(57)【要約】  【解決手段】  天然食料品の比率に由来する比率で複数の抗酸化化合物を含む相乗的栄養補助剤。  【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
相乗的抗酸化力を有する栄養補給剤の組成物を決定する方法であって、
（ａ）食料品の抗酸化化合物を同定する工程と、
（ｂ）前記食料品に同定された少なくとも２つの前記抗酸化化合物の食料品の比率を測定する工程であって、前記食料品の比率は前記少なくとも２つの化合物それぞれの相互比率である、前記比率を測定する工程と、
（ｃ）前記少なくとも２つの抗酸化化合物の抗酸化力を測定する工程と、
（ｄ）前記少なくとも２つの抗酸化化合物の混合物を、それらの食料品の比率で生成する工程と、
（ｅ）前記混合物の抗酸化力を測定する工程と、
（ｆ）前記混合物中の前記抗酸化化合物の単独の抗酸化力値の合計に基づいて予想される抗酸化力と、前記混合物の抗酸化力とを比較することにより、前記混合物が相乗的な抗酸化特性を有するか否かを決定する工程であって、相乗作用は前記抗酸化力が前記予想される抗酸化力よりも大きい場合に示されるものである、前記決定する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
少なくとも２つの抗酸化化合物として同定された化合物について（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）を繰り返す工程を有し、前記少なくとも２つの抗酸化化合物のうち少なくとも１つが異なるものである、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、４若しくはそれ以上の抗酸化化合物が同定され、前記混合物が少なくとも３つの前記抗酸化化合物の組み合わせを有するものである、方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、少なくとも３つの抗酸化化合物が同定され、前記繰り返す工程は、２または３つの抗酸化化合物の考えられ得る組み合わせの追加の混合物について行われるものである、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記繰り返す工程は、２または３つの抗酸化化合物の考えられ得る混合物すべてについて行われるものである、方法。
【請求項６】
抗酸化化合物を有する栄養補助剤であって、前記抗酸化化合物が、相互に相乗的抗酸化特性を提供する比率で基本的に２または３つの抗酸化化合物から成るものである、栄養補助剤。 
【請求項７】
請求項６記載の栄養補助剤において、前記２または３つの抗酸化化合物が、
（ａ）食料品の抗酸化化合物を同定する工程と、
（ｂ）前記食料品に同定された少なくとも２つの前記抗酸化化合物の食料品の比率を測定する工程であって、前記食料品の比率は前記少なくとも２つの化合物それぞれの相互比率である、前記比率を測定する工程と、
（ｃ）前記少なくとも２つの抗酸化化合物の抗酸化力を測定する工程と、
（ｄ）前記少なくとも２つの抗酸化化合物の混合物を、それらの食料品の比率で生成する工程と、
（ｅ）前記混合物の抗酸化力を測定する工程と、
（ｆ）前記混合物中の前記抗酸化化合物の単独の抗酸化力値の合計に基づいて予想される抗酸化力と、前記混合物の抗酸化力とを比較することにより、前記混合物が相乗的な抗酸化特性を有するか否かを決定する工程であって、相乗作用は前記抗酸化力が前記予想される抗酸化力よりも大きい場合に示されるものである、前記決定する工程と
によって決定された相互の比率である、栄養補助剤。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記食料品は果物である、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記抗酸化力は
酸素ラジカル吸収能分析（ＯＲＡＣ）、
ペルオキシ亜硝酸ＯＲＡＣ分析（ＮＯＲＡＣ）、
ペルオキシ亜硝酸ＯＲＡＣ分析（ＮＯＲＡＣ）、
酸素ラジカル吸収能ピロガロールレッド分析（ＯＲＡＣ−ＰＧ）、
２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジルラジカル分析（ＤＰＰＨ）、
プラズマの鉄還元能力分析（ＦＲＡＰ）、
トロロックス等価抗酸化能力分析（ＴＥＡＣ）、
ビタミンＣ等量抗酸化能分析（ＶＣＥＡＣ）、
２’−アジノビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）分析（ＡＢＴＳ）、
第二銅還元抗酸化能分析（ＣＵＰＲＡＣ）、
総ラジカルトラップ抗酸化パラメーター（Ｔｏｔａｌ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｉｎｇ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：ＴＲＡＰ）分析、または
細胞抗酸化活性分析（ＣＡＡ）によって測定されるものである、方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記抗酸化力はＯＲＡＣにより測定されるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願書類の相互参照
２００９年１０月２０日に提出された米国特許仮出願第６１／２７９，３６８号、２０１０年３月２日に提出された米国特許仮出願第６１／３３９，２４４号、および２０１０年６月１４日に提出された米国特許仮出願第６１／３９９，５４８号の利益を請求し、この参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
植物は、細胞シグナル伝達分子、抗酸化物質、または侵入する害虫に対する毒素として機能するフェノール化合物を産生する（Ｃｒｏｚｉｅｒら、２００６）。果物の化合物について研究が行われ（Ｒｏｂａｒｄｓら、１９９９；Ｆｒａｎｋｅら、２００４；Ｈａｒｎｌｙら、２００６）、抗酸化力が高いことから、フェノール化合物が主に注目された。
【０００３】
果物にみられる濃度の個々のフェノール化合物の抗酸化力と果物全体の抗酸化力には相違があり（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ、１９９７；ＺｈｅｎｇおよびＷａｎｇ、２００３）、果物全体の抗酸化力の方が高い。この相違に考えられる説明としては、果物に未確認の化合物がある、果物に存在する多数の化合物を合計しても濃度が低い、またはフェノール化合物の間に相乗的相互作用があるなどの可能性がある。
【０００４】
ＬｉｌａおよびＲａｓｋｉｎ（２００５）は、内的相互作用（ｅｎｄｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、つまりその薬理学的作用を変化させる可能性がある植物内の相互作用と、関連性のない植物成分および／または薬物の相互作用である外的相互作用（ｅｘｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）の点で、相加的または相乗的増強について考察した。外的相互作用による抗酸化相乗作用は注目されてきた。ＹａｎｇおよびＬｉｕ（２００９）は、リンゴ抽出物とケルセチン３−β−Ｄ−グルコシドの組み合わせがヒト乳癌細胞に相乗的な増殖抑制作用を示すことを報告した。大豆およびアルファルファの植物エストロゲン抽出物およびアセローラチェリー抽出物の組み合わせは相乗的に作用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＤＬ酸化を抑制する（Ｈｗａｎｇら、２００１）。ＬｉａｏおよびＹｉｎ（２０００）は、アルファ・トコフェロールおよび／またはアスコルビン酸とコーヒー酸、カテキン、エピカテキン、ミリセチン、没食子酸、ケルセチン、およびルチンの組み合わせは、Ｆｅ２＋誘導脂質酸化系において、前記化合物いずれか単独よりも抗酸化活性が高いことを証明した。
【０００５】
効果的な天然防腐剤を開発または発見することに目下の関心がある（Ｇａｌａｌ、２００６）。抗菌薬として抽出物（Ｓｅｒｒａら、２００８；Ｃｏｎｔｅら、２００９）、フェノール化合物（Ｒｏｄｒ’ｉｇｕｅｚ  ＶａｑｕｅｒｏおよびＮａｄｒａ、２００８）、または化合物の混合物（Ｏｌｉｖｅｉｒａら、２０１０）を利用するなどのアプローチがある。考えられる抗酸化物質混合物の機能性の背後にあるメカニズムを理解することは、潜在的な保存料の開発に重要である。
【０００６】
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
フェノール化合物は、抗酸化および抗菌特性を有することが知られている。これらの特性は、食品または飲料の保存に有用と考えられる。食品中のフェノール化合物の相互作用による抗酸化特性は、あまり研究されていなかった。果物の抗酸化物質の組み合わせがどのように協調して作用するかを理解することは、今後の食品および／または飲料保存における利用を後押しする。
【０００８】
１つの態様は、食料品には抗酸化フェノール化合物の相乗的組み合わせが存在することの発見である。相乗的内的相互作用が前記抗酸化物質自体の間に発生するという発見は重要である。別の態様は、抗酸化物質の相乗的組み合わせを決定する系であり、相乗作用はこれらの抗酸化化合物が前記混合物中に存在する比率に一部依存するという発見である。
【０００９】
別の態様は、考えられる相乗的抗酸化物質の組み合わせおよび比率を決定するモデルとして、果物などの食料品を利用するものである。食料品に存在する抗酸化物質の考えられる比率および組み合わせをすべて試すという、実行不可能なほどに長く、高額なプロセスよりも、前記抗酸化物質は食料品中に発生する組み合わせおよび比率で検討する。このように、相乗的な抗酸化力を有する可能性が高い組み合わせを検討する。
【００１０】
１つの態様は、相乗的な抗酸化力を有する栄養補給剤を製造する方法である。食料品では、少なくとも２つの抗酸化化合物が食料品中に同定され、個々の抗酸化力が決定されている。さらに、食料品中の相互の比率、つまり食料品の比率を決定している。前記混合物の抗酸化力が、個々に見て、前記相加的または予想される抗酸化力（前記混合物中の化合物の抗酸化力の合計）よりも大きいか否かを決定することで、前記化合物間で前記抗酸化力に相乗効果があるか否かを決定することができる。
【００１１】
抗酸化化合物は、抗酸化力を有する化合物である。抗酸化力の測定には、いかなる適切な系を用いることもできる。その例として、単一化合物および混合物の抗酸化力を酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）分析により決定する。この方法が数多くある抗酸化力測定の選択肢の中から選ばれたのは、一般的に利用され、学術研究以外でもよく知られているためであり、その目標の１つが前記結果をヒトの栄養または食品保存に応用できる可能性を示すことであったためである。しかし、抗酸化力を決定するために適した方法は、いずれも熟慮されている。これに限定されるものではないが、適した方法には以下の方法が含まれる：
ＯＲＡＣ−酸素ラジカル吸収能分析、
ＮＯＲＡＣ−ペルオキシ亜硝酸ＯＲＡＣ分析、
ＨＯＲＡＣ−ヒドロキシＯＲＡＣ分析、
ＯＲＡＣ−ＰＧ−酸素ラジカル吸収能ピロガロールレッド分析、
ＤＰＰＨ−２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジルラジカル分析、
ＦＲＡＰ−プラズマの鉄還元能力分析、
ＴＥＡＣ−トロロックス等価抗酸化能力分析、
ＶＣＥＡＣ−ビタミンＣ等量抗酸化能分析
ＡＢＴＳ−２’−アジノビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）分析、
ＣＵＰＲＡＣ−第二銅還元抗酸化能分析、
ＴＲＡ−総ラジカルトラップ抗酸化パラメーター（Ｔｏｔａｌ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｉｎｇ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）分析、および
ＣＡＡ−細胞抗酸化活性分析
抗酸化混合物の相乗作用は、まず、食料品中の化合物の相互比率である、食料品の比率で抗酸化化合物少なくとも２つを有する混合物を形成することで、および前記混合物の抗酸化能を決定することで決定する。
【００１２】
相乗作用は、前記混合物の予想される抗酸化力または相加的抗酸化力値と比較することで決定する。前記相加的値は、前記混合物の個々の抗酸化化合物それぞれの抗酸化力を、個々に見て、またはそれぞれか独立して機能すると仮定して合わせた値である。前記比較は、前記抗酸化化合物すべての混合物として得られた抗酸化力から、個々の化合物の抗酸化力の合計を引くことで計算することができる。結果がプラスであれば、相乗作用を示す。値がマイナスまたは統計的に小さなプラスまたはゼロの場合は、拮抗作用または化合物間に相互作用がないことを示す。前記抗酸化力を測定する場合、いくつかのサンプルの平均をとることで、統計的によりよい値が得られる。
【００１３】
別の態様は、相乗的抗酸化力を有する化合物の混合物を形成することで作成した栄養補助剤であり、前記混合物は、相乗的抗酸化力を有すると判断された相互の比率における、特定の抗酸化化合物の混合物である。
【００１４】
果物など、特定の食料品に認められる濃度比率で、個々のフェノール系抗酸化物質から開始することにより、内的相互作用のみによって相乗作用を証明できることが分かった。これは、食料品全体と個々の成分の抗酸化力の差を説明し、最適化された果物由来抗酸化保存料の開発の基盤を確立するのに役立つ。
【００１５】
食料品には、乾燥、凍結、加熱（低温殺菌を含む）、他の成分との混合、またはヒトの消費用に利用される前に食品に応用されるすべての処理などの後処理が行われる食品を含む、ヒトの消費用に栽培される植物由来の食品を含む。フェノール系抗酸化化合物を含む食品は、食料品として検討され、抗酸化化合物の相乗的組み合わせを決定するために分析することができる。例としては、果物（以下に例示されるオレンジ、イチゴ、およびブルーベリーなど）、野菜、ナッツ類、卵、植物油、穀物（黒米を含む）、大豆、チョコレート、シナモン、オレガノ、発酵飲料（赤ワイン）、茶、およびコーヒーを含む。鶏肉および魚など特定の肉には抗酸化物質が含まれ、相乗的抗酸化比率の決定に用いる食料品とみなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】組み合わせた場合−前記組み合わせに用いた個々の化合物の酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）の差（式１〜式３）。ここに示したすべての組み合わせは統計的に有意であり（Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差を用いてｐ<０．０５）、統計的に有意ではなかった組み合わせは示していない。Ｃ＝クロロゲン酸；Ｈ＝ヘスペリジン；Ｌ＝ルテオリン；Ｍ＝ミリセチン；Ｎ＝ナリンゲニン；Ｐ＝ｐ−クマル酸；Ｑ＝ケルセチン。ＨＣはＨとＣの混合物のＯＲＡＣ−ＨのＯＲＡＣおよびＣのＯＲＡＣを示し、他の組み合わせも同様である。各値は４回の測定の平均である。
【図２】オレンジにみられる濃度で３つのフェノール化合物を組み合わせた場合の酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）−２＋１  ＯＲＡＣデータの合計（式４）。このようにデータを解析することで、パターンが明らかになり、どの化合物の相互作用が最もＯＲＡＣに影響しているかを決定することが可能となる（さらに進んだ考察については本文を参照）。ここに示したすべての組み合わせは統計的に有意であり（ＡＮＯＶＡの推定を用いてｐ<０．０５）、統計的に有意ではなかった組み合わせは示していない。Ｃ＝クロロゲン酸；Ｈ＝ヘスペリジン；Ｌ＝ルテオリン；Ｍ＝ミリセチン；Ｎ＝ナリンゲニン；Ｐ＝ｐ−クマル酸；Ｑ＝ケルセチン。ＨＣ＋ＮはＨ、Ｃ、およびＮの混合物のＯＲＡＣ−ＨＣの混合物のＯＲＡＣおよびＮのＯＲＡＣを示し、他の組み合わせも同様である。各値は４回の測定の平均である。
【図３】オレンジにみられる濃度で４つのフェノール化合物を組み合わせた場合の酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）−３＋１  ＯＲＡＣデータの合計（式５）。このようにデータを解析することで、パターンが明らかになり、どの化合物の相互作用が最もＯＲＡＣに影響しているかを決定することが可能となる（さらに進んだ考察については本文を参照）。ここに示したすべての組み合わせは統計的に有意であり（ＡＮＯＶＡの推定を用いてｐ<０．０５）、統計的に有意ではなかった組み合わせは示していない。Ｃ＝クロロゲン酸；Ｈ＝ヘスペリジン；Ｌ＝ルテオリン；Ｍ＝ミリセチン；Ｎ＝ナリンゲニン；Ｐ＝ｐ−クマル酸；Ｑ＝ケルセチン。ＨＣ＋ＮはＨ、Ｃ、およびＮの混合物のＯＲＡＣ−ＨＣの混合物のＯＲＡＣおよびＮのＯＲＡＣを示し、他の組み合わせも同様である。各値は４回の測定の平均である。
【図４】フェノール化合物の構造と一電子還元電位。
【図５】イチゴ中の抗酸化化合物の構造。
【図６】ブルーベリー中の個々の化合物のＯＲＡＣ。
【図７】予想される結果と比較した１：１混合物および果物の比率の混合物のＯＲＡＣ。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１７】
ネーブルオレンジに認められるフェノール化合物の相乗的および拮抗的相互作用
ネーブルオレンジ（スイートオレンジ）に認められる濃度で個々のフェノール化合物（クロロゲン酸、ヘスペリジン、ルテオリン、ミリセチン、ナリンゲニン、ｐ−クマル酸、およびケルセチン）の抗酸化力の相互作用を分析し、拮抗的、相加的、または相乗的相互作用を観察した。２、３、および４種類のフェノール化合物の混合物を用意した。酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）分析を用い、これらの組み合わせの抗酸化力を定量化した。２つの化合物の３種類の組み合わせおよび３つの化合物の５種類の組み合わせに相乗作用があることが分かった。２つの化合物の拮抗的組み合わせも１種類見つかった。第４の化合物を追加しても、追加の相乗作用は発生しなかった。この結果を説明するためにモデルを開発した。還元電位、相対濃度、およびカテコール（ｏ−ジヒドロキシベンゼン）基の有無はこのモデルの因子であった。
【００１８】
材料と方法 
化学物質
トロロックス（（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２カルボン酸）（純度９７％、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、ナリンゲニン（９５％、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、ケルセチン水和物（９５％、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、水酸化ナトリウム（５０％溶液）、Ｋ２ＨＰＯ４、およびＫＨ２ＰＯ４（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．）はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）から購入した。クロロゲン酸（９５％）、ヘスペリジン（>８０％）、ルテオリン（９９％）、ミリセチン（９５％）、ｐ−クマル酸（９８％）、およびフルオレセイン（ナトリウム塩）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリー州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）から購入した。ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド）はＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  Ｉｎｃ．（米国バージニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）から購入した。
【００１９】
化学物質の調製
オレンジ中に認められる最も高濃度のフェノール化合物７種類、つまりクロロゲン酸、ヘスペリジン、ルテオリン、ミリセチン、ナリンゲニン、ｐ−クマル酸、およびケルセチンを選択した（Ｐｒｏｔｅｇｇｅｎｔｅら、２００３；Ｆｒａｎｋｅら、２００４；ＵＳＤＡフラボノイドデータベース２００７）。ヘスペリジンを除き、それぞれ無糖体として引用文献で定量化された。すべての化合物は既発表濃度で調製した（表１）。
【００２０】
【表１】
2013508724.tif 000003
【００２１】
オレンジは水分含有量が高いため、濃度調製は行わなかった。１００ｇは容積１００ｍＬと仮定して化合物を調製した。ヘスペリジンとルテオリンを除くすべての化合物を計量し（円滑に計量を行うため、表１の濃度の１０倍〜１０００倍とした）、メタノールに溶解した。ルテオリンおよびヘスペリジンのみが塩基性溶液で計量可能な濃度で完全に溶解したため、これら２つの化合物は室温（ＲＴ）でメタノールおよび１Ｎ  ＮａＯＨの８：２（ｖ：ｖ）混合物に調製した。前記フェノール原液は−２０℃で１ｍＬずつ保存した。フェノールは室温とし、ボルテックスにかけ、７：３（ｖ：ｖ）のアセトン：水に希釈し、表１の果物濃度に合わせた。トロロックスの標準曲線（分析の説明については以下を参照）に合わせるため、化合物をさらに７：３（ｖ：ｖ）のアセトン：水に希釈し、以下のモル濃度としてから９６ウェルプレートに移した：クロロゲン酸１０．７μＭ、ヘスペリジン１０．２μＭ、ルテオリン２．４５μＭ、ミリセチン０．７８６μＭ、ナリンゲニン２．６１μＭ、ｐ−クマル酸１．９５μＭ、およびケルセチン６．６２μＭ。溶解性は解凍および希釈後に確認した。フェノール化合物、フルオレセイン、およびトロロックスが関与する研究はすべて暗所で行い、分解を最小限とした。
【００２２】
混合物
２つの化合物の考えられる組み合わせすべてを、表１にみられる濃度で調整後、等量で混合し、確実に相対濃度が保たれるようにした。次に、混合物をさらに希釈し、個々の化合物の最低モル濃度に合わせ、トロロックスの標準曲線に適合させた。ＯＲＡＣを決定し、統計解析を行った後、統計的に上位３種類の２つの化合物の相乗的な組み合わせを、考えられるすべての第３の化合物と組み合わせ、同様の解析を行った。４つの化合物の組み合わせについても同じパターンを繰り返した。上位３種類の３つの化合物の相乗的な組み合わせを、考えられるすべての第４の化合物と組み合わせた。２、３、および４種類の化合物の組み合わせは、ＯＲＡＣ分析を行う同日に調製した。
【００２３】
酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）
前記ＯＲＡＣ分析はＤａｖａｌｏｓら（２００４）に従って行い、一部修正した。簡単に説明すると、フルオレセインをリン酸緩衝液に希釈して７０．３ｍＭとし、２５ｍＬずつ保存し、−２０℃で保存期間は１ヵ月以下とした。トロロックスをアセトンおよび水の７：３混合物に希釈して８０μＭとし、−２０℃で１００μＭずつ保存し、保存期間は１ヵ月以下とした。ＡＡＰＨは各ＯＲＡＣ分析を行う５分前にリン酸緩衝液に希釈し１２ｍＭとした。フルオレセインとＡＡＰＨは３７℃に加熱し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｏｒ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、米国バーモント州Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）により９６ウェルプレートのすべてのウェルに移した。すべての濃度のトロロックス（１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ）を同じ列のウェルに２回ずつ移し、標準曲線を作成した。フェノール溶液はあらかじめ指定したプレートレイアウトに従い、２回ずつウェルに移した。充填したプレートはすべて（３７℃に設定した）プレートリーダー内で１５分間加温した後、ＡＡＰＨを加え、その後蛍光発光を測定した。２つの各鏡像ウェルを平均し、１組としてカウントした。すべてのサンプルを４組測定し（合計８ウェル）必要な統計的検出力を得た。
【００２４】
すべてのウェルの蛍光発光を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２蛍光プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）により、４８５／２０ｎｍの励起波長および５２８／２０ｎｍの放射波長で毎分１２０分間測定した。ＯＲＡＣ値は、ネーブルオレンジでみられる濃度のフェノール類が含まれる溶液１Ｌあたりのトロロックス当量（ＴＥ／Ｌ）として表した。
【００２５】
統計
２つの化合物の組み合わせについては、２つの化合物を組み合わせて得られたＯＲＡＣ値の平均から個々の化合物のＯＲＡＣ値の平均の合計を引いて、差を計算した（式１）。
差＝（ａｂの組み合わせ）−（ａ単独＋ｂ単独）。（１）
同様に、３つおよび４つの化合物の組み合わせについても、組み合わせた値から個々の３または４つの化合物の平均を引いて差を計算した（式２および３）。
差＝（ａｂｃの組み合わせ）−（ａ＋ｂ＋ｃ）、（２）
差＝（ａｂｃｄの組み合わせ）−（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）。（３）
このように結果を表すことで、ＳＡＳ統計パッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、米国ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）のＦｉｓｈｅｒの最小有意差（ＬＳＤ）分析により、最小限の相加的組み合わせを容易に区別することができる。
【００２６】
さらに、化合物３つおよび４つの組み合わせについては、化合物３つまたは４つすべてを組み合わせて得られたＯＲＡＣ値の平均から２つまたは３つの化合物を組み合わせたＯＲＡＣ値の平均＋化合物１つのＯＲＡＣ値の合計を引いて差を計算した（式４および５）。
差＝（ａｂｃの組み合わせ）−（ａｂの組み合わせ＋ｃ単独）（４）
差＝（ａｂｃｄの組み合わせ）−（ａｂｃの組み合わせ＋ｄ）（５）
ＳＡＳを利用し、推定統計値を用いて組み合わせの有意性を決定し、この統計値ではデータを合わせた場合の誤差項を考慮に入れた。上述の差はＯＲＡＣ値の個々の結果と組み合わせた結果をＡＮＯＶＡにより比較し、事後検定として差を形成し、個々の化合物を合わせた作用と組み合わせの作用を決定した。
【００２７】
結果および考察
組み合わせたＯＲＡＣ値−個々のフェノールのＯＲＡＣ値の合計
図１は、式１〜式３により、統計的に有意な組み合わせすべてのＯＲＡＣ値を示している。ヘスペリジン／ミリセチン、ヘスペリジン／ナリンゲニン、およびヘスペリジン／クロロゲン酸の組み合わせは、検討した２１種類の双方向の組み合わせの中で統計的に相乗的なＯＲＡＣ値を有していた。有意な差を示した３つの化合物の組み合わせは、ヘスペリジン／クロロゲン酸／ナリンゲニン、ヘスペリジン／ミリセチン／ナリンゲニン、ヘスペリジン／ナリンゲニン／ルテオリン、ヘスペリジン／ナリンゲニン／ｐ−クマル酸、およびヘスペリジン／ナリンゲニン／ケルセチンであった。４つの化合物の組み合わせのＯＲＡＣ値は、４つの個々の値を引くと、すべて有意に相乗的であった。
【００２８】
逐次分析
逐次的に分析した場合（式４）、３つの化合物の組み合わせでは、一部の値が有意であった（図２）。例えば、ヘスペリジン／クロロゲン酸＋ナリンゲニン、クロロゲン酸／ナリンゲニン＋ヘスペリジン、およびヘスペリジン／ナリンゲニン＋クロロゲン酸はすべて有意に相乗的であり、すべてが図１のヘスペリジン／クロロゲン酸／ナリンゲニンの有意な結果と一致している。さらに、ヘスペリジン／ナリンゲニンを組み合わせるか、またはヘスペリジン／ナリンゲニンに第３の化合物を追加すると、常に有意にプラスとなることを我々は見出した。つまり、他の１つの化合物はヘスペリジン／ナリンゲニンのＯＲＡＣを上昇させると考えられる。
【００２９】
図１に示された一見プラスの結果にもかかわらず、４つの化合物を組み合わせた分析（式５）では、４つの化合物の組み合わせでは３つの化合物の組み合わせよりも未処理のＯＲＡＣ値が有意に高いことが示された（図１と図３を比較）。さらに、前記組み合わせにはヘスペリジンおよびナリンゲニンがすでに含まれており、第４の化合物を加えると、ほぼ必ずＯＲＡＣが低下した。化合物２つおよび３つの組み合わせにみられるように、ヘスペリジンを含む組み合わせにナリンゲニンを加えると、常にＯＲＡＣが有意に増加した。ヘスペリジンおよびナリンゲニンがすでに一緒になっており、第４の化合物を加えてＯＲＡＣが上昇したケースはなかった。第４の化合物が抗酸化物質のペアとしてのヘスペリジン／ナリンゲニンの性能を低下させると考えられ、またはこの性能には影響しない。相加的組み合わせとは対照的に（式１、図１）、個々のフェノール類の合計よりもＯＲＡＣ値が有意に低い２＋１および３＋１の組み合わせには、主にミリセチンまたはｐ−クマル酸が含まれていた。
【００３０】
拮抗的相互作用
拮抗的相互作用は数種類の組み合わせで明らかであった。有意な拮抗作用を示した２つの化合物の唯一の組み合わせは、ミリセチン／ナリンゲニンであった。相加的組み合わせの分析の中では、有意な拮抗作用を示した３つまたは４つの化合物の組み合わせはなかった（式２および式３）。（式４および式５）の逐次分析では、統計的に有意な拮抗的相互作用がいくつかあった（図２および３を参照）。ミリセチンは、拮抗的相互作用を示した２＋１のすべての組み合わせに含まれていた。ミリセチン／ナリンゲニンの拮抗的組み合わせにヘスペリジンを追加すると、前記組み合わせの拮抗作用が失われ、代わりに強い相乗作用が得られた。３＋１の組み合わせの拮抗的相互作用の中では５種類の組み合わせにミリセチンも存在したが、拮抗作用を示した３＋１の組み合わせでは、他の４種類に明らかなパターンはない。
【００３１】
５種類以上の組み合わせ
全体的に、２、３、および４つの化合物の数種類の組み合わせが、組み合わせた場合に有意な相乗作用を示すことが分かった。これらの結果と観察された相互作用を基に、複雑性が増しても、すでに３つの化合物の組み合わせで達成された抗酸化力よりも有意に高くなることはないと我々は予測した。化合物３つを超える組み合わせで複雑性が増しても、前記組み合わせの総ＯＲＡＣが増加することはなかった（図１）。４つの化合物の組み合わせでは、３つの化合物ですでに生じていない相互作用はそれ以上なかった。従って、５つ以上の化合物の組み合わせについては、それ以上分析は行わなかった。
【００３２】
構造解析
理論に縛られるわけではないが、フェノール化合物の抗酸化力は前記環状構造のヒドロキシル基の配列と数によって決まり、Ｂ環のカテコール基およびＣ環の２，３二重結合（図４参照）は２つの特徴を有すると考えられ、この特徴は抗酸化力と強い相関関係があることが示された（Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ、２００１；Ａｍｉ’ｃら、２００７）。これらの２官能基も、拮抗作用について考察される還元電位を予測する。ルテオリンもＢ環以降にカテコール基を有する。これらの官能基を基に、我々は前記Ｃ環に以下の２，３二重結合を作り、これらの結果の所見と同様の結果を示している。ミリセチンはカテコール基ミリセチンをいずれも有している。一方、前記２つの化合物はＢ環におよびＣ環に２，３二重結合を示した。しかし、これは最も強い相乗作用を示し、関連する構造的特徴はなく、抗酸化剤の強さと抗酸化力の改善との強い関連性は示されなかった。ナリンゲニンおよびヘスペリジンはいずれもこれらの実験でこれらの結果を示していない。実際、この化合物は重要なカテコール基または２，３二重結合を示したが、相乗作用を示したすべての組み合わせにこの化合物が存在している。さらに、ヘスペリジンはグリコシドであり、前記分子の抗酸化力をさらに妨害することが示された（Ｄｉ  Ｍａｊｏら、２００５）。ナリンゲニンおよびヘスペリジンは、これらの組み合わせの中では、最も濃度が高く、モル比が近い２つの化合物であり、このことが一見した相乗作用を説明している可能性がある（Ｃｕｖｅｌｉｅｒら、２０００）。
【００３３】
抗酸化物質を組み合わせた場合の相乗効果と拮抗効果を説明するため、いくつかの仮説が開発された。Ｐｅｙｒａｔ−Ｍａｉｌｌａｒｄら（２００３）は、弱い抗酸化物質と強い抗酸化物質の組み合わせについて報告したが、前記弱い抗酸化物質は前記強い抗酸化物質を再生させると考えられるため、前記組み合わせの全体的なラジカルクエンチング力が改善する。同様の状況で、前記強い抗酸化物質が前記弱い抗酸化物質を再生し、これが前記ラジカルをクエンチすることによって拮抗作用を説明できる。これは、前記組み合わせの全体的な抗酸化強度を低下させる。強い抗酸化物質と別の強い抗酸化物質の組み合わせでは、前記２つの化合物が互いに再生するため、全体的に抗酸化強度が向上する。抗酸化物質の相互作用を説明するために提示された他の仮定には、前記抗酸化物質の反応速度、前記相互作用する分子の極性、および前記酸化部位での前記抗酸化物質の有効濃度を含む（Ｆｒａｎｋｅｌら、１９９４；ＫｏｇａおよびＴｅｒａｏ、１９９５；Ｃｕｖｅｌｉｅｒら、２０００）。
【００３４】
還元電位
理論に縛られるわけではないが、予想される相互作用もフェノール系抗酸化物質の１電子還元電位を用いて理論的に決定することができる（図４）。前記還元電位は低いほど、分子がその電子を供与する可能性が高くなる。分子は、次にＥ値の高い分子にもその電子を供与する可能性が高い。これは、Ｐｅｙｒａｔ−  Ｍａｉｌｌａｒｄら（２００３）が提案した説明に定量的基礎を加えている。これらの還元電位に基づき（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃら、１９９４；Ｆｏｌｅｙら、１９９９；ＪｏｒｇｅｎｓｅｎおよびＳｋｉｂｓｔｅｄ、１９９８）、使用した７化合物は、ミリセチン>ケルセチン>ルテオリン>クロロゲン酸>ｐ−クマル酸>ヘスペリジン>ナリンゲニンの順とすることができるナリンゲニンの後にＡＡＰＨによって発生したペルオキシルラジカルを加える（Ｅ＝約１Ｖ；Ｂｕｅｔｔｎｅｒ、１９９３）。このことは、等モル濃度では、ミリセチンが常にケルセチン、次にルテオリンなどをペルオキシルラジカルに（再生するため）その電子を供与することを示唆している。しかし、ネーブルオレンジの場合、相対濃度には有意な差がある。ヘスペリジンおよびナリンゲニンは、還元電位が最も高く、分析した他の５つのフェノール化合物よりも相対濃度が有意に高いことも分かった。
【００３５】
理論的には、２種類の化合物のうち１種類がその電子を他方に供与する場合、２つの化合物のすべての組み合わせが相乗作用を示す可能性があり、ＡＡＰＨによって産生したペルオキシラジカルをより効果的に除去することができる。供与の階層も、前記還元電位に基づくと明白である。例えば、ヘスペリジンおよびナリンゲニンの組み合わせでは、ヘスペリジンがナリンゲニンに電子を供与し、これが前記ペルオキシラジカルに供与する。しかし、これでは正確な予測はできない。有意な組み合わせは数種類しかなく、すべてではない。
【００３６】
還元電位は一電子移動（ＳＥＴ）の指標であるが、前記ＯＲＡＣ分析の反応機序は水素原子移動（ＨＡＴ）に基づいている。残念ながら、フェノール化合物に利用できるＨＡＴの電圧基準はない。しかし、最終的な結果はまだ同じである（Ｏｕら、２００２）。ＳＥＴおよびＨＡＴでは、ペルオキシラジカルが最終的にペルオキシドとなり、前記抗酸化物質が電子を失い、その構造中に反応性が弱い対になっていない電子が生じる。いずれの機序でも、電子は取り除かれる必要がある。そのため、フェノール類の反応性の順は、２つの機序の間で同等であると推測することができる。この仮定は、定量的にモデルを開発するために作られた。
【００３７】
モデル
理論に縛られるわけではないが、カテコール基（またはヘスペリジンのメトキシカテコール基）の有無、前記還元電位、および前記相対濃度に焦点を当てることで、２つの化合物の相乗的（および拮抗的）組み合わせを説明することができる。カテコール基を持つフェノール分子は還元電位が低く、電子をより容易に供与する。低い相対濃度でカテコール基を持つ分子をカテコール基を持たない分子と組み合わせた場合、前記電子供与は最小限になる。これはミリセチン／ナリンゲニンの場合である。しかし、ミリセチン／ヘスペリジンでは、供与がより効率的に行われ、ヘスペリジンのメトキシカテコール基のため（ヘスペリジン／クロロゲン酸と同様に）相乗効果を生みだし、Ｂ環のヒドロキシル基が１つの化合物よりも再生効率が高い。ヘスペリジン／ナリンゲニンの場合、（カテコールから非カテコールへの）供与は効率的ではないが、濃度が圧倒的であり（ヘスペリジンはナリンゲニンの４倍の濃度で存在する）、前記組み合わせは有意である。
【００３８】
このモデルに合う組み合わせは少数である。ミリセチン／ケルセチン、ルテオリン／ケルセチン、およびミリセチン／ルテオリンはすべて単純な相加的ＯＲＡＣを有するが、それぞれにはカテコール基があり、理論的にはその組み合わせのペアに供与することができる。これらの化合物はある程度単純に電子を行ったり来たりさせると考えられるため、構造の類似性によって相互作用および相互の電子供与が非効率的に行われる可能性があり、ＯＲＡＣは相加的にしか得られない。これらの組み合わせの化合物は独立して、または相加的に、これらの化合物が破壊されるまで（環構造が開裂するまで）前記ペルオキシラジカルと相互作用すると考えられる。
【００３９】
同じモデルが３つの化合物の組み合わせにも当てはまる。有意であったすべての組み合わせにはヘスペリジンとナリンゲニンが含まれるが、第３の化合物を追加すると、前記ＯＲＡＣの差が大きくなった（図１）。還元電位の低い第３の化合物を追加すると、ヘスペリジンまたはナリンゲニンと比較して濃度が非常に低くても、電子移動またはその保存の効率が有意に高くなり、得られるＯＲＡＣ値が大きくなる。ヘスペリジン／ナリンゲニン＋第３の化合物を比較した場合（図２）、利益は前記ＯＲＡＣを上昇させる順にルテオリン>ケルセチン＝クロロゲン酸＝ｐ−クマル酸>ミリセチンであり、これは濃度と同様であるが（表１）、上述の還元電位の順序とは異なる（ミリセチン>ケルセチン>ルテオリン>クロロゲン酸>ｐ−クマル酸）。この場合、濃度は官能基または電子供与の効率よりも重要である。
【００４０】
４つの化合物の組み合わせについては、第４の化合物を追加すると（図３）多くの組み合わせで効率が低下し、ヘスペリジンを含む組み合わせにナリンゲニンを追加した組み合わせのみ、相乗作用が認められた。ヘスペリジンとナリンゲニンがすでに３つの化合物のグループに入っている場合、第４の化合物を追加しても効果がないか、または拮抗作用が認められた。これは、上述のカテコール基／還元電位／濃度モデルには当てはまらないように見える。有意な拮抗作用が得られた結果は、３，４，２＋１、および３＋１つの化合物の組み合わせで得られた相乗作用の結果と比較してすべて小さかった。第４の化合物は、３つの化合物の強いグループ間での電子移動の効率を低下させる可能性がある。これは、拮抗作用が得られる組み合わせすべてを説明している可能性がある。
【００４１】
本実施例の結論
ネーブルオレンジで認められた濃度および比率でフェノール化合物間に相乗的相互作用が生じるという我々の仮説は、真実であることが分かった。ナリンゲニンとヘスペリジンとの相互作用では最も相乗作用が示されたが、第３の化合物を追加するとこの相乗作用が増強された。第４の化合物を追加しても、３つの化合物の組み合わせと比較して前記ＯＲＡＣは有意に大きくならなかった。（１）官能基、（２）還元電位、および（３）相対濃度を一緒に分析すると、相乗的および拮抗的相互作用を最もよく説明できた。これらのフェノールの相乗的相互作用は、食品または飲料の保存に応用できる可能性がある。
【実施例２】
【００４２】
オレンジに認められる相乗的な植物化学物質の組み合わせ
実施例１で説明した手順に由来するデータを基に、補助成分を調整した。
【００４３】
表２では、ネーブルオレンジに認められる植物化学物質の強力な組み合わせを示している。また、比較のため、ＯＲＡＣ値が高い、現在市販されている２つの製品も含めた。表２は、１グラムあたりのＯＲＡＣが最も高いものから最も低いものの順となっている。
【００４４】
表３に示したとおり、合わせて２９％の相乗作用を示し、低コストで容易に入手できるため、表２の最も有望な組み合わせはヘスペリジン／ナリンゲニン／ｐ−クマル酸／ケルセチンである。
【００４５】
相乗作用を示した組み合わせは、補助成分の質および抗酸化力を有意に改善する可能性がある。前記データは、単純に個々の果物を無作為に組み合わせるか、毒性が未知の濃縮抽出物を作成するよりも、果物が示す検出力を証明しているが、非常に効果的で安全な用量を示している。
【００４６】
例：補助成分中の抗酸化物質混合物１グラムを使用することは、オレンジ約３０００ｇまたは６ｌｂｓに相当することになる。これは現実的に消費できる量ではなく、おそらく安全ではないだろう。この約１／３を含むカプセルは、１日に消費できる果物の量を控えめに示しており、そのような量が安全であることが確認できるが、まだ並はずれた抗酸化物質の相乗的保護を示す。カプセルは簡便で、果物の形で無理なく消費できるよりも抗酸化物質の量が多く、有効期間が長く、製品を支える会社をもたらすことになる。
【００４７】
【表２】
2013508724.tif 000004
【００４８】
【表３】
2013508724.tif 000005
【実施例３】
【００４９】
イチゴに認められるフェノール化合物の相乗的および拮抗的相互作用
イチゴに認められる相対濃度で、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）分析を用い、７種類のフェノール化合物の主に無糖体の相互作用を検討した。同様の組み合わせで発生した相互作用をより複雑な組み合わせで調査した。前記相互作用が発生する理由を説明するため、モデルを開発した。２つのフェノール化合物の３種類の組み合わせ、および３つのフェノール化合物の５種類の組み合わせで統計的に有意な相乗作用が観察された。２つのフェノール化合物の２種類の組み合わせ、および３つの化合物の１種類の組み合わせで統計的に有意な拮抗作用が観察された。還元電位、相対濃度、およびカテコール（ｏ−ジヒドロキシベンゼン）基の有無を含むモデルがこれらの結果を説明する。この例は、イチゴのフェノール化合物の骨格内で、複雑な環境で発生する可能性のある相互作用の一部を証明している。食品ベースの抗酸化物質の比で認められる相乗作用はフリーラジカル保護を最適化し、これは食品保存に応用することができる。
【００５０】
植物は、細胞シグナル伝達分子、抗酸化剤、または侵入する害虫に対する毒素として機能するフェノール化合物を産生する（Ｃｒｏｚｉｅｒら、２００６）。これらの多様なフェノール化合物が果物に存在し、広く特徴が決定されている（Ｒｏｂａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｈａｒｎｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。この特徴決定は、一部、これらの化合物の抗酸化力が高いために行われた。
【００５１】
イチゴは優れたフェノール化合物の供給源であり（Ａａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、総フェノール含有量は新鮮重１００ｇあたり約２９０ｍｇ没食子酸当量である。イチゴには様々なフェノール化合物が含まれ、シアニジンおよびペラルゴニジングリコシド、エラグ酸（グリコシド型およびタンニン型を含む）、カテキン、プロシアニジン、桂皮酸誘導体およびフラボノールを含む。生のイチゴの酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）は新鮮重１ｇあたり３５μｍｏｌトコフェロール当量（ＴＥ）であり（２００７  ＵＳＤＡ  ＯＲＡＣデータベース）、この値はブルーベリーおよびラズベリーよりも低いが、オレンジまたはバナナよりも高い。
【００５２】
（ほとんどの場合無糖体を使用し、）個々のフェノール抗酸化物質をイチゴに認められる濃度で調製することで、この組み合わせはイチゴの環境で相乗作用を示すことが分かると仮定することができた。ほとんどの場合無糖体を使用することで、観察された結果を説明するモデルを開発するため、フラボノイドのこれまでに研究された構造要素を説明することができた。これは、結果の外挿を実際の果物に限定することになるが、抽出物で調査されたとおり、最適化された果物由来抗酸化保存料の開発の基礎を確立する役に立つだろう。イチゴに認められる７種類のフェノール化合物の複雑な相互作用は、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）を用いて分析し、結果を説明するためのモデルを開発した。
【００５３】
材料と方法
化学物質
シアニジンクロライド（純度：９５％）、ｐ−クマル酸（９８％）、（＋）−カテキン（９６％）、ケルセチン−３−グルコシド（９０％）、ケンペロール（９６％）、エラグ酸（９６％）、ペラルゴニジンクロライド（９５％）、およびフルオレセイン２ナトリウム塩はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ（米国ミズーリー州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）から入手した。トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２−カルボン酸）、水酸化ナトリウム（５０％溶液）、Ｋ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４およびＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェル、黒側面、透明底プレートはＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国ペンシルバニア州Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ）から入手し、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド（ＡＡＰＨ）はＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＵＳＡ（米国バージニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）から入手した。
【００５４】
化学調整
表４は、栽培品種のイチゴにみられる、研究対象の７種類の化合物の濃度を示している。図５は当該構造を示している。イチゴの最高平均濃度を基に化合物を選択した。使用した濃度は、既発表の（２００７  ＵＳＤＡフラボノイドデータベース；Ｚｈａｏ、２００７）イチゴフェノールの絶対濃度から選択し、後のモデル化を容易にするため、グリコシド（ただし、タンニンではない）が完全に加水分解されると想定した。濃度を調節しても検討する相対濃度は変化しないため、１ｇの果物の裏ごしはサンプル調製用の容積１ｍｌと仮定した。エラグ酸を除くすべての化合物を計量し、メタノールに溶解した。エラグ酸は塩基性溶液中では計量可能な濃度でしか完全に溶解しないため、計量し、加熱したメタノールと１Ｍ水酸化ナトリウムの４：１混合物に溶解した。フェノール原液は−２０℃で１ｍＬずつ保存した。フェノール類は室温とし、ボルテックスにかけ、７：３（ｖ：ｖ）アセトン：水に希釈し、表４の果物濃度と一致させた。トロロックスの標準曲線に合わせるため（分析の説明については以下を参照）、化合物はさらに７：３（ｖ：ｖ）アセトン：水に希釈し、以下のモル濃度としてから９６ウェルプレートに移した：ｐ−クマル酸９．９９μＭ、シアニジン３．０４μＭ、カテキン４．５８μＭ、ケルセチン−３−グルコシド２．４５μＭ、ケンペロール１．６１μＭ、ペラルゴニジン５．１０μＭ、エラグ酸１５．４μＭ。溶解性は解凍および希釈後に確認した。フェノール化合物、フルオレセイン、およびトロロックスに関するすべての作業は暗所で行い、分解を最小限にした。
【００５５】
【表４】
2013508724.tif 000006
【００５６】
混合物
２つの化合物で考えられるすべての組み合わせを、表４に見られる濃度で調整後、等量ずつ混ぜ、相対濃度が保たれていることを確認した。次に、混合物をさらに希釈し、個々の化合物の最低モル濃度に合わせて前記トロロックスの標準曲線を当てはめた。ＯＲＡＣを決定し、統計解析を行った後、２つの化合物の相乗的組み合わせの中で統計的に上位３種類をすべての組み合わせと合わせ、同様に分析した。同様のパターンを４つ化合物の組み合わせでも行い、３つの化合物の相乗的組み合わせ上位３種類を考えられる第４の化合物すべてと組み合わせた。抗酸化力の統計的に有意な増加は４つの化合物の組み合わせで認められた。そのため、５つまたは６つの組み合わせは検討しなかったが、７種類の化合物すべてを組み合わせて分析した。組み合わせはＯＲＡＣ分析を行った同日に調製した。
【００５７】
酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）分析
ＯＲＡＣ分析は、Ｄａｖａｌｏｓら（２００４）の方法を一部修正し、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．、米国バーモント州Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）を用いて行った。反応は７５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）中で行い、最終分析混合物（２００μｌ）には酸化基質としてフルオレセイン（１２０μｌ、最終濃度７０．３ｍＭ）、酸素ラジカル発生源としてＡＡＰＨ（６０μｌ、最終濃度１２ｍＭ）、抗酸化物質（トロロックスまたはサンプル２０μｌ［最終濃度１〜８μＭ］）を含めた。前記分析のパラメーターは、リーダーの温度３７℃、サイクル数１２０、サイクル時間６０秒、振盪モードは各サイクル前の軌道振盪３秒とした。励起波長４８５／２０ｎｍおよび放射波長５２０／２０ｎｍの蛍光フィルターを使用した。予定したレイアウトを基に、鏡像で９６ウェルプレートにサンプルを調製した。各鏡像プレート１組の平均をとり、１つのデータポイントとしてカウントした。すべてのサンプルは４回ずつ測定し（合計８ウェル）、必要な統計的検出力を得た。データは溶液１リットルあたりのトロロックス当量（ＴＥ）マイクロモルとして表している。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）表計算ソフトにより分析し、曲線下面積を決定し、トロロックス標準曲線を基にトロロックス当量にデータを変換した。
【００５８】
統計
２つの化合物の組み合わせについては、両方の化合物を組み合わせて得られた平均ＯＲＡＣ値から個々の化合物の平均ＯＲＡＣ値を引いて差を計算した（式６）。
差＝（ａｂの組み合わせ）−（ａ単独＋ｂ単独）（６）
同様に、３つおよび４つの化合物の組み合わせについては、前記組み合わせから３つまたは４つの個々の化合物の平均を引いて差を計算した。このように結果を示すことで、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ統計パッケージ（バージョン９．１、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、米国ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）の混合モデルＡＮＯＶＡ推定を利用し、前記組み合わせが個々の合計よりも大きいか、小さいかを容易に区別することができた。
【００５９】
さらに、３つおよび４つの化合物の組み合わせについては、３つおよび４つの化合物をすべて組み合わせて得られた平均ＯＲＡＣ値から、２つおよび３つの化合物の組み合わせの平均ＯＲＡＣ値＋個別のＯＲＡＣ値１つを引いて差を計算した。
差＝（ａｂｃの組み合わせ）−（ａｂ単独＋ｃ単独）（７）
差＝（ａｂｃｄの組み合わせ）−（ａｂｃの組み合わせ＋ｄ）（８）
ＳＡＳを利用し、混合モデルＡＮＯＶＡ推定により組み合わせの有意性を判定したが、この推定ではデータを合わせるときの誤差項を考慮している。上述の差はＯＲＡＣ値の個々の結果および組み合わせた場合の結果のＡＮＯＶＡによりＳＡＳで比較し、事後検定として差を作り、個々の化合物を組み合わせた場合および組み合わせの効果を判定した。
【００６０】
本実施例の結果および考察
化合物および組み合わせの選択
我々が選択した７つの化合物は、イチゴのフェノール化合物すべてではないが、この選択は最も濃度が高く、市販されているものである。我々が選択した量は複数の研究（Ａａｂｙら、２００５；２００７  ＵＳＤＡフラボノイドデータベース；Ｚｈａｏ、２００７）のものであり、最高数量はグリコシドが完全に加水分解されることを想定している（ただし、エラグ酸の場合、ケルセチン−３−グルコシドを除きタンニンではない）。イチゴのフェノール化合物の大部分はグリコシドとして消費され、酵素活性、消化因子、および同時に存在する可能性のある他の食品がこの相互作用に影響するため、これは、必ずしも消化管の反応に利用できる総量を反映しているわけではない（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、２０００）。多くの季節のイチゴにみられ、多数の実験室で検討されている分析量の平均である。イチゴの由来が分かれば、調査対象の化学物質の骨格が分かる。
【００６１】
組み合わせへの一度に１つの化合物の追加を評価することで、停止時期を決定することができ、すなわち、４つの化合物の３＋１の組み合わせは３つの化合物の２＋１の組み合わせほど有意ではなかったため、５つの化合物の４＋１の組み合わせも、３つの化合物の組み合わせほど有意ではないだろう。この予測を確認するため、我々は７つの化合物すべてを一緒にした組み合わせを検討した（１１０４５±４５８μｍｏｌ  ＴＥ／Ｌ）。ＯＲＡＣ値の大きさは、４つの化合物の組み合わせでみられる値ほど大きくなかった。
【００６２】
相加的および逐次分析
２つの化合物の統計的に有意な組み合わせのＯＲＡＣ値を表５に示している。前記統計的方法は、式６または２、３、および４つの化合物のすべての組み合わせに関する同等の式を用いて行い、統計的に有意な結果は２つの化合物の組み合わせについてのみ認められ、これは図に含めている。２、３、および４つの化合物すべての他の組み合わせは有意ではなく、相加的と考えた。逐次分析（式７および８）では、３および４つの化合物のすべての組み合わせが、表５に含まれるものを除き、相加的であった。
【００６３】
フェノール構造
構造は、抗酸化物質の電位を決定する重要な因子である（Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓら、１９９６）。前記Ｂ環のｏ−ジヒドロキシ基（カテコール構造）は、前記ラジカル型に対する安定性が大きく、電子の非局在化に関与することができる（図５）。前記Ｃ環の４−オキソおよび前記ＡおよびＣ環の４−オキソ機能を持つ３−および５−ＯＨ基と関連した２，３二重結合は、ラジカルのクエンチング能を最大限とするために必須である。水酸化の程度も抗酸化活性には重要である。
【００６４】
【表５】
2013508724.tif 000007
【００６５】
抗酸化物質を組み合わせた場合の相乗効果と拮抗効果を説明するため、いくつかの仮説が開発された。Ｐｅｙｒａｔ−Ｍａｉｌｌａｒｄら（２００３）は、他の要因とともに、一部の抗酸化物質は組み合わせると再生するように作用し、より強いまたは弱い抗酸化物質が他方を再生すると指摘した。前記弱い抗酸化物質が前記強い抗酸化物質を再生する場合、これは全体的にプラスの（相乗）作用を有し、反対の現象が起こっている場合は、全体的にマイナスの（拮抗）作用を有する可能性がある。抗酸化物質の相互作用を説明するために提示された他の仮定は、前記抗酸化物質の反応速度、前記相互作用する分子の極性、および前記酸化部位での前記抗酸化物質の有効濃度を含む（Ｆｒａｎｋｅｌら、１９９４；ＫｏｇａおよびＴｅｒａｏ、１９９５；Ｃｕｖｅｌｉｅｒら、２０００）。
【００６６】
還元電位
予想される相互作用も、フェノール系抗酸化物質の一電子還元電位を利用して理論的に決定することができる。前記還元電位は低いほど、分子がその電子を供与する可能性が高くなる。分子は、次にＥ値の高い分子にもその電子を供与する可能性が高い。これは、Ｐｅｙｒａｔ−  Ｍａｉｌｌａｒｄら（２００３）が提案した説明に定量的基礎を加えている。利用できる既発表の還元電位を基に（ＪｏｒｇｅｎｓｅｎおよびＳｋｉｂｓｔｅｄ、１９９８；Ｆｏｌｅｙら、１９９９）、利用した７種類の化合物は、シアニジン>エラグ酸>ケルセチン−３−グルコシド（ケルセチンでは０．２９Ｖ；ジグルコシドのルチンは０．４Ｖ）>カテキン（０．３６Ｖ）>ペラルゴニジン>ケンペロール（０．３９Ｖ）>ｐ−クマル酸（０．５９Ｖ）の順とすることができる。シアニジン、エラグ酸、またはペラルゴニジンについては既発表の還元電位を見つけることはできなかった。これらの順番は、還元電位を予測する構造要素に基づいて決定した。
【００６７】
ｐ−クマル酸の後にＡＡＰＨによって発生したペルオキシルラジカルを加える（Ｅ＝約１Ｖ；Ｂｕｅｔｔｎｅｒ、１９９３）。このことは、等モル濃度では、シアニジンが常にエラグ酸、次にケルセチン−３−グルコシドなどをペルオキシルラジカルに（再生するため）その電子を供与することを示唆している。しかし、イチゴのフェノール濃度を用いると、相対濃度に有意な差がある。エラグ酸およびペラルゴニジンは、分析した他の５種類のフェノール化合物よりも有意に高い相対濃度で認められる。
【００６８】
理論的には、２種類の化合物のうち１種類がその電子を他方に供与する場合、２つの化合物のすべての組み合わせが相乗作用を示す可能性があり、ＡＡＰＨによって産生されたペルオキシラジカルをより効果的に除去することができる。供与の階層も、前記還元電位に基づくと明白である。例えば、ケンペロールとｐ−クマル酸の組み合わせでは、ケンペロールがｐ−クマル酸に電子を供与し、これが前記ペルオキシラジカルに供与する。しかし、これでは正確な予測はできない。有意な組み合わせは数種類しかなく、すべてではない。
【００６９】
還元電位は一電子移動（ＳＥＴ）の指標であるが、前記ＯＲＡＣ分析の反応機序は水素原子移動（ＨＡＴ）に基づいている。残念ながら、フェノール化合物に利用できるＨＡＴの電圧基準はない。しかし、最終的な結果はまだ同じである（Ｏｕら、２００２）。ＳＥＴおよびＨＡＴでは、ペルオキシラジカルが最終的にペルオキシドとなり、前記抗酸化物質が電子を失い、その構造中に反応性が弱い対になっていない電子が生じる。いずれの機序でも、電子は除去される必要がある。そのため、フェノール類の反応性の順番は、２つの機序の間で同等であると推測される。この仮定は、定量的にモデルを開発するために作られた。
【００７０】
モデル
いかなる特定の理論にも縛られないが、３つの因子、つまり相対濃度、還元電位、およびカテコール基の有無を組み合わせることで、前記結果を説明するモデルが開発されたと考えられる。選択したフェノール類は、エラグ酸>ペラルゴニジン>ｐ−クマル酸>カテキン>シアニジン>ケラセチン−３−グルコシド>ケンペロールの濃度順で調製した（表４を参照）。
【００７１】
一電子還元電位では、シアニジン≧エラグ酸>ケラセチン−３−グルコシド>カテキン>ペラルゴニジン>ケンペロール>ｐ−クマル酸の順となる。
【００７２】
７種類の化合物のうちの４種類、つまりエラグ酸、シアニジン、カテキン、ケラセチン−３−グルコシドにはカテコール基が含まれる。
【００７３】
統計的に有意な２種類の化合物の組み合わせについては（表４）、ｐ−クマル酸の濃度がカテキンよりも高かった。カテコール基を持ち、還元電位の低いカテキンは強い電子供与体であり、より濃度の高いｐ−クマル酸の再生を助け、相乗効果を生みだし、ｐ−クマル酸およびケラセチン−３−グルコシドを同様に相互作用させた。シアニジンおよびケラセチン−３−グルコシドはいずれもカテコール基を含むが、シアニジンは同じ濃度で存在し、いずれもカテコール基が含まれ、相乗的な結果を生み出す環境を作り、（還元電位に基づき）シアニジンがケラセチン−３−グルコシドを再生する可能性がある。拮抗作用では、ｐ−クマル酸をペラルゴニジンと組み合わせ、カテコール基の重要性を証明している。カテコール基がないと、ペラルゴニジンはｐ−クマル酸を効率的に再生することができず（これは還元電位から予測される）、ペラルゴニジンの濃度がはるかに高く、おそらく電子を引き離すが、前記ＡＡＰＨラジカルには容易に供与しないことで、ｐ−クマル酸があるとペラルゴニジンの抗酸化活性が崩壊するようにみえる。これは、ペラルゴニジンのＥ値はｐ−クマル酸に近い可能性があることを示唆している。最後に、シアニジンおよびペラルゴニジンも拮抗的に相互作用した。シアニジンのカテコール基および還元電位に基づき、相乗作用が予想される。構造の類似性と相対濃度の差は前記拮抗作用を説明している可能性があり、この相互作用はこのモデルに合わないが、３つおよび４つの化合物の組み合わせでも持続する。また一方、想定されたＥ値の順番は正しくない可能性がある。
【００７４】
３つの化合物の組み合わせについては、相加的組み合わせについて統計的に相乗的または拮抗的な結果は認められなかった（式６による）。しかし、段階的に分析した場合（式７）、有意な結果は上述のモデルによって説明することができる。ケラセチン−３−グルコシド／エラグ酸＋ｐ−クマル酸については、カテコール基があり、Ｅ値が低い２つの化合物にｐ−クマル酸を追加すると、より相乗的になった。これは、ｐ−クマル酸／（＋）−カテキンおよびｐ−クマル酸／ケラセチン−３−グルコシドで発生した作用と同様である。ケラセチン−３−グルコシド／エラグ酸＋シアニジンおよびシアニジン／エラグ酸＋ケラセチン−３−グルコシドについては、カテコール基を含む別の低Ｅ値化合物を追加することで、前記組み合わせの相乗作用が向上した。ｐ−クマル酸／ペラルゴニジン＋ケラセチン−３−グルコシドについては、カテコール基を有する低Ｅ値のケラセチン−３−グルコシドが、他の２つの化合物の単一ヒドロキシル基の抗酸化効率を有意に改善した。最後に、シアニジン／ペラルゴニジン＋ケラセチン−３−グルコシドについては、利用できるカテコール基がほぼ２倍であったため（ケラセチン−３−グルコシドとシアニジンの濃度は同等である）、シアニジン／ペラルゴニジンの組み合わせが有意に押し上げられた。
【００７５】
拮抗作用では、１つの組み合わせ、つまりｐ−クマル酸／カテキン＋ペラルゴニジンが有意であった。この場合、ｐ−クマル酸に電子を供与するカテキンにみられる有意な相乗作用（表５を参照）は、ペラルゴニジンの濃度が高く、カテコール基がないことで混乱する。このため、カテキンの有効性および拮抗作用の結果は最小限となる。
【００７６】
４つの化合物の組み合わせについては（データは図示せず）、相加的または逐次分析で有意な値はなかったが、前記傾向は同様のパターンを辿り、モデルによって説明される。例えば、ｐ−クマル酸／（＋）−カテキン／ケラセチン−３−グルコシド＋エラグ酸、ｐ−クマル酸／（＋）−カテキン／ペラルゴニジン＋ケラセチン−３−グルコシド、およびシアニジン／ケラセチン−３−グルコシド／ケンペロール＋エラグ酸はすべてＯＲＡＣ値がプラスであり、すべてが還元電位に沿って相互に電子を供与することのできるカテコール含有および非カテコール含有化合物から成る。ｐ−クマル酸／シアニジン／ケラセチン−３−グルコシド＋ペラルゴニジンおよびｐ−クマル酸／ケラセチン−３−グルコシド／ペラルゴニジン＋シアニジンの２種類の組み合わせで比較的、拮抗的ＯＲＡＣ値が高かった。このような場合、相対濃度が高く、カテコールがない、還元電位の低いペラルゴニジンがこれらの組み合わせの抗酸化力を低下させた。
【００７７】
他の検討事項
考えられる１つの懸念事項はアントシアニジンに対するｐＨの効果であり（Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｖａｒｇａｓら、２０００）、このうちシアニジンとペラルゴニジンの２つが検討された。アントシアニジンはｐＨ２で最も安定である。ｐＨが上昇すると、アントシアニジンは水とより容易に反応し、脱色し、カルコンに変換する。光は分解を促進し、他のフェノール化合物があると前記アントシアニジンの分解が遅くなる。本実施例では、化合物をメタノールに溶解したため、水は存在せず、すべての工程を暗所で行い、前記溶液をＯＲＡＣ水溶液の混合物に加えた際、前記反応は１時間以内に終了した。Ｏｓｍａｎｉら（２００９）は、シアニジングリコシドがｐＨ７の緩衝液に１時間入れた後も、最初の色を７０％保持していることを見いだした。そのため、分解は可能な限り最小限となっていたが、シアニジンおよびペラルゴニジンが一部分解された可能性がある。もう１つの懸念事項は、フェノール化合物間で複合体が形成する可能性である（Ｈｉｄａｌｇｏら、２０１０）。形成したかもしれない複合体はいずれも直接測定されなかったため、これらの相互作用の可能性または本結果に対する効果は軽視できない。それにもかかわらず、そのような複合体が形成し、相乗的または拮抗的結果に貢献していた場合、このような環境に他の化学物質が存在することで軽減または増加する可能性があるが、前記組み合わせが消耗されたまたは保存料として使用された場合に、これと同様の結果が予想されるだろう。
【００７８】
相乗作用または拮抗作用を正しく判定できる統計解析を利用した場合、化合物を追加すると標準誤差が大きくなり、サンプルの誤差範囲内で相乗作用を示すことがますます困難になる。これにより、（４つの化合物の組み合わせで）相乗的と考えられる組み合わせでも統計的に有意ではなかった理由が説明される可能性がある。本実施例では、７種類の化合物しか評価されず、主に無糖体に焦点が当てられていた。例えば、含まれる多くの化合物のグリコシド型数種類（例えば、ペラルゴニジンおよびシアニジングリコシド）、他のカテキン誘導体（エピカテキンなど）、他の桂皮酸誘導体およびフラボノール、およびエラジタンニンに分析を拡大することもできる。Ｂｒａｖｏ（１９９８）は、グリコシド型の抗酸化活性が有意に低いと結論付けた。ほとんどは無糖体を利用することで、中心となるフェノール構造の構造要素を検討することができる。これにより、フラボノイドの化学構造を利用して観察された結果を説明するモデルを開発することができ、前記モデルに使用するカテコール基は妨げない。このため、実際の果物に結果を外挿することには制限があるが、最適化された果物由来の抗酸化保存料を開発する基礎を確立した。
【００７９】
本実施例の結論
我々の結果は、分析したほとんどの相互作用が相加的であることを示しているが、有意な相乗作用を示したものもあり、有意な拮抗作用を示したものもあった。還元電位、相対濃度、およびカテコール基の有無を考慮したモデルがこれらの結果をほとんどすべて説明した。これにより、複雑な環境で発生する可能性のある相互作用の一部の理解が向上し、食品保存料など、組み合わせた場合の考えられる利益をさらに理解する重要な一歩を進んでいる。
【実施例４】
【００８０】
イチゴに認められる相乗的な植物化学物質の組み合わせ
以下の表６は、イチゴに認められる植物化学物質の組み合わせを示している。また、比較のため、個々の抗酸化物質およびＯＲＡＣ値が高く、現在市販されている４つの製品も含めた。表６は、ＯＲＡＣが最も高いものから最も低いものの順となっている。値は１グラムあたりである。
【００８１】
良好な結果を示し、いずれも低コストで容易に入手できるため、最も有望な組み合わせはｐ−クマル酸とカテキンである。ペラルゴニジンとケルセチン−３−グルコシドはこれよりも高価であるが、かなり低コストで大量に入手できる。ケルセチン−３−グルコシドと同等またはこれよりも良好な結果が得られると予想されるケルセチンも安価である。
【００８２】
本明細書に示し、相乗作用を示した組み合わせは、補助成分の質および抗酸化力を有意に改善する可能性がある。前記データは、単純に個々の果物を無作為に組み合わせるか、毒性が未知の濃縮抽出物を作成するよりも、果物が提供する力を証明しているが、非常に効果的で安全な用量を示している。
【００８３】
例：補助成分中の抗酸化物質を合計１グラムを使用することは、イチゴ約１０００ｇまたは２．２ｌｂｓに相当することになる。これは消費するには現実的ではないが、このおよそ半分を含むカプセルは１日で消費できる果物の量であり、上記の量が安全であることを確認している。またカプセルは簡便であり、長期保存ができ、製品を支える会社をもたらすことになる。
【００８４】
【表６】
2013508724.tif 000008
【００８５】
【表７】
2013508724.tif 000009
【実施例５】
【００８６】
ブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）に認められる抗酸化物質の果物の比率での相乗作用の可能性
ブルーブリーは抗酸化物質の豊富な供給源であり、癌を予防し、心臓を保護すると考えられる。果物全体は相互作用する可能性のある複雑な抗酸化物質を提供するが、これらの相互作用は、特に果物全体では十分研究されていない。
【００８７】
個々のブルーベリーフェノール化合物およびこれらの化合物を組み合わせた場合の抗酸化力は、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）分析を利用して発見された。
【００８８】
前記手順は、図１および３でそれぞれオレンジおよびイチゴについて説明された手順と同様のものとした。ブルーベリーに認められるフェノール化合物４種類、つまりクロロゲン酸（Ｃ）、ケルセチン（Ｑ）、ミリセチン（Ｙ）、およびマルビジン（Ｍ）が選択され、前記４種類の化合物について、個別にＯＲＡＣ分析を行った（図６を参照）。ＯＲＡＣ分析は、約１：１の比率、および前記果物の比率で４つの化合物の組み合わせについて行った。図７では、前記化合物それぞれの相加的作用に基づき予想される値を加えて、結果を示している。高い値は相乗作用を示し、低い値は拮抗作用を示す。
【００８９】
ＯＲＡＣ分析では、抗酸化物質または抗酸化物質の混合物による分解からフルオレセインが保護されたかを測定する。統計解析では、前記組み合わせの平均および標準誤差−個々の化合物の抗酸化力を推定する。（図６を参照）。
【００９０】
図７を参照すると、クロロゲン酸とマルビジン、およびミリセチンとケルセチンの組み合わせに潜在的に相乗作用が認められた。マルビジン、カテキン、クロロゲン酸、ケルセチン、およびミリセチンの中から３つおよび４つの組み合わせについても、さらに解析を行ったが、ここには示していない。しかし、これらの天然ブルーベリー抗酸化物質の多くでは、有意な相乗作用が認められた。この相乗作用は前記化合物を１：１の比で組み合わせた場合にも認められた。
【００９１】
このデータから、フェノール化合物を組み合わせる比率が、その組み合わせが相乗作用または拮抗作用を示すか否かに重要であることを示している可能性がある。さらに、代謝およびＵＶ照射によるフリーラジカル損傷により効率的に対抗するため、植物は相乗的比率を発達させた可能性がある。
【実施例６】
【００９２】
ブルーベリーに認められる相乗的な植物化学物質の組み合わせ
基本的に実施例１と同様の手順により、ブルーベリー中の化合物の組み合わせについてＯＲＡＣ値を測定した。
【００９３】
表８では、ブルーベリーに認められる植物化学物質の最も強力な組み合わせを示している。他に記載のない限り、値は果物に見られる比率を表している。表８は、相乗作用の割合（％）が最も高いものから最も低いものの順となっている。値は、フェノール化合物１ｍｍｏｌあたりとしている。
【００９４】
最も有意な組み合わせはカテキン／クロロゲン酸／マルビジン／ミリセチンであるが、現在マルビジンは非常に高価である。マルビジンを含まない最も相乗作用の高い組み合わせは、１：１の比でクロロゲン酸／ミリセチンである。天然ブルーベリーの比率でマルビジンを含まない最も相乗作用の高い組み合わせは、カテキン／クロロゲン酸／ケルセチンである。
【００９５】
相乗作用を示すことがわれわれの研究で証明された組み合わせは、補助成分の質および抗酸化力を有意に改善する可能性がある。我々のデータは、単純に個々の果物を無作為に組み合わせるか、または毒性が未知の濃縮抽出物を作成するよりも、果物および果物抗酸化物質が提供する能力を証明している。
【００９６】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2013508724.tif 000017
【図７】
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【国際調査報告】
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