(57)【要約】  本発明は、インテグリンの細胞外ドメインと結合することのできる抗体に関する。本発明の別の目的は、アーカイブ保管したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織におけるインテグリンを検出するための前記抗体の使用に関する。本発明は、また、免疫原が昆虫の発現培養物由来の組換え細胞外インテグリンドメインであるモノクローナルウサギ抗体を調製するための方法と、最も近縁のインテグリンホモログ間を識別し、特にＦＦＰＥ材料における免疫組織化学検査に適した抗インテグリン抗体をスクリーニングするための別の方法とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＬ鎖可変領域（ＶＬ）およびＨ鎖可変領域（ＶＨ）を含み、昆虫由来の糖鎖付加パターンを有するインテグリンおよび別の真核生物糖鎖付加パターンを有するインテグリンに対する、モノクローナルウサギ抗体またはその断片であって、該抗体が細胞外インテグリンドメインまたは細胞外インテグリン鎖ドメインの非閉塞エピトープに対する抗原結合特異性を有し、該抗体がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料および生細胞におけるインテグリンのインタクトなヘテロ二量体と実質的に同じ特異性で結合できる、モノクローナルウサギ抗体またはその断片。
【請求項２】
前記抗体がインテグリンαｖβ３の細胞外ドメインと結合し、好ましくはＶＬが配列番号９５（ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号９６（ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がインテグリンαｖβ５の細胞外ドメインと結合し、好ましくはＶＬが配列番号１５（ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号１６（ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がインテグリンαｖβ６の細胞外ドメインと結合し、好ましくはＶＬが配列番号１３５（ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号１３６（ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がインテグリンαｖβ８の細胞外ドメインと結合し、好ましくはＶＬが配列番号１７５（ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号１７６（ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がインテグリン鎖αｖの細胞外ドメインと結合し、好ましくはＶＬが配列番号２１５（ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号２１６（ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の、抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
必要に応じてデルタ膜貫通型として結合した、昆虫由来の糖鎖付加パターンを有する細胞外インテグリンドメインからなる組換え免疫原。
【請求項９】
配列番号１０、９０、１３０、１７０もしくは２１０のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列もしくは同じ機能を有する少なくとも９５％相同な配列の変種、変異体、部分を有する、請求項９に記載の免疫原。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫原をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項８もしくは９に記載の免疫原および／または請求項１０に記載のポリヌクレオチドでウサギを免疫化し、ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗血清を採取し、モノクローナル抗体を調製することによって得られるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
（ａ）昆虫細胞において細胞外インテグリンドメインを組換えにより発現させるステップと、
（ｂ）発現した細胞外インテグリンドメインを精製するステップと、
（ｃ）精製した細胞外インテグリンドメインによりウサギを免疫化するステップと、
（ｄ）ウサギからポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗血清を採取するステップと、
（ｅ）モノクローナル抗体を調製するステップと、
を含む、モノクローナルウサギ抗体を調製する方法。
【請求項１３】
（ａ）（ｉ）配列番号１１５(ＶＬ−αｖβ３)および配列番号１１６(ＶＨ−αｖβ３)、
（ｉｉ）配列番号３５(ＶＬ−αｖβ５)および配列番号３６(ＶＨ−αｖβ５)、
（ｉｉｉ）配列番号１５５(ＶＬ−αｖβ６)および配列番号１５６(ＶＨ−αｖβ６)、
（ｉｖ）配列番号１９５(ＶＬ−αｖβ８)および配列番号１９６(ＶＨ−αｖβ８)または
（ｖ）配列番号２３５(ＶＬ−αｖ)および配列番号２３６(ＶＨ−αｖ)
の抗体コード核酸配列を含む、少なくとも１種類のベクターを宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）培地中で該宿主細胞を培養し、コードされた抗体を発現させるステップと、
（ｃ）発現した抗体を精製するステップと、
を有する、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）およびＨ鎖可変領域（ＶＨ）を含む組換えモノクローナル抗体を製造するための方法。
【請求項１４】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料においてインテグリンを検出するための、請求項１〜６および１１のいずれかに記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項１５】
（ａ）選択されたインテグリンと結合することのできる抗体の試料を提供するステップと、
（ｂ）インテグリン配列を整列させて、選択されたインテグリンのαサブユニットおよび／またはβサブユニットの最も近縁のホモログを同定するステップと、
（ｃ）抗体試料を用いて、選択されたインテグリンの天然型およびその最も近縁のホモログ（単数または複数）についてディファレンシャルＥＬＩＳＡを実施し、選択されたインテグリンに対する抗体を蓄積させるステップ（一次スクリーニング）と、
（ｄ）ステップ（ｃ）の蓄積された抗体を用いて、選択されたインテグリンの天然型および別のインテグリンについて別のディファレンシャルＥＬＩＳＡを実施し、選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ（二次スクリーニング）と、
（ｅ）少なくとも１種類の細胞系は選択されたインテグリンを発現でき、必要に応じて別の細胞系は該選択されたインテグリンを発現できない、ＦＦＰＥ細胞系の免疫組織化学検査をステップ（ｄ）の蓄積された抗体を用いて実施し、これにより選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ（三次スクリーニング）と、
（ｆ）細胞系が哺乳動物において異種移植腫瘍として増殖される、ステップ（ｅ）のＦＦＰＥ細胞系の免疫組織化学検査をステップ（ｅ）の蓄積された抗体を用いて実施し、選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ（四次スクリーニング）と、
（ｇ）ステップ（ｆ）の蓄積された抗体を用いて、アーカイブ保管したＦＦＰＥ腫瘍の免疫組織化学検査を実施し、選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ（五次スクリーニング）と、
を含む、インテグリンαサブユニットおよび／またはβサブユニットそれぞれの最も近縁のホモログ間を識別することができ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料における免疫組織化学検査に適した抗インテグリン抗体をスクリーニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンの細胞外ドメインと結合することのできる抗体に関する。本発明の別の目的は、アーカイブ保管した(archival)ホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)組織におけるインテグリンを検出するための前記抗体の使用に関する。本発明は、また、免疫原が昆虫の発現培養物由来の組換え細胞外インテグリンドメインであるモノクローナルウサギ抗体を調製するための方法と、最も近縁のインテグリンホモログ間を識別し、特にＦＦＰＥ材料における免疫組織化学検査に適した抗インテグリン抗体をスクリーニングするための別の方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、２本の非共有結合鎖で構成された細胞接着分子ファミリーである。インテグリンの複雑な多ドメイン構造は、その僅かな変化に対して感受性である。インテグリンは、翻訳および転写、翻訳後糖鎖付加、細胞表面への送達、細胞内刺激による細胞表面活性化ならびに細胞外刺激による細胞表面活性化等、多くのレベルで制御される。アルファおよびベータ鎖は両者共に膜を横断し、細胞外マトリックスと細胞内区画を統合し、これにより最終的に接着、増殖、生存、遊走および浸潤の制御をもたらすシグナルのための経路を提供するクラスＩ膜貫通タンパク質である。
【０００３】
インテグリンは、多くのヒトの疾病における治療標的である。例えば、癌において、アルファ−ｖシリーズのインテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８）は、血管新生、化学および放射線療法から腫瘍細胞の保護、腫瘍生存ならびに局所免疫抑制と様々に関連付けられる。α５β１およびα４β１もまた血管新生と関連付けられ、一方α２β１およびα６β４は、腫瘍増殖と関連付けられてきた。αｖβ３過剰発現はヒトメラノーマの浸潤期と相関し、αｖβ３とαｖβ５は両者共に腫瘍浸潤内皮において特異的に上方制御され、そこでこれらが内皮表面における血管新生増殖因子の機能を制御すると考えられる。インテグリンの正確な発現パターンは、所定の腫瘍クラス間とクラス内の両方で高度に変動し、機能生物学を反映する。したがって、これらは腫瘍状態のバイオマーカーでもあり、その発現パターンは治療成績の予後であり、治療機会を定めることができる。
【０００４】
αｖインテグリン鎖に対して作製されたモノクローナル抗体ＤＩ−１７Ｅ６ならびにインテグリンαｖβ３およびαｖβ５を抑制する環化ＲＧＤ含有ペンタペプチドであるシレンジタイド(cilengitide)が臨床開発されている。しかし、一部には病理学的状態におけるインテグリン発現パターンの全体像が著しく不完全であるため、インテグリンを標的とする治療法の十分な治療における潜在能力は、依然として達成すべき課題である。インテグリン分布の病理学的特性評価は、新鮮凍結組織における実験に依存する。生細胞と凍結染色との連関は十分に確立されており、凍結組織はインテグリン染色の優れた基質であるが、その保存レベルおよび超微細構造の忠実性は、ＦＦＰＥ材料におけるルーチン手順によるものよりはるかに低い。これは、複雑な組織における染色の解釈に決定的な影響を及ぼす。さらに、ルーチンの診療ならびに一般および商業利用されている組織バンクは、ＦＦＰＥ材料を提供する。凍結臨床材料の獲得は、ロジスティックかつ多くの場合、臨床上−培養上の課題である、あるいは特定の腫瘍や稀少かつ貴重な臨床試料を取り扱う場合、これは単純に不可能となる。
【０００５】
先行技術においてＦＦＰＥ材料における明解なインテグリン検出が阻害されるのは、古典的組織学とインテグリン構造との相反する要求のためである。組織学は、必要に応じて熱処理を加えた、ホルムアルデヒド溶液、段階的アルコールおよびパラフィンワックス等、疎水性不溶化試薬による軟部親水性組織の広範なクロスリンク、浸透および安定化に関与する、組織構造の優れた強固な形態学的保存を必要とする。特に臨床組織学的実験において行われる場合、固定および包埋は、エピトープを隠す、あるいは破壊までも行う可能性があることが知られている。非天然条件は、むしろ抽出も分解もされていないが、主として閉塞されたインテグリンを生じる。立体構造的に活性を有する真正(obligate)インテグリンヘテロ二量体はこのような立体構造変化に対して感受性であり、これはＦＦＰＥ手順において生じるため閉塞から直ちに回復することはできない。
【０００６】
組織固定および包埋に関与する化学作用は、インテグリン構造に重大な影響を及ぼすため、当業者によって用いられる典型的で入手可能なモノクローナル抗体は、ＦＦＰＥ処理後にインテグリンを確実に認識しない。インテグリン細胞質ドメインを認識する抗体は、必然的に単一インテグリン鎖に限定され、これはインタクトなインテグリンヘテロ二量体の分布を報告しないため、ＦＦＰＥ材料において曖昧な染色パターンをもたらす。さらに、短いペプチドエピトープに対して作製されたこのような抗体は立体構造非依存的となる傾向があり、これは単一鎖または分解産物を検出し、インタクトなインテグリン複合体を検出し得る抗体よりも低い特異性および親和性をもたらす。
【０００７】
マウスモノクローナル抗インテグリンａｖβ３抗体ＬＭ６０９等、数種類のマウスモノクローナル抗体は、ＦＡＣＳまたは凍結組織によりαｖβ３およびαｖβ５インテグリンを検出するが、ＦＦＰＥ材料においてそのエピトープの有意なまたは再現性のある標識を示さない。その限定的なエピトープ認識におけるマウスモノクローナルの欠陥および低い親和性は広く認識されている。このような抗体がＦＦＰＥ材料に用いられる際に観察される分布パターンは、新鮮凍結の凍結切片材料において観察されるパターンとは異なるが、この後者の発現プロファイルは、このような組織から単離された生細胞のプロファイルと密接に一致する。このような抗体によるＦＦＰＥ染色は、疑わしい起源のものとして観察されなければならず、抗原復旧技術を開発してＦＦＰＥ材料からこのような決定基を回復しなければならない。
【０００８】
現在、ＦＦＰＥ患者腫瘍組織におけるインテグリンの特性評価を可能にするような、ＦＦＰＥ組織におけるαｖβ３またはαｖβ５細胞外エピトープを強く認識する利用可能なモノクローナル抗体はない。この状況の最終結果は、数十年間の病理学的標本が、インテグリンを標的とする治療法の恩恵が受けられる可能性のあった患者集団を明らかにし得るインテグリン発現プロファイルに関して解析できないことである。出現する治療の見通しにおいて、このような欠陥は、不幸なことに、効果的な治療がそれを必要とする者に届かないことを意味し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の基礎をなす技術的な課題は、ＦＦＰＥ材料、特にルーチンのＦＦＰＥ腫瘍生検における、インテグリン複合体の信頼のおける明解な検出を可能にする抗体を提供することである。別の課題は、ＦＦＰＥ材料の免疫組織化学検査においてインテグリンホモログ間で効果的な識別挙動を示す抗インテグリン抗体をスクリーニングするための方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】αｖβ３外部ドメインに対して作製されたサブクローンＥ３５２８−２−１２の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系(左)および異種移植片(右)の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２】精製抗αｖβ３インテグリン抗体クローンＥ３５２８−２−７による、異種移植片におけるＭ２１細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図３】精製抗αｖβ３インテグリン抗体Ｅ３５２８−２−７、Ｅ３５２８−２−１１およびＥ３５２８−２−１２による、癌細胞系Ｍ２１(左)およびＭ２１異種移植片(右)の免疫組織化学染色を示す図である。
【図４】画像解析(Ariol SL−50)およびＳｐｏｔｆｉｒｅによるグラフ表示を活用した、抗αｖβ３抗体Ｅ３５２８−２−７、Ｅ３５２８−２−１１およびＥ３５２８−２−１２による免疫組織化学染色の解析を示す図である。
【図５】画像解析(Ariol SL−50)を活用した、抗体αｖβ３＿Ｅ３５２８−２−７およびマウスモノクローナル抗体２０Ｈ９による免疫組織化学染色の解析を示す図である。クローン２０Ｈ９は、β３インテグリン鎖に対して作製された。「発現(％ｍａｘ)」は、Ｍ２１の発現に対して正規化される。
【図６】精製抗αｖβ３インテグリン抗体Ｅ３５３１−２２７−３およびＥ３５３１−２２９−３による、異種移植片におけるＭ２１細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図７】マルチクローン２２７(Ｅ３５３１−２２７−３、Ｅ３５３１−２２７−３およびＥ３５３１−２２７−６)の精製抗αｖβ３インテグリン抗体による、癌細胞系Ｍ２１(左)およびＭ２１異種移植片(右)の免疫組織化学染色を示す図である。
【図８−１】Ｍ２１細胞における発現の％として算出した、クローンＥ３５３１−２２７の抗αｖβ３抗体による免疫組織化学染色の解析の比較を示す図である。発現は、画像解析(Ariol SL−50)を活用して解析した。
【図８−２】Ｍ２１細胞における発現の％として算出した、マウスモノクローナル抗β３抗体２０Ｈ９とによる免疫組織化学染色の解析の比較を示す図である。発現は、画像解析(Ariol SL−50)を活用して解析した。
【図９】αｖβ５外部ドメインに対して作製されたサブクローンＥ３５３６−９９−３の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系(左)および異種移植片(右)の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１０】インテグリンαｖβ３およびαｖβ５の組換えヒト細胞外ドメインならびに全長精製血小板ｇｐｉｉｂｉｉｉａに対する、精製モノクローナルハイブリドーマ抗体Ｅ３５３１−２２７−３、Ｅ３５３１−２２９−３およびＥ３５３６−９９−２のＥＬＩＳＡプロファイルを示す図である。
【図１１】精製抗αｖβ５インテグリン抗体クローンＥ３５３６−９９−３による、異種移植片におけるＡ４３１およびＨＣＴ１１６細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図１２】精製抗αｖβ５インテグリン抗体Ｅ３５３６−９９−１、Ｅ３５３６−９９−２およびＥ３５３６−９９−３による、癌細胞系Ｕ８７ＭＧ(左)ならびにＵ８７ＭＧおよびＡ４３１異種移植片の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１３】画像解析(Ariol SL−50)およびＳｐｏｔｆｉｒｅによるグラフ表示を活用した、抗αｖβ５抗体Ｅ３５３６−９９−１、Ｅ３５３６−９９−２およびＥ３５３６−９９−３による免疫組織化学染色の解析を示す図である。
【図１４】サブクローンＥ３８６６−５２−１の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系(左)および異種移植片(右)の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１５−１】サブクローンＥ３８６６−５２−１の精製抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１５−２】サブクローンＥ３８６６−５２−１の精製抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１６】組換え抗αｖβ６インテグリン抗体による癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１７】組換え抗αｖβ６インテグリン抗体による、異種移植片における前立腺(prostate)癌細胞(上)およびＨＴ２９結腸癌細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図１８】画像解析(Ariol SL−50)を活用した、抗αｖβ６抗体による免疫組織化学染色(run3421)の解析を示す図である。
【図１９】抗ａｖβ６組換え抗体によるスライド間および実験間の再現性を示す図である。
【図２０】抗αｖβ８サブクローン１３３−９の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２１−１】抗αｖβ８サブクローンＥ３８７５−１３３−９の精製抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２１−２】抗αｖβ８サブクローンＥ３８７５−１３３−９の精製抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２２】組換え抗αｖβ８インテグリン抗体ＥＭ１３３０９による癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２３】組換え抗αｖβ８インテグリン抗体ＥＭ１３３０９によるヒト組織の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２４】組換え抗αｖβ８インテグリン抗体による、異種移植片における前立腺癌細胞（上）およびＨ１９７５肺癌細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図２５】画像解析(Ariol SL−50)を活用した、抗αｖβ８抗体ＥＭ１３３０９による免疫組織化学染色(run3422)の解析を示す図である。
【図２６】抗ａｖβ８組換え抗体ＥＭ１３３０９によるスライド間および実験間の再現性を示す図である。
【図２７】抗αｖサブクローンＥ３８７５−１３−９の上清によるＦＦＰＥ癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２８−１】サブクローンＥ３８７５−１３−９の精製抗αｖ抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２８−２】サブクローンＥ３８７５−１３−９の精製抗αｖ抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す図である。
【図２９】組換え抗αｖ抗体ＥＭ０１３０９による癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す図である。
【図３０】組換え抗αｖ抗体ＥＭ０１３０９による異種移植片におけるＤＵ−１４５（上）およびＨＴ２９細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図３１】画像解析(Ariol SL−50)を活用した組換え抗αｖ抗体ＥＭ０１３０９による免疫組織化学染色の解析を示す図である。
【図３２】抗αｖ組換え抗体ＥＭ０１３０９によるスライド間および実験間の再現性を示す図である。
【図３３】精製抗β３インテグリン抗体クローンＥ３５９２−２−１２による、異種移植片におけるＭ２１細胞の細胞膜染色を示す図である。
【図３４】精製抗β３インテグリン抗体Ｅ３５９２−２−４、Ｅ３５９２−２−１０およびＥ３５９２−２−１２による癌細胞系Ｍ２１(左)およびＭ２１異種移植片(右)の免疫組織化学染色を示す図である。
【図３５】画像解析(Ariol SL−50)およびＳｐｏｔｆｉｒｅによるグラフ表示を活用した、抗β３抗体Ｅ３５９２−２−４、Ｅ３５９２−２−１０およびＥ３５９２−２−１２による免疫組織化学染色の解析を示す図である。
【図３６】画像解析(Ariol SL−50)を活用した、抗体β３＿Ｅ３５９２−２−１２およびマウスモノクローナル抗体２０Ｈ９による免疫組織化学染色の解析を示す図である。
【図３７】組換えヒトαｖインテグリン細胞外ドメインおよび全長精製血小板ｇｐｉｉｂｉｉｉａに対する、ウサギ抗インテグリン由来の精製モノクローナルハイブリドーマ抗体Ｅ３８７５−１３３−９、Ｅ３８６６−０５２−１およびＥ３８７５−０１３−９のＥＬＩＳＡプロファイルを示す図である。
【図３８】組換えヒトαｖインテグリン細胞外ドメインおよび全長精製血小板ｇｐｉｉｂｉｉｉａに対する、ＥＢＮＡ組換えウサギ抗インテグリンモノクローナル抗体ＥＭ２２７０３、ＥＭ０９９０２、ＥＭ００２１２、ＥＭ０５２０１、ＥＭ１３３０９およびＥＭ０１３０９のＥＬＩＳＡプロファイルを示す図である。
【図３９】ビオチンビトロネクチンをリガンドとして用いたＲａｂＭａｂ抗体ＥＭ２２７０３、ＥＭ０９９０２、ＥＭ００２１２の受容体阻害アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、各鎖がＬ鎖(ＶＬ)および／またはＨ鎖(ＶＨ)の可変領域におけるウサギ起源の１または複数の相補性決定領域(ＣＤＲ)および必要に応じてフレームワーク領域(ＦＲ)を含む、１または複数のＬ鎖および／またはＨ鎖を含む抗体であって、インテグリンの細胞外または細胞内ドメインと結合する能力を有する抗体を提供することによって第一の課題を解決する。すなわち、抗体は、各領域がウサギ起源の少なくとも１個の相補性決定領域(ＣＤＲ)および必要に応じて１または複数のフレームワーク領域(ＦＲ)を含む、少なくとも１個のＬ鎖可変領域(ＶＬ)および／または少なくとも１個のＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含み、抗体はインテグリンの細胞外または細胞内ドメインと結合する能力を有する。
【００１２】
より詳細には、本発明は、抗体またはその断片が少なくともＬ鎖可変領域(ＶＬ)およびＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含み、抗体が細胞外インテグリンドメイン、細胞外インテグリン鎖ドメインまたは細胞内インテグリン鎖ドメインの非閉塞(non−occluded)エピトープに対する抗原結合特異性を有し、抗体がホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)材料におけるならびにＥＬＩＳＡの単離型におけるおよび／または生細胞の自然状態におけるインテグリンのインタクトなヘテロ二量体と実質的に同じ特異性で結合できる、昆虫由来の糖鎖付加パターンを有するインテグリンと任意の他の真核生物糖鎖付加パターンを有するインテグリンとの両方に対するモノクローナルウサギ抗体またはその断片を提供することによって第一の課題を解決する。
【００１３】
驚いたことに、ＦＦＰＥにおいて使用可能な抗体が、インテグリンまたはインテグリン鎖の細胞外または細胞内ドメインをウサギにおける免疫原として用いることによって容易に作製できることが、本発明者らによって実証された。最良の結果は、有利には組換えによって発現できるインタクトなドメインによって得られる。具体的には、昆虫細胞において調製される場合、細胞外ヘテロ二量体インテグリンドメインが効果的な免疫原であることが判明した。本発明に係る切断型インテグリン免疫原の提供は、エピトープの接触性を有意に増強し、抗原に対して優れた感受性および特異性の抗体をもたらす。モノクローナルウサギ抗体は、選択的に抗原と結合するが、これは糖鎖付加パターンとは非依存的である。本発明の活性抗体が昆虫由来の組換えタンパク質に対して産生されたとしても、これは抗原の糖鎖付加パターンの観点から多機能であり、したがって昆虫由来の組換え抗原の認識に適切であると考えられるが、このパターンに限定されるものではない。本発明の抗体は、任意の真核生物糖鎖付加パターンである特定のインテグリンの細胞外ドメインまたはその一部の認識に良く適している。糖鎖付加パターンは、混合状態ではなく、それぞれ別個の真核細胞または生物に由来することを理解するべきである。その際、作製された抗体は、複合体ＦＦＰＥマトリックス内の標的構造を特に認識することができる。本発明者らは、これらの抗体のＦＦＰＥ組織におけるインテグリン検出に対する予想外の適合性を示した。適合性は、その結果生じる抗体がＦＦＰＥ材料において非常に特異的で活性を有する限りにおいて実証される。ＦＦＰＥ材料におけるインテグリン複合体が本発明の抗体により容易に検出できることは、圧倒的な効果を有する。古典的なモノクローナル抗体は、ＦＦＰＥ材料において機能しないが、本発明の抗体は、同じ特異性でＦＦＰＥ材料および生細胞におけるその抗原と実質的に結合する。後者は、生細胞フローサイトメトリー（例えば蛍光標識細胞分取、すなわちＦＡＣＳ）において証明されるが、これに限定されない。本発明の抗体は、同じ特異性で、ＦＦＰＥ材料およびＥＬＩＳＡの単離型におけるその抗原と実質的に結合することもできる。後者は、本明細書の流れに沿って説明され、例３．３に詳述されている標準ＥＬＩＳＡにおいて証明されているが、これに限定されない。これにより達成されるＦＦＰＥ組織における染色パターンは、先行技術の抗体から必然的に得られる曖昧な結果に優る明らかな利点である。
【００１４】
現在まで少なくとも２４種のインテグリン複合体の組成が説明されてきた。インテグリンは、２本の非共有結合鎖で構成された細胞接着分子ファミリーである。両方のサブユニットであるアルファ(α)およびベータ(β)は、膜を横断し、細胞外マトリックスと細胞内区画を統合して細胞接着、増殖、遊走および浸潤を制御する細胞外シグナルを伝達する。それぞれの組成に基づき、細胞外および細胞内インテグリンドメインが割り当てられ、知られており、これらは従来の工程により調製することができる。天然起源のドメインが生物試料から単離されるか、あるいはドメインは組換えにより発現された後に精製される。特に、試料は、インテグリン分布パターンを解析する哺乳動物からｉｎ−ｖｉｖｏ採取される。試料の回収(withdrawal)は、適正な医療行為の後に行われるものとする。生物試料は、対象インテグリンを有するいかなる種類の生物種から採取されてもよいが、試料は特に実験動物またはヒト、より好ましくはラット、マウス、ウサギまたはヒトから採取される。下流のインテグリンプロセシングは、本技術分野において公知の任意の工程により行われ、続いてドメインの開裂および細胞外または細胞内ドメインの分離が行われる。細胞溶解は、浸透圧ショックを起こして細胞膜を穿孔できる適切なよく知られた溶解バッファー中で行うことができる。細胞構造の安定性は、また、ボールミル、フレンチプレス、超音波等の機械力によって、それぞれ細胞壁および細胞膜の酵素分解によって、および／または界面活性剤(tenside)の作用によって破壊してもよい。インテグリンは、撹乱物質を除去するようさらに精製することができる、あるいはインテグリンは、試料中で濃縮することができる。下流のプロセシングおよび／または濃縮は、好ましくは、沈殿、透析、ゲル濾過、ゲル溶出またはＨＰＬＣもしくはイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーの方法によって行われる。さらに収量を上げるため、数種類の方法を組み合わせることが推奨される。
【００１５】
好ましくは、細胞外インテグリンドメインは組換えにより発現されて精製される。タンパク質配列をコードするＤＮＡは、当業者にとって公知の技法によって獲得、増幅、必要に応じて改変または合成することができる。ＤＮＡは、ベクターに導入し、細胞内で転写および翻訳することができる。ドメインは、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｒｇ−タグまたはカルモジュリン結合タンパク質等、アフィニティークロマトグラフィーのためのタグと融合、あるいは確立された抗体親和性精製技法を用いて精製することができる。カラムにタンパク質懸濁液を充填し、タグを欠くあらゆる構成成分は直ちに溶出される。洗浄ステップによる非特異的結合体の除去後、タグと融合した構成物がカラムから取り出される。タグが抗体の誘導に影響を与える場合、免疫化の前に開裂除去する。
【００１６】
数種類の発現系は本技術水準(state of the art)である。興味深いことに、昆虫由来の組換えインテグリンドメインが適用される場合、免疫原のタンパク質成分に対する力価は有利に上昇し得る。昆虫由来の組換え哺乳動物糖タンパク質は不完全に糖化され、末端の糖プロセシングおよび伸長を欠き、これは、非組換えタンパク質または従来の真核生物発現の組換えタンパク質と比較してタンパク質エピトープが高度に露出していることを意味する。したがって、免疫原インテグリンドメインが、昆虫由来の糖鎖付加パターン、好ましくは細胞外ドメインを有することが好ましい。さらに、タンパク質または多糖類等、大型の担体と抗原を結合する場合、免疫応答を誘発またはむしろ上昇させる抗原特性が影響され得る。担体は、それ自身が免疫応答を誘発しないものとなることができる。
【００１７】
好ましい一実施形態は、インテグリンドメインがヒトの一次構造を有することであり、すなわち、アミノ酸配列は、配列データベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受託番号等、マッチングデータベースにおけるヒトエントリーと合致する。当業者であれば、本明細書に適用される配列を抜粋するためのこのような分子生物学的データベースを知っている。本発明のより好ましい一実施形態において、細胞外インテグリンドメインは、ヒトの一次構造および昆虫の糖鎖付加パターンを有する。
【００１８】
本発明の抗体は、免疫グロブリン遺伝子またはその断片によってコードされたポリペプチドを表す。抗体は、これらのそれぞれが下文に定義されている少なくとも１個のＬ鎖および／または少なくとも１個のＨ鎖、好ましくは少なくとも１個のＬ鎖および少なくとも１個のＨ鎖、より好ましくは２個のＬ鎖および２個のＨ鎖を含む。これは、Ｌ鎖が、前記Ｌ鎖の可変領域（ＶＬ）における少なくとも単一のＣＤＲ、特にウサギ起源のＣＤＲと、必要に応じて前記Ｌ鎖の可変領域（ＶＬ）における少なくとも単一のＦＲ、好ましくは少なくとも前記ＣＤＲおよび少なくとも前記ＦＲを含むことを意味する。Ｈ鎖は、前記Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）における少なくとも単一のＣＤＲ、特にウサギ起源のＣＤＲおよび／または前記Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）における少なくとも単一のＦＲ、好ましくは少なくとも前記ＣＤＲおよび少なくとも前記ＦＲを含む。抗体の抗原結合部分内において、ＣＤＲは抗原のエピトープと直接的に相互作用し、一方ＦＲはパラトープの三次構造を維持する。免疫グロブリンのＬ鎖とＨ鎖の両方において、それぞれ３個の相補性決定領域(ＣＤＲ−１からＣＤＲ−３)によって隔てられた３〜４個のフレームワーク領域(ＦＲ−１からＦＲ−４)が存在する。ＣＤＲまたは高頻度可変領域、具体的にはＣＤＲ−３領域、より具体的にはＨ鎖ＣＤＲ−３は、主として抗体親和性および特異性の原因である。
【００１９】
本発明の別の好ましい一実施形態において、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）は、２個のＣＤＲ、より好ましくは３個のＣＤＲを、最も好ましくは同数のＦＲまたはさらに１個多いＦＲと共に含む。本発明のさらに別の好ましい一実施形態において、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）は、２個のＣＤＲ、より好ましくは３個のＣＤＲを、最も好ましくは同数のＦＲまたはさらに１個多いＦＲと共に含む。別のより好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、各領域が２個のＣＤＲ、最も好ましくは３個のＣＤＲを、非常に好ましくは同数のＦＲまたはさらに１個多いＦＲと共に含む、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）およびＨ鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００２０】
すなわち、本発明の抗体は、それぞれ任意のインテグリンドメインまたは特に細胞外ドメインに結合能を付与する、少なくとも単一鎖の可変領域由来のこの最小限のスキャフォールドを含むであろう。本発明において、抗体は、前述の最小限のスキャフォールドを持っているのであれば、多くの他の十分に特徴付けられた免疫グロブリン断片として、あるいはいっそインタクトな免疫グロブリンとして存在してもよい。断片は、好ましくはＨ鎖（Ｈ）、Ｌ鎖（Ｌ）、可変領域（Ｖ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、共有結合した抗体Ｌ鎖および抗体Ｈ鎖の一部分（Ｆｄ）からなるＦａｂ断片等を含む群から選択される。
【００２１】
抗体のＬ鎖は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）を追加的に含むことができる。同様に、抗体のＨ鎖は、Ｈ鎖定常領域（ＣＨ）または特にＦｄ領域内の定常領域を意味するその一部分を追加的に含むことができる。Ｆｄ断片は抗体特異性の主要な決定基であり、エピトープ結合能を単独で保持する。本発明の抗体は、抗原結合には関与しない、補体カスケードのエフェクターとしてのＦｃ断片によって完成され得る。ＦａｂおよびＦｃ断片等の断片は、様々なペプチダーゼを用いた開裂により作製することができる。さらに、断片は、遺伝子操作して組換えにより発現することができ、これは好ましくはｓｃＦｖである。
【００２２】
本発明の範囲において、抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル起源となることができる。免疫応答が、生物にとって未知の、３．０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する抗原に起因する場合、哺乳類生物において通常、ポリクローナル抗体が産生される。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナルである。モノクローナル抗体の大きな利点として、不死の試薬源、安定した抗体特性および正確な特異性が挙げられる。ハイブリドーマ技術等、モノクローナル抗体産生のための一般的な技法もまた、当業者によく知られている。
【００２３】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体産生のための好ましい宿主生物種は、ラット、ヤギ、ウサギおよびマウスを含み、より好ましくはウサギである。ウサギ抗体、より好ましくはウサギモノクローナル抗体(ＲａｂＭａｂ)は、マウスモノクローナルよりも広い範囲のエピトープ認識と共により高い親和性を示すが、免疫系における多様性および延長したＣＤＲのため、マウス応答と比べてエピトープ、好ましくはヒトエピトープに対するより強い応答をもたらし得る。キメラ抗体は、１または複数のＣＤＲがウサギ源である限りにおいて、ＣＤＲ、ＦＲおよび／または定常領域が異なる哺乳類源に由来するよう遺伝子操作されてよいことを理解するべきである。したがって、キメラ抗体は、ＣＤＲのみならず、非ウサギ起源のＬ鎖およびＨ鎖の全可変領域を交換することによって得られる。あるいは、抗原結合部位の親和性は、可変領域内の一部のアミノ酸を選択的に交換することによって影響され得る。
【００２４】
モノクローナルウサギ抗体作製の基本原理(basic principal)は、マウスモノクローナルと同様のものであった。ウサギの免疫化に続いて、ポリクローナル血清を産生するウサギから脾臓が摘出される。免疫化されたウサギから単離されたウサギＢ細胞は、ウサギ形質細胞腫細胞系と融合されて、安定的なハイブリドーマを産生する。ハイブリドーマ細胞は、免疫原特異的な抗体分泌に関して検査され、その後クローニングされてよい。元来のウサギハイブリドーマ融合パートナー細胞系の確立は、Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９５、９２(２０)：９３４８〜９３５２によって記載されている。融合パートナー細胞系のさらなる開発は、米国特許第７,４２９,４８７(Ｂ２)号明細書に開示されている。さらに別の方法は、米国特許出願第１０／７０５,１０９号、第１０／２６６,３８７号、第１０／３１３,８８１号、第１０／３５０,８４１号および第１１／４７６,２７７号明細書に刊行されている。抗体をコードするインサートｃＤＮＡは、好ましくはクローニングされ、配列決定され、発現ベクターに挿入されて完全に定義された抗体を産生する。当業者であれば、Ｐｈａｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００３、８４(３)：３３２〜３４２に従ったＥＢＮＡ細胞発現系における等、組換え抗体産生の適切な技法を知っている。前記刊行物は、本発明の開示においてその全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００２５】
抗体またはその断片は、特に、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、αｖβ６またはαｖβ８の細胞外ドメインに対して作製される。
【００２６】
本発明の好ましい特定の一実施形態において、抗体またはその断片は、インテグリンαｖβ３の細胞外ドメインに対して作製される。ＶＬにおける適切なＣＤＲは、配列番号８１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および／または配列番号８３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＣＤＲは、配列番号８４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号８５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）および／または配列番号８６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号８１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および配列番号８３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号８４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号８５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）および配列番号８６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号８１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および配列番号８３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号８４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号８５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）および配列番号８６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
抗αｖβ３抗体の構成をさらに参照すると、ＶＬにおける適切なＦＲは、配列番号８７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および／または配列番号８９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＦＲは、配列番号９１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）および／または配列番号９４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号８７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および配列番号８９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＦＲは、配列番号９１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）および配列番号９４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号８７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および配列番号８９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号９１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）および配列番号９４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
抗αｖβ３抗体の構成における別の組み合わせの一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号８１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および／または配列番号８３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおける適切なＦＲが、配列番号８７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および／または配列番号８９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号８１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および配列番号８３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号８７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ３）、配列番号８８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ３）および配列番号８９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
抗αｖβ３抗体の構成におけるさらに別の組み合わせの一実施形態は、ＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号８４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号８５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）および／または配列番号８６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおける適切なＦＲが、配列番号９１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）および／または配列番号９４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号８４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号８５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）および配列番号８６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号９１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ３）、配列番号９３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ３）および配列番号９４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
抗αｖβ３抗体の構成における別の好ましい一実施形態において、ＶＬは配列番号９５（ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨは配列番号９６（ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＶＬは配列番号９５（ＶＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなり、および／またはＶＨは配列番号９６（ＶＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、抗体は抗αｖβ３ ｓｃＦｖとして生成される。
【００３１】
抗αｖβ３抗体は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）および／またはＨ鎖定常領域（ＣＨ）によって完成され得る。好ましくは、ＣＬは配列番号９７（ＣＬ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＨは配列番号９８（ＣＨ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
したがって、抗αｖβ３抗体は、より好ましくは、Ｌ鎖が配列番号９９（Ｌ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖が配列番号１００（Ｈ−αｖβ３）のアミノ酸配列を含む、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を含む。最も好ましくは、Ｌ鎖は配列番号９９（Ｌ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなり、および／またはＨ鎖は配列番号１００（Ｈ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなる。本発明の非常に好ましい一実施形態において、Ｌ鎖は配列番号９９（Ｌ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなり、Ｈ鎖は配列番号１００（Ｈ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなる。
【００３３】
本発明の別の好ましい特定の一実施形態において、抗体またはその断片は、インテグリンαｖβ５の細胞外ドメインに対して作製される。ＶＬにおける適切なＣＤＲは、配列番号１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および／または配列番号３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＣＤＲは、配列番号４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）および／または配列番号６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および配列番号３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）および配列番号６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および配列番号３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）および配列番号６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
抗αｖβ５抗体の構成をさらに参照すると、ＶＬにおける適切なＦＲは、配列番号７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および／または配列番号９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＦＲは、配列番号１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）および／または配列番号１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および配列番号９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＦＲは、配列番号１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）および配列番号１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および配列番号９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）および配列番号１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
抗αｖβ５抗体の構成における別の組み合わせの一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および／または配列番号３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおける適切なＦＲが、配列番号７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および／または配列番号９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および配列番号３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ５）、配列番号８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ５）および配列番号９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
抗αｖβ５抗体の構成におけるさらに別の組み合わせの一実施形態は、ＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）および／または配列番号６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおける適切なＦＲが、配列番号１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）および／または配列番号１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）および配列番号６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ５）、配列番号１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ５）および配列番号１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
抗αｖβ５抗体の構成における別の好ましい一実施形態において、ＶＬは配列番号１５（ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨは配列番号１６（ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＶＬは配列番号１５（ＶＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなり、および／またはＶＨは配列番号１６（ＶＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、抗体は、抗αｖβ５ ｓｃＦｖとして生成される。
【００３８】
抗αｖβ５抗体は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）および／またはＨ鎖定常領域（ＣＨ）によって完成され得る。好ましくは、ＣＬは配列番号１７（ＣＬ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＨは配列番号１８（ＣＨ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
したがって、抗αｖβ５抗体は、より好ましくは、Ｌ鎖が配列番号１９（Ｌ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖が配列番号２０（Ｈ−αｖβ５）のアミノ酸配列を含む、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を含む。最も好ましくは、Ｌ鎖は配列番号１９（Ｌ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなり、および／またはＨ鎖は配列番号２０（Ｈ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなる。本発明の非常に好ましい一実施形態において、Ｌ鎖は配列番号１９（Ｌ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなり、Ｈ鎖は配列番号２０（Ｈ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなる。
【００４０】
本発明のさらに別の好ましい特定の一実施形態において、抗体またはその断片は、インテグリンαｖβ６の細胞外ドメインに対して作製される。ＶＬにおける適切なＣＤＲは、配列番号１２１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および／または配列番号１２３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＣＤＲは、配列番号１２４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１２５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）および／または配列番号１２６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１２１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１２３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号１２４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１２５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）および配列番号１２６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１２１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１２３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号１２４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１２５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）および配列番号１２６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
抗αｖβ６抗体の構成をさらに参照すると、ＶＬにおける適切なＦＲは、配列番号１２７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および／または配列番号１２９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＦＲは、配列番号１３１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）および／または配列番号１３４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号１２７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１２９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＦＲは、配列番号１３１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）および配列番号１３４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号１２７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１２９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号１３１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）および配列番号１３４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
抗αｖβ６抗体の構成における別の組み合わせの一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号１２１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および／または配列番号１２３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおける適切なＦＲが、配列番号１２７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および／または配列番号１２９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１２１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１２３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号１２７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ６）、配列番号１２８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１２９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
抗αｖβ６抗体の構成におけるさらに別の組み合わせの一実施形態は、ＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号１２４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１２５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）および／または配列番号１２６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおける適切なＦＲが、配列番号１３１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）および／または配列番号１３４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号１２４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１２５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）および配列番号１２６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号１３１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ６）、配列番号１３３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ６）および配列番号１３４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
抗αｖβ６抗体の構成における別の好ましい一実施形態において、ＶＬは配列番号１３５（ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨは配列番号１３６（ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＶＬは配列番号１３５（ＶＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなり、および／またはＶＨは配列番号１３６（ＶＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、抗体は抗αｖβ６  ｓｃＦｖとして生成される。
【００４５】
抗αｖβ６抗体は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）および／またはＨ鎖定常領域（ＣＨ）によって完成され得る。好ましくは、ＣＬは配列番号１３７（ＣＬ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＨは配列番号１３８（ＣＨ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
したがって、抗αｖβ６抗体は、より好ましくは、Ｌ鎖が配列番号１３９（Ｌ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖が配列番号１４０（Ｈ−αｖβ６）のアミノ酸配列を含む、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を含む。最も好ましくは、Ｌ鎖は配列番号１３９（Ｌ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなり、および／またはＨ鎖は配列番号１４０（Ｈ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなる。本発明の非常に好ましい一実施形態において、Ｌ鎖は配列番号１３９（Ｌ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなり、Ｈ鎖は配列番号１４０（Ｈ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなる。
【００４７】
本発明のさらに別の好ましい特定の一実施形態において、抗体またはその断片は、インテグリンαｖβ８の細胞外ドメインに対して作製される。ＶＬにおける適切なＣＤＲは、配列番号１６１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および／または配列番号１６３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＣＤＲは、配列番号１６４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１６５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）および／または配列番号１６６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１６１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１６３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号１６４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１６５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）および配列番号１６６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１６１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１６３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号１６４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１６５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）および配列番号１６６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
抗αｖβ８抗体の構成をさらに参照すると、ＶＬにおける適切なＦＲは、配列番号１６７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および／または配列番号１６９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＦＲは、配列番号１７１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）および／または配列番号１７４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号１６７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１６９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＦＲは、配列番号１７１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）および配列番号１７４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号１６７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１６９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号１７１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）および配列番号１７４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
抗αｖβ８抗体の構成における別の組み合わせの一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号１６１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および／または配列番号１６３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおける適切なＦＲが、配列番号１６７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および／または配列番号１６９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号１６１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１６３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号１６７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖβ８）、配列番号１６８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１６９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
抗αｖβ８抗体の構成におけるさらに別の組み合わせの一実施形態は、ＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号１６４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１６５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）および／または配列番号１６６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおける適切なＦＲが、配列番号１７１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）および／または配列番号１７４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号１６４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１６５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）および配列番号１６６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号１７１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖβ８）、配列番号１７３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖβ８）および配列番号１７４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
抗αｖβ８抗体の構成における別の好ましい一実施形態において、ＶＬは配列番号１７５（ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨは配列番号１７６（ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＶＬは配列番号１７５（ＶＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなり、および／またはＶＨは配列番号１７６（ＶＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、抗体は、抗αｖβ８  ｓｃＦｖとして生成される。
【００５２】
抗αｖβ８抗体は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）および／またはＨ鎖定常領域（ＣＨ）によって完成され得る。好ましくは、ＣＬは配列番号１７７（ＣＬ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＨは配列番号１７８（ＣＨ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
したがって、抗αｖβ８抗体は、より好ましくは、Ｌ鎖が配列番号１７９（Ｌ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖が配列番号１８０（Ｈ−αｖβ８）のアミノ酸配列を含む、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を含む。最も好ましくは、Ｌ鎖は配列番号１７９（Ｌ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなり、および／またはＨ鎖は配列番号１８０（Ｈ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなる。本発明の非常に好ましい一実施形態において、Ｌ鎖は配列番号１７９（Ｌ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなり、Ｈ鎖は配列番号１８０（Ｈ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなる。
【００５４】
本発明のさらに別の好ましい特定の一実施形態において、抗体またはその断片は、インテグリンαｖの細胞外ドメインに対して作製される。ＶＬにおける適切なＣＤＲは、配列番号２０１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖ）および／または配列番号２０３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＣＤＲは、配列番号２０４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２０５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖ）および／または配列番号２０６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号２０１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖ）および配列番号２０３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号２０４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２０５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖ）および配列番号２０６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号２０１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖ）および配列番号２０３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号２０４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２０５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖ）および配列番号２０６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
抗αｖ抗体の構成をさらに参照すると、ＶＬにおける適切なＦＲは、配列番号２０７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖ）および／または配列番号２０９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＦＲは、配列番号２１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖ）および／または配列番号２１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号２０７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖ）および配列番号２０９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＦＲは、配列番号２１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖ）および配列番号２１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号２０７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖ）および配列番号２０９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号２１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖ）および配列番号２１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
抗αｖ抗体の構成における別の組み合わせの一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号２０１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖ）および／または配列番号２０３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおける適切なＦＲが、配列番号２０７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖ）および／または配列番号２０９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号２０１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−αｖ）および配列番号２０３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号２０７（ＦＲ−１−ＶＬ−αｖ）、配列番号２０８（ＦＲ−２−ＶＬ−αｖ）および配列番号２０９（ＦＲ−３−ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
抗αｖ抗体の構成におけるさらに別の組み合わせの一実施形態は、ＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号２０４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２０５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖ）および／または配列番号２０６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおける適切なＦＲが、配列番号２１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖ）および／または配列番号２１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号２０４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２０５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−αｖ）および配列番号２０６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号２１１（ＦＲ−１−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１２（ＦＲ−２−ＶＨ−αｖ）、配列番号２１３（ＦＲ−３−ＶＨ−αｖ）および配列番号２１４（ＦＲ−４−ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
抗αｖ抗体の構成における別の好ましい一実施形態において、ＶＬは配列番号２１５（ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨは配列番号２１６（ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＶＬは配列番号２１５（ＶＬ−αｖ）のアミノ酸配列からなり、および／またはＶＨは配列番号２１６（ＶＨ−αｖ）のアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、抗体は抗αｖ  ｓｃＦｖとして生成される。
【００５９】
抗αｖ抗体は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）および／またはＨ鎖定常領域（ＣＨ）によって完成され得る。好ましくは、ＣＬは配列番号２１７（ＣＬ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＨは配列番号２１８（ＣＨ−αｖ）のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
したがって、抗αｖ抗体は、より好ましくは、Ｌ鎖が配列番号２１９（Ｌ−αｖ）のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖が配列番号２２０（Ｈ−αｖ）のアミノ酸配列を含む、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を含む。最も好ましくは、Ｌ鎖は配列番号２１９（Ｌ−αｖ）のアミノ酸配列からなり、および／またはＨ鎖は配列番号２２０（Ｈ−αｖ）のアミノ酸配列からなる。本発明の非常に好ましい一実施形態において、Ｌ鎖は配列番号２１９（Ｌ−αｖ）のアミノ酸配列からなり、Ｈ鎖は配列番号２２０（Ｈ−αｖ）のアミノ酸配列からなる。
【００６１】
本発明の別の一実施形態において、インテグリン細胞質ドメインが、一次免疫原として用いられる。前記細胞質ドメインは、細胞内ドメインとも言う。これは、特にＮ末端融合タンパク質として発現する。融合のパートナーは、後述のディファレンシャルスクリーニングを行えるように変動（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＫＬＨ等）し得る、あるいは一次および二次スクリーニングを省略して細胞系アレイにおける三次スクリーニングへと直接進むことができる。細胞質ドメインの立体構造は細胞外ドメインよりも定義されておらず、対になる鎖に対して相対的に非依存的である、すなわち、例えばβ３に対して作製された抗体は、αｖβ３と会合(associate)したβ３とαｉｉｂβ３と会合したβ３の両方を認識するであろう。これは事実上、αｖと会合している場合、スクリーニングしてβ３のみを認識する抗体を得ることのできるＤＴＭ−αｖβ３複合体に対して作製された抗体と比べて特異性が低下している。αｖβ５に対して作製された抗体に同様の考察が適用される。しかし、利点は、インテグリン細胞質ドメインが哺乳類中で完全に保存されていることであり、したがって広範な種間交差反応が生じ得ることである。
【００６２】
具体的には、抗体またはその断片は、インテグリンβ３鎖の細胞質ドメインに対して作製される。このような抗β３抗体の特定の一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号４１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−β３）および／または配列番号４３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号４４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号４５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−β３）および／または配列番号４６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号４１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−β３）および配列番号４３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号４４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号４５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−β３）および配列番号４６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号４１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−β３）および配列番号４３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号４４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号４５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−β３）および配列番号４６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
抗β３抗体の構成をさらに参照すると、ＶＬにおける適切なＦＲは、配列番号４７（ＦＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４８（ＦＲ−２−ＶＬ−β３）および／または配列番号４９（ＦＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおける適切なＦＲは、配列番号５１（ＦＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号５２（ＦＲ−２−ＶＨ−β３）、配列番号５３（ＦＲ−３−ＶＨ−β３）および／または配列番号５４（ＦＲ−４−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号４７（ＦＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４８（ＦＲ−２−ＶＬ−β３）および配列番号４９（ＦＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨにおけるＦＲは、配列番号５１（ＦＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号５２（ＦＲ−２−ＶＨ−β３）、配列番号５３（ＦＲ−３−ＶＨ−β３）および配列番号５４（ＦＲ−４−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号４７（ＦＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４８（ＦＲ−２−ＶＬ−β３）および配列番号４９（ＦＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号５１（ＦＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号５２（ＦＲ−２−ＶＨ−β３）、配列番号５３（ＦＲ−３−ＶＨ−β３）および配列番号５４（ＦＲ−４−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
抗β３抗体の構成における別の組み合わせの一実施形態は、ＶＬにおける適切なＣＤＲが、配列番号４１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−β３）および／または配列番号４３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおける適切なＦＲが、配列番号４７（ＦＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４８（ＦＲ−２−ＶＬ−β３）および／または配列番号４９（ＦＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＬにおけるＣＤＲは、配列番号４１（ＣＤＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４２（ＣＤＲ−２−ＶＬ−β３）および配列番号４３（ＣＤＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、ＶＬにおけるＦＲは、配列番号４７（ＦＲ−１−ＶＬ−β３）、配列番号４８（ＦＲ−２−ＶＬ−β３）および配列番号４９（ＦＲ−３−ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
抗β３抗体の構成におけるさらに別の組み合わせの一実施形態は、ＶＨにおける適切なＣＤＲが、配列番号４４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号４５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−β３）および／または配列番号４６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおける適切なＦＲが、配列番号５１（ＦＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号５２（ＦＲ−２−ＶＨ−β３）、配列番号５３（ＦＲ−３−ＶＨ−β３）および／または配列番号５４（ＦＲ−４−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含むことである。好ましくは、ＶＨにおけるＣＤＲは、配列番号４４（ＣＤＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号４５（ＣＤＲ−２−ＶＨ−β３）および配列番号４６（ＣＤＲ−３−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含み、ＶＨにおけるＦＲは、配列番号５１（ＦＲ−１−ＶＨ−β３）、配列番号５２（ＦＲ−２−ＶＨ−β３）、配列番号５３（ＦＲ−３−ＶＨ−β３）および配列番号５４（ＦＲ−４−ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
抗β３抗体の構成における別の好ましい一実施形態において、ＶＬは配列番号５５（ＶＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＨは配列番号５６（ＶＨ−β３）のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＶＬは配列番号５５（ＶＬ−β３）のアミノ酸配列からなり、および／またはＶＨは配列番号５６（ＶＨ−β３）のアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、抗体は抗β３  ｓｃＦｖとして生成される。
【００６７】
抗β３抗体は、Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）および／またはＨ鎖定常領域（ＣＨ）によって完成され得る。好ましくは、ＣＬは配列番号５７（ＣＬ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＨは配列番号５８（ＣＨ−β３）のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
したがって、抗β３抗体は、より好ましくはＬ鎖が配列番号５９（Ｌ−β３）のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖が配列番号６０（Ｈ−β３）のアミノ酸配列を含む、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を含む。最も好ましくは、Ｌ鎖は配列番号５９（Ｌ−β３）のアミノ酸配列からなり、および／またはＨ鎖は配列番号６０（Ｈ−β３）のアミノ酸配列からなる。本発明の非常に好ましい一実施形態において、Ｌ鎖は配列番号５９（Ｌ−β３）のアミノ酸配列からなり、Ｈ鎖は配列番号６０（Ｈ−β３）のアミノ酸配列からなる。
【００６９】
ＣＤＲ、ＦＲ、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ、Ｌおよび／またはＨの組み合わせは下文に詳述する通り尽きることはないが、前記構成要素は任意の他の仕方で組み合わせることができることを理解するべきである。各組み合わせは、その結果生ずる抗体またはその断片がインテグリンの細胞外ドメインを認識する限りにおいて、本発明の範囲において理解するものと考えるべきである。
【００７０】
前記アミノ酸配列または同じ機能を有する相同配列の変種、変異体、部分が、定義および保護の範囲に含まれることも理解するべきである。オリジナル配列とその誘導体との間の変化の程度は、特にＦＦＰＥ材料における構造上の背景内の抗原認識の必要によって必然的に限定される。均等のペプチドおよびタンパク質、すなわち本発明の利益を広い範囲で理解することにより本発明が教示するところの配列と機能が類似のアミノ酸配列を作製するための数通り(a couple of)の方法が、当業者に知られている。したがって、本発明は本明細書において列挙されている変化も含む。本発明の抗体の基礎をなすアミノ酸配列の変種は、修飾（例えば、少なくとも１個のアミノ酸のアルキル化、アリール化またはアセチル化）、鏡像異性体の取り込み、少なくとも１個のアミノ酸の付加および／または別のペプチドもしくはタンパク質との融合から生じ得る。可能性のある変異は、欠失、挿入、置換、転座および／または逆位を含む。アミノ酸配列および抗体それぞれの一部とは、特定の機能の発現に十分な領域への制限に関する。例えば、細胞外インテグリンドメインに関する抗原とも結合するパラトープの特性評価のため、抗体の一部は非常に小さくなり得る。本発明の意義において、任意のサイズの部分と相同配列との間を明確に区別するべきである。後者の相同性は、配列全体に関する。好ましくは、オリジナル配列と、同じ特徴を有するその誘導体との間の相同性は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％に相当する。同様に、前述の任意のサイズの一部が変種または変異体に変化する場合、相同性を考慮するべきである。この教示は、本発明の課題を解決するのであれば、このような手順により本構成要素に基づいて開発されるあらゆるペプチド誘導体に及ぶ。
【００７１】
さらに、先行技術において、同じ機能を有する非相同ペプチドを作製するための数種類の技法が説明されている。本明細書において、非相同ペプチドは、上述の好ましい程度の相同性よりも低い相同性を有するアミノ酸配列を表す。例えば、本発明の目的の達成に関する活性に悪影響を与えることなく、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸を置換することが可能である。このようなアミノ酸の置換のため、適切で標準的な生化学および遺伝学の教科書が参照される。当業者によく知られているように、一部のアミノ酸は、類似の物理化学的特性を有し、したがって、これらのアミノ酸は互いに有利に置換され得る。これらは、アミノ酸グループ（ａ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（ｂ）セリンおよびスレオニン、（ｃ）アスパラギンおよびグルタミン、（ｄ）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（ｅ）リジンおよびアルギニン、ならびに（ｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。（ａ）から（ｆ）のある同一グループ内のアミノ酸同士は、互いに置換することができる。機能的に類似のアミノ酸配列を作製する一方法について記載する、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、ＰＮＡＳ １９９８、９５：１２１７９〜１２１８４、国際公開第１９９９／６２９３３号パンフレットおよび／または国際公開第２００２／３８５９２号パンフレットの教示に従ったさらなる変化も可能である。該参考文献は、これにより本明細書の一部を構成するものとして本発明の開示に援用する。引用されている方法を用い、本発明の任意のアミノ酸配列から開始して設計されるあらゆるアミノ酸配列、配列部分または配列を含む構造は、本発明の意義における配列であると考えられ、これは、本発明の目的を達成する限りにおいて、本発明に係る教示に含まれるであろう。
【００７２】
本発明の目的はまた、本発明に係る抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーに取り込まれ得る合成、非天然または修飾ヌクレオチドを代替的に含む、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの天然または合成ポリマーを意味する。各ヌクレオチドは、糖部分と、リン酸部分と、プリンまたはピリミジン残基とからなる。核酸は、ホスホロチオエートＤＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはシュピーゲルマー(spiegelmer)として必要に応じて修飾されてよい。用語「コードするポリヌクレオチド」は、タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの一部を暗号化する遺伝子の一部を意味する。転写開始または終結を制御する制御配列および／またはエレメントは含まれない。コード配列および／または制御エレメントは、一般に、細胞に存在していてよく、この場合自家性または内因性であると言い、あるいは細胞に存在していなくてもよく、この場合異種であると言う。用語「遺伝子」は、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列の発現を制御する制御エレメントを表す。
【００７３】
異種遺伝子は、遺伝子が導入された細胞において通常は見られない順序および／または配向性で配置された自家エレメントで構成されていてもよい。異種遺伝子は、細菌もしくはウイルスゲノムもしくはエピソーム、真核生物の核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは化学合成ＤＮＡ等、本技術分野において公知の任意のソースに完全にまたは部分的に由来してよい。構造遺伝子は、連続的なコード領域を構成することができる、あるいは適切なスプライスジャンクションに接する１または複数のイントロンを含むことができる。構造遺伝子は、様々な自然発生または合成ソースに由来する部分からなってよい。
【００７４】
本発明の好ましい一実施形態において、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１〜２９および３１〜４０、配列番号６１〜６９および７１〜８０、配列番号１０１〜１０９および１１１〜１２０、配列番号１４１〜１４９および１５１〜１６０、配列番号１８１〜１８９および１９１〜２００ならびに配列番号２２１〜２２９および２３１〜２４０の群から選択された、１または複数の核酸配列を含む。抗体およびその特定のアミノ酸配列に関する本明細書の従前の教示は妥当であり、好都合であれば、ポリヌクレオチドおよび特定の核酸配列に制限されることなく適用できると考えられる。
【００７５】
本発明の別の目的は、上述の本発明に係る抗体コードポリヌクレオチドを含むベクターに関する。用語「ベクター」は、多くのヌクレオチド配列が連結または組換えられて独自の構成を形成し、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列をセンスまたはアンチセンスの配向性で適切な非翻訳３’配列と共に細胞に導入することのできる、直鎖状または環状の、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡからなるプラスミド、ウイルス、自己複製配列、ファージまたはヌクレオチド配列となり得る組換えＤＮＡ構築物を表す。
【００７６】
プラスミドは、特に本発明の抗体またはその断片の組換え遺伝子をクローニングして発現するために、本発明の抗体コードポリヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明の意義において、プラスミドは、その宿主細胞の染色体の一部となることなく安定的に遺伝する遺伝的エレメントである。これは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、直鎖状と環状のどちらであってもよい。プラスミドは、細胞複製におけるその複製および安定的な遺伝を確実にする分子をコードする。本明細書において開示される出発材料プラスミドは、市販、一般公開、または入手可能なプラスミドからよく知られた公表された方法のルーチン利用により構築されてよい。本発明に従って利用することのできる多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者によく知られており、容易に手に入れることができる。さらに、当業者であれば、本発明における使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。
【００７７】
ベクターは、宿主細胞への導入に適切となるべきである。したがって、抗体コードポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞は、本発明のさらに別の目的である。本発明は、好ましくは単離された原核または真核細胞に関するが、細胞培養物、組織、器官等、さらには上述のベクターを有する本発明の宿主細胞を含む生物も包含するべきである。用語「宿主細胞」は、キメラ、異種もしくは自家核酸配列または前記配列をその時点で有するそれらの誘導体の導入によって遺伝子組換えされた細胞を表す。このような細胞は、トランスジェニック細胞とも言う。自家核酸配列が導入される場合、宿主細胞におけるこの配列のコピー数は、自然発生の配列のコピー数よりも多い。
【００７８】
本発明はまた、昆虫由来の糖鎖付加パターンを有する細胞外インテグリンドメインからなる組換え免疫原に関する。細胞外ドメインは、好ましくはデルタ膜貫通（ＤＴＭ）型として結合する。本発明の前記免疫原は、ウサギ等、最適な哺乳類生物種にそのまま注射すると、適応免疫応答を誘発することができる。より好ましくは、本発明の免疫原は、配列番号１０、９０、１３０、１７０もしくは２１０のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列もしくは同じ機能を有する少なくとも９５％相同な配列の変種、変異体、部分を有する。本発明の目的はまた、本発明の前記免疫原をコードするポリヌクレオチドである。好ましい一実施形態において、免疫原コードポリヌクレオチドは、配列番号３０、１１０、１５０、１９０もしくは２３０のヌクレオチド配列、または該アミノ酸配列もしくは同じ機能を有する少なくとも９５％相同な配列の変種、変異体、部分を有する。本発明の別の目的は、本発明に係る免疫原コードポリヌクレオチドを含むベクターに関する。さらに別の目的は、本発明に係る免疫原コードポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞である。宿主生物種が本発明の本保護範囲に含まれることを理解するべきである。抗体、またはその配列もしくはその相同配列の変種、変異体、部分、抗体コードポリヌクレオチドまたはベクター、宿主細胞等に関する本明細書の従前の教示は妥当であり、適切であれば前記または他の抗体を産生するための免疫原に制限されることなく適用できる。
【００７９】
本発明はまた、（ａ）昆虫細胞において細胞外インテグリンドメインまたはその断片を組換えにより発現させるステップと、（ｂ）発現した細胞外ドメインを精製するステップと、（ｃ）精製した細胞外ドメインによりウサギを免疫化するステップと、（ｄ）ウサギからポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗血清を採取するステップと、必要に応じて（ｅ）モノクローナル抗体を調製するステップと、を含む、ウサギ抗体を調製するための方法に関する。
【００８０】
好ましくは、モノクローナル抗体を調製するための方法は、次のステップ、（ａ）昆虫細胞において細胞外インテグリンドメインを組換えにより発現させるステップと、（ｂ）発現した細胞外インテグリンドメインを精製するステップと、（ｃ）精製した細胞外インテグリンドメインによりウサギを免疫化するステップと、（ｄ）ウサギからポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗血清を採取するステップと、（ｅ）モノクローナル抗体を調製するステップと、を含む。より好ましくは、該方法は、上に詳述した本発明の前記モノクローナル抗体の調製を意味する。
【００８１】
ステップ（ａ）のタンパク質発現は、数種類の適切な昆虫細胞、昆虫細胞系を入手でき、その遺伝子導入方法を知っている当業者にとってはルーチンの作業である。例えば、組換えバキュロウイルスで感染したＢＴＩ−Ｔｎ５Ｂ１−４（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）昆虫細胞系は、Ｓｆ９等、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来細胞系よりも大幅に速い速度で多くの分泌組換えタンパク質が産生されるため、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系において広く普及している。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系から得られる細胞外インテグリンドメインの収量を最適化するため、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞の懸濁液適応培養物を用いて、宿主細胞の状態、感染多重度、感染時の細胞密度および培地への栄養分および酸素の補給の効果を検査するための実験を容易に行うことができる。このような手順は、本分野の技術水準であり、例えば、Ｖａｌｌａｚｚａ ＆ Ｐｅｔｒｉ、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９、２９： ８５〜９２またはＭｅｈｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９８、３３０： ８６１〜８６９によって刊行されている。
【００８２】
抗体または免疫原の変化に関する従前の教示は妥当であり、好都合であればステップ（ａ）の変化した免疫原に制限されることなく適用できると考えられる。当業者には明らかなことであるが、本発明は、インテグリンの全長細胞外ドメインに限定されるものと解釈するべきではない。細胞外ドメインの生理的または人工断片、細胞外ドメインの二次修飾、種依存的変化および細胞外ドメインの対立遺伝子変種もまた、本発明に包含される。この点において、「対立遺伝子変種」は、遺伝的に単一の遺伝子座に存在し得る２以上の異なる種類の遺伝子またはＤＮＡ配列の内１個の遺伝子産物を表すものとして理解されている。人工断片は、好ましくは、診断対象のエピトープを少なくとも含む、合成的にまたは組換え技法により産生されたペプチドを包含する。
【００８３】
ステップ（ｅ）に従って昆虫細胞において発現される場合、細胞外インテグリンドメインは、成熟哺乳動物細胞における糖鎖付加パターンとは異なる欠損型付着(abherent)糖鎖付加パターンを有する。インテグリンは広範に糖化されている、すなわち質量で１０％を超えるため、このことは、昆虫タンパク質が、哺乳動物系において産生されるウサギ天然インテグリンとはさらに異なっていることを意味する。昆虫由来の免疫原は、前記免疫原のタンパク質要素に対して非常に増強された免疫原性およびより強い抗体応答をもたらす。
【００８４】
ステップ（ｂ）〜（ｄ）のタンパク質精製、哺乳動物免疫化および血清抽出は、本明細書および例の中に記載されている等、よく知られた技法および適切な研究室業務に従う。次に、ステップ（ｄ）の血清は、ポリクローナルの存在に関して検査され、検出された抗体は抗原認識に対してスクリーニングされる。適切な検査およびスクリーニングは、当業者であれば利用できる。
【００８５】
必要に応じて、抗体の調製は、単一特異性の種類の同一抗体、すなわちステップ（ｅ）のモノクローナルまで続けられる。モノクローナル抗体は通常、ミエローマ細胞をステップ（ｃ）に従って免疫化された哺乳動物から得られた脾細胞と融合することによって作製される。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する、融合細胞のみが増殖できる選択ＨＡＴ培地が特に用いられる。次に、いわゆるハイブリドーマが希釈され、マイクロタイターウェルにおいて単一の親細胞からクローンが増殖する。異なるクローンによって分泌される抗体は、細胞外インテグリンドメインの抗原と結合するその能力に対して検査される。したがって、本発明の抗体は特に下文の方法によって調製される。
【００８６】
当然のことながら、抗体は、本発明の前記方法によって細胞内インテグリンドメインを用いて同様に調製することができる。方法は、適宜変更しつつ(mutatis mutandis)適用するべきである。
【００８７】
本発明の目的はまた、昆虫細胞において組換えにより発現したインテグリンの細胞外または細胞質ドメインによるウサギの免疫化によって得られる抗体である。本発明の免疫原は抗体生成に用いることができるため、本発明は、特にそのそれぞれが本発明に係る免疫原および／またはポリヌクレオチドによりウサギを免疫化し、ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗血清を採取し、モノクローナル抗体を調製することによって得られるモノクローナル抗体に関する。免疫原およびウサギ抗体を調製するための方法に関する本明細書の従前の教示は妥当であり、適切であればこの工程によって産生される抗体産物に制限されることなく適用できると考えるべきである。
【００８８】
最も生産的かつ安定的なクローンは、培地中で高容量になるよう増殖させてよいが、最適なモノクローナルは、好ましくは組換え様式において発現される。これは、抗体コードインサートのｃＤＮＡクローニング、配列決定および発現ベクターへと挿入して完全に定義された抗体を産生することを必要とする。続いて、本発明はまた、（ａ）配列番号２１〜２９および３１〜４０、配列番号６１〜６９および７１〜８０、配列番号１０１〜１０９および１１１〜１２０、配列番号１４１〜１４９および１５１〜１６０、配列番号１８１〜１８９および１９１〜２００および／または配列番号２２１〜２２９および２３１〜２４０の核酸配列（単数または複数）を含むベクター（単数または複数）を宿主細胞に導入するステップと、（ｂ）培地中で宿主細胞を培養し、これによりコードされた抗体またはその断片を発現するステップと、（ｃ）発現した抗体またはその断片を精製するステップと、を含む、組換えモノクローナル抗体またはその断片を製造するための方法に関する。
【００８９】
ベクターは、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入等、本技術分野の任意の方法によって導入することができる。大腸菌属(Escherichia)の種またはバチルス属(Bacillus)の種等、細菌および古細菌を含む原核細胞は特に形質転換され、一方、ＣＨＯ、ＨｅＬａその他等、真核細胞は特にトランスフェクトされることを理解するべきである。３ドメイン系は、また、ウイルス媒体によって形質導入されてもよい。ベクターは、モノクローナル抗体またはその断片をコードする１または複数の核酸配列のいずれかを含むことができる。
【００９０】
ステップ（ａ）のさらに別の好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号１１５（ＶＬ−αｖβ３）および／または配列番号１１６（ＶＨ−αｖβ３）の核酸配列を含む。ステップ（ａ）のより好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号１１９（Ｌ−αｖβ３）および／または配列番号１２０（Ｈ−αｖβ３）の核酸配列を含む。
【００９１】
ステップ（ａ）の好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号３５（ＶＬ−αｖβ５）および／または配列番号３６（ＶＨ−αｖβ５）の核酸配列を含む。ステップ（ａ）のより好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号３９（Ｌ−αｖβ５）および／または配列番号４０（Ｈ−αｖβ５）の核酸配列を含む。
【００９２】
ステップ（ａ）の好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号１５５（ＶＬ−αｖβ６）および／または配列番号１５６（ＶＨ−αｖβ６）の核酸配列を含む。ステップ（ａ）のより好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号１５９（Ｌ−αｖβ６）および／または配列番号１６０（Ｈ−αｖβ６）の核酸配列を含む。
【００９３】
ステップ（ａ）の好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号１９５（ＶＬ−αｖβ８）および／または配列番号１９６（ＶＨ−αｖβ８）の核酸配列を含む。ステップ（ａ）のより好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号１９９（Ｌ−αｖβ８）および／または配列番号２００（Ｈ−αｖβ８）の核酸配列を含む。
【００９４】
ステップ（ａ）の好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号２３５（ＶＬ−αｖ）および／または配列番号２３６（ＶＨ−αｖ）の核酸配列を含む。ステップ（ａ）のより好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号２３９（Ｌ−αｖ）および／または配列番号２４０（Ｈ−αｖ）の核酸配列を含む。
【００９５】
ステップ（ａ）の別の好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号７５（ＶＬ−β３）および／または配列番号７６（ＶＨ−β３）の核酸配列を含む。ステップ（ａ）のより好ましい一実施形態において、導入されるベクター(単数または複数)は、配列番号７９（Ｌ−β３）および／または配列番号８０（Ｈ−β３）の核酸配列を含む。
【００９６】
好ましい一態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号１１５（ＶＬ−αｖβ３）および配列番号１１６（ＶＨ−αｖβ３）、（ｉｉ）配列番号３５（ＶＬ−αｖβ５）および配列番号３６（ＶＨ−αｖβ５）、（ｉｉｉ）配列番号１５５（ＶＬ−αｖβ６）および配列番号１５６（ＶＨ−αｖβ６）、（ｉｖ）配列番号１９５（ＶＬ−αｖβ８）および配列番号１９６（ＶＨ−αｖβ８）または（ｖ）配列番号２３５（ＶＬ−αｖ）および配列番号２３６（ＶＨ−αｖ）の核酸配列を含む１または複数のベクターを宿主細胞に導入するステップと、（ｂ）培地中で宿主細胞を培養し、これによりコードされた抗体を発現させるステップと、（ｃ）発現した抗体を精製するステップとを有する、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）およびＨ鎖可変領域（ＶＨ）を含む組換えモノクローナル抗体を製造するための方法に関する。数種類のベクターが、上述の前記配列番号の内一配列のみを有することにより有利に異なることを理解するべきである。ステップ（ａ）において、そのそれぞれが上述の前記配列番号の内一配列を保有する２種のベクターを導入することが好ましい。
【００９７】
さらに、抗体、アミノ酸配列およびそれらの変化、それらをコードするポリヌクレオチドならびにウサギ抗体の調製に関する本明細書の従前の教示は妥当であり、好都合であれば組換えモノクローナルの製造に制限されることなく適用できると考えられる。
【００９８】
ホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)材料におけるインテグリンの検出のための本発明の抗体またはその断片の使用は、さらに別の目的である。現在まで、インテグリンに対して作製され、ＦＦＰＥ材料における複合体と特異的かつ確実に反応する古典的モノクローナル抗体は存在しない。本発明の抗体、特にウサギモノクローナルのみがこのように高い親和性および特異性を有し、インテグリンの非閉塞エピトープの検出を可能にする。本明細書において互換的に用いられている用語「非閉塞」および「露出」は、エピトープが抗体によって認識され得る抗原の分子確認を意味すると解釈される。したがって、ＦＦＰＥ材料における本発明の抗体と凍結材料におけるマウスモノクローナルとを比較すると、同じ染色パターンが観察される。さらに、ＦＦＰＥ材料における本発明の抗体と、ＥＬＩＳＡにおける単離型インテグリンおよび／または生細胞における天然インテグリンの状態を比較、好ましくはＦＦＰＥ材料における本発明の抗体と生細胞におけるそれを比較すると、実質的に同じ染色パターンが観察される。
【００９９】
本発明の好ましい一実施形態において、ＦＦＰＥ材料は組織である。ＦＦＰＥ組織は、先ず解剖または生検によって動物標本から分離された組織の一部である。次に、この組織は、その劣化または変性を防ぎ、組織学的、病理学的または細胞学的実験のために顕微鏡下で明確に検査するため固定される。固定は、それにより組織が固定化、死滅および保存される、染色および顕微鏡観察のための工程である。固定後プロセシングは組織の染色試薬に対する透過性を高め、その高分子をクロスリンクして安定化し所定の位置に固定化する。多くの固定液、例えばブアン(Bouine)固定液、ホルマリンまたは液体窒素は、この目的のために用いられる。次に、この固定された組織をワックスに包埋して、その薄切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色により染色するのを可能にする。その後、ミクロトームによる切片作製が行われて微細な切片が作製され、抗体による染色を顕微鏡下で検査される。
【０１００】
本発明のより好ましい一実施形態において、ＦＦＰＥ組織は腫瘍組織であり、最も好ましくはヒト腫瘍組織である。腫瘍は、具体的には、扁平上皮、膀胱、胃、腎臓、頭部、頸部、食道、子宮頸部、甲状腺、腸、肝臓、脳、前立腺、泌尿生殖路、リンパ系、胃、喉頭および／または肺の腫瘍の群から選択される。腫瘍は、さらに具体的には、肺腺癌、小細胞肺癌、膵癌、神経膠芽腫、結腸癌および乳癌の群から選択される。さらに、血液および免疫系の腫瘍、より具体的には、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病および／または慢性リンパ性白血病の群から選択された腫瘍が好ましい。このような腫瘍は、本発明の意義においては癌とも言う。
【０１０１】
本発明の抗体は、インテグリン検出のためにＦＦＰＥ材料とインキュベートされる。用語「インキュベーション」は、材料、抗体および／または抗原の種類に応じたある明確な期間におけるＦＦＰＥ材料と本発明の抗体との接触を表す。インキュベーション工程は、その最適化が当業者にとって公知のルーチンの手順に従った様々な他のパラメータ、例えば検出感度にも依存する。化学溶液の添加および／または物理的手順の適用、例えば熱による衝撃は、試料中の標的構造の接触性を改善することができる。インキュベーションの結果、特異的なインキュベーション産物が形成される。
【０１０２】
形成された抗体／抗原複合体の適切な検出試験は、当業者にとって公知のものである、あるいはルーチン業務として容易に設計することができる。多くの異なる種類のアッセイが知られており、その例を下に説明する。本発明に係るアッセイは、インテグリン発現の検出および／または定量化に適したいずれのアッセイであってもよいが、後者は、好ましくは本発明の一次抗体と特異的に相互作用する物質によって決定される。
【０１０３】
本明細書における用語「特異物質」は、信頼のおける結合を確実にするため本発明の抗インテグリン抗体に対して高親和性を有する分子を含む。該物質は、好ましくは抗体の一部、例えば定常領域、具体的にはウサギの定常領域、場合によってより具体的にはＦｃ断片に対し特異的である。ウサギ抗体に対して明確な数の特異抗体が存在する。一部とは、特定の機能の発現、すなわち認識のための構造上の決定基の提供に十分な領域への限定を表す。本発明の文脈において、用語「認識」は、特異物質と標的抗体との間の任意の種類の相互作用、特に、共有結合、疎水性／親水性相互作用、ファンデルワールス力、イオン対、水素結合、リガンド−受容体相互作用、エピトープと抗体結合部位との間の相互作用、ヌクレオチド塩基対形成その他等、共有結合性または非共有結合性の結合または会合に関するが、これらに限定されるものではない。このような会合は、ペプチド、タンパク質または他のヌクレオチド配列等、他の分子の存在も包含することができる。
【０１０４】
特異物質は、認識、結合および相互作用を可能にする仕方で標的分子と相互作用することのできる生物学的および／または化学的構造で構成される。具体的には、物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、ポリマーおよび５０〜１．０００Ｄａの間の分子量を有する小分子、好ましくはタンパク質および核酸の群から選択される。特異物質は、信頼のおける検出を確実にするために十分な感受性および特異性を発現する。特異物質は、抗インテグリン抗体に対して少なくとも１０−７Ｍの親和性を有する。特異物質は、その標的分子に対して好ましくは１０−８Ｍ、さらに好ましくは１０−９Ｍの親和性を有する。当業者であれば、特異という用語は、試料中に存在する他の生体分子が、抗インテグリン抗体に対する特異物質とは有意に結合しないことを示すよう用いられていることを理解するであろう。好ましくは、標的分子以外の生体分子との結合のレベルが、標的分子の親和性の僅か１０％、より好ましくは僅か５％以下の結合親和性を生じる。最も好ましくは、物質は、本発明の一次抗インテグリン抗体との排他的かつ方向性を持った相互作用を保証するため、単一特異性である。非常に好ましい特異物質は、親和性と特異性に関する上述の最小限の判断基準の両方を満たすであろう。
【０１０５】
タンパク質またはペプチドは、好ましくは、抗体、サイトカイン、リポカリン、受容体、レクチン、アビジン、リポタンパク質、糖タンパク質、オリゴペプチド、ペプチドリガンドおよびペプチドホルモンからなる群から選択される。より好ましくは、特異物質として抗体が用いられる。核酸は、好ましくは一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡ酵素、アプタマーおよび／またはｓｉＲＮＡ、あるいはそれらの一部である。より好ましい核酸プローブはアプタマーであり、ＲＮＡにおいて利用できる２'−ヒドロキシル基は、数通りの分子内および分子間接触を促進するため、最も好ましくはＲＮＡアプタマーである。アプタマーは、標準的なホスホラミダイト化学反応を用いて合成することができる。さらに、約３０ヌクレオチドを超えるＲＮＡアプタマーは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写によって有利に大量合成することができる。アプタマーの選択、合成および精製は、当業者によく知られている。
【０１０６】
特異物質は標識することができる。その際、標識は、特異物質固有の特徴、モニタリングされる特異的インキュベーション産物および適用される検出方法、すなわち、必要とされる感度、コンジュゲーションの容易さ、安定性要件ならびに利用できる器具使用および処理規定に依存する。標識方法は、標識が容易に検出されるのであれば、特に限定されるものではない。「標識された特異物質」は、標識の存在を検出することによって本発明の抗インテグリン抗体の存在が検出できるように、標識と、リンカーまたは化学結合により共有結合した、あるいはイオン、ファンデルワールス、静電、疎水性相互作用または水素結合により非共有結合した物質である。
【０１０７】
抗体とタンパク質との特異的な免疫学的結合は、直接的または間接的に検出することができる。下文において、抗体−タンパク質ペアは、インテグリンに対して作製された本発明の一次抗体か、一次抗インテグリン抗体に対して作製された二次抗体のいずれかを包含することを理解するべきである。本発明に係る適切な検出方法の好ましい例は、発光、特に蛍光、さらにはＶＩＳ発色および／または放射性発光である。
【０１０８】
発光は、化学発光、生物発光またはフォトルミネセンスの結果生じる光放射に関する。化学発光は化学反応の結果生じる可視光の放射に関し、一方、生物発光はルシフェラーゼの活性を必要とする。現在好ましいのは、蛍光刺激としても知られているフォトルミネセンスであり、これは光子の吸収によって生じ、好ましくは、波長が３０〜５０ｎｍに変化し、約１０−８秒の時間内に光子として再度放出される放射線によって提供される。蛍光検出のための装置は、通常の卓上蛍光光度計、蛍光マルチウェルプレートリーダー、光ファイバ蛍光光度計、蛍光顕微鏡および蛍光検出と一体型のマイクロチップ／マイクロ流体システムを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
ＶＩＳ発色は、肉眼で目視できるように任意の無彩色物質を可視化することを表す。好ましくは、発色強度は光度計によって測定される。
【０１１０】
放射性同位元素の放射線は、シンチレーションによって測定される。液体シンチレーションの工程は、シンチレーションカクテルと呼ばれる有機溶媒および溶質の系におけるβ放射の捕捉による、試料内のβ崩壊の検出に関与する。試料中の３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐおよび３５Ｓ等、放射性同位元素によって放射されるβ崩壊電子は溶媒分子を励起し、次にエネルギーを溶質に移動させる。溶質のエネルギー放射(光量子)は、シンチレーションカウンター内の光電子増倍管によって電気シグナルに変換される。カクテルは、試料の均一な懸濁液を維持する溶解補助剤としても作用しなければならない。多くの場合、ガンマ線光子は他の崩壊過程の結果生じ(系列崩壊)、新たに形成された原子核の余剰エネルギーを取り除く。これらは質量を持たず、その経路に沿った衝突による直接電離を、あるとしても殆ど生じない。ガンマ光子は、３種の機序、コンプトン効果、光電効果および対生成の内１または複数により、検出および量子化のために吸収される。本発明の好ましいガンマ崩壊同位元素は１２５Ｉである。
【０１１１】
直接標識は、抗体と結合した蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性核種等を含む。ヨウ素−１２５(１２５Ｉ)で標識した抗体を用いてもよい。タンパク質に特異的な化学発光抗体を用いた化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度非放射性検出に適している。蛍光色素で標識した抗体も適している。蛍光色素の例として、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド(Texas red)およびリサミン(lissamine)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
間接標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼその他等、本技術分野においてよく知られた様々な酵素を含む。抗インテグリン抗体と酵素との共有結合は、グルタルアルデヒドとのカップリング等、様々な方法により行うことができる。酵素と抗体の両方は、遊離アミノ基を経由してグルタルアルデヒドと連結され、ネットワーク状になった酵素および抗体の副産物は除去される。別の方法において、糖タンパク質の場合、ペルオキシダーゼ等の酵素は糖残基を経由して抗体とカップリングする。酵素は、過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化され、抗体のアミノ基と直接連結される。炭水化物を含有する他の酵素も、この仕方によって抗体とカップリングすることができる。酵素カップリングは、スクシンイミジル６−（Ｎ−マレイミド(maleimido)）ヘキサン酸塩等、へテロ二官能性リンカーを用いて、抗体のアミノ基とβ−ガラクトシダーゼ等の酵素の遊離チオール基を連結することによって行われてもよい。西洋わさびペルオキシダーゼ検出系は、例えば、過酸化水素の存在下において、４５０ｎｍで検出できる可溶性産物を生成する発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に用いることができる。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば、４０５ｎｍで直ちに検出できる可溶性産物を生成する発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸と共に用いることができる。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、４１０ｎｍで検出できる可溶性産物を生成する発色基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノキシド(galactopyranoxide)(ＯＮＰＧ)と共に用いることができる。ウレアーゼ検出系は、ウレア−ブロモクレゾールパープル等の基質と共に用いることができる。
【０１１３】
本発明の好ましい一実施形態において、抗体は、放射性核種や、例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、オレゴングリーン(Oregon Green)(商標)、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミン(tetrarhodimine)イソチオシアネート(ＴＲＩＴＣ)、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素や、例えば緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、フィコエリトリン等の蛍光マーカーや、腫瘍関連プロテアーゼによって活性化される自動消光蛍光化合物や、例えばルシフェラーゼ、ＨＲＰ、ＡＰ等の酵素や、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニンその他を含むが、これらに限定されない検出可能成分で標識される。
【０１１４】
本発明の別の好ましい一実施形態において、核酸は、その全てが本技術分野においてよく知られた、ジゴキシゲニン、ビオチン、化学発光物質、蛍光色素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、高電子密度試薬、酵素で標識、または放射性同位元素で標識される。本発明の範囲において、核酸を標識するための好ましい同位元素は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉであり、より好ましくは３２Ｐ、３３Ｐまたは１２５Ｉである。
【０１１５】
競合および非競合免疫測定法等、種々の免疫測定法の技法を用いることができる。用語「免疫測定法」は、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、競合的酵素免疫分析法(ＥＭＩＴ)、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬｌＳＡ)、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ(ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡ)および微粒子酵素免疫測定法(ＭＥＩＡ)等の酵素免疫測定法(ＥＩＡ)、さらにキャピラリー電気泳動免疫測定法(ＣＥＩＡ)、放射免疫測定法(ＲＩＡ)、免疫放射定量測定法(ＩＲＭＡ)、蛍光偏光免疫測定法(ＦＰＩＡ)ならびに化学発光アッセイ(ＣＬ)を含むが、これらに限定されない技法を包含する。必要に応じて、このような免疫測定法は自動化されてよい。免疫測定法はレーザー誘起蛍光と併せて用いてもよい。フローインジェクションリポソーム免疫測定法およびリポソーム免疫センサー等、リポソーム免疫測定法もまた、本発明における使用に適している。さらに、タンパク質／抗体複合体の形成がマーカー濃度に応じてピーク比シグナルに変換される光散乱増加をもたらす比濁分析アッセイは、本発明の方法における使用に適している。本発明の好ましい一実施形態において、インキュベーション産物は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、蛍光免疫測定法(ＦＩＡ)または可溶性粒子免疫アッセイ(ＳＰＩＡ)によって検出される。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡの構成成分は、免疫学的反応の一方のパートナーと結合する酵素である。インテグリンのトレーサー抗原(分析物誘導体)は、好ましくは単一の捕捉用抗体(以下一次とする)を用いた競合ＥＬＩＳＡにおいて標識され、一方、抗体は、好ましくは第二の抗体(以下二次とする)による抗原−抗体複合体の沈殿を含む非競合ＥＬＩＳＡにおいて好ましくは標識される。抗原および２種類の抗体からなる複合体は、サンドイッチ複合体とも呼ばれる。検出は、その後の酵素による、基質から、視覚的発色、生物発光、蛍光または電気シグナルの測定(酵素電極)によって認識される産物、好ましくは呈色産物への変換を含む。ペルオキシダーゼ(例えばＨＲＰ)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびＡＰ等、本発明における標識に好ましい酵素は、当業者にとって公知のものである。
【０１１７】
追加的に好ましくは、合成中に免疫試薬に取り込まれるか、あるいはその後にアッセイの免疫試薬、好ましくは抗体とカップリングされる、放射性同位元素を利用する放射性免疫測定法である。
【０１１８】
フルオロフォアで有利に標識される抗体は、ＦＩＡに用いられる。
【０１１９】
ＳＰＩＡは、凝集の結果生じる銀粒子の変色を利用する。二次抗体も指標反応も必要ないため、本発明の範囲において特に有用である。同様に有利であるのは、呈色したラテックス粒子と結合した抗体を用いたラテックス凝集試験である。しかし、これは、前の洗浄ステップにおいて非結合および／または非特異的に結合した抗原を除去するために、インテグリンの強力な固定化を必要とする。
【０１２０】
一般に、検出するためのあらゆる方法は、非結合抗体をインテグリン／抗体複合体から分離するための徹底的な洗浄ステップを含む。さらに、いずれの検出方法の実験手順も当業者によく知られている。
【０１２１】
直接または間接標識から生じたシグナルは、例えば、発色基質由来の呈色を検出するための分光光度計を用いて、あるいは１２５Ｉを検出するためのガンマカウンター等、放射線を検出するための放射線カウンターを用いて、あるいは特定波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光光度計を用いて解析することができる。酵素結合抗体を検出するため、ＥＭＡＸマイクロプレートリーダー(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州メンロパーク)等、分光光度計をメーカーの取扱説明書に従って用いて定量解析を行うことができる。本発明のアッセイは、必要に応じて自動化することができる、あるいはロボット制御により行うことができ、複数の試料由来のシグナルを同時検出することができる。
【０１２２】
観察され、必要に応じてカメラまたは他の記録装置(例えば、光ダイオードおよびデータ記憶装置)によって記録された光学像は、本明細書における実施形態のいずれかにおいて、例えば画像をデジタル化し、画像をコンピュータに保存および解析することによって必要に応じてさらに加工される。種々の市販の周辺機器およびソフトウェアは、デジタル化、デジタル化したビデオまたはデジタル化した光学像の保存および解析のために利用できる。従来のシステムの一つは、標本視野から得られた光を、本技術分野において一般に使用されている冷却電荷結合素子(ＣＣＤ)カメラへと送る。ＣＣＤカメラは、画素(ピクセル)の配列を含む。標本から来た光は、ＣＣＤにおいて撮像される。標本の領域に対応する特定のピクセルが標本抽出されて、各位置の光強度読み取りをなす。複数のピクセルを並行処理して速度を上げる。本発明の装置および方法は、例えば、蛍光または暗視野顕微鏡技法による任意の試料の観察に容易に用いられる。
【０１２３】
本発明の好ましい一実施形態において、配列番号９０のＤＴＭ−αｖβ３に対して作製された、配列番号９９（Ｌ−αｖβ３）および配列番号１００（Ｈ−αｖβ３）のアミノ酸配列からなるウサギハイブリドーマクローンは、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生する。これはαｖβ３と選択的に結合する。本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号１０のＤＴＭ−αｖβ５に対して作製された、配列番号１９（Ｌ−αｖβ５）および配列番号２０（Ｈ−αｖβ５）のアミノ酸配列からなるウサギハイブリドーマクローンは、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生する。これはαｖβ５と選択的に結合する。本発明のさらに別の好ましい一実施形態において、配列番号１３０のＤＴＭ−αｖβ６に対して作製された、配列番号１３９（Ｌ−αｖβ６）および配列番号１４０（Ｈ−αｖβ６）のアミノ酸配列からなるウサギハイブリドーマクローンは、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生する。これはαｖβ６と選択的に結合する。本発明のさらに別の好ましい一実施形態において、配列番号１７０のＤＴＭ−αｖβ８に対して作製された、配列番号１７９（Ｌ−αｖβ８）および配列番号１８０（Ｈ−αｖβ８）のアミノ酸配列からなるウサギハイブリドーマクローンは、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生する。これはαｖβ８と選択的に結合する。本発明のさらに別の好ましい一実施形態において、配列番号２１０のＤＴＭ−αｖに対して作製された、配列番号２１９（Ｌ−αｖ）および配列番号２２０（Ｈ−αｖ）のアミノ酸配列からなるウサギハイブリドーマクローンは、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生する。これはαｖと選択的に結合する。本発明のさらに別の好ましい一実施形態において、配列番号５０のβ３免疫原に対して作製された、配列番号５９（Ｌ−β３）および配列番号６０（Ｈ−β３）のアミノ酸配列からなるウサギハイブリドーマクローンは、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生する。これはβ３と選択的に結合する。しかし、本明細書において記載されているいずれの代替的な配列またはその組み合わせを、本発明の使用に適用してもよいことを理解するべきである。抗体およびそのアミノ(amino)配列に関する本明細書の従前の教示は妥当であり、好都合であれば用途に制限されることなく適用できると考えられる。
【０１２４】
さらに、ＦＦＰＥ材料におけるインテグリン検出において発明の使用を実施するため、本発明は、そのそれぞれが本発明に係る抗体、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含むキットとして実施することができる。具体的には、抗体は、腫瘍または他のヒト疾病の、特にアーカイブ保管したＦＦＰＥ材料におけるインテグリンプロファイル、例えば、αｖインテグリンまたは他のインテグリンの発現プロファイルの特性評価のための診断検出キットに取り込まれてよい。本発明のキットは、本発明の方法を実施するための書面の取扱説明書を含むまたはユーザーを書面の取扱説明書へと導く物品を含むことができる。一実施形態において、キットは、レポーター成分またはレポーター装置をさらに含む。キット成分およびその使用に関する本明細書の従前の教示は妥当であり、好都合であればキットに制限されることなく適用できると考えられる。
【０１２５】
本発明は、（ａ）選択されたインテグリンと結合することのできる抗体の試料を提供するステップと、（ｂ）インテグリン配列を整列させて、選択されたインテグリンのαサブユニットおよび／またはβサブユニットの最も近縁のホモログを同定するステップと、（ｃ）抗体試料を用いて、選択されたインテグリンの天然型およびその最も近縁のホモログ(単数または複数)についてディファレンシャルＥＬＩＳＡを実施し、これにより選択されたインテグリンに対する抗体を蓄積させるステップ(一次スクリーニング)と、（ｄ）ステップｃ）の蓄積された抗体を用いて、選択されたインテグリンの天然型および別のインテグリンについて別のディファレンシャルＥＬＩＳＡを実施し、これにより選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ(二次スクリーニング)と、（ｅ）少なくとも１種類の細胞系は選択されたインテグリンを発現でき、必要に応じて別の細胞系は選択されたインテグリンを発現できない、ＦＦＰＥ細胞系の免疫組織化学検査をステップｄ）の蓄積された抗体を用いて実施し、これにより選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ(三次スクリーニング)と、（ｆ）細胞系が哺乳動物において異種移植腫瘍として増殖される、ステップｅ）のＦＦＰＥ細胞系の免疫組織化学検査をステップｅ）の蓄積された抗体を用いて実施し、これにより選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ(四次スクリーニング)と、（ｇ）ステップｆ）の蓄積された抗体を用いて、アーカイブ保管したＦＦＰＥ腫瘍の免疫組織化学検査を実施し、これにより選択されたインテグリンに対する抗体をさらに蓄積させるステップ(五次(quintenary)スクリーニング)と、を含む、インテグリンαサブユニットおよび／またはβサブユニットそれぞれの最も近縁のホモログ間を識別することができ、ＦＦＰＥ材料における免疫組織化学検査に適した抗インテグリン抗体をスクリーニングするための方法を教示することによって、第二の課題を解決する。
【０１２６】
一次スクリーニングは、免疫原の天然、生物活性、未変性型におけるディファレンシャルＥＬＩＳＡによって実施される(Ｍｅｈｔａら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３０： ８６１〜８６９)。標的免疫原がαｖβ３である場合、例えば一次スクリーニングは、αｖβ３対αｖβ５で行われる。このことは、一次スクリーニングが、一次標的と最も近縁の配列相同性を有するインテグリンにおけるカウンタースクリーニングを利用することを意味する。β３鎖と最も近縁のホモログはβ５であり、一方αｖは両方の複合体に共通である。このようにして、最も識別能力のある抗体が得られる。同様に、αｖβ５は対αｖβ８によりスクリーニングすることができる。アルファ鎖特異抗体のスクリーニングは同じ手順に従ってよく、すなわち、αｖβ１はα５β１特異抗体のカウンタースクリーニングとして用いることができる。二次スクリーニングは、ＥＬＩＳＡにおいて組換えインテグリンのより広範な一組を検査し、さらなる特異性を確認、例えばαｉｉｂβ３は、αｖβ３抗体、好ましくはαｖβ３モノクローナルのβ３鎖単独ではなくむしろαｖ複合体に対する特異性の確認に用いることができる。ステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）の蓄積された抗体を用いて、選択されたインテグリンの天然型および別の近縁インテグリンにおけるディファレンシャルスクリーニングが実施されることが好ましい。三次スクリーニングは、そのインテグリン発現プロファイルに対して生化学的特性評価されたＦＦＰＥ細胞系のＩＨＣにおける抗体染色を検査する。四次スクリーニングは、ヌードマウスにおいて異種移植腫瘍として増殖した同じ細胞系におけるＦＦＰＥ−ＩＨＣを利用する。五次スクリーニングは、アーカイブ保管したＦＦＰＥヒト腫瘍を検査する。例えば、三次および四次スクリーニングは、陽性スクリーニング標的としてＭ２１、Ｕ８７ＭＧおよびＭ２４メラノーマにおいて行われる。これらの系統は全て、本出願人ら(in house)および文献によるαｖβ３を発現するプロファイリングから判明しており、一方Ａ５４９、ＮＳＣＬＣ、ＲａｊｉおよびＨＴ２９は陰性スクリーニング標的である。これらの系統は全て、本出願人らおよび文献によるαｖβ３を発現しないプロファイリングから判明している。五次スクリーニングは、好ましくはαｖβ３陽性として悪性メラノーマおよび神経膠芽腫において、またαｖβ３陰性ヒト腫瘍としてＮＳＣＬＣおよびＣＲＣにおいて行われる。
【０１２７】
スクリーニング方法の一実施形態において、ステップ（ｃ）〜（ｇ）の内いずれかは、蓄積された抗体の識別能力および／または特異性を検出するさらなるステップを含む。
【０１２８】
本発明の範囲において、腫瘍生検等、ＦＦＰＥアーカイブ保管した患者材料における、また生細胞フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による、インテグリンの有効な検出を可能にする抗体が初めて提供された。ＦＡＣＳにおける染色パターンは、当業者にとって公知の関連モノクローナル抗体（例えば、αｖβ３に対しＬＭ６０９、αｖβ５に対しＰ１Ｆ６）により得られたパターンと一致する。本発明の抗体が、ＦＦＰＥ材料のみならず生細胞におけるその天然状態においても各インテグリンを検出することが示された。インテグリン、特にαｖβ３、αｖβ５、αｖβ６またはαｖβ８は、本願の出願以前ではルーチンのＦＦＰＥ生検材料において確実に可視化することができなかった、一次療法の標的である。本発明の強力な抗体は、アーカイブ保管したＦＦＰＥ材料におけるそのインテグリン標的を、凍結保存材料において公知のαｖβ３、αｖβ５またはαｖβ６特異的モノクローナル抗体により観察された分布と同じ染色パターンで認識するが、凍結組織学的検査材料に対して、ＦＦＰＥで典型的な、よく知られた、より高い空間分解能および形態保存品質で認識する潜在能力を有する。非常に適切な抗体はウサギモノクローナルであるが、これは単純に別の種に由来するというわけではなく、これらのＲａｂＭａｂは特異性、再現性および永続性を有する（すなわち、同じ試薬および同じ特異性で永続的である）と有利に証明されている。αｖβ３またはαｖβ５クローンを用いて作製されるＲａｂＭａｂは、アーカイブ保管したヒト腫瘍におけるαｖβ３またはαｖβ５を、古典的抗αｖβ３抗体ＬＭ６０９または抗ａｖβ５抗体ＰＩＦ６で染色された凍結固定材料と同じ染色パターンで認識する。β３細胞質ドメインを用いて作製されたＲａｂＭａｂは、標的細胞の公知のαｖβ３発現プロファイルに対応するパターンで異種移植片アレイを染色する。産生され、必要に応じて下文で明らかになる方法のスクリーニングにより選抜される抗体は、主にＦＦＰＥインテグリンにおいて機能するが、これは単離型インテグリンにおけるＥＬＩＳＡ、生細胞集団におけるフローサイトメトリーに用いてもよいし、あるいはさらに他の標準的な生化学的適用に付してもよい。抗体は、観察されるヒト疾病と受容体の生化学特性との間に、一般的でないが有用な妥当性確認の橋を提供する。
【０１２９】
本発明は、精製インテグリンドメイン、具体的には精製インテグリン細胞外ドメイン、より具体的にはヒト起源のそれを用いて抗インテグリン抗体の作製を教示する。本発明の免疫原は、短期間の免疫化で高い抗体価を生じる。高い抗体価は、免疫化の後に得られてアッセイに用いられる血清の高い希釈率によって反映される。同時に、他の血清成分によって生じ得る有害効果は、その存在が希釈されるため大幅に低減される。力価は、内在性かつ高度に相同なウサギインテグリンから糖鎖付加において多様性を生じる昆虫組換え免疫原産生によって、有利にさらに上昇し得る。抗体およびその誘導体は、工業生産規模の哺乳動物発現系における高い特異性、安定性および発現、低い製造コストならびに簡便な取り扱いによって特徴付けられる。これらの特徴は、交差反応性および有害効果の欠如を含む、再現性のある作用のための、またその適合するインテグリン構造との信頼のおける安全な相互作用のための基礎を構成する。抗体は発現ベクターにクローニングできるため、基礎研究および診断のための絶対的に安定的かつ再現性のある材料ソースを提供する。さらに、適切なキットは費用効率的に生産される。
【０１３０】
本明細書に引用されているあらゆる参考文献は、これにより本発明の開示において本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【０１３１】
本明細書に記載されている特異抗体、特定の方法、使用およびキットは当然のことながら変化する可能性があるため、本発明はこれらに限定されないことを理解するべきである。本明細書に用いられている専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲の限定を企図していないことも理解するべきである。添付の特許請求の範囲を含む本明細書において、文脈が明らかにそれ以外を指示しない限り、単数形はその対応する複数の指示対象を含む。したがって、例えば「単数形の抗体」の言及は、単数または複数の異なる抗体を含み、一方「複数形の抗体」の言及は、適宜変更しつつ適用できる筈であり、「単数形の方法」の言及は、当業者にとって公知の均等のステップおよび方法その他諸々の言及を含む。他に規定がなければ、本明細書に用いられているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を持つ。
【０１３２】
本発明に係る重要な技法は、本明細書において詳細に説明されている。詳細に説明されていない他の技法は、当業者によく知られた公知の標準方法に相当する、あるいは、該技法は、引用されている参考文献、特許出願または標準的な文献においてより詳細に説明されている。本願において言及されていない他の微生物、細胞系、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点等は、市販されている。本願において他のヒントが与えられていなければ、それはほんの一例として用いられたものであり、本発明において重要であるとは考えられず、他の適切なツールや生物材料に置き換えることができる。本明細書に記載されている方法および材料と類似または均等のものは、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な例が下に記載される。次の例は、具体例として提供されるものであって、限定を目的とするものではない。例において、汚染活性物を含まない標準試薬およびバッファー（実用的であれば）が用いられる。例は、特に、特徴の明示された組み合わせに限定されず、本発明の技術的な課題が解決されるのであれば、例示的な特徴が非限定的に再度組み合わされてよいと解釈するべきである。
【０１３３】
図１は、αｖβ３外部ドメインに対して作製されたサブクローンＥ３５２８−２−１２の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系（左）および異種移植片（右）の免疫組織化学染色を示す。
【０１３４】
図２は、精製抗αｖβ３インテグリン抗体クローンＥ３５２８−２−７による、異種移植片におけるＭ２１細胞の細胞膜染色を示す。
【０１３５】
図３は、精製抗αｖβ３インテグリン抗体Ｅ３５２８−２−７、Ｅ３５２８−２−１１およびＥ３５２８−２−１２による、癌細胞系Ｍ２１（左）およびＭ２１異種移植片（右）の免疫組織化学染色を示す。
【０１３６】
図４は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）およびＳｐｏｔｆｉｒｅによるグラフ表示を活用した、抗αｖβ３抗体Ｅ３５２８−２−７、Ｅ３５２８−２−１１およびＥ３５２８−２−１２による免疫組織化学染色の解析を示す。
【０１３７】
図５は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）を活用した、抗体αｖβ３＿Ｅ３５２８−２−７およびマウスモノクローナル抗体２０Ｈ９による免疫組織化学染色の解析を示す。クローン２０Ｈ９は、β３インテグリン鎖に対して作製された。「発現（％ｍａｘ）」は、Ｍ２１の発現に対して正規化される。
【０１３８】
図６は、精製抗αｖβ３インテグリン抗体Ｅ３５３１−２２７−３およびＥ３５３１−２２９−３による、異種移植片におけるＭ２１細胞の細胞膜染色を示す。
【０１３９】
図７は、マルチクローン２２７（Ｅ３５３１−２２７−３、Ｅ３５３１−２２７−３およびＥ３５３１−２２７−６）の精製抗αｖβ３インテグリン抗体による、癌細胞系Ｍ２１（左）およびＭ２１異種移植片（右）の免疫組織化学染色を示す。
【０１４０】
図８は、Ｍ２１細胞における発現の％として算出した、クローンＥ３５３１−２２７の抗αｖβ３抗体（上）およびマウスモノクローナル抗β３抗体２０Ｈ９（下）とによる免疫組織化学染色の解析の比較を示す。発現は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）を活用して解析した。
【０１４１】
図９は、αｖβ５外部ドメインに対して作製されたサブクローンＥ３５３６−９９−３の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系（左）および異種移植片（右）の免疫組織化学染色を示す。
【０１４２】
図１０は、インテグリンαｖβ３およびαｖβ５の組換えヒト細胞外ドメインならびに全長精製血小板ｇｐｉｉｂｉｉｉａに対する、精製モノクローナルハイブリドーマ抗体Ｅ３５３１−２２７−３、Ｅ３５３１−２２９−３およびＥ３５３６−９９−２のＥＬＩＳＡプロファイルを示す。
【０１４３】
図１１は、精製抗αｖβ５インテグリン抗体クローンＥ３５３６−９９−３による、異種移植片におけるＡ４３１およびＨＣＴ１１６細胞の細胞膜染色を示す。
【０１４４】
図１２は、精製抗αｖβ５インテグリン抗体Ｅ３５３６−９９−１、Ｅ３５３６−９９−２およびＥ３５３６−９９−３による、癌細胞系Ｕ８７ＭＧ（左）ならびにＵ８７ＭＧおよびＡ４３１異種移植片の免疫組織化学染色を示す。
【０１４５】
図１３は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）およびＳｐｏｔｆｉｒｅによるグラフ表示を活用した、抗αｖβ５抗体Ｅ３５３６−９９−１、Ｅ３５３６−９９−２およびＥ３５３６−９９−３による免疫組織化学染色の解析を示す。
【０１４６】
図１４は、サブクローンＥ３８６６−５２−１の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系（左）および異種移植片（右）の免疫組織化学染色を示す。
【０１４７】
図１５は、サブクローンＥ３８６６−５２−１の精製抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す。
【０１４８】
図１６は、組換え抗αｖβ６インテグリン抗体による癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す。
【０１４９】
図１７は、組換え抗αｖβ６インテグリン抗体による、異種移植片における前立腺(prostate)癌細胞（上）およびＨＴ２９結腸癌細胞の細胞膜染色を示す。
【０１５０】
図１８は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）を活用した、抗αｖβ６抗体による免疫組織化学染色（ｒｕｎ３４２１）の解析を示す。
【０１５１】
図１９は、抗ａｖβ６組換え抗体によるスライド間および実験間の再現性を示す。
【０１５２】
図２０は、抗αｖβ８サブクローン１３３−９の上清による、ＦＦＰＥ癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す。
【０１５３】
図２１は、抗αｖβ８サブクローンＥ３８７５−１３３−９の精製抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す。
【０１５４】
図２２は、組換え抗αｖβ８インテグリン抗体ＥＭ１３３０９による癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す。
【０１５５】
図２３は、組換え抗αｖβ８インテグリン抗体ＥＭ１３３０９によるヒト組織の免疫組織化学染色を示す。
【０１５６】
図２４は、組換え抗αｖβ８インテグリン抗体による、異種移植片における前立腺癌細胞（上）およびＨ１９７５肺癌細胞の細胞膜染色を示す。
【０１５７】
図２５は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）を活用した、抗αｖβ８抗体ＥＭ１３３０９による免疫組織化学染色（ｒｕｎ３４２２）の解析を示す。
【０１５８】
図２６は、抗ａｖβ８組換え抗体ＥＭ１３３０９によるスライド間および実験間の再現性を示す。
【０１５９】
図２７は、抗αｖサブクローンＥ３８７５−１３−９の上清によるＦＦＰＥ癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す。
【０１６０】
図２８は、サブクローンＥ３８７５−１３−９の精製抗αｖ抗体によるＦＦＰＥ癌細胞系の免疫組織化学染色を示す。
【０１６１】
図２９は、組換え抗αｖ抗体ＥＭ０１３０９による癌細胞系および異種移植片の免疫組織化学染色を示す。
【０１６２】
図３０は、組換え抗αｖ抗体ＥＭ０１３０９による異種移植片におけるＤＵ−１４５（上）およびＨＴ２９細胞の細胞膜染色を示す。
【０１６３】
図３１は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）を活用した組換え抗αｖ抗体ＥＭ０１３０９による免疫組織化学染色の解析を示す。
【０１６４】
図３２は、抗αｖ組換え抗体ＥＭ０１３０９によるスライド間および実験間の再現性を示す。
【０１６５】
図３３は、精製抗β３インテグリン抗体クローンＥ３５９２−２−１２による、異種移植片におけるＭ２１細胞の細胞膜染色を示す。
【０１６６】
図３４は、精製抗β３インテグリン抗体Ｅ３５９２−２−４、Ｅ３５９２−２−１０およびＥ３５９２−２−１２による癌細胞系Ｍ２１（左）およびＭ２１異種移植片（右）の免疫組織化学染色を示す。
【０１６７】
図３５は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）およびＳｐｏｔｆｉｒｅによるグラフ表示を活用した、抗β３抗体Ｅ３５９２−２−４、Ｅ３５９２−２−１０およびＥ３５９２−２−１２による免疫組織化学染色の解析を示す。
【０１６８】
図３６は、画像解析（Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０）を活用した、抗体β３＿Ｅ３５９２−２−１２およびマウスモノクローナル抗体２０Ｈ９による免疫組織化学染色の解析を示す。クローン２０Ｈ９は、β３インテグリン鎖に対して作製された。「発現（％ｍａｘ）」は、Ｍ２１の発現に対して正規化された。
【０１６９】
図３７は、組換えヒトαｖインテグリン細胞外ドメインおよび全長精製血小板ｇｐｉｉｂｉｉｉａに対する、ウサギ抗インテグリン由来の精製モノクローナルハイブリドーマ抗体Ｅ３８７５−１３３−９、Ｅ３８６６−０５２−１およびＥ３８７５−０１３−９のＥＬＩＳＡプロファイルを示す。
【０１７０】
図３８は、組換えヒトαｖインテグリン細胞外ドメインおよび全長精製血小板ｇｐｉｉｂｉｉｉａに対する、ＥＢＮＡ組換えウサギ抗インテグリンモノクローナル抗体ＥＭ２２７０３、ＥＭ０９９０２、ＥＭ００２１２、ＥＭ０５２０１、ＥＭ１３３０９およびＥＭ０１３０９のＥＬＩＳＡプロファイルを示す。
【０１７１】
図３９は、ビオチンビトロネクチンをリガンドとして用いたＲａｂＭａｂ抗体ＥＭ２２７０３、ＥＭ０９９０２、ＥＭ００２１２の受容体阻害アッセイを示す。
【０１７２】
図４０は、Ｍ２１におけるＥＭ０２２７０３のＦＡＣＳ滴定を示す。
【０１７３】
図４１は、Ａ５４９におけるＥＭ００９９０２のＦＡＣＳ滴定を示す。
【０１７４】
図４２は、ＨＴ２９におけるＥＭ０５２０２のＦＡＣＳ滴定を示す。
【０１７５】
図４３は、Ｍ２４−ｍｅｔ細胞におけるＥＭ１３３０９のＦＡＣＳ滴定を示す。
【実施例】
【０１７６】
例１：免疫原の作製
例１．１：細胞外ドメインαｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８ｖの作製
バキュロウイルス感染により、昆虫細胞系(Ｈｉｖｅ  Ｆｉｖｅ)において組換えヒトインテグリン細胞外ドメイン、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８を生成した。昆虫系列の陰性対照としての利用は適切であった。発酵(fermentation)後、その下流の工程は次の要素を含んだ。＜Ｍａｂ  １４Ｄ９＞Ｔｏｙｏｐｅａｒｌアフィニティーカラムにおけるクロマトグラフィー、Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ透析チューブ(ＤＴＭ−αｖβ３およびＤＴＭ−αｖβ５に対し６〜８ｋＤａ、ＤＴＭ−αｖβ８に対し２５ｋＤａ)による透析、カットオフ値３０ｋＤａを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＦＦ  Ｌａｂｓｃａｌｅによる濃縮(ＤＴＭ−αｖβ５およびＤＴＭ−αｖβ８のみ)、カットオフ値３０ｋＤａを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットによる濃縮ならびにＭｉｌｌｅｘ  ＧＶによる０．２μｍ濾過（ＤＴＭ−αｖβ３、ＤＴＭ−αｖβ６、ＤＴＭ−αｖβ８のみ）。
【０１７７】
２．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が得られるよう、５０ｍＭ  Ｎａ(ＣＨ３ＣＯＯ)、０．２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４のバッファー中に２２ｍｇのＤＴＭ−αｖβ３を溶解した。次に、原液を２２本の５００μｌバイアルに分注した。２．３６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が得られるよう、５０ｍＭ  Ｎａ(ＣＨ３ＣＯＯ)、０．２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４のバッファー中に１０．６ｍｇのＤＴＭ−αｖβ５を溶解した。次に、原液を９本の５００μｌバイアルに分注した。２．３６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が得られるよう、５０ｍＭ  Ｎａ(ＣＨ３ＣＯＯ)、０．２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４のバッファー中に１５ｍｇのＤＴＭ−αｖβ６を溶解した。２．７８ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が得られるよう、５０ｍＭ  Ｎａ(ＣＨ３ＣＯＯ)、０．２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４のバッファー中に１６．６ｍｇ  ＤＴＭ−αｖβ８を溶解した。
【０１７８】
液体窒素中でアリコートを凍結し、−８０℃で保存した。ルーチン実験の実行によりＢＣＡアッセイし、クーマシー染色を用いたＳＤＳ  ｐａｇｅまたはウエスタンブロッティングにより分析を行った。次の抗体をウエスタンブロッティングによるＤＴＭ−αｖβ３検出に用いた。一次Ｍａｂ  ＡＰ３  ＥＭＤ３３０５１５／ＣＨ０００、５μｇ／ｍｌ、２時間ＲＴ、および二次ヤギ(gout)抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)×ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ、１１５−０５５−０６２、１：１０００、１時間ＲＴ、続いてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  Ｔｒａｃｔｉｎ×ＡＰ、ＢｉｏＲａｄ、１６１−０３８２、１：５０００。次の抗体は、ウエスタンブロッティングによるＤＴＭ−αｖβ５検出に用いた。一次Ｍａｂ＜１１Ｄ１＞−ＣＨ００４、２．５μｇ／ｍｌ、１時間ＲＴ、および二次ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)×ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ、１１５−０５５−０６２、１：１０００、１時間ＲＴ、続いてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  Ｔｒａｃｔｉｎ×ＡＰ、ＢｉｏＲａｄ、１６１−０３８２、１：５０００。次の抗体をウエスタンブロッティングによるＤＴＭ−αｖβ６検出に用いた。一次Ｍａｂ  ４４２−５Ｃ４×ビオチン＜ｈｕ−インテグリンβ６＞３３０５１０／ＣＨ００１、２μｇ／ｍｌ、２時間ＲＴ、および二次抗ビオチン×ＡＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０６４、１：２５００、２時間ＲＴ、続いてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  Ｔｒａｃｔｉｎ×ＡＰ、ＢｉｏＲａｄ、１６１−０３８０、１：５０００。次の抗体をウエスタンブロッティングによるＤＴＭ−αｖβ８検出に用いた。一次Ｍａｂ  ＬＭ１４２×ビオチンＰｏｏｌ  Ａ  ２６９Ａ０７Ｈ１．Ｇ０１、５μｇ／ｍｌ、２時間ＲＴ、および二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）×ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ、１１５−０５５−０６２、１：１０００、１時間ＲＴ、続いてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  Ｔｒａｃｔｉｎ×ＡＰ、ＢｉｏＲａｄ、１６１−０３８２、１：５０００、１時間ＲＴ。
【０１７９】
免疫原は、その同種基質、例えばビトロネクチン(αｖβ３およびαｖβ５)ならびにフィブロネクチン(αｖβ３)と結合するその能力によって、生物活性および特異性を有するものとして特徴付けた。これらの調製は、インテグリンの構造上の忠実性に対する優れた標準(gold−standard)として認められた(Ｍｅｈｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９８、３３０： ８６１〜８６９、Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１、２９４： ３３９〜３４５)。組換えヒトインテグリン細胞外ドメインＤＴＭ−αｖβ３、ＤＴＭ−αｖβ５、ＤＴＭ−αｖβ６およびＤＴＭ−αｖβ８を免疫原として用いた。
【０１８０】
例１．２：細胞質ドメインβ３の作製
大腸菌(E．coli)ＢＬ２１においてＧＳＴと融合したヒトβ３インテグリン細胞質ドメインを産生し、免疫原としての組換え融合タンパク質として精製した。発酵後、下流の工程は次の要素を含んだ。細胞溶解、フレンチプレス、封入体の調製、透析によるリフォールディングおよび濃縮。１．２７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が得られるよう、０．１Ｍ炭酸ナトリウム、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ９．５のバッファー中に５５ｍｇのタンパク質を溶解した。次に、原液を２本の１０ｍｌバイアル、４本の５ｍｌバイアルおよび４本の１ｍｌバイアルに分注した。アリコートを濾過(０．２μｍ)し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。ルーチン実験の実行によりＢｒａｄｆｏｒｄアッセイし、クーマシー染色を用いたＳＤＳ  ｐａｇｅまたはウエスタンブロッティングにより分析を行った。次の抗体をウエスタンブロッティングによるβ３検出に用いた。一次ヤギ抗ＧＳＴ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｎｏ．２７−４５７７−０１、１：５０００、１時間ＲＴ、および二次Ｆ(ａｂ’)２断片ウサギ抗ヤギＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)×ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ、３０５−０５６−０４５、１：１０００、１時間ＲＴ、続いてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｃｔｉｎ−ＡＰコンジュゲート、ＢｉｏＲａｄ、Ｎｒ．１６１−０３８２、１：５０００。
【０１８１】
例１．３：ｇｐｉｉｂｉｉｉａの作製
以前に詳述した通り、オクチルグルコシドを用いて、古くなったヒト血小板から全長ヒトｇｐｉｉｂｉｉｉａを抽出した(Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９５、１０８(Ｐｔ ８)：２８２５〜３８）。
【０１８２】
例２：抗体の作製
ウサギモノクローナル抗体の作製は、４段階の手順に従った。（Ａ）ウサギの免疫化およびポリクローナル血清のスクリーニング、（Ｂ）ハイブリドーマ細胞を作製するための融合およびマルチクローン上清のスクリーニング、（Ｃ）サブクローニングおよびサブクローン上清のスクリーニング、ならびに（Ｄ）抗体コードインサートのｃＤＮＡクローニング、配列決定および完全に定義された抗体を産生するためのＥＢＮＡ発現ベクターへの挿入。ウサギ採血(bleeds)、ハイブリドーマ上清および精製抗体を、標準プロトコールに従ってＥＬＩＳＡにおいて固定化した精製免疫原に対して解析した。送達におけるαｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８の組換え細胞外ドメインに対するディファレンシャルスクリーニングによって陽性クローンを再試験し、特異性および活性を確認した。
【０１８３】
ステップ（Ａ）において、免疫原当たり数匹のウサギが免疫化され、抗血清の力価をモニタリングした。ＦＦＰＥ材料において全ウサギの予備採血は低希釈率(１：５０)であってもシグナルを生じなかったが、融合前の一次採血(ポリクローナル血清)では、既にはっきりとした曖昧でないシグナルが得られ、細胞表面タンパク質に対する特異性を強く示唆した。各ウサギにつき３回の採血が行われ、８〜１２週間後、免疫原当たり１匹の陽性ウサギを融合用に選抜した。
【０１８４】
ステップ（Ｂ）において、血清陽性ウサギからＢ細胞を単離し、単離したウサギＢ細胞とウサギ融合パートナー細胞系２４０Ｅ−Ｗを融合してウサギハイブリドーマ細胞を作製した。９６ウェルプレートにおいてＥＬＩＳＡにより融合をスクリーニングした。１０〜１００個の陽性クローンの上清が得られ、５〜６週間後に免疫原当たり３個のマルチクローンを選抜した。
【０１８５】
ステップ（Ｃ）において、ハイブリドーマをクローニングし、スクリーニングして適切な特異抗原認識する抗体を分泌するクローンを選抜し、種々の方法(ウエスタンブロッティング、ＩＨＣ、ＩＣＣ、フローサイトメトリー等)を用いて抗体を特徴付けた。サブクローンの上清は、特にＥＬＩＳＡにより特異抗原認識に対してスクリーニングした。陽性の試験したサブクローン上清を凍結し、使用まで−８０℃で保存した。その後、サブクローン上清は、第一段階は癌細胞系アレイにおいて、第二段階は第一のスクリーニングを検証するための癌細胞系アレイと並行した異種移植片組織において行う、例３の２段階工程でスクリーニングした。
【０１８６】
ステップ（Ｄ）において、選抜された抗体クローンのＤＮＡ配列を切り出し、ＥＢＮＡ発現ベクターにクローニングし、自動ｃＤＮＡサンガー色素配列決定法により配列決定した。Ｐｈａｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００３、８４(３)：３３２〜３４２に従って組換え抗体をＥＢＮＡ細胞発現系において産生したが、一過性トランスフェクション系のためにＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞とｐＴＴ５ベクターを用いる際は、それを僅かに修正した。抗体産生は、ＥＬＩＳＡおよびＩＨＣにより確認した。ＴｕｂｏＣａｐｔｕｒｅキット(Ｑｉａｇｅｎ)を用いて、メーカーの指示に従ってハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを単離し、続いてオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。専売(proprietary)のプライマーＯＹＺ６４−２およびＯＹＺｖｈ３を用いて、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）をＰＣＲ増幅した。専用のプライマーＯＹＺ６２およびＯＹＺ７１を用いて、Ｌ鎖（Ｌ）全体をＰＣＲ増幅した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用いて、ＰＣＲ断片のＶＨ領域を消化した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて、Ｌ  ＰＣＲ断片を消化した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを用いて、全消化産物を精製した。精製後、ＶＨまたはＬ断片を対応するＨまたはＬ鎖専用の発現ベクターにライゲーションし、コンピテント細胞ＤＨ５α（ＭＣ  Ｌａｂ）に形質転換した。形質転換コロニーを突いて採取し、対応する制限酵素を用いてインサートの確認を行った(予想されるサイズにより確認：ＶＨは約４４０ｂｐ、Ｌは７４０ｂｐ)。予想サイズのインサートを含むプラスミドは、プライマーにＴＴ５を用いて配列決定した。対応するベクターからＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩによりＬ鎖全体またはＨ鎖断片を切り出し、その後Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製した。約５０〜１００ｎｇのｃＤＮＡインサートを保存した。
【０１８７】
例３：抗体のスクリーニングおよび特性評価のための方法
例３．１  アレイ組成
２７種類の癌細胞系および１種類の昆虫細胞系を、リン酸緩衝した４％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７中で、１６〜２４時間にわたって室温で固定し、パラフィンに包埋し、２８種類の細胞系パラフィンブロック(ＣＡＸ０５)に準備した。アレイに用いた細胞系の一部のインテグリン細胞表面発現プロファイルは、それぞれαｖβ３およびαｖβ５インテグリン複合体に対して作製されたＬＭ６０９(Ｃｈｅｒｅｓｈ ＆ Ｓｐｉｒｏ、ＪＢＣ １９８７、２６２：１７７０３〜１７７１２)およびＰ１Ｆ６(Ｖａｒｎｅｒ ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ、Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ａｄｖ Ｏｎｃｏｌ １９９６、８７：６９)等、定義されたマウスモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって予め特徴付けられている(Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９５、１０８(Ｐｔ８)：２８２５〜３８)。
ＣＡＸ０５：
Ａ４３１  扁平上皮癌(squams cancer oes)
Ａ５４９  肺癌
Ａ２７８０ＡＤＲ  卵巣癌
Ｃ８１６１  メラノーマ
Ｃａｌｕ６  肺腺癌(lung adeno)
Ｃｏｌｏ２０５  結腸癌
ＤＵ１４５  前立腺癌
ＨＣＴ１１６  結腸癌
ＨＴ２９  結腸癌
Ｉｇｒｏｖ１  卵巣癌
Ｋｙｓｅ３０  扁平上皮癌
Ｌｏｘ  メラノーマ
Ｍ２１  メラノーマ
Ｍ２４−ｍｅｔ  メラノーマ
ＭＣＦ７  乳癌
ＭＤＡ−ＭＢ２３  乳癌
ＭＤＡ−ＭＢ４６８  乳癌
ＭｉａＰａＣａ２  膵癌
ＮＣＩ−Ｈ４６０ＬＣ  肺癌
Ｏｖｃａｒ−３  卵巣癌
ＰＣ３  前立腺癌
Ｒａｊｉ  ＢｕＢＶＬｔｔ’s  Ｌｙｍ
Ｓｆ９  昆虫細胞
ＳＫＯＶ３  卵巣癌
Ｓｕｉｔ７  膵癌
ＳＷ７０７  結腸癌
Ｕ８７ＭＧ  神経膠芽腫
ＷＭ１６４  メラノーマ。
【０１８８】
異なる実験的研究から得られたアレイ(Ｘｅｎｏ−０８−Ａ、Ｘｅｎｏ−０８−Ｍｕ１)は、賦形剤(vehicle)処理マウス由来の異種移植片を用いることによって構成される。
Ｘｅｎｏ−０８−Ａ：
Ｍ２１  マウス
Ｕ８７ＭＧ  マウス
ＨＣＴ１１６  ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス
Ａ５４９(ヒト肺癌)  ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス
Ｃａｌｕ６  ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス
Ｘｅｎｏ−０８−Ｍｕ１：
Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｕ８７ＭＧ、Ｍ２１、Ｃａｌｕ６、Ａ４３１、ＢＴ４７４、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１９７５、ＭＤＡ  ＭＢ−２３１、Ｍｅｓ−Ｓａ／Ｄｘ５、ＰＣ３、ＳＷ７０７、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ。
【０１８９】
正電荷を帯びたＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ(登録商標)Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ、ドイツ、ブラウンシュワイク）上に、癌細胞系アレイおよび異種移植片アレイの３μｍ切片をマウントし、乾燥剤と共に−８０℃で保存した。
【０１９０】
例３．２：ＩＨＣ手順
切片の脱パラフィン化から始まる免疫組織化学染色手順は、染色装置Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ(商標)またはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ(登録商標)ＸＴ(Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、米国トゥーソン)を用いて行われた。脱パラフィン化の後、エピトープ回復のために、切片をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーｐＨ８中で加熱、あるいはプロテアーゼと３７℃で８分間(プロテアーゼ１)または１２分間(プロテアーゼ２)インキュベートした。３％過酸化水素(ＯｍｎｉＭａｐ(商標)またはＵｌｔｒａＭａｐ(商標)キットの一部、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)中でインキュベーションすることにより、内在性ペルオキシダーゼをブロッキングした。第一の免疫組織化学的実験の日に上清を室温で温めた後、終濃度０．０１％(ｗ／ｖ)になるようアジ化ナトリウムを添加し、上清を４℃で保存した。一系列の上清は常に同じ装置で染色した。切片をマルチクローンおよびサブクローンの上清と、あるいは組換えにより発現した抗体(２〜１０μｇ／ｍｌ；１スライド当たり１００μｌ）とインキュベートし、次にＯｍｎｉＭａｐまたはＵｌｔｒａＭａｐキットのＨＲＰコンジュゲートポリマー等、適切な二次抗体と１６分間３７℃でインキュベートした。西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)は、３,３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩(ＤＡＢ)／Ｈ２Ｏ２反応を触媒し、目視できる不溶性の暗褐色沈殿物を生成する。切片をヘマトキシリンで対比染色した。スライドを水道水中で洗浄し、脱水し、永久マウント剤Ｅｎｔｅｌｌａｎ(登録商標)Ｎｅｕ(ＶＷＲ、ドイツ)中にガラスカバースリップでマウントした。スライドは室温で保存し、パラフィンブロックは６℃で保存した。
【０１９１】
免疫組織化学染色手順の図式：
Ａ．前処理
・脱パラフィン化（温度：７５℃、８分間、続いてＥＺ  Ｐｒｅｐバッファーで７５℃、８分間）
・細胞馴化（Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡバッファーｐＨ８、時間：４８分間；温度：９５℃）
あるいは、
・プロテアーゼ馴化（プロテアーゼ１：０．５Ｕ／ｍｌまたはプロテアーゼ２：０．１Ｕ／ｍｌ；時間：８または１２分間；温度：３７℃）
Ｂ．検出
・一次抗体（容量：１００μｌ；時間：３２分間；温度：３７℃）
・二次抗体（ＯｍｎｉＭａｐまたはＵｌｔｒａＭａｐ、ＨＲＰコンジュゲート；容量：１００μｌ；時間：１６分間；温度：３７℃）
・検出（ＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ）
・対比染色（ヘマトキシリンＩＩ；時間：８分間）
・対比染色後（ブルーイング(Bluing)試薬）
・スライドクリーニング。
【０１９２】
細胞系アレイを×２０倍(目盛りｘ／ｙ：１ピクセル＝０．３８×０．３８μｍ２)で自動顕微鏡Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０を用いて走査した。０．１ｍｍ２の円形領域(インプット領域面積)を各組織スポットに設定した。陽性免疫組織化学的標識の褐色を、Ａｒｉｏｌ  ＳＬ−５０の画像解析ソフトウェアを活用して「色調」、「色相」および「彩度」の閾値を設定することにより定量化した。インプット領域面積における陽性面積は、褐色に標識された組織の分率である。陽性面積の強度は、赤色、青色および緑色フィルターを用いて撮像された３枚の白黒画像において測定された褐色の平均濃淡値であった。濃淡値は、０(黒)から白(２５５)の範囲に及ぶ。発現は、陽性面積分率＊(２５５−強度)に従って算出した。データは、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ(登録商標)ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ(商標)（バージョン９．０、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて表示した。
【０１９３】
例３．３：ＥＬＩＳＡプロトコール
コーティングバッファー(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０μＭ  ＭｎＣｌ２；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；ｐＨ７．５)から吸着(４℃；１６時間)させることにより、マイクロタイタープレートに組換えインテグリン(１μｇ／ｍｌ)をコーティングした。プレートを洗浄(洗浄バッファー：０．５％ＢＳＡ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ中に溶解)し、ブロッキング(１時間；４℃；５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中に溶解)し、洗浄バッファー中に段階的に希釈した一次抗体とインキュベート(１時間；３７℃)した。洗浄後、二次検出用抗体(ヤギ抗ウサギＨＲＰ；１：５０００)を添加し(１時間；３７℃)、続いて洗浄し、クエン酸−リン酸バッファー(ｐＨ５．０)中テトラメチルベンジジン(１００μｇ／ｍｌ)を用いて検出し、硫酸で発色し、試薬ブランクを対照として４５０ｎｍで読み取った。結果は、通常陽性対照値の＜５％であるブランク値を引いた後に表した。
【０１９４】
例３．４：ＦＡＣＳ解析
トリプシン(０．５μｇ／ｍｌ)／ＥＤＴＡ(０．２μｇ／ｍｌ)を用いて対数増殖期の細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳプラス０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ）中で洗浄し、抗インテグリン抗体とインキュベート(６０分間；４℃；ＦＡＣＳバッファー中に１０μｇ／ｍｌ)した。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ−４８８標識抗ウサギＩｇＧ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)またはヤギ抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ(Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ)で染色(３０分間；４℃)し、ＦＡＣＳバッファー(５００μｌ／チューブ)中で洗浄、再懸濁した。細胞をＦＡＣＳｃａｎ(Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)で解析し、陰性対照(一次抗体を用いずＰＩおよび二次標識抗体で染色した細胞)のＭＩＦに対して平均強度蛍光(ＭＩＦ)を正規化した。
【０１９５】
例３．５：評価および統計
グラフィックソフトウェアパッケージＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ(Ｖｅｒ５．０：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．カリフォルニア州ラホヤ)に適合した非線形曲線により、３回複製したデータポイントからＥＬＩＳＡにおける抗体結合のＩＣ５０を決定した。ＢＤ  Ｆａｃｓ走査プログラム(ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ＭａｃＯＳ８．６)を用いてフローサイトメトリーを解析した。
【０１９６】
例４：抗αｖβ３クローンおよび抗αｖβ３抗体の特性評価
例４．１：Ｅ３５２８−２−７、Ｅ３５２８−２−１１およびＥ３５２８−２−１２の特性評価
ウサギＥ３５２８のマルチクローン２および６３から得られた２４個のサブクローン由来の上清を、癌細胞系ＣＡＸ０５のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいて無希釈でスクリーニングした。明確な膜輪郭を欠く細胞質シグナルは、非インテグリン特異的として除外した。マルチクローン２のサブクローンは、細胞膜染色を示す(図１)。特定の細胞型に関するサブクローンの選択性を、マウス  モノクローナルＩｇＧクローン２０Ｈ９と比較した。クローン２０Ｈ９は、ＦＦＰＥにおいて交差反応する抗β３鎖抗体（Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９５、１０８(Ｐｔ ８)２８２５〜３８）であるが、これは低い結合親和性を有する。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ａにおける２回目の実験において陽性サブクローンを試験し、腫瘍組織における交差反応性を確認した（表１）。
【０１９７】
【表１】
2013502205.tif 000002
【０１９８】
染色強度、公知のαｖβ３インテグリン陽性細胞に関する選択性および細胞膜染色の質に基づき、３個のサブクローン、２−７、２−１１および２−１２を最終クローンとして選抜した。３個の抗αｖβ３クローンは、明瞭な細胞膜染色を示しつつ類似の染色特性を示した(図２)。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ｍｕ１において、Ｍ２１異種移植片は唯一陽性であった(図３)。サブクローンは、αｖβ３を発現しないことが知られているＡ５４９およびＨＣＴ１１６を含む様々な範囲の癌腫(表２)ならびに足場非依存的Ｒａｊｉ−Ｔ細胞リンパ腫において陰性であった。これらのデータは、抗体のαｖβ３インテグリンエピトープと一致した。癌細胞系アレイにおける３種の抗体による染色の選択性および強度は、ほぼ同一であった(図４)。３種の抗体の染色の選択性をモノクローナル抗β３インテグリン抗体クローン２０Ｈ９と比較した(図５、クローンＥ３５２８−２−７を示す)。細胞選択性に関し、３個のクローンはクローン２０Ｈ９と同様の特性を示し、これは３種の抗体のエピトープがαｖβ３エピトープであることを示した。Ｍ２１細胞系におけるαｖβ３の高い発現は、以前にクローンＬＭ６０９を用いたＦＡＣＳ解析によって示されている（表２；Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００、８７(５)７１６〜７２３）。
【０１９９】
【表２】
2013502205.tif 000003
【０２００】
例４．２：Ｅ３５３１−２２７およびＥ３５３１−２２９の特性評価
ウサギＥ３５３１のＢリンパ球の第二の融合実験の後、例４．１と同様にサブクローン２２７−３を得た。癌細胞系ＣＡＸ０５のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいて、マルチクローン２２７および２２９から得られた１８個のサブクローン由来の上清を、無希釈でスクリーニングした。明確な膜輪郭を欠く細胞質シグナルは、非インテグリン特異的として除外した。両方のマルチクローンのサブクローンは優れた細胞膜染色を示した。特定の細胞型に関するサブクローンの選択性をマウスモノクローナルＩｇＧクローン２０Ｈ９と比較した。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ａにおける２回目の実験において陽性サブクローンを試験し、腫瘍組織における交差反応性を確認した。染色強度、公知のαｖβ３インテグリン陽性細胞に関する選択性および細胞膜染色の質に基づき、６個のサブクローンＥ３５３１−２２７−２、−２２７−３、２２７−６、−２２９−３、２２９−９および−２２９−１１を最終クローンとして選抜した。
【０２０１】
選抜した最終クローンを培養し、抗体を精製した。６個の抗αｖβ３クローンは、明瞭な細胞膜染色を示しつつ同様の染色特性を示した(図６)。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ｍｕ１において、Ｍ２１異種移植片は唯一陽性であった(図７)。Ｕ８７ＭＧは陰性であった。癌細胞系アレイＣＡＸ０８における３種の抗体Ｅ３５３１−２２７−２、Ｅ３５３１−２２７−３およびＥ３５３１−２２７−６による染色の選択性は、ほぼ同一であった(図８)。抗αｖｂ３抗体の染色の選択性をモノクローナル抗β３インテグリン抗体クローン２０Ｈ９と比較し、クローンＥ３５３１−２２７−３を示した(図８)。細胞選択性に関し、クローンはクローン２０Ｈ９と同様の特性を示し、これは６種の抗体のエピトープがαｖβ３エピトープであったことを示唆した。Ｍ２１細胞系におけるαｖβ３の高い発現は、クローンＬＭ６０９を用いたＦＡＣＳ解析によって以前に示された（表３； Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００、８７(５):７１６〜７２３）。最大量のＩｇＧを産生するクローンＥ３５３１−２２７−３およびＥ３５３１−２２９−３を配列決定したところ、同一の配列を示した（下記を参照のこと）。
【０２０２】
【表３】
2013502205.tif 000004
【０２０３】
「細胞膜染色」およびＭ２１細胞における強いシグナル等(as are)、６個のクローンＥ３５３１−２２７−２、−２２７−３、２２７−６、−２２９−３、２２９−９および−２２９−１１の染色特性は、抗体のαｖβ３インテグリンエピトープと一致した。抗体は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織においてαｖｂ３インテグリンを検出した。ＥＭ２２７０３をさらに開発した。これは、インタクトなαｉｉｂβ３において等しく良好に反応し(ＩＣ５０はＥＬＩＳＡにおいて同一であった)、これが両方のパートナーとの複合体におけるβ３鎖を検出していることを示す。このことは、スクリーニングされる対象を正確に検出するモノクローナル抗体の能力を反映する。実際には交差反応性は、αｖβ３のｉｎ  ｓｉｔｕにおける検出に重大な不利益を実証するべきではない。αｉｉｂβ３は、マクロファージ／巨核球血液骨系列単独で発現し、αｖβ３に特徴的な組織内の位置における観察はほとんど予想されない。
【０２０４】
例５：抗αｖβ５クローンおよび抗αｖβ５抗体の特性評価
ウサギＥ３５３６のマルチクローン１３、４０および９９から得られた２７個のサブクローン由来の上清を、癌細胞系ＣＡＸ０５のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいて無希釈でスクリーニングした。３個のサブクローン９９−１、９９−２および９９−３は、細胞膜染色を示した（図９）。これらハイブリドーマ上清は、αｖβ３よりもαｖβ５に対して高度に特異的であり（見かけ上のＫｄにおける係数＞１００）、免疫原における５０ｐＭのＥＣ５０を有する（図１０）。異種移植片アレイにおいて陽性サブクローンを試験し、腫瘍組織における交差反応性を確認した（図９、右カラム）。細胞系は、異種移植片組織と比較すると、培養において増殖した場合に様々な程度のαｖβ５発現を示した。
【０２０５】
【表４】
2013502205.tif 000005
【０２０６】
染色強度、公知のαｖβ５インテグリン陽性細胞に関する選択性および細胞膜染色の質に基づき、３個のサブクローン９９−１、９９−２および９９−３を最終クローンとして選抜した（表４）。３個の抗αｖβ５クローンは、細胞膜を標識した(図１１)。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ｍｕ１において、数種類の異種移植片、特にＡ４３１は陽性であった(図１２)。３個の抗αｖβ５クローンＥ３５３６−９９−１、−９９−２および−９９−３は、細胞選択性および画像解析によって測定された染色強度に関して非常に類似した染色特性を示した(図１３)。高度なαｖβ５＿Ｅ３５３６−９９−１(または−９９−２もしくは−９９−３）シグナルを示した細胞系(すなわち、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、Ｋｙｓｅ３０、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４６０)は、クローンＰ１Ｆ６を用いたＦＡＣＳにより解析した高度なαｖβ５発現を示した（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９９７、２３４(１):１５６〜１６４、Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００、８７(５):７１６〜７２３）。Ｍ２１細胞系は、免疫組織化学検査による低いシグナルおよびＦＡＣＳ解析による対応する低いシグナルを示した（表５）。αｖ陰性であるＲａｊｉリンパ腫細胞は、免疫組織化学検査を用いた癌細胞系アレイにおいてシグナルを示さなかった。
【０２０７】
【表５】
2013502205.tif 000006
【０２０８】
サブクローン特性は、αｖβ５インテグリンの分布に関してＦＡＣＳおよび生化学データと一致し、サブクローン９９をαｖβ５インテグリンエピトープと反応するものとして支持した。ｃＤＮＡ配列決定から明らかになった通り、クローン９９は独自のハイブリドーマ細胞に由来した（下記を参照のこと）。
【０２０９】
例６：抗αｖβ６クローンおよび抗αｖβ６抗体の特性評価
これらのマルチクローンから得られた３３個のサブクローン由来の上清を、無希釈で癌細胞系ＣＡＸ０８のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいてスクリーニングした。明確な膜輪郭を欠く細胞質シグナルは、非インテグリン特異的であるとして除外した。癌細胞系において試験した多くのサブクローン上清は、加熱およびプロテアーゼ前処理後に陽性であった。マルチクローン５２（図１４）、１０６および１１８のサブクローンは、優れた細胞膜染色を示した。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ｍｕ１における２回目の実験において陽性サブクローンを試験し、腫瘍組織における交差反応性を確認した。プロテアーゼ前処理は、サブクローン５２および１０６に対してより強いシグナルを生じた。したがって、プロテアーゼ前処理した異種移植片のみにおいてこれらのサブクローン上清を試験した。マルチクローン５２の異なるサブクローンは、それらの染色選択性および特異性において同一であった。マルチクローン５２および１１８のサブクローンとは対照的に、クローン１０６−１はＳＷ７０７において陰性であった（表６）。
【０２１０】
【表６】
2013502205.tif 000007
【０２１１】
異種移植片組織において、非小細胞肺癌細胞系(ＮＳＣＬＣ)Ｈ１９７５は最高の染色強度を示した(図１４Ｈ)。癌細胞系アレイにおいては２種の扁平上皮癌Ｋｙｓｅ３０(図１４Ｉ)およびＡ４３１(図１４Ａ)が、また異種移植片アレイにおいてはＡ４３１異種移植片(図１４Ｂ)が、強いシグナルを示した。癌細胞系アレイにおいて高度な染色強度を有する細胞系は、ＨＴ２９(図１４Ｇ)、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、Ｃｏｌｏ２０５およびＡ４３１であった。このことは、これらの細胞系における高度なβ６インテグリンｍＲＮＡと一致する。マルチクローン５２、１０６および１１８のサブクローン上清の選択性および特異性は、抗体によって認識されるαｖβ６エピトープと一致する。染色強度、公知のαｖβ６インテグリン陽性細胞に関する選択性および細胞膜染色の質に基づき、９個のサブクローン５２−１、５２−２、５２−３、５２−４、５２−６、５２−８、５２−９、１０６−１および１１８−１を最終クローンとして選抜した(表６)。同一染色のサブクローンの内、最高のＩｇＧ濃度を有するサブクローンを最終クローンとして選抜した。
【０２１２】
最高のＩｇＧ濃度を有するクローンであるクローンＥ３８６６−５２−１を培養し、標準プロトコールに従って抗体を精製した。抗体の活性は、癌細胞系アレイにおけるＩＨＣによって示した(図１５)。組換え抗体を用いて、癌細胞系アレイおよび異種移植片の数枚のスライドを染色した(図１６)。ＨＴ２９結腸癌、Ｈ１９７５肺癌および患者前立腺腫瘍外植片ＰＲＸＦ  ＭＲＩＨ（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ、フライブルク）の異種移植片において、抗αｖβ６組換え抗体は顕著なシグナルを示し、一方β６  ｍＲＮＡを発現しないＭ２１メラノーマ異種移植片は陰性であった（図１６）。抗αｖβ６組換え抗体は明瞭な細胞膜染色を示した（図１７）。画像解析を活用して癌細胞系アレイにおけるシグナルを定量化した（図１８）。ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５またはＭＤＡ−ＭＢ４６８等、強い抗体染色シグナルを有する細胞系は、β６インテグリンｍＲＮＡの高いｍＲＮＡレベルを有する細胞系と一致した。組換え抗αｖβ６抗体は、自動染色手順により高度なスライド間（ｒ＝０．９９６）および実験間（ｒ＝０．９９１、図１９）再現性を示した。
【０２１３】
αｖβ６インテグリンペプチドに対して作製されたウサギＩｇＧ組換え抗体αｖβ６（ＥＭ０５２０１）は、ＦＦＰＥ組織に適切であった。「細胞膜染色」および高度なβ６インテグリンｍＲＮＡを発現する細胞系における強いシグナル等、組換え抗体αｖβ６（ＥＭ０５２０１）のＥＬＩＳＡ特異性および染色特性は、抗体のαｖβ６インテグリンエピトープと一致した。
【０２１４】
例７：抗αｖβ８クローンおよび抗αｖβ８抗体の特性評価
これらのマルチクローンから得られた３６個のサブクローン由来の上清を、癌細胞系ＣＡＸ０８のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいて無希釈でスクリーニングした。３６個のサブクローン全てが膜シグナルを示し、非インテグリン特異的細胞質染色のために除外されたものはない。癌細胞系において試験した多くのサブクローン上清は、加熱およびプロテアーゼ前処理後に陽性であった。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ｍｕ１においてさらに試験して、腫瘍組織における交差反応性を確認するため、各マルチクローンにつき最高ＩｇＧ濃度を有する４個のサブクローンを選抜した（図２０）。プロテアーゼ前処理は、サブクローンに対しより強いシグナルをもたらした。マルチクローン６のサブクローンは、異種移植片において陰性であった。Ｏｖｃａｒ−３、Ｍ２４ｍｅｔ、ＭＤＡ−ＭＢ４６８およびＡ４３１等、癌細胞系アレイにおいて高度な染色強度を有する細胞系は、最高のβ８インテグリンｍＲＮＡ発現を示した（表７）。公知のβ８  ｍＲＮＡ発現に関する選択性および細胞膜染色の質に基づき、サブクローン４０−４、４０−１０、４０−１１、１３３−５、１３３−８および１３３−９を最終クローンとして選抜した。同一染色であったサブクローンの内、最高ＩｇＧ濃度を有するサブクローンを最終クローンとして選抜した。
【０２１５】
【表７】
2013502205.tif 000008
【０２１６】
最高ＩｇＧ濃度を有するクローンであるクローンＥ３８７５−１３３−９を培養し、標準プロトコールに従って抗体を精製した。癌細胞系アレイにおけるＩＨＣによって抗体の活性を示した（図２１）。
【０２１７】
組換え抗体を用いて、癌細胞系アレイ、異種移植片および正常ヒト組織から生じたアレイの数枚のスライドを染色した。その全てがβ８  ｍＲＮＡを発現する癌細胞系Ｏｖｃａｒ−３(卵巣癌)、Ｍ２４−ｍｅｔ(メラノーマ)およびＭＤＡ−ＭＢ４６８(乳癌)は陽性であり、一方β８  ｍＲＮＡを持たないＭＣＦ−７細胞(乳癌)は陰性であった（図２２）。これらの細胞系から異種移植片を利用することはできない。Ｈ１９７５肺癌異種移植片およびより強力な前立腺腫瘍外植片ＰＲＸＦ  ＭＲＩＨ（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ、フライブルク）異種移植片において、抗αｖβ８組換え抗体はある程度のシグナルを示した（図２２）。ヒト末梢神経において最も強いシグナルが観察された（図２３）。抗αｖβ８組換え抗体は明瞭な細胞膜染色を示した（図２４）。画像解析を活用して癌細胞系アレイにおけるシグナルを定量化した（図２５）。Ｏｖｃａｒ−３、Ｍ２４−ｍｅｔおよびＭＤＡ−ＭＢ４６８等、強い抗体染色シグナルを有する細胞系は、β８インテグリンｍＲＮＡの高度なｍＲＮＡレベルを有する細胞系と一致した。組換え抗αｖβ８抗体は、高度なスライド間(ｒ＝０．９８２)および実験間(ｒ＝０．９８６、図２６)再現性を示した。
【０２１８】
αｖβ８インテグリンペプチドに対して作製されたウサギＩｇＧ組換え抗体αｖβ８（ＥＭ１３３０９）は、ＦＦＰＥ組織に適切であった。「細胞膜染色」、高度なβ８インテグリンｍＲＮＡを発現する細胞系における強いシグナルおよび有髄末梢神経の強い標識等、組換え抗体αｖβ８（ＥＭ１３３０９）のＥＬＩＳＡ特異性および染色特性は、抗体のαｖβ８インテグリンエピトープと一致した。
【０２１９】
例８：抗αｖクローンおよび抗αｖ抗体の特性評価
予め選抜されたαｖβ８だけではなくαｖβ６と結合するマルチクローンは、マルチクローンＥ３８６６−６８およびＥ３８７５−１３であった。これらのマルチクローンから得られた２４個のサブクローン由来の上清を、癌細胞系ＣＡＸ０８のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいて無希釈でスクリーニングした。２４個のサブクローンは全て強い細胞膜シグナルを示したが、ある程度の細胞質シグナルも示した（図２７）。９個のサブクローン、すなわちマルチクローンＥ３８７５−１３から５個およびマルチクローンＥ３８６６−６８から４個を異種移植片組織における試験のため選抜し、腫瘍組織における交差反応性を確認した。非常に強いシグナルのために、クローン１３−３、１３−９および６８−７の上清を１：５および１：１０希釈した。希釈した上清１３−３および１３−９は、Ｒａｊｉリンパ腫細胞およびＳｆ９昆虫細胞を除いた癌細胞系アレイにおける全細胞を染色した。異種移植片は強い細胞膜シグナルを示し、ある程度の細胞質染色も示す（図２７）。１：５希釈した後、サブクローン６８−７は、サブクローン１３−３に陽性の細胞系であるＭｉａＰａｃａ２を染色しなかった。マルチクローンＥ３６８８−６８のサブクローンのエピトープは、Ｅ３８７５−１３とは異なる可能性がある。それらの最高ＩｇＧ濃度に基づき、サブクローンＥ３８７５−１３−３および−１３−９を最終クローンとして選抜した（表８）。
【０２２０】
【表８】
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【０２２１】
最高ＩｇＧ濃度を有するクローンであるクローンＥ３８７５−１３−９を培養し、標準プロトコールに従って抗体を精製した(プロテインＧセファロース、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ)。癌細胞系アレイにおけるＩＨＣにより抗体の活性を示した(図２８)。
【０２２２】
組換え抗体を用いて癌細胞系アレイおよび異種移植片アレイの数枚のスライドを染色した(図２９)。癌細胞系および異種移植片において、抗αｖ組換え抗体は顕著なシグナルを示した。陰性であったのは、αｖインテグリンｍＲＮＡを発現しないＲａｊｉおよびＰｆｅｉｆｆｅｒリンパ腫等、リンパ腫細胞系であった。抗αｖ組換え抗体は明瞭な細胞膜染色を示した(図３０)。画像解析を活用して癌細胞系アレイにおけるシグナルを定量化した(図３１)。組換え抗αｖ抗体は、スライド間(ｒ＝０．９４７)および実験間(ｒ＝０．９２４、図３２)再現性を示した。
【０２２３】
αｖβ８インテグリンペプチドに対して作製されたウサギＩｇＧ組換え抗体αｖ(ＥＭ０１３０９)は、ＦＦＰＥ組織に適切であった。「細胞膜染色」、αｖインテグリンｍＲＮＡを発現する細胞系における強いシグナル、およびαｖインテグリンを発現しないリンパ腫細胞系においてシグナルがない等、組換え抗体αｖ(ＥＭ０１３０９)のＥＬＩＳＡ特異性および染色特性は、抗体のαｖ鎖エピトープと一致した。
【０２２４】
例９：抗β３細胞質ドメインインテグリンクローンおよび抗β３細胞質ドメインインテグリン抗体の特性評価
マルチクローン２および６７から得られた２４個のサブクローン由来の上清を、癌細胞系ＣＡＸ０５のＦＦＰＥ細胞系アレイにおいて無希釈でスクリーニングした。明確な膜輪郭を欠く細胞質シグナルは、非インテグリン特異的として除外した。マルチクローン２のサブクローンは、優れた細胞膜染色を示した。特定の細胞型に関するサブクローンの選択性をマウスモノクローナルＩｇＧ、クローン２０Ｈ９と比較した。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ａにおける第二の実験において陽性サブクローンを試験し、腫瘍組織における交差反応性を確認した。染色強度、公知のαｖβ３インテグリン陽性細胞に関する選択性および細胞膜染色の質に基づき、３個のサブクローン、２−４、２−１０および２−１２を最終クローンとして選抜した（表９）。
【０２２５】
【表９】
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【０２２６】
選抜した最終クローンを培養し、抗体を精製した。３個の抗β３クローン、Ｅ３５９２−２−４、−２−１０および−２−１２は、明瞭な細胞膜染色を示しつつ同様の染色特性を示した(図３３)。異種移植片アレイＸｅｎｏ−０８−Ｍｕ１において、Ｍ２１異種移植片は陽性であった(図３４)。Ｕ８７ＭＧは陰性であった。癌細胞系アレイＣＡＸ０８における３種の抗体による染色の選択性は、ほぼ同一であった(図３５)。染色の強度は変化し、クローンＥ３５９２−２−１２に対して最も強かった。３種の抗体の染色の選択性をモノクローナル抗β３細胞外ドメインインテグリン抗体クローン２０Ｈ９と比較し、クローンＥ３５９２−２−１２について示した(図３６)。細胞選択性に関し、３個のクローンはクローン２０Ｈ９と同様の特性を示し、これは３種の抗体のエピトープがβ３エピトープであることを示唆した。Ｍ２１細胞系における高度なαｖβ３発現は、クローンＬＭ６０９を用いたＦＡＣＳ解析によって以前に示された（表１０；Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００、８７(５):７１６〜７２３）。
【０２２７】
【表１０】
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【０２２８】
「細胞膜染色」およびＭ２１における強いシグナル等、３個のクローンＥ３５９２−２−４、−２−１０および−２−１２の染色特性は、抗体のβ３インテグリンエピトープと一致した。β３インテグリンペプチドに対して作製されたウサギハイブリドーマクローンＥ３５９２−２−４、２−１０および−２−１２は、ＦＦＰＥ組織に適した抗体を産生した。それらのエピトープ認識は、それらの結合するβ３細胞質ドメインエピトープと一致した。最も強く染色する抗体Ｅ３５９２−２−１２を産生するクローン由来の抗体鎖をｃＤＮＡクローニングし、抗体コード領域を複数回配列決定した（下記を参照のこと）。
【０２２９】
例１０：配列決定および配列リスト
数個のクローンをｃＤＮＡ配列決定により評価した（表１１）。コンピュータ可読形式に記録された情報は、書面の配列リストと同一である。
【０２３０】
【表１１】
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【０２３１】
クローン由来の各Ｈ鎖およびＬ鎖につき一次配列決定を３回行い、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いてコンティグに組み立て、ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメントツールを用いて解析した。クローンＥ３５３１−２２７−３および−２２９−３は同一のＨ鎖およびＬ鎖配列を有し、抗体集団の単クローン性が確認された。クローンＥ３５３６−９９−１、−９９−２および−９９−３は、同一のＨ鎖およびＬ鎖配列を有し、抗体集団の単クローン性が確認された。
【０２３２】
例１１：組換えＲａｂＭａｂは、ＥＬＩＳＡによりそのリガンドに特異的である
プレートにインテグリンが１μｇ／ｍｌコーティングされた標準ＥＬＩＳＡ条件において、抗体は、ｇｐｉｉｂｉｉｉａとαｖβ３の両方と交差反応性(ＩＣ５０が約(〜)１００倍低い)を示すＥＭ０９９０２を例外として、４  ｌｏｇ濃度を超えて定義されるように基本的にその免疫原に対して単一特異性であり、最も近縁のインテグリン鎖と有意に交差反応せず（図１０、３７、３８）、よって複合体のβ５鎖とβ３鎖の両方における関連エピトープを明らかに認識した。αｖβ５の発現はαｖβ３よりも高頻度に見られ、ＥＭ０９９０２由来のシグナルはＩＨＣにおいて非常に強いため、これはＦＦＰＥ利用に重大には影響しないであろう。他の組換え抗体の特異性は、ハイブリドーマ上清およびそれに由来する抗体とＥＬＩＳＡおよびＩＨＣ染色において区別できなかった(図１０、３７、３８)。実際に、ｃＤＮＡ配列決定において、抗αｖβ３抗体の２種、ＥＭ２２７０３およびＥＭ２２９０３は、単一クローンに由来することが判明した。ＥＬＩＳＡにおける特異性およびＥＬＩＳＡにおいて、ＩＣ５０として表す見かけ上の結合親和性を表１２に示す。
【０２３３】
【表１２】
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【０２３４】
例１２：組換えＲａｂＭａｂは、その受容体とのリガンド結合に影響を及ぼさない
抗体と小分子は両者共にインテグリン活性を抑制または増強することができるが、本明細書において選抜されたＲａｂＭａｂは、リガンド結合に効果がなかった（図３９）。予測通りに反応したαｖｂ３およびαｖｂ５の阻害剤は、陽性(シレンジタイド)および陰性(ｃ(ＲβＡ−ＤｆＶ))であった。
【０２３５】
例１３：生細胞フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）における組換えＲａｂＭａｂ
ＦＡＣＳにおいて、天然インテグリンは、それらの天然糖鎖付加パターンをｉｎ  ｓｉｔｕで示し、そのためこれらは特異性の「優れた標準」を表す。標準的な十分に特徴付けられたマウスモノクローナル抗体と比較して、ＦＡＣＳにおいてＲａｂＭａｂを評価した。αｖβ８に対する抗体は市販されていない。抗体はＦＡＣＳにおいて細胞型依存的様式で反応し、ＦＡＣＳプロファイルは、抗体のＥＬＩＳＡプロファイルと密接に一致した。これらの結果を、第二層(second layer)の対照抗体に対して正規化した蛍光の平均強度としてまとめた（表１３）。ＲａｂＭａｂとマウスＭａｂとの間の発現の絶対レベルの差は、第二層の抗体の変化する親和性によるものである可能性があった。
【０２３６】
【表１３】
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【０２３７】
マウス抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞が高レベルのαｖ、αｖβ３およびαｖβ５を発現し、αｖβ６またはαｖβ８を発現しないことを示した。これらの細胞において、ＲａｂＭａｂ  ＥＭ０１３０９は強く、１７Ｅ６マウス抗αｖ比較体に匹敵するレベルで反応した。マウス抗体は、ＨＴ−２９ＣＲＣ細胞において高レベルのαｖを示し、αｖβ３はなく、高レベルのαｖβ５およびある程度のαｖβ６を示した。ＲａｂＭａｂはこれを裏づけ、高度のαｖβ８インテグリン発現も示した。ＲａｂＭａｂ  ＥＭ０１３０９は、弱く反応した。マウス抗体は、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞において高レベルのαｖを示し、αｖβ３は示さず、高レベルのαｖβ５を示し、αｖβ６は示さなかった。ＲａｂＭａｂ結合はこれを裏づけ、αｖβ８インテグリンの発現も示さなかった。ＲａｂＭａｂ  ＥＭ０１３０９は反応しなかった。マウス抗体は、高レベルのαｖ、αｖβ３およびαｖβ５を示し、αｖβ６を示さず、Ｍ２４  Ｍｅｔメラノーマ細胞におけるβ１の強い発現を示した。ＲａｂＭａｂはこれを裏づけ、ＥＭ１３３０９の強い結合も示し、αｖβ８インテグリンの発現を明らかにした。ＲａｂＭａｂ  ＥＭ０１３０９は反応しなかった。マウス抗体は、高レベルのαｖ、αｖβ３およびαｖβ５を示し、αｖβ６を示さず、Ｍ２１メラノーマ細胞においてβ１の強い発現を示した。ＲａｂＭａｂはこれを裏づけ、高レベルのＥＭ１３３０９結合も示し、αｖβ８発現を示した。ＲａｂＭａｂ  ＥＭ０１３０９は反応しなかった。マウス抗体は、Ｍ２１−Ｌメラノーマ細胞においてαｖ、αｖβ３、αｖβ５またはαｖβ６を示さず、β１の強い発現を示した。バックグラウンドを超えて有意に結合するＲａｂＭａｂはない。マウス抗体は、Ｍ２１−ｇｐｉｉｂメラノーマ細胞においてαｖ、αｖβ３、αｖβ５またはαｖβ６を示さなかったが、β１およびβ３の強い発現を示した。ＲａｂＭａｂ  ＥＭ０５２０１、ＥＭ１３３０９およびＥＭ０１３０９は結合しなかった。しかし、ＥＭ２２７０３とＥＭ０９９０２は両方共に反応し、ＥＭ２２７０３の反応は強かった。このことは、ＥＭ２２７０３がαｉｉｂβ３と交差反応でき、ＥＭ０９９０２がαｖβ３とαｉｉｂβ３の両方と弱く交差反応できた、ＥＬＩＳＡデータ（例１１を参照のこと）を支持する。
【０２３８】
生細胞フローサイトメトリーは明解であった。抗体は、αｖ欠損Ｍ２１−Ｌ細胞系ではバックグラウンドを超えて反応しなかった。ＥＭ２２７０３およびＥＭ０９９０２によって、ならびにＥＭ０５２０１およびＥＭ１３３０９によって得られた正規化ＭＩＦは１００に近いため、これは、標準的なＬＭ６０９およびＰ１Ｆ６試薬によって得られるものより相当に大きい、基礎的なルーチンで得られる抗体のシグナル・ノイズ比を示唆する。これが一次ＲａｂＭａｂそれ自身の特性ではなく、より高度な親和性の第二層蛍光発生(fluorescinated)試薬の結果であるかは依然として明らかではなく、いかなる理由であれ、ＲａｂＭａｂはＦＡＣＳのための優れた試薬であった。
【０２３９】
ＥＭ２２７０３は、ＦＡＣＳにおいてＬＭ６０９に匹敵する染色を生じ、これがαｖβ３複合体を認識するがＭ２１−ｇｐｉｉｂとも強く反応することを確認し、ＥＭ２２７０３により認識されているのがインテグリン複合体におけるβ３鎖であることを示した。
【０２４０】
ＥＭ０９９０２染色は、一般にＰ１Ｆ６染色に匹敵するが、β３鎖およびβ５鎖と弱く反応する。これは、ＥＭ０９９０２の予想標的であるαｖβ５を発現しないＭ２１−ｇｐｉｉｂ細胞のＦＡＣＳにおいて可視化した。抗体の力価決定によって、ＥＬＩＳＡデータから予想される強力なαｖβ５シグナルを保持しつつ試薬の最適濃度を選択してαｖβ３交差反応性を最小限に抑えることができ、これはＦＡＣＳにおいては０．３〜１μｇ／ｍｌであった。
【０２４１】
ｂ３細胞質ドメインに対して作製されたＥＭ００２１２は、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡにおいて陰性であった。これは種、アイソタイプおよび標的対照であるため、それは特異性の優れた指標であり、１００：１の優れたシグナル・ノイズ比がＦＡＣＳにおいて得られていることを示唆する。
【０２４２】
ＥＭ０５２０１は、αｖβ６に対し非常に特異的であり、このタンパク質のみが、それが発現することが知られているＨＴ２９細胞上に存在することを明らかにした。
【０２４３】
ＥＭ１３３０９は、αｖβ８インテグリンの生細胞ＦＡＣＳを可能にする初めての試薬であり、ＨＴ２９癌腫ならびにＭ２１およびＭ２４  ｍｅｔメラノーマにおいて、αｖβ８がαｖβ６よりも広範に発現するという驚くべき情報を提供した。星状神経細胞系列においてαｖβ８が報告されているため、神経外胚葉性系列の染色は意外ではないと思われるが、癌腫の染色は予想外であり、生物学を反映している可能性がある。最近のαｖβ８解析は、腸ＡＰＣにおけるその発現が該部位における炎症反応を制御することを示した。おそらく、ＣＲＣ系列のＨＴ２９もこのような機序を反映している。
【０２４４】
αｖ細胞外ドメインに対するＥＭ０１３０９は、ＨＵＶＥＣを除いて一様に陰性であった。
【０２４５】
要約すると、ＲａｂＭａｂ抗体は、生細胞フローサイトメトリーにおいて機能することを示した。このことは、生化学と腫瘍検証および特性評価のための組織ＩＨＣとの間に、有用な橋を提供する。特に、αｖβ６およびαｖβ８試薬は、インテグリン研究の重要なソースであり、ＲａｂＭａｂにおけるこれらの反応性プロファイルを備えるこのような抗体を作製する能力は、最終的にアーカイブ保管した組織におけるインテグリン発現パターンの厳密な解析の扉を開放する。
【０２４６】
例１４：滴定実験
ＦＡＣＳにおける滴定実験を行って、適切な染色濃度を検査した（図４０〜４３）。曲線形は飽和を示唆しないが、１ｍｇ／ｍｌを超えると平坦になり始めた。ウサギモノクローナル抗体は、ＦＡＣＳにおける強力な結合体である。特に、ＥＭ０９９０２は高い親和性を有し、０．１μｇ／ｍｌ抗体濃度において強力な結合が観察され、したがって、＜１ｕｇ／ｍｌ染色濃度で良好に用いられる。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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