(57)【要約】  ＰＣＲ曲線を処理するための、及び放物線状ＰＣＲ曲線の存在を識別するためのシステム及び方法が提供される。ＰＣＲ曲線の区分線形近似を使用することにより、放物線状ＰＣＲ曲線の場合に、より現実的なエルボー値が決定されるのを可能にする。
2013503373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放物線形状を有するリアルタイムＰＣＲデータ曲線のＣｔ値を決定するコンピュータ実行方法であって、
コンピュータシステムで実行される以下のステップ：
−  ＰＣＲ成長曲線を表す、複数の座標値（ｘ，ｙ）を有するデータセットを受信し；
−  ｘ*で終わる第１線形セグメントと、ｘ*で始まる第２線形セグメントとを有する２セグメント区分線形関数を使用して、前記データセットを近似し；
−  ａ）前記データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、あらかじめ決められた閾値０．９０を上回るかどうか；そして、
ｂ）前記データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ２値が閾値０．８５を上回るかどうか；そして、
ｃ）前記第２セグメントの傾き及び該第１セグメントの傾きの両方がゼロよりも大きい場合、該第２セグメントの傾きが該第１セグメントの傾きよりも大きいかどうか
を決定し；そして、もしそうであれば：
−  前記第２線形セグメントと、ベースライン減算された水平ラインの平均値との交点を決定することによって、前記データセットのＣｔ値を推定し；そして
−  前記Ｃｔ値を表示又はさらなる処理のために出力すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記２セグメント区分線形関数が：
【数１】
2013503373.tif 000024
の形を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記データセットの近似は、ｘ*における目的関数を最小化することを含み、前記目的関数は：
【数２】
2013503373.tif 000025
の形を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｘ*は、前記目的関数を、ｘ＝ｎ０からｎ−１までの全てのデータポイントに適用することにより決定され、ｎは前記データセットの長さであり、ｎ０はあらかじめ決められた出発座標であり、そしてｘ*は、最小の赤池情報量係数（ＡＩＣ）を有するｘの値として決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＩＣは、以下の等式：
【数３】
2013503373.tif 000026
［式中、ｍは前記モデルの自由度の数であり、ｙはデータ・ベクトルであり、そして
【数４】
2013503373.tif 000027
は予測モデル・ベクトルである］
によって定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｃｔ値の推定は：
【数５】
2013503373.tif 000028
［式中、
ｃは前記第２線形セグメントの傾きであり、そしてｂは前記第１線形セグメントのｙ切片である］
の形の等式を適用することを含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ２値が、あらかじめ決められた閾値を上回るかどうかを決定する際に、前記あらかじめ決められた閾値が０．９９である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ２値が閾値を上回るかどうかを決定する際に、前記閾値が０．９５である、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
放物線形状を有するリアルタイムＰＣＲデータ曲線のＣｔ値を決定するためにプロセッサを制御するコードを記憶する有形のコンピュータ可読媒体であって、前記コードは、プロセッサによって実行されたときに、前記プロセッサが、
−  ＰＣＲ成長曲線を表す、複数の座標値（ｘ，ｙ）を有するデータセットを受信し；
−  ｘ*で終わる第１線形セグメントと、ｘ*で始まる第２線形セグメントとを有する２セグメント区分線形関数を使用して、前記データセットを近似し；
−  ａ）前記データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、あらかじめ決められた閾値０．９０を上回るかどうか；そして、
ｂ）前記データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ２値が閾値０．８５を上回るかどうか；そして、
ｃ）前記第２セグメントの傾き及び前記第１セグメントの傾きの両方がゼロよりも大きい場合、前記第２セグメントの傾きが前記第１セグメントの傾きよりも大きいかどうか
を決定し；そして、もしａ），ｂ）及びｃ）であれば：
−  前記第２線形セグメントと、ベースライン減算された水平ラインの平均値との交点を決定することによって、前記データセットのＣｔ値を推定し；そして
−  前記Ｃｔ値を表示又はさらなる処理のために出力する、
ようにする指示を含んでいる、コンピュータ可読媒体。
【請求項１０】
前記２セグメント区分線形関数が
【数６】
2013503373.tif 000029
の形を有する、請求項９に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１１】
前記データセットを近似する指示は、ｘ*における目的関数を最小化する指示を含み、前記目的関数は
【数７】
2013503373.tif 000030
の形を有する、請求項９又は１０に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１２】
Ｃｔ値を推定する指示は、
【数８】
2013503373.tif 000031
の形の等式を適用する指示を含み、
上記式中、ｃは第２線形セグメントの傾きであり、そしてｂは第１線形セグメントのｙ切片である、請求項９から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって、ＰＣＲ分析モジュールと、インテリジェンス・モジュールとを含み、
−  前記ＰＣＲ分析モジュールは、ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成し、前記データセットは、それぞれが一対の座標値（ｘ，ｙ）を有する複数のデータポイントを含み、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）値を含む当前記領域内にデータポイントを含み；
−  前記インテリジェンス・モジュールは、
−  ｘ*で終わる第１線形セグメントと、ｘ*で始まる第２線形セグメントとを有する２セグメント区分線形関数を使用して、前記データセットを近似し；
−  ａ）前記データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、あらかじめ決められた閾値０．９０を上回るかどうかを決定し；そして、
ｂ）前記データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ２値が閾値０．８５を上回るかどうかを決定し；そして、
ｃ）前記第２セグメントの傾き及び前記第１セグメントの傾きの両方がゼロよりも大きい場合、前記第２セグメントの傾きが前記第１セグメントの傾きよりも大きいかどうかを決定する
ことによって、前記ＰＣＲ成長曲線が放物線形状を有するかどうかを決定し；そして、もしそうであれば：
−  前記第２線形セグメントと、ベースライン減算された水平ラインの平均値との交点を決定することによって、前記データセットのＣｔ値を推定し；そして
−  前記前記Ｃｔ値を表示又はさらなる処理のために出力する
ことによってＣｔ値を決定するためにＰＣＴデータセットを処理するように適合されている、
リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム。
【請求項１４】
前記２セグメント区分線形関数が：
【数９】
2013503373.tif 000032
の形を有する、請求項１３に記載のＰＣＲシステム。
【請求項１５】
前記データセットの近似は、ｘ*における目的関数を最小化することを含み、ここで前記目的関数は：
【数１０】
2013503373.tif 000033
の形を有する、請求項１３又は１４に記載のＰＣＲシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して言えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データを処理するシステム及び方法に関し、そしてより具体的には、ＰＣＲ増幅曲線における特徴的なサイクル閾値（Ｃｔ）又はエルボー値（ｅｌｂｏｗ  ｖａｌｕｅ）、又は放物線形状を有する他の成長曲線におけるエルボー値を決定するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、特定の核酸配列を酵素的に合成又は増幅するイン・ビトロ法である。この反応は典型的には、逆ストランドとハイブリッド形成し、そして増幅されるべき鋳型又は標的ＤＮＡ配列を隣接させて配置させる２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを使用する。プライマーの伸長は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。鋳型変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼによるアニール済プライマーの拡張を伴う反復する一連のサイクルの結果、特異的なＤＮＡフラグメントが指数関数的に蓄積される。増幅プロセスの検出及び定量化を容易にするように、蛍光プローブ又はマーカーがプロセス中に使用されるのが一般的である。
【０００３】
具体的には、増幅開始後、又は分析のための物理的な反応サンプリング後に試薬を添加することを必要としない、均質な蛍光技術が魅力的である。模範的な均質な技術は、当該領域を配置するためのオリゴヌクレオチド・プライマーと、シグナル発生のための蛍光標識又は色素とを使用する。ＰＣＲをベースとする典型的な方法は、２つの相互作用する発色団を有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド・プローブ（隣接ハイブリダイゼーション・プローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、ただ１つのフルオロフォアを有する単一オリゴヌクレオチド・プローブ（Ｇ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｃｒｏｃｋｅｔｔ，Ａ．Ｏ．及びＣ．Ｔ．Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；２９０：８９−９７及びＳｉｍｐｌｅＰｒｏｂｅｓ，ＩｄａｈｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び、共有結合性の蛍光標識付きオリゴヌクレオチド・プローブの代わりにｄｓＤＮＡ色素（例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）を使用する技術を用いる。ＰＣＲにおいて全ての二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合するＤＮＡ結合色素は、結合すると色素の蛍光発光を引き起こす。従って、ＰＣＲ中のＤＮＡ生成物の増大はこうして蛍光強度を増大させ、サイクル毎に測定され、これにより、ＤＮＡ濃度が定量化され得る。しかし、すべてのｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ生成物との非特定的な結合が生じ、正確な定量化に影響を及ぼすことが潜在的な欠点である。標準希釈を基準として、ＰＣＲにおけるｄｓＤＮＡ濃度を決定することができる。
【０００４】
蛍光レポータープローブは、特異的プローブが結合するＤＮＡ配列だけを検出し、ひいては特異性を著しく増大させる。このことは、非特異的なＤＮＡ増幅が存在していても増幅の定量化を可能にする。同じ反応においていくつかの標的を検出するために、蛍光プローブは多重アッセイにおいて使用することができる。これらの多重アッセイでは、異なる色を有する標識を備えた特異的プローブを標的毎に使用する。蛍光レポータープローブの特異性はまた、増幅中の望ましくない副生成物であるプライマー二量体によって引き起こされる測定の妨害を防ぐ。大抵の用途は、プローブに結合された蛍光レポーター化合物と蛍光のクエンチャーとの相互作用に基づく。レポーターとクエンチャーとが近接している限り、励起源（例えばレーザー、及びＬＥＤなど）による励起時には、ベース蛍光だけを検出することができる。一旦増幅が生じると、レポーターとクエンチャー化合物との相互作用は分断され、検出可能な蛍光シグナルがもたらされる。ＰＣＲサイクル毎に増幅されて生成物が増大すると、レポーターとクエンチャー化合物との相互作用が減衰されることにより、蛍光が比例的に増大することになる。一般に、蛍光は増幅サイクル毎に検出・測定され、生成物の指数関数的増大に対応する蛍光の幾何学的増大が、各反応において閾値サイクル（ＣＴ）を決定するために用いられる。
【０００５】
典型的なリアルタイムＰＣＲ曲線が図１に示されている（実線）。ここでは、典型的なＰＣＲプロセスのためのサイクル数に対して、蛍光強度値がプロットされている。この場合、ＰＣＲ生成物の形成は、ＰＣＲプロセスの各サイクルにおいてモニタリングされる。増幅は普通、サーモサイクラー内で測定される。サーモサイクラーは、増幅反応中に蛍光シグナルを測定するための構成部分及びデバイスを含む。このようなサーモサイクラーの一例はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１１０４６８）である。増幅生成物は例えば、標的核酸に結合したときにだけ蛍光シグナルを発する蛍光標識付きハイブリダイゼーション・プローブによって、又は或る事例では二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素によっても検出される。
【０００６】
典型的なＰＣＲ曲線の場合、一般にエルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値と呼ばれるベース領域の終端における遷移点を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特徴を理解するのに極めて有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用することができる。例えば、典型的には、特定のシグナル閾値が、分析されるべき全ての反応に対して決定され、そして、この閾値に達するために必要とされるサイクルの数（Ｃｔ）が、標的核酸に対して、並びに基準核酸、例えば標準又はハウスキーピング遺伝子に対して決定される。標的核酸及び基準核酸に対して得られたＣｔ値に基づいて、標的分子の絶対又は相対コピー数を決定することができる（Ｇｉｂｓｏｎ他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１；Ｂｉｅｃｈｅ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：２７５９−２７６５，１９９９；国際公開第９７／４６７０７号；同第９７／４６７１２号；同第９７／４６７１４号）。図１のベース領域１５の終端における領域２０内のエルボー値は、サイクル数３６の領域内にあることになる。
【０００７】
既知量のＲＮＡ又はＤＮＡの連続希釈のリアルタイムＰＣＲによって生成された標準曲線と、結果とを比較することにより、ＲＮＡ又はＤＮＡの量を決定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における標的分子の絶対又は相対コピー数は、標準曲線を有するサイクル閾値（Ｃｔ）とを、基準核酸のサイクル閾値（Ｃｔ）と、又は絶対定量化された標準核酸と比較することにより決定することができる。加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の効率は、分析されるべき反応のそれぞれに対するサイクル閾値（Ｃｔ）を、基準核酸のサイクル閾値（Ｃｔ）と比較することによって決定することができる。
【０００８】
ＰＣＲ曲線のエルボー（又はサイクル閾値Ｃｔ）の決定は、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の定量分析のために必要とされる。この用途のために、２００５年１２月２０日付けで出願された米国特許出願第１１／３１６，３１５号明細書；２００６年２月６日付けで出願された米国特許出願第１１／３４９，５５０号明細書；２００６年７月１９日付けで出願された米国特許出願第１１／４５８，６４４号明細書；２００６年９月１９日付けで出願された米国特許出願第１１／５３３，２９１号明細書；２００７年９月２５日付けで出願された米国特許出願第１１／８６１，１８８号明細書；２００８年９月１２日付けで出願された米国特許出願第１２／２０９，９１２号明細書（ＥＬＣＡアルゴリズム）に記載されているように、例えば正規化データ曲線と閾値との交点に基づく、又は正規化データ曲線上で最大曲率又は二次導関数を分析的に（例えば曲率アルゴリズムを使用）又は数値的に決定することによる、多くのアルゴリズムが開発されている。これらの方法は、基礎となる曲線がシグモイド形に近似するならば、極めてよく機能する。生データ曲線が放物線形状を有する稀な事例の場合、これらの方法によって決定されたエルボー値は、データ曲線の調査によって予期されるよりも大きいエルボー値となるのが典型的である。
【０００９】
図１に示された西ナイルウイルス（ＷＮＶ）アッセイから得られたリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を考察する。黒い実線曲線は典型的なシグモイド形状を有する。この形状は以前に開発されたアルゴリズムを用いて分析しやすい。しかしながら、破線曲線は、放物曲線に似ており、平坦域を欠いている。図１に示された２つのエルボー値は、一例としてＥＬＣＡアルゴリズムによって分析される場合、下記表１に示された値を有する。ＥＬＣＡアルゴリズムは、曲率又は二次導関数における最大値の点としてエルボー値を数値的に決定する。
【００１０】
【表１】
2013503373.tif 000003
【００１１】
実線曲線のエルボー値は、通常シグモイド曲線に割り当てられる値と一致するのに対して、破線で示された放物曲線のエルボー値のところに引かれた垂直線は破線曲線と、通常この曲線に割り当てられるよりも著しく高い値で交差する。
【００１２】
従って、これらのタイプの曲線を扱うためのシステム及び方法を開発し、そしてまた、このような放物曲線が存在する場合にはそれを識別することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、ＰＣＲ曲線を処理するための、そして放物線状ＰＣＲ曲線の存在を識別するためのシステム及び方法を提供する。一実施態様によれば、ＰＣＲ曲線の区分線形近似を使用することにより、放物線状ＰＣＲ曲線の場合に、より現実的なエルボー値が決定されるのを可能にする。
【００１４】
本発明の一態様によれば、放物線形状を有するリアルタイムＰＣＲデータ曲線のＣｔ値を決定するコンピュータ実行方法が提供される。この方法は、コンピュータシステムのプロセッサ又は他の装置又は機械（例えばサーモサイクラー）内で実行されるステップを含み、そしてこれらのステップは、ＰＣＲ成長曲線を表す、複数の座標値（ｘ，ｙ）を有するデータセットを受信し；ｘ*で終わる第１線形セグメントと、ｘ*で始まる第２線形セグメントとを有する２セグメント区分線形関数を使用して、データセットを近似するステップを含む。この方法はまた典型的には、ａ）データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、０．９０以上であるあらかじめ決められた閾値を上回るかどうか；そして、ｂ）データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ2値が０．８５以上の閾値を上回るかどうか；そして、ｃ）第２セグメントの傾き及び第１セグメントの傾きの両方がゼロよりも大きい場合、第２セグメントの傾きが第１セグメントの傾きよりも大きいかどうかを決定し；そして、もしそうであれば、第２線形セグメントと、ベースライン減算された水平ラインの平均値との交差を決定することによって、データセットのＣｔ値を推定するステップを含む。この方法はまた典型的には、Ｃｔ値を表示又はさらなる処理のために出力するステップを含む。一の実施態様において、２セグメント区分線形関数は、
【００１５】
【数１】
2013503373.tif 000004
【００１６】
の形を有する。
【００１７】
ある実施態様において、データセットの近似は、ｘ*における目的関数を最小化することを含み、目的関数は
【００１８】
【数２】
2013503373.tif 000005
【００１９】
の形を有する。
【００２０】
具体的には、ｘ*は、目的関数を、ｘ＝ｎ０からｎ−１までの全てのデータポイントに適用することにより決定され、ｎはデータセットの長さであり、ｎ０はあらかじめ決められた出発座標であり、そしてｘ*は、最小の赤池情報量係数（ＡＩＣ）を有するｘの値として決定される。ある実施態様では、ＡＩＣは等式：
【００２１】
【数３】
2013503373.tif 000006
【００２２】
によって定義され、上記式中、ｍはモデルの自由度の数であり、ｙはデータ・ベクトルであり、そして
【００２３】
【数４】
2013503373.tif 000007
【００２４】
は予測モデル・ベクトルである。別の実施態様では、Ｃｔ値の推定は、
【００２５】
【数５】
2013503373.tif 000008
【００２６】
の形の等式を適用することを含み、上記式中、ｃは二次線形セグメントの傾きであり、そしてｂは第１線形セグメントのｙ切片である。データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、あらかじめ決められた閾値を上回るかどうかを決定するための或る実施態様において、あらかじめ決められた閾値は０．９９である。データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ２値が閾値を上回るかどうかを決定するためのさらに別の実施態様において、閾値は０．９５である。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、放物線形状を有するリアルタイムＰＣＲデータ曲線のＣｔ値を決定するためにプロセッサを制御するコードを記憶する有形のコンピュータ可読媒体が提供される。コードは典型的には、プロセッサによって実行されたときに、プロセッサが、ＰＣＲ成長曲線を表す、複数の座標値（ｘ，ｙ）を有するデータセットを受信し；ｘ*で終わる第１線形セグメントと、ｘ*で始まる第２線形セグメントとを有する２セグメント区分線形関数を使用して、データセットを近似するようにする指示を含んでいる。コードはまた典型的には、ＰＣＲ曲線が放物線形状を有するかどうかを決定する指示を含んでいる。或る特定の態様において、この決定は、ａ）データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、０．９０以上の閾値を上回るかどうか；そして、ｂ）データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ2値が０．８５以上の閾値を上回るかどうか；そして、ｃ）第２セグメントの傾き及び第１セグメントの傾きの両方がゼロよりも大きい場合、第２セグメントの傾きが第１セグメントの傾きよりも大きいかどうかを決定することによって行われる。コードはまた典型的には、もしａ），ｂ）及びｃ）が真であれば、第２線形セグメントと、ベースライン減算された水平ラインの平均値との交点を決定することによって、データセットのＣｔ値を推定し；そしてＣｔ値を表示又はさらなる処理のために出力する指示を含んでいる。一の実施態様において、２セグメント区分線形関数は
【００２８】
【数６】
2013503373.tif 000009
【００２９】
の形を有する。
【００３０】
或る実施態様において、データセットを近似する指示は、ｘ*における目的関数を最小化する指示を含み、目的関数は
【００３１】
【数７】
2013503373.tif 000010
【００３２】
の形を有する。
【００３３】
具体的には、ｘ*は、目的関数を、ｘ＝ｎ０からｎ−１までの全てのデータポイントに適用することにより決定され、ｎはデータセットの長さであり、ｎ０はあらかじめ決められた出発座標であり、そしてｘ*は、最小の赤池情報量係数（ＡＩＣ）を有するｘの値として決定される。或る実施態様において、ＡＩＣは等式：
【００３４】
【数８】
2013503373.tif 000011
【００３５】
によって定義され、上記式中、ｍはモデルの自由度の数であり、ｙはデータ・ベクトルであり、そして
【００３６】
【数９】
2013503373.tif 000012
【００３７】
は予測モデル・ベクトルである。別の実施態様において、Ｃｔ値を推定する指示は、
【００３８】
【数１０】
2013503373.tif 000013
【００３９】
の形の等式を適用する指示を含み、上記式中、ｃは二次線形セグメントの傾きであり、そしてｂは第１線形セグメントのｙ切片である。
【００４０】
本発明のさらに別の態様によれば、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって、ＰＣＲ分析モジュールと、インテリジェンス・モジュールとを含み、ＰＣＲ分析モジュールは、ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成し、前記データセットは、それぞれが一対の座標値（ｘ，ｙ）を有する複数のデータポイントを含み、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）値を含む当該領域内にデータポイントを含み；インテリジェンス・モジュールは、Ｃｔ値を決定するためにＰＣＴデータセットを処理するように適合されている、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。Ｃｔ値は典型的には、ｘ*で終わる第１線形セグメントと、ｘ*で始まる第２線形セグメントとを有する２セグメント区分線形関数を使用して、データセットを近似し；そしてＰＣＲ曲線が放物線形状を有するかどうかを決定することによって決定される。曲線が放物線形状を有するかどうかを決定することは典型的には、ａ）データセットの終わりまでの、ｘ*で始まるデータポイントに対する二次フィットのＲ2値が、０．９０以上の閾値を上回るかどうかを決定し；そして、ｂ）データセットのほぼ全てにわたる２セグメント区分フィットのＲ2値が０．８５以上の閾値を上回るかどうかを決定し；そして、ｃ）第２セグメントの傾き及び第１セグメントの傾きの両方がゼロよりも大きい場合、第２セグメントの傾きが第１セグメントの傾きよりも大きいかどうかを決定し；そして、もしａ）、ｂ）、及びｃ）が真であるならば、第２線形セグメントと、ベースライン減算された水平ラインの平均値との交差を決定することによって、データセットのＣｔ値を推定し；そしてＣｔ値を表示又はさらなる処理のために出力することによって、行われる。ＰＣＲシステムの一の実施態様において、２セグメント区分線形関数は
【００４１】
【数１１】
2013503373.tif 000014
【００４２】
の形を有する。
【００４３】
或る実施態様において、データセットの近似は、ｘ*における目的関数を最小化することを含み、目的関数は
【００４４】
【数１２】
2013503373.tif 000015
【００４５】
の形を有する。
【００４６】
具体的には、ｘ*は、目的関数を、ｘ＝ｎ０からｎ−１までの全てのデータポイントに適用することにより決定され、ｎはデータセットの長さであり、ｎ０はあらかじめ決められた出発座標であり、そしてｘ*は、最小の赤池情報量係数（ＡＩＣ）を有するｘの値として決定される。或る実施態様において、ＡＩＣは等式：
【００４７】
【数１３】
2013503373.tif 000016
【００４８】
によって定義され、上記式中、ｍはモデルの自由度の数であり、ｙはデータ・ベクトルであり、そして
【００４９】
【数１４】
2013503373.tif 000017
【００５０】
は予測モデル・ベクトルである。別の実施態様において、Ｃｔ値の推定は、
【００５１】
【数１５】
2013503373.tif 000018
【００５２】
の形の等式を適用することを含み、上記式中、ｃは二次線形セグメントの傾きであり、そしてｂは第１線形セグメントのｙ切片である。
【００５３】
図面及び特許請求の範囲を含めて、本明細書の残りの部分を参照すると、本発明の他の特徴及び利点を理解することができる。本発明のさらなる特徴及び利点、並びに本発明の種々の実施態様の構造及び作業について、添付の図面を参照しながら下記に詳しく説明する。図面において同じ符号は、同一又は機能的に同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、シグモイド形状を有するＰＣＲプロセスと関連する典型的な成長又は増幅曲線（実線）、及び放物線形状を有するＰＣＲプロセス曲線（破線）を示す図である。
【図２】図２は、放物線状ＰＣＲ曲線、及び区分線形近似を示す図である。
【図３】図３は、図１の破線（放物線形状ＰＣＲ曲線）に相当するサイクル２５からサイクル４９までの、サイクル数に対するＡＩＣのプロットを示す図である。
【図４】図４は、一の実施態様に従ってＰＣＲ曲線における遷移値を決定するプロセスを示す図である。
【図５】図５は、本発明の方法及びシステムを実施するために使用することができるソフトウェア・リソースとハードウェア・リソースとの関係を示す一般的なブロック・ダイアグラムの例である。
【図６】図６は、サーモサイクラー装置とコンピュータシステムとの関係を示す一般的なブロック線図の例である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、放物線形状のＰＣＲ曲線を識別し、そしてＣｔ値を決定するためにこのような曲線を処理するシステム及び方法を提供する。
【００５６】
ＰＣＲ法との関連における成長曲線又は増幅曲線１０の一例が図１に示されている。図示のように、曲線１０は遅延相領域１５と、指数相領域２５とを含む。遅延相領域１５は一般にベースライン又はベースライン領域と呼ばれる。このような曲線１０は、遅延相領域と指数相領域とを繋ぐ当該遷移領域２０を含む。領域２０は、一般にエルボー又はエルボー領域と呼ばれる。エルボー領域は典型的には、ベースラインの終わり、及び基礎となるプロセスの成長速度又は増幅速度の遷移を画定する。領域２０内の特異的遷移点を識別することは、基礎プロセスの挙動を分析する上で役立つことがある。典型的なＰＣＲ曲線において、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値と呼ばれる遷移点を識別することは、ＰＣＲ法の定性的及び定量的な特徴を理解する上で有用である。例えば、Ｃｔ値は、被分析試料中に存在するＤＮＡの量を量子化するために使用することができる。量子化は、Ｌｏｇ（ＤＮＡ量）対Ｃｔ値の較正曲線法を実施することにより得られる。後続の試料についてはその後、較正曲線と一緒にＣｔ値を使用することにより、当該試料中のＤＮＡの推定値を直接得ることができる。ＤＮＡ試料に関する定性的な情報を提供するために、Ｃｔ値を使用することもできる。
【００５７】
平坦域なしの放物線形状を有する同様の曲線を提供し得る他の過程は、細菌過程、酵素過程、及び結合過程を含む。例えば細菌成長曲線において、当該遷移点は、遅延相内の時点λと呼ばれている。本発明に従って分析することができるデータ曲線を生成する他の具体的な方法は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）法、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）法、及び転写媒介増幅（ＴＭＡ）法を含む。ＳＤＡ法及びＮＡＳＢＡ法及びデータ曲線の例は、Wang, Sha-Sha他、“Homogeneous Real-Time Detection of Single-Nucleotide Polymorphisms by Strand Displacement Amplification on the BD ProbeTec ET System”, Clin Chem 2003 49 (10):1599、及びWeusten, Jos J.A.M.他、“Principles of Quantitation of Viral Loads Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification in Combination With Homogeneous Detection Using Molecular Beacons”, Nucleic Acids Research, 2002 30(6):26 にそれぞれ見いだすことができる。このように、本明細書の残りの部分では、本発明の実施態様及び態様を、ＰＣＲ曲線に対する適用可能性に関して論じるが、本発明を、他の方法に関連するデータ曲線に適用できることは言うまでもない。
【００５８】
図１に示すように、典型的なＰＣＲ成長曲線のデータは、ｘ軸を定義するＰＣＲサイクル数と、ｙ軸を定義する累積ポリヌクレオチド成長のインジケータとを有する二次元座標系で表すことができる。典型的には、蛍光マーカーの使用が最も幅広く用いられる標識付けスキームであるため、累積成長のインジケータは蛍光強度値である。しかしながら、用いられる具体的な標識付けスキーム及び／又は検出スキームに応じて他のインジケータを使用できることは言うまでもない。累積シグナル成長の他の有用なインジケータの例は、ルミネッセンス強度、化学発光強度、生物発光強度、リン光強度、電荷移動、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射能強度、反射率、透過率及び吸光度を含む。サイクルの定義は、時間、プロセス・サイクル、単位作業サイクル及び再生サイクルを含むこともできる。
【００５９】
一般的プロセスの概観
図１に示されたリアルタイムＰＣＲ成長を考察する。各曲線のＣｔ値又はエルボー値と呼ばれる数値を図１から得ることが望まれる。図示のように、ＰＣＲ曲線の実データが放物線形状の曲線をもたらすことがしばしばある。このような放物線形状の曲線に対しては、標準的なＣｔ決定プロセスはうまく働かない。表１を参照しながら上述したように、実線で示された曲線のエルボー値は、通常シグモイド曲線に割り当てられる値と一致するのに対して、破線で示された放物曲線のエルボー値は、この曲線に典型的に割り当てられる値よりも著しく高い。
【００６０】
一の実施態様によれば、ＰＣＲ曲線内の遷移値、例えば動的ＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値を決定するプロセス１００を、図４を参照しながら手短に説明することができる。ステップ１１０において、曲線を表す試験データセットを受信又はその他の形式で獲得する。プロットされたＰＣＲデータセットの一例を図１に示す。図１では、ｙ軸及びｘ軸は、ＰＣＲ曲線に対してそれぞれ蛍光強度及びサイクル数を表す。特定の態様において、データセットは、軸に沿って連続的な、そして等間隔を置いたデータを含むことになっている。
【００６１】
プロセス１００が、ＰＣＲデータ獲得装置、例えばサーモサイクラー内に位置するインテリジェンス・モジュール（例えば命令を実行するプロセッサ）内で実施される場合、データセットは、データが収集されるのにともなってリアルタイムでインテリジェンス・モジュールに提供してよく、或いは、データセットをメモリーユニット又はバッファ内に保存し、そして試験が完了した後でインテリジェンス・モジュールに提供してもよい。同様に、データセットは、獲得装置とのネットワーク接続（例えばＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えばＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続）を介して、別個のシステム、例えばデスクトップ・コンピュータシステム又はその他のコンピュータシステムに提供してもよく、或いは、可搬性媒体、例えばＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はメモリースティックなどに提供してもよい。或る態様において、データセットは、座標値対（又は二次元ベクトル）を有するデータ点を含む。ＰＣＲデータの場合、座標値対は典型的には、サイクル数及び蛍光強度値を表す。データセットがステップ１１０において受信又は獲得されたあと、データセットを分析することにより、ベースライン領域の端部を決定することができる。
【００６２】
ステップ１２０において、既知のプロセスに従ってデータセットを処理することにより、データセット／曲線のＣｔ値を決定する。例えばＥＬＣＡ法を用いてよい。ステップ１３０において、データセット／曲線が放物線形状の特徴を有するかどうかを決定する。一の実施態様において、下記条件の全てが満たされていれば、データセット／曲線は、放物線特徴を有すると判断され、そして下記のように、等式４によって予測される値に、Ｃｔ値を変化させる：
１．所与のデータポイントの終わりまでの、ｘ*から始まるデータポイントに対する二次フィットを計算する。もしもこのフィットのＲ2値が、あらかじめ決められた閾値（デフォルト＝０．９０以上）を上回るならば、ＣT値を受け入れる。一の実施態様において、閾値を０．９９に設定する。
２．（全てのサイクルにわたる）生データに対する区分線形フィットのＲ２値＞閾値（デフォルト＝０．８５以上）。一の実施態様において、閾値を０．９５に設定する。
３．ａ＞０であり且つｃ＞０であるならば、比ｃ／ａは、所与の閾値（デフォルト＝１．１）よりも大きい。
【００６３】
データセット／曲線が放物線の特徴を呈していると判断された場合、プロセスはステップ１４０に進む。
【００６４】
ステップ１４０において、放物曲線のＣｔ値を決定する。破線で示した曲線（放物曲線）に対してより適切なエルボー値を定義するために、一の実施態様において、ＲＴ−ＰＣＲ曲線に対して区分線形近似を用いる。一の実施態様に基づく放物曲線の区分線形関数近似は次の通り提供される：
【００６５】
【数１６】
2013503373.tif 000019
【００６６】
この等式において、区分線形関数は、共通の点ｘ*で接合されている２つの線形関数を含む。等式１の適用を図２に示す。図２には、放物曲線及び区分線形近似の両方が示されている。
【００６７】
一実施態様の場合、所与のｘ*値における等式２に示された目的関数を最小化することにより、区分線形曲線を決定する。
【００６８】
【数１７】
2013503373.tif 000020
【００６９】
等式２においてどのｘ*値を用いるかを決定するために、一の実施態様において、目的関数を、ｘ*＝ｎ0...ｎ−１からの全てのデータポイントに適用する。理論上は、ｎ0はサイクル１又はサイクル２又はサイクル３などとして定義することができるが、しかし、処理資源消費を低減するのを助けるために、ｎ0はおよそサイクル２０又は２５などに設定する。それというのも、これらのサイクル値は典型的には、ベースライン領域の終わりの前に来るからである。最小赤池情報量係数（ＡＩＣ）を有するｘ*の値を選ぶ。赤池情報量係数は： 
【００７０】
【数１８】
2013503373.tif 000021
【００７１】
によって定義され、上記式中、ｍはモデルの自由度の数であり、ｎはデータセットの長さであり、ｙはデータ・ベクトルであり、そして
【００７２】
【数１９】
2013503373.tif 000022
【００７３】
は予測モデル・ベクトルである。一旦区分線形関数が決定されたら、ベースライン減算生データ曲線の平均値のところで引かれた水平ラインと、区分線形関数の第２部分との交点としてＣｔ値を推定する。数学的には、これは
【００７４】
【数２０】
2013503373.tif 000023
【００７５】
となる。
【００７６】
ステップ１５０において、等式４によって決定されたＣｔ値を、表示又はさらなる処理のために出力するか又は戻す。グラフィカル表示は、図４の分析を行ったシステムとカップリングされた表示装置、例えばモニタースクリーン又はプリンターでレンダリングすることができ、或いは、表示装置上でレンダリングするために別個のシステムにデータを提供することもできる。しかしながら、ステップ１３０において、データセット／曲線が放物線特徴を呈していないと判断された場合には、ステップ１２０で用いられたプロセスによって決定されたＣｔ値は、ステップ１５０で出力される。言うまでもなく、所望の場合には両方のＣｔ値を出力することもできる。また或る実施態様の場合、例えば、処理される曲線が平面域を有さない条件下では、等式４の放物線Ｃｔ決定プロセスを、上記のような別のアルゴリズム、例えばＥＬＣＡのサブセットではなく、独立したアルゴリズムとして用いることもできる（例えば図４のステップ１２０が省かれる）。
【００７７】
或る実施態様において、本発明による方法は、例えばデータセットを入力するための入力装置、例えばキーボード、及びマウスなど；曲線領域内の当該特定の点を表すためのディスプレイ装置、例えばモニター；この方法における各ステップを実施するのに必要な処理装置、例えばＣＰＵ；ネットワーク・インターフェイス、例えばモデム、データセットを保存するためのデータ記憶装置、プロセッサ上で実行するコンピュータ・コード、などを含むコンベンショナルなパーソナル・コンピュータシステムによって実施することができる。さらに、この方法は、ＰＣＲ分析モジュール内で実施することもできる。
【００７８】
ＰＣＲシステムの一例を図５〜６に示す。図５は、本発明の方法及びシステムを実施するために使用することができるソフトウェア・リソースとハードウェア・リソースとの関係を説明する一般ブロック・ダイアグラムを示す。図６に示すシステムは、サーモサイクラー装置内に配置することができる動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの部分であるインテリジェンス・モジュールとを含む。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して、分析モジュールからインテリジェンス・モジュールへ、又はその逆の方向に転送される。データセットは例えば、図４に示されたフローチャートに従って処理することができる。このフローチャートは、例えば図５に示されたフローチャートに従って、コンピュータシステムのハードウェア上に保存されたソフトウェアによって好都合に実施することができる。図５を参照すると、コンピュータシステム（２００）は、例えばＰＣＲ反応中に得られた蛍光データを受信するための受信手段（２１０）と、本発明の方法に従って前記データを処理するための計算手段（２２０）と、計算手段によって得られた結果に従って前記データの一部を交換するための適用手段（２３０）と、コンピュータ・スクリーン上に結果を表示するための表示手段（２４０）とを含んでいてよい。図６は、サーモサイクラー装置とコンピュータシステムとの相互作用を示す。システムは、サーモサイクラー装置内に配置することができる動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの部分であるインテリジェンス・モジュールとを含む。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して、分析モジュールからインテリジェンス・モジュールへ、又はその逆の方向に転送される。データセットは、プロセッサ上で実行する、インテリジェンス・モジュールの記憶装置上に記憶されたコンピュータ・コードによって、図５に従って処理することができ、また処理後、分析モジュールの記憶デバイスに戻し転送することができ、ここで修正済データを表示装置上に表示することができる。
【００７９】
言うまでもなく、放物曲線決定プロセスを含むＣｔ決定プロセスは、コンピュータシステムのプロセッサ又は他の装置又は機械（例えばサーモサイクラー）上で実行するコンピュータ・コードにおいて実施することができる。コードは、Ｃｔ決定プロセスの種々の態様及びステップを実施するためにプロセッサを制御する指示を含む。コードは典型的には、有形の媒体、例えばハードディスク、ＲＡＭ、又は可搬性媒体、例えばＣＤ、ＤＶＤ、又はメモリースティックなどに記憶される。同様に、プロセスは、ＰＣＲ装置、例えば、プロセッサを含むサーモサイクラーにおいて実施することができる。プロセッサは、プロセッサ内に組み入れられるか、又はプロセッサとカップリングされたメモリーユニット内に記憶された指示を実行する。コード源とのネットワーク接続又は直接接続を介して、又はよく知られている可搬性媒体を使用して、このような指示を含むコードをＰＣＲ装置メモリーユニットへダウンロードすることができる。
【００８０】
当業者には明らかなように、本発明のエルボー決定プロセスは、種々様々なプログラミング言語、例えばＣ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃなど、並びに、データの視覚化及び分析に有用なプリパッケージングされたルーティン、関数、及び手順を提供するアプリケーション、例えばＭａｔｈｅｍａｔｉｃａを使用してコードすることができる。
【００８１】
上述のように、本発明のシステム及び方法は、ＰＣＲ増幅曲線において特徴的なサイクル閾値（Ｃｔ）又はエルボー値、又は放物線形状を有する他の成長曲線におけるエルボー値を決定するのに有用である。ＰＣＲ曲線のエルボー（又はサイクル閾値Ｃｔ）の決定は、リアルタイム（ＲＴ−ＰＣＲ）の定量分析に必要となる。これは、例えば分析結果を患者に伝える際に現実的且つ具体的な有用性を有する。具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応をモニタリングするために蛍光データを使用するときに、成長曲線の形状が放物線状である場合に本発明のシステム及び方法はより正確なデータを提供する。このようなデータは、反応をモニタリングするのに有用であるだけではなく、技術的な効果、例えばＰＣＲ中に増幅された標的核酸の定量化、又は、得られたデータに基づくＰＣＲ反応条件の適合をも可能にする。
【００８２】
本発明の理解を助けるために、下記実施例及び図面を提供する。本発明の真の範囲は添付の請求項に示されている。
【実施例】
【００８３】
実施例
サイクル２５からサイクル４９までのｘ*値に対して、等式Ｉの回帰曲線フィットを行った。曲線フィット毎に、等式３に従ってＡＩＣを計算した。図３に示されているのは、図１に示された破線曲線に相当するサイクル２５からサイクル４９までの、サイクル数に対するＡＩＣのプロットである。最小ＡＩＣは、サイクル数４１において発生することが見いだされ、そしてｘ*＝４１を使用した等式１の係数が｛ａ＝０．００２４７２；ｂ＝０．０３４６０；ｃ＝０．２５３８７｝であることが見いだされた。これらの係数は、等式２において関数を最小化することにより決定した。この区分線形フィットは３つの条件が満たされたため、受け入れられる。すなわち：
（１）ｃ＞０及びｃ／ａ＝１０２．７、これは閾値１．１よりも大きい。
（２）サイクル４１からサイクル５０までの生データの二次フィットのＲ２値が０．９９９６７であり、これは閾値０．９０又は０．９９よりも大きい。
（３）全てのサイクル数にわたる区分線形フィットのＲ２値は０．９８７２であり、これは閾値０．８５又は０．９５よりも大きい。
【００８４】
等式４、及び蛍光の平均ベースライン減算値＝０．００５３３を用いると、Ｃｔは、Ｃｔ＝４１．０２と計算される。
【００８５】
実施例を用いて、そして具体的な実施態様に関して本発明を説明してきたが、本発明は、開示された実施態様に限定されるものではないことは明らかである。反対に、当業者には明らかなように、種々の変更形及び類似の配置にも本発明の範囲が及ぶものとする。
【図１】
2013503373.tif 000034
【図２】
2013503373.tif 000035
【図３】
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【図４】
2013503373.tif 000037
【図５】
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【図６】
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