(57)【要約】  本発明はメトホルミン及びロスバスタチンの経口医薬組成物に関する。詳細には、メトホルミン及びロスバスタチン、徐放性担体及び／又は賦形剤を含む本発明の医薬組成物は、スタチン系による副作用を低減させ、かつ１日１回投与の安全性、患者の利便性及びコンプライアンスを強化するものである。さらに、前記薬物の初期血中有効濃度を制御し、徐放性による生体内での安定したレベルで薬物の濃度を維持することができ、高脂血症を予防及び治療する医薬組成物として使用され得るものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロスバスタチンの副作用を低減させる高脂血症の予防及び治療のための医薬組成物であり、前記医薬組成物は：（ａ）治療的有効量のメトホルミン又はその薬物的許容される塩、及び（ｂ）治療的有効量のロスバスタチン又はその薬物的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ロスバスタチンの副作用を低減させる高脂血症の予防及び治療のための医薬組成物であり、前記医薬組成物は：（ａ）治療的有効量のメトホルミン又はその薬物的許容される塩、（ｂ）徐放性担体及び（ｃ）高脂血症予防及び治療の有効量のロスバスタチン又はその薬物的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項３】
ロスバスタチンの副作用を低減させる高脂血症の予防及び治療のための医薬組成物であり、前記医薬組成物は：（ａ）治療的有効量のメトホルミン又はその薬物的許容される塩、（ｂ）徐放性担体（ｃ）高脂血症予防及び治療の有効量のロスバスタチン又はその薬物的に許容される塩、及び（ｄ）高脂血症の予防及び治療の効果を持つ賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載された医薬組成物であり、前記メトホルミンの薬物的に許容される塩が、メトホルミンＨＣｌ塩、メトホルミンアセチルサリチル酸塩、メトホルミンフマル酸塩、メトホルミンコハク酸塩、メトホルミンマレイン酸塩、メトホルミンマロン酸塩を含む群から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載された医薬組成物であり、ロスバスタチンの薬物的に許容される塩が、ロスバスタチンカルシウム塩、ロスバスタチンＨＣｌ塩、ロスバスタチンアセチルサリチル酸塩、ロスバスタチンフマル酸塩、ロスバスタチンコハク酸塩、ロスバスタチンマレイン酸塩、ロスバスタチンマロン酸塩を含む群から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
【請求項６】
請求項１に記載された医薬組成物であり、前記副作用が、筋肉痛、筋肉細胞障害及び横紋筋融解症を含む群から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
【請求項７】
請求項２又は３のいずれか一項に記載された医薬組成物であり、前記徐放性担体が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、アルキルヒドロキシプロピリメチルセルロース、プロピレンオキシド、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポビドン及びその誘導体、コーンスターチ、ポテトスターチ、前ゲル化スターチ及びその誘導体、ヒドロキシエチルスターチ、デキストリン及びその誘導体、デキストラン、マルトデキストリン、ポリデキストロース、アルギン酸及びその誘導体、グアガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、シクロデキストリン、アラビアゴム、ジェランガム、カラヤゴム、カゼイン、タラガム、タマリンドガム、トラガカントゴム、ガッチガム、ゼラチン、コラーゲン、プロタミン、ゼイン、カルボマー、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、グルコマンナン、グルコサミン、アラビノガラクタン、フルセレラン、ポルラン、ポリウレタン、キトサン、キチン、アガー、ペクチン、カラギーナンを含む群から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
【請求項８】
請求項３に記載された医薬組成物であり、前記賦形剤が、ミクロ結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、アルキルヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテート、セルロースアセテートナフタレート、プロピレンオキシド、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポビドン及びその誘導体、コーンスターチ、ポテトスターチ及びその誘導体、ヒドロキシメチルスターチ、デキストリン及びその誘導体、デキストラン、マルトデキストリン、ポリデキストロース、グアガム、ロカストビーンガム、キサンタンガム、シクロデキストリン、アラビアゴム、ジェランゴム、カラヤゴム、カゼイン、タラガム、タマリンドガム、トラガカントガム、ガッチガム、ゼラチン、コラーゲン、プロタミン、カルボマー、ポリアクリリアミド、カルナウバワックス、ビイーズワックス、スクロース、脂質スクロース、ラクトース、ポリビニルアセテート、ジエチルアミノアセテート、ポリウレタン、キトサン、キチン、アガー、ペクチン、カラギーナン又はシェレックを含む群から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
【請求項９】
請求項２に記載された医薬組成物であり、（ａ）メトホルミン：（ｂ）徐放性担体：（ｃ）ロスバスタチンの混合物の重量比が、１：０．０１〜５：０．００１〜０．５である、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項３に記載された医薬組成物であり、（ａ）メトホルミン：（ｂ）徐放性担体：（ｃ）ロスバスタチン：（ｄ）賦形剤の混合物の重量比が、１：０．０１〜５：０．００１〜０．５：０．０１〜５である、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９又は１０のいずれか一項に記載された医薬組成物であり、前記メトホルミンが、水又は生理的ｐＨ溶解媒体中で約２〜２４時間一定に放出される、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項９又は１０のいずれか一項に記載された医薬組成物であり、前記ロスバスタチンの５０〜１００％が、水又は生理的ｐＨ溶解媒体中で約１０〜６０分間で即時に放出される、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項９又は１０のいずれか一項に記載された医薬組成物であり、前記ロスバスタチンが、水又は生理的ｐＨ溶解媒体中で約１〜２４時間以上一定に放出される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトホルミンとロスバスタチンの経口医薬組成物に関する。詳細には、本発明は、メトホルミン、ロスバスタチン、徐放性担体及び／又は賦形剤を含み、スタチン系薬剤による副作用を低減し、及び１日１回投与の患者の安全性、利便性及びコンプライアンスを強化する。さらに前記医薬の初期有効濃度を制御し、かつ徐放による生体内での安定したレベルで前記医薬濃度を維持することにより、高脂血症の予防及び治療のための医薬組成物として有利に使用されるものである。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症は、コレステロール、トリグリセリドなどの血液中の血漿脂質成分の異常な上昇により起こる一連の疾患を伴う。高脂血症又は血液中の血漿脂質の増加は、しばしば心臓血管疾患及び動脈硬化の両方の発症に関連している。詳しくは、高脂血症は、アテローム性動脈硬化症と高トリグリセリド症を惹起し発症する第１のリスク因子として作用するものであり、膵炎を引き起こす。
【０００３】
一般に、脂質を低下させるスタチン系薬剤は、狭心症や心筋梗塞などの冠動脈硬化により起こる心疾患を予防及び治療する最善の医薬として使用される。例えば、ロスバスタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤（ＵＳＰ）であり、コレステロールの代謝経路を制御するものであり、主に、高脂血症及び複合脂質異常症により増加したコレステロール、ＬＤＬ−コレステロール及びトリグリセリドのレベルを低下させる効果及び、同時にＨＤＬ−コレステロールの増加させる効果を持つ。
【０００４】
ロスバスタチンはＬＤＬ−コレステロール及びトリグリセリドのレベルを低下させ、ＨＤＬを他の既存のスタチンよりも多く増加させる。しかしこれは、コレステロールの合成段階の律速段階における低コレステロールレベル同様、ＣｏＱ１０、ドリコール及びイソプレノイドの前駆体の減少により起こる筋肉毒性を起こすものであるが、これはメバロン酸の合成を抑制して最後は筋肉痛、筋肉細胞障害及び横紋筋融解などの重篤な効果を与える結果となる（Ａｍ  Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ、１０２、ｐｐ．１６５４−１６６２、２００８；Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、８２、ｐｐ．９６９−９７５、２００８）。
【０００５】
しかし最近の研究では、ロスバスタチンを含むスタチンのよく知られた症状である横紋筋融解症はリガーゼアストロジン−１アルファに関係する、ということが明らかとなった。特に、筋肉タンパク質は、ＵＰＰ（ユビキチンプロテアソーム経路）の活性と関連する細胞メカニズムを介して破壊される。ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３としてのアストロジン−１（ＭＡＦｂｘ：筋萎縮Ｆ−ボックス）及び他のリガーゼＭＵＲＦ１（筋リングフィンガ１）はＵＰＰ形成のための要素であり、筋萎縮を惹起する。とりわけアトロジン−１は、筋萎縮の初期段階で誘導され、筋肉減少に先立って増加することが知られている。例えば、アストロジン−１欠失マウスは筋萎縮に抵抗性を持ち、アストロジン−１が筋肉のタンパク質の重要なタンパク質を破壊するということを示す（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｖｅｓｔ．、１１７、ｐｐ．３９４０−３９５１、２００７）。
【０００６】
アストロジン−１は、ＰＧＣ−１アルファと密接に結合することが知られており、これは、筋肉及び他の組織のホメオスタシス、温度制御及び糖代謝に関連する生理的反応に関与する転写コアクチベータであることが知られている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｖｅｓｔ．、１１７、ｐｐ．３９４０−３９５１、２００７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３（４４）、ｐｐ．１６２６０−１６２６５、２００６）。
【０００７】
ＰＧＣ−１アルファがスタチンによる骨格筋肉障害を軽減するという結果は、ミトコンドリアの数及び機能が筋肉全体にとって重要な役割を果たしていることを意味する。ＰＧＣ−１アルファの活性化段階を説明するために、活性化ＡＭＰＫ酵素が細胞中でミクロソームとともにグルコーストランスポータータンパク質を筋肉細胞膜へ輸送し、ＧＬＵＴ−４（グルコーストランスポーター４）の上昇を引き起こす。最後に、Ｐ３８ＭＡＰＫがリン酸経路を通過し最後にＰＣＧ−１が活性化される。
【０００８】
活性化ＰＧＣ−１アルファは、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル系を通じてＦｏｘ０−リン酸化し、核局在化及びアトロジン−１の転写を阻止する。即ち、ＰＣＧ−１アルファの過剰発現はアトロジン−１の発現を抑制し、筋障害を防止することが予想される。Ｃ１Ｃ１２筋管の場合、ＰＧＣ−１発現は、アトロジン−１アルファの発現に低減されることが示される（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｖｅｓｔ．、１１７、ｐｐ．３９４０−３９５１、２００７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６、８５８、６１８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｍ  Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ、１０２、ｐｐ．１６５４−１６６２、２００８
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、８２、ｐｐ．９６９−９７５、２００８
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｚｖｅｓｔ．、１１７、ｐｐ．３９４０−３９５１、２００７
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３（４４）、ｐｐ．１６２６０−１６２６５、２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＰＧＣ−１アルファ活性化と密接に関連するＡＭＰＫを活性化するために、メトホルミンと呼ばれる薬剤がある。メトホルミンは化学的にはビグアニドとして分類され、その平均投与量は最大一日２５００ｍｇであり、適切な投与方法としては、５００ｍｇ又は７５０ｍｇ錠剤を食間に一日２、３回である。これが、非インスリン依存糖尿病としての糖尿病治療を行う患者に用いられる場合、血糖値はグルコースの生成を抑制することで制御される。
【００１３】
しかしこれまで、本発明の医薬組成物に関する報告はなかった。本発明の医薬組成物は、経口医薬組成物であり、メトホルミン及びロスバスタチンを含み、これにより、スタチンの副作用を低減し、一日１回投与の安全性、患者の利便性とコンプライアンスを強化することができ、前記医薬組成物の初期有効血中濃度を制御し、徐放性組成物として供され、生体中で安定したレベルを維持し、高脂血症の予防及び治療のために有用な有効量を安定して供給する、ものである。
【００１４】
本発明の発明者は、前記医薬組成物を研究し、メトホルミンとロスバスタチンを含む医薬組成物が、スタチンの副作用を低減し、一日１回投与の安全性、患者の利便性とコンプライアンスを強化することができ、前記医薬組成物の初期有効血中濃度を制御し、徐放性組成物として供され、生体中で安定したレベルを維持し、高脂血症の予防及び治療のために有用な有効量を安定して供給する、ものであることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記の課題を達成するために、本発明は、メトホルミン（メトホルミン及びその薬物的に許容される塩の治療的有効量）及びロスバスタチン（ロスバスタチン及びその薬物的に許容される塩の治療的有効量）を含み、ロスバスタチンの副作用を低減させ、高脂血症を予防及び治療する医薬組成物を提供する。
【００１６】
１つの実施態様では、本発明は、（ａ）治療的有効量のメトホルミン又はその薬物的に許容される塩、（ｂ）徐放性担体及び（ｃ）治療的有効量のロスバスタチン又はその薬物的に許容される塩を含む、医薬組成物を提供する。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は、（ａ）治療的有効量のメトホルミン又はその薬物的に許容される塩、（ｂ）徐放性担体、（ｃ）治療的有効量のロスバスタチン又はその薬物的に許容される塩、及び（ｄ）賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００１８】
ここで定められる用語「メトホルミンの薬物的に許容される塩」には、メトホルミンの全ての塩を含み、薬物的に許容される塩、好ましくはメトホルミンＨＣｌ塩、メトホルミンアセチルサリチル酸塩、メトホルミンフマル酸塩、メトホルミンコハク酸塩、メトホルミンマレイン酸塩、メトホルミンマロン酸塩などであり、より好ましくはメトホルミンＨＣｌ塩が含まれるが、これらの限定されない。
【００１９】
ここで定められる用語「ロスバスタチンの薬物的に許容される塩」には、薬物的に許容される全ての塩、好ましくはロスバスタチンカルシウム塩、ロスバスタチンＨＣｌ塩、ロスバスタチンアセチルサリチル酸塩、ロスバスタチンフマル酸塩、ロスバスタチンコハク酸塩、ロスバスタチンマレイン酸塩、ロスバスタチンマロン酸塩などであり、より好ましくはロスバスタチンカルシウム塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
ここで定められる用語「副作用」には、スタチンにより起こるものであり、好ましくは筋肉痛、筋肉細胞障害、横紋筋融解症などであり、より好ましくは横紋筋融解症が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
ここで定められる用語「徐放性担体」は、血液中濃度の急上昇による副作用を抑制し、その徐放の適切なタイミングを維持するものを含むが、これに限定されない。
【００２２】
１以上の担体が以下のもの、即ち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、アルキルヒドロキシプロピリメチルセルロース、プロピレンオキシド、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポビドン及びその誘導体、コーンスターチ、ポテトスターチ、前ゲル化スターチ及びその誘導体、ヒドロキシエチルスターチ、デキストリン及びその誘導体、デキストラン、マルトデキストリン、ポリデキストロース、アルギン酸及びその誘導体、グアガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、シクロデキストリン、アラビアゴム、ジェランガム、カラヤゴム、カゼイン、タラガム、タマリンドガム、トラガカントゴム、ガッチガム、ゼラチン、コラーゲン、プロタミンゼイン、ゼイン、カルボマー、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、グルコマンナン、グルコサミン、アラビノガラクタン、フルセレラン、ポルラン、ポリウレタン、キトサン、キチン、アガー、ペクチン、カラギーナンであり、好ましくは、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポビドン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、より好ましくは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、最も好ましくは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択されるが、それらに限定されない。その量は錠剤又は製品中に約１％〜８０％含まれる。
【００２３】
ここで薬物コーティング層、簡単な医薬組成物又は追加のマトリクス層として定められる用語「賦形剤」は、以下のものを含むがそれらに限定されない。即ち、ミクロ結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、アルキルヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテート、セルロースアセテートナフタレート、プロピレンオキシド、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポビドン及びその誘導体、コーンスターチ、ポテトスターチ及びその誘導体、ヒドロキシメチルスターチ、デキストリン及びその誘導体、デキストラン、マルトデキストリン、ポリデキストロース、グアガム、ロカストビーンガム、キサンタンガム、シクロデキストリン、アラビアゴム、ジェランゴム、カラヤゴム、カゼイン、タラガム、タマリンドガム、トラガカントガム、ガッチガム、ゼラチン、コラーゲン、プロタミン、カルボマー、ポリアクリリアミド、カルナウバワックス、ビイーズワックス、スクロース、脂質スクロース、ラクトース、ポリビニルアセテート、ジエチルアミノアセテート、さらに、ポリウレタン、キトサン、キチン、アガー、ペクチン、カラギーナン又はシェレックが含まれ、好ましくはポリビニルアルコール、セルロースアセテート、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリビニルアルコール、より好ましくはヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリビニルアルコール、さらに好ましくはヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリビニルアルコールであり、その量は錠剤中に０．０１〜５０％が含まれる。
【００２４】
以下、製造プロセスの例を示す：
ステップ（１）は、メトホルミン、徐放性担体及び／又は賦形剤を混合した後の乾燥顆粒を製造する。
【００２５】
ステップ（２）は、ステップ（１）の混合顆粒及び／又は活性成分（ロスバスタチン又はロスバスタチン乾燥顆粒）との錠剤を調製する。
【００２６】
ステップ（３）はステップ（２）の錠剤をコーティング剤及び／又は活性成分（ロスバスタチン又はロスバスタチン乾燥顆粒）でコーティングする。
【００２７】
ステップ（４）は、ステップ（３）のコーティングされた錠剤をさらに、フィルム形成賦形剤でコーティングする。上述のプロセスを通じて、本発明の「メトホルミン及びロスバスタチンを含む医薬組成物」が製造され得る。
【００２８】
本発明は、経口医薬組成物に関し、その活性成分がメトホルミン及びロスバスタチンであり、これにより、スタチン系による副作用を低減し、一日１投与の安全性、患者の便利性及びコンプライアンスを強化するものである。さらに、これは、前記医薬の初期有効血中濃度を制御し、制御された徐放性医薬組成物として供され、前記薬物の血中の濃度を安定に維持し、安定した効果を与えることができる。
【００２９】
以下本発明の製品の成分及び原理についてより詳細に記載する。
【００３０】
本発明の製品は、メトホルミン、１つのビグアニド及びロスバスタチン、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤を医薬活性成分として含み、特に前記製品は１日１回投与される。
【００３１】
とくに前記医薬組成物の主成分のロスバスタチンの有効投与量は、約１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約３ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは約５ｍｇ〜３０ｍｇの範囲である。メトホルミンについては、約１００ｍｇ〜約２５００ｍｇ、好ましくは約１５０ｍｇ〜１５００ｍｇ、より好ましくは約２００ｍｇ〜１１００ｍｇの範囲である。さらに好ましくは、ロスバスタチン／メトホルミン系の有効投与量については、以下の投与量が１日１回投与される；５ｍｇ／２５０ｍｇ、５ｍｇ／５００ｍｇ、５ｍｇ／１０００ｍｇ、１０ｍｇ／２５０ｍｇ、１０ｍｇ／５００ｍｇ、１０ｍｇ／１０００ｍｇ、２０ｍｇ／２５０ｍｇ、２０ｍｇ／５００ｍｇ、２０ｍｇ／１０００ｍｇである。
【００３２】
好ましい実施態様では、（ａ）メトホルミン（治療的に有効なメトホルミン又はその医薬的に許容される塩の量）、（ｂ）徐放性担体及び（ｃ）ロスバスタチン（治療的に有効なロスバスタチン又はその医薬的に許容される塩の量）の混合物の比は、１：０．０１〜５：０．００１〜０．５、好ましくは１：０．０５〜２：０．００５〜２：０．００５〜０．０２５；であり、（ａ）メトホルミン（治療的に有効なメトホルミン又はその医薬的に許容される塩の量）、（ｂ）徐放性担体、（ｃ）ロスバスタチン（治療的に有効なロスバスタチン又はその医薬的に許容される塩の量）及び（ｄ）賦形剤の混合物の比は、１：０．０１〜５：０．００１〜０．５：０．０１〜５、好ましくは、１：０．０５〜２：０．００５〜０．０２５：０．００５〜０．０２５である。
【００３３】
本発明の医薬医薬組成物の構成は、メトホルミンが徐放性パターンを示し、２〜２４時間の間、好ましくは４〜２０時間の間、より好ましくは６〜１６時間の間に水又は生理的ｐＨ溶解媒体中に一定に溶出され、ロスバスタチンが即時放出パターン又は徐放パターンを示す。即時放出パターンを示す場合には、５０〜１００％、又は好ましくは７０〜９０％が水又は生理的ｐＨ溶解媒体中に、約１０〜６０分、好ましくは約２０〜５０分、より好ましくは約２５〜４０分で溶出される。徐放性を示す場合は、約１〜２４時間、好ましくは約４〜２０時間、より好ましくは約６〜１６時間又はそれ以上の間一定に放出される。
【００３４】
活性成分としてメトホルミン及びロスバスタチンを含む本発明の医薬組成物は、それらを同時に活性成分、徐放性担体及び賦形剤と共に用いることで、副作用を抑制し、投与量の徐放性を制御し、かつ前記薬物の安定レベルの溶出速度を維持する効果を持つ。
【００３５】
本発明の医薬組成物中に１部分として含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトトール、スターチ、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ミクロ結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルから選択される。処方される場合には、噴射剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。
【００３６】
本発明の医薬組成物の好ましい投与量は患者の状態及び体重、疾患の状況、薬物のタイプ、投与経路及び投与期間に依存するが、それは当業者により適切に選択され得ることである。
【００３７】
メトホルミン及びロスバスタチンを含む本発明の医薬組成物の成分及び原理は以下詳細に説明される。
【００３８】
この医薬組成物の製造手順の例は次のステップを含む。
【００３９】
第１のステップ（ａ）は、（１）メトホルミン及び（２）１以上のカルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒトヂキシメチルセルロース、  ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの徐放性担体を適切な比で混合して後乾燥顆粒を製造することである。
【００４０】
第２のステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）からの顆粒に賦形剤及び／又は活性成分（ロスバスタチン又はロスバスタチン乾燥顆粒）を添加し、錠剤プレスを用いて錠剤を調製することである。
【００４１】
第３のステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の錠剤をコーティング剤及び／又は活性成分（ロスバスタチン又はロスバスタチン乾燥顆粒）でコーティングすることである。
【００４２】
最後のステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）でコーティングされた錠剤を最終的にフィルムコーティングするプロセスを含むことで、本発明の医薬組成物の製造方法を提供する。本発明の医薬組成物の製造に関与する全ての手順は通常のプロセスに従い実施され得る。
【００４３】
医薬的に許容される賦形剤は、前記顆粒製造（ステップ（ａ））の手順の間、錠剤製造（ステップ（ｂ））の手順の間、混合手順（ステップ（ｃ））の間に添加され得る。
【００４４】
さらに、錠剤の表面のフィルム層形成（ステップ（ｄ））は、ステップ（ａ）の顆粒生成へ、ステップ（ｂ）の錠剤形成へ及び／又はステップ（ｃ）の錠剤コーティングへ追加され得る。
【００４５】
さらに、本発明は、医薬組成物の製造方法を提供することを含み、これは上述のプロセスを用いて製造される（ａ）乾燥顆粒を添加する追加のステップを含み、（ｂ）上述の徐放性担体、（ｃ）ロスバスタチン（ロスバスタチン又はロスバスタチンの医薬的に許容される塩の治療的有効量）及び（ｄ）医薬的に許容される賦形剤を含む。
【００４６】
医薬産業で知られる賦形剤は、前記医薬組成物に添加され得るものであり、次のものが含まれる：バインダ、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、保存剤、甘味剤、芳香剤、安定化剤、湿潤剤、  緩衝液、抗微生物剤、増量剤、酸化防止剤又は希釈剤などである。
【００４７】
本発明で使用され得る１以上のバインダは、さらに次の共通するバインダ：好ましくは水、有機溶媒、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ミクロ結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストリン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ゲル化前スターチ又はアラビアゴムから選択される。
【００４８】
崩壊剤は、以下の共通する崩壊剤：好ましくはスターチグリコレートナトリウム、  クロスポビドン、クロスリンク化カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、スターチ、カルボキシメチルセルロースカルシウム及びそれらの混合物、から選択され得る。
【００４９】
潤滑剤は、共通する以下の潤滑剤：好ましくはステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、軽無水珪酸及びそれらの混合物から選択され得る。
【００５０】
湿潤剤は、共通する以下の湿潤剤：好ましくはポリエチレングリコール、分子量が２００００未満で構造中にアルコール性ヒドロキシ基を有する化合物又はそれらの混合物、から選択され得る。
【００５１】
必要な場合には、１以上の以下の着色剤：二酸化チタン、鉄酸化物、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、アルミニウムレーキなど、が錠剤に添加され得る。
【００５２】
本発明の１以上の保存剤は、安息香酸、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどから選択され得る。これらの他に甘味剤、芳香剤、安定化剤及び希釈剤もまた添加され得る。
【００５３】
本発明の医薬組成物を用いて一連の経口組成物が製造され得る。例えば、メトホルミン及びロスバスタチンを活性成分として含み、かつ医薬的に許容される塩である上述の賦形剤との組合せで、直接圧縮錠剤、圧縮コーティング錠剤、二層錠剤及び三層錠剤を製造可能である。
【００５４】
上述のように、メトホルミン、ロスバスタチン、徐放性担体及び／又は賦形剤を含む本発明の経口医薬組成は、スタチンによる副作用を低減し、１日１回投与の安全性、患者の利便性及びコンプライアンスを強化する。さらに、前記薬物の初期有効血中濃度を制御し、徐放性により生体内で安定したレベルで前記薬物の濃度を維持し、高脂血症を予防し治療するための医薬組成物として有利に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、実施例２〜４、及び比較実施例１（「ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ」社製品「Ｃｒｅｓｔｏｒ（Ｒ）」）でのロスバスタチンの溶解試験の結果を示す。
【図２】図２は、実施例２〜４、及び比較実施例２（「Ｍｅｒｃｋ」社製品「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ  ＸＲ（Ｒ）」）でのロスバスタチンの溶解試験の結果を示す。
【図３】図３は、ロスバスタチン（Ａ）の濃度に依存するアトロジン−１の発現レベル、及びメトホルミン（Ｂ）の濃度に依存するＰＧＣ−１の発現レベルを示す。
【図４】図４は、ロスバスタチン及び／又はメトホルミンが以下の方法でラット筋芽細胞株Ｌ６で処置された際の細胞数を示す：ここで、Ａ：  ネガティブコントロール；Ｂ：  ２０μＭのロスバスタチン；Ｃ：  ２０μＭのロスバスタチン及び１μＭののメトホルミン；Ｄ：  ２０μＭのロスバスタチン及び１０μＭののメトホルミン；Ｅ：  ２０μＭのロスバスタチン及び２０μＭののメトホルミン；Ｆ：  ２０μＭのロスバスタチン及び１００μＭののメトホルミンを示す。
【図５】図５は、２０μＭのロスバスタチン及び種々の濃度のメトホルミンにおける細胞生存数を示す。
【図６】図６は、ネガティブコントロール、２０μＭのロスバスタチン及び２０μＭのロスバスタチンと２０μＭのメトホルミン、でのアトロジン−１の発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下の記載及び実施例は本発明の選択された実施態様を説明する。これらに基づき、変法・変更などが当業者に示唆され、それらは全て本発明の本質及び範囲に含まれる。
【００５７】
実施例１：徐放性顆粒の調製
１−１．徐放性乾燥メトホルミン顆粒の調製
メトホルミン塩酸塩（Ｇｒａｎｕｌｅｓ、Ｉｎｄｉａ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２２０８（Ｍｅｔｏｌｏｓｅ  ９０ＳＨ−１０００００ＳＲ、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０１（Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ６０３、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ）、ミクロ結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ１０２、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｂｌａｎｏｓｅ  ７ＨＦ、Ａｑｕａｌｏｎ）を高速ミキサ（ＳＰＧ−２、Ｄａｌｔｏｎ）中で５分間混合し；その後湿式顆粒方法で生成された混合物を約１時間乾燥オーブン中で５０〜７０℃で乾燥し、シーブメッシュ番号３で篩分けした。最後に前記混合物から、下表１の組成物に従って徐放性を持つ乾燥メトホルミン顆粒を製造した。
【００５８】
【表１】
2013516409.tif 000002
１−２.ロスバスタチン顆粒の調製
ロスバスタチンカルシウム（Ｂｉｏｃｏｎ、Ｉｎｄｉａ）、リン酸カルシウム（Ｃａｌｉｐｈａｒｍ  Ｔ、Ｉｎｎｏｐｈｏｓ）、ミクロ結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ１０２、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）及びラクトース（Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ、ＤＭＶ−Ｆｏｎｔｅｒｒａ）を５分間混合し、シーブメッシュ番号４０で篩分けし、その後これとクロスポビドン（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  ＣＬ、ＢＡＳＦ）及びステアリン酸マグネシウム（Ｊｕｎｓｅｉ）と混合し、これをシーブメッシュ番号３０で高速ミキサー（ＳＰＧ−２、Ｄａｌｔｏｎ）中で５分間篩分けした。最後に前記乾燥ロスバスタチン顆粒を、下表２の組成物に従って製造した。
【００５９】
【表２】
2013516409.tif 000003
実施例２：医薬組成物（１）の調製
２−１．錠剤の調製
実施例１−１で調製された徐放性を持つ乾燥メトホルミン顆粒を、ステアリン酸マグネシウム（錠剤当たり１０ｍｇ、表１と同量）と完全に混合し、シーブメッシュ番号３０で篩分けし、その混合物を錠剤プレス  （Ｅｋ０、Ｋｏｒｓｃｈ）を用いて通常の圧力で錠剤に錠剤化した。その後１錠剤当たりメトホルミン１０３０ｍｇを含む白色徐放性錠剤を１００製造した。
【００６０】
２−２．錠剤のコーティング
実施例２−１で調製された徐放性錠剤をコーティングパン（Ｈｉ−ｃｏａｔｅｒ、Ｓｅｊｏｎｇ  Ｐｈａｒｍａ  Ｔｅｃｈ）上に置き、空気で満たして３０〜４５℃に維持した。表３の組成に従い、ロスバスタチン及びオパドライ（Ｏｐａｄｒｙ、ＰＶＡが４５．５２％含まれるコーティング剤、Ｃｏｌｏｒｃｏｎ）とを４倍量の水中で懸濁させ、その後得られた懸濁液を前記乾燥錠剤上に、空気厚を用いてスプレー装置で噴霧し、その後約１０分間乾燥させた。オパドライ（Ｏｐａｄｒｙ、ＰＶＡが４５．５２％含まれるコーティング剤、Ｃｏｌｏｒｃｏｎ）の量は錠剤の全量に対して５％であった。さらに、錠剤の安定性を保証するために、追加のフィルムコーティング手順が、上述のコーティングの前／後で実施され得る。ただしここでは行わなかった。
【００６１】
【表３】
2013516409.tif 000004
実施例３：医薬組成物（２）の調製
３−１．二層錠剤の調製
実施例１−１で調製された徐放性を持つ乾燥メトホルミン顆粒をステアリン酸マグネシウム（錠剤当たり１０ｍｇ、表と同じ量）と完全に混合し、シーブメッシュ番号３０で篩分けし、得られた混合物と実施例１−２で調製された乾燥ロスバスタチン顆粒とを錠剤プレス（Ｅｋ０、Ｋｏｒｓｃｈ）を用いて、韓国薬局方に記載された製造方法により二層錠剤に錠剤化した。
【００６２】
３−２.錠剤のコーティング
上述の実施例３−１から得られた二層錠剤を、空気で満たされ３０〜４５℃に維持されたコーティングパン（Ｈｉ−ｃｏａｔｅｒ、Ｓｅｊｏｎｇ  Ｐｈａｒｍａ  Ｔｅｃｈ）に置いた。コーティング剤を表４の組成に従い調製した。その後コーティング剤を前記乾燥錠剤上に空気圧を用いて操作されたスプレー装置で噴霧した。その後約１０分間室温で乾燥させた。コーティング剤の量は、錠剤の全量に対して約４％であった。
【００６３】
【表４】
2013516409.tif 000005
実施例４：医薬組成物（３）の調製
４−１．単純医薬組成物の調製
実施例１−１から得られた徐放性を持つ乾燥メトホルミン顆粒を、ステアリン酸マグネシウム（錠剤当たり１０ｍｇ、表１と同じ量）と完全に混合し、シーブメッシュ３０で篩分けした。混合物を６０回回転させ、その後実施例１−２で得られた乾燥ロスバスタチン錠剤とともに６０回回転させた。その後混合物を錠剤プレス（Ｅｋ０、Ｋｏｒｓｃｈ）を用いて平均厚で錠剤へ錠剤化した。最後に単純医薬組成物が製造された。
【００６４】
４−２．錠剤のコーティング
上述の実施例４−１から得られた錠剤をコーティングパン（Ｈｉ−ｃｏａｔｅｒ、Ｓｅｊｏｎｇ  Ｐｈａｒｍａ  Ｔｅｃｈ）に置き、空気で満たし２０〜４５℃に維持した。コーティング剤を上の表４の組成に従い調製し、それを前記乾燥錠剤に空気圧で操作されるスプレー装置で噴霧した。それを約１０分間室温で乾燥した。コーティング剤の量は、全錠剤に対して約４％であった。
【００６５】
参考実施例１：細胞培養
ここで使用されたラット筋芽細胞株Ｌ６は韓国細胞株バンクから得た。細胞は、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、Ｌ−グルタミン、０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム及び１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、Ｔ−７５フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内で細胞数が１ｘ１０６に達するまで培養した。細胞を分化させるために、細胞を２％ＨＳ（馬血清、Ｇｉｂｃｏ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む培地に接種し、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でインキュベートした。培地を２日毎に交換し、３、４日毎に継体培養した。さらに、この実施例で使用した前記筋芽細胞は、使用する前には６ウェルプレート（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に０．３×１０６まで分化した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）で洗浄ステップの後、前記細胞はＥＬＩＳＡ、ＭＴＴ及びＰＣＲ分析に使用された。
【００６６】
参考実施例２：実験準備
２−１．試薬
Ｌ６株（骨格筋細胞）は韓国細胞株バンクから入手し、ＰＧＣ−１及びアトロジン−１α抗体はサンタクルーズバイオテクノロジ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びアブカム（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ、ＵＫ）からそれぞれ入手し、さらにウサギＩｇＧ−Ｈ＆Ｌに対する山羊ポリクローナル抗体第２抗体をアブカムから入手した。
【００６７】
細胞培地のために使用されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。トリプシン、ウシ胎児血清及び馬血清は全てＧｅｎＤＥＰＯＴから入手した。タンパク質アッセイ試薬はＢｉｏ−ｒａｄから入手した。
【００６８】
ＥＬＩＳＡで使用されるブロッキング緩衝液、ＴＭＢ溶液及びストップ溶液はＧｅｎＤＥＰＯＴから入手し、ＰＢＳはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。イムノ９６ウェルプレートはＮｕｎｃ（ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｕ１６  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手し、ＭＴＴアッセイ用のＭＴＴ溶液はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）から入手し、最後にＤＭＳＯはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
【００６９】
２−２．実験装置
実験には、ミクロプレート発光ジニアス（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｇｅｎｉｏｕｓ、Ｍｏｌｅｒｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）、遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、顕微鏡（ＩＳ−７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ）及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いた。
【００７０】
参考実施例３：統計分析
統計及び比較分析は、グラフパッドＰＲＩＳＭ統計パッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．００、  Ｇｒａｐｈｐａｄｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いて実施し、トルコの事後テスト（Ｔｕｒｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）により再確認した。全ての報告データは、平均±Ｓ．Ｄ．である。
【００７１】
実験例１：溶解試験
１−１．錠剤（１）の溶解試験
実施例２〜４で製造されたロスバスタチンの溶解試験が、韓国薬局方の溶解試験方法Ｎｏ．２により、表５で示される同じ条件に基づき実施された。
【００７２】
【表５】
2013516409.tif 000006
アッセイ：ロスバスタチンを分析するために、サンプル溶液を表６に従って、ＨＰＬＣ（ＭＤ−２０１０  ｐｌｕｓ、Ｊａｓｃｏ）を用いて行った。メトホルミンを分析するためにサンプル溶液を２０倍に希釈し、２３２ｎｍで分析した。
【００７３】
さらに、比較実施例１（製品「ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ」社の「Ｃｒｅｓｔｏｒ（Ｒ）」）及び比較実施例２（製品「Ｍｅｒｃｈ」社の「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ  ＸＲ（Ｒ）」）を、本発明の製品の溶解速度と比較のために同じ条件で実施した。
【００７４】
【表６】
2013516409.tif 000007
表７及び図１で示される結果によると、実施例２及び３で調製したロスバスタチンの溶解速度は、比較実施例１と同様に中間的パターンを示した。しかしロスバスタチンの溶解速度は１２時間一定を維持した。その徐放性が、初期段階に（表７及び図１を参照）薬物の急激な増加を抑制し得ることが証明される。
【００７５】
【表７】
2013516409.tif 000008
１−２．錠剤（２）の溶解試験
実施例２〜４でのメトホルミンの溶解速度を決定するために、実験例１−１と同じ方法で溶解試験を行った。実施例２〜４のメトホルミンの溶解速度は比較実施例２（表８及び図２を参照）と類似して１２時間一定であった。
【００７６】
【表８】
2013516409.tif 000009
実験例２：ＥＬＩＳＡによる抗体の識別
ロスバスタチン及びメトホルミンにおいてアトロジン−１及びＰＧＣ−１αの発現を確かめるために、それぞれの抗体を処理し分析した。アッセイ希釈緩衝液で１０μｌ／ｍＬに希釈された血清サンプルの１００μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のそれぞれのウェルに分配し、４℃で一晩（１２時間）インキュベートした。非結合材料を、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）含むリン酸緩衝生理的食塩水で４回洗浄して除去した。
【００７７】
前記プレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）含むリン酸緩衝生理的食塩水で４回洗浄し；ＰＢＳに１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を含む２００μｌのブロッキング溶液（ＧｅｎＤＥＰＯＴ）をそれぞれのウェル上に播種し、４℃で２時間インキュベートした。
【００７８】
ＰＢＳ−Ｔ及びアッセイ希釈緩衝液中で１：１０００希釈された第１抗体（Ａｂｃａｍ）で４回洗浄し；その後それぞれのウェルが、ウェル当たり１００μｌを重複して試験され、室温で４時間インキュベートされた。
【００７９】
ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、アッセイ希釈緩衝液で１：１０００希釈された１００μｌのウサギ抗ウシＩｇＧ−ＨＲＰを全てのウェルに添加して、前記プレートを室温で１時間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。３０％Ｈ２Ｏ２を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の新たに調製したテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液をそれぞれのウェルに添加した。室温で１５分後、５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を止めた。その後ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸収を測定した。
【００８０】
図３Ａに示されるように、ロスバスタチン濃度が増加するに従い、アトロジン−１のタンパク質発現が増加した。
【００８１】
図３Ｂに示されるように、０．１μＭのメトホルミンの処理は、ネガティブコントロールと比べて有意差を示さなかったが、一方１μＭを超えるメトホルミンの処理はＰＧＣ−１αの増加を起こした（図３参照）。
【００８２】
実験例３：細胞形態
メトホルミンの濃度によるＬ６細胞株の形態を比較するために、０．５ｘ１０５筋細胞を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のそれぞれに播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間３７℃でインキュベーターした。２０μｌのロスバスタチンで処理し、０、１、１０、２０及び１００μＭのメトホルミンでそれぞれ処理した。４８時間後、それらの全てを顕微鏡で観察した（ＩＳ−７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ）。
【００８３】
図４に示されるように、ロスバスタチンの２０μＭで処理されたＬ６細胞のコンフルエンスは、処置のされていないグループに比較して大きく減少していた。しかしＬ６細胞のコンフルエンスはメトホルミンの増加とともに増加した。従って、ロスバスタチンによる筋肉障害がメトホルミンを添加することで低減することが予想される（図４参照）。
【００８４】
実験例４：ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイは、Ｌ６筋細胞の生存率を決定することで実施された。１ｘ１０４細胞が９６ウェルプレートのそれぞれに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間３７℃でインキュベートした。
【００８５】
ロスバスタチンは２０μＭで処理し、メトホルミンは０、１０、２０及び１００μＭで処理した。それらを４８時間インキュベーター内でインキュベートし、それぞれのウェルを１ｍｇ／１ｍｌのＭＴＴ溶液で処理し、さらに２時間インキュベーター内でインキュベートした。その後それぞれのウェルをＤＭＳＯで処理し、ホルマザンを溶解するために１０分間ホイルでカバーした。最後に、ホルマザンの光学密度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍで測定した。
【００８６】
図５に示されるように、２０μＭのロスバスタチンのみで処理したグループは細胞の生存率の有意な減少が見られた。しかし、ロスバスタチンとメトホルミンとの組合せ処理では、メトホルミン濃度が増加するにつれて細胞生存率は増加した。特にロスバスタチンのみのグループと比較して、２０μＭのロスバスタチンと２０μＭのメトホルミンで処理したグループは３１．６％の増加が見られ、２０μＭのロスバスタチンと１００μＭのメトホルミンで処理したグループでは３９．９９％増加した。これにより、メトホルミンをロスバスタチンへ添加することは細胞生存率を増加させ、その結果ロスバスタチンによる細胞障害を抑制する、ということが示唆された（図５参照）。
【００８７】
実験例５：ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写）
メトホルミンの濃度に依存する筋細胞中のアトロジン−１のｍＲＮＡレベルを測定するために、前記細胞を５００μｌのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズし、及び３μｇの全ＲＮＡを細胞スクラパーを用いて集めた。筋細胞から抽出した全ＲＮＡを２μｌの５Ｘ緩衝液ＲＴ、１μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれのｄＮＴＰ５ｍＭ）、０．５μｌのＲｎａｓｅ阻害剤（１０ユニット／μｌ）、２ユニットのオムニスクリプト逆転写酵素（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、及び２０μｌのＲｎａｓｅフリー水（ＤＥＰＣ）の混合物中に入れ；逆転写反応を、３７℃で６０分及び７２℃で１５分実施してｃＤＮＡを合成した。ミニサイクラ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲを行った。３μｌの合成ｃＤＮＡを２μｌの１０ｘ緩衝液（Ｃｏｓｍｏ−Ｇｅｎｔｅｃ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれのｄＮＴＰ５ｍＭ）、０．３μｌの１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｏｓｍｏ−Ｇｅｎｔｅｃ）混合物中に入れ；２μｌのそれぞれのプライマ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ製）及び水を添加して全容量を２０μｌにし；増幅させた。
【００８８】
ＰＣＲでは、最初の変性を９６℃で３分間行い、３０秒間９６℃、３０秒間５５℃及び３０秒間７２℃の３０サイクルを行い；伸長反応を７２℃で５分間実施した。さらにβアクチンでは２６サイクル行った。ＲＴ−ＰＣＲで使用されたプライマは下表９に示される。
【００８９】
【表９】
2013516409.tif 000010
図６に示されるように、アトロジン−１のｍＲＮＡ発現は、ネガティブコントロールに比較して２０μＭのロスバスタチンで処理されたグループで増加が見られた。しかし、２０μＭのロスバスタチンと２０μＭのメトホルミンで処理されたグループはアトロジン−１のｍＲＮＡ発現の減少が見られた。従ってこのことは、メトホルミンをロスバスタチンへ添加することで、アトロジン−１のｍＲＮＡ発現がブロックされたということであり、ロスバスタチンによるＬ６筋細胞障害が抑制される、ということを示唆する（図６参照）。
【００９０】
参考実施例、実施例及び実験例に関連して説明された本発明は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００９１】
本発明はメトホルミン及びロスバスタチンの経口医薬組成物に関する。詳細には、メトホルミン及びロスバスタチン、徐放性担体及び／又は賦形剤を含む本発明の医薬組成物は、スタチン系による副作用を低減させ、かつ１日１回投与の安全性、患者の利便性及びコンプライアンスを強化するものである。さらに、前記薬物の初期血中有効濃度を制御し、徐放性による生体内での安定したレベルで薬物の濃度を維持することができ、高脂血症を予防及び治療する医薬産業分野において適用される得るものである。
【図１】
2013516409.tif 000011
【図２】
2013516409.tif 000012
【図３】
2013516409.tif 000013
【図５】
2013516409.tif 000014
【図４】
2013516409.tif 000015
【図６】
2013516409.tif 000016
【国際調査報告】
2013516409.tif 000017
2013516409.tif 000018