(57)【要約】  本発明は、グラム陰性細菌の免疫原性組成物およびワクチン、それらの製造、ならびに医学分野でのそうした組成物の使用の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞外亜鉛の取り込みに関与する、グラム陰性細菌の外膜タンパク質を含む、免疫原性組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要ならばキャリアタンパク質と結合して、少なくとも第1のグラム陰性細菌菌株の外膜タンパク質を認識する免疫応答を引き起こす能力を有する抗原を含有する、免疫原性組成物またはワクチンであって、前記外膜タンパク質は細胞外亜鉛の取り込みに関与するものである、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２】
前記の第1のグラム陰性細菌菌株がナイセリア菌株でない、請求項１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３】
前記外膜タンパク質が、PCT/EP2009/052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO 00/55327に記載の配列番号２もしくはそれに記載のその断片、WO 99/57280に記載の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO 00/11182に記載の配列番号2、4、および6、もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列で構成されない、請求項１または２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４】
前記外膜タンパク質が、内在性外膜タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５】
前記外膜タンパク質が、600-1000アミノ酸長である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６】
細胞外亜鉛の取り込みにおける前記外膜タンパク質の関与は、前記タンパク質を欠失した外膜小胞に対する亜鉛の結合が減少する、および/または、前記タンパク質を欠失した細胞で亜鉛の蓄積が減少するということである、および/または、前記タンパク質を欠失した細胞が唯一の亜鉛源としてカルプロテクチンの存在下で生育する能力の低下を示すということである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７】
前記外膜タンパク質の発現が、低い細胞外亜鉛濃度に応答してアップレギュレートされる、請求項１〜６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８】
低い細胞外亜鉛濃度に応じた、前記外膜タンパク質発現のアップレギュレーションは、前記タンパク質の発現が亜鉛キレート剤の存在下でアップレギュレートされる可能性があるということである、請求項７に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９】
前記の第１のグラム陰性細菌菌株が、低い遊離亜鉛レベルを示すヒトおよび/または動物の身体部分に感染する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０】
前記の低い遊離亜鉛レベルが、亜鉛のカルプロテクチンとの結合に起因する、請求項９に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１】
前記の第１のグラム陰性細菌菌株が、ヒトおよび/または動物の気道もしくは血液もしくは尿路もしくは腸に感染する、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２】
前記の第１のグラム陰性細菌菌株が、ボルデテラ属（Bordetella）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；ボレリア属（Borrelia）；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病ボレリア）（Borrelia burgdorferi）；ブルセラ属（Brucella）；ヤギ流産菌（Brucella melitensis）；ヒツジ流産菌（Brucella ovis）、クラミジア属（Chlamydia）；クラミジア・シタッシ（オウム病クラミジア）（Chlamydia psittaci）；クラミジア・トラコマチス（トラコーマクラミジア）（Chlamydia trachomatis）；大腸菌属（Escherichia）；大腸菌（Escherichia coli）；ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；レジオネラ属（Legionella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）；エルシニア属（Yersinia）；エルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；赤痢菌属（Shigella）；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）；シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）；コクシエラ属（Coxiella）；および コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii）からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３】
前記の第１のグラム陰性細菌菌株が、アシドボラックス属（Acidovorax）; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４】
前記外膜タンパク質が、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５】
前記抗原が、前記外膜タンパク質に由来するポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６】
抗原を含有する、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含んでおり、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７】
抗原を含有する、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、加えて前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８】
前記抗原もしくはポリペプチドもしくは前記免疫原性断片が、PCT/EP2009/052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO 00/55327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO 99/57280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO 00/11182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列を有していない、請求項１７または１８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９】
少なくとも１つの追加の抗原を含有する、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０】
前記抗原もしくはポリペプチドもしくは免疫原性断片がTdfIタンパク質に由来する、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；および配列番号49からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するか、または前記ポリペプチドが、前記の一群から選択される配列の免疫原性断片を含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるが、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項２０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
G - S/A/V - S/A/V/G - X - P - V/l/M - V/l - - G - Q/M/L - X - G/S/A - X - R 
を含む、請求項２０または２１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の91-104位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項２２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
D - V/A/M - S/A - 2(X) - S/G - P/A - D - H - T/A/N -V/l
を含む、請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の116-126位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項２４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
G - L/V/A/l - V/l - N/D - V/l/L - X - D - X - K/ - l/L/V - P
を含む、請求項２０〜２５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の154-164位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項２６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
G - X - G/S/A - Y/F/W/V - G/S/T/N - X - Q/R/L - 3(X) - Y - G - L/l/V - L/l/P - G/A - H/D
を含む、請求項２０〜２７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の250-265位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項２８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
R - X - D/E - X - R/K/Q/D - G/T/S/A - E/Q/S/D - 3(X) - P - 3(X) - l/F/V/L - 3(X) - R/A/K/Q - 5(X) - D/N/R/G - Y - X - H - X - E
を含む、請求項２０〜２９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３１】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の334-363位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項３０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３２】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
R - X - P - X - A/P/V/T - Q/E/M - E - L/M - Y/F - A/S/Y/T - X - G - X - H - X - A - T/L/S - X - T/S/A - F/Y/l/V - E/Q - (1-9)X - G - D/N/Q - X - X - L
を含む、請求項２０〜３１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３３】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の510-536、537、538、539、540、541、542、543もしくは544位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項３２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３４】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
Y - X - Q/G - 2(X) - A - X- - F/L/Y/l - X - G - X - E/D - G/A/V - 3(X) - Y/F/H/Q - 8(X) - G/S/A/T - X - F/S - G - D - X - V/l - R/K/N - A/G
を含む、請求項２０〜３３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３５】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の595-628位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項３４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３６】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
P/A - R - X - P/S/A - A/P/G - X - R - L/V/A - S/G
を含む、請求項２０〜３５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３７】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号１の657-665位、または配列番号２〜49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項３６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３８】
前記の少なくとも1つの追加の抗原が、TdfHタンパク質、またはその免疫原性断片である、請求項１９〜３７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３９】
前記TdfHタンパク質が、配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するか、または請求項４２〜５５のいずれか１つに記載のTdfHタンパク質であり、または前記免疫原性断片が、前記の一群のアミノ酸配列から選択される配列の免疫原性断片であって、その前記免疫原性断片が、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項３８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４０】
前記抗原または前記ポリペプチドまたは前記免疫原性断片がTdfHタンパク質に由来する、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するか、または前記ポリペプチドが前記の一群から選択される配列の免疫原性断片であって、その前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項４０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４２】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片がアミノ酸モチーフ：
R - S/T - V/l - P - G - A - F/Y - T - Q/N - Q/V/L/l - D - K/Q - G/A/S - S/Q - G - X - V/L - S - V/L - N -V/l - R - G - X - S/N/T - G - F/L - G - R - V/A - N - S/T - M/Q - V/l - D - G - V/l - S/T - Q - T - F
を含む、請求項４０または４１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４３】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の81-121位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項４２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４４】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
F - S/N/D/E - G - S/T/A/K - A/G/S/N - G - l/L/V/A - N - S/T/A - L - X - G - S - A - N - L/F - R/K -T - L/l - G/N/S - V/A - D/N - D
を含む、請求項４０〜４３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４５】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の156-178位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項４４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４６】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
S - X - R/K/Q - X - V/l/S/L - S/A - Q - N/D - Y/F - R/K - V/l - G - G - G
を含む、請求項４０〜４５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４７】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の226-239位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項４６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４８】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
L - F/A/L/V - K - L/l/F/V - E/R - Y - X - G/N/D/S - V/D/K/H - 4(X) - T/G/N/l - A/L - Q/N/S -F/L/l/Y - R - X - L/M/Y - X - T/N - X -l/L/V - G/A/S - S/T/G - R - K/R/N/S - l/L - X - N - R/D/K/N - N/T - Y - Q
を含む、請求項４０〜４７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４９】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の333-367位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項４８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５０】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
P - X - G - S/K/E - Q - X - F/l - N/H/K/l - T/S - F/l/V/L - Y - F/L/l - D
を含む、請求項４０〜４９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５１】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の491-503位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項５０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５２】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
N - H/Y - S - V/A/L/M - S/T/l/M - l/L/F - S - A - X - F/Y/L/l - G/D/S/H - D/T/P - Y/G/L - F -M/N/S/T - P - F - X - S/T/G - Y/F - S/A - R/H/K - T/S - H - R - M/l/V/A - P - N - l/V - Q/K/R - E -M/Y/V - Y/F - F - S/T
を含む、請求項４０〜５１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５３】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の574-608位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項５２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５４】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ：
E/D - V/l - K/Q - N - L/A/V - F/L - D - R/K - R/L/K/N - Y - l/V/M - D/N - P/A - L - D/Y
を含む、請求項４０〜５３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５５】
前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の846-860位、または配列番号51〜71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC末端に含有する、請求項５４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５６】
前記の少なくとも１つの追加の抗原が、TdfIタンパク質またはその免疫原性断片である、請求項１９および請求項４０〜５５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５７】
前記TdfIタンパク質が、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；および配列番号49からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するか、もしくは請求項２２〜３７のいずれか１つに記載のTdfIタンパク質であって、または前記免疫原性断片が、前記の一群のアミノ酸配列から選択される配列の免疫原性断片であって、その前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項５６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５８】
前記の少なくとも１つの追加の抗原が、fHbpポリペプチド、Hsfポリペプチド、Hapポリペプチド、NadAポリペプチド、およびlipo28ポリペプチドからなる一群から選択されるか、またはそれらの免疫原性断片である、請求項１９〜５７および２７２〜２７８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５９】
前記抗原を有する細菌外膜小胞標品を含有する、請求項１〜５８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６０】
前記抗原の発現が、前記外膜小胞標品においてアップレギュレートされている、請求項５９に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６１】
前記アップレギュレーションが、同一菌株の野生型細菌由来の外膜小胞標品における前記抗原の発現に対する相対的なものであって、たとえば外膜小胞を調製した野生型細菌と比較される、請求項６０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６２】
前記アップレギュレーションが、1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5または10倍以上である、請求項６０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６３】
前記外膜小胞標品をもたらす宿主細胞が、前記抗原の生産について遺伝的に改変されている、請求項５９〜６２のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６４】
前記外膜小胞標品をもたらす宿主細胞が、内在性タンパク質の機能発現の破壊によって遺伝的に改変されており、このタンパク質は遺伝的改変のない宿主細胞では前記抗原の発現を抑制する、請求項６３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６５】
前記宿主細胞が、異種の、および/または、強力な、および/または、亜鉛で制御されない、プロモーターからの前記抗原の発現をもたらすよう遺伝子改変されている、請求項６３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６６】
内在性タンパク質は、遺伝的改変のない宿主細胞では、内在性プロモーターと結合することによって前記抗原の発現を抑制するが、その内在性タンパク質が、前記の異種の、および/または、強力な、プロモーターと結合しない、請求項６５に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６７】
前記異種プロモーターが、宿主細胞内で、前記抗原の内在性プロモーターより強力なプロモーターとなる、請求項６５または６６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６８】
前記の異種の、および/または強力なプロモーターが、IPTG誘導性プロモーターである、請求項６５〜６７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６９】
前記内在性タンパク質が、ナイセリア菌またはグラム陰性細菌のZurリプレッサーである、請求項６４または６６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７０】
前記外膜小胞標品が、２つ以上のグラム陰性細菌菌株から分離される、請求項５９〜６９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７１】
前記グラム陰性細菌菌株の少なくとも１つは、請求項１２または１３に記載の一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項７０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７２】
製薬上許容される賦形剤を含有する、請求項１〜７１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７３】
アジュバントを含有する、請求項１〜７２のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７４】
亜鉛塩を含有する、請求項１〜７３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７５】
抗原および、場合によっては、追加の抗原をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜５８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、前記ポリヌクレオチドが真核生物プロモーターに、機能しうるように連結されている、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７６】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、グラム陰性細菌菌株による感染に対する免疫応答、たとえば防御反応を生じさせる能力を有する、請求項１〜７５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、２つ以上の異なる細菌菌株による感染に対する免疫応答、たとえば防御反応を生じさせる能力を有する、請求項７６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７８】
１つまたは複数の前記の異なるグラム陰性細菌菌株が、ボレリア属（Borrelia）；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病ボレリア）（Borrelia burgdorferi）；ブルセラ属（Brucella）；ヤギ流産菌（Brucella melitensis）；ヒツジ流産菌（Brucella ovis）；クラミジア属（Chlamydia）；クラミジア・シタッシ（オウム病クラミジア）（Chlamydia psittaci）；クラミジア・トラコマチス（トラコーマクラミジア）（Chlamydia trachomatis）；大腸菌属（Escherichia）；大腸菌（Escherichia coli）；レジオネラ属（Legionella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；エルシニア属（Yersinia）；エルシニア・エンテロコリチカ（腸炎エルシニア）（Yersinia enterocolitica）；赤痢菌属（Shigella）；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）；シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）；コクシエラ属（Coxiella）；コクシエラ・ブルネッティ（Q熱コクシエラ）（Coxiella burnetii）；Acidovorax; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）からなる一群から選択される細胞属もしくは種に属する、請求項７６または７７に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７９】
請求項５９〜６９の免疫原性組成物またはワクチンの外膜小胞標品をもたらすことができる、遺伝子操作されたグラム陰性細菌菌株。
【請求項８０】
防御的用量または有効量の、請求項１〜７９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、グラム陰性細菌感染またはグラム陰性細菌性疾患を治療または予防するための方法。
【請求項８１】
グラム陰性細菌感染もしくはグラム陰性細菌性疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはグラム陰性細菌性疾患の予防もしくは治療用の薬剤の、製造に使用するための、請求項１〜７９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８２】
前記グラム陰性細菌感染またはグラム陰性細菌性疾患が、ボレリア属（Borrelia）；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病ボレリア）（Borrelia burgdorferi）；ブルセラ属（Brucella）；ヤギ流産菌（Brucella melitensis）；ヒツジ流産菌（Brucella ovis）；クラミジア属（Chlamydia）；クラミジア・シタッシ（オウム病クラミジア）（Chlamydia psittaci）；クラミジア・トラコマチス（トラコーマクラミジア）（Chlamydia trachomatis）；大腸菌属（Escherichia）；大腸菌（Escherichia coli）；レジオネラ属（Legionella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；エルシニア属（Yersinia）；エルシニア・エンテロコリチカ（腸炎エルシニア）（Yersinia enterocolitica）；赤痢菌属（Shigella）；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）；シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）；コクシエラ属（Coxiella）；コクシエラ・ブルネッティ（Q熱コクシエラ）（Coxiella burnetii）；Acidovorax; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）からなる一群から選択される細菌属または種に属するグラム陰性細菌菌株によって引き起こされる感染または疾患である、請求項８０に記載の方法、または請求項８１に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンもしくは使用。
【請求項８３】
前記感染または疾患が、ナイセリア菌株以外のグラム陰性細菌菌株によって引き起こされる感染または疾患である、請求項８２に記載の方法、または免疫原性組成物もしくはワクチンもしくは使用。
【請求項８４】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８６】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシドボラックス属（Acidovorax）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項８４または８５に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８７】
防御用量もしくは有効量の、請求項８４または８５に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシドボラックス属（Acidovorax）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項８８】
アシドボラックス属（Acidovorax）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシドボラックス属（Acidovorax）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項８４または８５に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項８９または９０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９２】
防御用量もしくは有効量の、請求項８９または９０に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項９３】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項８９または９０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９４】
前記アシネトバクター属がアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）である、請求項９１〜９３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１０の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１０の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合してと、配列番号１０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項９５または９６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９８】
防御用量もしくは有効量の、請求項９５または９６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項９９】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項９５または９６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１００】
前記アシネトバクター属（Acinetobacter）がアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）である、請求項９７〜９９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１０１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１１の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１１の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０３】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１０１または１０２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０４】
防御用量もしくは有効量の、請求項１０１または１０２に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１０５】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１０１または１０２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０６】
前記アシネトバクター属（Acinetobacter）がAcinetobacter johnsoniiである、請求項１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１０７】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０８】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１２の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１２の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０９】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１０７または１０８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１０】
防御用量もしくは有効量の、請求項１０７または１０８に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１１１】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１０７または１０８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１２】
前記アシネトバクター属（Acinetobacter）がAcinetobacter juniiである、請求項１０９〜１１１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１１３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１４】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１３の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１３の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１５】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１１３または１１４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１６】
防御用量もしくは有効量の、請求項１１３または１１４に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１１７】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１１３または１１４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１８】
前記アシネトバクター属（Acinetobacter）がアシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）である、請求項１１５〜１１７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１１９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１４のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１４の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１４の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１４のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１１９または１２０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２２】
防御用量もしくは有効量の、請求項１１９または１２０に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１２３】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１１９または１２０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２４】
前記アシネトバクター属（Acinetobacter）がAcinetobacter radioresistensである、請求項１２１〜１２３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１２５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１５のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１５の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１５の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１５のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１２５または１２６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２８】
防御用量もしくは有効量の、請求項１２５または１２６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１２９】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１２５または１２６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１６のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１６の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１６の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１６のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３２】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１３０または１３１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３３】
防御用量もしくは有効量の、請求項１３０または１３１に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１３４】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１３０または１３１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１７のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１７の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１７の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１７のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１３５または１３６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３８】
防御用量もしくは有効量の、請求項１３５または１３６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１３９】
アシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアシネトバクター属（Acinetobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１３５または１３６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１８および配列番号１９からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１８；配列番号１９の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号１８および配列番号１９からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１８：配列番号１９の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４２】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アクチノバチルス属（Actinobacillus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１４０または１４１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４３】
防御用量もしくは有効量の、請求項１４０または１４１に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アクチノバチルス属（Actinobacillus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１４４】
アクチノバチルス属（Actinobacillus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアクチノバチルス属（Actinobacillus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１４０または１４１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４５】
前記アクチノバチルス属（Actinobacillus）がActinobacillus minorである、請求項１４２〜１４４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１４６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２０；配列番号２１；および配列番号２２からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４７】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２０；配列番号２１；および配列番号２２からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２０：配列番号２１；配列番号２２の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４８】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アクチノバチルス属（Actinobacillus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１４６または１４７に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４９】
防御用量もしくは有効量の、請求項１４６または１４７に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アクチノバチルス属（Actinobacillus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１５０】
アクチノバチルス属（Actinobacillus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアクチノバチルス属（Actinobacillus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１４６または１４７に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５１】
前記アクチノバチルス属（Actinobacillus）がアクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）である、請求項１４２〜１４４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１５２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２３の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２３の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５４】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、Alcanivoraxによって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１５２または１５３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５５】
防御用量もしくは有効量の、請求項１５２または１５３に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、Alcanivorax感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１５６】
Alcanivorax感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはAlcanivorax感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１５２または１５３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５７】
前記AlcanivoraxがAlcanivorax borkumensisである、請求項１５４〜１５６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１５８】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２４のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２４のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２４の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２４の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２４のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６０】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アゾアルカス属（Azoarcus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１５８または１５９に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６１】
防御用量もしくは有効量の、請求項１５８または１５９に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アゾアルカス属（Azoarcus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１６２】
アゾアルカス属（Azoarcus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアゾアルカス属（Azoarcus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１５８または１５９に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２５のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６４】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２５の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２５の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２５のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６５】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アゾトバクター属（Azotobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１６３または１６４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６６】
防御用量もしくは有効量の、請求項１６３または１６４に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アゾトバクター属（Azotobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１６７】
アゾトバクター属（Azotobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアゾトバクター属（Azotobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１６３または１６４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６８】
前記アゾトバクター属（Azotobacter）がアゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）である、請求項１６５〜１６７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１６９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２６のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２６の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２６の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２６のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ボルデテラ属（Bordetella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１６９または１７０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７２】
防御用量もしくは有効量の、請求項１６９または１７０に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１７３】
ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１６９または１７０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７４】
前記ボルデテラ属（Bordetella）がボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）である、請求項１７１〜１７３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１７５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２７のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２７の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２７の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２７のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ボルデテラ属（Bordetella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１７５または１７６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１７８】
防御用量もしくは有効量の、請求項１７５または１７６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１７９】
ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１７５または１７６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８０】
前記ボルデテラ属（Bordetella）がパラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）である、請求項１７７〜１７９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１８１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２８のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２８の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２８の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２８のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８３】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ボルデテラ属（Bordetella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１８１または１８２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８４】
防御用量もしくは有効量の、請求項１８１または１８２に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１８５】
ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１８１または１８２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８６】
前記ボルデテラ属（Bordetella）が百日咳菌（Bordetella pertussis）である、請求項１８３〜１８５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１８７】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２９のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８８】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号２９の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号２９の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号２９のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１８９】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ボルデテラ属（Bordetella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１８７または１８８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９０】
防御用量もしくは有効量の、請求項１８７または１８８に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１９１】
ボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはボルデテラ属（Bordetella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１８７または１８８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９２】
前記ボルデテラ属（Bordetella）がBordetella petriiである、請求項１８９〜１９１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１９３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３０および配列番号３１からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３０；配列番号３１の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９４】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３０および配列番号３１からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３０：配列番号３１の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９５】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、コマモナス属（Comamonas）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１９３または１９４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９６】
防御用量もしくは有効量の、請求項１９３または１９４に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、コマモナス属（Comamonas）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１９７】
コマモナス属（Comamonas）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはコマモナス属（Comamonas）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１９３または１９４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１９８】
前記コマモナス属（Comamonas）がコマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）である、請求項１９５〜１９７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項１９９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２００】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３２の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号３２の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、デルフチア属（Delftia）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項１９９または２００に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０２】
防御用量もしくは有効量の、請求項１９９または２００に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、デルフチア属（Delftia）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２０３】
デルフチア属（Delftia）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはデルフチア属（Delftia）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項１９９または２００に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０４】
前記デルフチア属（Delftia）がデルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）である、請求項２０１〜２０３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２０５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３３の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号３３の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、Diaphorobacterによって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２０５または２０６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２０８】
防御用量もしくは有効量の、請求項２０５または２０６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、Diaphorobacter感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２０９】
Diaphorobacter感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはDiaphorobacter感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２０５または２０６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３４および配列番号３５からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３４；配列番号３５の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３４および配列番号３５からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３４：配列番号３５の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１２】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ヘモフィルス属（Haemophilus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２１０または２１１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１３】
防御用量もしくは有効量の、請求項２１０または２１１に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２１４】
ヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２１０または２１１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１５】
前記ヘモフィルス属（Haemophilus）がヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）である、請求項２１２〜２１４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２１６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３６および配列番号３７からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３６；配列番号３７の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１７】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号６８および配列番号６９からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号６８；配列番号６９の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１８】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３６および配列番号３７からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３６：配列番号３７の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号６８および配列番号６９からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号６８：配列番号６９の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２０】
請求項２１６に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンと、請求項２１７または２１９に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを組み合わせて含む、または請求項２１８に記載の免疫原性組成物と、請求項２１７または２１９に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを組み合わせて含む、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ヘモフィルス属（Haemophilus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２１６〜２２０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２２】
防御用量もしくは有効量の、請求項２１６〜２２０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２２３】
ヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患の、治療もしくは予防用の薬剤の製造に使用するための、請求項２１６〜２２０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２４】
前記ヘモフィルス属（Haemophilus）がヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）である、請求項２２１〜２２３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２２５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；および配列番号４１からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；および配列番号４１からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号３８：配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、マンヘミア属（Mannheimia）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２２５または２２６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２８】
防御用量もしくは有効量の、請求項２２５または２２６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、マンヘミア属（Mannheimia）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２２９】
マンヘミア属（Mannheimia）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはマンヘミア属（Mannheimia）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２２５または２２６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３０】
前記マンヘミア属（Mannheimia）がヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）である、請求項２２７〜２２９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２３１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号７０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４２の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号４２の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４２のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３４】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号７０の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号７０の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号７０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３５】
請求項２３１に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンと、請求項２３２または２３４に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを組み合わせて含む、または請求項２３３に記載の免疫原性組成物と、請求項２３２または２３４に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを組み合わせて含む、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３６】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、モラクセラ属（Moraxella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２３１〜２３５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３７】
防御用量もしくは有効量の、請求項２３１〜２３５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、モラクセラ属（Moraxella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２３８】
モラクセラ属（Moraxella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはモラクセラ属（Moraxella）感染もしくは疾患の、治療もしくは予防用の薬剤の製造に使用するための、請求項２３１〜２３５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３９】
前記モラクセラ属（Moraxella）がカタル球菌（Moraxella catarrhalis）である、請求項２３６〜２３８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２４０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号７１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４３の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号４３の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号７１の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号７１の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号７１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４４】
請求項２４０に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンと、請求項２４１または２４３に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを組み合わせて含む、または請求項２４２に記載の免疫原性組成物と、請求項２４１または２４３に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを組み合わせて含む、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４５】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、パスツレラ属（Pasteurella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２４０〜２４４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４６】
防御用量もしくは有効量の、請求項２４０〜２４４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、パスツレラ属（Pasteurella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２４７】
パスツレラ属（Pasteurella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはパスツレラ属（Pasteurella）感染もしくは疾患の、治療もしくは予防用の薬剤の製造に使用するための、請求項２４０〜２４４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４８】
前記パスツレラ属（Pasteurella）がパスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）である、請求項２４５〜２４７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２４９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４４；配列番号４５；および配列番号４６からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４４；配列番号４５；および配列番号４６からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４４：配列番号４５；配列番号４６の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、パスツレラ属（Pasteurella）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２４９または２５０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５２】
防御用量もしくは有効量の、請求項２４９または２５０に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、パスツレラ属（Pasteurella）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２５３】
パスツレラ属（Pasteurella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはパスツレラ属（Pasteurella）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２４９または２５０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５４】
前記パスツレラ属（Pasteurella）がパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）である、請求項２５１〜２５３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２５５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４７のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４７の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号４７の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４７のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、プロテウス属（Proteus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２５５または２５６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５８】
防御用量もしくは有効量の、請求項２５５または２５６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、プロテウス属（Proteus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２５９】
プロテウス属（Proteus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはプロテウス属（Proteus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２５５または２５６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６０】
前記プロテウス属（Proteus）がプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）である、請求項２５７〜２５９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２６１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４８のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４８のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４８の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号４８の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４８のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６３】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、シュードモナス属（Pseudomonas）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２６１または２６２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６４】
防御用量もしくは有効量の、請求項２６１または２６２に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、シュードモナス属（Pseudomonas）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２６５】
シュードモナス属（Pseudomonas）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはシュードモナス属（Pseudomonas）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２６１または２６２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６６】
前記シュードモナス属（Pseudomonas）がシュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）である、請求項２６３〜２６５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２６７】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４９のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６８】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号４９の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号４９の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号４９のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２６９】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２６７または２６８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７０】
防御用量もしくは有効量の、請求項２６７または２６８に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２７１】
スフィンゴモナス属（Sphingomonas）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはスフィンゴモナス属（Sphingomonas）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２６７または２６８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５０のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５０の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号５０の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７４】
抗原を追加して含む、請求項２７２または２７３に記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、前記抗原は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、または前記抗原は、配列番号１の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７５】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ナイセリア属（Neisseria）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２７２〜２７４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７６】
防御用量もしくは有効量の、請求項２７２〜２７４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ナイセリア属（Neisseria）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２７７】
ナイセリア属（Neisseria）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはナイセリア属（Neisseria）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２７２〜２７４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２７８】
前記ナイセリア属（Neisseria）が髄膜炎菌（Neisseria meningitis）である、請求項２７５〜２７７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２７９】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５１および配列番号５２からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５１；配列番号５２の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８０】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５１および配列番号５２からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５１：配列番号５２の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８１】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アグレガチバクター属（Aggregatibacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２７９または２８０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８２】
防御用量もしくは有効量の、請求項２７９または２８０に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アグレガチバクター属（Aggregatibacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２８３】
アグレガチバクター属（Aggregatibacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアグレガチバクター属（Aggregatibacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２７９または２８０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８４】
前記アグレガチバクター属（Aggregatibacter）がアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）である、請求項２８１〜２８３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２８５】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８６】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５３の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号５３の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５３のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８７】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、アグレガチバクター属（Aggregatibacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２８５または２８６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８８】
防御用量もしくは有効量の、請求項２８５または２８６に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、アグレガチバクター属（Aggregatibacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２８９】
アグレガチバクター属（Aggregatibacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはアグレガチバクター属（Aggregatibacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２８５または２８６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９０】
前記アグレガチバクター属（Aggregatibacter）がAggregatibacter aphrophilusである、請求項２８７〜２８９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２９１】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５４のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５４のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９２】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５４の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号５４の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５４のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９３】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、カンピロバクター属（Campylobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２９１または２９２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９４】
防御用量もしくは有効量の、請求項２９１または２９２に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、カンピロバクター属（Campylobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項２９５】
カンピロバクター属（Campylobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはカンピロバクター属（Campylobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２９１または２９２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９６】
前記カンピロバクター属（Campylobacter）がカンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）である、請求項２９３〜２９５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項２９７】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５５のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５５のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９８】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５５の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号５５の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５５のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２９９】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、カンピロバクター属（Campylobacter）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項２９７または２９８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３００】
防御用量もしくは有効量の、請求項２９７または２９８に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、カンピロバクター属（Campylobacter）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項３０１】
カンピロバクター属（Campylobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはカンピロバクター属（Campylobacter）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項２９７または２９８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０２】
前記カンピロバクター属（Campylobacter）がカンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）である、請求項２９９〜３０１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物もしくはワクチン、または方法。
【請求項３０３】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；配列番号６３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；および配列番号６７からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；配列番号６３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０４】
抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は、配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；配列番号６３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；および配列番号６７からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；配列番号６３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７の配列をそれぞれ認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０５】
前記免疫原性組成物またはワクチンが、ヘモフィルス属（Haemophilus）によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を引き起こすことができる、請求項３０３または３０４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０６】
防御用量もしくは有効量の、請求項３０３または３０４に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、ヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患を治療または予防するための方法。
【請求項３０７】
ヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防に使用するための、またはヘモフィルス属（Haemophilus）感染もしくは疾患の治療もしくは予防用の、薬剤の製造に使用するための、請求項３０３または３０４に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０８】
前記ヘモフィルス属（Haemophilus）がインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）である、請求項３０５〜３０７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３０９】
請求項１〜３０８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造するための方法であって、前記抗原の生産に十分な条件下で十分な時間、前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する宿主細胞を培養し、その培地から抗原を回収すること；場合によっては、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーからなる一群から選択される方法によって、前記抗原を精製すること；ならびに、前記抗原を、製薬上許容される担体もしくは賦形剤とともに製剤化すること、を含む前記方法。
【請求項３１０】
前記抗原が、宿主細胞にとって内在性である、請求項３０９に記載の方法。
【請求項３１１】
前記抗原が宿主細胞にとって外因性であって、その細胞が前記外因性抗原をコードする核酸を含有するよう遺伝的に改変されている、請求項３０９に記載の方法。
【請求項３１２】
宿主細胞が前記抗原を生産するよう遺伝的に改変されている、請求項３０９に記載の方法。
【請求項３１３】
宿主細胞が、内在性タンパク質の機能的発現を損なうことによって、遺伝的に改変されており、このタンパク質が遺伝的に未改変の宿主細胞内で、前記抗原の発現を抑制するものである、請求項３１２に記載の方法。
【請求項３１４】
宿主細胞が、異種の、および/または強力な、および/または亜鉛で制御されない、プロモーターから、前記抗原の発現をもたらすよう遺伝的に改変されている、請求項３１２に記載の方法。
【請求項３１５】
遺伝的に改変されていない宿主細胞内で内在性プロモーターと結合することによって前記抗原の発現を抑制する内在性タンパク質が、前記の、異種の、および/または強力なプロモーターと結合しない、請求項３１４に記載の方法。
【請求項３１６】
前記の、異種の、および/または強力なプロモーターが、宿主細胞内で、前記抗原の内在性プロモーターより強いプロモーターである、請求項３１４または３１５に記載の方法。
【請求項３１７】
前記の、異種の、および/または強力なプロモーターがIPTG誘導性プロモーターである、請求項３１４〜３１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１８】
前記内在性タンパク質が、ナイセリアまたはグラム陰性細菌のZurリプレッサーである、請求項３１３〜３１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１９】
前記抗原を生産する少なくとも1つの第１のグラム陰性細菌菌株を培養することであって、この前記抗原が、被験体に投与されたとき、前記第１のグラム陰性細菌菌株によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を生じさせる外膜小胞の生産をもたらすのに十分なレベルで生産される、前記菌株を培養すること；その培養菌株から外膜小胞を調製すること；ならびに、前記外膜小胞と製薬上許容される担体もしくは賦形剤とを組み合わせて、被験体に投与するのに適した免疫原性組成物を製造することを含む、請求項５９〜７１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造するための方法。
【請求項３２０】
前記細菌菌株の培養が、亜鉛キレート剤を含む培地中で行われる、請求項３１９に記載の方法。
【請求項３２１】
前記亜鉛キレート剤が、0.01-100、0.1-10、0.3-5、または0.5-1 μMの濃度で培地中に存在する、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２２】
培地中に含まれる前記亜鉛キレート剤がTPENである、請求項３２０または３２１に記載の方法。
【請求項３２３】
前記細菌菌株の前記培養が、Catlin培地中で行われる、請求項３１９に記載の方法。
【請求項３２４】
前記の第１のグラム陰性細菌菌株が、前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含む、請求項３１９〜３２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２５】
前記抗原の生産が、異種の、および/または強力な、プロモーターからの発現による、請求項３１９〜３２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２６】
培養菌株から外膜小胞を調製する前記ステップが、0-0.5%、0.02-0.4%、0.04-0.3%、0.06-0.2%、0.08-0.15%、または好ましくは0.1% の界面活性剤、好ましくはデオキシコール酸による抽出を含む、請求項３１９〜３２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２７】
培養菌株から外膜小胞を調製する前記ステップが、界面活性剤を使用せずに実施される、請求項３１９〜３２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２８】
請求項１〜７１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンと、製薬上許容される賦形剤とを組み合わせるステップを含む、請求項７２に記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造するための方法。
【請求項３２９】
請求項３０９〜３２８のいずれか１つに記載の方法によって製造される、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３３０】
請求項１〜３０８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンでレシピエントを免疫化するステップ、ならびに、そのレシピエントから免疫グロブリンを分離するステップを含む、グラム陰性細菌性疾患の予防または治療に使用するための、免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項３３１】
請求項３３０に記載の方法から得られる、免疫グロブリン標品。
【請求項３３２】
請求項３３１に記載の免疫グロブリン標品、および製薬上許容される賦形剤を含む、医薬品。
【請求項３３３】
TdfIタンパク質および/またはTdfHタンパク質に対するモノクローナル抗体、ならびに製薬上許容される賦形剤を含む、医薬品。
【請求項３３４】
請求項３３２または３３３に記載の医薬品の有効量を患者に投与するステップを含む、グラム陰性細菌性疾患を治療または予防するための方法。
【請求項３３５】
グラム陰性細菌性疾患の治療または予防に使用するための、請求項３３２または３３３に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性細菌の免疫原性組成物およびワクチン、それらの製造、ならびに医学分野でのそうした組成物の使用の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞外亜鉛の取り込みに関与する、グラム陰性細菌の外膜タンパク質を含む、免疫原性組成物に関する。このようなタンパク質は、多くのさまざまなグラム陰性細菌種に属する菌株の間で高度な保存を示すので、有望な抗原である。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性細菌は、数多くのヒトの病態の原因病原体であり、これらの細菌のうち多くのものに対して効果のあるワクチンを開発することが必要である。したがって、抗原がワクチン構成成分として有用となるように、グラム陰性菌種の中で、できればそれらの菌種の間で、よく保存されているさらに他の抗原、たとえば外膜タンパク質を特定する必要がある。
【０００３】
髄膜炎菌（N. meningitidis）の血清型Bの場合、その多糖莢膜が、ヒトのポリシアル酸含有糖タンパク質、たとえば神経細胞接着分子に、免疫学的に類似しているために免疫原性に乏しいことが原因となって、ワクチンの開発が妨げられてきた。したがって、ワクチン製造戦略は、PorAのような、髄膜炎菌外膜の表面露出構造に集中したが、菌株間の主要外膜タンパク質の抗原変異性が高いことによって阻まれている。
【０００４】
しかしながら、髄膜炎菌（N. meningitidis）は、細胞外の亜鉛の取り込みに関与する、外膜タンパク質"TdfI"もしくは"ZnuD"（WO 00/55327のBASB082；髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Bの配列決定されたゲノム内の遺伝子座タグNMB0964；本明細書では配列番号1）を発現することが最近明らかになった。亜鉛はポリンによる受動拡散によって外膜を通過するとこれまで考えられていたので、これは驚くべきことであり、この知見は、グラム陰性細菌の外膜を横断する亜鉛取り込みに関与するタンパク質の最初の発見である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第00/55327号パンフレット
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、グラム陰性細菌の多数の種から、数多くの菌株でTdfIのホモログを同定した。これらの種の間でアミノ酸配列が保存されていることは、遊離亜鉛のレベルが低い環境での亜鉛の能動的取り込みにおける、TdfIの重要性を反映していると考えられる。TdfIおよびその同定されたホモログ、並びに未同定のホモログは、グラム陰性細菌感染に対するワクチン開発のための、有望な抗原供給源となる。TdfIとその同定済みのホモログとの間で、二次構造のアミノ酸配列が保存されていることにより、このようなワクチンは、個々の血清型、亜種および菌株だけでなく、微生物種の全構成員を越えて、すなわち他の分類レベルに対しても、防御をもたらすことができる。実際、実施例に示すように、TdfIは、血清型群にかかわらず、テストしたほとんどすべてのナイセリア菌株に対して交差殺菌性抗体を誘導することができるので、このことは、この外膜タンパク質が普遍的な髄膜炎菌（N. meningitidis）抗原として用いられる可能性を裏付ける。
【０００７】
本発明が基礎を置く、もう1つの驚くべき発見は、細胞外亜鉛の取り込みに関与する、別の髄膜炎菌（N. meningitidis）外膜タンパク質、"TdfH"（WO 00/11182のBASB024；本明細書では配列番号50）の同定である。TdfIは、細胞外環境から遊離亜鉛を捕捉することに関与すると考えられているが、TdfHは、実施例に示すように、遊離型でない、錯体を形成した亜鉛、たとえばカルプロテクチンに結合した亜鉛と結合すると思われる。グラム陰性細菌のさまざまな種から、いくつかの菌株でTdfIのホモログを同定したが、アミノ酸配列の高度の保存が認められる。したがって、TdfI、TdfHおよびそれらのホモログに対するアナログが、グラム陰性細菌感染および疾患に対するワクチン接種のための抗原の供給源として有用であると期待される。
【０００８】
本発明の基礎となる研究を受けて、現在では、髄膜炎菌（N. meningitidis）および他の多くのグラム陰性種が、外膜を越えて亜鉛を取り込むための能動機構を有すると考えられている。このような機構は、少なくともTdfIおよびTdfHを必要とするものであって、宿主（たとえば人体）において、特に気道のような特定の部分において、遊離亜鉛レベルが低いために必要となる可能性がある。実施例で示すように、遊離亜鉛が少ない状況において、または亜鉛がたとえばカルプロテクチンと錯体を形成しているような場合に、それぞれ、TdfIまたはTdfHを欠いた細胞の生存能力が損なわれる。TdfIまたはTdfHを発現するグラム陰性細菌を宿主免疫系の標的とすることを目的とするワクチン接種は、そうした細菌による感染に対する効果的な予防もしくは治療をもたらすことを約束するものであって、このようなワクチンは、これらのタンパク質の保存された性質の結果として、グラム陰性種の中で、おそらくはそうした種の間で、交差防御性を有する可能性がある。これらのタンパク質の1つに基づく抗原を含有するワクチンによって与えられる防御は、当該細菌に向けられた殺菌性免疫応答に起因することが考えられるが、単に、そのタンパク質の亜鉛取り込み活性の妨害に起因する可能性もある。TdfIおよびTdfH由来抗原を両方とも含有するワクチンは、そのことによって2つの確認されている亜鉛取り込み機構をともに標的とするので、特に有効なものとなり得る。
【０００９】
したがって、本発明は、TdfIおよび/またはTdfH、ならびにそれらのホモログといった、細胞外亜鉛の取り込みに関与する外膜タンパク質を発現するグラム陰性細菌に対する免疫応答を引き起こすための、免疫原性組成物またはワクチン、および方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ウェスタンブロットによるTdfIの検出。（A）TSB（レーン1）、RPMI（レーン2）で培養したHB-1、およびRPMIで培養したtdfIノックアウト株（レーン3）。（B）増量したTSBを添加したRPMIで培養したHB-1。（C）RPMI（レーン1）、0.5μM亜鉛添加RPMI（レーン2）、または1μM亜鉛添加RPMI（レーン4）で培養したHB-1。（D）RPMI（レーン1）、TPEN濃度を増加させたRPMI（レーン2〜4でそれぞれ0.1、0.5、および1μM）で培養したHB-1。
【図２】野生型およびzur変異株におけるTdfIの発現。RPMI、600 nM亜鉛またはTBSを含有するRPMIで培養したHB-1およびzur変異株の細胞溶解物中のTdfIの存在を、ウェスタンブロット分析により評価した。
【図３】TdfIのトポロジーモデル。プラグドメインはダークグレー、βストランドはライトグレー、細胞外ループは白で色付けされている。ヒスチジン/アスパラギン酸ストレッチは枠で囲んだ。
【図４】TdfIによる亜鉛の結合および輸送。（A）TdfIを含有する、または含有しない外膜小胞への亜鉛の結合を、PAR競合アッセイにより測定した。（B）野生株、tdfI変異株、およびtonB変異株のICP-MSにより測定された細胞内亜鉛濃度。
【図５】TdfIの亜鉛制御は、髄膜炎菌において高度に保存されている。亜鉛添加RPMIまたは亜鉛無添加RPMIで培養した指定菌株の細胞溶解物のウェスタンブロット。aクローン群という名称は(36)から取ったもので、その菌株がMulti-Locus Enzyme Electrophoresisによって分類されたが、特定のクローンに割り当てられなかったことを示す。
【図６】TdfIワクチンのタンパク質プロファイル。抗血清生産のためマウスを免疫化するために使用される外膜小胞は、SDS-PAGEによって分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【図７】SBAで使用される細胞上でのTdfI発現に及ぼすIPTGの影響。実施例1を参照されたい。
【図８−１】髄膜炎菌（N. meningitidis） MC58株のTdfIと、053422、FAM18、およびZ2491、保有菌株α14、α153、およびα275のTdfIとのアミノ酸配列アラインメント。TonBボックス（Tb）、プラグドメイン、ループ、および膜貫通ドメイン（Tm）には配列上に印を付け、His-およびAsp-リッチストレッチには下線を付した。
【図８−２】髄膜炎菌（N. meningitidis） MC58株のTdfIと、053422、FAM18、およびZ2491、保有菌株α14、α153、およびα275のTdfIとのアミノ酸配列アラインメント。TonBボックス（Tb）、プラグドメイン、ループ、および膜貫通ドメイン（Tm）には配列上に印を付け、His-およびAsp-リッチストレッチには下線を付した。
【図９−１】TdfIホモログのアミノ酸配列アラインメント。ヒスチジンアスパラギン酸リッチストレッチはグレーで強調した。
【図９−２】TdfIホモログのアミノ酸配列アラインメント。ヒスチジンアスパラギン酸リッチストレッチはグレーで強調した。
【図９−３】TdfIホモログのアミノ酸配列アラインメント。ヒスチジンアスパラギン酸リッチストレッチはグレーで強調した。
【図１０−１】ZnuDペプチドアレイ：回復期の患者、または健康な保菌者から得られたヒト血清の個別反応。実施例3を参照されたい。この図は、US 61/312959の図8に相当する。図10の説明文の中で上から下までの一覧に記載されたサンプルは、US 61/312959の図8の説明文の中で上部左から下部右までの（行に沿って読む）一覧に記載されたサンプルに相当する。
【図１０−２】ZnuDペプチドアレイ：回復期の患者、または健康な保菌者から得られたヒト血清の個別反応。実施例3を参照されたい。この図は、US 61/312959の図8に相当する。図10の説明文の中で上から下までの一覧に記載されたサンプルは、US 61/312959の図8の説明文の中で上部左から下部右までの（行に沿って読む）一覧に記載されたサンプルに相当する。
【図１１−１】培地との相関におけるZnuDの発現レベル。実施例3を参照されたい。
【図１１−２】培地との相関におけるZnuDの発現レベル。実施例3を参照されたい。
【図１１−３】培地との相関におけるZnuDの発現レベル。実施例3を参照されたい。
【図１１−４】培地との相関におけるZnuDの発現レベル。実施例3を参照されたい。
【図１２−１】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１２−２】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１２−３】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１２−４】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１２−５】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１２−６】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１２−７】免疫化のために使用されるOMV。実施例3を参照されたい。
【図１３−１】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−２】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−３】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−４】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−５】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−６】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−７】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−８】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−９】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−１０】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１３−１１】TdfIホモログのマルチプルアラインメント。
【図１４−１】TdfHホモログのマルチプルアラインメント。
【図１４−２】TdfHホモログのマルチプルアラインメント。
【図１４−３】TdfHホモログのマルチプルアラインメント。
【図１４−４】TdfHホモログのマルチプルアラインメント。
【図１４−５】TdfHホモログのマルチプルアラインメント。
【図１４−６】TdfHホモログのマルチプルアラインメント。
【図１５】カルプロテクチンのTdfHとの結合。
【図１６】ZnもしくはMn存在下でのカルプロテクチンのTdfHとの結合。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、髄膜炎菌（N. meningitidis）が亜鉛取り込みに関与する外膜タンパク質を発現するが、その少なくとも1つ（TdfI）は、もっともよく調べられている髄膜炎菌（N. meningitidis）菌株、ならびに他の多数のグラム陰性細菌種に見いだされる、という発見に基づく。髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型BのTdfIは、すべての血清型の髄膜炎菌（N. meningitidis）菌株に対する交差殺菌性抗体を誘導することが明らかになったので、これらのタンパク質、および他のグラム陰性種におけるそれらのホモログは、グラム陰性細菌感染を防ぐための有望な抗原となる。
【００１２】
本明細書で使用される「TdfIタンパク質」および「TdfHタンパク質」という用語は、髄膜炎菌（N. meningitidis）において同定された個別のタンパク質、ならびにそれらのホモログを表すために使用される。
【００１３】
したがって、ある態様において、本発明は、抗原を含む免疫原性組成物もしくはワクチンを提供するが、この抗原は、必要に応じてキャリアタンパク質と結合すると、少なくとも第1のグラム陰性細菌株の外膜タンパク質を認識する免疫応答を生じさせることができるものであって、前記外膜タンパク質は細胞外亜鉛の取り込みに関与する。
【００１４】
本明細書で使用される「免疫原性組成物」または「ワクチン」は、宿主に投与されたとき、免疫応答を生じさせることができる、少なくとも1つの抗原を含有する組成物を意味する。本明細書で使用される「免疫応答」は、B細胞抗体反応を意味する。
【００１５】
「抗原」は、本発明の文脈によれば、体内で免疫応答を刺激する任意の物質である。ある実施形態において、抗原は、その抗原によって引き起こされる免疫応答により認識される、第1のグラム陰性菌株の外膜タンパク質に由来するポリペプチドである。この意味において「由来する」とは、その抗原が、出発点として前記外膜タンパク質を使用し、物質的に（たとえば、標的変異、トランケーションなどによって）、または知的に（たとえば、合成ポリペプチドをデザインするために当該タンパク質の既知の配列を使用して）作製されることを意味する。本明細書で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結された2つ以上のアミノ酸残基の、任意の鎖を意味する。免疫原性組成物もしくはワクチンは、前記抗原に加えて、1つもしくは複数の追加の抗原を含有することができる。
【００１６】
「キャリアタンパク質」は、典型的には免疫系による抗原の検知を強化または促進するために、抗原が結合する、または付着する、またはコンジュゲートする、任意のタンパク質を意味する。この用語は、小ペプチドおよび大ポリペプチド（>10 kDa）をいずれも含むものとする。キャリアは、任意のペプチドもしくはタンパク質とすることができる。それは、1つもしくは複数のTヘルパーエピトープを含んでいてもよい。キャリアタンパク質は、たとえば、破傷風トキソイド（TT）、破傷風トキソイドフラグメントC、毒性のない破傷風毒素変異体、ジフテリアトキソイド（DT）、CRM197、ニューモリシン（Ply）、protein D、PhtD、またはPhtDEとすることができる。
【００１７】
抗原によって引き起こされる免疫応答は、第1の（すなわち1つの）細菌菌株の外膜タンパク質を認識することができるが、2つ以上の菌株に存在する外膜タンパク質を認識する可能性もあり、その場合前記タンパク質は、菌株間で同一である必要はないが、それぞれのタンパク質がいずれも、その抗原によって生じる免疫応答によって認識されるよう、類似したエピトープを共有していなければならない。特に興味深いのは、一定のグラム陰性種の複数菌株、またはすべての菌株を認識する免疫応答を引き起こすことであって、この場合、前記菌株は、血清型群、血清型、血清亜型、または抗原の由来するもとの外膜タンパク質の正確なアミノ酸配列のうち少なくとも1つが異なる。交差防御は、個別の種を越えて広がることもある。
【００１８】
本明細書で使用される「外膜タンパク質」という用語は、グラム陰性細菌の外膜に内在する、または外膜に付着した、または外膜上に発現された、ポリペプチドもしくはタンパク質を意味する。このタンパク質は内在性膜タンパク質であり、すなわち膜の内部に組み込まれているとすることができるが、場合によってはペリプラズムおよび/または細胞外に露出する部分を有していてもよい。あるいはまた、このタンパク質は外膜の細胞外表面に付着していてもよく、脂質二重層、または内在性タンパク質のいずれかに直接付着することができる。外膜タンパク質は600〜1000アミノ酸長の間であることが好適である。
【００１９】
タンパク質の亜鉛取り込みへの関与とは、そのタンパク質が、遊離の、または錯体化した、細胞外亜鉛と結合し、必要に応じて、結合した亜鉛を、外膜を越えて輸送することを意味する。グラム陰性細菌外膜タンパク質が、亜鉛の結合、および、場合によってはその輸送に関与するか否かは、当業者が容易に確認できると思われるが、実施例は、これを達成することができるいくつかの方法、たとえば、タンパク質構造のモデリング、亜鉛イオン封鎖競合アッセイ、および外部亜鉛濃度に応じたタンパク質の発現制御アッセイなどを提供する。より詳細には、前記外膜タンパク質の亜鉛取り込みへの関与とは、当該タンパク質を欠損した外膜小胞の亜鉛結合が減少し、かつ当該タンパク質を欠損した細胞における亜鉛の蓄積が減少することであり、ならびに/または、唯一の亜鉛源としてカルプロテクチンが存在する場合、当該タンパク質を欠損した細胞が増殖能力の低下を示すことである。
【００２０】
前記免疫応答により認識される外膜タンパク質が、ある特定の実施形態では、PCT/EP2009/052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO 00/55327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO 99/57280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO 00/11182の配列番号2、4および6、もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列で構成されない可能性があることに留意すべきである。それに加えて、またはその代わりに、前記外膜タンパク質を発現する前記の第1のグラム陰性細菌菌株はナイセリア菌株ではない。
【００２１】
ある実施形態において、前記外膜タンパク質の発現は、亜鉛の利用可能性が低いことに対応して、アップレギュレートされる。この発現のアップレギュレーションは、トリプティックソイブロス（TSB）のような亜鉛含有複合培地で増殖させたときのタンパク質発現レベルと比べて、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、またはそれ以上となり得る。このような発現のアップレギュレーションは、亜鉛キレート剤、たとえば1-25μMの、TPEN（N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン）が適当であるが、これを用いて、またはCatlin培地のような亜鉛の少ない合成培地を用いて達成することができる。
【００２２】
ある実施形態において、前記免疫応答によって認識される外膜タンパク質を発現する、前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、ヒトおよび/または動物の、遊離亜鉛レベルの低い身体部分に感染する菌株である。そのような部分としては、たとえば、気道および血液、ならびに尿路および腸がある。前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、気道に感染する下記の種に属することが適当である：Brucella sp.、Coxiella sp.、Pseudomonas sp.、Acinetobacter sp.、Moraxella sp.、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、Haemophilus parasuis、Haemophilus somnus、Legionella pneumophila、Actinobacillus pleuropneumoniae、百日咳菌（Bordetella pertussis）、Bordetella parapertussis、Bordetella bronchoseptica、Mannheimia haemolytica、Pasteurella dagmatis、およびPasteurella multocida。ある実施形態において、前記の低レベルの遊離亜鉛は、亜鉛がカルプロテクチンのような分子に結合した結果である。
【００２３】
低レベルの遊離亜鉛とは、遊離亜鉛が5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、または0.01μM未満であることを意味し、誘導結合プラズマ質量分析法で約1.69μM亜鉛を有するRoswell Park Memorial Institute培地1640 (RPMI)中に存在するような濃度である。本明細書で使用される「亜鉛」はZn2+を指している。
【００２４】
特定の実施形態において、前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、Bordetella; 百日咳菌（Bordetella pertussis）; Borrelia; Borrelia burgdorferi; Brucella; Brucella melitensis; Brucella ovis; Chlamydia; Chlamydia psittaci; Chlamydia trachomatis; Escherichia; 大腸菌（Escherichia coli）; Haemophilus; インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）; Legionella; Legionella pneumophila; Neisseria; 淋菌（Neisseria gonorrhoeae）; 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）; Pseudomonas; 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）; Yersinia; Yersinia enterocolitica; Moraxella; Moraxella catarrhalis; Shigella; Shigella flexneri; Shigella dysenteriae; Shigella boydii; Coxiella; およびCoxiella burnetiiからなる一群から選択される種または属に属する。
【００２５】
別の実施形態において、前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、Acidovorax; Acinetobacter; Acinetobacter baumannii; Acinetobacter baumannii; Acinetobacter calcoaceticus; Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; Acinetobacter lwoffii; Acinetobacter radioresistens; Actinobacillus; Actinobacillus minor; Actinobacillus pleuropneumoniae; Aggregatibacter; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Aggregatibacter aphrophilus; Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; Azoarcus; Azotobacter; Azotobacter vinelandii; Bordetella; Bordetella bronchiseptica; Bordetella parapertussis; 百日咳菌（Bordetella pertussis）; Bordetella petrii; Campylobacter; Campylobacter coli; Campylobacter upsaliensis; Comamonas; Comamonas testosteroni; Delftia; Delftia acidovorans; Diaphorobacter; Haemophilus; インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）; Haemophilus parasuis; Haemophilus somnus; Mannheimia; Mannheimia haemolytica; Moraxella; Moraxella catarrhalis; Neisseria; 淋菌（Neisseria gonorrhoeae）; 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）; Pasteurella; Pasteurella dagmatis; Pasteurella multocida; Proteus; Proteus mirabilis; Pseudomonas; Pseudomonas stutzeri; およびSphingomonasからなる一群から選択される種または属に属する。
【００２６】
より詳細には、前記の第1のグラム陰性細菌菌株の外膜タンパク質は、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含むが、この配列番号1は、髄膜炎菌（N. meningitidis） MC58株のTdfIであり、配列番号2〜49はそのホモログであって、配列番号50は髄膜炎菌（N. meningitidis） MC58株のTdfHであり、配列番号51〜71はそのホモログである。
【００２７】
別の態様において、本発明は、抗原を含有する免疫原性組成物またはワクチンを提供するが、その抗原は、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％同一のポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要に応じてキャリアタンパク質と結合したときに、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こす能力を有する。
【００２８】
この態様において、抗原を（少なくとも一部分において）構成するポリペプチドは、少なくとも前記ポリペプチドがある程度アミノ酸配列同一性を共有しているアミノ酸配列を認識する、免疫応答を引き起こすことができる。同一性の程度は、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 または100％とすることができる。ある実施形態において、ポリペプチドは、そのポリペプチドがアミノ酸配列同一性を共有するアミノ酸配列と、同一または実質的に同一の免疫原性を有する。
【００２９】
「同一性」は、当技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定される、場合によって、2つ以上のポリペプチド配列間の、または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係性である。当技術分野では、「同一性」は、場合によって、ポリペプチド配列、またはポリヌクレオチド配列の間の、一連のそうした配列間のマッチによって決定される配列関連性の程度も意味する。「同一性」は既知の方法により容易に計算することができ、その方法には、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; ならびにCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載の方法などがあるがこれらに限定されない。同一性を決定する方法は、調べる配列の間で最大のマッチを与えるように考えられている。さらに、同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。二つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラムの方法には、GCGプログラムパッケージの中のGAPプログラム(Devereux, J., et aI., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN (Altschul, S.F. et aI., J Mol. BioI. 215: 403-410 (1990)、およびFASTA( Pearson and Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988))などがあるが、これらに限定されない。BLASTファミリーのプログラムはNCBIおよび他のソースから公開されている（BLAST Manual, Altschul, S., et aI., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et aI., J Mol. BioI. 215: 403-410 (1990)）。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【００３０】
ポリペプチド配列比較のためのパラメーターは下記を含むことができる：
アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol BioI. 48: 443-453 (1970)
比較行列： BLOSSUM62、Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)より
ギャップペナルティ（Gap Penalty）：8
ギャップ長ペナルティ（Gap Length Penalty）：2
これらのパラメーターとともに使用できるプログラムは、Genetics Computer Group, Madison WIから、"ギャップ(gap)"プログラムとして公開されている。前記パラメーターは、ペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップにはペナルティは付けない）。
【００３１】
ClustalWプログラムを用いたペアワイズアラインメントのためのパラメーターは、下記を含むことができる：
ギャップ開始ペナルティ  :10.00
ギャップ伸長ペナルティ  :0.10
タンパク質重み行列      :Gonnetシリーズ
DNA重み行列            :IUB
ClustalWプログラムを用いたマルチプルアラインメントのためのパラメーターは、下記を含むことができる：
ギャップ開始ペナルティ            :10.00
ギャップ伸長ペナルティ            :0.20
相違配列遅延                      :30 %
DNA 遷移重み                      :0.50
タンパク質重み行列                :Gonnet シリーズ
DNA重み行列                       :IUB
ネガティブマトリクス使用          :OFF
特に指定のない限り、本明細書で「同一性」は、テスト配列ではなく基準配列の全長について表示される。配列番号1および50とそれらの同定されたホモログとのマルチプルアラインメントを図10および11に示し、同一性の値を表5および6に示す。
【００３２】
この態様の、ある実施形態において、前記の抗原またはポリペプチドは、場合によっては、PCT/EP2009/052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO 00/55327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO 99/57280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO 00/11182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片の、アミノ酸配列を有していてもよい。
【００３３】
他の態様において、本発明は、抗原を含有する免疫原性組成物もしくはワクチンを提供するが、その抗原は、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、さらに前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合すると、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる。
【００３４】
本明細書で使用される「免疫原性断片」は、本発明のアミノ酸配列（すなわち配列番号1〜71の1つ）の全長ではないが一部の長さについて、完全に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、それは少なくとも、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができるものであり、前記断片はそのアミノ酸配列の断片である。ある実施形態において、免疫原性断片は、アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の免疫原としての活性を有するものであって、前記断片はそのアミノ酸配列の断片である。前記免疫原性断片は、少なくとも一部分は、アミノ酸配列の細胞外部分に由来するものであって、この断片はそのアミノ酸配列の断片である。前記断片は、他には、たとえば、本発明のアミノ酸配列の切断誘導体であってもよく、それはたとえば、アミノ-もしくはカルボキシ-末端アミノ酸配列を含む一連の連続した残基である。本発明のアミノ酸配列の分解型も使用することができる。
【００３５】
この態様の、ある実施形態において、前記の抗原もしくはポリペプチドもしくは免疫原性断片は、場合によっては、PCT/EP2009/052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO 00/55327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO 99/57280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO 00/11182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列を有していないことがある。
【００３６】
前記の抗原もしくはポリペプチドもしくは免疫原性断片は、特に、TdfIタンパク質に由来するものとすることができるが、その場合、前記ポリペプチドがアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または前記免疫原性断片がその断片であるアミノ酸配列は、配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；および配列番号49からなる一群から選択される。
【００３７】
他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、次のアミノ酸モチーフの少なくとも1つを含む：
91 - G - S/A/V - S/A/V/G - X - P - V/l/M - V/l - - G - Q/M/L - X - G/S/A - X - R; 
116 - D - V/A/M - S/A - 2(X) - S/G - P/A - D - H - T/A/N -V/l;
154 - G - L/V/A/l - V/l - N/D - V/l/L - X - D - X - K/ - l/L/V - P;
250 - G - X - G/S/A - Y/F/W/V - G/S/T/N - X - Q/R/L - 3(X) - Y - G - L/l/V - L/l/P - G/A - H/D;
334 - R - X - D/E - X - R/K/Q/D - G/T/S/A - E/Q/S/D - 3(X) - P - 3(X) - l/F/V/L - 3(X) - R/A/K/Q - 5(X) - D/N/R/G - Y - X - H - X - E;
510 - R - X - P - X - A/P/V/T - Q/E/M - E - L/M - Y/F - A/S/Y/T - X - G - X - H - X - A - T/L/S - X - T/S/A - F/Y/l/V - E/Q - (1-9)X - G - D/N/Q - X - X - L;
595 - Y - X - Q/G - 2(X) - A - X- - F/L/Y/l - X - G - X - E/D - G/A/V - 3(X) - Y/F/H/Q - 8(X) - G/S/A/T - X - F/S - G - D - X - V/l - R/K/N - A/G; および
657 - P/A - R - X - P/S/A - A/P/G - X - R - L/V/A - S/G。
【００３８】
各モチーフに先行する数字は、さらに他の実施形態において、モチーフを含むポリペプチドと配列番号1を並べたときに、そのモチーフに相当する配列番号1配列の最初のアミノ酸の、配列番号1配列中の位置を示す。ある実施形態において、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、配列番号1の前記の最初のアミノ酸の位置、または配列番号2〜49の同等位置から始まる前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC-末端に含んでいる。
【００３９】
モチーフは標準的なアミノ酸一文字標記を用いて表され、左から右へ、N-末端からC-末端として表される。たとえば、モチーフの他のアミノ酸に対して特定の位置にある"- G -"は、その位置にグリシン残基が必要であることを示すが、たとえば、"- S/A/V -"は、セリンまたはアラニンまたはバリン残基が（優先順位なしで）その位置を占めなければならないことを示す。指定のない位置、すなわち、任意のアミノ酸残基とすることができる位置は、"X"で表され、複数の連続したそのような残基は、たとえば3(X)で表され、これは" - X - X - X -"を意味する。
【００４０】
上記のように、前記抗原または前記ポリペプチドまたは前記免疫原性断片は、具体的にはTdfIタンパク質から得られる。あるいはまた、前記抗原または前記ポリペプチドまたは前記免疫原性断片はTdfHタンパク質から得られ、その場合、前記ポリペプチドがアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または前記免疫原性断片がその断片であるアミノ酸配列は、配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択される。
【００４１】
他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、下記のアミノ酸モチーフの少なくとも1つを含む：
81 - R - S/T - V/l - P - G - A - F/Y - T - Q/N - Q/V/L/l - D - K/Q - G/A/S - S/Q - G - X - V/L - S - V/L - N -V/l - R - G - X - S/N/T - G - F/L - G - R - V/A - N - S/T - M/Q - V/l - D - G - V/l - S/T - Q - T - F;
156 - F - S/N/D/E - G - S/T/A/K - A/G/S/N - G - l/L/V/A - N - S/T/A - L - X - G - S - A - N - L/F - R/K -T - L/l - G/N/S - V/A - D/N - D;
226 - S - X - R/K/Q - X - V/l/S/L - S/A - Q - N/D - Y/F - R/K - V/l - G - G - G;
333 - L - F/A/L/V - K - L/l/F/V - E/R - Y - X - G/N/D/S - V/D/K/H - 4(X) - T/G/N/l - A/L - Q/N/S -F/L/l/Y - R - X - L/M/Y - X - T/N - X -l/L/V - G/A/S - S/T/G - R - K/R/N/S - l/L - X - N - R/D/K/N - N/T - Y - Q
491 - P - X - G - S/K/E - Q - X - F/l - N/H/K/l - T/S - F/l/V/L - Y - F/L/l - D;
574 - N - H/Y - S - V/A/L/M - S/T/l/M - l/L/F - S - A - X - F/Y/L/l - G/D/S/H - D/T/P - Y/G/L - F -M/N/S/T - P - F - X - S/T/G - Y/F - S/A - R/H/K - T/S - H - R - M/l/V/A - P - N - l/V - Q/K/R - E -M/Y/V - Y/F - F - S/T; および
846 - E/D - V/l - K/Q - N - L/A/V - F/L - D - R/K - R/L/K/N - Y - l/V/M - D/N - P/A - L - D/Y。
【００４２】
各モチーフに先行する数字は、さらに他の実施形態において、モチーフを含むポリペプチドと配列番号50を並べたときに、そのモチーフに相当する配列番号50配列の最初のアミノ酸の、配列番号50配列中の位置を示す。ある実施形態において、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、前記の配列番号50の最初のアミノ酸の位置、または配列番号51〜71の同等位置から始まる前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加アミノ酸を、前記モチーフのN-および/またはC-末端に有する。このモチーフは、TdfIモチーフに関連して、上記のように表される。
【００４３】
上記のように、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、上記の他に1つもしくは複数の抗原を追加して含有することができる。前記免疫原性組成物もしくはワクチンがTdfIタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原を含有するような実施形態において、少なくとも1つの前記追加抗原は、本明細書に記載のTdfHタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原とすることができる。反対に、前記免疫原性組成物もしくはワクチンがTdfHタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原を含有するような実施形態では、少なくとも1つの前記追加抗原は、本明細書に記載のTdfIタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原とすることができる。その代わりに、またはそれに加えて、このような追加抗原には、任意の抗原が含まれる可能性があり、その抗原は、「第1の」抗原と同じグラム陰性菌株もしくは種に対して、またはグラム陰性細菌もしくはその分類群に対しても、免疫応答を引き起こすことがあるが、引き起こさないこともある。少なくとも1つの前記追加抗原は、たとえば、髄膜炎菌（N. meningitidis）由来のfHbpポリペプチド、またはHsfポリペプチド、またはHapポリペプチド、またはNadAポリペプチド、またはlipo28ポリペプチドであることが適当である。
【００４４】
fHbpはナイセリア（Neisseria）属のGNA1870タンパク質を意味し、Hsfはナイセリア（Neisseria）属のNMB0992タンパク質（WO99/31132； WO99/58683の配列番号2および4[BASB029]）、Hapはナイセリア（Neisseria）属のNMB1985（WO99/55873 - BASB006）タンパク質、NadAはナイセリア（Neisseria）属のNMB1994タンパク質、lipo28はナイセリア（Neisseria）属のGNA2132もしくはNMB2132タンパク質を意味する。ここに記載されるGNAおよびNMBの数字は、それぞれ、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis） A群およびB群でコードされるポリペプチドを表し、ゲノム配列はwww.neisseria.orgから入手できる。
【００４５】
さらに、タンパク質が本明細書で具体的に言及される場合、それは未変性の全長タンパク質、およびその天然バリアントへの言及とするのが適切であるが、その抗原性断片が含まれることもある。これらは、そのタンパク質のアミノ酸配列から連続して取り出された、少なくとも15アミノ酸を含有する、または少なくとも15アミノ酸からなる断片（多くの場合、本明細書に具体的に記載される）であるが、適切なのは、少なくとも20アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、または少なくとも50アミノ酸である。抗原性断片は、免疫原性断片であるともいえる。さらに、本明細書のタンパク質およびタンパク質配列への言及は、前記タンパク質配列、言い換えると、前記タンパク質のアミノ酸配列に由来する、7、10、12、15、20、30、40もしくは50個（またはそれ以上）の連続アミノ酸の免疫原性断片を含んでなるポリペプチドを包含すると考えられる（場合によっては、この前記免疫原性断片は、必要ならばタンパク質キャリアと結合して、前記タンパク質もしくは前記タンパク質配列を認識することができる免疫応答を引き起こす能力を有する）。
【００４６】
Hsf：Hsfは、オートトランスポータータンパク質に共通する構造を有する。たとえば、髄膜炎菌（N. meningitidis） H44/76株由来のHsfは、アミノ酸1-51で構成されるシグナル配列、成熟タンパク質のアミノ末端にあるヘッド領域（アミノ酸52-479）（これは表面が露出しており、可変領域（アミノ酸52-106、121-124、191-210、および230-234）を含む）、ネック領域（アミノ酸480-509）、疎水性αヘリックス領域（アミノ酸518-529）、および4つの膜貫通ストランドが外膜の両側をつなぐアンカードメイン（アミノ酸539-591）からなる。
【００４７】
全長Hsfは、本明細書の免疫原性組成物に使用することができるが、さまざまなHsfトランケートおよび欠失型も、免疫原性組成物もしくはワクチンのタイプに応じて使用することができる。
【００４８】
Hsfがサブユニット組成物もしくはワクチンに使用される場合、可溶性パッセンジャードメイン部分；たとえば、アミノ酸52-479の完全なドメイン、もっとも適切なのはその保存部分、たとえば、アミノ酸134-479の配列を使用することができる。適当な形のHsfは、WO 01/55182に記載のタンパク質の可変領域を欠失させるように、トランケートされていてもよい。
【００４９】
適当なバリアントは、WO 01/55182に記載の、1、2、3、4、または5つの可変領域の欠失を含むと考えられる。上記配列および下記の配列は、NもしくはC末端のいずれか一方、または両方で、1、3、5、7、10、もしくは15個以下のアミノ酸だけ伸長させる、またはトランケートすることができる。
【００５０】
したがって、Hsfの適当な断片は、Hsfのヘッド領域全体を含むが、これはアミノ酸52-473を含有することが適切である。さらに他のHsfの適当な断片は、ヘッドの表面露出領域を含み、これは下記のアミノ酸配列のうち1つもしくは複数を含む：52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440、および469-479。
【００５１】
Hsfが外膜小胞標品中に存在する場合、それは、全長タンパク質として、またはアミノ酸1-51および134-591の融合物からなるバリアントとして（アミノ酸配列134からC末端までの成熟外膜タンパク質を生じる）、発現される可能性がある。適当な形のHsfは、WO 01/55182に記載のタンパク質の可変領域を欠失させるようにトランケートされていてもよい。適当なバリアントは、WO 01/55182に記載の、1、2、3、4、または5つの可変領域の欠失を含むと考えられる。ある態様では、第1および第2の可変領域が欠失している。
【００５２】
適当なバリアントは、アミノ酸配列52から237まで、または54から237までのアミノ酸配列の間から残基を欠失していると考えられるが、より適切には、アミノ酸52から133まで、または55から133までの間から残基を欠失する。成熟タンパク質はシグナルペプチドを欠いたものである。
【００５３】
Hap：髄膜炎菌（Neisseria meningitis）由来のHap様タンパク質のコンピューター解析は、少なくとも3つの構造ドメインを明らかにする。H44/76株由来のHap様配列を基準と見なすと、アミノ酸1-42を含むドメイン1は、オートトランスポーターファミリーに特徴的なSec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸43-950を含むドメイン2は、表面が露出しやすく免疫系にアクセスしやすいパッセンジャードメインをコードするが、951からC末端（1457）までの残基を含むドメイン3は、βストランドをコードすると予想され、このβストランドは、バレル様構造を構築して、外膜の中にアンカーとして固定される可能性が高い。ドメイン2および3は、表面露出しやすく、よく保存されており（テストした全菌株で80%を越える）、大腸菌（E. coli）においてサブユニット抗原として作製することができるので、興味深いワクチン候補となる（Pizza et al. (2000), Science 287: 1816-1820も参照されたい）。
【００５４】
本明細書の免疫原性組成物は、全長Hapタンパク質を含有することができるが、OMV標品に組み込まれていれば好適である。本明細書の免疫原性組成物は、Hapのパッセンジャードメインを含有してもよく、これはH44/76株においてアミノ酸残基43-950で構成される。このHap断片は、本明細書のサブユニット組成物に用いるのが特に有利であると思われる。Hapのパッセンジャードメインの上記配列は、NもしくはC末端のいずれか一方、または両方で、1、3、5、7、10、15、20、25、もしくは30個以下のアミノ酸だけ伸長させる、またはトランケートすることができる。
【００５５】
本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、ある実施形態において、細菌外膜小胞標品を含有し、この標品が、組成物もしくはワクチンの抗原を含んでいる。このような組成物もしくはワクチンは、本発明の別の態様として与えられる方法によって作製することが可能であり、その方法は、前記抗原を産生する少なくとも１つの第1のグラム陰性細菌菌株を培養することを含むが、この前記抗原は、被験体に投与されたとき、少なくとも前記の第1のグラム陰性細菌菌株による感染に対して、防御反応を引き起こす外膜小胞の生産をもたらすのに十分なレベルで、産生される；さらにこの方法は、培養株から外膜小胞を調製すること；ならびに前記外膜小胞と製薬上許容される担体もしくは賦形剤を組み合わせて、被験体への投与に適した免疫原性組成物を作製することを含む。
【００５６】
「被験体に投与されたとき、少なくとも前記の第1のグラム陰性細菌菌株による感染に対して、防御反応を引き起こす外膜小胞の生産をもたらすのに十分なレベル」とは、前記抗原を含有する外膜小胞の投与時に免疫応答が誘導され、その免疫応答が、前記第1のグラム陰性菌株によって引き起こされる疾患を予防し、その発症を遅らせ、もしくはその重症度を下げるものである、またはその疾患の症状を軽減、もしくは完全になくすものであるような、十分な抗原が産生されることを意味する。
【００５７】
実施例で示すように、TdfIの発現は、遊離亜鉛濃度に応じて制御され、遊離亜鉛レベルの減少は、TdfI発現のアップレギュレーションと相関する。（TdfHの発現も、それほどではないが、遊離亜鉛レベルに影響されると考えられている。）したがって、前記方法において、前記細菌株の培養は、前記抗原の発現をアップレギュレートするために、亜鉛キレート剤を含有する培地中で行うことができるが、濃度は0.01-100、0.1-10、0.3-5、または0.5-1μMが適当である。前記亜鉛キレート剤は、たとえば、TPENとすることができる。亜鉛キレート剤の使用に代わるものとして、本発明による前記の培養をCatlin培地中で行うことができる。
【００５８】
方法に関するある実施形態において、抗原は、前記第1のグラム陰性細菌株において、前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターから発現される。それに加えて、またはその代わりに、前記抗原は、異種の、および/または強力な、プロモーターからの発現によって生産されるが、すなわち、ある実施形態においてこのようなプロモーターは、遺伝子操作で前記細菌株の染色体に入れられ、前記抗原をコードするポリヌクレオチド配列と、機能しうるように連結される。当業者には周知のとおり、「異種」という用語は、天然では一緒に存在することのない2つの生物学的成分のことをいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、またはプロモーターなどの制御領域とすることができる。異種成分は天然では共存しないが、遺伝子に対して異種であるプロモーターが機能しうるように遺伝子に連結される場合のように、いっしょに機能することはできる。「強力な」プロモーターは、機能しうるように連結されたポリヌクレオチド配列の高レベルな発現を駆動するプロモーターである。特定の種に属する細菌株に関して高レベルをもたらすものは、そうした菌株において強力なプロモーターがなんであるか知られているように、当業者によく知られていると考えられる。
【００５９】
さらに、前記方法に関して、培養株から外膜小胞を調製するステップは、界面活性剤抽出によって行うことができるが、他の方法によって行うこともできる。前記の場合、前記抽出は、0-0.5%、0.02-0.4%、0.04-0.3%、0.06-0.2%、0.08-0.15%または0.1%の界面活性剤の使用を伴うことができる。好ましくは、界面活性剤はデオキシコール酸である。
【００６０】
上記のように、前記抗原の発現は、前記第1のグラム陰性細菌株から生成される外膜小胞において、たとえば、遊離亜鉛の低い条件下での培養の結果として、アップレギュレートすることができる。したがって、前記抗原の発現は、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンに含まれる外膜小胞標品においてアップレギュレートすることが可能であって、これらはそのような標品を含んでいる。このようなアップレギュレーションは、同一菌株の野生型細菌由来の外膜小胞標品中の前記抗原の発現と比較することができる。具体的には、前記抗原の発現は、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍またはそれ以上アップレギュレートすることができる。
【００６１】
遊離亜鉛の低い条件で培養する代わりに、またはそうした条件で培養することに加えて、このような前記抗原発現のアップレギュレーションを達成するために、前記外膜小胞標品をもたらす宿主細胞を、前記抗原の産生について遺伝子改変することができる。このような改変は、内在性タンパク質の機能的発現の破壊を含んでおり、このタンパク質は遺伝子改変されていない宿主細胞において前記抗原の発現を抑制するものである。したがって、このような、内在性リプレッサータンパク質の標的化された破壊の後、前記抗原の発現はもはや抑制されず、すなわち相対的にアップレギュレートされる。ある実施形態において、内在性リプレッサータンパク質は、ナイセリアまたはグラム陰性細菌のZurリプレッサーである。リプレッサータンパク質発現の破壊の代わりに、またはそれに加えて、宿主細胞は、抗原をコードするポリヌクレオチドと、機能しうるように連結された、異種の、および/または、強力な、プロモーターの導入によって改変されていてもよい。このようなプロモーターは上記で述べた。前記の導入プロモーターは誘導性であって、すなわちプロモーターは、たとえばIPTGもしくは熱などの、それぞれ、化学的もしくは環境的刺激に応じて、「スイッチオンにする」または「アップレギュレートする」ことができる。
【００６２】
本発明はさらに、もう1つの態様において、遺伝子操作されたグラム陰性細菌株を提供するが、この菌株から、外膜小胞標品を含む本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンのこのような標品を得ることができる。
【００６３】
ある実施形態において、免疫原性組成物もしくはワクチンは、2つ以上のグラム陰性細菌株から分離された外膜小胞標品を含有する。もう1つの実施形態において、前記菌株のうち少なくとも1つは、下記からなる一群から選択される細菌種もしくは属に属する；ボレリア属（Borrelia）；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病ボレリア）（Borrelia burgdorferi）；ブルセラ属（Brucella）；ヤギ流産菌（Brucella melitensis）；ヒツジ流産菌（Brucella ovis）；クラミジア属（Chlamydia）；クラミジア・シタッシ（オウム病クラミジア）（Chlamydia psittaci）；クラミジア・トラコマチス（トラコーマクラミジア）（Chlamydia trachomatis）；大腸菌属（Escherichia）；大腸菌（Escherichia coli）；レジオネラ属（Legionella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；エルシニア属（Yersinia）；エルシニア・エンテロコリチカ（腸炎エルシニア）（Yersinia enterocolitica）；赤痢菌属（Shigella）；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）；シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）；コクシエラ属（Coxiella）；コクシエラ・ブルネッティ（Q熱コクシエラ）（Coxiella burnetii）；アシドボラックス属（Acidovorax）; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）。
【００６４】
本発明のもう1つの態様において、免疫原性組成物もしくはワクチンを作製するための方法が与えられ、これは下記を含む：前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有する宿主細胞を、前記抗原を生産するための条件下で、それに十分な時間、培養し、培養液から抗原を回収すること；必要に応じて、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーからなる一群から選択される方法で前記抗原を精製すること；ならびに、前記抗原を、製薬上許容される担体もしくは賦形剤とともに製剤化すること。このような方法に関連して、抗原は宿主細胞にとって内在性であってもよいが、宿主細胞が外因性抗原の導入によって遺伝的に改変されていてもよい。前記抗原を作製するための宿主細胞の遺伝子改変には、上記のように、内在性リプレッサータンパク質の破壊、ならびに異種の、および/または強力なプロモーターの使用などがある。
【００６５】
本発明は、与えられた方法によって作製される免疫原性組成物もしくはワクチンにまで及ぶ。
【００６６】
前記抗原、および、状況に応じて、1つもしくは複数の追加の抗原に加えて、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、１つもしくは複数の製薬上許容される賦形剤、アジュバント、および亜鉛塩を含有することができる。
【００６７】
本発明の他の態様において、抗原、ならびに、必要に応じて上記のような追加の抗原をコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含有する、免疫原性組成物もしくはワクチンが与えられるが、この場合前記ポリヌクレオチドは、真核生物プロモーターに、機能しうるように連結されている。このような態様において、抗原それ自体は投与されないが、コードするポリヌクレオチドの投与後にin vivoで生成される。このような技術は当技術分野で知られており、たとえば、Wolff et al., Science, (1990) 247: 1465-8を参照されたい。このようなポリヌクレオチドでの抗原の発現は、哺乳動物細胞内で発現を駆動する能力を有する、真核生物プロモーターの制御下にあると考えられる。ポリヌクレオチドは、他の抗原をコードする配列を追加して含んでいてもよい。このような真核生物プロモーターの例には、宿主として哺乳動物細胞を使用するウイルス由来のプロモーターがあり、これにはアデノウイルスプロモーターおよびレトロウイルスプロモーターが含まれる。あるいはまた、哺乳動物プロモーターを使用することもできるだろう。
【００６８】
上記の免疫原性組成物もしくはワクチンは、ある実施形態において、グラム陰性細菌株による感染に対する防御反応を生じさせることができる。本明細書で使用される「防御反応」は、グラム陰性細菌株によって引き起こされる疾患を予防し、その発症を遅らせ、もしくはその重症度を下げる免疫応答、またはその疾患の症状を軽減し、もしくは完全に取り除く免疫応答を意味する。他の実施形態において、前記組成物もしくはワクチンは、2つ以上の異なる細菌株による感染に対する、防御反応を生じさせることができる。前記の1つもしくは複数の異なるグラム陰性細菌株は、下記からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属することが適当である：ボレリア属（Borrelia）；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病ボレリア）（Borrelia burgdorferi）；ブルセラ属（Brucella）；ヤギ流産菌（Brucella melitensis）；ヒツジ流産菌（Brucella ovis）；クラミジア属（Chlamydia）；クラミジア・シタッシ（オウム病クラミジア）（Chlamydia psittaci）；クラミジア・トラコマチス（トラコーマクラミジア）（Chlamydia trachomatis）；大腸菌属（Escherichia）；大腸菌（Escherichia coli）；レジオネラ属（Legionella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；エルシニア属（Yersinia）；エルシニア・エンテロコリチカ（腸炎エルシニア）（Yersinia enterocolitica）；赤痢菌属（Shigella）；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）；シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）；コクシエラ属（Coxiella）；コクシエラ・ブルネッティ（Q熱コクシエラ）（Coxiella burnetii）；Acidovorax; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）。
【００６９】
ある態様において、本発明は、グラム陰性細菌性疾患もしくは感染症の治療または予防のための方法を提供するが、その方法は、防御用量もしくは有効量の上記本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを投与することを含む。
【００７０】
別の態様において、グラム陰性細菌性疾患もしくは感染症の治療または予防に用いるための、上記免疫原性組成物もしくはワクチンが与えられる。
【００７１】
本明細書で使用される「疾患」は、細菌感染症、または細菌感染によって引き起こされる、もしくは細菌感染に関係するなんらかの疾患、たとえば上気道感染症、ならびに侵襲性細菌性疾患、たとえば菌血症および髄膜炎を意味する。
【００７２】
前記グラム陰性細菌性疾患は、任意のグラム陰性細菌株によって引き起こされる感染症もしくは疾患とすることができるが、適当な当該菌株は、下記からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する：ボレリア属（Borrelia）；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病ボレリア）（Borrelia burgdorferi）；ブルセラ属（Brucella）；ヤギ流産菌（Brucella melitensis）；ヒツジ流産菌（Brucella ovis）；クラミジア属（Chlamydia）；クラミジア・シタッシ（オウム病クラミジア）（Chlamydia psittaci）；クラミジア・トラコマチス（トラコーマクラミジア）（Chlamydia trachomatis）；大腸菌属（Escherichia）；大腸菌（Escherichia coli）；レジオネラ属（Legionella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；エルシニア属（Yersinia）；エルシニア・エンテロコリチカ（腸炎エルシニア）（Yersinia enterocolitica）；赤痢菌属（Shigella）；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）；シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）；コクシエラ属（Coxiella）；コクシエラ・ブルネッティ（Q熱コクシエラ）（Coxiella burnetii）；Acidovorax; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）。特定の実施形態において、前記菌株はナイセリア属菌株でないこともある。
【００７３】
本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、添加物を添加して、または添加せずに、経口で、経鼻で、鼻咽頭に、非経口で、経腸で、経胃で、局所に、経皮で、皮下に、筋肉内に、錠剤、固体、粉末、液体、エアロゾルの形で、局部的もしくは全身的に、投与することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際的方法は、当業者に知られており、すなわち明らかであって、Remingtons Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)のような出版物に詳細に記載されている。
【００７４】
経口投与は、組成物を消化から守ることが必要であると認識されている。これは典型的には、酸加水分解および酵素的加水分解に対して抵抗性にする薬剤と組成物を組み合わせることによって、または適当な抵抗性のある担体の中に組成物をパッケージすることによって達成される。消化から守る手段は当技術分野で周知のことである。
【００７５】
組成物は、グラム陰性細菌性疾患に罹る危険にさらされている動物に投与され、疾患およびその合併症の発症を予防し、または少なくともある程度、阻止する。これを達成するのに十分な量が、「治療上有効な量」と定義される。治療に使用するために有効な量は、たとえば、免疫原性組成物もしくはワクチン、投与法、患者の体重および全身健康状態、ならびに処方医師の判断によって決まる。免疫原性組成物もしくはワクチンの単回投与もしくは複数回投与は、患者に必要とされ、しかも許容される投与量および頻度、ならびに投与経路に応じて、行うことができる。
【００７６】
免疫原性組成物もしくはワクチンは、宿主において免疫応答、特に液性免疫応答を引き起こすのに有効な量で投与される。免疫化のための量は概して、70kgの患者あたり約0.001 mgから約1.0 mg、より一般的には70kgの患者あたり0.001 mgから約0.2 mgまでの幅がある。特に、抗原が血流中にではなく、体腔、または臓器内腔などの孤立した部位に投与される場合、患者あたり1日0.001から約10mgまでの投与量を使用することができる。実質的にもっと高い投与量（10から100 mgまで、またはそれ以上）は、経口、経鼻、または局所投与では可能である。初回投与後、同じく別の組成物で追加免疫を行うことができるが、少なくとも1回、より一般的には2回の追加免疫が好ましい。免疫原性組成物もしくはワクチンは、典型的には、所与のグラム陰性細菌株もしくは種に関して免疫学的にナイーブな哺乳動物に投与される。特定の実施形態において、哺乳動物は、約5歳未満、好ましくは約2歳未満のヒト乳幼児であり、抗原組成物は、次の時点のいずれか1つもしくは複数の時点で、投与される：生後2週間、1ヶ月、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11ヶ月、もしくは1年、または15、18、もしくは21ヶ月、または2、3、4、もしくは5歳。概して、いかなる動物への投与も、最初に病徴が兆す前に、またはグラム陰性細菌株もしくは種に暴露した可能性のある、もしくは実際に暴露した、最初の兆候の時点で、開始することが好ましい。
【００７７】
他の実施形態において、本発明は、（たとえば、グラム陰性細菌性疾患の予防もしくは治療に使用するために）免疫グロブリンを調製する方法を提供するが、その方法は本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを用いてレシピエントを免疫化するステップ、ならびにそのレシピエントから免疫グロブリンを取り出すステップを含む。このようにして得られる免疫グロブリン標品は、製薬上許容される賦形剤を追加して含有する医薬製剤の形で与えられることもある。
【００７８】
ポリクローナル抗体生産のための接種材料は、典型的には、免疫原性組成物もしくはワクチンを、生理食塩水などの生理学的に許容される希釈剤、または水性組成物を生成するための、ヒトの使用に適した他のアジュバント中に分散させることにより調製される。免疫を刺激する量の接種材料を、哺乳動物に投与し、接種された哺乳動物は、その後、免疫原性組成物もしくはワクチンが防御抗体を誘導するのに十分な時間、維持される。抗体は、アフィニティクロマトグラフィーなどのよく知られた方法によって望ましい程度まで分離することができる。抗体は、通常使用されるさまざまな動物、たとえば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラットもしくはヒトから得られる、抗血清標品を含めることができる。動物から採血し、血清を回収する。
【００７９】
本発明にしたがって作製される免疫グロブリンは、全抗体、抗体フラグメント、またはサブフラグメントを含む可能性がある。抗体は、任意のクラスの全免疫グロブリン、たとえば、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体、またはTdfIタンパク質およびTdfHタンパク質に対する二重特異性を有するハイブリッド抗体とすることができる。それらは、フラグメント、たとえばF(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含むことができる。免疫グロブリンには、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより、抗体のように作用する、天然タンパク質、合成タンパク質、または遺伝子操作タンパク質も含まれる。
【００８０】
本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、レシピエントに投与することができ、このレシピエントは次に、該特定の免疫原性組成物もしくはワクチンのチャレンジに応じて産生される免疫グロブリンの供給源となる。このようにして処置された被験体は血漿を提供することになるが、この血漿からは高力価免疫グロブリンが、従来の血漿分画法によって得られるであろう。高力価免疫グロブリンは、所定のグラム陰性細菌種もしくは菌株による感染に対して抵抗性を与え、またはこれを治療するために、別の被験体に投与されることになる。本発明の高力価免疫グロブリンは、特に、乳幼児や免疫力の低下した個体において、または治療が必要であるがその個体がワクチン接種に反応して抗体を産生する時間がない場合に、グラム陰性細菌性疾患の治療または予防に有用である。
【００８１】
本発明のもう1つの態様は、TdfIタンパク質および/またはTdfHタンパク質に対して反応するモノクローナル抗体、ならびに製薬上許容される賦形剤を含有する医薬製剤であって、これはグラム陰性細菌による感染症を治療または予防するために使用することができる。このような医薬製剤は、任意のクラスの全免疫グロブリン、たとえば、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体、またはTdfIタンパク質およびTdfHタンパク質に対する二重特異性を有するハイブリッド抗体とすることができるモノクローナル抗体を含有する。それらは、フラグメント、たとえばF(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含むことができる。モノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野でよく知られており、脾細胞と骨髄腫細胞との融合が挙げられる（Kohler and Milstein, 1975, Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow and Lane 1988）。あるいはまた、モノクローナルFvフラグメントを、適当なファージディスプレイライブラリーのスクリーニングで得ることができる（Vaughan TJ et a1,1998, Nature Biotechnology 16; 535）。モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の技法を用いて、ヒト化、または部分的にヒト化することもできる。
【００８２】
本発明は、免疫グロブリンもしくはモノクローナル抗体を含有する、有効量の上記医薬製剤を患者に投与するステップを含む、グラム陰性細菌性疾患の治療または予防のための方法、ならびにそうした疾患の予防または治療に使用するための上記製剤に及ぶ。
【００８３】
本特許明細書の中で引用されるあらゆる参考文献もしくは特許出願は参考として本明細書に組み入れられる。
【００８４】
（実施例）
本明細書に記載の実施例および実施形態は、説明のみを目的としており、それらを考慮してさまざまな修正または変更が当業者に示唆されるが、それは本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきものであることが認められている。本明細書に引用されたあらゆる刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【実施例１】
【００８５】
TdfIのアップレギュレーションを示すOMVの免疫原性
TdfIは、髄膜炎菌（N. meningitidis）が血液中に存在するときに発現すると考えられる遺伝子である。したがって、TdfIは、菌株を通常の培地中で培養すると、普通は発現されないが、たとえば、野生株H44/76は、特別な培養条件（ヘミンを添加したRPMI培地）でこのタンパク質を発現させるようにすることができる。以下の実験は、TdfI発現が組み換えによって（IPTGの使用による）誘導性となった、H44/76株の使用を詳述する。これは、この菌株から作られたOMVワクチンの表面上でのTdfIの過剰発現を可能にするが、加えて、この抗原を発現する菌株を培養して、TdfIに対して生じた抗体が通常の培養条件（＋IPTG）下でTdfIを発現するこのような改変株を死滅させることができるかどうかを立証する簡単な方法を提供する。SBAに使用される細胞上のTdfI発現に及ぼすIPTGの影響を図7に示す。
【００８６】
10匹のマウスからなる群を、筋肉内経路で、0、21、および28日目にOMVで3回免疫化した。各接種は、MPLとともにAlPO4で製剤化された5μg（タンパク質含量）のOMVからなるものであった。OMVは、莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレートされ、LOS免疫型がgalE型となるよう操作された、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）H44/76株から得られた。TdfIがアップレギュレートされている、またはアップレギュレートされていないOMVの比較を行った（IPTG誘導プロモーターの制御下でのアップレギュレーション）。42日目に、（培地中にIPTGを添加後、または添加せずに）TdfIを発現する、または発現しない同型株H44/76 (B:15:P1.7,16)を用いて血清殺菌アッセイで分析するために、血液サンプルを採取した。
【００８７】
髄膜炎菌（N. meningitidis）株は、ペトリ皿の10μg/mlクロラムフェニコールを含有するGC寒天上で、37℃+ 5% CO2で一晩培養した。それを、1000μM IPTG添加または無添加の液体TSB培地中で3時間、継代培養した。個々の血清は、56℃で30分間、不活化した。血清サンプルは、0.5% HBSS-BSAで希釈した後、平底マイクロプレート中の25μlの容量で、2倍希釈(8回希釈)した。細菌は、0.5% HBSS-BSAで希釈して8.103 CFU/mlが得られ、この希釈液12.5μlを血清希釈液に加えた。さらにウサギ補体(12.5μl)を各ウェルに加えた。振とう条件下で37℃にて75分間インキュベーション後、この15μlの混合物を、37℃+ CO2で一晩インキュベートされた、あらかじめ加温されたGC寒天プレート上に広げた。
【００８８】
CFUを計数し、死滅率を算出した。SBA力価は、50%の死滅率を与える希釈度である。
【００８９】
SBA力価：標的細胞によるTdfI発現の影響
2013522177.tif 000003
IPTGなしでは、TdfIは標的細胞上に発現せず、この細胞はアップレギュレートされたTdfI OMVで免疫化されたマウス由来の血清によって死滅しない。TdfI発現がIPTGにより特異的に誘導されると、標的細胞はTdfIを発現し、抗TdfI-OMVマウス血清によって死滅する。
【実施例２】
【００９０】
ワクチンとなり得る髄膜炎菌（Neisseria meningitis）の新規亜鉛制御型外膜タンパク質
要約
ヒト宿主において遊離鉄の濃度は低いので、効率的な鉄獲得機構は、病原性細菌の重要な病原性因子となる。グラム陰性細菌では、TonB依存性外膜受容体が、鉄の獲得に関与する。しかしながら、ヒト宿主において同様に不足している他の金属の、細菌外膜を越える輸送は、ごくわずかしか明らかになっていない。本研究では、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）の新規TonB依存性外膜受容体の特性を明らかにした。本研究者らは、細菌が亜鉛制限下でこのタンパク質を生産し、それが亜鉛取り込みに関与することを示す。さらに、このタンパク質は分離株の間で高度に保存されており、しかも殺菌性抗体を誘導する能力を有するので、これまで有効な万能ワクチンが得られていない髄膜炎菌（N. meningitidis）に対するワクチンを開発するための新たな候補となる。TdfIと呼ばれるこのタンパク質のホモログは、気道内に常在する他の多くの病原体にも見いだされるので、受容体を介した亜鉛の取り込みが、この生態学的適所での生存に特に重要であることが示唆される。
【００９１】
序論
グラム陰性細菌の細胞表層は、内膜および外膜の2つの膜からなり、これら2つの膜は、ペプチドグリカン層を含むペリプラズムによって隔てられている。外膜は環境からの有害化合物に対するバリアを形成する。ほとんどの栄養分は、ポリンと総称される大量のチャンネル形成外膜タンパク質を介した受動拡散で、外膜を通過することができる。しかしながら、栄養分の細胞外濃度が低い場合は、拡散という選択肢はない。これが、たとえば、鉄の場合である。鉄がラクトフェリンおよびトランスフェリンなどの鉄輸送および鉄貯蔵タンパク質によって捕捉されているヒト宿主の体内で、病原体は遊離鉄の低濃度に直面する。したがって、効率のよい鉄獲得機構は、重要な病原性因子となるので、多くの病原体で広範に研究されてきた（1、2）。
【００９２】
鉄制限条件下で培養すると、グラム陰性細菌は、宿主の鉄結合タンパク質、ヘム、またはシデロフォアの受容体として機能する、外膜タンパク質の合成を誘導するが、このシデロフォアは、鉄制限条件下で細菌が生産して分泌する小さな鉄キレート化合物である。このような受容体の分析された結晶構造は、22ストランドのβバレルを示し、これは開口チャネルを形成せずにN末端プラグドメインによって閉じられている（3）。リガンドが受容体に結合した後、それに続く取り込みは、内膜内外のプロトン勾配のエネルギーを必要とする能動過程であって、それは3つのタンパク質からなる複合体であるTonB複合体を介して、外膜内の受容体と共役する（4、5）。
【００９３】
鉄獲得機構は、多くのグラム陰性細菌で広く研究されているが、細菌外膜を通過する亜鉛およびマンガンなどの他の必須重金属の輸送については、まだほとんど知られていない。これらの微量元素の濃度も、ヒト宿主体内で低く、ヒト宿主はたとえば、感染に対応してメタロチオネインおよびカルプロテクチンを生産することによって、侵入病原体の金属利用可能性を低下させる（6、7）。したがって、グラム陰性病原体は、これらの金属のための効果的な獲得機構を有する可能性があり、それは鉄獲得機構と類似しているかもしれないが、そうでない可能性もある。
【００９４】
髄膜炎菌（Neisseria meningitis）は、鼻咽頭粘膜に無症候性に定着しうるヒトの偏性病原体である。時に、その細菌が血流に入り、死亡率の高い髄膜炎および敗血症を引き起こす可能性がある（8）。髄膜炎菌（N. meningitidis）のほとんどの病原性血清型については莢膜多糖に基づいてワクチンが利用可能であるが、血清型B株髄膜炎菌に対するワクチンは十分でない。血清型B株の多糖莢膜は、それがヒトの糖タンパク質と類似しているため、免疫原性に乏しい（9）。したがって、莢膜下抗原が、代替ワクチン成分として研究されている；しかしながら、こうした研究は、主要な外膜タンパク質の抗原変異性が高いことにより頓挫した。したがって、関心は、TonB依存性受容体を含むマイナー抗原にシフトしている。
【００９５】
鉄制限条件下で培養したとき、髄膜炎菌（N. meningitidis）は、いずれも鉄の取り込みに関与するラクトフェリン（10）、トランスフェリン（11）、ヘモグロビン（12、13）、およびエンテロバクチン（14）のためのTonB依存性受容体を生産する。ホモロジー検索に基づいて、Turnerら（15）は、3つのナイセリア菌株の、入手可能なゲノム配列の中で、推定TonB依存性ファミリー（Tdf）メンバーに対する7つの追加の遺伝子を特定した。興味深いことに、これらのtdf遺伝子のうち一部の発現は、さまざまなマイクロアレイ研究（16、17）において、鉄の利用可能性によって影響されないようであったが、そのことは、それらの産物が鉄以外の金属の輸送に関与する可能性があることを示している。そこで本発明者らは、これらのうち1つの受容体の、合成の調節、機能、およびワクチンとなる可能性を研究し、この受容体が亜鉛の取り込みに関与することを示す。
【００９６】
結果
TdfIはヘム受容体ではない。
TdfI（髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型A株Z2491および血清型B株MC58の配列決定されたゲノム中のローカスタグ、それぞれNMA1161およびNMB0964）は、ナイセリアゲノム中に存在する７つの新規推定TonB依存性受容体のうちの１つとして、あらかじめ特定された（15）が、これはナイーブなヒト血清の存在下でアップレギュレートされることが判明した（18）。今まで研究されたほとんどすべてのTonB依存性受容体は鉄獲得に関与するので、TdfIは鉄複合体を輸送すると推測した。この考えは、NMA1161のアミノ酸配列を用いたblast検索（19）が、ヘム取り込み用の外膜受容体、たとえばカタル球菌（Moraxella catarrhalis）のHumA、に対して高い配列相同性を示し、同一性は41%、相同性は58%であったという事実によって強められた。
【００９７】
TdfIの機能を評価するために、HB-1と称される血清型B株H44/76の無莢膜性派生株のtdfI欠失変異株を構築した。ドットブロット解析での評価によって、HB-1およびtdfI変異株に対して同様のヘムの結合が見られ、tdfI変異株は、唯一の鉄源としてヘムを用いてプレート上でなお増殖することが可能であった。TdfIを発現する大腸菌（Escherichia coli）細胞によるヘム結合の増加も見られなかった。また、大腸菌ヘム要求株を補完することもできなかった（データ不記載）。したがって、TdfIはヘム受容体と相同的ではあるが、ヘム受容体としては機能しないとの仮説を立てた。
【００９８】
亜鉛によるtdfIの制御
TdfIはヘム受容体でなく、鉄による制御も見られないので、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）H44/76莢膜欠損株HB-1においてtdfIの発現を検出することができる条件を探した。富栄養の複合培地であるトリプティックソイブロス（TSB）で細菌を培養すると、ウェスタンブロットでTdfIを検出することはできなかった（図１A、レーン1）。しかしながら、化学的に組成の明らかな合成培地RPMI培地中で細菌を培養すると、TdfIは細菌溶解物中で検出可能であった（図１A、レーン2）。検出されたシグナルの特異性は、RPMI中で培養したtdfIノックアウト株中にそれが存在しないことによって実証された（図１A、レーン3）。本発明者らは、RPMIに添加された小量のTSBが存在するだけで、TdfI合成にマイナスの影響を及ぼすことに気づいた（図１B）；TSBはtdfIの転写を抑制する化合物を含有すると思われる。RPMIは微量金属源を含有しないことに気づいたので、コバルト、モリブデン、マンガン、銅、および亜鉛を含有する微量金属混合物の添加が、tdfI発現を抑制するかどうか調べることを決定したが、これは実際そういうことであると思われた。次に、上記すべての金属を別々にテストし、亜鉛が特異的に、μMを下回る濃度でもtdfIの発現抑制を引き起こすことが明らかになった（図１C）。標準的なRPMI培地は特別な亜鉛源を添加していないので、細菌の増殖に必要な、利用可能な亜鉛はおそらく、水、および/または培地作製に使用された塩に含まれる微量成分に由来する。誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）でRPMI培地中の亜鉛濃度を測定し、それが約110ppb（約1.69μM）であると判明した。
【００９９】
tdfIの亜鉛による調節は、RPMI培地に特異的な亜鉛キレート剤N,N,N',N'-テトラキス-(2-ピリジルメチル)-エチレンジアミン（TPEN）を添加すると、さらにいっそう明白になった。培地にTPENを添加すると、TdfI合成が用量依存的に増加した（図１D）。しかしながら、1μM TPENを上回る濃度は、おそらく培地から全亜鉛が枯渇するため、細胞増殖を完全に阻害した。増殖は亜鉛の添加によって回復させることができた（データ不記載）。tdfIの亜鉛による制御は、500 nM亜鉛もしくは0.5μM TPENを添加した、または添加しない、RPMI中で増殖させた培養物から得られた全RNAを用いた、定量的リアルタイムPCR（RT-qPCR）によって確認された。データから、亜鉛の存在下で13.8倍の抑制が示され、TPENの存在下で3.8倍のアップレギュレーションが示された。TPENおよび亜鉛添加の間の倍数差は52.6倍であった。
【０１００】
tdfI発現における転写制御因子Zurの役割
大腸菌では、亜鉛取り込み制御因子（Zur）はznuACB遺伝子の発現を制御することが判明しているが、この遺伝子は、ペリプラズム結合タンパク質、ATPアーゼ、および内在性内膜成分をコードしており、これらはペリプラズムから細胞質への亜鉛輸送に必要とされる（23）。亜鉛存在下で、Zurは、znuACBオペロンのプロモーター中のZur結合要素（コンセンサスGAAATGTTATANTATAACATTTC）と結合し、それによって転写をブロックする。
【０１０１】
髄膜炎菌（N. meningitidis） MC58株のゲノム配列中で、大腸菌zur遺伝子のホモログ、すなわちNMB1266、ならびにznuCBAのホモログ、すなわちNMB0588、NMB0587、およびNMB0586を特定した。さらに、ナイセリアtdfIの上流の領域中に大腸菌Zur結合コンセンサスに類似した配列（GtAATGTTATATaATAACAaact）、およびznuC（cAAAcGTTATACagTAtCATaTC）（大腸菌コンセンサスと同一のヌクレオチドは大文字とする）を見いだした。tdfI発現の制御にZurが関与することを確認するために、HB-1株のzur変異株を作製したが、この変異株は実際に、TdfIを構成的に生産した（図2）。また、RT-qPCRから、いずれも亜鉛存在下で培養されたzur変異株ではその親株と比べて、znuAおよびtdfIの発現レベルが、それぞれ5倍および34倍に増加するので、znuAおよびtdfIの発現にZurが関与することが実証された。
【０１０２】
TdfIは亜鉛獲得を促進する
tdfIの発現は、亜鉛の利用可能性によって制御されるので、TdfIは亜鉛の受容体、または亜鉛含有複合体として機能する可能性が高い。本発明者らは、まず、アミノ酸配列を解析し、www.rostlab.orgのPROFtmbプログラムを用いてTdfIのトポロジーモデルを構築した（図3）。TdfIは、推定される細胞外ループL3に2つのシステイン残基を含有する。これらのシステインがジスルフィド結合を形成しているならば（このことは、DTTあり、またはDTTなしのSDS-PAGEによる、細菌の膜画分の解析により支持されるが、このサンプルと還元剤とのインキュベーションは結果として、おそらくはジスルフィド結合の破壊に起因する、電気泳動移動度の変化をもたらした）、それらは、2つのごく近接した、ヒスチジンおよびアスパラギン酸残基に富む、アミノ酸残基のストレッチをもたらすが（図3）、これら2つのストレッチは、大腸菌のペリプラズムZnuAタンパク質においても、HisおよびAsp残基のストレッチが亜鉛との結合に関与している（25）ので、機能的に重要であると考えられる。したがって、本発明者らは、TdfIが遊離亜鉛と結合し、これをペリプラズムに輸送する可能性を考慮した。この仮説を調べるために、まずTdfIが亜鉛と結合するかどうか判定した。亜鉛に対して外膜小胞が4-(2-ピリジルアゾ)レゾルシノール（PAR）と競合する能力について、外膜小胞のTdfIの有無で比較した。TdfIを含有する外膜小胞は、TdfIを含有しない小胞と比べて、約40%の亜鉛結合の増加を示した（図4A）。亜鉛の輸送を調べるために、ICP-MSを用いて、tdfIノックアウト、tonBノックアウト、およびそれらの親株を、細胞内亜鉛の蓄積について比較した。HB-1はtdfI変異株もしくはtonB変異株より約33%多くの亜鉛を蓄積したが、それは、TdfIが遊離亜鉛を輸送すること、ならびにこの輸送にTonB系が必要であることを示す（図4B）。
【０１０３】
TdfIが実際に遊離亜鉛の取り込みに関与するならば、tdfI変異株では、野生株より高い外部亜鉛濃度でznu遺伝子発現の脱抑制が生じることが予想される。この考えを検証するために、tdfI変異株および親株を、500 nM亜鉛を追加したRPMI培地で培養したが、この追加された亜鉛は、野生株においてtdfI発現をほとんど抑制するものの完全には抑制しない（図1C）。つぎに、tdfIおよびznuA mRNAの相対レベルを、RT-qPCRで測定した。tdfI変異株は、遺伝子発現を検出するために使用された、tdfI遺伝子の最初の437ヌクレオチドをまだ含有している。tdfI変異株において、18.6倍多くのtdfIおよび7.4倍多くのznuAが発現されていたが、そのことは、tdfI変異株の細胞内亜鉛濃度が、使用された培養条件下では親株より低いことを示す。また、znuAノックアウト株は、亜鉛存在下で高レベルのTdfIを発現したが、これによって、細胞内で十分な亜鉛レベルを維持するためにZnuAが必要であることが確認された（図4C）。したがって、TdfIおよびZnuAはいずれも、亜鉛の輸送に関与する。
【０１０４】
TdfIの保存
TdfIの機能に加えて、TdfIが、髄膜炎菌万能ワクチンのためのワクチン候補となるかどうかも調べる必要がある。基準の1つは、この抗原が保存されていなくてはならないということである。まず、入手可能な髄膜炎菌（N. meningitidis）ゲノムを調べ、TdfIが、その成熟タンパク質について97-99%という顕著なアミノ酸同一性を有することが判明した（図8）。配列の相違は、タンパク質全体にわたって散在していて、予想される細胞外ループ領域に集中してはいないが、ナイセリア外膜タンパク質では、この領域が抗原変異性となることが多い（図8）。次に、異なる血清型および異なるクローン系統に由来する32個の異なる髄膜炎菌（N. meningitidis）分離株のパネルで、TdfIの存在を分析した。500 nM亜鉛添加もしくは無添加のRPMI培地中で各菌株を培養し、H44/76株のTdfIに対する抗血清を用いて、ウェスタンブロットで分析した。全菌株が、亜鉛存在下でTdfIの抑制を示した（図５）。
【０１０５】
次に、他の病原性細菌に対するTdfIの相同性を知る必要がある。まず、TdfIを淋菌（N. gonorrhea）と比較し、これら2つのナイセリア菌株間で96%同一性、および97%相同性を見いだした。次に、NCBIのblastプログラムを、アミノ酸レベルで40%同一性のカットオフで使用して、他の病原性細菌のTdfIホモログを検索した。カタル球菌（M. catarrhalis）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびアクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）などの、他の病原性細菌においてホモログを特定したが、平均するとアミノ酸レベルで41%同一性および59%相同性となり、TdfIホモログはすべて、His/Asp領域を有する（図９）。興味深いことに、百日咳菌（B. pertussis）では、tdfIホモログはznuABCおよびzur遺伝子のホモログに隣接した位置にあり、やはり、これらの遺伝子間の機能的関連性を示している。さらに、これらのTdfIホモログはすべてHisおよびAspリッチストレッチを含有する（図９）。
【０１０６】
TdfIは殺菌性抗体を誘導する
TdfIがワクチンとなり得る可能性を検討するために、過剰発現レベルのこのタンパク質を含有するナイセリア外膜小胞を用いてマウスを免疫し(図６A)、得られた血清で殺菌性抗体の有無を調べた。通常、血清殺菌アッセイはTSB培地で培養した細菌で行われる；しかしながら、こうした条件下ではtdfIは発現されない。したがって、血清の殺菌活性は、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導性プロモーターからTdfIを発現する菌株でテストし、IPTGあり、およびIPTGなしで増殖させた培養物を比較した。細菌の培養中にIPTGが存在しない場合、血清の殺菌力価は<1:100であるが、IPTGが存在する場合、1:1042であった。免疫前の血清の力価も<1:100であった。これらのデータは明らかに、TdfIが殺菌性抗体を誘導できることを示す。正常な染色体にコードされるtdfIの発現レベルが、補体を介した死滅をもたらすのに十分であるかどうかも調べる必要があった。このために、TSB培地中でTdfIを構成的に生産し、しかもこの培地中で野生株と同等に増殖する、zurノックアウト株を使用した。
【０１０７】
考察
亜鉛の高親和性ZnuABC取り込み系は、淋菌（N. gonorrhoeae）ですでに確認されている（30）。上記のように、髄膜炎菌ゲノム、および他の多くの細菌ゲノムで、ホモログを見いだすことができる。サルモネラ菌（Salmonella enterica）では、このABCトランスポーターは、病原性と関連付けられている（31）。いずれの場合も、亜鉛獲得に関与する外膜受容体は特定されておらず、亜鉛はポリンを通って拡散すると考えられている。
【０１０８】
しかしながら、ヒト宿主では、遊離亜鉛レベルが低すぎて受動拡散では細菌の増殖が維持できない可能性が高い。ヒト血清中の亜鉛の総量は約19μMであるが、圧倒的大部分はアルブミンなどの血清タンパク質と結合している（32）。そこで、亜鉛によって制御される外膜受容体、TdfIを特定した。増殖培地に700 nM亜鉛を添加すると、TdfIの発現は完全に抑制された。TdfIの機能は、未結合（遊離）亜鉛と結合してこれを輸送することである。亜鉛はまず外部ループにあるHis/Aspストレッチに結合した後、プラグドメインの上部にある2つのヒスチジンを介して内部移行すると予想される（図３ｂ）。亜鉛取り込みおけるTonB系の考えられる役割は、バレルからプラグを引き抜くことであり、この動きに伴って、2つのHis残基と結合した亜鉛はペリプラズムの中に輸送され、そこでペリプラズム結合タンパク質ZnuAによって捕捉される。
【０１０９】
興味深いことに、tdfIおよびznuA発現に関する同様の制御が、淋菌（N. gonorrhoeae）を用いたマイクロアレイ研究で報告された（33）。tdfIホモログNGO1205およびznuAホモログNGO0168は、NGO0542遺伝子を欠失した変異株でアップレギュレートされた。この遺伝子は、グラム陽性生物に存在するマンガン依存性過酸化物反応性制御因子に相同であるため、当該研究ではperRとして解釈された（34）。しかしながら、これは本発明者らがzurと解釈した同一の遺伝子である。zurが存在しないこと、または亜鉛が存在しないことによって、同一の制御が示されるので、zurという解釈の方が明らかに正確である。perRではなくzurという解釈のさらに他の証拠は、淋菌（N. gonorrhoeae）での同じ研究からもたらされる。淋菌perR変異株を用いて行われたマイクロアレイは、リボソームタンパク質L31およびL36のアップレギュレーションも示した。ナイセリアゲノムは、これらのタンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ2コピー含有し、各タンパク質の一形態は亜鉛リボンモチーフを含有する。亜鉛の利用可能性は、枯草菌（B. subtilis）で発現されるL31/L36タンパク質のタイプを制御する重要な因子であることが判明した（34）。淋菌perR変異株において、亜鉛リボンを欠失したL31およびL36パラログの発現が特異的に誘導されるが、それは、perR変異株での亜鉛制御の破壊を強く示す。さらに、別の研究（17）では、マイクロアレイを行って、酸化的ストレスに対する反応を確認したが、perRも、PerR研究（33）で特定されたいかなる遺伝子も脱抑制されず、tdfIおよびznuAの発現に及ぼすマンガンの調節作用はまったく見られない。
【０１１０】
すでに、tdfI発現は、活性な補体の存在下で誘導されることが報告された（18）。このマイクロアレイ研究において、血清および熱失活血清の存在下で培養した髄膜炎菌（N. meningitidis）の発現プロフィールを比較し、TdfIが未処理血清の存在下で23倍脱抑制されることが判明した。亜鉛と補体制御との関係は、ただちに明白ではないかもしれない。類似した調節回路の発見に対する考えられる説明は、アレイ研究の細菌を、BSAを添加したRPMIで前培養したことである可能性がある。アルブミンは亜鉛をキレートすることが知られているので、前培養条件は、亜鉛を厳しく制限したかもしれない。ヒト血清の熱処理は、アルブミンから亜鉛を放出させるので、それによってtdfIの発現は抑制される。この説明は、細菌培養時にBSAをTSB培地に添加すると、TdfI発現が誘導されるという事実で補強される。
【０１１１】
HagenおよびCornelissenによる研究(35)では、ヒト上皮細胞における淋菌（N. gonorrhoeae）の細胞内生存にTdfタンパク質のいずれかが必須であるかどうかが調べられた。その著者らは、TdfIホモログノックアウト（NG1205）もテストしたが、この変異株は細胞内生存について影響を受けなかった。
【０１１２】
TdfIの保存は顕著である；配列決定された髄膜炎菌（N. meningitidis）菌株間の同一性は98.6%であり、成熟タンパク質のアミノ酸レベルでの相同性は99.2%である。TdfIタンパク質は、検討したすべての髄膜炎菌に見いだされ、すべての菌株が、亜鉛で制御されるtdfIの発現を示した。配列決定された髄膜炎菌菌株のTdfIタンパク質と淋菌菌株のTdfIタンパク質との間には、アミノ酸レベルで96.1%同一性および97.3%相同性がある。TdfI配列間の相違は、タンパク質全体にわたって散在し、特定のループに集中していない。本発明者らは他の細菌のホモログとの、TdfIアミノ酸同一性が平均41%であることを見いだし、すべてのケースでHis/Aspストレッチは保存されている。興味深いことに、TdfIホモログは特に、ヒトおよび動物の気道に定着する細菌種に見いだされた。おそらく、気道の粘膜層では、未結合亜鉛濃度が低すぎて、ポリンを通過する十分な受動拡散は不可能であるため、TdfIが細菌の増殖および生存に不可欠となる。TdfIは細胞内の生存には必須ではない（35）が、遊離亜鉛濃度がやはり非常に低いと思われる血清および髄液のような体液中では必須となることが考えられる。また、気道、血清、および/または脳脊髄液中で利用できる錯体型の亜鉛をTdfIが追加的に認識することは無視できない。
【０１１３】
本発明者らは、さらに、TdfIがマウスで殺菌性抗体を誘導することができること、ならびに、こうした抗体が特異的にTdfIに対するものであることを示した。また、染色体座からTdfIを発現する細菌を使用すると、殺菌活性を検出することができたが、このことは、感染時に、抗原濃度が髄膜炎菌（N. meningitidis）の除去を可能にするほど十分に高いことを示す。
【０１１４】
高レベルの保存、およびTdfI特異的殺菌性抗体を生じる可能性によって、TdfIはすぐれたワクチン候補となる。
【０１１５】
材料および方法
使用する略語：IPTG、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド；PAR、4-(2-ピリジルアゾ)レゾルシノール；RPMI、Roswell Park Memorial Institute培地1640；Tdf、TonB-依存性ファミリー；TPEN, N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン；TSB、トリプティックソイブロス；ICP-MS、誘導結合プラズマ質量分析。
【０１１６】
菌株および培養条件
図5に示すナイセリア菌株は、研究所の収集保存株に由来する。特に指示のある場合を除き、実験はHB-1株およびその変異株を用いて実施した。HB-1は、血清型BのH44/76株の無莢膜性派生株である（Bos & Tommassen, 2005）。髄膜炎菌（N. meningitidis）は、37℃にてろうそく瓶の中で、Vitox（Oxoid）および、必要ならば、抗生物質（カナマイシン、100μg/ml；クロラムフェニコール、10μg/ml）を含有するGC寒天（Oxoid）プレート上で増殖させた。液体培養物は、37℃にて振盪しながら、プラスチックフラスコ内のTSB（Difco）またはRPMI（Sigma）中で増殖させた。IPTG、亜鉛、およびTPENを指定の濃度で添加した。金属を、混合物（終濃度で340 nM ZnSO4、160 nM Na2MoO4、800 nM MnCl2、80 nM CoCl2および80 nM CuSO4）として、または特に指定のない限り、単一化合物として混合物の場合と同じ濃度で、加えた。塩化第二鉄を終濃度8μMとして加えた。大腸菌株DH5αおよびTOP10F’（Invitrogen）を通常のクローニングに使用し、発現にはBL21（DE3）（Invitrogen）を使用した。大腸菌hemA変異株を用いて、TdfIのヘム輸送を評価した（22）。大腸菌は、必要ならば100μg/mlアンピシリン、50μg/mlカナマイシン、または25μg/mlクロラムフェニコールを添加して、Luria-Bertani培地上で増殖させた。大腸菌ヘム要求性変異株C600 hemA::kan (22)用には、培地に5-アミノレブリン酸を添加した。
【０１１７】
プラスミドおよび変異体の構築
すべてのプライマーは、MC58ゲノム配列に基づいて、NMB0964 (tdfI), NMB1730 (tonB), NMN0586 (znuA), NMB1266 (zur)を用いて設計した。
【０１１８】
大腸菌で高レベルのタンパク質生産を行うために、シグナル配列をコードする部分のないtdfI遺伝子を、H44/76株の染色体DNAから、PCRで増幅したが、これにはNdeIおよびBamHIの制限酵素認識部位（太字）をそれぞれ保有するプライマー
2013522177.tif 000004
および
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を使用した。得られた産物はメーカーの推奨する方法にしたがってpCRII-TOPO（Invitrogen）にクローニングして、pCRII-tdfIが得られ、さらにNdeI/BamHI制限切断によりpET11a（novagen）にサブクローニングして、結果としてプラスミドpET11a-edfIが得られた。
【０１１９】
tdfI欠失構築物を得るために、カナマイシン耐性遺伝子カセット（36）を、プライマー
2013522177.tif 000006
および
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を用いてPCRで増幅し、MluIおよびBsrGI消化後、同酵素で消化されたpCRII-tdfIにクローニングした。その結果得られた構築物pCRII-tdfI::kanにおいて、カナマイシン耐性カセットは、tdfIのbp437から1344までの間の領域と置き換わっている。0964-Rおよび0964-Fプライマーを用いたPCRに、pCRII-tdfI::kanを使用し、得られた産物を用いてHB-1を形質転換した（37）。カナマイシン耐性コロニーは、正確な遺伝子置換について、PCRでテストした。
【０１２０】
H44/76由来のtdfI遺伝子全体を、それぞれNdeIおよびAatIIの制限酵素認識部位（太字）を含有するプライマー
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および
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を用いて増幅した。得られたPCR産物を、NdeIおよびAatII制限酵素認識部位を用いて、pCRII-TOPOにクローニングし、pEN11-pldA（36）にサブクローニングした。その結果得られたプラスミドpEN11-tdfIは、ナイセリアの複製可能なプラスミドとなるが、これはtdfIの発現制御のためにlacIQ遺伝子およびタンデムlac/tacプロモーターを含有する。
【０１２１】
tonBノックアウトを作製するための構築物は、プライマーを用いて、tonB遺伝子の上流および下流のDNA断片を増幅することによって作製されたが、前記プライマーは、一方の断片用のtonB-1 (GTACGATGATTGTGCCGACC)、AccI制限酵素認識部位（太字）を有する
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ならびに、他方の断片用の、AccI制限酵素認識部位（太字）を有する
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およびtonB-4 (GCCATACTGTTGCGGATTTGA) である。2つの断片は、それぞれ、pCRII-TOPOにクローニングした後、pCRII-TOPOベクター中に導入された制限酵素認識部位であるAccIおよびSpeI部位を用いて互いにライゲートした。次に、AccI部位を用いて、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ遺伝子を、あらかじめpCRII-TOPOにクローニングしたpKD3（38）から、AccI部位を含有するプライマーを用いたPCT増幅によって、クローニングした。その結果得られた構築物は、tonB-1およびtonB-4プライマーを用いたPCRによって増幅され、この直鎖断片を用いて髄膜炎菌（N. meningitidis） HB-1を形質転換した。
【０１２２】
zur遺伝子は、同じ戦略にしたがってノックアウトされた。上流および下流断片は、この場合、次のプライマーで増幅された：zur-1 (TTCGCCGATGGCGGAATACA)、太字のAccI制限酵素認識部位を有する
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太字のAccI制限酵素認識部位を有する
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およびzur-4 (TCCTATTGCGCAATACCCCC)。
【０１２３】
髄膜炎菌（N. meningitidis） H44/76株の、CE2001と称されるporA派生株（39）をpMF121で形質転換した結果、莢膜の遺伝子座全体が欠失し、トランケートされた外側コアを有するリポ多糖が生産された（36）。髄膜炎菌（N. meningitidis）のtonB、exbB、およびexbD遺伝子を含有するpLAFR由来プラスミド（13）は、すでに報告された。
【０１２４】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
細胞溶解物を6時間培養した細菌から調製した。細胞はOD600nm 1まで希釈し、ペレット状として、2% SDSおよび5% 2-メルカプトエタノールを含有するSDS-PAGEサンプルバッファー100μl中で煮沸した。標準的なSDS-PAGEによりタンパク質を分離した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色するか、または25 mM Tris-HCl、192 mMグリシン、20% メタノール中で、ウェットトランスファーシステム（Biorad）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜（Protran）に転写した。0.1% Tween 20および0.5% Protifar (Nutricia)を含有するPBS中で1時間、膜をブロックした。ブロットを、ブロッキングバッファー中の抗体とともにインキュベートした。抗体結合は、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Biosource）および高感度化学発光検出（Pierce）を使用することによって検出した。
【０１２５】
免疫化
pET11a-tdfIを含有するBL21（DE3）細胞は、LB中で、OD A600 0.6まで培養した後、1 mM IPTGを添加し、培養を2時間続行した。封入体に蓄積したTdfIタンパク質を、（40）に記載のように単離し、この精製タンパク質を用いて、Eurogentecでウサギを免疫化した。得られた抗血清SN1042を、1/5000希釈で使用した。
【０１２６】
1 mM IPTG存在下、または非存在下で培養されたCE1523 /pEN11-tdfI株の外膜小胞を、デオキシコール酸抽出（41）で調製し、これを用いて（32）に記載のようにマウスを免疫化した。1群あたり10匹のマウスから血清を、42日後に採取してプールした。本実験は、ベルギーの関連する国家の指針、およびGlaxoSmithKline Biologicalsの企業方針に準拠した。
【０１２７】
RT-qPCR
RT-qPCRは、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR SystemおよびSYBR green master mix (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの推奨する方法にしたがって実施した。4x109 ナイセリア細胞を3 ml Trizol（Invitrogen）中に再懸濁することによって全RNAを分離した。600μlクロロホルムを添加し、遠心分離した後、上相を75%エタノールと1:1で混合した。これをnucleospin RNA IIカラム(Macherey-Nagel)に載せ、次にこれをnucleospin RNA IIキットのバッファーB3で洗浄し、水100μlで溶出した。次にRNAをTurbo DNA Free (Ambion)で処理して、DNAを含まないRNAを得た。cDNAを作製するために、Transcriptor High fidelity cDNA合成キット（Roche）を、メーカーの推奨する方法にしたがって使用して、ランダムヘキサマーから1μgの全RNAを逆転写した。対照として、同様の対応サンプルを調製したが、このサンプルでは反応混合物から逆転写酵素を削除した。PCRは96ウェルプレート（Applied Biosystems）で25μl容量として三連で実施し、次のサイクルパラメーターを用いた：酵素活性化のために95℃にて10分、続いて95℃にて15秒および60℃にて1分を40サイクル。融解プロットを行って、シグナルが特定のアンプリコンから生じることを確認した。データ解析は、comparative cycle threshold法（Applied Biosystems）を用いて実施し、相対的な発現レベルを確定した。rmpM転写物を用いて、すべてのデータを標準化した。
【０１２８】
ICP-MS
全亜鉛濃度は、Utrecht UniversityのGeochemistry部門の統合実験室で、ICP-MSによって測定した。髄膜炎菌（N. meningitidis）菌株を、出発OD A550 0.1から6時間、RPMI培地中で培養した；この時点でサンプルを採取し、残りの培養物は1μM亜鉛の存在下でさらに1時間培養した。この時間の後、第2のサンプルを採取した。両サンプル（7ml）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、水に再懸濁し、56℃にて1時間で死滅させ、-80℃で凍結した。その後、サンプルを解凍し、超音波処理して、0.22μmフィルター（Millipore）で濾過した。
【０１２９】
PAR競合アッセイ
PAR競合アッセイは、比色反応であって、この反応では、PAR亜鉛錯体のオレンジ色が、PARから亜鉛を遊離させることができるタンパク質もしくは化学物質の存在下で黄色に変わる。アッセイは、下記の改変を加えて（42）に記載のように行った：50μMではなく30μM亜鉛を添加して、まずPAR-亜鉛溶液を測定した後、キュベットに外膜小胞を加えて、その溶液を再度測定した。このようにして、時間経過の中でUVによって引き起こされる可能性のある色の変化を回避した。次にデータを、まずPAR-亜鉛の測定値に基準化した後、PARのみのサンプルに基準化して、外膜小胞の結合値を得た。示された結果は、500 nmでの吸収の基準化データである。
【０１３０】
血清殺菌性アッセイ
野生型H44/76をpEN11-tdfIで形質転換し、一夜培養プレートから、振盪フラスコ中の125μM FeCl3含有TSBに接種したが、これは1 mM IPTGを含有するか、または含有しておらず、OD A550が0.5に達するまで37℃にて3時間培養した。検査すべき血清は、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）（GIBCO）、0.3% BSA中で1:100に希釈した後、滅菌U底96ウェルマイクロタイタープレート（NUNC）で50μl容量として段階希釈した（2倍希釈ステップ、8回希釈）。細菌をHBSS、0.3% BSAで希釈して、約13,000 CFU/mlとし、その懸濁液サンプル37.5μlを血清希釈液に添加した。マイクロタイタープレートを37℃にて15分間振盪しながらインキュベートした。次に、幼若ウサギ補体（Pelfreez）12.5μl、またはその血清の毒性に関する対照として熱失活（56℃45分）補体をウェルに添加した。振盪しながら37℃にて1時間インキュベートした後、マイクロタイタープレートを氷上に置き、死滅を停止させた。各ウェルにつき20μlをGCプレートにスポットし、プレートを傾けて、液滴がプレートを流れ落ちるようにした。一晩インキュベートした後、コロニーを計数し、死滅のパーセンテージを算出した。殺菌力価は、>50%死滅を生じる血清の最大希釈度として定義した。
【０１３１】
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【０１３２】
表１．配列決定されたナイセリア菌株における成熟TdfIタンパク質配列の保存
【表１】
2013522177.tif 000014
【実施例３】
【０１３３】
ZnuD: 髄膜炎菌（Neisseria meningitis）の一価および万能ワクチンとなりうるワクチン候補
概要
髄膜炎菌（Neisseria meningitis）血清型Bは、若年集団の細菌性敗血症および髄膜炎の主な原因である。利用可能なワクチンは野生株から得られた外膜小胞に基づいている。しかしながら、乳幼児では、そうしたワクチンは、変異しやすい主要外膜タンパク質である、相同PorAを発現する菌株に対してしか防御をもたらさない。若年集団の髄膜炎菌感染を予防することができるワクチンの開発を可能にするワクチン抗原を特定するために、ZnuD（TdfI）を可能性のある候補として認定した。そこで、本発明者らは、ZnuDの潜在的価値の分析を拡張して、それが、亜鉛制限下で増殖させた時に、テストしたすべての髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型B菌株によって発現される、非常によく保存された抗原であること、血清型にかかわらずテストした菌株の大半に対して交差殺菌性抗体を誘導すること、ならびに感染時およびほぼ確実に保因時にも発現されることを示した。さらに、抗ZnuD抗体は、抗ヒト補体H因子結合タンパク質（fHbp）で死滅させられなかった菌株の補体死滅をもたらすことができる。
【０１３４】
序論
髄膜炎菌（Neisseria meningitis）はグラム陰性の莢膜に包まれた細菌である。それは、成人人口の約10%の上気道に無症状で定着している、ヒト偏性病原菌である。時として、それが血流に移行すると、菌血症となり、髄膜炎に進行して死に至る可能性がある。髄膜炎菌（N. meningitidis）は、急速に進行し、流行を引き起こしやすいことから、もっとも恐れられている細菌感染症の一つである。この細菌は、莢膜多糖の化学組成に基づいて、13の血清型に分類される。しかしながら、血清型A、B、C、Y、およびW-135だけが病気に関与しており、Xもわずかに関与していた。ヒトにおいて有効な免疫を与える複合多糖体ワクチンは、血清型A、C、Y、およびW-135について利用可能となっている。残念ながら、複合物アプローチが血清型B（MenB）に容易に適用できなかったのは、その莢膜多糖が、神経細胞接着分子のような、宿主のポリシアル酸化された糖タンパク質と構造的類似性を共有するためである。
【０１３５】
第1世代のMenBワクチンは、リポオリゴ糖（LOS）含量を減らすために界面活性剤で抽出後、精製された外膜小胞（OMV）に基づくものであった。PorAは、もっとも大量に存在する外膜タンパク質（OMP）であり、これらのOMVにおいて免疫優性の成分である。しかしながら、PorAは、OMVに基づくワクチンの有効性を制限する高い抗原変異性を、特に年齢2-4年未満で示すが、これは総計で欧州におけるMenB症例の約50%となる年齢群であり、1歳未満の乳児で約16/100,000の発生率である。この限界を克服するために、保存されているマイナーOMPを探索した。
【０１３６】
最近、膜内在性OMPのワクチン候補としての可能性が認識された。このタンパク質は、亜鉛取り込み成分Dに関わるZnuDと称され、亜鉛制限下で発現されて、亜鉛の取り込みに関与する。このタンパク質のワクチン候補としての可能性に基づいて、本研究を拡大して、ヒトにおける抗ZnuD抗体の存在、交差殺菌性抗体を誘導するその可能性を探求し、このタンパク質が非常によく保存され、しかもST-23クローナルコンプレックス由来の少数の血清型Y株を例外として、テストした髄膜炎菌（N. meningitidis）の全菌株で、血清型にかかわらず発現されることを確認した。
【０１３７】
結果
ZnuDは免疫原性であり、ヒトにおいて発現される。
ZnuDは、TPENなどの亜鉛キレート剤の添加後でなければ、古典的な寒天培養培地上での髄膜炎菌（N. meningitidis）の増殖で発現されないので、ホストでのその発現が疑問となる。ZnuDがヒトにおいて発現されていることを実証する間接的な方法は、回復期の患者および/または健康なキャリアの血清中の、抗ZnuD抗体の存在を評価することである。この目的のために、未成熟タンパク質の77%をカバーするペプチドアレイ法を使用した。
【０１３８】
12人の回復期の患者の血清、および11人のキャリアの血清をこのペプチドアレイで3〜5回テストした。図10は、2群の被験体間の、個々の反応の強度を示す。ペプチドに対する反応の強度、および血清が認識するペプチドの数はいずれも、回復期患者群の方がキャリア群より多大であった。回復期血清はすべて、少なくとも同じ5つの不連続ペプチドに対して反応したが、それはZnuDが感染時に明確に発現されることを示す。いくつかのペプチドに対して反応するキャリア血清中に抗体が存在することは、上気道定着時にZnuDが発現されることも示唆する。
【０１３９】
ZnuDのワクチンとしての可能性を評価するための関連培養条件の開発
すでに示したように、抗ZnuD抗体は、ZnuDを過剰発現するよう遺伝子改変されたその類似株の補体による死滅をもたらすことができる。大規模な菌株パネルを使用することによるZnuD抗体の交差殺菌能力の評価は、これら全株を遺伝子改変しておくことはできない。ZnuDの発現はZurで制御されるので、Δzur株と同レベルの、野生株によるZnuD発現を達成するのに必要な、亜鉛キレート剤の量を決定した。これはMH寒天プレートで20μM TPENを使用することで達成された（図11）。
【０１４０】
ZnuDは非常によく保存された抗原であって、ST23クローナルコンプレックス由来の一部のGerman血清型Y株を除くすべての髄膜炎菌（Neisseria meningitis）菌株で発現される。
ZnuDが、血清型A、B、C、W-135、およびYからの132菌株のパネルに関して、1株を除く全菌株で発現されることはすでに示した。これを拡張して、追加の43菌株について確認したが、これには、イギリス、スペインおよびドイツ在住の回復期の患者から2005年以降に分離された、血清型A、C、W135、およびYのそれぞれ2菌株、ならびに血清型Bの30菌株が含まれる。世界的には、テストした175菌株のうち、1株だけがZnuDを発現しなかった。この菌株はドイツの患者で分離された、ST-23クローナルコンプレックス由来の血清型Yである。このST-23クローナルコンプレックス由来の血清型Y株には特に注意を払った。ドイツで分離された7株をテストして、すべてがZnuDを発現したわけではなかった。配列分析から、4菌株については1つのヌクレオチドの欠失による停止変異が明らかとなった。そのうち3菌株は同一位置で欠失していた。
【０１４１】
ZnuDは血清型A、B、C、W-135、およびYに対する交差殺菌性抗体を誘導する。
ヒトにおけるZnuDの発現および免疫原性の実証は、本発明者らに、髄膜炎菌（N. meningitidis）万能ワクチン抗原としてZnuDの可能性をより深く評価することを促した。この目的のために、ZnuDを過剰生産する、またはしない2つの菌株からOMVを作製した。これら2つの菌株は、いずれもfHbpファミリーBを発現するH44/76株に由来するので、よく似た背景を有する。OMV標品中に残りの莢膜多糖が存在すること、ならびに抗LOSおよびPorA特異的殺菌性抗体が誘導されることを回避するために、galEおよびporA欠失変異を2つの菌株で行った。
【０１４２】
SDS-PAGE分析から、ZnuDは過剰生産株から作製されたOMVのタンパク質含量の約15%に相当するが、対照OMV標品中には見られないことが示唆された（図12a）。fHbpはOMV中に存在すると、きわめて免疫原性であると報告されたので、その含量をELISAでチェックした。ZnuD OMV中のfHbpの量は、対照OMVより4倍高かった（図12b）。マウスおよびモルモットをAlPO4に吸着されたOMVで3回免疫した。血清サンプルは、3回目の免疫化の2週間後に採取し、群あたり3プールの血清を得るようプールした。
【０１４３】
ELISAを用いてZnuDおよびfHbpの両者に対する反応を評価した（表３）。対照OMVを用いた免疫化は、マウスおよびモルモットのいずれにおいても、抗ZnuD抗体をほとんど、もしくはまったく誘導しなかった（それぞれGMT = 73および10 EU/ml）。予想通り、ZnuD OMVで免疫化した動物の血清では、高レベルの抗ZnuD抗体が測定された（それぞれGMT = 15096および5893 EU/ml）。驚くべきことには、fHbpの免疫原性は、マウスとモルモットとでは異なるように思われる。対照またはZnuD OMVで免疫化したモルモットの血清中の抗fhbp抗体レベル（それぞれ335および2733 EU/ml）は、マウス血清のレベル（それぞれ1342および59314 EU/ml）より明らかに低い。抗-対照OMVと抗ZnuD OMV血清との間の、抗fHbp抗体レベルの相違は、対照およびZnuD OMVにおけるfHbp量の相違に沿うものである。
【０１４４】
プールした血清は、TPENあり、またはなしで培養した髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Bの14菌株パネルに対するSBAをテストした。これらの菌株のうち6つは、通常、MenBワクチンの評価のためにHPAで使用される。このパネルには、2つの流行株（H44/76およびNZ98/254）、ならびに4つのもっとも流行した英国の血清亜型が含まれており、これらは2000年および2001年のMenB疾患の59.3%の原因となった（M01-240013、M01-240101、M01-240149、およびM01-240355）。TPENの存在下でのZnuDの発現は、上記14株のすべてについてウェスタンブロット分析で確認された。それに加えて、OMVで免疫化した動物の血清中には抗fHbp抗体が存在するため、組換えfHbp Bで免疫化したマウスの血清プールも、殺菌性アッセイで検査した（表3）。
【０１４５】
抗fHbp抗体の殺菌活性は、細菌によるfHbpの発現レベルと関連しており、ファミリー特異的である。古典的な培養条件を用いると、中程度（+/-）から高レベル（++）のfHbp Bを発現する5株だけが、抗fHbp B血清により死滅した（陽性のカットオフは128で固定）が、fHbp Aもしくは低レベルのfHbp Bのいずれか一方を発現する菌株はいずれも死滅しなかった。TPEN存在下で、同じ5つの菌株プラス2株（NZ124およびDE10690-06）は、抗fHbp B抗体により死滅する。TPEN存在下もしくは非存在下で得られるSBA力価は、世界的に類似しており、TPEN存在下でわずかに高い力価が測定される傾向がある。これは、抗体によってもたらされる、補体による死滅に対する菌株の感受性が、キレート剤の存在下で格段に増加するわけではないことを示唆する。
【０１４６】
対照OMVで免疫化したマウスの血清は、菌株がTPENの非存在下で培養された場合、菌株の補体死滅をもたらすことができない。キレート剤の存在下では、3株だけが、カットオフをわずかに上回るSBAを示した。これらの3株は、抗fHbp B抗体によって死滅したので、抗-対照OMV血清で観察された死滅は、ほぼ確実に、抗fHbp抗体の存在に起因し、さらに、TPENとともに培養したとき菌株の補体死滅に対する感受性がわずかに増加することに起因する。これらの抗fHbp抗体の役割は、ΔfHbp H44/76株を用いて殺菌性アッセイを行うことによって、上記3株のうち1株について明確に実証された（表4）。対照OMVで免疫化したモルモットの血清による死滅がないことは予想されており、ELISAの結果によって示唆される通り、この種においてfHbpの免疫原性が低いことに起因する。
【０１４７】
亜鉛キレート剤の非存在下では、ZnuD OMVで免疫化したマウスの血清は、4株を除いてテストした菌株の補体による死滅をもたらさなかった。これら4株は、抗fHbp抗体によっても死滅した。これらの抗fHbp抗体の役割は、ΔfHbp H44/76株を用いて殺菌性アッセイを行うことによって、明確に実証された（表4）。ZnuDの発現を可能にした殺菌性アッセイでテストした同じ抗ZnuD OMV血清は、テストした14菌株のうち12株の死滅をもたらすことができる。モルモットの血清を用いて、同様の結果が観察された。培地中にTPENが存在しないと、菌株は、3株を除いて、活性のある補体の存在下で死滅しなかった。また、これらの3株の1つであるH44/76に関して、抗fHbp抗体の役割は、ΔfHbp菌株を使用することによって実証された。TPENが存在すると、2株を除く全菌株が死滅し、SBA力価はカットオフを明確に上回った。死滅しなかった2株は、マウス血清で死滅しなかったのと同じ菌株である。これらの2菌株（760676およびM05-024072）によるZnuDの発現は、ウェスタンブロット分析によって実証された。
【０１４８】
第3群のマウスおよびモルモットは、無関係の抗原を過剰発現するH44/76株から精製されたOMVで免疫化した。TPEN存在下または非存在下で、血清殺菌性アッセイにおいて、結果は、対照血清について観察された結果と同様である（データ記載せず）。加えて、各血清型、A、C、W-135およびY、の1株についても殺菌性アッセイを行い、これらの4つの血清型に対する、抗ZnuD抗体の交差殺菌活性を確認した（データ記載せず）。
【０１４９】
殺菌性抗体の標的としてのZnuDおよびfHbpの確認
ZnuDが殺菌性抗体の主要な標的であることを確認するために、そしてTPEN存在下の方が高い殺菌力価が観察される傾向があることから、TPENあり、またはなしの殺菌性アッセイにΔznuD H44/76株を使用した（表4）。
【０１５０】
TPEN非存在下では、SBA力価は、血清の起源（免疫化に使用した動物種およびOMV）が何であっても、H44/76株とΔznuD株との間で類似していた。この殺菌条件では、ΔfHbp株について死滅は見られなかった。こうした結果は、ZnuD発現がない場合、fHbpが殺菌性抗体の主要な標的であることを示す。
【０１５１】
TPEN存在下では、ΔfHbp株は、対照動物の血清で死滅せず、ΔznuD株とWT H44/76株の両者で同様の力価が測定された。予想通り、抗ZnuD OMV血清を使用すると、殺菌力価はH44/76株よりΔznuD株の方が低くなった。
【０１５２】
これらの結果は、ZnuD OMVが抗fHbpおよび抗ZnuD殺菌性抗体の両者を誘導したが、対照OMVは抗fHbp抗体の産生だけを引き起こしたことを示す。その結果はまた、殺菌性抗体を介した補体死滅を誘導するために、fHbpおよびZnuDの同時発現が必要でないことを示す。
【０１５３】
考察
ZnuDは、Mueller Hinton培地、もしくはTryptic Soy Broth培地などの古典的な培地上では発現されない。これらの培地は、偏好性微生物を培養するために開発されたので、少数元素に富んでいる。MH寒天培地中、亜鉛の総量は、メーカーによって200μgから450μg/Lまでさまざまである。こうした培地中で、遊離亜鉛は、髄膜炎菌（N. meningitidis）が、亜鉛獲得専用の外膜受容体を特異的に発現する必要がないような濃度でおそらく利用可能であって、それは、非特異的ポリンを通過する亜鉛の受動拡散が、細菌の増殖を可能にするのにおそらくは十分であるからである。ウシ血清中、遊離亜鉛の量は約0.01μg/L（0.15 nM）と見積もられ、これは血清中の亜鉛の総量（800μg/L）の約0.0008%に相当する。小児では、全亜鉛濃度は約750μg/Lと見積もられ、外挿により遊離亜鉛は、やはりおよそ0.01μg/Lとなるはずである。脳脊髄液中では、全亜鉛濃度は約111μg/Lである。ヒトにおけるZnuDの発現は、回復期患者の血清中の抗体の欠如によって間接的に立証された。ペプチドアレイの結果も、保因者における発現を示唆する。ペプチドアレイで測定されたシグナルの強度から、上気道でのZnuD発現が血液中より低いと結論することは間違いに違いない。実際、実験は、微生物の定着によって誘導される粘膜免疫応答を反映しにくい血清IgGを検出するよう計画された。現在行われている研究は、急性期の患者の脳脊髄液中で髄膜炎菌（N. meningitidis）の直接染色を実施することによってZnuDのin vivo発現を実証することを目標としている。
【０１５４】
古典的培地上でZnuDの発現を可能にするために、亜鉛キレート剤の使用が必要である。金属キレート剤の使用は、TbpA/Bなどの鉄結合タンパク質の能力を実証するためにすでに記載されたので、上記は先行例を示すものではない。しかしながら、in vivo ZnuD発現レベルに相当する濃度を選択するために、ZnuD発現レベルに及ぼすTPEN濃度の影響を検討した（データ記載せず）。この目的のために、Δzur株におけるZnuDの発現をベンチマークとして使用した。用量範囲実験から、TPEN 20μMの濃度が選択された。キレート剤の使用を回避する試みとして、他の培地が評価段階にあることにも留意すべきである。以前Neisseriaの増殖のために開発された、化学組成の明確な限定培地であるCatlin培地について期待できる結果が得られた。フローサイトメトリー分析は、この培地でのZnuD発現が、MH寒天培地上で生育したΔzur株によるZnuDの発現に類似していることを示唆する（データ記載せず）。
【０１５５】
ZnuDのin vivo発現を再現しうるよう選択した培養条件（MH寒天培地＋20μM TPEN）を用いて、43株のパネルを、このOMPの発現について評価した。ZnuDは、これらのすべての菌株で検出された。全体として、182株の髄膜炎菌（N. meningitidis）をそれらのZnuDの発現について分析した。ZnuD発現は、血清型Yの7株を除く全菌株で証明されたが、この7株はすべて最近ドイツにて、ST-23クローナルコンプレックスから分離されたものである。それらのうち4株については、発現がないことは停止変異に関連付けられたが、残りの3株については、ヌクレオチド配列分析に基づく説明はなされない。ZnuDの発現は、古いMenY株で実証されたので、血清型Y株でのZnuDの発現を評価するために、いっそう入念な注意を払うつもりである。
【０１５６】
ZnuDは内在性OMPであるため、本発明者らは、それを免疫系に提示するためにOMVを選択した。これらのOMVは、ΔgalEおよびΔporA H44/76株から、0.5% DOCで抽出し、LOS含量を減少させた。このような条件で、本発明者らは、このタイプのOMVがLOSに対する殺菌性抗体の生産を誘導しないことをすでに立証している。対照OMVで免疫化したマウスおよびモルモットは、少数の菌株に対する限定的な殺菌性反応を誘導した。この防御反応は、ほぼ確実に、抗fHbp抗体の生産と関連付けられるものであって、それは、ELISAでのその抗体の存在によって、ならびに殺菌性アッセイでのΔfHbp株の使用によって、実証されるとおりである。その結果から、fHbpは、OMV中でその天然高次構造をとって提示されると、小胞の抽出のために界面活性剤を使用したせいで、こうしたOMV中に小量しか存在しなくても、特にマウスにおいて、免疫原性の高いタンパク質であることも示唆された。ZnuD OMVで免疫化したマウスおよびモルモットはいずれも、抗ZnuD抗体の生産を引き起こした。ELISAデータによれば、これら2種におけるZnuDの免疫原性は、fHbpと比べてきわめて類似しているように思われる。抗ZnuD OMV血清は、血清型にかかわらずテストしたすべての菌株の補体死滅を引き起こすことができたが、それはZnuDの発現を可能にする培養条件でのみである。例外は、血清型Bの2つの菌株であり、これに関して死滅しなかったのは、ZnuD発現の欠如によるものではない。このような死滅の欠如を説明するために、さらに研究が継続中である。死滅した菌株の中で、2株は、最近、5つのタンパク質およびNZ98/254由来OMVを基本とする多価ワクチンにより誘導される交差防御を評価する、乳幼児の臨床試験に使用されたので、興味深い。この複合ワクチンで免疫された被験体の血清は、M01-240355株の死滅をもたらすことができず、1歳で、乳幼児の50%しか、M01-240101株に対する交差防御を示さなかった。これら2つの菌株は、英国で分離されたが、それぞれST-213およびST-269クローナルコンプレックスに由来する。この2つのクローナルコンプレックスは、2008年に英国の症例から分離されたMenB菌株の39%に相当する。この前臨床研究において、ZnuD OMVで免疫化したマウスおよびモルモットはいずれも、上記2株に対して高い殺菌性反応を引き起こした（ウサギSBA力価 > 1700）。M01-240355株に関して、上記の死滅は、この菌株がfHbp Aを発現するので、抗ZnuD抗体および抗fHbp B抗体の共存によるものではない。さらに、本発明者らは、M01-240101株がヒト補体の存在下で抗ZnuD抗体によってやはり死滅することを確認した（データ記載せず）。
【０１５７】
結論として、ZnuDは、あらゆる血清型B株によって発現される、非常によく保存されたタンパク質であり、テストした血清型B株の大半、ならびに血清型A、C、W、およびY株に対しても、交差殺菌性反応をもたらすことができる。ZnuDの利点は、ZnuDが非常によく保存されていること、ならびに、現在までただ１つのファミリーしか報告されていないことである。より包括的なワクチンは、fHbpおよびZnuDの両方を併せ持つ可能性が考えられる。
【実施例４】
【０１５８】
TdfHに対するカルプロテクチンの結合
カルプロテクチンは好中球、マクロファージ、および扁平上皮により産生される。それは、炎症性腸疾患に関する糞便中の診断ツールとして使用される。さらに、それは、LPSと接触することでアップレギュレートされ、患者が髄膜炎である場合、脳脊髄液中に見いだすことができる。カルプロテクチンは、ヒトタンパク質S100A8およびS100A9のヘテロ四量体であり、2つの亜鉛もしくはマンガン原子と結合することができる。コンフルエント層にナイセリア菌を蒔いたプレート上にカルプロテクチンをスポットすると、亜鉛および/またはマンガンを捕捉して隔離するため、初期に生育阻害が生じる。本発明者らは、ナイセリア菌が、結合部位の一方（低親和性部位）からのみ、亜鉛および/またはマンガンを得ることができると考える。初期の透明化は、高親和性部位への亜鉛および/またはマンガンの捕捉から生じることであり、それが生育阻害の原因となる。低親和性部位も亜鉛および/またはマンガンでいっぱいになった場合、ナイセリア菌は、TdfHを介して取り込むことによって、これらの金属を利用することができる。したがって、初期の透明化の後、透明ゾーンの中で生育が観察される。さらに、透明ゾーン内でTonB変異株が生育しないことによって示されるように、取り込み過程は、TonBによって外膜と行き来する内膜中のプロトン駆動力を必要とする。
【０１５９】
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大量にTdfHを発現するpEN11派生体を用いて、TdfHがカルプロテクチンと結合しうるかどうか調べた。pEN11-TdfH-ターミネーターを有するB2450を、1 mM IPTGあり、およびなしの、TSB培地中で培養した。6時間の培養後、1 OD550nmの細菌を採取し、HBSSで1回洗浄した。細菌を1 ml HBSS中に再懸濁し、4μgのカルプロテクチンを添加した。カルプロテクチンを1時間結合させておき、その後、細胞をHBSSで2回洗浄した。次にペレットをサンプルバッファー中に再懸濁し、10分間煮沸した。その後、溶解物をSDS-PAGE、ならびに抗カルプロテクチンによるウェスタンブロットで分析した（図15）。
【０１６０】
図15に示すように、シグナルは検出可能であったが、サンプル中に存在するTdfHの量について予想されるより弱かった。そこで、結合ステップに亜鉛またはマンガンを加えると結合がより良好になるかどうかを調べた（図16）。亜鉛またはマンガンが存在すると、有意に多くのカルプロテクチンがTdfHと結合した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2013522177000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月13日(2012.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要ならばキャリアタンパク質と結合して、少なくとも第1のグラム陰性細菌菌株の外膜タンパク質を認識する免疫応答を引き起こす能力を有する抗原を含有する、免疫原性組成物またはワクチンであって、前記外膜タンパク質は細胞外亜鉛の取り込みに関与するものである、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２】
前記外膜タンパク質の発現が、例えば亜鉛キレート剤の存在下で、低い細胞外亜鉛濃度に応答してアップレギュレートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３】
前記の第１のグラム陰性細菌菌株が、アシドボラックス属（Acidovorax）; アシネトバクター属（Acinetobacter）；アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）；アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）；Acinetobacter johnsonii; Acinetobacter junii; アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）；Acinetobacter radioresistens; アクチノバチルス属（Actinobacillus）；Actinobacillus minor; アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）；アグレガチバクター属（Aggregatibacter）；アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）；Aggregatibacter aphrophilus；Alcanivorax; Alcanivorax borkumensis; アゾアルカス属（Azoarcus）；アゾトバクター属（Azotobacter）；アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ボルデテラ属（Bordetella）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Bordetella bronchiseptica）；パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；Bordetella petrii；カンピロバクター属（Campylobacter）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）；コマモナス属（Comamonas）；コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）；デルフチア属（Delftia）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）；Diaphorobacter; ヘモフィルス属（Haemophilus）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）；ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）；マンヘミア属（Mannheimia）；ヘモリチカ菌（Mannheimia haemolytica）；モラクセラ属（Moraxella）；カタル球菌（Moraxella catarrhalis）；ナイセリア属（Neisseria）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；パスツレラ属（Pasteurella）；パスツレラ・ダグマティス（Pasteurella dagmatis）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；プロテウス属（Proteus）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；シュードモナス属（Pseudomonas）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；およびスフィンゴモナス属（Sphingomonas）からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項１または２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４】
抗原を含有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含んでおり、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５】
抗原を含有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は配列番号 1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号7；配列番号8；配列番号9；配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；配列番号15；配列番号6；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号24；配列番号25；配列番号26；配列番号27；配列番号28；配列番号29；配列番号30；配列番号31；配列番号32；配列番号33；配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列番号42；配列番号43；配列番号44；配列番号45；配列番号46；配列番号47；配列番号48；配列番号49；配列番号50；配列番号51；配列番号52；配列番号53；配列番号54；配列番号55；配列番号56；配列番号57；配列番号58；配列番号59；配列番号60；配列番号61；配列番号62；配列番号63；配列番号64；配列番号65；配列番号66；配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；および配列番号 71からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、加えて前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６】
前記外膜タンパク質又は前記抗原もしくはポリペプチドもしくは前記免疫原性断片が、PCT/EP2009/052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO 00/55327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO 99/57280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO 00/11182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列を有していない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７】
前記の少なくとも１つの追加の抗原が、fHbpポリペプチド、Hsfポリペプチド、Hapポリペプチド、NadAポリペプチド、およびlipo28ポリペプチドからなる一群から選択されるか、またはそれらの免疫原性断片である、請求項１〜６及び１０〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８】
前記抗原を有する細菌外膜小胞標品を含有し、場合により前記抗原の発現が、前記外膜小胞標品においてアップレギュレートされている、請求項１〜７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９】
亜鉛塩を含有する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０】
a.  配列番号５０のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原、または
b.  配列番号５０の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号５０の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号５０のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原、
を含む免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１】
抗原を追加して含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、前記抗原は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または少なくとも約100％の同一性を有するポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、または前記抗原は、配列番号１の配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含み、前記免疫原性断片は、配列番号１の配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、配列番号１のアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造するための方法であって、前記抗原の生産に十分な条件下で十分な時間、前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する宿主細胞を培養し、その培地から抗原を回収すること；場合によっては、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーからなる一群から選択される方法によって、前記抗原を精製すること；ならびに、前記抗原を、製薬上許容される担体もしくは賦形剤とともに製剤化すること、を含む前記方法。
【請求項１３】
前記抗原を生産する少なくとも1つの第１のグラム陰性細菌菌株を培養することであって、この前記抗原が、被験体に投与されたとき、前記第１のグラム陰性細菌菌株によって引き起こされる感染または疾患に対する防御反応を生じさせる外膜小胞の生産をもたらすのに十分なレベルで生産される、前記菌株を培養すること；その培養菌株から外膜小胞を調製すること；ならびに、前記外膜小胞と製薬上許容される担体もしくは賦形剤とを組み合わせて、被験体に投与するのに適した免疫原性組成物を製造することを含む、請求項８に記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造するための方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物またはワクチンでレシピエントを免疫化するステップ、ならびに、そのレシピエントから免疫グロブリンを分離するステップを含む、グラム陰性細菌性疾患の予防または治療に使用するための、免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法から得られる、免疫グロブリン標品。
【請求項１６】
グラム陰性細菌性、例えば髄膜炎菌性の疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれか１項に定義された免疫原性組成物又はワクチンの使用。
【国際調査報告】
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