(57)【要約】  本発明は、特定される総ＢＢＩタンパク質濃度、および（例えばキモトリプシン阻害物質活性および内毒素含量をはじめとする）他のＢＢＩの特性を有する、ＢＢＩ生成物を精製する新規方法について記載する。
2013516429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物を精製する方法であって、
（ａ）大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームにクロマトグラフ分離を施すステップと；
（ｂ）任意選択的に、大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに１つまたは複数の分離技術を施すステップと、
を含み、少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物が得られる方法。
【請求項２】
クロマトグラフ分離が、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフ分離が、イオン交換カラムを含んでなるイオン交換クロマトグラフィーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イオン交換カラムが、アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、またはその組み合わせを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
イオン交換カラムが前記ＢＢＩ生成物を保持する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
イオン交換カラムが前記ＢＢＩ生成物を保持しない、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の分離技術が、膜分離、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、重力分離、および任意のその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の分離技術が膜分離である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
大豆加工ストリームが、少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2の体積流量で膜を通過する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
体積流量が、約１〜約４００リットルの流体／時間−ｍ2である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
大豆加工ストリームが、約０℃〜約１００℃の温度で膜を通過する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
大豆加工ストリームが、約２５℃〜約７５℃の温度で膜を通過する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
膜が、精密濾過膜、限外濾過膜、またはその組み合わせを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨを調節してＢＢＩタンパク質の等電点未満に保ち、前記イオン交換樹脂によるＢＢＩタンパク質の保持を提供するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＢＩタンパク質が前記イオン交換樹脂によって保持されないように、ｐＨを調節してＢＢＩタンパク質の等電点よりも高く保つステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
１つまたは複数の分離技術が、前記クロマトグラフ分離に先だって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたは複数の分離技術が、前記クロマトグラフ分離の後に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
精製ＢＢＩ生成物が、少なくとも約９５質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
精製ＢＢＩ生成物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および任意のその組み合わせと少なくとも９０％の同一性を有する、少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
精製ＢＢＩ生成物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および任意のその組み合わせと少なくとも９５％の同一性を有する、少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物を精製する方法であって、
（ａ）大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに１つまたは複数の分離技術を施すステップと；
（ｂ）大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームにクロマトグラフ分離を施すステップと
を含み、少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物が得られる、方法。
【請求項２２】
少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物を精製する方法であって、
（ａ）大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに少なくとも１つの分離技術を施して、前記大豆タンパク質を含んでなる第１の透過液と、前記不純物を含んでなる第１の残余分を形成するステップと；
（ｂ）前記第１の透過液に少なくとも１つの分離技術を施して、不純物を含んでなる第２の透過液と、大量のタンパク質留分を含んでなる第２の残余分を形成するステップと；
（ｃ）少なくとも１つのクロマトグラフ分離に通過させるために、前記第２の残余分をキャリアストリームと合わせて、前記加工ストリーム中の他のタンパク質からＢＢＩタンパク質ストリームを単離するステップと；
（ｄ）前記ＢＢＩタンパク質ストリームを液体沈殿媒体と合わせ、それに少なくとも１つの分離技術を施して、沈殿ＢＢＩタンパク質画分を形成するステップと；
（ｅ）前記沈殿ＢＢＩタンパク質画分を液体洗浄剤と合わせて、可溶化ＢＢＩタンパク質画分を形成するステップと；
（ｆ）前記可溶化タンパク質画分に少なくとも１つの分離技術を施して、精製可溶化ＢＢＩタンパク質画分を形成するステップと；
（ｇ）前記精製可溶化タンパク質画分に少なくとも１つの分離操作を施して、精製ＢＢＩ生成物を形成するステップと
を含み、少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物が得られる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、２００９年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２９１，３１２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、精製ボーマン・バークインヒビター（ＢＢＩ）プロテインを大豆加工ストリームから回収する方法を提供する。具体的には、本開示は、ＢＢＩ生成物をクロマトグラフ分離するステップを含み、ＢＢＩ生成物を単離し除去する１つまたは複数の分離技術が含まれていてもよい方法を提供し、ＢＢＩ生成物は、少なくとも９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度で表される純度を有する。
【背景技術】
【０００３】
大豆加工ストリームは、相当量のプロテアーゼインヒビターを含有する。プロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシン、キモトリプシンを阻害し、そして一連の様々な重要代謝機能を制御する、多様な他の重要な膜貫通プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。プロテアーゼインヒビターの局所投与は、数カ所に局在していてもまたは身体の大きな部分に関わっていてもよい、皮膚炎症の一般的な形態であるアトピー性皮膚炎などの病状において用途がある。プロテアーゼインヒビターの色素除去活性、および紫外線誘発色素沈着を予防するそれらの能力は、生体外および生体内の双方で実証されている（例えば、Ｐａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１６：５８７−５９５［２００１］を参照されたい）。プロテアーゼインヒビターはまた、創傷治癒を促進することが報告されている。例えば分泌型白血球プロテアーゼインヒビターを局所的に塗布すると、組織破壊が逆転し、創傷治癒過程を加速することが実証された。さらにセリンプロテアーゼインヒビターは、紅斑性狼瘡患者において疼痛を軽減させる一助にもなり得る（例えば、米国特許第６，５３７，９６８号明細書を参照されたい）。
【０００４】
天然プロテアーゼインヒビターは、穀類（オート麦、大麦、およびトウモロコシ）、芽キャベツ、タマネギ、ビート根、小麦、シコクビエ、および落花生などの多様な食物に見られる。関心のもたれる供給源は、大豆である。大豆中に存在するプロテアーゼインヒビターの平均レベルは、２つの最重要なプロテアーゼインヒビターであるＫｕｎｉｔｚおよびボーマン・バークで、それぞれ約１．４％および０．６％である。
【０００５】
ボーマン・バークプロテアーゼインヒビター（ＢＢＩ）として知られているプロテアーゼインヒビターは、トリプシンおよびキモトリプシンの低分子量タンパク質（７〜８ｋＤａ）両刃阻害物質であり、大豆から単離される。それは６０年以上前に初めて発見され（Ｂｏｗｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．，１９４６，６３，５７４；引き続いてＢｉｒｋ，Ｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９６１，５４，３７８−３８１；およびＢｉｒｋ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，１９６８，Ｖｏｌ．１２，２５−２９によってさらに特性解析された）、いくつかの実験系における、その強力な抗発癌性効果の発見以来、科学研究コミュニティから新たな関心が寄せられている。
【０００６】
トリプシンおよびキモトリプシン阻害性に加えて、ＢＢＩはまた、カテプシンＧ、エラスターゼ、およびキマーゼなどの他のプロテアーゼ活性を阻害する能力も有する（そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、Ｂｉｒｋ  Ｙ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ，１９８５，２５：１１３−１３１；Ｌａｒｉｏｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ，１９９３，５８：１４３７−１４４４；およびＷａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  １９９７，３４４：１３３−１３８）。ＢＢＩタンパク質は、およそ６５〜７７個のアミノ酸残基と、およそ７つのジスルフィド架橋からなる。ＢＢＩは、そのアミノ酸システインの高濃度（約２０質量％）、高水溶解性、熱変性耐性、および独立した阻害部位でトリプシンとキモトリプシンを阻害する能力を有することで特徴付けられる、タンパク質である。
【０００７】
粗製および精製ＢＢＩのどちらも、培養中、および実験動物中において、様々な各種誘発性の細胞悪性形質転換を予防し、または軽減させることが良く知られている（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｔｈｅ  Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎｓ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ，Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒ，１９９８：６８，１４０６Ｓ−１４１２Ｓ）。例えば（１）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ：ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ７８：１６７−２０９，１９９８；（２）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ：Ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ；（３）Ｔｒｏｌｌ，Ｗ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｅｄｓ．；Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，９−６４，１９９３；（４）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｓｚｕｈａｊ，Ｂ．Ｆ．，Ｎｅｗｂｅｒｎｅ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｉｌｌｉｎｇｓ，Ｐ．Ｃ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ，Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ．Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  １９：２８１−３０２，１９９３；（５）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（ｓｕｐｐｌ．）．５４：１９９９ｓ−２００５ｓ，１９９４；（６）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ；Ｔｒｏｌｌ，Ｗ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｅｄｓ．；Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，６５−９１，１９９３（７）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ．Ｉｎ：Ｓｏｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｈｉｈｉｒｏ  Ｓｕｇａｎｏ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，ｐｐ．２０７−２２３，２００５；（８）Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｒｉａｌｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｂｏｗｍａｎ  Ｂｉｒｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ．２００６年１０月１２および１３日にＤｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙで開催されたシンポジウム「Ｓｏｙ  ＆  Ｈｅａｌｔｈ  ２００６；Ｄｉｅｔｅｔｉｃ  ��ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ｄｉｅｔｅｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」議事録（近刊）；（９）Ｂａｒｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｇｅｒｈａｅｕｓｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｋｎａｓｍｕｌｌｅｒ，Ｉａｎ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄａｖｉｄ  ＤｅＭａｒｉｎｉ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｉｓｓａ  Ｇｅｒｈａｕｓｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．，ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００９もまた参照されたい。
【０００８】
一般にボーマン・バークインヒビター濃縮物（ＢＢＩＣ）と称されるＢＢＩに富んだ大豆抽出物は、１９９２年４月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）において治験薬（ＩＮＤ）の地位を得た。ＢＢＩＣは、特定条件下で細胞の悪性形質転換に対して阻害活性を示すことが示されており、その投与は、様々な形態の癌に作用することが示されている。例えば米国特許第７，４０４，９７３号明細書を参照されたい。さらなる例として、全生涯にわたって１．０％の食餌性ＢＢＩＣを与えられた動物は、成長に異常がないことが示され、寿命が顕著に長くなることが分かっている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，１９：２８１−３０２）。
【０００９】
ＢＢＩＣはまた、動物モデルおよびヒト臨床試験において、口腔癌、筋ジストロフィーの治療、筋肉消耗予防、抗炎症活性、放射線防護活性において作用することが示されている。（例えばＫｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｓｏｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，２００５、および米国特許公開公報第２００８／０３００１７９Ａ１号明細書を参照されたい）。ＢＢＩＣはまた、マウスにおいて腹腔内注射に続いて、肺、腎臓、および肝臓組織中で、タンパク質分解活性を阻害することが示されている（Ｏｒｅｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９９１，６９：１６５−１７６）。ＢＢＩＣはまた、神経筋疾患の影響を改善することが示されている（米国特許出願公開第２００８０３００１７９号明細書、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５  Ｎｏｖ；９９（５）：１７１９−２７、Ａｒｂｏｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７  Ｍａｒ；１０２（３）：９５６−６４）。
【００１０】
前述の米国特許第５，３３８，５４７号明細書は、高活性ＢＢＩ濃縮（ＢＢＩＣ）生成物によって、発癌を抑制し阻害する方法を開示し、生物学的活性レベルは、キモトリプシン阻害物質含量によって測定される。これらのＢＢＩ濃縮生成物は、脱脂大豆粉またはフレークから得られる酸性大豆可溶性物質から製造され、それはｐＨ４〜５の酸性水溶液によって抽出され、遠心分離によって不溶性物質が除去されている。大豆可溶性物質に限外濾過を施して粗製ＢＢＩ濃縮物を生成し、それを希釈し噴霧乾燥して最終乾燥ＢＢＩ濃縮生成物を生成した。本特許で開示される好ましいプロセス実施形態では、粗製ＢＢＩ濃縮物をアセトンで処理してＢＢＩ濃縮沈殿物を生成し、それを風乾して粉砕し、水で再度スラリーにして濾過し、次に凍結乾燥または噴霧乾燥して、最終ＢＢＩ濃縮生成物を生成した。この生成物は、改善された発癌阻害剤であると述べられている。Ｋｅｎｎｅｄｙらはまた、Ｏｄａｎｉら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３，７４，８５７）によって記載される方法を用いて、ＢＢＩ濃縮生成物をさらに精製し得ることに言及しており、その方法は、ＢＢＩＣ生成物を１つの断片がトリプシン阻害部位を有し、別の断片がキモトリプシン阻害部位を有する２つの別々の断片に分断するステップを伴う。しかしキモトリプシン阻害部位を有する画分の阻害活性は、大きく損なわれた。
【００１１】
ＢＢＩＣはまた、動物モデルおよびヒト臨床試験において、口腔癌、筋ジストロフィーの治療、筋肉消耗予防、抗炎症活性、放射線防護活性の機能があることが示されている。（例えばＫｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｒ．，Ｓｏｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，２００５、および米国特許公開公報第２００８／０３００１７９Ａ１号明細書を参照されたい）。ＢＢＩＣはまた、マウスにおいて腹腔内注射に続いて、肺、腎臓、および肝臓組織中で、タンパク質分解活性を阻害することが示されている（Ｏｒｅｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９９１，６９：１６５−１７６）。
【００１２】
ＢＢＩＣ生成物が、発癌の予防および改善に潜在的改善を提供する可能性の観点から、様々な方法により、多様な癌の病状のための潜在的治療用薬剤として、純粋なそして様々なＢＢＩＣ製剤を調製する試みがなされている。（米国特許第５，２１７，７１７号明細書；関連文献のレビューは、Ｋｅｎｎｅｄｙらによって、その内容全体を本明細書に援用する米国特許第５，３３８，５４７号明細書で提供される）。これもまたＫｅｎｎｅｄｙらに付与された米国特許第４，７９３，９９６号明細書は、ＢＢＩＣを得るために、大豆をアセトンで処理し、続いてエタノール抽出してアセトンで沈殿させる方法を開示する。Ｋｅｎｎｅｄｙらは、Ｐｅｒｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９：８６０−８６１（１９７０）によって教示されるエタノール抽出工程に先だって、大豆をアセトンで処理することにより、得られたＢＢＩＣが、細胞の悪性形質転換を阻害するのにより効果的であることを発見した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
当該技術分野で目下使用される精製方法は、様々である。いくつかの方法は、固定化トリプシンまたはキモトリプシンによる親和性精製を使用する。固定化トリプシンは、ＢＢＩとＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）との双方に結合するので、特に純粋なＢＢＩ生成物は単離されない。別法として、固定化キモトリプシンの使用を伴う方法は、ＫＴＩに結合しない一方で、多数の使用と浄化工程に続いて、キモトリプシンが樹脂から漏出する可能性などのいくつかの問題を有する。多数の以前のＢＢＩ精製方法は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用し、その技術はＢＢＩ異性体の副分画をもたらし得る。さらにアニオン交換クロマトグラフィーでは、ＢＢＩ収率の顕著な損失なしに、ＫＴＩを含まないＢＢＩ画分を得ることが困難であった。したがって、これまでに使用された方法は、本明細書に記載される精製ＢＢＩを生成できなかった。
【００１４】
精製ＢＢＩタンパク質を得るために当該技術分野で知られている現行の方法は、ＢＢＩのＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）タンパク質によるコンタミネーションに起因する、低い純度レベルが欠点である。使用される単離方法次第では、内毒素レベルもまた問題になり得る。現行の方法は出発原料として丸大豆を使用し、次にそれは様々な手段によって脱脂されてもよい。対照的に、本発明の方法は、出発原料として脱脂大豆白色フレークを使用する。その結果、先行技術は、高い純度レベルを有するＢＢＩ生成物について記載しておらず、特に、先行技術は、大豆から得られる高純度レベルを有するＢＢＩ生成物について記載していない。さらにＢＢＩは、１９４０年代にＢｏｗｍａｎによって同定され、１９６０年代にＢｉｒｋによってさらに特性解析されたことが留意される（Ｂｏｗｍａｎ  Ｄ．Ｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，６３：５４７−５５０，１９４６；Ｂｉｒｋ，Ｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９６１，５４，３７８−３８１；およびＢｉｒｋ．Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，１９６８，Ｖｏｌ．１２，２５−２９）。しかし文献において、または商業的に、本明細書に記載される純度レベルを有するＢＢＩ生成物は、欠如している。
【００１５】
したがって大豆加工ストリームから、精製ＢＢＩタンパク質、ならびに他の構成要素を回収するのに使用し得る方法に対する必要性がある。したがって本発明は、高純度のＢＢＩタンパク質を含んでなるＢＢＩ生成物を単離する、新規方法について記載する。さらに本発明の方法は、目下当該技術分野で知られている方法よりも少ない工程を利用し、それは結果として、時間とコスト要件の双方を減少させる。なおもさらには、大豆単離物の加工には水を必要とするので、本発明の方法は、大豆単離物加工の結果として残る水に必要な水処理量を減少させることで、発生する汚染を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、特定される総ＢＢＩタンパク質濃度と、他のＢＢＩの特性（例えばキモトリプシン阻害物質活性および内毒素含量をはじめとする）を有する、ＢＢＩ生成物を精製する新規方法について記載する。
【００１７】
本発明の特定の態様では、本発明は、大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームにクロマトグラフ分離を施すステップを含み、大豆加工ストリームに１つまたは複数の分離技術を施すステップがさらに含まれていてもよい、特定される総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物を精製する方法に関する。特定の態様では、ＢＢＩ生成物は少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有する。
【００１８】
本発明のさらなる特定の態様では、クロマトグラフ分離は、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される。特定の態様では、クロマトグラフ分離はイオン交換クロマトグラフィーである。他の特定の態様では、クロマトグラフ分離は、イオン交換カラムを含んでなるイオン交換クロマトグラフィーである。さらなる他の特定の態様では、イオン交換カラムは、アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、またはその組み合わせを含んでなる。なおもさらなる他の特定の態様では、方法は、ｐＨを調節してＢＢＩタンパク質の等電点未満に保ち、イオン交換樹脂によるＢＢＩタンパク質の保持を提供するステップを含む。なおもよりさらなる他の特定の態様では、方法は、ＢＢＩタンパク質がイオン交換樹脂によって保持されないように、ｐＨを調節してＢＢＩタンパク質の等電点よりも高く保つステップを含む。
【００１９】
本発明のさらなる特定の態様では、クロマトグラフ分離に先だって、１つまたは複数の分離技術が実施される。本発明の他の特定の態様では、クロマトグラフ分離後に、１つまたは複数の分離技術が実施される。
【００２０】
本発明のさらなる特定の態様では、１つまたは複数の分離技術が、膜分離、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、重力分離、および任意のその組み合わせからなる群から選択される。特定の態様では、１つまたは複数の分離技術は膜分離である。他の特定の態様では、膜分離は、精密濾過膜、限外濾過膜、またはその組み合わせを含んでなる。
【００２１】
本発明のさらなる特定の態様では、精製ＢＢＩ生成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および任意のその組み合わせと少なくとも９０％の同一性を有する、少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００２２】
本発明の別の特定の態様では、本発明は、少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物を精製する方法に関し、本方法は、（ａ）大豆タンパク質おとび不純物を含んでなる大豆加工ストリームに１つまたは複数の分離技術を施すステップと；（ｂ）大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームにクロマトグラフ分離を施すステップを含み、少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物が得られる。特定の態様では、ステップ（ａ）がステップ（ｂ）の前に実施される。
【００２３】
本発明の別の特定の態様では、本発明は、少なくとも約９０質量％の総ＢＢＩタンパク質濃度を有するＢＢＩ生成物を分離し精製する方法に関し、本方法は、
（ａ）大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに少なくとも１つの分離技術を施して、大豆タンパク質を含んでなる第１の透過液と、不純物を含んでなる第１の残余分を形成するステップと；（ｂ）第１の透過液に少なくとも１つの分離技術を施して、不純物を含んでなる第２の透過液と、大量のタンパク質留分を含んでなる第２の残余分を形成するステップと；（ｃ）少なくとも１つのクロマトグラフ分離に通過させるために、第２の残余分をキャリアストリームと合わせて、加工ストリーム中の他のタンパク質からＢＢＩタンパク質ストリームを単離するステップと；（ｄ）ＢＢＩタンパク質ストリームを液体沈殿媒体と合わせ、それに少なくとも１つの分離技術を施して、沈殿ＢＢＩタンパク質画分を形成するステップと；（ｅ）沈殿ＢＢＩタンパク質画分を液体洗浄媒体と合わせて、可溶化ＢＢＩタンパク質画分を形成するステップと；（ｆ）可溶化タンパク質画分に少なくとも１つの分離技術を施して、精製可溶化ＢＢＩタンパク質画分を形成するステップと；（ｇ）精製可溶化タンパク質画分に少なくとも１つの分離操作を施して、精製ＢＢＩ生成物を形成するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】加工ストリームから、精製大豆ホエータンパク質を回収する方法の工程０〜４を示す概略工程図である。
【図１Ｂ】加工ストリームから、精製大豆ホエータンパク質を回収する方法の工程５、６、１４、１５、１６、および１７を示す概略工程図である。
【図１Ｃ】加工ストリームから、精製大豆ホエータンパク質を回収する方法の工程７〜１３を示す概略工程図である。
【図２】大豆ホエーストリームから、ＢＢＩタンパク質を回収する膜ベースの方法を示す概略工程図である。
【図３】結果的に得られたＢＢＩ生成物をはじめとする、本発明に従ったＢＢＩ精製中に発生する様々な残余分および透過液を示す、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。
【図４】本発明の方法によって単離された、特定の新規ＢＢＩタンパク質配列のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法データを図示す。
【図５】二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に続く、本発明のＢＢＩタンパク質を示す。
【図６】市販されるＢＢＩ製品の２Ｄ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図７】ＯｄａｎｉおよびＩｋｅｎａｋａによる、当該技術分野で既知の大豆からのＢＢＩの一次構造を示す。
【図８】新規ＢＢＩタンパク質アイソフォームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書に記載されるのは、タンパク質の製造から発生する多様なマメ科および非マメ科植物加工ストリームから、高度精製ＢＢＩタンパク質およびその他の生成物を回収する新規方法である。例えば、本開示の方法は、ＢＢＩタンパク質またはその他の生成物の回収、または大豆ホエーストリームの様々な構成要素の分離、または双方を提供するように選択され設計された、１つまたは複数の分離技術または方法（例えばクロマトグラフ分離または膜分離）を含んでなる。ＢＢＩタンパク質、および大豆ホエーストリームの１つまたは複数の他の構成要素（例えばオリゴ糖類をはじめとする様々な糖類）の回収は、複数の分離技術を利用してもよい。特定の分離技術は、加工ストリームの他の構成要素から分離され回収される、所望の構成要素によって決まる。
【００２６】
例えば精製ＢＢＩ画分は、典型的には、最初に１つまたは複数の不純物（例えば微生物またはミネラル）を除去し、続いて１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質（すなわちグリシニンおよびβ−コングリシニン）をはじめとする追加的不純物を除去し、続いて（例えばＫＴＩおよび他の非ＢＢＩタンパク質またはペプチドをはじめとする）１つまたは複数の大豆ホエータンパク質を除去し、および／または続いて糖類をはじめとする１つまたは複数の追加的不純物を大豆ホエーから除去することで調製される。高純度形態のＢＢＩタンパク質の回収は、希釈により純度を損なうホエーストリームのその他の主要構成要素（例えば貯蔵タンパク質、ミネラル、および糖類）を除去しながら、タンパク質の拮抗物質でありおよび／または有害効果がある構成要素（例えば内毒素）の除去を通じて、タンパク質画分を精製することで、同様に純度を改善することによって改善される。大豆ホエーの様々な構成要素の除去は、典型的には、大豆ホエー構成要素を除去する前および／または最中に、大豆ホエーを濃縮するステップを含む。
【００２７】
貯蔵タンパク質、糖類、ミネラル、およびその他の不純物の除去は、所望のＢＢＩタンパク質に富み、拮抗物質または毒素であることもでき、さもなければ有害効果を及ぼすこともできる不純物を含まない画分を生じる。例えば典型的には、大豆貯蔵タンパク質富化画分を１つまたは複数の大豆ホエータンパク質に富んだ画分と共に回収することもできる。もう１種の糖類（例えばオリゴ糖類および／または多糖類）に富んだ画分もまた、典型的に調製される。したがって本方法は、ＢＢＩタンパク質の回収に適した画分を提供し、水性大豆ホエーからの他の有用な生成物の回収のために使用し得る他の画分もまた提供する。例えば大豆ホエーストリームから糖類および／またはミネラルを除去することで、それから糖類をさらに分離し得る有用な画分が生成され、ひいては次の追加的な有用な画分が生じる。濃縮糖および（クエン酸を含んでもよい）ミネラル画分、および行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として再循環されてもよい比較的純粋な加工ストリーム。このようにして生成されたプロセス水は、本方法を実施する上で特に有用であることもできる。したがって本方法のさらなる利点は、従来の単離物調製法と比較して、減少したプロセス水の所要量であることもできる。
【００２８】
本開示の方法は、少なくとも２つの点で、大豆タンパク質単離物および濃縮物を製造する従来の方法と比較して利点を提供する。言及されたように、大豆タンパク質材料を製造する従来の方法は、典型的には大豆ホエーストリーム（例えば水性大豆ホエーまたは大豆糖蜜）を廃棄する。したがって本開示の方法によって回収される生成物は、付加産物に相当し、従来の大豆タンパク質単離物および大豆タンパク質濃縮物製造との関連で、目下実現されていない収入源に相当する。さらに商品性のある生成物を回収する大豆ホエーストリームまたは大豆糖蜜の処理は、好適には、大豆ホエーストリームまたは大豆糖蜜の処理および廃棄に付随するコストを低減させる。例えば本明細書の他の箇所で詳述する本発明の様々な方法は、比較的純粋な加工ストリームを提供し、それは様々な他の工程で容易に利用され、または行うとしても最小の処理で廃棄されてもよく、それによって方法の環境影響を低下させる。本開示の方法に関連した特定のコストは存在するが、単離される付加産物の利益および廃棄物処理の最小化は、あらゆる付加費用を代償すると考えられる。
【００２９】
Ａ．酸可溶性タンパク質
大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆貯蔵タンパク質の等電点（例えばｐＨ約４．５）において、脱脂大豆フレークまたは大豆粉の水性抽出物から沈殿する。したがって大豆タンパク質単離物は、一般に、酸性液体媒質中で可溶性でないタンパク質を含む。同様に、２番目に最も精製された大豆タンパク質材料である、大豆タンパク質濃縮物のタンパク質は、同じく酸性液体媒質中で一般に可溶性でない。しかし本開示の方法によって回収される大豆ホエータンパク質は、一般に酸可溶性であり、すなわちそれらは酸性液体媒質中で可溶性である。
【００３０】
例えば本開示は、水性大豆ホエーに由来して、周囲条件（例えば約２５℃の温度）において、比較的広範なｐＨの水性（典型的には酸性）媒質（例えばｐＨ約２〜約１０、約２〜約７、または約２〜約６を有する水性媒質）中で有利な溶解度を示す、大豆タンパク質組成物を提供する。典型的には大豆タンパク質組成物の溶解度は、１リットル当たり少なくとも約１０グラム（ｇ／Ｌ）であり、より典型的には少なくとも約１５ｇ／Ｌであり、なおもより典型的には少なくとも約２０ｇ／Ｌである。（添付の特許請求に含まれる）ｐＨ範囲にわたる溶解度への言及は、特定溶解度が、特定ｐＨ範囲内に入るいずれかのそして全てのｐＨ値で達成されることを示唆するものと理解される。例えば約２〜約１０のｐＨ範囲にわたる少なくとも約１０ｇ／Ｌの溶解度への言及は、特定溶解度が、３、４、５、６などのｐＨで達成されることを示唆する。
【００３１】
本開示の方法による酸可溶性大豆タンパク質の回収は、当該技術分野における顕著な進歩に相当する。本明細書で言及されるように、典型的には廃棄される大豆ホエーストリームから、酸可溶性タンパク質が回収される。
【００３２】
Ｂ．ボーマン・バークプロテアーゼインヒビター
本明細書で考察されるように、例えば大豆ホエーストリームおよび大豆糖蜜ストリームをはじめとする大豆加工ストリームは、相当量のボーマン・バークプロテアーゼインヒビター（ＢＢＩ）を含有する。このプロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシン、キモトリプシンを阻害し、そして一連の重要な代謝機能を制御する、カテプシンＧ、エラスターゼ、およびキマーゼなどの多様な他の重要プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。
【００３３】
本実施形態に従って単離されるＢＢＩタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなってもよい。図４は、本発明によって単離された新規ＢＢＩタンパク質アイソフォームの質量分析法データ結果を示す。一実施形態では、ＢＢＩタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である、より好適には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、なおもより好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、最も好適には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも９５％と同一である、アミノ酸配列を含んでなってもよい。
【００３４】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は配列番号１と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００３５】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は配列番号２と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００３６】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は配列番号３と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００３７】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は配列番号４と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００３８】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は配列番号５と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００３９】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は配列番号６と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００４０】
本発明の特定の態様では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、アミノ酸配列を比較することで判定される。本発明の別の態様では、配列同一性は、アミノ酸配列と、その保存アミノ酸置換とを比較することで判定され得る。本発明の別の態様では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数の保存的置換を有し得る。本発明の別の態様では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数の非保存的置換を有し得る。
【００４１】
天然アミノ酸としては、例えばアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）が挙げられる。
【００４２】
保存的および非保存的アミノ酸置換は当業者に知られており、例えば酸性アミノ酸で別の酸性アミノ酸を置き換えることは、保存的置換と見なすこともできるのに対し、塩基性アミノ酸で酸性アミノ酸を置き換えることは、非保存的置換と見なすこともできる。同様に、極性アミノ酸で別の極性アミノ酸を置き換えることは、保存的置換と見なすこともできるのに対し、非極性アミノ酸で極性アミノ酸を置き換えることは、非保存的置換と見なすこともできる。アミノ酸は一般に、（置換が保存的または非保存的かどうかを判定する指針として使用し得る）以下のカテゴリーに分けられる。（１）極性／親水性：Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｃ、およびＹ；（２）非極性／疎水性：Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＭ；（３）酸性：Ｄ、Ｅ、およびＣ；（４）塩基性：Ｋ、Ｒ、およびＨ；（５）芳香族：Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨ；および（６）脂肪族：Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＰ。
【００４３】
１つまたは複数のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と同一でない本発明の特定の態様では、このような１つまたは複数のアミノ酸配列もまた、キモトリプシンおよびトリプシン活性の双方を阻害することが知られているＢＢＩタンパク質として機能する。これらの機能を確認する方法は本明細書に記載され、当業者に知られている。
【００４４】
組成物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と同一でない、１つまたは複数のアミノ酸配列を含んでなる本発明の他の態様では、このような１つまたは複数のアミノ酸配列もまた、キモトリプシンおよびトリプシンの双方を阻害することが知られているＢＢＩタンパク質として機能する。これらの機能を確認する方法は本明細書に記載され、当業者に知られている。
【００４５】
ＢＢＩタンパク質は、およそ６５〜７７個のアミノ酸残基と、およそ７個のジスルフィド架橋を含んでなる。ＢＢＩタンパク質の一次構造は、１９７２年以来知られており（Ｏｄａｎｉ  Ｓ．ａｎｄ  Ｔ．Ｉｋｅｎａｋａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３  ７４：６９７  １９７２）、図７に記載される。
【００４６】
目下、本開示のＢＢＩ生成物の純度は、他のＢＢＩ生成物と比較して、かつて達成されたことのないレベルの純度に相当すると考えられている。ＢＢＩ画分の純度は、総ＢＢＩタンパク質濃度、比活性（キモトリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質で測定される）、およびＢＢＩの拮抗物質として機能する構成要素、毒素、またはＢＢＩ単位量当たりの効率を単に希釈する以上に有害効果を及ぼす他の構成要素の不在の関数である。一般に、本開示のＢＢＩ生成物の総ＢＢＩタンパク質濃度は、少なくとも約７０質量％、または少なくとも約８０質量％である。典型的には、本開示のＢＢＩ生成物の総ＢＢＩタンパク質濃度は、少なくとも約９０質量％、少なくとも約９１質量％、少なくとも約９２質量％、少なくとも約９３質量％、少なくとも約９４質量％、少なくとも約９５質量％、少なくとも約９６質量％、少なくとも約９７質量％、少なくとも約９８質量％、および少なくとも約９９質量％である。
【００４７】
「純粋」モノマータンパク質は、一次元または二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動後に単一バンドを生じ、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはイオン交換カラムから単一の対称的吸光度ピークとして溶出され、単一セットの質量分光測定、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはＷ吸光度スペクトルシグナルを生じ、該当する場合は汚染酵素活性を含まない。絶対純度は確立され得ないので、慣例的に単純な純度基準、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の単一バンドを超えるタンパク質が検出できないことが使用される。（Ｍｏｈａｎ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，３０７−３２３（１９９２）を参照されたい）。図３は、一次元ゲル電気泳動に続く本発明のＢＢＩタンパク質を示す。図５は、二次元ゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に続く本発明のＢＢＩタンパク質を示す。図３および５で示されるように、本発明のＢＢＩタンパク質は、等電点が異なる６．５ｋＤａおよび１４．４ｋＤａの分子量標準間の単一バンドとして示される。単一バンドのみの存在は、生成物中の汚染物質（混入物質）の欠如を示唆する。比較として、図６は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（製品番号Ｔ９７７７）によって市販されるＢＢＩ生成物の２Ｄ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図６では、対照的に、サンプルＢＢＩタンパク質が図５中のＢＢＩタンパク質と同じ分子量標準間にありながら、単一バンドで出現していないことが明らかである。これは、残留Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタープロテインならびに非タンパク質構成要素をはじめとする混入物質が、本発明のＢＢＩタンパク質よりもＳｉｇｍａ  ＢＢＩサンプル中により多く存在したことを示唆する。
【００４８】
ＢＢＩ純度と共に、本開示のＢＢＩ生成物の総タンパク質含量は有利であり、および／または技術分野の進歩に相当する。本開示の生成物のＢＢＩタンパク質含量は、例えばＯｈｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｂａｒｒ，Ｊ．Ｋ．，Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｕｒｅｔ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，１９３（１９７８）に記載されるＬｏｗｒｙ法はじめとする、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定することもできる。一般に、本開示のＢＢＩ生成物の総タンパク含量は、少なくとも約６０質量％（乾燥質量基準）、少なくとも約７０質量％、少なくとも約８０質量％、または少なくとも約８５質量％である。典型的には、本開示のＢＢＩ生成物の総タンパク質含量は、少なくとも約９０質量％、少なくとも約９１質量％、少なくとも約９２質量％、少なくとも約９３質量％、少なくとも約９４質量％、少なくとも約９５質量％、少なくとも約９６質量％、少なくとも約９７質量％、少なくとも約９８質量％、および少なくとも約９９質量％である。
【００４９】
ＢＢＩ生成物が、目下、適していると考えられる様々な用途は、内毒素含量が比較的低いことを要とする。例えば様々な治療用途は、ＢＢＩ生成物が、製薬等級材料に適用される規制を満たすことを要する。したがって様々な好ましい態様では、ＢＢＩ生成物の総内毒素含量は、好適には約５．０ＥＵ／ｇタンパク質以下、約４．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、約４．０ＥＵ／ｇタンパク質以下、約３．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、約３．０ＥＵ／ｇタンパク質以下、約２．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、約２．０ＥＵ／ｇタンパク質以下、約１．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、約１．０ＥＵ／ｇタンパク質以下、および約０．５ＥＵ／ｇタンパク質以下である。例えば、このような様々な態様に従って、ＢＢＩ生成物の総内毒素含量は、典型的には約０．５〜約５ＥＵ／ｇタンパク質、より典型的には約０．５〜約２．５ＥＵ／ｇタンパク質、なおもより典型的には約０．５〜約１ＥＵ／ｇタンパク質である。
【００５０】
ＢＢＩタンパク質は、キモトリプシンとトリプシンの双方を阻害することが知られている一方で、タンパク質含有組成物の他の構成要素（例えばＫＴＩタンパク質）は、トリプシンのみを阻害することが知られている。したがって目下、キモトリプシン阻害物質活性とトリプシン阻害物質活性の比率が、ＢＢＩタンパク質存在の指標と考えられている。概して、キモトリプシン阻害物質活性とトリプシン阻害物質活性の比率は、少なくとも約１：１、少なくとも約１：２、少なくとも約１：３、少なくとも約１：４、少なくとも約１：５、少なくとも約１：６、少なくとも約１：７、少なくとも約１：８、少なくとも約１：９、または少なくとも約１：１０である。本発明の特定の態様では、キモトリプシン阻害物質活性とトリプシン阻害物質活性の比率は、約１：１、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、または約１：１．９である。
【００５１】
本開示のＢＢＩ生成物のキモトリプシン阻害物質活性（キモトリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質、またはＣＩＵ／ｇタンパク質を単位として表される）は、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定されてもよい。概して、本開示のＢＢＩ生成物のキモトリプシン阻害物質活性は、少なくとも約５００ＣＩＵ／ｇタンパク質、より概して少なくとも約１０００ＣＩＵ／ｇタンパク質、およびさらにより概して少なくとも約１２００ＣＩＵ／ｇタンパク質である。典型的には、本開示のＢＢＩ生成物のキモトリプシン阻害物質活性は、少なくとも約１６００ＣＩＵ／ｇタンパク質、少なくとも約２５００ＣＩＵ／ｇタンパク質、少なくとも約２７００ＣＩＵ／ｇタンパク質、または少なくとも約３０００ＣＩＵ／ｇタンパク質である。
【００５２】
キモトリプシン阻害物質活性は、以前述べられたようにして（Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｖｏｌ  ３４４、Ｎｏ．１  ｐｐ．１３３−１３８）、以下の修正を加えて実施される。ウシ膵臓からのα−キモトリプシンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（カタログ番号Ｃ４１２９、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、活性キモトリプシンは、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７３  １３１：１０７−１１７）によって記載される方法に基づいて、メチルウンベリフェリルｐ−トリメチルアンモニオシンナマートクロリド（ＭＵＴＭＡＣ、カタログ番号Ｍ５４０７、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）での活性部位滴定によって定量化した。ＢＢＩサンプルを脱イオン蒸留（ｄＩ）Ｈ2Ｏ中で、およそ１ｍｇ  ＢＢＩ／ｍｌに希釈した（例えば１ｍｇ／ｍｌの精製ＢＢＩ、１０ｍｇ／ｍｌのＳＷＰを秤量する）。シリコン処理微量遠心管内で以下を合わせた。ａ）０〜５μｌのＢＢＩサンプル、；ｂ）０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７、５μｌ；およびｃ）１０μｌの５０ｕＭ活性キモトリプシン（１ｍＭのＨＣｌおよび２ｍＭのＣａＣｌ2中に溶解）。混合して室温で１０分間インキュベートする。残留キモトリプシン活性をアッセイするために、サンプルをｄＩ  Ｈ2Ｏで１：４０に希釈し、８９５μｌのアッセイ緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）と８０μｌの１０ｍＭ  ｓｕｃＡＡＰＦ−ｐＮＡ（カタログ番号Ｓ７３８８、Ｓｉｇｍａｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する１．５ｍｌガラスキュベットに、２５μｌの希釈サンプルを移して混合し、即座に１０秒間隔で、Ａｂ４１０ｎｍで１分間の測定を開始する。４０〜８０％阻害の範囲で結果が得られるように、阻害物質溶液の濃度を調節し、外挿して、キモトリプシンを完全に阻害するのに要するサンプル量を判定する。キモトリプシン阻害活性（ＣＩ単位／ｇ）は、Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｖｏｌ  ３４４，Ｎｏ．１  ｐｐ．１３３−１３８）で既述されたように、１ｍｇの活性キモトリプシンを完全に阻害し得るサンプル量と定義される。
【００５３】
同様に、本開示のＢＢＩ生成物のトリプシン阻害物質活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質、またはＴＩＵ／ｇタンパク質を単位として表される）は、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定されてもよく、例えばその中で１ＴＩＵは１ｍｇのトリプシンを阻害し得る基質量と定義され、１トリプシン単位はｐＨ８．２および３７℃で、ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＡ）を基質として、１０分間あたりの０．０１９のΔＡ410に等しい。一般的に本開示のＢＢＩ生成物のトリプシン阻害物質活性は少なくとも約４００ＴＩＵ／ｇタンパク質、より一般的に少なくとも約６００ＴＩＵ／ｇタンパク質、およびなおもより一般的に少なくとも約８００ＴＩＵ／ｇタンパク質である。典型的には、本開示のＢＢＩ生成物のトリプシン阻害物質活性は、少なくとも約１０００ＴＩＵ／ｇタンパク質、少なくとも約１２００ＴＩＵ／ｇタンパク質、少なくとも約１４００ＴＩＵ／ｇタンパク質、または少なくとも約１６００ＴＩＵ／ｇタンパク質である。トリプシン阻害物質活性は、好適には約３０００ＴＩＵ／ｇタンパク質以下である（すなわち理論的に純粋である）。
【００５４】
本開示のＢＢＩ生成物は、上で特定される特性の１つ、組み合わせ、または全部を示してもよいものと理解される。例えば本開示のＢＢＩ生成物は、特定されるＢＢＩ純度およびキモトリプシン阻害物質活性を示してもよい。ＢＢＩ生成物はまた、特定されるＢＢＩ純度、トリプシン阻害物質活性またはキモトリプシン阻害物質活性、および本明細書で開示される配列を示してもよい。さらなる例として、ＢＢＩ生成物は、特定されるＢＢＩタンパク質濃度および総内毒素含量を示してもよい。これらの態様で、そしてなおも別の態様で、本開示のＢＢＩ生成物は、特定される総大豆タンパク質濃度およびトリプシン阻害物質活性を示してもよい。ＢＢＩ生成物はまた、特定される総大豆タンパク質濃度およびキモトリプシン阻害物質活性も示してもよい。さらなる例として、本開示のＢＢＩ生成物は、特定される総大豆タンパク質濃度および総内毒素含量を示してもよい。これらのＢＢＩ生成物の諸特性の組み合わせは例示的であり、この一覧が網羅的であることは意図されない。すなわち本開示に従って、ＢＢＩ生成物は、上で特定される何れかの範囲内の上で特定される何れかの値で、上記の諸特性の任意の組み合わせを示してもよい。
【００５５】
本開示のＢＢＩ生成物は、経口、局所適用、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、および腹腔内投与からなる群から選択される、少なくとも１つの様式によって対象に投与される医薬品に含まれてもよい、多様な医薬組成物中で利用されてもよい。本発明の特定の態様では、投与経路としては、経口また非経口投与が挙げられる。本発明の他の態様では、投与経路としては、食品を手段とする経口投与が挙げられる。治療法の所望の持続時間と有効性次第で、本発明に従った組成物は、１回または数回、そしてまた断続的に、例えば日毎または週毎ベースで、数日間、数週間、または数ヶ月、異なる投薬量で、異なる経路の組み合わせによって投与してもよい。本開示のＢＢＩ生成物はまた、健康補助食品調合物中で利用されてもよい。医薬品および健康補助食品組成物の適切な形態としては、例えばシロップ、粉末、クリーム、注射剤、懸濁液、エマルション、錠剤、カプセル、ロゼンジ、坐薬、および口内洗浄液が挙げられる。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるＢＢＩ生成物を含んでなる食品の提供である。このような食品としては、飲料と、フードバーと、または食品摂取時に本明細書に記載されるＢＢＩ生成物が摂取されることが当業者に知られている他の消耗品とが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
一実施形態では、食品は飲料であってもよい。好ましい飲料としては、即席飲料（ＲＴＤ）または乾式混合飲料（ＤＢＢ）が挙げられる。飲料は、実質的に濁った飲料または実質的に透明な飲料であることもできる。適切な飲料の非限定的例としては、ミルクベースの飲料、ミルク類似飲料（例えば豆乳、ライスミルクなど）、体重管理飲料、プロテイン・シェーク、食事代替飲料、コーヒーベース飲料、栄養飲料、エナジードリンク、乳児用調製粉乳、果汁ベース飲料、果実飲料、果物風味飲料、野菜ベース飲料、スポーツドリンクなどが挙げられる。飲料のｐＨは変動してもよく、酸性、中性、またはアルカリ性であってもよい。
【００５８】
別の実施形態では、食品は、グラノーラバー、シリアルバー、栄養バー、またはエネルギーバーなどのフードバーであってもよい。なおも別の実施形態では、食品は穀物ベース製品であってもよい。穀物ベース食品の非限定的例としては、朝食用シリアル、パスタ、パン、ベイクド製品（すなわちケーキ、パイ、ロール、クッキー、クラッカー）、およびスナック製品（例えばチップ、プレッツェルなど）が挙げられる。穀物ベース食品の食用材料は、小麦（例えば漂白小麦粉、全粒粉、小麦胚芽、小麦ふすま）、トウモロコシ（例えばコーンフラワー、コーンミール、コーンスターチなど）、オート麦（例えば膨化オート麦、オートミール、オート麦粉など）、米（例えば膨化米、米粉、米デンプン）などに由来してもよい。別の実施形態では、食品は栄養補給剤であってもよい。栄養補給剤は、液体または固体であってもよい。
【００５９】
様々な医薬用途に加えて、本開示のＢＢＩ生成物はまた、多種多様なパーソナルケア製品への組み込みにも適する。例えば本開示のＢＢＩ生成物は、目下、肌の光老化を低下させると考えられており、（例えば、Ｐａｉｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６：５８７−５９５（２００１）を参照されたい、したがって美容およびスキンケア製品への組み込みに適する。
【００６０】
本発明のＢＢＩは、天然植物ベースのマトリックスからＢＢＩを分離、単離、または精製できるようにする、あらゆる原料またはあらゆるプロセスから入手し得る。非限定的例として、天然植物ベースのマトリックスは、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆ  ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スメイルメディックシード（ｓｎａｉｌ  ｍｅｄｉｃ  ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ属、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとする、マメ科または非マメ科植物に由来し得る。本発明の特定の態様では、ＢＢＩは様々な加工ストリーム中で大豆から得られる。様々な大豆加工ストリームとしては、例えば水性大豆抽出物ストリーム（脱脂大豆材料からなど、その中で大豆ストリームタンパク質の構成要素が可溶性形態であるあらゆるストリーム）、水性豆乳抽出物ストリーム（その中で大豆ストリームタンパク質の構成要素が可溶性形態であるホールまたは部分的脱脂大豆材料からのあらゆるストリーム）、水性大豆ホエーストリーム（貯蔵タンパク質の沈殿または塩析から得られるあらゆるホエーストリーム；沈殿法としては熱ならびに化学処理が挙げられる）、水性大豆糖蜜ストリーム（水性大豆ホエーストリームからの水分除去によって発生するあらゆるストリーム）、水性大豆タンパク質濃縮物大豆糖蜜ストリーム（大豆タンパク質濃縮工程からの可溶性糖類のアルコール抽出からのあらゆるストリーム）、水性大豆透過液ストリーム（より小さな分子量タンパク質が膜を通過する、異なる分子量タンパク質画分の分離から得られるあらゆるストリーム）、および水性豆腐ホエーストリーム（豆腐凝固工程から得られるあらゆるホエーストリームを含む）が挙げられる。本発明の方法によって単離されるＢＢＩ生成物の量は、１グラム程度にわずかであってもよく（実験室規模単離）、または数トンであってもよい（工業的または大規模単離）。
【００６１】
Ｃ．大豆ホエータンパク質を得る方法
分離は決して１００％でないため、各ストリーム中に残留構成要素があり得ることが分離技術当業者によって理解される。さらに当業者は、分離技術が出発原料次第で異なり得ることを理解する。
【００６２】
工程０（図１Ａ参照）−ホエータンパク質前処理は、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）糖蜜、ＩＳＰホエー、大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）糖蜜、ＳＰＣホエー、機能性大豆タンパク質濃縮物（ＦＳＰＣ）ホエー、およびそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、供給流から出発し得る。ホエータンパク質前処理工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、塩酸、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｐＨを調節した後の工程０のｐＨは、約３．０〜約６．０、または３．５〜５．５、または約５．３であり得る。温度は約７０℃〜約９５℃、または約８５℃であり得る。温度保持時間は約０分間〜約２０分間で異なり、または約１０分間であり得る。保持時間後、ホエーストリームから沈殿物を分離するために、典型的には間欠排出ディスク清澄化遠心分離である遠心分離工程にストリームを通過させる。ホエータンパク質前処理からの生成物としては、ストリーム０ａ中のホエーストリーム（前処理大豆ホエー）（分子量約５０キロダルトン（ｋＤ）以下）の水相中の可溶性構成要素と、前処理大豆ホエー、貯蔵タンパク質、およびそれらの組み合わせなどのストリーム０ｂ中の不溶性のより大きな分子量のタンパク質（約３００ｋＤ〜約５０ｋＤ）とが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
工程１（図１Ａ参照）−微生物学減少（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、前処理大豆ホエーをはじめとするが、これに限定されるものではない、ホエータンパク質前処理工程の生成物から出発し得る。この工程は、前処理大豆ホエーの精密濾過を伴う。この工程のプロセス変量および代替物としては、遠心分離、全量濾過、加熱滅菌、紫外線滅菌、精密濾過、クロスフロー膜濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約３．５〜約５．５、または約５．３であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃または約５０℃であり得る。工程１からの生成物としては、ストリーム１ａ中の貯蔵タンパク質、微生物、ケイ素、およびそれらの組み合わせと、ストリーム１ｂ中の精製前処理大豆ホエーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
工程２（図１Ａ参照）−水およびミネラル除去は、ストリーム１ｂまたは４ａからの精製前処理大豆ホエー、またはストリーム０ｂからの前処理大豆ホエーから出発し得る。それは水除去および部分的ミネラル除去のためのナノ濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロスフロー膜濾過、逆浸透、蒸発、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程２のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約３．５〜約５．５、または約５．３であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。この水除去工程からの生成物としては、ストリーム２ａ中の精製前処理大豆ホエーと、ストリーム２ｂ中の水、幾種かのミネラル、一価のカチオン、およびそれらの組み合わせとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
工程３（図１Ａ参照）−ミネラル沈殿工程は、ストリーム２ａからの精製前処理大豆ホエー、またはストリーム０ａまたは１ｂからの前処理大豆ホエーから出発し得る。それはｐＨおよび／または温度変化による沈殿工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、撹拌または再循環反応タンクが挙げられるが、これに限定されるものではない。ミネラル沈殿工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸、塩化ナトリウム、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程３のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約８．０であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ｐＨ保持時間は、約０分間〜約６０分間、または約５分間〜約２０分間で異なり、または約１０分間であり得る。ストリーム３の生成物は、精製前処理大豆ホエーと沈殿したミネラルとの懸濁液である。
【００６６】
工程４（図１Ａ参照）−ミネラル除去工程は、ストリーム３からの精製前処理ホエーと沈殿したミネラルとの懸濁液から出発し得る。それは遠心分離工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、遠心分離、濾過、全量濾過、クロスフロー膜濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ミネラル除去工程からの生成物としては、ストリーム４ａ中の脱ミネラル前処理ホエーと、ストリーム４ｂ中の幾種かのタンパク質ミネラル複合体がある不溶性ミネラルとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
工程５（図１Ｂ参照）−タンパク質分離および濃縮工程は、ストリーム４ａからの精製前処理ホエー、またはストリーム０ａ、１ｂ、または２ａからのホエーから出発し得る。それは限外濾過工程を含む。限外濾過工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロスフロー膜濾過、限外濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程５のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約８．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム５ａからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム５ｂからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６８】
工程６（図１Ｂ参照）−タンパク質の洗浄および精製工程は、ストリーム４ａまたは５ａからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、または精製前処理ホエー、またはストリーム０ａ、１ｂ、または２ａからのホエーから出発し得る。それは透析濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、再スラリー化、クロスフロー膜濾過、限外濾過、水透析濾過、緩衝液透析濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。タンパク質洗浄および精製工程で使用し得る加工助剤としては、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程６のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム６ａからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム６ｂからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
工程７（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム５ｂおよび／またはストリーム６ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それはナノ濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、逆浸透、蒸発、ナノ濾過、水透析濾過、緩衝液透析濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程７のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム７ａからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム７ｂからの生成物としては、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
工程８（図１Ｃ参照）−ミネラル除去工程は、ストリーム５ｂ、６ｂ、７ａ、および／または１２ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それは電気透析膜工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、イオン交換カラム、クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。このミネラル除去工程で使用し得る加工助剤としては、水、酵素、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。酵素としては、プロテアーゼ、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程８のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜５０℃、または約４０℃であり得る。ストリーム８ａからの生成物としては、導電率が約１０ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）〜約０．５ｍＳ／ｃｍ、または約２ｍＳ／ｃｍの脱ミネラル大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム８ｂからの生成物としては、ミネラル、水、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７１】
工程９（図１Ｃ参照）−色除去工程は、ストリーム８ａ、５ｂ、６ｂ、１２ｂ、および／または７ａからの脱ミネラル大豆オリゴ糖類から出発し得る。それを活性炭素床利用する。この工程のプロセス変量および代替物としては、イオン交換が挙げられるが、これに限定されるものではない。この色除去工程で使用し得る加工助剤としては、活性炭素、イオン交換樹脂、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。温度は、約５℃〜約９０℃、または約４０℃であり得る。９ａからの生成物ストリームとしては、着色化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム９ｂは脱色溶液である。ストリーム９ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７２】
工程１０（図１Ｃ参照）−大豆オリゴ糖類分画工程は、ストリーム９ｂ、５ｂ、６ｂ、７ａ、および／または８ａからの大豆オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それはクロマトグラフィー工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロマトグラフィー、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この大豆オリゴ糖類分画工程で使用し得る加工助剤としては、当業者なら使用樹脂に基づいて分かるであろう、ｐＨを調節するための酸または塩基が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１０ａからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１０ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
工程１１（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム９ｂ、５ｂ、６ｂ、７ａ、８ａ、および／または１０ｂからの大豆オリゴ糖類から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、蒸発、逆浸透、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。水除去工程で使用し得る加工助剤としては、脱泡剤、蒸気、真空、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。温度は、約５℃〜約９０℃、または約６０℃であり得る。ストリーム１１ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１１ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７４】
工程１２（図１Ｃ参照）−大豆オリゴ糖類工程からの追加的タンパク質分離は、ストリーム７ａ、５ｂ、および／または６ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それは限外濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロスフロー膜濾過、孔径約５０ｋＤ〜約１ｋＤの限外濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この糖類工程からのタンパク質分離で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、プロテアーゼ、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１２のｐＨは約２．０〜約１２．０、約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム１２ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１２ａからの生成物としては、ペプチド、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
工程１３（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム１２ａからのペプチド、および他のタンパク質から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、逆浸透、ナノ濾過、噴霧乾燥、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１３ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１３ｂからの生成物としては、ペプチド、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７６】
工程１４（図１Ｂ参照）−タンパク質分画工程は、ストリーム６ａおよび／または５ａからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせから出発して実施されてもよい。それは限外濾過（孔径３００ｋＤ〜１０ｋＤ）工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロスフロー膜濾過、限外濾過、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。クロスフロー膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１４のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム１４ａからの生成物としては、貯蔵タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１４ｂからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
工程１５（図１Ｂ参照）−水分除去工程は、ストリーム６ａ、５ａ、および／または１４ｂからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、蒸発、ナノ濾過、ＲＯ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１５ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１５ｂの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７８】
工程１６（図１Ｂ参照）−熱処理およびフラッシュ冷却工程は、ストリーム６ａ、５ａ、１４ｂ、および／または１５ｂからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質から出発し得る。それは超高温工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、加熱滅菌、蒸発、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この熱処理およびフラッシュ冷却工程で使用し得る加工助剤としては、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。加熱工程の温度は、約１２９℃〜約１６０℃、または約１５２℃であり得る。温度保持時間は、約８秒間〜約１５秒間、または約９秒間であり得る。フラッシュ冷却時には、温度は約５０℃〜約９５℃、または約８２℃であり得る。ストリーム１６からの生成物としては、大豆ホエータンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７９】
工程１７（図１Ｂ参照）−乾燥工程は、ストリーム６ａ、５ａ、１４ｂ、１５ｂ、および／または１６からの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質から出発し得る。それは乾燥工程を含む。液体供給温度は、約５０℃〜約９５℃、または約８２℃であり得る。入口温度は、約１７５℃〜約３７０℃、または約２９０であり得る℃。排気温度は、約６５℃〜約９８℃、または約８８℃であり得る。１７ａからの生成物ストリームとしては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１７ｂからの生成物としては、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせを含む、大豆ホエータンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８０】
Ｄ．水性ホエーストリーム
大豆加工ストリームの一種である水性ホエーストリームおよび糖蜜ストリームは、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する。ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦，オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆ  ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スメイルメディックシード（ｓｎａｉｌ  ｍｅｄｉｃ  ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロフィア（ｊａｔｒｏｐｈｉａ）、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとするマメ科または非マメ科植物が挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
【００８１】
大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されており、典型的には廃棄物として廃棄される。より具体的には、水性大豆ホエーストリームは、典型的には約１０質量％未満、典型的には約７．５質量％未満、なおもより典型的には約５質量％未満の総固形分を有する。例えば様々な態様で、水性大豆ホエーストリームの固形分は、約０．５〜約１０質量％、約１質量％〜約４質量％、または約１〜約３質量％（例えば約２質量％）である。したがって工業的大豆タンパク質単離物製造中に、処理または廃棄しなくてはならない顕著な量の廃水が発生する。
【００８２】
大豆ホエーストリームは、典型的には、出発原料大豆の最初の大豆タンパク質含量のかなりの部分を含有する。本明細書の用法では「大豆タンパク質」という用語は、概して、大豆に天然のあらゆるそして全てのタンパク質を指す。天然大豆タンパク質は、概して、親水性シェルで取り囲まれる疎水性コアを有する球形タンパク質である。例えばグリシニンやβ−コングリシニンなどの貯蔵タンパク質をはじめとする、多数の大豆タンパク質が同定されている。大豆タンパク質はさらに、上記のＢＢＩタンパク質などのプロテアーゼインヒビターを含む。大豆タンパク質はまた、レクチン、リポキシゲナーゼ、β−アミラーゼ、およびルナシンなどの赤血球凝集素も含む。大豆植物は、形質転換されて、常態では大豆植物によって発現されない他のタンパク質を産生してもよいことに留意されたい。本明細書の「大豆タンパク質」への言及は、このようにして生成されたタンパク質も同様に考察するものと理解される。
【００８３】
乾燥質量基準で、大豆タンパク質は、大豆ホエーストリームの少なくとも約１０質量％、少なくとも約１５質量％、または少なくとも約２０質量％（乾燥質量基準）を構成する。典型的には、大豆タンパク質は、大豆ホエーストリームの約１０〜約４０質量％、または約２０〜約３０質量％（乾燥質量基準）を構成する。大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆の貯蔵タンパク質のかなりの部分を含有する。しかし単離沈殿後に残留する大豆ホエーストリームも、同様に１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質を含有する。
【００８４】
様々な大豆タンパク質に加えて、水性大豆ホエーストリームは、さらに１つまたは複数の炭水化物（すなわち糖類）を含んでなる。概して糖類は、大豆ホエーストリームの少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４５質量％（乾燥質量基準）を構成する。典型的には、糖類は、大豆ホエーストリームの約２５％〜約７５％、より典型的には約３５％〜約６５％、なおもより典型的には、約４０％〜約６０質量％（乾燥質量基準）を構成する。
【００８５】
大豆ホエーストリームの糖類は、概して１つまたは複数の単糖類、および／または１つまたは複数のオリゴ糖類または多糖類を含む。例えば、様々な態様で、大豆ホエーストリームは、グルコース、果糖、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される単糖類を含んでなる。典型的には単糖類は、大豆ホエーストリームの約０．５％〜約１０質量％、より典型的には約１％〜約５質量％（乾燥質量基準）を構成する。さらにこれらの態様および様々な他の態様に従って、大豆ホエーストリームは、スクロース、ラフィノース、スタキオース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるオリゴ糖類を含んでなる。典型的にはオリゴ糖類は、大豆ホエーストリームの約３０％〜約６０％、より典型的には約４０％〜約５０質量％（乾燥質量基準）を構成する。
【００８６】
水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、例えば様々なミネラル、フィチン酸、クエン酸、およびビタミンをはじめとする多様な構成要素を含む、灰分画を含んでなる。大豆ホエーストリーム中に典型的に存在するミネラルとしては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、マグネシウム、塩化物、鉄、マンガン、亜鉛、銅、およびそれらの組み合わせが挙げられる。大豆ホエーストリーム中に存在するビタミンとしては、例えばチアミンおよびリボフラビンが挙げられる。その正確な組成にかかわらず、灰分画は、典型的には大豆ホエーストリームの約５％〜約３０％、より典型的には約１０％〜約２５質量％（乾燥質量基準）を構成する。
【００８７】
水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、概して大豆ホエーストリームの約０．１％〜約５質量％（乾燥質量基準）を構成する、脂肪画分を含んでなる。本発明の特定の態様では、脂肪含量は酸加水分解によって測定され、大豆ホエーストリームの約３質量％（乾燥質量基準）である。
【００８８】
上の構成要素に加えて、水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、例えば様々な細菌、カビ、および酵母をはじめとする、１つまたは複数の微生物を含んでなる。これらの構成要素の割合は、典型的には、ミリリットル当たり約１×１０2〜約１×１０9コロニー形成単位（ＣＦＵ）で変動する。本明細書の他の箇所で詳述されるように、様々な態様で、タンパク質の回収および／または単離に先だって、水性大豆ホエーストリームを処理してこれらの構成要素を除去する。
【００８９】
言及されたように、大豆タンパク質単離物の従来の製造は、典型的には、大豆タンパク質単離物の単離後に残留する、水性大豆ホエーストリームの廃棄を含む。本開示に従って、１つまたは複数のタンパク質および様々な他の構成要素（例えば糖類およびミネラル）の回収は、比較的純粋な水性ホエーストリームをもたらす。それからタンパク質および１つまたは複数の構成要素が除去された従来の大豆ホエーストリームは、概して廃棄および／または再利用に先立って処理が必要である。本開示の様々な態様に従って、水性ホエーストリームは、行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として利用されてもよい。例えば水性ホエーストリームは、本開示の１つまたは複数の濾過（例えば透析濾過）操作で使用されてもよい。
【００９０】
大豆糖蜜ストリームは追加的タイプの大豆加工ストリームであることから、本明細書に記載される方法は、大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリームからのＢＢＩタンパク質の回収に加えて、同様に、大豆タンパク質濃縮物の製造において発生する大豆糖蜜ストリームの１つまたは複数の構成要素の回収に適するものと理解される。
【００９１】
Ｅ．ＢＢＩタンパク質の回収
本明細書に記載される方法は、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する水性ホエーストリーム中に存在する、精製ＢＢＩタンパク質の回収および単離を対象とする。上で考察したように、ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦，オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆ  ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スメイルメディックシード（ｓｎａｉｌ  ｍｅｄｉｃ  ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロフィア（ｊａｔｒｏｐｈｉａ）、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとする、マメ科または非マメ科植物挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆の精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
【００９２】
本開示は、大豆タンパク質単離物の製造において発生する、水性大豆ホエーストリームからのＢＢＩタンパク質の回収に適した多様な方法を包含する。概して、本開示の方法は、（例えば水性大豆ホエーストリームをはじめとする）大豆加工ストリームの特定構成要素を分離するように設計され設定された、１つまたは複数の操作を含んでなる。
【００９３】
概して、本開示に従って、例えば以下をはじめとする、当該技術分野で良く知られている多様な分離または精製技術の何れかを利用して、水性大豆ホエー中に見られる様々な妨害性構成要素を除去し、それから精製ＢＢＩタンパク質を単離してもよい。膜分離技術（例えば限外濾過、精密濾過、ナノ濾過などの濾過、および／または逆浸透）、クロマトグラフ分離技術（例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および例えばアニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーをはじめとする親和性クロマトグラフィー、模擬移動床クロマトグラフィー、膨張床吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換膜クロマトグラフィー、および混合床イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、およびそれらの組み合わせ。濾過用途では、濾過媒質の透過度が、サンプルの化学、分子または静電諸特性によって影響され得るが、様々な構成要素分離の主要原理は分子サイズである。本明細書の他の箇所で詳述されるように（例えば下の図２への言及）、本開示の方法は、典型的には、除去するホエーストリームの特定構成要素次第で、１つを超えるタイプの分離膜を利用する。例えば方法の一工程は限外濾過分離膜を利用して、ナノ濾過分離膜を用いる１つまたは複数の工程がそれに続いてもよい。
【００９４】
様々な態様で、本開示は大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリーム中に存在する、精製ＢＢＩタンパク質を回収および単離する方法を提供する。本発明の方法が、大豆ホエーまたは大豆糖蜜ストリームに限定されるものではなく、多種多様なマメ科または非マメ科植物加工ストリームから、タンパク質および様々な他の構成要素を回収するのに使用されてもよいことに留意すべきである。様々な態様で、高比率のＢＢＩタンパク質を含んでなる画分が、大豆ホエーストリームから回収される。例えば、本明細書の他の箇所で詳述されるように、本開示の方法は、かつて達成されたことのない純度レベルのＢＢＩタンパク質組成物を提供する。
【００９５】
本開示の方法によって処理された大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されている。ＢＢＩタンパク質の回収および／または単離を促進するために、ホエーストリームは好適には、方法の初期段階で濃縮される。大豆ホエーストリームを濃縮することは、ホエーストリームからのＢＢＩタンパク質の回収および分離を助ける。例えば本開示の好ましい実施形態では、ＢＢＩタンパク質の回収に先だって、水性大豆ホエーまたはその画分を分離膜に接触させ、水性大豆ホエーを含んでなる残余分と、水を含んでなる透過液とを形成することで、水性大豆ホエーから水を除去する。本開示の別の実施形態では、当該技術分野で知られているあらゆる方法を通じて、例えば蒸発によって、水を大豆ホエーから除去してもよい。
【００９６】
ＢＢＩタンパク質の回収と共に、本開示の方法は、典型的には、大豆ホエーストリーム中に存在する糖類からタンパク質を分離する。本開示の方法は、大豆ホエーストリームの糖類を１つまたは複数の画分（例えば単糖類に富む画分および／またはオリゴ糖類に富む画分）に分離するように、構成され制御されていてもよい。これは多段階で実施されて、タンパク質から異なる糖類が分離されてもよい。大豆ホエーストリームからの糖類の回収は、このようにしてさらなる生成流を提供する。言及されたように、糖の除去は、典型的には、それから糖類を分離し得る画分を生成し、濃縮糖画分、および行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として再循環されてもよい比較的純粋な水性画分の双方が生じる。糖類を除去する残余分の処理に続き、残余分をさらに処理して追加的構成要素を除去する。
【００９７】
言及されたように、本開示によって処理されてもよい様々な大豆ホエーストリームは、１つまたは複数のミネラル（例えばリンおよびカルシウム）を含む。１つまたは複数のミネラルの存在は、例えば膜の汚損と、回収を所望する構成要素（すなわちＢＢＩタンパク質）からの分離の困難さによって、後処理過程に難題をもたらすこともあることが観察されている。これらの所望の構成要素の回収に加えて、概して大豆ホエーからのミネラルの除去は、目下、純度がより高いＢＢＩ生成物の回収にも寄与すると考えられている。本明細書の他の箇所で詳述されるように、大豆ホエーからのミネラル除去は、概して、例えば沈殿および遠心分離をはじめとする、当該技術分野で知られている方法に従って開始してもよい。フィチン酸が、典型的には、本方法によって処理された水性大豆ホエーストリーム中に存在するので、カルシウムおよびマグネシウムなどのミネラルは、典型的にはカルシウムおよびマグネシウムフィチン酸の形態で回収される。除去される他のミネラルとしては、例えばナトリウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガン、および銅もまた挙げられる。
【００９８】
不溶性固形物除去の特定の態様では、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、およびそれらの組み合わせを使用してもよい。これらの方法によって除去される不溶性固形物は、典型的には５ミクロンよりも大きい。
【００９９】
精密濾過は、精密濾過膜を使用することで、固体粒子を流体から分離する方法である。適切な精密濾過膜は、例えばポリスルホン、変性ポリスルホン、セラミック、およびステンレス鋼をはじめとする当該技術分野で知られている適切な材料から構成される。精密濾過膜は、典型的には、約０．１ミクロン〜約２０ミクロン範囲の孔径を有する。特定の態様では、精密濾過膜は約０．２ミクロン〜約２ミクロンにわたる孔径を有する。
【０１００】
限外濾過は精密濾過と類似するが、分離膜の孔径の点で異なる。限外濾過膜は、典型的には、より低い分子量を有する分子から、（例えばタンパク質をはじめとする、高分子量を有する分子を分離するのに使用される。適切な限外濾過膜は、典型的には、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニリデンフッ化物（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セラミック、ステンレス鋼、または薄膜複合材などの当該技術分野で知られている適切な材料から構成される。限外濾過膜は、典型的には約１〜約３００キロダルトン（ｋＤａ）または約５〜約５０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。さらにまたは代案としては、適切な限外濾過膜は、約０．００２ミクロン〜約０．５ミクロンの孔径を有してもよい。
【０１０１】
ナノ濾過は、流体から小分子を除去するのに使用される。適切なナノ濾過膜は、典型的には、当該技術分野で知られている適切な材料（例えばポリエステル上のポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セラミック、およびポリアミド−タイプの薄膜複合材）から構成され、典型的には約０．１〜約５ｋＤａまたは約１〜約４ｋＤａのＭＷＣＯを有する。さらにまたは代案としては、適切なナノ濾過膜は、約０．９ナノメートル〜約９ナノメートルの孔径を有してもよい。
【０１０２】
逆浸透（または超濾過）は、典型的には糖類の濃縮のために使用される。適切な逆浸透膜としては、概して当該技術分野で知られているもの（例えば孔径が０．５ｎｍ未満の膜）が挙げられる。
【０１０３】
本発明の濾過工程で利用される分離膜は、単独でまたは組み合わせで、当該技術分野で知られている、１つまたは複数の立体配置に従って配置されてもよい。例えば膜は、その中で（任意の分離スクリーン層と共に）膜層が共に組み合わされた、平板、またはカセットモジュールの形態に構成されてもよい。水性大豆ホエーは、概して重なりの一端の交互の溝内に導入され、流体は膜を通過して、１つまたは複数の濾液または透過液溝に入る。分離膜はまた、その中で膜の交互の層が中空の中核周囲に巻かれる、らせん巻きモジュールに配列されてもよい。水性大豆ホエーがモジュールの一端に導入される一方で、流体は膜の交互の層を通過して、モジュールのコア内に向かう。さらなる例として、分離膜は、比較的細い膜管束を含んでなる中空繊維モジュールに配列されてもよい。水性大豆ホエーがモジュール内に導入され、流体は、モジュールを通過する大豆ホエー流を横断する膜管束を通過する。適切な膜配置は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，９４６，０７５号明細書に記載される。
【０１０４】
本発明の濾過工程は、本明細書でさらに詳しく述べるように、直接（ノーマルフロー）濾過または接線流（クロスフロー）濾過を利用してもよい。直接濾過またはノーマルフロー濾過では、流体（すなわち水性大豆ホエー）は、そのまま分離膜に向かって運ばれる。代案としては、接線流またはクロスフロー濾過では、流体（すなわち水性大豆ホエー）は、分離膜表面に沿って接線方向に運ばれてもよい。接線流またはクロスフロー濾過の１つの利点は、水性大豆ホエー流によって膜上に接線方向に及ぼされる摩擦または掃引力が、典型的には、流動速度を保つのを助けることである。したがって本開示の方法の様々な態様において、１つまたは複数のステップ、およびそれらの組み合わせは、クロスフロー濾過として操作される。適切なクロスフローフィルターとしては、米国特許第６，９４６，０７５号明細書に記載されるものをはじめとする、概して当該技術分野で知られているものが挙げられる。液体通過は、適切には、ノーマルフローおよび／または接線流（すなわちクロスフロー）に従って進行してもよいものと理解される。図２に示される実施形態、およびその他の態様との関連で、本明細書の他の箇所で詳述される他の膜分離ユニットを通る液体の通過は、これらの機序のどちらかまたは双方に従って進行してもよいものとさらに理解される。
【０１０５】
本発明によって記載される方法は、大豆ホエーストリームから様々な構成物を逐次除去し、または精製ＢＢＩ生成物を回収または単離する、適切な分離操作または操作の組み合わせの選択を伴い、ＢＢＩ生成物は、当該技術分野でかつて達成されたことのない純度レベルを有する。本発明の特定の態様では、および本明細書の他の箇所で詳述されるように、ＢＢＩタンパク質を回収する方法は、膜分離と（例えばイオン交換）クロマトグラフ分離操作の組み合わせを利用する。様々な態様で、個々のＢＢＩタンパク質の回収は、（当該技術分野で「ＳＭＢ」構造と言及されることが多い）模擬移動床操作によって進行する。
【０１０６】
本明細書の他の箇所で言及されるように、本開示の方法によって処理された水性大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されている。様々な態様で、水性大豆ホエーは、標的とされる個々のタンパク質の回収に先だって、水分除去により少なくとも約２（例えば約３または約６）倍に濃縮される。
【０１０７】
ＢＢＩタンパク質を回収する他の方法と比較して、模擬移動床を使用する非ＢＢＩタンパク質の回収は、概して、少なくともある程度は水性大豆ホエーの複数サンプル処理への適応性に起因する、コスト低下、処理能力、および／または順応性の利点もまた提供してもよい。
【０１０８】
大豆ホエーストリームの１つまたは複数の構成要素が、ＢＢＩタンパク質の回収を妨げることもあることが観察されている。例えば大豆タンパク質単離物の製造中に、典型的にはシリコーンであるケイ素化合物が、通常、Ｈｙｄｒｉｔｅ  ＣｈｅｍｉｃａｌまたはＥｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから市販されるものなどのケイ素含有化合物の形態で、脱泡剤として導入されることが多い。正確な起源を問わず、有機ケイ素化合物は、典型的には、ケイ素含量を基準にして約１５百万分率（ｐｐｍ）まで、約１０ｐｐｍまで、または約５ｐｐｍまでの濃度で、大豆ホエーストリーム中に存在する。有機ケイ素化合物の存在は、大豆ホエーストリームのＢＢＩタンパク質の回収を妨げることもあるので、概して望まれない。
【０１０９】
したがって本明細書の他の箇所で詳述されるように、ＢＢＩタンパク質の回収および分離処理に先だって、様々な態様で、大豆ホエーストリームからシリコーンおよび／または他の有機ケイ素化合物が除去される。好適には、ケイ素化合物は、本明細書でさらに詳述するように、大豆ホエーが痕跡量以下のレベルの有機ケイ素を含有する程度まで、除去される。さらにまたは代案としては、水性大豆ホエーは、水性大豆ホエーの所望の構成要素の回収を妨げることもあり、および／または方法の最終回収生成物中で望まれない、１つまたは複数の微生物を含むこともある。
【０１１０】
これらの妨害性構成要素を除去するために、ケイ素脱泡剤および／または１つまたは複数の微生物の保持に対して選択的である分離膜を使用して、大豆ホエーストリームを濾過し、ケイ素および／または１つまたは複数の微生物を含んでなる残余分と、水性大豆ホエーを含んでなる透過液とを得てもよい。この最初の精製で使用される（例えば精密濾過をはじめとする）特定の膜は、除去する構成要素を考慮して選択される。選択される膜のタイプ、および大豆ホエーストリームから除去する構成要素にかかわらず、好適には所望のＢＢＩタンパク質の少なくともかなりの部分が、そして好適には実質的に全部が、残余分中に見られる。さらにこの点において、水性大豆ホエーを含んでなる透過液への言及は、１つまたは複数の不純物を除去するホエーストリームの処理が大豆ホエーストリームの他の構成要素に及ぼす影響は、たとえあったとしてもわずかであることを示唆することに留意されたい。
【０１１１】
様々な代案の態様で、ホエーストリームに含有される細菌は、タンパク質回収に先だって加熱により死滅させてもよい。細菌を破壊するための大豆ホエーストリームの加熱様式は厳密に決定的でなく、概して、当該技術分野で知られている従来の方法に従って行ってもよい。しかし微生物を破壊する大豆ホエーストリームの加熱は、タンパク質変性のリスクを持ち込むこともある。したがって大豆ホエーストリームの加熱を含まない方法による、大豆ホエーストリームからの細菌および他の微生物の除去が概して好ましい。
【０１１２】
図２は大豆タンパク質単離物の製造において発生する大豆ホエーストリームから、１つまたは複数の個々のタンパク質を回収する、本開示の方法の実施形態を示す。
【０１１３】
図２に示されるように、水性大豆ホエー１は、膜の反対側の第１の透過液ゾーン８内の圧力よりも高い圧力で分離膜７の片側に接する第１の濾過供給ゾーン６を含んでなる、膜分離ユニット５内に導入される。好適には、膜分離ユニット５は、少なくとも１つの精密濾過膜を含んでなる。
【０１１４】
膜分離ユニット５内の分離膜７を越える膜貫通圧力は、概して少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約２５ｐｓｉ、少なくとも約５０ｐｓｉ、少なくとも約１００ｐｓｉ、または少なくとも約１５０ｐｓｉである。流体は、典型的には、以下の体積流量または流速で膜を通過する。少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2、または約１〜約２００リットル流体／時間−ｍ2の流れ方向を横断する膜断面積。流速は、例えば濾過のタイプ、膜の汚損などによって影響されることもある。大豆ホエーは、典型的には約０℃〜約１００℃の温度、より典型的には約２５℃〜約６０℃の温度で、膜分離ユニットの濾過供給ゾーン内に導入される。典型的には水性大豆ホエー１は、残余分のために体積が約５％減少する。
【０１１５】
分離膜を越える液体通過は、第１の透過液ゾーン８内に、第１の残余分９と第１の透過液１３をもたらす。第１の残余分９は、主として１つまたは複数の微生物と不溶性物質を含んでなり、特に第１の残余分９は、典型的には第１の透過液１３と比較して微生物に富む。好適には、第１の残余分９は、水性大豆ホエーの微生物含量の実質的に全部でないとしても、かなりの部分を含有する。なおもより好ましくは、第１の残余分９はまた、消泡剤（例えば水性大豆ホエー中に存在する、有機ケイ素−または脂質−含有含有化合物のケイ素）のかなりの部分を含んでなり、特に好適には、消泡剤含量を基準にして、水性大豆ホエーの消泡剤含量の少なくとも約７０質量％、より好適には少なくとも約８０質量％、さらにより好適には少なくとも約９０質量％を含んでなる。第１の透過液１３は、主として、可溶性大豆貯蔵タンパク質、大豆ホエータンパク質、様々な糖類、水、ミネラル、イソフラボン、およびビタミンなどの水性大豆ホエーストリームの様々な残りの構成要素の全てを含んでなる。
【０１１６】
再度図２に言及すると、第１の透過液１３は、第２の透過液ゾーン２０内の圧力よりも高い圧力で分離膜１９の片側に接する第２の濾過供給ゾーン１８を含んでなる、膜分離ユニット１７内に導入される。膜分離ユニット１７は、好適には分離膜１９として、少なくとも１つの限外濾過膜を含んでなる。膜分離ユニット１７内の分離膜１９を越える膜貫通圧力は、概して少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約１０ｐｓｉ、少なくとも約２５ｐｓｉ、少なくとも約５０ｐｓｉ、少なくとも約１００ｐｓｉ、または少なくとも約１５０ｐｓｉである。流体は、典型的には、以下の体積流量または流速で膜を通過する。少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2、または約１〜約１５０リットル流体／時間−ｍ2の流れ方向を横断する膜断面積。大豆ホエーは、典型的には、約０℃〜約１００℃の温度、より典型的には約２５℃〜約６０℃の温度で、膜分離ユニットの濾過供給ゾーン内に導入される。典型的には、水性大豆ホエー１は、少なくとも約５、または約５〜約７５（例えば約２５）の濃縮係数に濃縮される。限外濾過工程には透析濾過が含まれていてもよい。透析濾過体積は、典型的には、残余分１部当たり約１〜約１０部の透析濾過体積に及んでもよい。
【０１１７】
分離膜を通る液体通過は、第２の残余分２１と第２の透過液２５をもたらす。第２の残余分２１は水性大豆ホエーのタンパク質含量の顕著な画分を含んでなり、したがってＢＢＩタンパク質の回収のためにさらに処理される。好適には第２の残余分２１は、第１の濾過供給ゾーン６内に導入された水性大豆ホエー中に存在する様々な大豆ホエータンパク質の少なくとも約２５質量％〜少なくとも約９０質量％（例えば少なくとも約５０質量％）（乾燥質量基準）を含んでなる。
【０１１８】
再度図２に言及すると、第２の透過液２５は、概して、第２の残余分２１中で回収されないあらゆるタンパク質と、大豆ホエーストリームの様々な他の構成要素（例えば様々な糖類、水、ミネラル、ビタミン、およびイソフラボン）とを含んでなる。図２には示されないが、水性ホエーストリームから個々の構成要素を単離しおよび／または除去するために、適切な分離操作に従って、第２の透過液２５の構成要素をさらに処理してもよい。追加的分離工程に続いて、廃棄または使用に先立って、行うとしても最小の処理を要する、比較的純粋な水ストリームが好適には形成される。したがって本明細書に記載される本発明は、例えば環境の質を改善することで環境上の利点もまた有する。
【０１１９】
第２の残余分２１をキャリアストリーム２３と合わせて、少なくとも１つのイオン交換樹脂３０を含有するイオン交換カラムまたはユニット２９への供給材料２４を形成する。キャリアストリームの正確な組成は、厳密に決定的ではない。したがって本明細書に記載される本発明はまた、例えば環境の質を改善することで環境上の利点も有する。ＢＢＩタンパク質の回収の様々な態様において、キャリアストリームは、例えばクエン酸ナトリウムをはじめとする非揮発性緩衝液、または例えばギ酸アンモニウムをはじめとする揮発性緩衝液を含んでなる。例えば様々な態様において、キャリアストリームは、約１０〜約３０ミリモル濃度（例えば２０ｍＭ）の濃度で水性混合物中に対イオンを含有する、緩衝液を含んでなる。
【０１２０】
第２の残余分２１および／または供給流２４のｐＨは大豆タンパク質の溶解度に影響を及ぼし、沈殿タンパク質はイオン交換樹脂の汚損をもたらすこともある。したがって特定限度内で、イオン交換カラムへの供給材料の（例えば緩衝による）ｐＨ調節が所望されることもある。必要ならば供給材料のｐＨは、例えば第２の残余分の希釈、キャリアストリーム、および／または残余分とキャリアストリームの組み合わせによって提供される供給材料によって、範囲内に保たれてもよい。希釈剤の組成は厳密に決定的でなく、典型的には、当業者に容易に選択されてもよい水性媒体（例えば脱イオン水）である。供給材料のｐＨに影響を及ぼすのに加えて、希釈はまた、典型的には供給材料の固有イオン強度を低下させ、それはタンパク質とイオン交換樹脂の結合を促進する。さらにまたは代案としては、供給材料のｐＨは、キャリアストリームの選択によって制御されてもよい。
【０１２１】
イオン交換樹脂は、第２の残余分２１および供給材料２４中に存在する、１つまたは複数のタンパク質の選択的保持および回収に適するように選択される。様々な態様で、イオン交換樹脂は、ＢＢＩタンパク質を非ＢＢＩタンパク質から分離するように、選択的なＢＢＩタンパク質保持または非ＢＢＩタンパク質保持について選択される。以下の考察は、水性大豆ホエー（すなわち第２の残余分２１）からのＢＢＩタンパク質の回収および単離に注目する。しかし以下の手順は、他の標的タンパク質（例えばＫＴＩタンパク質）ならびに水性以外の（例えば噴霧乾燥から戻された）他の各種受け入れストリームの回収のために、容易に適合できるものと理解される。
【０１２２】
イオン交換ユニットの正確な構成にかかわらず、ＢＢＩタンパク質の回収のための適切なイオン交換樹脂としては、多様なカチオンおよびアニオン交換樹脂が挙げられる。イオン交換カラムへの供給材料次第で、カチオン交換樹脂とアニオン交換樹脂のどちらもＢＢＩタンパク質の回収に適するが、様々な態様でイオン交換樹脂はカチオン交換樹脂を含んでなる。例えばその等電点（ｐＩ）未満のｐＨに曝露したタンパク質は正電荷域を有する可能性がより高く、したがってカチオン交換樹脂とより密接に結合する。供給流中のほとんどのタンパク質は、ＢＢＩ、そして供給材料の典型的なｐＨよりも高いｐＩを有する。したがってこれらのタンパク質は、典型的には樹脂とより密接に結合する。ＢＢＩタンパク質含有画分は、樹脂を適切な溶離液に接触させることにより、イオン交換カラムから容易に溶出させることもできる。
【０１２３】
代案としては、供給材料のｐＨがＢＢＩタンパク質のｐＩを下回るように調節して、イオン交換樹脂によるＢＢＩタンパク質の保持を提供してもよい。他のタンパク質（例えばＫＴＩタンパク質）もまた、樹脂に結合する。しかし所望の画分の回収は、タンパク質画分の差次的溶出のために、イオン交換樹脂を適切な溶離液と接触させることで進行してもよい。
【０１２４】
適切なカチオン交換樹脂としては、当該技術分野で良く知られている多様な樹脂が挙げられる。少なくとも１つの実施形態では、イオン交換樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されるＰｏｒｏｓ  ２０  ＨＳを含んでなり、これはスルホプロピル基（例えばプロピルスルホン酸、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3-）で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーで表面被覆された、架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックスである。
【０１２５】
残余分および／または供給材料のｐＨの調節は、非ＢＢＩタンパク質の沈殿をもたらすこともあることが観察されている。このような場合、沈殿タンパク質は、イオン交換カラム内への導入に先だって、あらゆる膜分離技術（例えば限外濾過、精密濾過、ナノ濾過などの濾過、および／または逆浸透）、クロマトグラフ分離技術（例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および例えばアニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーをはじめとする親和性クロマトグラフィー、模擬移動床クロマトグラフィー、膨張床吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換膜クロマトグラフィー、および混合床イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、（例えば硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムをそれぞれ使用した塩析または塩溶をはじめとする）重力分離、またはその組み合わせによって、供給材料から分離してもよい（図２には示されない）。分離は、約１〜１０に及ぶｐＨで約０℃〜１００℃で実施してもよい。
【０１２６】
再度図２に言及すると、イオン交換カラム３０を通る供給材料２４の通過後に、溶出ＢＢＩタンパク質ストリーム３３が回収される。
【０１２７】
必要ならば、イオン交換樹脂を適切な溶離液と接触させて、溶出ＢＢＩタンパク質含有ストリーム３３およびＫＴＩタンパク質含有ストリーム３７を得る。イオン交換カラムからのタンパク質溶出は、典型的には多段階工程を通じて進行する。様々な態様に従って、第１段階では、イオン交換樹脂からのＢＢＩタンパク質除去のために、カラムを溶離液と接触させる。適切な溶離液としては、例えば塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムの混合物が挙げられる。例えば適切な溶離液は、１ｍＭ〜４００ｍＭの溶液を使用して、塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムの体積比が約１５：１〜約２５：１である、塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムの混合物を包含し得る。このようにして溶出されるＢＢＩタンパク質に加えて、ＢＢＩタンパク質含有ストリームも（例えばｐＨ、イオン強度などの）条件次第で、イオン交換カラムを通過し得る（すなわち通過画分）。溶出緩衝液としては、例えば緩衝液および適切な対イオンが挙げられ、それは当業者によって判定され得る。第２段階では、例えばＫＴＩタンパク質含有ストリーム３７の形態の非ＢＢＩタンパク質を除去するために、イオン交換樹脂を溶離液と接触させる。
【０１２８】
ＢＢＩタンパク質を保持しない（すなわち通過画分）イオン交換カラムを使用してＢＢＩタンパク質が得られる本発明の特定の態様では、ＢＢＩタンパク質はカラムの固定相と同一の電荷を担持し、その結果、保持されずに通過する。しかし非ＢＢＩタンパク質は、カラムによって保持される。
【０１２９】
再度図２に言及すると、ＢＢＩタンパク質含有ストリーム３３は、液体沈殿媒体４５と共に、沈殿ゾーンを含んでなる分離ユニット４１内に誘導される。概して液体沈殿媒体４５は、沈殿剤を含んでなる。典型的には、液体沈殿剤は硫酸アンモニウムを含んでなり、ＢＢＩタンパク質ストリーム３３からＢＢＩタンパク質を沈殿させる。様々な態様において、液体沈殿媒体は、液体沈殿媒体中のその飽和濃度の約３０％〜約６０％（例えば約４０％〜約５０％）の濃度で、硫酸アンモニウムを含んでなる。
【０１３０】
沈殿ゾーン内におけるＢＢＩタンパク質画分３３と沈殿媒体４５の接触は、沈殿ＢＢＩタンパク質画分４９と、分離ユニット４１から除去される上清５３とを形成する。沈殿ＢＢＩタンパク質画分４９は、塩または緩衝液の存在または不在下で水性洗浄媒体５７と合わせられて、可溶化ＢＢＩタンパク質画分６１が形成する。このＢＢＩタンパク質画分６１は、残留沈殿剤（例えば硫酸アンモニウム）および１つまたは複数の他の不純物を含むこともある。
【０１３１】
図２に示されるように、可溶化タンパク質画分６１は、あらゆる残留沈殿剤および１つまたは複数の不純物を除去するために、透析または透析濾過ユニット６５内に誘導される。透析または透析濾過ユニットの形態および構成は厳密に決定的でなく、ユニットは当業者によって容易に選択されてもよい。例えば適切な透析カセットを含んでなる透析ユニット（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓによって製造されるＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ；分子量カットオフ２０００ダルトン）、または（大規模分離により適していてもよい）クロスフロー濾過膜を含んでなる透析濾過ユニットを利用してもよい。残留沈殿剤および／または不純物の除去は、可溶化タンパク質画分６１の導電率をモニタリングすることで判定される。ひとたび適切な不純物除去が達成されたら、透析または透析濾過ユニット６５から、精製ＢＢＩ可溶化タンパク質画分７３を取り出す。精製可溶化ＢＢＩタンパク質画分７３を乾燥ユニット７７（例えば凍結乾燥ユニットまたは噴霧乾乾燥ユニット）内に導入して、乾燥精製ＢＢＩタンパク質生成物８１を形成してもよい。精製可溶化ＢＢＩタンパク質画分７３の処理によって、ＢＢＩタンパク質画分から１つまたは複数の残留不純物を除去し、本発明の精製ＢＢＩタンパク質生成物８１が形成されてもよい。例えば１つまたは複数の内毒素を除去するために、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１１４による処理を使用する。
【０１３２】
図３は、最終ＢＢＩ生成物をはじめとする、図２で示される本発明の方法において単離された、様々な残余分および透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析を示す。レーン１は分離に先立つ大豆ホエーの組成を示し、複数成分の存在が示唆される。対照的にレーン８は、本発明の分離法に続いて大豆ホエーから単離されたＢＢＩタンパク質を示し、実質的に追加的構成要素は含まれず、高レベルの純度が示唆される。
【０１３３】
図２に示されるプロセススキームは、使用出発原料や、上述の大豆ホエー構成要素の分離および回収順序に限定されるものではなく、例えば添付の特許請求の範囲に記載されるものをはじめとする、上で論じたものと異なる加工スストリームを調製するのに利用してもよい。
【０１３４】
Ｆ．ＢＢＩタンパク質を製造する追加的方法
特定の実施形態では、本発明のＢＢＩタンパク質は、例えば組換え手段によって、または合成的に生成される。本発明のタンパク質の組換え生産は、当業者に知られている標準技術を使用して行われる。このような方法としては、例えば１つまたは複数のコード核酸配列を作成することが挙げられ、それは全長ｃＤＮＡ配列をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法によって実施し得る。所望の核酸配列の生成に続いて、配列を（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｐＣＡＬ−ｎ発現プラスミドをはじめとする）発現プラスミドに挿入し、次にそれを微生物に形質移入する；次に（例えば抗生物質耐性選択マーカーまたは発光選択マーカーをはじめとする）選択マーカーを使用して、所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローン選択を実施する；所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローンの大量生産がそれに続く；所望のクローンからペプチドを精製する（例えばＧｏｒｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１，４１０７−４１１６に記載される方法；米国特許第４，９８０，４５６号明細書を参照されたい）。代案としては本発明のペプチドは、合成手段または半合成手段（例えば組換え生産と合成手段の組み合わせ）によって製造し得る。
【０１３５】
合成的製造は、例えばＣａｒｐｉｎｏ  Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｈａｎ．ＧＹ、Ｊ．（Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１；３７；３４０４−３４０９）に記載のフルオレニルメチロキシカルボニル（ＦＭＯＣ）−保護基ストラテジーを応用し、またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−保護基ストラテジーを応用することで実施し得る。ペプチドは、例えば多重ペプチド合成装置を使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｂ．（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３；８５，２１４９−２１５４）に記載の固相ペプチド合成手段によって合成される。次に粗製ペプチドを精製する。
【０１３６】
本発明のタンパク質を合成製造するための例示的方法は、続く節に記載される。装填量０．２４ｍｍｏｌ／ｇで、１００ｍｇのＴｅｎｔａｇｅｌ−Ｓ−ＲＡＭ（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）を市販のペプチド合成装置（ＰＳＭＭ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ））に移し、そこでペプチド配列をカルボジイミド／ＨＯＢｔ法に従って段階的に構築する。ＦＭＯＣ−アミノ酸誘導体は、５倍等モル過剰量のジ−イソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ−イソプロピル−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加してあらかじめ活性化され、反応容器に移した後に樹脂担体と３０分間混合された。洗浄工程は、例えばＤＭＦの添加と、１分間にわたる完全混合によって実施される。切断工程は、例えばＤＭＦ中のピペリジンの添加と、４分間にわたる完全混合によって実施される。個々の反応および洗浄溶液の除去は、溶液を反応容器底のフリットを通して押し出すことで達成される。アミノ酸誘導体ＦＭＯＣ−Ａｌａ、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、ＦＭＯＣ−Ｉｌｅ、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、およびＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｏｒｐｅｇｅｎ）が用いられる。合成が完了したら、ペプチド樹脂を乾燥させる。トリフルオロ酢酸／ＴＩＳ／ＥＤＴ／水（９５：２：２：１ｖｏｌ）による室温で２時間の処理により、ペプチドアミドを引き続いて切断する。濾過、溶液濃縮、および氷冷ジエチルエーテル添加による沈殿の手段を通じて、粗生成物を固体として得る。次に０．１％ＴＦＡ中のＲＰ−ＨＰＬＣによって、６０％アセトニトリル上の勾配５、流速１２ｍｌ／分で４０分間、および２１５ｎｍにおけるＵＶ検出の手段による溶離剤の評価で、プチドを精製する。個々の画分の純度は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析法によって判定される。
【０１３７】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下で定義する。
【０１３８】
「酸可溶性」という用語は、本明細書の用法では、約２〜約７のｐＨを有する水媒質中において、１リットル（ｇ／Ｌ）当たり１０グラムの濃度で、少なくとも約８０％の溶解度を有する物質を指す。
【０１３９】
「大豆タンパク質単離物」または「単離大豆タンパク質」という用語は、本明細書の用法では、無水ベースで少なくとも約９０％大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料を指す。
【０１４０】
「対象（単数）」または「対象（複数）」という用語は、本明細書の用法では、病的状態の治療を必要とする、哺乳類（好適にはヒト）、鳥、魚、爬虫類、または両生類を指し、病的状態としては、筋肉、無制御な細胞増殖、自己免疫疾患、および癌と関連付けられている疾患が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４１】
「加工ストリーム」という用語は、本明細書の用法では、例えば水性大豆抽出物、水性豆乳抽出物、水性大豆ホエーストリーム、水性大豆糖蜜ストリーム、水性大豆タンパク質濃縮物大豆糖蜜ストリーム、水性大豆透過液ストリーム、水性豆腐ホエーストリームをはじめとし、さらに例えば本明細書で開示される方法に従って中間生成物として回収され得る、液体および乾燥粉末双方の形態の大豆ホエータンパク質をはじめとする、水性ストリーム、溶剤ストリーム、または乾燥（例えば噴霧乾燥）から戻されたストリームをはじめとする、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程に由来する、二次的または偶発的生成物を指す。
【０１４２】
「その他のタンパク質」という用語は、本明細書の用法では、ルナシン、レクチン、デヒドリン、リポキシゲナーゼ、およびそれらの組み合わせを含むが、これに限定されないと定義される。
【０１４３】
「大豆ホエータンパク質」または「大豆ホエー」という用語は、本明細書の用法では、ＢＢＩ、ＫＴＩ、ルナシン、リポキシゲナーゼ、デヒドリン、レクチン、ペプチド、およびそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、大豆貯蔵タンパク質が典型的には不溶性であるｐＨにおいて、可溶性であるタンパク質を含むと定義される。大豆ホエータンパク質は、貯蔵タンパク質をさらに含んでもよい。
【０１４４】
「大豆オリゴ糖類」という用語は、本明細書の用法では、糖を含むが、これに限定されないと定義される。糖は、スクロース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、単糖類、およびそれらの組み合わせ含むが、これに限定されるものではないと定義される。
【０１４５】
本発明の要素またはその好ましい実施形態を述べる際の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」と言う冠詞、および「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素を意味することが意図される。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」は、包括的であることが意図され、列挙される要素以外の追加的要素があってもよいことを意味する。
【０１４６】
本発明の範囲を逸脱することなく、上の化合物、生成物、および方法には様々な変更を加え得るので、上の説明および下の実施例に包含される全ての事項は例示的であり、限定的でないと解釈されるものとする。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：大豆ホエータンパク質からのＢＢＩタンパク質の回収
およそ３．７質量％の総タンパク量含量と、２２．５質量％（乾燥質量基準）の総固形分を有する水性大豆ホエー（１４５ｌ）をＢＴＳ−２５またはＭＭＭ０．４５ミクロン精密濾過膜を含有するＯＰＴＩＳＥＰ  ７０００濾過モジュール内に導入する。膜に水性大豆ホエーを通過させると、水性大豆ホエーを含有する透過液（３．２質量％の固形分を有する１３２Ｌ）と、大豆ホエーの最初の細菌含量の９９％以上、および大豆ホエーのケイ素脱泡剤含量の９０％以上を含有する残余分とが形成される。
【０１４８】
精密濾過モジュールからの透過液（１３２ｌ）を孔径およそ１００ｋＤａを有する再生セルロース（ＲＣ）限外濾過膜を含有する、ＯＰＴＩＳＥＰ  ７０００濾過モジュール内に導入した。透過液を限外濾過膜に通過させると、糖類、ミネラル、およびビタミンを含有する第２の透過液と、およそ２５．４質量％の固形分およびおよそ８３質量％（乾燥ベース）の総大豆タンパク質含量を有する第２の残余分（約２Ｌ）とが形成された。
【０１４９】
第２の残余分（５１６ｍｌ）を少量のバッチで、ｐＨ３の２０ｍＭクエン酸ナトリウムであらかじめ平衡化させたＰｏｒｏｓ  ２０  ＨＳカチオン交換樹脂（６８．３ｍｌカラム床体積）を含有するイオン交換カラム内に導入した。ｐＨ３の２０ｍＭクエン酸ナトリウムで５倍希釈し、必要に応じてＨＣｌを添加することで、イオン交換樹脂と接触させる残余分（すなわちイオン交換カラム内に導入される供給流）のｐＨを約４．１５に保つ。
【０１５０】
線流速およそ７６ｃｍ／時間でカラムを通る残余分の各バッチの通過からは、ＢＢＩタンパク質ストリーム（およそ７３ｇ）が生成した。ＢＢＩタンパク質を含有する第２のタンパク質画分（およそ９ｇ）は、ｐＨ３の２０ｍＭクエン酸ナトリウム中の４００ｍＭ塩化ナトリウムでの溶出によってイオン交換カラムから回収され、他のタンパク質を含有する第３のタンパク質画分（およそ２７ｇ）は、ｐＨ３の２０ｍＭクエン酸ナトリウム中の１Ｍ塩化ナトリウムでの溶出によってイオン交換カラムから回収された。ＢＢＩ含有画分からは、驚くべきことにそして意外にも、純粋なＢＢＩ組成物が生成した。この画分は、（例えばｐＩがＢＢＩと同じかまたはそれ以下である、ＫＴＩおよび他の大豆ホエータンパク質をはじめとする）タンパク質をさらに含有することが予期された。
【０１５１】
ＢＢＩタンパク質ストリーム（およそ６．４５Ｌ）をおよそ２３℃の温度でおよそ３０分間、（ＮＨ4）2ＳＯ4によって４０％飽和にして、上清および沈殿ＢＢＩタンパク質画分を形成し、それを遠心分離によって分離した。
【０１５２】
沈殿ＢＢＩタンパク質画分をおよそ２３℃の温度で、それぞれおよそ５分間にわたり、４５％飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4洗浄媒体と２回接触させた。
【０１５３】
沈殿ＢＢＩタンパク質画分を最小体積の脱イオン水中で可溶化して、Ｐｉｅｒｃｅ  ２Ｋ分子量カットオフＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセットに移し、脱イオン水に対して徹底的に透析した。ＢＢＩタンパク質画分を透析カセットから回収し、遠心分離して少量の沈殿した材料を除去した。
【０１５４】
可溶性ＢＢＩタンパク質画分を４℃の温度にして、十分な１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４溶液（温度４℃で）を添加し、１％の最終Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４濃度を得た。この混合物を４℃の温度でおよそ６０時間撹拌した。混合物をおよそ４０℃で３０分間加熱して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４の曇り点沈殿（相分離）を得た。
【０１５５】
混合物を遠心分離して、上部のＢＢＩタンパク質画分相を収集した。内毒素に富む下部のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４相を４℃の温度で３０分間、脱イオン水洗浄媒体と接触させた。混合物を４０℃の温度で３０分間加熱して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４の曇り点沈殿（相分離）を得た。混合物を遠心分離して上部の残留ＢＢＩタンパク質画分相を収集し、先のＢＢＩタンパク質画分材料と合わせた。驚くべきことにそして意外にも、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４溶液は他の溶液よりもはるかに良く機能して、内毒素を除去した。
【０１５６】
総ＢＢＩタンパク質画分をＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ０．２ミクロンＨＴ  ＴｕｆｆｒｙｎメンブランＡｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルターに通過させ、エタノール洗浄ガラスバイアルに入れた。バイアルをＬａｂｃｏｎｃｏ  Ｆｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５凍結乾燥システム上で−８０℃で凍結して、凍結乾燥させた。
【０１５７】
およそ２．９ｇのＢＢＩ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で＞９５％の純度）が回収された。表１は、実施例１に記載される方法に従って、各精製工程で得られた結果を示し、究極的に高純度の生成物がもたらされる。
【０１５８】
【表１】
2013516429.tif 000003
【０１５９】
実施例２：大豆ホエータンパク質からのＢＢＩタンパク質の回収
８６．２質量％（乾燥質量基準；窒素燃焼アッセイ、標準ケルダール法による測定）の総タンパク量含量を有する噴霧乾燥大豆ホエータンパク質（４４ｇｍ）を脱イオン水中で最終濃度１０％（ｗ／ｖ）に再懸濁し、室温で２時間撹拌した。次に懸濁液をＢｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１０ローター内で１０分間、４０００×Ｇで遠心分離して不溶性物質を除去した。上清を４体積のクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ３．０）で希釈して、濃塩酸で最終ｐＨ３．０にさらに調節した。ｐＨ調節された上清を遠心分離し、Ｊｏｕａｎ  Ｃ６０ローター内で室温で３０分間、４０００ＲＰＭで不溶性物質を除去し、上清をデカントしてカラム装入材料として使用した。
【０１６０】
カラム展開に使用した溶液は、次のとおりであった。溶液Ａ：脱イオン水；溶液Ｂ：クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ、ｐＨ２．１。Ａｘｉｃｈｒｏｍ５０／３００カラム内のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（４２４ｍｌ）の２１．６×５ｃｍのカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を３カラム体積の９８％溶液Ａ、２％溶液Ｂ中で平衡化した。前段落に記載される最終大豆ホエータンパク質溶液（２．２９リットル、１４．２ｍｇ／ｍｌタンパク質；修正Ｌｏｗｒｙ法、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｔ、Ｍｉｃｒｏ−Ｌｏｗｒｙ、ＯｎｉｓｈｉおよびＢａｒｒ変法を使用して推定される）を流速５０ｍｌ／分でカラムに注入した。カラムを９８％の溶液Ａ、２％の溶液Ｂ（２０カラム体積）で洗浄し、次に５カラム体積にわたる２〜１５％直線勾配の溶液Ｂと、それに続く追加的な２０カラム体積の均一濃度の１５％溶液Ｂで溶出した。次に追加的な２０カラム体積の均一濃度の２０％溶液Ｂと、それに続く５カラム体積の１００％溶液Ｂで溶出を実施した。
【０１６１】
カラム溶出相全体を通じて、代表的な画分を収集した。画分１（１７４０ｍｌ）は２９７〜２１２０ｍｌで収集された。１５％の均一濃度の溶出工程全体は、画分２（８５００ｍｌ）として収集された。２０％溶液Ｂ均一濃度の工程全体は、画分３（８５００ｍｌ）として収集された。画分４（２１２０ｍｌ）は１００％溶液Ｂ溶出を含んでなる。精製ＢＢＩは、画分２中で、１０〜２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｌｅｓ，ＣＡ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いて同定された。
【０１６２】
可溶性ＢＢＩタンパク質画分を４℃の温度にして、十分な１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４溶液（４℃の温度）を添加して、１％の最終Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４濃度を得た。この混合物を４℃の温度でおよそ６０時間撹拌した。混合物をおよそ４０℃で３０分間加熱して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４の曇り点沈殿（相分離）をもたらした。
【０１６３】
混合物を遠心分離して、上部のＢＢＩタンパク質画分相を収集した。内毒素に富む下部のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４相を４℃の温度で３０分間、脱イオン水洗浄媒体と接触させた。混合物を４０℃の温度で３０分間加熱して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４の曇り点沈殿（相分離）をもたらした。混合物を遠心分離して、上部残留ＢＢＩタンパク質画分相を収集し、先のＢＢＩタンパク質画分材料と合わせた。次にＶｉｒｔｉｓ  Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ  ２５ＸＬを使用してこの材料を部分凍結乾燥し、サンプル体積をおよそ１５０ｍｌに減少させた。
【０１６４】
総ＢＢＩタンパク質画分をＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ０．２ミクロンＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルターに通過させて、エタノール洗浄ガラスバイアルに入れた。バイアルをＶｉｒｔｉｓ  Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ  ２５ＸＬ凍結乾燥システム上で−８０℃で凍結して、凍結乾燥した。
【０１６５】
およそ３．６ｇのＢＢＩ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で＞９５％の純度）が回収された。表２は、実施例２に記載される方法に従って、各精製工程で得られた結果を示し、究極的に高純度の生成物がもたらされる。
【０１６６】
【表２】
2013516429.tif 000004
【０１６７】
実施例３：ＢＢＩタンパク質サンプルと本発明のＢＢＩタンパク質との比較
既知のＢＢＩタンパク質構造と、本発明のＢＢＩタンパク質の比較として、表３に、それぞれに見られるアミノ酸残基のモル百分率（ｍｏｌ％）を記載する。本発明のＢＢＩ生成物は、ＵＣ  ＤａｖｉｓのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって、Ｌ−８８００  Ｈｉｔａｃｈｉ分析器を使用して分析された。分析器はイオン交換クロマトグラフィーを使用してアミノ酸を分離し、「ポストカラム」ニンヒドリン反応検出システムがそれに続いた。標準加水分解手順は、６Ｎ  ＨＣｌを１１０℃で２４時間使用した。標準酸加水分解に先だって、システイン酸およびメチオニンスルホンの酸安定形態を生じる過ギ酸での酸化によって、システイン（およびシスチン）およびメチオニンを測定した。トリプトファンは、ＭＥＳ加水分解工程を使用して測定した。
【０１６８】
【表３】
2013516429.tif 000005
【０１６９】
実施例４：病的状態を治療するためのＢＢＩ
先に考察したように、対象において特定の病的状態を治療するのに、本発明のＢＢＩタンパク質が使用される。ＢＢＩタンパク質は、単一ＢＢＩタンパク質であり、または本明細書に記載されるＢＢＩタンパク質のあらゆる混合物である。本発明のＢＢＩタンパク質は、例えば本発明のＢＢＩタンパク質と薬学的に許容できるキャリアとを含んでなる組成物として、または本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる食品として、投与し得る。
【０１７０】
本発明のＢＢＩタンパク質は、使用していない間の機能的骨格筋量および力の喪失を予防することが判明する。本発明のＢＢＩタンパク質の食餌への添加は、後肢懸垂期間に続く骨格筋萎縮症を顕著に減弱することが判明する。さらに本発明のＢＢＩタンパク質の投与は、ｍｄｘマウスにおいてジストロフィー筋の機能的改善を生じることが判明し、したがって例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化、脊髄筋萎縮症、および脊髄損傷をはじめとする、退行性筋疾患を治療するための本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物のさらなる用途が実証される。
【０１７１】
後肢懸垂実験および方法については以前に述べられており、当業者に知られている（例えばＭａｔｕｓｚｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｔ  Ｓｐａｃｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｄ  ７５：５８１−５８８，２００４；Ａｒｂｏｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｒｃｈ  ２００７  ｖｏｌ．１０２  ｎｏ．３：９５６−９６４；Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅ−Ｇｒａｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００８０３００１７９を参照されたい）。神経変性筋疾患実験および方法については以前に述べられており、当業者に知られている（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｎｏｖ；１０９（５）：１４９２−９；Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅ−Ｇｒａｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００８０３００１７９）。
【０１７２】
使用しないことに伴う筋肉萎縮症の進行を阻止する、本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物の能力は、筋肉負荷除去（例えば後肢懸垂）中に変化することが知られている、いくつかの生理学的パラメータを測定することで、マウスにおいて実証される。ＢＢＩ処置（すなわち本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物投与）された懸垂および非懸垂動物において得られる結果と、ａＢＢＩ（すなわち高圧蒸気滅菌されて阻害活性が除去された本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物の投与）または標準固形飼料のどちらかを給餌された動物とを比較する。各実験で、３種の供給材料の１つを給餌されたマウスに後肢懸垂を実施し、またはそれを非懸垂対照として使用する。
【０１７３】
最初の実験では、３ヶ月齢マウスを使用して、後肢懸垂に伴う筋萎縮の量を減少させるＢＢＩ補給食の能力を実証する。この実験では、１４日間懸垂されたマウスにＢＢＩ−またはａＢＢＩ−補給食のどちらかを与える。懸垂に続いて、筋肉を解剖して力を測定する。強縮力は、ａＢＢＩ給餌動物よりもＢＢＩ給餌動物でより大きい。筋肉グラム質量当たりの張力で測定される平均比筋力は、ａＢＢＩ給餌動物よりもＢＢＩ給餌動物でより高い大きい。ＢＢＩ給餌動物の筋肉質量は、ａＢＢＩ給餌動物の筋肉質量を上回る。ａＢＢＩ給餌動物の％萎縮は、ＢＢＩ給餌動物を上回る。
【０１７４】
ＢＢＩ給餌動物において筋肉質量増大が観察されるので、６ヶ月齢のマウスを使用して、より大規模な研究を実施する。
【０１７５】
これらの実験では、実験的期間前後に、続く懸垂および非懸垂マウスの体重を測定する。各群の非懸垂動物は、１４日間にわたり体重のわずかな増大を示す。懸垂ＢＢＩ給餌およびａＢＢＩ給餌動物の体重は、１４日間の後肢懸垂にわたり低下する。１４日間の後肢懸垂にわたり、懸垂対照給餌動物の体重は低下する。体重低下は、以前に多数の研究によって報告されており（Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｂｏｏｔｈ，Ｆ．Ｗ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９０  ６８：１−１２の参考文献を参照されたい）、総食物摂取量の低下と、摂取食物グラム数当たりの体重増加の低下の双方に起因することが提案されている（Ｍｏｒｅｙ  Ｅ  Ｒ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２９：１６８−１７２，１９７９）。
【０１７６】
本発明のＢＢＩタンパク質が、非使用萎縮中の筋肉損失を減弱できるかどうかを判定するために、対照食またはＢＢＩ補給食のどちらかを給餌される動物を３、７、または１４日間懸垂する。ＢＢＩ補給食は各時点で、筋肉量の損失を減弱することが分かる。７日間の後肢懸垂後、ＢＢＩ給餌動物の筋肉量は、ａＢＢＩ給餌と対照給餌動物を上回る。ＢＢＩ給餌動物の平均ヒラメ筋質量は、ａＢＢＩ給餌および対照給餌動物を上回る。ＢＢＩ給餌動物の％萎縮は限定的であり、ａＢＢＩ給餌および対照給餌動物と比較するとより低い。対照給餌非懸垂、ＢＢＩ給餌非懸垂、およびａＢＢＩ給餌非懸垂の筋肉質量は異ならなかった。
【０１７７】
筋肉当たりの平均繊維数は全ての群で同様であり、後肢懸垂が個々の筋肉繊維の消失を誘発しないことが示唆される。したがって個々の筋肉繊維の繊維面積を横断面で測定する。繊維サイズに変化があるかどうかを判定する簡単な方法は、高倍率視野（例えば４０×対物）中の繊維数を定量化することである。繊維サイズの増大は、視野中の繊維数を減少させる（すなわち筋肉繊維が細いほど、繊維数は増大する）。この方法を使用して、後肢研究におけるＢＢＩ給餌動物の平均繊維数はａＢＢＩ給餌動物と比較してより少なく、それはＢＢＩ給餌動物における萎縮の低下を実証する。
【０１７８】
ラミニン染色筋肉の横断面を分析し、繊維面積を直接測定する。平均繊維面積は、ａＢＢＩ給餌動物と比較してＢＢＩ給餌動物で増大する。
【０１７９】
したがって本発明のＢＢＩタンパク質の投与は、繊維サイズの減少を少なくとも遅延させ、それによって筋肉の全体的質量を保つことで、後肢懸垂に伴う筋肉萎縮を改善する。
【０１８０】
筋肉が機能を保つかどうかを判定するために、全ての食餌群において、非懸垂および懸垂動物双方のヒラメ筋の収縮測定を実施する。ＢＢＩ給餌懸垂動物によって生じる総強縮力は、同様の対照給餌およびａＢＢＩ給餌動物を上回る。結果は、筋肉萎縮症モデル中において、本発明のＢＢＩタンパク質が機能的筋肉量を維持し、筋肉による全体的により大きな力の生成を可能にし得ることを実証する。
【０１８１】
マウスで観察される筋肉量の変化は、ＢＢＩ摂取と相関する。さらに具体的には、１４日の実験期間にわたって摂取される食物の量が、個々の動物の筋肉質量に対してプロットされる。結果は、１日当たり摂取ＢＢＩ食物量と、筋肉質量の間の正相関を示す。１日当たり食物摂取量の関数としての筋肉質量に対するＢＢＩの効果は、ａＢＢＩ摂取と比較して増大している。より多量のＢＢＩを摂取したサブセットに対するＢＢＩ給餌動物の再評価は、ヒラメ筋を評価した際に、筋肉萎縮量のさらなる低下を示す。ａＢＢＩ給餌マウスにおける同様の分析は、ヒラメ筋にこのような変化がないことを示唆する。これはＢＢＩ消費量の増大が、筋萎縮の度合いを低下させることを示唆する（すなわち用量反応）。これらの結果は、食物量が、またはさらに具体的には消費ＢＢＩの量が、後肢懸垂に伴う筋萎縮量を低下させる上で重要であることを示唆する。
【０１８２】
追加的実験では、浸透圧ポンプを挿入して、６ヶ月齢のマウスに、本発明のＢＢＩタンパク質または本発明のａＢＢＩタンパク質のどちらかを直接送達する。各動物に、ＢＢＩ（１０％ｗ／ｖ）またはａＢＢＩ（１０％ｗ／ｖ）のどちらかを含有する、Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）を背中の前方部分、皮膚直下に外科的に挿入する。ポンプは２週間にわたって、例えば０．５μｌ／時間の速度で、溶液を絶え間なく放出する。ＢＢＩ処置動物の筋肉質量は、ａＢＢＩ処置動物の筋肉質量を上回る。ＢＢＩによる筋肉量維持は、１４日間の懸垂に続く筋肉質量亢進をもたらす。実験はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルであるｍｄｘマウスでも実施された。
【０１８３】
これらの実験では、本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物、具体的にはそれを補給した食物によるオスｍｄｘマウスの治療を４週齢で開始し、１２週間継続する。動物体重を毎週モニターして記録する。対照ｍｄｘマウスと、１．０％ＢＢＩ補給食を与えたｍｄｘマウスの間で、体重増大の差は観察されない。これに加えて、さらなる対照として、野性型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢＢＩ補給食を与え、ＢＢＩが正常な非ジストロフィー筋肉のサイズまたは機能に何らかの変化を誘発するかどうかを判定する。
【０１８４】
ｍｄｘマウスの横隔膜は、４ヶ月齢で通例のヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して観察可能な、かなりの線維化を示す。線維症組織の筋肉細胞からのより大きな差別化は、筋肉組織を赤色に染色し、線維化および結合組織を紺青色に染色する三重染色法を使用して達成し得る。ＢＢＩの給餌は、対照ｍｄｘマウスと比較して、Ｈ＆Ｅおよび三重染色を使用して染色されたｍｄｘマウスの横隔膜の外観を著しく改善することが分かる。
【０１８５】
さらにｍｄｘマウスの筋肉繊維には、およそ４週齢で開始する明白な退化／再生周期がある。筋肉繊維の再生は、再生繊維の中心に出現する衛星細胞の活性化と融合を必要とする。したがって再生筋肉繊維の尺度は中心核筋肉繊維（ＣＮＦ）の存在であり、ＣＮＦ比の増大は再生増大を意味する。筋肉切片をラミニンで染色して筋肉繊維の輪郭を描き、核染色４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで核を染色する。各筋肉で、ＣＮ数は、総繊維数の比率として測定され、各測定で合計２〜４の筋肉を使用する。ＢＢＩ処置に続いて、前脛骨筋、ＥＤＬ筋肉、および横隔膜筋肉中のＣＮＦ比の顕著な低下が観察される。
【０１８６】
エバンスブルー染料を使用して、未処置およびＢＢＩ処置ｍｄｘマウス双方で、膜の完全性を判定する。屠殺の２４時間前に、動物にエバンスブルー染料を腹腔内注射する。筋肉を切片化して固定し、蛍光顕微鏡下で観察して、膜損傷の度合いを判定する。少なくとも１匹の未処置ｍｄｘ動物において、大腿四頭筋中の浸潤領域増大が観察される。
【０１８７】
ｍｄｘマウスのＥＤＬ筋肉は、非ジストロフィー動物と比較して、質量および断面積の増大を示す。しかし全ての質量増大が、断面積当たりの力（比筋力）の改善と相関するわけではなく、むしろｍｄｘ筋肉の比筋力の顕著な低下もあり得る。ＢＢＩ処置は、比筋力を維持しながら、筋肉量、絶対筋力、および断面積を顕著に増大させる。これらの結果は、強度改善がＢＢＩ処置によって得られることを示唆する。比筋力は変化しないが、筋肉量および絶対筋力の増大は、日常のタスクで機能するより高い能力を動物に提供する。筋肉質量対体重比の顕著な増大があることから、筋肉量増大は、単に全体的体重増大に起因しない。
【０１８８】
したがって上記の実施例のそれぞれによって実証されるように、このデュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスモデルのマウスによる１２週間のＢＢＩ摂取に続いて、骨格筋の複数の形態学的および機能的測定における顕著な改善がある。
【０１８９】
したがって本発明は、本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物を使用する方法を提供する。
【０１９０】
これもまた本明細書で実証されるように、本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物の投与は、退行性筋疾患のマウスモデル中で骨格筋機能を改善し、これは筋肉の強度増大と質量増大の双方からもたらされる。
【０１９１】
さらに本発明は、退行性筋疾患または障害の症状を軽減し、および／または進行を遅延させる組成物と方法を提供する。
本明細書で実証されるように、本発明のＢＢＩタンパク質を含んでなる組成物による処置は、退行性筋疾患デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおける骨格筋機能を改善する。
【０１９２】
当業者は、本明細書に記載される方法および組成物が例示的な実施形態を代表するものであり、本発明の範囲に対する制限を意図するものでないことを容易に理解するであろう。発明の範囲と精神を逸脱することなく、様々な置換と修正を本明細書で開示される本開示に加えてもよいことが、当業者にはすぐに分かるであろう。
【０１９３】
本明細書中で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が具体的に個々に参考として援用されて示されるかのように、同じ程度までその全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１９４】
本明細書に例証的に記載される本開示は、適切には、本明細書で具体的に開示されないあらゆる要素または要素群、制限または制限群の不在下で実施されてもよい。したがって例えば本明細書の各場合において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」、および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」の何れかは、他の２つのどちらかの用語で置き換えてもよい。用いられた用語および表現は、限定でなく説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示され記載される徴群のいかなる同等物もまたはその一部も排除することは意図されず、本開示が特許請求する範囲内で、様々な修正が可能であることが認識される。したがって本開示は、好ましい実施形態と任意の徴群によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正形態およびバリエーションが、当業者によって用いられてもよいものと理解すべきである。このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内であると見なされる。
【図１Ａ】
2013516429.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
2013516429.tif 000013
【図４】
2013516429.tif 000014
【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013516429.tif 000016
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