(57)【要約】超小型イメージング・サイトメータは、細胞との間で相対動作する検知位置を備える。光源からの光が集束素子によって、この検知位置で複数の焦点合わせされた照射スポットまたはラインに集束されて、細胞が検知位置を横切るときにこの細胞を照射する。集光レンズが、細胞から発する光を集めて、この集めた光の焦点をアレイ光センサ上に再び合わせる。集束素子は、表面が球面または非球面のマイクロレンズのアレイを備えてもよい。このシステムは、アレイ光センサによって生成されて、アレイ光センサに当たる光の強度および分布を示す信号に、少なくとも部分的に基づいて、細胞のデジタル・イメージを構成する処理ユニットを備えてもよい。このシステムは、蛍光として各細胞から発する光を使用して細胞を特徴付けることができる。
2013522629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超小型組立てイメージング・サイトメータであって、
細胞との間で相対動作する検知位置と、
光源と、
集束素子であって、前記集束素子が、前記光源からの光を、前記検知位置で焦点合わせされた複数の照射スポットに集束させて、前記細胞が、前記検知位置を横切るときに、前記焦点合わせされた照射スポットのうちの１つまたは複数によって照射される、前記集束素子と、
アレイ光センサと、
前記細胞から発する光を集めて前記アレイ光センサ上に再び焦点を合わせる集光レンズとを備える、超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２】
流路をさらに備え、
該流路を通って、前記細胞が流動流体によって輸送され、前記流路が、少なくとも一部分が実質的に透明な壁に少なくとも部分的に囲まれている、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項３】
少なくとも部分的に、前記細胞の動きから前記相対動作が生じる、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項４】
少なくとも部分的に、前記サイトメータの一部分の動きから、前記相対動作が生じる、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項５】
前記細胞がスライドに付着され、少なくとも部分的に前記スライドの動きから、前記相対動作が生じる、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項６】
前記細胞の照射が前記検知位置の側から実行され、前記細胞から発する前記光の検知が前記検知位置の同じ側から実行される、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項７】
前記細胞の照射が前記検知位置の側から実行され、前記細胞から発する前記光の検知が前記検知位置とは異なる側から実行される、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項８】
前記集束素子が、球面を有するマイクロレンズのアレイを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項９】
前記集束素子が、非球面を有するマイクロレンズのアレイを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１０】
前記集束素子が、少なくとも１つの回析要素を備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１１】
前記光源がレーザを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１２】
前記アレイ光センサが、画素のアレイを備え、前記画素上に当たる光の強度および分布を示す信号を生成し、前記サイトメータがさらに、少なくとも部分的に前記信号に基づいて、前記細胞のデジタル・イメージを構成する処理ユニットを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１３】
前記処理ユニットが、部分的に、前記細胞の様々な部分から様々な時点で得られた光の強度読取り値を空間的に相関付けすることにより、前記細胞の前記デジタル・イメージを構成する、請求項１２に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１４】
前記細胞の様々な部分から様々な時点で得られた前記光の強度読取り値を相関付けすることが、少なくとも部分的には、前記細胞が前記検知位置を横切る際の速度に基づいて実行される、請求項１３に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１５】
前記集束素子が、マイクロレンズの直線アレイを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１６】
前記集束素子が、マイクロレンズの２次元アレイを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１７】
前記アレイ光センサが、画素の直線アレイを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１８】
前記アレイ光センサが、画素の２次元アレイを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項１９】
前記検知位置と前記アレイ光センサの間に少なくとも１つの光フィルタをさらに備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２０】
前記アレイ光センサが、電荷結合デバイス・センサ、電子増倍型電荷結合デバイス・センサ、アバランシェ・フォトダイオード・センサ、光電子増倍管、および相補型金属酸化膜半導体センサから成るグループから選択された少なくとも１つのセンサを備える、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２１】
前記焦点合わせされた複数の照射スポットが、焦点合わせされた照射スポットのアレイを形成し、前記アレイが、前記細胞および前記検知位置の動きに対して傾斜している、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２２】
前記アレイ光センサに近接した光学素子をさらに備え、前記光学素子が、前記超小型組立てイメージング・サイトメータを実質的に共焦点になるよう構成する、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２３】
前記光学素子が、マイクロレンズのアレイを備える、請求項２２に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２４】
前記光学素子が、一束の光ファイバを備える、請求項２２に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２５】
前記集光レンズが、蛍光として前記細胞から発する光を集めて再び焦点を合わせる、請求項１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項２６】
サイトメトリを実行する方法であって、
光源を使用して光ビームを生成すること、
前記光ビームからの光を集束して、細胞との間で相対動作する検知位置において、焦点合わせされた複数の照射スポットを生成すること、
前記細胞から発する光を集めてアレイ光センサ上に再び焦点を合わせること、
前記アレイ光センサに当たる光の強度および分布を示す、前記アレイ光センサからの信号を生成すること、
処理ユニットを使用して、少なくとも部分的に前記アレイ光センサからの前記光に基づいて、前記細胞のデジタル・イメージを構成することを備える、方法。
【請求項２７】
前記信号を変換して、前記アレイ光センサに当たる光のパターンを表す数値にすることをさらに備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞のデジタル・イメージを構成することは、
前記アレイ光センサに当たる前記光の時系列での読取り値を取得すること、
前記焦点合わせされた個々の照射スポットに対応する前記アレイ光センサからの光読取り値を別々に追跡すること、
少なくとも部分的には、既知のシステム幾何形状、前記細胞の移動速度、および光読取り値を取得する際の周波数に基づいて、前記別々の光読取り値を空間的に位置合わせすることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞から発する前記光をフィルタリングして、前記光源が放射する波長の光を選択的にブロックし、蛍光として前記細胞から発する波長の光を選択的に通過させることをさらに備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記アレイ光センサに近接した光学素子を設けることをさらに備え、
前記光学素子が、超小型組立てイメージング・サイトメータを実質的に共焦点になるよう構成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
超小型組立てイメージング・サイトメータであって、
細胞との間で相対動作する検知位置と、
光源と、
集束素子であって、前記集束素子が、前記光源からの光を、前記検知位置で焦点合わせされた複数の照射ラインに集束させて、前記細胞が、前記検知位置を横切るときに、前記焦点合わせされた照射ラインのうちの１つまたは複数によって照射される、前記集束素子と、
光センサと、
前記細胞から発する光を集めてアレイ光センサ上に再び焦点を合わせる集光レンズとを備える、超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項３２】
前記光センサが、画素のアレイを備える、請求項３１に記載の超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【請求項３３】
超小型組立てイメージング・サイトメータであって、
細胞との間で相対動作する検知位置と、
光源と、
集束素子であって、前記集束素子が、前記光源からの光を、前記検知位置で焦点合わせされた複数の照射スポットまたはラインに集束させて、前記細胞が、前記検知位置を横切るときに、前記焦点合わせされた照射スポットまたはラインのうちの１つまたは複数によって照射される、前記集束素子と、
アレイ光センサと、
前記細胞から発する光を集めて前記アレイ光センサ上に再び焦点を合わせる集光レンズと、
前記光センサからの信号を分析して、細胞を分類する処理ユニットと、
前記分類された細胞を、少なくとも２つの収集チャネルのうちの１つに送る仕分け機構とを備える、超小型組立てイメージング・サイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超小型組立てイメージング・フロー・サイトメータに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメトリは、生体細胞の計算およびその特性に関係する技術特徴である。図１には、イメージ・フロー・サイトメトリとして知られている技法を実行するためのシステムの略図が示してある。イメージング・フロー・サイトメトリの基本的な形態では、細胞１０１は、流体中で懸濁されており、狭い透明なチューブ１０２の中で一列に並んでいる。エントレインメント（entrainment）は、流体力学的絞込み(hydrodynamic focusing)を含め、いくつかの方法の任意のもので実現することができる。光源１０３は、各細胞１０１が測定位置を通過するときに、それを照射する。光源１０３は、たとえばレーザでもよい。光源１０３からの光は、測定される細胞１０１によって散乱する。対物レンズ１０６によって、ある一定の光１０５が集められ、その向きが変えられて光センサ１０７でイメージが形成される。光センサ１０７は、たとえば、顕微鏡またはカメラの構成部品でもよい。光１０５をセンサ１０７に案内する際に、たとえば、部分反射鏡１０８および追加のレンズ１０９を含め、様々な光学構成部品が対物レンズ１０６と協働してもよい。センサ１０７からの出力信号は、処理ユニット１１０に送られ、この処理ユニット１１０が、この信号を記憶および分析して、各細胞についての情報、たとえば、そのサイズおよびその内部構造についての何らかの情報を識別してもよい。
【０００３】
ある種の用途では、たとえば、携帯用途のために、または小規模な医院で循環腫瘍細胞のスクリーニングを行うために、コンパクトなサイトメトリ・システムが望ましいことがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様によれば、超小型組立てイメージング・サイトメータは、細胞、光源、および集束素子との間で相対運動する検知位置を備える。集束素子は、光源からの光を集束して検知位置で焦点合わせされた複数の照射スポットにし、その結果、細胞は、検知位置を横切るときに、この焦点合わせされた照射スポットのうちの１つまたは複数によって照射される。サイトメータはさらに、アレイ光センサ、および細胞から発する光を集めてアレイ光センサ上に再び焦点を合わせる集光レンズを備える。実施形態によっては、超小型組立てイメージング・サイトメータはさらに、流路を備え、この流路を通って、細胞が流動流体によって輸送され、この流路は、少なくとも一部分が実質的に透明な壁に少なくとも部分的に囲まれている。少なくとも部分的に細胞の動きから、相対運動が生じることがある。少なくとも部分的にサイトメータの一部分の動きから、相対運動が生じることがある。実施形態によっては、細胞がスライドに付着され、少なくとも部分的にスライドの動きから、相対運動が生じる。実施形態によっては、細胞の照射は検知位置の側から実行され、細胞から発する光の検知が検知位置の同じ側から実行される。実施形態によっては、細胞の照射は検知位置の側から実行され、細胞から発する光の検知が検知位置と異なる側から実行される。集束素子は、表面が球面のマイクロレンズのアレイを備えてもよい。集束素子は、表面が非球面のマイクロレンズのアレイを備えてもよい。集束素子は、少なくとも１つの回析要素を備えてもよい。光源は、レーザを備えてもよい。実施形態によっては、アレイ光センサは、画素のアレイを備え、この画素上に当たる光の強度および分布を示す信号を生成し、サイトメータはさらに、少なくとも部分的にこの信号に基づいて、細胞のデジタル・イメージを構成する処理ユニットを備える。実施形態によっては、処理ユニットは、部分的に、細胞の様々な部分から様々な時点で得られた光の強度読取り値を空間的に相関付けすることにより、細胞のデジタル・イメージを構成する。実施形態によっては、細胞の様々な部分から様々な時点で得られた光の強度読取り値を相関付けすることは、少なくとも部分的には、細胞が検知位置を横切る際の速度に基づいて実行される。集束素子は、直線配列されたマイクロレンズを備えてもよい。集束素子は、２次元配列されたマイクロレンズを備えてもよい。アレイ光センサは、直線配列された画素を備えてもよい。アレイ光センサは、２次元配列された画素を備えてもよい。実施形態によっては、超小型組立てイメージング・サイトメータはさらに、検知位置とアレイ光センサの間に少なくとも１つの光学フィルタを備える。実施形態によっては、アレイ光センサは、電荷結合デバイス・センサ、電子増倍型電荷結合デバイス・センサ、アバランシェ・フォトダイオード・センサ、光電子増倍管、および相補型金属酸化膜半導体センサから成るグループから選択された少なくとも１つのセンサを備える。実施形態によっては、焦点合わせされた複数の照射スポットが、焦点合わせされた照射スポットのアレイを形成し、このアレイは、細胞および検知位置の動きに対して傾斜している。超小型組立てイメージング・サイトメータはさらに、アレイ光センサに近接した光学素子を備えてもよく、この光学素子は、超小型組立てイメージング・サイトメータを実質的に共焦点になるよう構成する。光学素子は、一連のマイクロ開口を備えてもよい。光学素子は、一束の光ファイバを備えてもよい。実施形態によっては、集光レンズは、細胞から蛍光として発する光を集めて再び焦点を合わせる。
【０００５】
別の態様によれば、サイトメトリを実行する方法は、光源を使用して光ビームを生成するステップと、この光ビームからの光を集束して、細胞との間で相対運動する検知位置において、焦点合わせされた複数の照射スポットを生成するステップと、細胞から発する光を集めてアレイ光センサ上に再び焦点を合わせるステップとを含む。この方法はさらに、アレイ光センサに当たる光の強度および分布を示す、アレイ光センサからの信号を生成するステップと、処理ユニットを使用して、少なくとも部分的にはアレイ光センサからの信号に基づいて、細胞のデジカメ・イメージを構成するステップとを含む。この方法はさらに、各信号を変換して、アレイ光センサに当たる光のパターンを表す数値にするステップを含んでもよい。実施形態によっては、細胞のデジタル・イメージを構成するステップはさらに、アレイ光センサに当たる光の時系列での読取り値を取得するステップと、焦点合わせされた個々の照射スポットに対応するアレイ光センサからの光読取り値を別々に追跡するステップと、少なくとも部分的には、既知のシステム幾何形状、細胞の移動速度、および光読取り値を取得する周波数に基づいて、別々の光読取り値を空間的に位置合わせするステップとを含む。実施形態によっては、この方法はさらに、細胞から発する光をフィルタリングして、光源が放射する波長の光を選択的にブロックし、蛍光として細胞から発する波長の光を選択的に通過させるステップを含む。実施形態によっては、この方法はさらに、アレイ光センサに近接した光学素子を設けるステップを含み、この光学素子は、超小型組立てイメージング・サイトメータを実質的に共焦点になるよう構成する。
【０００６】
別の態様によれば、超小型組立てイメージング・サイトメータは、細胞、光源、および集束素子との間で相対運動する検知位置を備える。集束素子は、光源からの光を集束して検知位置で複数の焦点合わせされた照射ラインにし、その結果、細胞は、検知位置を横切るときに、この焦点合わせされた照射ラインのうちの１つまたは複数によって照射される。焦点合わせされた超小型組立てイメージング・サイトメータはさらに、光センサ、および細胞から発する光を集めてアレイ光センサ上に再び焦点を合わせる集光レンズを備える。この光センサは、画素のアレイを備えてもよい。
【０００７】
別の態様によれば、超小型組立てイメージング・サイトメータは、細胞、光源、および集束素子との間で相対運動する検知位置を備える。集束素子は、光源からの光を集束して、検知位置で焦点合わせされた複数の照射スポットまたはラインにし、その結果、細胞は、検知位置を横切るときに、この焦点合わせされた照射スポットまたはラインのうちの１つもしくは複数によって照射される。超小型組立てイメージング・サイトメータはさらに、アレイ光センサ、細胞から発する光を集めてアレイ光センサ上に再び焦点を合わせる集光レンズ、光センサからの信号を分析して細胞を分類する処理ユニット、および分類された細胞を少なくとも２つの収集経路に送る仕分け機構を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】イメージ・フロー・サイトメトリを実行するためのシステムの略図である。
【図２】本発明の実施形態による、超小型組立てイメージング・サイトメータの概略斜視図である。
【図３】本発明の実施形態による、図２の超小型組立てイメージング・サイトメータの一部分を垂直方向から見た図である。
【図４】本発明の実施形態による、図２の例示的な超小型組立てイメージング・サイトメータの一部分の概略上面図である。
【図５Ａ】本発明の実施形態による、図２の超小型組立てイメージング・サイトメータの様々なセンサ位置で取得された光の読取り値が、時間の関数としてどのように変化するのかを示す図である。
【図５Ｂ】空間的な位置合わせの後での、図５Ａの軌跡を示す図である。
【図６】図５Ａおよび５Ｂのデータから構成されるデジタル・イメージを示す図である。
【図７】本発明の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・サイトメータを示す図である。
【図８】他の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・サイトメータを示す図である。
【図９】さらなる他の実施形態による、超小型組立てイメージング・サイトメータを示す図である。
【図１０】図９の超小型組立てイメージング・サイトメータにおけるいくつかの構成要素の傾斜の効果を示す図である。
【図１１】検知位置の同じ側から、細胞が照射され、検知される、他の実施形態による超小型組立てイメージング・サイトメータを示す図である。
【図１２】他の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・フロー・サイトメータを示す図である。
【図１３】本発明の実施形態による、図１２のシステムの垂直方向から見た図である。
【図１４】図１２のシステムの検知領域を通って１つの細胞が横切ることで得ることができる、一連の光強度の読取り値を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態による、仕分け機構と結合された検出および分析のシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
図２は、本発明の実施形態による、超小型組立てイメージング・サイトメータ２００の概略斜視図を示す。図２は、必ずしも一定の縮尺で描かれたものではなく、明確にするために、部品によっては割愛され、または簡略化されている。
【００１０】
本開示のために、用語「超小型組立て」とは、従来の工作機械および組立て技法で実現可能な公差よりもはるかに小さい組立て公差で、非常に小さい構造体の組立てを可能にする、構成部品、機器、および技法を使用して組み立てることを意味する。たとえば、個々の構成部品は、機能的な特徴および約５〜１００ミクロン程度の寸法を有し、約０．１〜１０ミクロン程度の組立て公差で小さい構成部品を扱うように特別に設計された機器を使用して組み立ててもよい。超小型組立て技法により、普通なら広く離れてしまう光学構成部品または機械構成部品の間隔が狭くなり、集積化および並列化が可能になる。
【００１１】
超小型組立てイメージング・サイトメータ２００は、流路２０１を備え、これを通って、細胞１０１が流動流体中を輸送される。流路２０１は、壁２０２によって囲まれており、この壁は、実質的に透明な少なくとも一部分を有する。このシステムはまた、光源２０３を備え、この光源は、細胞１０１を照射するためのビーム２０４を生成する。ビーム２０４はコヒーレントなビームであることが好ましく、したがって光源２０３はレーザであることが都合よい。
【００１２】
集束素子２０５は、光源２０３からの光を受光し、この光を集束して、流路２０１内の検知位置２０７において、焦点合わせされた複数の照射スポット２０６を生成する。流路２０１を通って細胞１０１が流れることにより、検知位置２０７と細胞１０１の間に相対運動が生じる。いつの時点においても、細胞１０１は、検知位置２０７を横切るときに、照射スポット２０６のうちの１つまたは複数のスポットによって照射されてもよい。例示的なシステム２００では、集束素子２０５は、２次元配列されたマイクロレンズ２０５Ａを備えるが、他の種類の集束素子を使用することもできる。たとえば、集束素子２０５は、新規のナノ開口アレイ（original nanoaperture array）の透過ホログラムまたは反射ホログラム、フレネル・ゾーン・プレート・アレイ、または他の種類の集束素子とすることもできる。各マイクロレンズ２０５Ａは、照射スポット２０６を生成してもよい。（明確にするために、図２には、２つのスポット２０６のみが示してある。）検知位置２０７は、実質的に平坦でもよく、焦点合わせされた照射スポット２０６の場所によって規定される。
【００１３】
細胞１０１が焦点合わせされた照射スポットのうちの１つに当たると、細胞１０１から光２０８が発する。たとえば、細胞１０１は、ビーム２０４からの焦点合わせされた光で励起されるとき、蛍光性によって光を発する蛍光体で識別されてもよい。あるいは、超小型組立てイメージング・サイトメータ２００は、細胞１０１から散乱した光を使用して、細胞１０１の直接イメージングを実行してもよい。細胞１０１から発した光２０８の少なくともいくらかが、集光レンズ２０９によって集められ、アレイ光センサ２１０上に再び焦点が合う。（別の光の束２１４が、図２に破線で示してあり、細胞１０１が流路２０１の異なる位置にあるときに、細胞１０１から発することがある光を示す。）フィルタ２１１など１つまたは複数のフィルタを、検知位置２０７とアレイ光センサ２１０の間に配置してもよい。たとえば、フィルタ２１１は、流路２０１とレンズ２０９の間、レンズ２０９とアレイ光センサ２１０の間、またはレンズ２０９が複数の素子を備える場合にはレンズ２０９の各要素の間に存在してもよい。たとえば、フィルタ２１１は、光源２０３が放出する波長の光を選択的にブロックし、蛍光として細胞１０１から発する波長の光を選択的に通過させ、その結果、アレイ光センサ２１０に達する光は、実質的にはその全てが蛍光によって形成される。たとえば、アレイ光センサ２１０は、デジタル・カメラの構成部品でもよく、規則的な配列の感光性素子を備えてもよく、これらを画素と呼んでもよい。アレイ光センサ２１０は、場合によっては、図示していない他の電子装置の制御下で、所与の露出時間中に各画素に当たる光の強度を示す信号を生成する。したがって、この信号は、露出中にアレイ光センサ２１０に当たる光の強度および分布を示す。これらの信号は、記憶、分析、または表示のために、処理ユニット２１３に伝達してもよい（２１２）。この信号は、たとえばアナログ・デジタル変換器（図示せず）を使用して、デジタル値に変換してもよく、この変換器は、システム内の任意の好都合な位置に存在してもよい。処理ユニット２１３は、マイクロプロセッサおよび他の電子構成部品を備えてもよく、たとえば、アレイ光センサ２１０からの信号の様々な分析を実行するよう特別にプログラムされた汎用コンピュータでもよい。後でより詳細に説明するように、処理ユニット２１３は、間隔を置いて適時に取得されるアレイ光センサ２１０からの一連のデジタル・イメージを収集してもよく、またこの一連のイメージから、細胞１０１のイメージを構成してもよい。
【００１４】
図３には、図２に示したＹ方向に沿って見た、例示的な超小型組立てイメージング・サイトメータ２００の一部分の垂直方向からの図が示してある。マイクロレンズ２０５Ａが、ビーム２０４を受光する。マイクロレンズ２０５Ａは、球面（すなわち、各マイクロレンズの曲面が球の一部分でよい）を有してもよく、好ましくは、非常に小さいスポット・サイズと高解像度を実現するために非球面を有してもよい。非球面マイクロレンズを含む、マイクロレンズのアレイを作製するための技法が知られている。たとえば、Ｈｏｎｇｍｉｎ  Ｋｉｍ、Ｇｉｂｏｎｇ  Ｊｅｏｎｇ、Ｙｏｕｎｇ−Ｊｏｏ  Ｋｉｍ、およびＳｈｉｎｉｌｌ  Ｋａｎｇ著「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｈｅｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｌｅｎｓ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅａｄ−Ｏｎｌｙ−Ｍｅｍｏｒｙ  Ｃａｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．８Ｂ、２００６年、６７０８〜６７１２頁を参照されたい。この文献の開示全体を、参考として本明細書に援用する。マイクロレンズ２０５Ａのサイズおよび間隔は、任意の実行可能な値でよいが、マイクロレンズ２０５Ａは、５〜２０ミクロンの間隔で集中配置することが好ましい。例示的な一実施形態では、各マイクロレンズ２０５Ａは、直径が約１５ミクロンでもよく、マイクロレンズ２０５Ａは、約１５ミクロン間隔で密に詰めて配置してもよい。各マイクロレンズ２０５Ａ間の任意のすき間を不透明に作製し、その結果、集束素子２０５を通る任意の光が、マイクロレンズ２０５Ａのうちの１つの焦点面を通過することが好ましい。集束素子２０５から検知位置２０７までの距離は、たとえば、約１０〜１００ミクロンでもよく、５０ミクロン未満であることが好ましい。本発明を実施するシステムには、結果として得られるイメージの所望の画素密度に応じて、図に示したものよりも多くのまたは少ないマイクロレンズが含まれ得る。実施形態によっては、約２００個のマイクロレンズを使用してもよい。
【００１５】
各マイクロレンズ２０５Ａは、ビーム２０４の一部分の焦点を合わせ、その結果、焦点合わせされた複数の照射スポット２０６が、検知位置２０７で生成される。検知位置２０７は、流路２０１の中央近くにあることが好ましく、流路２０１は、細胞１０１が流路２０１を移動するときに、細胞１０１を保持して検知位置２０７を囲むことが好ましい。システム２００は、多種多様な細胞を特徴付け、任意の適切な速度で動作するように構成することができるが、典型的な細胞１０１は、直径約１０〜２０ミクロンであり、たとえば１〜５０ミリメートル／秒の速度で流路２０１を移動することができる。システムのサンプリング解像度は、デジタル・イメージが得られる転送速度、および細胞１０１が流路２０１を移動する際の速度で決定される。システムの光学的解像度は、主に、焦点合わせされた照射スポット２０６のサイズによって設定される。非球面マイクロレンズ２０５Ａは、０．５ミクロン以下の焦点スポット・サイズを実現できる可能性がある。
【００１６】
細胞１０１から発する光２０８は、集光レンズ２０９によって集められ、アレイ光センサ２１０上に再び焦点が合う。集光レンズ２０９は、簡略な両凸レンズとして図３に示してあるが、平凸レンズ、メニスカス・レンズ、マルチ素子レンズ、または他の種類のレンズを含め、任意の適切なレンズ構成を使用してもよい。システムの光学解像度は、主に、焦点合わせされた照射スポット２０６のサイズによって設定されるので、様々なマイクロレンズ２０５Ａからの光が、アレイ光センサ２１０の表面上の別々の識別可能なプール（discernible pools）に送られる限り、集光レンズ２０９の性能は重要ではないこともある。処理ユニット２１３は、センサ２１０のいくつかの隣接画素からの読取り値を単に合計して、焦点合わせされた任意の特定の照射スポット２０６から発する光２０８の強度を評価してもよい。図３に示したシステムでは、集光レンズ２０９は等倍に構成されるが、これは要求事項ではない。集光レンズ２０９は、焦点合わせされた照射スポット２０６のより大きいかまたはより小さいイメージを、アレイ光センサ２１０上に投射するように構成することもできる。実施形態によっては、集光レンズ２０９は、等倍イメージと比較して２倍〜５倍の間で拡大されたイメージを投射することもできる。流路２０１からアレイ光センサ２１０までの距離は任意の適切な距離でもよいが、たとえば、約５〜１５ミリメートルでもよい。
【００１７】
アレイ光センサ２１０は、様々なマイクロレンズ２０５Ａからの光の強度を別々に読み取ることができる、任意の適切な種類の光センサでもよい。たとえば、アレイ光センサ２１０は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）センサでもよい。ＣＣＤセンサでは、一連の感光性部位は、半導体基板上に製造される。一連の感光性部位は、そこに当たる光の強度に比例した速度で、その部位に電子が蓄積される特性を有する。イメージを得るために、一連の感光性部位はクリアされ、特定の露出時間において光に曝される。露出時間が経過した後、感光性部位からの電子がＣＣＤ記憶レジスタにシフトされる。次いで、各レジスタ内の電子数（the number of electrons）は、おおよそ、露出中、対応する感光性部位に当たった光の量に比例する。記憶部位からの電荷がデバイスからシフトし、通常は個々に電圧に変換され、この電圧が、たとえばアナログ・デジタル変換器を使用して数値に変換される。結果として得られる数値のアレイを、デジタル・イメージと呼んでもよい。サイトメトリ・システム２００の場合、デジタル・イメージは、露出時間中にアレイ光センサ２１０に当たる光のパターンを表す。
【００１８】
本発明の実施形態においては、他の種類のアレイ光センサ、特に高感度用途向けに最近開発されたセンサも使用してよい。たとえば、アレイ光センサ２１０は、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサ、電子増倍型電荷結合デバイス（ＥＭＣＣＤ）センサ、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）センサ、光電子増倍管（ＰＭＴ）、または、ＡＰＤもしくはＰＭＴのアレイを備えることもできる。複数のセンサを使用してもよい。たとえば、マイクロレンズ２０５について一つの個別のセンサを使用することもできる。
【００１９】
フィルタ２１１は、それが存在する場合には、たとえば透明な基板を選択的に被覆することによって形成されるダイクロイック・フィルタでもよく、したがって、波長の特定の１つまたは複数の帯域のみの光がフィルタ２１１を容易に通過し、他の波長の光がフィルタ２１１によって実質的に阻止される。サイトメトリ・システム２００が、蛍光として細胞１０１から発する光を測定するのに使用されるとき、フィルタ２１１が特に有用になることがある。フィルタ２１１は、ビーム２０４に含まれる波長における光を実質的に阻止するように構成してもよいが、細胞１０１の蛍光体が蛍光を発する際の波長の帯域における光を実質的に通過させるように構成してもよい。
【００２０】
マイクロレンズ２０５Ａの間隔は細胞１０１のサイズに相当するので、集束素子２０５は、細胞１０１が検知位置２０７を通過するときに、焦点合わせされた照射スポット２０６によって確実に細胞１０１が良好にカバーされるよう、細胞１０１と検知位置２０７の間の動きに対して傾斜させてもよい。
【００２１】
図４には、図２に示したＺ方向から見た、アレイ光センサ２１０の表面の概略上面図が示してあり、流路２０１に対する焦点合わせされた照射スポット２０６のアレイを傾ける効果を示すために、細胞１０１と焦点合わせされた照射スポット２０６が重畳される。図４の例で明らかなように、たとえ焦点合わせされた照射スポット２０６の間隔を（マイクロレンズ２０５Ａの間隔に対応させて）互いに比較的広く空けても、細胞１０１は、流路２０１を移動するときに、焦点合わせされた９個の異なる照射スポットに直面する。これらの９個のスポットは、細胞１０１にまたがる間隔が密な経路Ａ〜Ｉを追跡（trace）することになり、その結果、移動している間、細胞１０１は良好にカバーされる。
【００２２】
細胞１０１のデジタル・イメージを構成するために、システム２００は、アレイ光センサ２１０に当たる光の時系列での読取り値を取得する。個々の焦点合わせされた照射スポット２０６に対応する、アレイ光センサ２１０上の位置が識別され、別々に追跡される。図５Ａには、細胞１０１が流路２０１を移動するときに、経路Ａ〜Ｉに対応するセンサの位置での光の読取り値が、時間の関数としてどのように変化する可能性があるのかが示してある。見て分かるように、細胞１０１は、まず経路Ｇに沿って照射され、後に徐々にその他の経路に沿って照射され、最後に経路Ｆが光を受光する。システムの幾何形状および細胞１０１の移動速度が知られており、読取り値が取得される際の周波数が知られているので、経路Ａ〜Ｇに沿って取得される光の強度軌跡を空間的に位置合わせして、細胞１０１のデジタル・イメージを形成することができる。空間的に位置合わせされた軌跡が、図５Ｂに示してある。次いで、図６に示すように、空間的に位置合わせされたデータを組み立てて細胞１０１のデジタル・イメージを生成し、図６には、高い方の光強度が、低い方の光強度よりも明るいモノクロ階調で示してある。もちろん、他の実施形態によるサイトメータは、様々な数の焦点合わせされた照射スポット２０６を使用してもよく、図６に示した解像度よりもはるかに高い解像度のイメージを生成してもよい。
【００２３】
この例では、細胞１０１上の特定の位置から蛍光として発する光が増大すると、結果として信号の光強度が高くなり、その結果、より多くの蛍光体を担持する細胞の各部分が図６ではより明るく表してある。必要なら、この関係を逆にして、より多くの光を発する細胞１０１の各部分が、結果として生じるデジタル・イメージにおいてより暗く表される。システム２００が、ビーム２０４に含まれる光の波長での（蛍光を用いることのない）直接イメージング用に使用される場合、細胞１０１は、アレイ光センサ２１０上に影を落とすものと考えてもよく、したがって、細胞１０１の密度が高い部分では、アレイ光センサ２１０に達する光が少なくなる。
【００２４】
実施形態によっては、超小型組立てイメージング・サイトメータは、システムが実質的に共焦点になるよう構成する光学素子を、アレイ光センサ２１０の近くに備えてもよい。図７には、本発明の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・フロー・サイトメータ７００が示してある。システム７００の構成部品のいくつかは、前述のシステム２００の構成部品と同様であり、システム２００と同じ参照ラベルが与えてある。システム７００は、アレイ光センサ２１０に近くに光ファイバ・バンドル７０１を追加することにより、実質的に共焦点となるよう構成される。光ファイバ・バンドル７０１の個々のファイバの上部７０２は、光を受け入れる狭小部分を除いて不透明であるか、または反射するよう構成されることが好ましい。たとえば、ファイバの各部分は、１００〜２００ナノメートルの厚さのアルミニウム・メッキまたは金メッキで被覆してもよい。次いで、各ファイバは、受け入れた光をアレイ光センサ２１０に送る。したがって、ファイバの上端部７０２は、開口プレートと同様な働きをして、検知位置２０７から発する光を優先的に受け入れ、他の軸方向の位置から発する光を優先的に排除する。たとえば、検知位置２０７で照射スポット２０６から発し、レンズ２０９によって結像される光は、光束７０６などペンシル形の光線になり、ファイバ７０１のうちの１つの上面に達するとき、しっかり焦点が合う。検知位置２０７の下の位置から発する光は、光束７０３と同様に発散して、レンズ２０９によって収束されて光束７０５などのペンシル状にしてもよい。光束７０５は、ファイバ７０１に達する時点までに小さいスポットにまで収束することがなく、したがって、ファイバ端部の不透明な部分によってほとんど排除される。同様に、前述の検知位置２０７から発する光は収束し、ファイバ２０７に達する時点までに再び発散することになり、したがって、やはりファイバ７０１によってほとんど排除される。したがって、システム７００は、検知位置２０７から発する光を優先的に通過させ、他の軸方向の位置から発する何らかの光を優先的に阻止する。
【００２５】
図８には、他の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・フロー・サイトメータ８００が示してある。システム８００の構成部品のいくつかは、前述のシステム２００の構成部品と同様であり、システム２００と同じ参照ラベルが付されている。さらに、別の光学構成部品である開口プレート８０１が、アレイ光センサ２１０の表面近くに設けられている。開口プレート８０１は、一連の開口８０２以外では実質的に不透明である。各開口８０２は、マイクロレンズ２０５Ａのうちの１つに対応し、焦点合わせされた対応する照射スポット２０６から発する光の通過を可能にするように位置合わせされる。光学素子８０１は、実質的に共焦点になるようシステム８００を構成する。すなわち、開口８０２には、検知位置２０７ではなく軸方向の位置からの光を阻止する効果がある。たとえば、ペンシル状の光線８０３が、検知位置２０７よりずっと下の位置８０４から発する。結果として生じる光は、集光レンズ２０９によって再集束されて別のペンシル状の光線８０５になり、検知位置２０７から生じる光束８０６よりもゆっくりと収束する。したがって、ペンシル状の光線８０５は、開口８０２のうちの１つによって部分的に阻止され、影のついた領域８０７で示してある。システム８００は、検知位置２０７から発する光を優先的に通過させ、他の軸方向の位置から発する何らかの光を優先的に阻止するので、このシステムは、実質的に共焦点になるように構成されていないシステムよりも、コントラストまたは解像度が高いイメージを生成することができる。理想的には、開口プレート８０１は、レンズ２０９の焦点位置に配置されて、開口８０２を非常に小さくすることが可能になり、検知位置２０７から発する光と検知位置２０７ではない軸方向の位置から発する光とを効果的に区別することが可能になる。次いで、焦点合わせされた照射スポット２０６のうちの１つから発する各光束は、アレイ光センサ２１０に達する時点までにわずかに発散し、処理ユニットは、アレイ光センサ２１０のいくつかの画素からの読取り値を合計することにより、各光束の強度を評価することができる。
【００２６】
図９には、他の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・フロー・サイトメータ９００が示してある。この実施形態では、マイクロレンズの２次元アレイではなく、マイクロレンズ２０５Ａの直線アレイ９０１が使用される。マイクロレンズ・アレイ９０１は、流路２０１に対して傾斜していることが好ましい。それに応じて、直線アレイ光センサ９０２が設けられ、やはり流路２０１に対して傾斜していることが好ましく、マイクロレンズ・アレイ９０１と位置合わせされている。直線アレイ光センサ９０２は、ＣＣＤセンサ、ＥＭＣＣＤセンサ、ＡＰＤ、ＰＭＴ、ＣＭＯＳセンサ、または他の種類のセンサを含め、任意の適切な種類のセンサを備えてもよい。マイクロレンズ・アレイ９０１によって設けられた焦点合わせされた照射スポット２０６が、比較的間隔を広く開けて配置されていたとしても、傾斜させた配置により、流路２０１を移動する細胞１０１は、移動している間に良好にカバーされ、比較的密度が高い状態で結像されることが確実になる様子が、図１０に示してある。システム９００による細胞１０１のデジタル・イメージの構成は、図４〜６に関して前述した構成に類似している。システム９００はまた、システム９００を実質的に共焦点になるよう構成する１つまたは複数の光学素子を備えてもよく、蛍光として細胞１０１から発する光を検知してもよく、または直接イメージングを実行してもよい。
【００２７】
図１１には、他の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・フロー・サイトメータ１１００が示してある。前述のシステム２００では、検知位置２０７の両側から細胞を照射し検知したが、超小型組立てイメージング・サイトメータ１１００は、検知位置２０７と同じ側から細胞を照射し検知する。システム１１００では、光ビーム２０４は、集束素子２０５によって焦点を合わせられて、焦点合わせされた複数の照射スポット２０６になる。集束素子２０５は、一連のマイクロレンズとして示してあるが、任意の適切な集束素子でもよい。波長選択ミラー１１０１は、焦点合わせされた照射スポットが検知位置２０７に位置するよう、光を流路２０１に向ける。たとえば、ミラー１１０１は、ビーム２０４から入射する光のほぼ全てを反射するように構成されたダイクロイック・ミラーでもよい。光２０８が細胞１０１から放射され、放射光２０８の少なくともある部分が、集光レンズ２０９によって集められ、再び焦点が合う。波長選択ミラー１１０１は、細胞１０１が蛍光として光を放射する際の波長帯域におけるほぼ全ての光を通過させるよう構成することができるので、システム１１００は、蛍光として発する光を使用して細胞をイメージングするのに特に適している。任意選択の追加フィルタ２１１はさらに、集光された光２０８を調整してもよく、この光がアレイ光センサ２１０上に焦点が合う。アレイ光センサ２１０は、２次元アレイまたは直線アレイでもよく、ＣＣＤセンサ、ＥＭＣＣＤセンサ、ＡＰＤ、ＰＭＴ、ＣＭＯＳセンサ、または他の種類のセンサを含め、任意の適切な種類の光センサを備えてもよい。システム１１００は、システムが実質的に共焦点になるよう構成する光学素子を備えてもよく、たとえば、開口プレート８０１は、開口８０２または光ファイバ・バンドルを有する。システム１１００を使用しての細胞１０１のデジタル・イメージの構成は、システム２００について前述し、図４〜６に示したのと同様にして進行する。
【００２８】
図１２には、他の実施形態による、超小型組立て共焦点イメージング・フロー・サイトメータ１２００が示してある。システム１２００の構成部品のいくつかは、前述のシステム２００の構成部品と同様であり、システム２００と同じ参照ラベルが付与されている。細胞１０１などの細胞は、壁２０２によって閉じ込められた流路２０１を移動する。光源２０３は、光ビーム２０４を生成する。光源２０３は、たとえばレーザでもよい。集束素子１２０１は、光源２０３からの光を受光し、この光を集束する。システム２００の集束素子２０５と対照的に、集束素子１２０１は、一連の円柱レンズ１２０１Ａ、または別の種類の光学構成部品であり、これは、検知位置２０７で、もしくはその近くで細胞を照射するために、ビーム２０４からの光を、照射ライン１２０２など複数のラインに集束させる。散乱かそれとも蛍光によって細胞から発する光は、開口プレート１２０３において集光レンズ２０９によって集められ、再び焦点が合う。開口プレート１２０３は、照射ライン１２０２からの焦点合わせされた光を受光するように位置合わせされた、一連の狭いスリット１２０４を備える。したがって、このシステムは、検知位置２０７から離れたＺ軸位置から発する光を除去する傾向があるという点で共焦点である。開口プレート１２０３を通過する光は、光源２１０に達する。（明確にするために、任意選択のフィルタを図１２から省いてある。）光センサ２１０は、センサに当たる光の強度を示す信号を生成し、記憶、分析、または表示のために、この信号を処理ユニット２１３まで伝送してもよい（２１２）。
【００２９】
システム１２００は、互いに十分に近いので、いくつかのラインが単一の細胞に直ちに当たることがある照射ライン１２０１を生成するものとして示してあるが、これは要求事項ではなく、実際には、集束素子１２０１は、細胞の予想サイズよりさらに離間した照射ラインを生成するのが好ましいことがある。細胞は、流路２０１内で互いに広く離れることがしばしばあるので、照射ライン１２０２の間隔を広く空けると、１つの照射ラインのみから光が生じ、いつの時点でも１つの細胞がセンサ２１０に到達することがある。その構成では、センサ２１０は、簡略化し、単純なフォトダイオード、光電子増倍管、または光の強度を測定するが、画素のアレイは含まない他の種類のセンサとすることもできる。
【００３０】
図１３には、本発明の実施形態による、システム１２００の垂直方向から見た図が示してある。見て分かるように、スリット１２０４は、システムが共焦点になるよう構成し、たとえば、検知位置２０７からずれた位置で発した光束１３０２の一部分１３０１を排除する。
【００３１】
図１３にはまた、本発明の実施形態による、システム１２００の別の態様が示してある。流路２０１は、検知位置２０７に対して傾斜している。図１３には、傾斜が角度θで示してあり、説明を明確にするために、実際に行うのに比べて誇張していることがある。システム１２００の共焦点態様をとともに、検知位置２０７に対する流路２０１の傾斜により、結果として、プール１３０３で例示した光の細長い各プールがセンサ２１０に当たり、細胞１０１に対して固有のＺ軸の位置から実質的に発する。
【００３２】
図１４には、システム１２００の検知領域２０７を通って１つの細胞１０１が横切ることで得ることができる、一連の光強度の読取り値を示す図である。読取り値は時系列で取得され、したがって、各読取り値は、特定の時点で細胞１０１から発する光の強度を示し、この特定の時点は、細胞１０１の特定のＸ位置に対応し、また細胞内の特定のＸ位置にも対応する。たとえば、読取り値は十分頻繁に取得してもよく、その結果、細胞１０１は、各読取り値の間で０．２５〜０．５マイクロメートル移動する。流路２０１は傾斜しているので、各読取り値は、細胞内の特定のＺ位置にも対応する。図１４は、蛍光として細胞１０１から発する光の測定値を表すことができ、細胞１０１が各照射ラインの間にある時点において、非常に低い照射レベルが記録される。図１４の仮定の例では、細胞１０１の核が照射ライン１２０２のうちの１つを横切るときに、最も高い強度読取り値が得られる。センサ２１０が画素のない単一のセンサであっても、読取り値を組み合わせると、少なくともＸ−Ｚ断面において細胞１０１の構造についての情報が得られる。センサ２１０が個々の画素のアレイを備えている場合、細胞のＹ方向の構造についての何らかの構造情報も利用可能になる可能性がある。多色蛍光イメージングを使用するイメージング用途によっては、各蛍光色について別々の検出器を設けることが望ましい。
【００３３】
システム１２００には６つの円柱レンズ１２０１Ａのみが示してあるが、他の数を使用できることも当業者には理解されよう。たとえば、２０〜１００もの照射ラインを生成してもよい。例示的な一実施形態では、約４０の円柱レンズを使用してもよく、それぞれの半径が約２５マイクロメートル（幅が５０マイクロメートル）であり、その結果、検知位置２０７の長さは、Ｘ方向に約２ミリメートルである。流路２０１の高さが約５０マイクロメートルの場合、検知位置２０７に対する流路の好ましい傾斜は、約θ＝５０／２０００＝０．０２５ラジアンである。流路の高さ、ならびに使用されているマイクロレンズの数およびサイズに応じて、他の適切な傾斜角度が実現可能である。
【００３４】
集束素子１２０１と同様の集束素子を使用して、検知位置２０７において照射のラインを形成し、図９に示した通りシステム９００で照射および検知を実現するように、同じ側から細胞を照射し検知するシステムを構成することもできることが、当業者には理解されよう。
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、処理ユニット２１３が実行する分析の結果を使用して、細胞を仕分けてもよい。たとえば、処理ユニット２１３は、センサ２１０または９０２が生成する信号を分析して、特定の細胞が循環腫瘍細胞であるかどうか判定してもよい。循環腫瘍細胞は、細胞のサイズ、核のサイズ、および核と細胞質の比といった特定の測定値を特徴としてもよく、それらの全てが、本発明の実施形態によるシステムを使用して検出可能となる可能性がある。検出および分析のシステムは、仕分け機構と結合して、ある検出基準に合致する特定の細胞を隔離することができる。このようなシステムが図１５に示してあり、例示的な検出手段としてシステム１２００を使用する。特定の細胞の分析に基づいて、処理ユニット２１３は、細胞を分類し、信号１５０１を仕分けユニット１５０２に送ることができ、この仕分けユニット１５０２が、２つのチャネル１５０３、１５０４のうちの一方に各細胞を送って収集する。たとえば、仕分けユニット１５０２は、個々の細胞の経路の向きを変えるための圧電力要素または光学力要素を備えてもよい。
【００３６】
本発明の実施形態は、直線チューブ内に閉じ込められた細胞を走査するものとして説明してきたが、電気泳動、圧力駆動流、光ピンセット、電動移動ステージ、および他の技法を含め、広範囲の細胞送達技法のうち任意の技法を使用するシステムで本発明の実施形態を利用してもよいことが、当業者には理解されよう。細胞は、エレクトロウェッティング駆動液滴における油乳濁液中のペイロードとして、または電磁ビーズ識別（magnetic bead tagging）によって補助された磁気輸送を用いて運搬してもよい。細胞を担持するスライドの機械的な動きにより、細胞が静止しているときのサイトメータの構成部品の動きにより、または、細胞およびサイトメータの構成部品が様々な速度もしくは様々な方向に移動するときの相対運動により、細胞と検知位置の間の相対運動を実現することもできる。特許請求の範囲は、利用される細胞送達法によって限定されるものではない。
【００３７】
本発明は、明確にして理解するために、ここで詳細に説明してきた。しかし、添付特許請求の範囲に記載の範囲内で、何らかの変更および修正を実施してもよいことが、当業者には理解されよう。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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