(57)【要約】  本発明は、発酵食品生産物におけるフレーバー産生を改善する方法、Ｓ．テルモフィルス、ここにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている、並びに、前記株を含む食品生産物を記載する。更に、本発明は、改善されたフレーバー産生を有するＳ．テルモフィルスを同定する方法、および発酵食品生産物におけるフレーバー産生を改善するためのその使用を記載する。【選択図】図１
2013503652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵ブロス中のフレーバー産生を増大する方法であって、Ｓ．テルモフィルス株を使用して発酵媒体を発酵する工程を具備し、ここにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性されている方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、以下の１つまたは１つ以上によりグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化される方法：
−  ｇｄｈＡ遺伝子の欠失、挿入または変異；
−  ｇｄｈＡ遺伝子プロモータを弱いプロモータで置換すること；
−  アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ；および
−  ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の方法であって、発酵ブロスが食品産生物である方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、発酵ブロスが発酵食品生産物である方法。
【請求項５】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているＳ．テルモフィルス株。
【請求項６】
請求項５に記載の株であって、食品等級である株。
【請求項７】
Ｓ．テルモフィルス株ＣＢＳ１２５１８４。
【請求項８】
請求項５〜７の何れか１項に記載のＳ．テルモフィルスを含む発酵ブロス。
【請求項９】
請求項８に記載の発酵ブロスであって、発酵食品生産物である発酵ブロス。
【請求項１０】
請求項９に記載の発酵ブロスであって、発酵食品生産物がヨーグルトおよびチーズから選択される発酵ブロス。
【請求項１１】
請求項５〜７の何れか１項に記載のＳ．テルモフィルスまたは請求項８または９に記載の発酵ブロスを含む食品生産物。
【請求項１２】
改善されたフレーバー産生を有するＳ．テルモフィルス株を同定する方法であって、Ｓ．テルモフィルス株におけるＧＤＨ−活性をスクリーニングする工程を具備する方法。
【請求項１３】
Ｓ．テルモフィルス株の使用であって、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されており、発酵食品生産物、特にヨーグルトまたはチーズにおけるフレーバー産生を改善するための使用。
【請求項１４】
Ｓ．テルモフィルス株の使用であって、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されており、ＧＤＨが活性なＳ．テルモフィルス株を使用して製造されたヨーグルトに比較して、ヨーグルトにおいてＬ．ブルガリクスの減少されたコロニー形成単位を得るための使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および微生物学発酵を使用する食品生産の分野に関し、そこにおいてストレプトコッカス・テルモフィルス（Streptococcus thermophilus）が使用され、それは食品生産物中のフレーバー産生を改善する。
【背景】
【０００２】
ストレプトコッカス・テルモフィルスは、食品産業のための重要な乳酸菌（ＬＡＢ）である。それは、高い調理温度を使用するイタリアおよびスイスチーズの産生のために使用され、ヨーグルトの生産のためにラクトバシルス・デルブルエキイ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）との共培養において使用される。
【０００３】
更に、Ｓ．テルモフィルスは、多様な量のフレーバーを生産できる。しかしながら、それは、その急速な酸性化能のために頻繁に使用される。これは、大部分のアミノ酸生合成および変換経路の存在を示す。しかしながら、ストレプトコッカス（Ｓ．）・テルモフィルスLMG18311は、ゲノムに基づいて完全なペントースリン酸経路を有さないことが予測される。ペントースリン酸経路は、還元的生合成において使用するためのＮＡＤＰＨの供給源として全ての生物の要求を満たす。大部分のＬＡＢは、完全なペントースリン酸経路を有する。全ての生命体はＮＡＤＰＨを必要とすることから、Ｓ．テルモフィルスは、ＮＡＤＰＨを合成するために代替経路を必要とする。
【０００４】
Ｓ．テルモフィルスの入手可能なゲノムスケールモデル（Ｐａｓｔｉｎｋら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９，ｖｏｌ．７５，ｎｏ．１１：３６２７−３６３３）に基づくと、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ生成のための最も適した経路であるように予測された。一般に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性を提示する株は、グルタメートからα−ケトグルタレートを作り出すことが可能であり、そのために、Ｇｌｕを含む反応培地中でアミノ酸を分解することが可能である。
【発明の概要】
【０００５】
Ｓ．テルモフィルスのゲノムスケールモデルは、ペントースリン酸経路の酸化部分の不在と、代替的なＮＡＤＰＨを生ずる代謝経路の必要性を示した。代謝モデルは、アミノ酸代謝、特に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼがこのＮＡＤＰＨを提供するであろうことを示す。
【０００６】
従って、本発明は、何れの経路がＮＡＤＰＨ生成のためにＳ．テルモフィルスにより使用されるのかを発見することを目指す。Ｓ．テルモフィルスの入手可能なゲノムスケールモデルが使用され、モデルは、最初にグルタミン酸デヒドロゲナーゼが最も適した経路であると予測する。本発明者らは、この遺伝子のノックアウトを構築し、得られた変異体を、増殖実験、発酵挙動により、転写レベルについて分析した。
【０００７】
Ｓ．テルモフィルスにおけるＧＤＨの崩壊がアミノ酸代謝作用のより高い活性を導くことが発見され、増加したアンモニア産生により示された。これは、ＧＤＨ、ａ−ケトグルタレートの産生がアミノ酸代謝作用における必須因子であると考えられることから極めて驚くべきことであった。彼らはまた、不活性なＧＤＨＳを有するテルモフィルスが、活性なＧＤＨを有する同じＳ．テルモフィルスと比較して改善されたフレーバープロファイルを有することを発見した。
【０００８】
本発明の目的は、改善されたフレーバーの生産能力を有するＳ．テルモフィルスを提供することである。Ｓ．テルモフィルスによる更なるアミノ酸利用はまた、ヨーグルト中での共培養におけるより少数のラクトバシルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）をもたらすだろう。Ｌ．ブルガリクスは、ヨーグルト発酵の終点での強い酸性化に関与することから、これはヨーグルトにおけるより少ないポスト酸性化を引き起こし、それ自体は、ヨーグルトのより穏やかな味を引き起こす。
【０００９】
従って、第１の態様において、本発明は、発酵ブロス中のフレーバー産生を増大する方法であって、Ｓ．テルモフィルス株を使用する発酵媒体を発酵する工程を具備し、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている方法に関する。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株であって、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている株に関する。
【００１１】
更なるもう１つの態様において、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株を含む発酵ブロスであって、そこにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている発酵ブロスを提供する。
【００１２】
本発明は更に、Ｓ．テルモフィルス株を含む食品生産物であって、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているＳ．テルモフィルス株を含む食品生産物、またはそこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているＳ．テルモフィルス株を含む発酵ブロスに関する。
【００１３】
本発明はまた、増大されたフレーバー産生を有するＳ．テルモフィルス株を同定する方法であって、Ｓ．テルモフィルス株におけるＧＤＨ−活性をスクリーニングする工程を具備する方法に関する。
【００１４】
もう１つの態様において、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株の使用であって、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されており、発酵食品生産物、特にヨーグルトまたはチーズ中のフレーバー産生を改善するための使用に関する。
【００１５】
最後の態様において、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株の使用であって、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されており、ＧＤＨが活性なＳ．テルモフィルス株を使用して製造されたヨーグルトに比較して、ヨーグルトにおいて減少されたＣＦＵのＬ．ブルガリクスを得るための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明は、以下の図面について、以下でより詳細に説明されるであろう。
【図１】図１は、発酵サンプルのヘッドスペースのＧＣ−ＭＳ分析を示す。Ｓ．テルモフィルスはＣＤＭ上で増殖された；サンプルは、指数増殖期の終わりに得られた（ＯＤ６００〜１．３）。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明は、発酵ブロスにおいて、特にＳ．テルモフィルスにより産生される、フレーバー産生を増大するための方法であって、Ｓ．テルモフィルス株を使用して発酵媒体を発酵する工程を具備し、そこにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている方法に関する。
【００１８】
本発明の方法は、ａ）発酵媒体を準備すること；ｂ）発酵媒体を少なくともＳ．テルモフィルス株、ここにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている株を播種すること；ｃ）発酵ブロスを得るために発酵を可能にすること；および任意にｄ）食品生産物の製造のために発酵ブロスの全てまたは一部分を使用すること；の工程を具備してよい。
【００１９】
発酵ブロスは、それ自体フレーバー提供媒体として供給されてもよく、または産生されたフレーバー化合物が発酵ブロスから単離されてもよく、続いて食品生産物、飼料生産物などの製造において使用されてもよい。
【００２０】
ここで使用されるとき用語「フレーバー産生の増大」は、食品生産物に対してフレーバーを提供するために重要な増大された量の少なくとも１つの化合物の産生をいう。不活性化グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む（以下、「ＧＤＨ−不活性」ともよぶ）Ｓ．テルモフィルス株についてのフレーバー産生における改善は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが有意なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する（ＧＤＨ−活性）同じＳ．テルモフィルス株と比較して規定されるだろう。ここで使用されるとき、ＧＤＨ−不活性株は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが有意なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＧＤＨ−活性）を有する同じＳ．テルモフィルス株（「親」株）に比較して、多くても約１０％、例えば、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、好ましくは約２％および更にまた好ましくは約１％の残余のＧＤＨ活性を有するだろう。用語「グルタミン酸デヒドロゲナーゼが有意なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＧＤＨ−活性）を有する同じＳ．テルモフィルス株（「親」株）」は、ＧＤＨ−不活性Ｓ．テルモフィルス株が由来する株を示すために使用される。
【００２１】
ＧＤＨ−不活性株におけるフレーバー産生は、株が、フレーバー産生のために重要な少なくとも１つよりも多くの化合物の少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％または約１５％が産生されるときに、増大されるまたは改善されるだろう。フレーバー産生のために重要な化合物は、これらに限定するものではないが、アセトアルデヒド、メタンチオール、２−メチルプロパナール、２−ブタノン、３−メチルブタナール、２−メチルブタナール、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、３−メチル−２−ブテナール、２−ヘプタノン、メチオナール、ヘプタナール、ベンズアルデヒド、ジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）、２−ノナノン、２−ウンデカノン、アセトン、ジアセチル、およびエチルアセテートを含む。好ましくは、ＧＤＨ−不活性株は、アセトアルデヒドおよび２−メチルプロパナールの少なくとも１つの増大された量またはアセトアルデヒドおよび２−メチルプロパナールの両方の増大された量を産生する。
【００２２】
不活性化グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含むＳ．テルモフィルス株は、ここにおいてまた、ＧＤＨ−不活性株とも称される。株は、好ましくは組み換えＤＮＡ技術により作られた組み換え株である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは；ｇｄｈＡ遺伝子の欠失、挿入または変異；弱いプロモータでのｇｄｈＡプロモータの置換；アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ；およびｓｉＲＮＡ；の１つまたは１つ以上により不活性化されてよい。ＧＤＨ−不活性株は、本質的に非機能的なＧＤＨを含む。ここで使用されるとき、用語「本質的に非機能的なＧＤＨ」は、ＧＤＨ活性が、極僅かであり、増殖のために十分なＮＡＤＰＨをＳ．テルモフィルス株に対して提供するために不十分であることを意味する。
【００２３】
アミノ酸配列は、本質的に非機能的なＧＤＨを産生するために変更されてよい。この目的のために、アミノ酸残基は、不活性ＧＤＨを得るために、欠失、挿入または変異されてもよい。アミノ酸配列の変異は、所望の位置で天然に存在するアミノ酸をもう１つのアミノ酸に変更することと理解される。部位特異的な変異生成が、例えば、ＧＤＨの触媒部位におけるアミノ酸残基を変更するために適用されてもよく、そのアミノ酸残基は、基質の結合または共同因子の結合のために重要であり、そのアミノ酸残基は、ＧＤＨの正確な折り畳みのためにまたはＧＤＨの構造上重要なドメインである。アミノ酸配列は、部位特異的な変異生成を使用して変異されてもよく、または代替的に、ランダム変異生成を使用して、例えば、ＵＶ照射、化学的変異生成法またはランダムＰＣＲ法を使用して変異されてもよい。或いは、ｇｄｈＡ遺伝子が、公知のノックアウト技術を使用して、部分的または完全に欠失または不活性化されてもよい。もう１つの代替法は、ｇｈｄＡプロモータを弱いまたは不活性なプロモータで置換して、ＧＤＨの発現の欠如をもたらすことである。当業者は、どのようにｇｄｈＡプロモータをもう１つのプロモータで置換するのかが分かる。
【００２４】
当業者が、活性GDHタンパク質の発現が生じないために、ｇｄｈＡ遺伝子（グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする）の適切な修飾を導入するための適切な戦略を選択することは通常業務である。例えば、インビトロで変異生成のための方法は、サンブロックらの文献に記載される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、１９８９）。対応する方法もまたキットの形態で商業的に入手することが可能である（例えば、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  ｂｙ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）。ＧＤＨ−欠失は、例えば、遺伝子置換技術により達成されてよく、これは当業者に周知である。
【００２５】
Ｓ．テルモフィルス株ＣＮＲＺ１０６６、ＬＭＧ１８３１１およびＬＭＤ−９からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、公のデータベースから知られる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい）。それらは等しい。ＧＤＨアミノ酸配列は、４５０のアミノ酸からなる。ＧＤＨタンパク質は、ストレプトコッカス種の間で高度に保存される（大部分のストレプトコッカス株で７５％よりも高い同一性）。
【００２６】
ｇｄｈＡ遺伝子はまた、アンチセンスＤＮＡまたは（ｍ）ＲＮＡまたはＲＮＡｉ、好ましくはｓｉＲＮＡを使用してサイレンシング（または「スイッチオフ」）されてもよい。用語、遺伝子サイレンシングは、一般に、遺伝子組み換え以外の機序により遺伝子をスイッチオフすることを表すために使用される。即ち、正常な環境下で発現されるだろう遺伝子は、細胞内の機構によりスイッチオフされる。当業者は、どのように本発明に対して遺伝子サイレンシングを適用するのか、およびどうように適切な遺伝子サイレンシング構築物を選択および製造するのかが分かる。
【００２７】
本発明者らは、例の節で下文に示すように、全体のｇｄｈＡ遺伝子をノックアウト（または欠失）することを選択している。
【００２８】
発酵媒体は、それがＳ．テルモフィルスによる発酵を可能にする何れかの水性培地であってよい。「発酵」または「発酵培養」は、通常（必然的にではないが）嫌気性条件下で、炭水化物をアルコールおよび／または酸に変換する細菌の増殖のために使用される増殖培養をいう。「発酵媒体」は、発酵培養を設置するために使用される増殖媒体をいい、他方「発酵ブロス」は、一般に、発酵した媒体（即ち、発酵中および／または発酵後）を指すために使用される。しかしながら、両方の用語は、ここにおいて交換可能に使用されてもよく、意味は文脈から明らかだろう。発酵媒体は、糖源およびタンパク質源を含む何れかの発酵媒体であってよい。糖源は、使用されるＳ．テルモフィルス株により発酵される何れかの糖であってよく、これらに限定するものではないが、ラクトース、スクロース、デキストロース、グルコースなどを含む。タンパク質源は、何れかのタンパク質源であってよく、これらに限定するものではないが、乳タンパク質、植物タンパク質、魚タンパク質、肉タンパク質などを含む。特に、発酵食品生産物の生産のためには、タンパク質源が乳タンパク質および植物タンパク質から選択されることが好ましい。
【００２９】
発酵ブロスは、何れかの発酵ブロスであってよいが、発酵食品生産物であってもよく、即ち、それ自身ヒトおよび／または動物の消費に適切な液体、半固体および／または固体の食品生産物（栄養組成物）であってもよい。
【００３０】
Ｓ．テルモフィルスは、通常、乳タンパク質を含む乳型主成分の発酵媒体、例えば、乳を発酵することによるヨーグルトおよびチーズの製造において使用される。それはまた、通常、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）の大豆タンパク質、例えば、豆乳を含む大豆型主成分の発酵媒体を使用する大豆ヨーグルトの製造において使用される。Ｓ．テルモフィルスは更に、炭素およびエネルギーの供給源、例えば、炭水化物、例えば、糖、例えば、ラクトースを必要とする。好ましくは、乳型主成分の媒体（「乳基質」とも称する）は、天然または再構成された乳、スキムミルクまたは他のもの、または乳に基づく媒体または乳製品起源の生産物に基づく媒体である。
【００３１】
この乳基質または大豆型主成分の媒体は、乳デザートの製造のために一般に使用されるアイテム、固体アイテム、例えば、果物、チョコレートチップまたはシリアル、例えば、更にまた甘味製品または液体チョコレートを含んでよい。
【００３２】
有利に、本発明の株は、全ての種類の発酵乳および／または大豆製品の製造において使用される。
【００３３】
従って、本発明は、発酵酪農製品の製造のためのプロセスに関し、そこにおいて乳基質は、本発明の少なくとも１つのＳ．テルモフィルス株で発酵される。
【００３４】
或いは、本発明はまた、発酵された大豆製品の製造のためのプロセスに関し、そこにおいて、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）の大豆タンパク質、例えば、豆乳を含む大豆型主成分発酵媒体は、本発明の少なくとも１つのＳ．テルモフィルス株で発酵される。
【００３５】
それはまた、このプロセスにおいて、本発明のＳ．テルモフィルス株と１つまたは１つ以上の更なる細菌株、特に、他の乳酸菌との組み合わせの使用のために提供することが可能である。「乳酸菌」(ＬＡＢ)は、乳酸または他の有機酸（例えば、プロピオン酸）を発酵の最終産物として産生する細菌をいい、例えば、しかしながらこれらに限定するものではないが、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オイノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの属の細菌である。
【００３６】
好ましくは１つまたは１つ以上の更なる細菌株は、ラクトバシルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）および／またはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から選択される。
【００３７】
本発明はまた、Ｓ．テルモフィルス株に関し、そこにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されている株に関する。前記株は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの完全に機能的なコピーを含まない。それは組み換え株または天然の株（非ｇｍｏおよび非変異体）であってよい。好ましくは、それは組み換え株である。テルモフィルス株は、好ましくは食品等級である。「食品等級」は、例えば、ＵＳ食品医薬品局（ＦＤＡ）などの関連行政当局によりヒトおよび／または動物消費のために安全と評価されていることをいう。株は、上述のとおりに製造されてよい。実施形態において、株はＳ．テルモフィルス株ＣＢＳ１２５１８４であり、それはブタペスト条約の規則下にＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されている（２００９年９月３日に受託）。
【００３８】
更に、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株を含む発酵ブロスについて提供し、そこにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは不活性化されている。発酵ブロスは、それ自身発酵食品生産物、例えば、ヨーグルトまたはチーズであってもよく、または発酵ブロスは、食品生産物の製造において使用されてもよい。「食品」または「食品生産物」は、ヒトおよび／または動物の消費のために適切な液体、半固体および／または固体の食品生産物（栄養組成物）をいう。食品または食品生産物は、それ自身発酵（「発酵食品生産物」）されていてもよく、例えば、ヨーグルト、チーズ、ケフィアなどであってよく、または本発明の方法を使用して製造された発酵食品生産物または発酵ブロスを含んでもよい。
【００３９】
例えば、発酵ブロスは、他の食品生産物、例えば、液体食品（例えば、飲料、スープ、ヨーグルトまたはヨーグルトに基づく飲料、乳シェイク、清涼飲料、果実飲料、発酵酪農製品、食事代替物、発酵果実および／またはジュース製品など）または固体食品／飼料（食餌、食餌代替物、スナック、例えば、キャンディバー、動物飼料、発酵酪農製品、発酵食品または飼料生産物、アイス製品、凍結乾燥食品添加物、チーズなど）または半固体食品（デザートなど）において使用されてもよい。発酵ブロスは、単に食品生産物に対して添加されてもよく、またはそのような食品生産物の生産プロセスの間に使用されてもよい。
【００４０】
或いは、発酵ブロスは、濃縮されてもよく、希釈されてもよく、または食品組成物を製造するために使用される前に前処理されてもよい。前処理は、濾過および／または遠心分離、滅菌、凍結乾燥、凍結などを含む。発酵ブロスそれ自身／または前処理発酵ブロスは、基本的に上記の方法の一次生産物である。これらの一次生産物は、例えば、発酵食品生産物の場合においてそれ自身使用されてもよく、食品生産物材料として使用されてもよく、即ち、最終食品生産物を製造するときに、適切な量の一次生産物が材料として使用されてもよい。本発明に従う食品組成物は、適切な量の一次生産物（発酵ブロス、例えば、それ自身または前処理物）を含む、または適切な量の一次生産物からなる。
【００４１】
食品生産物または発酵ブロスは、好ましくはそれ自身発酵食品生産物であり、それは、これらに限定するものではないが、発酵酪農食品産生物、例えば、ヨーグルト、チーズ、ケフィア、バターミルク、サワークリーム、大豆ヨーグルトなどを含む。そのような食品生産物は、更に酪農デザートの製造のための一般的な材料、例えば、果実、チョコレートチップまたはシリアル、例えば、また更に甘味製品、液体チョコレートなどを含んでもよい。食品生産物は、更に例えば、乳化剤、ゲル化剤、安定剤、甘味料などの一般的な食品材料を含んでもよい。当業者は、本発明の（発酵された）食品生産物を使用してどのように食品生産物を製造するかが分かる。
【００４２】
有利な実施形態において、発酵食品生産物は、ヨーグルトまたはチーズから選択される。ヨーグルトの製造のために、乳基質は、少なくとも本発明のＳ．テルモフィルス株およびラクトバシルス・デルブルエキイ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）を使用して発酵される。他の細菌、例えば、ＬＡＢが、例えば、ヨーグルトプロバイオティック特性を提供するために添加されてもよい。チーズの製造のために、乳基質は、少なくとも本発明に従うＳ．テルモフィルス株、および好ましくは、チーズ製造のための開始培養、例えば、一般的に使用される開始培養、任意に付加培養を使用して発酵される。本発明のＳ．テルモフィルス株はまた、チーズ開始培養の一部分であってもよい。
【００４３】
本発明はまた、改善された（増大された）フレーバー産生を有するＳ．テルモフィルス株を同定する方法であって、Ｓ．テルモフィルス株におけるＧＤＨ−活性をスクリーニングする工程を具備する方法を提供する。更なる工程は、１つまたは１つ以上のＧＤＨ−不活性株の選択、またはＧＤＨ−不活性株を同定することであってよい。改善されたフレーバー産生を有するそのような株は、上述のような発酵ブロス、食品生産物または発酵食品生産物の製造において有利に使用される。ＧＤＨ−活性をスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知の方法を使用して行われてよく、例えば、以下の例に記載される方法を使用してよい。
【００４４】
また、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株の使用に関し、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼは不活性化されており、発酵食品生産物、特に、ヨーグルトまたはチーズにおけるフレーバー産生を改善するための使用に関する。
【００４５】
アセトアルデヒドは、同様なＧＤＨ−活性な株と比べてＧＤＨ−不活性株において過剰に産生され、ヨーグルトにその特有のフレーバーを与える。２−メチルプロパナールは、ナッツフレーバーを与え、それは、特にある種類のチーズ、例えば、チェダーチーズに望ましい。
【００４６】
最後に、本発明は、Ｓ．テルモフィルス株の使用に関し、そこにおいてグルタミン酸デヒドロゲナーゼが不活性化されており、ＧＤＨが活性なＳ．テルモフィルス株を使用して製造されたヨーグルトに比較して、ヨーグルトにおいてＬ．ブルガリクスの減少されたＣＦＵを得るための使用に関する。２つの株は、フレーバー産生の公正な比較を可能にするために、好ましくは同様または同一の条件下において発酵される。用語「コロニー形成単位（ＣＦＵ）」は、生存可能な細菌または真菌数の測定単位である。
【００４７】
本書において、およびその特許請求の範囲において、動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用は、その非限定的な意味において使用され、その後に続く事項が含まれることを意味するが、しかしながら特に言及されない事項が排除されるものではない。加えて、動詞「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、「本質的になる（consist essentially）」により置換されてよく、本発明の組成が、特に特定されたものとは異なる更なる成分（単数または複数）を含んでもよいことを意味し、更なる成分（単数または複数）は、本発明の特有の特徴を変更するものではない。
【００４８】
数値に関して使用されるとき、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」（約１０（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  １０）、約１０（ａｂｏｕｔ  １０））は、好ましくは値が問題の値である１０に±１％の範囲の値であってよいことを意味する。
【００４９】
加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による成分への言及は、文脈が１つおよび１つのみの成分が存在することを明確に要求する場合を除いて、１つよりも多くの成分が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、従って、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００５０】
本明細書において引用された全ての参考特許および文献は、引用することによりその全体がここに組み込まれる。
【００５１】
上記の記載および図面は本発明の幾つかの実施形態を説明するために含まれるものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは明白だろう。本開示から始まり、多くの更なる実施形態が、当業者には明らかであり、それらは保護および本発明の本質の範囲内にあり、それらは、先行技術および本特許の開示の明らかな組み合わせである。
【例】
【００５２】
［材料および方法］
細菌株、媒体および増殖条件
本検討において使用された株は、ストレプトコッカス（Ｓ．）テルモフィルスＬＭＧ１８３１１、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  （Ｌ．）  ｌａｃｔｉｓ）ＭＧ１３６３およびラクトバシルス（Ｌｂ．）プランタルムＷＣＦＳ１であった。細胞は嫌気的に増殖した。Ｌ．ラクチスおよびＳ．テルモフィルスはグルコース（ＧＭ１７）が補われたＭ１７ブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）中で、３０℃と４２℃のそれぞれで、１％（重量／体積）の最終濃度まで増殖された。Ｓ．テルモフィルスΔｇｄｈＡは、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）の存在において増殖した。Ｌｂ．プランタルムは、グルコースが補われたマン・ロゴサ・シャープ（Ｍａｎｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ、ＭＲＳ）ブロス（Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で、３７℃で最終濃度が１％（重量／体積）まで増殖された。エシェリキア・コリＤＨ５α（２７）を１つの酵素アッセイのために使用し、ＴＹＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）において３７℃で好気的に培養された。
【００５３】
発酵実験のために、細胞は既知組成培地（ＣＤＭ）において増殖された。
【００５４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈＡ）活性
Ｌｂ．プランタルム、Ｌ．ラクチスＭＧ１３６３およびＳ．テルモフィルス（野生型およびｇｄｈＡノックアウトの両方）の培養物は、ＯＤ６００〜１まで増殖させた。培養物を遠心し、５０ｍＭのβ−グリセロフォスフェート（ｐＨ７）中で２回洗浄した（４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間）。２回目の洗浄工程の後に、ペレットをＯＤ６００〜２００／ｍＬにまで同じ緩衝液中で濃縮した。ビート−ビーティングにより細胞崩壊（４×３０秒、スピード４．０、Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０）の後に、遠心分離により、細胞崩壊堆積物を除いた（１３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１７Ｒ）。ｇｄｈＡアッセイは、バックグラウンドノイズに対して敏感であるために、細胞非含有抽出物をスライド−ア−ライザー（ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｉｚｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｋｃｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で精製し、５０ｍＭのβ−グリセロフォスフェート（ｐＨ７）中、４℃で、一晩、透析した。細胞非含有抽出物をスライド−ア−ライザーからシリンジを使用して除去し、直ちに酵素活性の測定のために使用した。
【００５５】
ｇｄｈＡ活性は、比色分析グルタメートアッセイで分析した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０１３９０９２０３５）。反応混合物を３７℃でインキュベートし、５０ｍＭのリン酸カリウム／ＴＥＡ緩衝液ｐＨ９（溶液１、キット）、１．７６Ｕ／ｍＬのジアフォラーゼ＋ＮＡＤ（溶液２、キット）、２ｍＭのＩＮＴ（溶液３、キット）、１００ｍＭのグルタメート、１３．８ｍＭのＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋および細胞非含有抽出物を含む。ＮＡＤＰＨの形成の後に、４９２ｎｍでの吸光度の増加をモニタリングすることにより分光光度法を行った。
【００５６】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）活性
Ｌｂ．プランタルム（陽性対照）およびＳ．テルモフィルスの培養物をＯＤ６００〜１まで増殖した。培養物を遠心し、５５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中のメガヒュージ１．０Ｒ（Ｍｅｇａｆｕｇｅ  １．０Ｒ（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で洗浄した（５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）。２回目の洗浄工程の後、ペレットを１ｍＬの５５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中で濃縮し、ビート−ビーティング（４×３０秒間、スピード４．０、Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０）および遠心（１３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１７Ｒ）を行った。Ｇ６ＰＤＨ活性は、ホンジョウ（Ｈｏｎｊｏｈら、２００３、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：１８８８−１８９６）による記載の通りに分析した。反応混合物を２５℃でインキュベートし、５５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、３．３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＮＡＤＰ＋および３．３ｍＭのグルコース−６−ホスフェートおよび細胞非含有抽出物を含んだ。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの形成の後、３４０ｎｍでの吸光度の増加をモニタリングすることにより分光光度法を行った。
【００５７】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）活性
Ｅ．コリＤＨ５α（陽性対照として使用）およびＳ．テルモフィルス（野生型およびｇｄｈＡ変異体）の培養物をＯＤ６００〜１まで増殖した。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により採取し、３５ｍＭトリス／ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．５）中で２回洗浄した。細胞ペレットを１ｍＬの３５ｍＭトリス／ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．５）中で濃縮し、ビート−ビーティング（４×３０秒間、スピード４．０、Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０）した。ＩＣＤＨ活性は、クビトコビッチらによる記載の通りに分析した（Ｃｖｉｔｋｏｖｉｔｃｈら、１９９７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６５０−６５５）。反応混合物を３７℃でインキュベートし、３５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭのイソシトレート、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２、０．３５ｍＭのＮＡＤＰ＋および細胞非含有抽出物を含んだ。ＮＡＤＰＨの形成の後に、３４０ｎｍでの吸光度の増大のモニタリングにより分光光度法を行った。
【００５８】
Ｓ．テルモフィルスのためのｇｄｈＡノックアウト構築
分子クローニング技術を標準的な実験室手順に従い行った。野生型株Ｓ．テルモフィルスＬＭＧ１８３１１を、ブロンキビストらの記載の通りのオーバーラッピングＰＣＲ産物の自然変換を使用する機能的なｇｄｈＡ遺伝子（ΔｇｄｈＡ）を欠く変異体の構築のために使用した（Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔら、２００６．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：６７５１−６７５６）。
【００５９】
Ｌｂ．プランタルムのためのｇｄｈＡ／ｇｌｎＡノックアウトの構築
Ｌｂ．プランタルムにおいて、ｇｄｈＡおよびｇｌｎＡ（グルタミンシンテターゼ）の両方のダブルノックアウトを以前に記載された戦略に従い構築した（Ｇｏｆｆｉｎら、２００６．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：７９３３−７９４０）。両方の遺伝子は、遺伝子約６００ｂｐの内部フラグメントの挿入を有する自殺プラスミド（ｐＧＩＭ００８およびｐＪＤＣ９）を使用する単一交差により不活性化された。エリストマイシンおよびクロラムフェニコールの付加が、挿入の安定性を保証する。この変異体は、Ｓ．テルモフィルスｇｄｈＡ変異体と機能的に同じである。
【００６０】
バッチ培養
発酵は、１Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＢＶ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）内でデュプリケートで行った。発酵は、Ｂｉｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＡＤＩ  １０１０およびＢｉｏ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ＡＤＩ  １０２５により制御された（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＢＶ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。Ｓ．テルモフィルス野生型およびΔｇｄｈＡをＣＤＭ中で一晩培養し、１０００ｍＬのｐＨ制御ＣＤＭの接種材料として使用し、培地は、１％で接種された。ｇｄｈＡノックアウトのための培地は、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を補われた。株は、増殖の間、４２℃で増殖され、ｐＨは、２．５ＭのＮａＯＨの添加によりｐＨ＝６．５で一定に維持された。
【００６１】
Ｌｂ．プランタルム野生型およびΔｇｄｈＡは、ＣＤＭ中で一晩培養され、１０００ｍＬのｐＨ制御ＣＤＭの接種材料として使用され、培地は１％で接種された。ｇｄｈＡノックアウトのための培地は、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）およびエリストマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を補われた。株は、増殖中、３７℃で増殖され、ｐＨは、２．５ＭのＮａＯＨの添加によりｐＨ＝５．５で一定に維持された。
【００６２】
培養物は１００ｒｐｍの一定の速度で攪拌された。増殖の後、３０分毎に６００ｎｍで細胞密度を測定された。ＨＰＬＣおよびＲＮＡ単離のためのサンプル（２×２５ｍＬ）は指数増殖期の終わりに得た。ＧＣ−ＭＳ分析のためのサンプル（３ｍＬ）は、中間指数増殖期および静止期で得た。
【００６３】
ゲノムスケールでのｍＲＮＡ転写レベルの分析
ＲＮＡ単離
幾つかの改変を伴って他に記載されたようにＲＮＡを単離した（Ｓｐｅｒａｎｄｉｏら、２００５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３７６２−３７７８．）。中間指数増殖期で、各発酵槽からの２５ｍＬの培養物（制限培地および完全培地の両方についてデュプリケートのサンプル）を１４０００ｒｐｍで２分間に亘る室温での遠心により直ちにペレット化した（Ｈｅｒｏｌａｂ、Ｕｎｉｃｅｎ  ＭＲ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ペレットを液体窒素中で急速に凍結し、−８０℃で更なる使用まで保存した。凍結ペレットを４００μＬのＴＥに再懸濁し、５００μＬのフェノール−クロロホルム（５：１）、１５μＬの２０％ドデシル硫酸ナトリウム、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８および０．６ｇジルコニウムガラスビーズを含むネジ蓋付きチューブに移した。細胞をファストプレップ（Ｆａｓｔｐｒｅｐ、Ｓａｖａｎｔ、ＦＰ１２０）中で、４０秒間、５．０で破壊し、混合物をビーズを除去するために遠心した（１３０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）。次に、５００μＬの冷クロロホルムを上清に添加し、続いて、遠心分離工程（１３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行った。遠心分離の後、ＤＮＡｓｅＩ処理を我々は３０分、３７℃に変更したことを除いて、製造者のプロトコールに続き、０．５ｍＬの水相をハイ・ピュア・ＲＮＡ・単離キット（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＲＮＡ抽出のために使用した。ＲＮＡは、６０μＬの溶出緩衝液（キット中に提供される）において溶出され、サンプルは−８０℃で保存した。
【００６４】
ＲＮＡの濃度をＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で検査し、質を２１００バイオアナライザー（２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）により試験した。２３Ｓ／１６Ｓ比が１．６よりも高いサンプルだけは、標識化のために使用した。
【００６５】
ｃＤＮＡ合成および標識
５μｇＲＮＡからの第１の鎖ｃＤＮＡ合成を以前記載されたように行った（Ｓａｕｌｎｉｅｒら、２００７．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：１７５３−１７６５；Ｓｅｒｒａｎｏら、２００７．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．６：２９）。合成されたｃＤＮＡを精製し、シアニン３およびシアニン５で全てのサンプルについて標識した。標識されたｃＤＮＡの質およびその濃度をＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で測定した。
【００６６】
ハイブリダイゼーション
ラベルされたｃＤＮＡ（サンプル当たり０．３μｇ）のハイブリダイゼーションを以前記載されたように行った（Ｓａｕｌｎｉｅｒら、２００７．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：１７５３−１７６５；Ｓｅｒｒａｎｏら、２００７．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．６：２９)。サンプルは、特注設計のアジレント・テクノロジー・オリゴ・マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｌｉｇｏ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）上でアジレント・６０マー・オリゴ・マイクロアレイ・プロセッシング・プロトコール・バージョン４．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６０−ｍｅｒ  ｏｌｉｇｏ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）を使用してハイブリダイズした（Ｓａｕｌｎｉｅｒら、２００７．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：１７５３−１７６５）。
【００６７】
スキャニングおよびデータ解析
スライドをスキャン・アレイ・エクスプレス・スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｃａｎｎｅｒ）により解像度５μｍでスキャンした。データ解析および処理は他に記載されたように行った（Ｓａｕｌｎｉｅｒら、２００７．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：１７５３−１７６５；Ｓｅｒｒａｎｏら、２００７．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．６：２９）。折り畳み変化は２Ｍとして規定する、ここでＭ＝２ｌｏｇ（ｃｙ５強度／ｃｙ３強度）（Ｓｅｒｒａｎｏら、２００７．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．６：２９）。有意に調節された遺伝子は、その平均ｐ値が５％未満であり、そのＭ値が１．５に等しいか、または１．５よりも高い遺伝子として規定された。
【００６８】
スキャン強度、正規化、スケーリング、サイバーＴ（Ｃｙｂｅｒ−Ｔ）および偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ、ＦＤＲ）の選択は、他で記載されたように行った（Ｂｌｏｍら、２００８．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．９：４９５）。単一遺伝子ｆｄｒ基準を通過しないマイクロアレイデータにおけるより微細な差次的発現を表すために、それらが以下の基準に従う場合に、マルチプル遺伝子のＦＤＲの相乗平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ）を算出した：（ｉ）遺伝子が同じオペロンの一部分である、（ｉｉ）それらが同様の差次的発現を示す（例えば、ｇｄｈＡ変異体において発現された全ての合計）（ｉｉｉ）それらが後の代謝的変換に関与する（ひいては同じ代謝経路の一部分）。
【００６９】
これらの基準により、我々は、共発現された遺伝子からなる２つの異なる経路を発見し、それは、各経路についてオペロンにおいて組織化された（シトレート経路およびコンピテント遺伝子）
比較ゲノミクス
ＥＲＧＯインフォマティクス・スウィート（Ｔｈｅ  ＥＲＧＯ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｕｉｔｅ、ｈｔｔｐ：／／ｅｒｇｏ．ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ＥＲＧＯ／）を使用して、ゲノムレベルで、Ｓ．テルモフィルスと他のシーケンシングされたＬＡＢとを比較した。特に、ペントースリン酸経路の存在を試験し、入手可能な５３のＬＡＢゲノムの間で比較した。
【００７０】
アンモニア測定
発酵サンプルの上清中のアンモニア濃度を、アンモニアキット（Ｒ−ｂｉｏｐｈａｒｍ  ＡＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＵＶ法を使用して測定した。
【００７１】
タンパク質濃度
細胞非含有抽出物中のタンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ．ＵＳＡ）を使用して測定した。
【００７２】
代謝分析
サンプル中の揮発性成分を同定するために、パージ・アンド・トラップ・サーマル・デソルプション・コールド・トラップ・ガスクロマトグラフィを以前に記載された通りに使用した（Ｅｎｇｅｌｓ．１９９７．ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｓｍｉｔら、２００４．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：３９６−４０２）。ヘッドスペースサンプルを、フィジョン・ＭＦＡ８１４・コールド・トラップ（Ｆｉｓｏｎｓ  ＭＦＡ８１５  ｃｏｌｄ  ｔｒａｐ、ＣＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）において濃縮し、続いて、ＣＩＰ−ＳＩＬ５ＣＢロウ・ブリード・カラム（ＣＩＰ−ＳＩＬ  ５  ＣＢ  ｌｏｗ−ｂｌｅｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を備えたＧＣ−８０００トップ・ガス・カラムクロマトグラフィ（ＧＣ−８０００  ｔｏｐ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、ＣＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で分離し、更に、フレームイオン化検出器により検出した。
【００７３】
発酵サンプルの錠生中に存在する細胞外代謝産物を他で記載されるように測定した（Ｓｔａｒｒｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ．１９９１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：３５３５−３５４０）
［結果］
ＮＡＤＰＨ生成の予測およびｇｄｈＡノックアウトの構築
導入部において記載されたとおり、我々は以前に開発されたＳ．テルモフィルスのゲノムスケールモデル（Ｐａｓｔｉｎｋら、２００９．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：３６２７−３６３３）を使用して、ＮＡＤＰＨ発生経路について探索した。Ｓ．テルモフィルスは、完全なペントースリン酸経路を有さず、この経路を介してＮＡＤＰＨは生ずることができないと予測される。モデルは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼが有力なＮＡＤＰＨ生成酵素であるかもしれないことを予測した。これらの酵素がコードする経路は、α−ケトグルタレートを介して関連しており、これは重要な生体化合物である。モデルの予測は、酵素活性をアッセイすることにより実験的に試験された。また、予測されたＰＰＰの不在は、ＰＰＰの第１の酵素、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を測定することにより検証した。
【００７４】
Ｌｂ．プランタルムおよびＳ．テルモフィルスの細胞非含有抽出物をＧ６ＰＤＨ活性のために分析した。この株が完全なペントースリン酸経路を有することが公知であることから、Ｌｂ．プランタルムを陽性対照として使用した。酵素アッセイは、Ｌｂ．プランタルムがＧ６ＰＤＨ活性を有し、Ｓ．テルモフィルスがＧ６ＰＤＨ活性を有さないことを実際に示した（表１）。
【００７５】
Ｌｂ．プランタルム、Ｌ．ラクチスおよびＳ．テルモフィルス野生型およびΔｇｄｈＡの細胞非含有抽出物をＧＤＨ活性について分析した。Ｌ．ラクチスは、陰性対照として使用した。Ｌｂ．プランタルムおよび野生型Ｓ．テルモフィルスはＧＤＨ活性を有する（表１）。予期された通り、ｇｄｈＡノックアウトは、ＧＤＨ活性を有さない。
【表１】
2013503652.tif 000003
【００７６】
Ｓ．テルモフィルス野生型およびΔｇｄｈＡおよびＥ．コリＤＨ５αの細胞非含有抽出物をイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性について分析した。Ｅ．コリは、陽性対照として使用し、ＩＣＤＨ活性を実際に有する。Ｅ．コリのＩＣＤＨは、ＴＣＡ回路における重要な調整酵素であり、そのためにこの酵素の高い活性が観察される。ＩＣＤＨ活性は、野生型のＳ．テルモフィルスについては観察されず、それに対してｇｄｈＡ変異体はＩＣＤＨ活性を有する（表１）。
【００７７】
この知見と、Ｓ．テルモフィルスの野生型がグルタメートを利用できるという観察（Ｔａｎｏｕｓら、２００２．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．８２：２７１−２７８）に基づいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ変異体が、ブロンキビストら（前掲）により記載されたようなオーバーラップＰＣＲ産物の自然変換を使用する構築された。ｇｄｈＡのオープンリーディングフレームが、クロラムフェニコール抵抗性を与えるＰ３２−ｃａｔカセットにより交換された。この検討において使用されたプライマーは表２に掲載され、全てのＰＣＲ反応は、フージョンポリメラーゼ（Ｆｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行われた。
【表２】
2013503652.tif 000004
【００７８】
ｇｄｈＡの上流および下流の組み換えフラグメント（１．５ｋｂ）をＰＣＲによりＵｐＤｅｌｇｄｈＡ１／ＵｐＤｅｌｇｄｈＡ２およびＤｎＤｅｌｇｄｈＡ１／ＤｎＤｅｌｇｄｈＡ１プライマー対を使用してそれぞれ増幅した。ｐＮＺ５３２０からのＰ３２−ｃａｔカセット（ｐＮＺ５３１８の派生物、ｌｐ２９１フラグメントの除去）（Ｌａｍｂｅｒｔら、２００７．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：１１２６−１１３５）を、ＵｐｃａｔおよびＤｎｃａｔプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。３つのオーバーラップＰＣＲ産物を等モル濃度で混合し、プライマーＵｐＤｅｌｇｄｈＡ１／ＤｎＤｅｌｇｄｈＡ２を使用するＰＣＲにより結合し、次にＰＣＲ混合物を自然変換のために使用した。変異体の遺伝子型は、組み換え領域の上流および下流に配置されたプライマーでのＰＣＲにより確認された。対照として、我々はペントースリン酸経路陽性のＬＡＢ、Ｌｂ．プランタルムを使用し、それについて、同様のｇｄｈＡ変異体を構築した。この変異体の構築のために使用されたプライマーを表３に掲載する。
【表３】
2013503652.tif 000005
【００７９】
代謝反応
発酵サンプルをＨＰＬＣ上で分析した（表４）。野生型は、ホモ乳酸増殖を示し、これは以前に観察および記載された通りであった（Ｈｏｌｓら、２００５．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２９：４３５−４６３）。ｇｄｈＡ変異体はまた、主にラクテートを生成し、少量のホルメートを生成し、それはシトレートを消費する。同じ増殖率で、野生型よりも少ないグルコースが変異体により消費され、これはより効率的な増殖を示しうる。
【表４】
2013503652.tif 000006
【００８０】
揮発性物質のプロファイルは２つの株で同様である；しかしながら、ｇｄｈＡ変異体は、野生型よりも多くのアセトアルデヒド、アセトンおよび２−メチルプロパナールを産生する。
【００８１】
ｇｄｈＡはまた、より多くのトレオニンを消費し、これはトレオニンアルドラーゼによるトレオニン変換からのアセトアルデヒド産生を指し示しうる。また、ｇｄｈＡ変異体は、野生型よりも多くのプロパノンを産生し、プロパノンは、解糖の一部分として形成されうる。幾つかのアルデヒド、例えば、２−メチルプロパナールおよび３−メチルブタナールがｇｄｈＡ変異体からのサンプル中で高い濃度で見られる。これらのアルデヒドは、バリンおよびロイシン代謝の間にそれぞれ産生され、ＨＰＬＣデータは、野生型に比較して変異体により分岐アミノ酸の高い消費を実際に示す。
【００８２】
同じサンプルにおけるアミノ酸のＨＰＬＣ分析は（表５）、野生型よりもｇｄｈＡ変異体によって、全てのアミノ酸がより多く消費されることを示す。
【表５】
2013503652.tif 000007
【００８３】
加えて、変異体はまた、野生型に比べて高いアンモニア産生（３倍に匹敵する）を示し（表６）、これは、高いアミノ酸消費と十分に一致する。これは恐らく、アミノ酸分解を示す。
【表６】
2013503652.tif 000008
【００８４】
Ｌｂ．プランタルムの場合において、発酵サンプルは、Ｓ．テルモフィルスのために使用されたものと同じ手続きに続き分析された（表４）。ｇｄｈ／ｇｌｎＡ変異体および野生型は主な代謝に相違を示さない；ラクテート、ホルメートおよびアセテートが同様の量で産生される。更に、アミノ酸測定は、アスパルテートを除いて、変異体による異なるアミノ酸の同様な利用を示す（表５）。野生型およびｇｄｈＡ／ｇｌｎＡ変異体の揮発性物質プロファイルはほぼ等しい（データは示さず）。
【００８５】
トランスクリプトーム分析
遺伝子発現におけるｇｈｄＡ遺伝子の不在の影響をマイクロアレイで検討した。差次的な制御のために、我々は、以下の基準を満たす遺伝子のみを選択した（ｉ）比率≧１．２５および（ｉｉ）ＦＤＲ値＜０．０５。これらの基準により、我々は１４２遺伝子が差次的に発現することを発見した（表Ｓ１）。理論的に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、ｇｄｈＡ変異体において激しく下方制御される。ΔｇｄｈＡは、ＮＡＤＰＨを産生するための代替的な経路を必要とする；近年開発されたシンフェニーモデル（Ｐａｓｔｉｎｋら、２００９．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：３６２７−３６３３）からの予測は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼであった。アレイデータは、シトレート代謝（相乗平均ＦＤＲ＜０．０５、平均比率≧１．２５）；メチルクエン酸シンターゼ、アコニテートシンターゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼの上方制御を示した。この上方制御はまた、シトレート（ＨＰＬＣ分析）の消費および高いＩＣＤＨ活性に一致し、ＮＡＤＰＨのためのイソクエン酸デヒドロゲナーゼの重要性が示されうる。更に、アミノ酸代謝の同じ部分は、ｇｄｈＡ変異体において影響される；幾つかのアミノ酸トランスポーターが変異体において上方制御され、分岐鎖アミノ酸エクスポーターが下方制御される。ヒスチジンアンモニアリアーゼが下方制御され、この酵素は、窒素代謝の一部分である。ホスホセリンアミノトランスフェラーゼは、ｇｄｈＡ変異体において極めて上方制御される；この酵素は、Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリンおよび２−オキソグルタレートからのグルタメートおよびホスホノオキシピルベートの形成を触媒する。
【００８６】
コンピテンスに関与する共発現遺伝子（相乗平均＜０．０５；平均比率≧１．２５）は、野生型に比べて変異体において下方制御された。
【００８７】
比較ゲノミクス
ＥＲＧＯバイオインフォマティクススウィートを使用して、入手可能なシーケンシングされたＬＡＢをペントースリン酸経路の不在において比較した。Ｓ．テルモフィルスだけが不完全なＰＰＰを有するＬＡＢではない。実際に、少数のＳ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）およびＳ．ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）株を除外する殆ど全てのストレプトコッカスは、Ｓ．テルモフィルスＰＰＰにおける１３２ｇｄｈＡ変異の酸化部分を欠く。全てのストレプトコッカスは、同様の共通する祖先を共有するが、この先祖は、異なる分岐において分かれる。大部分のストレプトコッカスにおけるＰＰＰ遺伝子の遺伝子喪失の事象は、恐らく並行して、機能的な理由のために生じた。Ｓ．テルモフィルスは、その速い増殖について知られており、異なるストレプトコッカスの間での遺伝子喪失の事象は、珍しいとも思われず、増殖遅延をもたらすものでもない。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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