(57)【要約】  本発明は、バイオリーチングのための添加物であって、それが、硫化鉱からの銅回収率を増大することを可能にする添加物を開示する。そこにおいて、この添加物は、実質的にリポタンパク質リカナンターゼとｐＨが０．８〜３の硫酸溶液とにより構成される。リポタンパク質リカナンターゼは、配列番号１に示される配列と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、または配列番号２に示される配列と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列の翻訳産物である。また、改良されたバイオリーチングプロセスが保護され、それは、本発明に記載された通りの鉱石バイオリーチングプロセスの間に当該添加物を添加することと；および、慣習的なプロセスを継続し、５〜２０％に増大された同回収率を得ることとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリーチングのための添加物であって、
ａ）５〜９９％のリポタンパク質リカナンターゼと、
ここで、リポタンパク質リカナンターゼは配列番号１に示される配列について少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する；
ｂ）１〜９５％のｐＨが０．８〜３の硫酸溶液と；
を含むことを特徴とする添加物。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオリーチングのための添加物であって、リポタンパク質リカナンターゼが配列番号２に示される配列について少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列によりコード化されることを特徴とする添加物。
【請求項３】
バイオリーチングプロセスであって、この方法が以下の工程を含むことを特徴とするバイオリーチングプロセス；
ａ）バイオリーチングシステムを提供すること；
ｂ）請求項１〜２の何れか１項に記載のバイオリーチングのための添加物を添加すること；および
ｃ）習慣的なバイオリーチングプロセスを継続すること。
【請求項４】
請求項３に記載のバイオリーチングプロセスであって、添加物が、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの濃度で添加されることを特徴とするバイオリーチングプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
発明の目的
本発明は、バイオリーチングシステムにおける銅の回収率を増大することができるバイオリーチング添加物を開示する。そこにおいて、この添加物は、実質的にリポタンパク質リカナンターゼとｐＨ０．８〜３での硫酸とで構成される。リポタンパク質リカナンターゼは配列番号１に定義される配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するアミノ酸配列を有し、または配列番号２に定義される配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するヌクレオチド配列の翻訳産物である。
【０００２】
それはまた、改良されたバイオリーチング方法であって、バイオリーチングシステムを提供すること、本発明で定義される通りのバイオリーチングのための添加物を添加すること；および慣習的なバイオリーチングプロセスを継続し、銅回収率の増大を達成することを含む。
【０００３】
背景技術
硫化銅鉱の処理は、現在、鉱石の破砕、磨鉱および浮遊選鉱と、それに続く、精鉱の溶融−変換および金属の電解精錬に関連するに物理的および化学的プロセスに基づいた技術に支えられている。実際には、８０パーセント以上の銅は、前述の慣習的な方法として公知の製錬ルートに続く鉱石処理により生産され、それは鉱石堆積物および処理プラントの特定の特徴に依存して、高および中純度の鉱石に制限されている。このため、従来の製錬方法では経済性が見込めず、未だ有効な技術が開発されておらず、手付かずの比較的低品位な硫化銅鉱石が未使用資源として膨大な量残っている。
【０００４】
一方、鉄酸化細菌、硫黄酸化細菌を用いた硫化銅鉱の可溶化はバイオリーチングという名称で定着している(Rawlings DE; Biomineralization of metal-containing ores and concentrates, TRENDS in Biotechnology, Vol.21 No.1, p38-42, 2003)。
【０００５】
バイオリーチングとは酸性環境において微生物を直接、もしくは間接的に利用し母材から金属を溶出させる方法である。これらの処理にはバクテリア界および古細菌界に属し、且つ好酸性、独立栄養性を有する微生物が適用可能である。具体的にバイオリーチングに適用可能な微生物種としてはアシジフィリウム（Acidiphilium）種、レプトスピリルム（Leptospirillum）種、スルホバシルス（Sulfobacillus）種、およびアシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）種、アシジチオバシルス・チオオキシダンス（Acidithiobacillus thiooxidans）種並びにこれらの近縁種、古細菌ではアシジアヌス（Acidianus）種、フェルロプラスマ（Ferroplasma）種、メタロスファエラ（Metallosphaera）種、スルホロブス（Sulfolobus）種、セルモプラスマ（Thermoplasma）種およびその近縁種が挙げられる。
【０００６】
上記微生物種の中でも最も重要な微生物はアシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）種およびアシジチオバシルス・チオオキシダンス（Acidithiobacillus thiooxidans）種である。
【０００７】
バイオリーチングプロセスにおける微生物の集積が金属の回収に直接若しくは間接的にかかわっていると提唱されてきた(Rawlings DE. Characteristics and adaptability of iron- and sulphur-oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates. Microb Cell Fact. 2005 May 6;4(1):13)。
【０００８】
例えば、アシジチオバシルス・フェルロオキシダンスおよびアシジチオバシルス・チオオキシダンスは酸素を電子受容体として利用し、還元型硫黄、例えば亜硫酸、元素硫黄、チオン酸イオンの酸化を触媒し、最終産物として硫酸を産生することができる。また代謝中間物として亜硫酸、チオ硫酸塩を還元することができる。これら反応の過程によって直接的そして間接的に鉱石中の硫化鉱を可溶化できる。間接的には硫化鉱表面の硫黄皮膜が抑え、酸化剤と反応可能な面積が増大する。また直接的には微生物生体を産生するため硫化鉱に含まれる元素硫黄を酸化し元素硫黄を電子受容体として利用する。また、アシジチオバシルス・フェルロオキシダンスは酸素を電子受容体とし鉄（II）イオンを鉄（III）イオンに酸化することが可能である。強力な酸化剤である鉄（III）イオンは硫化鉱および酸化が必要とされるその他の硫化物も酸化することが可能である。
【０００９】
バイオリーチングプロセスにおける今までの実施形態は鉱石に酸、通常硫酸を添加し、溶媒抽出と電解精錬を伴い金属を回収するというものであった。バイオリーチングの浸出形態はカラム、ガビオン（コンクリート製６ｍカラム）、ヒープ（大規模な鉱石積層体）、タンクリーチングである。
【００１０】
従来法のバイオリーチングを促進若しくは改善するため、いくつかのプロセスが
提案されている。例えば米国特許ＵＳ６．１１０．２５３(Kohr et al., 2000)ではヒープの温度を少なくとも５０℃まで上昇させるという手法が提案されいる。その他にも、加熱の代わりにヒープに炭素元である二酸化炭素、炭酸塩鉱石、有機炭素を添加するという既報もあるＷＯ２００５／０７３４１４(Du Plessis and De Kock, 2005)。
【００１１】
その他の手法として特定の微生物を添加する方法がある。例えば、特許ＣＬ４４．５４６および出願ＵＳ１１／２５６，２２１では強い鉄酸化能力をもつＷｅｎｅｌｅｎ  アシジチオバシルス・フェルロオキシダンスDSM 16786株を使用している。同様に出願ＣＬ２１０１−２００５および出願ＵＳ１１／５０６，０３１でも強い鉄酸化能力を持つＬｉｃａｎａｎｔａｙ  アシジチオバシルス・チオオキシダンスDSM 17318株を添加している。これら二つの発明はチリ共和国のバイオシグマ社により開発された。
【００１２】
本発明は、何れかのバイリーティングシステムにおいて鉱石からの銅回収を最適化するという技術的課題にアプローチし、それを、「何れかのバイオリーチングシステムに対して添加され」、このバイオリーチングプロセスの銅回収効率を改善する添加剤により達成する。従って、本発明は、既に存在するバイオリーチングシステムの効率を増大するための他の何れの戦略を補足する。
【００１３】
本発明の添加物は前述のように、実質的にｐＨ０．８〜３の硫酸溶液とリポタンパク質リカナンターゼとのバイオリーチングプロセスに対する添加からなる。既存の手法に本発明と類似した添加物はなく、機能および組成の何れにおいても類似した技術は存在しない。リポタンパク質リカナンターゼは、バイオシグマ社のバイオリアクターにおいて純粋培養されたアシジチオバシルス・チオオキシダンスまたはアシジチオバシルス・チオオキシダンスとアシジチオバシルス・フェルロオキシダンスを組み合わせて培養した際の培養液上清において初めて発見され；発案者らは、それを単離し、配列決定し、本発明の添加物としての使用を確立した。
【００１４】
このタンパク質は、現在、論文などには公開されておらず、最も近いものがZhangらによって公表されており(Trans Nonferrous Met. Soc. China 18 (2008)1398-1402)、それは、Ａ．フェルロオキシダンスが熱酸性水で細胞沈殿物を処理した後に単離されたため、Ａ．フェルロオキシダンスのリポタンパク質は細胞外部に関連していると記載する。この論文は今回見出されたリポタンパク質の機能を割り当てるものではなく；それは、ペプチドマス研究（ペプチドマスフィンガープリント）により分類し、発見されたペプチドの可能な機能性をコンピューター分析するのみである。一方、本発明は、驚くべきことに、１つのタンパク質、特に、リカナンターゼがバイオリーチングシステムにおいて銅回収量を増加する添加物において使用できることを確立した。
【００１５】
発明の説明
この本発明は、バイオリーチングシステムにおいて銅回収量を増加できるバイオリーチングのための添加物を開示する。そこにおいて、この添加物は、バイオリーチング条件において、実質的にpH０．８から３の硫酸溶液とリポタンパク質リカナンターゼとで構成され、そこにおいて、リポタンパク質リカナンターゼは、配列番号１に示される配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するアミノ酸配列を有する、または配列番号２に示される配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するヌクレオチド配列の翻訳産物である。
【００１６】
本発明の添加物は、５から９９パーセントのリポタンパク質リカナンターゼを含み、１から９５パーセントのpH０．８から３の硫酸溶液を含む。このタンパク質はクローニングによって得られたセクレトームからの総抽出物から濃縮することにより生産されてもよく、または現在存在する入手可能な他のタンパク質生産技術を用いて生産されてよい。
【００１７】
本発明の第２の側面は、バイオリーチングプロセスの改善に焦点を当てるものであり、それは、バイオリーチングシステムを提供すること、本発明に示されるようなバイオリーチングのための添加物を添加すること；および５〜２０％までバイオリーチングシステムにおける同回収率を増大する慣習的なバイオリーチングプロセスを継続することを含む。
【００１８】
本発明の添加物中の活性物質であるリポタンパク質リカナンターゼは、アシジチオバシリ（Acidithiobacilli）に属するバクテリア中でも特にアシジチオバシルス・フェルロオキシダンス種とアシジチオバシルス・チオオキシダンス種の分泌タンパク質またはセクレトームにおいて見出される。
【００１９】
バイオリーチングプロセスは、バクテリアと鉱石の接触面における相互作用を含み、それは、主にエキソポリサッカロイド細胞外マトリックスによって構成され、そこにおいて細胞は、タンパク質やその他の代謝産物を生産し、それらは重要な役割を果たす。一方、細胞外膜および周辺質に位置するタンパク質、例えば輸送タンパク質、および酵素は、硫化物及び鉄の酸化において非常に重要な因子であり、鉱石からの銅の放出を可能にする。この基本的な相互作用は、バクテリア−ミネラル境界面において生じ、それは、バクテリア接着プロセスおよび恐らくバイオリーチングを誘導する電子の交換を含む。本発明者らは、バイオリーチング株が、純粋培養または混合培養において、ある特定のグループのタンパク質を分泌し、それが潜在的に硫化鉱のバイオリーチングを可能にする上で重要な役割を果たすことを発見した。
【００２０】
上記に基づき、本発明者らは、唯一のエネルギー源として硫黄元素中で増殖されたアシジチオバシルス・フェルロオキシダンス、アシジチオバシルス・チオオキシダンスの純粋培養（セクレトーム）において、およびこれらの２つのバクテリアの混合培養（メタセクレトーム）において細胞外空間に分泌されたタンパク質を特徴付けた。これは、タンパク質を同定するためのものであり、それは水不溶性基質との相互作用と、バクテリア−ミネラル相互作用の理解に寄与することを可能にし、それらはバイオリーチングプロセスを制御する。
【００２１】
A. チオオキシダンス種を用いた培養においてのみ分泌タンパク質が検出され、後期対数増殖期（約１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）において得られる総分泌タンパク質量は０．５〜２ｍｇ／Ｌの範囲であることが判明した。Ａ．フェルロオキシダンス種を用いた純粋培養では分泌タンパク質は発見されておらず、Ａ．チオオキシダンス種とＡ．フェルロオキシダンス種を混合培養した場合にはＡ．チオオキシダンス（thiooxidans）種の純粋培養のセクレトームのタンパク質とは異なるメタセクレトームのタンパク質が検出された。これらはＡ．フェルロオキシダンス種はＡ．チオオキシダンス種と相互作用するタンパク質を分泌している、若しくはＡ．フェルロオキシダンス種によりＡ．チオオキシダンス種の分泌タンパク質が変化していることを示す。
【００２２】
本発明において見られた分泌タンパク質の濃度は０．５から２ｍｇ／Ｌと他の種の分泌タンパク質濃度の例と比較すると低い。バシルス（Bacillus）種では２００ｍｇ／Ｌに近い濃度が報告されている。
【００２３】
まず、本発明のバイオリーチングに対して添加剤を用いるという目的で、得られたセクレトームを５倍に濃縮し、これらの濃縮物を用いて試験を行い、バイオリーチングにおけるそれらの効果を観察した。
【００２４】
アシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）種とアシジチオバシルス・チオオキシダンス（Acidithiobacillus thiooxidans）種に属するバクテリアの特徴の一つとして好酸性であり、ｐＨが１〜３、またはもっと低いｐH領域で増殖するということが挙げられる。実際に試験では培地のｐＨは１．６であった。よって、このｐＨ範囲内で、これらのバクテリアのセクレトーム、および例えば、リカナンターゼなどを構成するタンパク質が安定であることがを期待できる。従って、全ての試験はこのｐＨを維持して行われ、試験に用いられた材料もこのｐＨを維持して行われた。また、材料のｐＨ調整には硫酸が用いられた。それは、硫酸は脱プロトン化された酸であるために、それ自体が所望の範囲内にｐＨを維持する緩衝剤となるためである。
【００２５】
驚くべきことに、Ａ．フェルロオキシダンス（ferrooxidans）種とＡ．チオオキシダンス（thiooxidans）種を播種したバイオリーチングシステムに対して添加したときに、Ａ．チオオキシダンスのセクレトームと、Ａ．フェルロオキシダンスおよびＡ．チオオキシダンスのメタセクレトームの両方ともに、６〜８パーセントの銅の回収率が有意に増加し、そこにおいて銅鉱石は黄銅鉱を主体とする鉱石を用いた。一方で分泌タンパク質を添加したにも関わらず、積層体に含まれる微生物群には有意な差は見られなかった。この知見はバイオリーチングプロセスにおいて銅回収率向上という点で、非常に経済的に重要である。なぜならこの知見はこのバイオリーチング技術である本発明のプロセスが特異的且つ直接的に影響を与え、バイオリーチングが促進され微生物が増加している間に銅の浸出が進んでいることを示唆しているからである。
【００２６】
第二にセクレトームの画分用いた試験を行った。この目的はセクレトームのタンパク質全てが銅回収向上に必要であるのか、それともそのうちのいくつかまたは１つが必要であるのかを明快にすることである。分泌タンパク質のうち３．５ｋＤａから３０ｋＤａの画分と３０ｋＤａ以上の画分を用いて試験を行った。同試験より分泌タンパク質のうち３．５ｋＤａから３０ｋＤａの画分が積層体からの銅回収向上を可能にすることが分かった。一方３０ｋＤａ以上の画分は効果を示さなかった。
【００２７】
分泌タンパク質の銅浸出促進活性を有する画分が特定されたのち、同活性画分のタンパク質を精査したところ同活性画分の大部分がリポタンパク質リカナンターゼというタンパク質で占められていることが判明した。よって、リポプロテインリカナンターゼが前述のバイオリーチングにおける銅回収率向上の原因であると示唆された。
【００２８】
同リポプロテインリカナンターゼは当バイオシグマのバイオリアクターから単離されたタンパク質である。そのアミノ酸配列とヌクレオチド配列がすでに明らかにされており、アミノ酸配列を配列番号１に、ヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【００２９】
これらアミノ酸配列及びヌクレオチド配列はアメリカ合衆国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，  ＥＥＵＵ）のデータベース、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ  （ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）のデータベース比較に用い、ＢＬＡＳＴ  （Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）の公開情報を利用することで決定された。
【００３０】
アミノ酸配列の決定において、ＮＣＢＩとＵｎｉＰｒｏｔＫＢのデータベースにおいて二つ似た配列が公開されていることが判明した。ＮＣＢＩではｒｅｆ｜ＹＰ＿００２２２０８３８．１｜というコードで、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢではＢ７Ｊ９０４＿ＡＣＩＦ２というコードで登録されている。ｒｅｆ｜ＹＰ＿００２２２０８３８．１｜はアシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）ＡＴＣＣ５３９９３株の想定リポタンパク質として、Ｂ７Ｊ９０４＿ＡＣＩＦ２はアシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）ＡＴＣＣ２３２７０株の想定リポタンパク質として。この二つの配列はそれぞれ配列番号１に示す配列と９６パーセトの相同性を有しいる。これらのタンパク質アシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）ＡＴＣＣ５３９９３株のリポタンパク質は右記公表(DOE Joint Genome Institute, EEUU)基ており、アシジチオバシルス・フェルロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）ＡＴＣＣ２３２７０株のリポタンパク質は右記(Valdes et al., 2008 en BMC Genomics 9 (1), 597)に基ている。これらの論文では遺伝的な情報から同想定リポタンパク質遺伝子に注釈がつけられているだけで、再現実験やタンパク質の合成などは行っていない。一方、ＮＣＢＩのデータベースから得られたＡＴＣＣ  ２３２７０株のリポタンパク質ヌクレオチド鎖ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００１２１９．１とＡＴＣＣ５３９９３のリポタンパク質ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００１１３２．１は１００パーセント一致した。これら二つのＤＮＡ鎖をＢＬＡＳＴ検索によって得られたヌクレオチド鎖配列番号２と比較するとその相同性は87パーセントであった。これは一つの遺伝子が似た配列で公表されていることを示すものである。
【００３１】
前述した通り、本発明はまた、次の工程を含むバイオリーチングプロセスを改善することを目的とする；
ａ）バイオリーチングシステムの提供を提供すること；
ｂ）酸中に１０から９９パーセントのリポタンパク質リカナンターゼから構成されるバイオリーチング添加物を添加すること、そのリポタンパク質リカンターゼは、配列番号１に示す配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２に示す配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するヌクレオチド配列によりコード化される；
ｃ)通常のバイオリーチングを継続すること。
【００３２】
バイオリーチングシステムはガビオンカラム、ダンプ、若しくは反応容器内での攪拌が知られている。０．０１から１００ｍｇ／Ｌの同添加物を添加することで、上記ｂ)工程を含まないプロセスよりも５から２０パーセントの銅回収率増加を得ることが可能である。
【００３３】
一方、リポタンパク質リカナンターゼがこれら銅回収率増加の原因であるが、我々のデータからセクレトーム中にそのほかのタンパク質が同時に存在しても、その活性は、減少しないことが判明した。よって同分泌タンパク質の３．５ｋＤａから３０ｋＤａ画分若しくは分泌タンパク質全てを加えても、銅回収率において同じ結果が得られた。
【００３４】
前述のようにリポタンパク質リカナンターゼは配列番号１に示される配列番号について少なくとも５０パーセントの相同性を有するアミノ酸配列を有し、または配列番号２に示される配列について少なくとも５０パーセントの相同性を有するヌクレオチドの翻訳産物である。本発明の若干の好ましい選択肢において、リポタンパク質リタカナンターゼは、配列番号１に示される配列番号について、少なくとも６０％または７０％または８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有すると定義され、または配列番号２に示される配列番号について、少なくとも６０％または７０％または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列によりコード化されると定義される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】１５パーセント変性ポリアクリルアミドゲルにおいてＡ．チオオキシダンスの培養液のセクレトームを濃縮して得られたリポタンパク質リカナンターゼを電気泳動した図。
【図２】試験に用いた黄銅鉱の鉱物学的解析を示す。全ての鉱物のなかの85.5パーセントが黄銅鉱であり、銅を含む鉱物種は９９パーセント以上が黄銅鉱である。
【図３】図３では異なる画分から得られた分泌タンパク質を用いた際のバイオリーチング銅回収率が示されている３つのグラフを示す。
【００３６】
図３Ａ．１は、Ａ．チオオキシダンス由来のセクレトームを添加した際のバイオリーチング銅回収率を示す。
【００３７】
図３Ｂ．１は、Ａ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの混合培養によって得られたセクレトームを添加した際のバイオリーチング銅回収率を示す。Ａ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの混合培養によって得られたセクレトームを添加することで有意に銅回収率が増加していることがわかる。
【００３８】
図３Ｃ．１は、Ａ．チオオキシダンス由来のセクレトームの３．５から３０ＫＤａの画分を用いた際のバイオリーチングにおける銅回収率の推移を示す。Ａ．チオオキシダンス由来のセクレトームの3.5 から 30 KDaの画分を添加することで有意に銅回収率が増加していることがわかる。
【００３９】
図３Ａ．２は、Ａ．チオオキシダンス培養によって得られたセクレトームを添加した際のＡ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの微生物量の推移を示す。
【００４０】
図３Ｂ．２は、Ａ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの混合培養によって得られたセクレトームを添加した際のＡ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの微生物量の推移を示す。
【００４１】
図３Ｃ.２は、Ａ．チオオキシダンス由来のセクレトームの３．５から３０ＫＤａの画分を用いた際のＡ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの微生物量の推移を示す。
【００４２】
我々は、Ａ．チオオキシダンス培養によって得られたセクレトーム、Ａ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの混合培養によって得られたセクレトーム、Ａ．チオオキシダンス由来のセクレトームの３．５から３０ＫＤａの画分どれを用いた際でもバイオリーチング試験の通常の微生物培養に影響を与えていないことが観察した。
【図４】図４では１５パーセント変性ポリアクリルアミドゲル上でクローニング後大腸菌タンパク質発現システムより生産したリポタンパク質リカナンターゼを電気泳動した際の電気泳動像を示す。放射性同位体を用い、ケミカルルミネセンスにより可視化している。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
例．１リカナンターゼ濃縮とその分析の手段
１．１  バイオリーチング試験のためのリカナンターゼの濃縮アシジチオバシルス・チオオキシダンス（Acidithiobacillus thiooxidans）は左記無機培地（９９０ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４５ｍｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、５２ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２１ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２、ｐＨ１．６）に元素硫黄が１パーセント(g/v)を添加し、培養された。３０℃、回転振とうにて攪拌、培養した後、１分間、５０パーセントの強度で超音波処理を行った（WiseClean、Daihan）。超音波処理後、５．０００ｘｇ、１５分間、４℃で遠心分離を行った。
【００４４】
１．１．１  ５倍のセクレトームの生産
上記遠心分離後の上精液を同じ条件で遠心分離を再び行い、穴径が０．２μmのフィルターを用い、ろ過を行った。１００ｍＬから１００００ｍＬのろ過後の培養液を減圧遠心器を用い４０℃、１００ｍｂａｒにて濃縮した。(RapidVap concentrator equipment (Labconco))最終的に、培養液を１０分の１から５分の１の体積まで削減し、培養液に含まれるタンパク質の濃度は５から１０ｍｇ／Ｌに達した。体積が減ることで水素イオンも濃縮され培養液のｐＨが下がる。そのためｐＨが１以下にならないよう、適宜１ＭのＮａＯＨを添加した。
【００４５】
得られた濃縮液は蒸留水と硫酸で調製したｐＨ１．６の希硫酸を用い、４℃で一晩透析を行った。透析膜には３．５ｋＤａのメンブランを用いた。(SnakeSkin（登録商標）、Thermo Fisher Scientific)。
【００４６】
１．１．２  セクレトームの異なる画分の産生
リカナンターゼを多く含む画分を試験する為に、透析処理液を３０ｋＤａの穴径を持つフィルターでろ過を行った。(Amicon（登録商標） Ultra-15, Millipore)フィルターには３．５から３０ｋＤａのリカナンターゼを多く含む画分が残り、硫酸を用いｐＨ１．６調製されたにろ液には３０ｋＤａより大きな画分が残る。
【００４７】
１．２  リカナンターゼの分析と同定。
【００４８】
前述のフィルター処理によって得られたフィルター画分を市販のタンパク質沈殿キット(2D-Cleanup kit、GE Helathcare)を用い沈殿させた。沈殿を尿素７Ｍ、チオウレア２Ｍ、ＣＨＡＰＳ４％ｗ／ｖおよびＴｒｉｚｍａ  ｂａｓｅの２０ｍＭを含む溶液に添加し再攪拌、溶解を行った。最後にタンパク質の濃度はブラッドフォード法にて５９５ｎｍの吸光度を用い定量された。
【００４９】
５から２０μｇのタンパク質が１５パーセント変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いられた。１０〜１５ｋＤａの間に見られるバンドがリカナンターゼに相当する。
【００５０】
同バンドを切り出し、市販のタンパク質抽出キット(In-Gel tryptic digestion kit, Pierce)を用いバンドに含まれるタンパク質を抽出した。同サンプルを液クロマトグラフィーと質量分析計（Orbitrap XL Mass Spectrometer ，Thermo Fisher Scientific）に供し、分析を行い、ペプチド鎖の結果が判明した。
【００５１】
質量分析計によって得られたスペクトルはＸｃａｌｉｂｕｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ(Thermo Scientific)というソフトを用いて解析された。同ソフトはＮＣＢＩの公開データベースに従って、ペプチドのリストの作成が可能である。本発明では当バイオシグマが所有するＡ．フェルロオキシダンスＤＳＭ１６７８６株とＡ．チオオキシダンスＤＳＭ１７３１８株のゲノムデータを用いた。
【００５２】
上記方法の最初の検索でペプチド鎖ＡＤＡＡＱＳＴＡＮＥＡＬＡＫ；ＡＮＡＡＱＳＴＡＴＤＡＬＳＫＡＮＡＡＱＳＴＡＤＱとＡＥＥＡＮＥＫＶＥＲが１００パーセント、リカナンターゼペプチドであると同定された。
【００５３】
配列番号１と配列番号２に示す配列はショットガンシーケンスと呼ばれる方法にて得られた。
【００５４】
Ａ．チオオキシダンスＤＳＭ１７３１８のヌクレオチド配列解読と注釈はアメリカのＡｇｅｎＣｏｕｒｔ社にて行われた。
【００５５】
２．  バイオリーチング試験
バイオリーチング試験は常にフラスコ系にて行われた。それぞれのフラスコには１００ｍＬのｐＨ１．６の無機培地：９９０ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４５ｍｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、５２ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２１ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２、１．５ｇ／ＬのＦｅ（ＩＩＩ）、２．５ｇ／ＬのＦｅ（ＩＩ）が１％ｐ／ｖの黄銅鉱の精鉱の存在下で添加された。同精鉱の鉱物比率は図２に示すように８５．５パーセント以上が黄銅鉱であり、銅鉱物の９９パーセント以上が黄銅鉱である。
【００５６】
鉱物学的解析は光学偏光法を以って行われた。光学偏光法ではそれぞれのサンプル３ｇを埋没させ、薄片を作成、偏光顕微鏡で偏光を観察し鉱物を特定および計上する。
【００５７】
バイオリーチング試験にあたって、試験開始時にＡ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスがそれぞれ１．００×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬで播種された。
【００５８】
バイオリーチング試験では二つのコントロールが実施された。一つは無機培地のみで微生物の播種を行わないものである(WITHOUT/INOCULUM)。これは化学的に浸出された銅量を明確にする為である。二つ目は無機培地を用い、微生物の播種の播種を行い、添加物を添加しない条件である(WITHOUT/ADDITIVE)。これは通常のバイオリーチングで浸出される銅量を明確にする為のものであり、本発明の添加物が添加された改善されたバイオリーチングと比較する為の試験区である。
【００５９】
上記バイオリーチング試験においてフラスコは３０℃で培養され、２１日間攪拌を行い、週の平日に全細胞数、全鉄濃度、鉄（ＩＩ）イオン濃度、銅（ＩＩ）イオン濃度などの分析を行った。分析には以下の技術を用いた。
【００６０】
２．０．１  全細胞数計数
バイオリーチング試験においてＡ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンスの細胞数の計数はトーマ血球計数板を用いて光学顕微鏡で観察することで行われた。
【００６１】
２．０．２  銅濃度及び各種鉄濃度の測定
銅（ＩＩ）イオン濃度と全鉄濃度の測定は原子吸光度を用い測定された(Perkin Elmer Aanalyst 400 model)。また、鉄（ＩＩ）イオン濃度はｏ−フェナントロリン酸を用い、吸光度を測定することで導かれた。
【００６２】
２．１  セクレトームの完全なタンパク質画分の添加
まず最初に、試験を行い、そこにおいて、Ａ．チオオキシダンス（図３Ｂ．１）とＡ．チオオキシダンスとＡ．フェルロオキシダンス（図３Ｂ．１）の混合物の両方のセクレトームの５倍に濃縮物され、約５ｍｇの総タンパク質／ＬをｐＨ１．６で含む完全なタンパク質画分を添加した。Ａ．チオオキシダンスのセクレトームおよびＡ．チオオキシダンスおよびＡ．フェロオキシダンスの混合物のメタセクレトームの両方が有意な銅の回収率における増大を示すことが観察できた。
【００６３】
図３Ａ．１は、５倍に濃縮されたＡ．チオオキシダンスのセクレトームが添加されたときの銅化収率のパーセンテージを示す。
【００６４】
図３Ａ．２は、５倍のＡ．チオオキシダンスのセクレトームが直接にバイオリーチングプロセスに影響することを我々が結論できるように、両方のアッセイにおいて同様に維持されたバイオマスを示す。
【００６５】
図３Ｂ．１は、５倍濃縮されたＡ．チオオキシダンスおよびＡ．フェルロオキシダンスの混合物のメタセクレトームを添加したときの銅回収率のパーセンテージを示す。我々は、２１日目に、添加物なしの通常のバイオリーチングよりも同回収率が６％よりも高いことを観察した。われわれは図３Ｂ．２において、両方の試験においてバイオマスが同様に維持されたことが観察でき、従って、われわれは、Ａ．チオオキシダンスおよびＡ．フェルロオキシダンスの混合物のメタセクレトームの５倍濃縮物がバイオリーチングプロセスに直接影響することを結論付けることができる。
【００６６】
２．２  Ａ．チオオキシダンスのセクレトームの異なる画分の添加
１．１．２の例に従い、バイオリーチング試験はＡ．チオオキシダンスのセクレトームの中でもリカナンターゼが多く含まれる３．５〜３０ＫＤａの画分を用いて行われた。また同時にＡ．チオオキシダンスのセクレトームの３０ｋＤａ以上の画分をもちいてバイオリーチング試験が行われた。図．３Ｃ．１に同試験の結果が見られる。Ａ．チオオキシダンスのセクレトームの中でもリカナンターゼが多く含まれる３．５〜３０ＫＤａの画分を用いた条件にて有意に銅回収率が増加している。
【００６７】
図．３Ｃ．１では異なる濃度でＡ．チオオキシダンスのセクレトームを添加し、そのときの銅回収率の推移を示している。５倍に濃縮したＡ．チオオキシダンスのセクレトームの３．５〜３０ｋＤａの画分を添加した条件では試験開始から２１日が経過した時点で添加物なしの通常のバイオリーチングと比較して５パーセント銅回収率が高い。一方３０ｋＤａ以上の画分を用いた条件では添加物なしのコントロールと比較して有意な銅回収率向上は見られなかった。図．３Ｃ．２では微生物量がコントロールも含めた上記３つの条件において近似していることが分かる。よって、５倍に濃縮したＡ．チオオキシダンスのセクレトームの３．５〜３０ｋＤａの画分がバイオリーチングに対して直接影響を与えていると結論付けることが可能である。
【００６８】
３．リカナンターゼのクローニング
リポタンパク質リカナンターゼがバイオリーチングに影響を与えていると結果が出たのち、同タンパク質の配列解読に取り掛かった。解読されたアミノ酸配列は配列番号１に示される。
【００６９】
Ａ．チオオキシダンス種の中でもＬｉｃａｎａｎｔａｙＤＳＭ１７３１８株のゲノム体系化はタンパク質を用いて行われた。同ＬｉｃａｎａｎｔａｙＤＳＭ１７３１８株はバイオシグマが所有する微生物である（特許出願中CL 2101-2005およびUS11/506,031）。同作業中に配列番号２に示されるリカナンターゼの遺伝子が発見された。
【００７０】
同リカナンターゼのヌクレオチド配列を有する遺伝子は当バイオシグマにて開発されたｐＢＭ４  ｐｎｉｔ  ｈｉｓｔａｇ  ｖｅｃｔｏｒ（特許出願中 CL 2115-2007 and US12/174,374)にクローニングされ、大腸菌ＢＬ２１株に下記方法で導入された。
【００７１】
３．１遺伝子の増幅
同リカナンターゼのヌクレオチド配列を有する遺伝子はPCR法にて増幅された。ＰＣＲ法では５’ＨｉｎｄＩＩＩ末端、３’ＮｏｔＩ末端の制限酵素サイトとヒスチジンタグを持つプライマーを用いて行われた。末端ヒスチジンタグは同タンパク質を過剰発現したのち単離する為に導入した。
【００７２】
増幅の条件は以下の通り。開始９４℃１分、ＤＮＡ変性９４℃４５秒、ＤＮＡアニーリング５２度４５秒、ＤＮＡ伸長７２度１分３０秒、ＤＮＡ変性からＤＮＡ伸長までを１０サイクル行い引き続きＤＮＡ変性９０℃４５秒、ＤＮＡアニーリング５２度４５秒、ＤＮＡ伸長７２度１分３０秒、ＤＮＡ変性からＤＮＡ伸長までを２５サイクル行った。最終サイクルのＤＮＡ伸長は７２℃、１０分間実施された。増幅されたＤＮＡ断片は４℃で保存され、ＰＣＲ産物の精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ，  ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製された。
【００７３】
３．２リカナンターゼ遺伝子クローニング
本発明においてクローニングに用いられたｐＢＭ４  ｐｎｉｔ  ｈｉｓｔａｇプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩの制限酵素によって６時間３７℃で切り出され、続いて６５℃、１０分間の熱処理を行いそれら制限酵素を失活した。続いてエタノール沈殿により切断されたプラスミドを沈殿させ、同沈殿を蒸留水中に再びけん濁した。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片、及び制限酵素によって切断されたプラスミドの定量はＮａｎｏＤｒｏｐ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔを用いて行われた。増幅ＤＮＡ溶液１に対し切断プラスミドを２０倍等量加え２０℃、３時間培養しＤＮＡライゲーションを行った。大腸菌ＢＬ２１と上記ライゲーション後のプラスミドを用いて形質転換を行った。形質転換には電気窄穴法が用いられた。
【００７４】
３．３大腸菌によるリカナンターゼの発現
形質転換した大腸菌の選択にはカナマイシンが用いられた。また同時にPCR法を用いて形質転換されているか、プラスミドに遺伝子が挿入されているか確かめた。
【００７５】
リカナンターゼ遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されていると確認された大腸菌を０．２パーセントのグルコース、カナマイシンを添加したＬＢ培地に播種して培養を行った(LeMaster DM & Richards FM; Preparative-Scale Isolation of Isotopically Labeled Amino Acids, Analytical Biochemistry, Vol.122, No.2,p238-247, 1982)。対数増殖期まで培養したのち、遠心分離を行い（１０．０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）分離後の上澄みを穴径０．２μｍのニトロセルロースフィルターでろ過し、減圧濃縮を行った。同時に残った大腸菌を燐酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄しタンパク質再けん濁液を用い再けん濁を行い全タンパク抽出物が得られた。上記上澄み液とタンパク抽出物を１５パーセント変性ポリアクリルアミドゲルに装填し１５０Ｖ、１時間電気泳動を行った。電気泳動後、同変性ゲルに４００ｍＶ、１時間垂直に電圧をかけニトロセルロースメンブランに移した。移動後、ニトロセルロースメンブランをＨｉｓ−Ｐｒｏｂ−ＨＲＰに浸しブロッキング処理を行った。その後化学蛍光試薬であるＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加、培養した後、放射性写真のフィルムに暴露した。
【００７６】
上記試験の結果は図．４にて示され、上記試験にて大腸菌内でリカナンターゼが発現したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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