(57)【要約】【課題】ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための、改善された系および方法が必要とされている。【解決手段】  方法は、生物材料（例えば、ＤＮＡ断片または増幅されたＤＮＡの形態であり得る核酸）を担持するビーズを基板の規定位置で磁気的にホールドすることと、ビーズに局所的な電場を印加して生物材料または生物材料の反応の生成物もしくは副生物を隔離することとを含む。例えば、ビーズを、会合した生物材料を有する他のビーズから隔離する。種々の実施形態における電場は、増幅またはシーケンシング反応のための試薬を濃縮し、ならびに／または検出可能な反応副生物を濃縮および隔離する。例えば、個々のビーズ周囲の核酸を隔離することにより、電場は、エマルジョンＰＣＲの代替物としてのクローン増幅を可能とし得る。【選択図】  図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物材料を担持するビーズを基板の規定位置で磁気的にホールドすることと、前記ビーズに局所的な電場を印加して前記生物材料または前記生物材料の反応の生成物もしくは副生物を隔離することを含む方法。
【請求項２】
前記電場を、テンプレートＤＮＡ断片、プライマー、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰの１つ以上を前記位置周囲で濃縮するように適合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電場が、ＤＣおよびＡＣコンポーネントを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記電場が、ＤＮＡ増幅およびＤＮＡシーケンシングの少なくとも１つを促進する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記電場が、前記ビーズと結合または会合したＤＮＡのクローン増幅を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
局所ｐＨ変化、局所導電率変化、局所電荷濃度変化、および局所発熱の少なくとも１つを計測することにより、シーケンシング直前のヌクレオチドのＤＮＡ鎖中への取り込みを検出することをさらに含み、前記ＤＮＡ鎖は前記ビーズに会合している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記規定位置でおけるナノセンサが、局所ｐＨ変化、局所導電率変化、局所電荷濃度変化、および局所発熱の少なくとも１つを計測する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
複数の局在磁場領域またはそのアレイが、複数のビーズをホールドする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズを前記局在磁場領域と約一対一対応でホールドする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ブリッジ増幅をさらに使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
ビーズの数が、前記ビーズに会合したＤＮＡ断片の数より多い、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
緩衝液媒体を前記基板および位置に導入することをさらに含み、前記緩衝液媒体は、イオンについて前記イオンが水中で有するものとは異なる移動度および拡散を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
電場を生物材料の環境への閉じ込めのために印加することと、ＤＮＡ増幅またはシーケンシングを前記生物材料に対して実施することを含み、前記閉じ込めは、前記生物材料を複数の領域中に隔離する方法。
【請求項１４】
前記生物材料を複数のビーズと会合させ、前記ビーズを前記複数の領域のそれぞれにおいて局在磁場により定位置でホールドする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の領域をＤＮＡ増幅に適合させ、前記電場が、ある仮想ウェル中の生物材料を異なる仮想ウェル中の他の生物材料から隔離する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ増幅が、前記ビーズ上でＤＮＡのクローン集団を発生させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ増幅が、センサの表面上でＤＮＡのクローン集団を発生させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記電場が、ＡＣおよびＤＣコンポーネントを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
増幅およびシーケンシング反応を実施することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
電場が、ＤＮＡアンプリコンの隔離に最適化された周波数、波形、「デッドスポット」波形、および電圧を有する、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記仮想ウェルが、反応試薬および／または反応副生物を濃縮する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
増幅されたＤＮＡを担持するビーズを、増幅されたＤＮＡを担持しないビーズから、前記ビーズに会合した電荷に基づき分離することを含み、前記ビーズ分離を電気泳動により実行する、自動化された方法。
【請求項２３】
前記ビーズ分離が、フロースルー機構に基づく、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ビーズを、後続の増幅反応において再使用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ビーズを、いかなる増幅生成物も除去するように処理する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記処理が、前記ビーズに付着したプライマーの除去、および新プライマーの前記ビーズへの結合または会合を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記処理が、プライマーを開裂部位において酵素開裂し、続いて前記プライマーの一部をライゲートして前記プライマーを再作出することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ断片を生物材料から精製する方法であって、電場を流体環境中で印加することを含み、前記流体環境は、濾材を少なくとも部分的に含有し、生物材料を前記濾材を介して運搬するときにＤＮＡ断片を前記生物材料から分離するように前記電場を適合させる方法。
【請求項２９】
前記濾材が、前記生物材料の残部と比較して前記ＤＮＡ断片の異なる移動度を提供する多孔性膜または媒体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ抽出、ＤＮＡライブラリー構築、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡエンリッチメント、およびＤＮＡシーケンシングの少なくとも１つを実施することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
インレットチャンバに低ｐＨ溶液を提供して細胞溶解を促進することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記電場の強度、極性、空間変動性、および一時的特性の少なくとも１つを、前記ＤＮＡ断片を前記生物材料から精製するために構成することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
複数の粒子を、ＤＮＡ分子を含有する流体環境中に配置することを含み、前記流体環境中での前記粒子のフローを引き起こして前記ＤＮＡ分子に対する剪断力を生成してＤＮＡ断片を生成する方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡ断片が、平滑末端を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記粒子のフローの引き起こしを、流体素子および可撓性壁を有するポンプを介して実施する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡ抽出、ＤＮＡライブラリー構築、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡエンリッチメント、またはＤＮＡシーケンシングの少なくとも１つを実施することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
単一デバイス上で実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ断片を前記粒子から濾過器および重力の少なくとも１つを使用することにより分離することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記流体環境に隣接する、および前記流体環境と共通の壁を有する少なくとも１つの制御チャネルを作動させることをさらに含み、前記壁は、前記制御チャネル中の圧力を増加させると変形する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
核酸を基板に結合させるための部分に結合した実質的に平面な基板、ならびに核酸増幅および核酸シーケンシングの少なくとも１つに系を再使用可能なように前記核酸を前記基板から分離する手段を含む系。
【請求項４０】
前記結合の部分が、単相液体中で作動可能である、請求項４０に記載の系。
【請求項４１】
核酸クローンを前記基板の表面上に発生させる、請求項４０に記載の系。
【請求項４２】
加熱サイクルまたは等温増幅のいずれかにより核酸増幅を可能とする、請求項４０に記載の系。
【請求項４３】
前記基板が、窪みまたは台を含む、請求項４０に記載の系。
【請求項４４】
シーケンシング反応におけるヌクレオチドの取り込みを検出するための装置をさらに含み、前記装置は、局所Ｐｈ変化、局所発熱検出、局所キャパシタンス変化および局所電荷濃度および局所導電率変化の少なくとも１つを検出する、請求項４０に記載の系。
【請求項４５】
前記装置が、蛍光および化学発光の少なくとも１つを検出する、請求項４０に記載の系。
【請求項４６】
２つのプライマーの１つを溶液中に、および１もしくは２つのプライマーを表面上にさらに含み、または１つのプライマーを前記溶液中に、および１もしくは２つのプライマーを前記表面上にさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
ナノセンサに隣接するビーズを捕捉する手段に結合した実質的に平面のセンサアレイであって、前記ナノセンサは、生物材料または生物反応生成物もしくは副生物を検出し得るセンサアレイと、ビーズを放出して前記アレイの再使用を促進する手段とを含み、前記ビーズは、生物材料のクローン集団を単相流体環境中に含有する系。
【請求項４８】
前記生物材料が、核酸またはアナログ、タンパク質、およびＤＮＡ断片の１つである、請求項４７に記載の系。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ断片が、前記ビーズに直接結合している、または前記ビーズにリンカーもしくはキャリアを介して間接的に結合している、請求項４８に記載の系。
【請求項５０】
前記ナノセンサが、局所ｐＨ変化、局所導電率変化、局所電荷濃度変化、および局所発熱の少なくとも１つを検出し得る、請求項４７に記載の系。
【請求項５１】
ビーズを捕捉する手段および前記ビーズを放出する手段が、磁石である、請求項４７に記載の系。
【請求項５２】
前記ビーズを捕捉する手段が、非共有結合を作出するための部分であり、前記ビーズを放出する手段が、前記非共有結合を化学的および／または熱的に破壊するコンポーネントである、請求項４７に記載の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１０月４日に出願された標題「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６１／３８９，４９０号明細書；２０１０年１０月４日に出願された標題「Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ−Ｆｒｅｅ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６１／３８９，４８４号明細書；２０１１年２月１５日に出願された標題「Ｃｈａｍｂｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」の米国仮特許出願第６１／４４３，１６７号明細書；および２０１１年５月２７日に出願された標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６１／４９１，０８１号明細書の優先権および恩典を主張し、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ＳｅｒｖｉｃｅｓとともにＩＲＳにより付与されたＱｕａｌｉｆｙｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｇｒａｎｔの下、政府支援を受けて行われた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
迅速でコスト効率的なＤＮＡシーケンシングの方法（例えば、ハイスループットにおけるもの）は、個別化医療および診断試験を進歩させる重要な態様のままである。一部の公知のＤＮＡシーケンシングのための系は、ＤＮＡ試料を種々の下位系間（例えば、核酸隔離下位系と増幅下位系との間）で移すことを要求し、したがって非効率性および潜在的汚染をもたらす。一部の公知のＤＮＡシーケンシングの方法は光学的検出を用い、それは煩雑で高価であり得、スループットを制限し得る。他の系は、電子センシングの一部の形態を利用するが、センサおよびシーケンシングフローセルは１回使用の使い捨てであり、それは使用者へのコストを実質的に増加させ、コスト効率的に製造することができるセンサの複雑性を制限する。それというのもそれは単回使用後に処分されるためである。一部の系は、シーケンシングが実施される同一のフローセル内で増幅法を利用し、増幅物をフローセルに直接結合させ、再使用を妨害する。他の系は、ビーズおよび試料を、低濃度を利用する小エマルジョン中に混合するエマルジョンＰＣＲを利用する。ポアソン分布に起因して、ビーズおよび試料のほとんどが、単一ビーズおよび単一試料を有するエマルジョン中でまとまらず、したがって失われる。ビーズのコストは、シーケンシングのコストの相当な部分であり、そのコストのほとんどは、いかなる有用なデータも生成もせずに処分される。現在の系は、実質的に試料の全ての利用、およびビーズの再使用を可能とし、したがって使用者へのコストを低減させる。
【０００４】
現在のＤＮＡシーケンシング系は、典型的には、十分な試料を有するために全ゲノム増幅を必要とする。それというのも、試料は極めて非効率的に利用されるためである。そのような全ゲノム増幅法は、典型的には、顕著な量の増幅のバイアスをゲノムの異なる部分に導入し、前記バイアスを克服するためのより高レベルのカバレージを要求する。試料、および試薬を所望の反応または結合が生じ得る容量に局在化する方法は、全ゲノム増幅の必要性を排除し、または低減させ、したがって必要とされるカバレージを低減させ得る系について想定される別の態様である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための、改善された系および方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載の実施形態は、ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための系および方法に関する。一部の実施形態において、系および方法は、完全自動化された統合プラットフォームを含み得、それによりコストを低減させ、スループットを改善し、および／または使用の方法を簡素化する。
【０００７】
一態様において、本発明は、反応、例えば核酸増幅またはシーケンシング反応のための生物材料、反応物質、および／または反応副生物を隔離する方法を提供する。本方法は、生物材料（例えば、ＤＮＡ断片または増幅されたＤＮＡの形態であり得る核酸）を担持するビーズを基板の規定位置で磁気的にホールドすることと、ビーズに局所的な電場を印加して生物材料または生物材料の反応の生成物もしくは副生物を隔離することとを含む。例えば、ビーズは、会合した生物材料を有する他のビーズから隔離する。種々の実施形態における電場は、増幅もしくはシーケンシング反応のための試薬を濃縮し、ならびに／または検出可能な反応副生物を濃縮および隔離する。例えば、個々のビーズ周囲の核酸を隔離することにより、電場は、エマルジョンＰＣＲの代替物としてクローン増幅を可能とし得る。他の実施形態において、電場は、ビーズに近接するナノセンサを隔離して局所ｐＨ変化、局所導電率変化、局所電荷濃度変化および局所発熱の少なくとも１つの検出を促進する。ビーズは、局在磁場領域のアレイの形態でトラップすることができる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、核酸増幅および／またはシーケンシングを実施する方法を提供する。本方法は、電場を生物材料の環境への閉じ込めのために印加することと、生物材料に対して核酸増幅および／または核酸シーケンシングを実施することとを含む。電場を介する外的環境からの環境の閉じ込めは、生物材料を複数の領域中に隔離する効果を有する。閉じ込めは、増幅および／または検出を促進する仮想ウェルを作出し、仮想ウェル間の汚染を防止する。種々の実施形態において、生物材料を複数のビーズに会合させ、ビーズを複数の領域のそれぞれにおいて局在磁場により定位置でホールドする。ある実施形態において、仮想ウェル内の増幅は、ビーズのそれぞれに会合する、またはセンサの表面上のＤＮＡのクローン集団を発生させる。
【０００９】
別の態様において、本発明は、増幅された核酸を担持するビーズの集団を、増幅された核酸を担持しないビーズの集団から分離する、自動化された方法を提供する。本方法は、ビーズの集団をビーズに会合した電荷に基づき分離することを含む。分離は、電気泳動により実行することができる。ビーズ分離はフロースルー機構に基づき得、ビーズは後続の増幅反応において、例えば、ビーズをいかなる増幅生成物および／またはプライマーも除去するように処理することにより再使用することができる。
【００１０】
さらに他の態様において、本発明は、ＤＮＡ断片を生物材料から精製する方法を提供する。本方法は、電場を流体環境中で印加することを含み、前記流体環境は、濾材を少なくとも部分的に含有する。この態様において、電場は、ＤＮＡ断片を生物材料から分離するように適合させる。それというのも、生物材料は濾材を介して運搬されるためである。種々の実施形態において、濾材は、生物材料の残部と比較してＤＮＡ断片の異なる移動度を提供する多孔性膜または媒体である。ＤＮＡ断片は、精製されると、例えば、本明細書に記載の方法および系を使用してＤＮＡライブラリー構築、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡエンリッチメント、および／またはＤＮＡシーケンシングに使用することができる。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、生物材料から隔離されたＤＮＡを剪断する方法を提供する。本方法は、複数の粒子を、ＤＮＡ分子の集団を含有する流体環境中で配置することと、粒子のフローを流体環境中で引き起こしてＤＮＡ分子に対する剪断力を生成してＤＮＡ断片を生成することを含む。そのような実施形態において、剪断力は、平滑末端を生成して後続のライブラリー構築を支援する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、核酸増幅および／またはシーケンシングのための系を提供する。系は、核酸を基板に結合させるための部分に結合した実質的に平面な基板、ならびに核酸増幅および核酸シーケンシングの少なくとも１つに再使用可能なように核酸を基板から分離する手段を含む。増幅の間、系は、核酸クローンを基板の表面上で発生させる。増幅は、加熱サイクルまたは等温増幅によりのいずれかを含み得る。種々の実施形態において、系は、シーケンシング反応におけるヌクレオチドの取り込みを検出するための装置をさらに含む。検出は、局所ｐＨ変化、局所発熱検出、局所キャパシタンス変化ならびに局所電荷濃度および局所電導率変化の少なくとも１つに基づき得る。
【００１３】
一部の態様において、本発明は、生物材料または生物反応生成物もしくは副生物を検出するための系を提供する。系は、実質的に平面なセンサアレイを含み、センサアレイは、アレイ中のそれぞれのナノセンサに隣接するビーズを捕捉する手段を含む。ナノセンサは、生物材料または生物反応生成物もしくは副生物を検出し得る。系は、例えば、磁気的、化学的、酵素的手段によりビーズを放出してアレイの再使用を促進する手段をさらに含む。
【００１４】
本明細書に記載の方法および系の一部の実施形態において、機器は、基板、多孔性部材および電極を含む。基板は、試料を受容するように構成されたマイクロ流体チャネルを画定する。多孔性部材は、少なくとも部分的にマイクロ流体チャネル内に配置される。電極は、電場を生成するように構成され、多孔性部材の少なくとも一部を電場内に配置することができるようにマイクロ流体チャネルに結合している。多孔性部材および電場は、試料が多孔性部材を介して運搬される場合に核酸を試料から分離することができるように協調的に構成することができる。
【００１５】
一部の実施形態において、機器は、基板、複数の粒子およびフロー機構を含む。基板は、複数のＤＮＡ分子を含有する試料を受容するように構成されたマイクロ流体チャネルを画定し得る。他の実施形態において、機器は、プローブとして使用することができ、ウェルまたは他の流体環境中に挿入することができる。複数の粒子は、マイクロ流体チャネル内に配置されるように構成することができる。フローを生成するための機構は、複数の粒子が複数のＤＮＡ分子に対する剪断力を生成して複数のＤＮＡ断片を生成するようにマイクロ流体チャネル内での試料および複数の粒子のフローを生成するように構成することができる。一部の実施形態において、直交制御およびフロー通路を有する複合流体ゲートから作製されたオンチップ蠕動ポンプ（Ｖａｌｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または外圧は、通路中で要求されるフローを発生させ得る。
【００１６】
本発明は、ポリヌクレオチド増幅および配列分析のための磁気アレイおよびその磁気アレイを使用する方法を提供し、それにより、迅速で簡便な、および／または低コストのＤＮＡシーケンシングを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ビーズおよびビーズを捕捉するために使用することができるセンサを有する磁気アレイを示す。
【図１Ｂ】磁気アレイ上でセンサとの一対一の対応で捕捉されたビーズを示す。
【図１Ｃ】次の試料のための使用可能な状態である、ビーズが洗い落とされた後のセンサアレイを示す。
【図１Ｄ】一組の非球形磁気粒子を用いて使用されるセンサアレイの概略図を示す。
【図２Ａ−Ｂ】ビーズがロードされた実施形態による磁気アレイの顕微鏡写真を示す。
【図３】成長するＤＮＡ鎖中へのヌクレオチドの取り込みに関与する反応の概略説明であり、ピロリン酸の放出ならびに付随するｐＨ増加および放熱を示す。
【図４】成長するＤＮＡ鎖中へのヌクレオチドの取り込みに関与する反応の概略説明であり、ピロリン酸の放出ならびに付随するｐＨ増加および放熱を示す。
【図５Ａ】シーケンシング系のマイクロ流体チャネルと電気接続された一連のナノセンサの概略説明を示す。
【図５Ｂ】シーケンシング機器を介して実施されるシーケンシング操作の出力を示すグラフを示す。
【図６】センサ上の複数の荷電部分の濃縮または閉じ込めに使用される一組の電極を有する電子センサのアレイを示す。
【図７】センサにわたるシーケンシングのために定位置でホールドされるクローンビーズの磁気または電気または電磁的保持を示す。
【図８Ａ】ナノセンサを含むシーケンシング系の一部の画像を示す。
【図８Ｂ】ナノセンサ、およびシーケンシング系のマイクロ流体チャネルと電気接続された一連のナノセンサの概略説明を示す。
【図９】シーケンシング系内のナノセンサのアレイの概略説明を示す。オンチップ増幅は任意選択である。
【図１０】例示的なシーケンシングチップのコンポーネントを示す。
【図１１】電気力、概略実施形態およびシミュレーションからの濃度図を示す。
【図１２】流線電場およびシミュレーションからの電極上の水平垂直線における電位を示す。
【図１３】磁気アレイによりホールドされたビーズ上のＤＮＡの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１４】試料分子を引き付けるための電気泳動濃縮／閉じ込め場を作出し、増幅反応を閉じ込めるための電極を有するセンサ、および増幅反応におけるその使用を示す。
【図１５】一対一対応における電気的閉じ込め電極およびセンサのアレイを示す。
【図１６Ａ】ビーズに付着したクローンＤＮＡを有する一組のビーズならびにセンサおよび磁気アレイを示す。
【図１６Ｂ】それぞれの捕捉されたＤＮＡ被覆ビーズがセンサにわたり定位置でホールドされた、捕捉されたビーズの組を示す。
【図１６Ｃ】ビーズの第２の組ならびに部分的にビーズが装着したセンサおよび磁気閉じ込めアレイを示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｃのセンサおよび磁気閉じ込めアレイにより捕捉されたビーズの２つの組を示す。
【図１７】増幅およびシーケンシング反応に使用される電気泳動濃縮／閉じ込め場を作出するための電極を有するセンサを示す。
【図１８Ａ−Ｂ】ビーズ分離系の一実施形態の異なる図を説明する。
【図１９】一実施形態によりポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための統合プラットフォームの概略説明である。
【図２０】ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための統合プラットフォームのマイクロ流体部分の実施形態を示す。
【図２１】ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための統合プラットフォームのマイクロ流体部分の実施形態を示す。
【図２２】ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための統合プラットフォームのマイクロ流体部分の実施形態を示す。
【図２３】ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための統合プラットフォームのマイクロ流体部分の実施形態を示す。
【図２４】ポリヌクレオチドを抽出、増幅およびシーケンシングするための統合プラットフォームのマイクロ流体部分の実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において使用される「ビーズ捕捉フィーチャ」は、単一ビーズをセンサに対して固定位置で一時的にホールドし得、基板上の局所磁気構造、外部磁石、局所的磁気構造、ビーズの位置を固定する力としてのファン・デル・ワールス力、または重力を利用し得る窪みを含み得るフィーチャを意味し得る。場合により、ビーズは共有または非共有結合を使用して定位置で結合させることができる。
【００１９】
本明細書において使用される「クローン」は、ビーズまたは粒子の実質的に全ての集団が同一の核酸配列のものであることを意味し得る。一部の実施形態において、「メイトペア」、「ペアドエンド」、または他の類似の方法論に望まれる、単一試料ＤＮＡ断片を伴う２つの集団が存在し得；集団は、ビーズまたは粒子上でおおまかに類似の数で存在し得、ビーズまたは粒子にわたりランダムに分布され得る。
【００２０】
本明細書において使用される「閉じ込め」は、あるビーズまたは粒子において発生した分子（例えばＤＮＡ）が、ビーズまたは粒子のクローン性を実質的に維持するように同一のビーズまたは粒子に会合して留まることを意味し得る。
【００２１】
本明細書において使用される「隔離する」は、ビーズまたは粒子のクローン性を維持するために必要な、ある仮想ウェルから別の仮想ウェルへのマイグレーション、拡散、フロー、または他の移動の防止を意味する。
【００２２】
本明細書において使用される「局在磁気フィーチャ」は、個々のビーズを実質的に平面な基板上でホールドするために実質的に平面な基板上で作出された磁気フィーチャを意味し得る。
【００２３】
本明細書において使用される「局在磁場」は、第１の磁気領域のＮ極と第２の磁気領域のＳ極との間の容量に実質的に存在し、または単一の磁気領域のＮ極とＳ極との間の容量に実質的に存在する磁場を意味し得る。
【００２４】
本明細書において使用される「局在電場」は、少なくとも２つの電極間の容量に実質的に存在する電場を意味し得る。
【００２５】
本明細書において使用される「ナノセンサ」は、直径または非球形ビーズまたは粒子の長軸に対して計測された０．１、１、５、１０または２０マイクロメートルの１つ未満のビーズまたは粒子を検出するように設計されたセンサを意味し得る。あるいは、センサは、前記ビーズもしくは粒子に会合した部分、または反応が前記ビーズもしくは粒子に会合した部分を含む反応生成物もしくは副生物に会合した部分に感受性であり得る。前記部分は、ＤＮＡ断片、水素イオン、または対イオンである他のイオンを含み得、したがって前記ビーズもしくは粒子または前記ビーズもしくは粒子に結合もしくは会合した部分に会合し得る。
【００２６】
ナノセンサには、「ＮａｎｏＢｒｉｄｇｅ、「ＮａｎｏＮｅｅｄｌｅ、ＩＳＦＥＴ、ＣｈｅｍＦＥＴ、ナノ熱量計またはカンチレバーベースｐＨセンサまたはそれらの組合せが含まれ得る。
【００２７】
本明細書において使用される「粒子」は、非球形部分、例えば分子、分子の凝集体、固体粒子に結合した分子、または粒子、および当該技術分野において公知の他の形態を意味し得る。
【００２８】
本明細書において使用される「単相液体」は、全体的に相対的に均等な物理的特性、例として、密度、屈折率、比重のような特性を有する液体であり、それには水性、混和性水性および有機混合物が含まれ得るが、非混和性液体、例えば油および水は含まれない。単相液体とみなされないことを液体に潜在的にもたらすとはみなされない物理的特性の中には、局所ｐＨ変動、電荷密度、およびイオン濃度または温度が含まれる。
【００２９】
本明細書において使用される「実質的に平面な」は、デバイスの局所平面に対して５０μｍを超過しない小さい台、隆起区画、穴、窪み、または粗さを許容する。反り、捩れ、カッピングまたは他の平面歪みに起因する変動は、許容されるオフセットの一部を構成するとみなされない。本明細書に記載の使用に必須ではないが、５０μｍを超過する突起または窪みは、デバイスが実質的に平面であるとみなされることを除外しない。５０μｍ超の寸法を有する流体チャネルおよびまたは前記流体チャネルを発生させるための構造も、デバイスが実質的に平面であるとみなされることを除外しない。
【００３０】
本明細書において使用される「仮想ウェル」は、対象の種または種の組、典型的には、ＤＮＡまたはビーズが、所望の反応または相互作用に必要な期間の間に隣接する「仮想ウェル」中に実質的にマイグレートしない、局所電場または局所磁場閉じ込め帯域を指す。
【００３１】
本発明の一部の実施形態において、本発明は、シーケンシング化学を実施するための自動化された再使用可能な系を提供する。一部の実施形態において、系により実施される化学法には、ｄＮＴＰがＤＮＡのコロニー、相補的プライマー、およびポリメラーゼを含み得る複合体に結合する、図３に概略的に示される合成によるシーケンシングが含まれ得る。ポリメラーゼは、ｄＮＴＰを成長する伸長プライマーに取り込み、前記取り込みの副生物として、電子センサにより検出することができる水素イオン、ピロリン酸および熱を作出する。塩基取り込みが生じたかどうか、または複数の取り込みが生じたかどうかを決定し、そのような取り込み前にどの試薬が送達されたかを知ることにより、ＤＮＡの配列を決定することができる。
【００３２】
磁気アレイ
本発明は、ポリヌクレオチド増幅および配列分析のための磁気アレイおよび磁気アレイを使用する方法を提供し、それにより、迅速で簡便な、および／または低コストのＤＮＡシーケンシングを提供する。磁気アレイは、アレイを形成するために基板上に複数の磁気領域を有する基板を含み得、局在磁場は、本明細書に記載の磁気ビーズをトラップするために十分である。局在磁気フィーチャは、永久磁性材料（例えば、強磁性体）から形成することができ、または非永久的であり得、電場により磁化（および消磁）することができる。
【００３３】
アレイは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６８２，８３７号明細書に記載の公知の基板材料のいずれかから形成することができる。ある実施形態において、基板材料には、ケイ素、ケイ素ベース材料、ガラス、改質もしくは機能化ガラス、プラスチック、金属、セラミックプラスチックの少なくとも１つまたはそれらの組合せが含まれ得る。基板は一般に、非磁性材料である。
【００３４】
局在磁気フィーチャは、永久磁性材料（例えば、強磁性体）を用いて作出することができ、または非永久的であり得る（例えば、電磁誘導領域）。ある実施形態において、複数の局在磁気フィーチャは、磁性材料から形成することができ、それぞれの領域は、実質的に均等なサイズおよび形状であり得、それによりアレイ（例えば、格子様パターン）を形成し、したがって複数の局在磁気フィーチャまたはそのアレイを形成することができる。ある実施形態において、磁気フィーチャは、非均等であり得る。例示的な実施形態において、磁気フィーチャは、例えば、アルミニウム、コバルト、サマリウム、ネオジム、ホウ素、銅、ジルコニウム、白金、クロム、マンガン、ストロンチウム、鉄および／またはニッケルを含み、その合金を含む磁性材料から少なくとも部分的に形成することができる磁気バーであり得、他の材料および元素を含み得る。一実施形態において、磁気フィーチャは、ニッケルおよび白金の合金（例えば、約５０％−５０％）またはコバルトおよび白金の合金（８０％Ｃｏ  ２０％Ｐｔ）またはコバルト、クロムおよび白金の合金から少なくとも部分的に形成することができる。局在磁場は、基板上のウェル内に含有させることができ、あるいは、基板はウェルを含有せず、増幅またはシーケンシング試薬の基板表面にわたる自由なフローを可能とし、それにより試薬の連続添加および制御（例えば、シーケンシングのためのＮＴＰの連続添加）を簡素化し、それはロングリードシーケンシングについてのデフェージングおよびシグナル対ノイズ比を直接改善し得る。
【００３５】
さらなる実施形態において、ウェル構造、窪み、突起、またはビーズもしくは粒子の運動を限定する他の手段は、局在磁場と組み合わせて利用してビーズまたは粒子を固定位置で保持することができ、ビーズ捕捉フィーチャを形成する。
【００３６】
種々の製作の方法は、局在磁気フィーチャ（例えば、磁気バー）の作出に使用することができる。ある実施形態において、局在磁気フィーチャまたはバーは、フォトリソグラフィ、次いで磁気層のスパッタリングにより製作することができるシャープエッジを有する。他の実施形態において、局在磁気フィーチャ（例えば、バー）は、磁気層のスパッタリング／コーティング、次いでフォトリソグラフィ、次いでイオンミリングして過剰材料をエッチングオフし、シャープまたは規定角のエッジの作出により製作することができる。一部の実施形態において、製作は、多層レジストリソグラフィを利用することができる。
【００３７】
局在磁気フィーチャは、単一ドメイン状態であるように構成することができる。局在磁気フィーチャは、多数の層を用いて製作することができ、強磁性材料と別の材料、例えばクロムの中間層とを交互にして多層磁気構造の保磁力を改善する。交互層に加えて、タンタル、ＭｇＯなどの材料または当該技術分野において公知の他の適切な材料のシード層および保護層が存在し得る。多数の交互層、例えば２から４０の層、例えば、２から４の層、５から１０の層、１０から１６の層、または１６から３０の層、または３２の層以上が存在し得る。粒子配向は、局在磁気フィーチャ上の長軸に並行であり得る。層の厚さは、それぞれの層について５ｎｍから１５ｎｍ以上で変動し得る。
【００３８】
一部の実施形態において、局在磁気フィーチャは、約２０ミクロンの長さを有し、１から２ミクロンの幅を有する矩形プリズムであり得、ビーズまたは粒子をホールドするためのギャップは、ビーズの直径が４．５ミクロンである場合、２から３．５ミクロンであり得る。長さ、幅、およびギャップは全て、より大きいまたはより小さいビーズまたは粒子のために適宜スケールアップまたはダウンすることができる。例えば、２．８ミクロンビーズについては、局在磁気フィーチャは、１０ミクロンの長さ、１から２ミクロンの幅、および１．２５から２．５ミクロンの前記ビーズまたは粒子をホールドするためのギャップを有し得る。
【００３９】
アレイは、高密度または低密度アレイであり得る。アレイは、一般に、１ｍｍ２当たり少なくとも１００の磁気領域を含有し、ある実施形態において、１ｍｍ２当たり少なくとも１，０００の局在磁気フィーチャを含有し、ある実施形態において、１ｍｍ２当たり少なくとも１０，００００の局在磁気フィーチャを含有する。アレイは、少なくとも１，０００、２，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００または１００，０００，０００以上の局在磁気フィーチャを含有し得る。
【００４０】
局在磁場は、５０μｍ以下のサイズを有する磁気粒子を（磁力により）トラップするために十分であり得る。ある実施形態において、局在磁場は、２０μｍ以下、５μｍ以下、５００ｎｍ以下、または５０ｎｍ以下のサイズを有する磁気粒子をトラップするために十分であり得る。ある実施形態において、ビーズは、約３μｍから約５μｍの直径を有し、他の実施形態において、ビーズは約０．５μｍから３μｍの直径を有する。磁気粒子は、強磁性体、常磁性体、または超常磁性体であり得、好適な材料は、米国特許第７，６８２，８３７号明細書に記載のとおり周知である。ビーズは、例えば、約５から５０μｍ、例えば約１５μｍの高さを有するチャネルを介するフローによりアレイ中に移動させることができる。チャネルの幅は変動し得るが、一部の実施形態において、約５００μｍから１ｍｍ、例えば約８００μｍであり得る。他の実施形態において、チャネル幅は、１ｍｍから２０ｍｍ以上であり得る。一部の実施形態において、チャネルは、高さをより良好に制御するための支柱またはリブを有し得る。他の実施形態において、単一試料についてより多くのアレイ位置を収容するため、または複数試料を収容するために並行チャネルを利用することができる。
【００４１】
磁気ビーズまたは粒子を磁気アレイを用いずに利用する本発明の一部の実施形態において、前記磁気ビーズは、均等な間隔を有する単層に自己集合し得る。他の実施形態において、自己集合するビーズまたは粒子は非磁性であり得る。一部の実施形態において、センサに付随する窪みは、一対一対応を促進し得、ビーズとセンサとの間のより良好な整列をもたらし得、より良好な検出を可能とする。ビーズの緩慢な移転または移動は、条件を結合に適切なものとしてセンサによるビーズの整列を可能とした後に適切であり得る。そのような移転または移動は、ｘ、ｙ、θを含み得る多次元で生じ得、経時的に変動する移動ならびにセンサの間隔およびビーズのサイズを収容するための距離を有し得る。他の実施形態において、円形流体移動を使用して高速のビーズローディングを確保することができる。
【００４２】
深ウェルを用いる設計において、ビーズも粒子も、流体フローに適切に接近可能でないことがある。一部の実施形態において、ビーズまたは粒子は、流体フローにより接近可能である。それというのも、それらはデバイスの表面上で突起し得るためである。結果として、ビーズは、試薬の導入により迅速に応答し得、より良好でより迅速な、より効率的な洗浄および反応を許容する。
【００４３】
図１Ａは、磁気アレイ１０４Ａへのビーズ１０２の添加を概略的に説明する。図１Ｂは、アレイ１０４Ｂ上の保持領域との一対一対応での前記ビーズの位置決めを概略的に説明する。図１Ｃは、次の試料のための使用可能な状態である、ビーズが洗い落とされた後のセンサアレイを示す。
【００４４】
図１Ｄは、磁気保持を有するセンサアレイ１０４Ｃ、示されていない電気的閉じ込めを有するセンサアレイまたは自己集合した粒子を有するセンサアレイ１０４Ｄとともに使用される、磁性、常磁性、非磁性粒子またはそれらの組合せが球形以外の形状のものであり得る本発明の種々の実施形態を説明する。一実施形態において、前記粒子は、実質的に平面であり得る。実質的に平面な粒子は、円形、矩形１０６Ａ、星形、六角形１０６Ｂ、または別の形状であり得る。他の実施形態において、粒子は、樹状、例として、自己集合した３次元ＤＮＡ網目により形成された樹状構造であり得、前記粒子の表面積を大きくする。前記樹状粒子は、一般に球形、実質的に平面、卵形、または任意の他の形状であり得る。一部の実施形態において、プライマーは、前記樹状粒子に付着させることができる。他の実施形態において、ＤＮＡナノボールを樹状粒子または他のタイプの粒子もしくはビーズに付着させることができる。さらに他の実施形態において、前記粒子は、多孔性または部分的に多孔性であり得；前記粒子が多孔性または部分的に多孔性である場合、細孔サイズは、プライマー伸長シーケンシングまたは適宜他の用途に必要なＤＮＡ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび他の部分の自由移動を可能とするために十分なサイズのものであり得る。ビーズという用語が利用される全ての箇所において、それは本明細書に記載の任意の形状のものであり得ることが想定することができる。
【００４５】
図２Ａおよび２Ｂは、本明細書において種々の実施形態に記載のビーズが充填された局在磁気アレイの顕微鏡写真を示し、達成可能な常に高い占有レベルを説明し、単一磁性または常磁性ビーズを磁気アレイ中の単一位置において定位置でホールドすることができる本発明のさらなる実施形態を説明する。前記ビーズは、それぞれのセンサにわたり１つのみのビーズに十分な余地が存在し得るようにサイズ化することができ、したがってアレイ位置とビーズとの間の一対一対応を提供する。それぞれのセンサにわたり１つのみのビーズのための余地が存在し得るが、ビーズをセンサに近接して整列させることができる場合、ビーズ間の追加の距離が存在し得、センサ間のクロストークの低減をもたらす。例えば、一組のビーズは、直径が１０ミクロンであり得、直径が８ミクロンであり得るセンサにわたり局在し、センサは、１５ミクロン離れて間隔を空けることができ、ビーズ間に５ミクロンの空間をもたらす。センサ上で保持すべき２つのビーズについて不十分な余地が存在する場合、センサのサイズはビーズよりも大きくてよい。ビーズ、センサ、および間隔のサイズは変動し得る。他の実施形態において、ビーズは、サイズが１０ミクロンよりも大きく、例えば１５ミクロン、２０ミクロン、２５ミクロン以上であり得る。さらなる実施形態において、ビーズは１０ミクロンよりも小さく、例えば５ミクロン、３ミクロン、２ミクロン、１ミクロン、または１ミクロン未満であり得る。センサは、ビーズのサイズと協調するようにサイズ化することができ、したがって、サイズが直径８ミクロンよりも大きくてよく、またはそれよりも小さくてよく、潜在的に直径１ミクロン未満から１、２、３、５、１０、１５、２０ミクロン以上の範囲に及ぶ。センサ間の間隔も１５ミクロンよりも大きくてよく、または１５ミクロンよりも小さくてよく；センサ間隔は、センサ間１ミクロン未満から、１、２、３、５、１０、１５、２０、２５ミクロン以上の範囲に及び得る。センサは、正方形、矩形、六角形または他の２次元パターンで配置することができる。主としてＤＮＡ用途、例として増幅、リアルタイムＰＣＲ、シーケンシング、デジタルＰＣＲ、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブアレイについて本明細書に記載されるが、磁気アレイは他の用途、例えば抗体または他のタンパク質を利用およびまたは検出する用途または方法に利用することができる。
【００４６】
４．５μｍ直径の磁気ビーズを用いる一部の実施形態において、０．０７〜０．１４ｍｍ／秒のフロー速度が局在磁場による捕捉を可能とするためのビーズローディングに望ましいことがある。１．４〜４．２ｍｍ／秒のフロー速度は、磁気ビーズの遊離を防止するための試薬送達に望ましいことがある。＞５．６ｍｍ／秒のフロー速度は、ビーズ除去に望ましいことがある。他の実施形態において、気泡の使用を使用してビーズを除去することができる。より大きいおよびより小さいビーズを、より高いおよびより低いフロー速度を用いて使用することができるが、関係は線形でなくてもよい。
【００４７】
他の再使用法
一組のシーケンシングサイクルが完了した後、プライマーを除去し、置き換えることができる。緩衝液条件は、ビオチンストレプトアビジン結合を弱めるように変化させることができ、例えば低ｐＨにおける高濃度のＧｕＨＣｌであり；あるいは、温度を７０Ｃ超に上昇させてビオチンストレプトアビジン結合を破壊することができる。より低温を低イオン強度緩衝液、例えばマイクロモル濃度の塩濃度を有する緩衝液とともに使用することもできる。上記の組合せ、例えばより高温および低イオン強度緩衝液を利用することもできる。同様に、チオール結合を高温において破壊することができる。攻撃的手段を利用することができる。それというのも、ポリメラーゼおよびＤＮＡへの損傷がもはや起こり得ないためであり、それというのも、シーケンシング反応は既に完了しているためである。一実施形態において、有機試薬を利用して伸長したプライマーと表面との間の結合、例えば共有結合を破壊することができる。伸長したプライマーを除去した後、新プライマーをセンサ上の容量にフローさせることができ、デバイスを別の組のＤＮＡ試料に対する別の組のシーケンシングサイクルに再度使用することが可能となる。前記新プライマーは、単相液体中で結合させることができる。前記新プライマーは、プライマーのセンサへの結合または会合を支援する、前記プライマーを含有する流体中に含まれる追加の試薬も有し得る。新プライマーを増幅反応において利用して本明細書に記載の後続の配列分析のための新クローン集団を発生させることができる。前記増幅は、ＰＣＲまたは等温増幅であり得る。
【００４８】
さらなる実施形態において、増幅またはシーケンシングアレイは、ビーズの除去により再使用することができる。前記除去は、例えば、永久磁石の移動または電磁石の活性化から生じ得る外部磁場の印加により行って、ビーズまたは粒子を、それらが前記増幅またはシーケンシングアレイ中でホールドされる場所から引き寄せ、移動または遊離させることができる。
【００４９】
前記ビーズまたは粒子をビオチンストレプトアビジン結合、チオール結合、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、または他の核アナログハイブリダイゼーションなどにより定位置でホールドする代替的実施形態において、続いて新ビーズまたは粒子を増幅またはシーケンシングアレイ中で結合または会合させることができるように、前記結合の解放を、温度およびまたはビーズもしくは粒子に近接する流体環境を変化させることにより達成して結合を可逆的に破壊することができる。
【００５０】
シーケンシング
図３および４は、成長するＤＮＡ鎖中へのヌクレオチドの取り込みに関与する反応の概略説明であり、ピロリン酸の放出ならびに付随するｐＨ増加および放熱を示す。本明細書に記載のとおり、統合シーケンシングプラットフォームは、ｐＨ変化または電荷濃度または移動度を電子工学的に検出してＤＮＡを「電気的にシーケンシングする」するように構成された電子センシング下位系を含み得る。他の実施形態において、電子センシング下位系は、この反応から生じる温度変化を電子工学的に検出してＤＮＡを「電気的にシーケンシングする」ように構成することができる。
【００５１】
図５Ａは、２組のビーズを示し、一方はビーズに結合または付着したＤＮＡのクローンの組、およびビーズに結合または付着したＤＮＡのクローンの組を有さない組である。この系は、参照として使用すべき、ビーズに結合または会合したクローンＤＮＡを有さないビーズの利用を許容し、オフセット、ヌクレオチドおよび他の試薬電荷、温度、流体フローおよび圧力、緩衝液濃度変化ならびに除去すべき他の系の可変要素を除去する。図５Ａに示されるとおり、概略的な系５１０において、前記系可変要素の除去は、少なくともハードウエアにおいてアナログ減算を使用して行うことができる。他の実施形態において、系の可変要素の除去は、ソフトウエアにおいて、およびまたは外部ハードウエアにおいて実施することができる。さらに他の実施形態において、ローカルハードウエアおよびソフトウエアならびにまたは外部ハードウエアの組合せを利用することができる。図５Ｂは、ほとんどの推定取り込み反応が、反応が生じなかったことを示すシグナルレベルをもたらす一方、一部の推定取り込み反応が、単一の取り込みイベントを示すシグナルレベルをもたらし、他の推定取り込み反応が、クローンＤＮＡのホモポリマー領域中での複数の取り込みイベントを示すシグナルレベルをもたらす、得られたデータを示す。
【００５２】
さらなる実施形態において、電子センシング下位系は、バルク溶液中の、センサの表面を横断する（センサに結合した部分、またはセンサの表面のデバイ長内の部分のいずれかから）、ビーズもしくは粒子の表面を横断する（ビーズもしくは粒子に結合した部分、またはビーズもしくは粒子の表面のデバイ長内の部分のいずれかから）、またはそれらの組合せのいずれかの導電率の変化を検出し得る。さらに別の実施形態において、電子センシング下位系は、センサの表面付近または表面上での、ビーズまたは粒子の表面付近または表面上での電荷変化を検出し得る。例えば、電子センシング下位系は、センサ、もしくはビーズもしくは粒子の表面のデバイ長内の、または表面もしくはビーズもしくは粒子に結合した部分の電荷変化を検出し得る。
【００５３】
図６は、ナノセンサ６０４およびシーケンシング系と電気接続されたマイクロ流体チャネルを伴う一連のナノセンサ６１０の概略説明を含む。ナノセンサは、ナノセンサに直接結合または会合したクローンＤＮＡ６０２を有し得、それぞれのナノセンサに伴う電極または磁気素子６０８を有し得る。他の実施形態において、センサは、ビーズ上のクローンＤＮＡの電荷変化、前記クローンＤＮＡに会合した対イオンの変化、または取り込みから生じる副生物を検出し得る。ナノセンサ６０４は、オンチップシグナル増幅のためのシグナル増幅器６０６をさらに含み得る。ナノセンサ６０４は、公知の絶縁材料、例えばＳｉＯ２、Ａｌ２０３、ＳｉＮ、およびＴａＯ２のいずれかをさらに含み得る。ある実施形態において、ナノセンサは、絶縁層により分離された同軸および／または並列導電層を含み得る。導電層は、任意の好適な材料、例えば金、白金、アルミニウム、炭素、またはポリシリコンから形成することができる。
【００５４】
（磁気）ビーズおよびＤＮＡ断片は、シーケンシング系中に運搬することができる。図７に示されるとおり、シーケンシング系は、シーケンシング系内で画定されるマイクロ流体チャネルと電気接続された一連のナノセンサ７０８を含み得る。ビーズまたは粒子７０２は、一部の実施形態において局在磁場を形成し得、他の実施形態において局在電場を形成し得る磁気または電極素子７１０により前記センサ７０８にわたり位置させることができ、センサ７０８および磁気素子は両方とも、基板７１２に付随させて構成することができる。ビーズまたは粒子７０２は、それに結合または会合したクローンＤＮＡ７０４を有し得る。次いで、ヌクレオチド、プライマー、マグネシウムおよびポリメラーゼ７０６を含み得る試薬を提供してシーケンシング反応を開始することができる。他の実施形態において、磁気または電極素子７１０が磁気素子である場合、それらは永久磁気素子または電磁素子のいずれかであり得る。
【００５５】
他の態様において、本発明は、磁気アレイを使用してポリヌクレオチドをシーケンシングして本明細書に記載の局在磁気フィーチャのアレイを形成する方法を提供する。本方法は、磁気アレイと複数の磁気ビーズと接触させることを含み、磁気ビーズは、それぞれ、それに付着したクローン増幅されたＤＮＡセグメントを有し、それは一本鎖、部分的に二本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖、部分的に二本鎖、二本鎖のいずれであろうと、テンプレートＤＮＡは変性により一本鎖ＤＮＡに変換することができ、シーケンシングプライマーは一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせてシーケンシングに備えることができる。
【００５６】
ベースコーリング後、アレイ上のそれぞれの位置において記録された配列をアセンブルすることができる。例えば、アレイのそれぞれの位置における断片のアイデンティティが未知であり得る場合、ショットガンシーケンシング法を使用することにより、またはポリヌクレオチド配列を参照配列（例えば、野性型配列）に基づきアセンブルすることができる。
【００５７】
クローンＤＮＡ配列は、それぞれ、ヌクレオチド取り込みのためのテンプレートとして作用する一本鎖領域を有し得る。一本鎖領域は、少なくとも１０塩基長であり得、または一部の実施形態において少なくとも３００塩基長であり得、または他の実施形態において少なくとも１ｋｂ長であり得る。本発明は、それにより、長く正確でコスト効率的な読取りを提供する。本明細書に定義の１つのクローン集団中でポリヌクレオチドの２つ以上の増幅された集団が存在し得、単一クローン集団内の増幅集団のそれぞれについて別個のシーケンシング反応を実施することができるように、ポリヌクレオチドの異なる増幅集団は異なるプライマーを有し得る。
【００５８】
別の態様において、磁気アレイは、微小環境のｐＨ変化を測定するための隣接ナノセンサを含み、微小環境には、局在磁場によりホールドされるビーズに近接する環境が含まれる。この態様において、マイクロアレイがＤＮＡの電子シーケンシングに有用であり得る。ｐＨ変化を検出することによりシーケンシングする方法は、一般に、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１６６７２７号明細書に記載されている。ポリヌクレオチドの取り込みを検出する代替法、例として熱シーケンシング（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１６６７２７号明細書に記載のもの）、電荷濃度、荷電種の移動度および副生物の検出、ならびに公知の光学的検出法を使用することができる。
【００５９】
磁気アレイは、アレイを形成するために基板上に複数の局在磁気フィーチャを有する基板を含み、局在磁場は、本明細書に記載の磁気ビーズをトラップするために十分である。局在磁気フィーチャは、永久磁性材料（例えば、強磁性体）から形成することができ、または非永久的であり得、電場により磁化（および消磁）することができる。
【００６０】
他の実施形態において、本明細書において後述するとおり、電場を使用してビーズまたは粒子をある位置にホールドまたは保持することができる。
【００６１】
検出器
磁気または常磁気ビーズまたは粒子は、磁気アレイによりセンシング領域にわたりまたはそれに近接する定位置でホールドすることができ、局在磁場のアレイを形成する。保持された磁気または常磁気ビーズは、ＤＮＡの単一クローン集団を有し得る。前記ビーズは、それぞれのセンサにわたり１つのみのビーズに十分な余地が存在するようにサイズ化することができ、したがってセンサとビーズとの間の一対一対応を提供する。それぞれのセンサにわたり１つのみのビーズのための余地が存在し得るが、ビーズをセンサにわたり整列させる場合、ビーズ間の追加の距離が存在し得、センサ間のクロストークの低減をもたらす。
【００６２】
磁気シーケンシングアレイは、局在磁場のそれぞれの周辺（微小環境）の少なくとも１または２つのナノセンサを有する複数のナノセンサを含む。ナノセンサは、それぞれの微小環境（例えば、それぞれの局在磁場の周辺）中のわずかなｐＨ変化または電荷濃度を検出するための高い感受性を有する。例えば、アレイは、１０００ナノセンサ以上、２０００ナノセンサ以上、４０００ナノセンサ以上、１０，０００ナノセンサ以上、１００，０００ナノセンサ以上、１，０００，０００ナノセンサ以上、１０，０００，０００ナノセンサ以上または１００，０００，０００ナノセンサ以上を含み得る。ナノセンサは、対応する微小環境または重合反応の発生におけるイオン（Ｈ＋）濃度増加、またはＤＮＡに会合した対イオン増加を測定するために十分な２つの端子を有する計測電極を含み得る。
【００６３】
ナノセンサは、十分に間隔を介した（例えば、２０から３０ｎｍの間隔）、対応する微小環境中のイオン濃度変化を検出するように構築された正端子および負端子を有する少なくとも一対の計測電極を含み得る。他の実施形態において、電極間の間隔は、１００ｎｍから５００ｎｍであり得、または１０００ｎｍから５０００ｎｍであり得る。より具体的には、ナノセンサは、ビーズおよび別の材料上での生物材料の取り込みイベントまたは化学反応に対する結果としての対応する微小環境のイオン濃度変化により引き起こされる微小環境内の流体のインピーダンスの変化を検出し得る。代替的実施形態において、センサは、米国仮特許出願第６１／３８９，５９０号明細書、標題「Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ」に記載の抵抗性半導体素子であり得る。さらに別の実施形態において、ナノセンサは、米国特許第７，６９５，９０７号明細書「Ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ」、米国特許第７，９４８，０１５号明細書、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＦＥＴ  Ａｒｒａｙｓ」、米国特許出願公開第２０１１／０１７１６５５号明細書、標題「ｐＨ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ」および米国特許出願第１３／１１８，０４４号明細書、標題「Ｎａｎｏ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｒｒａｙ」に記載のＣｈｅｍＦＥＴまたはＩＳＦＥＴであり得、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。ナノセンサという用語が本明細書において利用される場合、それは、上記の一組の電極とみなすことができ、または抵抗性半導体素子であり得、またはＩＳＦＥＴもしくはＣｈｅｍＦＥＴもしくは上記センサの組合せであり得る。
【００６４】
本発明の一部の実施形態において、異なるセンシング法の組合せ、例えばＮａｎｏＮｅｅｄｌｅおよびＮａｎｏＢｒｉｄｇｅ、またはＩＳＦＥＴおよびＮａｎｏＮｅｅｄｌｅを利用することができる。一部の実施形態において、異なるセンサは、標的部分に関連する異なる特性をセンシングし得る。例えば、ＮａｎｏＮｅｅｄｌｅは、標的部分と結合または会合した部分の導電率を検出し得る一方、ＮａｎｏＢｒｉｄｇｅは、標的部分と結合または会合した電荷を検出し得る。
【００６５】
図８Ａは、ナノセンサのアレイの顕微鏡写真、および単一のナノセンサ８０２の拡大図を示す。インピーダンス計測は、取り込まれたヌクレオチドを検出するためのそのようなナノセンサにより使用することができる。インピーダンス計測は、重合反応から生じるＨ＋イオンピロリン酸の放出または電荷の局所変化を検出する。一般に、動作周波数は、反応の開始におけるインピーダンスに対する、反応の過程にわたるインピーダンスの最大変化について選択することができる。例えば、一部のジオメトリーについて、周波数は約０．１から９ＫＨｚであり得る。代替的ジオメトリーにおいて、周波数は１０ＫＨｚ以上であり得る。一部の実施形態において、ナノセンサに、Ｈ＋イオン放出または反応のｐＨ変化を検出するためにｐＨ感受性材料（例えば、酸化還元感受性材料）を有するまたは有さない単一ペアの電極を実装することができる。インピーダンス計測は、一例として、周期的な下位シグナルで−Ａから＋Ａボルトまたはその逆をスイープしながら電流を測定することにより行うことができる。Ａよりも小さい振幅を有するパルス波、および約２５Ｈｚ以上の周波数を印加することができる。電圧スイープの間の電流の計測は、ナノセンサに近接する溶液中のｐＨの変化を示し得る。図８Ｂは、前記ナノセンサ８０２のアレイの概略説明を示し、オンチップ増幅器８０４がそれぞれのナノセンサに付随し得る。
【００６６】
図９は、シーケンシング系内のナノセンサ９０２のアレイの概略説明を示す。ナノセンサは、誘電体９０６により分離された２つの電極９０４を含み得る。ナノセンサのアレイを含むものとして図９に示されているが、他の実施形態において、計測は単一の電極ペアを用いて行ってインピーダンス、電荷、または電流計測を介してイオン構成またはｐＨの変化を検出することができる。
【００６７】
系は、以下のとおり配列分析のために較正することができる。種々の環境源からの共通のノイズおよびシグナル（例えば、熱ノイズ、混合もしくは流体ノイズ、またはヌクレオチド電荷もしくは他の試薬の効果）を低減させるため、ＤＮＡを有さない１つまたは複数のビーズをＤＮＡコートされたビーズと同様の環境中に局在化することができる。２つのセンサ（ＤＮＡコートされたビーズおよびＤＮＡを有さないビーズまたはビーズを有さないセンサの微小環境を検出する）から記録されたシグナル間の示差計測は、ノイズを大幅に低減させ、検出の間のシグナル対ノイズ比の改善をもたらす。一部の実施形態において、複数の局所参照センサを組み合わせて局所平均参照を作出することができる。他の実施形態において、磁気フィーチャは、ビーズを有さないセンサ位置の作出を省くことができる。一部の実施形態において、示差計測は、あるサイクルにおける反応を有さない隣接ＤＮＡビーズと同一サイクルについての対象のビーズとを比較することにより行うことができる。他の実施形態において、示差計測のための隣接ビーズは、流体フローを実質的に同一の時間において受容する領域、またはＤＮＡを有さずまたはＤＮＡを有し、そのサイクルにおける反応を有さないビーズから選択することができる。他の実施形態において、２つ以上の単一サイクルにわたるバックグラウンドシグナルの平均化を使用することができる。流体または標的部分との接触または相互作用から遮蔽される別のセンサとのそのセンサの示差計測。
【００６８】
一部の実施形態において、統合シーケンシングプラットフォームは、より良好なシグナル対ノイズ比を生成し、シーケンシング検出におけるプロトン（Ｈ＋イオン）およびＯＨ−効果からのノイズレベルを低減させ、ならびに／または仮想ウェルにおいて公知の系および方法を使用して現在可能であり得るものよりも良好な隔離を生成し得る。０００１より具体的には、一部の実施形態において、系および方法は、上記の性能を改善するように構成された緩衝液媒体を用いることができる。緩衝液は、Ｈ＋（プロトン）イオンについて水中における拡散係数とは異なる移動度および拡散係数を有し得る。緩衝液は、Ｈ＋およびＯＨ−についての係数の異なる変化も有し得る。一部の実施形態において、緩衝液媒体は、水に極めて類似するが、異なるＨ＋の移動度を有する材料、例えば酸化ジュウテリウム（Ｄ２Ｏまたは重水）またはこの機能性を有する任意の一般材料であり得る。移動度の差異は、重合反応において放出されるＨ＋イオンの移動を示し得る。別の態様において、緩衝液媒体は、Ｈ＋イオンについて異なる移動度を有する材料および／または異なる材料、例えばＤＮＡ、ヌクレオチド、プライマーまたは他の部分を含み得、ゲルタイプ材料であり得る。ゲルタイプ材料は、ゲルタイプ材料内で放出されるＨ＋イオンについて異なる移動度および拡散をもたらし、より容易な検出を促進し、より良好なシグナル対ノイズ比をもたらす。
【００６９】
シーケンシングのために系を較正するため、および個々のセンサから記録されたシグナルが適切および正確であり得ることを確保するため、ヌクレオチドの共通配列をシーケンシングされている全てのテンプレートＤＮＡ鎖中に埋め込むことができる。この共通配列は、増幅プライマーの設計により増幅段階の間に導入することができる。例えば、ＡＡＴＣＧＡの配列は、全ての配列のフロントエンドにおいて取り込むことができ、系を較正するために利用することができ、ヌクレオチド取り込みのそれぞれの既知の読出しを可能とし、２つ以上の塩基取り込みとは異なる単一塩基取り込みの較正も許容する。塩基の４つ全て、塩基の３つ、塩基の２つ、または単一塩基を利用し得る、塩基の任意の組合せを利用することができ、単一塩基取り込み、２塩基取り込み、または任意数の塩基、最大８塩基（８塩基を含む）以上の取り込みを含み得る。異なるプライマーを、異なる試料をコード化する手段として使用することもできる。
【００７０】
電気的閉じ込めおよび保持
一実施形態において、磁気アレイは、局在磁場のそれぞれの周囲に電場を作出し、それによりテンプレートＤＮＡ、ポリヌクレオチドおよびｄＮＴＰを局在磁場周囲で濃縮し（例えば、電気浸透、電気泳動または誘電泳動力による）、それによりポリヌクレオチド増幅または重合反応を高めるように位置された電極を含み得る。電場は、ＰＣＲまたはシーケンシングプロセスの間にアレイの領域間の隔離を作出し、ＤＮＡ鎖および／もしくはヌクレオチドもしくは他の荷電分子をクローンＰＣＲのためのビーズに導き、ならびに／またはヌクレオチドをシーケンシングのためのＤＮＡコートされたビーズに導き得る。例えば、電極をビーズ捕捉位置下およびビーズ捕捉領域を包囲するいくつかの位置、例えば円形または正方形配置で位置させて重合反応を高めることができる。シーケンシング分析のための磁気アレイは、記載の非磁気基板上で作出することができる。画素化構造であり得る読出し電気回路およびオンチップ増幅器は、基板上に実装することができる。続いて、図１０に示される、反応の微小環境と直接または間接的に接触し得る個々のナノセンサを製作することができる。磁気バーアレイ１００６は、局在磁場を発生させてビーズをセンサ１００８に近接させて会合させる。任意選択の付随の増幅器１００４は、統合デバイス１００２の一部として図１０に示されるとおりセンサ層の上方または下方に製作することができる。マイクロ流体チャネルを構造中に埋設することができる。チップは、データ収集ユニットと作動可能に接続させることができる。他の実施形態において、ビーズ捕捉フィーチャ中のビーズ保持は、局在電場を利用して生じ得る。一部の実施形態において、ビーズまたは粒子は非磁性であり得る。さらに別の実施形態は、電場をビーズ捕捉フィーチャ、センサまたは他の所望の位置のそれぞれの周囲に作出するように位置させた電極を含み得、それによりテンプレートＤＮＡ、ポリヌクレオチドおよびｄＮＴＰを濃縮して（例えば、電気浸透、電気泳動または誘電泳動力による）、それによりポリヌクレオチド増幅または重合反応を高める。電場は、ＰＣＲまたはシーケンシングプロセスの間にアレイの領域間の隔離を作出し、ＤＮＡ鎖および／もしくはヌクレオチドもしくは他の荷電分子をクローンＰＣＲのためのビーズに導き、ならびに／またはヌクレオチドをシーケンシングのためのＤＮＡコートされたビーズに導き得る。
【００７１】
図１１は、より低い拡散定数を有する荷電部分を所望の容量に局在化するために組み合わせる力の一部、例として印加電場から生じ得る電気泳動フロー、摩擦力、静電気力、および電気泳動力を概略説明する。概略１１０８は、電極１１０６上に印加される電圧を発生させて局在電場を発生させる電圧源１１１８を示す。
【００７２】
局在電場は、ＡＣおよびまたはＤＣコンポーネントを含み得、非正弦波形を利用し得る。前記非正弦波形は、三角波、方形波、任意の形状の波を含み得る。前記非正弦波形は、例えば正弦波形のピーク中に「デッドスポット」を含み得、ハイブリダイゼーション結合、酵素結合、他の結合、および酵素活性が潜在的に干渉する電場の存在なしで生じることを可能とする。他の「デッドスポット」は、例えば、方形波中で利用することができ、電圧をＡボルトのレベルにある期間上昇させ、次いで０ボルトにある期間低減させることができる。次いで、電圧をＡボルトに再度上昇させ、次いで負のＡボルトの振幅とすることができる。「デッドスポット」は、０ボルトであることが必要でないが、電場により影響を受ける異なる部分間の所望の相互作用が生じ得るように十分に低減させることができる。荷電分子濃縮に対する局在電場１１０９の結果は、電場から生じ、実質的な隔離を提供し得る実質的な勾配を示す。
【００７３】
主としてＤＮＡ用途について本明細書に記載されるが、上記の電気的閉じ込めを他の用途、例えば抗体または他のタンパク質または化学代謝物質を利用およびまたは検出する用途または方法に利用することができる。一部の実施形態において、シーケンシングまたは増幅以外の他の反応は、一組の仮想ウェル中で実施することができる。そのような用途における実際的使用のため、隔離が必要である部分は、荷電または他の荷電部分と会合することが必要である。
【００７４】
図１２は、電極１２０６に印加されている電場から生じるシミュレーション１２０８からの電極上の水平垂直線１２０９における電位を示す。荷電部分、例としてビーズ付近のＤＮＡアンプリコンを捕捉し、それらが隣のビーズにマイグレートするのを防止するのに使用することができる、ＤＣ電圧に起因する流線電場１２０２および電位。このシミュレーションはｄＮＴＰマイグレーションについて実施した。
【００７５】
増幅
本発明の一実施形態において、磁気バーおよび電極アレイは、磁場およびまたは電場によりアレイの領域を隔離することにより磁気ビーズ上でＤＮＡ断片をクローン増幅するエマルジョンフリー法を提供する。ビーズ上でのクローン増幅は、一般に、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，３２３，３０５号明細書に記載されている。本発明は、ＤＮＡ鎖を増幅の間ビーズ、粒子またはセンサの表面上に固定化し、それによりＤＮＡ鎖の他のビーズ、粒子、またはセンサへの拡散をさらに防止するブリッジ増幅を用い得る。
【００７６】
ＤＮＡ断片を増幅する例示的方法において、磁気ビーズを、電場を形成する電極を有する磁気バーアレイ上に注入することができる。ＤＮＡ鎖テンプレート（二本鎖または一本鎖）をチャンバ中に注入してビーズ分布につき望ましいＤＮＡ鎖に標的化された濃度でビーズ上を進行させ、それによりクローン増幅を可能とする。ある実施形態において、ポリクローン領域が発生しないことを確保するため、インプットＤＮＡの濃度は、ほとんどのセンサ領域が１つの試料ＤＮＡ分子を有しまたはそれを有さないほど十分に低いことが必要である。次いで、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼをチャンバ中に注入することができ、記載のとおり電場によりビーズ周囲で濃縮することができる。増幅のためのＤＮＡプライマーは、任意の工程において、例えばｄＮＴＰおよび／またはポリメラーゼを添加するときに提供することができ、またはＤＮＡテンプレートとともに提供することができる。ビーズ上に固定化されたＤＮＡ断片は、ＰＣＲまたは等温増幅により増幅することができる。二本鎖ＤＮＡが出発材料である場合、増幅プロセスの第１の工程は、二本鎖断片の「メルティング」により一本鎖テンプレートを作出し、次いでプライマーアニーリングおよび伸長工程、ならびにＰＣＲを利用する場合には反復加熱冷却サイクルを行い、または等温増幅については温度の連続制御を行う。図１３は、本明細書に記載のアレイ中にホールドされた二本鎖ＤＮＡを有するクローンビーズの蛍光顕微鏡写真を示す。
【００７７】
増幅プロセスの間、誘電泳動力も、アンプリコンの保持により増幅を受ける異なるセンサ領域間の交差汚染の防止を支援し得る。図１５に説明される実施形態において、センサの電圧レベルに対して同一の電圧を有するものとして追加の電極が示される。図１４に示される代替的実施形態において、センサの両側上の電極は互いに対して異なる値を有する反対符号または同一符号の電圧を有し得る。
【００７８】
さらに、ゲルタイプ材料は、磁気アレイによる増幅またはシーケンシングの間、異なる領域中およびまたはその領域間で隔離材料として作用し得る。そのようなゲルタイプ緩衝液媒体の使用は、ある局在磁場から隣（または隣接する）局在磁場へのＤＮＡ鎖の最小の拡散をもたらし得る。それというのも、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、および他の材料をサイクル注入の間導入し、ゲルタイプまたはスポンジ状媒体を介して輸送することができるためである。ゲルタイプ材料は、任意の好適な材料、例えばアガロースまたはアクリルアミドまたは架橋を物理的または化学的トリガーを介して開始することができる他の架橋材料であり得る。そのようなトリガーの一例は、温度の変化（物理的トリガーとして）、または物質の添加（材料に対して化学的変化を生成して媒体をゲルタイプ相にするため）である。
【００７９】
「ゲル様」または「スポンジ状」材料は、ビーズ付近の容量でのＤＮＡ鎖の閉じ込めも介助し得、または局在磁場中またはその付近でのＤＮＡ鎖の閉じ込めも介助し得、および／またはポリヌクレオチドの拡散も低減させ得る。そのような実施形態において、ヌクレオチドおよび他の材料は、より容易に拡散させることができるが、ＤＮＡ鎖、特に試料またはアンプリコン断片の自由な拡散を妨げることができる。
【００８０】
一部の実施形態において、本方法は、系の増幅部分におけるＤＮＡの拡散を低減させ得る。
【００８１】
図１４は、センサアレイ中の区域中で、または個々のセンサ１４０２上でクローン集団を発生させることができる代替的実施形態を示す。センサは、ＮａｎｏＮｅｅｄｌｅもしくはＮａｎｏＢｒｉｄｇｅまたは重合のイベントを検出するための他のセンサであり得る。一実施形態において、プライマー１４０４をセンサの表面と優先的に結合、会合させ、またはそれに付着させることができる。前記プライマー１４０４は、材料の差異の結果として優先的に付着させることができ、センサの材料は、センサアレイのセンサ間の区域よりも付着について有利であり得る。代替的実施形態において、マスクをセンサアレイのセンサ間の区域に施与し、次いで表面修飾を実施することができる。続いて、マスクを除去することができ；表面修飾が実施されていないセンサアレイのセンサ間の区域を残す。表面修飾には、ビオチンの付着、金の層の施与および当該技術分野において公知の種々の他の方法が含まれ得る。
【００８２】
次いで、プライマー１４０４を、センサアレイ中のセンサ１４０２の表面上の区域に優先的に施与することができる。一実施形態において、プライマーは、ビオチンストレプトアビジン結合の結果として付着させることができ、ビオチンまたはストレプトアビジンをプライマーの５’末端に付着させることができる。別の実施形態において、チオール基をプライマーの５’末端に付着させることができ、次いでそれはセンサ上に予め施与された金の層に結合し得、Ａｕ−Ｓ結合を形成する。ＰＣＲ反応が望まれる場合、プライマーを、２つのチオール金結合を形成することができるようにＤＴＰＡにより修飾することができ、そうでなければＰＣＲにおいて定型的に使用される６０から９５Ｃで生じ得る解離を防止する。標的ＤＮＡ１４０６は、電極１４０８Ａおよび１４０８Ｂにより発生させた電場１４０６によりプライマー１４０４の区域中で濃縮することができる。プライマー、ｄＮＴＰ１４１０、およびポリメラーゼ１４０８を導入し、場合により電極１４０８Ａおよび１４０８Ｂにより発生させた電場により濃縮することができる。
【００８３】
一部の実施形態において、増幅は、あるプライマーがビーズの表面上に存在し得、第２のプライマーが溶液中に存在し得る固相増幅であり得る。他の実施形態において、増幅は、全てのプライマーがビーズ上に存在する固相であり得、または両方のプライマーが溶液中に存在し、一方のプライマーまたは両方のプライマーがビーズ上にも存在し得る増幅を実施することができる。さらなる実施形態において、一方のビーズが溶液中に存在し、一方のプライマーまたは両方のプライマーがビーズ上にも存在する増幅を実施することができる。
【００８４】
電極構成は、種々の異なる形態、例として、フローセルの一方または両方の主要な平面上の実質的に平面な電極を取り得、またはビーズと対向する表面上の電極、およびそれぞれのセンサに付随する一組の小電極、またはビーズ捕捉領域が存在し得る。図１５は、一組のセンサ１５０２を電極構造１５０４および１５０６と会合させて局在化することができ、電極構造はビーズ捕捉フィーチャの直近に局在した電極１５０４を有し得、大電極構造１５０６はビーズ捕捉フィーチャおよび小電極１５０４を取り囲み得る一実施形態を概略説明する。ビーズ捕捉フィーチャは、実施形態をシーケンシングまたは検出に使用する場合、センサ活性区域に近接し得る。大電極を円形として説明するが、それは正方形、矩形、卵形または他の形状であり得、小電極１５０４を完全に取り囲む必要はない。
【００８５】
実質的に平面な構造は、より良好な整列または場集束のための窪みもしくはウェル、またはより良好な流体フロー特性のための台を含み得る。
【００８６】
一部の実施形態において、増幅前、ビーズを一本鎖ＤＮＡ断片と会合させてモノクローンビーズを作出することができる。典型的には、ＤＮＡ濃度を測定することができ、次いでＤＮＡを、平均して１つ未満の断片がそれぞれのビーズに結合し得るように希釈形態でビーズに導入することができる。多くのビーズはＤＮＡ断片を有さず、ほとんどのビーズは単一断片を有さず、少数のビーズが２つ以上の断片を有する。定量に必要とされる工程は、別個の装置および別個の処理を要求することが多い。定量は、リアルタイムＰＣＲ、または２６０ｎｍにおける吸光度の測定を利用して行うことができることも多い。
【００８７】
３つ以上の電極を利用する場合、異なる電圧を任意の組の電極に利用することができる。
【００８８】
ポリマーは、より高い電圧およびより短い持続時間を有する１つの相を有するＡＣ場と併せて利用して標的分子の指向された移動度を提供することができる。
【００８９】
一実施形態において、試料は、極めて希釈して作製することができ、および／または小容量の試料試薬を利用し、ビーズ上にロードすることができる。ＤＮＡはビーズの一部に結合し、次いで仮想ウェル中で増幅され、ＤＮＡを有するビーズを作出する。シーケンシングプライマーは、試料ＤＮＡにライゲートされる相補体よりも短く作製することができる。配列が既知のため、正確なｄＮＴＰを添加および検出することができる。一実施形態において、複数のｄＮＰＴを同時に添加することができる。例えば、全てのｄＮＴＰを添加する場合、ポリメラーゼは断片の末端に及び、大シグナルを発生させる。前記大シグナルは、増幅プロセスの一部として発生させることができる。これは、ビーズが最小増幅を有する場合であっても、ＤＮＡを有するビーズの検出およびその数の計数を可能とする。どのくらいのビーズがシグナルを有するかを知ることは、適正な希釈の計算を可能として理想数のモノクローンビーズを発生させる。シグナルは電気的、光学的または当該技術分野において公知の任意の他のタイプの検出シグナルであり得る。
【００９０】
一部の実施形態において、アンプリコン、ポリメラーゼまたは他の部分の電気的閉じ込めは、いかなる物理的ウェル構造も有さないデバイスにより利用することができる。他の実施形態において、デバイスは、窪みまたは突起が存在する実質的に平面な表面であり得る。さらに他の実施形態において、デバイスはウェル構造を有し得る。
【００９１】
電気的濃縮
図６および１２に説明されるとおり、センサアレイに、誘電泳動濃縮を実施するために利用することができる電極の追加のアレイを提供することができる。誘電泳動濃縮を最初に実施して試料ＤＮＡ１２０６ｄＮＴＰ１２１０、プライマー、およびポリメラーゼ１２０８をそれぞれのセンサまたは増幅領域に引き付けることができ、利用すべきそれぞれの前記部分のより低い濃度を許容する。次いで、増幅を、試料ＤＮＡ分子を局在化することができるそれぞれのセンサの領域中で開始することができる。電場を発生させた仮想ウェルは、アンプリコンがある仮想ウェルから離れ、別の仮想ウェルに移動し、交差汚染が発生するのを防止し得る。同様の様式において、アンプリコンを局在化するために使用される場は、アンプリコン、プライマー、およびポリメラーゼもセンサの領域または増幅領域に濃縮し得る。
【００９２】
別の実施形態において、試料は、エマルジョンフリーナノウェルの既存の電極を使用して増幅領域中で濃縮することができる。一実施形態において、電極は単一平面上に設置することができる。別の実施形態において、電極は仮想ウェルの平面に並行な第２の平面に付加することができる。別の実施形態において、ＡＣおよびまたはＤＣ電圧入力の混合が予想される。
【００９３】
別の実施形態において、誘電泳動を使用してＤＮＡを濃縮することができる。濃縮の間またはその後、電流を計測してＤＮＡ濃度を測定することができる。別の実施形態において、濃縮されたＤＮＡを下記のインターカレート色素の使用により定量することができる。
【００９４】
隔離場電極も濃縮に利用することができる。一部の実施形態において、同一の電極および場を利用することができる。他の実施形態において、隔離場を発生させるために使用されるものに対して、より少ないまたはより多い電極を利用して濃縮場を発生させることができる。
【００９５】
濃縮を利用して試料の利用、例えば後続の増幅のための仮想ウェルへのＤＮＡ試料の指向または引き寄せを最大化することができる。濃縮を利用してポリメラーゼを増幅のための仮想ウェルに、またはビーズもしくはセンサと会合させることができるＤＮＡのクローンの組に指向または引き寄せることもでき、前記ポリメラーゼはシーケンシング反応において利用することができる。同様の様式において、他の部分、例えばｄＮＴＰ、プライマー、他の酵素、および他の生物学的または他の荷電部分を反応における使用、または後続の反応における使用のために濃縮することができる。
【００９６】
試料ＤＮＡの顕著な増幅は、十分なＤＮＡ試料が所望のプロトコルのために十分高い濃度において利用可能であることを確保するために実施することが多い。この増幅は、バイアスを導入し得、経時的な追加コストおよび資源であり得る。試料を増幅する必要性を低減または排除する能力が望ましいことがある。一実施形態において、ロードすべきビーズを充填床中に封入し、それを越えて試料をポンプ輸送することができる。一部の実施形態において、試料を、ビーズを有する区域を介して複数回ポンプ輸送して試料が結合する追加の機会を提供することができる。体積に対する高い表面積は、使用すべき最小試料を可能とすべきである。続いて、ビーズを、フローセル中に移動させることができ、ビーズを磁気アレイにより定位置でホールドすることができ、局所コロニーをＰＣＲまたは等温増幅によりビーズ上に作出することができる。
【００９７】
複数試料
多くのプロジェクトはチップの全使用を要求しないため、複数試料を単一チップ中にロードすることが望ましいことがある。一実施形態において、試料をチップアセンブリ中に統合されたバルブを使用してチップ上の壁により分離された個々の帯域中に指向することができる。そのようなバルブは、流体路中に統合されたポリジメチルシロキサンＰＤＭＳバルブであり得る。別の実施形態において、試料をチップ上の壁により分離された別個の帯域中に、チップアセンブリ上の多重インプットを有するチップアセンブリから分離されたバルブを使用して指向することができる。別の実施形態において、別個のインプットおよびアウトプットを有する別個の帯域が存在し得る。別の実施形態において、試料は局所電場を使用してチップまたはフローセル上の別個の帯域中に指向することができる。正電場（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｉｅｌｄ）を印加してＤＮＡまたはＤＮＡコートされたビーズを所望の領域に引き付けることができる一方、負電場（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｉｅｌｄ）を印加してＤＮＡまたはＤＮＡコートされたビーズを不所望の領域から遠ざけることができる。別の実施形態において、試料を別個の帯域中に電磁石を使用して指向して磁気または常磁性ビーズを分離することができる。別の実施形態において、試料を、個々のレーン中に自己シーリングポートを使用して送達することができる。自己シーリングポートは、ゴム隔膜および針を含み得る。
【００９８】
別の実施形態において、試料を異なる時点において注入することができ、新ビーズを予め空のビーズ位置からのシグナルに起因して区別することができる。
【００９９】
本発明の一部の実施形態において、試料調製プロセスの一部として、「バーコード」をそれぞれの試料に付随させることができる。このプロセスにおいて、ショートオリゴをプライマーに添加し、それぞれの異なる試料がプライマーに加えて異なるオリゴを利用する。プライマーおよびバーコードをライブラリー発生プロセスの一部としてそれぞれの試料にライゲートさせる。したがって、それぞれのコロニーの発生に付随する増幅プロセスの間、プライマーおよびショートオリゴも増幅される。バーコードの付随をライブラリー調製プロセスの一部として行うため、２つ以上のライブラリー、したがって２つ以上の試料をクローン集団の発生において利用することが可能であり、ショートオリゴを試料配列とともにシーケンシングすることによりどのビーズおよびコロニーがどの試料を端緒とするのかの決定を許容する。
【０１００】
試料分離法は、試料識別子と併せて使用することができる。例えば、チップは、４つの別個のチャネルを有し、４つの異なるバーコードを使用して１６個の異なる試料の同時ランを可能とし得る。これは、より短いバーコードの使用を許容する一方、明確な試料同定を依然として提供する。
【０１０１】
図１６Ａ〜Ｄに示される代替的実施形態において、試料は、磁気アレイおよび付随のセンサアレイを有し得る系中に運び入れることができる。あるいは、系は、増幅および検出アレイの組合せを有し得、アレイのそれぞれの素子はセンサおよび仮想ウェルを作出するように構成された一組の電極を有し得る。前記アレイ１６０２Ａの一部のみを占有するように構成されたＤＮＡ試料の組１６０４Ａを、前記アレイ１６０２Ａに導入することができ、付随した試料を有するための利用可能な区域の一部をもたらす。次いで、そのような試料をそれぞれの仮想ウェルに付随するセンサにより検出することができ、図１６Ｂに示されるアレイ１６０２Ｂをもたらし、または増幅し、次いで検出することができる。図１６Ｂは、部分的に充填された磁気アレイの顕微鏡写真も示す。図１６Ｃは、さらなる試料の組１６０４Ｂを示し、それを次いで磁気およびセンサアレイ１６０２Ｂに導入することができ、図１６Ｄに示されるより完全に充填されたアレイ１６０２Ｃをもたらす。
【０１０２】
電気的閉じ込めおよびシーケンシングの組合せ
図１７は、シーケンシング反応において使用することができるセンサのアレイ中のセンサ上で増幅された領域の使用を説明する。ＤＮＡ試料１７０２をアレイ系１７１０中に運び入れ、アレイは、センサ領域１７１０に付着、結合または会合させることができる予備局在ビーズ、またはプライマー１７０８のいずれかを用いて構成することができる。ポリメラーゼ１７０４、ｄＮＴＰ１７０６および追加のプライマーを同時に、予めまたは続いてアレイに導入することができる。増幅反応１７１２が完了した後、センサアレイ上の容量を洗浄し、アンプリコン、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを除去し、アレイ位置に付随している局所的に結合会合または付着したクローンの組をもたらす。次いで、ポリメラーゼ１７１８、プライマー１７１４、および個々のｄＮＴＰ１７０６をセンサアレイ上の容量中にフローさせることができ、結合、取り込み、および取り込みイベントの検出を許容し、異なる増幅された試料ＤＮＡ分子の配列の決定をもたらす。シーケンシング反応に使用されるポリメラーゼ１７１８は、増幅反応に使用されるものと同一のタイプのポリメラーゼ１７０４であり得、または異なるタイプのポリメラーゼであり得る。
【０１０３】
クローンビーズの分離
図１９の一部は、クローンＤＮＡを有する磁気または常磁性ビーズを、会合した増幅生成物を有さない、および／または不完全な増幅および／または短いクローンを有する磁気または常磁性ビーズから分離し得る系の概略説明を示す。次いで、結合したクローン増幅されたＤＮＡセグメントを有する磁気または常磁性ビーズ１９３４をシーケンシング系中に運搬することができ、大部分が増幅されたＤＮＡを欠く磁気または常磁性ビーズ１９３４を廃棄チャンバに運搬し、ならびに／またはＰＣＲおよびエンリッチメント系内に保持することができるように、磁気ビーズ１９３４を分離することができる。分離または「エンリッチメント」は、電場をＰＣＲおよびエンリッチメント系の一部を横断して印加して電気泳動フローを誘導することにより生成することができる。したがって、増幅されたＤＮＡを有する磁気または常磁性ビーズ１９３４は、高荷電であり、大部分が増幅されたＤＮＡを欠く磁気常磁性ビーズ１９３４から効率的に分離することができる。この様式において、シーケンシング系に送達される試料は、シーケンシングに望ましい長さのＤＮＡ鎖を有する増幅されたＤＮＡを有する実質的に唯一のビーズを含み得る。同様に記述されるとおり、シーケンシング系に送達される試料は、１００％に接近するクローンビーズの割合を含み得る。クローンビーズの分離は、非磁性ビーズまたは任意の他のタイプのビーズであり得、その表面は荷電分子によりコートされ、またはされていない。
【０１０４】
クローンビーズを発生させる場合、大きい割合のビーズはＤＮＡテンプレートを有し得えない。さらに、他のビーズは不十分な増幅を有し得る。それらのビーズは、有用なシーケンシングを提供しない。それというのも、それはより良好な効率のためにそれらのビーズを除去することが望ましいことがあるためである。本発明の一部の実施形態において、テンプレートを有さない、または最小量のテンプレートを有するビーズを、電場を使用して分離するエンリッチメントモジュールを使用することができる。
【０１０５】
テンプレートにより完全にロードされたビーズは、より高い電荷を有し、したがって電場中をプライマーまたはわずかなテンプレートのみを有するビーズよりも遠くに移動し得る。図１８Ａ〜Ｂに示される一実施形態において、この分離は、モジュール１８００を介してフロー中で行うことができる。第１の流体インプット１８１１Ａは、混合されたビーズの注入を可能とする。第２のインレット１８１２Ａは、ビーズを有さない緩衝溶液の注入を可能とする。第１のアウトレット１８１１Ｂは、第１のインレット１８１１Ａから下流であり得る。第２のアウトレット１８１２Ｂは、第２のインレット１８１２Ａから下流であり得る。流体は、ポート１８０９を介してモジュール中またはその外に運び入れることができる。流体系は、基板１８０２、およびＰＤＭＳ１８０８ガラスまたは他の材料の層中に形成されたチャネル１８１０を有し得る。
【０１０６】
流体フロー速度は、より多くの液体が第２のインレット中にフローするように流体抵抗またはポンピング速度により設定することができる。一実施形態において、インレットおよびアウトレット幅を変えて異なる流体抵抗を作出することができるが、流体抵抗を改変する他の方法、例えば異なる長さ、高さが予想される。同様に、第１のアウトレット１８１１Ｂおよび第２のアウトレットの流体抵抗を、より多くの液体が第１のアウトレット１８１１Ｂの外にフローするように改変することができる。そのような設定において、フローに垂直な微小速度を有さないビーズは、第１のアウトレットポート１８１１Ｂを流出し得る。追加のアウトプットチャネルを追加して中間レベルのテンプレートを有するビーズの分離を促進することができる。
【０１０７】
テンプレートがロードされたビーズが流路の外から第２のアウトレット１８１２Ｂにマイグレートするように流体フローに垂直な電場の発生を可能とする一対の電極１８１３を提供することができる。流体ポート１８０９は、系配管への接続を可能とする。
【０１０８】
電極は、電気泳動と適合性の任意の電極材料から作製することができる。一部の実施形態において、ディスクリート金属ワイヤを使用することができるが、金属トレースも予想される。金属、例えば白金、白金／イリジウム、金および他の貴金属または合金が、耐腐食性材料、例えばステンレス鋼の他に予想される。非金属電極、例えば炭素も予想される。
【０１０９】
フロースルーエンリッチメントモジュールチャンバは、非導電性材料、例えば成形プラスチック、ガラス、セラミックまたは溶融性ポリマー、例えばＰＤＭＳから構築することができる。流体コンポーネントを融合または結合させてフローチャンバを作出することができる。
【０１１０】
電極に印加される電圧は、必要であればビーズが電極に固着する場合、低減または周期的に反転させることさえできる。使用される電圧は、電気分解に要求されるものよりも大きいことが望ましい（２５Ｃ、ｐＨ７において１．２３Ｖ）。より高い電圧およびより狭いギャップは、より高い電界強度およびより大きい力をビーズ上に提供する。系上の電圧は、テンプレートを有さない、または限定されたテンプレートを有するビーズをフローさせ、それらのビーズを第２のアウトレットに流入するほど十分に遠くに移動させることができない一方、テンプレートを有するビーズを第２のアウトレット中に指向することができるように、電圧またはフロー速度を調整することにより較正することができる。
【０１１１】
非フロースルーエンリッチメントモジュールも予想されるが、それらはフロースルー系ほど容易に自動化することができない。一実施形態において、ビーズをチャンバに導入することができ、磁場または重力はビーズをプルダウンする。電場は、テンプレートを有するビーズをプルアップして設置することができる。一部の実施形態において、捕捉膜または濾過器を正極の前方に追加してビーズの濃縮を促進することができる。
【０１１２】
一部の実施形態において、増幅されたＤＮＡを有さないビーズもしくは粒子（クローンビーズ）、およびまたは不十分に増幅されたＤＮＡを有するビーズもしくは粒子、または短すぎる増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズおよびもしくはビーズもしくは粒子を再循環させ、後続の増幅反応に再使用して十分に増幅されたクローンビーズまたは粒子を発生させることができる。ビーズまたは粒子は、前記ビーズまたは粒子がシーケンシングに利用された後に再循環させることもできる。前記ビーズまたは粒子は、単一系内で自動的に再循環させることができる。
【０１１３】
一部の実施形態において、増幅されたＤＮＡを有さないビーズまたは粒子は、ビーズまたは粒子を試料間での汚染を防止するためのさらなる処理なしで直接再使用または再循環させることができる。これは、例えば、単一試料をいくつかの増幅反応に利用する場合に有利であり得、いかなる交差汚染も無関係となる。それというのも、試料は実際に同一であるためである。他の実施形態において、生じ得る交差汚染の量は重要でないとみなすことができる。それというのも、交差汚染の量は十分低いためである。
【０１１４】
他の実施形態において、ビーズは、交差汚染を防止するように処理することができる。前記処理は、例えば、前記ビーズまたは粒子からの全てのプライマーの除去および置き換えを含み得、前記プライマーは、例えば、ストレプトアビジン結合、チオール結合などを使用してビーズまたは粒子に会合または結合させることができ、結合を破壊することができ、別の部分を結合させることができる。ビーズまたは粒子に結合したプライマーは、予め利用されたものと同一のプライマーであり得、または例えば、プライマーの一部として含められる異なるバーコードを有する異なるプライマーであり得る。
【０１１５】
他の実施形態において、交差汚染は、独自のニック部位を有するプライマーを利用することにより防止することができ、プライマーをニック生成し、洗浄し、スプリントオリゴを提供し、プライマーをオリゴのライゲーションにより回復させ、元の配列、またはオリゴについて別の所望の配列を再生または発生させる。
【０１１６】
統合系
図１９は、統合シーケンシングプラットフォームの概略説明である。統合シーケンシングプラットフォームは、ＤＮＡ抽出系、ライブラリー構築系、増幅系  エンリッチメント系、およびシーケンシング系（本明細書に記載の電気的検出系または「センシングユニット」を含み得る）を含み得る。別個の系として概略的に示されるが、統合シーケンシングプラットフォームは、それらの系の全てを単一のマイクロ流体／マイクロ電子デバイス（または「チップ」）内に含み得る。系のそれぞれを以下により詳細に記載する。
【０１１７】
ＤＮＡ抽出系は、分析すべき生物試料（例えば血液）を受容するためのインレットチャンバ１９１０を含む。インレットチャンバは、生物試料内に含有される細胞の溶解を促進するための溶液を含み得る。そのような溶液は当該技術分野において周知であり、典型的には溶解緩衝液と呼ばれる。一部の実施形態において、溶解溶液をインレットチャンバ中に注入し、生物試料と混合することができる。ＤＮＡは、生物試料からオンチップ抽出素子１９２０を介して抽出することができる。抽出素子１９２０は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル内に配置することができ、多孔性部材から構築された濾材を含む。抽出素子１９２０は、濾材を横断する電場を生成するように構成された１つ以上の電極も含み得る。したがって、濾材および電場の組合せは、高電荷のＤＮＡ（参照文字ＤＮＡにより識別）の、生物試料の他の部分からの分離を引き起こす。さらに、抽出素子１９２０は、ＤＮＡ１９１２を他の核酸（すなわち、ＲＮＡ）から分離するように構成することができる。
【０１１８】
一部の実施形態において、電極は、電場の特性を調整し、したがって抽出素子の分離特性を最適化するように制御することができる。例えば、電極は、電場の強度、極性、空間変動性および／または一時的特性を調整するように制御することができる。一部の実施形態において、抽出素子１９２０は、２つの電極を含み得る：第１の電極は多孔性濾材下に配置し、第２の電極は第１の電極の上方で対角線上に配置する。
【０１１９】
図１９に示されるとおり、ライブラリー構築系は、ＤＮＡ断片化および／またはサイズ選択素子１９１６を含み得る。断片化および／またはサイズ選択素子１９１６は、下記の素子および方法を介して平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片を生成するように構成することができる。断片化素子１９２０は、１つ以上のマイクロ流体チャネル１９２２を含み、その中に分離されたＤＮＡを一組の断片化ビーズ１９２４とともに配置することができる。より具体的には、ＤＮＡ抽出系により生成された分離ＤＮＡは、ＤＮＡ断片化および／またはサイズ選択素子１９１６中に任意の好適な機構（例えば、加圧注入、電気泳動移動、重力供給、熱誘導移動、超音波移動など）により運搬または「注入」することができる。同様に、断片化ビーズ１９２４は、ＤＮＡ断片化および／またはサイズ選択素子１９１６中に任意の好適な機構により運搬することができる。
【０１２０】
断片化および／またはサイズ選択素子１９１６は、マイクロ流体チャネル１９２２内でのＤＮＡの溶液および断片化ビーズ１９２４の移動を生成するためのポンプ１９２６を含み得る。ポンプ１９２６は、例えば、蠕動ポンプであり得る。一部の実施形態において、ポンプ１９２６は、マイクロ流体チャネル１９２２と流体接続された、変形した場合にマイクロ流体チャネル１９２２内でフローを生成する可撓性側壁を有する１つ以上のマイクロ流体素子を含み得る。しかしながら、他の実施形態において、任意の好適な機構を使用してマイクロ流体チャネル１９２２内でのＤＮＡの溶液および断片化ビーズ１９２４の移動を生成することができる（例えば、溶液の選択的加熱および冷却、マイクロ流体チャネルの空気圧、電気泳動運動などを介して）。
【０１２１】
断片化ビーズ１９２４は、ＤＮＡの分離、切断および／またはそうでなければＤＮＡ断片（参照文字ＤＮＡ−ＳＥＧにより識別）への分割に好適な任意の材料から構築することができる。一部の実施形態において、断片化ビーズ１９２４は、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、セラミックなどから構築することができる。さらに、断片化ビーズ１９２４は、断片化素子１９２０が所望の特性（例えば、長さ、鎖特性など）を有するＤＮＡ断片を生成するように任意の好適なサイズおよび／またはジオメトリーを有し得る。さらに、マイクロ流体チャネル１９２２のサイズおよび／またはジオメトリー（例えば、断面形状、アスペクト比など）を、マイクロ流体チャネル１９２２内での、および断片化ビーズ１９２４との接触におけるＤＮＡの移動が、ＤＮＡの所望の剪断を生成するように選択することができる。例えば、一部の実施形態において、断片化ビーズ１９２４は、実質的に球形であり得、５０μｍ以下の直径を有し得る。他の実施形態において、断片化ビーズ１９２４は、５００ｎｍ以下の直径、または５０μｍから５００ｎｍの任意の直径を有し得る。一部の実施形態において、マイクロ流体チャネル１９２２は、水力直径が１から５００μｍの範囲であり得る（すなわち、図２４に示されるとおり、マイクロ流体チャネル１９２２の断面積は実質的に矩形であり得、したがってサイズは水力直径として表すことができる）。他の実施形態において、マイクロ流体チャネル１９２２の水力直径は、１０から２００μｍの範囲であり得る。さらに他の実施形態において、マイクロ流体チャネル１９２２の水力直径は、５００ｎｍ以下の範囲であり得る。さらに、実質的に矩形として図２４に示されるが、他の実施形態において、マイクロ流体チャネルは任意の好適な形状、例えば半円形、卵形、テーパード形などを有し得る。一部の実施形態において、剪断されたＤＮＡ末端の酵素仕上げを行って末端が平滑末端であることを確保することができる。
【０１２２】
他の実施形態において、酵素溶液はマイクロ流体チャネル１９２２中に運搬してＤＮＡの酵素断片化を少なくとも部分的に生成することができる。
【０１２３】
断片化の完了時、ＤＮＡ断片を断片化ビーズ１９２４から分離することができる。ＤＮＡ断片は、断片化ビーズ１９２４から、任意の好適な機構、例えば、濾過器、重力（または求心力）分離、電場などにより分離することができる。一部の実施形態において、例えば、ＤＮＡ断片は、断片化ビーズ１９２４から、図２０を参照して以下に記載される１つ以上の制御ラインまたは制御チャネルの作動により分離することができる。特に、制御チャネルは、マイクロ流体チャネル１９２２から流体的に隔離されるがそれに隣接し、通常垂直なチャネルであり得る。制御チャネルは、例えば、マイクロ流体チャネルの一部も画定する側壁により画定することができる。この様式において、制御チャネル内の流体の圧力を増加させることができる場合、共通の側壁は変形し得、それによりマイクロ流体チャネル１９２２の一部のフロー区域を変化させる。ＤＮＡ断片を断片化ビーズ１９２４から分離するため、マイクロ流体チャネルのフロー区域が断片化ビーズを保持するために十分小さいが、ＤＮＡ断片のその通過を可能とするほど大きいように、圧力を制御チャネルに選択的に印加することができる。別の手法では、一部の実施形態において、チャネル中のバルブを部分的に閉鎖することができ、漏洩「シーブバルブ（ｓｉｅｖｅ  ｖａｌｖｅ）」を作出してＤＮＡ断片を断片化ビーズ１９２４から分離する。
【０１２４】
一部の実施形態において、断片化および／またはサイズ選択素子は、マイクロ流体チャネル中に埋設された一組の電極をさらに含み得る電気泳動デバイスを含み得、絡み合ったポリマー、緩衝液および洗浄溶液を導入する手段をさらに含み得る。
【０１２５】
図１９にさらに示されるとおり、次いで、ＤＮＡ断片を増幅およびエンリッチメント系中に運搬することができる。増幅およびエンリッチメント系は、下記のとおりシーケンシングすることができる断片化されたＤＮＡからクローン増幅されたＤＮＡを生成するように構成することができる。ＰＣＲおよびエンリッチメント系は、ＤＮＡ断片を一連の磁気ビーズ１９３４と会合させることができるマイクロ流体チャネル１９３２のアレイを含み得る。ＤＮＡ断片および磁気または常磁性ビーズ１９３４は、マイクロ流体チャネル内に、対応する磁気アレイを介して位置させることができる。この様式において、ＤＮＡ断片および磁気または常磁性ビーズ１９３４は、所望の位置に維持して正確および効率的な試料増幅を促進することができる。例えば、ＤＮＡ断片および磁気または常磁性ビーズ１９３４は、「フロースルー」マイクロ流体チャネル１９３２内の所望の位置に維持することができ、所望の試薬をマイクロ流体チャネル１９３２内で運搬し、ＤＮＡ断片と接触させてＤＮＡ断片の増幅を促進することができる。
【０１２６】
標的ＤＮＡのビーズ上への増幅後、ビーズを上記の電気泳動ソータ１９３８中でソートすることができ、適切量の増幅生成物１９４０を有するビーズをシーケンシングモジュール１９３６中に移動させることができる。
【０１２７】
上記のとおり、統合シーケンシングプラットフォームは、本明細書に記載の系の全てを単一マイクロ流体／マイクロ電子デバイス（または「チップ」）内に含み得、または１つの系中のモジュラーデバイスであり得る。図２０〜２４は、ポリヌクレオチドの抽出、増幅およびシーケンシングのための統合プラットフォームのマイクロ流体部分の実施形態を示す。
【０１２８】
図２０におけるとおり、マイクロ流体デバイス２０００は、１つ以上のインプットまたはアウトプットポート２００６を有し得る。流体は、前記ポート２００６を介して流体チャネル２００４に導入することができる。制御ライン２００２は、バルブ２００８の活性化を介する流体のフローを制御し得る。制御ライン２００２を加圧することにより、制御ライン２００２と流体チャネル２００４との間の壁を変形させ、流体チャネルをピンチオフし、バルブ２００８を閉鎖する。図２１は、同様の制御ライン２１０２、流体チャネル２１０４およびバルブ２１０８を有するが、追加の交差路２１１０を有する流体系のさらなる実施形態を示し、制御ラインは流体チャネル２１０２がシールされる点に完全に変形し得るほど狭く、交差路２１１０がバルブ２１０８として作用するのを防止する。図２２は、デバイス２２００Ａおよび２２００Ｂの一部の顕微鏡写真を示し、流体チャネル２２０４を拡大し、制御ライン２２０２の活性化の可視化を可能とする。デバイス２２００Ａの写真の場合、制御ラインは活性化されておらず、バルブ２２０８が開放しているように把握することができる。制御ライン２２０２の活性化後、デバイス２２００Ｂにおいてバルブ２２０８Ｂが変形し、流体チャネル２２０４をシールしたことを把握することができる。図２３は、ＰＤＭＳバルブデバイス２３０２のいくつかの写真、例としてチャネル中の常磁性ビーズ２３０４の顕微鏡写真、およびフローが生じる場合の写真、およびバルブが活性化され、フローが生じない場合についての写真を示す。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載のビーズ、試薬および／または試料の「注入」またはフローを、本明細書に記載のマイクロ流体チャネルと相互作用し、および／またはそれを妨害する一連の制御ラインにより制御し得る。図２４に示されるとおり、および上記のとおり、制御ラインを拡張して溶液および／またはビーズをデバイスの所定の部分内に保持することができる。
【０１２９】
ピコリットル量の増幅またはシーケンシング試薬を流体系中に注入するため、例えば、ｄＮＴＰのビーズに固定化されたＤＮＡプライマー上への取り込みのため、磁気アレイはマイクロ流体系を利用し得る。例えば、マイクロ流体プラットフォームは、反応物質を局在磁場に注入／送達するためのラインを含有し得る。シーケンシングの実施形態のため、マイクロ流体系は、ヌクレオチド三リン酸の基板または局在磁場への連続注入を制御する。マイクロ流体チャネルは、直径が１から１００μｍの範囲であり得、またはある実施形態において、直径が１０から２０μｍの範囲であり得る。マイクロ流体系を製作するための材料および方法は、公知である。例えば、マイクロ流体系は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、成形または機械加工プラスチックまたはガラスを用いて製作することができる。
【０１３０】
したがって、本発明は、ある態様において、複数の局在磁気フィーチャにおいて磁力によりトラップされた磁気ビーズまたは粒子を有し、それぞれの磁気ビーズまたは粒子はそれに結合した配列分析のためのクローン増幅されたＤＮＡセグメントを有する、本明細書に記載の磁気アレイを提供する。ＤＮＡセグメントは、例えば、本明細書に記載の場合により電場を有する磁気アレイを使用してクローン増幅することができる。
【０１３１】
増幅およびシーケンシングアレイは、統合プラットフォーム中に連続順序で配置することができる。例えば、磁気アレイ上での増幅後、ビーズをＤＮＡ電気泳動力に基づきエンリッチすることができる。具体的には、増幅されたＤＮＡを有し、適切な長さを有するビーズは、ＤＮＡシーケンサと一体化した出口に寄せるべき最小要求電荷を有し得る。空のビーズ、ならびに不完全な増幅または過度に短いＤＮＡアンプリコンを有するビーズは、別のアウトレットを介して分離することができる。
【０１３２】
複数試料を単一チップ中で処理することが望ましいことがある。それというのも、多くのプロジェクトはチップの全キャパシティを要求しないためである。他のプロジェクトは、チップのキャパシティを超過する単一試料を有し得る。一部の実施形態において、１つ以上の試料を装置中に、個々のチューブ、チューブストリップ、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート中で導入することができる。一部の実施形態において、試料ウェルをシールして装置上での寿命を延長させる。他の実施形態において、プレートを冷却して試料寿命を増加させることができる。他の実施形態において、試料をロボットピペッターによるソフトウエア選択様式で査定することができる。系は、試料が大きすぎる場合、試料を複数流体チャネルまたはチップにわたり分割し得、または試料が組合せ可能である場合に試料を組み合わせ得る（例えば、配列バーコード化試料を使用）。一部の実施形態において、試料は同一のシーケンシングデバイス中で異なるチャネル中で異なる時間においてロードすることができ、試料が利用可能になる場合に試料のランを可能とする。一部の実施形態において、装置に提供される試料は、シーケンシングの準備済みである。他の実施形態において、試料はシーケンシング準備済み試料を発生させるように装置により処理することができる。
【０１３３】
一実施形態において、標的濃縮は、ハイブリダイゼーションベースのプルアウトにより作出することができる。固体担体、例えばプルアウトビーズは、制御数の結合部位により官能化することができる。一部の実施形態において、それらはＤＮＡプライマーコンプリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）であり得る。未増幅試料はそれぞれの末端上でライゲートされた既知のプライマーを有し得る。一部の実施形態において、プライマーは、プルアウトビーズ上でＤＮＡにハイブリダイズする。部位が排出された後、残留ＤＮＡを洗い流し、続いてビーズに結合したＤＮＡを変性させ、既知量のＤＮＡを放出させる。
【０１３４】
別の実施形態において、それぞれのＤＮＡ断片にライゲートされたプライマーをプライマーコンプリメントに結合させ、インターカレート色素の蛍光検出を使用して検出することができる。プライマーは既知の長さのものであり得るため、シグナルレベルは断片の数に比例する。別の実施形態において、ポリメラーゼおよび会合したｄＮＴＰを導入し、全長二本鎖ＤＮＡを作出することができる。プライマーシグナルからの情報と組み合わせる場合、全長インターカレート色素シグナルレベルは、平均断片長の決定を可能とする。
【０１３５】
種々の実施形態を特定のフィーチャおよび／またはコンポーネントの組合せを有するものとして記載したが、上記の実施形態のいずれかからの任意のフィーチャおよび／またはコンポーネントの組合せを有する他の実施形態が可能である。
【０１３６】
種々の実施形態を上記した一方、それらは例として提示されるにすぎず、限定するものではないことを理解すべきである。上記の方法および／または概略図がある順序で生じるあるイベントおよび／またはフローパターンを示す場合、あるイベントおよび／またはフローパターンの順序付けを改変することができる。実施形態を特に示し、記載した一方、形態および詳細の種々の変更を行うことができることが理解される。実施形態を核酸検出またはＤＮＡシーケンシングについて特に示し、記載した一方、系を種々の他の生化学反応およびその検出のために構成または使用することができることが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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