(57)【要約】  本発明は、好中性細胞のアポトーシスをモデュレーションする化合物に関する。特に、本発明は、好中球依存性炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と、好中性細胞中の細胞質ＰＣＮＡと結合しているタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物に関する。本発明はまた、好中球依存性炎症過程の処置において使用するための化合物の同定法にも関する。本発明はさらに、好中球減少症の処置において使用するためのペプチドに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と、ＰＣＮＡと結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物。
【請求項２】
前記化合物が、ＰＣＮＡのドメイン間接続ループにおけるＰＣＮＡとＰＣＮＡに結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する、請求項１記載の使用のための化合物。
【請求項３】
前記化合物がペプチドである、請求項１または２記載の使用のための化合物。
【請求項４】
前記化合物が、
ａ）配列番号３または２３からなるアミノ酸配列；
ｂ）タグに融合した配列番号３または２３からなるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１、配列番号１２または配列番号２４からなるアミノ酸配列；
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列に相同であり、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの前記配列と少なくとも８０％の同一性を提示する、配列；および
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列の少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項５】
炎症過程を含む疾病が、好中性細胞によって媒介される、請求項１〜４のいずれか記載の使用のための化合物。
【請求項６】
炎症過程を含む疾病が、心虚血、細菌性心内膜炎、化膿性心膜炎、結節性多発動脈炎、川崎病、白血球破壊性血管炎、顕微鏡的多発血管炎、細菌性血管腫症、成人呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、気管支肺炎、潰瘍、クローン病、火傷、急性痛風、偽痛風、感染性関節炎、血清反応陰性脊椎関節炎、リウマチ様多発性関節炎、若年性関節炎、骨関節炎および移植片拒絶からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項７】
前記化合物が、好中性細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１〜６のいずれか記載の使用のための化合物。
【請求項８】
好中球減少症の処置における使用のための、ＰＣＮＡのカルボキシ末端領域またはその少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントを含むペプチドであって、前記のＰＣＮＡのカルボキシ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２４９〜２６１からなる、前記ペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、
ａ）配列番号７からなるアミノ酸配列；
ｂ）タグに融合した配列番号７からなるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１６または配列番号１７からなるアミノ酸配列；
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列に相同であり、そして（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの前記配列と少なくとも８０％の同一性を提示する、配列；および
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列の少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含む、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、好中性細胞のアポトーシスを防ぐ、請求項８または９記載のペプチド。
【請求項１１】
ａ）配列番号３または７からなるアミノ酸配列；
ｂ）タグに融合した配列番号３または７からなるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６または配列番号１７からなるアミノ酸配列；
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列に相同であり、そして（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの前記配列と少なくとも８０％の同一性を提示する、配列；および
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列の少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に定義したようなペプチドおよび１つ以上の生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１３】
ａ）候補化合物を、ＰＣＮＡおよびＰＣＮＡと結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドと接触させる工程、
ｂ）候補化合物の存在下および非存在下において、ＰＣＮＡと結合しやすい前記の少なくとも１つのポリペプチドに結合したＰＣＮＡの量を比較する工程；および
ｃ）ＰＣＮＡに結合しやすい前記の少なくとも１つのポリペプチドに結合したＰＣＮＡの量が、前記候補化合物の非存在下よりも前記候補化合物の存在下の方が低いならば、前記候補化合物を選択する工程
を含む、好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物の同定のための方法。
【請求項１４】
ＰＣＮＡに結合しやすいタンパク質が、ｐ２１、配列番号２３のペプチド、配列番号１１のペプチド、配列番号１２のペプチド、および配列番号１６のペプチドの群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
炎症過程を含む疾病または好中球減少症の処置のための薬物についてスクリーニングするためのターゲットとしてのＰＣＮＡのin vitroにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中性細胞のアポトーシスをモデュレーションする化合物に関する。特に、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と、好中性細胞中の細胞質ＰＣＮＡと結合しているタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物に関する。本発明はまた、好中球依存性炎症過程の処置において使用するための化合物の同定法にも関する。本発明はさらに、好中球減少症の処置において使用するためのペプチドに関する。
【０００２】
発明の背景
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ＤＮＡの合成および修復において重要な因子であり、初めはＤＮＡポリメラーゼδ（デルタ）およびε（イプシロン）の補助タンパク質として特徴づけられた。今まで記載された全てのＰＣＮＡ機能は専らその核における局在を反映する。過去数年間に、多くのタンパク質がＰＣＮＡと相互作用をすることが判明し、これには種々の酵素および調節タンパク質、例えばＣＤＫまたはＣＤＫ阻害剤ｐ２１／ｗａｆ１が挙げられる（Waga et al. 1994; Nature 369:574-578）。推論として、ＰＣＮＡは、複製以外の細胞経路において、例えばヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得、従って、これら全ての細胞過程を接続する「細胞コミュニケーター」として作用すると仮定されてきた。
【０００３】
好中球および炎症
好中球は最終分化したエフェクター細胞であり、その主な機能は炎症部位に移動し、そこで抗感染作用および炎症誘発作用を発揮する。しかしながら、好中球は炎症過程をモデュレーションすることができることを示す証拠が増えている（Nathan et al. 2006; Nat. Rev. Immunol. 6:173-182）。
【０００４】
特に、それらは免疫調節に関与する多種多様なサイトカインおよびその寿命を増加させるタンパク質、例えばＭｃｌ−１、Ａ１／Ｂｆｌ−１、アネキシン−１およびガレクチンの両方を合成して、宿主防御におけるその機能を効率的に実施することができる。しかしながら、一旦そのエフェクターの役割が終わると、その時間的に調節されたアポトーシス、その後の組織マクロファージによる食作用が、成功裏の炎症の消退には必要である（Rossi et al. 2007; Biochem. Soc. Trans. 35:288-291）。従って、好中球のアポトーシスは、炎症の消退において中心的な役割を果たしているが、その分子機序は依然として不完全にしか解明されていない（Simon et al. 2003; Immunol. Rev. 193:101-110）。マクロファージおよび樹状細胞とは異なり、好中球は増殖せず、そして短い寿命を有する。しかし、それらはいくつかの細胞周期調節タンパク質、例えばサイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、ｐ２７およびサバイビンを発現し、増殖とアポトーシスとの間の密接な関係の観点から、好中球はそれらを使用して自身の生存を調節しているのかもしれない。
【０００５】
好中球は増殖せず、そして全く感染がないと非常に短い時間しか生存しない（約６時間）。しかしながら、感染が起こっている部位上では、好中球の生存時間は有意に増加する。しかしながら、好中球の蓄積は、感染生物にとって有害である。従って、好中球はマクロファージによって（食作用によって）効率的に破壊されなければならない。この食作用の工程は、炎症を消退させるための必須な工程である。適切な様式でそれが起こらなければ、炎症は適切に消退せず、そして慢性的な炎症に至り得る。
【０００６】
従って、好中球のアポトーシスを促進することのできる化合物を得ることが望ましく、このような化合物は炎症の処置を可能とする。
【０００７】
好中球および好中球減少症
好中球減少症は、血中の好中球（顆粒球）数の減少である。好中球減少症は、骨髄系細胞またはその前駆体の内因性の欠陥によって引き起こされ得る。好中球減少症はまた、特定の薬物の使用、骨髄浸潤または置換、特定の感染、または免疫反応からも生じ得る。最も一般的な原因としては、薬物の投与、感染および骨髄浸潤過程が挙げられる。
【０００８】
好中球減少症が重度であれば、細菌感染および真菌感染のリスクおよび重度は増加する。好中球数が５００／μLより下に下降すれば、内因性微生物叢（例えば口内または腸内）が感染を引き起こし得る。数が２００／μLより下に下降すれば、炎症応答は存在しない場合がある。急性で重度の好中球減少症は、特に別の因子（例えば癌）も免疫系を損なっている場合、急速で致命的な感染の素因となる。
【０００９】
従って、好中球のアポトーシスを防ぐことのできる化合物を得ることが望ましく、このような化合物は好中球減少症の処置を可能とする。
【００１０】
発明の説明
本発明者らは、成熟した好中球が高いレベルのＰＣＮＡを発現し、これは驚くべきことに専ら好中球の細胞質に局在することを見出した。さらに、ＰＣＮＡは、おそらくその活性化を防ぐために、プロカスパーゼと恒常的に結合していた。特に、細胞質のＰＣＮＡレベルは、好中球の生存率と平行して変化した。実際に、細胞質のＰＣＮＡレベルはアポトーシス中には減少し、そしてin vitroまたはin vivoにおける生存因子Ｇ−ＣＳＦへの曝露中には増加した。
【００１１】
顕著には、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１から誘導された競合ペプチドは、好中球のアポトーシスをトリガーし、従ってＰＣＮＡタンパク質相互作用の特異的なモデュレーションが好中球の生存に影響を及ぼすことを実証することが判明した。
【００１２】
ＰＣＮＡから誘導されたペプチドはまた、ＰＣＮＡタンパク質相互作用をモデュレーションするために使用することができ、そして好中球のアポトーシスを誘導または防止のいずれかを行なうことができることがさらに判明した。
【００１３】
ＰＣＮＡは、マウス骨髄の好中球においても発現されたが、ＬＰＳにより誘導された肺炎症の消退中に回収されたアポトーシスする傾向のある好中球においてはほんの弱くしか発現されなかった。さらに、ＰＣＮＡの過剰発現は、好中球に分化したＰＬＢ９８５骨髄細胞を、ＴＲＡＩＬまたはグリオトキシンにより誘導されたアポトーシスに対して有意により耐性なものとした。多くのパートナーとの結合部位である、ＰＣＮＡドメイン間接続ループにおける突然変異は、ＰＣＮＡにより媒介される抗アポトーシス効果を有意に減少させた。これらの結果は、ＰＣＮＡを、好中球の寿命のレギュレーターとして同定し、これにより、病的な炎症または好中球減少症をモデュレーションする新規なターゲットが強調される。
【００１４】
従って、本発明者らは、興味深いことに専らその細胞質にＰＣＮＡを発現する好中球におけるＰＣＮＡの意外な抗アポトーシス的な役割を同定した。従って、ＰＣＮＡの生物学的活性を阻害またはトリガーする化合物を、それぞれ炎症または好中球減少症の処置に使用することができた。
【００１５】
炎症過程を含む疾病の処置における使用のための化合物
それ故、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置における使用のための、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と、ＰＣＮＡと結合しやすい、特に好中性細胞中の細胞質ＰＣＮＡと結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物に関する。
【００１６】
本発明による化合物は、例えば、ペプチド、小分子、抗体またはアプタマーに対応し得る。
【００１７】
好ましい態様において、前記化合物はペプチドである。「ペプチド」は、最大５０アミノ酸長であるアミノ酸（天然、修飾および／または通常ではないアミノ酸を含む）の鎖を意味する。ペプチドは例えば約６〜５０、１０〜５０、または１５〜５０、２０〜５０、６〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、または１５〜２５アミノ酸の長さを有し得る。
【００１８】
本発明によるペプチドは、例えば、ＰＣＮＡの少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメント、またはＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチドのフラグメント、例えば、ｐ２１、Ｒｆｃ１、Ｒｆｃ３、ＦＥＮ−１、ＤＮＡリガーゼ−１、トポイソメラーゼＩＩα、Ｃｄｔ１、Ｒｒｍ３、ＷＲＮ、ＲＥＣＱ５、ＵＮＧ２、ＭＰＧ、ｈＭＹＨ、ＡＰＥ２、ＸＰＧ、ＣＡＦ−１、ＰＡＲＰ−１、ＷＳＴＦ、ＤＮＭＴ１、Ｅｃｏ１、Ｃｈｌ１、ｐ５７、ＩＮＧ１ｂまたはｐ５３に対応し得る。
【００１９】
好ましい態様において、ペプチドは、ＰＣＮＡの少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。このようなフラグメントは、好ましくは、ＰＣＮＡのドメイン間接続ループの少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸を含む。実際に、実施例９に示したように、配列番号３のＰＣＮＡフラグメントを含むペプチド３および４は、好中球のアポトーシスをトリガーすることができる。従って、ペプチドは、例えば、配列番号３の配列、またはその少なくとも８０、８５、９０または９５％同一である配列、またはその少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。
【００２０】
あるいは、ペプチドは、ｐ２１の少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。このようなフラグメントは、好ましくは、ｐ２１の残基１４１〜１６０におよぶ、配列番号２３のｐ２１フラグメントの少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸を含む。実際に、実施例６に示したように、配列番号２３の配列を含むカルボキシｐ２１ペプチドは、好中球のアポトーシスをトリガーすることができる。従って、ペプチドは、例えば、配列番号２３の配列、またはその少なくとも８０、８５、９０または９５％同一な配列、またはその少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。
【００２１】
本発明によるペプチドはさらに、タグ、例えば、細胞へのペプチドの侵入を増強するタグを含み得る。タグは、例えば、ＨＩＶ−１Ｔａｔポリペプチドから誘導されたタグを含むまたはからなり得る。好ましくは、タグは、配列番号２７のタグ（好ましくはペプチドのＮ末端に位置する）または配列番号８のタグ（好ましくはペプチドのＣ末端に位置する）を含むまたはからなる。配列番号１１、１２および２４は、タグに融合したＰＣＮＡまたはｐ２１の少なくとも６連続したアミノ酸のフラグメントからなる本発明によるペプチドの具体例である。
【００２２】
ペプチドはさらに、その溶解度またはバイオアベイラビリティを増強するための、例えばアセチル化などの化学的修飾を含み得る。
【００２３】
それ故、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、ペプチド、好ましくは
ａ）配列番号３または２３からなるアミノ酸配列；
ｂ）タグに融合した配列番号３または２３からなるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１、配列番号１２または配列番号２４からなるアミノ酸配列；
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列と相同で、そして（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの前記配列と少なくとも８０％の同一性を提示する配列；または
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列の少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むまたはからなるペプチドに関する。
【００２４】
ペプチドがＰＣＮＡ以外の別のタンパク質から誘導された場合、本発明によるペプチドは、好ましくは、ＰＣＮＡに、特に好中性細胞中の細胞質のＰＣＮＡに結合しやすい。
【００２５】
本発明の質問アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、主題のポリペプチド配列が、質問アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸改変を含み得ることを除き、主題のポリペプチドのアミノ酸配列は質問配列と同一であることを意図する。別の言葉で言えば、質問アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、主題配列中の５％（１００中５）までのアミノ酸残基を挿入、欠失または別のアミノ酸を用いて置換し得る。
【００２６】
２つ以上の配列の同一性または相同性を比較するための方法は当技術分野において周知である。その全長を考慮した場合に２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つけるNeedleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453)を使用する「needle」プログラムを例えば使用し得る。needleプログラムは、例えば、ebi.ac.ukワールドワイドウェブサイト上で利用できる。本発明による同一率を、好ましくは、１０．０に等しい「ギャップオープン」パラメーター、０．５に等しい「ギャップ伸長」パラメーター、およびBlosum62マトリックスを用いて、EMBOSS::needle（グローバル）プログラムを使用して計算する。
【００２７】
参照配列に対して「少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一」であるアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドは、参照配列と比較して欠失、挿入および／または置換などの突然変異を含み得る。好ましい態様において、突然変異は、以下の表に示したような保存的置換に対応する。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
本明細書全体を通して、「ＰＣＮＡ」という用語は、ヒト増殖細胞核抗原タンパク質を指す。好ましい態様において、「ＰＣＮＡ」は配列番号１の配列のタンパク質を指す。しかしながら、この用語はまた、配列番号１のタンパク質の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体も包含する。本発明の背景において、ＰＣＮＡタンパク質は、好ましくは、細胞質ＰＣＮＡ、最も好ましくは好中性細胞に見られる細胞質ＰＣＮＡである。
【００３０】
「ＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチド」という表現は、ＰＣＮＡと、好ましくは好中性細胞中の細胞質ＰＣＮＡと相互作用することのできるタンパク質を指す。ドメイン間接続ループに対して強い親和性を有するペプチドについてスクリーニングすることを目的とした研究が、ペプチドバンクを使用して実施されている（Warbrick 2006, Oncogene 25:2850-2859）。ｐ２１は、ＰＣＮＡに対して最も高い親和性で結合するものの中に含まれる（Moldovan et al. 2007; Cell 129:665-679）。ＰＣＮＡの相互接続しているループドメインに結合する他のＰＣＮＡパートナーとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、クランプローダー（Ｒｆｃ１、Ｒｆｃ３）、Ｆｌｐａ−エンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ−１）、ＤＮＡリガーゼ−１、トポイソメラーゼＩＩα、複製ライセンス因子（Ｃｄｔ１）、ヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼ（Ｒｒｍ３、ＷＲＮ、ＲＥＣＱ５）、ミスマッチ修復酵素（ＵＮＧ２、ＭＰＧ、ｈＭＹＨ、ＡＰＥ２）、ヌクレオチド除去修復酵素（ＸＰＧ）、ヒストンシャペロン（ＣＡＦ−１）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ−１）、クロマチンリモデリング因子（ＷＳＴＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）、姉妹染色分体接着因子（Ｅｃｏ１、Ｃｈｌ１）、細胞周期レギュレーター（ｐ５７）、およびアポトーシスレギュレーター（ＩＮＧ１ｂ、ｐ５３）が挙げられる。従って、ＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチドは、こうしたタンパク質のいずれかに対応し得る。
【００３１】
より具体的には、本発明者らは、好中性細胞の細胞質ＰＣＮＡが、カルボキシｐ２１（実施例６参照）と、およびプロカスパーゼ−８、プロカスパーゼ−１０、プロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−９を含むいくつかのプロカスパーゼと（実施例８参照）相互作用しやすいことを見出した。
【００３２】
「相互作用を阻害すること」によって、分子が別の分子に結合するのを防ぐことを意味する。相互作用の阻害は、当業者に周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、それはウェスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫共沈降（co-ip）アッセイ、プルダウンアッセイ、架橋アッセイ、ラベル転移アプローチ（ＦＲＥＴまたはＨＴＲＦアッセイ）または酵母ツーハイブリッドアッセイによって測定され得る。当業者は、化合物が、ＰＣＮＡと、ＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチド、例えばｐ２１、カルボキシｐ２１またはプロカスパーゼとの間の相互作用を阻害するかどうかを、競合結合アッセイを実施することによって容易に決定することができる。
【００３３】
本発明の背景において、前記化合物は、好ましくは、ＰＣＮＡのドメイン間接続ループにおける、すなわち、配列番号１のＬ１２１残基からＥ１３２残基までにおよぶＰＣＮＡタンパク質の領域における、ＰＣＮＡと、ＰＣＮＡに結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドとの相互作用を阻害する。実際に、本発明者らは、このドメインで行なわれている相互作用を阻害するペプチド（すなわちペプチド３、４およびカルボキシｐ２１）が好中球のアポトーシスをトリガーすることを見出した。当業者は、化合物が、ＰＣＮＡのドメイン間接続ループで行なわれている相互作用を阻害するかどうかを、例えば、ＰＣＮＡのドメイン間接続ループに結合することが知られている、カルボキシｐ２１を用いての競合的結合アッセイを実施することによって、容易に決定することができる。
【００３４】
本明細書において使用した「ｐ２１」という用語は、ヒトｐ２１タンパク質を指し、これは、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、ＣＡＰ２０、ＣＤＫＮ１、ＣＩＰ１、ＭＤＡ−６、ｐ２１ＣＩＰ１、ＳＤＩ１またはＷＡＦ１とも呼ばれる。好ましい態様において、「ｐ２１」は、配列番号２６の配列のタンパク質を指す。しかしながら、この用語はまた、配列番号２６のタンパク質の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体も包含する。
【００３５】
本明細書全体を通して、「炎症過程を含む疾病」は、炎症と呼ばれる悪化した免疫応答に起因する疾病を指す。炎症は、例えば、以下の特徴によって特徴付けられる：発赤、発熱、腫脹および疼痛。悪化した炎症は、例えば、病原体による感染、火傷、化学的刺激、凍傷、毒素、物理的損傷、過敏症に因る免疫反応、自己免疫過程、自己炎症過程、電離放射線、異物、移植片拒絶または虚血によって引き起こされ得る。本明細書の背景において、炎症過程を含む疾病はまた炎症疾病とも呼ばれる。
【００３６】
好ましい態様において、炎症過程を含む疾病は好中性細胞によって媒介される。従って、本発明は、好中球のアポトーシスを誘導する際におよび／または好中性細胞によって媒介される炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、ＰＣＮＡと、ＰＣＮＡに結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物に関する。
【００３７】
より好ましくは、炎症過程を含む疾病は、心臓病態、血管病態、肺病態、消化管病態、皮膚病態または腎臓病態（感染によって引き起こされるまたは引き起こされない）である。さらにより好ましくは、炎症過程を含む疾病（すなわち炎症疾病）は、心虚血（特に発作から４日後）、細菌性心内膜炎、化膿性心膜炎（例えば、細菌性心内膜炎、肺炎、または縦隔感染症に関連）、結節性多発動脈炎、川崎病、白血球破砕性血管炎、顕微鏡的多発血管炎、細菌性血管腫症（例えばＡＩＤＳに関連）、成人呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、細菌性、ウイルス性、またはマイコプラズマ性気管支肺炎、潰瘍、クローン病、火傷、痛風（例えば急性痛風）、偽痛風、関節炎（例えば感染性関節炎、リウマチ様多発性関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎または骨関節炎）、血清反応陰性脊椎関節症、移植片拒絶、心筋炎、アミロイドーシス、ホートン病、高安病、クリオグロブリン血症、血管炎、リウマチ性紫斑病、ＡＮＣＡ陽性血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群）、アテローム、慢性閉塞性肺疾病、汎小葉型肺気腫、間質性肺炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚炎、スチル病、微結晶性関節症（痛風、関節軟骨石灰化、ヒドロキシアパタイトの沈着）、乾癬性関節炎、股関節症、全身性ループス、炎症性筋疾患、壊死性筋疾患、糸球体腎炎、間質性腎症、肉芽腫性腎症、ブドウ膜炎からなる群より選択される。
【００３８】
本発明によると、「炎症細胞」という表現は、白血球、例えば顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、単球、マクロファージ、樹状細胞またはリンパ球を指す。好ましくは、「炎症細胞」という表現は好中球を指す。
【００３９】
好ましい態様において、炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物は、炎症細胞のアポトーシスを誘導する。より好ましくは、前記化合物は、好中性細胞のアポトーシスを誘導する。
【００４０】
化合物が炎症細胞のアポトーシスを誘導したかどうかの決定は、当業者により周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、それは、例えばアネキシンＶによる標識後に外面化したホスファチジルセリンの量を測定することによって定量され得る。このような実験において、外面化したホスファチジルセリンは、蛍光色素に結合したアネキシンＶを用いて染色され得、従って、実施例１に記載のように、フローサイトメトリーによるアポトーシスの検出が可能となる。
【００４１】
「処置」という用語は、治癒目的（病態の発達を少なくとも軽減または停止させることを目的とする）または予防目的（病態が出現するリスクを減少させることを目的とする）のための処置を意味すると理解される。
【００４２】
好中球減少症の処置において使用するためのペプチド
別の局面において、本発明は、好中球減少症の処置において使用するための、ＰＣＮＡのカルボキシ末端領域を含むペプチド、またはその少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントに関し、前記のＰＣＮＡのカルボキシ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２４９〜２６１からなる領域として定義される。
【００４３】
好ましい態様において、前記ペプチドは、ＰＣＮＡのカルボキシ末端領域（配列番号１のアミノ酸２４９〜２６１）の少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなる。実際に、実施例９に示したように、配列番号７のＰＣＮＡフラグメントを含むペプチド８および９は、好中球のアポトーシスを防ぐことができる。従って、前記ペプチドは、例えば、配列番号７の配列、またはその少なくとも８０、８５、９０または９５％同一の配列、またはその少なくとも６、１０、１５または２０連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。
【００４４】
本発明によるペプチドはさらに、タグ、例えば細胞へのペプチドの侵入を増強するタグを含み得る。タグは、例えば、ＨＩＶ−１Ｔａｔポリペプチドから誘導されたタグ（好ましくはペプチドのＮ末端に位置する）またはＲＹＩＲＳタグ（好ましくはペプチドのＣ末端に位置する）を含むまたはからなり得る。配列番号１６および１７は、タグに融合したＰＣＮＡのカルボキシ末端領域の少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントからなる本発明によるペプチドの具体例である。
【００４５】
ペプチドはさらに、その溶解度またはバイオアベイラビリティを増強するための、例えばアセチル化などの化学的修飾を含み得る。
【００４６】
それ故、本発明は、好中球減少症の処置において使用するための、ペプチド、好ましくは
ａ）配列番号７からなるアミノ酸配列；
ｂ）タグに融合した配列番号７からなるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１６または配列番号１７からなるアミノ酸配列；
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列に相同であり、そして（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの前記配列と少なくとも８０％の同一性を提示する配列；および
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列の少なくとも６つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むまたはからなるペプチドに関する。
【００４７】
好ましい態様において、好中球減少症の処置において使用するためのペプチドは、炎症細胞の、好ましくは好中性細胞のアポトーシスを防ぐおよび／または阻害する。化合物が炎症細胞のアポトーシスを誘導したかどうかの決定は、当業者により周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、それは、例えばアネキシンＶによる標識後に外面化したホスファチジルセリンの量を測定することによって定量され得る。このような実験において、外面化したホスファチジルセリンは、蛍光色素に結合したアネキシンＶを用いて染色され得、従って、実施例１に記載のように、フローサイトメトリーによるアポトーシス細胞の検出が可能となる。
【００４８】
「好中球減少症」という用語は、異常に低い数の好中球、例えば血液１μLあたり１５００以下の好中球、好ましくは血液１μLあたり１０００以下の好中球、最も好ましくは血液１μLあたり５００以下の好中球によって特徴付けられる血液学的疾患を指す。
【００４９】
本明細書において使用するこの用語は、慢性、周期性および急性好中球減少症を含む。好中球減少症は、例えば、慢性特発性好中球減少症、先天性好中球減少症または続発性好中球減少症、例えば感染誘発性好中球減少症、薬物誘発性好中球減少症、アルコール症誘発性好中球減少症、自己免疫性好中球減少症、ＡＩＤＳにおける慢性続発性好中球減少症、骨髄置換によって引き起こされる好中球減少症、細胞傷害性化学療法によって引き起こされる好中球減少症、放射線療法によって引き起こされる好中球減少症、葉酸またはビタミンＢ１２欠乏症によって引き起こされる好中球減少症、脾機能亢進によって引き起こされる好中球減少症、またはＴγ−リンパ球増殖性疾病によって引き起こされる好中球減少症に対応し得る。
【００５０】
本発明によるペプチド
本発明の別の局面は、前記の段落において定義したようなペプチドに関する。
【００５１】
好ましくは、本発明によるペプチドは、ＰＣＮＡタンパク質のアミノ酸配列から誘導される。
【００５２】
好ましい態様において、本発明によるペプチドは、
ａ）配列番号３または７からなるアミノ酸配列；
ｂ）タグに融合した配列番号３または７からなるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６または配列番号１７からなるアミノ酸配列；および
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列に相同であり、そして（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの前記配列に対して少なくとも８０％の同一性を提示する配列
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列の少なくとも６、１０、１５または２０の連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
ペプチドがＰＣＮＡ以外の別のタンパク質から誘導された場合、本発明によるペプチドは、好ましくは、ＰＣＮＡに、特に好中性細胞中に見られる細胞質のＰＣＮＡに結合しやすい。
【００５４】
さらに、本発明によるペプチドは、好ましくは、炎症細胞の、好ましくは好中性細胞のアポトーシスをモデュレーション（すなわち誘導、防ぐまたは阻害する）する。例えば、配列番号３の配列を含むまたはからなるペプチドおよびそれから誘導されたペプチドは、好ましくは、炎症細胞のアポトーシスを誘導する。一方で、配列番号７の配列を含むまたはからなるペプチドおよびそれから誘導されたペプチドは、好ましくは、炎症細胞のアポトーシスを防ぐおよび／または阻害する。
【００５５】
本発明による薬学的組成物
本発明はさらに、本明細書において定義したようなペプチドおよび１つ以上の生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
【００５６】
本発明のペプチドを含む薬学的組成物は、全ての組成物を含み、前記ペプチドは、意図する目的を達成するのに効果的な量で含まれる。さらに、薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物へと活性化合物を加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な生理学的に許容される担体を含み得る。
【００５７】
「生理学的に許容される担体」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、そして投与される宿主に対して毒性ではない、任意の担体を包含することを意味する。適切な生理学的に許容される担体は当技術分野において周知であり、そして例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985）に記載されており、これはこの分野における標準的な参考テキストである。例えば、非経口投与のために、上記活性成分は、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などのビヒクルに、注射用の投与単位形で製剤化され得る。
【００５８】
生理学的に許容される担体とは別に、本発明の組成物はまた、少量の添加剤、例えば安定化剤、賦形剤、緩衝剤および保存剤を含み得る。本発明の組成物はさらに第二の活性成分を含み得る。
【００５９】
本発明のペプチドは、意図する目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、クモ膜下腔内、鼻腔内、経口、直腸、経皮、頬側、外用、局所、吸入または皮下の使用を含むがそれらに限定されない多くの異なる経路によって達成され得る。非経口および外用経路が特に好ましい。
【００６０】
投与しようとする用量は、個々の必要性、所望の効果および選択した投与経路に依存する。投与する用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、併用処置（あれば）、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存することが理解される。各処置に必要とされる全用量は、複数回の用量または１回の用量によって投与され得る。
【００６１】
意図する送達経路に依存して、前記化合物は液体（例えば溶液、懸濁液）、固体（例えば丸剤、錠剤、坐剤）または半固体（例えばクリーム、ゲル）の剤形として製剤化され得る。
【００６２】
本発明はまた、本明細書において定義したようなペプチドの有効量をそれを必要とする被験体に投与する工程を含む、炎症過程を含む疾病または好中球減少症を処置する方法に関する。
【００６３】
「有効量」は、処置しようとする疾病を防ぐ、処置するまたは減速することのできるペプチドの濃度を達成するのに十分な量を意味する。このような濃度は、当業者によって規定通りに決定され得る。実際に投与される化合物の量は、典型的には、医師または獣医によって、処置しようとする容態、選択した投与経路、投与する実際の化合物、被験体の年齢、体重および応答、被験体の症状の重度などを含む、関連する環境を鑑みて決定される。また、投与量は、投与されるペプチドの安定性に依存し得ることが当業者によって理解されるだろう。
【００６４】
「それを必要とする被験体」は、処置しようとする炎症過程を含む疾病または好中球減少症に罹患しているまたは罹患しやすい個体を意味する。本発明の背景において処置しようとする個体は好ましくはヒトである。
【００６５】
本発明によるスクリーニング法
本発明者らは、ＰＣＮＡ、特に細胞質ＰＣＮＡが、好中球などの炎症細胞におけるアポトーシスをモデュレーションする際に役割を果たすことを見出した。
【００６６】
従って、本発明は、好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置のための薬物についてスクリーニングするためのターゲットとしてのin vitroにおけるＰＣＮＡの使用に関する。
【００６７】
より特定すると、本発明は、
ａ）候補化合物を、ＰＣＮＡおよびＰＣＮＡと結合しやすい少なくとも１つのポリペプチドと接触させ；
ｂ）候補化合物の存在下および非存在下において、ＰＣＮＡと結合しやすい前記の少なくとも１つのポリペプチドに結合したＰＣＮＡの量を比較し；そして
ｃ）ＰＣＮＡに結合しやすい前記の少なくとも１つのポリペプチドに結合したＰＣＮＡの量が、前記候補化合物の非存在下よりも前記候補化合物の存在下の方が少なければ、候補化合物を選択することを含む、
好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物の同定法に関する。
【００６８】
この方法において、ＰＣＮＡは好ましくは細胞質ＰＣＮＡに対応する。最も好ましくは、ＰＣＮＡは、好中性細胞から得られた細胞質ＰＣＮＡに対応する。
【００６９】
候補化合物の存在下および非存在下においてＰＣＮＡに結合しやすい前記の少なくとも１つのポリペプチドに結合したＰＣＮＡの量の比較は、当業者に周知の種々の方法によって行なわれ得る。例えば、これは、実施例１に記載したように、免疫共沈降およびウェスタンブロットアッセイによって、または酵母ツーハイブリッドスクリーニングアッセイによって、またはフローサイトメトリーによって（例えばビアコアシステムを使用して）実施され得る。
【００７０】
この方法の背景において、カルボキシｐ２１を、ＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチドとして使用し得る。実際に、カルボキシｐ２１は、増殖細胞においてＰＣＮＡパートナーと干渉することが知られている（Warbrick et al. 2006; Oncogene 25:2850-2859）。さらに、実施例６において詳述したように、カルボキシｐ２１は、ＰＣＮＡにより媒介される好中球の抗アポトーシス作用を打ち消すことができるので、好中性細胞におけるＰＣＮＡと干渉することができる。それ故、競合結合アッセイにおける候補化合物によるカルボキシｐ２１の置換は、候補化合物もまた、ＰＣＮＡのドメイン間接続ループにおいてＰＣＮＡと結合し、そしてそれ故、炎症疾病の処置に使用することができることを示す。
【００７１】
あるいは、ペプチド３（配列番号１１）、ペプチド４（配列番号１２）またはペプチド８（配列番号１６）もまた、本発明による方法の背景において、ＰＣＮＡに結合しやすいポリペプチドとして使用され得る。特に、カルボキシｐ２１、ペプチド３およびペプチド４は、炎症疾病の処置のための薬物をスクリーニングする場合に使用され得、そしてペプチド８は、好中球減少症の処置のための薬物についてスクリーニングする場合に使用され得る。
【００７２】
本発明の背景においてスクリーニングされる化合物および薬物としては、ペプチド、小分子、抗体、アプタマーおよび核酸、例えばアンチセンス核酸およびｓｉＲＮＡが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７３】
本明細書において引用した全ての参考文献（ジャーナル記事または要約、公表された特許出願、発行された特許または任意の他の参考文献を含む）の全体が本明細書への参照により組み入れられ、これには引用された参考文献に提示された全てのデータ、表、図および本文が含まれる。
【００７４】
本発明は、以下の実施例および図面の観点からさらに評価される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ＰＣＮＡは成熟好中球の細胞質に専ら発現される。（Ａ）好中球（ＰＭＮ）、リンパ球（Ｌｙ）またはＰＬＢ９８５前骨髄球性細胞におけるＰＣＮＡ免疫検出。５０，０００個の細胞／レーンを、一次抗体としてＰＣ１０ｍＡｂを使用して分析した。（Ｂ）それぞれ細胞質画分（Ｃｙｔ）、顆粒画分（Ｇｒ）および核画分（Ｎｕ）のコントロールマーカーとして作用するβ−アクチン（５７ｋＤａ）、ヒト好中球エラスターゼ（２９ｋＤａ）またはラミンＢ（４２ｋＤａ）と共に、種々の好中球細胞内区画におけるＰＣＮＡの発現。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを５０μgのタンパク質／レーンを使用して泳動させ、そしてＰＣＮＡをＰＣ１０ｍＡｂを用いて検出した。（Ｃ）in vitroでの好中球分化の間におけるヒトＣＤ３４＋細胞におけるＰＣＮＡ局在の免疫蛍光分析。ＰＣＮＡ発現を、分化前（ＣＤ３４＋）およびＣＤ３４＋−顆粒球の分化中の種々の時点（７または１３日目）、および成熟好中球において、核標識のためのウサギｐＡｂ Ａｂ５およびＴＯ−ＰＲＯ３ヨウ化物を使用して調べた。厳密な核の局在（白いバー）または核と細胞質の混合した局在（斜線のバー）または厳密な細胞質の局在（黒いバー）を示す細胞の比率は、顕微鏡下で細胞を計測することによって得られた。その後、比率を、各パネルの右に示したヒストグラム上にプロットした。パネルＡ、ＢおよびＣは、同じ結果を出した３回の中の代表的な実験を示す。
【図２】ＰＣＮＡは、好中球のアポトーシス中にプロテアソームによって分解される。（Ａ）単独で（常時存在のアポトーシス）または抗Ｆａｓ ｍＡｂ（１０ng/ml）またはグリオトキシン（２mg/ml）を用いて、３７℃で１、３または１５時間インキュベーションした好中球におけるＰＣＮＡ発現の動態。抗ＰＣＮＡ ＰＣ１０ｍＡｂを使用した好中球細胞質画分（５０μg／レーン）のウェスタンブロット分析。アクチンイムノブロットは、同じ膜上におけるローディングコントロールとして作用した。（Ｂ）（Ａ）のように培養され、そしてそれぞれアポトーシスおよび壊死を評価するためのアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよび７−ＡＡＤを用いて標識された好中球におけるホスファチジルセリン外面化のフローサイトメトリー測定。（Ｃ、Ｄ）そのそれぞれの特異的な発色性のＩＥＴＤ−ｐＮＡおよびＤＥＶＤ−ｐＮＡ基質を使用した好中球溶解液中におけるカスパーゼ−８（Ｃ）およびカスパーゼ−３（Ｄ）活性の分光光度的決定。（Ｅ）（Ａ）のように培養した好中球における生存（上のパネル）およびＰＣＮＡ発現（下のパネル）に対する、示した濃度におけるプロテアソーム阻害剤ＰＳ−３４１の効果。アポトーシスは、３７℃で１５時間（Ｔ１５ｈ）好中球をインキュベーションすることによって得られ、そして好中球の生存は、アネキシン−Ｖ−７−ＡＡＤ−好中球の比率として評価され、細胞のアポトーシスおよび壊死は除外され、そして新しく単離した好中球（Ｔ０）と比較した。値は２回実施した４回の独立した実験の平均±ＳＥＭである、ｐ＊＜０．０５（スチューデントｔ検定）。同じ実験設定下で得られた代表的なＰＣＮＡのイムノブロットを下のパネルに示す。（Ｆ）抗Ｆａｓまたはグリオトキシンと共に３７℃で６時間インキュベーションし（Ｔ６ｈ）、そして新しく単離された好中球（Ｔ０）と比較した、好中球におけるＰＣＮＡの発現に対するＰＳ−３４１（１mM）の効果。下のパネルにおいて、メンブランのコロイド状金染色をローディングコントロールとして使用した。パネルＡ〜Ｄ、Ｆは少なくとも４回実施した代表的な実験からのものであり、そして同一の結果を出している。
【図３】in vitroまたはin vivoにおいてＧ−ＣＳＦにさらされた好中球において安定なＰＣＮＡタンパク質レベルが維持される。（Ａ）Ｇ−ＣＳＦによるＰＣＮＡタンパク質発現の時間依存的なモデュレーション。好中球をＧ−ＣＳＦ（１０００Ｕ/ml）の存在下または非存在下において３７℃で培養した。０、３、６または１５時間インキュベーションした後、細胞を溶解し、そしてウェスタンブロット分析をＰＣ１０ｍＡｂを用いて実施し、一方、抗アクチンはローディングコントロールとして作用した。（Ｂ）ＰＣＮＡタンパク質発現に対するＧ−ＣＳＦの用量依存的効果。好中球を、Ｇ−ＣＳＦの非存在下（０）または存在下（２００または１０００Ｕ/ml）、３７℃で１５時間インキュベーションし、そして（Ａ）に記載のように分析した。同じ条件下における生存好中球、すなわちアネキシン−Ｖ−７−ＡＡＤ−細胞の比率をブロットの下のヒストグラムに報告する。（Ｃ）Ｇ−ＣＳＦで処理した好中球におけるＰＣＮＡおよびＢＬｙＳのｍＲＮＡ発現および転写の動的分析。全ＲＮＡを、示した時間かけて１０００Ｕ/mlのＧ−ＣＳＦの存在下または非存在下で培養した好中球から抽出し、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび一次転写物リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＰＣＮＡ、ＢＬｙＳおよびβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の遺伝子発現について分析した。その発現は、各試料の３回の反応のβ２ｍに正規化した後に、平均正規化発現（ＭＮＥ）単位として示される。ａ、ｂ、ｃについてのデータは３回の中の代表的な１回の実験のものである。（Ｄ）Ｇ−ＣＳＦ処理ドナーから単離された好中球におけるＰＣＮＡタンパク質発現の分析。代表的なＧ−ＣＳＦ処理ドナーからの好中球を、（＋Ｇ−ＣＳＦ）サイトカイン曝露前または曝露中のいずれかに分析し、新しく単離した細胞（０）または１５時間培養した細胞のいずれかからの溶解液中においてＰＣＮＡを免疫検出した。（Ｂ）のように培養後の生存好中球の比率をブロット下のヒストグラムに示す。（Ｅ）Ａｂ５ ｐＡｂを用いて検出した好中球ＰＣＮＡの共焦点免疫蛍光顕微鏡。好中球を、in vivoにおけるＧ−ＣＳＦ処理の前または最中（＋Ｇ−ＣＳＦ）にドナーから単離した。データは、４つの異なるドナーの代表である１つのＧ−ＣＳＦ処理ドナーからのものである。
【図４】ＬＰＳを鼻腔内に投与されたマウスのＢＭからまたはＢＡＬＦから単離されたマウス好中球におけるＰＣＮＡ発現。（Ａ）ＢＭからまたは末梢血から単離されたマウス好中球における、Ａｂ５ ｐＡｂを用いて検出された好中球ＰＣＮＡの共焦点免疫顕微鏡。（Ｂ）漸増するグリオトキシン濃度で処理したＢＭから単離したマウス好中球におけるＰＣＮＡタンパク質発現の分析。プロカスパーゼ−３のウェスタンブロット分析を好中球細胞質画分に実施し（２０μg／レーン）、そしてメンブランのコロイド状金染色をローディングコントロールとして使用した。アネキシン−Ｖ標識後に測定された生存好中球の比率を、上のヒストグラムに示す。（Ｃ）鼻腔内へのＬＰＳの滴下後の気道内における好中球およびマクロファージの動員の動態。ＢＡＬＦをＬＰＳ攻撃から１６、２４、４８および７２時間後に得、そしてＭＧＧによって染色して、下のパネルに示されているように好中球とマクロファージを区別した。（Ｄ）１６時間または４８時間のＬＰＳ攻撃後にＢＡＬＦから単離された好中球の共焦点免疫蛍光顕微鏡。（Ｅ）（Ｂ）に記載のようにＢＭおよびＢＡＬＦから単離された好中球細胞質画分におけるＰＣＮＡおよびプロカスパーゼ−３のウェスタンブロット分析（５０μg／レーン）。（Ｆ）ＢＭおよびＢＡＬＦ好中球（ＰＭＮ）におけるＰＣＮＡアポトーシスを、３７℃で一晩インキュベーションした後にアネキシンＶ標識によって評価した。
【図５】ＰＣＮＡ競合ペプチドであるカルボキシｐ２１による好中球アポトーシスの増強。合成カルボキシｐ２１およびコントロールの改変されたｐ２１ペプチド（ＰＣＮＡへの結合に重要として同定されたその荷電アミノ酸が、そのＰＣＮＡへの結合を防ぐように改変された）を好中球と共にインキュベーションして、アポトーシスに対するその効果を評価した。（Ａ）２つのカルボキシｐ２１（緑色）および１つの改変されたｐ２１ペプチド（赤色）に結合したＰＣＮＡの構造（紫色、青色およびオレンジ色を使用して３つのモノマーを区別する）。示された構造はＭＤシミュレーションの終わりに得られる。二次構造エレメントはリボンの表示によって強調されている；２つの異なる視点が提示されている（環の上からおよび側面から）。カルボキシｐ２１はＰＣＮＡに強力に結合したままであるが、改変されたペプチドとＰＣＮＡとの相互作用は急速に失われて、従って、ＰＣＮＡに対するより低い親和性を実証する。（Ｂ、Ｃ）カルボキシｐ２１に対する曝露は、常時存在する好中球のアポトーシスを増強した。好中球を、単独でまたは５０mMカルボキシｐ２１または改変されたカルボキシｐ２１と共に３７℃で６時間培養した。アポトーシスを受けた好中球の比率を、（Ｂ）ＤｉＯＣ６標識後に脱分極したミトコンドリアとして、またはアネキシンＶ標識後のホスファチジルセリン外面化（ｃ）として評価した。基礎アポトーシスをインキュベーション前に評価した。データは５つの独立した実験の平均±ＳＥＭである、Ｐ＊＜０．０５；Ｐ＊＊＜０．０１（スチューデントｔ検定）。（Ｄ）３時間の平行したアポトーシス中に漸増するカルボキシｐ２１濃度に曝露された好中球における減少したＰＣＮＡの発現。アポトーシスはアネキシンＶ標識によって測定された。同じ試料において、ＰＣＮＡ発現はウェスタンブロット分析によって評価され、そしてバンドは濃度測定スキャンによって定量された。データは４回の中の１回の代表的な実験からのものである。（Ｅ）カルボキシｐ２１はＧ−ＣＳＦの好中球生存促進効果を逆転した。好中球をＧ−ＣＳＦ（１０００Ｕ/ml）と共にまたは用いずに、カルボキシｐ２１（５０μM）の存在下または非存在下で１５時間インキュベーションし、その後、アネキシンＶ標識によってアポトーシス細胞の比率を決定した。データは、少なくとも５回の独立した実験の平均±ＳＥＭである、Ｐ＊＜０．０５；Ｐ＊＊＜０．０１（スチューデントｔ検定）。
【図６】安定なＰＣＮＡトランスフェクションは、好中球へと分化するＰＬＢ９８５骨髄細胞をアポトーシスから防御する。（Ａ）コントロール（ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクションされた細胞）およびｐｃＤＮＡ３−ＰＣＮＡでトランスフェクションされたＰＬＢ９８５細胞におけるＰＣＮＡの発現。ＰＣＮＡは、ＤＭＦによる誘導分化前（−ＤＭＦ）および分化後（＋ＤＭＦ）に、コントロールおよび安定にトランスフェクションされた（ＰＣＮＡ）ＰＬＢ９８５細胞において、Ａｂ５ ｐＡｂを使用して免疫蛍光によって検出された。蛍光は、分化前にイメージＪソフトウェアによって定量した（ヒストグラム）。データは４回の独立した実験の平均±ＳＥＭである、Ｐ＊＊＜０．０１（スチューデントｔ検定）。（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）ＤＭＦにより分化させたコントロール、ＰＣＮＡまたは突然変異したＰＣＮＡによりトランスフェクションされたＰＬＢ９８５細胞を、２μg/mlのグリオトキシンまたは１０ng/mlのＴＲＡＩＬを用いてまたは用いずに、アポトーシスを誘導した。（Ｂ）ヨウ化プロピジウムによる標識後にＤＮＡフラグメンテーションを示すｓｕｂ−Ｇ１期における細胞の比率。（Ｃ）ヘキスト標識後にクロマチン凝縮を示す細胞の比率。（Ｄ）ＤｉＯＣ６標識後にミトコンドリア脱分極を有する細胞の比率。（Ｅ）蛍光ＩＥＴＤに基づいた基質を使用したカスパーゼ−８活性化を有する細胞の比率。データは４回の独立した実験の平均±ＳＥＭである（スチューデントｔ検定を使用してＰ＊＊＜０．０５およびＰ＊＜０．０１）。
【図７】免疫共沈降（ｃｏ−ＩＰ）実験は、プロカスパーゼ−８、プロカスパーゼ−１０およびプロカスパーゼ−９をＰＣＮＡパートナーとして同定する。Ｃｏ−ＩＰ実験を好中球の細胞質を使用して実施した。非結合材料（ＵＢ）および結合（Ｂ）した免疫沈降タンパク質を、ウェスタンブロット分析によって分析した。ＩＰはＰＣＮＡ ｐＡｂ（ＩＰ ＰＣＮＡ）または空ビーズ（ＩＰコントロール）を使用し、一方、ウェスタンブロット分析は両方のＰＣ１０抗ＰＣＮＡを使用して、ＰＣＮＡおよび抗プロカスパーゼ−８ｍＡｂ（Ａ）または抗プロカスパーゼ−１０ｍＡｂ（Ｂ）または抗プロカスパーゼ−３ｍＡｂ（Ｃ）または抗プロカスパーゼ−９ｍＡｂ（Ｄ）の存在を確認した。（Ｅ）組換えＰＣＮＡ（１００μM）の存在下または非存在下、好中球細胞質、チトクロムｃ（５０μM）およびＡＴＰ（１mM）を使用して実施したin vitroにおけるプロカスパーゼ−９活性化アッセイ後の切断されたカスパーゼ−９の免疫検出の動態。（Ｆ）コントロールと比較した、野生型または突然変異ＰＣＮＡを過剰発現するＰＬＢ９８５細胞におけるカスパーゼ−９活性。ＣＤ１１ｂ−カスパーゼ−９二重陽性細胞を、ＤＭＦにより誘導した分化の前後にフローサイトメトリーによって測定した。データは４回の独立した実験の平均±ＳＥＭである（スチューデントｔ検定を使用してＰ＊＊＜０．０５およびＰ＊＜０．０１）。
【図８】ｓｉＲＮＡによるＣＤＫ２またはＧＡＤＤ４５α発現のノックダウンは、アポトーシスに対して、ＤＭＦにより分化されたＰＬＢ細胞を感作する。ＤＭＦにより分化されたＰＬＢ９８５細胞を、２回、コントロール（ＣＴ）−ｓｉＲＮＡまたはＣＤＫ２−ｓｉＲＮＡまたはＧＡＤ４５α−ｓｉＲＮＡを用いて、ＤＭＦ処理の３および４日後にトランスフェクションした。アポトーシスを受けるＰＬＢ９８５細胞の比率に対する、ＣＤＫ２またはＧＡＤＤ５αｓｉＲＮＡの効果を、ＤｉＯＣ６標識後のミトコンドリア脱分極によって測定した。データは３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図９】核のＳＶ４０ＮＬＳ−ＰＣＮＡ突然変異体は抗アポトーシス効果を全く有さない。（Ａ）コントロールＰＬＢ９８５と比較した、野生型ＰＣＮＡまたは核のＳＶ４０ＮＬＳ−ＰＣＮＡ突然変異体を安定に過剰発現する好中球に分化したＰＬＢ９８５細胞におけるＣＤ１１ｂの膜発現。ＰＬＢ９８５細胞をＤＭＦを用いて５日間処理して、顆粒球の分化を誘導した。ＣＤ１１ｂ発現をフローサイトメトリーによって測定し、そしてＣＤ１１ｂ陽性細胞の比率として表現した。（Ｂ）ＰＬＢ９８５細胞におけるＤＩＯＣ６標識後のミトコンドリア脱分極分析。細胞を１μg/mlのグリオトキシンの存在下または非存在下において１６時間インキュベーションして、アポトーシスを誘導した。データは、低下したミトコンドリア能を有するアポトーシス細胞の比率であり、そして９回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表現される、Ｐ＊＜０．０５（ウィルコクソン検定）。（Ｃ）ヨウ化プロピジウム染色後のＤＮＡフラグメンテーションを示すｓｕｂＧ１期におけるＰＬＢ９８５細胞の比率。データは６回の独立した実験の平均±ＳＥＭである、Ｐ＊＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【００７６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＰＣＮＡポリペプチドの配列を示す。
配列番号２〜７は、ＰＣＮＡポリペプチドから誘導されたペプチドの配列を示す。
配列番号８は、ＲＹＩＲＳタグの配列を示す。
配列番号９〜１７は、そのＣ末端がＲＹＩＲＳタグを用いてタグ化されているか、またはそのＮ末端がＨＩＶ−１Ｔａｔポリペプチドから誘導されたタグを用いてタグ化されているかのいずれかである、ＰＣＮＡポリペプチドから誘導されたペプチドの配列を示す。配列番号９〜１７のペプチドは、それぞれ、ペプチド１、２、３、４、５、６、７、８および９と呼ばれる。
配列番号１８〜２２は、実施例１に記載したペプチドの配列を示す。
配列番号２３は、ｐ２１から誘導されたペプチドの配列を示す。
配列番号２４は、そのＣ末端がＲＹＩＲＳタグでタグ化されている、ｐ２１から誘導されたペプチドの配列を示す。このペプチドはカルボキシｐ２１と呼ばれる。
配列番号２５は、陰性コントロールとして使用されるペプチドの配列を示す。
配列番号２６はｐ２１ポリペプチドの配列を示す。
配列番号２７はＴＡＴタグの配列を示す。
配列番号２８は、ｐｃＤＮＡ３−ＮＬＳ（ＳＶ４０）−ＰＣＮＡプラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号２９は、ｐｃＤＮＡ３−ＮＬＳ（ＳＶ４０）−ＰＣＮＡプラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００７７】
実施例
実施例１：材料および方法
好中球の単離、Ｃ３４＋前駆体の顆粒球への分化、および細胞培養。
健康なドナー（フランス血液機構（Etablissement Francais du Sang）、パリ）またはＧ−ＣＳＦで処理した健康ドナー（造血幹細胞の動員を誘導するために１０mg/kgを５日間）（バイオ療法部門、ネッケル病院、フランス）からのヒト好中球を、ＥＤＴＡで抗凝固化した血液から、Witko-Sarsat et al. (1999, Blood 94:2487-2496)に記載のように、ポリモルホプレップ（Nycomed）を通した密度勾配遠心分離を使用して単離した。血液ドナーは、本試験に参加するためにその書面によるインフォームドコンセントを提出し、これは、Inserm施設内審査委員会およびネッケル小児病院（パリ、フランス）の倫理委員会によって承認された。ＣＤ３４＋細胞から顆粒球への分化を、いくつかの小さな改変を加えて、Hino et al. (2000, Br. J. Haematol. 109:314-321)に記載のように誘導した。簡潔に言うと、ＣＤ３４＋細胞を臍帯血から単離し、そしてその後、幹細胞因子（ＳＣＦ;１０ng/ml）、ＩＬ−３（１０ng/ml）およびＩＬ−６（１００ng/ml）と共に７日間かけて培養した。ＣＤ３６−細胞を単離し、そしてその後、Ｇ−ＣＳＦ（１０ng/ml）、ＳＣＦ（１００ng/ml）およびＩＬ−３（１０ng/ml）と共に１３日間かけてインキュベーションして、顆粒球への分化を促進した。種々の時点で染色したＭＧＧを使用して、分化をモニタリングした（データは示さず）。
【００７８】
ＨｅＬａ、ＰＬＢ９８５およびＮＢ４前骨髄球性細胞株を、１０％ウシ胎児血清の補充されたＲＰＭＩ中で培養した。ＮＢ４細胞をＡＴＲＡ（１mM）（Sigma）を用いて５日間かけて誘導して分化させ、そして顆粒球の分化をＣＤ１１ｂの発現によって、およびＭＧＧ染色後の形態学的分析によって検証した（データは示さず）。ＰＬＢ９８５細胞の顆粒球への分化は、０．５％ＤＭＦに５日間さらすことによって誘導され、そしてＮＢ４について検証した。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の機能的分析を、ルシゲニン増幅化学発光を用いて単一光子ルミノメーター（AutoLumat LB953, Berthold Co.）で決定した。化学発光基質のルシゲニン（１０，１０−ジメチル−９，９−ビアクリジウムジナイトレート）を使用して、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ依存性細胞外スーパーオキシドアニオン形成を選択的に測定した。簡潔に言うと、５×１０５個の細胞、すなわち好中球またはＰＬＢ９８５細胞を含む１００μlを、１００μlのルシゲニン（０．２mM）および５０μlの刺激物質、すなわちＨＢＳＳまたはＰＭＡのいずれか（１６μMの最終濃度）を含むポリスチレンチューブに分配した。発光を、４０分間かけて２回測定し、そして合算した全数として表現した。
【００７９】
免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡分析。
ＰＣＮＡ細胞内局在を研究するための好中球、ＨｅＬａ、ＣＤ３４＋、ＰＬＢ９８５またはＮＢ４細胞の免疫標識を、Kantari et al. (2007, Blood 110:4086-4095)に記載のように実施した。細胞を２０分間かけて氷上でＰＢＳ−３．７％ホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、そして室温で５分間かけてＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（０．２５％）を用いて、その後、１０分間氷冷メタノールを用いて透過処理し、１：２５に希釈したウサギｐＡｂ（Ａｂ５、Calbiochem）と共に４５分間かけて、その後、１：１００に希釈したビオチニル化ウサギＩｇＧ（Dako Cytomation）と共に３０分間かけて、その後、１：２００に希釈したストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ−５５５（２mg/ml，Molecular Probes）と共に３０分間かけてインキュベーションした。核を、１：１００に希釈したＴＯ−ＰＲＯ３ヨウ化物（１mM溶液、Molecular Probes）によって３０分間かけて染色した。ＰＣＮＡとの同場所局在のために、マウス抗プロカスパーゼ−８（クローン１２Ｆ５、１：２５希釈、Alexis Biochemicals）または抗プロカスパーゼ−９（クローンＰ１０−Ｆ７，１：２５希釈、Santa Cruz）ｍＡｂを一次抗体として使用し、その後、Alexafluor-488のコンジュゲーションした抗マウスｍＡｂ（Molecular Probe、１：１００に希釈）を使用した。スライドにPermafluor封入剤（Vector Laboratories）を使用してマウントし、そしてZeiss ＬＳＭ−５共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いての共焦点顕微鏡によって分析した。蛍光を、イメージＪソフトウェアバージョン１．４２ｄ（Becton-Dickinson）を使用して定量した。
【００８０】
アポトーシスの分析。
好中球のアポトーシスを、好中球を３７℃で単独で（常時存在のアポトーシス）または抗ＦａｓｍＡｂ（１０ng/ml；Beckman-Coulter）もしくはグリオトキシン（２mg/ml；Sigma）と共に（Ward et al. 1999, J. Biol. Chem. 274:4309-4318）指定した時間インキュベーションすることによってトリガーした。好中球のアポトーシスを、アネキシンＶ後のホスファチジルセリン外面化および７−ＡＡＤ標識（Kantari et al. 2007, Blood 110:4086-4095）；ＤｉＯＣ６標識後のミトコンドリア脱分極（Moriceau et al. 2009, J. Immunol.182:7254-7263）；好中球溶解液における分光光度測定（Biovision）によって測定したカスパーゼ−３およびカスパーゼ−８の活性によって評価した。ＤＭＦにより分化したＰＬＢ９８５細胞において、アポトーシスをグリオトキシンまたはｒＴＲＡＩＬ（１０ng/ml；RD System）（Yin et al. 2005, Int. J. Biochem. Cell Biol. 37:1696-1708）によってトリガーし、そしてカスパーゼ−８およびカスパーゼ−９活性を、ＣＤ１１ｂ＋細胞を開閉した後に、Caspase-Glow（登録商標）アッセイ（Promega）を使用して決定した。アポトーシス誘導クロマチン凝縮およびＤＮＡフラグメンテーションをそれぞれ、青色蛍光色素ヘキスト（５mg/ml）を用いてのＤＮＡ染色およびヨウ化プロピジウム染色の後に評価した（Goepel et al. 2004, J. Leukoc. Biol. 75:836-843）。ｐ２１カルボキシ末端配列（残基１４１〜１６０）に対応し、そしてその細胞への侵入を促進するためのＲＹＩＲＳカルボキシ末端伸長部分を含む、カルボキシｐ２１（KRRQTSMTDFYHSKRRLIFSRYIRS、配列番号２４）を合成および精製した（Genecust）。ＰＣＮＡへのその結合に関与する荷電アミノ酸が、動的なシミュレーション研究に従って改変されている改変されたペプチドが（KRRQTGETDFDHAKAALIFSRYIRS、配列番号２５）、コントロールとして作用した。ＰＳ−３４１（LC Laboratories）およびＭＧ１３２の効果を、示したように好中球アポトーシスおよびＰＣＮＡ発現について試験した。
【００８１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび一次転写物（ＰＴ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＰＴリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、Tamassia et al. (2008, J. Immunol.181:6563-6573)に記載のように、公共データベースＲＴプライマーＤＢ（ワールドワイドウェブサイトmedgen.UGent.be/rtprimerdb/）で入手できる遺伝子特異的プライマー対（Invitrogen）を使用して、以下のエントリーコード下で実施した：ヒトＰＣＮＡ（７８３９）、ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（７８４１）およびα２−ミクログロブリン（β２ｍ）（３５３４）。反応条件は、以下のように、全てのプライマーセットについて同一であった：５０℃で２分間、９５℃で２分間、そしてその後、９５℃で１５秒間を４０サイクル、および６０℃で１分間。β２ｍは、白血球におけるその安定な発現レベルから正規化遺伝子として選択された。データをＱ−Ｇｅｎｅソフトウェア（ワールドワイドウェブサイトBioTechniques.com）を用いて計算し、そしてβ２ｍ正規化後に平均発現（ＮＭＥ）単位として表現される。ＰＴリアルタイムＰＣＲを、Rossato et al. (2007, Eur. J. Immunol. 37:3176-3189)に記載のように、選択された遺伝子のイントロン領域から設計されたプライマーを使用して（公共データベースＲＴプライマーＤＢを参照）、以下のエントリーコード下で実施した：ＰＴ−ＰＣＮＡ（７８４０）、ＰＴ−ＢＬｙＳ（７８４２）およびβ２ｍ（３５３４）。同じＲＮＡ試料を逆転写酵素の非存在下において処理し、そしてゲノムＤＮＡコンタミに対するコントロールとして作用した。ノザンブロット分析をTamassia et al. (2008, J. Immunol.181:6563-6573)に記載の通りに実施した。
【００８２】
ＬＰＳにより誘導された気道炎症のin vivoモデル。
末梢血好中球および大腿からのＢＭ成熟好中球を、パーコール密度勾配を使用して、Mocsai et al. (2002, Immunity 16:547-558)に記載のように単離した。マウスにおける鼻腔内ＬＰＳ投与およびＢＡＬＦからの細胞の回収を、Chignard et al. (2000, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)に記載の通りに実施した。マウスを、欧州動物福祉規則に準拠したＩｎｓｅｒｍガイドラインに従って処置した。体重２５〜３０ｇの７週令の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに（Charles Rivers）、ケタミンとキシラジンの混合物の筋肉内注射によって麻酔し、そしてその後、５０μlの食塩水に溶解した３３０μg/kgのＬＰＳを鼻腔内に沈着させた。種々の時点において、動物を致死量のペントバルビタールナトリウム（Sanofi）の腹腔内注射によって殺滅し、肺好中球を単離した。その後、各マウスの気管にカニューレを挿入し、そしてシリンジおよび複数サイクルの食塩水滴下（０．５ml）および吸引を用いて気管支肺胞洗浄を実施して、４mlの気管支肺胞洗浄液の容量を得た。後者を遠心分離にかけ、ペレット化した細胞を回収し、そしてサイトスピン遠心分離およびDiff-Quik製品を用いての染色後に細胞分画を行なった。気管支肺胞洗浄液中の好中球は、フィコール密度勾配遠心分離によって単離された。
【００８３】
プラスミドベクター構築および組換えＰＣＮＡ発現。
組換えＰＣＮＡを、ヒトＰＣＮＡ ｃＤＮＡを含むプラスミドＰＥＴＰＣＮＡ（Dr Bruce Stillmanからの親切なるギフト、Cold Spring Harbor, NY）を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて産生し、そしてWaga et al. (1994, Nature 369:574-578)に記載のように精製した。ＰＬＢ９８５細胞におけるＰＣＮＡの過剰発現を得るために、ＰＣＮＡ ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＤＮＡ３／ｎｅｏ（Invitrogen）のＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩ制限酵素部位との間にサブクローニングした。部位特異的突然変異誘発をQuickchange法（Stratagene）を使用して実施し、ドメイン間接続ループに位置する公知のｐ２１相互作用配列内の荷電アミノ酸上で突然変異したＰＣＮＡを得た（ＰＣＮＡ−Ｄ１２０Ａ−Ｄ１２２Ａ−Ｅ１２４Ａ−Ｅ１３０Ａ−Ｅ１３２Ａ、配列番号１の突然変異の位置）。全てのｃＤＮＡ配列を直接的なシークエンスによって確認した。ＰＬＢ９８５細胞を、AMAXA system（登録商標）装置を使用して、製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。簡潔に言うと、細胞（２×１０６）を、１μgのプラスミド（コントロールｐｃＤＮＡ３−ネオマイシンまたはｐｃＤＮＡ３−ＰＣＮＡまたはｐｃＤＮＡ３−突然変異ＰＣＮＡ）を含む１００μlの細胞系溶液に再懸濁した。その後、細胞を電気穿孔し、そして培養プレートに移した。トランスフェクションされた細胞をクローニングし、そしてネオマイシン（１mg/ml）に対するその耐性に基づいて選択した。
【００８４】
ウェスタンブロット分析および免疫共沈降実験。
好中球に超音波をかけ、そして細胞質タンパク質を、ＰＣ１０ｍＡｂまたはＡｂ５ｐＡｂ抗ＰＣＮＡのいずれかを使用して標準的なイムノブロット手順に従って（Moriceau et al. 2009, J. Immunol.182:7254-7263）分析した。免疫共沈降実験を、空洞現象によって得られた好中球細胞質を使用して実施した（Witko-Sarsat et al. 1999, Blood 94:2487-2496）。細胞質（５００mg）を５０mlのプロテインＧおよびＡｂ５ｐＡｂと混合し、そして振とう下で４℃で３０分間インキュベーションした。試料を、ストリンジェントな洗浄緩衝液（５０mMトリス、５００mM ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で洗浄した、セファロースでコーティングされた磁気ビーズ（Milteny）を含むカラムにのせた。カラムを、この緩衝液を用いて２回、ＮａＣｌが３００mMであること以外は同じ緩衝液を用いて２回、そして最後に塩濃度の低い緩衝液（２０mMトリスｐＨ７．５）を用いて５回洗浄した。試料は、３０mlの５回の試料緩衝液を用いてカラムから溶出され、そして可能性あるパートナーに対する種々のｍＡｂを使用してウェスタンブロットによって分析した。ＰＣＮＡは、ＰＣ１０ｍＡｂを用いてウェスタンブロット上で検出され、そして、プロカスパーゼは、抗プロカスパーゼ−８（Calbiochem）ｍＡｂまたはマウス抗プロカスパーゼ−１０（Santa Cruz）または抗プロカスパーゼ−９（Santa Cruz）または抗プロカスパーゼ−３（Santa Cruz）ｍＡｂのいずれかを用いて、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションした抗マウスＩｇＧ（Nordic Immunology、１：５０００に希釈）を用いて、SuperSignal West Pico検出キット（Pierce）を使用して検出された。
【００８５】
動的シミュレーションを使用した改変されたｐ２１ペプチドのインシリコでの設計。
ＰＣＮＡに結合せず、コントロールペプチドとして使用できる改変されたｐ２１ペプチドを設計するために、本発明者らはまず、３つのカルボキシｐ２１ペプチド（RQTSMTDFYHSKR、配列番号１８）と複合体を形成したＰＣＮＡの２０ns長の分子動力学（ＭＤ）シミュレーションから得られた軌道に基づいたＰＣＮＡ−ｐ２１相互作用（データは示さず）の原子レベルでの詳細度の一覧表を作った。その後、本発明者らは、ＰＣＮＡと強い相互作用を形成するｐ２１ペプチドアミノ酸を同定し、そして続いて、改変されたｐ２１ペプチド（RQTGETDFDHAKA、配列番号１９）と複合体を形成したＰＣＮＡの新たなＭＤシミュレーションを行なった。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションに使用された最初の座標セットを、ペプチドSAVLQKKITDYFHPKK (PDB ID 1VYJ、配列番号２０）と複合体を形成したＰＣＮＡのＸ線構造から調製した。ＰＣＮＡトリマーの３つのシミュレーションを行なった：（ｉ）ＭＤ１：３つの各モノマー（Ｘ線ファイルにおいて標識されたＡ、ＢおよびＥ）と相互作用するｐ２１ペプチド（RQTSMTDFYHSKR、配列番号２１）とＰＣＮＡトリマー、（ｉｉ）ＭＤ２：３つの改変されたペプチド（RQTGETDFDHAKA、配列番号２２）とＰＣＮＡ、および（ｉｉｉ）ＭＤ３；２つのｐ２１ペプチド（ＰＣＮＡモノマーＡおよびＣ上）および１つの改変されたペプチド（ＰＣＮＡモノマーＥ上）とＰＣＮＡ。シミュレーション戦略は、実走行を２０ｎｓ続けること以外は以前に記載のように実施した。システムは、明確な水分子、タンパク質および対イオンを含む、約１０００００原子を含む。計算は、ＮＡＭＤソフトウェアを使用してＣｒａｙＸＴ４の２５６コア上で実施した。得られた軌道の分析は、ＰＣＮＡと改変されたｐ２１ペプチドの間の戦略的な相互作用がないことを示し、それはＰＣＮＡにほとんど結合することができないという証拠を提供する。カルボキシｐ２１とＰＣＮＡとの間の相互作用は、２０ｎｓのシミュレーション中にも安定であり続けた。
【００８６】
統計学的分析。
統計学的分析を、Ｓｔａｔｖｉｅｗソフトウェアパッケージを使用して実施した。スチューデントｔ検定を使用して比較を行なった。Ｐ＜０．０５の場合に差異を有意と判断した。
【００８７】
ペプチド合成。
配列番号９〜１７のペプチドは、ＧｅｎｅＣｕｓｔによって供給された。これらのペプチドは、細胞へのペプチドの侵入を容易にするためのタグを含む。その後、ペプチドをＰＢＳ中で希釈するか、またはエタノールもしくはＤＭＳＯ中に可溶化した。
【００８８】
好中球アポトーシスに対するペプチドの効果。
好中球を、健康なボランティアの血液からポリモルホプレップを使用して単離した（Witko-Sarsat et al. 1999; Blood 94:2487-96）。その後、これらの好中球の生理学的なアポトーシスを、１０％血清の補充されたＲＰＭＩ培養培地中で３７℃で１６時間インキュベーションすることによって活性化した。これらの条件下で、好中球は自発的なアポトーシスを受け、これはホスファチジルセリン外面化を測定することによって評価され得る（Kantari et al. 2007; Blood 110:4086-95; Moriceau et al. 2009; J Immunol 182:7254-63）。ホスファチジルセリンを蛍光色素に結合したアネキシンＶを使用して染色し、Ｆａｃｓｃａｎ（Beckton Dickinson）を使用したフローサイトメトリーによるアポトーシスを受けた好中球の検出が可能となる。アネキシンＶで染色された好中球はホスファチジルセリンを発現し、そしてマクロファージによって認識され食作用を受ける。さらに、７ＡＡＤインターカレーター剤を用いての二次染色を使用して、後期アポトーシスを示した（Durant et al. 2004; J Leukocyte Biol 75:87-98）。従って、全アポトーシスは、７−ＡＡＤ陽性またはアネキシンＶ陽性のいずれかである細胞の比率によって測定される（残りの細胞は生存と判断される）。早期アポトーシスは、アネキシンＶ陽性でかつ７−ＡＡＤ陰性である好中球の比率によって測定される。後期アポトーシスは、アネキシンＶ陽性でかつ７−ＡＡＤ陽性である好中球の比率によって測定される。７ＡＡＤ陽性である壊死細胞は、フローサイトメトリー分析によってサイズ／粒度分布のデータに基づいて分析から排除される。試験したペプチドは、２００μMの最終濃度で好中球培養液に加えられた。
【００８９】
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＮＬＳ（ＳＶ４０）−リンカー−ＰＣＮＡ構築物。
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＮＬＳ（ＳＶ４０）−リンカー−ＰＣＮＡ構築物を、ｐｃＤＮＡ３−ＰＣＮＡと、
【化１】
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とを用いて構築した。
【００９０】
柔軟性があり親水性のリンカー配列は、Leonhardt et al. 2000; J Cell Biol. 149:271-280に記載のｐＥＶＲＦプラスミドからであった。ダイマー化したオリゴヌクレオチドを、Ｎｏｔ１およびＸｈｏ１によって消化されたｐｃＤＮＡ３−ＰＣＮＡと直接ライゲーションした。
【００９１】
実施例２：成熟したヒト好中球は、その細胞質において専らＰＣＮＡを発現する。
好中球溶解液のウェスタンブロット分析は、容易に、リンパ球におけるそれと同等な量のＰＣＮＡを検出したが、ＰＬＢ９８５前骨髄球細胞系におけるそれよりも少ない量のＰＣＮＡを検出した（図１Ａ）。
【００９２】
驚くべきことに、好中球の細胞内分画は、細胞質のみにおける高いＰＣＮＡ含量を示し、そして核および顆粒におけるその不在を示した（図１Ｂ）。分画手順の品質は、それぞれ細胞質、顆粒および核に対して、α−アクチン、エラスターゼおよびラミン−Ｂの特異的マーカーの検出によって検証された。
【００９３】
実施例３：核から細胞質へのＰＣＮＡの再局在化は、顆粒球分化中に起こる。
ＰＣＮＡ細胞内局在はまた、臍帯血から単離され、そしてＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦと共に培養した、ヒトＣＤ３４＋細胞のin vitroにおける顆粒球分化の経過中のＰＣＮＡ免疫標識後の共焦点顕微鏡によって研究された。完全な顆粒球の成熟を、メイグリュンワルドギムザ（ＭＧＧ）染色後に形態学的分析によって評価した。分化を誘導する前は、ＰＣＮＡはＣＤ３４＋細胞の核にほぼ専ら検出可能であったが、ＩＬ３−Ｇ−ＣＳＦ処理から７日後には、前記タンパク質は細胞質と核の混合した分布を示した（図１Ｃ）。１３日目に、殆どの細胞が、多葉性の核を有し、ＰＣＮＡは細胞質に局在し、これは、成熟した末梢好中球に観察されたものと似ている。
【００９４】
核局在、細胞質局在、または核と細胞質の混合した局在を有する細胞を計測することからなる、定量分析（図１Ｃのヒストグラム参照）は、分化した好中球の核から細胞質へのこのＰＣＮＡの再分布を確認した。
【００９５】
実施例４：ＰＣＮＡは、好中球アポトーシスの間にプロテアソーム分解にターゲティングされるが、それはＧ−ＣＳＦによって安定化される。
その現在の名称によって示されるように、ＰＣＮＡレベルは細胞周期中にモデュレーションされ、そして増殖細胞のＳ期の間に特に高い。以下に示したように、ＰＣＮＡ発現はまた、しかしながらその生存状態の関数として、非増殖好中球においてもモデュレーションされているようであった。実際に、常時存在のまたはより顕著な抗Ｆａｓまたはグリオトキシンにより増強されたアポトーシス後に観察され得るように、ＰＣＮＡ発現は、死の経路とは関係なく、アポトーシスを受けた好中球において減少していた（図２Ａ）。アポトーシス過程は、ホスファチジルセリン外面化によって評価され（図２Ｂ）、これは予期された通り、３７℃で１５時間インキュベーションした後のアネキシン−Ｖ＋および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）−細胞の有意な増加を確認し、これはさらに抗ＦａｓｍＡｂまたはグリオトキシンによって増強された。同様に、カスパーゼ−８（図２Ｃ）およびカスパーゼ−３（図２Ｄ）活性の時間依存的な増加が、常時存在のアポトーシス中の好中球において観察され、これもさらに、抗Ｆａｓまたはグリオトキシン曝露後に増強された。最後に、好中球アポトーシスはまた、ＤｉＯＣ６標識後のミトコンドリア脱分極によって実証された。従って、減少したＰＣＮＡ発現（図２Ａ）は、使用した試験または実験条件に関係なく、アポトーシス度と平行するようである。特に、プロテアソーム阻害剤（ＰＳ−３４１）（図２Ｅ）およびＭＧ１３２はアポトーシスにより誘導されるＰＣＮＡ減少を逆転し、そして結果として、好中球の死滅を有意に阻害した。興味深いことに、ＰＳ−３４１もまた、抗Ｆａｓまたはグリオトキシンと共に６時間好中球をインキュベーションした後に行なわれるＰＣＮＡ分解を逆転し（図２Ｆ）、よって、プロテアソームにより媒介されるＰＣＮＡ分解がそれぞれ死のレセプターおよびミトコンドリアアポトーシス経路で起こっていると推測される。
【００９６】
ＰＣＮＡレベルが好中球の生存と密接に連関しているという観察は、好中球の寿命を延ばすと記載されている、Ｇ−ＣＳＦによって維持される安定なＰＣＮＡレベルによって実証された（Maianski et al. 2004; J. Immunol. 172:7024-7030）。事実、ＰＣＮＡ発現動態の分析は、３７℃で６時間インキュベーションした後に観察された減少が、Ｇ−ＣＳＦによって完全に防止され、ＰＣＮＡは１５時間まで上昇したままであったことを明らかとした（図３Ａ）。このようなＧ−ＣＳＦにより誘導されたＰＣＮＡレベル安定化は用量依存性であり、延長された好中球の生存と明瞭に関連していた（図３Ｂ）。２１時間までＧ−ＣＳＦと共に好中球をインキュベーションしても、それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび一次転写物リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価したところ、ＰＣＮＡ ｍＲＮＡ発現または転写は改変されなかったが、ＢＬｙＳ遺伝子発現はアップレギュレーションされた（Scapini et al. 2003; J. Exp. Med. 197:297-302）（図３Ｃ）。これらの観察は、ＰＣＮＡ遺伝子特異的プライマーの種々の対およびノザンブロット実験を使用することによって確認された。特に、細菌に由来したホルミル化ペプチドではなく、インターフェロン−ｇが、ＰＣＮＡ分解を防ぎ、ここでも好中球の生存に対するその防御的効果を支持する。好中球の生存を正に調節する上でのＰＣＮＡの関与はさらに、Ｇ−ＣＳＦで５日間かけて処理した健康ドナーの血液から単離された好中球を調べることによって確認された。実際に、イムノブロットによって評価されたこれらの好中球におけるＰＣＮＡ含量は、Ｇ−ＣＳＦ処理前に比較して顕著に増加した（図３Ｄ）。
【００９７】
共焦点顕微鏡分析（図３Ｅ）によっても確認された、Ｇ−ＣＳＦ処理ドナーにおけるより高い好中球細胞質ＰＣＮＡ発現は、常時存在のアポトーシスを受けるこれらの好中球の傾向が減少したことに明解に関連していた（図３Ｄ）。
【００９８】
実施例５：リポ多糖（ＬＰＳ）により誘導された肺炎症の消退中に単離されたマウス好中球における低いＰＣＮＡレベル。
in vivoにおける好中球生存を調節する際のＰＣＮＡの役割についてより多くの洞察を得るために、本発明者らは、骨髄（ＢＭ）または末梢血のいずれかから単離されたマウス好中球を研究し、そしてそれらがその細胞質内でＰＣＮＡを発現することを観察した（図４Ａ）。ヒト好中球における以前の所見に沿って、グリオトキシンは、アネキシンＶ標識によって評価したところ、用量依存的にＢＭ好中球においてアポトーシスをトリガーする（図４Ｂ）。適切に、プロカスパーゼ−３およびＰＣＮＡ発現の平行的な減少がウェスタンブロット分析によって観察され、従って、ＰＣＮＡがマウス好中球生存に関連することを確認した。本発明者らは次に、炎症消退中における炎症好中球の調査を可能とする、マウスＬＰＳ誘導肺炎症モデルに切り換えた。以前に記載されているように（Chignard et al. 2000; Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090）、ＬＰＳの鼻腔内滴下は、気道内における大量の好中球の動員をトリガーし、２４時間後に最大に蓄積される（図４Ｃ）。炎症の消退はＬＰＳ投与から４８時間後に始まり、そして動員された好中球の減少した流入、増加したアポトーシス、およびマクロファージにより媒介される食作用によって特徴付けられる（図４Ｃ）。特に、好中球数は７２時間後に非常に低く、そして９６時間後に、全ての好中球はマクロファージによって消失したようである（Chignard et al. 2000; Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090）。実際に、ＬＰＳ攻撃から１６時間後に気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から単離された肺好中球は細胞質ＰＣＮＡを発現したが、ＬＰＳ攻撃から４８時間後には、細胞質ＰＣＮＡの発現は、ＰＣＮＡ免疫標識後の共焦点顕微鏡分析によって示されたように殆ど検出できなかった（図４Ｄ）。ＬＰＳ攻撃から４８時間後にＢＭまたはＢＡＬＦから単離された好中球におけるＰＣＮＡのウェスタンブロット分析は、後者における低いＰＣＮＡ発現を確認した（図４Ｅ）。興味深いことに、ＬＰＳ攻撃から４８時間後に単離された好中球は、ＢＭ好中球と比較して、３７℃で一晩培養した後にアネキシンＶ陽性の増加した比率によって実証されたように、弱い生存能を示した（図４Ｆ）。ここでも、高いＢＭ好中球生存率は、顕著に上昇したＰＣＮＡレベルと関連していた。これとは対照的に、肺好中球はＰＣＮＡおよびプロカスパーゼ−３を鋭く消失させ、これによりそのアポトーシス促進状態が実証される（図４Ｅ）。
【００９９】
これらのデータはin vitroにおける所見を拡張し、そしてＰＣＮＡが、好中球の生存能を調節することによって、炎症消退中の好中球の生存／アポトーシスバランスを制御する際に主要なプレイヤーとして作用し得るという概念を支持する。
【０１００】
実施例６：ＰＣＮＡパートナーと干渉することが知られるｐ２１ペプチドは、ＰＣＮＡにより媒介される好中球の抗アポトーシス効果に対抗する
ＰＣＮＡは内因性の酵素活性を全く有さず、そしてその生物学的役割は、種々のパートナーとの会合を媒介するその能力に依拠する（Warbrick et al. 2000; Bioessays 22:997-1006, Maga et al. 2003; J. Cell Sci. 116:3051-3060）。殆どのＰＣＮＡ相互作用はドメイン間接続ループで起こる。現在知られているＰＣＮＡに対して最も高い親和性を有するタンパク質はＣＤＫ阻害剤ｐ２１であり、これは結合ポケットを実質的に満たし、これは細胞複製の阻害および他のＰＣＮＡにより調節される機能におけるその主な役割を説明する。
【０１０１】
それ故、本発明者らは、増殖細胞においてＰＣＮＡパートナーと干渉することができるとして以前に確証された、ｐ２１（いわゆるカルボキシｐ２１）の残基１４１〜１６０に対応するペプチドの効果を試験した（Warbrick et al. 2006; Oncogene 25:2850-2859）。
【０１０２】
成熟好中球においてはｐ２１は基礎条件下で殆ど検出できず（Klausen et al. 2004; J. Leukoc. Biol. 75:569-578）、それにより、細胞質ＰＣＮＡの抗アポトーシス活性の調節におけるその関与は除外される。ＰＣＮＡに結合しない改変されたカルボキシｐ２１ペプチドはまた分子動力学的シミュレーションを使用して設計され、そしてコントロールとして使用された（図５Ａ）。
【０１０３】
ＰＣＮＡに結合しそしてＰＣＮＡパートナーと競合すると推定されるカルボキシｐ２１は、好中球のアポトーシスをトリガーし、これはＤｉＯＣ６標識後の脱分極したミトコンドリアを有する細胞の比率がより高いことによって評価され、一方、改変されたカルボキシｐ２１ペプチドではこのような活性は全く観察されなかった（図５Ｂ）。カルボキシｐ２１のアポトーシス促進効果はまた、アネキシンＶ標識後に外面化したホスファチジルセリンを有する細胞の有意に増加した比率によって実証された（図５Ｃ）。カルボキシｐ２１によりトリガーされたアポトーシスは、ＰＣＮＡ発現の用量依存的な減少と平行したことに注意されたい（図５Ｄ）。さらに、カルボキシｐ２１はＧ−ＣＳＦにより誘導された好中球の生存を有意に阻害し（図５Ｅ）、ここでも好中球生存におけるＰＣＮＡの調節的な役割を強く示唆する。
【０１０４】
これらのデータに基づいて、本発明者らは、カルボキシｐ２１は、細胞周期依存的な機序を介して、おそらく細胞質ＰＣＮＡパートナーと競合することによって、好中球アポトーシスをトリガーしたと結論づけた。
【０１０５】
実施例７：ＰＣＮＡ過剰発現は、好中球の細胞モデルである分化したＰＬＢ９８５においてアポトーシスの誘導を遅延させる。
好中球は、トランスフェクション実験には適さない、短寿命で非増殖性の初代細胞である。それ故、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）処理時に好中球へと分化し得る、ＰＬＢ９８５のような、前骨髄球性細胞株は、成熟好中球を模倣した価値ある細胞モデルを構成する（Pedruzzi et al. 2002; Br. J. Haematol. 117:719-726）。
【０１０６】
従って、ＰＬＢ９８５細胞はｐｃＤＮＡ３ＰＣＮＡ（ＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡ）を用いて安定にトランスフェクションされ、これは細胞分化の前後のＰＣＮＡ免疫標識後の共焦点顕微鏡によって確認された（図６Ａ）。蛍光定量は、空プラスミドで安定にトランスフェクションされたコントロールＰＬＢ９８５と比較して、安定にトランスフェクションされたＰＬＢ−ＰＣＮＡにおける有意に増加したＰＣＮＡ発現を示した（図６Ａ）。ＤＭＦ処理後、分化した顆粒球のそれぞれの表現型および機能的マーカーである、そのＣＤ１１ｂ発現またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性における差異は全く観察されなかった。予期されたように、分化前にはスーパーオキシド産生は全く得られず、一方、有意な化学発光が、コントロールおよびＰＣＮＡを過剰発現するＰＬＢ９８５の両方においてホルボール−１２−ミリステート−１３（ＰＭＡ）によってトリガーされた。従って、ＰＣＮＡ過剰発現は顆粒球分化および応答性に影響を及ぼさなかった。以前に記載されたように、アポトーシスは、ＰＬＢ９８５細胞において、死のレセプター経路を介してＴＲＡＩＬを使用して、またはミトコンドリア経路を介してグリオトキシンを使用してトリガーされ得る（Moriceau et al. 2009; J. Immunol. 182:7254-7263）。ＤＭＦ誘導分化後、ＰＣＮＡを過剰発現するＰＬＢ９８５細胞は、ＤＮＡフラグメンテーション（図６Ｂ）またはクロマチン凝縮（図６Ｃ）によって判断したところ、コントロールプラスミドでトランスフェクションされた分化したＰＬＢ９８５と比較して、ＴＲＡＩＬまたはグリオトキシンにより誘導されたアポトーシスに対して防御された。さらに、ミトコンドリア脱分極またはカスパーゼ−８活性のいずれかは、常時存在、ＴＲＡＩＬまたはグリオトキシンにより誘導されたアポトーシス後のＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡにおいて、コントロールと比較して有意により低かった（図６Ｄ、Ｅ）。その後、ＰＣＮＡ配列の残基１２０〜１３２に対応するｐ２１相互作用ドメインでもあるＰＣＮＡドメイン間接続ループにおける荷電突然変異を使用して、このＰＣＮＡドメインがその抗アポトーシス活性に関与しているかどうかを決定し、よって、ドメイン間接続ループの突然変異したＰＣＮＡを発現するＰＬＢ９８５細胞を作製した。ミトコンドリア脱分極によって評価されるＰＣＮＡの抗アポトーシス活性は、ＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡと比較して、ドメイン間接続ループの突然変異したＰＣＮＡを発現するＰＬＢ９８５において有意に減少した（図６Ｄ）。同様に、この突然変異体ＰＣＮＡを用いて安定にトランスフェクションされたＰＬＢ９８５はまた、ＴＲＡＩＬまたはグリオトキシン誘導アポトーシス後に、ＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡと比較して増加したカスパーゼ−８活性を有していた（図６Ｅ）。アポトーシス刺激の非存在下で、ＰＣＮＡは分化により誘導されるアポトーシスから防御し、これは好中球の生理学的なアポトーシスを反映し得る。
【０１０７】
まとめると、これらのデータは、いくつかのＰＣＮＡタンパク質パートナー（群）はＰＣＮＡドメイン間接続ループに結合して、観察される抗アポトーシス効果を媒介し得ることを強く示唆する。これらの観察はまた、カルボキシｐ２１が、ＰＣＮＡ部位に特異的に結合することによって、好中球のアポトーシスをトリガーすることを示した結果を実証する。
【０１０８】
実施例８：ＰＣＮＡはプロカスパーゼ−８、プロカスパーゼ−１０、プロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−９と会合し、そして後者の活性化を干渉する。
最後に、本発明者らは、好中球細胞質を使用して免疫共沈降（ＩＰ）実験を実施して、その抗アポトーシス活性に関与し得る、可能性ある細胞質ＰＣＮＡパートナーを同定した。
【０１０９】
Ｍｃｌ−１は好中球において発現される最も重要なＢｃｌ−２ホモログの１つであり、その発現はアポトーシス中に減少する。それは増殖中の細胞におけるＰＣＮＡパートナーとして以前に記載されたので（Fujise et al. 2000; J. Biol. Chem. 275:39458-39465）、本発明者らはＰＣＮＡがＭｃｌ−１に結合し得るかどうかを調べた。Ｍｃｌ−１は成功裏に免疫沈降され得たが、ＰＣＮＡと、Ｍｃｌ−１、または他のＢｃｌ−２ホモログ、例えばアポトーシス促進性タンパク質ＢａｘまたはＢｉｄとの間に物理的な会合は全く検出されなかった。
【０１１０】
これとは対照的に、同じＰＣＮＡ免疫共沈降プロトコールを使用して、プロカスパーゼ−８（図７Ａ）、プロカスパーゼ−１０（図７Ｂ）、プロカスパーゼ−３（図７Ｃ）およびプロカスパーゼ−９（図７Ｄ）を特異的ｍＡｂを使用して検出することができた。さらに、相互作用が、ウェスタンブロット分析のための抗プロカスパーゼＩＰおよび抗ＰＣＮＡを使用した相互免疫沈降実験を使用して確認された。さらに、好中球に対して実施された抗ＰＣＮＡおよび抗プロカスパーゼを用いての二重免疫標識からの結果は、ＰＣＮＡがプロカスパーゼ−８、−１０、−３および−９と同じ場所に局在し得ることを強く示唆する。おそらく、細胞質ＰＣＮＡ−プロカスパーゼの相互作用がその活性化を防ぐのだろう。
【０１１１】
その仮説は、全てのアポプトソーム成分、すなわち、以前に記載されたような（McStay et al. 2008; Cell Death Differ. 15:322-331）プロカスパーゼ−９およびアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）を含む好中球細胞質を使用して、in vitroアッセイにおいてプロカスパーゼ−９切断を評価することによって試験した。外来性の精製したチトクロムｃおよびｄＡＴＰは、カスパーゼ−９のウェスタンブロット分析によって証明されるように、時間依存的にプロカスパーゼ−９切断（３７ｋＤａ）をトリガーした（図７Ｅ）。しかしながら、精製したＰＣＮＡを混合物に加えた場合、プロカスパーゼ−９切断は遅延し、持続的なプロカスパーゼ−９（４７ｋＤａ）および３７ｋＤａフラグメントの検出の消滅がなされ、従って、精製したＰＣＮＡはプロカスパーゼ−９の活性化を損なうことを実証する。同じ濃度（１００mM）で試験したオボアルブミンはプロカスパーゼ−９の活性化に影響を及ぼさず、そしてコントロールとして作用した。カスパーゼ−９活性化を次に、ＰＣＮＡまたはドメイン間接続ループ突然変異体を過剰発現するＰＬ９８５細胞において調べた。ＤＭＦへの曝露から６日後、カスパーゼ−９活性は非分化細胞とは異なり上昇した。このカスパーゼ−９活性は、加齢した好中球の生理学的なアポトーシスに対応し得る。特に、この分化により誘導されたカスパーゼ−９活性化は、コントロールＰＬＢ９８５よりもＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡにおいて有意により低く、従って、ＰＣＮＡの抗アポトーシス効果を確認する。これに対し、分化により誘導されるアポトーシスに対する防御効果は、突然変異体ＰＣＮＡを発現するＰＬＢ９８５においては全く観察されなかった（図７Ｆ）。
【０１１２】
合わせると、これらの所見は、ドメイン間接続ループがＰＣＮＡ−プロカスパーゼ−９相互作用に関与することを強く示唆する。
【０１１３】
実施例９：ＰＣＮＡから誘導されたペプチドは、好中球のアポトーシスを増強し得る
ＰＣＮＡの３次元構造を分析し、そしてタンパク質の表面において曝露される領域を同定した。ＰＣＮＡのこれらの曝露された領域から誘導されたペプチドを合成した。これらのペプチドの配列は以下である：
−APNQEKVSDYEMKLM（配列番号２）
−MKLMDLDVEQLGIPEQEYS（配列番号３）
−KDGVKF（配列番号４）
−SQTSNVDKEEEAV（配列番号５）
−MSADVPL（配列番号６）
−YYLAPKIEDEEGS（配列番号７）。
【０１１４】
細胞へのこれらのペプチドの侵入を容易にするために、タグをペプチドに融合させた。２つの異なるタグを使用した：ＨＩＶ−１Ｔａｔポリペプチドから誘導されたＴａｔタグ（YGRKKRRQRRR、配列番号２７）をペプチドのＮ末端に融合するか、またはＲＹＩＲＳタグ（配列番号８）をペプチドのＣ末端に融合させた（表Ｉ参照）。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
ペプチドを好中球細胞に加え、そして細胞アポトーシスに対するその効果を、ホスファチジルセリン外面化を測定することによって分析した。ホスファチジルセリンを蛍光色素に結合させたアネキシンＶを使用して染色し、フローサイトメトリーによるアポトーシスを受けた好中球の検出を可能とした。アネキシンＶで染色された好中球はホスファチジルセリンを発現し、そしてマクロファージによって認識および食作用を受ける。さらに、７ＡＡＤインターカレート剤を用いての２回目の染色を使用して、後期アポトーシスを示し、初期アポトーシスと後期アポトーシスとの間の区別を可能とした。
【０１１７】
結果を以下の表ＩＩからＶＩに示す。
【０１１８】
【表３】
2013522169.tif 000006
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
２００μMの濃度で加えられた場合、配列番号１２の配列のペプチド（ペプチド４）はアネキシンＶ染色の増加を誘導し、そして好中球のアポトーシスを増強するようであった（表ＩＩ）。興味深いことに、このペプチドはＰＣＮＡのｐ２１相互作用部位に対応する。このペプチドのアポトーシス促進活性は、後期アポトーシスで特に明瞭であった（表ＩＶ）。
【０１２４】
さらに、ＰＣＮＡタンパク質の同じ部分に対応するが異なるタグを有する、配列番号１１の配列のペプチド（ペプチド３）もまた、５００μMの濃度で加えられた場合、アネキシンＶ染色の増加を誘導した（表Ｖ）。
【０１２５】
従って、ペプチド３および４は好中球に対してアポトーシス促進活性を示し、そしてそれらを炎症疾病の処置のために使用することができることが実証された。
【０１２６】
さらに、ペプチド８は、好中球に対して有意な抗アポトーシス活性を示すことが判明した。ＰＣＮＡカルボキシ末端に位置しそして好中球生存をトリガーするこのペプチドは、抗アポトーシスタンパク質を安定化させる、ＰＣＮＡ模倣体として作用し得る。この活性は、好中球減少症（周期性または先天性好中球減少症）に観察されるような過剰な好中球アポトーシスの場合に有用であり得る。特に、これらの好中球減少症は、好中球におけるＰＣＮＡ足場を安定化させる化合物であるＧ−ＣＳＦによって処置される（図３／７に示すように）。Ｇ−ＣＳＦ処置を除いて、これらの好中球減少症に対する他の処置はなく、そして高いレベルの好中球アポトーシスを減少させるように探索される可能性ある分子機序はない。従って、その結合部位がＰＣＮＡカルボキシ末端である特異的なＰＣＮＡパートナーと干渉することによって好中球アポトーシスを減少させることは、有望な治療戦略を構成する。
【０１２７】
実施例１０：結果の考察
好中球の寿命のアポトーシスによる調節は、宿主防御エフェクター細胞としてのその機能と、これらの有害な可能性のある細胞の安全なターンオーバーとの間の微細なバランスを提供する。好中球のアポトーシスは炎症の消退に必須であり、そして遅延したアポトーシスおよび損なわれた好中球のクリアランスは、事実、慢性炎症の特徴である。それ故、好中球は注意深く編成された寿命を有し、これは、連続的なステップと重要な制御点を有する予め確立された細胞内「時計」の存在を必要とするが、これは依然として決められていない。
【０１２８】
本明細書において、本発明者らは、ＤＮＡ複製および修復に関与している周知の核タンパク質であり、増殖中の細胞のみにおいて生か死かの決定に関与する中心分子の１つとして考えられるＰＣＮＡは、好中球生存の主要なレギュレーターの全ての特徴を示すことを見出した。実際に、本発明者らは、循環中の成熟好中球は上昇した量のＰＣＮＡを含んでいるが、そのＰＣＮＡ含量はその生存状態の関数として変化したことを観察した。アポトーシスを受ける好中球においては、カスケードをシグナリングするトリガーが外因性（死レセプター）または内因性経路（ミトコンドリア）を通して進行しようと関係なく、ＰＣＮＡはプロテアソームにより媒介される分解を受けた。これに対して、ＰＣＮＡレベルは、好中球の生存を延長する因子、例えばＧ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−ｇによって安定に維持される。さらに、ＬＰＳ誘導肺炎症のマウスモデルにおいて、炎症消退中にＢＡＬＦから単離されたアポトーシス前の好中球におけるＰＣＮＡレベルは、骨髄から精製された完全に生存した好中球におけるものよりもはるかに低く、好中球ＰＣＮＡレベルは、炎症中にその生存状態に応じて変化するという考えを支持する。特に、少なくともヒト好中球におけるＰＣＮＡ含量のモデュレーションは転写後事象のみに関与するようである。なぜなら、ＰＣＮＡｍＲＮＡ発現の変化が、サイトカインにより誘導された好中球の生存中または生理学的アポトーシス中には検出されなかったからである。同様に、ＰＣＮＡ遺伝子誘導が、in vivoにおいてＧ−ＣＳＦで処理したドナーから単離された好中球で起こるとは報告されていない。本明細書において、Ｇ−ＣＳＦで処理したドナーから単離された好中球は、好中球生存におけるその主要な役割を保ちつつ、延長した生存と、しかしまた高いＰＣＮＡ含量を示した。ＰＣＮＡが好中球生存にとって不可欠であるかどうかは、ＰＣＮＡノックアウト動物が現在ないために探索することはできない。
【０１２９】
数多くの研究によると、ＰＣＮＡは、数多くの異なるタンパク質に結合する顕著なアダプター分子として核において機能する。実際に、幾人かの著者が、多くの細胞核プロセス（ＤＮＡ複製、ヌクレオチド切断修復、複製後ミスマッチ修復およびアポトーシスなど）のためのコミュニケーションセンターとして、ＤＮＡ分子に沿った移動プラットフォームである、トリマーＰＣＮＡのための中心的な役割を確立した。
【０１３０】
好中球のような循環していない細胞では、ＰＣＮＡ抗アポトーシス活性は、核機能に全く理論的に関与しない機序を介して進行すべきである。そして実際に、本研究で明らかになった１つの顕著な特徴は、好中球細胞質におけるＰＣＮＡの排他的な局在であり、そして本発明者らは、後の好中球成熟の段階におけるその核から細胞質への再局在化を記述した。核から細胞質への輸送またはＰＣＮＡを細胞質区画内に留めておく隔離機序のいずれかにおける根底にある機序は依然として解読されていない。本発明者らは、初生好中球において、ＰＣＮＡがプロカスパーゼ−８、プロカスパーゼ−１０、プロカスパーゼ−９、プロカスパーゼ−３と構成的に会合し、おそらく、その活性化を防ぐために細胞質内にそれらを隔離していることを明瞭に実証した。ＰＣＮＡによるプロカスパーゼ−９の隔離は、アポトーシスを阻害する非常に効率的な方法であることが分かる。しかしながら、他の細胞質タンパク質との会合が、好中球におけるＰＣＮＡの抗アポトーシス効果を媒介し得ることを除外できない。
【０１３１】
増殖中の細胞においては、ＰＣＮＡは、強力なＣＤＫ阻害剤として初めて同定された、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ２１によって密接に制御される。構造的研究は、ｐ２１がポリメラーゼ結合にとって必要である表面領域を直接的に遮断することを示した。生化学的研究は、ｐ２１が他のＰＣＮＡパートナーに対する効果的な競合物質であることを示すことによって、その概念を広げた。実際に、カルボキシｐ２１ペプチド（ＰＣＮＡ配列上の残基１２０〜１３２）のような、ＰＣＮＡドメイン間接続ループに結合するための共通配列を有する合成ペプチドは、細胞周期を通した進行を停止し、そして増殖中の細胞にトランスフェクションされた場合にアポトーシスを誘導する。本明細書において、本発明者らはカルボキシｐ２１が好中球アポトーシスおよび同時にＰＣＮＡ分解を直接的にトリガーすることを示した；それはまた好中球の生存を延長するＧ−ＣＳＦの能力も損ない、従って、ＰＣＮＡは好中球におけるＧ−ＣＳＦ抗アポトーシス効果にとって絶対に不可欠であることを明らかに証明した。
【０１３２】
これらの観察はまた、合成ＣＤＫ阻害剤であるロスコビチンが、好中球アポトーシスをトリガーし、そして結果として、in vivoにおける炎症消退を促進するという報告と一致する。従って、これらの著者は、これまで細胞周期調節に制限されていたＣＤＫ活性が、好中球のような非増殖細胞においてもアポトーシスを制御し得るという証拠を提供した。ロスコビチンはまた肺感染の後の炎症の消退および加速した回復を向上させることが示されている。さらに、いくつかの細胞周期タンパク質が好中球分化中にダウンレギュレーションされるが、成熟好中球は高いレベルのＣＤＫ２およびＣＤＫ阻害剤ｐ２７を発現した。実際に、炎症中に、好中球は、増殖中の細胞においてアポトーシスと分裂促進進行の制御との間の連関として作用する、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーメンバーであるサバイビンをアップレギュレーションすることができる。従って、ＰＣＮＡ以外の細胞周期調節タンパク質が、同様に好中球の寿命の制御に関与し得る。
【０１３３】
炎症における可能性ある細胞標的としてみなされていた好中球に関する殆どの研究は、その移動および流入を遮断するように試みた。しかしながら、ターゲティングし得る好中球生物学の別の局面は、しばしば過小評価されているけれども、好中球生存のモデュレーションである。この後者の点では、好中球の生存／死を制御する特異的で密接に調節された分子機序の徹底的な解明が、効率的および効果的に介入するために必要とされる。本明細書において報告された結果は特筆すべきであるが、これはＰＣＮＡが好中球生存の糸を引っ張る細胞質プラットフォームとして作用するという実証だけによるものではなく、また、炎症または好中球減少症の観点から好中球およびその細胞内経路について考える新たな方法を白日の下にさらしたことによるものでもある。
【０１３４】
実施例１１：ＣＤＫ２またはＧＡＤＤ４５ｓｉＲＮＡは、アポトーシスに対してＤＭＦ分化ＰＬＢ９８５を感作した
ＣＤＫ２およびＧＡＤＤ４５は、増殖細胞におけるＰＣＮＡの核パートナーであると記載されている。本発明者らは、ＣＤＫ２およびＧＡＤＤ４５の両方が好中球細胞質内に存在し、ｓｉＲＮＡ技術を使用したＣＤＫ２およびＧＡＤＤ４５タンパク質のレベルの減少が、好中球に分化したＰＬＢ９８５細胞を感作し、アポトーシスに対して好中球に分化したＰＬＢ９８５細胞を増強したことを示した。
【０１３５】
特に、ｓｉＲＮＡ手順を、ＤＭＦ処理から３日後および４日後に、５日目のアポトーシス率の分析前に実施した。この時点で、ＤＭＦにより分化したＰＬＢ９８５細胞において全てのＰＣＮＡは細胞質にあった。ＣＤＫ２またはＧＡＤＤ４５ｓｉＲＮＡの効果はＣＤ１１ｂ発現に対して全く観察されず、従って、それは分化過程に影響を及ぼさなかったことを示唆する。混ぜたｓｉＲＮＡではなく、ＣＤＫ２またはＧＡＤＤ４５ｓｉＲＮＡが、ミトコンドリア脱分極によって評価したところ、ＰＬＢ９８５細胞が分化後に受ける構成的アポトーシスを僅かにしかし有意に増強した（図８）。
【０１３６】
これらのデータは、ＰＣＮＡパートナー、すなわちＣＤＫ２およびＧＡＤＤ４５αとの干渉が、好中球アポトーシスをトリガーし得るという新たな所見を確認する。
【０１３７】
実施例１２：顆粒球分化中の核から細胞質への再局在化は、成熟好中球におけるＰＣＮＡの抗アポトーシス活性に必須である
「好中球様細胞」と考えられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）により分化したＰＬＢ９８５細胞を使用して、ＰＣＮＡ抗アポトーシス活性に対するＰＣＮＡ排出のモデュレーションの影響を研究した。ＰＣＮＡの核隔離が成熟好中球においてそのＰＣＮＡ抗アポトーシス活性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＰＬＢ９８５細胞を、ＳＶ４０−ＮＬＳ−ＰＣＮＡと称される核ＰＣＮＡ突然変異体を用いて安定にトランスフェクションし；実際に、以前に記載のように、ＰＣＮＡとＳＶ４０ＮＬＳの融合によりその排他的な核局在が得られる。従って、本発明者らは、以前に野生型ＰＣＮＡについて記載したように、ＳＶ４０−ＮＬＳ−ＰＣＮＡが、分化したＰＬＢ９８５細胞において抗アポトーシス効果を有するかどうかを研究した。予期した通り、核へと侵入する増加した能力を示すＳＶ４０−ＮＬＳ−ＰＣＮＡ突然変異体の過剰発現は、ＰＣＮＡ免疫標識後の直接的な蛍光によって証明されたように、未分化のＰＬＢ９８５細胞において増加したＰＣＮＡ核局在をもたらした。同様に、損なわれた核から細胞質への再局在が、ＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡと比較して増加した核蛍光によって証明されたように、ＤＭＦにより分化したＰＬＢ９８５−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＰＣＮＡにおいて観察された。核免疫蛍光の定量は、ＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡと比較してＰＬＢ９８５−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＰＣＮＡにおいて観察された有意な増加を確認した。しかしながら、ＰＣＮＡの核から細胞質への再局在化におけるこの欠陥にも関わらず、ＤＭＦ処理後のＣＤ１１ｂ発現における有意な差異は、ＰＬＢ９８５−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＰＣＮＡとＰＬＢ９８５−ＰＣＮＡとの間に全く観察されなかった。これらのデータは、ＰＣＮＡ核保持は、ＣＤ１１ｂ発現によって評価したところ顆粒球分化を阻害しなかったことを示唆する（図９Ａ）。本発明者らは次に、この核ＳＶ４０ＮＬＳ−ＰＣＮＡ突然変異体が、好中球に分化したＰＬＢ９８５においてその抗アポトーシス活性を依然として媒介し得るかどうかを研究した。直接的にＢａｋに結合してミトコンドリア脱分極をトリガーする真菌毒素であるグリオトキシンを使用してアポトーシスをミトコンドリア経路を介してトリガーした。本発明者らは、野生型ＰＣＮＡを過剰発現するＰＬＢ９８５細胞は、Ｄｉｏｃ６標識（図９Ｂ）およびＤＮＡフラグメンテーション（図９Ｃ）後に測定したミトコンドリア脱分極によって判定したところ、コントロールプラスミドでトランスフェクションされたＰＬＢ９８５と比較して、グリオトキシンにより誘導されるアポトーシスに対して防御されたことを確認した。予測されたように、核ＳＶ４０−ＮＬＳ−ＰＣＮＡ突然変異体を発現するＰＬＢ９８５は抗アポトーシス活性を示すことができず、従って、成熟好中球におけるその抗アポトーシス活性に対するＰＣＮＡ細胞質細胞内局在の不可欠な役割を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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