(57)【要約】低温下で調製されたコメタンパク質濃縮物は、機能性及び有益な生理作用（コレステロール値の減少、血中尿素窒素を増加させることのない乳酸脱水素酵素活性の増加）の点で改善されている。コメタンパク質濃縮物により、ダイズタンパク質濃縮物よりも比較的少ない水で湿潤ドウを製造することができた。したがって、コメタンパク質濃縮物を使用することで、濃縮物を含有する食品処方の加工工程が改善された。有利なことに、食品の貯蔵寿命は延長され、口当たりの質感は良くなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、７２℃以下の温度、かつｐＨ  ３．０〜６．５の条件下で、（ｉ）デンプン粒加水分解（ＧＳＨ）活性を持つ酵素、及び（ｉｉ）第２デンプン加水分解酵素により、コメ基質中のデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びに
（ｂ）前記残渣画分から前記可溶性デンプン画分を分離して前記コメタンパク質濃縮物を得る工程、
を含む、低温工程により製造された、コメタンパク質濃縮物を含有する食品であって、前記食品中のコメタンパク質濃縮物が湿潤ドウの形態であり、該湿潤ドウが、同量のダイズタンパク質から製造される湿潤ドウと比較して約４５％未満の水分を含有する、食品。
【請求項２】
前記食品が、栄養補助食品、又は栄養補助食品の成分である、請求項１に記載の食品。
【請求項３】
前記食品が、機能性食品、又は機能性食品の成分である、請求項１に記載の食品。
【請求項４】
前記食品が、動物用飼料添加剤、又は動物用飼料添加剤の成分である、請求項１に記載の食品。
【請求項５】
前記食品が食品添加物である、請求項１に記載の食品。
【請求項６】
（ａ）可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、７２℃以下の温度、かつｐＨ  ３．０〜６．５の条件下で、（ｉ）デンプン粒加水分解（ＧＳＨ）活性を持つ酵素、及び（ｉｉ）第２デンプン加水分解酵素により、コメ基質中のデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びに
（ｂ）前記残渣画分から前記可溶性デンプン画分を分離して前記コメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む、請求項１に記載のコメタンパク質濃縮物を含む食品の製造方法。
【請求項７】
前記ＧＳＨ活性を持つ酵素がグルコアミラーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グルコアミラーゼが、ヒュミコラ（Humicola）株、リゾプス（Rhizopus）株、又はアスペルギルス（Aspergillus）株から得られたものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２デンプン加水分解酵素がα−アミラーゼである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記α−アミラーゼが細菌源から得られたものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＳＨ活性を持つ酵素が、トリコデルマ（Trichoderma）株又はアスペルギルス（Aspergillus）株における異種での発現により得られる、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記コメタンパク質濃縮物を精製する工程を更に含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記コメタンパク質濃縮物を乾燥させる工程を更に含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量が少なくとも２０％である、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記コメ基質がスラリー化され、かつ乾燥固形物含量が１０〜５５％である、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度が７０℃〜５５℃である、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）工程（ｂ）で得られる前記コメタンパク質濃縮物を、ｐＨ  ３．０〜６．５かつ７０℃〜５５℃の温度下で、ＧＳＨ活性を持つ酵素及びデンプン加水分解酵素を用い、酵素活性により加水分解して、可溶性デンプンと不溶性のコメタンパク質とを含む画分を得る工程、並びに
（ｂ）前記画分を分離して高純度のコメタンパク質濃縮物を得る工程を更に含む、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）工程（ｄ）で得られる前記高純度のコメタンパク質濃縮物を乾燥させる工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）の前記デンプン加水分解酵素がα−アミラーゼである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記高純度のコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量が少なくとも６０％である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年８月２４日に出願された米国仮出願特許第６１／３７６，５７９号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、コメタンパク質濃縮物を含有する食品、並びにこのような食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
コメは最大規模の食材の一つであり、世界人口の半分強に主食として扱われている。例えば、コメは特に食品処方でデンプン源として使用され、並びにグルタミン酸一ナトリウム、アルコール、及びビールの製造工程では炭素源として使用される。加えて、コメはミルク（米国特許第４，７４４，９９２号を参照されたい）、及び離乳食処方の成分として使用される。コメは、７５〜８０％のデンプン、８〜９％のタンパク質、９〜１２％の水、及び２．４〜５％の他の成分から構成される。高分子量の貯蔵タンパク質グルテリンがコメタンパク質の８０〜９０％を占める。アルブミン、グロブリン、及びプロラミンが残りのタンパク質の１０〜２０％を占める。
【０００４】
コメタンパク質成分はいくつかの特に望ましい特性を有する。例えば、コメタンパク質は、他の植物性タンパク質と比較して低アレルギー性であり、必須アミノ酸に富む。例えば、コメタンパク質はすべての食品タンパク質のうちメチオニンを最も高濃度に含有する（＞４．０％）。しかしながら、これまで、食品処方及び飲料品処方中のコメタンパク質の機能特性及び生理作用に対する研究は限定的なものであった。これまでに、コメタンパク質は、コレステロール低下作用などの有益な生理作用を有することが報告されているが、コメタンパク質がこれらの作用を及ぼす機構については充分に解明されていない。例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：６９４〜７０３を参照されたい。この関係において、コメタンパク質は、ダイズタンパク質、及びダイズタンパク質加水分解物から得られる高分子量画分と同様の特性を共有する。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｄｉｅｔｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃ．９１：８２０〜８２７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：２７６〜２８２を参照されたい。
【０００５】
コメデンプン加水分解物及び／又は高タンパク質コメ粉製造工程は典型的には、７５℃を超える温度下で熱安定性のαアミラーゼを用いコメ粉スラリーを加熱調理する工程を含む。高アルカリ性抽出（＞ｐＨ  １０．０）を使用して不溶性タンパク質を分離することもできる。Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１０７１〜１０７３；米国特許第４，９９０，３４４号を参照されたい。しかしながら、高温工程（ＨＴ工程）を用いると、コメタンパク質は変性することになる。Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：２２９〜２３２を参照されたい。更に、ＨＴ工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を食品に組み込もうとする試行は、コメタンパク質濃縮物の持つ吸湿性により妨害されてきた。ＨＴ工程の濃縮物は非常に多量の水分を吸収し、コメ濃縮物を含有する食品を脆くする。実際的なドウを製造するには多量の水を添加する必要があるが、多量の水を添加することで貯蔵寿命は半減してしまう。
【０００６】
国際公開第２００５／０８２１５５（Ａ２）号は、低温工程（ＬＴ工程）を用い、高純度のコメタンパク質濃縮物を製造する方法を開示する。ＬＴ工程では、コメ基質を２種類のデンプン加工酵素と接触させる。ここで、少なくとも１種の酵素はデンプン粒加水分解酵素（ＧＳＨＥ）である。コメデンプン粒は、変性温度下及びコメタンパク質の等電点のあるいは等電点付近のｐＨで加水分解される。ＬＴ工程は、国際公開第２００５／０８２１５５号に示されるような従来のＨＴ工程によるコメタンパク質濃縮物よりも、可溶性タンパク質をより高濃度に有する、コメタンパク質濃縮物を有利に産生する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、ＬＴ工程により製造されるコメタンパク質濃縮物を提供する。このコメ濃縮物は、ＨＴ工程により調製されたコメ濃縮物と比較して有利な特性を有する。例えば、ＬＴ工程により、質感及び凝集性が改善されたコメタンパク質濃縮物が製造される。これらの有利な特性により、コメタンパク質濃縮物を含有する食品の調製工程を改善することが可能である。例えば、コメタンパク質濃縮物は、同量のダイズタンパク質から製造される湿潤ドウと比較して約４５％未満の水を含有する湿潤ドウ形態で、食品に添加することもできる。この特性は有利なことに、食品の貯蔵寿命を改善し、かつ質感をより口当たりの良いものにする。更に、ＬＴ工程により製造したコメタンパク質濃縮物は、有益な生理作用（コレステロールを減少させ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を増加させ、血中尿素窒素（ＢＵＮ）を減少させる）も有する。したがって、コメタンパク質濃縮物を含有する食品、例えば、スナックバーを健康補助食品として使用することもできる。
【０００８】
一態様では、低温工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を含有する食品が提供される。低温工程は：
（ａ）可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、７２℃以下の温度、かつｐＨ  ３．０〜６．５の条件下で、（ｉ）デンプン粒加水分解（ＧＳＨ）活性を持つ酵素、及び（ｉｉ）第２デンプン加水分解酵素により、コメ基質に含まれるデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びに
（ｂ）残渣画分から可溶性デンプン画分を分離してコメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む。
【０００９】
食品はコメタンパク質濃縮物を湿潤ドウの形態で含有する。食品は、飲料、栄養補助食品又栄養補助食品の成分、動物用飼料添加剤又は動物用飼料添加剤の成分、あるいはヒトによる食用に適している食品添加物であり得る。
【００１０】
他の態様では、上記食品の製造方法が提供される。この方法は：
（ａ）可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、７２℃以下の温度、かつｐＨ  ３．０〜６．５の条件下で、（ｉ）デンプン粒加水分解（ＧＳＨ）活性を持つ酵素、及び（ｉｉ）第２デンプン加水分解酵素により、コメ基質に含まれるデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びに
（ｂ）残渣画分から可溶性デンプン画分を分離してコメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む。
【００１１】
一実施形態では、ＧＳＨ活性を持つ酵素はグルコアミラーゼであり、グルコアミラーゼは、ヒュミコラ（Humicola）株、リゾプス（Rhizopus）株、又はアスペルギルス（Aspergillus）株から得られるものであり得る。あるいは、ＧＳＨＥはαアミラーゼであり得る。同様に、第２デンプン加水分解酵素もＧＳＨＥ、例えば、微生物由来のα−アミラーゼであり得る。しかしながら、第２デンプン加水分解酵素は、βアミラーゼ又はプルラナーゼなど、ＧＳＨＥ以外の酵素であってもよい。一部の実施形態では、ＧＳＨＥは、トリコデルマ（Trichoderma）株又はアスペルギルス（Aspergillus）株での非相同な発現により得られる。
【００１２】
上記の方法では、コメ基質は、１０〜５５％の乾燥固形物含量でスラリー化され得る。一部の実施形態では、上記工程の温度は７０℃〜５５℃であり得る。この方法は更に、下位区分（ｂ）において得られるコメタンパク質濃縮物を、ｐＨ  ３．０〜６．５かつ７０℃〜５５℃の温度の条件下で、ＧＳＨ活性を持つ酵素及びデンプン加水分解酵素を用い、酵素活性により加水分解して、可溶性デンプンと不溶性のコメタンパク質とを含む画分を得る工程、並びに（ｄ）画分を分離して高純度のコメタンパク質濃縮物を得る工程、を含み得る。上記方法は更に、コメタンパク質濃縮物を精製する工程及び／又は乾燥する工程を含み得る。コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも２０％であり、及び高純度のコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも６０％である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
添付図面が本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、様々な実施例を例示する。
【図１】湿潤ドウを製造するためのコメ及びダイズタンパク質の水和濃度を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
低温下で調製されたコメタンパク質濃縮物は、機能性及び有益な生理作用（コレステロール値の減少、乳酸脱水素酵素活性の増加、及び血中尿素窒素の減少など）の点で改善されている。コメタンパク質濃縮物を使用することで、濃縮物を含有する食品処方の加工工程が改善された。有利なことに、食品の貯蔵寿命は延長され、口当たりの質感は良くなる。
【００１５】
１．定義及び略記
特に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義が適用される。
【００１６】
１．１．定義
用語「コメ」は、イネ科（Oryza saliva）として分類される植物を指す。用語「コメ基質」は、全粒、破砕粒（broken grains）、ライスグリッツ、及びコメ粉などのコメのすべての形態又は部分（脱穀済み又は未脱穀）を包含する。
【００１７】
用語「デンプン」は、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎ（式中、ｎは任意の数であり得る）の植物性多糖複合体を指す。用語「デンプン粒」は、糊化を起こしていない未調理（生）のデンプンを指す。用語「糊化」は、デンプン分子を可溶化させて粘稠な懸濁液を形成することを指す。
【００１８】
用語「コメタンパク質濃縮物」は、コメタンパク質濃縮物を約１０％（重量／重量）超有するコメタンパク質画分を指す。パラメータを修飾する場合、「約」は、通常、パラメータの測定に関係してくる、実験誤差の程度を指す。用語「高純度のコメタンパク質濃縮物」は、コメタンパク質含量が少なくとも約６０％であるタンパク質画分を指す。この用語により包含されるコメタンパク質含量は、例えば、具体的には、少なくとも６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７２％、７５％、又は８０％以上である。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換的に使用される。
【００１９】
用語「変性温度」は、タンパク質が自身の二次構造又は三次構造を失う温度を指す。用語「等電点」は、タンパク質又はタンパク質混合物が担持する電荷が正味０になるｐＨを指す。
【００２０】
用語「デキストロース当量」（ＤＥ）は、Ｄ−グルコースとして乾燥重量ベースで算出された総還元糖の測定値である。加水分解されていないデンプン粒のＤＥは本質的に０であり、Ｄ−グルコースのＤＥは１００である。
【００２１】
用語「総糖含量」は、デンプン組成物中に存在する総糖含量を指す。用語「乾燥固形分含量」（ｄｓ）は、スラリーに含有される、固形分（乾燥重量ベース）の合計量（％）を指す。用語「スラリー」は、不溶物を含む水性混合物を指す。「ブリックス計」は、所定の温度で溶液の糖含量を測定するための周知の比重計を指す。ブリックス計は、糖水溶液１００ｇあたりに存在するショ糖のグラム数を測定する（総可溶化糖含量）。ブリックス測定は、比重計又は屈折計により頻繁になされる。
【００２２】
用語「デンプンの加水分解」は、水分子の付加によるグリコシド結合の開裂を指す。語句「デンプンの大部分」は、デンプンの少なくとも８０％を意味する。
【００２３】
用語「重合度」（ＤＰ）は、所定のサッカリン中に含まれるアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）を指す。例えば、グルコース及びフルクトースなどの単糖はＤＰ１である。マルトース及びスクロースなどの二糖はＤＰ２の例である。「ＤＰ３＋」は、重合度が３を超えるポリマーを意味する。
【００２４】
本明細書で使用される用語「デンプン粒加水分解酵素」及び「デンプン粒加水分解（ＧＳＨ）活性を持つ酵素」（総じて、ＧＳＨＥ）は、粒形態のデンプンの加水分解能を持つグルコアミラーゼ又はαアミラーゼを意味する。より一般的な用語「デンプン加水分解酵素」は、ＧＳＨＥ、又はデンプンを加水分解する他の酵素を指す。グルコアミラーゼ又はαアミラーゼ以外のデンプン加水分解酵素としては、限定するものではないが、プルラナーゼ、βアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、及びβグルカナーゼが挙げられる。
【００２５】
用語「組み換えＧＳＨＥ」、「組み換え発現させたＧＳＨＥ」及び「組み換えにより製造したＧＳＨＥ」は、宿主細胞で、非相同的なポリヌクレオチドから産生された、成熟型のＧＳＨＥタンパク質配列を指す。記号「ｒ」は、組み換えタンパク質を示すために使用することができる。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株で発現させたヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）変種、サーモイデア（thermoidea）のＧＳＨＥは、「ｒＨ−ＧＳＨＥ」と記載される。用語「ネイティブなＧＳＨＥ」及び「ｎＧＳＨＥ」は宿主生物から得られたものであるＧＳＨＥを意味し、この場合、ＧＳＨＥをコードしているポリヌクレオチドは、宿主生物に内在性のものである。
【００２６】
用語「アミラーゼ」は、デンプンの加水分解を触媒する酵素を指す。用語「α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）」は、α−１，４−グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。これらの酵素は、１，４−Ｄ−グルコース単位を含有する多糖中の１，４−Ｄ−グリコシド結合のエキソ型又はエンド型加水分解に作用するものとしても報告されている。これらの酵素を記載するのに使用される他の用語はグリコゲナーゼである。例示的な酵素としては、α−１，４−グルカン４−グルカノヒドラーゼグルカノヒドラーゼ（alpha-1,4-glucan 4-glucanohydrase glucanohydrolase）が挙げられる。
【００２７】
用語「グルコアミラーゼ」は、酵素のうちアミログルコシダーゼのクラス（ＥＣ．３．２．１．３，グルコアミラーゼ、α−１，４−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）のものを指す。これらはエキソ作用型の酵素であり、アミロース及びアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を放出する。この酵素はまたα−１，６及びα−１，３結合を加水分解するが、α−１，４結合の場合と比較してその速度はかなり遅い。
【００２８】
用語「グリコシル化」は、炭水化物部分の付加によるタンパク質の転写後修飾を指し、この炭水化物がＮ−結合又はＯ−結合のいずれかの結合をすることにより、糖タンパク質が生じる。糖タンパク質のＮ−結合炭水化物部分は、グリコシド結合によりアスパラギン残基のｐ−アミド窒素に結合する。Ｏ−結合型の糖は、セリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基を介し、グリコシド結合によりタンパク質に結合する。
【００２９】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ−末端部分に結合し、成熟型のタンパク質が細胞外に分泌されるのを促進するアミノ酸配列を指す。成熟型の細胞外タンパク質には、分泌プロセス時に切断されたシグナル配列は存在しない。
【００３０】
「遺伝子」は、ポリペプチドの産生に関与するＤＮＡセグメントを指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びにそれぞれのコード配列（エキソン）の間に存在する介在配列（イントロン）を包含する。
【００３１】
用語「核酸」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはこれらの単鎖又は二本鎖及び化学的に修飾されたもののうちのいずれかを意味する。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細において同義的に使用され得る。遺伝子暗号は縮重することから、特定のアミノ酸をコードするのに１つを超えるコドンを使用することができ、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを包含する。
【００３２】
「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット及び同様物などが挙げられる。「発現ベクター」は、好適な宿主においてＤＮＡを発現させるよう作用することのできる好適な制御配列に制御可能に連結させたＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。このような制御配列には、転写プロモーター、転写を制御するための任意的なオペレータ配列、ｍＲＮＡの部位に結合する好適なリボソームをコードしている配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列が包含され得る。用語「制御可能に連結させた」は、要素が機能的に関連付けることができる配置にある近接を指す。例えば、配列の転写を制御する場合、プロモーターを、制御可能にコード配列に連結させることができる。
【００３３】
用語「選択マーカー」は、宿主で発現することができ、かつ導入した核酸又はベクターを含有するこれらの宿主の選別を容易にさせる遺伝子を指す。選択マーカーの例としては、限定するものではないが、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）、あるいは代謝優位性を付与する遺伝子、例えば宿主細胞に対する栄養上の優位性を付与する遺伝子が挙げられる。
【００３４】
用語「得られたものである」は、用語「それに由来する」、「それから得られる」若しくは「それから得ることができる」、及び「それから単離される」を包含する。
【００３５】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明に従うＧＳＨＥをコードしているポリヌクレオチドを含有する発現ベクター又はＤＮＡコンストラクトに好適な、宿主を意味する。例えば、「宿主細胞」は、細胞及びトリコデルマ（Trichoderma）種などの糸状菌の細胞から作製されたプロトプラストのいずれをも意味し得る。用語「糸状菌」は、限定するものではないが、真菌類（Eumycotina）の下位分類のうち、限定するものではないがＴ．リーゼイ（T．reesei）（以前はＴ．ロンギブラキアタム（T．longibrachiatum）として分類され、現在ではヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）としても既知である）、Ｔ．ビリデ（T．viride）、Ｔ．コニングリ（T．koningli）、Ｔ．ハルジアナム（T．harzianum）；ペニシリウム種（Penicillium sp.）；ヒュミコラ種（Humicola sp.）、例えば、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）及びヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）；クリソスポリウム種（Chrysosporium sp.）、例えば、Ｃ．ラクノウエンス（C．lucknowense）；グリオクラジウム種（Gliocladium sp.）；アスペルギルス種（Aspergillus sp.）、例えば、Ａ．オリゼ（A．oryzee）、Ａ．ニデュランス（A．nidulans）、Ａ．ニガー（A.niger）、及びＡ．アワモリ（A.awamori）；フザリウム種（Fusarium sp.）、ニューロスポラ種（Neurospora sp.）、ヒポクレア種（Hypocrea sp.）、及びエメリセラ種（Emericella sp）などの、糸状形態の菌をすべて指す。
【００３６】
用語「接触させること」は、各酵素を各コメ基質に充分な程度にごく近接しさせて配置することを指す。当業者は、酵素溶液を各コメ基質を混合することで効果的な接触が可能であることを認識するであろう。用語「インキュベートする」は、所定の時間にわたって所与の条件下でコメ基質を加水分解酵素と混合することを指す。
【００３７】
用語「酵素による変換」は、コメ基質を修飾することで可溶性加水分解粒状コメデンプンを生成すること、及び好ましくはグルコースを生成することを指す。用語「スラリー」は、不溶性のデンプン粒を含有する水性混合物を指す。多くの場合、用語「スラリー」及び「懸濁液」は互換的に使用される。
【００３８】
用語「培養すること」は、液体又は固体培地で、好適な条件下で、微生物細胞集団を増殖させることを指す。一実施形態では、「培養すること」は、典型的には容器又はリアクタ内で、デンプン粒基材を発酵させることによりグルコースシロップ又は他の所望の最終産物へと生物変換させることを指す。
【００３９】
用語「回収」、「単離」、及び「分離」は、天然に関連付けられる少なくとも１種の成分からタンパク質、細胞、核酸、又はアミノ酸を取り出すことを指す。同様に、この用語は、可溶性デンプン加水分解産物を含む混合物を、実質的に不溶性のコメタンパク質からなる残渣から分離することを指す。
【００４０】
細胞を参照する用語「形質転換した」、「好適に形質転換した」又は「トランスジェニック」は、細胞がそのゲノムの中にあるいは複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして非ネイティブ（すなわち、非相同）な核酸配列を組み込まれたことを意味する。用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づきポリペプチドが産生されるプロセスを指す。プロセスには転写及び翻訳の両方を包含する。核酸配列を細胞内に挿入する文脈において、用語「導入された（introduced）」は、「形質移入」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味する。この用語は、核酸配列を真核細胞又は原核細胞に組み込むことを包含し、核酸配列は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、樹脂、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込み、自己複製レプリコンに変換すること、又は一過性に発現させること（例えば、ｍＲＮＡの形質移入）ができる。
【００４１】
用語「比活性」は、特定の条件下で単位時間あたりに酵素調製物により産物へと変換される基質のモル数として定義される、酵素単位を意味する。比活性は、特に注記のない限り、単位／タンパク質ｍｇとして表される。本明細書で使用するとき、「酵素活性」は、基質に対する酵素の作用を指す。用語「デンプン粒加水分解酵素単位」は、アッセイ条件下、例えば、５０℃でｐＨ  ４．５、あるいは２５℃でｐＨ  ５．０の条件下で、デンプン粒基質から１分あたり１ｍｇのグルコースを産生するのに必要とされる酵素量として定義される。
【００４２】
用語「栄養補助食品」は、ヒトの食事に欠けている、又は充分な量摂取されない栄養素を供給する食品を指す。用語「機能性食品」は、割増栄養価を提供する添加物を含む食品を指す。用語「動物用飼料」は、特にヒト以外の動物による消費を目的に設計された食品を指す。用語「食品添加物」は、貯蔵寿命を改善するために食品に添加される成分を指す。
【００４３】
「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈中で明確に記載されない限り複数形も包含される。本明細書で使用するとき、用語「含有する（comprising）」及びその関連語は、それらが包括するという感覚で使用され、すなわち用語「包含する（including）」及びその対応する同類語と等価である。
【００４４】
１．２．略語
別途記載のない限り以下の略号を使用する：
【００４５】
2013535983.tif 000003
【００４６】
２．コメタンパク質濃縮物を製造するための低温工程（ＬＴ工程）
コメタンパク質濃縮物は、国際公開第２００５／０８２１５５（Ａ２）号に記載のＬＴ工程を用い製造することができる。方法は、コメタンパク質を変性させる温度を下回る温度下かつコメ基質中のタンパク質の等電ｐＨ若しくは等電ｐＨ付近のｐＨ条件下で、コメ基質を酵素により加水分解する工程を包含する。２つの画分、すなわち、（１）デンプン加水分解産物の可溶性デンプン画分、及び（２）不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分が得られる。可溶性デンプン画分は、残渣画分から分離することができ、コメタンパク質濃縮物は、残渣画分から得ることができる。一実施形態では、コメタンパク質濃縮物は、残渣画分を更に処置せずに得られる。他の実施形態では、残渣画分を加工して、画分中のコメタンパク質の割合（重量％）を更に増加させることもできる一部の実施形態では、コメタンパク質濃縮物は、高純度のコメタンパク質濃縮物である。
【００４７】
２．１．コメ基質
本発明の工程に使用されるコメ基質は、任意の既知の資源から得ることができる。例えば、コメ基質は、コメ粉又は脱穀したコメ基質であり得る。コメ基質は、例えば、約６〜１０％の総タンパク質（Ｎ×５．９５；Ｎは、ケルダール法により測定される総窒素量（％）を表し、コメの場合の換算率が５．９５である）；約７０〜８２％の炭水化物；約９〜１２％の水分；約０．４〜１．５％の粗脂肪；約０．６〜０．８％の灰及び約０．２〜０．６％の繊維を含有し得る。
【００４８】
穀粒に見られるコメタンパク質は、水への可溶性が限定されている。これらのタンパク質は主に不溶性の（アルカリ可溶性）グルテン（約８０〜９０％）；塩溶性のグロブリン（７〜１５％）；水溶性のアルブミン（９〜１０％）；及びアルコール可溶性のプロラミン（約２〜５％）である。Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．４７：５；Ｐｅｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．１７：３５１；Ｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．７１：４０９〜１１を参照されたい。
【００４９】
一部の実施形態では、コメ基質は、加工時に水に分散させる前に又はコメ基質を湿式粉砕する前に、所望の粒径へと製粉することができる。加工前に水を添加してスラリーを調製してもよい。スラリー中のコメ基質の乾燥固形物含量は、約１０〜約５５％、約２０〜約５０％、約２５〜約４５％、約２０〜約４０％、約２０〜約３５％、又は約３０〜３５％である。
【００５０】
２．２．デンプン粒加水分解酵素（ＧＳＨＥ）
本開示の方法に使用される少なくとも１種のデンプン加水分解酵素は、デンプン粒加水分解酵素（ＧＳＨＥ）である。ＧＳＨＥは、グルコアミラーゼ活性又はαアミラーゼ活性を持つ。Ｔｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：８４６〜５５；Ｋａｎｌａｙａｋｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６５：３７９〜８５を参照されたい。ＧＳＨＥは、天然に産生されたものであっても、組み換えにより産生されたものであってもよい。組み換えにより産生されたＧＳＨＥは、遺伝的に改変されていてもよい。天然に産生されるＧＳＨＥは、ヒュミコラ（Humicola）種、アスペルギルス（Aspergillus）種、ムコール（Mucor）種、及びリゾプス（Rhizopus）種などの真菌細胞から回収される。例えば、リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）由来のＧＳＨＥがＡｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：９５７〜６４及び米国特許第４，８６３，８６４号に記載されている。ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）のＧＳＨＥがＡｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２５〜２９及び欧州特許第１７１  ２１８号に記載されている。アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）の変種、カワチ（kawachi）のＧＳＨＥがＨａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３〜２９に記載されている。アスペルギルス・シロウサミ（Aspergillus shirousami）のＧＳＨＥがＳｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：１９０５〜１４に記載されている。
【００５１】
ＧＳＨＥは、ＡＴＣＣ  １６４５３、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）１５２１９、ＮＲＲＬ  １５２２０、ＮＲＲＬ  １５２２１、ＮＲＲＬ  １５２２２、ＮＲＲＬ  １５２２３、ＮＲＲＬ  １５２２４及びＮＲＲＬ  １５２２５などの菌類並びに遺伝子改変されたこれらの菌株などから回収することもできる。欧州特許第１７１  ２１８号を参照されたい。一実施形態では、ＧＳＨＥは、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）株、特にヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）の変種、サーモイデア（thermoidea）（Ｈ−ＧＳＨＥ）株から得ることができる。米国特許第４，６１８，５７９号を参照のこと。他の実施形態では、ＧＳＨＥはアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、特にＡ．アワモリ（A．awamori）の変種、カワチ（kawachi）（Ａ−ＧＳＨＥ）から得ることができる。Ｈａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３〜２９を参照されたい。更なる実施形態では、ＧＳＨＥ酵素は、麹菌のＲ．ニビウス（R.niveus）（商品名「ＣＵ  ＣＯＮＣ」で市販）などのリゾプス（Rhizopus）から得ることができ、あるいは商品名ＧＬＵＣＺＹＭＥで市販されている、リゾプス（Rhizopus）由来の酵素である。
【００５２】
２．２．１．αアミラーゼ
一部の実施形態ではαアミラーゼが使用される。αアミラーゼは酵素委員会（ＥＣ）番号ＥＣ  ３．２．１．１を有する酵素である。一部の実施形態では、αアミラーゼは熱安定性の微生物由来のαアミラーゼである。好適なαアミラーゼとしては、天然に産生されるアミラーゼ、並びに組み換えにより産生されるαアミラーゼ及びαアミラーゼ変異体が挙げられる。αアミラーゼは、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）、Ｂ．レンタス（B.lentus）、Ｂ．リケニフォルミス（B.licheniformis）、Ｂ．コアギュランス（B.coagulans）、及びＢ．アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）などのバチルス種（Bacillus）から得られたものであり得る（例えば、米国特許第５，７６３，３８５号；同第５，８２４，５３２号；同第５，９５８，７３９号；同第６，００８，０２６号、及び同第６，３６１，８０９号を参照されたい）。有用なアミラーゼを産生するバチルス（Bacillus）株としては、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号（American Type Culture Collection Accession Nos.）（ＡＴＣＣ（登録商標））３９７０９；ＡＴＣＣ  １１９４５；ＡＴＣＣ  ６５９８；ＡＴＣＣ  ６６３４；ＡＴＣＣ  ８４８０；ＡＴＣＣ  ９９４５Ａの株が挙げられる。有用な市販のαアミラーゼとしては、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ；ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ；ＧＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９７（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，ａ  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）１２０−Ｌ、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）ＬＣ、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）ＳＣ、及びＳＵＰＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）が挙げられる。
【００５３】
２．２．２．αアミラーゼ活性
α−アミラーゼ単位（ＡＡＵ）は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，９５８，７３９号に開示されている方法に従って測定されたα−アミラーゼ活性を指す。ＡＡＵの１単位は、特定の条件下で１分あたり１０ｍｇのデンプンを加水分解するのに必要とされる酵素の量を指す。α−アミラーゼ活性に関するアッセイは、化学的に保護された非還元末端糖を有する基質としてｐ−ニトロフェニルマルトヘプトシド（ＰＮＰ−Ｇ７）を使用する。ＰＮＰ−Ｇ７は、例えば、α−アミラーゼなどのエンドアミラーゼにより開裂することができる。開裂後に、α−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼは基質を消化し、黄色味を呈しかつ可視分光測光法により４１０ｎｍで測定することのできるＰＮＰ分子を遊離させる。ＰＮＰの放出速度はα−アミラーゼ活性に比例する。所定の試料のＡＡＵを標準対照に対して算出する。
【００５４】
２．２．３．グルコアミラーゼ
グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）は、デンプンの非還元末端から連続したグルコース単位を除去する。この酵素は、デンプン、アミロース及びアミロペクチンの直鎖及び分枝状グリコシド結合のいずれをも加水分解することができる。グルコアミラーゼは、バクテリア、植物、及び真菌から得られるものであり得る。
【００５５】
アスペルギルス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、ヒュミコラ（Humicola）、及びムコール（Mucor）族の真菌から分泌されるグルコアミラーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）、ムコール・ミエヘ（Mucor miehe）、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）、アスペルギルス・シロウサミ（Aspergillus shirousami）、及びヒュミコラ（Humicola）（サーモマイセス（Thermomyces））ラニギノサ（laniginosa）などの真菌株から得られたものである（例えば、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７〜１１０２；国際公開第９２／００３８１号；同第００／０４１３６号；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９〜５０５；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．６１：３０１〜０８；及びＪｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：２１８〜２３を参照されたい）。グルコアミラーゼ活性を持つ市販の酵素は、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，ａ  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／ＳのＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ（商標）−４００及びＧ  ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９０  ４Ｘ）又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種（ＣＵ．ＣＯＮＣ（商標）、新日本化学（日本）；ＧＬＵＣＺＹＭＥ（商標）、天野エンザイム（Amano Pharmaceuticals）（日本））から製造される。
【００５６】
グルコアミラーゼは、トリコデルマ（Trichoderma）宿主などの異なる宿主細胞で発現させることもできる。例えば、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）の変種、サーモイデア（thermoidea）由来のヒュミコラ（Humicola）−グルコアミラーゼ（Ｈ−ＧＡ）を、米国特許第７，３０３，８９９号に記載のように、遺伝子組み換えによりトリコデルマ（Trichoderma）宿主から発現させることもできる。一般的な発酵後、発酵ブロスを遠心処理し、バイオマスを分離することもできる。発現されたグルコアミラーゼを含有する透明な培養濾液は、応用研究で使用する前に、限外濾過を用いて濃縮することもできる。
【００５７】
２．２．４．グルコアミラーゼ活性
例えば、ｐＨ  ４．６、４０℃の条件下でのインキュベーション中に可溶性のデンプン基質の２％（重量／体積）溶液から放出される還元糖を測定することで、グルコアミラーゼ活性を判定する。グルコアミラーゼ単位（ＧＵ）は、特定の条件下で、１時間あたりに可溶性のデンプンから１ミリグラムの還元糖をグルコースの形態で放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。
【００５８】
２．３．遺伝子組み換えを用いてのＧＳＨＥの製造
ＧＳＨＥは、遺伝子組み換えにより発現されたＧＳＨＥ（ｒＧＳＨＥ）であってもよい。ｒＧＳＨＥとしては、ある種から得られる及び他の異なる種で発現された天然に生じるタンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、天然に生じるタンパク質の配列を、遺伝子工学により改変することもできる。改変されたタンパク質配列は、例えば、天然に生じる配列と比較して比活性又は熱安定性が改善されるなどといった有利な特性を有し得る。ｒＧＳＨＥ配列が改変される程度は変化し得る。例えば、ｒＧＳＨＥは、同一の種から天然に生じるＧＳＨＥ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有し得る。
【００５９】
ｒＧＳＨＥは、ＧＳＨＥが得られた株とは異なる宿主真菌株で発現させることもできる。一部の実施形態では、真菌株はアスペルギルス（Aspergillus）種、トリコデルマ（Trichoderma）種、フザリウム（Fusarium）種、又はペニシリウム（Penicillium）種などの糸状真菌株である。真菌宿主としては、Ａ．ニデュランス（A．nidulans）、Ａ・アワモリ（A.awamori）、Ａ．オリゼ（A.oryzee）、Ａ．アキュレアタス（A．aculeatus）、Ａ．ニガー（A.niger）、Ａ．ジャポニクス（A.japonicus）、Ｔ．リーゼイ（T.reesei）、Ｔ．ビリデ（T．viride）、Ｆ．オキシスポラム（F．oxysporum）、及びＦ．ソラニ（F．solani）が挙げられる。アスペルギルス（Aspergillus）株は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜４３及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  ４１：８９〜９８に記載されている。例えば、好適なＴ．リーゼイ（T.reesei）株としては、ＡＴＣＣ  １３６３１、ＡＴＣＣ  ２６９２１、ＡＴＣＣ  ５６７６４、ＡＴＣＣ  ５６７６５、ＡＴＣＣ  ５６７６７及びＮＲＲＬ  １５７０９が挙げられる。一部の実施形態では、宿主株は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３に記載のＲＬ−Ｐ３７誘導体であり得る。
【００６０】
ＧＳＨＥを発現する宿主株は、遺伝子工学により予め操作することもできる。一部の実施形態では、真菌宿主の様々な遺伝子を不活性化させることができる。これらの遺伝子はセルロース分解性酵素、例えばエンドグルカナーゼ（ＫＧ）及びエキソセロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ）など（例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ３）をコードし得る。米国特許第５，６５０，３２２号は、ｃｂｈ１遺伝子及びｃｂｈ２遺伝子に欠失を有するＲＬ−Ｐ３７の誘導体株を開示する。
【００６１】
２．４．ベクター及び真菌の形質転換
ＧＳＨＥをコードしている非相同的なポリヌクレオチドは、ベクター、特にＧＳＨＥコード配列に制御可能に連結された制御配列を含む発現ベクターを用い、真菌宿主細胞に導入することもできる。ベクターは、真菌宿主細胞に導入する際に、宿主細胞の複製可能なゲノムに組み込むことのできる任意のベクターであり得る。Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（インターネットでは＞＞ｗｗｗ．ＦＧＥＳＣ．ｎｅｔ＜＜）は好適なベクターを掲載する。更なる例としては、好適な発現及び／又は組み込みベクターは、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６〜４２８）及び米国特許第５，８７４，２７６号に見出すことができる。例示的なベクターとしては、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００、及びｐＥＮＴＲ／Ｄが挙げられる。
【００６２】
ＧＳＨＥをコードしている核酸は、真菌宿主細胞で転写活性を示す好適なプロモーターに、制御可能に連結させることができる。プロモーターは、宿主細胞にとって相同的な又は非相同なタンパク質をコードしている遺伝子から得られるものであり得る。例えば、トリコデルマ（Trichoderma）宿主で有用なプロモーターとしては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２が挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとってネイティブなものであり得る。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T.reesei）が宿主である場合、プロモーターは、例えば、受入番号Ｄ８６２３５でＧｅｎＢａｎｋに登録されている誘導型プロモーター、ｃｂｈ１などの、トリコデルマ・リーゼイ（T.reesei）のネイティブなプロモーターであり得る。誘導型プロモーターは、環境による制御又は発生による制御下で活性なプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは真菌宿主細胞にとって異種性のものである。他の有用なプロモーターの例としては、Ａ．アワモリ（A.awamori）及びＡ．ニガー（A.niger）のグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２３０６〜１５及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１〜８５を参照されたい。同様に、Ｔ．リーゼイ（T.reesei）のｘｉｎ１遺伝子及びセロビオヒドロラーゼ遺伝子のプロモーターも利用できる。欧州特許第１３７  ２８０（Ａ１）号を参照されたい。
【００６３】
ＧＳＨＥコード配列はシグナル配列に制御可能なように連結させることもできる。シグナル配列をコードしているＤＮＡは、発現させるＧＳＨＥ遺伝子と、もともと関係づけられているものであり得る。例えば、シグナル配列は、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のＧＳＨＥ遺伝子によりコードされているものであり得る。シグナル配列及びプロモーター配列は、同じ源から得られるものであり得る。例えば、シグナル配列は制御可能にｃｄｈ１プロモーターに連結しているｃｄｈ１シグナル配列であり得る。
【００６４】
発現ベクターは典型的には終結配列を含有する。終結配列及びプロモーター配列は、同じ源から得られるものであり得る。一部の実施形態では、終結配列は宿主細胞にとって同属のものであり得る。Ｔ．リーゼイ（T.reesei）などのトリコデルマ（Trichoderma）株から得られるｃｂｈ１が好適な終結配列であり得る。他の有用な真菌ターミネーターとしては、Ａ．ニガー（A.niger）又はＡ．アワモリ（A.awamori）のグルコアミラーゼ遺伝子から得られるものが挙げられる。Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４，上掲）及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４，上掲）を参照されたい。
【００６５】
発現ベクターは典型的には選択マーカーを含有する。選択マーカーの例としては、抗菌性耐性（例えば、ハイグロマイシン及びフレオマイシン）を付与することが挙げられる。ａｍｄＳ、ａｒｇＢ及びｐｙｒ４マーカーなどの栄養要求性の選択マーカーを使用することもできる。トリコデルマ（Trichoderma）の形質転換用のベクター系に有用なマーカーは、例えば、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９２），Ｃｈａｐ．６；及びＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９２）に記載される。例えば、選択マーカーは、アセトアミダーゼ酵素をコードするａｍｄＳ遺伝子であり得る。ａｍｄＳマーカーを用い形質転換させた細胞は、アセトアミドを窒素源として増殖させることができる。Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５〜７９；及びＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１：１５５〜６４を参照されたい。
【００６６】
ＧＳＨＥをコードしているポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、所定の真菌宿主生物中で自己複製することのできる、あるいは宿主ＤＮＡ中に組み込むことのできるベクターであり得る。一実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。一実施形態では、発現ベクターは、プロモーター、ＧＳＨＥコード領域、及びターミネーターのすべてが、発現させる遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含む。それ自体の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインは残しつつ、望ましくない（例えば、不要なドメインをコードしている）ＤＮＡ配列を欠失させることもできる。
【００６７】
他の実施形態では、発現ベクターは、予め構築し、高頻度の転写に必要とされる配列及び選択マーカを含有させることもできる。ＧＳＨＥ遺伝子又はその一部に関するコード領域は、発現コンストラクトプロモーター配列及びターミネーター配列の転写制御下にあるようこの汎用発現ベクターに挿入することができる。例えば、発現させた配列は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。
【００６８】
ＧＳＨＥ、プロモーター、ターミネーター、及び他の配列をコードしているポリヌクレオチドを含有するベクターを連結させ、かつそれらを好適なベクターに挿入させるのに使用される方法は当該技術分野において周知である。連結は、概して一般的な制限部位でライゲーションさせることで実行できる。このような部位が存在しない場合、従来法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター、リンカー又はＰＣＲプライマーを使用する。ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９），及びＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）ｐｐ  ７０〜７６を参照されたい。
【００６９】
不活性化された遺伝子を１つ以上有する真菌宿主細胞を得るにあたり既知の方法を使用することができる。米国特許第５，２４６，８５３号；米国特許第５，４７５，１０１号；及び国際公開第９２／０６２０９号を参照されたい。遺伝子の不活性化は、完全な又は部分的な欠失、挿入による不活性化、あるいは意図される目的に関し遺伝子を機能しないものにする任意の他の手段により実行できる（すなわち、遺伝子は、機能性タンパク質の発現を阻害される）。トリコデルマ（Trichoderma）種又はクローン化された他の糸状性真菌宿主から任意の遺伝子を欠失させることができる。例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子の欠失は、不活性化させる所望される形態の遺伝子を既知の方法により挿入することで得られる。次に、所望の遺伝子をコードしている領域の内部にある適切な制限酵素認識部位（一箇所又は複数ヶ所）で欠失プラスミドを切断し、遺伝子コード配列又はその部分を選択マーカーで置換する。マーカー遺伝子のいずれかの側に残したまま、遺伝子座から隣接するＤＮＡ配列を（好ましくは約０．５〜２．０ｋｂ）欠失させる。適切な欠失プラスミドは、概してプラスミド中に固有の制限部位が存在するものであり、これにより、隣接するＤＮＡ配列を含む遺伝子を配列断片から欠失させ、かつ単鎖線状遺伝子として除去されることになる選択マーカー遺伝子を配列断片に含有させることができる。
【００７０】
ＤＮＡコンストラクト又はベクターを宿主細胞に導入する技術は周知であり、例えば、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、リポフェクション法を用いる形質移入、ＤＥＡＥ−デキストリンを用いる形質移入、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＮＡをコーティングした微粒子を用いる高速微粒子銃、及びとりわけプロトプラストの融合などが挙げられる。一般的な形質転換法は、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）及び他の文献に教示される。糸状菌の形質転換法は、特にＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６に開示される。異種のタンパク質をトリコデルマ（Trichoderma）で発現させる方法は、米国特許第６，０２２，７２５号；同第６，２６８，３２８号；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７〜２３３；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．７：５９６〜６０３；欧州特許第２４４  ２３４号；及び同第２１５  ５９４号に開示される。同様に、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ」，ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ｐｐ．１２９〜１４８，１９９２も参照される。同様に、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９：９９１〜１００１  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓも参照される。
【００７１】
遺伝子的に安定な形質転換はベクター系により構築され、ＧＳＨＥをコードしている核を宿主株の染色体に安定的に組み込むことができる。次に形質転換体を既知の手法により精製することができる。１つの非限定的な例では、ａｍｄＳマーカーを含有する安定的な形質転換体は、アセトアミドを含有する固体培養培地上で、そのより迅速な増殖速度、及びぎざぎざしていないより滑らかな円形コロニーの形成により、不安定な形質転換体から識別される。一部の場合では、非選別型（例えば、アセトアミドを含まない）の固体培地で形質転換体を増殖させ、この培養培地から胞子を回収し、これらの胞子が続いて出芽しかつアセトアミドを含有する選択培地で増殖する割合を判定することで、安定性を更に試験する場合がある。当該技術分野において既知の他の方法を使用して形質転換体を選別することもできる。
【００７２】
一実施形態では、形質転換用のトリコデルマ種（Trichoderma sp.）の調製には、真菌糸状態由来のプロトプラストの調製が包含される。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６を参照されたい。菌糸は、出芽させた栄養胞子から得ることができる。この場合、細胞壁を消化する酵素により菌糸を処理することで、プロトプラストが得られる。次に、懸濁培地に浸透圧安定剤を存在させることでプロトプラストを保護できる。好適な安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及び同様物が挙げられる。通常、懸濁溶媒中のこれらの安定剤の濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍの間で変化し、例えば、ソルビトールの場合１．２Ｍなどである。
【００７３】
宿主トリコデルマ種（Trichoderma sp.）株へのＤＮＡ取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。概して、約１０ｍＭのＣａＣｌ２〜５０ｍＭのＣａＣｌ２が取り込み用溶液に使用される。取り込み用溶液中の他の成分としては、例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）（ｐＨ  ６．０）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの緩衝系が挙げられる。ポリエチレングリコールが細胞膜と融合するよう機能し、したがって、培地の内容物をトリコデルマ種（Trichoderma sp.）株の細胞質へと透過させ送達することで、プラスミドＤＮＡが核に移行されるものと考えられる。この融合は、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを高頻度に残すことになる。
【００７４】
通常、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）のプロトプラスト又は透過処理を施した細胞を密度１０５〜１０７／ｍＬで含有する懸濁液が形質転換に使用される。適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトール；５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の、これらのプロトプラスト又は細胞１００μＬを、所望のＤＮＡと混合する。
【００７５】
概して、高濃度のＰＥＧを取り込み用溶液に加えることができる。０．１〜１倍量の２５％のＰＥＧ  ４０００、例えば、０．２５倍量の２５％のＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、及び塩化カリウムなどの添加剤も形質転換時に取り込み用溶液及び助剤に加えることができる。同様の手順が他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号及び同第６，２６８，３２８号を参照されたい。
【００７６】
次いで１０〜３０分にわたって混合物をおよそ０℃でインキュベートすることができる。追加のＰＥＧを混合物に添加して、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列の取り込みを更に高めることもできる。概して、形質転換混合物の５〜１５倍の体積の２５％のＰＥＧ  ４０００を加えることができるが、しかしながら、これよりも多量及び少量に添加することが好適である場合もある。２５％のＰＥＧ  ４０００は、形質転換混合物の約１０倍の体積である。ＰＥＧを加えた後、次に、形質転換混合物を室温下又は氷上のいずれかでインキュベートした後にソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を加えることができる。次に、プロトプラスト懸濁液を、増殖培地の溶解アリコート（molten aliquots）に更に加えることができる。この増殖培地は、形質転換体のみを増殖させるものである。当業者であれば、同様の手順及び手法を使用して宿主細胞を形質転換させ、次に、宿主細胞で、異種由来の他の酵素、例えばデンプン加水分解酵素を発現させることができることを充分認識するであろう。
【００７７】
２．５．細胞培養
適切な宿主細胞は、概して、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ，Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１〜８６（１９８８）ａｎｄ  Ｉｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６に記載されるものなどの、生理塩及び栄養分を含有する標準培地で培養される。一般的に市販されている調製培地としては、酵素用麦芽エキス（ＹＭ）ブロス、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、及びサブロー・デキストロース（ＳＤ）ブロスが挙げられる。培養条件も同様に標準的なものである。例えば、所望される程度にまでＧＳＨＥが発現されるまでの間、培養物を振盪培養器又は発酵槽で適切な培地でおよそ２８℃にてインキュベートすることができる。糸状菌に好適な培養条件は、科学文献に記載され、又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（インターネット：＞＞ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＦＧＳＣ．ｎｅｔ＜＜）から利用することができる。
【００７８】
真菌の増殖が確立されたら、デンプン加水分解酵素、特に本明細書で定義されるようなＧＳＨＥを発現させるのに、又は発現を可能にさせるのに有効な条件に細胞を暴露させる。ＧＳＨＥをコードしている配列が、誘導型プロモーターの制御下にある場合、ＧＳＨＥの発現を誘導するのに有効な濃度の誘導剤、例えば、糖、金属塩又は抗菌剤を培地に添加することができる。
【００７９】
２．６．ＧＳＨＥ活性の確認
ＧＳＨＥアッセイは、デンプン加水分解酵素をコードしている異種性のポリヌクレオチドで形質転換させた細胞株によりデンプン加水分解酵素の発現を評価することができる。ＧＳＨＥアッセイは、タンパク質レベル、ＲＮＡレベル、あるいは特にグルコアミラーゼ活性及び／又は産生に対する機能的なバイオアッセイの使用により実施することができる。ＧＳＨＥの発現を解析するにあたり一般的に選択される例示的なアッセイとしては：ノザンブロット、ドットブロット（ＤＮＡ又はＲＮＡ解析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、適切に標識されたプローブを用いるインサイツハイブリダイゼーション、及びサザンブロットが挙げられる。
【００８０】
ＧＳＨＥの産生及び／又は発現に関しては、例えば、培養培地中のグルコースなどの糖の還元を直接測定するアッセイにより、及びグルコアミラーゼ活性、発現、及び／又は産生の測定に関するアッセイにより、試料を直接的に測定することができる。ＧＳＨＥ活性のアッセイに好適な基質としては、デンプン粒基質が挙げられる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キット番号１５−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）又はＴｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ，Ｃａｎａｄａ）などの装置を用いる任意の従来法により判定することができる。好適なグルコースオキシダーゼキット及びグルコースヘキソースキットはＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。グルコアミラーゼ活性は、３，５ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定されうる。Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４９〜５４を参照されたい。１つの非限定的な例では、ｒＧＳＨＥは、１５％の固体デンプン水分散体中のデンプン粒の、固形分含量のうち少なくとも９０重量％、９５重量％、及び９７重量％をグルコースへと加水分解する。加えて、タンパク質の発現は、細胞若しくは組織切片の免疫組織化学染色的な染色、又は組織培養培地の例えば、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡによるイムノアッセイなどの、免疫学的な手法により評価することができる。このような免疫アッセイを使用して、ＧＳＨＥの発現について質的及び量的評価をすることができる。このような手法の詳細は当業者に既知であり、このような手法の実施に関する多くの試薬は市販されている。ＧＳＨＥは、トリコデルマ（Trichoderma）宿主の組み換え体により、培養培地１Ｌあたりタンパク質１グラム（ｇ／Ｌ）以上で発現させることができる。トリコデルマ（Trichoderma）宿主組み換え体により発現されたＧＳＨＥの量は、培養培地１Ｌあたり、２ｇ、５ｇ、１０ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、又は５０ｇを超え得る。
【００８１】
２．７．ＧＳＨＥ活性の精製及び／又は単離
概して、細胞培養で産生されたデンプン加水分解酵素（例えば、ｎＧＳＨＥ又はｒＧＳＨＥ）は培地に分泌され、かつ例えば、細胞培養培地から不要な成分を除去することで単離することができる。一部の場合では、ＧＳＨＥは、細胞可溶化物から回収する必要がある細胞型形態（cellular form）で産生され得る。酵素は、当業者により慣習的に使用される技術を用い、それを産生した細胞から精製することができる。例としては、限定するものではないが、アフィニティ・クロマトグラフィー法（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１６：２１５）；イオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３６：３７；Ｆｌｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３１４；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：３３６；ａｎｄ  Ｅｌｌｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３９６：３０７）−例えば、分離能の高い物質を用いるイオン交換法が挙げられる（Ｍｅｄｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ８０８：１５３；ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｔｏｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ８６５：１２３；ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ７：２８７）−；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；等電点電気泳動法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安沈殿；及び例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲル濾過が挙げられる。
【００８２】
３．ＬＴ工程条件
ＬＴ工程では、コメ基質を好ましくはスラリー形態で含む組成物を、少なくとも１種のＧＳＨＥと接触させ又はインキュベートすることで、デンプン粒を加水分解することができる。ＧＳＨＥは、細胞を含まない抽出物（例えば、培養培地からのＧＳＨＥ単離物）に供給され、あるいはＧＳＨＥを発現し分泌する真菌細胞を含有する培養培地（例えば、発酵ブロス）に供給される。１種以上のＧＳＨＥをＬＴ工程に使用できる。２種以上のＧＨＳＥが使用される場合、それらはグルコアミラーゼ及びαアミラーゼと組み合わせることができ、あるいはそれらは複数の異なるグルコアミラーゼ又は複数の異なるαアミラーゼである。１種以上のα−アミラーゼを１種以上のグルコアミラーゼと共に加える場合、αアミラーゼ単位（ＡＡＵ）対グルコアミラーゼ単位（ＧＵ）比は１５：１〜１：１５の範囲である。一部の実施形態では、比の範囲は１０：１〜１：１０；５：１〜１：５；４：１〜１：４；約２：１〜１：４；又は約２：１〜１：２であり得る。一部の実施形態では、グルコアミラーゼは、αアミラーゼと同時にコメ基質に加えられる。他の実施形態では、グルコアミラーゼ及びαアミラーゼは連続的に加えることもできる。この場合、ＧＳＨＥは互いに約１〜６０分以内に、又は約１〜３０分以内に添加することができる。
【００８３】
デンプン加水分解酵素は、ＧＳＨＥと共に使用することができる。デンプン加水分解酵素はＧＳＨＥであり得る。デンプン加水分解酵素がＧＳＨＥ以外の酵素である場合、この酵素は、デンプンの加水分解を触媒させるにあたり当業者に周知の濃度及び条件で使用される。ＧＳＨＥに加えて、デンプン加水分解酵素としては、限定するものではないが、プルラナーゼ、βアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、及びβ−グルカナーゼが挙げられる。
【００８４】
グルコアミラーゼは、乾燥固形分を１０〜５５％に調整することができるコメ基質を含有する組成物に、スラリーの約０．００１〜１５．０ＧＵ／ｇ  ｄｓで添加することができる。他の実施形態では、グルコアミラーゼは、約０．０１〜１０．０ＧＵ／ｇ  ｄｓ、約０．０１〜５．０ＧＵ／ｇ  ｄｓ、約０．０１〜２．０ＧＵ／ｇ  ｄｓ、約０．０１〜１．５ＧＵ／ｇ  ｄｓ、約０．０５〜１．５ＧＵ／ｇ  ｄｓ、又は約０．１〜１．０ＧＵ／ｇ  ｄｓの量で添加することができる。
【００８５】
一般的に、α−アミラーゼは、コメ基質を含有する組成物に、αアミラーゼの比活性に依存して、コメ基質メートルトン（ＭＴ）あたり約０．００１〜５．０ｋｇの量で添加することができる。一部の実施形態では、α−アミラーゼは、約０．０１〜５．０ｋｇ／ＭＴ；約０．０５〜４．０ｋｇ／ＭＴ；約０．１〜２．５ｋｇ／ＭＴ；又は約０．５〜１．５ｋｇ／ＭＴの量で添加することができる。例えば、約０．０１〜１．５ｋｇのＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７又はＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，ａ  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を１メートルトンのデンプンに添加することができる。他の実施形態では、ＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７又はＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤを約０．０５〜１．０ｋｇ／ＭＴ；約０．１〜０．６ｋｇ／ＭＴ；約０．２〜０．６ｋｇ／ＭＴ；又は約０．４〜０．６ｋｇ／ＭＴの量で添加することができる。
【００８６】
コメ基質及び加水分解酵素を含有する混合物を、コメ基質を含むタンパク質の変性温度以下の温度でインキュベートすることができる。一部の実施形態では、この温度は約７２℃、７０℃、６８℃、６５℃、６３℃、６０℃、５８℃、５５℃、５０℃、４５℃、又は４０℃未満であるが、但し１０℃未満ではない。他の実施形態では、工程は約７０℃〜５０℃の温度で実施され得る。更なる実施形態では、工程は約７０℃〜５５℃の温度、及び同様に約６５℃〜５５℃の温度で実施することができる。混合物は、約ｐＨ  ３．０〜ｐＨ  ６．５；約ｐＨ  ３．０〜ｐＨ  ６．０；約ｐＨ  ３．０〜ｐＨ  ５．５；約ｐＨ  ３．５〜ｐＨ  ５．０；約ｐＨ  ３．０〜ｐＨ  ４．０；約ｐＨ  ４．５〜６．５；又は約ｐＨ  ５．０〜６．０の範囲のｐＨでインキュベートすることもできる。上記の温度及びｐＨでインキュベートする場合、混合物は、例えば、約２〜１００時間、約１０〜１００時間、約５〜５０時間、又は約１０〜２４時間にわたってインキュベートすることができる。
【００８７】
一部の実施形態では、コメ基質の乾燥固形分のうちの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が可溶性のデンプン加水分解産物に変換される。一部の実施形態では、コメ基質の乾燥固形分は完全に可溶化される。この工程の総可溶化乾燥固形物のパーセントとしてのグルコース収率は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、又は９９．５％であり得る。
【００８８】
コメ基質の少なくとも８０％、８５％及び９０％のデンプン粒を、２４時間で可溶化及び加水分解することができる。他の実施形態では、コメ基質の少なくとも９５％のデンプン粒を、２４時間で可溶化及び加水分解することができる。更に他の実施形態では、コメ基質の少なくとも９８％のデンプン粒を、２４時間で可溶化及び加水分解することができる。
【００８９】
コメ基質に対する酵素反応を終了させるためには、インキュベートされるスラリーのｐＨは、ｐＨ約３．０〜４．０に低下され得る。充分なインキュベーション時間の経過後、インキュベートしたスラリーから、実質的に不溶性のコメタンパク質濃縮物を含有する残渣は残して、可溶化されたコメデンプン加水分解産物を含有する画分を分離することができる。当業者であれは分離をなすための方法を充分承知しているであろう。一般的に、これらの分離法のうち一部のものとしては、遠心分離；一般的な濾過法及び膜分離法が挙げられる。
【００９０】
３．１．コメタンパク質濃縮物
コメ基質に含まれるデンプンの大部分を加水分解することにより、可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とが生じる。可溶性デンプン画分は、コメタンパク質濃縮物と呼ばれ、残渣画分から分離することができる。例えば、コメタンパク質濃縮物は、水に懸濁し、フィルターを通すことで更に精製することができる。コメタンパク質濃縮物中のタンパク質のパーセントは１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％を超える。一部の実施形態では、コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は約１０％〜６０％；約１０％〜５０％，約２０％〜４５％、又は約３０％〜４０％の範囲である。
【００９１】
上記のようにして得られたコメタンパク質濃縮物を、更にＧＳＨＥ及びデンプン加水分解酵素と共に、上記温度及びｐＨで一定時間インキュベートし、残りの粒状の又は不溶性のデンプンを加水分解することによって、高純度のコメタンパク質濃縮物を得ることもできる。前述同様に、２つの画分、すなわち、可溶性コメタンパク質と不溶性コメタンパク質が得られる。これらの画分を分離することで高純度のコメタンパク質濃縮物を得ることができる。
【００９２】
残留物に残っているデンプンの酵素加水分解は、約５５℃〜６０℃の温度でｐＨを例えば、ｐＨ  ５．５から、ｐＨ  ３．０〜４．０の範囲のｐＨに下げることで終了させることができる。次に、可溶性のコメデンプン加水分解産物を上記残渣から分離することで高純度のコメタンパク質濃縮物が得られる。最初の加水分解反応に使用したものと同じデンプン加水分解酵素を使用することができ、又はＧＳＨＥとデンプン加水分解酵素の異なる組み合わせを使用することもできる。高純度のコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量（Ｎ×５．９５）は、概して６０％、６３％、６５％、６８％、７０％、及び７５％を超える。一部の実施形態では、高純度のコメタンパク質濃縮物は、約６５％以上、及び同様に約７０％以上のタンパク質含量を有する。
【００９３】
この工程に従って得られたコメタンパク質濃縮物又は高純度のコメタンパク質濃縮物は、従来の及び周知の技術、例えば、真空乾燥法、スプレー乾燥法、及び凍結乾燥法などを用い乾燥させてもよい。一部の実施形態では、本発明に従って得られるコメタンパク質濃縮物の水分含量は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、及び２％未満である。一部の実施形態では、得られた高純度のタンパク質濃縮物は、水分含量が６％、５％、４％、３％、及び更には２％になるように乾燥させることもできる。一部の実施形態では、水分含量は約２％〜５％である。
【００９４】
３．２．コメタンパク質濃縮物の特性
コメタンパク質濃縮物又は高純度のコメタンパク質濃縮物は、ダイズタンパク質濃縮物と比較して、特定のアミノ酸の含量（％）が相対的に高い。例えば、本発明の手順に従って得られたコメタンパク質濃縮物の方が、グルタミン酸、バリン、ロイシン、プロリン、メチオニン、アルギニン、アスパラギン酸、又はアラニンの量が多い。
【００９５】
更に、本明細書に記載の方法に従って得られたタンパク質濃縮物及び高純度のタンパク質濃縮物は、従来の高温処理を用いるデンプン加工法により得られるタンパク質画分よりも特性が改善されている。例えば、タンパク質濃縮物及び高純度のタンパク質濃縮物は、従来のＨＴ工程により得られるタンパク質と比較して、アルカリ性のｐＨで、特にｐＨレベル１０．０でより大きな溶解性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、本発明のコメタンパク質濃縮物のタンパク質溶解度は、ｐＨ  １０の条件下では少なくとも２０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％である。更なる実施形態では、タンパク質濃縮物及び高純度のタンパク質濃縮物には、ＨＴ工程で製造されたタンパク質濃縮物と比較して、酸性ｐＨ条件下で、特にｐＨ  ２．０の条件下で、より良好な溶解度を有するタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、ｐＨ  ２．０の条件下での溶解度は少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも３０％である。
【００９６】
３．３．コメタンパク質濃縮物を含有する食品
コメタンパク質濃縮物を食品に使用することができる。この態様では、コメタンパク質濃縮物は他の食品成分、調味料、安定剤、保存料、及びこれに類するものなどと共に使用することができる。まず始めに、コメタンパク質濃縮物を、水又は他の好適な溶媒に分散させて湿潤ドウを形成した後に他の食品成分と混合する。この目的に関し、「湿潤ドウ」は、分塊圧延及び／又は押し出し加工並びに更なる加工に好適なものになるよう、水又は他の好適な溶媒に充分に分散したドウである。コメ濃縮物から形成される湿潤ドウは、ダイズタンパク質から湿潤ドウを製造するのに必要とされる量よりも４５重量％少ない水又は他の好適な溶媒を含有し得る。本文脈において、「約」は４５重量％から値がある程度変動することを予測するものであり、この変動は、測定法及び相対湿度などに関連付けられる標準誤差に由来するものである。したがって、この「約」表記により、一般的に、ダイズタンパク質の湿潤ドウよりも４０〜５０重量％少ない水を有するドウを包含する。約４５％「少ない」により、ダイズ湿潤ドウと比較して相対含水量が例えば４０％、３５％、３０％少ないことを意味するが、但しこれはコメタンパク質湿潤ドウが分塊圧延及び／又は押し出し加工並びに更なる加工に尚も好適である場合に限る。
【００９７】
コメタンパク質濃縮物は食品添加物であってもよい。このような実施形態の一つでは、コメタンパク質濃縮物は、機能性食品、例えば、栄養補給用のバー又は菓子に、添加物として更なる栄養価を提供し得る。コメタンパク質濃縮物は、栄養補助食品又は栄養補助食品の成分として使用することもできる。例えば、コメタンパク質濃縮物を食品に添加して、食事でのタンパク質摂取を補給させることもできる。コメタンパク質濃縮物の使用法についての非限定例としては、ヌガー型のバーセンター、又はカラメルセンターの成分、又は他の同様の高粘性のバーセンターが挙げられる。
【００９８】
コメタンパク質濃縮物は、ヒト以外の動物への用途が意図される動物用飼料に添加することもできる。コメタンパク質濃縮物は動物用飼料に成分として添加することもでき、動物用飼料において実質的なタンパク質源とすることもできる。
【００９９】
本開示の主題は、以降の実施例に更に詳細に記載される。引用するすべての参照は、参照することで、その内容をすべて明確に本明細書に組み込む。以降の例は説明のため提供されるが、請求される本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
国際公開第２００５／０８２１５５（Ａ２）号に記載の方法を用い、ＬＴ工程によりコメタンパク質濃縮物を製造した。本実験では、穏やかに撹拌しながら、１０ｋｇの胚芽米を４０ｋｇの水に一晩付け、その後（９５％超が３０メッシュスクリーンを通過する程度に）精米することでスラリーを調製した。スラリーのｐＨは５．５に調節した。２種のＧＳＨＥを使用して、デンプンの加水分解を触媒した：α−アミラーゼ、Ｇ  Ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９７（２ＡＡＵ／ｇ  ｄｓデンプン）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ−Ｄａｎｉｓｃｏから市販）、及びヒュミコラ（Humicola）由来のデンプン粒加水分解グルコアミラーゼ（１．０ＧＡＵ／ｇ  ｄｓデンプン）（参照により本案件に組み込まれる米国特許第７，３０３，８９９号を参照されたい）。このスラリーを６０℃で２４時間インキュベートした。フィルター押圧で可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを分離することでケーキの形態で不溶性のコメタンパク質を得た。ケーキを水に懸濁し、充分に撹拌して均一に混合した後、再度フィルター押圧で通過させた。フィルター押圧により得られたコメタンパク質ケーキを真空オーブン乾燥機で６０℃にて乾燥させ、更なる評価に使用した。ＬＴ工程により得られたコメタンパク質濃縮物の組成を表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2013535983.tif 000004
【０１０２】
（実施例２）
同様に、従来のＨＴ工程を用いコメタンパク質濃縮物を調製した。典型的実験では、穏やかに撹拌しながら、１０ｋｇの胚芽米を４０ｋｇの水に一晩付け、その後（９５％超が３０メッシュスクリーンを通過する程度に）精米することでスラリーを調製した。スラリーのｐＨは５．５に調節した。Ｇ  Ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９７（２ＡＡＵ／ｇ  ｄｓデンプン）及びヒュミコラ（Humicola）由来のデンプン粒加水分解グルコアミラーゼ（１．０ＧＡＵ／ｇ  ｄｓデンプン）を加え、スラリーを６０℃で２４時間インキュベートした。次にフィルター押圧により可溶性の固形分を分離し、不溶性のコメタンパク質ケーキを水に懸濁し、充分に撹拌して均一に混合させた後、再度フィルター押圧により通過させた。２度目のフィルター押圧により得られたコメタンパク質ケーキを、真空オーブン乾燥機で６０℃にて乾燥させた。コメタンパク質の組成を表２に提供する。
【０１０３】
【表２】
2013535983.tif 000005
【０１０４】
（実施例３）
チョコレート・ヌガー型のバーセンターで、ＬＴ工程により製造したコメタンパク質濃縮物をダイズタンパク質単離物（Ｓｏｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｐｒｏ  ５１６（Ｓｏｌａｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）））と比較した。この型のチョコレート・センターは、栄養補給バー又は菓子バーの成分として使用することもできた。コメタンパク質濃縮物は、他のバー成分と共に層状にすることもできる。タンパク質単離物を含有する食品を、表３に示すレシピに従って調製した。
【０１０５】
2013535983.tif 000006
【０１０６】
最終的な食品組成を表４に示す。「ＬＴコメ」食品は、ＬＴ工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を含有し、「ダイズ」食品はダイズタンパク質単離物を含有する：
【０１０７】
【表４】
2013535983.tif 000007
【０１０８】
コメタンパク質濃縮物を用い湿潤ドウを製造するのに必要とされる水は、最終的な配合物の７％（重量／重量）であった。対照的に、ダイズタンパク質濃縮物を用い湿潤ドウを製造するのに必要とされる水は、最終的な配合物の１２％（重量／重量）であった。理論に束縛されるものではないが、コメタンパク質濃縮物中のタンパク質は、ＬＴ工程でより高度な水和状態を維持することから、湿潤ドウの形成に必要とされる水が少なくなるものと考えられる。
【０１０９】
このコメタンパク質濃縮物の特性は予期されないものであり、かつコメタンパク質濃縮物を含有する食品に有利な特性を付与する。例えば、添加水の量が少なくなると、最終タンパク質濃度及び食品中の最終タンパク質含量を高くできる。更に、コメタンパク質濃縮物を含有する湿潤ドウの最終的な質感は非常に望ましいもの（ずっしりと重く、まとまりやすく、かつ柔軟）であった。対照的に、ダイズタンパク質単離物を用いた湿潤ドウは、望ましくないもの（軽く、まとまりにくく、かつ脆い）であった。
【０１１０】
湿潤ドウの水分含量が低くなることで、コメタンパク質濃縮物を様々な食品に組み込む際に使用される加工工程は容易なものにもなる。例えば、まとまりにくく、崩れやすいドウと比較して、ドウの操作性が良いことから、湿潤ドウの予想外の質感により、加工時の操作性も良好なものになる。更には、製造工程時に必要とされる水分量が少なくなることから、コメタンパク質濃縮物を含有する食品の操作工程はより経済的なものである。
【０１１１】
（実施例４）
以降の実験を実施し、コメ及びダイズタンパク質を充分に水和させて、栄養補給用のバー用のタンパク質含量の高いマトリックスのドウを製造するのに必要な水の量を測定し、比較した。表５に示す標準的な高タンパク質ドウ配合物を使用して、ダイズ及びコメタンパク質を比較した。この処方により、添加する追加の水の量を測定しながら、ドウの形成をモニターした。表５の手順に従い、様々な材料を混合し、次いでドウが形成されるまで５０ｇずつ増分させて追加の水を添加した。
【０１１２】
【表５】
2013535983.tif 000008
【０１１３】
表５に示されるような処方を完全に混合した後、各バッチは乾燥粉末様になった（いずれもドウを形成できなかった）（図１を参照されたい）。５０、１００、及び１５０ｇの水の添加時には、いずれのバッチでもドウの形成は観察されなかった。図１に示されるように、２００ｇの水を添加してはじめて、コメタンパク質バッチは、分塊圧延及び／又は押し出し加工並びに更なる加工に好適なドウを形成した。大豆タンパク質バッチは、４５０ｇの水を添加してはじめて好適なドウを形成した。
【０１１４】
コメドウは０．８５９の水分活性を有する一方で、ダイズドウはの水分活性は０．９３８であった。いずれの場合も貯蔵寿命が１２ヶ月以上である処方を得るにあたり調整が必要であったものの、ダイズ処方はコメ処方と比較して承認しづらいものであった。ダイズタンパク質処方では、室温で１週間保管した後、かびの発生が観察された。
【０１１５】
ダイズドウは、食した場合に口腔を非常に乾燥させ、糊のようになった。ダイズドウの質感は非常に弾性の強いものであった。コメドウでは糊様の特性は少なく、舌の上でより滑らかであり、かつ口腔を乾燥させる程度が少なかった。ライスドウはダイズドウよりも酸味が強かったものの、チョコレートフレーバーのライスドウはより好ましいものであった。
【０１１６】
要約すると、コメタンパク質は、ダイズタンパク質よりも水分含量が少ないドウを形成することができる。得られたコメドウは、口腔の感覚が改善され、すなわち、より滑らかになり、かつ口腔の乾燥感及びざらざらした食感が軽減されていることを示す。これらの特性は、可能な限り多くのタンパク質をバーに含有させることができるという点から、栄養補給用のバー用の高タンパク質ドウの製造に有益である。したがって、コメタンパク質は栄養補給用のバーの製造に望ましい材料であると考えられる。
【０１１７】
（実施例５）
無糖カラメル中で、ＬＴ工程で製造したコメタンパク質濃縮物とダイズタンパク質単離物とを比較した。この種類のカラメルは、栄養補給用又は菓子用バーで層として使用することができる。タンパク質単離物を含有する食品を、表６に示すレシピに従って調製した。
【０１１８】
2013535983.tif 000009
【０１１９】
最終的な食品組成を表７に示す。「ＬＴコメ」食品は、ＬＴ工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を含有し、「ダイズ」食品はダイズタンパク質単離物を含有する：
【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
ＬＴ工程コメタンパク質濃縮物は、予想外に粘度が低かったことから非常に使用しやすかった。粘度が低いことは、食品の製造工程において有利であり、特に、低粘度のコメタンパク質濃縮物を粘度の高い最終的な食品中で他の食品成分と組み合わせる場合に有利である。
【０１２２】
無糖カラメルの製造は、色味を出すために加熱する工程を包含する。上記されるように、ＬＴ工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を分散させるのに必要とされる水の量は、ダイズタンパク質単離物と比較してより少量である。コメタンパク質濃縮物を含有する無糖カラメルは水分含量が少ないことから、加熱工程の長さは有利に短縮されることになる。加熱時間が短縮されることで、全体的な調理時間及びエネルギー消費量が減少することになる。
【０１２３】
（実施例６）
食物タンパク質が血漿コレステロール濃度に影響を与えることは広く知られており、特に植物性タンパク質は、動物性タンパク質と比較して、血漿コレステロールを減少させ得る。コレステロール低下のメカニズムは現在でも明らかとなっていないものの、この効果はタンパク質の構造に起因するものであると考えられ、すなわち、調製法により影響を受ける可能性がある。したがって、本実施例では、ＬＴ工程及びＨＴ工程により製造されたコメタンパク質濃縮物の効果を比較した。
【０１２４】
コレステロール低下活性に加え、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定した。乳酸の蓄積は疲労状態を誘起する。ＬＤＨは、肝臓において乳酸のピルビン酸への変換を触媒することにより、筋肉中で乳酸の蓄積を減少させる。したがって、ＬＤＨ活性は、運動時の代謝を評価するための最も重要な指標のうちの１つである。
【０１２５】
血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度も測定した。ＢＵＮ濃度は運動時のタンパク質及びアミノ酸代謝に応答して上昇する。ＢＵＮ濃度は負荷の重い運動（すなわち、高負荷）時に筋肉の持久性を評価するにあたり非常に高感度な指標であり、長時間にわたる中〜高強度の運動時の疲労度を評価するための一般的な生化学的指数として使用することができる。ＢＵＮが高いほど、負荷に対する耐性が低くなる。例えば、Ｐｏｏｒｔｍａｎｓは、長時間の運動時にＢＵＮ濃度が上昇することを報告している。Ｐｏｏｒｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）「Ｄｏ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｅｔｓ  ｈａｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｒｉｓｋｓ  ｏｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｈｌｅｔｅｓ？」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔ  Ｎｕｔｒ．Ｅｘｅｒｃ．Ｍｅｔａｂ．１０：２８〜３８を参照されたい。
【０１２６】
ＬＴ−及びＨＴ工程のコメタンパク質濃縮物の効果を評価するために、コメタンパク質濃縮物を添加した餌をラットに与え、動物モデルを構築した。ラットには、ＬＴ工程（「ＬＴ」）又はＨＴ工程（「ＨＴ」）製の同量のコメタンパク質濃縮物を４週間投与した。要約すると、ＬＴ及びＨＴ群で血漿コレステロール濃度の低下が観察され、ＬＴを与えたラットはＨＴを与えたラットと比較して好ましい程度にまでコレステロール低下作用を示した。驚くべきことに、ＬＤＨ活性は、基本的な餌を投与した対照群（ＢＤ）及びＨＴ群と比較してＬＴ群において統計的に有意に高かった。ＬＴ及びＨＴ群の両方でＢＵＮ濃度のわずかな低下が観察されたが、統計的に有意な差はなかった。ＬＴ及びＨＴのいずれもが、試験したラットの肝重量に負の影響は与えなかった。
【０１２７】
６．１．解析手順
血液を３０００×ｇで１０分間遠心分離することで血漿を得た。総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性、及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）などの様々な生化学的パラメータを自動解析機Ｈｉｔａｃｈｉ  ７１７０Ａ（日立、東京）を用い測定した。ＴＣ及びＴＧについての波長は５０５ｎｍであり、ＨＤＬ−Ｃについての波長は６００ｎｍであった。対となる試料を用いｔ−検定を統計解析のために用いた。
【０１２８】
６．１．１．コレステロール測定
自動解析機Ｈｉｔａｃｈｉ  ７１７０Ａ（日立、東京）を用いコレステロール濃度を測定した。すべての試薬はＲｏｃｈｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから得られる。血漿はラットの血液を３０００×ｇで１０分間遠心分離させて得た。次に血漿を生理食塩水で希釈した。試料及び標準を解析用にバイアルに注ぎ入れた。自動解析機の波長は５０５ｎｍに設定し、コレステロール濃度は次の式を用い算出した：
コレステロール濃度＝Ａ（試料）／Ａ（標準）＊Ｃ（標準）、
式中、Ａ＝吸光度であり、及びＣ＝標準の濃度である。
【０１２９】
６．１．２．ＬＤＨ測定
Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪからのアッセイ系を用い、ＬＤＨ活性を測定した。簡潔に言えば、ＮＡＤＨを酸化させることで生じる３４０ｎｍでの吸光度の減少により反応速度を測定した。反応の開始直線領域からΔＡ３４０／分を測定した。１単位は、２５℃、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ  ７．３）にて、特定の条件下で、１分あたりに１マイクロモルのＮＡＤＨが酸化される単位として定義される。
【０１３０】
６．１．３．ＢＵＮ測定
Ｓａｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：８１６〜２６に記載されるアッセイ法を改変して、ＢＵＮを測定した。最初の反応では、ウレアーゼが、触媒反応により尿素を炭酸アンモニウムへと変換させる。この反応は、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）の濃度に依存する第２の反応と連結している。第２の反応の速度は、３４０ｎｍでの吸光度の変化により、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋へと変換する速度として測定することができる：
【０１３１】
【化１】
2013535983.tif 000011
【０１３２】
６．２．血漿コレステロール濃度が高いモデルの確立
ラット（体重約１８ｇ）をＳｈａｎＨｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄから購入し、それぞれ、温度（２１〜２５℃）及び湿度（４０〜５０％）が制御された、明暗サイクルが１２時間の室内の金属製のケージに収容した。ラットには５日間基本的な餌（ＢＤ）を与え、実験室内の環境に順応させた。続いて、ラットをそれぞれ６匹ずつ８群に分け、実験用の餌を割り当てた。コレステロールを含有する実験用の餌（ＥＤＣＣ）の化学的な組成を表８に示した。ラットには、１日あたり、体重１ｋｇあたり、０．４ｇのＬＴ又はＨＴを含有するＥＤＣＣを与えた。
【０１３３】
【表８】
2013535983.tif 000012
【０１３４】
実験試料を与える前に、眼窩静脈から血液試料を採血した。実験１は５匹の群であり、血漿コレステロール濃度に対するＬＴ及びＨＴの効果を比較した。実験２は３匹の群であり、耐久性に対するＬＴ及びＨＴの効果を比較した。食餌投与期間は４週間であった。
【０１３５】
表９は、それぞれＥＤＣＣ及びＢＤを与えたラットのＴＣ、ＴＧ、及びＨＤＬ−Ｃにおける変化を示す。ＥＤＣＣ群での血漿総コレステロール濃度は、対照群のものと比較して統計的に有意に高かった（Ｐ＜０．０１）ことから、このモデルは首尾よく確証された。
【０１３６】
【表９】
2013535983.tif 000013
【０１３７】
値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３ラット／基）である。＊Ｐ＜０．０２５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【０１３８】
６．３．ＬＴ及びＨＴ工程のコメタンパク質濃縮物によるコレステロール低下作用
表１０は、ＬＴ及びＨＴ餌を与えたラットにおいて、３０日後に総血清コレステロールが統計的に有意に減少していたことを明らかにする（Ｐ＜０．０１）。ＬＴ及びＨＴによるコレステロール低下の程度は、ＥＤＣＣ餌の場合と比較してそれぞれ２６．８７％及び１９．６０％であった。この結果は、コメタンパク質濃縮物の機能特性は、ＨＴ工程よりもＬＴ工程で製造した場合の方が、より効果的に維持されることを示す。表１０中の「ＭＤ」は平均群を指し、この群ではラットには、１日あたり、体重１ｋｇあたり、０．０１ｇのＸｕｅ  Ｋａｎｇ  Ｎｉｎｇ（モナスカス（Monascus）株の高品質な粒を発酵させることで得られる紅色酵母米（Ｈｏｎｇ  Ｑｕ）１００％）を含有するＥＤＣＣを与えた。
【０１３９】
【表１０】
2013535983.tif 000014
【０１４０】
値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３ラット／基）である。＊Ｐ＜０．０２５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【０１４１】
６．４．疲労モデルの確立
疲労モデルを確立させるために、ラットには、実施例６．２に記載した高血漿コレステロール濃度モデルを確立するのに使用したものと同一条件下で、ＢＤ、ＬＴ、又はＨＴを与えた。ラットには、ラットの総体重の約４％を有する物体を用い負荷をかけた。負荷をかけたラットを水（２８〜３２℃）中で４０分間泳がせた。３０分休息させた後、それぞれのマウスから血液を回収し、肝臓を摘出し、計量した。実施例６．１．２に概説される手順を用い、血液試料中のＬＤＨ活性を測定した。
【０１４２】
６．５．ＬＤＨ活性に対するＬＴ及びＨＴ工程のコメタンパク質濃縮物の効果
表１１に示されるように、上記疲労モデルからの血液試料におけるＬＤＨ活性は、ＢＤ及びＨＴ群においてよりも、ＬＴ群において、統計的に有意に、かつ予想外にずっと高かった。ＬＴでは、同じ用量でのＨＴと比較して特にＬＤＨ活性が５８．５６％も増加していた。ＬＤＨ活性の増加により、乳酸の代謝の増加及び疲労打破（stave prostration）が見込まれる。
【０１４３】
【表１１】
2013535983.tif 000015
【０１４４】
値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３ラット／基）である。＊Ｐ＜０．０２５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【０１４５】
６．６．ＢＵＮ濃度に対するＬＴ及びＨＴ工程のコメタンパク質濃縮物の効果
ＬＤＨ活性を測定するために屠殺したのと同じ動物でＢＵＮ濃度を測定した。表１２で示されるように、ＬＴ及びＨＴ工程のコメタンパク質濃縮物の両方に関し、ＢＵＮ濃度のわずかな減少が観察された。結果は統計的に有意なものではなかったものの、ＬＴ工程のコメタンパク質濃縮物は確実にＢＵＮ濃度を上昇させなかった。したがって、この結果は、実施例６．５でＬＤＨ活性を用い測定されたように、ＬＴ工程のコメタンパク質濃縮物が持久力を増強し、疲労耐性を増強することと一致する。
【０１４６】
【表１２】
2013535983.tif 000016
【０１４７】
値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３ラット／基）である。＊Ｐ＜０．０２５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【０１４８】
６．７．肝重量に対するＬＴ及びＨＴ工程のコメタンパク質濃縮物の効果
ＬＤＨ活性を測定するために屠殺したのと同じ動物で総体重及び肝重量を測定した。表１３の結果は、ＬＴ及びＨＴ群の両方で総体重がＢＤ群よりもわずかに、しかしながら統計的に有意な程度に低下していたと示しており、おそらくこれらの群において、全体的なカロリー摂取量がより制限されたことを反映している。総体重対肝重量比に統計的に有意な差は存在しないものの、ＬＴ及びＨＴがラットの肝臓に対して負の影響を有さないことが示された。
【０１４９】
【表１３】
2013535983.tif 000017
【０１５０】
値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３ラット／基）である。＊Ｐ＜０．０２５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【０１５１】
意図された使用に関する趣旨又は範囲から逸脱することなく、同様のものを用いる、組成物及び方法に様々な改変及び変更を加えることができることは当業者には明白であろう。したがって、このような改変及び変更は、それらが添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内で提供されるものである。
【図１】
2013535983.tif 000018
【国際調査報告】
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2013535983.tif 000020
2013535983.tif 000021