(57)【要約】  本発明はイムノコンジュゲートに関する。特定の実施態様では、本発明は、少なくとも一の単鎖エフェクタ部分と２以上の抗原結合部分とを含んでなるイムノコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、このようなイムノコンジュゲートをコードする核酸分子、この核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、さらに、本発明のイムノコンジュゲートの製造方法、そして、疾患の治療におけるこれらイムノコンジュゲートの使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも一の第一エフェクタ部分と、
(b) Ｆｖ及びＦａｂからなる群から独立して選択される第一および第二の抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートであって、
このとき該第一エフェクタ部分は、該第一抗原結合部分とアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有しており、
該第二抗原結合部分は、ｉ)該第一エフェクタ部分又はｉｉ)該第一抗原結合部分のいずれかとアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有している、イムノコンジュゲート。
【請求項２】
前記イムノコンジュゲートが、第一エフェクタ部分と、一又は複数のリンカー配列によって連結された第一および第二の抗原結合部分とから基本的になる、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
前記第一および第二の抗原結合部分の各々がＦａｂ分子である、請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
前記第一Ｆａｂ分子が、その重鎖又は軽鎖のカルボキシ終末アミノ酸で、第二Ｆａｂ分子の重鎖又は軽鎖のアミノ末端アミノ酸に連結している、請求項３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
前記第二Ｆａｂ分子が、その重鎖又は軽鎖のカルボキシ終末アミノ酸で、前記エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結している、請求項４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
前記エフェクタ部分が、そのカルボキシ終末アミノ酸で、前記第一Ｆａｂ分子のアミノ末端アミノ酸に連結している、請求項４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
前記第一Ｆａｂ分子が、その重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端で、前記エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結している、請求項３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８】
前記エフェクタ部分が、そのカルボキシ終末アミノ酸で、第二Ｆａｂ分子の重鎖又は軽鎖の末端アミノ酸に連結している、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
一又は複数のｓｃＦｖ分子にそのアミノ末端アミノ酸で連結した第一単鎖エフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートであって、このとき前記第一単鎖エフェクタ部分が一又は複数のｓｃＦｖ分子にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結している、イムノコンジュゲート。
【請求項１０】
a) 少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と、
b) 第一および第二の抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートであって、
このときこの各々の抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣκおよびＩｇＥ ＣＨ４からなる群からそれぞれ選択される免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域に連結しており、
該第一抗原結合部分が該第一エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ末端アミノ酸で連結しており、そして、該第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲート。
【請求項１１】
前記抗原結合部分の各々が、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含む定常領域にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結したｓｃＦｖ分子を含む、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
前記抗原結合部分の各々が、ＩｇＥ ＣＨ４ドメインを含む定常領域にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結したｓｃＦｖ分子を含む、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗原結合部分の各々がＩｇＧ Ｃκドメインを含む定常領域にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結したｓｃＦｖ分子を含む、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記第一抗原結合部分が、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含む定常領域にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結したｓｃＦｖ分子を含み、このとき該第二抗原結合部分が、ＩｇＧ Ｃκドメインを含む定常領域にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結したｓｃＦｖ分子を含む、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
a) 少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と、
b) 第一および第二の抗原結合部分とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、
このとき該抗原結合部分の各々がＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにそのカルボキシ末端アミノ酸で連結したｓｃＦｖ分子を含み、
該第一抗原結合部分が該第一エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結しており、そして、この第一および第二の抗原結合部分が少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲート。
【請求項１６】
前記第一抗原結合部分の定常領域が、少なくとも一のジスルフィド結合によって前記第二抗原結合部分の定常領域に共有結合している、請求項１０から１５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
前記第一抗原結合部分の免疫グロブリンドメインが、ジスルフィド結合によって前記第二抗原結合部分の免疫グロブリンドメインに共有結合している、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
少なくとも一のジスルフィド結合が、前記第一および第二の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのカルボキシ末端に位置する、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
少なくとも一のジスルフィド結合が、前記第一および第二の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのアミノ末端に位置する、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
少なくとも２のジスルフィド結合が、前記第一および第二の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのアミノ末端に位置する、請求項１９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
前記イムノコンジュゲートがさらに第二エフェクタ部分を含み、このとき前記第二抗原結合部分が前記第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ末端アミノ酸で連結している、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
a) 第一および第二の単鎖エフェクタ部分と、
b) 第一および第二の抗原結合部分とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、
このとき該抗原結合部分の各々が、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにその重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端アミノ酸で連結したＦａｂ分子を含み、
該ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの各々が、該エフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ末端アミノ酸で連結しており、そして、第一および第二の抗原結合部分が少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲート。
【請求項２３】
前記ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインが単一のジスルフィド結合で連結している、請求項２２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２４】
少なくとも一のジスルフィド結合が、前記第一および第二の抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に位置する、請求項２２又は請求項２３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２５】
少なくとも一のジスルフィド結合が、前記第一および第二の抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのアミノ末端に位置する、請求項２２又は請求項２３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２６】
少なくとも２のジスルフィド結合が、前記第一および第二の抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのアミノ末端に位置する、請求項２５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２７】
タンパク質分解性切断部位が、前記抗原結合部分と前記エフェクタ部分との間に位置する、請求項１から２６のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２８】
前記第一および第二の抗原結合部分の可変領域が同じ抗原に特異的である、請求項１から２６のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２９】
前記第一および第二の抗原結合部分の可変領域が異なる抗原に特異的である、請求項１から２６のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３０】
前記第一および第二の抗原結合部分がフィブロネクチンの外ドメインＢ(ＥＤＢ)に特異的である、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３１】
前記第一又は前記第二の抗原結合部分がフィブロネクチンの外ドメインＢ(ＥＤＢ)に特異的である、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３２】
ＥＤＢに特異的である前記１または２の抗原結合部分が、ＥＤＢのエピトープへの結合についてモノクローナル抗体Ｌ１９と競合する、請求項３０又は請求項３１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３３】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：９５のポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３４】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：１０８に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３５】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３６】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０４のポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３７】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：１１７に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３８】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１７のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３９】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０５のポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４０】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１８に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４１】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４２】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０６のポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４３】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１９に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４４】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４５】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０７のポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４６】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１２０に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４７】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１２０のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４８】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：９６のポリペプチド配列を含む、請求項３０から３２のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項４９】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０９に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項３０から３２のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５０】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５１】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：９６のポリペプチド配列を更に含む、請求項３３から４７のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５２】
前記第一および第二の抗原結合部分がテネイシンのＡ１ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１)に特異的である、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５３】
前記第一又は前記第二の抗原結合部分がテネイシンのＡ１ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１)に特異的である、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５４】
ＴＮＣ−Ａ１に特異的である前記１または２の抗原結合部分が、ＴＮＣ−Ａ１のエピトープへの結合についてモノクローナル抗体Ｆ１６と競合する、請求項５２又は５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５５】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：９９のポリペプチド配列を含む、請求項５２又は請求項５４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５６】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１２に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５２又は請求項５４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５７】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５８】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１００のポリペプチド配列を含む、請求項５２又は請求項５４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５９】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１３に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５２又は請求項５４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６０】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１３のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６１】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０１のポリペプチド配列を含む、請求項５２から５４のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６２】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：１１４に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５２から５４のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６３】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１１４のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項６２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６４】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１０１のポリペプチド配列を更に含む、請求項５８から６０のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６５】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：２１５のポリペプチド配列を含む、請求項５２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６６】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：２１６に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６７】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：２１６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項６６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６８】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：２３５のポリペプチド配列を含む、請求項５２又は５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６９】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２３６に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項５２又は５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７０】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２３６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項６９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７１】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：２３５のポリペプチド配列を更に含む、請求項６５から６７のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７２】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：１３又は配列番号：１５の重鎖可変領域配列を含む、請求項５２又は請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項７３】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：９又は配列番号：１１の軽鎖可変領域配列を含む、請求項５２又は請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７４】
前記イムノコンジュゲートが配列番号：９又は配列番号：１１の軽鎖可変領域配列を更に含む、請求項７２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７５】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：１４又は配列番号：１６に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７６】
前記重鎖可変領域配列が配列番号：１４又は配列番号：１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７７】
前記軽鎖可変領域配列が配列番号：１０又は配列番号：１２に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７８】
前記軽鎖可変領域配列が配列番号：１０又は配列番号：１２のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７９】
前記第一および第二の抗原結合部分がテネイシンのＡ2ドメイン(ＴＮＣ-Ａ2)に特異的である、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８０】
前記第一又は前記第二の抗原結合部分がテネイシンのＡ2ドメイン(ＴＮＣ-Ａ2)に特異的である、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８１】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項７９又は８０に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項８２】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、請求項７９又は８０に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項８３】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１、配列番号：２０５の群から選択される軽鎖可変領域配列を更に含む、請求項８１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８４】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８５】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８６】
前記軽鎖可変領域配列が、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８７】
前記軽鎖可変領域配列が、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８８】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項７９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８９】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項７９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９０】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項８９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９１】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項７９又は８０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９２】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項７９又は８０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９３】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項９２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９４】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択されるポリペプチド配列を更に含む、請求項８８から９０のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９５】
前記第一および第二の抗原結合部分が線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)に特異的である、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９６】
前記第一又は前記第二の抗原結合部分が線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)に特異的である、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９７】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項９５又は９６に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項９８】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、請求項９５又は９６に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項９９】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される軽鎖可変領域配列をさらに含む、請求項９７に記載のイムノコンジュゲート。 
【請求項１００】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項９７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０１】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１００に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０２】
前記軽鎖可変領域配列が、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項９８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０３】
前記軽鎖可変領域配列が、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１０２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０４】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２０９、配列番号：２１１、配列番号：２１３、配列番号：２１７、配列番号：２１９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項９５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０５】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項９５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０６】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１０５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０７】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３および配列番号：２３７の群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項９５又は９６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０８】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項９５又は９６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０９】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１０８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１０】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１１、配列番号：２１９および配列番号：２２１の群から選択されるポリペプチド配列と配列番号：２３１のポリペプチド配列とを含む、請求項９５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１１】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２０９、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択されるポリペプチド配列と、配列番号：２２９のポリペプチド配列とを含む、請求項９５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１２】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１３のポリペプチド配列と配列番号：２３３のポリペプチド配列とを含む、請求項９５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１３】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１７のポリペプチド配列と配列番号：２３７のポリペプチド配列とを含む、請求項９５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１４】
前記第一および第二の抗原結合部分がメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)に特異的である、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１５】
前記第一又は前記第二の抗原結合部分がメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)に特異的である、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１６】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の重鎖可変領域配列を含む、請求項１１４又は１１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１７】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１１４又は１１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１８】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の軽鎖可変領域配列を更に含む、請求項１１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１９】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：２５８又は配列番号：２６２の配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２０】
前記重鎖可変領域配列が、配列番号：２５８又は配列番号：２６２のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１１９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２１】
前記軽鎖可変領域配列が、配列番号：２６０又は配列番号：２７２の配列に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１１７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２２】
前記軽鎖可変領域配列が、配列番号：２６０又は配列番号：２７２のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１２１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２３】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５１又は配列番号：２５５のポリペプチド配列を含む、請求項１１４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２４】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５２又は配列番号：２５６に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１１４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２５】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５２又は配列番号：２５６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１２４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２６】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５３又は配列番号：２６５のポリペプチド配列を含む、請求項１１４又は１１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２７】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５４又は配列番号：２６６に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１１４又は１１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２８】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５４又は配列番号：２６６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１２７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２９】
前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５３又は配列番号：２６５のポリペプチド配列を更に含む、請求項１２３から１２５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３０】
前記第一および第二の抗原結合部分の可変領域が、癌細胞又はウイルスに感染している細胞の細胞表面抗原に、または、腫瘍に発現されるＥＣＭ分子に特異的である、請求項１から２８のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３１】
前記細胞表面抗原が腫瘍関連抗原又はウイルス抗原である、請求項１３０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３２】
前記イムノコンジュゲートがただ１つのエフェクタ部分を持ち、該エフェクタ部分がサイトカインである、請求項１から２０のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３３】
前記サイトカインが、インターロイキン２(ＩＬ-２)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、インターフェロン-α(ＩＮＦ-α)およびインターロイキン１２(ＩＬ-１２)からなる群から選択される、請求項１３２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３４】
前記サイトカインがＩＬ-２である、請求項１３３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３５】
前記サイトカインがＩＬ−12である、請求項１３３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３６】
前記サイトカインが、前記サイトカインのためのレセプターを持つ細胞による細胞障害反応を誘発する、請求項１３２から１３５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３７】
前記サイトカインが、前記サイトカインのためのレセプターを持つ細胞による増殖反応を誘発する、請求項１３２から１３５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３８】
前記イムノコンジュゲートが２つのエフェクタ部分を持ち、該エフェクタ部分がサイトカインである、請求項１及び１０から２６のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３９】
前記サイトカインの各々が、ＩＬ-２、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＮＦ-αおよびＩＬ-１２からなる群からそれぞれ選択される、請求項１３８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４０】
前記サイトカインの両方がＩＬ-２である、請求項１３９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４１】
前記サイトカインの両方がＩＬ−12である、請求項１３９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４２】
前記サイトカインが、前記サイトカインのためのレセプターを持つ細胞による細胞障害反応を誘発する、請求項１３８から１４１のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４３】
前記サイトカインが、前記サイトカインのためのレセプターを持つ細胞による増殖反応を誘発する、請求項１３８から１４１のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４４】
前記イムノコンジュゲートが、コントロールのエフェクタ部分の解離定数の少なくとも２倍である解離定数(ＫＤ)で、エフェクタ部分レセプターと結合する、請求項１から１４３のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４５】
前記イムノコンジュゲートが、投与期間の終わりに、インビボでの腫瘍体積の増加を少なくとも３０％阻害する、請求項１から１４４のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４６】
請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが前記第一および第二の抗原結合部分の重鎖と前記第一エフェクタ部分をコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４７】
請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが前記第一および第二の抗原結合部分の軽鎖と前記第一エフェクタ部分をコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４８】
請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが前記第一抗原結合部分の一軽鎖と、前記第二抗原結合部分の一重鎖と、前記第一エフェクタ部分とをコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４９】
請求項３から８のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが前記第一及び第二のＦａｂ分子の両方の重鎖と前記エフェクタ部分とをコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５０】
請求項３から８のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが前記第一及び第二のＦａｂ分子の両方の軽鎖と前記エフェクタ部分とをコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５１】
請求項３から８のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが前記第一Ｆａｂ分子の一軽鎖と、前記第二Ｆａｂ分子の一重鎖と、前記エフェクタ部分とをコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５２】
請求項９に記載のイムノコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５３】
請求項１０から２０のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、このときイムノコンジュゲートがただ１つのエフェクタ部分を持ち、そして該ポリヌクレオチドが、前記抗原結合部分及び前記エフェクタ部分のうちの１つをコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。 
【請求項１５４】
請求項１０から２１のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、このときイムノコンジュゲートが２つのエフェクタ部分を持ち、そして該ポリヌクレオチドが、前記抗原結合部分のうちの１つと前記エフェクタ部分のうちの１つをコードするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５５】
請求項２２から２６のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、このとき該ポリヌクレオチドが、前記第一抗原結合部分の重鎖可変領域と前記第一エフェクタ部分とをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５６】
請求項２２から２６のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、このとき該ポリヌクレオチドが、前記第一抗原結合部分の軽鎖可変領域と前記第一エフェクタ部分とをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
請求項１４６から１５６のいずれか一に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる発現カセット。
【請求項１５８】
請求項１５７に記載の発現カセットを含んでなる発現ベクター。
【請求項１５９】
請求項１５８に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１６０】
さらに原核生物の宿主細胞として定められる、請求項１５９に記載の宿主細胞。
【請求項１６１】
さらに真核生物の宿主細胞として定められる、請求項１５９に記載の宿主細胞。
【請求項１６２】
請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの製造方法であって、請求項１５９から１６１のいずれか一に記載の宿主細胞を、イムノコンジュゲートの発現に適切な条件下で培養することを含む方法。
【請求項１６３】
活性化されたＴリンパ球細胞の増殖および分化を促進する方法であって、活性化されたＴリンパ球細胞を、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１６４】
前記イムノコンジュゲートが細胞障害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)活性を誘導する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
活性化されたＢリンパ球細胞の増殖および分化を促進する方法であって、活性化されたＢリンパ球細胞を、請求項１から１３４、１３６から１４０及び１４２から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１６６】
ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の増殖および分化を促進する方法であって、ＮＫ細胞を、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１６７】
前記イムノコンジュゲートがＮＫ／リンパ球活性化キラー(ＬＡＫ)抗腫瘍細胞障害性を誘導する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記イムノコンジュゲートの少なくとも一のエフェクタ部分がＩＬ-２である、請求項１６３から１６７のいずれか一に記載の方法。
【請求項１６９】
顆粒球、単球又は樹状細胞の増殖および分化を促進する方法であって、顆粒球、単球又は樹状細胞を、請求項１から１３３、１３７から１３９及び１４３から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１７０】
前記イムノコンジュゲートの少なくとも一のエフェクタ部分がＧＭ−ＣＳＦである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
Ｔリンパ球の分化を促進する方法であって、Ｔリンパ球細胞を、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１７２】
前記イムノコンジュゲートの少なくとも一のエフェクタ部分がＩＬ−12である、請求項１６３、１６６又は１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
ウイルス複製を阻害する方法であって、ウイルス感染している細胞を、請求項１から１３３、１３８、１３９、１４４及び１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１７４】
主要組織適合性複合体Ｉ(ＭＨＣ Ｉ)の発現を上方制御する方法であって、細胞を、請求項１から１３３、１３８、１３９、１４４及び１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む方法。
【請求項１７５】
前記イムノコンジュゲートの少なくとも一のエフェクタ部分がＩＦＮ-αである、請求項１７３又は１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
細胞死を誘導する方法であって、細胞を、請求項１から１３２、１３６、１３８、１４２、１４４及び１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１７７】
前記イムノコンジュゲートがＥＤＢに特異的である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記イムノコンジュゲートがＴＮＣ−Ａ１に特異的である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７９】
前記イムノコンジュゲートがＴＮＣ−Ａ２に特異的である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８０】
前記イムノコンジュゲートがＭＣＳＰに特異的である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８１】
前記イムノコンジュゲートのエフェクタ部分が、ＩＬ-２、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)および腫瘍壊死因子-β(ＴＮＦ-β)からなる群から選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８２】
前記エフェクタ部分がＩＬ-２である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
標的細胞の走化性を誘導する方法であって、標的細胞に、請求項１から１３２、１３８、１４４及び１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１８４】
前記イムノコンジュゲートのエフェクタ部分が、インターロイキン８(ＩＬ-８)、マクロファージ炎症性タンパク質−1α(ＭＩＰ-1α)、マクロファージ炎症性タンパク質−1β(ＭＩＰ-1β)およびトランスフォーミング増殖因子-β(ＴＧＦ-β)からなる群から選択される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記細胞がインビボである、請求項１６３から１８４のいずれか一に記載の方法。
【請求項１８６】
個体の疾患を治療する方法であって、個体に、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートを含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項１８７】
前記疾患が癌である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記イムノコンジュゲートがＥＤＢに特異的である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記イムノコンジュゲートがＴＮＣ−Ａ１に特異的である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
【請求項１９０】
前記イムノコンジュゲートがＴＮＣ−Ａ２に特異的である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
【請求項１９１】
前記イムノコンジュゲートがＦＡＰに特異的である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
【請求項１９２】
前記イムノコンジュゲートがＭＣＳＰに特異的である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
【請求項１９３】
前記イムノコンジュゲートがＩＬ-２を含む、請求項１８６から１９２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９４】
前記組成物が、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹膜内に、病巣内に、頭蓋内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼内に、口腔内に、局所的に、局所性に、吸入によって、注射によって、注入によって、持続性点滴によって、標的細胞を直接浸す局所性灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームで、または、脂質組成物で投与される、請求項１８６から１９３のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９５】
請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートと薬学的担体とを含む組成物。
【請求項１９６】
必要とする患者の疾患を治療するための医薬の製造に使用するための、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート又は請求項１９５に記載の組成物。
【請求項１９７】
前記疾患が癌である、請求項１９６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９８】
必要とする患者の疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート又は請求項１９５に記載の組成物の使用。
【請求項１９９】
前記疾患が癌である、請求項１９８に記載の使用。
【請求項２００】
必要とする患者の疾患の治療のための、請求項１から１４５のいずれか一に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０１】
前記疾患が癌である、請求項２００に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０２】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、細胞活性に影響するエフェクタ部分を選択的に運搬するための抗原特異性イムノコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、このようなイムノコンジュゲートをコードする核酸分子及び、該核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、さらに、本発明のイムノコンジュゲートを製造するための方法、そして、疾患の治療におけるこれらイムノコンジュゲートを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞種の選択的な破壊は、様々な臨床状況で望ましいことが多い。例えば、健康な細胞および組織を完全かつ損傷を与えないで、腫瘍細胞を特異的に破壊することは、癌治療の主要な目的である。細胞での多くのシグナル伝達経路は、細胞の生存および／または死と関連している。したがって、細胞生存又は死に伴う経路因子を直接運搬することによって、細胞の維持又は破壊に寄与しうる。
サイトカインは、免疫系の調節に関与する細胞シグナル伝達分子である。癌療法で用いられる場合、サイトカインは、抗腫瘍効果を有し、ある種の腫瘍の免疫原性を増やしうる免疫調節性薬剤として作用することができる。しかしながら、免疫応答を活性化したり抗腫瘍効果を示すのに十分な濃度のサイトカインを腫瘍部位に到達させるためには、迅速な血中クリアランスや腫瘍特異性を欠いているため、高用量のサイトカインの全身投与が必要となる。高レベルの全身サイトカインは、激しい毒性と有害な反応を引き起こしうる。
【０００３】
インビボで特定の部位（例えば腫瘍又は腫瘍微小環境）にサイトカインなどのシグナル伝達経路因子を運搬する一つの方法は、その部位に特異的な免疫グロブリンに因子をコンジュゲートすることである。サイトカインなどのシグナル伝達経路因子をインビボの特定の部位に運搬するための早期戦略は、リンホトキシン、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)、インターロイキン２(ＩＬ-２)および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)を含む様々なサイトカインに免疫グロブリン重鎖をコンジュゲートさせたものを含んでいた。免疫グロブリン重鎖は、化学的にサイトカインにコンジュゲートさせたり、免疫グロブリン−サイトカインコンジュゲートを融合タンパク質として発現させたりしていた。Nakamura K. and Kubo, A. Cancer Supplement 80:2650-2655 (1997)；Jun, L. et al., Chin. Med. J. 113:151-153 (2000)；及び、Becker J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7826-7831 (1996)を参照。研究者等は、インビボで特定の部位にサイトカインを標的化させることができることだけでなく、モノクローナル抗体は他の多くのタンパク質よりも血中半減期が長いという点において利点があったことを観察した。ある非コンジュゲートサイトカイン、すなわちＩＬ-２の高用量には全身性の毒性があるので、低用量で全身性の副作用を最小限に抑えつつ、腫瘍部位で免疫賦活性を最大に発揮する免疫グロブリン−サイトカイン融合タンパク質の能力は、研究者に、免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートが適切な治療剤であることを確信させるものとなった。しかしながら、運搬薬剤としての免疫グロブリンの臨床的有用性を制限する主な理由の一つは、場合によって免疫グロブリン分子のサイズが大きいために、取り込みが不十分であり、腫瘍での破壊が不十分であることである。Xiang, J. et al., Immunol. Cell Biol. 72:275-285 (1994)を参照。加えて、免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートが補体を活性化し、Ｆｃレセプターと相互作用しうることが示唆された。治療的イムノコンジュゲートが好適な抗原保持細胞よりむしろＦｃレセプターを発現する細胞に標的化されうるので、この固有の免疫グロブリン特性は不利と見られていた。
【０００４】
これらの問題を克服するための一つの試みは、操作された免疫グロブリンフラグメントの使用である。多くの研究は、免疫グロブリンフラグメント−サイトカインイムノコンジュゲートの特徴を詳述している。Savage, P. et al., Br. J. Cancer 67:304-310 (1993)；Harvill, E.T. and Morrison S.L., Immunotechnol. 1:95-105 (1995)；及び、Yang J. et al., Mol. Immunol. 32:873-881 (1995)を参照。通常は、２の一般的な免疫グロブリンフラグメント-サイトカイン融合タンパク質コンストラクトがある。そして、Ｆ(ａｂ')２-サイトカインが大腸菌において発現される哺乳動物細胞およびｓｃＦｖ-サイトカインにおいて発現される。Xiang, J. Hum. Antibodies 9:23-36 (1999)を参照。免疫グロブリン親分子の腫瘍結合反応性およびサイトカインの機能的活性は、これら多くのタイプのイムノコンジュゲートに維持されている。近年の臨床前試験では、これら融合タンパク質は、インビボで腫瘍関連抗原を発現する腫瘍にサイトカインを標的化すること、及び免疫十分な動物モデルにおいて原発性及び転移性両方の腫瘍を阻害することが示された。
【０００５】
免疫グロブリンフラグメント−サイトカインイムノコンジュゲートの例には、ＰＣＴ公報ＷＯ２００１／０６２２９８Ａ２に記載されるｓｃＦｖ−ＩＬ-２イムノコンジュゲート；米国特許第５６５０１５０号に記載される免疫グロブリン重鎖フラグメント−ＧＭ−ＣＳＦイムノコンジュゲート；ＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１１９８９７Ａ２に記載されるイムノコンジュゲート（ここではｓｃＦｖ−ＩＬ−１２第一サブユニットはＩＬ-１２第二サブユニット-ｓｃＦｖとジスルフィド結合(一又は複数)のみを共有している）、ＰＣＴ公報ＷＯ９９／２９７３２Ａ２に記載されるイムノコンジュゲート（ここではＩｇ重鎖フラグメント−ＩＬ−１２第一サブユニットはＩｇ重鎖フラグメント-ＩＬ-１２第二サブユニットとジスルフィド結合(一又は複数)のみを共有している）が含まれる。これら第二世代のイムノコンジュゲートが第一世代の免疫グロブリン−サイトカインコンジュゲートと比較して、いくらか向上する性質を有するが、腫瘍細胞に対してより有効性が高い、また、これら生成物の副作用（例えば毒性、非腫瘍細胞の破壊など）の数及び重症度が少ない、より多くかつさらにより安全な特異的治療薬の発達が望まれている。加えて、許容できる治療的活性レベルを維持しつつ、さらにイムノコンジュゲートを安定させる方法を同定することが望ましい。
本発明は、知られているイムノコンジュゲートと比較して、向上した有効性、作用の高い特異性、毒性の低減、及び向上した安定性を表すイムノコンジュゲートを提供する。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の簡単な概要）
本発明の一態様は、知られているイムノコンジュゲートと比較して、向上した有効性、作用の高い特異性、毒性の低減、及び向上した安定性を表すイムノコンジュゲートに関する。本発明のイムノコンジュゲートは、インビボでエフェクタ部分を標的部位に選択的に運搬するために用いることができる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、サイトカインを標的部位に運搬するものであり、このとき、サイトカインは、局在する生体学的効果、例えば局所の炎症反応、Ｔ細胞増殖および活性化の刺激および／またはＢおよび／またはＮＫ細胞の活性化を発揮することができる。
【０００７】
本発明の一態様は、少なくとも一の第一エフェクタ部分と、Ｆｖ及びＦａｂからなる群から独立して選択される少なくとも一の第一および一の第二の抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートであって、このとき第一エフェクタ部分は、第一抗原結合部分とアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有しており、第二抗原結合部分は、ｉ)第一エフェクタ部分又はｉｉ)第一抗原結合部分の何れかとアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有している、イムノコンジュゲートに関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、そのアミノ末端アミノ酸で一又は複数のｓｃＦｖ分子に接合した少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートであって、このときこの第一単鎖エフェクタ部分がそのカルボキシル末端アミノ酸で一又は複数のｓｃＦｖ分子に接合している、イムノコンジュゲートである。
【０００９】
本発明の別の態様は、少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と第一および第二の抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートであって、このとき第一および第二各々の抗原結合部分は、そのカルボキシル末端アミノ酸で、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣκおよびＩｇＥ ＣＨ４からなる群からそれぞれ選択される免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域に接合したｓｃＦｖ分子を含み、このとき第一抗原結合部分はエフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ末端アミノ酸で接合しており、そしてこのとき、第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲートである。
【００１０】
本発明の別の態様は、少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と第一および第二の抗原結合部分とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、このとき第一および第二各々の抗原結合部分はＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにそのカルボキシ末端アミノ酸で接合したｓｃＦｖ分子を含んでなる、そしてこのとき第一抗原結合部分はエフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ末端アミノ酸で接合しており、そして、第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲートである。
【００１１】
本発明の別の態様は、第一および第二の単鎖エフェクタ部分と第一および第二の抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートであって、このとき各々の抗原結合部分は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにその重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端アミノ酸で接合したＦａｂ分子を含み、そしてこのとき各々のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、エフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ末端アミノ酸で接合しており、そして、第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲートに関する。
【００１２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：９５のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０４のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０５のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０６のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０７のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：９６のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９６のポリペプチド配列と、配列番号：９５および１０４−１０７からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９５、９６および１０４−１０７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有するポリペプチドを含む。
【００１３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０８と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１７と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１７のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１８と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１２０と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１２０のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００１４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１３又は配列番号：１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９又は配列番号：１１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１３又は配列番号：１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域と、配列番号：９又は配列番号：１１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域とを含む。
【００１５】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１４又は配列番号：１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１４又は配列番号：１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０又は配列番号：１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０又は配列番号：１２のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００１６】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００又は配列番号：２１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０１又は配列番号：２３５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：１０１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００１７】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００１８】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【００１９】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００２０】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、コンジュゲートは、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００２１】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００２２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【００２３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００２４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２１１、配列番号：２１３、配列番号：２１７、配列番号：２１９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３および配列番号：２３７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１１、配列番号：２１９および配列番号：２２１の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２２９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１３の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３３の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００２５】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００２６】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【００２７】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２６０又は配列番号：２７２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２６０又は配列番号：２７２のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００２８】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は配列番号：２６５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２５３又は配列番号：２６５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００２９】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００３０】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは少なくとも一のエフェクタ部分を含み、このエフェクタ部分はサイトカインである。特定の実施態様において、エフェクタ部分は、インターロイキン２(ＩＬ-２)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、インターフェロン-α(ＩＮＦ-α)、インターロイキン-１２(ＩＬ-１２)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、マクロファージ炎症性タンパク質−１α(ＭＩＰ-１α)、マクロファージ炎症性タンパク質−１β(ＭＩＰ-１β)およびトランスフォーミング増殖因子-β(ＴＧＦ-β)からなる群から選択されるサイトカインである。他の実施態様では、少なくとも一の抗原結合部分は、フィブロネクチンの外ドメインＢ(ＥＤＢ)、テネイシンのＡ１ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１)、テネイシンのＡ2ドメイン(ＴＮＣ-Ａ2)、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)；及び、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)といった抗原決定基の何れか一に特異的である。
【００３１】
他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、コントロールエフェクタ部分に対するよりも、少なくともおよそ１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０倍大きい解離定数(ＫＤ)で、エフェクタ部分レセプターと結合する。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、投与期間の終わりに、インビボでの腫瘍体積の増加を少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％阻害する。他の実施態様では、コントロールエフェクタ部分又は「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、イムノコンジュゲートは悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存を少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％延長する。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む発現ベクターに関する。
本発明の別の態様は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片を発現する宿主細胞に関する。 
本発明の別の態様は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片の製造方法に関し、この方法は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする発現ベクターにて形質転換した宿主細胞を、同発現に適切な条件下で培養することを含む。
【００３３】
本発明の別の態様は、活性化されたＴリンパ球細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、活性化されたＴリンパ球細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、活性化されたＢリンパ球細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、活性化されたＢリンパ球細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、ＮＫ細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、顆粒球、単球又は樹状細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、顆粒球、単球又は樹状細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)の分化を促進する方法に関し、Ｔリンパ球細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、ウイルス複製を阻害する方法に関し、ウイルス感染している細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の他の態様は、主要組織適合性複合体Ｉ(ＭＨＣ Ｉ)の発現を上方制御する方法に関し、標的細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、細胞死を誘導する方法に関し、標的細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む。
本発明の別の態様は、標的細胞の走化性を誘導する方法に関し、標的細胞に本発明のイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む。
本発明の別の態様は、個体の疾患を治療する方法に関し、個体に本発明のイムノコンジュゲートと薬学的担体とを含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】様々なイムノコンジュゲート融合形態の概略図。図１のすべてのコンストラクトは、（抗原結合部分において）２つの抗体ｓｃＦｖ断片と、（エフェクタ部分として）それに連結される１つ又は２つのサイトカイン分子とを含む。パネルＡからＥは、抗原結合部分およびエフェクタ部分の異なる結合性およびストイキオメトリを示す。パネルＡは「ダイアボディ」−ＩＬ-２融合を表す。この「ダイアボディ」は２つの同一ポリペプチド鎖から非共有結合的に集積する。パネルＢは、サイトカインにそのカルボキシ末端で融合するＦａｂ分子の重鎖を含み、そのサイトカインが次に第二Ｆａｂ重鎖にそのカルボキシ末端で融合しているイムノコンジュゲートを示す。軽鎖は重鎖Ｆａｂ−サイトカイン−重鎖Ｆａｂポリペプチドと同時に発現され、イムノコンジュゲートを形成する。あるいは、２つの軽鎖がサイトカインに融合してもよく、重鎖が同時に発現される。パネルＣにおいて、２つのＦａｂ重鎖は互いに直接融合する。サイトカインは、アミノ末端ペプチド結合を第二抗原結合部分重鎖と共有する。パネルＤおよびＥに示すように、パネルＢおよびＣの２つの分子形態が変化して、Ｆａｂ鎖がｓｃＦｖ断片に置換される。
【図２】２つの抗原結合部分と少なくとも一又は複数のエフェクタ部分を含む更なるイムノコンジュゲートの概略図。パネルＡは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインにそのカルボキシ末端で融合したＦａｂ分子を示す。共有結合性抗原結合部分ホモ二量体化を達成するために、人工的なジスルフィド結合を、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に導入してよい（パネルＡ内の右のイムノコンジュゲート）。パネルＡに示すＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンＥ ＣＨ４ドメインと置換されうる。パネルＡのＦａｂ部分は、パネルＢのｓｃＦｖ断片に置換される。パネルＣのイムノコンジュゲートでは、天然のＩｇＧヒンジは、Ｆａｂ分子に対してＣ末端融合した。ヒンジのカルボキシ末端領域がＩｇＧヒンジ領域に対してＣ末端融合する定常ドメインの集積に際していくつかの幾何学的な制約を課し得たので、人工的なリンカーはヒンジのカルボキシ終末領域とＩｇＧ ＣＨ３ドメインのアミノ末端との間に導入されてよい。パネルＤに示すように、ヒンジ領域は、また、ｓｃＦｖ断片と免疫グロブリン定常ドメインとの間に導入されてよい。パネルＡからＤでは、ＩｇＧ１ ＣＨ３又はＩｇＥ ＣＨ４ドメインを用いて、コンストラクトをホモ二量体化する。パネルＥは、ＣＨ１／Ｃκヘテロ二量体化相互作用により二量体化が達成されるイムノコンジュゲートを表す。パネルＤのイムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートにつき１又は２のサイトカインを有してよい。
【図３】腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた有効性実験の結果を示す。Ｆ９奇形癌腫を、１２９ＳｖＥｖマウスに皮下注入し、カリパスを用いて腫瘍サイズを測定した。２つの異なる濃度の「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、Ｆａｂ−インターロイキン-２−Ｆａｂ（Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ）イムノコンジュゲートと比較した。この濃度はおよその数のイムノコンジュゲート分子を表す。図３において、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは「Ｆａｂ−Ｌ１９」と表示し、コンジュゲートしていないインターロイキン２コントロールは「Ｕｎｃｏｎｊ  ｒＩＬ-２」と表示し、「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子は「ダイアボディ」と表示する。フィブロネクチンの外ドメインＢ（ＥＤＢ）に対するＬ１９抗体を用いて、ダイアボディおよびＦａｂ−Ｌ１９イムノコンジュゲートに抗原結合部分を生成した。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明に示す。
【図４】腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒト胃腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔを、ＳＣＩＤ−ベージュマウスの脾臓内に注入した。図４において、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは「Ｆａｂ−Ｌ１９」と表示し、コンジュゲートしていないインターロイキン２コントロールは「Ｕｎｃｏｎｊ  ｒＩＬ-２」と表示し、「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子は「ダイアボディ」と表示する。抗ＥＤＢ抗体であるＬ１９を用いて、ダイアボディおよびＦａｂ−Ｌ１９イムノコンジュゲートに抗原結合部分を生成した。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明に示し、この量は同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図５】１００×および４００×拡大率のヒト子宮組織の免疫組織化学画像を示す。実施例３に記述される方法によって生成される２Ｂ１０可変領域は、ヒトのテネイシンのＡ２ドメイン（ＴＮＣ−Ａ２）と結合する。Ｆａｂ断片の２Ｂ１０可変領域はＦＬＡＧ断片に融合させた（ＳＨＤ２Ｂ１０−ＦＬＡＧ）。健康及び癌性のヒト子宮組織試料を、免疫組織化学的染色のために調製した。その後、試料をＳＨＤ２Ｂ１０−ＦＬＡＧ  Ｆａｂ断片と共にインキュベートした。次いで、試料を洗浄し、ＦＬＡＧエピトープに特異的な蛍光抗体と共にインキュベートした。癌性組織試料は、健康な組織試料と比較して、ＴＮＣ−Ａ２のより高い発現レベルを表した。
【図６】免疫蛍光表面積の％として、様々なヒト組織試料におけるＴＮＣ−Ａ２の発現レベルを示す。健康な個体および癌患者からの様々なヒト組織試料を、図５にて説明したように、ＳＨＤ２Ｂ１０−ＦＬＡＧ  Ｆａｂ断片と共にインキュベートした。
【図７】免疫蛍光表面積の％として、様々なヒト組織試料における線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の発現レベルを示す。健康な個体および癌患者からの様々なヒト組織試料を、ＦＡＰ（Ａｂｃａｍ）に対する市販の抗体と共にインキュベートした。グラフ上の各々の棒の下部分はＦＡＰの腫瘍発現を表すのに対して、グラフ上の各々の棒の上部分は正常なＦＡＰ発現を表す。
【図８】公知のＩｇＧ抗体であるＬ１９のＥＤＢに対する親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。
【図９】ＥＤＢに特異的なＦａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。イムノコンジュゲートのＦａｂ断片はＬ１９抗体から得た。
【図１０】ＥＤＢに特異的な「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ダイアボディｓｃＦｖ断片はＬ１９抗体から得た。「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質は、ｓｃＦｖ断片とＩＬ-２分子との間に位置する８アミノ酸リンカーを含む。
【図１１】ＥＤＢに特異的な「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ダイアボディｓｃＦｖ断片はＬ１９抗体から得た。「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質は、ｓｃＦｖ断片とＩＬ-２分子との間に１２アミノ酸リンカーを含む。
【図１２】固定したテネイシンのドメインＡ１（ＴＮＣ−Ａ１）に対する公知のＩｇＧ抗体であるＦ１６の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。また図１２は、ＴＮＣ−Ａ１に対するＦ１６抗体のＦａｂ断片の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。Ｆ１６  ＩｇＧおよびＦａｂ分子について算出した解離定数（ＫＤ）を図に示す。
【図１３】固定したＩＬ-２レセプターに対するＩＬ-２の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ＩＬ-２Ｒのβおよびγ鎖のヘテロ二量体化は、Merchant, A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677-681 (1998)に記載されるように、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の「ノブ−イントゥ−ホール」変異体にそれぞれの鎖を融合させることによって達成した。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１４】ＴＮＣ−Ａ１およびＩＬ-２レセプターに対する「ダイアボディ」−ＩＬ-２融合タンパク質の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ダイアボディのｓｃＦｖ分子はＦ１６抗体から得られる。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１５】ＴＮＣ−Ａ１およびＩＬ-２レセプターに対するＦａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。イムノコンジュゲートのＦａｂ分子はＦ１６抗体から得た。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１６】ＴＮＣ−Ａ１およびＩＬ-２レセプターに対するｓｃＦｖ−ＩＬ-２−ｓｃＦｖイムノコンジュゲートの親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。イムノコンジュゲートのｓｃＦｖ分子はＦ１６抗体から得た。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１７】図１２−１６に示されるＢＩＡＣＯＲＥ研究から得られるＫＤ値の概要表である。
【図１８】フィブロネクチンのＥＤＢドメインを標的とする「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、テネイシンＣのＡ２ドメインを標的とするＦａｂ−インターロイキン-２−Ｆａｂイムノコンジュゲート（配列番号：３及び７それぞれの重鎖および軽鎖の可変領域を含む「Ｆａｂ−ＳＨ２Ｂ１０」と表示する）と比較する有効性実験の結果を示す。図１８では、コンジュゲートしていないインターロイキン-２コントロールを「Ｕｎｃｏｎｊ  ｒＩＬ-２」と表示し、「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を「Ｌ１９ダイアボディ」と表示する。抗ＥＤＢ抗体であるＬ１９を用いて、ダイアボディイムノコンジュゲートの抗原結合部分を生成した。奇形癌腫細胞株Ｆ９を、１２９系統の免疫適格マウスの皮下に注入した。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）を図の説明文に示す。６日目に治療を始め、実験１１日目までに合計５回の注入を行った。
【図１９】抗ＦＡＰ又は抗テネイシンＣ、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲート（３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｂ３（抗ＦＡＰ）、２Ｆ１１および２Ｂ１０コンストラクト（抗テネイシンＣ）のＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成した）によるＮＫ−９２細胞の増殖の誘導を、コンジュゲートしていないヒトＩＬ-２と比較して示す。２日間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏシステムを使用して細胞増殖を測定した。
【図２０】様々なインターロイキン−１２含有イムノコンジュゲートによるＩＦＮ−γ産生の誘導を、コンジュゲートしていないサイトカイン、又はＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０ドメインを別々の分子に含有するイムノコンジュゲートと比較して測定しているＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。パネルＡは、フィブロネクチンコートプレート上での結果を示す。パネルＢは、溶液での結果を示す。
【図２１】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ヒト（ｈｕ）  ＦＡＰ（Ａ）およびネズミ科（ｍｕ）  ＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローン１９Ｇ１、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）及びｍｕＦＡＰ（Ｄ）に結合するクローン２０Ｇ８、そしてｈｕＦＡＰ（Ｅ）およびｍｕＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローン４Ｂ９について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２２】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）およびｍｕＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローン５Ｂ８、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）及びｍｕＦＡＰ（Ｄ）に結合するクローン５Ｆ１、そしてｈｕＦＡＰ（Ｅ）およびｍｕＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローン１４Ｂ３について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２３】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）およびｍｕＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローン１６Ｆ１、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）及びｍｕＦＡＰ（Ｄ）に結合するクローン１６Ｆ８、そしてｈｕＦＡＰ（Ｅ）およびｍｕＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローンＯ３Ｃ９について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２４】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）およびｍｕＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローンＯ２Ｄ７、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）、ｍｕＦＡＰ（Ｄ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｅ）に結合するクローン２８Ｈ１、そしてｈｕＦＡＰ（Ｆ）、ｍｕＦＡＰ（Ｇ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｈ）に結合するクローン２２Ａ３について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２５】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）、ｍｕＦＡＰ（Ｂ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｃ）に結合するクローン２９Ｂ１１、及びｈｕＦＡＰ（Ｄ）、ｍｕＦＡＰ（Ｅ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローン２３Ｃ１０について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２６】ヒト（ｈｕ）  ＴＮＣ  Ａ２に結合する、親和性成熟抗ＴＮＣ  Ａ２  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、クローン２Ｂ１０＿Ｃ３Ｂ６（Ａ）、クローン２Ｂ１０＿６Ａ１２（Ｂ）、クローン２Ｂ１０＿Ｃ３Ａ６（Ｃ）、クローン２Ｂ１０＿Ｏ７Ｄ８（Ｄ）、クローン２Ｂ１０＿Ｏ１Ｆ７（Ｅ）、及びクローン２Ｂ１０＿６Ｈ１０（Ｆ）について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２７】３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの精製のために行われる３つの精製工程の概要を示す。
【図２８】３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ（ＡおよびＢ）の精製の結果、４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ（ＣおよびＤ）の精製の結果を示す。（Ａ、Ｃ）  精製手順中のの分画及び最終産物を含む４−１２％ビス−トリスおよび３−８％トリス  アセテートＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ、Ｄ）  ３つの精製工程後の分析用サイズ排除クロマトグラフィ。
【図２９】２Ｂ１０  Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製の結果を示す。（Ａ）  精製手順中の分画および最終産物を含む４−１２％ビス-トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）  ３つの精製工程後の分析用サイズ排除クロマトグラフィ。
【図３０】抗フィブロネクチンＥＤＢ Ｌ１９ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの安定性評価を示す。Ｌ１９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは、２０ｍＭ ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に６．３ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、室温及び４℃で４週間貯蔵した。試料は、(ペレット前沈殿物質に遠心分離した後)ＵＶ分光測定により濃度(Ａ)を、分析的サイズ排除クロマトグラフィにより凝集(Ｂ)を毎週分析した。
【図３１】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦＡＰおよびヒトＩＬ-２レセプター-β／γ（ＩＬ２Ｒ  ｂｇ）に対する、ＦＡＰ標的化３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３２】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦＡＰに対する、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３３】ヒト及びネズミ科のＩＬ-２レセプター-β／γ及びα鎖に対する、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、二状態反応モデル(two-state-reaction model)へのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３４】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦＡＰおよびヒトＩＬ-２レセプター-β／γ（ＩＬ２Ｒ ｂｇ）に対する、ＦＡＰ標的化３Ｄ９ Ｆａｂ−ＩＬ2−Ｆａｂコンストラクトの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３５】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のキメラＴＮＣ Ａ２融合タンパク質およびヒトＩＬ-２レセプター-β／γ（ＩＬ２Ｒ ｂｇ）に対する、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３６】ＮＫ９２細胞の増殖を誘導する際の、ＴＮＣ Ａ２を認識する（２Ｂ１０）又はＦＡＰを認識する（３Ｆ２および４Ｇ８）標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの有効性を、ＩＬ-２（プロリュウキン）およびフィブロネクチン-ＥＤＢを認識するＬ１９ダイアボディと比較して示す。ダイアボディは２つのＩＬ-２エフェクタ部分を有するのに対して、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトはただ１つのＩＬ-２エフェクタ部分を有するので、ｘ軸はＩＬ-２分子の数に規準化した。２日間インキュベートした後、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏシステムを使用して測定した。
【図３７】溶液中での、ヒトＰＢＭＣからの（Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋ヘルパーＴ細胞、（Ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞および（Ｄ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を含む異なるエフェクタ細胞群上のＦＡＰを認識するＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートとインキュベートした後の、ＩＬ-２媒介性ＩＬ-２レセプターシグナル伝達の結果としての、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図３８】イムノコンジュゲートが溶液中に存在する場合又はマイクロタイタープレート上にコートしたＦＡＰ又はＴＮＣ Ａ２により固定されている場合の、ＮＫ９２細胞のＩＦＮ−γ放出および増殖を誘導する際の、ＴＮＣ Ａ１（２Ｆ１１）、ＴＮＣ  Ａ２（２Ｂ１０）又はＦＡＰ（３Ｆ２、４Ｂ３および３Ｄ９）を認識する標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの有効性を、ＩＬ-２と比較して示す。
【図３９】腫瘍間質に特異的な２つの異なるＩＬ-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒト大腸腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔを、ＳＣＩＤマウスの脾臓内に注入した。ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを「ＳＨ２Ｂ１０」と表示し、コンジュゲートしていないＩＬ-２コントロールを「プロリュウキン」と表示し、フィブロネクチンＥＤＢ標的化ダイアボディ−ＩＬ-２分子を「ダイアボディ」と表示する。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明文に示し、同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図４０】腫瘍間質に特異的な２つの異なるＩＬ-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮをＳＣＩＤマウスの腎臓内に注入した。ＦＡＰ標的化３Ｆ２又は４Ｇ８  Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを「ＦＡＰ３Ｆ２」および「ＦＡＰ４Ｇ８」と表示し、コンジュゲートしていないＩＬ-２コントロールを「プロリュウキン」と表示し、フィブロネクチンＥＤＢ標的化ダイアボディ−ＩＬ-２を「ダイアボディ」と表示する。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明文に示し、同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図４１】腫瘍間質に特異的な２つの異なるＩＬ-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９をＳＣＩＤマウスの静脈内に注入した。ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを「２Ｂ１０」と表示し、フィブロネクチンＥＤＢ標的化ダイアボディ−ＩＬ-２分子を「ダイアボディ」と表示する。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明文に示し、同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図４２】ＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン-Ｂ結合体）を有するＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概略（Ａ）と、精製したＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【図４３】ＴＦ−１細胞上のＧＭ−ＣＳＦおよびＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン−Ｂ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較した、ＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖アッセイの結果を示す。
【図４４】Ｆａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有するＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概略（Ａ）と、精製したＦａｂ−ＩＬ１２−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【図４５】健康なドナーの新鮮ヒト血液から単離したＰＢＭＣを用いて、ＩＬ−１２およびＦａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、ＩＬ−１２誘導ＩＦＮ-γ放出を試験するアッセイの結果を示す。
【図４６】ＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン-Ｂ結合体）を有するＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概略（Ａ）と、精製したＦａｂ−ＩＦＮα２−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【図４７】ＩＦＮ−α（ＲｏｆｅｒｏｎＡ, Roche）およびＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン-Ｂ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、（Ａ）ジャーカットＴ細胞及び（Ｂ）Ａ５４９腫瘍細胞のＩＦＮα誘導性増殖阻害を試験するアッセイの結果を示す。
【図４８】ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ精製の溶出プロフィル（Ａ）と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen、ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元）による同じＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの分析的特徴付けの結果（Ｂ）を示す。
【図４９】ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ精製の溶出プロフィル（Ａ）と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen、ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元）による同じＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの分析的特徴付けの結果（Ｂ）を示す。
【図５０】ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞を用いた、Ｆａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと、ＦａｂとしてＭＨＬＧ  ＫＶ９（ＭＣＳＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、ＩＬ-２誘導性ＩＦＮ−γ放出を試験するアッセイの結果を示す。
【図５１】ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞を用いた、Ｆａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと、ＦａｂとしてＭＨＬＧ１  ＫＶ９（ＭＣＳＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、ＩＬ-２誘導性ＩＦＮ−γ放出を試験するアッセイの結果を示す。
【図５２】フローサイトメトリによって定まる、Ｃｏｌｏ３８細胞へのＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１  ＫＶ９  Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合を示す。二次抗体のみ又は細胞のみをネガティブコントロールとした。
【図５３】Ｆａｂとして２Ｂ１０（ＴＮＣ Ａ２結合体）を有する２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概要（Ａ）と、精製した２Ｂ１０  Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
定義
特に定めのない限り、本明細書中で使用するすべての技術的及び科学的な用語は、概して、当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で用いられる命名法や、後述する細胞培養、分子遺伝学、核酸化学およびハイブリダイゼーションの実験手順は、よく知られているものであり、当分野で共通して用いられるものである。標準的な技術および手順は、概して、本文全体にわたって示される当分野及び様々な一般的参考書の従来の方法に従って実施される(一般に、出典明記によってここに援用されるSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照)。
【００３６】
ここで使用しているように、用語「イムノコンジュゲート」は、少なくとも一つのエフェクタ部分および少なくとも一つの抗原結合部分を含むポリペプチド分子に関する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも一つの単鎖エフェクタ部分および少なくとも２の抗原結合部分を含む。本願明細書において記述されるように、抗原結合分子は相互作用の、そして、様々な配位の多様によってエフェクタ部分に取り付けられてもよい。
【００３７】
ここで使用しているように、用語「エフェクタ部分」はポリペプチド、例えばタンパク質又は糖タンパク質に関する。そして、それはシグナル伝達又は他の細胞経路で細胞性活性に、例えば、影響する。したがって、本発明のエフェクタ部分は、エフェクタ部分のための一つ以上のレセプターを支えている細胞の応答を調整するために細胞膜の外側でからシグナルを伝えるレセプターの媒介となられたシグナル伝達と関係していてもよい。一実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のための一つ以上のレセプターを支えている細胞の細胞障害反応を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のための一つ以上のレセプターを支えている細胞の増殖反応を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のためのレセプターを支えている細胞の分化を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のためのレセプターを支えている細胞の内在性細胞性タンパク質の発現(すなわち上方制御又はダウンレギュレート)を変えてもよい。エフェクタ部分の非制限実施例は、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質を有し、補助因子を含む。エフェクタ部分は、イムノコンジュゲートを形成するために、様々な配位の抗原結合部分と関係していてもよい。
【００３８】
ここで使用しているように、用語「サイトカイン」は、生物学的であるか細胞性機能又は方法を(例えば免疫、炎症および造血)媒介となっておよび／または制御する分子に関する。用語「サイトカイン」本願明細書において使用する‖「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」を含む、そして、「インターロイキン。」、有用なサイトカインの実施例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−1α、ＩＬ−1β、ＩＬ−２、ＩＬ−3、ＩＬ−4、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＩＬ−7、ＩＬ−8、ＩＬ−10、ＩＬ−12、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＭＩＰ−1α、ＭＩＰ−1β、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βを含むが、これに限定されるものではない。
【００３９】
ここで使用しているように、用語「単鎖」は、ペプチド結合によって線形に結合されるアミノ酸性モノマをを含んでなっている分子に関する。一実施態様では、エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。単鎖エフェクタ部分の非制限実施例は、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質を有し、補助因子を含む。エフェクタ部分がサイトカインである及び興味があるサイトカインが自然の多量体として通常提供されるときに、各々、多量体のサイトカインのサブユニットはエフェクタ部分の単鎖によって順次コードされる。したがって、有用な単鎖エフェクタ部分の非制限実施例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−1α、ＩＬ−1β、ＩＬ−２、ＩＬ−3、ＩＬ−4、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＩＬ−7、ＩＬ−8、ＩＬ−10、ＩＬ−12、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＭＩＰ−1α、ＭＩＰ−1β、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βを含む。
【００４０】
ここで使用しているように、用語「コントロールエフェクタ部分」は、複合していないエフェクタ部分に関する。例えば、本発明のＩＬ−２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクタ部分と比較するときに、コントロールエフェクタ部分はフリーな、複合していないＩＬ−２である。同様に、例えば、本発明のＩＬ-１２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクタ部分と比較するときに、コントロールエフェクタ部分はフリーな、複合していないＩＬ−12(例えば、ｐ40およびｐ35サブユニットがジスルフィド結合(ｓ)だけを共有するヘテロダイマタンパク質として存在する)である。
【００４１】
ここで使用しているように、用語「エフェクタ部分レセプター」は、エフェクタ部分に結合特異的にが可能なポリペプチド分子に関する。例えば、ＩＬ−２がエフェクタ部分である所で、ＩＬ−２(例えばイムノコンジュゲートを含んでなっているＩＬ−２)と結合するエフェクタ部分レセプターはＩＬ−２レセプターである。同様に、例えば、ＩＬ-１２がイムノコンジュゲートのエフェクタ部分である所で、エフェクタ部分レセプターはＩＬ−12レセプターである。エフェクタ部分特異的にが複数のレセプターと結合する所で、特にエフェクタ部分と結合するすべてのレセプターはそのエフェクタ部分のための「エフェクタ部分レセプター」である。
【００４２】
ここで使用しているように、用語「抗原結合部分」は、特異的にが抗原決定基に結合するポリペプチド分子に関する。一実施態様では、特定のタイプの腫瘍細胞に対する実施例又は抗原決定基を支えている腫瘍間質のために、抗原結合部分は、それが標的部位に付着される(例えばエフェクタ部分又は第二抗原結合部分)独立体を導くことが可能である。さらに本願明細書において定められるように、抗原結合部分はそれの抗体および断片を含む。そばに、「特異的には、結合する」結合が抗原のために選択的で、不必要な又は非特異的相互作用と区別されてもよいために、意味される。一実施態様では、さらに本願明細書において定められ、従来技術において知られているように、イムノコンジュゲートは定常領域を有する少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。有用な重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α, δ, ε, γ又はμを含む。有用な軽鎖定常領域は、２のアイソタイプ：κおよびλを含む。
【００４３】
ここで使用しているように、用語「抗原決定基」は「抗原」および「エピトープ」と同義で、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位(例えばアミノ酸の隣接する範囲又は非連続アミノ酸の異なる領域から成り立つ立体配置的配位)に関する。そして、抗原結合部分-抗原複合体を形成する。
【００４４】
ここで使用しているように、それが他の抗原結合部分およびエフェクタ部分の中で自由に存在するように、用語「コントロール抗原結合部分」は抗原結合部分に関する。例えば、本発明のＦａｂ−ＩＬ2−Ｆａｂイムノコンジュゲートをコントロール抗原結合部分と比較するときに、コントロール抗原結合部分は遊離したＦａｂである。そこにおいて、Ｆａｂ−ＩＬ2−Ｆａｂイムノコンジュゲートおよび遊離したＦａｂ分子両方は特に同じ抗原決定基と結合してもよい。
【００４５】
当分野において使用され、および／または受容される１つの用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書で使用される用語の定義は、明白に反対のことが言及されない限り、全てのこのような意味を含むことが意図される。特定の例は、重鎖と軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域中に見いだされる不連続抗原組み合わせ部位を説明するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によって記載されており、これらは参照により本明細書に援用され、ここでこの定義は、互いに対して比較した場合に、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも関わらず、抗体またはその改変体のＣＤＲをいうためのいずれの定義の適用も、本明細書で定義され、および使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記に引用した参考文献の各々によって定義されたＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基は、比較として表１において以下に記載される。特定のＣＤＲを含む正確な残基の番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。
【００４６】
【表１】
2013502209.tif 000002
【００４７】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列についての番号付けを定義した。当業者は、配列それ自体を超えたいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメインに「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを明白に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって示される番号付けシステムをいう。他に特定されない限り、ＡＢＭ中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムに従う。配列表の配列(配列番号ですなわちある：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９６、９７、など)は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。
【００４８】
イムノコンジュゲート
イムノコンジュゲートは、少なくとも一つのエフェクタ部分および少なくとも一つの抗原結合部分を含むポリペプチド分子である。一実施態様では、エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも２の抗原結合部分を含む。イムノコンジュゲートの抗原結合部分およびエフェクタ部分は、本願明細書において詳述するものを含む。イムノコンジュゲートの部分が様々な標的分子(例えば腫瘍細胞又は腫瘍間質に発現されるタンパク質分子上の抗原決定基)を結合する。抗原結合部分の非制限実施例は、本願明細書において記述される。一実施態様では、下で本願明細書において、少なくとも一つの抗原結合部分は、表５において代表されるポリペプチドの一つ以上の抗原決定基の方向を目指す。本発明のイムノコンジュゲートは、一般的に以下の性質の一つ以上を表す。同じエフェクタ部分を持つ異なる配位の知られていたイムノコンジュゲートと比較すると、作用の高い特異性は、毒性を稀釈しておよび／または安定性を向上させた。
【００４９】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、第一エフェクタ部分および少なくとも第一および第二の抗原結合部分を少なくともを含んでなる。好ましい実施態様では、第一エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。好ましい実施態様では、第一であるものおよび第二抗原結合部分は、ＦｖおよびＦａｂからなる群から、独立して選択される。特定の実施態様において、第一エフェクタ部分は、アミノ−を共有する又は、第一抗原結合部分および第二抗原結合部分を有する。
【００５０】
一実施態様では、第一エフェクタ部分は、カルボキシ終末ペプチド結合を第一抗原結合部分と共有して、さらにアミノ末端ペプチド結合を第二抗原結合部分と共有する。他の実施態様では、第一抗原結合部分は、カルボキシ終末ペプチド結合を第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分と共有して、さらにアミノ末端ペプチド結合を第二抗原結合部分と共有する。他の実施態様では、第一抗原結合部分は、アミノ末端ペプチド結合を第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分と共有して、さらにカルボキシ終末ペプチドを第二抗原結合部分と共有する。
【００５１】
一実施態様では、エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分は、カルボキシ終末ペプチド結合を第一重鎖可変領域と共有して、さらにアミノ末端ペプチド結合を第二重鎖可変領域と共有する。他の実施態様では、エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分は、カルボキシ終末ペプチド結合を第一軽鎖可変領域と共有して、さらにアミノ末端ペプチドを第二軽鎖可変領域と共有する。他の実施態様では、第一重又は軽鎖可変部は、第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分にカルボキシ終末ペプチド結合でつながれて、第二重又は軽鎖可変部に、アミノ末端ペプチド結合でさらにつながれる。他の実施態様では、領域がそうである第一重又は軽鎖変数は、好ましくは第一エフェクタ部分に単鎖エフェクタ部分をアミノ末端ペプチド結合でつないで、第二重又は軽鎖可変部に、カルボキシ終末ペプチド結合でさらにつながれる。
【００５２】
一実施態様では、エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分は、カルボキシ終末ペプチド結合を重第一Ｆａｂ又は軽鎖と共有して、さらにアミノ末端ペプチド結合を重第二Ｆａｂ又は軽鎖と共有する。他の実施態様では、重第一Ｆａｂ又は軽鎖は、カルボキシ終末ペプチド結合を第一単鎖エフェクタ部分と共有して、さらにアミノ末端ペプチド結合を重第二Ｆａｂ又は軽鎖と共有する。他の実施の形態では、重第一Ｆａｂ又は軽鎖は、アミノ末端ペプチド結合を第一単鎖エフェクタ部分と共有して、さらにカルボキシ終末ペプチド結合を重第二Ｆａｂ又は軽鎖と共有する。
【００５３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは一つ以上のｓｃＦｖ分子にアミノ末端ペプチド結合を共有している第一エフェクタ部分を少なくともを含んでなる、そして、第一エフェクタ部分はさらにカルボキシ終末ペプチド結合を一つ以上のｓｃＦｖ分子と共有する。好ましい実施態様では、エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。
【００５４】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは第一エフェクタ部分を少なくともを含んでなる、そこにおいて、各々抗原結合部分の好ましくは単一の鎖エフェクタ部分、そして、第１および第２の抗原結合部分は免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域にそのカルボキシ終末アミノ酸で接合されるｓｃＦｖ分子を含む、そして、第一抗原結合部分は第一エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ終末アミノ酸で接続される、そして、第１および第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合で連結される共有結合でである。好ましい実施態様では、定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ1、ＩｇＧ  ＣＨ2、ＩｇＧ  ＣＨ3、ＩｇＧ  Ｃカッパ、ＩｇＧ  Ｃラムダおよび免疫グロブリンＥ  ＣＨ４ドメインからなる群から、独立して選択される。一実施態様では、第一抗原結合部分の免疫グロブリンドメーンは、ジスルフィド結合による第二抗原結合部分の免疫グロブリンドメーンに連結される共有結合でである。一実施態様では、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１および第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメーンの中でカルボキシ終末で位置される。他の実施態様では、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１および第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメーンの位置されたアミノ末端基である。他の実施態様では、少なくとも２のジスルフィド結合は、第１および第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメーンの位置されたアミノ末端基である。
【００５５】
特定の実施態様において、ＩｇＧ  ＣＨ1ドメインを含んでなる定常領域にそのカルボキシ終末アミノ酸で接合されるｓｃＦｖ分子を各々を含んでなって、イムノコンジュゲートは第１および第２の抗原結合部分を含む。そこにおいて、第一抗原結合部分は第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ終末アミノ酸で接続される、そして、第１および第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合で連結される共有結合でである。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に、そのカルボキシ終末アミノ酸でさらに接続されてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。
【００５６】
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートはＩｇＧ  Ｃカッパドメインを含んでなる定常領域にそのカルボキシ終末アミノ酸で接合されるｓｃＦｖ分子を各々を含む第１および第２の抗原結合部分を含む。そこにおいて、第一抗原結合部分は第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ終末アミノ酸で接続される、そして、第１および第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合で連結される共有結合でである。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に、そのカルボキシ終末アミノ酸でさらに接続されてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。
【００５７】
他の特定の実施態様において、免疫グロブリンＥ  ＣＨ４ドメインを含んでなる定常領域にそのカルボキシ終末アミノ酸で接合されるｓｃＦｖ分子を各々を含んでなって、イムノコンジュゲートは第１および第２の抗原結合部分を含む。そこにおいて、第一抗原結合部分は第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ終末アミノ酸で接続される、そして、第１および第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合で連結される共有結合でである。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に、そのカルボキシ終末アミノ酸でさらに接続されてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。
【００５８】
他の特定の実施態様において、免疫グロブリンＥ  ＣＨ3ドメインにそのカルボキシ終末アミノ酸で接合されるｓｃＦｖ分子をを含んでなって、イムノコンジュゲートは各々第１および第２の抗原結合部分を含む。そこにおいて、第一抗原結合部分は第一エフェクタ部分、好ましくは単一の鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ終末アミノ酸で接続される、そして、第１および第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合で連結される共有結合でである。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に、そのカルボキシ終末アミノ酸でさらに接続されてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。
【００５９】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは第１および第２のエフェクタ部分および第１および第２の抗原結合部分を含む。そこにおいて、各々、部分が含んでなる抗原結合の中で、ＩｇＧ1 ＣＨ3ドメイン、そして各々のＩｇＧ1 ＣＨ3ドメインにその重又は軽鎖カルボキシ終末アミノ酸で接合されるＦａｂ分子はエフェクタ部分のうちの１のアミノ末端アミノ酸にそのそれぞれのカルボキシ終末アミノ酸で接合される、そして、第１および第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合で連結される共有結合でである。好ましい実施態様では、第一および／または第二エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。さらなる態様において、抗原結合部分のＩｇＧ1 ＣＨ3ドメインは、ジスルフィド結合でつながれてもよい。他の実施態様では、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１および第２の抗原結合部分のＩｇＧ1 ＣＨ3ドメインの中でカルボキシ終末で位置される。他の実施態様では、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１および第２の抗原結合部分のＩｇＧ1 ＣＨ3ドメインの位置されたアミノ末端基である。他の実施態様では、少なくとも２のジスルフィド結合は、第１および第２の抗原結合部分のＩｇＧ1 ＣＨ3ドメインの位置されたアミノ末端基である。  
【００６０】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、エフェクタ部分および抗原結合部分の間に位置される一つ以上のタンパク分解性切断部位を含む。
イムノコンジュゲート(例えば抗原結合部分および／またはエフェクタ部分)の構成成分は、直接、または、本願明細書において記述されるかまたは従来技術において周知である様々なリンカー(一つ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーで例えばある一般的に２-１０のアミノ酸について)で連結されてもよい。
【００６１】
特定の実施態様では、特に知られていたイムノコンジュゲート調製と比較して、イムノコンジュゲートは、溶液の安定性を向上させた。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、解離定数(ＫＤ)、つまりコントロール抗原結合部分のためのそれより低い少なくともおよそ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５回を有する抗原決定基と結合する。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、コントロール抗原結合部分のためのそれより低いおよそ１０回であるＫＤを有する抗原決定基と結合する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＫＤ、つまりおよそ１０  ｎＭ未満、およそ１  ｎＭ未満又はおよそ０．１  ｎＭ未満を有する抗原決定基と結合する。
【００６２】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、知られていたイムノコンジュゲート調製と比較して優れた安全性質を有する。イムノコンジュゲートは、好ましくはより少してより激しくない副作用、例えば毒性、非腫瘍細胞の破壊、などを誘発する副作用の減少は、エフェクタ部分レセプターの方へ本発明のイムノコンジュゲートの稀釈された結合能のものであると考えられてもよい。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、コントロールエフェクタ部分のためのそれより大きい少なくともおよそ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５回であるＫＤを有するエフェクタ部分レセプターと結合する。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、コントロールエフェクタ部分のためのそれより大きいおよそ２回であるＫＤを有するエフェクタ部分レセプターと結合する。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、コントロールエフェクタ部分のためのそれより大きいおよそ１０回であるＫＤを有するエフェクタ部分レセプターと結合する。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子の対応するエフェクタ部分のためのそれより大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回であるＫＤを有するエフェクタ部分レセプターと結合する。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲートの対応するエフェクタ部分のためのそれより大きいおよそ１０回である解離定数ＫＤを有するエフェクタ部分レセプターと結合する。
【００６３】
他の実施態様では、特に知られていたイムノコンジュゲート調製と比較して、イムノコンジュゲートは、優れた有効性を有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、よりよく生体内で腫瘍体積の増加を阻害することが可能でおよび／または、悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長することがより優れて可能である。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくともおよそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％生体内に腫瘍体積の増加を阻害する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、１３日の投与期間末までには、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％生体内に腫瘍体積の増加を阻害する。コントロールエフェクタ部分と関連して、他の実施態様では、それの必要性の哺乳動物に投与されるときに、イムノコンジュゲートは少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。コントロールエフェクタ部分と関連して、他の実施態様では、それの必要性の哺乳動物に投与されるときに、イムノコンジュゲートは少なくとも３０％、３２％又は３５％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。コントロールエフェクタ部分と関連して、他の実施態様では、それの必要性の哺乳動物に投与されるときに、イムノコンジュゲートはおよそ３０％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と関連して、他の実施態様では、それの必要性の哺乳動物に投与されるときに、イムノコンジュゲートは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と関連して、他の実施態様では、それの必要性の哺乳動物に投与されるときに、イムノコンジュゲートは少なくとも３０％、３２％又は３５％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と関連して、他の実施態様では、それの必要性の哺乳動物に投与されるときに、イムノコンジュゲートはおよそ３０％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。他の実施態様では、コントロールエフェクタ部分又は「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と関連して、イムノコンジュゲートは、少なくとも５％、１０％又は１５％悪性腫瘍をもつ哺乳動物の生存を延長する。
【００６４】
抗原結合部分
特定のタイプの腫瘍細胞に対する実施例又は抗原決定基を支える腫瘍間質のために、本発明のイムノコンジュゲートの抗原結合部分は、一般に、特定の抗原決定基と結合するポリペプチド分子であって、それが標的部位に付着される(例えばエフェクタ部分又は第二抗原結合部分)独立体を導くことが可能である。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の、ウイルス感染している細胞の表面上の、他の病気にかかった細胞の表面上の、自由に血清の、および／または細胞外基質(ＥＣＭ)の表面に提供される抗原決定基と結合してもよい。
【００６５】
腫瘍抗原の非制限実施例は、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−1／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ100、ペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰＩＶ)、タンパク質(ＡＤＡｂｐ)、サイクロフィリンｂ、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ関連する抗原(ＣＲＣ)-Ｃ017-1Ａ／ＧＡ733、およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−1を結合するアデノシンおよび、ＰＳＡ-２、そして、ＰＳＡ-３、ＣＡＰ−2、およびその免疫原性エピトープＰＳＡ−1を含む膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ3-ゼータ鎖腫瘍抗原の中でＭＡＧＥ-ファミリ(例えば、ＭＡＧＥ-Ａ１、ＭＡＧＥ-Ａ2、ＭＡＧＥ-Ａ3、ＭＡＧＥ-Ａ4、ＭＡＧＥ-Ａ5、ＭＡＧＥ-Ａ6、ＭＡＧＥ-Ａ7、ＭＡＧＥ-Ａ8、ＭＡＧＥ-Ａ9、ＭＡＧＥ-Ａ10、ＭＡＧＥ-Ａ11、ＭＡＧＥ-Ａ12、ＭＡＧＥ-Ｘｐ2(ＭＡＧＥ-Ｂ2)、ＭＡＧＥ-Ｘｐ3(ＭＡＧＥ-Ｂ3)、ＭＡＧＥ-Ｘｐ4(ＭＡＧＥ-Ｂ４)、ＭＡＧＥ-Ｃ１、ＭＡＧＥ-Ｃ2、ＭＡＧＥ-Ｃ3、ＭＡＧＥ-Ｃ4、ＭＡＧＥ-Ｃ5)、ＧＡＧＥ-腫瘍抗原(例えば、ＧＡＧＥ-１、ＧＡＧＥ-２、ＧＡＧＥ-３、ＧＡＧＥ-４、ＧＡＧＥ-５、ＧＡＧＥ-６、ＧＡＧＥ-７、ＧＡＧＥ-８、ＧＡＧＥ-９)、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ-１、ＮＡＧ、ＧｎＴ-Ｖ、ＭＵＭ-１、ＣＤＫ4、チロシナーゼ、ｐ53、ＭＵＣファミリ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ｐ21ｒａｓ、ＲＣＡＳ1、アルファ−フェトプロテイン、Ｅカドヘリン、α-カテニン、β-カテニンおよびγ-カテニンのファミリ、ｐ120ｃｔｎ、ｇｐ100、Ｐｍｅｌ117、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ｃｄｃ27、腺腫様ポリープ症大腸菌のタンパク質(ＡＰＣ)、ホドリン、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ３７、免疫グロブリン-イディオタイプ、ｐ15、ｇｐ75、ＧＭ2およびＧＤ2ガングリオシド、ヒト乳頭腫ウィルスタンパク質のようなウイルス生成物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリ、ｌｍｐ−1、Ｐ1Ａ、核抗原(ＥＢＮＡ)をＥＢＶ１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-２(ＨＯＭ-ＭＥＬ-４０)、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-４、ＳＳＸ-５、ＳＣＰ−1およびＣＴ−7およびｃ−ｅｒｂＢ−2が含まれる。 
【００６６】
ウイルス抗原の非制限実施例は、インフルエンザウイルス血球凝集素、エプスタインバーウイルスＬＭＰ-１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ2糖タンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ160を有し、ＨＩＶ  ｇｐ120を含む。
ＥＣＭ抗原の非制限実施例は、ｓｙｎｄｅｃａｎ、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、関連、カドヘリン、ラミニン、ラミニンタイプ上皮細胞成長因子、レクチン、フィブロネクチン、切欠き、テネイシンを有し、ｍａｔｒｉｘｉｎを含む。
【００６７】
本発明のイムノコンジュゲートは、細胞表面抗原の以下の特定の非制限実施例と結合してもよい：ＦＡＰ、Ｈｅｒ2、ＥＧＦＲ、ＣＤ2(Ｔ細胞表面抗原)、ＣＤ3(ＴＣＲと関係しているヘテロマルチマ)、ＣＤ22(Ｂ細胞レセプター)、ＣＤ23(低親和性免疫グロブリンＥレセプター)、ＣＤ25(ＩＬ-２レセプターα鎖)、ＣＤ30(サイトカイン受容体)、ＣＤ33(骨髄細胞表面抗原)、ＣＤ40(腫瘍壊死因子レセプター)、ＩＬ−6Ｒ(ＩＬ6レセプター)、ＣＤ20、ＭＣＳＰおよびＰＤＧＦβＲ(β血小板由来増殖因子レセプター)。 
【００６８】
一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは２以上の抗原結合部分を含む。そこにおいて、各々のこれらの抗原結合部分は特に同じ抗原決定基と結合する。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは２以上の抗原結合部分を含む。そこにおいて、各々のこれらの抗原結合部分は特に異なる抗原決定基と結合する。   
【００６９】
抗原結合部分は、抗原決定基に特定の結合を保持する何かタイプもの抗体又は断片単独であってもよい。抗体断片はＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、２が分解するＦ(ａｂ')ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片を含むが、これに限定されるものではない(Hudson and Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)を参照)。
【００７０】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、フィブロネクチン(ＥＤＢ)のＥｘｔｒａ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｂのために特定である少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＥＤＢのエピトープにモノクローナル抗体Ｌ19と結合を争ってもよい少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。ＷＯ  ２００７／１２８５６３Ａ１(本願明細書に引用したものとする完全に)参照。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ19モノクローナル抗体から得られる第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をＬ19モノクローナル抗体から得られる第二Ｆａｂ重鎖と共有するＩＬ−２分子と共有するポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ19モノクローナル抗体から得られる第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をＬ19モノクローナル抗体から得られる第二Ｆａｂ重鎖と共有するＩＬ−12分子と共有するポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ19モノクローナル抗体から得られる第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をＬ19モノクローナル抗体から得られる第二Ｆａｂ重鎖と共有するＩＦＮα分子と共有するポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ19モノクローナル抗体から得られる第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をＬ19モノクローナル抗体から得られる第二Ｆａｂ重鎖と共有するＧＭ−ＣＳＦ分子と共有するポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ19モノクローナル抗体から得られる第一ｓｃＦｖがカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をＬ19モノクローナル抗体から得られる第二ｓｃＦｖと共有するＩＬ−２分子と共有するポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９６のポリペプチド配列と、配列番号：９５および１０４−１０７からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９５、９６および１０４−１０７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有するポリペプチドを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０８と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１７と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１７のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１８と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１２０と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１２０のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって連結される共有結合でである。
【００７１】
一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、テネイシン(ＴＮＣ-Ａ１)のＡ１ドメインのために特定である少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ−Ａ１のエピトープにモノクローナル抗体Ｆ16と結合を争ってもよい少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。ＷＯ  ２００７／１２８５６３Ａ１(本願明細書に引用したものとする完全に)参照。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも１、一般的にＡ１のために特定である２以上の抗原結合部分および／またはテネイシン(ＴＮＣ-Ａ１又はＴＮＣ-Ａ4又はＴＮＣ−Ａ１／Ａ4)のＡ4ドメインを含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートはテネイシンのＡ１ドメインのために特定の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−12分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有するポリペプチド配列を含む。そして、それは次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインのために特定の第二Ｆａｂ重鎖と共有する。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインのために特定の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインのために特定の第二Ｆａｂ重鎖と共有するＩＬ−２分子と共有するポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインのために特定の第一ｓｃＦｖがカルボキシ終末ペプチド結合を次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインのために特定の第二ｓｃＦｖと共有するＩＬ−２分子と共有するポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１３又は配列番号：１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９又は配列番号：１１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１３又は配列番号：１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域と、配列番号：９又は配列番号：１１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１４又は配列番号：１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１４又は配列番号：１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０又は配列番号：１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％���９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０又は配列番号：１２のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００又は配列番号：２１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０１又は配列番号：２３５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：１０１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシン(ＴＮＣ-Ａ2)のＡ2ドメインのために特定である少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートはテネイシンのＡ2ドメインのために特定の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−12分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有するポリペプチド配列を含む。そして、それは次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ2ドメインのために特定の第二Ｆａｂ重鎖と共有する。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートはテネイシンのＡ2ドメインのために特定の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子と共有するポリペプチド配列を含む。そして、それは次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ2ドメインのために特定の第二Ｆａｂ重鎖と共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の��から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、コンジュゲートは、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)のために特定である少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートはＦＡＰのために特定の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−12分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有するポリペプチド配列を含む。そして、それは次にカルボキシ終末ペプチド結合をＦＡＰのために特定の第二Ｆａｂ重鎖と共有する。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートはＦＡＰのために特定の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子と共有するポリペプチド配列を含む。そして、それは次にカルボキシ終末ペプチド結合をＦＡＰのために特定の第二Ｆａｂ重鎖と共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２１１、配列番号：２１３、配列番号：２１７、配列番号：２１９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３および配列番号：２３７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１１、配列番号：２１９および配列番号：２２１の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２２９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１３の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３３の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２６０又は配列番号：２７２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２６０又は配列番号：２７２のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は配列番号：２６５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２５３又は配列番号：２６５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７５】
一実施態様では、抗原結合部分は、抗原決定基を結合することが可能な可変部を少なくともを含んでなる。本本発明で有用な非制限可変部は、ネズミ、霊長類又はヒトの起源の中であってもよい。ヒトの可変部は、ハイブリードーマ法によって作られるヒトのモノクローナル抗体から得られてもよい。ヒトのモノクローナル抗体の産生のためのヒトの骨髄腫および細胞株は、例えば、Kozbor et al., J Immunol. 133:3001-3005 (1984)およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)によって記述された。内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の能力の範囲を生産することで、免疫処置に応じて、ヒトの可変部は、また、可能であるトランスジェニック動物(例えばマウス)によって生産されてもよい。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスの抗体重鎖Ｊ領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合の欠失が内在性抗体産生の完全な阻害において生じることは、記述された。このような生殖細胞系変異体マウスのヒトの生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転送は、抗原性抗原投与の際にヒト抗体を産生する。Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)参照。
【００７６】
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【００７７】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいては、問い合わせ配列および対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは以下である。マトリックス＝単一、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティー＝１、結合ペナルティー＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。
【００７８】
内部の欠失のためではなく、５’欠失または３’欠失のために対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対して行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを計算する場合に、対象配列の５’および３’短縮を計算に入れないからである。５’末端または３’末端で短縮されている対象配列については、問い合わせ配列と比較して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の全体の塩基のパーセントとして一致／アラインしない、対象配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／アラインされるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージが、同一性パーセントから減算され、特定のパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／アラインしない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示されるような、対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために計算される。
【００７９】
例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基の問い合わせ配列とアラインされる。欠失は対象配列の５’末端で起こり、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端における最初の１０塩基の一致／アラインメントを示さない。この１０個の対合しない塩基は配列の１０％を表し（一致しない５’末端および３’末端の数／問い合わせ配列における塩基の総数）、従って、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０塩基が完全に一致するならば、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が１００塩基の問い合わせ配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／アラインしない、対象の５’末端または３’末端上の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手動で補正されない。再度、問い合わせ配列と一致／アラインしない対象配列の塩基の５’および３’のみが、手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためには行われない。
【００８０】
本発明の問い合わせアミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象のポリペプチドのアミノ酸配列が、対象のポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたりに５個までのアミノ酸の変化を含んでもよいこと以外は、問い合わせ配列と同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中の５％までのアミノ酸残基が挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で、または参照配列中の残基間に個々に、もしくは参照配列中の１つ以上の連続する基においてのいずれかで散在して、これらの末端間の任意の位置に存在してもよい。
【００８１】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、参照ポリペプチドに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいては、問い合わせ配列および対象配列は両方ともヌクレオチド配列であるか、または両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは以下である。マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティー＝１、結合ペナルティー＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。
【００８２】
内部の欠失のためではなく、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失のために対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対して行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体同一性パーセントを計算する場合に、対象配列のＮ末端およびＣ末端短縮を計算に入れないからである。Ｎ末端またはＣ末端で短縮されている対象配列については、問い合わせ配列と比較して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の全体の塩基のパーセントとして、対応する対象の残基と一致／アラインしない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。残基が一致／アラインされるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージが、同一性パーセントから減算され、特定のパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／アラインしない、対象配列のＮ末端およびＣ末端への残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のためのものと見なされる。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側の位置の問い合わせ残基のみである。
【００８３】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列とアラインされる。欠失は対象配列のＮ末端で起こり、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。この１０個の対合しない残基は配列の１０％を表し（一致しないＮ末端およびＣ末端の数／問い合わせ配列における残基の総数）、従って、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０残基が完全に一致するならば、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が１００残基の問い合わせ配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／アラインしない、対象配列のＮ末端またはＣ末端上の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手動で補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢによって示されるような、問い合わせ配列と一致／アラインしない、対象配列の残基のＮ末端およびＣ末端のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためには行われない。
【００８４】
【表２−０１】
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【表２−０２】
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【００８５】
【表３−０１】
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【表３−０２】
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【表３−０３】
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【表３−０４】
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【表３−０５】
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【００８６】
【表４−０１】
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【表４−０２】
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【表４−０３】
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【表４−０４】
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【表４−０５】
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【表４−０６】
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【表４−０７】
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【表４−０８】
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【表４−０９】
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【００８７】
【表５】
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【００８８】
【表６−０１】
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【表６−０２】
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【表６−０３】
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【表６−０４】
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【表６−０５】
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【表６−０７】
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【表６−０８】
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【表６−０９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【００８９】
【表７−０１】
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【表７−０２】
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【表７−０３】
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【００９０】
【表８−０１】
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【表８−０２】
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【表８−０３】
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【表８−０４】
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【表８−０５】
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【表８−０６】
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【表８−０７】
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【表８−０８】
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【表８−０９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【表８−１９】
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【表８−２０】
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【表８−２１】
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【表８−２２】
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【表８−２３】
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【表８−２４】
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【表８−２５】
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【表８−２６】
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【００９１】
宿主細胞 
本明細書で使用する、「宿主細胞」なる用語は、本発明のイムノコンジュゲートないしはその断片を生成するために操作され得る任意の種の細胞系を指す。一実施態様では、宿主細胞は、イムノコンジュゲートフラグメントを産生させるように操作される。宿主細胞は、数例を挙げれば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞ないしハイブリドーマ細胞、酵母菌、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞などの培養細胞、例えば哺乳類の培養細胞などがあるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物又は動物組織も含まれる。一実施態様では、本発明の宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートないしはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本発明の宿主細胞は真核生物でも原核生物でもよい。
【００９２】
イムノコンジュゲートポリペプチド及びそのフラグメントの精製
本発明のイムノコンジュゲートないしそのフラグメントは、当分野で公知の技術、例えば高性能液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどによって精製されてよい。特定のタンパク質を精製するために使用する実際の条件は、総電荷、疎水性、親水性などのような因子にある程度依存しており、当分野の技術者にとって明らかである。
親和性クロマトグラフィ精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリクスが使われてよい。あるいは、親和性クロマトグラフィ精製のために、イムノコンジュゲートの単鎖エフェクタ部分を特異的に結合する任意の抗体が用いられてもよい。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラットなどに限らず様々な宿主動物が、本発明のイムノコンジュゲートないしその断片による注射によって免疫化されてよい。イムノコンジュゲートは、側鎖官能基に付着した側鎖官能基又はリンカーによって、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)などの適切な担体に付着されてよい。様々なアジュバントは、宿主種に応じて免疫応答を増やすために用いてよく、フロイント(完全及び不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、 キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ(カルメット-ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。したがって、一実施態様は、本発明のイムノコンジュゲートの製造方法であって、本発明のイムノコンジュゲートないしそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、同発現に適切な条件下で培養することを含む方法を含む。
【００９３】
イムノコンジュゲートの使用方法 
本発明のイムノコンジュゲートは、特定の抗原決定基を標的化し、標的及び感作した細胞での様々な細胞性応答を誘発するために有用である。本発明のイムノコンジュゲートは診断試薬としても有用である。抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合は、エフェクタ部分に特異的な二次抗体を用いて容易に検出されうる。一実施態様では、二次抗体およびイムノコンジュゲートにより、細胞又は組織表面に位置する抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合の検出が容易になる。
いくつかの実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートの有効量が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートの治療上有効量が疾患の治療のために個体に投与される。本明細書中で用いる「有効量」なる用語は、投与される細胞又は組織での生理学的変化を生じさせるために必要である本発明のイムノコンジュゲートの量として定める。本明細書中で用いる「治療上有効量」なる用語は、疾患の副作用を除去、低減、遅延、最小化又は予防する本発明のイムノコンジュゲートの量として定める。
【００９４】
本発明のイムノコンジュゲートは、そのまま又は医薬組成物の形で被検体に投与されてよい。一実施態様では、疾患は増殖性疾患、例えば癌である。癌などの増殖性疾患の非限定的な例には、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、及び腎臓癌が含まれる。本発明のイムノコンジュゲートを使用して治療されうる他の細胞増殖性疾患には、腹部、骨、胸部、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸領域および泌尿生殖系に位置する新生物が含まれるがこれらに限定されるものではない。また、前癌状態ないし病変および癌の転移も含まれる。同様に、他の細胞増殖性疾患もまた、本発明のイムノコンジュゲートによって治療されてよい。このような細胞増殖性疾患の例には、上記の器官系に位置する腫瘍形成のほかに、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および他の任意の細胞増殖性疾患が含まれるがこれらに限定されない。他の実施態様では、疾患は、自己免疫状態、移植拒絶反応、外傷後免疫応答および感染症（例えばＨＩＶ）に関連がある。より具体的には、イムノコンジュゲートは、リンパ腫、自己免疫状態、移植拒絶反応、移植片対宿主病、乏血および脳卒中を含む免疫細胞媒介性疾患に関与する細胞を除去する際に使われてよい。当業者は、多くの場合、イムノコンジュゲートは治癒ではなく、部分的な利益を示すものであることを理解する。いくつかの実施態様において、いくつかの利点を有する生理学的変化も治療上の利益であると考慮される。ゆえに、いくつかの実施態様では、生理学的変化を提供するイムノコンジュゲートの量は、「有効量」又は「治療上有効量」とみなされる。治療を必要とする被検体、患者又は個体は一般的に哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【００９５】
投与の組成物、製剤、用量および手段
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体に溶解又は分散した一又は複数のイムノコンジュゲートの有効量を含む。「薬学的又は薬理学的に許容可能」なる表現は、必要に応じて例えばヒトなどの動物に投与したときに、有害な、アレルギー的な又は他の予期しない反応を生じない分子及び組成物を指す。出典明記によってここに援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990によって例示されるように、少なくとも一のイムノコンジュゲートおよび場合によって更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示内容を考慮して当業者に知られるであろう。さらに、動物(例えばヒト)の投与のためには、調製物が、ＦＤＡの生物学的基準又は他国の関係当局の要請に応じて、無菌性、発熱原性、一般的な安全性および純度基準を満たさなければならないと理解されるであろう。
本明細書中で使用する「薬学的に許容可能な担体」には、当分野の技術者に知られるように(例えば、出典明記によってここに援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照)、任意及びすべての、溶媒、バッファ、分散培地、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、色素、このような材料およびこれらの組合せが含まれる。従来のいずれかの担体が活性成分に適合しない場合を除き、治療的又は薬学的な組成物の使用が考慮される。
【００９６】
イムノコンジュゲートは、固形、液体又はエアゾール形態で投与されるか否か、注入としての投与経路のために無菌である必要があるか否かに応じて、異なる種類の担体を含んでよい。本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹膜内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼内に、口腔内に、局所的に、局所性に、吸入（例えば噴霧吸入）によって、注射によって、注入によって、持続性点滴によって、標的細胞を直接浸す局所性灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームで、または、脂質組成物（例えばリポソーム）で、あるいは、当分野の技術者に知られる他の方法又は任意の組合せによって(例えば、出典明記によってここに援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照)投与されうる。非経口投与、特に静脈内注射は、本発明のイムノコンジュゲートなどのポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使われる。
被検体に投与される本発明の組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、治療さる疾患の種類、以前の又は同時の治療的介入、患者の特発性及び投与の手段などの物理的及び生理学的要因によって測定されてよい。投与に対して責任がある実務者は、いずれにしても、組成物中の活性成分(一又は複数)の濃度、及び個々の被検体に適した用量(一又は複数)を決定する。
【００９７】
ある実施態様では、薬学的組成物は、例えば、少なくともおよそ０．１％の本発明のイムノコンジュゲートを含んでよい。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ユニットの重量のおよそ２％〜７５％、又はおよそ２５％〜およそ６０％、例えばそこから導き出せる任意の範囲を含んでよい。他の非限定的な例では、また、用量は、およそ１マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ５マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ１０マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ５０マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ１００マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ２００マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ５００マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ１ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ５ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ１０ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ５０ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ１００ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ２００ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、およそ１０００ｍｇ／ｋｇ／体重、又はそれ以上、及びそこから導き出せる任意の範囲を含んでよい。ここで列挙した数から導き出せる範囲の非限定的な例では、およそ５ｍｇ／ｋｇ／体重からおよそ１００ｍｇ／ｋｇ／体重、およそ５マイクログラム／ｋｇ／体重からおよそ５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数に基づいて投与されうる。
【００９８】
いずれにせよ、組成物は、一又は複数の構成成分の酸化を遅延させるために、様々な抗酸化剤を含んでよい。さらに、微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤のような防腐剤によってもたらされ得、限定するものではないが、パラベン(例えばメチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はその組合せが含まれる。
イムノコンジュゲートは、遊離塩基、中和又は塩の形態の組成物に調製されてよい。薬学的に許容可能な塩類には、酸添加塩類、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基にて形成されるもの、又は、例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸にて形成されるものが含まれる。また、遊離カルボキシ基にて形成された塩類は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基、または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得られうる。
組成物が液体状態である実施態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えばトリグリセライド、植物油、リポソーム)およびこれらの組合せを含むがこれらに限定しない、溶媒又は分散培地であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、例えば液体ポリオール又は脂質などの担体中での分散による必要粒子径の維持によって、例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって、又はこれらの方法の組合せによって、適切な流動性が維持されうる。多くの場合、生理的に許容可能なｐＨ値を維持するために、例えば糖質、塩化ナトリウム又はこれらの組合せなどの等張剤、および／または緩衝剤を含めることが好ましい。
【００９９】
他の実施態様では、本発明において点眼、鼻溶液又は噴霧、エアゾール又は吸入器を使用してもよい。このような組成物は、標的組織の種類と適合するように一般に設計される。非限定的な例において、鼻溶液は通常、点滴又は噴霧で鼻通路に投与されるように設計された水溶液である。多くの点で鼻分泌物と類似するように鼻溶液が調製されているので、正常な線毛作用が維持される。ゆえに、いくつかの実施態様では、水溶性の鼻溶液は、通常、等張又はわずかに緩衝し、およそ５．５からおよそ６．５のｐＨを維持する。さらに、必要であれば、眼科用薬剤、薬剤又は適切な薬剤安定剤に使用されるものと類似する抗菌性防腐剤が、製剤に含まれてよい。例えば、様々な市販の鼻調製物が知られており、抗生物質又は抗ヒスタミン剤などの薬剤を含む。 
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、経口摂取などの経路により投与されるように調製される。これらの実施態様では、固形組成物は、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン類、錠剤、ピル、カプセル(例えば硬質又は軟質な殻で覆われたゼラチンカプセル)、徐放性製剤、頬側組成物、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハ又はその組合せを含んでよい。口腔用組成物は、食物摂取により直接取り込まれてよい。経口投与のための好適な担体は、不活性希釈剤、吸収可能な食用の担体又はこれらの組合せを含む。本発明の他の態様において、口腔組成物はシロップ又はエリキシル剤として調製されてよい。シロップ又はエリキシル剤は、例えば、少なくとも一の活性剤、甘味料、防腐剤、香料、色素、防腐剤又はこれらの組合せを含んでよい。
【０１００】
ある実施態様では、口腔組成物は、一又は複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香料およびこれらの組合せを含んでよい。ある実施態様では、組成物は、結合剤、例えばトラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン又はこれらの組合せ；賦形剤、例えば二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム又はこれらの組合せ；崩壊剤、例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギン酸又はこれらの組合せ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味料、例えばスクロース、ラクトース、サッカリン又はこれらの組合せ；香料、例えばセイヨウハッカ、ウィンターグリーン油、サクランボ香料、オレンジ香料など；又は前記のこれらの組合せの、一又は複数を含んでよい。投薬単位の形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体などの担体を含んでよい。様々な他の材料は、コーティングとして、あるいは投薬単位の物理的な形態を変更するために用いてよい。例えば、錠剤、ピル剤又はカプセル剤はシェラック、糖もしくはその両方でコーティングされてよい。
他の投与様式に適切である他の製剤には坐薬が含まれる。坐薬は、直腸、膣又は尿道への挿入のために、通常投薬用の、様々な重量および形状の固形投薬形態である。挿入の後、坐薬は、軟化、融解又は腔体液に溶解する。一般に、坐薬のための従来の担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセライド又はこれらの組合せが含まれる。ある実施態様では、坐薬は、例えばおよそ０．５％〜およそ１０％、好ましくはおよそ１％〜およそ２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成されてよい。
【０１０１】
無菌の注射用溶液は、必要であれば先に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に必要な量の本発明のイムノコンジュゲートを含めて、その後フィルター滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本的な分散培地及び／又は他の成分を含む滅菌ベヒクル中に様々な滅菌した活性成分を含ませることによって調製される。無菌の注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための無菌粉末の場合、調製の好適な方法は、予めフィルター滅菌した液体培地から活性成分と任意の他の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要に応じて最適に緩衝し、液体希釈液をまず十分な食塩又はグルコースにて注射の前に等張にする。ＤＭＳＯを溶媒として使用して、極めて迅速に浸透させ、小さい領域に高濃度の活性剤を運搬させる場合、直接注射のための高濃度組成物の調製も考慮される。
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用を防がなくてはならない。周知のことだが、エンドトキシン汚染は最小限安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質に保たれなければならない。
特定の実施態様において、注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はこれらの組合せを組成物に使用することによって達成されうる。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
まずサイトカインの抗体媒介性運搬がHarvill E.T., and Morrison S.L. Immunotech. 1(2): 95-105 (1995)により行う場合、コンストラクトは腫瘍抗原ターゲッティングのための２つの抗原結合部分と、リンパ球活性化を誘導するための２つのサイトカイン部分を有するものとした（ＩＬ-２分子はＩｇＧ３の各重鎖Ｃ末端に融合する）。サイトカインの親和性は一般的にそのレセプターに対して高い。２つのサイトカインユニットを保持する分子は、結合活性（または多結合価）効果のために、サイトカインレセプターに対してさらに高い親和性を有しうる。ゆえに、このような分子は、腫瘍へのターゲティングが起こる前でさえも、血流のリンパ球を容易に活性化することができる。この効果は患者には望ましくない。対照的に、ただ１つのサイトカイン部分と２以上のターゲッティングドメインを保持するイムノコンジュゲート分子は、循環中のリンパ球を活性化する可能性が低く、腫瘍に全イムノコンジュゲート分子を方向付けすることができ、この腫瘍でリンパ球活性化が低速度で起こりうる。ゆえに、図１および２に示す分子をインターロイキン２（ＩＬ-２）を用いてモデルサイトカインとして構築した。図に示すように、生成したすべての分子は、腫瘍抗原に対して二価であって、ＩＬ-２サイトカインに対して二価又は一価である。抗原に対する親和性を、例としてＬ１９抗体を用いて２つの異なるイムノコンジュゲート形態について比較した。対照として、この抗体を、ヒトＩｇＧ１形態、ダイアボディ形態（図１Ａ）およびＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合（図１Ｂ）にクローニングした。ＶＨとＶＬとの間のリンカーペプチドを８又は１２のアミノ酸長となるように、ダイアボディ内で１つの可変性を試験した。フィブロネクチンの精製した抗原外ドメインＢ（ＥＤＢ）をＢＩＡＣＯＲＥチップ上に固定し、抗体融合コンストラクトを親和性測定のために可溶性分析物として用いた。図８から１１にこの実験の結果を示す。ＩｇＧは、二価の結合事象の理想的な例であった。ここで、２６０ｐＭの親和定数を観察した。Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合コンストラクトは３１０ｐＭの親和性となった。これはＩｇＧと本質的に同一である。ダイアボディの２つの変異体（図１０および１１に示す）はそれぞれ２７０ｐＭおよび３６０ｐＭの親和性を測定した。ゆえに、これらコンストラクトのすべては抗原に対して類似の親和性を有する。抗原およびＩＬ-２レセプターに対する親和性は、Ｆ１６抗体配列に基づいた類似のコンストラクトを用いて行った(Brack, S.S. et al., Clin. Canc. Res. 12(10): 3200-3208 (2006))。図１２は、ＴＮＣ−Ａ１ドメインがＢＩＡＣＯＲＥチップに固定されている場合の、Ｆ１６ ＩｇＧおよびその対応する一価性Ｆａｂ断片のＢＩＡＣＯＲＥセンサグラムを示す。これら特定の実験条件下で、ＩｇＧ分子は２．６ｎＭの親和定数を示し、Ｆａｂ分子は５０ｎＭの親和定数を示した。ここで、二価性に起因する親和性の増加は２０倍である。ダイアボディ、Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂおよびｓｃＦｖ−ＩＬ２−ｓｃＦｖイムノコンジュゲートは、それぞれ５ｎＭ、４．８ｎＭおよび１２ｎＭの抗原に対する親和性を示した。ゆえに、これらコンストラクトのすべては、Ｆａｂ断片の一価のものよりもＩｇＧ分子の二価の特性に非常に���似する、対抗原親和性を有する。
【０１０３】
ＩＬ-２レセプターに対する親和性に注目した場合、違いはより顕著であった。ＩＬ-２レセプター結合能を調べるために、ヘテロダイマーＩＬ-２レセプターの発現を可能にするツールを作製した。ＩＬ-２レセプターのβ鎖は、「ノブ−イントゥ−ホール」技術を用いてヘテロ二量体化（Ｆｃ（ノブ））するように操作したＦｃ分子に融合した(Merchant, A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677-681 (1998))。次いで、ＩＬ-２レセプターのγ鎖をＦｃ（ホール）変異体に融合し、Ｆｃ（ノブ）と二量体化させた。その後このヘテロ二量体Ｆｃ−融合タンパク質を、ＩＬ-２／ＩＬ-２レセプター相互作用を分析するための基質として用いた。図１３は、固定したＩＬ-２レセプターを用いた、分析物として市販のＩＬ-２（プロリュウキン）のＢＩＡＣＯＲＥセンサグラムを示す。およそ０．５ｎＭの測定された親和性は既に公になっている値の通りである。ＩＬ-２レセプターに対する様々なコンストラクトの親和性を図１７にまとめる。観察された重要な結果は、サイトカインに関して二価であるダイアボディ（Ｆ１６ ｄｉａ ＩＬ２）と、ただ１つのＩＬ-２部分を保持するＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ分子との間に違いがあった。ダイアボディは二価であり、ＩＬ-２は一価であるが、ダイアボディのＩＬ-２レセプター結合親和性（０．８ｎＭ）は、コンジュゲートしていないＩＬ-２（プロリュウキン）の親和性（０．５ｎＭ）と同等であった。Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合はダイアボディと比較しておよそ１０分の１のＩＬ-２レセプター結合親和性を有しており、それは図１９に示すようにＮＫ９２細胞の増殖を誘導する能力が低減していたことに現れていた。
【０１０４】
実施例２
一般的なＦａｂライブラリの構築
Ｆａｂ形態の一般的な抗体ライブラリを、以下のＶ−ドメイン組合せを用いてヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて構築した。ＤＰ４７−３ライブラリのためにＶＨ３＿２３重鎖とＶｋ３＿２０κ軽鎖、ＤＰ８８−３ライブラリのためにＶＨ１＿６９重鎖とＶｋ１＿１７κ軽鎖。表２を参照。両ライブラリは、軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３および重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３においてランダム化し、スプライシング バイ オーバーラッピング エクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲによって１ライブラリにつき３つのフラグメントから集めた。フラグメント１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、フラグメント２は、Ｌ３からＨ３に拡がる中央の定常フラグメントであるのに対し、フラグメント３はランダム化したＨ３と抗体遺伝子の３’部位を含む。
以下のプライマーの組合せを用いて、ＤＰ４７−３ライブラリのためのライブラリフラグメントを生成した。フラグメント１（ＬＭＢ３−ＬｉｂＬ１ｂ＿ｎｅｗ）、フラグメント２（ＭＳ６３−ＭＳ６４）、フラグメント３（Ｌｉｂ２Ｈ−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。表９を参照。以下のプライマーの組合せを用いて、ＤＰ８８−３ライブラリのためのライブラリフラグメントを生成した。フラグメント１（ＬＭＢ３−ＲＪＨ＿ＬＩＢ３）、フラグメント２（ＲＪＨ３１−ＲＪＨ３２）及びフラグメント３（ＬＩＢ８８＿２−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。表１０を参照。
【０１０５】
【表９】
2013502209.tif 000063
【表１０】
2013502209.tif 000064
【０１０６】
ライブラリフラグメント生成のためのＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。９４℃で５分の初期変性と、９４℃で１分、５８℃で１分および７２℃で１分を２５サイクルと、７２℃で１０分間の最終伸長。アセンブリＰＣＲのために、等モル比率の３フラグメントを鋳型として用いた。アセンブリＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。９４℃で３分の初期変性と、９４℃で３０秒、５８℃で１分および７２℃で２分を５サイクル。この段階で、フラグメント１−３の外側の配列に相補的プライマーを加え、７２℃で１０分間の最終伸長の前に、さらに２０サイクル行った。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂコンストラクトをアセンブリした後、Ｆａｂコンストラクトを、同じように処理したアクセプタファジミドベクターと共に、ＤＰ４７−３ライブラリのためにＮｃｏＩ／ＮｏｔＩにて、そして、ＤＰ８８−３ライブラリのためにＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにて消化した。ＤＰ４７−３ライブラリのために、２２．８μｇのＦａｂライブラリを１６．２μｇのファジミドベクターにてライゲートした。ＤＰ８８−３ライブラリのために、３０．６μｇのＦａｂライブラリを３０．６μｇのファジミドベクターにてライゲートした。
精製したライゲーションは、それぞれＤＰ４７−３ライブラリに６８の形質転換体、ＤＰ８８−３ライブラリに６４の形質転換体を用いて、ＤＰ４７−３に４．２の１０１０、ＤＰ８８−３に３．３×１０９のサイズの最終ライブラリを得た。
Ｆａｂライブラリを表出するファジミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選別に用いた。
【０１０７】
実施例３
抗ＴＮＣ Ａ２クローン２Ｂ１０の選別
ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグの５'サブクローニングを行ったヒトＴＮＣ−Ａ２を発現する大腸菌に対して選別を行った。表５の配列番号：５７を参照。抗原は、発現の際にインビボでビオチン化された。選別は、以下のプロトコールに従って溶液中で行った。（ｉ）全量１ｍｌ中で０．５時間のおよそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ８８-３と１００ｎＭのビオチン化ヒトＴＮＣ Ａ２との結合、（ｉｉ）５．４×１０７ストレプトアビジンコート磁気ビーズを１０分間添加することによるビオチン化ヒトＴＮＣ−Ａ２と付着したファージの捕捉、（ｉｉｉ）１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回および１ｍｌのＰＢＳにて５回によるビーズの洗浄、（ｉｖ）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（ｖ）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド以上選別を行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレート上で抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。以下のようなＥＬＩＳＡによって特定の結合体を識別した。１００μｌの１００ｎＭ ビオチン化ヒトＴＮＣ-Ａ２をニュートラアビジンプレートの各ウェルにコートした。
Ｆａｂ含有細菌上清物を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いてそれらのＦｌａｇ-タグにより結合Ｆａｂを検出した。識別したら、クローン２Ｂ１０を０．５リットルの培養体積で細菌を用いて発現させ、親和性精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いたＳＰＲ-分析によってさらに特徴付けした。表３の配列番号：３および７を参照。
【０１０８】
実施例４
抗ＴＮＣ Ａ１／Ａ４クローン２Ｆ１１の選別
ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグの５'サブクローニングを行ったヒトＴＮＣ−Ａ１を発現する大腸菌に対して選別を行った。表５の配列番号：５９を参照。抗原は、発現の際にインビボでビオチン化された。選別は、以下のプロトコールに従って溶液中で行った。（i）全量１ｍｌ中で０．５時間のおよそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ４７−３と１００ｎＭのビオチン化ヒトＴＮＣ Ａ１との結合、（ii）５．４×１０７ストレプトアビジンコート磁気ビーズを１０分間添加することによるビオチン化ヒトＴＮＣ−Ａ１と付着したファージの捕捉、（iii）１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回および１ｍｌのＰＢＳにて５回によるビーズの洗浄、（iv）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（v）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド以上選別を行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレート上で抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。
抗原のタグを認識する望ましくないクローンと競合させるために、すべての結合反応物に、カルボキシ終末ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグを含む１００ｎＭ 非ビオチン化ヒトＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを添加した。
【０１０９】
第一スクリーニング工程では、以下のＥＬＩＳＡによって特定の結合体を識別した。１００μｌの１００ｎＭ ビオチン化ヒトＴＮＣ-Ａ１をニュートラアビジンプレートの各ウェルにコートした。Ｆａｂ含有細菌上清物を添加し、ヒトＴＮＣ−Ａ１に特異的に結合したＦａｂを、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いてそれらのＦｌａｇ-タグにより検出した。 
第二スクリーニング工程では、交差反応性を決定するために、抗原としてネズミ科ＴＮＣ−Ａ１、ヒトＴＮＣ−Ａ４およびｍｕＴＮＣ−Ａ４を用いて上記のＥＬＩＳＡを繰り返した。すべての抗原は、そのＣ末端に同じａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグをを含み、インビボでビオチン化された。表５の配列番号：５０および６１を参照。
識別したら、クローン２Ｆ１１を０．５リットルの培養体積で細菌を用いて発現させ、親和性精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いたＳＰＲ-分析によってさらに特徴付けした。表３の配列番号：９および１３を参照。
【０１１０】
実施例５
抗ＦＡＰクローンの選別（一次選別）
ポリ-リジン及び６×ｈｉｓ-タグの上流にクローニングしたヒト又はネズミ科の線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った。表５の配列番号：５３および５５を参照。選別の前に、選別のラウンドに応じて、１０μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。選別は、以下のプロトコールに従って行った。（i）およそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ４７-３の、固定したヒト又はネズミ科ＦＡＰへの２時間の結合、（ii）５ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回及び５ｍｌのＰＢＳにて５回によるイムノチューブの洗浄、（iii）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（iv）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選別は、ヒトＦＡＰの抗原濃度減少しながら、最終選別ラウンドでは場合によっては５ｕｇ／ｍｌのネズミ科ＦＡＰを使用して、３又は４ラウンド以上行った。特異的な結合体を、バックグラウンドの５倍の高さのシグナルと定義し、ＥＬＩＳＡによって識別した。ＮＵＮＣマキシソーププレートを１０ｕｇ／ｍｌのヒト又はネズミ科ＦＡＰにてコートし、その後Ｆａｂ含有細菌上清物の添加、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いたそれらのＦｌａｇ-タグによる特異的結合Ｆａｂの検出を行った。
ＥＬＩＳＡポジティブクローンを、９６ウェルフォーマット中で１ｍｌの培養物として細菌を用いて発現させ、上清物をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いた動態学的スクリーニング実験に用いた。
【０１１１】
実施例６
抗ＦＡＰ親和性成熟ライブラリの構築
３つの親和性成熟ライブラリは、一次抗ＦＡＰ選別から予め選択した抗体に基づいて構築した。より正確に言うと、それらは、（i）抗ヒトＦＡＰクローン２Ｄ９（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰ２Ｄ９）（表３の配列番号：６７および６９を参照）、（ii）抗ネズミ科ＦＡＰクローン４Ｂ８（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰ４Ｂ８）（表３の配列番号：７１および７３を参照）、および（iii）交差反応性クローン７Ａ１、１３Ｂ２、１３Ｃ２、１３Ｅ８、１４Ｃ１０および１７Ａ１１（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰプール）（７Ａ１の可変領域配列に対応する表３の配列番号：７５および７７；１３Ｃ２の可変領域配列に対応する表３の配列番号：７９および８１；１３Ｅ８の可変領域配列に対応する配列番号：８３および８５；１４Ｃ１０の可変領域配列に対応する配列番号：８７および８９；そして、１７Ａ１１の可変領域配列に対応する配列番号：９１および９３）に基づいている。
これら各ライブラリは、軽鎖（Ｌ１／Ｌ２）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２又は重鎖（Ｈ１／Ｈ２）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の何れかをランダム化している２つのサブライブラリからなる。これらサブライブラリは形質転換でプールした。これら各サブライブラリは、増幅およびアセンブリの４つの連続した工程により構築した。
Ｌ１／Ｌ２ライブラリでは、増幅およびアセンブリプロトコールには、（i）フラグメント１（ＬＭＢ３−ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ１＿ｒａｎｄ＿ｂａ＿ｏｐｔ）およびフラグメント２（ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ１＿ｆｏ−ＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ）の増幅；（ii）  外側のプライマーＬＭＢ３とＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａを用いてフラグメント１及び２をアセンブリし、フラグメント３のための鋳型の作製；（iii）フラグメント３（ＬＭＢ３−ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ２＿ｒａｎｄ＿ｂａ）およびフラグメント４（ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ２＿ｆｏ−ＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ）の増幅；及び、（iv）上記と同じ外側のプライマーを用いたフラグメント３および４の最終アセンブリが含まれる。プライマー配列については表１１を参照のこと。
【０１１２】
【表１１】
2013502209.tif 000065
【０１１３】
Ｈ１／Ｈ２ライブラリでは、増幅およびアセンブリプロトコールには、（i）フラグメント１（ＲＪＨ５３−ＤＰ４７＿ＣＤＲ１＿ｒａｎｄ＿ｂａ＿ｏｐｔ）とフラグメント２（ＤＰ４７＿ＣＤＲ１＿ｆｏ−ＭＳ５２）の増幅；（ii）外側のプライマーＲＪＨ５３とＭＳ５２を用いてフラグメント１及び２をアセンブリし、フラグメント３のための鋳型の作製；（iii）フラグメント３（ＲＪＨ５３−ＤＰ４７＿ＣＤＲ２＿ｒａｎｄ＿ｂａ）およびフラグメント４（ＤＰ４７＿ＣＤＲ２＿ｆｏ−ＭＳ５２）の増幅；及び、（iv）上記と同じ外側のプライマーを用いたフラグメント３および４の最終アセンブリが含まれる。プライマー配列については表１２を参照。
【表１２】
2013502209.tif 000066
【０１１４】
最終アセンブリ生成物は、クローン２Ｄ９、４Ｂ８又はクローン７Ａ１、１３Ｂ２、１３Ｃ２、１３Ｅ８、１４Ｃ１０および１７Ａ１１の等モル混合物のプラスミド調製に基づく同様に処理したアクセプタベクターと共に、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９およびａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８のＬ１／Ｌ２サブライブラリではＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩにて、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９及びａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８のＨ１／Ｈ２サブライブラリではＭｕｎＩおよびＮｈｅＩにて、並びに、ａ.ｍ.ＦＡＰｐｏｏｌのＬ１／Ｌ２ライブラリではＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩにて、そしてａ.ｍ.ＦＡＰプールのＨ１／Ｈ２ライブラリではＢｓｐＥＩ／ＰｓｔＩにてそれぞれ消化した。以下の量の消化したランダム化(部分的)Ｖ−ドメインおよび消化したアクセプタベクター(一又は複数)を、それぞれのライブラリのためにライゲートした。(μｇのＶ-ドメイン／μｇのベクター)：ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９ Ｌ１／Ｌ２サブライブラリ(５．７／２１．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９ Ｈ１／Ｈ２サブライブラリ(４．１／１５．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８ Ｌ１／Ｌ２サブライブラリ(６．５／２４．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８ Ｈ１／Ｈ２サブライブラリ(５．７／２１．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰプールＬ１／Ｌ２サブライブラリ(４．４／２０)、ａ.ｍ.ＦＡＰプールＨ１／Ｈ２サブライブラリ(３．４／１５．５)。
Ｌ１／Ｌ２およびＨ１／Ｈ２サブライブラリの精製したライゲートをプールし、３つ各々の親和性成熟ライブラリのために６０の形質転換体に用い、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９には６．２×１０９、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８には９．９×１０９およびａ.ｍ.ＦＡＰプールには２．２×１０９のサイズの最終ライブラリを得た。
これらＦａｂライブラリを表出するファジミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製にて精製し、二次選別に用いた。
【０１１５】
実施例７
親和性成熟抗ＦＡＰクローンの選別
ポリ-リジン及び６×ｈｉｓ-タグの５'にクローニングしたヒト又はネズミ科の線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った。表５の配列番号：５３および５５を参照。選別の前に、選別のラウンドに応じて、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ又は０．２μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。選別は、以下のプロトコールに従って行った。(ｉ) およそ１０１２ファジミド粒子のライブラリａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８又はａ.ｍ.ＦＡＰプールの、固定したヒト又はネズミ科ＦＡＰへの２時間の結合、(ii) （ライブラリと選別ラウンドに応じて）５ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回及び５ｍｌのＰＢＳにて５回によるイムノチューブの洗浄、(iii) １ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び(v) 対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選別は２ラウンド以上行い、３つのライブラリ各々について個々に条件を調整した。具体的には、選別パラメータは、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９(ラウンド１では５μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計２０回の洗浄、ラウンド２では１μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計３０回の洗浄)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８(ラウンド１では１μｇ／ｍＬのネズミ科ＦＡＰと合計３０回の洗浄、ラウンド２では０．２μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計４０回の洗浄)、およびａ.ｍ.ＦＡＰプール(ラウンド１では５μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計３０回の洗浄、ラウンド２では５μｇ／ｍＬのネズミ科ＦＡＰと合計３０回の洗浄)とした。特異的な結合体を、バックグラウンドの５倍の高さのシグナルと定義し、ＥＬＩＳＡによって識別した。ＮＵＮＣマキシソーププレートを１μｇ／ｍｌ又は０．２μｇ／ｍｌのヒト又はネズミ科ＦＡＰにてコートし、その後Ｆａｂ含有細菌上清物の添加、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いたそれらのＦｌａｇ-タグによる特異的結合Ｆａｂの検出を行った。
ＥＬＩＳＡポジティブクローンを、９６ウェルフォーマット中で１ｍｌの培養物として細菌を用いて発現させ、上清物をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いた動態学的スクリーニング実験に用いた。
【０１１６】
実施例８
異なる形態の標的化ＩＬ-２の有効性研究
有効性実験は、腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態を使用して実施した。Ｆ９奇形癌腫を、１２９ＳｖＥｖマウスに皮下注入し、カリパスを用いて腫瘍サイズを測定した。２つの異なる濃度の「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、Ｆａｂ−インターロイキン-２−Ｆａｂ(Ｆａｂ−ＩＬ２-Ｆａｂ)イムノコンジュゲートと比較した。この濃度はおよその数のイムノコンジュゲート分子を表す。結果を図３に示す。Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、有意な腫瘍成長阻害を示し、２つの異なる濃度のダイアボディ形態及びコントロールよりも良好である。 
また、腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態にて処理したマウスの生存を試験した。ヒト胃腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔを、ＳＣＩＤ−ベージュマウスの脾臓内に注入した。２つの異なる濃度の「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、Ｆａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較した。この濃度はおよその数のイムノコンジュゲート分子を表す。結果を図４に示す。Ｆａｂ−ＩＬ-２−ａｂ形態は、ダイアボディ形態およびコントロールと比較して高い割合の生存を示した。
【０１１７】
実施例９
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. etal., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように、標準的な方法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は製造業者の指示に従って用いた。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に示されている。 
【０１１８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は二本鎖配列決定法にて測定した。
【０１１９】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化した遺伝子合成により合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ社(Regensburg, Germany)により調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している遺伝子セグメントを、ｐＧＡ18(ａｍｐＲ)プラスミドにクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法にて濃度を測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを適切な制限部位にて消化し、各発現ベクターにサブクローニングした。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５'末端ＤＮＡ配列にて消化した。表１３および１４はそれぞれ、それらをコードする例示的なリーダーペプチドとポリヌクレオチド配列を示す。
【０１２０】
【表１３】
2013502209.tif 000067
【表１４】
2013502209.tif 000068
【０１２１】
イムノコンジュゲートの調製
結果として生じたＤＮＡ配列を、哺乳動物発現ベクター（軽鎖のために１つ、重鎖／融合タンパク質のために１つ）内の、ＭＰＳＶプロモーターの制御下かつ合成ポリＡ部位の上流にサブクローニングした。各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を持っている。
下記の実施例に適したイムノコンジュゲートは、リン酸カルシウム-形質移入を使用して、哺乳動物発現ベクターにて指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞を同時形質移入して生産した。あるいは、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３細胞にポリエチレンイミン(ＰＥＩ)によって発現ベクターを形質移入するか、又は安定して形質移入されたＣＨＯ細胞プールを用いた。３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦＡＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトは、プロテインＡマトリクスを用いた親和性クロマトグラフィによって精製されうるのに対して、２Ｂ１０ベースのＴＮＣ Ａ２標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトはプロテインＧマトリクスの親和性クロマトグラフィによって精製しなければならない。
【０１２２】
簡単に言うと、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは、一アフィニティ工程(プロテインＧ)の後にサイズ排除クロマトグラフィ(Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００, GE Healthcare)を行って上清から精製した。プロテインＧカラムは２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ７．５に平衡化し、上清をロードし、カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは８．８ｍＭ 蟻酸ｐＨ３にて溶出した。溶出した分画をプールし、最終製剤バッファ：２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。図５３は、精製および分析の例示的な結果を示す。
ＦＡＰ標的化３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は４Ｇ８ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは、一アフィニティ工程(プロテインＡ)の後にサイズ排除クロマトグラフィ(Superdex 200, GE Healthcare)からなる同様の方法によって精製した。プロテインＡカラムは２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化し、上清をロードし、カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した後に、１３．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５にて洗浄した。場合によって３度目に１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムｐＨ５にて洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ2-Ｆａｂは、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３にて溶出した。溶出した分画をプールし、最終製剤バッファ：２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
【０１２３】
実施例１０
更なる抗ＦＡＰ親和性成熟ライブラリ(クローン３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｇ８、４Ｂ３および２Ｃ６に基づく)の構築
抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンから予め選択した交差反応性の抗体、すなわち、クローン３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｇ８、４Ｂ３及び２Ｃ６を基礎として、さらに４つの親和性成熟ライブラリを構築した(３Ｆ２の可変領域配列に対応する表３の配列番号：１７および２１；３Ｄ９の可変領域配列に対応する表３の配列番号：２３および２５；４Ｂ３の可変領域配列に対応する表３の配列番号：３３および３５；２Ｃ６の可変領域配列に対応する表３の配列番号：４１および４３)。より正確に言うと、４つのライブラリは、１)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２、４Ｇ８および４Ｂ３(可変重鎖のＣＤＲ１および２においてランダム化したＶＨライブラリ、すなわちＨ１／Ｈ２ライブラリ)、２)抗ＦＡＰクローン３Ｄ９および２Ｃ６(可変軽鎖のＣＤＲ１および２においてランダム化したＶＬライブラリ、すなわちＬ１／Ｌ２ライブラリ)、３)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２(軽鎖のＣＤＲ３にソフトランダム化を持つＬ３ライブラリ、すなわちＬ３ライブラリ)および４)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２(重鎖のＣＤＲ３にソフトランダム化を持つＨ３ライブラリ、すなわちＨ３ライブラリ)に基づく。それぞれＬ１／Ｌ２およびＨ１／Ｈ２ライブラリには、抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンで概説したのと全く同じように、最初の２つのライブラリを構築した。これに対して、クローン３Ｆ２に基づくＬ３およびＨ３親和性成熟ライブラリには、２つの新規なプライマーを用いて、親のクローンのＬ３(ＡＭ＿３Ｆ２＿ＤＰＫ２２＿Ｌ３＿ｂａ：CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC、下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｎ(４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物)である)、及びＨ３(ＡＭ＿３Ｆ２＿ＤＰ４７＿Ｈ３＿ｆｏ：GGCCGTATATTACTGTGCG AAA GGG TGG TTT GGT GGT TTT AAC TACTGGGGCCAAGGAAC、下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｎであり、イタリック体の塩基は６０％が所定の塩基で４０％がＧ、並びにイタリック体の下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｋ(２つのヌクレオチドＧおよびＴの混合物)である)にソフトランダム化を導入した。ライブラリサイズは以下のようになった。Ｈ１／Ｈ２ライブラリ(１．１３×１０１０)、Ｌ１／Ｌ２ライブラリ(５．６×１０９)、Ｌ３ライブラリ(２．３×１０１０)およびＨ３ライブラリ(２．６４×１０１０)。
【０１２４】
実施例１１
親和性成熟抗ＦＡＰクローンの選別
６×リジンおよび６×ｈｉｓタグの上流にクローニングしたヒト及びネズミ科の線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った(表５の配列番号：５３および５５を参照)。ライブラリ及び選別のラウンドに応じて、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ又は０．０２μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンについて記述したように、選別およびＥＬＩＳＡベースのスクリーニングを行った。二次スクリーニングはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサ(Biorad)を使用して行い、動態学的速度定数および親和性を同じ計測器上で親和性精製したＦａｂ調製物を分析して決定した。以下の親和性成熟クローンを識別した。１９Ｇ１(表３の配列番号：１２１および１２３を参照)、２０Ｇ８(表３の配列番号：１２５および１２７を参照)、４Ｂ９(表３の配列番号：１２９および１３１を参照)、５Ｂ８(表３の配列番号：１３３および１３５を参照)、５Ｆ１(表３の配列番号：１３７および１３９を参照)、１４Ｂ３(表３の配列番号：１４１および１４３を参照)、１６Ｆ１(表３の配列番号：１４５および１４７を参照)、１６Ｆ８(表３の配列番号：１４９および１５１を参照)、Ｏ３Ｃ９(表３の配列番号：１５３および１５５を参照)、２２Ａ３(表３の配列番号：１６５および１６７を参照)、及び２９Ｂ１１(表３の配列番号：１６９および１７１を参照)(これらすべてのクローンはＨ１／Ｈ２ライブラリから選択し、親のクローン３Ｆ２から得た)、Ｏ２Ｄ７(表３の配列番号：１５７および１５９を参照)(親のクローン３Ｆ２に基づいてＬ３ライブラリから選択した)、及び２８Ｈ１(表３の配列番号：１６１および１６３を参照)および２３Ｃ１０(表３の配列番号：１７３および１７５を参照)(これら２つのクローンはＨ１／Ｈ２ライブラリから選択し、親のクローン４Ｇ８から得た)。
図２１−２５は、ＦＡＰに対する選択した親和性成熟Ｆａｂの表面プラズモン共鳴を示し、表１５は各々の親和性を示す。選択したＦａｂは、ｐＭからｎＭの高親和性範囲を持ち、選択したクローンについて測定したように、ヒト(ｈｕ)及びネズミ科(ｍｕ)ＦＡＰ並びにカニクイザル(ｃｙｎｏ)ＦＡＰについて交差反応性である。親和性成熟した抗ＦＡＰ ＦａｂをＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態に変換した。結合の特異性は、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞に発現される、ＦＡＰに非常にホモログなＤＰＰＩＶへ結合しないことから示される。
【０１２５】
【表１５】
2013502209.tif 000069
【０１２６】
実施例１２
抗ＴＮＣ Ａ２親和性成熟ライブラリの構築(クローン２Ｂ１０に基づく)
親和性成熟ライブラリは、一次ＴＮＣ Ａ２選別から予め選択した抗体に基づいて構築した。より正確に言うと、それは、親のクローン２Ｂ１０に基づいており、２つのサブライブラリからなる。１) 軽鎖(Ｌ１／Ｌ２)のＣＤＲ１およびＣＤＲ２をランダム化したＶＬサブライブラリ、及び２) 重鎖(Ｈ１／Ｈ２)のＣＤＲ１およびＣＤＲ２をランダム化したＶＨサブライブラリ。これらのサブライブラリは形質転換によりプールした。これら各サブライブラリは、増幅およびアセンブリの４つの連続した工程により構築した。Ｌ１／Ｌ２ライブラリでは、１)フラグメント１(ＬＭＢ３−ＡＭ＿Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ１＿ｂａ)およびフラグメント２(ＲＪＨ５０(Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ１／Ｌ２＿ｆｏ)−ＲＪＨ５１(Ｖｋ１Ａ３０＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ))の増殖、２) 外側のプライマーＬＭＢ３およびＲＪＨ５１(Ｖｋ１Ａ３０＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ)を用いてフラグメント１および２をアセンブリし、鋳型を作製、３)フラグメント３(ＬＭＢ３−ＡＭ＿Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ２＿ｂａ及びフラグメント４(ＲＪＨ５２(Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ２／Ｌ３)−ＲＪＨ５１(Ｖｋ１Ａ３０＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ))の増幅、そして、４)上記と同じ外側のプライマーを用いてフラグメント３および４の最終アセンブリ。Ｈ１／Ｈ２ライブラリでは、１)フラグメント１(ＲＪＨ５３−ＡＭ＿ＤＰ８８＿Ｈ１＿ｂａ＿ｏｐｔ)およびフラグメント２(ＲＪＨ５４(ＤＰ８８＿Ｈ１／Ｈ２＿ｆｏ)−ＭＳ５２)の増殖、２)外側のプライマーＲＪＨ５３およびＭＳ５２を用いてフラグメント１および２のをアセンブリし、鋳型を作製、３)フラグメント３(ＲＪＨ５３−ＡＭ＿ＤＰ８８＿Ｈ２＿ｂａ)およびフラグメント４(ＲＪＨ５５(ＤＰ８８＿Ｈ２Ｈ３＿ｆｏ)−ＭＳ５２)の増幅、そして、４)上記と同じ外側のプライマーを用いてフラグメント３および４の最終アセンブリ。最終アセンブリ生成物は、ＶＬサブライブラリについてはＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩ、そしてＶＨサブライブラリについてはＭｕｎＩ及びＮｈｅＩ消化し、同様に消化したアクセプタベクターにクローニングした。ライブラリサイズは１．１６×１０１０の独立したクローンとなった。
【０１２７】
【表１６】
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【表１７】
2013502209.tif 000071
【０１２８】
実施例１３
親和性成熟した抗ＴＮＣ Ａ２クローンの選別
ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグの上流にクローニングしたヒトＴＮＣ Ａ２を発現する大腸菌に対して選別を行った(表５の配列番号：５７を参照)。抗原は、発現の際にインビボでビオチン化された。１００から２ｎＭのヒトＴＮＣ Ａ２の漸減濃度を用いて、一次ＴＮＣ Ａ２選別について記述したように、溶液中で選別を行った。ＥＬＩＳＡによる親和性成熟クローンの識別の後、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサ(Biorad)を用いて二次スクリーニングを行い、動態学的速度定数および親和性を同じ計測器上で親和性精製したＦａｂ調製物を分析して決定した。以下の親和性成熟クローンが識別された。２Ｂ１０＿Ｏ１Ｆ７(表３の配列番号：２０１および２０３を参照)、２Ｂ１０＿６Ｈ１０(表３の配列番号：２０５および２０７を参照)、２Ｂ１０＿Ｃ３Ａ６(表３の配列番号：１８５および１８７を参照)、２Ｂ１０＿Ｄ１Ａ２(表３の配列番号：１８９および１９１を参照)、及び２Ｂ１０＿Ｏ７Ｄ８(表３の配列番号：１９７および１９９を参照)(これらすべてはＶＬサブライブラリから得た)、並びに２Ｂ１０＿Ｃ３Ｂ６(表３の配列番号：１７７および１７９を参照)および２Ｂ１０＿６Ａ１２(表３の配列番号：１８１および１８３を参照)(これら２つのクローンはＶＨサブライブラリから得た)。さらに、クローン２Ｂ１０＿Ｄ１Ａ２では、Ｖ３２Ｄ変異体を生成した(カバット番号付けに従う)(表３の配列番号：１９３および１９５を参照)。
図２６は、ＴＮＣ Ａ２に対する選択した親和性成熟Ｆａｂの表面プラズモン共鳴を示し、表１８は各々の親和性を示す。選択したＦａｂはｐＭの高親和性範囲を持つ。
【表１８】
2013502209.tif 000072
【０１２９】
実施例１４
２Ｂ１０、３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトの精製
２Ｂ１０、３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトのために他の精製法(実施例９に記載のものに加えて)を開発した。３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトは、プロテインＡマトリクスを使用した親和性クロマトグラフィ(例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ)にて精製されうるが、２Ｂ１０ベースのＦａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトはプロテインＧマトリクス上での親和性クロマトグラフィによって精製しなければいけない。精製手順は以下の４つの工程に基づく。
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ又はプロテインＧによる親和性クロマトグラフィ
２．レトロウイルス不活性を維持する低ｐＨ
３．ＤＮＡを除去するための、陰イオン交換クロマトグラフィ−ＣａｐｔｏＱクロマトグラフィ
４．凝集物を除去するための、陽イオン交換クロマトグラフィ−ＳＰセファロースＦＦクロマトグラフィ
あるいは、小規模で凝集物を除去するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムのサイズ排除クロマトグラフィ(GE Healthcare)を用いることもできる。
【０１３０】
精製手順の例は以降、３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂついて示す。第一工程では、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地(Invitrogen)中の一過性ＰＥＩ−形質移入ＨＥＫ２９３細胞の上清をｐＨ７に調整し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム(GE Healthcare)に加え、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７にて洗浄し、そして、８．８ｍＭ ナトリウムギ酸塩、ｐＨ３にて溶出した。選択した分画は、洗浄バッファに交換し、ＣａｐｔｏＱカラム(GE Healthcare)に加え、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。フロースルーをｐＨ５に調整し、ＳＰセファロースＦＦカラム(GE Healthcare)に加え、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて洗浄し、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて溶出した。分画は最終製剤バッファに交換した。図２７は精製手順の概要を示す。
精製した３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは精製後純粋であり(図２８Ａ)、凝集物を含んでいなかった(図２８Ｂ)。記述した精製手順は４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂにも応用した。４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂと同様な動態であった。精製した材料は精製の後純粋であり、凝集物を含んでいなかった(図２８Ｃ−Ｄ)。
【０１３１】
Ｆａｂフラグメントとして２Ｂ１０(ＴＮＣ Ａ２結合体)を有するＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態についても精製を行った。第一工程では、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地(Invitrogen)中の一過性ＰＥＩ−形質移入ＨＥＫ２９３細胞の上清をｐＨ７に調整し、プロテインＧカラム(GE Healthcare)に加え、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７にて洗浄し、そして、８．８ｍＭ ナトリウムギ酸塩、ｐＨ３にて溶出した。選択した分画は、洗浄バッファに交換し、ＣａｐｔｏＱカラム(GE Healthcare)に加え、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。フロースルーをｐＨ５に調整し、ＳＰセファロースＦＦカラム(GE Healthcare)に加え、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて洗浄し、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて溶出した。分画は最終製剤バッファに交換した。
図２９は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(NuPAGE Novex ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ, 還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付け(Ａ)、及び３つ各々の精製工程後の生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィ(Ｂ)を示す。最終生成物中に２．３％の凝集物が検出された。
【０１３２】
実施例１５  安定性試験
Ｆａｂフラグメントとしてフィブロネクチン外ドメインＢ結合体Ｌ１９を有するＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態について安定性試験を行った。安定性試験のために、Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトをプロテインＡ親和性クロマトグラフィによって精製し、ｐＨ３で溶出した後、記載したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム(GE Healthcare)によるサイズ排除クロマトグラフィを行った。３つの異なるバッファを試験し、２０ｍＭ ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を適切なバッファとした。その後、Ｌ19 Ｆａｂ-ＩＬ2-Ｆａｂは、６．３ｍｇ／ｍｌの濃度で２０ｍＭ ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に調製し、室温及び４℃で４週間保存した。図３０は例示的な安定性データを示す。プローブは、ＵＶ分光法により濃度を(図３０Ａ)(ペレット前の沈殿物質に遠心分離した後)、そして、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムによる分析的サイズ排除クロマトグラフィにより凝集内容を(図３０Ｂ)毎週分析した。結果は、コンストラクトが６ｍｇ／ｍｌの濃度で４℃又は室温で２８日間保存されたとき、並びに凍結／解凍を繰り返した後にも、凝集も分解も起こらなかったことを示す。これらのデータは、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態が非常に安定であり、ＩｇＧ抗体に値する動態であることを示す。
【０１３３】
実施例１６  表面プラスモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ)によるＦＡＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ結合親和性
３つのＦＡＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト、３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ、４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂおよび３Ｄ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの結合親和性を、表面プラズモン共鳴にて測定した。
ＦＡＰ結合を測定するため、ＦＡＰを固定した抗Ｈｉｓ抗体(ペンタＨｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ＃３４６６０)にて捕捉し、コンストラクトを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とし、Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクトを１０ｎＭから３．２ｐＭまで１:５に希釈した。以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 ９００秒、流速 ９０μｌ／分。チップは、６０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ２にて再生した。曲線を１：１モデルにフィッティングし、ＫＤ値(Ｒｍａｘ局所、ＲＩ＝０)を求めた。 
ＩＬ-２レセプター(ＩＬ-２Ｒ)鎖の親和性を決定するために、ＩＬ-２Ｒのβおよびγ鎖(ｂ／ｇ；ノブ-イントゥ-ホール コンストラクト)又はα鎖(ａ)をチップに固定し、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とした。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクト３Ｆ２及び３Ｄ９を２５ｎＭから０．７８ｎＭまで１:２に希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １００秒、解離 １８０秒、流速９０μｌ／分。２０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．５にて再生した。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクト４Ｇ８は、１００ｎＭから３．１２５ｎＭに希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 １８０秒、流速４０μｌ／分。３０秒間、３Ｍ ＭｇＣｌ２による再生。
表１９は、３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ、４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂおよび３Ｄ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合親和性の概要を示す。親和性のピコモル値はＢｉａｃｏｒｅの検出限界に達する。図３１−３４は、それぞれＢｉａｃｏｒｅセンサグラムおよび親和性を示す。
【表１９】
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【０１３４】
実施例１７
表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ)によるＴＮＣ Ａ２標的化Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ結合親和性
ＴＮＣ Ａ２結合を決定するために、ビオチン化抗原(ＴＮＣ ｆｎ５−Ａ１−Ａ２−Ａ３ドメイン、融合、大腸菌で発現、ｆｎ５およびＡ３ドメインは常にヒト起源であるのに対して、Ａ１およびＡ２ドメインはヒト、ネズミ科又はカニクイザルである)をストレプトアビジンチップ上に固定し、イムノコンジュゲートコンストラクトを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とした。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは２５ｎＭから０．３９ｎＭの１:２希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 １８０秒、流速５０μｌ／分。６０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．５による再生。曲線を１：１モデルにフィッティングし、ＫＤ値を求めた。ネガティブコントロールとして、ＨＥＫ細胞で生産されるＴＮＣドメイン１から８を用いた(ＴＮＣ１-８ＨＥＫ)。
ＩＬ-２レセプター(ＩＬ-２Ｒ)β及びγ鎖(ｂ／ｇ；ノブ-イントゥ-ホール コンストラクト)の親和性を測定するために、ＩＬ-２Ｒコンストラクトをチップに固定し、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とした。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂイムノコンジュゲートは２５ｎＭから０．７８ｎＭの１:２希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １００秒、解離 １８０秒、流速９０μｌ／分。２０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．５にて再生を行った。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクトは、１００ｎＭから３．１２５ｎＭに希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 １８０秒、流速４０μｌ／分。３０秒間、３Ｍ ＭｇＣｌ２による再生。表２０は２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合親和性の概要を示し、図３５は各々のＢｉａｃｏｒｅセンサグラムおよび親和性を示す。
【０１３５】
【表２０】
2013502209.tif 000074
【０１３６】
実施例１８
標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの生物活性は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較して、いくつかの細胞アッセイにおいて調査した。
【０１３７】
ＮＫ９２細胞の増殖の誘導 
ＴＮＣ Ａ２(２Ｂ１０)又はＦＡＰ(３Ｆ２および４Ｇ８)を認識する標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ分子は、フィブロネクチン-ＥＤＢを認識するＩＬ-２(プロリュウキン)およびＩＬ-２ Ｌ１９ ダイアボディと比較して、ＮＫ９２細胞の増殖を誘導する能力について調べた。
２μｇ／ｍｌのヒトテネイシン、ＦＡＰ又はフィブロネクチンを９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートに４℃で終夜かけてコートした。プレートをブロックした後、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト又はダイアボディをプレートに滴定し、結合のために室温(ＲＴ)で９０分間インキュベートした。結合していないコンストラクトを取り除くために集中的に洗浄した後、ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(１００００細胞／ウェル)を加えた。ポジティブコントロールとして、プロリュウキンをいくつかのウェルの溶液中に加えた。細胞は、加湿インキュベーター(５％ＣＯ２)中で３７℃で２日間インキュベートし、細胞を溶解して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット(Promega)を用いてＡＴＰ測定値によって増殖を決定した。
図３６の結果は、すべてのＦａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトがＮＫ９２細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化し、それらの増殖を刺激することが可能であったことを示す。シグナル伝達に必要なＩＬ-２Ｒβ／γヘテロ二量体の結合親和性が低減しているので、細胞成長を誘導する作用は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較しておよそ１０分の１以下に低減した。しかしながら、高用量での全体の有効性は維持され、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。
【０１３８】
ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導
更なる試験において、発明者等は、溶液中で、ヒトＰＢＭＣからの、Ａ) ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、Ｂ) ＣＤ４＋ＣＤ２５-ＣＤ１２７＋ヘルパーＴ細胞、Ｃ) ＣＤ３＋, ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞およびＤ) ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を含む異なるエフェクター細胞群上の、ＦＡＰを認識するＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ分子(４Ｇ８に基づく)と共にインキュベートした後のＩＬ-２媒介性ＩＬ-２Ｒシグナル伝達の結果としてのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を試験した。
提供者の指示に従って、健康なドナーの血液から単離したＰＢＭＣを、固定／透過、及び抗ホスホＳＴＡＴ５抗体(Becton Dickinson)にて染色する前に、異なる濃度のプロリュウキン又はＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂにて２０分間処理した。リン酸化したＳＴＡＴ５並びにＦＯＸＰ３の細胞内染色の後、フローサイトメトリ(ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ)によって異なるサブ集団を決定するために、表面マーカー(ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６およびＣＤ１２７)を染色した。
図３７の結果は図３６の所見を裏付けるものであり、４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトが様々なＩＬ-２Ｒポジティブエフェクター細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化し、ＩＬ-２Ｒ下流のシグナル伝達およびＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することが可能であったことを示す。シグナル伝達に必要なＩＬ-２Ｒβ／γヘテロ二量体に対する結合親和性が低減していたので、ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する作用は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較しておよそ１０分の１以下に低減していた。しかしながら、高用量での全体の有効性は維持され、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。
【０１３９】
溶液中及び固定によるＩＦＮ-γ放出および増殖誘導
更なる試験では、発明者等は、標的化ＩＬ-２イムノコンジュゲートが結合し、腫瘍細胞又は腫瘍間質上に固定され、そして、エフェクター細胞を活性化しうる腫瘍で生じる状況を再現することを目的とした。このために、発明者等は、溶液中で、ＮＫ９２細胞によるＩＦＮ-γ放出アッセイ並びにイムノコンジュゲートによる増殖アッセイを行うか、あるいは、発明者等は、ＴＮＣ又はＦＡＰ抗原にてマイクロタイタープレートをコートして、標的化ＩＬ-２イムノコンジュゲートをＴＮＣ又はＦＡＰへの結合によって固定した。
２μｇ／ｍｌのヒトテネイシン又はＦＡＰを９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートに４℃で終夜かけてコートした。プレートをブロックした後に、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトをプレートに滴定し、結合のためにＲＴで９０分間インキュベートした。結合していないコンストラクトを除去するために集中的に洗浄した後、ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(１００００細胞／ウェル)を加えた。ポジティブコントロールとして、プロリュウキンをいくつかのウェルの溶液中に加えた。増殖を測定するために、細胞は、加湿インキュベーター(５％ＣＯ２)中で３７℃で２日間インキュベートし、細胞を溶解して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット(Promega)を用いてＡＴＰ測定値によって増殖を決定した。ＩＦＮ-γの放出は、Becton DickinsonのヒトＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットにて細胞の上清中でＦａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂと共に２４時間インキュベートした後に、異なる手法で測定した。
この結果は、ＦＡＰ、ＴＮＣ Ａ１又はＴＮＣ Ａ２を標的とするすべてのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトが、ＮＫ９２細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化し、その細胞の増殖(図３８Ａ)並びに溶液中に存在する場合にはＩＦＮ-γ分泌(図３８Ｃ)を誘導したことを裏付けるものであった。シグナル伝達に必要なＩＬ-２Ｒβ／γヘテロ二量体の結合親和性が低減しているので、ＩＦＮ-γ放出を誘導する作用は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較しておよそ１０分の１以下に低減した。しかしながら、高用量での全体の有効性は維持され、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。マイクロタイタープレートをＦＡＰ又はＴＮＣにてコートし、コンストラクトをプレートに固定した場合、ＦＡＰ、ＴＮＣ Ａ１又はＴＮＣ Ａ２を標的とするすべてのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトは、ＮＫ９２細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化して、細胞成長(図３８Ｂ)およびＩＦＮ-γ放出(図３８Ｄ)を誘導することが依然として可能であった。溶液中で行ったアッセイと比較して、コーティングしてないＩＬ-２(プロリュウキン)と固定したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトとの間の有効性の相違は一桁大きかったが、高用量での有効性は維持されており、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。
これらのデータは、全身の曝露は低いが、機能を媒介する疾患の部位に集積する標的化イムノコンジュゲートを生成するというコンセプトを強く支持する。
以下の実施例では、発明者等は、これらのインビトロ特性が異種移植片モデルにおいてインビボで優れた有効性を示すか否かを調べた。
【０１４０】
実施例１９  ヒト腫瘍細胞株の異種移植片におけるＦＡＰ及びＴＮＣ Ａ２に対する標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートのインビボ有効性
いくつかの異種移植片モデルにおいて、ＦＡＰおよびＴＮＣ Ａ２に対する標的化Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂイムノコンジュゲートをそれらの抗腫瘍有効性について試験した。
【０１４１】
ＬＳ１７４Ｔ異種移植片モデル
ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＳＣＩＤマウスの脾臓内に注入したヒト結腸直腸ＬＳ１７４Ｔ細胞株において試験した。
元々はＥＣＡＣＣ(細胞培養物の欧州保存機関)から入手したＬＳ１７４Ｔ細胞(ヒト大腸カルシノーマ細胞)を増殖させた後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞貯蔵所に寄託した。ＬＳ１７４Ｔは、１０％ＦＣＳ(PAA Laboratories, Austria)、１％Ｇｌｕｔａｍａｘおよび１％ＭＥＭ非必須アミノ酸(Sigma)を含有するＭＥＭ イーグルズ培地中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２下、水飽和した空気中、３７℃で培養した。脾臓内注入には、９２．８％の生存度のインビトロ１５継代物を用いた。麻酔したＳＣＩＤ／ベージュマウスの左腹部に小さな切り傷を付けた。５０マイクロリットル(ＡｉｍＶ培地中３×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞)の細胞懸濁液を、腹壁を貫いて脾臓の莢膜直下に注入した。鉗子を用いて創傷を閉じた。
雌ＳＣＩＤマウス(実験開始時８−９週齢、Taconics, Denmarkから購入)は、預託ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、１２時間明所／１２時間暗所の１日周期の特定病原体除去条件下で維持した。実験研究プロトコールは審査を受け、地方自治(Ｐ２００８０１６)に承認された。到着後、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために動物を１週間維持した。継続的な健康管理を定期的に行った。
試験０日目にマウスの脾臓内に、３×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞を注入し、ランダム化し、計量した。腫瘍細胞注入の１週間後に、マウスに、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ(Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ−ＳＨ２Ｂ１０)、フイブロネクチン-ＥＤＢ標的化Ｌ１９ ＩＬ-２−ダイアボディ又はプロリュウキンを、週２回、３週間静脈注射した。
すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ベヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群にはＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト、ダイアボディ又はプロリュウキンを注射した。２００μｌにつき適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じて原液をＰＢＳにて希釈した。
図３９は、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、フィブロネクチン-ＥＤＢを標的とするネイキッドＩＬ-２(プロリュウキン)およびＩＬ-２ダイアボディ分子と比較して、生存中位値の向上において優れた有効性を示したことを示す。
【０１４２】
【表２１】
2013502209.tif 000075
【０１４３】
ＡＣＨＮ異種移植片モデル
ＦＡＰ標的化３Ｆ２又は４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＳＣＩＤマウスの腎臓内に注入したヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮにおいて試験した。
元々はＡＴＣＣ(米国培養細胞系統保存機関)から入手したＡＣＨＮ細胞(ヒト腎臓腺癌細胞)を増殖させた後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞貯蔵所に寄託した。ＡＣＨＮは１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２下、水飽和した空気中、３７℃で培養した。腎臓内注入には、９７．７％の生存度のインビトロ９継代物を用いた。麻酔したＳＣＩＤマウスの右腹部かつ腹膜壁に小さい切り傷(２ｃｍ)を付けた。５０μｌ(ＡｉｍＶ培地中１×１０６のＡＣＨＮ細胞)の細胞懸濁液を腎臓内の２ｍｍの莢膜に注入した。鉗子を用いて創傷を閉じた。
雌ＳＣＩＤマウス(実験開始時８−９週齢、Charles River, Sulzfeld, Germanyから購入)は、預託ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、１２時間明所／１２時間暗所の１日周期の特定病原体除去条件下で維持した。実験研究プロトコールは審査を受け、地方自治(Ｐ２００８０１６)に承認された。到着後、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために動物を１週間維持した。継続的な健康管理を定期的に行った。
試験０日目にマウスの腎臓内に、１×１０６のＡＣＨＮ細胞を注入し、ランダム化し、計量したた。腫瘍細胞注入の１週間後に、マウスに、プロリュウキン、Ｌ１９ ＩＬ-２  ダイアボディ又はＦＡＰ標的化４Ｇ８又は３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、週２回、３週間静脈注射した。
すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ベヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群にはプロリュウキン、Ｌ１９ ＩＬ-２ダイアボディ又はＦＡＰ標的化４Ｇ８又は３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを注射した。２００μｌにつき適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じて原液をＰＢＳにて希釈した。
図４０は、ＦＡＰ標的化３Ｆ２及び４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、フィブロネクチン-ＥＤＢを標的とするネイキッドＩＬ-２(プロリュウキン)およびＩＬ-２ダイアボディ分子と比較して、生存中位値の向上において優れた有効性を示したことを示す。ネズミ科ＦＡＰに高い親和性を有する４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂが、３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂより優れた有効性を示した。
【０１４４】
【表２２】
2013502209.tif 000076
【０１４５】
Ａ５４９異種移植片モデル
ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに静脈注射したヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９において試験した。
元々はＡＴＣＣ(ＣＣＬ−１８５)から入手したＡ５４９非小細胞肺カルシノーマ細胞を増殖させた後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞貯蔵所に寄託した。腫瘍細胞株は通常通り、１０％ＦＣＳ(Gibco)を含むＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２下、水飽和した空気中、３７℃で培養した。９８％の生存度の２継代物を移植に用いた。１動物につき２×１０６細胞を、２００μｌのＡｉｍＶ細胞培養培地(Gibco)に含め尾静脈へ注入した。
雌ＳＣＩＤ−ＦｃγＲＩＩＩマウス(ＧＬＹＣＡＲＴ-ＲＣＣ)(実験開始時８−９週齢、RCC, Switzerlandで交配)は、預託ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、１２時間明所／１２時間暗所の１日周期の特定病原体除去条件下で維持した。実験研究プロトコールは審査を受け、地方自治(Ｐ２００８０１６)に承認された。到着後、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために動物を１週間維持した。継続的な健康管理を定期的に行った。
試験０日目にマウスの静脈内に５×１０６のＡ５４９細胞を注入し、ランダム化し、計量した。腫瘍細胞注射の１週後に、マウスに、２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ又はＬ１９ ＩＬ-２ダイアボディを、週２回、３週間静脈注射した。
すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ベヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト又はＬ１９ ＩＬ-２ダイアボディを注射した。２００μｌにつき適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じて原液をＰＢＳにて希釈した。
図４１は、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、フィブロネクチン-ＥＤＢを標的とするＩＬ-２ダイアボディ分子と比較して、生存中位値の向上において優れた有効性を示したことを示す。
【０１４６】
【表２３】
2013502209.tif 000077
【０１４７】
実施例２０  標的化ＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製
ＦａｂフラグメントとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有するＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの最初の精製は、一過性形質移入ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の上清から行った。簡単に言うと、Ｆａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂは、プロテインＡの後にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。プロテインＡカラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化した。上清をロードし、カラムを、始め２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．５にて、その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。標的化ＧＭ−ＣＳＦを、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ３にて溶出し、その後中和した。製剤化のために、以下のバッファを用いた。２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７。
図４２は、精製の溶出特性及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付けの結果を示す。収率は４．８ｍｇ／Ｌであった。
【０１４８】
実施例２１
標的化ＧＭ-ＣＳＦ Ｆａｂ-ＧＭ-ＣＳＦ-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、ＦａｂとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＧＭ-ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＧＭ-ＣＳＦ依存性増殖アッセイにおいて分析した。簡単に言うと、ＧＭ-ＣＳＦ依存的に増殖するＴＦ−１細胞を、終夜をかけて飢餓状態にした後、９６ウェル平底プレート中１００００細胞／ウェルで播いた。ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ(Miltenyi #130-093-862)又はＦａｂ−ＧＭ-ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、溶液中の細胞へ滴定した。５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で３７℃で２日間増殖させた後、細胞を溶解し、ＡＴＰ内容物をPromegaのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイにて測定した。ＧＭ-ＣＳＦ未処置の細胞を計算のために０％の成長とした。図４３の結果は、Ｆａｂ−ＧＭ-ＣＳＦ−ＦａｂイムノコンジュゲートがＴＦ−１細胞の増殖を強力に誘導したことを示す。
【０１４９】
実施例２２  標的化ＩＬ−１２ Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製
Ｆａｂフラグメントとして４Ｇ８(ＦＡＰ結合体)を有するＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの最初の精製は、一過性形質移入ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の上清から行った。簡単に言うと、Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂは、プロテインＡの後にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。プロテインＡカラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化した。上清をロードし、カラムを、始め２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。２回目の洗浄は、１３．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５にて行った。１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムｐＨ５による３回目の洗浄の後、標的化ＩＬ-１２は、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３にて溶出し、その後中和した。製剤化のために、以下のバッファを用いた。２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７。
図４４は、精製の溶出特性及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付けの結果を示す。収率は４３ｍｇ／Ｌであった。
【０１５０】
実施例２３
標的化ＩＬ-１２ Ｆａｂ-ＩＬ１２-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、Ｆａｂとして４Ｇ８(ＦＡＰ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、健康なドナーのヒト新鮮血液から単離したＰＢＭＣを用いて、ＩＬ−１２および精製した４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの効果と比較して、ＩＬ−１２誘導性ＩＦＮ-γ放出について分析した。
簡単に言うと、ＰＢＭＣを、健康なドナーのヒト新鮮血液から単離し、ＡＩＭ Ｖ培地の９６ウェルＵ底プレート(１.５×１０５細胞／ウェル)に播いた。一定濃度の１０ｎｇ／ｍｌのｈｕＩＬ-２(Peprotech)をすべてのウェルに加えた。Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂコンストラクトは培地で希釈し、ＰＢＭＣへ滴定した。Becton DickinsonのｈｕＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットＩＩ(＃550612)を用いて、およそ２０時間後に上清を採集し、ＩＦＮ-γ濃度を決定した。
図４５の結果は、選択した量のヒト(ｈｕ)ＩＬ-２単独並びにＩＬ-１２単独は、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ-γ放出を有意に誘導できなかったのに対して、両サイトカインの組合せはＰＢＭＣによるＩＦＮ-γ放出を有意に引き起こした(Ａ)。Ｆａｂ−ＩＬ−１２−Ｆａｂコンストラクトは、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-２の存在下で、濃度依存的な様式でヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ-γ放出を誘導した(Ｂ)。
【０１５１】
実施例２４
標的化ＩＦＮ-α Ｆａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製
ＦａｂフラグメントとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有するＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの最初の精製は、一過性形質移入ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の上清から行った。簡単に言うと、Ｆａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂは、プロテインＡの後にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。プロテインＡカラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化した。上清をロードし、カラムを、始め２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５にて、その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。Ｆａｂ−ＩＦＮα2−Ｆａｂを、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ３にて溶出し、その後中和した。製剤化のために、以下のバッファを用いた。２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７。
図４６は、精製の溶出特性及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付けの結果を示す。収量は８．４ｍｇ／Ｌであった。
【０１５２】
実施例２５
ＩＦＮ-α Ｆａｂ-ＩＦＮα２-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、ＦａｂとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＩＦＮ-α(Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ、Ｒｏｃｈｅ)及び精製したＬ１９ Ｆａｂ-ＩＦＮα２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用と比較して、ジャーカットＴ細胞及びＡ５４９腫瘍細胞のＩＦＮα誘導性増殖阻害について分析した。簡単に言うと、ＩＦＮ-α誘導性増殖阻害を受けやすいＡ５４９およびジャーカットＴ細胞を、９６ウェル平底プレートに５０００細胞／ウェル(Ａ５４９)又は１００００細胞／ウェル(ジャーカット)となるように播いた。適切な細胞培養培地でのＲｏｆｅｒｏｎ Ａ(Roche)又はＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂの希釈物を溶液中の細胞へ滴定した。５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で３７℃で２日間増殖させた後、細胞を溶解し、ＡＴＰ内容物をPromegaのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイにて測定した。ＩＦＮ-α未処置の細胞を計算のために０％の成長とした。
図４７の結果は、Ｆａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂコンストラクトが、ＩＦＮ-α(Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ)に相当する濃度依存的な様式で、Ａ)ジャーカットＴ細胞及びＢ)Ａ５４９細胞の増殖を阻害したことを示す。
【０１５３】
実施例２６  ＭＣＳＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの調製
ヒト化抗ＭＣＳＰ ＭＨＬＧ抗体は、出典明記によって全体の内容がここに援用される国際公開２００６／１００５８２(特に実施例１を参照)に記載されるように生成し、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態(配列番号：２５５、２５６、２６１、２６２を参照)に変換した。
ヒト化抗ＭＣＳＰ ＭＨＬＧ１抗体は以下の通りに生成した。抗ＭＣＳＰ抗体２２５．２８のネズミ科アミノ酸配列(軽鎖および重鎖は下記を参照)は、一まとまりのヒト生殖細胞系抗体Ｖ遺伝子と整列配置し、配列同一性および相同性に従って分類した。
225.28 軽鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ65007(配列番号２６７)：
DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK
225.28 重鎖；利用可能なＧｅｎＢａｎｋ寄託番号なし(配列番号２６８)：
QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS
【０１５４】
潜在的アクセプター配列は、全体的に高い相同性と、すでにあるアクセプター配列の正しい標準的な残基の存在に基づいて選択した。ヒト生殖細胞系配列ＩＧＨＶ３-１５(ＩＭＧＴ寄託番号Ｘ９２２１６)を重鎖のアクセプターとし、配列ＩＧＫＶ１-９(ＩＭＧＴ寄託番号Ｚ０００１３)を軽鎖に選択した。ヒト化コンストラクトは、軽鎖ではＭ−ＫＶ１(配列番号：２６３、２６４、２６９、２７０参照)、７(配列番号：２６５、２６６、２７１、２７２)および９(配列番号：２５３、２５４、２５９、２６０)と記し、重鎖ではＭＨＬＧ１(配列番号：２５１、２５２、２５７、２５８参照)と記した。
それらの設計した抗体配列の遺伝子は、従来のＰＣＲ技術によって生成し、発現プラスミドの構築のためにヒトＩｇＧ１およびκ定常ドメインに融合させた。 
抗体は、ＨＥＫ又はＣＨＯのような哺乳類の細胞培養系においてＩｇＧとして又はＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合タンパク質として発現させ、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィを経て精製した。軽鎖変異体Ｍ−ＫＶ１およびＭ−ＫＶ７の結合データを比較すると、カバット位置４６のプロリン残基は抗原への機能的結合に必須であることが明らかとなった。２つの異なる手法を用いて以下のアミノ酸の存在を確認した。Ａ）いわゆる復帰突然変異がＩＧＫＶ１-９のヒトフレームワークに導入された。そして、Ｂ）復帰突然変異の存在を避けるために、全フレームワーク２領域(カバット位置３５−４９)が、ＧｅｎＢａｎｋ登録事項ＡＡＡ１７５７４のヒト抗体の対応する領域によって交換された。この抗体は位置４６のプロリン残基を天然に有する。
【０１５５】
ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ又はＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは、一アフィニティ工程(プロテインＡ)の後にサイズ排除クロマトグラフィ(Superdex 200, GE Healthcare)からなる前記(実施例９)の方法によって精製した。プロテインＡカラムは２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化し、上清をロードし、カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した後に、１３．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５にて洗浄した。場合によって３度目に１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムｐＨ５にて洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ2-Ｆａｂは、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３にて溶出した。溶出した分画をプールし、最終製剤バッファ：２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
図４８(ＭＨＬＧ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)及び図４９(ＭＨＬＧ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)は、精製の溶出特性(Ａ)と、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス-トリス ミニゲル、Invitrogen、ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)によるＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ又はＭＨＬＧ１ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの分析的特徴付けの結果(Ｂ)を示す。
【０１５６】
実施例２７
ＭＣＳＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、ＦａｂとしてＭＨＬＧ ＫＶ９又はＭＨＬＧ１ ＫＶ９(ＭＣＳＰ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＮＫ９２細胞上で、精製した４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ(ＦＡＰ結合体)およびＭＨＬＧ又はＭＨＬＧ１ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの作用と比較して、ＩＬ-２誘導性ＩＦＮ-γ放出について分析した。
ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(予めＩＬ-２抜きで２時間インキュベートしたもの)を、ＮＫ細胞培地(ＭＥＭａ＋１０％ＦＣＳ＋１０％ウマ血清＋０．１ｍＭ ２‐メルカプトエタノール＋０．２ｍＭ イノシトール＋０．０２ｍＭ 葉酸)の９６ウェルＵ底プレート(１０５細胞／ウェル)に播いた。ＭＣＳＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ-２−ＦａｂイムノコンジュゲートはＮＫ細胞培地に希釈し、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと直接比較して、ＮＫ９２細胞へ滴定した。２２から２４時間後に上清を採集し、Becton DickinsonのヒトＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットＩＩ(＃550612)を用いてＩＦＮ-γ濃度を決定した。
図５０(ＭＨＬＧ ＫＶ９  Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)および図５１(ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)の結果は、ＭＣＳＰ又はＦＡＰに標的化したすべてのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、濃度依存するが用いた抗原結合部分には依存しないで、ＮＫ９２細胞内のＩＦＮ-γ分泌を同程度に誘導したことを示す。
【０１５７】
実施例２８
ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートによる細胞結合アッセイ
精製したＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ヒトＭＣＳＰ発現Ｃｏｌｏ３８メラノーマ細胞への結合についてフローサイトメトリによって試した。簡単に言うと、細胞を採取し、計数して、生存度について調べた。細胞は、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に１．１１２×１０６(生存)細胞／ｍｌに調整し、丸底９６ウェルプレートに１８０μｌ／ウェル(２０００００細胞／ウェル)に等分した。２０μｌの(異なる希釈物の)ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ免疫サイトカインを細胞含有ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を遠心分離(４分、４００×ｇ)にて回収し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにて洗浄し、再懸濁し、１２μｌ／ウェルの二次抗体(ＦＩＴＣ-コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ(ａｂ’)２フラグメントヤギ抗ヒトＦ(ａｂ’)２(Jackson Immuno Research Lab #109-096-097)と共に４℃で３０分間インキュベートし、１．５ｍｌの水およびグリセロール＝原液の１:１混合物に溶解し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに１:２０で希釈した。続いて細胞を１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにて洗浄した後、ＰＢＳの洗浄工程を行い、遠心分離(４分、４００×ｇ)にて回収し、プロピジウムヨウ素(ＰＩ)を含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ機器(Software FACS Diva)を使用して測定を行った。結果を図５２に示す。ここでは、ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂイムノコンジュゲートがＣｏｌｏ３８細胞に用量依存的に非常に良く結合したことが示される。
【０１５８】
概要及び要約の項ではなく詳細な説明の項は特許請求の範囲を理解するために用いられるものと解する。発明者(一又は複数)によって意図されるように、概要および要約の項はすべてではないが一又は複数の本発明の例示的実施態様を記載するものであり、ゆえに、いかなる形であれ本発明および添付の請求の範囲を制限するものではない。
本発明は、その特定の機能および関連性の実施を例示する機能的な構成要素と共に先に記載されている。これらの機能的構成要素の境界は、記載の便宜上、本明細書中で任意に定めている。その特定の機能および関連性が適切に実行される限りにおいて、境界の定義は変わりうる。
特定の実施態様の先の記載は、本発明の全体的な本質を十分に明らかにしているので、他者は当分野の技術内の知識を用いて、過度な実験を要することなく、また本発明の全体的な概念から逸脱することなく、その特定の実施態様を多様な用途に、容易に変更及び／又は応用することができる。したがって、本明細書に提示される教示および手引きに基づいた、このような応用および変更は、意図する範囲内であり、開示さた実施態様と均等な範囲内のものである。本明細書中の表現又は用語は説明のためのものであって限定するものではなく、本明細書中の用語又は表現は教示及び手引きを考慮して当業者に解釈されるものであることは理解できるであろう。
本発明の幅および範囲は、上記いずれかの例示的な実施態様によって限定されるものではなく、以降の特許請求の範囲及びその同等な記載に従ってのみ定義されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013502209.tif 000133
2013502209.tif 000134
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