(57)【要約】誘導多能性幹細胞（iPS細胞）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞の実質的に純粋な集団を提供する。この細胞集団を生成する方法およびこの細胞集団からiPS細胞を生成する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞初期集団を、多能性に関連するマーカーを特異的に認識する試薬と接触させる工程；
選択された細胞集団を提供するために、多能性に関連する該マーカーを発現する細胞を選択する工程；および
選択された細胞集団を、リプログラミング因子のカクテルと接触させる工程
を含む、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を産生する方法であって、
選択された細胞が、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）となるよう誘導される、前記方法。
【請求項２】
選択された細胞集団におけるリプログラミング効率が、初期集団におけるプログラミング効率の少なくとも約2倍である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
選択された細胞集団におけるリプログラミング効率が、初期集団におけるプログラミング効率の少なくとも約5倍である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
多能性に関連するマーカーがSSEA3である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
体細胞がヒト線維芽細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ヒト線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
初期集団が初代インビトロ培養物である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
選択する工程が、フローサイトメトリーによる細胞の単離を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
リプログラミング因子が、該リプログラミング因子をコードする核酸を含むウイルス粒子として提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
リプログラミング因子が、該リプログラミング因子の核作用性・非組み込み性ポリペプチドとして提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
リプログラミング因子のカクテルが、OCT4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、およびLin28からなる群より選択される因子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
リプログラミング因子のカクテルが、OCT4、SOX2、KLF4、およびcMYCを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
体細胞初期集団を、多能性に関連するマーカーを特異的に認識する試薬と接触させる工程；
iPS細胞となる向上した潜在能力を有する体細胞集団を提供するために、多能性に関連する該マーカーを発現する細胞を選択する工程
を含む、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）となる向上した潜在能力を有する体細胞集団を濃縮する方法。
【請求項１４】
多能性に関連するマーカーがSSEA3である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
体細胞がヒト線維芽細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
ヒト線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
初期集団が初代インビトロ培養物である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
請求項13記載の方法により調製された、iPS細胞となる向上した潜在能力を有する体細胞の実質的に純粋な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
U.S.C. §119(e)に従い、本願は、2009年8月21日出願の米国仮特許出願第61/276,112号の出願日の優先権を主張し；その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
ヒト体細胞を、多能性に関連する一つまたは複数のマーカーに関して選択し、誘導多能性幹（iPS）細胞となる向上した潜在能力を有する精製された細胞集団を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ある個体と遺伝的に同一の多能性幹細胞を生成することは、基礎調査および将来の免疫学的適合性の新規の細胞療法に特別な機会を提供することである（Byrne JA. (2008) Human Mol. Gen. 17: R37-41（非特許文献1））。霊長類の体細胞を多能性の状態にリプログラムする方法には、体細胞核移植（Stojkovic M, et al. (2005) Reprod Biomed Online 11: 226-231（非特許文献2）; Byrne JA, et al. (2007) Nature 450: 497-502（非特許文献3））、多能性幹細胞との体細胞融合（Cowan CA, et al. (2005) Science 309: 1369-1373（非特許文献4））および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を産生する直接リプログラミング（Takahashi K, et al. (2007) Cell 131: 861-872（非特許文献5）; Park IH, et al. (2008) Nature 451: 141-146（非特許文献6）; Yu J, et al. (2007) Science 318: 1917-1920（非特許文献7）; Kim D, et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 472-476（非特許文献8）; Soldner F, et al. (2009) Cell. 136: 964-977（非特許文献9）; Huangfu D, et al. (2008) Nature Biotechnology 26: 1269-1275（非特許文献10）; Li W, et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 16-19（非特許文献11））がある。これらの方法論は、しかし、リプログラミング効率の低さおよびその根底にあるメカニズムの知識不足により特徴づけられる。これまでに、より分化した細胞はより低いリプログラミング効率を示すこと（Gurdon JB and Byrne JA. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100: 8048-8052（非特許文献12））および異なる体細胞型は差次的なリプログラミング能力を有していること（Aoi T, et al. (2008) Science 321: 699-702（非特許文献13）; Aasen T, et al. (2008) Nature Biotechnology 2008; 26(11): 1276-1284（非特許文献14））が実証されているが、当技術分野では、差次的なリプログラミング潜在能力を有する体細胞型の中の細胞亜集団は同定されていない。
【０００４】
差次的なリプログラミング潜在能力を有する体細胞集団内の細胞亜集団または亜集団群の単離は、リプログラミング効率を大きく増加させる方法を提供し、それによって、この技術に基づく潜在的用途の実現性を高めるであろう（Byrne JA. (2008) Human Mol. Gen. 17: R37-41（非特許文献1））。このような亜集団の単離はまた、基礎調査研究において、根底にあるリプログラミングメカニズムを理解するための道具を提供すると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Byrne JA. (2008) Human Mol. Gen. 17: R37-41
【非特許文献２】Stojkovic M, et al. (2005) Reprod Biomed Online 11: 226-231
【非特許文献３】Byrne JA, et al. (2007) Nature 450: 497-502
【非特許文献４】Cowan CA, et al. (2005) Science 309: 1369-1373
【非特許文献５】Takahashi K, et al. (2007) Cell 131: 861-872
【非特許文献６】Park IH, et al. (2008) Nature 451: 141-146
【非特許文献７】Yu J, et al. (2007) Science 318: 1917-1920
【非特許文献８】Kim D, et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 472-476
【非特許文献９】Soldner F, et al. (2009) Cell. 136: 964-977
【非特許文献１０】Huangfu D, et al. (2008) Nature Biotechnology 26: 1269-1275
【非特許文献１１】Li W, et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 16-19
【非特許文献１２】Gurdon JB and Byrne JA. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100: 8048-8052
【非特許文献１３】Aoi T, et al. (2008) Science 321: 699-702
【非特許文献１４】Aasen T, et al. (2008) Nature Biotechnology 2008; 26(11): 1276-1284
【発明の概要】
【０００６】
誘導多能性幹（iPS）細胞（iPS細胞）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞の実質的に純粋な集団を提供する。誘導多能性幹（iPS）細胞（iPS細胞）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞集団を濃縮する方法、この細胞集団を用いてiPS細胞を生成する方法、およびこの方法により生成されたiPS細胞を使用する方法も提供する。
【０００７】
本発明のいくつかの局面では、iPS細胞となる向上した潜在能力を有する体細胞の実質的に純粋な組成物を提供する。iPS細胞となる向上した潜在能力を有する体細胞は、多能性に関連する一つまたは複数のマーカーを発現し、かつその多能性マーカーを発現しない体細胞よりも高いリプログラミング効率を示す。本発明のいくつかの態様において、多能性マーカーは、ステージ特異的胚抗原3（SSEA3）である。関心対象の集団には、体細胞の初代培養物、すなわちヒト体組織に直接由来する継代初期の細胞（＜１０継代）が含まれる。いくつかの態様において、体細胞は初代線維芽細胞であり、それには皮膚線維芽細胞が含まれるがこれに限定されない。いくつかの態様において、効率の向上は少なくとも約2倍またはそれ以上である。
【０００８】
本発明のいくつかの局面では、誘導多能性幹（iPS）細胞（iPS細胞）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞集団を濃縮または選択する方法を提供する。これらの方法では、体細胞集団を、多能性に関連するマーカーを特異的に認識する試薬と接触させ、多能性マーカーを発現する細胞を選択する。いくつかの態様において、多能性マーカーはSSEA3である。いくつかの態様において、接触させる体細胞初期集団はヒト線維芽細胞集団である。いくつかのこのような態様において、ヒト線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。いくつかの態様において、体細胞初期集団は初代培養物である。
【０００９】
本発明のいくつかの局面では、体細胞からiPS細胞を生成する方法を提供する。これらの方法では、体細胞初期集団を、多能性に関連するマーカーを特異的に認識する試薬と接触させ、多能性マーカーを発現する細胞を選択し、選択した細胞をリプログラミング因子と接触させる。いくつかの態様において、多能性マーカーはSSEA3である。いくつかの態様において、接触させる体細胞初期集団はヒト線維芽細胞集団である。いくつかのこのような態様において、ヒト線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。いくつかの態様において、体細胞初期集団は初代培養物である。いくつかの態様において、リプログラミング因子はウイルス粒子として提供される。いくつかの態様において、リプログラミング因子は核作用性・非組み込み性ポリペプチドとして提供される。いくつかの態様において、リプログラミング因子は以下の因子の一つまたは複数を含む：OCT4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、およびLin28。いくつかの態様において、リプログラミング因子は、OCT4、SOX2、KLF4、およびcMycを含む。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下に十分な記載がなされている本発明の方法および組成物についての詳細を読むことで当業者に明らかとなろう。
【００１１】
本発明は、以下の詳細な説明を添付図面と併せて読むことで最大の理解がなされる。本特許または出願の書類には、少なくとも一つのカラー図面が含まれる。カラー図面を含む本特許または特許出願公報の複写物は、請求および必要経費の支払により関係庁から提供される。図面の様々な特徴点は、慣行にしたがい、原寸通りではないことを強調したい。そうではなく、様々な特徴点の寸法は、分かりやすさのために適宜拡大または縮小されている。以下の図表が図面に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】初代ヒト皮膚線維芽細胞からのSSEA3の発現。（A〜B）初代成人線維芽細胞株HUF1：（A）位相差画像、および（B）SSEA3発現の免疫細胞化学検出（緑色）。（C〜D）HUF1細胞における（C）TRA-1-60および（D）TRA-1-81の免疫蛍光染色。（E）HUF1細胞の位相差画像にSSEA3発現を重ね合わせたもの。（F）主に細胞膜からのSSEA3/488検出および核周囲からの限局的検出を示す、初代ヒト線維芽（HUF1）細胞の共焦点断面図。（G）H9ヒト胚性幹細胞におけるSSEA3/488の検出。（H）488二次抗体のみによるHUF1細胞の陰性対照染色。（C〜H）細胞核を青色で標識するDAPI染色。スケールバーは100ミクロンを表す。
【図２】SSEA3陽性の初代成人線維芽細胞のFACS分析および単離。（A）8つの追加の初代成人皮膚線維芽細胞株におけるSSEA3発現の免疫細胞化学分析。（B）SSEA3/488抗体複合体との生存したままの結合（live binding）後にFACS分析したHUF1細胞のヒストグラム。（C）一晩の接着後にFACS選別したSSEA3陽性およびSSEA3陰性集団におけるSSEA3/488蛍光シグナルの検出。SSEA3染色は緑色である。DAPI染色は青色である。スケールバーは100ミクロンを表す。
【図３】HUF1由来誘導多能性幹細胞（HiPS-1対照）の特徴づけ。（A）未選別のHUF1細胞へのレトロウイルス形質導入により生成されたiPS細胞（HiPSC-1対照）からの多能性マーカーの発現。細胞核を青色で標識するDAPI染色。スケールバーは100ミクロンを表す。（B）HiPS-1対照株のSKY核型分析。（C）HiPS-1対照株由来の奇形腫の組織学的分析。
【図４】HUF1細胞へのレトロウイルス形質導入後のコロニーおよび細胞株の形態。（A）ESC様の特性が見られない大きなバックグラウンドコロニー。（B）ESC様のiPSCコロニー。（C）誘導後にSSEA3選択された細胞株の形態。（A〜C）スケールバーは100ミクロンを表す。
【図５】SSEA3選択HiPSC株の多能性マーカー発現および核型決定。（A）H9 ESCおよびSSEA3選択HiPSC株における多能性マーカーの発現。アルカリホスファターゼ（AP）染色は暗赤色／紫色である。DAPI染色画像は青色のはめ込みである。スケールバーは100ミクロンを表す。（B）SSEA3選択iPSC株（HiPS-2C）のスペクトル核型決定（SKY）。（C）SSEA3選択iPSC株（HiPSC-2C）由来の奇形腫の組織学的分析。
【図６】差次的なSSEA3発現を示す初代皮膚線維芽細胞亜集団の転写分析。3つのHUF1細胞亜集団：SSEA3陰性細胞（SSEA3発現／検出における下位10%に相当）、SSEA3中間細胞（発現／検出における上位10%と下位10%との間の中間の80%の細胞に相当）およびSSEA3陽性細胞（SSEA3発現／検出における上位10%に相当）からのNanog、Sall4、hTert、およびGapdhの相対的発現。各試料につき3つの生物学的複製物を分析した。相対的遺伝子発現値は、その遺伝子に関する3つの亜集団の全体平均に対する各試料の遺伝子発現レベルを表す。
【図７】成人皮膚生検におけるSSEA3の発現。ラット抗SSEA3一次抗体およびヤギ抗ラット488二次抗体への曝露後に有意な蛍光を示した細胞亜集団は、成人皮膚の真皮乳頭層の構造物内部で検出された。ヤギ抗ラット二次抗体に曝露したのみでは、同じ構造物から有意な蛍光が検出されなかった（アイソタイプ対照）。SSEA3発現は緑色、DAPIは白色である。スケールバーは100ミクロンを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の組成物および方法の記載に先だって、本発明は記載された特定の組成物および方法に限定されず、当然それらは変化し得るものであることを理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は、特定の態様を記載する目的のみを有し、限定することを意図していないことも理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００１４】
範囲をもった数値が提供される場合、その範囲の上限および下限の間にある各中間値もまた、文脈が明らかにそうではないことを示していない限りその下限の10分の1の単位まで、具体的に開示されているものと理解されたい。言及された範囲内の任意の言及された値または中間値とその言及された範囲内の任意の他の言及された値または中間値との間にあるそれより小さい各範囲もまた、本発明に包含される。これらの小範囲の上下限は、個々に、その範囲に含まれる場合と除外される場合があり、そして、その小範囲に限度値のいずれか一方が含まれる場合、どちらも含まれない場合またはどちらも含まれる場合の各範囲とも本発明に包含されるが、ただし、言及された範囲において任意の限度値が個別に除外されている場合はそれに従う。言及された範囲が限度値の一方または両方を含む場合、その含まれる限度値のいずれか一方または両方を除外した範囲もまた本発明に包含される。
【００１５】
本明細書で使用するすべての技術・科学用語は、別途定義がなされていない限り、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているのと類似または等価な任意の方法および材料を使用することができるが、ここではいくつかの見込みのある好ましい方法および材料について記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、その刊行物の引用に関係する方法および／または材料を開示および記載するものとして、参照により本明細書に組み入れられる。相反がある場合、組み入れられた刊行物のいかなる開示よりも本明細書の開示が優先されることを理解されたい。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形の語「一つの（a）」、「一つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照を包含することに留意されなければならない。したがって、例えば、「一つの（a）リプログラミング因子ポリペプチド」に対する参照は、複数のそのようなポリペプチドを包含し、「その（the）誘導多能性幹細胞」に対する参照は、一つまたは複数の誘導多能性幹細胞および当業者に公知のその等価物に対する参照を包含する、等である。
【００１７】
本明細書で議論される刊行物は、本願出願日前のそれらの開示のために提供されるにすぎない。本明細書のいかなる記載も、本発明がそのような刊行物に先行するものであると認定される権利が先行発明によって失われたことを容認すると解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日と異なっている可能性があり、個別の確認を要する場合がある。
【００１８】
定義
誘導多能性幹（iPS）細胞（iPSC）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞の実質的に純粋な集団を提供する。誘導多能性幹（iPS）細胞（iPS細胞）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞集団を濃縮する方法、およびこの細胞集団からiPS細胞を生成する方法もまた提供される。これらはその後、移植のため、薬物スクリーニングのため、細胞の分化および相互作用の実験モデルのため；増殖因子および分化因子を明らかにするインビトロスクリーニングアッセイのため、細胞の発達および調節に関与する遺伝子を特徴づけるため等に使用され得る。これらの細胞は、これらの目的のために直接的に使用されることもあるし、性能を変化させるよう遺伝的に修飾されることもある。本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下に十分な記載がなされている本発明の方法および組成物についての詳細を読むことで当業者に明らかとなろう。
【００１９】
「分化した体細胞」または簡略形の「体細胞」という用語は、生物内のすべての細胞型を生じさせることはできない生物内のまたは生物の任意の細胞を包含する。換言すると、体細胞は、体内の3つの胚葉のすべて、すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞を自然には生じさせない十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、神経細胞および神経前駆細胞の両方を包含し、後者は中枢神経系のすべてまたはいくつかの細胞型を自然に生じさせることができる可能性があるが、中胚葉系または内胚葉系の細胞を生じさせることはできない。
【００２０】
「初代細胞」、「初代細胞株」および「初代培養物」という用語は、本明細書中で互換可能に用いられ、対象に由来し、インビトロで限られた回数の培養物の継代の間、すなわち分割の間、増殖することができる細胞および細胞培養物をさす。例えば、初代培養物は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、または15回継代されている場合があるが、危機的段階に至るほどの回数は継代されていない培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、インビトロで、10回未満の継代の間維持される。
【００２１】
「多能性」は、生物内のすべての細胞型に分化する細胞の能力を意味する。「多能性幹細胞」は、a）自己再生することができ、かつb）生物内のすべての細胞型を産生するよう分化することができる細胞を意味する。「誘導多能性幹細胞」という用語は、胚性幹（ES）細胞のように、生物内のすべての細胞型に分化する能力を維持しつつ長期間培養することができるが、（胚盤胞の内部細胞塊に由来する）ES細胞とは異なり、体細胞、すなわちより狭くより規定された潜在能力を有し実験的操作なしに生物内のすべての細胞型を生じることができない細胞に由来する多能性幹細胞を包含する。iPS細胞は、hESC様の形態を有し、核・細胞質比が大きく、輪郭が明瞭であり、核が目立つ平らなコロニーとして増殖する。さらに、iPS細胞は、アルカリホスファターゼ、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT、およびzfp42を含むがこれらに限定されない当業者に公知の重要な多能性マーカーを一つまたは複数発現する。さらに、iPS細胞は奇形腫を形成することができる。さらに、これらは生きた生物内で外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織を形成するかまたはそれに寄与することができる。
【００２２】
「iPS細胞となる潜在能力を有する」は、体細胞がiPS細胞となるよう誘導され得る、すなわち、そうなるようにリプログラムされ得ることを意味する。換言すると、その体細胞は、多能性細胞の形態学的特徴、増殖能力および多能性を有する細胞を樹立するように再分化するよう誘導され得る。
【００２３】
「リプログラミング効率」という用語は、リプログラミング因子と接触した場合にiPS細胞コロニーを生じる初代細胞培養物の能力をさすのに使用される。「向上したリプログラミング効率」は、その細胞が、リプログラミング因子と接触した場合に、対照と比べて向上した、iPS細胞を生じる能力を示すことを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「リプログラミング因子」は、細胞に対して転写を変化させるよう作用し、それによって細胞を複能性（multipotency）または多能性（pluripotency）にリプログラミングする、一つまたは複数の生物学的に活性な因子、すなわち、生物学的活性因子のカクテルをさす。リプログラミング因子は、本発明の細胞に個別に提供されることもあるし、単一組成物として、すなわちリプログラミング因子の予め混合された組成物として提供されることもある。これらの因子は、同じモル比で提供されることもあるし、異なるモル比で提供されることもある。これらの因子は、本発明の細胞を培養する過程で一度に提供されることもあるし、複数回提供されることもある。いくつかの態様において、リプログラミング因子は、Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Nanog；およびLin-28を含むがこれらに限定されない転写因子である。
【００２５】
本明細書中で、「処置」、「処置している」、「処置する」等の用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得るということを概してさすのに使用される。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防ぐという意味で予防的な場合もあるし、かつ／または、疾患および／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な安定化または治癒という意味で治療的な場合もある。本明細書で使用する場合、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（a）疾患または症状にかかる傾向があるが未だそれを患っていると診断されていない対象においてその疾患または症状が生じるのを予防すること；（b）その疾患症状を阻害すること、すなわち、その進行を止めること；または（c）その疾患症状を緩和すること、すなわち、その疾患または症状を軽減させること、を含む。
【００２６】
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書中で互換可能に用いられ、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトをさす。
【００２７】
誘導多能性幹（iPS）細胞（iPSC）となる向上した潜在能力を有するヒト体細胞の実質的に純粋な組成物を提供する。上述のように、「体細胞」という用語は、生物内のすべての細胞型を生じさせることはできない、すなわち、多能性でない、生物内の任意の細胞を包含する。換言すると、体細胞は、体内の3つの胚葉のすべて、すなわち外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞を自然には生じさせない十分に分化した細胞である。本願の実質的に純粋な組成物を含み得る体細胞の例は、外胚葉（例えば、ケラチン細胞）、中胚葉（例えば、線維芽細胞）、内胚葉（例えば、膵臓細胞）、または神経堤系（例えば、メラニン細胞）由来の細胞である。体細胞は、例えば、皮膚線維芽細胞、ケラチン細胞、膵臓ベータ細胞、神経細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞、肝細胞、肝幹細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、破骨細胞、骨芽細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、シュワン細胞等であり得る。これらは、実験的操作なしには増殖しないか、またはするとしても、それらの固有形、例えば最終分化細胞をより多く生じることができるにとどまる細胞であり得るか；または、それらは、特定系統の細胞を生じることができる時点まで、例えば、成体の非多能性・複能性の幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、肝幹細胞等まで分化し得る。いくつかの態様において、細胞は、当技術分野で周知のように、それらの分化段階を反映する表現型、例えば、その細胞の分化状況を反映するマーカー、細胞形態、および／または機能的特徴を有する。一つの非限定的な例として、体細胞は、線維芽細胞系の細胞であり得る。この系統の細胞には、当技術分野で周知のように、分化した線維芽細胞、例えば皮膚線維芽細胞、および分化度の低い前駆細胞、例えば循環および組織由来の間葉系幹細胞；上皮間葉移行由来の細胞等が含まれる。皮膚線維芽細胞は、ビメンチンおよび／または線維芽細胞表面抗原（FSA）を発現し得、分化度の低い線維芽細胞は、CD34および／または熱ショックタンパク質47（HSP47）を発現し得る。さらに、線維芽細胞は、一般的な「線維芽細胞様」の形態を有し、これは概して、一つまたは二つの核小体を有する楕円形で斑点のある核を取り囲む枝分かれした細胞質を含むものである。
【００２８】
誘導多能性幹（iPS）細胞（iPSC）となる向上した潜在能力を有する細胞は、体細胞であることに加えて、多能性マーカーであるステージ特異的胚抗原3（SSEA3）を検出可能レベルで発現する。換言すると、体細胞は、SSEA3発現に関して陽性である、すなわち、それらはSSEA3+細胞である。SSEA3は、Shevinsky LH, et al (1982) Cell 3: 697-705により最初に報告された、細胞表面の糖脂質および糖ペプチドの両方に存在する糖質の細胞表面抗原である。SSEA3に対する抗体は、例えば、Milliporeからカタログ番号mab4303で市販されている。
【００２９】
当業者は、言及される発現レベルが、細胞表面上のマーカータンパク質の検出可能な量を反映していることを理解すると考えられる。（マーカー特異的試薬の結合レベルがアイソタイプ適合対照と検出可能なほどには相違しない）染色陰性細胞は、それでも、微量のマーカーを発現している可能性がある。そして、特定のマーカーに関して細胞を「陽性」または「陰性」と称することは当技術分野で一般的であるが、実際の発現レベルは量的形質である。細胞表面上の分子数は数log規模でばらつきが生じ得るが、それでも「陽性」と特徴づけられる。
【００３０】
細胞の染色強度は、定量レベルの蛍光色素（特異的試薬、例えば抗体が結合した、細胞表面マーカーの量に比例する）をレーザーで検出するフローサイトメトリーによってモニターすることができる。フローサイトメトリーまたはFACSは、特異的試薬に対する結合強度および他のパラメーター、例えば細胞サイズおよび光散乱に基づき細胞集団を分離するのにも使用することができる。絶対的な染色レベルは個々の蛍光色素および試薬調製物によって異なる可能性があるが、データは対照に対して正規化することができる。
【００３１】
そのばらつきを対照をもとに正規化するため、各細胞が、特定の染色強度を有するデータ点として記録される。これらのデータ点は、任意の染色強度を測定単位とする対数スケールで表示され得る。一つの例において、試料中で最も明るく染色された細胞は、非染色細胞よりも4 log高い強度であり得る。この様式で表示される場合、染色強度のlog値が高い範囲の細胞は明るく、低強度の細胞は陰性であることは明らかである。「低」陽性染色細胞は、アイソタイプ適合対照よりも明るい染色レベルを有するが、その集団内で通常見られる最も明るく染色した細胞ほどの強度はない。別の対照は、その表面上のマーカー密度が明らかな基材、例えばビーズ製造物または細胞株を利用するものであり得、これは、強度に関する陽性対照を提供する。
【００３２】
iPS細胞となる向上した潜在能力を有する体細胞、すなわち、本明細書中、これ以降では「本発明のSSEA3+細胞」と称されるSSEA3体細胞、の分離／濃縮方法も提供する。濃縮された細胞集団は、実質的に純粋な集団であり、「実質的に純粋」は、その集団の細胞の少なくとも約70%、約75%、または約80%が選択された表現型であること、通常はその集団の少なくとも85%または90%が選択された表現型であること、場合によりその集団の少なくとも95%またはそれ以上、例えばその集団の95%、98%、および最大100%が選択された表現型であることを意味する。
【００３３】
本発明の方法において、iPS細胞となる向上した潜在能力を有する体細胞、すなわちSSEA3+体細胞は、体細胞初期集団から、エクスビボまたはインビトロで、すなわち、個体の体外で、および場合により培養環境で、分離される。この、本明細書中以降では「本発明の初期集団」と称される体細胞初期集団は、しばしば、体細胞の複合混合物または異種培養物である。本発明の初期集団は、任意の哺乳動物種、例えばヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等から採取され得る。本発明の初期集団は、新鮮な細胞または凍結細胞を含む場合があり、これらは新生児、子供または成体由来であり得、かつ皮膚、筋肉、骨髄、末梢血、臍帯血、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃、およびその他の分化した組織を含む組織由来であり得る。組織は、生存するドナーからの生検またはアフェレーシスによって採取されるか、または死後約48時間以内の死亡もしくは臨終期のドナー、もしくは新鮮な凍結組織、死後約12時間以内に凍結されかつ約-20℃以下で、通常はほぼ液体窒素温度（-190℃）で無期限に維持される組織から採取され得る。組織から細胞を単離するため、細胞の分散または懸濁に適した溶液が使用され得る。そのような溶液は一般に、平衡塩溶液、例えば、通常の生理食塩水、PBS、ハンクス平衡塩溶液等であり、これらには適宜、低濃度の、一般には5〜25mMの許容可能なバッファーと共にウシ胎仔血清またはその他の天然要素が補充される。適当なバッファーには、HEPES、リン酸バッファー、乳酸バッファー等が含まれる。
【００３４】
いつかの態様において、SSEA3+体細胞、すなわち、本発明のSSEA3+細胞は、本発明の体細胞初期集団から、細胞の分散または懸濁の後直ちに分離される。いくつかの態様において、本発明の初期集団は、まず、細胞の異種培養物、例えば、線維芽細胞初代培養物を形成するよう培養され、次いで、SSEA3を発現する細胞を濃縮する分離技術に供される。いくつかの態様において、本発明の初期集団は、本発明の初期集団から本発明のSSEA3+細胞を分離するときまで、通常は約-80℃からほぼ液体窒素温度（-190℃）で凍結および凍結保存されている。このような事例において、細胞は通常、10% DMSO、50%血清、40%バッファー培地、またはそのような温度で細胞を保存するのに当技術分野で一般に使用されるその他のいくつかの溶液中で保存され、そして当技術分野で一般に知られておりかつ以下にさらに記載されるような方法により解凍および再培養される。
【００３５】
本発明の体細胞初期集団からの本発明のSSEA3+細胞の分離は、任意の適当な分離技術によって行われ得る。例えば、本発明のSSEA3+細胞は、アフィニティー分離技術によって本発明の初期集団から分離され得る。アフィニティー分離技術には、アフィニティー試薬でコートされた磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリクス、例えばプレートに結合させたアフィニティー試薬を用いる「パンニング」、アフィニティー試薬に連結させたまたはアフィニティー試薬と組み合わせて使用される細胞毒性薬、例えば補体および細胞毒、またはその他の適当な技術が含まれ得る。正確な分離を実現する技術には、様々な精巧度、例えばマルチカラーチャンネル、小角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル等を有し得る蛍光標示式細胞分取器が含まれる。細胞は、死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることにより死細胞に対して選択され得る。本発明のSSEA3+細胞の生存性に過度の悪影響を及ぼさない任意の技術が使用され得る。
【００３６】
アフィニティー分離技術によって本発明のSSEA3+細胞を分離するため、本発明の体細胞初期集団を、多能性に関連するマーカー、すなわちSSEA3マーカーを特異的に認識しこれに選択的に結合するアフィニティー試薬と接触させる。「選択的に結合」は、その分子が、関心対象の標的に対して優先的に結合するかまたは他の分子よりも標的に対して高い親和性で結合することを意味する。例えば、抗体は、その抗体が特異性を示すエピトープを含む分子に結合し、無関係のエピトープに対しては結合しない。いくつかの態様において、アフィニティー試薬は、抗体、すなわち、SSEA3に特異的な抗体であり得る。いくつかの態様において、アフィニティー試薬は、SSEA3に対する特異的受容体またはリガンド、例えば、ペプチドリガンドおよび受容体；エフェクターおよび受容体分子、SSEA3に特異的なT細胞受容体等であり得る。いくつかの態様において、SSEA3に特異的な複数のアフィニティー試薬が使用され得る。抗体およびT細胞受容体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、かつ、トランスジェニック動物、免疫処置動物、ヒトまたは動物の不死化B細胞、その抗体またはT細胞受容体をコードするDNAベクターをトランスフェクトした細胞等により産生され得る。抗体の調製およびそれらの特異的結合メンバーとしての使用適性についての詳細は、当業者に周知である。特に関心がもたれるのは、抗体のアフィニティー試薬としての使用である。これらの抗体は、適宜、分離に使用する標識に結合される。特定の細胞型の分離を容易にする標識には、直接的な分離を実現する磁気ビーズ；支持体に結合させたアビジンまたはストレプトアビジンによって除去することができるビオチン；蛍光蛍光標示式細胞分取器と共に使用することができる蛍光色素等が含まれる。使用できる蛍光色素には、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセインならびにテキサスレッドが含まれる。多くの場合、各々の抗体は、マーカーごとに独立した選別を実現できるよう、異なる蛍光色素で標識される。
【００３７】
本発明の体細胞初期集団は、アフィニティー試薬と接触させ、利用可能な細胞表面抗原に結合するのに十分な時間インキュベートされる。インキュベーションは通常、少なくとも約5分間であり、通常は約60分未満である。分離の効果が抗体の不足によって制限されないよう、反応混合物が十分な抗体濃度を有することが望ましい。適当な濃度は滴定によって測定されるが、典型的には、細胞懸濁物中への抗体の希釈は約1:50（すなわち、抗体1部に対して反応容量50部）、約1:100、約1:150、約1:200、約1:250、約1:500、約1:1000、約1:2000、または約1:5000である。細胞を懸濁する培地は、細胞の生存性を維持する任意の培地である。好ましい培地は、0.1〜0.5% BSAまたは1〜4%ヤギ血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水である。様々な培地が市販されており、これらが細胞の性質に従い使用され得る。これらにはダルベッコ改変イーグル培地（dMEM）、ハンクス基本塩溶液（HBSS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（dPBS）、RPMI、イスコフ培地、5mM EDTA含有PBS等が含まれ、しばしばウシ胎仔血清、BSA、HSA、ヤギ血清等が補充される。
【００３８】
接触させた集団の中の、アフィニティー試薬によって標識される細胞、すなわち、本発明のSSEA3+細胞は、任意の適当なアフィニティー分離技術、例えば上記のまたは当技術分野で公知の技術によって選択される。分離後、分離された細胞は、細胞の生存性を維持する任意の適当な培地、通常は回収チューブの底側に血清のクッションが敷かれている培地に回収され得る。様々な培地が市販されており、これらが細胞の性質に従い使用され得る。これらにはdMEM、HBSS、dPBS、RPMI、イスコフ培地等が含まれ、しばしばウシ胎仔血清が補充される。
【００３９】
SSEA3+体細胞が高度に濃縮された組成物はこのようにして達成される。SSEA3+体細胞は、細胞組成物の約70%、約75%、約80%、約85%、約90%またはそれ以上、濃縮細胞組成物の約95%またはそれ以上であり、好ましくは濃縮細胞組成物の約95%またはそれ以上である。換言すると、この組成物は、SSEA3+体細胞の実質的に純粋な組成物である。この実質的に純粋な組成物の細胞はまた、同細胞から分離されたSSEA3を発現しないまたは低レベル発現する細胞と比べて高レベルのNanog遺伝子を発現する。さらに、この実質的に純粋な組成物の細胞は、形態学的に、同細胞から分離された細胞と区別できず；例えば、ヒト皮膚線維芽細胞集団から濃縮された場合、SSEA3+体細胞は、SSEA3-ヒト皮膚線維芽細胞と形態学的に実質的に同じまたは同一に見える。
【００４０】
SSEA3+体細胞、すなわち本発明のSSEA3+細胞は、直ちに使用され得る。あるいは、本発明のSSEA3+細胞は、液体窒素温度で凍結され、解凍し再使用できる状態で長期間保存され得る。このような事例において、細胞は通常、10% DMSO、50%血清、40%緩衝培地、またはこのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般に使用されているいくつかの他の溶液中で凍結され、そして、当技術分野で一般に知られている凍結培養細胞の解凍方法で解凍される。
【００４１】
本発明のSSEA3+細胞は、様々な培養条件下でインビトロ培養され得る。培養培地は、液体、または、例えば寒天、メチルセルロース等を含有する半固体であり得る。細胞集団は、適宜、適当な栄養培地、例えば、通常はウシ胎仔血清（約5〜10%）、L-グルタミン、チオール、特に2-メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、イスコフ改変DMEMまたはRPMI-1640中に懸濁され得る。
【００４２】
培養物は、細胞が反応性となる増殖因子を含み得る。本明細書で定義される場合、増殖因子は、培養環境またはインタクトな組織内で、膜貫通受容体に対する特異的な作用を通じて、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子には、ポリペプチド因子および非ポリペプチド因子が含まれる。
【００４３】
本発明のSSEA3+細胞は、多種多様な方法で使用され得る。馴化培地である栄養培地は、様々な段階で単離され、その成分が分析され得る。分離は、HPLC、逆相HPLC、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、またはその他の、分子量、モル体積、電荷、それらの組み合わせによって分離を行う非破壊的技術等によって達成され得る。これらの技術の一つまたは複数は、特定の画分をさらに濃縮するために組み合わされ得る。本発明の細胞それ自体は、例えば、本発明の細胞をより特徴づけるために、例えば、遺伝子発現に関して分析され得る。
【００４４】
本発明のSSEA3+細胞の一つの好ましい用途は、iPS細胞を産生することである。本発明のSSEA3+細胞をiPS細胞となるよう誘導するために、本発明のSSEA3+細胞の実質的に純粋な集団、すなわち、体細胞初期集団をアフィニティー試薬と接触させ、SSEA3を発現する細胞について選択を行うことにより初期集団から選択された細胞集団を、リプログラミング因子（RF）と接触させる。本明細書で使用する場合、リプログラミング因子は、細胞に対して転写を変化させるよう作用し、それによって細胞を複能性または多能性にリプログラミングする、一つまたは複数の生物学的に活性な因子、すなわち、生物学的活性因子のカクテルをさす。いくつかの態様において、リプログラミング因子は、Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Nanog；およびLin-28を含むがこれらに限定されない転写因子である。
【００４５】
Oct3/4ポリペプチドは、ホモサピエンスPOUクラス5ホメオボックス1（POU5F1）としてしても公知であり、その配列がGenBankアクセッション番号NP_002692およびNM_002701に見出される、ヒトOct3/4のアミノ酸配列と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Oct3/4ポリペプチド、例えば、GenBankアクセッション番号NM_002701で提供される配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、または100%同一のポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明においてリプログラミング因子としての用途が見出される。
【００４６】
Sox2ポリペプチドは、その配列がGenBankアクセッション番号NP_003097およびNM_003106に見出される、ヒトSox2、すなわち性決定領域Yボックス2タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Sox2ポリペプチド、例えば、GenBankアクセッション番号NM_003106で提供される配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、または100%同一のポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明においてリプログラミング因子としての用途が見出される。
【００４７】
Klf4ポリペプチドは、その配列がGenBankアクセッション番号NP_004226およびNM_004235に見出される、ヒトKlf4、すなわちクルッペル様因子4のアミノ酸配列と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Klf4ポリペプチド、例えば、GenBankアクセッション番号NM_004235で提供される配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、または100%同一のポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明においてリプログラミング因子としての用途が見出される。
【００４８】
c-Mycポリペプチドは、その配列がGenBankアクセッション番号NP_002458およびNM_002467に見出される、ヒトc-Myc、すなわち骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログのアミノ酸配列と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。c-Mycポリペプチド、例えば、GenBankアクセッション番号NM_002467で提供される配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、または100%同一のポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明においてリプログラミング因子としての用途が見出される。
【００４９】
Nanogポリペプチドは、その配列がGenBankアクセッション番号NP_079141およびNM_024865に見出される、ヒトNanog、すなわちNanogホメオボックスのアミノ酸配列と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Nanogポリペプチド、例えば、GenBankアクセッション番号NM_024865で提供される配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、または100%同一のポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明においてリプログラミング因子としての用途が見出される。
【００５０】
Lin-28ポリペプチドは、その配列がGenBankアクセッション番号NP_078950およびNM_024674に見出される、ヒトLin-28、すなわち線虫（C.elegans）のLin-28ホモログのアミノ酸配列と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Lin-28ポリペプチド、例えば、GenBankアクセッション番号NM_024674で提供される配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、または100%同一のポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明においてリプログラミング因子としての用途が見出される。
【００５１】
いくつかの態様において、リプログラミング因子は、リプログラミング因子をコードする核酸として、本発明のSSEA3+細胞の実質的に純粋な組成物に提供される。標的哺乳動物細胞に異種遺伝子を導入するのに有用な多くのベクターが利用可能である。それらのベクターは、例えばサイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルス由来ベクター、プラスミド、小環状のDNAのように、エピソームとして維持されるものもあるし、例えばMMLV、HIV-1、ALV等のレトロウイルス由来ベクターのように、相同組み換えまたは無作為組み込みを通じて標的細胞のゲノムに組み込まれるものもある。
【００５２】
リプログラミング因子をコードする核酸は、本発明の細胞に直接的に提供され得る。換言すると、本発明のSSEA3+体細胞と、リプログラミング因子をコードする核酸を含むベクターとを、そのベクターが細胞に取り込まれるように接触させる。細胞を核酸ベクターと接触させるための方法、例えばエレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびリポフェクションは、当技術分野で周知である。
【００５３】
あるいは、リプログラミング因子をコードする核酸は、ウイルスを介して本発明の細胞に提供され得る。換言すると、本発明のSSEA3+体細胞と、リプログラミング因子をコードする核酸を含むウイルス粒子とを接触させる。レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、非分裂細胞のトランスフェクションに使用できることから、本発明の方法に特に適している（例えば、Uchida et al. (1998) P.N.A.S. 95(20): 11939-44を参照のこと）。一般に利用されているレトロウイルスベクターは、「不完全」である、すなわち、増殖感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。その代わり、ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖が必要となる。
【００５４】
リプログラミング因子をコードする核酸を含むウイルス粒子を生成するために、リプログラミング因子をコードする核酸を含むレトロウイルス核酸が、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージされる。パッケージング細胞株が異なると、カプシドに取り込まれるエンベロープタンパク質も異なり、このエンベロープタンパク質がそのウイルス粒子の細胞に対する特異性を決定する。エンベロープタンパク質には、少なくとも3つの型、同種指向性、両種指向性および異種指向性がある。同種指向性エンベロープタンパク質、例えばMMLVと共にパッケージされたレトロウイルスは、大部分のマウスおよびラットの細胞型に感染することができ、これは、BOSC23（Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90: 8392-8396）のような同種指向性パッケージング細胞株を使用することによって生成される。両種指向性エンベロープタンパク質、例えば4070A（Danos et al, 前出）を保持するレトロウイルスは、ヒト、イヌおよびマウスを含む大部分の哺乳動物の細胞型に感染することができ、これは、PA12（Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 431-437）;PA317（Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902）；GRIP（Danos et al. (1988) PNAS 85: 6460-6464）のような両種指向性パッケージング細胞株を使用することによって生成される。異種指向性エンベロープタンパク質、例えば、AKR envと共にパッケージされたレトロウイルスは、マウス細胞を除く大部分の哺乳動物の細胞型に感染することができる。本発明のCD33+体細胞が確実にパッケージウイルス粒子の標的となるよう、適当なパッケージング細胞株が使用され得る。リプログラミング因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞株に導入する方法および同パッケージング株により生成されたウイルス粒子を回収する方法は、当技術分野で周知である。
【００５５】
本発明の細胞に対してリプログラミング因子を核酸として提供するのに使用されるベクターは、典型的には、その発現を駆動するのに適した、すなわちリプログラミング因子核酸の転写活性化に適したプロモーターを含む。これには、普遍的に作用するプロモーター、例えば、CMV-b-アクチンプロモーター、または誘導性のプロモーター、例えば、特定の細胞集団において活性を示すプロモーターまたはテトラサイクリン等の薬物の存在に反応するプロモーターが含まれ得る。転写活性化により、転写が標的細胞における基準レベルの少なくとも約10倍、少なくとも約100倍、通常は少なくとも約1000倍増大することが意図される。さらに、本発明の細胞にリプログラミング因子を提供するのに使用されるベクターは、例えばCre/Lox等のリコンビナーゼ系を用いることで後で除去しなければならない遺伝子を含むか、またはそれらを発現する細胞は、例えばヘルペスウイルスTK、bcl-xs等の選択的毒性を提供する遺伝子を持たせることで、破壊され得る。
【００５６】
いくつかの態様において、リプログラミング因子は、リプログラミング因子の核作用性・非組み込み性ポリペプチドまたはリプログラミング因子ポリペプチドとして提供される。換言すると、本発明のSSEA3+体細胞と、リプログラミング因子をコードしかつ核において作用するポリペプチドとを接触させる。非組み込み性とは、そのポリペプチドが、宿主細胞、すなわち、本発明のSSEA3+体細胞のゲノムに組み込まれないことを意味する。
【００５７】
リプログラミング因子ポリペプチドは、典型的には、リプログラミング因子がポリペプチド透過ドメインに融合されているポリペプチド配列を含む。ペプチド、ペプチド模倣物および非ペプチドキャリアを含む多くの透過ドメインが当技術分野で公知であり、本発明の核作用性・非組み込み性ポリペプチドにおいて使用され得る。例えば、透過ペプチドは、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の転写因子であるアンテナペディアの第3アルファヘリックスから取得され得、これはペネトラチンと称される。別の例として、透過ペプチドは、HIV-1 tatの塩基性領域のアミノ酸配列を含み、例えば、天然に存在するtatタンパク質のアミノ酸49〜57を含み得る。他の透過ドメインには、ポリアルギニンモチーフ、例えば、HIV-1 revタンパク質のアミノ酸34〜56の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニン等が含まれる（例えば、転座ペプチドおよびペプトイドの教示に関して参照により詳細が本明細書に組み入れられる、Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 Apr; 4(2): 87-96；およびWender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97(24): 13003-8；公開された米国特許出願20030220334；20030083256；20030032593；および20030022831を参照のこと）。ノナアルギニン（R9）配列は、効果の高いPTDの一つであることが特徴づけられている（Wender et al. 2000；Uemura et al. 2002）。
【００５８】
リプログラミング因子ポリペプチドのリプログラミング因子ポリペプチド配列はまた、場合により、生成物の可溶性を向上させるポリペプチドドメインに融合され得る。このドメインは通常、所定のプロテアーゼ切断部位、例えばTEVプロテアーゼによって切断されるTEV配列を通じてRFに連結される。リンカーはまた、一つまたは複数のフレキシブル配列、例えば1〜10個のグリシン残基を含み得る。いくつかの態様において、融合タンパク質の切断は、生成物の可溶性を維持するバッファー中で、例えば、0.5〜2M尿素の存在下、RFの可溶性を向上させるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在下等で実施される。関心対象のドメインには、エンドソーム溶解性（endosomolytic）ドメイン、例えば、インフルエンザHAドメイン；およびその他の製造に役立つポリペプチド、例えば、IF2ドメイン、GSTドメイン、GRPEドメイン等が含まれる。
【００５９】
リプログラミング因子ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて、細胞ベースのシステムで生成され得る。リプログラミング因子ポリペプチドをコードする核酸（例えばcDNAまたはゲノムDNA）は、複製可能な発現用ベクターに挿入される。多くのこのようなベクターが利用可能である。ベクター成分は一般に、以下の一つまたは複数を含むがこれらに限定されない：複製起点、一つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【００６０】
リプログラミング因子ポリペプチドは、直接的に組み換え産生されるだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても、例えば、その成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特定の切断部位を有するポリペプチドとしても組み換え産生され得る。発現ベクターは通常、選択遺伝子を含み、これは選択マーカーとも呼ばれる。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。
【００６１】
発現ベクターは、宿主生物により認識され、かつリプログラミング因子コード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む。プロモーターは、それに機能的に連結された特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（5'側）に位置する非翻訳配列（一般に約100〜1000bp）である。このようなプロモーターは、典型的には、誘導性および構成性の2つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば栄養分の存在もしくは非存在または温度の変化に反応してそれらの制御下にあるDNAからの転写のレベルの増加をもたらすプロモーターである。様々な宿主細胞候補に認識される多数のプロモーターが周知である。ネイティブのリプログラミング因子ポリペプチドプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方が、リプログラミング因子ポリペプチドの発現を指示するのに使用され得る。しかし、一般には、強い転写および高い収量を実現する異種プロモーターが好ましい。高等真核生物による転写は、多くの場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーは、通常約10〜300bpのDNAのシス作用性エレメントであり、プロモーターに対してその転写を増大させるよう作用する。エンハンサーは比較的、方向および位置非依存的であり、転写ユニットの5'側および3'側、イントロン内およびコード配列自体の内部で見出される。
【００６２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5'非翻訳領域から、ときには3'非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、WntポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分内のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。発現ベクターを含む細胞は、所望のポリペプチドの発現を提供する条件下で増殖させ、所望のポリペプチドはその後、従来法により細胞溶解産物から抽出される。
【００６３】
あるいは、リプログラミング因子ポリペプチドは、無細胞系において、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第61/271,000号に教示される方法により、生成され得る。
【００６４】
当技術分野で一般に知られている方法による精製の後、リプログラミング因子ポリペプチドは、標準的なタンパク質形質導入方法により本発明の細胞に提供される。いくつかの事例において、タンパク質形質導入法は、キャリア物質および少なくとも一つの精製されたリプログラミング因子ポリペプチドを含む組成物と細胞との接触を含む。適当なキャリア物質およびその利用法の例には、米国特許第6,841,535号に記載されるChariot（商標）（Active Motif, Inc., Carlsbad, Calif.）；Bioport（登録商標）（Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, Calif.）、GenomeONE（Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan）およびProteoJuice（商標）（Novagen, Madison, Wis.）のような市販の試薬、または、ナノ粒子状タンパク質形質導入試薬、例えば、米国特許出願第10/138,593号に記載される試薬が含まれるがこれらに限定されない。
【００６５】
リプログラミング因子は、個別に、または単一組成物として、すなわち、リプログラミング因子の予め混合された組成物として、本発明のSSEA3+体細胞に提供され得る。リプログラミング因子は、同時にまたは異なる時点で順々に、本発明の細胞に添加され得る。いくつかの態様において、少なくとも3つの精製されたリプログラミング因子、例えばOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチドおよびKlf4ポリペプチドのセットが添加される。いくつかの態様において、4つの精製されたリプログラミング因子、例えば、Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、Klf4ポリペプチドおよびc-Mycポリペプチドのセットが細胞に提供される。いくつかの態様において、細胞は、約30分間〜約24時間、例えば、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、12時間、16時間、18時間、20時間または約30分間から約24時間までの任意の他の期間、精製されたIFポリペプチドの存在下でインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞のタンパク質形質導入は、同一または異なるIFポリペプチドを用いて、ほぼ毎日〜ほぼ4日毎の頻度、例えば1.5日毎、2日毎、3日毎の頻度またはほぼ毎日からほぼ4日毎までの任意の他の頻度で反復される。典型的には、リプログラミング因子は、本発明の細胞に一度提供され、その細胞は16〜24時間リプログラミング因子と共にインキュベートされ、その後の時点で培地が新鮮な培地に交換され、細胞がさらに培養されるか、または、リプログラミング因子は、本発明の細胞に二度提供され、各々の提供の後にリプログラミング因子との16〜24時間のインキュベーションが二回行われ、その後の時点で培地が新鮮な培地に交換され、細胞がさらに培養される。
【００６６】
本発明のSSEA3+体細胞をリプログラミング因子と接触させた後、接触させた細胞は、iPS細胞の成長を促すよう培養される。ES細胞の増殖を促すよう細胞を培養し、ES細胞クローンを単離し、かつES細胞の成長を促すようにそれらのES細胞クローンの細胞を培養する方法は、当技術分野で周知であり、そのいずれも、本発明において、リプログラムされた本発明のSSEA3+体細胞からiPS細胞を増殖、単離、そして再培養するのに使用され得る。
【００６７】
本発明のSSEA3+体細胞集団からそうなるように誘導されたiPS細胞は、hESC様形態を有し、核・細胞質比が大きく、輪郭が明瞭であり、核が目立つ平らなコロニーとして増殖する。さらに、iPS細胞は、アルカリホスファターゼ、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT、およびzfp42を含むがこれらに限定されない当業者に公知の重要な多能性マーカーを一つまたは複数発現する。さらに、iPS細胞は奇形腫を形成することができる。さらに、これらは生きた生物内で外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織を形成またはそれに寄与することができる。
【００６８】
遺伝子は様々な目的で、例えば、機能喪失変異を有する遺伝子を取り換えるため、マーカー遺伝子を提供するため等の目的で、本発明のSSEA3+体細胞またはそれ由来のiPS細胞に導入され得る。あるいは、アンチセンスmRNAまたはリボザイムを発現させることにより、望まない遺伝子の発現をブロックするベクターが導入される。他の遺伝子治療の方法は、正常な前駆細胞に優位性を与えこれを選択圧に供することを可能にする薬剤耐性遺伝子、例えば多剤耐性遺伝子（MDR）または抗アポトーシス遺伝子、例えばbcl-2の導入である。当技術分野で公知の様々な技術、例えば上記のような、エレクトロポレーション、カルシウム沈降DNA、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染等が、核酸を標的細胞に導入するのに使用され得る。DNAを導入する個別の方法は本発明の実施において重要ではない。
【００６９】
SSEA3+体細胞またはそれ由来のiPS細胞が遺伝的に修飾されたことを確認するため、様々な技術が利用され得る。細胞のゲノムが制限処理され、増幅が行われまたは行われずに使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応；ゲル電気泳動；制限分析；サザンブロット、ノーザンブロット、およびウェスタンブロット；配列決定等はすべて利用され得る。細胞は、その細胞が、導入DNAの発現能力を維持しつつ骨髄細胞系のすべてへと成熟できることを確認するため、様々な条件下で増殖させ得る。その細胞の多能性が維持されていることを確認するために、様々なインビトロおよびインビボ試験が利用され得る。
【００７０】
本発明の方法の利点は、それらが、iPS細胞となる高いリプログラミング効率を有する細胞の実質的に純粋な集団を提供する点にあることに着目されたい。「高いリプログラミング効率」は、その細胞が、リプログラミング因子と接触した場合に、対照よりも高い、iPS細胞を生じる能力を示すことを意味する。高いリプログラミング効率を示す細胞または細胞集団は、iPS細胞を生じる能力が、対照細胞または対照細胞集団の能力の約150%、対照細胞または対照細胞集団の能力の約200%、約300%、約400%、約600%または約800%である。換言すると、初代細胞または初代細胞培養物は、対照初代細胞または対照初代細胞集団の約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約6倍、もしくは約8倍の数のiPSコロニーまたはそれ以上を生じる。いくつかの事例において、対照細胞／対照細胞集団は、本発明の多能性マーカーを発現しない。いくつかの事例において、対照集団は、本発明の多能性マーカーを発現する細胞をある程度は含むが、その多能性マーカーを発現する細胞に関して濃縮されていない集団であり、すなわち、細胞のわずか約2%またはそれ未満、5%またはそれ未満、7%またはそれ未満、10%またはそれ未満、ときどき15%、20%、もしくは30%またはそれ未満、場合により40%、50%、60%、もしくは70%またはそれ未満が多能性マーカーを発現する。典型的には、本発明の方法は、対照集団のリプログラミング効率よりも少なくとも約2倍またはそれ以上に大きい、増大したリプログラミング効率を提供する。
【００７１】
上記の方法によって産生されたiPS細胞は、レシピエントの分化性細胞または分化細胞を再構成または補充するのに使用され得る。誘導細胞は、様々な系統の細胞型に分化し得る。分化細胞の例には、外胚葉系（例えば、神経細胞および線維芽細胞）、中胚葉系（例えば、心筋細胞）、または内胚葉系（例えば、膵臓細胞）の任意の分化細胞が含まれる。分化細胞は、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、神経細胞（例えば、ドーパミン作動性神経細胞）、乏突起膠細胞、乏突起膠細胞前駆細胞、肝細胞、肝幹細胞、星状膠細胞、筋細胞、造血細胞、または心筋細胞の一つまたは複数であり得る。
【００７２】
誘導細胞由来の分化細胞は、最終分化細胞である場合もあるし、それらは特定の系統の細胞を生じることができる場合もある。例えば、誘導細胞は、様々な複能性細胞型、例えば神経幹細胞、心臓幹細胞、または肝幹細胞に分化することができる。これらの幹細胞はその後、新たな細胞型にさらに分化し得る、例えば、神経幹細胞は神経細胞に分化し；心臓幹細胞は心筋細胞に分化し；肝幹細胞は肝細胞に分化し得る。
【００７３】
誘導細胞をより特化した細胞型に分化させる方法は多く存在する。誘導細胞を分化させる方法は、幹細胞、特にES細胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血幹細胞（HSC）を分化させるのに使用される方法と同様であり得る。いくつかの事例において、分化はエクスビボで行われ；いくつかの事例において、分化はインビボで行われる。
【００７４】
ES細胞から神経幹細胞を生成する任意の公知の方法が、誘導細胞から神経幹細胞を生成するのに使用され得る。例えば、Reubinoff et al., (2001), Nat, Biotechnol., 19(12): 1134-40を参照のこと。例えば、神経幹細胞は、誘導細胞をノギン（noggin）またはその他の骨形成タンパク質アンタゴニストの存在下で凝集浮遊物として培養することによって生成され得る。例えば、Itsykson et al., (2005), Mol, Cell Neurosci., 30(1): 24-36を参照のこと。別の例において、神経幹細胞は、誘導細胞懸濁物を、増殖因子、例えばFGF-2の存在下で凝集物を形成するように培養することによって生成され得る。Zhang et al., (2001), Nat. Biotech., (19): 1129-1133。いくつかの事例において、凝集物は、FGF-2を含有する無血清培地中で培養される。別の例において、誘導細胞は、FGF-2を含有する無血清培地の存在下で、マウスの間質細胞株、例えばPA6と共培養される。さらに別の例において、誘導細胞は、FGF-2を含有する無血清培地に直接移され、直接分化を誘導される。
【００７５】
誘導細胞由来の神経幹細胞は、神経細胞、乏突起膠細胞、または星状膠細胞に分化し得る。多くの場合、神経幹細胞を生成するのに使用される条件は、神経細胞、乏突起膠細胞、または星状膠細胞を生成するのにも使用することができる。
【００７６】
ドーパミン作動性神経細胞は、パーキンソン病およびその他の神経変性疾患において中心的な役割を果たしており、したがって、特に関心対象となる細胞である。ドーパミン作動性神経細胞への分化を促進するために、誘導細胞は、無血清条件下でPA6マウス間質細胞株と共培養される。例えば、Kawasaki et al., (2000) Neuron, 28(1): 3140を参照のこと。他の方法も記載されている。例えば、Pomp et al., (2005), Stem Cells 23(7): 923-30；米国特許第6,395,546号、例えば、Lee et al., (2000), Nature Biotechnol., 18: 675-679を参照のこと。
【００７７】
乏突起膠細胞もまた、誘導細胞から生成され得る。誘導細胞から乏突起膠細胞への分化は、ES細胞または神経幹細胞を乏突起膠細胞に分化させる公知の方法により達成され得る。例えば、乏突起膠細胞は、誘導細胞または神経幹細胞を間質細胞と共培養することにより生成され得る。例えば、Hermann et al. (2004), J Cell Sci. 117(Pt 19): 4411-22。別の例において、乏突起膠細胞は、誘導細胞または神経幹細胞を、インターロイキン（IL)-6受容体またはその誘導体がIL-6サイトカインまたはその誘導体に連結されている融合タンパク質の存在下で培養することにより生成され得る。乏突起膠細胞はまた、当技術分野で公知の他の方法により誘導細胞から生成することができる。例えば、Kang et al., (2007) Stem Cells 25, 419-424を参照のこと。
【００７８】
星状膠細胞もまた、誘導細胞から産生され得る。星状膠細胞は、誘導細胞または神経幹細胞を、bFGFおよびEGFを含有する神経系培地の存在下で培養することにより生成され得る。例えば、Brustle et al., (1999), Science, 285: 754-756を参照のこと。
【００７９】
誘導細胞は、当技術分野で公知の方法により膵臓ベータ細胞に分化され得る。例えば、Lumelsky et al., (2001) Science, 292: 1389-1394; Assady et al., (2001), Diabetes, 50: 1691-1697; D'Amour et al., (2006), Nat. Biotechnol., 24: 1392-1401; D'Amour et al., (2005), Nat. Biotechnol. 23: 1534-1541。この方法は、誘導細胞を、アクチビンAを補充した無血清培地中で培養し、次に、オールトランスレチノイン酸を補充した無血清培地の存在下で培養し、次に、bFGFおよびニコチンアミドを補充した無血清培地の存在下で培養することを含み得る。例えば、Jiang et al., (2007), Cell Res., 4: 333-444。他の例において、この方法は、誘導細胞を、無血清培地、アクチビンA、およびWntタンパク質の存在下で約0.5〜約6日間、例えば約0.5、1、2、3、4、5、6日間培養し；次に、約0.1%〜約2%、例えば0.2% FBSおよびアクチビンAの存在下で約1〜約4日間、例えば約1、2、3、または4日間培養し；次に、2% FBS、FGF-10、およびKAAD-シクロパミン（ケト-N-アミノエチルアミノカプロイルジヒドロシンナモイルシクロパミン）、およびレチノイン酸の存在下で約1〜約5日間、例えば1、2、3、4、または5日間培養し；次に、1% B27、ガンマセクレターゼ阻害剤、およびエクステンジン-4（extendin-4）と共に約1〜約4日間、例えば1、2、3、または4日間培養し；そして最後に、1% B27、エクステンジン-4、IGF-1、およびHGFの存在下で約1〜約4日間、例えば1、2、3、または4日間培養することを含む。
【００８０】
肝臓細胞または肝幹細胞は、誘導細胞から分化され得る。例えば、誘導細胞を酪酸ナトリウムの存在下で培養することで、肝細胞が生成し得る。例えば、Rambhatla et al., (2003), Cell Transplant, 12: 1-11を参照のこと。別の例において、肝細胞は、誘導細胞を無血清培地中、アクチビンAの存在下で培養し、次に、同細胞を線維芽細胞増殖因子4および骨形成タンパク質2の下で培養することにより産生され得る。例えば、Cai et al., (2007), Hepatology, 45(5): 1229-39。例示の態様において、誘導細胞は、誘導細胞をアクチビンAの存在下で約2〜約6日間、例えば約2、約3、約4、約5、または約6日間培養し、次いで、誘導細胞を肝細胞増殖因子（HGF）の存在下で約5日間〜約10日間、例えば約5、約6、約7、約8、約9、または約10日間培養することによって、肝臓細胞または肝幹細胞に分化される。
【００８１】
誘導細胞は、心臓筋細胞にも分化し得る。骨形成タンパク質（BMP）のシグナル伝達の阻害により、心臓筋細胞（または心筋細胞）が生成され得る。例えば、Yuasa et al., (2005), Nat. Biotechnol., 23(5): 607-11を参照のこと。したがって、例示の態様において、誘導細胞は、胚様体の形成の前に、ノギンの存在下で約2〜約6日間、例えば約2、約3、約4、約5、または約6日間培養され、胚様体が約1週間〜約4週間、例えば約1、約2、約3、または約4週間培養される。
【００８２】
他の例において、心筋細胞は、誘導細胞を白血病抑制因子（LIF）の存在下で培養することにより、またはES細胞から心筋細胞を生成する当技術分野で公知の他の方法にそれらを供することにより、生成され得る。例えば、Bader et al., (2000), Circ. Res., 86: 787-794、Kehat et al., (2001), J. Clin. Invest., 108: 407-414; Mummery et al., (2003), Circulation, 107: 2733-2740。
【００８３】
誘導細胞から他の細胞型を生成する方法の例には、（1）脂肪細胞を生成するために、誘導細胞をレチノイン酸、白血病抑制因子（LIF）、甲状腺ホルモン（T3）、およびインスリンの存在下で培養すること、例えば、Dani et al., (1997), J. Cell Sci., 110: 1279-1285；（2）軟骨細胞を生成するために、誘導細胞をBMP-2またはBMP4の存在下で培養すること、例えば、Kramer et al., (2000), Mech. Dev., 92: 193-205：（3）平滑筋を生成する条件下で誘導細胞を培養すること、例えば、Yamashita et al., (2000), Nature, 408: 92-96；（4）ケラチン細胞を生成するために、誘導細胞をベータ-1インテグリンの存在下で培養すること、例えば、Bagutti et al., (1996), Dev. Biol., 179: 184-196；（5）マクロファージを生成するために、誘導細胞をインターロイキン-3（IL-3）およびマクロファージコロニー刺激因子の存在下で培養すること、例えば、Lieschke and Dunn (1995), Exp. Hemat., 23: 328-334；（6）マスト細胞を生成するために、誘導細胞をIL-3および幹細胞因子の存在下で培養すること、例えば、Tsai et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 9186-9190；（7）メラニン細胞を生成するために、誘導細胞をデキサメタゾンおよび間質細胞層、造血幹細胞因子（steel factor）の存在下で培養すること、例えば、Yamane et al., (1999), Dev. Dyn., 216: 450-458；（8）骨芽細胞を生成するために、誘導細胞をデキサメタゾン、レチノイン酸、アスコルビン酸、ベータ-グリセロリン酸の存在下でマウス胎仔骨芽細胞と共培養すること、例えば、Buttery et al., (2001), Tissue Eng., 7: 89-99；（9）骨芽細胞を生成するために、誘導細胞を骨形成因子の存在下で培養すること、例えば、Sottile et al., (2003), Cloning Stem Cells, 5: 149-155；（10）骨格筋細胞を生成するために、誘導細胞中でインスリン様増殖因子2を過剰発現させ、この細胞をジメチルスルホキシドの存在下で培養すること、例えば、Prelle et al., (2000), Biochem. Biophys. Res. Commun., 277: 631-638；（11）誘導細胞を、白血球を生成するための条件に供すること；または（12）造血前駆細胞を生成するために、誘導細胞をBMP4ならびに、SCF、FLT3、IL-3、IL-6およびGCSFの一つまたは複数の存在下で培養すること、例えば、Chadwick et al., (2003), Blood, 102: 906-915、が含まれる。
【００８４】
いくつかの事例において、体細胞の亜集団が精製または単離され得る。いくつかの事例において、所望の細胞型に特異的な一つまたは複数のモノクローナル抗体が細胞集団と共にインキュベートされ、それらに結合した細胞が単離される。他の事例において、所望の細胞亜集団は、細胞型特異的なプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する。
【００８５】
特定の態様において、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ・EGFP融合タンパク質が、細胞型特異的な様式で発現される。その精製方法は、構築物（例えば、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ・EGFP）を細胞型依存的な様式で発現する細胞が濃縮された細胞集団を得るために、細胞を緑色蛍光細胞の選択により選別し、必要に応じてこの選別を繰り返すことを含む。所望の細胞亜集団の選択は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル（HSVtk/GCV）自殺遺伝子システムを有する細胞を増殖する陰性選択または2シストロン性レポーターを発現する細胞の陽性選択によっても達成され得る。例えば、Anderson et al. (2007) Mol. Ther. (11): 2027-2036。
【００８６】
誘導細胞、または誘導細胞から分化した細胞は、疾患（例えば遺伝的欠陥）を処置するための治療として使用され得る。この治療は、その疾患の原因の処置に向けられたものであってもよく；あるいは、この治療は、その疾患または状態の影響を処置するためのものであってもよい。誘導細胞は、対象の損傷部位またはその近傍に移入されてもよく；または、細胞は、同細胞が損傷部位に移動またはホーミングするように、対象に導入することもできる。移入された細胞は、負傷または損傷した細胞と適宜置き換えられ、対象の状態全般を改善し得る。いくつかの場合において、移入された細胞は、組織再生または修復を刺激し得る。
【００８７】
移入される細胞は、誘導細胞から分化した細胞であり得る。移入される細胞はまた、誘導細胞から分化した複能性幹細胞であり得る。いくつかの事例において、移入される細胞は、分化していない誘導細胞であり得る。
【００８８】
対象に対する処置の施行回数は様々であり得る。対象への誘導細胞および／または分化細胞の導入は一回のイベントであり得るが；特定の状況において、そのような処置は、限られた期間改善をもたらし、継続的な処置の繰り返しを必要とし得る。他の状況において、効果が確認される前に複数回の細胞の投与が必要とされ得る。厳密なプロトコルは、疾患または状態、その疾患の段階および処置される個々の対象のパラメーターに依存する。
【００８９】
細胞は、以下の経路のいずれかを通じて対象に導入され得る：非経口、静脈内、動脈内、筋内、皮下、経皮、気管内、腹腔内または髄液内。
【００９０】
誘導細胞は、細胞に分化され、次いで、広範な疾患または障害に罹患した対象に移入され得る。神経学的疾患または障害に罹患した対象は、特に幹細胞治療からの利益を享受することができる。いくつかのアプローチにおいて、誘導細胞は、神経学的状態、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷、またはその他の中枢神経系障害を処置するために、神経幹細胞または神経細胞に分化され、次いで損傷部位に移植され得る。例えば、Morizane et al., (2008), Cell Tissue Res., 331(1): 323-326; Coutts and Keirstead (2008), Exp. Neurol., 209(2): 368-377; Goswami and Rao (2007), Drugs, 10(10): 713-719を参照のこと。
【００９１】
パーキンソン病の処置のために、誘導細胞は、ドーパミン作動性神経細胞に分化され、次いでパーキンソン病の対象の線条体に移植され得る。多発性硬化症の処置のために、神経幹細胞は、乏突起膠細胞または乏突起膠細胞の前駆体に分化され、次いでMSを罹患した対象に移入され得る。
【００９２】
あらゆる神経学的疾患または障害の処置において、成功可能性の高いアプローチは、対象に神経幹細胞を導入することであり得る。例えば、アルツハイマー病、脳梗塞または脊髄損傷を処置するために、誘導細胞は、神経幹細胞に分化された後、損傷部位に移植され得る。誘導細胞はまた、脳および脊髄の修復のためにそれらを病変部へ移動させる指令に応答するよう操作され得る。例えば、Chen et al., (2007), Stem Cell Rev., 3(4): 280-288。
【００９３】
神経学的障害以外の疾患もまた、誘導細胞から分化した細胞、例えば誘導された複能性幹細胞または多能性幹細胞を使用する幹細胞治療により処置され得る。変性心疾患、例えば虚血性心筋症、伝導疾患および先天性欠損は、幹細胞治療からの利益を享受することができる。例えば、Janssens et al., (2006), Lancet, 367: 113-121を参照のこと。
【００９４】
膵島細胞（またはランゲルハンス島の初代細胞）は、糖尿病（例えば真性糖尿病、1型）に罹患した対象に移植され得る。例えば、Burns et al., (2006) Curr. Stem Cell Res. Ther., 2: 255-266を参照のこと。いくつかの態様において、誘導細胞由来の膵臓ベータ細胞が、糖尿病（例えば真性糖尿病、1型）に罹患した対象に移植され得る。
【００９５】
他の例において、誘導細胞由来の肝臓細胞または肝幹細胞は、肝疾患、例えば、肝炎、肝硬変、または肝不全に罹患した対象に移植される。
【００９６】
誘導細胞由来の造血細胞または造血幹細胞（HSC）は、血液の癌、またはその他の血液もしくは免疫障害に罹患した対象に移植され得る。造血細胞またはHSCにより処置される可能性のある血液の癌の例には、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキン病、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫が含まれる。多くの場合、このような疾患に罹患した対象は、高速に分裂する血球を殺すために放射線処置および／または化学療法処置を受けなければならない。これらの対象への誘導細胞由来HSCの導入は、空となった細胞貯蔵庫を最充填する助けになり得る。
【００９７】
いくつかの事例において、誘導細胞由来の造血細胞またはHSCは、癌と直接戦うためにも使用され得る。例えば、同種HSCの移植は、腎臓癌の処置に有望であることが示されている。例えば、Childs et al., (2000), N. Engl. J. Med., 343: 750-758を参照のこと。いくつかの態様において、誘導細胞由来の同種HSCが、または自己HSCすらも、腎臓または他の癌を処置するために対象に導入され得る。
【００９８】
誘導細胞由来の造血細胞またはHSCはまた、血球以外の細胞または組織、例えば、筋肉、血管または骨を生成または修復するために対象に導入され得る。このような処置は、多くの障害に対して有用であり得る。
【００９９】
いくつかの事例において、誘導細胞は、免疫不全動物、例えば、SCIDマウスに移入され、分化するよう導かれる。移植した細胞は、分化細胞型と腫瘍細胞の混合物を形成し得る。関心対象の特定の分化細胞型は、系統特異的マーカーの利用により、例えば、蛍光標識細胞分取法（FACS）もしくはその他の選別法、例えば、磁気細胞分離法（MACS）により、腫瘍細胞から選択および精製され得る。この分化細胞は、その後、疾患または状態を処置するために、対象（例えば、自己対象、HLA適合対象）に移植され得る。疾患または状態は、造血障害、内分泌欠損、神経変性障害、脱毛、またはその他の本明細書に記載される疾患もしくは状態であり得る。
【０１００】
iPS細胞は、任意の生理学的に許容できる培地と共に投与され得る。それらは単独で提供されることもあるし、または、例えばそれらが移植される組織内でのそれらの増殖および／または組織化を補助する適当な基質またはマトリックスと共に提供されることもある。通常、少なくとも1×105個の細胞が、好ましくは1×106個またはそれ以上が投与される。細胞は、注射、カテーテル等により導入され得る。細胞は液体窒素温度で凍結され、解凍により使用できる状態で長期間保存され得る。凍結される場合、細胞は通常、10% DMSO、50% FCS、40% RPMI 1640培地中で保存される。解凍後、細胞は、前駆細胞の増殖および分化に関連する増殖因子および／または間質細胞の使用により拡張され得る。
【０１０１】
本明細書に記載される本発明のSSEA3+体細胞を差次的に同定するのに十分な染色試薬を含むキットが提供され得る。関心対象の組み合わせは、本発明のマーカーまたはマーカーの組み合わせに特異的な一つまたは複数の試薬を含み得、さらに、本発明のSSEA3+細胞の指標となる他のタンパク質、例えばNanogに特異的な染色試薬を含み得る。染色試薬は、好ましくは抗体であり、これは検出可能なように標識され得る。キットはまた、チューブ、バッファー等、および使用説明書を含み得る。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および解説を提供するために記述するものであり、本発明者らが発明とみなしている範囲を限定することは意図しておらず、以下の実験が実施した全てまたは唯一の実験であることを表明することも意図していない。使用した数値（例えば、量、温度等）に関しては精度の確保に努めているものの、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。そうでないことが示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧は大気圧または大気圧付近である。
【０１０３】
材料および方法
初代成人皮膚線維芽細胞（HUF）細胞株の単離。9つの初代成人皮膚線維芽細胞（HUF）株を本研究で誘導し使用した。参加者の性別および年齢は以下の通りであった：HUF1  男性  28、HUF2  男性  62、HUF3  女性  30、HUF4  男性  42、HUF5  女性  46、HUF6  女性  60、HUF7  男性  35、HUF8  男性  45、およびHUF9  女性  31。これらの体細胞の誘導およびその後のiPSC生成についての承認はStanford University Institutional Review BoardおよびStanford University Stem Cell Research Oversight Committeeから受け、参加者各個人からインフォームドコンセントを得た。各HUF株の誘導については、Stanford University Dermatology Clinicの皮膚科専門医が成人ドナーから同意を得、内腕4mmの皮膚のパンチ生検を得た。
【０１０４】
皮膚生検を、Ca/Mg非含有のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA）で洗浄し、約12個の小片に切り刻んだ後、10%ウシ胎仔血清（FBS, Invitrogen）および100IU/mlペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）からなるマウス胚性線維芽細胞（MEF）培地を含有するゼラチンコート6ウェル細胞培養プレート（Corning Enterprises, Corning, NY）に播種し、37℃の5% CO2インキュベーター内で培養した。培養培地は、生検の接着が観察される（通常第4〜6日）までは、2日毎に一部を交換し、次いで、その後は2日毎に全部を交換した。線維芽細胞の移動があった（通常第10〜12日）後、接着している生検細片および結合している上皮細胞を手作業で除去し、その線維芽細胞を80〜90%コンフルエンスになるまで拡張した。この初代培養物を、0.05%トリプシン・EDTA（Invitrogen）への短時間の曝露を介して継代し、新鮮な培養培地を含むゼラチンコート175cmフラスコに播種した。これらの体細胞を、90%コンフルエンスに達するまで培養し、次いで、10%ジメチルスルホキシド（DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, http://www.sigmaaldrich.com）を補充したMEF培地中で凍結させた。
【０１０５】
細胞培養。HUF細胞は、10% FBS（Invitrogen）および100IU/mlペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したDMEM（Invitrogen）からなるMEF培地中で増殖させた。細胞が約80〜90%コンフルエンスに達した場合、それらを0.05%トリプシン・EDTA（Invitrogen）で軽く処理し、新しい培養皿に1:3の比率で分割した。ヒト誘導多能性幹細胞（iPS細胞）およびH9ヒト胚性幹細胞（hESC）は、20% Knockout Serum Replacer（KSR, Invitrogen）、2mM L-グルタミン（Invitrogen）、0.1mM非必須アミノ酸（Invitrogen）、0.1mMβ-メルカプトエタノール（Millipore, Billerica, MA, http://www.chemicon.com）、100IU/mlペニシリン・ストレプトマイシンおよび10ng/ml組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（β-FGF, Invitrogen）を補充したDMEM/F12からなるhESC培地中で維持した。継代については、ホッケースタイル（半ループ）に改造したガラスピペットチップを用いることで、個々のコロニーの切り取りおよびプレートからの掻き取りを同時に行い、新鮮なhESC培地を含有するマイトマイシンC（Sigma）不活性化MEF播種培養皿に移した。本研究におけるすべての調査は、National Academy of Sciencesのガイドラインに準拠するものであった。
【０１０６】
共焦点像。共焦点像は、Zeiss LSM510 Metaレーザースキャン共焦点顕微鏡（Carl Zeiss, Jena, Germany）およびZeiss 63' Plan-Apochromat対物レンズ（NA 1.4）を用いて取得した。DAPIについては、励起は405nmで行い、420〜480nm帯域フィルターを使用した。Alexa488については、励起は488nmで行い、505〜530nm帯域フィルターを使用した。両方の検出装置のピンホールを１Airy単位に設定した。サンプリングは、0.095μm/ピクセル、ピクセルあたり12ビットおよび2.18μsのピクセル滞留時間で行った。
【０１０７】
SSEA3生細胞の染色およびFACS細胞選別。約一千万個のHUF1細胞を、0.05%トリプシン・EDTA（Invitrogen）への5分間の曝露を通じてトリプシン処理し、トリプシンを不活性化させるためにMEF培地に曝露し、次いで、氷冷PBS＋2%ヤギ血清（PBS-G）で2回洗浄した。一回目の洗浄後、細胞を40マイクロメートルフィルターに通すことで細胞集塊を除去した。各洗浄において、細胞を5分間、80gで遠心分離し、その上清を取り除き、細胞を氷冷PBS-G中に穏やかに再懸濁した。洗浄後、細胞を、1.5mlエッペンドルフチューブ内で、1:100 SSEA3抗体（Millipore, mab4303）を含有する1mlの氷冷PBS-G中に再懸濁し、穏やかに振盪しながら4℃の暗所で45分間インキュベートした。一次抗体の結合後、細胞を氷冷PBS-Gで3回洗浄し、次いで、1.5mlエッペンドルフチューブ内で、1:200 Alexa 488結合ヤギ抗ラットIgM（Invitrogen, A21212）を含有する1mlの氷冷PBS-G中に再懸濁し、穏やかに振盪しながら4℃の暗所で45分間インキュベートした。二次抗体の結合後、細胞を氷冷PBS-Gで3回洗浄し、次いで2mlの氷冷PBS-G中に再懸濁し、再度、40マイクロメートルフィルターに通し、その後直ちにFACSAriaセルソーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）での青色レーザー励起（488nm）により分析および選別した。データを分析し、ダブレット除外ゲーティングを行い、関連する集団をBD FACSDivaソフトウェア（BD Biosciences）を用いて選別した。SSEA3発現に関して上位10%内でゲートした細胞を「SSEA3陽性」集団に選別し、SSEA3発現に関して下位10%内でゲートした細胞を「SSEA3陰性」集団に選別した。両方の集団とも、レトロウイルスの形質導入前に3日間、接着、増殖および回復させた。免疫蛍光分析に使用する細胞は、死細胞および非生存細胞を除去するために、一晩の接着後直ちに固定し、転写分析に使用する細胞は、分析前に6日間培養した。
【０１０８】
レトロウイルスの産生、感染およびiPSCの生成。以下のプラスミドをAddgeneから入手した：pMXs-hOCT3/4(17217)、pMXs-hSOX2(17218)、pMXs-hKLF4(17219) 、pMXs-hc-MYC(17220) 、pUMVC(8449)、およびpVSV-G(8454)(Addgene Inc., Cambridge, MA, USA)。293FT細胞（Invitrogen）は、0.5mg/ml Geneticin（Invitrogen）を補充したMEF培地中で維持し、トランスフェクション前に90〜95%コンフルエンスに達するまで培養した。トランスフェクションの1日前に、新鮮な抗生物質非含有の培養培地を細胞に添加した。各175cmフラスコにおいて、形質導入遺伝子（OCT4、SOX2、KLF4、またはcMYC）を保有する10μgのプラスミドDNAと共に10μgのエンベローププラスミドpVSV-Gおよび15μgのパッケージングプラスミドpUMVCを用いて293FT細胞のトランスフェクションを行った。120ulのLipofectamine 2000（Invitrogen）および15mlのopti-MEM（Invitrogen）によってトランスフェクションを6時間促進させ、次いで抗生物質を含まない18mlの新鮮なMEF培地に交換した。2日後、ウイルス上清を、遠心およびMillex-HV 0.45umフィルターユニット（Millipore）によるろ過により回収した。そのウイルス上清を、20℃で2.5時間の17,000RPMの超遠心分離（Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA, http://www.beckman.com）により100xまで濃縮し、その後、4℃で一晩、MEF培地中に再懸濁した。これらの100x濃縮ウイルスストックをそのまま使用するか、-80℃で小分けして凍結させた。
【０１０９】
形質導入の一日前、HUF1細胞を、ゼラチンコート6ウェルプレートにウェルあたり105個の細胞となるよう播種した。翌日（第0日とする）、濃縮レトロウイルス上清を解凍し、20x OCT4、10x SOX2、10x KLF4、10x cMYCの比で混合し、新鮮なMEF培地を2ml量（ウェルあたり）までおよび8ng/mlポリプレンを補充し、次いで、37℃および5% CO2下でHUF1細胞に曝露した。24時間後に（第1日に）、ウイルス上清混合液を取り除き、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、新鮮なMEF培地中で培養した。第2日に、2回目の形質導入を同じウイルス濃度で行った。第3日に、再度、ウイルス上清混合液を取り除き、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、新鮮なMEF培地中で培養した。形質導入5日後（第5日）、細胞をトリプシンと再懸濁し、計数し、放射線照射したMEFフィーダーを事前に蒔いておいた10cm培養皿に播種した。生物学的複製物あたり105個の形質導入HUF1細胞を播種した。一晩のインキュベーションの後、MEF培地をhESC培地に交換し、その後、必要に応じて、この培地を毎日または一日おきに取り換えた。hESC様コロニーは、形質導入の14日後あたりから、バックグラウンドコロニーの間で見られ始めた。第21日に、このコロニーを手作業で掻き取り、MEFフィーダーを事前に蒔いておいた12または6ウェルプレートに移した。拡張を続けそれらのhESC様形態を維持するコロニーをさらに継代し；拡張および／または自発的な分化をしないコロニーは廃棄した。
【０１１０】
アルカリホスファターゼ染色および免疫蛍光。アルカリホスファターゼ（AP）染色は、Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を製造元のプロトコルに従い用い、室温の暗室内で30分間行った。免疫蛍光については、細胞を4%パラホルムアルデヒド／PBSで20分間固定し、PBSで2回洗浄し、PBS中4%ヤギ血清で30分間ブロックした。すべての手順を室温で行った。Nanog染色については、ブロッキング前に、細胞を室温で1時間、1% Triton-X100で透過処理した。その後、一次抗体をPBSに添加し、穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートした。その次の日に、細胞をPBSで洗浄した後、蛍光剤結合二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで3回リンスし、DAPIを使用して核を標識した。以下の一次抗体およびそれらの希釈物を使用した：SSEA3（1:200, IgM, Millipore, mab4303）、SSEA4（1:200, IgG, Millipore, mab4304)、TRA1-60（1:200, IgM, Millipore, mab4360）、TRA1-81（1:200, IgM, Millipore, mab4381）、Nanog（1:100, IgG, Abcam, Cambridge, MA, USA, ab21603）。使用した二次抗体は以下のものであった：Alexa 594結合ヤギ抗ラットIgM（1:500, Invitrogen, A21213）、Alexa 488結合ヤギ抗ラットIgM（1:500, Invitrogen, A21212）、Alexa 488結合ヤギ抗マウスIgM（1:500, Invitrogen, A21042）、Alexa 488結合ヤギ抗マウスIgG（1:500, Invitrogen, A11001）、Alexa 594結合ヤギ抗ウサギIgG（1:500, Invitrogen, A11012）。
【０１１１】
核型決定。スペクトル核型決定（SKY）を以前に公開されたプロトコルに従い実施した（Nguyen HN and Reijo Pera R. (2008) Cold Spring Harb. Protoc. 5047）。簡潔に述べると、細胞を0.03ug/ml KARYOMAX（登録商標）COLCEMID（登録商標）Solution（Invitrogen）で一晩処理し、次いで、細胞を再懸濁するために37℃で5分間0.05%トリプシン（Invitrogen）で処理した。トリプシンは、10% FBSを含有するDMEM培地を添加することによって不活性化した。事前に温めておいた、等量の0.4%塩化カリウムおよび0.4%クエン酸ナトリウムを含有する低張液をゆっくりと細胞に添加し、37℃で7分間、膨張を進行させた。カルノア溶液（メタノール：氷酢酸、3:1比）を使用して30分間細胞を固定した。次いで、細胞を、プレクリーンスライド（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA）に滴下し、位相差顕微鏡によりメタフェーズスプレッドの状態を測定した。室温で数日間のエイジングの後、スライドを、37℃の加湿チャンバー中で2日間、ヒト染色体用SKYPAINT（商標）DNAキット（Applied Spectral Imaging, Vista, CA, USA）のプローブとハイブリダイズさせた。SkyViewスペクトルイメージングシステム（Applied Spectral Imaging）を用いて、染色したメタフェーズスプレッドを可視化し分析した。
【０１１２】
拍動性心筋細胞へのインビトロ分化。胚様体形成のために、iPS細胞を、DMEM + 20% FBSを含有する超低接着プレート（Corning）に播種した。懸濁状態で8日間増殖させた後、細胞凝集物を、同じ培地を含むゼラチンコート培養皿に移し、細胞を接着させた。培地は、3週間目までまたは拍動性心筋細胞が観察されるまで、2〜3日毎に取り換えた。
【０１１３】
奇形腫アッセイ。各移植片につき、約106個のiPS細胞を手作業で収集し、洗浄し、300ulのhESC培地を含む1.5mlチューブに再懸濁し、次いで、雌SCIDマウス（Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA, USA）に皮下注射した。移植4〜8週後の任意の目に見える腫瘍を切り出し、4%パラホルムアルデヒド／PBS溶液で一晩固定した。次いで、この組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、3つの胚葉すべての代表的組織の存在について試験した。
【０１１４】
RNA抽出およびリアルタイムPCR分析。RNeasy Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）を製造元の説明書に従い用いて総RNAを精製した。500ngのRNAを、Superscript III（Invitrogen）およびランダムヘキサマーによる逆転写に使用した。各試料由来の1.25μlのcDNAを、5μlのCells Direct 2Xリアクションミックス（Invitrogen）、2.5μlの0.2X PPPミックス（48genes, Taqman/ Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA）、0.5μlのPlatinum Taq（Invitrogen）および0.75μlのTE Bufferからなるマスターミックスと混合した。この反応物を、サーモサイクラー（Applied Biosystems）を用いて以下の条件下で予備増幅した：95℃、10分を1サイクルならびに95℃、15秒および60℃、4分を14サイクル。次に、この反応物を、終濃度20μlとなるようTEバッファーで希釈した。2.25μlの予備増幅産物を、Biomark Fluidigmシステム（Fluidigm Corporation, San Francisco, CA, USA）を製造元の推奨に従い用いる後半のリアルタイムPCR分析に使用した。各試料および遺伝子のCt値を、qBasePlus（Biogazelle, Zulte, Belgium）により、GAPDH、RPLPOおよびCTNNB1に対して正規化した。各試料の遺伝子発現レベルを、3つの異なるHUF1亜集団（SSEA3陰性、SSEA3中間、およびSSEA3陽性）ごとにその遺伝子の全体平均と比較し、相対遺伝子発現値を得た。
【０１１５】
統計的分析。分散分析（ANOVA）による統計的比較は、Statviewソフトウェア（SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA）を用い、統計的有意性を0.05に設定して実施した。
【０１１６】
結果
本発明者らは、健常な成人男性（HUF1）由来の皮膚生検から線維芽細胞株を誘導し（図1A）、免疫組織化学を使用して、多能性幹細胞と通常関連している細胞表面マーカーの発現の特徴づけを行った（図1B、CおよびD）。本発明者らは予期せず、リプログラミングの前でさえも、HUF1細胞集団が、ステージ特異的胚抗原3（SSEA3；図1B）の発現について異種性の細胞を含んでいることを確認した。SSEA3は、一般に胚性／多能性マーカーと考えられている細胞表面スフィンゴ糖脂質である（Kannagi R, et al. (1983) Embo J. 2: 2355-2361; Enver T, et al. (2005) Human Molecular Genetics 14: 3129-3140）。位相差画像とSSEA3免疫蛍光画像の重ね合わせにより、SSEA3発現が細胞表面全体で検出されることが明らかとなり（図1E）、共焦点顕微鏡を使用することにより、本発明者らは、SSEA3発現が、主として細胞膜に局在していることを確認した（図1F）。核周囲領域付近でもさらなる小規模かつ限局的なSSEA3蛍光領域が検出されたが、これは、核周囲の小胞体および／またはゴルジ体におけるSSEA3の細胞内プロセシングおよびパッケージングを反映していると考えられる（図1F）。注目すべきは、陽性対照では、H9ヒト胚性幹細胞（hESC）において強いSSEA3の細胞表面発現が確認され（図1G）、陰性対照では発現が確認されなかった（図1H）ことである。
【０１１７】
本発明者らは次に、線維芽細胞の一つのサブセットにおけるSSEA3の発現がHUF1特異的なものなのかそれともより一般的な観察なのかについてを試験した。8つの追加の初代成人線維芽細胞株を皮膚生検から誘導し、免疫染色した。本発明者らは、8つの株すべてがSSEA3陽性の細胞亜集団を含んでいることを確認した（図2A）。SSEA3/488抗体複合体で染色したHUF1細胞の蛍光標識細胞分取（FACS）分析は、細胞の大亜集団がSSEA3発現をほとんどまたは全く示さず、小亜集団が検出可能なSSEA3発現を示すことを明らかにした（図2B）。その後、本発明者らは、SSEA3/488蛍光細胞の上位10%および下位10%をそれぞれ本発明者らのSSEA3陽性集団および陰性集団として（FACSを通じて）単離し、培養した（図2B）。非生存細胞の分析を排除するために一晩接着を行った後の、この2つの集団の免疫蛍光分析は、SSEA3陽性集団の>97%が検出可能なSSEA3/488蛍光を発し、SSEA3陰性集団の0%が検出可能なSSEA3/488蛍光を発することを明らかにし（図2C）、これにより、蛍光標識細胞分取プロセスが異種性の体細胞集団から生存細胞の亜集団を精製できることが実証された。これらの亜集団はその後、iPS細胞へのリプログラミングに使用した。
【０１１８】
これまでのリプログラミング研究は、本発明者らが、OCT4、SOX2、KLF4、およびcMYCを発現するレトロウイルスベクターを使用して未選別のHUF1体細胞集団全体をリプログラムし、対照のH9 ESCと同じ多能性マーカーを発現するiPS細胞を生成できることを実証していた（図3A）。リプログラムされた細胞は、正常な核型を有し（図3B）、インビトロで拍動性心筋細胞およびインビボで3つの胚葉すべての代表的組織に分化した（図3C）。
【０１１９】
本発明者らは、本発明者らのSSEA3陽性およびSSEA3陰性集団に、同一実験条件下で同一レトロウイルスベクターを形質導入し、形質導入細胞を不活性化マウス胚性線維芽細胞（MEF）上に播種した。標準的なhESC条件下での3週間の培養後、3名の独立したhESC生物学者による二重盲検分析により、プレートをiPSCコロニー形成について試験した。iPSCの形態を有するコロニーを掻き取り、拡張した。本発明者らは、形質導入SSEA3陰性細胞は多くの大きなバックグラウンドコロニーを形成した（複製物あたり10〜27個、図4A）がiPSCコロニーは生じなかった点で3名の生物学者全員が一致し；対照的に、形質導入SSEA3陽性細胞はiPSCコロニーを形成した（複製物あたり4〜5個、図4B）が大バックグラウンドコロニーはほとんど形成しなかった（複製物あたり0〜1個、表1）点で3名の生物学者全員が一致したことを確認した。iPSC様コロニーに由来する細胞株のさらなる特徴づけは、それらがhESC様形態を有し、核・細胞質比が大きく、輪郭が明瞭であり、核が目立つ平らなコロニーとして増殖することを明らかにした（図4C）。
【０１２０】
5株をさらに拡張し特徴づけたところ、そのすべてが、アルカリホスファターゼ、Nanog、SSEA3、SSEA4、TRA160およびTRA181を含む、hESCにより発現される重要な多能性マーカーの発現を示した（図5A）。SSEA3で選択したiPS細胞はまた、正常な男性の核型（46、XY）（図5B）、機能的な拍動性心筋細胞への分化能力およびインビボでの3つの胚葉すべての代表的組織への分化能力を示した（図5C）。最も重要なことは、本発明者らは、形質導入されたSSEA3陰性細胞からのiPSCコロニー形成またはiPSC株誘導を確認しておらず、このことは、これらの細胞が、SSEA3発現細胞に対して有意に低いリプログラム潜在能力を有しているかまたはその能力を持ってすらいないことを示唆している、ということである（表1）。さらに、SSEA3を強く発現する初代線維芽細胞の10倍濃縮物は、対照誘導率と比較して有意に高いiPSC株誘導効率（8倍増加）を示した（p<0.05、表1）。
【０１２１】
（表１）SSEA3で選別した初代皮膚線維芽細胞からのヒトiPS細胞の誘導
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*対照誘導に対する百分率として計算した。
**HiPS-2E株は増殖不調を示したため、これを含めなかった。
各生物学的複製物は、MEFを含む10cm培養皿に播種しhESC培地で3週間培養した100,000個の形質導入細胞を表す。
【０１２２】
本発明者らは次に、SSEA3陽性集団に高いリプログラミング性を付与している可能性のある、Nanog（Silva J, et al. (2006) Nature 441: 997-1001）、Sall4（Wong CC, et al. (2008) PLoS ONE 3: e1955）およびhTert（Park IH, et al. (2008) Nature 451: 141-146）を含む遺伝子ならびにいくつかの対照ハウスキーピング遺伝子（Gapdh、RplpoおよびCtnnb1）の発現を試験した。本発明者らは、SSEA3発現細胞の上位10%および下位10%に相当する、それぞれ、SSEA3陽性および陰性の細胞集団に加えて、全HUF1細胞集団の残りの80%に相当する中間のSSEA3発現細胞も含めた。3つの亜集団の各々について3つの生物学的複製物を分析した。この分析は、Sall4、hTertまたはハウスキーピング遺伝子については遺伝子発現に有意差がみられなかったが（図6および表2）、Nanogの発現が、SSEA3陽性細胞集団において、SSEA3中間集団またはSSEA3陰性集団のいずれと比較しても有意に高い（p<0.05）ことを明らかにした（図6および表2）。
【０１２３】
（表２）SSEA3陽性および陰性のHUF1細胞の転写分析
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細胞をSSEA3に関して選別し、6日間の培養後に3つの集団を分析した。
細胞をトリプシン処理し、RNAを抽出し、cDNAを作製し、透過処理し、フリューダイム分析した。
CTNNB1、GAPDHおよびRPLPOを用いた正規化を通じて、較正正規化相対量（CNRQ）の遺伝子発現レベルを得た。
SSEA3陽性生物学的複製物（Rep）は、SSEA3発現細胞の上位10%から得た。
SSEA3中間複製物は、SSEA3中間集団から得た。
SSEA3陰性生物学的複製物は、SSEA3発現細胞の下位10%から得た。
HiPS1A-SSEA3選択試料は、SSEA3陽性HUF1細胞に由来するヒトiPS細胞を表す。
HiPS1-対照試料は、未選別のHUF1細胞に由来するヒトiPS細胞を表す。
【０１２４】
考察
本研究で、本発明者らは予期せず、通常は多能性細胞に関連している細胞表面マーカーであるSSEA3が、初代ヒト皮膚線維芽細胞生検由来の細胞亜集団において強く発現されることを確認した。SSEA3陽性細胞は、形態学的には、SSEA3陰性線維芽細胞から識別できないようであった（図2C）。SSEA3抗原の発現は、他の複能性幹細胞、例えば成体の間葉系幹細胞または表皮幹細胞のマーカーとはみなされていない（Deans RJ and Moseley AB. (2000) Exp Hematol 28: 875-884; Lavker RM and Sun TT. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 13473-13475）。
【０１２５】
いくつかの最近の研究は、ヒトiPS細胞が、リプログラムされる細胞のクロマチンへの遺伝的因子の恒久的組み込みを行わなくとも生成できることを実証している（Kim D, et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 472-476; Soldner F, et al. (2009) Cell 136: 964-977; Kaji K, Norrby K, Paca A, et al. (2009) Nature 458: 771-775; Woltjen K, et al. (2009) Nature 458: 766-770; Yu J, et al. (2009) Science 324: 797-801）。これらの組み込みを伴わないヒトiPS細胞は、将来の患者特異的な細胞治療に大きな期待を抱かせるものである（Byrne JA. (2008) Human Mol. Gen. 17: R37-41）が、そのリプログラミング効率は一般に非常に低い。リプログラミング効率を向上させる方法、特に、リプログラムするのが困難な細胞型、例えば、本研究で使用した初代成人線維芽細胞に対する方法は、このアプローチの実現性を大いに高めると考えられる。本発明者らの、HUF1株を用いた対照iPSC株の誘導効率は非常に低く、200,000細胞からわずか1個のiPSC株の誘導であった。しかし、本研究において、本発明者らは、上位のSSEA3発現細胞の10倍精製が、未選別の細胞に対して8倍およびSSEA陰性細胞に対してはそれよりずっと大きく、リプログラミング効率を上昇させることができることを実証した。実際、本発明者らは、高いリプログラミング効率を有する細胞集団の同定に加えて、有意に低いリプログラミング効率を有するまたはリプログラミング能力を有さないSSEA3陰性集団も同定した。SSEA3陽性集団と陰性集団の間の比較分析は、現時点では理解の乏しいリプログラミングのメカニズムを我々が解明するのに役立つと考えられる。
【０１２６】
本発明者らの、SSEA3陽性集団および陰性集団の転写分析は、SSEA3陽性集団における有意に高いNanogの発現を明らかにした（p<0.05）。高いNanog発現はリプログラミング効率を向上させることが実証されており（Silva J, et al. (2006) Nature 441: 997-1001）、このことは、Nanogが、確認された差次的なリプログラミングにおいて役割を果たしていることを示唆している。しかし、hESCおよび完全にリプログラムされたiPS細胞におけるNanog発現のレベルは、SSEA3発現HUF1細胞の数千倍であり、そのため、他の因子もまた、確認された差次的なリプログラミングにおいて役割を果たしている可能性があることに留意されるべきである。将来の、網羅的な転写プロファイリングおよびエピジェネティックプロファイリングを用いた研究が、SSEA3陽性亜集団と陰性亜集団の間の相違点のさらなる同定を支援するはずであり、リプログラミングのメカニズムの解明の手助けとなり得る。
【０１２７】
まとめ
まとめると、本発明者らは、多能性マーカーSSEA3を発現するヒト皮膚線維芽細胞の亜集団の同定および単離について報告し、本発明者らは、これらのSSEA3発現細胞からの高いiPS細胞生成効率を実証し、非SSEA3発現細胞からはiPSCが生成されないことを確認し、そして、本発明者らは、SSEA3発現線維芽細胞における有意に高いNanog発現を明らかにし、これにより、差次的なリプログラミングについての考えられるメカニズムの説明を提案した。ヒト皮膚線維芽細胞の異種性集団において多能性マーカーを同定し、多能性にリプログラムされる傾向が有意に高い細胞亜集団を単離し、かつ、その差次的なリプログラミングを説明するメカニズムを特定したのは、本研究が初めてである。
【０１２８】
ここまで解説してきたのは、本発明の原理にすぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載または表示されていないとしても、本発明の原理を具現化しその精神および範囲に包含される様々な改変物を考案できるであろうことを理解されたい。さらに、本明細書に示されたすべての実施例および条件付き言い回しの主意は、読み手が本発明の原理および本発明者らにより提供される当技術分野の発展のための構想を理解する手助けとされることであり、そのような具体的に示された実施例および条件への限定を意味しないものと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、局面および態様ならびにその特定の実施例を示す本明細書中のすべての記載は、それらの構造的等価物および機能的等価物の両方を包含することが意図されている。さらに、そのような等価物には、現時点で知られている等価物および将来開発される等価物、すなわち、構造によらず同じ機能を発揮するよう開発される任意の要素、の両方が含まれることが意図されている。したがって本発明の範囲は、本明細書に示され記載された例示の態様に限定されることは意図されていない。そうではなく、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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