(57)【要約】  提供されるものは、染色体再編成を伴う腫瘍、特に甲状腺の腫瘍又は新生物の診断、予後及び治療のための新規方法及び組成物である。加えて、抗腫瘍剤を同定する方法が記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が、腫瘍を、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍を、有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者の試験試料において少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）のレベルを測定することを含み、対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べた試験試料におけるｍｉＲのレベルの存在又は増加が、被験者が前記腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す、方法。
【請求項２】
染色体再編成が転座である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
染色体再編成が染色体１９に存在する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
染色体再編成が染色体バンド１９ｑ１３を伴う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ｍｉＲが、切断点領域の近位に位置するｍｉＲクラスターであるか、又はｍｉＲクラスターに属する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ｍｉＲクラスターが、Ｃ１９ＭＣ又はｍｉＲ−３７１−３クラスターである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｃ１９ＭＣクラスターの少なくとも１つのｍｉＲ及びｍｉＲ−３７１−３クラスターの少なくとも１つのｍｉＲのレベルが測定される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｃ１９ＭＣクラスターのｍｉＲが、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１２−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１２−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１５−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１５−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１６ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１６ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１６ｂ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ａ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１７ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｄ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｆ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ａ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２１−１；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２１−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２３；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２４；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２５；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２６ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２６ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２６ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ＊；又はｈｓａ−ｍｉＲ−５２７；（表１も参照すること）である、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
腫瘍が、甲状腺の、腫瘍又は新生物（neoplasia）である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍が甲状腺腺腫である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍が、被験者における１つ以上の予後マーカーと関連する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が甲状腺腺腫であり、予後マーカーが７トリソミーである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
被験者がヒトである、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項８に定義されているｍｉＲＮＡの発現レベルの増加により特徴付けられる甲状腺腫瘍のサブタイプの検出方法であって、好ましくは、請求項８に定義されているｍｉＲＮＡの、検出と、場合により定量と、を含む、方法。
【請求項１５】
腫瘍に、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍に罹患している対象を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜１４のいずれか１項に定義されている少なくとも１つのｍｉＲの発現を阻害すること又はｍｉＲの活性の量若しくはレベルを減少することができる化合物と、場合により薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
被験者が、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法により診断される、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ｍｉＲがｍｉＲ−３７３であり、腫瘍が、甲状腺の腫瘍又は新生物である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
染色体再編成を伴う腫瘍の細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ｉ）腫瘍細胞において、好ましくは染色体再編成を有する腫瘍細胞において、対照細胞と比べて、発現が誘導又は増加される１つ以上のｍｉＲの発現又は活性を阻害する１つ以上の作用物質を、細胞に導入すること；及び
（ｉｉ）１つ以上の作用物質がｍｉＲの発現又は活性を阻害する条件下に細胞を維持し、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害すること
を含む方法。
【請求項１９】
腫瘍に対する抗腫瘍剤を同定する方法であって、試験剤を細胞に提供すること、及び染色体再編成を有する腫瘍細胞における発現レベルの増加に関連する少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含み、このとき細胞におけるｍｉＲのレベルが、適切な対照細胞と比べて、減少することが、試験剤が抗腫瘍剤であること示す、方法。
【請求項２０】
腫瘍が、甲状腺の腫瘍又は新生物であり、細胞が甲状腺腺腫細胞である、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に定義された１つ以上のｍｉＲを検出するための１つ以上の試薬を含む、請求項１〜１３又は１８〜２０のいずれか１項記載の方法において有用な、キット。
【請求項２２】
１つ以上の試薬が、請求項１〜２１のいずれか１項に定義された１つ以上のｍｉＲに特異的なプライマー及び請求項１〜２１のいずれか１項に定義された１つ以上のｍｉＲに特異的なプローブを含む群から選択される、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのｍｉＲが、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５２０ｃ、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及び／又はｍｉＲ−３７３を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項記載の方法、又は請求項２１〜２２のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分子生物学の分野に関する。より詳細には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）分子を伴う方法及び組成物に関する。分析のために又はｍｉＲＮＡアレイのような分析用ツールとしてｍｉＲＮＡを単離する、標識する、調製する方法及び組成物が記載される。加えて、診断、治療及び予後におけるｍｉＲＮＡの適用がある。より詳細には、本発明は、ｍｉＲ、特に、染色体切断点領域に近接して位置するｍｉＲクラスターに属するｍｉＲの、染色体再編成を伴う腫瘍の治療における診断及び治療標的としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の発生は、多くの場合、遺伝子調節及び発現の変更によってもたらされる転座のような染色体再編成を伴う。例えば、甲状腺腺腫は、７トリソミー及び染色体再編成を有するクローン染色体異常を示す。甲状腺腺腫は、被包性増殖及び侵襲性の欠如それぞれによってその悪性の対応物、すなわち濾胞状癌と区別することができる高頻度のヒト腫瘍である。ヨウ素が十分な領域においても、甲状腺腺腫は４〜７％の成人において生じ、ヨウ素が不足している領域では、この数字は約５０％に上昇しうる。これらの頻繁な良性腫瘍の病因は、不十分にしか理解されていないが、クローン染色体異常は、ほぼ４０％の小結節において観察することができ、疾患の発生に関わるゲノム領域及び遺伝子の位置を正確に示す可能性がある（ＤｅＬｅｌｌｉｓ、内分泌器官の腫瘍の病理学及び遺伝学（Pathology and genetics of tumours of endocrine organs）、２００３年４月２３〜２６日、フランス、リヨンにおける編集及び見解統一会議、３２０  Ｓ．ＩＡＲＣプレス、リヨン、２００４年）。ほぼ２０％の腫瘍は、７トリソミーを有するクローン染色体異常を示し（Ｂａｒｔｎｉｔｚｋｅら、癌、遺伝学、細胞遺伝学（Cancer Genet. Cytogenet.）３９（１９８９年）、６５〜６８頁）、クローン細胞遺伝学的異常を有する腫瘍の約２０％は、染色体バンド１９ｑ１３を伴う異常を示す（Ｂｅｌｇｅら、癌、遺伝学、細胞遺伝学（Cancer Genet. Cytogenet.）１０１（１９９８年）、４２〜４８頁）。ヨーロッパ及び米国における甲状腺腺腫の極めて高い罹患率を考慮するだけでも、４〜５百万人が甲状腺におけるこのゲノム変更によって影響を受けていると推定することができる。１９ｑ１３切断点は、位置クローニングにより１５０ｋｂのセグメントに指定されており、このクラスター領域における可能な標的遺伝子は、いくらか詳細に調査されてきた（Ｂｅｌｇｅら、細胞遺伝学（Cytogenet. Cell Genet.）９３（２００１年）、４８〜５１頁；Ｒｉｐｐｅら、遺伝子染色体癌（Genes Chromosomes Cancer）２６（１９９９年）、２２９〜２３６頁）。しかし、染色体１９の長腕は、ヒトゲノムの他の領域と比較して著しく高い遺伝子密度を示し、今まで、タンパク質コード遺伝子だけがこれらの高頻度構造的染色体異常の標的として考慮されてきた。
【０００３】
染色体異常を伴う腫瘍の療法についての相当数の研究にもかかわらず、この種類の腫瘍、特に甲状腺腺腫は、効果的に診断し、治療することが困難なままであり、この疾患の診断、治療及び予防において改善が必要であることを示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、部分的には、２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子クラスター、すなわち、染色体再編成の染色体切断点領域に極めて近接して位置し、正常対照細胞と比べて一貫して活性化されるＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３の甲状腺腺腫特異的特徴を同定することに基づいている。
【０００５】
したがって、本発明は、被験者が、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍を有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者の試験試料における少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）のレベルを測定することを含む方法を包含する。対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べた試験試料におけるｍｉＲのレベルの変更は、被験者が前記腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す。
【０００６】
特定の態様では、被験者が、甲状腺の腫瘍又は新生物を有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者の試験試料における少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）のレベルを測定することを含む方法が、本明細書において提供される。対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べた試験試料におけるｍｉＲのレベルの変更、特に増加は、被験者が甲状腺の腫瘍又は新生物を有する又は発生する危険性がある、のずれかであることを示す。
【０００７】
別の特定の態様では、ｍｉＲ発現と、好ましくは染色体再編成、特に染色体転座を伴う腫瘍との相関関係又は前記腫瘍の素因を同定することを含み、（ａ）疾患又は状態を有する又は有することが疑われる被験者の試料から単離されたｍｉＲを標識すること；（ｂ）ｍｉＲをｍｉＲアレイにハイブリダイズすること；（ｃ）アレイへのｍｉＲハイブリダイゼーションを決定すること；及び（ｄ）基準と比較して疾患又は状態の代表的な試料に異なって発現したｍｉＲを同定することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０００８】
特定の態様では、ｍｉＲ発現と、好ましくは、染色体１９、特に染色体バンド１９ｑ１３での染色体再編成を伴う腫瘍との相関関係を同定することを含み、被験者の試験試料における少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）のレベルを測定することを含む方法が、本明細書において提供される。対照試料における対応するｍｉＲ試験のレベルと比べた試験試料におけるｍｉＲのレベルの変更、特に増加は、被験者が前記腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す。
【０００９】
典型的には、本発明の方法は、試験試料における少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含み、ここでｍｉＲは、染色体再編成、特に染色体転座に関連する切断点領域に近接して位置するｍｉＲクラスターである又はそれに属する。
【００１０】
特定の態様では、異なって発現したｍｉＲを同定することは、試料のｍｉＲプロフィールを生成すること及びｍｉＲプロフィールを評価して、試料におけるｍｉＲが正常試料と比較して異なって発現しているかを決定することを含む方法が、本明細書において提供される。特定の実施態様において、ｍｉＲプロフィールは、表３に示されているように、Ｃ１９ＭＣクラスター及び／又はｍｉＲ−３７１−３クラスターの１つ以上のｍｉＲから選択される。好ましくは、ｍｉＲプロフィールは、ｍｉＲ−３７１−３クラスターの１つ以上のｍｉＲから選択される。
【００１１】
特定の態様において、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍は、甲状腺の１つ以上の腫瘍又は新生物、特に甲状腺腺腫である。特定の態様において、ｍｉＲプロフィールは、表３に示されている１つ以上のｍｉＲから選択され、ここでは、甲状腺腺腫細胞は正常細胞と区別されている。
【００１２】
特定の実施態様において、ｍｉＲプロフィールは、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５２０ｃ、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲを伴い、ここで正常試料と比較した１つ以上のｍｉＲＮＡの発現における差は、甲状腺腺腫を示す。
【００１３】
特定の態様では、正常試料と比較したｈｓａ−ｍｉｒ−３７１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３；  ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１２−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１２−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１５−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１５−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１６ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１６ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１６ｂ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ａ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１７ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｄ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｆ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ａ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｃ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｅ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２１−１；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２１−２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２２；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２３；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３＊；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２４；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２５；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−３ｐ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２６ａ−１；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２６ａ−２；  ｈｓａ−ｍｉｒ−５２６ｂ；  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ＊；  ａｎｄ／ｏｒ  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２７；（詳細は表１を参照すること）の発現の増加が甲状腺腺腫を示す方法が、本明細書において提供される。
【００１４】
本発明の方法の幾つかの実施態様において、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍は、被験者における１つ以上の予後マーカーと関連する。例えば、甲状腺腺腫の場合、予後マーカーは７トリソミーである。加えて、分子診断マーカー、すなわち甲状腺の腫瘍及び新生物の核酸配列及びタンパク質は、国際出願ＷＯ２００３／０９３３１０、ＷＯ２００２／０８３７２７及びＷＯ２００１／０２７２６５に記載されており、これらの開示内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【００１５】
特定の態様では、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍の細胞の増殖を阻害する方法であって、
【００１６】
（ｉ）対照細胞と比べて、染色体再編成を有する腫瘍細胞においてその発現が誘導又は増加される１つ以上のｍｉＲの発現又は活性を阻害する１つ以上の作用物質を、細胞に導入すること；及び
【００１７】
（ｉｉ）１つ以上の作用物質がｍｉＲの発現又は活性を阻害する条件下に細胞を維持し、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００１８】
特定の実施態様において、細胞はヒト細胞である。
【００１９】
特定の態様において、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３の発現が上方制御され、甲状腺腫瘍のような好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍、すなわち甲状腺腺腫において下方制御されている、細胞増殖の制御に関与する腫瘍サプレッサーＬＡＴＳ２又は他の遺伝子を共通推定標的として有する方法が、本明細書において提供される。
【００２０】
特定の態様では、正常組織と比較して、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍の細胞におけるＣ１９ＭＣクラスターの少なくとも１つのｍｉＲ及び／又はｍｉＲ−３７１−３クラスターの少なくとも１つのｍｉＲのレベルを調節する方法であって、幾つかの場合では過剰発現の原因であるプミリオホモログ１（ＰＵＭ１）遺伝子（実施例４を参照すること）の発現を低減又は阻害する作用物質の有効量を投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００２１】
少なくとも１つのｍｉＲのレベルは、当業者に周知の多様な技術を使用して測定することができる。一つの実施態様において、少なくとも１つのｍｉＲのレベルは、ノーザンブロット分析を使用して測定される。別の実施態様において、試験試料における少なくとも１つのｍｉＲのレベルは、対照試料における対応するｍｉＲのレベルよりも大きい。
【００２２】
本発明は、被験者において１つ以上の予後マーカーに関連する腫瘍を診断する方法であって、被験者の腫瘍試料において少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含み、対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べて、試験試料における少なくとも１つのｍｉＲのレベルの変更、特に増加が、被験者が１つ以上の予後マーカーと関連する腫瘍を有することを示す方法も提供する。一つの実施態様において、少なくとも１つのｍｉＲのレベルは、被験者から得た試験試料のＲＮＡを逆転写して、一連の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズして、試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを提供すること；及び試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼイーションプロフィールと比較することによって測定される。少なくとも１つのｍｉＲのシグナルにおける変更は、被験者がそのような腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す。一つの実施態様において、予後マーカーは、クローン細胞遺伝学的異常のような有害予後マーカー、例えば７トリソミー及び特に染色体バンド１９ｑ１３を伴う構造変更を有するクローン染色体異常を含む。
【００２３】
本発明は、被験者の腫瘍を治療する方法であって、少なくとも１つのｍｉＲのシグナルが対照試料から生成されたシグナルと比べて調節解除（例えば、上方制御）される方法も包含する。
【００２４】
本発明は、被験者から得た試験試料のＲＮＡを逆転写して、一連の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズして、試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを提供すること；及び試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼイーションプロフィールと比較することによって、被験者が被験者において１つ以上の有害予後マーカーに関連する腫瘍を有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法も包含する。シグナルにおける変更、特に増加は、被験者が腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す。
【００２５】
本発明は、少なくとも１つのｍｉＲが対照細胞と比べて被験者の腫瘍細胞において上方制御されている腫瘍を有する被験者において、腫瘍を治療する方法も包含する。少なくとも１つのｍｉＲが腫瘍細胞において上方制御されている場合、方法は、少なくとも１つのｍｉＲの発現を、被験者における腫瘍細胞の増殖が阻害されるように阻害する、少なくとも１つの化合物の有効量を被験者に投与することを含む。
【００２６】
関連する実施態様において、本発明は、被験者において腫瘍を治療する方法であって、対照細胞と比べて腫瘍細胞において少なくとも１つのｍｉＲの量を決定し、腫瘍細胞に発現するｍｉＲの量が対照細胞に発現するｍｉＲの量よりも大きい場合、被験者における腫瘍細胞の増殖を阻害するように、被験者に少なくとも１つの単離ｍｉＲの有効量を投与して、腫瘍細胞に発現するｍｉＲの量を変更することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、少なくとも１つのｍｉＲ発現インヒビター化合物及び薬学的に許容される担体を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物を更に提供する。より詳細には、本発明は、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍に罹患している被験者を治療する医薬組成物であって、染色体再編成の切断点領域に近接して位置するｍｉＲクラスターに属する少なくとも１つのｍｉＲの発現を阻害することができる又はｍｉＲの活性の量若しくはレベルを減少することができる化合物と、場合により薬学的に許容される担体とを含む前記組成物に関する。通常、治療される被験者は、腫瘍を罹患することが本発明の方法によって診断される。
【００２８】
他の実施態様において、本発明は、腫瘍に対する抗腫瘍剤を同定することであって、試験剤を細胞に提供すること及び染色体再編成を有する腫瘍細胞における発現レベルの増加に関連する少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含み、適切な対照細胞と比べて細胞におけるｍｉＲのレベルの減少が、試験剤が抗腫瘍剤であること示すことを提供する。
【００２９】
更なる実施態様において、本発明は、被験者が腫瘍を有するか又は発生する危険性があるかを診断する本発明の方法；ｍｉＲ発現と、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍との相関関係を同定することを含む本発明の方法；又は本明細書に記載される抗腫瘍剤を同定する本発明の方法に有用なキットであって、１つ以上のｍｉＲを検出するために１つ以上の試薬を含む前記キットに関する。
【００３０】
特定の態様において、本明細書に開示されているように、少なくとも１つのｍｉＲは、Ｃ１９ＭＣクラスター及び／又はｍｉＲ−３７１−３クラスターから選択される。特定の実施態様において、ｍｉＲは、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５２０ｃ、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３からなる群より選択される。
【００３１】
特定の態様において、好ましくは染色体再編成、すなわち染色体転座、特に１９ｑ１３．４を伴う平衡転座を伴う腫瘍は、ヒト新生物、より詳細には、甲状腺腺腫、間葉腫瘍又はリンパ腫のようなヒト上皮腫瘍である。
【００３２】
特定の態様では、その発現が特定の甲状腺腫瘍、すなわちヒストタイプ、被包性増殖及び侵襲性の欠如、並びにヨウ素が十分な領域における罹患率のような甲状腺腺腫の生物病理学的特徴と相関するｍｉＲＮＡの同定も本明細書において提供される。
【００３３】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、ｍｉＲクラスター、特にＣ１９ＭＣクラスター及び／又はｍｉＲ−３７１−３クラスター、より好ましくは前記Ｃ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３クラスターのいずれか１つ又は両方でコードされているマイクロＲＮＡの１つ又は幾つかの同時解析及び標的化をそれぞれ含む。
【００３４】
別の特定の態様では、その活性化及び過剰発現の原因である機構を制御することにより、例えばＰＵＭ１プロモーターを下方制御してこれらのｍｉＲの発現を変更する、そうでなければＰＵＭ１エクソン／イントロン配列の近接部分と、特にＣ１９ＭＣクラスター及び／又はｍｉＲ−３７１−３クラスターにおける染色体１９の配列との融合転写物の発現、安定性、分解などに干渉する方法も、本明細書において開示される。ＰＵＭＩをコードする核酸分子とハイブリダイズするＰＵＭ１、特にオリゴヌクレオチド化合物の発現を調節する化合物及び方法は、当業者に知られており、例えば米国特許出願ＵＳ２００５／０２６１２１７Ａ１に記載されており、その開示内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本発明の多様な目的及び利点は、好ましい実施態様及び実施例の以下の詳細な説明を、添付の図面を考慮して読んだとき、当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
特許又は出願ファイルは、カラーで作製された１つ以上の図面及び／又は１つ以上の写真を含有する場合がある。カラー図面及び／又は写真を有するこの特許又は特許出願公報のコピーは、要請があり、必要な費用が支払われたら欧州特許庁又は米国特許商標庁によって提供されうる。
【図１】２つのｍｉＲＮＡクラスターのＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３を有する染色体領域１９ｑ１３．４の略図である。約１５０ｋｂの良性甲状腺腫瘍の共通切断点クラスター（ＢＰＣ）が垂直方向の矢で示されている。ｍｉＲ−５１２−１（プリｍｉＲ）は、成熟ｍｉＲ−５１２−５ｐをコードし、ｍｉＲ−３７１（プリｍｉＲ）は、成熟ｍｉＲ３７１−３ｐをコードしている。遺伝子符号は以下のタンパク質コード遺伝子を意味する：ＺＮＦ３３１＝ジンクフィンガータンパク質３３１、ＤＰＲＸ＝多岐対関連ホメオボックス、ＮＬＲＰ１２＝１２含有ＮＬＲファミリーピリンドメイン。
【図２Ａ】細胞株及び原発性腫瘍におけるｍｉＲ−５２０ｃ、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３の発現である。ｍｉＲＮＡの相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。ｍｉＲＮＡの値をＲＮＵ６５Ｂ（ＲＮＡ、Ｕ６核内低分子２）に規準化した。１９ｑ１３．４の再編成を有する腺腫から誘導した５つの細胞株（Ｓ１４１．２、Ｓ２９０．１、Ｓ１２１、Ｓ２１１、Ｓ４０．２）（黒色棒）及び他の構造的再編成を有する甲状腺腺腫から誘導した３つの細胞株（Ｓ５３３、Ｓ３２５、Ｓ２７０．２）（白色棒）の甲状腺細胞株におけるｍｉＲ−５２０ｃの発現。
【図２Ｂ】非新生物性甲状腺組織の３つの試料（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３）（白色棒）、１９ｑ１３．４の再編成を有する５つの腺腫（Ｓ８０１、Ｓ８４９、Ｓ８４２、Ｓ８４６、Ｓ８１４）（黒色棒）及び細胞遺伝学的に検出可能な異常を有さない５つの腺腫（Ｓ８０５、Ｓ８０６、Ｓ８８９、Ｓ９２０、Ｓ９２５）（白色棒）におけるｍｉＲ−５２０ｃの発現。
【図２Ｃ】非新生物性甲状腺組織の３つの試料（黒色点付棒（ｍｉＲ−３７１−３ｐ）、斜線棒（ｍｉＲ−３７２）及び横線棒（ｍｉＲ−３７３））、１９ｑ１３．４の再編成を有する５つの腺腫（黒色（ｍｉＲ−３７１−３ｐ）、大方眼棒（ｍｉＲ−３７２）及び小方眼棒（ｍｉＲ−３７３））、並びに細胞遺伝学的に検出可能な異常を有さない５つの腺腫（黒色点付棒、斜線棒及び横線棒））（ケース番号は表２を参照すること）。
【図２Ｄ】１９ｑ１３．４の再編成を有する腺腫から誘導した５つの細胞株（黒色棒（ｍｉＲ−３７１−３ｐ）、大方眼棒（ｍｉＲ−３７２）及び小方眼棒（ｍｉＲ−３７３））、並びに他の構造的再編成を有する甲状腺腺腫から誘導した３つの細胞株（黒色点付棒（ｍｉＲ−３７１−３ｐ）、斜線棒（ｍｉＲ−３７２）及び横線棒（ｍｉＲ−３７３））（ケース番号は表２を参照すること）。標準偏差における高い変動は、非常に高いＣｔ値に起因する。
【図３】細胞株Ｓ４０．２における転座ｔ（１；１９）（ｐ３５．２；１３．４）によりもたらされる誘導染色体１への融合遺伝子のゲノム構造である。細胞株Ｓ４０．２において同定された融合転写物ＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−Ｉ（ジェンバンク受入番号ＧＱ３３４６８７）及びＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−ＩＩ（ジェンバンク受入番号ＧＱ３３４６８８）の由来を説明する詳細な概略図である。１ｐ３５．２におけるＰＵＭ１のゲノム領域は、１９ｑ１３．４におけるＣ１９ＭＣのゲノム領域に、ＰＵＭ１のエクソン１０の後で融合する。２本の垂直棒は、両方とも選択的スプライシングにより始まるＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−Ｉ及びＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−ＩＩそれぞれにおけるＰＵＭ１のエクソン１−１０の後に位置する３′−配列を示す。融合転写物を、３′−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−Ｉ）又はＲＴ−ＰＣＲ（ＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−ＩＩ）のいずれかの実験によって検出した。定量化したｍｉＲＮＡをその名称により強調した。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲ−５１７ａの発現分析である。ＰＣＲ反応を実施し、次に４％小型ＤＮＡアガロースにより分析した。予測されるＤＮＡフラグメントは、６２ｂｐの大きさを有するので、Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をマーカー（Ｍ）として使用した。レーン１：Ｓ４０．２、２：逆転写酵素なしのＳ４０．２（−ＲＴ）、３：Ｓ１２１、４：Ｓ１２１−ＲＴ、５：甲状腺（正常）、６：甲状腺−ＲＴ、７：胎盤、８：胎盤−ＲＴ、９：Ｓ２７０．２、１０：Ｓ２７０．２−ＲＴ、１１：Ｓ２９０．１、１２：Ｓ２９０．１−ＲＴ、１３：Ｓ１４１．２、１４：Ｓ３２５、１５：Ｓ２１１、１６：Ｓ２１１−ＲＴ、１７：胎児ＲＮＡ、１８：成人精巣、１９：胎児ＲＮＡ−ＲＴ、２０：Ｓ１４１．２−ＲＴ、２１：成人精巣−ＲＴ、２２：Ｓ３２５−ＲＴ（細胞株及び腫瘍試料についての詳細は、表１を参照すること）。
【図５】細胞株Ｓ４０．２における転座ｔ（１；１９）（ｐ３５．２；１３．４）によりもたらされる誘導染色体１への融合遺伝子のゲノム構造である。細胞株Ｓ４０．２において同定された融合転写物ＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−Ｉ（ジェンバンク受入番号ＧＱ３３４６８７）及びＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−ＩＩ（ジェンバンク受入番号ＧＱ３３４６８８）の由来を説明する詳細な概略図である。１ｐ３５．２におけるＰＵＭ１のゲノム領域は、１９ｑ１３．４におけるＣ１９ＭＣのゲノム領域に、ＰＵＭ１のエクソン１０の後で融合する。２本の垂直棒は、両方とも選択的スプライシングにより始まるＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−Ｉ及びＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−ＩＩそれぞれにおけるＰＵＭ１のエクソン１−１０の後に位置する３′−配列を示す。融合転写物を、３′−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−Ｉ）又はＲＴ−ＰＣＲ（ＰＵＭ１−ＦＵＳ−１９ｑ−ＩＩ）のいずれかの実験によって検出した。定量化したｍｉＲＮＡをその名称により強調した。
【図６】細胞株Ｓ４０．２の部分核型である。ｔ（１；１９）（ｐ３５．２；ｑ１３．４）によりもたらされる染色体１及び１９、並びにそれらの誘導体を示す部分Ｇバンド核型である。
【図７】中期ＦＩＳＨによるＰＵＭ１切断点の図解である。両方とも１ｐ３５．２におけるＰＵＭ１のゲノム配列の全体に及んでいる２つの重複するＢＡＣクローン、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４及びＲＰ１１−１１３６Ｅ４を有する、ＦＩＳＨの後の細胞核Ｓ４０．２の中期の一部である。１ｐ３５．２における切断点はＰＵＭ１の中に位置し、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４及びＲＰ１１−１１３６Ｅ４の分離により示されている。ｄｅｒ（１）に対するＲＰ１１−１１３６Ｅ４の弱い残留シグナルのため、切断点は、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４に対して遠位のＲＰ１１−１１３６Ｅ４の中に位置する。
【図８】ｍｉＲ−３７１−３ｐの相対的な発現である。ｍｉＲ−３７１−３ｐの相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【図９】ｍｉＲ−３７２の相対的な発現である。ｍｉＲ−３７２の相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【図１０】ｍｉＲ−３７３の相対的な発現である。ｍｉＲ−３７３の相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【図１１】ｍｉＲ−５２０ｃ．３ｐの相対的な発現である。ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【図１２】ｍｉＲ−３７１−３ｐの相対的な発現である。ｍｉＲ−３７１−３ｐの相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。絨毛膜絨毛の核型を括弧内に示す。
【図１３】ｍｉＲ−３７２の相対的な発現である。ｍｉＲ−３７２の相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【図１４】ｍｉＲ−３７３の相対的な発現である。ｍｉＲ−３７３の相対的な発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【図１５】ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対的な発現である。２つの甲状腺腺腫組織（１つは１９ｑ１３．４の再編成がなく（Ｓ９２５）、１つは１９ｑ１３．４再編成がある（Ｓ９５８））、１９ｑ１３．４の再編成がある甲状腺腺腫から誘導された１つの細胞株（Ｓ４０．２）、並びに８つの異なる培養絨毛膜絨毛（第１及び／又は第２継代）におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対的発現は、リアルタイムＰＣＲ（３つの独立した実験の平均標準偏差）により決定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１０３に規準化した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、ｍｉＲＮＡの調製及び特徴決定、並びに染色体再編成、特に染色体転座のため発生する腫瘍の治療、予後及び診断用途におけるｍｉＲＮＡの使用に関する組成物及び方法を対象とする。
【００３８】
本発明は、ヨウ素が十分な領域でも高い罹患率を有する一般的なヒト腫瘍である甲状腺腺腫に基づき、それにより説明される。染色体バンド１９ｑ１３．４の再編成は、甲状腺腺腫において頻繁に見られ、まさに、ヒト上皮癌における最も頻度のある特定の染色体転座となっている（Ｂｅｌｇｅら、癌、遺伝学、細胞遺伝学（Cancer Genet. Cytogenet.）１０１（１９９８年）、４２〜４８頁）。２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子クラスター、すなわちＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３は、これらの染色体再編成の切断点領域に極めて近接して位置している。マイクロＲＮＡのｍｉＲ−５２０ｃ及びｍｉＲ−３７３に関連する幹細胞は、これらのクラスターのメンバーであり、インビトロ及びインビボにおいて上皮細胞の侵襲性増殖に関与している（Ｈｕａｎｇら、ネイチャー細胞生物学（Nat.Cell Biol.）１０（２００８年）、２０２〜２１０頁）。
【００３９】
腫瘍形成におけるマイクロＲＮＡの役割についての概念は、例えばＣａｌｉｎら、２００２年により取り組まれ、染色体再編成において見られる切断点と、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の指定との間の関連性を２００４年に示した（Ｃａｌｉｎら、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）９９（２００２年）、１５５２４〜１５５２９頁；Ｃａｌｉｎら、米国科学アカデミー紀要１０１（２００４年）、２９９９〜３００４頁）。更に、ｍｉＲＮＡ配座への位置が近いことに起因する細胞原腫瘍形成遺伝子、すなわちｃ−ｍｙｃの活性化が記載されている（Ｃａｌｉｎら、（２００４年）、上記；Ｇａｕｗｅｒｋｙら、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）８６（１９８９年）、８８６７〜８８７１頁）。しかし、染色体再編成において見られる切断点とｍｉＲＮＡ遺伝子の位置との一致は知られているが、腫瘍形成マイクロＲＮＡの活性化をもたらす転座の例は今まで示された又は考慮されたことがない（例えば、Ｃａｌｉｎ及びＣｒｏｃｅ、臨床研究（J. Clin. Invest.）１１７（２００７年）２０５９〜２０６６頁を参照すること）。
【００４０】
本発明の範囲内で実施された実験は、驚くべきことに、染色体バンド１９ｑ１３．４の再編成によって、Ｃ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３クラスターの両方が一貫して活性化され、したがって甲状腺腺腫の個別の分子サブタイプの描写を可能にすることを明らかにした。ヒト新生物において１９ｑ１３．４の再編成が頻繁に生じることを考慮すると、本発明は、現在、両方のクラスターの活性化は、ヒト新生物においてより一般的な現象である及びｍｉＲの変更された発現は、他の染色体再編成を伴う腫瘍においても有意でありうる、という見解である。
【００４１】
したがって、本発明は、被験者が、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍を有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者の試験試料において少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）のレベルを測定することを含み、対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べた試験試料におけるｍｉＲのレベルの存在又は増加が、被験者が前記腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す方法に関する。
【００４２】
更に、本発明は、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍に罹患している被験者を治療する医薬組成物であって、先行請求項のいずれかにおいて定義された又は本明細書において、より特定的には表１において定義された少なくとも１つのｍｉＲの発現を阻害することができる又はｍｉＲの活性の量若しくはレベルを減少することができる化合物と、場合により薬学的に許容される担体とを含む前記組成物に関する。
【００４３】
加えて、本発明は、好ましくは染色体再編成を伴う腫瘍の細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ｉ）対照細胞と比べて、好ましくは染色体再編成を有する腫瘍細胞においてその発現が誘導又は増加される１つ以上のｍｉＲの発現又は活性を阻害する１つ以上の作用物質を、細胞に導入すること；及び
（ｉｉ）１つ以上の作用物質がｍｉＲの発現又は活性を阻害する条件下に細胞を維持し、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害すること
を含む方法に関する。
【００４４】
本明細書に開示される方法、プロセス及び／又は使用のそれぞれ及びいずれかに付される腫瘍が良性又は悪性腫瘍であることは、本発明の範囲内である。実施態様において、腫瘍は、甲状腺の腫瘍若しくは甲状腺過形成、乳房の悪性癌、良性若しくは悪性の生殖細胞系の腫瘍又は卵巣癌である。
【００４５】
更に、本発明は、胎盤及び／又は妊娠性障害の状態を診断又は決定する方法であって、被験者の試験試料における少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）のレベルを測定することを含み、対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べた試験試料におけるｍｉＲのレベルの存在又は増加が、被験者が胎盤及び／又は妊娠性障害の前記状態を有する又は発生する危険性がある、のいずれかであることを示す方法に関する。その実施態様において、ｍｉＲは本明細書に開示されているｍｉＲであり、好ましくは、ｍｉＲはｍｉＲクラスターに属し、好ましくは、ｍｉＲクラスターは、Ｃ１９ＭＣクラスター及びｍｉＲ−３７１−３クラスターを含む群から、より好ましくは表１のｍｉＲから選択される。実施態様において、胎盤及び／又は妊娠性障害は、子癇前症、子宮内発育遅延、胎盤の奇胎（placenta moles）及びこれらの残遺物から選択される。別の実施態様において、方法は、胎児の染色体異常の診断のためである。より好ましい実施態様において、染色体異常は、Ｘ染色体又は２１トリソミーの欠失である。
【００４６】
本発明は、また、腫瘍に対する抗腫瘍剤を同定する方法であって、試験剤を細胞に提供すること及び好ましくは染色体再編成を有する腫瘍細胞における発現レベルの増加に関連する少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含み、適切な対照細胞と比べた細胞におけるｍｉＲのレベルの減少が、試験剤が抗腫瘍剤であること示す方法に関する。
【００４７】
更に、本発明は、好ましくは染色体再編成を有する腫瘍の診断及びそれに対する抗腫瘍剤の同定に関する本発明の方法において有用であり、本明細書に記載されている１つ以上のｍｉＲを検出するために１つ以上の試薬を含むキットに関する。
【００４８】
ｍｉＲの存在を検出する方法は、当業者に知られており、例えば、Ｃｉｓｓｅｌｌ  ＫＡ、Ｄｅｏ  ＳＫ（２００９年）マイクロＲＮＡ検出のトレンド（Trends in microRNA detection）、分析的生物分析化学（Anal Bioanal Chem）３９４：１１０９〜１１１６頁に記載されている又はｍｉＲＮＡ−ＦＩＳＨを用いること、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを使用することは、Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ、Ｅｌｔｏｎ  ＴＳ、Ｎａｎａ−Ｓｉｎｋａｍ  Ｐ、Ｖｏｌｉｎｉａ  Ｓ、Ｃｒｏｃｅ  ＣＭ、Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ、マイクロＲＮＡの前駆体形態と成熟形態のその場での分析を組み合わせる方法論及びそれらの推定標的との相関関係（A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets）、ネイチャープロトコール（Nat Protoc.）２００９年；４（１）：１０７〜１５頁若しくは Ｓｏｎｇ  Ｒ、Ｒｏ  Ｓ、Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ＪＤ、Ｐａｒｋ  Ｃ、ＭｃＣａｒｒｅｙ  ＪＲ、Ｙａｎ  Ｗ、多くのＸ結合マイクロＲＮＡが減数分裂性染色体不活性化を回避する（Many X-linked microRNAs escape meiotic sex chromosome inactivation）、ネイチャージェネティクス（Nat Genet.）２００９年４月；４１（４）：４８８〜９３頁、電子出版２００９年３月２２日を参照すること；又はノーザンブロットを用いることは、例えばＶａｌｏｃｚｉ  Ａ、Ｈｏｒｎｙｉｋ  Ｃ、Ｖａｒｇａ  Ｎ、Ｂｕｒｇｙａｎ  Ｊ、Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ  Ｓら（２００４年）、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロット分析によるマイクロＲＮＡの高感度及び特異的検出（Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes）、核酸研究（Nucleic Acids Res）３２：ｅ１７５を参照すること。
【００４９】
Ｃ１９Ｍクラスターでは、Ｂｅｎｔｗｉｃｈ  Ｉ、Ａｖｎｉｅｌ  Ａ、Ｋａｒｏｖ  Ｙ、Ａｈａｒｏｎｏｖ  Ｒ、Ｇｉｌａｄ  Ｓら（２００５年）、数百の保存及び非保存ヒトマイクロＲＮＡの同定（Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs）、ネイチャージェネティクス（Nat Genet）３７：７６６〜７７０頁において最初に記載されたことが認識されており、Ｌｅｈｎｅｒｔ  Ｓ、Ｖａｎ  Ｌｏｏ  Ｐ、Ｔｈｉｌａｋａｒａｔｈｎｅ  ＰＪ、Ｍａｒｙｎｅｎ  Ｐ、Ｖｅｒｂｅｋｅ  Ｇら（２００９年）、ヒトマイクロＲＮＡとＡｌｕ反復の共進化の証拠（Evidence for co-evolution between human microRNAs and Alu-repeats）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４：ｅ４４５６において、最初にＣ１９Ｍと呼ばれた。
【００５０】
そうでないことが特に記述されていない限り、用語「癌」及び「腫瘍」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００５１】
本明細書において交換可能に使用されるとき、「ｍｉＲ」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、又は「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子の非プロセス又はプロセス済ＲＮＡ転写物を意味する。ｍｉＲがタンパク質に翻訳されないとき、用語「ｍｉＲ」はタンパク質を含まない。非プロセスｍｉＲ遺伝子転写物は、「ｍｉＲ前駆体」とも呼ばれ、典型的には約７０〜１００個のヌクレオチドの長さのＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲ前駆体を、ＲＮアーゼ（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮアーゼ１１１，例えば大腸菌ＲＮアーゼ１１１）による消化でプロセスして、活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にすることができる。この活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、「プロセス済」ｍｉＲ遺伝子転写物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。用語「ｍｉＲ」は、本明細書で使用されるとき、成熟ｍｉＲ、プレｍｉＲ、プリｍｉＲ又はｍｉＲシード配列が含まれる１つ以上のｍｉＲ−オリゴヌクレオチドを含むことができることが理解されるべきである。特定の実施態様において、多様なｍｉＲ核酸の混合物を使用することもできる。また、特定の実施態様において、ｍｉＲを修飾して、送達を増強することができる。
【００５２】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）の情報はＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能であり、ｈｔｔｐ：／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／においてｍｉＲＮＡの登録を維持管理している。（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ら、「ｍｉＲベース：マイクロＲＮＡゲノム用ツール」（“miRBase: tools for microRNA genomics”）、ＮＡＲ  ２００８  ３６（データベース発行）：Ｄ１５４−Ｄ１５８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ら、「ｍｉＲベース：マイクロＲＮＡ配列、標的及び遺伝子命名法」（“miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature” ）、ＮＡＲ  ２００６  ３４（データベース発行）：Ｄ１４０−Ｄ１４４又はＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．、「マイクロＲＮＡ登録」（“The microRNA Registry”）、ＮＡＲ  ２００４  ３２（データベース発行）：Ｄ１０９−Ｄ１１１も参照すること）。ｍｉＲベース配列データベースは、多様な供給源からの公表されているｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列及び注釈を含む。ｍｉＲベース登録は、公表前の新たなｍｉＲＮＡのために、従来の命名法に適合する特有の名称を新規ｍｉＲＮＡ遺伝子に提供する。また、ｍｉＲベース標的は、動物における断定ｍｉＲＮＡ標的の供給源である。
【００５３】
活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然のプロセシング経路を介して（例えば、無傷の細胞又は細胞溶解産物を使用して）又は合成プロセシング経路により（例えば、単離したダイサー、アルゴノート又はＲＮアーゼ１１１のような単離したプロセシング酵素を使用して）ｍｉＲ前駆体から得ることができる。活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子を、ｍｉＲ前駆体からプロセスすることなく、生物学的又は化学的な合成により直接産生できることも理解される。
【００５４】
本発明は、被験者が腫瘍を有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者の試験試料における少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定し、試験試料におけるｍｉＲのレベルを対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比較することを含む方法を包含する。本明細書で使用されるとき、「被験者」は、染色体再編成、特に染色体１９における転座を伴う腫瘍を有する又は有すると疑われる任意の哺乳動物でありうる（実施例も参照すること）。特定の実施態様において、被験者は、腫瘍を有する又は有すると疑われるヒトである。本発明の方法及びキットに使用されるのが好ましいｍｉＲは、下記の表１に記載されている。
【００５５】
【表１−１】
2013502906.tif 000002
【００５６】
【表１−２】
2013502906.tif 000003
【００５７】
【表１−３】
2013502906.tif 000004
【００５８】
【表１−４】
2013502906.tif 000005
【００５９】
【表１−５】
2013502906.tif 000006
【００６０】
【表１−６】
2013502906.tif 000007
【００６１】
【表１−７】
2013502906.tif 000008
【００６２】
【表１−８】
2013502906.tif 000009
【００６３】
【表１−９】
2013502906.tif 000010
【００６４】
【表１−１０】
2013502906.tif 000011
【００６５】
【表１−１１】
2013502906.tif 000012
【００６６】
【表１−１２】
2013502906.tif 000013
【００６７】
【表１−１３】
2013502906.tif 000014
【００６８】
【表１−１４】
2013502906.tif 000015
【００６９】
【表１−１５】
2013502906.tif 000016
【００７０】
【表１−１６】
2013502906.tif 000017
【００７１】
ｍｉＲベースａｃｃ＃という用語は、ｍｉＲベースデータベースにおいて示された配列の受入番号を表す。ｍｉＲベースデータベースは、公表されたｍｉＲＮＡ配列及び注釈の検索可能なデータベースである。そのウエブサイトは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／である。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ら、「ｍｉＲベース：マイクロＲＮＡゲノム用ツール」（“miRBase: tools for microRNA genomics”）、ＮＡＲ  ２００８  ３６（データベース発行）：Ｄ１５４−Ｄ１５８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ら、「ｍｉＲベース：マイクロＲＮＡ配列、標的及び遺伝子命名法」（“miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature”）、ＮＡＲ  ２００６  ３４（データベース発行）：Ｄ１４０−Ｄ１４４又はＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．、「マイクロＲＮＡ登録」（“The microRNA Registry”）、ＮＡＲ  ２００４  ３２（データベース発行）：Ｄ１０９−Ｄ１１１も参照すること。
【００７２】
上記に示された配列は、配列番号１がｈｓａ−ｍｉｒ−３７１であり、配列番号２がｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−３ｐであるなど、配列番号１〜１２１として提示されている付属配列も含有することができる。
【００７３】
少なくとも１つのｍｉＲのレベルを、被験者から得た生物学的試料の細胞において測定することができる。例えば、組織試料を、染色体再編成に関連する腫瘍を有すると疑われる被験者から、従来の生検技術により取り出すことができる。そのような組織試料は、試験試料を形成することができる。別の例では、血液試料を被験者から取り出すことができ、白血球をＤＮＡ抽出のために標準的な技術により単離することができ、それは好ましくは試験試料を形成する。血液又は組織試料は、好ましくは放射線療法、化学療法又は他の治療措置を開始する前に被験者から得る。対応する対照組織又は血液試料のような、正常試料とも呼ぶことができる対照試料を、被験者の未罹患組織から、正常な個体若しくは個体の集団から又は被験者の試料の大部分の細胞に対応する培養細胞から得ることができる。次に対応する組織又は血液試料のような対照試料は、被験者の試料と共にプロセスされ、これによって、被験者の試料の細胞における所定のｍｉＲ遺伝子から産生されるｍｉＲのレベルを対照試料の細胞における対応するｍｉＲレベルと比較することができる。この手順は、試験試料、正常試料又は対照試料が使用される、本明細書に開示されているそれぞれ及び任意の方法、プロセス又は使用に適用される。
【００７４】
対照試料における対応するｍｉＲのレベルと比べた被験者から得た試料におけるｍｉＲのレベルの変更、すなわち増加は、被験者における腫瘍の存在を示す。本発明によると、試験試料における少なくとも１つのｍｉＲのレベルは、対照試料における対応するｍｉＲのレベルよりも大きい（すなわち、ｍｉＲの発現は「上方制御」されている）。本明細書で使用されるとき、ｍｉＲの発現は、被験者の細胞又は組織試料におけるｍｉＲの量が対照細胞又は対照組織試料における同じｍｉＲの量よりも大きい場合に、「上方制御」される。対照及び正常試料における相対的なｍｉＲ遺伝子発現は、１つ以上のＲＮＡ発現基準によって決定することができる。基準は、例えば、ゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、基準細胞株におけるｍｉＲ遺伝子発現レベル又は正常なヒト対照の集団から予め得たｍｉＲ遺伝子発現のレベルを含むことができる。これは、本明細書に開示されているそれぞれ及び任意の方法、プロセス又は使用に適用される。
【００７５】
試料におけるｍｉＲのレベルは、生物学的試料においてＲＮＡ発現レベルを検出するのに適した任意の技術を使用して測定することができる。生物学的試料の細胞においてＲＮＡ発現レベルを決定するのに適した技術（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチューハイブリダイゼーション）は、当業者に良く知られている（実施例も参照すること）。特定の実施態様において、少なくとも１つのｍｉＲのレベルは、ノーザンブロット分析を使用して検出される。例えば、全細胞ＲＮＡを、核酸抽出緩衝液の存在下での均質化、続く遠心分離により細胞から精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをＤＮアーゼによる処理及び沈殿によって除去する。次にＲＮＡ分子を、標準的技術に従ってアガロースゲルでのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに移す。次にＲＮＡを加熱によりフィルターに固定する。特定のＲＮＡの検出及び定量化は、当該のＲＮＡに相補的な適切に標識したＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用して達成される（例えば、その開示が全て参照として組み込まれる、分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、第７章を参照すること）。これは、本明細書に開示されているそれぞれ及び任意の方法、プロセス又は使用に適用される。
【００７６】
所定のｍｉＲのノーザンブロットハイブリダイゼーションに適したプローブを、所定のｍｉＲの核酸配列から産生することができる。標識ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの調製方法及び標的ヌクレオチド配列へのそのハイブリダイゼーションの条件は、分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、第１０及び１１章に記載されており、その開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００７７】
例えば、核酸プローブを、例えば３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ若しくは３５Ｓのような放射性核種；重金属；又は標識リガンドの特異的結合対メンバーとして機能することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジン若しくは抗体）、蛍光分子、化学発光分子、酵素などで標識することができる。
【００７８】
プローブを、Ｒｉｇｂｙら、分子生物学ジャーナル（J. Mol. Biol）１１３（１９７７年）、２３７〜３５１頁のニック翻訳法又はＦｅｉｎｂｅｒｇら、分析生化学（Anal. Biochem.）１３２（１９８３年）、６〜１３頁のランダムプライミング法のいずれか（これらの開示は全て参照として本明細書に組み込まれる）により標識して、高度に特異的な活性にすることができる。後者は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡテンプレートから高度に特異的な活性の３２Ｐ標識プローブを合成する選択法である。例えば、ニック翻訳法により既存のヌクレオチドを高放射能ヌクレオチドに代えることによって、特異的活性の３２Ｐ標識核酸プローブを、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを十分に越えて調製することが可能である。
【００７９】
次にハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ検出を、ハイブリダイズしたフィルターを写真フィルムに曝すことにより実施することができる。ハイブリダイズしたフィルターに曝された写真フィルムの濃度走査は、ｍｉＲ遺伝子転写物レベルの正確な測定を提供する。別の手法を使用して、ｍｉＲ遺伝子転写物レベルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒのようなコンピュータ画像化システムにより定量化することができる。
【００８０】
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの放射性核種標識化が実用的ではない場合、ランダムプライマー法を使用して、類似体、例えばｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジントリホスフェートをプローブ分子に組み込むことができる。ビオチン化プローブオリゴヌクレオチドは、色変化を生じる蛍光染料又は酵素と結合したアビジン、ストレプトアビジン及び抗体（例えば、抗ビオチン抗体）のようなビオチン結合タンパク質と反応させることによって、検出することができる。
【００８１】
ノーザン及び他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加えて、ＲＮＡ転写物のレベルを決定することは、インサイチューハイブリダイゼーションの技術を使用して達成することができる。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも少ない細胞を必要とし、細胞全体を顕微鏡カバースリップに置き、細胞の核酸内容物を、放射性又は別の方法で標識された核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブを含有する溶液でプローブすることを伴う。この技術は、被験者の組織生検試料を分析するのに特に好適である。インサイチューハイブリダイゼーション技術の実施は、米国特許第５，４２７，９１６号においてより詳細に記載されており、その開示は、全て参照として本明細書に組み込まれる。所定のｍｉＲのインサイチューハイブリダイゼーションに適したプローブを、核酸配列から産生することができる。このインサイチューハイブリダイゼーションは、本明細書に開示されているそれぞれ及び任意の方法、プロセス又は使用に適用される。
【００８２】
本明細書に開示されているそれぞれ及び任意の方法、プロセス又は使用に関して、細胞におけるｍｉＲ遺伝子転写物の相対数は、ｍｉＲ遺伝子転写物の逆転写、続く逆転写転写物のポリメラーゼ連鎖反応による増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写物のレベルを、内部基準、例えば同じ試料の存在する「ハウスキーピング」遺伝子のｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部基準として使用するのに適した「ハウスキーピング」遺伝子には、例えば５Ｓ  ｒＲＮＡ、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ又はｔＲＮＡが含まれる。定量ＲＴ−ＰＣＲの方法及びその変形は、当該技術の技能の範囲内である。
【００８３】
本明細書に開示されている方法、プロセス又は使用の幾つかの場合では、試料において複数の異なるｍｉＲの発現レベルを同時に決定することが望ましいことがある。本明細書に開示されているそのような方法、プロセス又は使用の他の場合では、腫瘍に関連する全ての既知のｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを決定することが望ましいことがある。数百のｍｉＲ遺伝子の腫瘍特異的発現レベルを評価することは、時間がかかり、大量の全ＲＮＡ（それぞれのノーザンブロットにおいて少なくとも２０ｐｇ）及び放射性同位元素を要するオートラジオグラフ技術を必要とする。
【００８４】
これらの制限を克服するために、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的なプローブオリゴデオキシヌクレオチドのセットを含有する、マイクロチップフォーマット（すなわち、マイクロアレイ）のオリゴライブラリーを構築することができる。ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを生成し、それらをマイクロアレイのプローブオリゴデオキシヌクレオチドにハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション又は発現プロフィールを生成することによって、そのようなマイクロアレイを使用して、生物学的試料における多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを決定することができる。次に試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを対照試料と比較して、どのマイクロＲＮＡが腫瘍において変更された発現レベルを有するかを決定することができる。これは、本明細書に開示されているそれぞれ及び任意の方法、プロセス又は使用に適用される。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８６】
「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は、（例えば、ハイブリダイゼーションによって）検出される分子を意味する。
【００８７】
「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド」とは、特定のｍｉＲ又は特定のｍｉＲの逆転写物にハイブリダイズする選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８８】
特定の試料の「発現プロフィール」又は「ハイブリダイゼイーションプロフィール」は、実質的に試料状態の指紋であり、２つの状態は同様に発現する任意の特定の遺伝子を有する場合があるが、多数の遺伝子の評価は、細胞の状態に特有な遺伝子発現プロフィールの生成を同時に可能にする。すなわち、正常細胞を腫瘍細胞と区別することができ、腫瘍細胞内では、異なる予後状態（例えば、良好な又は不十分な長期生存の見込み）を決定することができる。異なる状態の腫瘍細胞の発現プロフィールを比較することによって、どの遺伝子がそれぞれに状態において重要であるか（遺伝子の上方及び下方制御を含む）に関する情報が得られる。
【００８９】
本明細書において好ましく使用されるとき、用語「遺伝子再編成」は、実施態様において、例えば染色体転座、逆位又は中間部欠失により影響を受けうる１つ又は幾つかの染色体の一部の非相同的再編成を意味する。
【００９０】
染色体再編成は、好ましくは、インサイチューハイブリダイゼーションが含まれるが、これに限定されない伝統的な細胞遺伝学又は分子細胞遺伝学によって検出される。
【００９１】
本明細書において好ましく使用されるとき、腫瘍が染色体再編成を伴うという用語は、実施態様において、少なくとも幾つかの腫瘍細胞がそのような染色体再編成を示す又は表示することを意味する。
【００９２】
本明細書において好ましく使用されるとき、結果が、例えば腫瘍を有する被験者を「示す」という用語は、結果が、被験者が腫瘍を有する証拠を提供することを意味する。
【００９３】
腫瘍細胞又は正常細胞において異なって発現する配列、並びに異なる予後結果をもたらす異なる発現の同定は、多数の方法でこの情報を使用することを可能にする。例えば、特定の治療レジメンを（例えば、化学療法薬が特定の患者において長期予後を改善するために作用するかを決定するために）評価することができる。
【００９４】
同様に、診断を患者試料と既知の発現プロフィールとの比較により実施又は確認することができる。更に、これらの（個別の遺伝子ではなく）遺伝子発現プロフィールは、腫瘍発現プロフィールを抑制する又は不十分な予後プロフィールを良好な予後プロフィールに転換する薬剤候補のスクリーニングを可能にする。
【００９５】
したがって、本発明は、被験者が本明細書に定義されている腫瘍を有するか又は発生する危険性があるかを診断する方法であって、被験者から得た試験試料のＲＮＡを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズして、試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを提供し、試験試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼイーションプロフィールと比較することを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変更、特に増加が、被験者が腫瘍を有する又は発生する危険性がある、のいずれかを示す方法を提供する。
【００９６】
一つの実施態様において、マイクロアレイは、Ｃ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３クラスターの相当部分のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴデオキシヌクレオチドを含む。
【００９７】
マイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から生成した遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。アレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有することができ、一方は活性成熟配列を含有し、他方はｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である。アレイは、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件において対照として機能することができる、僅か数個の塩基によりヒトオルソルグと異なる１つ以上のマウス配列のような対照を含有することもできる。両方の種のｔＲＮＡも、マイクロチップに印刷することができ、特定のハイブリダイゼーションにおいて内部の相対的に安定した陽性対照を提供する。非特異的ハイブリダイゼーションにおける１つ以上の適切な対照も、マイクロチップに含めることができる。この目的のために、配列は、任意の既知のｍｉＲＮＡとあらゆる相同性が不在であることに基づいて選択される。
【００９８】
マイクロアレイは、当該技術に既知の技術を使用して作製することができる。例えば、適切な長さ、例えば４０個のヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドは、Ｃ６位で修飾され、市販のマイクロアレイ系、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｉＧｒｉｄ（商標）１００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライドを使用して印刷された５′−アミンである。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーは、標的ＲＮＡを標識プライマーで逆転写することにより調製される。最初の鎖合成の後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性して、ＲＮＡテンプレートを分解する。次に、このように調製された標識標的ｃＤＮＡを、ハイブリダイズ条件下、例えば、６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミドを２５℃で１８時間にわたってマイクロアレイチップにハイブリダイズし、続いて０．７５×ＴＮＡにより３７℃で４０分間洗浄する。固定プローブＤＮＡが試料において相補的標的ｃＤＮＡを認識するアレイの位置で、ハイブリダイゼーションが生じる。標識標的ｃＤＮＡは、結合が生じるアレイに正確な位置を示し、自動的な検出及び定量化を可能にする。結果は、ハイブリダイゼーション事象の列挙からなり、患者の試料において特異的ｃＤＮＡ配列の相対的存在量、したがって対応する相補的ｍｉＲの相対的存在量を示す。一つの実施態様によると、標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識プライマーから調製されたビオチン標識ｃＤＮＡである。次にマイクロアレイを、例えばＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ６４７複合体を使用するビオチン含有転写物の直接的な検出によりプロセスし、従来の走査方法を使用して走査する。アレイにおける各スポットの画像強度は、患者試料における対応するｍｉＲの存在量に比例する。
【００９９】
アレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現検出にとって幾つかの利点を有する。第１には、数百の遺伝子の網羅的な発現を同じ試料において１つの時点で同定することができる。第２には、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計によって、成熟及び前駆体の両方の分子の発現を同定することができる。第３には、ノーザンブロット分析と比較して、チップは少量のＲＮＡを必要とし、２．５ｐｇの全ＲＮＡを使用して再現可能な結果を提供する。比較的制限された数のｍｉＲＮＡ（種あたり数百）は、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドプローブを有する、幾つかの種に共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのようなツールは、多様な条件下でそれぞれ既知のｍｉＲの種横断的発現についての分析を可能にする。
【０１００】
特定のｍｉＲの定量発現レベルアッセイの使用に加えて、Ｃ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３クラスターのメンバーの相当部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを用いて、ｍｉＲ発現パターンの分析のためにｍｉＲ遺伝子プロファイリングを実施することができる。個別のｍｉＲの特徴を、確立された疾患マーカー又は直接疾患状態に関連付けることができる。
【０１０１】
本明細書に記載されている発現プロファイリング方法によると、腫瘍を有すると疑われる被験者の試料における全ＲＮＡを定量的に逆転写して、試料のＲＮＡに相補的な標識標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。次に標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズして、試料のハイブリダイゼイーションプロフィールを提供する。結果は、試料におけるｍｉＲＮＡの発現パターンを代表する試料のハイブリダイゼイーションプロフィールである。ハイブリダイゼイーションプロフィールは、試料の標的オリゴデオキシヌクレオチドとマイクロアレイのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドとの結合からのシグナルを含む。プロフィールを、結合の存在又は不在（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、記録されるプロフィールは、それぞれのハイブリダイゼーションからのシグナルの強度を含む。プロフィールを、正常、すなわち非腫瘍性の対照試料から生成したハイブリダイゼイーションプロフィールと比較する。シグナルにおける変更は、被験者における腫瘍の存在を示す。
【０１０２】
腫瘍に罹患している被験者を治療するための、本明細書において定義され、それぞれ開示されている少なくとも１つのｍｉＲの発現を阻害することができる化合物の使用としの上記開示は、本明細書に開示されている胎盤及び／又は妊娠性障害に罹患している又は罹患している危険性がある被験者の治療にも同様に当てはまる。同じことはそれぞれの医薬組成物にも当てはまる。
【０１０３】
ｍｉＲ遺伝子発現を測定する他の技術も当該技術の技能の範囲内であり、ＲＮＡ転写及び分解の速度を測定する多様な技術を含む。
【０１０４】
用語「治療する」、「治療している」及び「治療」は、本明細書で使用されるとき、疾患症状の発症を予防若しくは遅延すこと及び／又は疾患若しくは状態の症状の重篤度若しくは頻度を軽減することを含む、疾患又は状態、例えば腫瘍に関連する症状を改善することを意味する。用語「被験者」及び「個体」は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス又は他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、齧歯類若しくはネズミ科の種属が含まれるが、これらに限定されない哺乳動物のような動物を含むことが本明細書において定義される。好ましい実施態様において、動物はヒトである。
【０１０５】
本発明の治療方法の一つの実施態様において、ｍｉＲ発現を阻害する少なくとも１つの化合物の有効量を被験者に投与することができる。本明細書で使用されるとき、「ｍｉＲ発現を阻害する」は、治療後の活性成熟形態のｍｉＲの産生が、治療前に産生された量よりも少ないことを意味する。当業者は、例えば治療方法について上記に考察されたｍｉＲ転写物レベルを決定する技術を使用して、ｍｉＲ発現が腫瘍細胞において阻害されたかを容易に決定することができる。阻害は、遺伝子発現のレベルにおいて（すなわち、ｍｉＲをコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することによって）又はプロセシングのレベルにおいて（例えば、成熟活性ｍｉＲへのｍｉＲ前駆体のプロセシングを阻害することによって）生じることができる。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、ｍｉＲ発現を阻害する化合物の「有効量」は、腫瘍関連染色体の特徴に関連する腫瘍に罹患している被験者において腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、被験者の大きさ及び体重；疾患の侵入の程度；被験者の年齢、健康及び性別；投与経路；並びに投与が局所的か又は全身的かのような要因を考慮することによって、所定の被験者に投与されるべきｍｉＲ発現阻害化合物の有効量を容易に決定することができる。
【０１０７】
例えば、発現阻害化合物の有効量は、治療される被験者の概算又は推定体重に基づくことができる。そのような有効量は、本明細書に記載されるように、とりわけ非経口的又は経腸的に投与される。例えば、被験者に投与される発現阻害化合物の有効量は、約５〜３０００マイクログラム／ｋｇ体重、約７００〜１０００マイクログラム／ｋｇ体重の範囲でありうるか又は約１０００マイクログラム／ｋｇ体重を越えることができる。
【０１０８】
当業者は、ｍｉＲ発現を阻害する化合物を所定の被験者に投与する適切な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば、発現阻害化合物を（例えば、単回注射又は沈着として）被験者に１回投与することができる。あるいは、発現阻害化合物を、被験者に１日１回又は２回、約３〜約２８日間にわたって、より好ましくは約７〜約１０日間にわたって投与することができる。特定の投与レジメンにおいて、発現阻害化合物は、１日１回、７日間にわたって投与される。投与レジメンが多回投与を含む場合、被験者に投与される発現阻害化合物の有効量は、投与レジメン全体にわたって投与される化合物の総量を含むことができる。
【０１０９】
ｍｉＲ遺伝子発現を阻害するのに適した化合物には、二本鎖ＲＮＡ（例えば、短若しくは小型干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸及びリボザイムのような酵素ＲＮＡ分子が含まれる。これらの化合物は、それぞれ、所定のｍｉＲを標的にすること、標的ｍｉＲを破壊すること又は標的ｍｉＲの破壊を誘導することができる。
【０１１０】
例えば、所定のｍｉＲ遺伝子の発現を、ｍｉＲの少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列相同性を有する単離二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によりｍｉＲ遺伝子の干渉を誘導することによって、阻害することができる。  特定の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は「短又は小型干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１１１】
本発明の方法に有用なｓｉＲＮＡは、約１７個のヌクレオチドから約２９個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約１９個から約２５個のヌクレオチドの長さの短二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン・クリック塩基対合相互作用（本明細書以降「塩基対合」）により一緒にアニーリングしている、センスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍｉＲに含有されている核酸配列と実質的に同一の核酸配列を含む。
【０１１２】
本明細書で使用されるとき、標的ｍＲＮＡに含有されている標的配列と「実質的に同一」であるｓｉＲＮＡの核酸配列は、標的配列と同一である又はそのようなｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を仲介するのに依然として適している限り、１、２つ若しくはそれ以上のヌクレオチドにより標的配列と異なっている核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２つの相補的一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができる又は２つの相補的な部分が塩基対合しており、一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合している単一分子を含むことができる。
【０１１３】
ｓｉＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更により天然に生じるＲＮＡと異なる変更ＲＮＡであることもできる。そのような変更には、非ヌクレオチド材料の、例えばｓｉＲＮＡの末端への若しくはｓｉＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチドへの付加又はｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾又はデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドの置換が含まれうる。
【０１１４】
ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は、３′オーバーハングを含むこともできる。本明細書で使用されるとき、「３′オーバーハング」は、二重ＲＮＡ鎖の３′末端から伸びている少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを意味する。したがって、特定の実施態様において、ｓｉＲＮＡは、１〜約６個のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）の長さ、１〜約５個のヌクレオチドの長さ、１〜約４個のヌクレオチドの長さ又は約２〜約４個のヌクレオチドの長さの少なくとも１つの３′オーバーハングを含む。特定の実施態様において、３′オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２個のヌクレオチドの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３オーバーハングを含むことができる。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡは、化学的若しくは生物学的に産生することができる又は国際出願ＷＯ２００９／０３３１４０（この開示内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれる）において単離ｍｉＲについて記載されているように、組み換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を産生及び試験する例示的な方法は、米国公開特許出願第２００２／０１７３４７８Ａ１号及び米国公開特許出願第２００４／００１８１７６Ａ１号に記載されており、これらの開示は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
所定のｍｉＲ遺伝子の発現を、アンチセンス核酸により阻害することもできる。本明細書で使用されるとき、「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの活性を変更する核酸分子を意味する。本発明の方法における使用に適したアンチセンス核酸は、ｍｉＲの隣接核酸配列に相補的な核酸配列を一般に含む一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ，ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。アンチセンス核酸は、ｍｉＲの隣接核酸配列に５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的又は９５〜１００％相補的な核酸配列を含むことができる。ｍｉＲの核酸配列は本明細書において提供される。いかなる理論にも束縛されるものではないが、アンチセンス核酸は、ｍｉＲ／アンチセンス核酸二重鎖を消化するＲナーゼＨ又は別の細胞ヌクレアーゼを活性化すると考えられる。
【０１１７】
アンチセンス核酸は、核酸主鎖又は糖及び塩基部分（若しくはこれらの同等物）に対して修飾を含有して、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達又は分子の効力に関する他の特性を増強することもできる。そのような修飾には、コレステロール部分、アクリジンのような二重鎖挿入剤又は１つ以上のヌクレアーゼ耐性基が含まれる。
【０１１８】
アンチセンス核酸は、化学的若しくは生物学的に産生することができる又は単離ｍｉＲについて記載されているように、組み換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることができる。産生及び試験の例示的な方法は、当該技術の技能の範囲内である（例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｈｅｎｇ、サイエンス（Science）２６１（１９９３年）、１００４頁及び米国特許第５，８４９，９０２号（これらの開示は全て参照として本明細書に組み込まれる）を参照すること）。
【０１１９】
最近では、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を機能化するツールとして使用され、ＡＳＯ阻害後のｍｉＲＮＡレベルの低減が、効力を示すことが一般に報告されている。例えば、ショウジョウバエＳ２細胞における２′−ｏ−メチルオリゴヌクレオチドによるｍｉＲＮＡ発現の阻害が、Ｂｅｒｇｅｒらによりインビトロ細胞発生生物学−動物（In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.）４１（２００５）、１２〜１８頁において記載されている。加えて、分解を有さないインビボのＡＳＯに基づいたマイクロＲＮＡの強力なインヒビターが、Ｄａｖｉｅｓら、核酸研究（Nucleic Acids Res.）３７（２００９年）、７０〜７７頁に記載されており、両方の文書の開示内容は参照として本明細書に組み込まれる。ｍｉＲ−３７１−３及びＣ１９ＭＣクラスターのもののような染色体再編成に関連するｍｉＲＮＡの発現及び活性をそれぞれ阻害するために、同様の手法を本発明に従って使用することができる。
【０１２０】
所定のｍｉＲ遺伝子の発現を、酵素核酸により阻害することもできる。本明細書で使用されるとき、「酵素核酸」は、ｍｉＲの隣接核酸に相補性を有し、ｍｉＲを特異的に切断することができる基質結合領域を含む核酸を意味する。酵素核酸基質結合領域は、例えば、ｍｉＲの隣接核酸配列に５０〜１００％の相補性、７５〜１００％の相補性又は９５〜１００％の相補性がありうる。酵素核酸は、塩基、糖及び／又はリン酸塩基に修飾を含むこともできる。本発明の方法に使用される例示的な酵素核酸は、リボザイムである。
【０１２１】
酵素核酸は、化学的若しくは生物学的に産生することができる又は単離ｍｉＲについて記載されているように、組み換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることができる。酵素核酸分子、すなわちリボザイムを産生及び試験する例示的な方法は、Ｗｅｒｎｅｒ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、核酸研究（Nucl. Acids Res.）２３（１９９５年）、２０９２〜２０９６頁；Ｈａｍｍａｎｎら、アンチセンス及び核酸薬の開発（Antisense und Nucleic Acid Drug Dev.）９（１９９９年）、２５〜３１頁；Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅら、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）１１（１９９２年）、１５２５〜１５３０頁；Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅら、遺伝子（Gene）１４９（１９９４年）、４７〜５４頁、並びに米国特許第４，９８７，０７１号に記載されており、これらの開示は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
ｍｉＲ遺伝子発現を阻害する別の化合物群は、例えばＫｒｕｅｔｚｆｅｌｄｔ  Ｊらにより記載されたいわゆるアンタゴｍｉＲである（Ｋｒｕｅｔｚｆｅｌｄｔ  Ｊら（２００５年）、「アンタゴｍｉｒ」によるインビボでのマイクロＲＮＡのサイレンシング（Silencing of microRNAs in vivo with ‘antagomirs'）、ネイチャー（Nature）４３８（７０６８）：６８５〜６８９頁）。
【０１２３】
ｍｉＲ発現を阻害する少なくとも１つの化合物の投与は、腫瘍関連染色体の特徴に関連する腫瘍を有する被験者において腫瘍細胞の増殖を阻害する。本明細書で使用されるとき、「腫瘍細胞の増殖を阻害する」ことは、細胞を死滅させること又は細胞の増殖を永久若しくは一時的に阻止若しくは遅延することを意味する。腫瘍細胞増殖の阻害は、被験者におけるそのような細胞の数が、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の投与後に一定のままである又は減少する場合に推測することができる。腫瘍細胞増殖の阻害は、そのような細胞の絶対数は増加するが、腫瘍増殖の速度が減少する場合にも推測することができる。
【０１２４】
被験者の体内における腫瘍細胞の数は、直接的な測定により又は原発性若しくは転移性腫瘍量の大きさの推定により決定することができる。例えば、被験者における腫瘍細胞の数は、免疫組織学的な方法、フローサイトメトリー又は腫瘍細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の技術により測定することができる。
【０１２５】
ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物を被験者の腫瘍細胞に送達するのに適した任意の手段により被験者に投与することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物により又はこれらの化合物をコードする配列を含む核酸により被験者の細胞に形質移入するのに適した方法によって、投与することができる。一つの実施態様において、細胞は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミド又はウイルスベクターにより形質移入される。
【０１２６】
真核細胞への形質移入の方法は当該技術において良く知られており、例えば、細胞の核又は前核への核酸の直接的な注入；エレクトロポレーション；リポソーム転移又は親油性材料により仲介される転移；レセプター仲介核酸送達、生体弾道又は粒子加速；リン酸カルシウム沈殿及びウイルスベクターにより仲介される形質移入が含まれる。
【０１２７】
例えば、細胞を、リポソーム転移化合物により、例えばＤＯＴＡＰ（Ｎ〔１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリイル−アンモニムメトメチルスルフェート、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｎｎｅｎｗａｌｄ  ２、８２３７２  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮのような同等物により形質移入することができる。使用される核酸の量は、本発明の実施には重要でなく、許容可能な結果を、０．１〜１００マイクログラムの核酸／１０５細胞で達成することができる。例えば、１０５細胞あたり３マイクログラムのＤＯＴＡＰの比率の約０．５マイクログラムのプラスミドを使用することができる。
【０１２８】
ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を、任意の適切な経腸又は非経口投与経路により被験者に投与することもできる。本発明に適した経腸投与経路には、例えば経口、直腸内又は鼻腔内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル注入）；組織周辺及び組織内注射（例えば、腫瘍周辺及び腫瘍内注射、網膜内注射又は網膜下注射）；（例えば、浸透圧ポンプによる）皮下注入を含む皮下注射又は沈着；例えばカテーテル又は他の設置装置による目的の組織への直接的な適用（例えば、網膜ペレット又は坐剤又は有孔性、無孔性若しくはゼラチン状材料を含む移植片）；並びに吸入が含まれる。特に適した投与経路は、患者への注射、注入及び静脈内投与である。
【０１２９】
本発明の方法において、ｍｉＲ発現阻害化合物を、裸ＲＮＡ、送達試薬との組み合わせ又はｍｉＲ発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば、組み換えプラスミド若しくはウイルスベクター）のいずれかによって被験者に投与することができる。  適切な送達試薬には、例えば、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリジン）及びリポソームが含まれる。
【０１３０】
ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む組み換えプラスミド及びウイルスベクター、並びにそのようなプラスミド及びベクターを腫瘍細胞に送達する技術が、本明細書において考察される。
【０１３１】
特定の実施態様において、リポソームを使用して、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はこれらをコードする配列を含む核酸）を被験者に送達する。リポソームは、核酸の血中半減期を増加することもできる。本発明における使用に適したリポソームを、一般に中性又は陰性荷電リン脂質及びコレステロールのようなステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成することができる。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームの大きさ及び血流におけるリポソームの半減期のような要因を考慮することにより導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａら、生物物理学及び生体工学の年間論評（Ann. Rev. Biophys. Bioeng.）９（１９８０年）、４６７頁；並びに米国特許第４，２３５，８７１、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号及び同第５，０１９，３６９号（これらの開示は全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、リポソームを調製するために多様な方法が知られている。
【０１３２】
本発明の方法に使用されるリポソームは、リポソームを腫瘍細胞に向けて標的化するリガンド分子を含むことができる。腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体のような腫瘍細胞に広く存在するレセプターに結合するリガンドが好ましい。
【０１３３】
本発明の方法に使用されるリポソームを、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを避けるように修飾することもできる。そのような修飾リポソームは、オプソニン作用阻害部分を表面に有するか又はリポソーム構造内に組み込む。特に好ましい実施態様において、本発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部分とリガンドの両方を含むことができる。
【０１３４】
本発明のリポソームの調製に使用されるオプソニン作用阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合した大型の親水性ポリマーである。本明細書で使用されるとき、オプソニン作用阻害部分は、例えば、膜それ自体への脂溶性アンカーの膜への挿入により又は膜脂質の活性基への直接的な結合により、化学的又は物理的に膜に結合する場合、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン作用阻害親水性ポリマーは、米国特許第４，９２０，０１６号（その開示は全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＭＭＳ及びＲＥＳによるリポソームの取り込みを有意に減少させる保護表面層を形成する。
【０１３５】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧ又はＰＰＧ及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；ポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドンのような合成ポリマー；直鎖、分岐鎖又は樹木状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えばカルボン酸基又はアミノ基が化学的に結合している、ポリビニルアルコール及びポリキシリトール、並びにガングリオシドＧＭ１のようなガングリオシドが含まれる。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ若しくはメトキシＰＰＧ又はそれらの誘導体も適している。加えて、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーでありうる。オプソニン作用阻害ポリマーは、また、アミノ酸若しくはカルボン酸を含有する天然の多糖類、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖類若しくはオリゴ糖類（直鎖若しくは分岐鎖）；又は例えばカルボン酸基の結合をもたらす炭酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖類若しくはオリゴ糖類でありうる。好ましくは、オプソニン作用阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はそれらの誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、時々、「ペグ化リポソーム」と呼ばれる。
【０１３６】
オプソニン作用阻害部分を、多数の周知技術のいずれか１つによりリポソーム膜に結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合し、次に膜に結合することができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３及び比率が３０：１２のテトラヒドロフランと水のような溶媒混合物を６０℃で使用する還元的アミノ化を介して、ステアリルアミン脂溶性アンカーにより誘導体化することができる。
【０１３７】
オプソニン作用阻害部分で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームよりかなり長時間循環に留まる。このために、そのようなリポソームは、時々、「ステルス」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性」微小血管系により栄養を受け取る組織に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系の欠損、例えば固形腫瘍により特徴付けられる組織は、これらのリポソームを効率的に蓄積する（例えば、Ｇａｂｉｚｏｎら、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A）１８（１９８８年）、６９４９〜６９５３頁を参照すること）。加えて、ＲＥＳにより低減された取り込みは、肝臓及び脾臓におけるリポソームの有意な蓄積を防止することによってステルスリポソームの毒性を低下する。したがって、オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はこれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１３８】
ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を、これらを被験者に投与する前に当該技術において既知の技術によって、時々「薬剤」と呼ばれる医薬組成物として処方することができる。したがって、本発明は、腫瘍を治療する医薬組成物を包含する。一つの実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの単離ｍｉＲ発現阻害化合物を含む。特定の実施態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、対照細胞よりも腫瘍細胞においてその発現が大きいｍｉＲ遺伝子に特異的である。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌であり発熱物質を含まないことが特徴である。本明細書で使用されるとき、「医薬製剤」には、ヒト及び獣医学的用途のための製剤が含まれる。本発明の医薬組成物を調製する方法は、当該技術の技能の範囲内であり、例えば、レミントン薬学（Remington’s Pharmaceutical Science）、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８５年）及びフィラデルフィア科学大学（University of Sciences in Philadelphia）による最新版レミントン：薬剤学の科学及び実施（Remington:The Science and Practice of Pharmacy）（２０００年）ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２に記載されており、両方の文書の開示は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
本発明の医薬製剤は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（若しくはこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）（例えば、０．１〜９０重量％）又はその生理学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体と混合して含む。本発明の医薬組成物は、リポソームに封入されている少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）及び薬学的に許容される担体を含むこともできる。
【０１４１】
特に適切な薬学的に許容される担体は、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【０１４２】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に耐性がある少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含む。当業者は、例えば、２′位で修飾されている１つ以上のリボヌクレオチドをｍｉＲに組み込むことにより、ヌクレアーゼ耐性である核酸を容易に合成することができる。適切な２′修飾リボヌクレオチドには、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及び０−アリルで２′位が修飾されているものが含まれる。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬賦形剤及び／又は添加剤を含むこともできる。適切な医薬賦形剤には、安定剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、例えば、生理学的に生体適合性のある緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キーラント（例えばＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ビスアミド）若しくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加又は場合によりカルシウム若しくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム若しくは乳酸カルシウム）の添加が含まれる。本発明の医薬組成物を、液体で使用するために包装することができる又は凍結乾燥することができる。
【０１４４】
本発明の固体医薬製剤では、従来の非毒性で固体の薬学的に許容される担体を使用することができ、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどである。
【０１４５】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記に提示された担体及び賦形剤のいずれか、並びに１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含むことができる。エアゾール（吸入）投与用の医薬組成物は、０．０１〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の、上記に記載されたリポソームで封入されている少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）及び噴射剤を含むことができる。望ましい場合には担体も含めることができ、例えば、経鼻送達用のレシチンである。
【０１４６】
本発明は、抗腫瘍剤を同定する方法であって、試験剤を細胞に提供すること及び細胞における少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含む方法も包含する。一つの実施態様において、方法は、試験剤を細胞に提供すること及び腫瘍細胞における発現の増加に関連する少なくとも１つのｍｉＲのレベルを測定することを含む。適切な対照細胞と比べた、細胞におけるｍｉＲのレベルの減少は、試験剤が抗腫瘍剤であることを示す。
【０１４７】
適切な作用物質には、薬剤（例えば、小型分子、ペプチド）及び生物巨大分子（例えば、タンパク質、核酸）が含まれるが、これらに限定されない。作用物質を、組み換え的、合成的に産生することができる又は天然の供給源から単離（すなわち精製）することができる。そのような作用物質を細胞に提供する多様な方法（例えば、形質移入）は、当該技術において良く知られており、そのような方法の幾つかが本明細書上記に記載されている。少なくとも１つのｍｉＲの発現を検出する方法（例えば、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）も、当該技術において良く知られている。
【０１４８】
これら及び他の実施態様は、本発明の記載及び実施例に開示及び包含されている。本発明に用いられる材料、方法、使用及び化合物のいずれかに関する更なる文献は、例えば電子装置を使用して公共の図書館及びデータベースから検索することができる。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）及び／又は国立衛生研究所（National Institutes of Health）の国立医学図書館（National Library of Medicine）が主催する公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。更なるデータベース及びウェブアドレス、例えば欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である欧州バイオフィンフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）（ＥＢＩ）のものが当業者には知られており、インターネットの検索エンジンを使用して得ることもできる。バイオテクノロジーについての特許情報の概説、並びに遡及検索及び最新知識に有用な特許情報の関連供給源の調査は、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４年）、３５２〜３６４頁に提示されている。
【０１４９】
上記の開示は、本発明を一般的に記載する。特に記述のない限り、本明細書において使用される用語は、オックスフォード生化学及び分子生物学辞典（Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ０１９８５０６７３２において提示された定義を示す。幾つかの文書は、本明細書の文章の全体にわたって引用されている。引用された全ての参考文献（本出願の全体にわたって引用された参考文献、発行された特許、公開された特許出願及び製造会社の仕様書、説明書などが含まれる）の内容は、参照として本明細書に明確に組み込まれるが、引用されたいずれかの文書を本発明の従来技術として認めるということは全くない。
【０１５０】
より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照して得ることができ、これは例示のみの目的で本明細書において提示され、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１５１】
実施例
以下の実施例は、本発明を更に例示するが、本発明の範囲をいかようにも制限するものとして考慮されるべきではない。本明細書に用いられるもののような従来の方法の詳細な記載は、引用文献において見出すことができる（「診断及び治療のメルクマニュアル」（“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”）第１７版、Ｂｅｅｒｓ及びＢｅｒｋｏｗ編（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．２００３年）も参照すること）。本発明の実施は、特に指示のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技術を用い、それらは当該技術の技能の範囲内である。
【０１５２】
分子遺伝子技術及び遺伝子技術の方法は、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＤＮＡクローニング（DNA Cloning）、第Ｉ及びＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）（Ｇａｉｔ編、１９８４年）；核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；転写及び翻訳（Transcription And Translation）（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；動物細胞の培養（Culture Of Animal Cells）（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ及びＡｌａｎ、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７年）；哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ編）；分子生物学の現行プロトコール及び分子生物学のショートプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology）、第３版（Ａｕｓｕｂｅｌら編）；組み換えＤＮＡ方法論（Recombinant DNA Methodology）（Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；酵素学における方法（Methods In Enzymology）、第１５４及び１５５巻（Ｗｕら編）；固定細胞及び酵素（Immobilized Cells And Enzymes）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ、分子クローニングの実践的指針（A Practical Guide To Molecular Cloning）（１９８４年）；論文、酵素学における方法（the treatise, Methods In Enzymology）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；細胞における免疫科学法及び分子生物学（Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology）（Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；実験免疫学のハンドブック（Handbook Of Experimental Immunology）、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｗｅｉｒ及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）の最新号において一般的に記載されている。本開示において参照される試薬、クローニングベクター及び遺伝子操作用のキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＣｌｏｎＴｅｃｈのような商業的供給者から入手可能である。細胞培養及び培地採取についての一般的技術は、大規模哺乳類細胞培養（Large Scale Mammalian Cell Culture）（Ｈｕら、バイオテクノロジーにおける最新見解（Curr. Opin. Biotechnol.）８（１９９７年）、１４８頁）；血清無含有培地（Serum-free Media）（Ｋｉｔａｎｏ、バイオテクノロジー（Biotechnology）１７（１９９１年）、７３頁）；大規模哺乳類細胞培養（バイオテクノロジーにおける最新見解２（１９９１年）、３７５頁）及び哺乳類細胞の懸濁培養（Suspension Culture of Mammalian Cells）（Ｂｉｒｃｈら、バイオプロセス技術（Bioprocess Technol.）１９（１９９０年）、２５１頁）；ｃＤＮＡアレイから情報を抽出する（Extracting information from cDNA arrays）、Ｈｅｒｚｅｌら、ＣＨＡＯＳ  １１（２００１年）、９８〜１０７頁において概説されている。
【０１５３】
補足材料及び方法
本明細書に用いられるもののような従来の方法についての詳細な記載は、引用文献において見出すことができる。
【０１５４】
組織及び細胞株
全ての試料は、Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓｔｉｆｔ，Ｂｒｅｍｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）の一般及び内臓外科（Department of General and Visceral Surgery）で甲状腺切除術を受けている患者から得た。計画の認可は、地方論理委員会から得て、ヘルシンキ宣言（第２５章）に概説されたヒト被験者に関わる医療研究の原則に従った。各腫瘍から１片を細胞培養のためにハンクス液に保存し、第２片を遺伝子発現研究のために液体窒素に保存した。細胞株を甲状腺腺腫細胞から以前に報告されたように誘導した（Ｂｅｌｇｅら、細胞生物学ジャーナル国際版（J. Cell Biol. Int. Rep.）１６、（１９９２年）３３９〜３４７頁）。胎児、胎盤及び精巣組織からの保存ＲＮＡを対照として使用した。
【０１５５】
細胞培養及び細胞遺伝学的分析
組織消化、原発性細胞株の培養及び細胞遺伝学的分析を、以前に記載された方法に従って実施した（Ｂｅｌｇｅら、癌、遺伝学、細胞遺伝学（Cancer Genet. Cytogenet.）１０１（１９９８年）、４２〜４８頁；Ｒｏｑｕｅら、癌、遺伝学、細胞遺伝学６７（１９９３年）、１〜６頁）。消化の前に、各試料をスライドと接触させて、ＦＩＳＨスクリーニング用の試料を得た。
【０１５６】
ＲＮＡの単離、逆転写及びリアルタイムＰＣＲ定量化（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）試薬又はｍｉｒＶａｎａ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｗｏｏｄｗａｒｄ、ＵＳＡ）ｍｉＲＮＡ単離キットを製造会社の説明書に従って使用して、組織から、並びに固定細胞株から抽出した。ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３及びｍｉＲ−５２０ｃ）及びＲＮＵ６Ｂ（ＲＮＡ、Ｕ６核内低分子２；相対的定量化用の内部対照）特異的ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ  ＡｓｓａｙｓからのＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ  ＲＴ  Ｋｉｔ及び遺伝子特異的ＲＴプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造会社の説明書に従って使用して、１０ｎｇの全ＲＮＡから生成した。反応を、サーマルサイクラーにより、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次に４℃で保存した。全ての逆転写は、テンプレートのない対照及びマイナスＲＴ対照（−ＲＴ）を含んだ。リアルタイムＰＣＲは、ｍｉＲＮＡ及びＲＮＵ６Ｂ特異的プローブ、並びにＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。反応を、９６ウエルプレートにおいて、９５で１０分間、続いて９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の４０サイクルによりインキュベートした。全ての反応を３重に実施した。相対的定量化（ＲＱ）は、ＲＱ＝２＿ＤＤＣｔ  ２（−Ｄｅｌｔａ  Ｄｅｌｔａ  Ｃ（Ｔ））法（Ｌｉｖａｋら、方法（Methods）２５（２００１年）、４０２〜４０８頁）に基づいたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳソフトウエアを使用して計算した。Ｃｔデータを内部対照ＲＮＵ６Ｂに規準化した（Ｙｕら、癌細胞（Cancer Cell）１３（２００８年）、４８〜５７頁）。
【０１５７】
３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲを介した融合転写物の検出
３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲを細胞株Ｓ４０．２で実施した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をアンカープライマーとして使用し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素についての説明書に従って僅かな修飾により実施した。３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及びネステッド３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲを、条件をＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に適合させ、Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に記載されたように実施した。サザンブロットを、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識されたＰＵＭ１特異的プローブ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｆｅｈｒらにより記述されたとおりに実施した（Ｆｅｈｒら、癌、遺伝学、細胞遺伝学ジャーナル（J. Cancer Genet. Cytogenet.）１８０（２００８年）、１３５〜１３９頁）。目的のフラグメントを切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で抽出し、次にｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローンした。目的のクローンからプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により単離し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで配列決定した。
【０１５８】
３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲを介した融合転写物の検出用プライマー
ＰＵＭ１特異的プライマー（プライマー（エクソン）配列（５′−３′））：
Ｅｘ１＿Ｕｐ（エクソン２）  ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡ
Ｅｘ３＿Ｕｐ（エクソン４）  ＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧＡ
Ｅｘ４＿Ｕｐ（エクソン５）  ＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴ
Ｅｘ５＿Ｌｏ（エクソン６）  ＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＡ
Ｅｘ７＿Ｕｐ（エクソン８）  ＡＣＣＴＡＡＴＧＣＧＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡ
Ｅｘ８＿Ｕｐ（エクソン９）  ＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＣ
Ｅｘ９＿Ｕｐ（エクソン１０）  ＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧ
【０１５９】
ｃＤＮＡ合成用プライマー（プライマー配列（５′−３′））：
ＡＰ２  ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣ（Ｔ）１７
オリゴｄＴ  ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ（Ｔ）２４
【０１６０】
３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用プライマー（プライマー配列（５′−３′））：
ＵＡＰ２  ＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣ
Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ３′  ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ
Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ３′ネステッド  ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ
【０１６１】
ＰＣＲにより生成されたサザンブロット用ＰＵＭ１特異的プローブ：
１．プライマーＥｘ４＿ＵｐとＥｘ５＿Ｌｏの間の配列
２．プライマーＥｘ３＿ＵｐとＥｘ５＿Ｌｏの間の配列
【０１６２】
プライマー：
Ｅｘ３＿Ｕｐ（エクソン４）＝ＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧＡ
Ｅｘ４＿Ｕｐ（エクソン５）＝ＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴ
Ｅｘ５＿Ｌｏ（エクソン６）＝ＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＡ
【０１６３】
ＲＴ−ＰＣＲを介した融合転写物の検出
ｐｏｌｙａｄｑプログラム（Ｔａｂａｓｋａら、遺伝子（Gene）２３１（１９９９年）、７７〜８６頁）を用いて、Ｃ１９ＭＣクラスターにおける可能なポリＡ部位を検出した。すぐ近くにプライマーを設計し、これを後にＰＵＭ１特異的プライマーと一緒に使用した。Ｓ４０．２の全ＲＮＡを、以前に記載されたｃＤＮＡ合成に使用されるＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して単離した。ＰＣＲを、ＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、続いてセミネステッドＰＣＲにより実施した。目的のフラグメントを切除し、上記に記載されたように抽出し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで配列決定した。
【０１６４】
ＲＴ−ＰＣＲを介した融合転写物の検出用プライマー
ＰＵＭ１−プライマー：Ｅｘ８＿Ｕｐ  ＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＣ
ＰＵＭ１−プライマー：Ｅｘ９＿Ｕｐ  ＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧ
＃１９−プライマー：５００−クラスター＿ポリＡ＿Ｉ  ＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡ
【０１６５】
融合転写物の確認
前の結果を、融合転写物内に局在化した異なるプライマーを使用して確認した。ＰＣＲを上記に記載されたように実施した。目的の大きさのフラグメントを切除し、抽出し、配列決定した（上記を参照すること）。
【０１６６】
融合転写物の確認用プライマー
＃１９−プライマー：１９＿１  ＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＴＧＣＴ
＃１９−プライマー：１９＿２  ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴ
＃１９−プライマー：１９＿３  ＣＴＡＧＧＧＴＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＴＧＣ
ＰＵＭ１−プライマー：Ｅｘ８＿Ｕｐ  ＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＣ
ＰＵＭ１−プライマー：Ｅｘ９＿Ｕｐ  ＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧ
【０１６７】
ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ及びｍｉＲ−５１９ａ用のｍｉＲＮＡ特異的プライマーを、Ｃｈｅｎらにより記載されたように設計した（Ｃｈｅｎら、核酸研究（Nucleic Acids Res.）３３（２００５年）、ｅ１７９）。ｃＤＮＡを、Ｃｈｅｎら（２００５年）上記に従うが、ステムループプライマー濃度（５ｎＭ）における小さな変更、並びにアニーリング温度（６８℃）及び持続時間（１０秒間）を変更したＰＣＲ反応を伴って、１μｇの全ＲＮＡから生成した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により実施した。伸長を７２℃で１５秒間実施した。
【０１６８】
ｍｉＲＮＡ特異的プライマー
ｍｉＲ−３７１−５ｐループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＴＣ
ｍｉＲ−３７１−５ｐループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＧＴＧＣＣ
ｍｉＲ−３７２ループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＧＣＴＣ
ｍｉＲ−３７３ループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＣＣ
ｍｉＲ−５１２−５ｐループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＡＧＴ
ｍｉＲ−５１７ａループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＴＣ
ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＣＣＴＣ
ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐループプライマー
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＡ
ｍｉＲ−３７１−３ｐ順方向  ＡＣＣＧＣＴＡＡＧＴＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧ  
ｍｉＲ−３７１−５ｐ順方向    ＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＧＧ
ｍｉＲ−３７２順方向  ＧＧＴＣＡＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＴＴＴＧ  
ｍｉＲ−３７３順方向  ＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧ
ｍｉＲ−５１２−５ｐ順方向  ＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡ
ｍｉＲ−５１７ａ順方向  ＣＧＧＣＧＧＡＴＣＧＴＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＡ
ｍｉＲ−５１９ａ順方向  ＣＣＧＧＣＴＡＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧ
ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ順方向  ＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＴＡＧ
ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐ順方向  ＡＣＣＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＣ
逆方向プライマー  ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ
【０１６９】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
Ｉ−ＦＩＳＨ分析を甲状腺腫瘍の接触調製物（touch-preparation）により実施した。１９ｑ１３．４再編成の検出のために、ｔｂｐｃ１９（甲状腺切断点クラスター１９ｑ１３）と呼ばれる二重色分裂再編成プローブ（dual-color, break-apart rearrangement probe）（ＰａｎＰａｔｈ、Ｂｕｄｅｌ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した。再編成プローブは、良性甲状腺病巣における１９ｑ１３．４の共通切断点クラスターの遠位（３′−ｔｂｐｃ１９；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識されている）及び近位（５′−ｔｂｐｃ１９；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５で標識されている）にそれぞれ位置する２つのプローブの混合物である。１枚のスライドにつき１０μｌの分裂プローブを使用した。同時変性を、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ勾配（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により８０℃で３分間実施し、続いて加湿チャンバによりハイブリダイゼーションに３７℃で一晩付した。後ハイブリダイゼーションを、０．１×ＳＳＣにより６１℃で５分間実施した。中間期核をＤＡＰＩ（０．７５μｇ／ｍｌ）で対比染色した。スライドを、Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２＋蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査した。画像をＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍデジタルカメラにより撮り、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で編集した。それぞれの場合において、重複していない２００個の核をスコア付けした。共存シグナル（緑色／赤色）は、非再編成切断点領域を示し、一方、別々の緑色と赤色のシグナルは、染色体領域１９ｑ１３．４の再編成を示す。Ｓ８４２のｔｂｐｃ−１９における中期ＦＩＳＨを、接触調製物のＩ−ＦＩＳＨについて上記に記載されたとおりに実施した。中期の処置をＫｉｅｖｉｔｓらにより記載されたように実施した（Ｋｉｅｖｉｔｓら、血球計算（Cytometry）１１（１９９０年）１０５〜１０９頁）。染色体１の切断点の決定では、ＦＩＳＨを細胞株Ｓ４０．２の中期調製物に対して実施した。プローブとして、両方ともＰＵＭ１の全ゲノム配列に及んでいる２つの重複クローンＲＰ１１−１１３６Ｅ４（ＡＱ７０７６２６及びＡＱ７３３８６４）とＲＰ１１−２０１Ｏ１４（ＡＬ３５６３２０．８）（ｉｍａＧｅｎｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。ＤＮＡを、  Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。１μｇの単離プラスミドＤＮＡを、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ＲＰ１１−２０１Ｏ１４）又はビオチン−１６−ｄＵＴＰ（ＲＰ１１−１１３６Ｅ４）のいずれかを用いて、ニック翻訳（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により標識した。中期の処置、続くＦＩＳＨ実験を、上記に記載されたように実施した同時変性及び後ハイブリダイゼーションを除いてＫｉｅｖｉｔｓら（１９９０年）上記により以前に記載されたとおりに実施した。
【０１７０】
染色体１９プローブ
【数１】
2013502906.tif 000018
【０１７１】
ＰＡＣ１３１７３は、ＢＡＣクローンのＡＣ０１１４５３．４及びＡＣ０１１４８７．５に対応する。
【０１７２】
統計分析
結果を平均±標準偏差（ＳＥ）として表す。統計比較を、非対応スチューデントｔ検定により実施した。０．０５未満のｐ値を有意であると考慮した。
【０１７３】
実施例１：シリカ分析は甲状腺腫瘍における１９ｑ１３．４切断点クラスターに対してＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３が極めて近接していることを明らかにする
クローン細胞遺伝学的異常を有する甲状腺腫瘍の約２０％が、遺伝子バンド１９ｑ１３を伴う異常を示す（Ｂｅｌｇｅ，Ｇ．ら、癌、遺伝学、細胞遺伝学（Cancer Genet. Cytogenet.）１０１（１９９８年）４２〜４８頁）。今まで、位置クローニング及びシリカ分析によって、切断点は、２つのｍｉＲＮクラスター、すなわちＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３をコードする遺伝子に極めて近接して位置している１５０ｋｂ（キロベース）のセグメント内のクラスターにおいて見出されている（Ｂｅｌｇｅら、細胞遺伝学（Cytogenet. Cell Genet.）９３（２００１年）、４８〜５１頁）（図４）。４６の縦列反復霊長類特異的ｍｉＲＮＡ遺伝子を有する１００ｋｂの長さのＣ１９ＭＣクラスターは、全ての既知のヒトｍｉＲＮＡ遺伝子の約８％を占め、現在まで発見された最大のヒトｍｉＲＮＡ遺伝子クラスターである（Ｂｏｒｔｏｌｉｎ−Ｃａｖａｉｌｌｅら、核酸研究（Nucleic Acids Res.）３７（２００９年）、３４６４〜３４７３頁）。Ｒｅｎら（Ｒｅｎら、トランスレーショナル医療ジャーナル（ J. Transl. Med.）７（２００９年）、２０頁）は、このクラスターに４，６９１個の標的を予測した。最近の証拠は、ｍｉＲＮＡが、主に胎盤に発現している非タンパク質コードＰｏＩ−ＩＩ転写物のイントロンによりコードされることを示唆している（Ｂｏｒｔｏｌｉｎ−Ｃａｖａｉｌｌｅら、（２００９年）上記）。その大型クラスターと対照的に、ｍｉＲ−３７１−３クラスターは、５つのｍｉＲＮＡがコードされる、およそ１，０５０ｂｐのかなり小さな領域の範囲である。両方のクラスターのｍｉＲＮＡは、同様のシード配列を共有する大型ｍｉＲＮＡファミリーに属する（Ｌａｕｒｅｎｔら、幹細胞（Stem Cells）２６（２００８年）、１５０６〜１５１６頁）。注目すべきは、近年、幾つかの群が、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）においてｍｉＲＮＡの特徴的な性質を有するＣ１９ＭＣとｍｉＲ−３７１−３のクラスターのメンバーの発現に関連付けられている（Ｒｅｎら、（２００９年）上記；Ｌａｕｒｅｎｔら、（２００８年）上記；Ｌｉら、細胞生化学ジャーナル（J. Cell. Biochem.）１０６（２００９年）、１０２０〜１０３０頁）。ｍｉＲー３７３の腫瘍形成の可能性についての最初の証拠は、ヒト精巣生殖細胞腫瘍において得られ、それは野生型ｐ５３の存在下で腫瘍発生性増殖を可能にすることを示した（Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅら、細胞（Cell）１２４（２００６年）、１１６９〜１１８１頁）。前立腺腫瘍において、ｍｉＲ−３７３及びｍｉＲ−５２０ｃは、下方制御されていることが見出されたが、両方とも、インビトロで移動及び浸襲を刺激した（Ｙａｎｇら、臨床及び実験病理学国際ジャーナル（Int. J. Clin. Exp. Pathol.）２（２００９年）、３６１〜３６９頁）。最近、Ｈｕａｎｇら（Ｈｕａｎｇら、ネイチャー細胞生物学（Nat. Cell Biol.）１０（２００８年）、２０２〜１２０頁）は、ｍｉＲ−３７３及びｍｉＲ−５２０ｃが、ＣＤ４４の抑制によってインビボ及びインビトロで腫瘍浸襲及び転移を促進することを実証することができた。興味深いことに、ＣＤ４４発現の定常的及び定量的変化は、甲状腺腫瘍の増殖及び予後に関与していた。浸襲挙動が甲状腺腫瘍の異なる診断において極めて重要な意味があるので、実験は、甲���腺腺腫における両方のｍｉＲＮＡクラスターの可能な上方制御についての疑問に答えるように実施した。
【０１７４】
実施例２：１９ｑ１３異常を有する腺腫はその転座のないものよりも有意に高いレベルのＣ１９ＭＣクラスターのメンバーを発現する
甲状腺腺腫における１９ｑ１３転座の可能な標的としての２つクラスターのうちのいずれかの役割を評価するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１９ｑ１３再編成を有する甲状腺腺腫の確立された５つの細胞株及び他のクローン異常を有する腺腫の３つの細胞株において、Ｃ１９ＭＣクラスターの３つのメンバー、すなわちｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ及びｍｉＲ−５１９ａの発現を比較した（表２を参照すること）。
【０１７５】
【表２−１】
2013502906.tif 000019
【０１７６】
【表２−２】
2013502906.tif 000020
【０１７７】
濾胞性甲状腺腫瘍の分析した試料及び遺伝子のサブグループと共に使用した細胞株についての細胞遺伝学的詳細は、従来の細胞遺伝学により及び／又は分裂二重色再編成プローブ（ｔｂｐｃ−１９）による中期蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（Ｉ−ＦＩＳＨ）により決定した。元の腫瘍にだけクローン異常が見出された細胞株の場合では、それから確立された細胞株が提示されている。
【０１７８】
全ての細胞株を、ＳＶ４０誘導サブゲノムフラグメントを使用して原発性腫瘍から確立した。１９ｑ１３再編成を有する５つの細胞株のうち４つは、３つのｍｉＲＮＡの検出可能なレベルを発現したが、残りの細胞株（Ｓ１２１，表２）及び他の異常を有する全ての細胞株では、３つのｍｉＲＮＡのいずれの発現も示されなかった（図４）。これらの細胞株を使用して、Ｃ１９ＭＣクラスターの別のメンバー、すなわちｍｉＲ−５２０ｃの発現をリアルタイムＰＣＲにより定量化（ｑＲＴ−ＰＣＲ）した。このクラスターの他のメンバーから得た結果と類似して、高い発現が、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ及びｍｉＲ−５１９ａを発現する、１９ｑ１３再編成を有する同じ４つの細胞株にだけ示されたが（図５ａ）、有意に低い発現が、残りの細胞株において見られた（ｐ値＝０．００１６５９；詳細は表３を参照すること）。
【０１７９】
【表３】
2013502906.tif 000021
【０１８０】
１９ｑ１３再編成を含有する組織又は細胞株におけるクラスターＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３のｍｉＲＮＡの発現についての統計分析（ｔ−検定、両側）を、１９ｑ１３再編成を有さない正常な甲状腺組織及び／又は腺腫と比較した。データは統計ソフトウエアＲ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して得た。（ｄ．ｆ．＝自由度、ｔ＝スチューデントｔ値）。
【０１８１】
おそらく、細胞株Ｓ１２１におけるＣ１９ＭＣクラスターの全ての検査メンバーの顕著に低い発現は、染色体転座によりもたらされる切断点領域の一部の欠失によってもたらされうる。同等の結果が原発性腫瘍からも得ることができるかを見るために、７０個の甲状腺結節を、細胞培養前に得た細胞学的試料における中期蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（Ｉ−ＦＩＳＨ）によって特徴決定した。結果を、通常は従来の細胞遺伝学により補足した。結節のＦＩＳＨスクリーニングは、染色体バンド１９ｑ１３のクローン再編成を有する５つの腫瘍を検出した（図５）。１９ｑ１３再編成を有する全ての甲状腺結節は、１９ｑ１３再編成を有さない試料（腺腫及び周囲の甲状腺組織；詳細は表３を参照すること）よりも有意に高いレベル（ｐ値≦０．００３１３３）のｍｉＲ−５２０を発現することを示すことができた（図５ｂ）。
【０１８２】
実施例３：１９ｑ１３異常を有する腺腫はその転座のないものよりも有意に高いレベルのｍｉＲ−３７１−３クラスターのメンバーを発現する
１９ｑ１３再編成がｍｉＲ−３７１−３クラスターの発現も活性化するかを見るために、このクラスターの３つのメンバーの発現を、前に使用した同じ試料において定量化した。１９ｑ１３再編成を有する全ての腫瘍は、周囲の組織学的に正常な甲状腺組織（ｐ値≦０，０２２３６）の３つの試料及び細胞遺伝学的に正常な腺腫（ｐ値≦０．０１４２８）よりも有意に高いレベルのｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３を発現することを示した（図５ｃ）。次にｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３の発現を細胞株で定量化して、同等の結果を得た（図５ｄ）。興味深いことに、Ｃ１９ＭＣクラスターメンバーの発現が不在又は非常に低い細胞株Ｓ１２１は、ｍｉＲ−３７１−３クラスターの非常に高い発現を示し、したがって、この細胞株ではＣ１９ＭＣクラスターの一部が欠失しているという概念が更に強化された。
【０１８３】
実施例４：プミリオホモログ１（ＰＵＭ１）遺伝子の近位部分の転座がＣ１９ＭＣ及ｍｉＲ−３７１−３クラスターを活性化する
ｍｉＲＮＡクラスターの活性化に関与する機構を更に理解するために、１９ｑ１３群のうちの１つの細胞株を更に詳細に調査した。この細胞株は、明らかな平衡転座ｔ（１；１９）（１ｐ３５．２；ｑ１３．４）によりもたらされた染色体バンド１９ｑ１３の再編成を示す（図６）。適切なＢＡＣ（細菌人工染色体）プローブによって、染色体１の切断点が、プミリオホモログ１（ＰＵＭ１）内の領域まで絞られた（図７オンライン）。ＰＵＭ１はＲＮＡ結合タンパク質をコードし、成人組織において広範囲の発現を示す。２２個のエクソンを有し、染色体バンド１ｑ３５．２において約１５０ｋｂに及んでいる（Ｓｐａｓｓｏｖ及びＪｕｒｅｃｉｃ、遺伝子（Gene）２９９（２００２年）、１９５〜２０４頁；Ｓｚａｂｏら、ゲノム生物学（Genome Biol.）５（２００４年）、Ｒ５９）。転座によって、ＰＵＭ１の近位部分はｍｉＲＮＡクラスターと並列になる（図６）。したがって、３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲを使用して、ＰＵＭ１の近位部分と染色体１９の配列との間の可能性のある融合転写物を検出した。最初に、ＰＵＭ１のエクソン１−１０、続く染色体１９の切断点領域の異所性配列からなる融合転写物を検出することが可能であった（ジェンバンクＧＱ３３４６８７に提出した）。この転写物の存在から、この細胞株における染色体切断は、ＰＵＭ１のイントロン１０内に位置することを結論付けることができた。したがって、ＲＴ−ＰＣＲ実験は、エクソン１０内の配列を順方向プライマー（プライマー：Ｅｘ９＿Ｕｐ（ＰＵＭ１のエクソン１０）ＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧ及びＣ１９ＭＣの後のプライマー：５００−クラスター＿ポリＡ＿Ｉ  ＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡ）として使用して実施し、それによって、境界がＣ１９ＭＣの遠位境界から明確に伸びている１つの融合転写物の一部を検出することが可能であった（ジェンバンク受入番号ＧＱ３３４６８８；図６）。これらの結果から、細胞株Ｓ４０．２において、両方のクラスターが、ＰＵＭ１プロモーターにより誘導された大型ＰｏＩ−ＩＩ転写物の一部になったことを推定することが妥当であると思われる。異所性ＰｏＩ−ＩＩプロモーターによる活性化は、一般に、転座が両方のｍｉＲＮＡクラスターを活性化する機構であり、近年の研究の結果（Ｂｏｒｔｏｌｉｎ−Ｃａｖａｉｌｌｅら、核酸研究ジャーナル（J. Nucleic Acids Res.）３７、（２００９年）３４６４〜７３頁）のように、大型ＰｏＩ−ＩＩ誘導転写からのＣ１９ＭＣクラスターのｍｉＲＮＡの明確な「天然の」世代と一致する機構でありうる。
【０１８４】
実施例５：ｍｉＲクラスターの活性化に関連する遺伝子転座を伴う腫瘍
本明細書において実施された組織学的分析から、定義によると濾胞状癌の診断をもたらす、対応する腫瘍の浸襲性の証拠は見出されなかった。また、１９ｑ再編成を有さない腺腫と比較して、他の差は明確ではなかった。１９ｑ１３．４を伴う平衡転座も、子供の希な良性腫瘍様病巣である肝臓の間葉性過誤腫（mesenchymal hamartoma）（ＭＨＬ）に記載されており（Ｓｐｅｌｅｍａｎら、癌、遺伝学、細胞遺伝学（Cancer Genet. Cytogenet.）４０（１９８９年）、２９〜３２頁）、より一般的には、染色体バンド１９ｑ１３の切断は、多様なヒト新生物（例えば、小型細胞肺癌又は結腸癌）において報告されている。更に、ＣａｎｃｅｒＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ／Ｍｉｔｅｌｍａｎデータベース（ＮＣＢ）によると、染色体バンド１９ｑ１３は、まさに、ゲノムの染色体異常により最も頻繁に標的にされている領域に属する。したがって、これらのうちの幾つかが、まさに、本明細書において調査されるｍｉＲＮＡクラスターの２つのうちいのいずれか又は両方も標的にするかは、依然として決定されていない。しかし、甲状腺上皮内における、数千の潜在的な標的を有する２つの重要な「胚」ｍｉＲＮＡクラスターのクローン再発現は、甲状腺腺腫の大きなサブグループの発生に因果的に関連するという豊富な証拠が存在する。単一の標的を有するこれらのｍｉＲＮＡの個別の効果はヒト腫瘍と関連しているが、機械学的には、観察される効果は、対応するｍｉＲＮＡの単一標的の調節解除よりも遺伝子発現の網羅的変化によりもたらされる可能性が高い。
【０１８５】
したがって、本発明により実施される実験は、Ｃ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３クラスターのｍｉＲを、上皮腫瘍における高頻度の染色体再編成の標的遺伝子にする可能性が高い。更に、これは、共通の染色体再編成がｍｉＲＮＡ遺伝子又はｍｉＲＮＡクラスターそれぞれの活性化と相関する最初の証拠である。したがって、ｍｉＲ、特に切断点領域の近位に位置するｍｉＲクラスターに属するものが、そのような染色体再編成を伴う腫瘍の治療における重要な診断及び治療ツールを表すことを予測することは、賢明である。
【０１８６】
実施例６：腫瘍及び異なる腫瘍細胞株それぞれにおける２つの幹細胞マイクロＲＮＡ遺伝子クラスターＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３の発現
全ＲＮＡを、製造会社の説明書に従ってＱＩＡＧＥＮ  ｍｉＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞株及び腫瘍組織から単離した。
【０１８７】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５２０ｃ及びｍｉＲ−１０３）特異的ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ  ＡｓｓａｙｓからのＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ  ＲＴ  Ｋｉｔ及び遺伝子特異的ＲＴプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造会社の説明書に従って使用して、２００ｎｇの全ＲＮＡから生成した。ｍｉＲ−１０３は、相対的定量化のための内在性対照として機能した。反応を、サーマルサイクラーにより、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次に４℃で保存した。全ての逆転写は、テンプレートのない対照及びマイナスＲＴ対照（−ＲＴ）を含んだ。
【０１８８】
リアルタイムＰＣＲは、ｍｉＲＮＡ特異的プローブ及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。反応を、９６ウエルプレートにおいて、９５で１０分間、続いて９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の４０サイクルによりインキュベートした。全ての反応を３重に実施した。
【０１８９】
相対的定量化（ＲＱ）は、ＲＱ＝２−ΔΔＣｔ方法に基づいたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳソフトウエアを使用して計算した。Ｃｔ値を内部対照ｍｉＲ−１０３に規準化した。
【０１９０】
両方のクラスターのｍｉＲＮＡの相対的発現は、２つの甲状腺腺腫組織（１つは１９ｑ１３．４再編成を有さず（Ｓ９２５）、１つは１９ｑ１３．４再編成を有する（Ｓ９５８））、１９ｑ１３．４再編成を有する甲状腺腺腫から誘導した１つの細胞株（Ｓ４０．２）、並びに１０個の異なる腫瘍誘導細胞株（すべて１９ｑ１３．４再編成を有さず）においてｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。
【０１９１】
結果
結果を図８〜１１に示す。
【０１９２】
１９ｑ１３．４再編成を有する両方の試料（甲状腺腺腫組織Ｓ９５８及び甲状腺腺腫誘導細胞株Ｓ４０．２）は、両方のクラスターの測定した全てのｍｉＲＮＡにおいて高い発現レベルを示した。これらのｍｉＲＮＡの発現レベルは、子宮頸癌細胞株ＭＲＩＨ−２１５においても僅かに増加した。
【０１９３】
実施例７：絨毛膜絨毛試料採取により得た胎盤細胞の細胞培養における２つの幹細胞マイクロＲＮＡ遺伝子クラスターＣ１９ＭＣ及びｍｉＲ−３７１−３の発現
全ＲＮＡを、製造会社の説明書に従ってＱＩＡＧＥＮ  ｍｉＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、培養絨毛膜絨毛細胞から単離した。
【０１９４】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５２０ｃ及びｍｉＲ−１０３）特異的ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ  ＡｓｓａｙｓからのＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ  ＲＴ  Ｋｉｔ及び遺伝子特異的ＲＴプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造会社の説明書に従って使用して、２００ｎｇの全ＲＮＡから生成した。ｍｉＲ−１０３は、相対的定量化のための内在性対照として機能した。反応を、サーマルサイクラーにより、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次に４℃で保存した。全ての逆転写は、テンプレートのない対照及びマイナスＲＴ対照（−ＲＴ）を含んだ。
【０１９５】
リアルタイムＰＣＲは、ｍｉＲＮＡ特異的プローブ及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。反応を、９６ウエルプレートにおいて、９５で１０分間、続いて９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の４０サイクルによりインキュベートした。全ての反応を３重に実施した。相対的定量化（ＲＱ）は、ＲＱ＝２−ΔΔＣｔ方法に基づいたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳソフトウエアを使用して計算した。Ｃｔ値を内部対照ｍｉＲ−１０３に規準化した。
【０１９６】
両方のクラスターのｍｉＲＮＡの相対的発現は、２つの甲状腺腺腫組織（１つは１９ｑ１３．４再編成を有さず（Ｓ９２５）、１つは１９ｑ１３．４再編成を有する（Ｓ９５８））、１９ｑ１３．４再編成を有する甲状腺腺腫から誘導した１つの細胞株（Ｓ４０．２）、並びに８個の異なる培養絨毛膜絨毛（第１及び／又は２継代）においてｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。
【０１９７】
結果
結果を図１２〜１５に表す。
【０１９８】
１９ｑ１３．４再編成を有する両方の試料（甲状腺腺腫組織Ｓ９５８及び甲状腺腺腫誘導細胞株Ｓ４０．２）は、両方のクラスターの測定した全てのｍｉＲＮＡにおいて高い発現レベルを示した。
【０１９９】
クラスターｍｉＲ−３７１−３のｍｉＲＮＡの高発現レベルは、Ｆｉ９２を除いて全ての絨毛膜絨毛試料においても検出された。興味深いことに、この試料の細胞遺伝学的分析は、４５，Ｘ０核型を明らかにした（ターナー症候群）。
【０２００】
クラスターＣ１９ＭＣのｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現は、僅かに増加した発現レベルしか示さなかったＦｉ１５６及びＦｉ１６０（両方とも第１及び第２継代）を除いて、全ての絨毛膜絨毛試料において高かった。
【０２０１】
明細書、特許請求の範囲、配列リスト及び／又は図面において開示されている本発明の特徴は、別個及びその任意の組み合わせの両方が、種々の形態で本発明を実現する材料となりうる。
【図１】
2013502906.tif 000022
【図２Ａ】
2013502906.tif 000023
【図２Ｂ】
2013502906.tif 000024
【図２Ｃ】
2013502906.tif 000025
【図２Ｄ】
2013502906.tif 000026
【図３】
2013502906.tif 000027
【図４】
2013502906.tif 000028
【図５】
2013502906.tif 000029
【図６】
2013502906.tif 000030
【図７】
2013502906.tif 000031
【図８】
2013502906.tif 000032
【図９】
2013502906.tif 000033
【図１０】
2013502906.tif 000034
【図１１】
2013502906.tif 000035
【図１２】
2013502906.tif 000036
【図１３】
2013502906.tif 000037
【図１４】
2013502906.tif 000038
【図１５】
2013502906.tif 000039
【配列表】
2013502906000001.xml
【国際調査報告】
2013502906.tif 000084
2013502906.tif 000085
2013502906.tif 000086
2013502906.tif 000087