(57)【要約】  対象の生存可能性を決定するためのアッセイキット及びアッセイ並びにサンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の総量を決定するためのアッセイキットを提供する。更に、対象由来サンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含み、ＦＬＣの量が少ないことが対象の生存率上昇及び／又はより良い全体的健康に関係し、より高レベルのＦＬＣが未検出の医学的問題が存在する可能性を示す、全体的健康のスクリーニング方法を提供する。
2013502569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の総量を検出するための１又は複数の検出剤を含む、サンプル中のＦＬＣの総量を決定するためのアッセイキット。
【請求項２】
抗遊離λ抗体及び抗遊離κ抗体又はその断片を含む、請求項１に記載のアッセイキット。
【請求項３】
前記抗体又はその断片が一緒に混合されている、請求項２に記載のアッセイキット。
【請求項４】
前記抗体又はその断片が、ラテックス粒子等の粒子に結合している、請求項２又は３に記載のアッセイキット。
【請求項５】
対象由来サンプル中のトータルＦＬＣを検出する全体的健康のスクリーニング方法において使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項６】
サンプル中の２５ｍｇ／Ｌ未満のトータル遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量が検出されるように適合されている、請求項１〜５に記載の方法において使用するためのアッセイキット。
【請求項７】
約１ｍｇ／ＬのトータルＦＬＣの量が検出されるように適合されている、請求項６に記載のアッセイキット。
【請求項８】
１〜８０ｍｇ／ＬのトータルＦＬＣの量が検出されるように適合されている、前記請求項のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項９】
比濁法キットである、前記請求項のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項１０】
サンプル中のコレステロール、クレアチニン、シスタチンＣ、及びＣＲＰの１又は複数の濃度を測定するための１又は複数の構成要素を更に含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項１１】
前記ＦＬＣ又は前記構成要素の濃度の標準曲線の作成を可能にする前記ＦＬＣ又は前記構成要素用の複数の標準を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項１２】
前記標準が、２５ｍｇ／Ｌ未満のＦＬＣ濃度を決定するための１又は複数の標準を含む、請求項１１に記載のアッセイキット。
【請求項１３】
対象に由来するサンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を決定することを含み、ＦＬＣの量が少ないことが前記対象の生存率の上昇及び／又はより良い全体的健康に関連し、より高レベルのＦＬＣが未検出の医学的問題が存在する可能性を示す、全体的健康のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記対象が、Ｂ細胞関連の疾患又は障害等の生命に関わる疾患の明らかな症状を有さない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遊離軽鎖の量が、前記サンプル中のトータル遊離軽鎖の量である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＦＬＣが、前記対象由来の血清サンプル中で決定される、請求項１３〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記トータルＦＬＣが、抗遊離軽鎖抗体を用いたイムノアッセイにより決定される、請求項１３〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、抗遊離κ軽鎖抗体及び抗遊離λ軽鎖抗体の混合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
比濁法により前記ＦＬＣの量を検出することを含む、請求項１３〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
３ｍｇ／Ｌ未満のＦＬＣを検出できる診断アッセイを用いて前記ＦＬＣを検出することを含む、請求項１３〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アッセイが、約１〜８０ｍｇ／ＬのＦＬＣを検出できる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが血清サンプルであり、トータルＦＬＣの量が２５ｍｇ／Ｌ未満であることが対象の全生存率の上昇の可能性を示す、請求項１３〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象由来のサンプル中のコレステロール、クレアチニン、シスタチンＣ、又はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の量を決定するステップを更に含む、請求項１３〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１３〜２３に記載の方法において使用するための説明書を更に含む、請求項１〜１２に記載のアッセイキット。
【請求項２５】
前記アッセイキットを用いて得られたＦＬＣ濃度を比較して対象の生存率上昇を示すための正常値を更に含む、請求項２３に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象又は個体の生存可能性を決定するための予測アッセイ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト個体等の対象で測定した時にその個体の長期生存可能性の指標となるファクターが過去に複数同定されており、例えば、コレステロール、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、及びシスタチンＣが含まれる。高レベルのこれらの化合物は、糖尿病、高血圧、心血管系疾患、及び腎機能障害に関連する。
【０００３】
本出願人らは、患者の広範囲の単クローン性免疫グロブリン血症をアッセイする方法として遊離軽鎖を長年研究してきた。診断におけるそのような遊離軽鎖の使用は非特許文献１に詳細に概説されている。
【０００４】
抗体は重鎖及び軽鎖を含む。これらは通常、２つの部分からなる対称性（ｔｗｏ−ｆｏｌｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を有し、それぞれが可変領域及び定常領域を含む２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖から構成される。各軽鎖／重鎖対の可変領域が結合して抗原結合部位を形成し、両方の鎖が抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。軽鎖にはκ及びλの２種類があり、全ての抗体分子はいずれかの軽鎖をもって産生されるが、両方の軽鎖をもって産生されることはない。ヒトではκ分子の約２倍のλ分子が産生されるが、これは一部の哺乳類では異なる。通常、軽鎖は重鎖に結合している。しかし、個体の血清又は尿中にはいくらかの非結合「遊離軽鎖」が検出可能である。遊離軽鎖は、軽鎖の重鎖への結合によって普段は隠れている遊離軽鎖表面に対して抗体を産生させることにより、特異的に同定することができる。遊離軽鎖（ＦＬＣ）では、この表面が露出しており、免疫学的に検出することが可能である。κ又はλ遊離軽鎖を検出するための市販のキットとしては、例えば、英国バーミンガムのザ・バインディング・サイト・リミテッド社（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）製の「Ｆｒｅｅｌｉｔｅ（商標）」が含まれる。本出願人らは以前に、遊離κの量、遊離λの量、及び／又は遊離κ／遊離λ比を測定することで患者において単クローン性免疫グロブリン血症を検出できることを見出した。これは例えば、完全型（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン多発性骨髄腫（ＭＭ）、軽鎖ＭＭ、非分泌型ＭＭ、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症、くすぶり型ＭＭ、形質細胞腫、及びＭＧＵＳ（意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症）の診断を補助するものとして用いられてきた。ＦＬＣの検出は、例えば他のＢ細胞障害（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｙｓｃｒａｓｉａ）の診断支援としても用いられており、更に、単クローン性免疫グロブリン血症一般を診断するための尿のベンス・ジョーンズタンパク質分析の代替法としても用いられてきた。
【０００５】
従来は、λ又はκ軽鎖の一方の増加を観察している。例えば、多発性骨髄腫は、悪性形質細胞の単クローン性増殖により生じ、１種類の免疫グロブリンを産生する１種類の細胞が増加する。その結果、遊離軽鎖λ又はκのいずれかの量の増加が個体内で観察される。この濃度上昇は測定することができ、通常、遊離κ／遊離λ比が測定され、正常範囲と比較される。これは単クローン性疾患の診断の助けとなる。更に、遊離軽鎖アッセイは患者の疾患の処置後の追跡にも用いられ得る。例えばＡＬアミロイドーシスの処置後の患者の予後診断に行われ得る。
【０００６】
非特許文献２は、単クローン性免疫グロブリン血症の診断における遊離κ及び遊離λ免疫グロブリンの血清基準範囲及び診断範囲について記載している。２１〜９０歳の個体を
イムノアッセイで研究し、免疫固定で得られた結果と比較し、Ｂ細胞障害を有する個体においてモノクローナル遊離軽鎖（ＦＬＣ）が検出されるようにイムノアッセイが最適化された。κ及びλＦＬＣの量並びにκ／λ比を記録し、Ｂ細胞障害を検出するための基準範囲が決定された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Serum Free Light Chain Analysis, Fifth Edition (2008) A.R. Bradwell et al, ISBN 0704427028
【非特許文献２】Katzman et al (Clin. Chem. (2002); 48(9): 1437-1944)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願人らは、ＦＬＣ、特にトータルＦＬＣ用のアッセイを、個体が見かけ上健康な対象である場合でも、個体の長期生存を予測するために用いることができることを見出した。ＦＬＣ濃度が統計的に有意に長期生存に関連することを見出した。更に、この関連は、コレステロール、クレアチニン、シスタチンＣ、Ｃ反応性タンパク質等の既存の長期生存予測マーカーと同様であるか、それよりも優れていると考えられる。
【０００９】
添付の図面を参照して以下に本発明を例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】トータルＦＬＣ濃度に基づいて三分位群に分類した研究集団の生存確率を示す図である。プロットは、上から順に、ライン１：トータルＦＬＣの中央値濃度が約２０ｍｇ／ｌの個体群；ライン２：中央値濃度が２８．２ｍｇ／ｌの個体群；ライン３（最も下のライン）：中央値濃度が約４２ｍｇ／ｌの個体群を示す。１６５５４名の生存プロットである。
【図２】図１の生存プロットに示されている三分位群のトータルＦＬＣ濃度の範囲（ｍｇ／デシリットルで表す）を示す図である。
【図３】十分位群で表したデータの更なる解析を示す図であり、１５０ヶ月の時点における十分位群の順でのプロットであり、一番上のラインが第１十分位群であり、一番下のラインが第１０十分位群である。
【図４】ＭＧＵＳ及び／又は異常ＦＬＣ患者を除いたデータを示す図であり、１５０ヶ月の時点における十分位群の順でのプロットであり、一番上のラインが第１十分位群であり、一番下のラインが第１０十分位群である。
【図５】市販されている個別の抗遊離κ及び抗遊離λアッセイキットを用いて得られたトータルＦＬＣ濃度を、抗λ及び抗κ遊離軽鎖抗体を併用したトータルＦＬＣアッセイキットを用いて得られたトータルＦＬＣ濃度と比較した図である。
【図６ａ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｂ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｃ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｄ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｅ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｆ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｇ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【図６ｈ】患者由来血清中でのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及びＦＬＣレベルを比較した図であり、これらが互いに関連しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
見かけ上健康な個体に由来する血清中のＦＬＣ濃度は、個体の腎臓がＦＬＣをろ過及び排泄する能力にある程度影響される。ＦＬＣクリアランスが制限された個体では、血清中に見られるＦＬＣのレベルが上昇する。したがって、ＦＬＣは腎機能の良いマーカーであると考えられる。単量体ＦＬＣκ分子（２５ｋＤａ）は二量体λ分子（５０ｋＤａ）とはサイズが異なるので、合わせて、これらは、例えばシスタチンＣ（１０ｋＤａ）よりも優れた糸球体ろ過のマーカーである。しかし、シスタチンＣと異なり、Ｂ細胞増殖中のＦＬＣ産生は多くの疾患で生じ、血清ＦＬＣは通常、それだけでは腎機能マーカーとして使用されない。データは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の患者であっても、ＦＬＣが腎機能に関係なく生存確率を与えることを示している。
【００１２】
しかし、Ｂ細胞増殖／活性のマーカーは重要であり、Ｂ細胞はＦＬＣの産生に関与するので、ＦＬＣ産生は臨床的に有用である。ＦＬＣの産生は、Ｂ細胞のアップレギュレーションの早期指標となる。これに関して、Ｔ細胞を介した炎症反応マーカーであるＣＲＰの使用を補完する。
【００１３】
高ＦＬＣ濃度は、慢性的な腎障害、Ｂ細胞活性化、又はＢ細胞増殖を示すと考えられる。したがって、異常なＦＬＣアッセイの結果は、現在複数の試験を併用する必要がある種々の疾患のマーカーとなり得る。この反対（ＦＬＣアッセイの結果が正常である場合）は、良好な腎機能及びＢ細胞の活性化又は増殖がないことを示す。したがってここで、ＦＬＣ濃度は個体の全体的健康の良い指標と見なされる。
【００１４】
本発明は、全体的健康をスクリーニングする方法であって、当該方法は、対象に由来するサンプル中の遊離軽鎖の量を検出することを含み、量が少ないことが生存率の上昇（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）及び／又はより良い全体的健康に関連し、より高レベルのＦＬＣは未検出の医学的問題が存在する可能性を示す。このアッセイは、例えば、対象の全体的健康チェックの一部としての全体的健康スクリーニングの一部として使用され得る。あるいは、具体的でない「全身倦怠感」、「具合が悪い（ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ
ｗｅａｔｈｅｒ）」、又は「全体的に気分が優れない（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｕｎｗｅｌｌ）」といった種類の症状を持続的に訴える患者において使用され得る。あるいはアッセイは、心理的原因によって気分が優れない患者と、症状の特定困難な生理学的原因によって気分が優れない患者とを区別するために、患者において使用され得る。
【００１５】
ＦＬＣの量を予め決められたＦＬＣの正常範囲と比較して、ＦＬＣの量が正常範囲より多いか少ないかを示してもよい。
【００１６】
ＦＬＣはκＦＬＣ又はλＦＬＣであり得る。しかし、κＦＬＣ又はλＦＬＣだけを検出すると、例えば患者において単クローン性に産生された一方又は他方のＦＬＣの異常に高いレベルを見逃すことがあるので、トータルＦＬＣ濃度を測定することが好ましい。
【００１７】
トータル遊離軽鎖とは、サンプル中の遊離κ軽鎖及び遊離λ軽鎖を足した総量を意味する。
【００１８】
好ましくは、対象は見かけ上健康な対象である。
【００１９】
本発明において、「見かけ上健康な対象（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｈｅａｌｔｙ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、（例えば後述するような）生命に関わる疾患又は状態の明らかな症状を有さない対象を指すと理解される。
【００２０】
好ましくは、方法は、対象において全生存率を予測する方法を提供する。これは、例えば、Ｂ細胞関連の疾患又は障害の診断又は具体的症状を有さない対象におけるものであり得る。
【００２１】
好ましくは、見かけ上健康な対象は、必ずしもＢ細胞関連疾患の症状を有しない。症状としては、反復感染、骨痛、及び疲労が含まれ得る。そのようなＢ細胞関連疾患は、好ましくは、骨髄腫、（例えば完全型免疫グロブリン骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫）、ＭＧＵＳ、ＡＬアミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、濾胞中心細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、プレＢ細胞白血病、又は急性リンパ芽球性白血病ではない。更に、個体は通常、骨髄機能が低下していない。個体は典型的には、多くのそのような疾患で通常見られる異常なλ：κＦＬＣ比を有さない。
【００２２】
「トータル遊離軽鎖」という用語は、対象に由来するサンプル中のκ遊離軽鎖とλ遊離軽鎖を足した量を意味する。
【００２３】
サンプルは通常、対象に由来する血清サンプルである。しかし、全血、血漿、尿、又は組織若しくは体液等のその他のサンプルも使用され得る。
【００２４】
典型的には、トータルＦＬＣ等のＦＬＣは、ＥＬＩＳＡアッセイ等のイムノアッセイにより、又はＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ビーズ等の蛍光標識ビーズを用いて決定される。
【００２５】
ＥＬＩＳＡは、例えば抗体を用いて特異的抗原を検出する。アッセイで使用される抗体の１又は複数が、基質を検出可能な分析物に変換することができる酵素で標識されていてよい。そのような酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び当該技術分野で公知のその他の酵素が含まれる。あるいは、酵素の代わりに、又は酵素と一緒に、その他の検出可能なタグ又は標識を用いてもよい。そのようなものとしては、ラジオアイソトープ、当該技術分野で公知の様々な着色標識及び蛍光標識、例えばフルオレセイン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミンレッド、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、金；及びビオチン等のコンジュゲート（例えば、英国のインビトロジェン社から入手可能）が含まれる。色素ゾル、金属ゾル、化学発光標識、又は着色ラテックスも使用され得る。これらの標識の１又は複数を本明細書に記載の種々の態様に従ってＥＬＩＳＡアッセイに使用してよく、あるいは、他のアッセイにおいて、本明細書に記載の標識抗体又はキットを使用してもよい。
【００２６】
ＥＬＩＳＡタイプのアッセイの構築自体は当該技術分野で周知である。例えば、ＦＬＣに特異的な「結合抗体」を支持体上に固定する。「結合抗体」は当該技術分野で周知の方法により支持体上に固定することができる。サンプル中のＦＬＣは、ＦＬＣに結合する「結合抗体」を介して、支持体上に結合する。
【００２７】
結合しなかった免疫グロブリンは洗い流される。
【００２８】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、結合した免疫グロブリンの存在は、関心のあるＦＬＣの結合抗体とは異なる部分に特異的な標識された「検出抗体」を用いて決定することができる。
【００２９】
関心のあるＦＬＣの結合を検出するためにフローサイトメトリーを用いてもよい。この技術は例えば細胞選別に関する分野で周知である。しかし、ビーズ等の標識粒子の検出及びそのサイズの測定にも利用することができる。Practical Flow Cytometry, 3rd Ed. (1994), H. Shapiro, Alan R. Liss, New York, and Flow Cytometry, First Principles (2nd Ed.) 2001, A. L. Given, Wiley Liss.等の多くの教科書にフローサイトメトリーは記載されている。
【００３０】
ＦＬＣ特異的抗体等の結合抗体の１つは、ポリスチレン又はラテックスビーズ等のビーズに結合している。ビーズをサンプル及び２次検出抗体と混合する。検出抗体は、好ましくは、検出可能なラベルで標識されており、これはサンプル中で検出されるべきＦＬＣに結合する。その結果、アッセイされるＦＬＣが存在すると、ビーズが標識される。
【００３１】
本明細書に記載されている他の分析物を検出できるように、それらの分析物に特異的なその他の抗体を用いてもよい。
【００３２】
その後、標識ビーズはフローサイトメトリーで検出され得る。異なる標識、例えば異なる蛍光標識を、例えば抗遊離λ抗体及び抗遊離κ抗体に使用してもよい。本明細書に記載されている他の分析物が検出できるように、それらの分析物に特異的なその他の抗体をこのアッセイ又は本明細書に記載されている他のアッセイで使用してもよい。これにより、結合した各型のＦＬＣの量を同時に測定することができ、又はその他の分析物の存在を決定することができる。
【００３３】
あるいは、又はそれに加えて、サイズの異なるビーズを、異なる抗体、例えば異なるマーカー特異的抗体に使用してもよい。フローサイトメトリーは異なるサイズのビーズを識別することができるので、サンプル中の各ＦＬＣ又は他の分析物の量を迅速に決定することができる。
【００３４】
別の方法では、例えば、市販のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ等の蛍光標識ビーズに結合した抗体を使用する。異なる抗体に異なるビーズを使用する。異なるビーズが異なる蛍光団混合物で標識されていることで、蛍光波長により異なる分析物を測定することが可能になる。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズは、米国テキサス州オースティンのルミネックス社（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能である。
【００３５】
好ましくは、用いられるアッセイは比濁法である。λＦＬＣ又はκＦＬＣを検出するための比濁アッセイは当該技術分野で一般的に公知であるが、トータルＦＬＣのアッセイは公知ではない。これらはアッセイの感度が最高レベルである。λＦＬＣ及びκＦＬＣの濃度は別々に決定してもよく、トータルＦＬＣ用の単一のアッセイで決定してもよい。そのようなアッセイは、典型的には５０：５０の比率で抗κＦＬＣ抗体及び抗λＦＬＣ抗体を含む。
【００３６】
抗体を遊離λ軽鎖及び遊離κ軽鎖の混合物に対して産生させてもよい。
【００３７】
トータルＦＬＣの量が正常値より多いか少ないかを決定するために、標準的な所定の値と比較してもよい。
【００３８】
以下に詳細に記載するように、本出願人らは、正常よりも高い濃度の血清ＦＬＣが生存率低下の可能性の有意な上昇に関連することを見出した。例えば血清ＦＬＣレベルがより低い人々よりもそうである。本明細書に記載のデータから、血清ＦＬＣの正常レベルは通常、約１５〜３５ｍｇ／Ｌ又は２０〜３５ｍｇ／Ｌ、２６〜３５ｍｇ／ｌ、又は好ましくは２５〜３２、又は２４〜３３ｍｇ／ｌのトータルＦＬＣである。３３超、例えば３４超
、３６超、４０超、４２超、４８超、５０超、５２超、５５超、７０ｍｇ／ｌ超のトータル血清ＦＬＣは、早期死亡の可能性の高まりを示す。個体の血清中において３３ｍｇ／ｍｌ又は３０未満、２８未満、２６未満、又は２５ｍｇ／ｌ未満であることは、対象の生存率の有意な上昇に関連する。生存確率の上昇は、２年、４年、６年、８年、１０年、１２年、１４年、１６年、又はそれ以上の期間に及び得る。本出願人らは、より低いＦＬＣ濃度と生存率上昇の確率との関連が１６０ヶ月を超える期間にわたり有意であることを見出した（例えば図１参照）。
【００３９】
これまで製造されてきたアッセイキットは、κ及びλＦＬＣを別々に測定して比率を計算することができるというものであった。これらは疾患症状を既に示している個体において従来使用されてきた。
【００４０】
アッセイは、サンプル中のＦＬＣ（例えばトータルＦＬＣ）を例えば約１〜１００ｍｇ／Ｌ又は１〜８０ｍｇ／Ｌで測定できることが好ましい。これにより、異なる希釈率でサンプルを再度アッセイせずとも、大多数の個体において血清ＦＬＣ濃度が検出されると予想される。
【００４１】
より低い濃度を観察することを新たに強調しているが、これは、好ましくは、診断アッセイが３０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ未満又は１０ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ又は１ｍｇ／Ｌの血清ＦＬＣを検出できることを意味する。
【００４２】
好ましくは、方法は、イムノアッセイを用いて、例えば抗遊離κ軽鎖抗体及び抗遊離λ軽鎖抗体又はそれらの断片の混合物を用いて、サンプル中のトータル遊離軽鎖の量を検出することを含む。そのような抗体は、抗κ抗体：抗λ抗体＝５０：５０であり得る。ＦＬＣに結合した抗体又は断片は、標識された抗体又は断片を用いて直接検出されてもよく、抗遊離λ抗体又は抗遊離κ抗体に対する標識抗体を用いて間接的に検出されてもよい。
【００４３】
抗体はポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体は、同じ鎖の異なる部分に対して産生されるので、検出すべき同じ種類の軽鎖間でのいくらかの可変性に対応するため、ポリクローナル抗体が使用され得る。ポリクローナル抗体の産生は例えば国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００４４】
好ましくは、特定され、全生存率が高い可能性を有意に示すとされる血清ＦＬＣ（例えばトータルＦＬＣ）の量は、３３未満、３２未満、３１未満、３０未満、２８未満、２６未満、２５未満、２４ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、又は１５ｍｇ／Ｌ未満である。
【００４５】
逆に、３３ｍｇ／Ｌ超、特に３４、３６、３８、４０、５０、５５、６０超、又は７０ｍｇ／ｍｌ超のレベルは、対象における全体的死亡率（ｏｖｅｒａｌｌ  ｄｅａｔｈ）が高い可能性を示すと見なされる。この方法を用いて、見かけ上健康な対象において、より悪い予後を示してもよく、あるいは、未検出の医学的問題が存在する可能性を強調し、更なる検査を正当化してもよい。
【００４６】
サンプル中の１又は複数の更なるマーカーを試験してもよい。そのようなマーカーとしては、コレステロール、クレアチニン（腎機能のマーカー）、シスタチンＣ、又はＣＲＰが含まれる。そのようなアッセイの使用は当該技術分野で一般的に公知である。更なるマーカーの使用は、更なるデータを提供し、予測の精度を向上させるか、潜在的な疾患／医学的問題の診断の助けとなることが予想される。
【００４７】
更に、例えば本発明の方法で用いるための、トータルＦＬＣ用のアッセイキットが提供
される。キットはサンプル中のトータルＦＬＣ量を検出し得る。そのようなアッセイキットは、２５ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは、サンプル中の約２０ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ未満、又は４ｍｇ／Ｌ未満のトータル遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出するように適合されていてよい。アッセイキットは、例えば比濁アッセイキットであり得る。好ましくは、キットは、ＦＬＣに対する１又は複数の抗体を含むイムノアッセイキットである。典型的には、キットは、抗κＦＬＣ抗体及び抗λＦＬＣ抗体の混合物を含む。典型的には、抗遊離κ抗体及び抗遊離λ抗体の５０：５０混合物が使用される。キットは、サンプル中の１〜１００ｍｇ／Ｌ又は好ましくは１〜８０ｍｇ／Ｌのトータル遊離軽鎖を検出するように適合されていてよい。
【００４８】
ＦＬＣに結合できる（Ｆａｂ）２又はＦａｂ抗体等の抗体断片を使用してもよい。
【００４９】
抗体又は断片は、例えば前述した標識を用いて標識化されていてもよい。ＦＬＣに結合した抗遊離λ又は抗遊離κを検出するために、標識された抗免疫グロブリン結合抗体又はその断片が提供されてもよい。
【００５０】
キットは、前述したコレステロール、クレアチニン等のその他のマーカーを試験するための構成要素を含むより大きな試験アッセイキットの一部であってもよい。そのようなマーカー用の抗体が提供されてもよい。
【００５１】
キットは、指定の範囲にアッセイを較正するための較正液（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ｆｌｕｉｄ）を含み得る。較正液は、好ましくは、例えば２５ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、又は１ｍｇ／Ｌまでの所定の濃度のＦＬＣを含む。また、キットは、ラテックス粒子上にコーティングされた「ブロッキング」タンパク質及び抗体の量を最適化することにより及び例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度等の補助的試薬の濃度を最適化することにより適合され得る。
【００５２】
キットは、例えばＦＬＣ用又はアッセイされ得るコレステロール、クレアチニン、シスタチンＣ、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）等のその他の化合物用の複数の標準対照を含み得る。標準対照は、ＦＬＣ又はその他の要素の濃度について作成される標準曲線の検証に使用され得る。そのような標準対照により、以前に較正された標準曲線が現在使用されている試薬及び条件に妥当であることが確認される。これらは通常、対照由来サンプルのアッセイとほぼ同時に使用される。標準は、アッセイがより低い濃度の遊離軽鎖を検出できるように、ＦＬＣ用に２０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは１５ｍｇ／Ｌ未満、約１０ｍｇ／Ｌ未満、又は５ｍｇ／Ｌ未満の１又は複数の標準を含み得る。
【００５３】
アッセイキットは、比濁法キットであり得る。これは、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、蛍光、化学発光、ビーズタイプのアッセイ、又はディップスティックであり得る。そのようなアッセイは当該技術分野で一般的に公知である。
【００５４】
アッセイキットは更に、本発明に係る方法で使用するための説明書を含んでもよい。説明書は、正常値と見なされるトータル遊離軽鎖の濃度の指標を含んでもよく、それより低い又は高いことは、固体の生存確率の上昇又は低下を示す。そのような濃度は上記で定義した通りであり得る。
【実施例】
【００５５】
米国のメイヨークリニックは、ミネソタ州オルムステッド郡で、５０歳以上（１９９５年１月１日時点）の２０，０００名を超える居住者をモニタリングした。英国バーミンガムのザ・バインディング・サイト・グループ・リミテッド社製の遊離κ軽鎖及び遊離λ軽鎖用「Ｆｒｅｅｌｉｔｅ（商標）アッセイを用いて、保存された凍結血清中のＦＬＣ濃度
を遡及的に測定した。Ｆｒｅｅｌｉｔｅアッセイは、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス等の形質細胞疾患（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の診断及びモニタリングの補助としてＦＤＡに承認されている市販の比濁アッセイである。これらの疾患では通常、λ又はκＦＬＣのいずれかの濃度の上昇及び異常なＦＬＣ比が生じる。
【００５６】
保存血清中のＦＬＣ測定におけるメイヨークリニックの研究者らの調査目的は、異常なＦＬＣ比及びＦＬＣの一方又は両方の濃度の上昇を有する対象がいるかどうかを決定することであった。次いで、そのようなＦＬＣ異常を有するが、インタクトな単クローン性免疫グロブリン産生の証拠がない対象を検査し、対象の悪性の形質細胞疾患のリスクが高いかどうかを決定した。
【００５７】
しかし、本出願人らは、モノクローナル免疫グロブリン又はモノクローナルＦＬＣの産生の証拠がない対象の分析が、トータルＦＬＣレベルがより低い対象の生存率上昇を示すと推測した。上記のデータはこのことが正しかったことを実証している。
【００５８】
図１は、トータル血清ＦＬＣ濃度に基づいて三分位群に分けた集団の生存プロットを示す図である。第１、第２、及び第３三分位群（上から順に）の特徴を以下の表に示す。
【００５９】
【表１】
2013502569.tif 000003
【００６０】
データの分布を図２に示す。
【００６１】
データを更に解析し、全対象並びにＭＧＵＳ及び／又は異常ＦＬＣ比の徴候を示さない対象について十分位群に分けたデータを得た。十分位群のレベルを以下の表に示す。
【００６２】
【表２】
2013502569.tif 000004
【００６３】
図３及び４は、全患者についてのデータ並びにＭＧＵＳ及び／又は異常ＦＬＣ比患者を除いたデータを示す図であり、生存率はＭＧＵＳ及び／又は異常ＦＬＣ比を有することに有意に起因しないことを示している。ＦＬＣのレベルが高い程、生存率は低い。ラインは、１５０ヶ月の位置において上から順に、それぞれ第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、及び第１０十分位群を表し、生存率とＦＬＣ濃度の間の良好な相関を示している。
【００６４】
アッセイキット
本発明に係る方法では以下のアッセイキットが使用され得る。このアッセイキットは、血清等の患者サンプル中に存在する遊離κ及び遊離λ軽鎖の合計を定量する。これは、１００ｎｍのカルボキシル修飾ラテックス粒子を、抗遊離κ及び抗遊離λ軽鎖ヒツジ抗体の５０：５０ブレンドでコーティングすることにより実現され得る。以下に例示するアッセイでは、トータル遊離軽鎖の測定範囲は１〜８０ｍｇ／Ｌである。しかし、別の測定範囲も同様に考慮することができる。
【００６５】
当該技術分野で一般的に公知の技術を用いて、今回の特定のケースではヒツジを用いて、抗遊離κ及び抗遊離λ抗血清を作製する。一般的な免疫化プロセスは国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００６６】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて抗κ及び抗λ抗血清を等濃度に希釈した。それらの抗体を合わせて、５０％抗κ抗体及び５０％抗λ抗体を含む抗血清を調製した。
【００６７】
カルボキシル修飾ラテックス上にコーティング量１０ｍｇ／ロットで抗体をコーティングした。これは標準的な手法を用いてなされた（例えば"Microparticle Reagent Optimization: A laboratory reference manual from the authority on microparticles" Eds: Caryl Griffin, Jim Sutor, Bruce Shull. Copyright Seradyn Inc, 1994 (P/N 0347835(1294)参照）。
【００６８】
この文献は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたアッセイキットの最適化についても詳細に記載している。
【００６９】
合わせた抗体を、市販のκ及びλのＦｒｅｅｌｉｔｅ（商標）キット（英国バーミンガムのザ・バインディング・サイト・グループ・リミテッド社から入手）を用いて得られた結果と比較した。これらのＦｒｅｅｌｉｔｅ（商標）キットは別個のアッセイでκ遊離軽鎖の量及びλ遊離軽鎖の量を特定する。トータルＦＬＣキットを用いて曲線を作成し、調整された濃度を用いて検証した。較正曲線は１〜８０ｍｇ／ｌのトータル遊離軽鎖について得ることができた。以下の結果の表中、結果は、κＦｒｅｅｌｉｔｅ（商標）、λＦｒｅｅｌｉｔｅ（商標）、及びトータル遊離軽鎖アッセイを用いてκ遊離軽鎖（ＫＦＬＣ）、λ遊離軽鎖（ＬＦＬＣ）、及びトータルＦＬＣについて得たものである。これらの結果を１５の異なる正常血清サンプルについて示す。比濁法により測定した結果を以下の表及び図５に示す。
【００７０】
結果は、抗κ及び抗λ遊離軽鎖抗体に基づいてトータル遊離軽鎖アッセイを用いる原理が有効であることを示している。
【００７１】
【表３】
2013502569.tif 000005
【００７２】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びＦＬＣの濃度は種々のファクターの影響を受ける
導入
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、陽性の急性期タンパク質であり、特定の腫瘍に反応して、及び、炎症反応中に、血清中で濃度が高まる。免疫グロブリン遊離軽鎖（ＦＬＣ）は免疫グロブリン合成の「副産物」として生成すると考えられるため、これら２つのタン
パク質の血清濃度間にある程度の相関がある可能性があった。以下の研究の目的は、集中治療室の患者から得た連続血清サンプル中における２つのタンパク質の濃度を決定することであり、これらの患者は、典型的には、集中治療中にＣＲＰ濃度の有意な変化を示すと予想される。
【００７３】
患者及び方法
患者は全員、種々の理由により（集中治療室内で）検査及び治療介入を受けていた。患者が治療室内にいる時間中、連続血液サンプルを採取し、ＣＲＰ及びＦＬＣの濃度を免疫比濁法により測定した。ＦＬＣは前述した通りに測定した。ＣＲＰはロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）から市販されているキット（ＣＲＰＬ３  Ｔｉｍａ−ｑｕａｎｔ  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて測定した。
【００７４】
結果
結果を添付のグラフに示す（図６参照）。一部の患者は、ＦＬＣ及びＣＲＰの両方の濃度の変化についてかなり良好な一致を示した。別の患者は、モニタリング期間の全期間ではないが一部において同様な傾向を示した。複数の患者では、ＦＬＣ濃度の変化がＣＲＰ濃度の変化と逆であった。
【００７５】
結論
一部の患者はＣＲＰ濃度とＦＬＣ濃度の変化にある程度の類似性を示したが、別の患者は、変化パターンが大きく異なっていた。このことは、種々のファクターが両タンパク質の濃度を制御しており、それらに互換性があるとは見なせないことを示している。
【００７６】
更なるデータ
生存率のデータ解析を世界の別の場所の患者に由来する種々のサンプルを用いて繰り返した。ドイツのエッセンの４０００名を超える患者のコホートから、上記と同様な結果が得られた。血清タンパク質の電気泳動の要求と一緒に血清遊離軽鎖を測定された、英国ウルバーハンプトンのニュークロス病院（Ｎｅｗ  Ｃｒｏｓｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の約５００名の患者を、生存率について追跡検査した。生存率において同様な差が観察され、６０ヶ月後において、第１五分位群では生存率が約９８％であり、第５五分位群では生存率が５０％であった（データ示さず）。
【００７７】
更に、英国バーミンガムのクイーン・エリザベス病院（Ｑｕｅｅｎ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有する１３２８名の患者を研究した。これらのうち、８９７名が種々の原因によるＣＫＤを有し、３８４名は腎移植を受けており、４７名は通常の血液透析を受けていた。年齢、性別、及び民族性で補正した血清クレアチニン濃度に基づいて種々のＣＫＤステージにグループ化した患者の生存について研究した（データ示さず）。研究の結果、ここでも遊離κ及び遊離λを合わせた濃度がＣＫＤのステージに関係なく生存に関するリスクを示すことが示された。したがって、ＦＬＣ濃度及び生存は、単純に腎機能に依存するのではなく、他のファクターにも依存する。
【図１】
2013502569.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2013502569.tif 000009
【図６ａ】
2013502569.tif 000010
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
2013502569.tif 000014
【図６ｆ】
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【図６ｇ】
2013502569.tif 000016
【図６ｈ】
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【図２】
2013502569.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月25日(2012.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の総量を検出するための１又は複数の検出剤を含む、血清、全血又は血漿サンプル中のＦＬＣの総量を決定するためのアッセイキットであって、前記１又は複数の検出剤は、ポリクローナル抗遊離λ抗体又はその断片、及び、ポリクローナル抗遊離κ抗体又はその断片を含み、それら抗体又はその断片は一緒に混合されている、アッセイキット。
【請求項２】
前記抗体又はその断片が、ラテックス粒子等の粒子に結合している、請求項１に記載のアッセイキット。
【請求項３】
対象由来サンプル中のトータルＦＬＣを検出する全体的健康のスクリーニング方法において使用するための、請求項１又は２に記載のアッセイキット。
【請求項４】
サンプル中の２５ｍｇ／Ｌ未満のトータル遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量が検出されるように適合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項５】
約１ｍｇ／ＬのトータルＦＬＣの量が検出されるように適合されている、請求項４に記載のアッセイキット。
【請求項６】
１〜８０ｍｇ／ＬのトータルＦＬＣの量が検出されるように適合されている、請求項１−５のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項７】
比濁法キットである、請求項１−６のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項８】
サンプル中のコレステロール、クレアチニン、シスタチンＣ、及びＣＲＰの１又は複数の濃度を測定するための１又は複数の構成要素を更に含む、請求項１−７のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項９】
前記ＦＬＣ又は前記構成要素の濃度の標準曲線の作成を可能にする前記ＦＬＣ又は前記構成要素用の複数の標準を含む、請求項１−８のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項１０】
前記標準が、２５ｍｇ／Ｌ未満のＦＬＣ濃度を決定するための１又は複数の標準を含む
、請求項９に記載のアッセイキット。
【請求項１１】
対象に由来するサンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を決定することを含み、ＦＬＣの量が少ないことが前記対象の生存率の上昇及び／又はより良い全体的健康に関連し、より高レベルのＦＬＣが未検出の医学的問題が存在する可能性を示す、全体的健康のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記対象が、Ｂ細胞関連の疾患又は障害等の生命に関わる疾患の明らかな症状を有さない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遊離軽鎖の量が、前記サンプル中のトータル遊離軽鎖の量である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＬＣが、前記対象由来の血清サンプル中で決定される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記トータルＦＬＣが、抗遊離軽鎖抗体を用いたイムノアッセイにより決定される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、抗遊離κ軽鎖抗体及び抗遊離λ軽鎖抗体の混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
比濁法により前記ＦＬＣの量を検出することを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
３ｍｇ／Ｌ未満のＦＬＣを検出できる診断アッセイを用いて前記ＦＬＣを検出することを含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アッセイが、約１〜８０ｍｇ／ＬのＦＬＣを検出できる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが血清サンプルであり、トータルＦＬＣの量が２５ｍｇ／Ｌ未満であることが対象の全生存率の上昇の可能性を示す、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象由来のサンプル中のコレステロール、クレアチニン、シスタチンＣ、又はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の量を決定するステップを更に含む、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１〜２１に記載の方法において使用するための説明書を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項２３】
前記アッセイキットを用いて得られたＦＬＣ濃度を比較して対象の生存率上昇を示すための正常値を更に含む、請求項２２に記載のアッセイキット。
【請求項２４】
サンプル中の遊離軽鎖（ＦＬＣ）の総量を検出するための１又は複数の検出剤を含む、血清、全血又は血漿サンプル中のＦＬＣの総量を決定するためのアッセイキットの使用であって、前記１又は複数の検出剤は、抗遊離λ抗体又はその断片、及び、抗遊離κ抗体又はその断片を含む、アッセイキットの使用。
【国際調査報告】
2013502569.tif 000019
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2013502569.tif 000021
2013502569.tif 000022
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2013502569.tif 000024
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