(57)【要約】  解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ），および任意にアレルゲンを含む医薬組成物を用いたアレルギー治療の方法。
2013522360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アレルギー反応誘導のための有効量の投与を通じて投与対象者のアレルギー治療に用いられる，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）であって，野生型と比べて実質的に低い毒性を示す，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項２】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記投与対象者が喘息患者，または喘息のリスクを抱える者である，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項３】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，変異サブユニットＡを含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項４】
請求項３に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記変異サブユニットＡが，配列番号１における部位６１または６３のアミノ酸変異を含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項５】
請求項４に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，ＬＴＳ６１ＫまたはＬＴＳ６３Ｋである，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項６】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記投与が経鼻的投与または経皮的投与である，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項７】
請求項６に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記投与が鼻腔内投与または舌下投与である，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項８】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，アレルゲンのない医薬組成物として処方される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項９】
請求項８に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記投与対象者が喘息患者，または喘息のリスクを抱える者である，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１０】
請求項８に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，変異サブユニットＡを含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１１】
請求項１０に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記変異サブユニットＡが，配列番号１における部位６１または６３のアミノ酸変異を含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１２】
請求項１１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，ＬＴＳ６１ＫまたはＬＴＳ６３Ｋである，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１３】
請求項８に記載の解毒した解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記医薬組成物は，経鼻的にまたは経皮的に投与される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１４】
請求項１３に記載の解毒した解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記医薬組成物は，鼻腔内にまたは舌下に投与される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１５】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，アレルゲンを含む医薬組成物として処方される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１６】
請求項１５に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記投与対象者が喘息患者，または喘息のリスクを抱える者である，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１７】
請求項１５に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，変異サブユニットＡを含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１８】
請求項１７に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記変異サブユニットＡが，配列番号１における部位６１または６３のアミノ酸置換を含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１９】
請求項１８に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，ＬＴＳ６１ＫまたはＬＴＳ６３Ｋである，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項２０】
請求項１５に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記医薬組成物は，経鼻的にまたは経皮的に投与される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項２１】
請求項２０に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記医薬組成物は，鼻腔内にまたは舌下に投与される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は，２０１０年３月２３日に出願された米国特許出願第１２／７２９，６４９号に対して優先権を主張し，その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
病的Ｔｈ‐２型免疫反応によって引き起こされるアレルギー性喘息は，欧米の国々における主要な健康問題のひとつである。アレルギー性喘息の症状としては，粘液産生の増大や気道過敏性が挙げられる。アレルゲンへの反復的露出は，アレルギー性喘息を引き起こす重要な要因である。
【０００３】
アレルギー性喘息の治療には，一般的にステロイドや他の抗炎症薬が用いられる。これらの薬剤はアレルギー反応を緩和するのみであり，アレルギー反応自体の発症を予防するものではない。近年，予防的アプローチとして，アレルギーワクチンの開発が進んでいる。典型的なアレルギーワクチンは，特異的免疫反応を誘導するためのアレルゲン（例えば，花粉性アレルゲンや微生物性アレルゲン）と，アレルゲン特異的免疫反応を高めるためのアジュバント（例えば，ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは変異型大腸菌易熱性エンテロトキシン）を含む。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）が，単体でもアレルゲンと組み合わせても，アレルギー性喘息治療に効果的であるという新たな発見に基づく。
【０００５】
したがって，本発明の第一の側面は，必要とする投与対象者（例えば，アレルギーに悩まされている，あるいはアレルギーのリスクを抱えた患者）に対する，抗アレルギー反応誘導に効果的な量の，解毒したＬＴ変異体の投与を通じたアレルギー治療の方法を特徴とする。解毒したＬＴ変異体は，野生型と比較して，実質的に低い毒性を示す。とりわけ，通常のＹ‐１副腎細胞アッセイで測定した場合，解毒したＬＴ変異体の毒性レベルは野生型ＬＴが示す毒性レベルの１％を超えなかった。また，通常のＣａｃｏ‐２細胞アッセイで測定した場合，解毒したＬＴ変異体の毒性レベルは野生型ＬＴが示す毒性レベルの１０％を超えなかった。
【０００６】
本発明の方法で用いられる解毒したＬＴは，変異サブユニットＡ，例えば以下に示す配列番号１の６１番目または６３番目の位置の置換アミノ酸を含む変異サブユニットＡを含みうる。ＬＴＳ６１ＫおよびＬＴＳ６３Ｋは共に例である。解毒したＬＴは，単体でも他のアレルゲンと組み合わせても，粘膜投与（例えば，経鼻投与または舌下投与）または他の経路（例えば，経皮投与）を通じて投与される医薬組成物に含まれて処方されうる。
【０００７】
本発明の範囲は，前述した，例えば粘膜又は経皮投与を通じてアレルギー治療に用いられるか，または治療薬の製剤に用いられる医薬組成物を含む。
【０００８】
本発明における一つまたは複数の実施例の詳細は，以下の説明に記されている。本発明における他の特徴や利点は，以下に記載の図面，複数の実施例の詳細な説明，および特許請求の範囲からも明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は，喘息モデルマウスに対し，ＬＴ変異体ＬＴＳ６１Ｋ，アレルゲンＤｅｒ  ｐ，またはそれらを組み合わせて投与する際の予防プロトコルおよび治療プロトコルを示す図である。
【図２】図２は，図１で示した予防プロトコルに従って，ＬＴＳ６１Ｋ，Ｄｅｒ  ｐ，またはそれらの組み合わせ（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ）を投与したマウスにおけるＡＨＲのレベル（エンハンスドポーズ値（Ｐｅｎｈ  ｖａｌｕｅ）で表される）を示すグラフである。＊：ｐ＜０．０５（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  生理食塩水）であり，＋：ｐ＜０．０５（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体）であり，＋＋：ｐ＜０．０１（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体）である。ｐ値は二要因分散分析によって求めた。ＬＴはＬＴＳ６１Ｋを表す。
【図３】図３は，図１で示した治療プロトコルに従って，ＬＴＳ６１Ｋ，Ｄｅｒ  ｐ，またはそれらの組み合わせ（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ）を投与したマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液におけるサイトカイン（Ａ：ＩＬ‐５であり，Ｂ：ＴＮＦ‐αであり，Ｃ：ＩＬ‐１２であり，Ｄ：エオタキシンであり，Ｅ：ＴＡＲＣ（胸腺および活性化制御ケモカイン）である）レベルを示すグラフである。＊：ｐ＜０．０５（ＬＴＳ６１Ｋ  対  コントロール，またはＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  生理食塩水）であり，＋：ｐ＜０．０５（ＬＴＳ６１Ｋ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体，またはＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体）であり，＋＋：ｐ＜０．０１（ＬＴＳ６１Ｋ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体，またはＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体）である。ｐ値はｔ検定によって求めた。ＬＴはＬＴＳ６１Ｋを表す。
【図４】図４は，図１で示した予防プロトコルに従って，ＬＴＳ６１Ｋ，アレルゲンＤｅｒ  ｐ，またはそれらの組み合わせ（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ）を投与したマウスのＤｅｒ  ｐ特異的ＩｇＡにおける血清（パネルａ），および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液（パネルｂ）レベルを示すグラフである。＊：ｐ＜０．０５（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体）であり，＋＋：ｐ＜０．０１（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  生理食塩水）である。ｐ値はｔ検定によって求めた。ＬＴはＬＴＳ６１Ｋを表す。
【図５】図５は，図１で示した治療プロトコルに従って，ＬＴＳ６１Ｋ，アレルゲンＤｅｒ  ｐ，またはそれらの組み合わせ（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ）を投与したマウスのＤｅｒ  ｐ特異的ＩｇＡにおける血清（パネルａ），および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液（パネルｂ）レベルを示すグラフである。＊：ｐ＜０．０５（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  Ｄｅｒ  ｐ単体）であり，＋＋：ｐ＜０．０１（ＬＴＳ６１Ｋ／Ｄｅｒ  ｐ  対  生理食塩水）である。ｐ値はｔ検定によって求めた。ＬＴはＬＴＳ６１Ｋを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書は，解毒したＬＴ変異体の，単体あるいは他のアレルゲンと組み合わせた有効量の投与を通じた，アレルギー（例えば，アレルギー性喘息）の処置方法に関する。本明細書における用語「処置」は，少なくとも一つの活性剤を含む化合物の，アレルギー性疾患，アレルギー性疾患の症状，またはアレルギー疾患の疾病素質を有する対象者に対する，アレルギー性疾患，アレルギー性疾患の症状，またはアレルギー疾患の疾病素質の，治療，治癒，軽減，緩和，または症状改善等を目的とした投与を意味ずる。本明細書における解毒したＬＴ変異体の「有効量」とは，対象者に治療効果を表す，すなわち，抗アレルギー反応を誘発し，対象者のアレルギー性症状を緩和するために必要なＬＴ変異体の量を意味する。抗アレルギー反応は，アレルギー反応に関する活性化された免疫細胞の浸潤および漸加の阻害，ＩｇＡ（特に，非抗原特異的ＩｇＡ）分泌の促進，ＴＡＲＣ分泌の減少，そしてＴｈ‐２型免疫反応の抑制を含む。Ｔｈ‐２型免疫反応は，体液性免疫の誘発，好酸球の活性化，細胞性免疫の制御，およびＩｇＥ産生の誘発などを引き起こす，Ｔｈ‐２型サイトカイン（例えば，ＩＬ‐４，ＩＬ‐５，ＩＬ‐１０，およびＩＬ‐１３）の放出によって特徴付けられる。有効量は，当業者にとっては明白であるが，剤の投与経路，添加物の用法，および他の活性剤と共同した使用法に基づき変化する。
【００１１】
本発明で示された方法における使用に適した解毒したＬＴ変異体は，共に一般的な技術であるＹ‐１副腎細胞アッセイおよびＣａｃｏ‐２細胞アッセイのいずれかを用いた検証によると，野生型と比較して実質的に低い細胞毒性を示す。Ｙ‐１副腎細胞アッセイおよびＣａｃｏ‐２細胞アッセイに関しては，例えば，以下に述べる文献を参照のこと。Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１：３３４−３３６；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３８−４９；Ｇｒａｎｔ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６２：４２７０−４２７８；Ｃｈｅｎｇ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：３８−４９；および  Ｐａｒｋ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｃｅ，３１：１０１−１０７．
【００１２】
Ｙ‐１副腎細胞アッセイ遂行のために，好ましくは，１５％ウマ血清，２．５％ウシ胎児血清，Ｌ‐グルタミン２ｍＭ，および炭酸水素ナトリウム１．５ｇ／Ｌを添加したハムＦ１２培地で培養されたマウスＹ‐１副腎腫瘍細胞を，９６ウェルの平底プレートに対し１ウェルあたり２×１０４個の細胞濃度（２００ｕｌ／ウェル）で植え付け，３７℃に保った５％ＣＯ２インキュベータ中で４８時間培養する。１倍濃度のリン酸生理食塩緩衝液（１×ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で細胞を数回洗浄した後，３７℃に保った５％ＣＯ２インキュベータ中で，様々な能動のテストＬＴ（野生型ＬＴあるいは変異型ＬＴ）で処理する。処理からおよそ２４時間後，光学顕微鏡で細胞を観察し，細胞の円形化を測定する。テスト標本におけるＬＴ毒性は，細胞円形化を引き起こすのに必要な最少ＬＴ濃度（ＥＣｉ），および５０％の細胞が円形化を起こすのに必要なＬＴ濃度（ＥＣ５０）によって定義される。
【００１３】
Ｃａｃｏ‐２細胞アッセイは次のように行われる。Ｃａｃｏ‐２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）を，２４ウェルのプレートにおいて，２０％ウシ胎児血清を添加したアルファＭＥＭ培地を用いて１ウェルあたり５×１０４個の細胞濃度で培養する。細胞の培養密度が１００％に近づいた時，培地を１％ウシ胎児血清および３‐イソブチル‐１‐メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）１ｍＭを添加したアルファＭＥＭ培地に交換する。５％ＣＯ２インキュベータ中で３０分培養した後，細胞にテストＬＴを混合し，さらに４時間培養する。氷冷したリン酸生理食塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を数回洗浄した後，室温下で１５分間０．１Ｎ塩酸２００μｌを用いて処理すると細胞が崩壊するので，溶液の上清を集める。テストＬＴの毒性レベルを示す上清中のｃＡＭＰ濃度を，ＥＬＩＳＡ法によって，例えばＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ社のＣｏｒｒｅｌａｔｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔを用いて測定する。
【００１４】
解毒したＬＴ変異体は，一箇所または複数個所の変異を，従来の遺伝子工学技術を用いて野生型ＬＴのサブユニットＡまたはサブユニットＢに導入することで作成される。野生型サブユニットＡ（成熟型）および野生型サブユニットＢのアミノ酸配列，並びに，ＡおよびＢサブユニットをエンコードするヌクレオチド配列を以下に示す。
【００１５】
2013522360.tif 000003
【００１６】
2013522360.tif 000004
【００１７】
2013522360.tif 000005
【００１８】
解毒したＬＴ変異体は，好ましくは，ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性に不可欠な部位，例えば，配列番号１における部位５３，６１，６３，６９，９７，１０４，１０６，１１０，または１１２，の変異残基を含む変異Ａサブユニットを含む。米国特許第６，１４９，９１９号，米国２００８１０１２０７８，Ｃｉｅｐｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（５１）：３０５４５−３０５５０，１９９５；ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３８−４９，２０００．を参照のこと。ＬＴ変異体において，ＡおよびＢサブユニットは典型的なＡＢ５ホロトキシン構造を形成する。一例において，解毒したＬＴ変異体（ＬＴＳ６１Ｋ）は，配列番号１における部位６１にＫを含む変異サブユニットＡ，および野生型サブユニットＢを含む。他の例において，解毒したＬＴ変異体（ＬＴＳ６３Ｋ）は，配列番号１における部位６３にＫを含む変異サブユニットＡ，および野生型サブユニットＢを含む。
【００１９】
他の解毒したＬＴ変異体は，米国２００１／００４４４１６，Ｎａｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７３（３）：１３３０−１３４２（２００５），Ｋｏｍａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（２）：２４８−２５４，１９９３；Ｍａｇａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６４（１２）：５４３４−５４３８，１９９６；ＷＯ９９／４７１６４，および米国特許第６，８１８，２２２号に開示されている。
【００２０】
解毒したＬＴ変異体は，従来の組換え技術を用いて作成することができる。例えば，ＬＴ変異体のＡおよびＢサブユニットをコードするヌクレオチド配列を，発現カセット内に挿入して，ホスト細胞（例えば，大腸菌細胞）で発現させることが可能である。ＡおよびＢサブユニットは，ホスト細胞中で，オリジナルに似たホロトキシン構造を形成し，例えばクロマトグラフィーを用いてホスト細胞から分離することが可能である。米国２００８１０１２７８を参照のこと。ＬＴ変異体の毒性は，上に述べたＹ‐１副腎細胞アッセイまたはＣａｃｏ‐２細胞アッセイのいずれかを用いて測定することが可能であり，また，実質的に低い毒性を示すＬＴ変異体を本発明の方法に用いるために同定することが可能である。
【００２１】
いずれの解毒したＬＴ変異体でも，単体でも他のアレルゲンと組み合わせても，アレルギー反応の治療に用いることができる。アレルゲンは，繰り返し露出された対象（例えば人間）におけるアレルギー反応，すなわち，ＩｇＥにより仲介される免疫反応，を誘発することが可能な物質である。アレルギー反応は，花粉アレルゲン（樹木，ハーブ，雑草等の花粉アレルゲン），昆虫アレルゲン（吸入抗原，唾液や毒アレルゲン，例えば，ダニアレルゲン，ゴキブリや蚊アレルゲン，ハチ毒アレルゲン），動物の毛やフケのアレルゲン（例えば，犬，猫，馬，ラット，はつかねずみ等）そして食物アレルゲンを含むタンパク質によって自然に引き起こされうる。樹木，草類及びハーブ類からの重要な花粉アレルゲンは，ブナ目，キクセイ目，マツ目及びカバの木（Ｂｅｔｕｌａ），ハンの木（Ａｌｎｕｓ），ヘイゼルの木（Ｃｏｒｙｌｕｓ），シデの木（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）並びにオリーブの木（Ｏｌｅａ），シダー（ｃｅｄａｒ）（スギ及びビャクシン），スズカケの木（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含むスズカケノキ科，ドクムギ，チモシー，イチゴツナギ，シノドン（Ｃｙｎｏｄｏｎ），カモガヤ，ホルカス（Ｈｏｌｃｕｓ），ファラリス（Ｐｈａｌａｒｉｓ），シーケール（Ｓｅｃａｌｅ），及びモロコシ属を含むイネ目，キク目，及びブタクサ，ヨモギ，及びパリエタリア（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）属のハーブを含むイラクサ目由来のものである。別の重要な吸入アレルゲンは，ダーマトファゴイド（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）及びユーログリファス（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）属のダニのハウスダストによるもの，例えば，レピトグリフィス（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ），グリシファガス（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ），及びペリプラネラ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｒａ）のようなダニの貯留によるもの，例えば，ブラテラ（Ｂｌａｔｅｌｌａ），ペリプラネタ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ），キロノムス（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ），及びクテノセッファィデス（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）のようなゴキブリ，蚊，ノミ由来のもの，更には，猫，犬，馬のような哺乳類由来のもの，蜂（アピダエ（Ａｐｉｄａｅ）超科），スズメバチ（ヴェスピデア（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）超科），及び蟻（フォーミコイダエ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）超科）等のハイメノプテラ（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）属に分類される昆虫に刺されたり噛まれたりすることに起因する毒アレルゲンである。菌類の重要な吸入アレルゲンには，アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属由来のものがある。
【００２２】
本発明の方法で用いられるアレルゲンの例としては，ダニのハウスダスト，雑草の花粉，樹木の花粉，および食物アレルゲンなどが挙げられるが，それに限定されるものではない。本発明の方法で用いられるアレルゲンは，従来の方法で生成されたタンパク質であることが望ましい。あるいは，任意のアレルゲンの天然源に由来する抽出物であってもよい。典型的には，アレルゲン抽出物は少なくとも一つ以上の抽出源アレルゲンのアイソフォームを含む。
【００２３】
解毒したＬＴ自体，または解毒したＬＴと少なくとも一つのアレルゲンの組み合わせのいずれも，例えばリン酸緩衝生理食塩水や炭酸水素ナトリウム水溶液といった，薬学的に許容できる担体を含む医薬化合物（例えばワクチン）として処方される。担体は，化合物中の活性剤と共存可能であり，好ましくは，活性剤の安定化が可能でかつ投与対象に対する毒性を有さないという意味において，「許容できる」ものである必要がある。担体は，投与の様態および経路，並びに標準の薬学的慣例に基づいて選択される。適切な薬学的担体および賦形剤は，その使用における薬学的必要性と同様に，Ｒｅｍｉｎｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓｎにおいて説明されている。
【００２４】
ワクチンの調整方法は，米国特許第４，６０１，９０３号，第４，５９９，２３１号，第４，５９９，２３０号，および第４，５９６，７９２号に開示された方法によってよく知られている。ワクチンは，注射可能な液体またはエマルジョンとして調整される。本発明におけるＬＴ変異体および他のアレルゲンとＬＴ変異体の組み合わせは，水，生理的食塩水，ブドウ糖，グリセロール，エタノール，およびそれらの組み合わせを含む，物理的に許容される添加物と混合されてもよい。加えて，ワクチンは，湿潤剤，乳化剤，またはｐＨ緩衝剤といった，ワクチン効果を高めるための少量の助剤を更に含んでもよい。ワクチンは，非経口注入（例えば，皮下または筋肉注射，あるいは経皮投与）あるいは経鼻投与（例えば，鼻腔内，舌下，または経口投与）を通じて投与されてもよい。また，それ以外の投与方式としては，坐薬投与，経口投与，あるいは局所投与であってもよい。坐薬形態の投与においては，結合剤および担体は，例えばポリアルカレングリコールやトリグリセリドを含んでもよい。経口投与剤は，例えば薬学的有効量のサッカリン，セルロース，炭酸マグネシウムあるいはそれに類する，通常使用される添加物を含んでもよい。これらの配合物は，溶液，懸濁剤，タブレット，錠剤，カプセル，徐放性製剤，または粉剤の形態をとる。
【００２５】
ワクチンは，製剤形態と両立可能な方法，および治療において効果的，防御的，かつ免疫原性的な量で投与される。特に，ワクチンにおける解毒したＬＴ変異体の量は，Ｔｈ‐２型免疫反応の抑制に十分な量である必要がある。投与量は投与される対象，例えば個体の免疫系における抗体産生能，および，必要な場合は，細胞性免疫の応答能に依存して変化する。投与に必要な活性剤の正確な量は，治療担当者の判断に依存する。しかしながら，適切な投与量の範囲は当業者の判断により容易に，マイクログラム単位で決定することが可能である。初期投与および追加投与量のための適切なレジームもまた変化しうるが，そのレジームは後の投与に先立つ初期投与を含む。ワクチンの使用は投与経路に依存し，また投与対象の大きさに応じて変化する。
【００２６】
当業者は，上記の説明に基づき，特に困難なく，本発明を最大限利用することが可能である。したがって，次に述べる実施様態は単に説明のためのものであって，本発明の開示を限定するためのものではない。本明細書で引用した全ての文献は，本明細書に参考として組み込まれる。
【００２７】
実施例１：ＬＴＳ６１Ｋ単体，またはＬＴＳ６１ＫとアレルゲンＤｅｒ  ｐの組み合わせによる，喘息モデルマウスにおけるＴｈ‐２型免疫反応の抑制
本実施例では，雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週）が用いられる。マウスはＳＰＦ（特定病原体除去）動物であり，水と食料は通常通り与える。マウスは，後述する図１に示された予防プロトコルまたは治療プロトコルに従って取り扱う。
【００２８】
予防プロトコル
マウスをランダムに（ｉ）〜（ｉｖ）の４グループに分割し，それぞれ０日目，７日目，１４日目に，（ｉ）生理食塩水（１個体あたり１０μｌ），（ｉｉ）Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（Ａｌｌｅｒｇｏｎ社のＤｅｒ  ｐ（１個体あたり２０μｇ），（ｉｉｉ）ＬＴ（Ｓ６１Ｋ）（１個体あたり１０μｇ），（ｉｖ）ＬＴ（Ｓ６１Ｋ）（１０μｇ）とＤｅｒ  ｐ（２０μｇ）の混合物を，それぞれ処理した。２週間後，マウスをＤｅｒ  ｐに２回（２８日目と３５日目）に感作させ，４２日目にＤｅｒ  ｐ（５０μｇ）の気管内注射を行った。マウスは最後の処理から３日後に殺処分した。
【００２９】
上記の処理を行ったマウスの気道過敏性（ＡＨＲ）レベルを求めるため測定を行った。より詳しくは，殺処分の前に，上記のマウスを様々な濃度のアセチル−β‐メチルコリン塩化物（メタコリン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し，非拘束性ホイールボディー型プレチスモグラフ（Ｂｕｘｃｏ）を用いて気道狭窄の指標であるエンハンスドポーズ値（Ｐｅｎｈ  ｖａｌｕｅ）測定した。図２に示されるように，ＬＴＳ６１Ｋ単体，またはＬＴＳ６１ＫとＤｅｒ  ｐで処理したマウスは，生理食塩水およびＤｅｒ  ｐ単体で処理したマウスより低いエンハンスドポーズ値（Ｐｅｎｈ  ｖａｌｕｅ）を示した。この結果は，ＬＴＳ６１Ｋ単体，またはＬＴＳ６１ＫとＤｅｒ  ｐの投与が，喘息モデルマウスにおける気道過敏性（ＡＨＲ）レベルを低下させたことを示している。
【００３０】
マウスから気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を採取した。トリパンブルーで染色した後，ＢＡＬ液における総細胞数をカウントした。結果として，ＬＴＳ６１Ｋ単体，またはＬＴＳ６１ＫとＤｅｒ  ｐで処理したマウスＢＡＬ液中の細胞数は，生理食塩水およびＤｅｒ  ｐ単体で処理したマウスのＢＡＬ液中の細胞数に比べ少なかった。
【００３１】
ＢＡＬ液におけるサイトカイン（例えばＩＬ‐２，ＩＬ‐５，ＴＮＦ‐α，エオスタシン）およびＴＡＲＣのレベルを，ｅ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＲ＆Ｄ  Ｄｕｏｓｅｔの分析キットを用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。Ｔｈ‐１型サイトカイン（例えば，ＩＬ‐２）レベルに関しては，ＬＴＳ６１Ｋ単体またはＬＴＳ６１ＫとＤｅｒ  ｐで処理したマウスと，生理食塩水およびＤｅｒ  ｐ単体で処理したマウスの間で差は見られなかった。一方，Ｔｈ‐２型サイトカイン（例えば，ＩＬ‐５，エオスタシン）およびＴＡＲＣのレベルに関しては，ＬＴＳ６１Ｋ単体，またはＬＴＳ６１ＫとＤｅｒ  ｐで処理したマウスの方が，生理食塩水およびＤｅｒ  ｐ単体で処理したマウスに比べ低かった。
【００３２】
さらに，上記のマウスから単離した脾臓細胞を，１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ，１ｍＭ塩化ピルビン酸塩，５０ｍＭ  ２‐メルカプトエタノール，２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン，１ｍＭ  非必須アミノ酸，１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン，および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを加えたｃＲＰＭＩ培地で満たした２４ウェルプレートにおいて，１ウェルあたり１×１０６個の細胞濃度で培養した。脾臓細胞は，１０μｇ  Ｄｅｒ  ｐで２〜３日処理した後，上清を回収した。上清中のＩＦＮ‐γ，ＩＬ‐４，およびＩＬ‐１０レベルを，Ｒ＆Ｄ  Ｄｕｏｓｅｔの分析キットを用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により測定した。加えて，１×１０５個の脾臓細胞を，１μｇ  Ｄｅｒ  ｐおよび０．１μｇまたは１μｇ  ＰＨＡ‐Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で満たした９６ウェルプレートに植え付け，培養した。細胞増殖は，ＣＣＫ‐８キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて，培養開始から４８時間，および７２時間後に測定した。脾臓細胞の増殖に関しては，４グループ間で差が見られなかったのに対して，ＬＴ（Ｓ６１Ｋ）単体，またはＬＴ（Ｓ６１Ｋ）とＤｅｒ  ｐで処理したマウスの方が，生理食塩水で処理したマウスに比べ低いＴｈ‐１およびＴｈ‐２型サイトカインレベルを示した。
【００３３】
上記の結果より，ＬＴＳ６１Ｋは，予防プロトコルに従って喘息モデルマウスに投与した場合，Ｄｅｒ  ｐと組み合わせた場合でも単体で用いた場合でも，ＴＡＲＣおよびＴｈ‐２型免疫反応を抑制することが示された。
【００３４】
治療プロトコル
マウスを，アレルゲンＤｅｒ  ｐおよび等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ，Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合物を用いて次のように感作させた。各々のマウスは，０日目と７日目に４０μｇ  Ｄｅｒ  ｐの皮内注射，そして１４日目に，Ｚｏｌｅｔｉｌ  ５０  ｐｌｕｓ  Ｒｏｍｐｕｎを用いた浅麻酔下で，５０μｇ  Ｄｅｒ  ｐの気管内注射を行った。感作したマウスをランダムに（ｉ）〜（ｉｖ）の４グループに分割し，それぞれ浅麻酔下で，（ｉ）生理食塩水（１個体あたり１０μｌ），（ｉｉ）Ｄｅｒ  ｐ（１個体あたり２０μｇ），（ｉｉｉ）ＬＴ（Ｓ６１Ｋ）（１個体あたり１０μｇ），（ｉｖ）ＬＴ（Ｓ６１Ｋ）（１０μｇ）とＤｅｒ  ｐ（２０μｇ）の混合物の鼻腔内投与を行った。投与は１６日目，１８日目，および２０日目の３度行った。２１日目に，Ｄｅｒ  ｐ（５０μｇ）の気管内注射を行い，その３日後（２４日目）に殺処分した。
【００３５】
気道過敏性（ＡＨＲ）および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の総細胞数を，上記の方法を用いて測定した。グループ（ｉｉ）およびグループ（ｉｖ）のマウスは，グループ（ｉ）およびグループ（ｉｉｉ）のマウスに比べ，低い気道抵抗性を示した。加えて，気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の細胞数に関しては，グループ（ｉｉｉ）およびグループ（ｉｖ）のマウスは，グループ（ｉ）およびグループ（ｉｉ）のマウスに比べ少ない値を示した。
【００３６】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中における種々のサイトカインレベルを，サンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて，上記の通りに測定した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中におけるサイトカイン，特にＴｈ‐２型サイトカインであるＩＬ‐５，ＴＡＲＣ，およびエオタキシンのレベルに関して，それぞれＬＴＳ６１Ｋ単体およびＬＴＳ６１ＫとＤｅｒ  ｐで処理したグループ（ｉｉｉ）およびグループ（ｉｖ）のマウスは，それぞれ生理食塩水およびＤｅｒ  ｐ単体で処理したグループ（ｉ）およびグループ（ｉｉ）のマウスに比べ，有意に低い値を示した。図３を参照のこと。
【００３７】
感作させたマウスから単離した脾臓細胞の増殖およびサイトカイン産生を，上記の方法で測定した。脾臓細胞の増殖に関しては，４つのグループ間で有意な差は見られなかった。一方，ＩＦＮ‐γ，ＩＬ‐４，およびＩＬ‐１０のレベルに関しては，グループ（ｉｉｉ）およびグループ（ｉｖ）のマウスは，グループ（ｉ）およびグループ（ｉｉ）のマウスに比べ有意に低い値を示した。
【００３８】
上記の結果より，ＬＴＳ６１Ｋは，図１に示された治療プロトコルに従って喘息モデルマウスに投与した場合，単体でもＤｅｒ  ｐと組み合わせてもどちらでも，ＴＡＲＣおよびＴｈ‐２型免疫反応を抑制することが示された。
【００３９】
実施例２：ＬＴＳ６１Ｋ単体，およびＬＴＳ６１ＫとアレルゲンＤｅｒ  ｐの鼻腔内投与を用いた，喘息モデルマウスにおける局所性および全身性のアレルゲン特異的ＩｇＡ誘導
アレルゲン特異的ＩｇＡは，アレルギー性喘息において保護機能を果たすことが知られている。予防プロトコルに従って処理されたマウス，および治療プロトコルに従って処理されたマウス（図１を参照のこと）両方における，Ｄｅｒ  ｐ特異的ＩｇＡのレベルを次のように測定する。マルチウェルプレートは，コーティングバッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３および３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ＝９．６）中において４℃で一晩中，Ｄｅｒ  ｐ（１０μｇ／ウェル）を用いてコートされた後，ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で洗浄し，０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてブロックした。マウスから採取した血清または気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液サンプルは，希釈した後，コートしたプレートにおいて４℃で一晩中培養した。その後，ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（１：１００００，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｌｇｉｃａｌｓ）をプレートに加えた。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，免疫染色のためにテトラメチルベンシジン（ＴＭＢ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を加えた。図４および５に見られるように，ＬＴＳ６１ＫとアレルゲンＤｅｒ  ｐの組み合わせは，予防プロトコルおよび治療プロトコルに従って処理したマウスの血中および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中における抗Ｄｅｒ  ｐ  ＩｇＡ産生を誘導する。
【他の実施形態】
【００４０】
本明細書で開示された全ての特徴は，他のいかなる特徴とも組み合わせることが可能である。本明細書で開示された特徴は，いずれも，同様，均等，または類似の目的に関わる他の特徴と置き換えることが可能である。したがって，特に明示されていない限り，開示されている特徴はそれぞれ，均等または類似の特徴の一例に過ぎない。
【００４１】
上記の説明に基づき，当業者はたやすく本発明の本質的特徴を理解し，本発明の意図および視野から逸脱することなく，多様な用途および状況に応じて，発明に多様な変形および修正を加えることが可能である。したがって，他の実施様態もまた請求項に含まれる。
【００４２】
【図１】
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【図２】
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【図３（１）】
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【図３（２）】
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【図３（３）】
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【図４（１）】
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【図４（２）】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月1日(2013.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アレルギー反応誘導のための有効量の投与を通じて投与対象者のアレルギー治療に用いられる，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）であって，野生型と比べて実質的に低い毒性を示す，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項２】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，アレルゲンのない医薬組成物として処方される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項３】
請求項１に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，アレルゲンを含む医薬組成物として処方される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記投与対象者が喘息患者，または喘息のリスクを抱える者である，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，変異サブユニットＡを含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項６】
請求項５に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記変異サブユニットＡが，配列番号１における部位５３，６１，６３，６９，９７，１０４，１０６，１１０，または１１２のアミノ酸変異を含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項７】
請求項５に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記変異サブユニットＡが，配列番号１における部位６１または６３のアミノ酸置換を含む，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項８】
請求項７に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，ＬＴＳ６１ＫまたはＬＴＳ６３Ｋである，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項９】
請求項１から３のいずれか一項に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記医薬組成物は，経鼻的にまたは経皮的に投与される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【請求項１０】
請求項９に記載の解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシンであって，前記医薬組成物は，鼻腔内にまたは舌下に投与される，解毒した大腸菌易熱性エンテロトキシン。
【国際調査報告】
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