(57)【要約】本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分であって、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を提供する。本発明はまた、ＲＴＫに関連する疾患を処置または予防するための方法およびＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合する部分を同定するための方法を提供する。本発明は、ＲＴＫ自己リン酸化、酵素活性化、および細胞シグナル伝達に必要とされるステップである非対称性のチロシンキナーゼ二量体形成の阻害による、病理学的に活性化されたＲＴＫ（ＦＧＦ受容体など）の薬理学的阻害のための新規なアプローチを提供する。
2013517282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分であって、該ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する、部分。
【請求項２】
前記ＲＴＫの触媒ドメインのヌクレオチド結合部位に結合しない、請求項１に記載の部分。
【請求項３】
前記ＲＴＫの一方の単量体のＮローブ上の非対称性の接触境界領域に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項４】
前記ＲＴＫの一方の単量体のＣローブ上の非対称性の接触境界領域に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項５】
内因性キナーゼ活性の喪失を引き起こさない、請求項１に記載の部分。
【請求項６】
ＲＴＫ単量体間の立体的な制約を増加させる、請求項１に記載の部分。
【請求項７】
前記ＲＴＫの二量体化を妨げない、請求項１に記載の部分。
【請求項８】
前記ＲＴＫの細胞質ドメインの二量体化を妨げる、請求項１に記載の部分。
【請求項９】
前記ＲＴＫは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）である、請求項１に記載の部分。
【請求項１０】
前記線維芽細胞増殖因子受容体は、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）である、請求項９に記載の部分。
【請求項１１】
前記線維芽細胞増殖因子受容体は、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）である、請求項９に記載の部分。
【請求項１２】
前記線維芽細胞増殖因子受容体は、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）である、請求項９に記載の部分。
【請求項１３】
前記線維芽細胞増殖因子受容体は、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）である、請求項９に記載の部分。
【請求項１４】
ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ５７７、ＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５７９、またはＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５８０に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項１５】
ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｓｐ５１９に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項１６】
ＦＧＦＲ１のＣ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項１７】
ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項１８】
ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項１９】
ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２０】
前記ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、前記ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、前記ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、前記ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、前記ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、および前記ＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択されるＲＴＫの領域に結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２１】
前記ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープに結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２２】
前記コンフォメーションエピトープは、前記ＲＴＫの前記非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される、請求項２１に記載の部分。
【請求項２３】
前記コンフォメーションエピトープは、Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、請求項２１に記載の部分。
【請求項２４】
前記コンフォメーションエピトープは、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、請求項２１に記載の部分。
【請求項２５】
前記ＲＴＫ上の近接エピトープに結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２６】
前記近接エピトープは、前記ＲＴＫの前記非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される、請求項２５に記載の部分。
【請求項２７】
小分子である、請求項１に記載の部分。
【請求項２８】
前記小分子は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、請求項２７に記載の部分。
【請求項２９】
前記小分子は、前記ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、前記ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、前記ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、前記ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、前記ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、および前記ＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される領域に結合する、請求項２７に記載の部分。
【請求項３０】
前記小分子は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の非対称性の接触境界領域に基づいて設計される、請求項２７に記載の部分。
【請求項３１】
ペプチド性分子である、請求項１に記載の部分。
【請求項３２】
前記ペプチド性分子は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の非対称性の接触境界領域に基づいて設計される、請求項３１に記載の部分。
【請求項３３】
前記ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、請求項３２に記載の部分。
【請求項３４】
前記ペプチド性分子は、前記ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、前記ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、前記ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、前記ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、前記ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、および前記ＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される領域に結合する、請求項３２に記載の部分。
【請求項３５】
前記ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基５７６〜５９４と少なくとも８０％同一の構造を含む、請求項３２に記載の部分。
【請求項３６】
前記ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ２のアミノ酸残基５７９〜５９７と少なくとも８０％同一の構造を含む、請求項３２に記載の部分。
【請求項３７】
単離抗体またはその抗原結合性一部分である、請求項１に記載の部分。
【請求項３８】
前記単離抗体またはその抗原結合性一部分は、イントラボディである、請求項３７に記載の部分。
【請求項３９】
前記抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項３７に記載の部分。
【請求項４０】
前記抗体またはその抗原結合性一部分は、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、ＩｇＧ４定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、およびＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む、請求項３９に記載の部分。
【請求項４１】
前記抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ１である、請求項４０に記載の部分。
【請求項４２】
前記抗体またはその抗原結合性一部分は、単鎖Ｆｖ断片、ＳＭＩＰ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、および単一ドメイン抗体である、請求項３７に記載の部分。
【請求項４３】
前記抗体またはその抗原結合性一部分は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下からなる群より選択されるＫＤで受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する、請求項３７に記載の部分。
【請求項４４】
請求項３７から４３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性一部分を産生するハイブリドーマ。
【請求項４５】
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の非対称性の接触境界領域上のコンフォメーションエピトープに結合する部分であって、該ＦＧＦＲのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する、部分。
【請求項４６】
ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基または該残基から１〜５Å以内に結合して、ＦＧＦＲ１のリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する、部分。
【請求項４７】
ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する、部分。
【請求項４８】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分であって、酵素として働くＲＴＫ単量体のＮローブと、基質として働くＲＴＫ単量体のＣローブとの間の境界領域を破壊する、部分。
【請求項４９】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分であって、該ＲＴＫの逆の脱リン酸化を阻害する、部分。
【請求項５０】
請求項１から４３および請求項４５から４９のいずれか一項に記載の部分ならびに薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項５１】
被験体におけるＲＴＫに関連する疾患を処置または予防するための薬の調製における、請求項１から４３および請求項４５から４９のいずれか一項に記載の部分の有効量の使用。
【請求項５２】
前記ＲＴＫに関連する疾患は、がんおよび重度の骨障害からなる群より選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記重度の骨障害は、軟骨無形成症、クルゾン症候群、およびシーザー−ショッツェン症候群からなる群より選択される障害である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記がんは、膠芽腫、多発性骨髄腫、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、および乳がんからなる群より選択される、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合して、該ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を同定するための方法であって、
ＲＴＫを候補部分と接触させるステップ；
同時にまたは順次、該ＲＴＫを、該ＲＴＫに対するリガンドと接触させるステップ；
酵素として機能するＲＴＫ単量体のＮローブと、基質として機能するＲＴＫ単量体のＣローブとの間の配置、配向、および／または距離に該部分が影響するか否かを決定して、該ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合して、該ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項５６】
前記部分は、前記ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記部分は、内因性のＲＴＫキナーゼ活性の喪失を引き起こさない、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する小分子であって、該ＲＴＫのトランス自己リン酸化を阻害する、小分子。
【請求項５９】
ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基または該残基から１〜５Å以内に結合する、請求項５８に記載の小分子。
【請求項６０】
ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する、請求項５８に記載の小分子。
【請求項６１】
前記ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、前記ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、前記ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、前記ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、前記ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、および前記ＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される領域に結合する、請求項５８に記載の小分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１０年１月１４日に出願された米国仮出願番号６１／３３５，９５０に関連し、この出願への優先権を主張する。上記出願の全容は、参考として本明細書に明確に援用される。
【０００２】
連邦政府によって支援された研究または開発についての陳述
本出願は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた、コントラクトＲ０１−ＡＲ  ０５１４４８、Ｒ０１−ＡＲ  ０５１８８６、およびＰ５０  ＡＲ０５４０８６の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
リガンド誘導性チロシン自己リン酸化は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）による活性化および細胞シグナル伝達の制御において重要な役割を果たす（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。構造的および生化学的研究により、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）（非特許文献７および非特許文献８）ならびにＦＧＦＲ２（非特許文献９）などのような受容体チロシンキナーゼの自己リン酸化は、連続的、かつ正確に順序付けられた分子間反応（これは、３つのフェーズに分けることができる）によって媒介されることが示された。たとえば、第１のフェーズは、キナーゼ活性の５０〜１００倍の刺激をもたらす、触媒コアの活性化ループ中に位置するチロシン（ＦＧＦＲ１においてＹ６５３）のトランスリン酸化を含む（非特許文献７）。第２のフェーズでは、ＦＧＦＲ１のキナーゼ挿入領域（Ｙ５８３、Ｙ５８５）、膜近傍領域（Ｙ４６３）、およびＣ末端尾部（Ｙ７６６）におけるチロシンを含むシグナル伝達タンパク質に対するドッキング部位として働くチロシン残基が、リン酸化される。最終の第３のフェーズでは、Ｙ６５４；活性化ループ中に位置する第２のチロシンが、リン酸化され、ＦＧＦＲ１キナーゼ活性におけるさらに１０倍の増加をもたらす（非特許文献７）。興味深いことには、互いに隣接するチロシン（たとえばＹ６５３、Ｙ６５４およびＹ５８３、Ｙ５８５）は、連続的にリン酸化されず、配列および構造の特異性の両方が、受容体チロシンキナーゼに対するリン酸化の順序を決定するということを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，（１９８８年）３巻（１１号）：４４３〜４４７頁
【非特許文献２】Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ，（２０００年）１０３巻（２号）：２１１〜２２５頁
【非特許文献３】ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＬｅｍｍｏｎ，Ｓｃｉ．  ＳＴＫＥ，（２００３年）１９１巻：ＲＥ１２
【非特許文献４】ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｎ，（１９９２年）９巻（３号）：３８３〜３９１頁
【非特許文献５】ＬｅｍｍｏｎおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，（１９９４年）１９巻（１１号）：４５９〜４６３頁
【非特許文献６】ＬｅｍｍｏｎおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，（１９９８年）８４巻：４９〜７１頁
【非特許文献７】Ｆｕｒｄｕｉら，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．，（２００６年）２１巻（５号）：７１１〜７１７頁
【非特許文献８】Ｌｅｗら，Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ，（２００９年）２巻（５８号）：ｒａ６
【非特許文献９】Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，（２００８年）１０５巻（５０号）：１９６６０〜１９６６５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
チロシンリン酸化は、細胞シグナル伝達において主要な役割を果たすが、受容体チロシンキナーゼのトランス自己リン酸化についての構造的根拠が何であるかは、まだ明らかではない。言いかえれば、二量体化した受容体内の一方のキナーゼ（酵素）が、どのように他方のキナーゼ（基質）のチロシン（複数可）のリン酸化を特異的かつ順次触媒するのかということの根底にある分子メカニズムは、まだ解明されていない。したがって、ＲＴＫの構造、リン酸化、およびシグナル伝達をより特徴付けることへの必要性がある。そのような特徴付けは、薬物、医薬品、または他の生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の標的となり得る領域の、情報に基づく同定を導くであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のチロシン自己リン酸化は、キナーゼ活性の調節ならびに細胞内シグナル伝達経路のリクルートおよび活性化において重要な役割を果たす。自己リン酸化は、連続的、かつ正確に順序付けられた分子間（トランス）反応によって媒介される。本発明は、活性化ＲＴＫキナーゼドメイン間の非対称性の二量体の形成が、刺激された細胞におけるＲＴＫのトランス自己リン酸化のために必要とされることを示す。ＦＧＦＲ１受容体チロシンキナーゼでは、たとえば、トランス自己リン酸化は、活性酵素として働く、一方のキナーゼ分子のＮローブ（ｌｏｂｅ）と、基質として働く、第２のキナーゼ分子のＣローブ上の特異的なドッキング部位との間の、特異的な非対称性の接触によって媒介される。受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域（ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）における、病理学的な機能喪失型の変異または腫瘍発生性変異は、非対称性の二量体形成およびトランス自己リン酸化を、それぞれ、妨げるかまたは促進するかもしれない。これらのデータは、線維芽細胞増殖因子受容体を含む受容体チロシンキナーゼのトランス自己リン酸化の制御の根底にある分子的根拠を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、ＲＴＫ自己リン酸化、酵素活性化、および細胞シグナル伝達に必要とされるステップである非対称性のチロシンキナーゼ二量体形成の阻害による、病理学的に活性化されたＲＴＫ（ＦＧＦ受容体など）の薬理学的阻害のための新規なアプローチを提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分を提供し、部分は、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する。一実施形態では、部分は、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化およびＲＴＫの活性化を阻害する。他の実施形態では、部分は、ＲＴＫの触媒ドメインのヌクレオチド結合部位に結合しない。さらに他の実施形態では、部分は、ＲＴＫの一方の単量体のＮローブ上の非対称性の接触境界領域、またはＲＴＫの一方の単量体のＣローブ上の非対称性の接触境界領域に結合する。一実施形態では、部分は、内因性キナーゼ活性の喪失を引き起こさない。言いかえれば、部分は、ヌクレオチド結合または基質結合をブロックしないが、キナーゼ活性を直接阻害する。他の実施形態では、部分は、ＲＴＫキナーゼドメインにおいてコンフォメーション変化を引き起こさない。他の実施形態では、部分は、ＲＴＫ単量体間の立体的な制約を増加させる。
【０００９】
一実施形態では、部分は、ＲＴＫの二量体化を妨げない。他の実施形態では、部分は、ＲＴＫの二量体化を妨げる。特定の実施形態では、部分は、ＲＴＫの細胞質ドメインの二量体化を妨げる。
【００１０】
一実施形態では、ＲＴＫは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、または線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）である。
【００１１】
一実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ５７７に結合する。他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５７９に結合する。さらに他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５８０に結合する。他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４において等価な残基に結合する。
【００１２】
他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｓｐ５１９に結合する。他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４において等価なアミノ酸残基に結合する。
【００１３】
さらなる実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ１のＣ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する。一実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する。一実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４において等価なアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。さらに他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択される少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択される少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。さらに他の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４において少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上の等価なアミノ酸残基に結合する。
【００１４】
他の実施形態では、部分は、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される、ＲＴＫの領域に結合する。
【００１５】
一実施形態では、部分は、ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープに結合する。コンフォメーションエピトープは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成されてもよい。他の実施形態では、コンフォメーションエピトープは、Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。さらに他の実施形態では、コンフォメーションエピトープは、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。さらなる実施形態では、コンフォメーションエピトープは、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、コンフォメーションエピトープは、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４において等価なアミノ酸残基であるアミノ酸残基を含む。
【００１６】
他の実施形態では、部分は、ＲＴＫ上の近接エピトープに結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される。
【００１７】
一実施形態では、部分は、小分子である。さらに他の実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。さらに他の実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、小分子は、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される領域に結合する。一実施形態では、小分子は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の非対称性の接触境界領域に基づいて設計される。
【００１８】
他の実施形態では、部分は、ペプチド性分子、たとえば、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の非対称性の接触境界領域に基づいて設計されるペプチド性分子である。さらに他の実施形態では、ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。さらなる実施形態では、ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。一実施形態では、ペプチド性分子は、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される領域に結合する。他の実施形態では、ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基５７６〜５９４と少なくとも８０％同一の構造を含む。他の実施形態では、ペプチド性分子は、ＦＧＦＲ２のアミノ酸残基５７９〜５９７と少なくとも８０％同一の構造を含む。
【００１９】
一実施形態では、部分は、イントラボディなどのような単離抗体またはその抗原結合性一部分である。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびキメラ抗体からなる群より選択される。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、ＩｇＧ４定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、およびＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む。さらに他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ１である。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、単鎖Ｆｖ断片、ＳＭＩＰ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、および単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下からなる群より選択されるＫＤで、受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する。
【００２０】
他の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分を産生するハイブリドーマを提供する。
【００２１】
他の態様では、本発明は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の非対称性の接触境界領域上のコンフォメーションエピトープに結合する部分を提供し、部分は、ＦＧＦＲのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する。
【００２２】
さらに他の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基または当該残基から１〜５Å以内に結合し、それによって、ＦＧＦＲ１のリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を提供する。他の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基または当該残基から１〜５Å以内に結合し、それによって、ＦＧＦＲ２のリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を提供する。他の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基または当該残基から１〜５Å以内に結合し、それによって、ＦＧＦＲ２のリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を提供する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分を提供し、部分は、酵素として働くＲＴＫ単量体のＮローブと、基質として働くＲＴＫ単量体のＣローブとの間の境界領域を破壊する。
【００２４】
さらに他の態様では、本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する部分を提供し、部分は、ＲＴＫの逆の脱リン酸化を阻害する。
【００２５】
他の態様では、本発明は、本発明の部分および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
さらに他の態様では、本発明は、被験体におけるＲＴＫに関連する疾患を処置または予防するための方法を提供する。方法は、本発明の有効量の部分を被験体に投与し、それによって、被験体における疾患を処置または予防するステップを含む。一実施形態では、ＲＴＫに関連する疾患は、がんおよび重度の骨障害からなる群より選択される。一実施形態では、重度の骨障害は、軟骨無形成症、クルゾン症候群、およびシーザー−ショッツェン症候群からなる群より選択される。他の実施形態では、ＲＴＫに関連する疾患は、ラッド症候群である。さらに他の実施形態では、がんは、膠芽腫、多発性骨髄腫、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、および乳がんからなる群より選択される。
【００２７】
他の態様では、本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合し、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を同定するための方法を提供する。方法は、ＲＴＫを候補部分と接触させるステップ；同時にまたは順次、ＲＴＫをＲＴＫに対するリガンドと接触させるステップ；酵素として機能するＲＴＫ単量体のＮローブと、基質として機能するＲＴＫ単量体のＣローブとの間の配置、配向、および／または距離に、部分が影響するか否かを決定し、それによって、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合し、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する部分を同定するステップを含む。一実施形態では、部分は、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する。他の実施形態では、部分は、内因性のＲＴＫキナーゼ活性の喪失を引き起こさない。
【００２８】
他の態様では、本発明は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の非対称性の接触境界領域に結合する小分子を提供し、小分子は、ＲＴＫのトランス自己リン酸化を阻害する。一実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択されるアミノ酸残基または前記残基から１〜５Å以内に結合する。他の実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｒ５７７、Ｐ５８２、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、およびＰ７０８からなる群より選択されるアミノ酸残基または前記残基から１〜５Å以内に結合する。他の実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基または前記残基から１〜５Å以内に結合する。他の実施形態では、小分子は、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される領域に結合する。
【００２９】
本発明の他の特長および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴った本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払いにより当該官庁から提供される。
【図１Ａ】図１は、非対称性の活性化ＦＧＦＲ１キナーゼ二量体の全体的な構造および受容体間の接触の詳細な図を示す図である。図１Ａは、活性リン酸化ＦＧＦＲ１の非対称性の二量体がリボン図で示されることを示す。非対称性の二量体の分子ＥおよびＳは、それぞれ、シアンおよび緑色とする。図１Ｂは、非対称性の二量体においてキナーゼの間で形成される境界領域の詳細な図を示す。ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＣＰ）および相互作用する残基は、棒で表現して示し、マグネシウムイオンは、青色の球体として示す。分子Ｓ由来の残基は、ダッシュを用いて標識する。この図において用いた配色は、すべての図に使用する。二次構造は、青色で標識する。図１Ｃは、分子Ｅの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｓの相互作用する残基と共にシアンで示されることを示す。分子Ｓ由来の代表的な残基を標識する。図１Ｄは、分子Ｓの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｅの相互作用する残基（薄いシアン）と共に緑色で示されることを示す（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）。
【図１Ｂ】図１は、非対称性の活性化ＦＧＦＲ１キナーゼ二量体の全体的な構造および受容体間の接触の詳細な図を示す図である。図１Ａは、活性リン酸化ＦＧＦＲ１の非対称性の二量体がリボン図で示されることを示す。非対称性の二量体の分子ＥおよびＳは、それぞれ、シアンおよび緑色とする。図１Ｂは、非対称性の二量体においてキナーゼの間で形成される境界領域の詳細な図を示す。ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＣＰ）および相互作用する残基は、棒で表現して示し、マグネシウムイオンは、青色の球体として示す。分子Ｓ由来の残基は、ダッシュを用いて標識する。この図において用いた配色は、すべての図に使用する。二次構造は、青色で標識する。図１Ｃは、分子Ｅの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｓの相互作用する残基と共にシアンで示されることを示す。分子Ｓ由来の代表的な残基を標識する。図１Ｄは、分子Ｓの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｅの相互作用する残基（薄いシアン）と共に緑色で示されることを示す（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）。
【図１Ｃ】図１は、非対称性の活性化ＦＧＦＲ１キナーゼ二量体の全体的な構造および受容体間の接触の詳細な図を示す図である。図１Ａは、活性リン酸化ＦＧＦＲ１の非対称性の二量体がリボン図で示されることを示す。非対称性の二量体の分子ＥおよびＳは、それぞれ、シアンおよび緑色とする。図１Ｂは、非対称性の二量体においてキナーゼの間で形成される境界領域の詳細な図を示す。ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＣＰ）および相互作用する残基は、棒で表現して示し、マグネシウムイオンは、青色の球体として示す。分子Ｓ由来の残基は、ダッシュを用いて標識する。この図において用いた配色は、すべての図に使用する。二次構造は、青色で標識する。図１Ｃは、分子Ｅの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｓの相互作用する残基と共にシアンで示されることを示す。分子Ｓ由来の代表的な残基を標識する。図１Ｄは、分子Ｓの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｅの相互作用する残基（薄いシアン）と共に緑色で示されることを示す（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）。
【図１Ｄ】図１は、非対称性の活性化ＦＧＦＲ１キナーゼ二量体の全体的な構造および受容体間の接触の詳細な図を示す図である。図１Ａは、活性リン酸化ＦＧＦＲ１の非対称性の二量体がリボン図で示されることを示す。非対称性の二量体の分子ＥおよびＳは、それぞれ、シアンおよび緑色とする。図１Ｂは、非対称性の二量体においてキナーゼの間で形成される境界領域の詳細な図を示す。ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＣＰ）および相互作用する残基は、棒で表現して示し、マグネシウムイオンは、青色の球体として示す。分子Ｓ由来の残基は、ダッシュを用いて標識する。この図において用いた配色は、すべての図に使用する。二次構造は、青色で標識する。図１Ｃは、分子Ｅの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｓの相互作用する残基と共にシアンで示されることを示す。分子Ｓ由来の代表的な残基を標識する。図１Ｄは、分子Ｓの表面の図が、棒およびリボンで表現した分子Ｅの相互作用する残基（薄いシアン）と共に緑色で示されることを示す（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）。
【図２Ａ】図２は、非対称性のＦＧＦＲ１キナーゼ二量体境界領域における残基の表面の分布を示す図である。図１Ａは、非対称性のキナーゼ二量体の全体的な構造がリボン形式で示されることを示す。図１Ｂは、分子Ｅ（酵素）の表面の表示をシアンで示す。近位の基質結合性領域を赤色で示し、遠位の基質結合性領域を黄色で示す。活性化ループ（Ａループ）およびヌクレオチド結合ループ（Ｎループ）を示す。図１Ｃは、示す分子Ｓのキナーゼ挿入領域におけるチロシン自己リン酸化部位（Ｙ５８３）と共に、分子Ｓ（基質）の表面の図を緑色で示す。分子Ｓの基質部位は赤色とし、遠位の基質部位は黄色とする。
【図２Ｂ】図２は、非対称性のＦＧＦＲ１キナーゼ二量体境界領域における残基の表面の分布を示す図である。図１Ａは、非対称性のキナーゼ二量体の全体的な構造がリボン形式で示されることを示す。図１Ｂは、分子Ｅ（酵素）の表面の表示をシアンで示す。近位の基質結合性領域を赤色で示し、遠位の基質結合性領域を黄色で示す。活性化ループ（Ａループ）およびヌクレオチド結合ループ（Ｎループ）を示す。図１Ｃは、示す分子Ｓのキナーゼ挿入領域におけるチロシン自己リン酸化部位（Ｙ５８３）と共に、分子Ｓ（基質）の表面の図を緑色で示す。分子Ｓの基質部位は赤色とし、遠位の基質部位は黄色とする。
【図２Ｃ】図２は、非対称性のＦＧＦＲ１キナーゼ二量体境界領域における残基の表面の分布を示す図である。図１Ａは、非対称性のキナーゼ二量体の全体的な構造がリボン形式で示されることを示す。図１Ｂは、分子Ｅ（酵素）の表面の表示をシアンで示す。近位の基質結合性領域を赤色で示し、遠位の基質結合性領域を黄色で示す。活性化ループ（Ａループ）およびヌクレオチド結合ループ（Ｎループ）を示す。図１Ｃは、示す分子Ｓのキナーゼ挿入領域におけるチロシン自己リン酸化部位（Ｙ５８３）と共に、分子Ｓ（基質）の表面の図を緑色で示す。分子Ｓの基質部位は赤色とし、遠位の基質部位は黄色とする。
【図３】図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＧＦＲ１の自己リン酸化を示す図である。時間の関数としての、室温での、ｗｔ−ＦＧＦＲ１（図３Ａ）およびＦＧＦＲ１−ＲＥ（図３Ｂ）の単離キナーゼドメインのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるリン酸化反応のプロファイル。図３Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＦＧＦＲ１−ＲＥのキナーゼ活性が維持されることを示す。ｗｔ−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体を発現するＬ６細胞の溶解産物を、抗ＦＧＦＲ１抗体を用いて免疫沈降に供した。次いで、免疫沈降物は、室温で、３０分間、ＦＧＦＲ１基質（ＰＬＣγ断片、結果において記載される）の存在下または非存在下においてインキュベートし、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｐＴｙｒ抗体または抗ＦＧＦＲ１抗体を用いるイムノブロッティングを行った。図３Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＧＦＲ１−ＲＥの自己リン酸化が強く損なわれることを示す。ｗｔ−ＦＧＦＲ１またはそのＲＥ変異体を発現するＬ６細胞を、３７℃で、１０分間、ＦＧＦの漸増濃度（示すように）により刺激した。非刺激またはＦＧＦ刺激細胞の溶解産物を、抗ＦＧＦＲ１抗体を使用する免疫沈降に供し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｐＴｙｒ抗体または抗ＦＧＦＲ１抗体を用いるイムノブロッティングを行った。図３Ｅは、ｗｔ−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ１−ＲＥを発現するＬ６細胞を、異なる時間（示すように）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦにより刺激したことを示す。非刺激またはＦＧＦ刺激細胞の溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、抗ｐＴｙｒ抗体または抗ＦＧＦＲ１抗体を用いるイムノブロッティングを行った。
【図４Ａ】図４は、単純化した略画（上）およびリボン図（下）の（図４Ａ）ｗｔ−ＦＧＦＲ１（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＹ２）、（図４Ｂ）ＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＸＸ）、および（図４Ｃ）活性化ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１−３Ｐ）（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＧＱＩ）のキナーゼドメインの構造を示す図である。略画において、触媒ループは、黄色で、活性化ループは、緑色で示し、ヘリックスαＣは、円柱として示す。ホスホチロシンは、略画において赤色とし、リボン図において棒で表現する。図４Ｄは、緑色、シアン、および青色でそれぞれ示す、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１−ＲＥ、およびＦＧＦＲ１−３Ｐのキナーゼ挿入ループのリボン図を示す。Ｒ５７６、Ｒ５７７、およびＲ５７７Ｅの側鎖は、棒で表現して示す。図４Ｅは、ＦＧＦＲ１（緑色）、ＦＧＦＲ１−ＲＥ（シアン）、およびＦＧＦＲ１−３Ｐ（青色）のキナーゼ挿入領域の重ね合せを示し、３つの構造におけるキナーゼ挿入領域の複数のコンフォメーションを明らかにする。
【図４Ｂ】図４は、単純化した略画（上）およびリボン図（下）の（図４Ａ）ｗｔ−ＦＧＦＲ１（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＹ２）、（図４Ｂ）ＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＸＸ）、および（図４Ｃ）活性化ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１−３Ｐ）（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＧＱＩ）のキナーゼドメインの構造を示す図である。略画において、触媒ループは、黄色で、活性化ループは、緑色で示し、ヘリックスαＣは、円柱として示す。ホスホチロシンは、略画において赤色とし、リボン図において棒で表現する。図４Ｄは、緑色、シアン、および青色でそれぞれ示す、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１−ＲＥ、およびＦＧＦＲ１−３Ｐのキナーゼ挿入ループのリボン図を示す。Ｒ５７６、Ｒ５７７、およびＲ５７７Ｅの側鎖は、棒で表現して示す。図４Ｅは、ＦＧＦＲ１（緑色）、ＦＧＦＲ１−ＲＥ（シアン）、およびＦＧＦＲ１−３Ｐ（青色）のキナーゼ挿入領域の重ね合せを示し、３つの構造におけるキナーゼ挿入領域の複数のコンフォメーションを明らかにする。
【図４Ｃ】図４は、単純化した略画（上）およびリボン図（下）の（図４Ａ）ｗｔ−ＦＧＦＲ１（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＹ２）、（図４Ｂ）ＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＸＸ）、および（図４Ｃ）活性化ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１−３Ｐ）（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＧＱＩ）のキナーゼドメインの構造を示す図である。略画において、触媒ループは、黄色で、活性化ループは、緑色で示し、ヘリックスαＣは、円柱として示す。ホスホチロシンは、略画において赤色とし、リボン図において棒で表現する。図４Ｄは、緑色、シアン、および青色でそれぞれ示す、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１−ＲＥ、およびＦＧＦＲ１−３Ｐのキナーゼ挿入ループのリボン図を示す。Ｒ５７６、Ｒ５７７、およびＲ５７７Ｅの側鎖は、棒で表現して示す。図４Ｅは、ＦＧＦＲ１（緑色）、ＦＧＦＲ１−ＲＥ（シアン）、およびＦＧＦＲ１−３Ｐ（青色）のキナーゼ挿入領域の重ね合せを示し、３つの構造におけるキナーゼ挿入領域の複数のコンフォメーションを明らかにする。
【図４Ｄ】図４は、単純化した略画（上）およびリボン図（下）の（図４Ａ）ｗｔ−ＦＧＦＲ１（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＹ２）、（図４Ｂ）ＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＸＸ）、および（図４Ｃ）活性化ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１−３Ｐ）（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＧＱＩ）のキナーゼドメインの構造を示す図である。略画において、触媒ループは、黄色で、活性化ループは、緑色で示し、ヘリックスαＣは、円柱として示す。ホスホチロシンは、略画において赤色とし、リボン図において棒で表現する。図４Ｄは、緑色、シアン、および青色でそれぞれ示す、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１−ＲＥ、およびＦＧＦＲ１−３Ｐのキナーゼ挿入ループのリボン図を示す。Ｒ５７６、Ｒ５７７、およびＲ５７７Ｅの側鎖は、棒で表現して示す。図４Ｅは、ＦＧＦＲ１（緑色）、ＦＧＦＲ１−ＲＥ（シアン）、およびＦＧＦＲ１−３Ｐ（青色）のキナーゼ挿入領域の重ね合せを示し、３つの構造におけるキナーゼ挿入領域の複数のコンフォメーションを明らかにする。
【図４Ｅ】図４は、単純化した略画（上）およびリボンダイヤグラム図（下）の（図４Ａ）ｗｔ−ＦＧＦＲ１（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＹ２）、（図４Ｂ）ＦＧＦＲ１−ＲＥ突然変異変異体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＫＸＸ）、および（図４Ｃ）活性化ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１−３Ｐ）（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＧＱＩ）のキナーゼドメインの構造を示す図である。略画において、触媒ループは、黄色で、活性化ループは、緑色で示し、ヘリックスαＣは、円柱として示す。ホスホチロシンは、略画において赤色とし、リボンダイヤグラム図において棒で表現する。図４Ｄは、緑色、シアン、および青色でそれぞれ示す、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１−ＲＥ、およびＦＧＦＲ１−３Ｐのキナーゼ挿入ループのリボンダイヤグラム図を示す。Ｒ５７６、Ｒ５７７、およびＲ５７７Ｅの側鎖は、棒で表現して示す。図４Ｅは、ＦＧＦＲ１（緑色）、ＦＧＦＲ１−ＲＥ（シアン）、およびＦＧＦＲ１−３Ｐ（青色）のキナーゼ挿入領域の重ね合せを示し、３つの構造におけるキナーゼ挿入領域の複数の立体構造コンフォメーションを明らかにする。
【図５】図５は、連続的に、順序付けられたＦＧＦＲ１チロシン自己リン酸化部位の間の距離を示す。ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１構造においてまだ観察されていない残基Ｙ７６６を含む）のモデルをリボン図で示し、６つのホスホチロシン部位を棒で表現し、赤色とする。ＦＧＦＲ１の６つの自己リン酸化部位の自己リン酸化の順番に番号を付け、相互自己リン酸化部位の間のおよその距離を示す。２つのホスホチロシン部位の間の距離は、非リン酸化ＦＧＦＲ１構造とリン酸化ＦＧＦＲ１構造との間の距離の平均であり、表中に概説する。
【図６】図６は、活性なＦＧＦＲ１−３ＰのＲ５７７およびＦＧＦＲ１−ＲＥのＲ５７７Ｅの周辺の電子密度を示す図である。図６Ａは、キナーゼ挿入領域の周辺の活性ＦＧＦＲ１−３Ｐ（３ＧＱＩ）の電子密度を示す。２つのキナーゼドメインをシアンおよび緑色のリボンで表現して示す。分子ＥのＤ５１９ならびに分子ＳのＲ５７７’およびＹ５８３Ｅ’は、棒で表現して示す。ＡＭＰ−ＰＣＰは、棒で表現して示し、Ｍｇイオンは、青色の球体として示す。２ＦｏＦｃ電子密度地図は、灰色で示し、１．０σで示した。図６Ｂは、ＦＧＦＲ１−ＲＥの例示２ＦｏＦｃ電子密度地図を、リボン図の２つのキナーゼドメインと共に示し、Ｒ５７６およびＲ５７７Ｅの側鎖を棒で表現して示し、１．０σで示したことを示す。
【図７】図７は、ＦＧＦＲ１−ＲＥの４つの分子すべての重ね合せを示す図である。結晶格子中のＦＧＦＲ１−ＲＥの４つの分子を重ね、緑色から薄緑色のグラデーションで色づけする。
【図８】図８は、非対称性のＦＧＦＲ１キナーゼおよびＦＧＦＲ２キナーゼの二量体の全体的な構造が、リボン図（図８Ａおよび８Ｂ）でまたは略画（図８Ｃおよび８Ｄ）として示されることを示す図である。近位および遠位の基質境界領域に、それぞれ、黄色または赤色の球を付ける。非対称性のＦＧＦＲ１キナーゼ二量体またはＦＧＦＲ２キナーゼ二量体の例証となる図。両方の構造のリン酸化領域および活性化ループを示す。ヘリックスαＣは円柱として示す。両方の構造の近位の基質境界領域に黄色の円を付け、遠位の基質境界領域に赤色の円を付ける。
【図９】図９は、ヒトＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２キナーゼ由来の配列の構造ベースのアライメントならびにヘリックスαＧの近くの機能喪失型の変異の位置を示す図である。図９Ａは、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の配列の下に、４つのＦＧＦ受容体について、ブランク（最も低い）、１ドット、２ドット、または星（最も高い）により、残基保存の程度を示す。ＦＧＦＲ１の全体的な構造は、灰色のリボンで示し、配列の構造中の対応する領域は、矢印により示す。緑色の残基は、分子Ｅ（酵素）のものとし、色づけした残基は、分子Ｓ（基質）のものとする。図９Ｂは、青色のボックス中の、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２のヘリックスαＧの近くのループにおける機能喪失型の変異の位置を示す。分子Ｅ由来のアミノ酸は、緑色で示し、分子Ｓ由来のアミノ酸は、赤色とする。ヘリックスαＧは、配列の上に標識を用い、黒色のボックスを付ける。
【図１０】図１０は、ｗｔ−ＦＧＦＲ１およびＲ５７７Ｅ変異体、ＦＧＦＲ１−ＲＥについてのデータ収集および構造精密化の統計量を示す。
【図１１】図１１は、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域に関与する可能性のある領域およびアミノ酸残基を示す図である。
【図１２】図１２は、線維芽細胞増殖因子受容体配列（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４）の配列アライメントを示す図である。囲った配列は、非対称性の接触境界領域の媒介に関与する配列を示し、青色および赤色のアミノ酸は、それぞれ、酵素および基質分子中に位置する。一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の囲ったアミノ酸残基のいずれかに結合する部分を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、ヒト受容体チロシンキナーゼ、たとえばヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４などのようなＦＧＦＲ受容体の非対称性の接触境界領域に結合する部分、たとえば小分子、ペプチド性分子、アプタマー、抗体またはその抗原結合性一部分、およびアドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）を提供する。本発明の部分は、受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合し、ＲＴＫのトランス自己リン酸化を阻害する。いくつかの場合では、部分は、ＲＴＫキナーゼドメインにおける内因性キナーゼ活性の喪失を引き起こさない。言いかえれば、部分は、ＲＴＫの二量体化を可能にするが、２つの非対称性の二量体の配置に影響するか、または受容体におけるコンフォメーション変化を改変もしくは妨げ、それによって、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害し得る。本発明は、ヒトＦＧＦＲ１のトランス自己リン酸化に必要とされる非対称性の接触境界領域の結晶構造の解読に、少なくとも一部に基づく。この境界領域の解読は、本発明の部分が標的にするかもしれない残基および部位およびエピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープおよび近接エピトープの同定を可能にした。
【００３２】
そのリガンドによる活性化の後に、受容体チロシンキナーゼの２つの単量体は、相互作用して、非対称性の接触境界領域によって特徴付けられる、非対称性の二量体を形成し、続いて、トランス自己リン酸化を受ける。本明細書において使用されるように、用語「非対称性の接触境界領域」は、第２の受容体チロシンキナーゼ単量体と非対称的に相互作用し、受容体チロシンキナーゼのチロシン残基のトランス自己リン酸化に必要とされる（これは、チロシンキナーゼ活性化および細胞シグナル伝達に必要とされるステップである）、一方の受容体チロシンキナーゼ単量体の領域を含むように意図される。非対称性の二量体境界領域の２つの領域は、相補的であり、非対称性の接触境界領域の形成は、受容体チロシンキナーゼの活性化に必要とされる。ＲＴＫ上のトランス自己リン酸化を受けるチロシンはそれぞれ、別個の非対称性の接触境界領域と関連する。
【００３３】
一実施形態では、受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域は、活性酵素として働くＦＧＦＲ１などのような一方の受容体チロシンキナーゼ分子のＮローブを含む。他の実施形態では、受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域は、基質として働くＦＧＦＲ１などのような受容体チロシンキナーゼ分子のＣローブを含む。一実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、図２において示されるようなＦＧＦＲ１の黄色の領域を含む。他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、図２において示されるようなＦＧＦＲ１の赤色の領域を含まない。他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ５７７を含む。他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｓｐ５１９を含む。さらに他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、酵素として働くＲＴＫのβ１−β２ループ、β３−αＣループ、またはβ４−Ｂ５ループを含む。他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、基質として働くＲＴＫのαＤ−αＥループ（キナーゼ挿入）、αＦヘリックス、またはαＦ−αＧループを含む。他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、酵素として働くＲＴＫの残基Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｄ５１９、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、またはＰ５５６を含む。他の実施形態では、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域は、基質として働くＲＴＫの残基Ｑ５７４、Ｒ５７７、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、またはＰ７０５を含む。特定の実施形態では、本明細書において記載される２つの単量体の非対称性の接触境界領域の相互作用は、ＦＧＦＲ１のＹ５８３のトランス自己リン酸化に必要とされる。他の実施形態では、本明細書において記載される２つの単量体の非対称性の接触境界領域の相互作用は、ＦＧＦＲ１のＹ６５３、Ｙ４６３、Ｙ７６６、Ｙ５８５、またはＹ６５４のトランス自己リン酸化に必要とされる。図９および１２において示される構造ベースの配列アライメントは、非対称性の接触形成に関与する残基が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４において保存されていることを示す。
【００３４】
一実施形態では、非対称性の接触境界領域は、非対称性のＦＧＦＲ１二量体において酵素として働くＦＧＦＲ１のＮローブにおける活性化セグメント、ヌクレオチド結合ループの先端、β３−αＣループ、β４−Ｂ５ループ、およびヘリックスαＣのＮ末端領域の間で形成される。この領域は、非対称性の二量体において基質として働く第２のＦＧＦＲ１分子のＣローブ中に位置するヘリックスαＦおよびαＧにおけるアミノ酸ならびにキナーゼ挿入領域のＮ末端残基と相互作用する（図１、２、８、および１１を参照されたい）。本明細書において使用されるように、用語「Ｎローブ」は、酵素として働くＲＴＫ単量体のヌクレオチド結合部位および／または非対称性の接触境界領域を含有する、ＲＴＫの一部を指す。本明細書において使用されるように、用語「Ｃローブ」は、基質として働くＲＴＫ単量体の触媒ドメインおよび／または非対称性の接触境界領域を含有する、ＲＴＫの一部を指す。
【００３５】
本明細書において使用されるように、用語「リン酸化」は、キナーゼによるタンパク質へのリン酸基の追加を指す。本明細書において使用されるように、用語「自己リン酸化」または「シスリン酸化」は、キナーゼタンパク質それ自体による、キナーゼのリン酸化を指す。本明細書において使用されるように、用語「トランス自己リン酸化」は、基質として作用するキナーゼタンパク質の一方の単量体の、二量体化した受容体において酵素として作用するキナーゼタンパク質の他方の単量体によるリン酸化を指す。リガンド誘導性トランス自己リン酸化は、ＲＴＫによる活性化および細胞シグナル伝達の制御において重要な役割を果たす。本明細書において使用されるように、用語「リガンド誘導性トランス自己リン酸化」は、そのリガンドへのＲＴＫの結合に際しての、受容体チロシンキナーゼのトランス自己リン酸化の活性化を指す。
【００３６】
本明細書において使用されるように、用語「部分」は、任意の部分が、受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合することを含むように意図され、部分は、ＲＴＫのトランス自己リン酸化を阻害する。部分は、小分子；ペプチド性分子（たとえば、受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域の構造に基づいて設計されるペプチド性分子）；単離抗体またはその抗原結合性一部分；アプタマーまたはアドネクチンとすることができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、部分は、ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域における特異的配列に結合するであろう。特定の実施形態では、部分は、ＦＧＦＲ受容体の非対称性の接触境界領域における特異的配列、たとえば、ＦＧＦＲ１の残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、またはＰ７０５に結合するであろう。ＲＴＫの一方の単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの一方の単量体のαＦ−αＧループ内のこれらの残基は、ヒトＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域ドメインを含み、受容体のトランス自己リン酸化にとって重要であることが本明細書において示される。当業者は、いくつかの実施形態では、本発明の部分が、他のＲＴＫにおける対応する残基、たとえば、非対称性の接触境界領域の類似するポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アライメントもしくは配列アライメントによって同じ位置にある残基を容易に標的にし得ることを十分に理解するであろう。当業者は、非対称性の接触境界領域における前述の残基（または一定の距離内、たとえば、それらの残基から１、２、３、４、もしくは５Å以内）に特異的に結合する部分が、たとえば、ＲＴＫのトランス自己リン酸化を妨げることによって、受容体の活性に拮抗することができることを十分に理解するであろう。
【００３８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の部分は、近接するアミノ酸残基または近接しないアミノ酸残基に結合し、ＲＴＫのトランス自己リン酸化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの非対称性の接触境界領域の配置に必要とされる挙動を妨げる分子的ウェッジ（ｗｅｄｇｅ）として機能してもよい。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープに結合する。本明細書において使用されるように、用語「エピトープ」は、本発明の小分子、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはペプチド性分子が結合してもよい、ＲＴＫの残基、モチーフ、部位、またはドメインを含むように意図される。コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＲＴＫ、たとえばヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の非対称性の接触境界領域由来の２つ以上の残基から構成されてもよい。特定の実施形態では、本発明の部分は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープに結合する。他の実施形態では、本発明の部分は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される３つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープに結合する。他の実施形態では、本発明の部分は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される４つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープに結合する。他の実施形態では、本発明の部分は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される５つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープに結合する。上記に示されるように、本発明の部分は、非対称性の接触境界領域のポケットもしくは空洞を形成するアミノ酸残基すべてに結合してもよいし、またはそれらは、非対称性の接触境界領域を形成する残基のサブセットに結合してもよい。ある実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープに結合する本発明の部分が言及される場合、部分が、エピトープを構成する特異的な残基にのみ結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列における他の残基に結合しないことが意図されることが理解されたい。
【００４０】
他の実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫ上の近接エピトープに結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＦＧＦＲの非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される。他の実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択されるエピトープである。
【００４１】
本発明の部分は、チロシンキナーゼ活性化にとって不可欠な距離および配向でＲＴＫ単量体の配置をするのに不可欠であるＲＴＫの非対称性の接触境界領域の間の重要なホモタイプの相互作用（塩橋など）を妨げることによって、受容体活性化に対してそれらの阻害効果を及ぼしてもよい。したがって、本発明の部分は、トランス自己リン酸化を妨げるが、ＲＴＫの二量体化を可能にしてもよい。本発明の部分が、ＲＴＫのグリコシル化形態上に現れてもよい糖残基に結合してもよいこともまた、当業者によって十分に理解されるであろう。本発明の部分が、アミノ酸残基および糖残基の両方から構成されるエピトープに結合するであろうということがさらに可能である。
【００４２】
用語「受容体チロシンキナーゼ」および「ＲＴＫ」は、チロシン残基をリン酸化する膜受容体の周知のファミリーを指すために区別なく本明細書において使用される。多数が、発生または細胞分裂において重要な役割を果たす。受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内触媒ドメインを有する。細胞外ドメインは、サイトカイン、増殖因子、または他のリガンドに結合し、システインリッチ領域、フィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、カドヘリン様ドメイン、クリングル様ドメイン、第ＶＩＩＩ因子様ドメイン、グリシンリッチ領域、ロイシンリッチ領域、酸性領域、およびジスコイジン様ドメインを含む、１つまたは複数の同定可能な構造モチーフから一般に構成される。細胞内キナーゼドメインの活性化は、細胞外ドメインへのリガンド結合によって達成され、これは、受容体の二量体化を誘導する。このように活性化された受容体は、触媒ドメインの外側のチロシン残基を自己リン酸化し、活性な受容体のコンフォメーションの安定化を促進することができる。リン酸化された残基はまた、次いで細胞内でシグナルを伝達するであろうタンパク質に対する結合部位としても働く。ＲＴＫの例は、Ｋｉｔ受容体（幹細胞因子受容体またはＳＣＦ受容体としても公知）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体、インスリン受容体、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体、神経増殖因子（ＮＧＦ）受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、ＰＤＧＦ受容体−α、ＰＤＧＦ受容体−β、ＣＳＦ−１受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体またはＦｍｓとしても公知）、およびＦｌｔ３受容体（Ｆｌｋ２としても公知）を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、ＲＴＫは、ＩＶ型ＲＴＫである。本発明の他の実施形態では、ＲＴＫは、Ｖ型ＲＴＫ、つまりＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー、またはＩＩＩ型ＲＴＫ、つまりＰＤＧＦ受容体ファミリーのメンバーである。
【００４４】
本明細書において使用されるように、用語「受容体チロシンキナーゼのＩＶ型ファミリー」または「ＩＶ型ＲＴＫ」は、典型的に、３つの免疫グロブリン様ドメイン（またはＩｇ様ドメイン）、１回膜貫通ヘリックスドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを含む受容体チロシンキナーゼを含むように意図される。ＲＴＫのＩＶ型ファミリーは、線維芽細胞増殖因子に結合する。ＩＶ型ＲＴＫの例は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書において使用されるように、用語「受容体チロシンキナーゼのＩＩＩ型ファミリー」または「ＩＩＩ型ＲＴＫ」は、それらの外部ドメインにおいて５つの免疫グロブリン様ドメインまたはＩｇ様ドメインを典型的に含有する受容体チロシンキナーゼを含むように意図される。ＩＩＩ型ＲＴＫの例は、ＰＤＧＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｆｌｔ３受容体（Ｆｌｋ２としても公知）、およびＫｉｔ受容体を含むが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、ＩＩＩ型ＲＴＫは、Ｋｉｔ（ＳＣＦ受容体としても当技術分野において公知である）である。Ｋｉｔは、他のＩＩＩ型ＲＴＫと同様に、１回膜貫通（ＴＭ）ドメインによって細胞質領域につながれるグリコシル化細胞外リガンド結合ドメイン（外部ドメイン）から構成される（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（２０００年）Ｃｅｌｌ  １０３巻：２１１〜２２５頁において概説される）。ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばＫｉｔまたはＰＤＧＦＲの他の特徴は、大きなキナーゼ挿入領域を有する細胞質タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインである。Ｋｉｔ受容体の少なくとも２つのスプライスアイソフォームが存在することが公知であり、短い方は、インフレームスプライス部位を利用する。Ｋｉｔのすべてのアイソフォームおよび他の上記に記載されるＲＴＫは、本発明によって包含される。
【００４６】
本明細書において使用されるように、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の「Ｉｇ様ドメイン」は、ＲＴＫの外部ドメイン中に存在することが当技術分野において周知であるドメインを含むように意図される。ＩＶ型受容体チロシンキナーゼのファミリーの外部ドメインでは、３つのそのようなドメインがある。ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ（ＩＩＩ型ＲＴＫ）のファミリー（たとえばＫｉｔ）の外部ドメインでは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５として公知である、５つのそのようなドメインがある。ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ１、Ｄ２、およびＤ３ドメインは、ＲＴＫのリガンドへの結合に関与する（ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（１９９０年）Ｃｅｌｌ  ６１巻：２０３〜２１２頁において概説される）。したがって、本発明の一実施形態では、用語「Ｉｇ様ドメイン」は、リガンド結合に関与するＲＴＫのドメインを含むようには意図されない。本発明の一実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４および／またはＤ５ドメインである。ＶＥＧＦ受容体ファミリーの外部ドメインでは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、およびＤ７として公知の、７つのＩｇ様ドメインがある。本発明の一実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのＤ７ドメインである。
【００４７】
本明細書において使用されるように、用語「触媒ドメイン」は、基質の触媒作用が起こる、酵素分子の領域を含むように意図される。たとえば、ＲＴＫの触媒ドメインは、基質として作用するＲＴＫ単量体の結合およびトランス自己リン酸化に関与する、酵素として作用するＲＴＫ単量体の残基を含む。本発明の特定の実施形態では、触媒ドメインは、図２において示されるＦＧＦＲ１の赤色の領域を含む。一実施形態では、触媒ドメインは、図４において示されるＦＧＦＲ１の黄色の領域を含む。
【００４８】
本明細書において使用されるように、語句「基質として作用する」または「基質分子」は、二量体化したＲＴＫの一部であり、他方の受容体チロシンキナーゼ単量体（二量体化したＲＴＫの一部であり、酵素として作用する）によってリン酸化される受容体チロシンキナーゼ単量体を含むように意図される。本明細書において使用されるように、語句「酵素として作用する」または「酵素分子」は、二量体化した受容体チロシンキナーゼの一部であり、基質として作用する他方のＲＴＫ単量体を酵素的にリン酸化するように作用するＲＴＫ単量体を含むように意図される。
【００４９】
同様に、本明細書において使用される用語「単量体」は、同じかまたは異なる型の第２のＲＴＫポリペプチドと結合していない単一ポリペプチド鎖であるＲＴＫ分子を指す。本明細書において使用される用語「二量体」は、２つのＲＴＫ単量体を含む分子を指す。本明細書において使用される用語「二量体化」は、２つのＲＴＫ単量体を含む二量体分子の形成を指す。
【００５０】
本明細書において使用される用語「単量体状態」は、ＲＴＫの状態を指し、ＲＴＫ分子は、同じかまたは異なる型の第２のＲＴＫポリペプチドと結合していない単一ポリペプチド鎖から構成される。ＲＴＫ二量体化は、トランス自己リン酸化および受容体活性化を導く。したがって、単量体状態におけるＲＴＫは、不活性な状態である。単量体状態はまた、単一ＲＴＫの非対称性の接触境界領域が、第２のＲＴＫの非対称性の接触境界領域とそれぞれ結合していない状態でもある。
【００５１】
用語、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の「外部ドメイン」は、当技術分野で周知であり、ＲＴＫの細胞外部分（ｐａｒｔ）、すなわち、形質膜の外側にあるＲＴＫの部分（ｐａｒｔ）をいう。
【００５２】
本明細書において使用されるように、ＩＶ型ＲＴＫとしても公知である、用語「線維芽細胞増殖因子受容体」、「ＦＧＦＲ」、「ＦＧＦ受容体」、または「ＦＧＦＲファミリー」は、線維芽細胞増殖因子に結合するＲＴＫ受容体を含む。上記に記載されるように、これらのＲＴＫは、それらの外部ドメインにおいて３つのＩｇ様ドメインを有する。ＦＧＦＲファミリー受容体の例は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４である。
【００５３】
本明細書において使用されるように、Ｖ型ＲＴＫとしても公知である、用語「血管内皮増殖因子受容体」、「ＶＥＧＦ受容体」、または「ＶＥＧＦ受容体ファミリー」は、血管内皮増殖因子に対するＲＴＫ受容体を含む。上記に記載されるように、これらのＲＴＫは、それらの外部ドメインにおいて７つのＩｇ様ドメインを有する。ＶＥＧＦファミリー受容体の例は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１としても公知である）、ＶＥＧＦＲ２（またＫＤＲまたはＦｌｋ−１としても公知である）、およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ−４としても公知である）である。
【００５４】
用語、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインの「膜近位領域」とは、形質膜に対して近接しており、好ましくは、リガンドとＲＴＫとの結合に直接関与していない、ＲＴＫの細胞外部分（ｐａｒｔ）をいう。膜近位領域の例には、それだけには限定されないが、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４ドメイン、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ５ドメイン、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ３−Ｄ４ヒンジ領域、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４−Ｄ５ヒンジ領域、およびＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７ドメインが含まれる。
【００５５】
本明細書中で使用する用語「ホモタイプ相互作用」とは、２つの単量体受容体からの２つの同一の領域間の相互作用をいう。
【００５６】
本明細書中で使用する用語「ヘテロタイプ相互作用」とは、２つの単量体受容体からの２つの異なる領域間の相互作用をいう。ヘテロタイプ相互作用は、２つの異なる種類の単量体受容体の二量体化の結果、または同じ単量体受容体の野生型および変異体形態の二量体化の結果であり得る。たとえば、がん患者は、特定の受容体の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子を保有し得ることが当技術分野で周知である。
【００５７】
本明細書中で使用する「プロトマー」とは、ＲＴＫなどのオリゴマータンパク質の構造単位である。プロトマーは、定義された化学量論でアセンブルしてオリゴマーを形成し得るタンパク質サブユニットである。ＶＥＧＦＲ受容体チロシンキナーゼファミリーは、共有結合されたホモ二量体であり、それぞれのＶＥＧＦＲプロトマーは、４本のストランドのβ−シートから構成され、これは、逆平行の様式において構造に構成されており、「システインノット増殖因子」と命名されている。
【００５８】
語句「リガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害する」とは、受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する本発明の部分の能力をいう。言い換えれば、この語句には、不活性または非リン酸化受容体立体配置の形成に向かって平衡をシフトさせる、本発明の部分の能力が含まれる。たとえば、本発明の部分は、部分の非存在下での受容体の活性と比較して、受容体チロシンキナーゼのトランス自己リン酸化を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％阻害し得る。いくつかの実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫのチロシン残基のすべてのトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、部分は、ＦＧＦＲ１のＹ６５３、Ｙ５８３、Ｙ４６３、Ｙ７６６、Ｙ５８５、およびＹ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫの触媒コアの活性化ループ中に位置するチロシン残基のすべてのトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、部分は、ＦＧＦＲ１の触媒コアの活性化ループにおける残基Ｙ６５３のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、本発明の部分は、キナーゼ挿入領域中に位置するチロシン残基のすべてのトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、部分は、ＦＧＦＲ１のキナーゼ挿入領域における残基Ｙ５８３およびＹ５８５のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。あるいは、部分は、ＦＧＦＲ１のキナーゼ挿入領域における残基Ｙ５８３のトランス自己リン酸化を阻害してもよいし、または部分は、ＦＧＦＲ１のキナーゼ挿入領域における残基Ｙ５８５のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫの膜近傍領域中に位置するチロシン残基のすべてのトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、部分は、ＦＧＦＲ１の膜近傍領域における残基Ｙ４６３のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫのＣ末端尾部中に位置するチロシン残基のすべてのトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、部分は、ＦＧＦＲ１のＣ末端尾部における残基Ｙ７６６のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫの活性化ループ中に位置するチロシン残基のすべてのトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、部分は、ＦＧＦＲ１の活性化ループにおける残基Ｙ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。
【００５９】
すべてのチロシン自己リン酸化部位のトランス自己リン酸化は、完全なＲＴＫ活性化に必要とされ、チロシン残基のトランス自己リン酸化は、特異的な順序で起こる。したがって、他の実施形態では、本発明の部分は、あるチロシン残基および続いてトランス自己リン酸化されるであろうあらゆるチロシン残基のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。たとえば、一実施形態では、部分は、残基Ｙ５８３、Ｙ４６３、Ｙ７６６、Ｙ５８５、およびＹ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、部分は、残基Ｙ４６３、Ｙ７６６、Ｙ５８５、およびＹ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、部分は、残基Ｙ７６６、Ｙ５８５、およびＹ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。他の実施形態では、部分は、残基Ｙ５８５およびＹ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。さらに他の実施形態では、部分は、残基Ｙ６５４のトランス自己リン酸化を阻害してもよい。
【００６０】
本明細書において使用される用語「不活性な状態」は、ＲＴＫ分子が下流のシグナル伝達を活性化することができないＲＴＫの状態を指す。不活性な状態は、受容体チロシンキナーゼが、二量体化できるが、２つの単量体の非対称性の接触境界領域ドメイン（たとえば、ＩＶ型受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域）の間の配置、配向、コンフォメーション、および／または距離が、受容体チロシンキナーゼの活性が阻害される（たとえば、受容体のチロシントランス自己リン酸化が阻害される、および／または受容体が下流のシグナル伝達経路を活性化する能力が阻害される）ように改変されている状態であってもよい。不活性な状態はまた、上記に記載されるように、単量体の状態を含む。実施例は、ＲＴＫリガンド誘導性トランス自己リン酸化に重要であるが、受容体二量体化に重要ではない特異的な保存されたアミノ酸残基があることを示す実験についてさらに議論する。用語「不活性状態」には、本発明の部分が、部分の非存在下での受容体のトランス自己リン酸化と比較して、受容体チロシンキナーゼのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低下または阻害し得る状態が含まれる。本明細書中に記述した機能的アッセイのうちの任意のものを使用して、受容体チロシンキナーゼのトランス自己リン酸化を阻害する本発明の部分の能力を決定し得る。一部の実施形態では、本発明の部分は、たとえば、被験体におけるほとんどまたはすべての標的ＲＴＫが不活性化されている場合に、幅広い効果を示し得る。他の実施形態では、本発明の部分は、たとえば、被験体における標的ＲＴＫの一部分が不活性化されている場合に、より狭い効果を示し得る。そのような実施形態では、前記部分の非存在下での受容体と比較して、受容体のうちの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が不活性状態に固定されている。
【００６１】
本明細書中で使用する用語「コンフォメーションエピトープ」または「非直鎖状エピトープ」または「不連続エピトープ」は、互換性があるように使用され、単一のタンパク質鎖中の連続していないアミノ酸である少なくとも２つのアミノ酸から構成されるエピトープをいう。たとえば、コンフォメーションエピトープは、介在アミノ酸のストレッチによって隔てられているが、本発明の部分によって単一のエピトープとして認識されるために十分に近い、２つ以上のアミノ酸から構成されていてもよい。さらなる例として、単一のタンパク質鎖上の介在アミノ酸によって隔てられているアミノ酸、または別々のタンパク質鎖上に存在するアミノ酸は、タンパク質の構造または複合体のコンフォメーション形状が原因で近接させられて、本発明の部分によって結合され得るコンフォメーションエピトープとなり得る。特定の不連続およびコンフォメーションエピトープが本明細書中に記載されている。
【００６２】
当業者には、一般に、本発明の部分によって結合される直鎖状エピトープは、ＲＴＫの二次、三次、または四次構造に依存していても、していなくてもよいことが理解されよう。たとえば、一部の実施形態では、本発明の部分は、天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているか否かにかかわらず、アミノ酸の群と結合し得る。他の実施形態では、本発明の部分は、エピトープを構成する個々のアミノ酸残基を認識しない場合があり、エピトープを認識および結合するために特定のコンフォメーション（ベンド、ツイスト、ターンまたは折り畳み）を必要とする場合がある。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「近接エピトープ」または「連続エピトープ」は、互換性があるように使用され、単一のタンパク質鎖中の連続したアミノ酸である少なくとも２つのアミノ酸から構成されるエピトープをいう。特定の近接エピトープは本明細書中に記載されている。一実施形態では、本発明の部分は、ＲＴＫ上の近接エピトープと結合する。別の実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域中の２つ以上の残基から構成される。
【００６４】
本明細書中で使用する語句「疎水性アミノ酸」とは、疎水性特性を含むアミノ酸、たとえば、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、セリン、プロリンおよび本明細書中に記載の他のものをいう。
【００６５】
本発明の様々な態様は、以下のサブセクション中にさらに詳述されている。
【００６６】
Ｉ．ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する小分子
本発明の一態様では、ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する部分は、小分子である。
【００６７】
本発明の小分子は、特定の機能的な特徴または特性によって特徴付けられる。たとえば、小分子は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の特異的な残基または領域に結合する。好ましい実施形態では、非対称性の接触境界領域への小分子インヒビターの結合は、ＲＴＫ単量体を、チロシンキナーゼドメインのトランス自己リン酸化および活性化を可能にする距離および配向（位置）にする移動（この後、下流のシグナル伝達経路のリクルートおよび活性化が続く）を妨げるであろう。小分子結合は、いくつかの実施形態では、受容体チロシンキナーゼが二量体化するのは可能にするが、２つの単量体の非対称性の接触境界領域ドメイン（たとえば、ＩＶ型受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域）の間の配置、配向、および／または距離に影響し、それによって、受容体チロシンキナーゼのリガンド誘導性トランス自己リン酸化および活性を阻害し得る。
【００６８】
用語「小分子化合物」、「小分子薬物」、「小分子」、または「小分子インヒビター」は、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４などのようなＦＧＦＲのリガンド誘導性トランス自己リン酸化または活性を阻害することができる、本発明の化合物を指すために区別なく本明細書において使用される。これらの化合物は、ＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＭＬＳＣＮ）データベースにおける化合物、関連するデータベースにおける化合物、またはその誘導体および／もしくは機能的類似体を含んでいてもよい。
【００６９】
本明細書において使用されるように、「類似体」または「機能的類似体」は、親化合物に構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる（たとえば、１つまたは複数の原子または官能基が追加されているか、除去されているか、または修飾されている）化学化合物または小分子インヒビターを指す。類似体は、もとの化合物と異なる化学的または物理的特性を有していても、有していなくてもよく、改善された生物学的および／または化学的活性を有していても、有していなくてもよい。たとえば、類似体は、より疎水性であってもよく、またはそれは、親化合物と比較して、改変された活性（増加した、減少した、もしくは親化合物と同一の）を有していてもよい。類似体は、もとの化合物の、天然に存在するかまたは天然に存在しない（たとえば組換え）バリアントであってもよい。他のタイプの類似体は、異性体（鏡像異性体、ジアステレオマー、およびその他同種のもの）および化合物の他のタイプのキラルバリアントならびに構造異性体を含む。類似体は、直鎖状化合物の分岐バリアントまたは環状バリアントであってもよい。たとえば、直鎖状化合物は、ある種の望ましい特性を与える（たとえば、親水性または生物学的利用能を改善する）ように、分岐されたかまたは他の場合には置換された類似体を有していてもよい。
【００７０】
本明細書において使用されるように、「誘導体」は、親化合物に構造的に類似しており、（実際にまたは理論上）その親化合物から誘導可能である、化学化合物または小分子インヒビターの化学的または生物学的修飾バージョンを指す。親化合物が、「誘導体」を生成するための出発物質であってもよく、それに対して、親化合物が、「類似体」または「機能的類似体」を生成するために出発物質として必ずしも使用されなくてもよいという点で、「誘導体」は、「類似体」または「機能的類似体」と異なる。誘導体は、親化合物と異なる化学的または物理的特性を有していても、有していなくてもよい。たとえば、誘導体は、より親水性であってもよく、またはそれは、親化合物と比較して、改変された反応性を有していてもよい。誘導体化（つまり化学的または他の手段による修飾）は、分子内での１つまたは複数の部分の置換（たとえば官能基における変化）を含んでいてもよい。たとえば、水素は、フッ素もしくは塩素などのようなハロゲンと置換されてもよく、またはヒドロキシル基（−−ＯＨ）は、カルボン酸部分（−−ＣＯＯＨ）と交換されてもよい。用語「誘導体」はまた、コンジュゲートおよび親化合物のプロドラッグ（つまり、生理学的条件下でもとの化合物に変換することができる化学的に修飾された誘導体）をも含む。たとえば、プロドラッグは、活性剤の不活性な形態であってもよい。生理学的条件下で、プロドラッグは、化合物の活性形態に変換されてもよい。プロドラッグは、たとえば、窒素原子上の１つまたは２つの水素原子を、アシル基（アシルプロドラッグ）またはカルバメート基（カルバメートプロドラッグ）と交換することによって形成されてもよい。プロドラッグに関するより詳細な情報は、たとえば、Ｆｌｅｉｓｈｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９巻（１９９６年）１１５頁；Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５年；およびＨ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  １６巻（１９９１年）４４３頁において見つけられる。用語「誘導体」はまた、すべての溶媒化合物、たとえば水和物または付加物（たとえばアルコールを用いた付加物）、活性代謝物、および親化合物の塩を記載するために使用される。調製されてもよい塩のタイプは、化合物内の部分の性質に依存する。たとえば、カルボン酸基などのような酸性基は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（たとえばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、および生理学的に許容できる４級アンモニウムイオンとの塩、およびアンモニアおよび生理学的に許容できる有機アミン（トリエチルアミン、エタノールアミン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンなど）との酸付加塩）を形成することができる。塩基性基は、たとえば、塩酸（「ＨＣｌ」）、硫酸、もしくはリン酸などのような無機酸と、または酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、もしくはｐ−トルエンスルホン酸などのような有機カルボン酸およびスルホン酸と、酸付加塩を形成することができる。塩基性窒素原子に加えてのカルボキシル基などのような、塩基性基および酸性基を同時に含有する化合物は、両性イオンとして存在することができる。塩は、たとえば、陽イオン交換または陰イオン交換によって、溶媒もしくは希釈剤中のまたは他の塩由来の無機または有機酸または塩基と化合物を組み合わせることによって、当業者らに公知の通常の方法によって得ることができる。
【００７１】
小分子は、１２００以下または１０００以下または９００以下または８００以下または７００以下または６００以下または５００以下または４００以下または３００以下または２００以下または１００以下または５０以下または２５以下または１０以下の分子量を有することが公知である。
【００７２】
本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫ、たとえばＩＶ型ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの非対称性の接触境界領域に結合するように選択または設計される。いくつかの実施形態では、小分子インヒビターは、ヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ２、ヒトＦＧＦＲ３、またはヒトＦＧＦＲ４の非対称性の接触境界領域に結合するように選択または設計され、それによって、トランス自己リン酸化して活性になる、たとえば、細胞内シグナル伝達経路を活性化する受容体の能力を阻害する。他の実施形態では、小分子インヒビターは、ＦＧＦ受容体の非対称性の接触境界領域に対して相同性を共有するドメインに結合するように選択される。たとえば、本発明の小分子は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえばＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域と少なくとも５０％同一の、少なくとも６０％同一の、少なくとも７０％同一の、少なくとも８０％同一の、少なくとも９０％同一の、または少なくとも９５％もしくは９９％同一のドメインに向けられてもよい。そのような小分子は、たとえば、ＦＧＦＲの非対称性の接触境界領域に機能的に類似しているタンパク質ドメインに結合することができるであろう。
【００７３】
本発明の小分子インヒビターはまた、ＲＴＫ、たとえばヒトＦＧＦＲまたはヒトＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に由来する特定のモチーフまたはコンセンサス配列に結合し、小分子インヒビターが、ＲＴＫファミリーのメンバー、たとえば、ＲＴＫのヒトＩＶ型ファミリーのメンバーの中で共有されるドメインに特異的に結合することを可能にしてもよい。
【００７４】
他の実施形態では、小分子インヒビターは、タンパク質の３次元構造を表すタンパク質モチーフまたはコンセンサス配列に結合する。そのようなモチーフまたはコンセンサス配列は、近接する一連のアミノ酸を表わさないが、ＲＴＫの三次元フォールディングに起因する非直鎖状アミノ酸の構成（つまり構造モチーフ）を表すであろう。そのようなモチーフの例は、ＦＧＦ受容体の非対称性の接触境界領域の直鎖状領域に基づいて設計されるモチーフであろう。そのようなモチーフおよびコンセンサス配列は、抗体に関するセクションにおいて議論される方法に従って設計されてもよい。
【００７５】
重要なことには、本発明の小分子インヒビターは、線維芽細胞増殖因子受容体の触媒ドメインのヌクレオチド結合部位に結合しない。
【００７６】
他の実施形態では、本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫ上の近接エピトープに結合する。本明細書において使用されるように、用語「エピトープ」は、小分子が結合してもよいＲＴＫの残基、モチーフ、部位、またはドメインを含むように意図される。一実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される。他の実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択されるエピトープである。
【００７７】
さらなる実施形態では、本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫの変異体の非対称性の接触境界領域に特異的に結合するように選択または設計される。好ましい実施形態では、変異体ＲＴＫは、腫瘍形成性変異体または腫瘍発生性変異体である。特定の一実施形態では、小分子インヒビターは、腫瘍発生性ＦＧＦＲ変異体に結合するように選択または設計される。本発明の小分子によって標的にされてもよいＲＴＫ変異体は、ＦＧＦＲ１の以下の１つまたは複数のアミノ酸：Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、またはＰ７０５において変異を有する線維芽細胞増殖因子受容体を含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、ＦＧＦＲにおける他の変異または他のＲＴＫにおける変異に適用可能であろうということが当業者によって十分に理解されるはずである。変異体ＲＴＫを標的にすることの１つの利点は、治療用小分子が、変異を含有する細胞上のＲＴＫにのみ結合し、健康な細胞にはほとんどまたは全く作用を与えない可能性があるということである。したがって、変異が腫瘍形成性変異である例では、腫瘍細胞のみを療法のために標的にし、副作用および投薬の必要量を低下させる可能性がある。
【００７８】
いくつかの実施形態では、小分子は、ヒトＦＧＦＲ、たとえば、ＦＧＦＲ１の残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、またはＰ７０５の特異的配列に結合する。好ましい実施形態では、本発明の小分子は、非対称性の接触境界領域の小さな空洞またはポケットを構成する、ＦＧＦ受容体における１つまたは複数の残基に結合してもよい。たとえば、本発明の小分子は、ＲＴＫの一方の単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの一方の単量体のαＦ−αＧループにおける１つまたは複数の以下の残基に結合してもよい。
【００７９】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の小分子は、近接するアミノ酸残基または近接しないアミノ酸残基に結合してもよく、チロシンキナーゼ活性化を可能にするＲＴＫのトランス自己リン酸化に必要とされる挙動を妨げる分子的ウェッジとして機能してもよい。本発明の小分子はまた、ホモタイプのＲＴＫ相互作用を妨げるか、または非対称性の接触境界領域を不安定にするために作用してもよい。当業者は、いくつかの実施形態では、本発明の小分子が、他のＩＶ型ＲＴＫにおける対応する残基、たとえば、類似するポケットもしくは空洞を形成する残基、または構造アライメントもしくは配列アライメントによって同じ位置にある残基を容易に標的にし得ることを十分に理解するであろう。
【００８０】
特定の実施形態では、本発明の小分子は、ＩＶ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープに結合する。コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＩＶ型ＲＴＫ、たとえばヒトＦＧＦＲ由来の非対称性の接触境界領域由来の２つ以上の残基から構成されてもよい。たとえば、コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＦＧＦＲ１の残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５の２つ以上から構成されてもよい。特定の実施形態では、本発明の小分子は、ＲＴＫの一方の単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの一方の単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される、ＲＴＫの領域における２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープに結合する。上記に示されるように、本発明の小分子は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域において同定されるポケットもしくは空洞を形成するアミノ酸残基のすべてに結合してもよいし、それらは、ポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットに結合してもよい。ある実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープに結合する本発明の小分子が言及される場合、小分子が、エピトープを構成する特異的な残基（たとえば非対称性の接触境界領域のポケットまたは空洞）にのみ結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列における他の残基に結合しないことが意図されることが理解されたい。
【００８１】
他の実施形態では、本発明の小分子は、ヒトＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５７９もしくはＡｒｇ５８０、またはＦＧＦＲ３もしくはＦＧＦＲ４における対応する残基に結合する。ヒトＦＧＦＲ２の残基Ａｒｇ５７９またはＡｒｇ５８０は、ＦＧＦＲ１の残基Ａｒｇ５７６と類似性であり、ＦＧＦＲ２の非対称性の接触境界領域の一部である。他の実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する。図９および１２において示される構造ベースの配列アライメントは、非対称性の接触形成に関与する残基を示し、これらの残基はＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４において保存されている。したがって、本発明の一実施形態では、小分子は、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４における等価な残基に結合する。本発明の小分子は、トランス自己リン酸化に不可欠なＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の間の重要なホモタイプの相互作用（塩橋など）を妨げることによって、受容体活性化に対してそれらの阻害効果を及ぼしてもよい。本発明の小分子は、トランス自己リン酸化を妨げるが、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの二量体化を可能にしてもよい。構造ベースの配列アライメントは、活性なＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の両方の構造において見つけられる非対称性の接触境界領域の形成に関与する残基の保存を示した（図９Ａ）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の小分子は、ＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の保存された領域を標的にしてもよい。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明の小分子は、高度な親和性で、たとえば、１×１０−７Ｍ以下のＫＤ、５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、１×１０−８Ｍ以下のＫＤ、５×１０−９Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤの親和性で、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの非対称性の接触境界領域に結合する。
【００８３】
本発明の小分子インヒビターは、当技術分野において公知のいくつかの方法によって作製されても、選択されてもよい。スクリーニング法は、ＲＴＫの所望の非対称性の接触境界領域に結合する、ライブラリー由来の小分子を同定するために使用することができる。ある方法、Ｃｈｅｍｅｔｉｃｓ（登録商標）（Ｎｕｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ）は、選択を容易にするために、ライブラリーにおけるそれぞれの分子にＤＮＡタグを使用する。Ｃｈｅｍｅｔｉｃｓ（登録商標）システムは、標的結合についての何百万もの化合物のスクリーニングを可能にする。小分子ライブラリーおよびタグベースのスクリーニングに関する特許は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願第２００７００２６３９７号；第２００６０２９２６０３号；第２００６０２６９９２０号；第２００６０２４６４５０号；第２００６０２３４２３１号；第２００６００９９５９２号；第２００４００４９００８号；第２００３０１４３５６１号である。
【００８４】
ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの所望の非対称性の接触境界領域に結合する、ライブラリー由来の小分子を同定するために使用されてもよい他の周知の方法は、ライブラリーメンバーが同定可能な標識によってタグ付けされたライブラリーを利用する方法を含む（すなわち、標識の同定がタグを付けられた分子の構造を示すように、ライブラリー中に存在するそれぞれの標識が、ライブラリー中に存在する個々の化合物構造と関連する）。タグを付けられたライブラリーに対する１つのアプローチは、たとえば、それぞれの全内容が、それらの全体として参照によって本明細書において組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０５８４７９  Ａ２（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）技術）ならびに米国特許第５，５７３，９０５号；第５，７０８，１５３号；第５，７２３，５９８号、第６，０６０，５９６号、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／０６１２１；ＷＯ  ９３／２０２４２；ＷＯ  ９４／１３６２３；ＷＯ  ００／２３４５８；ＷＯ  ０２／０７４９２９、およびＷＯ  ０２／１０３００８ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻、５３８１〜５３８３頁（１９９２年））；ＮｉｅｌｓｅｎおよびＪａｎｄａ（Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６巻、３６１〜３７１頁（１９９４年））；およびＮｉｅｌｓｅｎ、Ｂｒｅｎｎｅｒ、およびＪａｎｄａ（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５巻、９８１２〜９８１３頁（１９９３年））において記載されるように、オリゴヌクレオチドタグを利用する。そのようなタグは、たとえば、タグの多くのコピーを産生し、配列決定によってタグを同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅することができる。次いで、タグの配列は、結合分子の構造を同定し、これは、純粋な形態で合成し、活性について試験することができる。
【００８５】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者らに周知である。本発明の部分を同定するために使用されてもよいそのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ペプチドライブラリーを含むが、これらに限定されない（たとえば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．  ３７巻：４８７  ４９３頁（１９９１年）、およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：８４  ８８頁（１９９１年）を参照されたい）。化学的多様性ライブラリーを生成するための他の化学的物質は、当技術分野において周知であり、使用することができる。そのような化学的物質は、ペプトイド（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１９７３５）、コードペプチド（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（たとえば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６９０９  ６９１３頁（１９９３年））、ビニローグポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４巻：６５６８頁（１９９２年））、グルコース骨格を有する非ペプチド性（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ）ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４巻：９２１７  ９２１８頁（１９９２年））、類似有機合成の小さな化合物のライブラリー（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６巻：２６６１頁（１９９４年））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻：１３０３頁（１９９３年））、ならびに／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５９巻：６５８頁（１９９４年））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＲｕｓｓｅｌｌ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい、すべて前掲）、ペプチド核酸ライブラリー（たとえば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（たとえばＬｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４巻：１５２０  １５２２頁（１９９６年）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、小さな有機分子のライブラリー（たとえば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、１月１８日、３３頁（１９９３年）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号、ならびにその他同種のものを参照されたい）を含むが、これらに限定されない。先の刊行物はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。公的なデータベース、たとえばＰｕｂＣｈｅｍ（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｚｉｎｃ（Ｉｒｗｉｎお���びＳｈｏｉｃｈｅｔ（２００５年）Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｍｏｄｅｌ．  ４５巻（１号）：１７７〜８２頁）、ならびにＣｈｅｍＢａｎｋ（Ｓｅｉｌｅｒら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６巻（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３５１−Ｄ３５９）もまた、利用可能であり、一般に、小分子スクリーニングのために使用される。
【００８６】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販で入手可能である（たとえば３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓ．、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、９０５０  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．を参照されたい）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが、それら自体、市販で入手可能である（たとえばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、Ｐａ．、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍｄ．、などを参照されたい）。さらに、スクリーニング方法は、非常に十分に定義されているので、目的の標的に対する特定の化合物を同定するために専門の会社と契約することは一般的である（たとえばＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ（ｂｉｏｆｏｃｕｓ．ｃｏｍ）およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｌｅａｄ（ｑ−ｌｅａｄ．ｃｏｍ））。
【００８７】
当技術分野において周知であり、本発明の方法に適用されてもよい小分子を選択するための他の方法は、すべてそれらの全体で参照によって本明細書に組み込まれるＨｕａｎｇおよびＳｔｕａｒｔ  Ｌ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（１９９７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９４巻（２５号）：１３３９６〜１３４０１頁；Ｈｕｎｇら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６７０〜６７４頁；Ｚｈａｎｇら（２００７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０４巻：４６０６〜４６１１頁；またはＧｏｒｄｏｎ（２００７年）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２巻：９〜１６頁において概説される方法のいずれかである。
【００８８】
実験的なスクリーニング方法に加えて、本発明の小分子は、仮想スクリーニング方法を使用して選択されてもよい。仮想スクリーニング技術は、統計分析およびタンパク質ドッキングシミュレーションを使用して、ライブラリー由来のどの小分子が、タンパク質またはその中の特異的なエピトープに結合するかを予測する。最も一般には、仮想スクリーニング方法は、タンパク質の三次元構造をライブラリーにおける小分子の三次元構造と比較する。水素結合、静電力、およびファンデルワールス相互作用を含む、原子の間の結合エネルギーをシミュレートするアルゴリズムを用いることが一般的であるが、タンパク質−分子相互作用をモデル化するための異なる戦略が、使用される。典型的に、仮想スクリーニング方法は、１００万を超える化合物のライブラリーをスキャンし、おそらく強力な結合物であろう小分子の短いリストを返すことができる。本発明の小分子を同定するために使用されてもよい技術を詳述する、仮想スクリーニング方法のいくつかの概説が、入手可能である（Ｅｎｇｅｌら（２００８年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３０巻（１５号）、５１１５〜５１２３頁；ＭｃＩｎｎｅｓ（２００７年）．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  Ｏｃｔ；１１巻（５号）：４９４〜５０２頁；Ｒｅｄｄｙら（２００７年）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．  ８月；８巻（４号）：３２９〜５１頁；ＭｕｅｇｇｅおよびＯｌｏｆｆ（２００６年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  ３巻（４号）：４０５〜４１１頁；Ｋｉｔｃｈｅｎら（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３巻、９３５〜９４９頁）。小分子スクリーニングのさらなる例は、参照によって本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．２００５／０１２４６７８において見つけることができる。
【００８９】
本発明の小分子は、下記の表において示される骨格構造のうちの１つを含有してもよい。表中に引用される参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それらが、示される反応に干渉したり、有意に阻害したりするべきではないという点でのみ制限され、水素、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、置換アミノ、および当技術分野において公知の他のものを含むことができる。適した置換基は、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、ニトロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アリールオキシ、アリール−Ｓ−、ハロゲン、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、シアノ、シアネート、ニトリル、イソシアネート、チオシアネート、カルバミル、および置換カルバミルを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
【表１−１】
2013517282.tif 000003
【００９１】
【表１−２】
2013517282.tif 000004
【００９２】
【表１−３】
2013517282.tif 000005
【００９３】
【表１−４】
2013517282.tif 000006
【００９４】
【表１−５】
2013517282.tif 000007
【００９５】
ＩＩ．ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合するペプチド性分子
本発明の他の態様では、ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する部分は、ペプチド性分子である。ペプチド性分子は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域またはそのようなドメインに由来するコンセンサス配列に基づいて設計されてもよい。
【００９６】
一実施形態では、本発明のペプチド性部分は、タンパク質ドメイン全体、たとえば、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域全体を含むドメインを含んでいてもよい。そのようなペプチド性分子は、ＲＴＫに結合し、ＲＴＫのトランス自己リン酸化および活性化を妨げることによってアンタゴニストとして作用する。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ＩＶ型ＲＴＫなどのようなＲＴＫのドメインに対してわずか５０％ほどの同一性を有していてもよい。たとえば、本発明のペプチド性部分は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域ドメインまたはその一部と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であってもよい。特定の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ヒトＦＧＦＲ１のアミノ酸残基５７６〜５９４またはヒトＦＧＦＲ１の５７９〜５９７と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ヒトＦＧＦＲの特異的配列、たとえば、ＦＧＦＲ１の残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５に結合するかまたはそれを含む。他の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ヒトＦＧＦＲ１の領域、たとえば、ＦＧＦＲ１の一方の単量体のβ１−β２ループ、ＦＧＦＲ１の一方の単量体のβ３−αＣループ、ＦＧＦＲ１の一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＦＧＦＲ１の一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＦＧＦＲ１の一方の単量体のαＦヘリックス、およびＦＧＦＲ１の一方の単量体のαＦ−αＧループの特異的な残基に結合するかまたはそれを含む。
【００９８】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド性部分は、非対称性の接触境界領域の小さな空洞またはポケットを構成する、ＦＧＦＲにおける１つまたは複数の残基に結合してもよい（またはそれを含んでいても、それからなってもよい）。たとえば、本発明のペプチド性分子は、ヒトＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域における１つまたは複数の以下の残基：ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５に結合してもよい（またはそれを含んでいても、それからなってもよい）。
【００９９】
本発明のペプチド性部分は、近接するアミノ酸残基または近接しないアミノ酸残基に結合し、チロシンキナーゼ活性化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの非対称性の接触境界領域の配置に必要とされるリガンド誘導性トランス自己リン酸化を妨げる分子的ウェッジとして機能してもよい。いくつかの実施形態では、部分は、ＲＴＫの触媒ドメインのヌクレオチド結合部位に関与しない。他の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ホモタイプの受容体相互作用を妨げるかまたはリガンド受容体相互作用部位を不安定にするために作用してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ヒトＦＧＦＲ１上の１つまたは複数の以下の残基：Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、またはＰ７０５に結合してもよい（またはそれを含んでいても、それからなってもよい）。本発明のペプチド性部分は、非対称性の接触境界領域のポケットまたは空洞を形成するアミノ酸残基のすべてに結合してもよく（もしくはそれを含んでいても、それからなってもよい）、またはそれらは、ポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットに結合してもよい（もしくはそれを含んでいても、それからなってもよい）。当業者は、いくつかの実施形態では、本発明のペプチド性分子が、他のＩＶ型ＲＴＫにおける対応する残基、たとえば、類似するポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アライメントもしくは配列アライメントによって同じ位置にある残基を容易に標的にしてもよいことを十分に理解するであろう。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＩＶ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープに結合する。コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＩＶ型ＲＴＫ、たとえばヒトＦＧＦＲ、たとえばヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４受容体由来の非対称性の接触境界領域由来の２つ以上の残基から構成されてもよい。たとえば、コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される２つ以上の残基から構成されてもよい。特定の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＲＴＫの一方の単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの一方の単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択される、ＲＴＫの領域の２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープに結合する。
【０１０１】
他の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲ、たとえばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４上の近接エピトープに結合する。一実施形態では、近接エピトープは、線維芽細胞増殖因子受容体の非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される。他の実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択されるエピトープである。
【０１０２】
他の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ヒトＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５７９もしくはＡｒｇ５８０またはＦＧＦＲ３もしくはＦＧＦＲ４における対応する残基に結合する。ヒトＦＧＦＲ２の残基Ａｒｇ５７９またはＡｒｇ５８０は、ＦＧＦＲ１の残基Ａｒｇ５７６と類似性があり、ＦＧＦＲ２の非対称性の接触境界領域の一部である。他の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４における等価なアミノ酸残基に結合する。本発明のペプチド性分子は、リガンド誘導性トランス自己リン酸化およびチロシンキナーゼ活性化にとって不可欠な距離および配向でキナーゼ二量体の配置をするのに不可欠である、ＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の間の重要なホモタイプの相互作用（塩橋など）を妨げることによって、受容体活性化に対してそれらの阻害効果を及ぼしてもよい。本発明のペプチド性分子は、トランス自己リン酸化を妨げるが、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの二量体化を可能にしてもよい。構造ベースの配列アライメントは、活性なＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の両方の構造において見つけられる非対称性の接触境界領域の形成に関与する残基の保存を示した（図９Ａ）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の保存された領域を標的にしてもよい（図１２もまた、参照されたい）。
【０１０３】
本発明のペプチド性部分は、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５などのような、本明細書において同定されるアミノ酸配列のいずれかを含むかまたはそれからなるペプチドであってもよい。たとえば、本発明のペプチド性部分は、ＲＴＫの以下の領域：ＲＴＫの一方の単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの一方の単量体のαＦ−αＧループのいずれかを含むかまたはそれからなるペプチドであってもよい。
【０１０４】
本発明のペプチド分子は、その安定性、生物学的利用能、または溶解性を増加させるためにさらに修飾されてもよい。たとえば、ペプチド性分子内の１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基は、Ｄ−アミノ酸残基と交換されてもよい。本発明のペプチド性分子に適用される用語「模倣体」は、Ｄ−ペプチド性構造の化学構造を模倣しており、かつＤ−ペプチド性構造の機能的な特性を保持する分子を含むように意図される。用語「模倣体」は、下記に記載されるペプチドの「類似体」および／または「誘導体」を包含するようにさらに意図される。ペプチドアナログ、誘導体、および模倣体の設計に対するアプローチは、当技術分野において公知である。たとえば、Ｆａｒｍｅｒ，  Ｐ．Ｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｅ．Ｊ．  Ａｒｉｅｎｓ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０年、１０巻、１１９〜１４３頁；Ｂａｌｌ．  Ｊ．Ｂ．およびＡｌｅｗｏｏｄ，  Ｐ．Ｆ．（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ３巻：５５頁；Ｍｏｒｇａｎ，  Ｂ．Ａ．およびＧａｉｎｏｒ，  Ｊ．Ａ．（１９８９年）Ａｎｎ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２４巻：２４３頁；ならびにＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｍ．（１９８９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １０巻：２７０頁を参照されたい。Ｓａｗｙｅｒ，  Ｔ．Ｋ．（１９９５年）「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」Ｔａｙｌｏｒ，  Ｍ．Ｄ．  およびＡｍｉｄｏｎ，  Ｇ．Ｌ．（編）Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第１７章；Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．Ｂ．  ３ｒｄら（１９９５年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７巻：１１１１３〜１１１２３頁；Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．Ｂ．  ３ｒｄら（１９９４年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６巻：９９４７〜９９６２頁；およびＨｉｒｓｃｈｍａｎ，  Ｒ．ら（１９９３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５巻：１２５５０〜１２５６８頁もまた、参照されたい。
【０１０５】
本明細書において使用されるように、本発明のペプチド性分子の「誘導体」は、分子上の１つまたは複数の反応基が置換基により誘導体化されたペプチド性分子の形態を指す。ペプチド誘導体の例は、アミノ酸側鎖、ペプチド主鎖、またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端が誘導体化されたペプチド（たとえばメチル化されたアミド連結を有するペプチド性化合物）を含む。本明細書において使用されるように、本発明のペプチド性分子の「類似体」は、上記分子と異なるある種の化学構造もまた含有するが、上記分子の機能的な活性に必要な上記分子の化学構造をなお保持するペプチド性分子を指す。天然に存在するペプチドの類似体の例は、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を含むペプチドである。本明細書において使用されるように、本発明のペプチド性分子の「模倣体」は、上記分子の機能的な活性に必要な上記分子の化学構造が、上記分子のコンフォメーションを模倣する他の化学構造と交換されているペプチド性分子を指す。ペプチド模倣体の例は、ペプチド主鎖が１つまたは複数のベンゾジアゼピン分子により置換されているペプチド性化合物を含む（たとえばＪａｍｅｓ，  Ｇ．Ｌ．ら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０巻：１９３７〜１９４２頁を参照されたい）。
【０１０６】
本発明のペプチド性分子の類似体は、分子の特性が維持されるように、ペプチド性構造の１つまたは複数のＬ−またはＤ−アミノ酸が相同アミノ酸により置換されている分子を含むように意図される。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つまたは複数のアミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基とアミノ酸残基が交換される置換である。塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。本発明のペプチド性分子の構造においてなすことができる相同置換の非限定的な例は、Ｄ−チロシン、Ｄ−ピリジルアラニン、もしくはＤ−ホモフェニルアラニンとのＤ−フェニルアラニンの置換、Ｄ−バリンまたは脂肪族側鎖を有する他の天然もしくは非天然アミノ酸とのＤ−ロイシンの置換、ならびに／またはＤ−ロイシンまたは脂肪族側鎖を有する他の天然もしくは非天然アミノ酸とのＤ−バリンの置換を含む。
【０１０７】
模倣体、特にペプチド模倣体という用語は、同配体を含むように意図される。本明細書において使用されるような用語「同配体」は、第１の構造の立体的なコンフォメーションが第２の構造に特異的な結合部位と適合するために、第２の化学構造と置換することができる化学構造を含むように意図される。この用語は、特に、当業者らに周知のペプチド主鎖修飾（つまりアミド結合模倣体）を含む。そのような修飾は、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニル、アミド結合の完全交換、伸長、欠失、または主鎖架橋の修飾を含む。Ψ［ＣＨ２Ｓ］、Ψ［ＣＨ２ＮＨ］、Ψ［ＣＳＮＨ２］、Ψ［ＮＨＣＯ］、Ψ［ＣＯＣＨ２］、およびΨ［（Ｅ）または（Ｚ）  ＣＨ＝ＣＨ］を含む、いくつかのペプチド主鎖修飾が、公知である。上記に使用される命名法では、Ψは、アミド結合の不在を示す。アミド基に取って代わる構造は、括弧内に指定される。
【０１０８】
他の可能な修飾は、Ｎ−アルキル（もしくはアリール）置換（Ψ［ＣＯＮＲ］）またはラクタムおよび他の環状構造を構築するための主鎖架橋を含む。本発明の調節因子化合物の他の誘導体は、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、Ｏ修飾誘導体（たとえばＣ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、アルキルアミドおよびヒドラジドなどのような置換アミドを含むＮ末端修飾誘導体を含む。
【０１０９】
本発明のペプチド性分子は、当技術分野において公知の標準的な方法によって作製されてもよい。ペプチド性分子、たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域は、標準的な技術を使用して、ヒト細胞からクローニングされ、組換えベクター中に挿入され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系において発現されてもよい（たとえば酵母細胞の中へのベクターのトランスフェクションによって）。その代わりに、ペプチド性分子は、Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９年）Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ  ０１９９６３０６７４；Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４年）第２版、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ９１巻．  ＩＳＢＮ  ０９３５９４００３０；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５巻：２１４９〜２１５４頁などのような公知の合成方法を介して、設計され、新たに合成されてもよい。
【０１１０】
次いで、ペプチド性分子を、本明細書において記載されるアッセイのいずれか、たとえば、下記の実施例の部において記載されるものを使用して、機能的な活性について試験することができる。
【０１１１】
ＩＩＩ．ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する抗体
本発明の一態様では、ヒト受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域に結合する部分は、イントラボディなどのような、細胞に入ることができる抗体またはその抗原結合性断片である。
【０１１２】
本明細書において言及される用語「抗体」は、抗体全体およびその任意の抗原結合性断片（つまり「抗原結合性一部分」）または単鎖を含む。用語「抗体」は、イントラボディなどのような細胞内抗体を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互につながれた少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合性一部分を含む糖タンパク質を指す。重鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（ＶＨと本明細書において省略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（ＶＬと本明細書において省略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存された領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、以下の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。
【０１１３】
本明細書において使用される、抗体の「抗原結合性一部分」（または単に「抗体一部分」）という用語は、抗原（たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、完全長抗体の断片によって実行することができることが示されている。抗体の用語「抗原結合性一部分」内に包含される結合性断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ編、第３版  １９９３年）を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１のドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用してつなぐことができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；たとえばＢｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照されたい）。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合性一部分」という用語内に包含されるように意図される。これらの抗体断片は、当業者らに公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、完全な抗体と同じ方法において有用性についてスクリーニングされる。
【０１１４】
本明細書において使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すように意図される（たとえば、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に特異的に結合する単離抗体は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞性の物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。しかしながら、「単離抗体」は、たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域に、すべてが特異的に結合するポリクローナル抗体を含んでいてもよい。
【０１１５】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【０１１６】
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれることを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入された変異）が含まれ得る。しかし、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体が含まれることを意図しない。
【０１１７】
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合させたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１１８】
本明細書中で使用する用語「組換えヒト抗体」には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（たとえばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（以下にさらに記載）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換させた宿主細胞、たとえばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合はｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞性変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖系列のレパートリー中に天然では存在しないであろう配列である。
【０１１９】
本明細書中で使用する「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（たとえばＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【０１２０】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書中で用語「抗原と特異的に結合する抗体」と互換性があるように使用される。
【０１２１】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の任意の改変された形態、たとえば、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートをいう。
【０１２２】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体をいうことを意図する。さらなるフレームワーク領域の改変をヒトフレームワーク配列内に行い得る。当業者には、配列が特定の種に「由来する」場合、前記配列は、可変領域アミノ酸がマウス抗体からとられる場合などのように、タンパク質配列であり得るか、または、前記配列は、可変領域をコードしている核酸がマウスＤＮＡからとられる場合などのように、ＤＮＡ配列であり得ることが理解されよう。また、ヒト化抗体は、ヒトおよび非ヒト（たとえばマウスまたはウサギ）の抗体の公知の配列に基づいて設計してもよい。設計した抗体（ヒトおよび非ヒト残基をどちらも組み込む可能性がある）を、化学合成できる。また、配列をＤＮＡレベルで合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現させて、ヒト化抗体を作製してもよい。
【０１２３】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域の配列がマウス抗体に由来し、定常領域の配列がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域の配列が１つの種に由来し、定常領域の配列が別の種に由来する抗体をいうことを意図する。
【０１２４】
用語「抗体模倣体」または「抗体擬態物」とは、抗原と結合する抗体の能力を模倣することができる分子をいうことを意図し、これらは、ネイティブの抗体構造に限定されない。そのような抗体模倣体の例には、それだけには限定されないが、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチンに基づいた結合分子）、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー、およびバーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）が含まれ、これらのすべては、伝統的な抗体結合を模倣する一方で、明白に異なる機構を介して産生されて機能する結合構造を用いる。本発明の実施形態は、抗体またはその抗原結合性一部分に向けられているため、上述の抗体模倣体にも適用される。
【０１２５】
本明細書中で使用する、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域「と特異的に結合する」抗体とは、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤでＲＴＫの非対称性の接触境界領域ドメインと結合する抗体をいうことを意図する。
【０１２６】
本明細書中で使用する用語、タンパク質または細胞「と実質的に結合しない」とは、タンパク質または細胞と結合しないか、または高い親和性で結合しない、すなわち、タンパク質または細胞と１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを意味する。
【０１２７】
本明細書中で使用する用語「Ｋ会合」または「Ｋａ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用の会合速度をいうことを意図する一方で、本明細書中で使用する用語「Ｋ解離」または「Ｋｄ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用の解離速度をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、解離定数をいうことを意図する。抗体のＫＤ値は、当分野の十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
【０１２８】
本明細書中で使用する、ＩｇＧ型抗体に言及する場合の用語「高親和性」とは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域ドメインに対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプでは変動する場合がある。たとえば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
【０１２９】
抗体
本発明の抗体は、ＲＴＫ、たとえば受容体チロシンキナーゼのヒトＩＶ型ファミリーのメンバーの非対称性の接触境界領域ドメインに特異的に結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合し、したがって、受容体によるリガンド誘導性トランス自己リン酸化および下流シグナル伝達を阻害する。
【０１３０】
本発明の抗体は、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲ、たとえばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の特異的な非対称性の接触境界領域に結合するように選択または設計される。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫ、たとえばヒトＦＧＦＲのドメインに対して相同性を共有するタンパク質に結合するように選択または設計される。たとえば、抗体は、ＦＧＦＲ、たとえばＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のドメインに結合するように選択されても、設計されてもよい。そのような抗体またはその抗原結合性一部分は、おそらく、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域に機能的に類似している他のＲＴＫにおけるタンパク質ドメインに結合することができるであろう。
【０１３１】
本発明の抗体またはその抗原結合性一部分はまた、ＲＴＫ、たとえばヒトＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に由来する特定のモチーフまたはコンセンサス配列に結合するように選択または設計され、抗体またはその抗原結合性一部分が、ＲＴＫファミリーのメンバーの中で共有される非対称性の接触境界領域エピトープまたはドメインに特異的に結合するのを可能にしてもよい。そのような直鎖状コンセンサス配列は、たとえば、ＲＴＫの型または種にわたる様々なＲＴＫのドメイン、たとえば非対称性の接触境界領域をアライメントするために配列アライメントアルゴリズムを使用することによって見つけられてもよい。当業者は、たとえば様々な種（たとえば、ヒト、マウス、ラット）からのＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域のタンパク質配列をアラインメントして、どのタンパク質残基が、アラインメントした配列のうちの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％で保存されているかを決定し得る。その後、そのようなコンセンサス配列を使用して、コンセンサス配列と特異的に結合し、したがってＲＴＫの最も保存された残基と結合する抗体または他の部分を作製し得る。当業者には、最も高度に保存された残基は、進化を通して保存されており、タンパク質の機能に重要である可能性が最も高いものであることが理解されよう。あるいは、ＲＴＫの様々なクラスにわたってアラインメントを行う場合、そのようなコンセンサス配列に対して作製された抗体は、抗体が複数のＲＴＫの種類における類似の非対称性の接触境界領域と結合することを可能にするであろう。
【０１３２】
本発明の抗体は、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの触媒ドメインのヌクレオチド結合部位に結合しない。そのため、本明細書において記載される抗体は、受容体がその標的リガンドに結合する能力に拮抗しない。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＦＧＦＲ１の特異的配列、たとえば、ＦＧＦＲ１の残基Ｒ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５に結合する。
【０１３４】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、タンパク質における３次元構造を表すタンパク質モチーフまたはコンセンサス配列に結合する。そのようなモチーフまたはコンセンサス配列は、近接する一連のアミノ酸を表さないが、ＲＴＫの三次元フォールディングに起因する、近接しないアミノ酸の構成（つまり「構造モチーフ」または「非直鎖状エピトープ」）を表すであろう。そのようなモチーフの例は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域となるであろう。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の小さな空洞またはポケットを構成する、ＲＴＫにおける１つまたは複数の残基に結合してもよい。たとえば、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域における１つまたは複数の以下の残基：ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５に結合してもよい。他の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＦＧＦＲ２の非対称性の接触境界領域における１つまたは複数の残基：ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１に結合してもよい。さらに他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分はＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４における１つまたは複数の等価な残基に結合してもよい。
【０１３６】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、近接するアミノ酸残基または近接しないアミノ酸残基に結合し、チロシンキナーゼ活性化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの非対称性の接触境界領域の配置に必要とされるリガンド誘導性トランス自己リン酸化を妨げる分子的ウェッジとして機能してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分はまた、ホモタイプの受容体相互作用を妨げるかまたはリガンド受容体相互作用部位を不安定にするために作用してもよい。
【０１３７】
当業者は、いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分が、他のＩＶ型ＲＴＫにおける対応する非対称性の接触境界領域残基、たとえば、類似するポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アライメントもしくは配列アライメントによって同じ位置にある残基を容易に標的にしてもよいことを十分に理解するであろう。
【０１３８】
特異的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性一部分は、ＩＶ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープに結合する。コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＲＴＫ、たとえばヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の非対称性の接触境界領域由来の２つ以上の残基から構成されてもよい。たとえば、コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープは、ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５からなる群より選択される２つ以上の残基から構成されてもよい。
【０１３９】
上記に示されるように、本発明の抗体は、非対称性の接触境界領域のポケットもしくは空洞を形成するアミノ酸残基すべてに結合してもよく、またはそれらは、ポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットに結合してもよい。ある実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープに結合する本発明の抗体が言及される場合、抗体が、エピトープ（たとえば非対称性の接触境界領域のポケットまたは空洞）を構成する特異的な残基にのみ結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列における他の残基に結合しないことが意図されることが理解されたい。
【０１４０】
他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ヒトＦＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ５７９もしくはＡｒｇ５８０またはＦＧＦＲ３もしくはＦＧＦＲ４における対応する残基に結合する。ヒトＦＧＦＲ２の残基Ａｒｇ５７９またはＡｒｇ５８０は、ＦＧＦＲ１の残基Ａｒｇ５７６と類似しており、ＦＧＦＲ２の非対称性の接触境界領域の一部である。他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＦＧＦＲ２のＣ４９１、Ｆ４９２、Ｎ６６２、Ｇ６６３、Ｒ６６４、Ｌ６６５、Ｐ６６６、Ｖ６６７、Ｋ６６８、Ｗ６６９、Ｒ５７７、Ｒ５７９、Ｒ５８０、Ｐ５８１、Ｐ５８２、Ｅ５８５、Ｙ５８９、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｄ５８９、Ｉ５９０、Ｐ７０５、Ｇ７０６、Ｐ７０８、Ｆ７１３、Ｋ７２４、Ａ７２６、Ｎ７２７、Ｃ７２８、Ｔ７２９、Ｎ７３０、およびＥ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４における等価な残基に結合する。本発明の抗体または抗原結合性抗体断片は、リガンド誘導性トランス自己リン酸化およびチロシンキナーゼ活性化にとって不可欠な距離および配向でキナーゼ二量体の配置をするのに不可欠である、ＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の間の重要なホモタイプの相互作用（塩橋など）を妨げることによって、受容体活性化に対してそれらの阻害効果を及ぼしてもよい。本明細書において議論される実験は、非対称性の接触境界領域が、ＲＴＫ二量体形成を媒介すること、かつ二量体化が、受容体トランス自己リン酸化に必要であるが、十分ではないことを示す。したがって、本発明の抗体または抗原結合性抗体断片は、トランス自己リン酸化を妨げるが、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの二量体化を可能にしてもよい。構造ベースの配列アライメントは、活性なＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の両方の構造において見つけられる非対称性の接触境界領域の形成に関与する残基の保存を示した（図９Ａ）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体断片は、ＩＶ型ＲＴＫの非対称性の接触境界領域の保存された領域を標的にしてもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒト線維芽細胞増殖因子受容体の特異的な領域、たとえば、ＲＴＫの一方の単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの一方の単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの一方の単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの一方の単量体のαＦ−αＧループに結合する。
【０１４２】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲ上の近接エピトープに結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＦＧＦＲの非対称性の接触境界領域における２つ以上の残基から構成される。他の実施形態では、近接エピトープは、ＲＴＫの単量体のβ１−β２ループ、ＲＴＫの単量体のβ３−αＣループ、ＲＴＫの単量体のβ４−Ｂ５ループ、ＲＴＫの単量体のαＤ−αＥループ、ＲＴＫの単量体のαＦヘリックス、およびＲＴＫの単量体のαＦ−αＧループからなる群より選択されるエピトープである。
【０１４３】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体断片は、ＲＴＫの変異体の非対称性の接触境界領域に特異的に結合するように選択または設計される。好ましい実施形態では、変異体ＲＴＫは、腫瘍形成性変異体または腫瘍発生性変異体である。特定の一実施形態では、抗体または抗原結合性抗体断片は、腫瘍発生性ＦＧＦＲ変異体に結合するように選択または設計される。本発明の抗体または抗原結合性抗体断片によって標的にされてもよいＲＴＫ変異体は、以下の１つまたは複数のアミノ酸：ＦＧＦＲ１のＲ５７７、Ｄ５１９、Ｃ４８８、Ｆ４８９、Ｓ５１８、Ｔ５２１、Ｅ５２２、Ｄ５５４、Ｇ５５５、Ｐ５５６、Ｑ５７４、Ｐ５８７、Ｐ５７９、Ｗ６９１、Ｔ６９５、Ｐ７０２、Ｇ７０３、およびＰ７０５において変異を有する線維芽細胞増殖因子受容体を含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、ＦＧＦＲにおける他の変異または他のＲＴＫにおける変異に適用可能であろうということが当業者によって十分に理解されるはずである。変異体ＲＴＫを標的にすることの１つの利点は、治療用小分子が、変異を含有する細胞上のＲＴＫにのみ結合し、健康な細胞にほとんどまたは全く作用を与えない可能性があるということである。したがって、変異が腫瘍形成性である例では、腫瘍細胞のみを療法のために標的にし、副作用および投薬の必要量を低下させる可能性がある。
【０１４４】
好ましくは、抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、１×１０−８Ｍ以下のＫＤ、５×１０−９Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで、ヒトＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合する。たとえばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、およびＲＩＡを含む、ＲＴＫ、たとえばＦＧＦＲの非対称性の接触境界領域への抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野において公知である。抗体の結合動態（たとえば結合親和性）もまた、ＥＬＩＳＡ、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、およびＢｉａｃｏｒｅ分析によってなどのように、当技術分野において公知の標準的なアッセイによって評価することができる。
【０１４５】
イントラボディ−細胞内抗体
細胞内エピトープに結合することができる抗体、たとえばイントラボディは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合し、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害するのに有用である。イントラボディは、抗原に特異的に結合することができ、かつそれが細胞内で発現することができるようにおよび／または抗原に細胞内で結合するように操作された、抗体の少なくとも一部分（たとえばｓｃＦｖ）を含む。一般に、イントラボディは、その分泌をコードする配列を含有しない。哺乳動物細胞内での発現および／または正確な細胞内の位置へのターゲティングのための方法と組み合わせられる場合、イントラボディは、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域などのような細胞内の標的に対して特に有用である。イントラボディの生成は、当業者に周知であり、たとえば、それぞれの全内容が、参照によって本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５，８５１，８２９号；同第５，９６５，３７１号；同第６，００４，９４０号；同第６，０７２，０３６号；および同第５，９６５，３７１号において記載されている。さらに、イントラボディの構築は、ＯｈａｇｅおよびＳｔｅｉｐｅ、１９９９年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９１巻：１１１９〜１１２８頁；Ｏｈａｇｅら、１９９９年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９１巻：１１２９〜１１３４頁；ＷｉｒｔｚおよびＳｔｅｉｐｅ、１９９９年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８巻：２２４５〜２２５０頁；ならびにＳｔｏｃｋｓ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  Ｔｏｄａｙ  ９巻、２２号  ２００４年１１月において議論されている。組換え分子生物学的技術もまた、イントラボディの生成において使用されてもよい。
【０１４６】
一実施形態では、イントラボディを発現する核酸構築物は、標的細胞にトランスフェクトすることができる。イントラボディをコードする「抗体カセット」は、目的の細胞における抗体の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結された、標的ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に結合することができる抗体の一部をコードする、十分な数のヌクレオチドを含有していてもよい。イントラボディをコードする構築物は、標的細胞に送達され、標的ＲＴＫに結合し、それによって、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化に拮抗することができる。好ましい一実施形態では、抗体カセットの「イントラボディ遺伝子」（抗体）は、２つの可変ドメインのブリッジとしての適切なオリゴヌクレオチドによってＤＮＡレベルでつなぐことができ、翻訳の際に、ＲＴＫタンパク質などのような標的に結合することができる単一のペプチド（単鎖可変断片、「ｓｃＦｖ」と呼ばれる）を形成する、抗体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをコードするｃＤＮＡを利用する。イントラボディ遺伝子は、好ましくは、作動可能な分泌配列をコードせず、したがって、発現された抗体は、細胞内に保持される。
【０１４７】
他の実施形態では、特異的な局在化配列を、特異的な細胞内の位置にイントラボディを向けるためにイントラボディポリペプチドに付加することができる。イントラボディは、たとえば、以下の細胞内の位置に局在化させることができる：小胞体（Ｍｕｎｒｏら、１９８７年、Ｃｅｌｌ  ４８巻：８９９〜９０７頁；Ｈａｎｇｅｊｏｒｄｅｎら、１９９１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６巻：６０１５頁）；核（Ｌａｎｆｏｒｄら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４６巻：５７５頁；Ｓｔａｎｔｏｎら、１９８６年、ＰＮＡＳ  ８３巻：１７７２頁；Ｈａｒｌｏｗら、１９８５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：１６０５頁；Ｐａｐら、２００２年、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２６５巻：２８８〜９３頁）；核小体領域（Ｓｅｏｍｉら、１９９０年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４巻：１８０３頁；Ｋｕｂｏｔａら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １６２巻：９６３頁；Ｓｉｏｍｉら、１９９８年、Ｃｅｌｌ  ５５巻：１９７頁）；エンドソームコンパートメント（Ｂａｋｋｅら、１９９０年、Ｃｅｌｌ  ６３巻：７０７〜７１６頁）；ミトコンドリアマトリックス（Ｐｕｇｓｌｅｙ，  Ａ．  Ｐ．、１９８９年、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；ゴルジ装置（Ｔａｎｇら、１９９２年、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７巻：１０１２２〜６頁）；リポソーム（Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６９巻：１１８３頁）；ペルオキシソーム（Ｐａｐら、２００２年、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２６５巻：２８８〜９３頁）；トランス（ｂａｎｓ）ゴルジ網（Ｐａｐら、２００２年、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２６５巻：２８８〜９３頁）；および形質膜（Ｍａｒｅｈｉｌｄｏｎら、１９８４年、ＰＮＡＳ  ８１巻：７６７９〜８２頁；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９８７年、ＰＮＡＳ  ８９巻：３３９〜４３頁；Ｒｈｅｅら、１９８７年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１巻：１０４５〜５３頁；Ｓｃｈｕｌｔｚｅｔａｌ．、１９８４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １３３巻：４３１〜７頁；Ｏｔｓｕｙａｍａら、１９８５年、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎ．  Ｒｅｓ．  ７６巻：１１３２〜５頁；Ｒａｔｎｅｒら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３巻：２７７〜８４頁）。
【０１４８】
抗体カセットは、公知の手段のいずれかによって標的細胞に送達することができる。ある好ましい送達系は、全内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，００４，９４０号において記載されている。
【０１４９】
本発明の方法におけるイントラボディとしての使用／発現に適している抗ＲＴＫ抗体は、様々な他の方法によって容易に産生することができる。そのような他の方法は、単鎖抗体を形成するように修飾することができるポリクローナル抗体「全体」を産生するための従来の方法、またはたとえば、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域に対する高度な特異性および／もしくはアビディティを示す抗体を選択するためのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを含むが、これらに限定されない。ファージディスプレイライブラリースクリーニング方法は、本明細書においていくらか詳細に記載される。一実施形態では、本発明のイントラボディは、抗原に対する、完全抗体（つまり、全定常ドメインおよび可変領域を有する）の結合効力の少なくとも約７５％を保持する。一実施形態では、イントラボディは、完全抗体の結合効力の少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を保持する。他の実施形態では、イントラボディとしての使用に適している抗ＲＴＫ抗体は、種々の細胞内抗体ライブラリーのデノボ生産によって産生することができる（たとえばＴａｎａｋａら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１巻（５号）：ｅ２３を参照されたい）。
【０１５０】
他の実施形態では、組換え発現されたイントラボディは、予防または治療効果を媒介するように、患者に投与されてもよい。イントラボディを細胞内に向けるために、イントラボディポリペプチドは、「膜透過性配列」と結合させることができる。膜透過性配列は、細胞の外部から細胞の内部に細胞膜を通して進入することができるポリペプチドである。他のポリペプチドに連結される場合、膜透過性配列は、細胞膜を横切る、そのポリペプチドのトランスロケーションを指示することができる。有用な膜透過性配列は、シグナルペプチドの疎水性領域を含む（たとえば、全内容が、参照によって本明細書に組み込まれるＨａｗｉｇｅｒ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻：８９〜９４頁；Ｈａｗｉｇｅｒ、１９９７年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９巻：１８９〜９４頁；米国特許第５，８０７，７４６号および第６，０４３，３３９号を参照されたい）。膜透過性配列の配列は、任意のシグナルペプチドの疎水性領域に基づくものとすることができる。シグナルペプチドは、たとえば、ＳＩＧＰＥＰデータベースから選択することができる（たとえばｖｏｎ；  Ｈｅｉｊｎｅ、１９８７年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｅｑ．  Ｄａｔａ  Ａｎａｌ．  １巻：４１〜２頁；ｖｏｎ  ＨｅｉｊｎｅおよびＡｂｒａｈｍｓｅｎ、１９８９年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．；２２４巻：４３９〜４６頁を参照されたい）。特異的な細胞型がイントラボディポリペプチドの挿入のために標的にされることになっている場合、膜透過性配列は、好ましくは、その細胞型に内因性のシグナルペプチドに基づく。他の実施形態では、膜透過性配列は、ウイルスタンパク質（たとえばヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２）またはその断片（たとえばＰｈｅｌａｎら、１９９８年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６巻：４４０〜３頁を参照されたい）である。特定のイントラボディおよび／または特定の標的細胞型に対して適切な特性を有する膜透過性配列は、細胞膜を横切るイントラボディのトランスロケーションを指示するためのそれぞれの膜透過性配列の能力を評価することによって、経験的に決定することができる。
【０１５１】
操作および改変した抗体
抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列を本発明の方法に従って調製し、改変した抗体を操作設計するための出発物質として使用してよく、改変した抗体は、開始抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、元の可変領域の一方または両方（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、たとえば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を改変することによって、操作することができる。それに加えてまたは代わって、抗体は、たとえば抗体のエフェクター機能（複数可）を変更するために、定常領域（複数可）内の残基を改変することによって操作することができる。
【０１５２】
行うことができる１つの種類の可変領域の操作は、ＣＤＲ移植である。抗体は、主に６個の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。そのため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外の配列よりも、個々の抗体間の多様性が高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原の相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植した、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列が含まれる発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら（１９９８年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２７頁、Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．ら（１９８６年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁、Ｑｕｅｅｎ，  Ｃ．ら（１９８９年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｅ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６巻：１００２９〜１００３３頁、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１５３】
抗体のフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列が含まれる公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参考資料から得ることができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、そのそれぞれの内容が明確に本明細書中に参考として組み込まれている、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上でｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅから利用可能）、ならびにＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１年）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．  Ｍ．ら（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７巻：７７６〜７９８頁、およびＣｏｘ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｌ．ら（１９９４年）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：８２７〜８３６頁中に見つけることができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中に見つけることができる。
【０１５４】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５巻：３３８９〜３４０２頁）と呼ばれる配列類似度の検索方法のうちの１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較する。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列との間の統計的に有意なアラインメントが、アラインメントした単語の高スコアのセグメント対（ＨＳＰ）を含有する可能性が高いという点で、発見的なアルゴリズムである。そのスコアを伸長またはトリミングによって改善させることができないセグメント対は、ヒットと呼ばれる。手短に述べると、ＶＢＡＳＥ起源のヌクレオチド配列（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）を翻訳し、ＦＲ１からＦＲ３のフレームワーク領域（両端を含む）を保持する。データベース配列は、平均して９８個の残基の長さを有する。タンパク質の全長にわたって正確に一致する重複配列を除去する。オフにした低複雑度フィルター以外はデフォルトの標準のパラメータを用いたプログラムｂｌａｓｔｐ、およびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを使用したタンパク質のＢＬＡＳＴ検索により、上位５件のヒットがフィルタリングされて、配列一致が得られる。ヌクレオチド配列を６個すべてのフレームにおいて翻訳し、データベース配列の一致セグメント中にストップコドンを有さないフレームが潜在的なヒットとみなされる。これを、次に、６個すべてのフレームにおいて抗体配列を翻訳し、これらの翻訳物を、６個すべてのフレームにおいて動的に翻訳されたＶＢＡＳＥヌクレオチド配列と比較する、ＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを使用して確認する。ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から利用可能なものなどの他のヒト生殖系列配列データベースは、上述のようにＶＢＡＳＥと同様に検索することができる。
【０１５５】
同一性は、配列の全長にわたる抗体配列とタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸一致である。陽性（同一性＋置換の一致）は、同一ではないが、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスによって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合は、最大の陽性を有するヒットが、一致する配列ヒットであると決定される。
【０１５６】
同定されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中に見つかるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植することができるか、または、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１つもしくは複数の変異を含有するフレームワーク領域上に移植することができる。たとえば、特定の事例では、抗体の抗原結合能力を維持または増強させるために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが判明している（たとえば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１５７】
別の種類の可変領域の改変は、ＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（たとえば親和性）を改善させることである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性の変異誘発を行って変異（複数可）を導入することができ、抗体結合または目的の他の機能的特性に対する効果を、当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。たとえば、本発明の抗体を変異させてライブラリを作製してよく、その後、これを、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえば、線維芽細胞増殖因子受容体との結合についてスクリーニングし得る。好ましくは、保存された改変（上述）が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個または５個を超えない残基が変更される。
【０１５８】
別の種類のフレームワークの改変は、フレームワーク領域内、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１つまたは複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法は「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらの米国特許公開第２００３０１５３０４３号中にさらに詳述されている。
【０１５９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて、またはそれに代わって、本発明の抗体を、典型的には、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性などの、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、Ｆｃ領域内に改変が含まれるように操作し得る。さらに、本発明の抗体を、やはり抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、化学修飾（たとえば、１つもしくは複数の化学部分を抗体に付着させることができる）またはそのグリコシル化を変更させるために改変し得る。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳述されている。Ｆｃ領域中の残基の付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１６０】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されるように、たとえば増加または減少するように改変する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらの米国特許第５，６７７，４２５号中にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、たとえば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するために、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変更されている。
【０１６１】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異させる。より詳細には、抗体が、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌプロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比較して損なわれたＳｐＡ結合を有するように、１つまたは複数のアミノ酸の変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの境界領域内に導入する。この手法は、Ｗａｒｄらの米国特許第６，１６５，７４５号中にさらに詳述されている。
【０１６２】
別の実施形態では、抗体を、その生物学的半減期を増加させるために改変する。様々な手法が可能である。たとえば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの変異のうちの１つまたは複数を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Ｐｒｅｓｔａらの米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載のように、抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとったサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更することができる。これらの戦略は、抗体とＲＴＫの非対称性の接触境界領域との結合が損なわれない限りは有効である。
【０１６３】
さらに他の実施形態では、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによってＦｃ領域を変更する。たとえば、抗体が、エフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変更させられるエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であることができる。この手法は、どちらもＷｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号中にさらに詳述されている。
【０１６４】
別の例では、抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した（ａｂｏｌｉｓｈ）補体依存性細胞毒（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらの米国特許第６，１９４，５５１号中にさらに詳述されている。
【０１６５】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９における１つまたは複数のアミノ酸残基を変更し、それによって補体を固定する抗体の能力を変更させる。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらのＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号中にさらに記載されている。
【０１６６】
さらに別の例では、抗体依存性細胞毒（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるかおよび／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるために、以下の位置のうちの１つまたは複数のアミノ酸を改変することによってＦｃ領域を改変する：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。この手法は、ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２号中にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を有するバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．ら（２００１年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：６５９１〜６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の変異は、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善させることが示された。さらに、以下の組合せの変異体が、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善させることが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体のＣ末端を、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国仮出願第６０／９５７，２７１号に記載のように、システイン残基の導入によって改変する。そのような改変には、それだけには限定されないが、完全長重鎖配列のＣ末端でまたはその付近での既存のアミノ酸残基の置き換え、および完全長重鎖配列のＣ末端へのシステイン含有伸長の導入が含まれる。好ましい実施形態では、システイン含有伸長は、配列アラニン−アラニン−システインを含む（Ｎ末端からＣ末端）。
【０１６８】
好ましい実施形態では、そのようなＣ末端のシステイン改変の存在は、治療剤またはマーカー分子などのパートナー分子をコンジュゲートする位置を提供する。具体的には、Ｃ末端のシステイン改変による反応性チオール基の存在を使用して、以下に詳述するジスルフィドリンカーを用いてパートナー分子をコンジュゲートさせることができる。この様式での抗体とパートナー分子とのコンジュゲーションは、特定の付着部位についての制御の増加を可能にする。さらに、付着部位をＣ末端にまたはその付近に導入することによって、コンジュゲーションが最適化されて、抗体の機能的特性への妨害が低下または排除され、コンジュゲート調製物の単純分析および品質管理が可能となる。
【０１６９】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。たとえば、グリコシル化されていない（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体を作製することができる（すなわち抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、たとえば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。そのような炭水化物の改変は、たとえば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。たとえば、１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化の排除をもたらす、１つまたは複数のアミノ酸の置換を行うことができる。上記のような、グリコシル化されていないことは、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのような手法は、Ｃｏらの米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号中にさらに詳述されている。グリコシル化を変更するためのさらなる手法は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Ｈａｎａｉらの米国特許第７，２１４，７７５号、Ｐｒｅｓｔａの米国特許第６，７３７，０５６号、Ｐｒｅｓｔａの米国公開第２００７００２０２６０号、ＤｉｃｋｅｙらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０８４９２６号、ＺｈｕらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００６／０８９２９４号、およびＲａｖｅｔｃｈらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０５５９１６号中にさらに詳述されている。
【０１７０】
それに加えてまたは代わって、低下した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、グリコシル化の種類の変更を有する抗体を作製することができる。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが示されている。そのような炭水化物の改変は、たとえば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させることによって変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。たとえば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞系中で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを使用してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子を標的破壊することによって作製した（Ｙａｍａｎｅらの米国特許公開第２００４０１１０７０４号およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４年）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７巻：６１４〜２２頁を参照）。別の例として、ＨａｎａｉらのＥＰ１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードしているＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載しており、これにより、アルファ１，６結合関連の酵素の低下または排除によって、そのような細胞系中で発現された抗体は低フコシル化を示す。Ｈａｎａｉらはまた、抗体のＦｃ領域と結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素活性が低いか、または酵素活性を有さない細胞系、たとえばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）を記載している。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に付着させる能力が低下しており、やはりその宿主細胞中で発現された抗体の低フコシル化をもたらす、バリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞を記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁も参照）。ＵｍａｎａらのＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２号は、操作した細胞系中で発現された抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（たとえばベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作した細胞系を記載している（Ｕｍａｎａら（１９９９年）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７巻：１７６〜１８０頁も参照）。あるいは、フコシダーゼ酵素を使用して抗体のフコース残基を切断して除去し得る。たとえば、フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼがフコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，  Ａ．Ｌ．ら（１９７５年）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４巻：５５１���〜２３頁）。
【０１７１】
それに加えてまたは代わって、グリコシル化の種類の変更を有する抗体を作製することができ、その変更は、抗体のシアリル化（ｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）のレベルに関する。そのような変更は、どちらもその全体が参考として組み込まれているＤｉｃｋｅｙらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０８４９２６号およびＲａｖｅｔｃｈらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０５５９１６号に記載されている。たとえば、たとえばＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｅｎｓのシアリダーゼなどのシアリダーゼを用いた酵素反応を用い得る。そのような反応の条件は、一般に、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，８３１，０７７号に記載されている。適切な酵素の他の非限定的な例は、それぞれＳｃｈｌｏｅｍｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５巻（４号）、８８２〜８９３頁（１９７５年）およびＬｅｉｂｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３３８巻、５２９〜５３８頁（１９９９年）に記載されているノイラミニダーゼおよびＮ−グリコシダーゼＦである。脱シアリル化された抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを使用することによってさらに精製し得る。あるいは、シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素を用いることなどによる、シアリル化のレベルを増加させる方法を用い得る。そのような反応の条件は、一般に、Ｂａｓｓｅｔら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５１巻（３号）、３０７〜３１１頁（２０００年）に記載されている。
【０１７２】
本発明によって企図される本明細書中の抗体の別の改変はペグ化である。抗体は、たとえば抗体の生物学的（たとえば血清）半減期を増加させるためにペグ化することができる。抗体をペグ化するためには、抗体またはその断片を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片と付着される条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性の水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施する。本明細書中で使用する用語「ポリエチレングリコール」には、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のうちの任意のものが包含されることを意図する。特定の実施形態では、ペグ化する抗体はグリコシル化されていない抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。たとえば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらのＥＰ０  １５４  ３１６号およびＩｓｈｉｋａｗａらのＥＰ０  ４０１  ３８４号を参照されたい。したがって、ここに記載されているペグ化方法は、以下に記載の本発明のペプチド性分子にも適用される。
【０１７３】
抗体断片および抗体模倣体
本発明は伝統的な抗体に限定されず、抗体断片および抗体模倣体を使用することによって実施し得る。以下に詳述するように、多種多様な抗体断片および抗体模倣体の技術が現在では開発されており、当技術分野で広く公知である。これらの技術のうちのいくつかでは（ドメイン抗体、ナノボディ、およびＵｎｉＢｏｄｙなど）、伝統的な抗体構造の断片または他の改変を使用するが、伝統的な抗体結合を模倣する一方で明白に異なる機構を介して産生されて機能する結合構造を用いる、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディなどの代替技術も存在する。これらの代替構造の一部はＧｉｌｌおよびＤａｍｌｅ  （２００６年）  １７巻：６５３〜６５８頁中に総説されている。
【０１７４】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）とは、抗体の最も小さな機能的結合単位であり、ヒト抗体重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のどちらかの可変領域に対応する。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全にヒトのＶＨおよびＶＬ  ｄＡｂの一連の大きく高度に機能的なライブラリ（それぞれのライブラリ中に１００億個を超える異なる配列）、ならびに治療標的に特異的なｄＡｂを選択するためのこれらのライブラリの使用を開発している。多くの慣用の抗体と対照的に、ドメイン抗体は、細菌、酵母、および哺乳動物の細胞系中で良好に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第６，２９１，１５８号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，１７２，１９７号、第６，６９６，２４５号、米国出願第２００４／０１１０９４１号、欧州特許出願第１４３３８４６号、欧州特許第０３６８６８４号および第０６１６６４０号、ＷＯ０５／０３５５７２号、ＷＯ０４／１０１７９０号、ＷＯ０４／０８１０２６号、ＷＯ０４／０５８８２１号、ＷＯ０４／００３０１９号およびＷＯ０３／００２６０９号を参照することによって得ることができる。
【０１７５】
ナノボディとは、天然に存在する重鎖抗体のユニークな構造的および機能的特性を含有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、１個の可変ドメイン（ＶＨＨ）ならびに２個の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含有する。重要なことに、クローニングおよび単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能力を保有する完全に安定なポリペプチドである。ナノボディはヒト抗体のＶＨドメインと高い相同性を有しており、活性を全く失わずにさらにヒト化することができる。重要なことに、ナノボディは低い免疫原性の可能性を有しており、これはナノボディリード化合物を用いた霊長類の研究で確認されている。
【０１７６】
ナノボディは、慣用の抗体の利点を小分子薬の重要な特長と組み合わせる。慣用の抗体と同様、ナノボディは、高い標的特異性、その標的に対する高い親和性および低い固有の毒性を示す。しかし、小分子薬と同様、これらは酵素を阻害し、受容体のくぼみ（ｃｌｅｆｔ）に容易に接近することができる。さらに、ナノボディは非常に安定であり、注射以外の手段によって投与することができ（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ０４／０４１８６７号を参照）、製造が容易である。ナノボディの他の利点には、その大きさが小さいことの結果として、一般的ではないかまたは隠れたエピトープを認識すること、そのユニークな三次元の薬物様式の柔軟性によって高い親和性および選択性でタンパク質標的の空洞または活性部位内に結合すること、半減期の調整（ｔａｉｌｏｒ）、ならびに創薬の容易性および速度が含まれる。
【０１７７】
ナノボディは単一の遺伝子によってコードされており、ほとんどすべての原核生物および真核生物の宿主、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＵＳ６，７６５，０８７号を参照）、カビ（たとえば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）および酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ）（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＵＳ６，８３８，２５４号を参照）中で効率的に産生される。産生プロセスは拡張性があり、複数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは慣用の抗体と比較して優れた安定性を示すため、これらは、長い貯蔵寿命のすぐに使用できる溶液として処方することができる。
【０１７８】
Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ方法（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ０６／０７９３７２号を参照）とは、Ｂ細胞の自動の高スルーアウト（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ）の選択に基づいており、本発明との関係において使用することができる、所望の標的に対するナノボディを生じるための正当な方法である。
【０１７９】
ＵｎｉＢｏｄｙは別の抗体断片技術であるが、これはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づいている。ヒンジ領域の欠失は、伝統的なＩｇＧ４抗体の本質的に半分の大きさであり、ＩｇＧ４抗体の二価の結合領域の代わりに一価の結合領域を有する分子をもたらす。また、ＩｇＧ４抗体は不活性であり、したがって免疫系と相互作用しないことが周知であり、これは、免疫応答が所望されない疾患の処置に有利な場合があり、この利点はＵｎｉＢｏｄｙに伝えられる。たとえば、ＵｎｉＢｏｄｙは、結合している細胞を阻害またはサイレンシングするように機能し得るが、死滅はさせない。さらに、がん細胞と結合するＵｎｉＢｏｄｙは、それが増殖するように刺激しない。さらに、ＵｎｉＢｏｄｙは伝統的なＩｇＧ４抗体の約半分の大きさであるため、潜在的に有利な有効性を伴って、より大きな固形腫瘍にわたってより良好な分布を示し得る。ＵｎｉＢｏｄｙは、完全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体からクリアランスされ、その抗原に対して完全抗体と同様の親和性で結合することができる。ＵｎｉＢｏｄｙのさらなる詳細は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている特許出願ＷＯ２００７／０５９７８２を参照することによって得ることができる。
【０１８０】
アドネクチン分子とは、フィブロネクチンタンパク質の１つまたは複数のドメインに由来する操作した結合タンパク質である。フィブロネクチンは、人体中に天然に存在する。これは細胞外基質中に不溶性の糖タンパク質二量体として存在し、リンカータンパク質としても役割を果たす。また、これは血漿中でジスルフィド連結二量体として可溶性形態でも存在する。フィブロネクチンの血漿形態は肝臓細胞（肝細胞）によって合成され、ＥＣＭ形態は軟骨細胞、マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞、および上皮の一部の細胞によって産生される（Ｗａｒｄ  Ｍ．およびＭａｒｃｅｙ，  Ｄ．、ｃａｌｌｕｔｈｅｒａｎ．ｅｄｕ／Ａｃａｄｅｍｉｃ＿Ｐｒｏｇｒａｍｓ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ＢｉｏＤｅｖ／ｏｍｍ／ｆｉｂｒｏ／ｆｉｂｒｏ．ｈｔｍを参照）。既に言及したように、フィブロネクチンは、細胞接着分子として天然で機能し得るか、または細胞外基質中で接触させることによって細胞の相互作用を媒介し得る。典型的には、フィブロネクチンは３つの異なるタンパク質モジュール、すなわちＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型モジュールからできている。フィブロネクチンの機能の構造の総説には、ＰａｎｋｏｖおよびＹａｍａｄａ  （２００２年）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１５巻（パート２０）：３８６１〜３頁、ＨｏｈｅｎｅｓｔｅｒおよびＥｎｇｅｌ  （２００２年）  ２１巻：１１５〜１２８頁、ならびにＬｕｃｅｎａら（２００７年）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｃｌｉｎ．４８巻：２４９〜２６２頁を参照されたい。
【０１８１】
好ましい実施形態では、アドネクチン分子は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインから、２つのベータシートの間に分布した複数のベータストランドから構成されるネイティブタンパク質を変更することによって誘導する。起源の組織に応じて、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｇ）は、たとえば１Ｆｎ３、２Ｆｎ３、３Ｆｎ３などを表示し得る複数のＩＩＩ型ドメインを含有し得る。１０Ｆｎ３ドメインは、インテグリン結合モチーフを含有し、ベータストランドを接続する３つのループをさらに含有する。これらのループは、ＩｇＧ重鎖の抗原結合ループに対応するものと考えてよく、目的の標的、たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体と特異的に結合させるために、以下に記述した方法によって変更し得る。好ましくは、本発明の目的に有用なフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ、ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から受託コード：１ｔｔｇで入手することができるフィブロネクチンＩＩＩ型分子の構造をコードしている配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示す配列である。また、アドネクチン分子は、単純な単量体の１０Ｆｎ３構造ではなく１０Ｆｎ３関連分子のポリマーから誘導してもよい。
【０１８２】
ネイティブ１０Ｆｎ３ドメインは典型的にはインテグリンと結合するが、アドネクチン分子となるように適応させられた１０Ｆｎ３タンパク質は、目的の抗原、たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体と結合するように変更されている。一実施形態では、１０Ｆｎ３分子への変更は、ベータストランドへの少なくとも１つの変異を含む。好ましい実施形態では、１０Ｆｎ３分子のベータストランドを接続するループ領域は、ヒト受容体チロシンキナーゼ、たとえばＦＧＦＲまたはＩＶ型受容体チロシンキナーゼの非対称性の接触境界領域と結合するように変更されている。
【０１８３】
１０Ｆｎ３中の変更は、それだけには限定されないが、誤りがちなＰＣＲ、部位特異的変異誘発、ＤＮＡシャフリング、または本明細書中で参照した他の種類の組換え変異誘発を含めた、当技術分野で公知の任意の方法によって行い得る。一例では、１０Ｆｎ３配列をコードしているＤＮＡのバリアントｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接合成し、後にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写および翻訳し得る。あるいは、標準の方法を使用して天然の１０Ｆｎ３配列をゲノムから単離またはクローニングし（たとえば米国特許出願第２００７００８２３６５号に記載のように行う）、その後、当技術分野で公知の変異誘発方法を使用して変異させてもよい。
【０１８４】
一実施形態では、標的タンパク質、たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体を、カラムのレジンまたはマイクロタイタープレート中のウェルなどの固体支持体上に固定し得る。その後、標的を潜在的な結合タンパク質のライブラリと接触させる。ライブラリは、１０Ｆｎ３配列の変異誘発／ランダム化または１０Ｆｎ３ループ領域（ベータストランドではない）の変異誘発／ランダム化によって野生型１０Ｆｎ３から誘導した、１０Ｆｎ３クローンまたはアドネクチン分子を含み得る。好ましい実施形態では、ライブラリは、Ｓｚｏｓｔａｋら、米国出願第０９／００７，００５号および第０９／２４７，１９０号、Ｓｚｏｓｔａｋら、ＷＯ９８９／３１７００、ならびにＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ  （１９９７年）  ９４巻：１２２９７〜１２３０２頁に記載の技法によって作製したＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリであり得る。また、ライブラリは、ＤＮＡ−タンパク質ライブラリであってもよい（たとえば、Ｌｏｈｓｅ、米国出願第６０／１１０，５４９号、米国出願第０９／４５９，１９０号、およびＷＯ００／３２８２３号に記載）。その後、融合ライブラリを固定した標的（たとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域）と共にインキュベートし、固体支持体を洗浄して非特異的結合部分を除去する。その後、緊密に結合したものをストリンジェントな条件下で溶出させ、ＰＣＲを使用して、遺伝情報を増幅するか、または結合分子の新しいライブラリを作製してプロセスを繰り返す（さらなる変異誘発を用いてまたは用いずに）。選択／変異誘発のプロセスは、十分な親和性で標的と結合したものが得られるまで繰り返し得る。本発明で使用するためのアドネクチン分子を、Ｂｒｉｓｔｏｎ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ企業であるＡｄｎｅｘｕｓによって用いられるＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）技術を使用して操作し得る。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ技術を、上記で参照した技法に基づいて開発した（たとえばＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ  （１９９７年）  ９４巻：１２２９７〜１２３０２頁）。変更された１０Ｆｎ３ドメインのライブラリを作製し、本発明で使用し得る適切に結合するもの（ｂｉｎｄｅｒ）を選択する方法は、以下の米国特許および特許出願の文書中に完全に記載されており、本明細書中に参考として組み込まれている：米国特許第７，１１５，３９６号、第６，８１８，４１８号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、第７，１９５，８８０号、第６，４１６，９５０号、第６，２１４，５５３号、第６６２３９２６号、第６，３１２，９２７号、第６，６０２，６８５号、第６，５１８，０１８号、第６，２０７，４４６号、第６，２５８，５５８号、第６，４３６，６６５号、第６，２８１，３４４号、第７，２７０，９５０号、第６，９５１，７２５号、第６，８４６，６５５号、第７，０７８，１９７号、第６，４２９，３００号、第７，１２５，６６９号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、ならびに米国特許出願第２００７００８２３６５号、第２００５０２５５５４８号、第２００５００３８２２９号、第２００３０１４３６１６号、第２００２０１８２５９７号、第２００２０１７７１５８号��第２００４００８６９８０号、第２００４０２５３６１２号、第２００３００２２２３６号、第２００３００１３１６０号、第２００３００２７１９４号、第２００３００１３１１０号、第２００４０２５９１５５号、第２００２０１８２６８７号、第２００６０２７０６０４号、第２００６０２４６０５９号、第２００３０１００００４号、第２００３０１４３６１６号、および第２００２０１８２５９７号。１０Ｆｎ３などのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン中に多様性を生じさせ、次いで選択ステップを行うことは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または酵母表面ディスプレイ、たとえば、Ｌｉｐｏｖｓｅｋら（２００７年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６８巻：１０２４〜１０４１頁、Ｓｅｒｇｅｅｖａら（２００６年）  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ５８巻：１６２２〜１６５４頁、Ｐｅｔｔｙら（２００７年）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５巻：７〜１５頁、Ｒｏｔｈｅら（２００６年）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ６巻：１７７〜１８７頁、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  （２００５年）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：１１０５〜１１１６頁などの当技術分野で公知の他の方法を使用して達成し得る。
【０１８５】
当業者には、上記言及した参考文献中の方法を使用して、好ましい１０Ｆｎ３ドメイン以外のタンパク質から抗体擬態物を誘導し得ることが理解されよう。上記参照した方法によって抗体擬態物を作製するために使用することができるさらなる分子には、それだけには限定されないが、ヒトフィブロネクチンモジュール１Ｆｎ３〜９Ｆｎ３および１１Ｆｎ３〜１７Ｆｎ３ならびに非ヒト動物および原核生物からの関連するＦｎ３モジュールが含まれる。さらに、テネイシンおよびウンデュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）などの、１０Ｆｎ３と配列相同性を有する他のタンパク質からのＦｎ３モジュールも使用し得る。免疫グロブリン様の折り畳みを有する（が、ＶＨドメインと非関連の配列を有する）他の例示的なタンパク質には、Ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−２、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼインヒビター、Ｅ−カドヘリン、および抗生物質色素タンパク質が含まれる。関連構造を有するさらなるドメインは、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＶＣＡＭ−１のＣ２およびＩセットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩセット免疫グロブリンの折り畳み、ミオシン結合タンパク質ＨのＩセット免疫グロブリンの折り畳み、テロキンのＩセット免疫グロブリンの折り畳み、テリキン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、ＧＣ−ＳＦ受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、ベータ−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ならびにトランスグルタミナーゼに由来し得る。あるいは、１つまたは複数の免疫グロブリン様の折り畳みが含まれる任意の他のタンパク質を利用して、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎｇ）様結合部分を作製し得る。そのようなタンパク質は、たとえばプログラムＳＣＯＰを使用して同定し得る（Ｍｕｒｚｉｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４７巻：５３６頁（１９９５年）、Ｌｏ  Ｃｏｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：２５７頁（２０００年））。
【０１８６】
アプタマーは、本発明によって包含される別の種類の抗体模倣体である。アプタマーとは、典型的には、特定の分子標的と結合する小さなヌクレオチドポリマーである。アプタマーは一本鎖または二本鎖の核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得るが、ＤＮＡに基づくアプタマーは、最も一般的には二本鎖である。アプタマー核酸には定義された長さは存在しない。しかし、アプタマー分子は、最も一般的には１５〜４０個のヌクレオチドの長さである。
【０１８７】
アプタマーはしばしば複雑な三次元構造を形成し、これが標的分子に対するその親和性を決定する。アプタマーは、ほぼ完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作および増幅できることが主な理由で、単純な抗体を超える多くの利点を提供することができる。さらに、アプタマーは、多くの場合に免疫応答をわずかにしか誘導しないか、または誘導しない。
【０１８８】
アプタマーは様々な技法を使用して作製し得るが、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ．  （１９９０年）  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４６巻（６２８７号）：８１８〜２２頁）およびＳＥＬＥＸ方法（指数関数的な富化によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９２年．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２８巻（３号）：８６２〜９頁）を使用して、もともとは開発された。すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ．  Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  ＩＳＢＮ：９７８−３−５２７−３１０５９−３、Ｕｌｒｉｃｈら、２００６年．  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ９巻（８号）：６１９〜３２頁、Ｃｅｒｃｈｉａおよびｄｅ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｓ．  ２００７年．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３６１巻：１８７〜２００頁、ＩｒｅｓｏｎおよびＫｅｌｌａｎｄ．  ２００６年．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００６年  ５巻（１２号）：２９５７〜６２頁、米国特許第５５８２９８１号、第５８４０８６７号、第５７５６２９１号、第６２６１７８３号、第６４５８５５９号、第５７９２６１３号、第６１１１０９５号、ならびに米国特許出願第１１／４８２，６７１号、第１１／１０２，４２８号、第１１／２９１，６１０号、および第１０／６２７，５４３号を含めた、アプタマーを作製する他の方法およびその使用が公開されている。
【０１８９】
ＳＥＬＥＸ方法が明らかに最も一般的であり、３つの基本的なステップで実施する。第１に、候補核酸分子のライブラリを特定の分子標的との結合に関して選択する。第２に、標的に対して十分な親和性を有する核酸を、結合しないものから分離する。第３に、結合した核酸を増幅し、第２のライブラリを形成し、このプロセスを繰り返す。それぞれの反復に際して、標的分子に対してより高い親和性を有するアプタマーが選択される。ＳＥＬＥＸ方法は、本明細書中に参考として組み込まれている以下の出版物中により完全に記載されている：Ｂｕｇａｕｔら、２００６年．  ４巻（２２号）：４０８２〜８頁、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇら、２００７年  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２００７年  ２４巻（４号）：３８１〜４０３頁、およびＧｏｐｉｎａｔｈ．  ２００７年．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７年．  ３８７巻（１号）：１７１〜８２頁。
【０１９０】
また、本発明の「アプタマー」には、ヌクレオチドの代わりにペプチドから作製されたアプタマー分子も含まれる。ペプチドアプタマーはヌクレオチドアプタマーと多くの特性を共有し（たとえば、大きさが小さいこと、および高い親和性で標的分子と結合する能力）、ヌクレオチドアプタマーを作製するために使用したものと同様の原理を有する選択方法によって作製し得る。たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＢａｉｎｅｓおよびＣｏｌａｓ．  ２００６年．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．  １１巻（７〜８号）：３３４〜４１頁ならびにＢｉｃｋｌｅら、２００６年．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  １巻（３号）：１０６６〜９１頁。
【０１９１】
アフィボディ分子とは、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する、５８個のアミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく新しいクラスの親和性タンパク質を表す。この３つのヘリックスバンドルのドメインは、コンビナトリアルファージミドライブラリを構築するための骨格として使用されており、これから、ファージディスプレイ技術を使用して、所望の分子を標的とするアフィボディバリアントを選択することができる（Ｎｏｒｄ  Ｋ、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  Ｅ、Ｒｉｎｇｄａｈｌ  Ｊ、Ｓｔａｈｌ  Ｓ、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ、Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７年、１５巻：７７２〜７頁。Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ、Ｇｒｏｎｌｕｎｄ  Ｈ、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ、Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  （ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２年、２６９巻：２６４７〜５５頁）。アフィボディ分子の単純かつ堅調な構造とその低分子量（６ｋＤａ）とが組み合わされることで、これらは多種多様な応用、たとえば、検出試薬として（Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ、Ｈａｎｓｓｏｎ  Ｍ、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２年、２６１巻：１９９〜２１１頁）および受容体の相互作用の阻害（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ  Ｋ、Ｘｕ  Ｚ、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｇ、Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ２８−ＣＤ８０  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｙ  ａ  ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００３年、１６巻：６９１〜７頁）に適切となる。いくつかの実施形態では、アフィボディは、それを分泌コンパートメント中に存在させるように、ＫＤＥＬを用いて抗体配列を伸長することによって細胞内抗体として保持されるように改変される（たとえばＶｅｒｎｅｔら（２００９年）Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２５巻（６号）：４１７〜４２３頁を参照されたい）。アフィボディおよびその産生方法のさらなる詳細は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，８３１，０１２号を参照することによって得ることができる。
【０１９２】
ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ））は、非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するために開発された抗体模倣体ＤＲＰ（設計反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））技術の一例である。アンキリンなどの反復タンパク質またはロイシンリッチな反復タンパク質は遍在性の結合分子であり、これらは、抗体とは異なり、細胞内および細胞外に存在する。そのユニークなモジュール構造は反復する構造単位（反復）を特長とし、これらは一緒に積み重なって、可変性かつモジュール式の標的結合表面を示す細長い反復ドメインを形成する。このモジュラリティに基づいて、高度に多様化した結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを作製することができる。この戦略には、可変性の表面残基を示す自己適合性反復のコンセンサス設計および反復ドメインへのそのランダムアセンブリが含まれる。
【０１９３】
ＤＡＲＰｉｎは細菌発現系中で非常に高い収率で産生させることができ、これらは公知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含めた幅広い範囲の標的タンパク質に対する、特異性の高い高親和性のＤＡＲＰｉｎが選択されている。１桁のナノモルからピコモルの範囲の親和性を有するＤＡＲＰｉｎを得ることができる。
【０１９４】
ＤＡＲＰｉｎは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップの応用、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含めた、広い範囲の応用で使用されている。また、ＤＡＲＰｉｎは、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合した細胞内マーカータンパク質として、細胞内区画中で活性が高いことも証明された。さらに、ＤＡＲＰｉｎはｐＭ範囲のＩＣ５０でウイルス進入を阻害するために使用された。ＤＡＲＰｉｎは、タンパク質−タンパク質の相互作用を遮断するためだけでなく、酵素を阻害するためにも理想的である。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの、ほとんどの場合はアロステリックな様式での阻害が成功している。非常に速く特異的な腫瘍上の富化および非常に好ましい腫瘍対血液の比により、ＤＡＲＰｉｎはｉｎ  ｖｉｖｏ診断または治療手法に非常に適したものとなっている。
【０１９５】
ＤＡＲＰｉｎおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報は、どちらもその全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第２００４／０１３２０２８号および国際特許出願公開ＷＯ０２／２０５６５号中に見つけることができる。
【０１９６】
アンチカリンはさらなる抗体模倣体の技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒトの組織および体液中で天然かつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、化学的感受性化合物または不溶性化合物の生理的輸送および貯蔵に関連する様々な機能をｉｎ  ｖｉｖｏで行うように進化している。リポカリンは、タンパク質の一方の末端で、４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む堅調な固有の構造を有する。これらのループは、結合ポケットへの入り口を形成し、分子のこの部分中のコンフォメーションの相違が、個々のリポカリン間の結合特異性の変動の原因となっている。
【０１９７】
保存されたβ−シートフレームワークによって支持される超可変ループの全体的な構造は免疫グロブリンを連想させるが、リポカリンは、大きさに関して抗体とは相当に異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０〜１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖から構成されている。
【０１９８】
リポカリンをクローニングし、そのループを操作に供して、アンチカリンを作製する。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが作製されており、アンチカリンディスプレイにより、結合機能の選択およびスクリーニング、次いで原核生物または真核生物系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生が可能となる。研究により、事実上任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンを開発することができ、単離することができ、ナノモル以上の範囲の結合親和性を得ることができることを示すことに成功している。
【０１９９】
また、アンチカリンは、二重標的化タンパク質、いわゆるＤｕｏｃａｌｉｎとしての形式とすることもできる。Ｄｕｏｃａｌｉｎは、標準の製造プロセスを使用して容易に生成される１つの単量体タンパク質において２つの別々の治療標的と結合し、その一方で、その２つの結合ドメインの構造配向にかかわらず、標的特異性および親和性を保持する。
【０２００】
単一の分子による複数の標的の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、複数の原因因子の関与が公知である疾患において特に有利である。さらに、Ｄｕｏｃａｌｉｎなどの二価または多価の結合様式は、疾患における細胞表面分子の標的化、シグナル伝達経路におけるアゴニスト効果の媒介、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介した増強された内在化効果の誘導において顕著な潜在性を有する。さらに、Ｄｕｏｃａｌｉｎの高い固有の安定性は単量体のアンチカリンに匹敵し、Ｄｕｏｃａｌｉｎに柔軟な処方および送達潜在性を提供する。
【０２０１】
アンチカリンに関するさらなる情報は、どちらもその全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第７，２５０，２９７号および国際特許出願公開ＷＯ９９／１６８７３号中に見つけることができる。
【０２０２】
本発明との関係において有用な別の抗体模倣体の技術はアビマーである。アビマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのエクソンシャフリングおよびファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから進化しており、結合および阻害の特性を有する複数ドメインのタンパク質を生じる。複数の独立した結合ドメインの連結によりアビディティが生じることが示されており、慣用の単一エピトープの結合タンパク質と比較して改善された親和性および特異性がもたらされる。他の潜在的な利点には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける複数標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、改善された熱安定性およびプロテアーゼに対する耐性が含まれる。ナノモル以下の親和性を有するアビマーが様々な標的に対して得られている。
【０２０３】
アビマーに関するさらなる情報は、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許出願第２００６／０２８６６０３号、第２００６／０２３４２９９号、第２００６／０２２３１１４号、第２００６／０１７７８３１号、第２００６／０００８８４４号、第２００５／０２２１３８４号、第２００５／０１６４３０１号、第２００５／００８９９３２号、第２００５／００５３９７３号、第２００５／００４８５１２号、第２００４／０１７５７５６号中に見つけることができる。
【０２０４】
バーサボディは、本発明との関係において使用できる別の抗体模倣体の技術である。バーサボディとは、＞１５％のシステインを有する３〜５ｋＤａの小さなタンパク質であり、高いジスルフィド密度の骨格を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアを置き換えている。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸を少数のジスルフィドで置き換えることで、より小さく、より親水性であり（凝集および非特異的結合がより少ない）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性であり、より低い密度のＴ細胞エピトープを有するタンパク質がもたらされる。なぜならば、ＭＨＣ提示に最も寄与する残基は疎水性残基であるからである。これらの４つの特性はすべて、免疫原性に影響を与えることが周知であり、これらが一緒になって免疫原性の大きな減少を引き起こすと予想される。
【０２０５】
バーサボディのインスピレーションは、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびイソギンチャク（ａｎｅｍｏｎｅ）によって産生される天然の注射用生物製薬（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）から得られており、これは、予想外に低い免疫原性を示すことが公知である。選択された天然タンパク質ファミリーから開始して、設計およびスクリーニングによって、大きさ、疎水性、タンパク質分解性抗原プロセッシング、およびエピトープ密度を天然の注射用タンパク質の平均よりもはるかに低いレベルまで最小化する。
【０２０６】
バーサボディの構造を考慮すると、これらの抗体模倣体は、多結合価、多特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含めた多用途の様式を提供する。さらに、バーサボディはＥ．ｃｏｌｉ中で高い収率で製造され、また、その親水性および小さな大きさのため、バーサボディは可溶性が高く、高濃度で処方することができる。バーサボディは並外れて熱安定性であり（煮沸することができる）、長い貯蔵寿命を提供する。
【０２０７】
バーサボディに関するさらなる情報は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第２００７／０１９１２７２号中に見つけることができる。
【０２０８】
ＳＭＩＰ（商標）（小モジュール免疫製薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）−Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、標的結合、エフェクター機能、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、および発現レベルが維持および最適化されるように操作されている。ＳＭＩＰは、３つの明白に異なるモジュールドメインからなる。第１に、これらは、特異性を与える任意のタンパク質（たとえば、細胞表面受容体、単鎖抗体、可溶性タンパク質など）からなり得る結合ドメインを含有する。第２に、これらは、結合ドメインとエフェクタードメインとの間の柔軟なリンカーとして機能するヒンジドメインを含有し、ＳＭＩＰ薬物の多量体化の制御も助ける。最後に、ＳＭＩＰは、Ｆｃドメインまたは他の特別に設計したタンパク質を含めた様々な分子から由来し得るエフェクタードメインを含有する。様々な異なる結合、ヒンジ、およびエフェクタードメインを有するＳＭＩＰの単純な構築を可能にする設計のモジュラリティは、迅速かつカスタマイズ可能な薬物設計を提供する。
【０２０９】
どのようにして設計するかの例を含めた、ＳＭＩＰに関するさらなる情報は、Ｚｈａｏら（２００７年）  Ｂｌｏｏｄ  １１０巻：２５６９〜７７頁ならびに米国特許出願第２００５０２３８６４６号、第２００５０２０２５３４号、第２００５０２０２０２８号、第２００５０２０２０２３号、第２００５０２０２０１２号、第２００５０１８６２１６号、第２００５０１８０９７０号、および第２００５０１７５６１４号中（これらは、各々、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている）に見つけ得る。
【０２１０】
上記に提供した抗体断片および抗体模倣体の技術の詳細な説明は、本明細書との関係において使用できるすべての技術の包括的なリストであることを意図しない。たとえば、やはり限定するものではないが、ポリペプチドに基づく代替技術を含めた様々な追加の技術、たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＱｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５巻（８号）  ９２１〜９２９頁（２００７年）中に概要が示されている相補性決定領域の融合、ならびにすべて本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，７８９，１５７号、第５，８６４，０２６号、第５，７１２，３７５号、第５，７６３，５６６号、第６，０１３，４４３号、第６，３７６，４７４号、第６，６１３，５２６号、第６，１１４，１２０号、第６，２６１，７７４号、および第６，３８７，６２０号に記載されているＲＮＡアプタマー技術などの核酸に基づく技術を、本発明との関係において使用することができる。
【０２１１】
抗体の物理特性
ＲＴＫの非対称性の接触境界領域と結合する本発明の抗体は、様々な物理特性によってさらに特徴づけされ得る。様々なアッセイを使用して、これらの物理特性に基づいて様々な抗体のクラスを検出および／または区別し得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のどちらかの中に１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。可変領域中の１つまたは複数のグリコシル化部位の存在は、変更された抗原結合による、抗体の免疫原性の増加または抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９７２年）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１巻：６７３〜７０２頁、Ｇａｌａ  ＦＡおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ  （２００４年）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２巻：５４８９〜９４頁、Ｗａｌｌｉｃｋら（１９８８年）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８巻：１０９９〜１０９頁、Ｓｐｉｒｏ  ＲＧ  （２００２年）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２巻：４３Ｒ〜５６Ｒ頁、Ｐａｒｅｋｈら（１９８５年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１６巻：４５２〜７頁、Ｍｉｍｕｒａら（２０００年）  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７巻：６９７〜７０６頁）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こることが公知である。可変領域のグリコシル化を、Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔアッセイを使用して試験でき、これは、抗体を切断してＦａｂを生成し、その後、過ヨウ素酸塩の酸化およびシッフ塩基の形成を測定するアッセイを使用してグリコシル化について試験し得る。あるいは、可変領域のグリコシル化は、Ｄｉｏｎｅｘライトクロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ）を使用して試験され得、これは、Ｆａｂからの糖類を単糖へと切断し、個々の糖類含有量を分析する。一部の例では、可変領域のグリコシル化を含有しない抗体を有することが好ましい場合がある。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによって、または当技術分野で周知の標準の技法を使用してグリコシル化モチーフ内の残基を変異させることによって達成することができる。
【０２１３】
それぞれの抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有するが、一般に、抗体は６〜９．５のｐＨ範囲となる。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲となり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲となる。抗体は、この範囲の外のｐＩを有し得る。効果は一般に知られていないが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でいくらかの折り畳みの崩れ（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）および不安定性を有し得ると推測されている。等電点は、ｐＨ勾配を生じるキャピラリー等電点電気泳動アッセイを使用して試験してよく、正確さを増すためにレーザー集束を利用し得る（Ｊａｎｉｎｉら（２００２年）  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３巻：１６０５〜１１頁、Ｍａら（２００１年）  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ５３巻：Ｓ７５〜８９頁、Ｈｕｎｔら（１９９８年）  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８００巻：３５５〜６７頁）。一部の例では、正常な範囲内となるｐＩ値を含有する抗体を有することが好ましい。これは、正常な範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、または当技術分野で周知の標準の技法を使用して荷電表面残基を変異させることによって達成することができる。
【０２１４】
それぞれの抗体は、熱安定性の指標である融解温度を有する（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ＲおよびＭａｎｎｉｎｇ  ＭＣ  （２００２年）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３巻：３６１〜７１頁）。より高い熱安定性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより高い全体的な抗体の安定性を示す。抗体の融点は、示差走査熱量測定などの技法を使用して測定し得る（Ｃｈｅｎら（２００３年）  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０巻：１９５２〜６０頁、Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９年）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８巻：４７〜５２頁）。ＴＭ１は、抗体の最初の折り畳みの崩れの温度を示す。ＴＭ２は、抗体の完全な折り畳みの崩れの温度を示す。一般に、本発明の抗体のＴＭ１は６０℃より高いことが好ましく、好ましくは６５℃より高く、さらにより好ましくは７０℃より高い。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を使用して測定し得る（Ｍｕｒｒａｙら（２００２年）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０巻：３４３〜９頁）。
【０２１５】
好ましい実施形態では、迅速に分解されない抗体が所望され得る。抗体の断片化は、当技術分野で十分に理解されているように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定し得る（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＡＪおよびＨｕｇｈｅｓ  ＤＥ  （１９９５年）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７巻：３６２６〜３２頁）。
【０２１６】
別の好ましい実施形態では、最小限の凝集効果を有する抗体を選択する。凝集は、望まない免疫応答の惹起および／または変更されたかもしくは望ましくない薬物動態学的特性をもたらし得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集を、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および光散乱を含めた当技術分野で周知のいくつかの技法によって測定し、単量体、二量体、三量体または多量体を同定し得る。
【０２１７】
本発明のポリクローナル抗体の産生
本発明のポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な技法によって産生させることができる。ポリクローナル抗体は様々なＢ細胞系に由来し、したがって、同じ抗原上の複数のエピトープを認識し得る。ポリクローナル抗体は、典型的には、適切な哺乳動物を、目的の抗原、たとえばＲＴＫの非対称性接触境界領域で免疫化することによって産生させる。ポリクローナル抗体の産生にしばしば使用される動物は、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、ヒツジ、および最も一般的にはウサギである。ポリクローナル抗体を産生させる標準の方法は当技術分野で広く公知であり、本発明の方法と組み合わせることができる（たとえば、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｍ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｂｋｉｔｔｏ／Ｋｉｔｔｏｌａｂｐａｇｅ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＰＡｂ．ｈｔｍｌ、米国特許第４，７１９，２９０号、第６，３３５，１６３号、第５，７８９，２０８号、第２，５２０，０７６号、第２，５４３，２１５号、および第３，５９７，４０９号）。
【０２１８】
本発明のモノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、慣用のモノクローナル抗体方法、たとえば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５年）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技法を含めた、様々な技法によって産生させることができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原理上は、モノクローナル抗体を産生させる他の技法、たとえば、Ｂリンパ球のウイルスまたは腫瘍発生性形質転換を用いることができる。抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域、例えば、線維芽細胞増殖因子受容体上の任意のエピトープ、本明細書中に記述したコンセンサス（ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ）配列、あるいは本明細書中に記載の任意のコンフォメーション、不連続、または直鎖状エピトープに対して産生させ得ることに留意されたい。
【０２１９】
当技術分野で公知のいくつかの方法が、目的の不連続エピトープと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の特異的な選択に有用である。たとえば、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国公開第２００５／０１６９９２５号に開示されている技法は、タンパク質配列内の２つの異なるペプチドと結合する抗体の選択を可能にする。そのような方法は、本明細書中に開示したコンフォメーションおよび不連続エピトープを特異的に標的とするために、本発明に従って使用し得る。コンフォメーションエピトープがタンパク質の二次的構造である場合、そのような構造は、しばしば、より小さなペプチド（たとえば＜５０個のアミノ酸）中でより容易に形成される。したがって、動物をより小さなペプチドで免疫化することで、一部のコンフォメーションエピトープを捕らえることができる。あるいは、コンフォメーションエピトープを含む２つの小さなペプチドを柔軟なリンカー（たとえば、ポリグリコール、または極性の非荷電のアミノ酸のストレッチ）で接続させ得る。リンカーは、ペプチドが様々な相互作用の配向を探索することを可能にする。この構築体を用いた免疫化、次いで適切なスクリーニングにより、コンフォメーションエピトープに向けられた抗体の同定が可能となる場合がある。好ましい実施形態では、ＲＴＫの特定のドメイン（たとえば、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域）で動物を免疫化し、続いて目的のエピトープと結合する抗体についてスクリーニングすることによって、特定のコンフォメーションまたは直鎖状エピトープに対するペプチドを作製し得る。一実施形態では、低温電子顕微鏡観察（Ｊｉａｎｇら（２００８年）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻、１１３０〜１１３４頁、Ｊｏａｃｈｉｍ  （２００６年）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ＿ＩＳＢＮ：０１９５１８２１８９）を使用して、本発明の抗体または抗原結合断片によって結合されたエピトープを同定し得る。別の実施形態では、ＲＴＫまたはそのドメインを、結合した抗体またはその抗原結合断片と共に結晶化し、Ｘ線結晶構造解析によって分析して、結合した正確なエピトープを決定し得る。さらに、エピトープを、ＲＴＫ配列の一部分をマウスまたは別の種からの対応する配列で置き換えることによってマッピングし得る。目的のエピトープに向けられた抗体はヒト配列領域と選択的に結合し、したがって、標的エピトープを順次マッピングすることが可能である。このキメラに基づいたエピトープマッピングの技法は、様々な設定でのエピトープの同定における使用で成功している（その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれているＨｅｎｒｉｋｓｓｏｎおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  （１９９７年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  １０巻（６号）：５５９〜５６８頁、Ｎｅｔｚｅｒら（１９９９年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９年４月１６日、２７４巻（１６号）：１１２６７〜７４頁、Ｈｓｉａら（１９９６年）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９巻、５３〜６３頁を参照）。
【０２２０】
標的ＲＴＫ（たとえば線維芽細胞増殖因子受容体）中の目的のエピトープはグリコシル化されていないと考えられている。しかし、目的のＲＴＫがグリコシル化されている場合、抗体またはその抗原結合性一部分（および本発明の他の部分）を、関連するアミノ酸および／または糖残基と結合するように産生させ得る。たとえば、Ｋｉｔタンパク質は少なくとも１０箇所の潜在的なＮ連結グリコシル化の部位を有することが当技術分野で公知である（Ｍｏｒｓｔｙｎ、Ｆｏｏｔｅ、Ｌｉｅｓｃｈｋｅ  （２００４年）  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ：１５８８２９３０２５）。さらに、ＫｉｔはＯ連結グリコシル化およびシアル酸残基との付着を示し得ると考えられている（Ｗｙｐｙｃｈ  Ｊら（１９９５年）  Ｂｌｏｏｄ、８５巻（１号）：６６〜７３頁）。したがって、抗体またはその抗原結合性一部分（および本発明の他の部分）を、本明細書中で同定した任意のエピトープに付着していてもよい糖残基と結合するようにも産生させ得ることが企図される。この目的のために、目的の抗原性ペプチドを、正しくグリコシル化されるように動物細胞中で産生させてよく、その後、グリコシル化された抗原性ペプチドを使用して動物を免疫化し得る。グリコシル化されたペプチドを産生させるための適切な細胞および技法は当技術分野で公知であり、以下にさらに記載されている（たとえば、ＧｌｙｃｏＦｉ，Ｉｎｃ．、ニューハンプシャー州ＬｅｂａｎｏｎおよびＢｉｏＷａ、ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎから利用可能な技術を参照）。ペプチドの正しいグリコシル化を、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、酸加水分解（単糖の組成を決定するため）、化学的または酵素的切断、および質量分析（ＭＳ）などの任意の標準の方法を使用して試験して、グリカンを同定し得る。また、グリカン分析を加速させるためにレクチンに基づくアレイを使用するＰｒｏｃｏｇｎｉａ（ｐｒｏｃｏｇｎｉａ．ｃｏｍ）によって提供される技術も使用し得る。還元性アルカリ性切断もしくは「ベータ排除」、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー、および質量分析またはこれらの技法のうちの任意の組合せなどの技法を使用して、Ｏ−グリコシル化を具体的に検出し得る。
【０２２１】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は非常に良好に確立された手順である。免疫化プロトコルおよび融合のために免疫化した脾細胞を単離する技法は当技術分野で公知である。また、融合パートナー（たとえばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０２２２】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上述のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードしているＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、標準の分子生物学的技法を使用して非マウス（たとえばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。たとえば、キメラ抗体を作製するためには、当技術分野で公知の方法を使用してマウス可変領域をヒト定常領域に連結させることができる（たとえばＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。ヒト化抗体を作製するためには、当技術分野で公知の方法を使用してマウスＣＤＲ領域をヒトフレームワーク内に挿入することができる（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。あるいは、ヒトおよび非ヒト配列の知識が与えられた場合は、ヒト化抗体をＤＮＡまたはタンパク質レベルで設計し得る。そのような抗体を、直接化学合成し得るか、または、ＤＮＡを合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで発現させて、ヒト化抗体を産生させ得る。
【０２２３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体に向けられたそのようなヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫系の一部をマウス系の代わりに保有するトランスジェニックまたはトランス染色体マウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックおよびトランス染色体マウスには、本明細書中でそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭ  ｍｉｃｅ（商標）と呼ぶマウスが含まれ、これらは本明細書中で「ヒトＩｇマウス」と総称する。
【０２２４】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内在性のμおよびκ鎖の遺伝子座を不活性化させる標的化変異と一緒に、再構成されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードしているヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（たとえばＬｏｎｂｅｒｇら（１９９４年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻（６４７４号）：８５６〜８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖の導入遺伝子はクラススイッチおよび体細胞変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを生じる（Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．ら（１９９４年）、上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （１９９４年）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３巻：４９〜１０１頁、Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，  Ｄ．  （１９９５年）  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：６５〜９３頁、ならびにＨａｒｄｉｎｇ，  Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （１９９５年）  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６４巻：５３６〜５４６頁中に総説）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスによって保有されるゲノム改変は、そのすべての内容がその全体で本明細書中に具体的に参考として組み込まれている、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．ら（１９９２年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：６２８７〜６２９５頁、Ｃｈｅｎ，  Ｊ．ら（１９９３年）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５巻：６４７〜６５６頁、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：３７２０〜３７２４頁、Ｃｈｏｉら（１９９３年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４巻：１１７〜１２３頁、Ｃｈｅｎ，  Ｊ．ら（１９９３年）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２巻：８２１〜８３０頁、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４年）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：２９１２〜２９２０頁、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．ら（１９９４年）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６巻：５７９〜５９１頁、およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，  Ｄ．ら（１９９６年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：８４５〜８５１頁中にさらに記載されている。すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，７７０，４２９号、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４号およびＷＯ９９／４５９６２号、ならびにＫｏｒｍａｎらのＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号をさらに参照されたい。
【０２２５】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体を、ヒト重鎖の導入遺伝子およびヒト軽鎖のトランス染色体を保有するマウスなどの、導入遺伝子およびトランス染色体のヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用して産生させることができる。本明細書中で「ＫＭ  ｍｉｃｅ（商標）」と呼ぶそのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号中に詳述されている。
【０２２６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が当技術分野で利用可能であり、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。たとえば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用することができ、そのようなマウスは、たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号および第６，１６２，９６３号に記載されている。
【０２２７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランス染色体動物系が当後術分野で利用可能であり、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。たとえば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖のトランス染色体およびヒト軽鎖のトランス染色体をどちらも保有するマウスを使用することができ、そのようなマウスはＴｏｍｉｚｕｋａら（２０００年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７巻：７２２〜７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を保有するウシが当技術分野で記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０巻：８８９〜８９４頁）、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。
【０２２８】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ方法は、当技術分野で確立されている。たとえば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、および第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８号および第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８号および第６，１７２，１９７号、ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号および第６，５９３，０８１号を参照されたい。
【０２２９】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体を、免疫化の際にヒト抗体の応答を生じることができるようにヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。そのようなマウスは、たとえば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６号および第５，６９８，７６７号に記載されている。
【０２３０】
別の実施形態では、本発明の抗体を、Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．Ｄ．ら（（１９９１年）．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻、５８１頁）、Ｎｉｓｓｉｍ，  Ａ．ら（（１９９４年）．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３巻、６９２頁）ならびに米国特許第６，７９４，１３２号、第６５６２３４１号、第６０５７０９８号、第５８２１０４７号、および第６５１２０９７号に記載のように、周知のファージディスプレイ技法を使用して産生させ得る。
【０２３１】
さらなる実施形態では、本発明の抗体を、たとえば、米国特許第６，４２３，５３８号、第６，３００，０６５号、第６，６９６，２５１号、第６，６９９，６５８号に記載のように、酵母細胞表面ディスプレイ技術を使用して見つけ得る。
【０２３２】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化したマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化細胞系と融合させることができる。生じるハイブリドーマを、抗原に特異的な抗体の産生についてスクリーニングすることができる。たとえば、免疫化したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％のＰＥＧを用いて１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）と融合させることができる。あるいは、免疫化したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ大チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ）を使用した電界に基づく電気融合方法を使用して融合させることができる。細胞を平底マイクロタイタープレート中に約２×１０−５個でプレートに入れ、次いで、２０％の胎児クローン血清、１８％の「６５３」馴化培地、５％のオリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＨＡＴは融合の２４時間後に加える）を含有する選択培地中で２週間インキュベートする。約２週間後、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地中で細胞を培養することができる。その後、個々のウェルをＥＬＩＳＡによってヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングすることができる。大規模なハイブリドーマ成長が起こった後、通常は１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再度プレートに入れ、再度スクリーニングすることができ、まだヒトＩｇＧについて陽性である場合は、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも２倍でサブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して、特徴づけのために少量の抗体を組織培養培地中で産生させることができる。
【０２３３】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによって確認して、純度を保証することができる。緩衝溶液をＰＢＳに交換することができ、１．４３の消光係数を使用したＯＤ２８０によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコート分割し、−８０℃で保管することができる。
【０２３４】
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
また、本発明の抗体を、たとえば、当技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して、宿主細胞のトランスフェクトーマ（ハイブリドーマの一種）中で産生させることもできる（たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  （１９８５年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：１２０２頁）。
【０２３５】
たとえば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡを標準の分子生物学的技法（たとえば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用したＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列と作動可能に連結されるように発現ベクター内に挿入することができる。この文脈では、用語「作動可能に連結されている」とは、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図する機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター内にライゲーションされていることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合性があるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクター内に挿入することができ、またはより典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（たとえば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクター内に挿入される。記載した抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体の遺伝子を作製することができ、これは、ベクター内でＶＨセグメントがＣＨセグメント（複数可）と作動可能に連結されており、ベクター内でＶＫセグメントがＣＬセグメントと作動可能に連結されているように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター内に挿入することによる。それに加えてまたは代わって、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端と連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であることができる。
【０２３６】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」には、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（たとえばポリアデニル化シグナル）が含まれることを意図する。そのような調節配列は、たとえばＧｏｅｄｄｅｌ  （Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０年））に記載されている。当業者には、調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素が含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用し得る。さらに、調節要素は、ＳＲプロモーター系などの異なる供給源からの配列から構成され、これは、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復からの配列を含有する（Ｔａｋｅｂｅ，  Ｙ．ら（１９８８年）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８巻：４６６〜４７２頁）。
【０２３７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（たとえば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの付加配列を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（たとえば、すべてＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照）。たとえば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞中でメトトレキサート選択／増幅と共に使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【０２３８】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードしている発現ベクター（複数可）を標準の技法によって宿主細胞内にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の様々な形態には、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞内に導入するために一般的に使用されている多種多様な技法、たとえば、電気穿孔、カルシウム−リン酸沈降、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどが包含されることを意図する。理論的には、本発明の抗体を原核生物または真核生物のどちらの宿主細胞中でも発現させることが可能であるが、真核生物細胞、具体的には哺乳動物細胞は、正しく折り畳まれた免疫学的に活性のある抗体をアセンブルおよび分泌する可能性が原核生物細胞よりも高いため、真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞中での抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性抗体を高収率で産生させることに対して効果がないことが報告されている（Ｂｏｓｓ，  Ｍ．  Ａ．およびＷｏｏｄ，  Ｃ．  Ｒ．  （１９８５年）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６巻：１２〜１３頁）。
【０２３９】
本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７巻：４２１６〜４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を、たとえばＲ．  Ｊ．  ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ  （１９８２年）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９巻：６０１〜６２１頁に記載のようにＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用することが含まれる）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。具体的には、ＮＳＯ骨髄腫細胞を用いた使用に関して、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６号およびＥＰ３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードしている組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現、より好ましくは宿主細胞を増殖させている培養培地内への抗体の分泌を可能にするために十分な一定期間の間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を使用して培養培地から収集することができる。
【０２４０】
ＲＴＫの非対称性の接触境界領域と結合する抗体の特徴づけ
本発明の抗体を、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域（または本明細書中に記述したコンセンサス配列などの任意の選択された領域）との結合について、たとえば標準のＥＬＩＳＡによって試験することができる。手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌの精製した非対称性の接触境界領域（または好ましい受容体ドメイン）でコーティングし、その後、ＰＢＳ中の５％のウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈液（たとえば、免疫化したマウス、たとえば、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域で免疫化したマウスからの血漿の希釈液）をそれぞれのウェルに加え、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた二次試薬（たとえば、ヒト抗体には、ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃに特異的なポリクローナル試薬）と共に１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色（ｄｅｖｅｌｏｐ）させ、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最も高い力価を示す（ｄｅｖｅｌｏｐ）マウスを融合に使用する。
【０２４１】
また、上述のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングすることができる。高いアビディティでたとえばＲＴＫの非対称性の接触境界領域と結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴づける。−１４０℃で保管する５〜１０本のバイアル細胞バンクを作製するため、および抗体を精製するために、親細胞の反応性を保持している（ＥＬＩＳＡによる）それぞれのハイブリドーマからの１つのクローンを選択することができる。
【０２４２】
抗ＲＴＫ抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによって確認して、純度を保証することができる。緩衝溶液をＰＢＳに交換することができ、１．４３の消光係数を使用したＯＤ２８０によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコート分割し、−８０℃で保管することができる。
【０２４３】
選択されたモノクローナル抗体が特有なエピトープと結合するか否かを決定するために、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用してそれぞれの抗体をビオチン化することができる。上述のように、非標識のモノクローナル抗体およびビオチン化したモノクローナル抗体を使用した競合研究を、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域（たとえば、線維芽細胞増殖因子受容体）でコーティングした、ＲＴＫでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して行うことができる。ビオチン化したｍＡｂの結合は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−アルカリホスファターゼプローブを用いて検出することができる。
【０２４４】
精製した抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して、アイソタイプＥＬＩＳＡを行うことができる。たとえば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンを用いて終夜、４℃でコーティングすることができる。１％のＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製したアイソタイプ対照と、周囲温度で１〜２時間反応させる。その後、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのどちらかに特異的なアルカリホスファターゼとコンジュゲートさせたプローブと反応させることができる。プレートを上述のように発色させて分析する。
【０２４５】
ウエスタンブロッティングによって、抗ＲＴＫヒトＩｇＧをＲＴＫの非対称性の接触境界領域または本明細書中に提示したコンセンサス配列との反応性についてさらに試験することができる。手短に述べると、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％のウシ胎仔血清でブロッキングし、試験するモノクローナル抗体でプロービングする。ヒトＩｇＧの結合を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて発色させることができる。
【０２４６】
エピトープマッピングを用いて、本発明の抗体またはその抗原結合断片の結合部位を決定し得る。コンフォメーションエピトープのマッピングをさらに可能にするいくつかの方法が利用可能である。たとえば、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．  ２００４年、８巻（２号）：６１〜７７頁）に開示されている方法を使用し得る。Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらは、２つの新規技法であるＤｏｍａｉｎ  ＳｃａｎおよびＭａｔｒｉｘ  Ｓｃａｎを使用して不連続／コンフォメーションエピトープのマッピングに成功することができた。Ａｎｓｏｎｇら（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００６年．  ４巻（４号）：８４２〜７頁）に開示されている技法も使用し得る。Ａｎｓｏｎｇらは、親和性指向質量分析（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して、抗体Ｒ８Ｂ１２によって認識される不連続エピトープをマッピングした。さらに、タンパク質断層撮影（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）などのイメージング技法を使用して、標的ＲＴＫと結合する抗体またはペプチドを可視化し得る。タンパク質断層撮影は、以前に、分子相互作用についての識見を得るため、および、阻害性抗体が、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩと結合し、それによってＥＧＦＲを柔軟性のない不活性のコンフォメーションに固定することによって作用したことを示すために、使用されている（Ｌａｍｍｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８年．１０５巻（１６号）：６１０９〜１４頁）。また、部位特異的変異誘発などのより伝統的な方法も、不連続エピトープをマッピングするために適用し得る。不連続エピトープに参加すると考えられているアミノ酸領域を選択的に変異させ、本発明の抗体またはその抗原結合断片との結合についてアッセイし得る。どちらかの領域が変異している場合に抗体が結合できないことは、結合が両方のアミノ酸セグメントに依存していることを示している場合がある。上述のように、一部の直鎖状エピトープは、本発明の部分と結合するために存在していなければならない特定の三次元構造によって特徴づけられている。そのようなエピトープを、ＲＴＫがそのネイティブまたは折り畳まれた状態にある場合での抗体（または別の部分）の結合をアッセイし、ＲＴＫが変性されている場合での結合を再度アッセイすることによって、発見し得る。結合が折り畳まれた状態でのみ起こるという観察は、エピトープが、特定の折り畳まれた構造によって特徴づけられる直鎖状エピトープ、または折り畳まれたタンパク質中でのみ存在する不連続エピトープのどちらかであることを示す。
【０２４７】
本明細書中に記載の活性アッセイに加えて、タンパク質断層撮影を使用して、本発明の抗体またはその抗原結合断片が受容体チロシンキナーゼと結合して不活性化させることができるか否かを決定し得る。結合の相互作用の可視化は、抗体の結合が、非対称性の接触境界領域の配置に影響を与え得ること、または受容体チロシンキナーゼ中のコンフォメーション変化を変更もしくは妨げ得ることを示し得る。
【０２４８】
ＩＶ．本発明の部分を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明の部分を、本明細書中に記載のアッセイおよび当技術分野で周知のアッセイのうちの任意のものを使用して、ＲＴＫ阻害活性についてスクリーニングし得る。たとえば、受容体の内在化、受容体の自己リン酸化、および／またはキナーゼシグナル伝達を決定し得るアッセイを使用して、標的ＲＴＫ、たとえば線維芽細胞増殖因子受容体の活性化を妨げる部分を同定し得る。新しい阻害部分のスクリーニングは、当技術分野で公知の標準の方法を使用することによって、たとえば、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）手順（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから利用可能）を用いてＲＴＫまたは下流分子のリン酸化状態を決定することによって達成し得る。受容体、たとえばＦＧＦＲのリン酸化状態を、たとえば、ＦＧＦＲ１  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；カタログ番号−Ｆ４３０５−１５）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＧＦ  Ｒ１  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ  Ｅｃｏｎ  Ｐｋ，  １５プレート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）；カタログ番号−ＤＹＣ５０７９Ｅ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＧＦＲ１  （Ｙ４６３）  ＆  ＦＧＦＲ１  Ｄｕａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｐａｉｒ  （Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（登録商標）；カタログ番号−ＤＰ００２５）、Ｃ−Ｋｉｔ［ｐＹ８２３］ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ、ＨＵ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標）、カタログ番号−ＫＨＯ０４０１）、ｃ−ＫＩＴ［ＴＯＴＡＬ］ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ、ＨＵ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標）、カタログ番号−ＫＨＯ０３９１）などの市販のキットを使用して決定し得る。本発明の抗体、小分子、および他の部分を、そのＲＴＫ阻害活性を決定するためにそのようなキットを使用してスクリーニングし得る。たとえば、適切なリガンドおよび本発明の部分で処理した後、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）を行って、目的のＲＴＫのリン酸化状態、したがって活性化状態を決定し得る。本発明の部分は、ＲＴＫの活性化を妨げるものとして同定される場合がある。以下の実施例は、抗ホスホチロシン抗体を使用したＲＴＫの活性化の検出を含むアッセイを記載している。実施例（それに関連する方法および導入が含まれる）は、ＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を決定するために本明細書中で使用するさらなる方法を記載している。
【０２４９】
受容体の活性化はエンドサイトーシスおよび受容体の内在化をもたらし得るため、一部の実施形態では、受容体の内在化を妨げるその能力を測定することによって、標的ＲＴＫを阻害する本発明の部分の能力を決定することが有用である。受容体内在化アッセイは当技術分野で周知であり、たとえば、そのそれぞれの内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｆｕｋｕｎａｇａら（２００６年）  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  ８０巻（１号）１７〜２３頁、Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら（２００７年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３巻、５８７〜５９６頁（ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｏｍ／２００７／０４／１８／ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ＿ａｓｓａｙ．ｐｈｐ）に記載されている。受容体の内在化を決定するための１つの周知の方法は、リガンドを蛍光タンパク質、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または他の適切な標識剤でタグ付けすることである。リガンドと受容体との結合に際し、蛍光顕微鏡観察を使用して受容体の内在化を可視化し得る。同様に、本発明の部分を標識剤でタグ付けし、蛍光顕微鏡観察を使用して受容体の内在化を可視化し得る。部分が受容体の活性を阻害することができる場合、適切な対照と比較してリガンドの存在下における蛍光の内在化は低下する（たとえば、蛍光は、エンドソームまたは小胞中ではなく、部分（ｍｏｉｔｙ）が受容体と結合する細胞の周辺でのみ観察され得る）。
【０２５０】
上述のものに加えて、様々な他の受容体活性化アッセイが当技術分野で公知であり、そのうちの任意のものを使用して本発明の部分の機能を評価し得る。本発明に従って使用し得るさらなる受容体活性化アッセイは、米国特許第６，２８７，７８４号、第６，０２５，１４５号、第５，５９９，６８１号、第５，７６６，８６３号、第５，８９１，６５０号、第５，９１４，２３７号、第７，０５６，６８５号、ならびに、それだけには限定されないが、Ａｍｉｒ−Ｚａｌｔｓｍａｎら（２０００年）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５巻（６号）：３７７〜８０頁、ＮａｋａｙａｍａおよびＰａｒａｎｄｏｏｓｈ  （１９９９年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２２５巻（１〜２号）、２７、６７〜７４頁、Ｐｉｋｅら（１９８７年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １４６巻：３５３〜３６２頁、Ａｔｉｅｎｚａら（２００５年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  １１巻（６号）：６３４〜６４３頁、Ｈｕｎｔｅｒら（１９８２年）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５７巻（９号）：４８４３〜４８４８頁、ＷｈｉｔｅおよびＢａｃｋｅｒ  （１９９１年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０１巻：６５〜６７頁、Ｍａｄｄｅｎら（１９９１年）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９巻：２１０〜２１５頁、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄら（１９９０年）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９０巻：２４９〜２５３頁、Ｌａｚａｒｏら（１９９１年）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９２巻：２５７〜２６１頁、ＨｕｎｔｅｒおよびＣｏｏｐｅｒ  （１９８５年）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４巻：８９７〜９３０頁、ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  （１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６１巻：２０３〜２１２頁、ＫｎｕｔｓｏｎおよびＢｕｃｋ  （１９９１年）  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２８５巻（２号）：１９７〜２０４頁、Ｋｉｎｇら（１９９３年）  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５３巻：１４６５〜１４７２頁、Ｗａｎｇ．  （１９８５年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５巻（１２号）：３６４０〜３６４３頁、Ｇｌｅｎｎｅｙら（１９８８年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０９巻：２７７〜２８５頁、Ｋａｍｐｓ  （１９９１年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０１巻：１０１〜１１０頁、Ｋｏｚｍａら（１９９１年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０１巻：２８〜４３頁、Ｈｏｌｍｅｓら（１９９２年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１２０５〜１０頁、およびＣｏｒｆａｓら（１９９３年）  ＰＮＡＳ、ＵＳＡ  ９０巻：１６２４〜１６２８頁を含めた多くの科学出版物に記載されている。
【０２５１】
リガンド結合による受容体の活性化は、典型的には続く細胞内事象、たとえばＩＰ３などの二次メッセンジャーの増加を開始させ、これは次にカルシウムイオンの細胞内貯蔵を放出させる。したがって、受容体活性は、二次メッセンジャー、例えば、ＩＰ３、環状ヌクレオチド、細胞内カルシウム、もしくはＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、Ｇｒｂ２などのリン酸化されたシグナル伝達分子、または当技術分野で公知の他の可能な標的の量を測定することによって決定し得る。米国特許第７，０５６，６８５号は、受容体活性を検出するために本発明に従って使用し得るいくつかの方法を記載および言及しており、これは本明細書中に参考として組み込まれている。
【０２５２】
受容体内在化アッセイまたは受容体活性化アッセイなどの上述のアッセイの多くは、免疫学的結合アッセイを使用した標的ＲＴＫの検出または定量を含み得る（たとえば、受容体内在化アッセイ中に、細胞表面上のＲＴＫの量を検出するために放射性標識した抗体を使用する場合）。免疫学的結合アッセイは当技術分野で広く記載されている（たとえば、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号、および第４，８３７，１６８号を参照）。一般的な免疫アッセイの総説には、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３年）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１年）も参照されたい。
【０２５３】
受容体内在化研究、受容体活性化研究、または受容体検出アッセイにおいて使用し得るものなどの免疫アッセイは、しばしば、検出抗体およびＲＴＫによって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識するための標識剤を使用する（本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第７，０５６，６８５号を参照）。標識剤自体が、受容体を検出するために使用する抗体であってもよい（ここでいう抗体は、本発明の部分であってもなくてもよい）。あるいは、標識剤は、二次または三次抗体（たとえば標的ＲＴＫに特異的なマウスモノクローナル抗体と結合する抗マウス抗体）などの第３の薬剤であり得る。また、プロテインＡまたはプロテインＧなどの免疫グロブリン定常領域と特異的に結合することができる他のタンパク質も、免疫学的結合アッセイにおける標識剤として使用し得る。これらのタンパク質は、様々な種からの免疫グロブリン定常領域と強力な非免疫原性の反応性を示す（たとえば、Ｋｒｏｎｖａｌら（１９７３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１１巻：１４０１〜１４０６頁、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら（１９８５年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５巻：２５８９  ２５４２頁を参照）。また、標識剤は、ビオチン（ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合することができる）などの検出可能な薬剤で修飾することもできる。様々な検出可能な部分が当業者に周知である。
【０２５４】
一般的に使用されるアッセイには、非競合的アッセイ、たとえばサンドイッチアッセイ、および競合的アッセイが含まれる。一般的に使用されるアッセイ様式には、試料中のタンパク質の存在を検出および定量化するために使用するウエスタンブロット（免疫ブロット）が含まれる。アッセイで使用する特定の標識または検出可能な基は、ＲＴＫを検出するために使用する免疫グロブリンまたはＲＴＫと結合してそれを不活性化するように設計されている本発明の部分の特異的結合を顕著に妨害しない限りは、本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であることができる。そのような検出可能な標識は免疫アッセイの分野において十分に開発されており、一般に、そのような方法において有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。したがって、標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、蛍光色素（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他のもの）、ならびに比色標識、例えば、コロイド金または有色ガラスまたはプラスチックビーズ（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレンもしくはラテックス）が含まれる。
【０２５５】
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の構成要素に直接または間接的にカップリングさせ得る。また、標識は、たとえば酵素または蛍光体とのコンジュゲーションによって、シグナル生成化合物に直接コンジュゲートさせることもできる。標識としての目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、たとえばルミノールが含まれる。使用し得る様々な標識またはシグナル生成系の総説には、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０２５６】
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、たとえば、標識が放射性標識である場合、検出手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーなどにおける写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、これは、蛍光色素を適切な波長の光で励起させ、生じる蛍光を検出することによって検出し得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器を使用することによって、視覚的に検出し得る。同様に、酵素標識は、酵素の適切な基質を提供し、生じる反応生成物を検出することによって検出し得る。最後に、単純な比色標識は、単に標識と関連する色を観察することによって検出し得る。したがって、様々なディップスティックアッセイにおいて、コンジュゲートした金は多くの場合ピンク色を表す一方で、様々なコンジュゲートしたビーズはビーズの色を表す。
【０２５７】
本発明のさらなる態様では、本発明の部分は、標的ＲＴＫ上のエピトープと結合し、それでも受容体チロシンキナーゼが二量体化することを可能にし得る。この実施形態では、部分の結合は、２つの単量体の非対称性の接触境界領域（たとえば、２つの線維芽細胞増殖因子受容体単量体の非対称性の接触境界領域）間の配置、配向および／または距離に影響を与え、それによって受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する場合がある。言い換えれば、部分は、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインの、リガンド誘導性の二量体化を可能にするが、細胞表面境界領域での２つの外部ドメインの配置に影響を与えるか、または受容体チロシンキナーゼ中のコンフォメーション変化を変更もしくは妨げ、それによって受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する（たとえば、受容体の内在化を阻害する、および／または受容体のチロシン自己リン酸化を阻害する、および／または下流のシグナル伝達経路を活性化させる受容体の能力を阻害する）場合がある。
【０２５８】
したがって、一部の実施形態では、受容体の二量体化を可能にするが、受容体を不活性にさせる部分を同定することができるアッセイを用いることが有用である。そのようなアッセイは本明細書に記載されている。たとえば、実験は、上記受容体を用いて行われ、ここで、受容体の二量体化を架橋結合を使用して検出でき、受容体の活性化をホスホチロシン特異的抗体を使用して決定できる。
【０２５９】
また、ＲＴＫのコンフォメーション状態は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析によっても決定し得る。タンパク質のコンフォメーションおよび相互作用を決定するための蛍光の方法論の包括的な総説は、本明細書中に参考として組み込まれているＪｏｈｎｓｏｎ  （２００５年）  Ｔｒａｆｆｉｃ．  ２００５年１２月、６巻（１２号）：１０７８〜９２頁中に見つけることができる。ＦＲＥＴアッセイでは、目的のＲＴＫを適切なＦＲＥＴ蛍光体で標識する。ＲＴＫを標識した後、標識されたＲＴＫを発現する細胞を、本発明の試験部分およびＲＴＫのリガンド（たとえばＫｉｔ  ＲＴＫのＳＣＦ）と共にインキュベートする。ＦＲＥＴ分析により、リガンド結合に関連するＲＴＫ中のコンフォメーション変化、ＲＴＫの二量体化、および／または受容体の活性化の観察が可能となる。この方法によって、当業者は、下流の活性化なしのＲＴＫの二量体化を示すタンパク質のコンフォメーション変化を直接評価し得る。ＦＲＥＴ分析を行うためにいくつかの方法が利用可能であり、変動の大部分は、様々な蛍光体またはこれらの蛍光体を目的のタンパク質内に組み込むための様々な技法の使用から生じる。ＦＲＥＴ蛍光体および分析方法は当技術分野で周知であり、ＦＲＥＴ技術の手短な総説は、Ｈｅｙｄｕｋ（２００２年）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １３巻（４号）：２９２〜２９６頁およびそれの中の参考文献中で利用可能である。以下の出版物はＦＲＥＴ方法を詳しく述べており、本明細書中に参考として組み込まれている：Ｋａｊｉｈａｒａら（２００６年）  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３巻（１１号）：９２３〜９頁、Ｂｉｅｎｅｒ−Ｒａｍａｎｕｊａｎら（２００６年）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．１６巻（４号）：２４７〜５７頁、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（２００７年）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４６巻（１８号）：５３４９〜５７頁、米国特許第６，６８９，５７４号、第５，８９１，６４６号、およびＷＩＰＯ公開第ＷＯ／２００２／０３３１０２号。蛍光体がＲＴＫの機能またはＲＴＫと結合する本発明の部分の能力を妨害しない限りは、ＦＲＥＴ蛍光体を、ＲＴＫの任意のドメインまたはヒンジ領域内に組み込んで、コンフォメーション変化を検出し得る（たとえば、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域）。
【０２６０】
ＦＲＥＴに有用な蛍光体は、多くの場合、以下に記述する生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に有用なものと同じである。最も一般的なＦＲＥＴ方法は、反応性システイン残基を目的のタンパク質内で操作することである。その後、蛍光体は選択されたシステイン残基と容易に反応することができる。多くの場合、融合タンパク質を構築し、目的のタンパク質を緑色蛍光タンパク質と融合させる（Ｎｅｉｎｉｎｇｅｒら（２００１年）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２巻（８号）：７０３〜７０８頁を参照）。ＦＲＥＴのさらなる方法および有用な蛍光体は、本明細書中に参考として組み込まれている、ＨｕｅｂｓｃｈおよびＭｏｏｎｅｙ  （２００７年）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２８巻（１５号）：２４２４〜３７頁、ＳｃｈｍｉｄおよびＢｉｒｂａｃｈ  （２００７年）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ９７巻（３号）：３７８〜８４頁、Ｊａｒｅｓ−ＥｒｉｊｍａｎおよびＪｏｖｉｎ  （２００６年）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １０巻（５号）：４０９〜１６頁、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  （２００６年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３３５巻：１７〜２９頁、ＷａｌｌｒａｂｅおよびＰｅｒｉａｓａｍｙ  （２００５年）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６巻（１号）：１９〜２７頁、ならびにＣｌｅｇｇ  ＲＭ  （１９９５年）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６巻（１号）：１０３〜１０頁に記載されている。
【０２６１】
他の実施形態では、どのＲＴＫコンフォメーションがリガンド誘導性トランス自己リン酸化なしの二量体化の具体的な指標であるかが知られていないか、またはその決定が困難であり得る（受容体に依存する）。そのような場合、当業者は、受容体の二量体化を決定するアッセイを受容体の活性化またはトランス自己リン酸化を決定するものと組み合わせ得る。たとえば、ＲＴＫの二量体化を検出するための伝統的な架橋結合研究（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（１９９０年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、４巻（１２号）、１７８２〜１７９０頁によって例示）を、上述の受容体活性化アッセイのうちの任意のものと組み合わせて使用し得る。また、ＦＲＥＴおよび同様の系を使用して、受容体の活性化または二量体化を直接測定してもよい。たとえば、適切なＦＲＥＴ蛍光体をＲＴＫの細胞質ドメイン内およびリン酸化標的タンパク質（すなわち下流のシグナル伝達分子）内に組み込むことによって、ＦＲＥＴは、下流のシグナル伝達分子がＲＴＫにリクルートされたか否かを決定することができる。したがって、一実施形態では、成功した本発明の部分は、架橋結合またはＦＲＥＴによって測定して受容体の二量体化を可能にするが、ＦＲＥＴもしくはＢＲＥＴ分析による蛍光の欠如によってまたは他の受容体活性化アッセイ（たとえば、抗ホスホチロシン抗体およびウエスタンブロットを用いた自己リン酸化アッセイ）によって検出される、受容体の活性化を妨げるものである。したがって、本明細書中に記載の技法を使用して、当業者は、部分（たとえば、小分子、ペプチド、または抗体）を容易に試験して、それらがＲＴＫ活性を阻害するか否か、およびそれらが受容体の二量体化を可能にするか否かを決定することができる。
【０２６２】
具体的には、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）分析を使用して、ＲＴＫの活性を阻害する部分を同定し得る。米国特許公開第２００６０１９９２２６号、ＷＩＰＯ公開ＷＯ／２００６／０９４０７３号、およびＴａｎら（２００７年．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ７２巻：１４４０〜１４４６頁）は、ＲＴＫを活性化するリガンドを同定する方法を具体的に記載しており、したがって本明細書中に参考として組み込まれている。これらの技法は、タンパク質の相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで決定するために用いられている（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＰｆｌｅｇｅｒら（２００６年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １  ３３７〜３４５頁、Ｋｒｏｅｇｅｒら（２００１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７６巻（１６号）：１２７３６〜４３頁、およびＨａｒｉｋｕｍａｒら（２００４年）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６５巻：２８〜３５頁）。
【０２６３】
ＢＲＥＴは、ＲＴＫの活性化を妨げる部分についてスクリーニングすることによって、試験化合物から本発明の部分を同定するために有用である。
【０２６４】
本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公開第２００６／０１９９２２６号に記述されているように、ＢＲＥＴに基づくアッセイを使用して、生物発光性のドナー分子（ＤＭ）を有するタンパク質と蛍光のアクセプター部分（ＡＭ）を有するタンパク質との相互作用を監視することができる。手短に述べると、ＲＴＫ−ＤＭの融合体を発現する細胞は、基質の化学エネルギーを光へと変換する。ＡＭ（たとえばシグナル伝達タンパク質−ＡＭの融合体）がＲＴＫ−ＤＭの融合体と近接して存在する場合、細胞は特定の波長の光を放射する。たとえば、ＢＲＥＴに基づくアッセイを使用して、ＲＴＫ−ルシフェラーゼの融合体とＧＦＰ−シグナル伝達タンパク質の融合体との間の相互作用を評価することができる。これは、ドナー分子を化学的エネルギー変換ではなく特定の波長の光によって励起させ得るＦＲＥＴ分析とはわずかに異なる。ＢＲＥＴ分析に使用し得るルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、米国特許第５，２２９，２８５号、第５，２１９，７３７号、第５，８４３，７４６号、第５，１９６，５２４号、第５，６７０，３５６号中に見つけ得る。代替のＤＭには、適切な基質に作用して発光シグナルを生じさせることができる酵素が含まれる。そのような酵素の具体的な例は、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−グルクロニダーゼおよびベータ−グルコシダーゼである。これらの酵素の合成発光基質は当技術分野で周知であり、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）などの企業から市販されている。また、ＤＭは昆虫から単離または操作することもできる（米国特許第５，６７０，３５６号）。
【０２６５】
基質に応じて、ＤＭは異なる波長で光を放射する。ＤＭの基質の非限定的な例には、セレンテラジン、ベンゾチアゾール、ルシフェリン、ギ酸エノール、テルペン、およびアルデヒドなどが含まれる。ＤＭ部分は、ＲＴＫタンパク質のアミノ末端部分またはカルボキシル末端部分のどちらかと融合させることができる。好ましくは、ＲＴＫ−ＤＭの融合体内でのＢＤＭドメインの配置は、ネイティブタンパク質の活性または本発明の部分の結合を変更させない。ＲＴＫ−ＤＭの融合タンパク質を、リガンド結合およびネイティブタンパク質の下流のシグナル伝達分子と相互作用する能力などの生化学的特性をそれが保持することを確実にするために、試験することができる。
【０２６６】
ＢＲＥＴ分析におけるＡＭは、移動されたエネルギーを蛍光として再放射し得る。ＡＭの例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰなどのそのアイソフォームおよび誘導体が含まれる（Ｒ．  Ｙ．  Ｔｓｉｅｎ、（１９９８年）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３巻：５０９〜５４４頁）。好ましくは、ＡＭ−タンパク質の融合体内でのＡＭドメインの配置は、ネイティブタンパク質の活性を変更させない。ＡＭ−第２のタンパク質の融合タンパク質を、ＲＴＫとの相互作用などの関連ネイティブタンパク質の生化学的特性をそれが保持することを確実にするために、試験することができる。例として、標的ＲＴＫによってリン酸化されるか、またはそれと結合することができる任意の基質への、ＧＦＰタンパク質のアミノ末端融合を使用することができる。
【０２６７】
Ｖ．本発明の部分を含有する医薬組成物
別の態様では、本発明は、薬学的に許容されるキャリアと一緒に処方した、本発明の部分（たとえば、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性一部分（複数可）、抗体模倣体、小分子、またはペプチド性分子）のうちの１つまたは組合せを含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。そのような組成物には、本発明の抗体、または免疫コンジュゲート、小分子、もしくはペプチド性分子のうちの１つまたは組合せ（たとえば２つ以上の異なる）が含まれ得る。たとえば、本発明の医薬組成物は、標的ＲＴＫ上の異なるエピトープと結合するか、または相補的活性を有する抗体および小分子の組合せ、たとえば、ＦＧＦＲ１の非対称性の接触境界領域に結合する小分子およびＦＧＦＲ２の非対称性の接触境界領域に結合する小分子を含むことができる。
【０２６８】
また、本発明の医薬組成物は、組合せ療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、組合せ療法には、少なくとも１つの他の抗がん剤と組み合わせた、本発明の抗ＲＴＫ抗体（または小分子もしくはペプチド性分子）が含まれることができる。組合せ療法で使用することができる治療剤の例は、以下にさらに詳述されている。
【０２６９】
本明細書中で使用する「薬学的に許容されるキャリア」には、生理的に適合性のある任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（たとえば注射または注入によるもの）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の部分を、化合物を不活性化させ得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護する物質でコーティングし得る。
【０２７０】
本発明の医薬化合物には、１つまたは複数の薬学的に許容される塩が含まれ得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持しており、かつ望ましくない毒性効果を全く与えない塩をいう（たとえばＢｅｒｇｅ，  Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６巻：１〜１９頁を参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの無毒性の無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにΝ，Ν’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２７１】
また、本発明の医薬組成物には、薬学的に許容される抗酸化剤も含まれ得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性の抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性の抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が含まれる。
【０２７２】
本発明の医薬組成物中で用い得る適切な水性および非水性のキャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。
【０２７３】
また、これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在の予防は、滅菌手順によって、ならびに様々な抗細菌および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることによって、確実にし得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物内に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射用医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を包含させることによってもたらし得る。
【０２７４】
薬学的に許容されるキャリアには、無菌的な注射用溶液または分散液の即時調製のための、無菌的な水性溶液または分散液および無菌的な粉末が含まれる。医薬上活性のある物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。活性化合物と非適合性である場合以外は、本発明の医薬組成物における任意の慣用の媒質または薬剤の使用が企図される。また、補助活性化合物を組成物内に組み込むこともできる。
【０２７５】
治療組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌的かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序立った構造として処方することができる。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０２７６】
無菌的な注射用溶液は、所要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に組み込み、次いで滅菌微細濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記列挙したものからの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル内に組み込むことによって調製する。無菌的な注射用溶液を調製するための無菌的な粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）であり、これは、事前に滅菌濾過した溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【０２７７】
単一投薬形態を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置する被験体および特定の投与様式に応じて変動する。単一投薬形態を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【０２７８】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（たとえば治療反応）が提供されるように調節する。たとえば、単一のボーラスを投与し得、いくつかの分割した用量を期間にわたって投与し得、または、用量を治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低下もしくは増加させ得る。投与の容易性および用量の均一性のために、非経口組成物を単位投薬形態で処方することが特に有利である。本明細書中で使用する単位投薬形態とは、処置する被験体の単位投薬量として適した物理的に別々の単位体をいい、それぞれの単位体は、所要の医薬キャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位投薬形態の仕様は、（ａ）活性化合物の特有な特徴および達成する特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するためのそのような活性化合物を混合する（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）分野に固有の制限によって指示され、それに直接依存する。
【０２７９】
抗体、小分子、またはペプチド性分子の投与に関して、用量は、宿主体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇの範囲である。たとえば、用量は、０．３ｍｇ／ｋｇの体重、１ｍｇ／ｋｇの体重、３ｍｇ／ｋｇの体重、５ｍｇ／ｋｇの体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇの体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。例示的な処置レジームは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１カ月に１回、３カ月に１回または３〜６カ月毎に１回の投与を伴う。本発明の部分の好ましい投薬レジメンには、静脈内投与によって１ｍｇ／ｋｇの体重または３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれ、抗体は以下の投薬スケジュールのうちの１つを使用して与える：（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後、３カ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇの体重を１回、次いで１ｍｇ／ｋｇの体重を３週間毎。
【０２８０】
あるいは、抗体、小分子、またはペプチド性分子を、持続放出処方物として投与することができ、その場合、より低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における投与した物質の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変動する場合がある。予防的な応用では、比較的低い用量を比較的低頻度の間隔で長い期間にわたって投与する。一部の患者は、その余生の間ずっと処置を受け続ける。治療的な応用では、比較的短い間隔での比較的高い用量が、疾患の進行が低下または停止されるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、必要な場合がある。それ以降、患者に予防的レジームを施すことができる。
【０２８１】
特定の患者に毒性とならずに、患者、組成物、および投与様式において所望の治療反応を得るために有効な活性成分の量を得るために、本発明の医薬組成物中の活性成分および小分子の実際の用量レベルを変動させ得る。選択された用量レベルは、用いる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排出速度、処置の期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、重量、状態、全体的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含めた、様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０２８２】
本発明の抗ＲＴＫ部分の「治療上有効な用量」は、好ましくは、疾患症状の重篤度の減少、疾患症状が無い期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の苦痛が原因の障害もしくは能力欠如の予防をもたらす。たとえば、腫瘍の処置では、「治療上有効な用量」は、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を、無処置の被験体と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系中で評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のアッセイによって、化合物の阻害、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の能力を検査することによって、評価することができる。治療上有効な量の治療化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、または他の様式で被験体において症状を改善させることができる。当業者は、被験体の大きさ、被験体の症状の重篤度、および選択した特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０２８３】
本発明の抗ＲＴＫ部分を試験して、ＲＴＫのリガンド誘導性のトランス自己リン酸化への拮抗に有効であるか否かを決定し得る。抗ＲＴＫ部分を試験する１つの方法は、抗ＲＴＫ部分とＲＴＫとの間に相互作用が起こることを確認することである。たとえば、当業者は、本発明の抗体、小分子、またはペプチド性分子が、ＲＴＫの非対称性の接触境界領域と結合するか否かを試験し得る。そのような結合の試験は当技術分野で周知であり、抗ＲＴＫ部分を標識（たとえば放射性標識）するステップと、結合が起こり得る条件下で抗ＲＴＫ部分をＲＴＫと共にインキュベートするステップと、その後、複合体をゲルまたはホスフォスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）上で単離／可視化するステップとを含み得る。同様に、結合を決定するためにＥＬＩＳＡ技法を用い得る。
【０２８４】
本発明の部分がＲＴＫに拮抗しているか否かを決定するための別の方法は、ＲＴＫの細胞質ドメインのリン酸化状態を試験することである。具体的な実施形態では、有効な拮抗剤はＲＴＫの活性化および自己リン酸化を妨げる。ＲＴＫのリン酸化は、当技術分野で公知の標準の方法を使用して、たとえば、ＲＴＫのリン酸化された残基と特異的に結合する抗体を使用することによって試験し得る。リン酸化事象を検出するための他の方法には、米国特許第６５４８２６６号、もしくはＧｏｓｈｅら（２００６年）  Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．  ４巻：３６３〜７６頁、ｄｅ  Ｇｒａａｕｗら（２００６年）  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  ２７巻：２６７６〜８６頁、Ｓｃｈｍｉｄｔら（２００７年）  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ８４９巻：１５４〜６２頁に記載のもの、またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの［ガンマ−３３Ｐ］ＡＴＰを使用したキナーゼリン酸化アッセイのＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ（ＳＭＰ２００）プロトコルの使用が含まれる。当業者には、これらの方法、および実施例中に示されたものを使用して、ＲＴＫによってリン酸化されており、細胞内のシグナル伝達物質であるタンパク質のリン酸化状態を決定してもよいことが理解されよう。また、そのようなタンパク質のリン酸化状態の検出は、ＲＴＫが本発明の部分によって有効に拮抗されたか否かも示す。
【０２８５】
本発明の組成物を、当技術分野で公知の様々な方法のうちの１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は所望の結果に応じて変動する。本発明の結合部分の好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口の投与経路、たとえば注射または注入によるものが含まれる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」とは、経腸または局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【０２８６】
あるいは、本発明の抗ＲＴＫ結合部分を、局所、表皮または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの、非経口ではない経路を介して投与することができる。
【０２８７】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達系を含めた徐放性処方物などの、化合物を迅速な放出から保護するキャリアを用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような処方物を調製するための多くの方法が特許取得されているかまたは一般に当業者に公知である。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【０２８８】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。たとえば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、薬物を制御された速度で供給するための埋め込み型のマイクロ注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬物を投与するための治療用デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流の埋め込み型注入機器を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、複数チャンバ区画を有する浸透性薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透性薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。これらの特許は本明細書中に参考として組み込まれている。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に公知である。
【０２８９】
ＶＩ．本発明の部分の使用方法
別の態様では、本発明は、被験体に治療上有効な量の本発明の部分を投与することを含む、被験体においてＲＴＫに関連する疾患を処置する方法を提供する。本発明の抗ＲＴＫ部分、たとえば、抗体、小分子、またはペプチド性分子は、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の診断および処置に関与する、数々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断的および治療的な利用性を有する。本発明の結合部分を、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患を処置し、妨げ、そして診断するために、培養中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に、またはヒト被験体にたとえばｉｎ  ｖｉｖｏで、投与することができる。
【０２９０】
本明細書中で使用する「受容体チロシンキナーゼに関連する疾患」とは、ＲＴＫの活性によって媒介されるか、または異常なＲＴＫの発現もしくは活性化に関連する疾患または状態である。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の例には、たとえば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、糖尿病性網膜症または疼痛に関連する疾患などの、ＦＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＮＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体−α、ＰＤＧＦ受容体−β、ＣＳＦ−１受容体、およびＦｌｔ３受容体に関連する疾患または状態が含まれる。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の他の例は、重度の骨障害を含む。重度の骨障害は、軟骨無形成症、クルゾン症候群、およびシーザー−ショッツェン症候群からなる群より選択される障害を含む。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の具体的な例には、それだけには限定されないが、胃腸管系間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、乳がん、骨転移性乳がん、リンパ性疾患および腱鞘巨細胞腫が含まれる。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患のさらなる例には、膠芽腫、ラッド症候群、軟骨無形成症、クルゾン症候群、シーザー−ショッツェン症候群、アントレー−ビクスラー症候群、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、ジャクソン−ワイス症候群、カルマン症候群２、骨空洞性骨異形成症、プファイファー症候群、三角頭蓋症、結腸がん（小腸がんが含まれる）、肺がん、乳がん、膵がん、黒色腫（たとえば転移性悪性黒色腫）、急性骨髄性白血病、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がんおよび前立腺がんが含まれる。本発明の方法を使用して処置し得る他のがんの例には、腎臓がん（たとえば腎細胞がん）、膠芽細胞腫、リンパ性がん、脳腫瘍、慢性または急性の白血病（急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病が含まれる）、リンパ腫（たとえば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ系統の広汎性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節腫脹（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連の体腔に基づくリンパ腫）、胎生期癌、上咽頭の未分化がん腫（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭がん腫、骨がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、膣がん、外陰部がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、膠芽腫、多発性骨髄腫、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、小��期固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、扁平細胞がん、アスベストに誘導されるものを含めた環境誘導性がん、たとえば中皮腫、ならびに前記がんの組合せが含まれる。本発明の方法を使用して処置し得るリンパ性疾患、または「リンパ系の疾患」の例には、無フィブリノーゲン血症、貧血、再生不良性貧血、溶血性貧血、先天性非球状赤血球性貧血、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、鎌状赤血球貧血、腎性貧血、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、抗トロンビンＩＩＩ欠乏症、ベルナール−スーリエ症候群、血液凝固障害、血小板障害、青色ゴムまり様母斑症候群、チェディアック−東症候群、クリオグロブリン血症、播種性血管内血液凝固、好酸球増加症、エルトハイム−チェスター病、胎児赤芽球症、エバンス症候群、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、ファンコーニ貧血、巨大リンパ節過形成、血液疾患、異常血色素症、ヘモグロビン尿症、発作性、血友病Ａ、血友病Ｂ、新生児出血性疾患、組織球症、組織球症、ランゲルハンス細胞、組織球症、非ランゲルハンス細胞、ヨブ症候群、白血球減少症、リンパ節炎、リンパ管平滑筋肉腫症、リンパ浮腫、メトヘモグロビン血症、脊髄形成異常症候群、骨髄線維症、骨髄化生、骨髄増殖性障害、好中球減少症、パラプロテイン血症、血小板貯蔵プール欠乏症、真性赤血球増加症、タンパク質Ｃ欠乏症、タンパク質Ｓ欠乏症、紫斑病、血小板減少性、紫斑病、血栓性血小板減少性、ＲＨ−同種免疫、サルコイドーシス、サルコイドーシス、球状赤血球症、脾破裂、サラセミア、血小板無力症、血小板減少症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはヴォン・ヴィレブランド病が含まれる。
【０２９１】
さらに、様々な腫瘍細胞上でのＩＶ型ＲＴＫの発現を考慮すると、本発明の結合部分、組成物、および方法を使用して、たとえば胃腸管系間質腫瘍、肥満細胞疾患、および急性骨髄性白血病を含めた腫瘍形成性障害、たとえばＲＫＴを発現する腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる障害を有する被験体を処置することができる。腫瘍形成性障害を有する他の被験体の例には、以下に罹患している被験体が含まれる：腎臓がん（たとえば腎細胞がん）、膠芽細胞腫、脳腫瘍、慢性または急性の白血病（急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病が含まれる）、リンパ腫（たとえば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ系統の広汎性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節腫脹（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連の体腔に基づくリンパ腫）、胎生期癌、上咽頭の未分化がん腫（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭がん腫、骨がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、膣がん、外陰部がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児期固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、扁平細胞がん、アスベストに誘導されるものを含めた環境誘導性がん、たとえば中皮腫、ならびに前記がんの組合せ。
【０２９２】
本明細書中で使用する用語「被験体」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれることを意図する。非ヒト動物には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの、すべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい被験体には、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患に罹患しているヒト被験体が含まれる。
【０２９３】
本発明の部分（たとえば、小分子、ペプチド性分子、抗体、その抗原結合性一部分、抗体模倣体、および組成物）は、ＲＴＫに関連する疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。たとえば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性もしくは二重特異性分子、小分子、またはペプチド性分子を使用して、以下の生物活性のうちの１つまたは複数をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発させることができる：ＲＴＫ（たとえば、線維芽細胞増殖因子受容体）を発現する細胞の増殖を阻害および／もしくは死滅させること、ヒトエフェクター細胞の存在下でＲＴＫ（たとえば、線維芽細胞増殖因子受容体）を発現する細胞の貪食もしくはＡＤＣＣを媒介すること、またはＲＴＫのリガンド誘導性トランス自己リン酸化を阻害し、それによって受容体の活性に拮抗すること。
【０２９４】
本発明の抗ＲＴＫ部分をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与するための適切な経路は当技術分野で周知であり、当業者によって選択されることができる。たとえば、抗ＲＴＫ部分は、注射（たとえば静脈内または皮下）によって投与することができる。使用する分子の適切な用量は、被験体の年齢および重量ならびに結合部分の組成物の濃度および／または処方に依存する。
【０２９５】
既に記載したように、本発明の抗ＲＴＫ部分は、１つまたは他の複数の治療剤、たとえば、細胞毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と共に投与することができる。部分は、薬剤と連結させることができるか、または薬剤と別々に投与することができる。後者の場合（別々の投与）、結合部分は、薬剤を投与する前、後もしくはそれと同時に投与することができるか、または、他の公知治療、たとえば、抗がん治療、たとえば放射線と共に投与することができる。そのような治療剤には、とりわけ、それ単独では患者に毒性または準毒性があるレベルでのみ有効である、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミド、ヒドロキシ尿素などの抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは、１００ｍｇ／用量として４週間毎に１回静脈内投与し、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として２１日間毎に１回静脈内投与する。本発明の抗ＲＴＫ結合部分と化学療法剤の共投与は、異なる機構を介して作動し、ヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を与える、２つの抗がん剤を提供する。そのような共投与は、結合部分と非反応性にさせる、薬物に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化が原因の問題を解決することができる。
【０２９６】
異常細胞増殖に関連する疾患の予防および／または処置で使用するために本発明の抗ＲＴＫ部分−パートナー分子のコンジュゲートを投与する場合、投与化合物の循環濃度は、約０．００１μΜ〜２０μΜまたは約０．０１μΜ〜５μΜを使用し得る。
【０２９７】
本明細書中に記載の化合物の経口投与の患者用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。患者の体重に関連して記述すると、典型的な用量は、約０．０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、たとえば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２９８】
少なくとも一部の実施形態では、腫瘍増殖を遅延または阻害する患者用量は、１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下であることができる。たとえば、患者用量は、０．９、０．６、０．５、０．４５、０．３、０．２、０．１５、または０．１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下（薬物のモルに言及）であることができる。好ましくは、抗ＲＴＫ部分−薬物のコンジュゲートは、１日投薬量を少なくとも５日間の期間にわたって投与した場合に腫瘍の増殖を遅延させる。
【０２９９】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを使用して、化合物（たとえば、治療剤、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）は、ＲＴＫ細胞表面受容体を有する細胞を標的とすることができ、これは、そのような化合物を抗ＲＴＫ結合部分と連結することによる。たとえば、抗ＲＴＫ部分を、本明細書中にその全体が参考として組み込まれている米国特許第６，２８１，３５４号および第６，５４８，５３０号、米国特許公開第２００３００５０３３１号、第２００３００６４９８４号、第２００３００７３８５２号および第２００４００８７４９７号中に記載されているか、またはＷＯ０３／０２２８０６号に公開されている毒素化合物のうちの任意のものとコンジュゲートさせることができる。したがって、また、本発明は、ＲＴＫを発現する細胞をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで局在化させる方法も提供する（たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子などの検出可能な標識を用いる）。
【０３００】
また、標的特異的なエフェクター細胞、たとえば、本発明の組成物（たとえば、抗体、その抗原結合性一部分、小分子、またはペプチド性分子）と連結したエフェクター細胞は、治療剤としても使用することができる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球であることができる。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧもしくはＩｇＡ受容体保有細胞が含まれる。所望する場合は、エフェクター細胞を処置する被験体から得ることができる。標的特異的なエフェクター細胞は、生理的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。投与する細胞の数は１０８〜１０９個の桁数であることができるが、治療目的に応じて変動する。一般に、量は、標的細胞、たとえばＲＴＫを発現する腫瘍細胞において局在化し、たとえば貪食によって細胞死滅をもたらすために十分なものである。また、投与経路も変動することができる。
【０３０１】
標的特異的なエフェクター細胞を用いた治療は、標的細胞を除去するための他の技法と併せて行うことができる。たとえば、本発明の部分および／またはこれらの組成物を備えたエフェクター細胞を使用した抗腫瘍治療を、化学療法と併せて使用することができる。
【０３０２】
本発明は、試料および対照試料を、ＲＴＫ結合部分、たとえば、小分子、ペプチド性分子ヒトモノクローナル抗体、またはヒトＲＴＫと特異的に結合する他の結合部分と、抗体または他の部分と線維芽細胞増殖因子受容体などのヒトＲＴＫとの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、試料中のヒトＲＴＫ抗原の存在を検出する方法、またはヒトＲＴＫ抗原（たとえば、ヒト線維芽細胞増殖因子受容体の非対称性の接触境界領域）の量を測定する方法をさらに提供する。その後、複合体の形成を検出し、ここで、対照試料と比較した試料間の複合体形成の相違が、試料中のＲＴＫ、たとえば、線維芽細胞増殖因子受容体の存在の指標である。
【０３０３】
抗ＲＴＫ結合部分（たとえば、小分子、抗体、その抗原結合性一部分、またはペプチド性分子）および使用説明書を含むキットも、本発明の範囲内にある。キットは、免疫抑制試薬、細胞毒性剤もしくは放射性毒性剤などの１つもしくは複数の追加の試薬、または１つもしくは複数の追加の本発明の抗ＲＴＫ部分（たとえば、第１の抗ＲＴＫ部分とは別個のＲＴＫ抗原中のエピトープと結合する相補的な活性を有する抗ＲＴＫ結合部分）をさらに含有することができる。典型的には、キットには、キットの内容物の意図する使用を示すラベルが含まれる。用語ラベルには、キット上もしくはそれと共に提供されるか、または他の様式でキットに付随する、任意の文書または記録資料が含まれる。
【０３０４】
本発明は、さらに限定するとは解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例示されている。本出願の全体にわたって引用したすべての図およびすべての参考文献、特許、公開特許出願、および図面の内容は、明確にその全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
【実施例】
【０３０５】
リガンド誘導性チロシントランス自己リン酸化は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）による活性化および細胞シグナル伝達の制御において重要な役割を果たす（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（１９８８年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  １３巻（１１号）：４４３〜４４７頁；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（２０００年）Ｃｅｌｌ，  １０３巻（２号）：２１１〜２２５頁；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＬｅｍｍｏｎ（２００３年）Ｓｃｉ．  ＳＴＫＥ，  １９１巻：ＲＥ１２；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ（１９９２年）Ｎｅｕｒｏｎ，  ９巻（３号）：３８３〜３９１頁；ＬｅｍｍｏｎおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（１９９４年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  １９巻（１１号）：４５９〜４６３頁；ならびにＬｅｍｍｏｎおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（１９９８年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８４巻：４９〜７１頁）。構造的および生化学的研究により、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）（Ｆｕｒｄｕｉら（２００６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．，  ２１巻（５号）：７１１〜７１７頁およびＬｅｗら（２００９年）Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ，  ２巻（５８号）：ｒａ６）ならびにＦＧＦＲ２（Ｃｈｅｎら（２００８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０５巻（５０号）：１９６６０〜１９６６５頁）の自己リン酸化は、３つのフェーズに分けることができる、逐次的で、正確に順序付けられた分子間反応によって媒介されることが示された。第１のフェーズは、キナーゼ活性の５０〜１００倍の刺激をもたらす、触媒コアの活性化ループ中に位置するチロシン（ＦＧＦＲ１においてＹ６５３）のトランスリン酸化を含む（Ｆｕｒｄｕｉら、２００６年）。第２のフェーズでは、ＦＧＦＲ１のキナーゼ挿入領域（Ｙ５８３、Ｙ５８５）、膜近傍領域（Ｙ４６３）、およびＣ末端部（Ｙ７６６）におけるチロシンを含むシグナル伝達タンパク質に対するドッキング部位として働くチロシン残基が、リン酸化される。最終の第３のフェーズでは、Ｙ６５４；活性化ループ中に位置する第２のチロシンが、リン酸化され、ＦＧＦＲ１キナーゼ活性におけるさらに１０倍の増加をもたらす（Ｆｕｒｄｕｉら、２００６年）。興味深いことには、互いに隣接するチロシン（たとえばＹ６５３、Ｙ６５４およびＹ５８３、Ｙ５８５）は、順次リン酸化されず、配列および構造の特異性の両方が、リン酸化の順序を決定するということを示唆する。チロシンリン酸化は、細胞シグナル伝達において主な役割を果たすが、トランス自己リン酸化について構造的根拠が何であるかは、まだ明らかではない。言いかえれば、二量体化した受容体内の一方のキナーゼ（酵素）が、他方のキナーゼ（基質）のチロシン（複数可）のリン酸化を特異的にかつ順次触媒する方法の根底にある分子メカニズムは、まだ解決されていない。
【０３０６】
活性化ＦＧＦＲ１キナーゼドメインの、ホスホリパーゼＣγ（２つのＳＨ２ドメインおよびチロシンリン酸化部位から構成されるＰＬＣγ断片）に結合した結晶構造が、示されている（ＰＤＢコード３ＧＱＩ）（Ｂａｅら（２００９年）Ｃｅｌｌ  １３８巻（３号）：５１２〜５２４頁）。この構造では、キナーゼ分子（分子Ｅと称される酵素分子）の基質結合性ポケットは、対称関連分子（分子Ｓと称される基質分子）のＹ５８３Ｆによって占められる。このチロシン（Ｙ５８３Ｆ）は、キナーゼ挿入中に位置し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてリン酸化されるようになる第２のＦＧＦＲ１チロシンである（Ｆｕｒｄｕｉら、２００６年）。結晶構造、３ＧＱＩのより詳細な検査によって、実質的な結晶境界領域が、酵素として働く分子のＮローブと基質として機能する分子のＣローブとの間で同定された。この境界領域において、Ｒ５７７’とＤ５１９との間に直接的な相互作用がある（図６Ａ）。ラッド症候群を引き起こす、機能喪失型の変異であるＤ５１９Ｎ（Ｒｏｈｍａｎｎら（２００６年）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３８巻（４号）：４１４〜４１７頁）および膠芽腫において見つかった体性機能獲得型変異であるＲ５７６Ｗ（Ｒａｎｄら（２００５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０２巻（４０号）：１４３４４〜１４３４９頁）をもたらす遺伝性の変異が、立証されている。構造的および生化学的ツールを、Ｒ５７７が、ＦＧＦ刺激細胞において、Ｙ５８３および他のチロシン自己リン酸化部位のトランスリン酸化を可能にする、非対称性のＦＧＦＲ１二量体をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生成することに関与することを示すために利用した。これらのデータは、ＦＧＦＲ１のトランスリン酸化および細胞シグナル伝達における分子レベルの特異性を理解する根拠を提供する。
【０３０７】
（実施例１）
ＦＧＦＲ１の自己リン酸化におけるの非対称性の二量体化境界領域
ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）断片と複合体を形成した活性化ＦＧＦＲ１キナーゼの構造（Ｂａｅら（２００９年）Ｃｅｌｌ，  １３８巻（３号）：５１２〜５２４頁）は、２つの対称関連活性化キナーゼドメインが、キナーゼ挿入領域におけるＹ５８３のｉｎ  ｖｉｖｏトランス自己リン酸化を示す非対称性の二量体を形成することを示す（図１Ａおよび図１Ｂ）。２つのキナーゼ分子の非対称性の構成は、酵素（Ｅ）として働くキナーゼ分子における活性化セグメント、ヌクレオチド結合ループの先端、β３−αＣループ、β４−β５ループ、およびヘリックスαＣのＮ末端領域と、基質（Ｓ）として働く第２のキナーゼ分子におけるキナーゼ挿入ならびにＣローブヘリックスαＦおよびαＧの間の残基との間で形成される境界領域によって媒介される（図１Ｃおよび図１Ｄ）。重要なことには、基質分子のキナーゼ挿入領域に近い残基であるＲ５７７は、この境界領域に寄与する（図１Ｂ）。境界領域は、およそ８００Å２を覆う（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９７年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２２巻（１２号）：４８８〜４９０頁）。
【０３０８】
２つの活性ＦＧＦＲ１分子の間で形成された境界領域は、２つの領域からなる。一方は、活性化セグメントのＰ＋１領域の近くの近位の基質結合性部位である。他方は、基質結合性部位から遠位の領域である。遠位の基質結合性部位は、分子Ｅのヌクレオチド結合ループに隣接する領域と分子ＳのαＦ−αＧループおよびキナーゼ挿入領域のＮ末端残基との間で形成される。結晶構造において、明らかな電子密度が、Ｒ５７７およびＤ５１９について見られる（図６Ａ）。Ｒ５７７側鎖が、膠芽腫において変異しているアミノ酸であるＲ５７６（Ｒａｎｄら（２００５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０２巻（４０号）：１４３４４〜１４３４９頁）の側鎖のおよそ１８０°反対を向いていることに注目すべきである。
【０３０９】
非対称性の二量体境界領域の２つの領域は、相補的である（図２）。近位の基質結合性部位については、分子Ｅは、分子Ｓ由来のＹ５８３’に対してＣ末端の残基と短い逆平行β−シートを形成する活性化セグメント（Ｎ６５９−Ｖ６６４）由来の残基に主に寄与し、Ｒ５７０は、Ｅ５８２’と塩橋を形成する（図２Ｂ）。遠位の結合部位については、Ｒ５７７’は、Ｄ５１９の主鎖カルボニルおよび側鎖の両方に結合し、分子ＳにおけるヘリックスαＦおよびαＧの間のループは、β３−αＣおよびβ４−β５ループとの複数の脂肪性の接触を形成する（図２Ｃ）。
【０３１０】
（実施例２）
Ｒ５７７Ｅ  ＦＧＦＲ１変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるチロシンキナーゼ活性
Ｒ５７７Ｅ変異（ＦＧＦＲ１−ＲＥ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける効果を調査するために、自己リン酸化の実験を、ｗｔ−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ１−ＲＥキナーゼドメインを使用して行った。精製ＦＧＦＲ１キナーゼドメインを、室温で、ＡＴＰおよびＭｇ２＋と共にインキュベートし、ＥＤＴＡを用いてトランスリン酸化反応を停止し、非還元非変性ゲル上にすべての試料を流すことによって異なる時間にモニターした（図３Ａおよび図３Ｂ）。非変性ゲルにおけるｗｔ−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ１−ＲＥの反応プロファイルは、ｗｔ−ＦＧＦＲ１キナーゼドメインと比較した場合、ＦＧＦＲ１−ＲＥのトランスリン酸化および逆の脱リン酸化反応が実質的に遅延したことを明確に示した。ｗｔ−ＦＧＦＲ１キナーゼドメインのトランスリン酸化は、１０分以内に起こり、完全にリン酸化された状態に達し、次いで、逆の脱リン酸化反応を受けた。これは、３０分以内に完全にリン酸化されるようになり、次いで、逆反応を受けたＦＧＦＲ１−ＲＥと対照をなす。この実験は、ＦＧＦＲ１−ＲＥキナーゼドメインの内因性キナーゼ活性が維持されるが、それは、反応速度論的に遅延することを示す。
【０３１１】
Ｒ５７７Ｅ変異が完全長ＦＧＦＲ１の活性およびトランスリン酸化にどのように影響するかを研究するために、ｗｔ−ＦＧＦＲ１、およびＦＧＦＲ１−ＲＥをＬ６筋芽細胞において安定して発現させた（図３Ｃ）。ｗｔ−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ１−ＲＥを発現する細胞由来の溶解産物を免疫沈降させ、室温で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ自己リン酸化反応に供した（Ｆｕｒｄｕｉら（２００６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．，  ２１巻（５号）：７１１〜７１７頁）。図３Ｃは、完全長ｗｔ−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ１−ＲＥの両方が、同様の程度まで、チロシン自己リン酸化されるようになり、ＰＬＣγの２つのＳＨ２ドメインおよびリン酸化部位から構成される外因性の基質分子をリン酸化することができることを示す。これらの結果は、完全長Ｒ５７７Ｅ  ＦＧＦＲ１変異体のチロシンキナーゼ活性がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて維持されることを示す。
【０３１２】
（実施例３）
Ｒ５７７Ｅ変異体のチロシン自己リン酸化は、生細胞において強く損なわれる
ＦＧＦ刺激生細胞におけるＷＴまたはＲ５７７Ｅ  ＦＧＦＲ１変異体の自己リン酸化を比較した。ｗｔ−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ１−ＲＥの発現レベルについて一致した、安定したＬ６細胞系を、３７℃で１０分間、異なるＦＧＦ濃度により（図３Ｄ）または異なる時点で１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦにより（図３Ｅ）刺激した。受容体チロシンリン酸化のレベルは、抗ＦＧＦＲ１抗体により、非刺激またはＦＧＦ刺激細胞由来の溶解産物を免疫沈降に供し、その後抗ｐＴｙｒ抗体を用いるイムノブロッティングを行うことによって、決定した。ｗｔ−ＦＧＦＲ１を発現する細胞のＦＧＦ刺激は、リガンド依存性の受容体チロシンリン酸化をもたらした。対照的に、ＦＧＦＲ１−ＲＥを発現する細胞のＦＧＦ刺激は、リガンドの最高用量でさえ非常に弱いリン酸化しかもたらさなかった。単離完全長Ｒ５７７Ｅ変異体およびＲ５７７Ｅ変異体の精製キナーゼドメインの両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてキナーゼ活性を維持したので、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＧＦＲ１−ＲＥのチロシン自己リン酸化における劇的な低下は、その内因性キナーゼ活性の喪失によって引き起こされるのではない。
【０３１３】
（実施例４）
Ｒ５７７Ｅ変異体の結晶構造
キナーゼドメインの完全性に対するＲ５７７Ｅ変異の影響は、ＦＧＦＲ１変異タンパク質のキナーゼドメインの結晶構造を決定することによって検査した。Ｒ５７７Ｅ変異タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。変異タンパク質のロッド状の結晶を、室温で２週間成長させ、３．２Åの分解能まで回折した。これらの結晶は、空間群Ｃ２に属し、非対称単位においてＦＧＦＲ１−ＲＥの４つのコピーを含む。ＦＧＦＲ１−ＲＥの４つの分子はすべて、非常に類似するコンフォメーションをしており、キナーゼ挿入領域（アミノ酸５７６〜５９４）を有していない残基４６１〜７６２にわたって０．４Å未満のＲＭＳＤで重なり（図７）（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）、キナーゼ挿入は可動性であり、４つの分子のうちの２つのみにおいてモデル化した。４つのＦＧＦＲ１−ＲＥ分子はすべて、活性状態であり、３ＧＱＩと比較した場合、全体的なコンフォメーションにおける変化をほとんど示さない。非リン酸化ＦＧＦＲ１の構造もまた、２．７０Åの分解能まで、不活性なコンフォメーションにおいて決定した（表１；図１０）。
【０３１４】
手短に言えば、ＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体結晶構造は、広がった活性化ループを有する活性状態のキナーゼドメインである。活性化リン酸化ＦＧＦＲ構造において以前に見られたように、Ｎローブは、キナーゼ構造のＣローブの方に回転する（Ｃｈｅｎら（２００８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０５巻（５０号）：１９６６０〜１９６６５頁、およびＢａｅら（２００９年）Ｃｅｌｌ，  １３８巻（３号）：５１４〜５２４頁）。ＦＧＦＲ１−ＲＥの構造では、ＡＴＰアナログであるＡＣＰ−ＰＣＰについての密度は、ＮローブおよびＣローブの間の触媒間隙において見つけられなかった。ＦＧＦＲ１−ＲＥのＮローブにおけるヘリックスαＣは、ＦＧＦＲ１の以前に決定された構造よりも、活性化ループにわずかに接近して回転する（図４Ａおよび図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＦＧＦＲ１−ＲＥにおける２つの非リン酸化活性化ループチロシン（Ｙ６５３、Ｙ６５４）は、活性ＦＧＦＲ１構造におけるホスホチロシン（ｐＹ６５３、ｐＹ６５４）と同じ位置に位置する。
【０３１５】
（実施例５）
ＦＧＦＲ１の結晶構造の比較
ＦＧＦＲ１キナーゼ挿入領域のコンフォメーションは、残基５７６〜５９４にわたって、４〜５．４ÅのＲＭＳＤで、３つのＦＧＦＲ１構造すべて（本研究において決定したＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ１−ＲＥ、およびＦＧＦＲ１−３Ｐと称される３ＧＱＩ）の間で著しいコンフォメーション可動性を示す（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）（図４）。ＦＧＦＲ１−ＲＥについては、一方のキナーゼドメインがパートナーキナーゼドメインに対する基質としてそれ自体を提示する、上記に議論される非対称性の二量体は見られず、ＦＧＦＲ１−ＲＥでは、非対称単位における４つの分子はどれも、他方のＦＧＦＲ１分子の触媒間隙にキナーゼ挿入領域それ自体を提示しない。３つの構造すべてにおいて、Ｒ５７６は、類似する配向を維持する。しかしながら、ＦＧＦＲ１−ＲＥ構造において、側鎖Ｒ５７７Ｅの配向は、野生型ＦＧＦＲ１と比較して、およそ１８０°反転している（図４Ｄ）。残基５７７のコンフォメーションにおけるこの結晶学的に見られる改変は、このループがある期間にわたってとる構造的空間における変化を示す。
【０３１６】
受容体活性化およびトランスリン酸化の開始に際して、後に続く特定の順番でのチロシンリン酸化がある。これは、２つのキナーゼドメイン間の二量体化表面が、正確な順序でのリン酸化を可能にするように、順次利用されることを意味し、かつ２つのキナーゼ分子の間の特異的な相互作用が、それぞれの特異的なチロシンのリン酸化において重要な役割を果たすであろうということを示唆する。同じ酵素反応がタンパク質内のそれぞれのリン酸化部位で起こるので、これは驚くべきことであり、分子間相互作用の類似する表面特性を示唆する。
【０３１７】
最近、非対称性の二量体は、ＦＧＦＲ２のキナーゼドメインについて記載された（Ｃｈｅｎら（２００８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０５巻（５０号）：１９６６０〜１９６６５頁）。ＦＧＦＲ２結晶構造では、Ｙ７６９（ＦＧＦＲ１におけるＹ７６６と等価）は、他方のキナーゼドメインに対する基質となるように見える位置にトラップされている。Ｙ７６９は、キナーゼドメインのいちばんＣ末端に位置する。これらの２つの構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＣＬＹおよび３ＧＱＩ）の比較は、酵素（分子Ｅ）または基質（分子Ｓ）として作用する２つのＦＧＦＲファミリーキナーゼドメイン間の関係を鮮明に示す（図８）。両方の構造において、境界領域が覆う表面積は、８００〜９００Å２の範囲にあり（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９７年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２２巻（１２号）：４８８〜４９０頁）、近位および遠位の結合部位から構成される。２つの構造は、近位の基質結合性領域において、高度な構造的類似性が分子ＥのＣローブ中にあることを示す。しかしながら、遠位の基質結合性領域は、２つの構造の間で有意に異なる。遠位の基質結合性表面を含む分子ＥのＮローブ残基は、コンフォメーションが相違する（図２および図８）。ＦＧＦＲ１の構造では、遠位の結合部位は、β３−αＣループにおける残基ならびに相互作用にＡ４８８およびＦ４８９のみを寄与させるヌクレオチド結合ループ由来のアミノ酸によって形成される。しかしながら、β３−αＣループのコンフォメーションは、ＦＧＦＲ１とほとんど変わらないが、ＦＧＦＲ２のヌクレオチド結合ループは、コンフォメーションにおいて有意に改変しており、Ｇ４８８〜Ｇ４９３のすべての残基が結合に寄与する。そのため、キナーゼＮローブにおける構造的差異は、遠位の基質結合性部位を改変し、トランス自己リン酸化の連続的な性質におそらく重要であろう。
【０３１８】
ＦＧＦＲの構造ベースの配列アライメントは、活性なＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の両方の構造において見つけられる境界領域の形成に関与する残基の保存を示す（図９Ａ）（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅら（２０００年）：Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３０２巻（１号）：２０５〜２１７頁）。興味深いことには、ＦＧＦＲ１におけるヘリックスαＧのＮ末端の先端およびヘリックスαＧのＮ末端ループにおける隣接する領域は、基質（分子Ｓ）の一部として境界領域形成に関与するのに対して、ＦＧＦＲ２構造における同じ領域は、酵素（分子Ｅ）の一部である。さらに、ヘリックスαＧに対してＣ末端のループは、ＦＧＦＲ２構造における基質の一部として境界領域形成に関与する。キナーゼの本体（ｍａｉｎ  ｂｏｄｙ）にヘリックスαＧをつなぐ両方のループ上に、いくつかの機能喪失型の変異が臨床的に発見された（図９Ｂ）（Ｗｉｌｋｉｅ（２００５年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，  １６巻（２号）：１８７〜２０３頁）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける受容体の自己リン酸化活性の喪失は、トランスリン酸化のための境界領域形成の破壊から起こるかもしれない。
【０３１９】
実施例１〜５についての結論
受容体チロシンキナーゼは、特異的配列におけるリガンド活性化に応じてトランスリン酸化するが、トランスリン酸化事象のこの連続的な順序に関与する分子メカニズムは、理解されていない。ＦＧＦＲ１については、Ｙ５８３がトランスリン酸化される場合に、非対称性の二量体形成を媒介する２つの領域がある。さらに、この境界領域にとって本質的な残基、Ｒ５７７Ｅの単一の点変異は、生細胞におけるＦＧＦＲ１−ＲＥの自己リン酸化を劇的に低下させる。この変異がキナーゼの折り畳みを改変せず、重大なコンフォメーション変化を招かなかったことを確認するために、ＦＧＦＲ１−ＲＥを結晶化したが、ｗｔ−ＦＧＦＲ１に対する有意差は同定されなかった（図４Ｂおよび図４Ｃ）。これにより、生細胞におけるリガンド誘導性ＦＧＦＲ１自己リン酸化の喪失が、キナーゼドメインにおけるコンフォメーション変化によって引き起こされないことが確認される。生細胞におけるＦＧＦＲ１−ＲＥ変異体の自己リン酸化の劇的な低下は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、リガンド誘導性二量体化によってもたらされる立体的な制約によって検討することができる。生細胞では、自己リン酸化は、ＦＧＦおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン誘発性のＦＧＦＲ１二量体化によって媒介される。これらの条件下で、二次元におけるキナーゼドメイン間の相互作用は、立体的な制約を増加させ、二量体複合体内のキナーゼドメイン間の位置の可能性を減少させる。すなわち、細胞膜の細胞質面における受容体分子のキナーゼドメイン間の相互作用の限られた数のモードのみが可能になる。他方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境では、キナーゼドメインは、細胞膜における受容体二量体化によって生じる立体的な制約にさらされず、三次元で移動する自由が可能であり、このことは、Ｙ５８３および他のチロシン残基のトランスリン酸化を可能にする。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリガンド誘導性二量体ＦＧＦＲ１−ＲＥは、二量体化によって生じる立体的な制約により、破壊された境界領域をバイパスすることができず、トランスリン酸化ができない。
【０３２０】
ＦＧＦＲ１のトランスリン酸化は、正確に順序付けられた順番で起こり（Ｆｕｒｄｕｉら（２００６年）およびＬｅｗら（２００９年））、すべてのチロシン自己ホスホチロシン部位のリン酸化は、完全なＦＧＦＲ１活性化に必要とされる（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら（１９９６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １６巻（３号）：９７７〜９８９頁）。ＦＧＦＲ１のトランスリン酸化部位の順序は、以下のとおりである：Ｙ６５３、Ｙ５８３、Ｙ４６３、Ｙ７６６、Ｙ５８５、およびＹ６５４。際立って、これらの連続的なチロシンリン酸化部位のそれぞれの間の距離は、３５〜５０Åである（図５）。Ｙ５８３のリン酸化は、活性化ループにおけるＹ６５３のリン酸化の後の、順序の２番目に来る。さらに、ＦＧＦＲ１の完全な活性化は、順番においてリン酸化される最後の残基である、活性化ループにおけるＹ６５４のリン酸化によって達成される。Ｙ５８３のリン酸化の失敗は、トランスリン酸化の減衰または停止をもたらし、生細胞における受容体自己リン酸化の強力な阻害をもたらし得る。
【０３２１】
実施例１〜５についての材料および方法
タンパク質の発現および精製
部位特異的変異誘発を、変異（Ｒ５７７Ｅ）を導入するために実行し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ｃｏｄｏｎ＋）に形質転換した。培養物を、０．８のＯＤ６００まで３７℃でｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地中で増殖させ、１０時間、１８℃で、１ｍＭイソプロピル−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。細胞を採取し、溶解バッファー（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭフェニルメチル−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））中に再懸濁し、次いで、フレンチプレスによって溶解させ、その後細胞破片を除去するために遠心分離を行った。ＷＴおよびＦＧＦＲ１  Ｒ５７７Ｅ変異体（アミノ酸４５８〜７６５）の発現および精製は、先に記載されるように実行した（Ｆｕｒｄｕｉら、２００６年）。タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でアフィニティークロマトグラフィーによって最初に単離し、２５０ｍＭまでのイミダゾール勾配を用いて溶出した。溶出した試料は、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（Ｓ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーに供し、Ｍｏｎｏ−Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製したタンパク質の純度および質量は、エレクトロスプレーマススペクトロスコピーによって確認した。
【０３２２】
結晶化および構造決定
タンパク質は、１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。Ｒ５７７Ｅ変異タンパク質は、１ｍＭ  ＡＭＰ−ＰＣＰ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、２０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーに移し、スクリーニングおよび最適化に供した。結晶は、等容積のタンパク質溶液およびレザバーバッファー（１５％［ｗ／ｖ］ポリエチレングリコール３３５０、２００ｍＭクエン酸リチウム）を含む懸滴技術を使用して１４日間、室温で成長させた。結晶は、非対称単位中の４つの分子により、ａ＝１８６．８Å、ｂ＝７４．３Å、ｃ＝１３５．８Å、およびβ＝９７．４°の単位格子寸法を有する有心単斜晶（ｃｅｎｔｅｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｉｎｉｃ）空間群Ｃ２に属した。複合体の溶媒含有率は、約６１％であった。結晶は、１５％グリセロールを有するレザバーバッファーを含有する凍結防止剤に移し、次いで、液体窒素中で急速冷凍した。ｗｔ−ＦＧＦＲ１の結晶は、記載されるように得た（１４）。Ｗｔ−ＦＧＦＲ１結晶は、ａ＝２１２．０Å、ｂ＝４９．８Å、ｃ＝６６．５Å、およびβ＝１０７．５°の単位格子寸法を有するＣ２空間群に属した。データは、Ｒ５７７Ｅ  ＦＧＦＲ１変異体についてはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅでｂｅａｍｌｉｎｅ  Ｘ２９で、および野生型タンパク質については自社のソースを使用して収集した。データは、ＨＫＬ２０００を使用して処理した（Ｍｉｎｏｒら（２０００年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ８巻（５号）：Ｒ１０５〜１１０）。ＦＧＦＲ１についての分子置換の解（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、ＦＧＦＲ１（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら（１９９６年）Ｃｅｌｌ，  ８６巻（４号）：５７７〜５８７頁）（ＰＤＢコード：１ＦＲＫ）およびＦＧＦＲ−３Ｐ（Ｂａｅら（２００９年）Ｃｅｌｌ，  １３８巻（３号）：５１４〜５２４頁）（ＰＤＢコード：３ＧＱＩ）のキナーゼドメインの構造を使用して、Ｐｈａｓｅｒを用いて見つけた（ＭｃＣｏｙら（２００７年）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  ４０巻（Ｐｔ．４）：６５８〜６７４頁）。ｗｔおよび変異体ＦＧＦＲ１のモデル構築および精密化は、それぞれ、ＦＧＦＲ１−ＲＥについて２２．２％および２６．３％の、ならびにｗｔ−ＦＧＦＲ１について２０．３％および２５．４％の結晶学的ＲおよびＲｆｒｅｅまでＣｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ（２００４年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  ６０巻（Ｐｔ．１２、Ｐｔ．１）：２１２６〜２１３２頁）ならびにＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら（１９９８年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  ５４巻（Ｐｔ．５）：９０５〜９２１頁）を用いて実行した。図は、ＰＹＭＯＬ（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を使用して作成した。ＰＤＢｓｕｍは、分子間境界領域を計算するために使用した（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９７年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２２巻（１２号）：４８８〜４９０頁）。データおよび精密化の統計は、��１に概説する。
【０３２３】
ｗｔ−ＦＧＦ１およびＦＧＦＲ１−ＲＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスリン酸化
１μｌの精製ｗｔ−ＦＧＦＲ１（アミノ酸４５８〜７６５）またはＦＧＦＲ１−ＲＥ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、１μｌのそれぞれ２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中）、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５と混合し、次いで、室温で、９０分まで１０分ごとに、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中の１μｌの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡによりクエンチした。非変性ゲル電気泳動は、７％非変性ゲルを用い、反応試料を用いて実行した。
【０３２４】
細胞培養、免疫沈降、およびイムノブロッティング実験
ピューロマイシン抵抗性遺伝子を含有するレトロウイルスベクター（ｐＢＡＢＥ）は、Ｌ６筋芽細胞においてｗｔ−ＦＧＦＲ１またはＲ５７７Ｅ  ＦＧＦＲ１変異体を発現する安定した細胞系の生成のために利用した。細胞は、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。実験のために、細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で一晩飢餓状態にし、続いて、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦを用いて１０分間刺激した。細胞溶解産物は、免疫沈降に供し、その後様々な抗体を用いるイムノブロッティングを行った。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得、抗ＦＧＦＲ１抗体は、先に記載されている（Ｆｕｒｄｕｉら、２００６年およびＬｅｗら、２００９年）。
【０３２５】
均等物
当業者らは、日常的な実験を用いて、本明細書において記載される、本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するであろうし、確認することもできるであろう。そのような均等物は、以下の請求項によって包含されるように意図される。
【図２Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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