(57)【要約】質量分析データおよび分類アルゴリズムにより、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２を標的とした治療薬のような、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が固形上皮腫瘍癌患者に有効である可能性が高いかどうかを決定することが可能となる。該方法により、ＥＧＦＲを標的とした治療薬およびＣＯＸ２を標的とした治療薬の組み合わせが該癌患者に有用である可能性が高いかどうか；あるいはＮＦ−κＢ阻害剤による治療が該癌患者に有用である可能性が高いかどうかを決定することも可能となる。2013520681.tif 000005
2013520681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形上皮腫瘍癌患者を、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が高い患者として、あるいは治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が低い患者として識別する方法であって：
ａ）固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；
ｂ）ａ）で得た質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い;
ｃ）ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該スペクトルにおける選択された特徴の積分強度値を得；
ｄ）患者を治療薬または治療薬の組み合わせが有効である可能性が高い、または有効である可能性が低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムにｃ）で得た値を用いる
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
治療薬または治療薬の組み合わせがＥＧＦＲおよびＶＥＧＦを標的としたものである、請求項１の方法。
【請求項３】
治療薬または治療薬の組み合わせがＨＥＲ２を標的としたものである、請求項１の方法。
【請求項４】
治療薬または治療薬の組合せがトラスツズマブを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
治療薬または治療薬の組み合わせがＥＧＦＲを標的としたものであり、分類アルゴリズムにより、ＥＧＦＲを標的とした治療薬との組み合わせにおけるＣＯＸ２阻害剤による治療が有効である可能性が高く、ＥＧＦＲを標的とした治療薬のみによる治療が有効である可能性が低い患者として該患者を識別するクラス標識が得られる、請求項１の方法。
【請求項６】
ＣＯＸ２阻害剤がセレコキシブを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
ＣＯＸ２阻害剤がロフェコキシブを含む、請求項５の方法。
【請求項８】
クラス標識により該患者がＮＦ−κＢ阻害剤による治療が有効である可能性が高い患者としてさらに識別される、請求項１の方法。
【請求項９】
１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲が、
５７３２から５７９５
５８１１から５８７５
６３９８から６４６９
１１３７６から１１５１５
１１４５９から１１５９９
１１６１４から１１７５６
１１６８７から１１８３１
１１８３０から１１９７６
１２３７５から１２５２９
２３１８３から２３５２５
２３２７９から２３６２２
６５９０２から６７５０２
を含むｍ／ｚ範囲の群から選択される、請求項１の方法。
【請求項１０】
固形上皮腫瘍癌患者を、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が高い患者として、あるいは治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が低い患者として識別するよう設定された装置であって、
固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルの質量スペクトルを記憶する記憶装置、および
ａ）質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い、ｂ）１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該質量スペクトルにおける特徴の積分強度値を得、ｃ）患者を治療薬または治療薬の組み合わせが有効である可能性が高い、または低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムにｂ）で得た値を用いるよう設定されたソフトウェアの指示を実行するプロセッサーを含む装置。
【請求項１１】
治療薬または治療薬の組合せがＨＥＲ２を標的としたものである、請求項１０の装置。
【請求項１２】
治療薬または治療薬の組合せがＥＧＦＲおよびＶＥＧＦを標的としたものである、請求項１０の装置。
【請求項１３】
治療薬または治療薬の組み合わせがトラスツズマブを含む、請求項１０の装置。
【請求項１４】
治療薬がＥＧＦＲを標的としたものであり、分類アルゴリズムにより、ＥＧＦＲを標的とした治療薬との組み合わせにおけるＣＯＸ２阻害剤による治療が有効である可能性が高く、ＥＧＦＲを標的とした治療薬のみによる治療が有効である可能性が低い患者として該患者を識別するクラス標識が得られる、請求項１０の装置。
【請求項１５】
ＣＯＸ２阻害剤がセレコキシブを含む、請求項１４の装置。
【請求項１６】
ＣＯＸ２阻害剤がロフェコキシブを含む、請求項１４の装置。
【請求項１７】
ＮＦ−κＢ阻害剤による治療が有効である可能性が高いとして患者がさらに識別される請求項１０の装置。
【請求項１８】
所定のｍ／ｚ範囲が、
５７３２から５７９５
５８１１から５８７５
６３９８から６４６９
１１３７６から１１５１５
１１４５９から１１５９９
１１６１４から１１７５６
１１６８７から１１８３１
１１８３０から１１９７６
１２３７５から１２５２９
２３１８３から２３５２５
２３２７９から２３６２２ 
６５９０２から６７５０２
からなるｍ／ｚの群より選択される、請求項１０の装置。
【請求項１９】
ＣＯＸ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの治療が癌患者に有効である可能性が高いかどうかを予測する方法であって、
ａ）該癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；
ｂ）工程ａ）で得られた質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い；
ｃ）工程ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該スペクトルの選択された特徴の積分値を得；
ｄ）該患者をＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与による治療が有効である可能性が高いまたは低い患者として識別するために、別の固形上皮腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムに工程ｃ）で得た値を用いる
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
所定のｍ／ｚ範囲が、
５７３２から５７９５
５８１１から５８７５
６３９８から６４６９
１１３７６から１１５１５
１１４５９から１１５９９
１１６１４から１１７５６
１１６８７から１１８３１
１１８３０から１１９７６
１２３７５から１２５２９
２３１８３から２３５２５
２３２７９から２３６２２
６５９０２から６７５０２
からなるｍ／ｚの群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該方法が臨床検査センターで実施されるものである、請求項１の方法。
【請求項２２】
該方法が臨床検査センターで実施されるものである、請求項１９の方法。
【請求項２３】
ＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与が癌患者に有効である可能性が高いかどうかを予測するよう設定された装置であって、
該癌患者の血液由来サンプルの質量スペクトルを記憶する記憶装置、および
ａ）質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い、ｂ）工程ａ）における質量スペクトルの前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該質量スペクトルにおける選択された特徴の積分強度値を得、ｃ）患者をＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与による治療が有効である可能性が高いまたは低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムにｂ）で得た値を用いるよう設定されたソフトウェアの指示を実行するプロセッサーを含む装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は米国仮出願第６１／３３８，９３８号（２０１０年２月２４日）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下の利益を主張し、その内容を引用により本明細書中に取り込む。
【０００２】
本発明は、あるタイプまたはクラスの薬剤、および／またはそれらの組み合わせが癌患者に有効である可能性が高いかどうかを予測する方法およびシステムに関連する。該方法およびシステムは、患者の血液由来サンプルから得た質量分析データの使用およびその質量分析データに基づき作動する分類子として設定されたコンピューターに関連する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の出願人であるBiodesix, Incは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路を標的とした薬剤の治療が非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者に有効である可能性が高いかどうかを予測するＶｅｒｉＳｔｒａｔとして知られる検査を開発した。該検査は米国公開番号第７，７３６，９０５号に開示され、その内容を引用により本明細書中に取り込む。該検査はまた、Taguchi F. et al.1においても記載され、その内容を引用により本明細書に取り込む。該検査の出願は米国公開番号第７，８５８，３９０；７，８５８，３８９および７，８６７，７７５号においても開示されており、それらの内容を引用により本明細書中に取り込む。
【０００４】
簡単に述べると、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は癌患者の血清および／または血漿サンプルに基づくものである。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析およびコンピューターで実行されるデータ解析アルゴリズムの組み合わせにより、所定のｍ／ｚ範囲における８個の積分ピーク強度のセットが訓練コホートのものと比較され、患者サンプルのクラス標識が作製される：ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」、またはＶｅｒｉＳｔｒａｔ「未定義」。複数の臨床評価試験において、前処理血清／血漿がＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」であった患者は、上皮成長因子受容体阻害剤で治療された際に、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」であった患者と比べて有意に良好なアウトカムを有していた。少数のケース（２％未満）では決定することが出来ず、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「未定義」と標識された。ＶｅｒｉＳｔｒａｔは本発明の出願人であるＢｉｏｄｅｓｉｘ, Ｉｎｃ.から市販されており、非小細胞性肺癌患者の治療セレクションに用いられる。
【０００５】
現代の殆どのバイオマーカーに基づく検査は、腫瘍のタイプおよび組織学、特定の治療介入、ならびに臨床病理学的因子に関して非常に特異的である。例えば、腫瘍組織を用いた遺伝子検査、例えば、ＥＧＦＲドメインにおける突然変異、ＫＲＡＳ変異の検査、および蛍光In-Situハイブリダイセーション（ＦＩＳＨ）を用いた遺伝子コピー数検査は、非常に特殊な適応においてのみ有効である。ＥＧＦＲ変異から腺癌を伴う第一線ＮＳＣＬＣ癌におけるゲフィチニブ応答に関する示唆は得られるが、扁平上皮癌ではこのタイプのＮＳＣＬＣにおけるこれらの変異は非常に稀であるため、同様の有用性を示さない。ＫＲＡＳ変異は結腸直腸癌におけるセツキシマブに対する応答と相関し得るが、これをＮＳＣＬＣに転用しようとする試みは失敗であった。頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）におけるＥＧＦＲ阻害剤（ＥＧＦＲＩ）の有効性に関する既知のマーカーは存在しない。遺伝子検査におけるこれらの制限は、腫瘍新生の複雑なメカニズムの小さなパートにしか過ぎない非常に特殊な変異にそれらが焦点を絞っていることと関係するのかもしれない。また、これらの検査の全ては還元主義的な視点に基づくものであり、即ち、腫瘍生物学を腫瘍細胞のみに還元し、血管支持システムの内皮細胞、細胞外マトリックスおよび免疫系の成分（癌と関連する慢性的な炎症メカニズムに関与する炎症性細胞ならびにケモカインおよびサイトカインなど）からなる腫瘍微小環境と腫瘍細胞との相互作用を無視したものである。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書中において、腫瘍細胞におけるどの経路がＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」である上皮腫瘍の独特の性質に関わるかについての我々の理解およびその根拠を提供する。本明細書で提示される理解についての証拠は、いくつかのソース、例えば、臨床的証拠、現象論的証拠、文献的解析、および癌患者の血清サンプルの質量スペクトル分析に基づく分子学的証拠によるものである。本明細書で開示される認識の結果は、以下に記載されるある種の薬剤またはその組み合わせが癌患者に有効である可能性が高いか低いかを予測するための新たな方法（即ち、臨床検査）の形態を取り得る。
【０００７】
簡単に述べると、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と識別された患者では、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査はＥＧＦＲなどの成長因子および生存因子の受容体の１つまたはそれ以上の下流の経路の活性化状態を測定するが、適当な候補となる経路は、例えば、古典的および非古典的ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）、ＡｋｔならびにＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）で制御される反応（図２参照）である。化学療法およびプラセボ対照群のアウトカムにおける多様性により、これらの経路のこれら自身による活性化が予後不良に繋がり得ることが示唆され、ＮＦ−κＢ（活性化Ｂ細胞の核内因子κ−軽鎖エンハンサー）（細胞応答を制御し、炎症および免疫応答、ならびに細胞増殖および生存の制御に重要な役割を果たす重要な転写因子である）の関与が指摘される。それが化学療法に対する応答に関与することも知られている。
【０００８】
一般的な事柄として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は予後不良の群のサブセットを識別し、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療の固形上皮腫瘍癌患者における異なる利益を予測する。ＥＧＦＲ阻害剤はかかる薬剤の例である。抗ＥＧＦＲ薬が有効である可能性が高いと予測される患者はＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」標識で識別される；逆に抗ＥＧＦＲ薬が有効である可能性が低いと予測される患者はＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識で識別される。用語ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）は、単一の酵素ではなく少なくとも３個の関連するカスケードの名称として本明細書で用いられる（図２参照）。
【０００９】
上記の結果として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識と関連する患者では、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は「不良」の患者を予後不良の癌患者のサブグループとして診断する。実際、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者はＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」患者とは異なる疾患状態を有すると見做される。
【００１０】
さらに、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」標識を有する癌患者では、ＭＡＰＫ経路が関与する受容体のアゴニスト、受容体またはタンパク質を標的とした薬剤またはその組み合わせによる治療がより有効である可能性がより高く；ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識を有する患者ではかかる治療薬による治療から臨床利益を得る可能性は低い；一方で、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」では、これらの受容体、これらの経路の活性化には依存しない下流を阻害する療法または療法の組み合わせが有効である可能性が高い。
【００１１】
この認識の臨床への適用は、付属の請求項に反映されるように、いくつかの形態を取り得る。該方法は癌患者の血液由来サンプルの質量分析データを得ること、および分類子として機能するプログラムされたコンピューターを用いたスペクトルの解析に関連する。一形態において、固形上皮腫瘍癌患者を、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が高い患者として、あるいは治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が低い患者として識別する方法であって、ａ）固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；ｂ）ａ）で得た質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い;ｃ）ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該スペクトルにおける選択された特徴の積分強度値を得；ｄ）患者を治療薬または治療薬の組み合わせが有効である可能性が高い、または有効である可能性が低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムにｃ）で得た値を用いることを特徴とする方法が開示される。
【００１２】
別の一実施態様において、ＣＯＸ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与が癌患者に有効である可能性が高いかどうかを予測する方法であって、
ａ）該癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；
ｂ）工程ａ）で得られた質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い；
ｃ）工程ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上のｍ／ｚ範囲において該スペクトルの選択された特徴の積分値を得；
ｄ）該患者をＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与による治療が有効である可能性が高いまたは低い患者として識別するために、別の固形上皮腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムに工程ｃ）で得た値を用いる
ことを特徴とする方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】は患者の血液由来サンプルでＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査を行う工程を示すフローチャートである。
【００１４】
【図２】はヒトの細胞における選択されたシグナル伝達経路を示すチャートである。
【００１５】
【図３】は血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アイソフォームの選択された生物活性ならびに癌の進行および治療に対する耐性におけるその役割を表す図である。
【００１６】
【図４】はＥＧＦＲシグナル伝達経路、それらの相互作用および推定されるＳＡＡによる活性化のポイントを表す図である。
【００１７】
【図５】はＥｒｂＢファミリーの成長因子受容体、例えば、ＥＧＦＲおよびそれらの阻害剤の説明であり、Yarden Y, Shilo BZ. SnapShot: EGFR signaling pathway. Cell 2007; 131:1018の引用である。
【００１８】
【図６】は全ての公表されたＶｅｒｉＳｔｒａｔ分析における治療群によるＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者間のハザード比を示すフォレストプロットである。
【００１９】
【図７】は異なる化学療法を受けた患者の全生存率（ＯＳ）とこれらの患者のＶｅｒｉＳｔｒａｔ標識（「良」および「不良」）のカプラン−マイヤープロットを表したものである。
【００２０】
【図８】は異なる濃度のゲフィチニブの存在下におけるゲフィチニブ感受性細胞株ＨＣＣ４００６とゲフィチニブ耐性細胞株Ａ５４９のＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」血清中での増殖のプロットである。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から特に明確に指定されない限り、複数に関する言及を包含する。
【００２２】
本明細書で用いられるように。用語「固形上皮腫瘍」は、例えば、限定される必要はないが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＣＨＮ、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、黒色腫および直腸結腸癌（ＣＲＣ）である。
【００２３】
本明細書で用いられるように、「ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせ」は、例えば、限定されないが、ｅｒｂＢ受容体受容体ファミリー（例えば、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ２）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲまたはＭＥＴ）、Ｇタンパク質共役型受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、ＶＥＧＦ、成長因子（例えば、ＴＧＦαおよびＥＧＦ）、およびＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰＫまたはＰＫＣ経路の、またはそれらの上流の任意の別のタンパク質を標的とした治療薬または薬剤である。さらに、本明細書で用いられるように、用語「ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせ」は、既知の治療薬、ならびにこれらのタンパク質を標的とした未だ発見または開示されていない治療薬を包含する。さらに、治療薬の組み合わせは、それらが既に固形上皮腫瘍の治療に用いられているか否かにかかわらず、治療薬の任意の組み合わせを包含する。ある薬剤が特定のタンパク質または経路の阻害剤として同定されたとしても、かかる分類はその作用メカニズムの記載を表すと意図されるものではなく、それはこれらの薬剤の多くの作用メカニズムは完全には理解されていないからであることは記しておくべきであろう。例えば、排他的なリストとして意図されるものではないが、これらの治療薬は以下を含む：
（１）ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）：小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に分類される多くの薬剤が現在市場に出回っており、I−III相の治験が行われている。ＴＫＩは特定の分子の受容体、例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とすることができ、複数の受容体を標的とすることもできる（「マルチプルキナーゼ阻害剤」と呼ばれる）。これらは、例えば、限定されないが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、イマチニブ、ニロチニブ、ラパチニブである。
抗体に基づく阻害剤は、例えば、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、トラスツズマブ（抗−Ｈｅｒ２）である。
（２）ＨＧＦＲまたはＭＥＴ阻害剤：現在、I−II相の治験中にある長いリストのＭＥＴまたはＰＩ３Ｋ（ＭＥＴの下流のシグナル伝達酵素である）を阻害する薬剤が存在し、様々な段階において調査されているが、現時点では臨床的には用いられていない。例えば、ＸＬ８８０はＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の強力な阻害剤である。本明細書で用いられるように、用語「ＭＥＴ阻害剤」は、例えば、限定されないが、ＡＭＧ ２０８、ＡＭＧ １０２、ＡＲＱ １９７、ＡＶ−２９９、ＭｅｔＭａｂ、ＧＳＫ １３６３０８９（ＸＬ８８０）、ＥＭＤ １２１４０６３、ＥＭＤ １２０４８３１、ＭＧＣＤ２６５、クリゾタニブ（ＰＦ−０２３４１０６６）、ＰＦ−０４２１７９０３、ＭＰ４７０である。
（３）ＣＯＸ２阻害剤：本明細書で用いられるように、用語「ＣＯＸ２阻害剤」は、例えば、限定されないが、選択的ＣＯＸ２阻害剤：セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブである。
（４）ＣＯＸ１およびＣＯＸ２の両方を阻害する別の非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）は、イブプロフェン、アスピリン、インドメタシンおよびスリンダクである。かかる薬剤はＮＦ−κＢ活性化も抑制することが示されている。
（５）別のＮＦ−κＢ阻害剤：本明細書中で用いられるように、用語「ＮＦ−κＢ阻害剤」は、例えば、限定されないが、三酸化ヒ素（ＡＴＯ）、サリドマイドおよびそのアナログ、レスベラトロールである。さらに、ＣＯＸ２阻害剤はＮＦ−κＢ経路にも阻害効果を有する。故に、イブプロフェン、アスピリン、インドメタシンおよびスリンダクといったＮＳＡＩＤはＮＦ−κＢの活性化を抑制することが示されたため、ＮＦ−κＢ阻害剤と見做される。
【００２４】
本明細書で用いられるように、用語「ＶＥＧＦ阻害剤」は、例えば、限定されないが、ベバシズマブ、セジラニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ＢＩＢＦ １１２０、ラムシルマブ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、リニファニブ（ＡＢＴ８６９）、チボザニブ、ＢＭＳ−６９０５１４、ＸＬ８８０、スニチニブ、ソラフェニブ、ブリバニブ、ＸＬ−１８４、パゾパニブである。
【００２５】
本明細書で用いられるように、「標的とした治療」は、特定の酵素のモノクローナル抗体または小分子阻害剤といった薬剤または他の物質を受容体といった特定の分子を同定し攻撃するために用いるようなタイプの治療を意味する。これらの例は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ（エルロチニブ、ゲフィチニブ）、セツキシマブ、ベバシズマブなどである。
【００２６】
本明細書で用いられるように、用語「非標的化学療法」または「化学療法」は、ＤＮＡに干渉（アルキル化試薬、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなど、または代謝拮抗薬、例えば、５−フルオロウラシルまたはペメトレキセド、またはイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤）、または細胞分裂に干渉（ビノレルビン、ドセタキセル、パクリタキセルなど）することにより、急速に分裂する細胞に干渉する治療を意味する。
【００２７】
本明細書で用いられるように、「予後」は、治療を受けない場合または標準的な治療を適用された場合の臨床的アウトカムに関連する因子または測定結果を意味する。それは、疾患の自然な経過の測定結果と考えることが出来る。
【００２８】
用語「予測の」は、特定の治療方法が有効であるか有効ではないかに関連する因子または測定結果を意味する。予測因子により、予測マーカーの状態に依存して治療方法から異なる利益が得られることが示唆される２。本明細書で用いられるように、用語「疾患状態」は、異なる予後および／または異なる治療応答および／または特定の分子および／または代謝的特徴により特徴付けすることが出来る診断された病状の特定のサブタイプを意味する。
【００２９】
ディスカッション
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は血清サンプルの質量分析データから得た特徴に基づくため、現行の殆どのバイオマーカーを用いた検査とは異なり、癌に関連する一般的な因子を測定することが出来ることを我々は発見した。この事実により、以下に議論されるＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査を用いた治療のためのセレクションへの新たな臨床的適用が可能となる。特に、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査により、ＥＧＦＲ阻害のメカニズムにかかわらず、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と識別された患者間で同様に生存曲線を区分することが出来る。我々の先の研究において、酵素のＡＴＰ結合部位をブロックすることにより受容体を阻害する小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ（Iressa）およびエルロチニブ（Tarceva）１で治療した患者のサンプルセットにＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査を行った。ＮＳＣＬＣおよび直腸結腸癌（ＣＲＣ）の両方において、ＥＧＦＲを標的とした他の治療薬セツキシマブ（Erbitux）に関してもＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と識別された患者間で同様の区分が見られた３。セツキシマブはＥＧＦ受容体を直接ブロックする抗体である。
【００３０】
さらに、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査により、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と識別された患者間で、臨床病理学的特徴を超えて同様に区分することが出来る。例えば、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は、腫瘍が腺癌である患者でも腫瘍が扁平上皮癌である患者でも用いることができる。
【００３１】
また、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は、様々の固形腫瘍において、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と識別された患者間の区分を示す。ＮＳＣＬＣ、頭頚部扁平細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、およびＣＲＣにおいてこれが見られた３。
【００３２】
さらに、非標的化学療法で治療された患者のＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査による生存曲線の区分は、人種、介入治療のタイプ、および腫瘍タイプに依存して異なることが見出された。いくつかの非標的化学療法治療群において区分の証拠があるが、他では区分が存在しない。プラセボ群（即ち、介入治療を受けていない群）においても明確な区分が存在し、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査が予測的な要素を有することが示唆される。
【００３３】
図６のフォレストプロットは、現在までに刊行または公表された全てのＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査の分析を要約する。分析された各治療群のＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者間の全生存率のハザード比（ＨＲ）が示される。データは治療タイプに応じて分類されると考えられる。得られたハザード比の範囲によりＶｅｒｉＳｔｒａｔが実際に特定の治療タイプの結果としての良好または不良なアウトカムを示唆し、故に予測能を有することが示される。
【００３４】
図６において、治療は、Ｂ＝ベバシズマブ、Ｃ＝セツキシマブ、ＣＴ＝化学療法、Ｅ＝エルロチニブ、Ｇ＝ゲフィチニブである。刊行物／公表物は、[1] D. Carbone, 2nd European Lung Cancer Conference, April 2010、 [2] F. Taguchi et al., J  Natl Cancer Inst. 2007 Jun6;99(11):838-8461 からアップデートしたBiodesixのファイル, [3] C. Chung et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2010 Feb;19(2):358-653、 [4] D. Carbone et al., Lung Cancer 2010 Sept; 69(3):337-3404である。
【００３５】
非標的化学療法治療群の再分析により、タキセン治療群では明確な区分が見られなかったが、タキセンを含まない化学療法レジメン群ではＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」群間で区分が存在した（図７参照）。
【００３６】
検査がこのような広い適用範囲を有することは稀である。
【００３７】
まとめると、前記のディスカッションならびに図６および７から以下の結論が導かれる：
１．ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査により、ＥＧＦＲ阻害剤（ＥＧＦＲＩ）単独療法において、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ良および不良の患者間で約．４５のハザード比における区分が示され、それは、
−ＥＧＦＲＩの作用メカニズム、例えば、小分子ＴＫＩ（エルロチニブ、ゲフィチニブ）および抗体（受容体）阻害剤に基づくＥＧＦＲＩ（例えば、セツキシマブ）であるかに依存せず、
−組織学的タイプ、例えば、腺癌、および扁平細胞癌であるかに依存せず、
−組織、例えば、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＣＨＮ、およびＣＲＣであるかに依存しない。
２．他の集団的特徴の有意な相関は観察されなかった：
−遺伝子マーカー、例えば、ＥＧＦＲの変異状態またはＫＲＡＳの状態とは相関せず、
−性別および人種といった集団的特徴とは相関しない。
３．ＶｅｒｉＳｔｒａｔは、治療を受けていないＶｅｒｉＳｔｒａｔ不良およびＶｅｒｉｓｔｒａｔ良のサブグループ間の区分で示される強い予測的要素を有する。
−しかしながら、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」サブグループにおけるＥＧＦＲＩ単独療法による明確な治療利益は存在しない、即ち、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ不良サブグループにおけるエルロチニブによる治療はプラセボによる治療と実質的に同効果である一方、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」サブグループにおいては、ＥＧＦＲＩによる大きな治療利益が存在し、
−組み合わせ療法の効果は特定の薬剤の組み合わせおよび相互作用する経路に対するそれらの効果に依存する。
【００３８】
サンプルの質量スペクトルにおける特定のピークがＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」群においてのみ観察された結果とこれらの事実を全て合わせると、ＶｅｒｉＳｔｒａｔは固形上皮腫瘍において臨床的意義（不良アウトカム）を有する新たな疾患状態を定義するという結論が導かれる。観察された現象により、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」の腫瘍の分子学的状態に関するいくつかの仮説を立てることができる：ＥＧＦＲＩがこの種の患者に有効ではないため、ならびに、効果がＴＫＩおよび抗体療法と同程度であるため、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者において、該受容体および該チロシンキナーゼドメインの下流の経路がＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」患者と異なっている、即ちアップレギュレートされている可能性が高い。ＫＲＡＳの変異状態との相関は見られなかったため、侵されている経路はＲＡＳの下流であることがさらに結論される。
【００３９】
前記の観察、文献的解析および他の一連の根拠に基づき、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」腫瘍細胞の異なる特徴に腫瘍細胞のどの経路が関与しているかに関する我々の理解が本明細書で提供される。簡単に述べると、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と識別された患者においてＶｅｒｉＳｔｒａｔ試験はＥＧＦの受容体の下流の１つまたはそれ以上の経路の活性化を評価していることを我々は提案する；候補の可能性がある経路は、古典的および非古典的ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔならびにＰＫＣで制御される経路である（図２の２００Ａおよび２００Ｂを参照）。化学療法およびプラセボ対照群のアウトカムの多様性により、これらの経路のこれら自身による活性化が予後不良に繋がり得ることが示唆され、ＮＦ−κＢ転写因子（細胞生存の重要な制御因子であり、炎症過程および癌の進行に重要な役割を果たし、化学療法への応答に関与する）の関与が示唆され得る。
【００４０】
一般的な事柄として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は予後不良の群のサブセットを識別し、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療から固形上皮腫瘍癌患者が受ける恩恵を予測する。抗ＥＧＦＲ薬が有効である可能性が高いと予測される患者はＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」標識で識別される；逆に抗ＥＧＦＲ薬が有効である可能性が低いと予測される患者はＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識で識別される。ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識を有する患者がＭＡＰＫ経路を活性化する受容体を標的とした治療薬による治療から臨床利益を受ける可能性は低く；一方で、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者では、該受容体と独立したこれらの経路の活性化を阻害する療法または療法の組み合わせから臨床利益が得られる可能性が高い。
【００４１】
用語ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）は、単一の酵素ではなく少なくとも３個の関連するカスケードの名称として本明細書で用いられる（図２参照）。
【００４２】
前記の主張の結果として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識と関連する患者では、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は「不良」患者を予後不良の癌患者のサブグループとして予測する。
【００４３】
認識の結論は、いくつかのタイプの薬剤が癌患者に有効である可能性が高いか低いかを予測するための新しい方法、即ち臨床検査の形態を取り得る。
【００４４】
臨床適用の１つにおいて、本発明は、固形上皮腫瘍癌患者を、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬による治療が有効である可能性が高いか、該治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が低いか識別する方法であって、
ａ）固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；
ｂ）ａ）で得た質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い（例えば、バックグランドの除去、ノイズの推定、ノーマライゼーションおよびスペクトルのアラインメント）;
ｃ）ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲(および好ましくは下の表１で説明されるｍ／ｚピークに対応する下記のｍ／ｚ範囲）において該スペクトルにおける選択された特徴の積分強度値を得；
ｄ）患者を治療薬または治療薬の組み合わせが有効である可能性が高い、または有効である可能性が低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズム（例えば、k近傍法）にｃ）で得た値を用いる
ことを特徴とする方法であると見做すことが出来る。
【００４５】
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者の標的治療に対する耐性の打開の具体例として、ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブまたはロフェコキシブを治療レジメンとしてＥＧＦＲＩに追加することにより、ＥＧＦＲＩに対してＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識を有する患者の耐性を打開することが出来る可能性がある。故に、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査はＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲＩを含む組み合わせ療法の処方のインジケーターとして用いられ得る。
【００４６】
別の一具体例として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識はＮＦ−κＢの特異的な活性化と関連すると考えられ、故に、該検査はＮＦ−κＢ阻害剤から最も恩恵を受ける患者を選択し、それ故に不必要な治療およびそれに関連する死亡率を低減させるために用いることができる。
【００４７】
別の一具体例として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」標識は特定の非標的化学療法、特にＤＮＡ複製および遺伝子発現に干渉する薬剤（シスプラチン、ゲムシタビンまたはペメトレキセド）の治療利益が小さいこと（おそらくは、この過程におけるＮＦ−κＢ因子の関与による）に関連すると考えられる。
【００４８】
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」と標識された患者では、（１）受容体と独立してＭＡＰＫ経路の下流の活性化を阻害する薬剤、例えば、ＣＯＸ２阻害剤など、または（２）炎症性のホスト応答を最小化する薬剤の添加、あるいは、クロストーク経路の活性化を阻害する別の標的薬剤の添加により、標的薬剤に対する耐性を打開することが出来る。
【００４９】
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査
いくつかの治療薬または治療薬の組み合わせ、例えば、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬による治療用にかかる患者を選択するために固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルを検査する本開示による方法が、図１のフローチャートに工程１００として説明される。
【００５０】
工程１０２において、血清または血漿サンプルを患者から得る。一実施態様において、血清サンプルを３つのアリコートに分け、質量分析および後続の工程１０４、１０６（サブ工程１０８、１１０および１１２を含む）、１１４、１１６および１１８を書く折コートについて独立して行う。アリコートの数は、例えば４、５または１０アリコートのように異なっていてもよく、各アリコートは後続の工程に用いられる。
【００５１】
１０４において、該サンプル（アリコート）は質量分析で分析される。好ましい質量分析法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析であるが、他の方法でもよい。質量分析により、当該分野で周知のように、多数の質量／電荷（ｍ／ｚ）値における強度値を表すデータ点が得られる。一実施例において、該サンプルを解凍し、４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心する。さらに、該血清サンプルは１：１０、または１：５にＭｉｌｌｉＱ水で希釈してもよい。希釈サンプルはＭＡＬＤＩプレートのランダムに割り当てられた位置にトリプリケート（即ち、３つの異なるＭＡＬＤＩターゲット上に）スポットしてもよい。０．７５μｌの希釈した血清をＭＡＬＤＩプレート上にスポットした後、０．７５μｌの３５ｍｇ／ｍｌ シナピン酸／（５０％ アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））を加え、５回ピペッティングして混合してもよい。プレートは室温で乾燥することが出来る。本発明の本質に従って血清を調製および加工するために別の技法および方法が用いられ得ることは明らかである。
【００５２】
質量スペクトルは、自動または手動でスペクトルを収集するVoyager DE-PROまたはDE-STR MALDI TOF質量分析計を用いてリニアモードの陽イオンで獲得してもよい。各血清サンプルについて５２５または５００個のスペクトルを得るために、７５または１００個のスペクトルが各ＭＡＬＤＩスポットの７または５個の位置から収集される。スペクトルはタンパク質スタンダードの混合物（インスリン（ウシ）、チオレドキシン（E. coli）、およびアポミオグロビン（ウマ））を用いて外部校正される。
【００５３】
工程１０６では、１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を工程１０４で得たスペクトルについて行う。前処理工程１０６は、工程１０４で得た質量分析データ上で作動するソフトウェアの指示を用いた一般的な目的のコンピューターで実行される。前処理工程１０６は、バックグラウンドの除去（工程１０８）、ノーマライゼーション（工程１１０）およびアラインメント（工程１１２）を含む。バックグラウンドの除去工程は、好ましくはバックグラウンドのロバスト、非対称な推定を行うことに関連し、スペクトルからバックグラウンドが差し引かれる。工程１０８は米国特許番号第７，７３６，９０５ Ｂ２号および米国公開番号第２００５／０２６７６８９号（引用により本明細書中に取り込む）に記載されるバックグラウンド除去法を用いる。ノーマライゼーション工程１１０はバックグラウンドを差し引いたスペクトルのノーマライゼーションに関連する。ノーマライゼーションは部分イオン電流ノーマライゼーションの形態でもよく、あるいは、米国特許番号第７，７３６，９０５に記載されるように、全イオン電流ノーマライゼーションでもよい。工程１１２では、米国特許番号第７，７３６，９０５に記載されるように、ノーマライズし、バックグラウンドを差し引いたスペクトルを所定の質量スケール（分類子を用いた訓練セットの調査により得られる）にアラインする。
【００５４】
前処理工程１０６が行われると、工程１００は、所定のｍ／ｚ範囲におけるスペクトルの選択された特徴（ピーク）の値を得る工程１１４に進む。ピーク検出アルゴリズムのピーク幅設定を用い、ノーマライズおよびバックグラウンド除去を行った強度をこれらのｍ／ｚ範囲において積分し、この積分値（即ち、特徴の幅の間の曲線下面積）を特徴に割り当てることができる。このｍ／ｚ範囲においてピークが検出されなかったスペクトルについては、積分範囲は、その時点のｍ／ｚ位置のピーク幅に対応する幅を有するこの特徴の平均ｍ／ｚ位置周囲の間隔として定義することが出来る。この工程は米国特許番号第７，７３６，９０５にさらに詳しく記載される。
【００５５】
工程１１４では、米国特許番号第７，７３６，９０５に記載されるように、該スペクトルにおける特徴の積分値は１つまたはそれ以上の以下のｍ／ｚ範囲から得られる：
５７３２から５７９５
５８１１から５８７５
６３９８から６４６９
１１３７６から１１５１５
１１４５９から１１５９９
１１６１４から１１７５６
１１６８７から１１８３１
１１８３０から１１９７６
１２３７５から１２５２９
２３１８３から２３５２５
２３２７９から２３６２２
６５９０２から６７５０２．
【００５６】
好ましい実施態様において、値は表１に示される８個のこれらのｍ／ｚ範囲から得られ、適宜、１２個全ての範囲から得られてもよい。これらのピークの重要性および検出方法は米国特許番号第７，７３６，９０５号に記載される。
【００５７】
工程１１６において、工程１１４で得た値を分類子に供給する（図示された実施態様ではｋ近傍法（ＫＮＮ）分類子である）。該分類子は多数の他の患者（ＮＳＣＬＣ癌患者でもよく、あるいは、別の固形上皮癌、例えば、ＨＮＳＣＣ、乳癌の患者でもよい）からのクラス標識スペクトルの訓練セットを利用する。１１４の値および訓練セットへのＫＮＮ分類アルゴリズムの適用は米国特許番号第７，７３６，９０５号で説明される。別の分類子、例えば、確率的ＫＮＮ分類子または他の分類子が用いられてもよい。
【００５８】
工程１１８において、分類子によりスペクトルに「良」、「不良」または「未定義」が作製される。前述したように、工程１０４−１１８は、与えられたサンプルの３個の別々のアリコート（または用いられた任意のアリコート数）について並行して行われる。工程１２０において、全てのアリコートから同じクラス標識が得られたかどうかのチェックが行われる。もし同じでなかった場合、工程１２２で示されるように未定義の結果に変更される。全てのアリコートから同じ標識が得られた場合、工程１２４で示されるようにその標識が記録される。
【００５９】
本開示に記載されるように、工程１２４で報告される新たかつ予想外のクラス標識が開示される。
【００６０】
工程１０６、１１４、１１６および１１８が、典型的には、工程１０６の前処理工程、工程１１４でスペクトル値を得ること、工程１１６のＫ−ＮＮ分類アルゴリズムの適用、および工程１１８のクラス標識の作製をコードするソフトウェアを用いるプログラムされた一般的なコンピューターで行われることは明らかである。工程１１６で用いられるクラス標識スペクトルはコンピューターの記憶装置またはコンピューターがアクセス可能な記憶装置に記憶される。
【００６１】
我々の先行特許出願公報米国特許番号第７，７３６，９０５号に記載されるように、該方法およびプログラムされたコンピューターは臨床検査センターで実行されてもよい。
【００６２】
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査の作動メカニズムおよびその実際の結果に関する理解は、このセクションでさらに記載されるいくつかのソースに由来する。
【００６３】
タンパク質ＩＤからの直接的証拠
ＶｅｒｉＳｔｒａｔは血清または血漿のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのピーク強度を測定する。一実施態様において、ＶｅｒｉＳｔｒａｔのシグナチャーは後述の表１に記載される８個の質量分析のピークを含む。分類は、所定のｍ／ｚ範囲（前述のリストおよび表１を参照）においてサンプルの質量スペクトルを積分することにより強度、即ち特徴値を推定し、観察された８個の特徴値のセットを訓練サンプルのものと７近傍分類アルゴリズムを用いて関連付けすることにより行われる。この方法は非線形結合の特徴値を用いるものであり、一次元スコアの定義を行うことは出来ない。特徴値の線形結合のスコア関数を作製しようとする試みは常に失敗に終わり、常にパフォーマンスの低下を招いてきた。これら８個の特徴の全てまたは殆どが臨床的実用性を得るために有用であると考えられる。
【００６４】
用いた特徴値のペプチド含量を決定することによりＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査の作動メカニズムを理解することが出来るかもしれないと考えられていた。しかしながら、装置のｍ／ｚ解像度はそのｍ／ｚ範囲において１つのタンパク質またはペプチド鎖のみが存在することを保証するに足るほど高いものではないという事実により、これは困難となった。また、８個以上のペプチドが８個のピークシグナチャーを形成すると考えられ、そのいくつかは同じアミノ酸配列が翻訳後修飾を受けたものまたは酸化された形態であり、他のものは依然として未知のペプチドである可能性がある。加えて、特徴値、即ち推定されたピーク強度は、単にその被分析物がサンプル中に多く含まれることに対応するだけではない。これはＭＡＬＤＩのイオン化の複雑さによるものであり、即ち、検出器にヒットするイオン数は被分析物の量およびイオン化確率の両方に相関する。この半定量的な様式のピーク（特徴値）の比較により、タンパク質ＩＤの標準的な方法による比較が困難なままとなる（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。
【表１】
2013520681.tif 000003
【００６５】
これらの困難な事柄にもかかわらず、我々は表１のピークの３つが血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アイソフォームと関連している強い証拠を得た。我々はプールしたＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」およびＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」サンプル間でディファレンス（ＤＩＧＥ）分析を行い、ｍ／ｚ１１５２９および１１６８５のピークを十分な配列包括度で分離することに成功し、それらをＳＡＡ  １９−１２２およびＳＡＡ  ２０−１２２と同定した。理論的質量は実測されたｍ／ｚ値とよく一致した。ゲル上で観測された０．４のＰＩシフトも理論的予測値とよく一致する。さらに、ｍ／ｚ５８４３におけるピークは１１６８５のピークが２価に荷電したものと考えられる。これらのピークは、他でも観察されている５（Ducet, et al. Electrophoresis 1996, 17, 866-876、Kiernan et al. FEBS Letters 2003, 537, 166-170）。１１４４５のピークが、親ＳＡＡタンパク質のＣ末端からの切断物の配列に関連するＳＡＡアイソフォームである可能性もある。
【００６６】
別のタンパク質またはタンパク質のアイソフォームがＶｅｒｉＳｔｒａｔシグナチャーに存在することは明らかであるが、ＳＡＡアイソフォームがＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査の作動メカニズムにおいて重要な役割を果たすことも考えられる。以下のセクションでは、ＳＡＡがＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」シグナチャーの少なくとも３つのピークの主要な要素であるという発見に基づくＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査の作動メカニズムの推定される理論；ＳＡＡといくつかの受容体の相互作用およびこれらの相互作用の生物学的帰結に関する既知の情報、ならびに様々な癌細胞におけるＳＡＡと機能的に結合するこれらの受容体の存在に関する情報が提供される。しかしながら、本発明は必ずしもこの理論に基づく必要はなく、かかる理論は本発明を限定する意図は持たない。
【００６７】
癌のバイオマーカーとしてのＳＡＡに関する先行技術文献は、引用文献６−１６を参照すること。
【００６８】
ＳＡＡ：生物学的機能および腫瘍発症への関与
機能
ＳＡＡファミリーの決定的重要性は、ＳＡＡが進化を通して高度に保存された配列である１７という事実、およびＳＡＡの発現が感染、外傷または病的過程に応答して劇的に増加することにより示唆される。しかしながら、ＳＡＡの正確な生物学的機能は未だ完全には解明されていない。ＳＡＡはＨＤＬの成分として脂質の運搬および代謝に関与し、おそらくは疾患の急性期において保護的な役割を果たす１８が、慢性的な条件ではＳＡＡは有害因子となる。ＳＡＡの発現が高い状態が続くと、関節リウマチなどのいくつかの疾患ではアミロイドＡアミロイドーシスが誘発される１９。しかしながら、ＳＡＡの臨床的に重要な機能の範囲はかなり広く、慢性的な炎症および腫瘍形成への関与も含まれる。後者の２つは密接に関係しており、Vlasova and Moshkovskii２０ および Malle et al２１のレビューで詳述される。
【００６９】
ＳＡＡの腫瘍形成への関与は、その多面的な生物学的活性：炎症への関与、例えば、炎症促進性遺伝子の発現の活性化およびサイトカインの制御による慢性過程の補助、細胞外マトリックス分解への関与、抗アポトーシス性の性質、ならびに腫瘍形成に複雑に関与するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む特定の経路の活性化に起因する。
【００７０】
ＳＡＡは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着タンパクとして作用し得ること２２、ＥＣＭの分解およびリモデリングに重要な役割を果たし、腫瘍新生、転移、および腫瘍浸潤に関与する２４，２５マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を誘導すること１８，２３が示されている。
【００７１】
ＳＡＡの免疫に関連する機能は、そのサイトカイン様活性により定義される。ＳＡＡはＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの産生を促進し２６，２７（これはおそらくは、ＳＡＡ発現のポジティブフィードバックに繋がる）、同様に、細胞性免疫応答に重要な役割を果たすＩＬ−１２およびＩｌ−２３の産生も促進する２８。ＳＡＡがＰＩ３Ｋおよびｐ３８ ＭＡＰＫを活性化し得ることも示されている。
【００７２】
ＳＡＡの炎症の制御への関与は、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ経路の活性化を同時に伴うＣＯＸ２発現誘導能と関連する２９，３０。癌と炎症の重要な相互関係は数多くの研究およびレビューの対象である３１−３７。近年の大量のデータから、ＳＡＡは２つの過程間のメディエーターの１つとして重要な役割を果たすことが示唆されているが、これは、ＳＡＡが重要な炎症性および腫瘍形成経路、例えば、古典的および非古典的ＭＡＰＫ経路、転写因子ＮＦ−κＢのものを活性化することが出来ること、およびおそらくはそれらのクロストークに関わることによる。ＶｅｒｉＳｔｒａｔシグナチャーと関連するＳＡＡレベルの上昇は、該経路の活性化を測定に有用なものとして用いることができる。
【００７３】
ＳＡＡの生物学的活性と関連する受容体および経路
ＮＦ−κＢ転写因子は多くの上皮および血液性の悪性病変で恒常的に活性化していることが知られており、抗アポトーシス性およびアポトーシス性の標的遺伝子、マトリックスメタロプロテアーゼの発現、血管新生および細胞周期を制御することにより４１、炎症を伴う癌の進行に重要な役割を果たすと考えられている３８，３９，４０。他方、ＮＦ−κＢはアポトーシス促進性の遺伝子活性を発揮すること、および腫瘍抑制因子ｐ５３と協働してアポトーシスを誘導することも可能である４２。実際の作用は刺激、細胞種、および関与するサブユニットに依存する４３。Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢ因子の抗アポトーシス性およびアポトーシス性作用は必ずしも対立するものではないが、同じ標的遺伝子のアップレギュレーションにより同じ細胞で起こり得る４４。ＮＦ−κＢはおそらくは炎症と癌をリンクする因子の主な１つであるが、これは、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αといった炎症性サイトカイン、ならびにＭＭＰおよびＣＯＸ−２を誘導するサイトカインの誘導に関与することによる３５，４５，４６。ＮＦ−κＢの活性化はＥＧＦにより誘導されることがあり：ＥＧＦの刺激はＮＦ−κＢ活性化を介したデスレセプター誘導性アポトーシスを阻害する。
【００７４】
ＣＯＸ−２の過剰な発現は、広範囲の前悪性、悪性および転移性のヒト上皮癌４７、例えば、肺癌４８で見られる。ＣＯＸ２は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を介して細胞増殖、血管新生、アポトーシス、および細胞遊走を仲介し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの腫瘍原性シグナリングをトランス活性化する４９，５０。ＣＯＸ２はＥｒｋを介してＭＡＰＫをトランス活性化する４９，９２。その関係は相反的なものであり：ＭＡＰＫ経路を介して作用する上皮増殖因子（ＥＧＦ）はいくつかの上皮細胞においてＣＯＸ２活性を劇的に誘導する５１。ＴＧＦαによるＥＧＦＲの活性化はＣＯＸ２を刺激し、ＰＧＥ２放出の増加および有糸分裂誘発の増加を引き起こす５２。
【００７５】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードは、活性化した成長因子受容体からの成長刺激シグナルを伝達するため、通常のセルバイオロジーならびに癌の発症に重要な役割を果たす。ＭＡＰＫシグナル伝達はしばしば、成長因子の１つがそのチロシンキナーゼ型受容体（ＲＴＫ）である膜受容体に結合することにより開始され、Ｒａｆ、ＭＥＫおよび細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の作動を引き起こす。近年の研究により、ＲＴＫからＥＲＫへのシグナリングは単なる直線的なＲａｓ依存性経路よりもはるかに複雑なものであることが示され、ＥＴＫが仲介するＥＲＫシグナリングの強度、期間および細胞局在の決定に重要な役割を果たす様々なシグナリングモジュレーターが同定される必要がある５０。ＳＡＡは様々な上皮細胞のいくつかの受容体と機能的に結合し、この結合により、上記および特定の治療に対するＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者の耐性に繋がり得るＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの両方の下流の活性化が起こる（以下においても議論される）。これらの受容体のいくつかに関する概略を以下に示す。
【００７６】
ＦＰＲＬ受容体
ＦＰＲＬ受容体は幹細胞５３、腸上皮５４および肺５５を含む様々な細胞で発現される。ＳＡＡは古典的なＧタンパク質共役型受容体の１つであるＦＰＲＬ１と相互作用し、細胞機能および上皮増殖および／またはアポトーシスの制御に重要なシグナリングネットワークを誘起する。ＳＡＡのＦＰＲＬ１への結合により、インターロイキンの活性化および誘導が引き起こされる。ＦＰＲＬの関与によりプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）および転写因子ＮＦ−κＢ経路が活性化され３０、これはアポトーシスの阻害および癌の進行を伴う５６，５７，４１。ＳＡＡのＦＰＲＬ１への結合により、好中球およびリウマチ滑膜細胞におけるアポトーシスのレスキューが起こることも示されているが、これは、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナリングのリン酸化、ならびにＳＴＡＴ３活性化および細胞内Ｃａ２＋の放出により仲介され５８，５９，６０、それにより細胞の増殖および生存が促進される。
【００７７】
ＳＲ−ＢＩ受容体
スカベンジャーレセプターＢ−Ｉ（ＳＲ−ＢＩ）は、選択的なコレステロール取り込みを仲介する高密度リポタンパク質受容体として同定された６１。ＳＲ−ＢＩはステロイド産生組織および肝臓で最も多く発現されるが、炎症中のマクロファージおよび単球においても発現が上昇する；ＳＢ−ＢＩの発現の上昇は、ＳＡＡの存在も特徴であるヒトアテローム硬化病変における脂質含有マクロファージにおいても示されている。ＳＡＡはＳＲ−ＢＩが仲介する細胞コレステロールのエフラックスを促進する６２。
【００７８】
Baranova et al．６３では、ＨｅＬａおよびＴＨＰ１（ヒト急性単球性白血病細胞株）細胞におけるＳＡＡのＳＲ−ＢＩへの特異的結合（おそらくは、ＨＤＬと結合した状態で）はＥＲＫ１／２およびｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化、ならびにＩｌ−８分泌を伴うことが示された。ＳＲ−ＢＩ受容体の発現は、ヒト肺癌細胞株を含むさまざまな細胞で示されている６４。
【００７９】
ＲＡＧＥ
終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）は肺においてのみ検出可能なレベルで常時発現されているが、炎症部位において、主に炎症性および上皮細胞でその発現は急激に上昇する。上皮細胞のＲＡＧＥは、膜結合型または可溶型タンパクとして、ストレスにより大幅にアップレギュレートされる。ＲＡＧＥを介した恒久的なシグナリングにより生存経路が誘導され、アポトーシスおよび（ＡＴＰ欠乏による）ネクローシスが減弱された。これにより、多くの例において上皮の悪性化を引き起こす背景となる慢性的な炎症が導かれた６５。ＲＡＧＥの発現量の上昇は前立腺癌、直腸癌および胃癌に伴う；一方で、肺癌および食道癌の進行したステージはＲＡＧＥ発現量の低下を特徴とする６６。口腔扁平細胞癌では、ＲＡＧＥの発現は癌の進行および再発と強く相関し、ＲＡＧＥ陽性患者は著しく短い無病生存期間を示した。数多くの様々なリガンドの内、ＳＡＡは終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）と結合し、ＥＲＫ１／２およびｐ３８ ＭＡＰＫ経路を介してＮＦ−κＢを誘導する（ＣＯＸ経路を誘導することはない）ことが見出された６７。
【００８０】
ＴＬＲ
近年の発見により、ＳＡＡがＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）であるＴＬＲ４およびＴＬＲ２の内因性のリガンドとして作用し得ることが示された２１。ＴＬＲ４はいくつかのヒトの癌細胞で発現していることが見出された６８，６９。肺癌では、ＴＬＲ４の活性化により免疫抑制性サイトカインＴＧＦ−ベータ、血管新生促進性ケモカインＩＬ−８およびＶＥＧＦの産生が促進されることが示された。ＶＥＧＦおよびＩＬ−８分泌促進はｐ３８ ＭＡＰＫ活性化を伴う７０。ＳＡＡによるＴＬＲ４の活性化はｐ４２／４４およびｐ３８ ＭＡＰＫの活性化を必要とした７１。
【００８１】
ＴＬＲ２はまた、ＳＡＡの機能的受容体であることも示された。ＴＬＲ２を発現するＨｅＬａ細胞はＮＦ−κＢの強い活性化を伴ってＳＡＡに応答した；ＳＡＡによる刺激は、ＴＬＲ２−ＨｅＬａ細胞において、ＥＲＫ１／２（Ｐ−ＥＲＫ１／２）、ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｐ−ｐ３８）、およびＪＮＫ（Ｐ−ＪＮＫ） ＭＡＰＫのリン酸化の亢進を引き起こし、ＩκＢα（ＮＦκＢ阻害因子）分解の促進を加速した７２。ＳＡＡによる特異的な活性化の結果としてのＮＦ−κＢの刺激は、マクロファージにおいも示されている７３。
【００８２】
癌の発症および治療への耐性におけるＳＡＡの予想される相互作用およびその生物学的効果の簡単なスキームを図３に示す。これから見て取れるように、ＳＡＡの生物学的機能は、ＳＡＡと様々な受容体の相互作用を引き金とする多数の経路のクロストークの視点から見ることができ、それは最終的には少なくとも１つの主要なＭＡＰＫ経路：ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ２１，４１および／またはＮＦ−κＢ活性化に収束する。これらの相互作用のいくつかは図４のＥＧＦＲ伝達経路のスキームにおいて示される。
【００８３】
ＥＧＦＲはいくつかの主要な下流のシグナリング経路、例えば、Ｒａｓ−Ｒａｆ−Ｍｅｋ、ならびにホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、Ａｋｔ、およびＰＫＣからなる経路を活性化するチロシンキナーゼ型受容体（ＴＫＲ）である。次いで、これは、ＮＦ−κＢ転写活性化経路および炎症性経路、例えば、ＣＯＸ２により誘導されるものとの複数のクロストークの関係を介し、増殖、生存、浸潤、転移速度、および腫瘍血管新生に対する効果を有し得る。ＳＡＡはこれらの経路を、チロシンキナーゼ型受容体と独立して活性化することができる（幅広の矢印で示す）。
【００８４】
ＥＧＦＲの発現量の上昇および／または恒常的な活性化は数多くの癌、例えば、脳癌、乳癌、腸癌および肺癌に伴う。そのカスケードの成分の変動はその経路の活性化に繋がり、癌の発症および進行に関連すると考えられている。例えば、ＥＧＦＲキナーゼドメイン（非喫煙者）またはＫＲＡＳ（喫煙者）における活性化変異は肺癌の早期発症に関連する７４，７５。Ｒａｓタンパクは約２５％の腫瘍で恒常的に活性化しており、上流の制御とは独立して分裂促進シグナリングを誘起する７６,７７。新たに蓄積された大量のデータにより、非直線的なシグナリングおよびトランス活性化が癌の発症および進行に重要な役割を果たすことが示唆される。
【００８５】
ＳＡＡ相互作用と抗癌療法に対する耐性
化学療法、放射線療法および抗炎症療法
前で議論し、図３および４に示されるように、ＳＡＡと数多くの受容体との相互作用は抗癌療法に対する耐性と関連する経路の活性化に繋がる。化学療法および放射線療法に対する耐性におけるＮＦ−κＢの役割は既に議論される４１。ＮＦ−κＢを阻害すると、アポトーシス応答亢進により、放射線療法７８，７９、およびデス（death）サイトカイン８０に対する感受性が上昇する。同時に、放射線およびいくつかの化学療法剤への曝露はＮＦ−κＢの活性化および後続するアポトーシスへの耐性を引き起こす８１，７９。化学療法（ゲムシタビン）誘発性のＮＦ−κＢ活性化を阻害することにより、ＮＳＣＬＣ細胞株の化学療法誘発性アポトーシスへの感受性が回復することが示されている８２，８１。他方で、いくつかの場合において、ＮＦ−κＢは化学療法に対する感受性に関連することが示されており、例えば、ＮＦ−κＢはパクリタキセル誘発性細胞死に必要であることが示唆されている８２。
【００８６】
これらの情報を考慮すると、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者に特徴的な血漿または血清中のＳＡＡ濃度の上昇から導かれる１つの結論は、ＳＡＡの上昇によりＮＦ−κＢ転写因子およびＭＡＰＫ経路の活性化が引き起こされる可能性があるというものである。これは、主に放射線療法に耐性を有する癌と関連する可能性、および患者の化学療法に対する応答に影響する可能性がある。しかしながら、各治療タイプおよび患者のコホートについて個々に評価されるべき数多くの因子が存在する。
【００８７】
三酸化ヒ素、クルクミン、サリドマイドといったＮＦ−κＢ阻害剤は、数多くの臨床治験の対象とされてきた。しかしながら、ＮＦ−κＢ阻害剤は正常な造血前駆細胞の化学療法誘発性アポトーシスも亢進するため、ＮＦ−κＢ阻害剤を化学療法の佐剤として用いることにより骨髄の回復が遅れる可能性があった。ＮＦ−κＢは自然免疫応答および獲得免疫応答の活性化に重要な役割を有するため、阻害剤の長期間の使用は免疫不全のリスクを伴う可能性が高い４１ことは考慮されるべきである。
【００８８】
もし、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」シグナチャーが実際にＮＦ−κＢの特異的な活性化と相関しているならば、このシグナチャーはＮＦ−κＢ阻害剤が最も有効である患者の選択に用いることができ、不要な治療およびそれに伴う病的状態を減弱できる可能性がある。
【００８９】
受容体型チロシンキナーゼを標的とする治療
ｅｒｂＢ受容体およびＭＡＰＫ経路
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、４つのメンバー（ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）、ｅｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２））からなる上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する。上皮癌の大半は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＨＥＲ２受容体の異常な活性化を示すため、これらの受容体の特異的な阻害は標的抗癌療法のストラテジーとなり、多くの研究の対象とされる。
【００９０】
リガンドの非存在下において、ＥＧＦＲ受容体はキナーゼ活性が抑制されるような構造で存在する。リガンドの結合により、「二量体化ループ」を露出させるような構造変化が開始され、受容体の二量体化が誘起される。これらの転移は細胞膜を横切って中継され、キナーゼドメインを活性化する。この活性化スキームの多様性はＥｒｂＢファミリーで見られる。ＥｒｂＢ−３は機能的なキナーゼではないが二量体のパートナーをトランス活性化することができ、他方で、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ−２は活性化構造に「ロックされた」リガンド不在の発癌受容体である。
【００９１】
この二量体化によりチロシンキナーゼ機能の活性化が起こり、３つの主要なシグナリング経路を介したシグナル伝達に繋がり、最終的には、アポトーシスの回避、血管新生の持続、抗増殖シグナルへの耐性、増殖シグナルの自給自足、および転移が引き起こされる７７，８３。
【００９２】
該カスケードの構成要素の変化は該経路の活性化を引き起こし、癌の誘発および進行と関連すると考えられており、例えば、ＥＧＦＲキナーゼドメイン（非喫煙者）またはＫＲＡＳ（喫煙者）の活性化変異は肺癌の早期発症と関連する７４，７２。Ｒａｓタンパクは約２５％の腫瘍で恒常的に活性化しており、上流の制御とは独立した分裂促進シグナリングを誘導する７６，７７。
【００９３】
いくつかのチロシンキナーゼ阻害剤（２つの小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤−エルロチニブおよびゲフィチニブ、ならびにＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のデュアル阻害剤ラパチニブを含む）は、臨床現場で様々な固形腫瘍に現在使用される。ヒト化したモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ、ならびに２つの抗ＥＧＦＲ抗体−セツキシマブおよびパニツムマブも臨床適用が認可されている。
【００９４】
数多くの刊行物でレビューされるチロシンキナーゼ阻害剤（小分子ならびにモノクローナル抗体）に対する自然耐性ならびに獲得耐性は、活性化ＫＲＡＳ変異、ｍｅｔ−癌原遺伝子の増幅８４、およびＴ７９０Ｍ変異といった様々な因子に起因する。癌の多様性、および標的薬剤に対して耐性の複数の経路を示す能力により、単剤による治癒的療法の見込みは困難なものとなるが８４、これは、多くの理由の中でも取り分け、リガンドとその受容体の相互作用の通常上流にあるものとは独立してシグナリングの活性化が起こる可能性があることによる。複数のチロシンキナーゼの共発現、受容体下流の経路のクロストーク、および伝達カスケードの下流の活性化の重要性を示す証拠が増加している。
【００９５】
経路のトランス活性化は、複数の研究において耐性のメカニズムの１つであることが示唆された。例えば、インスリン様成長因子−Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）シグナリングは、ヒト乳癌および前立腺癌細胞株においてゲフィチニブによりブロックされたＥＧＦＲを代償できることが示された８５。発癌性のＰＩＫ３ＣＡまたは別のＲＴＫによる代替の下流のシグナリング、特に、Ａｋｔの活性化を介したものは、ＮＳＣＬＣにおけるＴＫＩに対する耐性のメカニズムの１つであると記載される８６。
【００９６】
Cappuzzoら８８は、ＮＳＣＬＣ患者のゲフィチニブに対する感受性はＡｋｔが活性化された場合に非常に低くなる一方で、ＥＧＦＲの発現はネガティブであることを観察し、ＥＧＦＲ非依存的活性化がゲフィチニブに対する耐性に繋がり得ることを確認した。
【００９７】
我々は、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査により測定されるようなＳＡＡの相互作用がＲＴＫ非依存的なＭＡＰＫカスケードの活性化を引き起こし、その結果として、ＴＫＩ耐性となることを提案する。このＳＡＡの活性化のメカニズムは、直接的でも間接的でもよい。ＳＡＡの直接的な作用はＲＡＧＥまたはＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体へのその結合により仲介され、古典的ＭＡＰＫ経路の活性化を引き起こし得る（ＪＮＫおよびｐ３８の活性化による）。様々な癌細胞および癌細胞と関連する細胞の表面におけるこれらの受容体の存在およびその相互作用は、Malle, et al２１でレビューされる。ＴＬＲ受容体の活性化の結果としてのＥＧＦＲの活性化を直接証明する証拠が存在する６６。
【００９８】
ＳＡＡの間接的な作用はＦＰＲＬ受容体を介して作用し、インターロイキンＩｌ６、およびＩｌ８の放出を引き起こし、次いで、Ｇタンパク質共役型受容体と反応し、ＰＫＣを活性化することで説明することができる。（ＰＫＣの活性化により細胞増殖および血管透過性が亢進され、ＭＡＰＫ経路におけるＭＥＫの活性化が引き起こされる８６）。加えて、それはＶＥＧＦの発現を誘導する。
【００９９】
ＳＡＡは、肺上皮細胞およびマクロファージにおけるＴＲＬ４のリガンドである。所要細胞で発現されるＴＬＲのライゲーションによってもＶＥＧＦレベルが上昇することが報告されている７０。
【０１００】
この情報により、ＳＡＡによる主要な３つの全てのＭＡＰＫ経路の下流の活性化に関与するメカニズムが存在する証拠が提供される。ＭＡＰＫ経路の下流の活性化はＲＴＫ非依存的であり、「交差する」チェックポイントから上流の標的阻害に対する耐性を引き起こす可能性がある。
【０１０１】
前記の観点から、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査を用いる併用療法を含む特定の治療に最も適した患者のセレクションは、薬剤耐性のいくつかのタイプを克服する道具となり得る。
【０１０２】
併用療法およびＶｅｒｉＳｔｒａｔシグナチャー
ＴＫＩおよびＣＯＸ２阻害剤
前記で議論したように、ＳＡＡはＣＯＸ２の発現を誘導することができる。肺癌におけるＣＯＸ２の過剰な発現は、Huang et al.８７により最初に報告され、約７０％の腺癌で観察され８８、他の数多くの研究により確認された。
【０１０３】
数多くの治験によりＣＯＸ２およびＥＧＦＲシグナリング経路のクロストークが示されている。前記で議論したように、ＭＡＰＫ経路を介して作用する上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、いくつかの上皮細胞においてＣＯＸ２活性を著しく誘導する４７。ＴＧＦαによるＥＧＦＲの活性化はＣＯＸ２を刺激し、ＰＧＥ２の放出および有糸分裂誘発の亢進を引き起こす４８。他方、ＣＯＸ２の産物であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、ＥＧＦ受容体をトランス活性化することができる４５。ＮＳＣＬＣにおいて、ＰＧＥ２が、ＥＧＦＲ非依存的な様式の細胞内クロストークによりＭＡＰＫ／Ｅｒｋ経路を活性化することが示され;この効果はＧタンパク質共役型受容体およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を通して仲介され、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性に寄与する可能性がある８９。
【０１０４】
他方で、ＣＯＸ２阻害剤はＮＦ−κＢ経路を阻害することが示されている:セレコキシブはＡｋｔおよびＩＫＫの抑制を介してその効果を発揮する。ヒト非小細胞性肺癌において、セレコキシブはＮＦ−κＢ、ならびにＴＮＦ誘導性のＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＥＲＫの活性化をＩＫＫおよびＡｋｔの抑制を介して抑制し、ＣＯＸ２、ならびに炎症、増殖および腫瘍新生に必要な他の遺伝子の合成のダウンレギュレーションを引き起こす４６,９０。アスピリンおよびイブプロフェンを含む他のＮＳＡＩＤは、ＩＫＫ活性化およびＩκＢα分解の抑制により作用することが示された。合わせると、これらの考察により標準的な抗癌療法にＣＯＸ２を追加することの強力な理論的根拠が提供される。
【０１０５】
ＮＳＣＬＣにおける抗炎症療法およびチロシンキナーゼ受容体標的療法の併用療法に関する研究およびそれらがＥＧＦＲ−ＴＫＩを克服する可能性は以前の文献でレビューされている９０,９１。治験の結果はネガティブであった:ゲフィチニブおよびセレコキシブの併用療法における応答率および患者の生存率、ならびにロフェコキシブおよびエルロチニブで治療した患者の病勢コントロール率９２,９３は単剤療法におけるものと同様であることが分かった。
【０１０６】
ＣＯＸ阻害剤の添加の効果が、この経路において示唆されるＳＡＡのアップレギュレーション効果により、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」患者においてより顕著となる可能性がある。しかしながら、下流のＭＡＰＫ活性およびＮＦ−κＢならびにそれらの相互作用に対するＣＯＸ２経路の阻害効果の度合いは不明であるため、該効果の度合いを予測することは困難である。この仮説はさらに研究されるべきである。
【０１０７】
細胞株に基づく証明（図８）
我々は、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」血清が腫瘍細胞に生物学的効果を及ぼし得ること、特に、薬剤感受性細胞株においてそれがゲフィチニブに対する耐性を増強し得ることを示してきた。ゲフィチニブ感受性細胞株ＨＣＣ４００６（エクソン１９が欠損したＥＧＦＲを有する）および耐性株Ａ５４９（ＥＧＦＲ野生型）を用いて実験を行った。ステージＩＩＩＢ／ＩＶであり、Ｖｅｒｉｓｔｒａｄ「良」および「不良」と識別されたＮＳＣＬＣ患者からヒト血清を得た。各分類の血清を合わせてプールを作製し、増殖阻害アッセイに用いた。２種類の組成の培地（ＲＰＭＩ／１０％「良」血清またはＲＰＭＩ／１０％「不良」血清）を用いて細胞を播種した（１０複製／薬剤濃度；２,０００細胞／ウェル）。２４時間後、ゲフィチニブを加え、プレートを６日間インキュベートした。増殖阻害の測定にはＭＴＴアッセイを用いた。結果を下記の表２および図８に示す。
【表２】
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【０１０８】
図８は、異なる濃度のゲフィチニブの存在下における、Ｖｅｒｉｓｔｒａｄ「良」およびＶｅｒｉｓｔｒａｄ「不良」血清中のゲフィチニブ感受性細胞株ＨＣＣ４００６およびゲフィチニブ耐性細胞株Ａ５４９の増殖を示すグラフである。図８において、％コントロールは、対応する増殖培地中における所定のゲフィチニブ濃度の吸光度の薬剤非存在下における吸光度の平均値に対する比から算出した。エラーバーは正規化した測定値の標準偏差を表す。
【０１０９】
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」血清中で増殖させた場合、感受性細胞において阻害の相対的な減弱が見られたが、耐性腫瘍細胞では有意な変化は見られなかった。この結果は、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」血清が腫瘍細胞に対し直接生物学的効果を有することを示し、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」血清の効果とは異なるものである。これらの結果は、ＶｅｒｉＳｔｒａｔメカニズム、それとホスト−腫瘍相互作用、および患者集団における標的療法の相対的な有効性との関係の我々の仮説を支持するものである。
【０１１０】
化学療法におけるＶｅｒｉＳｔｒａｔ
図７に示されるように、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」シグナチャーはいくつかの非標的療法に対する応答不良に関連するが、他のものには関連しない。ＶｅｒｉＳｔｒａｔ分類は、ＤＮＡ複製またはＮＦ−κＢで制御される遺伝子の転写に干渉する化学療法（シスプラチン、ゲムシタビンなど）におけるアウトカムと相関する可能性が高いが、非標的療法におけるＶｅｒｉＳｔｒａｔの有用性の具体的な範囲は実験的に決定する必要がある。
【０１１１】
かくして、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査の臨床における適用の例は、いくつかの非標的化学療法レジメン（ＤＮＡの複製および／またはＮＦ−κＢ転写因子で制御される遺伝子の活性化と相互作用するものなど）が癌患者に有効である可能性が低いかどうかを予測するための方法であり、サンプル（図１）にＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査を行い、もし結果が「不良」のクラス標識であれば該患者には有効である可能性が低いことを特徴とするものになろう。
【０１１２】
ＳＡＡがＮＦ−κＢ転写因子の活性化の原因であること、ならびに癌の進行および様々な療法への応答におけるＮＦ−κＢ活性化の役割に関する文献的情報を考慮に入れると、ＶｅｒｉＳｔｒａｔシグナチャーは主に放射線療法に耐性を有する癌、ならびに化学療法に対する患者の応答と相関する可能性がある。
【０１１３】
三酸化ヒ素、クルクミン、サリドマイドといったＮＦ−κＢ阻害剤は、抗癌剤として臨床治験で評価の対象となっている。しかしながら、それらの有用性は、これらの薬剤に対する応答のバイオマーカーが存在しないこと、ならびにそれらの副作用により、限定されたものとなっている。ＶｅｒｉＳｔｒａｔはＮＦ−κＢの活性化の亢進のバイオマーカーとして有用であり得、故に、ＮＦ−κＢ阻害剤が最も有効である患者（おそらくは、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」）のセレクションに有用となり得る。
【０１１４】
前記の全てをまとめると、本発明は図１のＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査のさらなる使用を包含する。一般的な事柄として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が患者に有効であるかを予測する。予測の度合いは、特定の薬剤または薬剤の組み合わせに依存するであろう。ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は、下流の制御を標的とする薬剤の効果は予測しない。
【０１１５】
一実施態様において、本発明は、固形上皮腫瘍癌患者を、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ経路またはＰＫＣ経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が高い患者として、あるいは治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が低い患者として識別する方法であって：
ａ）固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；
ｂ）ａ）で得た質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程（バックグラウンドの除去、ノーマライゼーションおよびスペクトルのアラインメント）を行い;
ｃ）ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲（および、好ましくは前記の表１で示されるｍ／ｚ範囲に対応するｍ／ｚ範囲）において該スペクトルにおける選択された特徴の積分強度値を得；
ｄ）患者を治療薬または治療薬の組み合わせが有効である可能性が高い、または有効である可能性が低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズム（例えば、ｋ近傍法）にｃ）で得た値を用いる
ことを特徴とする方法と見做すことができる。
【０１１６】
特定の例として、ＥＧＦＲ−ＩにＭＡＰＫ経路の下流の活性化を遮断する標的薬剤を加えることにより、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」シグナチャーを有する患者のＥＧＦＲ−Ｉに対する耐性を克服できる可能性がある。
【０１１７】
別の特定の例として、ＣＯＸ２阻害剤、セレコキシブおよびロフェコキシブをＥＧＦＲ−Ｉに治療レジメンとして加えることにより、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」シグナチャーを有する患者のＥＧＦＲ−Ｉに対する耐性を克服できる可能性がある。ＶｅｒｉＳｔｒａｔ検査は、故に、ＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲＩを含む併用療法を処方するためのインジケーターとして用いることができる。特定の実施態様において、ＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲＩの投与が癌患者に有効である可能性が高いかどうかを予測する方法は、ａ）癌患者の血液由来サンプルから質量スペクトルを得；ｂ）ａ）で得た質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程（バックグラウンドの除去、ノーマライゼーションおよびスペクトルのアラインメント）を行い；ｃ）ｂ）の質量スペクトルにおける前処理工程を行った後、１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲（および、好ましくは前記の表１で示されるｍ／ｚ範囲に対応するｍ／ｚ範囲）において該スペクトルにおける選択された特徴の積分強度値を得；ｄ）患者をＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ−Ｉの投与による治療が有効である可能性が高い、または有効である可能性が低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズム（例えば、ｋ近傍法）にｃ）で得た値を用いることを特徴とする。特に、クラス標識が「不良」の場合、該患者には有効である可能性が高いことが示唆される。
【０１１８】
別の特定の例として、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「不良」シグナチャーはＮＦ−κＢの特異的な活性化と相関すると考えられ、故に、該検査は、ＮＦ−κＢ阻害剤、およびＣＯＸ２阻害剤の標準的な化学療法への追加が最も有効である患者の選択に用いることができ、同時に、不必要な治療およびそれに関連する病的状態の軽減にも有用であろう。
【０１１９】
本開示の方法は、癌患者の血液由来サンプル（またはこれらのサンプルからの質量分析データ）を受け取り、これらの質量分析データを機械で読み取り可能な記憶媒体に蓄え、図１に示される工程および分類工程を機械で行う、例えば、クラス標識（ＶｅｒｉＳｔｒａｔ「良」または「不良」）を作製するようプログラムされたコンピューターを用い、故に前記の薬剤または薬剤の組み合わせが有効である可能性が高いとしての識別を予測する臨床試験センターで実行されてもよい。別の一実施態様として、本発明は、ＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与が癌患者に有効である可能性が高いかどうかを識別または予測するよう構成された装置として設定することができる。該装置は、癌患者の血液由来サンプルの質量スペクトルを記憶する記憶装置、コンピューターの記憶媒体またはデータベース、ならびにａ）質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い（図１参照）；ｂ）１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該質量スペクトルにおける特徴の積分強度値を得（例えば、表１のピークのリストに含まれる範囲または前記のｍ／ｚ範囲において）；ｃ）患者をＣＯＸ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせの投与による治療が有効である可能性が高い、または低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズム（例えば、ＫＮＮ分類アルゴリズム)にｂ）で得た値を用いるよう設定されたソフトウェアの指示を実行するプロセッサー（例えば、一般的な目的でプログラムされたコンピューターの一般的なＣＰＵ）の組み合わせを含む。
【０１２０】
別の一例において、本発明は、固形上皮腫瘍癌患者を、ＡｋｔまたはＥＲＫ／ＪＮＫ／ｐ３８またはＰＫＣでの、またはそれらの上流でのＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路に関わる受容体のアゴニスト、受容体もしくはタンパク質を標的にする治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が高い患者として、あるいは治療薬または治療薬の組み合わせによる治療が有効である可能性が低い患者として識別するよう設定された装置として具体化することができる。該装置は、固形上皮腫瘍癌患者の血液由来サンプルの質量スペクトルを記憶する記憶装置、およびａ）質量スペクトルにおいて１つまたはそれ以上の所定の前処理工程を行い（図１参照）、ｂ）１つまたはそれ以上の所定のｍ／ｚ範囲において該質量スペクトルにおける特徴の積分強度値を得（例えば、表１のピークのリストに含まれる範囲または前記のｍ／ｚ範囲において）、ｃ）患者を治療薬または治療薬の組み合わせが有効である可能性が高い、または低い患者として識別するために、別の固形腫瘍患者の血液由来サンプルから得たクラス標識スペクトルを含む訓練セットを用いた分類アルゴリズムにｂ）で得た値を用いるよう設定されたソフトウェアの指示を実行するプロセッサーの形態を取る。 
【０１２１】
開示される発明のさらなる例は付属の請求項で説明される。
【０１２２】
付録
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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