(57)【要約】溶液中のリガンドと、１層以上の反射防止誘電体層でコーティングされた透明な固体材料の表面に固定された受容体との分子相互作用の定量的測定方法であって、前記表面と前記溶液との接触面により反射される光を直接測定することによる方法、及びそのための装置。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のリガンドと固体表面に固定された前記リガンドの受容体との複合体の形成を検出及び／又は定量化するための方法であって、
以下の工程、
ａ）固体結晶質又は非晶質材料からなる基板の表面を、厚さ５０nm〜５００nmの１つ以上の誘電体層でコーティングして、これにより、水溶液と接触したときの前記表面の反射率が０．０１％未満となる工程、
ｂ）前記表面上に受容体分子を固定する工程、
ｃ）固定された受容体を担持する前記表面と、リガンドの分子を含有する溶液とを接触させる工程、
ｄ）溶液と固定された受容体を担持する前記表面との接触面から反射される光の強度を、時間の関数として測定し、反射光強度値を、薄層反射に関するフレネル公式によって、受容体と相互作用するリガンド分子の単位表面当たりの質量値に換算する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
工程ｄ）で測定した、反射光強度値又は受容体と相互作用するリガンド分子の単位表面当たりの質量値を、溶液中のリガンド分子の総量又は濃度に変換する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）で測定した、反射光強度値又は受容体と相互作用するリガンド分子の単位表面当たりの質量値を、リガンド−受容体親和性定数に変換する請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程ｄ）で測定した、時間の関数としての反射光強度値を、リガンド−受容体対の会合及び／又は解離の速度定数に変換する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
結晶質又は非晶質の固体材料からなる前記基板が、屈折率１．４〜１．７を有する、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記材料がシリカガラスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
誘電体層が、１．３５より大きい屈折率を有する請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）〜ｂ）により得た低反射率の前記表面を個別の領域に分割し、任意に列に配置し、個別の領域に個別の受容体を吸着させるか又は固定させ、そして、個別の領域からの反射光の強度を画像システムにより同時に測定する、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
受容体の機能を有しない他の分子（スペーサー）もまた、受容体とともに前記表面に固定される、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
リガンド−受容体対が、薬理学的関心のタンパク質、ペプチド、核酸、グリコプロテイン、炭水化物、ホルモン、脂質、細胞、細胞成分、ウイルス又は分子から選択される、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
受容体が、
ａ．化学結合；
ｂ．吸着；
ｃ．表面上に先に固定された分子又はポリマー上への吸着；
ｄ．電磁照射；
ｅ．プラズマ処理
を通して、表面上に固定化される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドを含有し、固定された受容体を担持する前記表面と接触する溶液が水溶液ではない、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
入射光の入射角、偏光状態、角度広がり及びスペクトル特性が、リガンド−受容体相互作用の存在下での反射光信号と光の反射と散乱によるバックグラウンド信号との比率を最適化するために選択される、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
固定された受容体を有する前記表面が、流れのない測定用セルに組み入れられるか、流れセル中に組み入れられるか、又は水浸探触子に組み入れられる、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載の方法を実施するための装置であって、
リガンドを有する溶液を含有し、リガンド−受容体反応を生じさせるために適切な少なくとも１つのセルと、溶液をセルに流し込み、そして流し出すための手段と、入射光及び反射光の強度をそれぞれ測定するのに適切な光源及び光検出器と、並びに任意に１つ以上の鏡、レンズ及び絞りとを含む、装置。
【請求項１６】
前記光源がＬＥＤ光源であり、
前記検出器が、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ検出器である、請求項１５記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の概要
本明細書において、表面の光反射率を減少させるような厚さ及び屈折率を有する１層以上の反射防止誘電体層でコーティングされた透明な固体材料の表面に固定された受容体と、溶液中のリガンドとの分子相互作用を、前記表面と前記溶液との接触面から反射される光を直接測定することにより、標識化部分を必要とせずに、定量的に測定するための方法が提供される。本発明は、また、本方法を実施するための装置も提供する。
【０００２】
従来技術
公知の技術において、リガンドと受容体との相互作用（すなわち、化学、生化学又は生物学的関心の可逆的なリガンド−受容体系の結合親和性及び反応速度）の測定に関して、数多くの方法が提案されてきた。主な方法の一覧が、"Biosensors and BioDetection", John M. Walker, Humana Press, 2009.に報告されている。公知の方法は、通常、受容体を適切な平らな表面に固定し、リガンドを含有している溶液をその面と接触させた後に、その表面の特性の一部（例えば、光学特性）の変化を、直接又は間接的に測定することを含む。前記の変化は、リガンド−受容体複合体の形成によって誘発される。
【０００３】
ある種の方法は、溶液中のリガンドの標識化、すなわち、リガンドを、放射性種（例えば米国特許出願第２００４／００１４０６０  Ａ１を参照）の蛍光性、発光性で共有結合修飾することを必要とする。しかしながら、リガンドの修飾は、通常、時間がかかり、かつ複雑な作業であり、非常に多くの種類のリガンドが使用されるスクリーニングアッセイ等においては制限的要因となり得ることに留意する必要がある。標識化のもう１つの短所は、リガンド−受容体の相互作用が、リガンドの化学修飾に影響される虞があることである。
【０００４】
（細胞膜の表面で起こっているような）受容体−リガンド相互作用をより効果的に模倣する別種の方法は、リガンドを標識化物質で修飾することなく、表面受容体−リガンド結合の形成により引き起こされる物理的性質における変化を利用する。この種の方法は、一般的に「無標識」と呼ばれる。これらの方法の一例が、GE Healthcare社(Uppsala、Sweden)の販売するBIAcore バイオセンサーによって提供されており、例えば、米国特許第５，３１３，２６４号及び米国特許第５，３７４，５６３号に記載されている。このバイオセンサーでは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Article Jiri Homola, Sinclair S. Yee, Gunter Gauglitz, "Surface plasmon resonance sensors: review", Sensors and Actuators B, vol. 54 (1999), pages 3-15参照）の原理に基づき、光のエバネッセント波が、銀又は金のような導電性材料製の薄層（５０nm）中の表面プラズモンとカップリングし、特定の角度で共鳴現象を起こす。これにより、最小の反射角度を測定することにより、リガンド−受容体対のような、金属上に固定された物質の層の屈折率を測定することができる。通常の使用においては、時間に対する屈折率の変化から、リガンドと受容体との結合定数が得られる。
【０００５】
この方法は、広く実用化されているものの、非常に複雑かつ高価であり、結合定数を測定する上で必ずしも正確とは限らない。例えば、刊行物"Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic interactions Between Aspects of biological macromolecules," Peter Schuck, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1997, 26, pp.541-66を参照されたい。結合定数を測定するためにBIAcore法を使用することに伴う問題は、この方法の複雑さによるところが大きい。というのは、測定した信号は、５つの材料の物理的性質に依存しており、それらは、推測的に知ることのできないパラメーターを含む複雑な関数に依存するからである。その５つの材料とは、ガラス又は類似する材料から作られた基板、導電性薄膜、生体適合性ポリマー層、受容体、相互作用を介して吸着する分子並びに水溶液である。
【０００６】
前記の問題により以下：
１）結合反応速度論により決定される親和性定数値と熱力学平衡状態で得られたそれらとの不一致；
２）信号が既知でないパラメーターに依存するため、リガンド／受容体対が表面上に形成された際に生じる信号の強度を予測することが不可能であること
のことが生じる。
【０００７】
無標識方法のもう１つのグループ（通常「反射干渉分光法」と称される）は、ガラス又は石英のような透明な基板により反射される光のスペクトルシフトの測定に基づくものであって、二酸化ケイ素又はポリスチレンのような誘電体材料からなる薄層でコーティングされた表面（１ミクロンの数分の１〜数十ミクロンからなる厚さ）を呈する。その基板は、いわゆるマイクロキュベットファブリーペロー干渉計に基づくバイオセンサー（例えば刊行物：A. Brecht, J. Ingenhoff, G. Gauglitz, "Direct monitoring of antigen-antibody interactions by spectral interferometry", Sensors and actuators B: Chemical, Vol 6, pp. 96-100 (1992))参照）の場合同様、平板状であってよく、又は一端を平らで滑らかにした繊維状に形作ることもできる（例えば、米国特許出願第５，８０４，４５３号及び第７，３１９，５２５号参照）。受容体の機能を有する前記表面（その上に様々な手法により分子が固定されている）を、分析対象が存在する溶液と接触するように置く。表面に、多色光を照射し、反射した光を回収して分光計に送る。誘電体層の厚さは、反射光のスペクトルに変調を加え、複数の干渉最大値及び最小値を生じ得る。干渉最大値及び最小値の位置は、誘電体層の厚さ及びその屈折率により一意的に決まる。リガンド分子の表面への付着は、反射光のスペクトルを変化させ、とりわけ、干渉最大値及び最小値の位置をシフトさせる。反射光のスペクトルにおけるこれらの変化を測定することにより、表面上の分子層の厚さを測定することが可能である。この原理に基づく計器の一例として、Fortebio （Menlo Park, CA 94025 USA）が販売するOctectを挙げる。
【０００８】
反射光のスペクトルの変化の測定に基づく上記の方法の変種が、最近の刊行物であるE. Ozkumur, J. W. Needham, D. A. Bergstein, R. Gonzalez, M. Cabodi, J. M. Gershon, B. B. Goldberg, M. S. Unlu., "Label-free and dynamic detection of Biomolecular interactions for high-throughput microarray applications," PNAS, Vol 105, pp. 7988-7992 (2008)で論じられている。この場合、シリコン平板に二酸化ケイ素の薄層をコーティングした検知面上に、個別の受容体を個別の円領域に固定し、その表面上にリガンド分子が付着することによって、反射光のスペクトルにもたらされる変化を、空間分解法により測定する。表面には、等間隔に並んだ波長を有する一連の単色光線を（波長可変レーザーから）順次照射し、各照明条件ごとに、表面の反射像をデジタルカメラで記録する。カメラの各光学素子（画素）によって記録された強度の値の配列から、検知面上の対応する領域から反射される光のスペクトルの一部を再構成することができる。このように、リガンドの付着によって引き起こされるスペクトルの変化を、分割された表面の各領域ごとに個別に測定することができる。
【０００９】
このグループの方法は、反射光のスペクトルの測定に基づくものであって、ＳＰＲの原理に基づく方法とは異なる物理原理に基づいているが、後者同様、分光計又は可変波長の単色光源（例えば、波長可変レーザー）を必要とし、実施するにはやや複雑かつ高価である。シリコンウエハ上の二酸化ケイ素の層により形成された基板を使用することに基づく異なる検出方法が、（米国特許第２００８／００６８１５号及び第７，６９２，７９８号）に記載されている。この方法では、表面上に固定された受容体と相互作用するリガンド分子の量の検出は、反射光の強度の測定に基づく。このアプローチは、分光計の使用を必要としないため、原理上は上記の方法よりも簡単であるが、シリコンの特異性による幾つかの問題により、その用途は限定される。その高屈折率により、水環境での測定はできず、検出は極めて狭い反射角に限定され、このため計器の複雑さが増し、液体サンプルを用いるその用途が限定される。さらに、シリコン基板は、可視光に対して透過的ではないため、この方法は、透明な基板を必要とする他の方法と組み合わせるには適切でない。
【００１０】
リガンド−受容体の相互作用の測定のための方法のもう一種は、機能化された表面を有する懸濁ナノ粒子の使用に基づく。この種の中で、水の屈折率に近い屈折率を有する非晶質のペルフルオロポリマーからなる懸濁ナノ粒子の使用に基づく無標識方法が、最近提案されている（ＥＰ１７９２１８３並びに刊行物：Davide Prosperi, Carlo Morasso, Francesco Mantegazza, Marco Buscaglia, Loren Hough, Tommaso Bellini, "Phantom Nanoparticles as Probes of Biomolecular Interactions", Small, Vol. 2, pp 1060-1067 (2006)及びDavide Prosperi, Carlo Morasso, Paolo Tortora, Diego Monti and Tommaso Bellini, "Avidin Decorated Core-Shell Nanoparticles for Biorecognition Studies by Elastic Light Scattering, ChemBioChem, Vol. 8, Issue 9, pp 1021-1028 (2007))。前記の方法では、溶液中のリガンドと懸濁ナノ粒子の表面上に固定された受容体との相互作用の検出は、相互作用が生じる際に各方面に散乱する光の強度の変化に基づく。前記方法は、他の無標識方法の限界の幾つかを克服し、溶液中のナノ粒子の自由拡散により極めて短時間に達する熱力学平衡状態での測定を容易にする。しかしながら、前記の方法では、リガンドが多価である、多くの一般的な相互作用の測定ができない。というのは、この場合、ナノ粒子の表面上に固定された受容体との相互作用により、リガンドの凝集が誘発される可能性があり、このため、これが散乱光の強度の測定に影響し、リガンド−受容体相互作用という点での検出された信号の解釈を難しくするためである。
【００１１】
標識化の必要がなく、かつ、多価のリガンドの使用を可能にする、リガンドと受容体との相互作用の測定用に最近提案されたもう一つの方法は、液体とそれと非常に近い屈折率を有するパーフルオロポリマーからなる拡張固体材料との接触面から反射される光の測定に基づくものである（特許ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００６１８号）。この方法においては、受容体の機能を有する分子が固定された接触面に付着する溶液中の分子の量は、機能化した平面からの鏡面反射を受けた光の強度の増加から直接導き出される。
【００１２】
この方法は、低価格の光源と検出器（例えば、ＬＥＤ及びフォトダイオード）を用いて実施することができるが、この方法の大きな欠点は、基板として使用されるパーフルオロポリマーの高コスト、そして、多くのフッ化化合物のように、超低反応性により特徴づけられるその材料表面への化学結合による受容体の固定化に関する既知のプロセスが存在しないことによるものである。
【００１３】
したがって、表面上のリガンド−受容体相互作用によって引き起こされる変化を直接利用し、リガンドの標識化作業を回避し、熱力学平衡状態での親和性定数値の測定を可能にし、それによって、間接的な方法、例えば、BIAcore等の欠点を回避しつつ、かつ、（生物学的及び薬理学的対象のリガンドの殆どは、複数の結合部位を有しているため）多価のリガンドの研究においてもその方法の使用を可能にすることによる、リガンドと受容体との相互作用を測定するための簡易な方法が利用可能になることが求められていた。特に、その信号が、組み立ての簡単な器具によって検出可能であり、かつ、既知のパラメーターを通じて定量的に解釈可能であり、かくして従来技術の欠点を克服する高感度な方法が求められていた。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、組立てたセルの断面の概略図を示す。
【図２】図２は、実験の実施に使用される照明装置及び捕集装置を、尺度的にではなく、摸式図的に表したものである。
【図３】図３は、測定の間に得られた画像を示す。
【図４】図４の上は、各スポットの輝度対時間を示すグラフである。図４の下は、方程式（２）を使って計算した、２つのスポットにおける表面質量密度の差の時間発展を示すグラフである。
【図５】図５において、測定された反射強度は、時間の関数として表されている。
【００１５】
発明の説明
本発明は、以下に記載する手順により、溶液中の分析物及びその濃度の定量的検出を可能にする光学的方法を通じて、既知の手法が直面する上記の欠点を回避し、これらの目的の達成を可能にする。
【００１６】
２つの異なる媒体の接触面の反射率は、その２つの媒体のうちの１つ（基板）の表面上にある、互いに重ね合わされた１つ以上の誘電体層（各々が数十又は数百ナノメーターの厚さを有する）の存在により大幅に減少し得ることが知られている。これらの層は、いわゆる反射防止コーティングを形成する。
【００１７】
水性媒体と接触した時に、表面の反射率が０．０１％未満、好ましくは０．００１％未満となるように誘電体層でコーティングされた基板（前記基板表面上には、受容体の機能を有する分子が固定されている）及び多層表面と水溶液との接触面から反射される光の強度を測定するための装置を用いることによって、接触面において、分子が集まって凝集体又は分子層を形成した時に、反射光の強度を測定することにより、水溶液との接触面に結合した分子の全質量を測定することが可能であることが今や見出された。
【００１８】
本発明の目的は、したがって、反射光の強度の測定値を用いて、溶液中のリガンドの存在、その量、濃度、リガンド自体のその受容体との結合親和性、会合及び／又は解離の反応速度定数を確認する方法であって、以下の工程：
ａ）水溶液と接触した表面の反射率が０．０１％未満となるように、厚さ５０nm〜５００nmの１つ以上の誘電体層で覆われた滑らかな平面を有する結晶質又は非晶質の固体材料からなる基板を作成する工程；
ｂ）前記表面に受容体分子を固定させる工程；
ｃ）受容体分子でコーティングされた前記表面を、リガンドを含有する溶液と接触させる工程；
ｄ）溶液と受容体分子でコーティングされた表面との接触面から反射される光の強度を、時間の関数として測定し、その反射光強度値を、フレネル公式を用いて、固定された受容体と相互作用するリガンド分子の単位面積質量に変換する工程
を含む。
【００１９】
固体材料からなる基板及び前記誘電体層は、好ましくは、それぞれ、１．４〜１．７及び１．３５〜１．６５の屈折率を有する。さらに、基板は、好ましくはシリカガラス製である。
【００２０】
一つの実現形において、工程ｄ）で測定した反射光強度値又は固定された受容体と相互作用するリガンド分子の単位表面当たりの質量値は、溶液中に存在するリガンド分子の総量又は濃度に変換される。
【００２１】
さらなる実施において、工程ｄ）で測定した反射光強度値又は固定された受容体と相互作用するリガンド分子の単位表面当たりの質量値は、リガンド−受容体対の親和性定数に変換される。
【００２２】
さらなる実施において、工程ｄ）で測定した時間の関数としての反射光強度値は、リガンド−受容体対の会合及び／又は解離の反応速度定数に変換される。
【００２３】
さらなる実施において、工程ａ）〜ｂ）を通じて得た低反射率面を個別の領域に分割し、場合によりマトリックスに配列する。個別の領域において、個別の受容体が吸着されるか又は固定され、そして個別の領域から反射される光の強度が、画像システムを通じて同時に測定される。
【００２４】
受容体でコーティングされた表面上に、受容体の機能を有しない他の分子（スペーサー）が固定される場合がある。さらに、低反射表面が、流れのない流れセル中の測定用セル中か、又は水浸探触子中のいずれかに入れられる場合がある。
【００２５】
本発明によれば、受容体及びリガンドは、薬理学的関心のタンパク質、ペプチド、核酸、グリコプロテイン、炭水化物、ホルモン、脂質、細胞もしくは細胞成分、ウイルス又は分子から選択される。受容体は、以下：
化学結合；
吸着；
分子又はポリマー上に吸着された結果としてのその表面上への固定；
電磁放射；
プラズマ処理
により本表面に固定され得る。
【００２６】
材料の表面と接触させられる、リガンドを含有する溶液は、水溶液であるか、又は有機溶媒を含有し得て、場合により水と混合され得る。
【００２７】
入射光の入射角、偏光、角度発散及びスペクトル特性は、受容体−リガンド相互作用の存在下での、反射光信号と、スプリアス反射及び散乱によるバックグラウンドノイズとの比を最適化するために選択される。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載されている方法を実施するための装置に関する。この装置は、リガンドを有する溶液を収容し、リガンド−受容体反応を生じさせやすい少なくとも１つのセル、セルへの、そしてセルからの溶液の流れをそれぞれ起こす手段、光源、並びに入射及び反射それぞれの放光強度を測定するための手段を備えた光検出器、そして場合により１つ以上の鏡、レンズ及びアパーチャを含む。
【００２９】
好ましい実施態様では、光源は、ＬＥＤ光源であり、前記検出器は、ＣＣＤ（電荷結合素子）又はＣＭＯＳ（相補型ＭＯＳ）である。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明の方法を通して、反射光の強度を測定することにより、下記に記載のとおり、溶液との接触面に存在する分子の総質量を測定することができる。
【００３１】
反射光強度値から、表面の個別の領域にコーティングされているリガンドの機能を有する分子に対応する質量の値が、次式によって得られる：
【００３２】
【数１】
2013509569.tif 000003
式中：
Ｉ０は、接触面に入射する光の強度を表し、
ＩＢは、接触面の非存在下で、検出器によって測定される光の強度を表し、
Ｒは、表面上に固定された受容体と任意の所定の時間接触したリガンドの量に依存する、フレネル公式から得た層状の誘電体媒体に関する反射係数（すなわち反射率）である。層状の誘電体媒体に関するフレネル公式は、例えば、Max Born and Emil Wolf, Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom, 1999, pages 59-70に報告されているそれらであってよい。
【００３３】
一例として、屈折率ｎ１の単一誘電体層でコーティングされた屈折率ｎ０の基板、その誘電体層と接触する屈折率ｎ０〜ｎ３の溶液の場合を検討する。この条件においては、層自体が、反射防止機能を有し、基板と溶液との接触面の反射率を低減させ得ることが知られている。表面上に入射する、波長λを有する単色コリメート光で照射する場合、誘電体層の厚さｈが、λ／（４ｎ１）値に近ければ近いほど、そして組み合わせｎ０ｎ３／ｎ１２が１に近ければ近いほど、反射率の減少がより顕著になる。例えば、下記パラメータ値に関して：
λ＝６３２．８nm（Ｈｅ−Ｎｅレーザー）
ｎ０＝１５８７±０００５（Schottガラスｎ−ＳＫ５）
ｎ１＝１４５７±０００５（非晶質ＳｉＯ２）
ｎ３＝１３３４±０００５（希釈水溶液）
ｈ＝１０９±１nm（λ／４ｎ１に近い）
リガンド及び受容体の非存在下、すなわち、基板と溶液の間に薄いＳｉＯ２誘電体層のみが存在する場合の接触面の反射係数Ｒ０は、５・１０−６未満であり、この場合、誘電体層が存在しない場合と比較して、Ｒ０が顕著に減少する。実際、後者の条件では、基板−溶液の接触面の反射係数は、約８・１０−３である。
【００３４】
吸着又は固定された受容体と相互作用するリガンドとの分子層の厚さが、１０ナノメーター未満であり、受容体分子の屈折率とリガンド分子の屈折率とが等しく、値ｎ２を有すると仮定すると、表面反射係数Ｒは、下記近似公式（正確な式との誤差が１％未満である）を用いて表すことができる：
【数２】
2013509569.tif 000004
式中：
Ｒ０、λ、ｎ２及びｎ３は、上記定義のとおりであり、
Ｒ１は、受容体固定化の手順の後に測定した接触面の反射係数（又は反射率）（相）であり、
Ｍ及びρは、リガンドの質量及び密度であり、
Ａは、固体材料（その上で受容体とリガンドとの付着が起こる）の表面積である。
【００３５】
方程式（１）及び（２）に現れる他の物理的な量は、一般に知られているか、又は反射強度の測定から個別に測定可能であるため、上の式から、受容体と相互作用しているリガンドの質量Ｍを求めることができる。
【００３６】
例えば、下記パラメーター値に関して：
Ｒ０＝５・１０−６
Ｒ１＝７・１０−６
ρ＝１．１５g/cm３（生体分子、代表的な値）
ｎ２＝１．４２    （生体分子、代表的な値）
リガンドと受容体の間の相互作用による、反射係数の、そして結果としての反射光の強度の分画変化（fractional change）は、Ｍ／Ａ＝１ng/mm2については３０％より大きく、そして、Ｍ／Ａ＝１００pg/mm2については、約３％である。
【００３７】
方程式（２）は、接触面に存在するリガンドの量が増加した場合、反射率が増大することを予測するものであるが、これは、光の波長λが、値４ｈｎ１（ここで、上記定義のとおり、ｈ及びｎ１は、それぞれ、誘電体層の厚さ及び屈折率である）に非常に近いという前提の下に成立することに留意すべきである。それ以外の場合、値λが４ｈｎ１よりも大きい、特にλ＞４（ｈｎ１＋ｄｎ２）（式中、ｄ及びｎ２は、それぞれ、受容体分子を含む機能化層の厚さ及び屈折率である）である場合、リガンドと受容体との間の相互作用は、反射率の減少を導き得る。本発明によれば、この場合も、反射率の変化を測定することにより、リガンドと受容体との相互作用を検出することができる。上記の例と同様に、反射率の前記の減少は、受容体と相互作用しているリガンドの質量と直接関連しており、測定された反射率の減少から、薄層フレネル公式により、相互作用しているリガンドの量を計算することができる。
【００３８】
表面上に固定された受容体と相互作用する、リガンドの機能を有する分子の質量を測定（上記のように実施）することにより、今度は、溶液中のリガンド分子の存在、そして場合により、その量もしくはその濃度を求めることができ、その結果、リガンドと受容体との親和性定数Ｋ（「結合定数」とも言う）又は会合及び解離の反応速度定数を求めることができる。
【００３９】
特に、平衡状態で受容体に結合しているリガンドの量は、「ラングミュア等温曲線」として知られる式によって表され、これは、受容体の量と親和性定数Ｋとに依存する。ラングミュアの等温式については、例えば、PC Hiemenez and R. Rajaglopalan, "Principles of Colloid and Surface Chemistry, Marcel Dekker, New York, 1997, pages 287-298を参照されたい。特定のリガンド−受容体対の親和性定数Ｋが分かっている場合、表面上に固定されたリガンドの物質収支を測定することにより、溶液中のリガンドの濃度を導き出すことができる。逆に、溶液中のリガンドの濃度が分かっている場合、表面上に固定されたリガンドの物質収支を測定することにより、受容体とリガンドとの親和性定数Ｋの値を導き出すことができる。
【００４０】
あるいは、表面上に固定されたリガンドの量を時間の関数として表したグラフを使って、会合及び解離の速度定数を導き出すことができる。その比から、リガンド−受容体対の親和性定数Ｋが得られる。例えば、ＳＰＲに基づく方法等、様々な無標識方法において通常使用されているこの手法は、例えば、書籍"Label-free biosensors, techniques and applications", edited by Matthew A. Cooper, Cambridge University Press, 2009, pages 85-109のRebecca L. Rich and David G. Myszka, "Extracting kinetic rate constants from binding responses"に記載されている。
【００４１】
本発明の方法は、方程式（１）で表される関係を満たす、不透明及び／又は吸光性（absorbent）の溶液に加えて、透明な溶液にも適用できる。実際、検出された光信号は、もっぱら溶液と基板との接触面に生じる鏡面反射によるものであり、光が溶液を通過する際に起こる光の吸収又は散乱の影響を受けない。さらに、本発明の方法は、入射光の、あらゆる入射角、あらゆる偏光状態、あらゆるコリメーションの度合い及び分光組成に適用可能である。というのは、反射率０．０１％未満を得るために、これら各種に合わせて、誘電反射防止層の厚さ及び屈折率が選択されるからである。
【００４２】
反射防止層一層又は複数の層を構成する誘電体材料は、例えば、真空蒸着（例えば、「スパッタリング」）により蒸着させた二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）であり得る。工程ａ）に記載のとおりに機能化されたその表面は、流れのない測定用のセル中に入れる場合、又は溶液を流すことができる測定用のセルに入れる場合、又は水浸探触子中に入れる場合がある。
【００４３】
使用する分子又は分子複合体（受容体の機能を有する）は、異なるメカニズムにより吸着又は固定されてよい。吸着は、受容体分子（場合により変性された）と固体表面との、又は分子と先に表面上に吸着若しくは固定された受容体分子の層との静電気的若しくは疎水性の相互作用によるものであり得る。固定化は、受容体分子の直接吸着又は反射コーティングの最後の層を構成する誘電体材料との共有化学結合の形成（例えば、アルコキシシラン及びそれらの誘導体での処理を用いたもの）によるものであるか、又は先に誘電体材料に吸着された分子若しくはポリマー（例えば、ポリ−リジン）との結合の形成によるものであり得る。受容体の機能を有する分子若しくは分子複合体は、化学的手法のような従来技術の方法により、又は電磁放射法により、又はプラズマ処理法により、固定化及び／若しくは化学変化を受け得る。
【００４４】
リガンドの機能を有する分子又は分子複合体は、受容体との相互作用により表面上に固定された後、それら自体が、他の分子又は分子複合体に対して受容体として作用し、それらと相互作用し得る。
【００４５】
受容体分子は、上述したように、受容体の機能を有しない分子（スペーサー）と組み合わせて使用することができる。これらの分子は、例えば、溶液中のリガンドとの相互作用が限定的な界面活性剤、炭水化物、タンパク質及び合成ポリマー又は他の分子から選択し得る。この限定的な相互作用は、受容体を使用せず、スペーサー分子だけを使用して本発明の方法による工程（ａ）を実施し、反射光の強度に有意な変化が観察されないことを工程（ｂ）において確認することにより検証することができる。
【００４６】
リガンド−受容体対は、ほぼ安定した結合を形成することができる親和性を有する分子の対、例えば、タンパク質、核酸、グリコプロテイン、炭水化物、ホルモンと定義される。特に抗体／抗原、酵素／インヒビター、炭水化物／炭水化物、タンパク質／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ペプチド／ペプチドの対を挙げることができる。
【００４７】
本発明による方法の工程（ａ）及び工程（ｂ）において、反射光強度の測定は、例えば１０ミリ秒以上のほぼ規則的な時間間隔で、反射光の強度を一定値に達するまで検出することにより実施される。
【００４８】
反射光の強度の変化は、異なる物理的な現象によって引き起こされる場合がある。例えば、リガンドの受容体への結合は、誘電体層に関連する光路長の変化を引き起こす場合がある。あるいは、その結合は、誘電体層の１層を構成する材料の屈折率又は光吸収特性の変化を引き起こす場合がある。前記結合はまた、受容体分子層又は下層の膨張を起こし、その結果として反射率の変化をもたらし得る。
【００４９】
本発明の方法は、１mm２の表面上で約１０ピコグラムのリガンドという検出限界を有するが、ＬＥＤ光源及びＣＣＤ又はＣＭＯＳ検出器のような低コストな部品を用い、溶液中の最小濃度に本質的な制限を与えずに、異なる種類の受容体−リガンド相互作用を同時に検出することができる。検出可能なリガンド濃度の最小値は、特定の受容体−リガンド対の結合定数に直接依存する。検出の前記限界は、従来技術の最も感度が高い手法のそれと同等である。
【００５０】
測定表面は、受容体が結合又は固定された表面、と定義される。この領域の面積は、（例えば、直径数十ミクロンの円領域に対応して）数百平方ミクロンの値まで小さくすることができ、そのため、１ピコグラムの数分の１のリガンドの検出を可能にする。測定の検知面は、幾つかの小さな測定表面に分けることができ、そこに個別の受容体を吸着又は固定させることができる。この場合、本発明の方法を用いて、反射光の強度を測定することにより、低反射率面の別個の位置にある別個の受容体と溶液中のリガンドとの相互作用を同時に特定し、測定することができる。特に、表面上にマトリックスに配列された別個の領域（スポット）に、受容体の機能を有する別個の分子を固定することができる。接触面から反射される光の強度は、次に画像システム（例えば、デジタルカメラで）で検出することができ、これにより、別個のスポットから反射される強度及びスポットの外側の受容体のない領域から反射される強度（これは反射率信号の基準として用いることができる）を同時に測定することができる。
【００５１】
本発明の方法は、化学基が水溶液に曝されることで溶液中の他の分子（リガンド）と結合することができる分子（受容体）を、（１つ以上の反射防止誘電体層によりその反射率が低減されている）表面上に付着又は固定することに基づく。表面上での様々な分子溶液の流れに反応して受容体と相互作用するリガンドの増加又は量の測定は、以下：
−第１層の分子と結合する流体中の分子（リガンド）の存在の検出；
−他の化学物質と混在しているリガンド分子のふるい分け；
−溶液中のリガンドの濃度の関数としての、結合したリガンドの量の測定、そしてそれによる
−リガンド−受容体相互作用の親和性定数の測定；
−時間の関数としての、結合したリガンドの量の測定、そしてそれによる
−会合及び解離定数の測定
を目的とする方法である。
【００５２】
驚くべきことに、１つ以上の反射防止誘電体層でコーティングされた表面からの光の反射が、本発明の方法に従って反射光の強度を測定することにより、受容体とリガンドとの相互作用を直接特定し、かつ測定する上で有効であることが見出された。
【００５３】
以下に記載する幾つかの実施例は、本発明を説明するものであって、限定する目的のものではない。
【００５４】
実施例
実施例１
【００５５】
画像取得システムを用いた溶液中の抗体と個別の領域に固定されたタンパク質との相互作用の同時検出
酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の１０９nmの層を、Schott Ｎ−ＳＫ５ガラス製プリズムの一方の側にスパッタリングで蒸着させて、その反対側に５°の角度を形成した。誘電体層の厚さ及び基板は、表面が、波長６３２．８nmを有する単色光の垂直入射条件下で水性媒体と接触したときに、その反射率を大幅に減少させるように選択した。
【００５６】
プリズムを、処理表面（以下「検知面」と称する）が水溶液と接触するように、流れセル中に入れた。図１は、組立てたセルの断面の概略図を示す。セルは、検知面と平行する平坦面を持たないように構成した。これは、検知面から反射される光の選択を、伝播方向に沿って、容易にするためである。
【００５７】
図２は、実験の実施に使用される照明装置及び捕集装置を、尺度的にではなく、摸式図的に表したものである。６３６nmのピーク波長を有する赤色ＬＥＤからの光は、（ケーラー照明のスキームに従い）絞り及びレンズにより平行にされ、形づくられて、検知面上に角度発散が制限された均等な照明を提供する。半反射鏡（ビームスプリッター）の助けを借りて、検出領域から反射される光は、レンズによって収集され、コンピュータに接続しているＣＣＤカメラのセンサー平面の上に、検知面のイメージを形成する。
【００５８】
集光レンズの裏側の焦点面に設置される絞りにより、対象の接触面から反射される光だけを選択することができ、セルの他の表面から反射される光線の殆どを遮断することができる。このようにして、検知面に映像を形成することに寄与する光は、ほぼもっぱら検知面自体の鏡面反射からのものであり、ＣＣＤセンサーの各素子により測定された強度は、方程式（１）による検知面の対応する領域において吸着される質量の表面密度に直接結びつく。
【００５９】
プリズムの検知面に、ピペットで、約０．１マイクロリットルの容量の２滴の液体粒子を、約２ミリメートル離して滴下した。最初の一滴は、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液＋１５０ミリモルのＮａＣｌを含有する水溶液（以下「リン酸緩衝液」と称する）及びタンパク質（濃度３マイクロモルのアビジン）（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ａ９２７５）からなる。２滴目は、リン酸緩衝液、タンパク質（濃度３マイクロモルのアビジン及び濃度６マイクロモルのビオチン）を含有する溶液からなる。この第２の溶液は、液滴の滴下の３０分前に調製した。アビジン−ビオチンの高い結合定数及び２つの試薬のモル比から、液体粒子の滴下の際、アビジン分子の結合サイトの約半分がフリーであると予測される。
【００６０】
滴下の約１０分後、プリズムを流れセルに入れ、リン酸緩衝液溶液を、１０マイクロリットル／分の流速で約３０分間、セル中に流すことにより、液滴を表面から除去した。
【００６１】
この手順は、検知面にアビジンタンパク質の層でおおわれている２つの領域（「スポット」）を作り出すことを目的とする。
【００６２】
第１の液滴によって作られるスポット（１）には、アビジンタンパク質があり、第２の液滴によって作られるスポット（２）には、その結合部位の約半分が結合していないアビジンタンパク質がある。実験の間、セルには、１０マイクロリットル／分という一定の流速で、下記の溶液：
ａ）総量３００マイクロリットルのリン酸緩衝液を；
ｂ）総量１００マイクロリットルの、濃度０．５マイクロモルのタンパク質ウシ血清アルブミン（ビオチンと共役したＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝液（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ａ８５４９）；
ｃ）総量３００マイクロリットルのリン酸緩衝液；
ｄ）総量１００マイクロリットルの、濃度０．１マイクロモルの抗ＢＳＡ抗体（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ｂ１５２０）；
ｅ）総量３００マイクロリットルのリン酸緩衝液
を流した。
【００６３】
実験の間中、５秒毎に検知面のデジタル画像をカメラに収め、画像をカメラに接続したコンピュータのハードディスクに保存した。
【００６４】
図３は、測定の間に得られた画像を示す。２つの液滴が滴下した領域を、破線の円で示した。各画像ごとに、各スポットに対応する画像部分の平均グレーレベル（平均輝度）を算出した。各スポットの輝度対時間を、図４の上のグラフに示す（黒色点：スポット１、明灰色点：スポット２）。
【００６５】
実験の工程（ｂ）の間に、スポット１の輝度がスポット２よりもより顕著に減少したことが注目される。輝度のこの変化は、固定された分子と、溶液中のビオチン分子と共役ＢＳＡとの間のアビジン−ビオチン結合の形成に起因する。同じ挙動が、工程（ｄ）の間にも観察されるが、ここでは、輝度の変化は、表面上のＢＳＡと溶液中の特異的抗体との結合の形成に起因する。表面上に分子が付着すると、反射光の強度が減少することが観察された。これは、ＬＥＤランプからの光が、６３３ナノメーターを上回るピーク波長を有し、これは、表面の反射率を最小限にする波長であるという事実による。
【００６６】
図４の下のグラフは、方程式（２）を使って計算した、２つのスポットにおける表面質量密度の差の時間発展を示す。これは、特に工程ａ）〜ｃ）の間に観察され得る信号の見かけのドリフトを減少させる。
【００６７】
実施例２
抗体と溶液中の固定されたタンパク質との相互作用の、レーザー源を用いた検出
酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の層を、実施例１の記載のとおり、ガラスプリズムの一方の側にスパッタリングにより蒸着した。プリズムを、コーティングした表面が水溶液と接触するように、流れセル中に入れた。５ミリワットＨｅ−Ｎｅレーザーからの光線を水溶液とプリズムとの接触面に送り、反射された光を、光の強度を電気信号に変換するフォトダイオードで検出した。セル中には、１０マイクロリットル／分のｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液＋１５０ミリモルのＮａＣｌを含有する水溶液（以下「リン酸緩衝液」と称する）の流れを次の順序：
ａ）リン酸緩衝液
ｂ）濃度３マイクロモルのタンパク質アビジン（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ａ９２７５）；
ｃ）リン酸緩衝液；
ｄ）濃度０．４マイクロモルのタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ａ６００３）；
ｅ）リン酸緩衝液；
ｆ）濃度０．５マイクロモルの、ビオチン（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ａ８５４９）と共役したタンパク質ＢＳＡ；
ｇ）リン酸緩衝液；
ｈ）濃度０．１マイクロモルの抗ＢＳＡ抗体（Sigma-Aldrich社販売、製品番号Ｂ１５２０）；
ｉ）リン酸緩衝液
で起こさせた。
【００６８】
図５において、測定された反射強度は、時間の関数として表されている。工程ａ）に先立って測定された反射光の強度値は、反射率３．２・１０−６に一致した。アビジンタンパク質が活性界面に吸着したことにより反射強度が増大した後（ａ）、ＢＳＡタンパク質を含有する溶液が流れるセル中では、それ以上の変化が観察されなかったが（ｃ）、ビオチンと共役したＢＳＡタンパク質を含有する溶液がで流されると、増大が観察された（ｅ）。このことは、反射強度の測定値が、ビオチンとアビジンとの特異的な相互作用を示すことを表している。抗−ＢＳＡを含有する溶液と呼応するように（ｇ）、さらなる反射信号強度の増大が観察されたが、これは、抗体と固定されたＢＳＡとの相互作用を示す。実施例１とは異なり、この場合、表面上の付着分子は、反射光の強度の増大を招いた。これは、使用されたレーザー照射が波長６３２．８ナノメーターであり、これは、まさに、表面の反射率が最小であるときの波長であったためである。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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