(57)【要約】  本発明は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなる少なくとも１つのペプチドを含んでいる薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなる少なくとも１つのペプチドを含んでいる薬学的組成物。
【請求項２】
上記組成物は、ライノウイルスの感染の予防および／または治療に使用されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記ライノウイルスは、ライノウイルス株８９およびライノウイルス株１４からなる群から選択されるライノウイルス株であることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
上記ライノウイルスは、ライノウイルス株８９であり、
上記カプシドタンパク質は、ＶＰ１であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
上記ライノウイルスのカプシドタンパク質の上記１番目〜８番目のアミノ酸残基は、ＮＰＶＥＮＹＩＤというアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
上記少なくとも１つのペプチドは、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱＰＳＴＳＶＳＳＨＡＡ、および、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱからなる群から選択されることを特徴とする請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
上記少なくとも１つのペプチドは、キャリアーに結合または融合されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
上記組成物は、少なくとも１つの薬学的賦形剤、および／または、少なくとも１つのアジュバントをさらに含んでいることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
上記アジュバントは、ミョウバン、好ましくはリン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、または炭水化物をベースとした粒子であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記組成物は、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与に適用されるものであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に規定されるペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜７に規定されるペプチドの、ライノウイルスの感染の予防および／または治療のための薬物を製造するための使用。
【請求項１３】
上記薬物は、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与されるものであることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
あらゆるライノウイルス株によって引き起こされる、哺乳類におけるライノウイルスの感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であって、以下の工程を含んでいる方法：
−哺乳類のサンプルを含んでいる抗体を準備する工程、
−上記サンプルと、ライノウイルス株８９またはライノウイルス株１４のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなる少なくとも１つのペプチドと、を接触させる工程、
−上記少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体の結合が検出された場合に、ライノウイルスの感染を診断する工程。
【請求項１５】
上記サンプルは、血液サンプル、好ましくは血清もしくは血漿、唾液サンプル、神経洗浄液サンプル、または、涙液サンプルであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記ライノウイルスは、ライノウイルス株８９であり、
上記カプシドタンパク質は、ＶＰ１であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記ライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基は、ＮＰＶＥＮＹＩＤというアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記少なくとも１つのペプチドは、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱＰＳＴＳＶＳＳＨＡＡ、および、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱからなる群から選択されることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ライノウイルスの感染に関連した、哺乳類における呼吸器疾患をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であって、以下の工程を含んでいる方法：
−哺乳類のサンプルを含んでいる抗体を準備する工程、
−上記サンプルと、ライノウイルスのＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド、ＶＰ３ポリペプチドおよびＶＰ４ポリペプチドまたは当該ポリペプチドのフラグメントと、を接触させる工程、
−上記ポリペプチドに結合している抗体のクラスを決定する工程、ならびに、
−以下の診断を行う工程、
−ＶＰ３に特異的なＩｇＧ１抗体およびＶＰ４に特異的なＩｇＧ１抗体、ならびに、ＶＰ３に特異的なＩｇＭ抗体が検出された場合の、細気管支炎の診断、
−ＶＰ４に特異的なＩｇＧ１抗体、ならびに、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体およびＶＰ２に特異的なＩｇＡ抗体が検出された場合の、喘息の診断、
−ＶＰ４に特異的なＩｇＧ１抗体が検出された場合の、クループの診断、
−ＶＰ１に特異的なＩｇＭ抗体が検出された場合の、けいれんの診断、
−ＶＰ１に特異的なＩｇＡ、ＶＰ２に特異的なＩｇＡ、ＶＰ３に特異的なＩｇＡおよびＶＰ４に特異的なＩｇＡが検出された場合の、二重ウイルス感染（ＨＲＶ／インフルエンザ）の診断。
【請求項２０】
上記サンプルは、血液サンプル、好ましくは血清もしくは血漿、唾液サンプル、神経洗浄液サンプル、または、涙液サンプルであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド、ＶＰ３ポリペプチドおよび／またはＶＰ４ポリペプチドのフラグメントは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記ライノウイルスは、ライノウイルス株８９であり、
上記カプシドタンパク質は、ＶＰ１であることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
上記ライノウイルスのカプシドタンパク質の上記１番目〜８番目のアミノ酸残基は、ＮＰＶＥＮＹＩＤというアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記フラグメントは、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱＰＳＴＳＶＳＳＨＡＡ、および、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ライノウイルスの感染を予防および／または治療するための、ライノウイルスの少なくとも１つの全長カプシドタンパク質の少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基の一続きの配列からなるアミノ酸配列を含んでいる少なくとも１つのポリペプチドを含んでいる薬学的組成物。
【請求項２６】
上記ライノウイルスは、ライノウイルス株８９およびライノウイルス株１４からなる群から選択されるライノウイルス株であることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
上記カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３であることを特徴とする請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
上記連続したアミノ酸残基の一続きの配列は、上記少なくとも１つの全長カプシドタンパク質の少なくとも９０個、好ましくは１００個のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
上記組成物は、少なくとも１つの薬学的賦形剤および／またはキャリアーをさらに含んでいることを特徴とする請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
上記組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含んでいることを特徴とする請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
上記アジュバントは、ミョウバン、好ましくはリン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、または炭水化物をベースとした粒子であることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
上記組成物は、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与に適用されるものであることを特徴とする請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
請求項２５〜２８に規定されるポリペプチドの、ライノウイルスの感染の予防および／または治療のための薬物を製造するための使用。
【請求項３４】
上記薬物は、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与されるものであることを特徴とする請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
哺乳類におけるライノウイルスの感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であって、以下の工程を含んでいる方法：
−哺乳類のサンプルを含んでいる抗体を準備する工程、
−上記サンプルと、ライノウイルス株８９および／またはライノウイルス株１４の少なくとも１つの全長カプシドタンパク質の少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基の一続きの配列からなるアミノ酸配列を含んでいる少なくとも１つのポリペプチドと、を接触させる工程、
−上記少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体の結合が検出された場合に、ライノウイルスの感染を診断する工程。
【請求項３６】
上記サンプルは、血液サンプル、好ましくは血清もしくは血漿、唾液サンプル、神経洗浄液サンプル、または、涙液サンプルであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３であることを特徴とする請求項３５または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ライノウイルスの感染の治療および予防のための薬学的組成物に関する。
【０００２】
ライノウイルスはエンベロープを有していないウイルスであって、２０面体カプシド内に一本鎖ＲＮＡゲノムを含んでいるウイルスである。ライノウイルスはピコルナウイルス（Picornaviridae）科に属する。上記ピコルナウイルス科にはエンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、エコーウイルス、番号が付されたエンテロウイルス、パレコウイルス）およびヘパトウイルス属（Ａ型肝炎ウイルス）が包含される。１１０以上の血清型が同定されている。
【０００３】
ライノウイルスは通常、エアロゾルを介して、または直接的接触によって感染する。接種の最初の部位（primary site）は鼻粘膜であり、より少ない程度で結膜も関連し得る。ライノウイルスは気道上皮に付着し、局所的に広がる。上記ライノウイルスの付着において主要なヒトライノウイルスレセプターは細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）である。損傷に対するヒトの防衛システムの自然な反応はＩＣＡＭ−１に関連し、当該ＩＣＡＭ−１は内皮細胞と白血球との結合を支持する。ライノウイルスはＩＣＡＭ−１を付着のためのレセプターとして用いることによってＩＣＡＭ−１を巧みに利用する。
【０００４】
気道におけるウイルスに対する局所的な炎症反応は、鼻汁、鼻詰まり、くしゃみ、および喉の炎症を引き起こし得る。鼻上皮の損傷は起こらないが、サイトカインおよび他の介在物質の産生によって炎症が媒介される。
【０００５】
鼻汁中のヒスタミン濃度は増加しない。疾患の３〜５日目までに、化学誘引物質（例えばインターロイキン−８）に対する反応として感染部位に移動してきた多核白血球によって鼻汁が粘液膿性となり得る。上記疾患の間、鼻粘液線毛輸送は顕著に減少し、数週間に渡って正常に機能しないこともある。分泌性免疫グロブリンＡおよび血清抗体は両方とも、上記疾患の治癒および再感染の防止に関連している。
【０００６】
ライノウイルスの感染によって引き起こされる風邪は、温暖な気候である９月から４月に最も頻繁に生じる。ライノウイルスの感染は一年中見られるが、秋の間の風邪の発生率の最初の増加および春の終わりの二回目の発生率のピークの主な原因となる。いくつかの研究によって、風邪の発生率は就学前および小学校の年齢の子供において最も高いことが実証されている。上記年齢のグループでは平均して１年あたり３〜８回の風邪が観察され、託児所（daycare）および幼稚園（preschool）に通っている子供ではより高い発生率を示す。関連する多数のウイルス性因子およびライノウイルスの多数の血清型のため、冬の間の各月に新規に風邪を発症する幼い子供は珍しくはない。成人および青年は一般的に１年あたり２〜４回の風邪を発症する。
【０００７】
最も一般的なライノウイルスの徴候、すなわち風邪は軽度であり、自然治癒性である。しかし、細気管支炎および肺炎を包含する重度の呼吸器疾患はめったに起こらない。
【０００８】
ライノウイルスの感染をワクチン接種によって予防する初期の試みは成功していないため（Mc Cray et al. Nature 329: 736-738 (1987); Brown et al. Vaccine 9: 595-601 (1991); Francis et al. PNAS USA 87: 2545-2549 (1990)）、現在のライノウイルスの治療は、鎮痛剤、充血除去剤、抗ヒスタミン剤および鎮咳薬を用いた対症療法に限定されている。ライノウイルスの血清型の多様性および異種の血清型による再感染の間の交差防御の欠如により、ワクチン接種による予防の成功は不可能であると考えられている（Bardin PG, Intern. Med. J. 34 (2004): 358-360）。それゆえ、それぞれの薬学的化合物の発達は主に抗ウイルス性分子（例えばインターフェロンおよび合成抗ライノウイルス化合物）の発達に集中しており、当該抗ウイルス性分子は予防のみではなく治療に用いることもできる。
【０００９】
WO 2008/057158は、ヒトライノウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ１のＣ末端領域に由来するライノウイルス中和免疫原ペプチドを含んでいるワクチンに関する。しかし、上記文献に開示されているペプチドのいくつかは、幅広いメンバーのライノウイルスの血清型を対象とする抗体の形成を誘導することができる。
【００１０】
EP 0 358 485には、４０個未満のアミノ酸残基を有しているライノウイルス血清型２のＶＰ２カプシドタンパク質のペプチドを含んでいるＴ細胞エピトープが開示されている。
【００１１】
本発明の目的は、ライノウイルスの感染を治療または予防するためのワクチンとして使用するための薬剤を初めて提供することである。
【００１２】
本発明は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなる少なくとも１つのペプチドを含んでいる薬学的組成物に関する。
【００１３】
ライノウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に由来するペプチドは、上記カプシドタンパク質の最初の８つのＮ末端アミノ酸残基を含んでおり、ライノウイルス粒子を対象とする抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの形成を誘導することができるということが判明した。上記少なくとも１つのペプチドは全部で、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個または５０個のアミノ酸残基を含んでいてもよい。従って、上記少なくとも１つのペプチドはライノウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはＶＰ４のアミノ酸残基１番目〜８番目, 好ましくは１番目〜９番目、１番目〜１０番目、１番目〜１１番目、１番目〜１２番目、１番目〜１３番目、１番目〜１４番目、１番目〜１５番目、１番目〜１６番目、１番目〜１７番目、１番目〜１８番目、１番目〜１９番目、１番目〜２０番目、１番目〜２１番目、１番目〜２２番目、１番目〜２３番目、１番目〜２４番目、１番目〜２５番目、１番目〜２６番目、１番目〜２７番目、１番目〜２８番目、１番目〜２９番目、１番目〜３０番目、１番目〜３１番目、１番目〜３２番目、１番目〜３３番目、１番目〜３４番目、１番目〜３５番目、１番目〜３６番目、１番目〜３７番目、１番目〜３８番目、１番目〜３９番目、１番目〜４０番目、１番目〜４１番目、１番目〜４２番目、１番目〜４３番目、１番目〜４４番目、１番目〜４５番目、１番目〜４６番目、１番目〜４７番目、１番目〜４８番目、１番目〜４９番目または１番目〜５０番目を含んでいる。
【００１４】
上記ペプチドは、ライノウイルスの感染の予防および／または治療においてそれぞれの組成物中で使用され得る。
【００１５】
本発明の別の局面は、ライノウイルスの感染を予防および／または治療するための、ライノウイルスの少なくとも１つの全長カプシドタンパク質の少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基の一続きの配列からなるアミノ酸配列を含んでいる少なくとも１つのポリペプチド（タンパク質）を含んでいる薬学的組成物に関する。
【００１６】
驚くべきことに、ライノウイルスの少なくとも１つの全長カプシドタンパク質の少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基の一続きの配列からなるアミノ酸配列を含んでいる少なくとも１つのポリペプチドを投与することによって、個体において、ライノウイルス（特にライノウイルスのカプシドタンパク質）を対象とする抗体の形成が誘導されることが判明した。
【００１７】
本発明の組成物のポリペプチドおよびペプチドは、上述したように、抗体の形成（特にＩｇＡの形成）を誘導する。ＩｇＡは粘膜免疫において重要な役割を果たしている。粘膜内層においては、結合する他のタイプの抗体全てと比較してより多くのＩｇＡが産生されている。ＩｇＡの分泌形態においては、ＩｇＡは、涙液、唾液、腸液および気道上皮からの分泌物を包含する粘液性分泌物において見られる主要な免疫グロブリンである。ＩｇＡはまた、血液中において少量見られる。驚くべきことに、本発明に係るペプチドを個体に投与した場合、（他の抗体クラスと比較して）ＩｇＡクラスの抗体が主に形成されることがわかった。以上のことは、本発明のペプチドがライノウイルスの感染に対して優れた予防を可能にすることを示している。なぜならライノウイルスの最初の感染経路は気道（特に気道の粘膜）であり、ＩｇＡは粘膜免疫において重要な役割を果たしていることが知られているためである。連続したアミノ酸残基の一続きの配列は、好ましくは上記少なくとも１つの全長カプシドタンパク質ののうちの少なくとも９０個、１００個、１１０個、１２０個、１５０個、２００個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、またはちょうど全てのアミノ酸残基からなり得る。本発明の特に好ましい実施形態では、連続したアミノ酸残基の一続きの配列は少なくとも９０個、特に１００個のアミノ酸残基を含んでいる。
【００１８】
ライノウイルスは、４つのウイルスタンパクＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含んでいるカプシドからなる。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３はタンパク質カプシドの主要な部分を形成している。それゆえ、好ましいカプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３である。
【００１９】
特に好ましい実施形態では、上記ライノウイルスのカプシドタンパク質はＶＰ１であり、好ましくはヒトライノウイルス８９のＶＰ１である。本発明の組成物において使用される特に好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列からなる、または以下のアミノ酸配列を含んでいる：
【００２０】
【表１】
2013508427.tif 000002
【００２１】
（ヒトライノウイルス８９のＶＰ１の１番目〜１００番目のアミノ酸残基）。
【００２２】
本発明に従って使用されるカプシドタンパク質の例としては、ヒトライノウイルス株１（特に１Ａおよび１Ｂ）、２、３、６、１４、１５、１６、１８、２３、２５、２９、３５、３７、４４、５４、７２、８３、８６、８９、９２およびＣが挙げられる。上記アミノ酸配列のそれぞれは以下の表中で特定されている。
【００２３】
【表２】
2013508427.tif 000003
【００２４】
【表３】
2013508427.tif 000004
【００２５】
【表４】
2013508427.tif 000005
【００２６】
【表５】
2013508427.tif 000006
【００２７】
【表６】
2013508427.tif 000007
【００２８】
【表７】
2013508427.tif 000008
【００２９】
【表８】
2013508427.tif 000009
【００３０】
【表９】
2013508427.tif 000010
【００３１】
最も好ましいカプシドタンパク質はヒトライノウイルス８９に由来する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記ライノウイルスは、ライノウイルス株８９およびライノウイルス株１４からなる群から選択されるライノウイルス株である。
【００３３】
もちろん、本発明のワクチンの交差反応をさらに促進するために、１つ以上のほかのライノウイルスの血清型の１つ以上の他のカプシドタンパク質を上記ワクチン中に使用してもよい（例えば、ヒトライノウイルス８９のＶＰ１とヒトライノウイルス１４のＶＰ１との組み合わせ）。
【００３４】
ライノウイルス株８９およびライノウイルス株１４のカプシドタンパク質は、約１００の公知のライノウイルス株の大部分と交差反応を示す。上記ライノウイルス株の１つに由来する本発明のポリペプチドの投与により、ヒトライノウイルスの血清型の大部分を対象とする抗体（特にＩｇＡ）の形成が誘導される。それゆえ、上記ライノウイルス株のカプシドタンパク質に由来するポリペプチドを使用することが特に好ましい。
【００３５】
特に好ましい実施形態によれば、上記カプシドタンパク質はヒトライノウイルス８９のカプシドタンパク質であり、以下のアミノ酸および核酸配列を含んでいる。
【００３６】
【表１０】
2013508427.tif 000011
【００３７】
【表１１】
2013508427.tif 000012
【００３８】
【表１２】
2013508427.tif 000013
【００３９】
【表１３】
2013508427.tif 000014
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記ライノウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ１の１番目〜８番目のアミノ酸残基は、ＮＰＶＥＮＹＩＤというアミノ酸配列を有している。
【００４１】
本明細書で提供される配列情報および先行技術において公知の配列情報によって、本発明において好適に用いられるペプチドを決定することができる。それぞれのアミノ酸の範囲は上述した通りである。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、上記少なくとも１つのペプチドは、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱＰＳＴＳＶＳＳＨＡＡ、および、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱからなる群から選択される。
【００４３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本発明に係るペプチドは、キャリアーに融合または結合されている。
【００４４】
好適なキャリアーは特に限定されるものではないが、Limulus polyphemusヘモシアニン（ＬＰＨ）、Tachypleus tridentatusヘモシアニン（ＴＴＨ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイドおよびジフテリア毒素、ＤＨＢｃＡｇ、ポリリボトールリボシルリン酸（polyribotol ribosyl phosphate：ＰＲＰ）、ＰｎｃＰＤ１１、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）並びにナノ粒子製剤（nanoparticle formulations）が挙げられる。一実施形態では、好適な免疫原性キャリアータンパク質はキーホールリンペットヘモシアニンである（ＫＬＨ）。
【００４５】
免疫系を刺激し、ワクチンに対する反応を増加させるために、本発明の組成物は少なくとも１つの薬学的賦形剤、および／または、アジュバントを含んでいる。
【００４６】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、上記アジュバントは、ミョウバン、好ましくはリン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、または炭水化物をベースとした粒子（ＣＢＰ）である。
【００４７】
本発明に係る製剤の有効性を高めるために、あらゆる種類のアジュバントが使用され得る。しかしながら、好ましいアジュバントはアルミニウムをベースとした化合物である。他の有用なアジュバントには、脂肪含有化合物または不活性化されたマイコバクテリアが挙げられる。ＰＢＣは、例えばEP 1 356 826によって公知である。
【００４８】
ミョウバンはＩｇＧ分子の形成をもたらすＴｈ２駆動アジュバント（Th2 driving adjuvant）として知られている。しかしながら、驚くべきことに、ミョウバンと本発明の上記少なくとも１つのポリペプチドとを組み合わせて使用すると、結果としてＩｇＧよりもむしろＩｇＡを誘導することが見出された。ＩｇＡは粘膜の分泌物において見られる分泌性免疫グロブリンであり、それゆえ、侵入してくるウイルスに対する防御の第１線であるため、ＩｇＡの誘導は特に有利である。
【００４９】
アジュバントは一般的に、ヒトへの投与に好適であれば異なる形態であってもよい。上記アジュバントのさらなる例としては、鉱物の油エマルジョンもしくは植物由来の油性エマルジョン、鉱物化合物（例えばリン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、またはリン酸カルシウム）、細菌生産物および誘導体（例えばＰ４０（Corynebacterium granulosumの細胞壁に由来する）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：ＬＰＳの誘導体）、並びにムラミールペプチド誘導体および当該誘導体の複合体（マイコバイクテリウム成分の誘導体）、ミョウバン、不完全フロイントアジュバント、リポシン、サポニン、スクアレン等が挙げられる（例えばGupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)) および Johnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289)参照）。
【００５０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記製剤は１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記ポリペプチドを含んでいる。本発明のポリペプチドは上記の量で哺乳類に投与される。しかし、投与されるポリペプチドの量は治療される被験体の体質（例えば体重）に依存する。さらに、投与される量はまた、投与経路にも依存する。
【００５１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、上記組成物は皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与に適用されるものである。
【００５２】
本発明の製剤の好ましい投与方法には、一般的なワクチン接種のために記載および推奨されている全ての標準的な投与レジーム（経口、経皮、静脈内、経鼻、粘膜経由、直腸等）が包含される。しかし、本発明に係る分子およびタンパク質を皮下投与または筋肉内投与することが特に好ましい。
【００５３】
本発明の別の局面は上述したペプチドに関する。つまり、本発明のペプチドはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなる。
【００５４】
本発明のさらなる局面は、上述のように規定されるポリペプチドまたはペプチドの、ライノウイルスの感染の予防および／または治療のための薬物を製造するための使用に関する。
【００５５】
上記薬物は、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣内投与または例えばパッチを貼ることによって経皮投与されることが好ましい。
【００５６】
ヒトライノウイルス（ＨＲＶｓ）は、一般的に風邪として知られている急性呼吸器疾患（ＡＲＴＩ）および上気道（ＵＲＴ）感染症の主要な原因である。しかし、上記ウイルスはまた、下気道において増殖することもでき、より重度の気道機能不全の原因となる。重要な一連の証拠が増加していることから、ＨＲＶが喘息の悪化（exacerbations）の〜５０％の原因となっており、幼児の免疫系を喘息の表現型へと導き得る要因の１つであることが実証されている。喘息へのＨＲＶの関与を示すさらなる証拠は、悪化の季節性に基づいている。ＨＲＶの感染は、一年中起こるが、通常は春および秋にピークとなる。また、上気道感染症の季節的パターンと喘息による入院との間には強い相関関係が見出されている。
【００５７】
ＨＲＶの感染の症状には明確なパターンがないため、ＨＲＶｓの存在を確認するためだけに臨床検査所（diagnostic laboratory）に譲渡されている。残念なことに、検査が常に利用可能なわけではないため、またはＨＲＶの感染が無害と考えられるため、ＨＲＶ株をスクリーニングする業務はめったに生じない。現在、ライノウイルスの感染の診断はＰＣＲをベースにした方法によるウイルスの直接的な検出によって主に行われている。しかし、陽性の結果によって属のレベルを超えて特定することはめったにできず、通常は「呼吸ピコルナウイルス（respiratory picornaviruses）」として報告される。株特異的な感染の中和に基づいた一般的に使用されている血清診断はまた、大集団を用いた調査には実用的ではない。それゆえ、ＨＲＶの感染の診断のため、およびヒトライノウイルスによって他の呼吸器疾患（例えば喘息）が引き起こされているかどうか決定するために、血清診断技術を改良する必要がある。
【００５８】
それゆえ、本発明の別の局面は、哺乳類におけるライノウイルスの感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であって、以下の工程を含んでいる方法に関する：
−哺乳類のサンプルを含んでいる抗体を準備する工程、
−上記サンプルと、ライノウイルス株８９またはライノウイルス株１４のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなる少なくとも１つのペプチドと、を接触させる工程、
−上記少なくとも１つのポリペプチドに対する抗体の結合が検出された場合に、ライノウイルスの感染を診断する工程。
【００５９】
さらに、本発明の別の局面は、哺乳類におけるライノウイルスの感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であって、以下の工程を含んでいる方法に関する：
−哺乳類のサンプルを準備する工程、
−上記サンプルと、ライノウイルス株８９および／またはライノウイルス株１４の全長カプシドタンパク質の少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基の一続きの配列からなるアミノ酸配列を含んでいる少なくとも１つのポリペプチドと、を接触させる工程、
−上記少なくとも１つのポリペプチドに対する免疫グロブリンの結合が検出された場合に、ライノウイルスの感染を診断する工程。
【００６０】
ライノウイルス株８９および１４のカプシドタンパク質（特にＶＰ１）を対象とする抗体は、驚くべきことに、幅広い種類のライノウイルス株のカプシドタンパク質に結合することもできる。上記の驚くべき事実は、哺乳類において（好ましくはヒトにおいて）あらゆるライノウイルス株によって引き起こされるライノウイルスの感染を診断するために利用される。それゆえ、本発明の方法は、特異的な血清型とは独立してライノウイルスの感染を診断することができる。上記少なくとも１つのポリペプチドは上述した特性を有している。
【００６１】
本発明に係る上記少なくとも１つのポリペプチドは、固相の支持体上に固定されていることが好ましい。上記構成によれば、上記少なくとも１つのポリペプチドに結合している抗体を固相の支持体に対して結合させることができ、分析されているサンプルがライノウイルスのカプシドタンパク質を対象とする抗体を含んでいるかどうか検出することができる。上記抗体の存在はライノウイルスの感染の診断を可能にする。
【００６２】
本発明に係る方法では、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＥが測定されることが好ましい。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記サンプルは血液サンプル、好ましくは血清もしくは血漿、唾液サンプル、神経洗浄液サンプル（neural lavage fluid sample）、または、涙液サンプルである。
【００６４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、上記カプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはＶＰ４である。
【００６５】
本発明の別の局面は、ライノウイルスの感染に関連した、哺乳類における呼吸器疾患をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であって、以下の工程を含んでいる方法に関する：
−哺乳類のサンプルを含んでいる抗体を準備する工程、
−上記サンプルと、ライノウイルスのＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド、ＶＰ３ポリペプチドおよびＶＰ４ポリペプチドまたは当該ポリペプチドのフラグメントと、を接触させる工程、
−上記ポリペプチドに結合している抗体のクラスを決定する工程、ならびに、
−以下の診断を行う工程、
−ＶＰ３に特異的なＩｇＧ１抗体およびＶＰ４に特異的なＩｇＧ１抗体、ならびに、ＶＰ３に特異的なＩｇＭ抗体が検出された場合の、細気管支炎の診断、
−ＶＰ４に特異的なＩｇＧ１抗体、ならびに、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体およびＶＰ２に特異的なＩｇＡ抗体が検出された場合の、喘息の診断、
−ＶＰ４に特異的なＩｇＧ１抗体が検出された場合の、クループ（croup）の診断、
−ＶＰ１に特異的なＩｇＭ抗体が検出された場合の、けいれんの診断、
−ＶＰ１に特異的なＩｇＡ、ＶＰ２に特異的なＩｇＡ、ＶＰ３に特異的なＩｇＡおよびＶＰ４に特異的なＩｇＡが検出された場合の、二重ウイルス感染（ＨＲＶ／インフルエンザ）の診断。
【００６６】
ライノウイルスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４ポリペプチドを対象とする特異的なクラス／アイソタイプの抗体の存在は、個体がどの種類の呼吸器疾患を患っている可能性があるかを示していることが見出された。それゆえ、抗体クラスおよび抗体特異性の決定は、個体における呼吸器疾患の診断を可能にする。特異的な標的に結合する抗体の存在を決定する手段および方法は当該分野において公知である。また、抗体のアイソタイプ／クラスの決定は当業者に知られている。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記サンプルは、血液サンプル、好ましくは血清もしくは血漿、唾液サンプル、神経洗浄液サンプル、または、涙液サンプルである。
【００６８】
ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３および／またはＶＰ４ポリペプチドのフラグメントは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４からなる群から選択されるライノウイルスのカプシドタンパク質の１番目〜８番目のアミノ酸残基を包含している、最小で８個および最大で５０個のアミノ酸残基からなることが好ましい。
【００６９】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記ライノウイルスはライノウイルス株８９であり、上記カプシドタンパク質はＶＰ１である。
【００７０】
上記ライノウイルスのカプシドタンパク質の上記１番目〜８番目のアミノ酸残基は、ＮＰＶＥＮＹＩＤというアミノ酸配列を有している。
【００７１】
上記フラグメントは、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱＰＳＴＳＶＳＳＨＡＡ、および、ＮＰＶＥＮＹＩＤＳＶＬＮＥＶＬＶＶＰＮＩＱからなる群から選択されることが好ましい。
【００７２】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
図１は、１年間にわたって採取されたヒトの血清におけるＶＰ１に対するＩｇＡの反応の季節性を示している。８名のアレルギー患者および６名の非アレルギー患者に由来する血清を冬、春、夏および秋に採集した。また、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体の力価はＥＬＩＳＡによって決定され、Ｙ軸上に光学値（optical value）として示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値（non-outliers）はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【００７４】
図２は、調査期間における、ワクチン接種を受けた個体のＶＰ１に特異的なＩｇＡの濃度を示している。ＶＰ１に特異的なＩｇＡの力価はＥＬＩＳＡによって測定した。献血（blood donation）の日をＸ軸上に当てはめ、光学的濃度（ＯＤ）をＹ軸上に当てはめている。光学値はヒトの血清におけるＩｇＡ抗体の濃度と対応している。
【００７５】
図３は、マウスにおけるＶＰ１に特異的なＩｇＡ反応を示している。各グループのマウスにＶＰ１抗原を用いて免疫接種した。ＶＰ１に特異的なＩｇＡの力価はＥＬＩＳＡによって測定され、Ｙ軸上に光学値として示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はマウスの血清におけるＩｇＡ抗体の濃度と対応している。
【００７６】
図４は、ヒトライノウイルスの血清型１４のＶＰ１を用いた中和試験を示している。
【００７７】
図５は、ヒトライノウイルスの血清型８９のＶＰ１を用いた中和試験を示している。
【００７８】
図６は、組み換えＶＰ１タンパク質の精製を示している。（Ａ）８９ＶＰ１および（Ｂ）１４ＶＰ１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にクマシーブルーを用いて染色され（左）、ニトロセルロース上でのブロッティング後に抗Ｈｉｓ６抗体を用いて染色された（右）。分子量（ｋＤａ）は左側に示されている。
【００７９】
図７は、免疫接種されたウサギおよびマウスの、ＶＰ１に特異的な免疫反応を示している。（Ａ）ウサギにおける、８９ＶＰ１に特異的なＩｇＧおよび１４ＶＰ１に特異的なＩｇＧの反応。ウサギには８９ＶＰ１または１４ＶＰ１を用いて免疫接種した。血清サンプルは、１回目の免疫接種の日（免疫前の血清（pre-immune serum））、ならびに、２回目および３回目の注射の後に３〜４週間の間隔（ボックスの上：免疫血清１；免疫血清２）で採取した。血清の希釈（ウサギα８９ＶＰ１；ウサギα１４ＶＰ１）はＸ軸上に示されている（対数で示された１０−３〜１０−６）。免疫原（８９ＶＰ１、１４ＶＰ１）に対するＩｇＧの反応性はバーとして示されている。（Ｂ）５匹のマウスのグループに８９ＶＰ１を用いて免疫接種した。血清サンプルは、１回目の免疫接種の日（０）および３週間の間隔（ｗ３〜ｗ９）で採取した（Ｘ軸）。上記グループのＩｇＧ１の反応性はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。８９ＶＰ１に対して特異的なＩｇＧ１の濃度は光学的濃度の値として示されている（Ｙ軸）。
【００８０】
図８は、組み換えＶＰ１に対して作製された抗ＶＰ１抗体がライノウイルス由来のＶＰ１およびウイルス全体と反応することを示している。（Ａ）ニトロセルロースにブロッティングされたＨＲＶ１４タンパク質抽出物および組み換え１４ＶＰ１を、抗１４ＶＰ１抗体および対応する免疫前の血清（ｐｒｅ−ＩＳ）と共にインキュベートした。分子量（ｋＤａ）は左側に示されている。（Ｂ）ネガティブ染色後のラベルされたウイルス調整物の電子顕微鏡写真。固定されたＨＲＶ８９を抗８９ＶＰ１ＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、直径１０ｎｍのコロイド金粒子に結合した二次ＩｇＧ抗体プローブによって結合部位を視覚化した。左側の顕微鏡写真は、４つの金粒子（ＧＰ）に結合したウイルス粒子（ＶＰ）の詳細を示している。右側の顕微鏡写真は免疫前のＩｇを用いた対照調製物を示している。バー：左側の顕微鏡写真、５０ｎｍ；右側の顕微鏡写真、１００ｎｍ。
【００８１】
図９は、組み換え１４ＶＰ１タンパク質または１４ＶＰ１由来のペプチドに対するウサギの抗血清の反応性を示している。ウサギには、組み換え１４ＶＰ１、ＰＶＰ１Ａ、ＰＶＰ１ＢまたはＰＶＰ３Ａ（ボックスの上側）を用いて免疫接種し、血清を１４ＶＰ１（上側）または８９ＶＰ１（下側）に接触させた。上記血清の希釈はＸ軸に示されている（対数で示された１０−３〜１０−６）。１４ＶＰ１に特異的なＩｇＧおよび８９ＶＰ１に特異的なＩｇＧの濃度は光学的濃度の値と対応している（バー：Ｙ軸）。
【００８２】
図１０は、ＨＲＶ１４が抗１４ＶＰ１抗体によって中和されたことを示している。１００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ１４を、図に示されているような抗血清の連続した希釈物を用いて、３７℃で２時間、予めインキュベートした。上記の混合物を２４ウェルプレート内のサブコンフルエント（subconfluent）なＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で４日後、残った細胞を、クリスタルバイオレットを用いて染色した。Ｐｒｅ−ＩＳ、免疫前の血清が対照として用いられた。
【００８３】
図１１は、（Ａ）調査したＨＲＶのＶＰ１配列の系統樹を示している。ＶＰ１配列はデータバンクから検索し、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて当該配列の類似性を分析した。（Ｂ）ＶＰ１に特異的なそれぞれの抗体による、ＨＲＶの感染の阻害。１００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ１４を、１：２（ａ）〜１：１６（ｄ）まで２倍ずつ連続して希釈したそれぞれの抗血清の希釈物を用いて、３７℃で３時間、予めインキュベートした。上記の混合物を９６ウェルプレート内のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で３日間の培養後、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色し、洗浄し、染色液を溶解させた。ＯＤは５６０ｎｍで読み取られた。４つの独立した実験における平均値±標準誤差が示されている。
【００８４】
図１２は、精製されたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のｈｉｓタグタンパク質を含んでいる、クマシーブルーで染色された１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している（レーン１：５μｌの分子マーカー；レーン２：１０μｌのＶＰ１；以下それぞれ、１０μｌのＶＰ２；１０μｌのＶＰ３；１０μｌのＶＰ４）。
【００８５】
図１３は、ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者由来のヒトの血液において検出されたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の反応を示している。ライノウイルス由来のカプシドタンパク質に特異的な４つの抗体について、５７人の患者の血清を試験した。力価はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【００８６】
図１４Ａは、ＨＲＶプロトタイプ株のＶＰ１アミノ酸配列のマルチプルアラインメントを示している。配列はProtein Databaseから検索し、ＧｅｎｅＤｏｃを用いて並べた後に手動で編集した。上記アラインメントは異なる種および異なるレセプターグループに属するＨＲＶ血清型を示している：ＨＲＶ３７および８９はメジャーグループジーナスＡであり、ＨＲＶ３、１４および７２はメジャーグループジーナスＢであり、ＨＲＶ１Ａ、１８および５４はＫ−タイプであり、ＨＲＶ１Ａ、ＨＲＶ２９および４４はマイナーグループジーナスＡである。黒い正方形は、ＨＲＶ８９株のＶＰ１に由来する３つのエピトープを意味している。
【００８７】
図１４Ｂは、ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者由来のヒトの血液において検出されたＥｐ＿１、Ｅｐ＿２およびＥｐ＿３に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の反応を示している。ＶＰ１由来のエピトープに特異的な６つの抗体について、５７人の患者の血清を試験した。力価はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【００８８】
図１５は、組み換えＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１由来のエピトープに対するモルモットＩｇＧの交差反応を示している。しかし、当該図１５は（診断のために使用される）抗原の認識のみに関する。図１５は各ウイルスの中和の証拠ではなく、交差防御を示している。異なるＨＲＶ株の中和は図１１Ｂに示されている。当該データは相関しているため、ＨＲＶ８９に由来するＶＰ１またはＶＰ１に由来するＮ末端フラグメントに対する抗体は、中和試験によって調べた場合に他の株も中和すると仮定することができる。
【００８９】
図１６は、主要なカプシドタンパク質ＶＰ１のエピトープマッピングを示している。
【００９０】
図１７は、ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者由来のヒトの血液において検出された、ＶＰ１のＮ末端エピトープに由来する合成ペプチドに対するＩｇＧ１の免疫反応を、既知のペプチド（Mc Cray et al., Nature 329 (1987): 736-738）と比較して示している。
【００９１】
図１８は、ＨＲＶ／インフルエンザ二重感染の患者における抗体の値に対するＲＯＣ曲線を示している。
【００９２】
図１９は、ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された５７人の患者に由来するヒトの血液において検出された、Ｐ１由来のペプチド（それぞれ、およそ３０個のアミノ酸（図１９Ａ）または２０個のアミノ酸（図１９Ｂ）を含んでいる）、またはＰ１Ａ由来のペプチド（Ｂ）（それぞれ、２０個のアミノ酸を含んでいる）に対するＩｇＧ１の反応を示している。ＩｇＧ１の反応性はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。図２０は、抗ＶＰ１抗体、抗ＶＰ２抗体、抗ＶＰ３抗体、抗ＶＰ４抗体によるＨＲＶの感染の阻害を示している。１０ＴＣＩＤ５０（Ａ）、１００ＴＣＩＤ５０（Ｂ）または１０００ＴＣＩＤ５０（Ｃ）のＨＲＶを、１：２〜１：１：１２８まで２倍ずつ連続して希釈したそれぞれの抗血清の希釈物を用いて、３７℃で３時間、予めインキュベートした。上記の混合物を９６ウェルプレート内のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で３日間の培養後、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色し、洗浄し、染色液を溶解させた。ＯＤは５６０ｎｍで読み取られた。
【００９３】
図２１は、１４ＶＰ１、８９ＶＰ１および３つの組み換え８９ＶＰ１フラグメントとのウサギ抗８９ＶＰ１抗体およびウサギ抗１４ＶＰ１抗体の反応性を示している。ウサギの血清は１：５０００に希釈されており、結合したＩｇＧ抗体に対応するＡ５６０がＹ軸上に示されている。
【００９４】
〔実施例〕
〔実施例１：異なる季節に測定された３人のアレルギー患者における、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体の反応〕
２００６年の冬（ｗｉｎ０６）、２００７年の春（ｓｐｒ）、２００７年の夏（ｓｕｍ）、２００７年の秋（ａｕｔ）および２００７年の冬（ｗｉｎ０７）に、血液サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡ実験によって、抗体の力価を測定した。ＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５μｇ／ｍｌのＶＰ１（ライノウイルス株８９のＶＰ１）にてコーティングするとともに、１：５０に希釈したマウスの血清にてインキュベートした。全ての実験を２回行い、ＯＤの平均値（mean OD）を算出した。結合した抗体は、１：１０００に希釈されたモノクローナルなマウスの抗マウス  ヒトＩｇＡ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）と、次いで、１：２０００に希釈されたラットの抗マウスＩｇＧ  ＰＯＸ結合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を用いて検出した。ＯＤを、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、４０５ｎｍおよび４９０ｎｍにおいて測定した。
【００９５】
抗体の力価は、季節によって異なるとともに、患者によって異なった。このことは、ＶＰ１によって、ライノウイルスへの暴露を判定できることを結論付けている（図１）。
【００９６】
〔実施例２：ライノウイルスのＶＰ１タンパク質による、健康なボランティア中での強力なＩｇＡ反応の誘導〕
健康なボランティアに対して、ライノウイルスのタンパク質であって、Ａｌ（ＯＨ）３に吸着された完全なＶＰ１分子、を含む製剤を接種した（２０μｇ／注射）。当該ワクチンは、被験者の上腕の皮下に対して３回注射された（０日、２１日、４２日）。最初のワクチン接種の前、並びに、６５日、７９日、９１日、９８日および１１９日目に、抗原特異的な免疫反応の進行を解析するために、血液を採取した。
【００９７】
図２では、ＥＬＩＳＡ測定によって、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体の増加が証明された。Ｘ軸は、血液をサンプリングした日を示し、Ｙ軸は、光学的濃度（Optical density：ＯＤ）の値に対応している。ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体は、６５日目に最大量に達し（ＯＤ＝０．５５１）、このとき、免疫前の血清（０日）と比較して、３倍に増加したＶＰ１に特異的な抗体が検出された。６５日目の後、ＩｇＡの濃度の緩やかな低下が検出された。しかしながら、１１９日目において、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体の濃度（ＯＤ＝０．３７２）は、０日目の濃度（ＯＤ＝０．１９５）の略２倍であった。
【００９８】
〔実施例３：免疫されたマウスにおける、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ反応〕
ＶＰ１に特異的なＩｇＡ反応を測定するために、５匹のマウスのグループに対して、３週間の間隔にて、水酸化アルミニウムに吸着させた５μｇのＶＰ１抗原を皮下投与した。最初の免疫接種の前の日（０）、および、２回目の免疫接種の後の日（６ｗ）に、尾の血管から血清サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡによって、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体の濃度を測定した。プレートを、５μｇ／ｍｌのＶＰ１タンパク質によってコーティングするとともに、１：５００に希釈されたマウスの血清を用いて一晩インキュベートした。結合したＩｇＡは、それぞれ、１：１０００に希釈されたモノクローナルなラットの抗マウスＩｇＡ抗体と、それに続く、１：２０００に希釈されたヤギの抗ラットＩｇＧ  ＰＯＸ結合抗体と、を用いて検出した。ＯＤを、４０５ｎｍおよび４９０ｎｍにおいて測定した。全てのＥＬＩＳＡ実験を２回行い、平均値を算出した。
【００９９】
組み換えＶＰ１タンパク質を用いた免疫接種が、マウスにおいて、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ反応を誘導したが、６週間後の抗体濃度の増加は顕著ではなかった（図３）。
【０１００】
〔実施例４：風邪感染に対するワクチンのための、ライノウイルス由来のＶＰ１の組み換え体〕
〔材料および方法〕
〔ＨＲＶ１４またはＨＲＶ８９のＶＰ１  ｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築〕
ＨＲＶ１４（３３）の全ゲノムを含んでいるプラスミドを、ＰＣＲにて１４ＶＰ１（ＨＲＶ１４のＶＰ１）を増幅するための鋳型として用いた。以下のプライマーを用いた。つまり、
５’    CGGAATTCCCATGGGCTTAGGTGATGAATTAGAAGAAGTCATCGTTGAGA    ３’
５’    GATGGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGGATTTAATGTCAC      ３’
というプライマーを用いた。
【０１０１】
制限酵素認識部位（ＮｃｏＩ，ＥｃｏＲＩ）に下線を付している。１４ＶＰ１のコーディング領域（データベース  ＃  ＡＹ３５５１９５）をコードしているｃＤＮＡを、プラスミドｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｃｏＩサイトおよびＥｃｏＲＩサイト内へ挿入した。
【０１０２】
株８９のウイルスストックを、「Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａ」のコレクションから入手した。ウイルスのＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞培養上清から調製し、最終濃度が０．０１Ｕ／μｌとなるように、ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ＵＳＡ）のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって、８９ＶＰ１  ｃＤＮＡ（ＨＲＶ８９のＶＰ１）を増幅した。なお、当該増幅には、以下のプライマーを用いた。つまり、
５’    CGGAATTCATTAATATGAACCCAGTTGAAAATTATATAGATAGTGTATTA    ３’
５’    CGATTAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACGTTTGTAACGGTAA        ３’
というプライマーを用いた。
【０１０３】
制限酵素認識部位（ＥｃｏＲＩ，ＡｓｅＩ）に下線を付している。完全な８９ＶＰ１のコーディング領域（データベース  ＃  ＡＹ３５５２７０）をコードしているｃＤＮＡを、ベクターｐＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｄｅＩサイトおよびＥｃｏＲＩサイト内へサブクローニングした。
【０１０４】
〔組み換え８９ＶＰ１および組み換え１４ＶＰ１の、発現および精製〕
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）内で、組み換え８９ＶＰ１、および、組み換え１４ＶＰ１を発現させた。１ｍＭのＩＰＴＧを用いて、５時間、３７℃の条件下にてタンパク質の合成を誘導した。６Ｍ  塩酸グアニジン、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８の溶液中に可溶化させた後で、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることによって、封入体画分（inclusion body fraction）から、組み換えタンパク質を精製した。洗浄バッファー（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，８Ｍ  尿素  ｐＨ５．９）を用いてタンパク質を洗浄し、そして、ｐＨ３．５である同じバッファーを用いてタンパク質を溶出した。タンパク質の調製物を、尿素の濃度を減少させた複数のバッファーに対して透析し、そして、最後にＨ２Ｏｄｄに対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、タンパク質の純度と濃縮度とを確認した。
【０１０５】
〔合成ペプチドおよびペプチド結合物（peptide conjugates）〕
ＨＲＶ１４に由来するペプチド（ＰＶＰ１Ａ、ＰＶＰ１Ｂ、および、ＰＶＰ３Ａ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＵＳＡ）  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａにて合成した。なお、当該合成は、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−ｙｌ）１，１，３，３  テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート］活性剤を用いるＦｍｏｃ（９  フルオレニル  メトキシ  カルボニル）法を用いて行った。以下のペプチドを、前段階のＨＰＬＣによって９０％よりも高い純度にまで精製し、これらが所望のものであることを、質量分析法によって確認した。つまり、
ＰＶＰ１Ａ：VVQAMYVPPGAPNPKEC    ＶＰ１の１４７番目〜１６２番目のアミノ酸（１０）；
ＰＶＰ１Ｂ：CRAPRALPYTSIGRTNYPKNTEPVIKKRKGDIKSY    ＶＰ１の２５６番目〜２８９番目のアミノ酸（ＷＯ２００８／０５７１５８参照）；
ＰＶＰ３Ａ：KLILAYTPPGARGPQDC    ＶＰ３の１２６番目〜１４１番目のアミノ酸（１０）。
【０１０６】
Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を用い、製造元の使用説明書にしたがって、精製したペプチドをＫＬＨへ結合させた。
【０１０７】
〔マウスおよびウサギへの免疫接種〕
ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｋｉｓｓｌｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へ免疫接種することによって、１４ＶＰ１、８９ＶＰ１、ＰＶＰ１Ａ、ＰＶＰ１ＢまたはＰＶＰ３Ａに対するウサギ抗体を得た。５匹のマウスのグループに対しても、３週間の間隔で、ミョウバンに結合した５μｇの８９ＶＰ１を皮下に免疫接種し、尾の血管から採血した。
【０１０８】
〔ＥＬＩＳＡ実験〕
ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌの８９ＶＰ１または１４ＶＰ１にてコーティングした。マウスの血清を１：５００に希釈し、ウサギの血清を１：１０３〜１：１０６に希釈した。１：１０００に希釈した、アルカリホスファターゼが連結したモノクローナルなマウスの抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、抗原に特異的なマウスのＩｇＧ１抗体を検出した。１：２０００に希釈した、ペルオキシダーゼが連結したロバの抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、抗原に特異的なウサギのＩｇＧ抗体を検出（developed）した。結合した抗体に対応するＯＤは、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ウサギ抗体に関しては４０５ｎｍおよび４９０ｎｍにて測定し、マウス抗体に関しては４０５ｎｍおよび４５０ｎｍにて測定した。
【０１０９】
〔抗ＶＰ１抗体の、ブロットされたライノウイルス抽出物、および、ライノウイルスに対する反応性〕
ＨＲＶが感染したＨｅＬａ細胞に由来する細胞培養上清を、ベンチフュージ（bench fuge）（１５.０００ｒｐｍ，１０分間，２０℃）にて遠心分離し、不溶性粒子を除去した。次いで、０．５ｍｌのＰＥＧ（４０％  ｖ／ｖ  ポリエチレングリコール６０００，２．４％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を、２ｍｌのウイルス含有上清へ加えた。上記溶液を、４℃で一晩インキュベートし、その後、室温でベンチフュージにて２，３００×ｒｐｍ、４５分間の遠心分離を行った。ペレットを、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そして、５０μｌのＳＤＳサンプルバッファー中に溶解した。１０μｌの当該ＨＲＶ１４タンパク質抽出物と、０．５μｇの精製した１４ＶＰ１と、を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離するとともに、ニトロセルロース膜上にブロットした。同様に準備したブロットを、１：５００に希釈したウサギの抗１４ＶＰ１抗体、または、これに対応する免疫前の血清イムノグロブリンを用いてインキュベートした。結合した抗体を、１２５Ｉにてラベルしたロバの抗ウサギＩｇＧを用いて検出し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１１０】
金免疫電子顕微鏡のために、再懸濁したウイルスの沈殿物の試料（４．２μｌ）を、カーボンにてコーティングされたプラズマ洗浄された銅製のグリッド上にピペットで取り、空気乾燥させた。５分後に、紙フィルターを用いて、残っている液体を除去した。次いで、上記グリッドを、以下のバッファー中で、うつぶせにしてインキュベートした（室温のモイストチャンバー）。つまり、初めに、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳ、次いで、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むｐＨ８．２のＴｒｉｓ  バッファーを用いた。
【０１１１】
次いで、以下のインキュベーション工程を行った。つまり、（ａ）５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにて５分間；（ｂ）ＯＤ２８ｎｍが０．６になるように調製したプロテインＧにて精製した抗ＶＰ１  Ｉｇまたは免疫前のＩｇにて４５分間；（ｃ）６×ＰＢＳバッファーにて各５秒間；（ｄ）６×Ｔｒｉｓ  バッファーにて各５秒間；（ｅ）１０ｎｍの直径を有するコロイド様の金粒子に結合したヤギの抗ウサギＩｇ（Ｐｌａｎｏ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＴｒｉｓ  バッファー中に１：２０で希釈したものにて３０分間；（ｆ）６×Ｔｒｉｓ  バッファーにて各５秒間；（ｇ）６×蒸留水にて各５秒間。グリッド上で酢酸ウラニルの飽和溶液をピペッティングすることによって、ラベリングの後で、ネガティブ染色を行った。１分後に、湿った紙フィルターを用いて余剰のネガティブな染色を除去した。次いで、風によってグリッドを乾燥させ、当該グリッドを、高解像度のＣＣＤカメラを備えたＰｈｉｌｉｐｓ  ＥＭ  ４１０  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて観察した。１６５，０００ｘ、または、２４０，０００ｘの倍率にて、顕微鏡写真を撮った。
【０１１２】
〔ＨＲＶ中和試験〕
ライノウイルスのストックと、ＨＲＶに対して感受性であるＨｅｌａ細胞の「Ｏｈｉｏ」株（Stott EJ and Tyrrell DA, Arch. Gesamte Virusforsch. 1968; 23:236-244.）と、を用いた。２４ウエルプレート中にＨｅｌａ細胞を播き、略９０％コンフルエンス（confluence）にまで増殖させた。第１の実験のセットでは、培地中のＨＲＶ１４（１００  ＴＣＩＤ５０）の３００μｌの試料を、３００μｌのウサギの抗血清（抗１４ＶＰ１、抗ＰＶＰ１Ａ、抗ＰＶＰ１Ｂ、若しくは、ＰＶＰ３Ａ）、または、対応する免疫前の血清（希釈なし、若しくは、１：２〜１：３２に希釈）を用いて２時間、３７℃にてインキュベートし、そして、当該試料を、細胞へ加えた。当該試験では、１％のＦＣＳおよび４０ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでいるＭＥＭ−Ｅａｇｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を、希釈液として用いた。湿気を帯びた５％のＣＯ２雰囲気下にて３４℃にてプレートをインキュベートし、３日後に、クリスタルバイオレットを用いて生存細胞を染色した。９６ウエルプレート中で、交差中和試験（Cross-neutralization tests）を行った。Ｈｅｌａ細胞を、２％のウシ胎仔血清、３０ｍＭのＭｇＣｌ２、および、１ｍＭのグルタミン（感染培地）を含む最小必須培地（minimal essential medium：ＭＥＭ）中に播き、略７０％コンフルエンスにまで、３７℃で一晩増殖させた。ＨＲＶ（１００μｌの感染培地中で、１００  ＴＣＩＤ５０）を、１００μｌの、希釈していない抗血清の各々、および、これらを同じ培地にて２倍に希釈した一連のもの、と混合した。３時間、３７℃にてインキュベートした後、細胞をこれらの溶液によって覆い、３４℃、３日間のインキュベーションを続けた。培地を除去し、クリスタルバイオレット（水中に１％）にて１０分間、細胞を染色した。水を用いて洗浄した後、プレートを乾燥させ、１時間攪拌しながら、３０μｌの１％ＳＤＳ中で染色液を溶解させた。そして、細胞防御（cell protection）を、ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒにて、５６０ｎｍにおけるＯＤとして定量化した。
【０１１３】
〔結果〕
〔ＨＲＶ８９およびＨＲＶ１４に由来する組み換えＶＰ１タンパク質の、発現および精製〕
ＨＲＶ８９の組み換えＶＰ１（８９ＶＰ１；図６Ａ）、および、ＨＲＶ１４の組み換えＶＰ１（１４ＶＰ１；図６Ｂ）を、これらのＣ末端にＨｉｓ６−ｔａｇを付した状態で、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。そして、これらを、１工程のニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、可溶化した封入体から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてクマシーブルー染色を行うと、精製されたタンパク質のバンドは、略３４ｋＤａに現れた。組み換えタンパク質８９ＶＰ１および組み換えタンパク質１４ＶＰ１は、これらのＣ末端にあるヘキサヒスチジンタグ（右側のレーン：図６）により、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体と特異的に反応した。
【０１１４】
８９ＶＰ１および１４ＶＰ１は、動物において、ＶＰ１に特異的な免疫反応を誘導する。組み換え８９ＶＰ１および組み換え１４ＶＰ１によってウサギに対して免疫接種をすると、ＶＰ１に特異的なＩｇＧ反応が誘導された（図７Ａ）。２回目の免疫接種の後で１０−５の血清希釈まで検出された抗体、および、３回目の免疫接種の後で１０−６の血清希釈まで検出された抗体に関して、８９ＶＰ１に対する免疫反応は、１４ＶＰ１に対する免疫反応よりも強かった。１４ＶＰ１に特異的なＩｇＧ反応は、２回目の免疫接種の後では、１０−３の血清希釈まで検出可能であり、３回目の免疫接種の後では、１０−４の血清希釈まで検出可能であった（図７Ａ）。ＶＰ１に特異的な抗体反応は、ミョウバンに吸着したＶＰ１タンパク質を用いてマウスを免疫接種した場合にも得られた。８９ＶＰ１に特異的なＩｇＧ１抗体は、１回目の免疫接種の後で既に検出され、２回目および３回目の免疫接種の時に増加し続けた（図７Ｂ）。
【０１１５】
〔組み換えＶＰ１タンパク質に対して作製した抗体の、ウイルス由来のＶＰ１および完全なビリオンに対する反応性〕
組み換えＶＰ１タンパク質、天然のウイルス由来のＶＰ１、および、ウイルス全体を用いた免疫接種によって誘導される抗体の反応性を、イムノブロッティングおよび電子顕微鏡の各々で試験した。代表例として、ニトロセルロースにブロットされたＨＲＶ１４タンパク質および１４ＶＰ１に対する、ウサギの抗１４ＶＰ１抗体の結合、および、免疫前のＩｇの結合を図８Ａに示す。組み換え１４ＶＰ１に対して作製された抗体は、略３４ｋＤａである天然の１４ＶＰ１および組み換えの１４ＶＰ１と反応したが、免疫前のＩｇは反応しなかった（図８Ａ）。抗８９ＶＰ１抗体のＨＲＶ８９に対する特異的な結合を、金免疫電子顕微鏡法を用いて視覚化した。固定化したビリオンを、抗８９ＶＰ１抗体、および、金が結合した二次抗体へ接触させると、略１０％のウイルス粒子が、１個から最大５個のコロイド金粒子によって覆われていることが観察された（図８Ｂ）。免疫前のＩｇを用いた対照とする調製物では、ビリオンに対する金の付着が全く観察されなかった。なお、２，３個の金粒子が存在したが、これらは、ウイルス粒子と結合していなかった（図８Ｂ；右側のパネル）。
【０１１６】
〔組み換え１４ＶＰ１を用いたウサギの免疫接種によって生じる、ＫＬＨに結合したＨＲＶ１４に由来するペプチドを免疫接種した場合よりも高い、１４ＶＰ１に特異的な抗体および８９ＶＰ１に特異的な抗体の力価〕
ワクチン候補になり得るものとして先に記載したＫＬＨに結合されたペプチドに対して、抗体を作製した。抗ペプチド血清は、ペプチドに特異的な抗体の高い力価（ＰＶＰ１Ａ：１０−３；ＰＶＰ１Ｂ：１０−５；ＰＶＰ３Ａ：１０−５）を有していた。しかしながら、組み換え１４ＶＰ１に対して作製した抗血清と比較した場合、これらは、１４ＶＰ１タンパク質と弱く反応するのみであるとともに、８９ＶＰ１と弱い交差反応を示した（図９）。最も著しくは、組み換え１４ＶＰ１に対して作製した抗血清は、１４ＶＰ１および８９ＶＰ１と同程度の反応性を示した。ＶＰ１タンパク質に対する抗血清は、ペプチドの抗血清よりも少なくとも１０倍強く、両方のウイルスタンパク質と反応した（図９）。
【０１１７】
〔１４ＶＰ１に特異的な抗体による、ペプチドに特異的な抗体よりも良好な、ＨｅＬａ細胞に対するＨＲＶの感染の阻害〕
次いで、組み換え１４ＶＰ１タンパク質に対して作製したウサギのＩｇＧ抗体が、ＨｅＬａ細胞に対するＨＲＶの感染を阻害し得るか否か、検討した。ＨＲＶ１４を用いて行った１セットの細胞防御試験の結果を、図１０に示す。１４ＶＰ１抗体が存在すると、抗血清を１：３２に希釈するまで、１００  ＴＣＩＤ５０において、ＨＲＶ１４の投与（challenge）による細胞死を阻害した。
【０１１８】
１４ＶＰ１に由来するペプチドに対する抗体および完全な１４ＶＰ１に対する抗体の、ウイルス感染に対する細胞防御能力も解析した。抗１４ＶＰ１血清、抗ＰＶＰ１Ｂ血清、または、抗ＰＶＰ３Ａ血清の連続希釈物（希釈なし、または、１：２〜１：３２に希釈）を、ＨＲＶ１４と共にインキュベートし、そして、ＨｅＬａ細胞へ添加した。３つの全ての抗ペプチド血清の細胞感染を阻害する能力は、互いの間で似ていた。抗ＰＶＰ１Ａおよび抗ＰＶＰ１Ｂの１：８の希釈物、および、抗ＰＶＰ３Ａの１：４の希釈物において、ＣＰＥの明確な減少が観察された。同程度の感染の阻害（換言すれば、部分的なＣＰＥ（partial CPE））が、抗１４ＶＰ１血清を１：３２に希釈するまで観察された。このことは、ウイルス感染を阻害する上で、後の抗血清（latter antiserum）の方が、略８倍、効果が高いことを示している（表１）。
【０１１９】
【表１４】
2013508427.tif 000015
【０１２０】
表１に、１４ＶＰ１およびＨＲＶ１４に由来するペプチドに対して作製した抗体による、感染の中和を示す。抗１４ＶＰ１抗体、抗ＰＶＰ１Ａ抗体、抗ＰＶＰ１Ｂ抗体、または、抗ＰＶＰ３Ａ抗体の希釈物（希釈なし、または、１：２〜１：３２に希釈）を、１００  ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ１４と予めインキュベーションし、これを、ＨｅＬａ細胞へ加えた。観察されたウイルスの中和効果、および、細胞変性効果（cytopathic effects：ＣＰＥ）を、以下のように記載した。＋＋＋：完全な中和；  ＋＋：最小ＣＰＥ；  ＋：部分的なＣＰＥ；  ＋／−：略完全なＣＰＥ；  −：完全なＣＰＥ。
【０１２１】
〔組み換えＶＰ１タンパク質に対して作製した抗体が示す、遠縁（distantly related）のＨＲＶ株に対する交差防御（cross-protection）〕
図１１Ａに、交差防御試験に用いたライノウイルスのタイプの進化上の関係を示す。これらは、異なる種、および、異なるレセプターグループに属するように選ばれている。つまり、ＨＲＶ３７およびＨＲＶ８９は、メジャーグループジーナスＡ（major group genus A）であり、ＨＲＶ３、ＨＲＶ１４およびＨＲＶ７２は、メジャーグループジーナスＢ（major group genus B）であり、ＨＲＶ１Ａ、ＨＲＶ１８およびＨＲＶ５４は、Ｋ−タイプ（換言すれば、ＶＰ１のＨＩループ中にリシンが存在するメジャーグループＨＲＶ（major group HRVs））であり、ＨＲＶ２９およびＨＲＶ４４は、マイナーグループジーナスＡ（minor group genus A）である。抗８９ＶＰ１抗体および抗１４ＶＰ１抗体は共に、半分のＨＲＶ血清型（HRV serotypes）のＨｅＬａ細胞への感染を阻害した。なお、当該阻害は、ウイルスの進化上の関係とは無関係であるとともに、濃度依存的であった（図１１Ｂ）。興味深いことに、抗１４ＶＰ１抗体は、抗８９ＶＰ１抗体よりも強く、ＨＲＶ８９の感染を阻害し、一方、抗８９ＶＰ１抗体は、ＨＲＶ１４の感染のみを弱く阻害した（図１１Ｂ）。両方の抗血清は、著しく、関連が弱いＨＲＶとの広範な交差反応を示した（図１１Ａと比較）。
【０１２２】
〔結論〕
ライノウイルスの感染に対するワクチンによる防御は、ライノウイルスによって引き起こされる喘息の悪化を軽減するために有用であり得る。ＨＲＶに由来するＶＰ１カプシドタンパク質を、幾つかの原因に対する、潜在的なワクチン抗原として検討した。ＨＲＶ１４の結晶構造を明らかにしたＲｏｓｓｍａｎｎ等の研究は、ＨＲＶの、ヒトの上皮細胞上に存在する自身のレセプターへの結合に、ＶＰ１が決定的に関与していることを示している。５コピーのＶＰ１が、キャニオンと呼ばれる窪みを形成すること、および、ＩＣＡＭ−１レセプターが当該キャニオンの中心部内へ結合すること、が見出されている。その上、ウイルスコート内の自然突然変異に関する研究により、ＨＲＶ１４の表面上の４つの中和免疫原性サイト（neutralizing immunogenic (NIm) sites）が同定された。更なる研究によって、ＶＰ１タンパク質上に存在する上記４つの抗原部位のうちの２つに対する抗体が、細胞の付着を阻害することが示された。
【０１２３】
ＨＲＶ８９およびＨＲＶ１４に由来する完全なＶＰ１タンパク質は、系統学的に遠いＨＲＶ−Ａ種とＨＲＶ−Ｂ種とに属するが、これらの各々を、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させ、その後で精製した。アラインメントには、ＣｌｕｓｔａｌＷ  ｐｒｏｇｒａｍ（http://www.ebi.ac.uk/clustalw）を用い、８９ＶＰ１と１４ＶＰ１との間で、わずかに、４５％のヌクレオチドにおける同一性および４１％のアミノ酸における同一性が見出された。組み換え１４ＶＰ１および８９ＶＰ１を、１つの工程で、Ｃ末端のＨｉｓ−ｔａｇを利用したニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。金免疫電子顕微鏡で示したように、８９ＶＰ１タンパク質と同様に、組み換え１４ＶＰ１を用いたマウスおよびウサギの免疫接種は、ウイルスおよび無傷のウイルスから天然のＶＰ１を識別する、ＶＰ１に特異的な抗体反応の進行を誘導した。
【０１２４】
ＶＰ１タンパク質によって得られる抗体反応を、ワクチンの候補として先に記載したＨＲＶ１４  ＶＰ１およびＶＰ３に由来するペプチドによって誘導される抗体反応と比較するとともに、ＨＲＶ１４内のＩＣＡＭ−１付着部位の一部分である、ＶＰ１タンパク質のＣ末端に存在するＰＶＰ１Ｂペプチドによって得られる抗体反応と比較した。抗ペプチド血清よりも抗ＨＲＶ１４  ＶＰ１血清の方が、ＶＰ１とより強く反応すること、および、抗ＨＲＶ１４  ＶＰ１血清は、より高い中和力価を示すことが明らかになった。完全なタンパク質に対して作製された抗体の中和能力がより高いことは、完全なタンパク質に対して作製された抗血清はＶＰ１タンパク質上の幾つかの異なるエピトープを認識するが故に、ペプチドに特異的な抗体よりも高い親和力を示し得るという事実に起因していると考えられる。
【０１２５】
８９ＶＰ１と１４ＶＰ１との間には、ヌクレオチドのレベルで４５％、アミノ酸のレベルで４１％という、比較的低い配列の同一性しかない。それにもかかわらず、これらの株の各々に由来する組み換えＶＰ１タンパク質に対して作製された抗体が、メジャーグループおよびマイナーグループに属する様々な異なるライノウイルス株の培養ＨｅＬａ細胞への感染を阻害することが見出された。後者の発見は、重要であり得る。というのも、このことは、幾つかのライノウイルス株に由来するＶＰ１タンパク質を組み合わせることによって、広範囲に交差防御ができる効果的なＨＲＶワクチンを作製することが可能であることを示している。このようなワクチンの効果は、別のカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ２、ＶＰ３および／またはＶＰ４）を加えることによって、改良することも可能である。後者は、交差防御をも誘導するので、近年、注目を集めている。ライノウイルスの組み換えカプシドタンパク質に基づいたワクチンの主要な利点は、外来の宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）内におけるラージスケールの組み換え体の発現により、適当なコストにて、制御された条件下でワクチン抗原を容易に製造し得ることにある。広範囲に交差防御ができるＨＲＶワクチンは、ライノウイルスによって引き起こされる喘息の発作に苦しんでいる患者のワクチン接種にとって特に有用であり得、喘息の悪化を軽減し得る。
【０１２６】
〔実施例５：ＨＲＶ８９のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４  ｃＤＮＡを含むベクターの構築〕
ＨＲＶ８９のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４をコードしているｃＤＮＡは、コドンがＥ．ｃｏｌｉにとって適しており、３’末端に６個のヒスチジン残基を付加した状態で、合成によって作製された。ｐＥＴ−２７ｂ（ＡＴＧ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ,Ｇｅｒｍａｎｙ）のマルチクローニングサイトのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメント内へ、完全な遺伝子を挿入した。その結果生じた構築物を、ｐ８９ＶＰ１ベクター、ｐ８９ＶＰ２ベクター、ｐ８９ＶＰ３ベクター、ｐ８９ＶＰ４ベクター、ＶＰ１遺伝子産物、ＶＰ２遺伝子産物、ＶＰ３遺伝子産物、および、ＶＰ４遺伝子産物と名付けた。ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のＤＮＡ配列を、ヌクレオチド配列決定および二重消化によって確認した。ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のＤＮＡ配列を、図１１に示す。
【０１２７】
〔実施例６：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４の組み換え体の発現および精製〕
組み換えカプシドタンパク質の発現を達成するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株であるＢＬ２１（ＤＥ３）をｐ８９ＶＰ１、ｐ８９ＶＰ２、ｐ８９ＶＰ３またはｐ８９ＶＰ４の各々を用いて形質転換した。そして、当該形質転換体を、１００μｇ／ｍｌにてカナマイシンを含んでいるＬＢプレート上に播いた。１００ｍｇ／Ｌにてカナマイシンを含んでいる２５０ｍｌのＬＢ培地へ、１つのコロニーを植菌した。当該培養物を、光学濃度（６００ｎｍ）が０．６になるまで増殖させ、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えることによって、タンパク質の発現を誘導した。３５００ｒｐｍ、４０Ｃ、１０分間の遠心分離によって、細胞を回収した。Ｎｉ−ＮＴＡを用いたＱｉａｇｅｎのプロトコールを用いて、精製を行った。１０ｍｌの６Ｍ  塩酸グアニジン中で４時間、変性条件下で、細胞の沈殿物を再懸濁した。遠心分離（２０分間、１８０００ｒｐｍ）の後、上清を、２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡと共に更に２時間インキュベートした。次いで、懸濁液をカラムに加え、当該カラムを１０ｍｌの洗浄バッファー（８Ｍ  尿素，１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．１）を用いて２回洗浄し、その後、１２ｍｌの溶出バッファー（８Ｍ  尿素，１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ３．５）を用いて溶出した。尿素のモル濃度を低下させる透析を行うことによって、再生を達成した。
【０１２８】
図１２に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、組み換えタンパク質の純度とサイズと、を解析した。推定タンパク質サイズが３３．６ｋＤａであるタンパク質のバンドがＶＰ１に対応し、推定タンパク質サイズが３０．８ｋＤａであるタンパク質のバンドがＶＰ２に対応し、推定タンパク質サイズが２７．８ｋＤａであるタンパク質のバンドがＶＰ３に対応し、推定タンパク質サイズが８．３ｋＤａであるタンパク質のバンドがＶＰ４に対応する。タンパク質のサイズを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によっても確認した。
【０１２９】
〔実施例７：ＭＢＰ−ＶＰ１エピトープ融合タンパク質を発現するコンストラクトのクローニング〕
ＶＰ１をコードするｃＤＮＡを、ＶＰ１に由来するエピトープをＰＣＲによって増幅するための鋳型として用いた（表Ｉ）。ｐＭａｌｃ４ＸベクターのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位（表Ｉ中の下線）を、Ｅ．ｃｏｌｉのｍａｌＥ遺伝子（当該遺伝子は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする）の下流側にＰＣＲ産物を挿入するために用いた。これによって、ＭＢＰ融合タンパク質を発現することができる（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）。ＶＰ１に由来するエピトープのためのｃＤＮＡの挿入をヌクレオチド配列決定によって確認した。なお、遺伝子産物を、Ｅｐ＿１、Ｅｐ＿２、および、Ｅｐ＿３と呼ぶ（図１４Ａ）。
【０１３０】
【表１５】
2013508427.tif 000016
【０１３１】
【表１６】
2013508427.tif 000017
【０１３２】
〔実施例８：ＭＢＰ融合タンパク質の発現および精製〕
実施例６に記載したように、組み換えの融合タンパク質（Ｅｐ＿１、Ｅｐ＿２、Ｅｐ＿３）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現させた。マルトースに対するＭＢＰの親和性を利用して、精製を行った。封入体の分画を、８Ｍ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて可溶化させるとともに、カラムバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ＝７．４）に対して透析した。透明な溶解物を、平衡化されたアミロースレジンアフィニティーカラムへ加え、６０ｍｌのカラムバッファーによって２回洗浄し、その後、１０ｍＭのマルトースを含む２０ｍｌのカラムバッファーを用いて溶出した。
【０１３３】
抗ＶＰ１ウサギ血清を用いたウエスタンブロット解析によって、融合タンパク質が所望のものであることを確認した。
【０１３４】
〔実施例９：ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者に由来する血液中の、ＶＰ１に特異的な抗体、ＶＰ２に特異的な抗体、ＶＰ３に特異的な抗体、および、ＶＰ４に特異的な抗体の検出〕
ヒトの血液中の、ＶＰ１に特異的な抗体、ＶＰ２に特異的な抗体、ＶＰ３に特異的な抗体、および、ＶＰ４に特異的な抗体の存在を調べるために、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。ＥＬＩＳＡのプレート（Ｎｕｎｃ）を、５μｇ／ｍｌのライノウイルスに由来するカプシドタンパク質の組み換え体（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４）を用いてコーティングし、対照としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いた。５７人のＨＲＶ陽性患者に由来する全血を、１：５０に希釈した。結合した１：０００のヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、１：２０００のヒツジの抗マウス  ペルオキシダーゼ結合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出した。光学値（ＯＤ  ４０５ｎｍ）を、Ｙ軸に示し、当該光学値は、ヒトの血液中のＶＰ１に特異的な抗体、ＶＰ２に特異的な抗体、ＶＰ３に特異的な抗体、および、ＶＰ４に特異的な抗体濃度（level）に対応している（図１３）。ＨＲＶ陽性の患者では、アイソタイプおよびサブクラスに特異的な免疫反応について、興味深い精巧な特異性が見られた。４種類のウイルスカプシドタンパク質のうち、ＶＰ１およびＶＰ２は、主としてＩｇＧ１およびＩｇＡによって認識され、ＶＰ３およびＶＰ４は、主としてＩｇＭと反応する。これらの結果は、ＨＲＶが感染した患者が、好ましくはＩｇＧ１抗体およびＩｇＡ抗体によって、異なるライノウイルス由来タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４）を認識していることを示している。また、これらの結果は、ライノウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患の悪化に苦しむ患者を識別するための、一般的および特別な、ライノウイルスの感染の診断およびモニターに、これらのタンパク質を利用可能であることを示している。
【０１３５】
〔実施例１０：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１に由来するエピトープに対する、抗ＨＲＶ  モルモットＩｇＧの反応性〕
ＨＲＶ８９の組み換えカプシドタンパク質およびＶＰ１に由来するエピトープが、様々な異なるライノウイルス株と交差反応するか否かを調べるために、５μｇ／ｍｌの各抗原を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。２７種類のライノウイルス株（異なる種、および、異なるレセプターグループに属している）に対して作製したモルモットの血清を、１：１０００に希釈した。抗原に特異的なＩｇＧを、１：２０００に希釈したヤギの抗モルモット  ペルオキシダーゼ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。結合した抗体に対応するＯＤを、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒによって、４０５ｎｍおよび４９０ｎｍにて測定した。対照として、抗ＨＲＶ８９血清および抗モルモット血清（Ｓｉｇｍａ）を用いた（図１５）。
【０１３６】
試験された株の略半数に対して作製した血清中で、抗ＶＰ１  ＩｇＧの高い力価が検出された。また、抗ＶＰ１抗体の濃度が高い血清中で、抗Ｅｐ＿１  ＩｇＧの力価の上昇が検出された。これらの発見は、ＨＲＶの感染（特に、気道疾患（airway diseases）との関連において）の診断にとって重要な暗示を含んでいる。というのも、これらの発見は、ＶＰ１、および、完全なタンパク質の殆どＮ末端の領域に存在するＶＰ１のエピトープが、メジャーグループに対して作製した抗モルモット血清によってのみならず、マイナーグループのライノウイルスに対して作製した血清によっても認識されることを示しているからである。
【０１３７】
〔実施例１１：様々な患者の臨床データを用いたＨＲＶに特異的な抗体の反応の比較〕
ＶＰ１に特異的な抗体、ＶＰ２に特異的な抗体、ＶＰ３に特異的な抗体およびＶＰ４に特異的な抗体の反応と種々の臨床症状との間に相関関係を見出すことが可能かどうかを調べるために、「Mann-Whitney」検定を用いた単変量解析を利用した（ｐ値＜０．０５であれば陽性であると見なす）。以下の臨床データについて考慮した：
・熱
・けいれん
・性
・クループ
・ＨＲＶ  ＰＣＲおよびインフルエンザＰＣＲ
・妊娠期間
・鼻炎
・咳
・煙への曝露
・喘鳴（Wheeze）
・喘鳴（Whistle）
・気管支拡張薬の投与
・喘息
・細気管支炎。
【０１３８】
有意な統計的関係が以下の間に見出された：
・ＶＰ１に特異的なＩｇＭおよびけいれん
・ＶＰ４に特異的なＩｇＧ１およびクループ
・ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に特異的なＩｇＡ、ならびにＨＲＶ／インフルエンザ二重陽性ＰＣＲ
・ＶＰ３およびＶＰ４に特異的なＩｇＧ１ｍ、ＶＰ３に特異的なＩｇＭ、ならびに細気管支炎
・ＶＰ４に特異的なＩｇＧ１、および、ＶＰ１およびＶＰ２に特異的なＩｇＡ、ならびに喘息
・ＶＰ１に特異的なＩｇＧ２、および、ＶＰ３およびＶＰ４に特異的なＩｇＡ、ならびに煙への曝露。
【０１３９】
次に、多変量解析を行った。基本的に当該試験では、臨床データを様々な方法でグループ化してから、単変量解析と同様に抗体の値と比較する。仮説が正しいとされたグループ（ｐ＜０．０５）は以下の２グループのみである：
グループ１：
喘息／細気管支炎／けいれん／クループ
グループ２：
喘息、細気管支炎、ウイルス陽性ＰＣＲ、けいれん、クループ。
【０１４０】
グループ２は、統計的に有意である種々の結果を生じた。当該結果は、単変量および多変量解析において非常に重要であると考えられるウイルス二重感染の存在の影響を主に受けていた。ＶＰ２に特異的なＩｇＭについては、ウイルス二重感染とけいれんとの間に関係があり、一方、ＶＰ１に特異的なＩｇＡについては、ウイルス二重感染と喘息との間に関係が見出された。
【０１４１】
さらに、抗体の濃度がＨＲＶ／インフルエンザ二重感染に対する生物学的マーカーとして使用され得ることが見出された。図２０は、二重感染の患者におけるＩｇの値に対するＲＯＣ曲線を示している。仮説において統計的な有意性があるだけではなく（生物学的マーカーとしてのＩｇの値）、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に特異的なＩｇＡに対する閾値を設定できる可能性もある。
【０１４２】
上記結果に基づけば、ライノウイルスの感染および当該感染と呼吸器疾患との関連性の診断のために血清検査を発展させることが可能であると想定される。
【０１４３】
〔実施例１２：主要なカプシドタンパク質ＶＰ１の抗原決定基のマッピング〕
ＨＲＶ８９の組み換えＶＰ１は、ヒトの血液サンプルにおいて免疫学的に最も重要な表面タンパク質であることがわかっている（図１３）。それゆえ、３つのＶＰ１に由来するフラグメントを、鋳型としてＶＰ１をコードしているｃＤＮＡを用いたＰＣＲによって増幅し、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＣ末端に融合させた。ＶＰ１に由来するフラグメントを含んでいるＭＢＰ融合タンパク質（それぞれ、およそ１００個のアミノ酸を含んでいる（図１４Ａ））を、Ｅ．ｃｏｌｉに発現させた。上記融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。抗ＭＢＰウサギ血清および抗ＶＰ１ウサギ血清を用いたイムノブロッティングによって、融合タンパク質の完全性を確認した（データは示されていない）。エピトープに特異的な抗体がヒトの血液中に見出されるかどうか、および、どの抗体のサブクラスが同定され得るかを評価するために、精製されたＭＢＰ融合タンパク質を用いた。図１４Ｂに示されているように、主要なＩｇＧ１エピトープは、タンパク質全体の最初の１００個を含んでいるＮ末端組み換えＶＰ１フラグメントに位置していた。ＩｇＡについては、促進された反応性が検出されたが、一方、ＩｇＭ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４については反応性が見られなかった（図１４Ｂ）。エピトープの特異性をさらに分析するために、ＶＰ１のＮ末端に由来する種々のペプチド（それぞれ、およそ３０個のアミノ酸（図１９Ａ）または２０個のアミノ酸（図１９Ｂ）を含んでいる）を合成した。その後、上記ペプチドを使用して、ＨＲＶに感染した患者における抗体反応の発生を調べた。両方の実験において、主要なＩｇＧ１のエピトープは、ＶＰ１タンパク質の最初の３２個のアミノ酸（図１９Ａ）または１５個のアミノ酸（図１９Ｂ）中にも位置していた。
【０１４４】
本実施例および図１９において参照されるアミノ酸配列は以下のものである：
ＶＰ１  ＨＲＶ８９の１番目〜１００番目のアミノ酸残基（Ｐ１と呼ばれる）
M N P V E N Y I D S V L N E V L V V P N I Q P S T S V S S H A A P A L D A A E T G H T S S V Q P E D M I E T R Y V I T D Q T R D E T S I E S F L G R S G C I A M I E F N T S S D K T E H D K I G K G F K
【０１４５】
【表１７】
2013508427.tif 000018
【０１４６】
ＶＰ１  ８９ＨＲＶのＰ１Ａに由来するペプチド
１．Ｐ１ａ
N P V E N Y I D S V L N E V L V V P N I Q
２．Ｐ１ｂ
V V P N I Q P S T S V S S H A A P A L D
３．Ｐ１ｃ
A P A L D A A E T G H T S S V Q P E D M
４．Ｐ１ｄ
Q P E D M I E T R Y V I T D Q T R D E T
５．Ｐ１ｅ
T R D E T S I E S F L G R S G C I A M I
６．Ｐ１ｆ
C I A M I E F N T S S D K T E H D K I G
７．Ｐ１ｇ
H D K I G K G F K T W K I S L Q E M A Q
【０１４７】
〔実施例１３：組み換えカプシドタンパク質に対して作製された抗体による、ＨｅＬａ細胞へのＨＲＶの感染の阻害〕
組み換えＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４カプシドタンパク質に対するウサギＩｇＧ抗体がＨｅＬａ細胞へのＨＲＶの感染を阻害し得るかどうかについて調べた。１セットの実験の結果が図１９に示されている。抗ＶＰ１、抗ＶＰ２、抗ＶＰ３および抗ＶＰ４の連続した希釈物（１：２〜１：１２８）を、１０ＴＣＩＤ５０、１００ＴＣＩＤ５０および１０００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ８９と共にインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に加えた。１０ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ８９を用いて試した場合、４つの全ての抗血清が細胞への感染を阻害する能力を示した。より多量のウイルスを使用した場合、抗ＶＰ１、抗ＶＰ２および抗ＶＰ４において、ＣＰＥの顕著な減少が見られた。
【０１４８】
以上のことは、ＶＰ１に対して作製された抗体だけではなく、ＶＰ２およびＶＰ４に対して作製された抗体もＨＲＶの感染からＨｅＬａ細胞を保護することができることを示唆している（図２０）。それゆえ、種々の組み換えカプシドタンパク質の混合物からなるワクチンは、他のＨＲＶ株に対して、より広範な交差反応を示す可能性があることが想定され得る。
【０１４９】
〔実施例１４：１４ＶＰ１、８９ＶＰ１および３つの組み換え８９ＶＰ１フラグメントとの、ウサギ抗８９ＶＰ１抗体および抗１４ＶＰ１抗体の反応性〕
ウサギ抗ＨＲＶ１４ＶＰ１血清および抗ＨＲＶ８９ＶＰ１血清の特異性を確認するために、ＨＲＶ８９由来のＶＰ１の３つの組み換えフラグメントと同様に、ＨＲＶ１４および８９に由来する、精製された組み換えＶＰ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ実験を行った。抗ＨＲＶ１４ＶＰ１抗体はＶＰ１、ならびに、ａａ１〜１００（実施例１２を参照）、ａａ１０１〜２００およびａａ２０１〜２９３にわたる３つのＶＰ１フラグメントと交差反応するが、抗ＨＲＶ８９ＶＰ１抗体に比べて、ずっと低い力価を有することがわかっている。上記の文脈において、注目すべきことに、ＨＲＶ１４およびＨＲＶ８９に由来するＶＰ１を用いた免疫接種によって得られた抗ＶＰ１血清は、異なった形で、８９ＶＰ１の上記の組み換えフラグメントと反応した。従って、後者の抗血清は、１４ＶＰ１に対して作製された抗血清に比べて、より多くのエピトープと反応するＩｇＧを含んでいると考えられる。さらに、以上のことは、ＶＰ１に由来するフラグメントを用いれば、遠縁のライノウイルスに対する抗体を検出することが可能であるという仮説を支持する。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】１年間にわたって採取されたヒトの血清におけるＶＰ１に対するＩｇＡの反応の季節性を示している。８名のアレルギー患者および６名の非アレルギー患者に由来する血清を冬、春、夏および秋に採集した。また、ＶＰ１に特異的なＩｇＡ抗体の力価はＥＬＩＳＡによって決定され、Ｙ軸上に光学値（optical value）として示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値（non-outliers）はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【図２】調査期間における、ワクチン接種を受けた個体のＶＰ１に特異的なＩｇＡの濃度を示している。ＶＰ１に特異的なＩｇＡの力価はＥＬＩＳＡによって測定した。献血（blood donation）の日をＸ軸上に当てはめ、光学的濃度（ＯＤ）をＹ軸上に当てはめている。光学値はヒトの血清におけるＩｇＡ抗体の濃度と対応している。
【図３】マウスにおけるＶＰ１に特異的なＩｇＡ反応を示している。各グループのマウスにＶＰ１抗原を用いて免疫接種した。ＶＰ１に特異的なＩｇＡの力価はＥＬＩＳＡによって測定され、Ｙ軸上に光学値として示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はマウスの血清におけるＩｇＡ抗体の濃度と対応している。
【図４】ヒトライノウイルスの血清型１４のＶＰ１を用いた中和試験を示している。
【図５】ヒトライノウイルスの血清型８９のＶＰ１を用いた中和試験を示している。
【図６】組み換えＶＰ１タンパク質の精製を示している。（Ａ）８９ＶＰ１および（Ｂ）１４ＶＰ１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にクマシーブルーを用いて染色され（左）、ニトロセルロース上でのブロッティング後に抗Ｈｉｓ６抗体を用いて染色された（右）。分子量（ｋＤａ）は左側に示されている。
【図７Ａ】免疫接種されたウサギおよびマウスの、ＶＰ１に特異的な免疫反応を示している。（Ａ）ウサギにおける、８９ＶＰ１に特異的なＩｇＧおよび１４ＶＰ１に特異的なＩｇＧの反応。ウサギには８９ＶＰ１または１４ＶＰ１を用いて免疫接種した。血清サンプルは、１回目の免疫接種の日（免疫前の血清（pre-immune serum））、ならびに、２回目および３回目の注射の後に３〜４週間の間隔（ボックスの上：免疫血清１；免疫血清２）で採取した。血清の希釈（ウサギα８９ＶＰ１；ウサギα１４ＶＰ１）はＸ軸上に示されている（対数で示された１０−３〜１０−６）。免疫原（８９ＶＰ１、１４ＶＰ１）に対するＩｇＧの反応性はバーとして示されている。
【図７Ｂ】免疫接種されたウサギおよびマウスの、ＶＰ１に特異的な免疫反応を示している。（Ｂ）５匹のマウスのグループに８９ＶＰ１を用いて免疫接種した。血清サンプルは、１回目の免疫接種の日（０）および３週間の間隔（ｗ３〜ｗ９）で採取した（Ｘ軸）。上記グループのＩｇＧ１の反応性はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。８９ＶＰ１に対して特異的なＩｇＧ１の濃度は光学的濃度の値として示されている（Ｙ軸）。
【図８Ａ】組み換えＶＰ１に対して作製された抗ＶＰ１抗体がライノウイルス由来のＶＰ１およびウイルス全体と反応することを示している。（Ａ）ニトロセルロースにブロッティングされたＨＲＶ１４タンパク質抽出物および組み換え１４ＶＰ１を、抗１４ＶＰ１抗体および対応する免疫前の血清（ｐｒｅ−ＩＳ）と共にインキュベートした。分子量（ｋＤａ）は左側に示されている。
【図８Ｂ】組み換えＶＰ１に対して作製された抗ＶＰ１抗体がライノウイルス由来のＶＰ１およびウイルス全体と反応することを示している。（Ｂ）ネガティブ染色後のラベルされたウイルス調整物の電子顕微鏡写真。固定されたＨＲＶ８９を抗８９ＶＰ１ＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、直径１０ｎｍのコロイド金粒子に結合した二次ＩｇＧ抗体プローブによって結合部位を視覚化した。左側の顕微鏡写真は、４つの金粒子（ＧＰ）に結合したウイルス粒子（ＶＰ）の詳細を示している。右側の顕微鏡写真は免疫前のＩｇを用いた対照調製物を示している。バー：左側の顕微鏡写真、５０ｎｍ；右側の顕微鏡写真、１００ｎｍ。
【図９】組み換え１４ＶＰ１タンパク質または１４ＶＰ１由来のペプチドに対するウサギの抗血清の反応性を示している。ウサギには、組み換え１４ＶＰ１、ＰＶＰ１Ａ、ＰＶＰ１ＢまたはＰＶＰ３Ａ（ボックスの上側）を用いて免疫接種し、血清を１４ＶＰ１（上側）または８９ＶＰ１（下側）に接触させた。上記血清の希釈はＸ軸に示されている（対数で示された１０−３〜１０−６）。１４ＶＰ１に特異的なＩｇＧおよび８９ＶＰ１に特異的なＩｇＧの濃度は光学的濃度の値と対応している（バー：Ｙ軸）。
【図１０】ＨＲＶ１４が抗１４ＶＰ１抗体によって中和されたことを示している。１００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ１４を、図に示されているような抗血清の連続した希釈物を用いて、３７℃で２時間、予めインキュベートした。上記の混合物を２４ウェルプレート内のサブコンフルエント（subconfluent）なＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で４日後、残った細胞を、クリスタルバイオレットを用いて染色した。Ｐｒｅ−ＩＳ、免疫前の血清が対照として用いられた。
【図１１Ａ】調査したＨＲＶのＶＰ１配列の系統樹を示している。ＶＰ１配列はデータバンクから検索し、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて当該配列の類似性を分析した。
【図１１Ｂ】ＶＰ１に特異的なそれぞれの抗体による、ＨＲＶの感染の阻害。１００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶ１４を、１：２（ａ）〜１：１６（ｄ）まで２倍ずつ連続して希釈したそれぞれの抗血清の希釈物を用いて、３７℃で３時間、予めインキュベートした。上記の混合物を９６ウェルプレート内のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で３日間の培養後、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色し、洗浄し、染色液を溶解させた。ＯＤは５６０ｎｍで読み取られた。４つの独立した実験における平均値±標準誤差が示されている。
【図１２】精製されたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のｈｉｓタグタンパク質を含んでいる、クマシーブルーで染色された１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している（レーン１：５μｌの分子マーカー；レーン２：１０μｌのＶＰ１；以下それぞれ、１０μｌのＶＰ２；１０μｌのＶＰ３；１０μｌのＶＰ４）。
【図１３】ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者由来のヒトの血液において検出されたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の反応を示している。ライノウイルス由来のカプシドタンパク質に特異的な４つの抗体について、５７人の患者の血清を試験した。力価はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【図１４Ａ】ＨＲＶプロトタイプ株のＶＰ１アミノ酸配列のマルチプルアラインメント（multiple alignment）を示している。配列はProtein Databaseから検索し、ＧｅｎｅＤｏｃを用いて並べた後に手動で編集した。上記アラインメントは異なる種および異なるレセプターグループに属するＨＲＶ血清型を示している：ＨＲＶ３７および８９はメジャーグループジーナスＡであり、ＨＲＶ３、１４および７２はメジャーグループジーナスＢであり、ＨＲＶ１Ａ、１８および５４はＫ−タイプであり、ＨＲＶ１Ａ、ＨＲＶ２９および４４はマイナーグループジーナスＡである。黒い正方形は、ＨＲＶ８９株のＶＰ１に由来する３つのエピトープを意味している。
【図１４Ｂ】ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者由来のヒトの血液において検出されたＥｐ＿１、Ｅｐ＿２およびＥｐ＿３に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の反応を示している。ＶＰ１由来のエピトープに特異的な６つの抗体について、５７人の患者の血清を試験した。力価はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【図１５】組み換えＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１由来のエピトープに対するモルモットＩｇＧの交差反応を示している。しかし、当該図１５は（診断のために使用される）抗原の認識のみに関する。図１５は各ウイルスの中和の証拠ではなく、交差防御を示している。異なるＨＲＶ株の中和は図１１Ｂに示されている。当該データは相関しているため、ＨＲＶ８９に由来するＶＰ１またはＶＰ１に由来するＮ末端フラグメントに対する抗体は、中和試験によって調べた場合に他の株も中和すると仮定することができる。
【図１６】主要なカプシドタンパク質ＶＰ１のエピトープマッピングを示している。
【図１７】ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された患者由来のヒトの血液において検出された、ＶＰ１のＮ末端エピトープに由来する合成ペプチドに対するＩｇＧ１の免疫反応を、既知のペプチド（Mc Cray et al., Nature 329 (1987): 736-738）と比較して示している。
【図１８】ＨＲＶ／インフルエンザ二重感染の患者における抗体の値に対するＲＯＣ曲線を示している。
【図１９Ａ】ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された５７人の患者に由来するヒトの血液において検出された、Ｐ１由来のペプチド（それぞれ、およそ３０個のアミノ酸（図１９Ａ）または２０個のアミノ酸（図１９Ｂ）を含んでいる）、またはＰ１Ａ由来のペプチド（Ｂ）（それぞれ、２０個のアミノ酸を含んでいる）に対するＩｇＧ１の反応を示している。ＩｇＧ１の反応性はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【図１９Ｂ】ＨＲＶに特異的なＰＣＲ試験の結果、陽性であると判定された５７人の患者に由来するヒトの血液において検出された、Ｐ１由来のペプチド（それぞれ、およそ３０個のアミノ酸（図１９Ａ）または２０個のアミノ酸（図１９Ｂ）を含んでいる）、またはＰ１Ａ由来のペプチド（Ｂ）（それぞれ、２０個のアミノ酸を含んでいる）に対するＩｇＧ１の反応を示している。ＩｇＧ１の反応性はＥＬＩＳＡによって測定され、光学値としてＹ軸上に示されている（ＯＤ  ４０５ｎｍ）。光学値はヒトの血清における抗体の濃度と対応している。上記の結果はボックスプロットとして示され、値の５０％はボックスの中にあり、外れ値ではない値はバーの間にある。ボックスの中の線は中央値を示している。
【図２０Ａ】抗ＶＰ１抗体、抗ＶＰ２抗体、抗ＶＰ３抗体、抗ＶＰ４抗体によるＨＲＶの感染の阻害を示している。１０ＴＣＩＤ５０のＨＲＶを、１：２〜１：１：１２８まで２倍ずつ連続して希釈したそれぞれの抗血清の希釈物を用いて、３７℃で３時間、予めインキュベートした。上記の混合物を９６ウェルプレート内のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で３日間の培養後、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色し、洗浄し、染色液を溶解させた。ＯＤは５６０ｎｍで読み取られた。
【図２０Ｂ】抗ＶＰ１抗体、抗ＶＰ２抗体、抗ＶＰ３抗体、抗ＶＰ４抗体によるＨＲＶの感染の阻害を示している。１００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶを、１：２〜１：１：１２８まで２倍ずつ連続して希釈したそれぞれの抗血清の希釈物を用いて、３７℃で３時間、予めインキュベートした。上記の混合物を９６ウェルプレート内のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で３日間の培養後、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色し、洗浄し、染色液を溶解させた。ＯＤは５６０ｎｍで読み取られた。
【図２０Ｃ】抗ＶＰ１抗体、抗ＶＰ２抗体、抗ＶＰ３抗体、抗ＶＰ４抗体によるＨＲＶの感染の阻害を示している。１０００ＴＣＩＤ５０のＨＲＶを、１：２〜１：１：１２８まで２倍ずつ連続して希釈したそれぞれの抗血清の希釈物を用いて、３７℃で３時間、予めインキュベートした。上記の混合物を９６ウェルプレート内のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞に加えた。３４℃で３日間の培養後、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色し、洗浄し、染色液を溶解させた。ＯＤは５６０ｎｍで読み取られた。
【図２１】１４ＶＰ１、８９ＶＰ１および３つの組み換え８９ＶＰ１フラグメントとのウサギ抗８９ＶＰ１抗体およびウサギ抗１４ＶＰ１抗体の反応性を示している。ウサギの血清は１：５０００に希釈されており、結合したＩｇＧ抗体に対応するＡ５６０がＹ軸上に示されている。
【図１】
2013508427.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2013508427.tif 000025
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2013508427.tif 000027
【図８Ｂ】
2013508427.tif 000028
【図９】
2013508427.tif 000029
【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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