(57)【要約】  本発明は、α−アミラーゼ、前記α−アミラーゼをコードする核酸、前記α−アミラーゼの生成方法、及び前記α−アミラーゼの使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−及びＣ−ドメイン、及びカルシウム−非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメインを含んで成る単離α−アミラーゼ。
【請求項２】
配列番号１−１２、２９及び３０のいずれかのＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＡ−ドメイン、配列番号１３〜１６及び３１のいずれかのＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＢ−ドメイン、及び配列番号１〜１２、２９及び３０のいずれかのＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＣ−ドメインを含んで成る単離α−アミラーゼ。
【請求項３】
前記Ａ−ドメインが、配列番号４のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、請求項２に記載のα−アミラーゼ。
【請求項４】
前記Ａ１−ドメインが、配列番号４の位置１〜５の範囲の位置で開始し、そして位置９４〜１１４の範囲の位置で終結し、例えば位置１〜３の範囲の位置で開始し、そして位置９９〜１０４の範囲の位置で終結するか、又は位置１〜３の範囲の位置で開始し、そして位置１０４〜１０９、特に位置１〜１０４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項５】
前記Ｂ−ドメインが、配列番号１３の位置９３〜１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１９５〜２１５の範囲の位置で終結し、例えば位置９７〜１０９の範囲の位置で開始し、そして位置１９９〜２１１の範囲の位置で終結するか、又は位置１００〜１０６の範囲の位置で開始し、そして位置２０２〜２０８、特に位置１０３〜２０８の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項６】
前記Ｃ−ドメインが、配列番号４のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項７】
前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号４の位置２０１〜２２１の範囲の位置で開始し、そして位置４７８〜４８３の範囲の位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲の位置で開始し、そして位置４８０〜４８３の範囲の位置で終結するか、又は位置２１１〜２１６の範囲の位置で開始し、そして位置４８０〜４８３、特に位置２１１〜４８３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項８】
配列番号１〜１２、２９及び３０のいずれかのα−アミラーゼよりも熱安定性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項９】
配列番号１〜１２、２９及び３０のいずれかのα−アミラーゼよりも低められたカルシウム感受性を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ、及びβ−アミラーゼ、セルラーゼ（β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼ）、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、イソアミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ及びプルラナーゼから成る群から選択された１又は２以上の酵素を含んで成る組成物。
【請求項１２】
洗濯及び／又は食器洗いのための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの使用。
【請求項１３】
布地の糊抜きのための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの使用。
【請求項１４】
ベークド製品の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの使用。
【請求項１５】
澱粉−含有材料の液化のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの使用。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼで澱粉−含有材料を液化することを含んで成る、液化された澱粉の製造方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼで澱粉−含有材料を液化して、液化されたマッシュを製造し、；
（ｂ）発酵できる糖類を生成するために、前記液化されたマッシュを糖化し；そして
（ｃ）発酵生物の存在下で前記発酵できる糖類を発酵すること
を含んで成る、発酵製品の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及び発酵生物と澱粉基質とを接触することを含んで成る、発酵製品の製造方法。
【請求項１９】
前記発酵製品が、アルコール（例えば、エタノール及びブラノール）、有機酸（例えば、琥珀酸及び乳酸）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート及び２−ケト−Ｌ−グロン酸）、アミノ酸（例えば、リシン）、及びタンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）から成る群から選択される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼをコードする核酸配列。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸配列を含んで成るプラスミド。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸配列又は請求項２１に記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２０に記載の核酸配列により形質転換された、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項２４】
（ａ）ハイブリッドα−アミラーゼの発現を導く条件下で、請求項２２に記載の宿主細胞を増殖し；及び
（ｂ）前記ハイブリッドα−アミラーゼを回収すること、
を含んで成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、α−アミラーゼ、前記α−アミラーゼをコードする核酸、前記α−アミラーゼの生成方法、及び前記α−アミラーゼの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、澱粉、及び他の線状及び枝分れ鎖の１，４−グルコシドオリゴ−及び多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
【０００３】
いくつかの知られている用途、例えば洗剤、ベーキング、醸造、澱粉液化及び糖化、例えば高フルクトースシロップ又はエタノールの製造へのα−アミラーゼの産業的使用の長い歴史が存在する。それらの及び他の用途は、微生物由来のα−アミラーゼ、特に細菌性α−アミラーゼを使用する。
【０００４】
使用される第１の細菌α−アミラーゼの１つは、広く特徴づけられており、そしてその結晶構造がこの酵素のために決定されている。Termamyl（登録商標）としても知られている、Ｂ．リケニホルミス（B. licheniformis）からのα−アミラーゼであった。アルカリアミラーゼ、例えばバチルス種株（ＮＣＩＢ １２２８９、ＮＣＩＢ １２５１２、ＮＣＩＢ １２５１３及びＤＳＭ ９３７５）（国際公開第９５/２６３９７号に開示される）は、洗剤において有用である特定グループのアミラーゼを形成する。それらの既知細菌アミラーゼの多くは、特定の用途においてそれらの官能性を改善するために変性されて来た。
【０００５】
Termamyl（登録商標）及び多くの高能率α−アミラーゼは、活性のためにカルシウムを必要とする。Termamyl（登録商標）の結晶構造は、３個のカルシウム原子が負に荷電されたアミノ残基により調整されるα−アミラーゼ構造体に結合されることを示す。カルシウムについてのこの必要条件は、強いキレート化合物が存在する用途において、例えば洗剤において、又は植物材料が多量の天然錯化剤、例えばフィチン酸塩を含む場合、全穀類からのエタノール生成の間、好都合ではない。
【０００６】
カルシウム−非感受性アミラーゼ、例えば欧州特許第１０２２３３４号及び国際公開第０３／０８３０５４号に開示されるα−アミラーゼ、及びUNIPROT:Q03657に開示される配列を有するバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）α−アミラーゼは知られている。
【発明の概要】
【０００７】
従って、低められたカルシウム−感受性を有するα−アミラーゼを提供することである。
【０００８】
本発明は、カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−及びＣ−ドメイン及びカルシウム−非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメイン又はその一部を含んで成るα−アミラーゼに関する。α−アミラーゼは、強い錯化剤の存在下で高い安定性及び／又は活性を有し、そしてさらに、種々の産業用途において相当に改善された性能を有する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のα−アミラーゼを含んで成る組成物、例えば洗剤組成物にも関する。
【００１０】
さらに、本発明は、本発明のα−アミラーゼをコードする核酸、そのような核酸を含んで成るプラスミド、そのようなプラスミド又は核酸を含んで成る宿主細胞、及びα−アミラーゼの生成方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、配列番号１〜１６、２９及び３０のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
定義
Ａ−、Ｂ−及びＣ−ドメイン：α−アミラーゼの構造は、３種の異なったドメインＡ、Ｂ及びＣを含む。例えば、Machius et al., 1995, J. Mol. Biol. 246: 545-559を参照のこと。用語「ドメイン」とは、完全な分子の明確且つ独立した副構造体を本質的に形成するポリペプチドの領域を意味する。α−アミラーゼは、Ａ−ドメインを示す、活性部位を有するβ/α−バレル、Ｂ−ドメインを示す、β−シート３とα−ヘリックス３との間のかなり長いループ、及びＣ−ドメイン、並びに多くの場合、また炭水化物結合ドメインから成る（例えば、国産公開第２００５／００１０６４号；Machiusなど., 同上）。
【００１３】
α−アミラーゼのドメインは、構造分析、例えば結晶学的技法により決定され得る。α−アミラーゼのドメインを決定するための他の方法は、α−アミラーゼのアミノ酸配列と、ドメインが決定されている別のα−アミラーゼとの配列アラインメントによる。Ｂ−ドメインが決定されているα−アミラーゼにおけるＢ−ドメインとアラインする配列は、所定のα−アミラーゼについてのＢ−ドメインとみなされ得る。
【００１４】
対立遺伝子変異体：用語、対立遺伝子変異体（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は自然界において突然変異により生じる。これにより個体集団内に多型が生じる場合もある。遺伝子の突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドは変化しない）場合もあるが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じる場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体とは、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
【００１５】
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、澱粉、及び他の線状及び枝分れ鎖の１，４−グルコシドオリゴ−及び多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。広範囲の生物、例えば細菌、例えばバチルス属の種、例えばバチルス・リケニルホルミス；菌類の種、例えばアスペルギラス・オリザエ（ＴＡＫＡ−アミラーゼ）又はアスペルギラス・ニガー；植物、例えば大麦及び哺乳類に由来するα−アミラーゼは知られている。
【００１６】
カルシウム−非感受性アミラーゼは、最適な活性及び/又は活性コンホメーション／構造の維持のためにカルシウムの存在を必要としないα−アミラーゼを意味する。
【００１７】
カルシウム−感受性アミラーゼは、その構造を保持し、そして/又は十分な酵素活性を有するためにカルシウムの存在を必要とするα−アミラーゼを意味する。いくつかのカルシウム−感受性アミラーゼに関して、それらが、活性コンホメーション下で酸性アミノ酸残基に調整されるカルシウム原子を含むことは示されている。多数のカルシウム−感受性α−アミラーゼが知られており、そしてそれらの有益な性質のために産業的に使用されて来た。カルシウム−感受性α−アミラーゼは一般的に、それらの構造において調整されるカルシウム原子の損失を導く状態、例えば洗剤組成物及び燃料マスに対して敏感である。
【００１８】
カルシウム感受性は、強い錯化剤の存在下で所定のα−アミラーゼをインキュべートし、そしてα−アミラーゼの活性又は安定性に対するこのインキュベーションの影響を分析することにより決定される。カルシウム−感受性α−アミラーゼは錯化剤の存在下でそれほど安定性ではないか、又はそのようなインキュベーションによりその活性の主要部分又はすべてを失うが、ところがカルシウム−非感受性α−アミラーゼはインキュベーションの間、活性を失わないか又は単にマイナーな部分を失うであろう。錯化剤強度は、当業界において知られている方法、例えば引用により本明細書に組込まれる、Nielsen et al, 2003, Anal. Biochem. 314: 227-234; 及び Nagarajan and Paine, 1984, J. Am. Oil Chem. Soc. 61 (9): 1475-1478に開示される方法を用いて評価され得る。そのようなアッセイのために使用され得る強い錯化剤の例は、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＴＭＰＡ（ジエチレントリアミン−ペンタ−メチレンリン酸）及びＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイルビス（リン酸））である。他の強い錯化剤が、α−アミラーゼのカルシウム感受性を決定するために使用され得る。当業者は、カルシウム感受性を決定するために使用する温度、ｐＨ及びカルシウム濃度を決定することができる。典型的には、最適温度よりも約５〜１０℃高い温度を用いる。
【００１９】
コーディング配列：用語、「コーディング配列」（coding sequence）とは、そのポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は通常、オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）により決定される。オープン・リーディング・フレームは通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧやＴＴＧ等の代替開始コドンから開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、組換えポリヌクレオチドの何れでもよい。
【００２０】
制御配列：用語、「制御配列」（control sequence）とは、本発明のα−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものとして定義される。各制御配列は、α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドに対して同種でも外来でもよく、互いに同種でも外来でもよい。そのような制御配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、制御配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、制御配列にリンカーを付加してもよい。これによりそのような制御配列と、α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドのコーディング領域との連結が容易になる。
【００２１】
発現：用語、「発現」（expression）とは、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを意味する。いすれかのステップとしては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
【００２２】
発現ベクター：用語、「発現ベクター」（expression vector）とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とするさらなるヌクレオチドと操作的に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子として定義される。
【００２３】
宿主細胞：用語、「宿主細胞」（host cell）とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換、トランスフェクション、形質導入等が可能な任意の細胞型を含む。用語「宿主細胞」とは、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。
【００２４】
改善された特性：用語、「改善された特性」（improved property）とは、α−アミラーゼに伴う特性であって、他のα−アミラーゼと比較して改善されたものをいう。そのような改善された特性としては、これらに限定されるものではないが、改変された温度−依存性活性プロフィール、熱安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、基質特異性、生成物特異性、及び化学安定性等が挙げられる。
【００２５】
核酸コンストラクト：用語、「核酸コンストラクト」とは、天然遺伝子から単離され、あるいは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、あるいは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味する。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な制御配列を含む場合、核酸コンストラクトは「発現カセット」と同義となる。
【００２６】
操作的に連結される：用語、「操作的に連結され」とは、ポリペプチドのコーディング配列が制御配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列の制御配列がコーディング配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【００２７】
親酵素：用語「親」α−アミラーゼとは、本発明のα−アミラーゼを生成するために修飾が行われるα−アミラーゼを意味する。親酵素は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド、又はいずれかの適切な手段により調製される、その変異体であり得る。例えば、親タンパク質は、修飾された又は改変されたアミノ酸配列を有する、天然に存在するポリペプチドの変異体であり得る。親はまた、対立遺伝子変異体でもあり得る。
【００２８】
ポリペプチドフラグメント：用語、「ポリペプチドフラグメント」とは、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は２以上（数個）のアミノ酸が欠失してなるポリペプチドを意味し、そのようなフラグメントはα−アミラーゼ活性を有する。
【００２９】
一観点によれば、フラグメントは、少なくとも４８１個のアミノ酸残基、例えば少なくとも４８３個、少なくとも４８６個、及び少なくとも４９３個のアミノ酸残基を含む。
【００３０】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性を、「配列同一性」というパラメーターで表す。
【００３１】
本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００３２】
本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００３３】
下位配列：用語、「下位配列」（subsequence）とは、成熟ポリペプチドコーディング配列の５'及び／又は３'末端から１又は２以上（数個）のヌクレオチドが欠失してなるポリヌクレオチド配列を意味し、ここで前記下位配列はα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。
【００３４】
変異体：用語「変異体」とは、改変、すなわち１又は２以上（数個）の位置での１又は２以上（数個）のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失を含んで成る、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは１つの位置を占有するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換を意味し；欠失とは１つの位置を占有するアミノ酸の除去を意味し；そして挿入とは１つの位置を有するアミノ酸に隣接して、そしてそれに続いて、アミノ酸、例えば１〜５個のアミノ酸の付加を意味する。
【００３５】
野生型：用語「野生型」α−アミラーゼとは、天然に存在する微生物、例えば天然において見出される細菌、酵母又は糸状菌により発現されるα−アミラーゼを示す。
【００３６】
変異体の設計上の規約
本発明の目的においては、特にことわらない限り、配列番号２７に開示されるハイブリッドポリペプチド（バチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼのアミノ酸１〜１０４（配列番号４）、続いてバチルス・サーキュランスα−アミラーゼのアミノ酸１０３〜２０８（配列番号１３）、続いてバチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼのアミノ酸２１１〜５１３（配列番号４）を有する）を用いて、別のα−アミラーゼの対応するアミノ酸残基を決定する。別のα−アミラーゼのアミノ酸配列を、配列番号２７に開示される成熟ポリペプチドとアラインし、そしてこのアラインメントに基づいて、配列番号２７に開示される成熟ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置の番号を、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）のＮｅｅｄｌｅプログラム、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降のバージョンで実施されるようなNeedleman-Wunschアルゴリズム (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を用いて決定することができる。
【００３７】
別のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、"ClustalW" (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948)を用いて、複数のポリペプチド配列のアラインメントにより確認され得る。
【００３８】
他の酵素が配列番号２７の成熟ポリペプチドとは異なり、その結果、従来の配列に基づく比較がそれらの関係を検出するのに失敗する場合（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615）、他の配列対比較アルゴリズムが使用され得る。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いてデータベースを検索する検索プログラムを用いることにより、より高い感度で配列に基づく検索を行うことができる。例えば、PSI-BLAST プログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成するもので、遠縁の相同体を検出することが可能である（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）。着目するポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが１又は２以上（数個）の表現がタンパク質構造データベースに存在する場合には、さらに高い感度が達成可能である。例えばGenTHREADER（Jones 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881）等のプログラムは、種々のソース由来の情報（PSI-BLAST、二次構造予測、構造アラインメントプロファイル、及び溶媒和ポテンシャル）をニューラルネットワークに入力し、クエリー配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919 の方法を用いれば、未知の構造の配列を SCOP データベースに存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。それらのアラインメントを用いれば、さらに着目するポリペプチドの相同性を生成することができる。そのようなモデルの精度を検証するには、その目的で開発された種々のツールを用いればよい。
【００３９】
既知構造のタンパク質の場合、構造的アラインメントの検索及び生成に、いくつかのツールやリソースが利用できる。例えばタンパク質の SCOP スーパーファミリーは構造的にアラインメントがなされており、そのようなアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２以上のタンパク質構造のアラインメントには、種々のアルゴリズム、例えばディスタンス・アラインメント・マトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96）又はコンビナトリアル・エクステンション（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747）が使用できる。さらには、これらのアルゴリズムを実行し、着目する構造について構造データベースに質問すれば、可能性のある構造的相同体を発見することも可能である（例えば Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567）。これらの構造的アラインメントを用いて、同一の構造的スーパーファミリーに属するタンパク質中の、構造的及び機能的に対応するアミノ酸残基を予測することもできる。この情報を、相同モデリング及びプロファイル検索から得られた情報と組み合わせれば、所望の突然変異によりあるタンパク質を近縁又は遠縁の相同体に移行させるためには、どの残基を変異させればよいかを予測することが可能となる。
【００４０】
本発明の種々のα−アミラーゼ変異体を記述するにあたり、参照の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。いずれの場合も、アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を用いる。
【００４１】
置換：アミノ酸置換については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、置換アミノ酸。従って、位置２２６におけるトレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重突然変異については、例えば加算記号（「＋」）により区切って表記する。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）に置換し、位置４１１のセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）に置換する突然変異を表す。或いは、多重突然変異をスペースで区切り、例えばＧ２０５Ｒ  Ｓ４１１Ｆのように表記する。
【００４２】
欠失：アミノ酸欠失については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置＊。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表す。多重欠失については、加算記号（「＋」）により区切って表記し、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」のように表記すればよい。
【００４３】
挿入：アミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸＃１、新たに挿入されるアミノ酸＃２；等］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの後にリシン及びアラニンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表す。
【００４４】
そのような場合において、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基の番号付けは、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対し、小文字を付加することにより行う。すなわち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
【００４５】
【表１】
2013516166.tif 000002
【００４６】
多重改変：多重改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）により分けられ、例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０のＡｒｇをＴｙｒにより置換し、位置１９５のＧｌｙをＧｌｕに置換する突然変異を表す。
【００４７】
異なった改変：異なった改変が１つの位置で導入され得る場合、その異なった改変はコンマ（,）により分けられ、例えば「Ａｒｙ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は位置１７０でのアルギンのチロシン又はグルタミン酸による置換を表す。「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、次の変異体を表す：Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ、Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ、Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ、及びＴｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ。
【００４８】
α−アミラーゼ
本発明のα−アミラーゼは、カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−ドメイン、カルシウム非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメイン及びカルシウム−感受性α−アミラーゼのＣ−ドメインを含んで成る。さらに、親α−アミラーゼは炭水化物−結合モジュールを含むことができる。
【００４９】
カルシウム−感受性α−アミラーゼ
カルシウム−感受性α−アミラーゼの例は、次のα−アミラーゼを包含する：
１．配列番号１のアミノ酸配列を有するバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ；
【００５０】
２．配列番号２のアミノ酸配列を有する、国際公開第２００５／００１０６４号に記載されるバチルス・フラボサーマス（Bacillus flavothermus）アミラーゼ、ＡＭＹ１０４８；
【００５１】
３．配列番号３のアミノ酸配列を有するバチルス・リケニルホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ；
【００５２】
４．配列番号４のアミノ酸配列を有するバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）α−アミラーゼ；
【００５３】
５．配列番号５のアミノ配列を有する、国際公開第００／６００６０号に記載されるバチルスsp. DSM12649に由来するα−アミラーゼＡＡ５６０；
【００５４】
６．配列番号６のアミノ酸配列を有する、国際公開第９５／２６３９７号に記載されるバチルス sp.株ＮＣＩＢ  １２５１２に由来するα−アミラーゼ；
【００５５】
７．配列番号７のアミノ酸配列を有する、国際公開第９５／２６３９７号に記載されるバチルス sp.株ＮＣＩＢ  １２５１３に由来するα−アミラーゼ；
【００５６】
８．配列番号８のアミノ酸配列を有する、Tsukamoto et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 151: 25-31により記載されるα−アミラーゼＳＰ７０７；
【００５７】
９．配列番号９のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼＴＳ−２２；
【００５８】
１０．配列番号１０のアミノ酸配列を有する、J. Appl. Microbiology, 1997, 82: 325-334 (ＳＷＡＬＬ：ｑ５９２２２)により記載されるα−アミラーゼＴＳ−２３；
【００５９】
１１．配列番号１１のアミノ酸配列を有する、国際公開第９７／００３２４号に記載されるバチルス sp. ＫＳＭ−ＡＰ１３７８ (ＦＥＲＭ  ＢＰ−３０４８)に由来するα−アミラーゼ；
【００６０】
１２．配列番号１２のアミノ酸配列を有する、国際公開第０２／１０３５６号に記載されるバチルス sp. Ａ７−７に由来するα−アミラーゼ；
【００６１】
１３．配列番号２９のアミノ酸配列を有するバチルス・ステアロサーモフィラス(Spezyme Xtra)に由来するα−アミラーゼ；
【００６２】
１４．配列番号３０のアミノ酸配列を有する、Jeang et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:3651 -3654に記載されるサイトファージ（Cytophaga）α−アミラーゼ；並びにそれらのカルシウム−感受性α−アミラーゼのいずれかのハイブリッド及び変異体。
【００６３】
他のカルシウム−感受性α−アミラーゼは、欧州特許第０２５２６６６号に記載されるＢ．リケニホルミス株（ＡＴＣＣ２７８１１）により製造されるα−アミラーゼを包含する。
【００６４】
カルシウム−感受性α−アミラーゼは、複数のカルシウム−感受性α−アミラーゼのハイブリッド、例えばバチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼとバチルス・リケニホルミスα−アミラーゼとの間のハイブリッドでよい。
【００６５】
市販のカルシウム−感受性α−アミラーゼは、次の商品名で市販されている製品である：Optitherm（登録商標） 及びTakatherm（登録商標）(Daniscoから入手できる); Maxamyl（登録商標） (Daniscoから入手できる)、 Spezym AA（登録商標）、Spezyme Delta AA（登録商標）、Spezyme Fred 及びSpezyme Xtra (Daniscoから入手できる)、及び Keistase（登録商標）Daiwaから入手できる)、PURASTARTM ST 5000E、及びPURASTAR（登録商標）HPAM L (Genencor Int. から入手できる)。
【００６６】
それらのカルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−、Ｂ−、Ｃ−及び炭水化物結合ドメインは次の表に提供される：
【００６７】
【表２】
2013516166.tif 000003
【００６８】
カルシウム−非感受性α−アミラーゼ
カルシウム−非感受性α−アミラーゼの例は次のものを包含する：
１．配列番号１３に示される配列を有するバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）α−アミラーゼ；
【００６９】
２．配列番号１4に示される配列を有するＫＳＭ  Ｋ−３６α−アミラーゼ；
【００７０】
３．配列番号１５に示される配列を有するＫＳＭ  Ｋ−３８α−アミラーゼ；
【００７１】
４．配列番号１６のアミノ酸配列を有するピロコーカス・ウオエセイ（Pyrococcus woesei）α−アミラーゼ；
【００７２】
５．配列番号３１のアミノ酸配列を有する、国際公開第０３／０８３０５４号に記載されるピロコーカスハイブリッドα−アミラーゼ；並びにそれらのα−アミラーゼのいずれかのハイブリッド及び変異体。
【００７３】
それらのカルシウム−非感受性α−アミラーゼのＡ−、Ｂ−、Ｃ−及び炭水化物結合ドメインは次の表に提供される：
【００７４】
【表３】
2013516166.tif 000004
【００７５】
本発明のα−アミラーゼ
本発明のα−アミラーゼは、カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−ドメイン、カルシウム非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメイン及びカルシウム−感受性α−アミラーゼのＣ−ドメインを含んで成る。
【００７６】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号１のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００７７】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号２のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００７８】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号３のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００７９】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号４のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８０】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号５のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８１】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号６のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８２】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号７のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８３】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号８のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８４】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号９のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８５】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号１０のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８６】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号１１のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８７】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号１２のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８８】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号２９のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００８９】
一態様によれば、Ａ−ドメインは、配列番号３０のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９０】
一態様によれば、Ｂ−ドメインは、配列番号１３のＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９１】
一態様によれば、Ｂ−ドメインは、配列番号１４のＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９２】
一態様によれば、Ｂ−ドメインは、配列番号１５のＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９３】
一態様によれば、Ｂ−ドメインは、配列番号１６のＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９４】
一態様によれば、Ｂ−ドメインは、配列番号３１のＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９５】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号１のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９６】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号２のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９７】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号３のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９８】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号４のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【００９９】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号５のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１００】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号６のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０１】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号７のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０２】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号８のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０３】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号９のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０４】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号１０のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０５】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号１１のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０６】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号１２のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０７】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号２９のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０８】
一態様によれば、Ｃ−ドメインは、配列番号３０のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する。
【０１０９】
α−アミラーゼは、カルシウム−感受性α−アミラーゼのＢ−ドメイン又はその一部を、カルシウム−非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメイン又はその一部により置換することにより生成され得る。α−アミラーゼはまた、カルシウム−非感受性α−アミラーゼのＡ−及びＣ−ドメイン又はその一部を、カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−及びＣ−ドメイン又はその一部により置換することにより生成され得る。ハイブリッドα−アミラーゼを生成する場合、アミノ酸は、２つのスプライシング部位、すなわちカルシウム−感受性α−アミラーゼの配列がカルシウム−非感受性α−アミラーゼの配列と組み合わされる２つの部位において欠失されるか又は挿入されるべきではない。
【０１１０】
上記表に提供されるカルシウム−感受性及びカルシウム−非感受性アミラーゼのＡ−、Ｂ−及びＣ−ドメインの境界は柔軟であり、そして配列に関するいくらかの自由が許容される。従って、一般的に、２０個までのアミノ酸、例えば２０個以下のアミノ酸、１０個以下のアミノ酸、６個以下のアミノ酸及び３個以下のアミノ酸、ドメインについての正確な境界から逸脱することが可能である。言い換えれば、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの配列により置換されるカルシウム−感受性α−アミラーゼの配列は、Ｂ−ドメインの境界の２０個以内のアミノ酸、例えば、１０個以下のアミノ酸、６個以内のアミノ酸及び３個以内のアミノ酸であり得る。例えば境界は、１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸又は１０個のアミノ酸、異なる。
【０１１１】
例えば、Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０２−２０７として決定されているＢ．アミロリケファシエンスα−アミラーゼ（配列番号１）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９２−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置１９７−２１７の範囲における位置で終結し、例えば位置９０−１０８の範囲における位置で開始し、そして位置１９８−２１３の範囲における位置で終結し、又は位置９９−１０５の範囲における位置で開始し、そして位置２０４−２１０の範囲における位置で終結する。Ｂ．アミロリケファシエンスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０１（Ａ１）＋２０８−３９６（Ａ２）及び３９７−４８３であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９１−１１１の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９６−１０１の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０１−１０６の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置１９８−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲における位置で終結し、例えば位置２０３−２０８の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結し、又は位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１１２】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１１として決定されているＢ．フラボサーマスα−アミラーゼ（配列番号２）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９８−２１８の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０２−２１４の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０５の範囲における位置で開始し、そして位置２０５−２１２の範囲における位置で終結する。Ｂ．フラボサーマスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８４であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０２−２２２の範囲における位置で開始し、そして位置４７９−４８４の範囲における位置で終結し、例えば位置２０７−２１２の範囲における位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲おける位置で終結し、又は位置２１２−２１７の範囲における位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。Ｂ．フラボサーマスα−アミラーゼはさらに、アミノ酸残基４８５−５８６の炭水化物結合ドメインを有する。その炭水化物結合ドメインは、アミラーゼ活性のために必要とされず、そして完全に又は部分的に欠失され得る。
【０１１３】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０４−２０７として決定されているＢ．リケニホルミスα−アミラーゼ（配列番号３）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換されるＢ．リケニホルミスα−アミラーゼの配列は、位置９４−１１４の範囲における位置で開始し、そして位置１９４−２１４の範囲における位置で終結し、例えば位置９８−１１０の範囲における位置で開始し、そして位置１９８−２１０の範囲における位置で終結し、又は位置１０１−１０７の範囲における位置で開始し、そして位置２０１−２０７の範囲における位置で終結する。Ｂ．リケニホルミスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０３（Ａ１）＋２０８−３９６（Ａ２）及び３９７−４８３であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９３−１１３の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９８−１０３の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０３−１０８の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置１９８−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲における位置で終結し、例えば位置２０３−２０８の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結し、又は位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１１４】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０５−２１０として決定されているＢ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ（配列番号４）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９５−１１５の範囲における位置で開始し、そして位置１９７−２１３の範囲における位置で終結し、例えば位置９９−１１１の範囲における位置で開始し、そして位置２０１−２１３の範囲における位置で終結し、又は位置１０２−１０８の範囲における位置で開始し、そして位置２０４−２１０の範囲における位置で終結する。Ｂ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０４（Ａ１）＋２１１−３９６（Ａ２）及び３９７−４８３であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９４−１１４の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９９−１０４の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０４−１０９の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０１−２２１の範囲における位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲における位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結し、又は位置２１１−２１６の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１１５】
Ｂ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼはさらに、アミノ酸残基４８４−５８６のＣ−末端拡張を有する。そのＣ−末端拡張は、アミラーゼ活性のために必要とされず、そして完全に又は部分的に欠失され得る。
【０１１６】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているバチルスα−アミラーゼ（配列番号５）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。バチルスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９６（Ａ２）及び３９９−４８５であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１１７】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているバチルスα−アミラーゼ（配列番号６）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。バチルスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８５であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１１８】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているバチルスα−アミラーゼ（配列番号７）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。バチルスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８５であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１１９】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているＳＰ７０７α−アミラーゼ（配列番号８）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。ＳＰ７０７α−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８５であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１２０】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているＴＳ２２α−アミラーゼ（配列番号９）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。ＴＳ２２α−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８４であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。ＴＳ２２α−アミラーゼはさらに、アミノ酸残基４８５−５８６の炭水化物結合ドメインを有する。その炭水化物結合ドメインは、アミラーゼ活性のために必要とされず、そして完全に又は部分的に欠失され得る。
【０１２１】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているＴＳ２３α−アミラーゼ（配列番号１０）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。ＴＳ２３α−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８４であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。ＴＳ２３α−アミラーゼはさらに、アミノ酸残基４８５−５８３の炭水化物結合ドメインを有する。その炭水化物結合ドメインは、アミラーゼ活性のために必要とされず、そして完全に又は部分的に欠失され得る。
【０１２２】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているＫＳＭ−ＡＰ１３７８α−アミラーゼ（配列番号１１）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。ＫＳＭ−ＡＰ１３７８α−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８５であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１２３】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０６−２１２として決定されているバチルスＳＰ７−７α−アミラーゼ（配列番号１２）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９６−１１６の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１００−１１２の範囲における位置で開始し、そして位置２０３−２１５の範囲における位置で終結し、又は位置１０３−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置２０６−２１２の範囲における位置で終結する。バチルスＳＰ７−７α−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０５（Ａ１）＋２１３−３９８（Ａ２）及び３９９−４８５であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０５−１１０の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０３−２２３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結し、又は位置２１３−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１２４】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０５−２１０として決定されているＢ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ（配列番号２９）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９５−１１５の範囲における位置で開始し、そして位置１９７−２１３の範囲における位置で終結し、例えば位置９９−１１１の範囲における位置で開始し、そして位置２０１−２１３の範囲における位置で終結し、又は位置１０２−１０８の範囲における位置で開始し、そして位置２０４−２１０の範囲における位置で終結する。Ｂ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０４（Ａ１）＋２１１−３９６（Ａ２）及び３９７−４８３であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９４−１１４の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９９−１０４の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０４−１０９の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置２０１−２２１の範囲における位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲における位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結し、又は位置２１１−２１６の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。Ｂ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼはさらに、アミノ酸残基４８４−４８６のＣ−末端拡張を有する。そのＣ−末端拡張は、アミラーゼ活性のために必要とされず、そして完全に又は部分的に欠失され得る。
【０１２５】
Ｂ−ドメインがアミノ酸残基１０３−２０８として決定されているサイトファーガスα−アミラーゼ（配列番号３０）に関して、カルシウム−非感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換される配列は、位置９３−１１３の範囲における位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲における位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲における位置で終結し、又は位置１００−１０６の範囲における位置で開始し、そして位置２０２−２０８範囲における位置で終結する。サイトファーガスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０２（Ａ１）＋２０９−３９７（Ａ２）及び３９８−４８４であることが決定された。本発明のα−アミラーゼは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９２−１１２の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９７−１０２の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０２−１０７の範囲おける位置で終結するＡ１−ドメインを含むことができる。本発明のα−アミラーゼは、位置１９９−２１９の範囲における位置で開始し、そして位置４７９−４８４の範囲における位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲における位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲おける位置で終結し、又は位置２０４−２０９の範囲における位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲おける位置で終結するＡ２及びＣ−ドメインを含むことができる。
【０１２６】
バチルス・サーキュランスα−アミラーゼ（配列番号１３）に関しては、Ｂ−ドメインはアミノ酸１０３−２０８として決定されている。本発明のα−アミラーゼは、位置９３−１１３の範囲における位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲における位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲における位置で終結し、又は位置１００−１０６の範囲における位置で開始し、そして位置２０２−２０８の範囲における位置で終結するＢ−ドメインを含むことができる。バチルス・サーキュランスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０２（Ａ１）＋２０９−３９５（Ａ２）及び３９８−４８２であることが決定された。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ１−ドメインは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９２−１１２の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９７−１０２の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０２−１０７の範囲おける位置で終結する。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ２−ドメインは、位置１９９−２１９の範囲における位置で開始し、そして位置３８５−４０５の範囲における位置で終結し、例えば位置２０４−２０９の範囲における位置で開始し、そして位置３９０−３９５の範囲おける位置で終結し、又は位置２０９−２１４の範囲における位置で開始し、そして位置３９５−４００の範囲おける位置で終結する。Ａ１及びＡ２ドメインは好ましくは、カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により同時に置換される。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＣ−ドメインは、位置３８６−４０６の範囲における位置で開始し、そして位置４７７−４８２の範囲における位置で終結し、例えば位置３９１−３９６の範囲における位置で開始し、そして位置４７９−４８２の範囲おける位置で終結し、又は位置３９６−４０１の範囲における位置で開始し、そして位置４７９−４８２の範囲おける位置で終結する。バチルス・サーキュラスα−アミラーゼはさらに、アミノ酸残基４８３−４９２のＣ−末端拡張を有する。その拡張はアミラーゼ活性のためには必要とされず、そして完全に又は部分的に欠失され得る。
【０１２７】
ＫＳＭ−Ｋ３６α−アミラーゼ（配列番号１４）に関しては、Ｂ−ドメインはアミノ酸１０４−２０７として決定されている。本発明のα−アミラーゼは、位置９３−１１３の範囲における位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲における位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲における位置で終結し、又は位置１００−１０６の範囲における位置で開始し、そして位置２０２−２０８の範囲における位置で終結するＢ−ドメインを含むことができる。バチルス・サーキュランスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０３（Ａ１）＋２０８−３９３（Ａ２）及び３９４−４８０であることが決定された。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ１−ドメインは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９３−１１３の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９８−１０３の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０３−１０８の範囲おける位置で終結する。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ２−ドメインは、位置１９８−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置３８３−４０３の範囲における位置で終結し、例えば位置２０３−２０８の範囲における位置で開始し、そして位置３８８−３９３の範囲おける位置で終結し、又は位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置３９３−３９８の範囲おける位置で終結する。Ａ１及びＡ２ドメインは好ましくは、カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により同時に置換される。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＣ−ドメインは、位置３８４−４０４の範囲における位置で開始し、そして位置４７５−４８０の範囲における位置で終結し、例えば位置３８９−３９４の範囲における位置で開始し、そして位置４７７−４８０の範囲おける位置で終結し、又は位置３９４−３９９の範囲における位置で開始し、そして位置４７７−４８０の範囲おける位置で終結する。
【０１２８】
ＫＳＭ−Ｋ３８α−アミラーゼ（配列番号１５）に関しては、Ｂ−ドメインはアミノ酸１０４−２０７として決定されている。本発明のα−アミラーゼは、位置９３−１１３の範囲における位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲における位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲における位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲における位置で終結し、又は位置１００−１０６の範囲における位置で開始し、そして位置２０２−２０８の範囲における位置で終結するＢ−ドメインを含むことができる。バチルス・サーキュランスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０３（Ａ１）＋２０８−３９３（Ａ２）及び３９４−４８０であることが決定された。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ１−ドメインは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９３−１１３の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置９８−１０３の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０３−１０８の範囲おける位置で終結する。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ２−ドメインは、位置１９８−２１８の範囲における位置で開始し、そして位置３８３−４０３の範囲における位置で終結し、例えば位置２０３−２０８の範囲における位置で開始し、そして位置３８８−３９３の範囲おける位置で終結し、又は位置２０８−２１３の範囲における位置で開始し、そして位置３９３−３９８の範囲おける位置で終結する。Ａ１及びＡ２ドメインは好ましくは、カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により同時に置換される。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＣ−ドメインは、位置３８４−４０４の範囲における位置で開始し、そして位置４７５−４８０の範囲における位置で終結し、例えば位置３８９−３９４の範囲における位置で開始し、そして位置４７７−４８０の範囲おける位置で終結し、又は位置３９４−３９９の範囲における位置で開始し、そして位置４７７−４８０の範囲おける位置で終結する。
【０１２９】
ピロコーカス・ウオエセイα−アミラーゼ（配列番号１６）に関しては、Ｂ−ドメインはアミノ酸１１０−１７１として決定されている。本発明のα−アミラーゼは、位置１００−１２０の範囲における位置で開始し、そして位置１６８−１８１の範囲における位置で終結し、例えば位置１０５−１１５の範囲における位置で開始し、そして位置１６６−１７１の範囲における位置で終結し、又は位置１０７−１１３の範囲における位置で開始し、そして位置１７１−１７６の範囲における位置で終結するＢ−ドメインを含むことができる。バチルス・サーキュランスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０９（Ａ１）＋１７２−３３８（Ａ２）及び３３９−４３５であることが決定された。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ１−ドメインは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９９−１１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０４−１０９の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０９−１１４の範囲おける位置で終結する。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ２−ドメインは、位置１６１−１８１の範囲における位置で開始し、そして位置３２８−３４８の範囲における位置で終結し、例えば位置１６７−１７２の範囲における位置で開始し、そして位置３３３−３３８の範囲おける位置で終結し、又は位置１７２−１７７の範囲における位置で開始し、そして位置３３８−３４３の範囲おける位置で終結する。Ａ１及びＡ２ドメインは好ましくは、カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により同時に置換される。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＣ−ドメインは、位置３２９−３４９の範囲における位置で開始し、そして位置４３０−４３５の範囲における位置で終結し、例えば位置３２４−３２９の範囲における位置で開始し、そして位置４３２−４３５の範囲おける位置で終結し、又は位置３２９−３４４の範囲における位置で開始し、そして位置４３２−４３５の範囲おける位置で終結する。
【０１３０】
ピロコーカスハイブリッドα−アミラーゼ（配列番号３１）に関しては、Ｂ−ドメインはアミノ酸１１０−１７１として決定されている。本発明のα−アミラーゼは、位置１００−１２０の範囲における位置で開始し、そして位置１６８−１８１の範囲における位置で終結し、例えば位置１０５−１１５の範囲における位置で開始し、そして位置１６６−１７１の範囲における位置で終結し、又は位置１０７−１１３の範囲における位置で開始し、そして位置１７１−１７６の範囲における位置で終結するＢ−ドメインを含むことができる。バチルス・サーキュランスα−アミラーゼのＡ及びＣ−ドメインはそれぞれ、アミノ酸残基１−１０９（Ａ１）＋１７２−３３８（Ａ２）及び３３９−４３５であることが決定された。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ１−ドメインは、位置１−５の範囲における位置で開始し、そして位置９９−１１９の範囲における位置で終結し、例えば位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０４−１０９の範囲おける位置で終結し、又は位置１−３の範囲における位置で開始し、そして位置１０９−１１４の範囲おける位置で終結する。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＡ２−ドメインは、位置１６１−１８１の範囲における位置で開始し、そして位置３２８−３４８の範囲における位置で終結し、例えば位置１６７−１７２の範囲における位置で開始し、そして位置３３３−３３８の範囲おける位置で終結し、又は位置１７２−１７７の範囲における位置で開始し、そして位置３３８−３４３の範囲おける位置で終結する。Ａ１及びＡ２ドメインは好ましくは、カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により同時に置換される。カルシウム−感受性α−アミラーゼの対応する配列により置換され得るＣ−ドメインは、位置３２９−３４９の範囲における位置で開始し、そして位置４３０−４３５の範囲における位置で終結し、例えば位置３２４−３２９の範囲における位置で開始し、そして位置４３２−４３５の範囲おける位置で終結し、又は位置３２９−３４４の範囲における位置で開始し、そして位置４３２−４３５の範囲おける位置で終結する。
【０１３１】
一態様によれば、α−アミラーゼは、０．１以上、好ましくは０．２５以上、さらにより好ましくは０．５以上、及び最も好ましくは、１以上の、Ｇ７−ｐＮＧアッセイにより測定される活性に対するPhadebasアッセイにより測定される活性の比率を有する。
Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイは、架橋された不溶性青色澱粉ポリマーを用いて、α−アミラーゼ活性を測定するためのアッセイである（Phadebas（登録商標）Amylase Test, supplied by Magle Life Sciences, Lund, Sweden）。
【０１３２】
Ｇ７−ｐＮＧアッセイは、可溶性色原体化合物ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドを用いて、α−アミラーゼ活性を決定するためのアッセイである。ＰＮＰ−Ｇ７基質及びα−グルコシダーゼを含むキットがBoehringer-Mannheimにより製造されている（カタログ番号１０５４６３５）。
【０１３３】
Ｐｈａｄｅｂａｓ及びＧ７−ｐＮＧアッセイを用いてα−アミラーゼ活性を決定するために、既知活性を有する対照アミラーゼがアッセイに包含されるべきであり、そして活性は対照α−アミラーゼに対して決定される。本発明に関しては、Ｐｈａｄｅｂａｓ及びＧ７−ｐＮＧアッセイにより測定される場合、同じ活性を有すると思われる対照α−アミラーゼは、配列番号３の配列を有する、商品名Termamyl（登録商標）としてＮｏｖｏｚｙｅｓ  Ａ／Ｓにより市販されるバチルス・リケニホルミスα−アミラーゼである。従って、対照α−アミラーゼは、Ｇ７−ｐＮＰアッセイにより測定される活性に対する、Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイにより測定される活性を測定する場合、１の比率を有する。
【０１３４】
可溶性基質に基づく活性に対する、不溶性基質に基づく活性の比率は、２種の特定の選択された基質に基づく活性の測定及び比率の計算により決定される。好ましくは、その比率は、親カルシウム−非感受性α−アミラーゼに関するよりも少なくとも１．５倍、例えば少なくとも２倍、少なくとも２．５倍及び少なくとも３倍、高い。
【０１３５】
Ｇ７ｐＮＧアッセイの活性に対するＰｈａｄｅｂａｓアッセイによる活性の比率を決定するための下記に開示される方法を用いて、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＢ．サーキュランスα−アミラーゼは、約０．０１４の比率を有することが見出された。
【０１３６】
本発明者は、有意な程度のカルシウム感受性がカルシウム−感受性α−アミラーゼのＢ−ドメインに割り当てられ得、そしてカルシウム−非感受性α−アミラーゼに由来するＢ−ドメイン又はその一部により、カルシウム−感受性α−アミラーゼの完全なＢ−ドメイン又はその一部を置換することにより、前記カルシウム−感受性α−アミラーゼの有益な良好特性のすべて又は少なくともいくらかを保持することが可能であることを発見した。
【０１３７】
本発明のα−アミラーゼは、それらの親カルシウム−感受性α−アミラーゼよりも、カルシウム消耗に対してそれほど敏感ではないが、しかし同時に、それらは親カルシウム−感受性α−アミラーゼの性能特性を維持する。カルシウム感受性は、カルシウム消耗環境において及び/又は酸性条件下で特定のα−アミラーゼの活性及び/又は安定性により表される。カルシウム消耗環境は、α−アミラーゼの多くの知られている用途において、例えば特定のカルシウムイオンにおける強い錯化剤結合金属イオンの存在下で、例えば洗濯工程の有益な効果のために強い錯化剤を通常含む洗剤において、又は天然錯化剤、例えばフィチン酸塩又はクエン酸塩を含む植物材料が存在する条件下で発生する。そのような強い錯化剤は、カルシウムイオンに対してカルシウム−感受性α−アミラーゼと競争し、そしてそれらの構造体に結合されるカルシウムイオンのためにカルシウム−感受性α−アミラーゼを、ある程度奪い、その結果、カルシウム−感受性α―アミラーゼの安定性又は活性が低められる。
【０１３８】
酸性条件もまた、カルシウム−感受性α−アミラーゼの安定性又は活性に影響を及ぼすことができる。低ｐＨは、カルシウム−感受性α−アミラーゼにおけるカルシウムイオンと調和するアミノ酸残基の陽子化を導くことができ、その結果、それらはカルシウムをもはや結合できず、そしてその結果、安定性及び/又は活性が失われると思われる。α−アミラーゼが酸性条件に暴露される適用の例は、国際公開第２００６／１３６１６１号に開示される消化疾患の治療へのα−アミラーゼの使用及び飼料へのその使用である。
【０１３９】
従って、α−アミラーゼは、強い錯化剤の存在下で改善された安定性及び/又は活性、及び/又は低いｐＨでの改善された安定性及び/又は活性を有する。
【０１４０】
さらに、α−アミラーゼは、α−アミラーゼの特性を改善するために、当業界において知られている追加の置換、挿入又は欠失を含むことができる。
【０１４１】
例えば、酸化できるアミノ酸残基は、引用により本明細書に組込まれる、国際公開第９４／０２５９７号及び国際公開第９４／１８３１４号の教授によれば、酸化条件下で、例えば漂白剤の存在下で酵素の安定性を改善するために、酸化できないアミノ酸残基により置換され得る。
【０１４２】
さらに、領域１７９−１８２（配列番号２７の番号付けを用いる）における２つのアミノ酸が、引用により本明細書に組込まれる国際公開第９６／２３８７３号に記載されるように、安定化/活性を改善するために欠失され得る。他のα−アミラーゼにおける対応する位置での２つのアミノ酸が欠失され得る。
【０１４３】
導入され得る追加の有益な置換は、引用により本明細書に組込まれる、国際公開第９９／２３２１１号、国際公開第０１／６６７１２号及び国際公開第２０００／００２６４３号に開示される。
【０１４４】
本発明のα−アミラーゼはさらに、カルシウム−非感受性α−アミラーゼに由来するＢ−ドメインに追加の置換、挿入又は欠失を含むことができる。カルシウム−非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメイン中の適切な置換、挿入又は欠失の例は、Ｂ．サーキュランスα−アミラーゼにおける次の改変に対応する改変である：Ｅ１７９＊、Ｎ１８０＊、Ｅ１８５Ｗ、Ｎ１８６Ｅ及びＤ１８９Ｔ（配列番号１３番号付け）（配列番号２７番号付けにおけるＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ 及び Ｄ１９１Ｔに対応する）。
【０１４５】
別の態様によれば、本発明のα−アミラーゼは、置換Ｑ１５０Ｔを含む。
【０１４６】
別の態様によれば、本発明のα−アミラーゼは、置換Ｔ１６４Ｖを含む。
【０１４７】
別の態様によれば、本発明のα−アミラーゼは、置換Ｋ１８４Ａを含む。
【０１４８】
一態様によれば、親カルシウム−感受性α−アミラーゼは、洗剤において良好な性能を有する、配列番号７のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼである。このカルシウム−感受性α−アミラーゼのＢ−ドメインは、配列番号１３のカルシウム−非感受性α−アミラーゼからのＢ−ドメインにより置換され得る。ハイブリッドはさらに、１又は２以上の次の改変を含むことができる：Ｅ１８３＊、Ｎ１８４＊、Ｅ１８９Ｗ、Ｎ１９０Ｅ、及び Ｄ１９３Ｔ（配列番号７番号付け）（配列番号２７番号付け７におけるＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ、及びＤ１９１Ｔに対応する）。それらのハイブリッドは、洗剤において良好な性能を示し、そして強い錯化剤の存在下で改善された安定性を有する。
【０１４９】
別の態様によれば、カルシウム−感受性α−感受性α−アミラーゼは、澱粉の液化のための顕著な特性を有する、配列番号４のＢ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼである。このα−アミラーゼのＢ−ドメインは、配列番号１３のＢ．サーキュランスからのＢ−ドメインにより置換され得、例えば配列番号４の位置１０４−２０９でのアミノ酸残基が、配列番号１３の位置１０３−２０８でのアミノ酸により置換され得る。ハイブリッドは任意には、１又は２以上の次の修飾を含むことができる：Ｅ１８１＊、Ｇ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ、Ｄ１９１Ｔ、Ｓ２９９Ｋ、Ｇ３０１Ｒ、Ａ３０２Ｄ、Ｄ４０５Ｎ、Ｄ４２８Ｎ、及び Ｐ４３０Ｄ（配列番号２７番号付け）。
【０１５０】
本発明のα−アミラーゼの他の例は、下記のものを包含する：
国際公開第０１／６６７１２号に開示される改変Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊+Ｒ１１８Ｋ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｒ３２０Ｋ＋Ｒ４５８Ｋ（配列番号５番号付け）を有する、配列番号５の変異体のＢ−ドメインが配列番号１３、１４又は１５のＢ−ドメインにより置換されている、ハイブリッド。例えば、配列番号１４のアミノ酸１０７−２０４は配列番号５の前記変異体のアミノ酸１０９−２０８を置換することができる。別の例においては、配列番号１５のアミノ酸１０４−２０９は配列番号５の前記変異体のアミノ酸１０６−２１３を置換できる。
【０１５１】
国際公開第０１／６６７１２号に開示される改変Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊+Ｒ１１８Ｋ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｒ３２０Ｋ＋Ｒ４５８Ｋ（配列番号５番号付け）を有する、配列番号５の変異体のＢ−ドメインが配列番号１４のＢ−ドメインにより置換されている、ハイブリッド。例えば、配列番号１４のアミノ酸１５８−２０４は配列番号５の前記変異体のアミノ酸１６０−２０８を置換することができる。
【０１５２】
国際公開第０６／０６６５９４号における配列番号２のアミノ酸配列及び置換Ｇ４６Ａ＋Ｔ４７Ｉ＋Ｇ１０５Ａ（配列番号３番号付け）を有する、ハイブリッド変異体α−アミラーゼＬＥ３９９のＢ−ドメインが配列番号１３のＢ−ドメインにより置換されている、ハイブリッド。例えば、配列番号１３のアミノ酸１０７−２０５はＬＥ３９９のアミノ酸１０６−２０２を置換することができる。
【０１５３】
国際公開第０６/００２６４３号に開示される突然変異Ｍ９Ｌ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｇ１４９Ａ＋Ｇ１８２Ｔ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｇ１８６Ａ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｍ２０２Ｌ＋Ｔ２５７Ｉ＋Ｙ２９５Ｆ＋Ｎ２９９Ｙ＋ Ｒ３２０Ｋ＋Ｍ３２３Ｔ＋Ａ３３９Ｓ＋Ｅ３４５Ｒ＋Ｒ４５８Ｋ（配列番号５番号付け）を有する配列番号５の変異体のＢ−ドメインが配列番号１３のＢ−ドメインにより置換されている、ハイブリッド。
配列番号８のＳＰ７０７α−アミラーゼのＢ−ドメインが配列番号１３のＢ−ドメインにより置換されている、ハイブリッド。
【０１５４】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。
【０１５５】
核酸コンストラクト
本発明は、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞中においてコーディング配列の発現を指図する１又は２以上（数個）の制御配列に操作的に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトにも関する。
【０１５６】
ポリヌクレオチドは、種々の手段により操作され得、ポリヌクレオチドの発現を提供することができる。発現ベクター依存して、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドを操作することが好適又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを修飾する技法は、当業者には周知である。
【０１５７】
制御配列は、プロモーター配列、すなわち本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識されるポリヌクレオチドである。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、如何なるポリヌクレオチドであってもよく、突然変異型、切断型、ハイブリッド型等のプロモーターであってもよく、そして、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得される。
【０１５８】
細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（amyM）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）xylA 及び xylB 遺伝子、大腸菌（E. coli）乳糖オペロン（lac operon）、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731）由来のプロモーター、並びに tac プロモーター（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25）が挙げられる。さらなるプロモーターは"Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94；及び Sambrook et al., 1989（同上）に記載されている。
【０１５９】
糸状菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Daria（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Quinn（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼ II、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−キシロシダーゼ由来のプロモーター、並びに NA2-tpiプロモーター（未翻訳リーダーがアスペルギラスにおけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの未翻訳リーダーにより置換されている、アスペルギラスにおける中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾されたプロモーター；非制限的な例としては、未翻訳リーダーがアスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエにおけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの未翻訳リーダーにより置換されている、アスペルギラス・ニガーにおける中間α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾されたプロモーターを列挙できる）由来のプロモーター；並びにこれらの突然変異型、切断型、ハイブリッド型プロモーターが挙げられる。
【０１６０】
酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール デヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH１、ADH２/GAP）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488 に記載されている。
【０１６１】
制御配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適切な転写ターミネーター配列も挙げられる。ターミネーター配列は、ポロペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に操作可能的に連結される。本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。
【０１６２】
糸状菌宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ由来のターミネーターが好ましい。
【０１６３】
酵母宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロームＣ（CYC1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のターミネーターが好ましい。酵母宿主細胞に有用な他のターミネーターは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
【０１６４】
制御配列としては、適切なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は転写される場合、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たすｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に操作可能的にに連結される。選択された宿主細胞において機能し得る任意のリーダー配列を使用することができる。
【０１６５】
糸状菌宿主細胞の場合、リーダー配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びアスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼ由来のリーダー配列が好ましい。
【０１６６】
酵母宿主細胞に適したリーダー配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）由来のリーダー配列が挙げられる。
【０１６７】
制御配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、ポリヌクレオチドのの３’末端に操作可能的に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。選択された宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０１６８】
糸状菌宿主細胞の場合、ポリアデニル化配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ由来のポリアデニル化配列が好ましい。
【０１６９】
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990 に記載されている。
【０１７０】
制御配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ−末端に連結され、前記ポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導する。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、前記ポリペプチドをコードするコーディング配列のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング配列を有していてもよい。他方では、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング配列を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディング配列が必要となるのは、例えば、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング配列を有さない場合である。他方では、ポリペプチドの分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング配列により、生来のシグナルペプチドコーディング配列をそのまま置換してもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に誘導し得る何れかのシグナルペプチドコーディング配列を使用できる。
【０１７１】
細胞宿主細胞についての効果的なシグナルペプチドコーディング配列は、バチルスＮＣＩＢ１１８３７マルトースアミロース、バチルス・リケニホルミスサブチリシン、バチルス・リケニホルミスβ−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリスｐｒｓＡについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング配列である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137により記載される。
【０１７２】
糸状菌宿主細胞において有効なシグナルペプチドコーディング配列としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ランギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ及びリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ由来の配列が挙げられる。
【０１７３】
酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼが挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
【０１７４】
制御配列としては、プロペプチドコーディング配列も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ−末端に配置されるプロペプチドをコードする配列である。得られるポリペプチドは酵素前駆体（proenzyme）又はプロポリペプチド（propolypeptide）（或いは場合によりチモーゲン（zymogen））と呼ばれる。プロポリペプチドは通常不活性であるが、触媒又は自己触媒によりプロペプチドがプロポリペプチドから切断されると、活性ポリペプチドに変換される。プロペプチドコーディング配列としては、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（nｐｒＴ）、ミセリオフィソラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子のための遺伝子からの配列が挙げられる。
【０１７５】
ポリペプチドのＮ−末端にシグナルペプチド及びプロペプチド配列の双方が存在する場合には、ポリペプチドのＮ−末端の隣にプロペプチド配列が配置され、プロペプチド配列のＮ−末端の隣にシグナルペプチド配列が配置される。
【０１７６】
また、宿主細胞の生育との関連において、ポリペプチドの発現調節を可能にする調節配列を付与することも望ましい。調節系の例としては、調節化合物の存在等の化学又は物理刺激に応答して遺伝子の発現を開始又は停止させる系が挙げられる。原核細胞系における調節系としては、lac、tac、及びtrp オペレータ系が挙げられる。酵母においては、例えば ADH2 系又はGAL1 系が使用できる。糸状菌においては、例えば アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、TAKA α−アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターを使用できる。他の調節配列の例としては、遺伝子の増幅を可能にする系が挙げられる。真核細胞系におけるそれらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子や、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に操作可能的にに連結される。
【０１７７】
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドと、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む組換え発現ベクターにも関する。前記種々のヌクレオチド及び制御配列を組み合わせ、１又は２以上（数個）の制限部位を含む組換え発現ベクターを構築すれば、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをそのような部位に挿入又は置換することができる。他方では、前記ポリヌクレオチド又は前記配列を含む核酸コンストラクトを、発現に適したベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現させてもよい。発現ベクターを創造する場合、発現に適した制御配列とコーディング配列とが操作可能的に連結されるように、コーディング配列をベクター内に配置する。
【０１７８】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に好適に利用でき、且つポリヌクレオチドの発現を生じ得るものであれば、任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）が使用できる。ベクターの選択は、通常はベクターを導入する宿主細胞と、ベクターとの適合性に依存する。ベクターは線状でも閉環状プラスミドでもよい。
【０１７９】
ベクターは自己複製ベクター、すなわち、染色体外成分として存在し、染色体複製とは独立に複製するベクターであってもよい。例としては、プラスミド、染色体染色体要素、ミニ染色体、又は人工染色体等が挙げられる。他方では、ベクターは、自己複製を促進する任意の手段を含んでいてもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノム内に組み込まれ、統合された染色体と一緒に複製されるものであってもよい。なお、宿主細胞のゲノムに導入されるＤＮＡ群は、単一のベクター又はプラスミドが含んでいてもよく、あるいは２以上のベクター又はプラスミドが共同で含んでいてもよい。
【０１８０】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入等を生じた細胞の選択を容易にする、１又は２以上（数個）の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、殺生物剤、ウイルス耐性、重金属耐性、原栄養又は栄養要求性等を付与する物質を産生する遺伝子である。
【０１８１】
細菌選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス又はバチルス・リケニホルミスからのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に適したマーカーとしては、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3 が挙げられる。糸状菌宿主細胞に使用される選択マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチン カルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hph（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス（Aspergillus）細胞での使用には、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の amdS 及び pyrG 遺伝子、並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）の bar 遺伝子が好適である。
【０１８２】
ベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込み、又は、細胞内におけるゲノムとは独立したベクターの自律的な複製を可能にする（１又は２以上の）要素を含むことが好ましい。
【０１８３】
宿主細胞ゲノムへの組み込みの場合、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、あるいはベクターのその他の要素に基づく相同又は非相同組換えにより、ゲノムへの組み込みを生じさせてもよい。他方では、宿主細胞ゲノムの染色体内の正確な位置に対して、相同組換えによるベクターの組み込みを生じさせるようなさらなるポリヌクレオチド配列を、ベクターが含んでいてもよい。正確な位置に組み込まれる確率を高めるためには、組み込み要素は、相同組換えの可能性を高めるよう、対応する標的配列と高い同一性を有する十分な数の核酸（例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対）を有することが好ましい。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムの標的配列に相同な配列であれば、任意の配列でよい。さらに、前記組み込み要素は、非コーディング配列でもコーディング配列ポリヌクレオチド配列でもよい。一方、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。
【０１８４】
自律的な複製の場合、ベクターは更に、問題の宿主細胞内でのベクターの自律的な複製を可能にする複製起点を含んでいてもよい。複製起点としては、自律的複製を生じさせるプラスミド複製子であって、細胞内で機能し得る任意の配列が挙げられる。本明細書において「複製起点」（origin of replication）又は「プラスミド複製子」（plasmid replicator）とは、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするポリヌクレオチドとして定義される。
【０１８５】
複製の細菌起源の例は、」Ｅ．コリにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、及びバチルスにおける複製を可能にするpUB110、pE194、pTA1060、及びρＡＭβ１の複製の起源である。
【０１８６】
酵母宿主細胞に使用される複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ、及び、ARS4とCEN6との組み合わせが挙げられる。
【０１８７】
糸状菌細胞において有用な複製起点の例としては、AMA1 及び ANS1 が挙げられる（Gems et al., 1991, Gene 98:61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）。AMA1 遺伝子の単離、及び、当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示の手法により達成することができる。
【０１８８】
本発明のポリヌクレオチドを２コピー以上、宿主細胞に挿入することにより、ポリペプチドの産生を増進してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増大は、前記配列の少なくとも１つの更なるコピーを宿主細胞ゲノム内に組み込むことにより、あるいは、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチド内に含め、適切な選択物質の存在下で細胞を培養した場合に、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、さらには前記ポリヌクレオチドのさらなるコピーを含む細胞が選択できるようにすることにより達成される。
【０１８９】
本発明の組換え発現ベクターを構築するため、上述の要素を連結するために使用される方法は、当業者には周知である（例えば Sambrook et al., 1989（同上）参照）。
【０１９０】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成を指図する１又は２以上（数個）の制御配列に対して操作可能的に連結される本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含んで成るコンストラクト又はベクターが宿主細胞中に導入され、その結果、前記コンストラクト又はベクターは、前述のように染色体インテグラント（integrant）として又は自己複製染色体外ベクターとして維持される。用語、「宿主細胞」とは、複製の間に生じる突然変異のために親細胞とは同一でない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源にかなりの程度、依存するであろう。
【０１９１】
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え生成において有用ないずれかの細胞、例えば原核生物又は真核生物であり得る。
【０１９２】
原核宿主細胞は、いずれかのグラム−陽性又はグラム−陰性細菌であり得る。グラム−陽性細胞は下記のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、オセンノバチルス（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）及びストレプトミセス（Streptomyces）。グラム−陰性細菌は下記のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：カンピロバクター（Campylobacter）、Ｅ．コリ（E. coli）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イリオバクター（llyobacter）、ネイセリア（Neisseria）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモレラ（Salmonella）及びウレアプラズマ（Ureaplasma）。
細菌宿主細胞は、いずれかのバチルス細胞、例えば次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens,）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ラクタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis cells）細胞。
【０１９３】
細菌宿主細胞はまた、いずれかのストレプトコーカス細胞、例えば次のものであり得るが、しかしそれらだけには制限されない：ストレプトコーカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコーカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコーカス・ウベリス（Streptococcus uberis）及びストレプトコーカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus）細胞。
【０１９４】
細菌宿主細胞はまた、いずれかのストレプトミセス細胞、例えば次のものであり得るが、但しそれらだけには限定されない：ストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞。
【０１９５】
バチルス細胞中へのＤＮＡの導入は例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 1 1 1-1 15を参照のこと）により、コンピテント細胞の使用（例えば、Young and Spizizen, 1961 , J. Bacteriol. 81 : 823-829, 又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971 , J. Mol. Biol. 56: 209-221を参照のこと）により、エレクトポーレション（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）により、又はコンジュゲーション（例えば、Koehler and Thorne, 1987, J. Bactehol. 169: 5271-5278を参照のこと）によりもたらされ得る。Ｅ．コリ細胞中へのＤＮＡの導入は例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580を参照のこと）又はエレクトロポレーション（例えば、Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145を参照のこと）によりもたらされ得る。ストレプトミセス細胞へのＤＮＡの導入は例えば、プロトプラスト形質転換及びエレクトロポレーション（例えば、Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405を参照のこと）により、コンジュゲーション（例えば、Mazodier ei a/., 1989, J. Bacte ol. 171: 3583-3585を参照のこと）により、又はトランスダクション（例えば、Burke et al., 2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294を参照のこと）によりもたらされ得る。シュードモナス細胞中へのＤＮＡの導入は例えば、エレクトロポレーション（例えば、Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397を参照のこと）により、又はコンジュゲーション（例えば、Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57を参照のこと）によりもたらされ得る。ストレプトコーカス細胞中へのＤＮＡの導入は例えば、天然の能力（natural competence）（例えば、Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297を参照のこと）により、プロトプラスと形質転換（例えば、Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207を参照のこと）により、エレクトロポレーション（例えば、Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804を参照のこと）により、又はコンジュゲーション（例えば、Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436を参照のこと）によりもたらされ得る。しかしながら、当業界において知られているいずれの方法でも、宿主細胞中へのＤＮＡの導入のためには使用され得る。
【０１９６】
宿主細胞はまた、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物又は菌類細胞でもあり得る。
【０１９７】
宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において「真菌」（fungi）とは、子嚢菌（Ascomycota）門、担子菌（Basidiomycota）門、ツボカビ（Chytridiomycota）門、及び接合菌（Zygomycota）門を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK の定義による）とともに、卵菌類（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995（同上）１７１頁に言及あり）及び全ての分生子形成菌（Hawksworth et al., 1995（同上））をも含む。
【０１９８】
真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において「酵母」（yeast）とは、有子嚢胞子酵母（Endomycetales）、担子胞子形成酵母、及び不完全菌に属する酵母（Blastomycetes）を含む。酵母の分類は今後変更される可能性があるが、本発明の目的においては、酵母はBiology and Activities of Yeast（Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載の定義に従うものとする。
【０１９９】
酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【０２００】
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。「糸状菌」は（Hawksworth et al., 1995（同上）に定義のとおり）全ての真菌亜門（Eumycota）及び卵菌亜門（Oomycota）の線状体を含む。糸状菌は通常、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類からなる菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素代謝は偏性好気性である。対して酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素代謝は醗酵でも可能である。
【０２０１】
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブイェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、テルモアスカス（Thermoascus）、ティエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。
【０２０２】
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、ブイェルカンデラ・アジュスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレジエナ（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ジルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロザ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium グラムinum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネガンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクララム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコキロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロール（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデ���マ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【０２０３】
真菌細胞は、公知の手法により、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換してもよい。アスペルギウス（Aspergillus）及びトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号及び Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474 に記載されている。フサリウム（Fusarium）属の形質転換に適した手法は、Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156、及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、例えばBecker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163；及び Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920 に記載の手法により形質転換される。
【０２０４】
生成方法
本発明はまた、（ａ）その野生型において、ポリペプチドの生成の助けと成る条件下でポリペプチドを生成することができる細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの生成方法にも関する。好ましい観点によれば、細胞は属[Genus]のものである。より好ましい観点に寄れば、細胞は属中の種[Genus species]である。最も好ましい観点によれば、細胞は属中の種の寄託番号[Genus species deposit number]である。
【０２０５】
本発明はまた、（a）ポリペプチドの生成を助ける条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０２０６】
宿主細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする、適切な培地において、及び条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は団体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業界において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販されているか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
【０２０７】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、ポリペプチド生成物の形成、又は酵素基質の消出の使用を包含する。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。
【０２０８】
ポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地から回収され得る。
【０２０９】
ポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）、実質的に純粋なポリペプチドが得られる。
【０２１０】
他の観点によれば、ポリペプチドは回収されず、むしろポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチド源として使用される。
【０２１１】
植物
本発明はまた、ポリペプチドを、回収できる量で発現し、そして生成するために、本発明の単離ポリヌクレオチドを含んで成るトランスジェニック植物、その植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、ポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食物又は飼料の品質を改良し、例えば栄養価値、嗜好性及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。
【０２１２】
トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物の例は、草、例えば湿潤地の草本（ブルーグラス、イチゴツナギ属）、飼草、例えばウシノケグサ、ドクムギ、温帯性草本、例えばヌカボ、及び穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、イネ、モロコシ、及びトウモロコシ（サトウモロコシ）である。
【０２１３】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えばルピナス、ジャガイモ、砂糖大根、エンドウ、インゲン豆及び大豆、及びアブラナ科植物（ブラシカセアエ科（Brassicaceae））、例えばカリフラワー、ナタネ種子及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）である。
【０２１４】
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子及び塊茎、並びにそれらの部分を含んで成る個々の組織、例えば表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。また特定の植物細胞区画、例えばクロロプラスト、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシゾーム及び細胞質が、植物部分であると思われる。さらに、組織起源が何であろうと、いずれの植物細胞でも、植物部分であると思われる。同様に、植物部分、例えば本発明の利用を促進するために単離された特定の組織及び細胞はまた、植物部分、例えば胚、内生精子、アリューロン及び被膜であると思われる。
【０２１５】
そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫はまた、本発明の範囲内に包含される。
【０２１６】
ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、ポリペプチドをコードする、１又は２以上（数個）の発現コンストラクトを、植物宿主ゲノム又はクロロプラストゲノム中に導入し、そして得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞中に成長せしめることによって構成される。
【０２１７】
発現コンストラクトは、選択の植物又は植物におけるポリヌクレオチドの発現のために必要とされる適切な調節配列により操作可能的に連結されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る核酸コンストラクトである。さらに、発現コンストラクトは、発現コンストラクトが組み込まれている宿主細胞を同定するために有用な選択マーカー、及び問題の植物中へのコンストラクトの導入のために必要なＤＮＡ配列を含んで成る（後者は、使用されるＤＮＡ導入方法に依存する）。
【０２１８】
調節配列、例えばプロモーター及びターミネーター配列、及び任意には、シグナル又はトランジット配列の選択は、例えばポリペプチドがいつ、どこで及びいかにして発現されることを所望するかに基づいて決定される。例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構成的又は誘発的であり、又は進行的、段階又は組織特異的であり、そして遺伝子生成物は、特定組織又は植物部分、例えば種子又は葉に標的化され得る。調節配列は、Taqueなど., 1988, Plant Physiology 86: 506により記載される。
【０２１９】
構成的発現のためには、次のプロモーターが使用され得る：３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーター、トウモロコシユビキチン１及びイネアクチン１プロモーターが使用され得る（Franck et al., 1980, Cell 21 : 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165）。器官特異的プロモーターは例えば、貯蔵吸込み組織、例えば種子、ジャガイモ塊茎及び果物（Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303）、又は代謝吸込み組織、例えば分裂組織（Ito など., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878）からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えばイネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Wu など., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889）、レグニンB4 からのＶｉｃｉａ ｆａｂａプロモーター及び未知の種子タンパク質遺伝子からのＶｉｃｉａ ｆａｂａプロモーター（Conrad など., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711）、種子油体タンパク質からのプロモーター（Chen など., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941）、ブラシカ・ナパス（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質napAプロモーター又は当業界において知られている、例えば国際公開第９１/１４７７２号に記載されるようないずれか他の種子特異的プロモーターであり得る。さらに、プロモーターは、葉特異的プロモーター、例えばイネ又はトマトからのｒｂｃｓプロモーター（Kyozuka など., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93）、イネからのａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Kagaya など., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674）、又は創傷誘発性プロモーター、例えばジャガイモｐｉｎ２プロモーター（Xu など., 1993, Plant Molecular Biology 22 : 573-588）であり得る。同様に、プロモーターは、非生物学的処理、例えば温度、渇水又は塩分の変更により誘発できるか、又はプロモーターを活性化する外部的に適用される物質、例えばエタノール、エストロゲン、植物ホルモン様エチレン、アブシジン酸、ジベレリン酸及び/又は重金属により誘発できる。
【０２２０】
プロモーターエンハンサー要素がまた、植物におけるポリペプチドのより高い発現を達成するために使用され得る。例えば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであり得る。例えば、Xuなど., 1993（前記）は、発現を増強するためへのイネアクチン１遺伝子の最初のイントロンの使用を開示する。
【０２２１】
発現コンストラクトの選択マーカー遺伝子及びいずれか他の部分は、当業界において入手できるそれらから選択され得る。
【０２２２】
核酸コンストラクトは、当業界において知られている従来の技法、例えばアグロバクテリウム介在性形質転換、ウイルス介在性形質転換、マイクロインジェクション（microinjection）、粒子衝撃（particle bombardment）、バイオリステック形質転換（biolistic transformation）及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノム中に組込まれる（Gasserなど., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, BiolTechnology 8 : 535; Shimamoto など., 1989, Nature 338: 274）。
【０２２３】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは、トランスジェニック双子葉類を生成するための選択方法であり（再考のためには、Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38を参照のこと）、そして、それはまた、単子葉類を形質転換するためにも使用され得るが、しかし他の形質転換方法が一般的にそれらの植物のために好ましい。現在、アグロバクテリウムアプローチを補足する、トランスジェニック単子葉類を生成するための選択方法は、胚細胞又は成長胚の粒子衝撃である（形質転換DNAにより被覆された微小金又はタングステン粒子）（Christou, 1992, Plant Journal 2 : 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil など., 1992, BiolTechnology 10: 667-674）。単子葉類の形質転換のための他の方法は、Omirullehなど., 1993, Plant Molecular Biology21: 415-428により記載されるようにプロトプラスト形質転換に基づかれる。本開示に従っての使用のための追加の形質転換方法は、米国特許第６,３９５，９６６号 及び第７，１５１，２０４号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されるそれらの方法を包含する。
【０２２４】
形質転換に続いて、発現コンストラクトを含む形質転換体が選択され、そして当業界において良く知られていた方法に従って、完全な植物に再生される。しばしば、形質転換方法が、２種の別々のＴ−ＤＮＡコンストラクトによる同時形質転換を用いることにより、再生の間又は次の生成において、選択遺伝子の選択的排除、又は特異的組換え酵素による選択遺伝子の部位特異的排除のために企画される。
【０２２５】
本発明に従って調製されたコンストラクトによる特定の植物遺伝子型の直接的形質転換の他に、トランスジェニック植物は、前記コンストラクトを欠いている第２植物に前記コンストラクトを有する植物を交雑することにより製造され得る。例えば、ポリペプチドをコードするコンストラクトは、その所定の品種の植物を直接形質転換する必要なしに、交雑により特定植物品種中に導入され得る。従って、本発明は、本発明に従って形質転換された細胞から直接再生された植物のみならず、またそのような植物の子孫も包含する。本明細書において使用され得る場合、子孫とは本発明に従って調製される親植物のいずれかの世代の子孫を言及することができる。そのような子孫は、本発明に従って調製されたＤＮＡコンストラクト、又は本発明に従って調製されたＤＮＡコンストラクトの一部を包含することができる。交雑は、ドナー植物系により出発植物系を交雑受粉することによりトランスジーンの植物系中への導入をもたらす。そのような段階の非制限的例は、米国特許第７，１５１，２０４号に示されている。
【０２２６】
植物は戻し交雑転換の工程を通して生成され得る。例えば、植物は、戻し交雑転換された遺伝子型、系統、同系繁殖体（inbred）、又はハイブリッドとして言及される植物を包含する。
【０２２７】
遺伝子マーカーが、１つの遺伝子バックグラウンドからの本発明の１又は２以上のトランスジーンの別のトランスジーンへの遺伝子移入を助けるために使用され得る。マーカー助力選択は、それが表現型変異により引起される誤差を回避するために使用され得ることで、従来の育種に対して利点を提供する。さらに、遺伝子マーカーは、特定の交雑の個々の子孫において相対的程度のすぐれた胚形質に関するデータを提供することができる。例えば、農業的に所望されない遺伝子バックグラウンドを有する所望する形質を有する植物が優れた親に交雑される場合、遺伝子マーカーは、興味ある形質を有するのみならず、また比較的大集団の所望する胚形質を有する子孫を選択するために使用され得る。この手段によれば、特定の遺伝子バックグラウンド中に１又は２以上の形質を遺伝子移入するために必要とされる世代の数が減じられる。
【０２２８】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で栽培し、そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０２２９】
組成物
本発明はまた、α−アミラーゼ及び少なくとも１つの追加の酵素を含んで成る組成物にも関する。追加の酵素は、β−アミラーゼ、セルラーゼ（β−グルコシダーゼ、セロビオヒドラーゼ及びエンドグルカナーゼ）、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、イソアミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、フィダーゼ、プロテアーゼ、プルラーゼ、及び/又はα−アミラーゼと共に商業的工程において有用な他の酵素から成る群から選択され得る。追加の酵素はまた、第二α−アミラーゼでもあり得る。そのような酵素は、澱粉加工、糖転換、アルコール及び他の有用な最終製品のための発酵、商業的洗剤及び清浄助剤、しみの除去、生地処理又は糊抜き、及び同様のものの業界において知られている。
【０２３０】
α−アミラーゼの使用方法−産業的適用
本発明のα−アミラーゼは、種々の産業的適用を可能にする価値ある特性を有する。特に、α−アミラーゼは、洗剤、特に洗濯用洗剤組成物及び食品洗い用、パルプ及び紙の製造、ビール製造、エタノール製造、及び澱粉転換工程のために使用され得る。
【０２３１】
α−アミラーゼは、澱粉加工、特に澱粉転換、特に澱粉の液化のために使用され得る（例えば、引用により本明細書に組込まれる、米国特許第３，９１２，５９０号、 欧州特許第０６３９０９号、欧州特許第２５２７３０号、国際公開第９６／２８５６７号、及び国際公開第９９／１９４６７号を参照のこと）。本発明のα−アミラーゼの他に、またＡＭＧ、プルラナーゼ及び他のα−アミラーゼを含んで成ることができる、澱粉転換目的のための組成物も企画される。
【０２３２】
さらに、α−アミラーゼは、甘味剤及びエタノール（引用により本明細書に組込まれる米国特許第５，２３１，０１７号を参照のこと）、例えば燃料、飲料及び産業用エタノールの澱粉又は全澱粉からの製造において特に有用である。
【０２３３】
α−アミラーゼはまた、布地、生地び衣料品の糊抜きのために（例えば、引用により本明細書に組込まれる国際公開第９５／２１２４７号、米国特許第４，６４３，７３６号、及び欧州特許第１１９９２０号を参照のこと）、ビール製造又は醸造、及びパルプ及び紙製造又は関連工程にも使用され得る。
【０２３４】
澱粉加工
天然澱粉は、室温で水に不溶性である微小顆粒から成る。水性澱粉スラリーが加熱される場合、その顆粒は、膨潤し、そして結果的に破裂し、澱粉分子は溶液中に分散する。この「ゲル化」工程の間、劇的な粘度の上昇がある。典型的な産業工程における固形レベルは３０−４０％であるので、澱粉は薄くされるか、又は「液化される」はずであり、その結果、それは適切に加工され得る。この粘度低下は主に、現在の商慣習において酵素分解により達成される。
【０２３５】
従来の澱粉−転換工程、例えば液化及び糖化工程は、引用により本明細書に組込まれる米国特許第３，９１２，５９０号、欧州特許第２５２７３０号及び欧州特許第０６３９０９号に記載される。
【０２３６】
一態様によれば、低分子量炭水化物成分、例えば糖又は脂肪に澱粉を分解する転換工程は脱分岐（debranching）段階を包含する。
【０２３７】
澱粉を糖に転換する場合、澱粉は解重合される。そのような解重合工程は、例えば前処理段階及び２又は３の連続工程段階、すなわち液化工程、糖化工程、及び所望する最終製品に依存して、任意の異性化工程から成る。
【０２３８】
所望する最終糖製品が例えば高フルクトースシロップである場合、デキストロースシロップがフルクトースに転換され得る。糖化工程の後、ｐＨが、６〜８の範囲、好ましくはｐＨ７．５の値に高められ、そしてカルシウムがイオン交換により除去される。次に、デキストロースシロップが、例えば固定されたグルコースイソメラーゼを用いて、高フルクトースシロップに転換される。
【０２３９】
発酵製品の製造
一般的に、全粒紛からのアルコール製造（エタノール）は、次の４つの主要段階に分けられ得る：製粉、液化、糖化及び発酵。
【０２４０】
穀物は、その構造を開き、そしてさらなる加工を可能にするために粉砕される。使用される２種の工程は、湿式又は乾式粉砕である。乾式粉砕の場合、全仁が粉砕され、そして工程の残りの部分に使用される。湿式粉砕は、細菌及び荒引き粉（澱粉顆粒及びタンパク質）を非常に良好に分離し、少々の例外ではあるが、シロップの同時生成の位置に適用される。
【０２４１】
液化工程の場合、澱粉顆粒が、ほとんど４以上のＤＰのマルトデキストリンに加水分解により溶解される。加水分解は、酸処理により、又はα−アミラーゼにより酵素的に実施され得る。酸加水分解は限定された基準に基づいて使用される。原料は、粉砕された全粒紛又は澱粉加工からの側留であり得る。
【０２４２】
典型的な酵素液化の間、長鎖澱粉がα−アミラーゼにより枝分れ鎖及び直鎖の短いユニット（マルトデキストリン）に分解される。酵素液化は一般的に、三段階ホットスラリー工程として実施される。スラリーが６０−９５℃（例えば、７７−８６℃、８０−８５℃又は８３−８５℃）に加熱され、そして酵素が添加される。液化工程は８５℃で１−２時間、実施される。ｐＨは一般的に５．５−６．２である、それらの条件下で最適な酵素安定性を確保するために、１ｍＭのカルシウムが添加される（約４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオンを供給する）。そのような処理の後、液化された澱粉は１０−１５の「デキストロース当量」（ＤＥ）を有するであろう。
【０２４３】
スラリーは続いて、９５−１４０℃、例えば１０５−１２５℃でジェット調理され、６０−９０℃に冷却され、そしてさらに酵素が添加され、最終加水分解が得られる。液化工程はｐＨ４．５−６．５、典型的にはｐＨ５−６で実施される。粉砕され、そして液化された穀粒はまた、マッシュとしても知られている。
【０２４４】
液化された澱粉−含有材料は、糖化酵素、例えばグルコアミラーゼの存在下で糖化される。糖化工程は、１２−１２０時間（例えば、１２−９０時間、１２−６０時間、及び１２−４８時間）続くことができる。
【０２４５】
しかしながら、通常、約３０分−２時間（例えば、３０−９０分）、３０−６５℃の温度、典型的には約６０℃の温度で前−糖化段階が実施され、続いて、同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）として言及される発酵の間、完全な糖化が実施される。そのｐＨは通常４．２−４．８、例えば４．５である。同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）工程の場合、糖化のための保持段階は存在せず、むしろ酵母及び酵素が一緒に添加される。
【０２４６】
典型的な糖化工程の場合、液化の間に生成されるマルトデキストリンは、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素、例えばイソアミラーゼ（米国特許第４，３３５，２０８号）又はプルラナーゼの添加により、デキストロースに転換される。温度は、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素の添加の前、６０℃に低められる。糖化工程は２４−７２時間、進行する。
【０２４７】
糖化酵素の添加の前、ｐＨは４．５以下に低められ、この間、高温（９５℃以上）が維持され、液化されたα−アミラーゼが不活性化される。この工程は、脱分岐酵素により正しく加水分解されな得ない、「パノース前駆体（panose precursors）」と呼ばれる短いオリゴ糖の形成を低める。通常、糖化生成物の約０．２−０．５％は、プルラナーゼにより分解され得ない枝分れ鎖の三糖パンノース（Glc pα1 -6Glc pα1 -4Glc）である。液化からの活性アミラーゼが糖化の間、存続する場合（すなわち、変性されない場合）、パンノースの量は１−２％ほどの高さであり、これは糖化収率を有意に低めるので、高く所望されるものではない。
【０２４８】
発酵可能糖（例えば、デキストリン、単糖類、特にグルコース）は、酵素による糖化により生成される。それらの発酵可能糖はさらに、精製され、そして/又は有用な糖製品に転換され得る。さらに、糖は、最終製品、例えばアルコール（例えば、エタノール及びブタノール）、有機酸（例えば、琥珀酸及び乳酸）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート及び２−ケト−Ｌ−グロン酸）、アミノ酸（例えば、リシン）、タンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）の製造のために微生物発酵工程における発酵原料として使用され得る。
【０２４９】
一態様によれば、液化工程段階の間の得られる発酵可能糖を用いて、アルコール、特にエタノールを生成できる。エタノール生成の場合、糖化酵素及び発酵生物（例えば、酵母）が一緒に添加され、そして次に、３０−４０℃の温度で実施されるＳＳＦ工程が通常使用される。
【０２５０】
発酵に使用される生物は、所望する最終製品に依存するであろう。典型的には、エタノールが所望する最終製品である場合、酵母が発酵生物として使用されるであろう。いくつかの好ましい態様によれば、エタノール−生成微生物は酵母及び特に、サッカロミセス、例えばＳ．セレビシアエの株である（米国特許第４，３１６，９５６号）。種々のＳ．セレビシアエは、商業的に入手でき、そして次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＦＡＬＩ (Fleischmann‘s Yeast)、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ (Alltech)、ＦＥＲＭＩＯＬ (DSM Specialties)、 ＲＥＤ ＳＴＡＲ (Lesaffre) 及び Ａｎｇｅｌ アルコール酵母 (Angel Yeast Company, China)。前記方法に使用される出発物質酵母の量は、適切な時間で商業的に有意な量のエタノールを生成するのに（７２時間以下で２５−４０％のＤＳを有する基質から少なくとも１０％エタノールを生成するのに）効果的な量である。酵母細胞は一般的に、発酵ブイヨン１ｍｌ当たり約１０４−約１０１２及び好ましくは約１０７−約１０１０個の生存酵母の量で供給される。酵母がマッシュに添加された後、それは約２４−９６時間、例えば３５−６０時間、典型的には発酵にゆだねられる。温度は約２６−３４℃、典型的には約３２℃であり、そしてｐＨはｐＨ３−６、例えばほぼｐＨ４−５である。
【０２５１】
発酵は、発酵微生物（例えば、酵母）の他に、栄養物及び追加の酵素、例えばフィターゼを含むことができる。発酵への酵母の使用は、十分に公知である。
【０２５２】
さらなる態様によれば、適切な発酵微生物の使用は、当業界において知られているように、発酵最終製品、例えばグリセロール、１，３−プロパンジオール、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、２−ケト−Ｌ−グロン酸、琥珀酸、乳酸、アミノ酸及びそれらの誘導体をもたらすことができる。より特定には、乳酸が所望する最終製品である場合、ラクトバチルスsp. (L, カゼイ)（Lactobacillus sp. (L. casei)）が使用され得；グリセロール又は１，３−プロパンジオールが最終製品である場合、Ｅ．コリが使用され得；そして２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、及び２−ケト−Ｌ−グロン酸が所望する最終製品である場合、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が発酵微生物として使用され得る。上記列挙される微生物は単なる例であり、そして当業者は所望する最終製品を得るために使用され得る他の発酵微生物を気づくであろう。
【０２５３】
ゲル化されていない澱粉−含有材料からの発酵製品の製造方法
本発明は、澱粉−含有材料のゲル化を伴わないで（すなわち、調理しないで）、澱粉−含有材料から発酵製品を製造するための方法に関する。発酵製品、例えばエタノールは、澱粉−含有材料及び水を含む水性スラリーを液化しないで製造され得る。一態様によれば、本発明の方法は、適切な発酵生物により発酵製品に発酵され得る糖を製造するために、澱粉−含有材料、例えば粒状澱粉を、初期ゲル化温度以下で、好ましくは、α−アミラーゼ及び／又は炭水化物−源生成酵素の存在下で糖化する（例えば、粉砕される）ことを包含する。この態様によれば、所望する発酵製品、例えばエタノールが、ゲル化されていない（例えば、調理されていない）、好ましくは粉砕された穀物、例えばトウモロコシから製造される。従って、一観点によれば、本発明は、炭水化物−源生成酵素及び発酵生物を用いて、澱粉−含有材料の初期ゲル化温度以下の温度で、前記澱粉−含有材料を同時糖化し、そして発酵することを含んで成る、澱粉−含有材料から発酵製品を製造するための方法に関する。一態様によれば、プロテアーゼがまた存在する。プロテアーゼは、いずれかの酸生菌類プロテアーゼ又はメタロプロテアーゼであり得る。発酵製品、例えばエタノールは、発酵の後、例えば蒸留により任意には回収され得る。典型的には、アミラーゼ、例えばグルコアミラーゼ及び/又は他の炭水化物−源生成酵素、及び/又はα−アミラーゼが、発酵の間、存在する。グルコアミラーゼ及び他の炭水化物−源生成酵素の例は、生澱粉加水分解グルコアミラーゼを包含する。α−アミラーゼの例は、酸性α−アミラーゼ、例えば酸性菌類α−アミラーゼを包含する。発酵生物の例は、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエの株を包含する。用語「初期ゲル化温度」とは、澱粉ゲル化が始まる最低温度を意味する。一般的に、水において加熱される澱粉は、約５０−７５℃でゲル化を始め；ゲル化の正確な温度は特定の澱粉に依存し、そして当業者により容易に決定され得る。従って、初期ゲル化温度は、植物種、植物種の特定品種及び成長条件に従って変化することができる。本発明においては、所定の澱粉−含有材料の所定ゲル化温度は、Gorinstein and Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461 -466により記載される方法を用いて、複屈折率が澱粉顆粒の５％で失われる温度として決定され得る。前記工程の開始の前、澱粉−含有材料中、１０−５５ｗ／ｗ％の乾燥固形物（DS）、好ましくは２５−４５ｗ／ｗ％の乾燥固形物、より好ましくは３０−４０ｗ／ｗ％の乾燥固形分を有する、澱粉−含有材料、例えば粒状澱粉のスラリーが調製され得る。前記スラリーは、水及び/又はプロセス水、例えば蒸留残渣（バックセット）、スクバー水、エバポレータ濃縮物又は蒸留物、蒸留からのサイドストリッパー水、又は他の酵素製品プラントからのプロセス水を含むことができる。本発明の方法は初期ゲル化温度以下で実施され、そして従って、粘度の有意な上昇が生じないので、高レベルの蒸留残渣が所望により、使用され得る。一態様によれば、水性スラリーは、約１−約７０体積％、好ましくは１５−６０体積％、特に約３０−５０体積％の水及び/又はプロセス水、例えば蒸留残渣（バックセット）、スクバー水、エバポレータ濃縮物又は蒸留物、蒸留からのサイドストリッパー水、又は他の酵素製品プラントからのプロセス水、もしくはそれらの組合せ、又は同様のものを含む。澱粉−含有材料は、粒子サイズを、好ましくは乾式又は湿式粉砕により、０．０５−３．０ｍｍ、好ましくは０．１−０．５ｍｍに低めることにより調製され得る。本発明の方法にゆだねられた後、澱粉−含有材料中の少なくとも ８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の乾燥固形物が可溶性澱粉加水分解物に転換される。本発明のこの観点での方法は、初期ゲル化温度で行われ、このことは、前記温度が典型的には、３０−７５℃好ましくは４５−６０℃の範囲にあることを意味する。好ましい態様によれば、前記方法は、２５−４０℃、例えば２８℃−３５℃、３０℃−３４℃、好ましくはほぼ３２℃の温度で実施される。一態様によれば、前記方法は、糖レベル、例えばグルコースレベルが、低レベル、例えば６ ｗ／ｗ％以下、例えば約３ ｗ／ｗ%以下、例えば約２ ｗ／ｗ％以下、例えば約１ ｗ／ｗ％以下、例えば約０．５ ｗ／ｗ%以下、又は０．２５ ｗ／ｗ％以下、例えば約０．１ ｗ／ｗ％以下で維持されるよう実施される。そのような低レベルの糖は、調節された量の酵素及び発酵生物を単純に使用することにより達成され得る。当業者は、使用する酵素及び発酵生物の用量/量を容易に決定することができる。酵素及び発酵生物の使用される量はまた、発酵ブイヨン中のマルトースを低濃度で維持するよう選択され得る。例えば、マルトースレベルは、約０．５ｗ／ｗ％以下、例えば約０．２ｗ／ｗ％以下に維持され得る。本発明の方法は、約３−７のｐH、好ましくは３．５−６のｐH又はより好ましくは４−５のｐＨで実施され得る。一態様によれば、発酵は６−１２０時間、特に２４−９６時間、進められる。
【０２５４】
ゲル化された澱粉−含有材料からの発酵製品の製造方法
この観点によれば、本発明は、液化段階、及び連続的又は同時に実施される糖化及び発酵段階を包含する、澱粉−含有材料から発酵製品、特にエタノールを生成するための方法に関する。従って、本発明は、
（ａ）α−アミラーゼの存在下で澱粉−含有材料を液化し；又は
（ｂ）炭水化物−源生成酵素を用いて、段階（ａ）で得られた液化材料を糖化し；
（ｃ）発酵生物を用いて発酵する段階を含んで成る、澱粉−含有材料から発酵製品の製造方法に関する。一観点によれば、プルラナーゼ、例えばファミリーＧＨ５７プルラナーゼがまた、液化段階にも使用される。一態様によれば、プロテアーゼ、例えば酸性菌類プロテアーゼ又はメタロプロテアーゼが、液化の前、間及び／又は後、添加される。一態様によれば、メタロプロテアーゼは、サーモアスカス（Thermoascus）の株、例えばサーモアスカス・アウランチアカス（Thermoascus aurantiacus）、特にサーモアスカス・アウランチアカスＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．０６７０に由来する。一態様によれば、炭水化物−源生成酵素は、下記に由来するグルコアミラーゼである：アスペルギラスの株、例えばアスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリの株、タラロミセス（Talaromyces）の株、特にタラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）の株、又はアセリア（Athelia）、特にアセリア・ロルフシ（Athelia rolfsii）の株、トラメテス（Trametes）、好ましくはトラメテス・シングラタ（Trametes cingulata）の株、パキキトスポラ（Pachykytospora）、例えばパキキトスポラ・パピラセア（Pachykytospora papyracea）の株、又はルコパキシラス（Leucopaxillus）、例えばルコパキシラス・ギガンテウス（Leucopaxillus giganteus）の株、又はペニオフォラ（Peniophora）、例えばペニオフォラ・ルホマルギナタ（Peniophora rufomarginata）の株、又はそれらの混合物。糖化段階（ｂ）及び発酵段階（ｃ）は、連続的に又は同時に実施され得る。プルラナーゼ及び／又はメタロプロテアーゼは、前記工程が連続的糖化及び発酵工程として実施される場合、糖化及び／又は発酵の間、及び段階（ｂ）及び（ｃ）が同時に実施される場合（SSF工程）、発酵の前又は間、添加され得る。プルラナーゼ及び／又はメタロプロテアーゼはまた、好都合には、液化の前（前液化処理）、すなわち段階（ａ）の前又は間、及び／又は液化の後（後液化処理）、すなわち段階（ａ）の後、添加され得る。プルラナーゼは最も好都合には、液化の前又は間、すなわち段階（ａ）の前又は間、添加される。発酵製品、例えば特にエタノールは任意には、発酵の後、例えば蒸留により回収され得る。発酵生物は好ましくは、酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビシアエの株である。特定の態様によれば、本発明の方法はさらに、段階（ａ）の前、
ｘ）澱粉−含有材料の粒子サイズを好ましくは粉砕することにより（例えば、ハンマーミルを用いて）低め；
ｙ）澱粉−含有材料及び水を含んで成るスラリーを形成する段階を含んで成る。
【０２５５】
好ましい態様によれば、粒子サイズは、＃７スクリーン、例えば＃６スクリーンよりも小さい。水性スラリーは、澱粉−含有材料中、１０−５５ｗ／ｗ％の乾燥固形物（ＤＳ）、例えば２５−４５又は３０−４０ｗ／ｗ％。の乾燥固形物（ＤＳ）を含むことができる。スラリーは、ゲル化温度以上に加熱され、そしてα−アミラーゼが添加され、液化（薄化（thinning））が開始される。スラリーは、ジェット−調理され、さらにスラリーがゲル化され、その後、段階（ａ）のα−アミラーゼにゆだねられる。液化は、３段階ホットスラリー工程として実施され得る。スラリーは６０−９５℃、好ましくは７０−９０℃、例えば好ましくは、８０−８５℃に、ｐＨ４−６、好ましくは４．５−５．５で加熱され、そしてα−アミラーゼが、任意にはプルラナーゼ及び/又はプロテアーゼ、好ましくはメタロプロテアーゼと一緒に添加され、液化（薄化）が開始される。一態様によれば、次にスラリーは、９５−１４０℃、好ましくは１００−１３５℃、例えば１０５−１２５℃の温度で、約１−１５分、好ましくは約３−１０分、特にほぼ５分間、ジェット−調理され得る。スラリーは６０−９５℃に冷却され、そしてさらに、α−アミラーゼ及び任意には、プルラナーゼ及び／又はプロテアーゼ、好ましくはメタロプロテアーゼが添加され、加水分解（二次液化）が完了される。液化工程は通常、ｐＨ４−６、特にｐＨ４．５−５．５で実施される。糖化段階（ｂ）は、当業界において良く知られている条件下で実施され得る。例えば、十分な糖化工程は約２４−約７２時間、続くことができるが、しかしながら３０−６５℃、典型的には約６０℃の温度で、典型的には４０−９０分の前−糖化、続いて、同時糖化及び発酵工程（ＳＳＦ工程）における発酵の間、完全な糖化を単に実施することは通常である。糖化は典型的には、２０−７５℃、好ましくは４０−７０℃、典型的には約６０℃の温度で、及びｐＨ４−５、通常ほぼｐＨ４．５で実施される。発酵製品、特にエタノールを製造するための最も広く使用される方法は、同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）工程であり、この場合、糖化のための保持段階は存在せず、このことは、発酵生物、例えば酵母及び酵素が一緒に添加され得ることを意味する。ＳＳＦは典型的には、２５−４０℃、例えば２８−３５℃、例えば３０−３４℃、好ましくは約３２℃の温度で実施され得る。一態様によれば、発酵は６−１２０時間、特に２４−９６時間、進行する。
【０２５６】
ビール製造
α−アミラーゼはまた、ビール製造工程及び類似する発酵にも使用され得；α−アミラーゼは典型的には、マッシング工程（mashing process）の間、添加されるであろう。前記工程は、上記粉砕、液化、糖化及び発酵工程に実質的に類似する。
【０２５７】
蒸留残渣による澱粉スラリー加工
粉砕された澱粉−含有材料を、水及び再循環された薄−蒸留残渣と共に組合し、水性スラリーをもたらす。スラリーは、１５−５５％ｄｓ  ｗ／ｗ（例えば２０−５０％、２５ − ５０％、２５ − ４５％、２５ −４０％、２０−３５％ 及び ３０−３６％ ds）を含むことができる。いくつかの態様によれば、再循環された薄−蒸留残渣（バックセット）は、約１０−７０ｖ／ｖの範囲（例えば、１０ − ６０％、１０ − ５０％、１０ − ４０％、１０ − ３０％、１０ − ２０％、２０ − ６０％、２０ − ５０％、２０− ４０％及び/又は２０ − ３０％）にある。
【０２５８】
粉砕された澱粉−含有材料は水及びバックセットと共に組合されるが、スラリーにおけるｐＨは調節されていない。さらに、ｐＨは、フィターゼ及び任意にはα−アミラーゼのスラリーへの添加の後、調節されていない。一態様によれば、スラリーのｐＨは、約４．５−約６．０の範囲（例えば、ｐＨ  ４．５ − ５．８; ４．５ − ５．６; ４．８ − ５．８; ５．０ − ５．８; ５．０ − ５．４; ５．２ − ５．５; 及び ５．２ − ５．９）にあろう。スラリーのｐＨは、スラリーに添加される薄蒸留残渣の量及びその薄蒸留残渣を含んで成る材料のタイプに依存して、約４．５−５．２であり得る。例えば、薄蒸留残渣のｐＨは、３．８ − ４．５であり得る。
【０２５９】
エタノール製造の間、酸が添加され、ビールウェルのｐＨが低められ、その結果、蒸留の前、微生物汚染の危険性が低められ得る。
【０２６０】
いくつかの態様によれば、フィターゼがスラリーに添加される。他の態様によれば、フィターゼの他に、α−アミラーゼがスラリーに添加される。いくつかの態様によれば、フィターゼ及びα−アミラーゼがスラリーに連続的に添加される。他の態様によれば、フィターゼ及びα−アミラーゼが同時に添加される。いくつかの態様によれば、フィターゼ及び任意には、α−アミラーゼを含んで成るスラリーは、約５分−約８時間（例えば、５分−６分間、５分−４時間、５分−２時間及び１５分−４時間）、インキュベートされる（前処理される）。他の態様によれば、スラリーは、約４０ − １１５℃（例えば、４５ − ８０°Ｃ、５０ − ７０°Ｃ、５０ − ７５°Ｃ、６０ − １ １０°Ｃ、６０ − ９５°Ｃ、７０ − １ １０°Ｃ、７０ − ８５°Ｃ及び７７ − ８６°Ｃ）の範囲の温度でインキュベートされる。
【０２６１】
他の態様によれば、スラリーは、澱粉−含有材料の澱粉ゲル化温度以下の約０−約３０℃（例えば、０ − ２５°Ｃ、０ − ２０°Ｃ、０ − １５°Ｃ、 ０ − １０°Ｃ 及び ０ − ５°Ｃ）の温度でインキュベートされる。いくつかの態様によれば、温度は、約６８℃以下、約６５℃以下、約６２℃以下、約６０℃以下及び約５５℃以下である。いくつかの態様によれば、温度は、約４５℃以上、約５０℃以上、約５５℃以上及び約６０℃以上である。いくつかの態様によれば、フィターゼ及びα−アミラーゼを含んで成るスラリーの澱粉ゲル化温度以下の温度でのインキュベーションは、一次（１°）液化として言及される。
【０２６２】
一態様によれば、粉砕された澱粉−含有材料は、トウモロコシ又はミロ（milo）である。スラリーは２５−４０％ＤＳを含み、ｐＨは４．８−５．２の範囲であり、そしてスラリーはフィターゼ及び任意には、α−アミラーゼと共に、６０−７５℃の範囲の温度で、５分−２時間、インキュベートされる。
【０２６３】
現在、液化工程に使用される市販の微生物α−アミラーゼは一般的に、ｐＨ５．６以下のｐＨレベルで約８０℃以上の温度で完全な粉砕された穀物を用いて乾式粉砕工程から液化された澱粉基質を生成するのに十分には安定していないと思われる。多くの市販のα−アミラーゼの安定性は、約４．０以下のｐＨで低められる。
【０２６４】
さらなる液化段階においては、インキュベートされた又は前処理された澱粉−含有材料は、約４．０−５．０のｐＨで約２分−約６時間（例えば、２分−４時間、９０分−１４０分及び９０分−１４０分）、より好ましくは１−２時間、澱粉−含有材料の澱粉ゲル化温度（例えば、７０−１２０℃、７０−１１０℃及び７０−９０℃）よりも約０−約４５℃高い温度の上昇に暴露される。温度は、短時間、例えば１−１５分間、従来の温度ジェット調理システムにより高められ得る。次に、澱粉はさらに、約７５−９５℃の範囲（例えば、８０−９０℃及び８０−８５℃）の温度で約１５−１５０分間（例えば、３０−１２０分）、加水分解され得る。好ましい態様によれば、ｐＨはそれらの工程の間、調節されず、そして液化されたマッシュのｐＨは、約ｐＨ４．０−５．８の範囲（例えば、ｐＨ４．５−５．８、４．８−５．４及び５．０−５.２）にある。いくつかの態様によれば、第２用量の熱安定性α−アミラーゼが二次液化工程に添加されるが、しかし他の態様によれば、追加の用量のα−アミラーゼは存在しない。
【０２６５】
インキュベーション及び液化工程に続いて、当業界において良く知られている糖化及び発酵段階が存在する。
【０２６６】
蒸留
任意には、発酵に続いて、アルコール（例えば、エタノール）は、例えば蒸留により抽出され、そして任意には、続いて１又は２以上の加工段階を伴う。
【０２６７】
いくつかの態様によれば、本明細書に提供される方法により製造されるエタノールの収率は、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも １６％、少なくとも１７％及び少なくとも１８％ (ｖ/ｖ) 及び少なくとも ２３％ ｖ/ｖである。本明細書に提供される方法に従って得られるエタノールは例えば、燃料エタノール、飲料エタノール、すなわち飲料用ニュートラル・スピリッツ又は産業用エタノールとして使用され得る。
【０２６８】
副産物
発酵からの残存物は、穀物であり、これは典型的には、液体又は乾燥された形で動物飼料のために使用される。さらなる態様によれば、最終製品は、発酵同時製品、例えば蒸留器の乾燥された穀物（ＤＤＧ）、及び蒸留器の乾燥された穀物＋溶解質を包含し、それらは例えば、動物飼料として使用され得る。
【０２６９】
液化、糖化、発酵、蒸留、及びエタノールの回収をいかにして実施するかについてのさらなる詳細は、当業者に良く知られている。
【０２７０】
本明細書に提供される方法によれば、糖化及び発酵は、同時に又は別々に実施され得る。
【０２７１】
パルプ及び紙製造
α−アミラーゼはまた、澱粉強化された故紙及びダンボールからのリグノセルロース性材料、例えばパルプ、紙及びダンボールの製造にも使用され得、特にこの場合、リパルピングが７以上のｐＨで生じ、そしてアミラーゼが強化澱粉の分解を通して廃棄材料の分解を促進する。α−アミラーゼは澱粉−被覆された印刷物からの製紙パルプの製造方法において特に有用である。前記方法は、国際公開第９５／１４８０７号に記載のように、次の段階：
ａ）パルプを製造するために紙を分解する段階、
ｂ）段階ａ）の前、間又は後、澱粉−分解酵素により処理する段階、及び
ｃ）段階ａ）及びｂ）の後、パルプからインク粒子を分離する段階を含んで成る。
【０２７２】
α−アミラーゼはまた、澱粉の変性において非常に有用であり、ここで酵素的に変性された澱粉は、アルカリ性充填剤、例えば炭酸カルシウム、カオリン及びクレーと一緒に製紙に使用される。α−アミラーゼにより、充填剤の存在下で澱粉を変性し、従って、より単純な統合工程を可能にする。
【０２７３】
布地、生地及び衣料品の糊抜き
α−アミラーゼはまた、布地、生地又は衣料品の糊抜きにおいても有用であり得る。布地加工産業においては、α−アミラーゼは従来、横糸編み糸上の保護膜として製織の間、作用してきた澱粉−含有サイズ剤の除去を促進するために糊抜き工程において助剤として使用される。製織りの後、サイズ剤被膜の完全な除去は、続く工程における最適結果を確保するために重要であり、この場合、生地は洗浄され、漂白され、そして乾燥される。酵素による澱粉の分解が好ましい。なぜならば、それはファイバーに対していずれの有害な効果も包含しないからである。加工費用を低め、そして製粉処理能力を高めるために、糊抜き工程は時々、洗浄及び漂白段階と組み合わされる。そのような場合、非酵素助剤、例えばアルカリ又は酸化剤が典型的には、澱粉を分解するために使用される。なぜならば、従来のα−アミラーゼは高ｐＨレベル及び漂白剤とほとんど適合できないからである。澱粉サイズの非酵素分解は、使用されるかなり攻撃的な化学製品のために、いくつかのファイバー損傷を導く。従って、α−アミラーゼはアルカリ溶液において改善された性能を有するので、そのα−アミラーゼを使用することが所望される。α−アミラーゼは、セルロース−含有生地又は布地を糊抜きする場合、単独で又はセルラーゼと組合して使用され得る。
【０２７４】
糊抜き及び漂白工程は、当業界において良く知られている。例えば、そのような工程は、本明細書に引用により組込まれる、国際公開第９５／２１２４７号、米国特許第４，６４３，７３６号及び欧州特許第１１９９２０号に記載される。
【０２７５】
清浄工程及び洗剤組成物
α−アミラーゼは、洗濯及び食器洗いを包含する種々の清浄又は洗浄工程のための洗剤組成物の成分として添加され得る。例えば、α−アミラーゼは、国際公開第９６／２３８７４号及び国際公開第９７／０７２０２号に記載される洗剤組成物に使用され得る。
α−アミラーゼは、従来使用される濃度で洗剤に組込まれ得る。例えば、本発明のα−アミラーゼは、従来の用量レベルの洗剤を用いて、洗浄／食器洗い溶液１Ｌ当たりα−アミラーゼ０．００００１−１０ｍｇ（純粋な活性酵素タンパク質として計算される）に対応する量で組込まれ得る。
【０２７６】
洗剤組成物は、例えば手洗い用又は洗濯機用洗剤組成物として、例えば汚れた布地の前処理に適した洗濯用添加剤組成物や、リンスを添加した柔軟剤組成物として調製することができる。また、家事全般における硬表面清浄作業用の洗剤組成物として、又は手洗い又は食器洗い機用に調製することができる。
【０２７７】
洗剤組成物はさらに、１又は２以上の他の酵素、例えばリパーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、別のアミロース分解酵素、例えば別のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトースアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ（例えば、Novozymes, DenmarkからのMannaway（登録商標））、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ及び／又はラッカーゼを含むことができる。
【０２７８】
洗剤酵素を洗剤組成物に含めるには、１又は２以上の酵素を含む個別の添加剤を加えてもよく、これら全ての酵素を含む組み合わせ添加剤を加えてもよい。洗剤添加剤、例えば個別の添加剤又は組み合わせ添加剤は、例えば粉末、液体、スラリー等として調製することができる。好ましい洗剤添加剤処方は、顆粒、特に非粉化顆粒、液体、特に安定化した液体、又はスラリーである。
【０２７９】
非粉化顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示の方法によって調製することができる。周知の方法により被覆してもよい。ワックス被覆材料の例としては、平均モル重量１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコール部分が１２〜２０の炭素原子を含み、１５〜８０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドが挙げられる。流動床法による適用に適した膜形成被覆材料の例は、英国特許出願第１４８３５９１号に記載のとおりである。液体酵素調製物を、確立された方法に従い、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸等を添加することにより安定化してもよい。保護された酵素は、例えば欧州特許出願第２３８，２１６号に開示の方法に従い調製することができる。
【０２８０】
洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
【０２８１】
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。
【０２８２】
そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
【０２８３】
そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約0.2％〜約40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体（「グルコサミド」）を含むであろう。
【０２８４】
洗剤は、０〜65％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばHoechstからのSKS−６）を含むことができる。
【０２８５】
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−N−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
【０２８６】
洗剤は、H2O2源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
【０２８７】
洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えば国際公開第９２/１９７０８号及び国際公開第９２/１９７０９号に記載のようにして配合され得る。
【０２８８】
洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば生地コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。
【０２８９】
洗剤組成物は、洗浄溶液１Ｌ当たり酵素タンパク質０．０１−１００ｍｇに対応する量、好ましくは酵素タンパク質０．０５５ｍｇに対応する量、特に酵素タンパク質０．１−１ｍｇに対応する量でいずれかの酵素を含むことができる。
【０２９０】
本明細書に記載される１又は２以上のα−アミラーゼはさらに、引用により本明細書に組込まれる国際公開第９７／０７２０２号に開示される洗剤配合物に組込まれ得る。
【０２９１】
この開示は次の実施例におけるさらなる詳細を包含するが、それらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。従って、次の実施例は、例示的であって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０２９２】
材料及び方法
α−アミラーゼ及び変異体の発酵
発酵を、当業界において良く知られている方法により、又は次の通りに実施することができる：
適切な発現プラスミドを有するＢ．サブチリス株を、適切な抗生物質を有するＬＢ−寒天プレート上に画線培養し、そして３７℃で一晩、培養する。
【０２９３】
コロニーを、５００ｍｌの振盪フラスコにおいて、適切な抗生物質（例えば、１０ｍｇ／ｌのクロラムフィニコール）により補充された１００ｍｌのＢＰＸ培地に移す。ＢＰＸ培地の組成は次の通りである：
ジャガイモ澱粉                １００ｇ／ｌ
大麦粉                        ５０ｇ／ｌ
ＢＡＮ５０００ＳＫＢ          ０．１ｇ／ｌ
カゼインナトリウム            １０ｇ／ｌ
大豆ミール                    ２０ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ      ９ｇ／ｌ
Pluronic（登録商標）          ０．１ｇ／ｌ
ＢＡＮは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓにより市販されているバチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ製品である。
【０２９４】
培養物は、３７℃、２７０rpmで４〜５日間、振盪される。
【０２９５】
細胞及び細胞残骸を、４,５００ｒｐｍでの２０−２５分間の遠心分離により発酵ブイヨンから除去した。その後、上清液を濾過し、完全に透明な溶液を得る。濾液を濃縮し、そしてＵＦ−フィルター（１０,０００カットオフ膜）上で洗浄し、そして緩衝液を２０ｍＭのアセテート（ｐＨ５．５）に変える。ＵＦ−濾液をＳ−セファロースＦ．Ｆ．上に適用し、そして溶出を、同じ緩衝液中、０．２ＭのＮａＣｌによる段階的溶出により実施する。溶出物を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）に対して透析し、そしてＱ−セファロースＦ．Ｆ．上に適用し、そして６カラム体積にわたって、０−０．３ＭのＮａＣｌからの線状グラジエントにより溶出する。活性（Phadebasアッセイにより測定される）を含む画分をプールし、ｐＨを７．５に調節し、そして残る着色物を０．５％ｗ／ｖｏｌ活性炭による５分間の処理により除去する。
【０２９６】
Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイ
α−アミラーゼ活性を、基質としてＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）錠剤を用いる方法により決定するＰｈａｄｅｂａｓ錠剤（Magle Life Sciences, Lund, Swedenにより供給されるPhadebas（登録商標） Amylase Test）は、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合され、そして錠剤化された、架橋された不溶性の青色澱粉ポリマーを含む。
【０２９７】
あらゆる単一の測定の場合、１つの錠剤を、５０ｍｌの５０ｍＭのBritton-Robinson緩衝液（５０ｍＭの酢酸、５０ｍＭのリン酸、５０ｍＭの硼酸、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００；ＮａＯＨにより興味ある値に調節されるｐＨ）を含む管において懸濁する。試験されるα−アミラーゼを、５０ｍＭのBritton−Robinson緩衝液に希釈する。これは、アミラーゼ溶液である。試験を、一定温度、例えば室温、３７℃又は５０℃で実施する。不溶性青色澱粉ポリマーを、α−アミラーゼにより加水分解し、可溶性青色フラグメントを得る。６２０ｎｍで分光測光的に測定される、その得られる青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。
【０２９８】
５７５μｌの基質溶液を、選択された温度で５分間、平衡化する。加水分解を、２５μｌのアミラーゼ溶液を基質溶液に添加し、そして選択された温度で１５分間、サンプルを軽い混合下でインキュベートすることにより開始する。反応を、１００μｌの１ＭのＮａＯＨを添加し、そして混合の後、すぐに氷溶上で冷却することにより停止する。５００ｇavでの３分間の遠心分離の後、２００μｌの上清液を、マイクロタイタープレートに移し、そして６２０ｎｍでの吸光度を読取る（Ａａｍｙｅ）。ブラインドを記載のようにして調製したが、但し２５μｌのアミラーゼ溶液を２５μｌの５０ｍＭのBritton−Robinson緩衝液により交換する。６２０ｎｍでのブラインドの吸光度はＡｂである。標準曲線を、既知活性を有するＴｅｒｍａｍｙｌの一連の希釈溶液を調製し、そして上記のようにして溶液への青色の放出を測定することにより同様にして調製する。６２０ｎｍでの標準の吸光度はＡｓである。標準曲線は、サンプルにおけるTermamyl活性に対するＡｓ−Ａｂのプロットである。興味あるアミラーゼの活性を、termamyl標準曲線に対するＡａｍｙｌ−Ａｂを比較することにより決定することができる。
【０２９９】
１５分のインキュベーションの後（試験時間）、測定される６２０ｎｍでの吸光度は、６２０ｎｍで０．２−２．０の吸光度単位の範囲にあることが重要である。この吸光度範囲においては、活性と吸光度との間に比例性（linearity）が存在する（Lambert−Beer法則）。従って、酵素（対象のアミラーゼ及び標準の両者）の希釈度は、この基準を満たすよう調節されるべきである。特定される組の条件（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝条件）下で、所定のα−アミラーゼ１ｍｇが一定量の基質を加水分解し、そして青色が生成されるであろう。
【０３００】
Ｇ７−ｐＮＰアミラーゼアッセイ
α−アミラーゼ活性をまた、ＰＮＰ−Ｇ７基質を用いての方法により決定することができる。ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドの略語であるＰＮＰ−Ｇ７は、エンド−アミラーゼにより分解され得るブロックオリゴ糖である。分解に続いて、キットに含まれるα−グルコシダーゼは、基質を消化し、黄色を有し、そして従って、λ＝４０５ｎｍ（４００−４２０ｎｍ）で可視分光測定法により測定され得る遊離ＰＮＰ分子を開放する。ＰＮＰ−Ｇ７基質及びα−グルコシダーゼを含むキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（カタログ番号１１８７６４７３号）により製造される。このキットからのＧ７−ＰＮＰ基質は、２２ｍモル／ｌの４、６−エチリデン−Ｇ７−ＰＮＰ及び５２．４ｍモル／ｌのＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０）を含み、そしてα−グルコシダーゼは５２．４ｍモル／ｌのＨＥＰＥＳ、８７ｍモル／ｌのＮａＣｌ、１２．６ｍモル／ｌのＭｇＣｌ２、４ｋＵ／ｌ以上のα−グルコシダーゼを含む。
【０３０１】
分析されるべきアミラーゼサンプルを、５０ｍＭのＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｅ９５０２））、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０において希釈する。使用の前、基質検量線用溶液を、１ｍｌのα−グルコシダーゼ含有試薬とキットからの０．２ｍｌの４，６−エチリデン−Ｇ７−ＰＮＰ含有試薬とを混合することにより製造した。ＰＣＲ機械におけるサンプルのインキュベーションの直後、サンプルを、残効緩衝液（residual activity buffer）(５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０)により１０倍に希釈する。アッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートに２０μｌの希釈された酵素サンプルを移し、そして８０μｌの基質検量線用溶液を添加することにより実施する。前記溶液を混合し、そして室温で１分間プレ−インキュベートし、そして吸光度をＯＤ４０５ｎｍで５分間２０秒ごとに測定する。
【０３０２】
時間依存性吸光度−曲線の傾斜（吸光度／分）は、所定組の条件下で問題のα−アミラーゼの比活性（酵素当たりの活性）に直接比例する。アミラーゼサンプルを、傾斜が１分当たり０．４吸光度単位以下になるレベルまで希釈すべきである。
【０３０３】
Ｅｎｚｃｈｅｋ（登録商標）アミラーゼ活性アッセイ
α−アミラーゼ活性をまた、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）基質を用いる方法により決定することができる。ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ａｍｙｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ (E33651, Invitrogen, La Jolla, CA, USA)における基質は、トウモロコシ澱粉誘導体、すなわちＤＱ（登録商標）澱粉であり、これは、蛍光が消光されるような程度までＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ色素によりラベルされたトウモロコシ澱粉である。
【０３０４】
約１ｍｇの凍結乾燥された基質を含む１つのバイアルを、１００μｌの５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に溶解する。バイアルを２０秒間かき混ぜ、そして溶解されるまで、時折混合しながら、暗室において室温に放置する。次に、９００μｌの１００ｍＭのアセテート、０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、０．１２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．５を添加し、十分にかき混ぜ、そして使用まで、暗室において貯蔵する。基質検量線用溶液を、残効緩衝液 (１００ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、０．１２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．５)により１０倍に希釈することにより調製し、希釈することにより、１００μｇ／ｍｌの基質濃度を得る。インキュベーションの直接、酵素を、１００ｍＭのアセテート、０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、０．１２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．５により２０ｎｇの酵素タンパク質／ｍｌの濃度に希釈する。
【０３０５】
アッセイのために、２５μｌの基質検量線用溶液を、黒の３８４ウェルマイクロタイタープレートにおいて２５μｌの希釈された酵素と共に１０秒間、混合する。蛍光強度を個々のウェルにおいて２５℃で１５分間、１分ごとに測定し（励起：４８５ｎｍ、放射：５５５ｎｍ）、そしてＶｍａｘを時間に対する蛍光強度のプロットの傾斜として計算する。そのプロットは線状であるべきであり、そして残効アッセイは、希釈された対照酵素溶液が前記残効アッセイの線状範囲内にあるよう調節されている。
【０３０６】
実施例１：ハイブリッドの調製
配列番号７で示される配列を有するカルシウム−感受性α−アミラーゼ及び配列番号１３で示される配列を有するカルシウム−非感受性α−アミラーゼの次のハイブリッドを調製した：
ハイブリッド１：配列番号７のアミノ酸残基１０６−２１５を除去し、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２１１により置換し、配列番号１７をもたらし、そして次の変更を導入し：Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ及びＤ１９２Ｔ（配列番号１７番号付けを用いる）、これは配列番号２７番号付けを用いてＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ及びＤ１９１Ｔに対応する。このハイブリッドの配列は、配列番号１８で示される。
【０３０７】
ハイブリッド２：配列番号７のアミノ酸残基１０６−２１４を除去し、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２１０により置換し、配列番号１９をもたらし、そして次の変更を導入し：Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ及びＤ１９２Ｔ（配列番号１９番号付けを用いる）、これは配列番号２７番号付けを用いてＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ及びＤ１９１Ｔに対応する。このハイブリッドの配列は、配列番号２０で示される。
【０３０８】
ハイブリッド３：配列番号７のアミノ酸残基１０６−２１３を除去し、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２０９により置換し、配列番号２１をもたらし、そして次の変更を導入し：Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ及びＤ１９２Ｔ（配列番号２１番号付けを用いる）、これは配列番号２７番号付けを用いてＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ 及び Ｄ１９１Ｔに対応する。このハイブリッドの配列は、配列番号22で示される。
【０３０９】
実施例２：錯化剤の存在下での安定性
酵素サンプルを、１．５％の最終濃度のＤＴＰＡと共に４９℃で１時間、緩衝液（ｐＨ８．０）（５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、ｐＨ８．０）においてインキュベートし、そして対照サンプルを４℃で１時間インキュベートした。さらに、酵素サンプルを、１．５％の最終濃度のＤＴＰＡと共に４２℃で１時間、緩衝液（ｐＨ１０．０）（５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、ｐＨ１０．０）においてインキュベートし、そして対照サンプルを４℃で１時間  インキュベートした。
【０３１０】
ＤＴＰＡを含む緩衝液ｐＨ８及びｐＨ１０におけるアミラーゼ安定性の決定のために、試験されるべき酵素を、５ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、ｐＨ８．０による希釈により、０．２５及び０．５ｍｇの酵素タンパク質／ｍｌに調節した。
【０３１１】
１６μｌの安定性緩衝液（５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、１．８７５％ＤＴＰＡ、ｐＨ８．０又はｐＨ１０．０）及び４０μｌのアミラーゼ溶液を、ニ重反復して９６ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに移し、そしてその内容物を、混合した。ＤＴＰＡの最終濃度は個々のウェルにおいて１．５％であった。個々のウェルからの２μｌを、４℃で配置される（対照サンプル）新規ＰＣＲマイクロタイタープレートに移した。ＰＣＲ  ＭＴＰを、ＰＣＲ機械において、緩衝液がｐＨ８．０を有する場合、４９℃で１時間（ｐＨ８．４９℃サンプル）、及び緩衝液がｐＨ１０．０を有する場合、４２℃で１時間（ｐＨ１０、４２℃サンプル）、インキュベートした。
【０３１２】
インキュベーションの直後、ＰＣＲプレート上のサンプルを、Ｇ７−ｐＮＰアミラーゼアッセイに記載されるようにして、アミラーゼ活性について分析した。アッセイ上でのＤＴＰＡからの干渉を低めるために、対照及びｐＨ８、４９℃サンプル／ｐＨ１０、４２℃サンプルの両者を、同じ濃度に希釈し、その後、残効について分析したことが注目されるべきである。対照サンプル及びｐＨ８、４９℃サンプル又はｐＨ１０、４２℃サンプルの両者の活性を、同じ９６ウェルプレート上で決定した。残効を、１００＊Ｖｍａｘ（ｐＨ８、４２℃又はｐＨ１０、４９℃サンプル）／Ｖｍａｘ（対照サンプル）
【０３１３】
【表４】
2013516166.tif 000005
【０３１４】
ハイブリッド１，２及び３は、高い安定性であり、そしてｐＨ８、４９℃及びｐＨ１０、４２℃の両者での１時間のインキュベーションの後、１００％残効を有する。比較すれば、欠失Ｄ１８３＊＋Ｔ１８４＊を有する配列番号７は、それらの条件下で２０％以下の残効を有し、そして配列番号７及びＳＰ７０７はそれほど残効を有さない。
【０３１５】
実施例３：追加のα−アミラーゼ
次のα−アミラーゼを調製した：
ハイブリッド４：配列番号５のアミノ酸残基１０６−２１２を除去し、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２０８により置換し、配列番号２３をもたらし、そして次の変更を導入し：Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ 及び Ｄ１９２Ｔ（配列番号２３番号付けを用いる）、これは配列番号２７番号付けを用いてＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、 Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ 及び Ｄ１９１Ｔに対応する。このハイブリッドの配列は、配列番号２４で示される。
【０３１６】
ハイブリッド５：配列番号８のアミノ酸残基１０６−２１２を除去し、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２０８により置換し、配列番号２５をもたらし、そして次の変更を導入し：Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ 及び Ｄ１９２Ｔ（配列番号２５番号付けを用いる）、これは配列番号２７番号付けを用いてＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、 Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ 及び Ｄ１９１Ｔに対応する。このハイブリッドの配列は、配列番号２６で示される。
【０３１７】
ハイブリッド４及び５（配列番号２４及び２６）、変更Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ及びＤ１９２Ｔ（配列番号５番号付けを用いる）（配列番号２７番号付けにおけるＥ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ及びＤ１９１Ｔに対応する）を有する配列番号５の変異体、及び配列番号８のα−アミラーゼを、実施例２に記載のようにして、ＤＴＰＡと共にインキュベートした。その結果は、ハイブリッド４及び５が、インキュベーションの後、ほとんど１００％の残効を有し、ところが他のα−アミラーゼは、インキュベーションの間、それらの活性のほとんどを失ったことを示す。
【０３１８】
実施例４：α−アミラーゼ変異体の安定性
配列番号２８のアミノ酸配列を有する対照α−アミラーゼ（変更：Ｅ181 ＊＋Ｇ182＊＋Ｅ187Ｗ＋Ｎ188Ｅ＋Ｄ191 Ｔ＋Ｄ407Ｎ＋Ｄ430Ｎ＋Ｐ432Ｄを有する、バチルス・ステアロサーモフィラス及びバチルス・サーキュランスα−アミラーゼのハイブリッド（配列番号２７））及びそのα−アミラーゼ変異体の安定性を、前記対照α−アミラーゼ及び変異体を、ｐＨ４．５及び５．５及び７５℃及び８５℃の温度で、０．１２ｍＭのＣａＣｌ２と共にインキュベートすることにより決定し、続いてEnzChek（登録商標）基質(EnzChek（登録商標）Ultra Amylase assay kit, E33651 , Molecular Probes, Invitrogen, La Jolla, CA, USA)を用いて、残効を決定した。
【０３１９】
精製された酵素サンプルを、酵素希釈緩衝液（１０ ｍＭ のアセテート、０．０１ ％ TRITON（登録商標）X100、０．１２ ｍＭ のＣａＣｌ2、ｐＨ  ５．０）により、０．５及び１又は５及び１０ｐｐｍ（μｇ／ｍｌ）の作業濃度に希釈した。２０μｌの酵素サンプルを、４８−ウェルＰＣＲ  ＭＴＰに移し、そして１８０μｌの安定性緩衝液（１５０ｍＭ のアセテート、１５０ｍＭのＭＥＳ、０．０１ ％ TRITON（登録商標）X100、０．１２ ｍＭ のＣａＣｌ2、ｐＨ４．５又は５．５）を個々のウェル添加し、そして混合した。アッセイを、２種の濃度の酵素を用いて２重反復下で実施した。７５℃又は８５℃でのインキュベーションの前、４０μlを採取し、そして対照サンプルとして氷上で貯蔵した。インキュベーションを、PCR機械において、３０／４５分間（ｐＨ４．５及び７５℃）、４５／６０分間（ｐＨ５．５及び７５℃）、５／１０分間（ｐＨ４．５及び８５℃）及び１０分間（ｐＨ５．５及び８５℃）、実施した。
【０３２０】
インキュベーションの後、対照サンプル及びＰＣＲ機械からサンプルを、残効緩衝液（１０ ｍＭ のアセテート、０．０１ ％ TRITON（登録商標）X100、０．１２ ｍＭ のＣａＣｌ2、ｐＨ  ５．５）により２０ｎｇ／ｍｌに希釈し、そして２５μｌの希釈された酵素を黒３８４−ＭＴＰに移した。残効を、Ｅｎｚｃｈｅｋ（登録商標）アミラーゼ活性アッセイについてのセクションに記載されるようにして、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）基質を用いて決定した。手短には、２５μｌの基質検量線用溶液（１００μｇ／ｍｌ）を、希釈された酵素と共に個々のウェルに添加する。蛍光を、４８５−Ｐ  ｎｍで励起フィルター及び５５５ｎｍで放射フィルターを用いて１５分間、１分ごとに決定した（蛍光リーダーは、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ、ＢＭＧである）。残効を個々の設定のために対照サンプルに対して標準化した。
【０３２１】
対数的崩壊を仮定して、半減期（Ｔ１/２（分））を、次の等式を用いて計算した：Ｔ１/２（分）＝Ｔ(分)＊ＬＮ(０．５)/ＬＮ(％ＲＡ/１００)、式中、Ｔは分でのアッセイインキュベーション時間であり、そして％ＲＡはアッセイで決定される％残効である。
このアッセイ設定を用いて、半減期を、表１に示されるように、対照α−アミラーゼ及びその変異体について決定した。
【０３２２】
【表５】
2013516166.tif 000006
【０３２３】
【表６】
2013516166.tif 000007
【０３２４】
【表７】
2013516166.tif 000008
【０３２５】
【表８】
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【０３２６】
【表９】
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【０３２７】
結果は、α−アミラーゼ変異体が対照α−アミラーゼよりも有意に高い半減期及び安定性を有することを示す。
【０３２８】
実施例５：α−アミラーゼ変異体を用いてのエタノールの製造
商品名ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ  ＳＣ（登録商標）としてＮｏｖｏｚｙｍｅｓにより市販されているバチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ変異体及び実施例４に記載される２種のα−アミラーゼ変異体の３種の小規模マッシュを、次の通りにして調製した：約５４ｇの粗引きとうもろこし、約５１ｇの水道水及び約４５ｇのバックセットを、２５０ｍｌのプラスチックボトルにおいて混合し、合計１５０ｇのスラリーを得た。トウモロコシスラリーのｐＨを４．５に調節した。酵素を、乾燥固形物１ｇ当たり２μｇのアミラーゼの濃度でマッシュに添加した。液化のために、α−アミラーゼをボトルに添加し、そしてそのボトルを十分に混合し、そして予備加熱された８５℃の水溶中に配置した。サンプルを、最初の３０分間、１０分ごとに、及び２時間の液化の残りのために、その後３０分ごとに振盪しながら、ｐｈ４．５で２時間、水浴に保持した。次に、サンプルを氷浴に冷却し；ｐＨを５．０に調節し、そして０．７５ｍｌのウレア及び０．４５ｍｌのペニシリンを添加し、それぞれマッシュにおける１０００及び３ｐｐｍの最終濃度に達した。次に、サンプルを、Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ  Ｆｕｅｌ（登録商標）（Novozymesにより市販をされているグルコアミラーゼ製品）による同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）にゆだねた。
【０３２９】
マッシュの５ｇアリコートを、マッシュ当たり５回反復して、予備−計量された円錐形遠心分離管中に写した。次に、ＳＳＦを、Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ  Ｆｕｅｌ（登録商標）を用いて３２℃の水浴において５時間、それらのマッシュに対して実施した。グルコアミラーゼ用量は、すべての発酵について０．５０ＡＧＵ／ｇ  ＤＳであった。ＳＳＦの間のＣＯ２重量損失を測定し、そしてエタノールを、５４時間のＳＳＦの後、ＨＰＬＣを用い定量化した。平均５４時間のＨＰＬＣ  ＳＳＦデータが下記表２に提供される。
【０３３０】
【表１０】
2013516166.tif 000011
【０３３１】
結果は、α−アミラーゼ変異体の使用がLIQUOZYME SC（登録商標）に比較して、有意に高いエタノールに収量をもたらしたことを示す。
【０３３２】
実施例６：洗剤における洗浄性能
洗剤におけるα−アミラーゼの洗浄性能を評価するために、洗浄実験を実施した。実施例１のハイブリッド１、２及び３の性能を、Mini Washアッセイを用いて試験し、そして欠失Ｄ１８３＊＋Ｔ１８４＊（配列番号７番号付け）を有する配列番号７のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼと比較した。この試験においては、酵素−洗剤溶液の洗浄性能を、いくつかの酵素用量で同時に試験できる。
【０３３３】
Ｍｉｎｉ  Ｗａｓｈアッセイの説明
Ｍｉｎｉ  Ｗａｓｈは、多くのビーカーを有し、個々のビーカーは８０ｍｌまでの酵素−洗剤溶液に保持できる。水の硬度を、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＮａＨＣＯ３の添加により１０°ｄＨに調節する。布地サンプル（この場合、ＣＳ−２８）を、１分当たり４０化イの浸水の頻度で酵素−洗剤溶液中に布地を浸すよう企画されたフレームに取り付ける。酵素−洗剤溶液の温度を、洗浄の間、調節する。洗浄の後、布地を流れる水道水によりすすぎ、そして続いて、暗室において乾燥する。酵素−洗剤溶液の洗浄性能を、ＺＥＩＳＳ ＭＣＳ ５２１ ＶＩＳ分光光度計により４６０ｎｍでその反射率を測定することにより評価する。
【０３３４】
布地
ＣＳ−２８は、CenterFor Test materials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlandsから入手できる技術的コメ澱粉染色された綿布地である。
【０３３５】
実験は、下記に特定される実験条件下で実施された：
【０３３６】
【表１１】
2013516166.tif 000012
【０３３７】
結果及び論議：
α−アミラーゼの洗浄性能を、欠失Ｄ１８３＊＋Ｔ１８４＊を有する配列番号７のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの洗浄性能に対して標準化した。
【０３３８】
【表１２】
2013516166.tif 000013
【０３３９】
実施例７：ハイブリッドの調製
次のハイブリッドを調製した。
ハイブリッド６：置換Ｍ９Ｌ＋Ｒ１１８Ｋ＋Ｇ１４９Ａ＋Ｇ１８２Ｔ＋Ｇ１８６Ａ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｍ２０２Ｌ＋Ｖ２１４Ｖ＋Ｔ２５７Ｉ＋Ｙ２９５Ｆ＋Ｎ２９９Ｙ＋Ｒ３２０Ｋ＋Ｍ３２３Ｔ＋Ａ３３９Ｓ＋Ｅ３４５Ｒ＋Ｒ４５８Ｋ（配列番号５番号付けを用いる）を有する配列番号５の変異体中のアミノ酸残基１０６−２１３を除き、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２０９により置換し、そして次の変更を導入し：Ｅ１８２＊、Ｎ１８３＊、Ｅ１８８Ｗ、Ｎ１８９Ｅ 及びＤ１９２Ｔ、これは、配列番号２７番号付けを用いれば、Ｅ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ及びＤ１９１Ｔに対応する。
【０３４０】
ハイブリッド７：配列番号８の変異体中アミノ酸残基１０６−２１３（配列番号８番号付けを用いる）を除き、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２０９により置換した。このハイブリッドの配列は、配列番号３３で示される。
【０３４１】
ハイブリッド８：配列番号１のアミノ酸１−３３により置換されるアミノ酸１−３５を有し、そして置換Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ（配列番号３番号付けを用いる）を有する変異体中のアミノ酸残基１０４−２０８を除き、そして配列番号１３のアミノ酸残基１０３−２０９により置換し、そして次の変更を導入し：Ｎ１０２Ｄ、Ｑ１４７Ｔ、Ｅ１７８＊、Ｎ１７９＊、Ｋ１８１Ａ、Ｅ１８４Ｗ、Ｎ１８５Ｅ 及びＤ１８８Ｔ、それらは、配列番号２７番号付けを用いれば、Ｎ１０５Ｄ、Ｑ１５０Ｔ、Ｅ１８１＊、Ｎ１８２＊、Ｋ１８４Ａ、Ｅ１８７Ｗ、Ｎ１８８Ｅ 及び Ｄ１９１Ｔに対応する。このハイブリッドの配列は、配列番号３４で示される。
【０３４２】
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
【０３４３】
本発明はさらに、次のパラグラフにより定義される：
パラグラフ１．親カルシウム−非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメインと少なくとも８０％の配列同一性を有し、さらに０．１以上、好ましくは０．２以上、さらに好ましくは０．５以上、及び最も好ましくは１以上のＧ７−ｐＮＧアッセイにより測定される活性に対するPhadebasアッセイにより測定される活性の高い比率を有するアミノ酸配列を含んで成る単離α−アミラーゼ。
【０３４４】
パラグラフ２．配列１３のアミノ酸１０５−２１０の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、パラグラフ１のα−アミラーゼ。
【０３４５】
パラグラフ３．カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−及びＣ−ドメイン及びカルシウム−非感受性α−アミラーゼを含んで成る単離α−アミラーゼ。
【０３４６】
パラグラフ４．１又は２以上の置換、挿入又は欠失をさらに含んで成る、前記パラグラフのいずれかのα−アミラーゼ。
【０３４７】
パラグラフ５．前記カルシウム−感受性α−アミラーゼが配列番号７であり、そして前記カルシウム−非感受性α−アミラーゼが配列番号１３であり、そして前記α−アミラーゼが任意にはさらに、１又は２以上の次の変更：Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊、Ｅ１８９Ｗ、Ｎ１９０Ｅ、Ｄ１９３Ｔ、Ｅ１８９Ｗ＋Ｎ１９０Ｅ＋Ｄ１９３Ｔ、Ｌ２１７Ｅ、Ｙ２０８Ｍ、Ｒ１１９Ｄ 及びＷ１８９Ｅ＋Ｌ２１７Ｅを含んで成る、パラグラフ３のα−アミラーゼ。
【０３４８】
パラグラフ６．前記カルシウム−感受性α−アミラーゼが配列番号４であり、そして前記カルシウム−非感受性α−アミラーゼが配列番号１３であり、そして前記α−アミラーゼが任意にはさらに、１又は２以上の次の変更：D181*+G182*、Ｅ １ ８ ７ Ｗ、Ｅ １ ８ ７ Ｗ ＋ Ｎ １ ８ ８ Ｅ ＋ Ｄ １ ９ １ Ｔ 、 Ｎ １ ８ ８ Ｅ 、 Ｄ １ ９ １ Ｔ、 Ｓ ２ ９ ９ Ｋ 、Ｓ２９９Ｋ＋Ｇ３０１Ｒ＋Ａ３０２Ｄ＋Ｄ４０５Ｎ＋Ｄ４２８Ｎ＋Ｐ４３０Ｄ、Ｇ３０１Ｒ、Ａ３０２Ｄ、Ｄ４０５Ｎ＋Ｄ４２８Ｎ及び Ｐ４３０Ｄを含んで成る、パラグラフ３のα−アミラーゼ。
【０３４９】
パラグラフ７．配列番号１−１２、２９及び３０のいずれかのＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＡ−ドメイン、配列番号１３−１６及び３１のいずれかのＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＢ−ドメイン、及び配列番号１−１２、２９及び３０のいずれかのＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＣ−ドメインを含んで成る単離α−アミラーゼ。
【０３５０】
パラグラフ８. 前記Ａ−ドメインが、配列番号１のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５１】
パラグラフ９. 前記Ａ−ドメインが、配列番号２のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５２】
パラグラフ１０. 前記Ａ−ドメインが、配列番号３のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５３】
パラグラフ１１. 前記Ａ−ドメインが、配列番号４のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５４】
パラグラフ１２. 前記Ａ−ドメインが、配列番号５のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５５】
パラグラフ１３. 前記Ａ−ドメインが、配列番号６のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５６】
パラグラフ１４. 前記Ａ−ドメインが、配列番号７のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５７】
パラグラフ１５. 前記Ａ−ドメインが、配列番号８のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５８】
パラグラフ１６. 前記Ａ−ドメインが、配列番号９のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３５９】
パラグラフ１７. 前記Ａ−ドメインが、配列番号１０のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３６０】
パラグラフ１８. 前記Ａ−ドメインが、配列番号１１のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３６１】
パラグラフ１９. 前記Ａ−ドメインが、配列番号１２のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３６２】
パラグラフ２０. 前記Ａ−ドメインが、配列番号２９のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３６３】
パラグラフ２１. 前記Ａ−ドメインが、配列番号３０のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７のα−アミラーゼ。
【０３６４】
パラグラフ２２. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号１の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９４−１１１の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置９６−１０１の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０１−１０６、特に位置１−１０１の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３６５】
パラグラフ２３. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号２の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３６６】
パラグラフ２４. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号３の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９３−１１３の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置９８−１０３の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０３−１０８、特に位置１−１０３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３６７】
パラグラフ２５. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号４の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９４−１１４の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置９９−１０４の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０４−１０９、特に位置１−１０４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３６８】
パラグラフ２６. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号５の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３６９】
パラグラフ２７. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号６の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７０】
パラグラフ２８. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号７の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７１】
パラグラフ２９. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号８の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７２】
パラグラフ３０. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号９の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７３】
パラグラフ３１. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号１０の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７４】
パラグラフ３２. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号１１の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７５】
パラグラフ３３. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号１２の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９５−１１５の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１００−１０５の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０５−１１０、特に位置１−１０５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７６】
パラグラフ３４. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号２９の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９４−１１４の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置９９−１０４の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０４−１０９、特に位置１−１０４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７７】
パラグラフ３５. 前記Ａ１−ドメインが、配列番号３０の位置１−５の範囲の位置で開始し、そして位置９２−１１２の範囲の位置で終結し、例えば位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置９７−１０２の範囲の位置で終結するか、又は位置１−３の範囲の位置で開始し、そして位置１０２−１０７、特に位置１−１０２の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−２１のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７８】
パラグラフ３６. 前記Ｂ−ドメインが、配列番号１３の位置９３−１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲の位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲の位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲の位置で終結するか、又は位置１００−１０６の範囲の位置で開始し、そして位置２０２−２０８、特に位置１０３−２０８の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−３５のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３７９】
パラグラフ３７. 前記Ｂ−ドメインが、配列番号１４の位置９３−１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲の位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲の位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲の位置で終結するか、又は位置１００−１０６の範囲の位置で開始し、そして位置２０２−２０８、特に位置１０４−２０７の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−３５のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８０】
パラグラフ３８. 前記Ｂ−ドメインが、配列番号１５の位置９３−１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１９５−２１５の範囲の位置で終結し、例えば位置９７−１０９の範囲の位置で開始し、そして位置１９９−２１１の範囲の位置で終結するか、又は位置１００−１０６の範囲の位置で開始し、そして位置２０２−２０８、特に位置１０４−２０７の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−３５のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８１】
パラグラフ３９. 前記Ｂ−ドメインが、配列番号１６の位置１００−１２０の範囲の位置で開始し、そして位置１６１−１８１の範囲の位置で終結し、例えば位置１０５−１１５の範囲の位置で開始し、そして位置１６６−１７１の範囲の位置で終結するか、又は位置１０７−１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１７１−１７６、特に位置１１０−１７１の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−３５のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８２】
パラグラフ４０. 前記Ｂ−ドメインが、配列番号３１の位置１００−１２０の範囲の位置で開始し、そして位置１６１−１８１の範囲の位置で終結し、例えば位置１０５−１１５の範囲の位置で開始し、そして位置１６６−１７１の範囲の位置で終結するか、又は位置１０７−１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１７１−１７６、特に位置１１０−１７１の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−３５のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８３】
パラグラフ４１. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号１のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８４】
パラグラフ４２. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号２のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８５】
パラグラフ４３. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号３のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８６】
パラグラフ４４. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号４のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８７】
パラグラフ４５. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号５のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８８】
パラグラフ４６. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号６のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３８９】
パラグラフ４７. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号７のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９０】
パラグラフ４８. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号８のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９１】
パラグラフ４９. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号９のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９２】
パラグラフ５０. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号１０のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９３】
パラグラフ５１. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号１１のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９４】
パラグラフ５２. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号１２のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９５】
パラグラフ５３. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号２９のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９６】
パラグラフ５４. 前記Ｃ−ドメインが、配列番号３０のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、パラグラフ７−４０のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９７】
パラグラフ５５. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号１の位置１９８−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲の位置で終結し、例えば位置２０３−２０８の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲の位置で終結するか、又は位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３、特に位置２０８−４８３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９８】
パラグラフ５６. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号２の位置２０２−２２２の範囲の位置で開始し、そして位置４７９−４８４の範囲の位置で終結し、例えば位置２０７−２１２の範囲の位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲の位置で終結するか、又は位置２１２−２１７の範囲の位置で開始し、そして位置４８１−４８４、特に位置２１２−４８４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０３９９】
パラグラフ５７. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号３の位置１９８−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲の位置で終結し、例えば位置２０３−２０８の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲の位置で終結するか、又は位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３、特に位置２０８−４８３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４００】
パラグラフ５８. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号４の位置２０１−２２１の範囲の位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲の位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲の位置で終結するか、又は位置２１１−２１６の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３、特に位置２１１−４８３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０１】
パラグラフ５９. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号５の位置１９３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５、特に位置２１３−４８５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０２】
パラグラフ６０. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号６の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５、特に位置２１３−４８５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０３】
パラグラフ６１. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号７の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５、特に位置２１３−４８５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０４】
パラグラフ６２. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号８の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５、特に位置２１３−４８５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０５】
パラグラフ６３. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号９の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８４、特に位置２１３−４８４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０６】
パラグラフ６４. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号１０の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８４の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８４、特に位置２１３−４８４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０７】
パラグラフ６５. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号１１の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５、特に位置２１３−４８５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０８】
パラグラフ６６. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号１２の位置２０３−２２３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結し、例えば位置２０８−２１３の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５の範囲の位置で終結するか、又は位置２１３−２１８の範囲の位置で開始し、そして位置４８２−４８５、特に位置２１３−４８５の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４０９】
パラグラフ６７. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号２９の位置２０１−２２１の範囲の位置で開始し、そして位置４７８−４８３の範囲の位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３の範囲の位置で終結するか、又は位置２１１−２１６の範囲の位置で開始し、そして位置４８０−４８３、特に位置２１１−４８３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４１０】
パラグラフ６８. 前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号３０の位置１９９−２１９の範囲の位置で開始し、そして位置４７９−４８４の範囲の位置で終結し、例えば位置２０４−２０９の範囲の位置で開始し、そして位置４８１−４８４の範囲の位置で終結するか、又は位置２０９−２１４の範囲の位置で開始し、そして位置４８１−４８４、特に位置２０９−４８４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、パラグラフ７−５４のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４１１】
パラグラフ６９. 配列番号１−１２、２９及び３０のいずれかのα−アミラーゼよりも熱安定性である、パラグラフ１−６８のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４１２】
パラグラフ７０. 配列番号１−１２、２９及び３０のいずれかのα−アミラーゼよりも低められたカルシウム感受性を有する、パラグラフ１−６９のいずれかのα−アミラーゼ。
【０４１３】
パラグラフ７１．パラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼ及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
【０４１４】
パラグラフ７２.パラグラフ１−７０のいずれかのα−グルコース、及びβ−アミラーゼ、セルラーゼ（β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼ）、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、イソアミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ及びプルラナーゼから成る群から選択された１又は２以上の酵素を含んで成る組成物。
【０４１５】
パラグラフ７３. 洗濯及び／又は食器洗いのためへのパラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼの使用。
【０４１６】
パラグラフ７４. 布地の糊抜きのためへのパラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼの使用。
【０４１７】
パラグラフ７５. ベークド製品の製造のためへのパラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼの使用。
【０４１８】
パラグラフ７６. 澱粉−含有材料の液化のためへのパラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼの使用。
【０４１９】
パラグラフ７７. パラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼにより澱粉−含有材料を液化することを含んで成る、液化された澱粉の製造方法。
【０４２０】
パラグラフ７８. 
（ａ）液化されたマッシュを製造するために、パラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼにより澱粉−含有材料を液化し；
（ｂ）発酵できる糖類を生成するために、前記液化されたマッシュを糖化し；そして
（ｃ）発酵生物の存在下で前記発酵できる糖類を発酵することを含んで成る、発酵製品の製造方法。
【０４２１】
パラグラフ７９.上記澱粉−含有材料が、α−アミラーゼ及びプルラナーゼ、例えばＧＨ５７プルラナーゼにより液化される、パラグラフ７８の方法。
【０４２２】
パラグラフ８０.上記プルラナーゼが、サーモコーカス（Thermococcus）株、例えばサーモコーカスsp.ＡＭ４、サーモコーカスsp. ＨＪ２１、サーモコーカス・バロフィラス（Thermococcus barophilus）、サーモコーカス・ガマトレランス（Thermococcus gammatolerans）、サーモコーカス・ヒドロサーマリス（Thermococcus hydrothermalis）、サーモコーカス・コダケレンシス（Thermococcus kodakarensis）、サーモコーカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）及びサーモコーカス・オンヌリネウス（Thermococcus onnurineus）株から；又はピロコーカス（Pyrococcus）株、例えばピロコーカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）及びピロコーカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）株から得られる、パラグラフ７９の方法。
【０４２３】
パラグラフ８１.液化の前、間及び／又は後、プロテアーゼ、例えば酸性菌類プロテアーゼ又はメタロプロテアーゼを添加することをさらに含んで成る、パラグラフ７８−８０のいずれかの方法。
【０４２４】
パラグラフ８２.上記メタロプロテアーゼが、サーモアスカス（Thermoascus）の株、好ましくはサーモアスカス・アウランチアカス（Thermoascus aurantiacus）、特にサーモアスカス・アウランチアカスＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．０６７０の株である、パラグラフ８１の方法。
【０４２５】
パラグラフ８３. パラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及び発酵生物と澱粉基質とを接触することを含んで成る、発酵製品の製造方法。
【０４２６】
パラグラフ８４. 前記発酵製品が、アルコール（例えば、エタノール及びブラノール）、有機酸（例えば、琥珀酸及び乳酸）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート及び２−ケト−Ｌ−グロン酸）、アミノ酸（例えば、リシン）、及びタンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）から成る群から洗濯される、パラグラフ７８−８３のいずれかの方法。
【０４２７】
パラグラフ８５. パラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼをコードする核酸配列。
【０４２８】
パラグラフ８６．パラグラフ８５の核酸配列を含んで成るプラスミド。
【０４２９】
パラグラフ８７．パラグラフ８５の核酸配列又はパラグラフ８６のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
【０４３０】
パラグラフ８８．パラグラフ８５の核酸配列により形質転換された、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞。
【０４３１】
パラグラフ８９．下記段階：
（ａ）ハイブリッドα−アミラーゼの発現を導く条件下でパラグラフ８７の宿主細胞を増殖する段階；及び
（ｂ）前記ハイブリッドα−アミラーゼを回収する段階を含んで成る、パラグラフ１−７０のいずれかのα−アミラーゼの調製方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月30日(2012.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム−感受性α−アミラーゼのＡ−及びＣ−ドメイン、及びカルシウム−非感受性α−アミラーゼのＢ−ドメインを含んで成る単離α−アミラーゼ。
【請求項２】
配列番号１−１２、２９及び３０のいずれかのＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＡ−ドメイン、配列番号１３〜１６及び３１のいずれかのＢ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＢ−ドメイン、及び配列番号１〜１２、２９及び３０のいずれかのＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性を有するＣ−ドメインを含んで成る単離α−アミラーゼ。
【請求項３】
前記Ａ−ドメインが、配列番号４のＡ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、請求項２に記載のα−アミラーゼ。
【請求項４】
前記Ａ１−ドメインが、配列番号４の位置１〜５の範囲の位置で開始し、そして位置９４〜１１４の範囲の位置で終結し、例えば位置１〜３の範囲の位置で開始し、そして位置９９〜１０４の範囲の位置で終結するか、又は位置１〜３の範囲の位置で開始し、そして位置１０４〜１０９、特に位置１〜１０４の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項５】
前記Ｂ−ドメインが、配列番号１３の位置９３〜１１３の範囲の位置で開始し、そして位置１９５〜２１５の範囲の位置で終結し、例えば位置９７〜１０９の範囲の位置で開始し、そして位置１９９〜２１１の範囲の位置で終結するか、又は位置１００〜１０６の範囲の位置で開始し、そして位置２０２〜２０８、特に位置１０３〜２０８の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項６】
前記Ｃ−ドメインが、配列番号４のＣ−ドメインと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項７】
前記Ａ２及びＣ−ドメインが、配列番号４の位置２０１〜２２１の範囲の位置で開始し、そして位置４７８〜４８３の範囲の位置で終結し、例えば位置２０６−２１１の範囲の位置で開始し、そして位置４８０〜４８３の範囲の位置で終結するか、又は位置２１１〜２１６の範囲の位置で開始し、そして位置４８０〜４８３、特に位置２１１〜４８３の範囲の位置で終結する配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項８】
配列番号１〜１２、２９及び３０のいずれかのα−アミラーゼよりも熱安定性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項９】
配列番号１〜１２、２９及び３０のいずれかのα−アミラーゼよりも低められたカルシウム感受性を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ、及びβ−アミラーゼ、セルラーゼ（β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼ）、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、イソアミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ及びプルラナーゼから成る群から選択された１又は２以上の酵素を含んで成る組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼで澱粉−含有材料を液化することを含んで成る、液化された澱粉の製造方法。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼで澱粉−含有材料を液化して、液化されたマッシュを製造し、；
（ｂ）発酵できる糖類を生成するために、前記液化されたマッシュを糖化し；そして
（ｃ）発酵生物の存在下で前記発酵できる糖類を発酵すること
を含んで成る、発酵製品の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及び発酵生物と澱粉基質とを接触することを含んで成る、発酵製品の製造方法。
【請求項１５】
前記発酵製品が、アルコール（例えば、エタノール及びブラノール）、有機酸（例えば、琥珀酸及び乳酸）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート及び２−ケト−Ｌ−グロン酸）、アミノ酸（例えば、リシン）、及びタンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）から成る群から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼをコードする核酸配列。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸配列を含んで成る宿主細胞。
【請求項１８】
（ａ）ハイブリッドα−アミラーゼの発現を導く条件下で、請求項１７に記載の宿主細胞を増殖し；及び
（ｂ）前記ハイブリッドα−アミラーゼを回収すること、
を含んで成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの製造方法。
【国際調査報告】
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