(57)【要約】  本発明は、癌の病因に関わらず、様々なタイプの癌患者における疾病状態および治療反応を観察するのに有用な、致死性細胞を同定および検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供する。【選択図】図２Ａ
2013504039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
致死性細胞の存在を被験者において検出する方法であって、該方法は、
前記被験者から生物学的試料を採取し、
前記試料において、ＢＭＤＳＣ内におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現特性を決定することを含み、
前記ＢＭＤＳＣ内におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積により、前記致死性細胞の存在が示唆される検出方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現は、該ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのタンパク質レベルを評価することによって決定する方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、前記ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αタンパク質の発現は、該ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用した免疫測定法により決定する方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、前記ＰＤＰＫ  ＦＡの異常な細胞内蓄積は、細胞質および細胞核の両方での発現レベルである方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、前記生物学的試料は、骨髄、末梢血、組織、腫瘍、腹水、または胸水である方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、前記ＢＭＤＳＣは、造血幹／前駆細胞および間葉幹／前駆細胞から成る群より選択される方法。
【請求項７】
癌患者の疾病状態および治療反応を観察する方法であって、該方法は、
前記被験者から生物学的試料を採取し、
前記試料中のＢＭＤＳＣ内におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現特性を決定することを含み、
前記ＢＭＤＳＣ内におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積により、前記癌患者の疾病状態および治療反応が予測される観察方法。
【請求項８】
請求項７の方法であって、前記治療反応は、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法などから成る群より選択される方法。
【請求項９】
請求項７の方法であって、前記癌患者は、膀胱、胸、脳、胆管、子宮頸部、結腸直腸、子宮内膜、食道、胃、肝臓、肺、上咽頭、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、および腎臓の癌、白血病、ならびにリンパ腫から成る群より選択される方法。
【請求項１０】
致死性細胞を生物学試料において検出するキットであって、
ＢＭＤＳＣ特異抗体、
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α特異抗体、および
補助試薬を含み、
前記ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのタンパク質発現レベルを評価することが可能なキット。
【請求項１１】
試験化合物を、致死性細胞を標的とした潜在的薬剤としてスクリーニングする方法であって、該方法は、
前記試験化合物を前記致死性細胞と接触させ、
前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定することを含み、
前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積の減少は、前記試験化合物が前記致死性細胞を標的とした潜在的薬剤であることを示唆しているスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、前記試験化合物は天然物の抽出物を含む方法。
【請求項１３】
請求項１１の方法であって、前記試験化合物は組み合わせ化学ライブラリーのメンバーを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の病因に関わらず、様々なタイプの癌患者における疾病状態および治療反応を観察するのに有用な、致死性細胞を同定および検出するための方法および組成物、ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇは２０００年（Ｃｅｌｌ、２０００、１００：５７−７０）に癌の特徴を列挙したが、従来の癌細胞の侵襲性行動に主に焦点を合わせたこの概念に基づく現在開発中の治療法は、過去５０年間癌患者を治療し得ないことがしばしばあった。最近の研究では、治療不可能な腫瘍、癌細胞、およびマーカーは、時に疾患の最終生成物に過ぎないこともあるという課題に取り組んできた。骨髄由来の幹／前駆細胞（ＢＭＤＳＣ）は、全身に散在しており、過剰創傷治癒と近似する腫瘍を発生させる間質へ様々な状態において継続的にリクルートされるという証拠が増加している。それは成長因子、ケモカイン、サイトカイン、および組織再生因子の一定の沈着を引き起こし、徐々に臓器微小環境を破壊し得る。結果的には臓器不全をもたらし、それと同時に宿主免疫抑制、抗アポトーシス、上皮組織の悪性形質転換、癌細胞の増殖、成長、浸潤、および転移拡散を促進する重大な段階につながる。しかしながら、治療不可能な癌の発症および進行において、線維芽細胞およびマクロファージなどの様々な種類の幹／前駆細胞および誘導体を含むＢＭＤＳＣの議論中かつ逆説的な役割は、現在の癌問題の解決において大きな課題のままである。（Ｂｉｎｇｌｅら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００２、１９６：２５４−２６５；Ｄｅ  ＷｅｖｅｒおよびＭａｒｅｅｌ、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００３、２００：４２９−４４７；ＣｏｎｄｅｅｌｉｓおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ｃｅｌｌ、２００６、１２４：２６３−２６６；ＤｉｒｅｋｚｅおよびＡｌｉｓｏｎ、Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、２００６、２４：１８９−１９５；Ｋａｐｌａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２００７、１３：７２−８１；Ｋａｒｎｏｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４９：５５７−５６３；Ｌｏｂｅｒｇら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、２００７、５７：２２５−２４１；Ｍａｓｓｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ、２００７、１３１：９９４−１００８；Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８、１８０：２０１１−２０１７；Ｃｈａｎｔｒａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎ、２００８、１：２３−３５；Ｇｅｒｍａｎｏら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２００８、４３：３７４−３７９；Ｌａｉｒｄら、Ｃｅｌｌ、２００８、１３２：６１２−６３０；Ｌｅ  ＢｉｔｏｕｘおよびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００８、１３０：１０７９−１０９０；Ｔａｋａｉｓｈｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２８７６−２８８２；ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｅｈｌｏｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００９、９：１−１９；Ｇｏｎｄａら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、２００９、８：２００５−２０１３；ＪｏｙｃｅおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、９：２３９−２５２；Ｍｉｓｈｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９、６９：１２５５−１２５８；ＰｓａｉｌａおよびＬｙｄｅｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、９：２８５−２９３）。過去５０年間、従来の癌細胞に主に焦点を合わせた従前の分子腫瘍学研究の他に、細胞腫瘍学および臨床腫瘍学の研究、より詳細には全身腫瘍学の研究が同時に強調されるべく取り組まれてきた。
【０００３】
プロリン指向性プロテインキナーゼＦＡ（ＰＤＰＫ  ＦＡ）／グリコーゲンシンターゼキナーゼ３α（ＧＳＫ−３α）は、当初、特定のタンパク質ホスファターゼ活性化因子Ａとして同定された（Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７６８−１１７７４；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７５９−１１７６７；Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９０、９：２４３１−２４３８）。本研究所では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αを、論争中である様々な種類の癌細胞の抗アポトーシス、抗分化、腫瘍形成、浸潤および化学療法剤耐性と関連する多基質／多機能ＰＤＰＫとしてさらに特徴付けた（Ｌｅｅら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９５、５８：４７４−４８０；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９５、５９：１４３−１５０；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９６、６１：２３８−２４５；Ｈｓｕら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８２：１４８０−１４８４；Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８９：１００４−１０１１；Ｙａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２０００、６：１０２４−１０３０；Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９２：１７５３−１７５８；Ｈｓｕら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９１：６５０−６５３；Ｃｈｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：１８４０−１８４７；Ｈｓｕｅｈら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：７７５−７８３；ＦｕおよびＹａｎｇ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００４、２４：１４８９−１４９４；Ｙａｎｇ、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００４、４：５９１−５９６；Ｙａｎｇ、Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ、２００５、１８：４３２−４３６；Ｈｓｕら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００６、２４：３７８０−３７８８）。残念ながら、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに関する以前の研究は、上述したように従来の癌細胞または前癌細胞に主として焦点を合わせた現在の主流の癌研究に主に関連したものであった。したがって、癌におけるこの信号伝達分子の影響は、未だ評価されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｎｇｌｅら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００２、１９６：２５４−２６５
【非特許文献２】Ｄｅ  ＷｅｖｅｒおよびＭａｒｅｅｌ、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００３、２００：４２９−４４７
【非特許文献３】ＣｏｎｄｅｅｌｉｓおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ｃｅｌｌ、２００６、１２４：２６３−２６６
【非特許文献４】ＤｉｒｅｋｚｅおよびＡｌｉｓｏｎ、Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、２００６、２４：１８９−１９５
【非特許文献５】Ｋａｐｌａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２００７、１３：７２−８１
【非特許文献６】Ｋａｒｎｏｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４９：５５７−５６３
【非特許文献７】Ｌｏｂｅｒｇら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、２００７、５７：２２５−２４１
【非特許文献８】Ｍａｓｓｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ、２００７、１３１：９９４−１００８
【非特許文献９】Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８、１８０：２０１１−２０１７
【非特許文献１０】Ｃｈａｎｔｒａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎ、２００８、１：２３−３５
【非特許文献１１】Ｇｅｒｍａｎｏら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２００８、４３：３７４−３７９
【非特許文献１２】Ｌａｉｒｄら、Ｃｅｌｌ、２００８、１３２：６１２−６３０
【非特許文献１３】Ｌｅ  ＢｉｔｏｕｘおよびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００８、１３０：１０７９−１０９０
【非特許文献１４】Ｔａｋａｉｓｈｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２８７６−２８８２
【非特許文献１５】ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｅｈｌｏｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００９、９：１−１９
【非特許文献１６】Ｇｏｎｄａら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、２００９、８：２００５−２０１３
【非特許文献１７】ＪｏｙｃｅおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、９：２３９−２５２
【非特許文献１８】Ｍｉｓｈｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９、６９：１２５５−１２５８
【非特許文献１９】ＰｓａｉｌａおよびＬｙｄｅｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、９：２８５−２９３
【非特許文献２０】Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７６８−１１７７４
【非特許文献２１】Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７５９−１１７６７
【非特許文献２２】Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９０、９：２４３１−２４３８
【非特許文献２３】Ｌｅｅら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９５、５８：４７４−４８０
【非特許文献２４】Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９５、５９：１４３−１５０
【非特許文献２５】Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９６、６１：２３８−２４５
【非特許文献２６】Ｈｓｕら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８２：１４８０−１４８４
【非特許文献２７】Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８９：１００４−１０１１
【非特許文献２８】Ｙａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２０００、６：１０２４−１０３０
【非特許文献２９】Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９２：１７５３−１７５８
【非特許文献３０】Ｈｓｕら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９１：６５０−６５３
【非特許文献３１】Ｃｈｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：１８４０−１８４７
【非特許文献３２】Ｈｓｕｅｈら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：７７５−７８３
【非特許文献３３】ＦｕおよびＹａｎｇ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００４、２４：１４８９−１４９４
【非特許文献３４】Ｙａｎｇ、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００４、４：５９１−５９６
【非特許文献３５】Ｙａｎｇ、Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ、２００５、１８：４３２−４３６
【非特許文献３６】Ｈｓｕら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００６、２４：３７８０−３７８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した従来の癌細胞に主として焦点を合わせた主流の癌研究に主に関連するＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αにおける以前の研究とは対照的に、本発明は、特に骨髄由来の幹／前駆細胞（ＢＭＤＳＣ）における信号伝達ＰＤＰＫの役割を調査することにある。骨髄由来の幹／前駆細胞（ＢＭＤＳＣ）は、上述したように過剰創傷治癒と近似する腫瘍を発生させる間質にリクルートされて存在し得る。このような新規手法を使用することによって、ＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な発現が、様々な重要臓器に関連する各種腫瘍の疾病状態および治療反応の観察、ならびに疾患が治療可能か治療不可能かの決定において、決定因子かつ指令因子の役割を担っていることが立証された。癌患者はＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な発現と関連する場合、疾患の病因に関わらず、治療可能範囲を逸する傾向にある。したがって、ＢＭＤＳＣがＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な発現と関連する場合、本発明において「致死性細胞」と総称する。従来の癌細胞に関する以前の研究とは対照的に、本発明は、癌の予防および治療のための一般的応用に向けた、新規に記載の侵襲性細胞である致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供する。例えば、早期癌患者は致死性細胞と関連しない場合、局所切除によって治療可能である傾向にある。それとは対照的に、早期癌患者は致死性細胞と関連する場合、外科手術では治療不可能な傾向にある。したがって、本発明は、より積極的かつ適切な治療に対する医師の判断を支援するために、治療反応を観察する方法および組成物を提供する。本明細書において提供される致死的細胞は、骨髄の内因的欠陥に起因する全身的免疫抑制、感染症、閉塞症、塞栓症、および多臓器不全に関連した全身性脱制御や造血、止血、恒常性、および免疫システムの失調を、かなり早期に検出するのに有用である普遍的に応用可能な予測因子として表される。より詳細には、致死性細胞は様々なタイプの癌患者において、疾病状態および治療反応を観察するための信頼性のある予測因子である。その一方で、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αは、薬剤スクリーニングを標的とした最も強いかつ理想的な候補物質として示される必要は必ずしもないであろう。しかしながら、この信号伝達分子を新規のプローブとして使用することで、本発明は治療反応および癌の進行を観察することにおいて決定的役割を担う致死的細胞を、検出かつ単離するための方法および組成物を提供する。したがって、本発明において示される致死的細胞は単離されると、癌の病因に関わらず、各種ヒト癌におけるより効果的かつ包括的な予防および治療に向けた治療的薬剤スクリーニングおよび評価のために、プロテオミクスおよびゲノミクスの網羅的発現特性を確立する方法および組成物、ならびにその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本明細書における一態様では、致死性細胞を示す被験者の骨髄由来の幹／前駆細胞（ＢＭＤＳＣ）における細胞発現特性の存在を検出する方法を提供する。該方法は、前記被験者から生物学的試料を採取し、前記試料中のＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定することを含む。前記被験者のＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積により、致死性細胞の存在が示唆される。いくつかの実施形態では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用した免疫測定法などによって、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのタンパク質レベルを測定して決定する。生物学的試料としては、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、または胸水を使用することが可能である。
【０００７】
本明細書における他の態様では、生物学的試料中の致死性細胞の存在を検出する診断キットを提供する。該キットは、前記試料中のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を検出するための少なくとも１つの試薬、および致死性細胞の存在を評価するための印刷指示書を含み、共に容器に梱包されている。さらなる検出試薬が含まれていても良い。
【０００８】
さらに、本明細書における他の態様では、癌の病因に関わらず、様々なタイプの癌患者における治療反応および疾患の進行を観察する方法を提供する。該方法は、前記被験者から生物学的試料を採取し、前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定することを含む。前記被験者におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積により、癌患者の疾病状態および治療反応が予測される。いくつかの実施形態では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用した免疫測定法などによって、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのタンパク質レベルを測定して決定する。生物学的試料としては、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、または胸水を使用することが可能である。
【０００９】
必要であれば、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現量の多い致死性細胞を検出するために、基本的にはＭｏｉｏｌｉら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、３：ｅ３９２２、２００８）により記載されている特異的磁性ビーズまたはフローセルソーターを用いて細胞を単離することも可能である。
【００１０】
さらに、本明細書における他の態様では、致死性細胞を標的にした潜在的薬剤として試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法は基本的に当業者に周知であり、かつ本発明の実施において使用される単離技術により致死性細胞を生物学的試料から採取し、試験化合物を生物学的試料と接触させ、かつ前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定することを含む。前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積の減少は、試験化合物が致死性細胞を標的とした潜在的薬剤であることを示唆している。いくつかの実施形態では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用する免疫測定法などによって、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのタンパク質レベルを測定して決定する。生物学的試料としては、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、胸水、または細胞株を使用可能である。試験化合物は天然物または組み合わせ化学ライブラリーのメンバーにおける抽出物を含む。
【００１１】
本発明の上記かつ他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と共に以下の詳細な説明を読むことによってさらに十分に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者が彼らの骨髄において致死性細胞と関連する場合、肺炎の進行および／または骨髄移植不全を有する傾向があることを示している（Ａ、Ｂ）。逆に、ＡＭＬ患者は致死性細胞と関連しない場合、治療または骨髄移植の後に良好な転帰を有する傾向がある（Ｃ）。
【図２Ａ】図２Ａは、致死性細胞に関連する肺癌患者の無病生存率（Ａ）を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、致死性細胞に関連する肺癌患者の全生存率（Ｂ）を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、致死性細胞に関連する全病期（Ａ）肺癌患者の無病生存率を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、致死性細胞に関連する全病期（Ｂ）肺癌患者の全生存率を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、致死性細胞に関連する第Ｉ期（Ｃ）における肺癌患者の無病生存率を示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、致死性細胞に関連する第Ｉ期（Ｄ）における肺癌患者の全生存率を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、致死性細胞に関連する様々なタイプの癌患者における無病生存率（Ａ）を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、致死性細胞に関連する様々なタイプの癌患者における全生存率（Ｂ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示を明確にするために、本発明の詳細な説明を以下のように細別して行うが、それにより限定されるものではない。
【００１４】
Ａ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味に用いられる。本明細書において参照される全ての特許、出願、公開出願およびその他の刊行物、ならびにＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、その全体が参照により援用される。この節に記載の定義が、本明細書において参照により援用される特許、出願、公開出願およびその他の刊行物に記載の定義に反しているかまたは一致しない場合には、この節に記載の定義は本明細書において参照により援用される定義よりも優先される。
【００１５】
本明細書において使用される「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１以上」を意味する。
【００１６】
本明細書において使用される用語「ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α」は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３αとしても知られている、多基質／多機能プロリン指向性プロテインキナーゼＦＡを指す（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９０、９：２４３１−２４３８；Ｙａｎｇ、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００４、４：５９１−５９６）。該タンパク質に対するＧｅｎＢａｎｋ登録番号はＡＡＤ１１９８６およびＡＡＨ２７９８４である。
【００１７】
本明細書において使用される「生物学的試料」とは、生物学的起源であるあらゆる試料を指し、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、または胸水が挙げられる。
【００１８】
本明細書において使用される用語「抗体」は、抗原エピトープに特異的に結合するよう必要な可変領域配列を含む単離または組換えの結合物質を指す。従って、抗体は所望の生物学的活性を示す、例えば標的の特異抗原に結合する、あらゆる抗体またはそのフラグメントである。したがって、最も広義の意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性、例えば、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的に結合する限り、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ディアボディ、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびにこれらに限定されるものではないが、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２などの抗体フラグメントを網羅する。
【００１９】
本明細書において使用される用語「致死性細胞」は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積に関連するＢＭＤＳＣを指す。
【００２０】
別に指示されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本技術分野および本発明の実施において使用されるもの、当業者の知識内である生化学および臨床病理の従来技術におけるものと同じ意味を有する。
【００２１】
Ｂ．致死性細胞を検出する方法およびキット、ならびにその使用
一態様では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積に関連するＢＭＤＳＣは、致死性細胞を同定および検出するための手段を提供する。他の態様では、生物学的試料における致死性細胞の同定は、癌の病因に関わらず、様々なタイプの癌患者における治療反応および疾病状態を観察するのに有用である。
【００２２】
従って、一態様において、本明細書では、致死性細胞を示す被験者において細胞発現特性の存在を検出する方法を提供する。該方法は、前記被験者から生物学的試料を採取し、前記試料におけるＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定することを含み、前記被験者におけるＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積は、致死性細胞の存在を示唆している。いくつかの実施形態では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用する免疫測定法などによりＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αタンパク質レベルを測定して決定する。生物学的試料としては、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、または胸水を使用することが可能である。
【００２３】
他の態様において、本明細書では、生物学的試料中の致死性細胞の存在を検出するキットを提供する。該キットは、前記試料におけるＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定するための少なくとも１つの試薬および印刷指示書を含み、共に容器に梱包されている。
【００２４】
他の態様において、本明細書では、致死性細胞を標的にした潜在的薬剤として試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法は基本的に当業者に周知であり、かつ本発明の実施において使用される単離技術によって致死性細胞を生物学的試料から採取し、試験化合物を生物学的試料と接触させ、かつ前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現を決定することを含む。前記試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常な細胞内蓄積の減少は、試験化合物が致死性細胞を標的とする潜在的薬剤であることを示唆している。いくつかの実施形態では、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用する免疫測定法などによって、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αタンパク質レベルを測定して決定する。生物学的試料としては、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、胸水、または細胞株を使用できる。試験化合物は天然物または組合せ化学ライブラリーメンバーの抽出物を含む。
【００２５】
ＢＭＤＳＣ内におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常発現の検出には、あらゆる適した方法が用いられ得る。発現は生物学的試料からのＢＭＤＳＣ内におけるタンパク質レベルを評価して決定することが可能である。例えば、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を使用する免疫測定法を使用し得る。適した方法としては、限定されるものではないが、免疫組織化学的分析、免疫細胞化学的分析、およびフローサイトメトリー分析が挙げられる。免疫組織化学的染色法では、細胞試料を、通常、脱水固定により調製し、続いて結合した遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させる。標識剤は、通常、視覚的に検出可能な、酵素標識、蛍光標識、発光標識などである。
【００２６】
１つの実施形態によれば、組織試料を被験者から採取し、該試料を包埋後、例えば、３〜５μｍに薄切し、従来の標本化技術に従って固定、標本化、および乾燥する。固定化剤はホルマリンを含み得る。標本を作製するための包埋剤は、例えば、パラフィンを含んでいてもよい。試料をこの状態で保存することが可能である。脱パラフィンおよび脱水の後、試料をＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αに特異的な抗体を含む免疫試薬と接触させる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含み得る。抗体は完全抗体、またはＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αタンパク質に特異的に結合可能なそのフラグメントを含み得る。好適なポリクローナル抗血清またはその他の抗体は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αタンパク質、またはその適したフラグメントで好適な宿主動物に免疫を与えることによって調製し、本技術分野の当業者に周知の従来技術に従って、抗血清を採取、および精製し得る。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αと特異的に反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、本技術分野で周知の方法により作製し得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。また、組換え抗体は、限定されるものではないが、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載の方法を含む、本技術分野で周知の方法によって製造され得るか、または市販品であってもよい。
【００２７】
抗体は、直接的または間接的に適当な検出可能な標識を担持する。あるいは、検出可能な標識は、例えば、第１抗体に結合する抗ウサギＩｇＧヤギ抗体などの第２抗体に結合させてもよい。多くの場合、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能な信号を供給する物質に共有または非共有的に結合して標識される。適した標識としては、限定されるものではないが、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などが挙げられる。
【００２８】
生物学的試料は任意の適した方法により被験者から採取可能である。生物学的試料としては、骨髄、血液、組織、腫瘍、腹水、または胸水を使用することが可能である。
【００２９】
癌の病因に関わらず、様々なタイプの癌患者における治療反応および疾病状態を観察するキットは、本明細書において定義されるＢＭＤＳＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α発現の決定において有用な少なくとも１つの試薬、および生物学的試料中のＢＭＤＳＣに致死性細胞が含有されているかどうかを評価するための印刷指示書を収納するサイズの少なくとも１つの容器を含み得る。本明細書において使用される用語「試薬」は、限定されるものではないが、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの抗体、分析用の緩衝液および担体を含む、本明細書において提供されるあらゆる方法を実施するのに有用なあらゆる化合物、組成物、または生物学的試薬（すなわち、試料、一定量または「用量」の細胞、抗体など）を意味する。
【００３０】
Ｃ．実施形態
具体的な実施形態において別に指示されない限り、全ての免疫組織化学的分析、免疫表現型分析、免疫細胞化学的分析、および統計的分析は、下記の方法に従った。
【００３１】
抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α特異抗体の産生、同定および特性解析。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのカルボキシル末端領域のアミノ酸配列４７１位から４８３位に対応するペプチドＱＳＴＤＡＴＰＴＬＴＮＳＳを、ペプチド合成機（９０５０型、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ社、マサチューセッツ州ベドフォード所在）を用いて合成した。架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用するＲｅｉｃｈｌｉｎ（１９８０）に記載の手順に従い、ペプチドの牛血清アルブミンへの結合を促進するためにシステイン残基をＮＨ２末端に追加した。親和性精製を行った抗体産物は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αのＣ−末端ペプチドであるアミノ酸４７１−４８３によりブロックされ得ることが認められ、この抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α抗体の免疫特異性が実証された。
【００３２】
免疫組織化学的分析。腫瘍細胞が最大の大きさを示した腫瘍を含むホルマリン固定パラフィン包埋組織の組織切片（５μｍ）をキシレン中で脱蝋し、段階的濃度のエタノール中で再水和した。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素でブロックした後、牛血清アルブミンで５分間ブロッキングした。次いで、スライドをｐＨ７．４の０．０５Ｍトリス緩衝液で希釈した抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α抗体（２μｇ／ｍＬ）と４℃で１６時間インキュベートした。その後、超エンハンサー（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］、非ビオチン検出システム、［ＢｉｏＧｅｎｅｘ社、カリフォルニア州サン・ラモン所在］）と室温で２０分間インキュベートし、続いて高分子−ＨＲＰ（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］）標識剤とさらに３０分間インキュベートした。最後に、ＤＡＢ（３−３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）で免疫染色すると、赤色から茶色になった。酵素反応を終了させた後、スライドをＤＳ−エンハンサー（Ｚｙｍｅｄ社、カリフォルニア州サンフランシスコ所在）中、室温で５分間インキュベートして、２つの染色系の相互作用を阻止した。その後、スライドをＣＤ３４抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、スライドを抗マウスアルカリホスファターゼと室温で３０分間インキュベートした。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を結合した抗体を可視化するために使用すると、青色になった。切片はメチルグリーン溶液で対比染色すると、緑色になった。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αとＣＤ３４との細胞共染色では、紫色から黒色を呈す。
【００３３】
免疫細胞化学的分析。細胞をポリリシンコートスライド上で７００ｒｐｍ、室温で３分間細胞遠心分離する（Ｋｕｂｏｔａ  ５２００、日本）。染色前、細胞スポットを３．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．２％トリトンＸ−１００で９０秒間処理する。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素でブロックした後、牛血清アルブミンで１０分間ブロッキングする。スライドをｐＨ７．４の０．０５Ｍトリス緩衝液で希釈した抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３α抗体（２μｇ／ｍＬ）と４℃で１６時間インキュベートした後、超エンハンサー（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］、非ビオチン検出システム、［ＢｉｏＧｅｎｅｘ社、カリフォルニア州サン・ラモン所在］）と室温で２０分インキュベートし、続いて高分子−ＨＲＰ（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］）標識剤とさらに３０分間インキュベートする。最後に、ＤＡＢ（３−３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）で免疫染色すると、赤色から茶色になった。酵素反応を終了させた後、スライドをＤＳ−エンハンサー（Ｚｙｍｅｄ社、カリフォルニア州サンフランシスコ所在）中、室温で５分間インキュベートして、２つの染色系の相互作用を阻止した。その後、スライドをＣＤ３４抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、スライドを抗マウスアルカリホスファターゼと室温で３０分間インキュベートした。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を結合抗体を可視化するために使用すると、青色になった。切片はメチルグリーン溶液で対比染色すると、緑色になった。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αとＣＤ３４との細胞共染色では、紫色から黒色を呈す。
【００３４】
統計的分析。統計的分析では、試料を致死性細胞が存在するグループと存在しないグループに分けた。全生存率は診断の日時から死亡または最後の追跡調査の日時までで計算した。無病生存率は診断の日時から再発、転移、死亡、または最後の追跡調査の日時までで測定した。カプラン・マイヤー法を用いて生存確率を決定し、対数順位検定を用いてグループ間の生存曲線を比較した。コックス比例ハザード回帰モデルにより影響を分析した。ロジスティック回帰を用いて治療反応における致死性細胞の存在によるリスクを計算した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとした。
【００３５】
本研究は、台湾国立科学委員会の承認を受けた調査プロジェクトおよび助成金の元に行われ、インフォームド・コンセントおよび協会の監視および倫理委員会により承認されている。
【００３６】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
積極的治療を施した後でのＢＭＤＳＣ内におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常発現と予後不良の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者との関連性。
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常発現は、疾患が進行しているＡＭＬ患者の骨髄において頻繁に検出することが可能である。免疫表現型分析により、ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞はほとんど存在せず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常細胞内蓄積と関連するＢＭＤＳＣと称されるＣＤ３４−間葉幹／前駆細胞（Ｍｏｉｏｌｉら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２００８、３：ｅ３９２２）（図１ＡおよびＢ）が、予後不良のＡＭＬ患者の骨髄において頻繁に検出され得る。このようなタイプの患者の７５％超は、積極的治療を施した後でさえ死亡した。それとは極めて対照的に、骨髄においてこのような種類のＢＭＤＳＣが存在しない（図１Ｃ）８０％を超えるＡＭＬ患者は治癒した。したがって、ＢＭＤＳＣがＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３αの異常細胞内蓄積と関連する場合、本発明の本文を通してＢＭＤＳＣを「致死性細胞」と総称した。初期の独立コホート研究によって、図１ＡおよびＢに示されるようにＡＭＬ患者が致死性細胞と関連する場合、治療後に不良な転帰を有する傾向があることが明らかとなった。それとは極めて対照的に、図１Ｃに示されるようにＡＭＬ患者は致死性細胞と関連しない場合、治療後に良好な転帰を有する傾向がある。したがって、本発明は致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供する。
【実施例２】
【００３８】
肺癌患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
肺癌は世界的に癌に関連した最大の死亡原因である。最近の治療法の進歩にも関わらず、肺癌患者の予後は未だ満足のいくものではない。患者の大多数は疾患を再発し、完全な腫瘍の切除後でさえ、結局は転移疾患により死亡する。これまでのところ、肺癌の腫瘍−結節−転移病期分類システムは、予後を予測するための指針として広く使用されている。しかしながら、同じ病期の肺癌患者、特に疾患の早期にある患者の予後は多様であり、各患者のための適切な治療法を確立するための計画はまだ考案されていない。したがって、最も不良転帰の危険性が高い同じ病期の範囲にある患者間でサブグループを同定するために、腫瘍の進行および転移に影響を及ぼし、かつ生物学的機能に関与するより信頼性のあるバイオマーカーを追求すべきである。
【００３９】
１５６人の肺癌患者が致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１にまとめた。２３歳から８２歳（平均６２歳）の年齢範囲の１５６人の研究対象患者（男性１００人および女性５６人）のうちで、平均腫瘍サイズは３．９±２．３ｃｍ（平均±ＳＤ；中央値、３ｃｍ）であった。７２人の患者（４６．２％）は喫煙歴があった。組織型に関しては、１１７人の患者（７５．０％）が腺癌、３６人の患者（２３．１％）が扁平上皮癌、および３人の患者（１．９％）が大細胞癌であった。分化の程度は、４２人の患者（２６．９％）を高分化、６５人の患者（４１．７％）を中分化、および４９人の患者（３１．４％）を低分化に段階付けた。病理学的Ｔ病期は、５０人の患者（３２．１％）をＴ１、５９人の患者（３７．８％）をＴ２、３０人の患者（１９．２％）をＴ３、および１７人の患者（１０．９％）をＴ４とした。２９人の患者（１８．６％）はＮ１レベルのリンパ節転移、２１人の患者（１３．５％）はＮ２レベル、および１２人の患者（７．７％）はＮ３レベルにあった。その一方で、９４人の患者（６０．３％）はリンパ節転移していなかった。肺癌患者は、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期に、６９人の患者（４４．２％）、２３人の患者（１４．７％）、５５人の患者（３５．３％）、および９人の患者（５．８％）をそれぞれ分類した。１５６人の肺癌患者のうちで、５年無病生存率および全生存率は、それぞれ３６．６％および４５．３％であった。
肺癌患者特性
【００４０】
【表１】
2013504039.tif 000003
略語：ＣＥＡ、癌胎児性抗原；ｐＴ、病理学的Ｔ病期；ｐＮ、病理学的Ｎ病期
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００４１】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に肺癌に応用可能であることを示唆している。したがって、肺癌患者の疾病状態および治療反応の決定における「致死性細胞」の役割を評価するために、この代表的な研究対象集団を使用することを決定した。実施例１に記載した「致死性細胞」の予後的意義における単変量解析によって、肺癌患者は、腫瘍間質、および／または末梢血、および／または腹水、および／または胸水、および／または骨髄において致死性細胞と関連する場合、極めて不良な転帰を有する傾向があることが明らかとなった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では８．８％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では６８．４％であった（Ｐ＜０．００１、図２Ａ；表２）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では１５．０％であるのに対し、陰性患者では８０．３％であった（Ｐ＜０．００１、図２Ｂ；表２）。
１５６人の肺癌患者の無病生存率および全生存率に対する予後因子の単変量解析
【００４２】
【表２】
2013504039.tif 000004
略語：ＣＥＡ、癌胎児性抗原；腫瘍浸潤の深度（ｐＴ）、病理学的Ｔ病期；リンパ節転移（ｐＮ）、病理学的Ｎ病期；ＮＳ、統計的に有意ではない
＊対数順位検定。
【００４３】
致死性細胞の予後値のロバスト性を評価するために、コックス多変量比例ハザード回帰分析を実施し、交絡因子を制御するよう全変数を用いて無病生存率および全生存率に関連する危険性推定を導き出した。多変量解析（表３）は、致死性細胞およびリンパ節転移が、無病生存率および全生存率に対する唯一の２つの独立予後因子であることを示した。致死性細胞は、肺癌の進行および患者生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（無病生存率においてＨＲ  ５．５７５、９５％  ＣＩ  ３．５０２−８．８７５、Ｐ＜０．００１、および全生存率においてＨＲ  ８．１０６、９５％ＣＩ  ４．７４１−１３．８５９、Ｐ＜０．００１）。
１５６人の肺癌患者の無病生存率および全生存率に対する潜在的予後因子のコックス多変量回帰分析
【００４４】
【表３】
2013504039.tif 000005
略語：ＨＲ、ハザード比、９５％ＣＩ、９５％信頼区間
【００４５】
さらに、９２人の早期患者のうち、３７人の患者（４０．２％）は致死性細胞を示し、良好な転帰を有し得なかった（図３ＡおよびＢ）。致死性細胞を有する早期患者は、致死性細胞を有さない早期患者と比較して、６倍を超える再発の危険性および１１倍を超える死亡の危険性を有していた（無病生存率においてＨＲ６．２０２、９５％ＣＩ  ３．２７８−１１．７３４、および全生存率においてＨＲ１１．１１２、９５％ＣＩ  ４．８５４−２５．４４０、Ｐ＜０．００１；表４）。より具体的には、６９人の第Ｉ期の患者のうち、４６人の患者（６６．７％）は致死性細胞を有しておらず、非常に良好な転帰を有していた。それとは極めて対照的に、残りの２３人の第Ｉ期の患者（３３．３％）は致死性細胞を示し、良好な転帰を有し得なかった（図３ＣおよびＤ）。第Ｉ期の肺癌患者は致死性細胞と関連する場合、同じ第Ｉ期の肺癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者と比較して、７．５倍を超える再発の危険性および１０．５倍を超える死亡の危険性を有していた（無病生存率においてＨＲ  ７．７３６、９５％ＣＩ  ３．５９６−１６．６４３、Ｐ＜０．００１、および全生存率においてＨＲ  １０．６８７、９５％ＣＩ  ４．２４７−２６．８９３；Ｐ＜０．００１）。致死性細胞と関連する場合の進行期の肺癌患者のハザード比は、さらに３５．２倍まで上昇した。詳細な結果を表４に示した。
１５６人の肺癌患者の無病生存率および全生存率に対する致死性細胞および独立予後因子のコックス回帰分析
【００４６】
【表４】
2013504039.tif 000006
略語：ＬＮ、リンパ節転移；ＨＲ、ハザード比、９５％ＣＩ、９５％信頼区間
【００４７】
興味深いことに、術後補助療法を受けた７４人の患者においても、致死性細胞は患者の転帰に著しく関与していた。補助療法に反応して、致死性細胞を有さない肺癌患者はより良好な転帰を有し、致死性細胞を有する患者は大多数が明らかに不良な転帰を有していた。５年生存率は、陽性患者では１２．０％であるのに対し、陰性患者では５４．２％であった（Ｐ＜０．００１）。ロジスティック回帰が適用されると、致死性細胞は単変量解析において補助療法反応の最も潜在的な予後予測因子であることが分かった（表５）。多変量解析は、致死性細胞（Ｐ＝０．００２）および病期（Ｐ＝０．０２４）は、補助療法反応の独立予後予測因子であることを示した（表５）。肺癌患者における致死性細胞は、補助療法反応の最も強い独立予後指標であることがさらに同定された（ＯＲ  １７．５３２、９５％ＣＩ  ２．９７７−１０３．１３３、Ｐ＝０．００２；表５）。
７４人の肺癌患者の補助療法反応における潜在的予後因子および予測因子としての致死性細胞のロジスティック回帰分析
【００４８】
【表５】
2013504039.tif 000007
略語；ＡＣ、腺癌；ＬＣＣ、大細胞癌；ＳＣＣ、扁平上皮癌；腫瘍浸潤の深度（ｐＴ）、病理学的Ｔ病期；ＬＮ状態（ｐＮ）、リンパ節転移（病理学的Ｎ）病期；ＯＲ、オッズ比；９５％ＣＩ、９５％信頼区間；ＮＳ、統計的に有意ではない
【００４９】
３０％を超える第Ｉ期の肺癌患者は致死性細胞と関連し、治癒的切除および／または全身補助療法の後でさえも乏しい治療反応および好ましくない転帰を有することが分かった。その一方で、比較的大集団の進行期肺癌患者は致死性細胞と関連し、かつ外科手術後および全身補助療法の後でさえも極めて好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向があることが分かった。致死性細胞は、全病期における肺癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は肺癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの肺癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する肺癌患者の治療において、従来型の侵襲性肺癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例３】
【００５０】
胃癌患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
胃癌は世界的に癌に関連した主な死亡原因の１つである。外科手術における技術の進歩および補助療法の使用にも関わらず、疾患の予後には憂鬱さが残る。患者の半分以上は治癒的切除を受けても、手術後数年のうちに時として全身転移を経験し得る。腫瘍−結節−転移病期分類システムに含まれる腫瘍浸潤の深度およびリンパ節転移は、予後を予測するための指針として広く使用されている。しかしながら、同じ病期の患者の予後は多様である。予後不良は効果的な救助治療法を欠いているために起こる。治療の指針として疾患の自然経過を予測し得る新たな生物学的マーカーを確立することが早急に必要とされている。
【００５１】
本研究は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有する全部で１４６人の胃癌患者を含むものであった（表６）。研究対象患者の臨床病理学的特性を表６にまとめた。２５歳から８６歳（平均６１．４歳）の年齢範囲の１４６人の研究対象患者（男性９４人および女性５２人）のうちで、平均腫瘍サイズは４．５±２．７（平均±ＳＤ、中央値、４．０）であった。腫瘍は２０人の患者（１４％）において噴門部、４８人の患者（３３％）において胃体部、および７８人の患者（５３％）において幽門部に位置していた。リンパ管浸潤およびリンパ節転移は、それぞれ７６人の患者（５２％）および８１人の患者（５５％）において発見された。腫瘍細胞は、２５人の患者（１７％）において粘膜（ｐＴ１）、３０人の患者（２１％）において筋固有層または漿膜下組織（ｐＴ２）、８３人の患者（５７％）において漿膜（ｐＴ３）、および８人の患者（５％）において隣接臓器（ｐＴ４）に浸潤していた。胃癌患者は、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期に、４５人の患者（３１％）、２５人の患者（１７％）、５８人の患者（４０％）、および１８人の患者（１２％）をそれぞれ分類した。ローレン分類に基づく組織型は、４８人の患者（３３％）においてびまん型、７６人の患者（５２％）において腸型、および２２人の患者（１２％）において混合型であった。使用された外科手術法は、４４人の患者（３０％）において胃全摘術、９６人の患者（６６％）において胃亜全摘術、および６人の患者（４％）において噴門側胃切除術であった。術後の補助化学療法を４４人の患者（３０％）において実施した。５年の無病生存率および全生存率は、それぞれ４７．７％および５３．０％であった。
胃癌患者特性
【００５２】
【表６】
2013504039.tif 000008
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００５３】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に胃癌に応用可能であることを示唆している。したがって、胃癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、胃癌患者は致死性細胞と関連する場合、極めて不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では１８．６％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では７４．７％であった（Ｐ＜０．００１）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では２０．６％であるのに対し、陰性患者では８２．７％であった（Ｐ＜０．００１）。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）、リンパ管浸潤（Ｐ＜０．００１）、および漿膜浸潤（Ｐ＝０．００１）は、無病生存率の独立予後因子であることが示された。全生存率に関しては、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）、リンパ管浸潤（Ｐ＝０．００２）、および漿膜浸潤（Ｐ＝０．００２）が独立予後因子であった。致死性細胞は、胃癌の進行および患者生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（無病生存率において、ＨＲ  ３．７４０、９５％ＣＩ  ２．１２４−６．５８７、Ｐ＜０．００１、および全生存率において、ＨＲ  ５．４０９、９５％ＣＩ  ２．８５８−１０．２３８、Ｐ＜０．００１）。
【００５４】
病期などのいくつかの因子は、以前の研究において予後因子として立証されてきた。しかしながら、同じ臨床病理学的病期の予後は、多様である。したがって、予後の不確定性を解決することに関心が高まっている。（表７）。７６人の進行期胃癌患者のうち、５０人の患者（６５．８％）も致死性細胞を示し、非常に不良な予後を有していた（５年無病生存率は１０．０％、および５年全生存率は１０．６％；Ｐ＜０．００１）。それとは極めて対照的に、７０人の早期患者のうち、２０人の患者（２８．６％）が意外にも致死性細胞を示し、かつ良好な転帰を有し得なかった（５年無病生存率は４０．０％、および５年全生存率は４５．０％；Ｐ＜０．００１）。致死性細胞を有する早期胃癌患者は致死性細胞を有さない早期患者と比較して、９倍を超える再発の危険性、かつ１６倍を超える死亡の危険性を有していた（無病生存率においてＨＲ  ９．６１２、９５％ＣＩ  ３．４１９−２７．０２１、および全生存率においてＨＲ  １６．５４０、９５％ＣＩ  ４．７０３−５８．１７１；Ｐ＜０．００１）。致死性細胞と関連する場合の進行期の胃癌患者のハザード比は、４０倍を超えるまでに上昇した。より詳細には、カプラン・マイヤー生存曲線および対数順位検定によって決定するところ、５年無病生存率は、早期胃癌患者が致死性細胞と関連する場合、同じ早期胃癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者の９２．０％からわずか４０．０％にまで劇的に低下した（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、進行期胃癌患者が致死性細胞と関連する場合、わずか１０．０％にまでさらに劇的に低下した。詳細な結果を表７にまとめた。
１４６人の胃癌患者の無病生存率よび全生存率に対する致死性細胞および病期のカプラン・マイヤーおよびコックス回帰分析
【００５５】
【表７】
2013504039.tif 000009
略語：ＨＲ、ハザード比、９５％ＣＩ、９５％信頼区間
＊対数順位検定
【００５６】
興味深いことに、術後補助化学療法を受けた４４人の患者においても、致死性細胞は患者の転帰に著しく関与していた。補助化学療法に反応して、致死性細胞を有さない胃癌患者はより良好な転帰を有し、致死性細胞を有する患者は大多数が明らかに不良な転帰を有していた。５年生存率は、陽性患者では１２．５％であるのに対し、陰性患者では５０．０％であった（Ｐ＜０．００１）。ロジスティック回帰が適用されると、胃癌患者における致死性細胞は単変量解析および多変量解析の両方において、補助療法反応の最も強い独立予後指標としてさらに同定された（生存率に対するＯＲ  ３４．５７５、９５％ＣＩ  ２．８４１−４２０．８３５、Ｐ＝０．００５）。
【００５７】
致死性細胞は、全病期における胃癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は胃癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの胃癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する胃癌患者の治療において、従来型の侵襲性胃癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例４】
【００５８】
乳癌患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
乳癌は女性の間で最もよく見られる癌であり、かつ癌による死亡原因の第２位である。患者の管理は現在のところ、臨床および病理学的特徴に基づいている。しかしながら、それらは疾患の多様性を部分的にのみ反映している。５０％を超える不良な転帰を有する患者は、従来の予後マーカーでは同定不可能である。実際、約３分の１のリンパ節転移陰性患者、および６０％のリンパ節転移陽性患者は、全身再発を経験している。文献では、いくつかのバイオマーカーが乳癌の予後において重要であることが示唆されている。しかしながら、補助療法が必要ない低リスクの患者、および全身再燃に対する高リスクのグループに対して、これらの因子は正確な予測のために十分ではない。個々の患者における進行の危険性を正確に予測することは不可能であるため、８０％を超える乳癌患者は補助療法を受けているが、ごく一部のみが該療法から利益を得ることが可能である。したがって、疾患の進行に対する低リスクおよび高リスクのグループの同定を助けるため、かつどの患者が補助療法から利益を得ることが可能であるかを決定するために、より感度の高い予後予測因子が早急に必要とされている。それにより、癌専門医は個々の患者に治療計画を調整し、同時に患者の生活の質を維持することも可能である。
【００５９】
１６７人の乳癌患者が致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表８にまとめた。２７歳から８０歳（平均４９．１歳）の年齢範囲の１６７人の研究対象患者（全て女性）のうちで、平均腫瘍サイズは３．６±２．１（平均±ＳＤ；中央値、３．０ｃｍ）であった。腫瘍は、４４人の患者（２６％）において組織学的グレード１、７２人の患者（４３％）においてグレード２、および５１人の患者（３１％）においてグレード３であった。１１８人の患者（７１％）はリンパ節転移していた。癌患者は、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期に、２１人の患者（１３％）、７５人の患者（４５％）、６５人の患者（３９％）、および６人の患者（３％）をそれぞれ分類した。ＰＲ陽性が７０人の患者（４２％）において検出され、一方で、ＥＲ陽性が９４人の患者（５６％）において検出された。追跡調査期間の間、３０人の患者（１８％）は局所領域の再発を経験し、かつ５５人の患者（３０．５％）は遠隔転移を経験した。１６７人の乳癌患者の５年生存率は、７７．２％であった。
乳癌患者特性
【００６０】
【表８】
2013504039.tif 000010
略語：ＰＲ、プロゲステロン受容体；ＥＲ、エストロゲン受容体
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００６１】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に乳癌に応用可能であることを示唆している。したがって、乳癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、乳癌患者は致死性細胞と関連する場合、極めて不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年生存率は、致死性細胞を有する患者では５４．２％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では８６．６％であった（Ｐ＜０．００１）。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）、リンパ節転移（Ｐ＝０．０１６）、腫瘍サイズ（Ｐ＜０．００１）、およびＥＲ状態（Ｐ＝０．００５）は、独立予後因子であることが示された。致死性細胞は乳癌患者の生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（ＨＲ  ６．０３３、９５％ＣＩ  ３．３２４−１０．９５０、Ｐ＜０．００１）。
【００６２】
さらに、９６人の早期乳癌患者のうち、７３人の患者（７６．０％）も致死性細胞を有しておらず、非常に良好な転帰を有していた（５年全生存は９４．５％；Ｐ＜０．００１）。それとはきわめて対照的に、残りの２３人の早期患者（２４．０％）は意外にも致死性細胞を示し、良好な転帰を有し得なかった（全生存率は６５．２％；Ｐ＜０．００１）。同様に、７５人の第ＩＩ期の患者のうち、５６人の患者（７４．７％）も致死性細胞を有さず、非常に良好な転帰を有していた（５年全生存率は９４．６％；Ｐ＜０．００１）。それとは極めて対照的に、残りの１９人の第ＩＩ期の患者（２５．３％）は致死性細胞を示し、良好な転帰を有し得なかった（５年全生存率は５７．９％；Ｐ＜０．００１）。
【００６３】
早期乳癌患者は致死性細胞と関連する場合、同じ早期乳癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者と比較して、１３．５倍を超える死亡の危険性を有していた（ＨＲ  １３．９４８、９５％ＣＩ  ５．０４７−５６．５４８；Ｐ＜０．００１）。致死性細胞と関連する場合の進行期乳癌患者のハザード比は、コックスハザード回帰分析によって決定されるところ、１９．４３４までも上昇した（９５％ＣＩ  ７．２１０−５２．３１９；Ｐ＜０．００１）。より詳細には、第ＩＩ期の乳癌患者は致死性細胞と関連する場合、同じ第ＩＩ期の乳癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者と比較して、１７倍を超える死亡の危険性を有していた（ＨＲ  １７．０７６、９５％ＣＩ  ５．５７３−５２．３１９；Ｐ＜０．００１）。多変量ロジスティック回帰分析によって、乳癌患者はいかなる致死性細胞とも関連しない場合、化学療法に反応した致死性細胞と関連する乳癌患者と比較すると、最大１３．１９５倍の生存オッズ比（９５％ＣＩ  ４．６７４−３１１．２４９；Ｐ＜０．００１）を有し、化学療法に反応して、最も強い独立した役割を維持していることがさらに明らかとなった。より詳細には、ロジスティック回帰分析によって決定されるところ、化学療法に反応して、いかなる致死性細胞も関連しない場合の第ＩＩ期の乳癌患者の生存オッズ比は、同じ第ＩＩ期の乳癌患者ではあるが致死性細胞を有する患者と比較して、最大２２．６８８倍まで上昇した（９５％ＣＩ  ４．８４１−１０６．３１５；Ｐ＜０．００１）。また、カプラン・マイヤー生存曲線および対数順位検定によって決定されるところ、５年生存率は、第ＩＩ期の乳癌患者が致死性細胞を有する場合、同じ第ＩＩ期の乳癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者の９１．９％と比較して、わずか４６．７％まで低下した。同様に、化学療法に反応して、いかなる致死性細胞とも関連しない場合の第ＩＩＩ期の乳癌患者の生存オッズ比は、同じ第ＩＩＩ期の乳癌患者ではあるが致死性細胞を有する患者と比較して最大５．８１５まで上昇し（９５％ＣＩ  １．７２２−１９．６３４）、致死性細胞を有する第ＩＩＩ期の乳癌患者の５年生存率は、７５％からわずか４７．４％まで低下した。
【００６４】
致死性細胞は、全病期における乳癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は乳癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの乳癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する乳癌患者の治療において、従来型の侵襲性乳癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例５】
【００６５】
前立腺癌患者は致死性細胞と関連する場合、好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
前立腺癌は、世界的に男性において最もよく見られる悪性腫瘍であり、かつ癌による死亡原因の第２位である。前立腺全摘出術（ＲＰ）または局所治療の放射線治療を含む潜在的治療法が使用可能であるにも関わらず、多くの患者が一次療法の後に疾病再発を経験する。臨床病期、グリーソングレード、および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルが予後因子として報告されており、かつヒト血清、尿、および精液における多数の分子マーカーが説明されてきた。しかしながら、前立腺癌は異種疾患として表され、個々の患者において悪性腫瘍と「無痛性」腫瘍との間を区別することが不可能であり、患者に積極的治療を行うべきかどうかの決定はいまだ困難なままである。したがって、各個人に対して適切な治療法を採用するために前立腺癌の侵襲性を予測することが早急に必要とされている。｛りんしょう びょうき｝
【００６６】
７９人の患者が致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表９にまとめた。４６歳から９５歳（平均７１歳）の年齢範囲の７９人の研究対象患者のうち、平均前処理ＰＳＡレベルは５０．６±７５．４ｎｇ／ｍＬ（平均±ＳＤ；中央値、２３．２ｎｇ／ｍＬ）であった。カットオフ値の７は、グリーソングレードの低および高の間を区別するために使用し、３６人の患者（４５．６％）および４３人の患者（５４．４％）においてそれぞれ見出した。患者は、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期に、９人の患者（１１．４％）、３６人の患者（４５．６％）、１０人の患者（１２．７％）、および２４人の患者（３０．４％）をそれぞれ分類した。診断材料を、５８人の患者（７３．４％）の原発性腫瘍、および２１人の患者（２６．６％）の再発性腫瘍から採取した。ＴＵＲＰを２１人の患者（２６．６％）の治療に使用し、ＴＵＲＰにさらに放射線治療、化学療法、およびホルモン療法を含む混合治療を３１人の患者（３９．２％）の治療に使用し、ＲＰを１３人の患者（１６．５％）の治療に使用し、かつＰＲにさらに放射線治療、化学療法、およびホルモン療法を含む混合治療を１４人の患者（１７．７％）の治療に使用した。追跡調査期間の間、３０人の患者（３８．０％）は疾病再発を経験した。７９人の前立腺癌患者の５年生存率は７７．０％であった。
前立腺癌患者特性
【００６７】
【表９】
2013504039.tif 000011
略語：ＰＳＡ、前立腺特異抗原；ＴＵＲＰ、経尿道的前立腺切除；ＲＰ、前立腺全摘出術
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００６８】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に前立腺癌に応用可能であることを示唆している。したがって、前立腺癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、前立腺癌患者は致死性細胞と関連する場合、不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年生存率は、致死性細胞を有する患者では６１．５％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では８６．２％であった（Ｐ＜０．００１）。致死性細胞は、経尿道的前立腺切除を受けた前立腺癌患者の生存率に対する最も強い独立予後指標としてさらに同定された（ＨＲ  ３．４８２、９５％ＣＩ  １．３４７−９．０００、Ｐ＝０．０１０）。
【００６９】
より詳細には、致死性細胞と関連している場合の早期前立腺癌患者の５年生存率は、９７．１％（致死性細胞を有さない早期患者）からわずか７２．７％まで劇的に低下した。同様に、致死性細胞と関連している場合の進行期前立腺癌患者の５年生存率は、７０．８％（致死性細胞を有さない進行期患者）からわずか４０．０％まで低下した（Ｐ＜０．００１；対数順位検定）。多変数コックス回帰分析によって、根治的前立腺全摘出術および／または放射線治療に反応して、致死性細胞を有する早期前立腺癌患者は、同じ早期前立腺癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者の６倍を超える不良な予後の危険性を有していること（ＨＲ６．１７８、９５％ＣＩ  １．４４５−１９．８３２；Ｐ＝０．０１３）がさらに確認された。致死性細胞と関連する場合の進行期前立腺癌患者のハザード比は、局所前立腺全摘出術、放射線治療、および全身補助療法に反応して、２４．３４０まで上昇した（９５％ＣＩ  ６．４１５−９２．３４９；Ｐ＜０．００１）。多変量ロジスティック回帰分析によって、陰性致死性細胞は全身補助療法を受けた４５人の患者の生存可能性の予測における最も強い独立予後予測因子としてさらに確立された（ＯＲ９．６００、９５％ＣＩ  １．５６６−５８．８６３；Ｐ＝０．０１５）。興味深いことに、致死性細胞および高ＰＳＡの両方と関連する前立腺癌患者は、致死性細胞を有さず、かつ低ＰＳＡを有するこれらの前立腺癌患者と比較して、２４倍を超える不良転帰の危険性を有していた。同様に、致死性細胞および高グリーソングレードの両方と関連する前立腺癌患者は、致死性細胞を有さず、かつ低グリーソングレードを有するこれらの前立腺癌患者と比較して、１８倍を超える不良転帰の危険性を有していた（ＨＲ１８．２１４、９５％ＣＩ  ３．８７２−８５．６９０；Ｐ＜０．００１）。
【００７０】
致死性細胞は、全病期における前立腺癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は前立腺癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的および適切な治療が、致死性細胞と関連するこれらの前立腺癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する前立腺癌患者の治療において、従来型の侵襲性前立腺癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例６】
【００７１】
早期子宮頸癌患者は致死性細胞と関連する場合、好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
子宮頸癌は世界的に女性の間で２番目に最もよく見られる悪性腫瘍である。パパニコロースミアスクリーニングプログラムの利用可能性の増加によって、その早期に疾患の診断が頻繁に行われている。外科手術が早期子宮頸癌患者のための治療の中心として表される。結節状態は補助療法のために重要であるが、それは臨床転帰を十分に説明しない。実際、リンパ節転移を有さない１０−１５％の患者は腫瘍を再発し、リンパ節転移を有する約半分の患者は補助療法後に治癒しない。治療抵抗および疾患の再発は、確実に予測されなければならない。したがって、再発の危険性における患者のサブグループを定義することを助けるため、かつ各患者に対する新たな治療計画を個々に調整するために、腫瘍の侵襲性に厳密に関連したより正確な予後バイオマーカーが必要とされている。
【００７２】
本研究は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有する全部で１４６人の早期子宮頸癌患者を含むものであった（表１０）。１４人の患者（９．６％）は第ＩＡ期疾患を有し、１１２人の患者（７６．７％）は第ＩＢ期を有し、かつ２０人の患者（１３．７％）は第ＩＩＡ期を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１０にまとめた。２２歳から８６歳（平均５０歳）の年齢範囲の１４６人の研究対象子宮頸癌患者のうちで、平均腫瘍サイズは２．４±１．４（平均±ＳＤ、中央値、２．０ｃｍ）であった。１２４の腫瘍（８４．９％）は扁平上皮癌であったが、１４の腫瘍（９．６％．）は腺癌、および８の腫瘍（５．５％）は腺扁平上皮組織型を示した。リンパ管およびリンパ節の転移は、４３人の患者（２９．５％）および２８人の患者（１９．２％）においてそれぞれ発見された。子宮頸癌試料における分化の程度は、５８人の患者（３９．７％）をグレード１、６０人の患者（４１．１％）をグレード２、および２８人の患者（１９．２％）をグレード３に段階付けた。５９人の患者（４０．４％）は術後に補助療法を受けた（４３人の患者は放射線療法を受け、１２人の患者は放射線療法および化学療法の両方を受け、および４人の患者は化学療法のみを受けた）。１４６人の子宮頸癌患者における５年の無病生存率および全生存率は、それぞれ７９．５％および８５．６％であった。
子宮頸癌患者特性
【００７３】
【表１０】
2013504039.tif 000012
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００７４】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に早期子宮頸癌に応用可能であることを示唆している。したがって、早期子宮頸癌患者の疾病状態および治療反応の決定において致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、早期子宮頸癌患者は致死性細胞と関連する場合、不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では４２．１％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では８４．５％であった（Ｐ＜０．００１）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では４１．２％であるのに対し、陰性患者では９１．５％であった（Ｐ＜０．００１）。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）およびリンパ節転移（Ｐ＜０．００１）は、無病生存率に対する独立予後因子であることが示された。全生存率に関しても、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）およびリンパ節転移（Ｐ＜０．００１）は、唯一の２つの独立予後因子であった。致死性細胞は、早期子宮頸癌の進行および患者生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（無病生存率において、ＨＲ  ８．５３３、９５％ＣＩ  ３．７９４−１９．１９０、Ｐ＜０．０１０、全生存率において、ＨＲ  ９．６７８、９５％ＣＩ  ３．９９７−２３．４３４、Ｐ＜０．００１）。
【００７５】
術後の補助療法を受けた５９人の患者のうちで、致死性細胞は患者の転帰と著しく関連していた。補助療法に反応して、致死性細胞を有さない早期子宮頸癌患者はより良好な転帰を有しており、致死性細胞を有する患者は明らかに不良な転帰を有していた。５年生存率は、致死性細胞を有する患者では１４．３％であるのに対し、致死性細胞を有さないこれらの患者では８０．８％であった（Ｐ＜０．００１）。ロジスティック回帰が適用されると、致死性細胞（Ｐ＝０．００８）、グレード（Ｐ＝０．０４５）、およびリンパ節転移（Ｐ＝０．０１５）は、単変量解析において治療反応の潜在的予後予測因子であった。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＝０．００６）およびリンパ節転移（Ｐ＝０．０３４）は、補助療法に反応する独立予後予測因子であることが示された。早期子宮頸癌における致死性細胞は、補助療法反応における最も強い独立予後指標であると同定された（ＯＲ  ３４．６３６、９５％ＣＩ  ２．７８６−４３０．５４３、Ｐ＝０．００６）。
【００７６】
致死性細胞は、子宮頸癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は子宮頸癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの早期子宮頸癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する早期子宮頸癌患者の治療において、従来型の侵襲性早期子宮頸癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例７】
【００７７】
結腸直腸癌患者は致死性細胞と関連する場合、好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
結腸直腸癌は世界で２番目に多い癌であり、癌に関連した死亡の３番目に多い原因である。結腸直腸癌の分子病態論に関する大きな進歩が達成されてきているにも関わらず、治療選択肢は未だ満足のいくものではない。診断による腫瘍病期は、未だ最も重要な予後の臨床病理学指標である。しかしながら、同じ病理学的病期を有する患者は、様々な生存転帰を示し得る。例えば、第ＩＩ−ＩＩＩ期の患者の予後決定における不正確さは、４０％にもなり得る。これは正しい補助療法プロトコルの選択において大変な困難をもたらし、多くの患者において過剰治療または過少治療ももたらし得る。したがって、転帰をより良く予測し、かつリスクに適合した治療のための新たな計画を保障する。
【００７８】
７４人の患者が致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１１にまとめた。２７歳から９７歳（平均６３歳）の年齢範囲の７４人の結腸直腸癌の研究対象患者（男性３７人おは、よび女性３７人）のうちで、平均腫瘍サイズは５．０±２．８ｃｍ（平均±ＳＤ；中央値、４．５ｃｍ）であり、腫瘍の原発部位は、５９人の患者（７９．７％）において結腸、および１５人の患者（２０．３％）において直腸と分類した。結腸直腸癌試料における分化の程度は、７人の患者（９．５％）を高分化、６１人の患者（８２．４％）を中分化、および６人の患者（８．１％）を低分化に段階付けた。癌患者は、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期に、９人の患者（１２．２％）、４０人の患者（５４．１％）、１８人の患者（２４．３％）、および７人の患者（９．５％）をそれぞれ分類した。浸潤の深度は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、およびＴ４に、２人の患者（２．７％）、８人の患者（１０．８％）、１３人の患者（１７．６％）、および５１人の患者（６８．９％）をそれぞれ評価して記録した。５０人の患者（６７．６％）は陽性病理学的Ｎ病期を有する一方で、２４人の患者（３２．４％）は陽性病理学的Ｎ病期を有していなかった。７４人の患者のうち３５人の患者（４７．３％）が補助療法を受けた。追跡調査の期限である２００５年までに、５０人の患者（６７．６％）は生存しており、２４人の患者（３２．４％）は病死した。７４人の結腸直腸癌患者の５年の無病生存率および全生存率は、それぞれ６７．５％および７０．２％であった。
結腸直腸癌患者特性
【００７９】
【表１１】
2013504039.tif 000013
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００８０】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に結腸直腸癌に応用可能であることを示唆している。したがって、結腸直腸癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、結腸直腸癌患者は致死性細胞と関連する場合、不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では４２．３％であるのに対し、陰性患者では８１．２％であった（Ｐ＜０．００１）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では４６．２％であるのに対し、陰性患者では８３．２％であった（Ｐ＜０．００１）。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＝０．００３）およびリンパ節転移（Ｐ＝０．０４０）は、無病生存率に対する独立予後因子であることが示された。また、全生存率についても、致死性細胞（Ｐ＝０．００５）およびリンパ節転移（Ｐ＝０．０２４）は、唯一の独立予後因子であった。致死性細胞は、結腸直腸癌の進行および患者生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（無病生存率において、ＨＲ  ４．２７９、９５％ＣＩ  １．６４７−１１．１１４、Ｐ＝０．００３、全生存率において、ＨＲ  ４．３０６、９５％ＣＩ  １．５５７−１１．９０９、Ｐ＝０．００５）。
【００８１】
より詳細には、第ＩＩ−ＩＩＩ期の結腸直腸癌患者は致死性細胞と関連する場合、補助化学療法の後に不良な転帰を有する傾向がある。カプラン・マイヤー生存曲線および対数順位検定によって決定されるところ、補助化学療法に反応して、５年生存率は致死性細胞を有する第ＩＩ−ＩＩＩ期の結腸直腸癌患者において、同じ第ＩＩ−ＩＩＩ期の結腸直腸癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者の７７．３％と比較すると、わずか３８．５％（Ｐ＜０．００１）まで低下した。ロジスティック回帰分析により、補助化学療法に反応して、いかなる致死性細胞も有さない第ＩＩ−ＩＩＩ期の結腸直腸癌患者の生存オッズ比は、同じ第ＩＩ−ＩＩＩ期の結腸直腸癌患者ではあるが致死性細胞を有する患者と比較して、最大５．４４０まで上昇することがさらに明らかになった（９５％ＣＩ  １．２１７−２４．３２１；Ｐ＝０．０２７）。
【００８２】
致死性細胞は、全病期における結腸直腸癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は結腸直腸癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的および適切な治療が、致死性細胞と関連するこれらの結腸直腸癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する結腸直腸癌患者の治療において、従来型の侵襲性結腸直腸癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例８】
【００８３】
膵臓癌患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
膵臓癌は癌による死亡原因の第４位であり、あらゆる固形癌の中で最も低い生存率を有する。それの遅い発見、急速な進行、ならびに化学療法および放射線療法に対する抵抗によって、膵臓癌は極めて致命的な新生物である。潜在的治癒切除を受けたこれらの患者において、５年生存率はわずか２０％である。その早期に診断を行うことは必ずしも容易ではないため、長年にわたる多数の調査により膵臓癌の正確なマーカーを発見するよう努められてきた。現在の標準血清マーカー、ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｌｅｗｉｓ（ａ）血液型抗原ＣＡ１９−９は、広く使用されているが、極めて悪性の挙動を有する患者を確実に区別することは不可能である。したがって、新規のスクリーニング、早期診断、および治療計画を開発するために、膵臓癌の分子的病因に対するより良い理解を促進し、かつ潜在的標的を提供するよう、多基質／多機能シグナル分子が大いに必要とされている。
【００８４】
本研究は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有する全部で７４人の膵臓癌患者を含むものであった。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１２にまとめた。３６歳から８０歳（平均６１．８歳）の年齢範囲の７４人の研究対象患者（男性４８人および女性２６人）のうちで、平均腫瘍サイズは４．４±１．９（平均±ＳＤ、中央値、４．０）であった。腫瘍は、５６人の患者（７５．７％）において膵頭部、および１８人の患者において膵体部または膵尾部に位置していた。リンパ管浸潤およびリンパ節転移は、３５人の患者（４７．３％）および３９人の患者（５２．７％）においてそれぞれ発見された。２００２年の病期分類システムによれば、腫瘍浸潤の深度は、１７人の患者（２３．０％）においてｐＴ２、４３人の患者（５１．４％）においてｐＴ３、および１３人の患者（２４．３％）においてｐＴ４であった。２００２年の病期分類システムによれば、患者は、第Ｉ期に１０人の患者（１３．５％）、第ＩＩ期に４０人の患者（５４．１％）、第３期に１１人の患者（１４．９％）、および第ＩＶ期に１３人の患者（１７．６％）が分類された。神経周囲の浸潤は４０人の患者（５４．１％）において観察された。腫瘍分化度は、１８人の患者（２４．３％）を高分化、３８人の患者（５１．４％）を中分化、および１８人の患者（２４．３％）を低分化に段階付けた。補助療法を２７人の患者（３６．５％）において実施した。２年の無病生存率および全生存率は、それぞれ１８．６％および２８．９％であった。
膵臓癌患者特性
【００８５】
【表１２】
2013504039.tif 000014
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００８６】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に膵臓癌に応用可能であることを示唆している。したがって、膵臓癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、膵臓癌患者は致死性細胞と関連する場合、極めて不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。２年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では５．５％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では５１．５％であった（Ｐ＜０．００１）。２年全生存率は、致死性細胞を有する患者では１３．３％であるのに対し、陰性患者では６７．６％であった（Ｐ＜０．００１）。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＝０．００１）、腫瘍位置（Ｐ＝０．００４）、リンパ節転移（Ｐ＝０．０１８）、およびＣＡ１９−９（Ｐ＝０．０４１）は、無病生存率に対する独立予後因子であることが示された。全生存率については、致死性細胞（Ｐ＝０．００１）、腫瘍位置（Ｐ＝０．００１）、およびＣＡ１９−９（Ｐ＝０．０１２）が独立予後因子であった。致死性細胞は、膵臓癌の進行および患者生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（無病生存率において、ＨＲ  ４．３０９、９５％ＣＩ  １．８９０−９．８２１、Ｐ＝０．００１、および全生存率において、ＨＲ  ４．８４４、９５％ＣＩ  １．８３１−１２．８１６、Ｐ＝０．００１）。
【００８７】
より詳細には、５８％を超える早期膵臓癌患者が致死性細胞を示し、かつ良好な転帰を有し得なかった（２年無病生存率においては１７．１％対７０．０％、および２年全生存率においては１５．６％対８０．０％；Ｐ＜０．００１）。早期膵臓癌患者は致死性細胞と関連する場合、同じ早期膵臓癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者と比較して、潜在的治療処理の後でさえ明らかにはっきりとした不良な転帰を有していた。ロジスティック回帰分析によって、膵臓癌患者は致死性細胞と関連する場合、補助療法への乏しい反応を有する傾向があることがさらに明らかになった。補助療法に反応して、膵臓癌患者の２年生存率が１２．５％であるのに対し、致死性細胞が陰性の膵臓癌患者では６６．７％であり、致死性細胞陰性の患者のオッズ比は陽性患者の１４倍を超えた（ＯＲ１４．２５０、９５％ＣＩ１．１６２−１７４．８０１；Ｐ＝０．０３８）。
【００８８】
致死性細胞は、全病期における膵臓癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は膵臓癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの膵臓癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する膵臓癌患者の治療において、従来型の侵襲性膵臓癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例９】
【００８９】
胆管癌患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
胆管癌は２番目に多い原発性の肝臓腫瘍である。過去３０年にわたって世界的に胆管の発生が上昇している。外科手術が依然として治療の可能性をもたらす唯一の治療介入のままである。残念ながら、胆管癌患者の予後は、外科治療および内科治療における最近の進歩にも関わらず、通常不満を感じるものである。リンパ節転移および組織学的グレードなどのいくつかの因子が予後因子として立証されてきた。しかしながら、同様の臨床病理学的病期における予後は多様である。したがって、最適な医学的管理のために、特に侵襲性疾患の患者の不良転帰を予測するより信頼性のあるバイオマーカーを開発するため、胆管癌に関与する分子および細胞の過程におけるより良い理解を得ることに強い関心がある。しかしながら、胆管癌の腫瘍侵襲性および進行に関する分子および細胞の作用機構は非常に不明確なままであり、さらに確立される必要がある。
【００９０】
１２１人の早期胆管癌患者は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１３にまとめた。２５歳から８９歳（平均６３．２歳）の年齢範囲の１２１人の胆管癌の研究対象患者（男性５２人および女性６９人）のうちで、平均腫瘍サイズは３．４±１．９ｃｍ（平均±ＳＤ；中央値、３ｃｍ）であった。胆道系における腫瘍の位置によって、腫瘍は、５６人の患者（４６．３％）および６５人の患者（５３．７％）において、それぞれ肝内および肝外の種類に分類した。分化の程度は、３６人の患者（２９．７％）を高分化、５９人の患者（４８．８％）を中分化、および２６人の患者（２１．５％）を低分化に段階付けた。腫瘍は、４３人の患者（３５．５％）において胆管（Ｔ１）、２５人の患者（２０．７％）において胆管の壁を越えて浸潤（Ｔ２）、および５３人の患者（４３．８％）において肝臓、胆嚢、膵臓および／または門脈または肝動脈の片側分枝に浸潤（Ｔ３）に限局した。９１人の患者（７５．２％）はリンパ節転移していなかった。早期胆管癌患者は、第ＩおよびＩＩ期に、５８人の患者（４７．９％）、および６３人の患者（５２．１％）をそれぞれ分類した。１２１人の早期胆管癌患者の５年生存率は３２．７％であった。
胆管癌患者特性
【００９１】
【表１３】
2013504039.tif 000015
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００９２】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に胆管癌に応用可能であることを示唆している。したがって、胆管癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー生存曲線および対数順位検定によって、１２１人中７５人（６２．０％）の早期胆管癌患者は致死性細胞を示し、非常に不良な転帰を有することが明らかになった。致死性細胞と関連する場合の早期胆管癌患者の５年生存率は、同じ早期胆管癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者の６５％を超える値から、２０％未満まで低下した（Ｐ＜０．００１、対数順位検定）。平均生存期間は、致死性細胞を有する患者において１４か月であったが、致死性細胞を有さない患者までは届かなかった（Ｐ＜０．００１）。コックス回帰分析によって、早期胆管癌患者は致死性細胞と関連する場合、同じ早期胆管癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者と比較すると、３倍を超える予後不良の危険性を有していた（ハザード比  ３．２６２、９５％ＣＩ  １．８０６−５．８８９；Ｐ＜０．００１）。さらに、別の２９人の進行期胆管癌患者が致死性細胞の研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。興味深いことに、２９人の進行期患者のうち、２５人の患者（８６．２％）もまた致死性細胞を示し、非常に不良な転帰を有していた。致死性細胞と関連する進行期胆管癌患者の２年生存率は５％未満であり、平均生存期間は７．２か月であった。
【００９３】
致死性細胞は、全病期における胆管癌患者の治療可能疾患または治療不可能疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は胆管癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの胆管癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する胆管癌患者の治療において、従来型の侵襲性胆管癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例１０】
【００９４】
腎癌患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
腎癌は男性における全悪性腫瘍の３％を占め、前立腺癌および膀胱癌に次いで３番目に多い泌尿器癌である。これまで、腫瘍の病期およびグレードは、腎癌患者の主要な予後パラメータであると考えられてきた。しかしながら、多くの場合、これらのパラメータは腎癌の臨床的挙動を予測するのに不十分であった。また、最近の研究で、腫瘍が限局する場合の再発を予測するために病期単独を信頼することは不可能であることが立証された。そのため、腎臓の切除が腎癌の主な治療法であるが、早期および限局した癌の約７０％のみに効果がある。したがって、腫瘍進行の危険性が高い患者を同定するために、さらなる予後因子が必要とされている。
【００９５】
８８人の腎癌患者は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１４にまとめた。３１歳から７３歳（平均５９歳）の範囲の男性５２人および女性３６人は、本研究において腎摘出術を受けた。腫瘍の平均サイズは７．０±４．７ｃｍであった。検査を受けた８８個の腫瘍の間で、７１個の腫瘍（８０．７％）は従来型（明細胞癌）、５個の腫瘍（５．７％）は乳頭状腎細胞癌、４個の腫瘍（４．５％）は混合型腎癌、１個の腫瘍（１．１％）は集合管癌、および７個の腫瘍（７．９％）は未分類腎細胞癌であった。グレード分布を以下に示す：２９個（３３．０％）がグレード１、３２個（３６．４％）がグレード２、１６個（１８．２％）がグレード３、および１１個（１２．５％）がグレード４。腫瘍病期を、腫瘍−結節−転移（ＴＮＭ）分類に従って定義した。５９個の腫瘍（６７．０％）は腎臓に限局され（第Ｉ−ＩＩ期）、かつ２１個の腫瘍（２３．９％）は腎臓の外部に拡張していた（第ＩＩＩ−ＩＶ期）。外科手術の際、４人の患者は遠隔転移していた。生存期間は外科手術の日から死亡日または追跡調査の最終日までで計算した。８８人の患者の５年の無病生存率および全生存率は、それぞれ６３．５％および７９．５％であった。
腎癌患者特性
【００９６】
【表１４】
2013504039.tif 000016
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【００９７】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に腎癌に応用可能であることを示唆している。したがって、腎癌患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、腎癌患者は致死性細胞と関連する場合、不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では３０．０％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では７９．３％であった（Ｐ＜０．００１）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では５３．３％であるのに対し、陰性患者では９３．１％であった（Ｐ＜０．００１）。多変量解析によって、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）、およびリンパ節転移（Ｐ＜０．００１）は、無病生存率に対する独立予後因子であることが示された。全生存率についても、致死性細胞（Ｐ＜０．００１）、およびリンパ節転移（Ｐ＝０．００１）は、唯一の独立予後因子であった。致死性細胞は、腎癌の進行および患者生存率に対する最も強い独立予後予測因子であることが分かった（無病生存率において、ＨＲ  ４．３０７、９５％ＣＩ  ２．０６８−８．９６９、Ｐ＜０．００１、全生存率において、ＨＲ  ８．３５９、９５％ＣＩ  ２．６５９−２６．２７２；Ｐ＜０．００１）。
【００９８】
より詳細には、カプラン・マイヤー生存曲線および対数順位検定によって決定されるところ、５年無病生存率は、早期腎癌患者が致死性細胞と関連する場合、同じ早期腎癌患者ではあるが致死性細胞を有さない患者の８６．４％から、わずか４０．０％まで低下した（Ｐ＜０．００１）。進行期腎癌患者では、致死性細胞陽性患者の５年無病生存率がわずか２０％であるのに対し、致死性細胞陰性患者では５４．５％であった。コックスハザード回帰分析によって、早期腎癌患者は、同じ早期腎癌患者ではあるがいかなる致死性細胞も有さない患者と比較して、３．５を超える再発の危険性を有しており（ＨＲ  ３．５４７、９５％ＣＩ  １．４９３−８．４２４；Ｐ＝０．００４）、かつ進行期腎癌患者のハザード比は８．９７４まで増加する（９５％ＣＩ  ３．６６７−２１．９６１  ；Ｐ＜０．００１）ことが明らかとなった。また、ロジスティック回帰分析によって、腎癌患者は致死性細胞と関連しない場合、外科手術および補助療法に反応して、生存オッズ比は８．３２０（９５％ＣＩ  １．９７２−３５．００９；Ｐ＝０．００４）を維持することが確認された。
【００９９】
致死性細胞は、全病期における腎癌患者の治療可能な疾患または治療不可能な疾患の状態、および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は腎癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの膵臓癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する腎癌患者の治療において、従来型の侵襲性腎癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例１１】
【０１００】
脳腫瘍患者は致死性細胞と関連する場合、非常に好ましくない転帰および乏しい治療反応を有する傾向がある。
脳腫瘍は中枢神経系において最もよく見られる腫瘍であり、異なる形態から構成されている。脳腫瘍の分子、生化学、および形態学的特徴に関する増大する情報量にも関わらず、それらの治療において効果は依然限られたものである。これまでのところ、年齢および組織学的グレードのみが生存率の独立予測因子として際立っている。各腫瘍グレードの範囲内において、各腫瘍グレードは単一の病理学的疾患単位ではなく可変悪性度を有する腫瘍範囲を包含するため、臨床経過はやはり変化する。したがって、新規の生物学的マーカーを同定することは、より効果的な治療手段を開発し、治療反応を予測し、かつ生存率を向上させるために極めて重要である。
【０１０１】
８１人の脳腫瘍患者は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的データおよび検体を有していた。研究対象患者の臨床病理学的特性を表１５にまとめた。３歳から７７歳（平均４２歳）の年齢範囲の研究対象の８１人の患者（男性４１人および女性４０人）のうちで、平均腫瘍サイズは４．７±２．３ｃｍ（平均±ＳＤ；中央値、４．０ｃｍ）であった。腫瘍試料を世界保健機構基準を使用して段階付けた。２８個の腫瘍（３５％）を低悪性度星細胞腫（グレード２）、１４個の腫瘍（１７％）を未分化または乏突起星細胞腫（グレード３）、および３９個の腫瘍（４８％）を多形性膠芽腫（グレード４）に分類した。５０人の患者（６１．７％）は術後に照射および／または化学療法を受けた。８１人の患者の５年の無病生存率および全生存率は、それぞれ２８．２％および４０．６％であった。
脳腫瘍患者特性
【０１０２】
【表１５】
2013504039.tif 000017
略語：グレード３、未分化または乏突起星細胞腫；グレード４、多形性膠芽腫
†連続変数の結果を平均±ＳＤとして表す。
【０１０３】
本研究における患者特性は現在の疫学的状況に類似しており、それは独立コホート研究においてこれらの事例から得られた結果が世界的に脳腫瘍に応用可能であることを示唆している。したがって、脳腫瘍患者の疾病状態および治療反応の決定における致死性細胞の役割を評価するために、この代表的な研究集団を使用することを決定した。カプラン・マイヤー法を用いた致死性細胞の予後的意義における単変量解析によって、脳腫瘍患者は致死性細胞と関連する場合、非常に不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では１１．１％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では４１．９％であった（Ｐ＜０．００１）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では１６．７％であるのに対し、陰性患者では５９．６％であった（Ｐ＜０．００１）。コックス単変量比例ハザード回帰分析によって、致死性細胞、年齢、および多形性膠芽腫が、疾病再発および死亡率の高い危険性と著しく関連していることが明らかとなった（Ｐ＜０．００１）。脳腫瘍患者における致死性細胞は、無病生存率（ＨＲ  ３．０１４、９５％ＣＩ  １．７７７−５．１１３、Ｐ＜０．００１）および全生存率（ＨＲ  ４．５３１、９５％ＣＩ  ２．４６３−８．３３６、Ｐ＜０．００１）に対する非常に強力な予後指標としてさらに同定された。
【０１０４】
興味深いことに、術後補助化学療法を受けた５０人の患者のうちで、致死性細胞はまた患者の転帰に著しく関与していた。補助化学療法に反応して、致死性細胞を有さない脳腫瘍患者はより良好な転帰を有し、致死性細胞を有する患者は大多数が明らかに不良な転帰を有していた。陽性患者の５年生存率は１０．０％であるのに対し、陰性患者では５３．２％であった（Ｐ＜０．００１）。ロジスティック回帰が適用されると、致死性細胞、年齢、および組織学が、単変量解析において補助療法反応の潜在的予後予測因子であった。致死性細胞は、どの脳腫瘍患者が補助療法からの利益を得るか決定に対して、最も強い独立予後指標としてさらに同定された（ＯＲ  ８．０８１、９５％ＣＩ  １．１４１−５７．２１３、Ｐ＝０．０３６）。
【０１０５】
致死性細胞は、全病期における脳腫瘍患者の治療可能な疾患また治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は脳腫瘍患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの脳腫瘍患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する脳腫瘍患者の治療において、従来型の侵襲性脳腫瘍細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
【実施例１２】
【０１０６】
癌患者は致死性細胞と関連する場合、積極的治療の後でさえも非常に好ましくない転帰を有する傾向がある。
１９４８人の様々なタイプの癌患者は、致死性細胞研究に使用可能である完全な臨床病理学的なデータおよび検体を有していた。１歳から９７歳（平均±ＳＤ、５６．４±１４．８）の年齢範囲の１９４８人の研究対象患者（男性９９７人および女性９５１人）のうち、癌の種類は、５５人の患者において膀胱癌、１８６人の患者において乳癌、８５人の患者において脳腫瘍、１６１人の患者において子宮頸癌、１６１人の患者において胆管癌、９３人の患者において結腸直腸癌、３０人の患者において子宮内膜癌、３８人の患者において食道癌、１４３人の患者において肝癌、１５２人の患者において胃癌、１６９人の患者において肺癌、９２人の患者において上咽頭癌、１３４人患者において口腔癌、６１人の患者において卵巣癌、１２７人の患者において膵臓癌、８３人の患者において前立腺癌、９３人の患者において腎癌、および８５人の患者においてリンパ腫であった。患者を２００６年４月まで観察した。約４３．６％の癌患者（１９４８人中８５０人）は致死性細胞を示した（表１６）。カプラン・マイヤー法によって、癌患者は、腫瘍間質、および／または末梢血、および／または腹水、および／または胸水、および／または骨髄において致死性細胞と関連する場合、非常に不良な転帰を有する傾向があることが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。５年無病生存率は、致死性細胞を有する患者では１７．１％であるのに対し、致死性細胞を有さないそれらの患者では７４．７％であった（Ｐ＜０．００１、図４Ａ）。５年全生存率は、致死性細胞を有する患者では２５．０％であるのに対し、致死性細胞を有さない患者では８４．１％であった（Ｐ＜０．００１、図４Ｂ）。癌の病因に関わらず、大多数の癌患者は致死性細胞と関連する場合、外科手術、化学療法、放射線療法、およびホルモン療法を含む積極的治療の後でさえ、不良な転帰を生じる傾向がある。
【０１０７】
致死性細胞は、全病期における癌患者の治療可能な疾患また治療不可能な疾患の状態および全種類の治療反応の決定において、決定因子および指令因子の役割を明らかに担っている。したがって、本発明は様々なタイプの癌患者において致死性細胞を検出する方法および組成物、ならびにその使用を提供するものである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの癌患者にとって確実に必要とされている。致死性細胞を標的とすることは、致死性細胞と関連する癌患者の治療において、従来型の侵襲性癌細胞を標的とするのと同様に不可欠かつ重要であるはずである。
患者特性
【０１０８】
【表１６】
2013504039.tif 000018
【０１０９】
興味深いことに、早期癌患者の比較的大集団はすでに致死性細胞と関連しており、かつ潜在的治療処理の後でさえ、良好な転帰を有し得ないことが分かった。一方で、進行期癌患者の比較的大集団は、いかなる致死性細胞も有しておらず、致死性細胞を有する同じ進行期の癌患者と比較して、治療の後にかなり良好な転帰を有することが分かった。したがって、致死性細胞および癌細胞の発症経路と病期は明らかに異なる。
【０１１０】
結論として、本発明において示される致死性細胞を標的とすることは、様々なタイプの癌患者の治療において、従来型の癌細胞を標的とすることと同様に等しく不可欠かつ重要であるはずである。より積極的かつ適切な治療が致死性細胞と関連するこれらの癌患者を治療するために必要とされている。
【図１（Ａ）】
2013504039.tif 000019
【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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