(57)【要約】  ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドを開示している。より具体的には、親和性ペプチドが生体適合性生分解性ポリマーに共有結合されている親和性バイオマトリックスを開示している。この親和性バイオマトリックスは、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスを調製するのに有用である。
2013522297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＰ−２に対し親和性をもち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及びこれらのフラグメントからなる群から選択される、ペプチド。
【請求項２】
生体適合性の生分解性ポリマーと、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつ少なくとも１つのペプチドと、を含む、親和性バイオマトリックス。
【請求項３】
前記親和性ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択される、請求項２に記載の親和性バイオマトリックス。
【請求項４】
前記生体適合性の生分解性ポリマーが天然ポリマーである、請求項２に記載の親和性バイオマトリックス。
【請求項５】
前記天然ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹、多糖、ＧＡＧ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の親和性バイオマトリックス。
【請求項６】
前記天然ポリマーがコラーゲンである、請求項５に記載の親和性バイオマトリックス。
【請求項７】
前記天然ポリマーが、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜、骨及び腱からなる群から選択される脱細胞化組織である、請求項６に記載の親和性バイオマトリックス。
【請求項８】
親和性バイオマトリックスとＢＭＰ−２とを含む、制御放出デバイス。
【請求項９】
前記デバイスが、スポンジ、粒子、注射可能なゲル、注射可能な液体、膜、フィルム、繊維及び繊維系スカフォールドからなる群から選択される形態をしている、請求項８に記載の制御放出デバイス。
【請求項１０】
親和性バイオマトリックスとＢＭＰ−２とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）に対し特異的な親和性をもつペプチドに関する。加えて、本発明は、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスにおけるこれらの親和性ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭＰ−２は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）と呼ばれるスーパーファミリーに属するタンパク質である。ＢＭＰ−２は、骨及び軟骨の形成を誘導することが知られている。例えば、ＢＭＰ−２は、ＢＭＰ−２をコラーゲンマトリックスと組み合わせて外科移植することによる、骨の修復の促進に使用されている。ＢＭＰ−２は、水性懸濁液として吸収性コラーゲンスポンジの中に装填される。このＢＭＰ−２は、非特異的にコラーゲンと結合する。しかしながら、ＢＭＰ−２に対するコラーゲン原繊維の低結合能力に起因して逆もまた同様であり、ＢＭＰ−２は、コラーゲンマトリックスから漏出し得る。このコラーゲンスポンジからのＢＭＰ−２の漏出は、移植部位における又はその近くにおける望ましくない過剰な及び／又は異所性の骨形成を引き起こす。望ましくない骨増殖は、更なる合併症を引き起こし、患者に更なる矯正手術（一回又は複数回）を必要とさせることになる。
【０００３】
したがって、望ましくない位置で骨形成を生じるという副作用を低減するために、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスが必要とされている。制御放出デバイスを作製するための標準的方法としては、典型的には、活性剤を封入するのに使用される微小球、桿体、シート又はペレットの形態での高分子マトリックスの使用が挙げられる。活性剤をポリマーマトリックス中に組み込むことができる様々な技術が既知である。例としては、溶媒蒸発、スプレー乾燥、乳化、溶融ブレンド及び別個のサイズ若しくは形状の粒子の単純な物理的混合が挙げられる。これらの分子の繊細な性質に起因し、これらのアプローチはいずれもペプチド又はタンパク質をポリマーの中に組み込むのに適用され得ない。ペプチド及びタンパク質は、溶媒により、乳化により、熱により、特に最終滅菌により、変性しやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスを製造する方法であって、タンパク質を変性させないないしはタンパク質の活性を不活性化しない方法が必要とされている。タンパク質の局所的持続放出を提供し、ひいては望ましくない異所性の骨形成を防止する、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスも所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、ＢＭＰ−２に対し親和性を持つペプチドについて述べた。これらの親和性ペプチドは、ＢＭＰ−２に対し特異的な親和性を有し、親和性バイオマトリックスを調製するのに有用である。親和性バイオマトリックス及びＢＭＰ−２から作製されるＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスも記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】直鎖でありかつジスルフィド結合で固定されたペプチドを含有し、ＢＭＰ−２に対し特異的な親和性をもつ、アミノ酸配列（親和性ペプチド）。
【図２】親和性バイオマトリックス及びＢＭＰ−２を含む制御放出デバイスの図表現。
【図３】ファージ選別により生成されたファージ提示ペプチドがＢＭＰ−２と結合することを確認するＢＭＰ−２ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ａ】交差反応性が最小限であるファージバインダーを示すファージ／ウェルの数の増加に関しての、確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｂ】交差反応性が高いファージバインダーを示すファージ／ウェルの数の増加に関しての、確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｃ】高いファージ濃度（１０１０ファージ／ウェル）で交差反応性であるファージバインダーを示すファージ／ウェルの数の増加に関しての、確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図５Ａ】ヒトｌｇＧに対する交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図５Ｂ】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ。
【図６】増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）を用いるＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドの濃度依存結合。
【図７】ＢＭＰ−２の存在下３日後のマウス（ＭＣＨ  １／２６）骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性の査定による、ＢＭＰ−２レセプターに結合する親和性ペプチドの機能的干渉。
【図８Ａ】配列番号６のペプチドをアセチル化Ｎ末端とリンカーとを含有するコラーゲンマトリックスに結合させる際に使用されるペプチドのアミノ酸配列（配列番号２３）。
【図８Ｂ】配列番号２３のペプチドを結合させた後のコラーゲン親和性バイオマトリックスの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
【図９】コラーゲンバイオマトリックスディスク及びコラーゲン親和性バイオマトリックスディスクの中に装填されたＢＭＰ−２の組み込み率（％）。
【図１０】３６日間にわたるコラーゲンバイオマトリックスディスク及びコラーゲン親和性バイオマトリックスディスクから放出されるＢＭＰ−２の量を示すインビトロ放出試験。
【図１１Ａ】ＢＭＰ−２に結合する配列番号３のフラグメントを示す変異体ファージＥＬＩＳＡ。
【図１１Ｂ】ＢＭＰ−２に結合する配列番号６のフラグメントを示す変異体ファージＥＬＩＳＡ。
【図１２】ＢＭＰ−２と、ＢＭＰ−２に結合するフラグメントのアミノ酸配列と、に結合する配列番号３及び配列番号６のフラグメントを同定するために使用されるアミノ酸配列。
【図１３】１５日間にわたるコラーゲンバイオマトリックスディスク及びコラーゲン親和性バイオマトリックスディスクから放出されるＢＭＰ−２の量を示す、２％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行われる、インビトロ放出試験。
【図１４】インビボケージ移植試験システムのために使用されるステンレス鋼チャンバーの画像。
【図１５】７日間にわたるコラーゲンバイオマトリックスディスク及びコラーゲン親和性バイオマトリックスディスクから放出されるＢＭＰ−２の量を示すインビボ放出試験。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書では、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドを説明する。一実施形態では、ＢＭＰ−２は、ヒト組み換えＢＭＰ−２である。ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、そのペプチドがＢＭＰ−２に対し特異的な結合親和性をもつことを示す。このペプチドは、直鎖であるか又はジスルフィド結合により固定されているかのいずれかであり得る。一実施形態では、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、図１に示す親和性ペプチドのうちのいずれか一つである。別の実施形態では、この親和性ペプチドは、図１に示す親和性ペプチドのうちのいずれか一つのフラグメントであり得る。この親和性ペプチドがＢＭＰ−２に対する特異的な親和性をもつ一方、この親和性ペプチドはＢＭＰ−２の生理活性に干渉しない。これらの親和性ペプチドは、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスの調製において有用である。
【０００８】
図１に示すＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、米国特許第６４７２１４７号に記載のｐｌＸファージディスプレイ技術を用いて、同定された。高複雑性（ライブラリー当たり１０９ペプチド配列）を有するプライマリーペプチドファージライブラリーを使用することで、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドを選別した。より具体的には、ビオチン化ＢＭＰ−２は、ストレプトアビジンコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で不動化させ、ｐｌＸマイナーコートタンパク質上でペプチド配列を提示するファージを導入した。ＢＭＰ−２に結合しなかったファージは洗い流し、ＢＭＰ−２に結合したファージを単離し、増幅した。ＢＭＰ−２に結合した単離ファージは、合計３ラウンドの上記手順に従う選別の第二ラウンド用のインプットに使用された。第三ラウンドの終わりに、ＢＭＰ−２に結合したファージは、ＢＭＰ−２への結合に機能するペプチドを決定するために、配列決定された。ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、図１に列挙されている。
【０００９】
ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、親和性バイオマトリックスを調製するのに有用である。親和性バイオマトリックスは、上記のように、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつ少なくとも１つのペプチドを生体適合性生分解性ポリマーに共有結合させることにより調製される。更に、親和性バイオマトリックスは、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスとして有用である。代表的な実施形態は、図２に図示される。ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスは、親和性バイオマトリックス及びＢＭＰ−２を含む。
【００１０】
親和性バイオマトリックスを調製するために使用される生体適合性生分解性ポリマーは、天然ポリマー、合成ポリマー及びこれらの組み合わせであり得る。生分解性ポリマーは、湿った体内組織にさらされると、容易に分解して小さなセグメントになる。セグメントは、次いで、体内に吸収されるか、又は体内を通過する。より具体的には、生分解されたセグメントは、永続的に追跡されないよう又はセグメントの残留物が体内に保持されないように、体内に吸収されるか又は体内を通過するため、永続的な慢性の異物反応を誘発しない。
【００１１】
好適な天然ポリマーとしては、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）、トロンビン、フィブロネクチン、ゼラチン、フィブリン、トロポエラスチン、ポリペプチド、ラミニン、プロテオグリカン、フィブリン糊、フィブリン血餅、多血小板血漿（ＰＲＰ）血餅、乏血小板血漿（ＰＰＰ）血餅、自己組織化ペプチドハイドロゲル及びアテロコラーゲンなどのタンパク質；デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース（例えば、メチルセルロース）、アルキルヒドロキシアルキルセルロース（例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースの塩、キチンの塩、カルボキシメチルキチンの塩、ヒアルロン酸の塩、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネートアルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、及び誘導体などの多糖；リボ核酸、デオキシリボ核酸などのポリヌクレオチド；並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
一実施形態では、天然ポリマーは、コラーゲンである。別の実施形態では、天然ポリマーは、脱細胞化組織から入手され得る。脱細胞化組織は、自己移植組織、同種組織又は異種組織から入手され得る。好適な脱細胞化組織としては、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜、骨、腱及びこれらに類するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
好適な合成ポリマーの例としては、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基含有ポリオキサエステル、ポリ（酸無水物）、ポリホスファゼン、これらの生体分子及びブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の目的上、脂肪族ポリエステルとしては、ラクチド（乳酸、ｄ−、１−及びメソラクチドを含む）、グリコリド（グリコール酸を含む）、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレン（１，３−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレンのアルキル誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチラート（繰り返し単位）、ヒドロキシバレラ−ト（繰り返し単位）、１，４−ジオキセパン−２−オン（その二量体１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオンを含む）、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オン２，５−ジケトモルホリン、ピバロラクトン、α，α−ジエチルプロピオラクトン、炭酸エチレン、シュウ酸エチレン、３−メチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン、３，３−ジエチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン、６，８−ジオキサビシクロオクタン−７−オンのホモポリマー及びコポリマー並びにこれらのポリマーブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
好適な脂肪族ポリエステルとしては、ラクチド（乳酸、Ｄ−、Ｌ−及びメソラクチドを含む）、グリコリド（グリコール酸を含む）、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレン（１，３−ジオキサン−２−オン）、炭酸トリメチレンのアルキル誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチラート（繰り返し単位）、ヒドロキシバレラ−ト（繰り返し単位）、１，４−ジオキセパン−２−オン（その二量体１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオンを含む）、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オンのホモポリマー及びコポリマー並びにこれらのポリマーブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
一実施形態では、生体適合性生分解性ポリマー及びＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、好適な反応基と、このポリマーに親和性ペプチドを共有結合させるための対応する官能基と、を有する。この反応基及び官能基は、ポリマー、親和性ペプチド及びこれらの組み合わせの上に存在し得る。好適な反応基としては、アリールアジド、カルボジイミド、ヒドラジン、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、カルボニル、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、ＰＦＰ−エステル、チオール、ピリジルジスルフィド及び／又はスルホン酸ビニル並びにこれらに類するものが挙げられるが、これらに限定されない。好適な官能基としては、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、エステル、チオール、アミン、アルケン、アルキン、アルキルハライド、ヒドラジン及び／又はアジド官能基が挙げられるが、これらに限定されない。有機化学又はポリマー化学の業者であれば、親和性ペプチド及びポリマーを上記好適な反応基及び対応する官能基で官能化して、親和性ペプチドをポリマーに共有結合させることができよう。例えば、コラーゲンに示されるリジン残基上のアミン官能基は、単純なカルボジイミド化学物質を用いて、親和性ペプチドのＣ末端カルボキシル基とカップリングさせることができる。
【００１６】
場合により、リンカー配列は、親和性ペプチドがＢＭＰ−２に結合する能力を向上させるために、図１に示すペプチドに付加され得る。このリンカー配列は、（ＳＧＧ）ｎ又は（ＸＸＸ）ｎであることができ、式中、Ｘは、セリン、グリシン、アラニン又はトレオニンのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、繰り返し単位の数ｎは、約１〜約１０である。別の実施形態では、繰り返し単位の数ｎは、約３〜約５である。
【００１７】
例えば、親和性バイオマトリックスは、可溶性及び／又は繊維状Ｉ型ウシコラーゲンから調製され得る。簡潔には、水に懸濁した、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度を有するコラーゲン懸濁液を、成形型に流し込み、次いで凍結乾燥する。熱脱水工程後、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）カップリング化学を用いて、親水性ペプチドをコラーゲンに結合させた。この方法で調製されたコラーゲン親和性バイオマトリックスは、多孔質三次元発泡スカフォールドの形状である。
【００１８】
この親和性バイオマトリックスは、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスとして有用である。ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスは、親和性バイオマトリックス及びＢＭＰ−２を含む。親和性バイオマトリックスに装填され得るＢＭＰ−２の量は、生体適合性生分解性ポリマーに結合した親和性ペプチドの量に依存する。生体適合性生分解性ポリマー上に存在する親和性ペプチドの量は、制御放出デバイス中のＢＭＰ−２の所望される量以上であり得る。したがって、送達されるＢＭＰ−２の１モルに対して少なくとも１モルの親和性ペプチドが存在し得る。当業者であれば、骨修復のために制御放出デバイス中にどれだけの量のＢＭＰ−２が所望されるかを判定できるであろう。この制御放出デバイスは、スポンジ、粒子、注射可能ゲル又は液体、膜、フィルム、繊維、繊維系スカフォールド及びこれらに類するものの形状であり得る。
【００１９】
一実施形態では、この制御放出デバイスは、注射可能ゲル又は液体の形状であり、ここで、親和性バイオマトリックスは水溶液中にあり、ＢＭＰ−２を含有する。好適な水溶液の例としては、生理学的緩衝液、生理食塩水、水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。注射可能なゲル又は液体デバイスを調製するために有用なポリマーは、上記の天然又は合成ポリマーから選択され得る。注射可能な液体又はゲルの場合、親和性バイオマトリックスは、水溶液中に約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。
【００２０】
場合により、合成骨無機質もまた、特定の用途のための機械的特性をしつらえるために、ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスの中に組み込むことができる。例えば、バイオマトリックスの引張り強度を増強するために、生理活性無機物質を組み込むことができ、これには、ヒドロキシアパタイト、フルオロ−ヒドロキシアパタイト及び／又はケイ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
ＢＭＰ−２制御放出デバイスは場合によりそこに組み込まれた細胞を有することもできる。好適な細胞タイプとしては、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、幹細胞、多能性細胞、臍帯細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、骨髄細胞、胚幹細胞、脂肪組織由来前駆細胞、末梢血前駆細胞、成体組織から単離された幹細胞、遺伝子的に形質転換された細胞、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスは、ＢＭＰ−２の無菌親和性バイオマトリックス及び無菌凍結乾燥粉末を含有するキットとして販売され得る。キット内に含有された親和性バイオマトリックス及びＢＭＰ−２は、電子ビーム、ガンマ線照射及び無菌調製方法を挙げることができるがこれに限定されない従来の滅菌手順により、滅菌することができる。
【００２３】
ＢＭＰ−２に対する制御放出デバイスは、制御されたやり方で局所的にＢＭＰ−２を供給することを可能にする。この制御放出デバイスは、骨修復又は再生が所望される部位に移植又は注射され得る。この局所的供給は、現行の供給方法により引き起こされる過剰な及び／又は異所性の骨形成に関する望ましくない作用を除去するのを助ける。この異所性骨形成の低減は、今度は、これらの移植の失敗率を低め、それゆえに患者のクオリティ・オブ・ライフを高める。
【実施例】
【００２４】
実施例１−ファージディスプレイによるＢＭＰ−２親和性ペプチドの選別
高複雑性（ライブラリー当たり１０９ペプチド配列）を有するプライマリーペプチドファージライブラリーを使用することで、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドを選別した。より具体的には、ビオチン化ＢＭＰ−２は、ストレプトアビジンコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で不動化させ、ｐｌＸマイナーコートタンパク質上でペプチド配列を提示するファージを導入した。ＢＭＰ−２に結合しなかったファージは洗い流し、ＢＭＰ−２に結合したファージを単離し、増幅した。ＢＭＰ−２に結合した単離ファージは、合計３ラウンドの上記手順に従う選択の第二ラウンドのためのインプットに使用された。
【００２５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレートに５マイクログラム／ｍＬのストレプトアビジンのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を２００マイクロリットル毎ウェルで装填し、４℃で一晩保持した。選別毎に２つのウェルをコーティングした。このストレプトアビジンコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを次に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート洗浄機を用いてＴｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で三回洗浄し、その後、ビオチン化ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、製品番号３５５−ＢＭ／ＣＦ）をＰＢＳ中５マイクログラム／ｍＬの濃度で装填した。このプレートを室温で３０分にわたって維持した。一方、エッペンドルフチューブ（１ｍＬ容量）を、３％の脱水ミルクのＴＢＳＴ溶液１ｍＬを用いてブロックした（ライブラリー当たり１つ）。このエッペンドルフチューブを室温にて３０分にわたって混転した。３７℃にて振盪器において、テトラサイクリンを添加した２ｘ  ＹＴ培地で、二つのＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩ大腸菌培養を開始した。次にエッペンドルフチューブ中のブロック溶液を廃棄し、ペプチドライブラリー１００マイクロリットル及びＴＢＳＴ溶液（３％ミルク添加）３００マイクロリットルで置き換えた。この溶液を室温にて１時間にわたって混転した。プライマリーペプチドファージライブラリーをブロッキングしながら、ストレプトアビジンでコーティングされたＢＭＰ−２装填ウェルをプレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、このプレートを室温にて１時間にわたってＴＢＳＴ溶液（３％ミルク）２５０マイクロリットルでブロッキングした。このブロッキング溶液を各ウェルから取り出し、廃棄し、ペプチドファージライブラリー溶液をそれぞれ対応するウェルにウェル当たり２００マイクロリットルの容量で導入した。これを１時間にわたって室温に維持した。このライブラリー−ミルク溶液を各ウェルから取り出し、廃棄し、ウェルをＴＢＳＴで手により３回洗浄した。２００マイクロリットルのｍｉｄ−ｌｏｇファージＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩ大腸菌を各ウェルに導入し、３７℃にて３０分にわたって培養した。感染した細菌を、テトラサイクリンを添加した２ｘ  ＹＴ培地５０ｍＬにおいて３７℃にて４時間にわたって生育させた。次に、この細菌を遠心分離により分離し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を用いてファージを沈殿させた。ＰＥＧで沈殿させたファージを第二ラウンドで使用し、上記プロセスを選別プロセスの計三回にわたって繰り返した。
【００２６】
第三ラウンドの終わりに、ＢＭＰ−２に結合したファージは、ＢＭＰ−２への結合に機能するペプチドを決定するために、配列決定された。ＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩ大腸菌を有する上層寒天中の単プラークのために、ファージ感染した細菌を沈着させた。得られたプラークを使用して、ＥＬＩＳＡを用いてＢＭＰ−２に結合しているファージを単離した。いったん単一のファージを同定してから、ＢＭＰ−２に結合したファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿させ、配列解析を行った。ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドは、図１に列挙されている。
【００２７】
これらのファージを、実施例２に記載のファージ滴定並びに実施例３に記載の確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
【００２８】
実施例２−ＢＭＰ−２選別で得たファージの滴定
実施例１に記載のＢＭＰ−２に結合したファージのＰＥＧ沈殿から生じたファージの濃度を判定するために、ファージ滴定を行った。
【００２９】
３７℃にて振盪器（１８０〜２５０ｒｐｍ）において２〜３時間にわたって、テトラサイクリンを添加した２ｘＹＴ培地で、大腸菌ＭＣ１０６１Ｆ’ＧＩＩを生育させた。ＰＥＧ沈殿原液が１０１２ファージ／ｍＬを含有しているものと仮定して、９６ウェルプレートでファージ滴定を行った。簡潔には、１００マイクロリットルの２ｘＹＴ培地を９６ウェルプレートのウェルに導入した。カラム１には、１０マイクロリットルの対応するファージ原液を導入した。連続１０倍希釈をカラム１２までプレートに対して行い、それぞれ１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、１０−１の濃度のファージを得た。各列は別のファージを含有する。ファージプラーク生育のために、それぞれ対応するファージ希釈系列１．５マイクロリットルをＬＢ／テトラサイクリン／凝固した上層寒天でコーティングしたＸ−Ｇａｌ寒天プレート／細菌懸濁液に導入した。プレートを上下逆にして３７℃にて一晩培養した。一晩培養した後、ファージプラークが良好に分離され、計数され得る希釈液を選択した。以下の式を使用して、滴定濃度を計算した：（プラーク数）（６６．７）（１０滴定数−１）×１００＝ファージ／ｍＬ、式中、６６．７は各ウェル中のファージの希釈係数であり、希釈数は、ファージプラークが計数され得るまでに行われた希釈の数である。１００を乗じることにより、ファージ懸濁液原液中のファージ／ｍＬの数が生じる。
【００３０】
計算されたファージ濃度を表１に示す。得られたファージ濃度を使用して、実施例３に記載の確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイのための希釈を行った。
【表１】
2013522297.tif 000003
【００３１】
実施例３−確認及び交差反応性ファージＥＬＩＳＡアッセイ
この実験では、ＢＭＰ−２に対する、実施例１で同定されたファージの結合を確認する。加えて、ファージがヒト血清アルブミン及びｈＩｇＧに結合を呈さないことも試験する。
【００３２】
９６ウェル黒色ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中５マイクログラム／ｍＬの濃度のストレプトアビジン（列Ａ〜Ｄ）、ｈＩｇＧ（列Ｅ及びＦ）並びにヒト血清アルブミン（列Ｇ及びＨ）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートをプレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄した。列Ｃ及びＤのストレプトアビジンコーティングされたウェルに、ビオチン化ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、製品番号３５５−ＢＭ／ＣＦ）の４マイクログラム／ｍＬ溶液を１００マイクロリットル導入し、３０分にわたって室温で静置した。他のウェルすべてに１００マイクロリットルのＰＢＳを導入した。これらのプレートを再び、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄した。これらのウェルを次に３％の脱水ミルクのＴＢＳＴ懸濁液２５０マイクロリットルでブロックし、最短でも１時間にわたって室温に静置した。ファージ滴定により判定したファージ濃度を用いて、ファージ原液の希釈を別個の９６ウェルプレートで行って、１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６及び１０５ファージ／ウェルのファージ濃度を得た。ブロッキンブ後、ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００マイクロリットルのファージ希釈液を対応するＥＬＩＳＡプレートに導入し、最短でも１時間にわたって室温にて静置した。このＥＬＩＳＡプレートを再び、プレート洗浄機を用いてＴＢＳＴで３回洗浄し、１００マイクロリットルのＨＲＰが共役したＡｎｔｉ−Ｍ１３  Ｐｈａｇｅ  Ｍａｂ（ＰＢＳ中に１：５０００で希釈）を各ウェルに導入した。これらのプレートを１時間にわたって室温にて静置し、その後、このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、ＰＯＤ  ＨＲＰ基質を各ウェルに導入した。１５０のゲインに設定した照度計を用いて、発光を読み取った。
【００３３】
図３、図４及び図５中のファージＥＬＩＳＡデータは、相対ルミネッセンスを示し、２のＮ値を有する。図３中のデータは、ＢＭＰ−２に対する単離ファージの結合を確認する。図４及び図５中のデータは、ｈＩｇＧ及びＨＳＡの両方に結合する配列番号４のペプチドを除いて、ｈＩｇＧ及びＨＳＡのそれぞれについてのファージの交差反応性は最小限であることを示す。
【００３４】
実施例４−増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）
ＡＬＰＨＡアッセイを用いて、親和性ペプチドに対するＢＭＰ−２の濃度依存性結合効率を評価した。
【００３５】
３．３マイクログラム／ｍＬのビオチン化ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、製品番号３５５−ＢＭ／ＣＦ）の希釈原液を２ｘアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０、０．０５％ＢＳＡ）を用い調製した。標準的な自動フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成手順を用いて、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号６を有する化学合成ペプチドを調製した。アッセイ用の各ペプチド溶液を１００マイクログラム／ｍＬ原液から調製した。この原液をアッセイ緩衝液中に１／２  ｌｏｇステップで連続希釈して、１００、３３．３、１１．１、３．７０、１．２３、０．４１、０．１４、０．０４６、０．０１５、０．００５１、０．００１７及び０．０００５６マイクログラム／ｍＬのペプチド濃度を得た。続いて、連続希釈したペプチドを、ビオチン化ＢＭＰ−２の３．３マイクログラム／ｍＬ溶液１０マイクロリットルを含有する対応するウェルに添加した。ビオチン化ＢＭＰ−２についての最終アッセイ試験濃度は、０．８２５マイクログラム／ｍＬであった。最終ペプチド濃度は、２５、８．３、２．８、０．９３、０．３１、０．１０、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００３及び０．０００１マイクログラム／ｍＬであった。次に、ニッケル（Ｎｉ）アクセプター及びストレプトアビジン（ＳＡ）ドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、製品番号６７６０６１９Ｍ）をアッセイ緩衝液中に１：１００で希釈し、その後、各試験ウェルに２０マイクロリットルを添加した。対照には、三種の異なる濃度でＢＭＰ−２単独を、並びに、ペプチド無しでＳＡビーズを、含有させた。プレートをアルミホイルでシールし光から保護し、室温にて卓上振盪器で４５分にわたって振盪した。二波長蛍光計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のＥｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０１  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、プレートの発光を読み取った。
【００３６】
図６のＡＬＰＨＡデータは、ペプチド配列の分子量に基づいてモル濃度を標準化した。図６のデータは、ＢＭＰ−２に対するペプチドの濃度依存結合を示す。ペプチド配列は、以下のように、ＢＭＰ−２に対するこれらの濃度依存結合により等級付けされた：配列番号６＞配列番号３＞配列番号２＞配列番号１。
【００３７】
実施例５−表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
表面プラズモン共鳴測定により、ＢＭＰ−２に対するペプチド結合親和性を配列番号３及び配列番号６について評価した。ＣＭ４シリーズＳセンサーチップを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｓ５１（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））装置で測定を行った。１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリング化学を用いてセンサーチップ上でｒｈＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、製品番号３５５−ＢＭ／ＣＦ）を不動化した。ＢＭＰ−２不動化チップ上に５マイクロモルの濃度でＢＭＰ−２親和性ペプチドを流し、屈折率の変化を記録した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いて、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。
【００３８】
表２に示すデータは、Ｎ値３での平均平衡解離定数である。データは、３００〜４００ｎＭの平均平衡解離定数を示す。
【表２】
2013522297.tif 000004
【００３９】
実施例６−アルカリホスファターゼ生理活性アッセイ
この実験では、マウス骨芽細胞を用い、親和性ペプチドが、ＢＭＰ−２に結合している細胞表面レセプターと干渉するかどうかを判定した。親和性ペプチド有り及び無しで、ＢＭＰ−２の存在下、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）生成をモニターした。
【００４０】
継代させた二つのＭＣＨＴ−１／２６細胞（マウス骨芽細胞細胞株）を前夜に４５００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接着させた。３種類の希釈率、１６、１６０及び８００ｎＭで配列番号６のペプチドを存在させ又は存在させずに、０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で連続希釈したＢＭＰ−２により、細胞を刺激した。３７℃にて３日にわたって培養した後、細胞を溶解緩衝液（２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１００ｍＭのトリス、ｐＨ＝８．０）で３７℃にて一晩溶解した。可溶化液の三分の一をｐ−ニトロフェニルホスフェートでのアルカリホスファターゼアッセイのために使用した。この反応を３７℃で１〜２時間にわたって行った。次に、このプレートを４０５ｎｍの波長にて吸光度プレートリーダーで読み取った。
【００４１】
図７は、配列番号６のペプチドがマウス骨芽細胞のＡＬＰ生成に最小の影響を有することを示す。このことは、配列番号６のペプチドがＢＭＰ−２の生理活性に干渉しないことを示す。
【００４２】
実施例７−コラーゲンバイオマトリックスフォームの調製
８０％の繊維性Ｉ型コラーゲン（３２ｍｇ）と２０％の溶解性Ｉ型コラーゲン（８ｍｇ）の４０ｍｇ／ｍＬ水溶液を４℃にて一晩撹拌した。この懸濁液を次にブレンダー内で３サイクル（３０秒〜１分／サイクル）にわたってホモジナイズした。およそ５ｍＬを、５ｃｍ×５ｃｍの寸法及び０．５ｃｍの高さを有する成形型に移した。このコラーゲン混合物をスパチュラの平坦な端部により平らにして、コラーゲンの高さ分布の均一性を確保した。次に、このサンプルを脱気し、その後、表３に示すサイクルプロファイルを用いて凍結乾燥した（Ｖｉｒｔｉｓ（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ））。次に、このサンプルを温度制御真空槽を用いて熱脱水した。次に、このコラーゲンバイオマトリックスフォームを生検パンチを用いて６ｍｍディスクに切り、使用可能になるまで乾燥窒素下、室温にて保存した。
【表３】
2013522297.tif 000005
【００４３】
実施例８−ＢＭＰ−２に対し親和性をもつペプチドをコラーゲンフォームに結合させることによる、親和性バイオマトリックスの調製
ペプチドを結合させるために、実施例７に記載のように調製した６ｍｍコラーゲン発泡ディスクをエッペンドルフチューブ内の１．８ｍＬの４０％のＥｔＯＨ／５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ  ５．５）の中に配置し、室温にて３０分にわたって混転した。このディスクを上記緩衝液から取り出し、０．５ｍＭの配列番号２３のＢＭＰ−２親和性ペプチド（図８Ａに示す配列番号６の結合ペプチド）を含有する１．８ｍＬの４０％のＥｔＯＨ／５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ  ５．５の中に配置した。標準的な自動フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成手順を用いて、ペプチドを調製した。このディスクを室温にて１時間にわたって混転させておいた。次に、０．５ＭのＥＤＣ原液１０マイクロリットル及び０．１Ｍのスルホ−ＮＨＳ原液１０マイクロリットル（どちらも４０％  ＥｔＯＨ／５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５．５）中）をエッペンドルフチューブの中に導入したところ、２．５ｍＭのＥＤＣと０．５ｍＭのスルホ−ＮＨＳが生じた（ペプチド、スルホ−ＮＨＳ及びＥＤＣについてのモル当量はそれぞれ１：１：５であった）。このディスクを室温にて４時間にわたって混転させておいた。次に、このディスクを、１０ｍＬの１ｘ  ＰＢＳ中で３０分にわたって混転することにより、すすいだ。このすすぎを計三回のすすぎサイクルで繰り返した。最後に、ディスクをＰＢＳから取り出し、真空下にて凍結乾燥機で一晩乾燥させた。三つの対照サンプルもまた上記手順で使用した。１＝コラーゲンスポンジ＋緩衝液、２＝コラーゲンスポンジ＋ペプチド／緩衝液、及び３＝コラーゲンスポンジ＋ＥＤＣ／ＮＨＳ／緩衝液。
【００４４】
ペプチドを結合させたコラーゲンフォームのミクロ構造をＳＥＭを用いて分析した。代表的な画像を図８Ｂに示す。この画像は、ペプチド共役コラーゲン発泡体がその多孔質ミクロ構造を保持すること示す。すべてのサンプルに対して、上清を凍結乾燥して乾燥粉末にし、ＲＰ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣを用いて分析した。データは、およそ４０％のＢＭＰ−２親和性ペプチド（配列番号２３）が６ｍｍコラーゲンディスクに共有結合していしたことを示す。
【００４５】
実施例９−ＢＭＰ−２定着試験
凍結乾燥したｒｈＢＭＰ−２を８．４ｍＬの滅菌水に溶解させ、ｒｈＢＭＰ−２の１．５ｍｇ／ｍＬ懸濁液を得た。荷重試験のために、実施例７及び実施例８で調製した直径６ｍｍの親和性バイオマトリックスを、０．２マイクロメートルの濾過エッペンドルフチューブ内に配置し、１００マイクロリットルの０．４ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液（２５０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ  ６．５）緩衝液）１００マイクロリットルを装填し、室温にて４５分にわたって静置した。濾過エッペンドルフチューブ内の親和性バイオマトリックスを３０００ｒｐｍで５分にわたって遠心処理し、上清を取り出した。生成物挿入における手順に従って、得られた上清の１：１０００００希釈物を用いて、ｒｈＢＭＰ−２イムノアッセイＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ＤＢＰ２００）を行った。ＢＭＰ−２の初期装填濃度から上清中のｒｈＢＭＰ−２の量を減算することにより、ｒｈＢＭＰ−２組み込み率（％）を判定した。対照として、親和性ペプチドを含まないＥＤＣ／ＮＨＳ架橋済みコラーゲンの両方の直径６ｍｍディスクを使用した。
【００４６】
図９中のデータは、親和性バイオマトリックスは、およそ４０重量％を装填する架橋済みコラーゲンディスクと比較して、ＢＭＰ−２全体（４０マイクログラム）のおよそ９０重量％を装填する。
【００４７】
実施例１０−コラーゲンディスクからのインビトロＢＭＰ−２放出
この実験では、模擬的な生理的条件下での親和性バイオマトリックスからのＢＭＰ−２のインビトロ制御放出を評価した。この放出実験のために、実施例７及び実施例８に記載の方法により調製されるような親和性バイオマトリックスの直径６ｍｍのディスクを２４ウェル細胞培養プレート内に配置した。このスポンジに１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液を４０マイクロリットル装填し、室温にて１５分にわたって静置した。実施例８で調製したＥＤＣ／ＮＨＳ架橋済みコラーゲンの直径６ｍｍのディスクを対照として使用した。装填したコラーゲンスポンジを次に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加したＰＢＳを１．５ｍＬ含有する２４ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。対応する時点にて、培地を取り出し、エッペンドルフチューブに移し、−２０℃にて凍結させた。コラーゲンディスクを含有するウェルに、新しい０．１％のＨＳＡのＰＢＳ溶液を１．５ｍＬ補給した。生成物挿入における手順に従って、放出培地の１：１０００希釈物を用いて、ｒｈＢＭＰ−２イムノアッセイＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ＤＢＰ２００）を各時点にて行った。標準曲線を用いることにより、対応するディスクからのｒｈＢＭＰ−２放出の量を判定した。
【００４８】
図１０中のデータは、親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが、３６日の時点でおよそ２５重量％のｒｈＢＭＰ−２の累積放出を有する一方で、ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋済みコラーゲンスポンジがおよそ９０重量％を放出することを示す。親和性バイオマトリックス制御放出デバイスからのｒｈＢＭＰ−２の初期の爆発的放出は、ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋済みコラーゲンスポンジと比較して、有意に低減される。
【００４９】
実施例１１−変異体ファージＥＬＩＳＡ
配列番号３及び配列番号６の親和性ペプチドにそれぞれ部位特異的突然変異誘発を行って、ＢＭＰ−２への結合にとって重要であるアミノ酸についての理解を得た。野生型の残基がセリンで置換されるセリンスキャンを行うことにより、配列番号３及び配列番号６の変異体を構築した。図１２は、ＢＭＰ−２に対する特異的な親和性に関し機能するより具体的なアミノ酸配列を同定するために試験された変異体配列を示す。配列番号２４〜配列番号２８は、配列番号３の変異体である。配列番号２９〜配列番号３２は、配列番号６の変異体である。
【００５０】
対応するカスタムオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。標準プロトコルを用いて、これらのオリゴヌクレオチド（oligonucletides）をｐＩＸ遺伝子の中に挿入した。まず、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、これらのオリゴヌクレオチドをリン酸化した。次に、このリン酸化オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡテンプレートにアニーリングした。Ｋｕｎｋｅｌ法を用いて、このアニーリングしたＤＮＡを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを用いて連結した。得られたＤＮＡを、イソプロパノール沈殿を用いて単離し、ゲルを反応の確認にかけた。最後に、電気的な形質転換受容能のある大腸菌を精製ＤＮＡで形質転換し、２ｘＹＴ／Ｔｅｔ／Ｘｇａｌ寒天プレート上に蒔き、一晩増殖させて、単一コロニーを単離した。５０ｍＬの２ｘＹＴ／ｔｅｔ培地中で振盪しながら、形質転換した細胞のアリコートを３７℃で一晩増殖させた。このファージを次に実施例１の手順に従ってＰＥＧ沈殿させた。ファージ滴定を行って、実施例２に記載のように、ＥＬＩＳＡアッセイのためにファージ濃度を判定した。実施例３の手順に従って、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。
【００５１】
変異体ファージＥＬＩＳＡアッセイデータ（図１１Ａ及び図１１Ｂ）は、配列番号３のフラグメント及び配列番号６のフラグメントがＢＭＰ−２に結合する根拠を示す。より具体的には、配列番号３のフラグメントである配列番号３３と、配列番号６のフラグメントである配列番号３４とが、ＢＭＰ−２への結合に重要であり、図１２に示されている。
【００５２】
実施例１２−コラーゲンディスクからのインビトロＢＭＰ−２放出
この実験では、実施例１０に記載のように、しかしながらＰＢＳ単独の代わりに熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳを使用して、模擬的な生理的条件下での親和性バイオマトリックスからのＢＭＰ−２のインビトロ制御放出を評価した。この放出実験のために、実施例７及び実施例８に記載の方法により調製されるような親和性バイオマトリックスの直径６ｍｍのディスクを２４ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置した。このスポンジに１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液を４０マイクロリットル装填し、室温にて１５分にわたって静置した。市販のコラーゲンディスクを対照として使用した。装填したコラーゲンスポンジを次に、熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳを１．５ｍＬ含有する２４ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。対応する時点にて、培地を取り出し、エッペンドルフチューブに移し、−２０℃にて凍結させた。コラーゲンディスクを含有するウェルに、新しい２％のＦＢＳのＰＢＳ溶液を１．５ｍＬ補給した。生成物挿入における手順に従って、放出培地の１：１０００希釈物を用いて、ｒｈＢＭＰ−２イムノアッセイＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ＤＢＰ２００）を各時点にて行った。標準曲線を用いることにより、対応するディスクからのｒｈＢＭＰ−２放出の量を判定した。
【００５３】
図１３中のデータは、親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが、１５日の時点でおよそ１５重量％のｒｈＢＭＰ−２の累積放出を有する一方で、市販のコラーゲンスポンジがおよそ９５重量％を放出することを示す。親和性バイオマトリックス制御放出デバイスからのｒｈＢＭＰ−２の初期の爆発的放出は、市販のコラーゲンスポンジと比較して、有意に低減される。
【００５４】
実施例１３−コラーゲンディスクからのインビボＢＭＰ−２放出
ケージ移植試験システムを使用して、親和性バイオマトリックスからのＢＭＰ−２のインビボ放出を評価した。インビボ環境での生理活性剤の制御放出を調査するためにケージ移植システムを用いる例は、Ｐａｕｌａ  Ｓ．Ｌｅｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｆｉｘ，Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃａｇｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｌｏｗ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １１，１９９０，ｐ．４６〜４９に記載されている。これらの方法を適合させて、親和性バイオマトリックスからのＢＭＰ−２のインビボ放出を測定した。
【００５５】
このインビボ実験は、実験用動物の取り扱い及び使用を管理するすべての適用され得る規制を遵守した。この実験についての動物福祉は、米国農務省（ＵＳＤＡ）動物福祉法（連邦規則９巻パート１、２及び３）（the United States Department of Agriculture’s（USDA）Animal Welfare Act（9 CFR Parts 1,2 and 3））を遵守した。実験動物の管理と使用に関する指針（The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）にも従った。具体的には商品名ＳＰＲＡＧＵＥ  ＤＡＷＬＥＹ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））種のＣｒｌ：ＣＤで販売されているアルビノラットの異系交配多目的品種である、７〜８週齢のオスのラットをこのインビボ実験に使用した。直接接触床を有するポリボックスに動物を個々に収容した。一日当たりおよそ１２時間にわたって蛍光灯を照射した。温度及び湿度をモニターし、毎日記録し、それぞれ６４℃〜７９℃及び３０％〜７０％の可能な最大限の範囲において維持した。ラットの基礎飼料は、適宜供給される特定のげっ歯類用試料から構成された。自動水システムを介して水道水を適宜供給した。実験デザインの簡潔な説明は、表４に見出すことができる。
【表４】
2013522297.tif 000006
【００５６】
３１６ゲージ、４６メッシュ（０．１４０ｍｍ（０．００５５インチ）ワイヤ直径）ステンレス鋼（Ｎｅｗａｒｋ  Ｗｉｒｅ  Ｃｌｏｔｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ））を用いて、ケージ移植片（長さ＝２５ミリメートル、直径＝１０ミリメートル）を手で構築した。０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてケージ移植片から発熱物質除去し、水で十分に洗浄した。予めドリル切削したポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ブロックを用いてチャンバー端部周りのシリコーンエラストマー（ＭＥＤ６２１５、ＮｕＳｉｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬＬＣ（Ｔｏｍｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ））キャップをキャスティングすることにより、ケージ移植片の一端を閉じた。対応するバイオマトリックスを添加した後、カスタムモデルのシリコーンエラストマーストッパー（Ｗａｃｋｅｒ  ＬＲ３００３／４０、Ａｌｂｒｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ，ＭＡ））キャップを使用して、ケージの開いた端部を閉じた。ケージにディスクを装填するのに先立って、キャップ及びケージをオートクレーブ処理した。
【００５７】
実施例７の手順に従って無菌条件下でコラーゲンディスクを調製した。次に、電子線照射（２５ｋＧｙ）を用いて、直径６ｍｍのディスクを滅菌した。実施例８に記載の方法を用いて無菌条件下で親和性バイオマトリックスを調製した。次に、表３に示した凍結乾燥方法を用いて、これらのサンプルを滅菌チャンバで凍結乾燥した。親和性ペプチドを含まない市販のコラーゲンの直径６ｍｍのディスクを対照として使用した。
【００５８】
移植に先立って、乾燥したバイオマトリックスをチャンバーの中に配置し、非吸収性縫合糸で適所で縫合した。次に、これらのディスクに、ディスク当たり３０マイクログラムの投与量でＢＭＰ−２の無菌溶液１００マイクロリットルを装填した。吸入麻酔（イソフルラン）を用いて各ラットに麻酔誘引した。眼科用軟膏を目に塗布し、麻酔時間中の組織の乾燥を予防した。各動物に、痛みのためのブプレノルフィン塩酸塩（０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）及び液体恒常性のための乳酸リンゲル液（ＬＲＳ、１〜５ｍＬ）を投与した。麻酔導入後、真空システムを備えた電気動物クリッパーを用いることにより、体毛を含ませずに、背側頸部領域から背側腰部領域までの動物の手術部位をクリップした。手術部位の周りの領域をクロルヘキシジン二酢酸で洗浄し、アルコールですすぎ、乾燥させ、１％濃度のヨウ素のヨードフォル水溶液を塗布した。麻酔にかけた動物を手術台に運び、無菌処理をした領域に滅菌外科用ドレープを適用した。手術中、動物には排気システム下でマスクによりイソフルラン麻酔を維持した。
【００５９】
ＢＭＰ−２を装填したディスクを含有する滅菌ケージ移植片を各ラットの皮下スペースの中に移植した。左胸郭において皮膚切開を行った。鈍器切開により、ラットの背部上に創傷チャンバーを収容するのにちょうど十分な大きさの皮下ポケットを作製した。ケージ移植片を皮下ポケットに配置し、間隙皮下スペースを最小化した。サンプルを含有する端部がシリコーン末端キャップに最も近く、シリコーンストッパーに最も遠く、切開部位に最も近くなるように、ケージ移植片を挿入した。ケージの近位端は、炎症を避けるために、切開ラインから最低１ｃｍの距離で挿入した。このケージ移植片を下に位置する筋肉に非吸収性縫合糸で縫合し、非吸収性縫合糸を用いて切開を閉じた。
【００６０】
創傷滲出物を移植後１、３、５及び７日目に採取した。流体採取に先立って、二酸化炭素／酸素及びイソフルランを用いて動物に穏やかに麻酔をかけた。簡潔には、２１Ｇ針を切開部位から最も遠いシリコーンストッパーの中程に挿入した。ラットを直立位置に保持して、流体が注射器の中に流れるようにした。３００マイクロリットルの最終容積が達成されるまで、注射器でゆっくりと吸引した。ｒｈＢＭＰ−２イムノアッセイＥＬＩＳＡを用いる分析までの間、サンプルを−８０℃で凍結した。実験完了時に、予め装填した二酸化炭素チャンバーに動物を配置し、１００％二酸化炭素を吸入させることにより安楽死させた。呼吸の視覚的徴候についての観察及び心臓の触診により、安楽死を確認した。
【００６１】
図１３中のデータは、親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが七日間にわたってＢＭＰ−２を常に放出することを示す。５日目及び７日目時点で、親和性バイオマトリックスは、対照コラーゲンディスクと比較して、ディスクから放出されるＢＭＰ−２に関し統計的な有意差を有する。
【００６２】
〔実施の態様〕
（１）  ＢＭＰ−２に対し親和性をもち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及びこれらのフラグメントからなる群から選択される、ペプチド。
（２）  生体適合性の生分解性ポリマーと、ＢＭＰ−２に対し親和性をもつ少なくとも１つのペプチドと、を含む、親和性バイオマトリックス。
（３）  前記親和性ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択される、実施態様２に記載の親和性バイオマトリックス。
（４）  前記生体適合性の生分解性ポリマーが天然ポリマーである、実施態様２に記載の親和性バイオマトリックス。
（５）  前記天然ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹、多糖、ＧＡＧ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様４に記載の親和性バイオマトリックス。
（６）  前記天然ポリマーがコラーゲンである、実施態様５に記載の親和性バイオマトリックス。
（７）  前記天然ポリマーが、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜（mesenter）、骨及び腱からなる群から選択される脱細胞化組織である、実施態様６に記載の親和性バイオマトリックス。
（８）  親和性バイオマトリックスとＢＭＰ−２とを含む、制御放出デバイス。
（９）  前記デバイスが、スポンジ、粒子、注射可能なゲル、注射可能な液体、膜、フィルム、繊維及び繊維系スカフォールドからなる群から選択される形態をしている、実施態様８に記載の制御放出デバイス。
（１０）  親和性バイオマトリックスとＢＭＰ−２とを含む、キット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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