(57)【要約】  ラベルフリー細胞アッセイを用いてＰＩ３Ｋ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ阻害剤を特徴付ける方法が開示されている。調整解除されたＰＩ３Ｋ経路を有しているか否かで細胞を特徴付ける方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上に、調節解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株を培養するステップと、
ｂ．前記細胞株を前記分子と共にインキュベートして分子処理された細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて前記分子処理された細胞株を分析し、分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞株内で前記分子データ出力と既知のＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を比較して、分子−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較結果を生成するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記既知のＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が、前記培養された調節解除されたＰＩ３Ｋ細胞株とともに前記ＰＩ３Ｋ阻害剤をインキュベートして、ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成するラベルフリーバイオセンサを用いて前記インキュベートされた細胞株を分析することによって生成されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記比較結果が前記分子データ出力と前記ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が類似していることを示す場合に、潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤を識別するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記調整解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株が、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株、ＨＥＲ２過剰発現細胞株、ＰＴＥＮ機能欠失細胞株、またはＰＩ３ＫＣＡ活性化変異細胞株から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株がＡ５４９細胞株またはＨ８２０細胞株であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記ＰＴＥＮ機能欠失細胞株がＡ４細胞株、Ａ７細胞株、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｃ、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｄ、または乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記ＨＥＲ２過剰発現細胞株が、ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、前記ＰＩ３ＫＣ活性化変異細胞株がＭＣＦ−７またはＴ４７Ｄであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記既知のＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２またはウォルトマンニンを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、標準のＰＩ３Ｋ経路細胞株をとともに前記分子をインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いて前記分子処理された細胞株を分析して第２の分子データ出力を生成するするステップと、同一の細胞株内で生成された前記第２の分子データ出力とＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を比較するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記細胞株がＥＧＦ受容体を過剰発現することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記細胞株がＡ４３１細胞株であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上で調節解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株を培養するステップと、
ｂ．前記細胞株をマーカー及び前記分子とともにインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて前記インキュベート細胞株を分析してマーカー−分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞株内の前記マーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較して、マーカー−分子／マーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較結果を生成するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記マーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が、培養された調節解除されたＰＩ３Ｋ細胞株とともにマーカー及びＰＩ３Ｋ阻害剤をインキュベートして、ラベルフリーバイオセンサを用いて前記インキュベートされた細胞株を分析してマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成することによって生成されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記比較結果のインデックスが前記マーカー−分子データ出力と前記マーカーＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が類似していること示す場合に、潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤を識別するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、通常のＰＩ３Ｋ経路細胞株とともに前記マーカー及び分子をインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いてマーカー−マーカー処理された細胞株を分析して第２のマーカー−分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株内で生成された前記第２のマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記マーカー及び分子をトール様受容体細胞株とともにインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いて前記トール様受容体インキュベート細胞株を分析して第３のマーカー−分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株内で生成された前記第３のマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を比較するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記トール様受容体細胞株がＴＬＲ９を発現することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記細胞株がＨｅｐＧ２細胞株であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記マーカーがＴＬＲ９作動物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法であって、前記マーカーがＥＧＦ、ヒスタミンまたはホルスコリンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法であって、前記調整解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株は、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株、ＨＥＲ２過剰発現細胞株、ＰＴＥＮ機能喪失型細胞株、またはＰＩ３ＫＣＡ活性化変異細胞株から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株がＡ５４９細胞株またはＨ８２０細胞株であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、前記ＰＴＥＮ機能欠失細胞株がＡ４細胞株、Ａ７細胞株、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｃ、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｄ、または乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法であって、前記ＨＥＲ２過剰発現細胞株が、ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法であって、前記ＰＩ３ＫＣ活性化変異細胞株がＭＣＦ−７またはＴ４７Ｄであることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ケルセチン、またはウォルトマンニンを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１３に記載の方法であって、ＲＯＣＫ経路活性に関して前記分子をアッセイするステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記アッセイのステップが、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上でＲＯＣＫ阻害剤応答性細胞株を培養するステップと、
ｂ．前記細胞株を前記分子と共にインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて前記インキュベート細胞株を分析して分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞内での前記分子データ出力と既知のＲＯＣＫ阻害剤データ出力とを比較して、分子−ＲＯＣＫ阻害剤比較結果を生成するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＲＯＣＫ阻害剤応答性細胞株が、内部において前記既知のＲＯＣＫ阻害剤によるＲＯＣＫの基本的な活性の阻害がロバストなバイオセンサシグナルを生成する細胞株を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記細胞株はＡ４３１、Ａ５４９、またはＨＴ２９から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１３に記載の方法であって、前記方法が少なくとも２つのマーカーを用いて独立的に実行されることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記マーカーが１）ＴＬＲシグナル伝達経路の活性化因子、２）Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３媒介シグナル伝達の活性化因子、３）Ｒｈｏ−またはＪＡＫ−媒介シグナル伝達の活性化因子、４）前記ＰＫＣ経路の活性化因子、及び５）ｃＡＭＰ−ＰＫＡまたはｃＡＭＰ−ＥＰＡＣ−ＰＩ３Ｋ経路の活性化因子を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記ＴＬＲシグナル伝達経路の活性化因子が、トール様受容体（１または複数）の作動物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記トール様受容体（１または複数）の作動物質が、ポリ（ＩＣ）またはＯＤＮ２００６を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３−媒介シグナル伝達の活性化因子が、プロテーゼ活性受容体サブタイプ２（ＰＡＲ２）の作動物質、またはヒスタミンＨ１受容体の作動物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、前記Ｒｈｏ−またはＪＡＫ−媒介シグナル伝達の活性化因子が、ＡＴＰ感受性ポタシウム（ＫＡＴＰ）イオンチャンネルのオープナーを含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、前記ＰＫＣ経路の活性化因子が、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化因子を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法であって、前記ｃＡＭＰ−ＰＫＡまたはｃＡＭＰ−ＥＰＡＣ−ＰＩ３Ｋ経路の活性化因子が、アデニリルシクラーゼの活性化因子を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項１３に記載の方法であって、前記方法が少なくとも２つのマーカーを用いて独立的に実行されることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記マーカーが、β２−アドレナリン受容体の作動物質、内因性ＧＰＲ１０９Ａの作動物質、ＥＧＦＲ作動物質、及びヒスタミンＨ１受容体の作動物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４２に記載の方法であって、前記マーカーが、前記β２−アドレナリン受容体に対するエピネフリン、ＧＰＲ１０９Ａに対するニコチン酸、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ、及びヒスタミンＨ１受容体に対するヒスタミンであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２９に記載の方法であって、前記細胞株が前記ＨＴ２９細胞株を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記方法が、少なくとも２つのマーカーを用いて独立的に実行されることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、前記マーカーが、ＰＫＣ及びＭＡＰＫ経路の活性化因子、ＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達の活性化因子、ｈＥＲＧ経路の活性化因子、並びにＧｐ−及びＧｉ−媒介シグナル伝達並びにＥＧＦＲ転写活性化の活性化因子を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記ＰＫＣ及びＭＡＰＫ経路の活性化因子が前記ＥＧＦＲ作動物質のＥＧＦを含み、前記ＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達の活性化因子が前記ＩＧＦ１Ｒ作動物質のＩＧＦ１であり、前記ｈＥＲＧ経路の活性化因子が前記ｈＥＲＧ活性化因子のマロトキシンを含み、かつ前記Ｇｑ−及びＧｉ−媒介シグナル伝達並びにＥＧＦＲ転写活性化の活性化因子がＮＴＳ１作動物質のニューロテンシンであることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項３３に記載の方法であって、前記マーカーが少なくともＥＣ７０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５及びＥＣ９９の濃度で添加されることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ１７６３１であり、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ−２９４００２であることを特徴とする方法。
【請求項４９】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上で、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＴ２９及びＨｅｐＧ２である４つの異なる細胞株を培養するステップと、
ｂ．細胞株の各々を前記分子とともにインキュベートして４つのインキュベート細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いてインキュベート細胞株の各々を分析してインキュベート細胞株の各々に関する分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞株内の前記分子データ出力とＲＯＣＫ阻害剤データ出力とを比較して、細胞株の各々に関する分子−ＲＯＣＫ阻害剤比較結果を生成するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記ＲＯＣＫ阻害剤データ出力が、前記ＲＯＣＫ阻害剤を細胞株の各々とともにインキュベートして、ラベルフリーバイオセンサを用いて当該インキュベートされた細胞株の各々を分析して細胞株の各々に関するＲＯＣＫ阻害剤データ出力を生成することによって生成されることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法であって、前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IV、またはＹ−２７６３２を含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４９に記載の方法であって、ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成するステップと、細胞株の各々に関する分子−ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤比較結果を生成するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／２９１，７３６号（出願日２００９年１２月３１日）の、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下における利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路は様々な細胞過程に関与する極めて重要なシグナル伝達系である。ＰＩ３Ｋ経路は、細胞増殖、細胞生存、細胞増幅、及び細胞アポトーシスを含む多くの生理学的な機能を調節する。ＰＩ３Ｋは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）及びＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む幅広い受容体によって活性化される二重脂質（dual lipid）及びプロテインキナーゼ（タンパク質キナーゼ）である。ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）セカンドメッセンジャーＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（３，４）Ｐ２、及びＰＩ（３，４，５）Ｐ３（ＰＩＰ３）の合成に触媒作用を及ぼす。これらのリン酸化脂質は、シグナル伝達事象の間に細胞膜において生成され、様々なシグナル伝達成分の補充及び活性化に寄与する。適切な細胞状況において、これらの脂質は、プロテインセリンスレオニンキナーゼ（タンパク質セリンスレオニンキナーゼ）、プロテインチロシンキナーゼ（タンパク質チロシンキナーゼ）、及びヘテロ三重体グアノシン三リン酸塩（ＧＴＰ）結合タンパク質（Ｇタンパク質）を調節する交換因子を含む様々なシグナル伝達タンパク質との反応を介して、細胞増殖、細胞生存、細胞分化、及び細胞遊走を含む様々な生理学的なプロセス（過程）を調節する。これらのタンパク質は、刺激されていない細胞のサイトソル内に位置しているが、脂質リン酸化反応に応じて、新しく生成されたホスホイノシチドと結合するこれらのタンパク質の能力の故に原形質膜に蓄積する。膜組織において、これらのタンパク質は活性化されて、アクチンの重合、シグナル伝達複合体の集合、及びプロテインキナーゼカスケード（タンパク質キナーゼカスケード）の促進（プライミング（priming））を含む様々な局地的な反応を開始する。この経路の過反応は人間の悪性腫瘍の原因となり、経路内の欠陥は２型糖尿病の原因となる。ＰＩ３Ｋ経路は、糖尿病及び悪性腫瘍を含む人間の病気に関わり、この経路の複雑さを理解することは、治療的介入に関する新しい道をもたらし得る。
【０００３】
ＲｈｏＧＴＰアーゼは、さらに大きなＲａｓスーパーファミリーのサブセットを表し、２０以上の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる。これらは、その〜２０ｋＤのサイズ故に、しばしば小さなＧＴＰアーゼと称され、最も十分に特徴付けられているのはＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２、及びＲａｃ１である。これらは、偏在的に発現したタンパク質であり、インテグリン、成長因子受容体、イオンチャンネル及びＧタンパク質結合受容体の活性化を介した、外部刺激物質からシグナルの導入（transduction）のための分子スイッチとして知られている。受容体または非受容体に依存した機構によるＧＴＰアーゼの活性化は、活性ＧＴＰ結合状態と非活性ＧＤＰ結合状態との間の遷移を介在する。様々な研究は、遺伝子転写、細胞増殖、細胞移動、細胞分裂、細胞形状変化の調節におけるＲｈｏＧＴＰアーゼの重要な役割を明らかにしてきた。従って、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の識別は、新しい薬剤をもたらし得る。本明細書において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のスクリーニングの方法が開示されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書において、ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤をスクリーニングする方法が開示されている。例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニング３つの方法及びこれらの組み合わせが開示される−（１）分子が、ＰＩ３Ｋ経路増幅細胞内のＰＩ３Ｋ阻害剤に対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてスクリーニングされる（２）分子が、そのバイオセンサの細胞応答がＰＩ３Ｋ経路増大細胞内のＰＩ３Ｋ経路関連の寄与を含むマーカーに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて、スクリーニングされる（３）そのバイオセンサインデックス（指標）、特にバイオセンサＤＭＲインデックスがＰＩ３Ｋである化合物の指標として使用されるマーカーのパネル（マーカーのパネルの各々は細胞タイプに関連している）に対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて、分子がアッセイされる。特に、開示されている方法は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をＰＩ３Ｋ阻害剤から分離する方法である。この開示されている方法は、ＰＩ３Ｋ経路調節解除（経路無秩序化）（deregulated）細胞を特徴付ける。
【０００５】
本明細書に開示されているのは、ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）をスクリーニングする方法である。この開示されている方法は、ＲＯＣＫ阻害剤をスクリーニングするために、３つの異なる方法及びそれらの組み合わせを含む−（１）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞内のＲｈｏキナーゼ阻害剤に対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて分子がスクリーニングされる（２）そのバイオセンサ細胞応答がＲｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞内のＲｈｏキナーゼ関連経路の寄与を含むマーカーに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて、分子がスクリーニングされる（３）そのバイオセンサインデックス、特にバイオセンサＤＭＲインデックス、がＲｈｏキナーゼ阻害剤である化合物の指標として使用されるマーカーのパネルに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて分子がアッセイされ、マーカーのパネルの各々は細胞タイプに関連している。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニング方法のフロー図である。
【図２】ＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニング方法のフロー図である。
【図３】ＰＩ３Ｋ阻害剤の表現型及び多重薬効性を識別する方法のフロー図である。
【図４Ａ】異なった用量の既知でありかつ可逆性のＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２への応答における人間の肺癌細胞株Ａ５４９の光バイオセンサＤＭＲシグナルを示す図であり、異なった用量のＬＹ２９４００２を用いた刺激におけるＡ５４９細胞のリアルタイムの動的応答を示している。
【図４Ｂ】異なった用量の既知でありかつ可逆性のＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２への応答における人間の肺癌細胞株Ａ５４９の光バイオセンサＤＭＲシグナルを示す図であり、ＬＹ２９４００２の用量に応じたＬＹ２９４００２誘発Ｎ−ＤＭＲ事象の大きさを示しており、当該大きさは、ＬＹ２９４００２を用いた刺激の後〜５０分の時点において測定されている。
【図５Ａ】異なった用量の既知でありかつ可逆性のＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニン（wortmannin）への応答における人間の肺癌細胞株Ａ５４９の光バイオセンサＤＭＲシグナルを示す図であり、異なった用量のウォルトマンニンを用いた刺激におけるＡ５４９細胞のリアルタイムの動的応答を示している。
【図５Ｂ】異なった用量の既知でありかつ非可逆性のＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニン（wortmannin）への応答における人間の肺癌細胞株Ａ５４９の光バイオセンサＤＭＲシグナルを示す図であり、ＬＹ２９４００２の用量に応じたウォルトマンニン誘発Ｎ−ＤＭＲ事象の大きさを示しており、当該大きさは、ウォルトマンニンを用いた刺激の後〜５０分の時点において測定されている。
【図６Ａ】化合物がＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つのＰＩ３Ｋ阻害剤、ケルセチン及びＬＹ２９４００２の不存在（バッファ）及び存在における休眠状態のＡ４３１細胞内のＥＧＦ誘発ＤＭＲシグナルを示しており、ＥＧＦ濃度は３２ｎＭであった。実験において、ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は１０μモルであり、少なくとも４つの複製が得られ、全ての曲線内のエラーバーは４つの複製の標準偏差を表し、ＥＧＦ、ヒスタミン、ホルスコリン、及びＯＤＮ２００６は、マーカーとみなされており、これらの対応するＤＭＲシグナルは全て、対応する標的から下流のＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含んでいる。
【図６Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つのＰＩ３Ｋ阻害剤、ケルセチン及びＬＹ２９４００２不存在（バッファ）及び存在におけるＡ５４９細胞内のヒスタミン誘発ＤＭＲシグナルを示しており、ヒスタミン濃度は１０μモルであった。実験において、ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は１０μモルであり、少なくとも４つの複製が得られ、全ての曲線内のエラーバーは４つの複製の標準偏差を表し、ＥＧＦ、ヒスタミン、ホルスコリン、及びＯＤＮ２００６は、マーカーとみなされており、これらの対応するＤＭＲシグナルは全て、対応する標的から下流のＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含んでいる。
【図６Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つのＰＩ３Ｋ阻害剤、ケルセチン及びＬＹ２９４００２不存在（バッファ）及び存在におけるＡ５４９細胞内のホルスコリン誘発ＤＭＲシグナルを示しており、ホルスコリン濃度は１６μモルであった。実験において、ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は１０μモルであり、少なくとも４つの複製が得られ、全ての曲線内のエラーバーは４つの複製の標準偏差を表し、ＥＧＦ、ヒスタミン、ホルスコリン、及びＯＤＮ２００６は、マーカーとみなされており、これらの対応するＤＭＲシグナルは全て、対応する標的から下流のＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含んでいる。
【図６Ｄ】化合物がＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つのＰＩ３Ｋ阻害剤、ケルセチン及びＬＹ２９４００２不存在（バッファ）及び存在におけるＨｅｐＧ２細胞内のＯＤＮ２００６誘発ＤＭＲシグナルを示しており、ＯＤＮ２００６濃度は５００ｎＭであった。実験において、ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は１０μモルであり、少なくとも４つの複製が得られ、全ての曲線内のエラーバーは４つの複製の標準偏差を表し、ＥＧＦ、ヒスタミン、ホルスコリン、及びＯＤＮ２００６は、マーカーとみなされており、これらの対応するＤＭＲシグナルは全て、対応する標的から下流のＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含んでいる。
【図７Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、休眠状態のＡ４３１細胞内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２のＤＭＲシグナルを示している。
【図７Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、Ａ５４９細胞内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２のＤＭＲシグナルを示している。
【図７Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２のＤＭＲ変化指数を示している（Ａ５４９細胞に対してはピナシジル、ホルスコリン、及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。この指数は、阻害剤の存在におけるマーカー誘発ＤＭＲシグナルの各々と阻害剤の不存在におけるそれに対応するシグナルを標準化した後に生成された。阻害剤によるマーカーの各々の変化の度合いは、マーカーの関数としてプロットされている。発生した順に左から右に示されているように、変化割合の計算の基礎に用いられるＤＭＲ事象は、Ａ５４９内のピナシジルに関するＮ−ＤＭＲ（刺激から５０分後）、Ａ５４９内のホルスコリンに関するＮ−ＤＭＲ（刺激から５０分後）、Ａ５４９内のヒスタミンに関する初期Ｐ−ＤＭＲ事象（ヒスタミン刺激の後〜１０分）及び後期Ｐ−ＤＭＲ事象（ヒスタミン刺激の後〜３０分）、並びにＡ４３１細胞内のＥＧＦに関する初期Ｐ−ＤＭＲ事象（ＥＧＦ刺激の後〜５分）及びその後のＮ−ＤＭＲ事象（ＥＧＦ刺激の後〜３０分）である。全ての場合においてＤＭＲ事象の各々の大きさは、ＰＩ３Ｋ阻害剤による変化の割合の計算の基礎として用いられる。同一の手順は、図８から１５を作成するために用いられた。
【図８Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、休眠状態のＡ４３１細胞株内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるケルセチンのＤＭＲシグナルを示している。
【図８Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるケルセチンのＤＭＲシグナルを示している。
【図８Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるケルセチンのＤＭＲ変化指数を示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図９Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、休眠状態のＡ４３１細胞内の既知のＰＩ３Ｋγ阻害剤である５−キノキサリン−６−イルメチレン−チアゾリジン−２，４−ジオン（5-quinoxalin-6-ylmethylene-thiazolindine-2,4-dione）のＤＭＲシグナルを示している。
【図９Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内の既知のＰＩ３Ｋγ阻害剤である５−キノキサリン−６−イルメチレン−チアゾリジン−２，４−ジオン（5-quinoxalin-6-ylmethylene-thiazolindine-2,4-dione）のＤＭＲシグナルを示している。
【図９Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋ阻害剤である５−キノキサリン−６−イルメチレン−チアゾリジン−２，４−ジオン（5-quinoxalin-6-ylmethylene-thiazolindine-2,4-dione）のＤＭＲ変化指数を示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１０Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、休眠状態のＡ４３１細胞内の既知のＰＩ３Ｋβ阻害剤II（＋／−）−７−メチル−２−（モルホリン−４−イル）−９−（１−フェニルアミノエチル）−ピリドル[１，２−ａ]−ピリミジン−４−オン（(+/-)-7-Methyl-2-(morpholin-4-yl) -9 -(1-phenylaminoethyl)-pyridol[1,2 -a]-pyrimidin-4-one）のＤＭＲシグナルを示している。
【図１０Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内の既知のＰＩ３Ｋβ阻害剤II（＋／−）−７−メチル−２−（モルホリン−４−イル）−９−（１−フェニルアミノエチル）−ピリドル[１，２−ａ]−ピリミジン−４−オン（(+/-)-7-Methyl-2-(morpholin-4-yl) -9 -(1-phenylaminoethyl)-pyridol[1,2 -a]-pyrimidin-4-one）のＤＭＲシグナルを示している。
【図１０Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋβ阻害剤II（(+/-)-7-Methyl-2-(morpholin-4-yl) -9 -(1-phenylaminoethyl)-pyridol[1,2 -a]-pyrimidin-4-one）のＤＭＲ変化指数を示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１１Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、休眠状態のＡ４３１細胞内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＰＩ−１０３のＤＭＲシグナルを示している。
【図１１Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＰＩ−１０３のＤＭＲシグナルを示している。
【図１１Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＰＩ−１０３のＤＭＲ変化指数を示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１２Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、休眠状態のＡ４３１細胞内のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の既知のネガティブコントロール（negative control）であるＬＹ３０３５１１のＤＭＲシグナルを示している。
【図１２Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の既知の陰性対照であるＬＹ３０３５１１のＤＭＲシグナルを示している。
【図１２Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２の既知の陰性対照であるＬＹ３０３５１１のＤＭＲ変化指数を示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１３Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知の弱いＰＩ３Ｋ阻害剤であるレスベラトロール（resveratrol）のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１３Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤III１−（２−ヒドロキシ−４−モルホリン−４−イル−フェニル）エタノン（1-(2-Hydroxy-4-morholin-4-yl-phenyl)ethanone）のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１３Ｃ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤II２−（モルホリン−４−イル）−ベンゾ[ｈ]クロメン−４−オン（2-(Morpholin-4-yl)-benzo[h]chromen-4-one）のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１４Ａ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１４Ｂ】化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＲＯＣＫ及びＰＫＡに対する二重阻害剤（dual inhibitor）であるＨ−８９のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９に対しては、ピナシジル、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対してはＥＧＦ）。
【図１５Ａ】ＰＩ３Ｋ阻害剤からＲＯＣＫ阻害剤を分離する、細胞／マーカーの高分解能パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、４つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対する既知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９細胞に対しては、ピナシジル、多重イノシン（poly(I:C)）、ＰＭＡ、ＳＬＩＧＫＶ−アミド、ホルスコリン及びヒスタミン、Ａ４３１細胞に対しては、エピネフリン（Ｅｐｉ）、ニコチン酸（ＮＡ）、ＥＧＦ及びヒスタミン（Ｈｉｓ））、ＨＴ−２９細胞に対しては、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、マロトキシン（ＭＴＸ）及びニューロテンシン（ＮＴ）、ＨｅｐＧ２細胞に対しては、ＯＤＮ２００６）。
【図１５Ｂ】ＰＩ３Ｋ阻害剤からＲＯＣＫ阻害剤を分離する、細胞／マーカーの高分解能パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、４つの細胞株に亘るマーカーの同一のパネルに対する既知のＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２のＤＭＲ変化インデックスを示しており、キナーゼ阻害剤は両方とも１０μモルで分析された。
【図１６】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法を示すフロー図である。
【図１７】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法を示すフロー図である。
【図１８】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の表現型及び多重薬効性を識別する方法を示すフロー図である。
【図１９】２つの化合物（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ２７６３２、及び他のＲｈｏキナーゼ阻害剤である「化合物」）の非存在（バッファ）及び存在における既知のＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３１（１０μモル）に反応した人間の肺癌細胞株Ａ５４９の光バイオセンサＤＭＲシグナルを示す図であり、１０μモルのこれら２つの阻害剤のいずれかが、Ｙ２７６３２を用いた刺激の前にＡ５４９を〜１時間事前処理するために用いられた。Ｙ２７６３２を用いたその後の刺激のための細胞の脱感作は、細胞の事前処理に用いられた化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることの指標である。
【図２０】２つの化合物（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ２７６３２、及び他のＲｈｏキナーゼ阻害剤である「化合物」）の非存在（バッファ）及び存在における既知のＡＴＰ感受性ポタシウムイオンチャンネルオープナー（opener）であるピナシジル（１０μモル）に反応した人間の肺癌細胞株Ａ５４９の光バイオセンサＤＭＲシグナルを示す図であり、ピナシジルを用いた刺激の前に、Ａ５４９を〜１時間事前処理するために用いられた。ピナシジルを用いたその後の刺激のための脱感作は、細胞の事前処理に用いられる化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることの指標である。ピナシジルはＲｈｏキナーゼ経路からの寄与を含む光応答をトリガした。従って、化合物によるＲＯＣＫ活性の阻害は、ピナシジルＤＭＲシグナルを減じる。
【図２１Ａ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内のＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２のＤＭＲシグナルを示している。
【図２１Ｂ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肝臓細胞株ＨｅｐＧ２内のＹ−２７６３２のＤＭＲシグナルを示している。
【図２１Ｃ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対するＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２のＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９細胞に対しては、ピナシジル、多重イノシン（poly(I:C)）、ＰＭＡ、ＳＬＩＧＫＶ−アミド、ホルスコリン及びヒスタミン、ＨｅｐＧ２細胞に対しては、ＯＤＮ２００６）。
【図２２Ａ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内のＲｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔのＤＭＲシグナルを示している。
【図２２Ｂ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肝臓細胞株ＨｅｐＧ２内のＲｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔのＤＭＲシグナルを示している。
【図２２Ｃ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対するＲｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔのＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９細胞に対しては、ピナシジル、多重イノシン（poly(I:C)）、ＰＭＡ、ＳＬＩＧＫＶ−アミド、ホルスコリン及びヒスタミン、ＨｅｐＧ２細胞に対しては、ＯＤＮ２００６）。
【図２３Ａ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内のＲｈｏキナーゼ阻害剤ＩＶのＤＭＲシグナルを示している。
【図２３Ｂ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肝臓細胞株ＨｅｐＧ２内のＲｈｏキナーゼ阻害剤ＩＶのＤＭＲシグナルを示している。
【図２３Ｃ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対するＲｈｏキナーゼ阻害剤ＩＶのＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９細胞に対しては、ピナシジル、多重イノシン（poly(I:C)）、ＰＭＡ、ＳＬＩＧＫＶ−アミド、ホルスコリン及びヒスタミン、ＨｅｐＧ２細胞に対しては、ＯＤＮ２００６）。
【図２４Ａ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肺癌細胞株Ａ５４９内のＣＤＫ１／２阻害剤IIIのＤＭＲシグナルを示している。
【図２４Ｂ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、肝臓細胞株ＨｅｐＧ２内のＣＤＫ１／２阻害剤IIIのＤＭＲシグナルを示している。
【図２４Ｃ】化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤であることを判定する、細胞／マーカーの特異性パネルベースのバイオセンサ細胞プロファイリング方法を示す図であり、２つの細胞株に亘るマーカーのパネルに対するＣＤＫ１／２阻害剤IIIのＤＭＲ変化インデックスを示している（Ａ５４９細胞に対しては、ピナシジル、多重イノシン（poly(I:C)）、ＰＭＡ、ＳＬＩＧＫＶ−アミド、ホルスコリン及びヒスタミン、ＨｅｐＧ２細胞に対しては、ＯＤＮ２００６）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
Ａ．ＰＩ３Ｋ
ＰＩ３Ｋは、二重脂質及びプロテインキナーゼを構成しており、かつ配列相同性、基質選択性及び機能における違いに従っている３つの主要なクラス：I、II及びIIIを含んでいる。ＰＩ３Ｋの主要なクラスの各々は、異なる細胞シグナル伝達プロセスに関与し、配列相同性または調節機構のいずれかに従ってさらに分類され得る。クラスＩのＰＩ３Ｋは、触媒サブユニット及び調節サブユニットを構成するヘテロ二量体である。クラスＩのＰＩ３Ｋの触媒サブユニットは、Ｐｉｋ３ｃａ、Ｐｉｋ３ｃｂ、Ｐｉｋ３ｃｄ及びＰｉｋ３ｃｇと各々称される４つの異なった遺伝子によって記号化されている４つのイソ型：ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ及びｐ１１０γを含む。触媒サブユニットに対応して、クラスＩのＰＩ３Ｋのイソ型は、ＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγと表記される。それらの調節サブユニットとの接続及び活性化機構に基づいて、クラスＩのＰＩ３Ｋのイソ型は、２つのカテゴリ：クラスＩＡ（ＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ及びＰＩ３Ｋδ）及びクラスＩＢ（ＰＩ３Ｋγ）に更にグループ分けされ得る。クラスＩＡのＰＩ３Ｋのイソ型は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって活性化され得る。クラスＩＡのＰＩ３Ｋの関連する調節サブユニットは、ｐ８５α、ｐ８５β、ｐ５５α、ｐ５５γ及びｐ５０αを含む。ＰＩ３Ｋ調節サブユニットは、休眠状態の細胞内でｐ１１０触媒サブユニットを低活性化状態に維持し、活性化された増殖因子受容体またはアダプタータンパク質のホスホチロシン残渣との直接的な反応によって、自身の活性化を仲介する。ｐ１１０と活性化されたＲａｓタンパク質との直接結合（増殖因子刺激によっても誘発される）は、ＰＩ３Ｋ活性を更に刺激する。クラスＩＢのＰＩ３Ｋの固有の触媒サブユニットは、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）によってのみ活性化され、ｐ８５タンパク質に関連しないアダプタに特異的に結合し得るｐ１１０γである。病態生理学的研究は、腫瘍形成を伴うＰＩ３Ｋα、血栓形成を伴うＰＩ３Ｋβ、免疫機能を伴うＰＩ３Ｋδ、及び炎症を伴うＰＩ３Ｋγの間の密接な関係を明らかにしてきた。クラスIIのＰＩ３Ｋは、単量体であり、調節サブユニットを持たず、人体内の３つのイソ型：ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２β及びＰＩ３Ｋ−Ｃ２γを含み、これらの最初の２つは、大部分の血管において発現し、    最後の１つは肝臓において限定的に発現する。クラスIIIのＰＩ３Ｋは、ヘテロ二量体であり、調節サブユニット（ｐ１５０）及び触媒サブユニット（Ｖｐｓ３４）から構成されている。Ｖｐｓ３４は、クラスＩのＰＩ３Ｋの触媒サブユニットとかなりの配列類似性を有している。クラスII及びIIIのＰＩ３−Ｋは、ＰＩ（３）Ｐ及びＰＩ（３，４）Ｐ２の合成を介した細胞内輸送において重要な役割を果たしている。
【０００８】
異なったクラスのＰＩ３Ｋが基質としてのリン脂質における選好性を有しており、ＰＩ３Ｋは、受容体チロシンキナーゼ及び他の細胞表面受容体によって活性化され、脂質セカンドメッセンジャーＰＩＰ３（ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート）が合成される。そして、ＰＩＰ３は、リン酸結合ドメインを含んでいるタンパク質を補充して活性化する原形質膜においてドッキング部位として機能する。これらの下流のＰＩ３Ｋエフェクタは、（i）Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢとしても知られている）、ＰＤＫ１（ホスホイノシチド依存性キナーゼ１）及びＴｅｃファミリーキナーゼ等の、細胞の成長、生存及び増殖を促進するプロテインキナーゼ；（ii）細胞運動性及び膜輸送を仲介するＧＴＰアーゼを調節するＧＡＰ（ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）及びＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子）；及び（iii）重要なシグナル伝達複合体の集合体の核になる足場タンパク質を含む。ＰＫＢ／Ａｋｔは、細胞シグナル伝達の下流にあるセントラルノード（central node）であり、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）、Ｂｃｌ−２−関連デスプロモータ（Bcl-2-associated death promoter）（ＢＡＤ）カスパーゼ９、ｐ７０Ｓ６−キナーゼ（ｐ７０Ｓ６ｋ）、ｅＩＦ４Ｅ−結合プロテイン（４Ｅ−ＢＰ１）及びフォークヘッドボックス転写因子（forkhead box transcription factor）（ＦＯＸＯ）等の幅広いタンパク質を、ポジティブまたはネガティブな態様で調節する。更に、ＰＩ３Ｋ経路の活性化は、２つのホスホイノシチドホスファターゼ、ＰＴＥＮ及びＳＨＩＰによって、ネガティブに調節される。ＰＴＥＮ（phosphatase and tensin homolog）は、ＰＩＰ３の３’ＯＨグループを脱リン酸化してＰＩＰ２に変換する３’ホスファターゼであり、腫瘍抑制因子として作用する。多くの位置で分岐してＲａｓ及びｐ５３に関与する様な多くの他の経路からのシグナルを一体化するＰＩ３Ｋ経路は、細胞シグナル伝達ネットワークの重要な伝達カスケードである。このように、ＰＩ３Ｋは、単一のセカンドメッセンジャー、ＰＩＰ３を用いて、細胞外のホルモンキュー（hormonal cue）を様々な細胞プロセスを制御する細胞内シグナル伝達タンパク質にリンクさせる。
【０００９】
ＰＩ３Ｋイソ型は、異なった基質特異性を生じさせるのみならず、異なった発現パターン及び調節様式も生じさせる。ＰＩ３Ｋイソ型の発現パターン及び機能は、異なったタイプの細胞において著しく異なる。ＰＩ３Ｋの構成的活性化及びＰＴＥＮの機能の損失は、様々な癌においてしばしば共存する。新たな証拠は、ＰＩ３Ｋ経路が癌内で最も高頻度で活性化されるシグナル伝達経路であることを示唆する。第１に、ＰＩ３Ｋのｐ１１０αイソ型は、原発腫瘍の範囲内の高頻度の変異によって活性され、今まで調査された全ての癌のタイプに亘る累積度数において〜１５％と推定され、このことは、ｐ１１０αがヒトゲノム内で最もよく変異するキナーゼだろうことを示唆する。第２に、ＰＩＰ３の脱リン酸化によってＰＩ３Ｋシグナル伝達を遮断するホスファターゼＰＴＥＮは、変異、遺伝子欠失、またはエピジェネティックサイレンシング（epigenetic silencing）によってしばしば不活性化される特徴がはっきりした腫瘍抑制因子である。さらに、ＰＩ３Ｋは、癌遺伝子Ｒａｓによってアロステリックに（allosterically）活性化され、ＰＩ３Ｋを活性化させる多くのチロシンキナーゼは、それ自体が癌内の変異または増幅の標的である。それとともに、これらの観察は、各々がＰＩ３Ｋシグナル伝達を促進する癌内における遺伝子変化のネクサス（nexus）を明らかにし、ＰＩ３Ｋ活性化が、腫瘍形成における最も重要な段階であろうことを示唆する。ｐ１１０の非αイソ型は、癌特有の変異を表さない。しかし、これらは、癌内でしばしば異なった態様で発現され、ｐ１１０αと対照的に、ｐ１１０の野生型非αイソ型は、細胞培養における過剰発現の際に発癌性である。細胞、特に無秩序なＰＩ３Ｋ経路活性を有する細胞を特徴付ける方法が、本明細書において開示されている。
【００１０】
キナーゼを活性化する変異を伴う癌は、これらの特定のキナーゼの適切な阻害剤を用いて効果的に治療される可能性が高い。ある重要なシグナル伝達経路内のキナーゼを標的にして人間の病気の治療のための薬剤を開発する戦略は、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、スニチニブ、及びラパチニブを含むキナーゼ阻害剤の成功例によって非常に支持される。ｐ１１０のイソ型は、有望な薬剤標的になっている。炎症及び自己免疫疾患（ｐ１１０δ、ｐ１１０γ及びｍＴＯＲ）、血栓症（ｐ１１０β）、ウイルス感染（ＰＩＫＫ）、及び癌（ｐ１１０α、ｍＴＯＲ他）の治療のための小分子ＰＩ３Ｋ阻害剤の開発が進行中である。
【００１１】
薬剤を用いてＰＩ３−Ｋファミリーを標的にすることにおける重要な試みは、ここのＰＩ３−Ｋイソ型がどのように通常の生理機能を制御するのかを知ることである。なぜならば、このことが特定のイソ型を標的にするための治療域を決定するからである。ＰＩ３−Ｋイソ型の活動をアンカップル（uncouple）するための遺伝学研究法は、これらの酵素の複雑な協調制御によって妨げられる。ｐ１１０αまたはｐ１１０β（２つの最も幅広く発現されるＰＩ３−Ｋ）のホモ接合体欠失は、マウス内の胚性致死性をもたらす。これらのイソ型のヘテロ接合体欠失は、ｐ８５調整サブユニットの補償ダウンレギュレーション（compensatory down regulation）によって複雑になる。ｐ８５イソ型のノックアウト（knockout）は、ＰＩ３−Ｋシグナル伝達における奇異性増大を誘発し、ｐ８５がＰＩ３−Ｋ活性を促進し（ｐ１１０触媒サブユニットを固定化することによって）かつそれを阻害する（基本的な活性を低下させかつ根本的なシグナル伝達複合体を隔離することによって）という事実をしめす。同様の効果は、ＰＩＫＫ間でも観察され、その場合ＤＮＡ−ＰＫの欠如が、ＡＴＭ及びｈＳｍｇ−１の発現を変化させる。これらの補償的機構に加えて、ＰＩ３−Ｋは、阻害剤やノックアウトされたものに異なった表現型を誘導させ得るキナーゼ非依存シグナル伝達活性を有する。例えば、ｐ１１０γノックアウトマウスは、慢性的圧迫過負荷に応じて心臓障害を発症し、その一方で、ｐ１１０γキナーゼデッド（dead）対立遺伝子を有するマウスはそうならなかった。この場合、差異は、ノックアウト内で阻害されているがキナーゼデッド対立遺伝子または阻害剤によって影響を受けないｐ１１０γによるＰＤＥ３Ｂのアロステリックな活性化に端を発する。
【００１２】
細胞透過性の小分子阻害剤は、生理学的関連モデルシステムにおける薬剤を用いたキナーゼの阻害の表現型の重要性を直接評価することを可能にする。薬理学的な標的検証の挑戦は、よく特徴付けられた、選択的なキナーゼ阻害剤が知られていることである。このことは、ＰＩ３−Ｋに関して特に当てはまっている。なぜなら、２つの主要な薬理学的手段、ウォルトマンニン及びＬＹ２９４００２が、これらのファミリー内で広く活性化する故である。
【００１３】
ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤は、様々な管内分析生化学的阻害アッセイを用いて最も良く発見される。生細胞におけるＰＩ３Ｋ基質リン酸化反応レベルの判定方法も、ＰＩ３Ｋの細胞活性を測定するために、かつＰＩ３Ｋ阻害剤をスクリーニングするために開発される。しかし、ＰＩ３Ｋの多くの潜在的な基質も、いくつかの他のタンパク質キナーゼによって潜在的にリン酸化される故に、細胞抽出物内で観察されるリン酸化反応の程度は、ＰＩ３Ｋの活性を正確に示すものでは必ずしもない。従って、潜在的な阻害剤の影響を含む細胞内のＰＩ３Ｋ活性のレベルの実証は、問題を抱えていた。
【００１４】
ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイが本明細書において開示されている。ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイは、生物学的構成要素（すなわち生細胞）、検出要素、及び構成要素の両方に関連しているトランスデューサを含んでいる。使用されるトランスデューサのタイプに応じて、細胞全てを検知するラベルフリーバイオセンサは、音バイオセンサ、電気的バイオセンサ及び光学的バイオセンサの３つの大きく分類され得る。
【００１５】
ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いたＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニング方法、特にバイオセンサ細胞プロファイリングアッセイを用いてＰＩ３Ｋ阻害剤のＰＩ３Ｋ亜類型の選択制を識別する方法が、本明細書において開示されている。
【００１６】
Ｂ．ＲｈｏＧＴＰアーゼ及びＲｈｏキナーゼ
ＲｈｏＧＴＰアーゼは、さらに大きなＲａｓスーパーファミリーのサブセットに相当し、かつ２０以上の細胞内シグナル伝達プロテインで構成される。これらは、その〜２０ｋＤのサイズの故に小さいＧＴＰアーゼとしばしば称され、最も十分に特徴付けられているものはＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２、及びＲａｃｌである。これらは、インテグリン、成長因子受容体、イオンチャンネル、及びＧタンパク質結合受容体分子の活性化を介して外部刺激からのシグナルを伝達するためスイッチとして知られている普遍的に発現されたタンパク質である。受容体及び非受容体依存機構によるＧＴＰアーゼの活性化は、活性ＧＴＰ束縛状体と不活性ＧＤＰ束縛状体との間の遷移を仲介する。多くの研究は、遺伝子転写、細胞増殖、細胞移動、細胞分裂、及び細胞形状変化の調整におけるＲｈｏＧＴＰアーゼの重要な役割を明らかにしてきた。従って、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の識別は、新しい薬剤をもたらし得る。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法が、本明細書において開示されている。
【００１７】
ＲｈｏＧＴＰアーゼ活性の調節は、ファミリーメンバの各々に特化している調節タンパク質によって制御される。これらの調節タンパク質は、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、及びグアニンヌクレオチド解離阻害因子（ＧＤＩ）の３つの一般的なカテゴリに分類される。ＧＥＦは、ＧＤＰのＧＴＰへの交換を促進するように作用するので、ＧＴＰアーゼを活性化する。ＧＡＰは、ＧＤＰのＧＴＰへの加水分解を制御し、適切な基本的活性レベルの維持に不可欠である。ＧＤＩタンパク質は、異なったＧＴＰアーゼに対する様々な親和性を有しており、これらが活性化されるのを防止する。ＧＥＦ、ＧＡＰ及びＧＤＩによる異なった調節は、細胞内のＲｈｏタンパク質の選択的空間的活性化／非活性化を可能にする。
【００１８】
Ｒｈｏタンパク質は、６０以上の既知の下流エフェクタを有し、これらのエフェクタは、所定のＲｈｏＧＴＰアーゼタンパク質に対する活性化の結果を決定する。ＲｈｏＧＴＰアーゼの下流標的は、活性化が細胞形態、極性、小胞輸送、または細胞サイクル制御において役割を果たすかを示す。活性化されたＲｈｏＡは、基質への細胞付着のテンション（tension）に影響し、この基質は細胞内のアクチンを十分有するストレス繊維によって維持される。その一方で、Ｒａｃｌ及びＣｄｃ４２は、葉状仮足及び糸状仮足のようなアクチンを多く含む末梢突起の構造に影響を与える。ほ乳類の細胞におけるＲｈｏＧＴＰアーゼ活性化の最も一般的な作用は、アクチン細胞骨格の再組織化を経る。アクチン重合を制御するタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）様キナーゼ、ロテキン、シトロン、ＰＩＰ５−キナーゼ（ホスファチジリノシトール  ４−ホスフェート  ５−キナーゼ）、及びｐ１４０ｍＤｉａであるＰＫＮを含む多くのＲｈｏ下流標的が識別される。
【００１９】
ＲＯＣＫとも称されるＲｈｏキナーゼは、ＲｈｏＡの主要なエフェクタである。ＲＯＣＫは、遺伝子産物ＲＯＣＫI及びＲＯＣＫII（各々Ｒｏｋｂ／ｐ１６０ＲＯＣＫ及びＲｏｋａとしても知られるキナーゼ−１及び−２を含むｒｈｏ関連コイルドコイル）に対応する〜１６０ｋＤａのセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。この２つのキナーゼは、触媒キナーゼ領域において８９％の同一性を有するヒト内で６４％の全体的同一性を有する。両方のキナーゼは、コイルドコイル領域、及びＣ１保存領域によって分割されたプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含む。Ｒｈｏキナーゼは、自身のＣＯＯＨ−終端ドメインによって自動的に調節され、当該ドメインは活性部分上に折り返されて自身のキナーゼ活性を阻害する。ＲｈｏＡの活性ＧＴＰ付属形式のみが、ＲＯＣＫに結合し、タンパク質の不活性化を遮断する。Ｒｈｏの活性型がＲＯＣＫに結合している限り、キナーゼは活性状態となる。Ｒｈｏキナーゼは、アラキドン酸及びスフィンゴシルホスフォリルコリンによっても活性化され得る。カスパーゼによる阻害性ＣＯＯＨ−末端の分割は、アポトーシスの間のＲＯＣＫ活性の増大をもたらし得る。
【００２０】
セリン／スレオニンキナーゼＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２は、活性化されたＲｈｏＧＴＰアーゼの直接的な標的であり、異常なｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝達は、多くのヒトの病気に関わる。ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２は、多くの成長因子、インテグリン活性化及び細胞ストレスを含む細胞外刺激に応じて活性化されたＲｈｏの活性化された下流である酵素のＡＧＣサブファミリーのメンバーに密接に関連している。ＲＯＣＫ活性化は、力の発生及び形態変化を促進する協奏的な一連の事象をもたらす。これらの事象は、細胞運動、付着、平滑筋収縮、神経突起退縮、及び食作用等の多くのアクチン−ミオシン介在プロセスに直接的に寄与する。さらに、ＲＯＣＫキナーゼは、増殖、分化、アポトーシス、及び発癌性形質転換に関与し、これらの反応は細胞タイプに依存するものであり得る。
【００２１】
ＲＯＣＫの活性化は、その後の異なった下流標的のリン酸化をもたらす。Ｒｈｏキナーゼの最も良く知られた標的は、は、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）である。ミオシンホスファターゼもＲｈｏキナーゼによってリン酸化され、この反応は、リン酸化されたＭＬＣの像体をもたらす。さらに、ＲＯＣＫは、それらの活性化ループにおいて保存されているスレオニンにおいて、ＬＩＭキナーゼ−１及びキナーゼ−２（ＬＩＭＫ１及びＬＩＭＫ２）をリン酸化し、ＬＩＭＫ活性、及びＦアクチン供給活性を遮断するその後のコフィリンタンパク質のリン酸化を増大させる。アクチン細胞骨格再構築に関与する多くの他のタンパク質は、ＲＯＣＫによってリン酸化される。
【００２２】
ＲＯＣＫ酵素は、細胞形態、ストレス繊維形成及び機能、細胞付着、細胞移動及び浸潤、上皮間葉転換、変形、食作用、アポトーシス、神経突起退縮、細胞質分裂、並びに細胞分化を含む複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。このように、ＲＯＣＫキナーゼは、癌、高血圧、血管痙攣、ぜんそく、早期陣痛、勃起不全、緑内障、アテローム性動脈硬化、心筋肥大及び神経疾患を含む様々な病気を治療する阻害剤の開発のための潜在的な標的を表す。
【００２３】
ぜんそくは、気管内の炎症細胞の浸潤及び活性化、並びに神経伝達物質及び炎症性メディエータを含む様々な刺激に対する気道過敏性に関連している早発性または遅発性ぜんそく反応によって特徴付けられる慢性的な気管炎症である。ぜんそくにおいて、補充された炎症細胞によってまたは常在構造細胞（resident structural cell）によって気管内に放たれたる炎症メディエータは、気管収縮作用の増大によって生ずる気道過敏性をもたらす。さらに、慢性的な炎症は、慢性的なぜんそくにおける固定的な気道閉塞及び気道過敏性の進展に寄与する気道の再構築を促進する。気道の再構築は、気管壁における細胞外基質タンパク質の過剰な堆積（線維症）及び気道を取り囲む収縮性の気管平滑筋の存在量の増加等のいくつかの重要な特徴を含む。気道過敏性は、筋肉内の内因性の機能変化によってまたは筋肉機能の神経性及び非神経性の制御における変化によってもたらされる気管平滑筋の収縮の増加によって部分的に説明され得る。さらに、気道過敏性の進展は、上皮層の損傷、粘膜腫脹、杯細胞過形成、及び気管壁の再構築等の、軌道内の物理的変化によって維持される。気道再構築は、網状板（lamina reticularis）の肥大、上皮下細胞外基質堆積の増大（線維症）、気道を取り囲む収縮性の気管平滑筋の存在量の増加によって特徴付けられる。現在のぜんそく治療法は、これらの特徴を満足に阻害できていない。現在、アレルギー性ぜんそくの急性及び慢性の特徴の治療は、β２−アドレナリン受容体作動物質（アゴニスト）（agonist）及び副腎皮質ステロイドによって、主になされている。過剰な気管平滑筋収縮によってもたらされる急性の気管支痙攣は、ほとんどの患者において、吸入するβ２−アドレナリン受容体作動物質によって満足に解消され得る。なぜなら、β２−アドレナリン受容体作動物質が気管平滑筋の弛緩をもたらすからである。しかし、不幸にも、患者はβ２−アドレナリン受容体作動物質に対する耐性を生じ得、これらの化学物質は、それらが体外において気管再構築（例えば、気管平滑筋増殖）の個々の特徴を阻害し得るという報告にもかかわらず、体内において気管炎症及び気管再構築に僅かな効果しかもたなくなる。吸引される副腎皮質ステロイドは、軽症の持続性ぜんそく、穏やかなぜんそく及び重症のぜんそくを含む様々なアレルギー性の疾患の調節の主力であり、ぜんそくを特徴付ける炎症プロセスの強度を低減する幅広い作用でよく知られている。しかし、不幸にも、気道炎症のいくつかの特徴（例えば、好中球増加）は、副腎皮質ステロイド治療に対して比較的無反応であり得る。さらに、副腎皮質ステロイドは、気管再構築の特徴を阻害することに部分的にしか効果を示さない。従って、副腎皮質ステロイドは気道再構築のいくつかの特徴（線維症、気管平滑筋肥大、粘液腺肥大）を効果的に抑えるが、気管壁再構築を元に戻すのにあまり効果を持たない。β２−アドレナリン受容体作動物質及び副腎皮質ステロイド治療に関する制限は、代替の薬品標的の調査及び識別を促す。これらの中で、Ｒｈｏキナーゼが、ぜんそくにおける気道過敏性の治療に対する潜在的な標的として浮上した。Ｒｈｏキナーゼは、ＲｈｏＡ及び単量体ＧＴＰ結合タンパク質のエフェクタ分子であり、ミオシンホスファ���ーゼの不活性化を介してＣａ２＋感作をもたらす。Ｒｈｏ−キナーゼの主たる生理学的機能は細胞の収縮、移動及び増殖を含む。これらの作用は、例えば、気流制限、気道過敏性、β−アドレナリン作用性脱感作、好酸球補給、及び気道再構築等の、ぜんそくの病態生理学的特徴に関連すると考えられる。
【００２４】
Ｃ．方法
本明細書にて開示されている方法、及びこの方法において使用され得る合成物及び可動物は、材料、物質、分子及びリガンド等の多くの異なったクラスから生じ得る。例えば、ＥＧＦＲ活性に関するマーカーとしてのＥＧＦ等の、マーカーと称される、ラベルフリーバイオセンサのアッセイに特化したこれらのクラスの特定のサブセットも開示されている。
【００２５】
分子混合物等の、これらのクラスの混合物も開示され、かつ開示される方法において使用され得ることが理解される。
【００２６】
いくつかの方法において、不明な分子、テスト分子及び薬剤候補分子、並びに既知の分子が使用され得る。
【００２７】
いくつかの方法または状況において、変化またはモジュレータが役割を果たす。同様に、既知のモジュレータが使用され得る。
【００２８】
いくつかの方法、及び合成物において、細胞が関連し、細胞が培養され、細胞培養が本明細書にて説明されるように使用され得る。
【００２９】
本明細書において開示されている方法は、バイオセンサを使用するアッセイに関する。いくつかのアッセイにおいて、アッセイは、アゴニズム（agonism）またはアンタゴニズム（antagonism）モードで実施される。しばしば、アッセイは、材料、物質または分子等の１または複数のクラスを用いて細胞を処理・治療することを含む。本明細書に記載されているように、対象者も処理・治療され得ることが理解される。
【００３０】
いくつかの方法において、例えば、分子と細胞との間の接触がなされ得る。説明される方法において、ＤＭＲ応答のようなバイオセンサ応答として現れる細胞応答等の応答が検出され得る。これら及び他の応答がアッセイされ得る。いくつかの方法において、バイオセンサからのシグナルは、ロバストなバイオセンサシグナル又はロバストなＤＭＲシグナルであり得る。
【００３１】
ラベルフリーバイオセンサを用いる開示される方法は、第１のプロファイル、第２のプロファイル及び変化プロファイル等のプロファイルを生成し得る。これらのプロファイル及びその他のものは、例えば分子に関する判定をするために使用され得、かつ本明細書にて説明されている任意のクラスとともに使用され得る。
【００３２】
本明細書にて開示されている分子、細胞、材料または物質等の化合物または合成物のライブラリ（library）及びパネル（panel）も開示される。
【００３３】
開示される方法は、バイオセンサシグナル、ＤＭＲシグナル、正規化、対照群、陽性対照、変化比較（modulation comparison）、インデックス、バイオセンサインデックス、ＤＭＲインデックス、分子バイオセンサインデックス、モジュレータＤＭＲインデックス、分子変化インデックス（molecule modulation index）、既知のモジュレータバイオセンサインデックス、既知のモジュレータＤＭＲインデックス、マーカーバイオセンサインデックス、マーカーＤＭＲインデックス、マーカーのバイオセンサシグナルの変化、ＤＭＲシグナルの変化、増強、及びインデックスの類似度等の様々な特性を使用し得る。
【００３４】
本明細書にて開示されている合成物、可動物またはその他の全ては、本明細書に開示されている任意の方法で特徴付けられ得る。
【００３５】
より高い及び抑制する並びに同様の用語等の特性評価に依存する方法が開示される。
【００３６】
いくつかの方法において、受容体又は細胞標的が使用される。いくつかの方法は、シグナル伝達経路（１または複数）、並びに分子によって処理された細胞及び他の細胞処理に関する情報を提供し得る。
【００３７】
いくつかの実施例において、効能または有効性が特徴となり、（例えば、薬剤候補分子の）直接的作用がアッセイされ得る。
【００３８】
１．ＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニング方法
ラベルフリーバイオセンサ細胞アッセイを用いてホスホイノシチド３−キナーゼ ＰＩ３Ｋ阻害剤をスクリーニングして特徴付ける方法が、本明細書において開示されている。この開示されている方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤をスクリーニングするための３つの異なった方法及びそれらの組み合わせを含む。
【００３９】
この３つの方法は：（１）ＰＩ３Ｋ経路増幅細胞内のＰＩ３Ｋ阻害剤に対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて分子がスクリーニングされ、当該ＰＩ３Ｋ経路増幅細胞が、ＰＩ３Ｋ経路無秩序細胞またはＰＩ３Ｋ経路過活性細胞である方法；（２）マーカーに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて分子をスクリーニングする方法であって、マーカーのバイオセンサ細胞応答がＰＩ３Ｋ経路増幅細胞内のＰＩ３Ｋ関連経路寄与を含む方法；及び、（３）マーカーのパネルに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて分子がアッセイされ、マーカーのパネルの各々は細胞タイプに関し、これらのバイオセンサインデックス、特にバイオセンサＤＭＲインデックスが、ＰＩ３Ｋ阻害剤である合成物を示すものとして用いられる方法である。特に、いくつかの実施例において、開示されている方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤からＲＯＣＫ阻害剤を分離可能である。開示されている方法は、ＰＩ３Ｋ経路が調節解除されているか否かに関して細胞を特徴付けるためにも使用され得る。
【００４０】
無傷細胞の環境内の新規な合成物の作用及び細胞性因果関係を、それらの標的タンパク質を介して分析する能力は、ＰＩ３Ｋイソ型等の細胞内標的タンパク質に関与する疾患の治療のための縫製物の有用性を判定するために重要である。理想的には、細胞ベースの活動を確立するために使用される方法は、関心のある標的タンパク質に特異的であり、多くの潜在的な阻害剤をテストすることを受け入れ、好ましい合成物の識別を許容するために定量的であるべきである。
【００４１】
薬剤の発見における支配的なパラダイムは個別の薬剤標的状で活動するために最大限選択されたリガンドをデザインするコンセプトであるが、多くの有効な薬剤、特にＰＩ３Ｋ素材剤を含むキナーゼ阻害剤は、単一の標的よりも複数のタンパク質の変化を介して作用する（すなわち、複合薬理（ポリファーマコロジ（polypharmacology）））。さらに、薬剤薬理学は、しばしば細胞または組織依存性を示す（すなわち、表現型の薬理）。表現型的プロファイルの生成に関与する細胞因子はほとんど知られていないが、転写後の調節、シグナル伝達カスケードの区分化、受容体のオリゴマー化及び構造性の受容体活性を含む因子が、「表現型薬理」と称されるに至る薬剤の薬理に影響を与え得るという実質的な証拠が存在する。従って、ＰＩ３Ｋ阻害剤を含む薬剤又は薬剤候補分子の作用の主たるモードは、薬理−複合薬理、表現型薬理及びシステム（統合）薬理（system （integrative）pharmacology）の少なくともいくつかのタイプを合わせたものである。
【００４２】
ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイは、しばしば、経路バイアスされていないが経路に敏感な態様の統合読み出し情報をもたらす。結果として、ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイは、受容体生物学及び薬剤薬理学の複雑性を反映する。ラベルフリーバイオセンサの非特異的な性質及び細胞生物学の複雑性（例えば、冗長なシグナル伝達要素、及び補償されたフィードバックループ）に加え、通常、単一標的ベースのラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイは、高い割合の偽陽性をもたらす。
【００４３】
開示されている方法は、僅かな偽陽性を伴う潜在的なＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニングのために、３つのタイプのラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを組み合わせる。ＲＯＣＫが、しばしばＰＩ３Ｋ経路と結合するので、ＲＯＣＫは、細胞タイプ依存態様及び受容体依存態様にてＰＩ３Ｋの上流または下流になり得、開示されている方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤からＲＯＣＫ阻害剤を分離することが可能であり、表現型薬理学（すなわち、無傷細胞内の主たるモード）がＰＩ３ＫにおけるＰＩ３Ｋ阻害剤の阻害作用に直接関連するＰＩ３Ｋ阻害剤の識別をもたらす。開示されている方法は、ＰＩ３Ｋ経路が増幅されているかまたはされていない細胞の識別も可能にする。
【００４４】
これらの方法の任意の組み合わせも開示されている。これらの組み合わせは、ＰＩ３Ｋ阻害剤を、それらの選択性、特異性、及びＰＩ３Ｋ阻害剤となる表現型薬理に関して特徴付けるために用いられ得る。
【００４５】
細胞株を特徴付けて、当該細胞株がＰＩ３Ｋ経路増幅を有しているか否かを判断する方法も開示される。特に、バイオセンサ変化インデックスまたはよく特徴付けられた（特徴が明らかにされている）いくつかのＰＩ３Ｋ阻害剤のバイオセンサインデックスが、特異な細胞株内のマーカーのパネルに対して生成され得る。ＰＩ３Ｋ阻害剤バイオセンサインデックスまたは変化インデックスのＰＩ３Ｋ阻害剤に対する感度、特に受容体チロシンキナーゼ及びＧＰＣＲマーカー起因バイオセンサシグナルの感度は、細胞株がＰＩ３Ｋ経路増幅状態であるかまたは調節解除（無秩序）（deregulated）状態であるか否かの読み出し情報として使用され得る。
【００４６】
図１に示すような方法が本明細書において開示され、当該方法において、分子は、ＰＩ３Ｋ経路増幅細胞内のＰＩ３Ｋ阻害剤に対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてスクリーニングされ、特定の濃度（例えば、ＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ１００、またはＥＣ２００）における既知のＰＩ３Ｋ阻害剤を用いた刺激を行うための分子事前処理細胞の脱感作は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である分子の指標として用いられる。分子または化合物は、特定の時刻（例えば、付着４時間後、付着の２０時間後、ＰＩ３Ｋ阻害剤による刺激の１時間前）において、培養された細胞にもたらされる。この方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤またはＰＩ３Ｋ経路モジュレータの高いスループットのスクリーニングに使用され得る。しかし、このような方法は、その統合的性質、及びＰＩ３Ｋ阻害剤に起因するバイオセンサシグナルに対する下流のシグナル伝達事象の寄与の故に、ＰＩ３Ｋ阻害剤の高い偽陽性をもたらし得る。ＰＩ３Ｋ経路増幅細胞は、ＰＩ３Ｋ経路カスケードにおける遺伝子変異または遺伝子発現の変化を経た細胞であり、構造的に活性化したＫ−Ｒａｓ変異、ＨＥＲ２のような成長因子受容体の過剰発現、ＰＴＥＮ等のＰＩ３Ｋ拮抗物質タンパク質の機能の喪失、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子内の変異の開始、及びＰＩ３Ｋイソ型の過剰発現を含み、これらはＰＩ３Ｋ経路の構造的な活性化をもたらす。このような細胞の例は、限定するものではないが、肺癌細胞株Ａ５４９及びＨ８２０（Ｋ−Ｒａｓの活性化変異を経た細胞）、Ａ４及びＡ７細胞（ＰＴＥＮの低い発現を経た細胞）、ヒト巨細胞肺癌細胞９５Ｃ及び９５Ｄ細胞（ＰＴＥＮタンパク質を持たない細胞）、並びにＭＤＡ−４６８（ＰＴＥＮの層いつを経た細胞）、ＢＴ４７４及びＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２の増幅を経た細胞）、ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ（変異したＰ１１０αを有する細胞）を含むいくつかの乳癌細胞他を含む。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、限定するわけではないがＬＹ２９４００２及びウォルトマンニンを含む既知かつ確立されたＰＩ３Ｋ阻害剤から選択される。
【００４７】
図２に示されている方法が本明細書において開示され、当該方法において、分子は、マーカーに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてスクリーニングされ、マーカーのバイオセンサ細胞応答は、ＰＩ３Ｋ経路増幅細胞内のＰＩ３Ｋ経路寄与を含み、マーカー（１または複数）は、そのバイオセンサシグナルの各々がＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含む場合に選択される。分子と良く知られているＰＩ３Ｋ阻害との変化プロファイルの類似度は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である分子の指標として用いられる。このような方法は、高いスループットのスクリーニングに適している。しかし、このような方法は、特定のＰＩ３Ｋ阻害剤に対し高い偽陽性を被り得る。このような方法の変形例は、ＰＩ３Ｋ阻害剤のスクリーニングの偽陽性を減らすために開発され得る。このようにするために、各々がＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含むバイオセンサシグナルをトリガするマーカーのパネルが使用されて、良く知られているＰＩ３Ｋ阻害剤及び化合物の変化インデックスが生成され得る。バイオセンサ変化インデックスの類似度は、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるかまたはそうでない化合物の読み出し情報として使用され得る。
【００４８】
図３に示すように、他の開示されている方法において、分子は、マーカーのパネルに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイによってアッセイされ、細胞タイプに関するマーカーのパネルの各々、そのバイオセンサインデックス、特にバイオセンサＤＭＲインデックスが、化合物がＰＩ３Ｋ阻害剤であることの指標として使用される。このような方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の複合薬理及び表現型の薬理を判定するのに非常に適している。この方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤スクリーニングに対して低い偽陽性をもたらし、ＲＯＣＫ阻害剤をＰＩ３Ｋ阻害剤から分離することも可能であるだろう。
【００４９】
２．ＲＯＣＫ阻害剤のスクリーニング方法
ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）をスクリーニングする方法が、本明細書において開示されている。この開示されている方法は、ＲＯＣＫ阻害剤をスクリーニングするための３つの異なった方法及びそれらの組み合わせを含む−（１）分子が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞内のＲｈｏキナーゼ阻害剤に対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてスクリーニングされる；（２）分子が、マーカーに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてスクリーニングされ、マーカーのバイオセンサ細胞応答がＲｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞内のＲｈｏキナーゼ関連経路寄与を含む；（３）分子が、マーカーのパネルに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてアッセイされ、細胞タイプに関するマーカーのパネルの各々、そのバイオセンサインデックス、特にバイオセンサＤＭＲインデックスが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤である化合物の指標として使用される。
【００５０】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、普通は、体外における様々な生化学的阻害アッセイを用いて発見される。生細胞内のＲＯＣＫ基質リン酸化反応レベルの判定方法は、Ｒｈｏキナーゼの細胞活性を測定するため、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤をスクリーニングするためにも開発される。しかし、ＲＯＣＫの多くの潜在的基質も、いくつかの他のタンパク質Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼによって潜在的にリン酸化させられるので、細胞抽出物内で観察されるリン酸化反応の程度は、ＲＯＣＫ酵素の活性を正確に反映したものでは必ずしもない。例えば、ミオシンの調節軽鎖成分（ＭＬＣ）は、Ｓｅｒ１９においてＲＯＣＫにとってリン酸化され得るが、いくつかの条件において、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、ミオトニックジストロフィー関連でありかつｃｄｃ４２に活性化されたキナーゼ（ＭＲＣＫ）、及びＺＩＰＫを含む追加のキナーゼに関する基質もリン酸化され得る。従って、潜在的阻害剤の効果を含む細胞内のＲＯＣＫ活性のレベルの決定には問題があった。
【００５１】
開示される方法は、ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイに関する。開示される方法は、ラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いて、分子をスクリーニングしてＲＯＣＫ阻害剤及び既存のＲＯＣＫ阻害剤として特徴付ける方法に関する。特に、開示されている方法は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤及び既存のＲｈｏキナーゼ阻害剤として分子をスクリーニングための３つの異なった方法及びこれらの組み合わせを含む。
【００５２】
図１６に示されているように、開示されている方法においては、分子は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞内のＲｈｏキナーゼ阻害剤に対するラベルフリーバイオセンサ細胞アッセイを用いてスクリーニングされ、特定の濃度（例えば、ＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ１００またはＥＣ２００）のＲｈｏキナーゼ阻害剤を用いた刺激を実行するための分子事前処理細胞の脱感作は、ＲＯＣＫ阻害剤である分子の指標として用いられる。分子又は化合物は、特定の時刻（例えば、付着４時間後、付着の２０時間後、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤による刺激の１時間前）において、培養された細胞にもたらされる。この方法は、ＲＯＣＫ阻害剤又はＲＯＣＫ経路モジュレータの高いスループットでのスクリーニングに用いられ得る。しかし、このような方法は、その統合的性質及びＲＯＣＫ阻害剤起因のバイオセンサシグナルへの下流シグナル伝達事象の寄与の故に、特定のＲＯＣＫ阻害剤に対して高い偽陽性をもたらし得る。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞は、Ｙ−２７６３２及びＨ−８９等の既知のＲｈｏキナーゼ阻害剤を用いた刺激において検知可能なバイオセンサ出力シグナルを生じさせる。Ａ４３１、ＨＴ２９及びＡ５４９細胞も例としてあげられる。
【００５３】
図２に示すように、他の開示される方法において、分子は、マーカーに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイを用いてスクリーニングされ、そのマーカーのバイオセンサ細胞応答は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤応答細胞内のＲｈｏキナーゼ関連経路の寄与を含み、そのバイオセンサシグナルの各々がＲＯＣＫ経路からの寄与を含む場合、マーカー（１または複数）が選択される。分子と既知のＲＯＣＫ阻害剤との間の変化プロファイルの類似度は、分子がＲＯＣＫ阻害剤であることに関する指標として使用される。このような方法は、高いスループットのスクリーニングに適している。しかし、このような方法は、特定のＲＯＣＫ阻害剤に対して高い偽陽性を被り得る。
【００５４】
図３に示されているように、更に他の開示される方法において、分子は、マーカーのパネルに対するラベルフリーバイオセンサの細胞アッセイによってアッセイされ、マーカーのパネルの各々は細胞タイプに関しており、そのバイオセンサインデックス、特にバイオセンサＤＭＲインデックスがＲｈｏキナーゼ阻害剤である化合物の指標として使用される。このような方法は、ＲＯＣＫ阻害剤の複合薬理及び表現型の薬理を判定するのに良好に適している。
【００５５】
これらの方法の任意の組み合わせも開示される。これらの組み合わせは、それらの選択性、特異性、及びＲＯＣＫ阻害剤になる表現型の薬理に関して、いくつかのＲＯＣＫ阻害剤に使用され得る。
【００５６】
３．具体的な実施例
ａ．表面において無秩序なＰＩ３Ｋ経路細胞株を培養するステップであり、当該表面がラベルフリーバイオセンサ分析に使用され得るステップ、ｂ．分子とともに当該細胞株をインキュベートして分子処理済み細胞株を生成するステップ、ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて分子処理済み細胞株を分析して分子データ出力を生成するステップ、ｄ．分子データ出力と、同一の細胞株内の既知のＰＩ３Ｋ阻害剤のデータ出力とを比較して、分子−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較結果を生成するステップ、を含む分子をアッセイする方法が開示される。
【００５７】
既知のＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が、培養された無秩序なＰＩ３Ｋ細胞株とともにＰＩ３Ｋ阻害剤をインキュベートして、ラベルフリーバイオセンサを用いて当該インキュベートされた細胞株を分析することによってＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成された方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００５８】
比較結果が分子データ出力とＰＩ３Ｋ阻害剤出力とが類似であると示す場合に潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤を識別するステップをさらに含む方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００５９】
調節解除された（deregulated）ＰＩ３Ｋ経路細胞株が、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株、ＨＥＲ２過剰発現細胞株、ＰＴＥＮ機能喪失型細胞株、またはＰＩ３ＫＣＡ活性化変異細胞株から選択される方法が開示されており、この方法において、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株がＡ５４９細胞株またはＨ８２０細胞株であり、ＰＴＥＮ機能喪失型細胞株がＡ４細胞株、Ａ７細胞株、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｃ、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｄ、または乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８であり、ＨＥＲ２過剰発現細胞株がＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３であり、ＰＩ３ＫＣ活性化変異細胞株がＭＣＦ−７またはＴ４７Ｄであり、既知のＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＬＹ２９４００２またはウォルトマンニンである。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６０】
さらに、通常のＰＩ３Ｋ経路細胞株と共に分子を培養し、ラベルフリーバイオセンサを用いて分子処理された細胞株を分析して第２の分子データ出力を生成するステップ、及び同一の細胞株内で生成された第２の分子データ出力とＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較するステップをさらに含む方法が開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６１】
細胞株がＥＧＦ受容体を過剰発現し、当該細胞株がＡ４３１細胞株である方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６２】
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析に使用され得る表面において調節解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株を培養するステップと、ｂ．マーカー及び分子と共に細胞株をインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いてインキュベート細胞株を分析してマーカー−分子データ出力を生成するステップと、ｄ．同一の細胞株におけるマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を比較して、マーカー−分子／マーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較結果を生成するステップと、を含む、分子をアッセイする方法が開示される。
【００６３】
マーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が、マーカー及びＰＩ３Ｋ阻害剤を培養されて調節解除されたＰＩ３Ｋ細胞株と共にインキュベートして、インキュベートされた細胞株を、ラベルフリーバイオセンサを用いて分析して、マーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成することによって生成される方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６４】
マーカー−分子データ出力及びマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が類似していることを比較結果が示す場合に潜在的なＰＩ３Ｋ阻害剤を識別するステップをさらに含み、マーカー及び分子を通常のＰＩ３Ｋ経路細胞株と共にインキュベートするステップと、マーカー−マーカー処理済細胞株をラベルフリーバイオセンサを用いて分析して第２のマーカー分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株内で生成された第２のマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較するステップと、をさらに含み、マーカー及び分子をトール様受容体細胞株と共にインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いてトール様受容体インキュベート細胞株を分析して第３のマーカー−分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株内で生成された第３のマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較するステップと、をさらに含む方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６５】
トール様受容体細胞株がＴＬＲ９を発現する方法も開示され、当該方法において、当該細胞株はＨｅｐＧ２細胞株であり、マーカーがＴＬＲ９作動物質を含み、当該マーカーは、ＥＧＦ、ヒスタミン、またはホルスコリンを含み、調節解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株が、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株。ＨＥＲ２過剰発現細胞株、ＰＴＥＮ機能喪失型細胞株、またはＰＩ３ＫＣＡ活性化変異細胞株から選択され、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株はＡ５４０９細胞株またはＨ８２０細胞株であり、ＰＴＥＮ機能喪失型細胞株はＡ４細胞株、Ａ７細胞株、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｃ、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｄ、または乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８であり、ＨＥＲ２過剰発現細胞株はＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３であり、ＰＩ３ＫＣ活性化変異細胞株はＭＣＦ−７またはＴ４７Ｄであり、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、ケルセチン、またはウォルトマンニンを含む。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６６】
ＲＯＣＫ経路活性に関して分子をアッセイするステップをさらに含む方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６７】
アッセイのステップが、ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析に用いられ得る表面においてＲＯＣＫ阻害剤応答細胞株を培養するステップと、ｂ．当該細胞株を分子と共にインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて当該インキュベート細胞株を分析して分子データ出力を生成するステップと、ｄ．同一の細胞における分子データ出力と既知のＲＯＣＫ阻害剤データ出力とを比較して、分子−ＲＯＣＫ阻害剤比較結果を生成するステップと、を含む方法が開示される。
【００６８】
ＲＯＣＫ阻害剤応答細胞株が細胞株を含む方法が開示される。当該細胞株内において、既知のＲＯＣＫ阻害剤によるＲＯＣＫの基本的な活性の阻害がロバストなバイオセンサシグナルを生成し、当該細胞株がＡ４３１、Ａ５４９またはＨＴ２９から選択され、当該方法は、少なくとも２つのマーカーを用いて独立的に実施される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００６９】
マーカーが、１）ＴＬＲシグナル伝達経路の活性化因子、２）Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３−媒介シグナル伝達の活性化因子、３）Ｒｈｏ−またはＪＡＫ−媒介シグナル伝達の活性化因子、４）ＰＫＣ経路の活性化因子、及び５）ｃＡＭＰ−ＰＫＡまたはｃＡＭＰ−ＥＰＡＣ−ＰＩ３Ｋ経路の活性化因子を含む方法が開示されている。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００７０】
方法が開示されており、当該方法において、ＴＬＲシグナル伝達経路が、トール様受容体（１または複数）の作動物質を含み、当該トール様受容体（１または複数）の作動物質は、Ｐｏｌｙ（ＩＣ）またはＯＤＮ２００６を含み、Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３−媒介シグナル伝達の活性化因子が、プロテーゼ活性化型受容体サブタイプ２（ＰＡＲ２）に対する作動物質またはヒスタミンＨ１受容体に対する作動物質を含み、Ｒｈｏ−またはＪＡＫ−媒介シグナル伝達の活性化因子が内因性ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）イオンチャンネルオープナーを含み、ＰＫＣ経路の活性化因子がタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化因子を含み、ｃＡＭＰ−ＰＫＡまたはｃＡＭＰ−ＥＰＡＣ−ＰＩ３Ｋ経路の活性化因子がアデニリルシクラーゼに対する活性化因子を含み、当該方法は少なくとも２つのマーカーを用いて独立的に実施され、マーカーは、β２−アドレナリン受容体に対する作動物質、内因性ＧＰＲ１０９に対する作動物質、ＥＧＦＲ作動物質、及びヒスタミンＨ１受容体に対する作動物質を含み、マーカーは、β２−アドレナリン受容体に対するエピネフリン、ＧＰＲ１０９Ａに対するニコチン酸、及びヒスタミンＨ１受容体に対するヒスタミンであり、細胞株は、ＨＴ２９細胞株を含み、当該方法は、少なくとも２つのマーカーによって独立的に実施され、マーカーはＰＫＣ及びＭＰＡＫ経路の活性化因子、ＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達の活性化因子、ｈＥＲＧ経路の活性化因子及びＧｑ及びＧｉ−仲介シグナル伝達及びＥＧＦＲトランス活性化の活性化因子を含み、ＰＫＣ及びＭＡＰＫ経路の活性化因子は、ＥＧＦＲ作動物質ＥＧＦを含み、ＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達の活性化因子は、ＩＧＦ１Ｒ作動物質ＩＧＦ１であり、ｈＥＲＧ経路の活性化因子は、ｈＥＲＧ活性化因子マロトキシンを含みかつＧｑ及びＧｉ媒介シグナル伝達及びＥＧＦＲトランス活性化の活性化因子はＮＲＳ１作動物質ニューロテンシンであり、マーカーは、少なくともＥＣ７０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５及びＥＣ９９の濃度にて追加され、当該ＲＯＣＫ阻害剤はＹ１７６３１でありかつＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ−２９４００２である。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００７１】
分子をアッセイする方法が開示されており、当該方法は、ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析に使用され得る表面において、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＴ２９及びＨｅｐＧ２の４つの異なった細胞株を培養するステップと、ｂ．細胞株の各々を分子と共にインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いてインキュベート細胞株の各々を分析して当該インキュベート細胞株の各々の分子データ出力を生成するステップと、ｄ．同一の細胞株内における分子データ出力とＲＯＣＫ阻害剤データ出力を比較して、細胞株の各々に関する分子−ＲＯＣＫ阻害剤比較結果を生成するステップと、を含む。
【００７２】
細胞株の各々とともにＲＯＣＫ阻害剤をインキュベートして、ラベルフリーバイオセンサを用いてインキュベート細胞株の各々を分析して細胞株の各々に関するＲＯＣＫ阻害剤データ出力を生成することによって、ＲＯＣＫ阻害剤データ出力が生成された方法が開示され、当該方法において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IVまたはＹ−２７６３２を含む。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００７３】
ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成するステップ、及び細胞株の各々に関して分子−ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤の比較結果を生成するステップをさらに含む方法も開示される。なお、これらの限定は単独でなされてもよいし、本明細書において開示されている任意の限定と組み合わせられてもよい。
【００７４】
Ｄ．音声バイオセンサ
水晶振動子共鳴装置等の音バイオセンサは、音波を用いて細胞応答を特徴付ける。音波は、通常、圧電物質を用いて生成されかつ受信される。音バイオセンサは、しばしば、共鳴タイプのセンサ構成で動作するように設計される。通常の構成において、薄いクオーツディスクが２つの金電極の間に挟み込まれる。電極間へのＡＣ信号の印加は、水晶の励起及び振動をもたらし、これは感度の高い発振回路として機能する。出力センサシグナルは、共鳴周波数及び運動抵抗である。共鳴周波数は、バイオセンサ表面が剛体である場合、吸着物質の全質量に大体比例する。液体環境下において、音センサ応答は、結合分子の質量のみならず、生成された分子複合体又は生細胞の粘弾性特性及び電荷の変化にも感受性がある。水晶に関連する細胞の共鳴周波数及び運動抵抗を測定することによって、細胞付着性及び細胞毒性を含む細胞プロセスがリアルタイムに理解され得る。
【００７５】
Ｅ．電気的バイオセンサ
電気的バイオセンサは、インピーダンスを用いて、細胞付着を含む細胞応答を特徴付ける。通常の構成において、生細胞は、一体化された電極アレイが埋め込まれているバイオセンサ表面に接触させられる。一定電圧で高周波数の小さなＡＣパルスが用いられて、電極間で電場が生成され、これが細胞の存在によって妨害される。電気的パルスは、集積電子回路を用いてオンサイト（onsite）で生成され、回路を経由した電流は時間に従う。結果として得られたインピーダンスは、細胞層の導電性の変化の指標である。細胞原形質膜は、電流が細胞の間または細胞の下を流れるようにする絶縁因子として機能し、インピーダンスの非常にロバストな変化をもたらす。インピーダンスベースの測定は、細胞付着及び拡散、細胞微動、細胞形態的変化並びに細胞死、並びに細胞シグナル伝達を含む、多くの細胞事象を研究するために適用されてきた。
【００７６】
Ｆ．光バイオセンサ
光バイオセンサは、表面結合電磁波を主に用いて細胞応答を特徴付ける。表面結合波は、光励起表面プラズモン（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）を用いて金基板において実現され得るか、または回折格子結合導波路モード共振（共振導波路回折格子、ＲＷＧ）を用いて誘電体基板において実現され得る。中赤外（mid-IR）ＳＰＲを含むＳＰＲに関して、読み出し情報は、反射光の強度が最小になる共鳴角度である。同様に、光結晶バイオセンサを含むＲＷＧバイオセンサに関して、読み出し情報は、最大の非結合効果（incoupling efficiency）が達成される共振角度または波長である。共振角度または波長は、センサ表面またはその近傍の局所的な屈折率に依存する。アッセイのための少数の流路に限定されるＳＰＲと異なり、ＲＷＧバイオセンサは、器具類及びアッセイの最近の進歩の故に、高いスループットのスクリーニング（ＨＴＳ）及び細胞アッセイに適している。通常のＲＷＧにおいて、細胞は、高い屈折率を有する物質によって構成されているバイオセンサが埋め込まれているマイクロタイタープレートのウェル内に直接的に配されている。刺激による屈折率の局所的な変化が生細胞の動的な質量再分配（ＤＭＲ）シグナルをもたらす。これらのバイオセンサは、受容体生物学、リガンド薬理、及び細胞付着を含む様々な細胞プロセスの研究に使用されてきた。
【００７７】
本発明は、コーニングエピック（Corning Epic）（登録商標）等の共振導波路回折格子バイオセンサを用いるのが好ましい。エピック（Epic）（登録商標）システムは、市場入手可能な波長積分システム、または角度インタロゲーションシステムもしくは掃引波長撮像システム（Corning Inc社、コーニング、ニューヨーク）を含む。商用のシステムは、温度制御ユニット、光検出ユニットからなり、ロボット装置を有するオンボード液体ハンドリングユニットまたはロボット装置を有する外部液体補助システムを伴っている。検出ユニットは、集積光ファイバの中心に配置され、〜７から１５秒の時間間隔で細胞応答の動的測定が可能である。化合物溶液は、オンボード液体ハンドリングシステム、外部液体補助システムを用いて取り入れられる。この２つのシステムの両方は、従来の液体ハンドリングシステムを用いる。高分解能撮像システム及び高収集光バイオセンサシステムを含む様々なＲＷＧバイオセンサシステムも使用可能である。
【００７８】
Ｇ．バイオセンサ及びバイオセンサ細胞アッセイ
ラベルフリー細胞ベースアッセイは、通常はバイオセンサを用いて、生細胞内の分子起因の応答を監視する。この分子は、天然物質または合成物質であり得、精製されているかまたは非精製の混合物であってもよい。バイオセンサは、通常は、光学的、電気的、熱量的、音的、磁力的他のトランスデューサ等のトランスデューサを用いて、バイオセンサに接している細胞内の分子認識事象または分子起因の変化を定量的な信号に変換する。これらのラベルフリーバイオセンサは、時間の経過に亘って分子複合体がどのように生成して解離するのかの特徴付けに関連する分子相互作用、またはセルが刺激にどのように応答するかの特徴付けに関連する細胞応答の分析に使用され得る。本発明の方法に適用可能なバイオセンサは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び共振導波路回折格子（ＲＷＧ）バイオセンサ等の光バイオセンサシステム、共振ミラー、エリプソメーター、並びにバイオインピーダンスシステム等の電気的バイオセンサシステムを含み得る。
【００７９】
１．ＳＰＲバイオセンサ及びシステム
ＳＰＲは、入射角の範囲に亘る偏光のウェッジ（wedge）を、表面プラズモンを励起するための導電性金属フィルム（例えば、金）を担持する平面ガラス基板に送出するプリズムに依存している。結果として得られるエバネッセント波は、金層内の自由電子雲と相互作用し、これによって吸収され、電子電荷密度波（すなわち、表面プラズモン）が生成されて反射光の強度が減少する。この強度が最小になる共鳴角度は、センサ表面の反対の面の金層に近接した溶液の屈折角度に依存している。
【００８０】
２．ＲＷＧバイオセンサ及びシステム
ＲＷＧバイオセンサは、例えば、基板（例えば、ガラス）、埋め込まれた回折格子または周期的構造を有する導波路薄膜、及び細胞層を含み得る。ＲＷＧバイオセンサは、回折格子による導波路内への光の共振結合を用いて、溶液−表面界面における全反射をもたらし、溶液−表面界面はその界面において電磁場を形成する。この電磁場は、エバネッセントな性質であり、これは、センサ表面から急激に減衰することを意味する。本来の値の１／ｅに減衰する距離は、侵入深さとして知られ、特定のバイオセンサのデザインに依存するが、通常は約２００ｎｍのオーダーである。このタイプのパイオセンサは、このようなエバネッセント波を用いて、センサ表面またはその近傍における細胞層のリガンド起因変化を特徴付ける。
【００８１】
ＲＷＧ機器は、角度変化または波長変化測定に基づいたシステムにさらに分類され得る。波長変化測定において、一定角度を有する入射光波長の範囲に亘る偏光は、導波路を照らすために使用される。特定の波長の光は、導波路内に結合させられて、導波路に沿って伝播する。代替的に、角度変化機器においては、単色光を用いてセンサが照明されて、当該光が共振的に結合させられる角度が測定される。
【００８２】
共振条件は、バイオセンサの表面に直接的に接している細胞層（例えば、細胞密集度、付着及び状態）によって影響を受ける。リガンドまたは検体が、生細胞内の細胞標的（例えば、ＧＰＣＲ、イオンチャンネル、キナーゼ）と相互作用した場合、細胞層内の局所的な屈折率の変化が、共振角度（または波長）の変化として検出される。
【００８３】
Corning（登録商標）Epic（登録商標）システムは、ラベルフリー生化学的アッセイまたは細胞ベースのアッセイのためのＲＷＧバイオセンサを使用する（Corning Inc社、コーニング、ニューヨーク）。Epic（登録商標）システムは、ＲＷＧプレートリーダ及びＳＢＳ（生体分子スクリーニング学会）規格マイクロチタープレートからなる。プレートリーダ内の検出システムは、集積光ファイバを用いて、細胞内でのリガンド起因によってもたらされる入射光の波長変化を測定する。一連の照明−検出ヘッドは、直線状に配されているので、反射スペクトルは３８４ウェルマイクロプレートの列内のウェルの各々から同時に収集される。プレート全体が走査されるので、センサの各々が複数回アドレス指定（addressed）され得、列の各々が順次アドレス指定される。入射光の波長は、収集されて分析に使用される。温度制御ユニットが機器内に含まれ得て、温度変動の故の入射光におけるスプリアスな（spurious）変化が最小化され得る。測定された応答は、細胞の集団の平均化された応答を表す。サンプルローディング等のシステムの様々な機構は、自動化され得、９６または３８６ウェルマイクロプレートと共に多重化され得る。液体ハンドリングは、オンボード液体ハンドラまたは外部液体ハンドリング補助装置によって行われる。特に、分子溶液は、ウェルの各々の底部において培養された細胞を有する細胞アッセイプレートのウェル内に直接加えられるかまたはピペット滴下される。細胞アッセイプレートは、細胞を覆う所定量のアッセイバッファ溶液を含む。所定回ピペット吸い上げ及びピペット滴下することによる単純な混合ステップも、分子添加ステップ含まれ得る。
【００８４】
３．電気的バイオセンサ及びシステム
電気的バイオセンサは、基板（例えばプラスチック）、電極及び細胞層からなる。この電気的検出方法において、細胞は、基板上に配列されている小さな金の電極上で培養され、このシステムの電気的インピーダンスは、経時的に追跡された。インピーダンスは、細胞層の導電性における変化の指標である。通常、固定された周波数にまたは変化させられる周波数の小さな一定電圧が、電極または電極アレイに印加され、回路を通る電流が時間に亘って監視される。電流におけるリガンド起因の変化は、細胞応答の指標を提供する。細胞全体の検出のインピーダンス測定は、１９８４年に初めて実現された。その後、インピーダンスベースの測定は、細胞付着及び拡散、細胞微動、細胞形態変化、及び細胞死を含む幅広い細胞事象の研究のために応用されてきた。従来のインピーダンスシステムは、小さな検出電極及び大きな基準電極を使用する故に、高いアッセイ変動性に影響を受ける。この変動性を克服するために、ＣｅｌｌＫｅｙシステム（ＭＤＳＳｃｉｅｘ社、サウスサンフランシスコ、ＣＡ）及びＲＴ−ＣＥＳ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ社、サンディエゴ、ＣＡ）等の最新のシステムは、マイクロ電極アレイを有する集積回路を使用している。
【００８５】
４．高空間分解能バイオセンサ撮像システム
ＳＰＲ撮像システム、エリプソメトリー撮像システム、及びＲＷＧ撮像システムを含む光バイオセンサ撮像システムは、高い空間的分解能を提供し、本発明の実施例において使用され得る。例えば、SPR imager（登録商標）II（GWC Technologies Inc社）は、プリズム結合ＳＰＲを使用し、固定角度の入射光でＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラを用いて反射光を収集する。表面における変化は、反射性の変化として記録される。従って、ＳＰＲ撮像は、アレイの全ての要素に関する測定値を同時に収集する。
【００８６】
撮像ベースの応用のためのＲＷＧバイオセンサに基づいた掃引波長光インタロゲーションシステムが使用され得る。このシステムにおいて、高速波長変更可能なレーザ光源が使用されて、マイクロプレートフォーマット内のＲＷＧバイオセンサの１のセンサまたはアレイが照明される。センサスペクトルは、レーザ波長走査の際に、時間に応じてセンサから反射される光パワーを検知することによって生成され得、コンピュータ化された共振波長インタロゲーションモデリングを用いた測定データの分析は、固定された受容体または細胞層を有するバイオセンサの空間的に分解・解像された画像の生成をもたらす。撮像センサを用いることは、インタロゲーションスキームに基づいた画像化を当然にもたらす。２次元ラベルフリー画像は、移動する部分なしに取得され得る。
【００８７】
代替的に、垂直偏波またはｐ偏光ＴＭ０モードを備える角度インタロゲーションシステムも使用され得る。このシステムは、光ビームのアレイを生成して、約２００μｍ×３０００μｍまたは２００μｍ×２０００μｍの寸法を有するＲＷＧセンサを光ビームの各々で照明する出射システム、及びこれらのセンサから反射される光ビームの角度の変化を記録するためのＣＣＤカメラベースの受信システムからなる。アレイ化された光ビームは、屈折光学レンズと共にビームスプリッタを用いることによって得られる。このシステムは、3秒ごとに４９個までのセンサ（７×７ウェルのセンサアレイ内）が同時にサンプリングされることを可能にするか、または３８４個までの全てのウェルマイクロプレートが、１０秒毎に同時にサンプリングされることを可能にする。
【００８８】
代替的に、走査波長インタロゲーションシステムも使用され得る。このシステムにおいて、一定の角度をもつ入射光波長の範囲をカバーしている偏光が使用されて、導波路回折格子バイオセンサに亘って照明がなされて走査が行われ、各々の位置における反射光が同時に記録され得る。走査を通じて、バイオセンサに亘る高解像度画像が取得され得る。
【００８９】
５．生細胞内の動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナル
細胞標的を通じた刺激に対する細胞応答は、下流シグナル伝達ネットワークの空間的及び時間的ダイナミクスによって符号化され得る。これにより、リアルタイムの細胞シグナル伝達の一体化の監視は、細胞生物学及び生理学の理解において有用な生理学的に関連のある情報をもたらし得る。
【００９０】
共振導波路回折格子（ＲＷＧ）バイオセンサを含む光バイオセンサは、細胞物質の動的再分配に関連する一体化された細胞応答を検出可能であり、細胞シグナル伝達の研究に非侵襲的手段をもたらす。全ての光バイオセンサは、それらがセンサ表面又はセンサ表面の非常に近傍の局所的な屈折率の変化を測定可能な点で共通している。原理上は、細胞内のリガンド起因の変化を特徴付けるためにエバネッセント波を用いることが可能である故に、ほとんど全ての光バイオセンサが細胞検知に適用可能である。エバネッセント波は、電磁場であり、溶液表面界面における光の全反射によって生成され、通常は、侵入深さまたは感知体積として知られる深度特性にて溶液内に短い距離（〜数１００ナノメートル）延在する。
【００９１】
最近、理論的及び数学的モデルが開発され、これらはリガンドを用いた刺激に応答する生細胞内で測定される光信号のパラメータ及び性質を記述する。これらのモデルは、既知の細胞生物物理学と組み合わされた３層導波路システムに基づいており、リガンド起因光信号を、受容体を通して仲介された特定の細胞プロセスと関連付ける。
【００９２】
バイオセンサが入射光によって照明されている領域に配されている細胞の平均応答を測定する故に、細胞の融合層は、最適なアッセイ結果を達成するために用いられ得る。バイオセンサの短い侵入深さと比較して細胞の寸法が大きい故に、センサ構成は、非従来的な３層システムとして考えられる：基板、回折格子構造を有する導波路フィルム、及び細胞層。従って、有効屈折率（すなわち、検出シグナル）におけるリガンド起因の変化は、一次まで、細胞走の下部の屈折率の変化と直接的に比例し得る。
【００９３】
【数１】
2013516172.tif 000002
ここで、Ｓ（Ｃ）は細胞層に対する感受性であり、Δｎｃはバイオセンサによって検出された細胞層のリガンド起因の局所的屈折率変化である。細胞内の所定の体積の屈折率がタンパク質等の生体分子の濃度によって主に決まるので、Δｎｃは、検知体積内の細胞標的または分子集合体の局地的濃度のリガンド起因の変化に直接比例すると仮定され得る。センサ表面から延在するエバネッセント波の指数関数的に減衰する特性を考慮して、リガンド起因光信号は、以下の式によって支配される。
【００９４】
【数２】
2013516172.tif 000003
ここで、ΔＺＣは細胞内への侵入深さであり、αは特異的屈折率増加（タンパク質に関して約０．１８／ｍＬ／ｇ）であり、ｚｉは質量再分配が発生する距離であり、ｄは細胞層内の１つのスライスの仮想的な厚さである。ここで、細胞層は、垂直方向において等間隔のスライスに分割される。上記式は、それぞれが応答全体に対して同等でない寄与を有する、リガンド起因の光信号がセンサ表面から異なった距離において発生する質量再分配の合計である。さらに、波長または角度変化に関して検出された信号は、センサ表面と垂直に発生する質量再分配に主に感受性を有する。その動的な性質の故に、これは、動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナルとも称される。
【００９５】
６．細胞及びバイオセンサ
細胞は、複数の細胞経路または機構に依存して、それらが受診する情報を符号化して統合する。タンパク質標的への検体の結合を特に測定する光バイオセンサを用いた親和性分析と異なり、生細胞はさらに非常に複雑で動的である。
【００９６】
細胞のシグナル伝達を研究するために、細胞はバイオセンサの表面に接触させられ得、これは細胞の培養によって達成され得る。これらの培養された細胞は、３つのタイプの接触態様を介してバイオセンサ表面に取り付けられ得る：３つのタイプとは、焦点接着、密接接触（close contact）及び細胞外基質接触であり、それぞれが独自の表面からの離間距離特性を有している。結果として、通常は、基本的な細胞膜は、〜１０−１００ｎｍ程度表面から離れて配される。懸濁細胞（suspension cell）に関して、細胞は、細胞表面受容体の共有結合、もしくは細胞表面受容体の特異的結合によって、または重力による単純な定着によって、バイオセンサ表面に接触され得る。このため、バイオセンサは、細胞の下部を検知することが可能である。
【００９７】
多くの場合、細胞は表面依存接着及び増殖を呈す。ロバストな細胞アッセイを実現するために、バイオセンサ表面は、細胞接着及び増殖を促進するためのコーティングを必要とし得る。しかし、表面特性は、細胞の生物学的状態への直接的な影響を有し得る。例えば、表面結合リガンドは、細胞によって与えられる力の下でどれくらい変形するかを決定付ける基板材料の機械的適合性のように、細胞の応答に影響を与え得る。培養条件（時間、血清濃度、密集度等）が異なることによって、得られた細胞状態は、１の表面と他の表面との差異、及び１の条件と他の条件との差異であり得る。従って、細胞状態を調節する特別な取り組みは、バイオセンサベースの細胞アッセイを開発するために必要であり得る。
【００９８】
細胞は、比較的大きな寸法（通常は数十μの範囲）を有する動的な物体である。刺激なしであっても、細胞は常に微動（細胞以下の分解能の低速度撮影の顕微鏡検査によって、及びナノメートルレベルの生体インピーダンス測定によって、組織培養において見られるような動態的変動及び細胞構造の再構築）している。
【００９９】
非刺激条件下において、ＲＷＧバイオセンサで分析した場合、細胞はほとんど正味０のＤＭＲ応用を普通は生成する。これは、部分的に光バイオセンサの低い空間的分解能の故であり、レーザ光点の大きなサイズ及び結合光の長い伝播距離によって決まる。レーザ光点のサイズは、観察される領域のサイズを決め、通常は一度に１の分析点のみが観察され得る。従って、バイオセンサは、通常は、光入射領域に配されている大量の細胞の平均化された応答を測定する。細胞は単一細胞レベルで微動をするが、大量の細胞は、正味０の平均ＤＭＲ応答をもたらす。さらに、細胞間マクロ分子は、高度に組織化されて空間的に束縛され、ほ乳類細胞内の場所を最適化する。細胞上及び細胞内のタンパク質のしっかりと制御された局在化は、特定の細胞機能及び応答を決定する。なぜならば、この局在化は、細胞が適切なパートナーと相互作用するタンパク質の特異性及び効率性を調節することを可能にしかつタンパク質活性化及び不活性化機構を空間的に分離することを可能にする故である。この制御故に、非刺激条件下において、感知体積内の細胞の局地的質量濃度は平衡状態に達し得、正味０の光学的応答をもたらす。一貫性のある光学的応答を達成するために、観察される細胞は、細胞のほとんどが単一の分裂周期を終えたばかりになるような期間、従来の培養条件下で培養され得る。
【０１００】
生細胞は、外因的なシグナルを感知して応答する優れた能力を有する。細胞シグナル伝達は、環境的キュー（環境信号）（environmental cue）が単一の明確に定義された応答をもたらす応答の線状鎖をトリガする直線ルートを介して機能すると考えられていた。しかし、調査は、外部刺激に対する細胞応答がさらに非常に複雑であることを示した。細胞が受信した情報が、処理されて、リン酸化及びシグナル伝達タンパク質の位相的再配置の複雑な時間的及び空間的パターンに符号化され得ることが明らかになった。タンパク質の適切な場所への空間的及び時間的標的付けは、タンパク質−タンパク質間の相互作用の特異性及び効率性を調節すること、ひいては細胞シグナル伝達及び応答のタイミング及び強度を記述することに不可欠である。細胞骨格認識、細胞周期チェック点及びアポトーシス等の重要な細胞判定は、精密な時間的制御及び活性化しているシグナルトランスデューサーの相対的な空間的分布に依存している。従って、Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）等の細胞標的で仲介された細胞シグナル伝達は、規則的で調節された態様において通常は進行し、一連の空間的及び時間的事象からなり、これらの多くは、細胞の局所細胞物質における局在的質量濃度又は再分配の変化をもたらす。これらの変化及び再分配は、感知体積内で発生した場合、光バイオセンサを用いてリアルタイムで直接追跡され得る。
【０１０１】
７．ＤＭＲシグナルは生細胞の生理学的な応答
受容体生物学を研究するための従来の薬理学的手法と比較して、リガンドが細胞システム内で発現した受容体に対して特異性を有する場合、リガンド起因ＤＭＲシグナルは受容体特異性を有し、用量依存性を有し、かつ飽和可能性を有することが示されている。多数のＧタンパク質結合受容体（ＣＰＣＲ）リガンドについて、有効性（ＥＣ５０の値によって測定）は、従来の方法を用いて測定されたものとほとんど同一と認められる。さらに、ＤＭＲシグナルは、期待された脱感作パターンを呈し、脱感作及び再感作は、全てのＧＰＣＲと共通である。さらに、ＤＭＲシグナルは、従来の技術で取得されたのと同様のＧＰＣＲリガンドの忠実度を維持する。さらに、バイオセンサは、完全作動物質、部分的作動物質、逆作動物質、拮抗物質（アンタゴニスト）（antagonist）、及びアロステリック調節因子を区別可能である。これらをもとに、これらの発見は、ＤＭＲが生細胞の生理学的応答を監視可能であることを示す。
【０１０２】
８．ＤＭＲシグナルは、生細胞内のリガンド−受容体ペアのシステム細胞生物学(systems cell biology)情報を含む
リガンドを用いた細胞の刺激は、一連の空間的及び時間的事象をもたらす。これらの非限定的な例は、リガンド結合、受容体活性化、タンパク質補充、受容体内在化及び再利用、第２メッセンジャー代替、細胞骨格再構築、遺伝子発現、並びに細胞付着変化を含む。細胞事象の各々が、それぞれの特性（反応速度（kinetics）、期間、大きさ、質量移動）を有している故に、かつバイオセンサが感知体積内の質量再分配に関連する細胞事象に主に感受性がある故に、細胞事象はＤＭＲシグナル全体とは異なる寄与をし得る。化学生物学、細胞生物学、及び生物物理学の手法は、リガンド起因ＤＭＲシグナルの細胞機構を解明するために使用され得る。最近は、特定の細胞シグナル伝達コンポーネント内の治療介入（intervention）のために直接化学薬品を使用する化学生物学が、生物学的疑問を解決するために使用されている。このことは、様々な異なったタイプの細胞標的の活性を特に制御する多数のモジュレータの識別の故に重要である。この手法は、受容体（表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、及びＧｑ−及びＧｓ−結合受容体を含む）によって仲介されたシグナル伝達及びそのネットワークの相互作用をマッピングするのに適している。
【０１０３】
ＥＦＧＲは、受容体チロシンキナーゼのファミリーに属している。ＥＧＦは、結合して、ＥＧＦＲの内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激し、主にＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びＪＮＫ経路に関与するシグナル伝達カスケードを開始する。ＥＧＦ刺激において、Ａ４３１細胞内の質量再分配をもたらす多くの事象がある（細胞株が内因的にＥＧＦＲを過剰発現する）。ＥＧＦＲシグナル伝達は、細胞の状態に依存することが知られている。結果として、ＥＧＦ起因ＤＭＲシグナルも細胞状態に依存する。０．１％のウシ胎児血清内で２０時間経て得られた休眠細胞において、ＥＧＦ刺激は、３つの異なった順次的なフェーズを伴うＤＭＲシグナルをもたらす：（i）増加するシグナルを伴う増加（ポジティブ）フェーズ（Ｐ−ＤＭＲ）、（ii）遷移フェーズ、及び（iii）減衰フェーズ（Ｎ−ＤＭＲ）。化学生物学及び細胞生物学の研究は、ＥＧＦ起因ＤＭＲシグナルが主にＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に結合されることを示しており、これはＭＥＫを介して進行して、細胞脱離をもたらす。２つの証拠は、Ｐ−ＤＭＲが、主に、細胞表面において活性化された受容体への細胞内標的の補充の故であることを示している。第１に、ダイナミンまたはクラスリン活性の遮断は、Ｐ−ＤＭＲ事象の大きさに小さな影響を与える。ダイナミン及びクラスリン、ＥＧＦＲ活性の２つの下流コンポーネント、はＥＧＦＲ内在化及びシグナル伝達の実行において重要な役割を果たす。第２に、ＭＥＫ活性の遮断は、Ｐ−ＤＭＲ事象を部分的に減衰させる。ＭＥＫは、ＭＡＰＫ経路において重要なコンポーネントであり、これは、最初に細胞質から細胞膜に移動し、ＥＧＦ刺激の後に、受容体を伴った内在化が起こる。
【０１０４】
他方、Ｎ−ＤＭＲ事象は、細胞脱離及び受容体内在化の故である。蛍光像は、ＥＧＦ刺激が、大量の内在化された受容体及び細胞脱離をもたらすことを示している。受容体内在化またはＭＥＫ活性の遮断が細胞脱離を防止すること、及び受容体内在化がダイナミン及びクラスリンの両方を必要とすることが知られている。このことは、ダイナミンまたはクラスリン活性の遮断が、受容体内在化及び細胞脱離の両方を抑制すべきであり、ＭＥＫ活性の遮断が、受容体内在化ではなく細胞脱離のみを抑制すべきであることを示している。予想通り、ダイナミンまたはクラスリン阻害剤は、ＥＧＦ起因Ｎ−ＤＭＲを完全に阻害し（〜１００％）、ＭＥＫ阻害剤は、Ｎ−ＤＭＲを部分的にのみ減衰させる（〜８０％）。蛍光像は、ＭＥＫではなくダイナミンの活性の遮断が受容体内在化を減じることを確認する。
【０１０５】
９．ＤＭＲシグナルは、生細胞におけるリガンド作用のシステム細胞薬理情報を含む
ＤＭＲシグナルが、細胞の底部内の細胞物質の動的再分配を含む多くの細胞事象の寄与からなる一体化した細胞応答であるので、ＤＭＲシグナル等のリガンド起因のバイオセンサシグナルは、システム細胞薬理情報を含む。ＧＰＣＲは、細胞内においてしばしばリッチな（rich）挙動を呈し、多くのリガンドが有効なバイアスをもたらして細胞の機構の特定の部分に有利に作用し得かつ経路的にバイアスされた効果を呈し得ることが知られている。従って、リガンドは、受容体の下流の細胞イベントがどのように測定されてリガンド薬理に関する読み出し情報（１または複数）として使用されるかに基づいて複数の効果を有し得る可能性は十分ある。実際、ほとんど経路的にバイアスされておりかつ単一のシグナル伝達事象のみをアッセイする従来の細胞アッセイにとって、ＧＰＣＲリガンドのシグナル伝達ポテンシャルを系統的に表すことは困難である。しかし、ラベルフリーバイオセンサ細胞アッセイが細胞シグナル伝達の事前情報を必要とせず、経路的にバイアスされておらずかつ経路感受性があるので、これらのバイオセンサ細胞アッセイは、リガンド選択性シグナル伝達及び任意のリガンドのシステム細胞薬理の研究に適している。
【０１０６】
１０．バイオセンサパラメータ
ＲＷＧバイオセンサまたはバイオインピーダンスバイオセンサ等のラベルフリーバイオセンサは、リアルタイムでリガンド起因の細胞応答を追うことが可能である。非侵襲及びマニピュレーションフリー（manipulation-free）のバイオセンサ細胞アッセイは、細胞シグナル伝達の事前情報を必要としない。結果として得られたバイオセンサシグナルは、受容体シグナル伝達及びリガンド薬理に関連する高度な情報を含む。マルチパラメータは、刺激における細胞の動的なバイオセンサ応答から抽出され得る。これらのパラメータは、限定するわけではないが、ダイナミクス全体、フェーズ、シグナル振幅、並びに１のフェーズから他のフェーズへの遷移時間を含む動的パラメータ、及びフェーズの各々の反応速度（Fang, Y., and Ferrie, A.M.(2008)"label-free optical biosensor for ligand-directed functional selectivity acting on β2 adrenoceptor in living cells". FEBS Lett. 582, 558-564; Fang, Y., et al., (2005) "Characteristics of dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label free optical biosensors". Anal. Chem., 77, 5720-5725; Fang, Y., et al., (2006) "Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing". Biophys. J., 91, 1925-1940 を参照のこと）を含む。
【０１０７】
Ｈ.定義
本発明の様々な実施例は、図面がある場合は図面を参照して詳細に説明される。様々な実施例への言及は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書ないで説明されている任意の例は、限定することを意図したものではなく、本発明の多くの可能な実施例のいくつかを単に説明するものである。
【０１０８】
１．１の
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されている場合、単数形「１つの（a, an）」及び「当該（前記）（the）」またはこれと同様の用語は、文脈が明確に定めていなければ、複数の対象を含む。従って、例えば、「１の医薬担体」は２以上のこのような担体等の組み合わせを含む。
【０１０９】
２．略語
当業者に良く知られている略語が使用され得る（例えば、「ｈ」または「ｈｒ」は時間、「ｇ」または「ｇｍ」はグラム、「ｍＬ」はミリリットル、「ｒｔ」は室温、「ｎｍ」はナノメートル、「Ｍ」はモル（モルの）等の略語）。
【０１１０】
３.約
例えば、本発明の実施例の説明において用いられている組成物内の含有物の量、濃度、体積、処理温度、処理時間、収率、フローレート、圧力等の値及びこれらの範囲を修飾する「約」は、例えば、化合物、組成物、濃縮物を生成するために用いられる通常の測定及び取り扱い手順または配合（use formulation）を通して；これらの手順の不注意なエラーを通して；本方法の実行に使用される製品、線源（source）、または複数の出発物質もしくは原料の差異等を通して発生し得る数値的量の変化に言及する。用語「約」は、特定の初期濃度または混合比を有する組成物または製剤の時効・経時劣化（aging）の故に異なる量、及び特定の初期濃度または混合比を有する塑性物又は製剤の混合または処理の故に異なる量を包含する。用語「約」によって修飾されても、本明細書に添付の特許請求の範囲は、これらの量と等しい量を含む。
【０１１１】
４．アッセイ
アッセイまたはこれと同様の用語は、分子または細胞等の物質の性質、例えば、存在、不存在、量、範囲、反応速度（kinetics）、ダイナミクス、または、リガンドもしくはマーカー等の１または複数の外因的な刺激を用いた刺激における刺激における細胞の光学的もしくはバイオインピーダンス的応答を判定する分析をいう。刺激に対する細胞応答のバイオセンサシグナルの生成は、アッセイであり得る。
【０１１２】
５．応答をアッセイする
「応答をアッセイする」またはこれと同様の用語は、応答を特徴付ける手段を用いることを意味する。例えば、分子が細胞と接触させられた場合、バイオセンサは、分子への暴露における細胞の応答のアッセイに使用され得る。
【０１１３】
６．アゴニズム（agonism）及びアンタゴニズム（antagonism）モード
アゴニズムモードまたはこれと同様の用語は、細胞が分子に対して暴露されて分子がＤＭＲシグナル等のバイオセンサシグナルをトリガする能力を判定するアッセイをいい、アンタゴニズムモードは、細胞が分子の存在においてマーカーに暴露されて、分子がマーカーに対する細胞応答のバイオセンサシグナルを調節する能力を判定するアッセイである。
【０１１４】
７．バイオセンサ
バイオセンサまたはこれと同様の用語は、検体の検出をするデバイスをいい、これは生物学的化学成分を物理化学的検出成分と組み合わせる。バイオセンサは、通常は３つの部分からなる：生物学的成分または要素（組織、微生物、病原体、細胞、またはこれらの組み合わせ）、検出要素（光学的、圧電効果的、電子化学的、温度的、または磁気的）、及び両方の成分・要素と関連付けられているトランスデューサ。生物学的成分または要素は、例えば、生細胞、病原体、またはこれらの組み合わせであってもよい。実施例において、光バイオセンサは、生細胞、病原体、またはこれらの組み合わせにおける分子認識または分子刺激事象を定量化可能な信号に変換する光トランスデューサを含んでもよい。
【０１１５】
８．バイオセンサ応答
「バイオセンサ応答」、「バイオセンサ出力シグナル」、「バイオセンサシグナル」またはこれと同様の用語は、細胞を有するセンサシステムの細胞応答に対する任意の反応である。バイオセンサは、細胞応答を定量化可能なセンサ応答に変換する。バイオセンサ応答は、ＲＷＧもしくはＳＰＲ等の光バイオセンサによって測定される刺激における光応答であるか、または電気的バイオセンサによって測定される刺激における細胞のバイオインピーダンス応答である。バイオセンサ応答が刺激における細胞応答に直接関連する故に、バイオセンサ応答及び細胞応答は、本発明の実施例において、交換可能に使用され得る。
【０１１６】
９．バイオセンサシグナル
「バイオセンサシグナル」またはこれと同様の用語は、刺激されている細胞の応答によって生成される、バイオセンサを用いて測定されるシグナルをいう。
【０１１７】
１０．細胞
細胞等は、半透過性の膜によって外部から境界付けられた原形質の小さな、通常は微視的な塊をいい、細胞等は、１または複数の核及び様々な他の細胞小器官を選択的に含み、単独でまたは他の同様な塊と反応して生体のすべての基礎的な機能を果たすことができ、合成細胞構造、細胞モデルシステム及び同様の人工的な細胞システムを含む独立的な機能がある生体物質の最小単位を生成する。
【０１１８】
細胞は、特定の病気に関連する細胞、特定の複製起源（origin）からの細胞タイプ、特定の標的に関連する細胞タイプ、また特定の生理学的機能に関連する細胞タイプ等の異なった細胞タイプを含み得る。細胞は、体内に生じた細胞、人工細胞、形質転換細胞、固定化細胞、初代細胞（primary cell）、胚幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞、または幹細胞由来細胞であってもよい。
【０１１９】
ヒトは、約２１０の既知の異なる細胞タイプからなっている。細胞のタイプの数は、ほぼ無制限であり得、細胞がどのように準備されたか（例えば、製造されたか、形質転換されたか、固定化されたか、またはヒトの体から新鮮な状態出分離されたか）及び細胞がどこから取得されたか（例えば、異なった年齢のヒトの体または異なった病気のステージ等）を考慮する。
【０１２０】
１１．細胞培養
「細胞培養（cell culture）（cell culturing）」は、原核生物のまたは真核性の細胞が制御された条件下で成長させられる処理をいう。「細胞培養」は、多細胞真核生物、特に動物の細胞から得られた細胞の培養だけではなく、複合組織及び器官の培養もいう。
【０１２１】
１２．細胞パネル
「細胞パネル」またはこれと同様の用語は、少なくとも２つのタイプの細胞を含むパネルである。この細胞は、本明細書に開示されている任意のタイプの細胞またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１２２】
１３．細胞応答
「細胞応答」またはこれと同様の用語は、刺激に対する細胞の任意の反応である。
【０１２３】
１４．細胞プロセス
細胞プロセスまたはこれと同様の用語は、細胞内または細胞によって生起するプロセスである。細胞プロセスの例には、限定するわけではないが、増殖、アポトーシス、壊死、分化、細胞シグナル変換、極性変化、移動・遊走、または形質転換を含む。
【０１２４】
１５．細胞標的
「細胞標的」等は、タンパク質または核酸等の生体高分子であり、これらの活性は外部刺激によって変化させられ得る。細胞標的は、通常は、酵素、キナーゼ、イオンチャンネル及び受容体等のタンパク質である。
【０１２５】
１６．特徴付け
特徴付けまたはこれと同様の用語は、リガンド、分子、マーカーまたは細胞等の物質の任意の性質に関する情報を収集することをいい、リガンド、分子、マーカーまたは細胞のプロファイルを取得すること等をいう。
【０１２６】
１７．含む
明細書及び特許請求の範囲に亘って、用語「含む」及びこの変化形は、「含むがこれらに限定しない」という意味であり、例えば他の添加物、成分、整数またはステップを排除することは意図していない。
【０１２７】
１８．本質的〜から構成される
実施例における「本質的に〜から構成される」は、例えば、表面組成、表面組成を生成するもしくは使用する方法、製剤、またはバイオセンサの表面の組成、及び本発明の製品、デバイスまたは装置に言及するものであり、特許請求の範囲内に列挙されている構成要素またはステップを含み得る。「本質的に〜から構成される」は、さらに他の構成要素またはステップであって、開示されているものを生成及び使用する組成物、製品、装置及び方法の基本的及び新規な性質に実質的に影響を与えない他の構成要素またはステップを含み得る。当該本発明は、組成物、製品、装置及び開示されているもの、例えば、特定の反応物、特定の添加剤または含有物、特定の試薬、特定の細胞もしくは細胞株、特定の表面変更因子もしくは表面状態、特定のリガンド候補、または同様の変更可能に選択される構造、物質または処理等である。本発明の構成要素またはステップの基本的性質に実質的に影響を与え得るかまたは本発明に望まれない特徴を与え得る要素は、例えば、バイオセンサ表面に対する細胞の親和性の低下、細胞表面受容体もしくは細胞内受容体への刺激の異常な親和性、リガンド候補等の刺激に対する応答における特異または正反対の細胞活性、及び同様の特性を含む。
【０１２８】
１９．成分
本発明の組成物を準備するために使用される成分及び本明細書に開示されている方法において使用される組成物自体が開示されている。これらまたは他の物体が本明細書に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合、これらの分子の個別、集合的組み合わせ及び順列についての特別な言及が明確になされていない場合でも、本明細書内にこれらの各々は予期され表されていることが理解されるべきである。従って、分子のクラスＡ、Ｂ及びＣが開示されておりかつ分子のクラスＤ、Ｅ及びＦが開示されており、Ａ−Ｄが開示されている場合、これらの各々が個別的に記載されていなくとも、これらの各々は個別及び集合的な予期される意味のある組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆが開示されている。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせも開示されていると考えられる。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループが開示されていると考えられる。この概念は、限定するわけではないが、本発明の成分を生成しかつ使用する方法におけるステップを含む本出願の全ての特徴に適用される。実行可能な様々な追加ステップがある場合、これらの追加ステップの各々は、本発明の方法の任意の特定の実施例または実施例の組み合わせを用いて実行され得る。
【０１２９】
２０．接触
接触またはこれと同様の用語は、分子相互作用が少なくとも２つの物（分子、細胞、マーカー、少なくとも１つの化合物もしくは組成物、少なくとも２つの組成物、または製品（１または複数）またはマシンを伴ったこれらのいずれか）の間で起こり得る場合に分子相互作用が起き得るように近接させることを意味する。例えば、接触は、少なくとも２つの組成物、分子、製品または物を接触させる、すなわちそれらが混合または触れあうように近接させることをいう。例えば、組成物Ａの溶液及び培養された細胞Ｂ得て、培養された細胞Ｂ上に組成物Ａの溶液を注入することは、組成物Ａの溶液を培養細胞Ｂに接触させることである。細胞をリガンドに接触させることは、リガンドを細胞にもたらして、細胞がリガンドにアクセス可能とすることである。
【０１３０】
本明細書で開示されている全ての物は、何とでも接触させることが可能であることが理解される。例えば、細胞は、マーカーまたは分子、バイオセンサ等と接触させることができる。
【０１３１】
２１．化合物及び組成物
化合物及び組成物は、本技術分野における一般的な意味を有する。分子、物質、マーカー、細胞、または試薬組成物等の具体的に指定されたもの、これらの指定されたものを含むもの、これらの指定されたものからなるもの及び本質的にこれらの指定されたものからなるものが開示されていると理解される。従って、特定の指定マーカーが使用される場合、当該マーカーを含み、当該マーカーからなり、または本質的に当該マーカーからなる組成物が開示されると理解される。適切ならば、具体的な指定がされている場合、当該指定されているものの化合物も開示されていると理解される。例えば、具体的な生物学的物質、ＥＧＦ等が開示されている場合、化合物に含まれるＥＧＦも開示される。
【０１３２】
２２．対照・対照群（コントロール）
対照・対照群（コントロール）、「対照（コントロール）基準」または「対照（コントロール）細胞」またはこれと同様の用語は、変化が測定される基準として定義される。例えば、対照群は実験には影響を受けないが、代わりにパラメータの定義されたセットの影響を受ける、すなわち、対照群は、処理前または処理後基準に基づいている。これらは、分析と並行して、または分析に先立ってもしくは分析の後に行われてもよく、これらは所定の基準であってもよい。例えば、対照群は、被験者、対象物または試薬等が、実験における手順、薬剤または変量等がないことを別とした並行実験などで処理される実験の結果をいってもよく、当該実験は、実験的効果の判定における比較の基準として使用される。従って、対照群は、手順、薬剤または変量等に関する効果を判定するために使用され得る。例えば、細胞における分析分子の効果が問題になっている場合、ａ）単純に、分子の存在における細胞の特性を記録し、ｂ）ａを実行して、その後に既知の活性または活性の欠如をもつ対照群分子、または対照群組成物（例えば、アッセイ緩衝溶液（媒体））の追加の影響を記録し、その後に分析分子の効果と対照群を比較してもよい。ある状況において、対照が一度実施されると、当該対照は基準として使用され得、当該状況においては、対照実験は再度実施する必要がなく、他の状況においては、対照実験は並行して行われるべきであり、その都度比較がなされる。
【０１３３】
２３．検出
検出またはこれと同様の用語は、分子起因のまたはマーカー起因の細胞応答を発見または検知するために、及び異なった分子に対して検知された応答を区別するために本発明の装置及び方法ができることをいう。
【０１３４】
２４．（薬品候補分子の）直接作用
「直接作用」またはこれと同様の用語は、細胞に独立して作用する（薬品候補分子の）効果である。
【０１３５】
２５．ＤＭＲシグナル
「ＤＭＲシグナル」またはこれと同様の用語は、刺激における細胞の応答によって生成され、光バイオセンサを用いて測定された細胞のシグナルをいう。
【０１３６】
２６．ＤＭＲ応答
「ＤＭＲ応答」またはこれと同様の用語は、光バイオセンサを用いたバイオセンサ応答である。ＤＭＲは、動的質量再分配（再分布）または動的細胞物質再分配（再分布）をいう。Ｐ−ＤＭＲは、ポジティブなＤＭＲ応答であり、Ｎ−ＤＭＲは、ネガティブなＤＭＲ応答であり、ＲＰ−ＤＭＲは立ち直り（recovery）Ｐ−ＤＭＲ応答である。
【０１３７】
２７．薬剤候補分子
薬剤候補分子またはこれと同様の用語は、薬剤またはファルマコフォア（pharmacophore）として機能する能力について分析される分析分子である。この分子は、リード分子（lead molecule）として考えられてもよい。
【０１３８】
２８．効能
効能またはこれと同様の用語は、理想的なまたは最適な条件下で所望の大きさの効果をもたらす能力である。これらの条件は、実生活の条件下での変化にかかわる関連する有効性のコンセプトから効能を区別する条件である。効能は、分子、細胞、組織またはシステムレベルにおける応答を生起させる能力と受容体占有状態との間の関係である。
【０１３９】
２９．より高い、阻害（抑制）及びこれらと同様の用語
より高い、増加する、上昇させる、上昇もしくはこれらと同様の用語またはこれらの変化形は、例えば、対照群と比較した場合に、基礎レベルを越えて増加することをいう。低い、より低い、減少する、低下する、減少もしくはこれらと同様の用語またはこれらの変化形は、例えば、対照群と比較した場合に、基礎レベルを越えて低下することをいう。例えば、基礎レベルは、細胞への作動物質または拮抗物質等の分子の添加前、すなわちこれらの不在における通常の生体内レベルである。阻害もしくは阻害の態様またはこれらと同様の用語は、低減または抑制をいう。
【０１４０】
３０．分子の存在状態において
「分子の存在状態において」またはこれと同様の用語は、培養細胞の分子との接触または分子への暴露をいう。接触または暴露は、刺激（刺激物質）が細胞に接触させられる前またはそのときに起き得る。
【０１４１】
３１．インデックス（指標）
インデックス（指標）またはこれと同様の用語は、一群のデータである。例えば、インデックスは、１または複数の変化プロファイルを含むリスト、表、ファイル、またはカタログであり得る。インデックスは、データの任意の組み合わせから生成され得る。例えば、ＤＭＲプロファイルは、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ及びＲＰ−ＤＭＲを有し得る。インデックスは、プロファイルの完成日、Ｐ−ＤＭＲデータ、Ｎ−ＤＭＲデータ、ＲＰ−ＤＭＲデータ、もしくはこれら内の任意の点、またはこれらもしくは他のデータの組み合わせを用いて生成されてもよい。インデックスは、これらの任意の情報の一群である。通常は、インデックスを比較する際、これらのインデックスは同種のデータ、すなわちＰ−ＤＭＲデータとＰ−ＤＭＲデータである。
【０１４２】
ｉ．バイオセンサインデックス
「バイオセンサインデックス」またはこれと同様の用語は、一群のバイオセンサデータで構成されているインデックスである。バイオセンサインデックスは、第１のプロファイル、または第２のプロファイル等の一群のバイオセンサプロファイルであり得る。このインデックスは、任意のタイプのデータから構成されていてもよい。例えば、プロファイルのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータ点からなっていてもよく、Ｐ−ＤＭＲデータ点であってもよく、これらの両方でもよく、またはインピーダンスデータ点でもよい。これは、プロファイル曲線と関連している全てのデータ点であってもよい。
【０１４３】
ii．ＤＭＲインデックス
「ＤＭＲインデックス」またはこれと同様の用語は、一群のＤＭＲデータからなるバイオセンサインデックスである。
【０１４４】
３２．既知の分子
既知の分子またはこれと同様の用語は、既知の薬理学的／生物学的／生理学的／病態生理学的活性・作用であり、これらの作用（１または複数）の正確な態様は既知でも未知でもよい。
【０１４５】
３３．既知のモジュレータ
既知のモジュレータまたはこれと同様の用語は、標的の少なくとも１つが既知の親和性と共に知られているモジュレータである。例えば、既知のモジュレータは、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＡ阻害剤、ＧＰＣＲ拮抗物質、ＧＰＣＲ作動物質、ＲＴＫ阻害剤、表皮成長因子受容体中和抗体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤または活性剤等であってもよい。
【０１４６】
３４．既知のモジュレータバイオセンサインデックス
「既知のモジュレータバイオセンサインデックス」またはこれと同様の用語は、既知のモジュレータに関して収集されたデータによって生成されたモジュレータバイオセンサインデックスである。例えば、既知のモジュレータバイオセンサインデックスは、細胞のパネルにおいて作用する既知のモジュレータのプロファイル、及びマーカーのパネル（マーカーのパネルの各々は、細胞のパネル内の細胞に対するものである）に対する既知のモジュレータの変化プロファイルからなっていてもよい。
【０１４７】
３５．既知のモジュレータＤＭＲインデックス
「既知のモジュレータＤＭＲインデックス」またはこれと同様の用語は、既知のモジュレータに関して収集されたデータによって生成されたモジュレータＤＭＲインデックスである。例えば、既知のモジュレータＤＭＲインデックスは、細胞のパネルにおいて作用する既知のモジュレータのプロファイル、及びマーカーのパネル（マーカーのパネルの各々は、細胞のパネル内の細胞に対するものである）に対する既知のモジュレータの変化プロファイルからなっていてもよい。
【０１４８】
３６．リガンド
リガンドまたはこれと同様の用語は、生物学的目的を達するために結合して生体分子を有する複合体を形成可能な物質、組成物または分子である。リガンドとそのターゲット分子との間の、実際の不可逆な共有結合は、生物学的システム内で希有である。受容体に結合しているリガンドは、化学的構造・配座すなわち受容体タンパク質の３次元形状を変化させる。受容体タンパク質の構造的状態は、受容体の機能的状態を決定する。結合の傾向または強度は、親和性と称される。リガンドは、基質、ブロッカー、阻害剤、活性剤、及び神経伝達物質を含む。放射性リガンドは、放射性同位体でラベル付けされたリガンドであり、蛍光リガンドは蛍光タグ付けされたリガンドである。この両方がリガンドとして考えられ得、受容体生物学的及び生化学的研究に関するトレーサーとしてしばしば使用される。リガンド及び分子は、交換可能に使用される。
【０１４９】
３７．ライブラリ
ライブラリまたはこれと同様の用語は、コレクション（収集物）である。ライブラリは、本明細書において開示されている全てのもののコレクションであってもよい。例えば、インデックスのコレクション、インデックスライブラリであってもよく；プロファイルのコレクション、プロファイルライブラリであってもよく；ＤＭＲインデックスのコレクション、ＤＭＲインデックスライブラリであってもよく；分子のコレクション、分子ライブラリであってもよく；細胞のコレクション、細胞ライブラリであってもよく；マーカーのコレクション、マーカーライブラリであってもよく；ライブラリは、ランダムまたは非ランダムでもよく、定義されていても定義されていなくともよい。例えば、既知のモジュレータのＤＭＲインデックスまたはバイオセンサインデックスのライブラリが開示されている。
【０１５０】
３８．マーカー
マーカーまたはこれと同様の用語は、バイオセンサ細胞アッセイにおけるシグナルを生成するリガンドである。シグナルは、少なくとも１つの特定の細胞シグナル伝達経路（１または複数）及び／または少なくとも１つの特定の標的（１または複数）を介して媒介されている少なくとも１つの特定の細胞プロセス（１または複数）の特性で（もあるべきで）ある。シグナルは、ポジティブもしくはネガティブ、または任意の組み合わせ（例えば振動）であってもよい。
【０１５１】
３９．マーカーパネル
「マーカーパネル」またはこれと同様の用語は、少なくとも２つのマーカーを含むパネルである。このマーカーは、異なった経路、同一の経路、異なった標的または同一の標的に関し得る。
【０１５２】
４０．マーカーバイオセンサインデックス
「マーカーバイオセンサインデックス」またはこれと同様の用語は、マーカーに関して収集されたデータによって生成されたバイオセンサインデックスである。例えば、マーカーバイオセンサインデックスは、細胞のパネルにおいて作用するマーカーのプロファイル、マーカーのパネルに対するマーカーの変化プロファイルから構成され得、マーカーのパネルの各々は、細胞のパネル内の細胞に対するものである。
【０１５３】
４１．マーカーＤＭＲインデックス
「マーカーバイオセンサインデックス」またはこれと同様の用語は、マーカーに関して収集されたデータによって生成されたバイオセンサＤＭＲインデックスである。例えば、マーカーＤＭＲインデックスは、細胞のパネルにおいて作用するマーカーのプロファイル、及びマーカーのパネルに対するマーカーの変化プロファイルから構成され得、マーカーのパネルの各々は、細胞パネル内の細胞に対するものである。
【０１５４】
４２．材料
材料は、物理的対象物の構成となる何か（化学的、生化学的、生物学的、またはこれらの組み合わせ）の有体的な一部である。
【０１５５】
４３．ミミック（模倣体）
本明細書において、「ミミック（模倣体）」またはこれと同様の用語は、参照対象の１または複数の機能を果たすことをいう。例えば、分子ミミックは、分子の１または複数の機能を果たす。
【０１５６】
４４．変化
変化させること、またはその態様は、細胞標的によって媒介される細胞活性を増加、減少または維持することを意味する。これらの言葉の１つがどこで使用されようとも、対照から１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、もしくは１０００％増加させられ得ること、または対照から１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、もしくは１０００％減少させられ得ることが開示される。
【０１５７】
４５．モジュレータ（修飾物質）
モジュレータ（修飾物質）またはこれと同様の用語は、細胞標的の活性を制御するリガンドである。これは、標的タンパク質のような細胞標的に結合するシグナル変化分子である。
【０１５８】
４６．変化比較（modulation comparison）
「変化比較」またはこれと同様の用語は、第１のプロファイル及び第２のプロファイルの正規化の結果である。
【０１５９】
４７．モジュレータバイオセンサインデックス
「モジュレータバイオセンサインデックス」またはこれと同様の用語は、モジュレータに関して収集されたデータによって生成されたバイオセンサインデックスである。例えば、モジュレータバイオセンサインデックスは、細胞のパネルにおいて作用するモジュレータのプロファイル、及びマーカーのパネルに対するモジュレータの変化プロファイルから構成されてもよく、マーカーのパネルの各々は、細胞のパネル内の細胞に対するものである。
【０１６０】
４８．モジュレータＤＭＲインデックス
「モジュレータＤＭＲインデックス」またはこれと同様の用語は、モジュレータに関して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスである。例えば、モジュレータＤＭＲインデックスは、細胞のパネルにおいて作用するモジュレータのプロファイル、及びマーカーのパネルに対するモジュレータの変化プロファイルから構成されてもよく、マーカーのパネルの各々は、細胞のパネル内の細胞に対するものである。
【０１６１】
４９．マーカーのバイオセンサシグナルを変化させる
「マーカーのバイオセンサシグナルを変化させる」またはこれと同様の用語は、マーカーを用いた刺激に対する応答における細胞のバイオセンサシグナルまたはプロファイルの変化をもたらすことをいう。
【０１６２】
５０．ＤＭＲシグナルを変化させる
「ＤＭＲシグナルを変化させる」またはこれと同様の用語は、マーカーを用いた刺激に対する応答における細胞のＤＭＲシグナルまたはプロファイルの変化をもたらすことをいう。
【０１６３】
５１．分子
本明細書で使用する場合、「分子」またはこれと同様の用語は、化学的分子または決まった分子量を有する分子として存在する生物学的、生化学的または化学的エンティティをいう。分子またはこれと同様の用語は、サイズにかかわらず、化学的、生化学的、または生物学的分子をいう。
【０１６４】
多くの分子は、有機分子（様々ある中で、共有結合にとって結合された炭素原子を含む分子）と称されるタイプであるが、いくつかの分子は炭素を含まない（酸素分子等の単なるガス分子、及びいくつかの硫黄ベースの高分子等の複合分子）。一般的な用語「分子」は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド、有機薬剤、小分子、受容体、抗体及び脂質等、分子の多数の記述的クラスまたはグループを含む。適切ならば、これらの分子が一般的なクラスの「分子」及びタンパク質等の名前を付けられたサブクラスの両方を表すという意図を損なわずに、分子のサブグループに方法を適用する故に、これらのさらに記述的な用語（タンパク質等、これらの多くは、自身が分子の重複するグループを表す）の１または複数が本明細書において使用される。特に示さない限り、用語「分子」は、特定の分子及びそれらの塩（薬剤的に条件を満たした塩等）を含む。
【０１６５】
５２．分子混合物
分子混合物またはこれと同様の用語は、少なくとも２つの分子を含む混合物を言う。２つの分子は、限定するものではないが、構造的に異なっている（すなわち、光学異性体）か、組成的に異なっている（例えば、タンパク質イソ型、糖型、異なったポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）修飾を伴う抗体）か、または構造的及び組成的に異なって（例えば、未精製自然抽出物、または未精製合成化合物）いてもよい。
【０１６６】
５３．分子バイオセンサインデックス
「分子バイオセンサインデックス」またはこれと同様の用語は、分子に関して収集されたデータによって生成されたバイオセンサインデックスである。例えば、分子バイオセンサインデックスは、細胞のパネルにおいて作用する分子のプロファイル、及びマーカーのパネルに対する分子の変化プロファイルから構成されていてもよく、マーカーのパネルの各々は細胞のパネル内の細胞に対するものである。
【０１６７】
５４．分子ＤＭＲインデックス
「分子ＤＭＲインデックス」またはこれと同様の用語は、分子に関して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスである。例えば、分子バイオセンサインデックスは、細胞のパネルにおいて作用する分子のプロファイル、及びマーカーのパネルに対する分子の変化プロファイルから構成されていてもよく、マーカーのパネルの各々は細胞のパネル内の細胞に対するものである。
【０１６８】
５５．分子インデックス
「分子インデックス」またはこれと同様の用語は、分子に関するインデックスである。
【０１６９】
５６．分子処理細胞
分子処理細胞またはこれと同様の用語は、分子に暴露されている細胞である。
【０１７０】
５７．分子変化インデックス
「分子変化インデックス」またはこれと同様の用語は、細胞のパネルにおいて作用するマーカーのパネルのバイオセンサ出力シグナルを変化させる分子の能力を表す指標である。変化インデックスは、任意の分子が不在の場合に対して、分子が存在する場合のマーカーを用いた刺激における細胞の応答の特定のバイオセンサ出力シグナルパラメータを正規化することによって生成される。
【０１７１】
５８．分子薬理
分子薬理またはこれと同様の用語は、システム細胞生物学もしくはシステム細胞薬理、または細胞に作用する分子の挙動の形態（１または複数）をいう。分子薬理学は、限定するわけではないが毒性、特定の細胞プロセス（１または複数）（例えば、増殖、分化、活性酸素種シグナル伝達）に影響を与える能力、または特定の細胞標的（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＪＡＫ２、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ２、またはアクチン）を変化させる能力によってしばしば特徴付けられる。
【０１７２】
５９．正規化
正規化またはこれと同様の用語は、データ、プロファイルまたは応答を調整して、例えば、少なくとも１つの共通変数を除去することを意味する。例えば、２つの応答が生成され、１つが細胞に作用するマーカーに関し、もう１つが細胞において作用するマーカー及び分子である場合、正規化は、分子が不在の場合のマーカー起因の応答と分子が存在する場合の応答とを比較して、マーカーのみによる応答を除去し、正規化された応答がマーカーに対する分子の調節による応答を表すようにする動作をいう。変化比較は、マーカーの第１のプロファイルと、分子が存在する場合のマーカーの第２のプロファイルを正規化することによって生成される（変化プロファイル）。
【０１７３】
６０．選択的
「選択的な」もしくは「選択的に」またはこれと同様な用語は、その後に説明される事象または状況が起き得るかまたは起き得ないことを意味し、当該説明には、その事象または状況がどこで起きるかの事例、及びどこでは起きないかの事例を含む。例えば、「選択的に、組成物は組み合わせを含み得る」というフレーズは、組成物が異なった分子の組み合わせを含んでもよいかまたは組み合わせを含まなくともよく、説明が組み合わせ及び組み合わせ（すなわち組み合わせの個々の要素）の不在の両方を含むことを意味する。
【０１７４】
６１．または
本明細書において使用されている用語「または」またはこれと同様の用語は、特定のリストの任意の１つの要素を意味し、そのリストの要素の任意の組み合わせも含む。
【０１７５】
６２．プロファイル
プロファイルまたはこれと同様の用語は、細胞等の組成物に関して収集されたデータをいう。プロファイルは、本明細書に記載されているラベルフリーバイオセンサから収集され得る。
【０１７６】
ｉ．第１の（主）プロファイル
「第１の（主）プロファイル」またはこれと同様の用語は、分子が細胞に接触した際に生成されるバイオセンサ応答、バイオセンサ出力シグナルまたはプロファイルをいう。通常は、第１のプロファイルは、正味０のバイオセンサシグナル（すなわちベースライン）に対する初期細胞応答の正規化の後に取得される。
【０１７７】
ii．第２の（副）プロファイル
「第２の（副）プロファイル」またはこれと同様の用語は、分子が存在する場合のマーカーへの応答における細胞のバイオセンサ応答またはバイオセンサ出力シグナルである。第２のプロファイルは、マーカー起因の細胞応答またはバイオセンサ応答を変化させる分子の能力の指標として使用され得る。
【０１７８】
iii．変化プロファイル
変化プロファイルまたはこれと同様の用語は、分子が存在する場合のマーカーの第２のプロファイルと任意の分子が存在しない場合のマーカーの第１のプロファイルとの間の比較である。比較は、例えば、第２のプロファイルから第１のプロファイル減算することによって、第１のプロファイルから第２のプロファイルを減算することによって、または第２のプロファイルを第１のプロファイルに対して正規化することによってもよい。
【０１７９】
６３．パネル
パネルまたはこれと同様の用語は、非検査物（マーカー、細胞、または経路）の所定のセットである。パネルは、ライブラリから被検査物を取り出すことで生成され得る。
【０１８０】
６４．陽性対照
「陽性対照」またはこれと同様の用語は、データ収集物をもたらし得るデータ収集の条件を示す対照である。
【０１８１】
６５．薬効を高める
薬効を高める（増強する）、薬効を高めた（増強された）、またはこれと同様の用語は、分子によって起因した細胞内のマーカーのバイオセンサ応答の特定のパラメータの増加をいう。マーカーの第１のプロファイルを、分子が存在する状態における同一の細胞内の同一のマーカーの第２のプロファイルと比較することによって、分子による細胞のマーカー起因のバイオセンサ応答の変化が計算可能である。ポジティブ変化は、分子がマーカーによって生起したバイオセンサシグナルの増加をもたらすことを意味する。
【０１８２】
６６．効力
効力またはこれと同様の用語は、所定の強度の効果を生成するために必要な量について表す分子活性の尺度である。例えば、高い効力の薬品は、低い濃度で大きな反応を引き起こす。効力は、親和性及び効能に比例する。親和性は、薬品分子が受容体に結合する能力である。
【０１８３】
６７．刊行物
本出願を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の全体の開示内容は、関連する分野の水準をさらに完全に説明するために、本出願に参照することによって含まれている。開示されている参考文献は、参考文献に依拠している文章内で説明されているものに含まれている材料に関して、参照されることによって個別に及び明確に本明細書に包含されている
６８．受容体
受容体またはこれと同様の用語は、細胞の原形質膜または細胞質内にあるタンパク質分子であり、これに移動性シグナル伝達（または「シグナル」）分子が付着する。受容体に結合する分子は「リガンド」と称され、ペプチド（神経伝達物質等）、ホルモン、調合薬、または毒素であってもよく、このような結合が起きた場合、受容体は細胞応答を通常開始する立体構造変化を起こす。しかし、いくつかのリガンドは、応答を引き起こさないで単に受容体を遮断する（例えば、拮抗物質）。受容体内のリガンド起因の変化は、リガンドの生物学的活性を構成する生理学的変化をもたらす。
【０１８４】
６９．ロバストなバイオセンサシグナル
「ロバストなバイオセンサシグナル」は、しばしば、ノイズのレベルまたは陰対照より著しく高い（３×、１０×、２０×、１００×、または１０００×等）振幅（１または複数）を有するバイオセンサシグナルである。陰対照応答は、アッセイ緩衝溶液（すなわち媒体）の追加後の細胞のバイオセンサ受容体である。ノイズレベルは、任意の溶液のさらなる追加なしの場合の細胞のバイオセンサシグナルである。任意の溶液の追加前に細胞がいつも溶液に覆われていることが注目される。
【０１８５】
７０．ロバストなＤＭＲシグナル
「ロバストなＤＭＲシグナル」またはこれと同様の用語は、ＤＭＲ形式の「ロバストなバイオセンサシグナル」である。
【０１８６】
７１．範囲
範囲は、本明細書において「約」１の特定の値から及び／または「約」他の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表された場合、他の実施例は、１の特定の値から及び／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を用いることによって値が近似値として表された場合、特定の値が他の実施例を形成することが理解される。範囲の各々の端点は、他の端点との非常に深く関係しておりかつ他の端点から独立していることがさらに理解される。本明細書に開示されている多数の値があることが理解され、値の各々は本明細書において「約」として、当該値に加えて特定の値も開示されていることが理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。ある値が開示されている場合、当業者に適切に理解されるとして、当該値「以下」、「当該値以上」、及び値の間の取り得る範囲も開示されていることが理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下」及び「１０以上」も開示されている。本出願に亘って、データは多数の異なった形式で提供され、このデータが終点及び始点、並びにデータ点の任意の組み合わせに関する範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点１５が開示されている場合、１０及び１５よりも大きい、１０及び１５以上、１０及び１５未満、１０及び１５以下及び１０及び１５と等しいこと、１０と１５との間が考慮され開示されている。２つの特定のユニットの間のユニットの各々も開示されていると理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
【０１８７】
７２．応答
応答またはこれと同様の用語は、任意の刺激に対する任意の反応である。
【０１８８】
７３．試料
試料またはこれと同様の用語は、動物、植物、真菌等；天然産物、天然産物抽出物等；動物から取り出した組織または器官；細胞（被験体内の細胞、被検体から直接取り出した細胞、培養で維持された細胞、または培養された細胞株から取り出された細胞）；細胞溶解物（もしくは溶解物留分）または細胞抽出物；本明細書に説明されているようにアッセイされる細胞または細胞物質（例えば、ポリペプチドまたは核酸）由来の１または複数の分子を意味する。試料は、細胞または細胞要素を含む任意の体液または排出物（例えば、限定するものではないが、血液、尿、糞便、唾液、涙液、胆液）であってもよい。
【０１８９】
７４．シグナル伝達経路
「規定された経路」またはこれと同様の用語は、シグナルの受信（例えば、外からのリガンド）から細胞応答（例えば、細胞標的の発現の増加）までの経路である。いくつかの場合、リガンドの受容体への結合による受容体活性化は、リガンドに対する細胞の応答に直結する。例えば、神経伝達物質ＧＡＢＡは、イオンチャンネルの一部である細胞表面受容体を活性化させ得る。ニューロン上のＧＡＢＡＡ受容体に結合しているＧＡＢＡは、受容体の一部である塩化物選択的なイオンチャンネルを開く。ＧＡＢＡ Ａ受容体の活性化によって、負の電荷を帯びた塩化物イオンが、ニューロンが活動電位を生成する機能を阻害するニューロン内に移動することが可能になる。しかし、多くの細胞表面受容体に関して、リガンド−受容体相互作用は細胞応答に直結していない。活性化された受容体は、細胞の挙動（性質）におけるリガンドの最終的生理的効果が生成される前に、細胞内側の他のタンパク質と最初に相互作用すべきである。しばしば、いくつかの相互作用細胞タンパク質の鎖の挙動は、受容体活性化を受けて変化させられる。受容体の活性化に起因する細胞変化のセットの全ては、シグナル変換機構または経路と称される。シグナル伝達経路は、比較的単純であるかまたは非常に複雑であり得る。
【０１９０】
７５．インデックスの類似性
「インデックスの類似性」またはこれと同様の用語は、２つのインデックスまたは少なくとも３つのインデックスの類似性を表す用語であり、１つは分子に関し、インデックスのパターンに基づきかつ／またはスコアのマトリクスに基づいている。スコアのマトリクスは、対応する細胞内の異なった分子の第１のプロファイルのシグネチャ（signature）、及びマーカーの各々に対する異なった分子の変化プロファイルの特性及び割合等のそれらの対照部分（counterpart）に強く関連している。例えば、より高いスコアがより類似している特性に与えられ、より低いかまたは負のスコアが非類似な特性に与えられる。分子変化インデックスにあるのは、変化の３つのタイプ、ポジティブ、ネガティブ及びニュートラルのみであるので、類似性マトリクスは比較的単純である。例えば、単純なマトリクスは、同一の変化（例えば、ポジティブ変化）に＋１のスコアを付与し、非類似の変化に−１のスコアを付与する。
【０１９１】
代替的に、異なったスコアが異なった基準を用いて変化のタイプに与えられ得る。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、１００％、２００％等のポジティブ変化に、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋１０、＋２０のスコアが対応して与えられ得る。反対に、ネガティブ変化対しては、同様であるが反対符号のスコアが与えられ得る。この手法に従って、マーカーのパネルに対するＬＹ２９４００２の変化インデックスは、図７Ｃに示されているように、非選択的なＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２が異なったマーカーによって引き起こされるバイオセンサ応答を異なって変化する：ピナシジル（−９％）、ホルスコリン（＋３３％）、ヒスタミン（初期Ｐ−ＤＭＲ、＋４１％；後期Ｐ−ＤＭＲ、＋９０％）、全てＡ５４９細胞内；ＥＧＦ（Ｐ−ＤＭＲ、−４２％）、ＥＧＦ（Ｎ−ＤＭＲ、−１８％）、休眠Ａ４３１細胞内。従って、ＬＹ２９４００２のコーディネーション（coordination）における変化インデックスは、（−１、３、４、９、−４、−２）と付与される。同様に、図８Ｃに示されているケルセチンに関して、コーディネーションにおけるそのスコアは、（−１、２、４、９、０、５）である。ＬＹ２９４００２とケルセチンとの間のスコアの比較によって、両方の分子が、試験された２つの細胞株内同様のモード・態様（１または複数）の作用、すなわち非選択的Ｐｉ３Ｋ阻害剤作用、を呈すると結論づけることが可能である。
【０１９２】
７６．安定した
医薬組成物に関して使用する場合、本願発明の分野において、「安定した」またはこれと同様の用語は、規定された期間かつ特定の保管条件の下での有効成分の一定の量以下（通常は１０％）損失を意味するとして通常は理解される。組成物が安定と考えられるために必要とされる時間は、製品の各々の使用方法・用途に関連し、製品の製造、品質管理及び検査のための製品の保持、卸売販売業者への製品の出荷または消費者への直送（製品は、最終的な使用の前に再度保管される）の商的実用性によって決まる。数ヶ月の安全因子を含み、薬剤の最小製品寿命は、通常は１年、このましくは１８ヶ月である。本明細書で使用されているように「安定した」という用語は、これらの市場の現状及び冷蔵条件（２℃−８℃）等の容易に手に入れられる環境条件における製品の保管及び搬送の能力に言及する。
【０１９３】
７７．物質
物質またはこれと同様の用語は、任意の物理的対象である。材料は物質である。分子、リガンド、マーカー、細胞、タンパク質及びＤＮＡは、物質と考えられ得る。機械または製品は、物質自体というよりは、むしろ物質から構成されている物と考えられる。
【０１９４】
７８．被検体（被験者）
本明細書において、被験者またはこれと同様の用語は固体を意味する。従って、「被検体」は、例えば、猫、犬等の家畜化された動物、家畜（牛、馬、豚、羊、山羊等）、実験動物（ネズミ、ウサギ、ラット、テンジクネズミ等）、ほ乳類、ヒト以外のほ乳類、霊長類、ヒト以外の霊長類、齧歯類、鳥類、は虫類、両生類、魚類、及び任意の他の動物を含み得る。１つの態様において、被検体は、霊長類またはヒト等のほ乳類である。被検体はヒトでなくともよい。
【０１９５】
７９．テスト分子
テスト分子またはこれと同様の用語は、テスト分子に関する情報を得る方法において使用される分子をいう。テスト分子は、未知または既知の分子であってもよい。
【０１９６】
８０.処理する
処理する、処理またはこれらと同様の用語は、少なくとも２つの意味で使用され得る。第１に、処理する、処理またはこれらと同様の用語は、被検体に対する投与または作業をいい得る。第２に、処理する、処理またはこれらと同様の用語は、物質及び細胞等の２以上の物質を共に混合する等の、任意２の２つのものの混合をいい得る。この混合は、少なくとも２つを一緒にしてこれらの間の接触が起こり得るようになす。
【０１９７】
処理する、処理またはこれらと同様の用語が、病気を有する被検体の文脈で使用された場合、これらの用語は、例えば、治療または症状の低減の意味を含まない。治療的またはこれと同様の用語が、処理する、処理またはこれらと同様の用語とともに使用された場合、これらの用語は、内在する病気の症状が低減されること、及び／または症状を引き起こす内在する細胞的、生理的または生化学的要因または機構が低減されることを意味する。この文脈で使用される場合、低減されるという語は、単に病気の生理学的状態ではなく、病気の分子の状態を含む病気の状態と比較した意味である。
【０１９８】
８１．トリガ
トリガまたはこれと同様の用語は、事象を誘発するかまたは開始させる応答等の作用をいう。
【０１９９】
８２．値
成分、材料、添加物、細胞タイプ、マーカー及び同様の特徴に関して開示された特定の値及び好ましい値、並びにこれらの範囲は、単なる例示であり、これらの値及び範囲は、他の定義された値または定義された範囲内の他の値を排除するものではない。本発明の成分、装置及び方法は、本明細書に記載されている任意の値もしくは任意の値の組み合わせ、特定の値、さらに具体的な値、及び好ましい値を含む値及び範囲を含む。
【０２００】
従って、本発明の方法、成分、製品、及び機械は、本明細書に記載されている様々な成分、ステップ、分子及び組成物等を含む、それらから構成される、または本質的にそれらから構成されるという態様で組み合わせられ得る。これらは、本明細書で定義されているようなリガンドを含む分子を特徴付ける方法；本明細書において定義されているインデックスを生成する方法；または本明細書に定義されているような薬剤発見の方法において使用され得る。
【０２０１】
８３.未知の分子
未知の分子またはこれと同様の用語は、未知の生物学的、薬理学的、生理学的、病態生理学的効果活性を有する分子をいう。
【０２０２】
８４．経路
本明細書において使用されている経路は、細胞内で発生する一連の化学反応をいう。経路内において、１つの分子または物質が変性させられ、これが、その後、他の分子または物質の変性を誘発し、その後も同様となる。しばしば、キナーゼ等の酵素は、これらの変性に関与する。経路は、細胞表面から核に向かって発生し得、かつ細胞内で細胞小器官から細胞小器官に向かって発生し得るか、または細胞質ゾルから細胞小器官もしくは細胞小器官から細胞質ゾルに向けて発生し得る。変性は、化学的（例えば、リン酸化）または物理的（例えば、１の位置から他の位置への転座）変性を含む。
【０２０３】
８５．シグナル伝達
シグナル伝達は、経路内の他の分子または物質の他の変性をもたらす、経路内の１の分子または物質の変性をいう。
【０２０４】
８６．調整解除された（無秩序な）ＰＩ３Ｋ経路細胞株
調整解除された（無秩序な）ＰＩ３Ｋ経路細胞株は、経路内の重要なシグナル伝達カスケードタンパク質（１または複数）の変化の故にＰＩ３Ｋ経路が過反応する細胞株である。これらの変化は、限定するものではないが、刺激されていない細胞内のＲａｓ及びＰＩ３Ｋの構成的活性化をもたらすＫ−Ｒａｓ（ＰＩ３Ｋの上流タンパク質）の変異、または同様にＰＩ３Ｋの構成的活性化をもたらすＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋの下流のネガティブ調節遺伝子（調節因子））の機能喪失を含む。例えば、調整解除された（無秩序な）ＰＩ３Ｋ経路細胞下部は、刺激されていない細胞内で構成的に活性化されるＫ−Ｒａｓ変異体を含むＡ５４９細胞下部である（(Krypuy, M.氏等 “High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer”. BMC Cancer 2006, 6, e295).）。
【０２０５】
ＰＩ３Ｋ経路に関連しているタンパク質は、限定するわけではないが、（１）ＡＫＴ及びＰＩ３Ｋファミリーであるもの及びこれらの調節因子である：AKT1, AKT2, AKT3, APPL, BTK, CTMP, GNB1, GRB10, GRB2, HSPB1, HSPCA, HSPCB, ILK, INPP5D (SHIP), INPPL1, MAPK8IP1(JIP1), MTCP1, PDK2, PDPK1, PIK3CA (p110a), PIK3CB (p110b), PIK3CG, PIK3R1(p85a), PIK3R2 (p85b), PIK3R3, PRKCA, PRKCB1, PRKCZ, PTEN, TCL1A, TCL1B; （２） ＩＧＦ−１または他のＲＴＫシグナル伝達経路: CSNK2A1, ELK1, FOS, GRB2, HRAS, IGF1, IGF1R, IRS1, JUN, MAP2K1, MAPK3, MAPK8, PIK3CB, PTPN11, RAF1, KRAS, RASA1, SHC1, SOS1, SRF; （３）アクチン組織及び細胞遊走のＰＩ３Ｋサブユニットｐ８５関連調節因子: AICDA, CDC42, CUTL1, PAK1, PDGFRA, RAC1, RHOA, WASL, ZFYVE21; （４）ＰＴＥＮ依存細胞サイクル停止因子及びアポトーシス因子: AKT1, CDKN1B (p27), CUTL1, FASLG, FOXO3A, GRB2, ILK, ITGB1, MAPK1, MAPK3, PDK1, PDK2, PTEN, PTK2, RBL2, SHC1, SOS1, ZFYVE21; （５）ＢＡＤリン酸化関連の抗アポトーシス経路: AKT1, ASAH1, BAD, CUTL1, GRB2, HRAS, IGF1R, IRS1, MAP2K1, MAPK1, MAPK3, PRKAR1B, RAF1, RPS6KA1, SHC1, SOS1, YWHAH, ZFYVE21; and （６）ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関連するタンパク質: AKT1, CUTL1, EIF3S10, EIF4A1, EIF4B, EIF4E, EIF4EBP1, EIF4G1, FKBP1A, FRAP1, MKNK1, PDK1, PDK2, PR48, PTEN, RHEB, RPS6, RPS6KB1, TSC1, TSC2, ZFYVE21、を含む。
【０２０６】
８７．データ出力
データ出力は、ラベルフリーバイオセンサ等の分析マシンを用いたアッセイを実行した後に生じる収集された結果をいう。例えば、ラベルフリーバイオセンサのデータ出力は、ＤＭＲシグナルであり得る。データ出力は、例えば、インデックス内に取り入れられ得ることが理解される。アッセイが、分子、ＰＩ３Ｋ、Ｒｈｏキナーゼ、マーカー、阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、マーカー分子、マーカーＰＩ３Ｋ阻害剤等を用いて実施される様々な種類のデータ出力が存在し得ることが理解される。分子−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較を生成する分子データ出力とＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力との比較等、任意の２つの出力の比較がなされ得ることが理解される。通常は、このような比較は、ＤＭＲデータ出力とＤＭＲデータ出力とのように、類似のデータ出力間で実施される。
【０２０７】
８８.潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤
潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、分子が本明細書において上述されているように既知のＰＩ３Ｋ阻害剤と同様であると判定される任意の分子である。この既知のＰＩ３Ｋ阻害剤は、限定するわけではないが、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、及びＰＩ−１０３等の非選択的なＰＩ３Ｋ阻害剤、並びにＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋγ及びＰＩ３Ｋδ阻害剤等の他のイソ型の選択的なＰＩ３Ｋ阻害剤を含む。既知のＰＩ３Ｋ阻害剤は、比較のための参照分子として使用され得る。
【０２０８】
８９．潜在的Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
潜在的Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤は、分子が本明細書において上述されているように既知のＲＯＣＫ阻害剤と同様であると判定される任意の分子である。この既知のＲＯＣＫ阻害剤は、限定するわけではないが、Ｙ２７６３２、Ｈ−８９及びＨ−８を含む。
【０２０９】
９０．Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株
Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株は、構造的に活性化されているＫ−Ｒａｓ変異が存在する細胞株である。Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株の例は、Ａ５４９細胞株である。
【０２１０】
９１．ＰＩ３Ｋ阻害剤及び既知のＰＩ３Ｋ阻害剤
ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの阻害剤として判定される任意の分子である。既知のＰＩ３Ｋ阻害剤は、限定するわけではないが、非選択的かつ不可逆なＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２、ケルセチン及びＰＩ−１０３等の非選択的かつ不可逆的なＰＩ３Ｋ阻害剤、並びにＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋγ及びＰＩ３Ｋδ阻害剤等の他のイソ型の選択的なＰＩ３Ｋ阻害剤を含む。既知のＰＩ３Ｋは、比較のための参照分子として使用され得る。
【０２１１】
９２.正常なＰＩ３Ｋ経路細胞株
正常なＰＩ３Ｋ経路細胞株は、ＰＩ３Ｋ経路が無秩序ではなく、構造的に活性化されていない。しかし、このような細胞株は、ＰＩ３Ｋ経路の構造的な活性化をもたらすことができないいくらかのタンパク質変異体を未だに含んでいてもよい。
【０２１２】
９３.作動物質
作動物質は、細胞内であってもよい細胞による応答を生成する細胞における受容体と結合する分子等の作用をもたらす分子または物質である。
【０２１３】
９４.拮抗物質
拮抗物質は、受容体に結合する分子等の作動物質の作用等を阻害（遮断等）する分子または物質であり、作動物質が結合するのを防止し、作動物質の作用を阻害する。
【０２１４】
９５.活性化因子
活性化因子は、基本の状態に比べて、状態の増加をもたらす。例えば、ＥＧＦは、ＥＧＦＲの活性化因子であり、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合は、シグナル伝達事象をもたらす。
【０２１５】
９６.ＴＬＲ９作動物質
ＴＬＲ９作動物質は、トール様受容体サブタイプ９（ＴＬＲ９）の作動物質である。ＴＬＲ作動物質は、ＯＤＮ２００６等であり得る。ＴＬＲは、１０パターン認識受容体のファミリー（ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０）である。ＣｐＧＯＤＮは、特定の配列関係（ＣｐＧモチーフ）の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む合成ＯＤＮである。ＣｐＧ ＯＤＮは、強い免疫活性化作用をもたらすＴＬＲによって認識される。ＴＬＲ９作動物質は、３つのクラス、タイプＡ、Ｂ及びＣに各々クラス分けされ得る。タイプＡのＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞から高いＩＦＮアルファ生成物をもたらす、ホスホロチオエート３’ポリ−Ｇストリングを含むが、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達の活性においては弱い。タイプＢのＯＤＮは、１または複数のＣｐＧを有する完全ホスホロチオエート構造骨格を含み、Ｂ細胞を活性化するが、ＩＦＮ−アルファ分泌物中においては弱い。タイプＣのＯＤＮは、完全なホスホロチオエート構造骨格及びＣｐＧ含有回帰性モチーフを含み、ＩＦＮ−アルファ生成物及びＢ細胞活性を含む（Krug, A.氏他. (2001) Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. Eur. J. Immunol. 31, 2154-2163）。
【０２１６】
９７．トール様受容体（ＴＬＲ）
ＴＬＲは、細菌感染を感知してそれに対抗するヒトの先天性免疫の重要な成分であり、後の適応的免疫反応の形成を制御する複数の機構に関与する。ＴＬＲは、感染病、自己免疫疾患、癌、及びアレルギー疾患を含む病気に関する新たな治療的標的の典型である。
【０２１７】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、特異的な病原体関連分子パターンを認識し、先天性免疫反応における重要な役割を果たす。これらは、病原体の侵入に対する防御の第一線において関与し、炎症、免疫細胞調節、生存及び増殖において重要な役割を果たす。今まで、１０のＴＬＲファミリーが認識されている。これらのうち、ＴＬＲ１、２、４、５及び６は、細胞表面に位置し、ＴＬＲ３、７、８及び９はエンドソーム／リソソーム区画に限局されている。ＴＬＲシグナル伝達経路の活性化は、ＴＩＲドメイン含有アダプタ、ＭｙＤ８８に関連している細胞質性のトール／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインから生じている。リガンドを用いた刺激において、ＭｙＤ８８は、両方の分子の死ドメインの相互作用を介して、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）をＴＬＲに補給する。リン酸化によって活性化されたＩＲＡＫは、その後、ＴＲＡＦ６と関連し、最終的にＪＮＫ及びＮＦ−κＢの活性化をもたらす。Ｔｏｏｌｉｐ及びＩＲＡＫ−Ｍは、ＩＲＡＫ−１と相互作用し、ＴＬＲ媒介シグナル伝達経路をネガティブに調整する。ＭｙＤ８８−独立経路は、ＩＲＦの活性化及びインターフェロン−βの発現を誘導する。ＴＩＲＡＰ、ＴＲＩＦ及びＴＲＡＭ等のアダプタを含むＴＩＲ−ドメインは、個別のＴＬＲシグナル伝達カスケードに対する特異性を提供することによってＴＬＲ−媒介シグナル伝達経路を調整する。
【０２１８】
９８．トール様受容体細胞株
トール様受容体細胞株は、内生的にまたは組み替え的にトール受容体を発現する細胞株である。従って、内生的トール受容体細胞株及び組替的トール受容体細胞株が存在する。例えば、ＨｅｐＧ２細胞はＴＬＲ細胞株である。なぜならば、ＨｅｐＧ２細胞が、エンドソーム内に位置しかつ機能的である低レベルのＴＬＲを発現する故である。ＨｅｐＧ２は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、及び多数のＴＬＲの下流の多数のシグナル伝達タンパク質（例えば、ICAM1 , CD14, MyD88, LY96, TRIF, TICAM2, TIRAP, CD83, SOCS1, TNFAIP3, TOLLIP, IRAKI , IRAK2, IRAK4, TRAF6, CCL5, CXCL10）も発現する。しかし、ＨｅｐＧ２は、ＴＬＲ１、４、５、７、８及び１０は発現しない（Nishimura, M.氏及びNaito, S.氏 Tissue-specific mRNA expression profiles of human Toll-like receptors and related genes. Biol. Pharm. Bull. 2005, 28, 886-892）。
【０２１９】
９９．ＲＯＣＫ阻害剤応答細胞株
ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤応答細胞株は、その中で既知のＲＯＣＫ阻害剤によるＲＯＣＫの基本的な活性の阻害が細胞内の検出可能バイオセンサシグナルをもたらす任意の細胞株である。例えば、Ａ５４９もＲＯＣＫ阻害剤応答細胞株である。活性化Ｋ−Ｒａｓ変異体の存在の故に刺激されていないＡ５４９は、調節解除されたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性を含む。ＲＯＣＫは、ＰＩ３Ｋの下流標的である。従って、ＬＹ２７６３２またはＨ８９等の既知のＲＯＣＫ阻害剤によってＲＯＣＫの基本的活性を阻害することは、Ａ５４９細胞内のロバストなＤＭＲシグナルもたらし得る。
【０２２０】
１００．ＩＫＫ経路
ＩＫＫ経路は、ＩＫＫまたはそれらの集合の上流または下流の任意のシグナル伝達分子をいう。ポリ（ＩＣ）等のトール受容体に対する作動物質は、ＩＫＫ経路を活性化し得る。ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）酵素複合体は、上流ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードの一部である。ＩκＢα（カッパＢの阻害剤）タンパク質は、ＮＦ−κＢタンパク質の核局在シグナル（ＮＬＳ）をマスキングして、それらを細胞質内に不活性状態で隔離し続けることに酔ってＮＦ−κＢ転写因子を不活性化する。ＩＫＫは、抑制性ＩκＢαタンパク質を特異的にリン酸化する。このリン酸化は、ＮＦ−κＢからのＩκＢαの解離をもたらし、それによってＮＦ−κＢを活性化する。
【０２２１】
１０１．ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、ＡＫＴまたはそれらの集合の上流または下流の任意のシグナル伝達分子をいう。Ａ５４９内のＧｑ−結合受容体ヒスタミン受容体等のＧＰＣＲに対する作動物質は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化し得る。アデニリルシクラーゼ活性化因子ホルスコリンも、ＥＰＡＣを介したＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性化をもたらす。
【０２２２】
１０２．Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３−媒介シグナル伝達
Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３−媒介シグナル伝達は、Ｇｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３の上流または下流の任意のシグナル伝達事象をいう。これらのシグナル伝達の活性化因子は、内因性プロテアーゼ活性型受容体サブタイプ２（ＰＡＲ２）に対するＳＬＩＧＫＶ−アミド等の作動物質であり得る。
【０２２３】
１０３．Ｒｈｏ−媒介シグナル伝達
Ｒｈｏ媒介シグナル伝達は、Ｒｈｏキナーゼと相互作用する分子または物質の上流または下流の任意のシグナル伝達をいう。ピナシジル等の内因性ＡＴＰ感受性ポタシウム（ＫＡＴＰ）イオンチャンネルのオープナーは、Ｒｈｏ媒介シグナル伝達の活性化因子であってもよい。
【０２２４】
１０４．ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）媒介シグナル伝達
ＪＡＫ媒介シグナル伝達は、ＪＡＫと相互作用する分子または物質の上流または下流のシグナル伝達をいう。ピナシジル等の内因性ＡＴＰ感受性ポタシウム（ＫＡＴＰ）イオンチャンネルのオープナーは、ＪＡＫ媒介シグナル伝達の活性化因子であってもよい。ＪＡＫ及びＳＴＡＴ（シグナル伝達・変換及び転写タンパク質）は、成長、生存分化及び病原体抵抗を調節する多くのサイトカイン受容体システムの重要な成分である。一例は受容体のＩＬ−６（またはｇｐ１３０）ファミリーであり、これらは、Ｂ細胞分化、細胞質生成（Plasmacytogenesis）及び急性期反応を共に調節する。サイトカイン結合は、受容体の二量体化をもたらし、自身または受容体をリン酸化する関連するＪＡＫを活性化する。受容体及びＪａｋのリン酸化部位は、受容体をＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ及び他の細胞経路と接続するＳＨ２−含有タンパク質及びアダプタ、及びＳｔａｔ３等のＳＨ２−含有Ｓｔａｔに対する結合部位として機能する。
【０２２５】
ヤヌスキナーゼ変異は、ヒトの血液学的悪性腫瘍における主要な分子事象である。Ｊａｋ２疑似キナーゼドメイン（Ｖ６１７Ｆ）における独特な体細胞変異は、真性赤血球増加症患者の＞９０％で発生し、かつ特発性血小板無力症及び特発性骨髄線維症患者の大部分で発生する。この変異は、造血前駆体の悪性の変形をもたらすＪａｋキナーゼの病理学的活性化をもたらす。急性巨核芽球性白血病をもついくらかの患者内に存在するいくつかのＪａｋ３疑似キナーゼドメイン変異は、Ｊａｋ３構造的活性をもたらす。体細胞に関する後天的なＪａｋ１内の機能獲得型変異は、成人Ｔ細胞急性リンパ性白血病の約２０％において発見される。
【０２２６】
１０５．ＰＫＣ経路
ＰＫＣ経路は、ＰＫＣまたはそれらの集合の上流または下流の任意のシグナル伝達分子または物質である。ＰＫＣ経路の活性化因子は、ＰＫＣ及びそのシグナル伝達経路を直接活性化するホルボール１２−ミリスチン酸塩１３−アセテート（ＰＭＡ）である。Ｇｑ−結合受容体またはＲＴＫに対する作動物質は、ＰＫＣ経路を活性化するために使用されてもよい。
【０２２７】
１０６．ヒスタミン受容体
ヒスタミン受容体は、それ対してヒスタミンが作動物質として作用する任意の受容体である。ヒスタミン受容体は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４受容体を含む４つのＧタンパク質結合受容体のファミリーである。ヒスタミン受容体は、Ａ５４９及びＡ４３１細胞等の免疫細胞内で内因的に発現する。
【０２２８】
１０７．ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路
ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路は、ｃＡＭＰもしくはＰＫＡまたはそれらの集合の上流または下流のシグナル伝達分子または物質である。アデニリルシクラーゼの活性化因子は、ホルスコリン等のｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路の活性化因子であるが、ホルスコリンはＡ５４９細胞内でのｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路を介したシグナル伝達ももたらす。Ｇｓ−結合受容体に対する作動物質は、ｃＡＭＰ経路の活性化因子でもあり得る。
【０２２９】
１０８．β２−アドレナリン受容体作動物質
β２−アドレナリン受容体作動物質は、β２−アドレナリン受容体における作動物質として機能する任意の分子または物質である。例えば、β２−アドレナリン受容体作動物質は、エピネフリン（Ｅｐｉ）等のＧｓ媒介シグナル伝達の活性化因子であってもよい。
【０２３０】
１０９．ＧＰＲ１０９Ａ
ＧＰＲ１０９Ａは、ニコチン酸（ナイアシン）に対して高い親和性を有する受容体であり（Wise, A.氏他.(2003). "Molecular identification of high and low affinity receptors for nicotinic acid". J. Biological Chemistry 278: 9869-9874; Soga, T.氏他 (2003). "Molecular identification of nicotinic acid receptor". Biochemical and Biophysical Research Communications 303: 364-369）、Ｇタンパク質結合受容体のニコチン酸受容体ファミリーの１つである（確認されている他のものはＧＰＲ１０９Ｂである）。ＧＰＲ１０９Ａは、ニコチン酸に対して高い親和性を有するＧｉ／Ｇｏタンパク質結合受容体である。ＧＰＡ１０９Ａの作動物質は、ニコチン酸等のＧｉ媒介シグナル伝達の活性化因子であり得る。
【０２３１】
１１０．ＥＧＦＲ
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む４つの受容体チロシンキナーゼのファミリーである。ＥＧＦＲの発現または活性に影響を与える変異は、癌をもたらし得る。Ａ４３１細胞は、主にＥＧＦＲを内因的に発現し、ＨＴ２９細胞はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を発現する。Ａ４３１細胞内のＥＧＦＲ受容体は、例えば、ＥＧＦを介して、少なくともＰＩ３Ｋ経路、ＰＫＣ経路、及びＭＡＰＫ経路を活性化し得る。
【０２３２】
１１１．ＨｅｐＧ２細胞株
ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−８０６５）は、ヒト肝細胞癌細胞株であり、高分化型の肝細胞癌を有する１５歳の白人のアメリカ人男性の肝臓組織から抽出された永久細胞株である。これらの細胞は、形態において上皮的であり、モデル染色体番号が５５であり、ヌードマウスにおいては発癌性ではなかった。これらの細胞は、様々な主要な血漿タンパク質を分泌する；例えば、アルブミン、トランスフェリン及び急性期タンパク質フィブリノーゲン、アルファ２−マクログロブリン、アルファ１−アンチトリプシン、トランスフェリン、及びプラスミノーゲン。これらの細胞は、ヒト成長ホルモンによる刺激に応答する。
【０２３３】
ＨｅｐＧ２細胞は、分極されたヒト肝細胞の研究のための適切な管内（体外）モデルシステムである。他の特徴的な分極肝細胞株は、ラット肝癌由来のバイブリッド細胞株ＷＩＦ−Ｂを含む。適切な培養条件を用いると、ＨｅＰＧ２細胞は、管内において各々が毛細胆管（ＢＣ）ドメイン及び類洞ドメインと似ている頂端及び基底細胞表面ドメインの制御可能な形成を伴うロバストな形態的及び機能的分化を呈する（http://www.ATCC.org内の要約を参照）。
【０２３４】
１１２．ＨＴ２９細胞株
ＨＴ２９細胞株は、ヒト、白人、結腸、腺癌、グレードII、上皮癌細胞株由来のものである。ＡＴＣＣカタログコードは、ＨＴＢ−３８である。ＨＴ２９細胞株は、培養中に、ＩｇＡ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、形質転換成長因子ベータ結合タンパク質、及びムチンの分泌成分を含む分子を分泌する（http://www.ATCC.org内の要約を参照）。
【０２３５】
１１３．Ａ５４９細胞株
Ａ５４９細胞株は、上皮性悪性腫瘍ヒト歯槽基底上皮細胞である。ＡＴＣＣカタログコードはＣＣＬ−１８５である。Ａ５４９は、５８歳の白人男性からの肺癌に関連する組織の外植によって１９７２年にイニシエート（initiate）された低三倍体（hypotriploid）ヒト細胞株である（http://www.ATCC.org内の要約を参照）。
【０２３６】
１１４．Ａ４３１細胞株
Ａ４３１細胞は、生物医学の研究において使用されるモデル細胞株である。さらに具体的には、これらは、異常に高いレベルの上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）を発現する故に、細胞サイクル及び癌関連細胞シグナル伝達経路の研究において使用される。Ａ４３１細胞は、ＥＧＦＲ発現に対する陽性対照としてしばしば使用される。Ａ４３１細胞は、機能的なｐ５３、強力な腫瘍抑制遺伝子を含んでいないので、増殖刺激に対して高い感受性がある。Ａ４３１細胞は、８５歳の女性患者の陰門内の類表皮癌から生成された。Ａ４３１細胞の上皮成長因子（ＥＧＦ）刺激は、成長、増殖及びアポトーシス等の細胞プロセスを制御する細胞内シグナル伝達タンパク質の急速なチロシンのリン酸化をもたらす。低い（ピコモル）濃度において、ＥＧＦはＡ４３１細胞の細胞成長を促進し、高い（ナノモル）濃度において、ＥＧＦは細胞を終端的に分化させる故に成長を阻害する。ブラジキニンによるＡ４３１細胞の処理は、基本的及びＥＧＦ起因ＥＧＦＲリン酸化を低減する。セルトリ細胞分泌成長因子（ＳＣＳＧＦ）を用いた処理は、細胞増殖を強く誘発する。ホルボールエステルを用いたＡ４３１細胞の刺激は、インターロイキン１−関連タンパク質ＩＬ１Ｈの発現を誘発する。
【０２３７】
１１５．ＰＫＣ及びＭＡＰＫ経路の活性化因子
ＰＫＣまたはＭＡＰＫ経路の活性化因子は、ＰＫＣまたはＭＡＰＫ経路を活性化する任意の分子または物質である。
【０２３８】
１１６．ＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達の活性化因子
ＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達の活性化因子は、ＩＧＦ１等のＩＧＦ１Ｒに対する作動物質のような、ＩＧＦ１Ｒから上流または下流のシグナル伝達を活性化する任意の分子または物質である。
【０２３９】
１１７．ｈＥＲＧ経路の活性化因子
ｈＥＲＧ経路の活性化因子は、マロトキシン等のｈＥＲＧの活性化因子のような、ｈＥＲＧ経路を活性化する任意の分子または物質である。
【０２４０】
１１８．Ｇｑ及びＧｉ媒介シグナル伝達並びにＥＧＦＲ転写活性化の活性化因子
Ｇｑ及びＧｉ媒介シグナル伝達並びにＥＧＦＲ転写活性化の活性化因子は、ニューロテンシン等のＮＴＳ１／ＮＴＳ３に対する作動物質のような、Ｇｑ及びＧｉ媒介シグナル伝達並びにＥＧＦＲ転写活性化を活性化する任意の分子または物質である。
【０２４１】
１１９．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IV、Ｈ８９、及びＨ８等の、Ｒｈｏキナーゼを阻害すると判定された任意の分子または物質である。
【０２４２】
I．例
１．    例１：２つの良く知られたＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２９４００２及びウォルト
マンニンの用量に依存した反応
i．  材料及び方法（例１から８に関する）
ａ．材料
エピネフリン、ニコチン酸、Ｙ−２７６３２、ピナシジル、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ホルスコリン、及びヒスタミンがSigma Chemical Co.社（セントルイス、ミズーリ州）から購入された。マロトキシン、ＰＩ−１０３、ＬＹ３０３５１１、レスベラトロール、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、ウォルトマンニン、ＨＡ１０７７、Ｈ−８、及びホルボール１２−ミリスチン酸塩１３−アセテート（ＰＭＡ）がBioMol International Inc社（プリマスミーティング、ペンシルベニア州）から取得された。上皮成長因子（ＥＧＦ）、ニューロテンシン、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＳＬＩＧＫＶ−アミドが、BaChem Americas Inc社（トーランス、カルフォルニア州）から取得された。ＯＤＮ２００６は、Imgenex社（サンディエゴ、カルフォルニア州９２１２１）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IV及びＣＤＫ１／２阻害剤III、ＰＩ３Ｋγ阻害剤5-quinoxalin-6-ylmethylene-thiazolindine-2,4-dione、ＰＩ３Ｋβ阻害剤II ＴＧＸ−２２１((+/-)-7-Methyl-2-(morpholin-4-yl) -9 -(1-phenylaminoethyl)-pyridol[1,2 -a]-pyrimidin-4-one)、ＤＮＡ ＰＫ阻害剤II ＬＹ２９３６４６（2-(Morpholin-4-yl)-benzo[h]chromen-4-one）、ＤＮＡ ＰＫ阻害剤III(1-(2-Hydroxy-4-morholin-4-yl-phenyl)ethanone)は、EMD Biosciences社（ギブスタウン、ニュージャージ州）から取得された。Epic（登録商標）３８４バイオセンサマイクロプレート細胞培養互換機は、Corning社（コーニング、ニューヨーク州）から取得された。
【０２４３】
ｂ．細胞培養
全ての細胞株は、American Type Cell Culture（マナッサス、バージニア州）から取得された。細胞培養培地は、以下の通りである：（１）１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、並びにヒト類表皮性癌Ａ４３１、ヒト肺癌Ａ５４９、及びヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２に対する抗生剤が添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地）；（２）１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、ヒト結腸直腸腺癌に対する抗生剤が添加されたマッコイ５ａ改変培地。
【０２４４】
細胞は、通常は、ウェル毎に〜１から２×１０４個の細胞を用いて、３から１５の継代で、バイオセンサマイクロプレート内の対応する培養培地の５０μｌ内に懸濁されて成長させられ、〜１日間、空気／５％ＣＯ２の条件下で３７℃の温度で培養される。１日間の培養に続いて血清なし培地内での１日の飢餓を経験したＡ４３１を除けば、他の全ての細胞は、飢餓なしに直接アッセイされる。アッセイの時刻における全ての細胞の密集度は、〜９５％から１００％であった。
【０２４５】
ｃ．光バイオセンサシステム及び細胞アッセイ
Ｅｐｉｃ（登録商標）ベータ版波長インタロゲーションシステム（Corning Inc社、コーニング、ニューヨーク州）が、細胞検出全体に使用された。このシステムは、温度制御ユニット、光検出ユニット、及びロボットを有するオンボード液体ハンドリングユニットからなっている。検出ユニットは、一体化された光ファイバの中心に配されており、〜１５秒の時間間隔での細胞応答の動的な測定が可能である。
【０２４６】
ＲＷＧバイオセンサは、センサ表面近傍の局所的屈折率における僅かな変化を検出可能である。細胞内の局所的屈折率がバイオマス（例えば、タンパク質、分子複合体）密度及びその分布に依存している故に、バイオセンサは、そのエバネッセント波を利用して、体内に生じた細胞内のリガンド起因の動的質量再分配を非侵襲的に検出可能である。エバネッセント波は、細胞内に伸張して指数関数的に減衰し、〜１５０ｎｍの特徴検出容積をもたらし、受容体活性化に媒介された任意の光応答が、エバネッセント波がサンプリングされている細胞の部分に亘る平均のみを表していることを暗に示す。受容体活性化の下流の多数の細胞事象の合計は、リガンド起因のＤＭＲの動態及び大きさを決定付ける。
【０２４７】
バイオセンサ細胞アッセイのために、分子溶液が、ＨＢＳＳを用いて保存されている濃縮された溶液を希釈することによって生成され（１×ハンクス平衡塩溶液、加えて２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ＰＨ７．１）、３８４ウェルポリプロピレン分子保管プレート内に持ち来され、分子ソースプレートが準備された。分子及びマーカーソースプレートの両方は、２段階アッセイが実施される際に別々に生成された。並行して、細胞がＨＢＳＳを用いて二回洗浄され、３０μｌのＨＢＳＳ内に保持されて、細胞アッセイプレートが準備された。細胞アッセイプレート並びに分子及びマーカーソースプレート（１または複数）の両方は、その後、リーダシステムのホテル内でインキュベーションされた。〜１時間のインキュベーションの後、細胞アッセイマイクロプレート内の全てのバイオセンサのベースライン波長が記録されてゼロに合わせられた。その後、２から１０分の連続的な記録が行われてベースラインが確立され、細胞が安定した状態に達したことが保証された。その後、細胞応答は、オンボード液体ハンドラを使用して１０μｌのマーカー溶液を細胞アッセイプレートにピペット滴下することによってトリガされた。
【０２４８】
マーカー起因の応答における分子の影響を調べるために、固定用量のマーカー（通常は、ＥＣ８０またはＥＣ１００）を用いた第２の刺激が与えられた。第２の刺激の直前に、マイクロプレート内の全てのバイオセンサの共振波長が再度標準化（normalize）されて第２のベースラインが確立された。２つの刺激は、通常は〜１時間隔てられた。
【０２４９】
全ての調査は、制御された温度（２８℃）において実施された。各々が少なくとも３回の反復（再現）を伴う少なくとも２つの独立した実験のセットが実行された。アッセイの変動係数は、＜１０％であった。
【０２５０】
ii．結果
ＰＩ３Ｋ及びＲａｓ癌タンパクは、多くの主要な腫瘍タイプにおいて活性化し、接続されたシグナル伝達経路を制御する。Ｋ−Ｒａｓ活性化変異体は、Ｒａｆ及びＰＩ３Ｋを含むその下流の因子の過度の活性化をもたらす。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９がＫ−Ｒａｓの活性化変異体を発現して調節解除されたＰＩ３Ｋ経路活性を呈する故に、このことは、ラベルフリーバイオセンサがＡ５４９細胞において作用するＰＩ３Ｋ阻害剤の影響を直接検出可能であることを示している。２つの良く知られたＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２９４００２及びウォルトマンニンが実験された。この両方のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の第１世代に属しており、広く知られておりかつ広く研究されている。両方は、ＰＩ３Ｋγを有する同一の結晶構造を持っており、ＰＩ３Ｋ経路のシグナル伝達機構の解明及びＰＩ３Ｋのイソ型の各々の精密な機能の利用において重要な役割を果たす。ウォルトマンニンは、菌代謝物であり、１９５７年に初めて分離され、１９７４年に構造に関して完全に解明された。これは、１９８７年に、好中球及び単核白血球における呼吸バーストの強力な抑制剤として記載され、１９９３年に強力なＰＩ３Ｋ阻害剤と判定された。ウォルトマンニンは、低いナノモル濃度において、ＰＩ３ＫのＡＴＰ結合部位内の触媒リジン残留物との共有結合性の反応を介して、ＰＩ３Ｋαを含むＰＩ３Ｋを不可逆的に阻害する。ＬＹ２９４００２（合成の汎ＰＩ３Ｋ阻害剤）は、１９９４年に、クラスＩのＰＩ３Ｋに対してマイクロモルＩＣ５０値を有する優位性のあるＰＩ３Ｋ阻害剤として記載された。
【０２５１】
図４に示されているように、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は、ＲＷＧバイオセンサEpic（登録商標）システムを用いて測定した際に、用量に依存しかつ可飽和であるＡ５４９内のＤＭＲシグナルをもたらす。Ｎ−ＤＭＲシグナルの大きさに基づいて、ＬＹ２９４００２Ｎ−ＤＭＲシグナルが可飽和とされ、最大振幅が〜４００ピコメートルで１４．７±１．５マイクロモルのＥＣ５０がもたらされた（ｎ＝４）。
【０２５２】
同様に、不可逆性のＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニンも、用量に依存する態様にて同様のＤＭＲシグナルをもたらし、〜７００ピコメートルの最大応答を伴って、７２．７±３．４ナノメータのＥＣ５０が産出された（ｎ＝４）（図５）。対照的に、両方のＰＩ３Ｋ阻害剤は、調節解除されたＰＩ３Ｋ経路を有する細胞であるＡ４３１細胞内では有意なバイオセンサシグナルを生成せず（図７Ａ、データは図示せず）、ＥＧＦ受容体がＡ４３１細胞内で過剰発現する。これらの結果は、ラベルフリーバイオセンサが生体内のＰＩ３Ｋ阻害剤の影響を直接検出して、Ａ５４９細胞等のＰＩ３Ｋ経路が調節解除された任意の細胞を特徴付けることが可能であることを示す。
【０２５３】
２．例２：ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２９４００２及びケルセチンによるマーカーのパネルの変化プロファイル
ラベルフリーバイオセンサは、刺激における統合された細胞応答を測定し、結果として得られたバイオセンサ細胞シグナルは、細胞標的を介した下流のシグナル伝達経路からの寄与を含む。ＰＩ３Ｋ経路は、受容体チロシンキナーゼ及びＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）を含む幅広い標的に媒介されたシグナル伝達に関与しているので、ＰＩ３Ｋ阻害剤はこれらの標的によって引き起こされるバイオセンサシグナルを変化させることが可能である。ＰＩ３Ｋイソ型の発現パターン及び基本的な活性が様々な細胞のタイプ間で非常に異なり得る故に、マーカーのパネルの変化プロファイルは、ＰＩ３Ｋ阻害剤によって異なったタイプの細胞間において興味深いものとなる。従って、２つの細胞株：Ａ５４９及びＡ４３１細胞が選択された。図６Ａに示すように、２つの既知のＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２９４００２及びケルセチンは、休眠Ａ４３１細胞内でＥＧＦ起因のＤＭＲシグナルを異なって変化させた。ケルセチンは、ＰＩ３Ｋにおける阻害的作用、ＧＰＲ３５における作動物質作用等を含む複数の薬理を有することが知られている。汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は、Ａ４３１細胞内のＥＧＦＤＭＲシグナルの初期Ｐ−ＤＭＲ事象及びその後のＮ−ＤＭＲ事象を減衰させ、ケルセチンはＥＧＦ ＤＭＲシグナルのＮ−ＤＭＲ事象のみを減衰させる。
【０２５４】
しかし、両方の化合物は、Ａ５４９細胞内のヒスタミン及びホルスコリンの両方のＰ−ＤＭＲシグナルを増強した（図６Ｂ及び図６Ｃの各々）。他方、ＬＹ２９４００２は、ＴＬＲ９作動物質ＯＤＮ２００６を用いた刺激に対する応答におけるＨｅｐＧ２のＤＭＲシグナルにおいて小さな影響を有し、ケルセチンはＯＤＮ２００６ＤＭＲシグナルを僅かに減衰させた（図６Ｄ）。
【０２５５】
ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体の天然の作動物質である。ホルスコリンは、アデニリルシクラーゼの活性化因子であり、この活性化はｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路をもたらす。ヒスタミンは、Ａ５４９細胞における内因性ヒスタミン受容体の天然の作動物質である。ＯＤＮ２００６は、トール様受容体９（ＴＬＲ９）の人工の作動物質である。ＴＬＲ９は、細胞内受容体である。ＥＧＦ受容体シグナル伝達が、Ａ４３１細胞内のＰＩ３Ｋ経路の活性化をもたらすことが良く知られている。しかし、Ａ５４９内のシグナル伝達経路に媒介されているホルスコリン及びヒスタミンの両方は、文献においては特徴があまりなかった。今回、両方の化学物質はＰＩ３Ｋ活性に感受性があるシグナル伝達をトリガした。同様に、ＨｅｐＧ２細胞内のＴＬＲ９の存在及び機能に関してはあまり知られていなかった。今回、ＨｅｐＧ２細胞内でＴＬＲ９が発現して機能し、光バイオセンサによってロバストに検出し得た。
【０２５６】
総合すれば、この結果は、ＰＩ３Ｋ経路が調節解除された細胞株Ａ５４９内で、既知のＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２９４００２及びケルセチンが異なった複数の薬理を呈すこと、両方の化合物が同様な表現型の薬理を生ずること、変化プロファイル、特にマーカーのパネルに対する変化パターン、が異なったＰＩ３Ｋ阻害剤を比較して特徴付けるために使用され得ることを示した。
【０２５７】
３．例３：ＤＭＲインデックスを用いた一連のＰＩ３Ｋ阻害剤の特徴付け
ＲＷＧバイオセンサ等の光バイオセンサは、刺激における細胞の動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナルを測定する。ＤＭＲインデックスは、生細胞のパネルにおける化学的作用の第１のＤＭＲプロファイルまたはシグナル、及び細胞のパネルに亘るマーカーのパネルに対する化学的作用の変化インデックスを含み、マーカーのパネルは細胞株の各々に関している。所定の細胞タイプにおけるバイオセンサシグナルがＰＩ３Ｋ経路からの寄与を含むマーカーのパネルが選択されて、ＰＩＫ阻害剤が特徴付けられた。これらのマーカーは、Ａ５４９細胞内のアデニリルシクラーゼ活性化因子ホルスコリン及びヒスタミン受容体作動物質ヒスタミン、Ａ４３１細胞内のＥＧＦ受容体作動物質ＥＧＦである。Ａ５４９内のＡＴＰ感受性ポタシウムイオンチャンネル活性化因子ピナシジルも、ＰＩ３Ｋ阻害剤に対する陰性対照として含まれたが、ＲＯＣＫ阻害剤に対しては陽性対照であった。Ａ５４９内のピナシジルＤＭＲシグナルＰＩ３Ｋ阻害剤に無反応であるが、Ｙ２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤によって完全に減衰させられ得る。ＰＩ３Ｋ阻害剤を特徴付けるためのこのようなＤＭＲインデックス付け手法の選択性をテストするために、既知のＰＩ３Ｋ阻害剤が含まれる１０００以上の化合物のライブラリがスクリーニングされた。
【０２５８】
結果は、最もよく特徴付けられた汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２が、Ａ４３１細胞内で小さなＤＭＲシグナルをもたらし（図７Ａ）、Ａ５４９細胞内でＮ−ＤＭＲシグナルをもたらし（図７Ｂ）、及びマーカーのパネルに対して独特な変化インデックスをもたらしたこと（すなわち、Ａ５４９内のピナシジル応答の小さな変化、Ａ５４９内のホルスコリン応答の増強及びＡ５４９内のヒスタミン応答の初期ＤＭＲシグナル及び後期ＤＭＲシグナルの両方の増強、並びにＡ４３１内のＥＧＦ応答のＰ−ＤＭＲ事象及びＮ−ＤＭＲ事象の両方の減衰）（図７Ｃ）を示した。化学的ＤＭＲ変化インデックスのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２との類似性に基づいて、〜２０個の該当が認識された。それらの中で、ＰＩ３Ｋβ阻害剤ＴＧＸ−２２１を除いて（図１０）、ケルセチン（図８）、ＰＩ３ＫＫγ阻害剤II 5-quinoxalin-6-ylmethylene-thiazolindine-2,4-dione（図９）、ＰＩ−１０３（図１１）、レスベラトロール（図１３Ａ）、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤III（図１３Ｂ）及びＤＮＡ−ＰＫ阻害剤II（図１３Ｃ）を含むライブラリ内の全ての既知のＰＩ３Ｋ阻害剤が識別され、これらの全てのＤＭＲ変化インデックスは類似である（すなわち、これらの阻害剤によるホルスコリン応答及びヒスタミン応答における著しい増強、及びＡ４３１細胞内のＥＧＦ応答のＰ−ＤＭＲ事象の僅かな減衰、Ａ５４９内のピナシジル応答の僅かな変化または無変化）。しかし、これらの阻害剤間において、おそらくそれらの効能及びイソ型選択性の差異の故に、Ａ４３１細胞及びＡ５４９細胞の両方内の第１のＤＭＲシグナルの大きな差異が存在する。ＰＩ３Ｋ阻害剤の差異による変化のパターン及び割合に大きな差異が存在し、これはイソ型選択性を示している。例えば、Ａ５４９細胞内のヒスタミン応答の後期Ｐ−ＤＭＲ事象をもって、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は最大の増強をもたらし、ＰＩ３Ｋγ阻害剤は僅かな増強をもたらし、ＰＩ３Ｋβ阻害剤IIは僅かな抑制をもたらし、これを踏まえてＰＩ３ＫβではなくＰＩ３Ｋγは、Ａ５４９細胞内のＧｑ結合Ｈ１受容体媒介シグナル伝達の主要成分である。Ａ５４９内のＰＩ３Ｋβイソ型の発現は、文献においては未知である。Ａ４３１細胞において、ＰＩ３Ｋβイソ型は、ＥＧＦＲシグナル伝達の下流であると知られている。予想通りに、この阻害剤によるＰＩ３Ｋβイソ型の阻害作用は、Ａ４３１細胞内のＥＧＦシグナルのＰ−ＤＭＲ事象を大きく減衰させる（図１０Ｃ）ＬＹ２９４００２の陰性対照化合物ＬＹ３０３５１１は、全く異なるタイプのＤＭＲインデックスをもたらした（図１２）。
【０２５９】
興味深いことに、Ｙ２７６３２（図１４Ａ）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IVを含む一連のＲＯＣＫ阻害剤、並びにＨ−８９（図１４Ｂ）、Ｈ−８、Ｈ−９、Ｈ−７、ＨＡ−１００４及びＨＡ−１００７を含む一連のＰＫＡ阻害剤も、これらのＲＯＣＫ阻害剤によるＡ５４９細胞内のピナシジル応答の完全なまたは著しい減衰を除いて、ある程度似ているＤＭＲ変化インデックスをもたらす（図１４、データは図示せず）。ＲＯＣＫ経路は、ＰＩ３Ｋ経路としっかりと結合されている。重要なことには、異なった化学物質によるピナシジルシグナルの変化プロファイルは、ＰＩ３Ｋ阻害剤からＲＯＣＫ阻害剤を分離するための識別因子として使用され得る。これは、Ａ５４９内のピナシジル応答がＰＩ３Ｋ阻害剤に無反応であるが、ＲＯＣＫ阻害剤によって完全に減衰させられ得る故である。
【０２６０】
４．例４：ＤＭＲインデックスを利用した一連のＰＩ３Ｋ阻害剤の高分解能特徴付け
多くのキナーゼ阻害剤が複数の薬理をしばしば呈することが良く知られている（すなわち、多くのキナーゼ阻害剤が細胞内の複数の標的の活性を変化させ得る）。さらに、キナーゼ阻害剤を含む薬剤は、転写後の変化、シグナル伝達カスケードの区画か、経路内の重要な遺伝子生成物の変化、受容体オリゴマー化、及び構造性受容体活性を含む多くの細胞因子の故に、細胞または組織依存の表現型薬理をしばしば呈する。結果として、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼが下方制御される細胞株内のＲＯＣＫ阻害剤として機能せずともよく；同様にタンパク質キナーゼＡ阻害剤Ｈ−８９、ＨＡ−１００４、Ｈ−８、Ｈ−９、ＨＡ−１０７７、及びＨ−７等の他のキナーゼ阻害剤が、ＰＩ３Ｋ経路が増幅される（例えば、ホスファターゼＰＴＥＮ等のネガティブフィードバックループの下方制御を介して）かまたは上方制御される細胞株内のＲＯＣＫ阻害剤表現型薬理を呈してもよい。従って、ＲＯＣＫ及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む薬剤または薬剤候補分子の作用の主たるモードは、少なくともいくつかのタイプの薬理（複合薬理、表現型薬理、及びシステム（統合的）薬理）の集合である。従って、生細胞内のＰＩ３Ｋ活性を実際に阻害するＰＩ３Ｋ阻害剤の表現型薬理を正確に検出するために、細胞のパネル及びマーカーのパネルを用い、高分解能のバイオセンサアッセイを用いることが可能である。従って、４つの異なった細胞株が選択された：Ａ５４９、Ａ４３１、ＨＴ２９及びＨｅｐＧ２細胞。マーカーのパネルは、Ａ５４９細胞のために選択され、これらのマーカーは、ピナシジル（ＡＴＰ感受性ポタシウムイオンチャンネルオープナー）、ポリ（ＩＣ）（トール様受容体サブタイプ３、ＴＬＲ３に対する作動物質）、ＰＭＡ（タンパク質キナーゼＣのための小分子活性化因子）、ＳＬＩＧＫＶ−アミド（内因性プロテーゼ活性受容体サブタイプ２に対する作動物質）、ホルスコリン（アデニリルシクラーゼに対する活性化因子）、及びヒスタミン（内因性ヒスタミン受容体に対する作動物質）である。これらのマーカーの全ては、用量に依存しかつ可飽和なバイオセンサシグナルをもたらすが、明らかなダイナミクス及び特徴は伴わない（データは図示せず）。ＥＣ１００に近いこれらのマーカーの濃度は、任意の分子、特にＲＯＣＫ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤、のバイオセンサ変化インデックスを生成するために選択された。これらのマーカーの各々は、様々な細胞シグナル伝達ももたらす。
【０２６１】
化学生物学的手法及び細胞生物学的手法と共にＥｐｉｃ（登録商標）を用いて、Ａ５４９細胞内のマーカー起因ＤＭＲシグナルの各々に相当する経路（１または複数）及びネットワーク相互作用（１または複数）が認識された。主たる見解は、以下で簡単に説明される。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Ａ５４９内の内因性トール様受容体（１または複数）の作動物質であり、その活性化はＩＫＫ経路及びＡＫＴ経路をもたらす。ＳＬＩＧＫＶ−アミドは、Ａ５４９内の内因性プロテーゼ活性受容体サブタイプ２（ＰＡＲ２）の作動物質であり、その活性化はＧｑ−、Ｇｉ−及びＧ１２／１３−媒介シグナル伝達をもたらす。ピナシジルは、Ａ５４９内の内因性ＡＴＰ感受性ポタシウム（ＫＡＴＰ）イオンチャンネルのオープナーであり、その活性はＲｈｏ−及びＪＡＫ−媒介シグナル伝達をもたらす。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化因子であり、その活性化はＰＫＣ経路及び脱顆粒をもたらす。ヒスタミンは、内因性ヒスタミン受容体（支配的にＨ１Ｒ、及び場合によりＨ３Ｒ）中立作動物質であり、その活性化はＡ５４９内のＧｐ及びＧｔ媒介であろうデュアルシグナル伝達をもたらす。ホルスコリンは、アデニリルシクラーゼの活性化因子であり、その活性化はＡ５４９内のｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路をもたらす。
【０２６２】
４つのマーカーがＡ４３１細胞に関して選択された：内因性β２−アドレナリン受容体作動薬エピネフリン（Ｅｐｉ）、内因性ＧＰＡ１０９Ａ作動物質ニコチン酸（ＮＡ）、ＥＧＦＲ作動物質ＥＧＦ、及び内因性ヒスタミン受容体１（Ｈ１Ｒ）作動物質ヒスタミン（Ｈｉｓ）。エピネフリンは、Ｇｓ媒介シグナル伝達をトリガし、ニコチン酸はＧｉ媒介シグナル伝達をもたらし。ヒスタミンはＧｑ媒介シグナル伝達をもたらし。ＥＧＦは少なくとも３つのシグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ経路、ＰＫＣ経路及びＭＡＰＫ経路）をトリガした（図示せず）。マーカーの各々に関して、ＥＣ８０またはＥＣ１００濃度は、化合物の変化インデックスを判定するために選択された。
【０２６３】
４つのマーカーがＨＴ２９のために選択された：内因性ＥＧＦ受容体作動物質ＥＧＦ、内因性ＩＧＦ１受容体作動物質ＩＧＦ１、内因性ｈＥＲＧ活性化因子マロトキシン、及び内因性ＮＴＳ１／ＮＴＳ３作動物質ニューロテンシン（ＮＴ）。ＨＴ２９細胞において、ＥＧＦはＰＫＣ及びＭＡＰＫ経路をトリガし、ＩＧＦ１はＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達をトリガし、マロトキシンがＭＡＰＫ経路をトリガし、ＮＴがＧｑ及びＧｉ媒介シグナル伝達及びＥＧＦＲ転写促進（データは図示せず）をもたらした。マーカーの各々に対して、ＥＣ８０またはＥＣ１００が、化合物の変化インデックスを判定するために選択された。
【０２６４】
ＯＤＮ２００６、ＨｅｐＧ２内の内因性ＴＬＲ９受容体の作動物質、がマーカーのために選択された。なぜならば、ＨｅｐＧ２細胞内のＯＤＮ２００６バイオセンサシグナルは、ＰＩ３Ｋ阻害剤（図６）ではなくＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２（データは図示せず）を用いた細胞の事前処理によって増強されることが見出されていた故である。
【０２６５】
図１５は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ１７６３１のインデックスとＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ−２９４００２のインデックスとを比較している。結果は、このような高分解能が、その表現型薬理、及び複合薬理に関して両方の阻害剤を詳細に特徴付けることを示した。このような手法は、ＰＩ３Ｋ経路内の、異なっているがしっかり結合されている２つのキナーゼを標的にしている阻害剤の２つのクラスを容易に分離するために使用され得る。
【０２６６】
５．例５：生細胞内のＹ−２７６３２起因のバイオセンサ応答の減衰が可能な化合物のスクリーニング
ＲＯＣＫが細胞の形態を調節する故に、ＲＯＣＫ阻害剤による基本的なＲＯＣＫ活性の阻害は、検出可能なバイオセンサシグナルをもたらし得た。実証のために、４つの細胞株が選択された：ヒト皮膚癌細胞株Ａ４３１、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９及びヒト生細胞株ＨｅｐＧ２。既知のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を用いた細胞の刺激は、Corning（登録商標）Epic（登録商標）ＲＷＧバイオセンサを用いて、Ａ４３１、Ａ５４９またはＨＴ−２９細胞内で検出可能であるがＨｅｐＧ２細胞内では検出できずかつ用量に依存するバイオセンサシグナルをもたらす（図２１、図２２、図２３、データは図示せず）。従って、Ａ４３１、Ａ５４９またはＨＴ−２９細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤応答細胞と考えられる。
【０２６７】
ＰＩ３Ｋ経路は、肺癌の全てのタイプ（例えば、扁平上皮細胞、腺癌肺細胞、小細胞肺癌細胞、非小細胞肺癌細胞）においてしばしば増幅され、ＲＯＣＫ経路はＰＩ３Ｋ経路にしっかりと結合されているので、Ａ５４９細胞は、ＲＯＣＫをスクリーニングするために使用された。従って、Ａ５４９細胞は、特定の期間（通常は約１時間）化合物（各々１０マイクロモル）を用いて個別に事前処理され、ＥＣ１００（〜１０マイクロモル）のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を用いて刺激された。図１９に示すように、Ｙ２７６３２を用いた事前処理は、細胞を第２のＹ−２７６３２刺激に対して著しく鈍感にする。同様に、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ（図１９内の「化合物」）も、Ａ５４９細胞内の同様な脱感作反応をもたらす。適切な終点測定（end-point measurement）を選択することによって、このような方法は、潜在するＲＯＣＫ阻害剤の高スループットのスクリーニングに適用され得る。
【０２６８】
６．例６：生細胞内のＲＯＣＫ経路感受性マーカー起因のバイオセンサ応答の減衰を可能な化合物のスクリーニング
多くの外部刺激は、ＲＯＣＫ経路の活性化をもたらし得る。ラベルフリーバイオセンサ細胞アッセイは、外部刺激によって媒介されるＲＯＣＫ経路を含む下流シグナル伝達を検出可能であるので、これらの外部刺激はＲＯＣＫ阻害剤をスクリーニングするためのマーカーとして使用され得る。１つの例が図２０に示されている。ピナシジルは、ＡＴＰ感受性ポタシウムイオンチャンネルオープナーである。ピナシジルを用いたＡ５４９細胞の刺激は、〜マイクロモルのＥＣ５０を伴った、用量に依存しかつ可飽和なバイオセンサシグナルをもたらす（図２０；データは図示せず）。既知のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ０２７６３２は、用量に依存してピナシジル応答を減衰させ得る；１０マイクロモルのＹ２７６３２は、ほとんど完全にピナシジル応答を減衰させた。８０のキナーゼ阻害剤ライブラリのスクリーニングは、同様な変化プロファイルをもたらす化合物の一群の識別をもたらす。これらの化合物は、２つの他の既知のＲＯＣＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤IV、並びにＨ−８９、Ｈ−７、Ｈ−８、ＨＡ−１００４、Ｈ−９及びＨＡ１０７７を含む既知のＰＫＡ阻害剤のファミリーを含む。文献検索の結果は、これらのＨ−シリーズＰＫＡ阻害剤がＲＯＣＫ阻害剤としても知られていることを示唆した。総合すれば、これらの結果は、本開示の方法が、特定の細胞タイプ内の既知のキナーゼ阻害剤の表現型薬理を判定するために使用可能であることを示唆している。
【０２６９】
７．バイオセンサ細胞アッセイとともに細胞／マーカーのパネルを使用するＲＯＣＫ阻害剤の表現型薬理及び複合薬理の特徴付け
多くのキナーゼ阻害剤がしばしば複数の薬理を呈することが良く知られている（すなわち、多くのキナーゼ阻害剤が細胞内の複数の標的の活性を変化させ得る）。さらに、キナーゼ阻害剤を含む薬剤は、転写後変化、シグナル伝達カスケードの区画か、経路内の重要な遺伝子生成物の変化、受容体のオリゴマー化、及び構造性受容体活性を含む多くの細胞因子の故に、しばしば細胞または組織依存の表現型薬理を呈する。結果として、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼが下方制御される細胞株においてＲＯＣＫ阻害剤として作用することができない；同様にタンパク質キナーゼＡ阻害剤Ｈ−８９、ＨＡ−１００４、Ｈ−８、Ｈ−９、ＨＡ−１０７７、及びＨ−等の他のキナーゼ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ経路が増幅される（例えば、ホスファターゼＰＴＥＮ等のネガティブフィードバックループの下方制御を介して）かまたは上方制御される細胞株内でＲＯＣＫ阻害剤表現型薬理を呈することができない。従って、ＲＯＣＫ阻害剤を含む薬剤または薬剤候補分子の作用の主たるモードは、少なくともいくつかのタイプの薬理（複合薬理、表現型薬理、及びシステム（統合）薬理）の集合である。生細胞内のＲＯＣＫ活性の阻害を介して作用するＲＯＣＫ阻害剤の表現型薬理を正確に検出するために、バイオセンサ細胞アッセイを用いる細胞のパネル及びマーカーのパネルを必要とする。従って、ＲＯＣＫ阻害剤応答細胞株、Ａ５４９、及びＲＯＣＫ阻害剤非応答細胞株、ＨｅｐＧ２、がモデルシステムとして選択された。Ａ５４９細胞に関するマーカーのパネルも選択された：ピナシジル（ＡＴＰ感受性ポタシウムイオンチャンネルオープナー）ポリ（ＩＣ）（トール様受容体サブタイプ３、ＴＬＲ３の作動物質）、ＰＭＡ（タンパク質キナーゼＣに対する小分子活性化因子）、ＳＬＩＧＫＶ−アミド（内因性プロテーゼ活性受容体サブタイプ２の作動物質）、ホルスコリン（アデニリルシクラーゼの活性化因子）、及びヒスタミン（内因性ヒスタミン受容体の作動物質）。これらのマーカーの全ては、用量依存でありかつ可飽和のバイオセンサシグナルをもたらし、明確なダイナミクス及び特性を伴った（データは図示せず）。ＥＣ１００に近い濃度が任意の分子、特にＲＯＣＫ阻害剤のバイオセンサ変化インデックスを生成するためにこれらのマーカーに対して選択された。
【０２７０】
図２１に示されているように、１０マイクロモル濃度のＹ−２７６３２は、特有のネガティブＤＭＲシグナルをもたらしたが、ｈｅｐＧ２内で正味０のＤＭＲシグナルをもたらした。Ｙ−２７６３２を用いたＡ５４９細胞の事前処理はピナシジル応答を減衰させたが、ポリ（ＩＣ）応答、ＰＭＡ応答、ＳＬＩＧＫＶ応答、ホルスコリン応答、並びにヒスタミンＤＭＲシグナルの初期及び後期応答を増強した。同様に、Ｙ−２７６３２事前処理は、Ｈｅｐ細胞内のＯＤＮ２００６ＤＭＲシグナルを増強した。
【０２７１】
細胞／マーカーのパネルを用いて、我々は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む５００を超える化合物をシステマチックに特徴付けた。ライブラリ内の分子のサブセットは、対応する細胞内の第１のプロファイルを含むバイオセンサインデックス、及びＹ−２７６３２バイオセンサインデックスと同様なマーカーのパネルに対する変化インデックスをもたらす。これらの分子は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IIIＲｏｃｋｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤IV、及びＨ−８９、Ｈ−８、Ｈ−９、Ｈ−７、ＨＡ−１００４、及びＨＡ−１０７７を含む一連のＰＫＡ阻害剤であった。２つの他のＲｈｏキナーゼ阻害剤の例は、図２２及び図２３に示した。対照的に、Ａ５４９細胞内でネガティブＤＭＲシグナルをもたらしたＣＤＫ１／２阻害剤IIIのＤＭＲインデックスが図２３に示されている。しかし、このキナーゼ阻害剤は、非常に異なったバイオセンサインデックスを呈し、特にＨｅｐＧ２細胞内で小さな減衰シグナルをトリガし、パネル内のほとんどのマーカーのバイオセンサシグナルを減衰させた（図２３）。
【０２７２】
Ｊ．参考文献
１．国際公開第ＷＯ２００６１０８１８３号、Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.M., Yuen, P.K.及びLahiri, J.「Optical biosensors and cells」
2. 米国特許出願第１２／６２３，６９３号、Fang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J.及びTran, E. 「Methods for Characterizing Molecules」、出願日：２００９年１１月２３日
3. 米国特許出願第１２／６２３，７０８号、Fang, Y., Ferrie, A.M., Lahiri, J.及びTran, E. 「Methods of creating an index」、出願日：２００９年１１月２３日
4. Okudela, K.氏他. Am. J. Pathology, 2004, 164, 91-100.
5. Downward, J. Nature Medicine 2008, 14, 1315-1316.
6. Yap, T. A.氏他. Curr. Opinion Pharmacol. 2008, 8, 393-412.
7. Engelman, J.A. Nature Reviews Cancer, 2009, 9, 550-562.
8. Serra, V.氏他, Cancer Res. 2008, 68, 8022-8030.
【図１】
2013516172.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月23日(2012.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上に、調節解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株を培養するステップと、
ｂ．前記細胞株を前記分子と共にインキュベートして分子処理された細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて前記分子処理された細胞株を分析し、分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞株内で前記分子データ出力と既知のＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を比較して、分子−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較結果を生成するステップと、含み、
前記比較結果が前記分子データ出力と前記ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が類似していることを示す場合に、潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤を識別するステップを任意的にさらに含み、
前記分子を通常のＰＩ３Ｋ経路細胞株とともにインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いて前記分子処理された細胞株を分析して第２の分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株において生成された前記第２の分子データ出力とＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較するステップと、を任意的にさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上で調節解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株を培養するステップと、
ｂ．前記細胞株をマーカー及び前記分子とともにインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて前記インキュベート細胞株を分析してマーカー−分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞株内の前記マーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較して、マーカー−分子／マーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤比較結果を生成するステップと、を含み
前記比較結果のインデックスが前記マーカー−分子データ出力と前記マーカーＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力が類似していること示す場合に、潜在的ＰＩ３Ｋ阻害剤を識別するステップを任意的にさらに含み、
通常のＰＩ３Ｋ経路細胞株とともに前記マーカー及び分子をインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いてマーカー−マーカー処理された細胞株を分析して第２のマーカー−分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株内で生成された前記第２のマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力とを比較するステップと、を任意的にさらに含み、
前記マーカー及び分子をトール様受容体細胞株とともにインキュベートするステップと、ラベルフリーバイオセンサを用いて前記トール様受容体インキュベート細胞株を分析して第３のマーカー−分子データ出力を生成するステップと、同一の細胞株内で生成された前記第３のマーカー−分子データ出力とマーカー−ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を比較するステップと、を任意的にさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記調整解除されたＰＩ３Ｋ経路細胞株が、Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株、ＨＥＲ２過剰発現細胞株、ＰＴＥＮ機能欠失細胞株、またはＰＩ３ＫＣＡ活性化変異細胞株から選択され、前記ＰＴＥＮ機能欠失細胞株がＡ４細胞株、Ａ７細胞株、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｃ、ヒト巨細胞肺癌細胞株９５Ｄ、または乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８であり、
任意的に、前記Ｋ−Ｒａｓ活性化変異細胞株がＡ５４９細胞株またはＨ８２０細胞株であり、前記ＨＥＲ２過剰発現細胞株がＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３であり、前記ＰＩ３ＫＣ活性化変異細胞株がＭＣＦ−７またはＴ４７Ｄであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１に記載の方法であって、前記アッセイのステップが、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上でＲＯＣＫ阻害剤応答性細胞株を培養するステップと、
ｂ．前記細胞株を前記分子と共にインキュベートしてインキュベート細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いて前記インキュベート細胞株を分析して分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞内での前記分子データ出力と既知のＲＯＣＫ阻害剤データ出力とを比較して、分子−ＲＯＣＫ阻害剤比較結果を生成するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．ラベルフリーバイオセンサ分析において使用され得る表面上で、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＴ２９及びＨｅｐＧ２である４つの異なる細胞株を培養するステップと、
ｂ．細胞株の各々を前記分子とともにインキュベートして４つのインキュベート細胞株を生成するステップと、
ｃ．ラベルフリーバイオセンサを用いてインキュベート細胞株の各々を分析してインキュベート細胞株の各々に関する分子データ出力を生成するステップと、
ｄ．同一の細胞株内の前記分子データ出力とＲＯＣＫ阻害剤データ出力とを比較して、細胞株の各々に関する分子−ＲＯＣＫ阻害剤比較結果を生成するステップと、を含み、
ＰＩ３Ｋ阻害剤データ出力を生成するステップと、細胞株の各々に関する分子−ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤比較結果を生成するステップと、を任意的にさらに含むことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2013516172.tif 000057
2013516172.tif 000058
2013516172.tif 000059