(57)【要約】抗体およびその誘導体を含めた新規のモジュレーター、ならびにこのようなモジュレーターを用いて過剰増殖性障害を処置する方法が提供される。一実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが提供され、このＮｏｔｕｍモジュレーターはヒト化抗体を含み、この抗体は、配列番号３３１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号３３２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む。他の好ましい実施形態では、本発明は、ｈＳＣ２．Ｄ２．２抗体と薬学的に許容される担体とを含む組成物の形態を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項２】
Ｎｏｔｕｍアンタゴニストを含む、請求項１に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項３】
抗体またはその免疫反応性断片を含む、請求項１に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項４】
前記抗体またはその免疫反応性断片が、モノクローナル抗体を含む、請求項３に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、請求項４に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖の相補性決定領域および前記軽鎖の相補性決定領域が、図７Ｂに示される相補性決定領域を含む、請求項４に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化抗体である、請求項６に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９４および配列番号９８に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４および配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２および配列番号９６に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項９】
請求項８に記載のアミノ酸重鎖可変領域またはアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体。
【請求項１２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項１に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１３】
免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む、請求項１２に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１４】
被験体に投与されると、腫瘍始原細胞の頻度を低減する、請求項１に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１５】
前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析、または腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項１４に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１６】
前記頻度の低下が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項１４に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１７】
前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項１６に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項１７に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項１９】
前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項１６に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項１９に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項２１】
前記腫瘍始原細胞が、腫瘍永続細胞を含む、請求項１４に記載の単離されたＮｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項２２】
Ｎｏｔｕｍ関連障害を処置する方法であって、治療有効量のＮｏｔｕｍモジュレーターを、Ｎｏｔｕｍ関連障害の処置を必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体またはその免疫反応性断片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体またはその免疫反応性断片が、モノクローナル抗体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記モノクローナル抗体が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖の相補性決定領域および前記軽鎖の相補性決定領域が、図７Ｂに示される相補性決定領域を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９４および配列番号９８に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４および配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２および配列番号９６に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記過剰増殖性障害が、新生物性障害を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記新生物性障害が、充実性腫瘍を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記充実性腫瘍由来の組織が、ＫＲＡＳ変異、ＡＰＣ変異、ＣＴＮＮＢ１変異、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
新生物性障害が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、または乳がんを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体における腫瘍始原細胞の頻度を低減するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用いて決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記頻度の低下が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、免疫グロブリン定常領域またはその断片をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、融合タンパク質を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターと異なる第２のＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍始原細胞の頻度の低減を必要とする被験体における腫瘍始原細胞の頻度を低減する方法であって、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項４７】
前記腫瘍始原細胞が、腫瘍永続細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記腫瘍永続細胞が、１または複数のマーカーを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群より選択される新生物性障害を患っている、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍始原細胞の前記頻度が、少なくとも１０％低減される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用いて決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記頻度の低下が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
抗がん剤による処置のために被験体における腫瘍を感作させる方法であって、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項６２】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記腫瘍が、充実性腫瘍である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗がん剤が、化学療法剤を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗がん剤が、生物学的薬剤を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
過剰増殖性障害の診断を必要とする被験体における過剰増殖性障害を診断する方法であって、
ａ．組織試料を前記被験体から得るステップと、
ｂ．前記組織試料を、少なくとも１つのＮｏｔｕｍモジュレーターと接触させるステップと、
ｃ．前記試料と会合した前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを検出または定量化するステップと
を含む、方法。
【請求項６７】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、モノクローナル抗体を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体が、レポーターと作動可能に会合している、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
Ｎｏｔｕｍ関連障害を診断または処置するのに有用な製品であって、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを含む容器と、前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを用いて前記Ｎｏｔｕｍ関連障害を処置または診断するための指示書とを含む、製品。
【請求項７０】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、モノクローナル抗体である、請求項６９に記載の製品。
【請求項７１】
前記容器が、読み取り可能なプレートを含む、請求項７０に記載の製品。
【請求項７２】
ＫＲＡＳ変異、ＡＰＣ変異、またはＣＴＮＮＢ１変異を呈示する充実性腫瘍を含む新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む、方法。
【請求項７３】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、アンタゴニストを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記新生物性障害が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＮｏｔｕｍ中和モジュレーターを投与するステップを含む、方法。
【請求項７８】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記新生物性障害が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群より選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
腫瘍始原細胞の集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮する方法であって、前記腫瘍始原細胞を、Ｎｏｔｕｍモジュレーターと接触させるステップを含む、方法。
【請求項８３】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍始原細胞を、フローサイトメトリー解析に供するステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記フローサイトメトリー解析が、ＦＡＣＳを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
過剰増殖性障害を患っている患者における腫瘍始原細胞を枯渇させる方法であって、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む、方法。
【請求項８８】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、モノクローナル抗体を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記モノクローナル抗体が、細胞傷害性剤と会合している、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ヒト化抗体を含むＮｏｔｕｍモジュレーターであって、前記抗体が、配列番号３３１に実質的に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号３３２に実質的に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む、Ｎｏｔｕｍモジュレーター。
【請求項９１】
ｈＳＣ２．Ｄ２．２抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項９２】
転移の阻害または防止を必要とする被験体における転移を阻害または防止する方法であって、薬学的有効量のＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む、方法。
【請求項９３】
前記被験体が、前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを投与する前、または前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを投与した後に腫瘍減量手順を受ける、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記腫瘍減量手順が、少なくとも１つの抗がん剤の投与を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記被験体が、前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを投与するときに寛解期にある、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
維持療法を必要とする被験体に維持療法を実施する方法であって、薬学的有効量のＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む、方法。
【請求項９７】
前記被験体が、前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターの投与前に新生物性障害について処置された、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを投与するとき、前記被験体が、前記新生物性障害について無症候性である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記被験体を前記新生物性障害について処置してから６カ月超経過後、前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが投与される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、モノクローナル抗体を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
Ｎｏｔｕｍ媒介性パラクリンシグナル伝達の阻害を必要とする被験体においてＮｏｔｕｍ媒介性パラクリンシグナル伝達を阻害する方法であって、薬学的有効量のＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照される出願
この出願は、米国特許法１１９（ｅ）の下、２０１０年８月２７日に出願された米国仮出願第６１／３７７，８８２号、２０１０年９月３日に出願された同第６１／３８０，１８１号、２０１０年９月３０日に出願された同第６１／３８８，５５２号、および２０１１年７月２１日に出願された同第６１／５１０，４１３号（これらの全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本出願は一般的に、組成物および過剰増殖性障害、それらの拡大増殖、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、回帰（ｒｅｌａｐｓｅ）、または転移を処置または改善するのにそれらを使用する方法に関する。広範な態様では、本発明は、新生物性障害を処置または予防するための、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストおよび融合構築物を含めたＮｏｔｕｍモジュレーターの使用に関する。特に好ましい実施形態では、本発明は、例えば、ＫＲＡＳおよび／またはＡＰＣが変異した結腸直腸がん、ならびにＫＲＡＳが変異した膵臓がんにおける悪性疾患を含めた悪性疾患を免疫療法により処置するための、抗Ｎｏｔｕｍ抗体の使用を提供する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介するＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照によりその全体において本明細書に援用される配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１１年８月２６日に創出され、１１２００．３．３０４．ｔｘｔと名付けられ、１３８，９２２バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞および前駆細胞の分化および細胞増殖は、器官形成における支持組織の成長、ならびに全ての生物の一生における大半の組織の細胞置換および細胞修復と協調して作用する正常な進行過程である。分化および増殖の決定は、細胞運命の決定および組織構造を維持するように均衡する、多数の因子およびシグナルにより制御されることが多い。正常な組織構造は、細胞が、細胞の分裂および組織の成熟を制御する微小環境の合図（ｃｕｅ）に応答することの結果として維持される。したがって、正常では、細胞増殖および分化が生じるのは、損傷した細胞もしくは死滅しつつある細胞の置換または成長に必要なものとしてだけである。残念ながら、例えば、多様なシグナル伝達化学物質が過小に存在することまたはそれらが過剰に存在すること、微小環境の変化の存在、遺伝子の変異、またはこれらの何らかの組合せを含めた無数の因子から、細胞増殖および／または分化の破壊が生じうる。正常な細胞の増殖および／または分化が、攪乱されるかまたは何らかの形で破壊されると、がんを含めた多様な疾患または障害がもたらされうる。
【０００５】
従来のがんの処置には、化学療法、放射線療法、手術、免疫療法（例えば、生物応答修飾剤、ワクチン、または標的化治療剤）またはこれらの組合せが含まれる。残念ながら、このような従来の処置には応答しないか、または応答が最小限であるがんがあまりに多く、患者に残される選択肢は少ない。例えば、一部の患者亜集団は、特定の療法の一般的な有効性にも拘らず、それらを非応答性とする遺伝子の変異（例えば、ＫＲＡＳ変異）を呈示する。さらに、がんの種類に応じて、手術などの適用可能な処置には、実行可能な代替法となりえないものもある。現行の標準治療の治療剤に固有の限界は、かつて処置を受け、その後再発した患者をケアしようと試みるとき、特に明らかとなる。このような場合には、奏効しなかった治療レジメンおよびその結果としてもたらされる患者の増悪が、最終的には治癒不能であることがわかる、より侵襲性の疾患として現れることが多い不応性の腫瘍に寄与する場合がある。多年にわたり、がんの診断および処置には多大な改善がなされてきたが、回帰（ｒｅｌａｐｓｅ）、腫瘍の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、および転移を防止する既存の療法が奏効しないことのために、多くの充実性腫瘍の全生存率は、大部分変化が見られないままである。したがって、より標的化された強力な療法を開発することは難題のままである。
【０００６】
研究の有望な一領域は、多くのがんの根底をなすと考えられる、腫瘍原性の「種子」細胞を標的とする標的化治療剤の使用を伴う。この目的では、大半の固形組織が、この組織の大部分を構成する分化した細胞型を生成させる、成体の組織常在性幹細胞集団を含有することが今や公知である。これらの組織において生じる腫瘍も同様にまた、幹細胞から生じる異質な細胞の集団からなるが、それらの全体的な増殖および構成において顕著に異なる。腫瘍細胞の大部分は、増殖能力が限定されていることがますます認識されているのに対し、がん細胞の少数の集団（一般に、がん幹細胞またはＣＳＣとして公知である）は、広範にわたり自己再生し、これにより、それらが腫瘍再誘発能を伴うことを可能とする独自の能力を有する。より具体的に述べると、がん幹細胞仮説は、無際限の自己再生が可能であり、それらの腫瘍前駆細胞への分化、およびその後最終的に分化した腫瘍細胞への分化の結果としての、それらの複製能力に漸進的に限定されてゆく腫瘍細胞を生成させることが可能な、異なる細胞（すなわち、ＣＳＣ）のサブセット（約０．１〜１０％）が各腫瘍内に存在することを提起する。
【０００７】
近年、これらのＣＳＣ（また、腫瘍永続細胞またはＴＰＣとしても公知である）は従来の化学療法剤または放射線に対してより耐性である可能性があり、したがって、標準治療の臨床治療の後に持続して、後に再発性腫瘍、二次的腫瘍の成長および転移を刺激しうることがますます明らかとなっている。さらに、ＣＳＣにおいて、器官形成および／または正常な組織常在性幹細胞の自己再生を制御する経路が脱制御される（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅ）かまたは変化し、自己再生するがん細胞の持続的拡大増殖および腫瘍の形成を結果としてもたらすことを示唆する証拠が増大しつつある。一般にそれらの各々の全体が、参考として本明細書に援用される、Ａｌ−Ｈａｊｊら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５３７８０８７；およびＤａｌｅｒｂａら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７５４８８１４を参照されたい。したがって、従来ならびにより近年の標的化処置法の有効性は、これらの多様な処置法にも拘らず、がんを永続化させることが可能な、耐性のがん細胞の存在および／または出現により、明らかに限定されている（それらの各々の全体が、参考として本明細書に援用される、非特許文献１；および非特許文献２）。このような観察は、従来の腫瘍減量剤（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）が、充実性腫瘍を患っている場合の患者の生存を実質的に延長することが一貫して不可能であることにより、そして腫瘍がどのようにして成長し、再発し、転移するのかについてのますます洗練された理解が進展することを介して確認される。したがって、新生物性障害を処置するための近年の戦略は、腫瘍の再発、転移、または患者の再発の可能性を減殺するために、腫瘍永続細胞の分化を消失させるか、枯渇させるか、サイレンシングするか、または促進することの重要性を認識している。
【０００８】
このような戦略を開発する努力により、伝統的ではない異種移植（ＮＴＸ）モデルを伴う近年の研究が具体化されており、そこでは、ヒト充実性腫瘍の初代標本が、もっぱら免疫不全マウスへと植え込まれ、継代されている。このような技法により、異質な腫瘍を発生させ、それらの成長を無際限に刺激する固有の能力を伴う細胞亜集団の存在が確認されている。既に仮説が立てられた通り、ＮＴＸモデルによる研究は、同定された腫瘍細胞のＣＳＣ亜集団が、化学療法および放射線照射などの腫瘍減量レジメンに対してより耐性であるように考えられることから、臨床応答率と全生存との間の不均衡が潜在的に説明されることを確認している。さらに、ＣＳＣ研究におけるＮＴＸモデルの利用は、薬物発見および候補薬物の前臨床評価において、腫瘍の再発および転移に大きな影響を及ぼし、これにより、患者の生存率を改善するＣＳＣ標的化療法をもたらしうる、根本的な変化を誘発している。進展がなされる一方、ＣＳＣの正体および分化の潜在能力を特徴付けるための実験プラットホームの欠如と共に、初代腫瘍組織および／または異種移植腫瘍組織の操作と関連する固有の技術的困難により、主要な難題が提起されている。したがって、がん幹細胞を選択的に標的とし、過剰増殖性障害の処置、防止、および／または管理において使用され得る、診断用化合物もしくは診断法、予防用化合物もしくは予防法、または治療用化合物もしくは治療法を開発する実質的な必要が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｕｆｆら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００６年）４２巻：１２９３〜１２９７頁
【非特許文献２】Ｚｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００９年）８巻：８０６〜８２３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
広義において、Ｎｏｔｕｍ関連障害（例えば、過剰増殖性障害または新生物性障害）の処置において使用され得る方法、化合物、組成物、および製品を対象とする本発明は、これらの目的および他の目的を掲げる。この目的では、本発明が、がん幹細胞を有効に標的とし、多種多様な悪性疾患を患っている患者を処置するのに使用され得る新規のＮｏｔｕｍモジュレーターを提供する。特定の実施形態では、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍポリペプチド、そのリガンド、またはその遺伝子を認識するか、これと競合するか、刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）か、これと拮抗するか、これと相互作用するか、これに結合するか、またはこれと会合し、Ｎｏｔｕｍタンパク質の、１または複数の生理学的経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータ−カテニン経路、Ｈｈ経路、またはＢＭＰ経路）に対する影響を調節するか、調整するか、変更するか、変化させるか、または修飾する任意の化合物を含みうる。本発明の選択された実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、単離形態にあるＮｏｔｕｍ自体またはその断片を含む場合もあり、他の部分と融合または会合しているＮｏｔｕｍ自体もしくはその断片（例えば、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ、ＰＥＧ−Ｎｏｔｕｍ、または標的化部分と会合しているＮｏｔｕｍ）を含む場合もある。他の選択された実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、本出願の目的では、Ｎｏｔｕｍを認識するか、これと競合するか、これと相互作用するか、これに結合するか、またはこれと会合し、腫瘍始原細胞を含めた新生物性の細胞を中和するか、消失させるか、低減するか、感作させるか、再プログラム化するか、阻害するか、またはそれらの増殖を制御する任意の構築物または化合物を意味すると考えられるものとするＮｏｔｕｍアンタゴニストを含みうる。好ましい実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターが、新生物性細胞を増殖させる（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）か、維持するか、拡大増殖させるか、増殖させる（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）か、またはそれらの生存、再発、再生、および／もしくは転移を他の形で促進する腫瘍始原細胞の能力を、サイレンシングするか、中和するか、低減するか、減少させるか、枯渇させるか、加減するか、減殺するか、再プログラム化するか、消失させるか、または他の形で阻害することが予測外にも見出された抗Ｎｏｔｕｍ抗体またはその断片もしくは誘導体を含む。
【００１１】
一実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、ヒト化抗体を含むことが可能であり、前記抗体が、配列番号３３１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号３３２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む。他の好ましい実施形態では、本発明が、ｈＳＣ２．Ｄ２．２抗体と薬学的に許容される担体とを含む組成物の形態である。
【００１２】
特定の他の実施形態では、本発明が、被験体に投与されると腫瘍始原細胞の頻度を低減するＮｏｔｕｍモジュレーターを含む。頻度の低下は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定することが好ましい。特に好ましい実施形態では、このような解析は、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて実施することができる。代替的に、限界希釈解析は、ヒト腫瘍生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を用いて実施することもできる。いずれの場合においても、頻度の低下についての解析、計算、または定量化は、正確な計算をもたらすポアソン分布統計の使用を含むことが好ましい。このような定量化法が好ましい一方で、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学など、他のそれほど労働集約的でない方法もまた、所望の値を提供するのに用いることができ、したがって、本発明の範囲内にあるものとして明示的に意図されることが理解されるであろう。このような場合、頻度の低下は、フローサイトメトリー解析を用いて決定することもでき、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定することもできる。
【００１３】
したがって、別の好ましい実施形態では、本発明が、Ｎｏｔｕｍ関連障害を処置する方法であって、治療有効量のＮｏｔｕｍモジュレーターを、それを必要とする被験体に投与し、これにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減するステップを含む方法を含む。ここでもまた、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定することが好ましい。
【００１４】
この点で、本発明は、Ｎｏｔｕｍポリペプチドが、多様な新生物の病因に関与する腫瘍永続細胞（すなわち、がん幹細胞）と会合するという発見に少なくとも部分的に基づくことが理解されるであろう。より具体的に述べると、本出願は、予測外にも、多様な例示的Ｎｏｔｕｍモジュレーターの投与が、腫瘍始原細胞を介する腫瘍原性のシグナル伝達を低減する場合もあり、阻害する場合もあり、消失させる場合もある（すなわち、腫瘍始原細胞の頻度を低減する）ことを示す。これは、腫瘍始原細胞の低減または消失または再プログラム化またはサイレンシングを介する場合であれ、腫瘍細胞形態の改変（例えば、分化の誘導、ニッシェの破壊）を介する場合であれ、シグナル伝達を低減し、今度は、腫瘍形成、腫瘍維持、拡大増殖、および／または転移、ならびに再発を阻害することを介するＮｏｔｕｍ関連障害のより有効な処置を可能とする。他の実施形態では、開示されるモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍ媒介性パラクリンシグナル伝達であって、腫瘍の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を刺激しうるパラクリンシグナル伝達に干渉する場合もあり、これを抑制する場合もあり、これを他の形で遅延させる場合もある。さらに、以下でより詳細に論じられる通り、Ｎｏｔｕｍポリペプチドは、Ｗｎｔ／ベータ−カテニン発がん性生存経路、ヘッジホッグ（Ｈｈ）発がん性生存経路、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）発がん性生存経路にも密接に関与する。本明細書で記載される新規のＮｏｔｕｍモジュレーターを用いてこれらの発生シグナル伝達経路に介入することにより、さらに１つより多い機構（すなわち、腫瘍始原細胞の低減および発生シグナル伝達の破壊）を介して障害を改善して、相加作用または相乗作用をもたらすこともできる。
【００１５】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、それを必要とする被験体におけるＮｏｔｕｍ媒介性障害を処置する方法であって、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む方法を含む。特に好ましい実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを、抗がん剤と会合させる（例えば、コンジュゲートさせる）。加えて、被験体の腫瘍組織が、隣接する正常組織と比較して、Ｎｏｔｕｍレベルの上昇を呈示する場合であれ、Ｎｏｔｕｍレベルの低減または抑制を呈示する場合であれ、このような破壊および副次的利益を達成することができる。
【００１６】
さらに、本発明のモジュレーターが、特定の充実性腫瘍を処置するのにとりわけ有効でありうることの証拠が存在する。したがって、他の特に好ましい実施形態では、本発明が、ＫＲＡＳ変異、ＡＰＣ変異、またはＣＴＮＮＢ１変異を呈示する充実性腫瘍を含む新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。
【００１７】
さらに他の実施形態では、本発明が、それを必要とする被験体におけるＮｏｔｕｍ媒介性パラクリンシグナル伝達を阻害する方法であって、薬学的有効量のＮｏｔｕｍモジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。
【００１８】
本発明の他の様相は、開示されるモジュレーターが、腫瘍始原細胞を同時にサイレンシングしながら、複数の発がん性生存経路を潜在的に破壊する能力を利用する。このような多重活性のＮｏｔｕｍモジュレーター（例えば、Ｎｏｔｕｍアンタゴニスト）は、標準治療の抗がん剤または腫瘍減量剤と組み合わせて用いる場合に特に有効であることがわかる場合がある。加えて、２つ以上のＮｏｔｕｍアンタゴニスト（例えば、Ｎｏｔｕｍにおける２つの個別のエピトープに特異的に結合する抗体）を、本教示に従い組み合わせて用いることができる。さらに、以下である程度詳細に論じる通り、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターは、場合によって、多様な化学的抗がん剤または生物学的抗がん剤と組み合わせた感作剤として、コンジュゲート状態で用いることもでき、非コンジュゲート状態で用いることもできる。
【００１９】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、抗がん剤による処置のために被験体における腫瘍を感作させる方法であって、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む方法を含む。本発明の特に好ましい態様では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、とりわけ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を用いて決定される腫瘍始原細胞の頻度の低減を結果としてもたらす。
【００２０】
同様に、本発明の化合物は、多様な生理学的機構を介して治療的利益をもたらしうるので、本発明はまた、とりわけ、特定の細胞過程を利用するように作製される、選択されたエフェクターまたはモジュレーターも対象とする。例えば、特定の実施形態では、好ましいモジュレーターを創出して腫瘍始原細胞の表面におけるＮｏｔｕｍまたは腫瘍始原細胞の表面近傍におけるＮｏｔｕｍと会合させ、被験体の免疫反応を刺激する。他の実施形態では、エフェクターが、任意のＮｏｔｕｍ酵素活性の中和を促進するエピトープを指向し、次いで、腫瘍微小環境および任意の関連するパラクリンシグナル伝達におけるＮｏｔｕｍ基質の量を低減するのに用いられる抗体を含みうる。さらに他の実施形態では、開示されるモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍ関連細胞を枯渇させることを介して作用する場合もあり、これを消失させることを介して作用する場合もある。したがって、本発明が、任意の具体的な作用方式に限定されず、所望の結果を達成する任意の方法またはＮｏｔｕｍモジュレーターを包含することを理解することが重要である。
【００２１】
このような枠組みの中では、開示される実施形態のうちの好ましい実施形態が、新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＮｏｔｕｍ中和モジュレーターを投与するステップを含む方法を対象とする。
【００２２】
他の実施形態は、Ｎｏｔｕｍ関連障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＮｏｔｕｍ枯渇化モジュレーターを投与するステップを含む方法を対象とする。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明が、維持療法（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）の方法であって、腫瘍塊の少なくとも一部を除去するようにデザインされた初期手順（例えば、化学療法手順、照射手順、または手術手順）後のある期間にわたり開示されるエフェクターを投与する維持療法の方法を提供する。このような治療レジメンは、何週間かにわたり投与する場合もあり、何カ月間かにわたり投与する場合もあり、何年間かにもわたり投与する場合もあり、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが予防的に作用して、転移および／または腫瘍の再発を阻害しうる。さらに他の実施形態では、開示されるモジュレーターを、転移を防止するかまたは遅延させる公知の腫瘍減量レジメンと共に投与することもできる。
【００２４】
上記で論じた治療的使用のほかに、本発明のモジュレーターを、Ｎｏｔｕｍ関連障害、および、特に、過剰増殖性障害を診断するのに使用され得ることも理解される。したがって、好ましい実施形態は、それを必要とする被験体における過剰増殖性障害を診断する方法であって、
ａ．組織試料を前記被験体から得るステップと、
ｂ．組織試料を、少なくとも１つのＮｏｔｕｍモジュレーターと接触させるステップと、
ｃ．試料と会合したＮｏｔｕｍモジュレーターを検出または定量化するステップと
を含む方法を含む。
【００２５】
このような方法は、本出願と共に容易に識別することができ、自動式プレートリーダー、専用レポーターシステムなど、一般に市販される技法を用いて容易に実施することができる。好ましい実施形態では、検出するステップまたは定量化するステップが、腫瘍始原細胞の頻度の低下を含む。さらに、既に上記で示唆した通りに、限界希釈解析を実施することができ、頻度の低下についての正確な計算をもたらすポアソン分布統計を使用することが好ましい。
【００２６】
同様に、本発明はまた、がんなどのＮｏｔｕｍ関連障害を診断およびモニタリングするのに有用なキットも提供する。この目的では、本発明が、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを含む容器、および前記Ｎｏｔｕｍモジュレーターを用いてＮｏｔｕｍ関連障害を処置または診断するための指示書を含む、Ｎｏｔｕｍ関連障害を診断または処置するのに有用な製品を提供することが好ましい。
【００２７】
本発明の他の好ましい実施形態はまた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）またはレーザー媒介型区分（ｌａｓｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）などの方法を介して、腫瘍始原細胞の集団または亜集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮するのに有用な手段としての、開示されるモジュレーターの特性も利用する。
【００２８】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、腫瘍始原細胞の集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮する方法であって、前記腫瘍始原細胞をＮｏｔｕｍモジュレーターと接触させるステップを含む方法を対象とする。
【００２９】
前出は概要であり、したがって、必然的に、細部の単純化、一般化、および省略を含有するものであり、このため、当業者は、概要は例示的であるにとどまるものであり、いかなる形であれ、限定的であることを意図するものではないことを理解するであろう。本明細書で記載される方法、組成物、および／またはデバイスおよび／または他の対象物の他の態様、特色、および利点は、本明細書で示される教示において明らかとなるであろう。概要は、以下の「発明を実施するための形態」にさらに記載される概念の、単純化された形態による選択を導入する目的で示されている。この概要は、特許請求される対象物の重要な特色または本質的な特色を同定することを意図するものではなく、特許請求される対象物の範囲を決定する一助として用いることを意図するものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、それぞれ、ヒトＮｏｔｕｍをコードする核酸配列（配列番号１）、アミノ末端シグナル配列を含むヒトＮｏｔｕｍ前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列（配列番号２）、アミノ酸の差異を示す部分的なマカク、マウスおよびヒトのタンパク質Ｎｏｔｕｍ配列のアラインメント（配列番号９９〜１０２）、ならびにＮｏｔｕｍ部分に下線を引いた、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ融合構築物の形態での例示的なＮｏｔｕｍモジュレーターのアミノ酸配列（配列番号３３３）および核酸配列（配列番号３３４）を表す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、それぞれ、ヒトＮｏｔｕｍをコードする核酸配列（配列番号１）、アミノ末端シグナル配列を含むヒトＮｏｔｕｍ前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列（配列番号２）、アミノ酸の差異を示す部分的なマカク、マウスおよびヒトのタンパク質Ｎｏｔｕｍ配列のアラインメント（配列番号９９〜１０２）、ならびにＮｏｔｕｍ部分に下線を引いた、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ融合構築物の形態での例示的なＮｏｔｕｍモジュレーターのアミノ酸配列（配列番号３３３）および核酸配列（配列番号３３４）を表す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、それぞれ、ヒトＮｏｔｕｍをコードする核酸配列（配列番号１）、アミノ末端シグナル配列を含むヒトＮｏｔｕｍ前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列（配列番号２）、アミノ酸の差異を示す部分的なマカク、マウスおよびヒトのタンパク質Ｎｏｔｕｍ配列のアラインメント（配列番号９９〜１０２）、ならびにＮｏｔｕｍ部分に下線を引いた、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ融合構築物の形態での例示的なＮｏｔｕｍモジュレーターのアミノ酸配列（配列番号３３３）および核酸配列（配列番号３３４）を表す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、それぞれ、ヒトＮｏｔｕｍをコードする核酸配列（配列番号１）、アミノ末端シグナル配列を含むヒトＮｏｔｕｍ前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列（配列番号２）、アミノ酸の差異を示す部分的なマカク、マウスおよびヒトのタンパク質Ｎｏｔｕｍ配列のアラインメント（配列番号９９〜１０２）、ならびにＮｏｔｕｍ部分に下線を引いた、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ融合構築物の形態での例示的なＮｏｔｕｍモジュレーターのアミノ酸配列（配列番号３３３）および核酸配列（配列番号３３４）を表す。
【図２】図２は、全トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）配列決定を用いて得られたヒトＮｏｔｕｍの遺伝子発現レベルを表すグラフである。
【図３】図３は、３つの異なる非伝統的異種移植（ＮＴＸ）結腸直腸腫瘍細胞系のうちの１つを有する未処置マウスおよびイリノテカン処置マウスから得られ、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された非腫瘍形成性（ＮＴＧ）濃縮細胞集団に対して正規化された、高度に濃縮された腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）および腫瘍永続細胞（ＴＰＣ）集団におけるヒトＮｏｔｕｍの相対的遺伝子発現レベルを示すグラフである。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、正常な結腸および直腸組織での平均の発現に対して正規化された、第Ｉ〜ＩＶ期疾患を有する患者からの結腸直腸腫瘍標本全体でのヒトＮｏｔｕｍの相対的遺伝子発現レベルを示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、１８個の異なる充実性腫瘍型のうちの１つを有する患者からの腫瘍標本全体（灰色ボックス）またはマッチさせたＮＡＴ（白色ボックス）でのヒトＮｏｔｕｍの、相対的または絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、１８個の異なる充実性腫瘍型のうちの１つを有する患者からの腫瘍標本全体（灰色ボックス）またはマッチさせたＮＡＴ（白色ボックス）でのヒトＮｏｔｕｍの、相対的または絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示すグラフである。
【図６】図６は、ｐ５３の過剰発現がない（白色）か過剰発現のない（黒色）２９３Ｔ対照細胞とともに、１１個の異なる腫瘍型のうちの１つを有する患者から得られた標本からの正常な隣接組織（白色）または腫瘍組織（黒色）における、ヒトＮｏｔｕｍタンパク質の相対的発現を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた３８個の別個のＮｏｔｕｍモジュレーターの、Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義される遺伝子配置（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）ならびに重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列をそれぞれ示す表である。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた３８個の別個のＮｏｔｕｍモジュレーターの、Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義される遺伝子配置（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）ならびに重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列をそれぞれ示す表である。
【図８−１】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−２】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−３】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−４】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−５】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−６】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−７】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−８】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−９】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−１０】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−１１】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図８−１２】図８Ａ〜Ｘは、本明細書の実施例に記載される、単離およびクローニングされた２４個の別個の抗Ｎｏｔｕｍ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図９】図９Ａ〜Ｄは、正準のＷｎｔ３Ａアッセイ、ならびにそれで測定された変異体Ｎｏｔｕｍ構築物Ｓ２３２Ａとともに可溶性ＮｏｔｕｍモジュレーターＮｏｔｕｍ−ｈＦｃおよびＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ（ヒト、マウスおよびマカク）の影響を表すグラフである。
【図１０】図１０は、阻害されないＷｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性に対して正規化された正準のＷｎｔ３Ａアッセイを用いて測定された、活性Ｎｏｔｕｍの阻害に関するいくつかの抗Ｎｏｔｕｍ抗体の活性をグラフによって示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｄは、阻害されないＷｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性に対して正規化された、様々な濃度での可溶性Ｎｏｔｕｍ構築物Ｎｏｔｕｍ−ＨｉｓおよびＮｏｔｕｍ−ｈＦｃに及ぼすＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２およびＳＣ２．Ａ１０６（別名１０Ｂ３）の影響を測定するために用いられた、正準のＷｎｔ３Ａアッセイのグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｄは、阻害されないＷｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性に対して正規化された、様々な濃度での可溶性Ｎｏｔｕｍ構築物Ｎｏｔｕｍ−ＨｉｓおよびＮｏｔｕｍ−ｈＦｃに及ぼすＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２およびＳＣ２．Ａ１０６（別名１０Ｂ３）の影響を測定するために用いられた、正準のＷｎｔ３Ａアッセイのグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｄは、阻害されないＷｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性に対して正規化された、様々な濃度での可溶性Ｎｏｔｕｍ構築物Ｎｏｔｕｍ−ＨｉｓおよびＮｏｔｕｍ−ｈＦｃに及ぼすＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２およびＳＣ２．Ａ１０６（別名１０Ｂ３）の影響を測定するために用いられた、正準のＷｎｔ３Ａアッセイのグラフである。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｄは、阻害されないＷｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性に対して正規化された、様々な濃度での可溶性Ｎｏｔｕｍ構築物Ｎｏｔｕｍ−ＨｉｓおよびＮｏｔｕｍ−ｈＦｃに及ぼすＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２およびＳＣ２．Ａ１０６（別名１０Ｂ３）の影響を測定するために用いられた、正準のＷｎｔ３Ａアッセイのグラフである。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、正準のＷｎｔ３Ａアッセイを用いた、ＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２およびＳＣ２．Ａ１０６（別名１０Ｂ３）による活性の種特異的な欠如をグラフによって示し、ここでは、いずれのモジュレーターもＷｎｔ経路のマカクまたはマウスの可溶性Ｎｏｔｕｍ構築物の拮抗作用の感知できる阻害を示さない。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、混合細胞集団での内因的に発現されるＮｏｔｕｍの影響（図１３Ａ）およびそれに及ぼすＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２の影響（図１３Ｂ）を例示する、有効な共培養Ｗｎｔ３Ａアッセイを確立したデータを提供する。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｎｏｔｕｍに対するポリクローナル抗体および本発明のモノクローナル抗体Ｎｏｔｕｍモジュレーターの両方が、選択されたタンパク質細胞溶解物でＮｏｔｕｍを検出することを示すウェスタンブロットを表す。
【図１５】図１５Ａ〜Ｇは、いくつかの異なる腫瘍型においてかつ疾患の異なる病期でのＮｏｔｕｍ上方制御を示す、ＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ａ１０９を用いて測定された、個々の患者細胞溶解物試料からのＮｏｔｕｍタンパク質レベルのグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、細胞ベースのアッセイにおける結腸直腸腫瘍細胞増殖および／またはアポトーシスに対する耐性を増大させるｈＮｏｔｕｍタンパク質（ＨｉｓおよびｈＦｃ）の能力、ならびにそのようなＮｏｔｕｍによって媒介される作用に拮抗するＮｏｔｕｍモジュレーターの能力を例示する。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、２つの異なる発色性エステラーゼ基質（ｐ−ニトロフェニルアセテート（ＰＮＰＡ）およびｐ−ニトロフェニルブチレート（ＰＮＰＢ））を用いた、マウス、マカクおよびヒトのＮｏｔｕｍならびに効力のないその変異体のエステラーゼ活性を定量化する生化学アッセイの様々な態様のグラフである。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ｈＮｏｔｕｍのエステラーゼ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターの能力を例示し、そこで、図１８ＡではｈＮｏｔｕｍの濃度を変化させ、図１８ＢではＮｏｔｕｍモジュレーターの濃度を変化させる。
【図１９】図１９は、ブタ膵臓のリパーゼ（黒色のバー）の陽性対照と一緒に提示される、ｈＮｏｔｕｍのリパーゼ活性（灰色のバー）を定量化する生化学アッセイのグラフである。
【図２０】図２０は、ｈＮｏｔｕｍのリパーゼ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターの能力をグラフによって示し、そこで、ｈＮｏｔｕｍの濃度は一定に保たれ、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの濃度を変化させる。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、ＴＣＦレポーターアッセイ（図２１Ａ）および４ＭＵＨアッセイ（図２１Ｂ）を用いて、点変異ヒトＮｏｔｕｍ（Ｓ２３２ＡおよびＤ３４０Ａ）が２９３．ＴＣＦ細胞でＷｎｔ３Ａの活性に拮抗する能力がないことをグラフによって示す。
【図２２】図２２は、ＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子の活性化を表す正準のＷｎｔシグナル伝達経路の簡略図である。
【図２３】図２３は、２９３．ＴＣＦ細胞でルシフェラーゼ転写の活性化によって実証された、Ｎｏｔｕｍ媒介性Ｗｎｔ３Ａ活性に拮抗する、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターの能力を例示し、そこで、ＬｉＣｌは陽性対照として作用する。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、Ｗｎｔ３Ａ活性タンパク質レベルを阻害するキメラＮｏｔｕｍタンパク質の能力に拮抗する、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターの能力を提示するグラフであり、そこで、図２４ＡはキメラＮｏｔｕｍがＷｎｔ３Ａ活性を阻害することができることを実証し、図２４ＢはＮｏｔｕｍモジュレーターの追加が活性を回復させることができることを示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、ＴＣＦアッセイ（図２５Ａ）および４ＭＵＨアッセイ（図２５Ｂ）の両方で、点変異Ｎｏｔｕｍ構築物が、ルシフェラーゼ活性のＷｎｔ３Ａ誘導に干渉するそれらの能力を保持することを例示する。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、ヒトおよびマカクのＮｏｔｕｍで生成される特定の点変異が、ＴＣＦアッセイ（図２６Ａ）および４ＭＵＨアッセイ（図２６Ｂ）で測定されるＮｏｔｕｍ酵素活性に拮抗するＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２の能力に干渉することができることを実証するグラフである。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、ＮｏｔｕｍモジュレーターをＮｏｔｕｍとインキュベートし、Ｗｎｔ３Ａ  ＣＭの添加の前に細胞へ曝露させたとき（図２７Ａ）、および細胞への曝露の前にＷｎｔ３Ａ  ＣＭとプレインキュベートしたときに（図２７Ｂ）、ＴＣＦアッセイでＷｎｔ３Ａ活性のＮｏｔｕｍ媒介性拮抗作用を阻害する、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターの能力を例示するグラフである。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、Ｎｏｔｕｍモジュレーターとして機能し、２４０μＭ（図２８Ａ）および９０μＭ（図２８Ｂ）の４ＭＵＨ濃度で測定されたとき、４ＭＵＨに対するＮｏｔｕｍの加水分解活性を用量依存的な様式で阻害する、オルリスタットの形態の小分子の能力を実証する。
【図２９Ａ】図２９Ａおよび２９Ｂは、Ｎｏｔｕｍによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱脂によるＷｎｔ３Ａの分配（図２９Ａ）、およびそれを阻害するＮｏｔｕｍモジュレーターの能力（図２９Ｂ）を表すウェスタンブロットである。
【図２９Ｂ】図２９Ａおよび２９Ｂは、Ｎｏｔｕｍによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱脂によるＷｎｔ３Ａの分配（図２９Ａ）、およびそれを阻害するＮｏｔｕｍモジュレーターの能力（図２９Ｂ）を表すウェスタンブロットである。
【図３０】図３０は、ＴＣＦアッセイを用いて測定された、マカク、マウスおよびヒトのＮｏｔｕｍに対する、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターの酵素中和特性をグラフによって示す。
【図３１】図３１Ａおよび３１Ｂは、ＳＣ２．Ｄ２．２（配列番号５６および配列番号５８）ならびにヒト化ＳＣ２．Ｄ２．２（配列番号３３１および配列番号３３２）の重鎖および軽鎖可変領域の整列させたアミノ酸配列をそれぞれ例示し、そこで、上部配列はヒト化誘導体であり、垂直マークはそれぞれのアミノ酸が同じであることを示し、Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義されるＣＤＲ配列には下線を引いた。
【図３２】図３２Ａ〜Ｃは、抗原の５つの異なる濃度に対するネズミのＳＣ２．Ｄ２．２の測定された親和性をグラフによって示し、固定された量の抗体および抗原の連続希釈物による無標識相互作用解析を用いて決定された、ネズミのＳＣ２．Ｄ２．２およびヒト化ＳＣ２．Ｄ２．２の親和性をそれぞれ比較する。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、開示されるモジュレーターを用いて生成された標準曲線、ならびに健康な被験体および卵巣がん患者から得られた試料で測定され、標準曲線から外挿されたＮｏｔｕｍの血漿中濃度をそれぞれ例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．序説
広義において、本発明の実施形態は、新規のＮｏｔｕｍモジュレーターおよびがんを含めた過剰増殖性障害を処置するか、管理するか、改善するか、またはその発生を防止することにおけるそれらの使用を対象とする。いかなる具体的な理論に拘束されることも望まずに述べると、開示されるモジュレーターは、腫瘍の成長を低減するかまたは遅延させ、腫瘍原性細胞を消失させるかまたは中和するほか、このような細胞の抗がん剤に対する感受性を変化させるのに有効であることが発見された。さらに、選択された腫瘍永続細胞（ＴＰＣ）とＮｏｔｕｍとして公知のタンパク質との間にこれまでのところ未知である表現型の関連が認められることが驚くべきことに発見された。この点で、選択されたＴＰＣ（すなわち、がん幹細胞またはＣＳＣ）が、正常組織と比較した場合に上昇したレベルのＮｏｔｕｍを発現させるほか、併せて充実性腫瘍の大半を構成する腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）および非腫瘍原性（ＮＴＧ）細胞と比較した場合にも上昇したレベルのＮｏｔｕｍを発現させることが見出された。したがって、選択された実施形態では、Ｎｏｔｕｍが、腫瘍関連マーカー（または抗原）を含み、選択された細胞の表面と会合したタンパク質のレベルおよび腫瘍の微小環境におけるタンパク質レベルの上昇に起因するＴＰＣおよび関連する新生物を検出、感作、および／または抑制するのに有効な薬剤をもたらすことが見出された。より具体的に述べると、かつ、なおより驚くべきことに、Ｎｏｔｕｍが明らかに分泌される（少なくともある程度）ことを踏まえると、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ構築物および免疫反応性アンタゴニスト（例えば、タンパク質に対する抗体）を含めたＮｏｔｕｍモジュレーターが、これらの腫瘍永続細胞を枯渇させるか、感作させるか、消失させるか、低減するか、再プログラム化するか、これらの細胞の分化を促進するか、あるいはこれらの細胞が広がって患者における腫瘍の成長もしくは再発を刺激し、かつ／またはこれらの細胞が持続的に患者における腫瘍の成長もしくは再発を刺激する能力を他の形で取り除くかまたは制限するのに有用でありうることもさらに発見された。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。既に示唆し、以下でも詳細に論じる通り、本明細書で開示される選択された実施形態は、コンジュゲートされた形態またはコンジュゲートされていない形態にある、Ｎｏｔｕｍに対する抗体を含む。Ｎｏｔｕｍモジュレーターの他の実施形態は、Ｎｏｔｕｍ、または、例えば、Ｎｏｔｕｍ融合構築物（例えば、Ｎｏｔｕｍ−Ｆｃ、Ｎｏｔｕｍ標的化部分など）もしくはＮｏｔｕｍコンジュゲート（例えば、Ｎｏｔｕｍ−ＰＥＧ、Ｎｏｔｕｍ−細胞傷害性剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）など）を含めた、その形態、変異体、誘導体、もしくは断片を含むことが好ましい。さらに他の実施形態では、モジュレーターが遺伝子レベルで作用することが可能であり、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの化合物を含みうる。前出のＮｏｔｕｍモジュレーターは、例えば、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの形態または投与および送達方法に依存して、選択された経路を刺激するかもしくはこれと拮抗するか、または特定の細胞（非ＴＰＣ支持細胞を含めた）を消失させるかもしくは枯渇させる競合的機構を介して、腫瘍永続細胞および／または関連する新生物の成長、増殖または生存を減弱しうる。
【００３３】
これらの発見を考えると、当業者は、本発明の特に好ましい実施形態が、大部分、Ｎｏｔｕｍモジュレーターおよび腫瘍始原細胞の頻度の低減におけるそれらの使用を対象とすることを理解するであろう。本明細書で広範にわたり論じられる通り、本発明と適合可能なＮｏｔｕｍモジュレーターは、Ｎｏｔｕｍと会合するか、結合するか、複合体化するか、または他の形で反応するかもしくは競合し、場合によって、腫瘍永続細胞の頻度の低下をもたらす任意の化合物を広く含む。本明細書で開示される例示的なモジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。好ましい特定の実施形態では、選択されたモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍに対する抗体またはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含む。このような抗体は、アンタゴニスト性の場合もあり、アゴニスト性の場合もある。他の好ましい実施形態では、本発明と適合可能なエフェクターが、Ｎｏｔｕｍ自体またはその反応性断片を含むＮｏｔｕｍ構築物を含む。このようなＮｏｔｕｍ構築物は、融合タンパク質を含むことが可能であり、免疫グロブリン、ステープルドペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、または生物学的応答修飾剤など、他のポリペプチドに由来する反応性ドメインを含みうることが理解されるであろう。さらに他の好ましい態様では、ＮｏｔｕｍエフェクターまたはＮｏｔｕｍモジュレーターが、ゲノムレベルで所望の効果を及ぼす核酸アセンブリーを含む。本教示と適合可能なさらに他のモジュレーターについては、以下で詳細に論じる。
【００３４】
関連して述べると、以下の議論は、Ｎｏｔｕｍモジュレーター、Ｎｏｔｕｍアンタゴニスト、および抗Ｎｏｔｕｍ抗体に関する。各用語のより詳細な定義を以下に示すが、この開示の目的では、これらの用語が大部分互換的であり、文脈により示されない限り、狭義に理解されるべきではないことが理解されるであろう。例えば、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストに関して言及する場合、これはまた、偶然アンタゴニスト性である本発明の抗体にも当てはまる。同様に、Ｎｏｔｕｍモジュレーターという用語は、開示されるＮｏｔｕｍアンタゴニストおよび抗Ｎｏｔｕｍ抗体を明示的に包含し、後者に対する言及はまた、文脈により除外されない限り、モジュレーターにも当てはまる。
【００３５】
ＩＩ．Ｎｏｔｕｍ
本明細書で用いられるＮｏｔｕｍという用語は、天然のＮｏｔｕｍペクチンアセチルエステラーゼタンパク質、その断片、またはその変異体を指す。代表的なＮｏｔｕｍオルソログには、ヒト（すなわち、ｈＮｏｔｕｍ）オルソログ、マウスオルソログ、マカクザルオルソログ、およびショウジョウバエオルソログが含まれるがこれらに限定されない。その遺伝子のヒトオルソログは、分子量を約５５．７ｋＤａとする４９６アミノ酸（ａａ）のポリペプチド構築物をもたらす、１４８８塩基対のオープンリーディングフレームを含む。ヒトＮｏｔｕｍタンパク質をコードする例示的な核酸配列を、配列番号１に示す一方で、対応するアミノ酸配列を、配列番号２に示す（それぞれ、図１Ａおよび１Ｂ）。ヒトＮｏｔｕｍタンパク質は、切り出されてこのタンパク質の成熟形態（すなわち、４７７ａａ）をもたらす、配列番号２のアミノ酸１〜１９を含む、予測されるシグナル配列またはリーダー配列を含むことが理解されるであろう。参考として、マウスＮｏｔｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７５２６３）が、ヒトＮｏｔｕｍと約９１％相同である一方、マカクザルＮｏｔｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００１１１２８２９）は、ヒトＮｏｔｕｍと約９６％相同である。直接の参照または文脈的な必然性により別段に示されない限り、Ｎｏｔｕｍという用語は、ヒトＮｏｔｕｍおよび免疫反応性の同等物を対象とするものとする。Ｎｏｔｕｍのヒトホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７８４９３、ＧｅｎｅＩＤ：１４７１１１）は、参考として本明細書に援用される、Ｔｏｒｉｓｕら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８４２９９５２においてより完全に記載されている。この用語はまた、抗体が特異的に結合しうるエピトープを含有する、Ｎｏｔｕｍの天然形態または変異体形態の断片も指しうることがさらに理解されるであろう。
【００３６】
ここでもまた、いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーター、および、特に、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストは、少なくとも部分的に、標準治療の治療レジメン（例えば、イリノテカン）の文脈外で発がん性の生存に干渉することを介して作用しうるほか、腫瘍始原細胞によるシグナル伝達を低減するかまたは消失させることを介しても作用し得ると考えられる。例えば、Ｎｏｔｕｍと拮抗することを介するＴＰＣの消失は、増殖する細胞を消失させる化学療法レジメンに対して細胞増殖を単に促進することを包含する場合もあり、それらの自己再生（すなわち、無際限の増殖）能力が失われるように、ＴＰＣの分化を促進する場合もある。
【００３７】
既に示した通り、Ｎｏｔｕｍは、特に、Ｗｎｔ経路、Ｈｈ経路、およびＢＭＰ経路に関与すると考えられる。この点で、当業者は、Ｎｏｔｕｍが、ヘパリン硫酸プロテオグリカンＤａｌｌｙ様（Ｄｌｐ）およびＤａｌｌｙを修飾することにより、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｇ）活性を抑制するものとして、当初Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属において同定された、分泌されたヒドロラーゼであることを理解するであろう。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属において、Ｎｏｔｕｍ遺伝子は、α／βヒドロラーゼスーパーファミリーの植物ペクチンアセチルエステラーゼと関連する、６７１アミノ酸残基のタンパク質をコードすると考えられる。より近年の証拠は、ショウジョウバエのＮｏｔｕｍ（ｄＮｏｔｕｍ）が、リパーゼとしてもまた機能し、Ｄｌｐのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを切断することにより、細胞表面からＤｌｐを放出しうることを実証している。ゲル電気泳動により証明される通り、Ｎｏｔｕｍを介するこれらの細胞表面プロテオグリカンの修飾および／または放出は、結果として、細胞表面におけるＤａｌｌｙタンパク質の発現レベルの急激な低下、およびＤｌｐの修飾形態への転換をもたらす。このような観察は、ｄＮｏｔｕｍが、おそらくはそれらのグリコアミノグリカン側鎖を修飾し、かつ／またはＤｌｐを細胞表面から放出することにより、ＤａｌｌｙおよびＤｌｐを介して増大するＷｇシグナル伝達およびヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達と拮抗することを示す。ｄＮｏｔｕｍによるこれらの修飾は、局所的なＷｇ濃度およびヘッジホッグ濃度を修飾し、したがって、これらのモルフォゲンの、それらの受容体との相互作用と拮抗するように作用する。さらに、ＤａｌｌｙまたはＤｌｐと会合したＷｇタンパク質またはヘッジホッグタンパク質の、細胞表面からの放出は、これらのモルフォゲンの長期にわたる活性を促進し、発生における組織のパターン形成に大きな影響を及ぼす。一般に、それらの各々の全体が、参考として本明細書に援用される、Ａｙｅｒｓら、２０１０年、ＰＭＩＤ：２０４１２７７５；Ｇｉｒａｌｄｅｚら、２００２年、ＰＭＩＤ：１２０１５９７３；およびＴｒａｉｓｔｅｒら、２００８年、ＰＭＩＤ：１７９６７１６２を参照されたい。
【００３８】
多様な研究はまた、ＤａｌｌｙプロテオグリカンおよびＤｌｐ関連プロテオグリカンが、脊椎動物のＷｎｔシグナル伝達において重要な役割を果たす可能性が高く（Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋｉら、２００１年、ＰＭＩＤ：１１７０２７８４；およびＦｉｌｍｕｓら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８５０５５９８）、Ｎｏｔｕｍが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属における類似のタンパク質と全く同様に、その受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄを介してＷｎｔシグナル伝達を調節するように作用することも示している。Ｗｇと同様に、哺乳動物のＮｏｔｕｍは、細胞表面からグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）グリピカン（ＤｌｐおよびＤａｌｌｙと類似のグリピカン）を放出することにより、Ｗｎｔ経路を下方制御すると提起されている（Ｔｒａｉｓｔｅｒら、前出）。細胞表面に結合すると、ＧＰＩアンカーグリピカンが、多様な形態のＷｎｔの、それらのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との相互作用を安定化させることにより、Ｗｎｔシグナル伝達を促進する一方で、細胞表面から放出されたグリピカンは、Ｗｎｔの、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に近位のＧＰＩアンカー細胞表面グリピカンとの相互作用を競合的に阻害することにより、Ｗｎｔシグナル伝達を抑制する（Ｆｉｌｍｕｓら、前出）。グリピカンが存在しないかまたは局所的なグリピカン濃度が減少すると、最低限でも、Ｆｚｄ受容体を介してベータ−カテニン経路のシグナル伝達を刺激するために細胞表面に存在しなければならないＷｎｔ濃度の閾値が上昇する。これらのデータは、さらなる研究と共に、哺乳動物（例えば、ヒト）のＮｏｔｕｍが、Ｗｎｔシグナル伝達と拮抗することを示している。Ｎｏｔｕｍはまた、転写の活性化についてのＷｎｔ／ベータ−カテニン標的としても同定されていることから、Ｎｏｔｕｍは、Ｗｎｔ／Ｆｚｄ／ベータ−カテニンシグナル伝達カスケードのフィードバック阻害剤であることが示唆される。
【００３９】
Ｗｎｔ／Ｆｚｄシグナル伝達は、器官形成時および発生時の多くの組織内で細胞運命決定に大きな役割を果たし、これらの経路の攪乱は、結果としてがんをもたらすことが多い。さらに、下部消化管の幹細胞が同定および／または操作されている複数のマウス遺伝子モデルは、Ｗｎｔ／ベータ−カテニン経路を介するシグナル伝達は、それら自身が、陰窩（幹細胞が常在することが公知の場所である）として公知の組織構造の基部における幹細胞の自己再生および拡大増殖を支持することが示唆されている、パネート細胞の生成をもたらす組織常在性幹細胞の分化の決定に影響を及ぼすことを示している。ＮｏｔｕｍによるＷｎｔシグナル伝達の脱制御および／またはＴＰＣ集団に近位のＮｏｔｕｍの局所濃度の増大によるこの経路のフィードバック制御の機能障害は、腫瘍形成、腫瘍成長の持続、および腫瘍の再発に寄与しうる。Ｎｏｔｕｍモジュレーターによりこの寄与を修飾すれば、腫瘍細胞の細胞表面に近位のＷｎｔ勾配の形成を変化させることを介する治療的利益がもたらされる可能性がある。
【００４０】
Ｎｏｔｕｍが細胞表面におけるグリピカン濃度を有効に低減する能力を踏まえるなら、Ｎｏｔｕｍはまた、細胞表面からグリピカンを放出することにより、ヘッジホッグ（Ｈｈ）モルフォゲン勾配に対しても制御を及ぼす可能性が高い。上記で言及した通り、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属では、Ｄａｌｌｙ関連グリピカンおよびＤｌｐ関連グリピカンがまたＨｈにも結合して、Ｈｈ受容体であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）と能動的に競合する。ＰｔｃとのＨｈへの結合についての競合は、近位ＨｈのＰｔｃへの結合を有効に低減して、転写因子のＧｌｉファミリーを介してＨｈエフェクター経路に作用する、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄを介するシグナル伝達の減少を結果としてもたらす。細胞表面からグリピカンを切断することにより、Ｎｏｔｕｍは、Ｈｈについての膜近位の競合濃度を低減し、このために、ＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄのリプレッサーであるＰｔｃに結合してこれを阻害する有効なＨｈ濃度の上昇を促進することにより、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄを介するＨｈシグナル伝達を増大させる（Ｔｒａｉｓｔｅｒら；およびＦｉｌｍｕｓ、いずれも前出）ことから、Ｐｔｃの遺伝子の不活化を介してＨｈシグナル伝達カスケードを活性化させる遺伝子モデルが潜在的に再現される。Ｗｎｔファミリーのタンパク質と同様、Ｈｈタンパク質は、脂質で修飾されており、複合体全体の溶解度を改善する会合タンパク質（例えば、グリピカン）の補助なしには、ごくわずかしか拡散しない（Ｅａｔｏｎ  Ｓ．、２００６年、ＰＭＩＤ：１６３６４６２８）。
【００４１】
Ｈｈモルフォゲン勾配は、多様な固形組織の器官形成および発生に極めて重要であり、Ｈｈモルフォゲン勾配の攪乱またはＰｔｃを介するＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄシグナル伝達を阻害する能力は、発生の異常およびがんと関連している。また、グリピカンおよびそれに会合したＨｈタンパク質の放散の増大を促進することにより、Ｎｏｔｕｍがまた、Ｈｈの溶解度が乏しい特徴、そのグリピカンとの会合が緊密であることのために、それまでには存在しなかったＨｈの新たな濃度勾配も創出することも認識すべきである。Ｈｈシグナル伝達が、他のモルフォゲンによるシグナル伝達経路と共に正常に作用して、正常な細胞運命の決定を制御するのに対し、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの構成的活性化は、基底細胞がん、髄芽腫、および膵臓腫瘍を結果としてもたらすことが示されている。また、Ｈｈシグナル伝達の上昇が、ＡＰＣおよび／またはＫＲＡＳの損傷と連動して、例えば、がんの発症および重症度を増幅しうることについての多くの証拠も存在する。ＮｏｔｕｍがＨｈの局所的な濃度の増大、およびグリピカンと会合するＨｈの、遠位における新たな濃度勾配を促進すると予測される能力のために、ＴＰＣと近位のＮｏｔｕｍレベルの上昇は、発がんおよび腫瘍の進行において重要ではあるがいまだに認知されていない因子である可能性がある。
【００４２】
最後に、グリピカンは、多様な組織におけるＢＭＰ／ＴＧＦ−ベータファミリーメンバーの局所的な濃度勾配を制御することが示されており（Ｐａｉｎｅ−Ｓａｕｎｄｅｒｓら、２０００年、ＰＭＩＤ：１０９６４４７３）、したがって、グリピカンが、細胞表面からのＮｏｔｕｍの切断および放出に対して感受性であれば、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達が減少し、かつ／または機能的に不活化される腫瘍およびマウスのがんモデルにおいて観察される通り、がんの進行を実際に促進しうるであろう（Ｋｏｄａｃｈら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８００８３６０；およびＨａｒｄｗｉｃｋら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８７５６２８８）。例を目的として述べると、ＢＭＰ受容体の変異は、ヒトにおける若年性ポリポーシス症候群およびがんの偶発的要因である。
【００４３】
上記で論じた通り、グリピカンは、異なる種類の増殖因子およびモルフォゲンを、組織特異的な形で制御する。グリピカンの遺伝子発現の変化もまた、Ｎｏｔｕｍの発現とは独立して発がんを媒介することを示している。例えば、グリピカン３は、増殖を阻害し、特定の腫瘍型における細胞死を誘導する。したがって、グリピカン３は、腫瘍の抑制因子として作用し、由来の異なる多数の腫瘍において下方制御される（Ｆｉｌｍｕｓ  Ｊ、２００１年、ＰＭＩＤ：１１３２００５４）。本発明の枠組みでは、ＴＰＣが高レベルのＮｏｔｕｍを発現させつつある腫瘍では、グリピカンの濃度が有効に低減され、これらの低減が発がんおよび腫瘍の進行に寄与すると考えられる。本明細書で開示される通り、提供されるＮｏｔｕｍモジュレーターは、これらのレベルを減弱し、所望の抗新生物応答を付与しうる可能性が高い。
【００４４】
前述のグリピカンを介する制御に加えて、Ｎｏｔｕｍのリパーゼ活性（以下の実施例２４で例示される）は、ＮｏｔｕｍがＷｎｔ活性を調節するさらなる機構、例えば、Ｗｎｔタンパク質を脱脂することにより、長期にわたるＷｎｔの輸送に影響を及ぼすほか、Ｗｎｔ受容体および共受容体との相互作用を攪乱して、それらのシャペロンとの相互作用を調節する機構も示唆する。広範にわたるリパーゼ活性はまた、脂質で修飾されたタンパク質を介する他のシグナル伝達経路（例えば、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、およびＨｈ）も攪乱しうる。したがって、本明細書で開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターは、この酵素活性に干渉して、腫瘍始原細胞の頻度をさらに低減し、新生物性の成長および／または転移を阻害しうる。
【００４５】
これらの経路は過去数年間に広範にわたり研究されてきたが、本発明による解明の前にＮｏｔｕｍの役割が完全に認知または利用されたことはなかった。この点では、肝細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、および膵臓がんを含めた多様な充実性腫瘍についての遺伝子発現プロファイリングは、Ｎｏｔｕｍがこれらの新生物を伴う患者において過剰発現することを示している。例えば、それらの各々がその全体において参考として本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／５６８，４７１、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／３０１，８２２、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，３７１，８４０；およびＴｏｒｉｓｕら、前出を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／５６８，４７１では、ヒトＮｏｔｕｍに対する単一抗体の生成が実証されたが、このような抗体が任意の種類の治療環境において有効であるという証拠は見られなかった。さらに、本発明の新規のＮｏｔｕｍモジュレーターとは異なり、開示される抗体が、分泌されたＮｏｔｕｍと拮抗して、本明細書で開示される抗新生物性の効果を生成させることは全く示されなかった。参考文献のうちのいずれにおいても、Ｎｏｔｕｍが腫瘍始原細胞と関連しているか、またはこの関連により、これらの腫瘍誘発物を感作させるか、消失させるか、もしくは他の形で中和し、これにより、異質な腫瘤の有効な処置を可能とする有効な機構がもたらされることは示されていない。
【００４６】
ＩＩＩ．腫瘍始原細胞
先行技術の任意の教示とは対照的に、本発明は、腫瘍始原細胞、および、とりわけ、腫瘍永続細胞を標的とし、これにより、新生物性障害の処置、管理、または防止を容易にするのに特に有用であるＮｏｔｕｍモジュレーターを提供する。より具体的に述べると、既に示した通り、驚くべきことに特異的な腫瘍細胞の亜集団が、Ｎｏｔｕｍを発現させ、がん幹細胞の自己再生および細胞生存に重要なモルフォゲンによるシグナル伝達の局所的調整を修飾する可能性が高いことが見出されている。したがって、好ましい実施形態では、本教示に従い、Ｎｏｔｕｍのモジュレーターを用いて腫瘍始原細胞の頻度を低減し、これにより、過剰増殖性疾患の処置または管理を容易にすることができる。
【００４７】
本明細書で用いられる、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）という用語は、腫瘍永続細胞（ＴＰＣ：すなわち、がん幹細胞またはＣＳＣ）および増殖性の高い腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇと称する）の両方を包含し、併せて一般に、腫瘤または腫瘍塊の固有の亜集団（すなわち、０．１〜４０％）を構成する。本開示の目的では、腫瘍永続細胞という用語とがん幹細胞という用語とは等価なものであり、本明細書では、これらを互換的に用いることができる。逆に、ＴＰＣは、単離された少数の細胞の連続移植（マウスを介する２代以上の継代）により実証される通り、それらが、腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に反復し、無際限の自己再生能力を有するという点において、ＴＰｒｏｇと異なる。以下でより詳細に論じられる通り、適切な細胞表面マーカーを用いる蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）は、少なくとも部分的に、それが単一の細胞と細胞塊（すなわち、ダブレットなど）とを識別する能力のために、高濃度に濃縮された細胞亜集団（純度＞９９．５％とする）を単離するのに信頼できる方法である。このような技法を用いて、高度に精製された少細胞数のＴＰｒｏｇ細胞を、免疫不全マウスへと移植すると、それらは、初代移植において、腫瘍の成長を刺激しうることが示されている。しかし、精製されたＴＰＣ亜集団とは異なり、ＴＰｒｏｇにより生成した腫瘍が、表現型の細胞異質性において親腫瘍を完全に反映するわけではなく、その後の移植における連続的な腫瘍形成を再開するには、実証可能な程度に非効率的である。これに対し、ＴＰＣ亜集団は、連続的に単離および移植されると、親腫瘍の細胞異質性を完全に再構成し、腫瘍を効率的に惹起しうる。したがって、当業者は、ＴＰＣとＴＰｒｏｇとは、初代移植では両方が腫瘍を生成させうるが、それらの間の決定的な差違は、少細胞数で連続移植されると、異質な腫瘍成長を永続的に刺激する、ＴＰＣの固有の能力であることを認識するであろう。ＴＰＣを特徴付ける他の一般的な手法は、細胞表面マーカーの形態および検討、転写プロファイル、および薬物応答を伴うが、マーカーの発現は、培養条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞系の継代と共に変化しうる。
【００４８】
したがって、本発明の目的では、腫瘍永続細胞が、正常組織における細胞の階層構造を支持する正常幹細胞と同様、多系統分化能を維持する一方で無際限に自己再生するそれらの能力により規定されることが好ましい。したがって、腫瘍永続細胞は、腫瘍原性の後代（すなわち、腫瘍始原細胞：ＴＰＣおよびＴＰｒｏｇ）および非腫瘍原性（ＮＴＧ）の後代の両方を生成させることが可能である。本明細書で用いられる非腫瘍原性細胞（ＮＴＧ）とは、腫瘍始原細胞から生じるが、それ自体は自己再生したり、腫瘍を構成する異質な腫瘍細胞の系統を生成させたりする能力を有さない腫瘍細胞を指す。実験に基づき述べると、ＮＴＧ細胞は、過剰な細胞数で移植されても、マウスにおいて腫瘍を再現的に形成することができない。
【００４９】
示される通り、ＴＰｒｏｇもまた、それらがマウスにおいて腫瘍を生成させる限定的な能力のために、腫瘍始原細胞（またはＴＩＣ）として類別されている。ＴＰｒｏｇは、ＴＰＣの後代であり、典型的には有限回数の非自己再生的細胞分裂が可能である。さらに、ＴＰｒｏｇ細胞は、初期腫瘍前駆細胞（ＥＴＰ）および後期腫瘍前駆細胞（ＬＴＰ）へとさらに分けることができ、これらの各々は、表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞構造を反復する能力が異なることにより識別することができる。このような技術的な差違にも拘らず、ＥＴＰおよびＬＴＰのいずれもが一般に、少細胞数で移植されると腫瘍を連続的に再構成することがそれほど可能ではなく、典型的には親腫瘍の異質性を反映しないという点において、ＴＰＣとは機能的に異なる。前出の差違にも拘らずまた、多様なＴＰｒｏｇ集団が、まれな機会には、通常は幹細胞に帰せられる自己再生能を獲得し、それら自身がＴＰＣ（またはＣＳＣ）となりうることも示されている。いずれにせよ、いずれの種類の腫瘍始原細胞も、単一の患者の典型的な腫瘍塊中で表出される可能性が高く、本明細書で開示されるモジュレーターによる処置にかけられる。すなわち、開示される組成物は一般に、特定の実施形態または腫瘍中で表出される混合物に関わらず、このようなＮｏｔｕｍ陽性腫瘍始原細胞の頻度を低減するかまたは化学療法感受性を変化させるのに有効である。
【００５０】
本発明の文脈では、ＴＰＣが、腫瘤を構成するＴＰｒｏｇ細胞（ＥＴＰ細胞およびＬＴＰ細胞の両方）、ＮＴＧ細胞、およびＴＰＣに由来しない腫瘍浸潤細胞（例えば、線維芽細胞／間質細胞、内皮細胞、および造血細胞）より腫瘍原性であり、比較的より休眠性であり、より化学療法耐性であることが多い。従来の療法およびレジメンが、大部分において、腫瘍を減量し、かつ、迅速に増殖する細胞を攻撃するようにデザインされていることを踏まえると、ＴＰＣは、より迅速に増殖するＴＰｒｏｇおよび他の腫瘤細胞集団より、従来の療法およびレジメンに対して耐性である可能性が高い。さらに、ＴＰＣは、多剤耐性輸送体の発現の増大、ＤＮＡ修復機構の増強、および抗アポトーシス性タンパク質など、それらを従来の療法に対して比較的化学療法耐性とする他の特徴を発現させることが多い。それらの各々がＴＰＣによる薬物耐性に寄与するこれらの特性は、病期の進んだ新生物を伴う大半の患者に長期的な利益を確実にする標準的な腫瘍処置レジメンが奏効しないこと、すなわち、持続的な腫瘍成長および再発を刺激するこれらの細胞（すなわち、ＴＰＣまたはＣＳＣ）を的確に標的として根絶するのに奏効しないことの重要な理由を構成する。
【００５１】
前述の先行技術による処置の多くとは異なり、本発明の新規の組成物は、被験体に投与されると、選択されたモジュレーターの形態または特異的な標的（例えば、遺伝物質、Ｎｏｔｕｍ、またはＮｏｔｕｍのリガンド）に関わらず、腫瘍始原細胞の頻度を低減することが好ましい。上記で言及した通り、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、ａ）腫瘍始原細胞の消失、枯渇、感作、サイレンシング、もしくは阻害；ｂ）腫瘍始原細胞の成長、拡大増殖もしくは再発の制御；ｃ）腫瘍始原細胞の開始、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、維持、もしくは増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の中断；またはｄ）腫瘍原性細胞の生存、再生、および／もしくは転移の他の形での妨害の結果として生じうる。一部の実施形態では、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、１または複数の生理学的経路が変化する結果として生じる。経路の変化は、腫瘍始原細胞の低減または消失を介する場合であれ、それらの潜在能力の改変を介する（例えば、分化の誘導、ニッシェの破壊）場合であれ、それらが腫瘍環境または他の細胞に影響を及ぼす能力に他の形で干渉する場合であれ、腫瘍形成、腫瘍の維持、ならびに／または転移および再発を阻害することにより、Ｎｏｔｕｍ関連障害のより有効な処置を可能とする。
【００５２】
腫瘍始原細胞の頻度のこのような低下を評価するのに使用され得る方法には、ポアソン分布統計を用いる計数、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍を発生させるかどうかの能力など、あらかじめ規定された決定的なイベントの頻度の評価を後続させることが好ましい、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析がある。このような限界希釈解析が、腫瘍始原細胞の頻度の低下を計算する好ましい方法であるのに対し、他の要求の少ない方法もまた、精度は若干低下するが、所望の値を有効に決定するのに用いることができ、本明細書の教示と完全に適合可能である。したがって、当業者により理解される通り、また、周知のフローサイトメトリー手段または免疫組織化学的手段を介しても、頻度の値の低下を決定することができる。前述の方法全てについては、例えば、それらの各々がそれらの全体において参考として本明細書に援用される、Ｄｙｌｌａら、２００８年、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２；およびＨｏｅｙら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１を参照されたい。
【００５３】
限界希釈解析に関しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍始原細胞の頻度の計数は、画分化されたヒト腫瘍細胞または画分化されていないヒト腫瘍細胞（例えば、それぞれ、処置された腫瘍および処置されていない腫瘍由来のヒト腫瘍細胞）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコロニー形成を助長する成長条件へと置くことにより達成することができる。このようにすれば、コロニーの単純なカウンティングおよび特徴付けを介してコロニー形成細胞を計数することもでき、例えば、系列希釈下におけるヒト腫瘍細胞のプレートへの配置、および各ウェルを播種の少なくとも１０日後におけるコロニー形成について陽性または陰性とスコア化することからなる解析を介してコロニー形成細胞を計数することもできる。それらが腫瘍始原細胞の頻度を決定する能力において一般により正確である、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈実験または限界希釈解析は、系列希釈下で、ヒト腫瘍細胞を、処置されていない対照条件または処置された条件から、例えば、免疫不全マウスへと移植し、その後、各マウスを移植の少なくとも６０日後における腫瘍形成について陽性または陰性とスコア化することを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析による細胞の頻度値の導出は、ポアソン分布統計を公知の陽性イベントおよび陰性イベントの頻度へと適用し、これにより、陽性イベントの定義を満たすイベント、この場合は、それぞれ、コロニーまたは腫瘍形成の頻度をもたらすことにより行うことが好ましい。
【００５４】
腫瘍始原細胞の頻度を計算するのに使用され得る本発明と適合可能な他の方法について述べると、最も一般的な方法は、定量化可能なフローサイトメトリー法および免疫組織化学的な染色手順を含む。すぐ上で記載した限界希釈解析法ほど正確ではないが、これらの手順は、労働集約性がはるかに低く、比較的短い時間枠で妥当な値をもたらす。したがって、当業者は、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である、当技術分野で認知された細胞表面タンパク質（例えば、以下の実施例１には、潜在的に適合可能なマーカーが示される）に結合する、１または複数の抗体または試薬を用いる、フローサイトメトリーによる細胞表面マーカープロファイルの決定を用い、これにより、多様な試料からＴＩＣレベルを測定しうることが理解されるであろう。さらに別の適合可能な方法では、当業者であれば、これらの細胞の境界を定めると考えられる細胞表面タンパク質に結合することが可能である１または複数の抗体または試薬を用いる免疫組織化学を介して、ｉｎ  ｓｉｔｕ（すなわち、組織切片）でＴＩＣの頻度を計数しうるであろう。
【００５５】
次いで、上記で言及した方法のうちのいずれかを用いると、本明細書の教示に従う、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターによりもたらされるＴＩＣ（または上記ではＴＰＣ）頻度の低下を定量化することが可能である。場合によっては、本発明の化合物が、ＴＩＣ頻度を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、なおまたは３５％低減しうる（消失、分化の誘導、ニッシェの破壊、サイレンシングなどを含めた、上記で言及した多様な機構を介する）。他の実施形態では、ＴＩＣ頻度の低下が、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のオーダーでありうる。特定の実施形態では、開示される化合物が、ＴＩＣ頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、なおまたは９５％低減しうる。当然ながら、ＴＩＣ頻度の任意の低下は、新生物の腫瘍原性、持続、再発、および侵襲性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）の対応する低下の結果としてもたらされる可能性が高いことが理解されるであろう。
【００５６】
ＩＶ．Ｎｏｔｕｍモジュレーター
いずれにせよ、本発明は、Ｎｏｔｕｍと関連する多数の悪性疾患のうちのいずれか１つを診断、処置、および／または予防するための、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストを含めたＮｏｔｕｍモジュレーターの使用を対象とする。開示されるモジュレーターは、単独で用いることもでき、化学療法剤もしくは免疫療法剤または生物学的応答修飾剤など、多種多様な抗がん化合物と共に用いることもできる。他の選択された実施形態では、２つ以上の異なるＮｏｔｕｍモジュレーターを組み合わせて用いて抗新生物効果の増強をもたらすこともでき、これらを用いて多重特異性構築物を作製することもできる。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。モジュレーターは、例えば、Ｎｏｔｕｍ融合構築物（例えば、Ｎｏｔｕｍ−Ｆｃ、Ｎｏｔｕｍ標的化部分など）またはＮｏｔｕｍコンジュゲート（例えば、Ｎｏｔｕｍ−ＰＥＧ、Ｎｏｔｕｍ−細胞傷害性剤、Ｎｏｔｕｍ−ｂｒｍなど）を含めた、可溶性Ｎｏｔｕｍ（ｓＮｏｔｕｍ）、または、その形態、変異体、誘導体もしくは断片を含むことがなおより好ましい。他の実施形態では、また、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、抗体（例えば、抗Ｎｏｔｕｍ  ｍＡｂ）またはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含むことも理解される。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターが、中和抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。他の実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、内部移行抗体を含みうる。さらに他の実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、枯渇化抗体を含みうる。さらに、前述の融合構築物と同様に、これらの抗体によるモジュレーターは、多様な（および、場合によって、複数の）作用機構を伴う方向付けられた免疫療法をもたらすために、選択された細胞傷害性剤、ポリマー、生物学的応答修飾剤（ＢＲＭ）などとコンジュゲートすることもでき、連結することもでき、他の形で会合させることもできる。さらに他の実施形態では、モジュレーターが、遺伝子レベルでも機能することが可能であり、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの化合物を含みうる。
【００５８】
開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターは、例えば、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの形態、会合させる任意のペイロード、または投与および送達方法に依存して、選択された経路を刺激するかもしくはこれと拮抗するか、または特定の細胞を消失させることを含めた多様な機構を介して、腫瘍細胞、特にＴＰＣおよび／または関連する新生物の増殖（ｇｒｏｗｔｈ、ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）または生存を枯渇させることもでき、消失させることもでき、阻害することもできることがさらに理解されるであろう。したがって、本明細書で開示される好ましい実施形態は、腫瘍永続細胞など、特定の腫瘍細胞亜集団の枯渇、阻害、またはサイレンシングを対象とするが、このような実施形態は、例示的なものであるに過ぎず、いかなる意味でも制限的なものではないことを強調しなければならない。むしろ、添付の特許請求の範囲に示される通り、本発明は、いかなる特定の機構または標的腫瘍細胞集団であるかを問わず、Ｎｏｔｕｍモジュレーターおよび多様なＮｏｔｕｍ媒介性過剰増殖性障害の処置、管理、または予防におけるそれらの使用を広く対象とする。
【００５９】
同じ意味で、本発明の開示される実施形態は、１または複数のＮｏｔｕｍアンタゴニストを含む。この目的で、本発明のＮｏｔｕｍアンタゴニストは、Ｎｏｔｕｍタンパク質またはその断片を認識するか、これに反応するか、これと結合するか、これと混合されるか、これと競合するか、これと会合するか、または他の形でこれと相互作用し、腫瘍始原細胞または腫瘤もしくはＮＴＧ細胞を含めた他の新生物性の細胞を消失させるか、サイレンシングするか、低減するか、阻害するか、妨害するか、制限するか、またはこれらの成長を制御する、任意のリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体またはこれらの免疫学的に活性な断片もしくは誘導体を含みうることが理解されるであろう。選択された実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍアンタゴニストを含む。
【００６０】
本明細書で用いられるアンタゴニストとは、受容体のリガンドへの結合または酵素の基質との相互作用を含めた、特定のタンパク質または指定されたタンパク質の活性を中和するか、遮断するか、阻害するか、解消するか、低減するか、またはこれらに干渉することが可能な分子を指す。より一般的に述べると、本発明のアンタゴニストは、抗体およびこれらの抗原結合断片または誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生体有機分子、ペプチド模倣体、医薬およびそれらの代謝物、転写制御配列および翻訳制御配列などを含みうる。アンタゴニストにはまた、低分子阻害剤、融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合し、これにより、その標的基質への結合を封鎖する受容体分子および誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質を指向するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、ならびにタンパク質に対するリボザイムも含まれうる。
【００６１】
本明細書で用いられて２つ以上の分子または化合物に適用される、認識するまたは特異的に認識するという用語は、それにより、１つの分子が他の分子に対して影響を及ぼす、共有結合または非共有結合による分子の反応、結合、特異的結合、組合せ、会合、相互作用、結合、連結、一体化、癒合、融合、または接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）を意味すると考えられるものとする。
【００６２】
さらに、本明細書の実施例で実証される通り、ある場合には、一部のヒトＮｏｔｕｍモジュレーターが、ヒト以外の種（例えば、マウス）に由来するＮｏｔｕｍと交差反応しうる。他の場合には、例示的なモジュレーターが、ヒトＮｏｔｕｍの１または複数のアイソフォームに特異的であることが可能であり、他の種に由来するＮｏｔｕｍのオルソログとの交差反応性を呈示しない。
【００６３】
いずれにせよ、当業者は、開示されるモジュレーターを、コンジュゲートした形態で用いる場合もあり、コンジュゲートされていない形態で用いる場合もあることを理解するであろう。すなわち、モジュレーターは、薬学的に活性な化合物、生物学的応答修飾剤、細胞傷害性剤もしくは細胞増殖抑制剤、診断用部分、または生体適合性の修飾剤と会合させることもでき、これらとコンジュゲートすることもできる（例えば、共有結合により、または非共有結合により）。この点では、このようなコンジュゲートが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位元素を含みうることが理解される。さらに、上記で示した通り、選択されたコンジュゲートは、少なくとも部分的にはコンジュゲーションを実施するのに用いられる方法に応じて、多様なモル比でＮｏｔｕｍモジュレーターに、共有結合により連結することもでき、非共有結合により連結することもできる。
【００６４】
Ｖ．抗体
ａ．概観
既に示唆した通り、本発明の特に好ましい実施形態は、抗体の形態にあるＮｏｔｕｍモジュレーターを含む。本明細書における抗体という用語は、その最も広義において用いられ、それらが、所望の生物学的活性（すなわち、Ｎｏｔｕｍとの会合または結合）を呈示する限りにおいて、とりわけ、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナルまたはポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、組換え生成抗体、イントラボディー、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、霊長動物化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖ＦｖＦｃ（ｓｃＦｖＦｃ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および他の任意の免疫学的に活性な抗体断片を網羅する。より広義において、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、これらの断片を、Ｆｃ領域またはその断片が含まれるがこれらに限定されない、別の免疫グロブリンドメインに融合させる場合もあり、これに融合させない場合もある、抗原結合部位を含有する分子を包含する。さらに、本明細書でより詳細に概括される通り、１つの抗体および複数の抗体という用語は、とりわけ、場合によって、少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含み、免疫グロブリンの免疫学的に活性な断片に融合させた、全長抗体およびＦｃ領域を含む変異体のＦｃ融合体、またはその断片を含めた、以下で記載されるＦｃ変異体を包含する。
【００６５】
以下でより詳細に論じられる通り、一般的な用語である抗体または免疫グロブリンは、生化学的に識別することができ、かつ、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて適切なクラスに容易に割り当てることができる、５つの異なる抗体のクラスを含む。歴史的な理由で、無傷抗体の主要なクラスを、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭと称する。ヒトでは、構造および特定の生化学的特性に応じて、ＩｇＧクラスおよびＩｇＡクラスを、さらに認知されたサブクラス（アイソタイプ）、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２へと分けることができる。ヒトにおけるＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１を最も豊富とする血清中のそれらの存在量の順位により名付けられていることが理解されるであろう。
【００６６】
抗体の５つのクラス全て（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）および全てのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のほか、これらの変異体が本発明の範囲内にあるが、例示だけを目的として、免疫グロブリンのＩｇＧクラスを含む好ましい実施形態について、ある程度詳細に論じる。しかし、このような開示は、例示的な組成物および本発明を実施する方法を実証するだけのものであり、いかなる形であれ、本発明の範囲またはこれに付属する特許請求の範囲を制限するものではないことが理解される。
【００６７】
この点で、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンは、分子量を約２３，０００ドルトンとする２つの同一な軽鎖ポリペプチドと、そのアイソタイプに応じて分子量を５３，０００〜７０，０００とする２つの同一な重鎖とを含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシア文字であるα、δ、ε、γ、およびμで表される。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、明確に異なる２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。当業者は、免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元的立体構成が周知であることを理解するであろう。
【００６８】
４つの鎖は、ジスルフィド結合を介してＹ字型の立体構成に接合され、ここで、軽鎖は、Ｙ字型の開口部に発して重鎖から分岐し（ｂｒａｃｋｅｔ）、可変領域を経てＹ字型の双対する末端へと続く。各軽鎖は、１つの共有結合的なジスルフィド結合を介して重鎖に連結されるが、重鎖は、ヒンジ領域における２つのジスルフィド結合により接合される。重鎖および軽鎖の各々はまた、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有し、それらの数は、ＩｇＧのアイソタイプに基づき変化しうる。
【００６９】
各重鎖は、一方の末端において、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端において、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の末端において、定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。この点で、軽鎖（ＶＬ）部分および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが、抗原の認識および特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動、循環半減期、補体結合など、重要な生物学的特性を付与し、これらを制御する。慣例により、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位となるのに応じて、定常領域ドメインの番号付けを大きくする。したがって、抗体のアミノ末端またはＮ末端は、可変領域を含み、カルボキシ末端またはＣ末端は、定常領域を含む。したがって、ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインは、それぞれ、実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００７０】
可変という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が、免疫グロブリン間で広範にわたり異なり、これらのホットスポットが、特定の抗体の結合および特異性についての特徴の大部分を規定する事実を指す。これらの超可変部位は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知である３つのセグメントに現れる。ＣＤＲに隣接する、可変ドメインの高度に保存的な部分を、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する。より具体的に述べると、天然の単量体のＩｇＧ抗体では、抗体の各アームに存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境においてその三次元立体構成をとるときに抗原結合部位を形成するように特異的に配置された、短く非連続のアミノ酸配列である。
【００７１】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの残余を含むフレームワーク領域は、分子間におけるアミノ酸配列のばらつきが小さい。むしろ、フレームワーク領域は、大部分がβシート構成をとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する、ループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間における非共有結合的な相互作用により、６つのＣＤＲを適正な配向性で配置する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合部位は、免疫反応性の抗原（すなわち、Ｎｏｔｕｍ）におけるエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体の免疫反応性の抗原エピトープへの非共有結合的な結合を促進する。ＣＤＲの位置は、当業者により容易に同定されうることが理解されるであろう。
【００７２】
以下でより詳細に論じられる通り、標準的な組換え法および発現法を用いて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全部または一部を組み換えるかまたは操作して、有効な抗体をもたらすことができる。すなわち、第１の抗体に由来する重鎖可変領域または軽鎖可変領域（またはこれらの任意の部分）は、第２の抗体に由来する重鎖可変領域または軽鎖可変領域の任意の選択された部分と混合しマッチさせることができる。例えば、一実施形態では、第１の抗体の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域の全体を、作動的な抗体をもたらす第２の抗体の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域の全体と対合させることができる。さらに、他の実施形態では、多様な抗体に由来する個別の重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲとを混合しマッチさせて、特徴を最適化した所望の抗体をもたらすことができる。したがって、例示的な抗体は、第１の抗体に由来する３つの軽鎖ＣＤＲ、第２の抗体に由来する２つの重鎖ＣＤＲ、および第３の抗体に由来する第３の重鎖ＣＤＲを含みうる。
【００７３】
より具体的に述べると、本発明との関係では、図７Ｂに開示される重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのうちのいずれかをこのようにして再配列して、本教示に従い最適化した抗Ｎｏｔｕｍ（例えば、抗Ｎｏｔｕｍ）抗体をもたらしうることが理解されるであろう。
【００７４】
いずれにせよ、相補性決定領域の残基数は、Ｋａｂａｔら（１９９１年、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｖａ．）による残基数、とりわけ、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＣＤＲ３）として規定することができる。ＣＤＲは、抗体ごとに大幅に変化する（かつ、定義により、Ｋａｂａｔによるコンセンサス配列との相同性を呈示しない）ことに注意されたい。フレームワーク残基の最大のアライメントは、Ｆｖ領域に用いられる番号付けシステムでのスペーサー残基の挿入を要求することが多い。加えて、種間の相違または対立遺伝子間の相違のために、所与の任意のＫａｂａｔ部位番号における特定の個別の残基の同一性も、抗体鎖ごとに変化しうる。また、定義が、互いと比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを包含する、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；およびＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２６２巻：７３２〜７４５頁（１９９６年）も参照されたい。前述の参考文献の各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、上記に引用された参考文献の各々により規定されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較のために示される。
【００７５】
【表１−１】
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簡便さを目的として述べると、図７Ｂに示されるＣＤＲならびに図３１Ａおよび３１Ｂで下線を付されるＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａらの用語法を用いて規定されるが、本出願の内容を踏まえるなら、当業者であれば、それぞれの各重鎖配列および各軽鎖配列について、Ｋａｂａｔらにより規定されるＣＤＲを容易に同定および計数することもできるであろうし、ＭａｃＣａｌｌｕｍらにより規定されるＣＤＲを容易に同定および計数することもできるであろう。したがって、このような用語法により規定されるＣＤＲを含む抗体は、本発明の範囲内に明示的に含まれる。より広く述べると、可変領域ＣＤＲのアミノ酸残基という用語は、上記で示した方法に基づく任意の配列または構造を用いて同定されるＣＤＲにおけるアミノ酸を包含する。
【００７６】
本明細書で用いられる可変領域フレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸残基という用語は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域におけるこれらのアミノ酸を指す。本明細書で用いられるフレームワーク領域またはＦＲ領域という用語は、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではない（例えば、ＫａｂａｔによるＣＤＲの定義を用いる）アミノ酸残基を包含する。したがって、可変領域のフレームワークは、約１００〜１２０アミノ酸の長さの非連続配列であるが、ＣＤＲの外側にあるアミノ酸だけを包含する。
【００７７】
Ｋａｂａｔらにより規定される重鎖可変領域およびＣＤＲの具体例では、フレームワーク領域１が、アミノ酸１〜３０を包含する可変領域ドメインに対応し、フレームワーク領域２が、アミノ酸３６〜４９を包含する可変領域ドメインに対応し、フレームワーク領域３が、アミノ酸６６〜９４を包含する可変領域ドメインに対応し、フレームワーク領域４が、アミノ酸１０３〜可変領域末端にわたる可変領域ドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖可変領域ＣＤＲの各々により同様に分離される。同様に、ＣｈｏｔｈｉａらまたはＭｃＣａｌｌｕｍらによるＣＤＲの定義を用いて、上記の通り、フレームワーク領域の境界を、それぞれのＣＤＲ末端により分離する。
【００７８】
前述の構造についての検討事項を念頭に置くと、当業者は、本発明の抗体が、多数の機能的実施形態のうちのいずれか１つを含みうることを理解するであろう。この点では、適合可能な抗体が、被験体において所望の生理学的応答をもたらす任意の免疫反応性抗体（この用語が本明細書で規定される通りの免疫反応性抗体）を含みうる。開示される抗体のうちのいずれかは、本教示と共に使用され得る一方、本発明の特定の実施形態は、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、もしくはヒトモノクローナル抗体、またはこれらの免疫反応性断片を含む。しかし、他の実施形態は、例えば、均一であるかまたは異質な、多量体の構築物、Ｆｃ変異体、およびコンジュゲート、またはグリコシル化について変化させた抗体を含みうる。さらに、このような立体構成は相互に除外的ではなく、適合可能な個別の抗体が、本明細書で開示される機能的態様のうちの１または複数を含みうることが理解される。例えば、適合可能な抗体は、ヒト化可変領域を伴う単鎖ダイアボディーまたは血清半減期を調節するようにグリコシル化パターンを変化させるＦｃ修飾を伴う完全ヒト全長ＩｇＧ３抗体を含みうる。当業者には他の例示的な実施形態が、容易に明らかであり、本発明の範囲内にあるものとして容易に識別可能でありうる。
【００７９】
ｂ．抗体の生成
周知の通り、本明細書の教示に従い、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた多様な宿主動物に接種し、これらを用いて抗体をもたらすことができる。接種される種に応じて免疫応答を増大させるのに使用され得る、当技術分野において公知のアジュバントには、フロイントアジュバント（フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、水酸化アルミニウムなどの無機物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油のエマルジョン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなど、潜在的に有用なヒト用アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。このようなアジュバントは、抗原を局所的な沈着物中に封鎖することにより急速な分散から保護する場合もあり、それらが、宿主を刺激して、マクロファージおよび免疫系の他の構成要素に走化性である因子を分泌させる物質を含有する場合もある。ポリペプチドを投与する場合は、免疫化のスケジュールが、ポリペプチドの、数週間にわたる２回以上の投与を伴うことが好ましい。
【００８０】
Ｎｏｔｕｍの免疫原で動物を免疫化した後、当技術分野で認知された技法を用いて、この動物から抗体および／または抗体生成細胞を得ることができる。一部の実施形態では、動物から採血するかまたはこれを屠殺することにより、抗Ｎｏｔｕｍポリクローナル抗体を含有する血清を得る。血清は、研究を目的として、動物から得られた形態で用いることもでき、代替法では、抗Ｎｏｔｕｍ抗体を免疫グロブリン画分化または均一な抗体調製物をもたらすように部分的または完全に精製することもできる。
【００８１】
ｃ．モノクローナル抗体
本発明の特定の態様と共にポリクローナル抗体を使用し得る一方で、好ましい実施形態は、Ｎｏｔｕｍ反応性のモノクローナル抗体の使用も含む。本明細書で用いられるモノクローナル抗体またはｍＡｂという用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、変異、例えば、少量で存在しうる天然の変異の可能性を除き同一である。したがって、修飾語句であるモノクローナルは、異なる抗体の混合物としてではない抗体の特徴を示し、任意の種類の抗体と共に用いることができる。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体が、Ｎｏｔｕｍと結合するかまたはこれと会合するポリペプチド配列を含む抗体であって、Ｎｏｔｕｍに結合するポリペプチド配列が、単一の標的結合ポリペプチド配列の複数のポリペプチド配列からの選択を包含する工程を介して得られる抗体を包含する。
【００８２】
好ましい実施形態では、抗体生成細胞系を、免疫化した動物から単離された細胞から調製する。免疫化の後、動物を屠殺し、リンパ節および／または脾臓のＢ細胞を、当技術分野において周知の手段により不死化させる。細胞を不死化させる方法には、それらをがん遺伝子でトランスフェクトする方法、それらに発がん性のウイルスを感染させ、それらを不死化細胞について選択する条件下で培養する方法、それらを発がん性の化合物下または変異を引き起こす化合物下に置く方法、それらを不死化細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させる方法、および腫瘍抑制遺伝子を不活化させる方法が含まれるがこれらに限定されない。骨髄腫細胞との融合を用いる場合は、骨髄腫細胞が、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞系である）ことが好ましい。不死化細胞は、Ｎｏｔｕｍまたはその免疫反応性部分を用いてスクリーニングする。好ましい実施形態では、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイを用いて初期スクリーニングを実施する。
【００８３】
より一般的に述べると、本発明と矛盾しない個別のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え法、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）またはＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標））、またはこれらの一部の組合せを含めた、当技術分野で公知の多種多様な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、上記で広く記載され、それらの各々が本明細書に援用される、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）においてより詳細に教示されるハイブリドーマ法などを用いて生成させることができる。抗体は、開示されるプロトコールを用いて、哺乳動物において、関連する抗原およびアジュバントを複数回にわたり皮下注射または腹腔内注射することにより惹起されることが好ましい。既に論じた通り、この免疫化は一般に、抗原反応性抗体（免疫化する動物をトランスジェニックとする場合は、完全ヒト抗体でありうる）の、活性化させた脾臓細胞またはリンパ球からの生成を含む免疫反応を誘発する。結果として得られる抗体を動物の血清から採取して、ポリクローナル調製物をもたらしうるのに対し、個別のリンパ球を脾臓、リンパ節、または末梢血から単離して、均一のモノクローナル抗体の調製物をもたらすことが一般により望ましい。リンパ球は、脾臓から得、不死化してハイブリドーマをもたらすことが最も典型的である。
【００８４】
例えば、上記の通り、選択工程は、固有のクローンの、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローンからの選択でありうる。選択されたＮｏｔｕｍ結合配列をさらに変化させて、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養物におけるその生成を改善し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低減し、多重特異性抗体などを創出することができ、標的結合配列の変化を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）を指向する個別の抗体を包含することが典型的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基を指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらに交差反応性でありうる他の免疫グロブリンが夾雑していないことが典型的であるという点において有利である。
【００８５】
ｄ．キメラ抗体
別の実施形態では、本発明の抗体が、少なくとも２つの異なる種または種類の抗体に由来する、共有結合させたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含みうる。本明細書で用いられるキメラ抗体という用語は、それらが所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくは特定の抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたはこれと相同である一方、鎖（複数可）の残りは、他の種に由来する抗体または他の抗体クラスもしくは他の抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたはこれと相同である構築物ならびにそのような抗体の断片を対象とする（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））ことが理解されるであろう。例示的な一実施形態では、本明細書の教示に従うキメラ抗体が、マウスＶＨアミノ酸配列およびマウスＶＬアミノ酸配列と、ヒト供給源に由来する定常領域とを含みうる。他の適合可能な実施形態では、本発明のキメラ抗体が、以下で記載されるＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体を含みうる。
【００８６】
一般に、キメラ抗体を作製する目標は、意図される対象種に由来するアミノ酸の数を最大化するキメラを創出することである。１つの例は、抗体が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくは特定の抗体サブクラスに属する１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方、抗体鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくは別の抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたはこれと相同である、ＣＤＲ移植抗体である。ヒトにおいて用いる場合は、齧歯動物抗体に由来する可変領域または選択されたＣＤＲを、ヒト抗体へと移植して、ヒト抗体の天然の可変領域またはＣＤＲを置換することが多い。これらの構築物は一般に、完全強度のモジュレーター機能（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣなど）をもたらす一方で、被験体による抗体に対する有害な免疫反応を低減する利点を有する。
【００８７】
ｅ．ヒト化抗体
ヒト化抗体とは、ＣＤＲ移植抗体に類似している。一般に、ヒト化抗体は、当初ヒト以外の動物において発生させたモノクローナル抗体から生成させる。本明細書で用いられる非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体が、レシピエントのＣＤＲに由来する残基を、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物など、非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基で置換したヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【００８８】
選択された実施形態では、アクセプター抗体が、コンセンサス配列を含みうる。ヒトコンセンサスフレームワークを創出するには、いくつかのヒト重鎖アミノ酸配列またはヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するフレームワークを整列させて、コンセンサスのアミノ酸配列を同定することができる。さらに、多くの場合、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインにおける１または複数のフレームワーク残基を、ドナー抗体に由来する、対応する非ヒト残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法を介して、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して、抗原への結合に重要なフレームワーク残基を同定することを介して、かつ、特定の位置におけるまれなフレームワーク残基を同定する配列比較を介して同定する。このような置換は、移植されたＣＤＲ（複数可）の適切な三次元的立体構成を維持する一助となり、フレームワーク置換を伴わない類似の構築物に対して親和性を改善することが多い。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基も含みうる。これらの修飾を行い、周知の技法を用いて抗体の性能をさらに洗練させることができる。
【００８９】
ＣＤＲの移植およびヒト化抗体については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０、同５，６９３，７６２、同５，６９３，７６１、同５，５８５，０８９、および同５，５３０，１０１において記載されている。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲのうちの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、フレームワーク領域のうちの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によってまた、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃも含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。また、例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻：１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２３巻：１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５巻：４２８〜４３３頁（１９９４年）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および同７，０８７，４０９も参照されたい。さらに別の方法は、ヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）と称し、例えば、Ｕ．Ｓ．２００５／０００８６２５に記載されている。本出願の目的では、ヒト化抗体という用語が、フレームワーク置換を伴わないか、または最小限のフレームワーク置換を伴うＣＤＲ移植抗体（すなわち、１または複数の移植された非ヒトＣＤＲを含むヒト抗体）を明示的に包含すると考えられる。
【００９０】
加えて、非ヒト抗Ｎｏｔｕｍ抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において開示される方法を介して、ヒトＴ細胞エピトープを特異的に欠失させるかまたは脱免疫化することにより改変することもできる。略述すると、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて解析することができ、これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７で規定される）を表す。潜在的なＴ細胞エピトープを検出するには、ペプチドスレディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）と称する、コンピュータによるモデル化法を適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において記載されているＶＨ配列およびＶＬ配列に存在するモチーフについて検索することもできる。これらのモチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのうちのいずれかに結合し、これにより、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域における少数のアミノ酸残基を置換することにより消失させることもでき、単一のアミノ酸置換により消失させることもできる。可能な限り、保存的置換を行う。ヒト生殖細胞系列の抗体配列における位置と共通のアミノ酸を使用し得ることが多いが、必ずしもそうではない。脱免疫化する変化を同定した後は、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸を、変異誘発または他の合成方法（例えば、新規の合成、カセット置換など）により構築することができる。変異誘発された可変配列は、場合によって、ヒト定常領域に融合させることもできる。
【００９１】
選択された実施形態では、ヒト化抗体の可変領域残基のうちの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％が、親フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列の可変領域残基に対応する。他の実施形態では、ヒト化抗体残基のうちの少なくとも８５％または９０％が、親フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列の残基に対応する。さらに好ましい実施形態では、ヒト化抗体残基のうちの９５％超が、親フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列の残基に対応する。
【００９２】
ヒト化抗体は、本明細書で記載される一般的な分子生物学法および生体分子操作法を用いて作製することができる。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つに由来する免疫グロブリンのＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離するステップと、操作するステップと、発現させるステップとを包含する。当業者には、このような核酸の供給源が周知であり、例えば、上記の通り、所定の標的に対する抗体または免疫反応性断片を生成させる、ハイブリドーマ、真核細胞、またはファージから得ることもでき、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子から得ることもでき、合成構築物から得ることもできる。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡは、適切な発現ベクターへとクローニングすることができる。
【００９３】
ヒト生殖細胞系列の配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．  Ａ．ら（１９９２年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７７６〜７９８頁；Ｃｏｏｋ，  Ｇ．  Ｐ．ら（１９９５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、１６巻：２３７〜２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｄ．ら（１９９２年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、２２７巻：７９９〜８１７頁；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５年）、ＥＭＢＯ  Ｊ、１４巻：４６２８〜４６３８頁において開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥの要覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な要覧をもたらす（Ｒｅｔｔｅｒら、（２００５年）、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、３３巻：６７１〜６７４頁を参照されたい）。これらの配列は、ヒト配列の供給源、例えば、フレームワーク領域およびＣＤＲに用いることができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４において記載されている通り、本明細書で示されるヒトコンセンサスフレームワーク領域もまた用いることができる。
【００９４】
ｆ．ヒト抗体
前述の抗体に加えて、当業者は、本発明の抗体が、完全ヒト抗体を含みうることを理解するであろう。本出願の目的では、ヒト抗体という用語が、ヒトに生成させた抗体および／または本明細書で開示されるヒト抗体を作製する技法のうちのいずれかを用いて作製した抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を含む。ヒト抗体についてのこの定義は、とりわけ、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００９５】
ヒト抗体は、当技術分野で公知の多様な技法を用いて生成させることができる。上記で示唆した通り、本教示に従い、ファージディスプレイ法を用いて、免疫活性の結合領域をもたらすことができる。したがって、本発明の特定の実施形態は、抗Ｎｏｔｕｍ抗体またはその抗原結合部分を生成させる方法であって、ファージにおいて抗体ライブラリー（好ましくはヒト抗体ライブラリー）を合成するステップと、このライブラリーをＮｏｔｕｍまたはその抗体結合部分でスクリーニングするステップと、Ｎｏｔｕｍに結合するファージを単離するステップと、免疫反応性断片をファージから得るステップとを含む方法をもたらす。例を目的として述べると、ファージディスプレイ法において用いられる抗体ライブラリーを調製する一方法は、ヒトまたはヒト以外の免疫グロブリン遺伝子座を含むヒト以外の動物を、Ｎｏｔｕｍまたはその抗原性部分で免疫化して免疫応答を創出するステップと、抗体生成細胞を免疫化された動物から抽出するステップと、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを抽出された細胞から単離するステップと、ＲＮＡを逆転写させてｃＤＮＡを生成させるステップと、プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅するステップと、ファージにおいて抗体を発現させるように、ｃＤＮＡを、ファージディスプレイベクターへと挿入するステップとを含む。より具体的に述べると、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲを介してｓｃＦｖリンカーと併せて組み換え、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）へとクローニングする。次いで、ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉへと電気穿孔することができ、次いで、このＥ．ｃｏｌｉにヘルパーファージを感染させる。これらの方法で用いられるファージは、典型的に、ｆｄファージおよびＭ１３ファージを含めた糸状ファージであり、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはファージ遺伝子ＶＩＩＩに組換えにより融合させる。
【００９６】
上記の通りに調製した、組換えによるコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の組換えヒト抗Ｎｏｔｕｍ抗体を単離することができる。好ましい実施形態では、ライブラリーが、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを用いて生成したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。当技術分野では、このようなライブラリーを調製およびスクリーニングする方法が周知であり、ファージディスプレイライブラリーを生成させるためのキット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、型番：２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、型番：２４０６１２）が市販されている。また、抗体ディスプレイライブラリーを生成させ、スクリーニングするのに使用され得る他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９１／１７２７１号、同第ＷＯ９２／２０７９１号、同第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ９３／０１２８８号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：１３７０〜１３７２頁（１９９１年）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻：８１〜８５頁（１９９２年）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）；Ｇａｒｒａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：１３７３〜１３７７頁（１９９１年）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９巻：４１３３〜４１３７頁（１９９１年）；およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照されたい）。
【００９７】
ナイーブのライブラリー（天然または合成のいずれか）によって生成された抗体は、中程度の親和性（Ｋａを約１０６〜１０７Ｍ−１とする）であるが、また、当技術分野において記載されている通り、二次的なライブラリーを構築し、これらから再選択することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、親和性成熟を模倣することもできる。例えば、変異は、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）の方法において、またはＧｒａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）の方法において、変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼを用いることにより（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）において報告されている）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてランダムに導入することができる。加えて、親和性成熟は、選択された個別のＦｖクローンにおいて、例えば、対象のＣＤＲにわたり、ランダム配列を保有するプライマーによるＰＣＲを用いて、１または複数のＣＤＲをランダムに変異させ、高親和性のクローンをスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域において変異誘発を誘導し、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出する方法について記載している。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、免疫化されていないドナーから得られる天然のＶドメイン変異体のレパートリーを伴うファージディスプレイを介して選択されるＶＨドメインまたはＶＬドメインを組み換え、数回のラウンドにわたり鎖をリシャフリングすることにより高親和性についてスクリーニングすることである。この技法は、解離定数Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を約１０−９Ｍ以下とする抗体および抗体断片の生成を可能とする。
【００９８】
それらの表面において結合対を発現させる真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリーを用いる類似の手順を使用し得ることがさらに理解されるであろう。ファージディスプレイ技術と同様に、真核生物によるライブラリーを対象の抗原（すなわち、Ｎｏｔｕｍ）に対してスクリーニングし、候補結合対を発現させる細胞を単離し、クローニングする。ライブラリー内容物を最適化し、反応性結合対を親和性成熟させるステップを採用することができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態では、ヒト抗体を、ヒト抗体を発現させるファージライブラリーから選択する（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）；Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２２２巻：５８１頁（１９９１年））。他の実施形態では、ヒト結合対を、酵母などの真核細胞において生成させたコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離することができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技法は、多数の候補モジュレーターをスクリーニングし、候補配列の比較的容易な操作（例えば、親和性成熟または組換えシャフリングを介する）をもたらすことを可能として有利である。
【００９９】
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化させたトランスジェニック動物、例えば、マウスへと導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、遺伝子の再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含めた全ての点でヒトにおいて見られるヒト抗体の生成と酷似するヒト抗体の生成が観察される。この手法は、例えば、以下：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：８１２〜１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：８４５〜５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：８２６頁（１９９６年）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）の科学刊行物と共に、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）法に関する、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；同５，５４５，８０６；同５，５６９，８２５；同５，６２５，１２６；同５，６３３，４２５；同５，６６１，０１６、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ６，０７５，１８１、および同６，１５０，５８４に記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原を指向する抗体を生成させるヒトＢリンパ球を不死化させることにより調製することもできる（このようなＢリンパ球は、新生物性障害を患っている個体から回収することもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて免疫化することもできる）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７巻（１号）：８６〜９５頁（１９９１年）；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照されたい。
【０１００】
ＶＩ．抗体の特徴
どのようにして得られようとも、または抗体モジュレーターが前述の形態のうちのいずれの形態（例えば、ヒト化形態、ヒト形態など）をとろうとも、開示されるモジュレーターの好ましい実施形態は、多様な特徴を呈示しうる。この点で、抗Ｎｏｔｕｍ抗体の生成細胞（例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー）を、例えば、頑健な成長、高度な抗体生成、および以下でより詳細に論じられる所望の抗体特徴を含めた所望の特徴について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、同系動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖させることもでき、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいて拡大増殖させることもでき、細胞培養物中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させることもできる。それらの各々が異なる抗体種を生成させるハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択し、クローニングし、拡大増殖させる方法は、当業者に周知である。
【０１０１】
ａ．中和抗体
特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターが、中和抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。中和抗体または中和アンタゴニストという用語は、リガンドまたは酵素に結合するかまたはこれと相互作用し、リガンドまたは酵素のその結合パートナーまたは基質への結合を防止し、中断されなければ２つの分子の相互作用から生じる生物学的応答を中断する抗体またはアンタゴニストを指す。抗体またはその免疫学的に機能的な断片もしくは誘導体の結合および特異性の評価では、過剰な抗体により、標的分子に結合した結合パートナーの量が、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上（本明細書の実施例に示されるＴＣＦアッセイなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける競合的結合アッセイにより測定される）低減される場合、抗体または断片は、リガンドまたは酵素のその結合パートナーまたは基質への結合を実質的に阻害する。Ｎｏｔｕｍに対する抗体の場合、中和抗体またはアンタゴニストは、ＮｏｔｕｍがＧＰＩを切断する能力を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上減殺し、これにより、遊離グリピカンの濃度を低減する。このグリピカン濃度の減殺は、当技術分野で認知された技法を用いて直接測定する場合もあり、このような低下がＷｎｔ、Ｈｈ、またはＢＭＰなど、Ｎｏｔｕｍ関連経路に対して及ぼす影響を介して測定する場合もあることが理解されるであろう。
【０１０２】
ｂ．内部移行抗体
証拠は、Ｎｏｔｕｍが細胞により分泌されうることを示すが、少なくとも一部のＮｏｔｕｍは、細胞表面との会合を維持する可能性が高く、これにより、開示されるモジュレーターの内部移行を可能とする。したがって、抗Ｎｏｔｕｍ抗体は、Ｎｏｔｕｍを発現させる細胞により、少なくともある程度は内部移行されうる。例えば、腫瘍始原細胞の表面においてＮｏｔｕｍに結合する抗Ｎｏｔｕｍ抗体は、腫瘍始原細胞により内部移行されうる。特に好ましい実施形態では、このような抗Ｎｏｔｕｍ抗体を、内部移行させると細胞を死滅させる細胞傷害性部分と会合させることもでき、これとコンジュゲートすることもできる。
【０１０３】
本明細書で用いられる、内部移行する抗Ｎｏｔｕｍ抗体とは、哺乳動物細胞と関連するＮｏｔｕｍに結合すると、この細胞により取り込まれる抗Ｎｏｔｕｍ抗体である。内部移行抗体には、抗体断片、ヒト抗体またはヒト化抗体、および抗体コンジュゲートが含まれる。内部移行は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生する場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発生する場合もある。治療的適用では、内部移行をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発生させることができる。内部移行させる抗体分子の数は、Ｎｏｔｕｍ発現細胞、とりわけ、Ｎｏｔｕｍ発現腫瘍始原細胞を死滅させるのに十分であるかまたは適度でありうる。場合によっては、抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、単一の抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、特定の毒素は、抗体にコンジュゲートした１つの毒素分子の内部移行が、腫瘍細胞を死滅させるのに十分であるように、殺滅の効力が高い。抗Ｎｏｔｕｍ抗体が、哺乳動物細胞におけるＮｏｔｕｍに結合すると内部移行するかどうかは、以下の実施例において記載されているアッセイを含めた多様なアッセイにより決定することができる。抗体が細胞へと内部移行するかどうかを検出する方法は、参照によりその全体において本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８において記載されている。
【０１０４】
ｃ．枯渇化抗体
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターが、枯渇化抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。枯渇化抗体という用語は、細胞表面において、または細胞表面の近傍においてＮｏｔｕｍに結合するかまたはこれと会合し、細胞の死滅または消失を誘導するか、促進するか、または引き起こす（例えば、補体依存性細胞傷害作用または抗体依存性細胞傷害作用を介して）抗体または断片を指す。以下でより完全に論じられる一部の実施形態では、選択された枯渇化抗体を、細胞傷害性剤と会合させるか、またはこれとコンジュゲートする。枯渇化抗体は、規定された細胞集団内の腫瘍永続細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を除去するか、消失させるか、または死滅させうることが好ましい。一部の実施形態では、細胞集団が、濃縮されるか、区分されるか、精製されるか、または単離された腫瘍永続細胞を含みうる。他の実施形態では、細胞集団が、腫瘍永続細胞を含む全腫瘍試料を含む場合もあり、腫瘍永続細胞を含む異質な腫瘍抽出物を含む場合もある。当業者は、本明細書の教示に従い、以下の実施例に記載されている標準的な生化学的技法を用いて、腫瘍永続細胞の枯渇をモニタリングおよび定量化しうることを理解するであろう。
【０１０５】
ｄ．エピトープとの結合
開示される抗Ｎｏｔｕｍ抗体は、選択された標的（複数可）により提示される異なるエピトープまたは決定基と会合するかまたはこれに結合することがさらに理解される。本明細書で用いられるエピトープという用語は、特定の抗体が認識することが可能であり、特定の抗体が特異的に結合することが可能な標的抗原の部分を指す。抗原がＮｏｔｕｍなどのポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置される連続アミノ酸および非連続アミノ酸の両方から形成されうる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質が変性しても保持されるが、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質が変性すると失われる。エピトープは、典型的に、固有の空間コンフォメーションにおける少なくとも３アミノ酸、およびより通常は少なくとも５アミノ酸、または８〜１０アミノ酸を包含する。より具体的に述べると、当業者は、エピトープという用語が、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能であるか、または分子と他の形で相互作用することが可能な任意のタンパク質決定基を包含することを理解するであろう。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸または炭水化物または糖の側鎖など、分子の化学的に活性な表面群（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなり、一般に特異的な三次元構造上の特徴のほか、特異的な電荷特徴を有する。加えて、エピトープは、直鎖状の場合もあり、コンフォメーション性の場合もある。直鎖状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体などの分子）との間の全ての相互作用点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に発生する。コンフォメーションエピトープでは、相互作用点が、直鎖においては互いに分離する、タンパク質におけるアミノ酸残基を横断して発生する。
【０１０６】
抗原における所望のエピトープを決定したら、例えば、本明細書で記載される技法を用いて、そのエピトープに対する抗体を生成させることができる。代替的には、発見過程において、抗体の生成および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報が明らかになりうる。次いで、この情報により、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能となる。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する抗体、すなわち、抗原への結合について競合する抗体を見出す競合研究を実施することである。それらの交差競合に基づく、抗体をビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）するためのハイスループット工程については、ＷＯ０３／４８７３１において記載されている。
【０１０７】
本明細書で用いられる、ビニングという用語は、それらの抗原への結合特徴に基づき抗体を群分けする方法を指す。ビンの割当ては、被験抗体の、観察される結合パターンがどれほど異なるかに応じて、ある程度恣意的である。したがって、この技法は、本発明の抗体を類別するのに有用なツールであるが、ビンがエピトープと常に直接相関するわけではなく、当技術分野で認知された他の方法を介して、このような初期決定をさらに確認するべきである。
【０１０８】
この警告を踏まえて、当技術分野において公知であり、本明細書の実施例でも示される方法を用いることにより、選択された一次抗体（またはその断片）が、第２の抗体と同じエピトープに結合するのか、または第２の抗体との結合について交差競合するのかを決定することができる。一実施形態では、飽和条件下で、本発明の一次抗体をＮｏｔｕｍに結合させ、次いで、二次抗体がＮｏｔｕｍに結合する能力を測定する。被験抗体が一次抗Ｎｏｔｕｍ抗体と同時にＮｏｔｕｍに結合することが可能であるならば、二次抗体は、一次抗体と異なるエピトープに結合する。しかし、二次抗体が、Ｎｏｔｕｍに同時に結合することが可能でないならば、二次抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、または一次抗体が結合したエピトープにごく近接するエピトープに結合する。当技術分野で公知であり、以下の実施例で詳述される通り、所望のデータは、直接的もしくは間接的な固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接的もしくは間接的な固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム（すなわち、表面プラズモン共鳴：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（すなわち、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）、またはフローサイトメトリー法を用いて得ることができる。本明細書で用いられる表面プラズモン共鳴という用語は、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。特に好ましい実施形態では、以下の実施例で実証される通り、ＢｉａｃｏｒｅまたはＦｏｒｔｅＢｉｏ装置を用いて解析を実施する。
【０１０９】
同じエピトープについて競合する抗体の文脈で用いられる場合の競合という用語は、抗体間の競合を、被験下の抗体または免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を防止するかまたは阻害するアッセイにより決定することを意味する。典型的に、このようなアッセイは、これらの標識されていない被験免疫グロブリンおよび標識された基準免疫グロブリンのうちのいずれかを保有する固体表面または細胞に結合させた、精製された抗原の使用を伴う。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下における固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常は、被験免疫グロブリンが過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合したエピトープに対して、立体障害が発生するのに十分な程度に近位の隣接エピトープに結合する抗体を包含する。本明細書の実施例では、競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細が提供される。通常、競合抗体が過剰に存在すると、基準抗体の共通抗原への特異的結合が、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害される。場合によっては、結合が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上阻害される。
【０１１０】
エピトープ特異性以外に、開示される抗体は、例えば、結合親和性、融解温度（Ｔｍ）、および等電点を含めた、多数の異なる物理的特徴を用いて特徴付けることができる。
【０１１１】
ｅ．結合親和性
この点では、本発明が、Ｎｏｔｕｍに対する結合親和性が高い抗体の使用をさらに包含する。その解離定数であるＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、≦１０−８Ｍである場合に、本発明の抗体は、その標的抗原に特異的に結合すると言う。Ｋｄが≦５×１０−９Ｍである場合に、抗体は、高い親和性で抗原に特異的に結合し、Ｋｄが≦５×１０−１０Ｍである場合に、極めて高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のＫｄを≦１０−９Ｍとし、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を約１×１０−４／秒とする。本発明の一実施形態では、解離速度を＜１×１０−５／秒とする。本発明の他の実施形態では、抗体が、Ｋｄを約１０−８Ｍ〜１０−１０ＭでＮｏｔｕｍに結合し、さらに別の実施形態では、Ｋｄ≦２×１０−１０ＭでＮｏｔｕｍに結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、解離定数またはＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を、１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、または５×１０−１５Ｍ未満とする抗体を含む。
【０１１２】
特定の実施形態では、Ｎｏｔｕｍに免疫特異的に結合する本発明の抗体の会合速度定数またはｋｏｎ速度（Ｎｏｔｕｍ（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）が、少なくとも１０５Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも２×１０５Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも５×１０５Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも１０６Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも５×１０６Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも１０７Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも５×１０７Ｍ−ｌ秒−ｌ、または少なくとも１０８Ｍ−ｌ秒−ｌである。
【０１１３】
別の実施形態では、Ｎｏｔｕｍに免疫特異的に結合する本発明の抗体のｋｏｆｆ速度（Ｎｏｔｕｍ（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）が、１０−ｌ秒−ｌ未満、５×１０−ｌ秒−ｌ未満、１０−２秒−ｌ未満、５×１０−２秒−ｌ未満、１０−３秒−ｌ未満、５×１０−３秒−ｌ未満、１０−４秒−ｌ未満、５×１０−４秒−ｌ未満、１０−５秒−ｌ未満、５×１０−５秒−ｌ未満、１０−６秒−ｌ未満、５×１０−６秒−ｌ未満、１０−７秒−ｌ未満、５×１０−７秒−ｌ未満、１０−８秒−ｌ未満、５×１０−８秒−ｌ未満、１０−９秒−ｌ未満、５×１０−９秒−ｌ未満、または１０−１０秒−ｌ未満である。
【０１１４】
本発明の他の選択された実施形態では、抗Ｎｏｔｕｍ抗体の親和性定数またはＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×１０１５Ｍ−１である。
【０１１５】
ｆ．等電点
前述の結合特性に加えて、抗Ｎｏｔｕｍ抗体およびその断片は、全てのポリペプチドと同様に、一般にポリペプチドが正味の電荷を保有しないときのｐＨとして規定される等電点（ｐＩ）を有する。当技術分野では、タンパク質の溶解度が、典型的に、溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）と等しいときに最も低くなることが公知である。したがって、抗体におけるイオン化可能な残基の数および場所を変化させ、ｐＩを調整することにより、溶解度を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、適切なアミノ酸置換を行うことにより（例えば、リシンなどの荷電アミノ酸を、アラニンなどの非荷電残基で置換することにより）操作することができる。あらゆる特定の理論に拘束されることを望まないが、抗体のｐＩの変化を結果としてもたらす前記抗体のアミノ酸置換により、抗体の溶解度および／または安定性を改善することができる。当業者ならば、どのアミノ酸置換であれば、特定の抗体が所望のｐＩを達成するのに最も適切であるのかを理解するであろう。
【０１１６】
タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動および多様なコンピュータアルゴリズムが含まれるがこれらに限定されない多様な方法（例えば、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔら、１９９３年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１４巻：１０２３頁を参照されたい）を介して決定することができる。一実施形態では、本発明の抗Ｎｏｔｕｍ抗体のｐＩが、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０よりも高い。別の実施形態では、本発明の抗Ｎｏｔｕｍ抗体のｐＩが、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０よりも高い。さらに別の実施形態では、本発明の抗体のｐＩを結果として変化させる置換が、それらのＮｏｔｕｍに対する結合親和性をそれほどは減殺しない。以下でより詳細に論じられる通り、とりわけ、ＦｃγＲへの結合を結果として変化させるＦｃ領域の置換（複数可）がまた、ｐＩも結果として変化させうることが意図される。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域の置換（複数可）が、とりわけ、ＦｃγＲ結合の所望の変化およびｐＩの任意の所望の変化の両方を果たすように選択される。本明細書で用いられる、ｐＩ値は、優勢な荷電形態のｐＩとして定義される。
【０１１７】
ｇ．熱安定性
抗体のＦａｂドメインのＴｍが、抗体の熱安定性の良好な指標であることが可能であり、保管寿命をさらに示しうることがさらに理解されるであろう。Ｔｍとは、所与のドメインまたは配列について５０％のアンフォールディングをもたらす温度に過ぎない。より低いＴｍは増大した凝集／低い安定性を示すのに対し、より高いＴｍは少ない凝集／高い安定性を示す。したがって、Ｔｍが高い抗体または断片もしくは誘導体が好ましい。さらに、当技術分野で認知されている技法を用いて、抗Ｎｏｔｕｍ抗体またはそのドメインの組成を変化させ、分子の安定性を増大させるかまたは最適化することが可能である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，９６０，１４２を参照されたい。したがって、一実施形態では、選択された抗体のＦａｂドメインのＴｍ値が、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、または１２０℃より高い。別の実施形態では、抗体のＦａｂドメインのＴｍ値が、少なくとも約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃、または約１２０℃より高い。タンパク質ドメイン（例えば、Ｆａｂドメイン）の熱融解温度（Ｔｍ）は、当技術分野で公知の任意の標準的な方法を用いて、例えば、示差走査熱量測定により測定することができる（例えば、それらの両方が参考として本明細書に援用される、Ｖｅｒｍｅｅｒら、２０００年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．、７８巻：３９４〜４０４頁；Ｖｅｒｍｅｅｒら、２０００年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．、７９巻：２１５０〜２１５４頁を参照されたい）。
【０１１８】
ＶＩＩ．Ｎｏｔｕｍモジュレーターの断片および誘導体
本発明の薬剤が、無傷の融合構築物を含むのであれ、抗体を含むのであれ、断片または誘導体を含むのであれ、選択されたモジュレーターは、Ｎｏｔｕｍと反応するか、結合するか、組み合わされるか、複合体化するか、接続するか、付着するか、接合するか、相互作用するか、または他の形でＮｏｔｕｍと会合し、これにより、所望の抗新生物効果をもたらす。当業者は、抗Ｎｏｔｕｍ抗体を含むモジュレーターを、抗体において発現する１または複数の結合部位を介して、Ｎｏｔｕｍと相互作用させるかまたは会合させることを理解するであろう。より具体的に述べると、本明細書で用いられる結合部位という用語は、目的の標的分子（例えば、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害剤）に選択的に結合することの一因となるポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも１つの結合部位（例えば、無傷のＩｇＧ抗体は、２つの結合ドメインと２つの結合部位とを有する）を含む。例示的な結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、または酵素ドメインが含まれる。本発明の目的では、Ｎｏｔｕｍの酵素として活性な領域（例えば、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ融合構築物の一部としての）が、基質（例えば、グリピカン）に対する結合部位を含みうる。
【０１１９】
ａ．断片
モジュレーターのどの形態（例えば、キメラ形態、ヒト化形態など）を選択して本発明を実施するかに関わらず、モジュレーターの免疫反応性断片を、本明細書の教示に従い使用され得ることが理解されるであろう。その最も広義において、抗体断片という用語は、無傷抗体（例えば、天然の免疫グロブリン）の少なくとも一部を含む。より具体的に述べると、断片という用語は、無傷または完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分（またはＦｃ融合体の場合におけるＮｏｔｕｍ分子）を指す。抗原結合断片という用語は、抗原に結合するか、または抗原への結合（すなわち、特異的結合）について無傷抗体と競合する（すなわち、それらが由来する無傷抗体と競合する）免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で用いられる抗体分子の断片という用語は、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体の軽鎖（ＶＬ）、抗体の重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディー、直鎖状抗体、抗体断片から形成された単鎖抗体分子および多重特異性抗体を包含する。同様に、Ｎｏｔｕｍの酵素的活性断片は、その、無傷Ｎｏｔｕｍと類似する形で（おそらく、ある程度効率を低下させてではあるが）Ｎｏｔｕｍ基質と相互作用し、それらを修飾する（例えば、それらを切断する（ｃｌｉｐ））能力を保持するＮｏｔｕｍ分子の一部を含む。
【０１２０】
当業者は、断片を、無傷のモジュレーターまたは完全なモジュレーター（例えば、抗体または抗体鎖）の化学的処理または酵素的処理を介して得る場合もあり、組換え手段を介して得る場合もあることを理解するであろう。この点で、多様な抗体断片が、無傷抗体の消化との関係で規定される一方、当業者は、このような断片は、化学的に新規に合成する場合もあり、組換えＤＮＡ法を用いることにより新規に合成する場合もあることを理解するであろう。したがって、本明細書で用いられる抗体という用語は、全抗体の修飾を介して生成させるか、または組換えＤＮＡ法を用いて新規に合成する抗体またはその断片もしくは誘導体を明示的に包含する。
【０１２１】
より具体的に述べると、抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を伴うＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化するその能力を反映する残余のＦｃ断片とを生成させる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋形成することも可能なＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１または複数のシステインを含めた、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨを、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を保有するＦａｂ’の記号表示とする。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成した。抗体断片の他の化学的連結もまた公知である。他の抗体断片のより詳細な説明については、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．  Ｅ．  Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９年）を参照されたい。
【０１２２】
Ｆｖ断片とは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する抗体断片であることがさらに理解されるであろう。この領域は、例えば、ｓｃＦｖでは共有結合的な性質でありうる緊密な会合下にある、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインによる二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。併せて６つのＣＤＲまたはこれらのサブセットが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でもなお、通常は結合部位全体より低い親和性においてではあるが、抗原を認識してこれに結合する能力を有する。
【０１２３】
他の実施形態では、抗体断片が、例えば、Ｆｃ領域を含み、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能、および補体結合など、無傷抗体において存在する場合にＦｃ領域と通常関連する生物学的機能のうちの少なくとも１つを保持する抗体断片である。一実施形態では、抗体断片が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期が無傷抗体と実質的に同様である一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含みうる。
【０１２４】
ｂ．誘導体
別の実施形態では、本発明のモジュレーターが、一価の場合もあり、多価（例えば、二価、三価など）の場合もあることがさらに理解されるであろう。本明細書で用いられる価数という用語は、抗体と会合する潜在的な標的（すなわち、Ｎｏｔｕｍ）の結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子または標的分子における特定の位置もしくは遺伝子座に特異的に結合する。本発明の抗体が、複数の標的結合部位（多価）を含む場合、各標的結合部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に特異的に結合する場合もある（例えば、異なるリガンドまたは異なる抗原に結合する場合もあり、同じ抗原における異なるエピトープまたは異なる位置に結合する場合もある）。本発明の目的では、対象の抗体が、ヒトＮｏｔｕｍに特異的な少なくとも１つの結合部位を有することが好ましい。一実施形態では、本発明の抗体が、分子の各結合部位がＮｏｔｕｍの単一の位置またはエピトープに特異的に結合するという点において一価である。他の実施形態では、抗体が、それらが複数の結合部位を含み、かつそれらの種々の結合部位が単一よりも多い位置またはエピトープと特異的に会合するという点において多価である。このような場合には、複数のエピトープが選択されたＮｏｔｕｍポリペプチドに存在することもあり、単一のエピトープがＮｏｔｕｍに存在することもある一方、第２の異なるエピトープが別の分子または別の表面に存在することもある。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照されたい。
【０１２５】
上記で示唆した通り、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合する場合もあり、標的分子ならびに異種ポリペプチドまたは固体の支持材料などの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合する場合もある。抗Ｎｏｔｕｍ抗体の好ましい実施形態は、２つの抗原だけに結合する（すなわち、二重特異性抗体）が、本発明ではまた、三重特異性抗体など、さらなる特異性を伴う抗体も包含される。限定なしに述べると、二重特異性抗体の例には、一方のアームがＮｏｔｕｍを指向し、他方のアームが他の任意の抗原（例えば、モジュレーターの細胞マーカー）を指向する二重特異性抗体が含まれる。当技術分野では、二重特異性抗体を作製する方法が公知である。全長二重特異性抗体の従来の生成は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁）。他のより洗練された適合可能な多重特異性構築物およびそれらの作製法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５に示されている。
【０１２６】
さらに他の実施形態では、所望の結合特異性を伴う抗体の可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。ヒンジ領域、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの融合体が好ましい。一例では、軽鎖の結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖の融合体をコードするＤＮＡと、所望の場合は、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡとを、別個の発現ベクターへと挿入し、適切な宿主生物へと共トランスフェクトする。これは、構築で用いられる３つのポリペプチド鎖の比率が同等でないことにより最適の収量がもたらされる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整するのに多大な柔軟性をもたらす。しかし、比率が同等な少なくとも２つのポリペプチド鎖が発現する結果として高収量がもたらされる場合、または比率が特別の重要性を有さない場合は、２つまたは３つのポリペプチド鎖全てのコード配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。
【０１２７】
この手法の一実施形態では、二重特異性抗体が、一方のアームにおいて第１の結合特異性を伴うハイブリッドの免疫グロブリン重鎖（例えば、Ｎｏｔｕｍ）と、他方のアームにおけるハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）とからなる。二重特異性分子の半分だけにおいて免疫グロブリン軽鎖が存在することにより分離の容易な方法がもたらされるので、この非対称性の構造は、所望の二重特異性化合物の、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの分離を促進することが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成についてのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁を参照されたい。ＷＯ９６／２７０１１において記載されている別の手法によれば、抗体分子の対を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化するように操作することができる。好ましいインターフェースは、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子のインターフェースに由来する１または複数の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。大型の側鎖（複数可）と同一であるかまたは類似のサイズである代償性の空洞（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｃａｖｉｔｙ）は、大きなアミノ酸側鎖を小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、第２の抗体分子のインターフェースを創出する。これは、ホモ二量体など、他の不要な最終生成物を上回るヘテロ二量体の収量を増大させるための機構をもたらす。
【０１２８】
二重特異性抗体にはまた、架橋抗体またはヘテロコンジュゲート抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート内の一方の抗体をアビジンに連結し、他方の抗体をビオチンに連結することができる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とすること（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）、およびＨＩＶ感染の処置（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）について提起されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋形成法を用いて作製することができる。当技術分野では適切な架橋形成剤が周知であり、多数の架橋形成法と共に、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０において開示されている。
【０１２９】
ＶＩＩＩ．Ｎｏｔｕｍモジュレーター：定常領域の修飾
ａ．Ｆｃ領域およびＦｃ受容体  
上記で示した、開示されるモジュレーター（例えば、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍまたは抗Ｎｏｔｕｍ抗体）の可変領域または結合領域に対する多様な修飾、置換、付加、または欠失に加えて、当業者は、本発明の選択された実施形態がまた、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または修飾も含みうることを理解するであろう。より具体的に述べると、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターが、とりわけ、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増大、免疫原性の低減、生成の増大、Ｆｃリガンド結合の変化、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の改変が含まれるがこれらに限定されない好ましい特徴を伴う化合物を結果としてもたらす、１または複数のさらなるアミノ酸残基の置換、変異、および／または修飾を含有しうることが意図される。この点で、これらのＦｃ変異体は、開示されるモジュレーターの有効な抗新生物特性を増強するのに用いると有利でありうることが理解されるであろう。
【０１３０】
本明細書におけるＦｃ領域という用語は、天然配列のＦｃ領域および変異体のＦｃ領域を含めた、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに用いられる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端へと延びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の生成または精製時において除去することもでき、抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することにより除去することもできる。したがって、無傷抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基を除去した抗体集団、Ｋ４４７残基を除去していない抗体集団、ならびにＫ４４７残基を伴う抗体とＫ４４７残基を伴わない抗体との混合物を有する抗体集団を含みうる。機能的Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域のエフェクター機能を保有する。例示的なエフェクター機能には、Ｃ１ｑへの結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体への結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細胞受容体：ＢＣＲ）などが含まれる。このようなエフェクター機能は一般的に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体の可変ドメイン）と組み合わさることを要求し、例えば、本明細書の定義で開示される多様なアッセイを用いて評価することができる。
【０１３１】
Ｆｃ受容体またはＦｃＲは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記載する。一部の実施形態では、ＦｃＲが、天然ヒトＦｃＲである。一部の実施形態では、ＦｃＲが、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するＦｃＲであり、これには、これらの受容体の対立遺伝子変異体、および選択的にスプライシングされた形態を含めた、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれる。ＦｃγＩＩ受容体は、主にこれらの細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）およびＦｃγＲＩＩＢ（阻害受容体）を包含する。活性化受容体であるＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体であるＦγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．、１２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）において総説されている。本明細書におけるＦｃＲという用語には、将来同定されるＦｃＲを含めた他のＦｃＲも包含される。Ｆｃ受容体またはＦｃＲという用語にはまた、特定の場合には、母体ＩｇＧの胎児への移動（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻：５８７頁（１９７６年）；およびＫｉｍら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：２４９頁（１９９４年））、および免疫グロブリンのホメオスタシスの制御の一因となる、新生児受容体であるＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、１８巻（１２号）：５９２〜５９８頁（１９９７年）；Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５巻（７号）：６３７〜６４０頁（１９９７年）；Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７９巻（８号）：６２１３〜６２１６頁（２００４年）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎら）を参照されたい）。
【０１３２】
ｂ．Ｆｃ機能
本明細書で用いられる補体依存性細胞傷害作用およびＣＤＣとは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。補体の活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の分子、例えば、同種（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原と複合体化した抗体への結合により惹起される。補体の活性化を評価するには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９６年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁において記載されているＣＤＣアッセイを実施することができる。
【０１３３】
さらに、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用またはＡＤＣＣとは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を保有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒素により標的細胞を死滅させることを可能とする細胞傷害の形態を指す。標的を指向する特異的な高親和性のＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を携え、このような殺滅に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は、細胞外における溶解であり、細胞間における直接の接触を必要とし、補体は伴わない。
【０１３４】
ＦｃＲとの結合親和性またはＡＤＣＣ活性を変化させたＮｏｔｕｍモジュレーター変異体とは、ＦｃＲとの結合活性および／またはＡＤＣＣ活性を、親抗体もしくは改変されていない抗体と比較して、または天然配列のＦｃ領域を含むモジュレーターと比較して増強または減殺したＮｏｔｕｍモジュレーター変異体である。ＦｃＲへの結合の増大を示すモジュレーター変異体は、親抗体もしくは改変されていない抗体または天然配列のＦｃ領域を含むモジュレーターよりも良好な親和性で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの結合の減少を示す変異体は、親抗体もしくは改変されていない抗体または天然配列のＦｃ領域を含むモジュレーターよりも良好ではない親和性で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの結合の減少を示すこのような変異体は、ＦｃＲへの感知可能な結合をほとんど保有しないかまたは全く保有しない場合があり、例えば、当技術分野において周知の技法により決定される通り、例えば、天然配列のＩｇＧのＦｃ領域と比較して、ＦｃＲへの結合が０〜２０％となる。
【０１３５】
ＦｃＲｎについて述べると、本発明の抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて５日より長いか、１０日より長いか、１５日より長いか、好ましくは２０日より長いか、２５日より長いか、３０日より長いか、３５日より長いか、４０日より長いか、４５日より長いか、２カ月より長いか、３カ月より長いか、４カ月より長いか、または５カ月より長い半減期（例えば、血清半減期）をもたらす、定常領域に対する修飾を伴うＦｃ変異体も含むかまたは包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体（またはＦｃ含有分子）の半減期の延長は、結果として、哺乳動物における前記抗体または抗体断片の高血清力価をもたらし、したがって、前記抗体もしくは抗体断片の投与頻度を低減し、かつ／または投与される前記抗体もしくは抗体断片の濃度を低減する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体は、当業者に公知の技法を介して生成させることができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するものとして同定されるアミノ酸残基を修飾する（例えば、置換するか、欠失させるか、または付加する）ことにより生成させることができる（例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号、同第ＷＯ０４／０２９２０７号、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６、およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒトＦｃＲｎへの結合、およびヒトＦｃＲｎと高親和性で結合するポリペプチドの血清半減期は、例えば、トランスジェニックマウスにおいてアッセイすることもでき、ヒトＦｃＲｎを発現させる、トランスフェクトされたヒト細胞系においてアッセイすることもでき、変異体のＦｃ領域を伴うポリペプチドを投与する霊長動物においてアッセイすることもできる。ＷＯ２０００／４２０７２はＦｃＲｎへの結合を改善するかまたは減殺した抗体の変異体について記載する。また、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、９巻（２号）：６５９１〜６６０４頁（２００１年）も参照されたい。
【０１３６】
ｃ．グリコシル化による修飾
さらに他の実施形態では、本発明の抗体のグリコシル化パターンまたは組成を修飾する。より具体的に述べると、本発明の好ましい実施形態は、１または複数の操作されたグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）、すなわち、グリコシル化パターンの変化またはＦｃ領域を含む分子に共有結合する炭水化物組成物の変化を含みうる。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能の増強もしくは低減、抗体の標的抗原に対する親和性の増大、または抗体生成の促進が含まれるがこれらに限定されない多様な目的に有用でありうる。エフェクター機能の低減が所望される場合には、分子を操作して非グリコシル化形態で発現させうることが理解されるであろう。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。すなわち、１または複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす１または複数のアミノ酸置換を行い、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および同６，３５０，８６１を参照されたい）。逆に、１または複数のさらなるグリコシル化部位における操作を介して、Ｆｃ含有分子に、エフェクター機能の増強または結合の改善を付与することもできる。
【０１３７】
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）または二分岐性ＧｌｃＮＡｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の組成を変化させたＦｃ変異体も作製することができる。これらおよび類似のグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法を介して、例えば、操作されたかまたは変異体の発現株を用いることにより、１または複数の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））を伴う共発現を介して、多様な生物もしくは多様な生物に由来する細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、またはＦｃ領域を含む分子を発現させた後で炭水化物（複数可）を修飾することにより、生成することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．  Ｌ．ら（２００２年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁；Ｕｍａｎａら（１９９９年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻：１７６〜１頁のほか、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号；同第ＷＯ９９／５４３４２号、Ｕｍａｎａら、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７巻：１７６〜１８０頁；Ｄａｖｉｅｓら、２００１７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、７４巻：２８８〜２９４頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８巻：３４６６〜３４７３頁；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，６０２，６８４；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／２７７，３７０；同１０／１１３，９２９；ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）法、（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作法（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＧ）；ＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉら、２００４年、ＪＭＢ、３３６巻：１２３９〜４９頁を参照されたい。
【０１３８】
ＩＸ．モジュレーターの発現
ａ．概観
所望のＮｏｔｕｍモジュレーターをコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることを介する）を用いて容易に単離し、配列決定することができる。モジュレーターが抗体である場合は、単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞（またはファージもしくは酵母に由来するコロニー）を、このようなＤＮＡの好ましい供給源として用いることができる。所望の場合は、核酸を本明細書で記載される通りにさらに操作して、融合タンパク質、またはキメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体を含めた薬剤を創出することもできる。より具体的に述べると、単離されたＤＮＡ（これは改変することができる）を用いて、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１において記載されている抗体を製造するための定常領域配列および可変領域配列をクローニングすることができる。
【０１３９】
この例示的な方法は、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの転換、および抗体に特異的なプライマーを用いるＰＣＲを介する増幅を伴う。本明細書で例示される通り、当技術分野では適切なプライマーが周知であり、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離される組換えヒト抗体または組換え非ヒト抗体を発現させるためには、抗体をコードするＤＮＡを、組換え発現ベクターへとクローニングし、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた宿主細胞へと導入することが理解されるであろう。さらに他の実施形態では、モジュレーターを、サルＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に所望の構築物を生成させない骨髄腫細胞に導入し、それらによって発現させる。以下でより詳細に論じられる通り、所望のモジュレーターを発現する形質転換細胞は、比較的大量に成長させて、融合構築物または免疫グロブリンの臨床的および商業的な供給をもたらすことができる。
【０１４０】
Ｎｏｔｕｍモジュレーターの所望の部分をコードする核酸が、ファージディスプレイ法、酵母ライブラリー、ハイブリドーマベースの技法、合成により、または商業的供給源のいずれから得られるかまたはこれらのいずれに由来するのであれ、本発明が、融合タンパク質および抗Ｎｏｔｕｍ抗体またはこれらの抗原結合断片もしくは誘導体を含めたＮｏｔｕｍモジュレーターをコードする核酸分子および核酸配列を明示的に包含することを理解されたい。本発明は、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下、または代替的に、中程度または低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下（例えば、以下で規定される）で、本発明のモジュレーターまたはこれらの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸と相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸または核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）もさらに包含する。本明細書で用いられる核酸分子または単離された核酸分子という用語は、少なくともＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を包含することを意図する。核酸分子は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあるが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。さらに、本発明は、限定なしに述べると、ベクター、プラスミド、宿主細胞、コスミド、またはウイルス構築物を含めた、このようなモジュレーターをコードするポリヌクレオチドを組み込む任意のビヒクルまたは構築物を含む。
【０１４１】
単離された核酸という用語は、この核酸が（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されたか、（ｉｉ）クローニングを介する組換えによりに生成させたか、（ｉｉｉ）例えば、切断およびゲル電気泳動による画分化を介して精製されたか、または（ｉｖ）例えば、化学合成を介して合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技法を介する操作に利用可能な核酸である。
【０１４２】
より具体的に述べると、本発明の抗体、またはこれらの断片、誘導体、ムテイン、もしくは変異体の一方または両方の鎖を含めたモジュレーターをコードする核酸、ハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分なポリヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、あるいはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、解析するか、変異させるか、または増幅するための配列決定用プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前出の相補的な配列も提供される。核酸は、任意の長さでありうる。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチド以上の長さの場合もあり、かつ／または１もしくは複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含む場合もあり、かつ／または大型の核酸、例えば、ベクターの一部の場合もある。これらの核酸は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、ＲＮＡヌクレオチドおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにこれらの人工の変異体（例えば、ペプチド核酸）を含みうる。抗体またはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含めた本発明のモジュレーターをコードする核酸は、上記の通りに単離されていることが好ましい。
【０１４３】
ｂ．ハイブリダイゼーションおよび同一性
示される通り、本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下において他の核酸とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。当技術分野では、核酸をハイブリダイズさせる方法が周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６を参照されたい。本出願の目的では、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（またはハイブリダイゼーション温度を４２℃とする、約５０％のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液など、他の類似のハイブリダイゼーション溶液）、ならびに０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６０℃の洗浄条件を用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、４５℃、６×ＳＳＣ中でハイブリダイズさせた後、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で１または複数回にわたり洗浄する。さらに、当業者は、互いと少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いとハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大または減少させることもできる。より一般的に述べると、本開示の目的では、核酸配列について実質的に同一であるという用語は、基準核酸配列と少なくとも約８５％、または９０％、または９５％、または９７％の配列同一性を呈示するヌクレオチド配列とみなされ得る。
【０１４４】
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータおよび適切な条件を案出するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、９および１１章）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５年、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、２．１０および６．３〜６．４節により示されており、例えば、核酸の長さおよび／または塩基組成に基づき、当業者が容易に決定しうる。
【０１４５】
本発明による核酸は、単独で存在する場合もあり、同種または異種である他の核酸と組み合わせて存在する場合もあることがさらに理解されるであろう。好ましい実施形態では、核酸を、前記核酸と同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結する。この文脈において、同種という用語は、核酸がまた発現制御配列に天然でも機能的に連結されることを意味し、異種という用語は、核酸が発現制御配列に天然で機能的に連結されるわけではないことを意味する。
【０１４６】
ｃ．発現
ＲＮＡおよび／またはタンパク質もしくはペプチドを発現する核酸などの核酸と、発現制御配列とは、前記核酸の発現または転写が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるような形で互いと共有結合により連結される場合、互いと機能的に連結される。核酸が機能的タンパク質へと翻訳され、発現制御配列がコード配列と機能的に連結される場合は、前記発現制御配列の誘導の結果として、コード配列においてフレームシフトを引き起こしたり、前記コード配列が所望のタンパク質またはペプチドへと翻訳されることができなくなったりすることなしに前記核酸の転写がもたらされる。
【０１４７】
本発明による発現制御配列という用語は、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を制御することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型の関数として変化しうるが、一般には、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する、５’側の非転写配列ならびに５’側の非翻訳配列および３’側の非翻訳配列を含む。より具体的に述べると、５’側の非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写を制御するためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列も含みうる。
【０１４８】
本発明によれば、プロモーターまたはプロモーター領域という用語は、発現する核酸配列に対して上流（５’側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および結合部位をもたらすことによりこの配列の発現を制御する核酸配列に関する。プロモーター領域は、遺伝子の転写の制御に関与するさらなる因子のさらなる認識部位および結合部位も包含しうる。プロモーターは、原核生物遺伝子の転写を制御する場合もあり、真核生物遺伝子の転写を制御する場合もある。さらに、プロモーターが、誘導的であり、誘導因子（ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に応答して転写を惹起する場合もあり、転写が誘導因子により制御されない場合は、構成的である場合もある。誘導的プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導因子が存在しない場合、発現しないかまたはわずかな程度だけ発現する。誘導因子の存在下では、遺伝子がオンに切り替わるか、または転写レベルが増大する。これは一般に、特異的な転写因子が結合することを介する。
【０１４９】
本発明による好ましいプロモーターには、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、およびＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ならびにこれらの人工のハイブリッドプロモーター（例えば、ＣＭＶ）が含まれ、この場合、これらの１または複数の部分を、例えば、さらなるイントロン（複数可）を含めて、またはさらなるイントロン（複数可）を含めずに、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などの他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの１または複数の部分に融合させる。
【０１５０】
本発明によれば、発現という用語は、その最も一般的な意味で用いられ、ＲＮＡの生成またはＲＮＡおよびタンパク質／ペプチドの生成を含む。発現という用語はまた、核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は、一過性で実施することもでき、安定的に実施することもできる。
【０１５１】
好ましい実施形態では、本発明によれば、核酸分子が、ベクター内に、適切な場合はこの核酸の発現を制御するプロモーターと共に存在する。本明細書では、ベクターという用語が、その最も一般的な意味で用いられ、核酸を、例えば、原核生物細胞および／または真核生物細胞へと導入し、適切な場合はゲノムへと組み込むことを可能とする、前記核酸用の任意の中間的なビヒクルを含む。この種のベクターは、細胞内で複製および／または発現させることが好ましい。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、またはウイルスゲノムを含みうる。本明細書で用いられるプラスミドという用語は一般に、染色体ＤＮＡとは独立に複製しうる、通常は環状のＤＮＡ二重鎖である、染色体外の遺伝物質の構築物に関する。
【０１５２】
本発明を実施することにおいて、場合によって、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法における多くの従来の技法を用いることが理解されるであろう。このような従来の技法は、本明細書で定義されるベクター、宿主細胞、および組換え法に関する。これらの技法は、周知であり、例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００年；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、前出において説明されている。例えば、細胞の単離および培養（例えば、その後における核酸またはタンパク質の単離のための）についての他の有用な参考文献には、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４年）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびこの文献で引用されている参考文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３年）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．が含まれる。核酸を作製する方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増幅、細胞からの精製、または化学合成を介する）、核酸を操作する方法（例えば、部位指向変異誘発、制限酵素消化、ライゲーションなどを介する）、および核酸を操作し作製するのに有用な多様なベクター、細胞系などは、上記の参考文献に記載されている。加えて、本質的に、任意のポリヌクレオチド（例えば、標識化またはビオチン化されたポリヌクレオチドを含めた）は、多様な商業的供給源のうちのいずれかから、特注品を注文することもでき、標準品を注文することもできる。
【０１５３】
したがって、一態様では、本発明が、本発明の抗体またはこれらの部分の組換え発現を可能とする組換え宿主細胞を提供する。本明細書では、このような組換え宿主細胞における発現を介して生成させた抗体を組換え抗体と称する。本発明はまた、このような宿主細胞の後代細胞、およびこのような宿主細胞に生成させた抗体も提供する。
【０１５４】
本明細書で用いられる組換え宿主細胞（または単に、宿主細胞）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を意味する。組換え宿主細胞および宿主細胞とは、特定の対象細胞だけを意味するわけではなく、また、このような細胞の後代も意味することを理解されたい。後続の世代では、変異または環境的影響のために特定の修飾が発生しうるため、このような後代は、実のところ、親細胞と同一ではないが、本明細書で用いられる宿主細胞という用語の範囲内になおも包含される。このような細胞は、上記の通り、本発明によるベクターを含みうる。
【０１５５】
別の態様では、本発明が、本明細書で記載される抗体またはこれらの部分を作製する方法を提供する。一実施形態によれば、前記方法は、上記のベクターでトランスフェクトまたは形質転換した細胞を培養するステップと、抗体またはこれらの部分を回収するステップとを含む。
【０１５６】
上記で示した通り、本発明の抗体（またはこれらの断片もしくは変異体）の発現は、所望の抗Ｎｏｔｕｍ抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（複数可）を含むことが好ましい。当業者に周知の方法を用いて、抗体のコード配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ法、合成法、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結した本発明の抗Ｎｏｔｕｍ抗体（例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメイン、またはこれらの部分、あるいは重鎖ＣＤＲもしくは軽鎖ＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、またはこれらの断片もしくは変異体）をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。好ましい実施形態では、このようなベクターが、抗体分子の重鎖（またはその断片）をコードするヌクレオチド配列、抗体の軽鎖（またはその断片）をコードするヌクレオチド配列、または重鎖および軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を包含しうる。
【０１５７】
本明細書の教示により本発明のヌクレオチドを単離および改変したら、それらを、抗Ｎｏｔｕｍ抗体またはこれらの断片を含めた、選択されたモジュレーターを生成させるのに用いることができる。
【０１５８】
Ｘ．モジュレーターの生成および精製
当技術分野で認知された分子生物学法および最新のタンパク質発現法を用いて、実質的な量の所望のモジュレーターを生成させることができる。より具体的に述べると、上記の通りに得られ、かつ、操作される抗体などのモジュレーターをコードする核酸分子を、多様な種類の宿主細胞を含む、周知の市販されるタンパク質生成系に組み込んで、前臨床的な量、臨床的な量、または商業的な量の所望の医薬品をもたらすことができる。好ましい実施形態では、モジュレーターをコードする核酸分子を、選択された宿主細胞への効率的な組込み、およびその後における所望のＮｏｔｕｍモジュレーターの高度な発現レベルをもたらすベクターまたは発現ベクターへと操作することが理解されるであろう。
【０１５９】
モジュレーターの生成には原核生物系を使用し得ることが理解されるが、Ｎｏｔｕｍモジュレーターをコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞、細菌宿主細胞、または酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用され得ることが好ましい。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入する任意の公知の方法を介しうる。当技術分野では、異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へと導入する方法が周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソームへの封入、およびＤＮＡの核内への直接的なマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターを介して哺乳動物細胞へ導入することもできる。当技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ４，３９９，２１６、同４，９１２，０４０、同４，７４０，４６１、および同４，９５９，４５５を参照されたい。当技術分野ではさらに、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を介する形質転換、遺伝子銃による形質転換、直接的な注射、電気穿孔、およびウイルスによる形質転換を含めた、植物細胞を形質転換する方法も周知である。当技術分野ではまた、細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法も周知である。
【０１６０】
さらに、宿主細胞を、本発明の２つの発現ベクター、例えば、重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクターで共トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの実質的に同等な発現を可能とする同一の選択マーカーを含有しうる。代替的に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、これらを発現させることが可能な単一のベクターを用いることもできる。このような状況では、軽鎖を重鎖の前に配置して、毒性の過剰な遊離重鎖を回避することが好ましい。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡを含む場合もあり、ゲノムＤＮＡを含む場合もある。
【０１６１】
ａ．宿主発現系
多くは市販されている多様な宿主発現ベクター系が、本明細書の教示に適合可能であり、本発明のモジュレーターを発現させるのに用いることができる。このような宿主発現系は、それを介して目的のコード配列が発現され得、その後精製され得るビヒクルを表すが、また、適切なヌクレオチドのコード配列で形質転換するかまたはトランスフェクトすると、ｉｎ  ｓｉｔｕで本発明の分子を発現させうる細胞も表す。このような系には、モジュレーターのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）などの微生物、モジュレーターのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトした酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属）、モジュレーターのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、モジュレーターのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスであるＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスであるＴＭＶ）を感染させるか、もしくはモジュレーターのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）でトランスフェクトした植物細胞系（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、バレイショなど）、または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６２】
細菌系では、多数の発現ベクターを、発現させる分子に意図される使用に応じて有利に選択し得る。例えば、モジュレーターの医薬組成物を作製するために、このようなタンパク質を大量に生成させる場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉによる発現ベクターであるｐＵＲ２７８ベクター（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  １巻、２号：１７９１頁（１９８３年））（この場合、コード配列は、融合タンパク質を生成させるように、ｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームで、ベクターへと個別にライゲーションすることができる）；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻：３１０１〜３１０９頁（１９８５年）；Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２４巻：５５０３〜５５０９頁（１９８９年））などが含まれるがこれらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、外来のポリペプチドを、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるのに用いることができる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへと吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解させた細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されうるように、トロンビンまたは因子Ｘａのプロテアーゼ切断部位を包含するようにデザインされる。
【０１６３】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるベクターとして用いることができる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において成長する。コード配列は、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）へと個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１６４】
哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を用いて、所望のヌクレオチド配列を導入することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、対象のコード配列を、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えを介して、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）への挿入により、感染させた宿主において生存可能でかつ分子を発現させることが可能な組換えウイルスを結果としてもたらす（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：３５５〜３５９頁（１９８４年）を参照されたい）。特異的な開始シグナルはまた、挿入されたコード配列の効率的な翻訳にも必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、由来が多様であることが可能であり、天然および合成のいずれでもありうる。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻：５１〜５４４頁（１９８７年）を参照されたい）。こうして、当技術分野では、発現のための宿主として利用可能な適合可能な哺乳動物の細胞系が周知であり、これらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が含まれる。これらの細胞系には、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞）、Ａ５４９細胞、および他の多数の細胞系が含まれる。
【０１６５】
組換えタンパク質を長期にわたり高収量で生成するために、安定的発現が好ましい。したがって、当技術分野で認知された標準的な技法を用いて、選択されたモジュレーターを安定的に発現させる細胞系を操作することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞を、濃縮した培地中で１〜２日間にわたり成長させることができ、次いで、選択培地へと切り替える。組換えプラスミド内の選択マーカーにより、選択に対する耐性が付与され、細胞がプラスミドをそれらの染色体へと安定的に組み込み、成長させて細胞巣（ｆｏｃｉ）を形成することが可能となり、今度は、これらをクローニングして、細胞系へと拡大増殖させることができる。この方法は、分子を発現させる細胞系を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞系は、分子と直接的または間接的に相互作用する組成物をスクリーニングし、評価するのに特に有用でありうる。
【０１６６】
当技術分野では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１１巻：２２３頁（１９７７年））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、４８巻：２０２頁（１９９２年））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、２２巻：８〜１７頁（１９８０年））が含まれるがこれらに限定されない、多数の選択系が周知であり、これらを用いることが可能であり、それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：３５７頁（１９８０年）：Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７８巻：１５２７頁（１９８１年））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７８巻：２０７２頁（１９８１年））；アミノグリコシドであるＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１２巻：４８８〜５０５頁；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３巻：８７〜９５頁（１９９１年）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２巻：５７３〜５９６頁（１９９３年）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻：９２６〜９３２頁（１９９３年）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２巻：１９１〜２１７頁（１９９３年）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ、１１巻（５号）：１５５〜２１５頁（１９９３年５月））；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ、３０巻：１４７頁（１９８４年））についての選択の基盤として用いることができる。組換えＤＮＡ法の当技術分野で一般に公知の方法を日常的に適用して所望の組換えクローンを選択することができ、このような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０年）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４年）、１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５０巻：１頁（１９８１年）において記載されている。安定で高収量の細胞系を確立するのに特に好ましい１つの方法は、特定の条件下における発現を増強するための効率的な手法をもたらすグルタミンシンターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含むことが理解されるであろう。ＧＳ系は、それらの各々が参考として本明細書に援用される、ＥＰ特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、同第０３２３９９７号、および同第０３３８８４１号との関連で、全体的または部分的に論じられる。
【０１６７】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特異的な形で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株も、選択することができる。タンパク質生成物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能および／または精製に重要でありうる。異なる宿主細胞は、翻訳後におけるタンパク質および遺伝子産物をプロセシングおよび修飾するための特徴的で特異的な機構を有する。発現させたポリペプチドの所望の修飾およびプロセシングを確実にするように、当技術分野で公知の適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のためには、一次転写物の適正なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核生物の宿主細胞が、本発明で用いるのに特に有効である。したがって、特に好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞のほか、例えば、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞、およびＴ４７Ｄ細胞などの乳がん細胞系、ならびに、例えば、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞などの正常乳腺細胞系が含まれるがこれらに限定されない。モジュレーターおよび選択された生成系に応じて、当業者は、モジュレーターの効率的な発現に適切な宿主細胞を容易に選択および最適化することができる。
【０１６８】
ｂ．化学合成
前述の宿主細胞系に加え、当技術分野で公知の技法（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．；およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，  Ｍ．ら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１０巻：１０５〜１１１頁を参照されたい）を用いて、本発明のモジュレーターを化学合成しうることが理解されるであろう。例えば、本発明のポリペプチド断片に対応するペプチドは、ペプチド合成器を用いることにより合成することができる。さらに、所望の場合は、非古典的アミノ酸または化学的なアミノ酸類似体を、ポリペプチド配列への置換または付加として導入することもできる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体などのデザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）が一般に含まれるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）アミノ酸の場合もあり、Ｌ（左旋性）アミノ酸の場合もある。
【０１６９】
ｃ．トランスジェニック系
本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターはまた、目的の免疫グロブリン重鎖配列および免疫グロブリン軽鎖配列（またはそれらの断片もしくは誘導体もしくは変異体）についてトランスジェニックである哺乳動物または植物の生成、ならびに回収可能な形態にある所望の化合物の生成を介してトランスジェニック的に生成させることもできる。哺乳動物におけるトランスジェニック的な生成と関連して、抗Ｎｏｔｕｍ抗体を、例えば、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中に生成させ、この乳汁から回収することができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，８２７，６９０、同５，７５６，６８７、同５，７５０，１７２、および同５，７４１，９５７を参照されたい。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を、上記の通りに、Ｎｏｔｕｍまたはその免疫原性部分で免疫化する。植物において抗体を作製する方法は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０４６，０３７および同５，９５９，１７７において記載されている。
【０１７０】
本明細書の教示に従い、標準的なトランスジェニック技術を介して、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターをコードする１または複数の核酸分子を動物または植物へと導入することにより、非ヒトトランスジェニック動物または非ヒトトランスジェニック植物を作製することができる。Ｈｏｇａｎおよび米国特許第６，４１７，４２９号を参照されたい。トランスジェニック動物を作製するのに用いられるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞の場合もあり、体細胞の場合もあり、受精卵の場合もある。非ヒトトランスジェニック生物は、キメラヘテロ接合体、非キメラヘテロ接合体、および非キメラホモ接合体でありうる。例えば、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）；およびＰｉｎｋｅｒｔ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照されたい。、一部の実施形態では、例えば、目的の重鎖および／または軽鎖をコードする標的化構築物により非ヒトトランスジェニック動物に、標的化された破壊および置換を施す。一実施形態では、トランスジェニック動物が、Ｎｏｔｕｍに特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現させる。抗Ｎｏｔｕｍ抗体は、任意のトランスジェニック動物において作製され得るが、特に好ましい実施形態では、ヒト以外の動物が、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。さらなる実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物が、血液、乳汁、尿、唾液、涙液、粘液、および他の体液中に所望の医薬品を発現し、この医薬品は、当技術分野で認知された精製技術を用いて容易に得ることができる。
【０１７１】
異なる細胞系を介して、またはトランスジェニック動物において発現させた抗体を含めたモジュレーターは、互いと異なるグリコシル化パターンを有する可能性が高い。しかし、本明細書で示される核酸分子によりコードされるか、または本明細書で示されるアミノ酸配列を含む全てのモジュレーターは、分子のグリコシル化状態に関わらず、かつ、より一般的に述べると、翻訳後修飾（複数可）の存在または非存在に関わらず、本発明の一部である。加えて、本発明は、翻訳時または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子または他の細胞のリガンドなどへの結合により異なって修飾されたモジュレーターも包含する。臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、低減、ツニカマイシンなどの存在下における代謝合成を介する特異的な化学的切断が含まれるがこれらに限定されない公知の技法により、多数の化学的修飾のうちのいずれかを実施することができる。本発明にはまた、例えば、Ｎ結合炭水化物鎖またはＯ結合炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、化学的部分のアミノ酸骨格への結合、Ｎ結合炭水化物鎖またはＯ結合炭水化物鎖の化学的修飾、および原核宿主細胞の発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が含まれる、多様な翻訳後修飾も包含される。さらに、本文および以下の実施例に示される通り、ポリペプチドはまた、酵素的標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、または親和性標識など、モジュレーターの検出および単離を可能とする検出用標識により修飾することもできる。
【０１７２】
ｄ．精製
本発明のモジュレーターを、組換え発現または本明細書で開示される他の技法のうちのいずれか１つを介して生成させたら、これを、免疫グロブリンを精製するための、当技術分野において公知である任意の方法により精製することもでき、より一般的に述べると、タンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法により精製することもできる。この点では、モジュレーターを単離することができる。本明細書で用いられる、単離されたＮｏｔｕｍモジュレーターとは、その天然環境の成分から同定および分離され、かつ／またはその天然環境の成分から回収されたＮｏｔｕｍモジュレーターである。その天然環境の夾雑成分とは、ポリペプチドの診断的使用または治療的使用に干渉する物質であり、これらには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれうる。単離されたモジュレーターには、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕのモジュレーターが含まれる。
【０１７３】
組換え技術を用いる場合は、Ｎｏｔｕｍモジュレーター（例えば、抗Ｎｏｔｕｍ抗体またはその誘導体もしくは断片）を細胞内で生成させることもでき、細胞膜周辺腔内で生成させることもでき、培地へと直接分泌させることもできる。所望の分子を、第１のステップとして細胞内で生成させる場合、粒子状残渣である宿主細胞または溶解させた断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外濾過を介して除去することができる。例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３頁（１９９２年）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔へと分泌される抗体を単離する手順について記載している。略述すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下において約３０分間にわたり解凍する。細胞残渣は、遠心分離を介して除去することができる。抗体を培地中に分泌させる場合は一般にまず、このような発現系に由来する上清を、市販されるタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎによる限外濾過ユニットを用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前出のステップのうちのいずれかに含ませてタンパク質分解を阻害し、抗生剤を含めて外来性の夾雑物の成長を防止することができる。
【０１７４】
細胞から調製したモジュレーター（例えば、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍまたは抗Ｎｏｔｕｍ抗体）組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができるが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、選択された構築物内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖、またはヒトＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ、６２巻：１頁（１９８３年））。全てのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ、５巻：１５６７頁（１９８６年））には、プロテインＧが推奨される。親和性リガンドを結合させるマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。細孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースにより達成されるより迅速な流量および短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。イオン交換カラムによる画分化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンによるクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂によるセファロースクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、等電点電気泳動（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質を精製するための他の技法もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、少なくとも部分的に、プロテインＡまたはプロテインＧによる親和性クロマトグラフィーを用いて精製する。
【０１７５】
ＸＩ．コンジュゲートしたＮｏｔｕｍモジュレーター
本発明のモジュレーターを、本明細書の教示により精製したら、それらを、薬学的に活性な部分もしくは診断用部分または生体適合性の修飾剤と連結することもでき、これに融合させることもでき、これにコンジュゲートする（例えば、共有結合による場合もあり、非共有結合による場合もある）こともでき、これと他の形で会合させることもできる。本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、広く用いられ、会合の方法に関わらず、開示されるモジュレーターと会合している任意の分子を意味すると考えられる。この点では、このようなコンジュゲートが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位元素を含みうることが理解される。さらに、上記で示した通り、選択されたコンジュゲートは、共有結合によりモジュレーターに連結することもでき、非共有結合によりモジュレーターに連結することもでき、コンジュゲーションを実施するのに用いられる方法に少なくとも部分的に依存して多様なモル比を呈示する。
【０１７６】
好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、選択された特徴（例えば、生体毒素、バイオマーカー、精製用タグなど）を付与するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとコンジュゲートするかまたは会合させうることが明らかであろう。より一般的に述べると、選択された実施形態では、本発明が、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートした（共有結合的なコンジュゲーションおよび非共有結合的なコンジュゲーションの両方を含めた）モジュレーターまたはその断片の使用であって、ポリペプチドが、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸を含む使用を包含する。構築物は、必ずしも直接連結する必要はないが、リンカー配列を介して発生させることができる。例えば、本発明のモジュレーターを、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合させるかまたはコンジュゲートすることにより、抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｎｏｔｕｍを発現させる特定の細胞型を、異種ポリペプチドの標的とすることができる。さらに、異種ポリペプチドに融合させるかまたはコンジュゲートしたモジュレーターはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるイムノアッセイでも用いることができ、当技術分野で公知の精製方法と適合可能でありうる。例えば、国際公開第ＷＯ９３／２１２３２号；欧州特許第ＥＰ４３９，０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａら、１９９４年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、３９巻：９１〜９９頁；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２年、ＰＮＡＳ、８９巻：１４２８〜１４３２頁；およびＦｅｌｌら、１９９１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻：２４４６〜２４５２頁を参照されたい。
【０１７７】
ａ．生体適合性の修飾剤
好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、モジュレーターの特徴を所望の通りに調整するか、変化させるか、改善するか、または調節するのに使用され得る生体適合性の修飾剤とコンジュゲートすることもでき、これと他の形で会合させることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体または融合構築物は、市販されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または類似の生体適合性ポリマーなど、比較的分子量の大きなポリマー分子を結合させることにより生成させることができる。当業者は、ＰＥＧが、抗体に特定の特性を付与する（例えば、半減期を調整しうる）ように選択しうる、多くの異なる分子量および分子構成で取得し得ることを理解するであろう。ＰＥＧは、多官能性リンカーを伴うかまたは伴わずに、ＰＥＧの、前記抗体または抗体断片のＮ末端またはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介してモジュレーターまたは抗体断片もしくは抗体誘導体に結合させることもでき、リシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介してモジュレーターまたは抗体断片もしくは抗体誘導体に結合させることもできる。結果として生物学的活性の喪失を最小限とする、直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化を用いることができる。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適のコンジュゲーションを確実にすることができる。反応しなかったＰＥＧは、例えば、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを介して、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。同様に、抗体または抗体断片をｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定とするか、またはそのｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、開示されるモジュレーターを、アルブミンにコンジュゲートすることもできる。その技法は当技術分野において周知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９３／１５１９９号、同第ＷＯ９３／１５２００号、および同第ＷＯ０１／７７１３７号、ならびに欧州特許第０４１３，６２２号を参照されたい。他の生体適合性コンジュゲートは、当業者に明らかであり、本明細書の教示に従い容易に同定することができる。
【０１７８】
ｂ．診断剤または検出剤
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーター、またはその断片もしくは誘導体を、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）の場合もあり、低分子の場合もあり、放射性同位元素の場合もある診断剤または検出用薬剤にコンジュゲートする。このようなモジュレーターは、過剰増殖性障害の発症もしくは進行をモニタリングするのに有用な場合もあり、開示されるモジュレーターを含めた特定の療法の有効性を決定する臨床試験手順の一部として有用な場合もある。このようなマーカーはまた、選択されたモジュレーターを精製するのに有用な場合もあり、ＴＩＣを分離または単離するのに有用な場合もあり、前臨床手順または毒性研究において有用な場合もある。
【０１７９】
このような診断および検出は、モジュレーターを、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼを含む多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子群；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ロダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光物質；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクォリンなどであるがこれらに限定されない生物発光物質；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性物質；多様な陽電子放出断層撮影において用いられる陽電子放出金属、非放射性の常磁性金属イオン、および放射性標識されたか、または特異的な放射性同位元素にコンジュゲートされた分子が含まれるがこれらに限定されない検出可能な物質に連結することにより達成することができる。このような実施形態では、適切な検出方法が、当技術分野において周知であり、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。
【０１８０】
上記で示した通り、他の実施形態では、モジュレーターまたはその断片を、ペプチドまたはフルオロフォアなどのマーカー配列に融合させて、免疫組織化学またはＦＡＣなどの精製手順または診断手順を容易にする。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列が、それらのうちの多くが市販されている、とりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）においてもたらされるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Ｇｅｎｔｚら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻：８２１〜８２４頁において記載されている通り、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁）および「ｆｌａｇ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８１】
ｃ．治療用部分
既に示唆した通り、モジュレーターまたはそれらの断片もしくは誘導体はまた、細胞毒素もしくは細胞傷害性剤、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体もしくはベータ放射体などの治療用部分とコンジュゲートすることもでき、これと連結することもでき、これに融合させることもでき、これと他の形で会合させることもできる。本明細書で用いられる細胞毒素または細胞傷害性剤には、細胞に有害であり、細胞の成長または生存を阻害しうる、任意の薬剤または治療用部分が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ＤＭ−１およびＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）などのメイタンシノイド、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、ならびにシクロホスファミドおよびその類似体または同族化合物が含まれる。さらなる細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を含めたアウリスタチン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、またはイプシロン−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）などのアマニチン、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ，Ｂ．Ｖ．）などのＤＮＡ副溝結合剤、ならびに改変ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ：Ｓｐｉｒｏｇｅｎ，Ｌｔｄ）を含む。さらに、一実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、抗ＣＤ３結合分子と会合させて、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、それらに腫瘍始原細胞を標的とさせることができる（ＢｉＴＥ法；例えば、参考として本明細書に援用される、Ｆｕｈｒｍａｎｎ，  Ｓ．ら、Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ、抄録５６２５号（２０１０年）を参照されたい）。
【０１８２】
さらなる適合可能な治療的部分には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）であるシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらに限定されない細胞傷害性剤が含まれる。治療用部分についてのより広範なリストは、それらの各々が参考として本明細書に援用される、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７５９５７号およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５において見出すことができる。
【０１８３】
選択されたモジュレーターはまた、放射性金属イオン（上記を参照されたい：例えば、放射性物質の放射性金属イオン）をコンジュゲートするのに有用な放射性物質または大環状キレート化剤（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）などの治療用部分にコンジュゲートすることもできる。特定の実施形態では、大環状キレート化剤が、リンカー分子を介して抗体に結合させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は一般に、当技術分野で公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４巻：２４８３頁；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、１０巻：５５３頁；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９年、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．、２６巻：９４３頁において記載されている。
【０１８４】
本発明のこの態様と適合可能であり得る例示的な放射性同位元素には、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｔｉｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、および２１１Ａｔが含まれるがこれらに限定されない。また、他の放射性核種、とりわけ、エネルギー範囲を６０〜４，０００ｋｅＶとする放射性核種も、診断剤および治療剤として利用可能である。処置される状態および所望の治療プロファイルに応じて、当業者は、開示されるモジュレーターと共に用いるのに適する放射性同位元素を容易に選択することができる。
【０１８５】
本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターはまた、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物へとコンジュゲートすることもできる。すなわち、本発明と適合可能な治療剤または治療用部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとはみなされない。例えば、特に好ましい実施形態では、薬物部分が、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドもしくはその断片でありうる。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（または別の細胞傷害性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス属の外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス性因子（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照されたい）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：１５６７頁）、およびＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照されたい）などのタンパク質、血栓剤（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）もしくは抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン；または、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、もしくは増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））などの生物学的応答修飾剤が含まれうる。上記で示した通り、モジュレーターをポリペプチド部分へと融合させるかまたはコンジュゲートする方法は、当技術分野において公知である。既に開示した対象の参考文献に加えて、例えば、それらの各々が参考として本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，３３６，６０３、同５，６２２，９２９、同５，３５９，０４６、同５，３４９，０５３、同５，４４７，８５１、および同５，１１２，９４６；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０４３８８号および同第ＷＯ９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８８巻：１０５３５頁；Ｚｈｅｎｇら、１９９５年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５４巻：５５９０頁；ならびにＶｉｌら、１９９２年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：１１３３７頁を参照されたい。モジュレーターの部分との会合は、必ずしも直接的な会合である必要はなく、リンカー配列を介して発生させることができる。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、それらの各々が本明細書に援用される、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４巻：２４８３頁；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、１０巻：５５３頁；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９年、Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、２６巻：９４３頁；Ｇａｒｎｅｔｔ、２００２年、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５３巻：１７１頁��おいて記載されている。
【０１８６】
より一般的に述べると、治療用部分または細胞傷害性剤をモジュレーターへとコンジュゲートする技法は周知である。アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸に不安定な結合、ｃｉｓ−アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で認知された任意の方法を介して、部分を、モジュレーターへとコンジュゲートすることができる（一般に、Ｇａｒｎｅｔｔ、２００２年、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５３巻：１７１頁を参照されたい）。また、例えば、Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、１９８５年）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５年）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）、およびＴｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、６２巻：１１９頁も参照されたい。好ましい実施形態では、治療用部分または細胞傷害性剤にコンジュゲートさせたＮｏｔｕｍモジュレーターは、細胞表面と会合したＮｏｔｕｍ分子への結合時に細胞によって内部移行され得、これにより、治療用ペイロードを送達することができる。
【０１８７】
ＸＩＩ．診断およびスクリーニング
示される通り、本発明は、過剰増殖性障害を検出または診断する方法、および患者に由来する細胞をスクリーニングして腫瘍始原細胞を同定する方法を提供する。このような方法は、処置のためにがんを有する個体を同定するステップ、またはがんの進行をモニタリングするステップを包含し、患者から得られる試料を、本明細書で記載されるＮｏｔｕｍモジュレーターと接触させること、およびモジュレーターの、試料中の結合したＮｏｔｕｍもしくは遊離Ｎｏｔｕｍとの会合の存在もしくは非存在、またはモジュレーターの、試料中の結合したＮｏｔｕｍもしくは遊離Ｎｏｔｕｍとの会合のレベルを検出することを含む。モジュレーターが、抗体またはその免疫学的に活性な断片を含む場合は、試料中のＮｏｔｕｍとの会合が、この試料が、腫瘍永続細胞（例えば、がん幹細胞）を含有しうることを示すことから、がんを有する個体を、本明細書で記載されるＮｏｔｕｍモジュレーターで有効に処置しうることが示される。方法は、結合レベルを対照と比較するステップをさらに含みうる。逆に、選択されたモジュレーターが、Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍである場合は、所望の情報をもたらす試料と接触させて、本明細書で記載される分子の酵素的特性をモニタリングすることができる（直接的な場合もあり、間接的な場合もある）。本明細書の教示と適合可能な他の診断法は、当技術分野において周知であり、専用のレポーティング系など、市販の物質を用いて実施することができる。
【０１８８】
例示的な適合可能なアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウェスタンブロット解析、フローサイトメトリーアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。より一般的に述べると、生物学的試料におけるＮｏｔｕｍの検出またはＮｏｔｕｍの酵素活性（またはその阻害）の測定は、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて達成することができる。
【０１８９】
別の態様では、そして、以下でより詳細に論じられる通り、本発明は、過剰増殖性障害を検出するか、モニタリングするか、もしくは診断するか、このような障害を有する個体を処置の可能性について同定するか、または患者における障害の進行（または後退）をモニタリングするためのキットであって、本明細書で記載されるモジュレーターおよびモジュレーターの試料に対する影響を検出するための試薬を含むキットを提供する。
【０１９０】
Ｎｏｔｕｍモジュレーター、ならびにそれらの後代を含めた、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを含む細胞、培養物、集団、および組成物はまた、Ｎｏｔｕｍ（例えば、Ｎｏｔｕｍポリペプチドまたはその遺伝的構成要素）と相互作用することにより腫瘍始原細胞またはそれらの後代の機能または活性に影響を及ぼす化合物または薬剤（例えば、薬物）についてスクリーニングするかまたはこれらを同定するのにも用いることができる。したがって、本発明は、Ｎｏｔｕｍまたはその基質と会合することを介して、腫瘍始原細胞またはそれらの後代の機能または活性に影響を及ぼしうる化合物または薬剤を評価または同定するためのシステムおよび方法をさらに提供する。このような化合物および薬剤は、例えば、過剰増殖性障害の処置についてスクリーニングされる候補薬物でありうる。一実施形態では、システムまたは方法が、Ｎｏｔｕｍを呈示する腫瘍始原細胞および化合物または薬剤（例えば、薬物）を包含し、細胞および化合物または薬剤（例えば、薬物）を互いと接触させる。
【０１９１】
本発明は、腫瘍始原細胞または後代細胞の活性または機能を変化させるためのＮｏｔｕｍモジュレーターまたは薬剤および化合物をスクリーニングおよび同定する方法をさらに提供する。一実施形態では、方法が、腫瘍始原細胞またはそれらの後代を、被験薬剤または被験化合物と接触させるステップと、被験薬剤または被験化合物により、Ｎｏｔｕｍ＋腫瘍始原細胞の活性または機能が調節されるかどうかを決定するステップとを包含する。
【０１９２】
集団内のこのような腫瘍始原細胞またはそれらの後代のＮｏｔｕｍと関連する活性または機能を調節する被験薬剤または被験化合物により、被験薬剤または被験化合物が活性薬剤であるものとして同定される。調節されうる例示的な活性または機能には、細胞形態の変化、マーカーの発現、分化または脱分化、成熟、増殖、生存能力、ニューロン前駆細胞またはそれらの後代のアポトーシスまたは細胞死が含まれる。
【０１９３】
細胞もしくは細胞培養物、または方法ステップ、または処置に言及して用いられる接触させるステップとは、組成物（例えば、Ｎｏｔｕｍ＋細胞またはＮｏｔｕｍ＋細胞培養物）と言及される別の実体との間の直接的または間接的な相互作用を意味する。直接的相互作用の具体例は、物理的相互作用である。間接的相互作用の具体例は、組成物が中間的な分子に作用し、これが言及される実体（例えば、細胞または細胞培養物）に作用する場合である。
【０１９４】
本発明のこの態様では、調節するということが、本発明の腫瘍始原細胞または後代細胞の特定の態様（例えば、転移または増殖）に関連していることが決定されている細胞活性または機能に対する効果の検出と適合可能な形で腫瘍始原細胞または後代細胞の活性または機能に影響を及ぼすことを示す。例示的な活性および機能には、形態の測定、発生マーカー、分化、増殖、生存能力、細胞の呼吸、ミトコンドリア活性、膜の完全性、または特定の条件と関連するマーカーの発現が含まれるがこれらに限定されない。したがって、腫瘍始原細胞または後代細胞を、化合物または薬剤と接触させ、腫瘍始原細胞または後代細胞の活性または機能に対する、本明細書で開示されているか、または当業者に公知である任意の調節を測定することにより、化合物または薬剤（例えば、候補薬物）を、このような細胞または後代細胞に対するその効果について評価することができる。
【０１９５】
薬剤および化合物をスクリーニングして同定する方法には、場合によって、所定の位置またはアドレスに位置付けまたは配置された細胞アレイ（例えば、マイクロアレイ）を含む、ハイスループットスクリーニングに適する方法が含まれる。ハイスループットのロボット式または手作業の方法により、化学的相互作用をプローブし、短時間で多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナル（例えば、フルオロフォア）および超高速で情報を処理する自動式解析を用いる技法が開発されている（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖら、Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．、７巻：１３３頁（２００４年）を参照されたい）。例えば、マイクロアレイ法は、特異的な遺伝子についての情報をもたらす一方で、数千にわたる遺伝子の相互作用を一度にプローブするのに広範にわたり用いられている（例えば、ＭｏｃｅｌｌｉｎおよびＲｏｓｓｉ、Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．、５９３巻：１９頁（２００７年）を参照されたい）。
【０１９６】
このようなスクリーニング法（例えば、ハイスループット）により、活性薬剤および活性化合物を迅速かつ効率的に同定することができる。例えば、細胞は、培養ディッシュ、培養チューブ、培養フラスコ、培養ローラーボトル、または培養プレート（例えば、８、１６、３２、６４、９６、３８４、および１５３６ウェルのマルチウェルプレートまたはマルチウェルディッシュなど、単一のマルチウェルプレートまたはマルチウェルディッシュ）の、場合によって、潜在的な治療用分子を同定するための規定された位置に位置づけるまたは配置（あらかじめ播種）することができる。スクリーニングされうるライブラリーには、例えば、小分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体用酵母ディスプレイライブラリー（Ａｄｉｍａｂ，ＬＬＣ）、ｓｉＲＮＡライブラリー、およびアデノウイルスによるトランスフェクションベクターが含まれる。
【０１９７】
ＸＩＩＩ．医薬調製物および治療的使用
ａ．処方物および投与経路
任意選択の任意のコンジュゲートを伴うモジュレーターの形態、意図される送達方式、処置またはモニタリングされる疾患、および他の多数の変数に応じ、当技術分野で認知された技法を用いて、本発明の組成物を、所望の通りに処方することができる。すなわち、本発明の多様な実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを含む組成物を、多種多様な薬学的に許容される担体とともに処方する（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：  Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ、２０版（２００３年）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４年）；Ｋｉｂｂｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照されたい）。ビヒクル、アジュバント、および希釈剤が含まれる、多様な薬学的に許容される担体は、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。さらにまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤など、薬学的に許容される補助物質一式も入手可能である。特定の非限定的な例示的担体には、生理食塩液、緩衝生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが含まれる。
【０１９８】
より具体的に述べると、一部の実施形態では、本発明の治療用組成物を、他の成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分と共に投与することもできることが理解されるであろう。逆に、場合によって、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、当技術分野において周知であり、モジュレーターの投与を容易にする比較的不活性な物質であるか、または活性化合物を、作用部位へと送達するのに薬学的に最適化された調製物へと加工する一助となる賦形剤および補助剤を含む、薬学的に許容される適切な担体を含有するように処方することもできる。例えば、賦形剤は、形態またはコンシステンシーをもたらす場合もあり、モジュレーターの薬物動態を改善する希釈剤として作用する場合もある。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧モル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９９】
全身投与用に開示されるモジュレーターは、経腸投与用に処方することもでき、非経口投与用に処方することもでき、局所投与用に処方することもできる。実際、３種類の処方物全てを同時に用いて、有効成分の全身投与を達成することができる。非経口薬物送達用および経口薬物送達用の賦形剤ならびに処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に示されている。非経口投与に適する処方物には、水溶性形態にある活性化合物の水溶液、例えば、水溶性の塩が含まれる。加えて、油性の注射用懸濁液に適するものとしての活性化合物の懸濁液も投与することができる。適切な親油性溶媒または親油性媒体には、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが含まれる。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含有することが可能であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる。場合によって、懸濁液はまた、安定化剤も含有する。リポソームはまた、細胞内への送達のための薬剤を封入するのにも用いることができる。
【０２００】
経腸投与に適する処方物には、硬質ゼラチンカプセルもしくは軟質ゼラチンカプセル、丸薬、コーティングされた錠剤を含めた錠剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、または吸入剤、およびこれらの制御放出形態が含まれる。
【０２０１】
一般に、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを含む本発明の化合物および組成物は、経口経路、静脈内経路、動脈内経路、皮下経路、非経口経路、鼻腔内経路、筋肉内経路、心内経路、脳室内経路、気管内経路、口腔内経路、直腸内経路、腹腔内経路、皮内経路、局所経路、経皮経路、および髄腔内経路、またはこれら以外では、植込みもしくは吸入を介する経路が含まれるがこれらに限定されない多様な経路を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそれを必要とする被験体に投与することができる。対象の組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、浣腸、注射、吸入剤、およびエアゾールが含まれるがこれらに限定されない、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと調合することができる。適切な処方物および投与経路は、意図される適用および治療レジメンにより選択することができる。
【０２０２】
ｂ．投与量
同様に、特定の投与レジメン、すなわち、投与量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。半減期などの経験的な検討事項は一般に、投与量の決定に寄与する。投与頻度は、療法期間にわたり決定および調整することができ、腫瘍始原細胞を含めた過剰増殖性細胞もしくは新生物性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持、新生物性細胞の増殖の低減、または転移の発生の遅延に基づく。代替的に、対象の治療用組成物の連続的な持続放出処方物も適切でありうる。上記で示唆した通り、当技術分野では、持続放出を達成するための多様な処方物およびデバイスが公知である。
【０２０３】
治療的観点から述べると、医薬組成物は、特定の適応を処置または予防するのに有効な量で投与する。治療有効量は、典型的に、処置される被験体の体重、被験体の身体状態もしくは健康状態、処置される状態の広がり、または処置される被験体の年齢に依存する。一般に、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、１用量当たり体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの範囲の量で投与することができる。特定の実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、１用量当たり体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの範囲の量で投与することができる。特定の他の実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、１用量当たり体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの範囲の量で投与することができる。場合によって、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、１用量当たり体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇの範囲の量で投与することができる。さらに場合によって、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、１用量当たり体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇの範囲の量で投与することができる。本発明の化合物が提供される特定の実施形態では、少なくとも体重１ｋｇ当たり約１００μｇ、少なくとも体重１ｋｇ当たり約２５０μｇ、少なくとも体重１ｋｇ当たり約７５０μｇ、少なくとも体重１ｋｇ当たり約３ｍｇ、少なくとも体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ、少なくとも体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの用量を投与する。
【０２０４】
他の投与レジメンは、参照によりその全体において本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７において開示されている通り、体表面積（ＢＳＡ）の計算に基づき予測することができる。当技術分野において周知の通り、ＢＳＡは、患者の身長および体重を用いて計算され、患者の身体の表面積により表される被験体のサイズの尺度をもたらす。本発明の選択された実施形態では、ＢＳＡを用いて、モジュレーターを、１０ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができる。他の好ましい実施形態では、モジュレーターを、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与し、なおより好ましくは、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、または４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与する。当然ながら、どのようにして投与量を計算するのかに関わらず、複数の投与量を選択された期間にわたり投与して、個別の投与より実質的に高量の絶対投与量をもたらしうることが理解されるであろう。
【０２０５】
いずれにせよ、Ｎｏｔｕｍモジュレーターは、それを必要とする被験体に、必要に応じて投与することが好ましい。主治医などの当業者は、処置される状態、処置される被験体の年齢、処置される状態の重症度、処置される被験体の一般的な健康状態などについての検討に基づき、投与頻度の決定を行うことができる。一般に、有効用量のＮｏｔｕｍモジュレーターを、１回または複数回にわたり被験体に投与する。より具体的に述べると、有効用量のモジュレーターは、毎月１回、毎月１回より多く、または毎月１回より少なく被験体に投与する。特定の実施形態では、有効用量のＮｏｔｕｍモジュレーターを、少なくとも１カ月間にわたる期間、少なくとも６カ月間にわたる期間、または少なくとも１年間にわたる期間を含めた複数回にわたり投与することができる。
【０２０６】
投与量およびレジメンはまた、１回または複数回の投与を施された個体における開示された治療用組成物について経験的に決定することもできる。例えば、個体には、本明細書で記載される通りに生成させた治療用組成物を、投与量を漸増させて施すことができる。選択された組成物の有効性を評価するには、特定の疾患、障害、または状態のマーカーを追跡することができる。個体ががんを有する実施形態では、これらに、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定、Ｘ線もしくは他の造影法を介する腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）もしくは本明細書で記載される方法により同定される抗原の測定；疼痛もしくは麻痺の軽減；腫瘍と関連する発話、視覚、呼吸、もしくは他の能力障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）の改善；食欲の増進；または容認された検査により測定される生活の質の向上もしくは生存の延長が含まれる。当業者には、投与量が、個体、新生物性状態の種類、新生物性状態の病期、新生物性状態が個体における他の場所へと転移し始めたかどうか、ならびに過去に用いられた処置および現在用いられている処置に応じて変化することが明らかであろう。
【０２０７】
ｃ．組合せ療法
本発明が目論む組合せ療法は、望ましくない新生物性の細胞増殖（例えば、内皮細胞の細胞増殖）を減少させるかもしくは阻害するか、がんの発生を減少させるか、がんの再発を減少させるかもしくは防止するか、またはがんの拡大もしくは転移を減少させるかもしくは防止するのに特に有用でありうる。このような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊を下支えして永続化させるＴＰＣ（例えば、ＮＴＧ細胞）を除去することにより感作剤または化学感作剤として機能し、最新の標準治療である腫瘍減量剤または抗がん剤のより有効な使用を可能とする。すなわち、Ｎｏｔｕｍモジュレーターおよび１または複数の抗がん剤を含む組合せ療法を用いて、確立したがんを減殺する、例えば、存在するがん細胞の数を減少させ、かつ／または腫瘍負荷を減少させることもでき、少なくとも１つのがんの症状もしくは副作用を改善することもできる。したがって、組合せ療法は、Ｎｏｔｕｍモジュレーター、ならびに細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、免疫療法剤、がんワクチン、抗血管新生剤、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、および抗転移剤が含まれるがこれらに限定されない、１または複数の抗がん剤の投与を指す。
【０２０８】
本発明の方法によれば、組合せによる結果が、各処置（例えば、抗Ｎｏｔｕｍ抗体および抗がん剤）を個別に実施する場合に観察される効果の和となることは要請されない。少なくとも相加的である効果が一般的に望ましいが、単剤療法の抗腫瘍効果を上回る抗腫瘍効果の任意の増大が有益である。さらに、本発明は、組み合わされた処置が相乗効果を呈示することも要請しない。しかし、当業者は、好ましい実施形態を含む特定の選択された組合せにより、相乗作用が観察されうることを理解するであろう。
【０２０９】
本発明による組合せ療法を実施するには、１または複数の抗がん剤と組み合わせたＮｏｔｕｍモジュレーター（例えば、抗Ｎｏｔｕｍ抗体）を、それを必要とする被験体に、被験体内に抗がん活性を結果としてもたらすのに有効な形で投与することができる。Ｎｏｔｕｍモジュレーターおよび抗がん剤は、腫瘍環境においてそれらの組み合わされた存在およびそれらの組み合わされた作用を所望の通りに結果としてもたらすのに有効な量で、かつ、有効な時間にわたり提供される。この目標を達成するためには、Ｎｏｔｕｍモジュレーターと抗がん剤とを、単一の組成物により、または同じ投与経路もしくは異なる投与経路を用いる２つ以上の異なる組成物として、同時に被験体に投与することができる。
【０２１０】
代替的に、モジュレーターは、例えば、数分間〜数週間の範囲の間隔だけ、抗がん剤による処置に先行する場合もあり、後続する場合もある。抗がん剤と抗体とを被験体に個別に適用する特定の実施形態では、各送達時の間の時間を、抗がん剤とモジュレーターとが、腫瘍に対して組合せ効果を及ぼしうるような時間とする。特定の実施形態では、抗がん剤およびＮｏｔｕｍモジュレーターの両方を、互いから約５分間〜約２週間以内に投与することが意図される。
【０２１１】
さらに他の実施形態では、モジュレーターおよび抗がん剤の投与の間に数日（２、３、４、５、６、または７日）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月）が経過する場合もある。Ｎｏｔｕｍモジュレーターおよび１または複数の抗がん剤（組合せ療法）は、１回、２回、または少なくとも状態が処置されるか、緩和されるか、または治癒するまでの期間にわたり投与することができる。組合せ療法は、複数回にわたり投与することが好ましい。組合せ療法は、毎日３回〜６カ月ごとに１回投与することができる。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日１回、３日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、６カ月ごとに１回などのスケジュールで行うこともでき、ミニポンプを介して持続的に行うこともできる。既に示した通り、組合せ療法は、経口経路、経粘膜経路、口腔内経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、非経口経路、腫瘍内経路、または局所経路を介して投与することができる。組合せ療法は、腫瘍部位から遠隔の部位に投与することができる。組合せ療法は一般に、組合せ療法が、腫瘍またはがんに成長を停止させるか、または重量もしくは容量を減少させるという条件で、腫瘍が存在する限り投与する。
【０２１２】
一実施形態では、短い処置サイクルにわたり、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを、１または複数の抗がん剤と組み合わせてがん患者に投与して、がんを処置する。抗体による処置の持続期間は、用いられる特定の抗がん剤により変化しうる。本発明はまた、非持続的な投与または毎日の用量を複数回の部分的な投与へ分割することも目論む。当業者は特定の抗がん剤に適する処置回数を理解するであろうし、本発明は、各抗がん剤に最適な処置スケジュールの持続的な評価を目論む。
【０２１３】
本発明は、その間に組合せ療法を投与する、少なくとも１つのサイクル、好ましくは複数のサイクルを目論む。当業者は、総サイクル数およびサイクル間の間隔と同様、１つのサイクルに適する期間を理解するであろう。本発明は、各モジュレーターおよび抗がん剤に最適な処置スケジュールの持続的な評価を目論む。さらに本発明はまた、複数回にわたる抗Ｎｏｔｕｍ抗体または抗がん剤の投与ももたらす。モジュレーターと抗がん剤とは、隔日または隔週で互換的に投与することもでき、一連の抗体による処置を施した後で、１または複数にわたる抗がん剤療法による処置を施すこともできる。いずれにせよ、当業者により理解される通り、化学療法剤の適切な用量は一般に、ほぼ臨床療法において既に用いられている用量であり、化学療法は、単独でまたは他の化学療法と組み合わせて投与する。
【０２１４】
別の好ましい実施形態では、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを、疾患の初期発生後における腫瘍再発の可能性を低減するかまたは消失させる維持療法において用いることができる。障害は処置され、初期腫瘍塊は消失するか、軽減されるか、または他の形で改善され、患者は無症状であるかまたは寛解していることが好ましい。このようなときは、標準的な診断手順を用いて疾患がほとんど示されないまたは全く示されなくても、薬学的有効量の開示されるエフェクターを、１回または複数回にわたり被験体に投与することができる。一部の実施形態では、エフェクターを、ある期間にわたり定期的なスケジュールで投与する。例えば、Ｎｏｔｕｍモジュレーターは、毎週、隔週、毎月、６週間ごと、２カ月ごと、３カ月ごと、６カ月ごと、または毎年投与しうるであろう。本明細書の教示を踏まえるなら、当業者は、疾患再発の潜在的可能性を低減する好ましい用量および投与レジメンを容易に決定しうるであろう。さらに、患者の応答ならびに臨床パラメータおよび診断パラメータに応じて、数週間、数カ月間、数年間の期間にわたり、なおまたは無際限に、このような処置を継続しうるであろう。
【０２１５】
さらに別の好ましい実施形態では、腫瘍減量手順後において、本発明のエフェクターを用いて、腫瘍転移の可能性を予防的に防止または低減することができる。本開示で用いられる腫瘍減量手順は、広く定義され、腫瘍または腫瘍の増殖を消失させるか、低減するか、処置するか、または改善する任意の手順、技法、または方法を意味するものとする。例示的な腫瘍減量手順には、手術、放射線処置（すなわち、ビーム照射）、化学療法、または切除が含まれるがこれらに限定されない。腫瘍の転移を低減する臨床手順および診断手順により示唆される通り、本開示の観点に照らして当業者により容易に決定される適切な時点において、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを投与する。エフェクターは、標準的な技法を用いて決定される薬学的有効用量で１回または複数回にわたり投与することができる。好ましい投与レジメンは、必要に応じて改変することを可能とする、適切な診断法またはモニタリング法を随伴する。
【０２１６】
ｄ．抗がん剤
本明細書で用いられる抗がん剤という用語は、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、抗体、ならびに免疫療法剤を含めた、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用され得る任意の薬剤を意味する。上記で論じた、選択された実施形態では、抗がん剤が、コンジュゲートを含むことが可能であり、投与前にモジュレーターと会合させうることが理解されるであろう。
【０２１７】
細胞傷害性剤という用語は、細胞の機能を減少させるかもしくは阻害する物質および／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する、すなわち、この物質は、細胞に対して毒性である。この物質は、生存する生物に由来する天然分子であることが典型的である。細胞傷害性剤の例には、細菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａによる阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓによる阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素、例えば、それらの断片および／または変異体を含めた、膵臓細胞外ＲＮａｓｅなどの細胞傷害性ＲＮａｓｅ；ＤＮａｓｅ  Ｉが含まれるがこれらに限定されない。
【０２１８】
化学療法剤とは、がん細胞の増殖（ｇｒｗｏｔｈ、ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および／または生存を非特異的に減少させるかまたは阻害する化合物（例えば、細胞傷害性剤または細胞増殖抑制剤）を意味する。このような化学的薬剤は、細胞成長または分裂に必要な細胞内過程を指向することが多く、したがって、一般に成長および分裂が急速であるがん性細胞に特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合化し、したがって、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤には、がん性細胞またはがん性となる可能性が高い細胞もしくは腫瘍原性の後代を生成させる可能性が高い細胞（例えば、ＴＩＣ）を阻害するかまたは阻害するようにデザインされた任意の化学的薬剤が含まれうる。このような薬剤は、組合せで、例えば、ＣＨＯＰ処方物で投与することが多く、最も有効であることが多い。
【０２１９】
本発明のモジュレーターと組み合わせて（またはこれとコンジュゲートして）使用され得る抗がん剤の例には、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアミラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、窒素マスタード、抗生剤、エンジイン抗生剤、ジネマイシン、ビスホスホネート、エスペラマイシン、色素タンパク質、エンジイン抗生剤（ｅｎｅｄｉｙｎｅ  ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）、発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）であるドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎抗体、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクォン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）である多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）であるゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）であるビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ｈ−Ｒａｓ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、およびＶＥＧＦ−Ａ阻害剤、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるがこれらに限定されない。この定義にはまた、抗エストロゲン剤および選択エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、副腎におけるエストロゲンの生成を制御する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、ならびに抗アンドロゲン剤のほか；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）であるｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）であるトポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）であるｒｍＲＨ；ビノレルビン、およびエスペラミシン、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体など、腫瘍に対するホルモンの作用を制御するかまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。他の実施形態は、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パチツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンが含まれるがこれらに限定されない、がん治療について承認された抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示と適合可能なさらなる抗がん剤を容易に同定することが可能であろう。
【０２２０】
ｅ．放射線療法
本発明はまた、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの放射線療法（すなわち、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡの損傷を誘導する任意の機構）との組合せももたらす。放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付け送達を用いる組合せ療法もまた目論まれ、標的化抗がん剤または他の標的化手段と連携させて用いることができる。放射線療法は、約１〜約２週間にわたりパルスで投与されることが典型的である。頭頸部がんを有する被験体には、放射線療法を、約６〜７週間にわたり投与することができる。場合によって、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。
【０２２１】
ｆ．新生物性状態
単独で投与されるのであれ、抗がん剤または放射線療法と組み合わせて投与されるのであれ、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターは、良性腫瘍または悪性疾患（例えば、腎臓（ｒｅｎａｌ）がん、肝臓（ｌｉｖｅｒ）がん、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、甲状腺がん、肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）がん；肉腫；神経膠芽腫；および多様な頭頸部腫瘍）；白血病およびリンパ系悪性疾患；神経障害、神経膠障害、星状細胞障害、視床下部障害、ならびに他の腺障害、マクロファージ障害、上皮障害、間質障害、および胞胚腔障害；ならびに炎症性障害、血管新生性障害、免疫障害、および病原体により引き起こされる障害などの他の障害が含まれうる、患者または被験体における新生物性状態を一般に処置するのに特に有用である。本発明の治療用組成物および方法による処置に特に好ましい標的は、充実性腫瘍を含む新生物性状態である。他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、血液系悪性疾患を診断、防止、または処置するのに用いることができる。本明細書で用いられる被験体または患者という用語は、任意の哺乳動物種を含むと明示的に考えられるが、処置される被験体または患者は、ヒトであることが好ましい。
【０２２２】
より具体的に述べると、本発明に従う処置にかけられる新生物性状態は、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱がん（扁平細胞がんおよび移行細胞がん）、骨がん（アダマンチノーマ、脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄腫瘍、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん、明細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頸部がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平細胞がん、大細胞がんなど）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ）ブドウ膜黒色腫、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺転移がん、および子宮がん（子宮頸がん、子宮内膜がん、および平滑筋腫）が含まれるがこれらに限定されない群より選択することができる。好ましい特定の実施形態では、がん性細胞が、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、肉腫、腎転移がん、甲状腺転移がん、および明細胞がんが含まれるがこれらに限定されない充実性腫瘍の群より選択される。
【０２２３】
血液系悪性疾患については、本発明の化合物および方法が、低悪性度ＮＨＬ、濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中等悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変性ＮＨＬ、原発性マクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腺症、小リンパ球性リンパ芽球腫、濾胞性リンパ芽球腫、びまん性大細胞リンパ芽球腫、びまん性小型切れ込み核細胞性リンパ芽球腫、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型切れ込み核細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫、大細胞を主とする濾胞性リンパ腫；小型切れ込み核細胞を主とする濾胞性リンパ腫；ならびに小型切れ込み核細胞および大細胞混合型濾胞性リンパ腫を含めた多様なＢ細胞リンパ腫を処置するのに特に有効でありうることがさらに理解されるであろう。Ｇａｉｄｏｎｏら、「Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ＣＡＮＣＥＲ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＆  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ、２巻：２１３１〜２１４５頁（ＤｅＶｉｔａら編、増補５版、１９９７年）を参照されたい。当業者には、これらのリンパ腫は、分類システムの変化のために異なる名称を有することが多く、リンパ腫が異なる名称の下に分類されている患者もまた、本発明の組合せ治療レジメンから利益を得うることが明らかなはずである。
【０２２４】
さらに他の好ましい実施形態では、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを用いて、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬまたはＢ−ＣＬＬ）などの白血病を含めた特定の骨髄系悪性疾患および血液系悪性疾患を有効に処置することができる。ＣＬＬは主として、５０歳以降に発症率の増大が始まり、６０歳代後半までにピークに達する老齢者の疾患である。ＣＬＬは一般に、新生物性の末梢血リンパ球の増殖を伴う。ＣＬＬの臨床所見は、リンパ球増多症、リンパ腺症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｌｉｙ）、脾腫、貧血、および血小板減少症を伴う。ＣＬＬの特徴的な特色は、モノクローナルＢ細胞の増殖および分化の中間段階で停止したＢリンパ球の蓄積であり、このようなＢ細胞は、表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）またはｓＩｇＭおよびｓＩｇＤの両方を発現させ、正常Ｂ細胞における密度より低い密度で単一の軽鎖を発現させる。しかし、上記で論じ、本明細書に付属の実施例でも示す通り、Ｂ−ＣＬＬ細胞では、選択されたＮｏｔｕｍ（例えば、Ｎｏｔｕｍ）の発現が上方制御され、これにより、開示されるモジュレーターを誘引する標的がもたらされる。
【０２２５】
本発明はまた、良性腫瘍または前がん性腫瘍を伴う被験体の防止的処置または予防的処置も提供する。いかなる特定の種類の腫瘍または新生物性障害も、本発明を用いる処置から除外すべきではないと考えられる。しかし、腫瘍細胞の種類は、第２の治療剤、特に、化学療法剤および標的化抗がん剤と組み合わせた本発明の使用に関与性でありうる。
【０２２６】
本明細書で論じられる通り、本発明の好ましい実施形態は、充実性腫瘍を患っている被験体を処置するためのＮｏｔｕｍモジュレーターの使用を含む。このような被験体では、これらの充実性腫瘍のうちの多くが、開示されるエフェクターによる処置に対してそれらを特に感受性としうる、多様な遺伝子の変異を呈示する組織を含む。例えば、ＫＲＡＳ変異、ＡＰＣ変異、およびＣＴＮＮＢ１変異は、結腸直腸がんを伴う患者において比較的一般的である。さらに、これらの変異を伴う腫瘍を患っている患者、とりわけＫＲＡＳ変異を伴う患者は通常、現在の療法に対して最も不応性である。典型的には単一のアミノ酸置換を結果としてもたらすＫＲＡＳの活性化変異はまた、肺腺がん、粘液腺腫、および膵管がんを含めた、処置が困難な他の悪性疾患にも関与している。
【０２２７】
現在のところ、結腸直腸がん患者がＥＧＦＲ阻害薬またはＶＥＧＦ阻害薬に応答するかどうかについての最も信頼できる予測は、例えば、特定のＫＲＡＳ「活性化」変異について調べることである。ＫＲＡＳは、結腸直腸がんのうちの３５〜４５％が変異し、その腫瘍が変異したＫＲＡＳを発現させる患者は、これらの薬物への応答が良好でない。例えば、ＫＲＡＳ変異は、結腸直腸がんにおけるパニツムマブ療法およびセツキシマブ療法に対する応答の欠如の前兆となる（Ｌｉｅｖｒｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６６巻：３９９２〜５頁；Ｋａｒａｐｅｔｉｓら、ＮＥＪＭ、３５９巻：１７５７〜１７６５頁）。結腸直腸がんを伴う患者のうちの約８５％は、ＡＰＣ遺伝子に変異を有し（ＭａｒｋｏｗｉｔｚおよびＢｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ．  ＮＥＪＭ、３６１巻：２４４９〜６０頁）、８００を超えるＡＰＣ変異が、家族性腺腫性ポリープ症および結腸直腸がんを伴う患者において特徴付けられている。これらの変異の大部分は、ベータ−カテニンの破壊を媒介する機能的能力を低減させた切断型ＡＰＣタンパク質を結果としてもたらす。ベータ−カテニン遺伝子であるＣＴＮＮＢ１における変異はまた、このタンパク質の安定化を結果として増大させることから、また、変異したＡＰＣが正常な細胞増殖プログラムおよび細胞分化プログラムを維持するのに要請されるベータ−カテニンの破壊を適切に媒介するのに奏効しないことの結果として生じる発がん機構でもある、いくつかの発がん性の転写プログラムの核内移入およびその後における活性化も結果としてもたらす。本明細書の実施例により示される通り、このような変異を含む腫瘍は、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターによる処置に対して特に感受性であることがわかる場合がある。
【０２２８】
ＸＩＶ．製品
１回または複数回の投与分のＮｏｔｕｍモジュレーターを含む、１または複数の容器を含む医薬パックおよび医薬キットもまた提供される。特定の実施形態では、単位用量が提供され、この単位用量が、１または複数のさらなる薬剤を伴うかまたは伴わずに、例えば、抗Ｎｏｔｕｍ抗体を含む所定量の組成物を含有する。他の実施形態では、このような単位用量が、単回使用用にあらかじめ充填された注射用シリンジにより供給される。さらに他の実施形態では、単位用量中に含有される組成物が、生理食塩液、スクロースなど、リン酸緩衝液などの緩衝液を含む場合もあり、かつ／または安定で有効なｐＨ範囲内で処方される場合もある。代替的に、特定の実施形態では、組成物を、適切な液体、例えば、滅菌水を添加して復元しうる凍結乾燥粉末として提供することもできる。好ましい特定の実施形態では、組成物が、スクロースおよびアルギニンが含まれるがこれらに限定されない、タンパク質の凝集を阻害する１または複数の物質を含む。容器（複数可）上の任意のラベル、または容器（複数可）と関連する任意のラベルは、封入された組成物が、最適の疾患状態を診断または処置するのに用いられることを示す。
【０２２９】
本発明はまた、単回投与用または複数回投与用の投与単位のＮｏｔｕｍモジュレーター、および場合によって、１または複数の抗がん剤を生成させるキットももたらす。キットは、容器および容器上にあるかまたは容器と関連するラベルまたはパッケージの添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成することができる。容器は、状態を処置するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグの場合もあり、皮下用注射針で穿刺可能な密栓を有するバイアルの場合もある）。このようなキットは一般に、適切な容器内に、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの薬学的に許容される処方物と、場合によって、同じ容器内または異なる容器内の１または複数の抗がん剤とを含有する。キットはまた、診断用または組合せ療法用の他の薬学的に許容される処方物も含有しうる。例えば、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターに加えて、このようなキットは、化学療法薬または放射線療法薬など、ある範囲の抗がん剤のうちの任意の１または複数；抗血管新生剤；抗転移薬；標的化抗がん剤；細胞傷害性剤；および／または他の抗がん剤も含有しうる。このようなキットはまた、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを抗がん剤または診断剤とコンジュゲートするのに適する試薬（例えば、参照によりその全体において本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９を参照されたい）も提供しうる。
【０２３０】
より具体的に述べると、キットは、さらなる成分を伴うかまたは伴わずに、Ｎｏｔｕｍモジュレーターを含有する単一の容器を有する場合もあり、各所望の薬剤用の異なる容器を有する場合もある。コンジュゲーション用に組み合わされた治療剤を提供する場合、単一の溶液を、モル等量の組合せであらかじめ混合することもでき、１つの成分を他の成分に対して過剰としてあらかじめ混合することもできる。代替的に、キットのＮｏｔｕｍモジュレーターおよび任意選択の抗がん剤は、患者に投与する前に異なる容器内で個別に維持することもできる。キットはまた、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、リンゲル液、およびデキストロース溶液など、滅菌の薬学的に許容される緩衝液または他の希釈剤を含有する第２／第３の格納手段も含む。
【０２３１】
キットの構成要素を１または複数の溶液により提供する場合、溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末（複数可）として提供することもできる。試薬または構成要素を乾燥粉末として提供する場合は、適切な溶媒を添加することにより粉末を復元することができる。溶媒はまた、別の容器でも提供されうることが想定される。
【０２３２】
上記で簡略に示した通り、キットはまた、抗体および任意選択の構成要素を動物または患者に投与するための手段、例えば、１または複数の注射針もしくはシリンジ、なおまたは点眼器、ピペット、あるいはそれにより処方物を動物へと注入または導入するかまたは身体の疾患領域へと適用する他のこのような装置も含有する。本発明のキットはまた、バイアルなどおよび他の構成要素を市販用の密閉容器、例えば、所望のバイアルおよび他の装置が配置および保持される、吹き出し成形または射出成形されたプラスチック容器などに格納するための手段も包含することが典型的である。任意のラベルまたはパッケージの添付文書により、Ｎｏｔｕｍモジュレーター組成物が、がん、例えば、結腸直腸がんを処置するのに用いられることを表示する。
【０２３３】
ＸＶ．研究用試薬
本発明の他の好ましい実施形態はまた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）、またはレーザー媒介型区分などの方法により、腫瘍始原細胞の集団または亜集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮するのに有用な手段としての開示されるモジュレーターの特性も利用する。当業者は、モジュレーターを、がん幹細胞を含むＴＩＣを特徴付けそして操作するためのいくつかの適合可能な技法において使用され得ることを理解するであろう（例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／６８６，３５９、同１２／６６９，１３６、および同１２／７５７，６４９を参照されたい）。
【０２３４】
ＸＶＩ．その他
本明細書で別段に規定されない限り、本発明との関連で用いられる科学技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段に要請されない限り、単数形の用語は、複数形を包含するものとし、複数形の用語は、単数形を包含するものとする。より具体的に述べると、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、文脈により別段に明確に定められない限り、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質を包含し、「細胞」への言及は、細胞の混合物などを包含する。加えて、明細書および添付の特許請求の範囲において示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を包含する。したがって、２．０〜３．０の範囲は、２．０、３．０、および２．０と３．０との間の全ての点を包含する。
【０２３５】
一般的に、本明細書で記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で用いられる用語法ならびにこれらの技法は、周知のものであり、一般に当技術分野で用いられている。別段に示されない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、本明細書の全体で引用されて論じられている多様な一般的参考文献および多様でより具体的な参考文献において記載されている従来の方法により実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００３年）を参照されたい。酵素反応および精製法は、当技術分野において一般に達成される通り、または本明細書で記載される通り、製造元の仕様に従い実施する。本明細書で記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および実験法との関連で用いられる用語法は、周知であり、かつ、当技術分野で一般に用いられる用語法である。
【０２３６】
本明細書中で開示されるかまたは引用される全ての参考文献または文書は、限定なしに述べると、参照によりそれらの全体において本明細書に援用される。さらに、本明細書で用いられる任意の節見出しは、構成だけを目的とするものであり、記載される対象を制限するものとしてはみなされないものとする。
【実施例】
【０２３７】
本発明はこのように概説されたが、例示として提供され、本発明を制限するものではない以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解される。実施例は、下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すものではない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度で示され、圧は大気圧またはその近くである。
【０２３８】
（実施例１）
腫瘍始原細胞集団の特徴付け
がん患者に存在するときの充実性腫瘍の細胞異質性を特徴付け、特定の表現型マーカーを用いて腫瘍永続細胞（ＴＰＣ；すなわちがん幹細胞：ＣＳＣ）の正体を解明し、臨床的に適切な治療標的を同定するために、当技術分野で認識されている技術を用いて大きな非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍バンクを開発し、維持した。多数の別個の腫瘍細胞系を含むＮＴＸ腫瘍バンクを、様々なの充実性腫瘍悪性疾患に罹患する多数のがん患者から最初に得られた異種腫瘍細胞の複数の継代を通して、免疫不全マウスで増殖させた。十分に規定された系統を有する多数の別個の初期継代ＮＴＸ腫瘍細胞系の連続した入手可能性は、それらがそれらの細胞系から精製される細胞の再現性および反復性の特徴付けを可能にするのでＴＰＣの同定および単離を大きく促進する。より詳しくは、単離または精製されるＴＰＣは、その細胞が由来する患者の腫瘍試料を再現するマウスで表現型的および形態学的に異種の腫瘍を生成するそれらの能力によって遡及的に（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）、最も正確に定義される。したがって、単離細胞の小集団を用いてマウスで完全に異種の腫瘍を生成する能力は、その単離細胞がＴＰＣを含むという事実の強い指標となる。そのような研究では、最小限に継代されたＮＴＸ細胞系の使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を大きく単純化し、容易に証明できる結果を提供する。さらに、初期継代ＮＴＸ腫瘍はイリノテカン（すなわちＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））などの治療剤にも応答し、それは、腫瘍増殖、現在の療法への抵抗性および腫瘍再発を駆動する根本機構に対する臨床的に重要な識見を提供する。
【０２３９】
ＮＴＸ腫瘍細胞系が樹立されたので、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）を特徴付けし、単離し、精製または濃縮するために用いることができる別個のマーカーを同定し、そのような集団の中でＴＰＣおよびＴＰｒｏｇ細胞を分離または解析するために、フローサイトメトリーを用いて構成要素の腫瘍細胞表現型を解析した。この点に関して、本発明者らは、タンパク質発現および潜在的に有益なマーカーの同時同定に基づく細胞の迅速な特徴付けを可能にした、商標登録されたプロテオームベースのプラットホーム（すなわちＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔ（商標）アレイ）を使用した。ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイは数百の別個の結合分子を含む商標登録されたプロテオームプラットホームであり、その多くは９６ウェルプレートに並べられて商業的な供給源から得られ、各ウェルはフィコエリトリン蛍光性チャンネルに異なる抗体を含有し、異なる蛍光色素の複数の追加の抗体がプレート全域のあらゆるウェルに並べられる。これは、関連する細胞の迅速な包含または非フィコエリトリンチャンネルを経た非関連細胞の消去を通して、選択された腫瘍細胞の亜集団における目的の抗原の発現レベルの決定を可能にする。ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイを当技術分野で周知である組織解離、移植および幹細胞技術と組み合わせて用いた場合（Ａｌ−Ｈａｊｊら、２００４年、Ｄａｌｅｒｂａら、２００７年、およびＤｙｌｌａら、２００８年、全て上記、各々の全体が、参考として本明細書に援用される）、関連するマーカーを有効に同定し、その後特定のヒト腫瘍細胞亜集団を非常に効率よく単離、移植することが可能であった。
【０２４０】
したがって、重度に免疫不全を起こしたマウスでヒト腫瘍のために通常なされているように、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系を確立した後に、８００〜２，０００ｍｍ３に到達した際に腫瘍をマウスから切除し、当技術分野で認識された酵素消化技術を用いて細胞を単一細胞懸濁液に解離した（例えば、本明細書に援用されるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照）。ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイを用いてこれらの懸濁液から得られたデータは、細胞ごとの絶対的（細胞につき）および相対的（集団内の他の細胞に対する）の両方の表面タンパク質発現を提供し、細胞集団のより複雑な特徴付けおよび層別化をもたらした。より具体的には、ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイの使用は、ＴＩＣまたはＴＰＣをＮＴＧ腫瘤細胞および腫瘍間質から先を見越して（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）区別したタンパク質またはマーカーの迅速な同定を可能にし、ＮＴＸ腫瘍モデルから単離された場合には、特定の細胞表面タンパク質の異なるレベルを発現する腫瘍細胞亜集団の比較的迅速な特徴付けを可能にした。詳細には、腫瘍細胞集団にわたり異種発現を有するタンパク質は、高レベルおよび低レベルの特定のタンパク質またはマーカーのいずれかを発現する、異なり、かつ高度に精製された腫瘍細胞亜集団の単離、および免疫不全マウスへの移植を可能にし、それによって、ＴＰＣが１つの亜集団か別の亜集団で濃縮されたかについての評価を促進する。
【０２４１】
濃縮するという用語は細胞を単離することと同義的に用いられ、出発細胞集団または初期細胞集団と比較して、１つの型の細胞の収量（画分）が他の型の細胞の画分より増加していることを意味する。好ましくは、濃縮することは、出発細胞集団と比較して細胞集団中の１つの型の細胞の百分率を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％または５０％を超えて増大させることを指す。
【０２４２】
本明細書で用いられるマーカーとは、細胞または組織の文脈において、疾患または障害に侵された組織または細胞集団の中かその上で同定されるものを含む、特定の細胞、細胞集団または組織と同定可能に関連するか、その中かその上で特異的に見出される化学的実体または生物学的実体の形の任意の特徴を意味する。明らかにされるように、マーカーは、性質が形態学的、機能的、または生化学的であってよい。好ましい実施形態では、マーカーは、特定の細胞型（例えば、ＴＰＣ）によって、または一定の条件下の細胞（例えば、細胞のライフサイクルの特定の時点または特定のニッシェにおける細胞）によって差次的または優先的に発現される細胞表面抗原である。好ましくは、そのようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは抗体、アプタマーまたは当技術分野で公知である他の結合分子のためのエピトープを有する。しかし、マーカーは、それらに限定されないがタンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸およびステロイドを含む、表面または細胞の中に見出される任意の分子からなることができる。形態学的マーカーの特徴または形質（ｔｒａｉｔ）の例には、形状、サイズおよび核と細胞質との比が含まれるが、これらに限定されない。機能的マーカーの特徴または形質の例には、特定の基質に接着する能力、特定の色素を組み込むか排除する能力（例えば、それに限定されないが親油性色素の排除）、特定の条件下で移動する能力、および特定の系統に沿って分化する能力が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、レポーター遺伝子、例えばそのレポーター遺伝子をコードする核酸配列のその細胞への導入、およびマーカーとして用いることができるレポータータンパク質の生成をもたらすその転写の結果として細胞によって発現されるレポーター遺伝子から発現されるタンパク質であってもよい。マーカーとして用いることができるそのようなレポーター遺伝子は、例えば蛍光性タンパク質酵素、染色小粒タンパク質（ｃｈｒｏｍｏｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、耐性遺伝子などであるが、これらに限定されない。
【０２４３】
関連した意味で、組織、細胞または細胞集団（例えば、安定したＴＰＣ表現型）の文脈において、マーカー表現型という用語は、特定の細胞または細胞集団を特徴付けるか、同定、分離、単離または濃縮するために用いることができる任意のマーカーまたはマーカーの組合せを意味する。具体的な実施形態では、マーカー表現型は、細胞表面マーカーの組合せの発現を検出または同定することによって決定することができる細胞表面表現型である。
【０２４４】
当業者は、多数のマーカー（またはそれらの不在）ががん幹細胞の様々な集団と関連付けられ、腫瘍細胞亜集団を単離して特徴付けるために用いられていることを認識するであろう。これに関して、例示的ながん幹細胞マーカーは、以下：
【０２４５】
【化１】
2013539468.tif 000003
を含む。例えば、各々が参考として本明細書に援用される、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０年、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６および２０１１／００２０２２１を参照。いくつかのこれらのマーカーが上記のＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイに含まれたことは理解されるであろう。
【０２４６】
同様に、特定の腫瘍型のがん幹細胞と関連する細胞表面表現型の非限定例には、
以下：
【０２４７】
【化２】
2013539468.tif 000004
ならびに当技術分野で公知である他のがん幹細胞表面表現型が含まれる。例えば、各々の全体が、参考として本明細書に援用される、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０年、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３を参照。当業者は、直前に例示されるものなどのマーカー表現型が、さらなる解析のためにＴＩＣおよび／またはＴＰＣの細胞または細胞集団を特徴付けるか、単離、精製または濃縮するために、標準のフローサイトメトリー解析および細胞選別技術と一緒に用いることができることを理解するであろう。本発明に関して興味のあるのは、解析される腫瘍標本が初代患者腫瘍標本であるか患者由来のＮＴＸ腫瘍であったか否かを問わず、ＣＤ４６、ＣＤ３２４、および任意選択でＣＤ６６ｃは、多くのヒトの結腸直腸（「ＣＲ」）、乳房（「ＢＲ」）、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺（ＳＣＬＣ）、膵臓（「ＰＡ」）、黒色腫（「Ｍｅｌ」）、卵巣（「ＯＶ」）および頭頸部がん（「ＨＮ」）腫瘍細胞の表面で高度にまたは不均一に発現される。
【０２４８】
（実施例２）
濃縮腫瘍始原細胞集団からのＲＮＡ試料の単離および解析
免疫不全マウスで腫瘍を開始するために、樹立された結腸直腸ＮＴＸ細胞系（ＳＣＲｘ−ＣＲ４）を用いた。平均腫瘍負荷（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）が約３００ｍｍ３に到達したならば、マウスを無作為化して、１５ｍｇ／ｋｇイリノテカンまたはビヒクル対照（ＰＢＳ）のいずれかで週２回、２０日間処置し、その時点でマウスを安楽死させ、実施例１に示すマーカー表現型を一般に用いて、新鮮に切除したＮＴＸ腫瘍からＴＰＣ、ＴＰｒｏｇおよびＮＴＧ細胞をそれぞれ単離した。より詳しくは、ＣＤ４６、ＣＤ３２４およびＣＤ６６ｃマーカーを用いる蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって細胞集団を単離し、直ちにペレットにし、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＬＴＰｌｕｓ  ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に溶解した。その後、用いるまで、溶解物を−８０℃で保存した。ＲＮＡ細胞溶解物を解凍した後、販売者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて全ＲＮＡを抽出し、再度販売者のプロトコールおよび推奨される機器設定を用いてＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）で定量化した。生じた全ＲＮＡ調製物は、遺伝子の配列決定および解析に適していた。
【０２４９】
ビヒクルまたはイリノテカンで処置されたマウスから前記のように単離されたＴＰＣ、ＴＰｒｏｇおよびＮＴＧ細胞集団から得られたＲＮＡ試料は、１試料につき５ｎｇの全ＲＮＡから出発して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤ３．０（オリゴライゲーション／検出による配列決定）次世代配列決定プラットホーム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる全トランスクリプトームの配列決定のために調製された。ヒトゲノムからの３４，６０９個の遺伝子へマッピングされた、ＳＯＬｉＤプラットホームによって生成されたデータは、Ｎｏｔｕｍを検出することができ、全ての試料においてＮｏｔｕｍレベルの検証可能な測定値を提供した。
【０２５０】
一般に、ＳＯＬｉＤ３次世代配列決定プラットホームは、ビーズに連結するクローン増幅ＲＮＡ／ＤＮＡ断片の平行した配列決定を可能にする。次に、試料中に存在する各断片の５０塩基の読取りを生成するために、色素標識オリゴヌクレオチドとのライゲーションによる配列決定が用いられ、合計で５０，０００，０００を超える読取りがゲノムでのタンパク質のｍＲＮＡ転写産物レベルの発現のずっと正確な表示を生成する。ＳＯＬｉＤ３プラットホームは、読取り範囲（ゲノム位置へ固有にマッピングされた読取り）だけに基づいて、発現だけでなく、ＳＮＰ、既知および未知の選択的スプライシング事象ならびに潜在的に新しいエクソンの発見を捕捉することができる。したがって、この次世代プラットホームの使用は、転写産物レベルの発現の差、ならびにそれらの発現されるｍＲＮＡ転写産物の特定のスプライス変異体の差または優先度の決定を可能にした。さらに、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの改変完全トランスクリプトームプロトコールを用いるＳＯＬｉＤ３プラットホームによる解析は、およそ５ｎｇの出発材料の前増幅を必要としただけであった。このことは、細胞のＴＰＣサブセットが、例えばＮＴＧまたは腫瘤よりも数が非常に少なく、したがって使える出発材料が非常に少ない量になる場合に、選別された細胞集団からの全ＲＮＡの抽出として重要である。
【０２５１】
標準的な工業上の実施の通り、二連で実行したＳＯＬｉＤ３プラットホームからの配列決定データを正規化し、変換し、倍率を計算した。図２で見られるように、データの解析は、転写産物レベルにおいてＮｏｔｕｍがＴＰＣでＴＰｒｏｇおよびＮＴＧ集団の２倍から５倍高く上方制御され、週２回の１５ｍｇ／ｋｇイリノテカンで処置されたＮＴＸ腫瘍保持マウスではさらに上昇したことを示した。極めて感度が高いＳＯＬｉＤ３解析プラットホームを用いて観察されたＮＴＸ腫瘍試料のＴＰＣ亜集団でのＮｏｔｕｍの過剰発現は、Ｎｏｔｕｍが結腸直腸の腫瘍形成および維持で重要な役割を果たし得ることを示唆する。
【０２５２】
（実施例３）
濃縮腫瘍始原細胞集団でのＮｏｔｕｍのリアルタイムＰＣＲ解析
ＴＰＣ集団対ＴＰｒｏｇおよびＮＴＧ細胞でＮｏｔｕｍの発現の増強を確認するために、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、前述の様々なＮＴＸ系から単離されたそれぞれの細胞集団で遺伝子発現レベルを測定した。そのようなリアルタイムＰＣＲ解析が、目的の特定の遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブのセットを用いて、別個の標的の遺伝子発現レベルのより直接的で迅速な測定を可能にすることは理解されるであろう。ＴａｑＭａｎリアルタイム定量的ＰＣＲは、複数の患者由来のＮＴＸ系細胞集団および対応する対照でＮｏｔｕｍ遺伝子の発現を測定するために用いられた、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ５９００ＨＴ機器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施された。以降の解析は、ＴａｑＭａｎシステムと一緒に供給された説明書に指定された通りに、および市販されているＮｏｔｕｍプライマー／プローブセット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行われた。
【０２５３】
図３に見られるように、３つの異なる結腸直腸ＮＴＸ腫瘍系（例えば、ＣＲ２、ＣＲ４およびＣＲ５）から単離されたＮＴＧ、ＴＰｒｏｇおよびＴＰＣ集団での遺伝子発現を調べた定量的リアルタイムＰＣＲは、Ｎｏｔｕｍ遺伝子発現がＴＰＣ細胞でおよそ２倍上昇すること、およびこの発現は、イリノテカンによる処置を受けたマウスではおよそ４倍にさらに上昇することを示す。リアルタイム定量的ＰＣＲのより広く容認された方法を用いた、ＴＰｒｏｇおよびＮＴＧ細胞対照と比較したＮＴＸ  ＴＰＣ細胞調製物での上昇したＮｏｔｕｍ発現の観察は、前の実施例のＳＯＬｉＤ３完全トランスクリプトーム配列決定データを確認し、結腸直腸新生物での駆動因子としてのＮｏｔｕｍをさらに示唆する。さらに、抗がん剤で処置された腫瘍で増加したＮｏｔｕｍの発現は、Ｎｏｔｕｍモジュレーターまたはアンタゴニストが補助療法として価値があることを証明し得ることを示す。
【０２５４】
（実施例４）
未分画結腸直腸腫瘍試料でのＮｏｔｕｍの発現
ＴＰｒｏｇおよびＮＴＧ細胞と比較したときに、結腸直腸腫瘍からのＴＰＣ集団でＮｏｔｕｍ遺伝子発現が上昇することが見出されたという事実を考慮して、正常な隣接組織（ＮＡＴ）および他の正常な組織試料に対して未分画結腸直腸腫瘍試料でもＮｏｔｕｍ発現レベルが上昇したかどうか決定するための実験を行った。提供されたプロトコールに従って、１１０個の結腸直腸患者腫瘍標本、正常な隣接組織および４８個の正常組織を含有するカスタム仕様のＴｕｍｏｒＳｃａｎ  ｑＰＣＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３８４ウェルアレイを設計し、注文作製をした。実施例３で詳述される手法および同じＮｏｔｕｍ特異的プライマー／プローブセットを用いて、カスタム仕様プレートのウェルでＴａｑＭａｎリアルタイム定量的ＰＣＲを次に実施した。
【０２５５】
図４Ａおよび４Ｂは、正常な結腸および直腸の組織での平均的発現に対して正規化した発現データの結果を、グラフ形式で示す。より具体的には、図４Ａは、１１０人の結腸直腸がん患者から得られた１６８個の組織標本（そのうち３５個の組織標本は結腸直腸がん患者からの正常な隣接組織である）および４８個の正常組織を使って生成されたデータを要約する。グラフでは、データはボックスおよびひげグラフで表され、メジアンの値はボックスの中の線で表される。同様に、図４Ｂは、腫瘍組織または正常な隣接組織から得られた２４個のマッチさせた結腸直腸患者標本からのデータを含有する。ここでは、プロットされたデータは、試料別にそれぞれの腫瘍とＮＡＴの間を関連させて提示される。図４Ａおよび４Ｂの両方は、提示される４つの病期の全てにおいて、Ｎｏｔｕｍ遺伝子の発現レベルが、結腸直腸腫瘍、および正常な隣接組織に対してマッチさせた腫瘍標本で上昇することを示す。
【０２５６】
さらに詳しくは、これらの初代患者腫瘍試料（ＮＴＸ腫瘍とは対照的に）でのリアルタイムＰＣＲの結果は、がんの病期（すなわち第Ｉ期〜第ＩＶ期疾患）にかかわりなく、Ｎｏｔｕｍ遺伝子発現が正常な隣接組織（ＮＡＴ）に対して患者腫瘍でおよそ１，０００倍高いことを示した。同様に、Ｎｏｔｕｍ遺伝子発現は、ＮＡＴに対してマッチさせた腫瘍でおよそ１０〜１００倍上昇した。さらに、Ｎｏｔｕｍ発現はほとんどの正常組織で比較的低く、正常な胎盤および肝臓組織だけが、病期によってクラスター化させた結腸直腸がん患者腫瘍で観察されたメジアンレベル以上の遺伝子発現レベルを有していた。未分画結腸直腸腫瘍試料でのＮｏｔｕｍの発現の上昇および正常な対照組織での比較的低い発現レベルは、悪性疾患の発達および支持におけるＮｏｔｕｍ遺伝子産物の役割に関して再び示唆的である。
【０２５７】
（実施例５）
例示的な腫瘍試料でのＮｏｔｕｍの差次的発現
１７個の他の異なる充実性腫瘍型のうちの１つと診断された患者からの追加の結腸直腸がん患者腫瘍試料および腫瘍標本でＮｏｔｕｍ遺伝子発現をさらに評価するために、実施例４でのように提供されたプロトコールに従って注文により組み立てたＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ  ｑＰＣＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３８４ウェルアレイを用いてＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。測定の結果は図５Ａおよび５Ｂに提示され、Ｎｏｔｕｍの遺伝子発現がいくつかの腫瘍試料で有意に上昇することを示す。
【０２５８】
これに関して、図５Ａおよび５Ｂは、１８個の異なる充実性腫瘍型のうちの１つを有する患者からの腫瘍標本全体（灰色ボックス）またはマッチさせたＮＡＴ（白色ボックス）でのヒトＮｏｔｕｍの、相対的または絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示す。図５Ａでは、データは、解析した腫瘍型ごとに平均のＮＡＴ遺伝子発現に対して正規化される。図５Ｂでは、Ｎｏｔｕｍの絶対的発現は様々な組織／腫瘍で評価され、データは、定量的リアルタイムＰＣＲによって指数関数的増幅に到達するために必要なサイクル数（Ｃｔ）としてプロットされている。増幅されていない標本は４５のＣｔ値を割り当てられ、それは実験プロトコールでの増幅の最後のサイクルを表す。データはボックスおよびひげグラフで表され、メジアンの値はボックスの中の線で表される。
【０２５９】
結腸直腸がんと診断された患者に加えて、子宮内膜、食道および子宮がんと診断された患者もＮＡＴに対して腫瘍で有意に多いＮｏｔｕｍ遺伝子発現を有し、これらの腫瘍でＴＰＣの自己再生および増殖に影響を与えることによってＮｏｔｕｍが病理学的役割も果たすかもしれないことを示唆した。より有意でないが、卵巣、前立腺および甲状腺の腫瘍も上昇したＮｏｔｕｍ発現を有していた。これらの試験からさらに明瞭であったことは、ほとんどのＮＡＴ試料でＮｏｔｕｍ遺伝子発現が概して低い〜検出不能までの間であって、最も高い発現が肝臓、精巣および肺で観察されたことである。再び、これらのデータは、いくつかの過剰増殖性障害での腫瘍形成または永続に関して、Ｎｏｔｕｍ発現が指標となること、および潜在的に手がかりを与えるものであることを示唆する。
【０２６０】
（実施例６）
様々なプールされた組織溶解物でのＮｏｔｕｍタンパク質の差次的発現
前の実施例によって証明されたようにいくつかの腫瘍形成試料でのＮｏｔｕｍ遺伝子発現の増強を立証した後、類似した腫瘍試料でのＮｏｔｕｍタンパク質の対応する増加のための証拠を追求した。これに関して、１１個の異なる腫瘍型またはそれらのそれぞれの正常な隣接組織からの溶解物のプールされた２つの反復物を含む逆相タンパク質アレイを、外因性プロモーター（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって駆動されたＴＰ５３過剰発現の有り無しで、２９３個の細胞の対照と一緒に提供した。溶解物でのＮｏｔｕｍタンパク質発現は、ヒトＮｏｔｕｍに対して生成されたマウスポリクローナル抗体、および比色検出試薬、および製造業者によって提供されたプロトコールを用いて検出された。製作されたアレイ上のスポットはフラットベッドスキャナを用いてデジタル画像に変換し、次に、ＡｌｐｈａＥａｓｅＦｃソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）内のＳｐｏｔＤｅｎｓｏ機能を使って定量化した。
【０２６１】
これらのアッセイの結果は図６に示され、Ｎｏｔｕｍタンパク質の発現が数種類の異なる腫瘍で上方制御されることを示す。より具体的には、図６は、１１個の異なる腫瘍型（すなわち、初代腫瘍試料）のうちの１つを有する患者から得られた標本からの、正常な隣接組織および２９３ＴＰ５３陰性対照（白）または２９３ＴＰ５３陽性対照および腫瘍組織（黒）でのヒトＮｏｔｕｍの発現レベルを示す。データを前記のように生成し、１スポットあたりの平均ピクセル強度として表した。プロットされたデータは、平均±ＳＥＭを表す。
【０２６２】
結腸直腸がんに加えて、Ｎｏｔｕｍタンパク質の発現は、黒色腫、前立腺がんおよび膵臓がんを有する患者からの腫瘍標本で有意に上昇するようである。これらのデータは、Ｎｏｔｕｍ過剰発現がこれらの腫瘍でＴＰＣの増殖および／または生存に関与する可能性を示唆する。さらに、Ｎｏｔｕｍタンパク質の検出は、これらの疾患の予後徴候となることがある。
【０２６３】
ＴＰＣ濃縮細胞集団および様々な腫瘍でＮｏｔｕｍが過剰発現される（遺伝子レベルおよびプロテオームレベルの両方で）ことを示す上の実施例、ならびにそのような上昇した発現レベルが腫瘍形成および腫瘍増殖と関連する可能性を考慮して、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの生成で用いることができるＮｏｔｕｍ免疫原を構築することが決定された。
【０２６４】
（実施例７）
タグ付きＮｏｔｕｍモジュレーターの構築および発現
Ｎｏｔｕｍモジュレーターの生成で用いるために、下記のように構築物を製作し、発現させた。出発点として、全読み取り枠（ＯＲＦ）配列番号１をコードするヒトＮｏｔｕｍのｃＤＮＡを、商業的な供給源（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；受託番号ＢＣ０６０８８２）から得た。ＤＮＡ配列決定によって、ｃＤＮＡクローンＯＲＦ配列は、参照配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿１７８４９３）と比較して変異がないことを確認した。
【０２６５】
組換え産物の精製および検出の容易さのために、完全長ＮｏｔｕｍのＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、８×−Ｈｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩエピトープ（ＩＢＡ  ＧｍＢＨ）をコードする配列を含むようにＰＣＲによって改変した。改変されたＮｏｔｕｍのＯＲＦをコードするＤＮＡは、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲクリーンアップカラム（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）のＮｏｔ  Ｉ部位とＸｈｏ  Ｉ部位の間にサブクローニングされたＤＮＡを用いてＰＣＲから精製し、ＤＮＡ配列決定によって変異がないことを確認した。この場合、野生型Ｎｏｔｕｍシグナルペプチド配列が、組換えタンパク質の分泌を指示する。
【０２６６】
本発明に従って、所望の組換え産物の産生で用いるためのｐＳＥＣ発現ベクターを構築した。ｐＳＥＣ−ＣＡＧ発現ベクターはＣＡＧプロモーターを含み、それは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主要最初期遺伝子エンハンサー／プロモーター領域、エンハンサー／プロモーター領域の下流に位置するβ−グロビン／ＩｇＧキメライントロンで構成される。ｐＳＥＣ−ＣＡＧベクターは、クローニングされたｃＤＮＡ挿入断片の強力な構成的発現を多くの細胞型で促進する。ｐＳＥＣ−ＣＡＧは、プラスミドでトランスフェクトされた細胞から発現される組換えタンパク質の分泌の増強を促進するための、ＩｇＫシグナルペプチド／リーダー配列も含む。ｐＳＥＣ−ＣＡＧ−ＮＯＴＵＭ−ＳｔｒｅｐＨｉｓを作製するために、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔからのエピトープタグ付きＮｏｔｕｍ  ＯＲＦを、ｐＳＥＣ−ＣＡＧベクターへ、Ｓｆｉ  Ｉ部位とＸｈｏ  Ｉ部位の間にＰＣＲによってサブクローニングした。
【０２６７】
懸濁液２９３細胞の１リットルのトランスフェクションのためにｐＳＥＣ−ＣＡＧ−ＮＯＴＵＭ−ＳｔｒｅｐＨｉｓ  ＤＮＡを用い、組換えタンパク質はニッケル−ＮＴＡカラムを用いてトランスフェクトされた細胞の上清から精製した。より具体的には、製造業者の指示に従ってリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてプラスミドｐＳＥＣ−ＣＡＧ−ＮＯＴＵＭ−ＳｔｒｅｐＨｉｓをトランスフェクトすることによって、組換えＮｏｔｕｍタンパク質を付着性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成した。付着細胞からの上清を４８時間で収集し、組換えＨｉｓタグ付きタンパク質は、ＡＫＴＡプライム機器を用いてＮｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）で精製した。組換えタンパク質（すなわち、ｈＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ）は、イミダゾールの線形勾配（最終濃度５００ｍＭ）を用いてカラムから溶出させ、Ｎｏｔｕｍタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣを用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラムでさらに精製してモノマータンパク質を収集した。精製されたＮｏｔｕｍタンパク質は、ＥＬＩＳＡによって、およびタンパク質ブロット解析によって確認された。収集した物質は、以降の実施例で免疫化のために用いた。
【０２６８】
同様に、直前に示すのと実質的に同じ技術および下記の実施例８に記載されるマウスＮｏｔｕｍ遺伝子を用いて、Ｈｉｓタグ付きマウスＮｏｔｕｍ（すなわち、Ｎｏｔｕｍ−Ｈｉｓ）をその後製作し、発現させた。この構築物は、続く実施例に記載される本発明のモジュレーターを特徴付けるためにも用いられた。
【０２６９】
（実施例８）
Ｆｃ−Ｎｏｔｕｍ融合モジュレーターの構築および発現
モジュレーター、免疫原、アッセイ試薬として用いるため、およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、追加の比較的より可溶性のＮｏｔｕｍタンパク質を生成した。より詳しくは、ヒトＮｏｔｕｍならびにマウスおよびアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａまたはマカク）のオルソログをそれぞれ用いてＦｃ構築物を作製した。本出願のために、特に明記しない限り、そのような構築物のＦｃ部分は起源がヒトである。
【０２７０】
実施例７に示すように、成熟したヒトＮｏｔｕｍタンパク質をコードするＤＮＡを、インフレームで隣接ＥｃｏＲ  ＩおよびＮｃｏ  Ｉ制限部位を含むようにＰＣＲによって増幅し、ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２ｂベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のＥｃｏＲ  Ｉ部位とＮｃｏ  Ｉ部位の間にサブクローニングして、マウスＩｇＧ２ｂ遺伝子に由来するＦｃドメインをコードする配列とインフレームで融合された、成熟したヒトＮｏｔｕｍタンパク質をコードする配列にインフレームで融合された、ＩＬ−２シグナルペプチド配列を含むｐＦＵＳＥ−ＮＯＴＵＭ−ｍＩｇＧを生成した。マウスＩｇＧ２ｂのＦｃドメインを、プラスミドｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）からＰＣＲによって増幅した、ヒトＩｇＧ２のＦｃをコードするＤＮＡ配列と置換した。ヒトＩｇＧ２  ＦｃのＰＣＲ産物をＢｇｌ  ＩＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化し、ベクターｐＦＵＳＥ−ＮＯＴＵＭ−ｍＩｇＧの同じ部位にサブクローニングして、ヒトＩｇＧ２遺伝子に由来するＦｃドメインをコードする配列とインフレームで融合された、成熟したヒトＮｏｔｕｍタンパク質をコードする配列にインフレームで融合された、ＩＬ−２シグナルペプチド配列を含むｐＮＯＴＵＭ−ｈＩｇＧ２  ｈＦｃを生成した。例示的なヒトＦｃ−Ｎｏｔｕｍ融合構築物のアミノ酸配列（配列番号３３３）および核酸配列（配列番号３３４）が図１Ｄに示され、そこで、分子のＮｏｔｕｍ部分は下線を引かれている。
【０２７１】
線状のポリエチレンイミンおよび標準方法を用いてｐＮＯＴＵＭ−ｈＩｇＧ２  ｈＦｃプラスミドでトランスフェクトさせたＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、組換えヒトＮｏｔｕｍ−Ｆｃタンパク質（すなわち、ｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃ）を生成した（例えば、参考として本明細書に援用されるＤｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．らＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００２年）３０巻：ｅ９頁を参照）。トランスフェクションの５日後に、プロテインＡカラムおよび製造業者の指示（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、組換えタンパク質を上清から精製した。カラムから溶出した物質を濃縮し（およそ１ｍｇ／ｍＬへ）、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０２７２】
類似した分子生物学的技術およびＤＮＡクローニング技術を用いて、マウスＮｏｔｕｍおよびマカクＮｏｔｕｍおよびヒトＦｃ領域を含む融合構築物を、アッセイ開発作業およびｉｎ  ｖｉｖｏ製品開発で使用するために製作した。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｎｏｔｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿１７５２６３）およびＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  Ｎｏｔｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ＿００１１１２８２９）のＯＲＦに対応する配列を、ＧＥＮＥＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってオリゴヌクレオチドから合成した。成熟したマウスＮｏｔｕｍタンパク質をコードするＤＮＡは、ＧＥＮＥＡｒｔによって供給されるベクターからＰＣＲによって増幅し、マウスＩｇＧ２ｂ  Ｆｃドメインをコードする配列がヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインをコードする配列と置換されたｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２ｂに由来するプラスミドである、ｐＳＣＲＸｖ００３のＥｃｏＲ  Ｉ部位およびＮｃｏ  Ｉ部位にサブクローニングした。これは、ヒトのＮｏｔｕｍがマウスのＮｏｔｕｍに置換されているｐＮＯＴＵＭ−ｈＩｇＧ２  ｈＦｃに大部分類似しているプラスミドｐＳＣＲＸｖ３−ｍｕｓ−Ｎｏｔｕｍを与えた。Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、上記。
【０２７３】
同様に、成熟したＭ．ｍｕｌａｔｔａのＮｏｔｕｍタンパク質をコードするＤＮＡは、ＧＥＮＥＡｒｔによって供給されるベクターからＰＣＲによって増幅し、ｐＳＣＲＸｖ００３のＥｃｏＲ  Ｉ部位およびＢｇｌ  ＩＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＣＲＸｖ００３−ｍａｃ−Ｎｏｔｕｍ（同じく、ヒトのＮｏｔｕｍがマカクＮｏｔｕｍに置換されているｐＮＯＴＵＭ−ＩｇＧ２  ｈＦｃに類似する）を与えた。上でヒトＦｃタグ付きヒトＮｏｔｕｍについて記載されるように、必要に応じて組換えマウスおよびマカクＮｏｔｕｍ−ヒトＦｃタグ付きタンパク質をＣＨＯ−Ｓ細胞で生成した。
【０２７４】
（実施例９）
Ｎｏｔｕｍ構築物を用いる抗Ｎｏｔｕｍ抗体の生成
本明細書の教示に従って、マウス抗体の形のＮｏｔｕｍモジュレーターを、ｈＮｏｔｕｍ−ＨｉｓまたはｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃによる接種を通して生成した。この点に関して、新生物障害の処置のためにＮｏｔｕｍの作用を阻害するために治療的に用いることができる、高親和性マウスモノクローナル抗体を生成するために、３系統のマウスを用いた。具体的には、以下の通りにＢａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１およびＦＶＢのマウス系統をヒト組換えＮｏｔｕｍで免疫化して、ハイブリドーマの生成のために用いた。
【０２７５】
６匹の雌マウス（各２匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）をＮｏｔｕｍ抗原の様々な調製物で免疫化することによってマウス抗体を生成した。免疫原にはＨｉｓタグ付きヒトＮｏｔｕｍ、または２９３細胞で発現されるＮｏｔｕｍ−Ｆｃが含まれた。全ての注射について、足蹠経路を通してマウスを免疫化した。等容量のＴＩＴＥＲＭＡＸまたはミョウバンアジュバントで乳化させた１０μｇのＮｏｔｕｍ免疫原を免疫化のために用いた。
【０２７６】
ヒトＮｏｔｕｍに特異的なマウスＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングするために、固相ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。簡潔には、ＰＢＳ中の０．０１〜１μｇ／ｍＬの異なる濃度のＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ（実施例７から）でプレートを一晩コーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによる洗浄の後、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより、２００μＬ／ウェルでウェルをＲＴで１時間ブロックした。Ｎｏｔｕｍ−Ｈｉｓでコーティングされたプレートの上で、５０μＬ／ウェルで、マウス血清希釈物をＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０，０００に希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと一緒にＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液をＲＴで１５分間にわたり加えた。洗浄の後、プレートをＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）で発色させ、ＯＤ４５０において分光計で解析した。
【０２７７】
血清陽性の免疫化マウスを屠殺し、流入領域リンパ節（肥大している場合、膝窩および鼠径部）を切除して、抗体産生細胞の供給源として用いた。電気融合によってＢ細胞の単一細胞懸濁液（６．３５×１０７細胞）を非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８０）と１：１の比で融合させた。電気細胞融合は、融合発生器モデルＥＣＭ２００１（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。細胞は、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ選択培地（ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ｃａｔ＃１５−０１７−ＣＭ）培地、１５％胎児クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリンおよび１６μＭチミジンを含有する）に再懸濁させ、次に、最終的に９６ウェルプレートにつき２×１０６個のＢ細胞を平板培養することを基準にして、２０個の９６ウェル平底組織培養プレートに２００μＬ／ウェルで平板培養した。次に、５％のＣＯ２および９５％の空気を含有する３７℃の加湿インキュベーターに、プレートを７〜１０日間置いた。
【０２７８】
上記のものに類似したＥＬＩＳＡアッセイを用いて、マウス免疫グロブリンを分泌する増殖陽性ハイブリドーマのウェルを、Ｎｏｔｕｍ特異性についてスクリーニングした。簡潔には、９６ウェルプレート（ＶＷＲ、６１０７４４）に、炭酸ナトリウム緩衝液中の０．４μｇ／ｍＬのヒトＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓを４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロックし、その後直ちに用いるか４℃で保存した。未希釈のハイブリドーマ上清を、ＲＴで１時間プレートの上でインキュベートした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧによってＲＴで１時間プロービングした。プレートは、次に前記の基質溶液と一緒にインキュベートし、ＯＤ４５０で読み取る。
【０２７９】
あるいは、ＥＬＩＳＡプレートにｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃを捕捉するために、ＥＬＩＳＡプレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃでコーティングした。プレートを洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いてＲＴで１時間ブロックし、未希釈のハイブリドーマ上清をスクリーニングするために用いた。その後、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧによってＲＴで１時間プロービングした。プレートは、次に前記の基質溶液と一緒にインキュベートし、ＯＤ４５０で読み取った。
【０２８０】
Ｎｏｔｕｍ特異的ハイブリドーマを細胞培養で拡大増殖させ、再平板培養し、再スクリーニングし、限界希釈または単一細胞ＦＡＣＳ選別によって逐次的にサブクローニングした。生じたクローン集団を拡大増殖させ、凍結用培地（９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）で冷凍保存し、液体窒素に保管した。
【０２８１】
ＥＬＩＳＡ解析から、これらのハイブリドーマのほとんどまたは全てからの精製抗体が、濃度依存的にＮｏｔｕｍに結合することが確認された。ＥＬＩＳＡプレートへＮｏｔｕｍが直接結合することがタンパク質の変性を引き起こすことができ、見かけの結合親和性は未変性タンパク質への結合を反映することができない点に注意すべきである。
【０２８２】
２つの融合を実施し、各融合は２０枚のプレートに播種された（１９２０ウェル／融合）。これは、ヒトＮｏｔｕｍに特異的な数ダースのマウス抗体を与えた。
【０２８３】
（実施例１０）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターの特徴付け
前の実施例で生成されたＮｏｔｕｍモジュレーターは、以下のように特徴付けられた：
抗体捕捉Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いて、抗体の結合特性を評価した。解離定数値Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を、選択された抗体について決定した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動態測定のために、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バイオセンサーを用いた。精製抗体を用いて、センサー表面での抗体の捕捉を通して定量的ｋｏｆｆ定数を導いた。標準のアミンカップリング化学を用いて、センサーチップのＣＭ５表面に抗マウスＩｇＧを固定化した。抗原を固定化抗体の上に注入して抗体抗原相互作用の解析を可能にする前に、各ｍＡｂを抗ＩｇＧ表面に捕捉した。
【０２８４】
抗Ｎｏｔｕｍ抗体のＢｉａｃｏｒｅ解析を用いて得られた定量的Ｋｄ値は、モノクローナル抗体のいくつかが非常に高親和性であり、Ｋｄ測定値は１×１０−７Ｍから７×１０−１０Ｍの範囲にあることを明らかにする。
【０２８５】
（実施例１１）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターのエピトープ決定
多重化競合的抗体ビニングは、参考として本明細書に援用される、Ｊｉａら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５１８３０８８に概略されている。参照ｍＡｂを捕捉するために、多重Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを抗マウスＩｇＧに結合した。各ｍＡｂが固有のスペクトルアドレスと関連するように、各ビーズは固有のスペクトルコーディングを有していた。ｍＡｂビーズ複合体の全てをマスターミックスにプールし、９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに等分して入れた。各ウェルでの参照抗体−ビーズ複合体のマスターミックスをまず抗原と、次にプローブｍＡｂと一緒にインキュベートしたが、各ウェルにつき１つの異なるプローブｍＡｂであった。競合的抗体ビニングアッセイでの抗原は、組換えＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓであった。プローブｍＡｂは、異なるエピトープを認識する参照ｍＡｂによって捕捉されていた抗原だけに結合した。シグナルは、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００でＲＦＵとして読み取られた。この実験は、スクリーニングされた抗体が、Ｎｏｔｕｍタンパク質の上の少なくとも４つの異なるエピトープに結合することを示した。
【０２８６】
（実施例１２）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターの配列決定
上記に基づいて、見かけ上高い親和性で固定化ヒトＮｏｔｕｍに結合するいくつかの例示的な異なるモノクローナル抗体を選択した。図７Ａおよび７Ｂで表形式により示すように、実施例９からのｍＡｂをコードするＤＮＡの配列解析は、多くが固有のＶＤＪ再配列を有し、新規相補性決定領域を提示することを確認した。図７Ｂに示す相補性決定領域が、上記のＣｈｏｔｈｉａらに従って定義されることに注意されたい。
【０２８７】
配列決定の開始のために、ＴＲＩＺＯＬ試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。１工程ＲＴ  ＰＣＲキットおよびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットをＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から購入し、ＲＮａｓｉｎはＰｒｏｍｅｇａからであった。カスタム仕様のオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【０２８８】
ハイブリドーマ細胞を、ＲＮＡ調製のためにＴＲＩＺＯＬ試薬で溶解した。１０４μＬから１０５の間の細胞を、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬに再懸濁させた。２００μｌのクロロホルムを添加した後、管を激しく振盪させた。試料を、４℃で１０分間遠心分離した。水相を新鮮なミクロチューブへ移し、等容量のイソプロパノールを加えた。管を激しく振盪させ、室温で１０分間インキュベートした。その後、試料を４℃で１０分の間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで一度洗浄し、室温で短時間乾燥させた。ＲＮＡペレットを、４０μｌのＤＥＰＣ処理水で再懸濁させた。ＲＮＡ調製物の品質は、１％アガロースゲルで３μＬを分画することによって決定した。使用するまで、ＲＮＡを−８０℃のフリーザーに保管した。
【０２８９】
マウス免疫グロブリンの重鎖およびカッパ軽鎖に特異的なコンセンサスプライマーセットで増幅されたハイブリドーマの可変ＤＮＡ配列は、可変ドメインプライマーの混合物を用いて得られた。各ＲＮＡ試料からＶＨおよびＶＫ遺伝子セグメントを増幅するために、１工程ＲＴ−ＰＣＲキットを用いた。Ｑｉａｇｅｎ１工程ＲＴ−ＰＣＲキットは、ＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑｉａｇｅｎ  １工程ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰミックスおよびＱ溶液、「困難な」（例えば、ＧＣに富む）鋳型の効率的な増幅を可能にする新規添加剤のブレンドを提供する。
【０２９０】
３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖またはカッパ軽鎖プライマーの０．５、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素混合物、ならびに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１ユニット）を含む反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写およびＰＣＲの両方に必要とされた試薬の全てを含有する。サーマルサイクラープログラムは、ＲＴ工程の５０℃で３０分間、９５℃で１５分間、続いて３０サイクルの（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１．０分間）であった。次に、７２℃で１０分間の最終インキュベーションがあった。
【０２９１】
直接ＤＮＡ配列決定のためにＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キットを用いてそれらを精製した。５０μＬの滅菌水を用いてスピンカラムからＤＮＡを溶出させ、次に両方の鎖から直接に配列決定をした。ＰＣＲ断片を直接に配列決定し、ＤＮＡ配列はＶＢＡＳＥ２を用いて解析した（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３巻；６７１〜６７４頁、２００５年）。
【０２９２】
上記のように、２４個（２４）の例示的な抗体重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列を図８Ａ〜８Ｘにそれぞれ示し（配列番号３〜９８）、これらおよび追加の抗ｈＮｏｔｕｍ抗体の遺伝子上の配置および派生ＣＤＲ（上記、Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義される）を、図７Ａおよび７Ｂに表の形式でそれぞれ示す（配列番号１０３〜３３０）。
【０２９３】
（実施例１３）
点変異を含むＮｏｔｕｍモジュレーターの構築
前記のように、Ｎｏｔｕｍは酵素のα／βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーである。Ｎｏｔｕｍの配列解析は、Ｇｌｙ２３０から始まるＧＸＳＸＧのシグネチャー触媒エルボー配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｌｂｏｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を特定し、そのＳｅｒ２３２は、このスーパーファミリーに特徴的な求核体、酸性残基およびヒスチジンの触媒三つ組の推定上の求核性残基であろう。ショウジョウバエ型（Ｓ２３７Ａ、Ｋｒｅｕｇｅｒ、２００４年、ＰＭＩＤ：１５４６９８３９）およびマウス型（Ｓ２３９Ａ、Ｔｒａｉｓｔｅｒ、２００８年、上記）のオルソログ残基の部位特異的変異誘発は、不活性のタンパク質をもたらす。したがって、そのタンパク質のＨｉｓタグ付きバージョンでＳ２３２Ａ変異を生成するために（すなわち、ｈＮｏｔｕｍ−Ｓ２３２Ａ−Ｈｉｓ）、野生型ヒトＮｏｔｕｍタンパク質の上で部位特異的変異誘発を実施するために、標準の分子生物学的技術（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を用いた。同様に、配列アラインメントは、ヒトＤ３４０が触媒性の酸性残基であることを示唆する。したがって、分子のＤ３４０Ａ変異バージョンを生成するために同じキットを用いてこの残基を変更した。実施例７および８に示すように、ヒトＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ発現ベクター（すなわち、ｈＮｏｔｕｍ−Ｓ２３２Ａ−ｈＦｃ）にこの変異を含むＮｏｔｕｍドメインをクローニングするために、ＰＣＲクローニングを用いた。前述のように次に構築物を発現させ、精製した。
【０２９４】
（実施例１４）
ＮｏｔｕｍモジュレーターはＷｎｔ３Ａの正準のシグナル伝達を変更する
ショウジョウバエのＮｏｔｕｍはＷｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達の機能的アンタゴニストであることが示されたが、マウスのＮｏｔｕｍは一過性トランスフェクションアッセイでベータカテニンルシフェラーゼレポーターの誘導に拮抗することが示されている。
【０２９５】
正準のＷｎｔシグナル伝達の活性化のためのレポーターを含む細胞の安定した集団を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスベクター、すなわちＴＣＦの転写応答エレメントの４つのタンデムリピートに連結された最小限のＣＭＶレポーターの制御下の二官能基のＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーターカセットをコードするｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１−ＴＣＦ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で形質導入した。２９３．ＴＣＦ細胞と呼ばれる形質導入された細胞集団は、以下の通りにＷｎｔ３Ａの正準のシグナル伝達アッセイでその後用いられた：９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、５０μＬの無血清ＤＭＥ培地に２．５×１０４の２９３．ＴＣＦ細胞を平板培養した。２４時間の血清飢餓の後、Ｌ／Ｗｎｔ３Ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６４７；Ｗｉｌｌｅｒｔ、２００３年）からの馴化培地（ＣＭ）の様々な希釈物、または親のＬ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６４８）からの未希釈ＣＭの２５μＬを、ＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳの２５μＬと一緒に各ウェルに加えた。ＣＭの添加の１８時間後に、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の１００μＬを黒い９６ウェルプレートに移し、５分後にＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ）を用いて各ウェルの発光を読み取った。図９Ａに見られるように、Ｗｎｔ３Ａを含有するＣＭの異なる濃度へ曝露させた細胞は、Ｌ細胞対照ＣＭへ曝露させた細胞と比較してルシフェラーゼシグナルの２倍から４倍の間の誘導を一般的に示した。より詳しくは、Ｗｎｔ３Ａ＋ＣＭ培地が２５％からおよそ３％に希釈されるに従って、Ｗｎｔ経路の活性化は発光の対応する減少と一緒に減少した。
【０２９６】
ルシフェラーゼレポーター系が確立されたならば、様々なＮｏｔｕｍモジュレーターの生物活性を決定するためのアッセイを以下の通りに実施した。９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、５０μＬの無血清培地に２．５×１０４の２９３．ＴＣＦ細胞を平板培養した。２３時間の血清飢餓の後、様々な濃度の様々なＮｏｔｕｍモジュレーター（例えば、上の実施例７、８および１３に従って得られたｈＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ、ｈＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ、ｈＮｏｔｕｍ−Ｓ２３２Ａ−Ｈｉｓ、マウスＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ、マウスＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ、マカクＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ、対照タンパク質−Ｈｉｓまたは対照タンパク質−ｈＦｃ）を含有するＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳの２５μＬを細胞に加えた。１時間後に、２５μＬのＷｎｔ３Ａまたは対照Ｌ細胞のＣＭを各ウェルに加えた。ＣＭを加えてから１８時間後に、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を各ウェルに加え、各ウェルの内容物を完全に混合して細胞を溶解し、溶解物の１００μＬを黒い９６ウェルプレートに移し、５分後に発光を読み取った。
【０２９７】
図９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄに見られるように、ヒトＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ、ヒトＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ、マウスＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ、マウスＮｏｔｕｍ−ｈＦｃおよびマカクＮｏｔｕｍ−ｈＦｃの全ては、２９３．ＴＣＦ細胞でＷｎｔ３Ａによって媒介されるルシフェラーゼの誘導に機能的に拮抗するが、実施例１３からのヒト−ＮＯＴＵＭＳ２３２Ａ変異体（ＨｉｓおよびｈＦｃ）ならびに対照−Ｈｉｓおよび対照−ｈＦｃタンパク質は、２９３．ＴＣＦ細胞でＷｎｔ３Ａによって媒介されるルシフェラーゼの誘導に拮抗しなかった。
【０２９８】
本発明の化合物を特徴付けるのに有用な機能アッセイの開発を実証する他に、図９Ｂ〜９Ｄは、可溶性Ｈｉｓタグ付きＮｏｔｕｍ構築物およびＦｃ−Ｎｏｔｕｍ融合タンパク質の両方が本明細書の教示に従ってＮｏｔｕｍモジュレーターとして効果的に作用することを示す。より具体的には、図９Ｂは、ルシフェラーゼ活性の減少で示される、Ｗｎｔ経路に及ぼすｈＮｏｔｕｍ−ＦｃおよびｈＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓモジュレーターの濃度依存的効果を例示し、ＩＣ５０計算値はそれぞれ０．４７０２および０．５０３１である。これらの結果は、Ｎｏｔｕｍ−ｈＦｃおよびＮｏｔｕｍ−ＨｉｓモジュレーターがＷｎｔ３Ａ経路に濃度依存的に拮抗するが、実施例１３の変異体Ｎｏｔｕｍモジュレーターは拮抗しないことをグラフで例示する図９Ｃで確認される。同様に、図９Ｄは、マウスＮｏｔｕｍモジュレーター（ＨｉｓおよびＦｃ）およびマカクＮｏｔｕｍ−ｈＦｃもＷｎｔ３Ａ正準経路に濃度依存的に拮抗することを示す。上記データはＮｏｔｕｍ／Ｗｎｔバイオアッセイを確証し、Ｎｏｔｕｍ細胞外ドメインの少なくとも一部を含む様々な可溶性Ｎｏｔｕｍ構築物がＷｎｔ経路に拮抗することができることを示す。
【０２９９】
（実施例１５）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮｏｔｕｍ活性を中和する
上記の２９３．ＴＣＦ細胞を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイによってＮｏｔｕｍに結合することが示された（実施例９）ハイブリドーマからの上清および／または精製抗体を、以下の通りにｈＮｏｔｕｍ−ＨｉｓまたはｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃ活性を中和するそれらの能力についてスクリーニングした。９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、５０μＬの無血清培地に２．５×１０４の２９３．ＴＣＦ細胞を平板培養した。２３時間の血清飢餓の後、様々な濃度の様々なＮｏｔｕｍタンパク質を含有するＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳの１０μＬを、ハイブリドーマからの上清の１５μＬまたは様々な濃度の精製抗体の１５μＬのいずれかと混合し、室温で５分間インキュベートした。２５μＬの抗体：Ｎｏｔｕｍ混合物を、次に２９３．ＴＣＦ細胞に加えた。１時間後に、２５μＬのＷｎｔ３Ａまたは対照Ｌ細胞のＣＭを各ウェルに加えた。ＣＭの添加の１８時間後に、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の１００μＬを黒い９６ウェルプレートに移し、５分後に発光を読み取った。抗体活性の解析のために、ＲＡＷルシフェラーゼＲＬＵをプロットしたか、データを正規化してＷｎｔ３Ａ  ＣＭ活性を１に、およびＬ細胞対照培地をゼロに設定したか（正規化されたＷｎｔ３誘導ルシフェラーゼ活性としてグラフに示す）、または正規化してＷｎｔ３Ａ  ＣＭ活性を１に、および最大Ｎｏｔｕｍアンタゴニスト活性時のルシフェラーゼシグナルをゼロに設定した（中和活性％としてグラフに示す）。
【０３００】
図１０に見られ得るように、１０μｇ／ｍＬの濃度で加えたとき、抗体のいくつかはＮｏｔｕｍ活性を阻害することができた。さらに、選択されたＮｏｔｕｍモジュレーター（例えば、ＳＣ２．Ａ１０６［別名１０Ｂ３］およびＳＣ２．Ｄ２．２）は特に有効であることが判明し、同じ濃度で８０％を超えるＮｏｔｕｍ阻害を示した。２９３．ＴＣＦルシフェラーゼ誘導アッセイでヒトＮｏｔｕｍの活性を阻害して、陰性対照とほぼ同じレベルまでルシフェラーゼシグナルを回復するその能力を実証するために、抗体ＳＣ２．Ｄ２．２をさらに特徴付けした（図１１Ａ）。より詳しくは、図１１Ａは、ＳＣ２．Ｄ２．２上清および精製抗体が濃度依存的に作用して、加えられたｈＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓの効果に拮抗することを示す。この効果は、ＳＣ２．Ｄ２．２精製抗体がそれぞれＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ（図１１Ｂ）およびＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ（図１１Ｃ）の様々な濃度に対して滴定される、図１１Ｂおよび１１Ｃでさらに例示される。各図の生じた曲線での変曲点は、抗体のモジュレーション活性が濃度依存的に作用して、可溶性Ｎｏｔｕｍの絶対量と比較してＮｏｔｕｍ活性に拮抗することを確認する。さらに、図１１Ｄに見られるように、見かけ上はＳＣ２．Ｄ２．２と同程度でないが、第２のＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ａ１０６もヒトＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓの活性を阻害することができた。まとめると、これらの結果は、本明細書で開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターが有効な中和候補を提供し、腫瘍始原細胞の頻度を低減するためのそのような化合物の使用を強く指し示すことを示す。
【０３０１】
（実施例１６）
ＮｏｔｕｍモジュレーターのＥＬＩＳＡによる特徴付け
抗体によって提示される高度の特異性はしばしば抗原オルソログに対する異なる効力をもたらし、それは疾患の異なる動物モデルでのこれらの分子の効能に影響を及ぼすことができる。Ｎｏｔｕｍの構造−機能関連性を調査するために、ヒト、マカクおよびマウスのＮｏｔｕｍタンパク質（実施例７および８）をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングした。これらの動物からのＮｏｔｕｍタンパク質の推測されたアミノ酸配列は高度の相同性を示し、それは、いくつかの種で観察されている生物学的および免疫学的交差反応性を説明する。前に論じたように、ヒトＮｏｔｕｍはサルＮｏｔｕｍと９７％同一であり、マウスと９１％同一である。（１）ジスルフィド結合（成熟したヒトＮｏｔｕｍ配列中の１６個のＣｙｓ残基はマウスＮｏｔｕｍ配列で保存されている）（２）Ｎ−グリコシル化部位；および（３）共通の酵素活性に基づいて予測された活性ドメインの完全な保存がある。アミノ酸置換のほとんどは、保存的である。ヒトおよびマウスの配列のＮ末端部分が最も多くのバリエーションを示し、いくつかのアミノ酸置換、欠失および／または挿入があった（図１Ｃ）。
【０３０２】
実施例９に従って、マウスを免疫化してモジュレーターを生成するために、ヒトＮｏｔｕｍの抗原構築物を用いた。ヒトとマウスのＮｏｔｕｍタンパク質の間に９１％の配列相同性があり、これらの抗体の大部分はマウスＮｏｔｕｍタンパク質と交差反応すると予想された。
【０３０３】
ヒトおよびマウスＮｏｔｕｍ  ｃＤＮＡの一過性トランスフェクションから生成された精製Ｎｏｔｕｍ抗原への選択されたハイブリドーマ由来のマウスｍＡｂの結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験された。当技術分野で認識される技術を用いてＥＬＩＳＡプレートを直接にコーティングするために、ヒトおよびマウスのＮｏｔｕｍを用いた。マウスｍＡｂの結合は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体と、続く比色西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｐｒｏｘｉｄａｓｅ）基質（ＴＭＢ基質、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）とで検出した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの吸光度は、４５０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーで測定した。
【０３０４】
直下の表１に見られるように、試験した４６個の抗体のうちの２２個はヒトＮｏｔｕｍに特異的であった：
【０３０５】
【表１−２】
2013539468.tif 000005
（実施例１７）
ＳＣ２．Ｄ２．２  Ｎｏｔｕｍモジュレーターのエピトープマッピング
ＳＣ２．Ｄ２．２とヒトＮｏｔｕｍとの相互作用の構造的基礎をより良く理解するために、キメラＮｏｔｕｍタンパク質を製作した。このアプローチは、オルソログが構造的に関係しているという事実を利用する。その目的のために、マウスＮｏｔｕｍ（マウス残基１５０〜４８４）に融合させたヒト成熟Ｎｏｔｕｍタンパク質（残基１９〜１４４）（両遺伝子は実施例７と一致する）のＮ末端で構成されるキメラＮｏｔｕｍ分子を生成し、前の実施例に示すのと同様の方法で発現させた。インフレームで融合体Ｎｏｔｕｍキメラタンパク質の構築のために、ヒトＮｏｔｕｍ遺伝子のＢａｍＨＩ制限切断部位を用いた。次に、Ｈｉｓタグ付きキメラＮｏｔｕｍ配列を含む発現ベクターを構築した。キメラＮｏｔｕｍ分子を試験し、上記のＷｎｔバイオアッセイで機能的に活性であることがわかった（下の実施例２７を参照）。
【０３０６】
ヒトおよびマウスのＮｏｔｕｍのｃＤＮＡの一過性トランスフェクションから生成された精製Ｎｏｔｕｍ分子へのＳＣ２．Ｄ２．２および他のマウスｍＡｂの結合は、ＥＬＩＳＡプレートに直接にコーティングされたヒトＮｏｔｕｍ、マウスＮｏｔｕｍおよびキメラヒト／マウスＮｏｔｕｍによるＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。抗Ｎｏｔｕｍ  ｍＡｂの結合は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体と、続く比色西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ基質、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）とで検出した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの吸光度は、４５０ｎｍにおいてマイクロプレートオートリーダーで測定した。
【０３０７】
前記のＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトＮｏｔｕｍおよびＮｏｔｕｍキメラタンパク質へのＳＣ２．Ｄ２．２抗体の結合を確認し、ＳＣ２．Ｄ２．２エピトープがヒトＮｏｔｕｍタンパク質のＮ末端の最初の１３５残基の中にあることを確認した。
【０３０８】
（実施例１８）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターは差次的種活性を示す
２９３．ＴＣＦ細胞を用いて、マウスＮｏｔｕｍ−ＨｉｓまたはマカクＮｏｔｕｍ−Ｆｃ活性を中和するそれらの能力について、精製されたＳＣ２．Ｄ２．２およびＳＣ２．Ａ１０６抗体を以下の通りに試験した。９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、５０μＬの無血清培地に２．５×１０４の２９３．ＴＣＦ細胞を平板培養した。２３時間の血清飢餓の後、様々な濃度のＮｏｔｕｍタンパク質を含有するＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳの１０μＬを、様々な濃度の精製抗体の１５μＬと混合し、室温で５分間インキュベートした。２５μＬの抗体／Ｎｏｔｕｍ混合物を、次に２９３．ＴＣＦ細胞に加えた。１時間後に、２５μＬのＷｎｔ３Ａまたは対照Ｌ細胞のＣＭを各ウェルに加えた。ＣＭの添加の１８時間後に、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の１００μＬを黒い９６ウェルプレートに移し、５分後に発光を読み取った。
【０３０９】
実施例１６に見られるようにマウスＮｏｔｕｍと交差反応性でないことに加えて、ＳＣ２．Ｄ２．２はマウスＮｏｔｕｍまたはマカクＮｏｔｕｍのいずれの活性も阻害しなかった（図１２Ａ）。同様に、実施例１６でマウスＮｏｔｕｍと交差反応性を示すにもかかわらず、抗体ＳＣ２．Ａ１０６はマウスまたはマカクのＮｏｔｕｍの活性を阻害しなかった（図１２Ｂ）。
【０３１０】
エピトープは成熟Ｎｏｔｕｍタンパク質のＮ末端の最初の１３５アミノ酸残基にあること、およびＳＣ２．Ｄ２．２がマカクＮｏｔｕｍの機能を阻害すること、またはマウスＮｏｔｕｍに結合するかその機能を阻害することができないことを示唆する実施例１７のＥＬＩＳＡデータに従って、ＳＣ２．Ｄ２．２の結合は、Ａｓｎ１２９（成熟Ｎｏｔｕｍタンパク質の最初から番号をつける）活性に干渉する可能性がある。図１Ｃの配列アラインメントを参照。すなわち、マカクおよびヒトのＮｏｔｕｍの関連する部分で唯一のアミノ酸差がＡｓｎ１２９にあるので、直接的な吸蔵（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）（すなわち、エピトープがエピトープを含む）、またはコンフォメーション変化、または立体障害のいずれかによるこの部位への干渉が強く示唆される。
【０３１１】
（実施例１９）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターは、共培養アッセイでＷｎｔ経路のＮｏｔｕｍ拮抗作用を低減する
Ｎｏｔｕｍ産生細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの挙動をより細かくモデル化するために、親の２９３Ｔ細胞（２９３．ｎｕｌｌ）または可溶性Ｎｏｔｕｍを発現する２９３Ｔ細胞（すなわち、２９３．Ｎｏｔｕｍ細胞）のいずれかのエフェクター細胞がレポーター２９３．ＴＣＦ細胞と様々な比で混合された共培養実験を実施した。次に、Ｗｎｔ３Ａ  ＣＭによる処理の後に、抗体の存在下でのＮｏｔｕｍの活性または阻害をこれらの細胞混合物から決定した。簡潔には、平板培養の前に１ウェルにつき５０μＬの無血清培地に細胞を混合することにより、エフェクター細胞とレポーター細胞との３つの異なる比、すなわち９６ウェルプレートの各ウェルにつき５×１０４：２．５×１０４、２．５×１０４：２．５×１０４細胞、または２．５×１０４：１．０×１０４細胞に対応する、２：１、１：１および１：２．５を試験した。
【０３１２】
直接的な共培養実験のために、２３時間の血清飢餓の後、２５μＬのＷｎｔ３Ａまたは対照Ｌ細胞のＣＭを、１００μＬの最終容量まで、各ウェルにつき２５μＬのＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳと一緒に各ウェルに加えた。ＣＭの添加の１８時間後に、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の１００μＬを黒い９６ウェルプレートに移し、５分後に発光を読み取った。
【０３１３】
図１３Ａに見られるように、全ての場合で、Ｎｏｔｕｍを分泌するエフェクター細胞との共培養は、親の２９３Ｔエフェクター細胞との共培養に対して全ての比においてＷｎｔ３Ａ誘導ルシフェラーゼ活性のより低いレベルに導く。興味深いことに、ルシフェラーゼ活性の全体的な誘導は、１ウェルあたりの細胞総数の減少に伴い増加し、培地消耗作用またはおそらく親の２９３細胞自体からの分泌Ｎｏｔｕｍの低いレベルによる作用のいずれかを示唆する。
【０３１４】
抗体拮抗作用実験のために、２５μＬのＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬの最終濃度の抗体を含有するウェルに細胞混合物を平板培養した。平板培養から２３時間後に、２５μＬのＷｎｔ３Ａまたは対照Ｌ細胞のＣＭを各ウェルに加えた。ＣＭの添加の１８時間後に、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の１００μＬを黒い９６ウェルプレートに移し、５分後に発光を読み取った。
【０３１５】
図１３Ｂに見られるように、２９３．ｎｕｌｌおよび２９３．ＴＣＦ細胞の共培養へのＳＣ２．Ｄ２．２の添加は、Ｗｎｔ３Ａ  ＣＭによるルシフェラーゼ活性の誘導に対してほとんど影響を及ぼさない。２９３．Ｎｏｔｕｍと２９３．ＴＣＦ細胞の共培養の場合、ＳＣ２．Ｄ２．２抗体の添加はＷｎｔ３Ａによって誘導されるルシフェラーゼの量を増加させ、抗体が２９３−Ｎｏｔｕｍ細胞から分泌されるＮｏｔｕｍを阻害し、２９３．ＴＣＦ細胞へのそのパラクリン作用を妨害することと一致する。ｉｎ  ｖｉｖｏ条件（例えばＮｏｔｕｍのオートクリンまたはパラクリン作用）をより精密に模倣する実験系でのそのような結果は、本明細書で開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターが、動物でＮｏｔｕｍによって媒介される事象に効果的に影響することができることを示唆する。
【０３１６】
（実施例２０）
細胞溶解物中のＮｏｔｕｍタンパク質の検出
ウェスタンブロットおよび、潜在的には免疫組織化学によってタンパク質発現を検出するマウスモノクローナル抗体を同定する試みにおいて、当技術分野の標準技術を用いて、変性条件下で４つの異なる細胞系（ＨｅｐＧ２、ＳＷ４８０、Ｋ５６２およびＣＨＯ）からのタンパク質細胞溶解物をＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−トリスゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で泳動した（ｒｕｎ）。製造業者のプロトコールに従ってｉＢｌｏｔ（登録商標）乾燥ブロッティング系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、タンパク質を次にＰＶＤＦ膜へ移し、膜はＰＢＳＴ中の３％ＢＳＡで２時間ブロックした。１μｇ／ｍＬのマウスポリクローナル、または２つのマウスモノクローナル抗体（ＳＣ２．Ａ１０１またはＳＣ２．Ａ１０９）の１つのいずれかで膜をプロービングし、ブロッキング、一次抗体と二次抗体によるインキュベーションの間にそれぞれ１０分の間ＰＢＳＴで３回洗浄した後に、ブロック緩衝液で１：５０００に希釈したＡＰ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ  Ｆｒａｇ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でＮｏｔｕｍを検出した。次に、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質：アルカリ性ホスファターゼのためのすぐ使用できる沈降基質系を用いてＮｏｔｕｍを検出した。この基質系は、色が青色から紫色で視覚的に観察することができる、不溶性ＮＢＴジホルマザン最終産物を産生する。
【０３１７】
細胞溶解物のプロービングのために用いられた抗体の各々は、ＳＷ４８０溶解物でヒトＮｏｔｕｍを検出し、それは、サイズが単量体として約５０ｋＤａ、多量体としては約１２５ｋＤａのようであった（図１４Ａ〜１４Ｂ）。３つ全ての抗体でプロービングしたときには、おそらく非二量体化グリコフォームに相当する６０ｋＤａ以下の範囲のわずかにより大きなバンドも観察された。
【０３１８】
（実施例２１）
プールされた様々な組織溶解物でのＮｏｔｕｍタンパク質の差次的発現
マウスポリクローナル抗体を用いてＮｏｔｕｍタンパク質発現が検出された、１１個の異なる腫瘍型またはそれらのそれぞれの正常な隣接組織からプールされた溶解物の２つの反復物を含む逆相タンパク質検証アレイを含む（実施例６、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）前の実施例によって証明されたように、いくつかの腫瘍形成試料でのＮｏｔｕｍ遺伝子発現の増強を実証した後。ウェスタンブロットによってヒトＮｏｔｕｍを認識するＳＣＲｘ２．Ａ１０９マウスモノクローナル抗体（実施例２０）を用いて、１１個の腫瘍型またはそれらのそれぞれの正常な隣接組織からの４３２個の組織溶解物の４つの希釈物を含むより包括的な逆相がんタンパク質溶解物アレイを、外因性プロモーター（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって駆動されたＴＰ５３過剰発現の有り無しで２９３細胞の対照と一緒に得た。比色検出試薬およびプロトコールはＰｒｏｔｅｏＳｃａｎアレイの製造業者（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供され、製作されたアレイ上のスポットは、スポット強度を定量化するためにＢＺＳｃａｎ２  ｊａｖａソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙ／ｂｚｓｃａｎ／）を用いるフラットベッドスキャナを用いてデジタル画像に変換した。データを前記のように生成し、１スポットあたりの平均ピクセル強度として表した。プロットされたデータは各組織標本の個々のスポット密度を表し、線は幾何平均を表す。
【０３１９】
これらのアレイからの結果は図１５Ａ〜１５Ｇに示され、Ｎｏｔｕｍタンパク質の発現が、がん患者の特定の亜集団を含むいくつかの異なる腫瘍型で上方制御されることを示す。より具体的には、図１５Ａ〜１５Ｇは、ヒトＮｏｔｕｍタンパク質の発現レベルが、黒色腫に加えて乳がん、結腸直腸がんおよび卵巣がんを有する患者のサブセットで上昇することを示す。さらに、Ｎｏｔｕｍタンパク質発現は、膵臓がんの神経内分泌サブタイプを有するほとんどの患者で上昇するようである（図１５Ｂ）。がん患者、特に後期の結腸直腸がんおよび疾患の膵臓神経内分泌サブタイプ（ランゲルハンス島細胞腫瘍）を有する患者の様々なサブセットにおいて上昇したＮｏｔｕｍタンパク質発現は、これらの腫瘍型で進行疾患および／または転移を促進することにおけるＮｏｔｕｍの役割を示唆する。
【０３２０】
腎臓および肝臓の腫瘍でのＮｏｔｕｍタンパク質発現の見かけの低減も、図１５Ｆおよび１５Ｇの結果で示される。この低減は、第ＩＶ期肝臓がんを除いて疾患の後期の病期で一般により大きく、低減された局所のＮｏｔｕｍレベルが腫瘍形成および腫瘍進行で役割を果たす可能性を示唆する。胆管がん腫瘍はＮｏｔｕｍをほとんど有していない（図１５Ｇ）が、胆管がんは胆管のがんであり、比較のためのＰｒｏｔｅｏＳｃａｎアレイの上に正常な胆管組織はなかった。
【０３２１】
（実施例２２）
ＮｏｔｕｍモジュレーターはＮｏｔｕｍによって誘導された細胞生存／増殖に拮抗する
実施例２および３に示すように、結腸直腸腫瘍からの腫瘍永続細胞ではＮｏｔｕｍ発現が上昇することが実証された。Ｎｏｔｕｍタンパク質がヒト結腸直腸がん細胞、ＨＣＴ−１１６細胞またはマウス系統枯渇（ｌｉｎｅａｇｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＮＴＸ腫瘍細胞（すなわちヒト腫瘍細胞）の細胞増殖および／またはアポトーシスに影響を与えるかどうかを決定するために、下記のように平板培養して組換えｈＮｏｔｕｍ（例えばｈＮｏｔｕｍ−ＨｉｓまたはｈＮｏｔｕｍ−ｈＦｃ）および抗Ｎｏｔｕｍ抗体へ曝露させた。次に、１２〜１４日後に細胞数を評価した。
【０３２２】
より具体的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍形成細胞を維持することが前に実証されていた無血清培地に、ＳＣＲｘ−ＣＲ４またはＳＣＲｘ−ＣＲ４２腫瘍からのマウス系統枯渇ＮＴＸ腫瘍細胞を２０，０００細胞／ウェルで平板培養し、続いて２４時間後に、ＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２もしくはＳＣ２．１０Ｂ３、またはアイソタイプ対照抗体（すなわちＭＯＰＣ）の存在下または不在下で、組換えヒトＮｏｔｕｍ（ＨｉｓまたはｈＦｃ）を添加した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２および５％Ｏ２で１４日間インキュベートし、製造業者の指示通りにＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイキットを用いて生存可能な細胞数を評価した。ＨＣＴ−１１６細胞系（市販されている結腸直腸腫瘍細胞系）については、ＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳに１ウェルにつき２，０００細胞で細胞を平板培養し、続いて２４時間後に、モノクローナル抗体ＳＣ２．Ｄ２．２またはＳＣ２．１０Ｂ３の存在下または不在下で組換えヒトＮｏｔｕｍを含有する無血清ＤＭＥＭを添加した。次に、ＨＣＴ−１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１２日間インキュベートし、細胞生存度をＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイキットで評価した。より高い読取値は、より高い生存細胞数の指標である。
【０３２３】
患者ＳＣＲｘ−ＣＲ４２からのマウス系統枯渇ＮＴＸ腫瘍細胞のｈＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍＬ）曝露（図１６Ａ）またはＳＣＲｘ−ＣＲ４のｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃ（１または１０μｇ／ｍＬ）曝露（図１６Ｂ）は、他の未処理の対照またはＭＯＰＣアイソタイプ対照抗体へ曝露させた細胞と比較して細胞数の２０〜４５％の増加をもたらした。反対に、ヒトＮｏｔｕｍ中和抗体ＳＣ２．Ｄ２．２（１０μｇ／ｍＬ）へのＳＣＲｘ−ＣＲ４細胞（高いレベルのＮｏｔｕｍ遺伝子を発現する）の曝露は、適当なＭＯＰＣアイソタイプ対照抗体で処理された細胞と比較して有意により少ない増殖を示した（図１６Ｂ）。同様に、抗Ｎｏｔｕｍ抗体ＳＣ２．１０Ｂ３（１０μｇ／ｍＬ）も、ＳＣ２．Ｄ２．２ほど効果的でなかったが細胞数に負の影響を及ぼすことができた（図１６Ｂ）。直前でなされた観察の確認として、１０μｇ／ｍＬのｈＮｏｔｕｍへのＨＣＴ−１１６細胞の曝露は、細胞数の２倍を超える増加をもたらした。重要なことに、ｈＮｏｔｕｍ曝露の結果としての細胞数の増加は用量依存的であるようであったが、抗Ｎｏｔｕｍモノクローナル抗体ＳＣ２．Ｄ２．２の存在によって妨害された（図１６Ｃ）。これらの観察は、ヒトＮｏｔｕｍタンパク質（例えばＨｉｓまたはｈＦｃ形態）が細胞増殖を増大させ得、かつ／またはアポトーシスを弱め、上記のアッセイでより高い細胞数をもたらすことができることを実証する。さらに、本明細書の教示に従って、ｈＮｏｔｕｍ中和モノクローナル抗体ＳＣ２．Ｄ２．２はこの活性を妨害することができ、Ｎｏｔｕｍ媒介性増殖を弱める。
【０３２４】
（実施例２３）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターは、Ｎｏｔｕｍ誘導性エステラーゼ活性に拮抗する
動物種にわたって見出されるそのオルソログを除いて、ヒトＮｏｔｕｍは、植物のペクチンアセチルエステラーゼに最も緊密に関係している。それは、α／βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーでもある。これらの関係は、酵素の可能な生化学機能を示唆する。
【０３２５】
Ｎｏｔｕｍがカルボキシエステラーゼ活性を有するか否かを試験するために、標準のアッセイ条件（Ｗｅｓｔら、ＰＭＩＤ：１９２２５１６６）を用いて精製組換えｈＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓを発色性エステラーゼ基質ｐ−ニトロフェニルアセテート（ＰＮＰＡ）およびｐ−ニトロフェニルブチレート（ＰＮＰＢ）と一緒にインキュベートした。簡潔には、ＰＮＰＡまたはＰＮＰＢを１０ｍＭの最終濃度までイソプロパノールに溶解／希釈した。これらの基質溶液をアッセイ緩衝液（０．１％アラビアゴム、２．３ｍｇ／ｍＬデオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｘｏｙｃｈｏｌａｔｅ）、１×ＰＢＳ）に１：１０に希釈して、規定量のｈＮｏｔｕｍ酵素とインキュベートし、発色団ｐ−ニトロフェノールの酵素的放出を４０５ｎｍでの吸光度測定によってモニタリングした。
【０３２６】
図１７Ａに見られるように、ｈＮｏｔｕｍの増加する量は、３７℃で１時間のインキュベーションの後にＰＮＢＡからますます多くの量のｐ−ニトロフェノールを放出させ、Ｎｏｔｕｍがカルボキシエステラーゼ活性を有することを実証する。推定上の触媒求核試薬が部位特異的変異誘発によって変更されている変異体Ｎｏｔｕｍ（Ｓ２３２Ａ）は、大幅に低減されたエステラーゼ活性を示した。図１７Ｂに示すように、マウスおよびマカクのＮｏｔｕｍタンパク質も、エステラーゼ活性を提示する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの組換えエステラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）も、陽性対照としてアッセイに含まれた（図１７Ｃ）。具体的には、図１７Ｃは、任意の特定の時点で、ＰＮＰＢ基質（白抜きの四角および破線）に対してＰＮＰＡ（黒べたの四角および実線）から放出されるｐ−ニトロフェノールのより強力なシグナルをｈＮｏｔｕｍが与えるが、Ｂａｃｉｌｌｕｓエステラーゼは、ＰＮＰＡ（黒丸および実線）に対してＰＮＰＢ基質（白丸および破線）を優先的に加水分解するようであることを示す。このデータは、ｈＮｏｔｕｍが定量可能な様式でエステラーゼ活性を誘導することができることを実証する。
【０３２７】
直前で提示された結果は、測定されたエステラーゼ活性が、開示されたＮｏｔｕｍモジュレーターのさらなる特徴付けを可能にするアッセイを提供するために用いることができることを示す。これに関して、図１８Ａおよび１８Ｂは、ＰＮＰＡおよびＰＮＢＡ基質の添加前の、ＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２と一緒のｈＮｏｔｕｍタンパク質のプレインキュベーションが、大幅に低減されたエステラーゼ活性をもたらすことを実証する。これは前の実施例で提示されるデータと全体的に一致し、再度ｈＮｏｔｕｍの酵素機能を中和するＳＣ２．Ｄ２．２抗体の能力を実証する。より具体的には、図１８Ａは、ＳＣ２．Ｄ２．２の量が固定され（なし、または１０μｇ／ｍＬ）、Ｎｏｔｕｍの濃度が変動する用量反応曲線を示す。図１８Ａに見られ得るように、ＳＣ２．Ｄ２．２抗体が存在する場合には、ｈＮｏｔｕｍレベルの増加は測定された酵素活性をある程度均一に増大させる。反対に、図１８Ｂは、ｈＮｏｔｕｍの量が１μｇ／ｍＬに固定され、ＳＣ２．Ｄ２．２の濃度が変動する、測定された酵素活性の用量反応曲線を提供する。生じた曲線は、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの存在がｈＮｏｔｕｍの酵素活性の量を濃度依存的に急激に低減することを明らかに示す。対照的に、対照抗体（ＭＯＰＣ）は、Ｎｏｔｕｍのエステラーゼ活性に影響を及ぼさない（データは示さず）。
【０３２８】
当業者は、本実施例が、Ｎｏｔｕｍの酵素活性に対するそれらの影響を測定することによって開示されているＮｏｔｕｍモジュレーターを特徴付けるために用いることができる別のアッセイを実証することを理解するであろう。
【０３２９】
（実施例２４）
ＮｏｔｕｍモジュレーターはＮｏｔｕｍ誘導性リパーゼ活性に拮抗する
α／βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーとしてのＮｏｔｕｍの特徴付けおよびその実証されたエステラーゼ活性に基づき、このタンパク質がリパーゼとして作用することもできると仮定された。当業者は、タンパク質のリパーゼ活性がＴｗｅｅｎ２０の脂肪分解を測定する比濁アッセイを用いて測定することができることを理解するであろう（Ｐｒａｔｔら、２０００年、ＰＭＩＤ：１０７０６６６０）。このように、ｈＮｏｔｕｍのリパーゼ活性を測定し、本発明のＮｏｔｕｍモジュレーターを特徴付けるために用いることができるさらに別のアッセイを提供するために、Ｔｗｅｅｎ２０の脂肪分解を含む実験を行った。
【０３３０】
簡潔には、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、３３．３ｍＭのＣａＣｌ２および０．３３％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するアッセイ緩衝液に組換えｈＮｏｔｕｍ（１μｇ／ウェル）を加えた。Ｔｗｅｅｎ２０のモノラウリル基がリパーゼ（例えばｈＮｏｔｕｍ）によって切断されるとき、遊離脂肪酸はＣａ２＋カチオンと不溶性複合体を形成して、濁った溶液をもたらし、そのＯＤを４０５ｎｍで測定してリパーゼ活性の尺度を提供することができる。陽性対照として、ブタ膵臓リパーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の活性を同じアッセイで測定した。図１９は、精製組換えＮｏｔｕｍがＴｗｅｅｎ２０を用量依存的な様式で切断することが可能であることを示し、そのような測定が本発明の化合物を特徴付けるさらに別の方法を提供することを実証する。
【０３３１】
この酵素的特性を利用し、本発明の特性をさらに例示するために、Ｎｏｔｕｍの脂肪分解活性に及ぼすＮｏｔｕｍモジュレーターの影響を決定するためにアッセイを実行した。その目的のために、様々な濃度のＳＣ２．Ｄ２．２をｈＮｏｔｕｍと一緒に設定された期間プレインキュベートし、その後その混合物をアッセイ緩衝液に加え、生じた酵素活性を前記のように測定した。アッセイの結果は、図２０にグラフで表す。
【０３３２】
生じた曲線は、ＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２のほとんど全ての濃度がＮｏｔｕｍのリパーゼ活性を実質的に除去するが、ブタ酵素陽性対照のリパーゼ活性には重大な影響を及ぼさないことを明らかに示す。さらに、図２０は、陰性対照抗体（ＭＯＰＣ）が、Ｎｏｔｕｍまたはブタ膵臓リパーゼのいずれのリパーゼ活性も阻害しないことを示す。
【０３３３】
そのような結果は、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターが、Ｎｏｔｕｍタンパク質の酵素的特性を妨害または破壊し、そしておそらく生理的状況でその固有の腫瘍形成能力に影響を及ぼす能力を明らかに例示する。
【０３３４】
（実施例２５）
Ｎｏｔｕｍヒドロラーゼ活性および点変異を含むＮｏｔｕｍモジュレーターにおける活性減少の蛍光アッセイ
標準のアッセイ条件を用いてヒドロラーゼの活性を測定するために、実施例２３および２４に記載されるアッセイに加えて、蛍光性エステラーゼ基質、４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート（Ｓｉｇｍａ）を用いることができる（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ、２００７年、ＰＭＩＤ：１７６２０４４１；ＪａｃｋｓおよびＫｉｒｃｈｅｒ、１９６７年、ＰＭＩＤ：５５８２９７１）。簡潔には、４−ＭＵＨを１．２ｍＭの最終濃度までＤＭＳＯに溶解した。この基質をアッセイ緩衝液（０．１Ｍトリス、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ）に１：１０に希釈し、規定量のＮｏｔｕｍ酵素または点変異Ｎｏｔｕｍ酵素と一緒にインキュベートし、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、蛍光分子４−メチルウンベリフェロンの酵素放出をモニタリングした（３５５ｎｍ励起、４６０ｎｍ発光）。
【０３３５】
図２１Ａは、増加する量の野生型ヒトＮｏｔｕｍ酵素が、Ｗｎｔ３Ａへの２９３．ＴＣＦ細胞の応答を用量依存的な様式で阻害することができることを示す（アッセイの詳細は実施例１４に記載される）。しかし、点変異体Ｓ２３２ＡおよびＤ３４０Ａは、２９３．ＴＣＦ細胞でＷｎｔ３Ａの活性に拮抗する能力を示さない。同様に、時間をわたっての相対的蛍光シグナルの線形増加によって実証されるように、野生型ヒトＮｏｔｕｍ（１反応につき６２．５ｎｇ）は４−ＭＵＨ基質を加水分解することが可能であるが、Ｓ２３２ＡおよびＤ３４０Ａ点変異体は４−ＭＵＨ基質を加水分解する能力を示さない（図２１Ｂ）。
【０３３６】
（実施例２６）
Ｎｏｔｕｍは正準のＷｎｔ経路においてＧｓｋ３の上流の工程で作用する
正準の（例えばＬＥＦ／ＴＣＦ）シグナル伝達経路の簡略図を図２２に表す。通常、ベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）は、それが細胞のアキシン／ＡＰＣ／ＧＳＫ３破壊複合体の一部である場合に（１）ＧＳＫ３（および図２２に示されていない他のキナーゼ）によるそのリン酸化、および（２）その後のユビキチン化に続いて、細胞の細胞質でプロテオゾームへ速やかに渡される。それらの受容体ＦｚｄへのＷｎｔ分子の結合はＤｓｈのリン酸化を促進し、それは複合体からアキシンを動員して破壊複合体からのベータカテニンの放出を引き起こす。これは細胞の核へのベータカテニンのトランスロケーションを可能にし、そこで、それはＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子と複合体を形成してＷｎｔ応答性遺伝子を活性化する。ＬｉＣｌは、ＧＳＫ３の小分子阻害剤であり（ＫｌｅｉｎおよびＭｅｌｔｏｎ、１９９６年、ＰＭＩＤ：８７１０８９２）、それは、正準のＷｎｔシグナル伝達経路の文脈において、ベータカテニンの安定化および放出の促進によって下流でのＷｎｔ応答性遺伝子の活性化をもたらす。
【０３３７】
図２３に見られ得るように、Ｗｎｔ３ＡのＣＭおよびＬｉＣｌ（４０ｍＭ）の両方は、２９３．ＴＣＦ細胞でルシフェラーゼ転写を活性化する。ヒトＮｏｔｕｍはＷｎｔ３Ａ  ＣＭに拮抗するが、ＳＣ２．Ｄ２．２単独ではＷｎｔ３Ａ  ＣＭによるルシフェラーゼの誘導を阻害しない。しかし、ＳＣ２．Ｄ２．２はヒトＮｏｔｕｍの活性を用量依存的な様式で阻害することができ、Ｗｎｔ３Ａ誘導性のルシフェラーゼ発現の回復をもたらす。最も重要なことに、ＬｉＣｌはヒトＮＯＴＵＭおよび／またはＳＣ２．Ｄ２．２の存在とは無関係にルシフェラーゼレポーターを活性化することができ、Ｎｏｔｕｍおよびモジュレーター抗体がＧＳＫ３の上流でそれらの作用を発揮することを示す。
【０３３８】
（実施例２７）
その生物活性に関係があるＳＣ２．Ｄ２．２エピトープの重要な残基の描写
実施例１７に記載されたキメラヒト／マウスＮｏｔｕｍタンパク質を、２９３．ＴＣＦアッセイに入れた。図２４Ａは、キメラ分子がＷｎｔ３Ａ  ＣＭによって媒介されるルシフェラーゼの誘導を阻害することができるが、その効力は野生型タンパク質より低いことを示す。図２４Ｂは、この活性をＳＣ２．Ｄ２．２で中和することができることを示し、実施例１７で提示されるＥＬＩＳＡデータと一致して、ＳＣ２．Ｄ２．２のエピトープがＮｏｔｕｍの最初の１４４残基に含有されることを示す。まとめると、キメラ分子の生物活性を中和するＳＣ２．Ｄ２．２の能力、実施例１８に示すようなＮｏｔｕｍの様々な種形態に対するＳＣ２．Ｄ２．２の活性データ、および図１Ｃに示す配列アラインメントは、ＳＣ２．Ｄ２．２のエピトープではヒトＮｏｔｕｍのＤ１４１残基が重要な残基である可能性を示唆する。（図１Ｃは、成熟したＮｏｔｕｍタンパク質の最初からの番号付けに基づいて、その残基にＤ１２９と注をつけるが、Ｄ１４１の注は野生型ヒトタンパク質前駆体を考慮している点に注意されたい）。
【０３３９】
エピトープでのその残基の重要性を正式に実証するために、ヒトＮｏｔｕｍのこの残基をマカク（Ｄ１４１Ｎ）またはマウス（Ｄ１４１Ｓ）の残基のいずれかへ点変異させるために、標準の分子生物学的技術を使用した。同様に、この位置のマカク残基をヒト残基（Ｎ１４１Ｄ）へ点変異させた。図２５は、これらの点変異の各々が、２９３．ＴＣＦアッセイ（図２５Ａ）および４−ＭＵＨ加水分解アッセイ（図２５Ｂ）で生物活性を保持したタンパク質を与えたことを示す。しかし、これらの点変異体は、ＳＣ２．Ｄ２．２によって中和されるそれらの能力で異なった（図２６）。マカク残基またはマウス残基のいずれかへのヒト残基の変異は、変異体Ｎｏｔｕｍタンパク質を中和するＳＣ２．Ｄ２．２の能力を除去したが（図２６Ａ）、マカクタンパク質残基をヒト残基（Ｎ１４１Ｄ）へ変更することは、野生型マカクタンパク質を中和することができない（図１２Ａ）にもかかわらず、今度はＳＣ２．Ｄ２．２が変異体タンパク質を中和するのを可能にした（図２６Ａ）。ＳＣ２．Ｄ２．２による中和挙動のこのパターンは、４−ＭＵＨアッセイでの変異体タンパク質でも観察された（図２６Ｂ）：ヒトＤ１４１残基の変更は、生じたタンパク質（Ｄ１４１Ｎ、Ｄ１４１Ｓ）を中和するＳＣ２．Ｄ２．２の能力を除去したが、マカク残基Ｎ１４１の変更は抗体が変異体タンパク質（マカクＮ１４１Ｄ）を中和するのを可能にした。これらのデータは、Ｎｏｔｕｍタンパク質の生物活性を中和するＳＣ２．Ｄ２．２の能力のためのＤ１４１残基の重要性を明らかに実証する。
【０３４０】
（実施例２８）
ＮｏｔｕｍとｒｈＷｎｔ３ＡとのインキュベーションはＷｎｔ活性の不活性化をもたらす
Ｗｎｔ３Ａシグナル伝達のＮｏｔｕｍ媒介性拮抗作用の動態を決定するために、２９３．ＴＣＦ細胞への複合体の添加の前に、組換えＮｏｔｕｍを、単独で、またはＳＣ２．Ｄ２．２の存在下で、組換えヒトＷｎｔ３Ａ（ｒｈＷｎｔ３Ａ）と一緒に３７℃で２時間プレインキュベートした。ｒｈＷｎｔ３Ａによるルシフェラーゼのこの生じた誘導を、ＮｏｔｕｍだけがまたはＮｏｔｕｍ＋ＳＣ２．Ｄ２．２がｒｈＷｎｔ３Ａの添加前の２時間細胞に加えられた、２９３．ＴＣＦアッセイのための標準プロトコールを用いて観察されたものと比較した。図２７Ａに見られ得るように、標準のアッセイ条件は、ＳＣ２．Ｄ２．２の不在下でＮｏｔｕｍが２５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＷｎｔ３Ａへ曝露させた２９３．ＴＣＦ細胞でルシフェラーゼの誘導を阻害することができること（黒丸）、および、ｒｈＷｎｔ３Ａの添加前に１０μｇ／ｍＬのＳＣ２．Ｄ２．２とともにＮｏｔｕｍをインキュベートすることはｒｈＷｎｔ３Ａに拮抗するＮｏｔｕｍの能力を妨害すること（白丸）を示す。しかし、２９３．ＴＣＦ細胞への添加前のＮｏｔｕｍおよびｒｈＷｎｔ３Ａのプレインキュベーションが興味深い。この場合には、ｒｈＷｎｔ３Ａへの細胞の応答は大幅に低減される（黒丸、図２７Ｂ）。対照的に、ｒｈＷｎｔ３Ａとのプレインキュベーション前のＮｏｔｕｍとＳＣ２．Ｄ２．２との複合体化は、ｒｈＷｎｔ３Ａへの細胞の感受性を回復させる（白四角、図２７Ｂ）。合わせると、これらのデータは、細胞表面に存在する分子と相互作用するのとは対照的に、ＮｏｔｕｍがｒｈＷｎｔ３Ａを直接に不活性化する可能性を示唆する。
【０３４１】
（実施例２９）
Ｎｏｔｕｍ活性の小分子阻害
実施例２３、２４および２５に示す試験はＮｏｔｕｍがエステルおよび脂質を加水分解する能力を有することを示し、実施例２８に提示するデータはそれが直接にｒｈＷｎｔ３Ａに作用することができることを示唆する。Ｎｏｔｕｍの推定上のヒドロラーゼ活性と一致して、この不活性化がＷｎｔ３Ａを脱脂するＮｏｔｕｍの能力に関係すると仮定することができた。２つの脂質がＷｎｔ３Ａに連結することが公知であり、Ｃｙｓ７７の飽和パルミテート鎖およびＳ２０９の不飽和パルミトレオイル鎖がそれである（ＬｏｒｅｎｏｗｉｃｚおよびＫｏｒｓｗａｇｅｎ、２００９年、ＰＭＩＤ：１９５５９６９５）。両方の脂質鎖は、Ｗｎｔ３Ａの分泌ならびにシグナル伝達にとって重要であることが示唆されている（Ｆｒａｎｃｈ−Ｍａｒｒｏら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８４３０７８４）。パルミテートはＣｙｓ７７でのチオエステル結合を通してＷｎｔ３Ａに連結するので、このことはＮｏｔｕｍがチオエステラーゼ酵素の公知の阻害剤によって不活性化されるかもしれないことを示唆する。そのような１つの小分子はオルリスタット（Ｘｅｎｉｃａｌ（登録商標））であり、それは多サブユニット酵素の脂肪酸シンターゼのチオエステラーゼサブユニットを阻害することが示されている（Ｋｒｉｄｅｌら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５０２６３４５）。したがって、実施例２５に記載される４−ＭＵＨアッセイを、様々な量の４−ＭＵＨ基質（２４０μＭまたは９０μＭ）およびオルリスタット（０〜１７０μＭ）の存在下で実施した。図２８に見られるように、オルリスタットは４ＭＵＨへのＮｏｔｕｍの加水分解活性を用量依存的な様式で阻害し、Ｎｏｔｕｍを阻害する小分子および公知のリパーゼ阻害薬物の両方の能力を実証する。
【０３４２】
（実施例３０）
Ｎｏｔｕｍとのインキュベーションに応じてのＷｎｔ３Ａの物理的挙動の変化
ＮｏｔｕｍがＷｎｔ３Ａに直接に作用してタンパク質を脱脂するならば、この切断はタンパク質の疎水性の変化をもたらすはずであり、それはＴｒｉｔｏｎＸ１１４分配アッセイで水相と界面活性剤相の間でのその分配挙動の変化によって測定することができる（Ｂｏｒｄｉｅｒ、１９８１年、ＰＭＩＤ：６２５７６８０）：脂質付加されたＷｎｔ３Ａは水相中に見出されるが、脱脂されたＷｎｔ３Ａは水相で目立つはずである（Ｗｉｌｌｅｒｔら、２００３年：ＰＭＩＤ：１２７１７４５１）。Ｎｏｔｕｍの酵素的特性を実証するために、０．１％ＢＳＡ中の１．５μｇのｒｈＷｎｔ３Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、２５０ｎｇのＮｏｔｕｍと一緒に室温で一晩インキュベートした。等容量の４．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１１４を混合物に加え、混合物を氷上で５分間、次に３７℃で５分間インキュベートした後、室温で５分間の２０００×ｇによる遠心分離を用いて相を分離した。分離の後、イオン強度およびＴｒｉｔｏｎＸ１１４含有量を正規化するために各試料を調整した後に、ＰＡＧＥ電気泳動によってアリコートを解析した。ゲルを泳動した後に、抗ｒｈＷｎｔ３Ａ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるイムノブロッティングのための膜へタンパク質バンドを移した。バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可視化した。
【０３４３】
図２９Ａに示すブロットで見られるように、Ｎｏｔｕｍの不在下では、ｒｈＷｎｔ３ＡはＴｒｉｔｏｎＸ１１４相（レーン６）だけに出現し、水相（レーン５）には現れない。反対に、ｒｈＷｎｔ３ＡとＮｏｔｕｍとのインキュベーションは、水相（レーン８）ならびにＴｒｉｔｏｎＸ１１４レーン（レーン９）でのｒｈＷｎｔ３Ａの出現をもたらす。これらのデータは、Ｗｎｔ３Ａを脱脂するＮｏｔｕｍの能力を示唆させる。しかし、そのような脱脂は本実験条件の下では不完全であり、それによってＴｒｉｔｏｎＸ１１４相で一部のｒｈＷｎｔ３Ａの観察された保持をもたらす可能性がある。
【０３４４】
ＮｏｔｕｍがショウジョウバエでＳｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）のモジュレーションに関連付けられていることも興味深い（Ａｙｅｒｓら、２０１０年、ＰＭＩＤ：２０４１２７７５）。Ｓｈｈは別の脂質改変タンパク質であり、具体的には成熟タンパク質のＮ末端Ｃｙｓ２４のアルファアミノ基を通してエステル化されるパルミチン酸鎖を含むものである（Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、２００８年、ＰＭＩＤ：９５９３７５５）。したがって、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達経路とのＮｏｔｕｍの以前に記載された遺伝子相互作用は、それらのシグナル伝達特性を脱制御（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｅ）して、結果として生じる発がんの促進での作用を伴う、Ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質のリパーゼに基づく脱脂を反映し得る。
【０３４５】
いずれの事象でも、図２９Ｂに示すように、ｒｈＷｎｔ３Ａの生理化学的な挙動を変化させるＮｏｔｕｍの実証された能力は、ＮｏｔｕｍモジュレーターＳＣ２．Ｄ２．２によって遮断することができる。レーン１はｒｈＷｎｔ３Ａの陽性分子量マーカーであり、各アリコート中の試薬の有無はそれぞれのレーンの上に記される（そこで、ａは水性画分であり、ｔはＴｒｉｔｏｎＸ−１１４画分であり、スライドバーはＮｏｔｕｍモジュレーターの濃度を示す）。再び、未処理のｒｈＷｎｔ３ＡはＴｒｉｔｏｎＸ１１４相（レーン３）だけに出現し、水相（レーン２）には現れない。再び、ｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃとの一晩のインキュベーションは、水相へのｒｈＷｎｔ３Ａの再分配をもたらす（レーン４および５を比較する）。ｈＮｏｔｕｍ−ＦｃをＳＣ２．Ｄ２．２とまずプレインキュベートするならば、この再分配を遮断することができる（レーン４および５に対してそれぞれレーン６および７を比較する）。遮断作用は、用いられるＳＣ２．Ｄ２．２の量に依存する；より多い量のＳＣ２．Ｄ２．２は、より多くのｒｈＷｎｔ３ＡがＴｒｉｔｏｎＸ１１４相に保持される結果をもたらす（レーン７および９を比較する）。再分配の遮断は、Ｎｏｔｕｍモジュレーターの特異性にも依存する；ｈＮｏｔｕｍ−Ｆｃが対照モノクローナル抗体ＭＯＰＣとまずプレインキュベートされる場合には、再分配の遮断は観察されない（レーン１０および１１）。
【０３４６】
（実施例３１）
ヒト、マウスおよびサルのＮｏｔｕｍのモジュレーション
上で実証されるように、モノクローナル抗体ＳＣ２．Ｄ２．２は、そのタンパク質のマウスまたはマカクのバージョンを阻害することなく、Ｎｏｔｕｍのヒトバージョンを特異的に阻害することが示されている。ヒトＮｏｔｕｍの第２のモノクローナル抗体モジュレーターＳＣ２．Ｄ１６は、上の実施例１４に記載される２９３．ＴＣＦアッセイを用いて、マウスおよびマカクのＮｏｔｕｍを阻害するその能力について特徴付けられた。図３０に示すように、ＳＣ２．Ｄ１６はヒトおよびサルのＮｏｔｕｍを類似した効力で阻害し、マウスＮｏｔｕｍに対して霊長類のＮｏｔｕｍタンパク質のいずれよりもわずかに強力であるかもしれない。
【０３４７】
（実施例３２）
モノクローナル抗体Ｎｏｔｕｍモジュレーターのヒト化
ｈＳＣ２．Ｄ２．２モジュレーターを提供するために、コンピューターを利用したＣＤＲグラフト化法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｌｃ．）および標準の分子工学技術を用いて、マウス抗体ＳＣ２．Ｄ２．２をヒト化させた。マウスフレームワーク配列へのそれらの最も高い配列相同性およびその正準構造に基づいて、可変領域のヒトフレームワーク領域を選択した。解析のために、ＣＤＲドメインの各々へのアミノ酸の割当ては、Ｃｈｏｔｈｉａらのナンバリングに従う。最適なヒト化抗体を生成するために、いくつかのヒト化抗体変異体を作製した。評価のために、マウスの軽鎖および重鎖可変領域全体およびヒト定常領域を含むマウス抗体のキメラバージョンも製作した。
【０３４８】
当技術分野で認識された技術を用いて、分子工学手法を実施した。その目的のために、製造業者のプロトコールに従って、ＳＣ２．Ｄ２．２ハイブリドーマから全ｍＲＮＡを抽出した（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製システム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＳＣ２．Ｄ２．２重鎖の可変領域を増幅して、配列決定をするために、完全なマウスレパートリーを標的にするように設計された、３２個のマウス特異的５’リーダー配列プライマーを含むプライマー混合物を、３’マウスＣγ１プライマーと組み合わせて使用した。同様に、カッパ軽鎖を増幅して配列決定をするために、マウスカッパ定常領域に特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて、Ｖｋマウスファミリーの各々を増幅するように設計された３２個の５’Ｖｋリーダー配列プライマー混合物を用いた。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、１００ｎｇの全ＲＮＡからＶＨおよびＶＬ転写産物を増幅した。
【０３４９】
ＳＣ２．Ｄ２．２ハイブリドーマのために合計８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した：Ｖカッパ軽鎖のために４つ、およびＶガンマ重鎖（γ１）のために４つ。ＱＩＡＧＥＮ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを増幅のために用いた（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）。抽出されたＰＣＲ産物は、特異的なＶ領域プライマーを用いて直接に配列決定をした。最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子メンバーを同定するために、ＩＭＧＴを用いてヌクレオチド配列を解析した。導かれた配列は、Ｖ−ＢＡＳＥ２を用い、およびマウス生殖細胞系データベースへのＶＨおよびＶＬ遺伝子のアラインメントによって、ＩｇＶ−およびＪ−領域の既知の生殖細胞系ＤＮＡ配列と比較した。
【０３５０】
配列解析：ヌクレオチド配列情報から、ＳＣ２．Ｄ２．２の重鎖および軽鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントに関するデータが得られた。組換えマウスＤ２モノクローナル抗体のクローニングのために、配列データに基づいて、ＳＣ２．Ｄ２．２のＩｇＶＨおよびＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセットを設計した。その後、Ｖ−（Ｄ）−Ｊ配列をマウスＩｇ生殖細胞系配列と整列させた。ＳＣ２．Ｄ２．２の重鎖遺伝子は、ＩＧＨＶ５−１７、ＤＱ５２ａ．１およびＪＨ１と同定された。軽鎖遺伝子は、ＶカッパＩＧＫＶ３−１２およびＪカッパ５、生殖細胞系遺伝子ファミリーからであった。
【０３５１】
得られた重鎖および軽鎖配列は、機能的ヒト可変領域配列と整列させた。配列相同性は、ヒトＶＨ３−４８およびＶＫＡ１９の生殖細胞系配列に対してそれぞれ８１％および６２％の同一性であることがわかった。これらの生殖細胞系は、ヒト化ＳＣ２．Ｄ２．２ｍＡｂのためのヒトフレームワークとして選び出した。ヌクレオチド配列は、ヒトおよびマウスの配列で見られるコドンを一般に用いて、ヒト化ＶＬおよびＶＨのタンパク質配列をコードするように設計された。各Ｖ遺伝子の合成ＤＮＡ断片は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成された。
【０３５２】
図３１ＡおよびＢで、ヒト化ＳＣ２．Ｄ２．２の重鎖（図３１Ａ）および軽鎖（図３１Ｂ）Ｖドメインの配列（上の配列−配列番号３３１および３３２）は、それぞれのマウスＳＣ２．Ｄ２．２のＶドメイン（下の配列−配列番号５６および５８）と整列した。縦のマークは、マウスおよびヒト化バージョンのアミノ酸が同一であることを示す。Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義されるＣＤＲは、下線を引かれている。可変領域が生成されたならば、ヒト化抗体およびキメラ抗体がさらなる特徴付けのために生成された。
【０３５３】
抗体産生のために、ヒト免疫グロブリン発現ベクターへのマウスおよびヒト化可変遺伝子ＰＣＲ産物の方向性クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ）を採用した。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲで用いられた全てのプライマーは、制限部位を含んだ（ＩｇＨのためにはＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ＩｇＫのためにはＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ、それらはヒトＩｇＧ１およびＩＧＫ定常領域をそれぞれ含有する発現ベクターへの直接的なクローニングを可能にした）。簡単には、ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で精製し、続いてそれぞれＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ（ＩｇＨ）、ＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ（ＩｇＫ）で消化した。消化されたＰＣＲ産物は、発現ベクターへのライゲーションの前に精製された。ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物の７．５μＬおよび２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡを有する１０μＬの総容量で実施された。コンピテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、４２℃の熱ショックを通して３μＬのライゲーション産物で形質転換し、アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）に平板培養した。次にＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターの同じ部位に挿入し、合成ＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩＶＫ挿入断片はそれぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位にクローニングした。
【０３５４】
ヒト化（すなわちｈＳＣ２．Ｄ２．２）抗体およびキメラＳＣ２．Ｄ２．２抗体を産生する細胞は、２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて適当なプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって生成された。これに関して、プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製された。１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）細胞を標準条件下で１５０ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養した。
【０３５５】
一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。１．５ｍＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭに５０μＬのＨＥＫ２９３トランスフェクション試薬と混合した１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに、等量のＩｇＨおよび対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（各ベクターＤＮＡの１２．５μｇ）を加えた。混合物を室温で３０分間インキュベートし、培養プレートに均一に分散させた。トランスフェクションの３日後に上清を収集し、１０％ＦＢＳを補充した２０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭと置換し、トランスフェクションから６日目に再び収集した。１０分間の８００×ｇでの遠心分離によって細胞残渣から培養上清を取り出し、４℃で保管した。組換えのキメラ抗体およびヒト化抗体をプロテインＧビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
【０３５６】
（実施例３３）
モノクローナル抗体Ｎｏｔｕｍモジュレーターの特徴付け
マウス可変領域を有するその類似したｍＡｂと比較したヒト化ＳＣ２．Ｄ２．２の親和性を特徴付けるために、３つの方法を用いた。第１に、ＥＬＩＳＡフォーマットで、抗原の連続希釈物に対してプロービングした、固定された量の抗体について、結合シグナルを測定した。測定されたシグナルレベルは、実質的に類似していた（データは示さず）。第２には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いるＢｉａｃｏｒｅによってマウスＳＣ２．Ｄ２．２の親和性を測定して、図３２Ａに示す結果を与えた。１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５ｎＭの濃度系列に基づいて、および１：１のラングミュア結合モデルを用いて、抗原への抗体結合のＫｄは０．１ｎＭ未満であると推定された。この相互作用の長い解離速度は、動態を通しての親和性の正確な決定を困難にした。次に、２５０、１２５および６２．５ｎＭの抗原の濃度系列をもちいるＦｏｒｔｅＢＩＯ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢＩＯ，Ｉｎｃ．）での生体層干渉法解析（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、マウス抗体をヒト化誘導体と直接比較した。図３２Ｂ（マウス可変領域）および図３２Ｃ（ヒト化可変領域）で見られるように、抗体の各々は優れた親和性を示し、ほとんど同一の結合曲線を生成した。曲線の類似性は、ヒト化工程が、誘導体化された抗体の動態に有害な影響を及ぼさなかったことを示すことは理解されるであろう。
【０３５７】
（実施例３４）
Ｎｏｔｕｍモジュレーターは診断剤として用いることができる
本明細書の教示に従って、開示されるＮｏｔｕｍモジュレーターは、患者からの生体試料でＮｏｔｕｍ関連バイオマーカーを検出する診断剤として用いることができる。
【０３５８】
Ｎｏｔｕｍは、細胞外液中に可溶性分子として、または細胞外基質と会合してある程度分泌されることが公知であり、近隣の細胞に対してパラクリン様式で作用し得る。そのような特性を示し、Ｎｏｔｕｍは特定の疾患状態で血清または血漿などの体液で検出可能であるはずであり、したがって診断目的のために有用であるか、疾患バイオマーカーとして役立ちうる。本発明のこの態様を確認するために、図３３Ａに示すようにサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを用いて、抗Ｎｏｔｕｍ抗体で標準曲線を生成した。生じた曲線は、図３３Ｂに示すように健康な被験体および卵巣がんを患っている患者から得られた血漿試料中のＮｏｔｕｍレベルを定量化するために次に用いた。
【０３５９】
より具体的には、ｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液に２μｇ／ｍｌで、マウスＳＣ２．Ｄ２．２を標準のＥＬＩＳＡプレートに吸収させた。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄した後に、周囲温度で２時間、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＢＳＡ緩衝液）でプレートをブロックした。プレートの内容物を払い落とし、様々な濃度（すなわち、標準曲線を提供するために）の精製組換えＮｏｔｕｍ−Ｈｉｓ、またはＢＳＡ緩衝液で希釈した患者試料を、周囲温度で最短２時間、プレートに加えた。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、その後、ＢＳＡ緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌでビオチンへコンジュゲートさせたＮｏｔｕｍ特異的マウスポリクローナル抗体を加えた。１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで再び洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼへコンジュゲートさせたストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：２０００希釈物と３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで全てのプレートを２回洗浄した後に、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をウェルに加え、暗所で３０分の間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの２Ｍ硫酸を加えることによって、呈色反応を停止させた。標準のプレートリーダーを用いて、全てのウェルでＯＤ４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０３６０】
図３３Ａの標準曲線から外挿された値を用いて、ＥＬＩＳＡサンドイッチフォーマットは、患者血漿試料中のＮｏｔｕｍ分析物濃度の感度が高い検出を可能にする。より詳しくは、図３３Ｂは、健康な成人（ｎ＝１２）および病期２〜４の一群の卵巣がん患者（ｎ＝７）からの血漿試料で導かれたＮｏｔｕｍ分析物濃度を示す。データは、健康な成人の血漿試料中の平均Ｎｏｔｕｍ濃度はおよそ８．６±１０．３ｎｇ／ｍｌであるが、卵巣がん患者でのＮｏｔｕｍ濃度は３６．５±２５．２ｎｇ／ｍｌで有意により高いようであることを示す。これらの結果は、開示された本発明のモジュレーターが新生物障害の検出および／またはモニタリングのための診断剤として有効に作用することができることを明らかに実証する。
【０３６１】
当業者は、その精神またはその中心的な特質から逸脱することなく本発明を他の具体的な形で具現化することができることをさらに理解するであろう。本発明の上の記載がその例示的な実施形態だけを開示するという点で、他の変形形態が本発明の適用範囲内であると企図されることを理解すべきである。したがって、本発明は、本明細書で詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲および内容の指標となるように、添付の請求項を参照すべきである。
【図２２】
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【図２９Ａ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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