(57)【要約】  がん幹細胞（ＣＳＣ）、好ましくは神経芽細胞腫幹細胞および神経膠芽腫幹細胞の治療的除去のための、パルボウイルス、好ましくはＨ−１ＰＶの使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん幹細胞（ＣＳＣ）を治療的に破壊する方法における使用のためのパルボウイルス。
【請求項２】
ＣＳＣを破壊するための医薬組成物の調製のための、パルボウイルスの使用。
【請求項３】
前記がん幹細胞が（ａ）化学療法または放射線療法に抵抗性のがん幹細胞、または（ｂ）潜在的に再発性のがん幹細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記がん幹細胞が神経芽細胞腫幹細胞または神経膠芽腫幹細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記パルボウイルスがＨ１（Ｈ−１ＰＶ）または近縁の齧歯類パルボウイルスである、請求項１または４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記近縁の齧歯類パルボウイルスがＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）またはラットウイルス（ＲＶ）である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記パルボウイルスが静脈内（ｉ．ｖ．）、腫瘍内、頭蓋内または脳内投与により投与される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがん幹細胞（ＣＳＣ）、好ましくは神経芽細胞腫または神経膠芽腫の幹細胞の治療的除去のためのパルボウイルス、好ましくはＨ−１ＰＶの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
小児において、神経系を起源とする腫瘍は最も頻度の高い固形腫瘍である。それらの中で、神経芽細胞腫は最も頻度が高い頭蓋外の固形腫瘍である。神経芽細胞腫は交感神経系の前駆細胞に由来し、交感神経鎖に沿った高度の悪性腫瘍に至る。ハイリスクの神経芽細胞腫はしばしば、ＭＹＣＮがん遺伝子の増幅およびＮ−ｍｙｃタンパク質の継続的な過剰発現を特徴とする。外科手術、メタヨードベンジルグアニジンによる放射性医薬品治療、自家幹細胞救援を使用した高用量化学療法、局部照射およびレチノイン酸維持療法を包含する集学的治療概念の導入にもかかわらず、ハイリスク神経芽細胞腫の患者は長期生存率が約３０％と転帰が非常に悪い。これらの腫瘍は治療上の課題が残っており、生き残った小児は治療に関連した急性および長期の毒性に苦しむ。
【０００３】
悪性のヒト神経膠芽腫はヒトの悪性脳腫瘍の最も大勢を占める。従来の神経膠腫治療のアプローチとしては、神経外科的手法（切除または定位処置）、放射線療法および化学療法が挙げられる。悪性神経膠腫の放射線療法（ＲＴ）は患者の生存期間を数カ月間延ばすが、他の標準療法同様、腫瘍の再発を防ぐことはできない。しかしながら、これらの療法にもかかわらず神経膠芽腫は不治と考えられており、その理由は電離放射線を使用した治療、化学療法および／または外科的な切除は患者寿命の非常に限定的な延長しか達成できないためである。典型的に、診断後の平均寿命は約１２から１６カ月である。したがって、特に神経芽細胞腫および神経膠芽腫のための新規の治療法が喫緊に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように本発明の目的は、現行の療法の不都合を克服する、腫瘍、好ましくは神経芽細胞腫または神経膠芽腫の効率的な療法のための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によると、この目的は特許請求の範囲に定義される発明の主題により達成される。驚くべきことにパルボウイルスはがん幹細胞を死滅させることにより効率的な療法に成功裡に用いられ得ることが見出された。
【０００６】
腫瘍溶解性ウイルスは有望な新種のがん細胞特異的生物剤であり、感染して正常な組織を残しながら形質転換された細胞を死滅させる。インビトロおよびインビボの両方で観察される腫瘍溶解作用に加えて、これらのウイルスはまた、ウイルス感染した腫瘍細胞の除去を誘導する免疫賦活性シグナルをももたらす。それによって自然免疫系および獲得免疫系は腫瘍抗原に到達し、交差提示およびワクチン作用に至る。神経芽細胞腫モデルにおいて、ニューカッスル病ウイルス、弱毒化ポリオウイルスならびに腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１および２を包含する種々の遺伝子改変の腫瘍溶解性ウイルスが適用されている。
【０００７】
いくつかの自律性の齧歯類パルボウイルスは形質転換の、および腫瘍由来の齧歯類およびヒト細胞株をインビトロで優先的に死滅させることを示した一方、非形質転換細胞においては細胞破壊的な活動は観察されなかった。特に、Ｈ−１ＰＶは種々の形質転換または腫瘍由来細胞中で複製して細胞変性作用を発揮することが見出された一方、非形質転換細胞はインビトロおよびインビボで影響されないままである。観察されたＨ−１ＰＶの腫瘍溶解作用は、感染した細胞のアポトーシスや壊死、またはリソソーム内腔からサイトゾルへのカテプシン放出を引き起こすリソソーム膜の透過化処理を包含する異なった細胞死プログラムに起因している。異なる悪性腫瘍における細胞死の誘導による個々のメカニズムは、主に個々の細胞のバックグラウンドに依存すると思われる。
【０００８】
Ｈ−１ＰＶは約５ｋｂの直線状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、小さな（２０〜２５ｎｍ）、無エンベロープのパルボウイルスである。核内でのその複製はＳ期関連因子に厳密に依存しており、溶解感染サイクルの完了は増殖および分化プロセスの結果として発現する細胞因子に密接に依存する。非構造タンパク質ＮＳ１はパルボウイルスの複製開始およびその細胞毒性の誘導に不可欠な役割を果たす。パルボウイルスは静止細胞をＳ期に入るように誘導する能力がなく、感染は宿主細胞がそれら自体でＤＮＡ複製に入るまで潜在したままである。この宿主細胞の複製への依存は、自律性齧歯類パルボウイルスの組織特異性、腫瘍親和性（ｏｎｃｏｔｒｏｐｉｓｍ）および腫瘍溶解活性を部分的に説明する。
【０００９】
ラットが天然のＨ−１ＰＶ宿主であるが、他の齧歯類、例えばハムスターおよびマストミスなどに実験的に感染させることができる。時折、ヒトの感染および抗体陽転が報告されている。Ｈ１−ＰＶは、ヒトにおいては全身に適用された場合でさえ非毒性のように見える。Ｈ−１ＰＶの腫瘍溶解作用は、種々のヒト腫瘍実体（ｅｎｔｉｔｙ）、例えばリンパ腫、膵臓がん、神経膠芽腫細胞株、肝がんおよび乳がんなどに対して、インビトロおよびインビボで研究されている。しかしながら、小児腫瘍に対するＨ−１ＰＶの腫瘍溶解作用はあまり研究されていなかった。
【００１０】
本発明に至る研究において、神経芽細胞腫細胞の治療のための腫瘍溶解性Ｈ−１ＰＶ適用についての前臨床インビトロ評価が実施された。Ｈ−１ＰＶの感染効率、ウイルス複製および溶解活性は、ＭＹＣＮステータスが異なる１１個の神経芽細胞腫細胞株において分析された。ウイルスの腫瘍選択性は、起源が異なる非悪性乳児細胞の短期培養物の感染により確認された。短期培養でのグリア細胞、神経細胞、アストロサイトの混合培養は、細胞の生存率または形態に対してＨ−１ＰＶが作用を持たないことを明らかにした。対照的に、０．００１から１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで試験された全ての神経芽細胞腫細胞株において溶解感染が誘導された。Ｈ−１ＰＶは活発に複製され、ウイルスの力価は感染後４８から９６時間以内に１０．０００倍まで増加した。Ｈ−１ＰＶの溶解作用はＭＹＣＮがん遺伝子の増幅または分化ステータスと独立して観察された。その上、ＭＹＣＮが増幅された神経芽細胞腫細胞株におけるウイルスタンパク質の発現はＮ−ｍｙｃ発現の下方制御と相関した。感染効率、迅速なウイルス複製および神経芽細胞腫細胞に対する徹底的な溶解作用は、非形質転換細胞へのＨ−１ＰＶの低毒性と相まって、このパルボウイルスを神経芽細胞腫の腫瘍溶解ウイルス療法の有望候補とする。
【００１１】
要約すると、本発明に至る実験は、がん幹細胞、例として神経芽細胞腫幹細胞のパルボウイルスへの感染が、非常に低い副作用しか持たない新しく高度に有効な療法を提示することを示す。この種の療法は化学療法および放射線療法に抵抗性のＣＳＣに関しても、なお有効である。
【００１２】
このように、本発明はがん幹細胞（ＣＳＣ）を治療的に破壊する方法における使用のためのパルボウイルス、好ましくは齧歯類パルボウイルスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で用いられる用語「がん幹細胞（ＣＳＣ）」は、正常幹細胞に関連した特性を有する、具体的には特定のがん試料中で見出される全ての細胞型を生じさせる能力を有する、（腫瘍または血液がん内で見出される）がん細胞をいう。ＣＳＣはしたがって、ＦＣＳ含有培地中で成長させる一般的に用いられる細胞培養よりもはるかに少ない細胞数で腫瘍原性（腫瘍形成性）である。ＣＳＣは幹細胞の自己再生および多様な細胞型への分化のプロセスを経て腫瘍を生成し得る。より最近の文献において、初期の用語「がん幹細胞」は用語「腫瘍幹様細胞」または「腫瘍始原細胞」に置き換えられている。このように、用語「腫瘍幹様細胞」または「腫瘍始原細胞」は用語「がん幹細胞」と本質的に同義である。
【００１４】
腫瘍内部のこの悪性細胞細画分は幹細胞マーカーの発現を特徴としており、神経外胚葉起源の腫瘍始原細胞、例えば神経膠芽腫または神経芽細胞腫などの場合、このマーカーはＣＤ１３３、ネスチンおよびＳＯＸ２などである。いくつかの悪性疾患、その中でも神経膠芽腫の場合、従来の細胞増殖抑制薬での治療はこの画分内の細胞数を増加させることがインビトロおよびインビボで示されている。したがって、これらの腫瘍幹細胞は新たな腫瘍を生じさせることにより再発および転移を引き起こすという仮説が立てられている。したがって、とりわけ小児および転移性疾患を有する患者の場合、ＣＳＣを標的とする本発明の療法はがん患者の生存性および生活の質を改善する。
【００１５】
用語「がん幹細胞を治療的に破壊すること」は、腫瘍内のＣＳＣの割合が治療に伴って減少するよう、ＣＳＣをパルボウイルスの腫瘍溶解および細胞毒性活性により死滅させることを意味する。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「パルボウイルス」は、野生型またはその組換え派生体、同様にかかるウイルスまたは派生体をベースとする近縁のウイルスまたはベクターを含む。遺伝子療法に有用である適切なパルボウイルス、派生体などは当業者に公知である。
【００１７】
本発明の使用の好ましい実施形態において、ＣＳＣは（ａ）化学療法または放射線療法に抵抗性のがん幹細胞、または（ｂ）潜在的に再発性のがん幹細胞である。
【００１８】
本発明の使用のさらに好ましい実施形態において、前記がん幹細胞は神経芽細胞腫幹細胞または神経膠芽腫幹細胞であり、これらは神経外胚葉起源のがん幹細胞のモデルを代表するものである。
【００１９】
さらに好ましい実施形態において、パルボウイルスは齧歯類パルボウイルス、好ましくはＨ１であるか、または近縁の齧歯類パルボウイルス、例えばＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）もしくはラットウイルス（ＲＶ）などである。
【００２０】
投与のため、これらのパルボウイルスなどは好ましくは適切な医薬担体と組み合わされる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば油／水エマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。その上、転移性ラット肝がんモデルにおいて、担体として役目を果たす自己腫瘍細胞の中に送達された場合にＨ−１ＰＶが治療ワクチンとして働くことを示すことができた（Ｒａｙｋｏｖら、２００７年）。かかる担体は従来法により処方し、適切な用量で対象に投与することができる。適切な組成物の投与は異なる方法により、例として静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により達成され得る。血液脳関門を通じて侵入する能力を持つ感染性ウイルス粒子が用いられる場合、例としてＨ−１ウイルスの静脈内投与により治療を実施、少なくとも開始することができる。しかしながら、長期の静脈内治療は、Ｈ１ウイルスに対する中和抗体の形成により不十分なものになる可能性がある。したがって、異なる様式の頭蓋内または腫瘍内へのウイルス適用が好ましいであろう。その上、腫瘍除去の間にまたは別々の処置により小さな皮下リザーバー（リッカム（Ｒｉｃｋｈａｍ）リザーバー）に連結されたシリコンカテーテルを留置した後は、さらなる外科手術を行うことなく様々な時にパルボウイルスを局所注入することができる。パルボウイルスまたは派生のベクターはまた、定位外科手術でまたはニューロナビゲーションを使用したターゲティングにより、ＣＳＣ内に注入されることもできる。上述の適用方法の組み合わせもまた可能である。
【００２１】
投与計画は担当医および他の臨床要因により決定されるものである。医学分野で周知であるように、任意の一人の患者に対する用量は多くの要因に依存し、これらの要因としては患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定のウイルスや細胞など、投与の時間および経路、全体的な健康および同時に適用される他の薬剤または療法が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（Ａ）ＮＢ１２４、ＭＯＩ  １のＨ−１ＥＧＦＰで感染後７２時間。（Ｂ）ＮＣＨ４２１、ＭＯＩ  ５０のＨ−１ＥＧＦＰで感染後３６時間。（Ｃ）Ｋｅｌｌｙ、ＭＯＩ  １のＨ−１ＥＧＦＰで感染後４８時間。（Ｄ）ＩＭＲ−３２、ＭＯＩ  １のＨ−１ＥＧＦＰで感染後４８時間。
【図２】（Ａ）ＮＢ１２４神経芽細胞腫前駆細胞のＮＳ１ウエスタンブロット。（Ｂ）３つの神経膠芽腫幹様細胞のＮＳ１ウエスタンブロット。
【図３】神経芽細胞腫始原細胞および神経膠芽腫幹様細胞のｗｔＨ−１ＰＶでの感染。詳細は実施例４を参照。
【図４】（Ａ）ＮＢ１２４の細胞形態、ｗｔＨ−１ＰＶで感染後３週間。（Ｂ）ＮＣＨ４２１の細胞形態、ｗｔＨ−１ＰＶで感染後３週間。
【図５】Ｈ−１ＰＶ感染は神経芽細胞腫始原細胞および神経膠芽腫幹様細胞において感染後１５日以内に細胞生存率を顕著に低減させる。左のパネル：Ｈ−１ＰＶでの感染後１５日目のＭＴＴ  ＮＢ１２４。右のパネル：Ｈ−１ＰＶでの感染後１５日目のＭＴＴ  ＮＣＨ４２１
【図６】Ｈ−１ＰＶは神経芽細胞腫始原細胞および３つの神経膠芽腫幹様細胞株に対して用量依存的な様式で細胞増殖抑制作用を誘導する。詳細は実施例７を参照。  以下の例は本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００２３】
材料と方法
（Ａ）細胞培養
ヒト神経芽細胞腫ニューロスフェア培養細胞ＮＢ１２４はＤｒ．Ｈｅｄｗｉｇ  Ｅ．Ｄｅｕｂｚｅｒ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｕｎｔｉ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｏｃｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。ヒト神経膠腫幹様細胞株ＮＣＨ４２１、ＮＣＨ４４１、ＮＣＨ６２０およびＮＣＨ６４４はＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙのＰＤ  Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓｔｅｌ  Ｈｅｒｏｌｄ−Ｍｅｎｄｅから入手した（Ｃａｍｐｏｓら、２０１０年）。基礎培地（幹細胞用）：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン。幹細胞培地：基礎培地、２０％ＢＩＴ１００サプリメント（ｐｒｏｖｉｔｒｏ  ＧｍｂＨ、ベルリン）、０．０２％ｂＦＧＦ（ＲＥＬＩＡ  Ｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、ヴォルフェンビュッテル）、０．０２％ＥＧＦ（ＲＥＬＩＡ  Ｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）。トリプシンブロッキング培地：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン）、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン。先に公表されたように幹様細胞をニューロスフェア培養として増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２で各増殖培地中で培養した（Ｗａｎら、２０１０年）。
【００２４】
（Ｂ）ウイルス生産および感染
野生型Ｈ−１ＰＶはＮＢＫ−３２４Ｋヒト胚腎臓細胞に感染させることにより生産し、ろ過（粒子の最大直径０．２μｍ）およびイオジキサノール勾配遠心分離により精製した。ウイルスストックのエンドトキシン混入は＜２．５ＥＵ／ｍｌであった。各増殖培地中で３７℃でトリプシン処理を行った後、細胞を単一細胞懸濁液としてＨ−１ＰＶに感染させた。
【００２５】
（Ｃ）感染性Ｈ−１ＰＶ粒子の検出
ウイルスの力価を先に記載されたように決定した（Ａｎｇｅｌｏｖａら、２００９年）。簡潔には、アッセイの２４時間前にＮＢ−３２４Ｋ細胞（７．６×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。予め感染させたニューロスフェア培養上清の１０倍段階希釈により細胞を感染させ、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
【００２６】
アルカリ溶解（０．７５Ｍ  ＮａＯＨ）の後、ＤＮＡをナイロン膜に転写し、架橋し、Ｐ３２で放射標識されたＮＳ−１特異的プローブを使用してハイブリダイズした。ブロットをオートラジオグラフィー用Ｘ線フィルムに露光した。力価実験は常に２連で実施した。ウイルスは教科書中で指示されるように感染多重度（ＭＯＩ、１細胞あたりのプラーク形成単位；ｐｆｕで表現される）で適用した。
【００２７】
（Ｄ）ウイルスＤＮＡの抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ
感染させたニューロスフェア細胞培養の上清を感染後の異なる時点で回収した。上清をＴＥバッファーに溶解した１Ｍ  ＮａＯＨ中で５６℃で３０分間アルカリ溶解に供した。等モル濃度のＨＣｌを使用して中和した後、滅菌水を使用して試料を１：１００に希釈して直接的に分析した。ウイルスＤＮＡの定量化は、他で記載されたように（Ａｂｓｃｈｕｅｔｚら、２００６年）、ＮＳ１特異的なＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ、カールスバッド（カルフォルニア州）、アメリカによる））を使用したリアルタイムｑＰＣＲにより、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ、カールスバッド（カルフォルニア州）、アメリカによる））を用いて行い、ＳＤＳ２．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ、カールスバッド（カルフォルニア州）、アメリカによる））によって分析した。簡潔には、Ｈ−１ＰＶの  ＮＳ１遺伝子内にある１４１ヌクレオチドのＤＮＡ断片を増幅し、プローブ：５’−６−ＦＡＭ−ＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧ−ＡＣＡＧＴＴＡ−Ｑ−ＭＧＢ  ３’を用いて検出した。１０１〜１０８コピー／反応の範囲で段階希釈した、ＮＳ１配列を含有したプラスミドをｑＰＣＲの標準化に用いた。個々の反応混合液（２０μｌ）は１×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．３μＭの標識ＮＳ１−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、０．３μＭの各プライマーおよび３μｌの鋳型から構成された。ＰＣＲ条件は５０℃で２分間（ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）による混入した鋳型の破壊）、次いで９５℃で１０分間、その後に９５℃で１５秒間の変性および６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長を４０サイクルであった。
【００２８】
（Ｅ）顕微鏡検査
Ｃｅｌｌ  Ｂソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｅｕｒｏｐａ  ＧｍｂＨ、ハンブルク、ドイツ）を用いた倒立位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ；Ｍｏｄｅｌ  ＣＫＸ４１）を用いて位相差画像を生成した。他の位相差画像はＬｅｉｃａ  ＤＦＣ３５０  ＦＸ（商標）カメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ヴェッツラー、ドイツ）およびＭａｃｉｎｔｏｓｈ用のＬｅｉｃａ  ＦｉｒｅＣａｍ（商標）ソフトウェアを用いて取得した。
【００２９】
（Ｆ）細胞生存率および溶解の評価
神経芽細胞腫細胞の増殖を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して、製造者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）により推奨されるように試験した。細胞（１ウェルあたり２，５００個の細胞）を９６ウェルプレート中で培養し、図中で指示されるＭＯＩで感染させた。１５日後、ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を使用して２時間までインキュベートした。上清を捨て細胞を乾燥させた後、１ウェルあたり１００μｌのイソプロパノールを添加した。消光値を５７０ｎｍでの測光法で決定した（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｐｌｕｓ（商標）、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、ハンツビル、アラバマ州、アメリカ）。
【００３０】
細胞溶解は、培地への乳酸デヒドロゲナーゼの放出をＣｙｔｏｔｏｘ９６細胞毒性アッセイキット（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ））を使用して製造者の説明書にしたがって測定することにより決定した。
【実施例２】
【００３１】
神経芽細胞腫前駆細胞および神経膠芽腫幹様細胞はＨ−１ＰＶに感染しやすいこと：
Ｈ−１ＰＶが神経芽細胞腫前駆細胞に感染可能であるか決定するため、ＮＢ１２４細胞を、１細胞あたり１複製単位の、ＧＦＰを発現する組換えの複製欠損Ｈ−１ウイルス（Ｈ−１ＥＧＦＰ）に供した。ＮＣＨ４２１神経膠芽腫ニューロスフェアをＭＯＩ  ５０のＨ−１ＥＧＦＰで感染させた。ＭＹＣＮを増幅させた神経芽細胞腫細胞株のＫｅｌｌｙおよびＩＭＲ−３２はＰｒｏｆ．Ｄｒ．Ｏｌａｆ  Ｗｉｔｔ、ＣＣＵ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ハイデルベルクにより好意で提供されたもので、陽性対照として役立った。免疫蛍光顕微鏡検査はＧＦＰの発現がＨ−１ＥＧＦＰに感染した後の神経芽細胞腫細胞株およびＮＢ１２４ニューロスフェア培養の両方において検出され得ることを明らかにしたが、このことは神経芽細胞腫細胞の感染成功および感染した神経芽細胞腫前駆細胞中でのウイルスプロモーターが駆動する遺伝子発現を指し示すものである（図１、左のパネルは位相差顕微鏡検査、中央のパネルはマージ、右のパネルは蛍光顕微鏡検査）。
【実施例３】
【００３２】
Ｈ−１ＰＶタンパク質の発現は神経芽細胞腫前駆細胞および高グレードの神経膠腫幹細胞において１５日間まで持続すること：
ｗｔＨ−１ＰＶタンパク質が感染した神経芽細胞腫および高グレードの神経膠腫前駆細胞において発現することを実証するため、感染細胞中のＮＳ１およびＮＳ２タンパク質についてのウエスタンブロット分析を実施した。ＮＳ１およびＮＳ２は宿主細胞感染に必要とされる非構造タンパク質で、ＶＰ１／２はウイルスカプシドの構造タンパク質である（Ｃｈｅｎら、１９８９年；Ｃａｉｌｌｅｔ−Ｆａｕｑｕｅｔら、１９９０年；Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒら、１９９０年）。１細胞あたり５０ｐｆｕのｗｔＨ−１ＰＶでの感染の後、これらのウイルスタンパク質は調査された全ての幹細胞株において、感染後９日目および１５日目で発現した（図２Ａ、Ｂ）。ヒト神経芽細胞腫（ＩＭＲ−３２）および神経膠芽腫（Ｕ８７）非幹細胞様細胞株は陽性対照として役立った。標準条件下で成長させたＵ８７ヒト神経膠芽腫細胞は陽性対照として役立った。
【実施例４】
【００３３】
Ｈ−１ＰＶは神経芽細胞腫前駆細胞および神経膠芽腫幹様細胞において活発に複製すること：
Ｈ−１ＰＶが神経芽細胞腫前駆細胞中で増えることが可能かという問題に取り組むため、細胞をｗｔＨ−１ＰＶで感染させた。上清中のウイルスゲノムコピー数をリアルタイムＰＣＲにより感染後３日から２１日までの時間範囲で決定した。ＮＢ１２４神経芽細胞腫細胞において、ウイルスゲノムコピー数は１，０００倍まで増加し、感染性粒子の力価は１００，０００倍までにも増加したが、このことはこれらの細胞中での高度に効率的なウイルス増殖を指し示す。これらの神経芽細胞腫前駆細胞における完全な感染性を持つウイルス子孫の複製効率は、感染後７２から１４４時間以内に１０２から１０４倍の増加で変動するという、ウイルスコピー数の顕著な増加を呈した標準の神経芽細胞腫細胞株における効率（Ｌａｃｒｏｉｘら、２０１０年）をなお超えるものであった。
【００３４】
ＮＣＨ４２１神経膠芽腫幹様細胞において、ウイルスゲノムコピー数は感染後２１日の間に１０，０００倍まで増加したが、これは幹細胞の性質を持たない他のヒト神経膠腫細胞株における複製効率（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙら、２００５年）に相当する。
【００３５】
感染性の子孫Ｈ−１ＰＶの発生を定量化するため、感染した同一の神経芽細胞腫前駆細胞株の培養上清を使用した感染性粒子アッセイを追加で実施した。子孫Ｈ−１ウイルスは生物学的に活性があった、すなわちＮＢＫ−３２４Ｋ細胞に感染することが可能であった。感染単位アッセイにおいて、感染性粒子は投入したウイルスと比較して神経芽細胞腫ニューロスフェア培養細胞ＮＢ１２４において４，０００倍に増加し、および神経膠腫幹様細胞株ＮＣＨ４２１において３，５００倍に増加することを決定できた（図３、上の曲線：Ｖｇ／ｍｌ、下の曲線：ＩＵ／ｍｌ）。
【００３６】
まとめると、Ｈ−１ＰＶは神経芽細胞腫前駆細胞および神経膠芽腫幹様細胞に増殖性感染することを明らかにできた。これらの細胞の感染が必須のウイルスタンパク質の発現、効率的なウイルス複製および感染性Ｈ−１ＰＶ子孫の生産を誘導することを実証できた。
【実施例５】
【００３７】
Ｈ−１ＰＶは神経芽細胞腫および高グレードの神経膠腫「幹」細胞株において溶解感染を誘導すること：
野生型Ｈ−１ＰＶでの神経芽細胞腫細胞の感染がどの程度であれば溶解性であったのかを試験するため、感染細胞の細胞形態を位相差顕微鏡検査により記録した。感染後３週間で、Ｈ−１ＰＶが１細胞あたり０．０１ｐ．ｆ．ｕ．以上のＭＯＩを適用した培養ＮＢ１２４細胞に対して顕著な細胞変性作用を誘導するのを示すことができた（図４Ａ）。感染後３週間で、Ｈ−１ＰＶが１細胞あたり１ｐ．ｆ．ｕ．以上のＭＯＩを適用した培養ＮＣＨ４２１細胞に対して顕著な細胞変性作用を誘導するのを示すことができた（図４Ｂ）。
【実施例６】
【００３８】
Ｈ−１ＰＶ感染は神経芽細胞腫前駆細胞および神経膠芽腫幹様細胞において感染後１５日以内に細胞生存率を顕著に低減させること：
Ｈ−１ＰＶが培養された神経芽細胞腫ニューロスフェアに対する顕著な細胞変性作用を誘導するのを示すことができた。代謝活性および細胞の完全性に関して細胞変性作用を定量化するため、感染後１５日目のＮＢ１２４細胞およびＮＣＨ４２１細胞においてｗｔＨ−１ＰＶのＭＯＩを増加させながらＭＴＴ試験を実施した。１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩの適用は、感染後１５日以内に生存する神経芽細胞腫前駆細胞を８０％、神経膠芽腫幹様細胞を６０％低減させた（図５）。
【実施例７】
【００３９】
Ｈ−１ＰＶは神経芽細胞腫前駆細胞および３つの神経膠芽腫幹様細胞株に対して用量依存的な様式で細胞増殖抑制作用を誘導すること：
ＮＢ１２４神経芽細胞腫ニューロスフェア培養細胞ならびに神経膠芽腫幹様細胞ＮＣＨ４２１、ＮＣＨ６２０およびＮＣＨ６４４を１細胞あたり１ｐｆ（図６、左のパネル）または１細胞あたり５０ｐｆｕ（図６、右のパネル）のいずれかで感染させ、続いて生存細胞を１つの時点あたり６ウェルの多連でカウントした。感染後１２日目から始まって１５日目まで、生存細胞数の顕著な差を各腫瘍幹細胞について実証することができた。ＭＯＩ  １を適用した場合、１細胞あたり５０ｐ．ｆ．ｕ．のより高いＭＯＩの適用後よりも作用は明らかではなかった（図６、上の曲線：モック、下の曲線：Ｈ−１ＰＶ）。
【実施例８】
【００４０】
「腫瘍幹細胞」に対する細胞増殖抑制作用はアポトーシスにより仲介されるものではないと考えらること：
神経芽細胞腫および高グレードの神経膠腫ニューロスフェア細胞培養をプロピジウムイオダイド（Ｉｄｏｄｉｎｅ）染色により、およびその後にＤＮＡ断片化およびアポトーシスの指標であるサブＧ１  ＤＮＡ含有（２ｎ未満）細胞集団の存在についてのフローサイトメトリーにより、分析した。並行して、ウイルスタンパク質、例えばＮＳ１などの検出のためのウエスタンブロットを実施した。しかしながらＮＳ１発現の誘導は、ＮＢ１２４神経芽細胞腫幹細胞および高グレードの神経膠腫「幹」細胞のいずれにおいても、Ｇ２アレストともサブＧ１集団の出現とも相関しなかった。
【００４１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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