(57)【要約】本明細書において、原核細胞における対象のポリペプチドの発現のために有用であるプロポリペプチドを報告する。それ故、プロポリペプチドは、対象のポリペプチドのＮ末端に融合している。本明細書において報告したプロポリペプチドは、改善された発現収率を提供し、そして融合ポリペプチドの取り扱い（下流の処理、精製）を改善する。例えば、効率的なエンドトキシン除去が行なわれ、一方で、プロポリペプチドを含む対象のタンパク質は、例えばアフィニティクロマトグラフィー材料に結合している。その後、プロポリペプチドは、組み入れられたプロテアーゼ開裂部位によって同族プロテアーゼを用いて、対象のポリペプチドから効率的に切断され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  アミノ酸配列タグ、
−  以下にすぐに隣接した第２のジペプチドＧＳ、
−  酵素的開裂部位
を含む、プロポリペプチド。
【請求項２】
第１のジペプチドＧＳに対してＮ末端にある少なくとも２つのアミノ酸残基の長さのリーディングアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のプロポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  請求項１〜２のいずれか１項記載のプロポリペプチド、および
−  対象のポリペプチド
を含む融合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のプロポリペプチドのＮ末端のアミノ酸が、遊離α−アミノ基を有することを特徴とする、請求項３記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列タグが、配列番号１１または配列番号１５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
酵素的開裂部位が配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
第１のジペプチドＧＳに対してＮ末端にあるリーディングアミノ酸配列が、配列番号０１から０８から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
対象のポリペプチドが、抗体重鎖または軽鎖、抗体フラグメント、一本鎖抗体、アポリポタンパク質、アポリポタンパク質変異体、アポリポタンパク質融合体、インターフェロン、インターロイキン、インシュリン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター変異体、コロニー刺激因子、成長ホルモン、または骨形成タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
対象のポリペプチドが、配列番号４３、または配列番号４４、または配列番号４５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項３〜７のいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
以下の工程
ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  アミノ酸配列タグ、
−  以下にすぐに隣接した第２のジペプチドＧＳ、
−  酵素的開裂部位、および
−  対象のポリペプチド
を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を準備する工程
ｂ）細胞を培養する工程、
ｃ）細胞または培養培地から融合ポリペプチドを回収する工程
ｄ）融合ポリペプチドを精製する工程、
ｅ）融合ポリペプチドを酵素的に開裂し、それにより対象のポリペプチドを産生する工程
を含む、対象のポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１１】
融合ポリペプチドが、第１のジペプチドＧＳに対してＮ末端にある少なくとも２つのアミノ酸残基の長さのリーディングアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第１のジペプチドＧＳに対してＮ末端にあるリーディングアミノ酸配列が、配列番号０１から０８から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞が原核細胞であることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
アミノ酸配列タグが、配列番号１１または配列番号１５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
酵素的開裂部位が、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
対象のポリペプチドが、抗体重鎖または軽鎖、抗体フラグメント、一本鎖抗体、アポリポタンパク質、アポリポタンパク質変異体、アポリポタンパク質融合体、インターフェロン、インターロイキン、インシュリン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター変異体、コロニー刺激因子、成長ホルモン、または骨形成タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが、配列番号４３、または配列番号４４、または配列番号４５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
５’から３’の方向に、
−  ジペプチドＧＳをコードする核酸、
−  アミノ酸配列タグをコードする核酸、
−  以下にすぐに隣接したジペプチドＧＳをコードする核酸、
−  酵素的開裂部位をコードする核酸
を含む核酸を含むキット。
【請求項１９】
−  細胞を、グルコース、酵母抽出物、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニン、チアミンＨＣｌ、消泡剤を含む培地中で培養し、
−  細胞に、酵母抽出物、グリセロール、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含む第１フィード溶液を供給し、
−  細胞に、Ｌ−プロリンを含む第２フィード溶液を供給し、
−  水酸化カリウム溶液およびグルコース溶液をｐＨ制御のために使用する
ことを特徴とする、原核細胞の培養のための方法。
【請求項２０】
−  ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を、グルコース、酵母抽出物、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニン、チアミンＨＣｌ、消泡剤を含む培地中で培養し、
−  細胞に、酵母抽出物、グリセロール、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含むフィード溶液を最初に供給し、
−  細胞に、Ｌ−プロリンを含むフィード溶液を２番目に供給し、
−  水酸化カリウム溶液およびグルコース溶液をｐＨ制御のために使用し、
ポリペプチドを細胞または培養培地から回収し、これによりポリペプチドが産生されることを特徴とする、ポリペプチドの産生のための方法。
【請求項２１】
第１フィードの添加が、５７８nmにおいて決定された約１５の光学密度において開始され、第２フィードの添加が、５７８nmにおいて決定された約５０の光学密度において開始され、そしてポリペプチドの発現が、５７８nmにおいて決定された約９０の光学密度においてＩＰＴＧを用いて誘導されることを特徴とする、請求項１９〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
培地が、約８．８５ｇ/ｌのグルコース、約６３．５ｇ/ｌの酵母抽出物、約２．２ｇ/ｌのＮＨ４Ｃｌ、約１．９５ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約２．９ｇ/ｌのＬ−プロリン、約０．７５ｇ/ｌのＬ−メチオニン、約１７．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、約２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約２５．８mg/ｌのチアミンＨＣｌ、約１．０ml/ｌの１０％消泡剤を含むことを特徴とする、請求項１９および２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
第１フィード溶液が、約３３３ｇ/ｌの酵母抽出物、約３３３ｇ/ｌの８５％グリセロール、約１．７ｇ/ｌのＬ−メチオニン、および各々約５ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含むことを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
第２フィード溶液が、約６００ｇ/ｌのＬ−プロリンを含むことを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
ｐＨ調節のための塩基が、１０％（ｗ／ｖ）ＫＯＨ溶液であり、そして酸が、７５％グルコース溶液であることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
培養が、約２５℃においてであることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
培養が、約ｐＨ６．５から約ｐＨ６．９の間のｐＨにおいてであることを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
第１フィードが、７０ｇ/ｈの速度で開始されることを特徴とする、請求項１９〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
第２フィードが、１０ml/ｈの速度で開始されることを特徴とする、請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
溶存酸素値が、５０％超に保持されることを特徴とする、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
溶存酸素値が、撹拌速度、通気速度、および空気圧を平行して増加させることによって５０％超に保持されることを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
撹拌速度が、約５００rpmから約１５００rpmであることを特徴とする、請求項１９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
通気速度が、約１０リットル／分から約２０リットル／分であることを特徴とする、請求項１９〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
空気圧が約３００mbarから約５００mbarであることを特徴とする、請求項１９〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
原核細胞が、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であることを特徴とする、請求項１９〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドが、アポリポタンパク質Ａ１であることを特徴とする、請求項１９〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
アポリポタンパク質Ａ１が、テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質であることを特徴とする、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
約８．８５ｇ/ｌのグルコース、約６３．５ｇ/ｌの酵母抽出物、約２．２ｇ/ｌのＮＨ４Ｃｌ、約１．９５ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約２．９ｇ/ｌのＬ−プロリン、約０．７５ｇ/ｌのＬ−メチオニン、約１７．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、約２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約２５．８mg/ｌのチアミンＨＣｌ、約１．０ml/ｌの１０％消泡剤を含む、原核細胞のための培養培地。
【請求項３９】
前記培地がさらに、約３３３ｇ/ｌの酵母抽出物、約３３３ｇ/ｌの８５％グリセロール、約１．７ｇ/ｌのＬ−メチオニン、および各々約５ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含む第１フィードを含むことを特徴とする、請求項３８記載の培養培地。
【請求項４０】
前記培地がさらに、約６００ｇ/ｌのＬ−プロリンを含む第２フィード溶液を含むことを特徴とする、請求項３９記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、原核細胞におけるポリペプチドの産生のための発現構築物を報告する。発現構築物は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ジペプチドＧＳ、アミノ酸タグ、ジペプチドＧＳおよびプロテアーゼ開裂部位を含むプロポリペプチドを含む。
【０００２】
発明の背景
組換えポリペプチドの産生のための発現系は最新の当技術分野において周知であり、そして、例えばMarino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159によって記載されている。
【０００３】
薬学的適用に使用するための抗体および抗体融合体などのポリペプチドは、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などの哺乳動物細胞において一般的に産生される。真核生物発現プラスミドのエレメントは、一般的に、原核生物の複製起点および原核生物選択マーカーを含む、例えばＥ．ｃｏｌｉのための原核生物プラスミド増殖ユニット、真核生物選択マーカー、および対象の構造遺伝子（群）の発現のための１つ以上の発現カセット（各々、プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写終結因子を含む）である。哺乳動物細胞における一過性発現のために、哺乳動物の複製起点、例えばＳＶ４０ＯｒｉまたはＯｒｉＰを含めることができる。プロモーターとして構成性または誘導性プロモーターを選択することができる。最適化された転写のためにコザック配列を５’非翻訳領域に含め得る。ｍＲＮＡプロセシング、特にｍＲＮＡスプライシングおよび転写終結のために、構造遺伝子の構成（エキソン／イントロン構成）に依存して、ｍＲＮＡスプライシングシグナル並びにポリアデニル化シグナルを含め得る。
【０００４】
薬学的適用における使用のための他のポリペプチド、例えばインシュリン、インターフェロンα−２、ソマトトロピン、インターロイキン−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびレテプラーゼを、原核細胞、酵母、および主にＥ．ｃｏｌｉにおいて産生することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドのエレメントは、一般的に、複製起点、選択マーカー、および対象の構造遺伝子（群）の発現のための１つ以上の発現カセットである。発現カセットは一般的にプロモーター、構造遺伝子および転写終結因子を含む。プロモーターとして構成性または誘導性プロモーターを使用することができる。最適化された転写のために、ｍＲＮＡの開始コドンより先にシャイン・ダルガーノ配列またはその変異体を５’非翻訳領域に含め得る。
【０００５】
発明の要約
本明細書において、原核細胞における対象のポリペプチドの発現のために有用であるプロポリペプチドを報告する。それ故、プロポリペプチドは、対象のポリペプチドのＮ末端に融合している。本明細書において報告したプロポリペプチドは、改善された発現収率を提供し、そして融合ポリペプチドの取り扱い（下流の処理、精製）を改善する。例えば、効率的なエンドトキシン除去が行なわれ、一方で、プロポリペプチドを含む対象のタンパク質は、例えばアフィニティクロマトグラフィー材料に結合している。その後、プロポリペプチドは、組み入れられたプロテアーゼ開裂部位によって同族プロテアーゼを用いて、対象のポリペプチドから効率的に切断され得る。
【０００６】
本明細書において１つの局面として、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  アミノ酸配列ＧＳを有する第１のジペプチド、
−  アミノ酸配列タグ、
−  以下にすぐに隣接したアミノ酸配列ＧＳを有する第２のジペプチド
−  酵素的開裂部位
を含むプロポリペプチドを報告する。
【０００７】
１つの態様において、プロポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＳを有する第１のジペプチドに対してＮ末端にあるリーディングアミノ酸配列を含む。別の態様において、リーディングアミノ酸配列は、少なくとも２アミノ酸残基の長さを有し、最大でも２０アミノ酸残基の長さを有する。さらなる態様において、リーディングアミノ酸配列は少なくとも２アミノ酸残基の長さを有し、最大でも１０アミノ酸残基の長さを有する。また１つの態様において、リーディングアミノ酸配列は、配列番号１〜８から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。さらなる態様において、リーディングアミノ酸配列は、配列番号１〜６から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０００８】
１つの態様において、プロポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  リーディングアミノ酸配列、
−  アミノ酸配列ＧＳを有する第１のジペプチド、
−  アミノ酸配列タグ
−  以下にすぐに隣接したアミノ酸配列ＧＳを有する第２のジペプチド、
−  酵素的開裂部位
からなる。
【０００９】
本明細書において報告したさらなる局面は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  場合によりリーディングアミノ酸配列、
−  アミノ酸配列ＧＳを有する第１のジペプチド、
−  アミノ酸配列タグ、
−  以下にすぐに隣接したアミノ酸配列ＧＳを有する第２のジペプチド、
−  酵素的開裂部位、および
−  対象のタンパク質
を含む融合ポリペプチドである。
【００１０】
以前に報告されているような全ての局面の１つの態様において、アミノ酸配列タグは、配列番号９から配列番号２７から選択されたアミノ酸配列を有する。１つの態様において、アミノ酸配列タグは、配列番号１１または配列番号１５のアミノ酸配列を有する。別の態様において、酵素的開裂部位は、配列番号２８〜４２から選択されたアミノ酸配列を有する。さらなる態様において、対象のポリペプチドは、抗体重鎖または軽鎖、抗体フラグメント、一本鎖抗体、アポリポタンパク質、アポリポタンパク質変異体、アポリポタンパク質融合体、インターフェロン、インターロイキン、インシュリン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター変異体、コロニー刺激因子、成長ホルモン、骨形成タンパク質から選択される。１つの態様において、対象のポリペプチドは、配列番号４３または配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列を有する。１つの態様において、対象のポリペプチドは、本明細書において報告したプロポリペプチドとは異なるポリペプチドであり、すなわち、対象のポリペプチドは、アミノ酸配列タグに直接的に融合したアミノ酸配列ＧＳを有するジペプチドに対応するアミノ酸配列を含まない。１つの態様において、対象のポリペプチドのＮ末端におけるアミノ酸は、下流の処理の後に遊離α−アミノ基を有する。１つの態様において、プロポリペプチドおよび／または対象のポリペプチドはグリコシル化されていない。
【００１１】
本明細書において別の局面として、以下の工程
ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に
−  場合によりリーディングアミノ酸配列
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  アミノ酸配列タグ、
−  以下にすぐに隣接した第２のジペプチドＧＳ、
−  酵素的開裂部位、および
−  対象のポリペプチド
を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を準備する工程
ｂ）細胞を培養する工程、
ｃ）細胞または培養培地から融合ポリペプチドを回収する工程
ｄ）融合ポリペプチドを精製する工程、
ｅ）融合ポリペプチドを酵素的に開裂し、それにより対象のポリペプチドを産生する工程
を含む、対象のポリペプチドを産生するための方法を報告する。
【００１２】
１つの態様において、細胞は原核細胞である。別の態様において、細胞はエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞またはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。１つの態様において、アミノ酸配列タグは、配列番号９から配列番号２７から選択されたアミノ酸配列を有する。１つの態様において、アミノ酸配列タグは、配列番号１１または配列番号１５のアミノ酸配列を有する。別の態様において、酵素的開裂部位は、配列番号２８〜４２から選択されたアミノ酸配列を有する。また１つの態様において、さらなるポリペプチドは、抗体重鎖または軽鎖、抗体フラグメント、一本鎖抗体、アポリポタンパク質、アポリポタンパク質変異体、アポリポタンパク質融合体、インターフェロン、インターロイキン、インシュリン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター変異体、コロニー刺激因子、成長ホルモン、骨形成タンパク質から選択される。１つの態様において、対象のポリペプチドは、配列番号４３または配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列を有する。１つの態様において、対象のポリペプチドは、本明細書において報告したプロポリペプチドとは異なるポリペプチドであり、すなわち、さらなるポリペプチドは、アミノ酸配列タグに直接的に融合したアミノ酸配列ＧＳを有するジペプチドを含まない。
【００１３】
本明細書においてさらなる局面として、５’から３’の方向に、
−  アミノ酸配列ＧＳを有するジペプチドをコードする核酸、
−  アミノ酸配列タグをコードする核酸、
−  以下にすぐに隣接したアミノ酸配列ＧＳを有するジペプチドをコードする核酸、
−  酵素的開裂部位をコードする核酸
を含む核酸を含むパーツのキットを報告する。
【００１４】
本明細書において報告した１つの局面は、
−  細胞を、グルコース、酵母抽出物、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニン、チアミンＨＣｌ、消泡剤を含む培地中で培養し、
−  細胞に、酵母抽出物、グリセロール、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含む第１のフィード溶液を供給し、
−  細胞に、Ｌ−プロリンを含む第２のフィード溶液を供給し、
−  水酸化カリウム溶液およびグルコース溶液をｐＨ制御のために使用する
ことを特徴とする、原核細胞の培養のための方法である。
【００１５】
本明細書において報告した１つの局面は、
−  ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を、グルコース、酵母抽出物、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニン、チアミンＨＣｌ、消泡剤を含む培地中で培養し、
−  細胞に、酵母抽出物、グリセロール、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含むフィード溶液を最初に供給し、
−  細胞に、Ｌ−プロリンを含むフィード溶液を２番目に供給し、
−  水酸化カリウム溶液およびグルコース溶液をｐＨ制御のために使用し、
ポリペプチドを細胞からまたは培養培地から回収し、これによりポリペプチドが産生されることを特徴とする、ポリペプチドの産生のための方法である。
【００１６】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、第１フィードの添加は、５７８nmにおいて決定された約１５の光学密度において開始され、第２フィードの添加は５７８nmにおいて決定された約５０の光学密度において開始され、そしてポリペプチドの発現は、５７８nmにおいて決定された約９０の光学密度においてＩＰＴＧを用いて誘導される。
【００１７】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、培地は、約８．８５ｇ/ｌのグルコース、約６３．５ｇ/ｌの酵母抽出物、約２．２ｇ/ｌのＮＨ４Ｃｌ、約１．９５ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約２．９ｇ/ｌのＬ−プロリン、約０．７５ｇ/ｌのＬ−メチオニン、約１７．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、約２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約２５．８mg/ｌのチアミンＨＣｌ、約１．０ml/ｌの１０％消泡剤を含む。
【００１８】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、第１フィード溶液は、約３３３ｇ/ｌの酵母抽出物、約３３３ｇ/ｌの８５％グリセロール、約１．７ｇ/ｌのＬ−メチオニン、および各々約５ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含む。
【００１９】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、第２フィード溶液は、約６００ｇ/ｌのＬ−プロリンを含む。
【００２０】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、ｐＨ調節のための塩基は、１０％（ｗ/ｖ）ＫＯＨ溶液であり、そして酸は、７５％グルコース溶液である。
【００２１】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、培養は、約２５℃においてである。
【００２２】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、培養は、約ｐＨ６．５から約ｐＨ６．９の間のｐＨにおいてである。
【００２３】
１つの態様において、培養は、約１０リットルの容量中においてである。
【００２４】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、第１フィードは、７０ｇ/ｈの速度で開始する。
【００２５】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、第２フィードは、１０ml/ｈの速度で開始する。
【００２６】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、溶存酸素値は、５０％超に保持される。特定の態様において、溶存酸素値は、撹拌速度、通気速度、および空気圧を平行して増加させることによって５０％超に保持される。
【００２７】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、撹拌速度は、約５００rpmから約１５００rpmである。
【００２８】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、通気速度は、約１０リットル/分から約２０リットル/分である。
【００２９】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、空気圧は、約３００mbarから約５００mbarである。
【００３０】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００３１】
本明細書において報告した方法の１つの態様において、ポリペプチドは、アポリポタンパク質Ａ１である。特定の態様において、アポリポタンパク質Ａ１は、テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質である。
【００３２】
本明細書において報告した１つの局面は、約８．８５ｇ/ｌのグルコース、約６３．５ｇ/ｌの酵母抽出物、約２．２ｇ/ｌのＮＨ４Ｃｌ、約１．９５ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約２．９ｇ/ｌのＬ−プロリン、約０．７５ｇ/ｌのＬ−メチオニン、約１７．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、約２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約２５．８mg/ｌのチアミンＨＣｌ、約１．０ml/ｌの１０％消泡剤を含む、原核細胞用の培養培地である。
【００３３】
１つの態様において、培地はさらに、約３３３ｇ/ｌの酵母抽出物、約３３３ｇ/ｌの８５％グリセロール、約１．７ｇ/ｌのＬ−メチオニン、および各々約５ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを含む第１フィードを含む。
【００３４】
１つの態様において、培地はさらに、約６００ｇ/ｌのＬ−プロリンを含む第２フィード溶液を含む。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書において報告したプロポリペプチドは、原核細胞における対象のポリペプチドの発現のために有用である。それは改善された発現収率を提供し、そして例えば下流の処理および精製の間などの取り扱いを改善する。例えば、効率的なエンドトキシン除去が行なわれ、一方で、プロポリペプチドを含む対象のタンパク質は、例えばアフィニティクロマトグラフィー材料に結合している。その後、プロポリペプチドは、組み入れられたプロテアーゼ開裂部位によって同族プロテアーゼを用いて、対象のポリペプチドから効率的に切断され得る。
【００３６】
本明細書において、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  場合によりリーディングアミノ酸配列、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  アミノ酸配列タグ、
−  以下にすぐに隣接した第２のジペプチドＧＳ、
−  酵素的開裂部位
を含むプロポリペプチドを報告する。
【００３７】
本出願内で使用される「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、直接的にまたは前駆体の形態で核酸によってコードされ得る、カルボキシα−アミノ酸の基を示す。個々のアミノ酸は、３つのヌクレオチド（いわゆるコドンまたは塩基トリプレット）からなる核酸によってコードされる。各アミノ酸は少なくとも１つのコドンによってコードされる。これは「遺伝子コードの縮重」として知られる。本出願内で使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸を示す。
【００３８】
「ポリペプチド」という用語は、天然で産生されたものであれ合成で産生されたものであれ、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸からなるポリマーを示す。約２０未満のアミノ酸残基のポリペプチドは「ペプチド」と称され得、一方、２つ以上のポリペプチドからなる、または１００を超えるアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」と称され得る。「ジペプチド」という用語は、ペプチド結合を用いて互いに接続された２つのアミノ酸残基からなるペプチドを示す。ポリペプチドはまた、非アミノ酸成分、例えば糖質基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどを含み得る。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現されている細胞によって加えられ得、そして細胞のタイプにより変化し得る。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸の点から定義される。糖質基などの付加は、一般的に明記されないが、それにも関わらず存在し得る。１つの態様において、対象のポリペプチドは、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質変異体／融合体である。別の態様において、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ａ１またはアポリポタンパク質Ａ１変異体／融合体である。さらなる態様において、アポリポタンパク質Ａ１はＮ末端でテトラネクチン三量体化ドメインに融合し、その結果、人工テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１融合ポリペプチドが得られる。１つの態様において、対象のポリペプチドは、配列番号４３から配列番号７６から選択されたアミノ酸配列を有する。別の態様において、対象のポリペプチドは、配列番号４３、または配列番号４４、または配列番号４５から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００３９】
「リーディングアミノ酸配列」という用語は、ペプチド結合を介して互いに接続されたアミノ酸またはアミノ酸残基の配列を示す。１つの態様において、リーディングアミノ酸配列は、１から２０のアミノ酸残基からなる。別の態様において、リーディングアミノ酸配列は、２から１５のアミノ酸残基からなる。さらなる態様において、リーディングアミノ酸配列は４から１０のアミノ酸残基からなる。また１つの態様において、リーディングアミノ酸配列は、
【化１】
2013535978.tif 000002
のアミノ酸配列を有する。さらなる態様において、リーディングアミノ酸配列は、
【化２】
2013535978.tif 000003
から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００４０】
「アミノ酸配列タグ」という用語は、特異的な結合特性を有する、ペプチド結合を介して互いに接続されたアミノ酸残基の配列を示す。１つの態様において、アミノ酸配列タグは、親和性タグまたは精製タグである。１つの態様において、アミノ酸配列タグは、Ａｒｇタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、３ｘＦｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｎａｎｏタグ、ＳＢＰタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、ＧＳＴタグまたはＭＢＰタグから選択される。さらなる態様において、アミノ酸配列タグは、
【化３】
2013535978.tif 000004
から選択される。
【００４１】
「酵素的開裂部位」という用語は、特異的にプロテアーゼによって開裂され得る、ペプチド結合を介して互いに接続されたアミノ酸残基の配列を示す。１つの態様において、プロテアーゼはＩｇＡプロテアーゼ、グランザイムＢ、Ｔｅｖプロテアーゼ、プレシジョンプロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼである。
【００４２】
「ＩｇＡプロテアーゼ」という用語は、以下の配列の１つを含む認識部位を有するNeisseria gonorrhoeaeに由来するプロテアーゼを示し、「↓」は、切断される結合の位置を示す：
【化４】
2013535978.tif 000005
【００４３】
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の成分の並立を示し、このように記載された成分が、その意図する様式で機能することを可能とする関係にある。例えば、分泌リーダーなどの領域およびポリペプチドをコードする２つのポリペプチドを連結すること。
【００４４】
アミノ酸配列をコードする核酸の連結は、例えばＰＣＲ法を使用しておよび／または簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって、当技術分野において公知の組換え法によって達成される。簡便な制限酵素部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣行に従って使用する。
【００４５】
原核細胞における対象のポリペプチドの組換え産生のために、とりわけ、高い発現収率および実践可能な下流の処理が考えられる。
【００４６】
Ｎ末端からＣ末端の方向に
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  アミノ酸配列タグ
−  第２のジペプチドＧＳ、および
−  酵素的開裂部位
を含む本明細書において報告したプロポリペプチドは、作動可能に連結された対象のポリペプチドの発現に有用である。有利な特性は、本明細書において報告したプロポリペプチドを対象のポリペプチドのＮ末端に融合した場合に発揮され得、これは原核細胞において組換え手段によって発現されるものである。従って、本明細書において報告したプロポリペプチドを使用して、発現収率および下流の処理を改善することができる。対象のポリペプチドは、本明細書において報告したプロポリペプチドおよび対象のポリペプチドを含む融合ポリペプチドとして原核細胞によって発現される。すなわち、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、本明細書において報告したプロポリペプチドおよび対象のポリペプチドを含む。
【００４７】
表１：種々の融合ポリペプチドの発現収率。各々のセルに与えられた最初の収率値は、実施例３ｂに記載の発酵法を用いて得られ、各々のセルにおける第２の収率値は、実施例３ａに記載の発酵法を用いて得られた。
【００４８】
【表１】
2013535978.tif 000006
2013535978.tif 000007
【００４９】
表１から、第２のジペプチドＧＳと酵素的開裂部位との間に追加のアミノ酸配列が全く挿入されていない、Ｎ末端において本明細書において報告したプロポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、介在アミノ酸配列を含むものよりも高い発現収率を提供することが分かる。２つ以上のアミノ酸残基のリーディングアミノ酸配列が、第１のジペプチドＧＳのＮ末端に存在し得る。
【００５０】
そのＣ末端において、本明細書において報告したプロポリペプチドは、酵素的開裂部位を含む。酵素的開裂部位は、プロテアーゼのための認識モチーフを含むアミノ酸配列である。この認識部位は、プロテアーゼがこの認識部位を特異的に開裂する限り任意のプロテアーゼに対するものであり得る、すなわち、この配列は、融合ポリペプチドの全アミノ酸配列中に唯１回しか出現しない。
【００５１】
特に有利なのはエンドトキシン除去の可能性であり、一方で、融合ポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィー材料に、すなわち、対象のポリペプチドのために特異的に設計されているのではなくアミノ酸配列タグに対して特異的に設計されているアフィニティ材料に結合している。これらの結合特性により、アミノ酸配列タグと対応するアフィニティ材料の任意の対応する組合せを使用することができる。エンドトキシン除去後に対象のポリペプチドを、プロテアーゼ開裂部位を使用することによって融合ポリペプチドから効率的に回収することができる。
【００５２】
以下の実施例および配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく示された手順に改変を行なうことができることが理解される。
【００５３】
配列表の記載
配列番号１〜８      アミノ酸配列
配列番号９〜２７    アミノ酸タグ
配列番号２８〜４２  プロテアーゼ開裂部位
配列番号４３〜７６  アポリポタンパク質アミノ酸配列
配列番号７７〜７８  変異アポリポタンパク質融合体アミノ酸配列
配列番号７９〜８４  プロポリペプチドアミノ酸配列
【００５４】
実施例
材料および方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, New York, (December 1989)に記載のようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の指示に従って使用した。
【００５５】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。唯一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位によってフランキングされる遺伝子セグメントを、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション（ＰＣＲ増幅を含む）によってアセンブルし、その後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp., USA）にＡオーバーハングを介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンスによって確認した。
【００５６】
実施例１
Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドの作製および説明
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１融合ポリペプチドを組換え手段によって調製した。３つの異なるテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１融合ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に示す（太文字、テトラネクチン三量体化ドメイン、変異体ＡおよびＢ）。変異体Ａは、テトラネクチンドメインのＮ末端における２つのアミノ酸残基の付加によって変異体Ｂとは異なる。変異体Ｃは、テトラネクチンドメインのＣ末端における５つのアミノ酸残基の付加によって変異体Ａとは異なる。
【００５７】
変異体Ａのアミノ酸配列（配列番号４４）：
【化５】
2013535978.tif 000008
【００５８】
変異体Ｂのアミノ酸配列（配列番号７７）：
【化６】
2013535978.tif 000009
【００５９】
変異体Ｃのアミノ酸配列（配列番号７８）：
【化７】
2013535978.tif 000010
【００６０】
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて前駆ポリペプチド（より大きな融合ポリペプチド）として発現された。以下のＮ末端プロポリペプチドを、改善された発現収率および下流の処理について試験した：
【００６１】
１）変異体Ｂと合わせたプロポリペプチドのアミノ酸配列（プラスミド５８０３）：
【化８】
2013535978.tif 000011
プロポリペプチド５８０３は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
−  アミノ酸配列ＭＲを有するリーディングアミノ酸配列、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１１）を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  第２のジペプチドＧＳ、および
−  ＰＲＰＰＴＰのアミノ酸配列（配列番号３３）を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位
を含む人工ポリペプチドである。
【００６２】
２）変異体Ａと合わせたプロポリペプチドのアミノ酸配列（プラスミド５８１６）：
【化９】
2013535978.tif 000012
プロポリペプチド５８１６は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
−  ＭＣＤＬＰＱＴＨＳＬのアミノ酸配列（配列番号３）を有するインターフェロン配列のフラグメントにコンジュゲーションしたメチオニンをコードするリーディングアミノ酸配列、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１１）を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  第２のジペプチドＧＳ、および
−  ＶＶＡＰＰＡＰのアミノ酸配列（配列番号３２）を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位
を含む人工ポリペプチドである。
【００６３】
３）変異体Ａと合わせたプロポリペプチドのアミノ酸配列（プラスミド５８２０）：
【化１０】
2013535978.tif 000013
プロポリペプチド５８２０は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  アミノ酸配列ＭＲを有するリーディングアミノ酸配列、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１１）を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  第２のジペプチドＧＳ、
−  ストレプトアビジンに由来する介在アミノ酸配列、および
−  ＶＶＡＰＰＡＰのアミノ酸配列（配列番号３４）を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位
を含む人工ポリペプチドである。
【００６４】
４）変異体Ａと合わせたプロポリペプチドのアミノ酸配列（プラスミド５８０５）：
【化１１】
2013535978.tif 000014
プロポリペプチド５８０５は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  アミノ酸配列ＭＲを有するリーディングアミノ酸配列、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１１）を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  ＡＨＦＷＱＱＡのアミノ酸配列（配列番号０２）を有する介在アミノ酸配列、および
−  ＰＲＰＰＴＰのアミノ酸配列（配列番号３８）を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位
を含む人工ポリペプチドである。
【００６５】
５）変異体Ｃと合わせたプロポリペプチドのアミノ酸配列（プラスミド５８１９）：
【化１２】
2013535978.tif 000015
プロポリペプチド５８１９は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  アミノ酸配列ＭＲを有するリーディングアミノ酸配列、
−  第１のジペプチドＧＳ、
−  ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１１）を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  ヒトＨＩＶ２ ｇｐ３２タンパク質に由来する介在アミノ酸配列、および
−  ＶＶＡＰＰＡＰのアミノ酸配列（配列番号３４）を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位
を含む人工ポリペプチドである。
【００６６】
６）変異体Ｂと合わせたプロポリペプチドのアミノ酸配列（プラスミド５８０６）：
【化１３】
2013535978.tif 000016
プロポリペプチド５８０６は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
−  リーディングアミノ酸配列（Ｍ、開始コドン）、
−  ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１１）を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  ＫＡＫＲＦＫＫＨのアミノ酸配列（配列番号０１）を有する介在アミノ酸配列、および
−  ＰＲＰＰＡＰのアミノ酸配列（配列番号４０）を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位
を含む人工ポリペプチドである。
【００６７】
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１変異体ポリペプチドを、in vitroでＩｇＡプロテアーゼを使用して酵素的開裂によって融合前駆タンパク質から回収した。
【００６８】
５８０３、５８１６、５８２０、５８０５、５８１９および５８０６と称される、種々のプロポリペプチドテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１をコードする融合遺伝子を、公知の組換え法および技術を用いて、適切な核酸セグメントの接続によってアセンブルした。化学合成によって作製された核酸配列はＤＮＡシークエンスによって確認された。
【００６９】
基本／開始Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミド４９８０の作製および説明
プラスミド４９８０（４９８０−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−ＳＡＣ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるコアストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、４３５ｂｐ長のコアストレプトアビジンをコードするＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩフラグメントと、プラスミド１９６６（１９６６−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−Ｔリピート；ＥＰ−Ｂ１４２２２３７に報告）に由来する３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩフラグメントのライゲーションによって作製された。
【００７０】
コアストレプトアビジンＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
−  Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製のためのベクターｐＢＲ３２２からの複製起点（Sutcliffe, J.G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90に記載のｂｐ位置２５１７〜３１６０に対応する）、
−  Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｙｒＦ突然変異体株の補完によるプラスミドの選択を可能とする（ウラシル栄養要求性）、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするSaccharomyces cerevisiaeのＵＲＡ３遺伝子（Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124）、
−  以下からなるコアストレプトアビジン発現カセット
−  Stuber, D., et al.（後記参照）に記載の合成リボソーム結合部位を含むＴ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152に記載のＴ５−ＰＮ２５／０３／０４ハイブリッドプロモーター）
−  コアストレプトアビジン遺伝子、および
−  ２つのバクテリオファージ由来の転写終結因子、λ−Ｔ０終結因子（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）およびｆｄ終結因子（Beck, E., and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58）、ならびに
−  Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃＩリプレッサー遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。
【００７１】
プロポリペプチドを含む最終発現プラスミドの作製（プラスミド５８０３、５８１６、５８２０、５８０５、５８１９および５８０６）
プラスミド５８０３（５８０３−Ｈｉｓ６−ＩｇＡ−ＴＰ７−ＴｒｉｐＢ−ＡｐｏＡＩ）は、プロポリペプチド５８０３を含むテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、唯一のフランキングするＥｃｏＲＩおよびＣｅｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を使用してベクター４９８０からコアストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、そして９５８ｂｐ長のＥｃｏＲＩＩ／ＣｅｌＩＩ５８０３プロポリペプチドテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質をコードする遺伝子セグメントを３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩ−４９８０ベクターフラグメントに挿入することによって調製された。
【００７２】
プラスミド
【化１４】
2013535978.tif 000017
を、プラスミド５８０３について前記したように作製した。
【００７３】
実施例２
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド５８０３、５８１６、５８２０、５８０５、５８１９および５８０６からのテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質の発現
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質５８０３、５８１６、５８２０、５８０５、５８１９および５８０６の発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ栄養要求性（ＰｙｒＦ）の補完による抗生物質を含まないプラスミドの選択を可能とするＥ．ｃｏｌｉ宿主／ベクター系を使用した（例えば、ＥＰ−Ｂ０９７２８３８およびＵＳ  ６，２９１，２４５参照）
【００７４】
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＳＰＺ−２（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈｉ−１、ΔｐｙｒＦ）において発現した。
【００７５】
形質転換、および選択培地におけるｐｙｒＦ栄養要求性の補完による細胞培養
Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株ＣＳＰＺ−２（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈｉ−１、ΔｐｙｒＦ）を、前の工程で得られた発現プラスミド（それぞれ、５８０３、５８１６、５８２０、５８０５、５８１９および５８０６）を用いて形質転換した。形質転換されたＣＳＰＺ−２細胞をまず３７℃で寒天プレート上で増殖させ、その後、０．６〜０．９の５５０nmにおける光学密度（ＯＤ５５０）となるまで０．５％カザミノ酸（Difco）を含むＭ９最小培地中の振とう培養液中で増殖させ、続いて、ＩＰＴＧ（１〜５mmol/ｌの最終濃度）を用いて誘導した。
【００７６】
３７℃で４〜１６時間の誘導期の後、収集前に、エーレンマイヤーフラスコ中の全培養ブロスを１時間または２時間かけて５０℃まで加熱する加熱工程により、細胞質性および可溶性の発現されたテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質を、不溶性タンパク質凝集体（いわゆる封入体）に移した（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。その後、細胞を遠心分離によって収集し、５０mmol/ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄し、そしてさらなる処理にかけるまで−２０℃で保存した。
【００７７】
発現解析
発現解析のために、遠心分離した培養培地の３ ＯＤ５５０nmユニット（１ ＯＤ５５０nm＝５５０nmにおけるＯＤが１である１mlの細胞懸濁液）の細胞ペレットを、０．２５mlの１０mmol/lリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に再懸濁し、そして細胞を超音波処理によって溶解した（５０％の強度で３０秒間の２回のパルス）。不溶性細胞成分は沈降し（遠心分離１４，０００rpm、５分間）、そして上清を、その容量の１/５の５×ＳＤＳ試料緩衝液（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５０mmol/lのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、５０mmol/lのＤＴＴ、１０％グリセロール、０．００１％ブロモフェノールブルー）と混合した。この不溶性細胞片画分（ペレット）を、０．３mlの１×ＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し、試料を５分間９５℃でインキュベーションし、そして再度遠心分離にかけた。続いて、タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）によって分離し、そしてクーマシーブリリアントブルーＲ色素を用いて染色した。
【００７８】
合成されたテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質は均一であり、そして不溶性細胞片画分に不溶性タンパク質凝集体（ＩＢｓ）の形態で見られた。発現収率は全てのクローンにおいて測定精度の範囲内で同一であり、そして全Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質と比べて３０〜６０％であった。
【００７９】
実施例３
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質の組換え産生のための１０リットルの高細胞密度のＥ．ｃｏｌｉの発酵
実施例３ａ
前培養
前発酵のために、約１ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約１ｇ/ｌのＬ−プロリンおよび約１mg/lのチアミンＨＣｌの補充されたSambrook, J., et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition, New York, (December 1989))に記載のＭ９培地を使用した。
【００８０】
前発酵のために、バッフルを有する１０００mlエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlのＭ９培地に、初代種子バンクアンプルからの２mlを用いて接種した。１〜３の光学密度（５７８nm）が得られるまで、培養を回転振とう機で１３時間かけて３７℃で実施した。
【００８１】
１０リットルの流加主要発酵
発酵のためにRiesenberg, et al.記載のバッチ培地を使用した（Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27）：２７．６ｇ/ｌのグルコース・Ｈ２Ｏ、１３．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ/ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７ｇ/ｌのクエン酸塩、１．２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６０mg/lのクエン酸鉄（III）、２．５mg/lのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５mg/lのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５mg/lのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３mg/lのＨ３ＢＯ３、２．５mg/lのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、８mg/lのＺｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ、８．４mg/lのチトリプレックスIII、１．３ml/lのシンペロニック１０％消泡剤。バッチ培地に、５．４mg/lのチアミンＨＣｌおよび１．２ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンをそれぞれ補充した。フィード１溶液は、１９．７ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの補充された７００ｇ/ｌのグルコースを含んだ。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は、５０ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよび５０ｇ/ｌのＬ−プロリンのそれぞれ補充された１２．５％（ｗ/ｖ）ＮＨ３水溶液であった。全ての成分を脱イオン水に溶解した。
【００８２】
発酵を、１０リットルのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ  ＤＣＵ３発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）において実施した。６．４リットルの無菌発酵バッチ培地と、前発酵からの３００mlの接種材料で開始して、バッチ発酵を３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbar、および通気速度１０リットル/分で実施した。最初に補充したグルコースが枯渇した後、温度を２８℃にシフトさせ、そして発酵は流加モードに入った。ここで一定して増加する撹拌速度（１０時間以内に５５０rpmから１０００rpmに、そして１６時間以内に１０００rpmから１４００rpmに）および通気速度（１０時間で１０リットル/分から１６リットル/分、そして５時間で１６リットル/分から２０リットル/分）と組み合わせてフィード１を添加することによって、溶存酸素（ｐＯ２）の相対値を５０％に保持した（ＤＯスタット、例えば、Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. (1987) 79-85参照）。さらなるアミノ酸の供給は、アルカリ溶液の添加から生じ、この時、ｐＨは、約８時間の培養後に調節下限（６．７０）に到達していた。組換え治療タンパク質の発現は、１mMのＩＰＴＧの添加によって７０の光学密度において誘導された。
【００８３】
バイオマスの収集
発酵終了時に、収集前に、発酵槽中の全培養ブロスを１時間または２時間かけて５０℃まで加熱する加熱工程により、細胞質性および可溶性の発現されたテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１を、不溶性タンパク質凝集体（いわゆる封入体）に移した（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。その後、発酵槽の内容物をフロースルー遠心分離器を用いて遠心分離にかけ（１３，０００rpm、１３リットル/ｈ）、そして収集されたバイオマスを、さらなる処理にかけるまで−２０℃で保存した。合成されたテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質は、不溶性のタンパク質凝集体（いわゆる封入体（ＩＢｓ））の形態で不溶性細胞片画分に排他的に見られた。
【００８４】
産物の数量化
発酵槽から得た試料、１つは誘導前のもの、そしてタンパク質発現の誘導後の指定した時点におけるその他のものを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。どの試料からも同じ量の細胞（ＯＤターゲット＝５）を５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、そして氷上での超音波処理を介して破壊した。その後、１００μLの各懸濁液を遠心分離にかけ（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を取り出し、そして別々のバイアルに移す。これは、可溶性および不溶性の発現されたターゲットタンパク質を識別するためである。各上清（＝可溶性）画分に３００μLのＳＤＳ試料緩衝液を、各ペレット（＝不溶性）画分に４００μLのＳＤＳ試料緩衝液（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。試料を振とう下で９５℃で１５分間加熱することにより、試料中の全てのタンパク質を可溶化および減少させる。室温まで冷却した後、５μLの各試料を、４〜２０％ＴＧＸ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）に移す。さらに、５μlの分子量標準（プレシジョンPlusプロテインスタンダード、Bio-Rad）および公知の産物のタンパク質濃度（０．１μg/μl）を有する３つの量（０．３μl、０．６μlおよび０．９μl）の定量スタンダードをゲル上に配置する。
【００８５】
電気泳動を２００Ｖで６０分間流し、その後、ゲルをＧｅｌＤＯＣ  ＥＺイメージャー（Bio-Rad）に移し、そしてＵＶ照射で５分間処理した。ゲルイメージを、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準物質を用いて直線回帰曲線を＞０．９９の係数を用いて計算し、そして元々の試料中のターゲットタンパク質のその濃度を計算した。
【００８６】
実施例３ｂ
前培養
前発酵のために、約１ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約１ｇ/ｌのＬ−プロリンおよび約１mg/lのチアミンＨＣｌの補充されたSambrook, J., et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition, New York, (December 1989))に記載のＭ９培地を使用した。
【００８７】
前発酵のために、バッフルを有する１０００mlエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlの改変Ｍ９培地に、寒天プレートからまたは初代種子バンクアンプルからの１〜２mlを用いて接種した。１〜３の光学密度（５７８nm）が得られるまで、培養を回転振とう機で１３時間かけて３７℃で実施した。
【００８８】
１０リットルの流加主要発酵
テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１の発酵および高収率の発現のために、以下のバッチ培地およびフィードを使用した：
８．８５ｇ/ｌのグルコース、６３．５ｇ/ｌの酵母抽出物、２．２ｇ/ｌのＮＨ４Ｃｌ、１．９４ｇ/ｌのＬ−ロイシン、２．９１ｇ/ｌのＬ−プロリン、０．７４ｇ/ｌのＬ−メチオニン、１７．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、２．０２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２５．８mg/lのチアミンＨＣｌ、１．０ml/lのシンペロニック消泡剤。フィード１溶液は、１．６７ｇ/ｌのＬ−メチオニンおよび各々５ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンの補充された、３３３ｇ/ｌの酵母抽出物および３３３ｇ/ｌの８５％グリセロールを含んだ。フィード２は、６００ｇ/ｌのＬ−プロリンの溶液であった。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は１０％（ｗ/ｖ）ＫＯＨ溶液であり、そして酸としては７５％グルコース溶液を使用した。全ての成分を脱イオン水に溶解した。
【００８９】
発酵を、１０リットルのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ  ＤＣＵ３発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）において実施した。５．１５リットルの無菌発酵バッチ培地と、前発酵からの３００mlの接種材料で開始して、流加発酵を、２５℃、ｐＨ６．７±０．２、３００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に補充したグルコースが枯渇する前に、培養液は１５の光学密度（５７８nm）に達し、そして発酵は流加モードに入り、この時フィード１を７０ｇ/ｈで開始した。培養液中のグルコース濃度をモニタリングしながら、フィード１を、グルコースの蓄積を回避しながら、そしてｐＨを調節上限値６．９近くに保持しながら、最大１５０ｇ/ｈまで増加させた。光学密度５０（５７８nm）において、フィード２を、１０ml/ｈの一定したフィード速度で開始した。撹拌速度（５００rpmから１５００rpm）、通気速度（１０リットル/分から２０リットル/分）および圧力（３００mbarから５００mbar）を平行して増加させることによって溶存酸素（ｐＯ２）の相対値を５０％超に保持した。組換え治療タンパク質の発現を、光学密度９０において１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導した。
【００９０】
産物の数量化
発酵槽から得た７つの試料、１つは誘導前のもの、そしてタンパク質発現の誘導後の指定した時点におけるその他のものを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。どの試料からも同じ量の細胞（ＯＤターゲット＝５）を５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、そして氷上での超音波処理を介して破壊した。その後、１００μLの各懸濁液を遠心分離にかけ（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を取り出し、そして別々のバイアルに移す。これは、可溶性および不溶性の発現されたターゲットタンパク質を識別するためである。各上清（＝可溶性）画分に３００μLのＳＤＳ試料緩衝液を、各ペレット（＝不溶性）画分に２００μLのＳＤＳ試料緩衝液（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。試料を振とう下で９５℃で１５分間加熱することにより、試料中の全てのタンパク質を可溶化および減少させる。室温まで冷却した後、５μLの各試料を、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Novagen）に移す。さらに、５μlの分子量標準（プレシジョンPlusプロテインスタンダード、Bio-Rad）および公知の産物のタンパク質濃度（０．１μg/μl）を有する３つの量（０．３μl、０．６μlおよび０．９μl）の定量スタンダードをゲル上に配置する。
【００９１】
電気泳動を２００Ｖで３５分間流し、その後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ色素で染色し、加熱した水を用いて脱染し、そしてデジタル化のために光学密度計（GS710, Bio-Rad）に移した。ゲルイメージを、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ１次元分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準物質を用いて直線回帰曲線を＞０．９８の係数を用いて計算し、元々の試料中のターゲットタンパク質のその濃度を計算した。
【００９２】
バイオマスの収集
発酵終了時に、収集前に、発酵槽中の全培養ブロスを１時間または２時間かけて５０℃まで加熱する加熱工程により、細胞質性および可溶性の発現されたテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１を、不溶性タンパク質凝集体（いわゆる封入体（ＩＢｓ））に移した（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。加熱工程後、合成されたテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ１前駆タンパク質は、ＩＢｓの形態で不溶性細胞片画分に排他的に見られた。
【００９３】
発酵槽の内容物を４〜８℃まで冷却し、フロースルー遠心分離器を用いて遠心分離にかけ（１３，０００rpm、１３リットル/ｈ）、そして収集されたバイオマスを、さらなる処理にかけるまで−２０℃で保存した。収集された全バイオマスの収率は、発現された構築物に依存して３９ｇ/ｌから９０ｇ/ｌの乾燥物の範囲であった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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