(57)【要約】  本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素（変異体のTrichoderma reeseiのエンドグルカナーゼＩが挙げられる）に関する。特に、本開示は熱安定性変異体の酵素、当該酵素を含んでいる組成物およびその使用方法に関する。
2013539971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシンまたはメチオニンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項２】
配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを含んでいる、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。
【請求項３】
配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンを含んでいる、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体の酵素。
【請求項４】
配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項５】
配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを含んでいる、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。
【請求項６】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項７】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にグリシンを含んでいる、熱安定性変異体のT. reeseiのエンドグルカナーゼＩ。
【請求項８】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項４に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項９】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項５に記載のＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。
【請求項１０】
配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンをさらに含んでいる、請求項８または９の記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項１１】
配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる、請求項１に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項１２】
配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる、請求項２に記載のＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。
【請求項１３】
配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる、請求項３に記載のT. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体の酵素。
【請求項１４】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項１に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項１５】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項２に記載のＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。
【請求項１６】
配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項３に記載のT. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体の酵素。
【請求項１７】
約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、野生型の酵素と比べて向上した熱安定性を示す、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項１８】
約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、少なくとも約０．５ｍモルＧＥ／μモル酵素／時間の比活性を有している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項１９】
エンドグルカナーゼまたはエキソグルカナーゼである、請求項１、４、６、８、１０、１１および１４のいずれか一項に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素。
【請求項２０】
T. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体の酵素である、請求項１、４、６、８、１０、１１および１４のいずれか一項に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素、または請求項２、５、９、１０、１２および１５のいずれか一項に記載のＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素。
【請求項２１】
真菌または細菌に由来する、請求項１、４、６、８、１０、１１および１４のいずれか一項に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素、または請求項２、５、９、１０、１２および１５のいずれか一項に記載のＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素。
【請求項２２】
Candida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia、Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、Volvariella、Xylaria またはSporotrichum thermophileからなる群から選択される真菌に由来する、請求項２１に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素を含んでいる、組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素をコードしている、単離された核酸。
【請求項２５】
制御配列と作動可能に連結されている請求項２４に記載の核酸を含んでいる、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを含んでいる、宿主細胞。
【請求項２７】
Escherichia、Pseudomonas、Proteus、Ralstonia、Streptomyces、Staphylococcus、Lactococcus、Bacillus、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Aspergillus、Chrysosporium lucknowenseまたはTrichoderma reeseiからなる群から選択される、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
熱安定性変異体の酵素を生成するための方法であって、
上記酵素を生成するための好適な条件において、請求項２６または２７に記載の宿主細胞を培養培地において培養することを包含している、方法。
【請求項２９】
培養培地、ならびに請求項２６または２７に記載の上記宿主細胞を含んでいる組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素を、上記培養培地の上清に含んでいる、組成物。
【請求項３１】
前処理したバイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、
初期の粘度を有している前処理したバイオマス混合物を、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させること；ならびに
前処理した上記混合物の初期の上記粘度を低下させるために十分な条件において、接触させた上記バイオマス混合物をインキュベートすることを包含している、方法。
【請求項３２】
バイオマスを糖に変換させる方法であって、
上記バイオマスを、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。
【請求項３３】
バイオマスを加水分解または分解する方法であって、
上記バイオマスを、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。
【請求項３４】
発酵生成物を生成する方法であって、
バイオマスを請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて第１の生成物を形成させること；ならびに
上記第１の生成物を、発酵生成物を生成するために十分な条件において１つ以上の発酵微生物とともに培養することを包含している、方法。
【請求項３５】
発酵生成物を生成する方法であって、
バイオマスを請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて第１の生成物を形成させること；ならびに
上記第１の生成物を、化学処理によって発酵生成物を生成するために十分な条件において化学溶液とともにインキュベーションすることを包含している、方法。
【請求項３６】
バイオマスを発酵させる方法であって、
１つ以上の発酵微生物を、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物によって処理されるバイオマスと接触させることを包含している、方法。
【請求項３７】
燃料を生成する方法であって、
バイオマスを請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて糖の溶液を得ること；ならびに
上記糖の溶液を、燃料を生成するために十分な条件において発酵微生物とともに培養することを包含している、方法。
【請求項３８】
発酵生成物を生成する方法であって、
バイオマスを、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて糖の溶液を得ること；ならびに
上記糖の溶液を、化学処理によって燃料を生成するために十分な条件において化学溶液とともにインキュベーションすることを包含している、方法。
【請求項３９】
上記バイオマスは結晶性セルロースを含んでいる、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
上記バイオマスはリグノセルロース性の植物材料を含んでいる、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
上記植物材料は、ススキ、シマヨシ、チカラシバ、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、クサヨシ、ヨシ、ムギのわら、オオムギのわら、キャノーラのわら、エンバクのわら、トウモロコシの茎および葉、ダイズの茎および葉、エンバクの外皮、モロコシ、イネの外皮、サトウキビのバガス、トウモロコシの繊維、可溶性物質を有している穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、ヒメアブラススキ、トウモロコシの穂軸、マツ、ヤナギ、ヤマナラシ、ポプラ木材ならびにエネルギーケインからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
食品加工の方法であって、
植物材料を、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、消化可能な植物材料を得ることを包含している、方法。
【請求項４３】
繊維製品をつや出しする方法であって、
繊維製品を、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、つや出しした繊維製品を得ることを包含している、方法。
【請求項４４】
繊維製品を洗浄する方法であって、
汚れた繊維製品を、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、清潔な繊維製品を得ることを包含している、方法。
【請求項４５】
製紙用パルプを漂白する方法であって、
製紙用パルプを、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、漂白した製紙用パルプを得ること
を包含している、方法。
【請求項４６】
研磨した結晶性セルロースの生成する方法であって、
結晶性セルロースを、請求項２３、２９および３０のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、研磨した結晶性セルロースを得ることを包含している、方法。
【請求項４７】
洗剤、および請求項１〜２２のいずれか一項に記載の酵素を含んでいる、洗濯用洗剤組成物。
【請求項４８】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の酵素を含んでいる、食品添加物。
【請求項４９】
上記接触は、約５０℃〜約５５℃、約５５℃〜約６０℃、または約６０℃〜約７０℃の温度において行われる、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
上記接触は約５０℃〜約５５℃の温度において行われる、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
上記接触は約６０℃〜約７０℃の温度において行われる、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
上記バイオマス、植物材料、繊維製品、汚れた繊維製品、製紙用パルプまたは結晶性セルロースは、接触させることの前に前処理される、請求項３１〜４６および４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本願は、それらの開示の全体が参照によって本明細書に援用される、２０１０年９月１５日に出願された米国仮出願第６１/３８３，２４０号および２０１０年１２月１０日に出願された米国仮出願第６１/４２２，０８１号の利益を主張する。
【０００２】
〔ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける配列表の提出〕
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける以下の提出の内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：677792001140SEQLISTING.TXT、記録日：２０１１年８月８日、サイズ：８ＫＢ）である。
【０００３】
本開示は、アミノ酸変異を含んでいる熱安定性グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素（Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼが挙げられる）に関する。特に、本開示はT. reeseiのエンドグルカナーゼを含んでいる組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
セルラーゼは、生物燃料の生成のために、バイオマスのセルロース性の成分を、発酵可能な糖に変換するための、現在の重要な興味深い対象である。いくつかの酵素（エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ）は、セルロースをグルコースに加水分解するために協調して作用する。糸状菌Trichoderma reeseiは、大量（＞５０ｇ／Ｌ）のセルロース分解性の酵素を分泌するその顕著な能力のために、工業的に使用されているセルラーゼ生成体である。当該真菌は結晶性セルロースの完全な分解に必要な、少なくとも７つの細胞外のセルラーゼを生産する。これらは、それぞれ総セルラーゼ含有量の５０％および２０％存在する、Ｃｅｌ７ＡおよびＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨ  ＩおよびＣＢＨ  ＩＩ）と呼ばれる２つのエキソグルカナーゼ；ならびにそれぞれ総セルラーゼ含有量の１５％、１０％、１％、＜１％および＜１％存在する、５つのエンドグルカナーゼ、Ｃｅｌ７Ｂ、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ１２Ａ、Ｃｅｌ６１ＡおよびＣｅｌ４５Ａ（ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ３、ＥＧ４およびＥＧ５）を含んでいる。
【０００５】
セルラーゼを用いた高温におけるリグノセルロースの加水分解は、見込まれる潜在的な利点（例えば低下した粘度に起因する固体のより多い添加、微生物汚染のより低い危険性、高温の前処理をともなったより優れた相溶性、およびより高い加水分解速度）を有している。しかし、T. reeseiのセルラーゼおよび真菌の他の酵素は、高温において、相対的に低い活性および安定性を有している（Takashima, S et al., J Biotechnol 65(2-3)163-71, 1998）。十分な量のセルラーゼを生成し、かつ分泌する能力は、セルロース性のバイオマスからの生物燃料の経済的な生産にとって最も重要であり、非真菌の発生源から得られる好熱性のセルラーゼは、これまでのところ、極めてわずかである（＜１００ｍｇ／Ｌ）。
【０００６】
したがって、より高温においてリグノセルロースを効率的に加水分解し得る熱安定性の真菌のセルラーゼに対する必要性が、当該技術に存在している。
【発明の概要】
【０００７】
この必要性を満たすポリペプチド、組成物および方法が提供される。
【０００８】
本開示は、熱安定性変異体の酵素（エンドグルカナーゼ活性を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７が挙げられる）に関する。これらの酵素は、リグノセルロースを加水分解すること、特に多糖およびオリゴ糖の分解（例えば、可溶性の糖への変換）（生物燃料の発酵性の生成、食品加工、繊維製品のつや出しおよび洗浄、研磨した結晶性セルロースの生成、ならびに製紙用パルプの漂白における使用を目的とする、が挙げられる）に使用され得る。熱安定性であるので、これらの酵素は、高温においてリグノセルロースを効率的に加水分解可能なセルロース分解性の酵素に対する要求を満たす。また、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された複数の核酸、ならびにこれらの核酸を含んでいるベクターおよび宿主細胞に関する。
【０００９】
したがって、本発明の一局面は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に、セリン、スレオニン、ロイシンまたはメチオニンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素を提供する。特定の実施形態において、上記酵素は配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを含んでいる。他の実施形態において、上記酵素は配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを含んでいる。
【００１０】
本発明の他の局面は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを含んでいる、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素を提供する。特定の実施形態において、上記酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる。他の実施形態において、上記酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる。
【００１１】
さらなる他の実施形態において、本発明は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンを含んでいる、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体の酵素を提供する。特定の実施形態において、上記酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる。他の実施形態おいて、上記酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる。
【００１２】
本発明の一局面は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素を提供する。特定の実施形態において、上記グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる。
【００１３】
本発明の他の局面は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを含んでいる、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素を提供する。特定の実施形態において、上記グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる。
【００１４】
上記グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素が、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを含んでおり、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンもしくはグリシンを含んでいる実施形態；または上記ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素が、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを含んでおり、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンもしくはグリシンを含んでいる実施形態において、上記酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に、セリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンという第３の変異を含んでいる。
【００１５】
本発明の一局面は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる他の局面は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にグリシンを含んでいる、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体を提供する。
【００１７】
それらの実施形態のいずれかにおける上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る実施形態において、上記酵素は、約５０℃における約１時間にわたるインキュベーション後に、親酵素と比べて向上した熱安定性を示す。いくつかの実施形態において、上記酵素は、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６５または７０℃において約１時間にわたってインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記熱安定性変異体の酵素は、０．５、０．７５、１．２５、１．５、１．７５または２時間にわたってインキュベートされる。
【００１８】
それらの実施形態のいずれかにおける上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る特定の実施形態において、上記酵素は約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、少なくとも約０．５ｍモルＧＥ／μモル酵素／時間の比活性を有している。いくつかの実施形態において、上記酵素は約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｍモルＧＥ／μｍｏｌ酵素／時間の比活性を有している。
【００１９】
それらの実施形態のいずれかにおけるグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素を提供する上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る実施形態において、上記酵素は、エンドグルカナーゼまたはエキソグルカナーゼである。
【００２０】
それらの実施形態のいずれかにおけるグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素またはＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素を提供する上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る実施形態において、上記酵素は、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。それらの実施形態のいずれかにおける、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素またはＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素を提供する上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る他の実施形態において、上記酵素は、真菌または細菌に由来しており、好ましくは、Candida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia、Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、Volvariella、XylariaまたはSporotrichum thermophileからなる群から選択される細菌または真菌に由来している。
【００２１】
本発明の他の局面は、それらの実施形態のいずれかにおける上述した局面のいずれかに係る熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる他の局面は、それらの実施形態のいずれかにおけるグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素またはＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素またはT. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素を提供する上述した局面による変異体の熱安定性酵素をコードしている単離された核酸を提供する。
【００２３】
本発明の一局面は、制御配列に作動可能に連結されている上述した局面の上記核酸を含んでいる発現ベクターを提供する。
【００２４】
本発明の他の局面は、上述した局面の発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、上記宿主細胞は、Escherichia、Pseudomonas、Proteus、Ralstonia、Streptomyces、Staphylococcus、Lactococcus、Bacillus、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Aspergillus、Chrysosporium lucknowenseまたはTrichoderma reeseiからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の他の局面は、当該酵素を生成するための好適な条件において、培養培地においてその実施形態のいずれかにおける宿主細胞を培養することを包含している、熱安定性変異体の酵素を生成するための方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる他の局面は、宿主細胞を提供する上述した局面による宿主細胞、および培養培地を含んでいる組成物を提供する。
【００２７】
本発明の他の局面は、培養培地の上清における、それらの実施形態のいずれかにおける、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素またはＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素またはT. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素を提供する上述した局面による熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物を提供する。
【００２８】
本発明の一局面は、初期の粘度を有している前処理したバイオマス混合物を、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させること、ならびに上記前処理した混合物の初期の粘度を低下させるために十分な条件において、接触させた上記バイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理したバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を提供する。
【００２９】
本発明の他の局面は、バイオマスを、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させることを包含している、バイオマスを糖に変換させる方法を提供する。
【００３０】
本発明の他の局面は、バイオマスを、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させることを包含している、バイオマスを加水分解または分解する方法を提供する。
【００３１】
本発明の他の局面は、バイオマスを、組成物提供する上述した局面に係る組成物と接触させて第１の生成物を形成させること、ならびに発酵生成物を生成するために十分な条件において、１つ以上の発酵微生物とともに第１の生成物を培養することを包含している、発酵生成物を生成する方法を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる他の局面は、第１の生成物を生成するためにバイオマスを、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させること、ならびに化学処理によって発酵生成物を生成するために十分な条件において、化学溶液とともに上記第１の生成物をインキュベーションすることを包含している、発酵生成物を生成する方法を提供する。
【００３３】
本発明の一局面は、組成物を提供する上述した局面に係る組成物によって処理されるバイオマスを、１つ以上の発酵微生物と接触させることを包含している、バイオマスを発酵させる方法を提供する。
【００３４】
本発明の他の局面はバイオマスを組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させ、糖の溶液を得ること、ならびに燃料を生成するために十分な条件において発酵微生物とともに糖の溶液を培養することを包含している、燃料を生成する方法を提供する。
【００３５】
本発明のさらなる他の局面は、バイオマスを組成物を提供する上述した局面に係る組成物を、１つ以上の発酵微生物と接触させて糖の溶液を得ることならびに化学処理によって燃料を生成するために十分な条件において、化学溶液とともに糖の溶液をインキュベーションすることを包含している、発酵生成物を生成する方法を提供する。
【００３６】
バイオマスを接触させることを包含している方法を提供する上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る特定の実施形態において、上記バイオマスは結晶性セルロースを含んでいる。他の実施形態において、上記バイオマスはリグノセルロースの植物材料を含んでいる。特定の実施形態において、上記植物材料は、ススキ、シマヨシ、チカラシバ、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、クサヨシ、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシの茎および葉、ダイズの茎および葉、エンバクの外皮、モロコシ、イネの外皮、サトウキビのバガス、トウモロコシの繊維、可溶性物質を有している穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、ヒメアブラススキ、トウモロコシの穂軸、マツ、ヤナギ、ヤマナラシ、ポプラ木材ならびにエネルギーケインからなる群から選択される。
【００３７】
本発明の他の局面は、バイオマスを、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させて消化可能な植物材料を得ることを包含している、食品加工の方法を提供する。
【００３８】
本発明の他の局面は、、繊維製品を、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させてつや出しした繊維製品を得ることを包含している、繊維製品のつや出し方法を提供する。
【００３９】
本発明のさらなる他の局面は、汚れた繊維製品を、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させて清潔な繊維製品を得ることを包含している、織を洗浄する方法を提供する。
【００４０】
本発明の一局面は、製紙用パルプを組成物を提供する上述した局面に係る組成物と接触させて漂白した製紙用パルプを得ることを包含している、製紙用パルプを漂白する方法を提供する。
【００４１】
本発明の他の局面は、結晶性セルロースを、組成物を提供する上述した局面に係る組成物と、接触させて研磨した結晶性セルロースを得ることを包含している、研磨した結晶性セルロースを生成する方法を提供する。
【００４２】
本発明の一局面は、洗剤およびそれらの実施形態のいずれかにおけるグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素またはＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素またはT. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素を提供する上述した局面に係る変異体の熱安定性酵素を含んでいる、洗濯用洗剤組成物を提供する。
【００４３】
本発明の他の局面は、それらの実施形態のいずれかにおけるグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素またはＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素またはT. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素を提供する上述した局面に係る変異体熱安定性の酵素を含んでいる、食品添加物を提供する。
【００４４】
それらの実施形態のいずれかにおけるバイオマス、植物材料、繊維製品、汚れた繊維製品、製紙用パルプまたは結晶性セルロースを接触させることを包含している方法を提供する上述した局面のいずれかと組み合わせられ得る特定の実施形態において、上記接触は、約５０℃〜約５５℃、約５５℃〜約６０℃または約６０℃〜約７０℃の温度において行われる。特定の実施形態において、上記接触は約５０℃〜約５５℃の温度において行われる。他の実施形態において、上記接触は約６０℃〜約７０℃の温度において行われる。いくつかの実施形態において、上記バイオマス、植物材料、繊維製品、汚れた繊維製品、製紙用パルプまたは結晶性セルロースは、接触させることの前に前処理される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼＩの結晶構造を示す。（ａ）はＡ〜Ｇに分類された変異部位を有している構造を示す。（ｂ）は、分類されたアミノ酸Ｇ２３０、Ｄ１１３およびＤ１１５を有している構造の２つ視点からの図を示す。The Protein Data Bank code（PDB）のコードは1EG1である（Kleywegt, GJ et al., J Mol Biol 272(3)383-397, 1997）。
【図２】図２は野生型のT. reeseiのＥＧＩの無細胞発現の酸化還元電位の最適化を示す。
【図３】図３は種々の温度における野生型のT. reeseiのＥＧＩの活性を示す。（ａ）はＤＮＳ法によって測定された、異なる時間の長さにわたる異なる温度におけるインキュベーション後のＴｒＥＧＩの活性を示す。（ｂ）は、ＣＭＣプレートにおけるスポッティングによって測定された、異なる時間の長さにわたる異なる温度におけるインキュベーション後のＴｒＥＧＩの活性を示す。
【図４】図４は、向上した熱安定性についての、T. reeseiのＥＧＩ変異体のスクリーニングおよび選択のための手順を示す。
【図５】図５は、熱処理前（左）および熱処理後（右）におけるT. reeseiのＥＧＩのＣＭＣプレートアッセイを示す。
【図６】図６は、スクリーニング処理によって同定されたT. reeseiのＥＧＩ変異体の活性に対する、異なる時間の長さにわたる熱処理の影響を示す。変異体は９６ウェルプレートにおける位置にしたがってｙ軸に分類されている。
【図７】図７は、４５分間にわたる５０℃における熱処理前（ａ）および熱処理後（ｂ）のT. reeseiのＥＧＩ変異体の活性を示す。ｙ軸は試験した変異体の数を示す。
【図８】図８は、向上した熱安定性をもたらすT. reeseiのＥＧＩ変異体のＧ２３０における置換を示す。
【図９】図９は、５０℃におけるT. reeseiのＥＧＩ変異体の熱安定性に対する、２３０位のアミノ酸における異なる変異の影響を示す。異なる列は、活性の測定の前の５０℃における異なるインキュベーション時間を表す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１０】図１０は、部位Ｃ（１１３位および１１５位のアミノ酸）に変異を有しているT. reeseiのＥＧＩの活性に対する熱処理の影響を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１１】図１１は、５０および５３℃におけるT. reeseiのＥＧＩの熱安定性に対する、２３０位、１１３位および１１５位のアミノ酸における変異の影響を示す。変異体は異なる時間の長さにわたって熱処理された。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１２】図１２は、異なるセルロースの基質におけるT. reeseiのＥＧＩ変異体の活性を示す。（ａ）および（ｃ）はAvicel（登録商標）に対する活性を示し、（ｂ）および（ｄ）は、IL-Avicel（登録商標）に対する活性を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１３】図１３は、T. reeseiのＥＧＩ変異体の、複数の基質に対する活性の比較を示す。（ａ）は、Avicel（登録商標）およびIL-Avicel（登録商標）に対する活性の比較を示す。（ｂ）はAvicel（登録商標）に対する活性の比較を示す。（ｃ）はIL-Avicel（登録商標）に対する活性の比較を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１４】図１４は、異なる温度における、T. reeseiのＥＧＩ変異体の無細胞抽出物の、Avicel（登録商標）に対する活性を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１５】図１５は異なる温度における、T. reeseiのＥＧＩ変異体の無細胞抽出物の、IL-Avicel（登録商標）に対する活性を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１６】図１６は、異なる温度において、Avicel（登録商標）における、選択された糖鎖付加を有する酵母において発現されたT. reeseiのＥＧＩ変異体の活性を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【図１７】図１７は、Avicel（登録商標）における、選択された糖鎖付加を有する酵母において発現されたT. reeseiのＥＧＩ変異体のＴ５０を示す。
【図１８】図１８は、酵母において発現された切り取り処理された糖鎖付加を有しているT. reeseiのＥＧＩ変異体の、異なる温度におけるIL-Avicel（登録商標）に対する活性を示す。ＧＥは“グルコース均等物”を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示は特定のアミノ酸部位における変異を有している熱安定性グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素（例えばエンドグルカナーゼ）を含んでいる、熱安定性変異体の酵素に関する。本開示は、さらに、熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物および当該酵素を発現し得る宿主細胞ならびにそれらの使用方法に関する。
【００４７】
〔Ｉ．定義〕
他に定義されていなければ、すべての科学用語および技術用語は、それらが関連する技術分野において一般的に用いられているときと同一の意味を有すると理解される。本願の開示の目的として、以下の用語が定義されている。
【００４８】
本明細書に用いられるとき“アミノ酸”という用語は、タンパク質の化学的な構築ブロックを指す。それはタンパク質において一般的に見られる２０個の標準のアミノ酸ならびにそれらの化学的に修飾された型またはアナログを包含している。
【００４９】
本明細書に用いられるとき“ポリペプチド”という用語は、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸残基の一本鎖によって作られる化合物を指す。“タンパク質”という用語は、“ポリペプチド”と同義である。
【００５０】
本明細書に用いられるとき“酵素”という用語は、触媒性の機能を実行するポリペプチドを指す。ポリペプチドのまさに触媒性の部分だけではなく、触媒性のドメインの機能的な役割から異なった機能的な役割を有する、または有していない、さらなるドメインまたはモチーフを包含し得る。これらの更なるドメインまたはモチーフは、天然に見られるか、または商業的に見られる他のポリペプチド由来であり得る。
【００５１】
本明細書に用いられるとき“野生型”という用語は、生物種において天然に生じるような、変異されていない型のポリペプチドまたは遺伝子を指す。
【００５２】
本明細書に用いられるとき“アライメントする”という用語は、２つのポリペプチドを構造的または機能的に位置合わせすることを指す。２つ以上のポリペプチドにおけるアミノ酸は、それらが異なるポリペプチドにおいて同一の位置に配置されている場合、アライメントされているとみなされる。また、２つ以上のポリペプチドにおけるアミノ酸は、異なるポリペプチドにおいて同一の機能を実行する場合、アライメントされているとみなされる。例えば、２つ以上の酵素においてアライメントしたアミノ酸は、例えばそれぞれの酵素または基質（基質群）と、同一の接触を形成し得る；または酵素の機能における同一の触媒性の役割を担い得る。アライメントは当該分野においてよく知られているアルゴリズムを用いて行われ得る。
【００５３】
本明細書に用いられるとき“熱安定性”という用語は、活性が測定可能であるまたは最適である温度において有する活性を失うことなく、特定の温度（例えば高温）に限定された曝露に耐えるためのタンパク質の機能を記載している。“活性”という用語は、定められた反応条件において与えられた基質の変換を定量的に記載している。“比活性”という用語は、定められた反応条件における酵素の量あたりの活性を定量的に記載している。
【００５４】
本明細書に用いられるとき“セルラーゼ”という用語は、セルロースがグルコース、セロビオースまたはセロトリオースに加水分解される酵素反応を触媒する酵素（またはそれらの酵素の活性）を指し、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼを有する酵素（例えばグルカノヒドロラーゼまたはセロビオヒドロラーゼ）、β−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼグルコヒドロラーゼの活性、および当該酵素の対応する酵素活性が挙げられる）を指す。
【００５５】
本明細書に用いられるとき“リグノセルロース”という用語は、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる任意の材料を指す。
【００５６】
本明細書に用いられるとき“グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素”という用語は、グリコシルヒドロラーゼファミリー７に属する酵素を指す。“ＧＨ７”という用語は、グリコシルヒドロラーゼファミリー７と同義である。“ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ”という用語は、エンドグルカナーゼの機能を有する、グリコシルヒドロラーゼファミリー７における酵素を指す。
【００５７】
〔ＩＩ  熱安定性変異体の酵素〕
本開示は、特定のアミノ酸において変異を含んで得る、熱安定性酵素（グリコシルヒドロラーゼファミリー７に属する酵素が挙げられる）に関する。出願人は、いかなる学説によっても結び付けられることは望んでいない；しかし、向上した熱安定性は、酵素の結晶化における高いB-Factorの値によって特徴づけられる、フレキシブルな部位における変異によって実現されると考えられている。好ましい実施形態では、酵素は配列番号１の２３０位、１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異を有している、Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼＩ（ＴｒＥＧＩ）である。他の実施形態では、酵素は、配列番号１の２３０位および／または１１３位および／または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異を有している、グリコシルヒドロラーゼ７（ＧＨ７）のメンバーである。ある実施形態において、ＧＨ７のメンバーはエンドグルカナーゼである。
【００５８】
（アミノ酸配列のアライメント）
配列番号１の２３０位、１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントする、グリコシルヒドロラーゼファミリー７のメンバーのアミノ酸は、配列番号１の２３０位、１１３位または１１５位のアミノ酸と構造的にアライメントするものである。配列番号１の２３０位、１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントする、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素のアミノ酸は、配列番号１における同一の位置においてアライメントされ得；それらの配列番号１の参照配列における同一の位置において見いだされない傾向にある。例えば、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素は、１位のアミノ酸において更なるメチオニンを有する配列番号１と同一の配列を有し得る。その場合、当該酵素の２３１位におけるグリシン残基は、配列番号１の２３０位のアミノ酸にアライメントするだろう。他の例の場合により、Cochliobolus carbonum由来のセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）の２３８位のアミノ酸であるリジン（シグナルペプチドなしの成熟した酵素において番号付けした残基）は、配列番号１の２３０位のアミノ酸にアライメントする。アライメントされたアミノ酸は、例えばいくつかが以下に議論されている、アルゴリズムを用いることによって、同定され得る。
【００５９】
２つ以上のポリペプチドの配列が比較ウィンドウ同士、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、もしくは手動のアライメントおよび目視検査によりきちんと調整された指定領域同士の最大の一致を比較され、アライメントされ得る。配列比較のために、典型的にある一つの配列が、試験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。既定のプログラムのパラメータを用いることができ、または代わりのパラメータを指定することもできる。本明細書に用いられるとき“比較ウィンドウ”は、非限定的に２０〜６００、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０の任意の数の連続する位置のセグメントであり、配列が同一数の連続的な位置の参照配列と最適にアライメントされた後に、当該参照配列と比較されるセグメントについての言及を包含する。配列のアライメントの方法は、当該分野においてよく知られている。一例は、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17)3389-3402に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いることである。配列の最適なアライメントのための他の例は、Smith and Waterman (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol 48(3)443-453の相同性アライメントアルゴリズム、the search for similarity method of Pearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8)2444-2448の類似性の方法の研究、コンピュータ制御のこれらのアルゴリズムの実行(GAP、BESTFIT、FASTAおよび Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI におけるTFASTA)、および手動のアライメントおよび目視検査［例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)を参照］である。
【００６０】
より好ましくは、参照配列の他の特定のアミノ酸と構造的にアライメントするアミノ酸は、類似の構造的なモチーフおよびフレキシブルな領域を同定するために結晶構造の比較により想定され得、後者は高いB-factor値によって特徴づけられる。
【００６１】
（アミノ酸における変異または置換）
酵素は、連続的に重合した複数のアミノ酸残基を含んでいるアミノ酸配列によって構成されている。また、他に示されていなければ、特定のアミノ酸配列は、暗黙的にそれらの保存的に修飾されたバリアントを包含する。変異体は、当該酵素における１つ以上のアミノ酸残基が、当該分野において知られている技術によって野生型の配列から変化した酵素を指す。アミノ酸配列を変化させるための技術としては、部位特異的突然変異導入、カセット変異導入、ランダム変異導入、合成のオリゴヌクレオチドの構築、クローニングおよび他の遺伝子工学の技術（Eijsink V G, et al., 2005. Biomol. Eng. 2221-30）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示における変化の結果、変異体の酵素は熱安定性の向上を有する。
【００６２】
配列番号１の２３０位または１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に、変異したアミノ酸を含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、野生型のアミノ酸配列において、配列番号１の２３０位または１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているものである。例えば、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩの野生型の配列が配列番号１である場合、変異体のT. reeseiのエンドグルカナーゼＩは、２３０位または１１３位または１１５位のアミノ酸において変異したまたは置換したアミノ酸を有する配列番号１の配列を有し得る。
【００６３】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位および／または１１３位および／または１１５位のアミノ酸とアライメントする、セリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、グリシン残基に、置換された／変異したアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素はエンドグルカナーゼである。最も好ましくは、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩである。
【００６４】
変異体は、天然に生じる標準の２０のアミノ酸残基、保存的に修飾されたバリアントのアミノ酸残基、コドンによってコードされていない天然に生じるアミノ酸残基および天然に生じないアミノ酸残基による、アミノ酸の置換を含んでいる。変異の結果として、酵素は、熱安定性の向上を有する。
【００６５】
本明細書に用いられるとき“保存的に修飾されたバリアントのアミノ酸”は、化学的に類似のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換をもたらす、それぞれのアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでいる。機能的に類似のアミノ酸を示している保存的な置換の表が、当該分野においてよく知られている。以下の８つの群は、互いに保存的なアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えばCreighton, Proteins (1984)を参照）。
【００６６】
２０の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソブチル酸、イソバリンおよびアルファ−メチルセリン）が野生型のポリペプチドのアミノ酸残基を置換し得る。限定された数の非保存的なアミノ酸、遺伝的なコードによってコードされていないアミノ酸および非天然のアミノ酸がアミノ酸残基を置換し得る。“非天然のアミノ酸”がタンパク質合成後に修飾され、および／または標準アミノ酸のものとは異なるそれらの側鎖（側鎖群）を有する。非天然アミノ酸は化学合成されることができ、好ましくは、市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリンならびに３，３−ジメチルプロリンが挙げられる。
【００６７】
（グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素）
いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、グリコシルヒドロラーゼファミリー７に属している。より好ましくは、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素は、エンドグルカナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−１，３−１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはエキソセルラーゼであり得る。いくつかの実施形態において、ＧＨ７の酵素は、エンドグルカナーゼである。最も好ましくは、エンドグルカナーゼは、配列番号１を有するTrichoderma reeseiのエンドグルカナーゼＩである、いくつかの好ましい実施形態において、エンドグルカナーゼは、炭水化物結合ドメイン（ＣＢＭ）を含んでいる。他の実施形態において、エンドグルカナーゼはＣＢＭを欠損している。
【００６８】
いくつかの実施形態において、酵素は細菌由来である。細菌の種は、グラム陽性（例えばBacillus、Streptococcus、Streptomyces、Staphylococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Clostridium、GeobacillusもしくはOceanobacillus）またはグラム陰性（例えばEscherichia coli、Pseudomonas、Salmonella、Campylobacter、Helicobacter、Flavobacterium、Fusobacterium、Ilyobacter、NeissenaまたはUreaplasma）であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、酵素は、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus formus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilisまたはBacillus thuringiensisに由来する。他の実施形態において、酵素は、Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis、Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus、Streptomyces achromogenes、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseusまたはStreptomyces lividansに由来する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、酵素は真菌由来である。好ましい実施形態において、酵素は、酵母種（Candida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、SchizosaccharomycesもしくはYarrowia）の由来、または糸状菌種（Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、Volvariella、Xylariaもしくは Sporotrichum thermophile）に由来する。いくつかの実施形態において、酵素は、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensisまたは Saccharomyces oviformisに由来する。他の実施形態において、酵素は、Acremonium cellulolyticus、Aspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、Aspergillus fumigatus、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Chrysosporium keratinophilum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium tropicum、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola grisea、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Irpex lacteus、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium funiculosum、Penicillium purpurogenum、Phanerochaete chrysosporium、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reeseiまたは Trichoderma virideに由来する。好ましい実施形態において、酵素は、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、Thielavia setosa、Thielavia subthermophilaまたは Thielavia terrestrisに由来する。
【００７０】
（酵素の熱安定性／活性）
酵素の活性は、酵素の熱安定性の指標として用いられ得る。異なる反応条件（例えば、異なる温度）における酵素の活性を監視することは、それらの条件における酵素の安定性を監視することに言い換えられる。酵素は、特定の反応条件において活性である場合、それらの条件において安定であるとみなされる。
【００７１】
好ましい実施形態では、変異体の熱安定性酵素は、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６５または７０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、親となる変異させられていない野生型の酵素と比べて、向上した熱安定性を示す。いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、０．５、０．７５、１．２５、１．５、１．７５、または２時間インキュベートされる。
【００７２】
いくつかの好ましい実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、少なくとも約０．５ｍモルＧＥ／μモル酵素／時間の、典型的には少なくとも約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｍモルＧＥ／μモル酵素／時間の比活性を有している。酵素は、一般的に、セルラーゼ活性（例えばエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ）、および／またはセルロース結合能を有している。
【００７３】
セルラーゼ活性またはセルロース結合能は、多くのよく知られている方法（酵素電気泳動像、還元糖アッセイ（例えば、ＤＮＳミクロまたはＤＮＳマクロ、ネルソン−ソモギー法のミクロまたはマクロ、ネルソン法のセミ−マクロ、フェリシアン化物−１、フェリシアン化物−２、ＰＡＨＢＡＨミクロまたはマクロ、ＢＣＡおよび改変したＢＣＡ）、パラニトロフェノール−標識グリコシドを用いたアッセイ、生成物の解析、総糖アッセイ（例えばフェノール−Ｈ２ＳＯ４またはアントロンＨ２ＳＯ４、酵素的グルコースアッセイおよびセルロース結合アッセイ）によって測定され得る。
【００７４】
セルラーゼ活性およびセルロース結合能のための基質としては、可溶性の基質または不溶性の基質が挙げられる。可溶性の基質は、例えば、セロデキストリンおよびその誘導体、短鎖セルラーゼ、β−メチルウンベリフェリル−オリゴ糖、ｐ−ニトロフェノール−オリゴ糖、長鎖セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。不溶性の基質としては、綿、Whatman No. 1フィルタ紙、パルプ（例えば、Solka Floc）、結晶性セルロース（例えば、綿、微結晶性セルロース（例えば、Avicel（登録商標））、バロニアのセルロース、細菌性セルロース、非結晶性セルロース（例えば、PASC、アルカリ膨潤セルロース）、染色セルロース、蛍光セルロース、色素生成および発蛍光団の誘導体（例えば、トリニトロフェニル−カルボキシメチルセルロース（ＴＮＰ−ＣＭＣ）およびFluramセルロース）、実用的なセルロース含有基質、α−セルロース、前処理したリグノセルロースバイオマス）が挙げられる。
【００７５】
（２３０位のアミノ酸の変異）
一局面において、本開示は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素に関する。
【００７６】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有している。
【００７７】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しているＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【００７８】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩの熱安定性変異体の酵素である。
【００７９】
（１１３位のアミノ酸における変異）
他の局面において、本開示は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有している、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素に関する。
【００８０】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有している。
【００８１】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【００８２】
（１１５位のアミノ酸における変異）
さらなる他の局面において、本開示は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有している、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素に関する。
【００８３】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンを有している。
【００８４】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にグリシンを有している、熱安定性変異体のT. reeseiのエンドグルカナーゼＩの酵素である。
【００８５】
（変異の組み合わせを有している酵素）
本開示は、特定のアミノ酸において変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の酵素を有している熱安定性変異体の酵素に関する。好ましい実施形態において、配列番号１の２３０位または１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有している。いくつかの実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位、１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異の組み合わせを有している。例えば、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異および配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異を有している。本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、上に記載されているような、配列番号１の２３０位、１１３位または１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異のすべての可能な組み合わせを有している酵素を有している。
【００８６】
Ａ）１１３位および１１５位のアミノ酸における変異
一局面において、本開示は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸においてさらに変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素に関する。
【００８７】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸にさらに変異を有している。
【００８８】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸においてスレオニンまたはグリシンを有している。
【００８９】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸にさらに変異を有しているＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【００９０】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに有している、変異体の熱安定性ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼ酵素である。
【００９１】
Ｂ）１１３位、１１５位および２３０位のアミノ酸における変異
好ましい実施形態において、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している。
【００９２】
好ましい実施形態において、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンを有している。
【００９３】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに有しており、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【００９４】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントする第２のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに有しており、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンをさらに有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【００９５】
Ｃ）２３０位および１１３位のアミノ酸における変異
一局面において、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。
【００９６】
好ましい実施形態において、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。
【００９７】
他の好ましい実施形態において、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを有している。
【００９８】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【００９９】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【０１００】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【０１０１】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。
【０１０２】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。
【０１０３】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。
【０１０４】
Ｄ）２３０位および１１５位のアミノ酸における変異
一局面において、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。
【０１０５】
好ましい実施形態において、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。
【０１０６】
他の好ましい実施形態において、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有している。
【０１０７】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに含んでいる、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【０１０８】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【０１０９】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有している、ＧＨ７ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。
【０１１０】
好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。
【０１１１】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。
【０１１２】
他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有している、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩ酵素である。
【０１１３】
〔ＩＩＩ．熱安定性変異体の酵素を含んでいるポリペプチド〕
いくつかの実施形態において、規定されている酵素は、機能的なドメイン（リーダーぺプチド、プロペプチド、結合ドメインおよび／または触媒性のドメインが挙げられる）と融合されている。好適な結合ドメインとしては、種々の特異性の炭水化物結合ドメイン（例えばＣＢＭ）（熱安定性変異体の酵素の使用の間に存在する炭水化物の成分に向上した親和性をもたらす）が挙げられるが、これに限定されない。酵素的に活性な好適なドメインは、所望の生成物の生成において、熱安定性変異体の酵素の活性を補助する活性を有している。触媒性ドメインの非限定的な例としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ（例えばキシラナーゼ）、エンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、グルカナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、ぺクチナーゼ、および／または他の活性（例えばプロテアーゼ、リパーゼおよび／または酸ホスファターゼなど）またはそれらの機能的な断片が挙げられる。
【０１１４】
融合タンパク質は、リンカー配列を介して必要に応じて上記ポリペプチドと連結されている。上記リンカー配列は、規定されている熱安定性変異体の酵素もしくはそれらの断片、および当該融合ドメインを、いずれの構成要素の特性に大きく影響せずに単純に連結するか、または意図されている用途にとって機能的な重要性を必要に応じて有している。いくつかの実施形態において、タンパク質分解性の切断部位は、融合タンパク質のパートナーおよび所定のタンパク質配列の間に設けられて、融合タンパク質配列の除去を可能にしている。
【０１１５】
〔ＩＶ．核酸、ベクターおよび宿主細胞〕
また、熱安定性変異体の酵素の製造方法、ベクターおよび宿主細胞が提供される。一局面において、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された核酸を提供する。他の局面において、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された核酸を含んでいる発現ベクターを提供する。さらなる他の局面において、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された核酸を含んでいる発現ベクターを有している宿主細胞を提供する。他の局面において、本開示は、当該酵素を生成するための好適な条件において、熱安定性変異体の酵素をコードしている核酸を有している発現ベクターを含んでいる宿主細胞を培養することによって、熱安定性変異体の酵素を生成する方法を提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、上記酵素をコードしているＤＮＡは、公開されている配列から化学合成され得るか、または遺伝子を有している宿主細胞から直接的に（例えばｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングまたはＰＣＲ増幅によって）入手され得る。いくつかの実施形態において、酵素は、発現カセットに含まれているか、および／または標準的な分子的なクローニング技術によって、好適な発現ベクターにクローニングされている。そのような発現カセットまたはベクターは、転写の開始または終結を補助する複数の配列（例えばプロモーターおよびターミネーター）を含んでおり、一般的に選択マーカーを含んでいる。
【０１１７】
発現ベクター／宿主細胞の組合せは、周知であり、示されている方法に使用され得る。典型的に、発現カセットまたはベクターは、好適な発現宿主細胞に導入され、当該発現宿主細胞は対応するポリペプチドを発現する。特に好適な発現宿主は、発現宿主の細菌の属（Escherichia（例えばEscherichia coli）、Pseudomonas (例えばP. fluorescensまたはP. stutzerei）、Proteus（例えばProteus mirabilis）、Ralstonia（例えばRalstonia eutropha）、Streptomyces、Staphylococcus（例えばS. carnosus）、Lactococcus（例えばL. lactis）、またはBacillus（subtilis、megaterium、licheniformisなど）が挙げられる）である。また、特に好適であるのは、酵母の発現宿主（例えばSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactisまたはPichia pastorisが挙げられる）である。特に適しているのは、真菌の発現宿主（例えばAspergillus niger、Chrysosporium lucknowense、Aspergillus（例えばA. oryzae、A. niger、A. nidulansなど）またはTrichoderma reesei）である。また好適であるのは、動物の発現宿主（例えばマウス（例えばＮＳ０）、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）または仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞株）である。また、他の真核細胞の宿主（例えば昆虫細胞またはウイルスの発現系（例えば、バクテリオファージ（例えばＭ１３、Ｔ７ファージもしくはラムダ）またはウイルス（例えばバキュロウイルス）は、熱安定性変異体の酵素を生成するために好適である。
【０１１８】
特定の対象の宿主における分泌タンパク質と相互作用するプロモーターおよび／またはシグナル配列は、異種性の生成、およびその宿主または他の宿主における当該酵素の分泌における、使用のための候補である。例として、糸状菌の系において、セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、TAKA−アミラーゼ（ａｍｙＡ)、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄ−プロモーターｃｇｈ1、ｃｂｈｌｌ、エンドグルカナーゼ遺伝子ＥＧＩ〜ＥＧＶ、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｅｇｌ１−ｅｇｌ５、ｇｐｄプロモータ、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ−１α、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１およびｈｅｘ１プロモーターに対する遺伝子を促進させるプロモーターは、特に好適であり、多数の異なる生物（例えばA. niger、T. reesei、A. oryzae、A. awamoriおよびA. nidulans）由来であり得る。いくつかの実施形態において、酵素は、好適な同種または異種のシグナル配列と組換え的に一体にされている。当該シグナル配列は、細胞外（または細胞周辺）の空間に熱安定性変異体の酵素の分泌を導き、それによって細胞上清（または細胞周辺腔もしくは溶菌液）における酵素活性の直接的な測定を可能にする。Escherichia coli、他のグラム陰性細菌および当該分野に公知の他の生物にとって、特に好適なシグナル配列としては、ｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴまたはＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を促進させる配列が挙げられる。Bacillus subtilis、グラム陽性生物および当該分野に公知の他の生物にとって、特に好適なシグナル配列としては、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢの発現を駆動する配列がさらに挙げられ、S. cerevisiaeまたは酵母にとって、特に好適なシグナル配列としては、キラートキシン、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、接合因子α、Ｉｎｕ１ＡまたはＧｇｐｌｐシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、例えば発現されたタンパク質の残りからそれらを除去する、多くのシグナル配列によって切断され得る。いくつかの実施形態において、酵素の残りは、単独に発現されるか、またはＮ末端もしくはＣ末端における他のペプチド、タグもしくはタンパク質（例えば６ＸＨｉｓ、ＨＡまたはＦＬＡＧタグ）との融合体として発現される。好適な融合体としては、親和性、精製または検出を容易にするタグ、ペプチドまたはタンパク質（例えば６ＸＨｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシンまたはＦＬＡＧタグ）、ならびに示されているポリペプチドの発現、分解またはプロセシングを容易にするタグ、ペプチドまたはタンパク質が挙げられる。好適なプロセシング部位としては、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、Ｋｅｘ２またはインビボもしくはインビトロの切断のための他のプロテアーゼの切断部位が挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、酵素は、多くの形質転換方法によって発現宿主細胞に導入される。当該形質転換方法としては、エレクトロポレーション、脂質に補助された形質転換または形質移入（“リポフェクション”）、（例えば塩化カルシウムおよび／またはリン酸カルシウムを用いた）化学的に媒介される形質転換、（例えば宿主細胞のプロトプラストの）酢酸リチウムを介した形質転換、微粒子銃“遺伝子銃”の形質転換、（例えば宿主細胞のプロトプラストの）ＰＥＧを介した形質転換、（例えば細菌または真核細胞のプロトプラストを用いた）プロトプラストの融合、リポソームを介した形質転換、Agrobacterium tumefaciens、アデノウイルスまたは他のウイルスもしくはファージの形質転換または形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
代替的に、酵素は細胞内に発現される。必要に応じて、酵素の細胞内発現、またはシグナル配列（例えば上述した配列）を用いた細胞周辺腔における分泌の後に、細胞透過化または溶解のステップは、熱安定性変異体の酵素を上清に放出させるために使用され得る。膜の障壁の破壊は、機械的な手段（例えば超音波、圧力処理（フレンチプレス）、キャビテーションまたは膜を分解する酵素（例えばリゾチームまたは酵素の混合物）の使用）によって達成される。さらなる代替として、酵素をコードしているポリヌクレオチドは、好適な無細胞発現系の使用によって発現される。無細胞系において、所定のポリヌクレオチドは、典型的にプロモーターの補助をともなって転写されるが、環状の発現ベクターを形成するためのライゲーションは任意である。他の実施形態において、ＲＮＡは外因的に加えられるか、または転写なしで生成され、無細胞系において翻訳される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、酵素は組換え的に生成され、他の実施形態において、ポリペプチドは合成的に生成されるか、または単純な生成源から精製される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、酵素は、例えば抽出、検出および／または精製を補助するために、Ｎ末端および／またはＣ末端の融合タンパク質として生成される。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ＸＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性ドメイン）、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグまたは当業者に公知の他のタグが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、タンパク質分解性の切断部位は、融合タンパク質の配列の除去を可能にするために、融合タンパク質のパートナーおよび所定のタンパク質配列の間に設けられている。融合タンパク質は、規定されているポリペプチドの活性を妨げないことが好ましい。
【０１２３】
〔Ｖ．組成物〕
いくつかの局面において、本開示は、特定のアミノ酸に変異を有するグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素をコードしている核酸を有している発現ベクターを含んでいる宿主細胞を含んでいる組成物を提供する。他の実施形態において、本開示は、培養培地の上清におけるグリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物を提供する。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、ＧＨ７ファミリーのエンドグルカナーゼである。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素は、T. reeseiのエンドグルカナーゼＩである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、組成物は１つ以上のさらなる所定のタンパク質を含んでいる。組成物に見られる所定のタンパク質の非限定的な例としては、ヘミセルラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ベータ−グルカナーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、ガラクタナーゼ、エンド−マンナナーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラッカーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、ホスファターゼ、脂肪分解性の酵素、クチナーゼおよび／または他の酵素が挙げられる。
【０１２５】
〔ＶＩ．使用方法〕
本開示の酵素、ベクター、宿主細胞および組成物は、種々の産業用途（単糖およびオリゴ糖へのバイオマス（例えば、セルロースおよびリグノセルロース）の消化、例えば、生物燃料の生成、繊維製品手法（洗浄、コットンの柔軟加工およびデニムの仕上げ処理が挙げられる）、例えば色のケア用、洗浄用および抗汚染（anti-deposition）用の洗剤の製造および使用；食品に基づく方法（食品加工およびマッシュが挙げられる）；パルプおよび紙の手法（例えば、製紙用パルプの漂白、脱インキ、廃液処理の改善、研磨された結晶性セルロースの製造および繊維改質）が挙げられる）における使用について見出されている。したがって、例えば可溶性の糖を生成するためのセルロース含有組成物の消化または加水分解（例えば、酵素発酵または化学発酵による）における、そのような用途にとっての、規定されている酵素、核酸および組成物の方法および使用が提供される。
【０１２６】
熱安定性変異体の酵素は、高温において酵素活性を維持している。いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、約５０〜５５℃、典型的に約５０、５１、５２、５３または５４℃；約５５〜６０℃、典型的に約５５、５６、５７、５８または５９℃；約６０〜７０℃、典型的に約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０℃の温度において使用される。
【０１２７】
向上したこの熱安定性は、変異体酵素を、高い温度において理想的に実施されるリグノセルロースの加水分解にとって特に好適にする。この特性のために、熱安定性変異体の酵素は、後述する種々の産業用途に使用され得る。
【０１２８】
（前処理されたバイオマス混合物の粘度の低下）
熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における当該熱安定性変異体の酵素を含んでいる、規定されている組成物は、種々の産業用途における利用（例えば生物燃料の生成における単糖およびオリゴ糖への分解前の、前処理されたバイオマス混合物の粘度の低下が挙げられる）について見出されている。
【０１２９】
例えば生物燃料の生成において、供給原料として使用されるバイオマスは、バイオマスのセルロース性成分の加水分解を阻害し得る高レベルのリグニンを一般的に含有している。典型的にバイオマスは、セルロース成分の加水分解への利用可能性を向上させるために、例えば高温および／または高圧を用いて、前処理される。しかし、前処理は、高粘度のバイオマス混合物を一般的に生じる。また、前処理されたバイオマス混合物の高粘度は、前処理されたバイオマス混合物の効率的な加水分解を妨害し得る。有利なことに、本開示のポリペプチドおよび組成物は、バイオマスのさらなる分解の前に、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させるために使用され得る。
【０１３０】
したがって、本開示の一部の実施形態は、初期の粘度を有している前処理されたバイオマス混合物を、本開示の熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物のいずれかと接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の上記初期の粘度を低下させるために十分な条件において、接触させた上記バイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法に関する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、開示されている方法は、前処理工程の一部として実施される。前処理工程はさらなるステップを含み得る。上記さらなるステップは、
本開示の熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物のいずれかを、高温下においてバイオマスを前処理するステップの後に、前処理されたバイオマス混合物に対して加えるステップ、および前処理されたバイオマス混合物の上記初期の粘度を低下させるために十分な条件において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物とともに、前処理されたバイオマスをインキュベーションするステップである。熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、混合物の温度が高い間にか、または混合物の温度が下げられた後に、前処理されたバイオマス混合物に加えられ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、熱処理が実施された同じ容器または容器（vessel or container）において実施される。他の実施形態において、上記方法は、熱処理が実施された容器とは別の容器または容器において実施される。
【０１３２】
バイオマスとしては、植物材料、都市ごみおよび紙屑が挙げられ得るが、これらに限定されない。植物材料としては、ススキ、シマヨシ、チカラシバ、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、クサヨシ、ヨシ、ムギのわら、オオムギのわら、キャノーラのわら、エンバクのわら、オートスペルト（oat spelt）、トウモロコシの茎および葉、ダイズの茎および葉、エンバクの外皮、モロコシ、イネの外皮、サトウキビのバガス、トウモロコシの繊維、オオムギ、エンバク、アマ、コムギ、リンシード、柑橘類のパルプ、綿実、ラッカセイ、アブラナ、ヒマワリ、エンドウマメ、ルピナス、ヤシの仁、ココナツ、コンニャク、イナゴマメガム、グアールガム、ダイズ、可溶性物質を有している穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、ヒメアブラススキ、トウモロコシの穂軸、マツ、針葉樹の軟木、ユーカリ、カンバ、ヤナギ、ヤマナラシ、ポプラ木材、交配種のポプラ、エネルギーケイン、短い輪作の木質収穫物、収穫物の残余物、庭ゴミまたはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
（バイオマスの消化）
熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる、規定されている組成物は、当該分野において周知の多種類のセルロース性バイオマス（植物バイオマス、微生物性バイオマス、精製セルロースおよびリグノセルロース性の供給原料が挙げられる）を分解するために使用され得る。
【０１３４】
生体燃料エネルギーは、植物の細胞壁の成分であるセルロースおよびヘミセルロースから主になっている。単量体の糖へのこれらの多糖の加水分解は、異なる化学結合を切断するために共働的に作用する１組の酵素を必要とする（Dodd and Cann, GCB Bioenergy, 1:2, 2009）。セルロースは、バイオマスにおける支配的な多糖（他の多糖（ヘミセルロース、リグニンおよびペクチンが挙げられる）とともに）である。セルロースは、無水セロビオース（直鎖状のβ−（１−４）−Ｄ−グルカン）のホモポリマーであり、β−１，４−グリコシド結合においてともに連結されているグルコースユニットを含んでいる。ヘミセルロース性成分は、化学組成において異なり得る。ヘミセルロースは、種々の置換基を有している複雑な分枝構造に、種々の化合物（例えば、キシラン、キシログルカン、アラビノキシランおよびマンナン）を含んでいる。しかし、一般的に多形のセルロースは、類似するグルカン鎖の不溶性の結晶マトリクスとして、主に植物組織に見られる。
【０１３５】
セルロース性のバイオマスとしては、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含有しているリグノセルロースバイオマスが挙げられる。精製セルロースとしては、ホロセルロース（例えば、Solka Flok）、微結晶性セルロース、（例えば、Avicel（登録商標）およびSigmacell）、および高い可溶性のセルロースエーテル（カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））が挙げられる。セルロース含有基質としては、可溶性の基質および不溶性の基質が挙げられる。可溶性の基質は、例えば、セロデキストリンおよびその誘導体、短鎖セルラーゼ、β−メチルウンベリフェリル−オリゴ糖、ｐ−ニトロフェノール−オリゴ糖、長鎖セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。不溶性の基質としては、綿、Whatman No. 1フィルタ紙、パルプ（例えば、Solka Floc）、結晶性セルロース（例えば、綿、微結晶性セルロース（例えば、Avicel（登録商標））、バロニアのセルロース、細菌性セルロース、非結晶性セルロース（例えば、PASC、アルカリ膨潤セルロース）、染色セルロース、蛍光セルロース、色素生成および発蛍光団の誘導体（例えば、トリニトロフェニル−カルボキシメチルセルロース（ＴＮＰ−ＣＭＣ）およびFluramセルロース）、実用的なセルロース含有基質、α−セルロース、前処理したリグノセルロースバイオマス）が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの局面において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、結晶性セルロースと接触させるために使用されて、セルラーゼ、エクスパンシンおよびセルロース結合タンパク質のアッセイのために使用される研磨された結晶性セルロースを生じさせる。
【０１３７】
他の局面において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、バイオマスと接触させるために使用されて、バイオマスを加水分解／分解するか、またはバイオマスを糖に変換する。いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、バイオマスと接触させるために使用され、その生成物は、発酵生成物を生成するために十分な条件下において、（複数の）発酵性微生物とともに培養されるか、または化学溶液とともにインキュベートされる。他の実施形態において、バイオマスは、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物によって処理され、当該バイオマスを発酵させるために１つ以上の発酵性微生物と接触させられる。好ましい実施形態において、バイオマスは前処理される。
【０１３８】
（生物燃料の生成）
規定されている本開示の酵素および組成物は、セルロース、セルロース含有バイオマス、およびセルロース含有供給原料の分解および加水分解における利用について見出されている。上記分解および加水分解は、例えば、生物燃料（例えば、エタノール、ブタノール、他の生成物または中間体）の生成ためにバイオマスから得られる化学的な供給原料または発酵の供給原料としての単糖、二糖およびオリゴ糖の生成を目的としている。規定されているポリペプチドのそのような利用のための方法および組成物が、提供される。当該利用は、例えば、（１）生物燃料の発酵性生成を目的とする、リグノセルロース分解性のバイオマスの、可溶性の糖への変換、（２）前処理されたリグノセルロースの、可溶性の糖への変換、（３）高塩濃度または高いイオン性の液体の存在下における、リグノセルロースの、可溶性の糖への変換、（４）高温（例えば、５０、５１、５２、５３、５４もしくは５５℃、またはこれらを超える範囲（例えば、６０℃〜７０℃））における、結晶性セルロースの、可溶性の糖への変換である。
【０１３９】
一実施形態において、規定されている組成物は、細胞の除去ありもしくはなしの粗製の発酵ブロスの構成においてか、または半精製もしくは精製の酵素調製物の形態において、酵素を含んでいる。代替的に、規定されている本開示の宿主細胞は、バイオマスを用いた発酵工程におけるポリペプチドの供給源として使用される。
【０１４０】
一実施形態において、本開示の酵素は、バイオマスの分解を補助して生物燃料（例えば、エタノール）を生成するためのセルロースの分解における利用について見出されている。エタノールは、バイオマスの酵素分解および放出された糖のエタノールへの変換によって生成される。この種のエタノールは、バイオエタノールまたは生物燃料としばしば呼ばれる。エタノールは、１％未満〜１００％以下の混合物における燃料の添加物または増量剤（燃料の代用品）として使用される。一実施形態において、バイオマスからの生物燃料の生成のために、規定されている酵素、組成物および方法は、セルロースの、その単量体（グルコース）または他の可溶性の糖への変換において、発酵（例えば、微生物発酵または化学発酵）による生物燃料（例えば、エタノール）への続く変換のために、使用される。例えば、規定されている酵素および方法は、酵素的な加水分解によるそのような変換（規定されているポリペプチドを用いた加水分解へと続く、典型的に高温において実施される前処理を必要に応じて包含している）のために使用され得る。
【０１４１】
一実施形態において、規定されている酵素は、植物材料のより大規模な加水分解のために、他のカルボヒドラーゼ（例えば、マンナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、α−ガラクトシダーゼおよび／またはセルラーゼ）と組み合わせて使用され得る。
【０１４２】
（食品加工）
また、本開示の酵素を含んでいる組成物は、食品または動物の飼料の加工および製造における利用について見出されている。いくつかの非栄養因子は、動物の飼料および人間用の食品の調製における特定の植物材料の使用を制限している。リグノセルロース性材料（例えばセルロール）を含有している植物材料は、動物による当該植物材料の消化性を大きく低下させる。この影響は、植物材料のより高い割合が飼料に変換されることを可能にし、飼料のコストを低下させるセルロース性の分解酵素（すなわち熱安定性変異体の酵素）の使用を介して低下される。さらに、熱安定性酵素の活性を介して、セルロース性材料は、さらなるエネルギーを供給するためにより容易く吸収され得るより単純な糖に分解される。したがって、本開示の酵素を含んでいる組成物は、食品または動物の飼料の加工および／または製造のために好ましく使用される。
【０１４３】
規定されている本開示の酵素は、単胃動物（例えば、家禽およびブタ）のための飼料に対する添加物、および人間の食品のための添加物として有用である。いくつかの実施形態において、酵素は、飼料の添加物としての代わりに飼料を前処理するために使用される。いくつかの実施形態において、酵素は、離乳直後のブタ、育児室のブタ、子ブタ、肥育しているブタ、成長期のブタ、最後の仕上げ中のブタ、産卵鶏、若鶏および／または七面鳥のための飼料に加えられるか、当該飼料を前処理するために使用される。いくつかの実施形態において、酵素は、植物材料（例えば、ヤシの仁、ココナツ、コンニャク、イナゴマメガム、グアールガム、ダイズ、オオムギ、エンバク、アマ、コムギ、トウモロコシ、ラインシード、柑橘類のパルプ、綿実、ラッカセイ、ナタネ、ヒマワリ、エンドウマメおよびルピナス）から得られた飼料に加えられるか、または当該飼料を前処理するために使用される。
【０１４４】
熱安定性のために、酵素は、粒状化ステップの前に飼料混合物に熱が加えられる固形飼料の製造工程における利用について見出されている。当該製造工程は、工業的なペレットミルのほとんど場合に見られる。一例において、酵素は、粒状化ステップに先立って他の飼料成分、または粒状化ステップの後にすでに形成された固形飼料に対して加えられる。
【０１４５】
食品加工を目的としているか、または飼料の補助剤としての酵素を含んでいる組成物において、当該組成物は、他の代替物（例えば、着色剤、芳香化合物、安定剤、ビタミン、ミネラル、および他の飼料もしくは食品を向上させる酵素など）を必要に応じて含んでいる。これは、いわゆるプレミックス（pre-mix）に適用される。本開示に係る食品添加物は、加工食品を製造するために、他の食品成分と組み合わせられ得る。生じる組合せの食品添加物は、加工食品を形成するために適切な量において他の食品成分（例えば、穀類または植物タンパク質）と混合される。
【０１４６】
（繊維製品の洗浄および洗剤）
また、規定されている酵素、方法および組成物は、繊維製品の手法（高温処理条件における洗浄、コットンの柔軟加工、およびデニムの仕上げ処理、コットン繊維のつや出しが挙げられる）、ならびに洗剤の製造および使用（例えば、色ケア、洗浄および抗汚染）における利用について見出されている。例えば、酵素は、セルロースを含んでいるシミおよび汚れの除去を容易にするための洗剤組成物における利用について見出されている。一実施形態において、酵素は洗剤組成物に使用され、そのような洗剤組成物およびその使用が提供される。一実施形態において、洗剤組成物は、アミラーゼ、マンナーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、エンドグルカナーゼおよびエキソグルカナーゼの群から得られた他の酵素との組合せにおいて、酵素を含んでいる。
【０１４７】
酵素を含んでいる本開示の洗剤組成物は、任意の好都合な形態（例えば、棒状、タブレット、粉末、粒状、ペーストまたは液体）にある。液体洗剤は、典型的に７０％以下の水および０〜３０％の（複数の）有機溶媒もしくは（複数の）非水性成分を含有している、一般的に水性である。
【０１４８】
洗剤組成物は、１つ以上の界面活性剤（例えば、非イオン性（半極性が挙げられる）、アニオン性、カチオン性、および／または双性イオン性）を含んでいる。界面活性剤は、０．１重量％〜６０重量％のレベルにおいて典型的に存在している。含められている場合に、洗剤は、約１％〜約４０％のアニオン性の界面活性剤（例えば、直鎖状のアルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、硫酸アルキル（脂肪アルコールの硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、二級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルコハク酸、アルケニルコハク酸、または石鹸）を典型的に含んでいる。含められている場合に、洗剤は、約０．２％〜約４０％の非イオン性の界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸のモノエタノールアミド、脂肪酸のモノエタノールアミド、ポリヒドロキシのアルキル脂肪酸アミド、またはグルコースアミンのＮ−アシル  Ｎ−アルキル誘導体（グルカミド））を典型的に含んでいる。
【０１４９】
洗剤組成物は、０〜６５％の洗剤のビルダーまたは錯化剤（例えば、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、アルキルコハク酸、アルケニルコハク酸、可溶性のシリケートまたは層状化されたシリケート）を必要に応じて含んでいる。洗剤組成物は、１つ以上のポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸共重合体およびラウリルメタクリレート／アクリル酸の共重合体））を必要に応じて含んでいる。洗剤は、過酸形成活性剤（例えば、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネート）と組み合わせられ得る、漂白系（例えば、過酸化水素原料）（例えば、過ホウ酸塩または過炭酸塩）を必要に応じて含んでいる。代替的に、漂白系は、アミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含んでいる。
【０１５０】
一実施形態において、酵素は、１リットルの洗浄溶液につき０．０１〜１００ｍｇの酵素タンパク質（好ましくは１リットルの洗浄溶液につき０．０５〜５ｍｇの酵素タンパク質、特に１リットルの洗浄溶液につき０．１〜１ｍｇの酵素タンパク質）に対応する量において加えられている。
【０１５１】
（製紙用パルプ加工）
他の実施形態において、規定されている組成物および酵素は、例えばセルロース性材料のパルプ化のための高温適用におけるパルプおよび紙の手法（例えば、製紙用パルプの漂白、脱インキ、廃液処理の向上、および繊維の改質）における利用について見出されている。そのような目的のための、規定されている酵素を使用する方法および組成物が提供される。例えば、一実施形態において、酵素は、製紙用パルプ（例えば、化学パルプ、半化学パルプ、クラフトパルプ、機械パルプまたはスルファイト法によって調製されたパルプ）の酵素補助漂白における利用について見出されている。いくつかの実施形態において、パルプは、酸素、オゾン、過酸化物またはペルオキシ酸を用いて漂白された無塩素パルプである。いくつかの実施形態において、酵素は、低リグニン含量を示す改変または連続のパルピング法によって生成されたパルプの酵素補助漂白に使用される。いくつかの実施形態において、酵素は単独において使用され、他の実施形態において、それらは、他の酵素（例えば、キシラナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼの酵素）との組合せにおいて提供される。
【０１５２】
以下の実施例は、与えられている実施形態を例示するために提示されており、発明の範囲を限定すると意図されていない。
【実施例】
【０１５３】
〔実施例１−Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼＩの変異生成〕
Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼＩ（ＴｒＥＧＩ）は、この酵素の結晶構造が利用可能であること、およびこのエンドグルカナーゼがTrichoderma reeseiによって産生される最も豊富なエンドグルカナーゼであることから向上した熱安定性をもたらすために最初に選択された。ＴｒＥＧＩの熱安定性を向上させる最初の手法は、B-factorにしたがった手法（B-FIT法）（Reetz, MT et al., Angew Chem Int Ed Engl 45(46):7745-51, 2006）を用いることに基づいていた。結晶構造から得られるB-factorは、ポリペプチドにおける残基の可動性の指標である。この手法において、最大の変動性のある部位に一致する最高の平均B-factorを有していた残基を、向上した熱安定性を得る目的の変異生成のために選択した。この手法は、中温性酵素の熱安定性がその構造における最大の変動性のある部位における厳密さを向上させることによって促進され得るという仮定に基づいていた。ＴｒＥＧＩの結晶構造を用いて、最高のB-factor値を有している２０残基を同定した（表１）。１つ以上のアミノ酸によって構成されている７つの部位（部位Ａ（２８４〜２８７位のアミノ酸）、部位Ｂ（３０１〜３０２位のアミノ酸）、部位Ｃ（１１３位、１１５位のアミノ酸）、部位Ｄ（２３８位のアミノ酸）、部位Ｅ（２３０位のアミノ酸）、部位Ｆ（３２３位のアミノ酸）、部位Ｇ（２９１位のアミノ酸））を、変異生成のために選択した（図１、表１）。
【０１５４】
【表１】
2013539971.tif 000003
【０１５５】
（T. reeseiのエンドグルカナーゼＩのクローニング）
Escherichia coliのコドン傾向を用いて合成されたＴｒＥＧＩ用の遺伝子（cel7b, UniProt No. P07981）を、GenScript（GenScript Corporation, Piscataway, NJ, USA）から購入した。フォワードプライマー（5’-AAAAAACATATGCAACAACCGGGCACCTCC-3’）（配列番号２）およびリバースプライマー（5’-AAAAAAGTCGACTTACAGACATTGCGAGTAGTA-3’）（配列番号３）を用いることによって、上記遺伝子をＰＣＲ増幅した。それから、プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ｄ−ＴｒＥＧＩを生成するためにＮｄｅＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化の後に、ＰＣＲ産物をｐＩＶＥＸ２．４ｄベクター（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）にクローニングした。クローン化した遺伝子の配列決定を、Elim Biopharmaceuticals（Hayward, CA, USA）において実施した。
【０１５６】
（T. reeseiのＥＧＩの部位特異的変異生成）
T. reeseiのＥＧＩの２３８位、２９１位および３２３位のアミノ酸における部位特異的変異生成（テンプレートとしてｐＩＶＥＸ２．４ｄ−ＴｒＥＧＩ）を、部位特異的変異生成キット（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を用いて、表２に示されているプライマーを用いて製造者のプロトコルにしたがって、実施した。
【０１５７】
【表２】
2013539971.tif 000004
【０１５８】
T. reeseiのＥＧＩの２３０位、１１３位＆１１５位、２８４〜２８７位、および３０１〜３０２位のアミノ酸を有している部位における部位特異的変異生成（テンプレートとしてｐＩＶＥＸ２．４ｄ−ＴｒＥＧＩ）を、ＯＥ−ＰＣＲを用いて実施した。第１のＰＣＲの産物を、プラスミドテンプレートｐＩＶＥＸ２．４ｄ−ＴｒＥＧＩ、および変異生成を予定している位置のみにおいてＥＧＩの標的配列と異なっている複数のプライマー（表１）を用いて生成した。ゲル精製に続いて、ＰＣＲ断片をＯＥ−ＰＣＲ用のプライマーおよびテンプレートとして使用して、T. reeseiのＥＧＩの変異生成された遺伝子を構築した。すべてのＰＣＲ反応を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いて実施した。ＯＥ−ＰＣＲ用の最適条件は、以下の通りである：３０秒間の９８℃における変性の１サイクル；１０秒間の９８℃における変性、３０秒間の６０℃におけるアニーリング、４０秒間の７２℃における伸長の３０サイクル；および５０分間の７２℃における最後の伸長。このＯＥ−ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、それから、変異ＥＧＩ遺伝子を有しているｐＩＶＥＸ２．４ｄプラスミドを構築するためのテンプレートプライマーとしてのｐＩＶＥＸ２．４ｄ−ＴｒＥＧＩを有しているメガプライマーとして使用した。すべてのプライマーは、ＩＤＴ（Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA, USA；表２）によって快く提供された。ＰＣＲ産物の量および純度を、１．２％のアガロースゲルにおいて分析した。すべてのキメラ遺伝子の配列決定を、Elim Biopharmaceuticals（Hayward, CA, USA）において実施した。
【０１５９】
（T. reeseiの変異体ＥＧＩ遺伝子のＰＣＲ）
T. reeseiの変異体ＥＧＩ遺伝子を含んでいる細胞の終夜の培養物１μＬをＰＣＲ反応に使用して、無細胞ＥＧＩ発現用のテンプレートを生成した。各反応混合物は、１００μＭのＴ７ｆｗｄプライマーおよびＴ７ｒｅｖプライマー、１×ＰＣＲ緩衝液、２．５ｍＭのｄＮＴＰおよび０．２ユニットのＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼからなり、２０μＬの最終の総体積を有していた。以下のプロトコルを使用した：５分間の９５℃における変性の１サイクル；２０秒間の９５℃における変性、２０秒間の５５℃におけるアニーリング、１分間の７２℃における伸長；および５分間の７２℃における最後の伸長。
【０１６０】
〔実施例２−T. reeseiのＥＧＩの無細胞合成〕
無細胞合成プラットフォーム（Kim, T et al., Biotechnol Bioeng DOI: 10.1002/bit.22856, 2010）を、上述のように生成されたT. reeseiのＥＧＩ変異体のタンパク質発現のために使用した。
【０１６１】
（Ｓ３０  細胞抽出物の調製）
一部の改変をともなったPrattの手順（Pratt, JM, Transcription and translation: A practical approach, 179, 1984）にしたがって、E. coli株BL21 Star（商標）(DE3)（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、およびその誘導体株（BL21 Star（商標）(DE3)-pGro7）から、細胞抽出物を調製した。ＧｒｏＥＬ／ＥＳをコードしているシャペロンプラスミドｐＧｒｏ７を、Takara Bio（TAKARA BIO, Shiga, Japan）から購入した。３Ｌの２×ＹＴＰＧ培地（２２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、および１００ｍＭのグルコースを補った２×ＹＴ）において、３７℃において強制的な撹拌および曝気をともなって、細胞を培養した。ｐＧｒｏを有している細胞のために、０．０５％のＬ−アラビノースを培地に加え、細胞密度（ＯＤ６００）が０．６に達したときにイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）を加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導した。細胞を、対数期の中間部（mid-log phase）（ＯＤ６００＝４．５）において回収し、緩衝液Ａ（湿潤細胞のｇごとに２０ｍＬ）にそれらを懸濁させることによって３回にわたって洗浄し、それから遠心分離した。緩衝液Ａは、０．０５％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含んでおり、１０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート緩衝液（ｐＨ８．２）、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭのグルタミン酸カリウムおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有していた。ペレットを−８０℃に保存する前に、湿潤細胞のペレットの重さを計った。
【０１６２】
解凍した細胞（１０ｇ）を、１２．７ｍＬの緩衝液Ｂ（２−ＭＥなしの緩衝液Ａ）に懸濁させ、２００００ｐｓｉの一定圧力においてFrench cell-press（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）において崩壊させた。それから、溶解物を、３００００ｇ、４℃において３０分にわたって遠心分離し、ペレット画分から分離し、それから再び遠心分離した。最後の上清を１００ｒｐｍにおいて振とうし、それから、プレインキュベーション溶液（２９３．３ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート  ｐＨ８．２、２ｍＭの酢酸マグネシウム、１０．４ｍＭのＡＴＰ、２００ｍＭのクレアチンリン酸、４．４ｍＭのＤＴＴ、０．０４ｍＭのアミノ酸、２６．７μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ）を、１０ｍＬの上記上清に穏やかに加え、それから穏やかに振とうしながら８０分にわたって３７℃においてインキュベートした。１００００の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有しているPierce membrane（SnakeSkin（商標） Pleated Dialysis Tubing, Rockford, IL, USA）を用いて、プレインキュベートしたサンプルを、４×４５分にわたって、それぞれ緩衝液Ｂに対して４℃において透析した。保持されている抽出物を、４０００ｇ、４℃において１０分にわたって遠心分離して、上清を得た。細胞抽出物の還元活性を消耗させるために、Ｓ３０抽出物を、１０ｍＭの酸化グルタチオンとともに、２時間にわたって３０℃においてインキュベートした。残余のグルタチオン分子を、２００倍体積の緩衝液Ｃ（ＤＴＴおよび２−ＭＥなしの緩衝液Ａ）に対して、３時間にわたって４℃において処理された抽出物を透析することによって除去した。生じた抽出物を、少量の分取物に分け、無細胞タンパク質合成に用いるまで−８０℃に保存した。
【０１６３】
（タンパク質合成）
無細胞タンパク質合成用の標準的な反応混合物は、１５μＬの総体積において以下の成分からなっていた：５７ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）；１．２ｍＭのＡＴＰ；０．８５ｍＭずつのＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ；０．１４ｍｇ／ｍＬのE. coliの総ｔＲＮＡ混合物（ＭＲＥ６００株由来）；９０ｍＭのグルタミン酸カリウム；８０ｍＭの酢酸アンモニウム；１２ｍＭの酢酸マグネシウム；３４μｇ／ｍＬのＬ−５−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（フォリン酸）；２．０ｍＭずつの２０のすべてのアミノ酸；２％のＰＥＧ（８０００）；６７ｍＭのクレアチンリン酸（ＣＰ）；３．２μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）；２．５ｍＭの酸化グルタチオン；２．５ｍＭの還元グルタチオン；１５０μｇ／ｍＬのＤｓｂＣ；１６．７μｇ／ｍＬのＰＣＲ産物；２７％（ｖ／ｖ）のＳ３０−ＧｒｏＥＬ／ＥＳ細胞抽出物。無細胞反応を、２時間にわたって３０℃において実施した。また、無細胞合成を用いて合成されたタンパク質量を決定するために、１０μＭのＬ−［Ｕ−１４Ｃ］ロイシン（１１．３ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、Amersham Biosciences/GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）を無細胞反応に加えた。無細胞発現されたタンパク質の可溶性を分析するために、無細胞混合物を、１５０００ｒｐｍ、４℃において１０分にわたって遠心分離した。合成された可溶性タンパク質の量を、遠心分離の上清を分析することによって決定した。他の文献（Kim, DM and Choi, CY, Biotechnol Prog 12(5):645-649, 1996）に記載されているように、液体シンチレーションカウンター（Tri-Carb 2810TR Liquid Scintillation Analyzer, Perkin-Elmer Inc., Waltham, MA, USA）を用いたＴＣＡ−不溶性放射性活性から、無細胞合成された各セルラーゼの量を見積もった。
【０１６４】
（T. reeseiのＥＧＩの無細胞発現にとっての酸化還元電位の最適化）
ＴｒＥＧＩはジスルフィド結合を有している。種々の酸化還元電位のもとにこの酵素を発現させることは、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオンの量を変えることによって達成され、無細胞合成を実施することは、これらのジスルフィド結合を正確に形成させるために必要な酸化還元空間（redox space）の調査になった。無脂肪合成における酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンの量は、以下の通りに変更された：酸化グルタチオン：還元グルタチオン−０：５、１：４、２：３、３：２、４：１および５：０ｍＭ。グルタチオンの総濃度は、無細胞合成反応において５ｍＭに常に維持された。種々の酸化還元条件のもとに合成されたＴｒＥＧＩ酵素は、ＣＭＣプレートにスポットされた。プレートを５０℃において終夜インキュベートし、コンゴレッドを用いて染色した。
【０１６５】
結果は、正確なジスルフィド結合形成によって構成されている活性な酵素が無細胞発現反応の酸化還元電位にかかわらず得られることを示している（図２）。
【０１６６】
〔実施例３−向上した熱安定性／活性を有しているＴｒＥＧＩ変異体のスクリーニング〕
スクリーニングにおける最初のステップは、野生型ＴｒＥＧＩがその活性のすべてまたはほとんどを消失する条件を同定することであった。それから、これらの条件を、向上した熱安定性を有している変異体を同定するためのスクリーニング条件として使用した。
【０１６７】
（ＴｒＥＧＩ変異体にとってのスクリーニング条件の選択）
野生型ＴｒＥＧＩの熱安定性を測定するために、無細胞合成されたＴｒＥＧＩの１０μＬ（２０ｐｍｏｌ）を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と混合した。異なる長さの時間（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０分）にわたって、種々の温度（４５、５０、５５、６０、６５、７０℃）において酵素混合物をインキュベートした後に、１．５％（ｖ／ｖ）のＣＭＣを、予熱処理した酵素混合物に加えて、１時間にわたって５０℃において加水分解反応を開始させた。ＤＮＳ法（Miller, GL, Anal Chem 31(3):426-428, 1959）によって、還元糖の濃度を測定した。
【０１６８】
また、野生型ＴｒＥＧＩの熱安定性を、ＣＭＣ−アガープレート上にスポットすることによって試験した。無細胞合成されたＴｒＥＧＩの１０μＬ（２０ｐｍｏｌ）を、２μＬの１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と混合した。異なる長さの時間（１０、３０、６０分）にわたって、５３、５５、５７、６０および６５℃において酵素混合物をインキュベートした後に、２μＬの酵素混合物をＣＭＣプレートにスポットした。
【０１６９】
図３に示されている結果に基づいて、３０分にわたる酵素の５０℃の予熱を、野生型の親ＴｒＥＧＩがこれらの条件においてその活性を消失したので、すべての変異体にとってのスクリーニング過程のために選択した。
【０１７０】
変異体ＴｒＥＧＩ酵素のスクリーニングおよび選択のプロトコルは、図４および以下に示されている。
【０１７１】
（ＴｒＥＧＩ変異体を選択するためのスクリーニング処理）
変異体をE. coliに形質導入し、プレートに播いた。各部位（部位Ａを除く）について、配列空間の９５％の適用範囲に対応するコロニーをピックして、深底の９６ウェルプレートにおいて終夜、培養した。次に、テンプレートとして終夜培養物を用いて９６ウェルプレートにおいて、これらのコロニーのＰＣＲを実施して、〜３００ｎｇ／μＬの直鎖のＴｒＥＧＩ遺伝子の産物をもたらし、続いて無細胞発現のために使用した。無細胞発現された１５μＬのＴｒＥＧＩ変異体に、２μＬの１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８５）を、約５までｐＨが下がるまで加えた。ＴｒＥＧＩ変異体を、それから、３０分にわたって５０℃に加熱し、その後にＣＭＣ−アガープレート（１％のＣＭＣ、１．５％のアガー、５０ｍＭのアセテート緩衝液（ｐＨ４．８５））にスポットし、５０℃において終夜、オーブンにおいてインキュベートした。無細胞合成を用いて発現させた組換えＴｒＥＧＩが３０分にわたる５０℃におけるインキュベーションによってすべての活性を消失する（図３）ので、無細胞発現された変異体ＴｒＥＧＩ酵素を、ＣＭＣプレートにスポットする前に、３０分にわたって５０℃においてインキュベートした。ＣＭＣプレートを、１％のコンゴレッドを用いて５分にわたって翌日に染色した。親より高い熱安定性を有している変異体は、熱処理後に活性を保持しており、したがってコンゴレッドを用いて染色したＣＭＣプレート上にハロ領域または消失領域を生じさせた。このため、プレートを、変異生成の次のラウンドにとっての親として使用され得る活性な酵素（ヒット）について分析した。部位Ａ〜Ｇにおける変異生成は、組換えＴｒＥＧＩに対して５０℃における向上した熱安定性を有している５００未満の変異体を生成した（図５；表３）。
【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
〔実施例４−向上した熱安定性を有しているＴｒＥＧＩ変異体の性質決定〕
スクリーニングによって同定された変異体を、ＴｒＥＧＩ変異体ともなうインキュベーションによるＣＭＣ加水分解を測定することによって、向上した熱安定性について試験した。
【０１７４】
（T. reeseiのＥＧＩ変異体の活性／熱安定性の測定）
ＴｒＥＧＩ変異体の活性／熱安定性を測定するために、無細胞合成された１０μＬの酵素（２０ｐｍｏｌ）を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８５）と混合した。異なる時間の長さ（０、１５、３０、４５、６０分）にわたる５０℃における酵素混合物のインキュベーション後に、１．１％（ｖ／ｖ）のＣＭＣを、予熱処理した酵素混合物に加えて、１時間にわたる５０℃における加水分解反応を開始させた。還元糖の濃度をｍＤＮＳ法（Miller, GL, Anal Chem 31(3):426-428, 1959）によって測定した。
【０１７５】
図６に示されている結果が表している通り、試験された変異体は、無細胞合成された野生型ＴｒＥＧＩと比べて、向上した活性を有していた。ＴｒＥＧＩの熱安定性に対する変異の影響は、ＣＭＣの添加前により長時間にわたって加熱されたサンプルにおいて特に著しい。ＴｒＥＧＩにおける変異された残基を、配列決定によって以下のように同定した：変異体Ｆ２、Ｆ３、Ｈ６およびＦ６は、Ｇ２３０Ｅ／Ｖ１１９Ｍ／Ｑ９３Ｈ変異によって構成されており、変異体Ｆ１２はＧ２３０Ｑ変異によって構成されており、変異体Ｇ１はＧ２３０Ｋ変異によって構成されており、変異体Ｇ８およびＨ３は、Ｇ２３０Ａ変異によって構成されており、変異体Ｇ１２は、Ｇ２３０Ｘ変異によって構成されており、変異体Ｈ１はＧ２３０Ｓ変異によって構成されている。
【０１７６】
図７は、アッセイ前に４５分にわたる５０℃における熱処理あり（ａ）および熱処理なし（ｂ）で試験したすべての変異体の結果を示している。示されている通り、変異体酵素の群は、野生型ＴｒＥＧＩより良好な熱安定性を有していた。
【０１７７】
（T. reeseiのＥＧＩの部位Ｅ（Ｇ２３０）における変異）
３０分にわたる５０℃におけるインキュベーション後に保持された高い活性を示した７０の変異体の配列決定によって、すべてではなく６つの変異体が部位Ｅ（２３０位のアミノ酸、グリシン）に変異を有していたことが明らかにされた。天然のグリシン残基の代わりの部位Ｅにおけるアラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、ロイシン、リジン、グルタミン酸、グルタミンおよびメチオニンの置換は、一部が図８に示されている向上した熱安定性を導いた。種々の長さの時間にわたる５０℃における熱処理の前後における、これらのいくつかの変異体の比活性を、図９にまとめている。上述したプロトコルを用いて、活性を測定した。最も安定な変異体Ｇ２３０Ｋは、１時間にわたる５０℃におけるインキュベーション後に、これらの条件下にその活性を消失する親のＴｒＥＧＩと比べて、約８０％の活性を保持していた。
【０１７８】
（T. reeseiのＥＧＩの部位Ｃ（Ｄ１１３、Ｄ１１５）における変異）
さらに、部位Ｃ（１１３、１１５位のアミノ酸）における変異は、ＴｒＥＧＩのより熱安定性のバリアント（熱処理によって保持された〜８０％の活性）を生じると示された。熱安定性のＴｒＥＧＩ変異体を生じる、この部位におけるアミノ酸置換は、Ｄ１１３Ｓ、Ｄ１１３Ｌ、Ｄ１１５ＴおよびＤ１１５Ｇであった。T. reeseiのＥＧＩの二重変異体Ｄ１１３Ｌ／Ｄ１１５ＴおよびＤ１１３Ｓ／Ｄ１１５Ｇは、図１０に示されているように、５０℃における加熱処理のありおよびなしにおいて、活性である。
【０１７９】
（T. reeseiのＥＧＩの部位Ｅ（Ｇ２３０）、および部位Ｃ（Ｄ１１３、Ｄ１１５）における変異）
複数の変異を有しているＴｒＥＧＩバリアントの熱安定性（表４）を、上述したプロトコルのように試験した。酵素濃度は０．１５〜０．３μＭであった。
【０１８０】
【表４】
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【０１８１】
３つのアミノ酸における変異Ｄ１１３Ｓ、Ｄ１１５ＴおよびＧ２３０Ｘ（Ｘ＝Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｅ、ＭまたはＴ）を有しているＴｒＥＧＩバリアント（表４）は、野生型ＴｒＥＧＩと比べて向上した熱安定性を示した（図１）。また、三重変異体は、Ｇ２３０単一の変異体に対して向上した比活性を有していた。さらに、ＴｒＥＧＩバリアントＧ２３０Ｔ／Ｄ１１３Ｓ／Ｄ１１５Ｔは、３０分にわたる５３℃における処理の後に活性を示した。Ｄ１１３Ｌ／Ｄ１１５Ｇの置換を有しているＴｒＥＧＩの二重変異体、およびこれらの置換（表４における変異番号１０〜１８）を含んでいるＴｒＥＧＩの三重変異体は、５０℃において実質的な活性を示さなかった。
【０１８２】
まとめると、実験結果は、Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼＩにある２３０位および／または１１３位および／または１１５位のアミノ酸残基における置換が酵素の熱安定性を向上させることを示している。この位置における異なるアミノ酸への変更は、５０℃以上の温度において、親酵素と比べて非常に向上した熱安定性を有している変異体酵素を生じさせた。熱安定性のこの向上は、変異体酵素がより長時間にわたってより高い温度において活性を維持することを可能にし、これによって、産物への基質の全体的により高い変換を可能にした。
【０１８３】
〔実施例５−セルロース性基質に対するT. reeseiのＥＧＩ変異体の活性〕
また、異なるセルロース性基質に対するＴｒＥＧＩ変異体の影響を調べた（図１２および１３）。
【０１８４】
（不溶性のセルロース性基質に対するエンドグルカナーゼ活性の測定）
不溶性基質についてのすべてのセルロース分解性アッセイを、１％（ｗ／ｖ）の基質、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８５）、０．１５〜０．３μＭのセルラーゼを含んでいる７０μＬの終体積、９６ウェルプレート、３つ１組、５０、５３または５５℃において実施した。９６ウェルプレートを、アルミホイルを用いて密封し、蒸発を最小化するための加熱された上部を有しているサーモサイクラーにおいてインキュベートした。セルラーゼ活性を、Avicel（登録商標）、および前処理されているイオン性の液体Avicel（登録商標）（IL-Avicel（登録商標））について測定した。混合物を、５０、５３または５５℃において１時間にわたってインキュベートした後に、後述するグルコースのオキシダーゼ−ペルオキシダーゼアッセイを用いて放出された可溶性の還元糖の量を測定する前に、４℃に冷却した。
【０１８５】
（グルコースのオキシダーゼ−ペルオキシダーゼアッセイ）
基質としてのAmplex Redを用いたグルコースのオキシダーゼ−ペルオキシダーゼアッセイによって、放出された可溶性の糖の量を測定した。簡単に説明すると、加水分解反応から得られた上清の８μＬを、１時間にわたって室温（ＲＴ）において８μＬのβ−グルコシダーゼ（５ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートして、可溶性のセロビオースのすべてをグルコースに変換させた。それから、６４μＬのグルコースオキシダーゼ（１．２５Ｕ／ｍＬ）、ＨＲＰ（１．２５Ｕ／ｍＬ）およびAmplex Red（６０μＭ）を含有している１２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４５）を加えること、および１０分にわたってＲＴにおいてインキュベーションすることによって、放出されたグルコースの量を測定した。形成されるレゾルフィンの量は、存在するグルコースの量と一致している。レゾルフィンの蛍光を、５３０ｎｍにおける励起および５９０ｎｍにおける発光検出によって測定した。
【０１８６】
図１２（ａ）および（ｂ）に示されているように、Ｇ２３０におけるグルタミン酸、グルタミン、リジン、アラニンまたはセリンの置換を有している同定されたＴｒＥＧＩ変異体は、５０℃におけるAvicel（登録商標）およびIL-Avicel（登録商標）の加水分解において、野生型ＴｒＥＧＩと比べて向上した活性を有していた。同様に、Ｄ１１３Ｓ、Ｄ１１５Ｔ変異、およびＧ２３０におけるグルタミン酸、グルタミン、リジン、アラニンもしくはセリンの置換を有しているＴｒＥＧＩの三重変異体は、５０、５３または５５℃におけるAvicel（登録商標）およびIL-Avicel（登録商標）の加水分解において、野生型ＴｒＥＧＩと比べて向上した活性を示した（図１２（ｃ）および（ｄ））。異なる変異体の活性における向上は、野生型ＴｒＥＧＩの活性を超えて約１．５〜５倍の範囲であった。
【０１８７】
ＴｒＥＧＩ変異体の活性の、異なるセルロース性基質に対する比較を図１３に示している。試験した変異体は、野生型ＴｒＥＧＩに対して、基質の加水分解における向上した活性を有していた。Ｇ２３０に単一のアミノ酸置換を有しているＴｒＥＧＩ変異体との比較において、３つのアミノ酸（Ｇ２３０、Ｄ１１３、Ｄ１１５）に変異を有しているＴｒＥＧＩ変異体は２．５倍〜の向上した活性を有していた（図１３（ｂ）および（ｃ））。
【０１８８】
〔実施例６−グリコシルヒドロラーゼファミリー７に由来する熱安定性変異体の酵素〕
この実施例は、変異なしの野生型酵素に対してその熱安定性を向上させるための、グリコシルヒドロラーゼファミリー７の変異を目的としている。使用される種々の技術は上述されている。
【０１８９】
第１のステップは、酵素のポリペプチド配列を配列番号１の配列とアラインメントさせて、これによって配列番号１の２３０位、１１３位および１１５位のアミノ酸とアラインメントするアミノ酸残基を同定することである。
【０１９０】
第２のステップは、セリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはグリシンに、同定されたこれらのアミノ酸の１つ以上を変異させることである。変異された酵素をそれから発現させ、精製する。
【０１９１】
第３のステップは、変異された酵素の熱安定性を測定することである。変異された酵素を、異なる時間の長さ（例えば、１５〜６０分の間）にわたって、ある温度（例えば、５０〜７０℃の間）においてインキュベートする。このインキュベーションの後に、変異体酵素のセルラーゼ活性を評価する。この評価は、種々のセルロース性基質を用いて実施され得る。酵素の野生型をこの評価におけるコントロールとして使用する。
【０１９２】
高温において最も活性な変異された酵素は、種々の産業用途（例えば、生物燃料生産、食品加工、繊維製品の洗浄など）に使用され得る。
【０１９３】
〔実施例７−T. reeseiの熱安定性のＥＧＩ変異体〕
この実施例では、異なるセルロース性基質におけるＴｒＥＧＩ変異体の熱安定性を試験した。
【０１９４】
（S. cerevisiaeにおけるT. reeseiのＥＧＩの発現）
S. cerevisiaeにおけるT. reeseiのＥＧＩおよび改変された変異体の生成のために、Ｃ末端に対して６つのヒスチジン残基を加えた後に、ｐＣｕ４２４ベクター（Labbe, S and Thiele, DJ, Methods Enzymol. 1999, 306, 145-153）に遺伝子をクローニングした。酵素の分泌を可能にするために、改変されたα−因子ＡｐｐＳ４シグナルペプチド（Rakestraw, JA, et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 103, 1192-1201）を上記遺伝子のＮ末端に加えた。T. reeseiのＥＧＩ遺伝子を含んでいるｐＣｕ４２４を、ＬｉＡｃ法（Gietz, RD and Schiestl, RH, Nat. Protoc. 2007, 2, 31-34）を用いて、さらなるｐｍｒ１ノックアウトを有しているS. cerevisiae株ＹＶＨ１０（Robinson, AS et al., Biotechnology (NY) 1994,12, 381-384）にトランスフォームした。発現のために、飽和されているＹＰＤ培地の前培養物を使用して、１Ｌの選択培地（ＳＣ−Ｔｒｐ）に植菌し、３日にわたって３０℃において培養した。培養物を、４０００ｇにおいて５分にわたって沈降させ、２５℃における３日間の誘導のために、５００μＭのＣｕＳＯ４を補ったＹＰＤ培地に懸濁させた。Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＥＧＩを培養上清から精製した。
【０１９５】
（S. cerevisiaeにおいて発現されたT. reeseiのＥＧＩのトリミンググリコシル化）
S. cerevisiaeにおいて発現されたT. reeseiの精製ＥＧＩの３〜５ｍｇを、ｐＨ７．０の２５ｍＭのリン酸緩衝液において２００ユニットのＰＮＧａｓｅＦ（NEB）とともに、１８時間にわたって３０℃においてインキュベートし、さらなる１００ユニットのＰＮＧａｓｅＦを加え、さらなる２４時間にわたってインキュベートした。
【０１９６】
（無細胞のT. reeseiのＥＧＩタンパク質の熱安定性）
Ｇ２３０部位およびＤ１１３Ｄ１１５部位に種々のアミノ酸置換を有しているT. reeseiのＥＧＩ変異体は、E. coli細胞抽出物（酵素をグリコシル化する能力を有していない）に基づく無細胞タンパク質合成を用いて発現されたときに、Avicel（登録商標）およびIL-Avicel（登録商標）に対する親酵素より熱安定性が高いとわかった。図１４に示されているように、T. reeseiのＥＧＩ変異体は、Avicel（登録商標）に対する５０℃における活性について、親酵素と比べて約２倍の向上を有している。図１５に示されているように、T. reeseiのＥＧＩ変異体は、IL-Avicel（登録商標）に対する５０℃における活性について、親酵素と比べて約５倍の向上を有している。
【０１９７】
（S. cerevisiaeにおいて発現されたT. reeseiのＥＧＩの熱安定性）
T. reeseiのＥＧＩの熱安定性変異体を酵母（S. cerevisiae）において発現させて、これらの酵素バリアントのグリコシル化の、それらの活性／安定性に対する影響を調べた。Ｄ１１３ＳＤ１５Ｔ変異と組み合わせてＧ２３０部位に種々のアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、ＴおよびＳ）を有している、酵母において発現させたT. reeseiのＥＧＩ変異体を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて精製した。酵母における発現によるこれらの酵素の過剰なグリコシル化（ＭＷ１００〜２００ｋＤａ）のために、ＰＮＧａｓｅＦを用いてＮ末端グリコシル化を切り取って、T. reeseiにおいて発現された未処理の酵素と非常に近いグリコシル化レベル（ＭＷ５５〜６０ｋＤａまで）を有しているＴｒＥＧＩ酵素を得た。切り取り処理されたグリコシル化を有している改変されたこれらの酵素の活性測定によって、Avicel（登録商標）およびIL-Avicel（登録商標）に対する５０℃〜６５℃の温度における向上した活性が示された（図１６〜１８）。最良の変異体（Ｇ２３０ＡＤ１１３ＳＤＴ変異）は、Avicel（登録商標）に対する６０℃における活性について、親酵素と比べて約２倍の向上を示し、IL-Avicel（登録商標）に対する６５℃における活性について、親酵素と比べて約２倍の向上を示した（図１８）。図１７は、Ｇ２３０ＡＤ１１３ＳＤＴ変異がAvicel（登録商標）に対するＴ５０の約４℃の上昇を有していたことを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月1日(2013.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素であって、
以下の変異：
ｉ．配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸におけるセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニン；
ｉｉ．配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸におけるロイシンまたはセリン；ならびに
ｉｉｉ．配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸におけるスレオニンまたはグリシンからなる群から選択される少なくとも２つの変異を含んでいる、熱安定性変異体の酵素。
【請求項２】
グリコシルヒドロラーゼファミリー７の熱安定性変異体の酵素であって、
ｉ．配列番号１の２３０位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニン；
ｉｉ．配列番号１の１１３位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリン；ならびに
ｉｉｉ．配列番号１の１１５位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを含んでいる、請求項１に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項３】
約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、野生型の酵素と比べて向上した熱安定性を示す、請求項１または２に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項４】
約５０℃において約１時間にわたるインキュベーション後に、少なくとも約０．５ｍモルＧＥ／μモル酵素／時間の比活性を有している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項５】
真菌または細菌に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素を含んでいる、組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素をコードしている、単離された核酸。
【請求項８】
制御配列と作動可能に連結されている請求項７に記載の核酸を含んでいる、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含んでいる、宿主細胞。
【請求項１０】
培養培地、ならびに請求項９に記載の宿主細胞を含んでいる組成物。
【請求項１１】
前処理したバイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、
初期の粘度を有している前処理したバイオマス混合物を、請求項６または１０に記載の組成物と接触させること；ならびに
前処理した上記混合物の初期の上記粘度を低下させるために十分な条件において、接触させた上記バイオマス混合物をインキュベートすることを包含している、方法。
【請求項１２】
バイオマスを糖に変換させる方法であって、
上記バイオマスを、請求項６または１０に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。
【請求項１３】
バイオマスを加水分解または分解する方法であって、
上記バイオマスを、請求項６または１０に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。
【請求項１４】
発酵生成物を生成する方法であって、
バイオマスを請求項６または１０に記載の組成物と接触させて第１の生成物を形成させること；ならびに
上記第１の生成物を、発酵生成物を生成するために十分な条件において、化学溶液または１つ以上の発酵微生物とともに培養することを包含している、方法。
【請求項１５】
上記接触は、約５０℃〜約５５℃、約５５℃〜約６０℃、または約６０℃〜約７０℃の温度において行われる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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