(57)【要約】  サンプル溶液の粘度を測定する方法及び装置を提供する。第１及び第２の空間的に離れた検出窓（Ｗ１、Ｗ２）を持つキャピラリー（２）がキャリア溶液で満たされる。サンプル溶液のプラグ（４）又は連続容積（４）が前記キャピラリー（２）内に注入され、前記キャピラリー（２）を通じて第１の圧でポンプして前記第１及び第２の検出器窓（Ｗ１、Ｗ２）を通過させる。それぞれの検出窓（Ｗ１、Ｗ２）の少なくとも一部が光源で照射される。それぞれの検出窓（Ｗ１、Ｗ２）で前記キャリア溶液又はサンプル溶液を通過する前記光源からの光は、検出位置の２次元配列を含むアレイ検出器（６）を用いて検出され、これはそれぞれの検出窓（Ｗ１、Ｗ２）を通過する前記サンプル溶液のプラグ（４）又はフローフロント（４）の光吸収のプロフィルを示すアレイ検出器出力シグナルを生成する。それぞれの検出窓（Ｗ１、Ｗ２）で前記サンプル溶液のプラグ（４）又はフローフロント（４）の検出の時間の間の時間差から、前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐは、その粘度が、前記第１のポンプ圧でポンプされる場合に前記キャリア溶液の粘度とほぼ等しい粘度の標準サンプル溶液のプラグ（４）又はフローフロント（４）についてそれぞれの検出窓（Ｗ１、Ｗ２）で検出される時間の知られる時間差を考慮して、計算することができる。
2013539047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル溶液の粘度を測定する方法であり、前記方法は：
キャリア溶液でキャピラリーを満たし、前記キャピラリーが第１及び第２の空間的に離れた検出窓を持ち；
前記キャピラリーの第１の端部内にサンプル溶液のプラグを注入し、かつ前記サンプル溶液のプラグを第１のポンプ圧でポンプして、前記サンプル溶液のプラグは、前記キャリア溶液により先行されかつ後続されるか、
又は、サンプル溶液を前記キャピラリーを通して第１の圧で連続的にポンプして、前記サンプル溶液のフローフロントが前記キャリア溶液で先行され、
それにより前記プラグ又はフローフロントが前記第１及び第２の検出窓を通過し；
それぞれの検出窓の少なくとも一部分を光源により照射し；
それぞれの検出窓で前記キャリア溶液又は前記サンプル溶液を通過する前記光源からの光をアレイ検出器を用いて検出し、前記アレイ検出器が検出器位置の２次元配列を含み；
それぞれの検出窓を通過する前記サンプル溶液プラグ又はフローフロントの光吸収のプロフィルを示すアレイ検出器出力シグナルを生成し；
それぞれの検出窓で前記サンプル溶液のプラグ又はフローフロントの検出の時間を決定し；
それぞれの検出窓で前記サンプル溶液のプラグ又はフローフロントの検出の時間の間の時間差Δｔを決定し；及び
前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のプラグについて前記時間差Δｔ、前記第１及び第２の前記キャピラリーの端部間の長さＬ、前記キャピラリーの第１の端部へ注入された前記プラグの長さｌｉｎｊ、及び前記第１のポンプ圧でポンプされる場合前記キャリア溶液の粘度とほぼ等しい粘度を持つ標準サンプル溶液のプラグについてそれぞれの検出窓で検出される時間の知られる時間差Δｔ０から、
ηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ（Ｌ／ｌｉｎｊ）；
と計算されるか；又は
前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のフローフロントについて前記時間差Δｔ、前記第１の端部及び前記第１の検出器窓間のキャピラリーの長さｌ１、前記第１の端部及び前記第２の検出器窓間のキャピラリーの長さｌ２、前記第１の端部及び前記第２の端部間のキャピラリーの長さＬ、及び前記第１のポンプ圧でポンプされる場合前記キャリア溶液の粘度とほぼ等しい粘度を持つ標準サンプル溶液のプラグについてそれぞれの検出窓で検出される時間の知られる時間差Δｔ０から、
ηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ［２Ｌ／（ｌ１＋ｌ２）］；
と計算される、
ことを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載のサンプル溶液の粘度を測定する方法であり、前記方法はさらに、前記サンプル溶液を形成するために緩衝液中に分析物を溶解させることを含む、方法。
【請求項３】
サンプル溶液の粘度の、前記サンプル溶液の濃度依存性を特徴付ける方法であり、前記方法は：
前記緩衝液中に第１の濃度で溶解させた前記分析物を、請求項２に記載の方法で、サンプル溶液の比粘度を測定し；及び
前記緩衝液中に前記第１の濃度とは異なる１以上の濃度で溶解させた前記分析物を、請求項２に記載の方法で、サンプル溶液の比粘度を測定することを含む、方法。
【請求項４】
サンプル溶液の粘度を測定する装置であり、前記装置は、
第１の端部と第２の端部、及び第１及び第２の空間的に離れた検出窓を持つキャピラリー；
前記キャピラリーの第１の端部へ第１のポンプ圧で溶液を選択的に供給するようの構成される注入器；
それぞれの検出窓の少なくとも一部分を照射するように構成される光源；
検出位置の２次元配列を含むアレイ検出器を含み、これは、前記光源から前記キャピラリー内の溶液を通過する光を検出し、及び前記キャピラリー内の溶液を通過する光の光吸収のプロフィルを示すアレイ検出器出力シグナルを生成するように構成され、
前記アレイ検出器からの前記シグナルを受けるように構成されるプロセッサを含み；
前記注入装置がキャリア溶液で満たされ、前記キャピラリーの第１の端部内にサンプル溶液のプラグを注入して、前記サンプル溶液のプラグが前記キャリア溶液で先行されかつ後続されるか、又は前記注入装置がキャリア溶液で満たされ、前記キャピラリーを通じてサンプル溶液を連続的にポンプして、前記サンプル溶液のフローフロントが前記キャリア溶液に先行され、それにより前記プラグ又はフローフロントが前記第１及び第２の検出窓を通過し；
前記プロセッサは、前記アレイ検出器出力シグナルからそれぞれの検出窓で前記サンプル溶液の前記プラグ又はフローフロントの検出の時間を決定し、及びそれぞれの検出窓で前記サンプル溶液プラグ又はフローフロントの前記検出時間の時間差を決定するように構成され；及び
前記プロセッサが、
前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のプラグについて前記時間差Δｔ、前記第１及び第２の前記キャピラリーの端部間の長さＬ、前記キャピラリーの第１の端部へ注入された前記プラグの長さｌｉｎｊ、及び前記第１のポンプ圧でポンプされる場合前記キャリア溶液の粘度とほぼ等しい粘度を持つ標準サンプル溶液のプラグについてそれぞれの検出窓で検出される時間の知られる時間差Δｔ０から、
ηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ（Ｌ／ｌｉｎｊ）；
と計算されるか；又は
前記プロセッサが、
前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のフローフロントについて前記時間差Δｔ、前記第１の端部及び前記第１の検出器窓間のキャピラリーの長さｌ１、前記第１の端部及び前記第２の検出器窓間のキャピラリーの長さｌ２、前記第１の端部及び前記第２の端部間のキャピラリーの長さＬ、及び前記第１のポンプ圧でポンプされる場合前記キャリア溶液の粘度とほぼ等しい粘度を持つ標準サンプル溶液のプラグについてそれぞれの検出窓で検出される時間の知られる時間差Δｔ０から、
ηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ［２Ｌ／（ｌ１＋ｌ２）］；
と計算される、ように構成される、装置。
【請求項５】
請求項４に記載の装置であり、前記検出位置の２次元配列が、それぞれの検出窓を横切る前記キャリア溶液及びサンプル溶液の光吸収の前記２次元分布を示すシグナルを与えるように構成される、装置。
【請求項６】
請求項４又は５のいずれか一項に記載の装置であり、前記光源が、前記サンプル溶液中に含まれる１以上の吸収成分により吸収される光波長を少なくとも１つ発光する、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置であり、前記光源は、紫外線（ＵＶ）光を供給し、前記アレイ検出器がＵＶ吸収を示すシグナルを与えるように構成される、装置。
【請求項８】
請求項７に記載の装置であり、前記光源は、１６０から１２００ｎｍ、好ましくは１８０又は１９０から１２００ｎｍの範囲の波長を持つ光を与えるように構成される、装置。
【請求項９】
請求項４乃至８のいずれか一項に記載の装置であり、前記アレイ検出器が、半導体センサ装置、好ましくはＣＭＯＳＡＰＳ、ＣＣＤ又はＣＩＤを含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル溶液の相対粘度及び比粘度の測定装置及び測定方法に関する。
本発明の実施態様は、溶液粘度、溶液濃度、拡散係数及びサイズを同時に測定するための装置を適用する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線（ＵＶ）吸収は、サンプル中の分析種（分子、イオンなど）の分離科学で使用されるキーとなる技術の１つである。かかる技術を適用する１つの具体的な装置が、本出願人の米国特許第７２６２８４７号明細書及び欧州特許第１５３０７１６Ｂ１号明細書に記載されている。米国特許第７２６２８４７号明細書には、光源、いくつかのキャピラリーの形状のサンプル容器及び検出器からなる光学装置が開示されている。前記キャピラリーは、前記光源と検出器の間に形成される光路内に配置され、前記検出器は前記キャピラリーを通る光の透過を可能にするように配置されている。前記光源はコリメートされた光のビームを与え、前記検出器は複数の検出器位置を持つ。前記検出器は、例えばアクティブ画素センサ（ＡＰＳ）である、エリアイメージング（領域撮像）装置である。前記キャピラリーのそれぞれは、前記キャピラリー内を流れる流体中の検出のためのサンプルを含むように適合される相対的な形状と寸法のコアを含む。前記キャピラリーは、空間的に分離された次の透過光路を定める：第１の壁路（それぞれのキャピラリーの前記壁のみに入りかつ出る）と第２のコア路（前記キャピラリーの壁とさらに追加の前記コアに入り、かつ出る）である。前記空間的に分離された壁路とコア路は前記検出器の個々の検出器位置へ結合される。さらに、前記検出器上の追加の個々の検出器位置は、光源からのさらなる空間的に分離された光（前記キャピラリーを通過しない）を受けるように構成される。米国特許第７２６２８４７号明細書の装置を、テーラー分散分析（Ｔａｙｌｏｒ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＴＤＡ）を用いてサンプルの拡散係数及び流体力学的半径を測定するために使用することは知られている。
【０００３】
生体薬物、タンパク質及びナノ粒子を含む溶液及び処方物を、それらが生体内でどのような挙動を示し得るかについてのより深い理解を得るために、完全に特徴づける必要性があることは知られている。特に、溶液の粘度及び溶液のレオロジーと溶液中の前記サンプルの流体力学的半径の測定が可能となることが望ましい、ということも知られている。さらに、希釈することなく非常に少量の容積のサンプルで操作してこれらのパラメータをモニターすることができることが望まれている、ということも知られている。前記サンプルを希釈する必要があるということは望ましいことではない、というのはこれにより処方されたサンプルの性質に影響を与える可能性があるからである。さらに、多くの生体医薬処方物は活性成分を高濃度（１０〜４００ｍｇ／ｍｌ、即ち４０％重量／重量）含み、多くの標準の技術（例えば従来の標準路長セルでのＵＶ吸収、及びサイズ排除クロマトグラフ）では希釈することなく使用することには適しない。
【０００４】
次の知られた技術は、興味の対象となる材料を含む溶液及び処方物を特徴付けるために適用され得る。
【０００５】
動的光散乱技術は、拡散係数を計算するために使用され得るが、前記拡散係数をＳｔｏｋｅｓ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ式を用いて流体力学的半径へ変換するためには前記サンプル粘度についての別の知識を持つことが必要である。
【０００６】
サイズ排除クロマトグラフは通常は、モノマー、オリゴマー及び凝集物の比率を決定するために使用されるが、この技術は希釈（しばしば、前記処方物とは異なる緩衝液で）及びクロマトグラフ分離を必要とする。
【０００７】
キャピラリー粘度測定は、流体の粘度を測定するためのよく確立された技術であり、及び、溶媒及びサンプル粘度及びそれらの差が、相対粘度測定装置（例えばＶｉｓｃｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）の使用により同時に測定される技術に含まれる。しかし、これらの粘度測定技術のいずれも、ＴＤＡを用いて拡散係数と流体力学的半径を同時に測定することは可能ではなかった。
【０００８】
古典的なキャピラリー粘度測定器はウベロード及びオストワルドの設計に基づく。重力により２点間を流れて移動する流体のメニスカスに要する時間が測定される。通常は前記時間は標準流体の時間を基準とし、前記標準で要する時間に対して前記サンプルで要する時間の比率として相対粘度が測定可能となる。ウベロード粘度計での時間の精度を改善するために画像化カメラを用いることが知られている（例えば、Ｗｉｌｌらの「ｗｗｗ．ｃｅｎａｍ．ｍｘ／ｓｉｍｐｏｓｉｏ２００８／ｓｍ  ２００８／．．．／ＳＭ２００８−Ｓ３Ｃ１−１１０４．ｐｄｆ．」を参照できる。かかるキャピラリー方法の全ては大容量の流体を使用し、これは、わずかなサンプル容量のみが利用可能であり、サンプル希釈が好ましくない場合には、わずらわしくかつ問題の起こる恐れがある。
【０００９】
ポリマー含有溶液の粘度は、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｒｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  １９９８、  １０、  １９−２６）で測定されてきた。メシチルオキシドがポリマー溶液中にＵＶマーカーとして溶解され、０．３５バールの一定圧力を用いて、同じポリマー溶液で満たされた直径５０μｍのキャピラリー内に駆動された。前記メシチルオキシドの先端部が前記キャピラリーの端部近くの窓に到達するに要する時間が測定され、水で満たされた同じキャピラリー内に駆動される水中のメシチルオキシドの要する時間に基準化される。前記の相対粘度は、この２つの時間の比で得られた。古典的なキャピラリー粘度計に対してＢｅｒｇｍａｎらの方法の利点は、少量の流体が使用可能である、ということである。
【００１０】
キャピラリーレオメーターは粘度をせん断速度の関数として測定するが、これはサイズを測定するようには設計されていない。
【００１１】
前記の技術はいずれも、粘度同様に拡散係数及びサイズに関する情報を提供するものではない。
【００１２】
米国特許第７０３９５２７Ｂ２号（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  Ｉｎｃ．）には、ミクロチャンネル中の溶質の分子拡散を決定する方法が開示され、ここでは溶質がミクロチャンネルの第１の端部へ導入され、第１の濃度プロフィルがミクロチャンネルに沿って第１及び第２の位置で測定される。さらに、この技術は、前記分子拡散と同時に前記速度も測定可能とする。しかし、この技術を、どのようにして粘度測定の問題に適用するかについて示唆がなく、さらにはそうするために望ましい点についてさえなんら示唆がない。
【００１３】
米国特許第７０３９５２７Ｂ２号は、非ガウス特にテーリングであるプロフィルに留意している。本出願のある実施態様の目的は、この技術を、濃度又はせん断力依存性流れを特徴付ける特徴（特に前記サンプルとキャリア媒体であってこれらが異なる組成物（例えば塩、糖又は他の添加物の異なる濃度）である場合に、前記サンプルとキャリア媒体の間の境界でのプロフィルに影響を与える特徴）を識別するために、プロフィルを理論へ詳細に適合させることで拡張させることである。他のいかなる方法も、単一の測定で濃度−依存性粘度を導き出すことはできない。
【００１４】
前記サンプルが、パルス又はフロントのいずれかでキャリア溶液中に注入される場合に、テーラー分散分析（ＴＤＡ）の原理を適用することは、当技術分野で知られている。本発明のある実施態様の目的は、これを拡散係数及び流体力学的半径の測定に適用することである。さらに、これまで、これらの技術が粘度測定に適用され得るということについてなんら認識されてこなかった。
【００１５】
国際出願公開第２０１０／００９９０７（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３０１３）は、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅにより２００８年７月２１日出願され、発明の名称「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｉ  ａｎｄ／ｏｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｂｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔａｙｌｏｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ」である。要約は以下の通りである。混合物Ｍを分析する方法であり、
（ｉ）第１の単分散成分、及び
（ｉｉ）少なくとも１つの検出装置について、前記第１の成分の応答係数とは異なる応答係数を持つ第２の成分を含み、
前記方法が次のステップ：
（Ａ）前記混合物Ｍがキャピラリーチューブの入口に注入され、前記キャピラリーの入口と出口間の流体力学的圧力及び／又は静水圧力により前記チューブ内をキャリア流体の流れで押されて移動し、それにより混合物Ｍの前記成分のテーラー分散の現象が前記チューブ内で起こり；
（Ｂ）成分（ｉ）と（ｉｉ）の両方の成分を同時に検出可能であり、かつ前記キャピラリーチューブの出口に設けられた検出装置を用いて、ステップ（Ａ）で得られるテーラー分散を反映するシグナルを測定し；
（Ｃ）ステップ（Ｂ）で得られたシグナルを分析して、成分（ｉ）と（ｉｉ）の特異的な寄与を決定し、かつそれにより以下の少なくとも１つを確立する：混合物Ｍ内の成分（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の濃度；及び／又は前記成分（ｉ）の平均流体力学的半径又は前記成分（ｉｉ）の平均流体力学的半径を決定する。さらに、前記文献には、ＴＤＡを用いて混合物中の個々の成分の濃度を決定する方法について記載されている。
【００１６】
本発明のある実施態様は以下に詳細に説明されているが、国際出願公開第２０１０／００９９０７（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３０１３）に記載されている技術とは、通常単一成分が試験される、という点で異なる。有利には、単一成分が試験される場合は、前記応答係数（所定のセル光路長で濃度による吸光度の変化）は通常は前記環境には依存しない。さらに、国際出願公開第２０１０／００９９０７（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３０１３）には、前記成分のプロフィル及び前記環境の関数として粘度の試験についてはなんら示唆もされていない。例えばこのような状態は、異なる組成物のサンプルとキャリア媒体との間の境界を横切って動く場合、又は前記サンプルのレオロジー挙動がその濃度に強く依存し、かつ前記濃度が前記キャピラリー内で時間−依存性プロフィルにより変動する場合に、起こり得る。さらに、ここで記載される方法は、前記サンプルと前記キャリア媒体内の成分を含む結合平衡を試験することを可能にする。これは、本出願人による米国特許第７２６２８４７号明細書及び欧州特許第１５３０７１６Ｂ１号明細書により、前記キャリア媒体が強いＵＶが吸収性又は散乱性である場合にそうである。本発明のある実施態様は複数の検出器位置とＵＶ吸収の有限の暴露を利用する。前記サンプルは前記画像化装置を横切って一定の速度で動く一方ノイズはランダムに時間及び空間に無関係であることから、適切な時間変位を用いて前記暴露を重ねることが、ノイズからシグナルを区別するために使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第７２６２８４７号明細書
【特許文献２】欧州特許第１５３０７１６Ｂ１号明細書
【特許文献３】米国特許第７０３９５２７Ｂ２号明細書
【特許文献４】国際出願公開第２０１０／００９９０７号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．：ｗｗｗ．ｃｅｎａｍ．ｍｘ／ｓｉｍｐｏｓｉｏ２００８／ｓｍ２００８／．．．／ＳＭ２００８−Ｓ３Ｃ１−１１０４．ｐｄｆ
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  １９９８、  １０、  １９−２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の実施態様の目的は、ここで記載され又はその他で認識される従来技術に伴う１以上の問題点を軽減又は解消することである。特に、本発明の実施態様の目的は溶液の粘度を測定する他の方法を提供することである。１つの実施態様では、本発明の課題は、溶液中の成分の拡散係数及びサイズの測定と同時に粘度を測定することである。本発明の具体的な実施態様は、溶液中に成分の濃度と粘度との間の関係及びかかる条件下での前記ピークプロフィルと粘度への影響の特徴付けを可能にする。この特徴付けは、前記成分が、前記キャリア溶液とは異なる組成物の注入溶液内に溶解している場合を含む。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の側面のよれば、サンプル溶液の粘度を測定する方法が提供され、前記方法は：キャリア溶液でキャピラリーを充填し、前記キャピラリーは第１及び第２の空間的に離れた検出窓を含み；サンプル溶液のプラグ（栓流）を前記キャピラリーの第１の端部内に注入し、かつ前記サンプル溶液のプラグを前記キャピラリーを通して、前記サンプル溶液のプラグが前記キャリア溶液で先行され続いて前記キャリア溶液が続いて流れるように第１のポンプ圧力でポンプして、又はサンプル溶液を前記キャピラリーを通して、前記サンプル溶液のフローフロント（流れ先端部）が前記キャリア溶液で先行されるように第１のポンプ圧力でポンプして、前記プラグ又はフローフロントが前記第１及び第２の検出窓を通過させ；それぞれの窓のそれぞれの少なくとも１部分を光源で照射し；前記キャリア溶液又は前記サンプル溶液を通過する光源からの光を、アレイ検出器を用いてそれぞれの検出窓で検出し、前記アレイ検出器が検出器位置の２次元配列を含み；前記それぞれの検出窓を通過する前記サンプル溶液プラグ又はフローフロントの光吸収のプロフィルを示す、アレイ検出器出力シグナルを生成し；それぞれの検出装置窓で前記サンプル溶液のプラグ又はフローフロントの検出時間を決定し；それぞれの検出窓での前記サンプル溶液プラグ又はフローフロントの検出時間の時間差Δｔを決定し；及び前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のプラグについての時間差Δｔ、前記第１及び第２の端部間の前記キャピラリーの長さＬ、前記キャピラリーの第１の端部へ注入された前記プラグの長さｌｉｎｊ、及び前記第１のポンプ圧力でポンプされる場合に前記キャリア溶液とほぼ等しい粘度を持つ標準サンプル溶液のプラグについてそれぞれの検出窓での検出時間の間の知られた時間差Δｔ０から計算され、ここでηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ（Ｌ／ｌｉｎｊ）であり；又は、前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のフローフロントについての時間差Δｔ、前記第１の端部と前記第１の検出器窓間の前記キャピラリーの長さｌ１、前記第１の端部と前記第２の検出器窓間の前記キャピラリーの長さｌ２、前記第１及び第２の端部間の前記キャピラリーの長さＬ、及び前記第１のポンプ圧力でポンプされる場合に前記キャリア溶液とほぼ等しい粘度を持つ標準サンプル溶液のプラグについてそれぞれの検出窓での検出時間の間の知られた時間差Δｔ０から計算され、ここでηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ［２Ｌ／（ｌ１＋ｌ２）］である。
【００２１】
本発明の利点は、粘度測定技術の改善方法が提供され、これは従来の技術よりもより簡便、正確であり、非常に小容量のサンプルのみ必要とするというさらなる利点を持つことである。１つの実施態様では、溶液中の成分の濃度が正確に特徴付けられ、このことは特に、賦形剤と活性医薬成分を高濃度で含まれ粘度が全ての成分の濃度に強く依存する生体医薬処方物である場合に利点となる。有利には本発明は、サンプル溶液の比粘度を、高粘性サンプルについても正確に測定され得る。医薬組成物として濃縮タンパク質組成物が単一の注射で投与される必要があり得ることから、圧力駆動流れ下で高粘性流体を測定できることは望ましい。しかし前記組成物の流れ方はその粘性に依存する。加えて、注射針を通るせん断速度での流体の流れはタンパク質を破壊し得るものであり、粘度の流速依存性が十分特徴付けられる場合にはこれを避けることができ、これは本発明の方法を用いることで可能になる。
【００２２】
有利には、本発明の実施態様は、光分解領域画像化検出器の使用により、溶液粘度、溶質濃度、拡散係数とサイズの測定を提供する。好適な検出器は、一般的にはエリアイメージャー（領域画像化装置）として参照され、ＣＭＯＳセンサとしてもまた参照され得る、アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）を含む。キャピラリーを通る間に圧力駆動流れの間に通過するサンプルプロフィル、フローフロント及び流速などのパラメータが変化することから、これらのパラメータをリアルタイムで特徴付けるために、前記高分解能エリアイメージング検出器は、高空間及び時間分解能を持つ。
【００２３】
前記方法はさらに、前記サンプル溶液を形成するために緩衝液中の溶質を溶解することを含む。
【００２４】
本発明の第２の側面によれば、サンプル溶液の粘度の前記サンプル溶液の濃度依存性を特徴付ける方法を提供し、前記方法は：本発明（請求項２）の方法で、第１の濃度で前記緩衝液中の溶質を持つサンプル溶液の粘度を測定し；及び本発明（請求項２）の方法で、前記第１の濃度とは異なる濃度でさらに１回以上で前記緩衝液中の溶質を持つサンプル溶液の粘度を測定することを含む。
【００２５】
本発明の第３の側面によれば、サンプル溶液の粘度を測定するための装置が提供され、前記装置は：第１の端部と第２の端部及び第１及び第２の空間的に離れた検出窓を持つキャピラリー；前記キャピラリーの第１の端部へ第１のポンプ圧力で選択的に溶液を供給するように構成される注入器；それぞれの検出窓の少なくとも一部分を照射するように構成される光源；前記光源から前記キャピラリー内の前記溶液を通過する光を検出するように構成され、及び前記キャピラリー内の溶液を通過する光の光吸収のプロフィルを示すアレイ検出器出力シグナルを生成するように構成される、検出器位置の２次元配列；前記アレイ検出器からの前記出力シグナルを受け取るように構成されるプロセッサを含み；ここで、前記注入器は、キャリア溶液で前記キャピラリーを充填し、かつ、前記サンプル溶液のプラグが、前記キャリア溶液に先行されて続いてキャリア溶液が流れるようにサンプル溶液のプラグを前記キャピラリーの第１の端部へ注入するか又は前記注入器はキャリア溶液で前記キャピラリーを充填し、かつ前記サンプル溶液のフローフロントが前記キャリア溶液で先行されるように前記キャピラリーを通るサンプル溶液を連続的にポンプするように構成されて前記プラグ又はフローフロントが前記第１及び第２の検出窓を通過するように構成され、前記プロセッサは、前記アレイ検出器出力シグナルからそれぞれの検出器窓での前記サンプル溶液の前記プラグ又はフローフロントの検出の時間を決定し、それぞれの検出窓での前記サンプル溶液プラグ又はフローフロントの検出時間間の時間差Δｔを決定するように構成され；及び前記プロセッサは、前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のプラグについての時間差Δｔ、前記第１と第２の端部間の前記キャピラリー長さＬ、前記キャピラリーの第１の端部へ注入された前記プラグの長さｌｉｎｊ、及び前記第１のポンプ圧力でポンプされる場合にその粘度がほぼ前記キャリア溶液の粘度と等しい標準サンプル溶液のプラグについて、それぞれの検出窓での検出時間の知られた時間差Δｔ０から計算するように構成され、ここでηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ（Ｌ／ｌｉｎｊ）であり；又は前記プロセッサは、前記サンプル溶液の比粘度ηｓｐを、前記サンプル溶液のフローフロントについての時間差Δｔ、前記第１の端部と第２の端部間の前記キャピラリー長さｌ１、前記第１と第２の検出窓間の前記キャピラリー長さｌ２、前記第１及び第２の端部間の前記キャピラリー長さＬ、及び前記第１のポンプ圧力でポンプされる場合にその粘度がほぼ前記キャリア溶液の粘度と等しい標準サンプル溶液のプラグについて、それぞれの検出窓での検出時間の知られた時間差Δｔ０から計算するように構成され、ここでηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ［２Ｌ／（ｌ１＋ｌ２）］である。
【００２６】
前記検出器位置の２次元配列は、それぞれの検出窓を横切る前記キャリア溶液及びサンプル溶液の光吸収の２次元分布を示すシグナルを与えるように構成される。
【００２７】
前記光源は、前記サンプル溶液内に含まれる１以上の吸収成分により吸収される少なくとも１つの波長の光を発光し得る。
【００２８】
前記光源は、紫外線光（ＵＶ）を供給するように構成され、かつ前記アレイ検出器はＵＶ吸収を示すシグナルを与えるように構成され得る。
【００２９】
前記光源は、１６０から１２００ｎｍ、好ましくは１８０又は１９０ｋａｒａ１２００ｎｍのハニの波長を持つ光を与える。
【００３０】
前記アレイ検出器は、半導体センサ装置、好ましくはＣＭＯＳ  ＡＰＳ、ＣＣＤ又はＣＩＤを含む。
【００３１】
本発明は以下、例示の方法で添付の図面を参照しつつ説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明の第１の実施態様に基づく、拡散係数、サイズ及び相対粘度を測定するための実施例を示す。
【図２】図２は、ある濃度範囲でキャリア溶液内にタンパク質を含むサンプルのプラグについて、圧力駆動流れが２つの窓を通過する際に得られるＵＶ吸収プロフィルのプロットである。
【図３】図３は、本発明の第２の実施態様に基づく、拡散係数、サイズ及び相対粘度を測定するための実験を示す。
【図４】図４は、キャリア溶液を含むキャピラリー中に連続的に注入されるサンプルにつき、圧力駆動流れが２つの窓を通過する際に得られるＵＶ吸収のプロットであり、前記サンプルは、１つの標準サンプルと２つの医薬組成物を含み、前記医薬の注入溶液は前記キャリア溶液の組成物とは異なる組成物を含み、通常でない粘度／濃度依存性を示す。
【図５】図５は、ＰＢＳ中のカフェイン（ｉ）、ＰＢＳ中の０．１％キサンタン溶液中のカフェイン（ｉｉ）及びＰＢＳ中のサクシノグリカン溶液中のカフェインのサンプルプラグを注入した後、２つの検出窓で画像化された時間に対してのＵＶ吸収のプロットである。
【図６】図６は、標準サンプルとして水（０％スクロース）中の２００ｐｐｍのカフェインの溶液を用いた前向き実施（フロントラン）を示し、ここでキャリア溶液Ｓとしては水である。前方側及び後ろ側の両方が与えられ、累積ガウス関数を用いて前方向プロフィルをフィットさせた。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の実施態様では、測定装置及び方法が提供され、これは一定ポンプ圧で、サンプルである溶液Ａを、最初キャリア溶液Ｓで充填されたキャピラリーを通じて駆動されることで操作される。溶液Ａは、パルスとして注入され、続いて溶液Ｓが連続して流されるか、又はフロントとして駆動され得る。流れているストリーム（流れ）（パルスとしてＳＡＳ、フロントとしてＳＡ）は前記キャピラリーの長さに沿って２つの分離された窓で、例えば米国特許第７２６２８４７号に記載されるエリアイメージング装置を含む形の組立装置を用いて画像化される。前記サンプルパルス又はサンプルフロントがそれぞれの窓を通貨する際の一連の画像フレームを分析することで、前記窓を出る時間、吸収プロフィル及び前記パルス又はフロントの変動をそれぞれの窓につき決定することができる。鋭いパルスでは、流速も又決定され得る。前記キャピラリーの長さ及び前記窓の位置を予め知ることで、前記サンプル溶液の比粘度が本発明により測定され得る。本発明の実施態様では、以下詳細に説明される以下のパラメータがまた同時に決定される：溶質濃度、拡散係数及びサイズ。前記光源の波長はまた、前記サンプルの光吸収が特定の波長では不適切である場合には変更され得る。例えば、タンパク質の希釈溶液は、理想的には２１４ｎｍでモニタされる。しかし、フロントランでのタンパク質の高濃度溶液は２８０ｎｍで最良に測定される、というのはこの条件下では２１４ｎｍでの吸収は大きすぎて前記検出器がその直線的ダイナミックレンジの限界を超えて操作されるからである。加えて、試験実施（ラン）間の濃度の変動により濃度と粘度の変動がさらに特徴付けられ得る。
【００３４】
本発明による粘度測定装置は図１及び３に示され、２つのバイアルＶ１とＶ２をつなぐキャピラリー２を含む。液体は、一定圧でＶ１からＶ２へ駆動される。バイアル１はキャリア溶液Ｓを含み、それにより前記キャピラリー２が最初前記キャリア溶液で満たされる。バイアル１は続いて、サンプル溶液Ａを含む第３のバイアルＶ３と交換される。前記サンプルは通常は、医薬又は生体医薬成分が前記キャリア溶液Ｓ又は異なる媒体Ｓ１に溶解されたものである。Ｓ１はＳとは、賦形剤、例えば塩や糖がＳ中途な異なる濃度で溶解したものを含む点で異なる。これは、活性医薬成分を安定化させるために使用される組成物である。前記窓Ｗ１、Ｗ２は、前記バイアルの間の前記キャピラリーの長さに沿って空間的に離されており、かつ前記キャピラリー２はループを形成し、それにより両方の窓Ｗ１、Ｗ２は、お互いに対してエリアイメージング検出器６の画素アレイにより画像化される領域で隣接されることで単一の光学組み立て物を用いて画像化され得る。前記サンプルＡのプラグを前記キャピラリー２へ注入するために、前記第３のバイアルＶ３が、前記サンプルＡの適切な容量が加圧下注入され後、前記第１のバイアルＶ１へ切り替えられる。前記検出器は、前記サンプル容量ＡＳＡのパルス又は前記フローフロントＳＡがそれぞれの窓を通過すると、前記エリアイメージング装置６で受け取られた光強度の測定を含むフレーム配列（シーケンス）を取得し、これらは通常はソフトウェアにより吸光度対時間のデータに変換される。
【００３５】
かかるデータから拡散係数及びサイズを決定する手順は、従来技術で記載されており、例えば「ｗｗｗ．ｐａｒａｙｔｅｃ．ｃｏｍ」から入手可能な応用例集ＴＮ００１、ＡＮ００１、ＡＮ００５及びＡＮ０１５（「Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｔａｙｌｏｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ」；「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ  ｆｏｒ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒ  ａ  ｗｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｎｇｅ」；「Ｒａｐｉｄ  ｓｉｚｉｎｇ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」；及び「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｚｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡｃｔｉＰｉｘ  ＴＤＡ２００  Ｎａｎｏ−Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」）である。かかるデータから拡散係数及びサイズの決定の手順はまた、従来技術、例えば米国特許第７０３９５２７号明細書に記載されている。
【００３６】
前記ピークの中心（実験がサンプル容量の注入されたプラグに基づく場合）が前記それぞれの窓の端部に到達する時間ｔ１及びｔ２、及び時間差Δｔ＝ｔ２−ｔ１が決定され得る。米国特許第７０３９５２７号明細書で留意すべきことは、これが速度を決定することができる、ということである。本発明の実施態様によると、これはさらに拡張されて、前記時間差及び／又は速度の決定が粘度の測定のキーとなるパラメータとなる、というのは、以下図１に関して説明される前記キャピラリーは一定温度に調温され前記駆動圧が非常に制御される場合に測定することで高い精度及び再現性を有するからである。有利には、米国特許第７０３９５２７号明細書に記載されるタイプの検出器組み立て物が、適切なソフトウェアと共に使用され、それぞれの窓で取得された前記ＵＶ吸収プロフィルの時間変位平均を、前記検出器の最後の画素を出る時間へそれぞれの暴露をシフトさせる。しかし、米国特許第７０３９５２７号明細書には、前記測定時間差が、他のパラメータと組み合わせて以下説明するように粘度を測定するために使用される、ということについての認識はない。加えて、本発明は、これらの測定が、前記キャピラリー中で非均一な組成を持つ流体の場合でも実行することを可能にする（図３で示される前記フローフロント測定の場合であって、キャリア溶液Ｓ及びサンプル溶液Ａの比率が時間と共に変化する）。
【００３７】
前記キャリア溶液Ｓ１の粘度は予め、標準溶媒Ｓ０に対して、例えばカフェインなどの希釈標準サンプル（これは前記粘度に大きな影響を与えない）のプラグを、２つの溶液中に注入し、前記２つの窓間時間差を測定することで、測定され得る。例えば、前記標準溶媒Ｓ０及び他のキャリア溶液Ｓ１として水を用いると、前記相対粘度ηｒｅｌは式１で与えられる。
ηｒｅｌ＝ηＳ１／ηＳ０＝Δｔ０、Ｓ１／Δｔ０、Ｓ０                          （１）
相対粘度及び比粘度（粘度増分）は以下与えられる式４で関連付けられる。
【００３８】
式１の添字は、前記マーカーサンプルが希釈され前記粘度に干渉しないことを示す。即ちΔｔ０は、希釈溶液、例えば水中のカフェインの検出器窓間の時間差であり、これに対して他のサンプル溶液の挙動が評価される。表１（以下与えられる）は、マーカーとして１ｍｇ／ｍＬ濃度でのタンパク質を用いて、かつ４から９の範囲の繰り返し数実験の設定を用いて得られるデータの例を与え、これは時間差の測定においていかに高精度が得られるかを示す。
【００３９】
有利には、２つの測定窓を使用して、テーラー分散分析（ＴＤＡ）として知られる技術が拡張される。前記検出器窓の間の移動時間の測定は、粘度計算を非常に高い精度かつ高い正確さを持つものにする。１つの測定窓を持つ方法の使用に対して特に利点は、時間差を用いることで、このことは、キャピラリー入口効果、圧力上昇時間及び定常状態到達時間からの前記測定された粘度の修正をすることの必要性をなくす、ということである。かかる効果は、理想的な方法での両方の窓への時間を変化させ、従って、前記２つの窓間を移動する時間差を測定することで自動的に除去される。
【００４０】
有利には、本発明の実施態様は、溶液粘度、溶質の拡散係数及び流体力学的半径及び溶質の濃度を測定することを可能にする。これは、前記技術を、ＵＶ吸収データからの溶液粘度の決定、及び前記同じ吸収データから前記残りのパラメータを決定する知られた技術を適用することで達成される。
【００４１】
有利には、米国特許第７２６２８４７号明細書に記載される形のエリアイメージング検出器を使用することで、単一の検出器を用いてキャピラリーの長さに沿って２つの検出窓をサンプル溶液のプラグ又はフローフロントが通る時間差の高い精度及び正確な測定結果を得ることを可能にする。
【００４２】
有利には、本発明の実施態様は、小径キャピラリーの使用及び背景散乱に対するシグナルの識別により、高濃度の溶液での測定を実施することを可能にする。有利には、本発明は、処方された生体医薬溶液を、希釈、濾過又は他の変更をおこなうことなく迅速に特徴付けることを可能にする。本発明の実施態様は、製剤開発（Ｒ＆Ｄ）及び安定性試験（Ｒ＆Ｄ、ＱＣ）において有用であることが認められ得る。本発明の実施態様は、例えば血清や血漿などの体液に特徴的な媒体中でのタンパク質−小分子及びタンパク質−タンパク質相互作用の測定を可能にする。体液は、高濃度のタンパク質を持ち、かつリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの標準キャリア溶液とは異なる粘度を持つ、キャリア溶液である。
【００４３】
本発明の実施態様は、粘度、拡散係数及び流体力学的半径の濃度依存性を、ピークプロフィルの詳細な分析により単一の実験で測定することを可能にする。具体的には、パルスとして注入されたピークが前記検出器窓を通過する場合、単一のガウス曲線の良好なフィッティングが達成される場合には、このことは、濃度による粘度の変動は大きくないことを示す。しかし、フロント挙動を持つピークプロフィルは、サンプルが前記キャリア媒体よりも非常に高い粘度を持つことを示す。これは図５に示されており、以下詳細に説明される。前記フロント方法を用いることで、使用されるフィッティング関数は累積ガウス曲線である。前記フロントをフィッティングすることから得られた前記見掛け半径は、前記後部分のフィッティングで得られるよりも高くなり、これはサンプル濃度が増加すると粘度の増加を示す。累積ガウスフィッティング関数から大きく外れる場合には、このことは、図４に例示されているような粘度と濃度の間の異常な関係を示すものであり得る。
【００４４】
図１を参照して、これは本発明の実施態様によるサンプル溶液の比粘度測定のための実施装置を模式的に示す。有利には同じ装置が又、拡散係数及びサイズ（即ち、流体力学的半径−本明細書中で同意語として使用される）の測定に使用される。左図は、流入バイアルと流出バイアル間に伸びるキャピラリー２を持つ初期構成を示す。最初前記流入バイアルは前記キャリア溶液を含むＶ１である。前記キャピラリーは前記キャリア溶液で満たされ、次に前記サンプル溶液Ｖ３を含む第３のバイアルＶ３がバイアルＶ１と交換される。左図は、前記サンプル溶液Ａがポンプ圧ΔＰｉｎｊで前記キャピラリー２に注入されることを示す。前記サンプル溶液Ａは、前記キャリア溶液Ｓに溶解した溶質を含む。中央図は、前記同じ装置であって、パルスで注入されたサンプル溶液Ａは、Ｖ１とＶ２の間の一定圧ΔＰで駆動され、第１の窓Ｗ１でテーラー分散により広がり中心を持つパルス４が画像化される。右図は、前記サンプル溶液４がさらにさらにテーラー分散により広がり第２の窓Ｗ２の端部でその中心を持ち、画像化される。画像化は、Ｗ１及びＷ２イメージング窓の後ろに示されるエアリイメージング検出器６を用いて実行され、米国特許第７２６２８４７号明細書に開示される形の単一のアクティブ画像センサから形成される。図１からは明確ではないが、理解されるべきことは、前記最大吸収はそれぞれのプラグの中心であり得る、ということである。
【００４５】
前記拡散係数、サイズ及び相対粘度を計算するために、前記イメージング窓を出る前記サンプル領域の時間（前記窓の流出端部で測定される中心時間）ｔ１とｔ２を測定する必要があり、前記時間差は：
ｔ２−ｔ１＝Δｔ                                                  （２）
である。
【００４６】
吸光度（Ａ）のプロフィルがそれぞれの窓で測定され、それぞれの窓での時間の対してプロットされ、それぞれの窓の前記プロフィルのパラメータ（例えば標準偏差、変動）が計算され得る。
【００４７】
表１は、標準サンプルとして１ｍｇ／ｍＬ濃度のタンパク質を用い、かつ範囲４から９の繰り返し数（ｎ）の実験設定を用いて得られたデータの例を示す。前記相対粘度は、前記標準サンプルについての時間差と比較した前記サンプルの時間差から決定される。表１の実施例では、ある範囲の濃度と賦形剤スクロースのレベルの範囲についてタンパク質溶液の粘度が、スクロースが添加されていない１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液としての標準に対して決定される。表１に示される結果は、相対粘度の測定ための式１の使用を例示する。
【００４８】
【表１】
2013539047.tif 000003
：ある範囲のタンパク質及びスクロース濃度にわたる無添加又は添加スクロースのタンパク質についての時間
繰り返し数が第２カラムに与えられておりそれぞれの時間の平均値が標準偏差と共に与えられている。
【００４９】
前記時間差は、誤差伝播理論を用いて計算されて得られる値よりもより小さい誤差を持つように見える。具体的に、誤差伝播理論では、未補正誤差は加算的である。例えば、Ｗ＝Ｘ−Ｙについて、Ｗの誤差は［（Ｘの誤差）２＋（Ｙの誤差）２］の平方根であり、例えば前記表の１ｍｇ／ｍＬデータでは、（０．５４２＋０．５３２）１／２＝０．７６となり、前記実際に観察された誤差は０．３９であり；このことは前記時間が関係してることを確認する。時間差でのＲＳＤの範囲は０．１から０．４％である。このことは、相対粘度は、０．５％よりもよい精度で測定され得ることを示す。相対粘度は最後のカラムに、標準としてのスクロース無添加１ｍｇ／ｍＬタンパク質と共にまとめられている。
【００５０】
図１の装置を用いて、生体医薬組成物を特徴付けるキャリア溶液Ｓを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した９０ｍｇ／ｍＬタンパク質の溶液を調製し、サンプル溶液Ａをとして、ＰＢＳ中に溶解した同じタンパク質の１００ｍｇ／ｍＬを調製して、これをＰＢＳキャリア溶液Ｓ内の９０ｍｇ／ｍＬタンパク質中に注入した。これは、欧州特許第１５３０７１６Ｂ１号明細書に記載された時間変位積算を持つＵＶエリアイメージング検出器を、図１の実験装置とともに用いて、非常に高濃度のタンパク質を含むキャリアと共に用いて、前記サンプルの真の濃度差が１０ｍｇ／ｍＬであることから、異なる効果を見出す可能性を例示するものである。拡散は、前記サンプルの拡散と比較してよく一致するキャリア溶液を用いて測定することが最良であることが知られている。
【００５１】
ＰＢＳ内の１００ｍｇ／ｍＬタンパク質（人血清アルブミン）をＰＢＳ中の同じタンパク質の９０ｍｇ／ｍＬキャリア溶液中に注入した実験結果画像が図２に示され、ここではキャリア溶液としてのＰＢＳキャリア溶液中に注入されたＰＢＳキャリア溶液中の１０ｍｇ／ｍＬについての実験結果を共に示してある（全て２８０ｎｍで画像化）。図２には４つの結果Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが示されており：Ａ及びＢは、ＰＢＳ中９０ｍｇ／ｍＬキャリア溶液内に注入されたＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍＬの窓１及び２に対応し；Ｃ及びＤは、ＰＢＳキャリア溶液内に注入されたＰＢＳキャリア溶液中１０ｍｇ／ｍＬのマド１及び２に対応する。前記ピーク増幅は同じように見える：このことはそれぞれの場合に１０ｍｇ／ｍＬであるサンプルとキャリア溶液間のタンパク質濃度差と整合する。前記キャリア溶液（Ａ及びＢ）としてＰＢＳ中の９０ｍｇ／ｍＬタンパク質についての時間は、キャリア溶液としてＰＢＳの時間と比較して非常に長いように見える（窓１については６．５分に対して１１分；窓２については１２．５分に対して２１分）。この重要な点は、ここで記載される前記エリアイメージング装置及び方法は、高濃度タンパク質溶液中で粘度が測定され得る、ということである。
【００５２】
以下の表２は、この実験からのデータを最後に行で示す。キャリア溶液ＰＢＳ内に注入したＰＢＳ内に中の１００と１０ｍｇ／ｍＬタンパク質サンプルの結果（行１と２）及び前記キャリア溶液としてＰＢＳ中９０ｍｇ／ｍＬタンパク質内に注入した１００ｍｇ／ｍＬタンパク質（行３）の結果とを比較した。水の粘度値は、流体力学的半径を計算するために用いた。粘度は、標準サンプルとしてＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬタンパク質に相対する。
【００５３】
【表２】
2013539047.tif 000004
：相対粘度の比較
＊は全半径計算で仮定された水の粘度値
明らかなことは、時間差に大きな増加があることであり、このことは相対粘度は、前記緩衝液のみに比較して緩衝液中に９０ｍｇ／ｍＬタンパク質のキャリア溶液ではずっと大きいことである。標準サンプルとして前記１０ｍｇ／ｍＬとすると、前記相対粘度は前記時間差の比であり、式１はηｒｅｌ＝５７５．１０／３５８．３５＝１．６０５となる。この値は、ＰＢＳ中での９０ｍｇ／ｍＬ血清アルブミン溶液の相対粘度につき独立して測定された値とよい一致を示す。
【００５４】
前記拡散係数は同じであるとして、前記粘度が９０ｍｇ／ｍＬのものに修正される場合、計算半径は３．３３７／１．６０５＝２．０７９ｎｍとなる。このノミナル値はタンパク質−タンパク質相互作用を示す。他の技術、例えば動的光散乱では血清アルブミンについて同様の効果を示す。
【００５５】
本発明の第１の実施態様では、前記キャリア溶液とは異なる粘度を持つサンプル溶液の長さｌｉｎｊのプラグを注入する際に測定される。これは、前記キャリア溶液Ｓに相対する前記サンプル溶液Ａの粘度ηｒｅｌを式４を用いて計算するために使用され得る。有利にはこのことは、一致させた緩衝液を準備する必要がないことを意味する。この粘度差は、前記サンプル自体が高濃度（例えば１００ｍｇ／ｍＬタンパク質）の場合又は前記サンプルが溶液中で、糖や塩を高濃度で含まれ、この処方溶液が前記キャリア溶液と異なる場合に、起こり得る。多くの生体医薬タンパク質は適切な緩衝液中で処方され、かかる場合にはＰＢＳキャリア溶液などの標準緩衝液が前記キャリア溶液として使用され得る。前記サンプルプラグが、前記キャリア溶液Ｓで満たされたキャピラリー内に注入される。前記サンプルの比粘度、ηｓｐは、２つの窓付きキャピラリーを用いて、前記キャリア溶液とほぼ同じの粘度を持つ試験材料（例えば前記キャリア溶液中に溶解したカフェインのマーカー）の希釈溶液の注入されたプラグについての時間差Δｔ０、及び前記相対及び比粘度が決定されるべき前記サンプルを用いた時間差Δｔから決定され得る。これは、最初サンプルで満たされる前記キャピラリーの分率ｌｉｎｊ／Ｌを知る必要がある。類推によりこのことは一連の電気抵抗と似ている（例えばＤ．  Ｋｉｍ、  Ｎ．  Ｃ．  Ｃｈｅｓｌｅｒ及びＤ．  Ｊ．  Ｂｅｅｂｅの、「Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、  ２００６、  ６、  ６３９−６４４」を参照）。高抵抗区画（前記注入プラグに相当）が存在する場合、全抵抗は前記種々の区画に長さ及び抵抗値に比例して増加する。比粘度は式３で与えられ、比粘度及び相対粘度は式４で結び付けられる。
ηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ（Ｌ／ｌｉｎｊ）                （３）
ηｓｐ＝（η−ηＳ０）／ηＳ０＝ηｒｅｌ−１                          （４）
前記注入長さｌｉｎｊは通常は、前記キャピラリー長さＬ、前記キャピラリー半径ｒ、圧ΔＰ及び前記圧が注入のために適用された全時間ｔｉｎｊを用いてポアズイユの法則より計算される。
ｌｉｎｊ＝ｒ２ΔＰｔｉｎｊ／８ηＳ０Ｌ                                （５）
当業者に知られているように、前記半径は、固定時間ｔについて既知圧ΔＰで駆動される場合に前記キャピラリーを移動する既知粘度ηＳ０の溶媒（例えば水）の質量Δｍ及び密度ρを決定することで容易に得られる。半径の計算のためにこの方法はポアズイユの法則を次にように変形して用いる。
ｒ＝［８ηＳ０ＬΔｍ／πρΔＰｔ］１／４                    （６）
本発明のこの実施態様は、炭水化物生体ポリマーキサンタン及びスクシノグリカンの溶液中に溶解したカフェインのプラグを用いた実験で得られた結果を考慮することで例示される。両方共低濃度で水溶液に粘度を増加させることが知られている。これらの溶液はせん断希釈性、即ちせん断速度が増加すると粘度が減少する。図５は、（ｉ）ＰＢＳ中、（ｉｉ）ＰＢＳ中０．１％重量／体積キサンタン及び（ｉｉｉ）ＰＢＳ中中０．１％重量／体積スクシノグリカン中に溶解したカフェインの希釈溶液のプラグを注入した結果を示す（全て、前記キャリア溶液としてＰＢＳを用いた）。図５は、一定圧１０００ミリバールで実施され、前記２つの窓で前記の３種類のサンプルのそれぞれにつき与えられた３回の繰り返実験結果の全てを重ねたものであり、前記技術の再現性を示すものである。（ｉ）及び（ｉｉ）についての波長は、２１４ｎｍ、（ｉｉｉ）についての波長は２５４ｎｍであった。カフェインは２１４ｎｍより２５４ｎｍでより低い吸収係数を持つことから、このことが全ての注入容積が同じであるけれども（ｉｉｉ）でのより小さいシグナル強度の原因である。
【００５６】
粘度測定に関して本発明いくつかの利点がこれらのデータを考慮することで導き出される。第一に、非常に少量のサンプルで結果が得られる、ということである。注入体積はわずか２３０ナノリットルである。これは他の技術に比べて数桁小さい。明らかなことは、スクシノグリカンに溶解したカフェインは最も遅いことであり、従って、この溶液は最も高い粘度を持つ、ということである。前記種々の粘度パラメータの定量的測定は前記結果から以下説明されるように導かれる。
【００５７】
第２の利点はピークプロフィルからの情報である。ＰＢＳ中の前記サンプルについてのプロフィルがガウス対称性を持つ一方で、スクシノグリカン中のサンプルについてのプロフィルが異なる先端面（フロンティグ）を持つ非対称性を示すことである。この挙動は、せん断希釈性と整合する。キャピラリー中でのせん断希釈流体については、前記速度勾配がゼロである中心部分で前記サンプルはせん断性を受けず、従って、高い粘度を持ち、一方で前記キャピラリーの壁の前記サンプルは最も高いせん断性を受け従って最も低い粘度を持つ。かかる状況では、前記フローフロントは、ニュートン流体の特徴である放物線形状から外れて、より平坦なプラグ状プロフィルを取る。図５の結果は、せん断希釈溶液中での非ニュートン挙動を定性的に研究するためのピークプロフィルを使用する利益を示すものである。
【００５８】
表３は、式３、４及び５を用いて、３つの異なる駆動圧で０．１％スクシノグリカンについての相対粘度及び比粘度、これらの条件下での前記溶液の絶対粘度、及び標準レオメトリー方法から得られた値との比較を例示する。前記キャピラリーは、Ｌ＝１２９．９ｃｍ及びｒ＝３８．６μｍであった。サンプル溶液は６秒間で圧５００ミリバールで注入された。温度は２５℃であった。２５℃での水の粘度ηＳ０は０．８９０５ｍＰａｓであり、Ｌ、Ｐｉｎｊ及びｔｉｎｊについての値を式５に代入して前記注入長さｌｉｎｊ＝４．８３ｃｍとなった。従って、前記ファクタＬ／ｌｉｎｊ＝１２９．９／４．８３＝２６．８９であった。第４列に与えられている比粘度の値は前記時間及び長さ比のファクタから誘導され、かつ第６列の粘度は前記水の粘度による相対粘度を掛け算して得られた。第７列に与えられるせん断速度は、式４（ｌ２−ｌ１）／（ｒΔｔ）を用いて計算され、ここで前記キャピラリー半径を、窓間の長さ（ｌ２−ｌ１）＝４０．５ｃｍ＝０．４０５ｍ及び前記第２列から時間差を用いた。表３の最後の列は、せん断速度の関数として０．１％スクシノグリカンについて独立した粘度のレオメトリー研究から得られた値を与えた。明らかに、本発明の第１の実施態様を用いて及び独立した方法を用いて測定された前記せん断依存粘度とでの間には良好な一致が見られる。
【００５９】
【表３】
2013539047.tif 000005
：０．１％のスクシノグリカンについての相対粘度、比粘度及び粘度を決定するためにカフェインピークについて時間の使用を示す。
それぞれの時間の違いは、３回繰り返し実験の平均値である。最後の列の粘度値は、独立したレオロジー方法からの値である。
【００６０】
ここまで記載された本発明の実施態様はキャリア溶液で満たされたキャピラリーに前記サンプルのプラグを注入することでサンプル組成物の特質を計算することに関するものであるが、以下さらに本発明の実施態様を説明し、そこではキャピラリーは最初キャリア溶液で満たされ、次にサンプル溶液が一定圧下で前記キャピラリー内に連続的に供給される、ものである。測定は前記サンプルのフローフロントの取得である（画像化）。
【００６１】
フロント分析では、前記２つの窓での時間が得られ、及びこの時間差Δｔから前記比粘度が、前記標準サンプルが時間差Δｔ０を与える前記キャリア溶液の粘度を大きく変えないような前記溶媒中での希釈溶液として例えばカフェインなどの標準サンプルとの実施を参照することで得られる。
【００６２】
希釈カフェインは、プラグ又はフロントとして注入される場合には前記キャリア溶液に抵抗を当てることがなく、従って、標準サンプルの必要性を満たす。
【００６３】
図３を参照して、ここにはフロント分析モードでの拡散係数、サイズ及び相対粘度の測定のための実験装置が示される。理解されるべきことは、これは実質的に図１の装置と同じであり従って、同じ符号が付されているということである。左図は、最初の配置であり、キャリア溶液Ｓが満たされた流入及び出流バイアル（Ｖ１とＶ２）の間に伸びる前記キャピラリーが設けられていることを示す。中央図は、前記流入バイアルＶ１が同じ溶液Ａを含むバイアルＶ３で置換され、これが前記キャピラリーを一定圧ΔＰで駆動される、ことを示す。前記中央図では、前記フローフロントは前記第１の窓Ｗ１の下流端部に位置している。右図は、後に第２の窓Ｗ２の端部で前記フローフロントの中央部で画像化される前記サンプルフローフロントを示す。Ｗ１及びＷ２の後ろのエリアイメージング検出器６は、単一のアクティブ画素センサ上に両方の窓で画像化する。
【００６４】
前記ＳＡフローフロントがそれぞれの窓を通過すると、前記イメージング検出器（個々の画素を示すために図中網掛けされている）が、ＳＡフロントが前記イメージング領域を横切る際に一連のフレーム画像を取得する。２つの連続するフレーム画像を分析することで、窓Ｗ１及びＷ２での前記フロントの中心、ｔ１及びｔ２、及び前記フロントの標準偏差及び変動が計算され得る。時間差Δｔ＝ｔ２−ｔ１は、Ｓ中に溶解した標準サンプルの希釈溶液のＳ中内へフロント又は前記の通りＳ中の標準サンプルのプラグ駆動される際に測定される時間差Δｔ０と比較される。比粘度は次にこれらの時間差及び前記第１及び第２の窓の端部への距離ｌ１及びｌ２をそれぞれ、及び前記キャピラリーの全長さＬに従う。
ηｓｐ＝［（Δｔ−Δｔ０）／Δｔ０］ｘ［２Ｌ／（ｌ１＋ｌ２）］          （７）
この式は流体原理から導かれる。流速、流体力学的抵抗及び圧力低下は、電子回路の電流、抵抗及び電圧に類似する（前記参考文献）。一定圧で前記キャピラリーを駆動する際に、前記流速は、前記サンプルの流体力学的抵抗が前記緩衝液よりもより大きいことから時間とともに減少する。流体力学的抵抗は直接粘度に比例することから、時間にわたり動く距離を積分することで式７を得る。
【００６５】
サンプル溶液の固有粘度ηｉは、必要ならば、前記プラグ分析又はフロント分析から計算された比粘度ηｓｐから式８を用いて質量濃度を組み合わせることで計算され得る。
ηｉ＝ｌｎ（１＋ηｓｐ）］／ｃ                                          （８）
濃度ゼロへ外挿限界では、前記固有粘度は極限粘度［η］と等しくなることが知られている（例えば、「Ｊ．  Ｌ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓ、  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｈａｐｅｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｄｕｃ．  １９９３、  ７０、  ６８５−６８９」参照）。前記極限粘度、通常は単位ｃｍ３ｇ−１で報告されるが、濃度に依存せず、溶質に特有のパラメータであり、タンパク質及びポリマーでは特に重要である。
【００６６】
本発明のこの第２の実施態様は、ある濃度範囲（％重量／体積）でスクロースの溶液に溶解されたカフェインを用いて実験で得られた結果を考慮することで例示される。図６は、キャリア溶液Ｓとして水を用いて、Ｓに溶解した標準サンプルとして水（０％スクロース）中の２００ｐｐｍカフェイン溶液を用いたフロント実験（ラン）を示す。前記検出波長は２１４ｎｍであり、かつ駆動圧は６３０ミリバールであった。それぞれの窓での前記フロントにつき１つの累積ガウス曲線へのフィッティングが示され、これらの中心から、前記時間が得られ、これによりこの場合時間差Δｔ０が与えられる。このフロント実験からのデータ曲線は、図３を参照して理解され得る。前記ＳＡフロントが前記第２の窓を通過し前記キャピラリーを満たした後、バイアルＶ３はＶ１と交換される。キャリア溶液は、その後前記キャピラリーを通して駆動され、前記プロフィルの後部を見ることを可能にする（即ちＡＳへの変化）。前記ＡＳプロフィルが前記窓を通過した後、前記吸光度は前記キャリア溶液に特有のベースラインへ戻ることとなる。
【００６７】
水をキャリア溶液として、ある範囲の濃度でスクロースを含む溶液に溶解したカフェイン２００ｐｐｍを含むフロント実験から得られた相対及び比粘度が表４に与えられる。表４に与えられるΔｔは、３回の実験の平均値である。水中のカフェインは標準サンプルであり、前記表で最初の行でΔｔ０として与えられている。相対標準偏差パーセントは再現性を示し、相対粘度の全ての値は２％よりよい精度で得られ得ることを示す。最終列には、文献から得られる値が与えられており（Ｊ．  Ｃｈｉｒｉｆｅ及びＭ．  Ｂｕｅｒａ、「Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇ．、  １９９７、  ３３、  ２２１−２２６」）、前記技術の誤差範囲内でよく一致していることを示す。
【００６８】
【表４】
2013539047.tif 000006
：  スクロース濃度の増加、５％、１０％、１５％及び２０％につき、第１及び第２の窓でのピーク間の時間差、及び比粘度と相対粘度を示す。
前記キャピラリーは、Ｌ＝１３２．２ｃｍ、ｌ１＝４４．９ｃｍ、ｌ２＝８９．９ｃｍ、２Ｌ（ｌ１＋ｌ２）＝１．９６であり、温度＝２５．０℃であった。
【００６９】
本発明のこの第２の実施態様を用いた事件から得られる結果はまた、サンプル濃度及び流体力学的半径の測定を準備するために使用され得る。濃度は、前記測定データの強度から得られ、即ちキャリア溶液とサンプル間の吸光度についての差として得られ、これは前記測定波長での吸光度係数を知ることで濃度に関連付けることが可能となる。流体力学的半径は以下で説明される。かかるデータから拡散係数及びサイズを決定する手順は、従来技術に、例えば「ｗｗｗ．ｐａｒａｖｔｅｃ．ｃｏｍ」から入手可能なアプリケーションノートＴＮ００１、ＡＮ００１、ＡＮ００５及びＡＮ０１５（「Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｔａｙｌｏｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ」；「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ  ｆｏｒ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒ  ａ  ｗｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｎｇｅ」；「Ｒａｐｉｄ  ｓｉｚｉｎｇ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」；及び「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｚｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡｃｔｉＰｉｘ  ＴＤＡ２００  Ｎａｎｏ−Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」）に記載されている。留意されるべきことは、前記標準テーラー分散式に影響を与える前記実験の間の速度の変化を補正するために、得られる前記半径は、前記キャリア溶液の粘度が通常は、フロント分析を考慮する場合にはファクタΔｔ／Δｔ０で割って補正され、後部分を分析する場合にはこのファクタを掛けることで補正されるべきであるということを仮定して得られる、ということである。
【００７０】
より複雑な系への本発明の前記第２の実施態様の応用は次に記載される。図５を参照して、これは第１及び第２の検出窓を通過するある範囲のサンプルのプラグについての吸収プロフィルを示す。トレースＡ及びＢは低濃度、窓１及び２それぞれでの小分子フロント（ソルベート）であり、これはカフェインプラグと同じ位置で鋭いフロントとして現れている（カーブＡ及びＣでガウス関数と見える）。これは前記ソルベートフロントフローが前記流体抵抗に影響を与えないことから標準時間差Δｔ０を与える。また、砂糖４％（重量／体積）を含む溶液中で高濃度（６０ｍｇ／ｍＬ、即ち６％（重量／体積））の薬物の２つの異なる処方物を用いた実験が示されている。キャリア溶液は水である。処方物１は窓１でトレースＣを、窓２でトレースＥを与える。処方物２は窓１でトレースＤを、窓２でトレースＦを与える。これらは顕著に遅く、従って、相対及び比粘度が高い精度で計算され得る。前記フロントの拡散係数及び半径は、２つの重なる累積ガウス関数へフィッティングさせることで得られる。前記フロントの上部部分は、前記砂糖溶液中での拡散に関係し（ここでは処方物は安定）、かつ前記サイズは前記分子の予想されるサイズから導かれる。前記フロントの下部部分は水中の前記薬物の拡散に関係する。前記データの分析は、前記薬物が前記水部分で高い流体力学的半径を持つことを示し、ミセル凝集物の形成と一致する。前記砂糖は独立して拡散し相対的に鋭いフロントを与え、それにより、前記薬物フロントの最先端は確実に前記砂糖部分から離れるように動き出す。
【００７１】
表５は、前記２つの薬物処方物についての相対粘度及び比粘度、及び両方の処方物での前記薬物についての固有粘度を得るための式７及び８の使用を例示する。
【００７２】
【表５】
2013539047.tif 000007
：２つの処方物中の薬物についての比粘度、相対粘度及び固有粘度を与えるための時間の使用。
両方の処方物も、ｃ＝０．０６０ｇｃｍ−３である。前記標準サンプルは水中のソルンベート又はカフェインであり、Δｔ０＝２８．５秒である。前記キャピラリーは、Ｌ＝１４３．３ｃｍ、ｌ１＝４９．９ｃｍ、ｌ２＝９６．３ｃｍ、２Ｌ（ｌ１＋ｌ２）＝２．００である。温度＝２５℃である。
【００７３】
有利には、本発明の実施態様は、サンプルの比粘度を、非常に小容量であっても測定を可能にする。パルスモードで（第１の実施態様）注入される容量は通常は１００から２５０ナノリットルである。フロントモード（第２の実施態様）では、前記容量は、通常約５マイクトリットルである。これは従来の技術に比べて実際に有利であり、従来の技術では通常は５０マイクロリットル以上が一回の測定で必要とされるからである。
【００７４】
本発明は、異なる技術を用いて達成される粘度測定とよく関連するサンプル溶液の相対粘度及び比粘度を測定する方法を提供する。図５及び表３を参照して示されるように、せん断希釈の効果を、前記ピークプロフィルへのせん断希釈の効果を観察することで評価することを可能にする。
【００７５】
有利には、本発明の実施態様は、フロント又はプラグの異なる部分を別々に分析することを可能にする、というのはこれらはキャリア媒体の異なる成分に対応し得るからである。これは図４の前記説明を参照して示され得る；前記フォロンとは１つの累積ガウス関数にフィッティングしないが、異なる半径を持つ成分を持ち２つの重なる累積ガウス関数として解析することが可能となる。
【００７６】
本発明のさらなる変形及び応用は、特許請求の範囲から外れることなく当業者には明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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