(57)【要約】  担子菌、特に担子菌フラムリナ・ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）から生じるアスパラギナーゼ酵素。Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を加水分解する方法。Ｌ−アスパラギンを含む物質におけるアクリルアミドの形成を低減する方法も記載される。【選択図】図２
2013539358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌から得ることができるアスパラギナーゼ酵素。
【請求項２】
前記担子菌が担子菌フラムリナ・ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）である、請求項１に記載のアスパラギナーゼ酵素。
【請求項３】
下記アミノ酸配列を有するアスパラギナーゼ酵素。
【化１】
2013539358.tif 000003
【請求項４】
固体形態、液体形態、又は固体と液体との中間の形態の、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素と、ラクトース、グリセロール又はアルブミンのいずれか１種から選択される賦形剤と、の組み合わせ。
【請求項６】
Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を加水分解する方法であって、
Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を含む物質を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素で処理する工程を含む方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を含む物質は、ヒトが摂取可能な製品又は動物が摂取可能な製品の少なくとも１種である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記物質は、飲料、カカオ豆、チーズ、コーヒー豆、菓子類、デザート、パン生地、ドレッシング、フライドポテト、ドリンク、肉製品、メディカルサプリメント、栄養補助食品、ペットフード、ポテトチップ、ソース、スナック又はスープの少なくとも１種から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
Ｌ−アスパラギンを含む食品物質におけるアクリルアミドの形成を低減する方法であって、
前記Ｌ−アスパラギンを含む食品物質に、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素を適用する工程と、
前記Ｌ−アスパラギンを含む物質を加熱する工程と、
を含む方法。
【請求項１０】
加熱が少なくとも１２０℃まで行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ−アスパラギンの供給源は、ヒトが摂取可能な製品又は動物が摂取可能な製品の少なくとも１種である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明の分野は、担子菌類、特に担子菌類フラムリナ・ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）から得ることができるアスパラギナーゼ酵素に関する。Ｌ−アスパラギンとＬ−グルタミンを加水分解する方法も開示される。Ｌ−アスパラギンを含む物質におけるアクリルアミドの形成を低減する方法もまた開示される。
【発明の背景】
【０００２】
食品技術におけるアスパラギナーゼ酵素の適用は、還元性炭水化物の存在下、食品の熱処理がアスパラギンをアクリルアミドにある程度変換するという発見に由来する。炭水化物は食品中にアミノ酸と同じくらい遍在していることから、食品の熱処理の間に発癌性及び遺伝毒性のあるアクリルアミドを発生させる恒常的リスクが存在する。熱処理とは、例えば、食品を焼いたり（ｂａｋｉｎｇ、ｒｏａｓｔｉｎｇ又はｂａｂｅｃｕｉｎｇ）揚げたりすることである。食品の熱処理中のアクリルアミドの形成開始は１２０℃超の温度で観察される。ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品添加物専門家委員会（ＪＥＣＦＡ）は、アクリルアミドへの食事曝露は、その遺伝毒性及び発癌性を考えるとヒトの健康上の懸念を意味する可能性があると述べている（２０１０年７月１日に閲覧したｗｗｗ．ｉｎｃｈｅｍ．ｏｒｇ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｊｅｃｆａ／ｊｅｃｅｖａｌ／ｊｅｃ＿４１．ｈｔｍを参照）。
【０００３】
食品産業における特定の懸念は、性質上熱処理を必要とする、多くのさまざまな、例えばパン、クッキー、スナック、ビスケット、シリアル、ロースト種子（カカオ、コーヒーなど）、押出成形及びカットされたポテト製品について生じる。
【０００４】
食品の熱処理は食品の品質にとって不可欠である。例えば、食品の褐変（メイラード）反応は、食品に典型的な風味、色及び抗酸化物質を形成する。さらに、食品の微生物学的安全性及び長期保存性は食品の熱処理によって達成される。
【０００５】
食品の熱処理の前にＬ−アスパラギンの選択的除去を可能にすることは望ましいことであろう。
【０００６】
アンチセンスのアスパラギンシンターゼ遺伝子及び塊茎特異的プロモーターを使用するジャガイモの遺伝子工学は、ジャガイモの塊茎に由来するアスパラギンを低減はするが排除はしないことが報告されている（Ｒｏｍｍｅｎｓ  ２００７）。アスパラギンの完全な排除はおそらくその植物を致死させるであろう。
【０００７】
酵素は、他の食品成分に影響を与えることなく、ある食品成分を改質するための理想的な選択ツールである。食品における酵素の触媒作用は、高い基質及び反応特異性、及び酵素作用の穏やかな物理的条件によって区別される。食品における酵素作用は、有機溶媒又は重金属が関与しないことから、より環境に優しい（「グリーンケミストリー」、「ホワイトバイオテクノロジー」）。食品成分の改質に用いられる酵素は、食品における毒性化合物の形成をもたらしうる副反応を回避しつつ単一の食品成分を改変することを可能とする。
【０００８】
しかしながら、食用タンパク質に由来するタンパク質結合アミノ酸（例えばアスパラギン）の選択的加水分解に関しては、現在のところ想定可能な酵素技術はない。各食品材料の典型的な構造特性及び官能特性を維持しつつ、となるとなおさらである。
【０００９】
食品中の例えば遊離性及び可動性のアスパラギンをアスパラギン酸へと加水分解することは望ましいことであろう。そうすれば、食品が熱処理される際にアスパラギンがアクリルアミド形成の前駆体分子として機能することはない。
【現況技術】
【００１０】
アスパラギナーゼ（ＥＣ  ３．５．１．１；Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラーゼ）は、アンモニアの放出を伴うＬ−アスパラギンのアスパラギン酸への加水分解を触媒する酵素である。その名の通り、アスパラギナーゼ酵素は線形のアミドにおける窒素−炭素結合に作用するが、Ｌ−アスパラギンのペプチド結合には作用しない。
【００１１】
Ｌ−アスパラギンは、検出された最初のアミノ酸であり（１８０６年、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の絞り汁）、Ｌ−アスパラギンは全ての生体細胞に遍在する。したがって、アスパラギナーゼ酵素は、原核微生物から脊椎動物まで自然界に豊富に存在する。Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｙ．Ｓ．及びＧｒｏｓｓｏｗｉｃｚ，Ｎ．，Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｍｉｄｅｓ  ｂｙ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６５：７１６−７２０（１９５７年）；Ｈｏ，Ｐ．Ｐ．Ｋ．，Ｆｒａｎｋ，Ｂ．Ｈ．及びＢｕｒｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６５：５１０−５１２（１９６９年）；Ｓｕｌｄ，Ｈ．Ｍ．及びＨｅｒｂｕｔ，Ｐ．Ａ．，Ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅｓ−Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｐａｐａｉｎ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｌｉｖｅｒ  Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４５：２７９７−２８０１（１９７０年）を参照。３２６アミノ酸を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来する四量体のアスパラギナーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｃｈ．及びＨａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ．  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｎａｔｕｒｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７０，  ９（１８），ｐｐ３５８５−３５９０）が最初に詳細に調べられた。
【００１２】
最近まで、Ｌ−アスパラギナーゼは、白血病細胞及び肥満細胞腫とする癌治療において細胞増殖抑制剤として使用されていた（Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｆ．Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ：Ｅｉｎ  ｎｅｕｅｓ  Ｐｒｉｎｚｉｐ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｉｅ  ｍａｌｉｇｎｅｒ  Ｎｅｏｐｌａｓｉｅｎ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９６９，  １９（６），３５１−３５６）。
【００１３】
つい最近になって、アスパラギナーゼ酵素は細菌（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ），Ｓｃｏｔｔｉら，２０１０；パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ），Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｓｔｏｅｆｆｅｌｅ及びＳｔｒｕｈａｌｌａ，２００８）及びカビ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ），Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎら，２００８年；アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ），Ｍａｔｓｕｉら，２００８年）に由来することが報告されている。二価及び三価のカチオン及び種々のアミノ酸及び遊離チオールの添加（Ｅｌｄｅｒら、２００７年）、又はアルファアミラーゼ（ｄｅ  Ｂｏｅｒ，２００６年）の添加、又はリン酸又はクエン酸と併用した塩化カルシウムの添加（Ｅｌｄｅｒら，２００５年）は、何らかの形でアスパラギナーゼ酵素の活性を支援することが主張されている。
【００１４】
グルタミナーゼ酵素はアスパラギナーゼ酵素に関連する。グルタミナーゼ酵素は、典型的には、例えばニワトリの腸内細菌叢で生じる乳酸菌（Ｔｈｏｎｇｓａｎｉｔら，２００８年；ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ），Ｗｅｉｎｇａｎｄ−Ｚｉａｄｅら，２００３年）、又は酵母（チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ），Ｉｙｅｒ及びＳｉｎｇｈａｌ，２０１０年）、又は海生菌類（ビューベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ），Ｓａｂｕら，２００２年）、又はアスペルギルス属のカビ（Ｐｒａｓａｎｔｈら，２００９年）から生じる。
【００１５】
食品技術におけるアスパラギナーゼ酵素の協奏的使用は最近のことである。２００７年にＰｒｅｖｅｎｔＡｓｅ（ＤＳＭ）酵素が欧州市場に導入された。ＰｒｅｖｅｎｔＡｓｅ（ＤＳＭ）酵素は、組み換えカビであるアスペルギルス・ニガーによって産生される。アクリルアウェイ（Ａｃｒｙｌａｗａｙ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）という名称の競合するアスパラギナーゼ酵素は、関連カビ種であるアスペルギルス・オリザエから得られており、これは、アスペルギルス・オリザエに由来するアスパラギナーゼ酵素をコードする遺伝子を担持する、遺伝的に改質された株の液中供給バッチ発酵（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ  ｆｅｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用することによって得られている。両アスペルギルス属（アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリザエ）は、安全な産業的使用の長い歴史を有し、天然に幅広く分布し、食品等級の酵素の製造に一般に使用されているとされている。
【００１６】
ベーキング用途では、アスパラギナーゼ酵素は、典型的には、アクリルアミドの形成を排除するために、食品の熱処理（例えばベーキング）の前にパン生地と混合される。フライドポテトには、アスパラギナーゼ酵素溶液中でのジャガイモ片の浸漬又はジャガイモ片へのアスパラギナーゼ酵素溶液の噴霧が使用されうる。このような処理は非常に有効でありうる。ポテトチップの製造では、Ｃｏｒｒｉｇａｎ（２００８年）は、未処理のポテトチップと比較して、最終製品中のアクリルアミドレベルが１６８８μｇ／ｋｇから６０μｇ／ｋｇに低下したことを報告している。アクリルアミドの形成の＞９９．９％の低下は実現可能なものと予想されていた（Ｅｌｄｅｒら，２００４年）。
【００１７】
アスパラギナーゼ酵素は包装前の工程で食品の熱処理によって加熱不活性化されることから、食品に適用されるアスパラギナーゼ酵素に関して製品の安全性は問題ではない。それ故、アスパラギナーゼ酵素は活性型で消費者に触れることはなさそうである。
【００１８】
担子菌類由来の酵素：
約１，０００種の食用菌類のほとんどは担子菌門（担子菌類）の部類に属している。担子菌類はしばしば高等菌類と呼ばれる。担子菌類は、４つの減数胞子を持つ柱状細胞を形成することによって繁殖する。担子菌類の生体構造は名前になっている（ラテン語Ｂａｓｉｄｉｕｍ＝柱）。担子菌類は、豊かな風味を有し、低エネルギーでありながらタンパク質及び繊維を多く含むことにより世界中で好まれている。さらに、アジアの文化では、担子菌類の多くに特有の健康保護及び治癒活性が付与されている。
【００１９】
腐生栄養性の担子菌類は、一般に、森林の有機堆積物、森林の土壌、葉のくず、及び倒木に存在する。栄養細胞は、長い糸状細胞（菌糸）を形成して地下の領域に広がる。地球上で最も厄介な有機材料である三次元のリグニンネットワーク上で生存するために、担子菌類は著しく強力な酸化還元酵素を有する。酸化還元酵素の中でもとりわけ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、万能ペルオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２産生ペルオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ）、及びラッカーゼ型のフェノールオキシダーゼが挙げられる。グリコシダーゼ（例えばセルラーゼ）もまた見出され、木のセルロース部分の分解に役立っている。
【００２０】
落葉樹及び針葉樹は多量のタンパク質及びアミノ酸を含まないことから、この特定の自然環境で増殖する菌類におけるアスパラギナーゼ酵素活性の発生は想定されないであろう。
【００２１】
担子菌類に由来するフラムリナ・ベルティペスの栽培品種は、エノキタケ、ｇｏｌｄｅｎ  ｎｅｅｄｌｅ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ又はｖｅｌｖｅｔ  ｆｏｏｔとしても知られる。長く細い白色の子実体を形成するフラムリナ・ベルティペスは、多用途のキノコとしてアジア料理に用いられる。キノコは伝統的に、生のまま使用されるか、スープ、サラダ及び他の料理用に缶詰にされる。キノコは約１週間冷蔵保存することができる。
【発明の目的】
【００２２】
本発明の目的は、高活性及び高い操作安定性を有するアスパラギナーゼ酵素を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、アスパラギナーゼ酵素の使用によって食品中のアクリルアミドの形成を低減することである。
【発明の概要】
【００２４】
本発明の一態様において、本発明は、担子菌、特に担子菌フラムリナ・ベルティペスから得ることができるアスパラギナーゼ酵素に関する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を加水分解する方法に関する。該方法は、Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を含む物質を、担子菌から得ることができるアスパラギナーゼ酵素で処理することを含む。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、Ｌ−アスパラギンを含む物質におけるアクリルアミドの形成を低減する方法に関する。該方法は、Ｌ−アスパラギンを含む物質に、担子菌から得ることができるアスパラギナーゼ酵素を適用することを含む。また、該方法は、Ｌ−アスパラギンを含む物質を加熱することを含む。
【００２７】
Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの少なくとも１種を含む物質は食品であってもよい。
【００２８】
本発明はさらに、本発明の方法によって得られる製品にも関する。
【００２９】
以下、本発明は、添付の図面に示す幾つかの実施形態に関連して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】液内培養で増殖したフラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素の細胞内形成の時間的経過を示す図である。
【図２】液内培養で増殖したフラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素の細胞外形成の時間的経過を示す図である。
【図３】フラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素のゲノム（Ａ）及びコード（Ｂ）ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（Ｃ）を示す図である。最初の１９アミノ酸はシグナル配列であることが判明した。
【図４】異種宿主としての大腸菌において発現させ、粗酵素として使用した、フラムリナ・ベルティペス由来のアスパラギナーゼ酵素の耐塩性を示す図である。
【図５】異種宿主としての大腸菌において発現させ、粗酵素として使用した、フラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図６】フラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素の最適ｐＨを示す図である。
【図７】異種宿主としての大腸菌において発現させ、粗酵素として使用した、フラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】ａ）活性染色した非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、及びｂ）フラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素の変性ＰＡＧＥ分離を示す図である。
【図９】フラムリナ・ベルティペスのアスパラギナーゼ酵素の最適温度を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００３１】
本発明及びその利点の完全な理解のため、図面を併用して本発明の詳細な説明を行う。
【００３２】
特許請求の範囲及び以下の詳細な説明を考慮すれば、本発明のさまざまな態様は、本発明を製造及び使用するための特定の方法の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されよう。
【００３３】
本発明において、アスパラギナーゼ酵素という用語は、Ｌ−アスパラギン及びＬ−グルタミンの両方を加水分解することができる酵素を指して用いられる。
【００３４】
本発明の目的は、アスパラギナーゼ酵素を用いて、アクリルアミド前駆体であるＬ−アスパラギンの協奏的酵素加水分解を行うことによって、熱処理された食品における発癌性のアクリルアミドの形成を著しく低減させることである。
【００３５】
本発明の一実施形態では、アスパラギナーゼ酵素の製造方法が開示される。アスパラギナーゼ酵素は操作安定性を有し、担子菌類フラムリナ・ベルティペスの菌糸体から得られる。
【００３６】
フラムリナ・ベルティペスの菌株は、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，ドイツ，ブラウンシュワイク）又はＣＢＳ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，オランダ，ユトレヒト）などの菌株保存機関を通じて市販されている。
【００３７】
野生地から子実体を採取することは必要とされないことから、担子菌類フラムリナ・ベルティペスの菌糸体の使用は生産及び培養の容易さの点で大きな有利性を有する。この担子菌類フラムリナ・ベルティペスは食材として広範に使用されているが、健康上のリスク又は安全上の懸念は見られない。
【００３８】
担子菌類フラムリナ・ベルティペスの菌体は、最低限の培地添加物しか要求されない液内培養で容易に増殖させることができる。有機炭素源、窒素源及びリン源は存在する必要がある。これらの供給源は、典型的には、酵母抽出物などの天然の混合物、又はグルコース＋無機アンモニウム及びリン酸塩によって提供される。微生物のすべての栄養培地において推奨される少量及び微量元素の混合物が添加される。担子菌類フラムリナ・ベルティペスの培養は、液内培養で３〜２０日間行われることが好ましく、６〜１５日間が好ましい。担子菌類フラムリナ・ベルティペスの培養中の温度は典型的には１０〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃である。ｐＨは約４〜８が典型的であり、約５〜７が好ましい。さらに、本発明の方法では弱光条件が典型的である。
【００３９】
バイオマス及びアスパラギナーゼ酵素の製造方法は温和な条件下で実施され、先行技術の方法とは対照的に環境に優しい。
【００４０】
アスパラギナーゼ酵素活性は、最初に図１に示すように細胞内に蓄積され、次に、図２に示す栄養培地へと分泌される。
【００４１】
栄養培地は、本発明の方法の操作、並びに当技術分野で既知の方法を用いたアスパラギナーゼ酵素の単離及び濃縮を容易にする。用いる方法としては、限外濾過、沈殿又は吸着が挙げられる。こうして細胞フリーのアスパラギナーゼ酵素の濃縮培養上清を得、技術的加水分解にさらに使用してもよい。アスパラギナーゼ酵素は、当技術分野で既知の方法により単離してもよいが、単離は必須ではなく、得られたアスパラギナーゼ酵素の粗混合物を本発明の方法にさらに使用してもよい。
【００４２】
フラムリナ・ベルティペスの液中培養の過程で、細胞内のアスパラギナーゼ酵素活性のピークは約１週間後に見られる。細胞外空間への排出は１２日後に開始され、およそ１４日後にピークに達する。
【００４３】
図８に見られるように、非変性ポリアクリルアミドゲル上の活性染色は触媒特異性を裏付けた。また、１３及び７４ｋＤａに精製酵素の活性バンドを示し、モノマー型に加えてオリゴマー型が存在することを示していた。
【００４４】
最高純度のアスパラギナーゼ酵素が必要とされる場合には、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の組み換え産物を使用してもよい。組み換え株を発現させるためには、アスパラギナーゼ酵素の全アミノ酸配列を知っておく必要がある。アスパラギナーゼ酵素の全アミノ酸配列は図３に示す通りである。これは、構造遺伝子の全３７２塩基配列から推定した全１２３アミノ酸部分の配列を示している。１８塩基対のシグナル配列がコード領域に先行する。
【００４５】
アスパラギナーゼ酵素は基質に加えられる。アスパラギナーゼ酵素を基質に加えることによって、アスパラギナーゼ酵素が基質と接触することが意図される。これは、アスパラギナーゼ酵素を用いて基質に対して例えば噴霧、浸漬又はコーティングを行うことを含みうる。基質は、好ましくは、Ｌ−アスパラギン又はＬ−グルタミンのいずれか１種を含む食品材料である。アスパラギナーゼ酵素は、比活性に応じて、通常、合計レベルで１〜２００ミリモルの濃度、好ましくは１０〜２０ミリモルの濃度で基質に適用される。アスパラギナーゼ酵素は純粋なタンパク質として加えることができる。或いは、アスパラギナーゼ酵素は、ラクトース、グリセロール又はアルブミンなどの材料をアスパラギナーゼ酵素に加えて投与を容易にすることによって、目的の用途に適合させることができる。製造した又は適合させたアスパラギナーゼ酵素は、酵素錠剤、顆粒、安定化液体又はペースト状調製物の形態をとることができる。
【００４６】
基質の加水分解を行うと、処理前の基質と比較してアスパラギン又はグルタミンレベルが著しく低下した基質が得られる。加水分解に使用可能な条件は標準的なものであり、当業者は容易に決定できる。
【００４７】
アスパラギナーゼ酵素活性はアスパラギナーゼ酵素が存在する化学的環境の影響を受けないことから、処理される基質としては、例えば以下のものが挙げられる。
飲料
カカオ豆
チーズ
コーヒー豆
菓子類
デザート
パン生地
ドレッシング
フライドポテト
フルーツドリンク
肉製品
医療食
栄養補助食品
ペットフード
ポテトチップ
ソース
スナック
スープ
【００４８】
特に、基質はヒト又は動物によって摂取可能な品目である。
【００４９】
基質におけるアスパラギンの加水分解の程度は、アスパラギンの低下又はアスパラギン酸若しくはアンモニアの増加を測定することによって、或いは食品の加工後に残存するアクリルアミドのレベルを測定することによって評価できる。
【００５０】
本発明の利点は、得られた新規のアスパラギナーゼ酵素が特異的な親和性を有し、Ｌ−アスパラギンの加水分解効率を改善することである。
【００５１】
さらに驚くべきことは、高温、高イオン強度及び種々のｐＨ条件を伴う工程での使用を可能にする、アスパラギナーゼ酵素の操作安定性に関する優れた技術的特性である（図４〜７）。水以外の付加的又はさらなる補助基質は必要ない。
【００５２】
新規のアスパラギナーゼ酵素は、良好なｐＨ安定性及びｐＨ５．５〜９の幅広い最適ｐＨを有する（図５、６参照）。大半の食品のｐＨはこの範囲にある。
【００５３】
アスパラギナーゼ酵素の操作安定性は５５℃という高温でも低下しない（図７参照）。
【００５４】
等電点ゲル電気泳動で決定したアスパラギナーゼ酵素のモノマー及びオリゴマーの等電点はほぼ５．２である。全配列から推定したアスパラギナーゼ酵素のモノマー及びオリゴマーの分子量は１２．８であり、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）から推定した凝集形態の分子量は約７４である（図８参照）。
【００５５】
図３に示すアスパラギナーゼ酵素の特有の配列はＥＳＩ−ＭＳ分析により決定した。最初に見出されたペプチドの相同性が最も高かったのは、カルボキシラーゼ／メタロペプチダーゼ（Ｅ値＞３０）、リパーゼ／エステラーゼ／デアセチラーゼ（Ｅ値＞１００）、及びペプシン様アスパラギン酸／グリコシドヒドロラーゼ（Ｅ値＞１４）であった。全般に不均一な結果及び乏しいＥ値は、このアスパラギナーゼ酵素は先例がなく真に新しいことを示している。これは、固有の起源である担子菌類の種によって説明される。
【００５６】
以下の非限定的な実施例での例示を通じて本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例において、使用した材料及び方法の概略は以下に説明する通りである。
【００５８】
［材料及び方法］
フラムリナ・ベルティペスの培養：
すべての培地及び機器は使用前にオートクレーブにかけ、実験全般を通じて標準的な滅菌方法を適用した。標準的な寒天培地（グルコース一水和物：３０．０ｇ／Ｌ；アスパラギン一水和物：４．５ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４：０．５ｇ／Ｌ；酵母抽出物：３．０ｇ／Ｌ；寒天：１５．０ｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．００５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０９ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．０３ｇ／Ｌ及びＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）０．４ｇ／Ｌを含む微量金属溶液：１．０ｍＬ／Ｌ）上でフラムリナ・ベルティペスを維持した。滅菌処理前に培地のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ６に調整した。
【００５９】
ウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ）（Ｍｉｃｃｒａ  Ｄ−９，Ａｒｔ，ドイツ，ミュールハイム）を用いて、１００ｍＬの滅菌標準栄養液中、フラムリナ・ベルティペスの菌糸体を有する１０×１０ｍｍの寒天プラグをホモジナイズすることによって、前培養液を調製した。液内培養液を２４℃及び１５０ｒｐｍで維持した。５日間の培養後、前培養液５０ｍｌを、最少培地（ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４：０．５ｇ／Ｌ；微量金属溶液：１．０ｍｌ／Ｌ）及びグルテン４０ｇ／Ｌ又はグルタミン１０ｍＭからなる本培養液２５０ｍｌにそれぞれ移した。
【００６０】
フラムリナ・ベルティペスからのアスパラギナーゼ酵素の調製：
１８日間の培養後、培養液を濾過し、細胞外のアスパラギナーゼ酵素含有上清（２００ｍＬ）を逆さまにして泡立てた［１］。１０，０００ｋＤａのＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いた限外濾過によって保持液を濃縮し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５を用いたＳｕｐｅｒｏｓｅ６のサイズ排除クロマトグラフィーによって両タンパク質を分離した。
【００６１】
活性試験：
０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０中の１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン又は１０ｍＭ  Ｌ−アスパラギンをそれぞれ３７℃まで予熱した。アッセイは、合計反応体積１５０μＬに天然酵素５０μｌ又は組み換え酵素１０μｌの添加によって開始し、１０〜２０分の後に３％ＴＣＡ  ２０μＬの添加又は９５℃での１０分間の加熱によって停止させた。アミノ酸なしで対照実験を行った。ＨＰＬＣにより生成物の形成を追跡した。３７℃で１分当たり１μＭのグルタミン酸又はアスパラギン酸をそれぞれ産生するのに必要とされる酵素の量として、一単位の酵素活性を計算した。
【００６２】
Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  Ｐｙｒａｍｉｄ，５μｍ，４ｍｍＩＤのカラム、溶離液Ａとしてメタノール、溶離液Ｂとして０．１Ｍ酢酸ナトリウム＋０．０４４％トリエチルアミン（ＨＣｌでｐＨを６．５に調整）、誘導体化試薬としてｏ−フタルジアルデヒド、及び蛍光検出器を使用してＨＰＬＣを行った。
【００６３】
遊離タンパク質：
標準としてウシ血清アルブミンを使用し、ローリー法に従って加水分解上清中のタンパク質濃度を測定した。
【００６４】
最適温度及びｐＨ：
培養中に又は組み換えタンパク質が可溶形態で入手可能になった後に酵素溶液を回収して、アスパラギナーゼ酵素の最適温度及びｐＨの決定を行った。３７℃において、ｐＨ４〜９（０．１Ｍ酢酸ナトリウム：ｐＨ４、５；０．１Ｍリン酸カリウム：ｐＨ６、７、８；０．１Ｍ炭酸ナトリウム：ｐＨ９）の範囲で最適ｐＨを調べた。最適温度は、最適ｐＨにおいて２０〜７０℃であった。
【００６５】
温度及びｐＨ安定性：
ｐＨ安定性を決定するために、１０μＬの組み換え酵素を３７℃で１６時間、４０μＬの上記各緩衝液中でインキュベートした。０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７）中の１０ｍＭグルタミン１００μＬを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。基質なしで対照実験を行った。反応を９５℃で１０分間停止させた。上述のＨＰＬＣ分析の後、生成したグルタミン酸を計算した。
【００６６】
温度安定性の分析のために、１０μＬの組み換え酵素を、それぞれの温度で１時間、４０μＬの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中でインキュベートした。その後、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７）中の１０ｍＭグルタミン１００μＬを加え、アッセイ混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。基質なしで対照実験を行った。反応を９５℃で１０分間停止させた。上述のＨＰＬＣ分析の後、生成したグルタミン酸を計算した。
【００６７】
トリプシンペプチドのＥＳＩ−タンデムＭＳ分析：
ペプチダーゼバンドをＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切り出し、乾燥し、トリプシン消化した。標準的なプロトコルに従って、得られたペプチドを抽出、精製した。ナノスプレーイオン源及び金コーティングしたキャピラリーを備えたＱｔｏｆ  ＩＩ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，英国）を用いて、ペプチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳを行った。衝突誘起解離実験のため、多価親イオン衝撃を四重極質量分析計からコリジョンセルへと選択的に伝達した（２５〜３０ｅＶ）。得られた娘イオンを直交飛行時間型質量分析計によって分離した。ＥＳＩ−タンデムＭＳ分析から得られたペプチドマスフィンガープリントを、公開されているタンパク質一次配列データベースにおける異種間のタンパク質同定に使用した。
【００６８】
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ及び変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
１２％のポリアクリルアミド分離用ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。アスパラギナーゼ酵素溶液２０μＬとローディング緩衝液［０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８），０．２Ｍ  ＤＴＴ，４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，０．２％ブロモフェノールブルー］２０μＬとを混合、１５分間沸騰させることによってサンプルを調製した。ゲル当たり２０ｍＡでの電気泳動の後、ゲルを銀又はクマシーブリリアントブルーで染色した。分子定量のために、２５０〜１０ｋＤａのマーカータンパク質（ＢｉｏＲａｄ，ドイツ）を使用した。
【００６９】
非変性条件下でＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。ローディング緩衝液［０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０．１％ブロモフェノールブルー］と１：１（ｖ／ｖ）で混合することによってサンプルを調製した。ゲル当たり１０ｍＡ及び８℃における電気泳動の後、ゲルを２．５％トリトンＸ−１００で２回洗浄した。染色は、グルタミナーゼによりＬ−グルタミンが脱アミドして、Ｌ−グルタミン酸が生成することに基づいている。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるＬ−グルタミン酸の酸化は、テトラゾリウム色素の不溶性着色ホルマザンへの還元と共役している。グルタミナーゼ染色液は、Ｌ−グルタミン１５ｍＭ、ウシ肝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ０．５ｇ／ｍＬ、リン酸カリウム（ｐＨ７）０．１Ｍ、ＮＡＤ２ｍｇ／ｍＬ、フェナジンメトスルファート０．０４ｍｇ／ｍＬ、及びニトロブルーテトラゾリウム２ｍｇ／ｍＬを含んでいた。酵素活性は、３７℃でのインキュベーション後に紫色バンドとして現れた。
【００７０】
等電点電気泳動法：
３５００Ｖｈ（２０００Ｖ，６ｍＡ，１２Ｗ）でｐＨ３〜１０の固定化ｐＨ勾配（Ｓｅｒｖａ，ドイツ）を備えるセルバライト（Ｓｅｒｖａｌｙｔ）（商標）プレコート（Ｐｒｅｃｏｔｅｓ）（商標）プレキャストゲルを用いて、ＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，スウェーデン）でＩＥＦポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ｐＩ３．５〜１０．７のタンパク質試験混合物（Ｓｅｒｖａ，ドイツ）を用いてアスパラギナーゼの等電点を５と推定した。ゲルを上述のようにクマシー染色、銀染色又は活性染色した。
【００７１】
ＲＮＡの調製：
ヌクレオスピン（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ）（登録商標）ＲＮＡプラントキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，ドイツ，デューレン）を用いて、ＲＮＡレイター（ＲＮＡＬａｔｅｒ）（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に保管した菌糸体５００ｍｇからＲＮＡを調製した。
【００７２】
ｃＤＮＡの合成：
全ＲＮＡ  ５μｇを３’ＰＣＲ（ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ  ３０＊Ｔ  ＶＮ）  ２５ｐｍｏｌと混合し、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏで１１μｌになるまで満たした。混合物を７０℃で５分間インキュベートし、その後、氷上で２分間冷却した。５×反応緩衝液  ４μｌ、ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ当量）２μｌ、リボロック（ＲｉｂｏＬｏｃｋ）（商標）０．５μｌ及びＳＭＡＲＴ  ＩＩＡ（ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧ）  ２０ｐｍｏｌを加えて混合し、３７℃で５分間インキュベートした。リバートエイド（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ）（商標）ＨマイナスＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素  ２００Ｕの添加後、混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。７０℃で５分間加熱することによって停止反応を行った。
【００７３】
１０×ロングＰＣＲ緩衝液  ２．５μｌ、ｄＮＴＰミックス（２．５ｍＭ当量）２μｌ、５’ＰＣＲ（ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ）  ２５ｐｍｏｌ、３’ＰＣＲ  ２５ｐｍｏｌ、ＤＭＳＯ  １μｌ、ロングＰＣＲ酵素ミックス  １Ｕ、ｓｓ  ｃＤＮＡ  ３μｌを加え、さらに２５μｌになるまでｄｄＨ２Ｏを加えて混合することによって、第二鎖合成を行った。
【００７４】
反応混合物を９４℃で５分間インキュベートし、その後、９４℃で２０秒間及び６８℃で６分間のインキュベーションを３０サイクル行い、最終的な伸長を６８℃で２０分間行った。
【００７５】
酵素及び試薬は、ドイツ，ザンクト・レオン＝ロートのＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。オリゴヌクレオチドは、ドイツ，エーバースベルクのＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
【００７６】
配列探索：
ペプチド配列から変性プライマーを推定した。１０×トゥルースタート（ＴｒｕｅＳｔａｒｔ）（商標）Ｔａｑ緩衝液  ２．５μｌ、ｄＮＴＰミックス（２．５ｍＭ当量）２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、フォワードプライマー２５ｐｍｏｌ、リバースプライマー２５ｐｍｏｌ、ＤＭＳＯ  ０．８μｌ、トゥルースタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼ  ０．６２５Ｕ、ｄｓ  ｃＤＮＡ  １μｌを加え、さらに２５μｌになるまでｄｄＨ２Ｏを加えて混合することによって、ＰＣＲを行った。
【００７７】
反応混合物を９５℃で５分間インキュベートし、その後、９５℃で３０秒間、（７２℃〜１℃／サイクル）で６０秒間、及び７２℃で９０秒間のインキュベーションを１２サイクル行うことによって、タッチダウンＰＣＲ［２］を行った。６０℃のアニーリング温度で別の２５サイクルを行った。最終的な伸長を７２℃で２０分間行った。
【００７８】
ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ酢酸，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８））中で加熱したアガロースゲル電気泳動（１％アガロース（Ｓｅｒｖａ，ドイツ，ハイデルベルク）によってＰＣＲを分析した。ＤＮＡ検出のために、約５０℃まで冷却後、０．０５‰ＳＹＢＲＳａｆｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を溶液に添加した。
【００７９】
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてアガロースゲルからＤＮＡの抽出を行った。
【００８０】
ベクター１μｌ、１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液  １μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ  ５Ｕ、５ｍＭ  ＡＴＰ  ０．５μｌ及びインサートＤＮＡ  ６．５μｌを混合することによって、ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（登録商標）ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結させた。反応混合物を２５℃で２時間インキュベートした。
【００８１】
形質転換のために、連結反応混合物５μｌを化学的コンピテント大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌに加えて氷上で２０分間インキュベートし、４２℃で４５秒間熱ショックを与え、氷上に再び戻した。ＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５００μＬをすぐに添加した。細胞を２００ｒｐｍ及び３７℃で６０分間振とうし、その後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（Ｒｏｔｈ）２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天上に置いた。植菌したプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【００８２】
コロニーＰＣＲによって陽性クローンの選択を行った。反応混合物は上記のように構成されていたが、プライマーＭ１３  ｕｎｉ（−２１）（ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）及びＭ１３  ｒｅｖ（−２９）（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ）を使用した。反応混合物に白色コロニー物質を再懸濁することによってテンプレートを加えた。
【００８３】
反応混合物を９５℃で５分間インキュベートし、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間／ｋｂのインキュベーションを４０サイクル行った。最終的な伸長を７２℃で２０分間行った。
【００８４】
ヌクレオスピンプラスミドＤＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（ドイツ，エーバースベルク）により配列決定を行った。
【００８５】
配列を完成させるために、同定されたアスパラギナーゼＤＮＡ断片から特異的プライマーを得、それぞれ、プライマー５’ＰＣＲ又は３’ＰＣＲと対を形成させた。５５℃でのアニーリング及び７２℃で１分間の伸長工程において上述のようにＰＣＲを行った。
【００８６】
５５℃でのアニーリング及び７２℃での１分間の伸長工程において、プライマーＦｖＮａｓｅ＿５’（ＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＧ）及びＦｖＮａｓｅ＿３’（ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧ）を用いて全アスパラギナーゼ配列の増幅を達成した。
【００８７】
配列を確認するために、ゲノムのＤＮＡ精製キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて菌糸体からゲノムＤＮＡを調製した。全アスパラギナーゼ配列を増幅し、配列を決定した。
【００８８】
ＤＮＡ及びアミノ酸配列の分析：
シグナルＰ３．０を用いた分析によってＮ末端シグナル配列の同定を行った［３］。ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋデータベース検索によって配列相同性を調べた［４］。
【００８９】
大腸菌における異種発現：
アスパラギナーゼをクローニングするために、プラスミドＤＮＡからその遺伝子を、両末端に隣接する制限部位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩに対してプライマーＦｖＮａｓｅ＿ＥｃｏＲＩ（ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣ）及びＦｖＮａｓｅ＿ＢａｍＨＩ（ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡ）を使用したＰＣＲによって増幅した。遺伝子カセットを消化し、Ｘ−ＺｙｍｅのｐＣＴＰ２発現ベクターにライゲーションして、発現構築体ｐＣＴＰ２−Ａｓｐａを得た。ＯＤ６００ｎｍが０．７になるまで、３７℃で、ｐＣＴＰ２−Ａｓｐａで形質転換された大腸菌株ＤＨ５α及びＪＭ１０５をＬＢ培地で増殖し、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発し、さらに一晩培養した。細胞をトリス緩衝液ｐＨ７．５に再懸濁し、超音波処理により溶解させ、遠心分離により細胞破壊片を除去した。硫酸アンモニウムを用いてアスパラギナーゼの精製を促進させた。
【００９０】
バチルス・サブティリス由来の組み換えアスパラギナーゼ：
細菌からのタンパク質の分泌はＡＴＰ依存性プロセスであり、これは、プレタンパク質の転座、及びそれに続く膜外表面におけるプレタンパク質のタンパク質分解的切断による成熟酵素の生成を含む。シグナル配列は、転座のために膜にタンパク質を標的化するのに必要なすべての情報を含む。
【００９１】
バチルス・サブティリスにおける分泌は大腸菌における分泌ほどは理解されていないが、同一の機構によって進行するものと一般に考えられている（Ｓａｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．，Ｊｒ．，Ｗｅｒｎｅｒ，Ｐ．Ｋ．及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍ．，１９８９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ  ５３：３３３−３６６；Ｏｖｅｒｈｏｆｆ，Ｂ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．，Ｓｐｉｅｓ，Ｍ．及びＦｒｅｕｄｌ，Ｒ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４１７−４２３）。二組の分泌タンパク質間の差異の１つはシグナルペプチドの長さであり、グラム陽性菌では対応するグラム陰性菌と比較して最大で２０アミノ酸長い傾向にある。よって、バチルス・サブティリスなどのグラム陽性菌において異種タンパク質を発現させるための一般的な戦略は、宿主の分泌器官に標的タンパク質を結合させることを含む（Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ａ．，１９８９，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃ．Ｈａｒｗｏｏｄ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３−１１４）。上記方法を用いた標準的なプロトコルは当技術分野で知られているが、それを、バチルス・サブティリスによる組み換えアスパラギナーゼの過剰発現に使用した。
【００９２】
［実施例１−フラムリナ・ベルティペスの培養］
すべての培地及び機器は使用前にオートクレーブにかけ、実験全般を通じて標準的な滅菌法を適用した。標準的な寒天培地（グルコース一水和物：３０．０ｇ／Ｌ；アスパラギン一水和物：４．５ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４：０．５ｇ／Ｌ；酵母抽出物：３．０ｇ／Ｌ；寒天：１５．０ｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．００５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０９ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．０３ｇ／Ｌ及びＥＤＴＡ  ０．４ｇ／Ｌを含む微量金属溶液：１．０ｍＬ／Ｌ）でフラムリナ・ベルティペスを維持した。滅菌処理前に培地のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ６に調整した。
【００９３】
ウルトラタラックス（Ｍｉｃｃｒａ  Ｄ−９，Ａｒｔ，ドイツ，ミュールハイム）を用いて、１００ｍＬの滅菌標準栄養液中、フラムリナ・ベルティペスの菌糸体を有する１０×１０ｍｍの寒天プラグをホモジナイズすることによって、前培養液を調製した。液内培養液を２４℃及び１５０ｒｐｍで維持した。５日間の培養後、前培養液５０ｍｌを、最少培地（ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４：０．５ｇ／Ｌ；微量金属溶液：１．０ｍｌ／Ｌ）及びグルテン４０ｇ／Ｌ又はグルタミン１０ｍＭからなる本培養液２５０ｍｌにそれぞれ移した。
【００９４】
［実施例２−フラムリナ・ベルティペスからの酵素の調製］
１８日間の培養の後、培養液を濾過し、細胞外の酵素含有上清（２００ｍＬ）を逆さまにして泡立てた。アスパラギナーゼ及びもう一種類のタンパク質のみが上清に残った。限外濾過（ＭＷＣＯ  １０，０００）により残りの液体を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６のサイズ排除クロマトグラフィーにより両タンパク質を分離した。
【００９５】
最初に存在した加水分解活性のほとんどが回復した。このことは、このプロトコルがわずか二工程を通じて有用な酵素濃縮物を生じさせたことを示している。
【００９６】
［実施例３−天然酵素を用いたＬ−アスパラギンの加水分解］
０．１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭアスパラギン１００μＬを３７℃で５分間予熱した。酵素溶液５０μＬを加えて反応を開始させた。３７℃及び４００ｒｐｍのサーモシェーカーで２０分間のインキュベーションの後、ＴＣＡ  ２０μＬを加えることによってアッセイを停止させた。基質なしで対照実験を行った。ＯＰＡ誘導体化後にＨＰＬＣによりアスパラギン酸含量を定量的に測定し、サンプルと対照の差異を利用して酵素の活性を計算した。
【００９７】
分析的証拠は、基質であるＬ−アスパラギンの迅速な酵素加水分解を示している。
【００９８】
［実施例４−天然酵素を用いたＬ−グルタミンの加水分解］
０．１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭグルタミン１００μＬを３７℃で５分間予熱した。酵素溶液５０μＬを加えて反応を開始させた。３７℃及び４００ｒｐｍのサーモシェーカーで２０分間のインキュベーションの後、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）２０μＬを加えることによってアッセイを停止させた。基質なしで対照実験を行った。ＯＰＡ誘導体化後にＨＰＬＣによりグルタミン酸含量を定量的に測定し、サンプルと対照の差異を利用して酵素の活性を計算した。
【００９９】
この分析的証拠は、基質であるＬ−グルタミンに関するアスパラギナーゼの有用な副活性を示している。
【０１００】
［実施例５−組み換え酵素を用いたＬ−アスパラギンの加水分解］
０．１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭアスパラギン１４０μＬを３７℃で５分間予熱した。水で２００倍に希釈した組み換え酵素溶液１０μＬを加えて反応を開始させた。３７℃及び４００ｒｐｍのサーモシェーカーで１０分間のインキュベーションの後、９５℃で１０分間加熱することによってアッセイを停止した。基質なしで対照実験を行った。ＯＰＡ誘導体化後にＨＰＬＣによりアスパラギン酸含量を定量的に測定し、サンプルと対照の差異を利用して酵素の活性を計算した。アスパラギンに関する組み換えアスパラギナーゼ酵素の活性を計算すると４３．３ｋＵ／Ｌであった。
【０１０１】
［実施例６−組み換え酵素を用いたＬ−グルタミンの加水分解］
０．１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭグルタミン１４０μＬを３７℃で５分間予熱した。水で２００倍に希釈した組み換え酵素溶液１０μＬを加えて、反応を開始させた。３７℃及び４００ｒｐｍのサーモシェーカーで１０分間のインキュベーションの後、９５℃で１０分間加熱することによってアッセイを停止した。基質なしでブランクを調製した。ＯＰＡ誘導体化後にＨＰＬＣによりグルタミン酸含量を定量的に測定し、サンプルとブランクの差異を利用して酵素の活性を計算した。グルタミンに関する組み換えアスパラギナーゼの活性を計算すると４．３ｋＵ／Ｌであった。
【０１０２】
本発明について詳細に説明してきたが、詳細な説明は、その発明の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。特許証により保護されるのが望ましいものは、以下の特許請求の範囲に記載の通りである。
【図１】
2013539358.tif 000004
【図２】
2013539358.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2013539358.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
2013539358.tif 000015
2013539358.tif 000016
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