(57)【要約】  Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するための組成物であって、（ｉ）Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的遺伝子、ＩＳ６１１０を標的とするプライマーおよび／またはプローブ、（ｉｉ）マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属特異的遺伝子、インタートランスクリプショナルスペーサー（ＩＴＳ）を標的とするプライマーおよび／またはプローブ、並びに、任意選択により、（ｉｉｉ）内部対照としての植物由来の遺伝子を標的とするプライマーおよび／またはプローブを含む、組成物を開示する。本組成物を用いてリアルタイムマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応を実施すると、単一反応により非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出することができ、従って臨床診断を高い信頼性で迅速かつ容易に実現することができる。
2013502922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核性マイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）および非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を識別可能に検出するための組成物であって、
配列番号１の塩基配列および配列番号２の塩基配列の１つまたは複数を含むプライマー；および
配列番号３〜１１の塩基配列の１つまたは複数を含むプライマー
を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物は、
配列番号１の塩基配列を含むプライマー；および
配列番号２の塩基配列を含むプライマー
の両者を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、
配列番号３〜９の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマー；および
配列番号１０〜１１の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマー
の両者を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、
配列番号１の塩基配列を含むプライマー；
配列番号２の塩基配列を含むプライマー；
配列番号３〜９の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマー；および
配列番号１０〜１１の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマー
を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
内部対照プライマーを更に含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記内部対照プライマーは、植物由来の遺伝子特異的プライマーであることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記植物由来の遺伝子は、レクチンであり、
前記植物由来の遺伝子特異的プライマーは、配列番号１５の塩基配列を含むプライマーおよび配列番号１６の塩基配列を含むプライマーの１つまたは２つ以上を含む
ことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０遺伝子に特異的なプライマーとしての、配列番号１の塩基配列を含むセンスプライマー、および
配列番号２の塩基配列を含むアンチセンスプライマー
の１つまたは２つ以上を含むＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出するための組成物。
【請求項９】
マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子に特異的なプライマーとしての、配列番号３〜９の塩基配列を含むセンスプライマーの１つ若しくは２つ以上；
配列番号１０〜１１の塩基配列を含むアンチセンスプライマーの１つ若しくは２つ以上；または
これらの組み合わせ
を含むマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するための組成物。
【請求項１０】
マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子に特異的な前記プライマーは、長さ１００ｂｐ以下のＰＣＲ増幅産物を形成することを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号１２の塩基配列を含むプローブ；
配列番号１３の塩基配列を含むプローブ；および
配列番号１４の塩基配列を含むプローブ
からなる群から選択される１つまたは２つ以上を含むＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するための組成物。
【請求項１２】
前記プローブは、その５’末端および３’末端で蛍光材料を用いて標識され、
５’末端で標識される前記蛍光材料（レポーター）および３’末端に標識される前記蛍光材料（クエンチャー）は相互に干渉する
ことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
５’末端に標識される前記蛍光材料は、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセインおよびシアニン−５（Ｃｙ５）からなる群から選択され、
３’末端に標識される前記蛍光材料は、６−カルボキシテトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）またはブラックホールクエンチャー−１，２，３（ＢＨＱ−１，２，３）である
ことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
リアルタイムＰＣＲアッセイを用いてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の識別、検出および解析を行うための組成物であって、
配列番号１の塩基配列および配列番号２の塩基配列の１つまたは２つ以上を含むプライマー；
配列番号３〜１１の塩基配列の１つまたは２つ以上を含むプライマー；並びに
配列番号１２〜１４の塩基配列の１つまたは２つ以上を含むプローブ
を含む組成物。
【請求項１５】
内部対照プライマー；および
内部対照プローブ
を更に含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記内部対照プライマーは、配列番号１５の塩基配列を含むセンスプライマー、または配列番号１６の塩基配列を含むアンチセンスプライマーであり、
前記内部対照プローブは、配列番号１７の塩基配列を含むプローブである
ことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、
（ｉ）Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０遺伝子に特異的なプライマーとプローブの混合物であって、
配列番号１の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号２の塩基配列を含むアンチセンスプライマー；並びに
配列番号１２の塩基配列を含むプローブ
を含む混合物；
（ｉｉ）マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子に特異的なプライマーとプローブの混合物であって、
配列番号３〜９の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号１０〜１１の塩基配列を含むアンチセンスプライマー；並びに
配列番号１３の塩基配列を含むプローブおよび／または配列番号１４の塩基配列を含むプローブ
を含む混合物；
（ｉｉｉ）内部対照遺伝子に特異的なプライマーとプローブの混合物であって、
配列番号１５の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号１６の塩基配列を含むアンチセンスプライマー；並びに
配列番号１７の塩基配列を含むプローブ
を含む混合物；並びに
（ｉｖ）緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび滅菌蒸留水を含む、ＰＣＲ反応混合物
を含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の解析用組成物を含む、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）解析キット。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組成物を用いて、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を解析する方法であって、
（１）サンプルから抽出された細菌のＤＮＡと解析用組成物を混合して、遺伝子解析用のサンプルを調製する工程；
（２）前記遺伝子解析用のサンプルをリアルタイムＰＣＲに供して、ＰＣＲ産物を得る工程；
（３）前記ＰＣＲ産物を定量して定量曲線を得る工程；並びに
（４）前記サンプルから抽出された前記細菌のＤＮＡに存在するＩＳ６１１０特異的遺伝子、ＩＴＳ特異的遺伝子および内部対照特異的遺伝子を、前記定量曲線を用いて定量する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
配列番号３〜１１の塩基配列の１つを含むＩＴＳ遺伝子特異的プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を識別可能に検出する組成物と、同組成物を用いたリアルタイムマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ＰＣＲ）によるＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の同時解析とに関する。更に詳しくは、本発明は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するための組成物であって、（ｉ）Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的遺伝子、ＩＳ６１１０を標的とするプライマーおよび／またはプローブ、（ｉｉ）マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属特異的遺伝子、インタートランスクリプショナルスペーサー（ＩＴＳ：ｉｎｔｅｒ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｐａｃｅｒ）を標的とするプライマーおよび／またはプローブ、並びに、任意選択により、（ｉｉｉ）内部対照としての植物由来の遺伝子を標的とするプライマーおよび／またはプローブを含む、組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、人類史上最も高い死亡率を示す感染症であり、幅０．２〜０．５μｍ、長さ１〜４μｍの桿状をしたマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の各菌が原因で起こる。
【０００３】
マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属には、様々なヒトおよび動物に感染し、結核などの呼吸器疾患、および癩などの疾患を引き起こす多様な菌種のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）があり、これまでに約１００菌種が知られている（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９４；１３（１１）：８８４−９０１）。
【０００４】
ヒトの結核の原因となる最も重要なマイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）として知られるマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）には、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、稀にしか出現しないマイコバクテリウム・ボビス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、および同種のものがある。マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）は、癩の原因として知られている（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｏｏｄ，Ｒ．Ｃ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９４；１３（１１）：８８４−９０１）。
【０００５】
結核は、発展途上国で有病率が高い疾患である、Ｋｏｒｅａでは毎年１２０，０００例のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）症例が新たに認められ、２００３年に報告された新たな結核感染は、３０，６８７例（１０万人あたり６４例に相当）にのぼり、Ｋｏｒｅａは、ＯＥＣＤ加盟国３０カ国のうち結核死亡率が１位という汚名を受けている（２００４年、大韓民国統計庁（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｏｆｆｉｃｅ）の統計データ）。
【０００６】
近年、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および他の免疫不全症候群の患者、免疫系が比較的弱い乳児などが、非結核性のマイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）に感染し、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症に関連した症状に類似した臨床症状を呈する非定型結核患者が増加している。
【０００７】
ＮＴＭの例として、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）（Ｍ．アビウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）またはＭ．アビウム・コンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ））、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ケロネー（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．ツラガイ（Ｍ．ｓｚｕｌａｇａｉ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゲナベンス（Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）などの非結核性のマイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられる（Ｂａｒｎｅｓ，Ｐ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９１；３２４（２３）：１６４４−１６５０）。
【０００８】
これらのＮＴＭ菌種の多くは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）治療薬に対して多剤耐性を示し、処置するのが難しい（Ｋａｍ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｐｕｔｕｍ  Ｓｍｅａｒ  Ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，１９８９−１９９９．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００２；３４（３）：３２４−３２９）。
【０００９】
ＮＴＭのうち最も多く見られるマイコバクテリウム・アビウム・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）は、主要な結核治療薬の有効性がＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の１／１０〜１／１００の低さであることが知られており、米国胸部疾患学会（ＡＴＳ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、非結核性のマイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の各菌種の疾患が原因となる疾患の診断および処置に関するガイドラインを示している（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９７；１５６（２）：Ｓ１−Ｓ２５）。
【００１０】
従って、非結核性のマイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、症状については結核性のマイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）とかなり類似してはいるものの、処置する薬剤の点で結核性のマイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）と異なる場合がある。結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）および非結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）をそれぞれ好適に処置するには、結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）と非結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）とを正確に識別すること、並びにその早期検出および診断が不可欠である。
【００１１】
一般的な結核の診断方法には、患者の臨床症状の検査、ツベルクリン皮膚反応検査、Ｘ線イメージング、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）検査および同種のものがある。最も容易な方法であるツベルクリン検査は、実施しやすいが、重篤な結核、麻疹および免疫抑制により起こるアネルギーの症例で偽陰性を示すことが多い。Ｘ線像の約２５％は、検出器の能力に応じて異なる場合があり、このためＸ線像を用いた診断は、異常な陰影を発見する検出器の能力、および異常な陰影を正確に判定する検出器の能力に左右される。
【００１２】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の検出は、最も正確な結核の診断方法であり、塗抹検査、培養試験、分子診断検査および同種のものが挙げられる。
【００１３】
塗抹検査は主に、チール・ネールゼン（Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）染色により抗酸性を確認する染色を使用する。この方法は、結果を容易かつ迅速に得ることを可能にするが、結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）と非結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）とを識別することができず、感度が低い。
【００１４】
培養試験は、１ｍｌの検体に細菌が約１０個しか存在しなくても細菌を検出できる程度に感度が高く、結核性のマイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の分離および正確な診断を可能にする。この方法は、長期間を要するものであり、たとえば、十分な訓練を受けた研究者が約４〜８週間培養および観察を行う必要があり、従って処置に適していないという問題がある。
【００１５】
新たに開発された培養方法にＢＡＣＴＥＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳ）がある。この方法は、Ｃ１４パルミテートを含む液体培養基にバチルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ）を接種し、放射性同位元素を用いて算出された増殖指数（ｇｒｏｗｔｈ  ｑｕｏｔｉｅｎｔ）から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の代謝により生成される１４ＣＯ２の量を推計する。この方法は、結果を平均で１６日後に得ることを可能にするが、放射性同位元素を取り扱う施設および専門家を必要とするという問題がある。
【００１６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に続く電気泳動は、特定の遺伝子部位を２〜３時間以内で増幅することにより、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を迅速かつ正確に確認できる方法である。この方法は、１日以内に臨床検体から９５％以上の感度および特異性でＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の検出を可能にするものであり、従って有用である（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３；  ３１（４）：７７６−７８）。
【００１７】
しかしながら、この方法は、キャリーオーバーコンタミネーションのリスクが高く、職業専門家を必要とする（Ｎｏｏｒｄｈｏｅｋ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：ａ  ｂｌｉｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ａｍｏｎｇ  ｓｅｖｅｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４；３２（２）：２７７−２８４）。
【００１８】
一方、結核診断の場合、ＰＣＲ検査は、塗抹陽性の検体では感度および特異性がかなり高く、抗酸菌の塗抹陽性でＰＣＲ陰性の検体は、ＮＴＭに感染していると見なし得ることについて考慮すべきである。
【００１９】
ＮＴＭによる肺疾患の頻度が高い米国は、抗酸菌の塗抹陽性でＰＣＲ陽性の被検体を暫定的に結核と診断し、ＰＣＲ阻害剤が存在するか否かを確認し、検査対象の被検体が再び陰性である場合、抗酸菌の塗抹陽性でＰＣＲ陰性の被検体を暫定的にＮＴＭと診断することを推奨している。最終的なＮＴＭ感染の診断を完了するには、４〜８週間の培養期間を要する（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  （ＣＤＣ）．Ｕｐｄａｔｅ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．２０００；  ４９：５９３−４）。最近、こうしたガイドラインによってＮＴＭ感染が検出されることがあるとはいえ、臨床的には、可能な限り、ＮＴＭを直接検出することが一層有用である。
【００２０】
Ｋｏｒｅａでは、結核の発症率が高く、ＮＴＭによる疾患の頻度は低い。このため、抗酸菌の塗抹陽性の被検体は、一般に結核に感染しているものと見なされ、抗結核剤による処置を受けるのが一般的である。しかしながら、近年、ＫｏｒｅａではＮＴＭ、およびＮＴＭによる疾患の発見率が高まっており、ＮＴＭが免疫機能の弱い人に疾患を引き起こす恐れがある。ＮＴＭは、診断しにくいうえ、薬剤耐性の頻度が高いため処置が難しく、再発率も高い（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａｎ  ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａ．Ｔｕｂｅｒｃ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１９９５；４２：２７７−９４．）。従って、ＮＴＭを識別可能に診断する方法に対する要求が増加している。
【００２１】
ＮＴＭを検出する最近の方法としてはＡＦＢ染色法があり、分子生物学的方法を用いてマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の菌種の識別に一般に使用される方法として、制限酵素と、特異的プローブを用いたＰＣＲ−ハイブリダイゼーションとを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰが挙げられる。
【００２２】
これらの方法はどれも感度が低いうえ、事前に培養するか、或いは、複雑な実験ステップを必要とするという問題があり、従って早い段階でのＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の迅速な検出での使用に適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
従って、本発明は、まだ解決されていない上記の問題および他の技術的問題を解決するためになされた。
【００２４】
本発明の１つの目的は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を正確に診断するため、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に特異的な遺伝子部位ＩＳ６１１０に対して優れた感度を持つプライマーおよび／またはプローブを提供することにある。
【００２５】
本発明のもう１つの目的は、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属（非結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ））の存在を確認するため、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属に多く存在するＩＴＳ遺伝子に対して高度に特異的な遺伝子部位を検出するような優れた感度を持つプライマーおよび／またはプローブを提供することにある。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、本プライマーおよび／またはプローブを用いたリアルタイムマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応により、Ｍ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）および非結核性のマイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を同時に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
１．  Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｅｎｕｓ）を検出するためのプライマー
本発明は、結核性マイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、および非結核性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を識別可能に検出するための組成物であって、配列番号１の塩基配列、および配列番号２の塩基配列の１つまたは複数を含むプライマー；並びに配列番号３〜１１の塩基配列の１つまたは複数を含むプライマーを含む、組成物に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明は、結核性マイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、および非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を識別可能に検出するための組成物であって、配列番号１の塩基配列を含むプライマー、および配列番号２の塩基配列を含むプライマーの両方；または、配列番号３〜９の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマー、および配列番号１０〜１１の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマーの両方を含む、組成物に関する。
【００２９】
一層好ましくは、本発明は、結核性マイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、および非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を識別可能に検出するための組成物であって、配列番号１の塩基配列を含むプライマー；配列番号３〜９の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含むプライマー；並びに配列番号１０〜１１の塩基配列の１つ若しくは２つ以上を含む、プライマー組成物に関する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「配列番号ｘの塩基配列を含むプライマー」という用語は、配列相同性が９５％以上である塩基配列を含む。たとえば、プライマーが２０ｂｐである場合、２０ｂｐの２つ以上が異なると、融解温度が５度以上低下し、従って悪い結果を招くのに対して、２０ｂｐの１つのみが異なる場合、ＰＣＲにおいて若干低いアニーリング温度で試験を行っても、同一の結果を得ることができる。
【００３１】
以下、本明細書では、説明しやすくするため、「配列番号ｘの塩基配列を含むプライマー」を単に「配列番号ｘのプライマー」という。
【００３２】
本明細書では、配列番号１のプライマー、および配列番号２のプライマーは、Ｍ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に特異的な遺伝子部位ＩＳ６１１０遺伝子部位を標的とするプライマーである。
【００３３】
一般には、「Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）」は、狭義にマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を意味する。本発明では、「Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）」は、広義にマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）だけでなく、マイコバクテリウム・ボビス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ミクロティ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、およびマイコバクテリウム・アフリカヌム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）を意味する。場合によっては、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、「Ｍ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」または「ＴＢ群（ＴＢ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」をいう。
【００３４】
ＩＳ６１１０遺伝子は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア・ボビス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｏｖｉｓ）などのＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群に見られる挿入配列である。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群は、ＰＣＲによる結核診断に一般に使用されるＩＳ６１１０を１０〜１２コピー含むことが知られている（Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０；２８（１２）：２６６８−２６７３）。しかしながら、Ｋｅｎｔらは、ＩＳ６１１０はプライマーの選択位置によって偽陽性の危険性（ｒｉｓｋ  ｒａｔｉｏ）に相違があることを報告した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５；３３（９）：２２９０−２２９３）。
【００３５】
このため、本発明の発明者らは、塩基配列の解析により偽陽性のリスクが低い部位を研究した。その結果、以下の例から分かるように、配列番号１のプライマーおよび配列番号２のプライマーは、Ｍ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）のＩＳ６１１０遺伝子のみを増幅するプライマー塩基配列であり、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群のＩＳ６１１０遺伝子部位において９７％以上のかなり高い感度と、９９％以上の陽性的中率を示す。これは、偽陽性のリスクが相当に低いことを意味する。こうした高い感度および陽性的中率を示すプライマーは、これまで発見されていない。
【００３６】
よって、配列番号１のプライマー、配列番号２のプライマー、またはその組み合わせを使用すると、Ｍ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を高い信頼性を持って検出することができる。
【００３７】
非結核性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の存在／非存在を確認するには、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の特定が重要である。これに関しては、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属ではｒｐｏＢ遺伝子が共通しており、従ってｒｐｏＢの有無を用いてマイコバクテリアの菌種を特定することができる（Ｌｅｅ，Ｈｙｅ−Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｌａｉｄ−ｏｐｅｎ  Ｎｏ．１０−２００１−００３８７０１）。
【００３８】
しかしながら、この特許は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰを使用するものであり、従って低感度、および複雑な実験ステップのため事前に培養が必要となるなどの問題がある。このためこの特許は、早い段階でのＭ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）およびマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｅｎｕｓ）の迅速な検出に使用するには適していない。
【００３９】
そこで、これらの問題を解決するため、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲに好適な１００ｂｐ以下のＰＣＲ増幅産物を形成する、ｒｐｏＢ遺伝子部位に特異的な新規なプライマーを開発した（Ｋａｎｇ  Ｊｉｎ  Ｓｅｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，韓国特許出願公開第２００８−００９０１５６号明細書）。
【００４０】
しかしながら、ｒｐｏＢは、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットをコードする遺伝子であり、本出願の特異性試験の結果からは、微生物の菌種の多くの種が陽性を呈さないものの、結核に類似した肺炎の症状を示すノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属微生物と、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属に類似したロドコッカス（ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物とは、いくつかの微生物で共通の作用を示す類似の塩基配列が存在するため、陽性を呈することが理解され得る。
【００４１】
一方、非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の存在を確認するには、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の特定が重要である。マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属にはＩＴＳ遺伝子およびｒｐｏＢ遺伝子が含まれており、従って、これらを使用して細菌の菌種を特定することが知られている（Ｋｉｍ  Ｉｎ  Ｓｏｏら、韓国特許第０７２５５７９号明細書）。
【００４２】
しかしながら、この特許は、ＰＣＲ−リバースハイブリダイゼーションのため約２５０〜４５０ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を形成するプライマーを使用するものであり、従って迅速な検出のためのリアルタイムＰＣＲに適していないという問題がある。
【００４３】
そこで、本発明者らは、ＩＴＳ部位のリアルタイムＰＣＲに好適なサイズの増幅産物を形成するプライマーを開発した。即ち、配列番号３〜１１のプライマーは、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属に特異的な遺伝子部位、ＩＴＳ遺伝子部位を標的とするプライマーである。これらのプライマーは、１００ｂｐ以下のサイズのＰＣＲ増幅産物を形成するものである。このため、これらのプライマーは、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属微生物およびロドコッカス（ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物と反応しないことから、これらのプライマーにより、有利にはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属をかなり確実かつ迅速に検出することが可能になり、以前より高い特異性を示す。
【００４４】
本発明によりＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出する組成物は選択的に、内部対照プライマーを更に含んでもよい。この内部対照を用いて、偽陰性の問題が起こるか否か、即ち、ＰＣＲ反応が正常に行われるか否かを確認する。サンプル中のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の有無にかかわらず、正常に発現した遺伝子をランダムに選択することができる。
【００４５】
好ましい実施形態では、内部対照プライマーは、全サンプルに加えられる植物由来の遺伝子特異的プライマーであってもよい。
【００４６】
この植物由来の遺伝子は、好ましくはレクチンであり、レクチン遺伝子特異的プライマーは、配列番号１５の塩基配列を含むプライマーでも、または配列番号１６の塩基配列を含むプライマーでもよい。
【００４７】
下記表１に、本発明の配列番号１〜１１のプライマー、配列番号１５のプライマー、および配列番号１６のプライマーの塩基配列を示す。
【００４８】
【表１】
2013502922.tif 000003
【００４９】
上記の配列では、「Ｒ」および「Ｙ」は、組み合わせた塩基配列であり、それぞれ「Ｒ＝Ａ＋Ｇ」および「Ｙ＝Ｃ＋Ｔ」を示す。
【００５０】
上記のように、本発明は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出するための組成物であって、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０遺伝子に特異的な新規なプライマーとして配列番号１の塩基配列を含むセンスプライマー、および配列番号２の塩基配列を含むアンチセンスプライマーの１つまたは２つ以上を含む、組成物を提供する。
【００５１】
更に、本発明は、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するための組成物であって、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）のＩＴＳ遺伝子に特異的なプライマーとして配列番号３〜９の塩基配列を含むセンスプライマーの１つ若しくは２つ以上；配列番号１０〜１１の塩基配列を含むアンチセンスプライマーの１つ若しくは２つ以上；またはその組み合わせを含む、組成物を提供する。
【００５２】
マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子に特異的なプライマーは、リアルタイムＰＣＲに好適な長さ１００ｂｐ以下のＰＣＲ増幅産物を形成する。
【００５３】
好ましい実施形態では、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）でも、またはマイコバクテリウム・ボビス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）でもよい。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の検出の信頼性は、ＩＴＳ遺伝子を用いてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群のＩＳ６１１０遺伝子を解析することにより、更に改善することができる。
【００５４】
好ましい実施形態では、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、非結核性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）であってもよい。この場合、ＩＴＳ遺伝子の塩基配列の解析により有利に確認できるのは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群よりむしろ非結核性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の存在および種類である。
【００５５】
更に、本発明者らは、配列番号３〜１１の塩基配列を含むプライマーが、以下の４２菌種のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の特定に有効であり、高い特異性を有することを確認した。
【００５６】
【表２】
2013502922.tif 000004
【００５７】
２．  Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するためのプローブ
別の態様では、本発明は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属を検出するための組成物であって、配列番号１２の塩基配列を含むプローブ；配列番号１３の塩基配列を含むプローブ；および配列番号１４の塩基配列を含むプローブからなる群から選択される１つまたは２つ以上を含む、組成物を提供する。
【００５８】
この組成物は任意選択により、内部対照プローブを更に含んでもよく、内部対照プローブは、好ましくは植物由来の遺伝子レクチンに特異的であり、配列番号１７の塩基配列を含むプローブである。
【００５９】
本発明では、「配列番号ｘの塩基配列を含むプローブ」という用語は、配列相同性が９５％以上の塩基配列を含む。説明しやすくするため、以下本明細書では、「配列番号ｘの塩基配列を含むプローブ」を単に「配列番号ｘのプローブ」という。
【００６０】
配列番号１２のプローブは、ＩＳ６１１０遺伝子部位と特異的に反応し、配列番号１３のプローブおよび配列番号１４のプローブは通常、検出可能な全マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子と反応するプローブである。
【００６１】
このため、ＩＳ６１１０遺伝子およびＩＴＳ遺伝子に特異的なプローブにより、サンプル中のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）がＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であるか否かをより正確に検出することができ、ＩＴＳ遺伝子の存在を確認することにより、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の存在を確認することができる。
【００６２】
特に、本発明によるＩＳ６１１０遺伝子またはＩＴＳ遺伝子に特異的なプローブは、ｔａｑｍａｎアッセイまたは分子ビーコンアッセイを用いた定量ＰＣＲアッセイに有用である。
【００６３】
このため、好ましい実施形態では、蛍光材料を用いてプローブをその５’末端および３’末端で標識し、５’末端で標識した蛍光材料（レポーター）、および３’末端で標識した蛍光材料（クエンチャー）は、相互に干渉してもよい。従って、プローブがサンプル中に存在するＩＳ６１１０またはＩＴＳ遺伝子に結合する場合、プローブの発色は抑えられているが、ポリメラーゼ連鎖反応を実施すると、プローブが分解し、その５’末端で標識した蛍光材料はクエンチされる一方、３’末端に標識した蛍光材料は発色する。
【００６４】
プローブの５’末端に標識する蛍光材料は特に限定されるものではなく、たとえば、蛍光材料は、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセインおよびシアニン−５（Ｃｙ５）からなる群から選択してもよいが、これに限定されるものではない。
【００６５】
更に、３’末端に標識する蛍光材料は、６−カルボキシテトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）でも、またはブラックホールクエンチャー−１，２，３（ＢＨＱ−１，２，３）でもよいが、これに限定されるものではない。
【００６６】
下記表２に、本発明の配列番号１２〜１４のプローブおよび配列番号１７のプローブの塩基配列をに示す。
【００６７】
【表３】
2013502922.tif 000005
【００６８】
３．  リアルタイムＰＣＲアッセイのための組成物およびキット
本発明は、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の識別、検出および解析を行うための組成物であって、配列番号１の塩基配列および配列番号２の塩基配列の１つまたは２つ以上を含むプライマー；配列番号３〜１１の塩基配列の１つまたは２つ以上を含むプライマー；並びに配列番号１２〜１４の塩基配列の１つまたは２つ以上を含むプローブを含む、組成物を提供する。
【００６９】
この組成物は、偽陰性を防止するため内部対照プライマーおよび内部対照プローブを更に含んでもよい。
【００７０】
内部対照プライマーは、配列番号１５の塩基配列を含むセンスプライマーでも、または配列番号１６の塩基配列アンチセンスプライマーでもよく、内部対照プローブは、配列番号１７の塩基配列を含むプローブであってもよい。
【００７１】
即ち、本発明による定量解析用組成物は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）若しくは非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を検出するためのプライマー、または、非結核性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を検出するためのプローブ、並びに任意選択により内部対照プライマーおよびプローブを含む。
【００７２】
臨床検体から抽出されたＤＮＡと共に２または３菌種の遺伝子を単一チューブで増幅し、得られた産物をリアルタイムで解析および検出するリアルタイムＰＣＲアッセイを、本発明による組成物を用いて実施することができる。
【００７３】
好ましい実施形態では、この組成物は、
（ｉ）配列番号１の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号２の塩基配列を含むアンチセンスプライマー；並びに配列番号１２の塩基配列を含むプローブを含む、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０遺伝子に特異的なプライマーとプローブとの混合物；
（ｉｉ）配列番号３〜９の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号１０〜１１の塩基配列を含むアンチセンスプライマー；並びに配列番号１３の塩基配列を含むプローブおよび／または配列番号１４の塩基配列を含むプローブを含む、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子に特異的なプライマーとプローブとの混合物；
（ｉｉｉ）配列番号１５の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号１６の塩基配列を含むアンチセンスプライマー；並びに配列番号１７の塩基配列を含むプローブを含む、内部対照遺伝子に特異的なプライマーとプローブとの混合物；並びに
（ｉｖ）緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび滅菌蒸留水を含む、ＰＣＲ反応混合物
を含む。
【００７４】
解析用組成物は、複数群のプライマー、および３群のプローブを含む。本発明の発明者らは、この組成物を用いてリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行った。その結果、本発明者らは、偽陽性のリスクをほぼ完全に排除して、検体中のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を検出および診断できることを確認した。
【００７５】
具体的には、混合物（ｉ）は、Ｍ．ツベルクローシス群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）のみを増幅することができ、かつ、ＩＳ６１１０遺伝子部位に対して９７％以上のかなり高い感度、および９９％以上の陽性的中率を示すプライマーと、このプライマーを用いて増幅されるＩＳ６１１０遺伝子部位に特異的に結合するプローブとを含む。
【００７６】
混合物（ｉｉ）は、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属特異的遺伝子、ＩＴＳ遺伝子を増幅することができ、かつ、リアルタイムＰＣＲを用いた解析に好適な長さのＩＴＳ遺伝子部位を形成するプライマーと、このプライマーを用いて増幅されるＩＴＳ遺伝子部位に特異的に結合するプローブとを含む。
【００７７】
今回のプローブは、検出可能な全マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のＩＴＳ遺伝子に結合し、従ってその結合によりマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の存在を確認することができる。
【００７８】
必要に応じて、この組成物は、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の異なる菌種から抽出された別の塩基配列を持つＩＴＳ遺伝子部位を含む１つまたは複数のプローブを更に含んでもよい。この場合、それぞれのマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の菌種を確認することができる。
【００７９】
このため、本組成物を含む解析キットを使用すると、結核に特異的な遺伝子を簡便かつ正確に定量的に解析することができ、非結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の存在を確認することも可能である。従って、結核の正確な診断のため、この解析キットを広く使用することができる。場合によっては、それぞれの混合物を別々に解析し、セットとして判断してもよい。
【００８０】
こうしたリアルタイムＰＣＲアッセイは、市販されているリアルタイムＰＣＲ装置を用いて行うことができ、リアルタイムＰＣＲ装置の例としては、ＳＬＡＮリアルタイムＰＣＲ検出系（ＬＧ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｏｒｅａ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ７０００／７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）（ＰｈａｒｍａＴｅｃｈ，ＵＳＡ）および同種のものがあるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
４．  Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｅｎｕｓ）の解析方法
解析のための本発明による組成物は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｅｎｕｓ）の存在を確認する定性解析に使用しても、その定量解析に使用してもよい。即ち、本発明は、解析用組成物を用いてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）若しくは非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を定量解析または定性解析する方法を提供する。
【００８２】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の存在を確認する定性解析については、解析用組成物を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ピークが観察される点を確認することにより実施してもよい。
【００８３】
更に、定量解析は、標準曲線との比較により行ってもよい。好ましい実施形態では、定量解析は、解析用組成物を用いて以下のステップにより行ってもよい：
（１）サンプルから抽出された細菌のＤＮＡと解析用組成物を混合して遺伝子解析用のサンプルを調製するステップ；
（２）遺伝子解析用のサンプルをリアルタイムＰＣＲに供してＰＣＲ産物を得るステップ；
（３）ＰＣＲ産物を定量して定量曲線を得るステップ；並びに
（４）サンプルから抽出された細菌のＤＮＡに存在するＩＳ６１１０特異的遺伝子、ＩＴＳ特異的遺伝子および内部対照特異的遺伝子を、定量曲線を用いて定量するステップ。
【００８４】
即ち、複数群のプライマーおよび３群のプローブ、即ち、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子ＩＳ６１１０に特異的なプライマー対およびプローブ、マイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｅｎｕｓ）のＩＴＳ遺伝子に特異的なプライマー対およびプローブ、並びにレクチン遺伝子などの内部対照遺伝子に特異的なプライマー対およびプローブを含む定量解析用組成物に、サンプルから抽出された細菌のＤＮＡを加え、リアルタイムＰＣＲを実施すると、ＩＳ６１１０遺伝子と、ＩＴＳ遺伝子と、レクチン遺伝子などの内部対照遺伝子とに特異的なそれぞれのプライマー対およびプローブがＤＮＡに結合し、ＰＣＲ産物が増幅される。
【００８５】
ＰＣＲ産物の解析方法としてｔａｑｍａｎ解析を使用する場合、ＩＳ６１１０遺伝子、ＩＴＳ遺伝子およびレクチン遺伝子に結合したプローブが分解し、発光する現象を用いて遺伝子の増幅を確認することにより、ＩＳ６１１０特異的遺伝子、ＩＴＳ特異的遺伝子および内部対照特異的遺伝子を解析することができる。
【００８６】
本発明の上記および他の目的、特徴並びに他の利点は、以下の詳細な説明を添付図面と合わせて考えるとより明確に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明による解析用組成物を用いた、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群陽性サンプルのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの結果を示す画像である。
【図２】本発明による解析用組成物を用いた、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属陽性サンプルのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの結果を示す画像である。
【図３】本発明による解析用組成物を用いた、陰性サンプルのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
次に、以下の例を参照しながら、本発明をより詳細に記載する。これらの例は、本発明の範囲および精神を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００８９】
実施例１：プライマーおよびプローブの作製
日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製のＤＮＡｓｉｓを用いて塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて塩基配列を解析し、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の関連機関ＮＣＢＩが管理するＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に受託番号ＮＣ０００９６２で寄託された塩基配列を解析することにより、本発明に使用するＩＳ６１１０特異的プライマーおよびプローブは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群のみを増幅できるプライマー塩基配列であることが確認された。
【００９０】
更に、Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｅｎｔｒｅｚからマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）ＩＴＳ遺伝子を入手し、ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘを用いて保存部位を解析し、塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて塩基配列を解析することにより、本発明に使用するＩＴＳ特異的プライマーおよびプローブも、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属のみを増幅できるプライマー塩基配列であることが確認された。
【００９１】
植物由来の遺伝子特異的プライマーおよびプローブの塩基配列については、当該技術分野において公開された特許から入手する。
【００９２】
実施例２：プライマーの合成
実施例１で解析したプライマーは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  ｅｄ．の段落１０．４２に記載された「オリゴヌクレオチド合成」法を用いてＭｅｔａｂｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）が合成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２００１）。
【００９３】
実施例３：臨床検体または標準株培養基からのマイコバクテリアＤＮＡの抽出
結核と思われる患者の痰または標準株培養基の１〜２ｍｌ、および１〜２ｍｌの４Ｎ  ＮａＯＨを１５ｍｌのチューブに入れ、続いて十分に撹拌し、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、得られた沈殿物に１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）を加え、続いて十分に撹拌し、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿物を１．５ｍｌのチューブに移し、これに１ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加え、続いて撹拌し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。再び上清を捨て、得られた沈殿物に５０〜１００ｕｉの５％（ｗ／ｖ）Ｃｈｅｌｅｘ  １００樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．）を加え、この混合物を１００℃で２０分間加熱し、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、分離したＤＮＡの上清をＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。
【００９４】
実施例４：プライマーおよびプローブを用いたリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応の解析
以下の表３に示すＰＣＲ反応組成物の処方に従いＰＣＲ反応組成物を調製し、以下の表４に示す反応条件下、ＳＬＡＮリアルタイムＰＣＲ検出系（ＬＧ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００９５】
反応産物をリアルタイムで測定し、反応の終了後、ＳＬＡＮ  ７．０プログラムを用いて結果を解析した。
【００９６】
以下の通り判定された：図１：Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群陽性、図２：マイコバクテリア属陽性、および図３：陰性。
【００９７】
【表４】
2013502922.tif 000006
【００９８】
【表５】
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【００９９】
実施例６：従来の培養方法（ＭＧＩＴ，ＢＤ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）と本発明のキットとを用いたＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の診断効果の比較試験
従来の培養方法（ＭＧＩＴ，ＢＤ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳ）と本発明のキットとの間でＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｅｎｕｓ）の診断効果を比較した。
【０１００】
比較に使用した培養方法は、製造者の指示に従って実施し、培養した陽性検体の菌種については、ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＭＴＢキット（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＵＳＡ）および塩基配列解析を用いて確認した。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表６】
2013502922.tif 000008
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「感度」という用語は、検査結果が陽性である疾患患者の割合、即ち、疾患に罹患している人が疾患であると判定される割合をいう。本明細書で使用する場合、「特異性」という用語は、健康な人が陰性と検出される割合、即ち、正常な人が正常であると判定される割合をいう。「陽性的中率」という用語は、ある診断法により陽性と見なされた人が、それに対応する疾患である確率をいう。「陰性的中率」という用語は、ある診断方法により陽性と検出された人が、それに対応する疾患ではない確率をいう。
【０１０３】
上記の表５の結果によれば、本発明による組成物を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施すると、結核性マイコバクテリア（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）および非結核性のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）について現時点で信頼性が最も高いアッセイ培養方法と比較して、実質的に同等の信頼性が得られることが明確に確認された。特に、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する感度が９７％以上、特異性が９９％であることから、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を正確に特定できることが示唆される。
【０１０４】
実施例７：結核に類似した肺炎の症状を呈するノカルジア属（ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｅｎｕｓ）微生物と、マイコバクテリア属に類似したロドコッカス（ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物との診断効果の比較試験
結核に類似した症状を呈するノカルジア（ｎｏｃａｒｄｉａ）属微生物と、ロドコッカス（ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物とについて、韓国特許出願第２００８−００９０１５６号明細書によるキットを使用して得られた結果を、本発明によるキットを用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られた結果と比較した。それらの結果を表６に示す。
【０１０５】
【表７−１】
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【表７−２】
2013502922.tif 000010
【０１０６】
表６から分かるように、本発明は、従来の特許組成物に見られる偽陽性の確率を完全に排除する。
【０１０７】
本発明の組成物を用いることにより、従来技術の特許と比較してかなり高い特異性でＮＴＭを検出し得ることが、前述の結果から理解できる。
【０１０８】
実施例８：様々なマイコバクテリアを用いた本発明のＲＴ−ＰＣＲの結果
実施例３および４の方法に従い４２菌種のマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）をＲＴ−ＰＣＲに供した。その結果を以下の表７に示す。
【０１０９】
【表８−１】
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【表８−２】
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【０１１０】
（表７では、マイコバクテリウムの値が３５未満である場合、マイコバクテリウムを「陽性」と定義し、ＩＣは、内部対照を意味する。更に、Ｃｔは閾値サイクルであり、これは、ＲＴ−ＰＣＲの結果、臨界値（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ）を超えるサイクル数を意味し、Ｎｏ  Ｃｔは、閾値サイクルがないことを意味する。）
【０１１１】
表７から分かるように、本発明によるＲＴ−ＰＣＲの結果、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群に属するＭ．ツベルクローシスＨ３７Ｒｖ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ボビスＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、およびＭ．ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の検査はすべて、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）陽性であり、残りのマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の検査はマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）陽性であった。従って、本発明による解析組成物を用いたＲＴ−ＰＣＲは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の検出に有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
前述から明らかなように、本発明による解析用組成物を用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の検出を、従来の方法と比較して短期間に高い感度および特異性で実現することができる。
【０１１３】
説明を目的として本発明の好ましい実施形態を開示してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に開示される本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な修正、付加および置換が可能であることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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