(57)【要約】本発明は、被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防において使用するための、ＶＥＧＦおよび／もしくはＨＩＦ経路を標的とする化合物を提供する。本発明はまた、このような化合物を含む薬学的組成物、および被験体における中耳炎を処置および／もしくは予防するための方法であって、このような化合物もしくは薬学的組成物を、上記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。上記化合物は、抗ＶＥＧＦ抗体もしくは抗ＶＥＧＦペプチドであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防において使用するための、ＶＥＧＦ経路および／もしくはＨＩＦ経路を標的とする化合物。
【請求項２】
ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を標的とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＶＥＧＦレセプターインヒビターである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
バタラニブもしくはソラフェニブである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
抗ＶＥＧＦペプチドである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項７】
ＨＩＦを不安定化する、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ＨＳＰ９０を阻害する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防において使用するための薬学的組成物であって、請求項１〜９のいずれかに従う化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
バタラニブから本質的になる、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
中耳炎の処置および／もしくは予防のための薬学的組成物の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１３】
被験体における中耳炎（ＯＭ）を処置および／もしくは予防するための方法であって、該被験体に、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を、もしくは被験体に請求項１０または１１に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防において使用するための化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
中耳炎（ＯＭ）（中耳（ＭＥ）の炎症）は、小児における聴覚障害の最も一般的な原因であり、潜在的には、言葉の遅れ、学習障害および行動障害（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を引き起こす。
【０００３】
幼児および小児における急性ＯＭ（ＡＯＭ）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含む細菌感染と最も頻繁に関連する。小児のうちの約４０％は、ＡＯＭ後の１ヶ月間、ＭＥ滲出を有し、そしてＡＯＭ後３ヶ月まで約１０％のみが、ＭＥ滲出をさらに有する。感染の症状がないこの持続性の滲出性ＯＭは、滲出性ＯＭ（ＯＭＥ）といわれる。ＯＭＥは小児において非常に一般的であり、１〜３歳齢では１０〜３０％の有病率で、４歳までに８０％の累積発生率である。ＯＭＥを有するいくらかの小児は、合併症（例えば、鼓膜内陥ポケット、耳小骨連鎖の侵食、コテステリン腫、慢性化膿性ＯＭもしくは耳漏（鼓膜穿孔および排膿）伴う慢性ＯＭを発症させるように進行する。
【０００４】
その再発性で慢性の性質と繋がる上記疾患の高い有病率は、罹患した小児において行われる多数の鼓膜切開術（鼓膜における通気チューブもしくは「グロメット」の挿入）の原因である。ＯＭはなお、先進国の小児における外科手術の最も一般的な原因である。グロメット挿入は、英国において最も一般的な手術である（１年に付き３０，０００例）。
【０００５】
臨床試験において、鬱血除去剤、粘膜溶解剤、ステロイド、抗ヒスタミン剤および抗生物質は、主に無効であることが見いだされた（非特許文献１）。従って、ＯＭおよびＯＭＥに対する新たな医療処置が臨床的に必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｏｕｓら（２００５）  Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．ＣＤ００１８０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
慢性ＯＭのマウスモデルを使用して、本発明者らは、ＯＭにおける炎症した中耳が、低酸素環境であり、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）の誘導があることを実証した。本発明者らはまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターおよびＨＩＦのインヒビターが、このようなマウスモデルの中耳粘膜における聴力喪失および炎症性変化を低下させ得ることを示した。
【０００８】
上記ＨＩＦ−ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的とすることから、ＯＭの予防および／もしくは処置における魅力的な治療選択肢が提供される。
【０００９】
従って、第１の局面において、本発明は、被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防において使用するための、上記ＶＥＧＦおよび／もしくはＨＩＦ経路を標的とする化合物を提供する。
【００１０】
本発明のこの局面の第１の実施形態において、上記化合物は、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を標的とする。
【００１１】
この実施形態において、上記化合物は、ＶＥＧＦレセプターインヒビター（例えば、バタラニブ、スニチニブもしくはソラフェニブ）であり得る。
【００１２】
あるいは、上記化合物は、抗ＶＥＧＦ抗体もしくは抗ＶＥＧＦペプチドであり得る。
【００１３】
本発明のこの局面の第２の実施形態において、上記化合物は、上記ＨＩＦ経路を阻害する。
【００１４】
この実施形態において、上記化合物は、ＨＩＦを不安定化することによって作用し得る。例えば、上記化合物は、ＨＩＦ  シャペロンＨＳＰ９０を阻害し得る。このような化合物の一例は、１７−ＤＭＡＧである。
【００１５】
第２の局面において、本発明は、被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防において使用するための薬学的組成物を提供し、上記薬学的組成物は、本発明の第１の局面に従う化合物を含む。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、以下に関する：
（ｉ）中耳炎の処置および／もしくは予防のための薬学的組成物の製造における、本発明の第１の局面に従う化合物の使用；ならびに
（ｉｉ）被験体における中耳炎（ＯＭ）を処置および／もしくは予防するための方法であって、上記被験体に、本発明の第１の局面に従う化合物、本発明の第２の局面に従う薬学的組成物、もしくは本発明の第３の局面に従うキットを投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｊｕｎｂｏマウスの中耳における低酸素を示す。スケールバー：Ａ、Ｂ、Ｃ＝５０μｍ；Ｄ＝１００μｍ、Ｇ＝２０μｍ；Ｆ＝１００μｍ。（Ａ）インビボで３時間にわたって６０ｍｇ／ｋｇ  ピモニダゾール（ＰＩＭＯ）で標識したＪｂｏ／＋マウス。矢印は、［ｅｐ］上皮における低酸素、［ｆ］結合組織線維細胞、［ｍφ］マクロファージ；［ｔｍ］側頭下顎骨（ｔｅｍｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｂｏｎｅ）、［ｍ］肥厚化した炎症粘膜、［ｅｘ］泡沫マクロファージ（ｍφ）および多形核細胞（ＰＭＮ）の混合物を含む滲出液を示す。抗ＰＩＭＯ抗体での免疫組織化学。＊裂溝は、組織の処理によって生成された人工産物であることに注意のこと。（Ｂ）ＰＩＭＯ標識ＷＴマウス、正常な薄い粘膜［ｍ］は、染色されない。（Ｃ）ＯＭを有する非標識Ｊｂｏ／＋マウスは、抗ＰＩＭＯ抗体の陰性コントロールである。（Ｄ）泡沫ｍφにおける低酸素。（Ｅ）Ｊｂｏ／＋マウスにおけるＰＩＭＯ標識の時間経過。そのインデックスは、以下のクラス：管腔、粘膜上皮および粘膜結合組織における炎症細胞、のうちの各々における陽性標識細胞について点数をスコア付けする。ヒストグラムの棒は、平均値±ＳＥＭである。４週間群のサイズ  ｎ＝８、７〜８週間  ｎ＝１０、１３〜１５週間  ｎ＝５、３１〜３７週間  ｎ＝７。（Ｆ）ＷＴマウスの耳管上皮［ｅｔ］における低酸素は、隣接する鼻咽腔［ｎｐ］上皮から鮮明に区別される。（Ｇ）Ｊｂｏ／＋マウスの耳滲出物細胞学：ラット抗マウスＦ４／８０ｍＡｂで染色した泡沫ｍφおよびＰＭＮ。
【図２】図２は、Ｊｂｏ／＋  耳分泌物のＦＡＣＳ分析を示す。ピモニダゾール標識Ｊｂｏ／＋マウスの中耳ＷＢＣを、ＰＩＭＯ（低酸素）に関して、Ｌｙ６ＧおよびＬｙ６Ｃ（ＰＭＮマーカー）、およびアネキシンＶ（アポトーシスマーカー）で染色した。ＰＭＮ集団を、Ｌｙ６ＧおよびＬｙ６Ｃシグナルに対してゲートをかけた。集団（１）正常な酸素の生存性ＰＭＮ、（２）低酸素の生存性ＰＭＮ、（３）低酸素のアポトーシスＰＭＮ。軸較正は、ｌｏｇ１０蛍光においてである。
【図３】図３は、Ｊｂｏ／＋マウスにおけるＨｉｆ−１αのウェスタンブロッティングを示す。レーン１  Ｊｂｏ／＋骨髄ＰＭＮ。レーン２  Ｊｂｏ／＋中耳ＷＢＣは、Ｈｉｆ−１α陽性バンドを示す。上記実験を、独立して３回行い、同じ結果が得られた。
【図４】図４は、Ｊｂｏ／＋マウスの中耳における遺伝子発現を示す。４週間のＪｂｏ／＋  血中ＷＢＣにおけるリアルタイム定量的ＰＣＲと比較して示される、Ｊｂｏ／＋  中耳ＷＢＣの４週間および１０週間のプールしたサンプルのリアルタイム定量的ＰＣＲ。ヒストグラムの棒は、三連のアッセイ（もしくはＶｅｇｆａおよびＥｖｉ１  ｎ＝１０）についての平均倍数増加である。エラーバーは、相対定量化（ＲＱ）の最小および最大であり、Δサイクル閾値のＳＥＭを表す。
【図５】図５は、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４でのＪｂｏ／＋マウスの処置が、中耳における炎症変化を低下させることを示す。ＷＴおよびＪｂｏ／＋マウスを、５０ｍｇ／ｋｇもしくは７５ｍｇ／ｋｇの薬物のいずれかで４週間にわたって処置し、擬（ｓｈａｍ）コントロールＪｂｏ／＋群には、ビヒクルのみを与えた。炎症粘膜は、上記５０ｍｇ／ｋｇ  試験においてより薄かった（ａ）。両方の試験において、薬物処置群は、それらのそれぞれの擬処置コントロールと比較して、より少ない血管（ｂ）およびリンパ管（ｃ）を有した；（ｄ）粘膜リンパ管は、コントロールより７５ｍｇ／ｋｇ処置Ｊｂｏ／＋マウスにおいて拡張が少なかった。上記５０ｍｇ／ｋｇ試験において、上記ＷＴ群のサイズ  ｎ＝８；Ｊｂｏ／＋薬物  ｎ＝１５；Ｊｂｏ／＋擬  ｎ＝１３であった。上記７５ｍｇ／ｋｇ試験において、ＷＴ  ｎ＝８；Ｊｂｏ／＋薬物  ｎ＝１５；Ｊｂｏ／＋擬  ｎ＝１５。ヒストグラムの棒は、平均値±ｓ．ｅ．ｍである。両側スチューデントｔ検定。
【図６】図６は、ＶＥＧＦレセプターインヒビターおよびＨＳＰ９０インヒビター１７−ＤＭＡＧでのＪｕｎｂｏマウスの処置が、聴力喪失を軽減することを示す。（Ａ）ＢＡＹ  ４３−９００６（ＷＴ、擬、薬物  それぞれ、ｎ＝５、１１、１１）での１５日間処置における聴性脳幹反応（ΔＡＢＲ）の変化（デシベル（ｄＢ）単位）；（Ｂ）ＳＵ−１１２４８（ＷＴ、擬、薬物  ｎ＝１０、１５、１５）での２８日間処置におけるΔＡＢＲ；（Ｃ）ＰＴＫ７８７（ＷＴ、擬、薬物  ｎ＝９、１３、１５）での２１日間処置におけるΔＡＢＲ；（Ｄ）ＰＴＫ７８７（ＷＴ  ｎ＝４０、擬  ｎ＝６０、ＰＴＫ７８７  ｎ＝３０）での２８日間処置におけるΔＡＢＲ；（Ｅ）１７−ＤＭＡＧ（ＷＴ  ｎ＝９、擬  ｎ＝１５、１７−ＤＭＡＧ  ｎ＝１５）での２８日間処置におけるΔＡＢＲ。各実験において、薬物処置に対する応答を、上記擬コントロールと比較した。ヒストグラムの棒は、平均値±ＳＥＭである。片側Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（詳細な説明）
（中耳炎（ＯＭ））
中耳炎は、中耳の炎症、もしくは中耳の感染である。中耳炎は、鼓膜と内耳との間の領域（耳管として公知の管を含む）で起こる。
【００１９】
急性中耳炎（ＡＯＭ）は、最も頻繁には、純粋にウイルス性であり、その通常付随するウイルス性ＵＲＩ（上気道感染）がそうであるように、自己限定である。耳の鬱血、ならびにおそらく軽度の不快感および耳鳴り（ｐｏｐｐｉｎｇ）があるが、その症状は、根底にあるＵＲＩとともに消散する。中耳（通常は、無菌である）が、細菌に汚染された場合、膿および中耳の圧力が結果として生じ得、これは、急性細菌性中耳炎といわれる。ウイルス性急性中耳炎は、ときおり、特に小児において、非常に短期間で細菌性中耳炎をもたらし得る。細菌性の場合は、鼓膜の穿孔、乳様突起腔の感染（乳様突起炎）を生じ得、非常に希な症例においては、髄膜炎を引き起こすようにさらに拡がり得る。
【００２０】
滲出性中耳炎（ＯＭＥ）は、単に、変化した耳管機能によって生じる陰圧の結果として中耳空間内で起こる流体の集まりである。滲出性中耳炎は、純粋にウイルス性ＵＲＩから起こり得る（痛みも細菌感染もない）か、または滲出性中耳炎は、急性細菌性中耳炎の前に起こり得るか、そして／またはその後に起こり得る。中耳における流体は、ときおり、伝音難聴を引き起こすが、それが音波による鼓膜の通常の振動を妨害する場合にのみである。数週間および数ヶ月を超えて、中耳の流体が、非常に濃く、糊様になり得る（従って、その名称は、膠耳である）。これは、伝音難聴を引き起こす可能性を増大させる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「中耳炎」とは、慢性ＯＭのすべての形態（ＯＭＥ、およびウイルス感染の結果として生じる急性ＯＭとは対照的に、細菌感染によって引き起こされる再発性急性ＯＭを含む）に関する。
【００２２】
慢性化膿性中耳炎が、鼓膜における穿孔（穴）および数週間以上にわたる中耳空間内の活発な細菌感染を含む。耳の外に排出する十分な膿（耳漏）が存在し得るか、または化膿は、双眼顕微鏡を使用して、検鏡中に見られるに十分最小限であり得る。この疾患は、耳管機能が不十分なヒトにおいてはるかにより一般的である。聴覚障害はしばしば、この疾患に付随する。
【００２３】
中耳が、細菌によって急性に感染した場合、圧力は、鼓膜の後方で増大する。重症な症例もしくは未処置の症例において、鼓膜は破れ得、中耳空間にある膿が、外耳道へと排出されることになる。他の点では健康なヒトにおける急性中耳炎の単純な症例において、身体防御は、感染を消散させるようであり、鼓膜は、ほぼ常に治癒する。しかし、いくつかの症例において、中耳からの排膿は、慢性的な状態になり得る。活発な中耳感染がある限り、鼓膜は、治癒しない。
【００２４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび分類不能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、中耳炎の最も一般的な細菌による原因である。耳管機能障害は、中耳からの無効な細菌排除をもたらす。
【００２５】
中耳炎は、通常は、適切な病歴と組み合わせて、鼓膜の可視化を介して診断される。
【００２６】
本発明と関連して使用される用語「中耳炎」は、ウイルス感染の結果として生じる急性ＯＭとは対照的に、主に、慢性ＯＭに関する。上記用語は、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の結果として生じるＯＭを排除し得る。
【００２７】
（ＶＥＧＦ／ＨＩＦ経路）
哺乳動物ＶＥＧＦリガンドは、いくつかの異なるスプライスバリアントおよびプロセシングされた形態（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＶＥＧＦ−Ｅを含む）として存在する４０ｋＤａの糖タンパク質である。
【００２８】
ＶＥＧＦリガンドは、３つのレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）  ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対してオーバーラップするパターンで結合する。
【００２９】
ＶＥＧＦの、それらのレセプターへの結合は、ＶＥＧＦＲホモダイマーおよびヘテロダイマーの形成を生じる。ダイマー化は、ＶＥＧＦＲを活性化し、細胞内チロシン残基の自己リン酸化をもたらす。
【００３０】
用語「ＶＥＧＦ経路」は、ＶＥＧＦ遺伝子もしくはタンパク質発現の上流の調節因子；もしくはＶＥＧＦタンパク質発現の下流の効果（例えば、脈管形成、白血球を動員する血管透過性を促進するシグナル伝達経路）を標的とすることを含む。
【００３１】
用語「ＨＩＦ経路」は、ＨＩＦ−１α発現もしくは活性を標的とすることを含む。ＨＩＦシグナル伝達経路は、ＶＥＧＦＲの上流にある。
【００３２】
Ｄｕｖａｌら（（２００７）  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １８：４６５９−４６６８）は、クライアントタンパク質ＶＥＧＦＲ２によるＨＳＰ９０のチロシンリン酸化は、内皮一酸化窒素シンターゼへのＶＥＧＦＲ２シグナル伝達に必要とされるという、もう一つの関連するＨＳＰ９０のＶＥＧＦＲ２との関係を報告している。
【００３３】
（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲインヒビター）
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ標的化インヒビターは、生物学的高分子（例えば、ペプチド、抗体、またはＤＮＡ−オリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡ−オリゴヌクレオチド）であってもよいし、低分子インヒビターであってもよい。
【００３４】
エピトープが不十分にしか保存されていないいくつかのＶＥＧＦファミリーメンバーが存在するので、リガンド自体よりむしろＶＥＧＦレセプターを標的とすることが好ましい場合がある。
【００３５】
抗ＶＥＧＦ抗体は公知である（例えば、ＶＥＧＦ特異的ヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブＴＭ）。ベバシズマブＴＭは、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２との相互作用を妨げることによって、ＶＥＧＦの生物学的活性を直接阻害する。ラニビズマブＴＭは、ＶＥＧＦ−Ａに結合して阻害する別の抗ＶＥＧＦヒト化モノクローナル抗体フラグメントである。ＨｕＭＶ８３３ＴＭは、現在臨床試験中の別の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。
【００３６】
抗ＶＥＧＦＲ−２抗体としては、完全ヒト抗ＶＥＧＦＲ抗体ＩＭＣ−２Ｃ６およびＩＭＣ−１１２１とともに、ＤＣ−１０１およびマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体ＩＭＣ−ＩＣ１１が挙げられる。
【００３７】
アプタマーは、高親和性および高特異性でタンパク質を結合するそれらの能力に関して選択されたＲＮＡ−オリゴヌクレオチドもしくはＤＮＡ−オリゴヌクレオチドである。ＰｅｇａｐｔａｎｉｂＴＭは、抗ＶＥＧＦ  ＲＮＡアプタマーである。
【００３８】
あるいは、上記インヒビターは、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ経路を標的とするリボザイムであり得る。アンジオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）（これは、ヒト疾患の治療剤として試験されている最初の合成リボザイムであった）は、ＶＥＧＦＲ−１  ＲＮＡを特異的に切断する。
【００３９】
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ相互作用を標的とする別のアプローチは、ＶＥＧＦを隔離し、ＶＥＧＦシグナル伝達をブロックするための、ＶＥＧＦ結合部位を含む可溶性レセプター（例えば、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＴＭ）の使用を包含する。
【００４０】
ＶＥＧＦスプライスバリアントを使用して、ＶＥＧＦＲの活性を調節することもまた、可能であり得る。
【００４１】
本発明において使用するための上記ＶＥＧＦＲインヒビターは、以下の群から選択され得る：ソラフェニブ、スニチニブ、バタラニブ、バンデタニブ、ＡＺＤ−２１７１、ＳＵ−６６６８、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＢＩＢＦ−１１２０、アキシチニブ、ＡＭＧ−７０６、ＡＥＥ−７８８、ＥＸＥＬ−０９９９、ＥＸＥＬ−７６４７、ＸＬ−８８０、ＥＸＥＬ−２８８０、ＳＵ−１４８１３、ＺＫ−３０４７０９、Ｅ−７０８０、ＣＨＩＲ−２６５、ＣＨＩＲ−２５８、ＯＳＩ−９３０、ＢＡＹ−５７９３５２、ＡＢＴ−８６９、ＢＭＳ−５８２６６４、ＫＲＮ−９５１およびＣＥＰ−７０５５。
【００４２】
このような低分子インヒビターのさらなる詳細は、Ｋｉｓｅｌｙｏｖら（（２００７）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ（２００７）  １６（１）：８３−１０７）に見いだされ得る。
【００４３】
上記ＶＥＧＦインヒビターは、アニリノフタラジンタイプ（例えば、バタラニブ）；もしくはウレアタイプ（例えば、ソラフェニブ）であり得る。
【００４４】
上記ＶＥＧＦインヒビターは、ソラフェニブ、スニチニブもしくはバタラニブであり得る。
【００４５】
（ＨＩＦ経路インヒビター）
多くの低分子ＨＩＦ−１インヒビターは、公知であり、以下の４つの化合物を含み、上記化合物は、同じチオフェンオキサジアゾールコア（ボックスで印が付けられている）を共有する：
【００４６】
【化１】
2013522350.tif 000002
また、２，２−ジメチルベンゾピラン化合物が、ＨＩＦ−１インヒビターとして開発中である。
【００４７】
上記化合物は、ＨＳＰ９０（ＨＩＦに対するシャペロン）に対して作用し得る。上記化合物は、例えば、１７−ジメチルアミノアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）であり得る。１７−ＤＭＡＧは、ＨＩＦ−１α不安定化および分解を誘導する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｉｌｔら（２００７）  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：１３７９−１３８８；Ｍｉｌｋｉｅｗｉｃｚら（２００７）  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８３：７５３−７６６）。
【００４８】
ＨＳＰ９０インヒビターは、抗癌薬として開発されてきた（例えば、タネスピマイシン（１７−ＡＡＧ）、レタスピマイシン塩酸塩（ＩＰＩ−５０５）、ＢＩＩＢ０１２、ＣＮＦ２０２４、ＡＵＹ９２２、ＳＴＡ−９０９０、ＩＰＩ−４９３、ＳＮＸ−５４２２メシレート、ＢＩＩＢ０２８、ＫＷ−２４７８、ＡＴ１３３８７、ＸＬ８８８、ＨＳＰ９９０、ＭＰＣ−３１００、ＡＢＩ−０１０；ＰＵ３、ラディシコールおよびノボビオシン）。Ｔｒｅｐｅｌら（２０１０）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １０：５３７−５４９、表１；およびＦｕｋｕｙｏら（２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｓ．２９０：２４−３５  図１）もまた参照のこと。
【００４９】
ゲルダナマイシンは、ＨＳＰ９０−シャペロン機能の阻害を介して抗癌活性を発現するベンゾキノンアンサマイシン抗生物質である。関連インヒビターとしては、ＫＯＳ−９５３、ＩＰＩ−５０４およびＩＰＩ−４９３が挙げられる（Ｆｕｋｏｙｏら（上記）を参照のこと）。ゲルダナマイシンは、ＨＳＰ９０  ＡＴＰａｓｅ活性を阻害することによって、成熟したマルチシャペロン複合体を解離させ、放出されたクライアントタンパク質は、その後、ユビキチンプロテアソーム経路によって分解される。ゲルダルマイシン（Ｇｅｎｄａｌｍｙｃｉｎ）は、ＨＳＰ９０クライアントタンパク質ＨＩＦ−１αの分解を誘導する。
【００５０】
（薬学的組成物）
第２の局面において、本発明は、被験体における中耳炎の処置および／もしくは予防における使用のための薬学的組成物を提供する。上記薬学的組成物は、本発明の第１の局面に従う化合物を含む。
【００５１】
上記薬学的組成物は、バタラニブから本質的になり得る。言い換えると、バタラニブは、ＶＥＧＦＲを阻害する、上記組成物の唯一の成分であり得る。バタラニブは、中耳炎の処置／予防において活性である、上記組成物の唯一の成分であり得る。上記薬学的組成物は、ＲＳＶ感染の処置のための成分を実質的に欠き得る。上記薬学的組成物は、いかなるジインドリルメタン関連インドール類を実質的に欠き得る。
【００５２】
上記薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤を含み得る。
【００５３】
（被験体）
本発明の化合物および組成物は、中耳炎を有する被験体（例えば、慢性中耳炎を有する被験体）を処置するために使用され得る。
【００５４】
あるいは、本発明の化合物および組成物は、中耳炎に罹るリスクがあると考えられる被験体を処置するために使用され得る。例えば、上記被験体は、過去にＯＭに罹患したことがあってもよいし、ＯＭと関連したウイルス感染もしくは細菌感染に罹るリスクを有していてもよいし、またはそのリスクにあってもよい。上記被験体は、その後ＯＭに罹りやすくなる異常な耳の構造もしくは生理（例えば、不十分な耳管機能）を有していてもよい。
【００５５】
上記被験体は、ヒト被験体（例えば、成人もしくは小児）であり得る。特に、上記被験体は、１〜４歳齢の間の小児であり得る。
【００５６】
上記被験体は、動物被験体、特に、飼い慣らされた動物もしくは家畜（例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、齧歯類、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシもしくはブタ）であり得る。
【００５７】
（投与）
本発明の化合物もしくは薬学的組成物は、中耳を処置するために適した任意の経路によって投与され得る。
【００５８】
適切な場合、上記薬学的組成物は、吸入によって、坐剤もしくは膣坐剤の形態で、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤もしくは撒布剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用によって、錠剤、カプセル剤もしくは卵形剤（ｏｖｕｌｅ）の形態で経口的に、投与され得る。あるいは、上記薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内に、筋肉内に、もしくは皮下に）注射され得る。
【００５９】
本発明は、ここで実施例によってさらに記載される。実施例は、本発明を実施するにあたって当業者の一助となるように働くことを意味するもので、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１−  Ｊｂｏ／＋  ＯＭマウスモデルにおける低酸素の調査）
ＯＭをさらに特徴付け、ＭＥの白血球（ＷＢＣ）における遺伝子発現研究の適切なコントロールを確立するために、耳液（ｅａｒ  ｆｌｕｉｄ）および末梢血におけるＷＢＣの鑑別を、調べた。Ｊｂｏ／＋マウスは、全身的な白血球増多を有しなかった（表Ｉ）。Ｊｂｏ／＋  耳液中のＷＢＣ数（１．７〜２．１×１０６／μｌ）は、血中より約１０００倍高く、細胞学から、高い多形核細胞（ＰＭＮ）数および少数のＦ４／８０陽性泡沫マクロファージ（ｍφ）が示された（図１Ｇ）。
【００６１】
表Ｉ．Ｊｕｎｂｏマウスの血液および耳における白血球
【００６２】
【表１】
2013522350.tif 000003
平均値±ＳＥＭ。ａＷＢＣ×１０３／μｌ。平均ＷＢＣ数は、同じ年齢のマウスに由来するＪｂｏ／＋血液と比較して、８週間（ｂＰ＜０．００１）および１５週間（ｄＰ＜０．００１）のＪｂｏ／＋耳液において有意に高かった。ｃＮＤ  行わず。
【００６３】
炎症した組織において、低酸素の生理学的駆動因子は、下層にある血管床からの好中球およびｍφの物理的分離と関連した好中球およびｍφによる酸素の取り込みであるようである。このモデルは、上記成体マウスの５〜６μｌ  ＭＥ内での炎症性細胞の蓄積に当てはまり得る。上記炎症したＭＥにおける低酸素を評価するために、本発明者らは、マウスにインビボでピモニダゾール（ＰＩＭＯ）（組織および細胞をｐＯ２＜１０トル（約１．５％  Ｏ２）で標識するマーカー）を注射した。免疫組織化学から、ＭＥ管腔および上皮内のおよび肥厚し炎症した粘膜の結合組織における炎症性細胞における低酸素が示された（図１Ａ、図１Ｃ、図１Ｄ）。低酸素は、４週間で明らかになり、７〜８週間で増大し、＞３０週間にわたっても慢性的に上昇したままであった（図１Ｅ）。通常の空気が満たされた水疱を有する、罹患していないＷＴ同腹仔において、薄い炎症していない粘膜は、低酸素ではなかった（図１Ｂ）。正常な生理学的（非炎症の）条件下で低酸素を出現させたＭＥ器官のごく一部が、上記耳管であった（図１Ｆ）。ＦＡＣＳ分析から、Ｊｂｏ／＋マウスの耳液のＰＭＮ集団における低酸素のさらなる証拠が提供された（図２）。２つの時点において、５〜８週間および１２〜１７週間では、生細胞およびアポローシス細胞が同様の割合であった。より高齢のＪｂｏ／＋マウスは、低酸素アポトーシス細胞の有意により大きな集団および対応して正常酸素状態のアポトーシス細胞のより低い集団を有した（表Ｉ）。標識されていないＪｂｏ／＋ＭＥ  ＰＭＮおよびＰＩＭＯ標識したＪｂｏ／＋マウス由来の染色していない末梢（正常酸素状態の）ＰＭＮは、陰性コントロールとして供した。ヨウ化プロピジウム染色から、上記Ｊｂｏ／＋ＰＭＮ集団のうちの７±２％が壊死したことが示された。Ｊｆ／＋マウスに由来するＭＥ液は一般に、淡黄色の漿液性滲出液であったが、それらは、低酸素である生存ＰＭＮおよびアポトーシスＰＭＮの集団を含んだ（表ＩＩ）；上記Ｊｆ／＋ＰＭＮ集団のうちの８±２％が、壊死した。
【００６４】
表ＩＩ．ピモニダゾール標識ＪｕｎｂｏマウスおよびＪｅｆｆマウスの耳液における多形核細胞集団の低酸素
【００６５】
【表２】
2013522350.tif 000004
平均多形核細胞（ＰＭＮ）パーセンテージ±ＳＥＭ。集団を、それらの％生存集団および％アポトーシス集団のパーセンテージとして表す。低酸素アポトーシスＰＭＮの集団は、５〜８週間  Ｊｂｏ／＋マウスより１２〜１７週間  Ｊｂｏ／＋においてより高かった（ａＰ＝０．００２４）。上記正常酸素状態アポトーシスＰＭＮ集団は、１２〜１７週間Ｊｂｏ／＋マウスより５〜８週間Ｊｂｏ／＋においてより高かった（ｂＰ＜０．００１）。
【００６６】
（実施例２−  Ｈｉｆ−１αタンパク質安定化の分析）
低酸素は、プロリルヒドロキシラーゼ２（ＰＨＤ２）の阻害によってＨｉｆ１−αタンパク質を安定化する。正常酸素状態条件下で、ＰＨＤ２は、Ｈｉｆ１−α中のプロリル残基をヒドロキシル化し、Ｈｉｆ１−αが、Ｅ３ユビキチンリガーゼＶＨＬによって結合およびポリユビキチン化し、プロテアソームによって分解されることを可能にする。ＨＩＦはまた、ＨＩＦとＮＦ−κＢ（炎症の主要な調節因子である転写因子）との間の相互作用を介して連結されるある範囲の炎症媒介因子によって、転写レベル、翻訳レベルおよび翻訳後レベルにおいて調節される。炎症性サイトカインの範囲は、ＯＭを有する患者の中耳において、およびＯＭの動物モデルにおいて記録されてきた（Ｊｕｈｎ，Ｓ．Ｋ．ら（２００８）  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１，１１７−１３８）。これらの中でも、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαは、ＨＩＦ−１α  ｍＲＮＡの翻訳を増大させる（Ｆｒｅｄｅ，Ｓ．ら（２００７）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４３５，４０５−４１９）。
【００６７】
低酸素がＨｉｆ−１αタンパク質安定化と関連したことを確認するために、ウェスタンブロットを行った。このことから、Ｊｂｏ／＋  耳液において、Ｍｒ  約９０〜１１０ｋＤおよびＭｒ  約７０ｋＤのＨｉｆ−１α陽性バンドの存在が示されたが、骨髄ＰＭＮコントロールにおいては示されなかった（図３）。次いで、遺伝子およびタンパク質の発現パターンを、Ｊｂｏ／＋マウスのＭＥにおいて調査した。適切なコントロールを確立するために、遺伝子発現レベルを、はじめに、４週間および１０週間で、ＷＴ血液およびＪｂｏ／＋血液において比較した。これらは匹敵した（＜２倍の差異）ので、４週間Ｊｂｏ／＋血液を参照点（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｉｎｔ）として使用した。ＰＭＮマーカーＧｒ−１は、耳液において２〜４倍高かった。このことは、おそらく、血液と比較して、より高いＰＭＮの鑑別を反映する（表Ｉ；図１Ｆ）。従って、この限界を超える任意の倍数変化は、遺伝子アップレギュレーションとして解釈した。血中ＷＢＣと比較して、Ｊｂｏ／＋  ＭＥ液  ＷＢＣでより高いＨｉｆ１−α（９〜１４倍）、Ｉｌ−１β（１１〜２１倍）およびＴｎｆα（２４〜３４倍）の発現があった（図４）。Ｉｌ−１βタンパク質を、耳滲出物において検出した（５０，３７１±２１，１２４ｐｇ／ｍｌ  ｎ＝７）が、Ｊｂｏ／＋マウスおよびＷＴマウスに由来する血清サンプル（ｎ＝２２）のうちの１４％を除いて、すべてにおいてアッセ検出限界未満であった。ＩＬ−１βは、血清中で検出可能であった場合、４〜６７ｐｇ／ｍｌの範囲であった。Ｔｎｆαはまた、血清（それぞれ、Ｊｂｏ／＋およびＷＴにおいて、１．６５±０．１６ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝１２）および１．４８±０．０４ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝１２））と比較して、耳滲出物（１２，３２１±１８８１ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝８））において上昇していた。
【００６８】
上記Ｊｂｏ／＋  ＭＥにおけるＨｉｆシグナル伝達の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）効果は、Ｇｌｕｔ１（１４〜２０倍）およびＶｅｇｆａ（１６４〜２４９倍）のアップレギュレーションにおいて明らかである（図４）。Ｖｅｇｆタンパク質は、血清と比較して、耳液において＞３９０倍上昇し、これらレベルは、４週間から８週間へと倍増した（表ＩＩＩ）。重要なことには、Ｖｅｇｆはまた、Ｊｆ／＋耳液において上昇した。このことにより、Ｈｉｆシグナル伝達が、ＯＭの単一モデルに限定されなかったことを確認した（表ＩＩＩ）。
【００６９】
表ＩＩＩ．  ＪｕｎｂｏマウスおよびＪｅｆｆマウスの血清および耳液におけるＶｅｇｆ力価（ｐｇ／ｍｌ）
【００７０】
【表３】
2013522350.tif 000005
平均値±ＳＥＭ（ｎ）。平均Ｖｅｇｆ力価は、それらそれぞれの年齢のＪｂｏ／＋マウスに由来する血清と比較して、４週間（ａＰ＝０．００３５）および８週間（ｂＰ＜０．００１）で、Ｊｂｏ／＋耳液においてより高かった。平均Ｖｅｇｆ力価は、４週間のＪｂｏ／＋耳液より８週間において有意に高かった（ｃＰ＝０．０３１）。平均Ｖｅｇｆ力価は、血清よりもＪｆ／＋耳液においてより高かった（ｄＰ＜０．００１）。
【００７１】
上記Ｊｂｏ／＋マウスのＭＥにおけるＥｖｉ１発現の３８〜７４倍の増大（図４）は、部分的には、Ｅｖｉ１が、ほとんど血中で検出可能でないことの反映である（他の遺伝子に関してサイクル２８〜３２と比較して、サイクル３５）。それにも関わらず、この結果は、Ｅｖｉ１が転写因子としてのその役割を介して、低酸素経路を混乱させる可能性を高める。Ｊｂｏ／＋マウスにおいて、Ｅｖｉ１発現は、下流の低酸素および炎症経路を調節不全にする、変異Ｅｖｉ１タンパク質によって引き起こされるフィードバックループ（複数可）によって駆動され得る。Ｅｖｉ１は、Ｈｉｆ−１αおよびＳｍａｄ３（これらは、マウスマクロファージにおいてＶｅｇｆ発現を動じ活性化する）を介してＨＩＦシグナル伝達に対して潜在的に影響を及ぼし得る。あるいは、ＡＰ−１を高めるＥｖｉ１の遠位ジンクフィンガードメインを介して、相互作用が起こり得る。Ｅｖｉ１における変異は、Ｖｅｇｆ発現に影響を及ぼし得る。なぜなら、ＡＰ−１は、ヒトＶＥＧＦプロモーター内に結合部位を有するからである。Ｊｅｆｆ変異体の場合、Ｆｂｘｏ１１とＨＩＦシグナル伝達との間には、明確なつながりはなく、このことは、調節不全になったＨＩＦシグナル伝達がまた、慢性ＯＭにおける下流の事象であり得ることを立証する。
【００７２】
（実施例３−ＯＭマウスモデルにおけるＶＥＧＦＲシグナル伝達およびＨｓｐ９０の阻害の効果）
Ｖｅｇｆは、脈管形成を誘導するように作用し、血管透過性およびＷＢＣの動員を高め、従って、炎症媒介因子および正円窓を介して拡散する毒素を介して、伝音聴覚喪失および二次性蝸牛機能不全を引き起こすことによって、ＯＭ病因に寄与し得る。
【００７３】
Ｖｅｇｆが炎症促進の役割を有するという仮定を試験するために、Ｊｕｎｂｏマウスを、低分子ＶＥＧＦＲインヒビターで処置した。上記Ｊｕｎｂｏマウスは、治療試験のためのよりよいマウスモデルである。なぜなら、ＯＭ表現型は、より高く浸透性（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）であるからである。例えば、切開の時、漿液性もしくは黄色い液体は、７〜１１週間  Ｊｆ／＋マウス（ｎ＝１４）の一方（５７％）もしくは両方（２１％）の鼓膜の後ろに明らかに見えたのに対して、液体は、８週間  Ｊｂｏ／＋マウス（ｎ＝５４）の一方（１４％）もしくは両方（７９％）の鼓膜の後ろに見えた（擬コントロール群からプールしたデータ）。液体が肉眼で明らかでなかった場合すら、Ｊｂｏ／＋マウスが、ある程度の顕微鏡的ＯＭを有したことは、注目すべきである。
【００７４】
Ｊｂｏ／＋マウスにおいて、４週間以降、進行性の聴力喪失があった。独立した試験において、ＢＡＹ  ４３−９００６で２週間、５０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（本明細書で以降ＰＴＫ７８７といわれる）で３週間、もしくは７５ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＫ７８７で４週間にわたるＪｂｏ／＋マウスの処置は、聴力喪失を低下させた（表ＩＶおよび図６）。ＢＡＹ  ４３−９００６での試験は、マウスが突然立毛した２週間後に終了した。ＢＡＹ  ４３−９００６が、ＰＴＫ７８７ほどには許容されなかったが、処置に対する陽性の治療応答は、ＯＭ処置のためのＨＩＦ経路標的としてＶＥＧＦＲの重要性の強い証拠である。
【００７５】
表ＩＶ．血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ）で処置したＪｕｎｂｏマウスにおける聴性脳幹（ΔＡＢＲ）反応（デシベル（ｄＢ）単位）の変化
【００７６】
【表４】
2013522350.tif 000006
聴力喪失の軽減には、ＭＥ粘膜における炎症変化の低下が付随した。ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４処置Ｊｂｏ／＋マウスは、水疱内腔において液体および炎症性細胞を有したが、処置は、上記５０ｍｇ／ｋｇ試験（図５ａ）において粘膜肥厚化を軽減し、両方の試験において、脈管形成およびリンパ管の数は、低下した（図５ｂおよび図５ｃ）。リンパ管拡張は、上記７５ｍｇ／ｋｇ投与群においてのみ軽減した（図５ｄ）。ＢＡＹ  ４３−９００６での２週間試験において、リンパ管数（１０．８±１．１  ｎ＝１１  マウス  対  １６．４±１．０  ｎ＝１１，Ｐ＝０．００１２）および管拡張（９．９±１．０μｍ  ｎ＝１１  対  １４．２±０．９μｍ  ｎ＝１１，Ｐ＝０．００７２）は低下したが、粘膜肥厚化や脈管形成においてはそうではなかった。なぜなら、おそらく、２週間後ではいずれも十分に進行しなかったからである。本発明者らは、続けて、ＨＩＦ−１αを不安定化するように作用するＨＳＰ９０インヒビター１７−ＤＭＡＧを試験した。その使用はまた、聴力喪失を軽減した（図６）。
【００７７】
低分子ＶＥＧＦＲインヒビターへの陽性の治療応答とは対照的に、ＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾンは、Ｊｂｏ／＋マウスにおいて聴力喪失を軽減しなかった（表Ｖ）。本発明者らは、本発明者らの試験においてロシグリタゾンを含めた。なぜなら、これは、マウスにおけるアレルギー性気道疾患において反応性酸素種生成、ならびにＨＩＦシグナル伝達の上流調節因子であるＮＦκＢおよびＨｉｆ−１αを調節することが示されているからである（Ｌｅｅら，２００６）。
【００７８】
表Ｖ．  ＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾンで処置したＪｕｎｂｏマウスにおける聴性脳幹（ΔＡＢＲ）反応（デシベル（ｄＢ）単位）の変化
【００７９】
【表５】
2013522350.tif 000007
平均ΔＡＢＲ（ｄＢ）±ＳＥＭ（ｎ）。上記平均ΔＡＢＲは、ＷＴマウスと比較して、薬物処置Ｊｂｏ／＋マウス（ａＰ＝０．０４１）および擬処置Ｊｂｏ／＋マウス（ｂＰ＝０．００２）の両方において有意に高かったのに対して、Ｊｂｏ／＋  薬物処置群および擬処置群は、有意差はなかった（ｃＰ＞０．０５）。
【００８０】
結論として、ＭＥ細胞低酸素は、ＭＥガスもしくは液体における酸素の物理的測定によって明らかにならない慢性ＯＭの共通する特徴であり得る。
【００８１】
ＯＭのＪｕｎｂｏモデルにおけるＭＥが慢性炎症性低酸素によって特徴付けられることが示され、そのことから、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦαおよびＩＬ−１β）が、Ｈｉｆ１−αを調節することにおいて役割を果たす可能性が高まった。Ｈｉｆ１−αシグナル伝達は、Ｖｅｇｆのアップレギュレーションと関連する。ＭＥ低酸素およびＶｅｆｇのアップレギュレーションという重要な知見を、Ｊｅｆｆ（慢性ＯＭの第２のマウスモデル）において独立して確認した。
【００８２】
ＶＥＧＦＲインヒビターであるＰＴＫ７８７およびＢＡＹ  ４３−９００６が聴力喪失の進行を低下させるという知見は、Ｖｅｇｆが慢性ＯＭにおいて重要な炎症促進の役割を果たすという仮定を裏付けた。
【００８３】
まとめると、この研究は、ＯＭが慢性低酸素炎症の他の疾患（例えば、関節リウマチ（Ｇｒｏｓｉｏｓ，Ｋ．ら（２００４）  Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．５３，１３３−１４２））に似ていることを示し、慢性ＯＭの処置においてＨＩＦおよびＶＥＧＦ経路を標的とする研究の新たな達成の手段を開く。
【００８４】
（材料および方法）
マウス。  類遺伝子性Ｃ３Ｈ／ＨｅＨ  Ｊｕｎｂｏ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，Ｎ．ら（２００６）  ＰｌｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２，ｅ１４９）、ならびにＣ３Ｈ／ＨｅＨおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊの混合した遺伝的背景をもつＪｅｆｆマウス（Ｈａｒｄｉｓｔｙ−Ｈｕｇｈｅｓ，Ｒ．Ｅ．ら（２００６）  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，３２７３−３２７９．）の人道的ケアおよび使用は、適切なＵＫホームオフィスライセンスの下で行った。
【００８５】
サンプル回収。  血液を、ペントバルビタールナトリウムのｉ．ｐ．過量によって誘導される終末麻酔（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）の下で、マウスの後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から回収した。各マウスの適度の容積の耳液（０．５〜２μｌ）を、氷冷ＰＢＳの中に集めた。
【００８６】
ピモニダゾール標識。  マウスを、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中に溶解した６０ｍｇ／ｋｇ  ピモニダゾール（ＰＩＭＯ）（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ，ＨＰＩ  Ｉｎｃ）でのｉ．ｐ．注射によってインビボで３時間、標識した。１０％  中性緩衝化ホルマリン中で、頭部を４８時間固定し、その後、Ｆｏｒｍｉｃａｌ（Ｄｅｃａｌ  Ｃｏｒｐ）で７２時間にわたって脱灰した。ワックス包埋した、ＭＥの３μｍ背側面切片を、ＰＩＭＯについて免疫染色した。ＦＡＣＳについては、耳液サンプルを、抗ＰＩＭＯ  ＦＩＴＣ、抗マウスＬｙ６ＧおよびＬｙ６Ｃ  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ）および抗アネキシンＶビオチン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ）／ストレプトアビジンパシフィックブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ）を使用して、壊死細胞を評価した。５０μｌ  ＥＤＴＡ血液サンプルを、１００μｌ  ＦＡＣＳバッファー中で希釈し、次いで、ＲＢＣ溶解バッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ）で処理した。
【００８７】
ＨＩＦウェスタンブロッティング。  Ｊｂｏ／＋骨髄ＰＭＮを、５２／６４／７２％  不連続等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対して単離し、５匹のマウスに由来するＭＥ液を、プロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む氷冷溶解バッファー（Ａｍｂｉｏｎ）の１５０μｌアリコート中に集めた。合わせた細胞質タンパク質および核タンパク質抽出物の３５μｇ  タンパク質サンプル、ならびに分子量マーカーを、７．５％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ニトロセルロースブロットをブロックし、一次抗体：１：５００  ウサギ抗ＨＩＦ−１α（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；１：１０００  ヤギＩｇＧ抗ヒト／マウスミエロペルオキシダーゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；１：５００  ウサギ抗βアクチン（Ａｂｃａｍ）とともに、４℃において一晩インキュベートした。ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）もしくはＨＲＰウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）二次抗体を、１：２０００において、１時間にわたって、かつ化学発光検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ）とともに使用した。
【００８８】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）および分析。  全血もしくはＭＥ液（ドライアイス上で集めた）由来の総ＲＮＡを、マウスＲｉｂｏＰｕｒｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ＷＴもしくはＪｂｏ／＋（５匹の雄性マウス、５匹の雌性マウス）から単離した。ＲＮＡ量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、完全性をゲル電気泳動によって評価した後、等量のＲＮＡをプールした。二本鎖ｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、１μｇの総ＲＮＡから合成した。ＲＴ−ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを使用して（表ＶＩ）、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＴａｑＭａｎ（登録商標）    Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して行った。
【００８９】
表ＶＩ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ
【００９０】
【表６】
2013522350.tif 000008
Ｖｅｇｆ、ＩＬ−１β、ＴＮＦαタンパク質アッセイ。  血清−ゲル凝固活性化因子チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）の中に、血液を集めた。ＰＢＳ中のＭＥ液サンプルを、５０００ｇにおいて２０秒間８℃で遠心分離した。上清および血清サンプルを、−８０℃においてアッセイまで貯蔵した。Ｖｅｇｆを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  マウスＶｅｇｆ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定し、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを、Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  （ＭＡＰ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【００９１】
薬物処置、ＡＢＲおよび炎症の分析。  ２７〜２９日齢のＷＴマウスおよびＪｂｏ／＋マウスに、ＢＡＹ  ４３−９００６を２週間、５０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＫ７８７を４週間、７５ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＫ７８７を４週間、ロシグリタゾンもしくは１０ｍｇ／ｋｇ  １７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）を４週間にわたって、１日に１回、経口栄養法によって投与した。水性ＰＴＫ７８７（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のストック溶液、もしくはＢＡＹ  ４３−９００６（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびロシグリタゾン（Ｍｏｌｅｋｕｌａ）のＤＭＳＯストック溶液を、−２０℃で凍結し、次いで、投与のために、２％  メチルセルロース中で１０倍希釈した。擬Ｊｂｏ／＋群の年齢、性別および試験前ＡＢＲ（３０〜６０ｄＢ）を合わせ、ビヒクルのみを与えた。クリック誘発ＡＢＲ（Ｚｈｅｎｇ，Ｑ．Ｙ．ら，（１９９９）  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｒｅｓ．１３０，９４−１０７）を、試験の最初と最後に（もしくは５０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＫ７８７試験において３週間後に）測定した。回復を伴うＡＢＲに関しては、麻酔を、１０ｍｇ／ｋｇ  キシラジンおよび１００ｍｇ／ｋｇ  ケタミンの混合物でのｉ．ｐ．注射によって誘導し、５ｍｇ／ｋｇ  アチパメゾール塩酸塩によって覚醒させた。組織学を、両方のＰＴＫ７８７試験において４週間で評価した。
【００９２】
画像取得および分析。  デジタル画像を、減光フィルタ付きの×２０、×４０もしくは×６０  Ｐｌａｎ  Ａｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを使用した、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡で、自動露出を使用して、ＣｏｌｏｒＶｉｅｗ  Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアで取得した。薬物試験において、画像分析のためのＨ＆Ｅ染色切片を、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒデジタル病理システム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）で×４００倍率においてスキャンした。鼓膜厚およびその内側面に沿った粘膜の厚み（蝸牛および耳管の開口部に隣接する領域を避ける）を、５回の測定値から平均した。毛細管およびリンパ管の数、ならびにそれらのそれぞれの直径を、内側粘膜（ｍｅｄｉａｌ  ｍｕｃｏｓａ）の標準化した１０００μｍ長において測定した。上記処置および遺伝子型を、形態測定を行う場合に評価者から隠した。
【００９３】
統計。スチューデントｔ検定もしくはＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定（ＡＢＲ測定については、音程データは、５ｄＢ増分ずつである）を行い、検定値ｐ＜０．０５を有意とみなした。パーセンテージを、ｔ検定を使用する前にアークサイン変換した。薬物試験において、片側検定を使用して、薬物処置群および擬処置群を比較し、別の方法では、両側検定を使用した。
【００９４】
本明細書の上記において言及されるすべての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載される方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、特許請求される発明が、このような具体的実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、分子生物学もしくは関連分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための記載される方式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
2013522350.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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