(57)【要約】生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供すること；ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてが、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化すること；上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを分離すること；および上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを結晶化することによる、ムコネートのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−異性体およびｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−異性体を生成するための方法。上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−異性体は、上記ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−異性体へとさらに異性化され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法であって、該方法は、
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程；
該ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてがｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程；
該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを分離する工程；および
該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを結晶化する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼおよびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現する組換え細胞を、前記再生可能炭素源を含む培地中で、かつ該再生可能炭素源が、該細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における酵素類によって３−デヒドロシキメートに変換され、かつ、該３−デヒドロシキメートがｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートへと生体触媒により変換される条件下で培養する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異性化反応は、酸により触媒され、ここで該酸は、無機酸もしくは有機酸であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異性化反応は、約３．０〜約６．５の間、もしくは約３．５〜約４．５の間のｐＨにおいて溶液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記異性化反応は、４７℃以上の温度、もしくは約６０℃以上の温度において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異性化反応は、８時間内に、７．７５時間内に、７．５時間内に、７．２５時間内に、７時間内に、６．７５時間内に、６．５時間内に、６．２５時間内に、６時間内に、５．７５時間内に、５．５時間内に、５．２５時間内に、５時間内に、４．７５時間内に、４．５時間内に、４．２５時間内に、４時間内に、３．７５時間内に、３．５時間内に、３．２５時間内に、３時間内に、２．７５時間内に、２．５時間内に、２．２５時間内に、２時間内に、１．７５時間内に、１．５時間内に、１．２５時間内に、１時間内に、０．７５時間内に、０．５時間内に、もしくは０．２５時間内に実質的に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記異性化反応は、実質的にｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの沈殿なしで進行する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記培養する工程は、前記組換え細胞および細胞外ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを含むブロスを生成し、かつ、該組換え細胞を該ブロスから除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項９】
前記分離する工程は、前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを酸性化によって溶液から沈殿させる工程を包含し、ここで好ましくは、該溶液は、約３．０未満、もしくは約２．０未満のｐＨへと酸性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離する工程は、約３７℃未満、約２５℃未満、約−４℃未満、もしくは約−２０℃未満の温度へと前記溶液を冷却する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへの前記異性化をモニターする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートは、有機溶媒で結晶化され、ここで好ましくは、該有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトン、およびテトラヒドロフランのうちの１種以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートから塩を除去する工程をさらに包含し、ここで好ましくは、該塩は、無機塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの第１の収穫物を沈殿させた後に、前記溶液を濃縮する工程；および
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの第２の収穫物を、濃縮した溶液から沈殿させる工程、
をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記異性化反応は、ほぼ大気圧より高い圧力で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約６５％をｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと、該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約７５％をｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと、該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約８５％をｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと、もしくは該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約９５％をｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートは、Ｉ２によって、貴金属水素化触媒によって、スポンジメタル水素化触媒によって、もしくは骨格水素化触媒によって触媒される反応において、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートに異性化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法であって、該方法は、
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを含む発酵ブロスを提供する工程；
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートのうちの実質的にすべてが、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、該ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程；
該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを該ブロスから分離する工程；および
該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを結晶化する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記発酵ブロスは、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼおよびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現する組換え細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換え細胞を前記発酵ブロスから除去する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵ブロスは容器中に提供され、ここで、前記異性化反応は、該容器中で行われ、ここで好ましくは、該容器は、発酵槽容器である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼおよびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現する組換え細胞を、前記再生可能炭素源を含む培地中で、かつ該再生可能炭素源が、該細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における酵素類によって３−デヒドロシキメートへと変換され、かつ、該３−デヒドロシキメートは、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートへと生体触媒により変換される条件下で、培養する工程、
をさらに包含し、
ここで該組換え細胞は、前記発酵槽容器中で培養され、それによって、前記発酵ブロスを生成する、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分離する工程は、前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを、有機溶媒を使用して溶液から抽出する工程を包含する、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトン、およびテトラヒドロフランのうちの１種以上を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分離する工程は、約７未満、約６．７５未満、約６．５未満、約６．２５未満、約６未満、約５．７５未満、約５．５未満、約５．２５未満、約５未満、約４．７５未満、約４．５未満、約４．２５未満、約４未満、約３．７５未満、約３．５未満、約３．２５未満、もしくは約３未満のｐＨにおいて行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記分離する工程は、前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを無機塩から分離する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記分離する工程は、有機溶媒を使用して溶液から前記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを抽出する工程を含まない方法と比較して、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの単離収率を増大させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、酵素３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する異種構造遺伝子、ならびに酵素カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに由来する異種構造遺伝子で形質転換された細菌細胞を使用し、ここで該細菌細胞の培養は、約８８時間以内に、少なくとも約１．３８Ｍ  グルコースを少なくとも約０．４２Ｍ  ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと生体触媒により変換する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
酵素３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸  ７−リン酸シンターゼおよび３−デヒドロキナ酸シンターゼを発現する異種ＤＮＡ配列をさらに含む、請求項２８に記載の細菌細胞形質転換体。
【請求項３０】
酵素トランスケトラーゼを発現する異種ＤＮＡ配列をさらに含む、請求項２９に記載の細菌細胞形質転換体。
【請求項３１】
前記細菌細胞は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路における変異を有し、３−デヒドロシキメートのコリスメートへの変換をブロックする変異細胞系から選択される、請求項３０に記載の細菌細胞形質転換体。
【請求項３２】
前記細菌細胞は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路における変異を有し、３−デヒドロシキメートのコリスメートへの変換をブロックする変異細胞系から選択される、請求項２８に記載の細菌細胞形質転換体。
【請求項３３】
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、酵素種３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する構造遺伝子、ならびに酵素種カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに由来する構造遺伝子で形質転換された細菌細胞を、該細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における前記酵素類によって３−デヒドロシキメートへと変換される炭素源を含む培地中で培養して、３−デヒドロシキメートの生体触媒による変換によって少なくとも約０．９５ミリモル／リットル／時間の速度でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼ、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸  ７−リン酸シンターゼ、および３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードする異種構造遺伝子を発現する形質転換された細菌細胞を、該細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における前記酵素類によって３−デヒドロシキメートに変換される炭素源を含む培地中で培養して、３−デヒドロシキメートの生体触媒による変換によって少なくとも約０．９５ミリモル／リットル／時間の速度でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、酵素種３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する構造遺伝子、ならびに酵素カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに由来する構造遺伝子で形質転換された細菌細胞を、炭素源を含む培地中で、該炭素源が、少なくとも約０．９５ミリモル／リットル／時間の速度でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと生体触媒により変換される条件下で、培養する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜１５および１８〜３５のいずれか１項に記載の方法によって生成される、再生可能なｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート。
【請求項３７】
ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法であって、該方法は、
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを、該ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートのうちの実質的にすべてがｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記異性化反応は、貴金属水素化触媒によって、スポンジメタル水素化触媒によって、もしくは骨格水素化触媒によって触媒される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法であって、該方法は、
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを、該ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの実質的にすべてがｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記異性化反応は、貴金属水素化触媒によって、スポンジメタル水素化触媒によって、もしくは骨格水素化触媒によって触媒される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１６〜１７および３７〜４０のいずれか１項に記載の方法によって生成された、再生可能なｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１０年１月８日に出願された米国仮特許出願第６１／３３５，６３８号の利益および優先権を主張し、この米国仮特許出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、再生可能な供給材料からムコネートを生物学的に生成することに関する。本発明は、より詳細には、再生可能なバイオマス由来炭素源から、ムコネート異性体、ならびにその前駆物質および誘導体を生成することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ジメチルテレフタレート（ＤＭＴ）の世界的消費は、２０１２年で平均して３９７万トン（メートル法の  トン）まで突出している。ＤＭＴは、テレフタル酸およびメタノールのエステルであり、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレートおよびポリトリメチレンテレフタレートが挙げられる）の生成において使用される。ＤＭＴはまた、産業用プラスチック、自動車部品、フィルム、釣り糸、および食品パッケージ材料の製造において使用される主要な成分である。
【０００４】
伝統的には、ＤＭＴ生成は、テレフタル酸を、パラキシレンの触媒による均一酸化（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）によって生成されるメタノールでエステル化することを利用する。例えば、液体パラキシレンは、コバルト塩触媒の存在下で空気によって酸化されて、オキシデート（ｏｘｉｄａｔｅ）含有ｐ−トルイル酸およびモノメチルテレフタレートを形成し得、エステル化は、メタノールの存在下で行われて、ＤＭＴを形成し得る。
【０００５】
トリメリト酸（ＴＭＡ）は、粉体塗料、インク、エナメル線（ｗｉｒｅ  ｅｎａｍｅｌ）、低揮発性の高性能可塑剤、および高温適用のための産業用ポリマーのための樹脂を含む、化学産業における中間体としての適用を有する別の商業的に重要な生成物である。ＴＭＡはまた、脱水されて、トリメリト酸無水物を生成し得、これは、ポリマーおよび化学的中間体の生成のための、別の商業的に重要な出発材料である。
【０００６】
伝統的には、ＴＭＡは、プソイドクメン（１，２，４−トリメチルベンゼン）の酸化によって生成される。テレフタル酸およびイソフタル酸は、溶媒としての酢酸および触媒系（コバルト、マンガンおよび臭素が挙げられる）の存在下で、ｐ−キシレンもしくはｍ−キシレンの液相酸化によって商業的に生成され得る。
【０００７】
これらプロセスは、多くの他の商業的に重要な化学前駆物質、中間体、および生成物を生成するためのプロセスのように、環境的に鋭敏な（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）かつ非再生可能な供給材料（例えば、石油供給材料）に大きく依存すること、およびそれらの望ましくない副生成物（例えば、温室効果ガス、重金属、ハロゲン、発癌性炭化水素）を生成する傾向に起因して、望ましくない可能性がある。よって、再生可能な供給材料を利用して、ＤＭＴ、ＴＭＡ、および他の化学生成物を生成する改善された方法およびシステムが必要である。
【０００８】
特許文献１（Ｆｒｏｓｔらによる）および特許文献２（Ｆｒｏｓｔらによる）に記載されるように（これら出願の開示はともに、それらの全体が本明細書に参考として援用される）、ＤＭＴおよびＴＭＡは、ムコン酸から生成され得る。さらに、ムコン酸（その二重結合および二酸の官能性に起因して、２，４−ヘキサジエン二酸としても公知）は、広く種々の反応を受け得る。多くのムコン酸誘導体は公知であり、これらとしては、ラクトン、スルホン、ポリアミド、ポリエステル、チオエステル、付加ポリマー、および他の化合物が挙げられる。このような化合物は、広く種々の用途を有し、上記用途としては、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、熱プラスチック（ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ）およびコーティングとしての用途が挙げられる。従って、再生可能な供給材料からムコン酸もしくはムコネートを生物学的に生成するための改善された方法は、ＤＭＴ、ＴＭＡおよび他の化学物質を生成するために非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国公開出願公開第２０１０／０３１４２４３号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／１４８０４９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の記載では、用語「ムコネート」および「ムコン酸」を使用する。用語「ムコン酸」とは、両方のカルボン酸官能基がプロトン化され、その分子が形式上中性種である化学種に言及する。ムコン酸は、化学式ＨＯＯＣ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−−ＣＯＯＨを有する。用語「ムコネート」とは、カルボン酸官能基のうちの一方もしくは両方が脱プロトン化されて、生理学的ｐＨ値において優勢な化学種であるアニオン性もしくは二重アニオン性の形態を与える、対応する脱プロトン化化学種に言及する。しかし、用語「ムコン酸」および「ムコネート」とは、同じ分子のプロトン化形態もしくは脱プロトン化形態に言及するので、上記分子のプロトン化と脱プロトン化（例えば、非イオン化とイオン化）形態との間の差異が有用に区別されない場合に、上記用語は同義語として使用される。
【００１１】
本発明は、バイオマス由来炭素源から、ムコネートの３種の異性体（すなわち、ｃｉｓ，ｃｉｓ異性体；ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ異性体；およびｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ異性体）、ならびにその前駆物質および誘導体を生成するための方法を提供する。上記異性体は、その２個の二重結合の周りの幾何的配置により、構造的に異なる。さらに、上記異性体は、異なる物理的特性（例えば、融点）および化学反応性を有し得る。上記方法は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路を有する微生物においてエリスロース  ４−ホスフェート（Ｅ４Ｐ）およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）へと生体触媒による変換を行う能力のある、容易に入手可能な炭素源からの生成物の微生物生合成を含み得る。
【００１２】
１つの好ましい炭素源は、Ｄ−グルコースである。有利なことには、本発明と関連して使用可能なＤ−グルコースおよび他の炭素源は、非毒性である。さらに、このような炭素源は、再生可能であり、デンプン、セルロース、ならびにトウモロコシ、サトウキビ、砂糖大根、木材パルプ、および他のバイオマス資源において見いだされる糖に由来する。
【００１３】
本発明における種々の工程を促進するために適した宿主微生物は、芳香族アミノ酸生合成の内因性共通経路を有する属から選択され得る。好ましい宿主生物としては、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに内因性の選択された遺伝子を発現するように遺伝子操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの変異株が挙げられる。本発明における使用のための１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉ変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４であり、これは、酵素シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするａｒｏＥ遺伝子座における変異に起因して、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）（芳香族アミノ酸生合成の共通経路に沿った中間体）をシキミ酸へと変換するのを触媒できない栄養要求性変異体である。
【００１４】
芳香族アミノ酸生合成の共通経路は、細菌および植物において、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを生成する。上記共通経路は、分子コリスメートで終了し、これは、その後、３つの別個の最終経路によってフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンへと変換される。
【００１５】
上記共通する芳香族アミノ酸生合成経路の生成効率を増大させるためのアプローチとしては、米国特許第５，１６８，０５６号（１９９２年１２月１日発行）、米国特許第５，６１６，４９６号（１９９７年４月１日発行）、および米国特許出願第０７／９９４１９４号（１９９２年１２月２１日出願、現在、放棄されている）（これらすべての開示は、それら全体が本明細書において参考として援用される）に記載されるものが挙げられる。
【００１６】
上記遺伝子操作された宿主生物を使用するにあたって、芳香族アミノ酸生合成へと指向される炭素の流れは、上記共通経路に沿って進行して、ＤＨＳの上昇した細胞内レベルを生じ得る。ＤＨＳは、上記芳香族アミノ酸生合成の共通経路に沿った変異（これは、ＤＨＳからコリスメートへの変換を妨げる）に起因して蓄積する。上記ＤＨＳは、酵素３−デヒドロシキミ酸脱水酵素（ａｒｏＺ）のための基質として働き、ＤＨＳに対するこの酵素の作用により、プロトカテクエートを生じる。プロトカテクエートは、その後、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ（ａｒｏＹ）として公知の別の酵素を介して、カテコールへと変換される。このように形成された上記カテコールは、続いて、酵素カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔＡ）の作用によって、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと変換される。
【００１７】
ＤＨＳからｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの生合成を触媒する３つの酵素（すなわち、ａｒｏＺ、ａｒｏＹ、およびｃａｔＡ）は、適切なプロモーターの制御下でこれら３つの酵素をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡを使用して、宿主細胞において発現され得る。炭素の流れは、それによって、芳香族アミノ酸生合成の経路から離れて、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを生成する分岐した経路へと押しやられ得る。このように形成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、細胞外培地（ｍｅｄｉｕｍ）へと蓄積され得、これは、遠心分離、濾過、もしくは当該分野で公知の他の方法によって上記細胞から分離され得る。上記単離されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、その後、化学的に水素化されて、アジピン酸を生じ得る。
【００１８】
本発明の種々の実施形態において、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートが生成された後、これは、引き続いて、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートもしくはｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートに異性化され得る。上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートもしくはｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートはともに、異なる物理的特性および化学反応性を有し、これらは、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートのものとは異なるかもしくはこれを超える有用性を与え得る。例えば、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−異性体は、水性培地および／もしくは有機培地においてｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートより高い溶解性を有し得、このことは、有利な回収および加工処理を可能にする。さらなる例として、上記ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−異性体は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応における反応物として上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−異性体を超える特有の有用性を有し得る。
【００１９】
一局面において、本発明は、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法を特徴とする。上記方法は、生体触媒による変換（例えば、上記ａｒｏＺ、ａｒｏＹ、およびｃａｔＡ酵素を利用する）を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてがｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを分離する工程、および上記分離されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを結晶化する工程（例えば、上記プロトン化ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸として）を包含する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法を特徴とする。上記方法は、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを含む発酵ブロスを提供する工程；上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてがｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程；上記ブロスから上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを分離する工程；および上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを結晶化する工程を包含する。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、本発明の特徴である方法によって生成されるｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを特徴とする。上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートは、塩（例えば、ムコン酸ナトリウム、ムコン酸カルシウム、もしくはムコン酸アンモニウムなどの無機塩）として回収され得る。
【００２２】
なお別の局面において、本発明は、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法を特徴とし、上記方法は、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてがｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程を包含する。例えば、上記異性化反応は、貴金属水素化触媒によって、スポンジメタル水素化触媒によって、もしくは骨格水素化触媒（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｔ）によって触媒され得る。
【００２３】
なお別の局面において、本発明は、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法を特徴とし、上記方法は、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの実質的にすべてがｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化される反応条件下で、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートをｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程を包含する。例えば、上記異性化反応は、貴金属水素化触媒によって、スポンジメタル水素化触媒によって、もしくは骨格水素化触媒によって触媒され得る。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、本発明が特徴とする方法によって生成されたｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート（例えば、再生可能なｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート）を特徴とする。
【００２５】
他の例において、上記局面のうちのいずれか、または本明細書に記載される任意の方法、器具、もしくは組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。
【００２６】
種々の実施形態において、上記方法は、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素（例えば、ａｒｏＺ）、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ（例えば、ａｒｏＹ）およびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼ（例えば、ｃａｔＡ）を発現する組換え細胞を、再生可能炭素源を含む培地中で、かつこのような再生可能炭素源が上記細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路において見いだされた酵素類によってＤＨＳに変換される条件下で、培養する工程を包含し、得られたＤＨＳは、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートへと生体触媒により変換される。
【００２７】
上記再生可能炭素源の発酵によるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの生成は、組換え細胞および細胞外ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを含むブロスを生成し得る。上記生成はまた、上記組換え細胞、細胞砕片、不溶性タンパク質および他の望ましくない固体を、上記ブロスから分離して、上記発酵によって形成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてもしくはその大部分を含む清澄にした発酵ブロスを与える工程を包含し得る。次いで、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートは、上記清澄にした発酵ブロス中においてｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化され得る。
【００２８】
特定の実施形態において、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを含む発酵ブロスは、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートもしくはｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するために提供され得る。上記発酵ブロスは、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼおよびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現する組換え細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上記発酵ブロスは、容器中で提供され、上記異性化反応は、上記容器中で行われる。上記容器は、発酵容器であり得る。いくつかの例において、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼおよびカテコール１，２−ジオキシゲナーゼを発現する組換え細胞は、上記再生可能炭素源を含む培地中で、かつ上記再生可能炭素源が、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における酵素類によって３−デヒドロシキメートへと変換され、かつ、上記３−デヒドロシキメートは、生体触媒によりｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートに変換される条件下で、培養され得る。例えば、上記組換え細胞は、上記発酵容器中で培養され得、それによって、上記発酵ブロスを生成することができる。さらに、上記組換え細胞は、所望の通り、上記発酵ブロスから除去され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上記異性化反応は、酸によって触媒される。上記酸は、無機酸（例えば、鉱酸）もしくは有機酸であり得る。酸は、水和形態もしくは無水形態のいずれかで上記プロセスに適用され得る。一例において、塩の副生成物は、硫酸アンモニウムであり得る。これは、その後、例えば、肥料として使用され得る。上記異性化反応は、約１．５〜約６．５の間（例えば、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５）のｐＨにおいて行われ得る。好ましくは、上記異性化反応は、約３．５〜約４．５の間のｐＨにおいて行われ得る。
【００３０】
特定の実施形態において、上記異性化反応は、約４７℃以上の（例えば、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、もしくはより高い）温度で行われる。好ましくは、上記異性化反応は、約６０℃以上の温度で行われ得る。上記異性化反応は、８時間以内、７．７５時間以内、７．５時間以内、７．２５時間以内、７時間以内、６．７５時間以内、６．５時間以内、６．２５時間以内、６時間以内、５．７５時間以内、５．５時間以内、５．２５時間以内、５時間以内、４．７５時間以内、４．５時間以内、４．２５時間以内、４時間以内、３．７５時間以内、３．５時間以内、３．２５時間以内、３時間以内、２．７５時間以内、２．５時間以内、２．２５時間以内、２時間以内、１．７５時間以内、１．５時間以内、１．２５時間以内、１時間以内、０．７５時間以内、０．５時間以内、もしくは０．２５時間以内で実質的に完了し得る。
【００３１】
種々の実施形態において、上記異性化反応は、その反応混合物からｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを実質的に沈殿させることなく進められる。特定の実施形態において、上記異性化反応は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化することをモニターする工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記異性化反応は、ほぼ大気圧より高い圧力で行われる。
【００３２】
種々の実施形態において、異性化後、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートは、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を沈殿させるのに十分な、さらなる酸性化によって、溶液、培地、ブロス、もしくは発酵ブロスから分離され得る。上記ブロスは、約３．０未満の（例えば、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２、もしくはこれより低い）ｐＨへと酸性化され得る。上記ブロスは、約２未満のｐＨへとさらに酸性化され得る。
【００３３】
特定の実施形態において、上記分離する工程は、約３７℃未満、約２５℃未満、約−４℃未満、もしくは約−２０℃未満の温度へと溶液を冷却する工程を包含する。
【００３４】
特定の実施形態において、上記分離する工程は、沈殿させられたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を分離するために、遠心分離、濾過、もしくは他の物理的プロセスを含む。種々の実施形態において、上記分離する工程は、有機溶媒を使用して、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを上記発酵ブロスから抽出する工程を包含する。上記有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトン、およびテトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、メチルテトラヒドロフラン、シクロヘキサノンもしくはシクロヘキサノール、またはこれらの混合物のうちの１種以上を含み得る。一実施形態において、上記抽出は、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の顕著な沈殿なく、約７〜４の間の（例えば、約７、６．７５、６．５、６．２５、６、５．７５、５．５、５．２５、５、５．７５、５．５、５．２５、４）ｐＨにおいて行われ得、酸の自動化された添加を使用して、上記抽出が進むにつれて、この領域に上記ｐＨを維持することを包含し得る。別の実施形態において、上記抽出する工程は、上記有機溶媒によって溶解される、沈殿したｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の存在下で、約４未満の（例えば、約４、３．７５、３．５、３．２５、３、２．７５、２．５、２．２５、２）ｐＨにおいて行われ得る。さらに別の実施形態において、上記抽出する工程は、細胞、細胞砕片、タンパク質、もしくは他の望ましくない物質を、上記発酵ブロスから最初に除去せずに、行われ得る。なお別の実施形態において、上記抽出する工程は、膜によって媒介され得る。
【００３５】
特定の実施形態において、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートは、上記発酵ブロスから最初に除去され得、次いで、上記異性化、分離、および精製工程に供され得る。このような除去は、抽出、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、選択的膜分離、電気透析、もしくは当該分野で公知の他の方法によって達成され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸は、有機溶媒を使用する結晶化によって精製される。上記有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトン、およびテトラヒドロフランのうちの１種以上を含み得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記結晶化は、上記発酵ブロスからの回収後に、沈殿したｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を乾燥させることなく行われ得る。特定の実施形態において、上記結晶化は、分離されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸から望ましくない塩を除去する工程を包含する。種々の実施形態において、上記結晶化は、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の第１の収穫物を集めた後に、上記結晶化培池を濃縮する工程、およびｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の第２の収穫物を上記濃縮した培池から集める工程を包含する。
【００３８】
特定の実施形態において、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法は、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの生成、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約６５％をｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程、および上記ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを単離する工程を包含する。上記方法は、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％を、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへと異性化する工程を包含し得る。あるいは、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートは、適切な条件（例えば、ｐＨ、温度、触媒など）下でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートから生成もしくは異性化され得る。
【００３９】
種々の実施形態において、上記異性化反応は、Ｉ２によって、貴金属水素化触媒によって、スポンジメタル水素化触媒によって、もしくは骨格水素化触媒によって、触媒される。上記貴金属は、水素化触媒として機能する任意の貴金属（例えば、白金、パラジウムなど）であり得る。上記スポンジメタルもしくは骨格触媒は、ニッケル−アルミニウム合金（例えば、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なＲＡＮＥＹ（登録商標）ニッケル触媒）であり得る。上記金属触媒は、不均一触媒（例えば、粒子）もしくは担持触媒（ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｃａｔａｌｙｓｔ）（例えば、シリカ、アルミナ、炭素などのような支持体上）の形態で存在し得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、酵素３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ならびに酵素カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに由来する異種構造遺伝子で形質転換された細菌細胞を使用する。ここで上記細菌細胞の培養物は、約８８時間以内に、１．３８Ｍ  グルコースを少なくとも約０．４２Ｍ  ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと変換するに少なくとも十分な速度で、グルコースをｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと生体触媒により変換する。上記細菌細胞形質転換体は、酵素３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸  ７−リン酸シンターゼおよび３−デヒドロキナ酸シンターゼを発現する異種ＤＮＡ配列を含み得る。上記細菌細胞形質転換体は、酵素トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸  ７−リン酸シンターゼおよび３−デヒドロキナ酸シンターゼを発現する異種ＤＮＡ配列を含み得る。上記細菌細胞は、３−デヒドロシキメートをコリスメートに変換することをブロックする、芳香族アミノ酸生合成の共通経路において変異を有する変異細胞系から選択され得る。上記細菌細胞は、３−デヒドロシキメートをコリスメートに変換することをブロックする、上記芳香族アミノ酸生合成の共通経路において変異を有する変異細胞系から選択される。
【００４１】
特定の実施形態において、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、酵素種３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する構造遺伝子、ならびに酵素種カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに由来する構造遺伝子で形質転換された細菌細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における上記酵素類によって３−デヒドロシキメートへと変換される炭素源を含む培地中で培養して、少なくとも約０．９５ミリモル／リットル／時間の速度で、３−デヒドロシキメートの生体触媒による変換によって、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する工程を包含する。他の実施形態において、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、少なくとも約０．９７ミリモル／リットル／時間以上、１．０ミリモル／リットル／時間以上、１．２ミリモル／リットル／時間以上、１．４ミリモル／リットル／時間以上、１．６ミリモル／リットル／時間以上、１．８ミリモル／リットル／時間以上、２．０ミリモル／リットル／時間以上の速度で生成される。
【００４２】
種々の実施形態において、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼ、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸  ７−リン酸シンターゼ、および３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードする異種構造遺伝子を発現する形質転換された細菌細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成の共通経路における上記酵素類によって３−デヒドロシキメートに変換される炭素源を含む培地中で培養して、３−デヒドロシキメートの生体触媒による変換によって、少なくとも約０．９５ミリモル／リットル／時間の速度で、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する工程を包含する。他の実施形態において、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、少なくとも約０．９７ミリモル／リットル／時間以上、１．０ミリモル／リットル／時間以上、１．２ミリモル／リットル／時間以上、１．４ミリモル／リットル／時間以上、１．６ミリモル／リットル／時間以上、１．８ミリモル／リットル／時間以上、２．０ミリモル／リットル／時間以上の速度で生成される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程は、酵素種３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する構造遺伝子、ならびに酵素カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに由来する構造遺伝子で形質転換された細菌細胞を、炭素源を含む培地中で、上記炭素源が、少なくとも約０．９５ミリモル／リットル／時間の速度でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと生体触媒により変換される条件下で培養する工程を包含する。他の実施形態において、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、少なくとも約０．９７ミリモル／リットル／時間以上、１．０ミリモル／リットル／時間以上、１．２ミリモル／リットル／時間以上、１．４ミリモル／リットル／時間以上、１．６ミリモル／リットル／時間以上、１．８ミリモル／リットル／時間以上、２．０ミリモル／リットル／時間以上の速度で生成される。
【００４４】
本発明の他の局面および利点は、以下の図面および説明から明らかになり、これらのうちのすべては、本発明の原理を、例示によってのみ示す。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
上記に記載される発明の利点は、さらなる利点とともに、添付の図面とともに考慮される以下の説明に言及することによって、よりよく理解され得る。図面は、必ずしも一定の大きさに比例しているわけではなく、代わりに、一般に、本発明の原理を図示する際に強調される。
【図１−１】図１は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路およびｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を３−デヒドロシキメートから合成する分岐経路を示す。
【図１−２】図１は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路およびｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を３−デヒドロシキメートから合成する分岐経路を示す。
【図２】図２は、プラスミドｐ２−４７のプラスミドマップを示し、プラスミドｐＫＤ８．２４３Ａが、プラスミドｐ２−４７、ｐＳＵ１−３１、およびｐＳＵａｒｏＺＹ  １５７−２７からどのように生成され得るかを図示する。
【図３】図３は、ｐＫＤ８．２９２のプラスミドマップを示し、プラスミドｐＫＤ８．２９２が、プラスミドｐＩＢ１３４５およびｐＣＬ１９２０からどのように生成され得るかを図示する。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、異なる培地中での、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの例を示す。
【図５】図５は、ｐＨ７におけるムコネート異性化反応についての１Ｈ  ＮＭＲ図形の例を示す。
【図６】図６は、ｐＨ４におけるムコネート異性化反応についての１Ｈ  ＮＭＲ図形の例を示す。
【図７】図７は、ｐＨ７におけるムコネート異性化反応についてのＨＰＬＣ図形の例を示す。
【図８】図８は、ｐＨ４におけるムコネート異性化反応についてのＨＰＬＣ図形の例を示す。
【図９】図９は、ｐＨ７におけるムコネート異性化反応についての経時変化の例を示す。
【図１０】図１０は、ｐＨ４におけるムコネート異性化反応についての経時変化の例を示す。
【図１１】図１１は、ムコン酸のバッチ培養生成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路（例えば、上記中間体ＤＨＳを介して機能するもの）を有し、酵素ａｒｏＺ、ａｒｏＹ、およびｃａｔＡを発現する能力を有する宿主細胞によって使用され得る発酵可能な炭素源から、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸およびｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を生成するための方法を包含する。１つの好ましい実施形態において、上記方法は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成するための、発酵可能な炭素源の存在下で、上記宿主細胞を培養する工程、および上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を異性化して、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸もしくはｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を生成する工程を包含する。
【００４７】
発酵可能な炭素源は、Ｄ−エリスロース  ４−ホスフェート（Ｅ４Ｐ）およびホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）（芳香族アミノ酸生合成の共通経路への２つの前駆化合物）へと生体触媒により変換され得る、本質的に任意の炭素源を含み得る。適切な炭素源としては、バイオマス由来の源、もしくは再生可能な源（例えば、デンプン、セルロース、およびグルコース、ペントース、およびフルクトースのような糖部分、ならびに微生物代謝を支持し得る他の炭素源（例えば、一酸化炭素）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｄ−グルコースは、上記バイオマス由来炭素源として使用され得る。
【００４８】
本発明において使用するのに適した宿主細胞は、所望の芳香族化合物の生合成による生成のために利用され得る属のメンバーを含む。いくつかの実施形態において、このような宿主細胞は、所望の芳香族化合物の産業スケールの生合成による生成に適している。特に、適切な宿主細胞は、少なくともＤＨＳの生成に対して機能的である芳香族アミノ酸生合成の内因性の共通経路を有し得る。共通する芳香族経路は、広く種々の微生物において内因性であり、種々の芳香族化合物の生成のために使用され得る。米国特許第５，１６８，０５６号および同第５，６１６，４９６号（その両方の開示は、それら全体が本明細書に参考として援用される）において記載されるように、例えば、微生物の芳香族アミノ酸生合成経路は、本発明において利用され得る。
【００４９】
図１は、芳香族アミノ酸生合成の共通経路およびこの経路において多くの中間体とともにＥ４ＰおよびＰＥＰからコリスミ酸をもたらす上記共通する芳香族経路を介してｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を３−デヒドロシキメートから合成する分岐経路を示す。Ｅ４Ｐの利用性は、ｔｋｔ遺伝子によってコードされるペントースリン酸経路酵素であるトランスケトラーゼによって増大され得る。上記経路における中間体としては、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸  ７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）、３−デヒドロキネート（ＤＨＱ）、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）、シキミ酸、シキメート３−ホスフェート（Ｓ３Ｐ）、および５−エノールピルビルシキメート（ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｏｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ）−３−ホスフェート（ＥＰＳＰ）が挙げられる。上記共通経路における酵素としては、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＦ）、ＤＨＱシンターゼ（ａｒｏＢ）、ＤＨＱデヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼ（ａｒｏＬ、ａｒｏＫ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ａｒｏＡ）およびコリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）が挙げられる。
【００５０】
このタイプの共通経路を含む宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＳｅｒｒａｔｉａ属に属する原核生物が挙げられる。真核生物宿主細胞もまた、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属もしくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母に関して利用され得る。
【００５１】
より具体的には、原核生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｌａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｂａｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｋａｓｕｇｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｍａｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、およびＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓを含む種に由来し得る。真核生物宿主細胞の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓが挙げられる。
【００５２】
宿主細胞は、ＤＨＳを分岐点分子であるコリスメートへと変換するのをブロックする変異を有する栄養要求性変異細胞系を含み得る。このような変異体は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼおよびコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子のうちの１種以上における変異に起因して、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）をコリスメートへ変換するのを触媒できず、そしてこのようにして、上昇した細胞内レベルのＤＨＳを蓄積する。このような変異細胞系の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＡＢ２８３４、ＡＢ２８２９およびＡＢ２８４９が挙げられる。
【００５３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４は、シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするａｒｏＥ遺伝子座における変異に起因して、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）をシキミ酸へ変換することを触媒できない。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４の使用は、芳香族アミノ酸生合成へ指向される炭素の流れが、ＤＨＳを超えて進行しないことを確実にし得る。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８２９（これは、ＥＰＳＰシンターゼをコードするａｒｏＡ遺伝子座における変異に起因して、シキメート  ３−ホスフェート（Ｓ３Ｐ）を５−エノールピルビルシキメート（ｅｎｏｉｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ）−３−ホスフェート（ＥＰＳＰ）へ変換することを触媒できない）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８４９（これは、コリスミ酸シンターゼをコードするａｒｏＣ遺伝子座における変異に起因して、ＥＰＳＰをコリスミ酸へ変換することを触媒できない）はまた、増大した細胞内レベルのＤＨＳを生じる。
【００５４】
宿主細胞は、細胞内ＤＨＳが、カテコールへの生体触媒による変換の基質として使用され得るように、形質転換され得、そのカテコールは、その後、ムコン酸へと変換され得る。例えば、宿主細胞は、組換えＤＮＡで形質転換されて、ＤＨＳが生成された後に、炭素の流れを芳香族アミノ酸生合成の共通経路から離れて、ムコン酸を生成するための分岐経路へと押しやり得る。
【００５５】
図１に示されるように、上記分岐経路における中間体は、プロトカテクエート、カテコール、およびｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸である。ＤＨＳをプロトカテクエートに生体触媒により変換することを担う酵素は、図１において「ａｒｏＺ」と表示される酵素３−デヒドロシキミ酸脱水酵素である。カテコールを形成するためのプロトカテクエートの脱炭酸を担う酵素は、図１において「ａｒｏＹ」と表示されるプロトカテク酸デカルボキシラーゼである。最後に、カテコールの酸化を触媒してｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する酵素は、図１において「ｃａｔＡ」と表示されるカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼである。標準的表記法に従って、これら酵素の発現のための遺伝子は、斜体を使用して示され、よって、それぞれ、ａｒｏＺ、ａｒｏＹ、およびｃａｔＡである。上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、その後、異性化され得る（示されない）。本発明の一実施形態において、宿主細胞は、上記遺伝子ａｒｏＺ、ａｒｏＹ、およびｃａｔＡの構成的発現を示し得る。別の実施形態において、宿主細胞は、上記遺伝子ａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡのうちのいずれか１種以上；またはこれらのうちの任意の２種の組み合わせの構成的発現を示し得る。さらに別の実施形態において、宿主細胞は、ａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡのうちのいずれの構成的発現も示さない場合がある。
【００５６】
上記酵素３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼは、微生物（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が芳香族類（ａｒｏｍａｔｉｃｓ）（ベンゾエートおよびｐ−ヒドロキシベンゾエート）ならびにヒドロ芳香族類（ｈｙｄｒｏａｒｏｍａｔｉｃｓ）（シキメートおよびキネート）を増殖のための唯一の炭素源として使用することを可能にするオルト切断経路から補充される。ＤＨＳデヒドラターゼは、キナ酸およびシキミ酸の微生物異化作用において重要な役割を果たす。Ｐａｔｅｌは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓによるｐ−ヒドロキシベンゾエートの異化作用の間に、プロトカテクエートのカテコールへの変換を触媒するように、プロトカテク酸デカルボキシラーゼを処方した。近年、Ｏｒｎｓｔｏｎは、Ｐａｔｅｌ株（現在、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓといわれる）の再検査［（ａ）Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｊ．Ｗ．；Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｃ．Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｗｅｎｈｏｅｋ  １９６９，３５，３２５．  （ｂ）Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｊ．Ｗ．Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｗｅｎｈｏｅｋ  １９７０，３６，１６１］により、プロトカテク酸デカルボキシラーゼが、ｐ−ヒドロキシベンゾエートの異化作用において代謝的に重要ではなかったと結論づけた［Ｄｏｔｅｎ，Ｒ．Ｃ．；Ｏｒｎｓｔｏｎ，Ｎ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８７，１６９，５８２７］。
【００５７】
上記分岐経路へと炭素の流れを指向するように上記宿主細胞を形質転換するための機構は、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、およびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼをコードする発現可能な配列を含む遺伝的エレメントの挿入を包含し得る。利用される正確な機構にかかわらず、これら酵素活性の発現は、上記宿主細胞へと組換え遺伝的エレメントの移入によって行われるかもしくは媒介されることが企図される。本明細書で定義される場合、遺伝的エレメントは、生成物（例えば、タンパク質、アポタンパク質、もしくはアンチセンスＲＮＡ）についての発現可能なコード配列を有する核酸（一般に、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含み、これらは、経路酵素機能を発揮し得るかもしくは制御し得る。上記発現される生成物は、酵素として機能し得るか、酵素活性を抑制もしくは抑制解除し得るか、または酵素の発現を制御し得る。これら発現可能な配列をコードする核酸は、染色体性（例えば、宿主細胞染色体へ挿入もしくは組み込まれる）もしくは染色体外性（例えば、プラスミド、コスミドなどによって運ばれる）のいずれかであり得る。
【００５８】
本発明の遺伝的エレメントは、プラスミド、コスミド、ファージ、酵母人工染色体もしくは上記遺伝的エレメントの、宿主細胞への移入を媒介する他のベクターによって、宿主細胞に導入され得る。これらベクターは、上記ベクターの複製を制御するｃｉｓ作用制御エレメントおよび上記ベクターによって運ばれる遺伝的エレメントとともに、複製起点を含み得る。選択マーカーは、上記遺伝的エレメントが導入された宿主細胞の同定を補助するために、上記ベクターに存在し得る。例えば、選択マーカーは、特定の抗生物質（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、もしくはネオマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子であり得る。
【００５９】
遺伝的エレメントを宿主細胞に導入することは、遺伝的エレメントが挿入される染色体外マルチコピープラスミドベクターを利用し得る。プラスミドが媒介する上記遺伝的エレメントの宿主細胞への導入は、制限酵素でのプラスミドの最初の切断、続いて、本発明に従う上記プラスミドおよび遺伝的エレメントの連結を包含する。連結された組換えプラスミドの再環化の際に、プラスミド移入のための形質導入もしくは他の機構（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）は、上記プラスミドを上記宿主細胞に移入するために利用される。遺伝的エレメントを上記宿主細胞に挿入するために適したプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２およびその誘導体（例えば、ｐＡＴ１５３ベクター、ｐＸｆ３ベクター、ｐＢＲ３２５ベクター、ｐＢｒ３２７ベクター、ｐＵＣベクター）、ｐＡＣＹＣおよびその誘導体、ｐＳＣ１０１およびその誘導体、ならびにＣｏｌＥ１が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、コスミドベクター（例えば、ｐＬＡＦＲ３）はまた、遺伝的エレメントを宿主細胞に挿入するために適している。プラスミド構築物の例としては、ｐ２−４７、ｐＫＤ８．２４３Ａ、ｐＫＤ８．２４３Ｂ、およびｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼをそれぞれコードするＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離されたａｒｏＺおよびａｒｏＹ遺伝子座を有する。プラスミド構築物のさらなる例としては、カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ｃａｔＡに対して内因性の遺伝的フラグメントを有するｐＫＤ８．２９２が挙げられる。
【００６０】
宿主細胞を形質転換するための方法はまた、芳香族アミノ酸生合成の共通経路への炭素の拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）を増大させる酵素をコードする遺伝子の挿入を包含し得る。遺伝子の発現は、主に、それ自体のプロモーターによって誘導されるが、任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）発現制御配列（例えば、リプレッサー、およびエンハンサー）を含む他の遺伝的エレメントは、タンパク質、アポタンパク質、もしくはアンチセンスＲＮＡのコード配列の発現もしくは抑制解除を制御するために含められ得る。さらに、組換えＤＮＡ構築物が生成され得、それによって、上記遺伝子の天然のプロモーターは、上記遺伝子生成物の発現を増大させるために、代替のプロモーターで置き換えられる。プロモーターは、構成性もしくは誘導性のいずれかであり得る。構成性プロモーターは、細胞の寿命の間に一定の速度で遺伝子の転写を制御するのに対して、誘導性プロモーターの活性は、特定の誘導因子の存在（もしくは非存在）によって決定される場合に変動する。例えば、制御配列は、上記宿主細胞ゲノム中に既にコードされる選択された酵素の過剰発現を促進するために、野生型宿主細胞に挿入され得るか、または代わりに、染色体外でコードされた酵素の合成を制御するために使用され得る。
【００６１】
ＤＨＳの過剰生成を促進する制御配列が使用され得る。先に示されるように、ＤＨＳは、ペントースリン酸経路酵素であるトランスケトラーゼ（ｔｋｔによってコードされる）とともに、チロシン感受性アイソザイム３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸  ７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ（ａｒｏＦによってコードされる）および３−デヒドロキノ酸（ＤＨＱ）シンターゼ（ａｒｏＢによってコードされる）の逐次的触媒活性によって、上記共通経路において合成される。これら生合成酵素の発現は、Ｄ−グルコースをＤＨＳへ変換するのを増大させるために増幅され得る。上記共通経路の第１の酵素であるＤＡＨＰシンターゼのインビボ触媒活性を増大させると、芳香族生合成へ向かうＤ−グルコース等価物の流れが増大する。しかし、ＤＡＨＰシンターゼ触媒活性のレベルは、芳香族生合成に関係するＤ−グルコースのパーセンテージにおいてさらなる改善は達成されないレベル以上に達する。芳香族アミノ酸生合成のこの制限レベルにおいて、上記ペントースリン酸経路酵素であるトランスケトラーゼの上記触媒レベルの増幅は、上記経路へと吸い上げられるＤ−グルコースのパーセンテージのかなりの増大を達成する。
【００６２】
増幅されたトランスケトラーゼ活性は、Ｄ−エリスロース  ４−ホスフェート濃度を増大させ得る。ＤＡＨＰシンターゼの２つの基質のうちの一方として、制限されたＤ−エリスロース  ４−ホスフェートの利用可能性は、ＤＡＨＰシンターゼ触媒活性を制限し得る。従って、ＤＡＨＰシンターゼ、ＤＨＱシンターゼおよびＤＨＱデヒドラターゼの触媒活性を増幅するための１つの方法は、これらの酵素をコードする組換えＤＮＡ配列で微生物触媒を形質転換することによってその酵素種を過剰発現することである。
【００６３】
ＤＡＨＰシンターゼおよびトランスケトラーゼの増幅された発現は、この経路へ向かう通常の炭素の流れが超過した状態にある、芳香族アミノ酸生合成の共通経路へ向かう炭素の流れのサージ（ｓｕｒｇｅ）を作り得る。共通の芳香族アミノ酸経路の個々の酵素によって触媒される、基質の生成物への変換の個々の速度が、ＤＡＨＰシンターゼの速度より低い場合、これら律速酵素の基質は、細胞内に蓄積し得る。
【００６４】
微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、頻繁に、外部環境（例えば、バルク発酵培地）へこのような基質を輸送する（ｅｘｐｏｒｔ）ことによって、蓄積された基質に対処する。このことは、上記共通経路を介する炭素の流れの喪失を生じる。なぜなら、輸送された基質は、代表的には、微生物の代謝に影響を受けない。ＤＨＱシンターゼは、律速共通経路酵素の例である。ＤＨＱシンターゼの増幅された発現は、この酵素の律速特徴を除去し、ＤＡＨＰおよびその非リン酸化アナログであるＤＡＨの蓄積を妨げる。ＤＨＱデヒドラターゼは、律速ではない。従って、ａｒｏＦがコードするＤＡＨＰシンターゼ、ｔｋｔがコードするトランスケトラーゼおよびａｒｏＢがコードするＤＨＱシンターゼの増幅された発現は、ＤＨＳの生成を増大させ、上記ＤＨＳは、ＤＨＳデヒドラターゼおよびプロトカテク酸デカルボキシラーゼの存在下で、カテコールに変換され、上記カテコールは、その後、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へと生体触媒により変換され、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、その後、異性化され得る。
【００６５】
上記炭素源とＤＨＳとの間の共通経路に沿った炭素の流れの効率を促進し得る１つのプラスミドは、プラスミドｐＫＤ１３６であり、これは、上記ａｒｏＦ、ｔｋｔおよびａｒｏＢ遺伝子をコードする。プラスミドｐＫＤ１３６は、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＦによってコードされる）およびトランスケトラーゼ（ｔｋｔによってコードされる）の増幅された発現に起因して、芳香族生合成への炭素の流れのサージを誘導する。次いで、炭素の流れのこのサージは、ＤＨＱシンターゼ（ａｒｏＢによってコードされる）の増幅された発現に起因して、ｐＫＤ１３６によるＤＨＳ合成へとそのまま送達される。
【００６６】
従って、本発明の好ましい実施形態として、ＤＨＳデヒドラターゼ、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、およびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼをコードするＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現遺伝子の異種由来の株を構築し、Ｄ−グルコースをｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸へ生体触媒により変換することを可能にした。Ｄ−グルコースの、ＤＨＳへの効率的変換を、上記宿主細胞をｐＫＤ１３６で形質転換した際に達成した。次いで、上記株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６を、プラスミドｐＫＤ８．２４３ＡおよびｐＫＤ８．２９２で形質転換した。結果は、酵素３−デヒドロシキミ酸脱水酵素（ａｒｏＺ）、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ（ａｒｏＹ）およびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔＡ）を発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２であった。この細菌細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２）に、１９９５年８月１日に寄託し、アクセッション番号６９８７５を割り当てられた。
【００６７】
別の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７／ｐＫＤ８．２９２を生成するために、プラスミドｐ２−４７およびｐＫＤ８．２９２で形質転換される。別の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７／ｐＫＤ８．２９２を生成するために、プラスミドｐＫＤ８．２４３ＢおよびｐＫＤ８．２９２で形質転換される。これら異種宿主細胞系の各々は、Ｄ−グルコースをｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸に変換することを触媒する。合成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、細胞外に蓄積し、上記細胞から分離され得る。その後、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸は、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸へと異性化され得、所望される場合、さらにｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸へと異性化され得る。
【００６８】
本発明は、従って、芳香族アミノ酸生合成の内因性共通経路を有する宿主細胞の形質転換体に関する。上記形質転換体は、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、およびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼをコードする異種遺伝子の構成的発現によって特徴付けられる。一実施形態において、上記細胞形質転換体は、酵素トランスケトラーゼ、ＤＡＨＰシンターゼ、およびＤＨＱシンターゼをコードする発現可能な組換えＤＮＡ配列でさらに形質転換される。別の実施形態において、上記宿主細胞は、３−デヒドロシキメートをコリスメートに変換するのをブロックするアミノ酸生合成の共通経路における変異を有する、変異を含む変異細胞系の群から選択される。なお別の実施形態において、３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して内因性である。さらなる実施形態において、カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼをコードする異種遺伝子は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに対して内因性である。
【００６９】
（再生可能なムコネート）
再生可能な、生物学的に得られる炭素源から生成されるムコン酸は、植物によって組み込まれた大気の二酸化炭素に由来する炭素から構成される（例えば、グルコース、スクロース、グリセリン、もしくは植物油のような炭素源に由来する）。従って、このようなムコン酸は、それらの分子構造において、化石燃料ベースもしくは石油ベースの炭素ではなく、再生可能な炭素を含む。よって、この特許の主題である上記生合成によるムコネート、および関連する派生生成物は、従来法によって生成されるムコネートより小さな炭素痕跡（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）および関連生成物を有する。なぜなら、それらは、化石燃料を枯渇させないか、石油が確保され、それらは、炭素サイクルにおける炭素量を増大させない（例えば、ライフサイクル分析は、世界的な炭素バランスに対して正味の炭素増大を示さない）からである。
【００７０】
上記生合成によるムコネートおよび関連生成物は、当該分野で公知の方法（例えば、二重炭素同位体フィンガープリント法（ｄｕａｌ  ｃａｒｂｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ））によって、化石燃料もしくは石油化学炭素源から生成されるムコネートおよび関連生成物から区別され得る。この方法は、化学的に同一の材料を別の方法で区別し得、１４Ｃと１３Ｃとの異性体比を使用して、供給源によって（すなわち、非生物学的に対して生物学的）上記材料中の炭素原子を区別する。上記炭素同位体１４Ｃは、不安定であり、５７３０年の半減期を有する。安定な１３Ｃ同位体に対する上記不安定な１４Ｃ同位体の相対量を測定することは、化石（長期間活動をとめた（ｌｏｎｇ  ｄｅａｄ））供給材料と生物圏の（生きている、よって、再生可能な）供給材料との間の標本炭素を区別することを可能にする（Ｃｕｒｒｉｅ，Ｌ．Ａ．  「Ｓｏｕｒｃｅ  Ａｐｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  Ｊ．Ｂｕｆｆｌｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｐ．ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，Ｅｄｓ．，  １  ｏｆ  Ｖｏｌ．  Ｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＵＰＡＣ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｌｅｗｉｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ）（１９９２）３−７４を参照のこと）。放射性炭素の年代測定における基本的仮定は、大気中の１４Ｃ濃度の定常性が、生きた生物における１４Ｃの定常性をもたらすということである。
【００７１】
単離されたサンプルを扱う場合、サンプルの年代は、関係性ｔ＝（−５７３０／０．６９３）ｌｎ（Ａ／Ａｏ）によってほぼ導き出され得る。ここでｔ＝年代であり、５７３０年は、上記不安定な１４Ｃ同位体の半減期であり、ＡおよびＡｏは、それぞれ、サンプルおよび現代の標準物質の特定の１４Ｃ活性である（Ｈｓｉｅｈ，Ｙ．，Ｓｏｉｌ  ＳｃＬ  Ｓｏｃ．Ａｍ  Ｊ．，５６，４６０，（１９９２））。しかし、１９５０年以来の大気圏核実験および１８５０年以来の化石燃料の燃焼が原因で、１４Ｃは、第２の地球化学的時間の特徴を獲得した。大気中ＣＯ２中のその濃度、そして従って、生きている生物圏における濃度は、１９６０年代半ばには、核実験のピーク時にほぼ２倍になった。上記濃度は、それ以来、概算の緩和半減期（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）約７〜１０年で、定常状態宇宙線による（大気中）ベースライン同位体率（１４Ｃ／１２Ｃ）約１．２×１０−１２へと徐々に戻った。（この後者の半減期は、同位体半減期とは区別されなければならない（すなわち、核時代の始まり以来の大気中および生物圏の１４Ｃの変動を追跡するために、詳細な大気核投入／崩壊関数（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｐｕｔ／ｄｅｃａｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を使用しなければならない）。それは、近年の生物圏炭素の年ごとの年代測定を約束するこの後者の生物圏１４Ｃ時間の特徴である。１４Ｃは、加速器質量分析（ＡＭＳ）によって測定され得、結果は、現代の炭素に対する割合の単位（ｆＭ）で与えられる。ｆＭは、米国国立標準技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＮＩＳＴ）の標準参照物質（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（ＳＲＭｓ）  ４９９０Ｂおよび４９９０Ｃ（それぞれ、シュウ酸標準物質ＨＯｘＩおよびＨＯｘＩＩとして公知）によって定義される。上記基本定義は、ＨＯｘＩの１４Ｃ／１２Ｃ同位体比の０．９５倍（ＡＤ  １９５０年を基準として）に関連する。現在の生きている生物圏（植物材料）では、ｆＭは約１．１である。
【００７２】
安定な炭素同位体である１３Ｃおよび１２Ｃの比は、供給源の識別および配分（ａｐｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔ）に対する補完の経路を提供する。所定の生体供給源の材料における１３Ｃ／１２Ｃ比は、上記二酸化炭素が固定され、正確な代謝経路をも反映するときには、大気中二酸化炭素における１３Ｃ／１２Ｃ比の結果である。局部的なバリエーションもまた存在する。石油、Ｃ３植物（広葉樹）、Ｃ４植物（禾本（ｔｈｅ  ｇｒａｓｓｅｓ））、および海洋カーボネート（ｍａｒｉｎｅ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）はすべて、１３Ｃ／１２Ｃおよび対応するδ  １３Ｃ値において顕著な差異を示す。さらに、Ｃ３植物およびＣ４植物の脂質物質は、その代謝経路の結果として、同じ植物の炭水化物成分に由来する物質とは異なって分析される。測定の正確さの範囲内で、１３Ｃは、同位体分別効果に起因して大きなバリエーションを示し、本発明に関してその最も顕著なものは、光合成機構である。植物における炭素同位体比が異なる大きな原因は、上記植物における光合成炭素代謝の経路、特に、第１のカルボキシル化（例えば、大気中ＣＯ２の最初の固定）の間に起こる反応の差異と密接に関連する。草木の２つの大きなクラスは、Ｃ３（もしくはカルビン−ベンソン）光合成回路を組み込むものと、Ｃ４（もしくはハッチ−スラック）光合成回路を組み込むものである。Ｃ３植物（例えば、堅木および針葉樹）は、温暖気候帯域において優勢である。Ｃ３植物においては、第１のＣＯ２固定もしくはカルボキシル化反応は、酵素リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼを必要とし、第１の安定な生成物は、３個の炭素の化合物である。他方で、Ｃ４植物は、熱帯地方の禾本、トウモロコシおよびサトウキビのような植物を含む。Ｃ４植物において、別の酵素であるホスホエノール−ピルビン酸カルボキシラーゼを必要とするさらなるカルボキシル化反応が、第１のカルボキシル化反応である。その第１の安定な炭素化合物は、４個の炭素の酸であり、これは、その後、脱炭酸される。このようにして放出されたＣＯ２は、上記Ｃ３回路によって再固定される。
【００７３】
Ｃ４植物およびＣ３植物はともに、ある１３Ｃ／１２Ｃ同位体比の範囲を示すが、代表的な値は、約−１０〜−１４‰（Ｃ４）および−２１〜−２６‰（Ｃ３）である（Ｗｅｂｅｒら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４５，２９４２（１９９７））。石炭および石油は、一般に、この後者の範囲に入る。上記１３Ｃ測定スケールは、本来は、ｐｅｅ  ｄｅｅベレムナイト（ＰＤＢ）石灰岩によって設定されるゼロによって定義され、ここで値は、この材料からのｐｐｔ偏差（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｔｈｏｕｓａｎｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）単位で与えられる。上記δ１３Ｃ値は、ｐｐｔ（パーミル）単位にあり、‰と省略され、以下のように計算される：
δ１３Ｃ≡（１３Ｃ／１２Ｃ）サンプル−（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質／（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質×１０００‰
上記ＰＤＢ標準物質（ＲＭ）は枯渇してしまったので、一連の代替のＲＭが、ＩＡＥＡ、ＵＳＧＳ、ＮＩＳＴ、および他の選択された国際同位体実験機関と協同して開発された。ＰＤＢからの‰偏差の表示法が、δ１３Ｃである。質量４４、４５および４６の分子イオンに関して、高性能安定比質量分析（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｒａｔｉｏ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＩＲＭＳ）によってＣＯ２に対する測定を行う。
【００７４】
従って、上記生合成されたムコネートおよび生合成されたムコネートを含む組成物は、１４Ｃ（ｆＭ）および二重炭素同位体フィンガープリント法に基づいて、それらの化石燃料および石油化学由来対応物から区別され得、それにより、新たな組成物が示される（例えば、米国特許第７，１６９，５８８号、同第７，５３１，５９３号、および同第６，４２８，７６７号）。これら生成物を区別する能力は、流通においてこれら物質を追跡するにあたって有益である。例えば、新たなおよび古い炭素同位体プロフィールを両方含む生成物は、古い物質からのみ作製される生成物から区別され得る。従って、生合成によるムコネートおよび誘導体物質は、それらの特有のプロフィールに基づいて、流通において追跡され得る。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：ａｒｏＺ遺伝子のクローニング）
ＤＨＳデヒドラターゼをコードする遺伝子（ａｒｏＺと称される）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＤＮＡのゲノムライブラリーから単離した。ゲノムＤＮＡを、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ａ１７０−４０から精製し、ＢａｍＨ  Ｉで部分的に消化して、１５ｋｂ〜３０ｋｂの範囲のフラグメントを生成した。得られたＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨ  Ｉで予め消化し、その後、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したコスミドｐＬＡＦＲ３に連結した。ｐＬＡＦＲ３は、ＲＫ２レプリコンを有するテトラサイクリン耐性コスミドである。連結したＤＮＡを、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してパッケージし、得られたファージ粒子を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＤ１３６に感染させた。プラスミドｐＫＤ１３６は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＦ）、およびＤＨＱシンターゼ（ａｒｏＢ）をコードする遺伝子、ならびにアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２５ベースのベクター（ｐＭＢ１複製起点）である。テトラサイクリンおよびアンピシリンの両方に耐性であるコロニーを、その後、Ｄ−グルコース（４ｇ  Ｌ）、シキミ酸（０．０４ｇ  Ｌ）、クエン酸第二鉄（０．０７ｇ  Ｌ）、ｐ−トルイジン（１．９ｇ  Ｌ）、アンピシリン（０．０５ｇ  Ｌ）、およびテトラサイクリン（０．０１３ｇ  Ｌ）を含む色素生成性最小培地（Ｍ９）プレートにプレートした。３７℃において４８時間にわたってインキュベートした後、コロニー５−８７を取り囲む増殖培地は、プロトカテク酸が上記プレート上にスポットされる場合に起こる、培地の黒ずみ（ｄａｒｋｅｎｉｎｇ）に似た、褐色に見えた。ＤＮＡは、コロニー５−８７の培養物から精製し、ｐＫＤ１３６およびテトラサイクリン耐性コスミド（ｐ５−８７といわれる）からなった。コスミドｐ５−８７は、ＢａｍＨ  Ｉで完全に消化した場合に、ＤＮＡの４個の検出可能なフラグメントを生成する１４ｋｂ  ＢａｍＨ  Ｉフラグメントを含んだ。
【００７６】
（実施例２：ａｒｏＺ遺伝子のクローニングの確認）
コスミドｐ５−８７が上記ａｒｏＺ遺伝子を含むという確認は、代表的には、Ｄ−グルコースをＤＨＳへ変換するＥ．ｃｏｌｉ株の形質転換が、ＤＨＳをプロトカテク酸へさらに変換し得るという事実に依拠した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４は、シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする上記ａｒｏＥ遺伝子における変異に起因して、培養上清中にＤＨＳを蓄積する。Ｄ−グルコースをＤＨＳに変換することは、ＡＢ２８３４がｐＫＤ１３６で形質転換される場合に最大化される。ＡＢ２８３４を、ｐＫＤ１３６およびｐ５−８７で同時形質転換して、アンピシリンおよびテトラサイクリンの両方に耐性であるコロニーを生成した。１ＬのＬＢ培地（４Ｌ  三角フラスコ）に、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ５−８７の一晩培養物（５ｍＬ）を接種した。上記培養物を、３７℃において８時間にわたって撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）増殖させた。次いで、上記細胞を採取し、グルコース（１０ｇ  Ｌ）、シキミ酸（０．０４ｇ  Ｌ）、アンピシリン（０．０５ｇ  Ｌ）、およびテトラサイクリン（０．０１３ｇ  Ｌ）を含む１Ｌ（４Ｌ  三角フラスコ）の最小Ｍ９培地中で再懸濁した。上記培養物を、３７℃インキュベーションへと戻した。上記培養物のアリコートを、２４時間後および６４時間後に取り出し、細胞を除去するために遠心分離にかけた。単離された上清５ｍＬを、各サンプルから集め、水を真空中で除去した。サンプルをＤ２Ｏ中に再溶解し、真空中で濃縮した。この手順の反復は、残りの水の、Ｄ２Ｏでの交換を生じ、サンプルを１Ｈ  ＮＭＲに因る分析に適したものにした。内部標準として３−（トリメチルシリル）プロピオン−２，２，３，３−ｄ４酸のナトリウム塩を使用して、約９ｍＭ  プロトカテク酸が、培養上清中に蓄積したことが決定された。δ６．９４（ｄ，  ７  Ｈｚ，  １Ｈ）およびδ  ７．４８  （ｄ，  ７  Ｈｚ，  ２Ｈ）における診断的共鳴は、プロトカテク酸を示した。ＤＨＳは、上記培養上清中に検出されなかった。この実験から、ＤＨＳデヒドラターゼ（ａｒｏＺ）をコードする遺伝子が、プラスミドｐ５−８７上に位置することが結論づけられた。
【００７７】
（実施例３：ａｒｏＺ遺伝子のサブクローニング）
上記ａｒｏＺコード挿入物のサイズを最小限にしようとする試みにおいて、プラスミドｐ５−８７をＢａｍＨ  Ｉで消化し、得られたフラグメントを、ＢａｍＨ  Ｉで予め消化し、ホスファターゼで処理したベクターｐＳＵ１９に連結した。プラスミドｐＳＵ１９は、上記ｐ１５Ａレプリコンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＤ１３６への上記連結生成物の形質転換後、得られたアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性コロニーを、ｐ−トルイジンおよびクエン酸第二鉄を含む色素生成性最小培地アガロースプレートを褐色にする能力について、実施例１に記載されるようにスクリーニングした。この技術を使用して、プラスミドｐＳＵ１−３１を単離した。これは、ｐＳＵ１９中に含まれる３．５ｋｂ  ＢａｍＨ  Ｉ挿入物からなった。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＳＵ１−３１を、実施例１に記載されるものに類似の条件下で、１Ｌスケールで増殖させた場合、上記培養上清の１Ｈ  ＮＭＲ分析は、１１ｍＭ  プロトカテク酸が細胞外に蓄積することを示した。
【００７８】
（実施例４：ａｒｏＹ遺伝子のクローニング）
上記ａｒｏＹ遺伝子を含むＤＮＡのフラグメントを、プロトカテクエートを通常合成する株が、代わりに、触媒的に活性なプロトカテク酸デカルボキシラーゼの存在下でカテコールを合成するという事実に基づいて単離した。コスミドｐ４−２０を調製した。これは、ｐＬＡＦＲ３に位置した３．５ｋｂ  ＢａｍＨ  Ｉ  ａｒｏＺフラグメントを含んだ。ＥｃｏＲ  Ｉで消化したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＤＮＡのライブラリーを、ｐＬＡＦＲ３中で先に構築したものに類似のコスミドｐ４−２０虫に調製した。λファージ頭部にパッケージしたＤＮＡを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＤ１３６に感染させ、その結果、アンピシリンおよびテトラサイクリンの両方に対して耐性のコロニーを生じた。コロニーを、ｐ−トルイジンおよびクエン酸第二鉄を含む色素生成性最小培地アガロースプレート上でスクリーニングした。色素生成性最小培地にカテコールを添加すると、等量のプロトカテク酸の添加よりも、周りを囲むアガロースの黒ずみがより濃くなるので、カテコールを合成するそれらコロニーが、プロトカテクエートを合成するコロニーの背景から選択され得ることが予測された。３７℃で約２４時間にわたってインキュベートした後、コロニー２−４７は、すべての他のコロニーが欠いている局所的な褐色の領域を生じていた。
【００７９】
コロニー２−４７からＤＮＡを単離したところ、プラスミドｐＫＤ１３６およびプラスミドｐ２−４７が得られた。これらプラスミドを、その後、コンピテント細胞に同時形質転換して、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７を生成した。上記ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７の培養上清を、実施例２に記載されるように、１Ｈ  ＮＭＲによって分析した。最小培地中で４８時間後に、５６ｍＭ  Ｄ−グルコースの溶液は、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７によって２０ｍＭ  カテコールの溶液へと変換されていた。
【００８０】
（実施例５：ａｒｏＹ遺伝子のサブクローニング）
プロトカテク酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡの単離のための、もとのストラテジーと同様に、ａｒｏＹ  ＥｃｏＲ  Ｉフラグメントの、その最小サイズへのサブクローニングはまた、ＤＨＳデヒドラターゼの存在下でのａｒｏＥ宿主株によるカテコールの合成に依拠した。ＥｃｏＲ  Ｉで完全になるまでのｐ２−４７の消化は、上記ａｒｏＹ挿入物が、約８ｋｂおよび１１．９ｋｂの２個のＥｃｏＲ  Ｉフラグメントからなることを示した。ｐＳＵ１−３１に上記１１．９ｋｂ  ＥｃｏＲ  Ｉフラグメントが位置することで、プラスミドｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７を得た。実施例２に記載されるものに類似の条件下で、１Ｌ  スケールで増殖させた場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７は、５６ｍＭ  Ｄ−グルコースを供給した場合に、培養上清中に１６ｍＭ  カテコールを蓄積させた。さらなるサブクローニングに関連した上記１１．９ｋｂ  ＥｃｏＲ  Ｉフラグメントのマッピングから、上記ａｒｏＹ遺伝子が、上記１１．９ｋｂ  フラグメントの中央部近くに位置しているようであることが示された。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩでのｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７の消化は、２．３ｋｂ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントを生じた。これを、ｐＳＵ１−３１に挿入して、プラスミドｐＫＤ８．２４３Ａを得た（図２）。上記２．３ｋｂ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントが上記ベクターに対して反対の配向にあるプラスミドｐＫＤ８．２４３Ｂをまた、単離した。これらプラスミドの各々を、ＡＢ２８３４へと、プラスミドｐＫＤ１３６で同時形質転換した。実施例２に記載されるものに類似の条件下で、１Ｌ  スケールで増殖させた場合、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａは、５６ｍＭ  Ｄ−グルコースから４８時間以内に１６ｍＭ  カテコールを合成したのに対して、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ｂは、１０ｍＭ  カテコールを合成した。プロトカテク酸（＜４ｍＭ）もまた、上記培養上清のうちのいくらかで検出されたが、一貫したベースではなく、微生物合成の最後に常にあるわけではなかった。細菌細胞系ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ（これは、酵素種３−デヒドロシキミ酸脱水酵素およびプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現する）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２）に、１９９６年３月１９日に寄託し、アクセッション番号９８０１４が割り当てられた。
【００８１】
（実施例６：ＤＨＳデヒドラターゼ、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、およびカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼの酵素活性）
Ｄ−グルコースをカテコールへ変換するのを触媒し得る生物におけるカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼの発現は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の微生物合成をもたらすと予測した。プラスミドｐＩＢ  １３４５を得た。これは、上記宿主ベクターｐＵＣ１９によって供給されたｌａｃプロモーターから発現されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ｃａｔＡ遺伝子を含む。３つのプラスミドシステムを、Ｄ−グルコースからｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを微生物合成するために設計した。プラスミドｐＫＤ１３６（ｐＭＢ１由来，アンピシリン耐性）およびｐＫＤ８．２４３Ａ（ｐ１５Ａ由来，クロラムフェニコール耐性は、使用される増殖条件下で安定に維持されることが見いだされた。第３のプラスミドであるｐＣＬ１９２０を、カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼの発現のために選択した。プラスミドｐＣＬ１９２０は、上記ｐＳＣ１０１複製起点、およびスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を含む低コピーベクターである。Ｓａｌ  ＩおよびＫｐｎ  ＩでのｐＩＢ１３４５の消化は、１．５ｋｂフラグメントを生じた。このフラグメントを、その後、ｐＣＬ１９２０に配置して、ｐＫＤ８．２９２を生成した（図３）。ここでカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼは、上記ベクターがコードしたｌａｃプロモーターから発現された。ｐＫＤ８．２４３ＡおよびｐＫＤ８．２９２でのＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６の形質転換は、アンピシリン、クロラムフェニコール、およびスペクチノマイシンに対して耐性であるコロニーを生じた。
【００８２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２が、ＤＨＳをｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートへ変換するのに必要なオルト切断経路からの遺伝子の各々を発現していることを確認するために、酵素活性を決定した。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２の培養物を、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）、アンピシリン（０．０５ｇ）、クロラムフェニコール（０．０２ｇ）およびスペクチノマイシン（０．０５ｇ）を含むＬＢ（１Ｌ）中、１０時間にわたって３７℃、２５０ｒｐｍにおいて増殖させた。細胞を採取し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に再懸濁した。フレンチプレス細胞破砕機（１６，０００ｐｓｉ）を２回通した後、その溶解物を、遠心分離（４００００ｇ，３０分，４℃）によって清澄にした。ＤＨＳデヒドラターゼ活性を測定するために、各アッセイは、（最終容積１ｍＬ）  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  ｍＭ  ＤＨＳ、および細胞溶解物を含んだ。ＤＨＳの添加後、プロトカテクエートの形成（ε＝３８９０  Ｍ１  ｃｍ１）を、２９０ｎｍで数分間にわたってモニターした。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８−２９２の３個のサンプルについて測定したＤＨＳデヒドラターゼ活性は、０．０７８ユニットｍｇ±０．００９であると決定された。ここで１ユニットは、１μｍｏｌのＤＨＳをプロトカテク酸に１分間で変換するのに必要な酵素量である。
【００８３】
カテコール  １，２−ジオキシゲナーゼの比活性を、上記で生成した同じ細胞溶解物を使用して決定した。各アッセイは、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ  カテコール、および細胞溶解物を含んだ。ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの形成を、２６０ｎｍの吸光度での増加を追跡することによってモニターした。上記アッセイの条件下でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートとカテコールとの間のモル吸光係数の差異が、１６，０００  Ｍ１  ｃｍ１であると仮定すると、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ＰＫＤ８−２９２におけるカテコール  １，２−ジオキシゲナーゼ活性は、０．２５ユニットｍｇ±０．０３であると決定された。ここで１ユニットは、１分あたりの１μｍｏｌのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの形成に対応する。
【００８４】
プロトカテク酸デカルボキシラーゼの活性を決定するために、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２を、実施例６において先に記載されるように増殖させた。細胞を採取し、７５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．１）中に再懸濁した。フレンチプレス細胞破砕機（１６０００ｐｓｉ）を通過させて破壊した後、その溶解物を、遠心分離（４００００ｇ，３０分，４℃）によって清澄にした。プロトカテク酸デカルボキシラーゼ活性を、プロトカテク酸の消費を追跡することによって決定した。各アッセイ（最終容積１ｍＬ）は、７５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．３ｍＭ  プロトカテク酸、および細胞溶解物を含んだ。２９０ｎｍでの吸光度の喪失を、経時的にモニターした。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２におけるプロトカテク酸デカルボキシラーゼ活性は、０．０２８ユニットｍｇ±０．００９であると決定された。ここで１ユニットは、１分あたりの１μｍｏｌのプロトカテク酸の酸化に対応する。
【００８５】
（実施例７：Ｄ−グルコースの、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートへの変換）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２を利用する、Ｄ−グルコースからのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの微生物合成を、以下のように進めた。ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）、アンピシリン（０．０５ｇ）、クロラムフェニコール（０．０２ｇ）およびスペクチノマイシン（０．０５ｇ）を含む１ＬのＬＢ培地（４Ｌ  三角震盪フラスコ中）に、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２の一晩培養物１０ｍＬを接種した。細胞を、２５０ｒｐｍにおいて１０時間にわたって３７℃で増殖させた。上記細胞を採取し、５６ｍＭ  Ｄ−グルコース、シキミ酸（０．０４ｇ）、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）、アンピシリン（０．０５ｇ）、クロラムフェニコール（０．０２ｇ）およびスペクチノマイシン（０．０５ｇ）を含む１ＬのＭ９最小培地中に再懸濁した。上記培養物を、３７℃インキュベーションへと戻した。最小培地中での再懸濁後、上記培養物のｐＨを、特に、最初の１２時間にわたって厳密にモニターした。上記培養物がｐＨ６．５に達したとき、５Ｎ  ＮａＯＨを添加して、上記ｐＨが約６．８に戻るように調節した。４８時間の蓄積期間にわたって、上記培養物を、ｐＨ６．３より下にさせないようにした。最小培地中で２４時間後に、実施例２に記載される方法を使用して、２３ｍＭ  Ｄ−グルコースとともにその培養上清中において、１２ｍＭ  ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートおよび１ｍＭ  プロトカテクエートを検出した。最小培地中で４８時間後に、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８．２４３Ａ／ｐＫＤ８．２９２は、５６ｍＭ  Ｄ−グルコースを１７ｍＭ  ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートに置き換えた。
【００８６】
（実施例７Ａ：２０Ｌスケールでのグルコースの、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートへの変換）
図７Ａは、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の生成についてＷＮ１／ｐＷＮ２．２４８の２０Ｌバッチ培養の結果を示す。その培養物を、６時間ごとに、ＩＰＴＧ（１００ｍＭ，１０ｍＬ）を使用してＯＤ６００＝３３において誘導した。約８８時間後に、上記ムコン酸タイター（ｔｉｔｅｒ）は、５９ｇ／Ｌ（３０％収率）であった。合成されたムコン酸の総量は、１４７５ｇであった。これは、約８８時間において、約１．３８Ｍ  グルコースを０．４２Ｍ  ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸に変換したことに対応する。表１は、培養を通じての種々の時間での上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸生成速度を示す（上記表は、時間の関数としての誘導後生産性を示すことに注意のこと。遠くの（ｏｕｔｌｙｉｎｇ）データ点が排除される（接種後４８時間および接種後５８時間）場合、平均速度は、１．１ｇ／Ｌ／時間である）。ＩＰＴＧ（例えば、酢酸エチル中）の再結晶化が上記ムコン酸タイターを増大させ得ることもまた見いだされた。例えば、いくつかの実験から、２０Ｌ  スケールで約５５〜６０ｇ／Ｌ  ムコン酸のタイターが示された。これは、ＩＰＴＧの再結晶化なしに観察された約５０ｇ／Ｌ生成に対して約１７％増加である（例えば、収率２４％に対して収率約３０％）。
【００８７】
表１．発酵におけるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネート生成速度
【００８８】
【表１】
2013516196.tif 000002
グルコースもしくは他の発酵可能な炭素源からのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの生成に従って、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成するための方法は、（ｉ）生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを提供する工程；（ｉｉ）ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの実質的にすべてがｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートに異性化される反応条件下で、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートに異性化する工程；および（ｉｉｉ）上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを分離し、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを結晶化する工程を包含する。
【００８９】
上記異性化反応は、酸（例えば、無機酸）によって触媒され得る。上記異性化反応は、ｐＨ７未満のｐＨにおいて、好ましくは、約４以下のｐＨにおいて溶液中で行われ得る。いくつかの例において、上記異性化のｐＨは、上記値より上であり得、そこでは、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネート、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネート、およびｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの１つ以上が溶液から沈殿する。
【００９０】
上記異性化反応は、室温より高いかもしくは発酵槽温度より高い温度で行われ得る。例えば、上記異性化反応は、約３０℃以上、および好ましくは、６０℃以上の温度で行われ得る。
【００９１】
上記分離する工程は、溶液を酸性化することによって、上記溶液から上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを沈殿させる工程を包含し得る。好ましくは、上記溶液は、約３未満のｐＨに酸性化され得る。上記分離する工程は、上記溶液を冷却する工程を包含し得る。上記溶液は、約３０℃未満、好ましくは０℃未満の温度へと冷却され得る。
【００９２】
再結晶化は、有機溶媒を使用し得る。上記有機溶媒は、極性非プロトン性溶媒（例えば、酢酸、ブタノール、イソプロパノール、プロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、水）、極性プロトン性溶媒（例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド）、および非極性溶媒（例えば、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル）のうちの１種以上を含み得る。
【００９３】
特定の実施形態において、上記方法は、上記分離されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートから塩を除去する工程を包含する。上記塩は、無機塩を含み得る。
【００９４】
特定の実施形態において、上記方法は、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのうちの少なくとも約５０％を、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートに、および好ましくは、９５％より多くを異性化する工程を包含する。
【００９５】
図１１は、６時間ごとに、ＩＰＴＧ（１００ｍＭ，１０ｍＬ）を使用してＯＤ６００＝３３において誘導したｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の生成についての、ＷＮ１／ｐＷＮ２．２４８の２０Ｌバッチ培養の結果を示す。約８８時間後に、上記ムコン酸タイターは、５９ｇ／Ｌ（３０％収率）であった。合成されたムコン酸の総量は、１４７５ｇであった。これは、約８８時間で約１．３８Ｍ  グルコースを０．４２Ｍ  ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸に変換するのに対応する。
【００９６】
（実施例８：ファーメンター中でのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへのインサイチュ異性化）
生体触媒による変換を介して再生可能炭素源から生成されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネート（例えば、実施例７および実施例７Ａの方法に従って）を提供した。上記ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを含むその発酵培養物を、６０℃に加温した。上記加温した発酵培養物を、０．５時間にわたって２Ｎ  硫酸を添加することによって、ｐＨ４に調節した。上記酸性化した培養物を、３．５時間にわたって反応させた。
【００９７】
上記反応を、１Ｈ  ＮＭＲおよびＰｒｅｖａｉｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を備えたＨＰＬＣによってモニターして、上記反応のエンドポイントを決定した。これらデータを、図７〜１０において、中性ｐＨにおけるコントロール実験とともに示す。一般に、このような異性化反応は、適切な反応パラメーター（例えば、時間、温度、ｐＨなど）を決定するためにモニターし得る。
【００９８】
図５は、粗製の発酵ブロス中で、ｐＨ７におけるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートからｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートへの異性化反応の１Ｈ  ＮＭＲによる追跡を示す。０〜１．２５時間および３．２５時間までの時間追跡を、中性ｐＨ（例えば、これは、実際の発酵の間における近似のｐＨレベルである）においてｃｉｓ，ｃｉｓ  ムコン酸からｃｉｓ，ｔｒａｎｓ  ムコン酸への異性化が本質的にないことを実証する。従って、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートの異性化は、実際の発酵の間には全くもしくは無視できる程度にしか起こっていない。
【００９９】
図６は、粗製発酵ブロスにおけるｐＨ４でのムコネート異性化反応についての１Ｈ  ＮＭＲによる追跡を示す。０〜１．２５時間および３．２５時間までの時間追跡は、ｃｉｓ，ｃｉｓ  ムコン酸からｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸への異性化が、酸性ｐＨにおいて急速に進み、上記異性化は、約１．２５時間後に本質的に完了することを実証する。
【０１００】
図７は、ｐＨ７におけるムコネート異性化反応についてのＨＰＬＣによる追跡を示す。図９は、ｐＨ７におけるムコネート異性化反応の時間経過を示す。１Ｈ  ＮＭＲによる追跡と同様に、これらＨＰＬＣによる追跡および時間経過は、中性ｐＨにおけるｃｉｓ，ｃｉｓ  ムコン酸からｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸への異性化が本質的にないことを実証する。
【０１０１】
図８は、ｐＨ４におけるムコネート異性化反応についてのＨＰＬＣによる追跡を示す。図１０は、ｐＨ４におけるムコネート異性化反応の時間経過を示す。１Ｈ  ＮＭＲによる追跡と同様に、これらＨＰＬＣによる追跡および時間経過は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸からｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸への異性化は、酸性ｐＨにおいて急速に進み、上記異性化は、約１．２５時間後に本質的に完了することを実証する。
【０１０２】
（実施例９：酸性化、沈殿、および濾過による発酵ブロスからのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の分離）
異性化後に（例えば、実施例８におけるように）、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含むブロスをほぼ周囲温度へと冷却し、上記細胞、細胞砕片および沈殿した固体を、遠心分離によって培養ブロスから除去した。あるいは、このような固体を、濾過によって除去し得る（例えば、１００ｋＤ  ＳＡＲＴＯＣＯＮ（登録商標）  Ｓｌｉｃｅカセットを介して）。次いで、上記無細胞ブロスを濾過によって清澄にして、タンパク質を除去した（例えば、１０ｋＤ  ＳＡＲＴＯＣＯＮ（登録商標）  Ｓｌｉｃｅカセットを介して）。
【０１０３】
濾過後に、上記清澄にしたブロスのｐＨを、濃硫酸を添加することによってｐＨ１．５に調節した。種々のｐＨ値において沈殿するｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの量を、表２に示す。
【０１０４】
表２．異なるｐＨ値におけるｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの沈殿
【０１０５】
【表２】
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上記酸性化したブロスを、撹拌せずに１．５時間にわたって４℃へと冷却したところ、その時間の間に、粗製ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸は、わずかに黄色の固体として沈殿した。この物質を濾過によって回収したところ、上記清澄化したブロスに存在する上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸のうちの約６０％を構成した。上記沈殿は、より長い期間（例えば、一晩）にわたって、そして／またはより低温（例えば、−２０℃）において継続し、塩の夾雑を減少させながら生成物の回収を増大させられ得る。
【０１０６】
上記濾液は、さらなるｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含んだ。上記さらなるｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を回収するために、上記濾液を減圧下でエバポレートして、その容積を約５０％減らした。上記濃縮した濾液を、−２０℃へと一晩冷却したところ、その時間の間に、粗製ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の第２の収穫物が沈殿した。上記沈殿物を、濾過により再び回収した。
【０１０７】
上記粗製ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸固体を合わせ、アセトニトリルを使用して結晶化して、精製されたｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを白色固体として生成させた。メタノールを使用する結晶化は、同様の収率を提供した。メタノールはまた、上記精製された生成物における塩の夾雑を減らした。
【０１０８】
図４Ａは、結晶化したｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。図４Ｂは、グルコースを欠く最小塩類培地中に再懸濁した結晶化したｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。上記図４Ｂのスペクトルは、上記発酵ブロス中の他の成分によって引き起こされるｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸のＮＭＲスペクトルシフトに近似し、従って、上記発酵ブロス中での上記ｃｉｓ，ｃｉｓからｃｉｓ，ｔｒａｎｓへの異性化反応を比較するためモニターすることを可能にする。
【０１０９】
（実施例１０：有機溶媒を使用する発酵ブロスからのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の抽出）
有利なことには、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸は、驚くべきことにかつ予測外に、上記ｃｉｓ，ｃｉｓ異性体もしくはｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ異性体のいずれよりも、有機溶媒中で可溶性である。従って、分離する工程（例えば、実施例８の分離する工程）は、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを溶液（例えば、発酵ブロス）から、有機溶媒を使用して抽出する工程を包含し得る。
【０１１０】
上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートが抽出される上記溶液は、培養発酵ブロス全体もしくは、無細胞でタンパク質を含まない発酵ブロスであり得る。例えば、濾過（例えば、上記ブロスを、０．１μＭ  中空ファイバー濾過ユニットに通過させる）によって、細胞をブロスから除去し得る。例えば、濾過によって（例えば、例えば、ＳＡＲＴＯＣＯＮ（登録商標）から入手可能な１０ｋＤ  接線流濾過システムを介して）、タンパク質は、ブロスから除去され得る。
【０１１１】
抽出用の上記有機溶媒（例えば、水相と非混和性の溶媒）としては、例えば、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、酢酸エチル、酢酸イソプロピル（酢酸プロピル）、ヘプタン（混合物）、メチル  ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、キシレン、塩化メチレン、シクロヘキサノール、デカリン、テトラリン、テトラロン、シクロヘキサン、酢酸ブチル、メチルテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロヘキサノン／シクロヘキサノール（市販の混合物）、１−オクタノール、イソアミルアルコール、および２−エチルヘキサノールのうちの１種以上が挙げられ得る。
【０１１２】
水相に添加され得、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの抽出および同時もしくはその後のエステル化をともに促進する他の有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトニトリル、およびアセトン、ならびにブタノール（例えば、１−ブタノールおよびイソブタノール）および水と完全には混和性でない他のアルコールのうちの１種以上が挙げられる。
【０１１３】
上記溶媒抽出は、約４未満のｐＨにおいて（例えば、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸が十分にプロトン化され、上記抽出に使用される上記有機溶媒へと分配されるｐＨにおいて）行われ得る。沈殿を誘導するに十分低いｐＨレベルですら、上記プロトン化したｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の画分は、溶液中に残り得る。例えば、および上記実施例９の表２に示されるように、ｐＨ３において、本来は上記溶液中にある上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸のうちの約６０％は、沈殿し、濾過によって分離され得る。しかし、溶液に残っている上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸のうちの約４０％は、濾過によって分離できないが、抽出によって回収できる。よって、溶媒抽出は、有機溶媒を使用して溶液から上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を抽出する工程を包含しない方法と比較して、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの単離収率を増大させ得る。ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートのいくらかの部分が沈殿し、上記水溶液中にないとしても、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートの抽出を進め得ることはまた、実施例９の表２中のデータから明らかである。
【０１１４】
上記溶媒抽出はまた、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを無機塩（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸カルシウム）から分離する工程を包含し得る。さらに、溶媒抽出は、やはり無機塩の沈殿を引き起こし、従って無機塩との夾雑を引き起こし得る沈殿より純粋なｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコネートを生成し得る。
【０１１５】
溶媒および／もしくはｐＨパラメーターの選択は、一連の単純な測定によって促進され得る。各可能性のある溶媒について、３種すべてのムコン酸異性体（ｃｉｓ，ｃｉｓ−異性体、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−異性体、およびｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−異性体）に対して抽出が行われ得る（例えば、分配係数を測定するために）。各異性体はまた、約ｐＨ１〜ｐＨ７未満の間の増分（例えば、０．５）を使用したｐＨ値の範囲に対して試験され得る。
【０１１６】
（実施例１１：溶媒抽出による発酵ブロスからのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の分離）
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸に異性化した発酵ブロスを得、これを、ｐＨ約３へと酸性化した。上記固体ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を濾過によって取り出して、約５〜１０ｇ／Ｌのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含む酸性化した発酵ブロスにした。
【０１１７】
１５ｍＬの上記濾過したブロスを各々含む個々の５０ｍＬコニカル遠心チューブに、以下の表に列挙される各溶媒１５ｍＬを添加した。各チューブを、２分間にわたって撹拌し、その有機相および水相を、分離させた。上記水相をピペットによって上記溶媒層から分離し、新しい５０ｍＬコニカルチューブに入れた。各抽出の上記水相および溶媒相の両方を、ＨＰＬＣを使用してムコン酸について分析した。第２の抽出を、新鮮な溶媒を使用して、上記分離した水層の各々に対して行った。再び、上記サンプルを撹拌し、沈殿させ、上記水相および有機相を分離し、分析した。
【０１１８】
結果を、以下の表３、表４および表５に示す。ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の異なる量を有する異なるブロスサンプルを使用して、各表における結果を得た。
【０１１９】
表３．  ９．８２ｇ／Ｌ  ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含むブロス
【０１２０】
【表３】
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表４．１０．６９ｇ／Ｌ  ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含むブロス
【０１２１】
【表４】
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表５．４．８６ｇ／Ｌ  ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含むブロス
【０１２２】
【表５】
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上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の十分量が沈殿した十分に低いレベルへと酸性化した後に、溶媒抽出がｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を回収する能力を試験するために、Ｍ９塩の溶液中のｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の溶液を使用して、発酵ブロスを模倣した。１５ｇのｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を、約６０ｇ／Ｌのタイターを与える２５０ｍＬのＭ９塩に添加した。これは、水酸化ナトリウムを使用して、上記ｐＨを７．０へと上昇させることによって達成した。次いで、上記ブロスを、硫酸でｐＨ３へと酸性化したところ、上記ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の沈殿が生じた。上記固体沈殿物を上記酸性混合物中に残し、スラリー全体を、上記に記載されるように、溶媒で２回抽出した。結果を、表６に示す。
【０１２３】
表６．沈殿したムコン酸を含め、６３．３４ｇ／Ｌ  ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含むブロス
【０１２４】
【表６】
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（実施例１２：ヨウ素によって触媒される、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸への異性化）
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸（１．００ｇ）、触媒量のＩ２（５３ｍｇ）、およびＭｅＣＮ（３５ｍｌ）を含む混合物を加熱して、１１時間にわたって還流した。室温へと冷却した後、その沈殿した固体を濾過し、冷ＭｅＣＮで洗浄した。真空下で乾燥させた後、０．８０ｇ（８０％収率）の精製ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸は、黄褐色粉末として存在した。この手順によって得られた物質は、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光法によって、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸であると確認された。上記異性化反応は、多くの他の試験した溶媒中よりも、非極性溶媒（例えば、ＴＨＦ）中でより進行した。
【０１２５】
（実施例１３：水素化触媒によって触媒される、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸の、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸への異性化）
ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸（１．００ｇ）および触媒量のパラジウム担持炭素（Ｐｄ／Ｃ，５％）を含む混合物を、５０ｍＬのメタノール中に調製する。上記メタノール反応混合物を、１時間にわたって還流させ、室温へと冷却し、次いで、上記担持されたパラジウム触媒を、濾過によって除去する。残った反応溶液を、元の容積の約１／２へとエバポレートし、次いで、１容積のＭｅＣＮで希釈する。減圧下でのエバポレーションを、上記メタノールが除去されかつ上記ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸が溶液から落ち始める（ｂｅｇｉｎｓ  ｔｏ  ｆａｌｌ  ｏｕｔ）まで継続する。得られた固体を濾過し、冷ＭｅＣＮで洗浄する。真空下で乾燥させた後、約０．８０ｇ（８０％収率）の精製ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸が、黄褐色粉末として存在し得る。この手順によって得られる物質は、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光法によって、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸であると確認され得る。
【０１２６】
（実施例１４：水素化触媒によって触媒される、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸への異性化）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（１．００ｇ）および触媒量のパラジウム担持炭素（Ｐｄ／Ｃ，５％）を含む混合物を、５０ｍＬのメタノール中に調製する。上記メタノール反応混合物を、１時間にわたって還流させ、室温へと冷却し、次いで、上記担持されたパラジウム触媒を、濾過によって除去する。残った反応溶液を、元の容積の約１／２になるまでエバポレートし、次いで、１容積のＭｅＣＮで希釈する。減圧下でのエバポレーションを、上記メタノールが除去されかつ上記ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸が溶液から落ち始めるまで継続する。得られた固体を濾過し、冷ＭｅＣＮで洗浄する。真空下で乾燥させた後、約０．８０ｇ（８０％収率）の精製ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸が、黄褐色粉末として存在し得る。この手順によって得られる物質は、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光法によって、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸であると確認され得る。
【０１２７】
本発明は、具体的に示され、そして特定の実施形態を参照して記載されてきたが、形態および詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって定義される発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者によって理解されるべきである。
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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