(57)【要約】  本発明は抗原特異的Ｔｒ１細胞治療の対象である患者が治療に応答するか否かを評価するための方法に関するものであって、前記方法は、前記患者由来の細胞サンプルに含まれるＴ細胞のin vitroにおける抗原特異的増殖を判定することと、前記抗原特異的増殖と指標基準とを比較することと、を含み、それによって前記患者が治療に応答するか否かを判定する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的Ｔｒ１細胞治療対象のヒト患者対象が処置に応答するか否かを評価するための方法であって、
−in
vitroにおいて前記患者由来の細胞サンプル中に含まれるＴ細胞の抗原特異的増殖を判定することと、
−前記抗原特異的増殖と指標基準とを比較することと、を含み、
それにより、患者が処置に応答するか否かを判定する方法。
【請求項２】
指標基準はＴｒ１処置前の前記患者から取得した細胞サンプル中に含まれるＴ細胞の抗原特異的増殖である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
in
vitroにおいて、T細胞の抗原特異的増殖の判定が、前記患者へのＴｒ１細胞の最後の投与後５日及び３０日の間に患者から取得した細胞サンプルにおいて実施される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞サンプルは抹消血液単核細胞、抹消白血球細胞であり、又はリンパ節生検、腸生検、滑膜生検、脳脊髄液又は期間支配法洗浄検査から取得した請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞の抗原特異的増殖の判定は、
−Ｔｒ１細胞を投与する抗原の存在下Ｔ細胞を含む細胞サンプルを培養することと、及び
−培養後２日から１０日でＴ細胞の増殖を判定することと、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は５日から３０日の間に毎週患者から取得された細胞サンプルで毎週繰り返す請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は５日から３０日の間に２週間毎に患者から取得された細胞サンプルで２週間毎に繰り返す請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者を応答者又は非応答者の群に分類するため請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患を評価し且つ前記治療の結果を追跡するための請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
クローン病を有し且つオボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞治療の対象である患者が処置に応答するか否かを評価するための請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
関節リウマチを有し且つＩＩ型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞治療の対象である患者が処置に応答するか否かを評価するための請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗原特異的Ｔｒ１細胞治療の対象である患者が処置に応答するか否かをin vitroにおいて評価するためのバイオマーカーとしての抗原特異的Ｔ細胞の増殖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は対象におけるＴｒ１細胞治療の有効性を評価するための方法に関するものであり、その後Ｔｒ１細胞治療における対象患者が前記治療に対する応答者か非応答者か否かを判定するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物学的化合物を用いた疾患又は状態の治療は挑戦回数を表す。それらのうちの１つはいずれの患者群が特定の治療に適しているのか、いずれの対象がこの治療に対する応答を示す予定なのか及びいずれの対象が一定時間経過後に応答を喪失する予定なのかを判定するものである。この情報は更なる患者の治療及び臨床研究設計における重大な衝撃を持つものである。
【０００３】
通常、バイオマーカーがこれらの問に対する答えを導き出す手助けをしてくれる。
【０００４】
バイオマーカーは、「通常の生物学的過程、病原性の過程又は治療干渉における藥理学的応答の指標として客観的に計測され且つ評価される特徴」として定義されることがある。
【０００５】
前記技術において、非常に多くの研究がサイトカインなどの分子の利用又は治療された対象が応答する予定があるか否か判定するための遺伝子発現の「プロファイル」として利用できることを記載する。
【０００６】
例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２又はインターフェロンガンマなどのＣＲＰ及びサイトカインなどの分子はインフリキシマブ及び他の生物学的化合物に対するクローン病の対象の応答を定義するためのバイオマーカーとして記載される。国際公開第２００８／１４７８６９号は、胃腸障害に対する治療効果を評価するためにＩＰー１０、ＭＣＰー１、ＭＭＰ−９、ＴＮＦーα、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＥＮＡー７８、ＭＰＯ、ＭＩＰ−１β及びＶＥＧＦの間から少なくとも１つの遺伝子発現の判定について記載する。国際公開第２００８／０４８９８６号は、また腸疾患障害に対する治療に対する応答者及び非応答者として個体を分類するための項目に選択される遺伝子発現系を計測することに依存している。別の実施形態では、欧州特許第２０５６１１０号明細書が抗−ＴＮＦ治療の応答を評価する特異なタンパクの判定を記載する。
【０００７】
本発明は慢性炎症性の疾患、自己免疫疾患、アレルギー症状、及び内臓移植の状態を治療するために利用されるＴｒ１細胞治療に関する。前文に示したように、Ｔｒ１細胞は複数の硬化症（国際公開第２００９／０５２８３号）、クローン病などの腸の炎症状態（国際公開第２００９／０６８５７５号）又はリューマチ関節炎などの関節炎の状態（国際公開第２００９／０５４２４２号）の治療に利用することができる。
【０００８】
バイオマーカーがこれらの状態に対する治療を達成するのを評価するために記載されているのに対して、Ｔｒ１細胞治療の達成を予想することを特異的に許容するバイオマーカーに必要である。Ｔｒ１細胞治療に対する患者の階層化をするため、及びＴｒ１細胞治療応答者と非応答患者とを区別するために必要である。
要約
【０００９】
本発明の１つの目的は、抗原特異的なＴｒ１細胞治療を受ける患者、好ましくは人間の患者が治療に応答するか否かを評価する方法であって、
−in
vitroにおいて、前記患者から細胞サンプルにおいて含まれるＴ細胞の抗原特異的な増殖を判定することと、
−前記抗原特異的増殖と指標基準とを比較することと、を含み、
それにより、患者が応答するか否かを判定する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、指標基準は患者から取得した指標基準であり、Ｔｒ１細胞治療前に前記患者から得た細胞サンプルに含まれるＴ細胞の抗原特異的な増殖である。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、Ｔ細胞を含んだ細胞サンプルは患者に対するＴｒ１細胞の最後の投与後、５日と３０日との間に患者から得たものである。１つの実施形態においては、in vitroにおいて、Ｔ細胞の抗原特異的増殖の判定は患者に対するＴｒ１細胞の最後の投与後、５日と３０日との間に患者から得た細胞サンプルにおいて実行される。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、細胞サンプルは末梢血単核細胞、末梢白血球細胞であるか又はリンパ節生検、腸生検、滑膜生検、脳脊髄液または気管支肺胞洗浄から取得する。
【００１３】
本発明における別の実施形態において、Ｔ細胞の抗原特異的な増殖の評価は、
−Ｔｒ１細胞直接である抗原の存在においてＴ細胞を含む細胞サンプルを培養し、且つ、
−培養の２〜１０日後においてＴ細胞の増殖を判定することを含む。
【００１４】
本発明における別の実施形態において、前述の方法は、患者に対するＴｒ１細胞の最後の投与後５日から３０日の間に毎週患者から取得された細胞サンプルにおいて毎週繰り返すこととなる。
【００１５】
本発明における別の実施形態において、前述の方法は、患者に対するＴｒ１細胞の最後の投与後５日から３０日の間に各２週毎に患者から取得した細胞サンプルにおいて各２週毎に繰り返される。
【００１６】
本発明の別の目的は、患者を応答群と非応答群とに分類するための前述の方法である。
【００１７】
本発明の別の目的は、疾患の進行を追跡し、且つ治療の結果を追跡するための前述の方法である。
【００１８】
本発明の別の目的は、クローン病を有し且つオボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するための前述の方法前述の方法である。
【００１９】
本発明の別の目的は、リューマチ関節炎を有し且つＩＩ型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するための前述の方法である。
【００２０】
本発明の別の目的は、抗原特異的Ｔｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するための前述の方法である。好都合にも、前記方法は抗原特異的Ｔｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）臨床的応答者（黒丸、ｎが９）及び臨床的非応答クローン病患者（白い四角、ｎが９）におけるオボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞を用いた処置後のＰＢＭＣのオボアルブミン特異的増殖の動態。結果は増殖指数の意味として表される。（Ｂ）臨床的応答者（黒丸、ｎが１０）及び臨床的非応答クローン病患者（白い四角、ｎが１０）におけるオボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞を用いた処置後のＰＢＭＣのオボアルブミン特異的増殖の動態。結果は増殖比率の意味として表される。
【図２】（Ａ）オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞処置前（黒い棒）又はオボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞処置後３週間（白い棒）の臨床的応答者（ＣＲ）及び臨床的非応答クローン病患者（ＣＮＲ）におけるＰＢＭＣのオボアルブミン特異的増殖の動態。結果は増殖指数として表される。（Ｂ）オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞処置後３週後及び８週後の臨床的応答者（ＣＲ）（ｎが１０）及び臨床的非応答クローン病患者（ＣＮＲ）（ｎが１０）におけるＰＢＭＣのオボアルブミン特異的増殖の動態。結果は増殖比率として表される。
【図３】（Ａ）臨床的応答者（ＣＲ）及び臨床的非応答クローン病患者（ＣＮＲ）の百分率は、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞処置後３週間のin vitroにおける、オボアルブミン特異的増殖の抑止を示す。（Ｂ）臨床的応用者（ＣＲ）（ｎが１０）及び臨床的非応答クローン病患者（ＣＮＲ）（ｎが１０）の百分率は、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞処置後３週間及び８週間のin vitroにおける、オボアルブミン特異的増殖での減少を示す。
【図４】（Ａ）最低のＣＤＡＩ処置の機能における応答患者（パネルＡ）及び非応答患者（パネルＢ）由来のＰＢＭＣのオボアルブミン特異的増殖のプロットは、オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞処置後５週及び８週の間において判定した。対数相関は応用患者由来のＰＢＭＣのオボアルブミン特異的増殖の間において観測された。
【図５】応答者（黒丸）及び非応答クローン病患者（白丸）の血液におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋の数値評価はフローサイトメトリーにより計測された。結果はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋の数（絶対数）（ｍｍ３）として表される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明による前述したようなＴｒ１細胞治療は、対象に対する抗原特異的なＴｒ１細胞の投与を基礎としている。本発明の１つの実施形態において、抗原特異的なＴｒ１細胞は投与前の前記抗原により刺激されない。本発明の１つの実施形態において、Ｔｒ１細胞治療はＴｒ１細胞が特異的な抗原の投与を含んでいない。抗原の選択は、治療対象の疾患又は状態に応じる。例えば、クローン病などの腸の炎症状態を治療するために、オブアルブミンなどの共通の人間に由来する食品抗原に対するＴｒ１細胞の特異性が使用される。
【００２３】
本発明者らは、Ｔｒ１細胞に特異な抗原に応答する治療をした患者から取得した細胞サンプルに含まれるＴ細胞の増殖を評価した。＜＜この後一文抜けています。原文p.4 6〜7行目＞＞
【００２４】
本発明の１つの目的は、それ故に抗原特異的なＴｒ１細胞治療を受ける患者が前記治療に応答するか否かを評価するための方法であって、
−in
vitroにおいて、前記患者由来の細胞サンプルに含まれるＴ細胞の抗原特異的増殖を判定することと、
−指標基準に対して前記抗原特異的増殖を比較することと、を含み、
それにより、患者が治療に応答するか否かを判定するものである。
【００２５】
１つの実施形態においては、患者は人間である。
【００２６】
１つの実施形態においては、患者は抗ＴＮＦ、ナタリズマブ、例えば抗ＩＬ１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ１２、抗ＩＬ１７、及び抗ＩＬ２３などの抗インターロイキンを含む群から選択される１つ以上の治療剤に対し適切に応答しなかったり、又は適切な応答をする見込みがなかったりする；治療剤の例としては、抗Ｂリンパ球；抗共刺激性分子；免疫寛容誘発剤；抗補体タンパク質；Ｔ細胞シグナル伝達阻害単核細胞遊走阻害剤；ＩＬ１受容体拮抗剤（アナキンラ）；５アミノサリチル酸及びメサラジン、スルファザリン、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド等の類似体；プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ブタメタゾン、ブドメタゾン、チキソコルトールなどのコルチコイド；サッカロマイセス・ブラウディなどのプロバイオティクス；ヒドロキシクロロキン；アザチオプリン；６ーメルカプトプリン；シクロスポリン；ミノサイクリン；Ｄ−ペニシラミン；サリドマイド；レフルノミド又はレフルミドがある。
【００２７】
ここで使用されているような、「不適切な応答」、「適切な応答を示さない」、又は「適切な応答をする見込みがない」という表現は、治療が完了した、又は効果がない、毒である、又は患者に関する限り耐性が低いようであることを示した患者による実際の又は可能性の高い応答に関するものである。
【００２８】
ここで使用されているような「Ｔｒ１細胞」という言葉は、後述する休止したＣＤ４＋ＣＤ２５ーＦｏｘＰ３−表現型を有し且つ活性状態において高レベルのＩＬ１０及び有意なレベルのＴＧＦーβを分泌する能力を有する細胞に関するものである。Ｔｒ１細胞はそれらの特異なサイトカイン特性によって部分的に同定されている；それらは高レベルのＩＬ１０、有意なレベルのＴＧＦβ及び中程度のレベルのＩＦＮγを生産する。しかしＩＬ４又はＩＬ２は少量か全く生産しない。サイトカインの生産は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体又はインターロイキン−２、ＰＭＡ＋イノマイシンなどのＴリンパ球のポリクローナル活性化因子を用いた活性後に細胞培養において一般的に評価される。代替的に、サイトカインの生産は、抗原提示細胞により提示された特異的なＴ細胞抗原を用いた活性化後に細胞培養において評価される。高レベルのＩＬ１０は少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌ、一般的には約１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００、１６０００、１８０００又は２００００ｐｇ／ｍｌ以上又はそれ以上で応答した。有意なレベルのＴＧＦβは少なくとも約１００ｐｇ／ｍｌ、一般的には約２００、３００、４００、６００、８００、又は１０００ｐｇ／ｍｌ以上又はそれ以上で応答した。中程度のレベルのＩＦＮγは０ｐｇ／ｍｌから少なくとも４００ｐｇ／ｍｌの間、一般的には約６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００ｐｇ／ｍｌ以上又はそれ以上を含む濃度に応答した。ＩＬ４又はＩＬ２は少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも約２５０、１００、７５、又は５０ｐｇ／ｍｌ、又はそれよりも少ないものでは僅かな応答をするか又は全く応答がなかった。
【００２９】
ここで使用される「治療」という言葉は、臨床治療及び予防及び防止処置に関するものであり、ここで目的は標的となる病理学上の疾患又は状態を防止又は遅らせ（減少、消滅）させることにある。Ｔｒ１治療及びＴｒ１療法はここでは同一の処置を使用した。
【００３０】
ここで使用される「指標基準」という言葉は、計測可能という観点から比較するための基礎として使用することのある任意の適した対象標準を広く含む。好ましくは、指標基準はＴｒ１治療前に患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルを使用して判定された個別化された基準である。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、指標基準はＴｒ１治療前に患者から取得し且つin vitroにおいて計測されたＴ細胞を増殖させたものである。従って、Ｔ細胞を含む細胞サンプルはＴｒ１治療前の患者から取得されたものであり、Ｔｒ１細胞注射前の最初のＴｒ１細胞注射初日であることが好ましく、且つＴ細胞増殖は指標基準を判定するために評価される。
【００３２】
１つの実施形態において、指標基準は指標値であるか又はT１細胞治療の応答に対する１つ以上の危険予知アルゴリズム又は計算された指標に由来するものである。指標基準は個体群研究に由来する数又は価値に関する可能性があり、特に制限されるものではないが、例えば似た年代の範囲の対象、同一の又は似た民族の対象、慢性の炎症性の疾患、自己免疫性の疾患又はアレルギー症状の家族歴を有する患者を含み；又は慢性の炎症性の疾患、自己免疫性の疾患又はアレルギー症状に対する、Tr1細胞治療を実施中の患者の開始サンプルに関するものである。
【００３３】
１つの実施形態においては、指標基準はアルゴリズム及び統計上の又は構造上の分類の他の方法を用いて構成される。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において、指標基準は実質的に健康な１人以上の対象に由来するコントロールサンプルにおいてTr1細胞が特異的な抗原と応答する場合にT細胞の増殖を計測することに由来するものである。ここで使用されているように、「実質的に健康な対象」とは慢性の炎症性の疾患、自己免疫性の疾患又はアレルギー症状を有する又は苦しんでいると以前に診断され又は同定されることのなかった者をいう。
【００３５】
本発明における別の実施形態において、指標基準は慢性の炎症性の疾患、自己免疫性の疾患又はアレルギー症状を有する又は苦しんでいると診断され又は同定された１人以上の対象に由来するコントロールサンプルにおいてTr1細胞が特異な抗原に応答するT細胞の増殖を計測することに由来するものである。
【００３６】
本発明における別の実施形態において、指標基準は慢性の炎症性の疾患、自己免疫性の疾患又はアレルギー症状の治療に対するＴｔｒ１細胞療法に対する応答として以前に同定された１人以上の対象に由来するコントロールサンプルにＴｒ１細胞が特異的な抗原に応答するＴ細胞の増殖を計測することに由来するものである。
【００３７】
本発明における別の実施形態において、指標基準は慢性の炎症性の疾患、自己免疫性の疾患又はアレルギー症状を治療に対するＴｒ１細胞療法に対する非応答として以前に同定された１人以上の対象に由来するサンプルにＴｒ１細胞が特異である抗原に応答するＴ細胞の贈即を計測することに由来するものである。
【００３８】
本発明における１つの実施形態によれば、細胞サンプルはＴ細胞及び抗原発現細胞を含む。
患者から取得可能な及び細胞を発現するＴ細胞及び抗原を含む細胞サンプルは、特にこれに限定されることはないが、抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、抹消白血球細胞、例えばリンパ節生体組織検査、腸又は滑液の生体組織検査、気管支肺胞洗浄又は脳脊髄の流れから取得された細胞サンプルなどの組織生体組織検査から得られた細胞サンプルを含むものである。
【００３９】
患者からＰＭＢＣを取得する方法については、特にこれに限定されるものではないが、白血球除去又は密度配勾性遠心性イオン（フィコール）を用いるＰＢＭＣ精製に伴う全血液凝集を含むものである。
【００４０】
抹消白血球細胞又は白血球を取得する方法については、特にこれに限定されるわけではないが、赤色細胞濾過又は血液サンプルからの溶液を含むものである。
【００４１】
抗原特異Ｔｒ１細胞治療の対象患者が治療に応答するか否かの評価方法に関する１つの例は、
−Ｔｒ１細胞投与下における抗原の存在下で患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルを培養することと、
−Ｔ細胞増殖を判定することと、である。
【００４２】
本発明の１つの実施形態において、患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルはＴｒ１細胞が投与された抗原存在下且つ前記抗原の不在下で培養される。
【００４３】
前記抗原の存在しない培養は活性状態のない基礎となるＴ細胞増殖のネガティブコントロールである。
【００４４】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは２〜１０日間、好ましくは３〜６日間、さらに好ましくは５日間培養される。
【００４５】
本発明における１つの実施形態において、培養細胞の濃度は１０４〜１０７細胞／ｍｌ、好ましくは１０５〜１０６細胞／ｍｌ、さらに好ましくは１０６細胞／ｍｌである。
【００４６】
本発明の１つの実施形態において、抗原の濃度は0.1μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの抗原、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１ｍｇ／ｍｌの抗原である。ここで使用されているように、数字の前の「約」という言葉は当該数字の値の大小１０％という意味である。
【００４７】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは血清供給Ｔ細胞培地又は血清欠損培地において培養される。
【００４８】
Ｔ細胞血清欠損培地の例は、特にこれに限定されるものではないが、Ｘ−ＶＩＶＯ及びＡＩＭ−Ｖを含む。
【００４９】
血清供給Ｔ細胞血清の例は、特にこれに限定されるものではないが、ＲＰＭＩ又はＩＳＣＯＶＥ培地、好ましくはヒト血清ＡＢ又は自己由来血漿供給培地を含む。
【００５０】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは３５℃〜３９℃、好ましくは約３７℃で、約５％ＣＯ２大気下において培養される。
【００５１】
本発明によれば、Ｔ細胞投与下における特異的抗原の応用において患者から取得した細胞サンプルに含まれるＴ細胞の増殖は、当業界において知られている周知の方法により評価される。
当該の方法の例には、特にこれに限定されるものではないが、トリチウム標識チミジンアッセイ、ＤＮＡにおける変化内容の計測、ＢｒｄＵ社アッセイ、例えば、ＷＳＴ１又はＭＴＴなどの活性マーカーの計測、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ又はＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡＱｕｅｏｕｓ溶液細胞増殖アッセイキット、及びＣＦＳＥ又はＰＫＨ２６を用いたフローサイトメトリーアッセイを含む。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは患者に対し抗原特異的Ｔｒ１細胞の最終的な投与から５日〜３０日の間経過した後、患者から取得した。
【００５３】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、患者に対する抗原特異的Ｔｒ１細胞の投与後、６日〜３０日の間、７日〜３０日の間、８日〜３０日の間、９日〜３０日の間、１０日〜３０日の間、１１日〜３０日の間、１２日〜３０日の間、１３日〜３０日の間、１４日〜３０日の間、１５日〜３０日の間、１６日〜３０日の間、１７日〜３０日の間、１８日〜３０日の間、１９日〜３０日の間、２０日〜３０日の間及び２１日〜３０日の間に患者から取得される。
【００５４】
１つの実施形態において、抗原特異的Ｔｒ１細胞治療に対する対象患者が治療に応答するか否かを評価する方法は、
−Ｔｒ１治療前に、好ましくはＴｒ１細胞注射前に最初のＴｒ１細胞注入の日に、患者から取得した細胞サンプルにおいてＴ細胞の増殖を評価することであって、前記増殖は指標基準であり、
−Ｔｒ１細胞治療を実施することであって、１つ以上のＴｒ１細胞の注入を含み、
−最後のＴｒ１細胞の注射後５、６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８、２９又は３０日後に患者から取得した細胞サンプルにおけるＴ細胞の増殖を評価することと、
−指標基準に対してＴｒ１細胞注射後に前記Ｔ細胞増殖を比較することと、を含む。
【００５５】
１つの実施形態において、前記Ｔ細胞増殖値又は指標は、（Ｔ細胞が判定される抗原の出現におけるＴ細胞増殖）／（Ｔｒ１細胞が判定される抗原の欠損におけるＴ細胞増殖）で計算される。
【００５６】
１つの実施形態において、抗原特異的なＴｒ１細胞治療に対する対象患者が前記治療に対する応答をするか否かを評価するための方法は、
−１回以上のＴｒ１細胞注射を含む、Ｔｒ１細胞治療を実施することと、
−最後の注射後、５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９又は３０日後の患者から取得した細胞サンプルにおいてＴ細胞の増殖を評価することと、
−指標基準を用いて前記Ｔ細胞増殖を比較することと、を含む。
【００５７】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルはＴｒ１治療前、及びＴｒ１治療の最後の投与後１週間毎に少なくとも４週間、患者から取得される。従って、本発明の方法は毎週実施される。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１治療前、及びＴｒ１治療の最後の投与後２週毎に少なくとも４週間、患者から取得される。従って、本発明の方法は２週毎に実施される。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１治療前、及びＴｒ１治療の最後の投与後１０日毎に少なくとも４週間、患者から取得される。従って、本発明の方法は１０日毎に実施される。
【００６０】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１細胞投与前、及び前記投与後毎週、少なくとも８週間、患者から取得される。
【００６１】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１細胞投与前、及び前記投与後２週毎、少なくとも８週間、患者から取得される。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１細胞投与前、及び前記投与後４週毎、少なくとも８週間、患者から取得される。
【００６３】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１細胞投与前、及び前記投与後毎月、少なくとも２か月間、患者から取得される。
【００６４】
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞サンプルは、Ｔｒ１細胞投与前、及び前記投与後３週目及び／又は５週目及び／又は８週目に、患者から取得される。
【００６５】
本発明によれば、指標基準との比較においてＴ細胞増殖の低下は、患者が治療に応答していることを示している。
【００６６】
本発明の１つの実施形態において、指標基準と比較して２０％以上優れた抗原の存在下におけるＴ細胞増殖の低下は患者が治療に応答していることを示している。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、指標基準と比較して３０％、４０％、５０％以上優れた抗原の存在下におけるＴ細胞増殖の低下は、患者が治療に応答していることを示している。
【００６８】
本発明における別の実施形態において、指標基準と比較して６０％、７０％、８０％、９０％以上優れた抗原の存在下におけるＴ細胞増殖の低下は、患者が治療に応答していることを示している。
【００６９】
本発明における別の実施形態において、下記の増殖指数（ＰＩ）が各測定で判定されることがある。
ＰＩ＝抗原存在下におけるＴ細胞増殖／抗原不在下におけるＴ細胞増殖
指標基準以下の提示時間で判定されたＰＩは患者が治療に応答していることを示す。
本発明の別の実施形態において、増殖比率（ＰＲ）は以下のように判定される。
ＰＲ＝（ＰＩ）ｔ／（ＰＩ）ｔ０
（ＰＩ）ｔは提示時間において判定された、例えば患者に対してＴｒ１細胞投与後３週間又は８週間で判定された、増殖指数を表す。
（ＰＩ）ｔ０は指標基準の増殖指数である、又は前記患者に対するＴｒ１細胞の注射前に患者から取得された細胞サンプルにおいてＴ細胞の抗原特異的増殖から計算された増殖指数であるｔ０で判定される増殖指数を表す。
【００７０】
１未満のＰＲは患者が治療に応答していることを示す。
【００７１】
本発明の１つの目的は抗原特異的なＴｒ１細胞治療に対する対象患者が治療に応答するか否かを評価する方法であって、
−in
vitroにおける前記患者由来の細胞サンプルにおいてＴ細胞含有の抗原特異的増殖を判定することと、
−指標基準に対する前記抗原特異的増殖を含むことと、を含み
それにより、前記患者を応答者と非応答者とに分類する。
【００７２】
ここで使用される「応答者」という言葉は応答をする又は治療又は処置に近い兆候として応答しそうな患者に関する。
【００７３】
ここで使用される「非応答者」という言葉は応答しない又は治療又は処置に近い兆候として応答する兆しがない患者に関する。
【００７４】
従って、「応答者」としての患者の分類はＴｒ１治療が成功することを示し、一方で「非応答者」として同定された患者は異なった治療を試すのが良い。
【００７５】
応答者又は非応答者として患者を分類することは、患者に対して最適の治療指針を予知することを可能とするという利点がある。
【００７６】
１つの実施形態において、Ｔｒ１細胞投与後２週間、好ましくは３週間、ＰＲが１未満に判定された患者は、前記治療の応答の５０％以上で優れた変化を有する。
【００７７】
好ましくは、本発明において、Ｔｒ１細胞投与後２週間、好ましくは３週間、ＰＲが１未満に判定された患者は、前記Ｔｒ１治療の応答の６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％又はそれ以上で優れた変化を有する。
【００７８】
１つの実施形態において、Ｔｒ１細胞投与後３週間から８週間、ＰＲが１未満に判定された患者は、前記治療の応答の５０％以上で優れた変化を有する。
【００７９】
好ましくは、本発明において、Ｔｒ１細胞投与後３週間から８週間、ＰＲが１未満に判定された患者は、前記Ｔｒ１細胞治療の応答の６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％又はそれ以上で優れた変化を有する。
【００８０】
本発明によれば、ここで前述したような患者から取得されたＴ細胞の増殖アッセイは疾患の投与及び治療成績の投与を可能にする。
【００８１】
本発明によれば、ここで前述したような患者から取得されたＴ細胞の増殖アッセイは治療に応答しない患者の危険性を評価し且つ改善しない彼／彼女の状態を評価することを可能とする。
【００８２】
本発明によれば、ここで前述したような患者から取得されたＴ細胞の増殖アッセイは患者のグループの統計を取ること且つ分類をすることを可能とする。
【００８３】
本発明によれば、前述した方法は腸の炎症症状を有し且つＴｒ１細胞治療の対象である患者が処置に応答しているか否かを評価するためのものである。前記処置において、患者はＴｒ１細胞治療の対象であり、ここでＴｒ１細胞は一般のヒトの健康に由来する食品の抗原に特異なものである。
【００８４】
「ヒトの健康に由来する食品の抗原」は免疫原性のペプチドに関するものであり、例えば以下の非限定項目の食品抗原のようにヒトに共通する食糧に由来する、リポカイン、Ｃａ結合Ｓ１００、α−ラクトアルブミンなどの牛抗原、ベータ−ラクトグロブリン、牛血清アルブミン、カゼインなどのラクトグロブリンである。食品抗原はパルブアルブミンなどの大西洋鮭の抗原、オボムコイド、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチーム又は鶏肉血清アルブミンなどの鶏抗原、トロポミオシンなどのピーナッツ、エビ抗原、アグルチニン又はグリアジンなどの小麦抗原、セロリプロフィンなどのセロリ抗原、キャロットプロフィンなどの人参抗原、ソーマチン、リンゴ脂質輸送タンパク質、リンゴプロフィなどのリンゴ抗原、ナシプロフィンなどの梨抗原、イソフラボン還元酵素、エンドキナーゼなどのアボガド抗原、アプリコット脂質輸送タンパク質などのアプリコット抗原、モモ脂質輸送タンパク質又はモモプロフィンなどの桃抗原、ＨＰＳ、大豆プロフィ、（ＳＡＭ２２）ＰＲ−Ｉ０  ｐｒｏｔなどの大豆抗原、断片、変異体及びそれらの混合物であることがある。
【００８５】
ここで使用されているような抗原の「断片」という言葉は、短いペプチドなどの抗原の任意の部分集合に関するものである。１つの実施形態として、抗原の断片は長さが少なくとも６つのアミノ酸からなるペプチドである。１つの実施形態として、抗原の断片は長さが６〜５０のアミノ酸のペプチドであり、好ましくは長さが６〜３０のアミノ酸のペプチドであり、更に好ましくは長さが６〜２０のアミノ酸のペプチドである。
【００８６】
例えば共通のヒトの健康に由来する食品抗原などの抗原の「変異」という言葉は、ここでは殆ど自然界の抗原を同定する抗原に関するものであり、且つ前記抗原は同一の生物学的活性を共有するものである。自然界の抗原とその変異との間の最小限の相違点は例えばアミノ酸の置換、削除及び／又は付加におけるものであり得る。そのような変異は例えばアミノ酸残基が似た側鎖を有するアミノ酸残基と置換した従来のアミノ酸置換であるかもしれない。似た側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、従来技術において定義されてきており、基礎となる側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性の側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ鎖を有する側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族を有する側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００８７】
１つの実施形態において、抗原変異体は、自然界の抗原の配列と比べて、少なくとも又は約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列一致が存在する。２つ以上のポリペプチドの配列間の関連性で使用される際、「一致」又は「同一の」という言葉は、２つ以上のアミノ酸残基の列間において一致する数によって判定されることを用いた、ポリペプチド間の配列関連性の度合いに関するものである。「一致」は（ある場合）特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム（例えば「アルゴリズム」）により対象とされたギャップ配列を有する２つ以上のシークエンスのより小さな間での同一一致の割合を計測する。関連するポリペプチドの一致は周知でない方法によって容易に計算できる。そのような方法は、特に限定されるものではないが、Computational Molecular Biology Lesk, A.
M., 等., Oxford University Press, New York, 1988年; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., 等., Academic Press, New York, 1993年; Computer
Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., 及び
Griffin, H. G., 等., Humana Press, New Jersey, 1994年; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,
G., Academic Press, 1987年; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及び Devereux, J., 等., M. Stockton Press, New York, 1991年; 及び Carillo 等., SIAM
J. Applied Math. 48巻, 1073頁
(1988年)に記載された方法に含まれる。一致を判定するために好まれる方法は配列試験の間に最も大きな一致を与えるようにデザインされる。一致を判定する方法は公に入手可能なコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の一致を判定するのに好まれるコンピュータープログラムの方法はＧＣＧプログラムパッケージに含まれ、ＧＡＰ（Devereux 等., Nucl.
Acid. Res. ／2, 387頁 (1984年); Genetics Computer Group, University
of Wisconsin, Madison, Wis.),
BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul 等., J. Mol. Biol. 215巻, 403-410頁 (1990年)）を含む。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは一致判定に使用されることがある。
【００８８】
「炎症性の腸の状態」は炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、食物アレルギー又は不耐症に関連する腸の炎症、乳タンパク質アレルギーに関連する腸の炎症、セリアック病に関連する腸の炎症、鶏卵アレルギーに関連する腸の炎症、又はピーナッツアレルギーに関連する腸の炎症に関する。
【００８９】
本発明によれば、患者から取得されたＴ細胞を含む細胞サンプルは、患者に直接Ｔｒ１細胞を注入した共通のヒトの健康に由来する食品抗原の存在下で培養される。２〜１０日後、Ｔ細胞の増殖は評価され、例えば、Ｔｒ１処置前に患者から取得したＴ細胞の増殖などの、指標基準の増殖と比較される。
【００９０】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法はクローン病を有し、且つオブアルブミン特異的なＴｒ１細胞治療を受ける対象が処置に応答するか否かを評価するためのものである。
【００９１】
本発明によれば、上記方法は多発性硬化症の状態を有し且つＴｒ１細胞治療を受ける患者が前記処置に応答するか否かを評価するためのものである。前記処置において、患者はＴｒ１細胞治療を対象としており、ここで前記Ｔｒ１細胞治療は多発性硬化症関連抗原に特異的である。「多発性硬化症関連抗原」の言葉はミエリン基礎タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／Ｃｌａｕｄｉｎｌ  １）、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ＮＯＧＯ  Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、２′３′−環状ヌクレオチド３′−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、断片、変異体およびそれらの混合物に関するものである。
【００９２】
本発明によれば、患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルはＴｒ１細胞が患者に直接注射される多発性硬化症関連抗原の存在下で培養される。２〜１０日後、Ｔ細胞の増殖は評価され且つ、指標基準の増殖（例えばＴｒ１処置前の患者から取得したＴ細胞の増殖）と比較される。
【００９３】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法は多発性の疾患を有し且つＭＢＰ又はＭＯＧ特異的Ｔｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するためのものである。
【００９４】
本発明によれば、上述した方法は関節炎の症状を有し且つＴｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するためのものである。前記処置において、患者はＴｒ１細胞治療を対象としており、ここで前記Ｔｒ１細胞は関節関連抗原特異的である。
【００９５】
「関節関連抗原」の言葉は、シトルリン置換型の環状及び直鎖状フィラグリンペプチド、ＩＩ型コラーゲンペプチド、人間の軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、異種核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂｌ、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＨＳＰ６０、６５、７０及び９０、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、コラーゲンタイプＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶペプチド、アネキシンＶ、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチルスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ  ［ＰＤＨ  ］、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、ＳＣＬ−７０、  ＳＣＬ−１００、アニオンカルジオリピン及びホスファチジルセリンを含む抗原、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリン、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリリン、アグリカン、断片、変異体およびそれらの混合物に関するものである。
【００９６】
「関節炎の状態」という言葉は、関節リウマチ、多発性軟骨炎、敗血症性関節炎、脊椎関節症または強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎（JIA）、乾癬性関節炎及び、全身性紅斑、シェーグレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛、線維筋痛症、サルコイドーシス、または血管炎などの関節炎に関連する疾患に関する。
本発明によれば、患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルは患者に直接注射されたＴｒ１細胞としての関節に関連した抗原の存在下において培養される。２〜１０日後、Ｔ細胞の増殖は評価され、（例えばＴｒ１処置前に患者から取得したＴ細胞の増殖などの）指標基準の増殖と比較される。
【００９７】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法は慢性関節リウマチを有し且つＩＩ型コラーゲン特異的なＴｒ１細胞治療を受ける対象が処置に応答するか否かを評価するためのものである。
本発明によれば、上述の方法は炎症性自己免疫状態を有し且つＴｒ１細胞治療対象の患者が処置に応答するか否かを評価するためのものである。
「ヒトＨＳＰ抗原」という言葉は、ヒトＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、断片、変異及びそれらの混合物に関するものである。
【００９８】
「炎症性自己免疫状態」という言葉は、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の腸の炎症状態に関するものであり、以下を含む；関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎及び若年性特発性関節炎等の関節炎状態；多発性硬化症；ウェゲナー病；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；喘息、移植拒絶応答（宿主対移植片疾患）；又は移植片対宿主病。さらに好ましくは、炎症性自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、喘息及び、移植片拒絶又は移植片の宿主に対する疾患からなる群から選択される。
【００９９】
本発明によれば、患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルは患者に直接注射されるＴｒ１細胞についてのヒトＨＳＰ抗原の存在下で培養される。２〜１０日後、Ｔ細胞の増殖は評価され且つ（例えばＴｒ１処理前の患者から取得したＴ細胞の増殖などの）指標基準の増殖と比較される。
【０１００】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法は関節リウマチを有し且つＨＳＰ特異的Ｔｒ１細胞治療を受ける患者が処置に応答するか否かを評価するためのものである。
本発明によれば、上述した方法は、アレルギー又は喘息状態を有し且つＴｒ１細胞治療の対象となる患者が処置に応答するか否かを評価するためのものである。前記処置において、患者はＴｒ１細胞治療の対象であり、ここでＴｒ１細胞は前記アレルギー又は喘息状態に関連するアレルゲン特異的である。
【０１０１】
前記アレルゲンは吸入型アレルゲン、摂取型アレルゲン又は接触型アレルゲンであることがある。「アレルギーや喘息状態」という言葉は、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、結膜炎、湿疹及びアナフィラキシーに関するものである。
【０１０２】
本発明によれば、患者から取得したＴ細胞を含む細胞サンプルは患者に直接注射されたＴｒ１細胞における抗原の存在下で培養される。２〜１０日後、Ｔ細胞の増殖は評価され、（例えばＴｒ１処置前の患者から取得したＴ細胞増殖などの）指標基準の増殖と比較される。
【実施例】
【０１０３】
実験手段
【０１０４】
オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローン生成
オボアルブミン特異的Ｔｒ１クローンはクローン病患者の末梢血単核細胞（PBMC）から生成した。フィコール密度勾配遠心分離によるＰＢＭＣ分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  スウェーデン国）の後、細胞はネイティブ照射オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  米国）、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ，  Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  ＮＪ）及びサイトカイン付加のショウジョウバエフィーダー細胞上清の存在下で３７℃、５％ＣＯ２濃度において培養された。培養から数日後、細胞はＸ−Ｖｉｖｏ１５において３７℃、５％ＣＯ２濃度においてショウジョウバエフィーダー細胞の層上で希釈方法を限定することによりクローニングされた。成長したクローンはその後回収され、且つ抗原特異性のため及びショウジョウバエフィーダー細胞を５億個に拡大する前にＴｒ１細胞を同定するために試験する。
ショウジョウバエフィーダー細胞
【０１０５】
ショウジョウバエフィーダー細胞はＴｒ１細胞クローンの刺激性と成長性を改善するためにＴｘ細胞によって製造された。シュナイダー２ショウジョウバエの細胞は膜貫通型のマウス抗ヒトＣＤ３抗体、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ５８、ヒトＩＬ−２及びヒトＩＬ４を用いて遺伝子導入した。細胞はＰＡＡ研究室（Ｐａｓｈｉｎｇ，  Ａｕｓｔｒｉａ）由来の発現した５つの培地において日常的に成長させる。
クローン病患者のＴｒ１細胞処置
【０１０６】
Ｔｒ１治療の耐容性を評価するための第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験は重篤な難治性のクローン病患者において２００８年３月に開始した。ＣＤＡＩ（クローン病活性指数、下記の記載を参照）が上述の２２０で活動期の疾患を確認する時に、１０６〜１０９の自己のオボアルブミン特異的なＴｒ１細胞が患者の静脈内に注射された。患者はここでその後彼らの疾患が活動している間１２週間にわたり投与された。
臨床的応答評価
【０１０７】
クローン病活性指数又はＣＤＡＩはクローン病を患う患者の疾患の活動を定量化するための調査の道具である。これはクローン病を治療するために使用する薬剤療法で実施された調査研究において重要である；疾患の応答又は寛解を定義するために、新しい薬物療法上の最も主要な研究はＣＤＡＩを使用する。２２０点以上は活動期の疾患を患った患者と同定する；ＣＤＡＩが１５０以下ならば疾患が寛解状態にある患者と同定する。基準線（処置前に受けたＣＤＡＩ）と比較して患者への処置後ＣＤＡＩが１００点を減少するならば処置への応答であるとして熟慮される（クローン病ＣＰＭＰ／ＥＷＰ／２２８４／９９の処置用の新薬生産の開発におけるガイドライン）。
【０１０８】
その後、ＣＤＡＩを基準とした、自己のオブアルブミン特異的なＴｒ１細胞処置を実行する患者は２グループに分類される、臨床的応答者（処置前と比較して処置後にＣＤＡＩが少なくとも１００点低下した患者）及び臨床的非応答者（処置前と比較した後ＣＤＡＩが１００点低下を示さなかった患者）である。ＣＤＡＩはＴｒ１細胞注射後、０週目及び１，３，５，８週及び／又は１２週の時点で計算される。
ＣＤＡＩ計算
【０１０９】
【表１】
2013539977.tif 000003
＊合併症、関節痛、ブドウ膜炎、結節性紅斑、アフタ性潰瘍、壊疽性膿皮症、裂肛、新しい瘻孔、膿瘍（項目ごとの得点は1）。
細胞培養及び増殖評価
【０１１０】
Ｔｒ１細胞注射後０週目（注射前の週）及び１，３，８及び１２週目の時点において、患者の末梢血液を採取し、且つＰＢＭＣをフィコール密度勾配遠心分離により単離した。次いで細胞はオボアルブミン存在下（４００ｎｇ／ｍｌ）又は不在下でＸＶｉｖｏ１５培地で５日間３７℃、５％ＣＯ２濃度下において１０６細胞／ｍｌの濃度にて培養した。５日間の培養の後、培養細胞の増殖は培養ウェル当たりの生存細胞数を評価することができるロシュ由来のＷＳＴ１キットを用いて計測した。
フローサイトメトリー
【０１１１】
フローサイトメトリーはオボアルブミン特異的なＴｒ１細胞を用いた処置の以前及び以後にクローン病患者から取得したＰＢＭＣ上で実施した。細胞は蛍光のＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ４モノクローナル抗体（Becton Dickinson Biosciences社由来のクローンＤＫ３）及び蛍光のＡＰＣ−標識された抗ＦｏｘＰ３抗体（eBioscience社由来のクローンＰＣＨ１０１）を用いて染色された。ＦｏｘＰ３染色前に、細胞はeBioscience社の透過処理バッファーを用いて３０分間透過処理した。
結果
【０１１２】
個々に記載された臨床試験は活動状態の疾患（ＣＤＡＩが２２０以上）を患うクローン病患者に自己特異的Ｔｒ１細胞を１回静脈内投与した場合の安全性及び有効性を判定することを目的とした。細胞注射後１２週間の間１８人の患者の封入及び追跡をした後、患者の２つのグループは、細胞注射以前及び以後と比較したＣＤＡＩの変動により示された処置に対する彼らの応答を基礎として、分類することができる。
【０１１３】
【表２】
2013539977.tif 000004
【０１１４】
通常の手順に従って、関連した臨床調査によるコントロールの後、２人の追加患者が含まれ、ＣＤＡＩデータは、臨床試験の終わりに更新された。結果が表２に示される。クローン病ＣＰＭＰ／ＥＷＰ／２２８４／９９の治療のための新薬生産の開発におけるガイドラインにより、Ｔｒ１細胞を投与した後、４週及び８週の間に判定された最低のＣＤＡＩは考慮された。
【０１１５】
【表３】
2013539977.tif 000005
【０１１６】
結果は、自己オボアルブミン特異的Ｔｒ１細胞が注射された後、１０人の患者は処置に応答を示し、前記応答は処置前と比較した処置後の少なくとも１００点のＣＤＡＩの低下により観察されたことを示した。
我々はその後応答者及び非応答者の患者グループの間のオボアルブミン特異的ＰＢＭＣ増殖を比較した。この目的のために、処置前後に採取された血液サンプルから単離されたＰＢＭＣはオブアルブミンの存在下又は非存在下において培養され、ＰＢＭＣの増殖は培養５日後に評価された。
【０１１７】
図１Ａは追跡期間中の２つのグループの増殖指数を示したものである。図１Ｂは追跡期間中の２つのグループの増殖率を示したものである。
【０１１８】
これらのデータは処置後、オボアルブミンに対する増殖応答が臨床的応答者でのみ減少し、且つ臨床的非応答患者では減少しなかったことを示している。
【０１１９】
図２ＡはＴｒ１細胞注射の特に３週間後に、増殖性の応答はＴｒ１細胞注射前の増殖性の応答と比較して応答者の患者において減少することを示す。これは、オブアルブミン特異的Ｔｒ１細胞静脈内注射後に、オブアルブミンへのＴ細胞応答における抑制活性が、注入された細胞により媒介した患者においてin vivoで生じたものであることを提示する。この生物学的な応答は臨床的応答患者の大部分（６０％）で見られるが、しかし臨床的非応答者群のある患者（１３％）でしか見られないものである（図３Ａ）。
【０１２０】
図２Ｂは、Ｔｒ１細胞処置後３週間及び８週間での各応答者及び非応答者に対する増殖性の比率を示す。応答患者における増殖性の比率の平均は、Ｔｒ１細胞処置後３週及び８週で明らかに１未満であり、これに反して非応答患者における増殖性の比率の平均は、Ｔｒ１細胞処置後３週間及び８週間で明らかに１よりも大きい。
【０１２１】
図３Ｂは、３週間及び８週間で１未満の増殖性の比率は応答者の８０％で観察されたことを示している。
【０１２２】
図４は、１未満の増殖性の比率は、応答患者におけるＴｒ１細胞処置後５週間及び８週間でＣＤＡＩの減少に統計的に相関することを示している。
【０１２３】
図５は、応答者又は非応答患者の血液における活性調整Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）の数が近似していることを示す。更には、応答者又は非応答患者の血液における活性調整Ｔ細胞の数は、Ｔｒ１細胞治療後変動しないことを示す。実際には、Ｔｒ１細胞注射後０週、３週及び１２週の時点で患者の血液中における調整Ｔ細胞の数の間には違いがない。
【０１２４】
この結果は、応答患者でのオボアルブミンへの増殖性の応答における減少はこれらの患者の血液における調整Ｔ細胞の全体の数についての増殖が原因となっていないことを示している。
【図１】
2013539977.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
2013539977.tif 000009
【図５】
2013539977.tif 000010
【国際調査報告】
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2013539977.tif 000012
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