(57)【要約】  本開示は、綿を用いて固体または液体試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）のような天然および人工の核酸を単離するための方法を提供する。充填される綿は、核酸を含有する溶液がそれを通過し、溶液中の核酸が結合に最適な媒体中で綿に結合するようなものである。核酸は、結合した核酸が水を含む液体による複数回の洗浄に耐えることができ、かつ水性バッファー中に溶出されるように綿に結合する。この水性バッファーとともに、溶出された核酸を、ＰＣＲを用いる増幅のために、または任意の他の生化学的もしくは分子生物学的なニーズのために直接用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から核酸を単離するための方法であって、前記方法が、
（ａ）溶解バッファーを核酸を含む前記試料に添加して、溶解溶液を得る工程；または
（ｂ）溶解バッファーを結合バッファーと組み合わせて前記試料に添加して、溶解溶液を得る工程；
（ｃ）結合バッファーを工程（ａ）の溶液に添加して、前記核酸をマトリックスに結合させるか、または工程（ｂ）の溶液を前記マトリックスに直接結合させる工程；および
（ｄ）前記マトリックスに結合した核酸を洗浄し、溶出させて、前記核酸を単離し、精製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が生物学的または非生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料が、血液、喀痰、血清、唾液または組織抽出物を含む群から選択され、かつ前記非生物学的試料が、化学合成したＰＮＡを含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶解バッファーが、グアニジンチオシアネート、塩酸グアニジン、ＥＤＴＡ、トリス、洗剤、ポリオール、グループＩＡ陽イオンを含有する一価塩もしくはグループＩＩＡ陽イオンを含有する二価塩、および任意に尿素を加えたタンパク質消化酵素、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＤＴＡが、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲、好ましくは約１００ｍＭの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グアニジンチオシアネートまたは前記塩酸グアニジンが、約０．１Ｍ〜約７Ｍの範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記尿素が、約０．０１Ｍ〜約７Ｍの範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記トリスが、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約２０ｍＭの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリオールが、約０．０１％〜約３０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０およびＴｗｅｅｎ２０またはこれらの任意の組合せを含む群から選択され、かつ前記タンパク質消化酵素がプロテイナーゼＫである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合バッファーが、任意にポリオールまたは非ポリオールを加えた水である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリオールが、ポリエチレングリコール、グリセロール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される水溶性ポリオール化合物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ポリオールが、メタノール、エタノール、プロパノールからなるアルコール、もしくは酸、アミン、アルコール、フェノール、アミドもしくはエステルの官能基を前記官能基の１つとして含む任意の水溶性液；またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄および前記溶出が、それぞれ、洗浄バッファーおよび溶出バッファーを用いて行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記洗浄が、約１％〜約９９％（ｖ／ｖ）、好ましくは約３０％〜約７０％（ｖ／ｖ）および任意に約５０％（ｖ／ｖ）の水性アルコールを含む洗浄バッファーによる最初の洗浄と、それに次ぐ、１００％の水を含む洗浄バッファーによる複数回の洗浄を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記水性アルコールが、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＰＧ、エチレングリコールおよびプロピレングリコールを含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記水が、脱イオン水、ＤＮアーゼ不含水、ＲＮアーゼ不含水、ミリＱ水、濾過水、水道水および地下水またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記洗浄バッファーが、約５〜約１２の範囲のｐＨを有する、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む群から選択される塩、またはビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミンおよびピペリジンを含む群から選択されるバッファーを任意に含むことができる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出バッファーが、約８〜約１１の範囲のｐＨを有するバッファーまたは塩とともに、約４５℃〜約９９℃の範囲の温度を有する温水を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記水が、脱イオン水、ＤＮアーゼ不含水、ＲＮアーゼ不含水、ミリＱ水、濾過水、水道水および地下水またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バッファーが、約５〜約１２の範囲のｐＨを有するか、または約７〜約１０のｐＫａを有する、ビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミンおよびピペリジンまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記塩が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度のＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記マトリックスが、綿、綿の誘導体および綿のブレンドを有する合成ポリマーまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記綿が、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、約１〜約１４の範囲のｐＨを有するバッファーで処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿および加工した綿を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料から核酸を単離するためのキットであって、前記キットが、マトリックスおよびバッファーを含む、キット。
【請求項２７】
前記マトリックスが、綿、綿の誘導体および綿のブレンドを有する合成ポリマーまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記綿が、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、約１〜約１４の範囲のｐＨを有するバッファーで処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿および加工した綿を含む群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記バッファーが、請求項５〜１１に記載の溶解バッファー、請求項１２〜１４に記載の結合バッファー、請求項１５および１９に記載の洗浄バッファー、ならびに請求項１５および２０〜２３に記載の溶出バッファーを含む群から選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記試料が、生物学的または非生物学的試料を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
前記生物学的試料が、血液、喀痰、血清、唾液または組織抽出物を含む群から選択され、かつ前記非生物学的試料が、化学合成したＰＮＡを含む群から選択される、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸の単離および精製に関する。より本質的には、本開示は、綿またはその誘導体を用いた核酸の単離および精製のための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸抽出プロトコルは、シリカベースのプロトコルと非シリカベースのプロトコルに大きく分類することができる。既存のシリカプロトコルと非シリカプロトコルは、非核酸成分を除去するための水洗浄に耐えることができず、あるパーセンテージのアルコールをその中に含む水性洗浄液を必要とする。溶出した核酸溶液中のアルコールの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害し、したがって、通常、両プロトコルとも、高速回転または残存アルコールを除去するための他の方法、および室温または高温の水性バッファーによる核酸の溶出を必要とする。場合により、両プロトコルとも、ポリエチレングリコールまたは水性アルコール洗浄に関して高塩濃度を必要とする。高濃度の塩および水性アルコールの使用は、核酸を溶出する前のこれらの成分の厳密な除去、または遠心分離機の使用などのように、核酸の溶出に制限を加える。したがって、既存のシリカベースのプロトコルまたは非シリカベースのプロトコルの中に、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）で用いることができるものはないが、それは、遠心分離機がエアロゾルを発生させるからである。文献中に報告されている非シリカベースのプロトコルの一部を以下に示す。
【０００３】
米国特許第７２６４９２７号：この文書には、核酸と結合し、最終的には、核酸をバッファーまたは脱イオン水中で溶出させるためのポリアルキレングリコールと高塩濃度の使用を伴うセルロースまたはセルロース紙の使用が記載されている。
【０００４】
米国特許第６０８４０９１号：核酸の単離に（ジャガイモデンプンのような）セルロース粉末を用いる方法が記載されている。
【０００５】
米国特許第５８０４６８４号：核酸の抽出に濾紙を用いる方法が記載されている。この場合、濾紙は、濾紙を支えるフィルターまたはバリアとしての柔らかいティッシュペーパーまたは綿片を用いて、プラスチックチップのような材料に収容されている。
【０００６】
上記のプロセスは全て、最終的な核酸の単離に市販のシリカカラムを用いるか、またはより長い試料処理時間（３０分超）を必要とするか、もしくはマトリックスの洗浄時の高濃度の塩の使用もしくは遠心分離機の使用などを伴う。セルロースベースの核酸抽出法の中に、１００％水性バッファーまたは水で核酸を洗浄するものはなく、通常は、あるパーセンテージのアルコールまたはポリオール含有化合物を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本開示は、試料から核酸の単離するための方法であって、前記方法が、（ａ）溶解バッファーを核酸を含む試料に添加して、溶解溶液を得る工程、または（ｂ）溶解バッファーを結合バッファーと組み合わせて試料に添加して、溶解溶液を得る工程、（ｃ）結合バッファーを工程（ａ）の溶液に添加して、核酸をマトリックスに結合させるか、または工程（ｂ）の溶液をマトリックスに直接結合させる工程、および（ｄ）マトリックスに結合した核酸を洗浄し、溶出させて、核酸を単離し、精製する工程を含む、方法；ならびに試料から核酸を単離するためのキットであって、前記キットが、マトリックスおよびバッファーを含む、キットに関する。
【０００８】
本開示の特徴は、添付の図と併せて、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図は、本開示と一致するいくつかの実施形態のみを示すものと理解されるため、これらを本開示の範囲に対する限定とみなすべきではない。というのは、本開示は、添付の図の使用を通じて、さらに具体的かつ詳細に説明されるからである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】［ａ］注射器、［ｂ］注射針、［ｃ］注射器に取り付けたプラスチック鋳型、［ｄ］スクリューキャップ式プラスチックボトル、［ｅ］ガラス試験管、［ｆ］スクリューキャップ式ガラスバイアルに充填された綿。
【図２】［ａ］使い捨てプラスチック製スポイト、［ｂ］成形したプラスチック製パスツールピペット、［ｃ］ガラス製パスツールピペット、［ｄ］ゴム製のヘッドを有するプラスチック製スポイト、［ｅ］綿棒、［ｆ］成形されたプラスチックピペットに充填された綿。
【図３】［ａ］エッペンドルフ管、［ｂ］スクリューキャップ式ガラス管、［ｃ］成形したプラスチック製１ｍＬチップ、［ｄ］ゴム製のヘッドを有する目盛付き使い捨てガラスピペット、［ｅ］ビスコース棒、［ｆ］プラスチック製およびゴム製のヘッドを有するガラスピペットに充填された綿。
【図４】様々なプロトコルで精製したＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅させた。レーン１：分子量マーカー、レーン２：１ｍＬピペットチップに充填されたビスコース、レーン３：市販のビスコース棒、レーン４：１ｍＬピペットチップに充填された綿、レーン５：市販のシリカカラム、レーン６：市販の綿棒を用いて精製したＤＮＡ、レーン７：増幅されていないＤＮＡ、レーン８：水ブランク。
【図５】様々なプロトコルで精製したＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅させた。レーン１：１ｍＬピペットチップに充填された綿、レーン２：水ブランク、レーン３：２ｍＬ注射器に充填された綿、レーン４：市販のシリカカラム、レーン５：分子量マーカー。
【図６】様々なプロトコルで精製したＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅させた。レーン１：分子量マーカー、レーン２：市販のシリカプロトコル、レーン３：１ｍＬピペットチップに充填された綿、レーン４：ピペットチップに充填されたＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙、レーン５：ＦＴＡカードプロトコル。
【図７】様々なプロトコルで精製した３０ｃｔ  ＲＮＡ試料をＲＴ−ＰＣＲで増幅させた。レーン１：分子量マーカー、レーン２：脱脂綿、レーン３：オートクレーブした綿、レーン４：水酸化ナトリウムで洗浄した綿、レーン５：塩酸で洗浄した綿、レーン６：吸収綿、レーン７：Ｑｉａｇｅｎ社製のシリカカラム、レーン８：ＦＴＡカード。
【図８】自動核酸抽出用の綿充填カートリッジの構成要素。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載された例示的実施例は、限定であることを意図するものではない。他の実施形態を利用してもよく、また、本明細書に提示された主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の変更を行なってもよい。本開示の態様は、本明細書に広く記載され、かつ図に示されているように、多種多様に組み合わせることができ、これらの態様は全て、明確に企図され、かつ本開示の一部を形成することが容易に理解されよう。
【００１１】
本開示は、試料から核酸を単離するための方法であって、前記方法が、
（ａ）溶解バッファーを核酸を含む試料に添加して、溶解溶液を得る工程；または
（ｂ）溶解バッファーを結合バッファーと組み合わせて試料に添加して、溶解溶液を得る工程；
（ｃ）結合バッファーを工程（ａ）の溶液に添加して、核酸をマトリックスに結合させるか、または工程（ｂ）の溶液を前記マトリックスに直接結合させる工程；および
（ｄ）マトリックスに結合した核酸を洗浄し、溶出させて、核酸を単離し、精製する工程
を含む、方法に関する。
【００１２】
本開示の一実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡを含む群から選択される。
【００１３】
本開示の別の実施形態では、試料は、生物学的または非生物学的試料である。
【００１４】
本開示のさらに別の実施形態では、生物学的試料は、血液、喀痰、血清、唾液または組織抽出物を含む群から選択され、非生物学的試料は、化学合成したＰＮＡを含む群から選択される。
【００１５】
本開示のまた別の実施形態では、溶解バッファーは、グアニジンチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  thiocyanate）、塩酸グアニジン、ＥＤＴＡ、トリス、洗剤、ポリオール、グループＩＡ陽イオンを含有する一価塩もしくはグループＩＩＡ陽イオンを含有する二価塩、および任意に尿素を加えたタンパク質消化酵素、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００１６】
本開示のまた別の実施形態では、ＥＤＴＡは、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲、好ましくは約１００ｍＭの濃度である。
【００１７】
本開示のまた別の実施形態では、グアニジンチオシアネートまたは塩酸グアニジンは、約０．１Ｍ〜約７Ｍの範囲の濃度である。
【００１８】
本開示のまた別の実施形態では、尿素は、約０．０１Ｍ〜約７Ｍの範囲の濃度である。
【００１９】
本開示のまた別の実施形態では、トリスは、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約２０ｍＭの濃度である。
【００２０】
本開示のまた別の実施形態では、ポリオールは、約０．０１％〜約３０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度である。
【００２１】
本開示のまた別の実施形態では、洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０およびＮＰ−４０またはこれらの任意の組合せを含む群から選択され、ここで、タンパク質消化酵素はプロテイナーゼＫである。
【００２２】
本開示のまた別の実施形態では、結合バッファーは、ポリオールまたは非ポリオールを任意に加えた水である。
【００２３】
本開示のまた別の実施形態では、ポリオールは、ポリエチレングリコール、グリセロール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される水溶性ポリオール化合物を含む。
【００２４】
本開示のまた別の実施形態では、非ポリオールは、メタノール、エタノール、プロパノールからなるアルコール、もしくは酸、アミン、アルコール、フェノール、アミドもしくはエステルの官能基を官能基の１つとして含む任意の水溶性液；またはこれらの任意の組合せを含む。
【００２５】
本開示のまた別の実施形態では、洗浄および溶出は、それぞれ、洗浄バッファーおよび溶出バッファーを用いて行なわれる。
【００２６】
本開示のまた別の実施形態では、洗浄は、約１％〜約９９％（ｖ／ｖ）、好ましくは約３０％〜約７０％（ｖ／ｖ）および任意に約５０％（ｖ／ｖ）の水性アルコールを含む洗浄バッファーによる最初の洗浄と、それに次ぐ、１００％の水を含む洗浄バッファーによる複数回の洗浄を含む。
【００２７】
本開示のまた別の実施形態では、水性アルコールは、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＰＧ、エチレングリコールおよびプロピレングリコールを含む群から選択される。
【００２８】
本開示のまた別の実施形態では、水は、脱イオン水、ＤＮアーゼ不含水、ＲＮアーゼ不含水、ミリＱ水、濾過水、水道水および地下水またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００２９】
本開示のまた別の実施形態では、前記洗浄バッファーは、約５〜約１２の範囲のｐＨを有する、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む群から選択される塩、またはビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミンおよびピペリジンを含む群から選択されるバッファーを任意に含むことができる。
【００３０】
本開示のまた別の実施形態では、溶出バッファーは、約８〜約１１の範囲のｐＨを有するバッファーまたは塩とともに、約４５℃〜約９９℃の範囲の温度を有する温水を含む。
【００３１】
本開示のまた別の実施形態では、水は、脱イオン水、ＤＮアーゼ不含水、ＲＮアーゼ不含水、ミリＱ水、濾過水、水道水および地下水またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００３２】
本開示のまた別の実施形態では、バッファーは、約５〜約１２の範囲のｐＨを有するか、または約７〜約１０のｐＫａを有する、ビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミンおよびピペリジンまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００３３】
本開示のまた別の実施形態では、塩は、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度のＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される
【００３４】
本開示のまた別の実施形態では、マトリックスは、綿、綿の誘導体および綿のブレンドを有する合成ポリマーまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００３５】
本開示のまた別の実施形態では、綿は、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、約１〜約１４の範囲のｐＨを有するバッファーで処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿および加工した綿を含む群から選択される。
【００３６】
本開示はさらに、試料から核酸を単離するためのキットであって、前記キットが、マトリックスおよびバッファーを含む、キットに関する。
【００３７】
本開示の一実施形態では、マトリックスは、綿、綿の誘導体および綿のブレンドを有する合成ポリマーまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００３８】
本開示の別の実施形態では、綿は、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、約１〜約１４の範囲のｐＨを有するバッファーで処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿および加工した綿を含む群から選択される。
【００３９】
本開示のさらに別の実施形態では、バッファーは、上記のような溶解バッファー、結合バッファー、洗浄バッファーおよび溶出バッファーを含む群から選択される。
【００４０】
本開示のまた別の実施形態では、試料は生物学的または非生物学的試料を含む。
【００４１】
本開示のまた別の実施形態では、生物学的試料は、血液、喀痰、血清、唾液または組織抽出物を含む群から選択され、非生物学的試料は、化学合成したＰＮＡを含む群から選択される。
【００４２】
本開示は、綿を用いる核酸抽出システムを構築するための方法に関する。綿は、核酸抽出において言及した全ての溶液が綿と相互作用するような形で収容される。
【００４３】
別の実施形態では、本開示で用いられる様々な材料の仕様を以下に示す。
【００４４】
綿、綿の誘導体、綿を含む材料および綿様材料：ふわふわとした綿は、綿植物の綿実の周りに丸莢として得られる。核酸抽出のために、綿は、マトリックスとして好ましい材料である。綿の形態は、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、バッファー（ｐＨ１〜１４）で処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿、加工した綿などであることができ、これらは好適である。任意の綿布もしくは異なる形態の綿または綿のブレンドもしくは綿含有材料を含む合成ポリマーを核酸抽出に用いることができる。綿に似た繊維としてふるまう羊毛、生糸、カシミヤなどのような材料も本開示の一部と考えられる。有機農法によって、または殺虫剤および農薬を用いて産生された綿も本開示の一部と考えられる。異なる地理的環境で産生された綿は、組成、構造、色および品質がわずかに異なり、世界の全領域で生育した綿は本開示の一部であると考えられる。綿由来の、またはその製造において綿を用いる材料を含む、任意の製品も本開示の一部と考えられ、核酸抽出に用いることができる。
【００４５】
溶解バッファー：溶解バッファーは、綿への核酸の結合を可能にし、かつ異なる種類の試料（血液、喀痰、血清、唾液、組織抽出物など）の取扱いも可能にする高濃度のＥＤＴＡを含有する。構成塩のバリエーションが可能であり、ＥＤＴＡの使用は一例として示されているのであって、本開示に対する限定とみなされるべきではない。通常、負電荷を有する任意の高濃度の分子は、溶液中の核酸と反発し、綿への結合を増強することができる。溶解バッファーは、グアニジンチオシアネートまたは塩酸グアニジン、ＥＤＴＡ、トリス、洗剤から構成され、任意に尿素、ポリオール、グループＩＡ陽イオンを含有する一価塩および／もしくはグループＩＩＡ陽イオンを含有する二価塩、ならびにプロテイナーゼＫまたは任意のタンパク質消化酵素を含む。グアニジンチオシアネートまたは塩酸グアニジンは、０．１〜７Ｍのどこかの濃度であることができる。グアニジンチオシアネートは、いくつかの用途では塩酸グアニジンまたは尿素と置き換えることができ、その濃度も、０．１〜７Ｍと様々であり得る。尿素はタンパク質を変性させるために用いられ、それは、グアニジン塩の機能を補完し、０〜７Ｍと様々であり得る。通常、文献に報告されている血液の溶解プロトコルのほとんどは、１〜２０ｍＭの範囲のＥＤＴＡを含んでいる。本発明者らの溶解バッファーは、好ましくは１０〜３００ｍＭの範囲、より好ましくは約１００ｍＭ範囲の、著しく異なる量のＥＤＴＡを含み得る。ＥＤＴＡ濃度は、ＲＮＡおよびＰＮＡのような他の核酸に対して操作することができるが、一般に、より高濃度のＥＤＴＡは、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲにおけるサイクル時間（Ｃｔ）およびシグナル強度を改善するのに役立つことが分かった。著しく異なる濃度のＥＤＴＡは、（血液の場合）ヘモグロビン中に存在する鉄を捕捉するのに役立ち、任意のＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ活性を防止し、かつ核酸が綿に結合することができる負電荷の強い雰囲気を生成する。その重要な側面は、本実施形態が、マトリックスへのＤＮＡ結合を塩基性条件下で行なう初めての例であるということである。重要なことに、溶液の結合ｐＨは、綿へのＤＮＡ／ＲＮＡ結合に大きな影響を及ぼし、したがって、結合には、約８〜１０のｐＨが好ましいが、７．１〜１２のｐＨを用いることもできる。塩化マグネシウムは、ＲＮアーゼ活性を失活させるために、通常、より高濃度で用いられるため、ＤＮＡ溶解プロトコルでは、それは存在しないかまたは最小量（２０ｍＭ以内）で用いられる。同様に、ＥＤＴＡの使用もＲＮアーゼを失活させ、ＭｇＣｌ２の使用は必ずしも必須ではなく、それは、任意の核酸用途について任意選択である。トリスは、溶解に選択されるバッファーであり、本発明者らは、０〜１００ｍＭを用いることができ、通常、約２０ｍＭが最適であることを見出した。本発明者らの溶解バッファーにおいて、トリスの役割は溶解を助けることであり、任意の好適なバッファーに置き換えることができることに留意すべきである。結合バッファーにおけるポリオールの使用は、切断され、変性したタンパク質の溶解度を高めることができる。結合バッファー中のポリオールのパーセンテージは、０〜３０％（ｖ／ｖ）であることができる。用途によっては、個別の結合バッファーを添加せず、溶解後に、核酸をマトリックスと直接結合させた。これらのバッファーは全て、通常、脱イオン水中で作製し、ＲＮＡ用途については、水を任意にＤＥＰＣで処理し、オートクレーブすることができる。プロテイナーゼＫ溶解は、血液、喀痰、唾液、精液などについては、上記の溶解バッファーの添加の前に行なうことができ、また、任意に溶解バッファーとともに行なうことができる。プロテイナーゼＫ処理は、記載した溶解バッファー中で効果があることが分かった。そのため、この処理は、溶解バッファー添加の前であってもよく、または核酸を含む任意の種類の液体試料については、溶解バッファーと一緒にすることができる。溶解バッファー中で用いられる洗剤は、ＳＬＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、または当技術水準で公知の任意の他のよく用いられるイオン性、非イオン性洗剤を含む群から選択され得る。
【００４６】
結合バッファー：溶解後に添加すると、核酸と綿との結合を開始させる結合バッファーは、組成とｐＨに関して非常に融通性が高いことが分かった。結合バッファーは、水を添加するだけで、溶解バッファー中の塩の濃度を希釈するのに十分であるほど融通性があり、核酸の綿への良好な結合が認められた。溶解時または結合バッファーの添加後に相互作用するように綿を入れて、所与の試料から核酸を抽出することができる。実際的には、結合バッファー組成物は、４〜１２、好ましくは７〜１０の範囲の任意のｐＨであることができる。血液、喀痰または唾液のような複雑な試料の場合、結合バッファーは、あるパーセンテージの、ＰＥＧ、グリセロール、ＰＰＧ、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのような、水溶性ポリオール化合物を有することができる。ＰＥＧおよびＰＰＧの分子量は、２００〜２００，０００の範囲であることができ、実際的には、それは、１０００〜２０，０００である。結合溶液中のポリオール化合物のパーセンテージは、最大５０％（ｖ／ｖ）であることができるが、実際的な用途では、それは、１〜３０％（ｖ／ｖ）である。ポリオール化合物は、溶解した成分の完全混和性を保証することができ、プロテイナーゼＫ溶解が完全である場合、ポリオールのパーセンテージを１％にまで減少させることができる。当技術水準で公知のバッファーとしては、結合バッファーを調製するために使用可能なｐＨ５〜１２の範囲、好ましくは７〜１０の範囲のビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミン、ピペリジンなどが挙げられ、バッファーの存在は、必須ではなく、それが使用可能な、試料タイプ、試料容量、温度、溶解バッファー組成に依存する。緩衝塩を用いる場合、その濃度は、１〜２００ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭ、最も好ましくは５〜５０ｍＭと様々であり得る。上記の濃度は、結合溶液の濃度であり、溶解バッファーに添加した後、濃度は、溶解バッファーの組成によって変化することになる。また、上で定義したｐＨは、それを作製したときの結合バッファーのｐＨについてのものであり、溶解バッファーに添加すると、混合溶液（溶解バッファー＋結合バッファー）のｐＨは変化し得る。メタノール、エタノール、およびプロパノールのようなアルコールはポリオールではないが、それらを結合バッファーの調製に用いることもできる。一般に、酸、アミン、アルコール、フェノール、アミド、エステルなどの官能基を官能基の１つとして有する任意の水溶性液を用いることができる。
【００４７】
洗浄バッファー：洗浄バッファーは、非核酸成分を綿から選択的に洗い落とす溶液である。臨床試料が血液の場合、結合後、綿は褐色になる。色を取り除くためには、あるパーセンテージのエタノールを含む洗浄バッファー（洗浄バッファー１と呼ぶ）が役立つことが分かった。具体的には、最初の洗浄を、１〜９９％（ｖ／ｖ）、好ましくは３０〜７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５０％（ｖ／ｖ）エタノールを含むバッファーまたは水を用いて行なった。必要な場合、非核酸成分を除去するために、複数回の水性エタノール洗浄を行なうことができるが、それは、試料に左右され得る。メタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＰＧ、エチレングリコール、プロピレングリコールまたは任意の他の水溶性アルコールを洗浄溶液中のエタノールに置き換えることができる。一価または二価の陽イオンがその組成として洗浄バッファー１とともに存在する洗浄バッファー２を用いることができる。洗浄バッファー１と２が同じ組成を有し、水、アルコールおよび一価または二価の陽イオンから構成され得ることも可能である。綿を洗浄バッファー１および２で洗浄する回数は、０〜１０回、理想的には１〜３回の範囲であることができる。その後の洗浄は、通常、脱イオン水によるものであり、洗浄回数は、１〜１０回、好ましくは２から５回、より好ましくは３〜５回であることができる。洗浄工程で用いる脱イオン水は、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ不含水、またはミリＱ水もしくは濾過水もしくは水道水もしくは地下水と置き換えることができる。本発明者らは、水性アルコールによる最初の洗浄で非核酸成分のほとんどが除去され、その後、複数回の水（１００％水）洗浄で残存アルコールが除去される傾向があることを認めた。水洗浄によって、得られる核酸がＰＣＲ可能で、ＰＣＲの阻害因子を全くまたは最小限しか含まないことが保証される。洗浄バッファーは、ｐＨ５〜１２の範囲の、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌのような塩、またはビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミン、ピペリジンなどのようなバッファーを任意に含むことができる。バッファーまたは塩、それらの組合せは、１〜１０００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭの範囲、より好ましくは約１００ｍＭの濃度であることができる。
【００４８】
溶出バッファー：任意の温かい（４５〜９９℃）水性バッファー溶液は、綿から核酸を溶出させることができる。溶出ｐＨは、重要であることが分かったが、８〜１１の範囲にあることが好ましく、核酸の完全な回収のために、溶出は、４５〜９９℃の温度で行なわれるべきである。溶出工程でのバッファー作製に用いられる脱イオン水は、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ不含水、またはミリＱ水もしくは濾過水もしくは水道水もしくは地下水と置き換えることができる。当技術水準で公知のバッファーとしては、溶出に使用可能なｐＨ５〜１２の範囲のビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミン、ピペリジンなどが挙げられるが、最も好ましいバッファーは、７〜１０の範囲のｐＫａを有するバッファーである。結合した核酸の溶出に綿を用いるときはいつでも、溶出バッファーは温かく、実際を考慮して、４５〜９９℃の範囲であるべきである。これは、文献に報告されているほとんどの方法と全く対照的である。それらの方法では、脱イオン水を用いて温かい条件で溶出を行なうが、綿に結合した核酸を温水で完全には溶出させることができず、バッファーまたは塩の存在が極めて重要である。塩は、０〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭの範囲の濃度のＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどであることができる。バッファーは、バッファー、すなわち、ビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミン、ピペリジンの群から選択することができる。
【００４９】
核酸の回収：現在のシステムを用いると、核酸の回収は、使用される溶解バッファー、結合バッファー、洗浄バッファーおよび溶出バッファー、ならびにこれらの組合せに左右される。組合せ次第では、核酸の回収は、任意のシリカベースの核酸抽出システムに匹敵し得る。低力価の試料の場合、本発明者らの綿ベースの核酸抽出アプローチの効率がシリカよりも良い場合があることも観察された。
【００５０】
綿の分量：綿の分量は、臨床試料の容量によって決まり、１〜３００μＬの範囲の試料の場合、５〜３０ｍｇの綿で十分であることが分かった。ミリリットルの範囲の試料の容量の場合、５０ｍｇ以上の綿が不可欠であり得る。任意の臨床試料、環境試料または野外試料から核酸を抽出するには、全体で１ミリグラムから１０グラムの綿で十分である。
【００５１】
各アッセイの価格：このプロトコルで用いられる綿は、任意の薬局または小売店で市販されている（オートクレーブされているかまたは浄化されている可能性がある）脱脂綿であるので、各核酸抽出の価格は最低限であり、これまで文献で報告されているうち最も安価なものの１つである。さらに、核酸溶出物中のＰＣＲ阻害因子の偶発的存在の排除、ＰＯＣ使用に対する単純さおよび適応性、自動化のしやすさなどを考慮することで、このアプローチが優れたものとなり、抽出当たりのコストは、おまけであろう。
【００５２】
成分の安全性および溶液の廃棄：綿ベースの核酸抽出システムでは、水性源のバッファーのほとんどが利用される。廃棄物は、これらのバッファーとともに、当業者が安全かつ効果的に処分することができる。綿は、カートリッジに充填することができ、溶解溶液、結合溶液、洗浄溶液は全て、医療従事者または分析者が廃棄物を処分する必要のないＰＯＣ使用向けのカートリッジに捕捉され、このカートリッジは内蔵型である。
【００５３】
抽出された核酸の使用：本実施形態に記載の綿プロトコルを用いて抽出された核酸は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ可能な状態であることができる。記載された綿プロトコルの他の用途は、保管、保存、さらなる生化学的および分子生物学的使用などのための、臨床試料からの核酸の回収に関するものである。抽出された核酸は、時には当業者が発見する任意の生化学的または分子生物学的用途に用いることができる。
【００５４】
核酸抽出に好適な形態の綿の使用：本実施形態は、遠心分離機または他の回転装置のような最小限の設備条件で綿を用いて、核酸を「ＰＣＲ可能な形態」で抽出することができる。綿は、試料の分量、試料の性質および試料の起源に応じて、核酸抽出に好適な任意の形態で充填することができる。核酸は、溶液またはエマルジョン中に得られたものであることが好ましく、これは、記載された溶解システム、結合システム、洗浄システムおよび溶出システムに従って処理される。したがって、綿の充填は、核酸抽出の重要な部分であり、綿が核酸を含む溶液と接触するようになり得る性質はいずれも、本開示の一部とみなされる。図１〜図３は、綿を充填することができるいくつかの方法を示しているが、それは、決して限定とみなされるべきではない。簡単に言うと、綿は、核酸を含む溶液が綿と接触するようになるか、または綿が液体と接触するように充填され、本開示の一部とみなされる。
【００５５】
別の実施形態では、綿は、プラスチック製の改良型１ｍＬ  ピペットチップ、プラスチック製の改良型２ｍＬ  ピペットチップ、１５ｍＬ  ファルコンチューブ、５０ｍＬ  ファルコンチューブ、１．５ｍＬ  エッペンドルフチューブ、２ｍＬ  エッペンドルフチューブ、５ｍＬ  ホウケイ酸ガラス試験管、４ｍＬ  スクリューキャップ式プラスチックバイアル、３ｍＬ  プラスチック製パスツールピペット、ガラス製パスツールピペット、ゴム球付きのガラス製パスツールピペット、ゴム球付きのプラスチック製パスツールピペット、ゴムとプラスチックの成型物が球として付いたガラスピペット、プラスチックキャップ付きの２ｍＬ  ガラスバイアル、使い捨てのオートクレーブ済み１０ｍＬ  プラスチック注射器、５ｍＬ  注射器に取り付けられたプラスチック成型物、５０ｍＬ  注射器に取り付けられた使い捨てユニットなどの中に充填することができる。綿は綿棒として作製することもでき、この棒は、手製または機械製であることができる。ビスコースと、任意の綿混合ポリマー（１〜１００％）、または化学的もしくは物理的に修飾された綿（１〜１００％）とでできた、図３［ｅ］に示す綿棒は、本開示の一部とみなされる。
【００５６】
臨床試料を保存するための綿の使用：綿を試料に直接曝露させて、吸収剤とすることができ、綿は、試料を安全な形態で安定化し、保存する。安全な形態は、添加された試料の核酸内容物がそれほど分解されない手段と定義される。結合は、可逆的な様式であることができ、その場合、核酸は、本実施形態に記載の核酸抽出プロトコルを用いて抽出することができる。綿には、場合により、試料および試料成分の安定性を向上させる安定化剤を埋め込むことができる。場合により、綿には、酵素もしくは化学物質、または本プロトコルで報告された溶解バッファー、もしくはプロテイナーゼＫを含む溶解バッファー、もしくは安定化するバッファー塩を加えたプロテイナーゼＫを埋め込むことができる。綿は、ＥＤＴＡ処理、アジ化ナトリウム処理、塩基処理、酸処理、溶解バッファー処理、蜂蜜処理、任意の抗菌剤処理、任意の抗微生物剤処理、任意の抗ウイルス化合物処理するか、またはＥＤＴＡとアジ化ナトリウム、抗菌剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、抗凝固剤、当技術水準で公知の臨床試料の安定化剤、蜂蜜、もしくはこれらの任意の組合せで処理することができる。保存するために綿に添加される試料の容量は、任意の容量であることができるが、実際的には、それは、１μＬ〜２０ｍＬであることができ、使用される綿の分量は、任意の量であることができ、実際的には、それは、１ｍｇ〜１０グラムであることができる。試料を回収するとき、それは、溶解バッファーが浸透した綿の上で行なうことができ、これも本開示の一部とみなされる。
【００５７】
核酸抽出用の綿充填システムの使用方法：綿を、本実施形態に記載の報告された核酸抽出プロトコルを用いて、図１〜図３に例示する装置に充填した。綿を、本実施形態に記載の溶解システム、結合システム、洗浄システムおよび溶出システムと相互作用させる機構は、加熱、振盪、ボルテックス処理、撹拌、持続的な運動、ピペッティング、または固体と液体を相互作用させる任意の他の手段であることができる。本質的には、核酸を含む液体が、綿繊維と接触するようになる。
【００５８】
別の実施形態では、本方法は、文献に報告されている最も簡単でかつ最も融通性が高い核酸抽出プロトコルの１つである。ほとんど全ての文献法は、内容物をスピンダウンするための遠心分離機、もしくは磁気粒子をそのままの位置に保持するための磁石、または両方を必要とし、本実施形態で報告された方法は、遠心分離機または磁石の必要性を完全に排除する。既存の核酸プロトコルは、試料の容量に限度があるか、またはより大きい容量の試料に対して複数回の処理を必要とする。このプロトコルは、単一の使い捨て抽出システムを用いてほぼ全ての試料分量（実際上は、１μＬ〜２０ｍＬ）をほぼ同じ時間で処理することができる。本方法は、さらなる特徴付け、およびＰＣＲ、シークエンシングまたはブロッティングなどの下流の処理にすぐに用いることができる核酸を生じさせる。このシステムは、その単純さのために、文献に報告されたものとしては初めて、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）または既定の実験室検査に等しく適したものになっている。
【００５９】
本実施形態に記載の綿プロトコルは、遠心分離機の使用の排除、ユーザー間の最小限のばらつき、シリカプロトコルに匹敵する効率、任意の既存の核酸プロトコルと比較した使い易さ、任意の試料分量を処理する能力、核酸の適切な回収、低力価試料を採取する能力、自動化のし易さ、既定の病院環境とポイント・オブ・ケア設定の両方への適合性、ならびに核酸の回収および品質における高い一貫性のような顕著な特色を有する。
【００６０】
別の実施形態では、本開示に記載された方法は、綿のような繊維性材料を用いて、ＰＣＲまたは逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）またはシークエンシングまたはブロッティングが可能なフォーマットで生物学的起源のほとんど全ての臨床試料または分析試料から核酸を抽出する。この手順は、溶解、綿への核酸の結合、水溶液による核酸が結合した綿の洗浄、およびＫＣｌのような塩を含むバッファー中での核酸の溶出を含む。シリカまたは非シリカプロトコルにおける典型的な溶解バッファーは、血液中の鉄に結合する、ＥＤＴＡ（キレート剤）のような、いくつかの四塩基性または二塩基性イオンを含む。報告された本プロトコルでは、全ての核酸が選択的に綿に結合する環境を作り出すために、高濃度のＥＤＴＡ（１０〜３００ｍＭ）を添加する。通常、マトリックス（シリカまたは非シリカ）への結合を可能にするために、溶解バッファーのｐＨを６に合わせる。その場合、タンパク質および他の成分の大半は、中性または正の電荷を有するのに対し、核酸は依然として負の電荷を有し、マトリックスと相互作用する。現在のシステムでは、結合ｐＨは、塩基性（ｐＨ８〜１１）であるべきであり、負電荷を有する過剰なＥＤＴＡ（１０〜３００ｍＭ）それ自体がバッファーとして働き、ｐＨを約８に至らせる。本発明者らのプロトコルは、核酸を溶解させ、塩基性ｐＨでマトリックスに結合させることができる初めてのプロトコルである。結合バッファーは、水、３〜１１の範囲のｐＨを有する任意の水性バッファー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ、１〜３０％）もしくはグリセロール（１〜３０％）もしくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ、１〜３０％）もしくはエチレングリコール（１〜５０％）もしくはプロピレングリコール（１〜５０％）もしくは任意の水溶性アルコールもしくは上記のものの任意の組合せを含有する水であることができる。結合バッファーは、溶解バッファー塩の希釈を保証し、ＥＤＴＡが豊富な雰囲気中での核酸の結合を増強し、かつ溶解した粒子を可溶化することができる。報告したプロトコルは、様々なｐＨを有する広範なバッファーに耐えて結合することができ、結合バッファーのｐＨまたは組成にとても融通性があることも文献では初めてである。長い試料処理時間、試料容量に対する限度および核酸の定量の実現不可能性は、ＦＴＡカードに付随する欠点であるが、これは、本実施形態で報告した、綿を用いる核酸抽出プロトコルでは存在しない。最後に、報告されている文献プロトコルは全て、室温または場合により、高温で水性バッファーまたは水中で溶出を行ない、本発明者らの核酸洗浄は室温で水を用いて、溶出は高温（５０〜９９℃）で行なう。本実施形態で定義したプロトコルおよびマトリックスを用いて、高温脱イオン水によって、結合した核酸の全てが溶出されるわけではなく、バッファーもしくは塩またはそれらの組合せの存在が絶対に必要である。このことも、結合した核酸を高温脱イオン水中でマトリックスから溶出させることができる文献の核酸抽出プロトコルとは全く対照的である（シリカプロトコルと非シリカプロトコルは両方とも、核酸の高温水溶出を可能にする）。溶出バッファーはｐＨ８〜１０の間のどこかであることができるが、これは、溶出ｐＨに融通性があり、ＫＣｌのような、相当な濃度の塩が、結合した核酸の綿からの効率的な溶出に好ましいことを示している。
【００６１】
別の実施形態では、下記の方法において、綿および他の綿ベースの繊維性材料を、綿からの核酸溶出に特有の、特別な溶解、結合、洗浄および溶出条件下での核酸の定量的抽出に用いた。本開示は、一態様では、綿を用いる、任意の環境源、臨床源、細菌源、真菌源、および動物源からの迅速な核酸単離システムを提供する。試料は、細胞ライセート、体液、植物、組織、および細菌細胞と細胞のライセートであることができる。綿およびビスコースは、それぞれ、所与の条件下で核酸に結合することが分かった天然におよび人工的に得られる繊維性材料である。綿上での核酸結合および核酸の選択的保持ならびに特定の溶出条件下での核酸の放出の過程をＤＮＡおよびＲＮＡにより例示する。
【００６２】
別の実施形態では、血液のような臨床試料からの典型的なＤＮＡ抽出において、血液を、グアニジンチオシアネート、ＥＤＴＡ、トリスのようなバッファー、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような洗剤から構成され、任意に尿素、ポリオール、グループＩＡ陽イオンを含有する一価塩および／またはグループＩＩＡ陽イオンを含有する二価塩、ならびにプロテイナーゼＫのようなタンパク質切断酵素を含む溶解バッファーで溶解させた。グアニジンチオシアネートの濃度は、０．１〜７Ｍのどこかであることができる。グアニジンチオシアネートは、いくつかの用途では、塩酸グアニジンと置き換えることができ、その濃度も、１〜６Ｍと様々に異なり得る。尿素はタンパク質を変性させるために用いられ、それは、グアニジン塩の機能を補完し、０〜７Ｍと様々に異なり得る。通常、文献に報告されている血液の溶解プロトコルのほとんどは、２０ｍＭの範囲のＥＤＴＡを含む。本発明者らの溶解バッファーは、綿への効率的な核酸結合のために、１０〜３００ｍＭの範囲、好ましくは約１００ｍＭ範囲のかなり大量のＥＤＴＡに耐えることができる。ＥＤＴＡ濃度は、ＲＮＡおよびＰＮＡのような他の核酸に対して操作することができるが、一般に、より高濃度のＥＤＴＡは、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲにおけるサイクル時間（Ｃｔ）およびシグナル強度を改善するのに役立つことが分かった。かなり高濃度のＥＤＴＡは、（血液の場合）ヘモグロビン中に存在する鉄を捕捉するのに役立ち、任意のＤＮアーゼ活性を防止し、かつ核酸が綿に結合することができる負電荷の強い雰囲気を生成する。その重要な側面は、バッファー中の顕著により高濃度のＥＤＴＡの添加がバッファーのｐＨを塩基性にすることであり、本発明者らの知る限り、本実施形態は、マトリックスへの核酸結合を塩基性条件下で行なう初めての例である。重要なことに、極めて酸性のｐＨでは、ＥＤＴＡが溶解バッファーから沈殿する可能性があるので、溶液の結合ｐＨは、綿への核酸結合を可能にするために塩基性でなければならず、したがって、結合には、８を上回るｐＨが好ましい。塩化マグネシウムは、ＲＮアーゼ活性を失活させるために、通常、より高濃度で用いられるため、核酸溶解プロトコルでは、それを用いることができる。トリスは、溶解に選択されるバッファーであり、本発明者らは、０〜１００ｍＭを用いることができ、通常、約２０ｍＭが最適であることを見出した。溶解または結合バッファーにおけるポリオールの使用は、プロテイナーゼＫの活性を増大させ、かつ切断されたタンパク質の溶解度を高めることができる。溶解バッファー中のポリオールのパーセンテージは、０〜３０％（ｖ／ｖ）であることができる。これらのバッファーは全て、脱イオン水中で作製し、ＲＮＡ用途については、水をＤＥＰＣで処理し、オートクレーブすることができた。プロテイナーゼＫ溶解は、血液、喀痰、唾液などについては、上記の溶解バッファーの添加の前に行なうことができ、また、尿、汗などについては、溶解バッファーとともに行なうことができる。プロテイナーゼＫ処理は、記載した溶解バッファー中で効果があることが分かった。そのため、この処理は、溶解バッファー添加の前であることができるし、または核酸を含む任���の種類の臨床試料については、溶解バッファーと一緒にすることができる。
【００６３】
別の実施形態では、溶解後に添加すると、核酸の綿との結合を開始させる結合バッファーは、組成に関して非常に融通性があることが分かった。結合バッファーは、水を添加するだけで、溶解バッファー中の塩の濃度を希釈するのに十分であるほど融通性があり、核酸の綿への良好な結合が認められた。溶解時または結合バッファーの添加後に相互作用するように綿を入れることができる。結合バッファー組成物は、５〜１２、好ましくは７〜１０の範囲の任意のｐＨであることができる。血液、喀痰または唾液のような複雑な試料の場合、結合バッファーは、あるパーセンテージの、ＰＥＧ、グリセロール、ＰＰＧ、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのような、ポリオール化合物を有することができる。エタノールまたは水性エタノールのような（シリカベースの核酸システムに）従来用いられている結合溶液は、綿に対する核酸の結合親和性を低下させることが分かった。すなわち、結合工程におけるエタノールの存在は、綿への核酸結合の効率を低下させることが分かった。
【００６４】
別の実施形態では、洗浄バッファーは、非核酸成分を綿から選択的に洗い落とす溶液である。臨床試料が血液の場合、結合後、綿は褐色になり、色を取り除くためには、あるパーセンテージのエタノールを含む洗浄バッファー（洗浄バッファー１と呼ぶ）が役立つことが分かった。具体的には、最初の洗浄を、１０〜９０％、好ましくは３０〜７０％、より好ましくは５０％エタノールを含むバッファーまたは水を用いて行なった。メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＰＧ、エチレングリコール、プロピレングリコールまたは任意の他の水溶性アルコールは、洗浄溶液中のエタノールに取って代わることができる。一価または二価の陽イオンがその組成として洗浄バッファー１とともに存在する洗浄バッファー２を用いることができる。洗浄バッファー１と２が同じ組成を有し、水、アルコールおよび一価または二価の陽イオンから構成され得ることも可能である。綿を洗浄バッファーで洗浄する回数は、０〜１０回、理想的には１〜３回の範囲であることができる。その後の洗浄は、通常、脱イオン水によるものであり、洗浄回数は、１〜１０回、好ましくは２から５回、より好ましくは３〜５回であることができる。洗浄工程で用いる脱イオン水は、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ不含水、またはミリＱ水もしくは濾過水もしくは水道水もしくは地下水に置き換えることができる。
【００６５】
別の実施形態では、綿からの核酸の溶出は、任意の水性バッファーを用いて行なうことができる。バッファー濃度は、溶出バッファー中１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭ、より好ましくは３０〜７０ｍＭである必要がある。当技術水準で公知のバッファーとしては、ｐＨ５〜１２の範囲、好ましくは７〜１０の範囲、より好ましくは８〜１０の範囲のビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、エタノールアミン、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミン、ピペリジンなどが挙げられるが、これらは高温条件下での綿からの核酸の溶出に有効である。綿からの核酸溶出は、５０〜１００℃、好ましくは７０〜９５℃、より好ましくは約８５℃の高温で行なわれる必要がある。
【００６６】
別の実施形態では、精製した核酸は、１０〜１００％の純度であることができ、通常、ＰＣＲ可能である。核酸の純度は、溶解バッファー、結合バッファー、洗浄バッファーおよび溶出バッファーと、精製用のマトリックス（綿または綿誘導体または綿混合材料）の最適な組合せによって決まる。本発明者らは、ＦＴＡカードもしくはセルロース結合粒子、またはセルロース濾紙は、これらのバッファー組合せの下では、効率的でないことを認め、綿が、核酸との相互作用に関して、他の形態のセルロースとは異なることを示した。関連した方法では、本開示は、以下の一般的なプロトコルを用いて、綿または綿誘導体または綿混合材料を固体マトリックスとして用いて核酸を含む試料から核酸を単離するための手段を提供する。
ａ）核酸を含む試料を溶解バッファーに添加した。溶解バッファーは、グアニジンチオシアネート、ＥＤＴＡ、トリス、洗剤から構成され、任意に尿素、ポリオール、グループＩＡ陽イオンを含有する一価塩および／またはグループＩＩＡ陽イオンを含有する二価塩、ならびにプロテイナーゼＫを含む。核酸試料と溶解バッファーを混合し、５０〜９５℃で１〜２０分間加熱した。
ｂ）結合バッファーを上記の溶液に添加する。結合バッファーは、水、ｐＨ４〜１１のバッファー、またはポリオールを含む溶液であることができる。結合バッファーの容量は、溶解バッファーの容量の０．１〜１０倍であることができる。
ｃ）上記の溶液を、好ましくは、室温で数秒間から数分間、綿と相互作用させた。
ｄ）その後、綿を、水性アルコールまたは水のみから構成される洗浄バッファーで特に洗浄した（最初の洗浄）。
ｅ）その後、残存アルコールが綿から除去されるまで、上記の綿を水またはバッファーで洗浄した。
ｆ）核酸を、ＫＣｌのような塩（グループＩＡもしくはグループＩＩＡ陽イオンを含む塩）から構成されるバッファーおよび／またはビシン様バッファーを用いて溶出させた。溶出された核酸は、通常、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることが可能である。
【００６７】
本開示で用いられる方法と従来技術で用いられる方法の比較説明を提供する以下の表を援用して、本開示をさらに説明する。この表は、核酸の単離に対して用いられる方法の特徴付けに用いられる様々な方法に関する重要な態様のいくつかを比較するものである。
【表１】
2013516186.tif 000002
【００６８】
本開示の技術を、以下の実施例を援用して、さらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例を、本開示の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【００６９】
一般的な方法論：核酸含有溶液を、好ましくは室温で、綿と接触させ、非核酸成分を、水性アルコールおよび水から構成される一連の洗浄液を用いて綿から洗い落とした。綿から得た核酸を、塩から構成される水性バッファーを用いて高温で溶出させた。溶出した核酸は、さらなる処理、またはＰＣＲが可能である。以下の実施例は、研究室で一般に用いられる１ｍＬピペットチップに充填した綿について示される。しかし、当業者であれば、綿を、液体がそれに接触する機会がある任意の形態で充填することができることを認識し得る。本質的に、入口と出口とを備え、その間に綿を充填することができるものはどれも、本開示の一部であるとみなされる。
【００７０】
実施例１：血液からのＤＮＡ抽出
ａ）５０μＬの血液を７５μＬの溶解バッファー（３０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）８ｍｇの綿を充填したプラスチック製の１ｍＬスポイト（図２［ａ］に示すような、綿スポイト）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿スポイトを各２ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）および洗浄バッファー２（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％  エタノール）で洗浄した。
ｅ）綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７１】
実施例２：血液からのＤＮＡ抽出
ａ）１００μＬの血液を１５０μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）３００μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した成形した１ｍＬピペットチップ（図３［ｃ］に示すような、綿チップ）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）および２ｍＬの洗浄バッファー２（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で洗浄した。
ｅ）綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を２００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７２】
実施例３：血液からのＤＮＡ抽出
ａ）１００μＬのマラリア（熱帯熱マラリア原虫（ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））寄生虫含有血液を１５０μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）３００μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した成形した１ｍＬピペットチップ（図３［ｃ］に示すような、綿チップ）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）で洗浄した。
ｅ）綿チップを２ｍＬの洗浄バッファー２（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で洗浄した。
ｆ）綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｇ）核酸を２００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７３】
実施例４：血液からのＲＮＡ抽出
ａ）５０μＬのチクングンヤ陽性血液を７５μＬの溶解バッファー（３０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した１ｍＬピペットチップを上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を２００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７４】
実施例５：唾液からのＤＮＡ抽出
ａ）５０μＬの唾液を１００μＬの溶解バッファー（１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）２５０μＬの結合バッファー（水中の１０％グリセロール）を上記の溶液に添加した。
ｃ）綿を充填した成形した１ｍＬピペットチップ（図３［ｃ］に示すような、綿チップ）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを３ｍＬの洗浄バッファー１（２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）各洗浄時に液体を３回ピペッティングすることにより、綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を２５０μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７５】
実施例６：血液からのＲＮＡ抽出
ａ）１００μＬのチクングンヤ陽性血液を１５０μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）３００μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した成形した１ｍＬピペットチップ（図３［ｃ］に示すような、綿チップ）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）および２ｍＬの洗浄バッファー２（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿チップを水（２×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７６】
実施例７：血液からのＲＮＡ抽出
ａ）５０μＬのチクングンヤ陽性血液を７５μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、８０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を５５℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を７０℃で２分間加熱した。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ８０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した２．５ｍＬの注射器（図１［ａ］に示すような、綿注射器）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）および２ｍＬの洗浄バッファー２（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿注射器を水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７７】
実施例８：喀痰からのＤＮＡ抽出
ａ）１００μＬの喀痰を１５０μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で５分間放置しておいた。その後、この溶液を７５℃で２分間加熱した。
ｂ）３００μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した５ｍＬベローズピペット（図２［ｂ］に示すような、綿ベローズ）を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）および洗浄バッファー２（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿ベローズを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  トリシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７８】
実施例９：血清からのＤＮＡ抽出
ａ）５０μＬの血清を７５μＬの溶解バッファー（６０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した成形した１ｍＬピペットチップ（図３［ｃ］に示すような、綿チップ）を綿と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを１ｍＬの洗浄バッファー１（５０％エタノール）および２ｍＬの洗浄バッファー２（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を２００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００７９】
実施例１０：血清からのＲＮＡ抽出
ａ）１００μＬのチクングンヤ陽性血清を１５０μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で２分間加熱した。
ｂ）３００μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を充填した成形した１ｍＬピペットチップ（図３［ｃ］に示すような、綿チップ）を綿と相互作用させた。
ｄ）その後、綿チップを３ｍＬの洗浄バッファー１（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿チップを水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を２００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００８０】
実施例１１：喀痰からのＤＮＡ抽出
ａ）５０μＬの喀痰を１５０μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．５）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を８５℃で６分間加熱した。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿を３ｍＬの洗浄バッファー１（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿を水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００８１】
実施例１２：喀痰からのＤＮＡ抽出
ａ）５０μＬの喀痰を７５μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．５）に添加した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で５分間放置しておいた。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿を３ｍＬの洗浄バッファー１（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿を水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００８２】
実施例１３：組織からのＲＮＡ抽出
ａ）５０μＬの狂犬病陽性組織を１７５μＬの溶解バッファー（４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍグアニジンチオシアネート、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．５）に添加し、７分間ボルテックス処理し、上清をチューブに移した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を７５℃で３分間加熱した。
ｂ）３５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）２０ｍｇの綿を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿を３ｍＬの洗浄バッファー１（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）綿を水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００８３】
実施例１４：血液からのＲＮＡ抽出
ａ）溶解バッファー、結合バッファー、洗浄バッファーおよび溶出バッファーをＤＥＰＣ水中で調製した。
ｂ）５０μＬのチクングンヤ血液を５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫおよび２５０μＬの溶解バッファー（５．６Ｍ  グアニジンチオシアネート、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に入れた。チューブを６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、このチューブを８０℃で２分間加熱した。
ｃ）１ｍＬの結合バッファー（１０％ＰＥＧ  ６０００）を上記の溶液に添加した。
ｄ）注射器レバーを前後に５回引くことによって、綿を充填した３ｍＬ注射器（図１［ａ］に示すような、綿注射器）を溶液と相互作用させた。
ｅ）その後、注射器レバーを前後に７回引くことによって、綿注射器を３ｍＬの洗浄バッファー１（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｆ）各洗浄時に、液体とともに注射器レバーを前後に３回引くことによって、綿注射器を水（３×２ｍＬ）で洗浄した。
ｇ）液体とともに注射器レバーを前後に２回引くことによって、核酸を２００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
ｈ）血液中に存在する核酸をＰＣＲ可能な形態で得た。プロトコル全体で約９分かかった。
【００８４】
実施例１５：ペプチド核酸（ＰＮＡ）抽出
ａ）５０μＬのＰＮＡ含有標準溶液を７５μＬの溶解バッファー（１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５．６Ｍの塩酸グアニジン、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス、０．０１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．５）に添加し、７分間ボルテックス処理し、上清をチューブに移した。得られた溶液を６０℃に加熱し、その温度で３分間放置しておいた。その後、この溶液を７５℃で３分間加熱した。
ｂ）１５０μＬの結合バッファー（０．１ｇ／ｍＬのＰＥＧ  ６０００を含む水）を上記の溶液に添加した。
ｃ）１０ｍｇの綿を上記の溶液と相互作用させた。
ｄ）その後、綿を３ｍＬの洗浄バッファー１（１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０％エタノール）で特に洗浄した。
ｅ）その後、綿を水（３×１ｍＬ）で洗浄した。
ｆ）タンパク質核酸を１００μＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  ビシン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．８）にて９５℃で溶出させた。
【００８５】
実施例１６：ＰＣＲ増幅
本開示のプロトコルで精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ試料を、ＰＣＲ増幅、次いで、ゲル電気泳動にかける。結果を図４、図５、図６、および図７に示す。図４は、ビスコース、市販のビスコース棒、１ｍｌピペットチップに充填された綿、市販のシリカカラムおよび綿棒を用いて単離および精製したＤＮＡ試料の比較バンドを提供する。同様に、図５は、様々なプロトコル、すなわち、１ｍＬピペットチップに充填した綿、２ｍＬ注射器に充填した綿、市販のシリカカラム、および分子量マーカーで精製したＤＮＡ試料の比較バンドを提供する。
【００８６】
また、図６は、様々なプロトコル、すなわち、分子量マーカー、市販のシリカプロトコル、１ｍＬピペットチップに充填した綿、ピペットチップに充填したＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ１濾紙およびＦＴＡカードプロトコルで精製したＤＮＡ試料の比較バンドを提供する。
【００８７】
さらに、図７は、様々なプロトコルで精製し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅させた３０ｃｔ  ＲＮＡ試料の比較バンドを提供する。これらのプロトコルでは、様々な綿マトリックス源、すなわち、脱脂綿、オートクレーブした綿、水酸化ナトリウムで洗浄した綿、塩酸で洗浄した綿および吸収綿が用いられた。
【００８８】
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、当業者には他の態様および実施形態が明らかであろう。本明細書に開示された様々な態様および実施形態は、説明のためのものであって、限定を意図するものではなく、その真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2013516186.tif 000003
【図２】
2013516186.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2013516186.tif 000008
【図７】
2013516186.tif 000009
【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年5月24日(2011.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から核酸を単離するための方法であって、前記方法が、
（ａ）塩基性ｐＨを有する溶解バッファーを核酸を含む前記試料に添加して、溶解溶液を得る工程；または
（ｂ）塩基性ｐＨを有する溶解バッファーを結合バッファーと組み合わせて前記試料に添加して、溶解溶液を得る工程；
（ｃ）結合バッファーを工程（ａ）の溶液に添加して、前記核酸を綿マトリックスに結合させるか、または工程（ｂ）の溶液を綿マトリックスに直接結合させる工程；および
（ｄ）前記マトリックスに結合した核酸を水で洗浄し、溶出させて、前記核酸を単離し、精製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が生物学的または非生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料が、血液、喀痰、血清、唾液または組織抽出物を含む群から選択され、かつ前記非生物学的試料が、化学合成したＰＮＡを含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶解バッファーが、グアニジンチオシアネート、塩酸グアニジン、ＥＤＴＡ、トリス、洗剤、ポリオール、グループＩＡ陽イオンを含有する一価塩もしくはグループＩＩＡ陽イオンを含有する二価塩、および任意に尿素を加えたタンパク質消化酵素、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択され、かつ前記溶解が、好ましくは、約８〜約１１の範囲のｐＨで行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＤＴＡが、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲、好ましくは約１００ｍＭの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グアニジンチオシアネートまたは前記塩酸グアニジンが、約０．１Ｍ〜約７Ｍの範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記尿素が、約０．０１Ｍ〜約７Ｍの範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記トリスが、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約２０ｍＭの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリオールが、約０．０１％〜約３０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０およびＴｗｅｅｎ２０またはこれらの任意の組合せを含む群から選択され、かつ前記タンパク質消化酵素がプロテイナーゼＫである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合バッファーが、任意にポリオールまたは非ポリオールを加えた水である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリオールが、ポリエチレングリコール、グリセロール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される水溶性ポリオール化合物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ポリオールが、メタノール、エタノール、プロパノールからなるアルコール、もしくは酸、アミン、アルコール、フェノール、アミドもしくはエステルの官能基を前記官能基の１つとして含む任意の水溶性液；またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄することおよび溶出させることが、それぞれ、洗浄バッファーおよび溶出バッファーを用いて行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記洗浄することが、約１％〜約９９％（ｖ／ｖ）、好ましくは約３０％〜約７０％（ｖ／ｖ）および任意に約５０％（ｖ／ｖ）の水性アルコールを含む洗浄バッファーによる第一の洗浄と、それに次ぐ、１００％の水を含む洗浄バッファーによる複数回の洗浄を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記水性アルコールが、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＰＧ、エチレングリコールおよびプロピレングリコールを含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記水が、脱イオン水、ＤＮアーゼ不含水、ＲＮアーゼ不含水、ミリＱ水、濾過水、水道水および地下水またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１および１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記洗浄バッファーが、約５〜約１２の範囲のｐＨを有する、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む群から選択される塩、またはビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミンおよびピペリジンを含む群から選択されるバッファーを任意に含むことができる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出バッファーが、約８〜約１１の範囲のｐＨを有するバッファーまたは塩とともに、約４５℃〜約９９℃の範囲の温度を有する温水を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記水が、脱イオン水、ＤＮアーゼ不含水、ＲＮアーゼ不含水、ミリＱ水、濾過水、水道水および地下水またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バッファーが、約５〜約１２の範囲のｐＨを有する、ビシン、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、リン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ピリジン、ピペラジン、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、エタノールアミンおよびピペリジンまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記塩が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度のＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記綿が、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、約１〜約１４の範囲のｐＨを有するバッファーで処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿および加工した綿を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
試料から核酸を単離するためのキットであって、前記キットが、綿マトリックスならびに好ましくは約８〜約１１の範囲のｐＨを有する溶解バッファー、結合バッファー、洗浄バッファーおよび溶出バッファーまたはこれらの任意の組合せを含む群から選択されるバッファーを含む、キット。
【請求項２６】
前記綿が、天然綿、脱脂綿、臨床等級の綿、市販の綿、綿紡糸、水で洗浄した綿、酸または塩基で洗浄した綿、オートクレーブした綿、約１〜約１４の範囲のｐＨを有するバッファーで処理した綿、塩溶液で処理した綿、有機溶媒で処理した綿、圧縮した綿および加工した綿を含む群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記バッファーが、請求項５〜１１に記載の溶解バッファー、請求項１２〜１４に記載の結合バッファー、請求項１５および１９に記載の洗浄バッファー、ならびに請求項１５および２０〜２３に記載の溶出バッファーを含む群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記試料が、生物学的または非生物学的試料を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記生物学的試料が、血液、喀痰、血清、唾液または組織抽出物を含む群から選択され、かつ前記非生物学的試料が、化学合成したＰＮＡを含む群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【国際調査報告】
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