
総合すると、ＣＤＶと同様にＣＭＸ００１は、ウイルスゲノム複製レベルにおいて、初期のＬＴ−ａｇ発現の下流である初代ヒトＲＰＴＥＣにおけるＢＫＶ複製を阻害すると結論される。ポリオーマウイルス複製は、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ機能に依存的であるが、改善されたＢＫＶ特異性は、感染細胞の活性化及びＬＴ−ａｇによって媒介されるウイルスゲノム複製部位への複製の優先的漸加に起因し得る。リゾファチジル（lysophatidylic）修飾は、ＣＤＶよりもおよそ４００倍低い濃度でＣＭＸ００１のより迅速且つ永続的な抗ウイルス効果をもたらし、その推定ＳＩ−９０は６２．５である。
【実施例１７】
【０３１０】
［ＣＭＸ００１とＪＣウイルス］
ＣＤＶと比較したＣＭＸ００１のヒト胎児グリア細胞株ＳＶＧにおけるＪＣＶ複製における効果を調べた。ＳＶＧ細胞におけるＣＭＸ００１の限定的な細胞毒性が、０．０１から０．１μＭの間の濃度で観察された。ＣＭＸ００１は、初期感染においてＪＣＶ感染細胞の用量依存的減少を引き起こし、以前に確立した感染においてＪＣＶ感染細胞を実質的に除去したが、これはウイルスＤＮＡ複製レベルにおける欠損のためと思われる。ヒトグリア細胞に対して毒性のない濃度におけるＪＣＶ感染の抑制及びバイオアベイラビリティ増加は、ＣＭＸ００１をＰＭＬ患者におけるＪＣＶ増殖の制限に利用できる可能性を示唆する。
【０３１１】
［材料と方法］
［細胞及びウイルス］
ヒト胎児グリア培養物を複製開始起点欠損（origin-defective）ＳＶ４０変異体でトランスフェクトし、その結果得られたＳＶ４０Ｔ抗原の安定的発現により不死化した細胞培養物を培養することによってＳＶＧ細胞を作出した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充した最少基礎培地（ＭＥＭ）中にＳＶＧ細胞を維持した。ＪＣＶのＭａｄ−４変種をヒト胎児脳前駆細胞由来のアストロサイトにおいて増殖させ、該細胞から精製した。ヒトＯ型赤血球の赤血球凝集（ＨＡ）によって、ウイルス濃度を決定した。
【０３１２】
［ＪＣウイルス感染］
９６ウエルプレートにおいてウエル当たり１×１０４〜２×１０４細胞、或いは６ウエルプレートにおいてウエル当たり３×１０５細胞の密度でＳＶＧ細胞を播種した。一晩３７℃で細胞を培養した。次に、培養用培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。５×１０４細胞当たり１０赤血球凝集素単位（ＨＡＵ）の濃度のＭａｄ−４  ＪＣＶを含有する最小限の容量のＰＢＳに細胞を９０分間曝露した。培養プレートの呼び容積（nominal volume）まで各ウエルに培養用培地を添加した。非感染対照培養物は、ウイルスなしのＰＢＳと９０分間インキュベートした。ＪＣＶに一晩曝露した後、培養用培地を薬物含有培地と交換した。
【０３１３】
［ＪＣＶ感染ＳＶＧ培養物の維持］
５×１０４細胞当たり１０赤血球凝集素単位（ＨＡＵ）の濃度のＭａｄ−４  ＪＣＶにＳＶＧ細胞を９０分間曝露することによって、感染ＳＶＧ細胞の培養物を作製した。培養プレートの呼び容積まで培養用培地を添加し、細胞に新しい培地を与え、７〜１１継代の間行った。７継代後、培養物は確立した感染であると考慮し、薬物処置実験に用いた。ＪＣＶ  ＤＮＡ特異的プローブとのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、細胞継代におけるＪＣＶ感染の維持を決定した。
【０３１４】
［薬物調製及び希釈］
本試験に用いた薬物の化学構造、生物学的特性及び作用機序を表１１に列挙する。シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手し、ＰＢＳ１ｍＬ当たり５ｍｇのストックとして−２０℃で保存した。Ａｒａ−Ｃを１ｍＬ当たり５及び２０μｇ濃度になるよう細胞培養用培地に直接希釈した。シドホビル（ＣＤＶ）は、Ｇｉｌｅａｄ（カリフォルニア州フォスターシティ）から入手し、１．２Ｍ水溶液ストックとして室温で保存した。ＣＤＶを０．０１、０．０３、０．０７、０．１及び１μＭ濃度になるよう細胞培地に直接希釈した。ヘキサデシルオキシプロピル−シドホビル、ＣＭＸ００１は、Ｃｈｉｍｅｒｉｘ  Ｉｎｃ（ノースカロライナ州、ダラム）から入手し、メタノール／水／水酸化アンモニウム（５０容量：５０容量：２容量）中の１．８ｍＭストックとして４℃で保存した。ＣＭＸ００１を０．０１、０．０３、０．０７、０．１及び１μＭ濃度となるよう細胞培養用培地に直接希釈した。
【０３１５】
［ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーション］
Ｈｏｕｆｆ、Ｓ．Ａ．、Ｄ．Ｋａｔｚ、Ｃ．Ｖ．Ｋｕｆｔａ及びＥ．Ｏ．Ｍａｊｏｒ（１９８９）「Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＩＤＳ」ＡＩＤＳ３：８４３〜５に以前に記載された通り、全長ＪＣＶビオチン化ＤＮＡ  ＢｉｏＰｒｏｂｅ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞におけるウイルスＤＮＡの複製を検出した。ＪＣＶプローブの非特異的対照として、ウシ胸腺ＤＮＡを用いた。
【０３１６】
［ＭＴＳアッセイ］
ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］アッセイを用いた細胞生存率の定量化は、無色テトラゾリウム塩を有色ホルマザンへと変換する、生細胞におけるミトコンドリア脱水素酵素の生物活性に基づく。メーカーの説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に従ってＭＴＳアッセイを行った。簡単に言うと、細胞から培養用培地を除去し、５０μＬのＰＢＳを９６ウエルプレートの各ウエルに添加した。１０μＬのＭＴＳ試薬を細胞の入ったウエル及び細胞のないウエルに添加し、バックグラウンドを決定した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、４９０ｎｍで吸光度を測定した。同一培養物においてトリパンブルー染色を行い、ＭＴＳ値を細胞生存率と相関させた。示されている最終値は、３回複製した結果である。無処置対照の値を１００％と設定し、他の全数値を対照のパーセンテージとして表す。
【０３１７】
［アラマーブルー（ＡＢ）アッセイ］
メーカーの説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）に従って、アラマーブルー（ＡＢ）アッセイを用いた細胞生存率の定量化を行った。簡単に言うと、細胞を含有する又は細胞を含有しない９６ウエルディッシュの各ウエルに１０μｌのＡＢ試薬を添加して、バックグラウンドを決定した。混合物を３７℃で６時間インキュベートし、吸光度を５７０ｎｍで測定し、６００ｎｍを参照波長として用いた。無処置対照の値を１００％と設定し、他の全数値を対照のパーセンテージとして表す。
【０３１８】
［ヘマトキシリン強度の半定量化］
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションに処置される培養物における細胞密度は、ＭＴＳ又はＡＢアッセイによって測定できなかったため、ヘマトキシリン染色強度の定量化によって処置される細胞培養物における細胞密度の近似値を求めた。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションのため、細胞を載せたカバーガラスを調製し、ヘマトキシリンで共染色した。その後、各カバーガラスを走査し、ＩｍａｇｅＪを用いてヘマトキシリン強度を定量化した。カバーガラス当たりの総細胞数を決定するため、１０個のランダムな位置において１００×拡大率で画像を取得した。各画像における細胞をくまなく計数し、各実験群につき１０個の画像から得られた計数を平均することにより、スライド当たりの平均細胞数を導き出した。正確に９００個の１００×拡大率の画像が、１８ｍｍ×１８ｍｍカバーガラスの表面に敷き詰められている。
【０３１９】
［ＤＮＡ抽出］
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキットを用いてメーカーの説明書（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に従って、非感染及びＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞培養物からＤＮＡを回収した。ＮＤ−８０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デラウェア州ウィルミントン）を用いてＤＮＡを定量化し、使用前に４℃で保存した。
【０３２０】
［定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）］
Ｒｙｓｃｈｋｅｗｉｔｓｃｈ、Ｃ．、Ｐ．Ｊｅｎｓｅｎ、Ｊ．Ｈｏｕ、Ｇ．Ｆａｈｌｅ、Ｓ．Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｏ．Ｍａｊｏｒ（２００４）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ−ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＣ  ａｎｄ  ＢＫ  ｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ」Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２１：２１７〜２１に以前に記載された通り、一対のＪＣＶ  Ｍａｄ−１特異的プライマー及びウイルスＴ抗原Ｎ末端のヌクレオチド配列を標的とするプローブによる定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、ＪＣＶ感染ＳＶＧ培養物におけるＪＣＶウイルスゲノムコピー数の定量化を行った。鋳型及びＤＮＡ溶出バッファーなしの二重陰性対照を加えて、精製プロセスの各ステップにおいて偽陽性を決定した。１００ｐｇから１０ａｇ（アトグラム）の範囲のＪＣＶ  Ｍａｄ−１プラスミド、ｐＭ１ＴＣの段階希釈を用いて検量線を作成し、これを感染細胞培養物のウイルスゲノムコピー数の計算に用いた。
【０３２１】
［統計］
データは、平均値プラスマイナス標準偏差（ＳＤ）のパーセンテージとして表記した。ソフトウエアＶＡＳＳＡＲＳＴＡＴＳを用いて有意水準１％で一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーＨＳＤ試験により、データを統計学的に評価した。
【０３２２】
［結果］
［薬物のＪＣＶ感染における活性を測定するための組織培養モデルとしてのＳＶＧ細胞］
ＪＣＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）のグリア細胞において溶菌により複製するため、ＪＣＶ複製における薬物処置の効果の試験にはＳＶＧ細胞が用いられてきた。ＳＶＧ細胞は、ＳＶ４０の複製開始起点欠損変異体による初代ヒト胎児脳培養物の不死化によって生じた異種培養物である。これは、ＳＶ４０Ｔ抗原の安定的な発現によって不死化した。ＳＶＧ細胞は形が不規則で、大型の核を含有する大型で扁平な細胞体を有するアストロサイトの形態を維持する（図３３ａ及び３３ｂ）。ＭＴＳアッセイを用いて、ＳＶＧ培養物の増殖動態及び細胞生存率を決定した。細胞を様々な密度で播種し、プレーティング２４時間後にＭＴＳアッセイ及びトリパンブルー染色によって細胞生存率を決定した。図３３ｃに示す通り、ＭＴＳ値（最適な密度）対、トリパンブルー染色によって決定した生細胞計数をプロットすることによって細胞生存率の検量線を作成した。予想通り、回帰解析（ｙ＝１×１０−５ｘ＋０．００１５、Ｒ２＝０．９６１４）により観察される通り、ＭＴＳ値と細胞生存率との間に直線関係が見られた。この検量線を用いて、ＭＴＳ値に基づいてその次の図における細胞数を決定した。ＳＶＧ培養物の経時的な生存率を決定するため、非感染又はＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞をウエル当たり２×１０３で９６ウエルプレートに播種し、プレーティング後１、２、３、４及び７日目にＭＴＳ値をモニターした。各日数のＭＴＳ値（データ図示せず）を図３３ｃにおいて導かれた等式を用いて細胞数に変換し、日数における対時間によりプロットし、０日目をプレーティング時とした。図３３ｄは、１日目の細胞数が、ウエル当たり２×１０３の播種量と同様であることを立証し、これは、細胞プレーティング後の細胞増殖の１日間の遅滞期間を示す。細胞は、１日目から３日目の間に指数増殖した。４日目までに、非感染培養物は、ＪＣＶ感染培養物よりも多くの細胞を含有したが、プレーティング後７日目までには、コンフルエントとなったため、どちらの培養物も細胞数は同様のものとなった。ＪＣＶ複製は７〜１４の間の日数を必要とするため、試験した時点において、非感染とＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞との間で増殖動態において大きな差異は観察されなかった。
【０３２３】
ＪＣＶ複製におけるＡｒａ−Ｃの効果を検査した以前の試験は、Ａｒａ−Ｃが、ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ感染を低下できることを示したため、本出願人らは、本試験に用いたＳＶＧ培養物においてこれらの結果を再現するよう努めた。５×１０４細胞当たり１０ＨＡ単位（ＨＡＵ）の濃度のＭａｄ−４  ＪＣＶに、或いは非感染対照としてＰＢＳ単独にＳＶＧ細胞を曝露した。ＪＣＶ曝露のおよそ２４時間後、非感染及びＪＣＶ感染細胞を１ｍＬ当たり０、５及び２０μｇのＡｒａ−Ｃで処置した。４日目に培養用培地を新しいＡｒａ−Ｃ含有培地に交換した。ＪＣＶ曝露７日後に、細胞生存率をＭＴＳ解析により測定し、活性ウイルス感染をｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションにより測定した。図３４ａに示す通り、ＪＣＶ感染培養物において褐色に染色されたＪＣＶ陽性細胞が存在したが、非感染培養物には存在しなかった。非感染及びＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞の２回複製プレートは、非特異的ＤＮＡプローブとのハイブリダイズも行った。非特異的プローブは陰性であり、これは、ＪＣＶプローブ特異性のエビデンスを提供した（データ図示せず）。ＪＣＶ陽性細胞を定量化し、ＪＣＶ陽性細胞のパーセンテージをＡｒａ−Ｃ対照なしのパーセンテージとして表記した（図３４ｂ）。Ａｒａ−Ｃ処置は、ＪＣＶ  ＤＮＡを含有する細胞のパーセンテージを、統計学的に有意な用量依存的に、１ｍＬ当たり５μｇでは２５％、１ｍＬ当たり２０μｇでは８３％減少させた（ｐ＜０．０５）。細胞生存率におけるＡｒａ−Ｃの効果も決定した（図３４ｃ）。ＭＴＳ解析は、５μｇ／ｍｌのＡｒａ−Ｃ処置は細胞毒性を生じないが、２０μｇ／ｍｌは細胞生存率を２１％減少（ｐ＜０．０１）させることを決定した。１ｍＬ当たり２０μｇのＡｒａ−Ｃ処置におけるＪＣＶ  ＤＮＡ陽性細胞のパーセンテージの減少が、細胞毒性効果による総細胞数減少における間接効果ではなくＪＣＶにおけるＡｒａ−Ｃの阻害効果によるものか決定するため、ＭＴＳ読み取り値を用いてＪＣＶ  ＤＮＡを含有する細胞のパーセンテージを培養物中に存在する生細胞数に対し正規化した（図３４ｄ）。細胞生存率に対する正規化は、１ｍＬ当り５及び２０μｇのＡｒａ−Ｃ処置が、ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞のパーセンテージをそれぞれ２７％及び７８％低下（ｐ＜０．０５）させたことを示し、これは図３４ｂに示す値と同様のものであった。これらの結果は、Ａｒａ−Ｃが、ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ複製を阻害することを立証する。従って、ＳＶＧ細胞は、ＪＣＶ複製における薬物処置の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検査するための本試験における妥当なモデルである。
【０３２４】
［ＳＶＧ細胞に対するＣＭＸ００１の限定的な細胞毒性］
ＣＤＶによるＰＭＬの処置は、稀な症例における陽性予後に関連してきたが、ＢＢＢを通過できず、細胞毒性が高いため有効な処置であるとは考えられない。ＣＭＸ００１は、多くのウイルスの抑制に関してＣＤＶよりも高レベルの効力を立証したシドホビルの修飾誘導体である。細胞生存率におけるＣＭＸ００１の効果を決定するため、０．０１〜１μＭ範囲の濃度のＣＭＸ００１又はＣＤＶで４日間ＳＶＧ細胞を処置した。ＣＤＶは、０．１〜１μＭの濃度範囲において、顕微鏡によって検出された細胞密度（図３５ａ）、或いはアラマーブルー（ＡＢ）染色によって測定された生存率（図３５ｂ）に対しいかなる目に見える変化も誘発しなかった。ＭＴＳよりも高感度の解析であるため、ＡＢ染色により細胞生存率を定量化した。重要なことに、細胞毒性は、１ｍＬ当たり２０〜５０μｇ（６３及び１５９μＭ）と、より高濃度のＣＤＶに関連してきた。ＣＭＸ００１による処置は、０．１及び１μＭ濃度において細胞密度を目に見えて低下させ、ある程度の形態学的変化を起こした（図３５ａ）。その上、図３５ｂに示す通り、試験した全濃度のＣＭＸ００１による処置は、０．０１μＭでは６％、０．１μＭでは１１％、１μＭでは３２％（ｐ＜０．０１）等、細胞生存率を低下させた。これらの結果から、本出願人らは、細胞生存率における影響が限定的であるため、０．０１〜０．１μＭの間の濃度範囲が、ＪＣＶにおける効果に関してＣＭＸ００１とＣＤＶを比較するのに適切であると結論する。
【０３２５】
［ＣＭＸ００１は、ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ複製を抑制する］
６ウエルプレートにおいて、コンフルエントなＳＶＧ細胞培養物に５×１０４細胞当たり１０赤血球凝集素単位（ＨＡＵ）のＭａｄ−４  ＪＣＶを曝露した。一晩ＪＣＶ曝露した後、０．０１、０．０３、０．０７及び０．１μＭ濃度のＣＭＸ００１若しくはＣＤＶ又は無処置対照として薬物希釈液で４日間細胞を処置した。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションにより、培養物におけるＪＣＶ  ＤＮＡ複製を測定した（図３６ａ）。ＪＣＶ陽性細胞を定量化し、ＪＣＶ陽性細胞のパーセンテージを無処置対照のパーセンテージとして表記した（図３６ｂ）。ＣＭＸ００１は、０．０３、０．０７及び０．１μＭ濃度に対しそれぞれ４６％、５７％及び７１％等、ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞のパーセンテージの用量依存的低下をもたらした。対照的に、同一濃度のＣＤＶは、ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞におけるいかなる有意な低下も誘発しなかった。ＣＭＸ００１は、試験した濃度において細胞生存率に影響を及ぼすため、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションによる定量化に用いたカバーグラスから総細胞数を決定した。図３６ａに示す通り、細胞密度はＣＤＶ処置試料において変化しなかった。しかし、ＣＭＸ００１処置は、細胞密度の用量依存的低下を生じた（図３６ｃ）。ＣＭＸ００１処置によるＪＣＶ  ＤＮＡ陽性細胞のパーセンテージの低下が、細胞毒性の影響による総細胞数減少における間接効果ではなくＪＣＶに対する薬物の阻害効果によるものであるか決定するため、ＪＣＶ  ＤＮＡを含有する細胞のパーセンテージをカバーガラス上の総細胞数に対して正規化した（図３６ｄ）。０．０１μＭのＣＭＸ００１処置は総細胞数の有意な低下を生じなかったが、一方、０．０３、０．０７及び０．１μＭ濃度においては、総細胞数の１４％、３９％及び４６％低下を生じた。ＡＢ染色によって測定した結果（図３５ｂ）と同様に、ＣＤＶは、試験したいかなる濃度においても細胞毒性を生じなかった。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞のパーセンテージの総細胞数に対する正規化は、ＣＭＸ００１が、０．１μＭ濃度において５２％の最大抑制で、ＪＣＶ  ＤＮＡを含有する細胞の量の用量依存的低下をもたらしたことを示した（図３６ｄ）。試験した無処置及びＣＭＸ００１処置群間のＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞の低下は、有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【０３２６】
［ＣＭＸ００１は、ＳＶＧ細胞におけるＪＣＶ  ＤＮＡ複製を低下させる］
ＣＭＸ００１は、ポリメラーゼ機能を阻害することによってＤＮＡウイルスを破壊するＣＤＶの誘導体である。従って、ＣＭＸ００１によるＪＣＶ増殖の抑制は、宿主ＤＮＡポリメラーゼによるウイルスＤＮＡ複製の妨害に起因する可能性がある。ＪＣＶ  ＤＮＡ複製がＣＭＸ００１の影響を受けるか決定するため、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ＣＭＸ００１処置したＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞に存在する全ウイルスＤＮＡを測定した。コンフルエントなＳＶＧ細胞培養物を５×１０４細胞当たり１０ＨＡＵのＭａｄ−４  ＪＣＶに曝露した。一晩ＪＣＶ曝露した後、ＪＣＶ感染細胞を異なる濃度のＣＭＸ００１若しくはＣＤＶ又は無処置対照として薬物希釈液で４日間処置した。細胞培養物から全ＤＮＡを回収し、複製試料から得られた等量のＤＮＡをＪＣＶ特異的ｑＰＣＲアッセイにおいて用いた。無処置対照におけるＪＣＶコピー数を１００％の値とし、他の全数値を対照のパーセンテージとして報告する。ＣＤＶ処置は、試験したいかなる濃度においても、ＳＶＧ細胞に存在するＪＣＶゲノムのコピー数に影響を及ぼさなかった。対照的に、ＣＭＸ００１処置は、感染細胞に存在するＪＣＶゲノムコピー数を０．０７及び０．１μＭ濃度でそれぞれ５７％（ｐ＜０．０１）及び６０％（ｐ＜０．０１）用量依存的に減少させた。この結果は、ＣＭＸ００１が、ＳＶＧ細胞の初期感染においてある程度のレベルでＪＣＶ  ＤＮＡ複製に影響を及ぼすことを立証する。ＪＣＶ感染におけるＣＭＸ００１のＥＣ５０は、ＳＶＧ細胞の感染においてＪＣＶコピー数の５０％低下を生じるＣＭＸ００１の濃度によって決定した通り、０．０４５μＭであった。
【０３２７】
［ＳＶＧ細胞の確立されたＪＣＶ感染におけるＣＭＸ００１の限定的な細胞毒性］
上述の結果は、ＣＭＸ００１が、ＳＶＧ細胞の新規又は初期感染においてＪＣＶ増殖を抑制することを立証する。しかし、患者がＰＭＬであると診断されるまでに、脳においてＪＣＶ増殖が相当な期間起きている。処置開始時には高レベルの後代ウイルスを産生するＪＣＶ感染細胞が存在するであろう。従って、ＣＭＸ００１が、進行中の感染に有効な処置となるか決定するため、本出願人らは、以前に確立した感染を用いてＳＶＧ細胞培養物におけるＣＭＸ００１の効果を測定するよう努めた。細胞生存率におけるＣＭＸ００１の効果を決定するため、非感染及びＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞を０．０１〜１μＭ範囲の濃度のＣＭＸ００１で４日間処置した。ＭＴＳ解析により細胞生存率を測定した。無処置細胞の生存率を１００％の値とし、他の全数値は対照を基準として示した。興味深いことに、ＣＭＸ００１は、０．０１又は０．１μＭの濃度では非感染又はＪＣＶ感染ＳＶＧ細胞の細胞生存率を変化させなかった（図３８）。しかし、１μＭ濃度のＣＭＸ００１は、非感染細胞の生存率を１５％低下させ（ｐ＞０．０５）、ＪＣＶ感染細胞の生存率を４０％低下させた（ｐ＜０．０１）。この傾向は、初期感染の生存率決定と一致する（図３５）。
【０３２８】
［ＣＭＸ００１処置は、確立された感染からＪＣＶ感染細胞を実質的に除去する］
進行中又は確立された感染におけるＪＣＶ増殖に対するＣＭＸ００１の効果を決定するため、非感染及び感染ＳＶＧ細胞培養物を０．１μＭのＣＭＸ００１又は無処置対照として薬物希釈液で４日間処置した。図３９ａの位相差顕微鏡によって観察される通り、ＣＭＸ００１処置は、非感染又はＪＣＶ感染細胞における細胞密度又は形態に最小限の効果があり、この結果は、図３８における細胞生存率の決定と一致する。ＣＭＸ００１処置培養物におけるＪＣＶ  ＤＮＡの存在をｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションにより決定し、細胞密度をヘマトキシリン染色強度により決定した。薬物処置なしの感染培養物においてＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞を観察した（図３９ｂ）。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞のパーセンテージを定量化し、無処置対照を１００％の値とし、０．１μＭ処置は対照のパーセンテージとして表記した。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞は、ＣＭＸ００１処置培養物において殆ど存在しなかった（図３９ｃ）。ＣＭＸ００１は、図３９ｄに示す細胞生存率において中程度の影響があった。ＪＣＶ  ＤＮＡ含有細胞のパーセンテージを総細胞数に対し正規化し（図３９ｅ）、ＣＭＸ００１処置が、ＳＶＧ細胞の確立された感染からＪＣＶ陽性細胞の９４％除去をもたらしたことを立証した（ｐ＜０．０５）。
【０３２９】
［考察］
本試験は、脂質と連結したシドホビル誘導体、ヘキサデシルオキシプロピル−シドホビル、ＣＭＸ００１が、ヒト胎児グリア細胞株ＳＶＧにおけるＪＣＶ増殖を抑制することを立証した。ＳＶＧ細胞におけるＣＭＸ００１の細胞毒性は、１μＭ以上の濃度でのみ観察された。ＣＭＸ００１は、初期感染においてＪＣＶ感染細胞の用量依存的減少をもたらし、確立された感染においてＪＣＶ感染細胞の有意な除去をもたらした。定量的ＰＣＲ解析は、ＣＭＸ００１が、ＪＣＶのＤＮＡ複製能力を最大６０％妨害することを明らかにした。ヒトグリア細胞に対し毒性を持たない濃度でのＪＣＶ感染の抑制及び患者における薬物のバイオアベイラビリティ増加は、ＣＭＸ００１をＰＭＬ患者におけるＪＣＶ増殖の制限に利用できる可能性を示唆する。
【０３３０】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーションとｑＰＣＲとの組み合わせは、ＪＣＶ  ＤＮＡ複製及びウイルス増殖を決定するための信頼のおけるアプローチである。ＣＭＸ００１が、ＪＣＶ複製に直接的に影響するか、その細胞毒性によってＪＣＶのコピー数を間接的に低下させるか理解するため、ウイルス複製の全測定値を細胞生存率に対し正規化した。細胞生存率測定の精度を確実にするため、ＭＴＳアッセイ（図３８）、アラマーブルー染色（図３５）及びヘマトキシリン強度の半定量化（図３６及び３９）等、様々な方法を本試験において用いた。細胞生存率を決定する全３通りの方法は、ＣＭＸ００１が、１μＭの濃度で細胞に対し最低限の毒性を有するとの同一の傾向を立証した。細胞生存率に対する正規化は、ＣＭＸ００１が、初期感染（図３６）及び確立された感染（図３９）においてＳＶＧ細胞モデルにおけるＪＣＶ感染を抑制することを明確に立証した。これらの結果は、ＣＭＸ００１が、活性感染におけるＪＣＶ複製に干渉する能力を有し、患者におけるＰＭＬ処置に適切な候補となり得ることを示唆する。
【０３３１】
ＣＭＸ００１は、ヘルペスウイルスからサイトメガロウイルスに及ぶウイルスＤＮＡポリメラーゼを阻害すると報告されたＣＤＶの誘導体である。ＣＭＸ００１処置したＪＣＶ感染ＳＶＧ培養物におけるＪＣＶゲノムの定量的ＰＣＲは、ＣＭＸ００１が、産生されるウイルスＤＮＡレベルを最大６０％低下させることを立証した（図３７）。この結果は、ＣＭＸ００１が、ウイルス増殖をＤＮＡ複製のレベルで抑制していることを示唆する。ウイルスのＤＮＡ複製なしでは、ビリオン構造タンパク質の産生に十分な鋳型もカプシドに入れるＤＮＡも存在しない筈であり、その結果、細胞が感染性後代を産生する能力の重大な低下をもたらす。ＣＭＸ００１はバイオアベイラビリティが向上したため、この薬物は宿主細胞への進入においてより効率的であるため、ＣＭＸ００１の血漿又はリンパを介した脳への導入が、ＣＤＶよりも優れた効力でＰＭＬ患者の脳におけるウイルス複製を有意に低下させる可能性がある。
【０３３２】
試験した０．０１〜０．１μＭの濃度範囲のＣＤＶは、ＪＣＶ複製においていかなる効果も示さなかったが、一方ＣＭＸ００１は、これらの濃度でＪＣＶ抑制におけるより強力な活性を立証した（図３６）。ＣＤＶが、ポリオーマウイルスの抑制において１ｍｌ当たり２０〜５０μｇ（６３〜１５９μＭ）の濃度範囲でのみ活性を有することが示された。ＪＣＶ増殖は、ＣＭＸ００１処置に対し非常に感受性が高いと思われる。関連ポリオーマウイルスであるＢＫウイルス感染に対するＣＭＸ００１の最大反応の５０％（ＥＣ５０）を生じる別の有効濃度は、０．１４μＭであると報告された。本試験に記載されている結果は、ＣＭＸ００１のＪＣＶに対するＥＣ５０が、０．０４５μＭであることを立証し、これは、ＣＭＸ００１が、ＪＣＶ感染症の処置に非常に有効な薬物となり得ることを示唆し、ＣＮＳにおいて良好なレベルを達成できると想定する。ヒトにおけるＪＣＶ増殖に対し有効となるのに必要な用量を決定するための将来的な試験が必要とされる。
【０３３３】
本試験は、細胞培養モデルにおいてＪＣＶ増殖の抑制因子としてのＣＭＸ００１のＣＤＶよりも優れた効力を強力に立証する。その上、ＣＭＸ００１は、経口バイオアベイラビリティや腎毒性低下等、ＣＤＶよりも多くの他の利点も有する。本試験において観察されたＪＣＶ感染を低下させるＣＭＸ００１の効力に基づき、ＣＭＸ００１は、ＰＭＬ治療法の評価に適切な薬物となり得る。
【表１５】
2013509433.tif 000058
【実施例１８】
【０３３４】
［ＣＭＸ００１の増強されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力］
表１２は、シドホビルと比較した、数種類のｄｓＤＮＡウイルスに対するＣＭＸ００１の増強されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。
【表１６】
2013509433.tif 000059
【実施例１９】
【０３３５】
［ＣＭＸ００１及びシドホビル−二リン酸塩］
ＣＭＸ００１は、活性抗ウイルス剤、シドホビル−二リン酸塩（ＣＤＶ−ＰＰ）への細胞の曝露を増加させる。図４０は、ＣＭＸ００１が、シドホビルよりも１０倍少ない薬物で８０倍多いＣＤＶ−ＰＰを生じることを示す。ＰＢＭＣにおけるＣＤＶ−ＰＰをＣＭＸ００１又はシドホビルと４８時間インキュベートした。ＣＤＶ−ＰＰのｔ１／２は６．５日間であった。図４１は、ＣＭＸ００１と４８時間インキュベーションした後のヒトＰＢＭＣにおけるＣＤＶ−ＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞内レベルを示す。ＣＤＶ−ＰＰのｔ１／２は３．９日間であった。図４２は、ＣＭＸ００１と１時間インキュベーションした後のヒトＰＢＭＣにおけるＣＤＶ−ＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルを示す。ＣＤＶ−ＰＰのｔ１／２は６．５日間であった。
【実施例２０】
【０３３６】
［ＣＭＸ００１クリアランス及び分布］
図４３は、４時間にわたるマウス腎臓からのシドホビル又はＣＭＸ００１のクリアランスを示す。図４４は、５ｍｇ／ｋｇの［Ｃ２−１４Ｃ］ＣＭＸ００１経口投与量４時間後のＣＭＸ００１の臓器分布を示す。ＣＭＸ００１は、経口に用いることができ、広範囲に分布する。
【実施例２１】
【０３３７】
［健常な成人志願者におけるＣＭＸ００１試験］
健常な成人志願者におけるＣＭＸ００１の無作為化二重盲検、プラセボ対照、単一用量、用量漸増試験を行った。
【０３３８】
［単一用量］
９群の単一用量コホート−ＣＭＸ００１：プラセボ（２：１）
各コホートにつき６名の対象；３６名がＣＭＸ００１投与；１８名がプラセボ投与
最高用量は、２ｍｇ／ｋｇ（７０ｋｇのヒトに１４０ｍｇ）であった。
【０３３９】
［複数回用量］
６群の複数回用量コホート−ＣＭＸ００１：プラセボ（２：１）（３週間にわたり３回の用量）
各コホートにつき５名の対象；２０名がＣＭＸ００１投与；１０名がプラセボ投与
【０３４０】
［安全性］
単一及び複数回用量は、十分に耐容性を示した；ワイヤレスカプセル内視鏡検査（ＷＣＥ）により有害作用なし
【０３４１】
表１３は、ＣＭＸ００１  ２ｍｇ／ｋｇ単一用量後のヒトの薬物動態を示す。
【表１７】
2013509433.tif 000060
【実施例２２】
【０３４２】
［健常な志願者におけるＣＭＸ００１試験］
ＣＭＸ００１錠剤対溶液製剤のバイオアベイラビリティ及びＣＭＸ００１薬物動態における食品の効果を比較する健常な志願者におけるオープンラベル、３期（3-way）クロスオーバー試験を完了した。２４名の健常な志願者は、４０ｍｇ錠剤（摂食）、４０ｍｇ錠剤（絶食）及び溶液として４０ｍｇ（絶食）の投与を受けた。高脂肪食の経口摂取は、ＣＭＸ００１血漿Ｃｍａｘをおよそ４０％低下させた。錠剤のＴｍａｘは、絶食状態における液体製剤と比較してほぼ１時間遅延した。ＡＵＣによって示される曝露は変化しなかった。有害事象は概して軽度であり、重大な有害事象はなかった。
【実施例２３】
【０３４３】
［ＢＫウイルスを有するヒトにおけるＣＭＸ００１］
ＢＫウイルスのウイルス尿症を発症したＨＳＣＴ及び腎移植レシピエントにおけるＣＭＸ００１の安全性及び耐容性を試験した。移植後集団におけるＣＭＸ００１の安全性及び耐容性を調べ、尿及び血漿中の経時的なＢＫＶ  ＤＮＡレベルをモニターする。
【０３４４】
［試験デザイン］
１２名のＨＳＣＴ及び１２名の腎移植レシピエント、無作為に２：１（ＣＭＸ００１：プラセボ）
ＢＫＶウイルス尿症＞１０４、ウイルス血症を発症した腎移植レシピエント＜１０４
併用バルガンシクロビル／ガンシクロビル、ＨＳＣＴレシピエントのみを除外
【０３４５】
投薬スケジュール：
【表１８】
2013509433.tif 000061
【０３４６】
表１４は、腎移植（ＲＴ）対象（４０ｍｇ／ｗｋ×５）における安全性データ（盲検）を示し、表１５は、幹細胞移植（ＳＣＴ）対象（４０ｍｇ／ｗｋ×５）における安全性データ（盲検）を示す。
【表１９】
2013509433.tif 000062
【表２０】
2013509433.tif 000063
【実施例２４】
【０３４７】
［ＨＳＣＴレシピエントにおけるＣＭＸ００１の第２相試験］
Ｒ＋造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）レシピエントにおけるＣＭＸ００１の安全性、耐容性及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症を予防又は管理する能力の多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増試験を計画した。試験集団は、生着した移植１４〜３０日後に登録したＣＭＶ  Ｒ＋ＨＳＣＴレシピエントである。ＣＭＸ００１：プラセボは、２：１である。１３名の対象をコホート１に登録した。
【０３４８】
［主目的］
［ＣＭＸ００１の安全性及び耐容性の決定］
ＣＭＸ００１のＲ＋ＨＳＣＴレシピエントにおいてＣＭＶ感染症を予防又は管理する能力の決定
【０３４９】
［主要エンドポイント］
安全性エンドポイントは、臨床評価及び検査値、有害事象（及び重大な有害事象）、検査値のベースラインからの変化、バイタルサイン及び腎機能を含む。
効力不全エンドポイントは、処置期間のＣＭＶ疾患の処置又は診断の結論におけるＣＭＶ  ＤＮＡｅｍｉａ＞２００コピー／ｍＬである。
【実施例２５】
【０３５０】
［ＣＭＸ００１及び進行性ワクシニア］
進行性ワクシニア患者の処置を試験した。軍隊入隊者、２０歳、原因不明のＡＭＬ、生ウイルス天然痘ワクチンの投与を受けた。化学療法後−重篤な進行性ワクシニア、多臓器不全及びシュードモナス敗血症。ワクシニア免疫グロブリン及び治験用抗ウイルス薬に対する反応が弱い−ワクチン接種部位周辺の病変及び抗ウイルス反応を欠く（ウイルス負荷量及び血清学によって示される）。ＣＭＸ００１（２００ｍｇ初回量）により患者を処置し、他の治療法の増加用量を投与した。５日以内に、ワクチン接種部位におけるウイルス培養物はワクシニアウイルスに対し陰性となり、皮膚病変は治癒し始めた。患者は、合計６用量で６又は７日毎にＣＭＸ００１の投与を受けた（ＭＭＷＲ  ２００９；５８：１〜４）。
【０３５１】
経口ＳＴ−２４６  ４００ｍｇを３月５日（ワクチン接種５１日後）に開始し、３月２５日に用量を１２００ｍｇに増加させた。経口ＣＭＸ００１  ２００ｍｇを３月２６日に投与し、次に毎週１００ｍｇを５週間（４月２７日まで）投与した。他の処置は、局所ＳＴ−２４６、局所イミキモド及び（ＩＶ）ＶＩＧＩＶを含む。
【実施例２６】
【０３５２】
［経口ＣＭＸ００１対ＩＶシドホビル］
図４５は、ＩＶシドホビル又は経口ＣＭＸ００１後の血漿シドホビル濃度の比較を示す。特に、図４５は、健常な対象における単一用量の２ｍｇ／ｋｇ  ＣＭＸ００１と比較した、単一静脈内用量の５ｍｇ／ｋｇシドホビルとプロベネシド（Ｃｕｎｄｙ、１９９９）を投与された患者における推定シドホビル血漿濃度を示す。
【実施例２７】
【０３５３】
［ＣＭＸ００１に対する抗ウイルス反応：最初の１５名のＥＩＮＤ患者の評価］
評価可能な患者のうち１名を除き、ＣＭＸ００１の抗ウイルス活性が生じた。
【０３５４】
［６名のＡｄＶ患者］
５／６名のアデノウイルスを有する評価可能な患者は、アデノウイルスが＞９９％（２ｌｏｇ１０）低下した、或いは検出限界を下回った。シドホビル及びＣＭＸ００１に対し前処置耐性を有する１名の患者は、ＣＭＸ００１によりウイルス血症がおよそ１．５ｌｏｇ１０低下し、ＣＭＸ００１中断後に３ｌｏｇ反跳した。
【０３５５】
６名のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）患者
３名がウイルス負荷量低下について評価でき、３／３名が応答した。ＣＭＶ低下について評価できなかった患者のうち２名は、ＣＭＸ００１療法を通じて検出不能レベルであった。１用量のみのＣＭＸ００１投与を受けた１名の患者はウイルス学的追跡調査を行わなかった。
【０３５６】
［２名のポリオーマウイルスＢＫ（ＢＫＶ）患者］
１名は＞１．５ｌｏｇ１０反応を有した。
【０３５７】
［１名のポリオーマウイルスＪＣ（ＪＣＶ）患者］
脳脊髄液（ＣＳＦ）及び尿における低レベルのＪＣＶは、ＣＭＸ００１療法により検出不能となった。
【０３５８】
［１名の播種性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）患者］
ＳＴ−２４６及びワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）処置中に検出可能で生存能力のあるワクシニアが病変部に存在。ＣＭＸ００１による処置後に除去。
【０３５９】
図４６は、ＣＭＸ００１処置に対するアデノウイルスのウイルス血症の患者の反応を示す。図４７は、患者におけるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のウイルス血症のＣＭＸ００１による処置を示す。
【０３６０】
表１６は、ＣＭＸ００１処置に対するアデノウイルスのウイルス血症の反応を示す。表１７は、ＣＭＸ００１に高強度曝露した（＞１９．２５ｍｇ／ｋｇ／月）１０名の患者の安全性検査データを示す。
【表２１】
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【表２２】
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【実施例２８】
【０３６１】
［アデノウイルスのＣＭＸ００１による処置］
移植患者（例えば、ＨＳＣＴ及び実質臓器移植（ＳＯＴ））におけるアデノウイルス疾患に対する医学上の必要性は、現在未だに満たされていない。ＨＳＣＴ：リスク因子は、若年、Ｔ細胞除去療法、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）その他を含む。ＳＯＴ：通常、末端器官疾患；経過の後期に起こり得る；疾患によるウイルス血症を呈さないこともある。アデノウイルスのウイルス血症に対し、≧１０００コピー／ｍＬが疾患の診断指標となる。これは、切迫した症状の発症を予測し、血漿中≧１０，０００コピー／ｍＬで死亡率を伴う。ウイルス負荷の低下は、アデノウイルス関連の死亡率から保護する。
【０３６２】
［提案された試験］
アデノウイルスのウイルス血症≧１０００コピー／ｍＬを有するＨＳＣＴ及びＳＯＴ患者が含まれる。エンドポイントは、２８日目における１ｌｏｇ１０の下落として測定されるウイルス血症の持続的な低下である。比較対照（comparator）は、第二の用量のＣＭＸ００１（２ｍｇ／ｋｇ対４ｍｇ／ｋｇ）である。９月齢以上。追跡調査３０日間。本試験は、切迫した死亡リスクのある患者（敗血症性ショック等）を除外する。本試験は、腎不全であれば参加できる。３週間の持続的な検出不能の後に投薬を中断することができる。本試験は、ウイルス負荷量はエンドポイントを満たすが検出不能ではない場合、或いはアデノウイルス疾患の反跳リスクがある場合、継続試験に参加できる。
【０３６３】
本試験は、移植を受けていない患者を含まない。ＡＬＣ＜３００対ＡＬＣ≧３００細胞／ｍｍ３及びＳＯＴ対ＨＳＣＴにより解析を層別化した。目的は、歴史的対照（historical control）に基づく＞４０％奏効率を示すことである。二次エンドポイントは、抗ウイルスＡＵＣの低下及び毒性尺度の改善によって測定される臨床改善を含む筈である。
【０３６４】
［継続試験］
上述の提案された試験を完了した患者の継続試験。ＣＭＸ００１は、以前の試験と同一用量となると思われる。参加は、上述の試験のエンドポイントを満たしたこと、アデノウイルス疾患の進行中のリスクがあることが必要とされる。最大６０日間の処置が認められる。アデノウイルスアッセイが検出不能レベルを３週間持続した場合、処置は、より早く中断することができる。目的は、アデノウイルス疾患を管理することである。
【実施例２９】
【０３６５】
［ＣＭＸ００１によるサイトメガロウイルスの処置］
［病歴］
不応性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を有し、Ｄ＋／Ｒ−移植レシピエントである４６歳女性は、反復性ＣＭＶウイルス血症（３ヶ月で４エピソード）の病歴があった。バルガンシクロビル療法は、重篤な好中球減少症を合併した（３回入院及びＧ−ＣＳＦによる進行中の処置）。患者は、高タクロリムスレベルに関連する腎機能不全の病歴があった（前ＣＭＸ００１処置糸球体濾過量は５１ｍＬ／分であった）。
【０３６６】
［ＣＭＸ００１による処置］
１２０ｍｇのＣＭＸ００１による処置を開始し、続いて毎週６０ｍｇ、最終用量１２０ｍｇを１週間に２回に用量を調整した。ＣＭＶは、ＣＭＸ００１処置により検出不能となり、処置期間において検出不能を維持した（その後２ヶ月）。ＷＢＣはより堅調となり、Ｇ−ＣＳＦ処置を減少させた。
【０３６７】
［ＣＭＸ００１による処置］：
【表２３】
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【０３６８】
ＣＭＸ００１療法の期間は、１６週間を超える。ＣＭＸ００１は、容易に耐容性を示した。介入性イベントは、アジスロマイシンで処置した咳、Ｇ−ＣＳＦに関連する体の痛み及びＣＭＸ００１療法に先立つ慢性胆嚢炎による胆嚢摘出を含んだ。腎臓、肝臓又は血液学的機能における薬物関連の有害変化は観察されなかった。
【０３６９】
［病歴］
以前（２７歳）に腎移植を行った５０歳男性の不応性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を処置した。患者は、病因不明の糸球体腎炎のため１９８１年に腎移植を受けた。ベースラインクレアチニンは、２．３ｍｇ／ｄＬであった。患者は、ＣＭＶ  ＤＮＡｅｍｉａに関連する原因不明熱（ＦＵＯ）を前年に発症した（６週間のＩＶ抗生物質により培養陰性心内膜炎を処置し、ＩＶガンシクロビルによりＣＭＶを処置した）。ＣＭＶウイルス血症は、周期的に再燃し、時に発熱を伴いつつ何ヶ月も持続した。ガンシクロビル／バルガンシクロビル療法によりクレアチニンは悪化した；レフルノミドを開始したが、ＣＭＶは持続した。腎機能障害のため、ホスカルネット又はシドホビルの使用を除外した。中等度低ガンマグロブリン血症；複数回用量のサイトメガロウイルス免疫グロブリン（ＣＭＶＩｇ）は、ウイルス血症除去に有用ではなかった。浸潤性扁平上皮癌状態−指切断後。
【０３７０】
［ＣＭＸ００１による処置］
ＣＭＸ００１は、１８０ｍｇで開始し、続いて毎週８０ｍｇとした。第一のＣＭＸ００１用量の後、ＣＭＶ血漿ＤＮＡは、１年間近くで初めて検出不能となった。ＣＭＸ００１は、十分な耐容性を示した。反復性扁平上皮癌を放射線療法で処置した。２週間のＣＭＸ００１用量省略の後、ＣＭＶ  ＤＮＡは、５，０３７コピー／ｍＬへと上昇した。治療法を元に戻した。クレアチニンは、ほぼ３ヶ月のＣＭＸ００１療法の間４．２〜４．７範囲で安定し続けた。癌の管理を試みるためミコフェノール酸塩を中断し、腎臓拒絶が後に起こった。ＩＮＲ／ＰＴ増加による致死的脳出血及び転移性癌が発生した。いずれのイベントもＣＭＸ００１に関係するとは考えられない。
【０３７１】
［病歴］
両肺移植を受けた腎不全の６８歳男性の不応性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を処置した。ＣＭＶウイルス血症をＩＶガンシクロビルにより処置した。進行中のウイルス血症のため、治療法をホスカルネットに切り替えた。血漿がＣＭＶ検出不能となったら、予防のためバルガンシクロビルによる処置を継続した。敗血症エピソードにおいてＣＭＶの再活性化が起こった（ガンシクロビルを開始し、ホスカルネットを２週間後に加えた）。腎不全進行のため透析が必要とされた。遺伝子型は、ガンシクロビルに対するＡ５９４Ｖ耐性変異を示した。ＵＬ５４（シドホビル又はホスカルネット）変異は検出されなかった。血圧低下及びクレブシエラ（Klebsiella）吸引肺炎を伴う尿ＶＲＥ感染症のための以前のＩＣＵケアは、患者の臨床状態を悪化させた。
【０３７２】
［ＣＭＸ００１による処置］
ＣＭＸ００１による処置開始後、ＣＭＶ  ＤＮＡは検出不能となった。第一、第三及び第五の用量の後に薬物動態試料を収集し、腎不全に基づく用量調整は必要とされなかった。第一の用量後のＣＭＸ００１ピーク血漿濃度は、２６４ｎｇ／ｍＬであり、シドホビルの血漿濃度は、全観察時点で２５０ｎｇ／ｍＬ未満を維持した。患者は複数の進行中の医学的問題を抱えていたが、ＣＭＶは抑制され続けた。ＣＭＸ００１は、十分に耐容性を示した。患者は、大量吸引後に積極的なケアを行わないことを決定した。図４８は、ＣＭＸ００１用量及びＰＣＲプロットによる血漿ＣＭＶを示す。
【実施例３０】
【０３７３】
［ＣＭＸ００１のアデノウイルスＩＣ５０］
表１８は、多くのアデノウイルス血清型／分離株のいくつかのＩＣ５０値を示す。
【表２４】
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【実施例３１】
【０３７４】
ＣＭＸ００１は免疫抑制ハムスターモデルにおいてアデノウイルスの誘導する死亡率を抑制する
シクロホスファミド免疫抑制ハムスターをアデノウイルス５に感染させた。ウイルス複製は、肝臓、副腎及び膵臓において行われた（Ｔｏｔｈら、ＰＮＡＳ  ２００９）。動物は７日目までに瀕死となった。
【０３７５】
２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ．ｉ．ｐ．のＣＭＸ００１投薬を最大２１日間及び曝露前又は曝露６時間、２４時間若しくは４８時間の投薬により、ハムスターは致死性曝露から救出された（肝臓ウイルス血症のほぼ１０６ｌｏｇ低下）。
【実施例３２】
【０３７６】
［ＣＮＳにおけるＨＳＶ−２複製におけるＣＭＸ００１の効果］
図４９は、ＣＮＳにおける単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）複製に対するＣＭＸ００１の効果を示す（Ｑｕｅｎｅｌｌｅら、ＪＩＤ、２０１０）。ＣＭＸ００１及びアシクロビルの結果が報告されている。
【０３７７】
上の記述は、本発明を説明するものであり、本発明を限定するものとして解釈するべきではない。数例の例示的な本発明の実施形態を記載してきたが、当業者であれば、例示的な実施形態において、本発明の新規の教示及び利点から実質的に逸脱することなく多くの修正を行ってよいことを容易に理解できるであろう。従って、このような修正は全て、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲内に含まれることを企図する。従って、上の記述は、本発明を説明するものであり、開示されている特定の実施形態へと限定するものと解釈するべきではなく、開示されている実施形態に対する修正と共に他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが企図されていることを理解するべきである。本発明は、次の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の均等物はそこに含まれるべきである。
【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2013509433.tif 000093
【図６】
2013509433.tif 000094
【図７】
2013509433.tif 000095
【図８】
2013509433.tif 000096
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2013509433.tif 000099
【図１２】
2013509433.tif 000100
【図１３】
2013509433.tif 000101
【図１４】
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【図１５】
2013509433.tif 000103
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2013509433.tif 000107
【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
2013509433.tif 000110
【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2013509433.tif 000118
【図２７】
2013509433.tif 000119
【図２８】
2013509433.tif 000120
【図２９】
2013509433.tif 000121
【図３０（１）】
2013509433.tif 000122
【図３０（２）】
2013509433.tif 000123
【図３１】
2013509433.tif 000124
【図３２】
2013509433.tif 000125
【図３３（１）】
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【図３３（２）】
2013509433.tif 000127
【図３４（１）】
2013509433.tif 000128
【図３４（２）】
2013509433.tif 000129
【図３５】
2013509433.tif 000130
【図３６（１）】
2013509433.tif 000131
【図３６（２）】
2013509433.tif 000132
【図３７】
2013509433.tif 000133
【図３８】
2013509433.tif 000134
【図３９（１）】
2013509433.tif 000135
【図３９（２）】
2013509433.tif 000136
【図３９（３）】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
2013509433.tif 000141
【図４４】
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【図４５】
2013509433.tif 000143
【図４６】
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【図４７】
2013509433.tif 000145
【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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2013509433.tif 000150
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