(57)【要約】  本発明は、低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法、および低アレルゲン性ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法に関する。さらに本発明は、本発明の方法により同定される低アレルゲン性ポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドの予防的および治療的使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来するＮ個のフラグメントを含むポリペプチドであって、隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつＮが３より大きい整数であるポリペプチドで構成されるポリペプチド群を準備する工程；
ｂ）前記ポリペプチドのＩｇＥ反応性を判定する工程；
ｃ）前記ポリペプチドのＴ細胞反応性を判定する工程；
ｄ）前記ポリペプチドが前記アレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導することが可能か否かを判定する工程；
ｅ）前記ポリペプチドが、アレルギー患者由来ＩｇＥの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性ＩｇＧ応答を誘導することが可能か否かを判定する工程；および
ｆ）前記ポリペプチドの中から、（ｉ）前記アレルゲンのいずれか１つよりもＩｇＥ反応性が低く、（ｉｉ）Ｔ細胞反応性を示し、（ｉｉｉ）１以上の前記アレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導することが可能であり、かつ（ｉｖ）アレルギー患者由来ＩｇＥの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性ＩｇＧ応答を誘導することが可能であるポリペプチドを選択する工程
を含む、低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法。
【請求項２】
前記ポリペプチド群内の少なくとも２つのポリペプチドが、それぞれ同一のフラグメントを含むもののその結合順序が異なることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド内のすべてのフラグメントが、それぞれ２０〜１００個のアミノ酸で構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、それぞれ独立して、２つの異なるアレルゲンに由来する４〜１２個のフラグメントからなることを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）で準備したポリペプチドの二次構造を決定して、ランダムコイル構造を示すポリペプチドを選択する工程をさらに含む先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アレルゲンが、花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ３、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１１、Ｐｈｌ  ｐ１２およびＰｈｌ  ｐ１３からなる群より選択されることを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
各フラグメントが、配列番号５５〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド群内の少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号２１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも４個のフラグメントを含む低アレルゲン性ポリペプチドであって、隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ少なくとも１つのフラグメントがＰｈｌ  ｐ１またはＰｈｌ  ｐ５に由来する低アレルゲン性ポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも４個のフラグメントを含む低アレルゲン性ポリペプチドであって、隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ各フラグメントが配列番号５５〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる低アレルゲン性ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２２、２３、２４、２５、３６および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１０に記載の低アレルゲン性ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号３９、４０、４１、４２、５３および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる請求項１１に記載の低アレルゲン性ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
アレルギー、好ましくは花粉症を予防および／または治療する医薬を製造するための請求項９〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１５】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
花粉症（Ａｌｌｅｒｇｙ  ｔｏ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ）を患う人は世界人口の１０％以上にのぼっている。本明細書において、４つの主要なオオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６由来の成分から構築した低アレルゲン性の組換えハイブリッド分子に基づく、花粉症治療用ワクチンの開発について記載する。この４つのアレルゲンのビルディングブロックおよびその組み合わせをコードするコドン最適化合成遺伝子を、エピトープマッピング解析および構造データに従って設計し、大腸菌で発現させた。１７種類の組換えハイブリッド分子をアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、発現量、純度および折り畳み（ｆｏｌｄ）、溶解度および低アレルゲン性に関して評価した。上記の４つの花粉アレルゲン由来の成分を組み合せたハイブリッド分子の中から低アレルゲン性ハイブリッド分子が４種類同定され、この４種類は、異なる動物モデルを免疫した際にいずれのモデルでも、アレルギー患者由来ＩｇＥの花粉アレルゲン認識を阻害するＩｇＧ抗体を誘導することが確認された。これらの低アレルゲン性ハイブリッド分子は、花粉症の免疫療法に用いる安全なワクチンとして提供される。
【０００２】
ＩｇＥ型アレルギーは、有病率が増加の一途をたどっている世界的な健康問題の１つである（１）。アレルギー性疾患は、主に花粉、ダニ、動物ふけやカビに由来する環境アレルゲンに対して特異的なＩｇＥ抗体が産生されることが特徴である（１）。肥満細胞または好塩基球の表面の受容体に結合したＩｇＥ同士が、多価性のアレルゲンを介して架橋を形成すると、炎症性メディエータが放出され、アレルギー症状が現れる（２）。また、抗原提示細胞の表面に存在するＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩを介した抗原提示が、ＩｇＥによって促進されると、Ｔ細胞媒介性アレルギー性炎症に関与するアレルゲン特異的Ｔ細胞の活性化が増強される（３、４）。現在、アレルゲン特異免疫療法は、アレルギーに対して長期間にわたり効果をもたらすことのできる唯一の原因療法であるが、粗製アレルゲン抽出物を使用するとその効果は妨げられる（５、６）。このような調製物には、アレルゲン性成分および非アレルゲン性成分が様々な量で含まれるため、生物活性を有する化合物が存在すると、副作用としてアナフィラキシー反応が起こるリスクが高くなる。また、臨床的に関連のあるアレルゲンの免疫原性が消失または低下している場合、抽出物から作られるワクチンの効力は弱くなる（７）。アレルゲンの性状解析は、ここ２０年間で、免疫化学や分子生物学の手法により大きく進展し、今日、最も一般的で最も重要なアレルゲンについては、その構造や免疫学的特性がすでに明らかになっている。天然のアレルゲンと非常に類似した特性を持つ組換えアレルゲンが作製されており、現在、これらの組換えアレルゲンをアレルギーの診断や治療に用いることが可能である（５）。また、免疫学上有益な特性を持つアレルゲン誘導体が組換えにより作製できることも示されている（８）。免疫療法による治療経過中のＩｇＥによる副作用を回避するために、低アレルゲン性のアレルゲン変異体が作製されており、ＩｇＥ結合能が大幅に低減したＢｅｔ  ｖ１由来の組換えフラグメントは、既に臨床試験で用いられている（９）。異なるアレルゲンの組み合わせからなるハイブリッド分子は、各アレルゲン単独よりも高い免疫原性を有することが示されている（１０〜１２）。
【０００３】
リンハルトらは、２つの主要な花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ２およびＰｈｌ  ｐ６それぞれの低アレルゲン性誘導体（すなわちＰｈｌ  ｐ２のモザイク分子およびＰｈｌ  ｐ６の欠失変異体）を組み合わせることにより、高い免疫原性を有する低アレルゲン性ハイブリッド分子を作製したが（参考文献２１）、先行するデータ（参考文献１５、１７）を踏まえると、予想外のものでもない。
【０００４】
本発明者らは、ハイブリッド技術とモザイク技術を組み合わせても、常に低アレルゲン性分子の創製につながるわけではないことを見出した。驚くべきことに、構成するフラグメントが同一であってもその結合順序が異なる２つの融合ポリペプチドは、極めて異なるＩｇＥ反応性を示したのである。従って、本発明は、ワクチンとして役立つ可能性を有する低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
ａ）少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来するＮ個のフラグメントを含むポリペプチドであって、隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつＮが３より大きい整数であるポリペプチドで構成されるポリペプチド群を準備する工程；
ｂ）前記ポリペプチドのＩｇＥ反応性を判定する工程；
ｃ）前記ポリペプチドのＴ細胞反応性を判定する工程；
ｄ）前記ポリペプチドが前記アレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導することが可能か否かを判定する工程；
ｅ）前記ポリペプチドが、アレルギー患者由来ＩｇＥの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性ＩｇＧ応答を誘導することが可能か否かを判定する工程；および
ｆ）前記ポリペプチドの中から、（ｉ）前記アレルゲンのいずれか１つよりもＩｇＥ反応性が低く、（ｉｉ）Ｔ細胞反応性を示し、（ｉｉｉ）１以上の前記アレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導することが可能であり、かつ（ｉｖ）アレルギー患者由来ＩｇＥの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性ＩｇＧ応答を誘導することが可能であるポリペプチドを選択する工程
を含む、低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法に関する。
【０００６】
本発明の一実施形態において、前記ポリペプチド群内の少なくとも２つのポリペプチドは、それぞれ同一のフラグメントを含むもののその結合順序が異なる。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、前記ポリペプチド内のフラグメントはいずれも、それぞれ２０〜１００個のアミノ酸で構成されている。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、前記ポリペプチドは、２つの異なるアレルゲンに由来する４〜１２個のフラグメントからなる。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法は、工程（ａ）で準備したポリペプチドの二次構造を決定して、ランダムコイル構造を示すポリペプチドを選択する工程をさらに含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、前記アレルゲンは、花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ３、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１１、Ｐｈｌ  ｐ１２およびＰｈｌ  ｐ１３からなる群より選択される。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、各フラグメントは、配列番号５５〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、前記ポリペプチド群内の少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号２１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも４個のフラグメントを含む低アレルゲン性ポリペプチドであって、隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ少なくとも１つのフラグメントがＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ２またはＰｈｌ  ｐ６に由来する低アレルゲン性ポリペプチドである。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも４個のフラグメントを含む低アレルゲン性ポリペプチドであって、隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ各フラグメントが配列番号５５〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる低アレルゲン性ポリペプチドである。
【００１５】
本発明の一実施形態において、前記低アレルゲン性ポリペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、３６および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、前記低アレルゲン性ポリペプチドは、配列番号３９、４０、４１、４２、５３および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物である。
【００１８】
本発明の別の態様は、アレルギー、好ましくは花粉症を予防および／または治療する医薬を製造するための本発明のポリペプチドの使用である。
【００１９】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である。
【００２０】
本発明のさらなる別の態様は、治療上有効な量の本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、それを必要とする個体に投与する工程を含む、アレルギー性疾患を予防および／または治療する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】主要なオオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６由来のアレルゲンフラグメントを組み合わせたハイブリッド分子の構造を示した図である（実施例１を参照）。
【図２】精製ハイブリッドタンパク質Ａ〜Ｑを含むＰＡＡゲルをクマシーで染色した図である（実施例１を参照）。左余白に分子量を示す（レーンｍ：分子量マーカー）。
【図３】水に溶解したタンパク質Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱの遠紫外線ＣＤスペクトルを示した図である。この遠紫外線ＣＤスペクトルは、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｐａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ、東京、日本）を用いて収集した（実施例２を参照）。
【図４】３名の典型的な花粉症患者における、ニトロセルロースに吸着したハイブリッドタンパク質およびコントロールタンパク質に対するＩｇＥの反応性を示した図である（実施例３を参照）。
【図５】野生型アレルゲンと比較してハイブリッドタンパク質のアレルゲン性が低減していることをＣＤ２０３ｃ発現により確認した図である（実施例４を参照）。
【図６】Ｐｈｌ  ｐ１とＰｈｌ  ｐ５との混合物、Ｐｈｌ  ｐ２とＰｈｌ  ｐ６との混合物、ＢとＣとの混合物、ＰまたはＱで免疫したマウスにおけるＩｇＧの反応性を示した図である。Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６のそれぞれに対する特異的ＩｇＧ１抗体の量の推移をＥＬＩＳＡ法により比較した（実施例６を参照）。
【図７】実施例７の結果を示した図である。Ｂ、Ｃ、ＰまたはＱで免疫したウサギにおけるＩｇＧの反応性、すなわち野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１（図７Ａ）、Ｐｈｌ  ｐ５（図７Ｂ）、Ｐｈｌ  ｐ２（図７Ｃ）、Ｐｈｌ  ｐ６（図７Ｃ）のそれぞれに対するＩｇＧ抗体応答を示した図である。
【図８】Ｂ、Ｃ、ＰまたはＧＰＨ（参考文献１１に記載の花粉アレルゲン由来ハイブリッド）で免疫したウサギにおけるＩｇＧの反応性、すなわち野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１に対するＩｇＧ抗体応答を示した図である（実施例８を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の方法は、低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法である。本発明の方法は、低アレルゲン性ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法でもある。本明細書における「低アレルゲン性」とは、ＩｇＥ反応性およびＩｇＥによる肥満細胞または好塩基球の脱顆粒を誘導する能力が低減していることを意味する。
【００２３】
本発明の方法は、第１の工程において、ポリペプチド群を準備する。前記ポリペプチド群内のポリペプチドは、それぞれ独立して、少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来するＮ個のフラグメントを含む。
【００２４】
ポリペプチド
前記ポリペプチド群は、少なくとも２つの異なるポリペプチドからなる。前記ポリペプチド群は、２〜１００、好ましくは３〜７５、より好ましくは４〜５０、最も好ましくは５〜３０の異なるポリペプチドからなることが好ましい。
【００２５】
前記ポリペプチドは、それぞれ独立して、少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来するＮ個のフラグメントを含むか、該フラグメントからなる。Ｎは３より大きい整数であり、好ましくは４〜２５、より好ましくは４〜２０、さらに好ましくは４〜１５、最も好ましくは４〜１０（例えば、４、５、６、７、８、９または１０）である。前記ポリペプチド群内のポリペプチドは、それぞれ同一または異なる数のフラグメントを含んでもよく、該フラグメントからなってもよい。すなわちＮは、前記ポリペプチド群内のポリペプチド間において同一であっても異なっていてもよい。ポリペプチド内の各フラグメントはすべて異なることが好ましい。
【００２６】
各フラグメントは、アレルゲンのアミノ酸配列における少なくとも８個、好ましくは８〜１００個、より好ましくは１０〜９０個、さらに好ましくは１２〜８０個、さらに好ましくは１５〜７０個、さらに好ましくは２０〜６０個の連続するアミノ酸からなる。
【００２７】
本発明において準備するポリペプチドは、前記アレルゲン由来のアミノ酸配列のみで構成されるものに限定されない。フラグメント（異なるアレルゲン由来の連続するアミノ酸配列からなるフラグメント）間に、外来の配列（例えば、スペーサー配列）が挿入されていてもよい。また前記ポリペプチドは、宿主細胞で発現させた際にポリペプチドの精製を容易にするためのタグ配列を含んでいてもよい。このようなタグ配列の例としては、ヘキサヒスチジンタグが挙げられ、ヘキサヒスチジンタグによってＮｉ２＋キレートクロマトグラフィーによる精製が可能になる。その他のタグは当業者に公知である。さらに前記ポリペプチドは、宿主細胞で発現させた結果、１番目のアミノ酸として外来のメチオニン残基が付加されていてもよい。前記ポリペプチドのＮ末端領域が、アレルゲンの内部フラグメントまたはＣ末端フラグメントである場合、同様のメチオニン付加がしばしば起こる。
【００２８】
本発明の一実施形態において、前記ポリペプチドは、以下の（Ｉ）〜（ＶＩＩ）：
（Ｉ）  Ｍｅｔ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ−ｔａｇ、
（ＩＩ）  Ｍｅｔ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ、
（ＩＩＩ）  Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ−ｔａｇ、
（ＩＶ）  Ｍｅｔ−ｔａｇ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ、
（Ｖ）  ｔａｇ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ、
（ＶＩ）  ｔａｇ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ−ｔａｇ、および
（ＶＩＩ）  Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ
のいずれかの構造で構成されていてもよい。上記式中、ＭｅｔはＮ末端メチオニン残基を示し、Ｆ１、Ｆ２およびＦＮは、それぞれ第１、第２および第Ｎフラグメントを示し、ｔａｇはタグ配列（例えば、ヘキサヒスチジンタグ（（Ｈｉｓ）６））を示す。これらの実施形態（Ｉ）〜（ＶＩＩ）において、フラグメント間に外来のアミノ酸は存在しない。すなわち、Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮは、アレルゲンフラグメントが連続する配列である。本発明の他の実施形態において、フラグメント間に１以上（例えば、１、２または３）の外来アミノ酸が存在してもよいが、存在しない方が好ましい。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、種々の方法により作製することができる。本発明の一実施形態において、ポリペプチドは、ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させることにより作製される。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。原核細胞を使用する場合、宿主細胞として好ましい細胞は大腸菌である。真核細胞としては、酵母、昆虫細胞またはＣＨＯ細胞などの細胞株などが挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする適切なポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入し、これを目的のポリペプチドが細胞内で発現されるような条件下で培養する。目的のポリペプチドは、細胞から分泌されるか、細胞内に蓄積される。細胞または培地から目的のポリペプチドを回収するために、公知の精製手法を用いることができる。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、例えば固相合成などの化学合成によって自体公知の手法に従って作製される。
【００３１】
アレルゲン
本明細書における「アレルゲン」とは、アトピー性個体においてＩ型過敏性反応を誘発し得る物質を意味する。ほとんどのヒトでは、寄生虫感染への防御としてのみ、有意な免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）応答が惹起される。しかし、一部の個体では、一般的な環境抗原に対してもＩｇＥ応答が惹起される。この遺伝的素因をアトピーと言う。アトピー性個体においては、寄生虫に由来しない抗原がＩｇＥの異常産生を誘導するため、Ｉ型過敏症を発症する。
【００３２】
本発明に係るアレルゲンには、動植物由来のアレルゲン（Ａｌｌｅｒｇｏｍｅデータベース：  ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｏｍｅ．ｏｒｇ）が包含される。前記アレルゲンは、通常、野生型アレルゲンである。前記アレルゲンとしては、アシブトコナダニ、ネッタイタマニクダニ、コナヒョウヒダニ、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ヤケヒョウヒダニ、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）、イエニクダニ、サヤアシニクダニ、ケナガコナダニ、チャバネゴキブリ、ワモンゴキブリ、ナミテントウ、アーカエオポタモビウス・シビリエンシス（Ａｒｃｈａｅｏｐｏｔａｍｏｂｉｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｅｎｓｉｓ）、ブラインシュリンプ、シマイシガニ、ヨーロッパエビジャコ、アメリカンロブスター、バナメイエビ、ヨシエビ、サガミイセエビ、ノーザンブラウンシュリンプ、ショウナンエビ、ウシエビ、ポンタスタカス・レプトダクティラス（Ｐｏｎｔａｓｔａｃｕｓ  ｌｅｐｔｏｄａｃｔｙｌｕｓ）、ネッタイシマカ、ウスイロユスリカ、キロノムス・サミ・サミ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｈｕｍｍｉ  ｔｈｕｍｍｉ）、台湾黒蚊、トリアトーマ・プロトラクタ（Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｐｒｏｔｒａｃｔａ）、トウヨウミツバチ、オオミツバチ、セイヨウミツバチ、ボンブス・ペンシルバニカス（Ｂｏｍｂｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ）、セイヨウオオマルハナバチ、ドリコベスプラ・アレナリア（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ  ａｒｅｎａｒｉａ）、ドリコベスプラ・マクラータ（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ）、トビキバアリ、ポリステス・アヌラリス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ  ａｎｎｕｌａｒｉｓ）、ヨーロッパアシナガバチ、ポリステス・エクスクラマンス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ  ｅｘｃｌａｍａｎｓ）、ポリステス・フスカタス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ  ｆｕｓｃａｔｕｓ）、フランスフタモンアシナガバチ、ポリステス・メトリカス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ  ｍｅｔｒｉｃｕｓ）、ポリビア・ポーリスタ（Ｐｏｌｙｂｉａ  ｐａｕｌｉｓｔａ）、ポリビア・スクテラリス（Ｐｏｌｙｂｉａ  ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ）、アカカミアリ、ヒアリ、ソレノプシス・リクテリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｒｉｃｈｔｅｒｉ）、ソレノプシス・サエヴィスマ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｓａｅｖｉｓｓｉｍａ）、モンスズメバチ、オオスズメバチ、ベスプラ・フラボピロサ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｆｌａｖｏｐｉｌｏｓａ）、ヨーロッパクロスズメバチ、ベスプラ・マクリフロンス（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ）、ウエスタン・イエロージャケット、ベスプラ・スクアモサ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｓｑｕａｍｏｓａ）、ベスプラ・ビジュア（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｖｉｄｕａ）、キオビクロスズメバチ、鳩扁ダニ、オオギョウレツムシガ、ネコノミ、セイヨウシミ、ヨーロッパトノサマガエル、イヌ、ネコ、ウシ、カリフォルニアマイワシ、タラ、ニワトリ、アナウサギ、メカジキ、ウマ、メグリム、モルモット、ハツカネズミ、ドブネズミ、タイセイヨウサケ、アカトゲトサカ、スルメイカ、ヒメリンゴマイマイ、ミダノアワビ、アニサキス・シンプレクス（Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、豚回虫、ナシ黒斑病菌、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、クルブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、クロコウジカビ、ニホンコウジカビ、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、紅色白癬菌、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、エピコッカム・パーピュラセンス（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）、ササクレヒトヨタケ、ミナミシビレタケ、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、癜風菌、マラセチア・シンポディアリス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）、ヒノキ、スギ、アリゾナイトスギ、ホソイトスギ、マウンテンシダー、ケードネズ、ユニペルス・サビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、エンピツビャクシン、ナツメヤシ、アスパラガス、サフラン、パイナップル、ハルガヤ、ギョウギシバ、オーチャードグラス、ヒロハノウシノケグサ、シラゲガヤ、オオムギ、ホソムギ、イネ、アメリカスズメノヒエ、オニクサヨシ、オオアワガエリ、ナガハグサ、ライムギ、セイバンモロコシ、コムギ、トウモロコシ、サンジャクバナナ、セロリ、ニンジン、ブタクサ、ブタクサモドキ、オオブタクサ、ハタヨモギ、ヒマワリ、レタス、カラシナ、セイヨウアブラナ、ヤセイカンラン、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、シロガラシ、テンサイ、シロザ、ノハラヒジキ、メロン、キウイフルーツ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓまたはＡｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、ブラジルナットノキ、ラッカセイ、ダイズ、レンズマメ、アオバナルーピン、エンドウマメ、インゲンマメ、リョクトウ、ヨーロッパハンノキ、シダレカンバ、セイヨウシデ、ヨーロッパグリ、ヘーゼルナッツ、ブラックウォルナット、カシグルミ、ホワイトオーク、ニチニチソウ、セイヨウトネリコ、ヨウシュイボタ、オリーブノキ、ヘラオオバコ、ゴマ、ライラック、アボカド、パラゴムノキ、メルクリアリス・アンヌア（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ａｎｎｕａ）、トウゴマ、モミジバスズカケノキ、スズカケノキ、オランダイチゴ、カナムグラ、リンゴ、クロミグワ、カベイラクサ、ヒカゲミズ、アンズ、サクランボ、セイヨウスモモ、アーモンド、モモ、セイヨウナシ、ヨーロッパキイチゴ、インドナツメ、マスカット、カシューナットノキ、レモン、マンダリン、オレンジ、ライチ、ピスタチオ、トウガラシ、トマト、およびジャガイモなどから選択される１以上の種由来のアレルゲンが挙げられる。
【００３３】
１以上のアレルゲンは、オオアワガエリ、シダレカンバ、ヤケヒョウヒダニ由来のアレルゲンであることが好ましく、オオアワガエリ由来のアレルゲンであることが最も好ましい。
【００３４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、フラグメントの起源であるアレルゲンはすべて、上記のリストに記載の１つの種に由来する。すなわち、この実施形態においては、異なる「起源であるアレルゲン」は、すべて同一の種に由来する。
【００３５】
本発明における好適なアレルゲン群は、花粉アレルゲン、例えばオオアワガエリ由来のアレルゲンからなる。前記アレルゲンは、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ３、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１１、Ｐｈｌ  ｐ１２およびＰｈｌ  ｐ１３からなる群より選択されることが好ましく、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６からなる群より選択されることが最も好ましい。これら選択され得る花粉アレルゲンのアミノ酸配列を、配列番号１〜１０にそれぞれ示す。
【００３６】
フラグメントの起源となり得る他の具体的なアレルゲンとしては、欧州特許第１８１７３３０（Ｂ１）号明細書に記載のものなども挙げられ、この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００３７】
前記ポリペプチド内のフラグメントは、少なくとも２つの異なるアレルゲン、好ましくは２〜１０つの異なるアレルゲン、より好ましくは２〜５つの異なるアレルゲン（例えば、２、３、４または５つの異なるアレルゲン）に由来する。
【００３８】
ある特別な実施形態において、前記ポリペプチド群は少なくとも２つのポリペプチドを含み、これらのポリペプチドは同一のフラグメントから構成されるもののその結合順序が異なる。
【００３９】
ＩｇＥ反応性の判定
本発明の方法は、さらなる工程において、前記ポリペプチドのＩｇＥ反応性を判定する。「ＩｇＥ反応性」とは、広義には、ある物質のＩｇＥ抗体に対する結合能を意味する。より具体的には、本明細書における「ＩｇＥ反応性」とは、前記ポリペプチドの、ポリペプチド内のフラグメントの起源である１以上のアレルゲンに対してアレルギーを示す個体由来のＩｇＥ抗体に結合する能力を表す。
【００４０】
ＩｇＥ反応性は、（１）フラグメントの起源である１以上のアレルゲンに対してアレルギーを示す個体の血清中のＩｇＥと、（２）前記ポリペプチドとの結合の程度を求めることにより測定できる。このＩｇＥ反応性の測定は、参考文献（１８）または（１９）に記載の方法により行ってもよい。
【００４１】
あるいは、ＩｇＥ反応性およびアレルゲン性は、１以上の前記アレルゲンに対してアレルギーを示す個体より単離したヒト好塩基球表面のＣＤ２０３ｃの発現量を調べることにより判定することもできる。実施例４および参考文献（２０）を参照のこと。
【００４２】
Ｔ細胞反応性の判定
本発明の方法は、さらなる工程において、前記ポリペプチドのＴ細胞反応性を判定する。本明細書における「Ｔ細胞反応性」とは、ある物質の、Ｔ細胞受容体に特異的に結合する能力を意味する。より具体的には、「Ｔ細胞反応性」とは、前記ポリペプチドの、Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を表す。
【００４３】
前記ポリペプチドのＴ細胞反応性は、
（１）フラグメントの起源である１以上のアレルゲンに対してアレルギーを示す個体より単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を準備し、
（２）このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞の増殖の程度を求める
ことにより測定できる。実施例５および参考文献（１６）を参照のこと。
【００４４】
防御性ＩｇＧ応答の誘導
本発明の方法は、さらなる工程において、前記ポリペプチドの、フラグメントの起源である１以上のアレルゲンに対してＩｇＧ応答を誘導する能力を判定する。この判定は、
（１）前記ポリペプチドで非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫し、
（２）この非ヒト哺乳動物における、フラグメントの起源である１以上の前記アレルゲンに対する特異的ＩｇＧ抗体の増加量を求める
ことにより実施できる。測定するＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体が好ましい。工程（２）はＥＬＩＳＡ法により行われることが好ましい。実施例６を参照のこと。
【００４５】
本発明の方法は、前記ポリペプチドが防御性ＩｇＧ応答をどの程度誘導できるかを判定する工程をさらに含む。この工程は、
（１）前記ポリペプチドで非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫して、ＩｇＧ抗体を含む組成物を準備し、
（２）前記ポリペプチド内のフラグメントの起源である１以上の前記アレルゲンに対してアレルギーを示す個体由来のＩｇＥ抗体を含む組成物を準備し、
（３）ＩｇＧ抗体を含む前記組成物が、１以上の前記アレルゲンと前記ＩｇＥ抗体との結合を阻害可能であるか否か、および／またはその阻害の程度を判定する
ことにより実施できる。
【００４６】
この試験は、ＥＬＩＳＡ法により行われることが好ましい。例えば、フラグメントの起源である野生型アレルゲンをＥＬＩＳＡプレートに固定し、このＥＬＩＳＡプレートを、ＩｇＧ抗体を含む前記組成物と接触させ、ＩｇＧ抗体と固定化アレルゲンとを結合させる。洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートを、ＩｇＥ抗体を含む前記組成物と接触させて、洗浄後、ＩｇＥ抗体量を求める。実施例７を参照のこと。
【００４７】
本発明のポリペプチドの選択
本発明の方法は、最終工程として、良好な特性を示しひいてはワクチンとしての利用可能性を有する有用なポリペプチドを選択する工程を含む。選択されるポリペプチドは以下の特性を有する必要がある:
（ｉ）ポリペプチド内のフラグメントの起源であるアレルゲンの１以上よりもＩｇＥ反応性が低い；
（ｉｉ）Ｔ細胞反応性を有する；
（ｉｉｉ）ポリペプチド内のフラグメントの起源であるアレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導できる；かつ
（ｉｖ）ポリペプチド内のフラグメントの起源であるアレルゲンへのアレルギー患者由来ＩｇＥの結合を阻害する防御性ＩｇＧ応答を誘導できる。
【００４８】
上記の（ｉ）に関しては、起源である少なくとも１つのアレルゲンより、対象のポリペプチドのＩｇＥ反応性が低い場合、そのポリペプチドは選択されるが、好ましくは、起源であるアレルゲンのいずれと比較しても対象のポリペプチドのＩｇＥ反応性が低い場合にのみ、そのポリペプチドは選択される。例えば、ポリペプチドがＰｈｌ  ｐ２およびＰｈｌ  ｐ５由来のフラグメントからなる場合、選択されるためには、ポリペプチドのＩｇＥ反応性は、Ｐｈｌ  ｐ２より低くかつＰｈｌ  ｐ５より低くなければならない。
【００４９】
選択されるためには、参考文献１６および実施例４に記載されるような定量的ＩｇＥ測定により求められるＩｇＥ反応性およびアレルゲン性が、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減していることが好ましい。
【００５０】
必要条件（ｉｉ）に関しては、対象のポリペプチドがアレルゲン特異的Ｔ細胞の活性化を誘導できる（実施例５）場合のみ、そのポリペプチドは選択される。
【００５１】
必要条件（ｉｉｉ）に関しては、対象のポリペプチドで免疫した際にアレルゲン特異的ＩｇＧ応答を誘導できる（例えば、実施例６を参照のこと）場合のみ、そのポリペプチドは選択される。
【００５２】
必要条件（ｉｖ）に関しては、対象のポリペプチドによる免疫化で誘導されたＩｇＧ抗体がアレルギー患者由来ＩｇＥの野生型アレルゲンへの結合を阻害できる（例えば、実施例７を参照のこと）場合のみ、そのポリペプチドは選択される。
【００５３】
本発明の方法により同定される低アレルゲン性ポリペプチド
本発明は、さらなる態様において、本発明により同定・作製される低アレルゲン性ポリペプチドに関する。
【００５４】
本発明の低アレルゲン性ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも４個のフラグメントを含んでもよく、該フラグメントからなってもよい。前記ポリペプチド内の隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ少なくとも１つのフラグメントはＰｈｌ  ｐ１またはＰｈｌ  ｐ５に由来する。フラグメントの数はＮ個であってもよく、Ｎは上記と同一の意味を有する。
【００５５】
本発明の別の実施形態において、本発明の低アレルゲン性ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも４個のフラグメントを含んでもよく、該フラグメントからなってもよい。前記融合ポリペプチド内の隣接する任意の２フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ各フラグメントは配列番号５５〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。これらのアミノ酸配列は、本願実施例で使用したフラグメントに含まれる。フラグメントの数はＮ個であってもよく、Ｎは上記と同一の意味を有する。本発明の低アレルゲン性ポリペプチドは、以下の（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＶ）：
（ＶＩＩＩ）Ｍｅｔ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ−ｔａｇ、
（ＩＸ）Ｍｅｔ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ、
（Ｘ）Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ−ｔａｇ、
（ＸＩ）Ｍｅｔ−ｔａｇ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ、
（ＸＩＩ）ｔａｇ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ、
（ＸＩＩＩ）ｔａｇ−Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ−ｔａｇ、および
（ＸＩＶ）Ｆ１−Ｆ２−．．．−ＦＮ
のいずれかの構造で構成されていることが好ましい。上記式中、ＭｅｔはＮ末端メチオニン残基を示し、Ｆ１、Ｆ２およびＦＮは、それぞれ第１、第２および第Ｎフラグメントを示し、ｔａｇはタグ配列（例えば、（Ｈｉｓ）６）を示し、各フラグメントは配列番号５５〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。通常、タグ配列は５〜１０個のアミノ酸で構成される。
【００５６】
本発明の低アレルゲン性ポリペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、３６および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことがより好ましい。これらのアミノ酸配列は、それぞれ構築物Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＰおよびＱに含まれる（実施例を参照のこと）。本発明の低アレルゲン性ポリペプチドは、以下の（ＸＶ）〜（ＸＸＩ）：
（ＸＶ）Ｍｅｔ−ＳＥＱ−ｔａｇ、
（ＸＶＩ）Ｍｅｔ−ＳＥＱ、
（ＸＶＩＩ）ＳＥＱ−ｔａｇ、
（ＸＶＩＩＩ）Ｍｅｔ−ｔａｇ−ＳＥＱ、
（ＸＩＸ）ｔａｇ−ＳＥＱ、
（ＸＸ）ｔａｇ−ＳＥＱ−ｔａｇ、および
（ＸＸＩ）ＳＥＱ
のいずれかの構造で構成されていてもよい。上記式中、ＭｅｔはＮ末端メチオニン残基を示し、ＳＥＱは配列番号２２、２３、２４、２５、３６および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｔａｇはタグ配列（例えば、（Ｈｉｓ）６）を示す。通常、タグ配列は５〜１０個のアミノ酸で構成される。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、配列番号３９、４０、４１、４２、５３および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなっていてもよい。構築物Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＰおよびＱは、それぞれこれらのアミノ酸配列からなる（実施例を参照のこと）。これらの実施形態は前述の構造（ＶＩＩＩ）または（ＸＶ）に相当する。
【００５８】
本発明の方法に関する上記のすべての実施形態は、本発明の低アレルゲン性ポリペプチドに適用することが可能であり、逆もまた同様である。
【００５９】
本発明のさらなる態様
さらに本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重により、複数の異なるポリヌクレオチド分子が１種類のポリペプチドをコードする場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドを宿主細胞で発現させることにより取得するための発現用コンストラクトであることが好ましい。発現用コンストラクトは、プロモーター配列、抗生物質耐性因子をコードする遺伝子、複製開始点などの当技術分野で公知の構成要素をさらに含んでいてもよい。
【００６０】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドがトランスフェクションされた細胞、または本発明のポリヌクレオチドで形質転換された細胞に関する。好適な細胞としては、真核細胞または原核細胞などが挙げられる。真核細胞にトランスフェクションする方法としては、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などの当技術分野で公知の方法が挙げられる。
【００６１】
さらに本発明は、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、１以上の薬学的に許容される担体または希釈剤（緩衝液や塩溶液など）をさらに含んでいてもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物はワクチン組成物である。ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントをさらに含む。
【００６２】
また本発明は、本発明のポリペプチドの調製方法に関する。この方法は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを準備する工程、該ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入する工程、得られた宿主細胞を目的のハイブリッドポリペプチドが発現される条件下で培養する工程、および前記細胞より発現産物を回収する工程を含む。前記ポリヌクレオチドは当技術分野で公知の方法により作製することができる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法によって作製することが好ましい場合もある。花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ３、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１１、Ｐｈｌ  ｐ１２およびＰｈｌ  ｐ１３のｃＤＮＡ配列を、配列番号１１〜２０にそれぞれ示す。当業者であれば、これらの配列および本願の開示に基づいて、本発明のポリペプチドをコードする適切な核酸を容易に設計することができる。
【００６３】
さらに本発明は、アレルギー性疾患を予防および／または治療する医薬を調製するための、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは細胞の使用に関する。このような医薬は、Ｉ型アレルギーのＤＮＡワクチン接種にそのまま直接使用できる、ワクチンをコードするポリヌクレオチドで構成されていてもよい。現在免疫療法に慣例的に使用されているＩ型アレルギー性疾患の経口、舌下または非経口用治療製剤を調製するために、組換えまたは合成ポリペプチドを使用してもよい。製剤例としては、舌下免疫療法用の製剤、または注射免疫療法用のアジュバント結合型ハイブリッドポリペプチドなどが挙げられる。本発明のさらなる適用の可能性として、例えば樹状細胞やその他の抗原提示細胞などの細胞を用いた免疫療法の形態なども挙げられる。これらの細胞は形質転換体であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原を発現する。好ましくは、適切なベクターにより形質転換されたオルソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）な細胞を使用する。
【００６４】
適用の一態様としては、アジュバント結合型ポリペプチドの皮下注射が挙げられる。別の可能性として、ポリペプチドの構成成分に対する免疫寛容またはアネルギーを誘導するために、ポリペプチドを経口投与または経鼻投与することも考えられる。すべての可能な製剤は、当業者に公知の基準（アジュバントの用量および用法に関する基準）に従って調製することができる。
【００６５】
さらに本発明は、予防接種または寛容誘導に用いる医薬を調製するための、本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載のポリペプチドもしくは細胞の使用に関する。ハイブリッドポリペプチドの予防投与とは、個体、好ましくはＩ型アレルギーにかかったことのない子供に、ハイブリッドワクチンの構成成分に対する免疫寛容、アネルギーもしくは非応答性、または防御免疫の状態を誘導するために、ハイブリッドポリペプチドを投与することを意味する。このような状態への誘導は、すでに確定診断されているアレルギー性疾患を治療するために、種々のプロトコールによって達成してもよい。このような予防療法を、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて行ってもよい。
【００６６】
本発明は、さらなる実施形態において、検体中のアレルゲン性タンパク質に対する抗体を検出するための、本明細書に記載のポリペプチドの使用に関する。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＡであってもよい。抗体の検出には、体液より採取した検体中の抗体の濃度を測定してもよい。検体は、動物由来でもヒト由来であってもよい。このような試験は、液相に存在するポリペプチド、または固相に固定されたポリペプチドに基づいて行われる。このような試験の例としては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、または検体中の特異抗体に結合させるためにポリペプチドを固定化して行うその他の試験などが挙げられる。あるいは、例えば競合的免疫アッセイのように、抗体を含有する液に直接ポリペプチドを加えて特異抗体を吸着させてもよい。
【００６７】
本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞増殖実験などの細胞実験に使用してもよい。
【００６８】
添付の配列表に記載のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の概要：
2013504307.tif 000002
2013504307.tif 000003
2013504307.tif 000004
【００６９】
アミノ酸配列を示す配列番号１〜１０において、シグナルペプチドを有する場合は、シグナルペプチドが欠失した成熟型ペプチドを示している。
【００７０】
以下の実施例により、本発明についてさらに説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７１】
以下の実験において、上記の手法は組み合わせることによって花粉のように複雑なアレルゲン物質にまで拡張可能であることを示す。本発明者らは、オオアワガエリ由来の４つの主要なアレルゲン（Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６）に基づく花粉症治療用ワクチンを作製した（１３、１４）。構造データおよびエピトープマッピング解析を参照して、これらのアレルゲンを低アレルゲン性のフラグメントに分割した。以下に、これらのフラグメントからそれぞれ異なる組み合わせで構成されるハイブリッドタンパク質の作製、その生化学的および免疫学的特性、ならびに花粉症ワクチン接種に用いる候補分子として４種類のハイブリッドタンパク質をどのようにして選択したかについて記載する。
【００７２】
＜実施例１＞
ハイブリッド分子の設計、発現および精製
低アレルゲン性ハイブリッド分子を作製するために、主要なオオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６由来のアレルゲンフラグメントを組み合わせて、図１に示すような１７種類の異なるハイブリッド分子を設計した。設計した各タンパク質（Ａ〜Ｑと記載する）のアミノ酸配列を表１に示す。Ｐ１ＭおよびＰ２Ｍは、以前に設計したアレルゲン誘導体（参考文献１５、１６）である。これらの配列はすべて、大腸菌発現用にコドン最適化されており、各配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）が、３’末端に６×ヒスチジンタグ、次いで終止コドンが付加されている。ハイブリッド分子Ａ〜Ｑをコードする遺伝子を、それぞれ発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングして、液体培養により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で発現させた。すべてのタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより標準プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従って精製した。発現したハイブリッド分子の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた（図２）。
【００７３】
【表１】
2013504307.tif 000005
【００７４】
＜実施例２＞
ハイブリッド分子の二次構造の推定
ハイブリッド分子の二次構造を決定するために、タンパク質Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱをそれぞれ水に溶解し、各タンパク質の遠紫外線ＣＤスペクトルをＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｐａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ、東京、日本）を用いて収集した。遠紫外線ＣＤスペクトルの収集は、（１６）の記載に準じて行った。二次構造を分析したところ、これらのハイブリッドタンパク質はすべて、ランダムコイル構造を示した。これは他の複数のアレルゲン誘導体においても以前に確認されている（１８、１９）。
【００７５】
＜実施例３＞
ハイブリッド分子のＩｇＥ反応性
ハイブリッド分子のＩｇＥ反応性を調べるために、花粉症患者の血清からＩｇＥを採取し、該ＩｇＥの、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６由来のハイブリッド分子Ａ〜Ｑ、ｒＰｈｌ  ｐ１、ｒＰｈｌ  ｐ２、ｒＰｈｌ  ｐ５、ｒＰｈｌ  ｐ６、またはネガティブコントロールであるＨＳＡに対する直接的な結合を、（１８、１９）に記載の非変性ドットブロット実験により調べた。花粉症患者のＩｇＥ抗体は、組換えタンパク質である「野生型」アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６には結合したが、コントロールタンパク質ＨＳＡには結合しなかった。一方、ハイブリッド分子Ａ〜Ｑに対しては、意外にもそれぞれ異なる反応性を示すことが分かった。しかし、この異なる反応性を一次構造によって説明することはできなかった（例えば、ハイブリッドＡとＣ、およびハイブリッドＥとＦは、それぞれ全く同一のアレルゲンフラグメントを含んでいるため）。
【００７６】
＜実施例４＞
ハイブリッド分子Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱの低アレルゲン性
４つのハイブリッド分子Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱを選択し、これらについてさらなる解析を行った。ＩｇＥ依存性のエフェクター細胞活性化に関するハイブリッドＢ、Ｃ、ＰおよびＱのＩｇＥ反応性を判定するために、花粉症患者より単離したヒト好塩基球表面のＣＤ２０３ｃの発現を調べた。ＣＤ２０３ｃは、ヒト好塩基球の活性化マーカーとして報告されており、受容体に結合したＩｇＥ同士がアレルゲンにより架橋を形成するとアップレギュレートされる（２０）。図５に示すように、等モル量の野生型アレルゲンと比較して少なくとも１０倍高い濃度のハイブリッド分子に対して、好塩基球は耐容性を示した（患者１〜１２）。このデータは、４つのハイブリッド分子Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱのアレルゲン性が大幅に減弱していることを示唆するものである。
【００７７】
＜実施例５＞
Ｔ細胞の増殖
ハイブリッド分子のＴ細胞反応性を評価するために、４名の花粉症患者より単離したＰＢＭＣを用いて、（１６）の記載に準じてｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖実験を行った。ハイブリッド分子のアレルゲン性は減弱しているものの、野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６のほとんどのＴ細胞エピトープは保存されていた（表２）。
【００７８】
【表２】
2013504307.tif 000006
【００７９】
＜実施例６＞
ハイブリッド分子Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱによる免疫化は、野生型アレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導した
Ｂ、Ｃ、ＰまたはＱによる免疫化で誘導されたＩｇＧ抗体が野生型アレルゲンｒＰｈｌ  ｐ１、ｒＰｈｌ  ｐ２、ｒＰｈｌ  ｐ５およびｒＰｈｌ  ｐ６を認識可能か否か判定するために、２つの異なる動物モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびウサギ）を使用した。Ｐｈｌ  ｐ１とＰｈｌ  ｐ５との混合物、Ｐｈｌ  ｐ２とＰｈｌ  ｐ６との混合物、ＢとＣとの混合物、ＰまたはＱでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６のそれぞれに対する特異的ＩｇＧ１抗体の量の推移をＥＬＩＳＡ法により比較した（図６）。ハイブリッドＢ＋Ｃ、ＰおよびＱは、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６に対して特異的なＩｇＧ１抗体応答を誘導することが可能であり、その応答は、野生型アレルゲン自体による抗体応答よりも強力であった。
【００８０】
Ｂ、Ｃ、ＰまたはＱによる免疫化をウサギに対しても行い、ウサギにおけるアレルゲン特異的なＩｇＧ抗体応答の推移を調べた。ウサギ抗血清を段階希釈し、各希釈液中のＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６のそれぞれに対する特異的ＩｇＧ抗体の有無をＥＬＩＳＡにより調べた。構築物Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱは、野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１（図７Ａ）、Ｐｈｌ  ｐ５（図７Ｂ）、Ｐｈｌ  ｐ２（図７Ｃ）およびＰｈｌ  ｐ６（図７Ｃ）に対してＩｇＧ抗体応答を誘導することができた。
【００８１】
＜実施例７＞
ハイブリッドアレルゲンＢ、Ｃ、ＰおよびＱによる免疫化は、アレルギー患者由来ＩｇＥの野生型アレルゲンおよび花粉抽出物への結合を阻害する防御性ＩｇＧ応答を誘導した
ハイブリッド分子Ｂ、Ｃ、ＰおよびＱにより誘導されたＩｇＧ抗体が、花粉症患者由来ＩｇＥのｒＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５、ｒＰｈｌ  ｐ６または天然由来の花粉抽出物への結合を阻害する能力を有するか否かを検討した。ＥＬＩＳＡプレートに固定した天然由来の花粉抽出物と、抗Ｐおよび抗Ｑのウサギ抗血清混合物、抗Ｂ、抗Ｃおよび抗Ｑのウサギ抗血清混合物、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６からなる花粉ハイブリッド（ＧＰＨ）（参考文献１１に記載）で免疫したウサギの抗血清、またはそれぞれの免疫前血清とをあらかじめインキュベーションして、ＥＬＩＳＡ阻害実験を行った。これらのウサギＩｇＧ抗体は、１４名の花粉症患者由来ＩｇＥの花粉抽出物への結合を次の通り阻害した：Ｐ＋Ｑ：７３％；Ｂ＋Ｃ＋Ｑ：７８％；ＧＰＨ：７５％（表３）。同様の実験を、ＥＬＩＳＡプレートに固定したｒＰｈｌ  ｐ１、ｒＰｈｌ  ｐ２、ｒＰｈｌ  ｐ５またはＰｈｌ  ｐ６を用いて行ったところ、平均阻害率は、Ｐｈｌ  ｐ１に対しては８１〜９４％（表４）、Ｐｈｌ  ｐ５に対しては８６〜９０％（表５）、Ｐｈｌ  ｐ２に対しては４５％（表６）、およびＰｈｌ  ｐ６に対しては３４％（表７）であった。
【００８２】
【表３】
2013504307.tif 000007
【００８３】
【表４】
2013504307.tif 000008
【００８４】
【表５】
2013504307.tif 000009
【００８５】
【表６】
2013504307.tif 000010
【００８６】
【表７】
2013504307.tif 000011
【００８７】
＜実施例８＞
ハイブリッド分子Ｂ、ＣおよびＰによる免疫化は、野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１に対するＩｇＧ応答を誘導した
ウサギ抗血清を段階希釈し、各希釈液中のＰｈｌ  ｐ１特異的ＩｇＧ抗体の有無をＥＬＩＳＡにより調べた。構築物Ｂ、ＣおよびＰは、野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１に対するＩｇＧ抗体応答を誘導することができた。このＩｇＧ応答を、高い免疫原性を有する分子として報告されている、野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ５およびＰｈｌ  ｐ６からなるハイブリッド分子（花粉ハイブリッド、ＧＰＨ）（１１）による免疫化で誘導されたＩｇＧ抗体量と比較した。驚くべきことに、ＣおよびＰで免疫したウサギにおいて誘導されたＰｈｌ  ｐ１特異的ＩｇＧ抗体の量は、ＧＰＨの場合の抗体量をさらに上回った。これらの結果を図８に示す。
【００８８】
参考文献
1. Kay AB., Kaplan AP, Bousquet J, Holt PJ.  Allergy and Allergic Diseases. Blackwell Scientific Publ./ Oxford, United Kingdom;2008.
2. Bischoff SC. Role of mast cells in allergic and non-allergic immune responses: comparison of human and murine data. Nat Rev Immunol. 2007.7:93-104.
3. van Nerveen, R.J., Knol, E.F., Ejrnaes, A., Wurtzen, P.A. IgE-mediated allergen presentation and blocking antibodies: regulation of T-cell activation in allergy. Int. Arch. Allergy Immunol. 2006. 141: 119.
4. Bieber T. Fc epsilon RI on human epidermal Langerhans cells: an old receptor with new structure and functions. Int Arch Allergy Immunol. 1997.113:30-4.
5. Valenta, R. and Niederberger, V. (2007).Recombinant allergens for immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 119, 826-830.
6. Focke M, Marth K, Flicker S, Valenta R. Heterogeneity of commercial timothy grass pollen extracts. Clin Exp Allergy. 2008, 38:1400-8.
7. Mothes, N., Heinzkill, M., Drachenberg, K.J., Sperr, W.R., Krauth, M.T., Majlesi, Y., Semper, H., Valent, P., Niederberger, V., Kraft, D., and Valenta, R. (2003). Allergen-specific immunotherapy with a monophosphoryl lipid A-adjuvanted vaccine: reduced seasonally boosted immunoglobulin E production and inhibition of basophil histamine release by therapy-induced blocking antibodies. Clin. Exp. Allergy 33, 1198-1208.
8. Linhart B., and Valenta, R. (2005). Molecular design of allergy vaccines. Curr. Opin. Immunol. 17, 646-655.
9. Niederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, P., Reisinger, J., Pelzmann, M., Hayek,B., Kronqvist, M., Gafvelin, G., Gronlund, H., Purohit, A., Suck, R., Fiebig, H., Cromwell, O., Pauli, G., van Hage-Hamsten, M., and Valenta, R. (2004). Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 14677-14682.
10. Linhart, B., Jahn-Schmid, B., Verdino, P., Keller, W., Ebner, C., Kraft, D., and Valenta, R. (2002). Combination vaccines for the treatment of grass pollen allergy consisting of genetically engineered hybrid molecules with increased immunogenicity. FASEB J. 16, 1301-1303.
11. Linhart, B., Hartl, A., Jahn-Schmid, B., Verdino, P., Keller, W., Krauth, M.T., Valent, P., Horak, F., Wiedermann, U., Thalhammer, J., Ebner, C., Kraft, D., and Valenta, R. (2005). A hybrid molecule resembling the epitope spectrum of grass pollen for allergy vaccination. J. Allergy Clin. Immunol. 115, 1010-1016.
12. Linhart, B. and Valenta, R. (2004). Vaccine engineering improved by hybrid technology. Int. Arch. Allergy Immunol. 134, 324-331.
13. Vrtala S., Susani M., Sperr W.R., Valent P., Laffer S., Dolecek C., Kraft D., and Valenta R. (1996) Immunologic characterization of purified recombinant timothy grass pollen (Phleum pratense) allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5). J Allergy Clin.Immunol 97, 781-787.
14. Vrtala S., Fischer S., Grote M., Vangelista L., Pastore A., Sperr W.R., Valent P., Reichelt R., Kraft D., and Valenta R. (1999) Molecular, immunological, and structural characterization of Phl p 6, a major allergen and P-particle-associated protein from timothy grass (Phleum pratense) pollen. J. Immunol. 163, 5489-5496
15. Mothes-Luksch, N., S. Stumvoll, B. Linhart, M. Focke, M.T. Krauth, A. Hauswirth, P. Valent, P. Verdino, T. Pavkov, W. Keller, M. Grote, R. Valenta. 2008. Disruption of allergenic activity of the major grass pollen allergen Phl p 2 by reassembly as a mosaic protein. J.Immunol. 181:4864-73.
16. Ball, T., B. Linhart, K. Sonneck, . Blatt, H. Hermann, P. Valent, A. Stoecklinger, C. Lupinek, J. Thalhamer, A.A. Fedorov, S.C. Almo, R. Valenta. 2009. Reducing allergenicity by altering allergen fold: A mosaic protein of Phl p 1 for allergy vaccination. Allergy 64:569-80.
17. Vrtala S., Focke M, Kopec J, Verdino P, Hartl A, Sperr WR, Fedorov AA, Ball T, Almo S, Valent P, Thalhamer J, Keller W, Valenta R. Genetic engineering of the major timothy grass pollen allergen, Phl p 6, to reduce allergenic activity and preserve immunogenicity. J. Immunol. 2007. 179: 1730-9
18. Vrtala, S., K. Hirtenlehner, L. Vangelista, A. Pastore, H.-G. Eichler, W. R. Sperr, P. Valent, C. Ebner, D. Kraft, R. Valenta. 1997. Conversion of the major birch pollen allergen, Bet v 1, into two nonanaphylactic T cell epitope-containing fragments. Candidates for a novel form of specific immunotherapy. J. Clin. Invest. 99: 1673-1681.
19. Swoboda I, Bugajska-Schretter A, Linhart B, Verdino P, Keller W, Schulmeister U, Sperr WR, Valent P, Peltre G, Quirce S, Douladiris N, Papadopoulos NG, Valenta R, Spitzauer S. A recombinant hypoallergenic parvalbumin mutant for immunotherapy of IgE-mediated fish allergy. J Immunol. 2007.178:6290-6.
20. Hauswirth AW, Natter S, Ghannadan M, Majlesi Y, Schernthaner GH, Sperr WR, Buhring HJ, Valenta R, Valent P.J. Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. Allergy Clin Immunol. 2002. 110:102-9.
21. Linhart, B., Mothes-Luksch, N., Vrtala, S., Kneidinger, M., Valent, P., and Valenta, R. 2008. A hypoallergenic hybrid molecule with increased immunogenicity consisting of derivatives of the major grass pollen allergens, Phl p 2 and Phl p 6. Biol. Chem. 389:925-33.
【図２】
2013504307.tif 000012
【図１】
2013504307.tif 000013
【図３】
2013504307.tif 000014
【図４】
2013504307.tif 000015
【図５−１】
2013504307.tif 000016
【図５−２】
2013504307.tif 000017
【図５−３】
2013504307.tif 000018
【図５−４】
2013504307.tif 000019
【図６】
2013504307.tif 000020
【図７】
2013504307.tif 000021
【図８】
2013504307.tif 000022
【配列表】
2013504307000001.app
【国際調査報告】
2013504307.tif 000023
2013504307.tif 000024
2013504307.tif 000025
2013504307.tif 000026
2013504307.tif 000027