(57)【要約】本発明は、新規なペプチドおよび構造体を提供する。さらに、本発明は、化合物を、細胞膜を横切って輸送する、ＨＢＶのＸタンパク質を拮抗または破壊する、ＨＢＶ感染症を治療および／または管理する、ＨＣＣを治療および／または予防する、ならびに標的タンパク質を分解する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項２】
前記ペプチドまたはその機能的に同等な変異体が、そのＮ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸１〜１５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸、および／またはそのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸２１〜３５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を含む請求項２に記載のペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項４】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）を含む請求項２に記載のペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項５】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥ（配列番号４）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲ（配列番号５）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）またはＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）からなる請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）からなるアミノ酸配列からなる請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項８】
前記ペプチドまたはその機能的に同等な変異体が、そのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸９〜３５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含む、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）を含む請求項８に記載のペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）またはＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）からなる請求項７から９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項１３】
化合物のための細胞膜透過性担体としての、請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体の使用。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体と、細胞に送達することが望まれる少なくとも１種の化合物とを含む構造体。
【請求項１５】
前記化合物が、核酸、ペプチド核酸、ポリペプチド、炭化水素、ペプチド模倣体、低分子阻害剤、プロテオグリカン、脂質、リポタンパク質、糖脂質、天然生成物または糖模倣体である、請求項１４に記載の構造体。
【請求項１６】
前記化合物が、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）もしくはその機能的に同等な変異体、ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含むペプチドである、請求項１５に記載の構造体。
【請求項１７】
前記化合物が、ＨＩＦ１αのＯＤＤ（ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３））またはその機能的に同等な変異体である、請求項１５に記載の構造体。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体を化合物に結合するステップを含む、化合物の細胞膜透過性を増加させる方法。
【請求項２１】
化合物と請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体とを含む構造体を、細胞または前記細胞を含む組成物に接触させるステップを含む、化合物を細胞中に送達する方法。
【請求項２２】
化合物と請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体とを含む構造体を被験体に投与するステップを含む、化合物を細胞中に送達する方法。
【請求項２３】
前記化合物が、細胞の細胞質に送達される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、細胞の核に送達される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｘタンパク質の機能の拮抗薬としての、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用。
【請求項２６】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法。
【請求項２８】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法。
【請求項３０】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法。
【請求項３２】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
分解分子とアミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体。
【請求項３６】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項３５に記載の構造体。
【請求項３７】
前記分解分子が、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である、請求項３５または３６に記載の構造体。
【請求項３８】
前記分解分子が、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）またはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）またはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）またはその機能的に同等な変異体、ＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）またはその機能的に同等な変異体を含むペプチドである、請求項３７に記載の構造体。
【請求項３９】
前記分解分子が、アミノ酸配列ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である、請求項３５または３６に記載の構造体。
【請求項４０】
核酸ベクターを含む請求項３５から３９のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸。
【請求項４１】
請求項３５から３９のいずれか一項に記載の構造体を被験体に投与するステップを含む、ＨＢＶ感染症を治療する方法。
【請求項４２】
請求項３５から３９のいずれか一項に記載の構造体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法。
【請求項４３】
請求項３５から３９のいずれか一項に記載の構造体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法。
【請求項４４】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の構造体を、細胞の混合集団または細胞の混合集団を含む組成物に接触させるステップを含む、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法。
【請求項４５】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の構造体を被験体に投与するステップを含む、被験体中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法。
【請求項４６】
少なくとも１種の標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体。
【請求項４７】
アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含むペプチドを含む、請求項４６に記載の構造体。
【請求項４８】
前記標的化分子が、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）もしくはその機能的に同等な変異体、またはアミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、請求項４６または４７に記載の構造体。
【請求項４９】
前記標的化分子が、Ｂ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１種または複数を標的化する、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項５０】
Ｂ−ｒａｆを標的化する前記標的化分子が、Ｂ−ｒａｆのオリゴマー形成ドメインまたはその一部を含む、請求項４９に記載の構造体。
【請求項５１】
Ｂ−ｒａｆの前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９）もしくはその機能的に同等な変異体、ＴＴＨＮＦＶＲＫＴＦＦＴＬＡＦＣＤＦＣＲＫＬＬ（配列番号９２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＳＬＰＧＳＬＴＮＶＫＡＬＱＫＳＰＧＰＱＲＥＲＫ（配列番号９３）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、請求項５０に記載の構造体。
【請求項５２】
Ｂ−ｒａｆを標的化し、アミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）またはその機能的に同等な変異体を含む、請求項５１に記載の構造体。
【請求項５３】
前記標的化分子が、Ｎ−Ｒａｓを標的化し、アミノ酸配列ＲＫＴＦＬＫＬＡ（配列番号９４）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＣＣＡＶＦＲＬ（配列番号９５）もしくはいずれかの機能的に同等な変異体を含む、請求項４９に記載の構造体。
【請求項５４】
前記標的化分子が、ＰＤＧＦ受容体を標的化し、アミノ酸配列ＭＰＮＬＷＦＬＬＦＬＧＬＶＡＡＭＱＬＬＬＬＬＦＬＬＬＦＦＬＶＹＷＤＨＦＥＣＳＣＴＧＬＰＦ（配列番号９６）またはその機能的に同等な変異体を含む、請求項４９に記載の構造体。
【請求項５５】
核酸ベクターを含む、請求項４６から５４のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸。
【請求項５６】
分解するためのタンパク質を標的化するための、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用。
【請求項５７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
請求項４６から５４のいずれか一項に記載の構造体または請求項５５に記載の核酸を、タンパク質を含む組成物に提供するステップを含む、タンパク質を分解する方法。
【請求項５９】
前記タンパク質を含む前記組成物が、細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記構造体または核酸を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
１種または複数のタンパク質の望ましくない濃度または活性に関連する疾患を治療するための薬剤の製造への請求項４６から５４のいずれか一項に記載の構造体または請求項５５に記載の核酸の使用。
【請求項６２】
請求項４９から５４のいずれか一項に記載の構造体または前記構造体をコードする核酸を被験体に投与するステップを含む、黒色腫を治療する方法。
【請求項６３】
請求項４９から５４のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸または前記構造体をコードする核酸を被験体に投与するステップを含む、黒色腫を治療する方法。
【請求項６４】
黒色腫を治療するための薬剤の製造への、請求項４９から５４のいずれか一項に記載の構造体または前記構造体をコードする核酸の使用。
【請求項６５】
請求項１１、１２、１８、１９、４０または５５のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチド、同ペプチドを含む構造体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞の形質膜は、多くの化合物の透過性に乏しく、例えば、治療薬または実験試薬としてのその効果を有意に減少させる。脂質、ポリカチオン、ナノ粒子およびペプチドに基づく方法の使用を含む、化合物の細胞透過性を改善するための技術が開発されてきた。しかしながら、これらの技術には問題がないわけではない。例えば、典型的に標的細胞に送達するための化合物に抱合させる細胞透過性担体ペプチドは、大きく、製造するのに高価であり得るので、商業的に実行不可能になっている。大きい担体ペプチドはまた、輸送する分子の高次構造に干渉し、これらの化合物の効果を減少させる。さらに、担体ペプチドは、典型的には、接着細胞と非接着細胞を区別しない。したがって、特に生体内で使用する場合に、確実に抱合型化合物を標的細胞に十分に送達する際に困難が生じ得る。例えば、多くの場合、動物に送達すると、抱合体が標的部位に到達することができる前に血液細胞が抱合体を駆逐し得る。さらに、化合物を細胞の核に送達することが通常要求されるが、いくつかの担体ペプチドは核に局在化しない。
【０００３】
ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルスエンベロープ、核およびＥ抗原、ポリメラーゼタンパク質およびＸタンパク質をコードする４つのＯＲＦを含む。ＨＢＶのＸタンパク質は、複合多面発現性分子であり、一般的に、ヘパドナウイルス科の他のＸタンパク質との相同性に基づいて、Ａ〜Ｆと表示される６つのドメインに分類される（Ｋｕｍａｒ、Ｊａｙａｓｕｒｙａｎ、＆Ｋｕｍａｒ、１９９６；Ｍｉｓｒａ、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ、＆Ｋｕｍａｒ、２００４）１，２。Ｘタンパク質の種々の機能は、十分に解明されていないが、ウイルスにある生存優位性を与えると考えられている。
【０００４】
Ｂ型肝炎は、感染した血液または血液を含む体液を通して伝染する。伝染は、輸血、性的接触、針刺し事故ならびに垂直および水平感染の両方によって起こり得る。近年の努力の焦点は、ＨＢＶウイルスの高い感染率がもたらされる予防接種による感染を防ぐことにあった。ワクチンは、ＨｂｓＡｇなどのウイルスエンベロープタンパク質の１種からなる。予防接種の全過程後、抗体保有率は、健常児および若年成人で９５〜１００％にもなり得る（Ｚａｎｅｔｔｉ、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ、＆Ｓｈｏｕｖａｌ、２００８）３。不幸にも、予防接種は、既に慢性的に感染している人を助けることはできず、今後の疾患の負担を減らさないだろう。さらに、多くの高リスク国は、大規模な予防接種計画のための資金を欠き、集団内での疾患認識に欠き、乏しい予防接種受診につながっている。
【０００５】
ＨＢＶによる世界中の４億人の人々の慢性的感染による肝細胞癌（ＨＣＣ；肝がん）の上昇する発生率は、主要な世界的な健康問題である４。ＨＢＶ  Ｘ遺伝子（Ｘタンパク質をコードする）が肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生を開始および／または加速することを示す証拠がある５、６。新規な抗がん剤および治療方針の大規模な探索にもかかわらず、ＨＣＣの治療の改善はほとんど成功してこなかった。外科手術のみが治癒をもたらすが、腫瘍切除は患者の１５％未満にしか実行可能でなく、急速な増殖を含むＨＣＣの侵攻性の特徴、化学療法に対する耐性および外科手術後の有効な補助療法の欠如のために、腫瘍切除後の再発率は５０％と高いままである７、８。
【０００６】
Ｘタンパク質は、ＨＣＣの発生における補因子であることが報告されている６。Ｘ遺伝子の高持続性の発現は、雄のトランスジェニックマウスの８４％で腫瘍発生をもたらした９、またはこれらのマウスを肝臓発癌物質の腫瘍化効果により感受性にした１０、１１。Ｘタンパク質は、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびマウス肝細胞を形質転換する１２。Ｘタンパク質は、肝細胞の増殖を促進し、個体を肝臓発癌物質の有害な効果にかかりやすくする腫瘍プロモーターである１０。Ｘタンパク質は、肝炎およびＨＣＣの患者の血清および肝臓中で検出可能である１３、１４。肝細胞中のＸタンパク質の発現は、ＤＮＡ修復およびチェックポイントの阻害を通してＳ期の細胞の蓄積をもたらした１５、１６。Ｘタンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を上方制御することにより、サバイビン１７、およびＴＧＦ−β１１８などの腫瘍形成および腫瘍生存を支持する因子を上方制御し、血管新生を刺激する１９。上記は、Ｘタンパク質のＣ型肝炎ウイルス誘導性肝臓病態形成２０、およびＨＣＣの発生を加速する能力も部分的に説明することができる。
【０００７】
Ｘタンパク質の発現および／または機能を撹乱する薬剤は、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖および生存を阻害し、Ｘタンパク質誘導性腫瘍形成を阻害するので、ＨＢＶに慢性的に感染している患者のＨＣＣの発生を防ぐまたは遅らせることができる。したがって、Ｘ遺伝子に対するＲＮＡｉは、Ｘ遺伝子発現ＨＣＣ細胞の増殖を減少させ、軟寒天中での足場非依存性増殖およびヌードマウスにおける腫瘍発生を減少させた２１。これは、Ｂ型肝炎ウイルス複製を阻害した２２〜２４。しかしながら、Ｘタンパク質の機能を特異的に阻害するまたはその分解を引き起こす安定化ペプチドもしくはペプチド模倣体およびこれらに由来する低分子阻害剤は、経口的に送達することができるので好ましく、標的外毒性のリスクを低下させることができるだろう。
【０００８】
本明細書中に言及する刊行物の文献詳細は本明細書の最後に集めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
新規なペプチド、同ペプチドを含む抱合体および／またはその使用を提供すること、あるいは少なくとも公衆に有用な選択を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態では、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体が提供される。
【００１１】
本発明の一実施形態では、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体が提供される。
【００１２】
本発明の一実施形態では、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体が提供される。
【００１３】
一実施形態では、ペプチドまたは機能的に同等な変異体は、そのＮ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸１〜１５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸、および／またはそのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸２１〜３５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含む。
【００１４】
一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）からなる。
【００１５】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥ（配列番号４）からなる。
【００１６】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲ（配列番号５）からなる。
【００１７】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）からなる。
【００１８】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）からなる。
【００１９】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）からなる。
【００２０】
第２の広い態様では、本発明は、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を提供する。
【００２１】
一実施形態では、ペプチドまたは機能的に同等な変異体は、そのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸９〜１５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含む。
【００２２】
一実施形態では、ペプチドまたは機能的に同等な変異体は、そのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸９〜３５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を提供する。
【００２４】
一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）からなる。
【００２５】
第３の広い態様では、本発明は、第１または第２の広い態様のペプチドまたは機能的に同等な変異体をコードする核酸を提供する。
【００２６】
第４の広い態様では、本発明は、第３の広い態様の核酸を含む核酸ベクターを提供する。
【００２７】
第５の広い態様では、本発明は、化合物のための細胞膜透過性担体としての、第１または第２の広い態様のペプチドまたは機能的に同等な変異体の使用を提供する。
【００２８】
第６の広い態様では、本発明は、少なくとも１種の第１または第２の広い態様のペプチドまたは機能的に同等な変異体と、細胞に送達することが望まれる少なくとも１種の化合物とを含む構造体を提供する。
【００２９】
一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥ（配列番号４）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲ（配列番号５）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）またはＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）からなる。
【００３０】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）からなる。
【００３１】
一実施形態では、化合物は、核酸、ペプチド核酸、ポリペプチド、炭化水素、ペプチド模倣体、低分子阻害剤、プロテオグリカン、脂質、リポタンパク質、糖脂質、天然生成物または糖模倣体である。
【００３２】
一実施形態では、化合物は、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。他の実施形態では、化合物は、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体である。別の実施形態では、化合物は、ＨＩＦ１αの酸素依存的分解（ＯＤＤ）（ＭＬＡＰＹＩＰＭ）（配列番号１３）またはその機能的に同等な変異体である。
【００３３】
第７の広い態様では、本発明は、第６の広い態様の構造体をコードする核酸を提供する。
【００３４】
第８の広い態様では、本発明は、第７の広い態様の核酸を含むベクターを提供する。
【００３５】
第９の広い態様では、本発明は、本発明の第１または第２の広い態様のペプチドまたは機能的に同等な変異体を化合物に結合するステップを含む、化合物の細胞膜透過性を増加させる方法を提供する。
【００３６】
第１０の広い態様では、本発明は、化合物と本発明の第１または第２の広い態様のペプチドまたは機能的に同等な変異体とを含む構造体を、細胞または細胞を含む組成物に接触させるステップを含む、化合物を細胞中に送達する方法を提供する。
【００３７】
関連する広い態様では、本発明は、化合物と本発明の第１または第２の広い態様のペプチドまたは機能的に同等な変異体とを含む構造体を被験体に投与するステップを含む、化合物を細胞中に送達する方法を提供する。
【００３８】
一実施形態では、化合物は、細胞の細胞質に送達される。別の実施形態では、化合物は、細胞の核に送達される。
【００３９】
第１３の広い態様では、本発明は、Ｘタンパク質の機能の拮抗薬としての、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、Ｘタンパク質の機能の拮抗薬としての、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用を提供する。
【００４１】
第１４の広い態様では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法を提供する。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法を提供する。
【００４３】
関連する広い態様では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法を提供する。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法を提供する。
【００４５】
第１５の広い態様では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。
【００４７】
第１６の広い態様では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法を提供する。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法を提供する。
【００４９】
第１７の広い態様では、本発明は、少なくとも１種の分解分子とアミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を提供する。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種の分解分子とアミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を提供する。
【００５１】
一実施形態では、分解分子は、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。他の実施形態では、分解分子は、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体である。別の実施形態では、分解分子は、アミノ酸配列ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。
【００５２】
第１８の広い態様では、本発明は、本発明の第１７の広い態様の構造体を被験体に投与するステップを含む、ＨＢＶ感染症を治療する方法を提供する。
【００５３】
第１９の広い態様では、本発明は、本発明の第１７の広い態様の構造体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法を提供する。
【００５４】
第２０の広い態様では、本発明は、本発明の第１７の広い態様の構造体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法を提供する。
【００５５】
第２１の広い態様では、本発明は、第６の広い態様の構造体を、細胞の混合集団または細胞の混合集団を含む組成物に接触させるステップを含む、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法を提供する。
【００５６】
関連する広い態様では、本発明は、第６の広い態様の構造体を被験体に投与するステップを含む、被験体中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法を提供する。
【００５７】
第２７の広い態様では、本発明は、少なくとも１種の標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を提供する。他の実施形態では、構造体は、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００５８】
一実施形態では、標的化分子は、Ｘタンパク質を標的化する。特定の一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）またはその機能的に同等な変異体を含む。別の実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００５９】
別の実施形態では、標的化分子は、Ｂ−ｒａｆを標的化する。特定の一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９）またはその機能的に同等な変異体を含む。他の実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＴＴＨＮＦＶＲＫＴＦＦＴＬＡＦＣＤＦＣＲＫＬＬ（配列番号９２）もしくはＳＬＰＧＳＬＴＮＶＫＡＬＱＫＳＰＧＰＱＲＥＲＫ（配列番号９３）またはいずれかの機能的に同等な変異体を含む。
【００６０】
特定の一実施形態では、構造体は、Ｂ−ｒａｆを標的化し、アミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００６１】
別の実施形態では、標的化分子は、タンパク質Ｎ−Ｒａｓを標的化する。一実施形態では、標的化分子は、Ｒａｆ−１からのペプチドを含む。一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＲＫＴＦＬＫＬＡ（配列番号９４）もしくはＣＣＡＶＦＲＬ（配列番号９５）またはいずれかの機能的に同等な変異体を含む。
【００６２】
別の実施形態では、標的化分子は、ＰＤＧＦ受容体を標的化する。一実施形態では、標的化分子は、ウシパピローマウイルスＥ５タンパク質からのペプチドを含む。一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＭＰＮＬＷＦＬＬＦＬＧＬＶＡＡＭＱＬＬＬＬＬＦＬＬＬＦＦＬＶＹＷＤＨＦＥＣＳＣＴＧＬＰＦ（配列番号９６）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００６３】
特定の一実施形態では、構造体は、少なくとも２個の標的化分子を含む。
【００６４】
第２８の広い態様では、本発明は、第２７の広い態様の構造体をコードする核酸を提供する。本発明はまた、前記核酸を含むベクターも提供する。
【００６５】
第２９の広い態様では、本発明は、分解するためのタンパク質を標的化するための、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用を提供する。他の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）、またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００６６】
第３０の広い態様では、本発明は、第２７の広い態様の構造体または第２８の広い態様の核酸を、タンパク質を含む組成物に提供するステップを含む、タンパク質を分解する方法を提供する。
【００６７】
一実施形態では、タンパク質を含む組成物は、細胞を含む。関連する実施形態では、本方法は、構造体または核酸を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。
【００６８】
別の広い態様では、本発明は、１種または複数のタンパク質の望ましくない濃度または活性に関連する疾患を治療するための薬剤の製造への第２７の広い態様の構造体または第２８の広い態様の核酸の使用を提供する。
【００６９】
別の広い態様では、本発明は、Ｂ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１種または複数を標的化する標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を被験体に投与するステップを含む、黒色腫を治療する方法を提供する。
【００７０】
関連する態様では、本発明は、Ｂ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１種または複数を標的化する標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体をコードする核酸を被験体に投与するステップを含む、黒色腫を治療する方法を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、黒色腫を治療するための薬剤の製造への、Ｂ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１種または複数を標的化する標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体の使用を提供する。
【００７２】
関連する態様では、本発明は、黒色腫を治療するための薬剤の製造への、Ｂ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１種または複数を標的化する標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体をコードする核酸の使用を提供する。
【００７３】
一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９）またはその機能的に同等な変異体を含む。他の実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＴＴＨＮＦＶＲＫＴＦＦＴＬＡＦＣＤＦＣＲＫＬＬ（配列番号９２）もしくはＳＬＰＧＳＬＴＮＶＫＡＬＱＫＳＰＧＰＱＲＥＲＫ（配列番号９３）またはいずれかの機能的に同等な変異体を含む。
【００７４】
特定の一実施形態では、構造体は、アミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００７５】
一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＲＫＴＦＬＫＬＡ（配列番号９４）もしくはＣＣＡＶＦＲＬ（配列番号９５）またはいずれかの機能的に同等な変異体を含む。
【００７６】
一実施形態では、標的化分子は、アミノ酸配列ＭＰＮＬＷＦＬＬＦＬＧＬＶＡＡＭＱＬＬＬＬＬＦＬＬＬＦＦＬＶＹＷＤＨＦＥＣＳＣＴＧＬＰＦ（配列番号９６）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【００７７】
別の態様では、本発明は、第１７の態様の構造体をコードする核酸を提供する。別の態様では、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、本明細書前記の任意の目的のための、本発明のペプチドもしくは構造体をコードする核酸、または前記核酸を含む核酸ベクターの使用を提供する。さらに、本発明は、本発明のペプチドもしくは構造体をコードする核酸、または前記核酸を含む核酸ベクターを利用する、本明細書前記の方法を提供する。
【００８０】
本発明はまた、大まかに、本出願の明細書中に言及するもしくは示す部分、要素または特徴の２つ以上の任意のまたは全ての組み合わせで、個別にまたは全体として、前記部分、要素および特徴に存すると言うこともでき、本発明が関する技術分野で既知の同等物を有する特定の整数が本明細書に言及されている場合、前記既知の同等物は、あたかも個別に示されているかのように本明細書に組み込まれるとみなされる。
【００８１】
新規な態様全てで考慮すべきである、本発明のこれらのおよび他の態様は、添付の図面を参照して、以下の説明から明らかになるだろうが、この説明は例示のために与えられるに過ぎない。
【００８２】
いくつかの図面は、異なる色で標識もしくは染色された細胞または核を説明している。特に明言しない限り、黒および白で複製する場合、これらの図面中目に見える全ての点は、使用した標識または染色により、細胞または核を表している。さらに、これらの図面中、「合併」結果は、核染色の発生と一致する細胞染色を説明している。一般的に、中心領域は核を表し、ハローは全体として細胞（細胞質を含む）を表している。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ｘタンパク質を発現するよう形質移入したＨｅｐＧ２細胞の核抽出物のウエスタンブロット解析を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、形質移入しないままにした（１レーン）、またはｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（２レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（３レーン）およびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（４レーン）を形質移入した。膜を、マウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体（１：２００希釈）、引き続いて、二次ヤギ抗マウスＨＲＰ抱合型抗体（１：１００００希釈）でプローブした。全長２１ｋＤａおよび切断型１７ｋＤａ  Ｘタンパク質バンドの位置を右側欄外に示す。
【図２】ペプチド１６〜３５が、Ｘタンパク質Ｎ末端ペプチド１〜５０に結合することを示す図である。ペプチド１〜５０でコーティングしたプレートに結合したａａ１〜５０を含む短鎖ＦＩＴＣ抱合型ペプチドにより発せられた蛍光を図示した。４０μｇ／ｍｌでペプチド１６〜３５を含むウェルはより強い蛍光をもたらし、これはペプチド１６〜３５がペプチド１〜５０に結合している証拠であった。
【図３】ペプチド１６〜３５より短いペプチドはペプチド１〜５０に結合できないことを示す図である。ペプチド１６〜３５に基づく短鎖ペプチドを使用した蛍光レベルにより示されるリガンド結合のグラフである。短縮ペプチドにより得られる結合は、親ペプチド１６〜３５で見られる結合と比較し得なかった。
【図４】ＨＩＦ−１αのＯＤＤに融合したペプチド１６〜３５はペプチド１〜５０に結合することを示す図である。このグラフは、ペプチド１６〜３５が標的化ペプチドの前または端のいずれかに位置する２種のＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドの結合を示している。親ペプチド１６〜３５および非結合ペプチド２１〜４０をそれぞれ陽性および陰性対照として含めた。
【図５】Ｘタンパク質を発現するよう形質移入し、Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドで処理したＨｅｐＧ２細胞の核コンパートメントのウエスタンブロット解析を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、形質移入しないままにした（１レーン）、またはｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（２、５および８レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（３、６および９レーン）およびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（４、７および１０レーン）を形質移入した。形質移入体を、未処理のままにした（１レーン）、または前（５〜７レーン）もしくは端（８〜１０レーン）でＯＤＤタグを有するＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドで処理した。全長２１ｋＤａおよび切断型１７ｋＤａ  Ｘタンパク質バンドの位置を左側欄外に示す。Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドは、Ｘタンパク質を分解した。
【図６】Ｘタンパク質を発現するよう形質移入し、Ｘタンパク質オリゴマー形成不安定性ドメイン融合ペプチドで処理したＨｅｐＧ２細胞の核分画のウエスタンブロット解析を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、形質移入しないままにした（１レーン）、またはｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（２、５および８レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（３、６および９レーン）およびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（４、７および１０レーン）を形質移入した。形質移入体を、未処理のままにした（１レーン）、または前（５〜７レーン）もしくは端（８〜１０レーン）で不安定性ドメインを有するＸタンパク質オリゴマー形成不安定性融合ペプチドで処理した。全長２１ｋＤａおよび切断型１７ｋＤａ  Ｘタンパク質バンドの位置を左側欄外に示す。Ｘタンパク質オリゴマー形成不安定性融合ペプチドは、Ｘタンパク質を分解した。
【図７】オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸプラスミドの形質移入により切断型Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質オリゴマー形成ペプチド（ａａ１６〜３５）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して細胞核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害した。
【図８】オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ  Ｍｙｃプラスミドの形質移入により全長Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質オリゴマー形成ペプチド（ａａ１６〜３５）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害した。
【図９】対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しないことを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸプラスミドの形質移入により切断型Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照細胞はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しなかった。
【図１０】対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しないことを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ  Ｍｙｃプラスミドの形質移入により切断型Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照細胞はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しなかった。
【図１１】オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）によるＸタンパク質の三次構造の破壊を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（１および４レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（２および５レーン）またはｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（３および６レーン）プラスミドを形質移入し、未処理のままにした（１〜３レーン）、またはオリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）で４８時間にわたって３回処理した（４〜６レーン）。核細分画を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体を用いてウエスタンブロット解析した。分子量マーカーを左側欄外に示す。
【図１２】ペプチドａａ１〜２０および１６〜３５およびは細胞透過性であることを示す図である。Ｘタンパク質のＮ末端領域からのａａ１〜２０、１６〜３５、２１〜４０および３４〜５３を含む４種のＦＩＴＣ標識化ペプチドをＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１３】共焦点顕微鏡がペプチドａａ１〜２０および１６〜３５は細胞透過性であることを確認することを示す図である。Ｘタンパク質からのａａ１〜２０、１６〜３５、２１〜４０および３４〜５３を含む４種のＦＩＴＣ標識化ペプチドをＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１４】細胞の共焦点型スライシングが、ペプチドａａ１６〜３５が細胞質および核に取り込まれることを明らかにしていることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜３５をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞の複数の光学的スライス像を細胞の下から上まで取った。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１５】ペプチドａａ１６〜３５由来の短鎖ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２も細胞透過性であることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１６】共焦点顕微鏡がペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２が細胞透過性であることを確認することを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１７】細胞の共焦点型スライシングが、ペプチドａａ１６〜２２が細胞質および核に取り込まれることを明らかにしていることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞の複数の光学的スライス像を細胞の下から上まで取った。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１８】Ｘタンパク質ペプチドａａ１６〜２２、１６〜３５のＨｅｐＧ２細胞への侵入がヘパリン結合に依存することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤおよび２μｇ／ｍｌヘパリンで前処理し、次いで、ＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２および１６〜３５と共に３時間インキュベートした。細胞によるペプチド取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。
【図１９】短鎖ペプチドａａ１〜１５および１６〜２０も細胞透過性であることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。短鎖ペプチドａａ１〜１５および１６〜２０は細胞透過性である。
【図２０】共焦点顕微鏡検査が短鎖ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２は細胞透過性であることを確認することを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した（上のパネル）。細胞の共焦点型スライシングは、ペプチドａａ１〜１５および１６〜２２が細胞質および核に取り込まれることを明らかにしている。細胞の複数の光学的スライス像を細胞の下から上まで取った。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図２１】短鎖ペプチドａａ１〜８が細胞透過性であることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１〜８およびａａ９〜１５をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。短鎖ペプチドａａ１〜８は細胞透過性である。
【図２２】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株に侵入することができるが、非接着性細胞株ＴＫ１に侵入することはできないことを示す図である。接着ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株、ならびに非接着性細胞株ＴＫ１をフルオレセイン化（ＦＩＴＣ標識化）Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査により可視化した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ化標識ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株に侵入することができたが、非接着細胞株ＴＫ１に侵入することはできなかった。
【図２３】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、Ｈ４４１、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１およびＲｉｎｍ５ｆ細胞株にあまり効率的に取り込まれないことを示す図である。接着性Ｈ４４１、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１およびＲｉｎｍ５ｆ細胞株をＦＩＴＣ標識化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査により可視化した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、Ｈ４４１、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１およびＲｉｎｍ５ｆ細胞株にあまり効率的に取り込まれなかった。
【図２４】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、非接着性末梢血単核細胞に侵入することができないことを示す図である。末梢血単核細胞をＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に８つのチャンバースライド中で３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査で調べた（下のパネル）。細胞核をＤＡＰＩで染色した（上のパネル）。３つの異なる領域を表す。
【図２５】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、接着性単球および潜在的接着性血小板に侵入することができることを示す図である。末梢血単核細胞をＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に８つのチャンバースライド中で３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査で視覚化した（中央のパネル）。細胞核をＤＡＰＩで染色した（上のパネル）。スライドを媒体で洗浄して非接着細胞を除去した。２つの異なる領域を表す。核に関してＦＩＴＣ標識化ペプチドの分布を示すために画像を合併した（下のパネル）。ペプチドを取り込んだ細胞を矢印で示す。小さい蛍光点はペプチドを取り込んだ接着性血小板を表し得る。
【図２６】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、非接着性赤血球および血小板に侵入しないことを示す図である。血液をフィンガープリックにより採取し、１０ｍＭクエン酸緩衝液に懸濁し、ＦＩＴＣ標識化１６〜２２ペプチドと共にインキュベートし、ガラススライド上に血液塗抹を調製した。細胞を光学顕微鏡検査（上のパネル）および蛍光顕微鏡検査（下のパネル）で調べた。
【図２７】接着性ＴＫ１  Ｔ細胞は、Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２を取り込むことを示す図である。ＴＫ１細胞をＭＡｄＣＡＭ−１コーティングしたガラススライド（左側のパネル）またはスライドに直接（右側のパネル）接着させ、ＦＩＴＣ標識化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共にインキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで染色した。２つの領域を表す。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。接着性ＴＫ１  Ｔ細胞は、Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２を取り込んだ。
【図２８】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、外来性ペプチドを細胞中に輸送することができることを示す図である。ＨＢＳＳ緩衝液中２ｍＭ  Ｍｎ＋＋で活性化したＴＫ１細胞を、ＭＡｄＣＡＭ−１コーティングした８ウェルガラスチャンバースライドに付着させた。ビオチン化Ｒ９ＹＤＲＲＥＹ（配列番号１４）およびＬＣＬＲＰＶＧＧＹＤＲＲＥＹ（配列番号１５）ペプチドを５０μＭで添加し、３０分後、細胞を洗浄して解析した。細胞をストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。ＹＤＲＲＥＹ（配列番号１６）ペプチドは外来性であり、β７インテグリンの細胞質ドメインに由来する。
【図２９】ペプチドａａ１６〜２２は、ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、ＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧに抱合した。ペプチド−ウサギＩｇＧ抱合体、ペプチドおよびＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞に添加し、ＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧ積荷の細胞取り込みを蛍光顕微鏡検査により評価した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧを取り込んだ細胞の数、すなわち、抗体を取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。ペプチドａａ１６〜２２は、ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞中に輸送した。
【図３０Ａ】ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、５’−アミノ基を含むＴｅｘ６１５標識化１８ｍｅｒオリゴヌクレオチド５ＡｍＭＣ１２−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣ（配列番号１８）に抱合した。ペプチド−１８ｍｅｒオリゴ抱合体をＨｅｐＧ２細胞に添加し、その取り込みを３０分、３時間および２４時間後に蛍光顕微鏡検査により評価した（Ａ）。抱合型オリゴの取り込みを３時間後に評価した（Ｂ）。１８ｍｅｒオリゴを、２．３、４．５および８．７μＭオリゴで、１０μＭ担体に抱合し、０．１４、０．３および０．６μＭの溶液中オリゴ最終濃度を得た（図３０Ｂ）。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＴｅｘ６１５標識化オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送した。
【図３０Ｂ】ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、５’−アミノ基を含むＴｅｘ６１５標識化１８ｍｅｒオリゴヌクレオチド５ＡｍＭＣ１２−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣ（配列番号１８）に抱合した。ペプチド−１８ｍｅｒオリゴ抱合体をＨｅｐＧ２細胞に添加し、その取り込みを３０分、３時間および２４時間後に蛍光顕微鏡検査により評価した（Ａ）。抱合型オリゴの取り込みを３時間後に評価した（Ｂ）。１８ｍｅｒオリゴを、２．３、４．５および８．７μＭオリゴで、１０μＭ担体に抱合し、０．１４、０．３および０．６μＭの溶液中オリゴ最終濃度を得た（図３０Ｂ）。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＴｅｘ６１５標識化オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送した。
【図３１】Ｂ−Ｒａｆ標的化ペプチドが、黒色腫細胞を死滅させることを示す図である。Ｂ−Ｒａｆ二量体形成ドメインに融合したポリＡｒｇ８担体ペプチドを含むＢ−Ｒａｆ  Ｘタンパク質融合ペプチド（ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ）（配列番号１９）、およびＸタンパク質不安定性ドメインをＣ３２およびＷＭ−２６６−４黒色腫細胞に添加して、それぞれ１０μＭおよび２０μＭの最終濃度にし、引き続いて、３７℃で３時間インキュベートした。細胞を、アポトーシスを引き起こさない対照細胞透過性ペプチド  ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号２０）と共にインキュベートした。アネキシンＶ  ｆｌｕｏｓで細胞を染色することにより、細胞のアポトーシスを検出した。核をＤＡＰＩで染色した。Ｂ−Ｒａｆ標的化ペプチドにより死滅させられた細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。Ｂ−Ｒａｆ標的化ペプチドは、黒色腫細胞を死滅させた。
【図３２】ペプチド１６〜３０が、Ｘタンパク質Ｎ末端ペプチド１〜５０に結合することを示す図である。ペプチド１〜５０コーティングしたプレートに結合した短鎖ＦＩＴＣ抱合型Ｘタンパク質ペプチドａａ１６〜３０、２０〜３５および１６〜３５により発せられる蛍光を図示した。１０、２０および４０μｇ／ｍｌでペプチド１６〜３０を含むウェルはより強い蛍光をもたらし、これはペプチド１６〜３０がペプチド１〜５０に結合している証拠であった。ＡおよびＢは反復実験である。
【図３３】Ｘタンパク質ａａ１６〜２２担体ペプチドによりＷＭ−２６６−４黒色腫細胞中に輸送されたポリクローナル抗Ｂ−ｒａｆ抗体は細胞にアポトーシスを起こさせることを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、ポリクローナルウサギ抗ヒトＢ−ｒａｆ抗体（ＨＰＡ００１３２８；Ｓｉｇｍａ）に抱合した。担体ペプチド−ウサギ抗Ｂ−ｒａｆ抗体抱合体（１μｇ／ｍｌ）、非抱合型担体ペプチドおよび非抱合型抗Ｂ−ｒａｆ抗体（１μｇ／ｍｌ）をＷＭ−２６６−４黒色腫細胞に添加し、アネキシンＶ  ｆｌｕｏｓを添加して３時間後に細胞アポトーシスを評価し、蛍光顕微鏡検査により視覚化した。未処理細胞を追加の対照として含ませた。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために結果を合併した。Ｘタンパク質担体ペプチドにより黒色腫細胞中に輸送されたポリクローナル抗Ｂ−ｒａｆ抗体は細胞にアポトーシスを起こさせた。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
以下は、一般用語で示される、その好ましい実施形態を含む本発明の説明である。本発明は、本発明を裏付ける実験データ、本発明の種々の態様の特定の例および本発明を実施する手段を提供する、本明細書中以下の見出し「実施例」の下に与えられる開示からさらに明らかにされる。
【００８５】
本発明者らは、驚くべきことに、細胞透過性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＸタンパク質由来のペプチドモチーフを同定した。これらのペプチドは、化合物を細胞（細胞の細胞質および核を含む）に送達するための細胞透過性担体として使用することができる。これらのペプチドは、以下を含むいくつかの利点を有する：これらのペプチドは、サイズが小さく、これらを製造するのに比較的経済的にしている；これらのペプチドは、接着細胞を標的化し、そのため、血液細胞などの非接着細胞により取り込まれないので、接着細胞への化合物の送達の効率を増加させることができる。本発明者らは、治療用化合物を被験体に送達するため、ならびに研究目的のためのペプチドの使用を意図している。
【００８６】
本発明者らはまた、驚くべきことに、Ｘタンパク質の二量体形成に必要とされるペプチドモチーフを同定した。これらのペプチドは、Ｘタンパク質の機能に拮抗し、本発明者らは、ＨＢＶ感染症の治療および／または管理、ＨＣＣの治療および／または予防、ならびに研究目的のためのその使用を意図している。さらに、これらのペプチドは、Ｘタンパク質を標的化および破壊するために、分解分子（例えば、Ｘタンパク質の不安定性ドメイン、または低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）の酸素依存的分解（ＯＤＤ）ドメイン）に抱合させることができる。このような構造体はまた、ＨＢＶ感染症の治療および／または管理、ＨＣＣの治療および／または予防に利点を有し、ならびに研究目的に有用となり得る。
【００８７】
さらに、本発明者らは、Ｘタンパク質の不安定性ドメインをタンパク質の分解を誘発するために使用することができることを示した。したがって、不安定性ドメインを、特定のタンパク質を標的化する分子に連結させて、分解するためのタンパク質を標的化または標識する構造体を形成することができる。このような構造体は、研究目的および治療上のいくつかの応用への用途を有することができる。例えば、このような構造体を、細胞中の望ましくないタンパク質活性もしくはタンパク質濃度を阻害または減少させるために使用することができるだろう。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「治療」とは、最も広義の文脈で考慮されるべきである。この用語は、完全に回復するまで被験体を治療することを必ずしも意味しない。したがって、「治療」には、例えば、１つまたは複数の障害の症状、１つまたは複数の症状の重症度の予防、寛解または管理、ならびに二次合併症の発生を予防するまたはそうでなくてもそのリスクを低下させることが広く含まれる。例えば、ＨＢＶ感染症の場合、治療には、ウイルス量の減少、もしくはウイルス量の進行中の管理、およびＨＢＶ感染症から生じる二次合併症の発生、特にＨＣＣの発生を予防するもしくはそうでなくてもそのリスクを低下させることが含まれる。疾患の「予防」は、疾患発生を完全に防ぐことを意味するよう解釈すべきではなく、これには疾患発生を遅らせることも含まれる。
ペプチドおよび機能的に同等な変異体
【００８９】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）を含むペプチドまたは前記ペプチドの機能的に同等な変異体を提供する。この中心アミノ酸配列は、ＨＢＶの成熟Ｘタンパク質のアミノ酸位置１６〜２０に対応する（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１８８５７；単離体ＨＢＶ−Ｃ６）。
【００９０】
本発明のこの実施形態のペプチドは、Ｎ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸１〜１５に相当する１個または複数のアミノ酸、および／またはＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸２１〜３５に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含むことができるので、ペプチド配列は、天然タンパク質からの連続したアミノ酸の領域に相当する。これらのペプチドはまた、ＮまたはＣ末端に異種性アミノ酸を含んでもよい。
【００９１】
別の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチドまたは前記ペプチドの機能的に同等な変異体を提供する。この中心アミノ酸配列は、ＨＢＶの成熟Ｘタンパク質のＮ末端アミノ酸１〜８に対応する（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１８８５７）。
【００９２】
本発明のこの実施形態のペプチドは、Ｃ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸９〜３５に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含むことができるので、ペプチド配列は、天然タンパク質からの連続したアミノ酸の領域に相当する。これらのペプチドはまた、ＮまたはＣ末端に異種性アミノ酸を含んでもよい。一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）を含む。
【００９３】
当業者は、本明細書の情報および他の公開された配列情報に鑑みて、天然Ｘタンパク質の位置１〜３５のアミノ酸を容易に認識するだろう。例として、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１８８５７もまた代表的な配列情報を提供していることを参照。さらに、Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｌ、Ｐｕｌｔ  Ｉ、Ｓｔｅｒｎｅｃｋ  Ｍ、Ｗｉｌｌ  Ｈ．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１９９９；５２：２５〜１３７は、いくつかのＸタンパク質についての配列情報を提供している。さらに、有用な配列情報の例を以下の表１に提供する。
【００９４】
【表１】
2013535954.tif 000002
【００９５】
例として、一実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥ（配列番号４）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲ（配列番号５）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）からなる。さらに別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）からなる。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）からなる。さらに別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）からなる。
【００９６】
他の実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦ（配列番号７１）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰ（配列番号７０）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧ（配列番号６９）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳ（配列番号６８）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号６７）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰ（配列番号６６）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧ（配列番号６５）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲ（配列番号６４）、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥ（配列番号４）またはＬＣＬＲＰＶＧＡ（配列番号６３）からなる。
【００９７】
本明細書で先に述べたように、本発明は、本発明のペプチドの機能的に同等な変異体を含む。本明細書で使用する句「機能的に同等な変異体」は、ペプチドの所望の機能を実質的に保持しながら、１個または複数の保存的アミノ酸置換がなされたペプチドを含む。例として、化合物を細胞に送達するために使用されるペプチドの場合、ペプチドおよびその機能的に同等な変異体は、細胞膜を横切り、好ましくは化合物を、細胞膜を横切って輸送する、細胞に入る能力を有するだろう。さらなる例として、Ｘタンパク質の拮抗薬として使用されるペプチドの場合、ペプチドおよびその機能的に同等な変異体は、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する能力を有するだろう。さらなる例として、分解するためのタンパク質を標的化するために使用されるペプチドの場合、ペプチドおよびその機能的に同等な変異体は、その後の分解の標的となるようにタンパク質を標識化する能力を有するだろう。
【００９８】
本発明のペプチドおよびその機能的に同等な変異体は、本明細書中で総括して「ペプチド」と呼ぶことができる。したがって、特に言及しない場合、本明細書中の本発明の「ペプチド」または「ペプチド（複数）」への言及は、その機能的に同等な変異体への言及を含むと解されるべきである。
【００９９】
本明細書で使用する場合、句「細胞膜を横切る」、「化合物を、細胞膜を横切って輸送する」、「細胞膜移行」などは、細胞まで送達されるペプチド、化合物ならびに／あるいはこのようなペプチドおよび化合物を含む抱合体の、細胞の外側から細胞の内側までの輸送を包含するよう広義に解されるべきである。これは、細胞膜を横切るもしくは通る輸送の特定の様式または機構を意味するよう解されるべきではない。同様に、句「化合物の細胞膜透過性を増加させる」とは、化合物が細胞膜を横切る能力の少なくともいくらかの増加または改善があったことを意味するよう広義に解されるべきである。
【０１００】
「機能的に同等な変異体」は、変異体であるペプチドよりも高いまたは低い活性レベルを有してよい。本発明の種々の実施形態では、機能的に同等な変異体は、変異体であるペプチドの活性レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％を有する。
【０１０１】
当業者は、本明細書に含まれる情報に基づいて、および当技術分野で既知の技術を使用して、所望の機能を容易に認識し、機能を評価して、本明細書のペプチドまたはその機能的に同等な変異体ペプチドの活性レベルを決定することができるだろう。しかしながら、例として、化合物を細胞に送達するためのペプチドの使用の場合、ペプチドまたは変異体は、細胞膜を横切り、好ましくは化合物を、細胞膜を横切って輸送し、細胞に入る能力を有するだろう、そしてこの機能および活性レベルは、例えば、後に本明細書の「実施例」の節に記載する技術を使用して、変異体（好ましくは、変異体を含む構造体）の細胞への取り込みに基づいて評価することができる。本明細書の他の実施形態（本明細書の他で記載する）では、本発明のペプチドが、Ｘタンパク質の拮抗薬として作用することが望ましい。このような場合、ペプチドまたはその機能的に同等な変異体は、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する能力を有するだろう、そして、その機能およびその活性レベルは、例えば、後に本明細書の「実施例」の節に記載する技術を使用して、評価することができる。他の実施形態（本明細書の他で記載する）では、本発明のペプチドが、分解するためのタンパク質を標識し、好ましくはタンパク質分解を誘発することが望ましい。このような場合、ペプチドまたはその機能的に同等な変異体は、その後の分解のためにタンパク質を標識化する能力を有するだろう、そして、その機能およびその活性レベルは、標的タンパク質の性質に鑑みて標準的な技術を使用して評価することができる。一実施形態では、後に本明細書の「実施例」の節に記載する技術を使用することができる。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の生化学的特性を有するアミノ酸の置換を意味するよう広義に解されるべきである。当業者は、アミノ酸側鎖置換基の類似性（例えば、そのサイズ、電荷、親水性、疎水性など）を含む、異なるアミノ酸間の相対的類似性に基づいて、適当な保存的アミノ酸置換を認識するだろう。例として、保存的置換には、ある脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸への置換、ヒドロキシルもしくは硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のヒドロキシルもしくは硫黄含有側鎖を有する別のアミノ酸による置換、芳香族アミノ酸の別の芳香族アミノ酸による置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による置換、または酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換が含まれる。例として、「保存的アミノ酸置換」には、
−グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンの別のものへの置換、
−セリン、システイン、スレオニンまたはメチオニンの別のものへの置換、
−フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの１又は別の置換、
−ヒスチジン、リジンまたはアルギニンの別のものへの置換、
−アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンの別のものへの置換
が含まれる。
【０１０３】
本発明のこの態様によるアミノ酸置換を含む機能的に同等な変異体は、好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の本来のペプチドとのアミノ酸配列類似性を保持するだろう。一実施形態では、機能的に同等な変異体は、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の本来のペプチドとの配列同一性を有する。
【０１０４】
本発明のペプチド（機能的に同等な変異体を含む）は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれらの混合物から構成されていてよく、非天然型アミノ酸を含んでよい。
【０１０５】
本発明のペプチド（機能的に同等な変異体を含む）は、「単離型」または「精製型」ペプチドであることを理解すべきである。「単離型」または「精製型」ペプチドは、それが天然に存在する環境から同定および分離された、または人工的に合成されたものである。これらの用語は、ペプチドが天然に存在する環境から精製または分離された程度を反映しないことを認識すべきである。
【０１０６】
本発明のペプチドは、天然の供給源から単離することができる、または好ましくはその方法が、本発明が関連する技術分野で容易に知られる化学合成（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ＧＢ、Ｌａｕｅｒ−Ｆｉｅｌｄｓ  ＪＬ、Ｌｉｕ  ＲＱおよびＢａｒａｎｙ  Ｇ（２００２）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｇｒａｎｔ  Ｇ（２００２）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｇｒａｎｔ  ＧＡ、第２版、９３〜２１９；２２０〜２９１、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）もしくは遺伝子発現技術により得ることができる。標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓｉｌｈａｖｙ等、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）；ならびにＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）に記載されている。本発明者らはまた、適当なトランスジェニック動物、微生物または植物による本発明のペプチドの製造を意図している。
核酸
【０１０７】
本発明のペプチドを組換え技術により製造することができる限り、本発明は、ペプチドのクローニングおよび発現を促進することができる、本発明のペプチドをコードする核酸および本発明のペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。特定の核酸およびベクターはまた、本明細書の後で詳述するように治療目的にも有用であり得る。
【０１０８】
本発明による核酸は「単離型」または「精製型」核酸であることを理解すべきである。「単離型」または「精製型」核酸は、それが天然に存在する環境から同定および分離された、または人工的に合成されたものである。これらの用語は、核酸が天然に存在する環境から精製または分離された程度を反映しないことを認識すべきである。本発明による核酸は、天然の供給源から単離することができる、または好ましくは当業者に容易に知られる化学合成もしくは組換え技術により得ることができる。
【０１０９】
本発明が関連する技術分野の当業者は、本明細書で提供するアミノ酸配列、その遺伝暗号および理解された縮重度、ならびに公開されたＸタンパク質核酸配列（例えば、Ｇｕｏ，Ｙ．およびＨｏｕ，Ｊ．中国本土で流行のＢ型肝炎ウイルスのコンセンサス配列の確立。Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｍｉｎ  Ｇｕｏ  Ｗｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｊｉ  Ｍｉａｎ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  １９：１８９〜２０００、１９９９参照）に基づいて、本発明のペプチドおよび機能的に同等な変異体をコードする種々の核酸を容易に同定することができるだろう。しかしながら、例として、以下の核酸が適当である：
ｃｔｔ  ｔｇｔ  ｃｔａ  ｃｇｔ  ｃｃｃ（Ｘタンパク質の領域１６〜２０を含むペプチド）（配列番号７２）
ｃｔｔ  ｔｇｔ  ｃｔａ  ｃｇｔ  ｃｃｃ  ｇｔｃ  ｇｇｃ（Ｘタンパク質の領域１６〜２２を含むペプチド）（配列番号７３）
ｃｔｔ  ｔｇｔ  ｃｔａ  ｃｇｔ  ｃｃｃ  ｇｔｃ  ｇｇｃ  ｇｃｔ  ｇａａ（Ｘタンパク質の領域１６〜２４を含むペプチド）（配列番号７４）
ｃｔｔ  ｔｇｔ  ｃｔａ  ｃｇｔ  ｃｃｃ  ｇｔｃ  ｇｇｃ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｃｇｃ（Ｘタンパク質の領域１６〜２６を含むペプチド）（配列番号７５）
ｃｔｔ  ｔｇｔ  ｃｔａ  ｃｇｔ  ｃｃｃ  ｇｔｃ  ｇｇｃ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｃｇｃ  ｇｇａ  ｃｇａ  ｃｃｃ  ｇｔｃ  ｔｃｇ  ｇｇｇ  ｃｃｇ  ｔｔｔ  ｇｇｇ（Ｘタンパク質の領域１６〜３５を含むペプチド）（配列番号７６）
ａｔｇ  ｇｃｔ  ｇｃｔ  ａｇｇ  ｃｔｇ  ｔｇｃ  ｔｇｃ  ｃａａ  ｃｔｇ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ｇｃｇ  ｃｇｇ  ｇａｃ  ｇｔｃ  ｃｔｔ  ｔｇｔ  ｃｔａ  ｃｇｔ  ｃｃｃ（Ｘタンパク質の領域１〜２０を含むペプチド）（配列番号７７）
【０１１０】
核酸ベクターは、一般的に、異種性核酸配列を含むだろう。これは、本発明の核酸配列に隣接する自然では見られない核酸配列である。構造体またはベクターは、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、原核生物のものでも真核生物のものでもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。適当な構造体は、好ましくは、本発明の核酸を宿主細胞中に送達するよう適合しており、このような細胞中で複製することができるまたはできない。本発明の核酸を含む組換え構造体は、例えば、本発明の核酸配列のクローニング、配列決定および発現に使用することができる。さらに、本発明の組換え構造体またはベクターは、治療目的に使用することができる。
【０１１１】
本発明が関連する技術分野の当業者は、本発明に使用するのに適した多くの構造体を認識するだろう。しかしながら、本発明者らは、ｐＵＣおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどのクローニングベクターならびにｐＣＤＭ８、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスなどの発現ベクターの使用が特に有用であることを意図している。
【０１１２】
構造体は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終結配列、複製起点および当技術分野で既知の他の適当な制御配列などの制御配列を含んでよい。さらに、構造体は、発現したタンパク質がその宿主細胞から分泌されるのを可能にするための分泌配列を含んでよい。さらに、発現構造体は、融合タンパク質またはペプチドとして挿入された本発明の核酸配列の発現をもたらす融合配列（異種性アミノ酸配列をコードするものなど）を含んでよい。有用な異種性アミノ酸配列には、例えば、その後のペプチドの単離および精製を助けることができるもの（例えば、ユビキチン、ｈｉｓ−タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグもしくはビオチン）またはペプチドの活性を補助するもの（例えば、細胞膜を通る輸送を助ける追加の配列、例えば、ポリアルギニン配列、ｔａｔもしくはペネトラチン）が含まれ得る。異種性アミノ酸配列はまた、ペプチドを別の化合物に連結させて本発明の構造体を形成するのを助けるペプチドリンカーを含んでもよい。
【０１１３】
本発明によると、宿主細胞への核酸ベクターの形質転換は、核酸配列を細胞に挿入することができる任意の方法により達成することができる。例えば、形質転換技術には、形質移入、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、吸着および微粒子銃が含まれる。
【０１１４】
認識されるように、本発明の形質転換核酸配列は、発現される能力が保持されるように染色体外のままであっても、宿主細胞の染色体内の１箇所または複数箇所に組み込まれてもよい。
【０１１５】
本発明の核酸配列のクローニングおよび発現に、当技術分野で既知の任意の数の宿主細胞を利用してよい。例えば、これらの宿主細胞には、それだけに限らないが、微生物、例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ｐＥＥ１４プラスミド系を使用したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの動物細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したもしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系が含まれる。本明細書の「実施例」で後に詳述する宿主細胞が特に有用であることが分かる。
【０１１６】
本発明による組換えペプチドは、当技術分野で標準的な種々の技術を使用したその発現の後に、形質転換宿主細胞または培地から回収することができる。例えば、界面活性剤抽出、超音波処理、溶解、浸透圧ショック処理および封入体精製がある。タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動などの技術を使用してさらに精製することができる。
【０１１７】
本発明のペプチドの組換え発現のための追加のまたは代替の方法論は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）から得ることができる。
担体
【０１１８】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、化合物を、細胞膜を横切って細胞中に輸送するための担体として使用することができる。したがって、本発明は、化合物を細胞に送達する方法、ならびに細胞に送達すべき化合物を本発明のペプチドに結合することにより、この化合物の細胞膜透過性を増加させる方法を提供する。本発明はまた、担体ペプチドと、細胞に送達することが望まれる少なくとも１種の化合物とを含む構造体を提供する。
【０１１９】
少なくとも１種の化合物は、細胞に送達することが望まれる任意の化合物であってよい。このような化合物には、治療上のもしくは診断上の利点をもたらすことができる化合物、または研究目的に有用な化合物が含まれる。特定の実施形態では、化合物は、核酸、ペプチド核酸、ポリペプチド（例えば、融合タンパク質を含む）、炭化水素、ペプチド模倣体、低分子阻害剤、化学療法剤、抗炎症薬、抗体、単鎖Ｆｖフラグメント（ＳＣＦＶ）、脂質、プロテオグリカン、糖脂質、リポタンパク質、糖模倣体、天然産物または融合タンパク質である。化合物が核酸である場合、これは例えば、ＤＮＡザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｃＲＮＡおよびリボザイム、ファージミド、アプタマーを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖、一本鎖、センス、アンチセンスまたは環状であり得る。当業者は、本発明のこの実施形態による化合物のさらなる例を容易に認識することができる。
【０１２０】
特定の一実施形態では、化合物は、Ｘタンパク質を分解するまたは分解するためのＸタンパク質を標的化するよう適合したペプチドである。例として、化合物は、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチド（またはその機能的に同等な変異体）である。他の実施形態では、化合物は、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体である。これらの配列の「機能的に同等な変異体」には（ここでまたは本明細書の他で言及する場合）、例えば、本明細書の表１に記載するものを含む既知のＨＢＶ変異体のいずれかに由来するペプチドが含まれる。代表的な配列には以下が含まれる：
【０１２１】
【表２】
2013535954.tif 000003
【０１２２】
別の実施形態では、化合物は、ＨＩＦ１αの酸素依存的分解ドメイン（ＯＤＤ）の配列（ＭＬＡＰＹＩＰＭ）（配列番号１３）を含むペプチド（またはその機能的に同等な変異体）である。
【０１２３】
本明細書で後にさらに記載するように、本発明のこの実施形態の構造体は、Ｘタンパク質の機能の拮抗薬として、したがって、肝細胞癌などのＨＢＶ感染症から生じる合併症を含むＨＢＶ感染症の治療に有用である。
【０１２４】
別の実施形態では、化合物は、Ｂ−ｒａｆの少なくとも一部を形成するペプチドを含むペプチドである。特定の一実施形態では、Ｂ−ｒａｆの一部を形成するペプチドは、アミノ酸配列ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。
【０１２５】
特定の一実施形態では、構造体は、ペプチドＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）およびペプチドＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）を含む。別の特定の実施形態では、構造体は、ペプチドＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）およびペプチドＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）を含む。
【０１２６】
別の特定の実施形態では、構造体は、ペプチドＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）およびペプチドＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）を含む。別の特定の実施形態では、構造体は、ペプチドＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）およびペプチドＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）を含む。
【０１２７】
担体ペプチドおよび細胞に送達すべき少なくとも１種の化合物を、任意の手段により互いに「結合」して、化合物の少なくとも一定レベルの機能および構造を保持しながら、ペプチドが化合物を、細胞膜を横切って細胞中に輸送することを可能にすることができる。単語「結合」などは、担体ペプチドと少なくとも１種の化合物との間の任意の形態の付着、結合、融合または会合（例えば、それだけに限らないが、共有結合、イオン結合、水素結合、芳香族スタッキング相互作用、アミド結合、ジスルフィド結合、キレート化）を包含すると広義に解されるべきであり、特定の強度の結合を意味すると解されるべきではない。担体ペプチドおよび少なくとも１種の化合物は、不可逆的または可逆的様式で結合することができ、細胞に侵入すると、化合物は担体ペプチドから放出される。
【０１２８】
少なくとも１種の化合物は、そのＮ末端、そのＣ末端または任意の他の位置で担体ペプチドに結合することができる。特定の一実施形態では、化合物は、そのＮ末端で担体ペプチドに結合される。別の特定の実施形態では、化合物は、そのＣ末端で担体ペプチドに結合される。
【０１２９】
当業者は、構造体に含ませる少なくとも１種の化合物の性質に鑑みて、本発明の構造体を製造するための方法論を容易に認識するだろう。このような方法は、ペプチドおよび化合物を別々に製造し、次いでこれらを結合すること、構造体の化学合成、構造体の組換え発現などを含む。
【０１３０】
例として、少なくとも１種の化合物がペプチドである本発明の実施形態では、構造体は、既知の組換え発現または化学合成技術（本明細書で前に記載したような）を使用して融合タンパク質の形態で製造してよい。担体ペプチドおよび細胞に送達すべきペプチド（化合物）はまた、別々に製造して後で互いに結合させてもよい。
【０１３１】
さらなる例として、細胞に送達すべき化合物が核酸の場合、担体ペプチドおよび核酸を（例えば、化学合成または組換え技術を使用して）別々に製造して、その後、いくつかの既知の技術の１つによって結合してもよい。
【０１３２】
さらなる例として、少なくとも１種の化合物が炭化水素である本発明の実施形態では、担体ペプチドおよび炭化水素を別々に製造して、その後、いくつかの既知の技術の１つによって結合してもよい。
【０１３３】
さらなる例として、少なくとも１種の化合物が脂質である本発明の実施形態では、担体ペプチドおよび脂質を別々に製造して、その後、いくつかの既知の技術の１つによって結合してもよい。
【０１３４】
単なる例として、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７、ＷＯ０１／１３９５７に記載されている方法論を使用して本発明の種々の構造体を製造してもよい。
【０１３５】
担体ペプチドおよび細胞に送達すべき少なくとも１種の化合物が直接互いに結合されていてもよいが、本発明の構造体はまた、少なくとも１種の化合物を担体ペプチドに結合するリンカー分子を利用してもよいことを認識すべきである。当業者は、本発明で有用な適当なリンカー分子を認識するだろう。しかしながら、例として、リンカー分子は、ペプチドであってよい。適当なリンカー分子の例はまた、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７に提供されている。
【０１３６】
本発明の実施に必ずしも必要ではないが、一実施形態では、構造体は、少なくとも１種の追加の異種性分子をさらに含んでよい。単なる例として、異種性分子は、構造体の活性（例えば、担体ペプチドもしくは細胞に送達すべき化合物、または両者の活性）を補助する、構造体を分解から保護するまたはそうでなくても構造体の半減期を増加させる、あるいは製造中に構造体の単離および精製を助けることができる分子であってもよい。一実施形態では、異種性分子は、細胞膜透過性を補助することができる分子（例えば、ポリアルギニン、Ｔａｔまたはペネトラチンなど）である。別の実施形態では、分子は、組換えで発現する構造体の単離を助けることができるｈｉｓ−タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグまたはビオチンであってもよい。別の実施形態では、異種性分子は、構造体を特定の細胞型に標的化するのを補助することができる分子である。本明細書で使用する場合、「構造体を特定の細胞型に標的化する」、「所望の細胞を特異的に標的化する」などの句は、１００％の特異性が好ましいが、１００％の特異性を要すると解されるべきではない。別の実施形態では、異種性分子は、構造体を特定の分子標的に標的化するのを補助することができる分子である。本明細書で使用する場合、「構造体を特定の分子標的に標的化する」、「所望の分子を特異的に標的化する」などの句は、１００％の特異性が好ましいが、１００％の特異性を要すると解されるべきではない。
【０１３７】
異なる異種性分子の組み合わせを本発明の構造体に使用してもよいことを認識すべきである。
【０１３８】
異種性分子は、異種性分子の化学的性質に鑑みて、（本発明の構造体の製造／ペプチド担体の少なくとも１種の化合物への結合に関して本明細書で前に記載したような）任意の適当な手段を使用して、担体ペプチドおよび／または細胞に送達すべき化合物に結合してもよいし、構造体の一部として合成してもよい。一実施形態では、異種性分子はペプチドベースである。しかしながら、本発明が関連する技術分野の当業者は、本発明の構造体に結合するまたは組み込むことができる代替性質の分子を容易に認識するだろう。代替分子の例は、例えば、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７に提供されている。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明のこの態様の構造体は、アミノ酸配列：
ＲＲＲＲＲＲＲＲＭＬＡＰＹＩＰＭＧＧＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号７８）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧＧＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号７９）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号８０）；または
ＲＲＲＲＲＲＲＲＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号８１）
を含む。
Ｘタンパク質の機能の拮抗薬
【０１４０】
一実施形態では、本発明の特定のペプチド（その機能的に同等な変異体を含む）および同ペプチドを含む構造体を、Ｘタンパク質の機能の拮抗薬として使用することができる。したがって、前記ペプチドおよび構造体を使用して、例えば、研究または治療目的のために、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱することができる。特定の一実施形態では、本発明者らは、ＨＢＶ感染症の治療および管理、ならびにＨＣＣの治療（本明細書で前に定義した予防を含む）へのペプチドまたはペプチドを含む構造体の使用を意図している。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、「拮抗薬」、「拮抗する」、「Ｘタンパク質の機能を攪乱する」などの用語は、Ｘタンパク質の機能または活性の低下を指すと広義に解されるべきである。これらの用語は、機能または活性の完全な阻害を意味すると解されるべきではない。当業者は、Ｘタンパク質の機能および活性を評価するために使用することができる方法を容易に認識するだろう。しかしながら、例として、本明細書の「実施例」の節に記載する方法論を使用することができる。
【０１４２】
一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）または本明細書に記載するその機能的に同等な変異体を含む。別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）または本明細書に記載するその機能的に同等な変異体を含む。
【０１４３】
一実施形態では、本発明は、分解分子と、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を提供する。
【０１４４】
一実施形態では、本発明は、分解分子と、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を提供する。
【０１４５】
分解分子は、Ｘタンパク質を分解するまたは分解するためのＸタンパク質を標的化するよう適合した任意の分子であってよい。一実施形態では、分解分子は、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。他の実施形態では、分解分子は、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体である。別の実施形態では、分解分子は、アミノ酸配列ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。当業者は、使用することができる他の適当な分解分子を容易に認識するだろう。しかしながら、例として、ポリユビキチン化を受ける任意のペプチドを使用することができる。
【０１４６】
この節で使用する句「機能的に同等な変異体」は、本明細書で前に記載したのと同じ一般的意味を有すると解されるべきである。さらに、特定のペプチド分解分子の機能的に同等な変異体は、少なくともいくらかのＸタンパク質を分解するまたは分解するためのＸタンパク質を標的化する能力を保持するだろう。ペプチド分解分子の変異体の機能および活性は、本明細書の「実施例」の節または当技術分野で既知の任意の他の適当な方法論に記載されている方法論を使用して決定することができる。
【０１４７】
本発明のこの実施形態のペプチドおよび構造体は、本発明の他のペプチドおよび構造体について本明細書で前に記載した技術を使用して製造することができる。構造体は、本発明の１種または複数のペプチドと１種または複数の分解分子の任意の組み合わせを含んでよい。これらはまた、例えば、本明細書で前に記載したものを含む追加の異種性分子およびリンカーを含んでもよい。これらはまた、本発明の他の構造体について前に記載したように、構造体が特定の細胞型もしくは特定の分子標的を標的化するのを可能にすることができる追加のモチーフまたは分子、ならびに／あるいは細胞透過性を補助することができるモチーフまたは分子を含んでもよい。特定の一実施形態では、構造体は、ポリアルギニンペプチド（例えば、Ｒ４〜Ｒｎ、一例ではＲ９）を含み、アミノ酸配列：
ＲＲＲＲＲＲＲＲＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（Ｒ８−代表的なオリゴマー形成ドメイン−不安定性ドメイン）（配列番号８２）；または
ＲＲＲＲＲＲＲＲＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧＧＭＬＡＰＹＩＰＭ（Ｒ８−代表的なオリゴマー形成ドメイン−ＨＩＦのＯＤＤ）（配列番号８３）
を含む。
分解するためのタンパク質の標的化
【０１４８】
一実施形態では、本発明のペプチドは、その後に分解するためのタンパク質を標的化または標識する能力を有する。これらのペプチドには、配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体が含まれる。特定の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）、ＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【０１４９】
本実施形態によると、本発明はまた、少なくとも１種の標的化分子と、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）、ＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）またはその機能的に同等な変異体を含む。
【０１５０】
この節で使用する句「機能的に同等な変異体」は、本明細書で前に記載したのと同じ一般的意味を有すると解されるべきである。さらに、前の段落で言及したペプチドの機能的に同等な変異体は、少なくともいくらかのＸタンパク質（もしくは別の標的タンパク質）を分解するまたは分解するためのＸタンパク質を標的化する能力を保持するだろう。ペプチド分解分子の変異体の機能および活性は、本明細書の「実施例」の節に記載する方法論または当技術分野で既知の任意の他の適当な方法論に記載されている方法論を使用していてもよい。
【０１５１】
さらに、句「分解するためのタンパク質を標的化する」などは、細胞または組成物中に存在する全てのタンパク質を標的化すること、または全てのこのような標的化もしくは標識化タンパク質をその後分解することを意味することを意図していない。
【０１５２】
標的化分子は、構造体がその後に分解するための対象とする特定のタンパク質を標的化することを可能にする任意の分子であってよい。例えば、標的化分子は、疾患に関係するタンパク質であってよい。好ましくは、標的化は特異的である。例として、この分子は、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体、単鎖Ｆｖフラグメント（ＳＣＦＶ）、アプタマー、ファージミド（ファージディスプレイ）または低分子であってよい。２種以上の標的タンパク質が分解のために標識され得るように、２種以上の標的化分子を構造体に組み込んでもよい。
【０１５３】
一実施形態では、ペプチドである標的化分子は、その標的の二量体形成ドメインまたは標的タンパク質との相互作用の部位を表すことができる。
【０１５４】
一実施形態では、標的化分子は、本発明のペプチド、好ましくは、ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。別の実施形態では、標的化分子は、配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。これらの実施形態では、標的化分子は、その後に分解するためのＸタンパク質を標的化するだろう。
【０１５５】
別の実施形態では、標的化分子は、タンパク質Ｂ−ｒａｆの一部を形成するペプチドである。特定の一実施形態では、Ｂ−ｒａｆのペプチドは、Ｂ−ｒａｆのオリゴマー形成ドメインまたはその一部を含む。一実施形態では、Ｂ−ｒａｆのペプチドは、アミノ酸配列ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、またはからなる。別の実施形態では、Ｂ−ｒａｆのペプチドは、それぞれＢ−ｒａｆのアミノ酸２３３〜２５５および４０５〜４２７を表すアミノ酸配列ＴＴＨＮＦＶＲＫＴＦＦＴＬＡＦＣＤＦＣＲＫＬＬ（配列番号９２）およびＳＬＰＧＳＬＴＮＶＫＡＬＱＫＳＰＧＰＱＲＥＲＫ（配列番号９３）、またはその機能的に同等な変異体を含む。これらの実施形態では、標的化分子は、その後に分解するためのＢ−ｒａｆを標的化するだろう。Ｂ−ｒａｆは、黒色腫に関係し、例えば、本発明のこの実施形態の構造体をその治療に使用することができる。
【０１５６】
他の実施形態では、標的化分子は、タンパク質Ｎ−ＲａｓまたはＰＤＧＦ受容体を標的化する。例えば、それぞれＲａｆ１のＮ−Ｒａｓ結合配列のアミノ酸１４３〜１５０または９５〜１０１を表すアミノ酸配列ＲＫＴＦＬＫＬＡ（配列番号９４）およびＣＣＡＶＦＲＬ（配列番号９５）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体である。さらなる例として、ＰＤＧＦ受容体と相互作用する４４ａａ残基ウシパピローマウイルスＥ５タンパク質（ＭＰＮＬＷＦＬＬＦＬＧＬＶＡＡＭＱＬＬＬＬＬＦＬＬＬＦＦＬＶＹＷＤＨＦＥＣＳＣＴＧＬＰＦ（配列番号９６）のペプチドもしくはペプチドフラグメント、またはその機能的に同等な変異体を使用することができる。これらの実施形態では、標的化分子は、その後に分解するためのＮ−ＲａｓまたはＰＤＧＦ受容体を標的化するだろう。Ｎ−ＲａｓおよびＰＤＧＦ受容体は、黒色腫に関係し、例えば、Ｂ−ｒａｆに基づく治療に対する耐性および本発明のこの実施形態の構造体をその治療に使用することができる。
【０１５７】
一実施形態では、構造体は、Ｎ−ＲａｓおよびＢ−ｒａｆの両方を標的化する１種または複数のペプチドを含んでよい。別の実施形態では、構造体は、ＰＤＧＦ受容体およびＢ−ｒａｆの両方を標的化する１種または複数のペプチドを含んでよい。別の実施形態では、構造体は、ＰＤＧＦ受容体、Ｎ−ＲａｓおよびＢ−ｒａｆを標的化する１種または複数のペプチドを含んでよい。
【０１５８】
Ｎ−Ｒａｓ、Ｂ−ｒａｆ、Ｒａｆ１、ウシパピローマウイルスＥ５タンパク質およびＰＤＧＦ受容体のペプチドに関して使用する場合の句「機能的に同等な変異体」は、本明細書のこの態様のペプチドの機能、すなわち、その後に分解するためのタンパク質を標的化する能力に鑑みても、本明細書で前に記載したのと同じ一般的意味を有すると解されるべきである。
【０１５９】
Ｎ−Ｒａｓ、Ｂ−ｒａｆおよびＰＤＧＦ受容体についての代表的なアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ中に見出すことができ、例えば、ＮＭ＿００２５２４（Ｎ−Ｒａｓ）、ＮＭ＿００４３３３（Ｂ−ｒａｆ）ならびにＮＭ＿００２６０９およびＮＭ＿００６２０６（ＰＤＧＦ受容体）を参照されたい。Ｒａｆ−１およびウシパピローマウイルスＥ５タンパク質についての代表的なアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ中に見出すことができ、例えば、ＮＭ＿００２８８０（Ｒａｆ−１）およびＮＰ＿０５６７４２（Ｅ５タンパク質）を参照されたい。
【０１６０】
当業者は、いくつかの代替標的化分子および本発明により有用に標的化され得る分子を容易に認識するはずである。しかしながら、例として、これらに限定されないが、以下の分子が有用な標的となり得る：がんに関しては、ＣＤ２０、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ−２）、ホスホリパーゼＣ−γ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ｍｙｃ、インスリン様増殖因子、ｒａｓ、ｒａｆ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＤＫ）、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ａｋｔキナーゼ、ｓｒｃ、（ヒストン脱アセチル化酵素）ＨＤＡＣ、Ｂｃｌ−２、ＸＩＡＰ、ｈｓｐ９０、Ｆｌｔ３、ｃ−ｋｉｔ、サイクリン依存性キナーゼ、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体、オータキシン、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、低酸素誘導因子、デルタ様４、サバイビン、ＬＭＴＫ３、ＲＡＮＫリガンド、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、未分化リンパ腫キナーゼ、エストロゲン受容体、アロマターゼ、アンドロゲン受容体、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ、インテグリン、ＣＴＬＡ−４および後者分子全てが相互作用する分子を使用することができる。また、炎症性疾患に関しては、例として、これらに限定されないが、標的化され得る分子には、白血球インテグリン（α４、β２およびβ７インテグリン）およびその相互作用パートナー、セレクチンおよびそのパートナー、ＴＮＦおよびその受容体、プロスタグランジンＤ２受容体ＤＰ１およびＣＲＴＨ２、ロイコトリエン受容体、ケモカインおよびその受容体、炎症性サイトカインおよびその受容体、シクロフィリン、デオキシハイプシン合成酵素およびデオキシハイプシン水酸化酵素、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホジエステラーゼ、ＮＦ−κＢ、インフラマソーム、エラスターゼ、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３複合体、Ｔｏｌｌ様受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ受容体、Ｔ細胞共刺激分子、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、補体成分およびその受容体、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、ＭＡＰキナーゼ（例えば、ｐ３８）ならびにｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が含まれ得る。
【０１６１】
二量体形成する上記代表的な分子のいずれかを使用して、それ自体を標的化することができ、そうでなければ相互作用分子およびリガンド、ならびにその由来ペプチドが適当な標的化分子として働くだろう。
【０１６２】
このような分子および他の分子は、例えば、Ｄａｎｃｅｙ  ＪＥ、Ｃｈｅｎ  ＨＸの分子的に標的化された抗がん剤の組み合わせを最適化するための戦略。Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００６年８月；５（８）：６４９〜５９；Ｐｅｎｇ  Ｘ、Ｐｅｎｔａｓｓｕｇｌｉａ  Ｌ、Ｓａｗｙｅｒ  ＤＢの出現した抗がん治療標的および心血管系：懸念材料は存在するか？  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０１０年４月２日；１０６（６）：１０２２〜３４；Ｂｅｎｓｏｎ  ＪＤ、Ｃｈｅｎ  ＹＮ、Ｃｏｒｎｅｌｌ−Ｋｅｎｎｏｎ  ＳＡ、Ｄｏｒｓｃｈ  Ｍ、Ｋｉｍ  Ｓ、Ｌｅｓｚｃｚｙｎｉｅｃｋａ  Ｍ、Ｓｅｌｌｅｒｓ  ＷＲ、Ｌｅｎｇａｕｅｒ  Ｃの制癌剤標的の検証。Ｎａｔｕｒｅ  ２００６年５月２５日；４４１（７０９２）：４５１〜６；Ｋｌｅｉｎ  Ｓ、Ｌｅｖｉｔｚｋｉ  Ａの標的化がん療法：将来性および現実。Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；９７：２９５〜３１９；Ｗｕ等。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２：５７〜６６、２００６；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＤＬの優れた抗炎症薬標的を作り出すのは何か？Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００６年３月；１１（５〜６）：２１０〜９．；Ｂｕｃｋｌｅｌ  ＤＲ、Ｈｅｄｇｅｃｏｃｋ  ＣＪＲの炎症および免疫調節の薬物標的。Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２：３２５〜３３２、１９９７；およびＫｕｌｋａｒｎｉ  ＲＧ、Ａｃｈａｉａｈ  Ｇ、Ｓａｓｔｒｙ  ＧＮの抗炎症および抗関節炎薬の新規標的。Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２００６；１２（１９）：２４３７〜５４に記載されている。
【０１６３】
本発明のこの態様の構造体は、本発明の１種または複数のペプチドと１種または複数の標的化分子の任意の組み合わせを含んでよい。
【０１６４】
本発明のこの実施形態のペプチドおよび構造体は、例えば、本発明の他の構造体について本明細書の他で記載した要素を含む、技術を使用して作ることができ、追加の成分を含み得る。例えば、これらは、例えば、本明細書で前に記載したものを含む、追加の異種性分子およびリンカーを含んでよい。これらはまた、構造体が所望の細胞を特異的に標的化するのを可能にする分子を含んでもよい。例えば、黒色腫細胞を標的化することを望む場合、ＹＩＧＳＲ（ラミニンペンタペプチド）（配列番号９７）もしくはＡｃ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（α−メラニン形成細胞刺激ホルモン類似体）（配列番号９８）を含むまたはからなるペプチドを使用してよい。さらなる例として、構造体はまた、本発明の他の構造体について前に記載した、細胞透過性を補助することができる追加のモチーフまたは分子を含んでもよい。特定の一実施形態では、構造体は、ポリアルギニンペプチド（例えば、Ｒ４〜Ｒｎ）を含む。例として、一実施形態（Ｂ−ｒａｆの標的化に関連する）では、構造体は、Ｒ８を含み、アミノ酸配列：
ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）
を含む。
構造体をコードする核酸および核酸ベクター
【０１６５】
本発明の構造体は、組換えクローニングおよび発現技術を使用して製造することができ、したがって、本発明は、構造体をコードする核酸およびこのような核酸を含むベクターを含むと解されるべきである。さらに、本発明のペプチド／構造体をコードする核酸は、治療上または試験管内で使用することができるということを認識すべきである。例えば、本発明のペプチドまたは構造体を、ＨＢＶ感染症もしくはＨＣＣの治療に、または任意の他の障害の治療のために、またはＸタンパク質もしくは分解するための任意の他のタンパク質を標的化するために使用する本発明の実施形態では、構造体をコードする核酸／発現ベクターを投与することができ、ペプチド／構造体がその後発現する。さらなる例として、本発明のペプチドが担体として使用される実施形態では、核酸／発現ベクターを被験体に投与することができ、ペプチド／構造体はその後発現し、関連細胞または組織に送達される。したがって、本発明は、これらの目的に適した核酸および核酸ベクターを含む。
【０１６６】
当業者は、本明細書で前に記載した担体ペプチドの核酸およびペプチド配列、ならびに細胞に送達すべきペプチド化合物の性質に鑑みて、本発明の構造体をコードする核酸の配列を容易に認識するだろう。同様に、当業者は、構造体をクローニングおよび発現するための適当なベクターを容易に認識するだろう。しかしながら、例として、核酸ベクター（例えば、ｐＵＣベクター、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス）および本明細書の他で詳述した技術（例えば、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７を含む）を使用することができる。
組成物
【０１６７】
本発明はまた、１種または複数の希釈剤、担体および／または賦形剤および／または追加の成分と共に本発明のペプチドおよび／または構造体（またはペプチドおよび／または構造体をコードする核酸）を含む組成物を提供する。この程度まで、本発明のペプチド、構造体または核酸の送達または投与への本明細書での言及は、本発明のペプチド、構造体および／または核酸を含む組成物の送達または投与への言及を含むことを認識すべきである。
【０１６８】
一実施形態では、１種または複数の希釈剤、担体および／または賦形剤は、試験管内での使用に適している。別の実施形態では、１種または複数の希釈剤、担体および／または賦形剤は、生体内での使用に適している（この例では、これらは「薬学的に許容される」と呼ぶことができる）。
【０１６９】
「薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤」は、医薬組成物を調製するのに有用な物質を含むことを意図しており、本発明のペプチド、構造体またはペプチドもしくは構造体をコードする核酸がその所期の機能を行うのを可能にしながらこれらと共に投与することができ、一般的に安全で、非毒性であり、生物学的にも他の点でも望ましくないものでない。薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤には、獣医学用途ならびにヒト製薬用途に適したものが含まれる。薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤の例としては、溶液、溶媒、分散媒体、遅延剤、乳剤などが挙げられる。
【０１７０】
標準的な希釈剤、担体および／または賦形剤に加えて、本発明による組成物は、１種または複数の追加の成分と共に、あるいは例えば、ペプチド、構造体、ペプチドもしくは構造体をコードする核酸、および／または細胞に送達すべき化合物の活性を高める、完全性を保護するまたはこのような薬剤の半減期もしくは貯蔵寿命を増加させるのを助ける、または他の所望の利点を提供するような様式で製剤化してもよい。例として、組成物は、タンパク質分解から保護する、生物学的利用能を高める、抗原性を減少させるまたは被験体に投与した場合の遅延放出を可能にする成分をさらに含んでよい。例えば、遅延放出媒体には、マクロマ、ポリ（エチレングリコール）、ヒアルロン酸、ポリ（ビニルピロリドン）またはヒドロゲルが含まれる。さらなる例として、組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、緩衝剤などを含んでもよい。本発明が関連する技術分野の当業者は、特定の目的のために望ましいさらなる添加剤を容易に同定するだろう。
【０１７１】
さらに、本発明の性能に必要ではないが、本発明のペプチド、構造体、ペプチドもしくは構造体をコードする核酸、および／または化合物の細胞透過性を、組成物の製剤化を通して増加または促進させてもよい。例えば、本発明のペプチド、構造体、ペプチドもしくは構造体をコードする核酸、および／または化合物を、リポソームに製剤化してもよい。さらなる例は、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７に提供されている。
【０１７２】
さらに、本発明による医薬組成物を、特定の例で細胞または被験体の利益になり得る追加の有効成分と共に製剤化してよいことが意図される。本発明が関連する技術分野の当業者は、本明細書中の本発明の記載、ならびに例えば、治療すべき任意の疾患の性質および進行を含む、ペプチド、化合物および／または構造体の送達が必要とされる目的に鑑みて、適当な追加の有効成分を容易に認識するだろう。一般的な例として、ＨＢＶ感染症を治療するために使用する薬剤（インターフェロンα、ラミブジン、アデホビルジピボキシル（ヘプセラ）、バラクルード（エンテカビル））、またはＨＣＣの発生を予防もしくは阻害するために使用する薬剤（ソラフェニブ、オーロラキナーゼ阻害薬ＰＨＡ−７３９３５８、ラクトフェリン、ω３脂肪酸、ゲフィチニブ、ＥＧＦＲ阻害剤、ウロコルチン、血管新生阻害薬（例えば、ＴＮＰ−４７０）、フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、免疫賦活薬）を使用してよい。
【０１７３】
本発明の組成物は、例えば、液剤、経口投与用液剤、注射用液剤、錠剤、コーティング錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、坐剤、経皮吸収パッチ、懸濁剤、乳剤、徐放製剤、ゲル剤、エアロゾルおよび散剤などの任意の慣用的形態に製剤化してよい。さらに、徐放製剤を利用してよい。選択する形態は、組成物を意図する目的および試料もしくは被験体への送達もしくは投与の様式を反映するだろう。単なる例として、被験体への投与のため、例えば、疾患（ＨＢＶ感染症およびＨＣＣを含むがこれらに限らない）の治療のために組成物を製剤化する場合、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７に例示される剤形を使用することができる。
【０１７４】
当業者は、適当な製剤化方法を容易に認識するだろう。しかしながら、例として、組成物を製剤化する特定の方法を、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００中に見出すことができる。
方法
【０１７５】
本明細書で前に述べたように、一実施形態では、本発明は、本発明の担体ペプチドまたは構造体を使用して、１種または複数の化合物を細胞に送達する方法を提供する。
【０１７６】
別の実施形態では、本発明は、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法を提供する。「接着」細胞とは（refers to are）、基質、マトリックス、他の細胞または表面に付着している細胞を指す。「非接着」細胞とは、基質、マトリックス、他の細胞または表面に付着していない細胞（例えば、血液中の循環細胞）を指す。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する特定のペプチド（その機能的に同等な変異体を含む）または前記ペプチドもしくは機能的に同等な変異体を含む構造体を使用して、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、前記ペプチド（その機能的に同等な変異体を含む）または前記ペプチドもしくは機能的に同等な変異体を含む構造体を被験体に投与するステップを含む、ＨＢＶ感染症を治療する方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、前記ペプチド（その機能的に同等な変異体を含む）または前記ペプチドもしくは機能的に同等な変異体を含む構造体を被験体に投与するステップを含む、ＨＣＣを治療（予防を含む）する方法を提供する。前記方法はまた、本発明の関連するペプチドもしくは構造体をコードする核酸および／または前記核酸を含むベクターを被験体に投与するステップを含んでもよいことを認識すべきである。
【０１７８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する特定のペプチド（機能的に同等な変異体を含む）または前記ペプチドもしくは機能的に同等な変異体を含む構造体を使用して、その後に分解するためのタンパク質を標的化する方法を提供する。前記方法はまた、本発明の関連するペプチドもしくは構造体をコードする核酸および／または前記核酸を含むベクターの使用を含んでもよいことを認識すべきである。前記方法は、研究目的のためまたは疾患、例えば、１種もしくは複数のタンパク質の望ましくない濃度もしくは活性に関連する疾患の治療に、または例えば、研究目的のための細胞および組織中のタンパク質のノックダウンのために使用することができる。例として、１種または複数の特定のタンパク質を標的化することにより、がんを治療するためにこの方法を使用することができる（本明細書に例示するように）。特定の一実施形態では、この方法は、分解するためのＢ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１つまたは複数を標的化することにより、黒色腫を治療するためのものである。がんおよび炎症性障害を治療するための適当な標的のさらなる例は、本明細書で前に提供されている。しかしながら、特定の例として、この方法は、タンパク質Ｃ２０、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ−２）、ホスホリパーゼＣ−γ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ｍｙｃ、インスリン様増殖因子、ｒａｓ、ｒａｆ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＤＫ）、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ａｋｔキナーゼ、ｓｒｃ、（ヒストン脱アセチル化酵素）ＨＤＡＣ、Ｂｃｌ−２、ＸＩＡＰ、ｈｓｐ９０、Ｆｌｔ３、ｃ−ｋｉｔ、サイクリン依存性キナーゼ、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体、オータキシン、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、低酸素誘導因子、デルタ様４、サバイビン、ＬＭＴＫ３、ＲＡＮＫリガンド、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、未分化リンパ腫キナーゼ、エストロゲン受容体、アロマターゼ、アンドロゲン受容体、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ、インテグリン、ＣＴＬＡ−４および後者分子全てが相互作用する分子の１種または複数を標的化することによりがんを治療するためのものである。
【０１７９】
本発明のペプチドおよび／または構造体（または同物をコードする核酸）の送達は、送達を必要とする目的に応じて、生体内または試験管内で起こり得る。
【０１８０】
ペプチドおよび／または構造体（または同物をコードする核酸）は、当業者により容易に認識されるようないくつかの異なる手段により、細胞に送達してよい。しかしながら、例として、試験管内法は、構造体および／またはペプチド（または同物をコードする核酸またはベクター）を、１種もしくは複数の細胞または対象となる１種もしくは複数の細胞もしくはタンパク質を含む組成物と接触される（例えば、Ｘタンパク質の機能を拮抗することに関連する実施形態では、１種もしくは複数の細胞および／または１種もしくは複数のＸタンパク質あるいは１種もしくは複数の細胞および／または１種もしくは複数のＸタンパク質を含む組成物に接触させる）；例えば、構造体またはペプチド（または同物をコードする核酸またはベクター）を、１種または複数の細胞（または特定の実施形態では対象となるタンパク質）が含まれる試料、組成物または媒体に接触させる（例えば、本発明の組成物を、１種または複数の細胞またはタンパク質を含む液体試料と混合する）ステップを含んでよい。別の実施形態では、本発明の方法は、構造体および／またはペプチド（または同物をコードする核酸またはベクター）を被験体に投与するステップを含む。
【０１８１】
本発明は種々の異なる同物に適用可能であることが、本発明の性質および本明細書に報告する結果に鑑みて、本発明が関連する技術分野の当業者に認識されるだろう。したがって、「被験体」には、対象となる任意の動物が含まれる。しかしながら、特定の一実施形態では、「被験体」は、哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０１８２】
本明細書の他で述べるように、本発明者らは、担体ペプチドおよび担体ペプチドを含む本発明の関連する構造体が非接着細胞に取り込まれないことを確認した。本発明者らは、投与される用量は薬剤の非特異的取り込みによって循環血液細胞中に希釈されるべきではないので、このことが前記ペプチドおよび構造体を、他の既知のペプチドおよび構造体よりも全身投与に適したものにしていると考えている。しかしながら、被験体への投与は、本発明の薬剤（ペプチド、化合物、構造体または同物をコードする核酸もしくはベクター）を被験体の体内の標的細胞に送達することができる任意の手段により起こり得る。例として、本発明の薬剤は、以下の経路の１つにより投与することができる：経口、局所、全身（例えば、経皮、鼻腔内もしくは坐剤により）、非経口（例えば、筋肉内、皮下もしくは静脈内注射により）、ＣＮＳへの投与により（例えば、髄腔内もしくは嚢内注射により）、肝臓への投与により（例えば、門脈内注射により）、埋め込みにより、および浸透ポンプ、経皮吸収パッチなどの装置を通した注入により。当業者は、他の適当な投与経路を同定することができる。代表的な投与経路はまた、例えばＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７にも概説されている。
【０１８３】
認識されるように、投与する薬剤の用量、投与期間および一般的な投与体制は、薬剤を送達する理由、薬剤を送達すべき標的細胞、および治療する被験体の任意の症状の重症度、治療する障害の種類、選択する投与の様式、ならびに被験体の年齢、性別および／または全身健康状態などの変数に応じて、被験体間で異なってよい。
【０１８４】
投与には、必要に応じて１日１回投与、いくつかの別々に分けた投与、または連続的な投与が含まれ得ることを認識すべきである。
【０１８５】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトに使用するための一定範囲の用量を処方するのに使用することができる。用量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用する任意の薬剤のために、治療上有効用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む細胞濃度範囲を達成するよう用量を細胞培養液または動物モデルで処方することができる。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。正確な処方、投与経路および用量は、患者の状態に照らして個々の医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５、Ｉｎ：Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁参照）。
【０１８６】
ＨＢＶ感染症の進行中、または感染が疑われた時からを含めた、ＨＣＣの発生前もしくは後の任意の時に投与が起こり得る。一実施形態では、本発明の薬剤は、ウイルス量および症状の進行中の管理を補助するために長期間、１日基準で投与される。別の実施形態では、本発明の薬剤は、ＨＣＣの発生を予防または遅延するために長期間または生涯、１日基準で投与される。投与体制の追加の例は、ＷＯ９１／０９９５８、ＷＯ０３／０６４４５９、ＷＯ００／２９４２７およびＷＯ０１／１３９５７に提供されている。
【０１８７】
本発明の方法が、試料、細胞または被験体への追加の薬剤または組成物の送達などの追加のステップをさらに含んでもよいことを認識すべきである。
実施例
実施例１
材料および方法
【０１８８】
ペプチド
ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ２．０、１４１００  Ｓｕｌｌｙｆｉｅｌｄ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｓｕｉｔｅ  ２００、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ２０１５１、ＵＳＡに注文した。
【０１８９】
【表３】
2013535954.tif 000004
【０１９０】
哺乳動物細胞株
ＨｅｐＧ細胞株は、肝細胞癌のヒト男性患者由来の肝がん細胞株である。細胞株は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＨＢ−８０６５）から得た。この細胞株にＢ型肝炎ウイルスゲノムの証拠は存在しない。完全ＭＥＭおよび５％  ＤＭＳＯを含む凍結溶液中で凍結させた細胞から、完全ＭＥＭ培地中３７℃および５％  ＣＯ２で細胞を増殖した。
【０１９１】
プラスミドＤＮＡの精製
ＤＨ５α大腸菌細胞中で増殖した３種のプラスミドを使用した。プラスミドｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸは、不安定性ドメイン（ａａ１４１〜１５３）を欠くＸタンパク質の切断型をコードする。これは、一連の８個のオーバーラップオリゴヌクレオチドおよび以下のようにＤＮＡ配列決定により確認された配列からインハウスで調製した：
ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸによりコードされる隣接制限部位を有する切断型Ｘタンパク質配列。
５’末端のＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎ１ならびに３’末端のＸｂａ  Ｉ制限部位。
【０１９２】
【化１】
2013535954.tif 000005
【０１９３】
逆相補
【０１９４】
【化２】
2013535954.tif 000006
【０１９５】
プラスミドｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質を発現する。プラスミドｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃは、全長Ｘタンパク質をコードし、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｌｅｖｒｅｒｏ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ  ｄｉ  Ｃａｇｌｉａｒｉにより親切にも寄付された。
【０１９６】
凍結ストックからの各々の形質転換体５μｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ１０ｍｌ中に添加することにより、上記３種のプラスミドの各々で形質転換した細菌を含むスタータ培養液を作った。培養液を３７℃の震盪機に一晩入れた。次いで、スタータ培養液を使用して、より大きな回分培養液を作った。１０ｍｌのスタータ培養液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ４００ｍｌと合わせた。この培養液を３７℃の震盪機に一晩入れた。次いで、ｍａｘｉｐｒｅｐプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、培養液からプラスミドＤＮＡを精製した。培養液を６０００ｇでまたは１０分間遠心分離し、製造業者の指示にしたがってＱｉａｇｅｎ  ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを細菌ペレットから抽出した。抽出したＤＮＡ試料を２００００ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収して１８０００ｇで１５分間再遠心分離した。得られた上清を、陰イオン交換樹脂を含む溶出チューブに流してＤＮＡを捕捉した。次いで、ＤＮＡを溶出緩衝液で溶出し、次いで回収したＤＮＡを、イソプロパノール１０．５ｍｌをＤＮＡ試料１５ｍｌに添加し、引き続いて２００００ｇで３０分間遠心分離することにより沈殿させた。次いで、ＤＮＡペレットをｄＨ２０に再懸濁した。試料中のＤＮＡの濃度をナノドロップ分光計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００）で測定した。
【０１９７】
形質移入前のプラスミドＤＮＡの前処理
プラスミドＤＮＡを形質移入に使用する前に、ＨｅｐＧ２細胞の混入を防ぐために滅菌した。ｄＨ２０に懸濁したＤＮＡに、ＮａＯＡｃを０．３Ｍおよび１００％  ＥＴＯＨを３０％容積添加し、この溶液を氷上に１０分間置いた。ＤＮＡを、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより沈殿させ、７０％（ｖ／ｖ）冷ＥｔＯＨで洗浄した。ＥｔＯＨの残りをｓｐｅｅｄ−ｖａｃで除去し、ＤＮＡを滅菌ｄＨ２０に再懸濁した。全試料を再懸濁して、１μｇ／μｌのＤＮＡ最終濃度にした。ＤＮＡ収率をナノドロップ分光計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００）で測定した。
【０１９８】
Ｘタンパク質分解ドメイン融合ペプチドによるＨｅｐＧ２形質移入体の処理
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＭＥＭ培地中１ウェル当たり１×１０６個の細胞で６ウェルプレート中に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩培養した。形質移入効率に干渉し得るのでＰＳＧ抗生物質は培地に添加しなかった。次いで、培地を取り出し、１０％ＦＣＳを含まないＭＥＭ培地に交換した。形質移入に使用したＤＮＡの量は４μｇであった。最初に、ＤＮＡ４μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２５０μｌと混合し、次いで、ｐｏｌｙｍａｇトランスフェクション試薬４μｌを添加した。混合物を２０分間インキュベートし、次いで、細胞に添加した。プレートを旋回台上の磁気プレート上に２０分間置いた。
【０１９９】
細胞透過性Ｘタンパク質分解ドメイン融合ペプチドを、１０％ＦＣＳを含まないＭＥＭ中細胞に１０μＭの濃度で添加し、細胞を４５時間インキュベートした。血清が低分子ペプチドを急速に分解し得るので、ペプチドを、ＦＣＳを含まないＭＥＭに添加した。追加のペプチド１０μＭをインキュベーションの３時間後に添加し、さらにペプチド１０μＭをインキュベーションの２１時間後に添加した。追加の一定分量のペプチドを添加する際、細胞を、ＦＣＳを含まないＭＥＭ中で洗浄し、ペプチドを添加し、細胞を３時間インキュベートした後、培地を、１０％ＦＣＳおよびＰＳＧを含むＭＥＭに変えた。細胞を溶解し、ウエスタンブロット解析によりＸタンパク質の発現を解析した。
【０２００】
オリゴマー形成ドメインペプチドによるＨｅｐＧ２形質移入体の処理
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＭＥＭ培地中１ウェル当たり１×１０５個の細胞で８ウェルチャンバースライド中に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間培養した。形質移入効率に干渉し得るのでＰＳＧ抗生物質は培地に添加しなかった。次いで、培地を取り出し、１０％ＦＣＳを含まないｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換した。形質移入に使用したプラスミドＤＮＡの量は０．１μｇであった。最初に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＢＸまたはｐｃＤＮＡ３−ＨＢＸ  ＭｙｃプラスミドＤＮＡのいずれか０．２μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２５μｌと混合し、次いで、ｐｏｌｙｍａｇトランスフェクション試薬０．２μｌを添加した（これらの溶液は、マスターミックスとして調製し、言及した量は１つのウェルについて示している）。混合物を２０分間インキュベートし、次いで、２５μｌを細胞に添加した。プレートを旋回台上の磁気プレート上に２０分間置き、その後、細胞を３時間インキュベートした。
【０２０１】
細胞に上記のようにＸタンパク質プラスミドベクターを形質移入した。磁気プレート上の形質移入の３時間後、オリゴマー形成ドメインペプチドａａ１６〜３５または対照Ｘタンパク質ペプチドａａ１４０〜１５３を、１０μＭの最終濃度で、１０％ＦＣＳを含まないＭＥＭ中細胞に添加し、細胞を３時間、２１時間または４５時間インキュベートした。２１時間インキュベートした細胞については、インキュベーションの３時間後に追加のペプチド１０μＭを添加した。ペプチドと共に４５時間インキュベートした細胞については、インキュベーションの３時間後に追加のペプチド１０μＭを添加し、インキュベーションの２１時間後にさらにペプチド１０μＭを添加した。追加の一定分量のペプチドを添加する際、細胞を、ＦＣＳを含まないＭＥＭ中で洗浄し、ペプチドを添加し、細胞を３時間インキュベートした後、培地を、１０％ＦＣＳおよびＰＳＧを含むＭＥＭに変えた。要約すると、形質移入３時間、３および２４時間、３、２４および４８時間後にペプチドを細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。
【０２０２】
アネキシンＶ標識化試薬２０μｌおよびヨウ化プロピジウム１０μｌをインキュベーション緩衝液１ｍｌに添加することにより、アネキシンＶ標識化溶液を調製した。細胞をインキュベーション緩衝液で洗浄し、アネキシンＶ標識化溶液１００μｌを各ウェルに添加し、引き続いて暗中室温で１５分間インキュベートした。細胞をインキュベーション緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ中２％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、スライドチャンバーを除去した。ＤＡＰＩを含む封入液１滴を細胞に添加し、カバーガラスで覆った。Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用することにより、蛍光顕微鏡検査でスライドを調査し、Ｎｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアを使用して写真を撮った。
【０２０３】
細胞溶解
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに希釈したトリプシンとのインキュベーションによりプレートから分離した。細胞を、ＦＣＳを含むＭＥＭで洗浄してトリプシンを不活性化し、１７５ｇで５分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、これらをＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、試料１０μｌを取り出し、トリパンブルーで染色し、血球計算器で細胞数を数えた。次いで、細胞を４０００ｇで５分間の遠心分離でペレット化し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。全ての液体の残りを除去し、細胞を細胞溶解に備えた。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを、１×１０６個の細胞当たり２０μｌで細胞に添加した。溶解を助けるために細胞を非常に良く再懸濁し、次いで、氷上に１０分間放置した。これらを１５０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して保存した。溶解緩衝液１３μｌ、２％ＳＤＳ  ２μｌ、デオキシコール酸Ｎａ  ２μｌ、ＤＮＡｓｅ緩衝液２μｌおよびＤＮＡｓｅＩ  １μｌを添加することにより、核の沈殿を処理した。各試薬を添加した後、粘着性の細胞可溶化物を激しく再懸濁し、次いで、３７℃で１０分間インキュベートした。
【０２０４】
ペプチド結合アッセイ
オリゴマー形成ペプチドを、粉末形態で受け取り、秤量し、滅菌１０％ＤＭＳＯ溶液に希釈して１０ｍｇ／ｍｌストック溶液を作った。Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄニュートラアビジンコーティングした９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１５５０７）のウェルをプレート洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄した。ビオチンタグを含むペプチド１〜５０を洗浄緩衝液中１０μｇ／ｍｌに希釈し、溶液１００μｌを、使用している各ウェルに入れた。プレートを室温で２時間インキュベートし、ウェルを、洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄した。４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのペプチド１〜５０の切断型蛍光変異体を三つ組でウェルに添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。次いで、ウェルを、低光条件下、洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄し、４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長でＢｉｏｔｅｋ蛍光プレートリーダーによりプレートを読み取った。
【０２０５】
Ｘタンパク質オリゴマー形成ペプチドの細胞透過性についてのアッセイ
細胞を、１０％ＦＣＳおよびＰＳＧを含むＭＥＭ中１ウェル当たり１×１０５個の細胞で８ウェルチャンバースライド中に播種した。次いで、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、次いで、ＦＣＳを含まない培地で３回洗浄した。ＦＣＳを含まない適当な培地２５０μｌ中のＸタンパク質ペプチドを、１０μＭの最終濃度で細胞に添加し、スライドを３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。スライドからプラスチック枠を取り出し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３６９３１）１滴を各試料に添加した。スライドを暗中で一晩乾燥させ、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用することにより、顕微鏡検査で調査した。Ｎｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアを使用して写真を撮った。次いで、さらなる調査のために、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して、共焦点顕微鏡検査でスライドを調査した。
【０２０６】
細胞透過性Ｘタンパク質ペプチドが細胞に入る経路の解明
細胞を、１０％ＦＣＳを含む完全ＭＥＭ培地中８つのチャンバースライドに、１ウェル当たり１×１０５個の細胞で、一晩蒔いた。細胞をＭＥＭ培地で３回洗浄し、３７℃で、１０μｍサイトカラシンＤまたはＭＥＭ中２μｇ／ｍｌのヘパリンのいずれかで３０分間前処置した。次いで、ペプチドを１０μＭの濃度で添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドおよびＰＢＳで３０分間固定し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３６９３１）１滴を各ウェルに添加した。スライドを暗中で一晩乾燥させ、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用することにより、顕微鏡検査で調査した。Ｎｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアを使用して写真を撮った。
【０２０７】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２による外来性ペプチドのＴＫ−１細胞中への輸送
８ウェルガラスチャンバースライドを、４℃で一晩、ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃでコーティングした。これらを、室温で２時間、ＦＣＳでブロックした。ＴＫ−１  Ｔ細胞をＨＢＳＳ緩衝液中２ｍＭ  Ｍｎ２＋／Ｃａ２＋で活性化し、ＭＡｄＣＡＭ−１コーティングしたガラススライドに添加し、引き続いて、１５分間インキュベートした。ペプチドＬＣＬＲＰＶＧＧＹＤＲＲＥＹ（配列番号１５）およびＲ９ＹＤＲＲＥＹ（配列番号１４）を５０μＭで添加し、引き続いて、３０分間インキュベートした。細胞を４％ＰＦＡ中で一晩固定し、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間透過処理し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで１時間ブロックし、ペプチドの存在をＦＩＴＣ−ストレプトアビジン（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ中に１：２００希釈  １時間）で検出した。スライドを、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄと共にマウントした。
結果
【０２０８】
ＨｅｐＧ２細胞中のＸタンパク質の操作した発現
ＨｅｐＧ２細胞に、Ｘタンパク質プラスミドｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃ  ４μｇまたはｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ  ４μｇを形質移入し、４８時間培養した。予備的実験により、より多い量はより高レベルのＸタンパク質を製造しないので、プラスミドＤＮＡ４μｇが最適プラスミド量であることが示された。Ｘタンパク質ベクターはマーカーを保有していなかったので、細胞にｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰベクターを形質移入して、形質移入効率を視覚化した。形質移入２４時間後の形質移入効率は２０〜３０％（データは図示せず）であると決定された。各細胞により発せられる蛍光レベルは、目に見えて高く、各細胞によるＧＦＰタンパク質の高い発現を示しているが、この形質移入レベルは、形質移入４８時間後に見られるものと類似であった。Ｘタンパク質は形質移入の４８時間後のウエスタンブロット解析によって検出されただけであったので、４８時間の細胞の形質移入を、研究の残りで使用した。形質移入体をウエスタンブロット解析に供し、Ｘタンパク質を発現したかどうかを決定した。さらに、形質移入しなかった正常ＨｅｐＧ２細胞を追加の対照として使用して、Ｘタンパク質がＨｅｐＧ２細胞株で内因的に発現しないことを確認した。細胞を溶解し、細胞可溶化物を、界面活性剤可溶性タンパク質を含む上清と、細胞核および界面活性剤不溶性物質を含む沈殿に細分画した。上清および核細分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に移動させた。膜をマウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体、引き続いて、二次ヤギ抗マウスＨＲＰ抱合型抗体でプローブした。抗Ｘタンパク質抗体は、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃプラスミドを形質移入したＨｅｐＧ２細胞の核抽出物を含むレーンに２種の異なるバンドを認識した（図１）。バンドは、ＨｅｐＧ２細胞の界面活性剤可溶性分画中には存在しなかった。バンドのサイズは、プラスミドにコードされるタンパク質の予想サイズと相関していた。ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸプラスミドによりコードされるタンパク質は、ａａ１４１〜１５３を含む不安定性ドメインを欠損しているＸタンパク質の切断型約１７ｋＤａバージョンである。対照的に、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃによりコードされるタンパク質は、ｍｙｃタグが付加した全長Ｘタンパク質であり、約２１ｋＤａの合計サイズを与える。形質移入しなかったＨｅｐＧ２細胞またはｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰのみを形質移入したＨｅｐＧ２細胞ではＸタンパク質は発現しなかった。
【０２０９】
Ｘタンパク質のオリゴマー形成に必要とされる最小ペプチドモチーフの定義
Ｘタンパク質の二量体形成に必要とされる最小ペプチドモチーフを定義するために、ストレプトアビジンコーティングしたプレートを使用して、リガンド結合アッセイを行った。この筋書きでは、Ｘタンパク質モノマーはそれ自体のリガンドとして働く。Ｘタンパク質のためのオリゴマー形成ドメインは、Ｎ末端５０ａａ残基内に含まれることが前に示された。ａａ１〜５０をコードする領域からの一連の短鎖ペプチドを合成した。Ｎ末端でビオチンタグに抱合したａａ１〜５０を含む親ペプチドをストレプトアビジンコーティングしたプレートに添加した。ストレプトアビジンは、ビオチンとの高い親和性結合を示すので、ペプチドを捕捉し、プレートに固定することができた。ａａ１〜２０、１６〜３５、２１〜４０および３４〜５３をコードする非ビオチン化ペプチドを、１０、２０および４０μｇ／ｍｌで、ペプチドａａ１〜５０でコーティングしたウェルに添加した。蛍光プレートリーダーを使用して検出するために、より小さいペプチドを各々ＦＩＴＣタグに抱合した。ペプチド１６〜３５は、ペプチド１〜２０、２１〜４０および３４〜５３よりも有意に強く２０および４０μｇ／ｍｌでペプチド１〜５０に結合した（表３；図２）。より低濃度のペプチドで行った結合は有意ではなかった。その領域１６〜３５を含むさらに小さいペプチドを作り、ａａ１６〜３５がＸタンパク質二量体形成に必要とされる最小ペプチドモチーフであるかどうか決定した。これらの合成ペプチド、すなわちａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２を、同じペプチド結合アッセイを使用して解析した。ペプチドは、ペプチド１〜５０と結合する能力において差を示さず、親ペプチド１６〜３５が示した強力な結合に匹敵することができなかった（図３）。したがって、調査したペプチドの中で、Ｘタンパク質の二量体形成に必要とされる最小ペプチドモチーフは、３０ａａペプチド１６〜３５である。
【０２１０】
【表４】
2013535954.tif 000007
【０２１１】
ＨＩＦ−１のＯＤＤに基づきＸタンパク質を分解することができる新規なペプチドの作製
上記結果は、Ｘタンパク質オリゴマー形成ドメインがａａ１６〜３５を含むことを証明した。ＨＩＦ−１αの酸素依存的分解（ＯＤＤ）ドメインが付着する標的化ペプチドとしてペプチド１６〜３５を利用するアプローチを考案した。ペプチド１６〜３５を、合成中にＮおよびＣ末端で８ａａＯＤＤドメインに融合し、Ｒ８配列をＮ末端に付加してペプチドを細胞透過性にした。標的化Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドは、Ｘタンパク質発現細胞に入り、Ｘタンパク質のオリゴマー形成ドメインに結合し、ｐＶＨＬに認識され、ペプチドのユビキン化および付着したＸタンパク質と一緒の分解がもたらされるだろうという理解であった。最初にＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドを試験して、これらがオリゴマー形成ペプチド１〜５０に結合することができるかどうかを決定した。これらは、ペプチド１６〜３５が標的化ペプチドの前に位置しているのか端に位置しているのかにかかわりなく、ペプチド１〜５０に結合することができた（図４）。驚くべきことに、これらは、親ペプチド１６〜３５よりも良くペプチド１〜５０に結合した。非結合ペプチド２１〜４０を陰性対照として使用したが、明らかにペプチド１〜５０に結合できなかった。
【０２１２】
Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドはＸタンパク質発現を減少させる
２種のＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドを、Ｘタンパク質発現レベルを減少させる能力について試験した。ＨｅｐＧ２細胞にＸタンパク質プラスミドｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃ  ４μｇ、またはｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰベクター４μｇのいずれかを形質移入した。Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドを、形質移入３時間、２４時間および４８時間後に細胞に反復して添加した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかったが、それ以外は同じ条件下で培養した。形質移入体をウエスタンブロット法に供してＸタンパク質が発現しているかどうかを決定した。細胞を溶解し、可溶化物を遠心分離して、界面活性剤可溶性タンパク質を含む上清分画と、細胞核および界面活性剤不溶性物質を含む沈殿を得た。上清および核細分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に移動させた。膜をマウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体、引き続いて、二次ヤギ抗マウスＨＲＰ抱合型抗体でプローブした。上記のように、Ｘタンパク質は、ＨｅｐＧ２形質移入体の界面活性剤可溶性分画中には存在しなかった（図５）。対照的に、Ｘタンパク質は、それぞれ約１７ｋＤａの切断型タンパク質および約２１ｋＤａの全長タンパク質として、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃを形質移入した細胞の核分画中に存在していた。前にＯＤＤタグを有するＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドは、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃにより産生されたＸタンパク質の完全な分解を引き起こした（図５）。末端にＯＤＤタグを有するＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドは、Ｘタンパク質のほぼ完全な分解を引き起こした（図５）。ｐＣＤＮＡ３．１−ＧＦＰを形質移入した対照細胞および形質移入していないＨｅｐＧ２細胞は、マウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体が特異的にＸタンパク質を認識したことを示すバンドを与えなかった。β−アクチンに対する抗体でブロットをプローブし、これによって各レーンが等量の可溶化物を含むことを保証した。
【０２１３】
Ｘタンパク質の不安定性ドメインに基づきＸタンパク質を分解することができる新規なペプチドの作製
Ｘタンパク質は、タンパク質の安定性の原因であるａａ１４０〜１５３に対応する領域を含んでいる（Ｌｉ等、２００６）２５。Ｘタンパク質オリゴマー形成ドメイン（ａａ１６〜３５）に融合した不安定性ドメイン（ａａ１４０〜１５３）を含む細胞透過性ペプチドを使用して、不安定性ドメインのＸタンパク質発現への影響を調査した。Ｘタンパク質オリゴマー形成ドメインの前または端のいずれかで付着している不安定性ドメインを用いて２種の融合ペプチドを作製した。これらを、Ｎ末端Ｒ８タグ担体ペプチドにより細胞透過性にした。ペプチドを、Ｘタンパク質プラスミドの形質移入３時間、２４時間および４８時間後にＨｅｐＧ２細胞に反復して添加した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかったが、それ以外は同じ条件下で培養した。形質移入体の各分画をウエスタンブロット法に供してＸタンパク質が発現しているかどうかを決定した。抗Ｘタンパク質抗体は、それぞれｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃを形質移入した細胞中で、切断（約１７ｋＤａ）型および全長（約２１ｋＤａ）型のＸタンパク質を認識した（図６）。前に不安定性ドメインを有するＸタンパク質オリゴマー形成−不安定性ドメイン融合ペプチドは、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃにより産生されたＸタンパク質の完全な分解を引き起こした。末端に不安定性ドメインを有するＸタンパク質オリゴマー形成−不安定性ドメイン融合ペプチドは、Ｘタンパク質のほぼ完全な分解を引き起こし、わずかに全長タンパク質を好んだ（図７）。形質移入していない親ＨｅｐＧ２細胞およびｐＣＤＮＡ３．１−ＧＦＰを形質移入した細胞は、Ｘタンパク質バンドを示さなかった。
【０２１４】
Ｘタンパク質のオリゴマー形成ドメインのスタンドアローン型（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ  ｆｏｒｍ）はＸタンパク質のアポトーシス促進機能を阻害する
オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）を、Ｘタンパク質のアポトーシス促進機能を阻害する能力について試験した。仮説は、ペプチドが、機能のための必要条件であるＸタンパク質の二量体形成を阻害するだろうというものであった（Ｍｕｒａｋａｍｉ等、１９９４）２６。ＨｅｐＧ２細胞を操作してｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃプラスミドを形質移入することによりＸタンパク質を発現させた。Ｘタンパク質オリゴマー形成ペプチド（ａａ１６〜３５）を、形質移入３時間、３および２４時間、または３、２４および４８時間後のいずれかで細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照細胞にｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸまたはｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃのいずれかを形質移入し、Ｘタンパク質に結合しないＸタンパク質ペプチドａａ１４０〜１５３の細胞透過型で処理した。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスの初期段階を視覚化し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で対比染色して壊死を検出した。ＤＡＰＩを添加して細胞核を染色した。切断（図７）型または全長（図８）型のＸタンパク質を発現するよう形質移入した細胞の約８０〜９０％が、アポトーシスを起こした。調査した時間経過にわたって細胞壊死は見られなかった。オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）の添加により、用量依存性様式でＸタンパク質媒介性アポトーシスが有意に減少した（図７および８）。対照的に、形質移入体のアポトーシスは、Ｘタンパク質に結合しないＸタンパク質ペプチドａａ１４０〜１５３に影響されなかった（図９および図１０）。したがって、Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害する能力は、オリゴマー形成ドメインペプチドの固有の性質である。全長Ｘタンパク質が切断型Ｘタンパク質よりも高いレベルのアポトーシス（細胞アポトーシスで２０〜３０％増加）を引き起こすことが分かった。
【０２１５】
オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）はＸタンパク質の三次構造を破壊する
本発明者らは、オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）がどのようにＸタンパク質媒介性機能に拮抗するのかを調査した。目的は、ペプチドがＸタンパク質の三次構造を破壊するかどうかを決定することであった。ＨｅｐＧ２細胞にｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  ＭｙｃまたはｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰプラスミドのいずれかを形質移入し、オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）で４８時間にわたって３回処理した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかった。非還元的ローディングバッファーを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより核細分画を分離して、Ｘタンパク質のジスルフィド結合を無傷に保った。タンパク質をＰＶＤＦ膜上に移動させ、マウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体、引き続いて、二次ヤギ抗マウスＨＲＰ抱合型抗体でプローブした。オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、Ｘタンパク質の全体的レベルを減少させず、アポトーシスの攪乱のための機構としてのＸタンパク質発現の減少を除外した（図１１）。ペプチドで処理していない形質移入体は、約３４ｋＤａの二量体型を含むより高次型、および明らかにさらに高次構造のＸタンパク質を発現した（図１１）。対照的に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ  Ｍｙｃを形質移入し、オリゴマー形成ドメインペプチドで処理した細胞は、それぞれ約１７ｋＤａおよび約２１ｋＤａの単量体型を発現した。これらは、約３４ｋＤａのＸタンパク質の二量体型も発現したが、より高次型は発現しなかった。結果は、オリゴマー形成ドメインペプチドがＸタンパク質の三次構造を破壊し、二量体形成およびより高次構造の形成を防ぐことを示している。Ｘタンパク質が、二量体として機能すると仮定すると、その二量体形成の破壊は、オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）がＸタンパク質のアポトーシス促進機能に拮抗する機構となり得る。
【０２１６】
オリゴマー形成ドメインペプチドの細胞透過性
オリゴマー形成ドメインペプチドａａ１６〜３５が、８アルギニン担体ペプチドに融合することなくＨｅｐＧ２細胞に自発的に入ることができることが思いがけなく分かった。これは、Ｘタンパク質のオリゴマー形成ドメインがＨＩＶにより発現されるＴＡＴタンパク質中に見出されるタンパク質形質導入ドメインを含むことを示唆している。Ｘタンパク質のＮ末端領域からのａａ１〜２０、１６〜３５、２１〜４０および３４〜５３を含む４種のＦＩＴＣ標識化ペプチドを、ＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して細胞によるその取り込みを記録した。ペプチドａａ１〜２０およびａａ１６〜３５は、試験した４種のペプチドの中で、細胞により容易に取り込まれた唯一のペプチドであった（図１２）。残りの２種のペプチドで処理した細胞による蛍光が低いのは、おそらくペプチドの細胞表面への非特異的結合に起因するだろう（図１２）。ペプチドで処理しなかった対照細胞は、蛍光を発しなかった。上記細胞を共焦点顕微鏡検査により調査して、ペプチドの分布のよりよい構想を得た。細胞の横断面解析により、ペプチドａａ１〜２０およびａａ１６〜３５が細胞の細胞質ならびに核中に取り込まれることが確認された（図１３および１４）。ペプチドａａ２１〜４０および３４〜５３は細胞透過性でなかった（図１３）。
【０２１７】
ペプチドａａ１６〜３５をより小さいフルオレセイン化ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２に分割し、これらをＨｅｐＧ２細胞に入る能力について試験した。３種のペプチド全てが細胞透過性で、親ペプチドａａ１６〜３５と同等レベルで細胞に取り込まれた（図１５）。共焦点顕微鏡検査により、３種のペプチド全てが細胞により取り込まれることが確認された（図１６）。細胞から取った共焦点スライス像は、ペプチドａａ１６〜２２が細胞質および細胞核の両方に取り込まれることを証明した（図１７）。
【０２１８】
細胞透過性ペプチドのＨｅｐＧ２細胞中への侵入はヘパリン結合に依存する
正確にどのように細胞透過性ペプチドが細胞の形質膜を通過するのかはまだ十分に理解されていない。いくつかのペプチドが、アクチンにより駆動されるエンドサイトーシスプロセスであるマクロピノサイトーシスを介して入り込むことが示唆されてきた。細胞表面上のアクチン伸長は、形質膜の細胞外環境中への拡張をもたらす。形質膜が戻って自身と融合すると、マクロピノソームを形成し、そうする際に大量の細胞外液をカプセル化および内部移行する。別の機構は、エンドサイトーシスプロセスを通したペプチドの内部移行をもたらすペプチドの細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を介する。ＨｅｐＧ２細胞を、サイトカラシンＤおよびヘパリンで前処理し、次いで、ＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２およびａａ１６〜３５と共に３時間インキュベートして、上記２つの機構のいずれかがＸタンパク質ペプチドの細胞取り込みを媒介するかどうかを決定した。対照細胞はＸタンパク質ペプチドで処理したが、いずれの化学物質でも処理しなかった。サイトカラシンＤは、形質膜の拡張を阻害することによりマクロピノサイトーシスを阻害するＦ−アクチン伸長阻害剤である。ヘパリンは、ペプチドの細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合に拮抗すると予想されるだろう。図１８に示すように、サイトカラシンＤによる細胞の前処理は、ペプチドの細胞内への侵入に影響を及ぼさず、マクロピノサイトーシスがペプチド内部移行に関与していないことを示した。対照的に、ヘパリンによる前処理は、ペプチドの細胞内への侵入を遮断し、ペプチドの細胞表面とのヘパリン結合が、Ｘタンパク質ペプチドによる細胞侵入に重要な役割を果たしていることを示した（図１８）。
【０２１９】
短鎖Ｎ末端ペプチドａａ１〜８、１〜１５および１６〜２０は細胞透過性である
フルオレセイン化ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して細胞によるその取り込みを記録した。３種のペプチド全てが細胞に取り込まれた（図１９）。ペプチドａａ１６〜２０とペプチドａａ１６〜２２の取り込みの効率には差がないように見えた。共焦点顕微鏡検査により、ペプチドａａ１〜１５および１６〜２０が細胞透過性であることが確認される。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用してペプチドの取り込みを確認した（図２０、上のパネル）。細胞の共焦点型スライシングにより、ペプチドａａ１〜１５および１６〜２２が細胞質および核に取り込まれることが明らかになった（図２０、下の２つのパネル）。Ｎ末端ペプチドａａ１〜１５を２つに分割し、各フルオレセイン化ペプチドをＨｅｐＧ２細胞中への取り込みについて試験した。ペプチドａａ１〜８のみが細胞透過性であると分かった（図２１）。
【０２２０】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、いくつかの異なる接着細胞株に入ることができるが、非接着細胞株ＴＫ１に入ることはできない
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２を、ヒトＣ３２黒色腫、ＤＵ１４５前立腺癌、ＴＫ１  Ｔ細胞リンパ種、Ｈ４４１肺癌、Ｒｉｎ−ｍ５ｆラット膵島腫瘍およびＣｏｓ−１／７ミドリザル腎細胞株を含む他の哺乳動物細胞株により取り込まれる能力について試験した。ＴＫ１細胞は、懸濁細胞であるが、他の全細胞は接着細胞である。細胞を、ＦＣＳの非存在下、細胞株に適した培地中で３時間、フルオレセイン化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共にインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞を陽性対照として使用した。Ｘタンパク質ペプチドは、細胞の型または供給源にかかわらず全ての接着細胞株に入ることができた（図２２および２３）(was able enter)。ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株は、ペプチドの効率的（９０％超細胞  陽性）取り込みを示し、ペプチドが細胞透過性であることを確認した（図２２）。対照的に、ペプチドは、Ｈ４４１、Ｃｏｓ−７、Ｃｏｓ−１およびＲｉｎ−ｍ５ｆ細胞株中にはあまり効率的に取り込まれなかった（６０〜７０％細胞  陽性）（図２３）。ペプチドは、懸濁細胞株ＴＫ１に入ることが完全にできなかった（図２２）。
【０２２１】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は非接着性単球およびリンパ球に入ることができない
前の実験は、ペプチドａａ１６〜２２が懸濁細胞株ＴＫ１に入ることができないことを示した。これが非接着細胞の一般的特徴であるかどうかを決定するために、ペプチドが非接着性ヒト末梢血単核細胞に入る能力を調査した。単球、リンパ球および血小板を含むバフィーコートをヒト血液１０ｍｌから単離し、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２と共に８チャンバースライド中で３時間インキュベートした。非接着性バフィーコート細胞は、蛍光を発せず、これらがペプチドを取り込まないことを示した（図２４）。対照的に、８チャンバースライドの底に接着した単球および血小板は蛍光を発し、これらがペプチドを取り込んだことを示した（図２５）。
【０２２２】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２は非接着性赤血球および血小板に入らない
全血をフルオレセイン化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２と共に３時間インキュベートして、赤血球および血小板がペプチドを取り込むことができるかどうかを決定した。血液をフィンガープリックで採取し、１０ｍＭクエン酸緩衝液に懸濁して、血液凝固を防止した。ペプチドとのインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、血液塗抹をガラススライド上に調製した。細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色した。大部分が赤血球（大細胞の大部分はドーナッツ形をしていた）および血小板である、存在する細胞型のいずれも細胞透過性ペプチドを取り込むことができなかった（図２６）。
【０２２３】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２は接着性ＴＫ１細胞に入ることができる
上記のように、懸濁したリンパ球細胞株ＴＫ１は、Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２を取り込むことができなかった。いったん活性化すると、循環性リンパ球は、血管内皮に接着する、抗原提示細胞に接着するおよび細胞外基質に接着し移動する能力を有する。接着性単球がペプチドを取り込んだという事実は、表面に接着したＴＫ１  Ｔ細胞もＸタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２を取り込むことができる可能性をもたらした。ＴＫ１細胞を、ＭＡｄＣＡＭ−１コーティングしたガラススライドに接着させた、またはガラススライドの表面に直接結合させた。スライドに接着した細胞を、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ中でＸタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２と共に３時間インキュベートした。α４β７を介してＭＡｄＣＡＭ−１に接着した実質的に全てのＴＫ１細胞がペプチドを取り込んだ一方で、ガラススライドに直接接着した細胞のわずか５０〜６０％がペプチドを取り込んだ（図２７）。
【０２２４】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２は外来性ペプチドを接着性ＴＫ−１  Ｔ細胞中に輸送することができる
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧを、ヒトインテグリンβ７サブユニットの細胞質ドメインからとったヘキサペプチドＹＤＲＲＥＹ（配列番号１６）に融合した。ペプチドをグリシンリンカーにより分離し、ビオチンタグをＮ末端に付加した。融合ペプチドを、ＭＡｄＣＡＭ−１に接着性のＴＫ−１細胞に入る能力について、Ｒ９担体ペプチドに融合したＹＤＲＲＥＹ（配列番号１６）ペプチドと比較した。両ペプチドがＴＫ−１細胞に取り込まれた（図２８）。Ｒ９ＹＤＲＲＥＹ（配列番号１４）ペプチドは全細胞に入ったが、細胞の特定の亜集団により、より多くの量が優先的に取り込まれるように見えた。対照的に、ＬＣＬＲＰＶＧＧＹＤＲＲＥＹ（配列番号１５）ペプチドは、全細胞により同様の量が均一に取り込まれた。
実施例２
材料および方法
【０２２５】
材料
ペプチド  ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ（配列番号１７）、ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号２０）およびビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）をＰｅｐｔｉｄｅ２．０により合成した。オリゴヌクレオチド５ＡｍＭＣ１２−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣ−Ｔｅｘ６１５（配列番号１８）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成した。ＦＩＴＣ抱合型ウサギＩｇＧをＳｉｇｍａから購入した（カタログ番号Ｆ９８８７）。Ｃ３２黒色腫細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−１５８５）、Ｗｍ２６６−４黒色腫細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−１６７６）およびＨｅｐＧ２肝がん細胞株（カタログ番号ＨＢ−８０６５）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。
【０２２６】
方法
トランスグルタミナーゼの精製
カゼインおよびトランスグルタミナーゼの混合物を含むＡｃｔｉｖａ酪農粉末（ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ−ＢＰ−ＭＨ、Ｋｅｒｒｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ｏｔａｈｕｈｕ、Ａｕｃｋｌａｎｄ；Ｌｅｓｎｉｅ’ｓ、Ｔａｍａｋｉ、Ａｕｃｋｌａｎｄから購入した）を、Ｈ２Ｏ１０ｍｌに溶解して２０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液２ｍｌ（ｐＨ４．０）を混合しながら添加し、溶液を１３０００ｇで３０分間遠心分離した。トランスグルタミナーゼのみを含む上清をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、Ａｑｕａｃｉｄｅを使用して酵素を濃縮した。１２％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上の電気泳動による単離した酵素の解析により、予想されたように３２、約３７ｋＤａの単一のバンドが明らかになった。
【０２２７】
トランスグルタミナーゼを使用した積荷のＸペプチドとの架橋結合
５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび５０ｍＭ  トリスＨＣｌからなる反応緩衝液（３０μｌ）を、２００μＭ  Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１．５μｌ、および１００μＭウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ  ３μｌもしくは１００μＭ  １８ｍｅｒ  ＧＦＰアンチセンスオリゴ３μｌのいずれかと混合して、８．７μＭの積荷最終濃度を得た。次いで、トランスグルタミナーゼを１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。溶液を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＥＤＴＡを１００ｍＭまで添加して反応を停止した。
【０２２８】
Ｘタンパク質担体ペプチドがウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣおよび１８ｍｅｒ  ＧＦＰアンチセンスオリゴをＨｅｐＧ２細胞中に輸送する能力の試験
ＨｅｐＧ２細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で一晩、８ウェルチャンバースライド中に１ウェル当たり１×１０５個の細胞で播種した。翌日、細胞を、血清を含まないＭＥＭで３回洗浄し、同媒体５００μｌに再懸濁し、ウェルに添加した。ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣおよびＧＦＰアンチセンスオリゴと架橋結合したＸタンパク質担体ペプチドを、０．５μＭの最終濃度で細胞に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。追加の実験で、抱合体の細胞中への取り込みのタイミングを決定するために、１８ｍｅｒオリゴに抱合したＸタンパク質担体ペプチドを細胞と共に２４時間、３時間および３０分間インキュベートした。非抱合型オリゴを対照として３時間細胞に添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定した。これらをＰＢＳで３回洗浄し、細胞核を視覚化するためにＤＡＰＩを添加し、引き続いて、蛍光性積荷の侵入について蛍光顕微鏡検査により調査した。
【０２２９】
ＨｅｐＧ２細胞中への侵入についての異なる比のＸタンパク質担体ペプチドおよび１８ｍｅｒ  ＧＦＰアンチセンスオリゴの抱合の試験
ＨｅｐＧ２細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で一晩、８ウェルチャンバースライド中に１ウェル当たり１×１０５個の細胞で播種した。翌日、細胞を、血清を含まないＭＥＭで３回洗浄し、同媒体５００μｌに再懸濁した。０．７５、１．５および３μｌの一定分量の１８ｍｅｒオリゴの１００μＭ溶液を、２００μＭのＸタンパク質担体（８．７μＭの最終濃度）ペプチド１．５μｌと混合して、２．３、４．５および８．７μＭのオリゴの最終濃度を得て、引き続いて、トランスグルタミナーゼと架橋結合した。１８ｍｅｒオリゴに抱合したＸタンパク質担体ペプチドを、０．１４、０．３、０．６μＭのオリゴの最終濃度で細胞に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。上記のように、細胞を固定し、蛍光顕微鏡検査のためにＤＡＰＩで染色した。
【０２３０】
Ｂ−ｒａｆ標的化ペプチドが黒色腫細胞を死滅させる能力の試験
黒色腫細胞株ＷＭ−２６６−４およびＣ３２を、８ウェルチャンバースライド中に完全ＭＥＭ培地中１ウェル当たり１×１０５個の細胞で播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、血清を含まないＭＥＭで３回洗浄し、同媒体５００μｌに再懸濁し、ウェルに添加した。Ｂ−ｒａｆ  Ｘタンパク質融合ペプチド（ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９））およびアポトーシスを引き起こさない対照細胞透過性ペプチド（ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号２０））をＣ３２およびＷＭ−２６６−４黒色腫細胞に添加して、それぞれ１０μＭおよび２０μＭの最終濃度とし、引き続いて、３７℃で３時間インキュベートした。アネキシンＶ標識化試薬２０μｌおよびヨウ化プロピジウム１０μｌをインキュベーション緩衝液１ｍｌに添加することにより、アネキシンＶ標識化溶液を調製した。細胞をインキュベーション緩衝液で洗浄し、アネキシンＶ標識化溶液１００μｌを添加し、引き続いて、暗中で１５分間インキュベートした。細胞をインキュベーション緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、スライドチャンバーを除去した。ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止試薬１滴を各試料に添加し、スライドを一晩乾燥させ、次いで、蛍光顕微鏡検査により調査した。
結果
【０２３１】
（仮の適当な区分後に配置するための）Ｘタンパク質のオリゴマー形成ドメインのサイズの精密化
領域１６〜３５を含む２種の小さいペプチドを合成して、ａａ１６〜３５がＸタンパク質二量体形成に必要とされる最小ペプチドモチーフであるかどうかを決定した。これらのペプチドは、ＮおよびＣ末端で切断されていた、すなわち、ａａ２０〜３５および１６〜３０であった。これらを同じペプチド結合アッセイを使用して解析した。ペプチド１６〜３０は、ペプチド１６〜３５よりもさらに強力にペプチド１〜５０に結合した一方で、ペプチド２０〜３５は、弱い結合を示しただけであった（図３２）。したがって、調査したペプチドの中で、Ｘタンパク質の二量体形成に必要とされる最小ペプチドモチーフは１５ａａペプチド１６〜３０（配列番号９０）である。
【０２３２】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２は抱合型ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することができる
ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、ＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧに抱合した。ペプチドをグリシンリンカーで分離し、グルタミン伸長をアルギニン残基で囲んで溶解性を補助し、ビオチンタグをＮ末端に付加した。ウサギＩｇＧに抱合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドは精製しなかったが、単純にＨｅｐＧ２細胞に添加した。これはＨｅｐＧ２細胞により容易に取り込まれた一方で、非抱合型ＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧは取り込まれなかった（図２９）。
【０２３３】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２は１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することができる
ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、５’アミノ基を含むＴｅｘ６１５標識化１８ｍｅｒオリゴヌクレオチド５ＡｍＭＣ１２−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣ（配列番号１８）に抱合した。１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドに抱合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドは精製しなかったが、単純にＨｅｐＧ２細胞に８．７μＭの最終濃度で添加した。これはＨｅｐＧ２細胞により３０分以内に容易に取り込まれた一方で、８．７μＭの非抱合型Ｔｅｘ６１５標識化１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドは取り込まれなかった（図３０Ａ）。１０μＭの担体ペプチドとの４．５〜８．７μＭオリゴの抱合から得られる細胞取り込みについての最適比で、１８ｍｅｒオリゴを異なる比で担体ペプチドに抱合し、０．３および０．６μＭの溶液中最終濃度を得た（図３０Ｂ）。
【０２３４】
細胞透過性担体ペプチドは抗がんペプチドをがん細胞中に輸送し、細胞死をもたらすことができる
Ｂ−ｒａｆ遺伝子中の突然変異（Ｖ６００→Ｅ）により全黒色腫の約５０％の増殖が駆動され、野生型Ｂ−ｒａｆの過剰発現により２５％が駆動される２７〜２９。突然変異型Ｂ−ｒａｆに特異的なＰＬＸ４０３２、低分子阻害剤は、患者の８０％で黒色腫の退行を引き起こしたので、近年騒動をもたらした３０。したがって、Ｂ−ｒａｆ腫瘍性タンパク質を標的化するアプローチは、黒色腫の治療の見込みを持っている。ここで、本発明者らは、Ｂ−ｒａｆの二量体形成界面に結合し、Ｂ−ｒａｆの破壊を引き起こすことができるペプチドを開発した。ポリａｒｇ（Ｒ８）細胞透過性ペプチドをＸタンパク質の分解ドメインおよびＢ−ｒａｆタンパク質からの二量体形成ドメイン（ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９））に融合した３１。ビオチンタグをＮ末端に含ませて、ペプチド  ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）を得た。ペプチドは、黒色腫細胞に取り込まれ、ポリユビキチン媒介性破壊のために黒色腫細胞を標的化するＢ−ｒａｆに結合し、細胞死をもたらすだろうと予想された。実際、ペプチドをＷＭ−２６６−４およびＣ３２黒色腫細胞に添加すると、腫瘍細胞死がもたらされた一方で、対照ペプチドビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号２０）は影響を及ぼさなかった（図３１）。
【０２３５】
細胞透過性担体ペプチドは抗Ｂ−ｒａｆ抗体を黒色腫細胞中に輸送し、細胞死をもたらすことができる
ここで、本発明者らは、Ｘタンパク質ａａ１６〜２２担体ペプチドＬＣＬＲＰＶＧを使用して、ウサギポリクローナル抗ヒトＢ−ｒａｆ抗体をＷＭ−２６６−４黒色腫細胞に送達し、担体ペプチドが抗体を細胞に細胞内送達することができるという前の知見を得た。Ｘタンパク質担体ペプチドにより送達される抗Ｂ−ｒａｆ抗体は、アネキシンＶ  ｆｌｕｏｓ染色によって検出されるように細胞にアポトーシスを起こさせた一方で、対照的に、非抱合型Ｂ−ｒａｆ抗体および担体ペプチドは検出可能な効果を有さなかった（図３３）。
【０２３６】
読者が不当な実験を行わずに本発明を実施することができるようにするために、特定の好ましい実施形態を参照して、本発明を本明細書に記載してきた。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、成分およびパラメータの多くをある程度変更もしくは修正する、または既知の同等物に置換することができることを容易に認識するだろう。このような修正および同等物はあたかも個々に示されているかのように本明細書に組み込まれることを認識すべきである。本発明はまた、個別的にまたは集合的に、本明細書で言及するまたは示すステップ、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに前記ステップもしくは特徴の任意の２つ以上の任意のおよび全ての組み合わせも含む。
【０２３７】
さらに、表題、見出しなどは、読者の本文書の理解を高めるために提供しており、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【０２３８】
上および以下に引用する全出願、特許および刊行物の全開示は、もしあれば、これにより参照により組み込まれる。
【０２３９】
しかしながら、本明細書中の任意の従来技術への言及は、その従来技術が世界の任意の国において一般知識の一部を形成していることの承認または任意の形の示唆ではなく、またそのように解釈されるべきではない。
【０２４０】
本明細書（および以下の任意の請求項）中、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単語「含む」、「含んでいる」などは、排他的意味と対照的に、包括的意味で、すなわち、「〜を含むがこれだけに限らない」という意味で解釈すべきである。
【０２４１】
参考文献
１．Ｋｕｍａｒ  Ｖ、Ｊａｙａｓｕｒｙａｎ  Ｎ、Ｋｕｍａｒ  Ｒ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質の切断型変異体（残基５８〜１４０）は、トランス活性化機能を保持する。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：５６４７〜５２、１９９６。
２．Ｍｉｓｒａ  ＫＰ、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ  Ａ、Ｋｕｍａｒ  Ｖ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質の保存されたアミノ末端領域（アミノ酸１〜２０）は、トランス抑制機能を示す。Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １０５：１５７〜６５、２００４。
３．Ｚａｎｅｔｔｉ  ＡＲ、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  Ｐ、Ｓｈｏｕｖａｌ  Ｄ。Ｂ型肝炎に対する予防接種の世界的影響：歴史的概要。Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：６２６６〜７３、２００８。
４．Ｌｏｄａｔｏ  Ｆ、Ｍａｚｚｅｌｌａ  Ｇ、Ｆｅｓｔｉ  Ｄ等：肝細胞癌予防：先進国の富裕と発展途上国の経済的制約との間の世界的出現。Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １２：７２３９〜７２４９、２００６。
５．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｓ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質：構造、機能および生物学。Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ  ４２：８１〜９９、１９９９。
６．Ｌｅｅ  ＡＴ、Ｌｅｅ  ＣＧ。発癌および形質転換ウイルス：Ｂ型肝炎ウイルスおよび肝細胞癌−疾病原因の関連。Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １２：２３４〜４５、２００７。
７．Ｎｅｗｅｌｌ  Ｐ、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ａ、Ｌｌｏｖｅｔ  ＪＭ。肝細胞癌における分子標的療法：前臨床モデルから臨床試験まで。Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４９：１〜５、２００８。
８．Ｐａｎｇ  ＲＷ、Ｐｏｏｎ  ＲＴ。肝細胞癌の分子生物学から標的療法まで：未来は現在である。Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ７２  Ｓｕｐｐｌ  １：３０〜４４、２００７。
９．Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．、Ｍｏｒｉｙａ，Ｋ．、Ｉｉｎｏ，Ｓ．、Ｙｏｔｓｕｙａｎａｇｉ，Ｈ．、Ｅｎｄｏ，Ｙ．、Ｍｉｙａｍｕｒａ，Ｔ．、およびＫｕｒｏｋａｗａ，Ｋ．トランスジェニックマウスにおけるＢ型肝炎ウイルスＨＢＸ遺伝子の高レベル発現および肝臓癌形成。Ｈｅｐａｔｏｌ  １９：８１０〜８１９、１９９４。
１０．Ｍａｄｄｅｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄ，Ｍ．Ｊ．およびＳｌａｇｌｅ，Ｂ．Ｌ．Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質は、ジエチルニトロソアミン誘導性新生物発生前病変の発生における腫瘍促進剤として作用する。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：３８５１〜３８５８、２００１。
１１．Ｚｈｕ  Ｈ、Ｗａｎｇ  Ｙ、Ｃｈｅｎ  Ｊ、Ｃｈｅｎｇ  Ｇ、Ｘｕｅ  Ｊ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質を発現しているトランスジェニックマウスは、より発癌物質誘導性肝臓癌形成しやすい。Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ７６：４４〜５０、２００４。
１２．Ｌｕｂｅｒ，Ｂ．、Ａｒｎｏｌｄ，Ｎ．、Ｓｔｕｒｚｌ，Ｍ．、Ｈｏｈｎｅ，Ｍ．、Ｓｃｈｉｒｍａｃｈｅｒ，Ｐ．、Ｌａｕｅｒ，Ｕ．、Ｗｉｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．、Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．およびＫｅｋｕｌｅ，Ａ．ヘパトーマ由来一体型ＤＮＡは、試験管内で多段階形質転換を引き起こす。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １２：１５９７〜１６０８、１９９６。
１３．Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ａ．およびＣｌａｙｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．Ｂ型肝炎ウイルス感染患者の血清中のＸ抗原ポリペプチド。Ｖｉｒｏｌ  １７７：３６７〜３７１、１９９０。
１４．Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ａ．、Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌｕｍｂｅｒｇ，Ｂ．Ｓ．ヘパドナウイルス感染症におけるＸ抗原／抗体マーカー。血清中のヘパダウイルスＸ遺伝子産物の存在および意義。Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ９８：１０７１〜１０７８、１９９０。
１５．Ｃｈｅｎ  ＨＹ、Ｔａｎｇ  ＮＨ、Ｌｉｎ  Ｎ、Ｃｈｅｎ  ＺＸ、Ｗａｎｇ  ＸＺ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質は、ＤＮＡ修復およびチェックポイント応答に干渉することにより、アポトーシスおよび細胞周期調節解除を誘導する。Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ３８：１７４〜８１、２００８。
１６．Ｐｏｌｌｉｃｉｎｏ  Ｔ、Ｔｅｒｒａｄｉｌｌｏｓ  Ｏ、Ｌｅｃｏｅｕｒ  Ｈ、Ｇｏｕｇｅｏｎ  ＭＬ、Ｂｕｅｎｄｉａ  ＭＡ。Ｂ型肝炎ウイルスＸ遺伝子のアポトーシス促進効果。Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ５２：３６３〜８、１９９８。
１７．Ｚｈａｎｇ  Ｘ、Ｄｏｎｇ  Ｎ、Ｙｉｎ  Ｌ、Ｃａｉ  Ｎ、Ｍａ  Ｈ、Ｙｏｕ  Ｊ、Ｚｈａｎｇ  Ｈ、Ｗａｎｇ  Ｈ、Ｈｅ  Ｒ、Ｙｅ  Ｌ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質は、ヘパトーマ組織中のサバイビン発現を上方制御する。Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：３７４〜８１、２００５。
１８．Ｐａｎ  Ｊ、Ｃｌａｙｔｏｎ  Ｍ、Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ  ＭＡ。Ｂ型肝炎ウイルスＸ抗原は、ＴＧＦ−β１の上方制御およびα２−マクログロブリンの下方制御によりトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）活性を促進する。Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８５（Ｐｔ２）：２７５〜８２、２００４。
１９．Ｌｅｅ  ＳＷ、Ｌｅｅ  ＹＭ、Ｂａｅ  ＳＫ、Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｓ、Ｙｕｎ  Ｙ、Ｋｉｍ  ＫＷ。ヒトＢ型肝炎ウイルスＸタンパク質は、肝臓癌形成における低酸素誘導血管新生の可能な媒体である。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８：４５６〜６１、２０００。
２０．Ｋｅａｓｌｅｒ  ＶＶ、Ｌｅｒａｔ  Ｈ、Ｍａｄｄｅｎ  ＣＲ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄ  ＭＪ、ＭｃＧａｒｖｅｙ  ＭＪ、Ｍｏｈａｍｍｅｄ  ＥＭ、Ｆｏｒｂｅｓ  ＳＪ、Ｌｅｍｏｎ  ＳＭ、Ｈａｄｓｅｌｌ  ＤＬ、Ｇｒｏｎａ  ＳＪ、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＦＢ、Ｓｌａｇｌｅ  ＢＬ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質を発現しているＣ型肝炎ウイルストランスジェニックマウス中の肝臓病態の増加。Ｖｉｒｏｌ  ３４７：４６６〜７５、２００６。
２１．Ｃｈａｎ  ＤＷ、Ｎｇ  ＩＯ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質のノックダウンにより、肝細胞癌細胞の腫瘍形成能が低下する。Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０８：３７２〜８０、２００６。
２２．Ｋａｙｈａｎ  Ｈ、Ｋａｒａｔａｙｌｉ  Ｅ、Ｔｕｒｋｙｉｌｍａｚ  ＡＲ、Ｓａｈｉｎ  Ｆ、Ｙｕｒｄａｙｄｉｎ  Ｃ、Ｂｏｚｄａｙｉ  ＡＭ。安定的にＨＢＶを発現するＨＥＰＧ２  ２．２．１５細胞株におけるｓｈＲＮＡによるＢ型肝炎ウイルス複製の阻害。Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５２：８７１〜９、２００７。
２３．Ｒｅｎ  ＪＬ、Ｐａｎ  ＪＳ、Ｃｈｅｎｇ  Ｔ、Ｄｏｎｇ  Ｊ、Ｌｕ  ＹＰ、Ｈｕａｎｇ  ＳＪ、Ｓｈｉ  ＨＸ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｌｉａｎ  ＹＭ。ＲＮＡ干渉は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現およびＨｅｐＧ２−Ｎ１０細胞の複製を阻害する。Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  ７：２３０〜６、２００６。
２４．Ｚｈａｏ  ＺＦ、Ｙａｎｇ  Ｈ、Ｈａｎ  ＤＷ、Ｚｈａｏ  ＬＦ、Ｚｈａｎｇ  ＧＹ、Ｚｈａｎｇ  Ｙ、Ｌｉｕ  ＭＳ。ＨｅｐＧ２．２．１５におけるＲＮＡ干渉によるＢ型肝炎ウイルス発現および複製の阻害。Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １２：６０４６〜９、２００６。
２５．Ｌｉ  Ｈ、Ｃｈｉ  ＣＹ、Ｌｅｅ  Ｓ、Ａｎｄｒｉｓａｎｉ  ＯＭ。Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質の分裂促進機能は、アミノ酸５１〜１４０内に存在し、ＮおよびＣ末端制御領域により調節される。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００６年１１月；８０（２１）：１０５５４〜６４。
２６．Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｓ、Ｃｈｅｏｎｇ  ＪＨ、およびＫａｎｅｋｏ  Ｓ。ヒト肝炎ウイルスＸ遺伝子は、Ｘタンパク質のトランス活性化を抑制する制御ドメインをコードする。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１５１１８〜１５１２３、１９９４。
２７．Ｓｈａｏ  Ｙ、Ａｐｌｉｎ  ＡＥ。Ｂ−ＲＡＦ標的化黒色腫細胞におけるＡｋｔ３−媒介性アポトーシス耐性。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０：６６７０〜８１、２０１０。
２８．Ｗｅｌｌｂｒｏｃｋ  Ｃ、Ｈｕｒｌｓｔｏｎｅ  Ａ。黒色腫の治療標的としてのＢＲＡＦ。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８０：５６１〜７、２０１０。
２９．Ｔａｎａｍｉ  Ｈ、Ｉｍｏｔｏ  Ｉ、Ｈｉｒａｓａｗａ  Ａ、Ｙｕｋｉ  Ｙ、Ｓｏｎｏｄａ  Ｉ、Ｉｎｏｕｅ  Ｊ、Ｙａｓｕｉ  Ｋ、Ｍｉｓａｗａ−Ｆｕｒｉｈａｔａ  Ａ、Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ、Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ。悪性黒色腫細胞株の増殖への過剰発現野生型ＢＲＡＦの関与。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：８７９６〜８０４、２００４。
３０．Ｂｏｌｌａｇ等。ＲＡＦ阻害剤の臨床効果は、ＢＲＡＦ突然変異黒色腫の広範な標的遮断を必要とする。Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：５９６〜９、２０１０。
３１．Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ  ＬＫ、Ｈｉｎｄｌｅｙ  ＡＤ、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  Ｅ、Ｋｏｌｃｈ  Ｗ。Ｒａｆ−１／Ｂ−Ｒａｆヘテロ二量体形成の制御および役割。Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２６２〜７２、２００６。
３２．Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｋ、Ｎｉｏ  Ｎ、Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ。微生物トランスグルタミナーゼの特性および用途。Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年５月；６４（４）：４４７〜５４。
【図１】
2013535954.tif 000008
【図２】
2013535954.tif 000009
【図３】
2013535954.tif 000010
【図４】
2013535954.tif 000011
【図５】
2013535954.tif 000012
【図６】
2013535954.tif 000013
【図７】
2013535954.tif 000014
【図８】
2013535954.tif 000015
【図９】
2013535954.tif 000016
【図１０】
2013535954.tif 000017
【図１１】
2013535954.tif 000018
【図１２】
2013535954.tif 000019
【図１３】
2013535954.tif 000020
【図１４】
2013535954.tif 000021
【図１５】
2013535954.tif 000022
【図１６】
2013535954.tif 000023
【図１７】
2013535954.tif 000024
【図１８】
2013535954.tif 000025
【図１９】
2013535954.tif 000026
【図２０】
2013535954.tif 000027
【図２１】
2013535954.tif 000028
【図２２】
2013535954.tif 000029
【図２３】
2013535954.tif 000030
【図２４】
2013535954.tif 000031
【図２５】
2013535954.tif 000032
【図２６】
2013535954.tif 000033
【図２７】
2013535954.tif 000034
【図２８】
2013535954.tif 000035
【図２９】
2013535954.tif 000036
【図３０Ａ】
2013535954.tif 000037
【図３０Ｂ】
2013535954.tif 000038
【図３１】
2013535954.tif 000039
【図３２】
2013535954.tif 000040
【図３３】
2013535954.tif 000041
【配列表】
2013535954000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月4日(2012.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＣＬＲＰ（配列番号１）；
ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦ（配列番号７１）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰ（配列番号７０）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧ（配列番号６９）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳ（配列番号６８）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号６７）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰ（配列番号６６）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧ（配列番号６５）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲ（配列番号６４）；
ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）；
のいずれか１個のアミノ酸配列からなるペプチドまたはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体の群から選択される第１セグメント（Ａ）と；任意選択により、ペプチドが融合ペプチドとなるように前記第１セグメントに結合し、１種または複数の異種性アミノ酸を含む第２セグメント（Ｂ）とならなるペプチド。
【請求項２】
Ｘタンパク質の全長配列からなるペプチドおよびアミノ酸配列ＭＡＡＲＶＣＣＱＬからなるペプチドを除く、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項３】
前記ペプチドまたは機能的に同等な変異体が、そのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸９〜３５に連続的に相当する１個または複数のアミノ酸をさらに含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）を含む請求項３に記載のペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項５】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）またはＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）からなる請求項２から４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項８】
化合物のための細胞膜透過性担体としての、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体の使用。
【請求項９】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体と、細胞に送達することが望まれる少なくとも１種の化合物とを含む構造体。
【請求項１０】
前記化合物が、核酸、ペプチド核酸、ポリペプチド、炭化水素、ペプチド模倣体、低分子阻害剤、プロテオグリカン、脂質、リポタンパク質、糖脂質、天然生成物または糖模倣体である、請求項９に記載の構造体。
【請求項１１】
前記化合物が、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）もしくはその機能的に同等な変異体、ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含むペプチドである、請求項１０に記載の構造体。
【請求項１２】
前記化合物が、ＨＩＦ１αのＯＤＤ（ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３））またはその機能的に同等な変異体である、請求項１０に記載の構造体。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体を化合物に結合するステップを含む、化合物の細胞膜透過性を増加させる方法。
【請求項１６】
化合物とアミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体とを含む構造体を、細胞または前記細胞を含む組成物に接触させるステップを含む、化合物を細胞中に送達する方法。
【請求項１７】
化合物とアミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体とを含む構造体を被験体に投与するステップを含む、化合物を細胞中に送達する方法。
【請求項１８】
前記化合物が、細胞の細胞質に送達される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、細胞の核に送達される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘタンパク質の機能の拮抗薬としての、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用。
【請求項２１】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法。
【請求項２３】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法。
【請求項２５】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法。
【請求項２７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
分解分子とアミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体。
【請求項３１】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）を含む、請求項３０に記載の構造体。
【請求項３２】
前記分解分子が、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である、請求項３０または３１に記載の構造体。
【請求項３３】
前記分解分子が、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）またはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）またはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）またはその機能的に同等な変異体、ＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）またはその機能的に同等な変異体を含むペプチドである、請求項３２に記載の構造体。
【請求項３４】
前記分解分子が、アミノ酸配列ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である、請求項３０または３１に記載の構造体。
【請求項３５】
核酸ベクターを含む請求項３０から３４のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸。
【請求項３６】
請求項３０から３４のいずれか一項に記載の構造体を被験体に投与するステップを含む、ＨＢＶ感染症を治療する方法。
【請求項３７】
請求項３０から３４のいずれか一項に記載の構造体を被験体に投与するステップを含む、肝細胞癌の発生を治療または阻害する方法。
【請求項３８】
請求項３０から３４のいずれか一項に記載の構造体を、Ｘタンパク質またはＸタンパク質を含む組成物に接触させるステップを含む、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する方法。
【請求項３９】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の構造体を、細胞の混合集団または細胞の混合集団を含む組成物に接触させるステップを含む、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法。
【請求項４０】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の構造体を被験体に投与するステップを含む、被験体中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法。
【請求項４１】
少なくとも１種の標的化分子とアミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体とを含む構造体。
【請求項４２】
アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含むペプチドを含む、請求項４１に記載の構造体。
【請求項４３】
前記標的化分子が、アミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）もしくはその機能的に同等な変異体、またはアミノ酸配列ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、請求項４１または４２に記載の構造体。
【請求項４４】
前記標的化分子が、Ｂ−ｒａｆ、Ｎ−ｒａｓおよびＰＤＧＦ受容体の１種または複数を標的化する、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項４５】
Ｂ−ｒａｆを標的化する前記標的化分子が、Ｂ−ｒａｆのオリゴマー形成ドメインまたはその一部を含む、請求項４４に記載の構造体。
【請求項４６】
Ｂ−ｒａｆの前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号８９）もしくはその機能的に同等な変異体、ＴＴＨＮＦＶＲＫＴＦＦＴＬＡＦＣＤＦＣＲＫＬＬ（配列番号９２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＳＬＰＧＳＬＴＮＶＫＡＬＱＫＳＰＧＰＱＲＥＲＫ（配列番号９３）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、請求項４５に記載の構造体。
【請求項４７】
Ｂ−ｒａｆを標的化し、アミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）またはその機能的に同等な変異体を含む、請求項４６に記載の構造体。
【請求項４８】
前記標的化分子が、Ｎ−Ｒａｓを標的化し、アミノ酸配列ＲＫＴＦＬＫＬＡ（配列番号９４）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＣＣＡＶＦＲＬ（配列番号９５）もしくはいずれかの機能的に同等な変異体を含む、請求項４４に記載の構造体。
【請求項４９】
前記標的化分子が、ＰＤＧＦ受容体を標的化し、アミノ酸配列ＭＰＮＬＷＦＬＬＦＬＧＬＶＡＡＭＱＬＬＬＬＬＦＬＬＬＦＦＬＶＹＷＤＨＦＥＣＳＣＴＧＬＰＦ（配列番号９６）またはその機能的に同等な変異体を含む、請求項４４に記載の構造体。
【請求項５０】
核酸ベクターを含む、請求項４１から４９のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸。
【請求項５１】
分解するためのタンパク質を標的化するための、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体の使用。
【請求項５２】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含む、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
請求項４１から４９のいずれか一項に記載の構造体または請求項５４に記載の核酸を、タンパク質を含む組成物に提供するステップを含む、タンパク質を分解する方法。
【請求項５４】
前記タンパク質を含む前記組成物が、細胞を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記構造体または核酸を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
１種または複数のタンパク質の望ましくない濃度または活性に関連する疾患を治療するための薬剤の製造への請求項４１から４９のいずれか一項に記載の構造体または請求項５１に記載の核酸の使用。
【請求項５７】
請求項４４から４９のいずれか一項に記載の構造体または前記構造体をコードする核酸を被験体に投与するステップを含む、黒色腫を治療する方法。
【請求項５８】
請求項４４から４９のいずれか一項に記載の構造体をコードする核酸または前記構造体をコードする核酸を被験体に投与するステップを含む、黒色腫を治療する方法。
【請求項５９】
黒色腫を治療するための薬剤の製造への、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の構造体または前記構造体をコードする核酸の使用。
【請求項６０】
請求項６、７、１３、１４、３５または５０のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【国際調査報告】
2013535954.tif 000042
2013535954.tif 000043
2013535954.tif 000044
2013535954.tif 000045
2013535954.tif 000046