(57)【要約】Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３が独立してＨまたはヒドロキシ保護基から選択される式Ｉの化合物を提供する。そのような化合物は、医薬組成物の調製に用いることができ、種々の生物学的状態の治療において有用である。2013522369.tif 000047
2013522369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉを有する化合物：
2013522369.tif 000042
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、独立してＨおよびヒドロキシ保護基から選択される。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２が、両方ともヒドロキシ保護基である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１およびＸ２が、両方ともｔ−ブチルジメチルシリル基であり、かつＸ３がトリエチルシリル基である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
式ＩＩを有する化合物：
2013522369.tif 000043
。
【請求項５】
式ＩＩＡを有する、請求項４記載の化合物：
2013522369.tif 000044
。
【請求項６】
式ＩＩＢを有する、請求項４記載の化合物：
2013522369.tif 000045
。
【請求項７】
式ＩＩＣまたはＩＩＤを有する、請求項４記載の化合物：
2013522369.tif 000046
。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
前記有効量が、組成物１グラムあたり約０．０１μｇ〜約１ｍｇの化合物を含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記有効量が、組成物１グラムあたり約０．１μｇ〜約５００μｇの化合物を含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の化合物の有効量を対象に投与することを含む、生物学的状態を患う対象を治療する方法であって、該生物学的状態が、乾癬；白血病；結腸がん；乳がん；前立腺がん；多発性硬化症；ループス；真性糖尿病；宿主対移植片反応；臓器移植片拒絶反応；関節リウマチ、喘息、もしくは炎症性腸疾患から選択される炎症性疾患；しわ、適切な皮膚の引き締まりの欠如、適切な皮膚水分量の欠如、もしくは不十分な皮脂分泌から選択される皮膚の状態；腎性骨ジストロフィー；または骨粗鬆症から選択される、前記方法。
【請求項１２】
前記生物学的状態が乾癬である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的状態が、白血病、結腸がん、乳がん、または前立腺がんから選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的状態が、多発性硬化症、ループス、真性糖尿病、宿主対移植片反応、または臓器移植片拒絶反応から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的状態が、関節リウマチ；喘息；またはセリアック病、潰瘍性大腸炎、およびクローン病から選択される炎症性腸疾患から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的状態が、しわ、適切な皮膚の引き締まりの欠如、適切な皮膚水分量の欠如、または不十分な皮脂分泌から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が対象に経口投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が対象に非経口投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が対象に経皮投与または局所投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、１日につき０．０１μｇ〜１日につき１ｍｇの投与量で投与される、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年３月２３日付で提出された米国特許仮出願番号第６１／３１６，６３１号の優先権を主張し、その全開示は参照によって、あらゆる目的に関してその全体が本明細書中に完全に記載されているかのように本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
分野
本技術は、ビタミンＤ化合物に関し、さらに詳細には、（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ならびにそれらの誘導体、ならびにこの化合物を含む薬学的製剤に関する。本技術はさらに、種々の疾患の治療における、および種々の疾患の治療に使用するための医薬の調製における、これらの化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
天然のホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびカルシトリオールとも称する）ならびにそのエルゴステロール系の類似体、すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２は、動物およびヒトにおけるカルシウム恒常性の非常に強力な調節因子であることが知られ、細胞分化におけるそれらの活性も立証されている。Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)（非特許文献１）。１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、種々の側鎖同族体化ビタミン、およびフッ素化類似体をはじめとする、これらの代謝産物の多くの構造的類似体が調製され、試験されている。これらの化合物のいくつかは、細胞分化およびカルシウム調節における活性の興味深い乖離を示す。活性におけるこの差異は、腎性骨ジストロフィー、ビタミンＤ抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬、およびある特定の悪性腫瘍などの種々の疾患の治療において有用であり得る。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の構造およびこの化合物中の炭素原子を示すために用いられる付番方式を以下に示す。
2013522369.tif 000003
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３＝１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール＝カルシトリオール
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)
【発明の概要】
【０００５】
概要
本技術は、（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ならびに関連化合物、（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３または（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む薬学的製剤、この化合物を用いた種々の疾患状態の治療法、ならびに種々の疾患状態を治療するための医薬の調製におけるこの化合物の使用を提供する。
【０００６】
したがって、１つの態様において、本技術は、下記の式Ｉを有する化合物を提供し、
2013522369.tif 000004
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、同一であっても、または異なっていてもよく、独立してＨまたはヒドロキシ保護基から選択される。いくつかの実施形態において、２０位の炭素は、式ＩＡの化合物で示されるようにＳ配置を有し、他のものでは、式ＩＢの化合物で示されるようにＲ配置を有する。
2013522369.tif 000005
【０００７】
式Ｉ、ＩＡ、またはＩＢの化合物のいくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、両方ともシリル基などのヒドロキシ保護基である。いくつかのそのような実施形態において、Ｘ１およびＸ２は両方ともｔ−ブチルジメチルシリル基であり、Ｘ３はトリエチルシリル基である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、化合物は式ＩＩを有する。
2013522369.tif 000006
【０００９】
いくつかの実施形態において、化合物は、以下で示すような式ＩＩＡを有する（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３であるか、または化合物は、以下で示すような式ＩＩＢを有する（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である。
2013522369.tif 000007
【００１０】
いくつかの実施形態において、式ＩＩＡの化合物は、式ＩＩＣの化合物（ＭＥＴ−１）であり、他の実施形態において、式ＩＩＢの化合物は、式ＩＩＤの化合物（ＭＥＴ−２）であり、下記の構造を有する。
2013522369.tif 000008
【００１１】
本技術の化合物は、ビタミンＤ受容体に対する強力な結合、強力な細胞分化および２４−ヒドロキシラーゼ活性の誘導、さらに、低いまたは非常に低いカルシウム血活性（ｃａｌｃｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をはじめとする、非常に有利な生物活性パターンを示す。したがって、本発明の化合物は、ある生物学的状態を患う対象を治療する方法で用いることができる。この方法は、有効量の本技術の化合物を、対象に投与することを含み、ここで、生物学的状態は、乾癬；白血病；結腸がん；乳がん；前立腺がん；多発性硬化症；ループス；真性糖尿病；宿主対移植片反応；臓器移植片拒絶反応；関節リウマチ、喘息、もしくは炎症性腸疾患から選択される炎症性疾患；しわ、適切な皮膚の引き締まりの欠如、適切な皮膚水分量の欠如、または不十分な皮脂分泌から選択される皮膚の状態から選択される。
【００１２】
本技術の化合物は、前記疾患および障害を治療するための組成物であって、薬学的に許容される担体を任意で含む該組成物中に、有効量で存在し得る。いくつかの実施形態において、化合物の量は、組成物１グラムあたり約０．０１μｇから組成物１グラムあたり約１ｍｇ、好ましくは組成物１グラムあたり約０．１μｇから組成物１グラムあたり約５００μｇを含み、１日につき約０．０１μｇから１日につき約１ｍｇ、好ましくは１日につき約０．１μｇから１日につき約５００μｇの投与量で局所、経皮、経口、または非経口投与することができる。
【００１３】
本技術のさらなる特徴および効果は、以下の詳細な説明および図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図１〜５は、天然のホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（図中、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と称する）と比較した、（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（図中、「ＭＥＴ−１」と称する）の種々の生物活性を示す。図６〜１０は、天然のホルモンである１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較した、（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（図中、「ＭＥＴ−２」と称する）の種々の生物活性を示す。
【図１】ＭＥＴ−１と天然のホルモンである１，２５（ＯＨ）２Ｄ３との間での核内ビタミンＤホルモン受容体に対する競合的結合のグラフを示す。ＭＥＴ−１は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と同じ親和性で核内ビタミンＤホルモン受容体と結合する。
【図２】ＭＥＴ−１の濃度の関数としてのＨＬ−６０細胞分化比率（％）を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のものと比較するグラフである。ＭＥＴ−１は、ＨＬ−６０細胞の単球への分化を引き起こすのに１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の約４倍の効力を有する。
【図３】ＭＥＴ−１のインビトロ転写活性を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のインビトロ転写活性と比較するグラフである。ＭＥＴ−１は、２４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写の増加において１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも約１０倍強力である。
【図４】ラットにおいてＭＥＴ−１の骨カルシウム動員活性を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性と比較する棒グラフである。ＭＥＴ−１は、骨カルシウム貯蔵の放出において１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも約２０倍効力が低い。
【図５】ＭＥＴ−１の腸カルシウム輸送活性を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較する棒グラフである。ＭＥＴ−１は、ラット腸での活性カルシウム輸送の促進において１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも有効でない。
【図６】ＭＥＴ−２と天然ホルモンである１，２５（ＯＨ）２Ｄ３との間での核内ビタミンＤホルモン受容体に対する競合的結合のグラフである。ＭＥＴ−２は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と同じ親和性で核内ビタミンＤホルモン受容体と結合する。
【図７】ＭＥＴ−２の濃度の関数としてのＨＬ−６０細胞分化比率（％）を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のものと比較するグラフである。ＭＥＴ−２は、ＨＬ−６０細胞の単球への分化の誘導において、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも約３倍の効力を有する。
【図８】ＭＥＴ−２のインビトロ転写活性を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較するグラフである。ＭＥＴ−２は、２４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写の増加において１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも約３倍強力である。
【図９】ラットにおいてＭＥＴ−２の骨カルシウム動員活性を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較する棒グラフである。ＭＥＴ−２は、骨カルシウム貯蔵の放出において１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも約１６倍効力が低い。
【図１０】ＭＥＴ−２の腸カルシウム輸送活性を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の腸カルシウム輸送活性と比較する棒グラフである。ＭＥＴ−２は、ラット腸での活性カルシウム輸送の促進において１，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも有効でない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を合成し、試験し、本明細書中に記載する種々の生物学的状態の治療において有用であることを見いだした。構造的に、これらの化合物は、以下に示すような式ＩＩＡおよびＩＩＢを有する。
2013522369.tif 000009
【００１６】
（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の調製は、適切な二環式Ｗｉｎｄａｕｓ−Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ型のケトン（ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）をアリル型ホスフィンオキシドＩＶと縮合し、続いて脱保護（Ｙ、Ｙ１およびＹ２ヒドロキシ保護基の除去）によって達成することができる。
2013522369.tif 000010
【００１７】
構造ＩＩＩＡおよびＩＩＩＢのヒドラインダノン（Hydraindanone）は、当業者には容易に明かとなるであろう、本明細書中に記載する公知方法を若干変更したものによって調製することができる。ビタミンＤ類似体の二環式ケトンを合成するために用いられる方法の具体例は、Mincione et al., Synth. Commun 19, 723, (1989);およびPeterson et al., J. Org. Chem. 51, 1948, (1986)で記載されているものである。２−アルキリデン−１９−ノル−ビタミンＤ化合物を合成するための全体的なプロセスは、その全体が、本明細書中で完全に記載されているかのように参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，８４３，９２８号明細書で示され、記載されている。ヒドリナノンＩＩＩＡおよびＩＩＩＢの調製の詳細は、本明細書中の実施例で見いだされる。
【００１８】
ホスフィンオキシドＩＶにおいて、Ｙ１およびＹ２は、シリル保護基などのヒドロキシ保護基である。ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基は、特に有用なヒドロキシ保護基の１例である。前述のプロセスは、多くのビタミンＤ化合物の調製に効果的に適用されている、コンバージェント合成概念の適用を表す（例えば、Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590 (1978);Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 449 (1983);Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414 (1983);Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986);Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986);J. Org. Chem. 51, 1269 (1986);DeLucaらの米国特許第５，０８６，１９１号明細書；DeLucaらの米国特許第５，５３６，７１３号明細書；およびDeLucaらの米国特許第５，８４３，９２８号明細書（それらはすべて、その全体として参照することによって、あらゆる目的に関して全体的に本明細書中に完全に記載されているかのように、本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。
【００１９】
スキーム１
2013522369.tif 000011
【００２０】
ホスフィンオキシドＩＶは、Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)、DeLucaらの米国特許第５，８４３，９２８号明細書；Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991)；およびDeLucaらの米国特許第５，０８６，１９１号明細書で記載されている手順に従って調製することができる便利な試薬である。スキーム１は、その全体が本明細書中で完全に記載されているかのように参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，８４３，９２８号明細書で概略を記載されている、ホスフィンオキシドＩＶを合成するための一般的手順を示す。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、「ヒドロキシ保護基」という用語は、限定されるものではないが、アルコキシカルボニル、アシル、アルキルシリルまたはアルキルアリールシリル基（本明細書中で以下、単に「シリル」基と称する）、およびアルコキシアルキル基などのヒドロキシ（−ＯＨ）官能基の一時的保護のために通常用いられる任意の基を表す。アルコキシカルボニル保護基は、アルキル−Ｏ−ＣＯ−基、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニルである。「アシル」という用語は、１〜６個の炭素を有するアルカノイル基（その全ての異性体）、あるいは１〜６個の炭素を有するカルボキシアルカノイル基、例えばオキサリル、マロニル、スクシニル、グルタリル基、または芳香族アシル基、例えばベンゾイル、またはハロ、ニトロもしくはアルキル置換ベンゾイル基を表す。アルコキシアルキル保護基は、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエトキシメチル、またはテトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニルなどの基である。好ましいシリル保護基は、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ジブチルメチルシリル、ジフェニルメチルシリル、フェニルジメチルシリル、ジフェニル−ｔ−ブチルシリルおよび類似のアルキル化シリルラジカルである。「アリール」という用語は、フェニル基、またはアルキル置換フェニル基、ニトロ置換フェニル基もしくはハロ置換フェニル基を表す。ヒドロキシ官能基に対する保護基の広範なリストは、Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T.W.;Wuts, P. G. M., John Wiley & Sons, New York, NY, (3rd Edition, 1999）で見出すことができ、これは文献に記載されている手順を用いて付加または除去することができ、参照することによって、本明細書中に完全に記載されているかのように全ての目的に関して、本明細書中に組み込まれる。
【００２２】
「保護ヒドロキシ」基は、ヒドロキシ官能基の一時的または永続的な保護のために通常用いられる前記基のいずれか、例えば前記定義のシリル、アルコキシアルキル、アシルまたはアルコキシカルボニル基によって、誘導体化または保護されたヒドロキシ基である。
【００２３】
本技術の化合物は、望ましく、非常に有利な生物活性パターンを示す。これらの化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較して、ビタミンＤ受容体に対する結合が比較的高く（図１および５を参照のこと）、ＨＬ−６０分化において高活性であるが、カルシウムを骨から動員する能力が非常に低く（図４および９を参照のこと）、腸カルシウム輸送活性が比較的低い（図５および１０を参照のこと）ことを特徴とする。したがって、これらの化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が著しいカルシウム血活性を示す投与量において、カルシウム血活性をあったとしてもほとんど有さないと特徴づけることができる。このように、それは、続発性副甲状腺機能亢進症型の腎性骨ジストロフィーの抑制のための療法として有用であり得る。
【００２４】
本技術の化合物はさらに、例えば自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、ループス、真性糖尿病、宿主対移植片反応、および臓器移植片拒絶反応においてなど、免疫系における不均衡によって特徴づけられるヒト障害の治療および予防について；さらには炎症性疾患、例えば関節リウマチ、喘息、および炎症性腸疾患、例えば、セリアック病、潰瘍性大腸炎およびクローン病の治療についても適している。座瘡、脱毛症および高血圧は、本技術の化合物で治療することができる他の状態である。
【００２５】
前記化合物はまた、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３と同等または１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも有意に高いかのいずれかの細胞分化活性によって特徴づけられる（図２および７を参照のこと）。したがって、この化合物はさらに、乾癬の治療のため、または特に白血病、結腸がん、乳がんおよび前立腺がんに対する抗がん剤としての治療剤も提供する。加えて、その比較的高い細胞分化活性のために、この化合物は、しわ、適切な皮膚水分量の欠如、すなわち、乾燥肌、適切な皮膚の引き締まりの欠如、すなわちたるんだ皮膚、および不十分な皮脂分泌をはじめとする、種々の皮膚状態を治療するための治療剤を提供する。この化合物の使用は、したがって、結果として皮膚に潤いを与えるだけでなく、皮膚のバリア機能を改善する。
【００２６】
本技術の化合物を用いて、本技術の化合物を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む薬学的製剤または医薬を調製することができる。そのような薬学的製剤および医薬を用いて、本明細書中に記載されるものなどの種々の生物学的障害を治療することができる。そのような障害を治療するための方法は、典型的には、有効量の化合物または化合物を含む適切な量の薬学的製剤もしくは医薬を、生物学的障害を患う対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象はほ乳類である。いくつかのそのような実施形態において、ほ乳類は、齧歯類、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、クマ、ブタ、ウサギ、またはモルモットから選択される。いくつかのそのような実施形態において、ほ乳類はラットであるか、またはマウスである。いくつかの実施形態において、対象は霊長類であり、例えばいくつかの実施形態において、ヒトである。
【００２７】
治療目的で、式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、およびＩＩＤによって定義される化合物を、医薬適用のために無害溶媒中溶液として、または好適な溶媒もしくは担体中、エマルション、懸濁液もしくは分散液として、または丸剤、錠剤もしくはカプセルとして、固体担体とともに、当該技術分野で公知の通常の方法に従って製剤化することができる。任意のそのような製剤は、他の薬学的に許容される非毒性賦形剤、例えば、安定剤、抗酸化剤、結合剤、着色剤または乳化もしくは味覚修飾剤を含有してもよい。薬学的に許容される賦形剤および担体は、一般的に当業者に公知であり、したがって本技術に含まれる。そのような賦形剤および担体は、例えば、"Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)（その全体はすべての目的について、完全に本明細書中に記載されているかのように参照することによって本明細書中に組み込まれる）で記載されている。
【００２８】
化合物は、経口、局所、非経口、または経皮投与することができる。化合物は、注射によって、または静脈内注入もしくは好適な無菌溶液によって、または液体もしくは固体投薬の形態で消化管を経由して、または経皮適用に適したクリーム、軟膏、パッチで、または類似の媒質の形態で有利に投与される。いくつかの実施形態において、１日につき約０．００１μｇ〜約１ｍｇの化合物の用量が治療目的に関して適切である。いくつかのそのような実施形態において、適切かつ有効な用量は、１日につき約０．０１μｇ〜約１ｍｇの化合物の範囲であり得る。他のそのような実施形態において、適切かつ有効な用量は１日につき約０．１μｇ〜約５００μｇの化合物の範囲であり得る。そのような用量は、当該技術分野でよく理解されているように、治療される疾患または状態の種類、疾患または状態の重症度、および対象の応答にしたがって調節される。化合物は、単独で、または別の活性ビタミンＤ化合物とともに、適切に投与することができる。
【００２９】
本技術で使用される組成物は、活性成分として、有効量の（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および／または（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と、好適な担体とを含む。本技術のいくつかの実施形態にしたがって使用される本明細書中の化合物の有効量は、一般的に、本明細書中で記載されるものなどの投与量であり、局所、経皮、経口、鼻、直腸、または非経口投与することができる。
【００３０】
式ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣおよびＩＩＤの化合物は、有利には、前骨髄球の正常なマクロファージへの分化をもたらすのに十分な量で投与することができる。前述の投与量が好適であり、当該技術分野で十分に理解されているように、投与される量は、疾患の重症度、ならびに対象の状態および応答にしたがって調節されると理解される。
【００３１】
化合物は、クリーム、ローション、軟膏、エアゾル、坐剤、局所パッチ、丸剤、カプセルもしくは錠剤として、または薬学的に無害かつ許容される溶媒もしくは油中の溶液、エマルション、分散液、もしくは懸濁液としての液体形態で、製剤化することができ、そのような調製物は、さらに、他の薬学的に無害または有益な成分、例えば安定剤、抗酸化剤、乳化剤、着色剤、結合剤もしくは味覚修飾剤を含有してもよい。
【００３２】
本技術の製剤は、活性成分を、その薬学的に許容される担体、および任意で他の治療成分とともに含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容され」なければならない。
【００３３】
経口投与に適した本技術の製剤は、それぞれがあらかじめ決められた量の活性成分を含有するカプセル、サシェ、錠剤もしくはロゼンジとしての個別単位の形態で；粉末もしくは顆粒の形態で；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液の形態で；または水中油型エマルションもしくは油中水型エマルションの形態であり得る。
【００３４】
直腸投与用製剤は、活性成分とカカオ脂などの担体とを組み入れた坐剤の形態、または浣腸の形態であり得る。
【００３５】
非経口投与に適した製剤は、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である活性成分の無菌油性または水性調製物を含む。
【００３６】
局所投与に適した製剤は、液体または半液体調製物、例えば、リニメント剤、ローション、アプリカント（applicant）、水中油型もしくは油中水型エマルション、例えばクリーム、軟膏もしくはペースト；または溶液もしくは懸濁液、例えば滴剤；またはスプレーとしてのものが挙げられる。
【００３７】
鼻投与に関して、スプレー缶、ネブライザーまたはアトマイザーで投与される、粉末、自動推進式もしくはスプレー式製剤の吸入を使用することができる。製剤は、投与される場合、好ましくは１０〜１００ミクロンの範囲の粒径を有する。
【００３８】
製剤は、好都合には、投与単位形態で提供することができ、調剤分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。「投与単位」という用語は、患者に対して活性成分をそのままで、または固体もしくは液体の医薬希釈剤または担体との混合物としてのいずれかで含む物理的および化学的に安定な単位用量として投与することができる単一の、すなわち１回量を意味する。
【００３９】
本明細書中で言及されるすべての参考文献は、その全体を参照することによって、本明細書中で完全に記載されているかのようにすべての目的に関して、特に本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【００４０】
実施例１：（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の合成
（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む本技術の化合物を、スキーム１〜３で示す方法を用いて調製した。スキーム２に示すように、化合物２は、Sicinski et al. (J. Med. Chem. 41, 4662-4672, 1998)によって記載されているようにビタミンＤ２（化合物１）をオゾン分解し、続いてホウ化水素で還元することによって得られる。ジアルコール２をピリジン中塩化トシルで処理して、トシレート化合物３を得る。ジクロロメタン中トリエチルシリルトリフレート（ＴＥＳＯＴｆ）および２，６−ルチジンで処理することによって化合物３を保護して、化合物４を得る。化合物４のトシレートをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中シアニドで置換して、シアノ化合物５を得た。化合物５をリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）とテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で反応させ、ヨウ化メチルでアルキル化して、化合物６を得、これを続いてジクロロメタン中水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）で還元して、アルデヒド７を得た。
【００４１】
スキーム３は、化合物７の式ＩＩＡの表題化合物（化合物１４）への変換を示す。まず、アルデヒド７をトリエチルホスホノアセテート８とＬＤＡの存在下で反応させて、アルケン９を得る。化合物９をメタノール中Ｐｄ／Ｃ上で水素化して、化合物１０を得、後者の化合物をメチルグリニャール試薬と反応させて、第３アルコール１１を得た。テトラプロピルパールテネートでＮ−メチルモルホリンＮ−オキシドの存在下で酸化し、続いて残存するアルコールをＴＥＳＯＴｆで、先と同じ条件下で保護することによって、ケトン１２を得た。化合物１２をＡ−環ホスホニウム塩（スキーム１から得られる化合物Ｈ）と、フェニルリチウムを用いてカップリングさせて、シリル保護されたビタミン誘導体である化合物１３（式ＩおよびＩＡの化合物）を得た。すべてのシリル保護基の除去をアセトニトリル（ＡＣＮ）中ＨＦで実施して、化合物１４（式ＩおよびＩＩＡの化合物）を得た。この生成物は後述するように完全に特性を決定した。
【００４２】
スキーム２
2013522369.tif 000012
【００４３】
スキーム３
2013522369.tif 000013
【００４４】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−２０−（ヒドロキシメチル）−プレグナン−８−オール（２）
ビタミンＤ２  １（５ｇ、１２．６ミリモル）およびピリジン（５ｍＬ、４．８９ｇ、６２ミリモル）のメタノール（４００ｍＬ）中溶液に−７８℃でオゾンを通した。反応混合物が藍色なったら、酸素で１５分間フラッシュして、残存するオゾンを除去し、次いでＮａＢＨ４（１．５ｇ、４０ミリモル）で処理した。１５分後、２回目のＮａＢＨ４（１．５ｇ、４０ミリモル）を添加し、混合物を室温まで温めた。３回目のＮａＢＨ４（１．５ｇ、４０ミリモル）を添加し、反応混合物を１８時間撹拌した。反応を水でクエンチし、減圧下で濃縮し、ジクロロメタンで抽出した。合した有機相を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（３０％、次いで５０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、ジオール２（２．６１ｇ、４９％）を無色結晶として得た。
融点１０７℃（酢酸エチル／ヘキサンから）；［α］Ｄ  ＋３２．９（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000014
Ｃ１３Ｈ２２Ｏ（Ｍ＋−Ｈ２Ｏ）について計算された精密質量：１９４．１６７１、実測値：１９４．１６７３。
【００４５】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−２０−［（ｐ−トルエンスルホニル）オキシ］メチル−プレグナン−８−オール（３）
塩化トシル（０．９ｇ、４．７３ミリモル）のピリジン（２ｍＬ）中予冷（−２０℃）溶液をジオール２（０．５２ｇ、２．４５ミリモル）の無水ピリジン（５ｍＬ）中混合物に−２０℃で添加した。反応混合物を３時間−２０℃で撹拌し、次いでこれを０℃まで温め、１８時間撹拌した。混合物を飽和ＣｕＳＯ４水溶液中に入れ、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を飽和ＣｕＳＯ４水溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、トシレート３（０．８６ｇ、９６％収率）を無色結晶として得た。
融点９５℃（酢酸エチル／ヘキサンから）；［α］Ｄ  ＋１７．４（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000015
Ｃ２０Ｈ３０Ｏ４ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：３８９．１７６３、実測値：３８９．１７５８。
【００４６】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−［（ｐ−トルエンスルホニル）オキシ］メチル−プレグナン（４）
トリエチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（０．６ｍＬ、０．７０ｇ、２．６５ミリモル）をトシレート３（０．６５ｇ；１．７８ミリモル）および２，６−ルチジン（０．３ｍＬ、０．２８ｇ、２．５８ミリモル）のジクロロメタン（６ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。反応混合物を１５分間攪拌し、これをジクロロメタンで希釈した。有機相を水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、生成物４（０．８４ｇ、９９％収率）を淡黄色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋２０．６（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000016
Ｃ２６Ｈ４４Ｏ４ＳＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：５０３．２６２７、実測値：５０３．２６２９。
【００４７】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（シアノメチル）−プレグナン（５）
シアン化ナトリウム（２ｇ、４１ミリモル）をトシレート４（０．８４ｇ、１．７５ミリモル）の無水ＤＭＳＯ（８ｍＬ）中溶液に添加した。結果として得られた混合物を９０℃で３時間撹拌し、次いで冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、シアニド５（０．５７ｇ、９７％収率）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋１６．６（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000017
Ｃ２０Ｈ３７ＯＮＳｉ（Ｍ＋）について計算された厳密質量：３３５．２６４４、実測値：３３５．２６５６。
【００４８】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（１'−メチル−１'−シアノ−エチル）−プレグナン（６）
ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、３．４ｍＬ、５．４ミリモル）をジイソプロピルアミン（０．７６ｍＬ、０．５４４ｇ、５．４ミリモル）のＴＨＦ（１ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。結果として得られた混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いでこれを−７８℃まで冷却し、シアニド５（０．４５ｇ、１．３４ミリモル）のＴＨＦ（２ｍＬ）中溶液を添加した。混合物を−７８℃で３０分間攪拌し、次いでヨードメタン（０．９ｍＬ、２．０４ｇ、１４．４ミリモル）を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間、次いで室温で１時間撹拌した。これを飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（１０％、次いで２０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、生成物６（０．４９ｇ、１００％収率）を得た。
［α］Ｄ  ＋３４．５（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000018
Ｃ２２Ｈ４１ＯＮＳｉ（Ｍ＋）について計算された厳密質量：３６３．２９５７、実測値：３６３．２９５７。
【００４９】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（１'−メチル−１'−ホルミル−エチル）−プレグナン（７）
水素化ジイソブチルアルミニウム（ジクロロメタン中１．０Ｍ、２．５ｍＬ、２．５ミリモル）を化合物６（０．４９ｇ、１．３５ミリモル）のジクロロメタン（３ｍＬ）中溶液に−１０℃で添加した。混合物を−１０℃で１時間撹拌し、次いでこれを飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液（５ｍＬ）でクエンチした。水相をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（１０％、次いで２０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、アルデヒド７（０．４７ｇ、９５％収率）を無色結晶として得た。
融点：７１〜７２℃（ＥｔＯＡｃ）；［α］Ｄ  ＋１２．８（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000019
Ｃ２２Ｈ４２Ｏ２ＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算された厳密質量（ＥＳＩ）：３８９．２８５２、実測値：３８９．２８５５。
【００５０】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（１'−ジメチル−３'−エチルオキシカルボニル−２'−プロペニル）−プレグナン（９）
ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、１．１ｍＬ、１．７６ミリモル）をジイソプロピルアミン（０．２４ｍＬ、０．１７２ｇ、１．７０ミリモル）の無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。３０分後、混合物を−１０℃まで冷却し、トリエチルホスホノアセテート８（０．３８ｍＬ、０．４２６ｇ、１．９ミリモル）を添加した。反応混合物を−１０℃で３０分間攪拌し、次いでアルデヒド７（３１．４ｍｇ、０．０８６ミリモル）の無水ＴＨＦ（１ｍＬ＋０．５ｍＬ）中溶液を、カニューレを通して添加した。混合物をアルゴン下、−１０℃で１時間撹拌し、次いでこれを３７℃まで２．５時間加熱し、後に室温で一晩攪拌した。ジクロロメタンを添加し、有機相を水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。生成物をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）上で精製した。カートリッジをヘキサン／酢酸エチル（２％）で洗浄して、９（３４．１ｍｇ、９１％収率）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  −４．６（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000020
Ｃ２６Ｈ４８Ｏ３ＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：４５９．３２７０、実測値：４５９．３２５４。
【００５１】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−２０−（１'−ジメチル−３'−エチルオキシカルボニル−プロピル）−プレグナン−８−オール（１０）
エステル９（３４．１ｍｇ、０．０７８ミリモル）のメタノール（５ｍＬ）中溶液を、粉末木炭（１０ｍｇ）上１０％パラジウムの存在下で室温にて２０時間水素化した。ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（２ｇ）を通して反応混合物をろ過し、これをメタノールでさらに洗浄した。溶媒を除去した後、エステル１０（２４．０ｍｇ、９５％）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋７．１（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000021
ｎａＣ２０Ｈ３６Ｏ３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量：３４７．２５６２、実測値：３４７．２５５６。
【００５２】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−２２−ジメチル−コレスタン−８，２５−ジオール（１１）
メチルマグネシウムブロミド（ジエチルエーテル中３．０Ｍ溶液、６５μＬ、０．１９５ミリモル）をエステル１０（２４ｍｇ、０．０７４ミリモル）の無水ジエチルエーテル（１．８ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。反応混合物を０℃で２時間、次いで室温で１８時間撹拌した。これを飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）にかけた。酢酸エチル／ヘキサン（１：１）で溶出して、ジオール１１（１９．２ｍｇ、８４％）を得た。
［α］Ｄ  ＋４．８（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000022
ｎａＣ２０Ｈ３８Ｏ２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：３３３．２７７０、実測値：３３３．２７７４。
【００５３】
（２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−２２−ジメチル−２５−［（トリエチルシリル）オキシ］−コレスタン−８−オン（１２）
分子篩Ａ４（１００ｍｇ）を４−メチルモルホリンオキシド（１５０ｍｇ、１．２８ミリモル）のジクロロメタン（６００μＬ）中溶液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌し、テトラプロピルアンモニウムパールテネート（８ｍｇ、２２．８マイクロモル）を添加し、続いてジオール１１（１９ｍｇ、０．０６１ミリモル）のジクロロメタン（４００＋２００μＬ）中溶液を添加した。結果として得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（２ｇ）に通してろ過し、これを酢酸エチルでさらに洗浄した。溶媒を除去した後、ケトン（１９ｍｇ）を無色油状物として得た。
【００５４】
トリエチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（２０μＬ、２３ｍｇ、０．０８８ミリモル）をケトン（１９ｍｇ、０．０６２ミリモル）および２，６−ルチジン（６０μＬ、５５ｍｇ、０．５１５ミリモル）のジクロロメタン（１．２ｍＬ）中溶液に−４０℃で滴加した。反応混合物を−４０℃で１５分間攪拌し、次いでこれをジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）に供した。ヘキサン／酢酸エチル（１％、次いで２％）で溶出して、保護されたケトン１２（２０．２ｍｇ、７８％収率）を得た。
［α］Ｄ  −１９．２（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000023
Ｃ２６Ｈ５０Ｏ２ＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：４４５．３４７８、実測値：４４５．３４８６。
【００５５】
（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１４）
フェニルリチウム（ジ−ｎ−ブチルエーテル中１．８３Ｍ、０．１ｍＬ、０．１８３ミリモル）をホスフィンオキシドＨ（１１０ｍｇ、０．１８９ミリモル）の無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中撹拌溶液に−３０℃で添加した。３０分後、混合物を−７８℃まで冷却し、ケトン１２（２０ｍｇ、４７．４マイクロモル）の無水ＴＨＦ（２００＋１００μＬ）中予冷溶液に添加した。反応混合物をアルゴン下、−７８℃で４時間、次いで＋４℃で１９時間撹拌した。酢酸エチルを添加し、有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）に供した。カートリッジをヘキサンおよび酢酸エチル／ヘキサン（１：９９）で洗浄して、粗生成物を得た。ビタミンを順相ＨＰＬＣ［９．４×２５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｓｉｌｉｃａカラム、４ｍＬ／分、ヘキサン／２−プロパノール（０．１％）溶媒系、Ｒｔ＝３．４分］によってさらに精製して、純粋な保護された化合物（１３）（３３．８３ｍｇ、９１％収率）を得た。
ＵＶ（ヘキサン中）λｍａｘ  ２６３．５，２５３．５，２４５．５ｎｍ；
2013522369.tif 000024
Ｃ４７Ｈ９０Ｏ３Ｓｉ３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量：（ＥＳＩ）８０９．６０９６、実測値：８０９．６０８６。
【００５６】
保護された化合物１３（３３．８２ｍｇ、４３．０モル）をＴＨＦ（４ｍＬ）およびアセトニトリル（３ｍＬ）中に溶解させた。アセトニトリル中４８％ＨＦ水溶液（１：９比、４ｍＬ）を０℃で添加し、結果として得られた混合物を室温で３時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を２ｍＬのヘキサン／酢酸エチル（７：３）で希釈し、ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）に供した。ヘキサン／酢酸エチル（７：３、次いで１：１）で溶出して、粗生成物１４を得た。ビタミン（１４）を、順相ＨＰＬＣ［９．４×２５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｓｉｌｉｃａカラム、４ｍＬ／分、ヘキサン／２−プロパノール（８５：１５）溶媒系、Ｒｔ＝７．８分］および逆相ＨＰＬＣ［９．４×２５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ１８カラム、３ｍＬ／分、メタノール／水（８５：１５）溶媒系、Ｒｔ＝１５．７分］によってさらに精製して、純粋な化合物１４（１４．３３６ｍｇ、７５％収率）を得た。
ＵＶ（ＥｔＯＨ中）λｍａｘ  ２６１．５，２５２．０，２４４．５ｎｍ；
2013522369.tif 000025
Ｃ２９Ｈ４８Ｏ３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：４６７．３５０１、実測値：４６７．３５０７。
【００５７】
実施例２：（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の合成
（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む本技術の化合物を、スキーム４〜６で示す方法を用いて調製した。スキーム４で示すように、化合物４を、スキーム２で図示し、実施例１で記載した同じステップによって得た。ＤＭＳＯ中重炭酸ナトリウムでのトシレート４のＫｏｒｎｂｌｕｍ酸化によって、アルデヒド１５を得た。化合物１５を水酸化テトラブチルアンモニウムでの処理によって２０位でエピマー化して、化合物１６を得、ホウ水素化ナトリウムで還元して、ジアステレオマーの混合物を得、これから２０Ｒ立体化学を有する化合物１７を単離した。
【００５８】
スキーム５で示されるように、化合物１７をスキーム２および３に示したものと類似した一連の合成ステップに付して、化合物１１の２０Ｒジアステレオマーである化合物２５を得た。同様に、スキーム６で示すように、化合物２５を、スキーム３の化合物１１と同じ一連の酸化、保護、トリエチルホスホノアセテート縮合および脱保護ステップに付して、化合物２８、（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を得た。この生成物は後述のように完全に特性を決定した。
【００５９】
スキーム４
2013522369.tif 000026
【００６０】
スキーム５
2013522369.tif 000027
【００６１】
スキーム６
2013522369.tif 000028
【００６２】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（ホルミル）−プレグナン（１５）
重炭酸ナトリウム（５ｇ、５９．５ミリモル）をトシレート４（２．３１ｇ、４．８１ミリモル）のＤＭＳＯ（１５ｍＬ）中溶液に添加した。反応混合物を１２０℃で１時間１５分攪拌し、これを酢酸エチルで希釈した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（５％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、生成物５（１．１９ｇ、７６％収率）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋４１．４（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000029
Ｃ１７Ｈ３１Ｏ２Ｓｉ［Ｍ−Ｅｔ］＋についての計算された厳密質量：２９５．２０９３、実測値：２９５．２１０３。
【００６３】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（ヒドロキシメチル）−プレグナン（１７）
水酸化テトラブチルアンモニウム（水中４０重量％溶液、４ｍＬ、３．９８ｇ、０．０１５モル）をアルデヒド５（０．９７ｇ、２．９９ミリモル）のジクロロメタン（２０ｍＬ）中溶液に添加した。反応混合物を１８時間室温で攪拌し、これをジクロロメタンで希釈した。有機相を水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。生成物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（３％、次いで５％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、異性体１６の混合物を得た（０．６９ｇ、７１％収率）。ホウ水素化ナトリウム（０．２ｇ、５．２９ミリモル）をアルデヒド１６（０．６９ｇ、２．１３ミリモル）のＴＨＦ（１０ｍＬ）およびエタノール（１０ｍＬ）中溶液に添加した。反応混合物を４５分間攪拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、酢酸エチルで抽出し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（４％、次いで２０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、純粋な異性体１７（０．３２６ｇ、４７％収率）ならびに両異性体１７および４の混合物（０．２７７ｇ、４０％収率）を得た。
［α］Ｄ  ＋３３．６（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000030
Ｃ１７Ｈ３３Ｏ２Ｓｉ［Ｍ−Ｅｔ］＋について計算された厳密質量：２９７．２２５０、実測値：２９７．２２４４。
【００６４】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−［（ｐ−トルエンスルホニル）オキシ］メチル−プレグナン（１８）
塩化トシル（０．３８ｇ、２ミリモル）のピリジン（３ｍＬ）中溶液を、カニューレを介してアルコール１７（０．３２６ｇ、１ミリモル）のピリジン（５ｍＬ）中溶液に−２０℃で移した。反応混合物を−２０℃で１時間、次いで＋４℃で一晩攪拌した。これを塩化メチレンで希釈し、ＣｕＳＯ４の飽和水溶液で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（５％、次いで１０％および２０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、トシレート１８（４２７ｍｇ、８９％収率）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋８．８（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000031
Ｃ２６Ｈ４４Ｏ４ＳＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量：５０３．２６２７、実測値：５０３．２６３９。
【００６５】
（８Ｓ，２０Ｓ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（シアノメチル）−プレグナン（１９）
シアン化ナトリウム（０．９ｇ、１８．４ミリモル）をトシレート１８（０．４１２ｇ、０．８５８ミリモル）のＤＭＳＯ（５ｍＬ）中溶液に添加した。結果として得られた混合物を９０℃で２時間撹拌し、次いで冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、シアニド１９（０．２４２ｇ、８５％収率）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋１７．３（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000032
Ｃ１８Ｈ３２ＮＯＳｉ［Ｍ−Ｅｔ］＋について計算された厳密質量：３０６．２２５３、実測値：３０６．２２５３。
【００６６】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（１'−メチル−１'−シアノ−エチル）−プレグナン（２０）
ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、２．４ｍＬ、３．８ミリモル）をジイソプロピルアミン（０．５４ｍＬ、０．３８４ｇ、３．８ミリモル）のＴＨＦ（２ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。結果として得られた混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いでこれを−７８℃まで冷却し、化合物１９（０．３２６ｇ、０．９７３ミリモル）のＴＨＦ（２ｍＬ）中溶液を添加した。混合物を−７８℃で３０分間攪拌し、次いでヨードメタン（１．２ｍＬ、２．７３ｇ、１９．２ミリモル）を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間、次いで室温で１時間撹拌した。これを飽和水性ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（５％、次いで１０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、生成物２０（０．１９７ｇ、５６％収率）を得た。
［α］Ｄ  ＋３０．９（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000033
Ｃ２２Ｈ４２ＯＮＳｉ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算された厳密質量：３６４．３０３１、実測値：３６４．３０４４。
【００６７】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（１'−メチル−１'−ホルミル−エチル）−プレグナン（２１）
水素化ジイソブチルアルミニウム（ジクロロメタン中１．０Ｍ、３．１ｍＬ、３．１ミリモル）を化合物２０（０．１９７ｇ、０．５４３ミリモル）のジクロロメタン（４ｍＬ）中溶液に−１０℃で添加した。混合物を−１０℃で１時間撹拌し、次いでこれを飽和水性酒石酸カリウムナトリウム溶液（５ｍＬ）でクエンチした。水相をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）上で精製した。カートリッジをヘキサン／酢酸エチル（９：１）で洗浄して、アルデヒド２１を無色油状物（０．１５ｇ、７５％収率）として得た。
［α］Ｄ  ＋３５．０（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）。
2013522369.tif 000034
Ｃ２２Ｈ４２Ｏ２ＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：３８９．２８４７、実測値：３８９．２８３８。
【００６８】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−８−［（トリエチルシリル）オキシ］−２０−（１'−ジメチル−３'−エチルオキシカルボニル−２'−プロペニル）−プレグナン（２２）
ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、５．２ｍＬ、８．３ミリモル）をジイソプロピルアミン（１．２ｍＬ、０．８４０ｇ、８．３ミリモル）の無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。３０分後、混合物を−１０℃まで冷却し、トリエチルホスホノアセテート８（１．９ｍＬ、２．１３ｇ、９．５ミリモル）を添加した。反応混合物を−１０℃で３０分間攪拌し、アルデヒド２１（０．１５ｇ、０．４１ミリモル）の無水ＴＨＦ（５ｍＬ＋３ｍＬ）中溶液を、カニューレを通して添加した。混合物をアルゴン下、−１０℃で１時間撹拌し、次いでこれを＋３７℃まで３時間加熱し、後にこれを室温で１８時間撹拌した。ジクロロメタンを添加し、有機相を水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。生成物をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）上で精製した。カートリッジをヘキサン／酢酸エチル（２％、次いで３％および５％）で洗浄して、生成物２２（９９ｍｇ、５５％収率）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋１８．１（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）；
2013522369.tif 000035
Ｃ２６Ｈ４８Ｏ３ＳｉＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：４５９．３２６５、実測値：４５９．３２５９。
【００６９】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−２０−（１'−ジメチル−３'−エチルオキシカルボニル−プロピル）−プレグナン−８−オール（２３）
エステル２２（９９ｍｇ、０．２３ミリモル）のメタノール（５ｍＬ）中溶液を、粉末木炭（１０ｍｇ）上１０％パラジウムの存在下で室温にて２０時間水素化した。ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（２ｇ）を通して反応混合物をろ過し、これをメタノールでさらに洗浄した。溶媒を除去した後、エステル２３（５０．４ｍｇ、６８％）を無色油状物として得た。
［α］Ｄ  ＋１５．３（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）。
2013522369.tif 000036
Ｃ２０Ｈ３７Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋について計算された厳密質量：３２５．２７３８、実測値：３２５．２７２７。
【００７０】
（８Ｓ，２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−２２−ジメチル−コレスタン−８，２５−ジオール（２４）
メチルマグネシウムブロミド（ジエチルエーテル中３．０Ｍ溶液、１３０μＬ、０．３９ミリモル）をエステル２３（５０ｍｇ、０．１５４ミリモル）の無水ジエチルエーテル（３ｍＬ）中溶液に０℃で添加した。反応混合物を０℃で２時間、次いで室温で１８時間撹拌した。これを飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）に供した。酢酸エチル／ヘキサン（１：１）で溶出して、ジオール２４（４８ｍｇ、１００％）を無色結晶として得た。
融点：１２２〜１２４℃（酢酸エチル／ヘキサンから）；［α］Ｄ  ＋２１．２（ｃ  ０．９８８，ＣＨＣｌ３）。
2013522369.tif 000037
ｎａＣ２０Ｈ３８Ｏ２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：３３３．２７６５、実測値：３３３．２７６４。
【００７１】
（２０Ｒ）−デス−Ａ，Ｂ−２２−ジメチル−２５−［（トリエチルシリル）オキシ］−コレスタン−８−オン（２５）
分子篩Ａ４（１００ｍｇ）を４−メチルモルホリンオキシド（９０ｍｇ、０．７７ミリモル）のジクロロメタン（４００μＬ）中溶液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌し、テトラプロピルアンモニウムパールテネート（９．７ｍｇ、２７．６マイクロモル）を添加し、続いてジオール２４（２９．４ｍｇ、０．０９５ミリモル）のジクロロメタン（３００＋１００μＬ）中溶液を添加した。結果として得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した。ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（２ｇ）を通して反応混合物をろ過し、これを酢酸エチルでさらに洗浄した。溶媒を除去した後、ケトン（２９．５ｍｇ）を無色油状物として得た。
【００７２】
トリエチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（３０μＬ、３５．１ｍｇ、０．１３３ミリモル）をケトン（２９．２ｍｇ、０．０９５ミリモル）および２，６−ルチジン（４０μＬ、３７ｍｇ、０．３４３ミリモル）のジクロロメタン（１．６ｍＬ）中溶液に−５０℃で滴加した。反応混合物を−４０℃で１５分間攪拌し、次いでこれをジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）にかけた。ヘキサン／酢酸エチル（１％、次いで２％）で溶出して、保護されたケトン２５（３４．４ｍｇ、８６％収率）を得た。
［α］Ｄ  −８．８（ｃ  １．０，ＣＨＣｌ３）。
2013522369.tif 000038
Ｃ２６Ｈ５１Ｏ２Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：４２３．３６５３、実測値：４２３．３６４９。
【００７３】
（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（２７）
フェニルリチウム（ジ−ｎ−ブチルエーテル中１．７０Ｍ、１０５μＬ、０．１７８ミリモル）をホスフィンオキシドＨ（７３．６ｍｇ、０．１２６ミリモル）の無水ＴＨＦ（５００μＬ）中撹拌溶液に−３０℃で添加した。３０分後、混合物を−７８℃まで冷却し、ケトン２５（３５ｍｇ、８２．９マイクロモル）の無水ＴＨＦ（４００＋３００μＬ）中予冷（−７８℃）溶液を添加した。反応混合物をアルゴン下、−７８℃で４時間、次いで＋４℃で１９時間撹拌した。酢酸エチルを添加し、有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残留物をＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）に供した。カートリッジをヘキサンおよび酢酸エチル／ヘキサン（１：９９）で洗浄して、粗生成物を得た。ビタミンを順相ＨＰＬＣ［９．４×２５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｓｉｌｉｃａカラム、４ｍＬ／分、ヘキサン／２−プロパノール（０．１％）溶媒系、Ｒｔ＝３．２分］によってさらに精製して、純粋な保護された化合物２６（５１．０９ｍｇ、７８％収率）を得た。
ＵＶ（ヘキサン中）λｍａｘ  ２６２．５，２５２．５，２４４．５ｎｍ；
2013522369.tif 000039
Ｃ４７Ｈ９０Ｏ３Ｓｉ３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：８０９．６０９１、実測値：８０９．６１０１。
【００７４】
保護された化合物２６（５０．９４ｍｇ、６４．８マイクロモル）をＴＨＦ（５ｍＬ）およびアセトニトリル（３ｍＬ）中に溶解させた。アセトニトリル中４８％ＨＦ水溶液（１：９比、４ｍＬ）を０℃で添加し、結果として得られた混合物を室温で２時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を２ｍＬのヘキサン／酢酸エチル（７：３）で希釈し、ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（５ｇ）に供した。ヘキサン／酢酸エチル（７：３、次いで１：１）で溶出して、粗生成物２０を得た。ビタミン２０を順相ＨＰＬＣ［９．４×２５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｓｉｌｉｃａカラム、４ｍＬ／分、ヘキサン／２−プロパノール（８５：１５）溶媒系、Ｒｔ＝７．４分］および逆相ＨＰＬＣ［９．４×２５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ１８カラム、３ｍＬ／分、メタノール／水（８５：１５）溶媒系、Ｒｔ＝１３．３分］によってさらに精製して、純粋な化合物２７（２２．７１ｍｇ、７９％収率）を得た。
融点：１５４℃（２−プロパノール／ヘキサンから）；ＵＶ（ＥｔＯＨ中）λｍａｘ  ２６１．０，２５２．０，２４４．０ｎｍ；
2013522369.tif 000040
Ｃ２９Ｈ４８Ｏ３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算された厳密質量（ＥＳＩ）：４６７．３４９６、実測値：４６７．３４８３。
【００７５】
実施例３：生物活性
ビタミンＤ受容体結合
試験材料
タンパク質源
完全長組換えラット受容体を大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＩＬ細胞で発現させ、２つの異なるカラムクロマトグラフィーシステムを用いて精製して、均一にした。第１のシステムは、このタンパク質上のＣ末端ヒスチジンタグを利用するニッケルアフィニティー樹脂であった。この樹脂から溶出されたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を用いてさらに精製した。精製されたタンパク質のアリコートを液体窒素中で急速冷凍し、そして使用するまで−８０℃で保存した。結合アッセイで使用するために、タンパク質を、０．１％Ｃｈａｐｓ界面活性剤を含むＴＥＤＫ５０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＫＣｌ）中で希釈した。受容体タンパク質およびリガンド濃度を、添加した放射標識リガンドの受容体への結合が２０％以下となるように最適化した。
【００７６】
試験薬物
標識されていないリガンドをエタノール中に溶解させ、濃度を、ＵＶ分光光度分析を用いて測定した（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３：モル吸光係数＝１８，２００およびλｍａｘ＝２６５ｎｍ；類似体：モル吸光係数＝４２，０００およびλｍａｘ＝２５２ｎｍ）。放射標識リガンド（３Ｈ−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、約１５９Ｃｉ／ミリモル）をエタノール中に１ｎＭの最終濃度で添加した。
【００７７】
アッセイ条件
放射標識リガンドおよび標識されていないリガンドを１００μＬの希釈されたタンパク質に１０％以下の最終エタノール濃度で添加し、混合し、一晩氷上でインキュベートして、結合平衡に達成させた。翌日、１００μＬのヒドロキシルアパタイトスラリー（５０％）を各管に添加し、１０分間隔で３０分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離によって集め、次いで０．５％Ｔｉｔｒｏｎ  Ｘ−１００を含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを、４ｍＬのＢｉｏｓａｆｅ  ＩＩシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに移し、混合し、シンチレーションカウンターに入れた。全結合量を、放射標識リガンドのみを含有する管から測定した。
【００７８】
ＨＬ−６０の分化
試験材料
研究薬物
研究薬物をエタノール中に溶解させ、ＵＶ分光光度分析を用いて濃度を測定した。細胞培養中に存在するエタノールの最終濃度（≦０．２％）を変えることなく、一連の薬物濃度を試験できるように、連続希釈を調製した。
【００７９】
細胞
ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ６０）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の存在下でインキュベートした。
【００８０】
アッセイ条件
ＨＬ６０細胞を１．２×１０５細胞／ｍＬで蒔いた。プレーティングの１８時間後、細胞を２連で、薬物で処理した。４日後、細胞を収集し、ニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイを実施した（Collins et al., J. Exp. Med. (1979) 149:969-974）。合計２００細胞を計数し、細胞内暗藍色ホルマザン堆積物を含有していた数を記録することによって、分化した細胞の比率を決定した。単球への分化の検証は、食細胞活性を測定することによって決定した（データは不掲載）。
【００８１】
インビトロ転写アッセイ
転写活性は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流の２４−ヒドロキシラーゼ（２４Ｏｈａｓｅ）遺伝子プロモーターを安定にトランスフェクトされたＲＯＳ１７／２．８（骨）細胞で測定した（Arbour et al., Analytical Biochem. (1998) 255(1):148-154）。細胞に様々な用量を投与した。投与の１６時間後に細胞を収集し、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＬＵ＝相対的ルシフェラーゼ単位。
【００８２】
腸カルシウム輸送および骨カルシウム動員
オスの離乳Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＤｉｅｔ１１（０．４７％Ｃａ）食餌＋ＡＥＫ油で１週間飼育し、続いてＤｉｅｔ１１（０．０２％Ｃａ）＋ＡＥＫ油で３週間飼育した。ラットは次いで０．４７％Ｃａを含有する食餌で１週間、続いて０．０２％Ｃａを含む食餌で２週間の飼育に切り替えた。投薬は、０．０２％カルシウム食餌の最終週中に開始した。４回の連続した腹腔内用量を約２４時間あけて与えた。最終投与の２４時間後、切断された頸部から血液を集め、そして血清カルシウムの濃度を骨カルシウム動員の尺度として測定した。腸の最初の１０ｃｍも反転腸管法を用いて腸カルシウム輸送分析のために集めた。
【００８３】
生物活性結果
（２０Ｓ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＭＥＴ−１）は、図１に示すように組換え型ビタミンＤ受容体に対する結合において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３とほぼ等しく有効である（それぞれ４×１０−１１Ｍおよび５×１０−１１ＭのＫｉ）。しかし、ＭＥＴ−１は、図２に示すように、培養中、ＨＬ−６０細胞の分化の誘導で、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３よりも４倍強力である（それぞれ７×１０−１０Ｍおよび３×１０−９Ｍ）。ＭＥＴ−１は、図３において示すように１，２５−（ＯＨ）２Ｄよりも骨細胞における２４−ＯＨａｓｅ遺伝子発現の刺激で１０倍強力である（それぞれ３×１０−１１Ｍおよび２×１０−１０Ｍ）。対照的に、インビボ試験は、ＭＥＴ−１が、骨カルシウム動員に対して１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３よりも２０倍活性が低く（図４）、そして腸カルシウム輸送を引き起こすのに１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３よりも著しく活性が低い（図５）ことを示した。
【００８４】
（２０Ｒ）−２−メチレン−１９−ノル−２２−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＭＥＴ−２）は、図６に示すように、組換えビタミンＤ受容体に対する結合において、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３と同等に有効である（どちらも５×１０−１１ＭのＫｉを示す）。ＭＥＴ−２は、図７で示すように、培養中でのＨＬ−６０細胞の分化の誘導で、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３よりも３倍強力である（それぞれ７×１０−１０Ｍおよび３×１０−９Ｍ）。しかし、ＭＥＴ−２は、図８で示すように、１，２５−（ＯＨ）２Ｄよりも骨細胞における２４−ＯＨａｓｅ遺伝子発現の刺激において約３倍効力が低い（それぞれ３×１０−１１Ｍおよび２×１０−１０Ｍ）。インビボ試験は、ＭＥＴ−２が骨カルシウム動員に関して、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３よりも１６倍活性が低く（図４）、腸カルシウム輸送を引き起こす際に１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３よりも著しく活性が低いことを示した（図５）。
【００８５】
比較例：表１は、本開示から得られる化合物（ＭＥＴ−１およびＭＥＴ−２）と比較した２−メチレン−１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３およびその２０Ｒ異性体の生物学的データを示す。前者の化合物は、２つの水素ではなく、２１位の炭素に結合した２つのメチル基を有する点で後者と異なる。ビタミンＤ受容体の結合およびＨＬ−５０分化は一般的に各化合物について一桁以内であるが、本発明の化合物は、カルシウム血活性に対して驚くべき予想外の効果を示す。２ＭＤ化合物は、２０Ｒ異性体の４．５ｍｇ／ｄＬから２０Ｓ異性体の９．３ｍｇ／ｄＬまでの非常に強力な正味の骨カルシウム動員活性を示すが、本発明のＭＥＴ化合物は実質的にカルシウム血活性を示さない。一方、２ＭＤ化合物はビヒクルよりも低い腸カルシウム血活性を示すが、本発明の化合物は、小さいが有意な漿膜対粘膜カルシウム比、すなわちＭＥＴ−２およびＭＥＴ−１についてそれぞれ１．２〜２．３を示す。
【００８６】
これらの特性は、どちらの化合物も、血清カルシウムの上昇が望ましくない疾患の治療において非常に有用であることを示す。したがって、これらの化合物は、慢性腎不全を患う患者の続発性副甲状腺機能亢進症の治療において有用であるはずである。なぜなら、心臓、大動脈および他の生命の維持に重要な器官の石灰化の恐れから、これらの患者において副甲状腺増殖およびプレプロ副甲状腺遺伝子の転写を抑制しつつ正常値よりも高く血清カルシウムを上昇させることは望ましくないからである。同様に、これらの化合物は、乳がん、結腸直腸がんおよび前立腺がんなどの悪性腫瘍の治療において、または多発性硬化症、ループス、関節リウマチ、１型糖尿病、および炎症性腸疾患などの自己免疫疾患の治療において有用である。これらはまた、移植片拒絶反応の予防においても有用である。
【００８７】
【表１】
2013522369.tif 000041
＊全ての化合物は２−メチレン−１９−ノル化合物である。
１指定されている場合を除き、７８０ｐＭの投与量。
２Ｓ／Ｍ＝漿膜Ｃａ２＋／粘膜Ｃａ２＋；指定されている場合を除き、７８０ｐＭの投与量。
３米国特許第５，８４３，９２８号明細書およびJ. Med. Chem. 1998, 41, 4662からのデータ。
４２６０ｐＭの投与量。
【００８８】
本技術は、説明のために本明細書中に記載された実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲内に含まれるようなそれらの形態をすべて包含すると理解される。
【図１】
2013522369.tif 000048
【図２】
2013522369.tif 000049
【図３】
2013522369.tif 000050
【図４】
2013522369.tif 000051
【図５】
2013522369.tif 000052
【図６】
2013522369.tif 000053
【図７】
2013522369.tif 000054
【図８】
2013522369.tif 000055
【図９】
2013522369.tif 000056
【図１０】
2013522369.tif 000057
【国際調査報告】
2013522369.tif 000058
2013522369.tif 000059