(57)【要約】  RAGEポリペプチドを含む融合タンパク質であって、当該RAGEポリペプチドが哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、そして当該融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分に、野生型RAGEペプチドに対して1つ以上の点突然変異を有する、当該融合タンパク質を開示する。前記点突然変異は、グリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換してもよい。また、そのようなタンパク質をコードする核酸、及びRAGEが介在する疾患を処置するためのそのようなタンパク質の使用方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンポリペプチドに結合した終末糖化産物受容体(RAGE)ポリペプチドを含む融合タンパク質であり、当該RAGEポリペプチドが、リガンド結合ドメインを有する哺乳類RAGEの断片を含み、当該RAGE融合タンパク質が、1つ以上の前記RAGEポリペプチド又は前記免疫グロブリンポリペプチドにおいて野生型の配列と比較して1つ以上の突然変異を含み、そして当該突然変異が、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び/又は変換するものである、前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記RAGEポリペプチドがヒトRAGEポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記突然変異が、野生型RAGEポリペプチド中のグリコシル化部位に存在する配列を変更するものである、請求項１又は２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記グリコシル化部位が、アミノ酸配列NXS又はNXTを有し、ここでXがいずれかのアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記突然変異が、1つ以上のグリコシル化部位を除去するため、野生型RAGEポリペプチド配列のNITをQITに、NGSをQGSに、NGSをNSSに、又はNSTをQSTに変更する突然変異を1つ以上含むものである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記グリコシル化部位が、RAGEポリペプチドのリガンド結合部位又はリガンド結合ドメインの内部にある、請求項１〜５のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記酵素開裂部位がフリン開裂部位であることにより、前記突然変異がRAGEポリペプチドのフリン(furin)開裂の認識部位に存在する野生型ポリペプチドの配列を変化させる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記突然変異が、野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸配列の：(i) PRHRALRをPHRAALRに；(ii) PRHRALRをPRHKALRに；(iii) PRHRALRをPRHRALAに；(iv) PRHRALRをPRHRALKに；(v) PRHRALRをPRHRALHに；又は(vi) PRHRALRをPRHRALTに変更する突然変異を1つ以上含むことにより、フリン開裂部位を除去するものである、請求項１及び７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記RAGEポリペプチドが野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸１〜２３を占めるN末端リーダーペプチドを含まない、請求項１〜８のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
1つ以上の突然変異が：野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸１〜２３を占めるN末端リーダーペプチドを含まないヒトRAGEポリペプチドの(i) N2Q; (ii) N58Q; (iii) G59S; (iv) N2Q及びN58Q;又は(v) N2Q及びG59Sの1つ以上を含むものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸１〜２３を占めるN末端リーダーペプチドを含まないヒトRAGEポリペプチドが：(i)配列番号：8、配列番号：16、若しくは配列番号：20;又は(ii) N末端のグルタミンが環状化してピログルタミン酸を有する、配列番号：8、配列番号：16、若しくは配列番号：20の1つ以上に記載の配列を有する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記突然変異がフリン開裂部位を除去するためのものであって、前記野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸１〜２３を占めるN末端リーダーペプチドを含まないヒトRAGEポリペプチドのR195A, R195K, R195T, R195H, R198A, R198K, R198H, R198Tの１つ以上を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸１〜２３を占めるN末端リーダーペプチドを含まないヒトRAGEポリペプチドが、配列番号：２０、又はN末端のグルタミンが環状化してピログルタミン酸を有する配列番号２０に記載の配列を有する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンポリペプチドが、ヒンジ領域の部分以上を含まないCH2ドメインの断片を含む、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記CH2ドメインの断片に含まれないヒンジ領域が配列番号：223又は配列番号：224に記載の配列を有する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記CH2ドメインがC末端を介して免疫グロブリンポリペプチドのCH3ドメインのN末端と連結する、請求項１４又は１５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンがヒトIgGを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンのCH2ドメインが、配列番号：３８、又はC末端にリシンを有しない配列番号：３８を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号：５８〜８２、配列番号９２〜１９０、又は配列番号：２００若しくは２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２０】
RAGEポリペプチドを含む融合タンパク質であり、当該RAGEポリペプチドが、配列番号：５８〜８２、配列番号９２〜１９０、又は配列番号：２００若しくは２０１のいずれか１つに記載されている、前記融合タンパク質。
【請求項２１】
モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はそれらの混合物の形態をとる、請求項１〜２０のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか1項に記載の融合タンパク質及び医薬として許容される担体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクションした宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか1項に記載の融合タンパク質又は請求項２２に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象中のRAGE介在疾患を治療する方法。
【請求項２７】
前記RAGE介在疾患が、糖尿病又は糖尿病後期合併症の症状を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記前記糖尿病又は糖尿病後期合併症の症状が、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性脚部潰瘍、心臓血管合併症、又は糖尿病性神経症の１つ以上を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記RAGE介在疾患が、アミロイドーシス、アルツハイマー症、癌、腎不全、自己免疫疾患に関連する炎症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、低酸素症、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、臓器移植、又は創傷治癒の障害の1つ以上を含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)に従い、2010年2月18日に出願された米国仮特許出願61/305,706に基づく優先権を主張し、かつ、35 U.S.C. 365(c)に従い、2010年4月23日に出願された国際出願PCT/US2010/032270に基づく優先権を主張する。2010年4月23日に出願された国際出願PCT/US2010/032270は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §  １１９（ｅ）に従い、2010年2月18日に出願された米国仮特許出願61/305,706に基づく優先権を主張する。米国仮特許出願61/305,706及び国際出願PCT/US2010/032270の開示は、それらの全体が本明細書中に参照により援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、終末糖化産物受容体(RAGE)を含む融合タンパク質、RAGE融合タンパク質をコードする核酸、及びそのようなタンパク質を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質又は脂質をアルドース糖とインキュベーションすることにより、タンパク質上のアミノ基の非酵素的糖化及び酸化が起こり、アマドリ付加物が形成される。その後、当該付加物は、追加の転位、脱水を起こし、そして他のタンパク質と架橋して終末糖化産物(AGE)という複合体を形成する。AGEの形成を促進する要素には、タンパク質のターンオーバーの遅延(例えばアミロイド症)、リシンを多く含む巨大分子の蓄積及び血中グルコースの増大(例えば糖尿病)がある(Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995))。AGEは、糖尿病及び老衰に関連する合併症を含む様々な障害に関与する。
【０００４】
AGEは、単核球、マクロファージ、毛細血管の内皮細胞、平滑筋細胞、間質細胞及びニューロン上の細胞表面受容体に対する、特異的かつ安定な結合を示す。そのような終末糖化産物受容体(RAGE)は、免疫グロブリンスーパージーンファミリーのメンバーである。RAGEの細胞外(N末端)ドメインは、1つのV(可変)型ドメイン、それに続く2つのC(定常)型ドメインの3つの免疫グロブリン型領域を有する(Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194 (1997))。この細胞外ドメインに、1つの膜貫通ドメインと、高度に荷電した短い細胞内尾部が続く。当該N末端細胞外ドメインは、RAGEの分解により、又はV及びCドメインからなる可溶性RAGE(sRAGE)を製造するための分子細胞生物学的アプローチにより単離される。
【０００５】
RAGEは、白血球、ニューロン、ミクログリア細胞及び血管内皮細胞等の様々な種類の細胞で発現している(例えばHori et al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995))。RAGEのレベルの増大は、加齢組織(Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997))、並びに糖尿病患者の網膜、血管及び腎臓(Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995))においても見出される。
【０００６】
AGEに加え、他の化合物もRAGEに結合し、及びRAGEを修飾する。RAGEは、アミロイドベータ(Aβ)、血清アミロイドA(SAA)、終末糖化産物(AGE)、S100(カルグラニュリンファミリーの炎症性メンバー)、カルボキシメチルリシン(CML)、アンフォテリン及びCD11b/CD18(Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005); Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001); Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003))等の、機能的に、及び構造的に様々な複数のリガンドに結合する。
【０００７】
AGE、S100/カルグラニュリン、β-アミロイド、CML(Nε-カルボキシルメチルリシン)、及びアンフォテリン等のリガンドのRAGEに対する結合は、様々な遺伝子の発現を変化させることが示されている。これらの相互作用は、p38活性化、p21ras、MAPキナーゼ、Erk1-2リン酸化、及び炎症性シグナルの転写メディエーターであるNF-κBの活性化を含む、シグナル伝達機構を開始させうる(Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001))。例えば、多くの種類の細胞において、RAGE及びそのリガンドの間の相互作用は、酸化ストレスを生じる場合があり、それにより、フリーラジカル感受性の転写因子であるNF-κBの活性化や、サイトカインIL-1β及びTNF-α等のNF-κBに制御される遺伝子の活性化を引き起こす。更に、RAGEの発現はNF-κBにより上方制御され、炎症又は酸化ストレス部位で発現の上昇が認められる(Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000))。故に、上昇し、しばしば有害なスパイラルは、リガンドの結合により開始される正のフィードバックループにより加速する。
【０００８】
異なる組織及び器官におけるRAGEの活性化は、多くの病態生理的結果をもたらす。RAGEは、急性及び慢性の炎症(Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999))、糖尿病の後期合併症、例えば血管透過性の増大等の発生(Wautier et al., J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995))、腎症(Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11:1488-1497 (2000))、動脈硬化(Vlassara et. al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996))、及び網膜症(Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607 (1999))等の、様々な症状に関与している。また、RAGEは、アルツハイマー症(Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996))、並びに腫瘍の浸潤及び転移(Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000))にも関与している。
【０００９】
RAGEは、広範囲に発現しており、様々な疾患モデルにおいて明らかな多面的な役割を果たしているが、通常の個体発生に必須とは認められない。例えば、RAGEノックアウトマウスは、明白な形態異常を示さないことから、RAGEは慢性的に刺激されたときに疾患の病態に一定の役割を果たすが、RAGEの阻害は、望ましくない急性の形質に何ら関与しないと考えられる(Liliensiek et al., J. Clin. Invest. 113:1641-50 (2004))。
【００１０】
RAGEに対する生理的リガンドの結合をアンタゴナイズすることにより、過剰な濃度のAGEや他のRAGEリガンドにより引き起こされる病態生理的変化を下方制御し得る。RAGEの内在的リガンドの結合を低下させることにより、RAGEが介在する障害に関連する症状を低下させ得る。可溶性RAGE(sRAGE)は、RAGEに対するRAGEリガンドの結合を効果的にアンタゴナイズできる。しかしながら、sRAGEの半減期は、インビボで投与するとき、1つ以上の障害に治療的に有効であるには短すぎる。
【００１１】
第二のポリペプチドとRAGEリガンドドメインが連結したものを含む融合タンパク質は、治療的に有用であるのに十分に長い半減期を有しつつ、天然のRAGEリガンドをアンタゴナイズする能力を提供し得る。幾つかの態様において、そのような融合タンパク質は、大スケールのバイオリアクター中でのタンパク質の発現の過程で、タンパク質プロセシング(例えばグリコシル化及び／又は酵素介在開裂)により改変させられる場合がある。そのようなプロセシングは、何ら改変されていない分子と比較して、融合タンパク質の半減期を低下させる場合もある。故に、本発明の化合物及び方法は、RAGE受容体に対するAGE及び他の生理的リガンドの結合をアンタゴナイズし、かつ望ましい薬物動態プロフィールを有する化合物の開発についての需要に取り組むものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の態様は、終末糖化産物受容体(RAGE)を含む融合タンパク質に関する。幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質は、野生型RAGEに対して1つ以上の点突然変異を有するRAGEタンパク質、及びこれをコードする核酸配列を含む。本発明の尚も他の態様は、本発明の融合タンパク質の作製に最適な核酸配列及び構築物や、それらを含有する組成物、並びに障害の処置のためのそのようなRAGEタンパク質の使用方法を含む。
【００１３】
幾つかの態様において、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドと連結した終末糖化産物受容体(RAGE)ポリペプチドを含有する融合タンパク質を含み、ここで当該RAGEポリペプチドは、リガンド結合ドメインを有する哺乳類RAGEの断片を含み、そして当該融合タンパク質は、野生型配列に対して1つ以上の突然変異を、1つ以上のRAGEポリペプチド又は免疫グロブリンポリペプチドに有し、ここで、当該突然変異は、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換する。幾つかの態様において、前記酵素開裂部位は、フリン開裂部位である。幾つかの態様において、前記免疫グロブリンポリペプチドは、CH2ドメイン又はCH2ドメインの断片を含む。また、幾つかの態様において、一部分以上のヒンジ領域が、CH2ドメイン断片に含まれない。また、幾つかの態様において、当該CH2ドメインは、C末端で、免疫グロブリンポリペプチドのCH3ドメインのN末端と連結する。
【００１４】
例えば、幾つかの態様において、本発明は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、ここで、a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、ここで、当該RAGEポリペプチドは、野生型RAGEポリペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、1つ以上のグリコシル化部位が除去及び／又は変換されており、かつb)免疫グロブリンポリペプチドは、CH2ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、一部分以上のヒンジ領域が、CH2ドメインの断片の部分として含まれない。一つの態様において、前記突然変異により除去及び／又は変換されるグリコシル化部位は、RAGEポリペプチドのリガンド結合ドメイン中にある。
【００１５】
他の態様において、本発明は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、ここで、a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、ここで、当該RAGEポリペプチドは、野生型RAGEポリペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、1つ以上の酵素開裂部位が除去及び／又は変換されており、かつb)免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、CH2ドメインの断片は、ヒンジ領域の部分以上を含まない。幾つかの態様において、前記酵素開裂部位は、フリン開裂部位である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、ここで、a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、ここで、当該RAGEポリペプチドは、i)野生型RAGEポリペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、1つ以上のグリコシル化部位が除去及び／又は変換され、かつii)野生型RAGEポリペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、1つ以上のフリン開裂部位が除去及び／又は変換されており、かつb)免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、CH2ドメインの断片は、ヒンジ領域の部分以上を含まない。
【００１７】
他の態様において、本発明は、本明細書中に記載のRAGE融合タンパク質をコードする核酸を含む。これらの核酸を含む発現ベクターやそのようなベクターをトランスフェクションした宿主細胞も提供される。
【００１８】
他の態様において、本発明は、対象中のRAGEが介在する障害を処置するための方法及び組成物を含む。当該方法は、対象に本発明のRAGE融合タンパク質を投与する工程を含んでもよい。当該組成物は、本発明のRAGE融合タンパク質及び医薬として許容される担体を含んでもよい。
【００１９】
本発明の融合タンパク質の特定の態様には、様々な長所が付随し得る。一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質の代謝安定性は、野生型RAGE融合タンパク質(即ち、1つ以上の点突然変異がないためグリコシル化部位又は酵素開裂部位のいずれも除去及び／又は変換されていないRAGE融合タンパク質)に対して増大してもよい。また、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEリガンドに対する高い親和性の(即ち生理的に適切な)結合能力を呈し得る。幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、高ナノモラー〜低マイクロモラーの範囲の親和性で、かつ類似の野生型RAGE融合タンパク質よりも高い親和性で、RAGEリガンド(例えばS100b、アミロイド-ベータ、カルボキシメチルリシン)に結合し得る。生理的RAGEリガンドに対してよりも高い親和性で結合することにより、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEに対する内在的リガンドの結合を阻害するのに使用され得るので、RAGE介在疾患を改善する手段を提供する。
【００２０】
本発明は、下記のような更なる特徴を有する。本発明は、以下の請求項、明細書及び図面に記載される詳細によってその用途が限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１は、本発明の別の態様における様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す。配列番号１は、ヒトRAGEのアミノ酸配列である。配列番号2は、アミノ酸1〜22のシグナル配列の無いヒトRAGEのアミノ酸配列である。
【図１Ｂ】配列番号3は、アミノ酸1〜23のシグナル配列の無いヒトRAGEのアミノ酸配列である。
【図１Ｃ】配列番号4ヒトsRAGEのアミノ酸配列である。配列番号5は、アミノ酸1〜22のシグナル配列の無いヒトsRAGEのアミノ酸配列である。配列番号6は、アミノ酸1〜23のシグナル配列の無いヒトsRAGEのアミノ酸配列である。
【図１Ｄ】配列番号7は、ヒトRAGEのV-ドメインを有するアミノ酸配列である。配列番号8は、ヒトRAGEのV-ドメインを有する別のアミノ酸配列である。配列番号9は、ヒトRAGEのV-ドメインのN末端断片である。配列番号10は、ヒトRAGEのV-ドメインの別のN末端断片である。配列番号11は、ヒトRAGEのアミノ酸124〜221のアミノ酸配列である。配列番号12は、ヒトRAGEのアミノ酸227〜317のアミノ酸配列である。配列番号11は、ヒトRAGEのアミノ酸23〜123のアミノ酸配列である。
【図１Ｅ】配列番号14は、ヒトRAGEのアミノ酸24〜123のアミノ酸配列である。配列番号15は、ヒトRAGEのアミノ酸23〜136のアミノ酸配列である。配列番号16は、ヒトRAGEのアミノ酸24〜136のアミノ酸配列である。配列番号17は、ヒトRAGEのアミノ酸23〜226のアミノ酸配列である。配列番号18は、ヒトRAGEのアミノ酸24〜226のアミノ酸配列である。
【図１Ｆ】配列番号19は、ヒトRAGEのアミノ酸23〜251のアミノ酸配列である。配列番号20は、ヒトRAGEのアミノ酸24〜251のアミノ酸配列である。配列番号21は、RAGEドメイン間リンカーである。配列番号22は、第二のRAGEドメイン間リンカーである。配列番号23は、第三のRAGEドメイン間リンカーである。配列番号24は、第四のRAGEドメイン間リンカーである。
【図１Ｇ】配列番号25は、ヒトRAGEアミノ酸1〜118をコードするDNAである。配列番号26は、ヒトRAGEアミノ酸1〜123をコードするDNAである。配列番号27は、ヒトRAGEアミノ酸1〜136をコードするDNAである。
【図１Ｈ】配列番号28は、ヒトRAGEアミノ酸1〜230をコードするDNAである。配列番号29は、ヒトRAGEアミノ酸1〜251をコードするDNAである。
【図１Ｉ】配列番号38は、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインの部分的アミノ酸配列である。配列番号39は、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインの一部をコードするDNAである。配列番号40は、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインのアミノ酸配列である。Panel I,
【図１Ｊ】配列番号40は、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインをコードするDNAである。配列番号41は、ヒトIgGのCH2ドメインのアミノ酸配列である。配列番号42は、ヒトIgGのCH3ドメインのアミノ酸配列である。配列番号44は、第五のRAGEドメイン間リンカーである。
【図１Ｋ】配列番号45は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成した1〜23アミノ酸のシグナル配列を有しないヒトsRAGEのアミノ酸配列である。配列番号46は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成したヒトsRAGEのVドメインを含む別のアミノ酸配列である。配列番号47は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成したヒトsRAGEのVドメインの別のN末端断片である。配列番号48は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成したヒトRAGEの24〜123アミノ酸のアミノ酸配列である。
【図１Ｌ】配列番号49は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成したヒトRAGEの24〜136アミノ酸のアミノ酸配列である。配列番号50は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成したヒトRAGEの24〜226アミノ酸のアミノ酸配列である。配列番号51は、N末端のグルタミン残基が環状化してピログルタミン酸を形成したヒトRAGEの24〜251アミノ酸のアミノ酸配列である。
【図１Ｍ】配列番号52は、配列番号38のヒトIgGのヒトCH2及びCH3ドメインの一部をコードする別のDNA配列である。配列番号53は、配列番号40のヒトIgGのヒトCH2及びCH3ドメインをコードする別のDNA配列である。
【００２２】
【図２Ａ】本発明の一つの態様における、第一のRAGE融合タンパク質(TTP-4000)コード領域をコードする、別のDNA配列の配列番号30を示す。太字で強調されたコード配列1〜753は、RAGE N末端タンパク質配列をコードし、一方、配列754〜1386は、ヒンジ領域の無いヒトIgG Fc(γ1)タンパク質配列をコードする。
【図２Ｂ】本発明の一つの態様における、第一のRAGE融合タンパク質(TTP-4000)コード領域をコードする、別のDNA配列の配列番号54を示す。太字で強調されたコード配列1〜753は、RAGE N末端タンパク質配列をコードし、一方、配列754〜1386は、ヒンジ領域の無いヒトIgG Fc(γ1)タンパク質配列をコードする。
【００２３】
【図３Ａ】本発明の一つの態様における、第二のRAGE融合タンパク質(TTP-3000)コード領域をコードする、別のDNA配列の配列番号31を示す。太字で強調されたコード配列1〜408は、RAGE N末端タンパク質配列をコードし、一方、配列409〜1041は、ヒンジ領域の無いヒトIgG Fc(γ1)タンパク質配列をコードする。
【図３Ｂ】本発明の一つの態様における、第二のRAGE融合タンパク質(TTP-3000)コード領域をコードする、別のDNA配列の配列番号55を示す。太字で強調されたコード配列1〜408は、RAGE N末端タンパク質配列をコードし、一方、配列409〜1041は、ヒンジ領域の無いヒトIgG Fc(γ1)タンパク質配列をコードする。
【００２４】
【図４】配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号56のアミノ酸配列を示し、これらはそれぞれ本発明の別の態様における4ドメインRAGE融合タンパク質をコードする。RAGE配列は、太字で強調している。
【００２５】
【図５】配列番号3５、配列番号3６、配列番号37、配列番号57のアミノ酸配列を示し、これらはそれぞれ本発明の別の態様における3ドメインRAGE融合タンパク質をコードする。RAGE配列は、太字で強調している。
【００２６】
【図６Ａ】図６は、本発明の別の態様における、RAGEポリペプチド配列及び免疫グロブリンポリペプチド配列を有する様々なRAGE融合タンパク質を示す。RAGE融合タンパク質は、配列番号34のRAGE融合タンパク質(TTP4000)のアミノ酸配列に対応し、当該配列において、アミノ酸1〜23のシグナル配列は除去されており、そして、当該RAGE融合タンパク質は、全長野生型RAGE配列(配列番号1)に対して点突然変異又は突然変異を有することにより、アミノ酸24で始まる数に基づき、グリコシル化部位及び／又はフリン開裂部位が除去される。以下の配列が提供される。配列番号62は、N2Q(即ち全長野生型配列のN25Qに相当)点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号63は、N58Q(即ち全長野生型配列のN81Qに相当)点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号64は、N2Q及びN58Qの点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号65は、R195A点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図６Ｂ】配列番号66は、R195K点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号67は、R198A点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号68は、R198K点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号69は、R198H点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図６Ｃ】配列番号70は、R198T点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号71は、N2Q及びR198A点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号72は、N58Q及びR198A点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号73は、N2Q、N58Q及びR198A点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図６Ｄ】配列番号74は、N288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号75は、N2Q及びN288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号76は、N58Q及びN288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号77は、N2Q、N58Q及びN288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図６Ｅ】配列番号78は、N2Q、R198A及びN288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号79は、N58Q、R198A及びN288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号80は、N2Q、N58Q、R198A及びN288Q点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号81は、G59S及びR198A点突然変異を有するTTP4000RAGE融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図６Ｆ】図６F〜６Jに記載される配列番号92〜111は、C末端のリシンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｇ】図６F〜６Jに記載される配列番号92〜111は、C末端のリシンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｈ】図６F〜６Jに記載される配列番号92〜111は、C末端のリシンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｉ】図６F〜６Jに記載される配列番号92〜111は、C末端のリシンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｊ】図６F〜６Jに記載される配列番号92〜111は、C末端のリシンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｋ】図６K〜６Oに記載される配列番号112〜131は、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸残基になった配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｌ】図６K〜６Oに記載される配列番号112〜131は、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸残基になった配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｍ】図６K〜６Oに記載される配列番号112〜131は、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸残基になった配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｎ】図６K〜６Oに記載される配列番号112〜131は、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸残基になった配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｏ】図６K〜６Oに記載される配列番号112〜131は、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸残基になった配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｐ】図６P〜６Tに記載される配列番号132〜151は、N末端グルタミンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｑ】図６P〜６Tに記載される配列番号132〜151は、N末端グルタミンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｒ】図６P〜６Tに記載される配列番号132〜151は、N末端グルタミンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｓ】図６P〜６Tに記載される配列番号132〜151は、N末端グルタミンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｔ】図６P〜６Tに記載される配列番号132〜151は、N末端グルタミンが除去された配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６Ｕ】図６U〜６Yに記載される配列番号152〜171は、C末端リシンが除去された配列番号132〜151にそれぞれ対応する。
【図６Ｖ】図６U〜６Yに記載される配列番号152〜171は、C末端リシンが除去された配列番号132〜151にそれぞれ対応する。
【図６Ｗ】図６U〜６Yに記載される配列番号152〜171は、C末端リシンが除去された配列番号132〜151にそれぞれ対応する。
【図６Ｘ】図６U〜６Yに記載される配列番号152〜171は、C末端リシンが除去された配列番号132〜151にそれぞれ対応する。
【図６Ｙ】図６U〜６Yに記載される配列番号152〜171は、C末端リシンが除去された配列番号132〜151にそれぞれ対応する。
【図６Ｚ】図６Z〜６DDに記載される配列番号172〜190及び200は、N末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸になり、そしてC末端リシンが除去された、配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６ＡＡ】図６Z〜６DDに記載される配列番号172〜190及び200は、N末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸になり、そしてC末端リシンが除去された、配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６ＢＢ】図６Z〜６DDに記載される配列番号172〜190及び200は、N末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸になり、そしてC末端リシンが除去された、配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６ＣＣ】図６Z〜６DDに記載される配列番号172〜190及び200は、N末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸になり、そしてC末端リシンが除去された、配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６ＤＤ】図６Z〜６DDに記載される配列番号172〜190及び200は、N末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸になり、そしてC末端リシンが除去された、配列番号62〜81にそれぞれ対応する。
【図６ＥＥ】図６EE〜６FFは、TTP4000RAGE融合タンパク質(即ち配列番号34)のアミノ酸配列に対応し、配列番号58は、N2Q、G59S、及びR198A点突然変異を有し、そのC末端リシンが除去されたものが配列番号59であり、配列番号58のN末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸残基になったものが配列番号60であり、配列番号58のN末端グルタミンが除去されたものが配列番号61であり、配列番号61のC末端リシンが除去されたものが配列番号82であり、配列番号58のN末端グルタミン残基がN末端ピログルタミンになり、そしてC末端リシンが除去されたものが配列番号201である。配列番号225は、1つのRAGE免疫グロブリンドメインと3グリコシル化部位の突然変異を有する、RAGE融合タンパク質に対応する。
【図６ＦＦ】図６EE〜６FFは、TTP4000RAGE融合タンパク質(即ち配列番号34)のアミノ酸配列に対応し、配列番号58は、N2Q、G59S、及びR198A点突然変異を有し、そのC末端リシンが除去されたものが配列番号59であり、配列番号58のN末端グルタミン残基がN末端ピログルタミン酸残基になったものが配列番号60であり、配列番号58のN末端グルタミンが除去されたものが配列番号61であり、配列番号61のC末端リシンが除去されたものが配列番号82であり、配列番号58のN末端グルタミン残基がN末端ピログルタミンになり、そしてC末端リシンが除去されたものが配列番号201である。配列番号225は、1つのRAGE免疫グロブリンドメインと3グリコシル化部位の突然変異を有する、RAGE融合タンパク質に対応する。
【図７】図７は、配列番号34のTTP4000RAGE融合タンパク質をコードするDNA配列(TTP4000)の他の態様を示し、ここで、RAGE融合タンパク質は、グリコシル化部位及び／又はフリン開裂部位を除去するように点突然変異又は突然変異を有する。図7Aは、配列番号221は、TTP4000RAGE融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【図７Ｂ】配列番号222は、TTP4000RAGE融合タンパク質をコードする別のヌクレオチド配列である。
【図８Ａ】配列番号83はヒトRAGEの当初アミノ酸シグナル配列である。配列番号84は、ヒトRAGEの当初アミノ酸シグナル配列をコードするDNA配列である。配列番号85は、ヒトRAGEの改変アミノ酸シグナル配列をコードするDNA配列である。
【図８Ｂ】配列番号86は、C末端リシンが除去された配列番号38に対応する。配列番号87は、C末端リシンが除去された配列番号40に対応する。配列番号88は、N末端アミノ酸の最初の11個及びC末端リシンが除去された配列番号40に対応する。配列番号89は、N末端アミノ酸の最初の11個が除去され、そしてNがQになった点突然変異(太字)を有する、配列番号40に対応する。配列番号90は、N末端アミノ酸の最初の10個が除去された配列番号42に対応する。配列番号91は、N末端アミノ酸の最初の11個が除去された配列番号42に対応する。
【図８Ｃ】配列番号191は、N2Q点突然変異を有する配列番号46に対応する。配列番号192は、N2Q及びN58Q点突然変異を有する配列番号46に対応する。配列番号193は、N58Q点突然変異を有する配列番号46に対応する。配列番号194は、N2Q点突然変異を有する配列番号47に対応する。配列番号195は、N2Q点突然変異およびN末端ピログルタミン酸残基を有する配列番号47に対応する。配列番号196は、免疫グロブリンポリペプチド中のグリコシル化部位を除去する突然変異をコードする順プライマー配列である。配列番号197は、配列番号196と領域が重複する逆プライマー配列である。配列番号198は、RAGEポリペプチド中のフリン開裂部位を除去する突然変異をコードする順プライマー配列である。配列番号199は、配列番号198と領域が重複する逆プライマー配列である。配列番号223は、IgG1のヒンジ領域を含む11アミノ酸ペプチドに対応する。配列番号224は、IgG1のヒンジ領域を含む10アミノ酸ペプチドに対応する。
【図８Ｄ】配列番号202は、配列番号62、92、112、132、152及び172の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｅ】配列番号203は、配列番号63、93、113、133、153及び173の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｆ】配列番号204は、配列番号64、94、114、134、154及び174の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｇ】配列番号205は、配列番号65、95、115、135、155及び175の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｈ】配列番号206は、配列番号66、96、116、136、156及び176の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｉ】配列番号207は、配列番号67、97、117、137、157及び177の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｊ】配列番号208は、配列番号68、98、118、138、158及び178の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｋ】配列番号209は、配列番号69、99、119、139、159及び179の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｌ】配列番号210は、配列番号70、100、120、140、160及び180の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｍ】配列番号211は、配列番号71、101、121、141、161及び181の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｎ】配列番号212は、配列番号72、102、122、142、162及び182の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｏ】配列番号213は、配列番号73、103、123、143、163及び183の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｐ】配列番号214は、配列番号74、104、124、144、164及び184の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｑ】配列番号215は、配列番号75、105、125、145、165及び185の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｒ】配列番号216は、配列番号76、106、126、146、166及び186の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｓ】配列番号217は、配列番号77、107、127、147、167及び187の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｔ】配列番号218は、配列番号78、108、128、148、168及び188の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｕ】配列番号219は、配列番号79、109、129、149、169及び189の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図８Ｖ】配列番号220は、配列番号80、110、130、150、170及び190の融合タンパク質をコードすることが出来る核酸配列である。
【図９Ａ】図9は、本明細書に記載のRAGE融合タンパク質のバッチ１〜５の薬物動態プロフィールの違いを示す。図9Aは、0〜336時間の期間にわたり血漿濃度を測定したものである。
【図９Ｂ】図9Bは、0〜48時間の期間にわたり血漿濃度を測定したものである。
【図１０】図10は、マウスに10mg/kgでバッチ１〜５を血管内投与した後のRAGE融合タンパク質の薬物動態的パラメーターの平均を示す。
【図１１】図１１は、下記バッチ１〜５のRAGE融合タンパク質のインビトロ安定性データを示す。図１１Aは表で、そして図１１Bはグラフでデータを表現している。
【図１２】図１２は、様々な突然変異RAGE融合タンパク質の結合親和性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
反対の記載が無い限り、以下に記載される数値パラメーターは、本発明により達成されるべき望ましい性質に依存して変動し得る概数である。少なくとも、そして特許請求の範囲の均等論の適用の限定を試みるものではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効桁(significant digit)の数を参照して、そして通常の丸め技術(rounding technique)を適用することにより解釈されるべきである。
【００２８】
更に、本出願において使用されるとき、単数「一つの("a", "an" and "the")」は、積極的に、かつ明示で1つの指示対象に限定されていない限り、複数の指示対象も包含すると認識されたい。「又は」という用語は、その文脈で明らかにそうではない表記がされていない限り、「及び／又は」という用語と区別されずに使用される。
【００２９】
また、「部分」及び「断片」という用語も、ポリペプチド、核酸、又は他の分子構築物の部分を示す用語として、区別されずに使用される。
【００３０】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、部分的又は全長タンパク質のいずれかを含み得るタンパク質分子を記載するものとして、区別されずに使用される。
【００３１】
当該技術分野で知られているように、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」は、1つのアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と、他のアミノ酸のα炭素のアミノ基の間で縮合反応が起こって形成されたペプチド結合により連結されたアミノ酸(典型的にはL-アミノ酸)の鎖である。典型的には、タンパク質を形成するアミノ酸は、アミノ末端から始まってカルボキシ末端方向に番号が振られている。
【００３２】
本明細書で開示されるペプチド、ポリペプチド及びタンパク質配列は、アミノ酸の慣用1文字コード、又は慣用3文字コードのいずれかを使用する。例えば、本明細書中で使用されるとき、アミノ酸は、以下の非限定的な列挙を含む。
グリシンはGly又はG;アラニンはAla又はA; イソロイシンはIle又はI; アスパラギンはAsn又はN; グルタミンはGln又はQ; セリンはSer又はS; スレオニンはThr又はT; プロリンはPro又はP; アルギニンはArg又はR; グルタミンはGlu又はE; リシンはLys又はK; ヒスチジンはHis又はH; ロイシンはLeu又はL;そしてピログルタミンはpEと表記される。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「上流」という用語は、タンパク質の場合は2つ目の残基に対してN末端側にあること、そして核酸の場合は2つ目の残基に対して5’末端側にあることを指す。また、本明細書中で使用されるとき、「下流」という用語は、タンパク質の場合は2つ目の残基に対してC末端側にあること、そして核酸の場合は2つ目の残基に対して3’末端側にあることを指す。
【００３４】
格別に言及が無い限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者に通常理解されているのと同じ意味で使用される。実施者は、当該技術分野の定義及び用語について、特にCurrent Protocols in Molecular Biology (例えばAusubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley & Sons, N.Y.)を参照する。アミノ酸残基の省略記号は、20種類の通常のL-アミノ酸のそれぞれを表すものとして当該技術分野で慣用されている3文字及び／又は1文字コードが使用される。
【００３５】
「核酸」とは、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)等のポリヌクレオチドである。この用語は、単鎖核酸、二重鎖核酸、及びヌクレオチド又はヌクレオチド類似体で構成されたDNA及びRNAを含むものとして使用される。
【００３６】
「ベクター」という用語は、第二の核酸分子を細胞内に輸送するのに使用され得る核酸分子を指す。一つの態様において、当該ベクターは、ベクター内に挿入されたDNA配列の複製を可能とする。当該ベクターは、少なくとも幾つかの宿主細胞中での核酸分子の発現を促進するためのプロモーターを含み得る。ベクターは、自己的に(染色体に同調せず)複製してもよく、又は宿主細胞の染色体に組み込まれても良い。一つの態様において、当該ベクターは、ベクター内に挿入された核酸分子の少なくとも一部に由来するタンパク質を生産できる発現ベクターを含み得る。
【００３７】
当該技術分野で知られているように、核酸同士をハイブリダイズする条件は、低〜高ストリンジェントの範囲で記載され得る。一般に、高ストリンジェントのハイブリダイズ条件は、高温の低塩緩衝液中でハイブリッドを洗浄することを指す。ハイブリダイゼーションは、65℃の0.5M NaHPO4及び７%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等のハイブリダイゼーション溶液を使用してDNAをフィルターに結合させ、これを0.25 M NaHPO4及び3.5% SDSで洗浄し、続いてこれを、プローブの長さに応じて室温から68℃の範囲の温度の0.1 x SSC/0.1% SDSで洗浄することであってもよい。例えば、高ストリンジェントの洗浄は、14ベースのオリゴヌクレオチドプローブの場合は37℃、17ベースのオリゴヌクレオチドプローブの場合は48℃、20ベースのオリゴヌクレオチドプローブの場合は55℃、25ベースのオリゴヌクレオチドプローブの場合は60℃、長さ約250ヌクレオチドのヌクレオチドプローブの場合は65℃の、6x SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウムで洗浄する工程を含む。核酸プローブは、[γ-32P]ATP等で末端修飾することにより、又は[α-32P]dCTP等の放射性標識されたヌクレオチドをランダムプライマー標識により導入することにより、放射性ヌクレオチドで標識されてもよい。あるいは、プローブは、ビオチン化又はフルオレセイン標識ヌクレオチドを導入することにより標識されてもよく、そして当該プローブは、ストレプトアビジン又は抗フルオレセイン抗体を使用して検出されてもよい。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、「小有機分子」は、1つ以上の炭素原子を含有する2000ダルトン未満の分子量の分子である。
【００３９】
「融合タンパク質」という用語は、2つ以上のタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドを指す。当該融合タンパク質は、別個のタンパク質に由来するアミノ酸部分の間に、アミノ酸の連結部分を含む場合もある。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、「免疫グロブリンペプチド」は、免疫グロブリン重鎖又はその部分を含んでもよい。一つの態様において、当該重鎖の部分は、Fc断片又はその一部であってもよい。本明細書中で使用されるとき、Fc断片は、重鎖ヒンジペプチド及び免疫グロブリンの重鎖のCH2及びCH3ドメインを、モノマー又はダイマーのいずれかで含む。又は、Fc断片のCH1が、免疫グロブリンポリペプチドとして使用されてもよい。重鎖(もしくはその部分)又は免疫グロブリンポリペプチドは、IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)、IgA(α)等の既知の重鎖アイソタイプのいずれか1つの断片に由来し、又はそれらであってもよい。加えて、重鎖(もしくはその部分)又は免疫グロブリンポリペプチドは、IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)等の既知の重鎖アイソタイプ、又は生物活性が変化したこれらのアイソタイプ又はサブタイプの突然変異体のいずれか1つの断片に由来し、又はそれらであってもよい。変化され得る生物活性の例として、ヒンジ領域の変化等による幾つかのFc受容体に対するアイソタイプの結合能力の減少が挙げられる。
【００４１】
「同一性」又は「同一性パーセント」という用語は、2つのアミノ酸配列間、又は2つの核酸配列間の配列同一性を指す。同一性パーセントは、整列させた比較される配列間で共通する残基（即ちアミノ酸又はヌクレオチド)の数から求められる。配列の整列及び比較は、当該技術分野で標準的なアルゴリズム(例えばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch,  1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444)を使用して、又はBLAST及びFASTAとして公に利用可能なこれらのアルゴリズムのコンピューター化されたバージョン(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)により実施されてもよい。National Institutes of Health, Bethesda MDを通じて利用可能なENTREZも、配列比較に使用できる。一つの態様において、2つの配列の同一性パーセントは、各アミノ酸ギャップが、それらが２つの配列の間の単一のアミノ酸ミスマッチであるとされるように、ギャップウエイト１のGCGを使用して決定され得る。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、「保存残基」という用語は、同一の構造及び／又は機能を有する複数のタンパク質の間で同一のアミノ酸を指す。保存残基の領域は、タンパク質の構造又は機能において重要であってもよい。故に、三次元的タンパク質において同定されるような隣接する(contiguous)保存残基が、タンパク質の構造又は機能において重要であってもよい。保存残基又は3D構造の保存領域を見付けるために、異なる種の、又は同一の種の異なる個体の同一又は類似のタンパク質の配列の比較が行われ得る。
【００４３】
本明細書中で使用されるとき、「類似体」は、野生型アミノ酸配列と一定の類似性又は同一性を有するポリペプチドを意味する。類似性の比較は、肉眼で、又はより一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて実施されうる。これらの市販のコンピュータープログラムは、2つ以上の配列の間の類似性パーセントを計算できる(例えばWilbur, W. J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730)。例えば、類似配列とは、他の態様において互いに、70%以上の同一性、75%以上の同一性、85%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、96%以上の同一性、97%以上の同一性、98%以上の同一性、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４４】
本明細書中で使用されるとき、90%以上の同一性を有するとは、ある配列が所定の配列と90%〜99.99%の範囲の同一性を有することを指す。故に、90%以上の同一性を有するとは、ある配列が所定の配列と91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99、99.5%の同一性を有することを含む。同様に、70%以上の同一性を有するとは、ある配列が所定の配列と70%〜99.99%の範囲の同一性を有することを指す。同一性パーセントの決定は、限定されないが、本明細書中に記載のアルゴリズム等を使用して決定されてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、ポリペプチド又はタンパク質の「ドメイン」は、独立した単位を有するポリペプチド又はタンパク質の領域を含む。ドメインは、構造、配列、及び/又は生物活性の観点から規定されても良い。一つの態様において、ポリペプチドドメインは、実質的にタンパク質の他の部分から独立して折り畳まれるタンパク質の領域を含み得る。ドメインは、限定されないが、PFAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISRECPROFILES、SAMRT、及びPROCLASS等のドメインデータベースを使用して同定されてもよい。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリンのドメインと構造的に類似の、又は同一のアミノ酸の配列である。免疫グロブリンドメインのアミノ酸配列の長さは任意である。一つの態様において、免疫グロブリンドメインは、250アミノ酸未満であってもよい。一例の態様において、免疫グロブリンドメインは、長さ約80〜150アミノ酸であってもよい。例えば、IgGの可変領域並びにCH1、CH2、及びCH3領域が、それぞれ免疫グロブリンドメインである。他の例において、IgMの可変領域、CH1、CH2、CH3及びCH4領域が、それぞれ免疫グロブリンドメインである。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、「RAGE免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリンのドメインと構造的に類似の、又は同一の、RAGEタンパク質由来のアミノ酸の配列である例えば、RAGE免疫グロブリンドメインは、RAGE V-ドメイン、RAGE Ig様C1-1型ドメイン(C1ドメイン)、又はRage Ig様C2-2型ドメイン(C2ドメイン)を有しても良い。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、「ドメイン間リンカー」は、2つのドメインを接続するポリペプチドを含む。ヒンジ領域は、IgGのドメイン間リンカーの一例である。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、「直接連結される」とは、連結される2つの基の間にいずれの原子も介在しない、2つの異なる基(例えば核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチドドメイン)の間の共有結合を規定する。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、「リガンド結合ドメイン」又は「リガンド結合部位」は、リガンドと直接相互作用するタンパク質中の残基、又はリガンドと直接相互作用する残基に近接するリガンドの位置取りに関与する残基を含む。リガンド結合ドメイン中の残基の相互作用は、モデル又は構造におけるリガンドと残基の空間的近接度により規定されてもよい。リガンド結合ドメインという用語は、リガンド結合ドメイン又はその部分の類似体を含む。ここで、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、又は親水性の類似性に基づき、リガンド結合ドメインの結合特異性が保持される限り、リガンド結合ドメイン中に意図的なアミノ酸の置換がなされてもよい。リガンド結合ドメインは、タンパク質又はポリペプチドの1つ以上のリガンド結合ドメイン中に存在していてもよい。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、「相互作用」という用語は、リガンド若しくは化合物、又はそれらの部分若しくは断片と、興味のある第二の分子の部分との間が近接している状態を指す。相互作用は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、又は静電気若しくは疎水性相互作用等の非共有結合であってもよく、又は共有結合であってもよい。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、「リガンド」は、リガンド結合ドメインと相互作用する分子又は化合物又は実体であり、基質若しくは類似体又はそれらの部分を含む。本明細書中に記載されるように、「リガンド」は、興味のあるタンパク質に結合する化合物を指してもよい。リガンドはアゴニスト、アンタゴニスト、又は調節因子であってもよい。あるいは、リガンドは、生物活性を有しなくてもよい。又は、リガンドは、他のリガンドの結合をブロックすることにより、生物活性を阻害してもよい。リガンドは、限定されないが、小分子阻害因子を含み得る。これらの小分子は、ペプチド、ペプチド模倣物(peptidomimetics)、有機化合物等を含み得る。また、リガンドは、ポリペプチド及び／又はタンパク質を含んでも良い。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、「調節化合物」は、興味のある分子の生物活性を変化又は変動させる分子を指す。調節化合物は、興味のある化合物の活性を増大又は減少させ、又は生理的若しくは化学的特性、もしくは機能的もしくは免疫的性質を変化させてもよい。RAGEにおいて、調節化合物は、RAGE又はその部分の、活性を増大若しくは減少させ、特性を変化させ、又は機能的もしくは免疫的性質を変化させてもよい。調節化合物は、天然及び／又は化学的に合成され、又は人工の、ペプチド、修飾したペプチド（例えばホスホペプチド)、抗体、炭水化物、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、等脂質、ヘテロ環式化合物、ヌクレオシド、若しくはヌクレオチド、又はそれらの部分、並びに小有機若しくは無機分子を含んでも良い。調節分子は、内在性の生理的化合物であってもよく、又は天然若しくは合成化合物であってもよい。あるいは、調節化合物は、小有機分子であってもよい。「調節化合物」という用語は、化学修飾されたリガンド若しくは化合物をも含み、また異性体及びラセミ体も含む。
【００５４】
「アゴニスト」は、受容体と結合して当該受容体が特異的に関与する薬理的応答を生じる複合体を形成する化合物を含む。
【００５５】
「アンタゴニスト」は、生物分子と結合して、実質的な薬理的応答を引き起こさない複合体を形成して、アゴニストにより誘導される生物学的応答を阻害できる化合物を含む。幾つかの場合、前記生物分子は、受容体(例えばRAGE)である。また、幾つかの場合、前記生物分子はアゴニストであってもよく、その場合、アンタゴニストはアゴニストと結合して、当該アゴニストがその標的と相互作用することを妨げる。
【００５６】
故に、RAGEアゴニストはRAGEと結合して、RAGEが介在する細胞プロセスを刺激し、そしてRAGEアンタゴニストは、RAGEが介在するプロセスがRAGEアゴニストにより刺激されるのを阻害し得る。例えば、一つの態様において、RAGEアゴニストにより刺激される細胞プロセスとして、TNF-α遺伝子の転写の活性化が挙げられる。
【００５７】
「ペプチド模倣物」という用語は、分子間の相互作用において基質と見なされるペプチドの構造を指す(Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252)。ペプチド模倣物は、アミノ酸及び／又はペプチド結合を含んでもいなくてもよいが、ペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの構造的及び機能的特徴を保持している合成構造を含んでも良い。ペプチド模倣物は、ペプチド、オリゴペプチド(Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367)；及び本発明のペプチド、又はアゴニスト、又はアンタゴニストに対応するアミノ酸の可能な全ての配列を表示する所定の長さのペプチドを含有するペプチドライブラリーも含む。
【００５８】
「処置する」とは、疾患又は障害の症状を改善すること、又は対象の状態を改善することを指す。「処置」は、本明細書中で使用されるとき、対象が罹患している所定の障害に対する全ての範囲の処置を指し、その障害により引き起こされる1つの症状又は大半の症状の緩和を含む。
【００５９】
「治癒」という用語は、対象の健康状態の回復、及び／又は対象の疾患又は障害の全ての又は実質的に全ての症状の緩和を指す。
【００６０】
「障害の発生の防止」とは、それをしなければ障害が発生する対象の障害の発生を妨げることを指す。
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、「EC50」は、測定される生物活性の50%をもたらす薬剤の濃度として定義される。例えば、測定可能な生物活性を有する治療剤のEC50は、その生物活性の50%を呈する当該薬剤の濃度の値を含み得る。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、「IC50」は、測定される活性の50%を阻害する薬物の濃度として定義される。例えば、RAGE結合のアンタゴニストのIC50は、RAGEのリガンド結合ドメインへのリガンドの結合を50%減少させるアンタゴニストの濃度の値を含み得る。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、「治療有効量」とは、治療が必要な患者に治療応答をもたらし得る薬物又は医薬剤の量を意味する。
【００６４】
これらの方法において、治療有効量の規定に影響し得る要素は、限定されないが、対象のサイズ及び重量、治療剤の生分解性、治療剤の活性、病変部位のサイズ、及び治療剤の生体利用効率が挙げられる。治療有効量は、そのような量が与えられなかった対応する対象と比較したとき、改善された処置、治癒又は副作用の緩和、又は疾患若しくは障害の進行速度の低下をもたらす量を含む。
【００６５】
「医薬として許容される担体」という用語は、本明細書中で使用されるとき、ヒト又は動物の対象における、例えばRAGEが介在する障害又は疾患の処置のための治療剤の投与等のための使用に適した化合物及び組成物を指す。
【００６６】
「医薬組成物」という用語は、本明細書中、哺乳類の宿主に、例えば経口、非経口、局所、吸入スプレー、脳室内、髄腔内、鼻腔内、直腸内、又は他の本明細書中に記載の任意の投与形態で、公知の非毒性の担体、希釈剤、アジュバント、ビヒクル等を含有する単位投与剤形で投与され得る、組成物を示す。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、「非経口」とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、又は吸入技術を含む。
【００６８】
本明細書中で使用されるとき、「拒絶」は、細胞、組織又は器官の破壊をもたらし、又は細胞、組織若しくは器官にダメージを与える、組織における免疫性若しくは炎症性応答を指す。拒絶される細胞、組織又は器官は、拒絶応答を増大させている同一の対象に由来したものであってもよく、又は他の対象から拒絶を示している対象に移植されたものであってもよい。
【００６９】
本明細書中で使用されるとき、「細胞」は、それぞれが独立した生物系を有する、哺乳類の生物系の構造的及び機能的単位を指す。当該技術分野で公知であるように、細胞は、核、細胞質、細胞内小器官、及び細胞を封入して当該細胞を他の細胞と独立させる細胞壁を有する。
【００７０】
本明細書中で使用されるとき、「組織」は、特定の機能を果たすために、類似の機能及び構造を有する、又は一緒に動作する、細胞の集合を指す。組織は、類似の細胞の集合及び細胞を囲む細胞間物質を含み得る。組織として、限定されないが、筋組織、神経組織及び骨組織が挙げられる。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、「器官」は、幾つかの特異的な機能で特定される、動物中の完全に差別化された構造及び機能単位を指す。器官は、特定の機能又は一群の機能を遂行する、一群の組織を含み得る。組織は、限定されないが、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮、膀胱、及び骨を含む。
【００７２】
「安定な」製剤は、含有されているRAGE融合タンパク質が、保存時にその物理的及び化学的安定性並びに生物活性を本質的に維持するものをいう。タンパク質の安定性を測定する様々な解析技術が当該技術分野で利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及びJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された時間測定され得る。迅速なスクリーニングのため、製剤は、40℃で1週間〜1ヶ月維持されて、その時点で安定性が測定される。例えば、凍結乾燥及び保存の後の凝集の程度は、RAGE融合タンパク質の安定性の指標として利用できる。例えば、「安定な」製剤は、RAGE融合タンパク質の約10%未満、好ましくは約5%未満が製剤中で凝集物として存在する製剤であってもよい。他の態様において、凍結乾燥製剤の凍結乾燥及び保存の後の凝集物形成の増大が判定され得る。例えば、「安定な」凍結乾燥製剤は、凍結乾燥組成物中の凝集物が、当該凍結乾燥製剤を40℃で1週間以上インキュベーションした場合に、約5%未満、又は約3%未満であるものである。他の態様において、RAGE融合タンパク質製剤の安定性は、本明細書中に記載の結合アッセイ等の生物活性アッセイを使用して測定されてもよい。
【００７３】
「再構築」製剤は、RAGE融合タンパク質が当該再構築製剤中に分散又は溶解するように凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤を希釈剤に溶解することにより調製される製剤である。再構築製剤は、前記融合タンパク質による処置を要する患者に投与(非経口投与等)されるのに適したものであってもよく、そして、幾つかの態様において、皮下投与に適したものであってもよい。
【００７４】
「等張」とは、興味のある製剤の浸透圧が約240〜約340 mOsm/kgであることを意味する。一つの態様において、等張製剤の浸透圧は、ヒト血液と本質的に等しい(285-310 mOsm/kg)。等張は、蒸気圧又は凝固点降下型浸透圧測定器を使用して測定できる。
【００７５】
「凍結乾燥保護剤」は、RAGE融合タンパク質と組み合わせたときに、凍結乾燥及びその後の保存に際して当該タンパク質の化学的及び／又は物理的不安定化を顕著に防止又は減少させる分子である。凍結乾燥保護剤の例として、スクロース又はトレハロース等の糖類；ポリオール、例えば糖アルコール、例えばエリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール；又はそれらの組合せが挙げられる。一つの態様において、凍結乾燥保護剤は糖を含有してもよい。他の態様において、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含有してもよい。更なる態様において、凍結乾燥保護剤は、スクロース等の非還元糖を含有してもよい。凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥前の製剤に「凍結保護量」で添加されてもよい。つまり、凍結保護量の凍結乾燥保護剤の存在下でRAGE融合タンパク質を凍結乾燥した場合、当該タンパク質は、凍結乾燥と保存を経て、本質的にその物理的及び化学的安定性並びに生物活性を維持する。
【００７６】
本明細書中の凍結乾燥製剤用の「希釈剤」は、医薬として許容され(ヒトに対して安全かつ無毒に投与される)、そして再構築製剤の調製に有用なものを指す。希釈剤の例として、蒸留水、注射用滅菌水(BWGI)、pH緩衝溶液(例えばリン酸緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液又はデキストロース溶液が挙げられる。一つの態様において、希釈剤は、注射に適した再構築製剤を提供する。他の態様において、希釈剤が注射に適した再構築製剤を提供する場合、当該希釈剤は、注射用水(WFI)を含有してもよい。
【００７７】
再構築製剤用の「保存料」は、希釈剤又は再構築製剤に添加されて、再構築製剤中の細菌の活性を本質的に低下させられる化合物である。一つの態様において、保存料の量は、複数の用途がある再構築製剤の生産を促進するのに有用な量で添加されてもよい。潜在的な保存料の例として、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物)、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の保存料の種類として、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチル及びベンジルアルコール、アリルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3−ペンタノール、及びm−クレゾールが挙げられる。
【００７８】
凍結乾燥製剤用の「バルク剤」は、凍結乾燥混合物に嵩を加えて物理的構造及び凍結乾燥ケーキの形成に貢献する(例えば開口構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの生産を促進する)化合物である。バルク剤の例として、限定されないが、マンニトール、グリシンおよびソルビトールが挙げられる。
【００７９】
RAGE融合タンパク質
本発明の態様は、融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードする核酸、そのような融合タンパク質を生産する方法、及びそのような融合タンパク質を使用する方法を含む。
【００８０】
例えば、幾つかの態様において、本は積みえの融合タンパク質は、終末糖化産物受容体(RAGE)ポリペプチドを含み、ここで当該RAGEポリペプチドは、哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、そして当該融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分に、野生型RAGEペプチドに対して1つ以上の点突然変異を有する。一つの態様において、当該融合タンパク質は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを含んでもよく、ここで、RAGEポリペプチドは、哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、そして当該RAGE融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分、及び／又はRAGE融合タンパク質の免疫グロブリン部分に、野生型RAGEペプチドに対して1つ以上の点突然変異を有する。
【００８１】
例えば、幾つかの態様において、本発明は、免疫グロブリンと連結したRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、ここで当該RAGEポリペプチドは、リガンド結合ドメインを含む哺乳類RAGEの断片を含み、そしてRAGEポリペプチド又は免疫グロブリンポリペプチドに、当該融合タンパク質の野生型配列に対して1つ以上の点突然変異を有し、ここで当該突然変異が、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換する。
【００８２】
前記RAGEポリペプチドは、いずれの哺乳類に由来してもよい。幾つかの態様において、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEポリペプチドである。また、前記免疫グロブリンポリペプチドも、いずれの哺乳類に由来してもよい。幾つかの態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンポリペプチドである。
【００８３】
点突然変異は、RAGE融合タンパク質の性質に有益な影響が生じるように選択され得る。本明細書中により詳細に記載されているように、RAGE融合タンパク質の様々な態様及び／又はそのようなタンパク質を使用又は生産する方法のぞれぞれにおいて、RAGE融合タンパク質は、当該分子の性質を改善するように改変されてもよい。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質は、1つ以上のRAGEポリペプチド、又は免疫グロブリンポリペプチドに、野生型配列に対して1つ以上の突然変異を有しないRAGE融合タンパク質と比較して改善されたリガンド結合活性を有してもよく、ここで、当該突然変異は、酵素開裂部位又はグリコシル化部位の1つ以上を除去及び／又は変換する。加えて、又はあるいは、本発明のRAGE融合タンパク質は、1つ以上のRAGEポリペプチド、又は免疫グロブリンポリペプチドに、野生型配列に対して1つ以上の突然変異を有しないRAGE融合タンパク質と比較して改善された安定性を有してもよく、ここで、当該突然変異は、酵素開裂部位又はグリコシル化部位の1つ以上を除去及び／又は変換する。加えて、又はあるいは、本発明のRAGE融合タンパク質は、1つ以上のRAGEポリペプチド、又は免疫グロブリンポリペプチドに、野生型配列に対して1つ以上の突然変異を有しないRAGE融合タンパク質と比較して改善された薬物動態プロフィールを有してもよく、ここで、当該突然変異は、酵素開裂部位又はグリコシル化部位の1つ以上を除去及び／又は変換する。
【００８４】
例えば、幾つかの態様において、前記点突然変異は、野生型ポリペプチドのグリコシル化部位の配列を変化させる。それにより、グリコシル化の種類及び／又は程度が改変され得る。
【００８５】
前記グリコシル化部位は、タンパク質中に見つかっている様々な種類のグリコシル化部位の1つであってもよい。例えば、幾つかの態様において、グリコシル化認識部位は、NXS又はNXTである。幾つかの態様において、Xはプロリンではない。故に、幾つかの態様において、前記点突然変異は、野生型のRAGEポリペプチド中の配列をNITからQITに、及び／又はNGSからQGSに、及び／又はNGS からNSSに、及び／又はNSTからQSTに変化させることにより、1つ以上のグリコシル化部位を除去及び／又は変換させる。幾つかの態様において、グリコシル化部位は、RAGE融合タンパク質のRAGE部分に位置している。例えば、グリコシル化部位は、幾つかの態様において、リガンド結合部位又はリガンド結合ドメイン内に位置していてもよい。加えて、及び／又はあるいは、グリコシル化部位は、RAGE融合タンパク質の免疫グロブリン部分に位置している。又は、RAGE融合タンパク質中に存在し得る他のグリコシル化部位が標的であってもよい。
【００８６】
幾つかの態様において、
点突然変異が、前記酵素開裂部位はフリン開裂部位であることにより、RAGEポリペプチドのフリン開裂における認識部位に存在する野生型RAGEポリペプチド中の配列を変化させる。例えば、他の態様において、前記点突然変異は、フリン開裂部位を変換及び／又は除去するように、野生型RAGEポリペプチドの配列(i)PRHRALRをPRHAALRに;(ii)PRHRALRをPRHKALRに;(iii)PRHRALRをPRHRALAに;(iv)PRHRALRをPRHRALKに;(v)PRHRALRをPRHRALHに;(vi)PRHRALRをPRHRALTに;(vii)PRHRALRをPRHHALRに;又は(viii)PRHRALRをPRHTALRに変化させる。
【００８７】
幾つかの態様において、前記融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、N末端リーダーペプチドを含まない。例えば、幾つかの態様において、前記融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、野生型RAGEの1〜23アミノ酸からなるN末端リーダーペプチドを含まない。あるいは、幾つかの態様において、前記融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、野生型RAGEの1〜22アミノ酸からなるN末端リーダーペプチドを含まない。あるいは、他の態様において、前記融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、野生型RAGEの1〜24アミノ酸からなるN末端リーダーペプチドを含まない。
【００８８】
幾つかの態様において、1つ以上の突然変異は、プロセシングされたヒトRAGEポリペプチドの、以下の(i)N2Q;(ii)N58Q;(iii)G59S;(iv)N2及びN58Q;又は(v)N2Q及びG59Sの1つ以上を含み、当該融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、野生型RAGEポリペプチドの1〜23アミノ酸からなるN末端リーダーペプチドを含まない。例えば、この番号付けにおいて、RAGE融合タンパク質は、配列番号34(2つのRAGE免疫グロブリン様ドメインを有するRAGE融合タンパク質であり、下記で詳述する)のRAGE融合タンパク質のアミノ酸配列に対応し、ここで、1〜23アミノ酸のシグナル配列は含まれず、そして当該RAGE融合タンパク質は、全長野生型RAGE配列(配列番号1)に対して点突然変異又は突然変異を有することにより、アミノ酸24で始まる数に基づき、グリコシル化部位及び／又はフリン開裂部位が、除去及び／又は変換される。また、この番号付けにおいて、RAGE融合タンパク質は、配列番号37(1つのRAGE免疫グロブリン様ドメインを有するRAGE融合タンパク質であり、下記で詳述する)のRAGE融合タンパク質のアミノ酸配列に対応し、ここで、1〜23アミノ酸のシグナル配列は含まれず、そして当該RAGE融合タンパク質は、全長野生型RAGE配列(配列番号1)に対して点突然変異又は突然変異を有することにより、アミノ酸24で始まる数に基づき、グリコシル化部位及び／又はフリン開裂部位が、除去及び／又は変換される。例えば、配列番号62は、2つのRAGEドメインを有するRAGE融合タンパク質のアミノ酸配列を提供し、ここで、第一のRAGEドメインは、全長RAGE野生型配列である配列番号１のN25Qに対応するN2Q点突然変異を有する。同様に、配列番号63は、2つのRAGEドメインを有するRAGE融合タンパク質のアミノ酸配列を提供し、ここで、当該ドメインは、全長RAGE野生型配列のN81Qに対応するN58Q点突然変異を有する。同様の配列は、単一のRAGEドメイン(例えば配列番号57、37、36及び35)又は3つのドメインを有するRAAGE融合タンパク質を用いて生産されてもよい。例えば、本明細書中に詳述するように、配列番号225は、RAGEのアミノ酸24〜136に対応する単一のRAGE免疫グロブリン様ドメインを有する融合タンパク質であり、当該融合タンパク質の位置2(即ち全長RAGEタンパク質のアミノ酸25に対応する)、58及び173に突然変異を有する。
【００８９】
本明細書中で詳述するように、RAGEポリペプチドは、全長RAGEの断片であってもよい。配列番号1は、全長RAGEのアミノ酸配列を提供する。
【００９０】
幾つかの態様において、ヒトRAGEポリペプチドは、融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分が野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸1〜23からなるN末端リーダーペプチドを含まないように処理される。この態様において、1つ以上の突然変異をグリコシル化部位に含むRAGEポリペプチドは、(i)配列番号8、配列番号16、若しくは配列番号20、又は(ii) 配列番号8、配列番号16、若しくはN末端グルタミンが環状化してピログルタミン酸を形成している配列番号20の1つ以上に記載される配列を含んでもよい。
【００９１】
同様に、幾つかの態様において、前記フリン開裂部位を除去する突然変異は、野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸1〜23から成るN末端リーダーペプチドを含まないヒトRAGEポリペプチドのR195A、R195K、R195T、R195H、R198A、R198K、R198H、R198Tの一つ以上を含む。この態様において、フリン開裂部位に1つ以上の突然変異を有するRAGEポリペプチドは、配列番号20、又はN末端のグルタミンが環状化してピログルタミン酸を形成する配列番号20に記載の配列を含んでも良い。この部位は、配列番号57、37、36及び35の短いRAGE融合タンパク質中には存在しない。
【００９２】
本明細書中により詳細に記載されるように、幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質の免疫グロブリン部分は、当該分子の性質を改善するように改変される。例えば、幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質は、2つのRAGE免疫グロブリン様ドメインを有するヒトRAGE融合タンパク質(例えば配列番号34)の位置288グリコシル化部位に突然変異を有し、ここで、融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、野生型RAGEポリペプチドのアミノ酸1〜23からなるN末端リーダーペプチドを含まない。幾つかの態様において、前記突然変異は、グリコシル化部位中のNSTをQSTに変化させる。一つの態様において、当該突然変異は、配列番号34として表されるRAGE融合配列に対して、N288Qの変異を有する。1つのRAGEドメインのみを有するRAGE融合タンパク質(例えば配列番号37)においても、同様のタンパク質が生産され得る。この場合、免疫グロブリンの突然変異は、位置173に見出されても良い。単一のRAGEドメインを有し、位置2、58及び173に突然変異を有するRAGE融合タンパク質の例として、橋列番号225(図6FF)が提供される。当業者は、2つのRAGEドメインを有する融合タンパク質において記載されている突然変異が、RAGEドメインを1つ又は3つ有するRAGE融合タンパク質の類似の位置に形成されてもよいことを理解する。配列番号57、37、36及び35に例示されるようなドメインを1つだけ有する短いRAGE融合タンパク質にはフリン開裂部位を存在しないが、3つのRAGE免疫グロブリン様ドメインを有する野生型RAGE融合タンパク質には存在する。
【００９３】
また、本明細書中に記載されているように、本発明のRAGE融合タンパク質、核酸構築物及び／又は他の組成物、方法及びシステムの各態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、CH2ドメイン又はCH2ドメインの断片を含んでもよい。一つの態様において、CH2ドメイン又はCH2ドメインの断片は、ヒンジ領域の一部以上を含まない。幾つかの態様において、CH2ドメイン又はCH2ドメインの断片は、C末端を介して、免疫グロブリンポリペプチドのCH3ドメイン又はCH3ドメインの断片のN末端と連結している。
【００９４】
免疫グロブリンドメインは、当該技術分野で知られる様々な免疫グロブリンに由来してもよい。幾つかの態様において、前記免疫グロブリンは、ヒトIgGを含む。故に、幾つかの態様において、免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインは、配列番号38、又はC末端リシンのない配列番号38(即ち配列番号86)、又はN末端プロリンのない配列番号38、又はN末端プロリン及びC末端リシンのない配列番号38(配列番号88)を含む。一つの態様において、CH2ドメインは、配列番号90又は91を含む。一つの態様において、CH2ドメイン(又はその断片)に含まれないヒンジ領域の部分は、配列番号223又は配列番号224に記載された配列を有する。配列番号89は、配列番号34の位置288に対応する位置で突然変異を生じたヒトIgG免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインの例を提供する。
【００９５】
故に、幾つかの態様において、本発明は、配列番号62〜81、配列番号92〜190、又は配列番号58〜61、82、200若しくは201のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含むRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を含み得る。また、いくつかの態様において、本発明は、配列番号62〜81、配列番号92〜190、又は配列番号58〜61、82、200若しくは201のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有するRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を含み得る。
【００９６】
本発明のRAGE融合タンパク質は、互いに非共有結合を形成し得る。故に、幾つかの態様において、本発明の融合タンパク質は、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はそれらの混合物を形成する。
【００９７】
例えば、幾つかの態様において、本発明は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを有する融合タンパク質を提供し、ここで、(a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、ここで、当該RAGEポリペプチドは、野生型RAGEポリペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、グリコシル化部位が除去及び／又は変換されており、かつ(b)免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、CH3ドメインと動作可能に連結している。他の態様において、本発明は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを有する融合タンパク質を提供し、ここで、(a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、ここで、当該RAGEポリペプチドは、野生型RAGEポリペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、フリン開裂部位が除去及び／又は変換されており、かつ(b)免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、CH3ドメインと動作可能に連結している。
【００９８】
尚も他の態様において、本発明は、RAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドを有する融合タンパク質を提供し、ここで、(a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含み、ここで、当該RAGE融合タンパク質は、(i)野生型RAGEポリペプチド及び／又は免疫グロブリンに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、グリコシル化部位が除去及び／又は変換されており、及び／又は(ii)野生型RAGEペプチドに対して1つ以上の残基で点突然変異又は突然変異を含むことにより、フリン開裂部位が除去及び／又は変換されており、かつ(b)免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、CH3ドメインと動作可能に連結している。本明細書中に記載されているように、幾つかの態様において、そして下記で詳述するように、免疫グロブリンポリペプチドは、ヒンジ領域の一部以上を含まないCH2ドメインの断片を含む。また、幾つかの態様において、CH2ドメインの一部として含まれないヒンジ領域又はその一部は、配列番号223又は配列番号224に記載の配列を有し、又は含む。
【００９９】
本発明の融合タンパク質中の野生型RAGEペプチドの突然変異は、野生型RAGE融合タンパク質(即ち、グリコシル化部位又はフリン開裂部位のいずれかを除去するための1つ以上の点突然変異がないRAGE融合タンパク質)と比較して、代謝安定性、薬物動態的半減期、及び／又は結合親和性を増大させ得る。幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、高ナノモラー〜低マイクロモラーの範囲の親和性でRAGEリガンド(S100b)と結合し得る。また、幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、対応する野生型RAGE融合タンパク質よりもRAGEリガンドに対する親和性が高い場合もある。例えば、幾つかの態様において、N2及び／又はN58のグリコシル化部位を除去するようにRAGEポリペプチド部分に1つ以上の点突然変異を有する本発明の融合タンパク質は、類似の野生型RAGE融合タンパク質よりもs100bに対する結合親和性が増大しており、そして2倍以上の結合親和性を有していてもよい。
【０１００】
図１〜８は、本発明の様々なアミノ酸及び核酸構築物の例を提供する。
【０１０１】
例えば、図1は、全長ヒトRAGE(配列番号１)、アミノ酸1〜22に相当するシグナル配列を除去した（配列番号2)、及び1〜23を除去した(配列番号3)全長ヒトRAGEのアミノ酸配列を提供する(図1A)。また、図１は、本発明のRAGE融合タンパク質に使用され得るヒトRAGEの様々な断片(配列番号4〜24及び44)(図1C〜1F及び図1J)、並びにこれらのRAGEポリペプチド配列及びRAGEポリペプチド配列の断片をコードするDNA配列(配列番号25〜29)(図1G〜1H)を提供する。また、図1(図1Iおよび図1J)は、CH2及びCH3ドメインを含むヒト免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列、ここで、CH2はヒンジ領域の少なくとも一部、を含まない(配列番号38)、CH2及びCH3ドメインを含むヒト免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列、ここでCH2はヒンジ領域の少なくとも一部を含まない(配列番号40)、ヒンジ領域の少なくとも一部を含むCH2ドメインを含むヒト免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号42)、CH3ドメインを含むヒト免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列、及びCH2及びCH3ドメインを含むヒト免疫グロブリンポリペプチドをコードするDNA配列、ここでCH2はヒンジ領域の少なくとも一部を含まない(配列番号41)、並びにここでCH2はヒンジ領域の少なくとも一部を含む(配列番号39)、を提供する。また、図１は、N末端グルタミン(Q)が環状化してピログルタミン酸になるRAGEの断片の配列を提供する(図1K及び1L)。図1Mは、それぞれ配列番号38及び40の免疫グロブリンポリペプチドをコードする他の核酸配列である配列番号52及び53を提供する。
【０１０２】
下記で詳述するように、図2及び3は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードする様々な核酸構築物の配列を提供する。図4及び5は、本発明の様々なRAGE融合タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【０１０３】
突然変異残基の位置は、本明細書中、哺乳類RAGEに関して、全長タンパク質のアミノ酸1〜23に相当するN末端配列を差し引いて記載される。例えば、シグナル配列がないRAGEポリペプチドの位置2のグルタミン残基(N)を指すN2は、全長RAGEの位置25のグルタミンに対応する(配列番号1)(図1)。故に、上記いずれかの態様における融合タンパク質は、配列番号3のヒトRAGEペプチドの断片を含むRAGEポリペプチドを含み得る。故に、上記のように、本明細書中で使用される特定の点突然変異の記載において、RAGE及び／又は免疫グロブリンポリペプチドの突然変異の位置は、配列番号3のアミノ酸配列、又は2つのRAGEドメインを有し配列番号34に記載されるRAGE融合タンパク質の残基の番号に基づく。配列番号3に対応するアミノ酸配列は、シグナル配列のないヒトRAGEの全長配列(残基1〜23のない配列番号1)に対応する。配列番号34のアミノ酸配列は、シグナル配列のない2つのRAGEドメインを有するRAGE融合タンパク質(残基1〜23のない配列番号1)に対応する。当業者は、2つのRAGEドメインを有する融合タンパク質(配列番号34)において記載される突然変異が、RAGEドメインを1つだけ、又は3つ有するRAGE融合タンパク質の類似の位置に形成され得ることを理解し得る。フリン開裂部位は、配列番号57、37、36及び35に記載されるようなドメインを1つだけ有する短いRAGE融合タンパク質には存在しない。
【０１０４】
RAGEポリペプチドがグリコシル化部位を除去する点突然変異を含む幾つかの融合タンパク質の態様において、当該点突然変異は、RAGEリガンド結合ドメインにあってもよい。そのような態様において、グリコシル化部位を除去する点突然変異は、代替的に、シグナル配列を含まない融合タンパク質のN末端の初めの100、90、80、70、60、50、40又は30アミノ酸以内にあってもよい。
【０１０５】
他の態様において、本発明は、上記いずれかの態様の融合タンパク質を提供し、ここで、(a)RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインおよび配列番号3の初めの200アミノ酸以上を含むヒト野生型RAGEペプチド(配列番号3)の断片を含み、ここで、当該RAGEポリペプチドは、(i)残基2又は58の1つ又は両方で点突然変異又は突然変異を含むことにより、グリコシル化部位が除去及び／又は変換されており、及び／又は(ii)残基193〜198の1つ以上で点突然変異を含むことにより、フリン開裂部位が除去及び／又は変換されており、かつ(b)免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含む。幾つかの態様において、本発明は、上記態様のいずれかの融合タンパク質を提供し、ここで、RAGEリガンド結合ドメインは、当該融合タンパク質の大半のN末端ドメインを含む。
【０１０６】
他の態様において、RAGEポリペプチドは、(a)N2Q、(b)N58Q、(c)N2Q及びN58Qからなる群から選択される点突然変異を含み、ここで当該点突然変異の位置は、配列番号3に基づくものであり、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号13、14、15、16、46、48又は49を含む。
【０１０７】
尚も他の態様において、前記点突然変異は、(a)R195A、(b)R195K、(c)R198A、(d)R198K、(e)R198H、及び(f)R198Tからなる群から選択される点突然変異に対応し、ここで、当該点突然変異の位置は配列番号3に基づき、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号5、6、17、18、19、20、45、50、又は51を含む。あるいは、前記点突然変異は、(a)R195A、(b)R195K、(c)R198A、(d)R198K、(e)R198H、及び(f)R198Tからなる群から選択される点突然変異に対応し、ここで、当該点突然変異の位置は配列番号3に基づき、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号5、6、17、18、19、20、45、50、又は51を含む。
【０１０８】
尚も他の態様において、前記点突然変異は、(a)N2Q;(b)N58Q;(c)N2Q及びN58Q;(d)R195A;(e)R195K;(f)R198A;(g)R198K;(h)R198H;(i)R198T;(j)N2Q及びR198A;(k)N58Q及びR198A;並びに(l)N2Q、N58Q、及びR198Aからなる群から選択される点突然変異に対応し、ここで、当該点突然変異の位置は配列番号3に基づき、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号5、6、17、18、19、20、45、50、又は51を含む。尚も他の態様において、前記点突然変異は、(a)N2Q;(b)N58Q;(c)N2Q及びN58Q;(d)R195A;(e)R195K;(f)R198A;(g)R198K;(h)R198H;(i)R198T;(j)N2Q及びR198A;(k)N58Q及びR198A;並びに(l)N2Q、N58Q、及びR198Aからなる群から選択される点突然変異に対応し、ここで、当該点突然変異の位置は配列番号3に基づき、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号5、6、17、18、19、20、45、50、又は51を含む。
【０１０９】
尚も他の態様において、前記点突然変異は、単独、又は任意の可能な組合せのR195H、R195T、及び／又はG59Sからなる群から選択される点突然変異、及び／又はR195H、R195T、及び／又はG59Sの1つ以上と組み合わせた上記突然変異に対応し、ここで、当該点突然変異の位置は配列番号3に基づき、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号5、6、17、18、19、20、45、50、又は51を含む。尚も他の態様において、前記点突然変異は、単独、又は任意の可能な組合せのR195H、R195T、及び／又はG59Sからなる群から選択される点突然変異、及び／又は上記突然変異に対応し、ここで、当該点突然変異の位置は配列番号3に基づき、そしてRAGEポリペプチドは、配列番号5、6、17、18、19、20、45、50、又は51を含む。
【０１１０】
下記表１は本発明の突然変異の非限定的な例を提供し、突然変異の位置は、配列番号34に記載のアミノ酸配列を有するRAGE融合タンパク質に基づく。表１の実際のアミノ酸配列(即ち、配列番号62〜81、配列番号92〜190並びに配列番号58〜61、82、200及び201)は、図6A〜6EEに示されている。
【表１】
2013520166.tif 000002
【０１１１】
他の態様において、本発明の融合タンパク質は、上記配列の一つと70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%以上の同一性のアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明の融合タンパク質は、配列番号62〜81、配列番号92〜190、又は配列番号58〜61、82、200若しくは201と70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%以上の同一性のアミノ酸配列を含み、ここでRAGE融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、i)1つ以上の残基に点突然変異又は突然変異を含むことにより、1つ以上のグリコシル化部位が除去及び／又は変換され、かつii)1つ以上の残基に点突然変異を含むことにより、1つ以上のフリン開裂部位が除去及び／又は変換されている。
【０１１２】
他の態様において、本発明の融合タンパク質は、配列番号62〜81、配列番号92〜190、又は配列番号58〜61、82、200若しくは201のいずれか1つに記載されているアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号62〜81、配列番号92〜190、又は配列番号58〜61、82、200若しくは201のいずれか1つのアミノ酸配列である。
【０１１３】
本発明の融合タンパク質のRAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合ドメインを含む哺乳類野生型RAGEペプチドの断片を含んでもよい。一つの態様において、RAGEペプチドの断片は、野生型RAGEペプチド由来の連続した25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、又は250以上のアミノ酸配列を含んでも良い。一つの態様において、当該RAGEポリペプチドは、配列番号6(図1C)のヒト野生型RAGEペプチドの断片を含む。
【０１１４】
上記態様のいずれかのRAGEポリペプチドのRAGEリガンド結合ドメインは、RAGE Vドメインを含んでもよく、例えば、図1D及び1Kの配列番号７、配列番号８、配列番号４６、並びに図8Cの配列番号１９１、配列番号１９２、又は配列番号１９３を参照されたい。あるいは、RAGE Vドメイン又はその断片と95%の相同性を有する配列が使用されてもよい。
【０１１５】
他の態様において、上記いずれかの態様のRAGEリガンド結合ドメインは、配列番号9、若しくはこれと95%以上の同一性を有する配列、又は配列番号10、若しくはこれと95%以上の同一性を有する配列(図1D)、又は配列番号47、若しくはこれと95%以上の同一性を有する配列(図1K)、又は配列番号194、若しくはこれと95%以上の同一性を有する配列、又は配列番号195、若しくはこれと95%以上の同一性を有する配列(図8C)を含んでも良い。
【０１１６】
他の態様において、リガンド結合ドメインは、配列番号1(図1)のアミノ酸23〜53を含んでも良い。他の態様において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸24〜52を含んでも良い。他の態様において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸31〜52を含んでも良い。他の態様において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸31〜116を含んでも良い。他の態様において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸19〜52を含んでも良い。例えば、リガンド結合ドメインは、RAGE Vドメイン又はその断片、例えばRAGEリガンドドメイン(例えば配列番号1のアミノ酸1〜118、23〜118、24〜118、31〜118、1〜116、23〜116、24〜116、31〜116、1〜54、23〜54、24〜54、31〜54、1〜53、23〜53、24〜53、若しくは31〜53又はその断片)を含んでも良い。あるいは、RAGEリガンドと機能的に結合するポリペプチドの断片が使用されてもよい。あるいは、RAGEドメイン又はその断片と70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%以上の同一性を有する配列が使用されても良い。
【０１１７】
更に、当該技術分野で知られているように、例えば配列番号1のアミノ酸配列1〜23を含むシグナル配列を除去した場合等、融合タンパク質のN末端がグルタミンである場合の態様において、当該グルタミン(例えば配列番号１のQ24)は、環状化してピログルタミン酸(pE)を形成し得る。本明細書中に記載されるように、N末端グルタミンが環状化してpEとなったこれらの各態様において、RAGEリガンド結合ドメインを有する配列は、グリコシル化部位を変換する1つ以上の点突然変異、若しくはグリコシル化部位を除去する1つの点突然変異を有してもよく、又は2つのグリコシル化部位を除去及び／又は変換する2つ以上の点突然変異を有しても良い。また、RAGE配列は、酵素(例えばフリン)開裂部位を変換及び／又は除去する突然変異を含んでも良い。
【０１１８】
本明細書中により詳細に記載されているように、本発明のRAGE融合タンパク質は、細胞内で発現されても良い。図7は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードするのに使用され得る拡散配列を提供し、ここで配列番号221は、野生型核酸配列(即ちヒトRAGE及びヒト免疫グロブリンの野生型)であり、配列番号222は、発現に最適化された核酸配列である。また、図8Aは、ヒトRAGEのシグナル配列に対応する、野生型及び改変核酸配列(配列番号84及び85)を提供する。
【０１１９】
故に、幾つかの態様において、RAGEポリペプチドは、更に、シグナル配列残基を含んでも良い。例えば、融合タンパク質のシグナル配列は、内在ヒトRAGEシグナル配列(配列番号83)又は内在配列を改変したシグナル配列(配列番号84等)、あるいはリーダー配列が最初の残基としてメチオニンでなくグリシンを有するシグナル配列(例えばNeeper et al., 1992)を含んでも良い。
【０１２０】
当該技術分野で理解されているように、本発明のRAGE融合タンパク質のCH3領域は、特定の組換えシステムにおいて発現されるときに転写後修飾により切り出されるC末端アミノ酸を有し得る(例えばLi, et al., BioProcessing J., 4:23-30 (2005))。一つの態様において、切り出されるC末端アミノ酸はリシン(K)である。故に、本発明の各タンパク質及びタンパク質組成物の他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、C末端リシン(K)のないアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでも良い。そのような融合タンパク質の非限定的な例として、配列番号92〜111、152〜171、59及び82が挙げられる。
【０１２１】
本明細書中で議論するように、融合タンパク質は、免疫グロブリン由来のポリペプチドを含んでも良い。様々な態様において、そして本明細書中で開示される例示的態様で示すように、RAGE融合タンパク質は、RAGE融合タンパク質の免疫グロブリンポリペプチド内のグリコシル化部位を除去するように、点突然変異を含む。例えば、一つの態様において、RAGE融合タンパク質は、配列番号34に記載の配列に基づく位置288(例えばN288Q)、及び／又は配列番号37に記載の配列に基づく位置173(例えばN173Q)に、突然変異を有してもよい。
【０１２２】
幾つかの態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、1つ以上のヒンジ領域を含まないCH2ドメイン又はドメインCH2の断片を含む。例えば、他の態様において、CH2ドメインの一部として含まれないヒンジ領域は、配列番号223又は224に記載の配列を有する。幾つかの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、免疫グロブリンポリペプチドのCH3ドメイン又はその断片のN末端と、C末端を通じて連結している。
【０１２３】
故に、幾つかの態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメインの断片以上、及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖又はその部分(即ち断片)を含んでも良い。例えば、重鎖断片は、免疫グロブリンのFc断片由来のポリペプチドを含んでもよく、ここで、Fc断片は、モノマーとして免疫グロブリン重鎖の重鎖ヒンジポリペプチド及びCH2及びCH3ドメインを含む。重鎖(又はその部分)は、公知の重鎖アイソタイプ：IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)、orIgA(α)のいずれか1つに由来してもよい。加えて、重鎖(又はその部分)は、公知の重鎖サブタイプ：IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)、若しくはIgA(α)、又はこれらのアイソタイプ又はサブタイプの突然変異で生物活性が改変されたもののいずれか1つに由来してもよい。前記免疫グロブリンは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインの両方を含んでも良い。例示的態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はそれらの断片を有するポリペプチドは、配列番号40(図1)又はその断片を含んでもよい。一つの態様において、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を有するポリペプチドは、配列番号38又はその断片を含んでも良い。免疫グロブリンペプチドは、配列番号39又は配列番号41(図1)の核酸配列にコードされても良い。配列番号38又は配列番号40の免疫グロブリン配列は、配列番号52又は配列番号53(図1)にコードされてもよく、ここで、当該配列のC末端のプロリン(CCGからCCC)及びグリシン(GGTからGGG)をコードするコドンの静かな塩基変換(silent base change)が、末端コドン付近の隠れた(cryptic)RNAスプライス部位を除去する(即ち、配列番号39のヌクレオチド622〜627は、配列番号52となるように改変され、又は配列番号41のヌクレオチド652〜657は、配列番号53となるように改変される)。他の態様において、配列番号42の断片は、Fcヒンジ領域の一部以上を含む初めの10又は11アミノ酸が除去された配列番号42を含む(例えば配列番号90又は91)。
【０１２４】
免疫グロブリン鎖のFc部分のヒンジ領域は、インビボで炎症を促進し得る。故に、一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGE由来のドメイン間リンカーを含むが、免疫グロブリン由来のドメイン間ヒンジポリペプチドを含まない。
【０１２５】
幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドと直接連結しており、ここで免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのCH2ドメインの断片以上、及びCH3ドメインの断片以上を含む。一つの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、配列番号42(図1)を含む。一つの態様において、一つの態様において、配列番号42の断片は、Fcヒンジ領域の一部以上を含む初めの10又は11アミノ酸が除去された配列番号42を含む(例えば配列番号90又は91)(図8B)。例えば、上記のように、幾つかの態様において、CH2ドメインから除去された11又は10アミノ酸ヒンジ領域は、それぞれ配列番号223又は224(図8C)に記載の配列を有する。
【０１２６】
上記のように、幾つかの態様において、前記CH2ドメインは、免疫グロブリンのCH3ドメインのN末端と、そのC末端を介して連結している。例えば、幾つかの態様において、融合タンパク質の上記いずれかの態様の免疫グロブリンポリペプチドは、配列番号86、87、88、又は89のいずれかを含み得る。図8Bに示すように、配列番号89は、配列番号34のRAGE融合タンパク質に記載のN288Qに対応する突然変異を有し、当該突然変異は、RAGE融合タンパク質の免疫グロブリン部分のグリコシル化部位を除去する。
【０１２７】
本発明のRAGE融合タンパク質に使用されるRAGEポリペプチドは、1つ又は複数のRAGE免疫グロブリンドメインを含んでも良い。加えて、あるいはその代わりに、RAGEの断片は、ドメイン間リンカーを有してもよい。例えば、RAGEポリペプチドは、上流(即ちN末端側)又は下流(即ちC末端側)ドメイン間リンカーと連結したRAGE免疫グロブリンドメインを含んでも良い。
【０１２８】
幾つかの態様において、RAGEポリペプチドは、それぞれ互いにドメイン間リンカーで連結した2つ（又はそれ以上)のRAGE免疫グロブリンドメインを含んでも良い。そのような態様において、RAGEポリペプチドは、互いに1つ以上のドメイン間リンカーで連結した複数のRAGE免疫グロブリンドメインを含んでも良い。更に、RAGEポリペプチドは、N末端RAGE免疫グロブリンドメイン及び／又はC末端免疫グロブリンドメインと連結した末端ドメイン間リンカーを含んでもよい。RAGE免疫グロブリンドメインとドメイン間リンカーとの更なる組合せは、本発明の範囲内である。
【０１２９】
一つの態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリンドメインと結合したRAGEドメイン間リンカーを有し、当該RAGE免疫グロブリンドメインのC末端アミノ酸は、当該RAGEドメイン間リンカーのN末端アミノ酸と連結し、そして当該RAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸は、免疫グロブリンポリペプチドのN末端アミノ酸と直接連結している。免疫グロブリンのCH2ドメインを有するポリペプチドは、上記のように、免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインの断片以上を含み、例えば、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインの断片以上である。例えば、前記免疫グロブリンポリペプチドは、ヒンジ領域が少なくとも部分的に除去されたCH2ドメインの断片を含んでも良い。
【０１３０】
一つの態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGEタンパク質由来の2つの免疫グロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチド由来の2つの免疫グロブリンドメインを含んでも良い。RAGE融合タンパク質は、第一のRAGE免疫グロブリンドメイン及び第二のRAGE免疫グロブリンドメインと連結する第一のドメイン間リンカー及び第二のRAGEドメイン間リンカーを含んでもよく、それにより、第一のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸は第一のRAGE免疫グロブリンドメインのC末端アミノ酸と連結し、第二のRAGE免疫グロブリンドメインのN末端アミノ酸は第一のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸と連結し、第二のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸は第二のRAGE免疫グロブリンドメインのC末端アミノ酸と連結し、そしてRAGEの第二のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸はCH2免疫グロブリンドメインのN末端アミノ酸と連結する。更なる態様において、RAGEの第二のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸は、CH2免疫グロブリンドメインのN末端アミノ酸と直接連結する。そのような構築物の例として、配列番号32、33、34及び56が提供される(図4)。
【０１３１】
あるいは、3ドメインRAGE融合タンパク質は、RAGE由来の1つの免疫グロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチド由来の2つの免疫グロブリンドメインを有していてもよい。例えば、RAGE融合タンパク質は、CH2免疫グロブリンドメイン又はCH2免疫グロブリンドメインの部分のN末端アミノ酸とRAGEドメイン間リンカーを介して連結した1つのRAGE免疫グロブリンドメインを含んでもよい。更なる態様において、RAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸は、CH2免疫グロブリンドメイン又はCH2免疫グロブリンドメインの部分のN末端アミノ酸と直接連結する。そのような構築物の例は、配列番号35、36、37及び57に提供される(図5)。
【０１３２】
RAGEドメイン間リンカーの断片は、天然でRAGE免疫グロブリンドメインの下流にあり、故に連結している、ペプチド配列を含んでもよい。例えば、RAGE Vドメインにおいて、ドメイン間リンカーは、天然でVドメインの下流にあるアミノ酸配列を有しても良い(図1F)。一つの態様において、当該リンカーは、配列番号21を含んでもよく、これは全長RAGE(配列番号1)のアミノ酸117〜123に対応する。あるいは、当該リンカーは、天然のRAGE配列の追加の部分を有するペプチドを含んでも良い。例えば、配列番号21の上流及び下流に幾つかのアミノ酸(例えば1〜3、1〜5、又は1〜10、又は1〜15アミノ酸)を含むドメイン間リンカーが使用されてもよい。故に、一つの態様において、ドメイン間リンカーは、全長RAGE(配列番号1)のアミノ酸117〜136を含む配列番号23を含む。あるいは、リンカーのいずれかの末端から1、2、又は3アミノ酸を除去した配列番号21の断片が使用されてもよい。他の対応において、リンカーは、配列番号21又は配列番号23との同一性が70%、75% 、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%以上のペプチドを含んでも良い。
【０１３３】
RAGE C1ドメインにおいて、リンカーは、天然でC1ドメインの下流にあるペプチド配列を含んでも良い。一つの態様において、リンカーは配列番号22を含んでもよく、これは全長RAGE(配列番号1)のアミノ酸222〜251に対応する。あるいは、リンカーは、天然のRAGE配列の追加の部分を有するペプチドを含んでも良い。例えば、幾つかの(1〜3、1〜5、又は1〜10、又は1〜15アミノ酸)アミノ酸を配列番号22の上流及び下流に含むリンカーが使用されてもよい。あるいは、リンカーのいずれかの末端から1〜3、1〜5、又は1〜10、又は1〜15アミノ酸を削除した配列番号22の断片が使用されてもよい。例えば、一つの態様において、RAGEドメイン間リンカーは、配列番号24を含んでもよく、これは全長RAGE(配列番号1)のアミノ酸222〜226に対応する。他の態様において、リンカーは、配列番号22又は配列番号24との同一性が70%、75% 、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%以上のペプチドを含んでも良い。
【０１３４】
グリコシル化部位及び／又は酵素開裂部位のいずれかを除去する様々な点突然変異の作製に使用され得るアミノ酸置換の例は、本明細書中に提供される。故に、本明細書中に記載されるように、グルタミン(Q)は、アスパラギン(N)に置換され得る。また、リシン(K)又はヒスチジン(H)は、アルギニン(R)に置換され得る。あるいは、別の態様において、アラニン(A)又はスレオニン(T)のような中性アミノ酸は、アルギニン(R)に置換され得る。あるいは、中性アミノ酸同士で置換されてもよく、例えばセリン(S)はグリシン(G)で置換されてもよい。
【０１３５】
加えて、当業者は、コードされる配列中の1つのアミノ酸又は僅かな割合のアミノ酸(典型的には約5%未満、より典型的には約1％未満)を変換、追加又は消去する個々の置換、欠失又は付加は、それらがアミノ酸を化学的に類似のアミノ酸で置換するものである場合、保存的に改変された変異(conservatively modified variation)であると理解し得る。機能的に類似のアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当該技術分野で周知である。下記に、保存的置換となるアミノ酸の群の例を示す。
(1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
(3)アスパラギン(N),グルタミン(Q)；
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；及び
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(T)、トリプトファン(W)
【０１３６】
一般に、保存的置換は、置換するアミノ酸(天然に存在する又は改変された)が、置換されるアミノ酸と構造的に関連している、即ち置換されるアミノ酸と概ね同一のサイズ及び電気的特性を有する置換である。故に、置換するアミノ酸は、側鎖に元のアミノ酸と同一又は類似の官能基を有し得る。「保存的置換」は、側鎖の官能基が適切な保護基で保護されていることを除いて置換されるアミノ酸と同一の置換するアミノ酸を利用することも意味し得る。
【０１３７】
当該技術分野で知られているように、アミノ酸は、酵素的又は非酵素的反応メカニズムのいずれかにより、天然の構造から化学的に改変されてもよい。例えば、一つの態様において、N末端グルタミン酸又はグルタミンは、水を失って環状化され、ピログルタミン酸(pyroE又はpE)を形成する(Chelius et al., Anal.Chem, 78: 2370-2376 (2006)及びBurstein et al., Proc. National Acad. Sci., 73:2604-2608 (1976))。あるいは、N末端ピログルタミンを有する融合タンパク質は、潜在的に、転写後プロセシングでN末端となるタンパク質中の位置にあるグルタミン酸をコードする核酸を通じてアクセスされ得る(例えば、配列番号1の残基24がグルタミンでなくグルタミン酸塩である場合)。本発明の融合タンパク質は、発現及び／又は精製の過程での酵素的又は非酵素的反応メカニズムにより起こり得る、又はタンパク質機能の他の側面において補助するために加えられる他の化学的変更を含む。
【０１３８】
本発明の融合タンパク質は、非共有結合によりインビボ又はインビトロで結合して、マルチマーを形成し得る。故に、上記融合タンパク質のいずれかの態様において、融合タンパク質は、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はそれらの混合物であってもよい。
【０１３９】
本発明の特定の態様に関連し得る様々な利点が存在する。幾つかの態様において、そして下記でより詳細に議論するように、本発明のRAGE融合タンパク質は、突然変異のない野生型RAGEペプチドを有する対応するタンパク質と比較して、対象に投与されたときに代謝的に安定であってもよい。
【０１４０】
また、下記でより詳細に議論するように、本発明のRAGE融合タンパク質は、突然変異のない野生型RAGEペプチドを有する対応するタンパク質と比較して、RAGEリガンドに対してより高い結合親和性を呈するものであってもよい。幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、高ナノモラー〜低マイクロモラーの範囲の親和性でRAGEリガンドと結合する。生理的RAGEリガンドに対する高い親和性での結合により、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEに対する内在的リガンドの結合を阻害することにより、RAGEが介在する疾患を緩和するのに使用され得る。
【０１４１】
RAGE融合タンパク質の生産方法
本発明は、上記態様に係る融合タンパク質のいずれか1つを生産する方法をも含む。故に、一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載の融合タンパク質のいずれか1つをコードする核酸配列を含む。
【０１４２】
本発明の核酸構築物は、本明細書中に記載の態様の各RAGE融合タンパク質をコードし得る。例えば、幾つかの態様において、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする単離された核酸を含み、ここで、RAGEポリペプチドは、リガンド結合ドメインを有する哺乳類RAGEの断片を含み、そして融合タンパク質は、1つ以上のRAGEポリペプチド又は免疫グロブリンポリペプチドの中に野生型配列に対して1つ以上の突然変異を含み、当該突然変異は、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換する。幾つかの態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、CH2ドメインの断片以上を含む。幾つかの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、ヒンジ領域を含まない。また、幾つかの態様において、酵素開裂部位は、フリン開裂部位である。
【０１４３】
RAGE融合タンパク質は、組換えDNA技術により操作され得る。例えば、一つの態様において、本発明は、上記態様に係る融合タンパク質のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列と相補的な、又は顕著に相同な配列を含む核酸配列を含み得る。例えば、連結したRAGEポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドは、1つの組換えDNA構築物にコードされてもよい。当該方法は、更に、DNA構築物を発現ベクターに組み込む工程を含んでも良い。また、当該方法は、当該発現ベクターを宿主細胞に導入する工程を含んでも良い。
【０１４４】
本発明の様々なRAGE融合タンパク質の上記態様のそれぞれは、そのようなRAGE融合タンパク質の生産に使用される核酸構築物、発現ベクター及び宿主細胞に含まれる。
【０１４５】
故に、本発明の態様は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでも良い。幾つかの態様において、本発明は、配列番号62〜81、92〜190、58〜61、82又は200、201のアミノ酸配列のいずれか1つをコードする核酸配列を提供する。
【０１４６】
他の態様において、核酸分子は、表1のRAGE融合タンパク質、即ち配列番号62〜81、92〜190、58〜61、82又は201のアミノ酸配列のいずれか1つと70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性が以上のアミノ酸配列を含むRAGE融合タンパク質をコードし、ここでRAGE融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、(i)グリコシル化部位を除去及び／又は変換する1つ以上の残基の点突然変異又は突然変異；及び／又は(ii)フリン開裂部位を除去及び／又は変換する1つ以上の残基の点突然変異を含む。
【０１４７】
他の態様において、前記核酸は、免疫グロブリンポリペプチドを含む融合タンパク質をコードし、ここで免疫グロブリンポリペプチドは、当初の免疫グロブリンアミノ酸配列に対して、免疫グロブリンポリペプチド中のグリコシル化部位を除去及び／又は変換する点突然変異を含む。
【０１４８】
点突然変異は、RAGE融合タンパク質の性質に有益な影響をもたらすように選択されてもよい。例えば、幾つかの態様において、前記点突然変異は、グリコシル化部位に存在する野生型RAGEポリペプチドの配列を変化させる。それにより、グリコシル化の種類及び／又は程度が変化し得る。
【０１４９】
グリコシル化部位は、タンパク質中に見出される様々な種類のグリコシル化部位の1つであってもよい。例えば、幾つかの態様において、グリコシル化認識部位は、NXS又はNXTである。幾つかの態様において、Xはプロリンではない。故に、幾つかの態様において、点突然変異は、野生型RAGEポリペプチドの配列を、NITからQIT、及び／又はNGSからQGS、及び／又はNGSからNSS、及び／又はNSTからQSTに変化させて、1つ以上のグリコシル化部位を除去及び／又は変化させる。幾つかの態様において、グリコシル化部位は、RAGE融合タンパク質のRAGE部分に位置する。グリコシル化部位は、幾つかの態様において、リガンド結合部位又はリガンド結合ドメイン内に位置してもよい。加えて、及び／又は代わりに、グリコシル化部位は、RAGE融合タンパク質の免疫グロブリン部分に位置する。あるいは、RAGE融合タンパク質中に存在し得る他のグリコシル化部位が標的であってもよい。
【０１５０】
幾つかの態様において、酵素開裂部位は、フリン開裂部位であり、そのため、点突然変異は、RAGEポリペプチドのフリン開裂における認識部位に存在する野生型RAGEポリペプチド中の配列を変化させる。例えば、別の態様において、点突然変異は、野生型RAGEポリペプチドの配列を以下のいずれか：(i)PRHRALRからPRHAALR;(ii)PRHRALRからPRHKALR;(iii)PRHRALRからPRHRALA;(iv)PRHRALRからPRHRALK;(v)PRHRALRからPRHRALH;(vi)PRHRALRからPRHRALT;(vii)PRHRALRからPRHHALR;又は(viii)PRHRALRからPRHTALRに変化させて、フリン開裂部位を除去及び／又は変換させる。
【０１５１】
例えば、核酸は、配列番号 202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、又は220との同一性が70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%以上の核酸配列を含み、ここで、核酸配列は、融合タンパク質をコードし、当該融合タンパク質のRAGEポリペプチド部分は、(i)グリコシル化部位を除去及び／又は変換する1つ以上の残基の点突然変異又は突然変異；及び／又は(ii)フリン開裂部位を除去及び／又は変換する1つ以上の残基の点突然変異を含む。他の態様において、本発明は、配列番号202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、又は220を含む核酸配列を提供する。
【０１５２】
本明細書中でより詳細に記載されるように、本発明のRAGE融合タンパク質は、当該タンパク質の精製された調製物を生産するために培養される細胞中で発現されてもよい。図7は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードするのに使用されてもよい核酸配列を提供し、ここで配列番号221は、野生型核酸配列(即ちヒトRAGE及びヒト免疫グロブリンの野生型)を含み、そして配列番号222は、それを細胞培養発現に最適化したものを含む。また、図8Aは、ヒトRAGEのシグナル配列に対応する、野生型及び改変核酸配列(配列番号84及び85)を提供する。
【０１５３】
故に、幾つかの態様において、本発明のRAGEポリペプチドをコードする核酸分子は、更にシグナル配列をコードする。本明細書の他の部分に記載されるように、RAGEポリペプチドは、当初のシグナル配列(配列番号83)、培養細胞内での発現を改善させるために当初の配列から改変したシグナル配列を含んでも良い。よって、本発明のRAGEポリペプチドをコードする核酸分子は、更に、当初の核酸シグナル配列(配列番号84)、又は当初の核酸配列から改変された核酸シグナル配列(例えば配列番号85)を含んでも良い。
【０１５４】
本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインの断片以上を含んでも良い。一つの態様において、免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインの断片は、配列番号38を含む。免疫グロブリンペプチドは、配列番号39又は配列番号41の核酸配列によりコードされていてもよい。配列番号38又は配列番号40の免疫グロブリンは、配列番号52又は配列番号53にコードされてもよく、ここで、当該配列のC末端のプロリン(CCGからCCC)及びグリシン(GGTからGGG)をコードするコドンの静かな塩基変換が、末端コドン付近の隠れた(cryptic)RNAスプライス部位を除去する(即ち、配列番号39のヌクレオチド622〜627は、配列番号52となるように改変され、又は配列番号41のヌクレオチド652〜657は、配列番号53となるように改変される)。
【０１５５】
上記のように、RAGE融合タンパク質は、組換えDNA構築物にコードされてもよく、当該方法は、DNA構築物を発現ベクターに組み込む工程を含んでも良い。故に、本発明の態様は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードする核酸をコードする発現ベクターをも含む。又、前記方法は、宿主細胞中に発現ベクターをトランスフェクションする工程を含んでも良い。本発明の発現ベクター及びトランスフェクションした宿主細胞は、本明細書中に記載の各態様に係るRAGE融合タンパク質をコードし得る。
【０１５６】
故に、幾つかの態様において、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする単離された核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、RAGEポリペプチドは、リガンド結合ドメインを有する哺乳類RAGEの断片を含み、そして融合タンパク質は、1つ以上のRAGEポリペプチド又は免疫グロブリンポリペプチドの中に野生型配列に対して1つ以上の突然変異を含み、当該突然変異は、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換する。幾つかの態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、CH2ドメインの断片以上を含む。また、幾つかの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、ヒンジ領域を含まない。また、幾つかの態様において、酵素開裂部位は、フリン開裂部位である。
【０１５７】
本発明の更なる他の態様は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードする核酸配列をコードする発現ベクターをトランスフェクションした細胞も含む。故に、幾つかの態様において、本発明は、免疫グロブリンペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含む発現ベクターをトランスフェクションした宿主細胞を含み、ここで当該RAGEポリペプチドは、リガンド結合ドメインを有する哺乳類RAGEの断片を含み、そして当該融合タンパク質は、野生型配列に対して、1つ以上のRAGEポリペプチド、又は免疫グロブリンポリペプチドに、1つ以上の突然変異を有し、そして当該突然変異は、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換する。幾つかの態様において、前記免疫グロブリンポリペプチドは、1つ以上のCH2ドメインの断片を含む。また、幾つかの態様において、CH2ドメイン又はその断片は、ヒンジ領域を有しない。また、幾つかの態様において、酵素開裂部位は、フリン開裂部位である。
【０１５８】
DNA構築物を発現ベクターに組み込むことを含む本発明の方法に関して、プラスミドは、異なる長さのヒトRAGEの5’cDNA配列をヒト免疫グロブリンポリペプチド(例えばIgG1 Fc (γ1))の3’cDNA配列と融合させたRAGE-IgG融合タンパク質を発現するように構築されてもよい。発現カセット配列は、標準的な組換え技術を使用したpcDNA3.1発現ベクター(Invitrogen, CA)等の発現ベクターに組み込まれても良い。あるいは、他のベクターが使用されてもよい。
【０１５９】
発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることを含む本発明の方法に関して、RAGE融合タンパク質は、哺乳類の発現系において発現してもよく、当該系において、発現構築物は、レトロウイルス、アデノウイルス又はバキュロウイルス等のウイルスを使用して、哺乳類細胞内に導入される。発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当該技術分野で周知であり、American Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎臓(HEK)293、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼若ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHepG2)、A549細胞、及び他の多くの細胞株を含む。幾つかの態様において、CHO又はHEK293細胞のいずれかが使用される。
【０１６０】
細胞株は、いずれの細胞株が高いレベルでRAGE融合タンパク質を発現するかを判定することにより選択されてもよい。使用され得る他の細胞株は、Sf9又はSf21細胞等の昆虫細胞株である。植物宿主細胞は、例えば、ニコチアーナ(Nicotiana)、アラビドプシス(Arabidopsis)、ウキクサ(duckweed)、トウモロコシ、小麦、ジャガイモ等である。細菌宿主細胞は、例えばE.coli及びストレプトマイケス(Streptomyces)等である。酵母宿主細胞は、シゾサッカロマイケス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロマイケス・セレウィシアエSaccharomyces cerevisiae)及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)を含む。RAGE融合タンパク質遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されるとき、RAGE融合タンパク質は、宿主細胞中でRAGE融合タンパク質が発現し、又はRAGE融合タンパク質が宿主細胞が培養されている培養培地中に分泌されるのに充分な器官、宿主細胞を培養することにより生産される。RAGE融合タンパク質は、標準的なタンパク質精製手段を使用して、培養培地から回収され得る。
【０１６１】
RAGE融合タンパク質をコードする核酸分子及びこれらの核酸分子を含む発現ベクターは、適切な哺乳類、植物、細菌又は酵母宿主細胞へのトランスフェクションに使用されてもよい。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する任意の公知の手段により行われ得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム包摂、及び核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。加えて、市販のトランスフェクション剤(例えば図6、Roche Molecular Bichemicals及びInvitrogenから入手可能)が使用されてもよい。
【０１６２】
加えて、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳類細胞に導入されてもよい。植物細胞を形質転換する方法は、当該技術分野で周知であり、例えばアグロバクテリア媒介形質転換、微粒子銃(biolistic)形質転換、直接インジェクション、エレクトロポレーション及びウイルス形質転換を含む。細菌及び酵母細胞を形質転換する方法も、当該技術分野で周知である。
【０１６３】
発現ベクターは、DNA微粒子銃を使用した発現系に送り込まれてもよく、プラスミドが、顕微鏡レベルの粒子、好ましくは金粒子に沈着させられ、この粒子が、標的細胞又は発現系に打ち込まれる。DNA微粒子銃技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、「遺伝子銃」は、細胞(例えばHelios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA)及び皮膚(PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK)に微小粒子を送達する用途で市販されている。
【０１６４】
生産細胞株からのRAGE融合タンパク質の発現は、様々な公知の技術を使用して促進されてもよい。例えば、グルタミンシンダーゼ遺伝子発現系(GS系)及びネオマイシン耐性系は、幾つかの条件下で発言を促進するためのありふれたアプローチである。
【０１６５】
幾つかの態様において、組換え発現ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)又はHEK細胞にトランスフェクションされ、発現は最適化されてもよい。他の態様において、前記細胞は、0.1〜20グラム／リットル、又は0.5〜10グラム／リットル、又は約1〜２グラム／リットルのタンパク質を生産してもよい。
【０１６６】
当外技術分野で公知であるように、そのような核酸構築物は、例えば所望の突然変異を含むプライマーを用いた核酸テンプレートのPCR増幅等により、突然変異により改変されてもよい。こうして、RAGEリガンドに様々な親和性を有するポリペプチドが設計され得る。一つの態様において、突然変異を有する配列は、当初のDNAに対して90%以上の同一性を有していてもよい。変異体は、ストリンジェントな条件下(即ち、約20〜27℃、DNA二本鎖の融解温度(TM)未満、１モラー塩)でハイブリダイズする核酸配列を含んでも良い。
【０１６７】
コーディング配列は、適切な宿主に発現ベクターをトランスフェクションすることにより発現してもよい。例えば、組換えベクターがチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞にステーブルトランスフェクションされ、RAGE融合タンパク質を発現する細胞が選択及びクローニングされてもよい。一つの態様において、組換え構築物を発現する細胞は、ネオマイシン耐性がコードされたプラスミドに抗生物質G418を適用することにより選択される。個々のクローンは選択され、細胞上澄のウェスタンブロット解析により高レベルの組換えタンパク質の発現が検出されたクローンが増幅され、そして、遺伝子産物が、タンパク質Aカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
【０１６８】
本発明のRAGE融合タンパク質は、本明細書中に記載の突然変異を有しないRAGよりもインビボでの安定性が改善されていてもよい。RAGE融合タンパク質は、更に、安定性、効率、強度及び生体利用可能性を改善するように改変されてもよい。故に、本発明のRAGE融合タンパク質は、転写後プロセシング又は化学修飾により改変されてもよい。例えば、RAGE融合タンパク質は、Lアミノ酸、Dアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸、α二置換アミノ酸、又はNアルキルアミノ酸を含むように合成されてもよい。加えて、タンパク質は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、ホスファチジルイノシトール等の脂質の結合、ジスルフィド結合の形成等により改変されてもよい。更に、RAGE融合タンパク質の生物学的安定性を増大させるために、ポリエチレングリコールが添加されてもよい。
【０１６９】
RAGE融合タンパク質へのRAGEアンタゴニストの結合
本発明のRAGE融合タンパク質は、様々な目的で使用され得る。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド、例えばRAGEアゴニスト、アンタゴニスト又はモジュレーター等を同定するための結合アッセイに使用されてもよい。
【０１７０】
例えば、一つの態様において、本発明は、(a)上記いずれかの態様に係るRAGE融合タンパク質を提供する工程；(b)興味のある化合物及び既知の結合親和性でRAGEと結合するリガンドを、前記RAGE融合タンパク質と混合する工程；及び(c)興味のある化合物の存在下での前記既知のRAGEリガンドのRAGE融合タンパク質への結合を測定する工程；を含む、RAGEモジュレーターを検出する方法を提供する。
【０１７１】
RAGE融合タンパク質は、RAGEモジュレーターを検出するキットに使用されてもよい。例えば、一つの態様において、本発明のキットは：(a)陽性対照としての、既知の結合親和性でRAGEと結合する化合物；(b)上記いずれかの態様に係るRAGE融合タンパク質；及び(c)取り扱い説明書を含んでも良い。
【０１７２】
例えば、RAGE融合タンパク質は、その全てが本明細書中に参照により援用される米国特許６９０８７４１に基本的に記載されている、潜在的なRAGEリガンドを同定する結合アッセイにおいて使用されてもよく、そのような結合アッセイの一つの態様において、公知のRAGEリガンドが、約５マイクログラム／ウェルの濃度で固体基材(例えばMaxisorbプレート)に被覆されており、各ウェルの全容積は約100マイクロリットル(μL)である。当該プレートは4℃で一昼夜インキュベーションされて、基質に前記リガンドを吸着又は結合させられてもよい。あるいは、より高温(例えば室温)でインキュベーション時間を短縮してもよい。リガンドが基質に結合する時間の経過後、アッセイウェルは吸引され、ブロッキング緩衝液(例えば50mMイミダゾール緩衝液中の1%BSA、pH7.2)が添加されて、非特異的な結合がブロックされてもよい。例えば、ブロッキング緩衝液は、室温で1時間添加されてもよい。当該プレートは吸引され、及び／又は洗浄緩衝液で洗浄されてもよい。一つの態様において、20mMイミダゾール、150mM NaCl、0.05% Tween-20、5 mM CaCl2及び5mM MgCl2を含有するpH7.2の緩衝液が、洗浄緩衝液として使用されてもよい。RAGE融合タンパク質は、漸増する希釈系列でアッセイウェルに添加されてもよい。結合が平衡を得られるように、RAGE融合タンパク質は、アッセイウェル中で、不動化されたリガンドと共にインキュベーションさせられ得る。一つの態様において、RAGE融合タンパク質は、37℃で約1時間、不動化されたリガンドと共にインキュベーションされる。他の態様において、より低温でより長い時間のインキュベーションが行われても良い。RAGE融合タンパク質と不動化されたリガンドをインキュベーションした後、未結合のRAGE融合タンパク質を除去するように、プレートが洗浄されてもよい。不動化したリガンドに結合したRAGE融合タンパク質は、様々な手段で検出されてもよい。一つの態様において、検出にはELISAが採用される。故に、一つの態様において、モノクローナルマウス抗ヒトIgG1、ビオチン化ヤギ抗マウスIgG、及びアビジン結合アルカリホスファターゼを含有する免疫検出複合体が、アッセイウェル中に不動化されたRAGE融合タンパク質に添加されてもよい。RAGE融合タンパク質及び免疫検出複合体との間の結合が平衡を得るように、免疫検出複合体は、不動化されたRAGE融合タンパク質と結合させられてもよい。例えば、前記複合体は、室温で1時間RAGE融合タンパク質と結合させられてもよい。この時点で、アッセイウェルを洗浄緩衝液で洗浄することにより、未結合の複合体が除去されてもよい。結合した複合体は、アルカリホスファターゼ基質であるパラニトロフェニルリン酸(PNPP)を添加することにより検出されてもよく、PNPPのパラニトロフェノールへの変換が、405nmの吸光度の増大として測定される。
【０１７３】
本発明の結合アッセイは、RAGEに結合するリガンドを定量するために使用されてもよい。一つの態様において、RAGEリガンドは、ナノモラー(nM)又はマイクロモラー(μM)の親和性で、RAGE融合タンパク質と結合する。他の態様において、RAGEリガンドは、0.1〜1000ナノモラー(nM)、又は1〜500nM、又は10〜80nM、又はこれらの範囲の間の範囲の親和性で、本発明のRAGE融合タンパク質と結合してもよい。
【０１７４】
細胞エフェクターの改変
本発明のRAGE融合タンパク質の態様は、RAGEにより媒介される生物学的応答を変化させるのに使用されてもよい。例えば、RAGE融合タンパク質は、RAGEが誘導する遺伝子発現の増大を変化させるように設計されてもよい。故に、一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、生物学的酵素の機能を変化させるのに使用されてもよい。例えば、RAGEおよびそのリガンドの間の相互作用は、酸化ストレスや、NF-κB、及びIL-1α、TNF-α等のNF-κBに制御される遺伝子の活性化を引き起こし得る。加えて、幾つかの他の制御経路、例えばp21ras、MAPキナーゼ、ERK1及びERK2等を含む経路は、AGE及び他のリガンドがRAGEに結合することにより活性化することが示されている。
【０１７５】
RAGE融合タンパク質の生理的特徴
sRAGEはRAGE介在疾患の制御において治療利益を有するが、ヒトsRAGEは血漿中での半減期が相対的に短いため、単独での治療利益に限界がある。例えば、sRAGEの免疫応答の持続時間で評価した場合、げっ歯類のsRAGEの半減期は、正常及び糖尿病のラットにおいて約20時間であるが、ヒトsRAGEの半減期は2時間未満である(Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999))。
【０１７６】
1.免疫グロブリンのヒンジの改変
sRAGEと類似の結合特性を有しつつより安定な薬物動態プロフィールを有するRAGE治療剤を生産するために、1つ以上の免疫グロブリンドメインと連結したRAGEリガンド結合部位を含むRAGE融合タンパク質が使用されてもよい。当該技術分野で公知のように、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖のFc部分を含んでも良い。
【０１７７】
免疫グロブリンFc部分は、RAGE融合タンパク質に幾つかの属性をもたらし得る。例えば、Fc融合タンパク質は、融合タンパク質の血清半減期をしばしば数時間から数日程度増大させ得る。薬物動態的安定性の増大は、一般に、Fc断片のCH2とCH3の間のリンカーとFcRn受容体との相互作用の結果である(Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000))。
【０１７８】
免疫グロブリンFcポリペプチドを有する融合タンパク質は安定性の増大という利益をもたらし得るが、そのような融合タンパク質は、宿主内に導入されたとき炎症性応答を引き起こす場合がある。この炎症性応答は、大半は、融合タンパク質の免疫グロブリンのFc部分による。この炎症性応答は、標的が排除されるべき疾患細胞種(例えば癌細胞及び／又は自己免疫疾患を引き起こすリンパ球の集団に発現している場合に望ましい特徴である。この炎症性応答は、標的が可溶性タンパク質の場合は、殆どの可溶性タンパク質は免疫グロブリンを活性化しないので、中間的な特徴である。しかしながら、この炎症性応答は、標的が、破壊されると不都合な副作用をもたらし得る細胞種に発現している場合は望ましくない特徴である。また、この炎症性応答は、組織の標的に結合する融合タンパク質の部分で炎症カスケードが構築される場合は望ましくない特徴である。多くの炎症のメディエーターは周囲の組織にとって有害であり得、及び／又は全身的作用を引き起こし得るからである。
【０１７９】
免疫グロブリンFc断片の主要な炎症性部位は、CH1とCH2の間のヒンジ領域にある。このヒンジ領域は様々な白血球上のFcR1〜3と相互作用して、これらの細胞に標的を襲わせる(Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000))。
【０１８０】
RAGE介在疾患の治療用としては、RAGE融合タンパク質は、炎症性応答の発生を必要としない。故に、本発明のRAGE融合タンパク質の態様は、免疫グロブリンドメインと連結したRAGEポリペプチドを有するRAGE融合タンパク質を含んでもよく、ここで免疫グロブリン由来のFcヒンジ領域は除去され、RAGEポリペプチドに置換される。このようにして、RAGE融合タンパク質と免疫細胞上のFc受容体との間の相互作用が最小化され得る。しかしながら、好ましい積み重ね、及びRAGE融合タンパク質の様々な免疫グロブリンドメインの間の他の三次元構造的な相互作用も重要である。故に、本発明のRAGE融合タンパク質の態様は、生物学的に不活性であるが構造的に類似の、RAGEのV及びC1ドメインを隔てるRAGEドメイン間リンカー、又はRAGEのC1及びC2ドメインを隔てるリンカーで、免疫グロブリン重鎖の正常なヒンジ領域を置換した物であり得る。故に、前記RAGE融合タンパク質のRAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリンドメイン／リンカー断片を形成するRAGE免疫グロブリンドメインの天然に存在する下流であるドメイン間リンカー配列を有し得る。これにより、RAGE又は免疫グロブリンのいずれかによる免疫グロブリンドメイン間の三次元的相互作用が維持され得る。
【０１８１】
一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、sRAGEと比較して、又は類似の野生型RAGE融合タンパク質と比較して、薬物動態的安定性が実質的に増大していてもよい。故に、一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、許容されない程度の炎症を生じずにRAGE介在疾患を処置する手段として、生理的リガンドがRAGEに結合するのをアンタゴナイズするのに使用されてもよい。本発明のRAGE融合タンパク質は、IgGと比較して炎症性応答の発生が実質的に低下していてもよい。更に、本発明のRAGE融合タンパク質は、類似の野生型RAGE融合タンパク質と比較して、一定期間中の血漿濃度が増大していてもよい。
【０１８２】
2．グリコシル化部位及びフリン開裂部位を除去した突然変異
a.  薬物動態
幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、1つ以上のRAGEポリペプチド又は免疫グロブリンポリペプチド中に野生型配列と比較して1つ以上の突然変異を有し、ここで当該突然変異は、1つ以上のグリコシル化部位又は酵素開裂部位を除去及び／又は変換する。例えば、当該突然変異は、フリン開裂部位を除去してもよい。加えて、及び／又はあるいは、当該突然変異は、グリコシル化部位を除去してもよい。
【０１８３】
フリン開裂は、2つのRAGEドメインを有する融合タンパク質(例えば配列番号32、33、34及び56に示すアミノ酸配列を有するもの)の約193〜198位で、RAGE融合タンパク質を開裂することができる。幾つかの態様において、フリン開裂部位の突然変異は、野生型配列と比較してRAGE融合タンパク質の薬物動態プロフィールを改善することを意図してなされてもよい。
【０１８４】
また、前記融合タンパク質のRAGE及び／又は免疫グロブリン部分のグリコシル化部位の突然変異は、当該タンパク質の安定性及び／又は薬物動態プロフィールのいずれかに影響を及ぼすことができてもよい。幾つかの態様において、グリコシル化部位の突然変異は、野生型配列と比較してRAGE融合タンパク質の薬物動態プロフィールを改善することを意図してなされてもよい。
【０１８５】
図9〜11は、本発明のRAGE融合タンパク質の態様が、野生型配列を有する類似のRAGE融合タンパク質と比較してどの位薬物動態プロフィールが改善されているかを示している。図9及び10のデータは、本発明のRAGE融合タンパク質10 mg/kg静脈内投与したマウスにおける当該融合タンパク質の薬物動態及び安定性を示す。図11のデータは、血漿中のRAGE融合タンパク質のインビトロでの安定性を示す。使用されたRAGE融合タンパク質は、以下のものである。
バッチ1 -CHO細胞由来、配列番号56(野生型); 
バッチ2 -HEK細胞由来、配列番号56(野生型); 
バッチ3 -HEK細胞由来、配列番号67(R198A);
バッチ4 -HEK細胞由来、配列番号71(R198A及びN2Q);及び
バッチ5 -HEK細胞由来、配列番号72(R198A及びN58Q)。
【０１８６】
図9で示すように、R198Aを有する(バッチ3)、並びにR198A及びN2Qを有する(バッチ4)RAGE融合タンパク質は、他の試験されたRAGE融合タンパク質と比較して、一定期間中、より高い血漿濃度を維持している(図9A及び図9B)。この効果は、0〜336時間(図9A)及び0〜48時間(図9B)の期間にわたり観察される。
【０１８７】
図10は、マウスに静脈注射(10 mg/kg)されたバッチ1〜5のRAGE融合タンパク質の薬物動態パラメーターの平均を示す。曲線下部面積(AUC)により評価された全体の薬物曝露(overall drug exposure)が、野生型RAGE融合タンパク質(バッチ1及び2)及びR198Aの突然変異のみ有するRAGE融合タンパク質(バッチ3)よりも、R198A及びN2Qの突然変異を有するRAGE融合タンパク質(バッチ4)並びにR198A及びN58Qの突然変異を有するRAGE融合タンパク質(バッチ5)において高いことが見て取れる。
【０１８８】
また、幾つかの態様において、野生型RAGE融合タンパク質と比較して突然変異を有するRAGE融合タンパク質の全身クリアランス(Clp)は様々であり得る。故に、R198A及びN2Qの突然変異(バッチ4)やR198A及びN58Qの突然変異(バッチ5)を有するRAGE融合タンパク質の全身クリアランスは、野生型RAGE融合タンパク質(バッチ1及び2)及びR198Aの突然変異のみ有するRAGE融合タンパク質(バッチ3)よりも低いことが認められる。また、幾つかの態様において、R198A及びN2Qの突然変異(バッチ4)やR198A及びN58Qの突然変異(バッチ5)を有するRAGE融合タンパク質の分布の定常体積(Vss)は、野生型RAGE融合タンパク質(バッチ1及び2)及びR198Aの突然変異のみ有するRAGE融合タンパク質(バッチ3)よりも低い場合がある。
【０１８９】
インビボでの血漿濃度は、様々な要素により増大し得る。1つの要素は、血漿内での前記融合タンパク質の安定性であり得る(即ち活発な取込み及び／又はクリアランスと比較して)。図11は、上記バッチ1〜5の試験されたRAGE融合タンパク質のインビトロでの安定性のデータを示す。幾つかの態様において、R198A及びN2Qの突然変異を有するRAGE融合タンパク質(バッチ4)の血漿中での安定性は、野生型RAGE融合タンパク質(バッチ1及び2)又はR198Aの突然変異を有するRAGE融合タンパク質と比較して、そしてより長い時間ではN58Q及びR198Aの突然変異を有するもの(バッチ5)と比較して増大することが認められる。
【０１９０】
故に、幾つかの態様において、フリン開裂部位を除去する(例えばR198A)突然変異及びRAGEのリガンド結合ドメイン及び／又はリガンド結合部位のグリコシル化部位を除去し、及び／又はグリコシル化を低下させる突然変異の両方を有するRAGE融合タンパク質が、野生型配列を有する類似のタンパク質と比較して、改善された薬物動態プロフィールを提供し得る。
【０１９１】
b. リガンドの結合
RAGE融合タンパク質は、インビボでRAGEと相互作用できるリガンドと結合することにより対象中のRAGEリガンドの潜在的に有害な効果を減少させる治療剤として機能し得る。例えば、下記でより詳細に議論するように、リガンド結合ドメインを有するRAGE融合タンパク質は、アミロイド-ベータと結合することにより、アルツハイマー症においてプラーク形成を減少し、幾つかの態様では回復させる。
【０１９２】
RAGEのグリコシル化は、リガンドの結合を低下させる(例えばOwasa et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1770: 1468-1474 (2007))。様々な条件下で培養した野生型RAGE融合タンパク質(例えば配列番号32、33、34及び56)を用いた最初の試験では、グリコシル化を低下させる条件、例えばツニカマイシン(糖タンパク質合成の最初のステップにおいてN-アセチルグルコサミン-1-リン酸(P-GlcNAc)をUDP-N-アセチルグルコサミンからドリコールリン酸に転移させるグリコシルトランスフェラーゼを阻害する)の存在下、及び／又は2−デオキシ−D-グルコース(例えばヘキソキナーゼ及びグルコースホスホイソメラーゼを阻害してこれらの酵素に仲介されるグリコシル化を減少させる)中で培養されたRAGE融合タンパク質が、逆相高圧液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)、及び液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー(LC-MS)により測定したとき、2−グリカン及び3−グリカン占有が損失して0−グリカン及び1−グリカン占有が増大したRAGE融合タンパク質の増大が引き起こされることを示唆した。例えば、ツニカマイシンの存在下で培養された細胞から発現されたRAGE融合タンパク質において、グリコシル化レベルが、当初RAGE融合タンパク質の集団で3−グリカンが約67%、2−グリカンが22%であったのが、RAGE融合タンパク質の集団で3−グリカンが約42%、2−グリカンが16%、そして0−グリカンが31%にまで減少したことが見出された。3−グリカン、2−グリカン又は0−グリカンRAGE融合タンパク質のいずれかに対応するRP-HPLCピークからRAGE融合タンパク質が単離されたとき、0−グリカンのRAGE融合タンパク質が、相対的な結合能が100%の対照RAGE融合タンパク質(即ち3−グリカンが約67%、2−グリカンが22%のRAGE融合タンパク質の混合物)と比較して、529%の結合能の増大を呈することが見出された。0−グリカンRAGE融合タンパク質で見出された結合能の増大は、3−グリカンの分画で見られる結合能(即ち約10倍の増大)と比較して尚も顕著であった(データ無し)。
【０１９３】
図12は、様々なRAGE融合タンパク質の突然変異における相対的な結合能を示すデータである。N2Q、R198A突然変異及びN2Q、N288Q、R198A突然変異において示されるように、RAGE融合タンパク質のN2Q突然変異は、リガンド(S100b)のRAGE融合タンパク質に対する結合能を顕著に改善する。興味深いことに、N2Q、R198A突然変異の構築物は、血漿中の薬物動態的半減期及び安定性の顕著な改善を示した。
【０１９４】
RAGE融合タンパク質による疾患の処置
本発明は、ヒト対象におけるRAGE介在疾患の処置のための方法をも包含する。一つの態様において、当該方法は、上記態様のいずれか1つのRAGE融合タンパク質を含むRAGE融合タンパク質を対象に投与することを含み得る。
【０１９５】
前記RAGE融合タンパク質は、医薬製剤として投与されてもよい。当該医薬製剤は、RAGE融合タンパク質、凍結乾燥保護剤及び緩衝剤を含有してもよい。
【０１９６】
様々な動物モデルが、RAGEを治療剤として調整する化合物の使用を実証するのに使用された。これらのモデルとして以下のものが挙げられる。
a)sRAGEは、動脈損傷後の再狭窄のラットモデルにおいて、糖尿病及び正常のマウスの両方で、RAGEによる、内皮、平滑筋及びマクロファージの活性化を阻害することにより、新生内膜形成を阻害した(Zhou et al., Circulation 107:2238-2243 (2003))。
b)sRAGE又は抗RAGE抗体のいずれかを用いたRAGE/リガンド相互作用の阻害は、全身性アミロイドーシスのマウスモデルにおけるアミロイドプラークの形成を減少させた(Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000))。アミロイドプラークの減少に伴い、処理された動物において、炎症性サイトカイン、インターロイキン6(IL-6)及びマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の減少、並びにNF-kBの活性の低下が認められた。
(c)RAGEトランスジェニックマウス(RAGE過剰発現及びRAGEドミナントネガティブ発現)は、ADのマウスモデルにおいてプラーク形成と認知障害を呈する(Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004))。
(d)糖尿病ラットをsRAGEで処理すると、血管透過性が低下する(Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48:2052-2058 (1999))。
(e)sRAGE処理により、糖尿病アポリポタンパク質E-nullマウスでアテローム性動脈硬化症の病変が縮小し、そしてdb/dbマウスの糖尿病性腎症の機能的及び形態的指標を阻害した(Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003))。
(f)sRAGEは、コラーゲン誘導関節炎のマウスモデルにおいて(Hofmann et al., Genes Immunol., 3:123-135 (2002))、実験的アレルギー性脳脊髄炎のマウスモデルにおいて(Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 (2003))、そして炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて(Hofmann et al., Cell, 97:889-901 (1999))、炎症の重症度を緩和した。
【０１９７】
故に、一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEにより仲介される糖尿病及び／又はそれによる合併症の症状を処置するのに使用されてもよい。他の態様において、糖尿病又は糖尿病性後期合併症の症状として、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性脚部潰瘍、糖尿病の心臓血管合併症、又は糖尿病性神経症を含んでも良い。
【０１９８】
その発現が糖尿病の病理に関連する分子の受容体として同定されたRAGEは、糖尿病の合併症の病態生理にとって基本的なものである。インビボでは、RAGEとそのリガンドとの相互作用の阻害は、糖尿病の合併症及び炎症の複数のモデルにおいて治療効果を示す(Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003))。例えば、抗RAGE抗体で2ヶ月処理すると、糖尿病マウスの腎機能が正常化し、腎臓の異常な組織病理が減少した(Flyvbjerg et al., Diabetes 53:166-172 (2004))。更に、RAGEリガンドと結合し、RAGE/リガンド相互作用を阻害する水溶性形態のRAGE(sRAGE)による処理は、糖尿病性アポリポタンパク質E-nullマウスのアテローム動脈硬化症の病変を縮小し、db/dbマウスの糖尿病性腎症の機能的及び形態的病理を軽減した(Bucciarelli et al., Circulation 106:2827-2835 (2002))。
【０１９９】
また、終末糖化産物(AGE)の形成に至る巨大分子の非酵素的グリコシド化は、炎症部位で、腎不全において、高血糖及び全身的又は局所的酸化ストレスに関連する他の症状の存在下で促進する(Dyer et al., J. Clin. Invest., 91:2463-2469 (1993); Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998))。血管内でのAGEの蓄積は、例えば透析関連アミロイド症の患者で見られるAGE-β2-ミクログロブリンで構成される関節アミロイドのように局所的に起こる場合もあり(Miyata et al., J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996))、又は糖尿病患者の血管及び組織のように全身的に起こる場合もある(Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995))。糖尿病患者においてAGEの経時的な進行的な蓄積は、AGEの沈着部位で内在的なクリアランス機構が機能できていないことを示唆する。そのような蓄積したAGEは様々な機構により細胞の特性を変化させることが出来る。RAGEは正常な組織及び血管においては発現が僅かであるが、当該受容体のリガンドが蓄積した環境では、RAGEが上方制御されることが示されている(Li et al., J. Biol. Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al., J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000))。RAGEの発現は、糖尿病の血管において、内皮組織、平滑筋細胞及び浸潤する単核ファゴサイトにおいて増大する。また、培養細胞における実験では、AGE-RAGE相互作用が、血管のホメオスタシスに重要な細胞の特性を変化させることが実証されている。
【０２００】
他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、アミロイドーシス及びアルツハイマー症を処置又は回復するのにも使用され得る。RAGEは、アミロイドベータ(Aβ)や、SAA及びアミリンを含む他のアミロイド生産タンパク質の受容体である(Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al., Lab Invest., 80:1101-1110 (2000))。また、AGE、S100b及びAβタンパク質を含むRAGEリガンドは、男性の老人斑の周囲の組織に認められる(Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al, Neurosci. Lett.., 336:167-170 (2003); Sasaki et al., Brain Res., 12:256-262 (2001; Yan et al., Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998))。RAGEは、サブユニットの組成にかかわらず、β-シート繊維材料(アミロイド-βペプチド、アミリン、血清アミロイドA、プリオン由来ペプチド)に結合することが示されている(Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000))。加えて、アミロイドの蓄積は、RAGEの発現の促進を引き起こすことが示されている。例えば、アルツハイマー症(AD)の患者の脳において、RAGEの発現は、ニューロン及びグリアで増大する(Yan, et al., Nature 382:685-691 (1996))。RAGEリガンドの発現に伴い、RAGEはAD患者の海馬中のアストロサイト及びミクログリアで上方制御されるが、ADを有しない者では上方制御されない(Lue et al., Exp. Neurol., 171:29-45 (2001))。これらの知見は、RAGEを発現する細胞は、老人斑の周囲で、RAGE/RAGEリガンドの相互作用を通じて活性化されることを示唆する。また、インビトロにおいて、Aβ誘導性のミクログリア細胞の活性化は、RAGEのリガンド結合ドメインに対する抗体でブロックできる(Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997))。これは、RAGEが線維形成(fibril assembly)の焦点となることを実証するものである(Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003))。
【０２０１】
また、sRAGE又は抗RAGE抗体のいずれかを使用したRAGE/リガンド相互作用の阻害は、全身性アミロイドーシスのマウスモデルにおいて、アミロイドプラークの形成を減少できる(Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000))。神経においてヒトRAGE及びヒトアミロイド前駆タンパク質を過剰発現する(スウェーデン及びロンドン突然変異)(突然変異hAPP)ダブルトランスジェニックマウスは、学習障害及び神経病理的異常を、単一の対応する突然変異hAPPトランスジェニックマウスよりも早期に発症する。一方、同一の突然変異hAPPバックグラウンド上にRAGEのドミナントネガティブ変異体を神経で発現することによりAβシグナリング能力の低下したダブルトランスジェニックマウスは、単一の対応するAPPトランスジェニックマウスよりも神経病理的及び学習的異常の発生の遅延を示す(Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004))。
【０２０２】
加えて、RAGE-アミロイド相互作用の阻害は、細胞のRAGE及び細胞ストレスマーカーの発現を低下させ(NF-κB活性化と同様)、そしてアミロイド沈着を縮小することが示されており(Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000))、これは、RAGE-アミロイド相互作用が、アミロイドが豊富な環境において(早期段階であっても)、またアミロイド蓄積において、両方の細胞特性の撹乱に一定の役割を果たすことを示唆する。
【０２０３】
故に、本発明のRAGE融合タンパク質は、アミロイドーシスの低下及びアルツハイマー症(AD)に関連するアミロイドプラーク及び認知障害の減少にも使用され得る。上記のように、sRAGEは、ADの動物モデルにおいて、脳内のアミロイドプラークの形成とその後の炎症性マーカーの増大の両方を減少させることが示されている。米国特許公開US 2005/0026811において、小分子RAGEアンタゴニストが、アルツハイマー症マウスのAβ沈着の進行の阻害に使用され、事前に存在するプラークの体積を減少させた(US 2005/0026811のパラグラフ581-586)。更に、そのような小分子RAGEアンタゴニストによる処理は、アルツハイマー症マウスモデルにおいて認知を改善した(US 2005/0026811パラグラフ587-590)。故に、アルツハイマー症のマウスモデルにおいて、Aβプラークが発生し認知が欠損したマウスを小分子RAGEアンタゴニストで処理すると、当該小分子RAGEアンタゴニストで処理しなかったアルツハイマー症マウスと比較して、プラーク体積の減少と認知能力の改善を呈した。これは、RAGEアンタゴニストコンパウンドが、アルツハイマー型の認知症の患者の認知能力を遅延若しくは停滞させ、又は認知能力を改善させ得ることを示す。
【０２０４】
また、細胞アッセイ及び動物実験の両方から、RAGEが、循環しているAβの血液脳障壁(BBB)を通るトランスサイトーシスを仲介することが示されている。そのようなAβのトランスサイトーシスの増大は、神経の酸化ストレス及び持続的な脳の血流の低下を引き起こす。RAGEの効果は、RAGEモジュレーターにより阻害できる(例えばMackic et al., J. Clin. Invest., 102:734-743 (1998)及びKumar et al., Neurosci., Program, p 141 (2000))。これらの知見は、更なる研究により確認された(例えばU.S. Patent No. 6,825,164 at col. 17, line 48 to col. 18, line 43; Deane et al., Nature Medicine, 9:907-913 (2003))。脳かん流の低下は、Aβと協調して作用し認知症を悪化させる虚血病変を促進し得る。また、脳内の血流が充分でないと、血液脳障壁を通るAβの輸送率が変化して、Aβのクリアランスが低下し、脳内のAβの蓄積が促進し得る(Girouard and Iadecola, J. Appl. Physiol., 100, 328-335 (2006) at page 332)。故に、RAGEアンタゴニストにより促進される脳内血流の増大は、アルツハイマー症の発症の遅延又は症状の軽減を示し得る。例えば、RAGEアンタゴニストは、アルツハイマー型の認知症の患者の認知能力の欠損の遅延若しくは停滞、又は認知能力の改善を示し得る。
【０２０５】
アルツハイマー症は、特定の範囲内で、NINCDS and DSM基準、Mini-Mental State Examination、及びClinical Dementia Ratingにより診断され得る。本発明の一つの側面は、本発明のRAGE融合タンパク質の投与を含む、認知能力の改善を含む。認知能力は、当該技術分野で公知のAlzheimer’s Disease Assessment Scaleの認知下位スケール(ADAS-cog)を用いて評価されてもよく、0〜70のスケールで認知機能を評点し、スコアが高いほど認知機能障害が重いことを示す。故に、スコアの低下は認知機能の改善を示す。本発明の一つの側面は、本発明に係るRAGE融合タンパク質を対象に投与して、対象のADAS-cogを低下させることを含む。当該対象は、アルツハイマー型の認知症、軽度から中度のアルツハイマー症、又は重度のアルツハイマー症に罹患したヒトであってもよい。
【０２０６】
加えて、アルツハイマー症の進行は、ヒトにおいて、General、Cognitive、Behavioral、及びActivities of Daily Livingの4つの機能の領域の試験を通じて評価されてもよい。そのような評価は、Interview Based Impression of Change (CIBIC又はCIBIC+)を使用して実施されてもよい。本発明のひとつの側面は、本発明のRAGE融合タンパク質の投与を含む、対象の機能の改善を含む。一つの態様において、当該対象の機能とは、General、Cognitive、Behavioral、及びActivities of Daily Livingの1つ以上を指す。
【０２０７】
他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、頭部の外傷に関連する認知症の処置に使用されてもよい。一つの態様において、対象の認知能力が改善する。他の態様において、対象の認知能力が維持される。他の態様において、対象の認知能力が欠損する速度が遅延する。
【０２０８】
また、本発明のRAGE融合タンパク質は、アテローム性動脈硬化及び他の心臓血管疾患を処置するのに使用されてもよい。故に、虚血性心疾患が、糖尿病患者において特に多いことが示されている(Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al, J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038 (1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979))。加えて、糖尿病患者においてアテローム性動脈硬化が糖尿病でない患者と比較して、アテローム性動脈硬化がより急速かつ発展的に進行することが示されている(例えばWaller et al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al., Chest, 2:251-257 (1976);及びPyorala et al., Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978))。糖尿病がアテローム性動脈硬化を促進する理由は様々であるが、AGEの減少はプラーク形成を減少し得る。
【０２０９】
他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、癌の処置に使用されてもよい。一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置される癌は、RAGEを発現する癌細胞を含む。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置され得る癌は、幾つかの癌細胞、グリオーマ、パピローマ等を含む。アンフォテリンは、RAGEとの相互作用が示されている高移動性I型非ヒストン染色体DNA結合タンパク質である(Rauvala et al.,  J. Biol. Chem., 262:16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993))。アンフォテリンは神経突起伸長を促進し、線溶系においてプロテアーゼ複合体の組み込みのための表面となることが示されている(細胞の移動性に関与することも知られている)。加えて、RAGEをブロックすることによる局所的腫瘍増殖阻害効果が、原発腫瘍モデル（C6グリオーマ)、Lewis肺転移モデル(Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000))、及びv-Ha-rasトランス遺伝子を発現するマウス中に自然発生したパピローマ(Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9178-9182 (1990))において観察されている。
【０２１０】
尚も他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、炎症の処置に使用されてもよい。他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、炎症性腸疾患に関連する炎症、関節リウマチに関連する炎症、乾癬に関連する炎症、多発性硬化症に関連する炎症、低酸素症に関連する炎症、脳卒中に関連する炎症、心臓麻痺に関連する炎症、出血性ショックに関連する炎症、敗血症に関連する炎症、臓器移植に関連する炎症、創傷治癒の障害、又は自己(例えば自己免疫)若しくは非自己(例えば移植された)細胞、組織、又は臓器の拒絶に関連する炎症の処置に使用されてもよい。
【０２１１】
例えば、血栓溶解治療の後、顆粒球等の炎症性細胞は、虚血組織等に浸入し、低酸素症により死滅するよりも多くの細胞を破壊し得る酸素ラジカルを生産する。抗体又は他のタンパク質アンタゴニストで、好中球の組織への浸入に関与する好中球表面の受容体を阻害すると、当該反応が緩和することが示されている。RAGEは好中球受容体のリガンドであるから、RAGEの断片を含むRAGE融合タンパク質は、デコイとして機能し、好中球が再かん流部位に移動するのを妨げることで、更なる組織の破壊を防ぐ。炎症の防止におけるRAGEの役割は、sRAGEが、おそらくRAGEにより、内皮細胞、平滑筋細胞の増殖及びマクロファージの活性化が阻害されることによる、糖尿病及び正常ラットにおける動脈損傷後の再狭窄のラットモデルにおける新生内膜の拡大を阻害することを示す研究により示唆される(Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003))。加えて、sRAGEは、遅延型過敏症、実験的自己免疫性脳炎、及び炎症性腸疾患を含む炎症のモデルを阻害した(Hofman et al., Cell, 97:889-901 (1999))。
【０２１２】
一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、自己免疫に基づく障害の処置に使用されてもよい。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質は、腎不全の処置に使用されてもよい。故に、本発明のRAGE融合タンパク質は、全身性ループス腎炎又は炎症性ループス腎炎の処置に使用されてもよい。例えば、S100/カルグラニュリンは、接続ペプチドで連結された2つのEF-ハンド領域を特徴とする密接に関連したカルシウム結合ポリペプチドのファミリーを含むことが示されている(Schafer et al., TIBS, 21:134-140 (1996); Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995);  Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995))。それらはシグナルペプチドを欠くが、S100/カルグラニュリンは細胞外空間、特に、嚢胞性線維症や関節リウマチ等の慢性免疫/炎症応答の部位に到達することが長く知られている。RAGEはS100/カルグラニュリンファミリーの多くのメンバーの受容体であり、リンパ球や単核ファゴサイト等の細胞に対し炎症性作用を誘導する。また、IL-10ヌルマウスの結腸炎、コラーゲン誘導関節炎、及び実験的自己免疫性脳炎モデルにおける遅延型過敏応答の研究において、RAGE-リガンド(S100/カルグラニュリン)相互作用は、炎症カスケードにおいて中心的な役割を果たすことが示唆される。
【０２１３】
一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、再狭窄の処置に使用されてもよい。一つの態様において、前記対象は、糖尿病患者である。
【０２１４】
I型糖尿病は、本発明のRAGE融合タンパク質で処置することにより防止又は緩和され得る。例えば、sRAGEは、非肥満糖尿病(NOD)マウスから重症複合免疫不全NODマウス（NOD-scidマウス)への脾臓細胞の移動を可能とすることが示されている。NOD-scidマウスは生得的には糖尿病を示さないが、糖尿病を誘導するためには、膵島細胞を破壊する免疫細胞の存在を必要とする。sRAGEで処理したNOD-scidレシピエントは、当該処理をしなかったものと比較して、糖尿病(NOD)マウスから移入した脾臓細胞により誘導される糖尿病の発症の低下を示した(U.S. Patent Publication 2002/0122799)。US 2002/0122799が言及するように、このモデルにおけるsRAGEを使用した実験結果は、後で免疫治療及び膵島移植が行われる臨床的条件等のヒトの疾患に関連する。
【０２１５】
故に、一つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、第一の部位から第二の部位への１つ以上の臓器、組織又は複数の細胞の移植に関連する炎症を処置するのに使用されてもよい。前記第一及び第二の部位は異なる対象であっても同一の対象であってもよい。別の態様において、移植された細胞、組織又は臓器は、膵臓、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、骨髄、血液、骨、筋肉、内皮細胞、動脈、静脈、軟骨、甲状腺、神経系、又は幹細胞を含む。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、第一の糖尿病でない対象から第二の糖尿病の対象への膵島細胞の移植を促進するのに使用され得る。
【０２１６】
他の態様において、本発明は、本発明のRAGE融合タンパク質を一定量対象に投与することにより骨粗鬆症を処置する方法を提供し得る(Zhou et al., J. Exp. Med., 203:1067 - 1080 (2006))。一つの態様において、前記骨粗鬆症を処置する方法は、更に、対象の骨密度を増大させる工程、又は対象の骨密度の低下する速度を低下させる工程を含み得る。
【０２１７】
故に、様々な選択される態様において、本発明は、対象中のAGEとRAGEの相互作用を阻害するのに充分な量の本発明のRAGE融合タンパク質を対象に投与することにより、対象中のAGEとRAGEの相互作用を阻害する方法を提供し得る。本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置される対象は、動物であってもよい。一つの態様において、当該対象はヒトである。当該対象は、糖尿病、糖尿病の合併症、例えば腎症、神経症、網膜症、脚部潰瘍、アミロイドーシス、又は腎不全及び炎症の患者であってもよい。あるいは、前記対象は、アルツハイマー症の患者であってもよい。別の態様において、前記対象は、癌の患者であってもよい。なおも他の態様において、前記対象は、全身性エリテマトーデス又は炎症性ループス腎炎の患者であってもよい。他の疾患であってもRAGEが介在するものは、本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置され得る。故に、本発明の更なる他の態様において、RAGE融合タンパク質は、ヒト又は動物の対象の、クローン病、関節炎、血管炎、腎症、網膜症、及び神経症の治療に使用されてもよい。他の態様において、自己免疫応答(例えば自己の拒絶)及び非自己免疫応答(例えば非自己の拒絶)のいずれも含む炎症は、RAGEにより介在されるのであるから、本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置され得る。
【０２１８】
上記のように、本発明は、対象中のAGEとRAGEの相互作用を阻害するのに充分な量の本発明のRAGE融合タンパク質を対象に投与することにより、対象中のAGEとRAGEの相互作用を阻害するための、上記態様のいずれかの態様のRAGE融合タンパク質に関する。一つの態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGE介在障害又は疾患の処置用の医薬に使用されてもよい。
【０２１９】
故に、本発明の態様は、糖尿病若しくは糖尿病後期合併症、骨粗鬆症、アミロイドーシス、アルツハイマー症、癌、腎不全、自己免疫疾患に関連する炎症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、低酸素症、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、臓器移植、又は創傷治癒の障害の1つ以上の症状を処置するためのRAGE融合タンパク質の使用にも関する。
【０２２０】
本発明は、糖尿病若しくは糖尿病後期合併症、骨粗鬆症、アミロイドーシス、アルツハイマー症、癌、腎不全、自己免疫疾患に関連する炎症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、低酸素症、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、臓器移植、又は創傷治癒の障害の1つ以上の症状を処置するための医薬の製造におけるRAGE融合タンパク質の使用にも関する。
【０２２１】
治療有効量は、対象中のRAGEとAGE若しくは他の内在的RAGEリガンドとの相互作用を阻害及び/又は防止できる量を含んでも良い。よって、当該量は、処置される対象によって様々である。当該化合物の投与は、時間、日、月、年又は単一の事象の単位であってもよい。他の様々な態様において、RAGE融合タンパク質の治療有効量は、約1 ng/体重kg〜約100 mg/体重kg、又は約10 μg/体重kg〜約50 mg/体重kg、又は約100 μg/体重kg〜約20 mg/体重kgであってもよい。正確な有効量は、当該技術分野で標準的な方法を用いた用量/応答アッセイ(Johnson et al., Diabetes. 42: 1179, (1993))により樹立され得る。故に、当業者に公知のように、有効量は、当該化合物の生体利用効率、生物活性及び生分解性に依存し得る。
【０２２２】
組成物
本発明は、上記態様のいずれかのRAGE融合タンパク質及び医薬として許容される担体を含有する組成物を含んでも良い。
【０２２３】
医薬として許容される担体は、当該技術分野で公知の標準的な医薬として許容される担体のいずれかを含み得る。一つの態様において、当該医薬担体は液体であって、RAGE融合タンパク質又は核酸コンストラクト製剤が溶液の形態であってもよい。他の態様において、医薬として許容される担体は粉末、凍結乾燥粉末、又は錠剤の形態の固体であってもよい。あるいは、当該医薬担体は、ゲル、坐薬又はクリームであってもよい。別の態様において、当該担体は、リポソーム、微小カプセル、細胞若しくはウイルスを包摂したポリマーであってもよい。故に、医薬として許容される担体という用語は、限定されないが、水、アルコール、リン酸緩衝生理食塩水、糖質(例えばスクロース又はマンニトール)、油脂、若しくはエマルジョン、例えば油/水エマルジョン、若しくはトリグリセリドエマルジョン、様々な種類の水和剤、錠剤、被覆錠剤及びカプセル等の、任意の標準的な医薬として許容される担体を指す。
【０２２４】
幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質は、中性の状態(両性イオン形態を含む)で、又は正若しくは負に荷電したものとして存在してもよい。幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質は、医薬として許容される塩を形成するように対イオンと組み合わせられても良い。
【０２２５】
「医薬として許容される塩」という用語は、1つ以上のRAGE融合タンパク質と1つ以上の対イオンを含有する複合体を指し、ここで当該対イオンは、医薬として許容される無機及び有機性の酸及び塩基に由来する。
【０２２６】
医薬として許容される無機塩基として、金属イオンが挙げられる。より好ましい金属イオンとして、限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及び他の生理的に許容される金属イオンが挙げられる。無機塩基に由来する塩として、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、錫、銅、第一鉄、第二鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン塩(manganic salts, manganous)、カリウム、ルビジウムナトリウム及び亜鉛、並びにそれらの通常の原子価のものが挙げられる。
【０２２７】
本発明のRAGE融合タンパク質の医薬として許容される酸付加塩は、限定されないが、以下の塩；蟻酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、カンファー酸、カルボン酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンディゾール酸（fendizoic acid）、メタホスホン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リジン酸、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アンスラニリン酸、メシリン酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニリン酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシブチル酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、カンファースルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸から調製され得る。
【０２２８】
医薬として許容される有機塩基として、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノルアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、４級アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチラミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジミウム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コール酸、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノ−及びジカルボン酸、フェニル−置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）ジハイドレート、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、及びトロメタモールが挙げられる。
【０２２９】
本発明のさらなる側面においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、アジュバント治療剤または他の知られた治療剤との併用治療剤による治療において利用されることができる。以下は、本発明のRAGE融合タンパク質調節剤と併用して利用されることのできるアジュバント及び追加の治療剤の非限定的なリストである；
【０２３０】
抗癌剤の薬理学的分類：
１．アルキル化剤：シクロホスファミド、ニトロソウレア、カルボプラチン、シスプラチン、プロカルバジン
２．抗生物質：ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン
３．代謝拮抗剤：メトトレキセート、シタラビン、フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、及び細胞毒性を有する抗癌化学療法剤
４．植物アルカロイド：ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、パクリタキセル
５．ホルモン：タモキシフェン、酢酸オクトレオチド、フィナステリド、フルタミド
６．生物学的反応修飾剤：インターフェロン、インターロイキン
【０２３１】
リューマチ関節炎の治療薬の薬理学的分類：
１．鎮痛剤：アスピリン
２．NSAID（非ステロイド系抗炎症剤）：イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナック
３．DMARD（疾患修飾性抗リューマチ薬）：メトトレキセート、金製剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン
４．生物学的反応修飾剤、DMARD：エタネルセプト、インフリキシマブ、ベクロメタゾン、メチルプレドニソロン、ベタメタゾン、プレドニソン、デキサメタゾンおよびハイドロコルチゾンなどのグルココルチコイド
【０２３２】
糖尿病の治療薬の薬理学的分類：
１．スルホニルウレア：トルブタミド、トラザミド、グリブリド、グリピジド
２．ビグアニド：メトホルミン
３．混合型の経口剤：アカルボース、トログリタゾン
４．インスリン
【０２３３】
アルツハイマー病の治療薬の薬理学的分類：
１．コリンエステラーゼ阻害剤：タクリン、ドネペジル
２．抗精神病剤：ハロペリドール、チオリダジン
３．抗うつ薬：デシプラミン、フルオキセチン、トラゾドン、パロキセチン
４．抗けいれん薬：カルバマゼピン、バルプロン酸
【０２３４】
一つの態様において、本発明の組成物は、単一または複数の追加の治療剤と組み合わせた、一定量のRAGE融合タンパク質を含んでよい。これまで記載した剤に加えて、以下の治療剤：シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン及び他のFK-506型の免疫抑制剤などの免疫抑制剤、が本発明のRAGE融合タンパク質と組み合わせて使用されることができる。
【０２３５】
一つの態様においては、本発明はしたがって、RAGE介在性疾患の治療方法であって、対象に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物学的反応修飾剤、鎮痛剤、NSAID、DMARD、（グルココルチコイドなどの）生物学的反応修飾剤、スルホニルウレア、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬、抗けいれん薬、及びシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、及び他のFK-506型の免疫抑制剤などの免疫抑制剤からなる群から選ばれる治療剤と併用した一定量のRAGE融合タンパク質を投与することを含む上記方法を提供することができる。さらなる実施態様においては、本発明は、さらに、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物学的反応修飾剤、鎮痛剤、NSAID、DMARD、（グルココルチコイドなどの）生物学的反応修飾剤、スルホニルウレア、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬、抗けいれん薬、並びにシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン及び他のFK-506型の免疫抑制剤などの免疫抑制剤から成る群から選らばれる、１つ以上の治療剤を含む、上記の本発明の医薬組成物を提供する。
【０２３６】
本発明が、一定量のRAGE融合タンパク質を追加の治療剤と組み合わせて対象に投与することを含むRAGE介在疾患を処置する方法に関するとき、RAGE融合タンパク質と追加の活性剤を投与する順番は、同時、後続(subsequent)又は連続投与であってもよい。
【０２３７】
凍結乾燥製剤
他の実施態様においては、本発明はまた、RAGE融合タンパク質を含む製剤も提供する。該製剤の実施態様は、凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質及び緩衝剤の凍結乾燥混合物も含むことができる。当該固体は、凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質及び緩衝剤を含有する水溶液を凍結乾燥することにより調製され得る。
【０２３８】
RAGE融合タンパク質製剤は、臨床的用途で、又は処方薬として製剤化された安定な治療剤を含有してもよい。例えば、幾つかの態様において、RAGE融合タンパク質製剤は、40℃で1週間置いた後の分解が、10%未満、又は5%未満、又は3%未満であってもよい。
【０２３９】
また、前記RAGE融合タンパク質は、希釈剤中で再構築した後に安定であってもよい。幾つかの態様において、当該RAGE融合タンパク質製剤中、沈殿として存在するRAGE融合タンパク質は、約10%未満、又は約5%未満、又は約4%未満、又は約3%未満、又は約2%未満、又は約1%未満である。
【０２４０】
本発明の核酸ベース又はタンパク質ベースの組成物、特にRAGE融合タンパク質又はその発現コンストラクトを投与する方法は、当該技術分野で周知の様々な投与方法により実施され得る。これらの方法は局所又は全身投与を含み、脳室内、髄腔内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内投与され、又はエアロゾルとして投与されてもよい。加えて、本発明の核酸ベース又はタンパク質ベースの組成物を、任意の適切なルート、例えば脳室内(intraventricular, intracerebroventricular)、髄腔内、及び内皮に、ポンプを用いた注射又は注入により投与するのが望ましい場合もある。例えば、脳室内注射は、Ommayaリザーバー等のリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより促進され得る。ポンプを用いた注入は、例えばカテーテルに取り付けられたインプラント可能なポンプ等により促進され得る。他の態様において、脳室内投与は、カテーテルに取り付けられたインプラント可能なポンプにより促進され得る。
【０２４１】
これらの、及び他のインプラント及び人工装具(prosthetics)は、本願融合タンパク質で、又は本願融合タンパク質を発現する核酸を含む発現コンストラクトで処理されてもよい。これにより、本願融合タンパク質は特定の罹患組織に直接投与できる。
【０２４２】
導入の方法は、最充填可能な又は生分解性のデバイスによって提供することも出来る。更に、投与は、デバイス、インプラント、ステント又は人工装具を被覆することにより行われ得ることも想定される。
【０２４３】
本明細書中でより詳細に記載されるように、RAGEは、様々な病態の発病に関与することが示唆されている。故に、本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、様々なRAGE介在障害の処置に使用され得る。
【０２４４】
幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、糖尿病の症状又は糖尿病後期合併症の症状の処置に使用されてもよい。例えば、糖尿病の症状又は糖尿病後期合併症の症状として、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性脚部潰瘍、心臓血管合併症、又は糖尿病性神経症の1つ以上が挙げられる。
【０２４５】
他の態様において、本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、アミロイドーシス、アルツハイマー症、癌、腎不全、自己免疫疾患に関連する炎症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、低酸素症、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、臓器移植、又は創傷治癒の障害の1つ以上を処置するのに使用されてもよい。
【０２４６】
あるいは、前記RAGE融合タンパク質製剤は、骨粗鬆症の処置に使用されてもよい。例えば、幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、対象の骨密度を増大させ、又は対象の骨密度の減少の速度を低下させる。
【０２４７】
幾つかの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、膵臓細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、骨髄細胞、血液細胞、骨細胞、筋細胞、内皮細胞、動脈細胞、静脈細胞、軟骨細胞、甲状腺細胞、又は幹細胞の1つ以上の拒絶を含んでも良い。あるいは、前記RAGE融合タンパク質は、腎不全の処置に使用されてもよい。
【０２４８】
幾つかの態様において、前記RAGE融合タンパク質製剤は、第一の部位から第二の部位への器官、組織、又は複数の細胞の移植に関連する炎症及び/又は拒絶を処置するのに使用されてもよい。当該第一及び第二の部位は、異なる対象内であっても同一の対象内であってもよい。様々な種類の細胞の移植は、本発明のRAGE融合タンパク質製剤を使用して改善され得る。例えば、移植される細胞、組織又は臓器は、膵臓、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、骨髄、血液、骨、筋肉、内皮、動脈、静脈、軟骨、甲状腺、又は幹細胞の細胞、組織又は臓器を含み得る。
【０２４９】
さまざまな凍結乾燥保護剤が、本発明のRAGE融合タンパク質の凍結乾燥製剤中で使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。例えば、該非還元糖は、スクロース、マンニトール、又はトレハロースを含んでよい。また、さまざまな緩衝剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されうる。ある実施態様において、緩衝剤はヒスチジンを含んでよい。
【０２５０】
凍結乾燥RAGE融合タンパク質は、追加の成分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤は、界面活性剤、キレート剤または充填剤のうちの少なくとも１つをさらに含んでよい。
【０２５１】
１つの実施態様においては、本発明は、希釈剤中で再構築された凍結乾燥RAGE融合タンパク質を含む再構築製剤を含み、ここで、再構築製剤中の該RAGE融合タンパク質濃度は、約１mg/mL〜約４００mg/mLの範囲である。あるいは、本明細書に記載のRAGE融合タンパク質の他の濃度も使用されてよい。
【０２５２】
他の実施態様においては、本発明は、RAGE融合タンパク質の安定な再構築製剤の調製方法も含む。該再構築製剤は、（対象への直接投与などの）直接的使用に好適な濃度を含んでよく、又はさらにデリバリー剤で希釈され及び／又はこれと混合されてよい。
【０２５３】
ある実施態様においては、該方法は、RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護剤の凍結乾燥混合物中のRAGE融合タンパク質の濃度が約１mg/mL〜約４００mg/mLの範囲となるように、上記凍結乾燥混合物を希釈剤中で再構築することを含んでよい。あるいは、本明細書に記載の他の濃度も、本明細書に記載のとおりに使用されてよい。
【０２５４】
さまざまな凍結乾燥保護剤が本発明の再構築RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。たとえば、非還元糖は、スクロース、マンニトール、又はトレハロースを含んでよい。また、さまざまな緩衝剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンを含んでよい。
【０２５５】
再構築RAGE融合タンパク質製剤は、追加の成分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤は、さらに、少なくとも１つの界面活性剤、キレート剤、又は充填剤を含んでよい。
【０２５６】
医薬に好適なさまざまな希釈剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質を再構築するために使用されてよい。ある実施態様においては、凍結乾燥RAGE融合タンパク質は滅菌されている。また、ある実施態様においては、希釈剤は滅菌されている。１つの実施態様においては、希釈剤は注射用の水（WFI）を含んでよい。また、ある実施態様においては、添加される希釈剤の量は、RAGE融合タンパク質の治療量及び薬物動態プロフィール、並びに製剤及び投与される担体の生物適合性に基づく。ある実施態様においては、再構築製剤は等張である。
【０２５７】
再構築RAGE融合タンパク質製剤は、さまざまな経路による投与に好適であることができ、そして着目のRAGE介在性疾患の治療に必要とされる。ある実施態様においては、再構築RAGE融合タンパク質製剤は、製剤の対象への静脈内、腹腔内、皮下、脳室内、鞘内、心室内、又は硬膜外投与のうちの少なくとも１つに好適である。
【０２５８】
さらに他の実施態様においては、本発明は、RAGE融合タンパク質を含む製造品を含んでよい。たとえば、ある実施態様においては、該製造品は、凍結乾燥RAGE融合タンパク質を保持する容器、及び希釈剤で凍結乾燥製剤を再構築するための指示書を含んでよい。ある実施態様においては、該製造品は、凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質、及び緩衝剤の凍結乾燥混合物を含む製剤を保持する容器を含んでよい。該製造品は、凍結乾燥製剤を希釈剤中で再構築するための指示書も含んでよい。
【０２５９】
さまざまな凍結乾燥保護剤が本発明の製造品中で使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。たとえば、非還元糖は、スクロース、マンニトール又はトレハロースを含んでよい。また、さまざまな緩衝剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンを含んでよい。
【０２６０】
本発明の製造品のRAGE融合タンパク質製剤は、更なる成分を含んでよい。ある実施態様においては、凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤は、さらに、界面活性剤、キレート剤、または充填剤のうちの少なくとも１つを含んでよい。
【０２６１】
医薬に好適なさまざまな希釈剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質を再構築するために使用されてよい。ある実施態様においては、凍結乾燥製剤は滅菌されている。その代わりに又はそれに加えて、希釈剤は滅菌されていてよい。１つの実施態様においては、希釈剤は注射用の水（WFI）を含んでよい。したがって、製造品は、凍結乾燥製剤を再構築するための希釈剤を保持する第２の容器をさらに含んでよく、ここで、希釈剤は注射用の水（WFI）である。ある実施態様においては、再構築製剤は等張である。
【０２６２】
また、ある実施態様においては、添加される希釈剤の量は、RAGE融合タンパク質の治療量及び薬物動態プロフィール、並びに製剤及び投与される担体の生物適合性に基づく。別の実施態様においては、指示書は、凍結乾燥製剤を再構築を本明細書に記載の濃度とするためものである。たとえば、ある実施態様においては、指示書は、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約４０mg/mL〜約１００mg/mLの範囲内となるように凍結乾燥製剤を再構築するためのものである。
【０２６３】
また、ある実施態様においては、提供された指示書にしたがって再構築された場合、再構築RAGE融合タンパク質製剤は、着目のRAGE介在性疾患の治療に必要とされ、さまざまな投与経路によって投与されるのに好適であることができる。ある実施態様においては、再構築RAGE融合タンパク質製剤は、製剤の対象への静脈内、腹腔内、皮下、脳室内、鞘内、心室内、又は硬膜外投与のうちの少なくとも１つに好適である。
【０２６４】
RAGE融合タンパク質を含む、製剤、製造品、及び製剤の製造方法のある実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１０mg/mL、少なくとも２０mg/mL、又は少なくとも５０mg/mLであってよい。別の実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１００mg/mL、又は２００mg/mL、又は４００mg/mLであってよい。たとえば、別の実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも約０．５mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１mg/mL〜約２００mg/mL、又は４０mg/mL〜４００mg/mL、５０mg/mL〜４００mg/mL、４０〜１００mg/mL、５０〜１００mg/mL、又は約４０〜５０mg/mLである。
【０２６５】
本明細書に記載のいずれの実施態様も、本発明の製剤中のRAGE融合タンパク質として使用されることができる。したがって、本明細書中に記載されるRAGE融合タンパク質の態様は、凍結乾燥製剤、再構築凍結乾燥製剤、又は凍結乾燥製剤若しくは再構築凍結乾燥製剤のいずれかの製造方法、又は本発明の凍結乾燥製剤若しくは再構築凍結乾燥製剤のいずれかを含む製造品のそれぞれに使用され得る。
【０２６６】
凍結乾燥製剤の調製
他の実施態様においては、本発明は、凍結乾燥前製剤、凍結乾燥製剤、再構築製剤及びそれらの調製方法を提供する。
【０２６７】
上記の着目のRAGE融合タンパク質の調製後、「凍結乾燥前製剤」が製造されることができる。凍結乾燥前製剤中に存在するRAGE融合タンパク質の量は、所望の用量体積、投与様式などを考慮して決定されることができる。ある実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の融合タンパク質量は、１mg/mL超であってよい。また、ある実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の融合タンパク質量は、約５mg/mL、１０mg/mL、５０mg/mL、１００mg/mL又は２００mg/mL未満であってよい。
【０２６８】
さらなる実施態様においては、凍結乾燥前製剤は、約４〜８のpHのpH緩衝溶液であってよい。他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤は、約５〜７のpHのpH緩衝溶液であってよい。例示的な緩衝剤は、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸及び本明細書に記載の他の有機酸を含む。緩衝剤濃度は、たとえば、緩衝剤及び（再構築製剤などの）製剤の所望の等張性に依存して、約１mM〜約１００mM、又は約５０mM未満、又は約２mM〜約５０mM、又は約１５mM未満、又は約３mM〜約１５mMであってよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンである。
【０２６９】
凍結乾燥保護剤が、凍結乾燥前製剤に添加されることができる。ある実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、糖を含む。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含む。或いは、非還元糖は、マンニトールを含む。或いは、非還元糖は、トレハロースを含む。凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤の量は一般に、再構築後に、得られた製剤が等張となるようなものである。しかしながら、たとえば、末梢非経口投与のための製剤におけるなど、高張な再構築製剤も好適である。さらに、凍結乾燥保護剤の量は、許容不能な量のタンパク質の分解及び／又は凝集が凍結乾燥によっておこるほど低くてはならない。別の実施態様においては、許容不能な量の凝集は、製剤中に２０％、又は１０％、又は５％以上のRAGE融合タンパク質が凝集体として存在する場合である。凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤濃度の例示的範囲は、約４００mM未満であることができる。他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤濃度の範囲は、約１００mM未満である。したがって、他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤濃度の範囲は、約０．５mM〜４００mM、又は約２mM〜２００mM、又は約３０mM〜約１５０mM、又は約６０〜６５mMである。また、いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、再構築製剤を等張とする量で添加される。
【０２７０】
RAGE融合タンパク質の凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤に対する比は、各RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護剤との組み合わせについて選択される。高濃度（すなわち、約５０mg/mL以上）のRAGE融合たんぱく質を含む等張の再構築製剤のある実施態様においては、凍結乾燥保護剤のRAGE融合タンパク質に対するモル比は、約５０〜約１５００モルの凍結乾燥保護剤に対して１モルのRAGE融合タンパク質であることができる。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤のRAGE融合タンパク質に対するモル比は、約１５０〜約１０００モルの凍結乾燥保護剤に対して１モルのRAGE融合タンパク質であることができる。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤のRAGE融合タンパク質に対するモル比は、約１５０〜約３００モルの凍結乾燥保護剤に対して１モルのRAGE融合タンパク質であることができる。あるいは、これらの範囲内の範囲が使用されてもよい。たとえば、これらの範囲は、凍結乾燥保護剤がスクロース、トレハロース、又はマンニトールなどの非還元糖である場合に好適であることができる。
【０２７１】
本発明の他の実施態様においては、界面活性剤が凍結乾燥前製剤に添加されてよい。或いは又はそれに加えて、界面活性剤は、凍結乾燥製剤及び／又は再構築製剤に添加されてよい。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート２０又は８０）（Tween20（商標）又はTween80（商標））；ポロキサマー（たとえば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤を含む。添加される界面活性剤の量は、再構築されたタンパク質の凝集を低下させ、そして再構築後の粒子の形成を最小化するものである。たとえば、界面活性剤は、約０．００１％〜０．５％の量で凍結乾燥前製剤中に存在してよい。たとえば、界面活性剤がポリソルベート８０を含む実施態様においては、該界面活性剤は、約０．００５％〜０．０５％、又は約０．００８％〜０．０１２％、又は約０．０１％の量で凍結乾燥前製剤中に存在してよい。或いは、界面活性剤は、０．００１mg/mL〜約１００mg/mL、又は約０．０１mg/mL〜約１０mg/mLの範囲の最終濃度をなすように製剤中に存在してもよい。あるいは、これらの範囲内の範囲が使用されてもよい。
【０２７２】
本発明のある実施態様においては、（スクロース又はヒスチジンなどの）凍結乾燥保護剤及び（マンニトール又はグリシンなどの）充填剤が、凍結乾燥前製剤の調製において使用されてよい。充填剤は、過剰のポケットをその中に含まない、均一な凍結乾燥ケーキの製造を可能とする。
【０２７３】
Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中に記載されたような他の医薬として許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤が、それらが製剤の所望の特性を害さないという条件で、凍結乾燥前製剤（及び／又は凍結乾燥製剤及び／又は再構築製剤）中に含まれてよい。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；EDTAなどのキレート剤；（Zn-タンパク質錯体などの）金属錯体；ポリエステルなどの生物分解性ポリマー；及び／又はナトリウムなどの塩を形成する対イオンを含む。
【０２７４】
本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、治療される特定の適応症のために必要な追加のタンパク質も含んでよい。追加のタンパク質は、該タンパク質のそれぞれがお互いに、又はRAGE融合タンパク質に対して有害な影響を与えない、補完的な活性を有するように選択されることができる。かかるタンパク質は、意図された目的のために有効な量で好適に併用されて存在する。
【０２７５】
本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、インビボ投与のために滅菌されることができる。これは、凍結乾燥及び再構築の前又は後に、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって達成されることができる。
【０２７６】
RAGE融合タンパク質、凍結乾燥保護剤及び他の任意の成分が一緒に混合された後、製剤は凍結乾燥されてよい。Hull50（商標）（Hull, USA）又はGT20（商標）（Leybold-Heraeus, Germany）凍結乾燥機などの多くの異なる凍結乾燥機がこの目的のために利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結し、そして次に、一次乾燥に適した温度で凍結内容物から氷を昇華させることによって達成される。この条件下で、生成物の温度は、共融点又は製剤の崩壊温度未満である。典型的には、一次乾燥のための棚温度は、約５０〜２５０mTorrの好適な圧力において（生成物が一次乾燥の間凍結したままであるという条件で）約−５０〜２５℃の範囲であろう。ある実施態様において、圧力は約１００mTorrであり、サンプルは約−３０〜２５℃で凍結乾燥されることができる。製剤、サンプルを保持する容器の種類（たとえば、ガラスバイアル）及び液体の体積は、乾燥に必要な時間を決定づけ、これは、２、３時間〜数日（たとえば、４０〜６０時間）の範囲であることができる。凍結乾燥条件は、製剤及びバイアルサイズによって異なる。
【０２７７】
いくつかの場合には、移動ステップをさけるために、その中でタンパク質の再構築が行われるべき容器中でタンパク質製剤が凍結乾燥されることが望ましい。この場合の容器は、たとえば、２、３、５、１０、２０、５０、１００、又は２５０ｃｃのバイアルであってよい。ある実施態様においては、容器は、１００mL以下の体積の再構築製剤を調製するのに好適な任意の容器である。
【０２７８】
一般命題として、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満である凍結乾燥製剤を生じるであろう。ある実施態様においては、凍結乾燥製剤の水分含量は、約３％未満である。他の実施態様においては、凍結乾燥製剤の水分含量は、約１％未満である。
【０２７９】
凍結乾燥製剤の再構築
所望の段階、典型的には、患者又は対象にRAGE融合タンパク質を投与する時点、で凍結乾燥製剤は、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約１０mg/mL超、又は２０mg/mL超、又は５０mg/mL超、又は約３０〜５０mg/mL、又は約５０mg/mLであるように、希釈剤で再構築される。別の実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１００mg/mL、又は２００mg/mL、又は４００mg/mLである。例えば、別の実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約１mg/mL〜約６００mg/mL、又は約１mg/mL〜約５００mg/mL、又は約１mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１mg/mL〜約２００mg/mL、又は約１０mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１０mg/mL〜約２００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約４００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約２００mg/mL、又は約５０mg/mL〜約４００mg/mL、又は約５０mg/mL〜約２００mg/mLの範囲内であってよい。他の実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約４０mg/mL〜約１００mg/mL、又は約５０mg/mL〜約１００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約５０mg/mLである。再構築製剤中のかかるRAGE融合タンパク質濃度は、再構築製剤の皮下デリバリーを目的とする場合には、特別に有用であると考えられる。しかしながら、静脈内投与などの他の投与経路のためには、再構築製剤中の低濃度のタンパク質が望ましいかもしれない（たとえば、再構築製剤中の約５〜５０mg/mL、又は約１０〜４０mg/mLのRAGE融合タンパク質）。したがって、いくつかの実施態様においては、再構築製剤中の融合タンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤中の融合タンパク質濃度の２倍以下であることができる。
【０２８０】
ある実施態様においては、再構築製剤中の融合タンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤中のそれよりも顕著に高い。たとえば、再構築製剤中の融合タンパク質濃度は、ある実施態様においては、凍結乾燥前製剤のそれの約２〜４０、又は２〜１０、又は３〜８倍であることができる。ある実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤のそれの約３〜６倍であることができる。凍結乾燥前製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約１５mg/mLである他の実施態様においては、再構築製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約５０mg/mL以上である（例えば、少なくとも３倍又は少なくとも４倍高い）。
【０２８１】
高濃度のタンパク質のデリバリーは、体積制限（１．５mL以下）及び投薬の必要条件（１００mg以上）のために、しばしば皮下投与において有利又は必要とされる。しかしながら、タンパク質濃度（５０mg/mL以上）は、製造過程で達成することは困難である。それは、高濃度では、タンパク質は加工中に凝集する傾向があり、かつ操作（ポンプなど）及び滅菌ろ過が困難であるからである。或いは、凍結乾燥過程は、タンパク質の濃縮を可能とする方法を提供することができる。たとえば、RAGE融合タンパク質は、体積（Vf）でバイアル中に充填され、そして凍結乾燥されてよい。凍結乾燥されたRAGE融合タンパク質は、もとの体積（たとえば、Vr=０．２５Vf）よりもより小さな体積（Vr）の水又は保存剤（たとえば、BWFI）で再構築され、再構築溶液中でより高濃度のRAGE融合タンパク質を生じる。この過程は、緩衝剤及び賦形剤の濃縮も起こす。皮下投与のためには、溶液は滅菌されていることが望ましい。
【０２８２】
再構築は通常、完全な水和を確実にするために、約２５℃の温度で行われるが、所望により他の温度も使用可能である。再構築に必要な時間は、たとえば、希釈剤の種類、賦形剤及びタンパク質の量に依存しうる。例示的な希釈剤は、注射用の滅菌水、静菌水（BWFI）、pH緩衝溶液（リン酸緩衝食塩水など）、滅菌食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む。ある実施態様においては、希釈剤は、注射に好適な再構築製剤を提供する。他の実施態様においては、希釈剤が注射に好適な再構築製剤を提供する場合、希釈剤は注射用の水（WFI）をふくんでよい。場合により、希釈剤は保存剤を含む。使用される保存剤の量は、タンパク質との適合性及び保存効率試験について異なる保存剤濃度を評価することによって決定されることができる。
【０２８３】
再構築製剤の投与
再構築製剤は、ヒトなどの哺乳動物に、ボーラス又は経時的な持続的輸注による静脈内投与による、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、鞘内、心室内、脳室内、硬膜外、経口、局所又は吸入経路によるなどの知られた方法にしたがって投与されることができる。
【０２８４】
実施態様においては、再構築製剤は、皮下（すなわち、皮膚の下への）投与によって哺乳動物に投与されることができる。かかる目的のためには、再構築製剤は、シリンジを用いて注射されてよい。しかしながら、（Inject-ease（商標）及びGenject（商標）装置などの）注入装置；（GenPen（商標）などの）インジェクターペン；（MediJector（商標）及びBioJector（商標）などの）無針装置；及び皮下パッチデリバリーシステムなどの、再構築製剤の投与のための他の装置が利用可能である。
【０２８５】
RAGE融合タンパク質の適切な用量又は治療的有効量は、たとえば、治療される状態、該状態の重篤度及び経過、RAGE融合タンパク質が予防的又は治療的目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴及びRAGE融合タンパク質への応答、並びに担当医師の判断に依存するであろう。RAGE融合タンパク質は、対象に、一度に又は一連の治療にわたって投与されてもよい。RAGE融合タンパク質は、唯一の治療として又は同時、後続又は連続投与の手段により、他の薬物又は治療とともに投与されてもよい。ある実施態様においては、たとえば、１又はそれ以上の別々の投与により、約０．１〜２０mg/kgの用量が対象への最初の候補用量である。上記のとおり、他の投与計画も有用である。
【０２８６】
製造品
本発明の他の実施態様においては、本発明の製剤を含み、かつ、その再構築及び／又は使用についての指示書を提供する製造品が提供される。製造品は、容器を含んでよい。好適な容器は、たとえば、ボトル、（デュアルチャンバーバイアルなどの）バイアル、（デュアルチャンバーシリンジなどの）シリンジ及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどのさまざまな材料で形成されてよい。容器は、凍結乾燥製剤を保持することができる。ある実施態様においては、容器に取り付けられた、又は結合したラベルがある。ラベルは、再構築及び／又は使用のための指示を示すことができる。たとえば、ある実施態様においては、ラベルは、凍結乾燥製剤が上記のタンパク質濃度に再構築されることを示すことができる。ラベルはさらに、製剤が皮下投与に有用又はそれを目的とするものであることを示すことができる。
【０２８７】
製剤を保持する容器は、製剤の（２〜６、または２〜１０又は２〜５０回の投与などの）反復投与を可能とするものであってもよい。製造品はさらに、商業的及び使用者の観点から望ましい、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用のための指示を含む添付文書を含む他の材料も含んでよい。
【実施例】
【０２８８】
本発明の対象である本発明の概念の特徴及び利益を、以下の実施例においてさらに例解する。
【０２８９】
実施例１A：RAGE融合タンパク質の生成
RAGE-IgG融合タンパク質を発現させるために２つのプラスミドを構築した。両プラスミドを、ヒトRAGEからの異なる長さの５’cDNA配列と、ヒトIgG Fc(γ１)からの同じ３’cDNA配列をライゲーションすることによって構築した。これらの発現配列（すなわち、ライゲーション産物）を次に、pcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen, CA）中に挿入した。2つの野生型RAGE融合タンパク質をコードする核酸配列を図２及び３に示す。TTP-4000RAGE融合タンパク質については、（太字で強調された）１〜７５３の核酸配列はRAGE N-末端タンパク質配列をコードするが、７５４〜１３８６の核酸配列は、IgG Fcタンパク質配列をコードする（図２）。TTP-3000については、（太字で強調された）１〜４０８の核酸配列は、RAGE N-末端タンパク質配列をコードするが、４０９〜１０４１の核酸配列はIgGタンパク質配列をコードする（図３）。
【０２９０】
RAGE融合タンパク質を生成するために、配列番号３０または配列番号３１のいずれかの核酸配列を含む発現ベクターを、安定にCHO細胞中にトランスフェクトした。陽性の形質転換体を、プラスミドによって付与されたネオマイシン耐性について選択し、そしてクローン化した。上清のウエスタンブロット分析によって検出した高生産性クローンを増殖させ、そして遺伝子産物をProtein Aカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞が組換えTTP-4000をリッター当たり約１．３グラムのレベルで産生するように、発現を最適化し得る。
【０２９１】
実施例１B:4つのドメインのRAGE融合タンパク質の別の生産
RAGE-IgG融合タンパク質を発現するためにプラスミドを構築した。プラスミドは、ヒトRAGEからの5’cDNA配列をヒトIgG Fc(γ1)からの3’cDNA配列とライゲーションした。cDNAを増幅するためにPCRを用いた。さらに、５‘末端においては、PCRプライマーが、クローニングからのEcoR1制限酵素部位及びKozakコンセンサス転写開始配列を加えた。３’末端においては、PCRプライマーは、終末コドンのすぐ先にXhoI制限を加えた。３‘末端においては、PCRプライマーは、終末コドンの近くのイムノグロブリン部分内の潜在的RNAスプライス部位を除去する、２つのサイレントな塩基の変更も含んだ。プロリン（配列番号３２中のタンパク質配列の番号付で残基４５９）をコードするコドンは、CCGからCCCに、そしてグリシン（配列番号３２中のタンパク質配列の番号付で残基４６０）をコードするコドンは、GGTからGGGに変更された。EcoRI及びXhoIでPCR断片を消化し、そしてMfe Iで消化した（Eco RIと適合する末端を形成するため）レトロベクタープラスミド（Gala, Incから入手可能なｐCNS-newMCS-WPRE（new ori））中に挿入し、そしてXho Iで消化した。クローン化されたプラスミドの挿入部分及びクローニングジャンクションを配列決定して、クローニングの間に何の突然変異もおこらなかったことを確認した。
【０２９２】
RAGE-IgG融合タンパク質を生産するために、配列番号５４の核酸配列を含む発現ベクターを、CHO細胞中に安定にトランスフェクトした。
【０２９３】
トランスフェクトされた細胞によって発現された、単離されたRAGE融合タンパク質TTP-4000の配列を、さまざまな特徴付け試験によって、配列番号３４又は配列番号５６のいずれか、あるいは配列番号３４及び配列番号５６の両方であるか確認した。したがって、配列番号３２の最初の２３アミノ酸によってコードされるシグナル配列を切断し、そしてN-末端残基はグルタミン（Q）またはピログルタミン酸（pE）またはそれらの混合物であった。特徴付け試験はまた、（配列番号３４又は配列番号５６の番号付に基づいて）N2及びN288におけるグリコシル化部位も示し、そして、この組換え系中で発現したときに、RAGE融合タンパク質のCH3領域が翻訳後修飾を通じてC末端残基が切断されうるということを示した。
【０２９４】
実施例１C：３つのドメインのRAGE融合タンパク質の別の生産
TTP-4000について上記したやり方でTTP-3000などの3つのドメインのRAGE融合タンパク質（たとえば、1つのRAGEドメインと２つのIgGドメイン）を発現するためにプラスミドを構築することができる。ヒトRAGEのアミノ酸１〜１３６をコードするヒトRAGEからの5’cDNA配列を、ヒトIgG Fc（γ1）からの3’cDNA配列とライゲーションすることによってプラスミドを構築した。cDNAの増幅のためにPCRが使用可能である。5’末端においてPCRプライマーは、クローニングのための（TTP-4000のために使用されるEco RI制限酵素部位などの）制限部位およびKozakコンセンサス翻訳開始配列を付加することができる。3’末端においてPCRプライマーは、（Xho I制限部位などの）制限部位を終止コドンのすぐ向こうに含んでよい。実施例１Bに記載したように、PCRプライマーは、イムノグロブリンCH２ドメインの3’末端に位置する潜在的RNAスプライス部位などの任意の潜在的RNAスプライス部位を除去するために必要であるかもしれないサイレントな塩基の変化も含んでよい。これらの潜在的スプライス部位を除去するためには、配列番号３５のプロリン３４４をコードするコドン（すなわち、配列番号３１のDNA配列中の番号付けに基づく残基１０３０〜１０３２）を、CCGからCCCに変更し、そして配列番号３５のグリシン３４５をコードするコドン（配列番号３１のDNA配列中の番号付けに基づく残基１０３３〜１０３５）をGGTからGGGに変更してよい。そして、PCR断片を好適な制限酵素（たとえば、Eco RI及びXho I）で消化し、レトロベクタープラスミドpCNS-newMCS-WPRE（new ori;Gala, Inc.から入手可能）中に挿入することができる。ベクターをMfe Iで消化して、Eco RIに適合する末端を形成し、そしてXho Iで消化する。クローン化プラスミドの挿入された部分及びクローニングジャンクションを配列決定して、クローニングの間に突然変異がおこっていないことを確認することができる。
【０２９５】
RAGE-IgG融合タンパク質を生産するために、配列番号５５の核酸配列（すなわち、潜在的スプライス部位を除去するためのDNA配列の変更を含む）を含む発現ベクターを、実施例１A及び１Bに記載したとおりに、CHO細胞中へ安定にトランスフェクトすることができる。
【０２９６】
トランスフェクトされた細胞により発現されたRAGE融合タンパク質TTP-3000の配列は、配列番号３６、配列番号３７又は配列番号５７又は配列番号３６、配列番号３６及び／又は配列番号５７の組み合わせであることができる。したがって、配列番号３５の最初の２２及び／又は２３アミノ酸によってコードされるシグナル配列を切断することができ、そして、N-末端残基はグルタミン（Q）又はピログルタミン酸（pE）又はそれらの混合物であることができる。グリコシル化は、（配列番号３７又は配列番号５７の番号付けに基づいて）N2及びN174の部位において起こることができ、及び／又は他のグリコシル化部位が存在するかもしれない。この組み換え系において発現されたとき、RAGE融合タンパク質のCH3領域は、翻訳後修飾によってC-末端残基が切断されているかもしれない。
【０２９７】
実施例２  RAGE融合タンパク質突然変異の作製
野生型RRP-4000RAGEプラスミドDNAは、以下の手段を使用して、部位指向的突然変異生成のテンプレートとして、また順及び逆プライマーの調製に使用され得る。
【０２９８】
残基288に突然変異を入れるために、野生型TTP-4000RAGEプラスミドに対して突然変異を含み、長さが32〜34ヌクレオチドの順プライマーが使用できる。一般に、当該プライマーは、前記突然変異の下流約10ヌクレオチドを含む。例えば、N288Q突然変異をコードする順プライマー配列は５’−GCCTCGGGAGGAACAGTAcAgTCCACCTACC(配列番号196)で、ここで小文字の塩基は野生型TTP-4000RAGEプラスミドに対して突然変異したヌクレオチドを表す。当該プライマーを、PCRにより前記融合タンパク質のDNAを増幅するための逆プライマーと組み合わせて使用して、コードされたアミノ酸は、野生型ではアスパラギン(aAc)であった部位がグルタミン(cAg)となり得る。5’末端に順プライマーと重複する領域を含む15〜20ヌクレオチドの逆プライマーが使用される。故に、逆プライマー配列は５’−TACTGTTCCTCCCGAGGCTTGGTCTTGG(配列番号197)であってもよく、ここで下線部は配列番号196の順プライマーと重複する領域を指す。
【０２９９】
残基198に突然変異R198Aを入れるため、配列５’−GCCTCGGCACCGGGCCCTGgcGACCGCCCCTAT(配列番号198)を有する順プライマー及び配列５’−CAGGGCCCGGTGCCGAGGCAGGCCAGGGGA(配列番号199)を有する逆プライマーが使用される。これらのプライマーを増幅に用いて、それらの途中にあるDNAは、野生型のアルギニン(cgG)がアラニン(gcG)に変化する。
【０３００】
前記突然変異は、突然変異順プライマー及び逆プライマーペア、鋳型のメチル化野生型若しくは突然変異プラスミドDNA、予想されるプライマーアニーリング温度に基づく標準的な増幅条件を使用して、PCRにより生産され得る。PCR産物は、DH5α-Ti化学コンピテント細胞中に形質転換され、100μg/mlのアンピシリンを含む温めておいたLBアガープレートに播種され、37℃で一昼夜インキュベーションされる。コロニーはコロニーPCRで解析されて、予想されたサイズのインサートを含む形質転換体が確認される。突然変異DNA配列の配列は、DNAシークエンシングにより確認された。
【０３０１】
同様の技術を使用して、配列番号202〜220が調製されてもよい。
【０３０２】
実施例3：HEK及びCHO細胞への突然変異RAGE融合タンパク質を発現するクローンのトランスフェクション
HEK293F細胞又はCHO細胞を、TTP-4000野生型又は突然変異の精製プラスミドDNAでトランスフェクションした。細胞は6ウェルプレートに播種され、Fugene 6(Roche)を、基本的に説明書の指示通りに使用した。24時間のトランスフェクション後、細胞を150mmのディッシュに移し、1mg/mlのG418を含有する選択培地で培養した。15〜20日後、抗生物質耐性クローンを、3mmクローニングディスクと0.25%トリプシンEDTAを使用して単離した。回収された細胞を24ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2の加湿インキュベーター中で、DMEM-10% FBS、1mg/mL G418を用いて培養した。
【０３０３】
各クローンの上澄を、抗RAGEmAb及び抗ヒトIgGFc抗体を使用する間接ELISAによるRAGE融合タンパク質の発現の試験に用いることができる。また、発現したRAGE融合タンパク質は、S100b及び抗ヒトIgGFc-AP抗体を使用する間接ELISAによる受容体-リガンド結合活性のアッセイに用いることもできる。例えば、RAGE融合タンパク質のアッセイにおいて、96ウェルELISAプレートを、抗RAGEmAb、抗ヒトIgGFcポリクローナル抗体、又はS100bでコーティングする。このプレートを1%BSA-TBSでブロッキングし、前記培養上澄を添加し、そしてアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgGFcを加えて、RAGE融合タンパク質の結合(即ち、RAGE融合タンパク質の、RAGEリガンド、抗RAGEmAb、又は抗ヒトIgG抗体のいずれかへの結合)を検出する。各インキュベーションの後、プレートを0.05%Tween20を含有するTBSで4回洗浄した。pNPP基質を添加し、マイクロプレートリーダーを用いて405nmの吸光度を検出した。
【０３０４】
陽性であったクローンを限界希釈により更に精製し、様々なRAGE融合タンパク質突然変異の陽性クローンが、それらのタンパク質の発現に使用され得る。
【０３０５】
実施例４：TTP-4000の発現及び精製
TTP-4000野生型RAGE融合タンパク質又はその変異体（即ち突然変異)を発現するステーブル細胞を、T225フラスコ中、DMEM-10% FBS、0.5mg/mL G418を用いて、37℃、5%CO2インキュベーターで1週間培養し、それを5Lのウエーブバイオリアクター(wave bioreactor)又はローラーボトルに移す。上澄をS100b結合活性について試験し、発現したタンパク質のレベルを、1週間置きに間接ELISAにより試験する。
【０３０６】
10〜25日間の培養後、培地を回収し、4℃、10,000xgで30分間遠心分離する。そして上澄を0.4μmフィルターと0.2μmフィルターで連続的に濾過する。濾過された培地(即ち上澄)に1/20の1M Tris-HCl(pH8.0)を添加し、タンパク質Aカラムにロードする。当該カラムを、〜20体積の1MのNaClを含有するPBSで、UV検出器上でOD280nmが0.05を下回るまで洗浄する。当該タンパク質を25mM、pH3.5の酢酸で溶出して、フラクションコレクターで回収する。当該溶出物を1.5M Tris-塩基溶液でpH6.5に調整し、Amicon超遠心濾過デバイスで濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4℃で一昼夜透析する。
【０３０７】
精製したタンパク質のS100b結合活性を間接ELISAにより試験する。タンパク質濃度は、ELISA及び280nmのUV吸光度の両方により判定した。精製タンパク質は、SDS-PAGE及びマイクロ流体チップベース自動電気泳動システムを用いた電気泳動により、純度、分子量及びタンパク質濃度も解析された。
【０３０８】
実施例５：マウスにおけるRAGE融合タンパク質の薬物動態
この実験で、10mg/kgのRAGE融合タンパク質をIV投与したCD-1マウス体内でのRAGE融合タンパク質の薬物動態及びインビトロでの安定性を試験した。マウス血漿中でのRAGE融合タンパク質(例えば下記のTTP4000及びその変異体)の濃度は、RAGE及び当該融合タンパク質の免疫グロブリン部分を検出することにより融合タンパク質を測定するように設計された酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して判定された。このアッセイにおいて、96ウェルマイクロタイタープレートを、pH9.6の炭酸緩衝剤中1μg/mLのRAGEモノクローナル抗体(R&D Systems, #MAB1145)溶液100μＬ／ウェルで被覆した。4℃で一昼夜インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝剤(0.05%Tween-20リン酸緩衝生理食塩水(PBS))で洗浄し、ブロッキング緩衝剤(3%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.05%Tween-20、PBS)で室温で2時間処理した。このアッセイプレートを0.05%Tween-20、PBS洗浄緩衝剤で洗浄し、そして、100μＬ／ウェルの：(1)TTP4000血漿校正標準(即ち既知の濃度のTTP4000で強化され、連続希釈された試料)；(2)品質管理(即ち本アッセイの定量範囲を定め、アッセイの性能をモニタリングする、既知の濃度のTTP4000で強化された試料)；及び(3)試料の希釈剤(即ち3%BSA、0.05% Tween-20、PBS)で希釈されたマウス血漿試料；が、プレートにロードされた。当該プレートをプレートシェーカーに置き、室温で1時間インキュベーションした。当該プレートを0.05 % Tween-20, PBSで洗浄し、そして100 μＬ／ウェルの検出抗体(ビオチン化抗ヒトIgG、Fc特異的抗体、Jackson Immuno Research製、1：1000)を添加し、攪拌しながら室温で1時間インキュベーションした。当該プレートを0.05 % Tween-20, PBS洗浄緩衝剤で再び洗浄し、そして新たに調製したストレプトアビジン/HRPの希釈物（1：100,000)を100μＬ／ウェル添加し、そして当該プレートを攪拌しながら室温で30分間インキュベーションした。30分間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、そして100μＬ／ウェルの3,3’,5’5’-テトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加して、攪拌せずに室温で約10分間インキュベーションした。100μＬ／ウェルの2M   H2SO4を添加して、反応を停止させた。Molecular Devices分光光度計を使用して(Lm1-Lm2: Lm1 = 450 nm, Lm2 = 650 nm)、吸光度を判定した。様々なRAGE融合タンパク質の血漿濃度を、SoftMax Proソフトウエア、4パラメーターフィットを使用して判定された。
【０３０９】
本実験で使用されたRAGE融合タンパク質は、以下のものである。
バッチ１-配列番号５６、CHO細胞由来(野生型)；
バッチ２-配列番号５６、HEK細胞由来(野生型)；
バッチ３-配列番号６７、HEK細胞由来(野生型に対しR198A)；
バッチ４-配列番号７１、HEK細胞由来(野生型に対しR198A及びN2Q)；
バッチ５-配列番号７２、HEK細胞由来(野生型に対しR198A及びN58Q)；
【０３１０】
図９に示すように、バッチ3(R198A)及びバッチ4(R198A及びN2Q)は、他の試験されたRAGE融合タンパク質と比較して、実験期間中により高い血漿濃度を維持した(図9A及び図9B)。この効果は、0〜336時間にかけて(図9A)、及び0〜48時間にかけて(図9B)確認された。
【０３１１】
図10は、10 mg/kgでマウスに静脈内投与されたバッチ1〜5のRAGE融合タンパク質の薬物動態パラメーターの平均を示す。曲線下部面積(AUC)により評価される全薬物曝露(Overall drug exposure)は、バッチ1及び2(野生型)及びバッチ3(R198A)よりも、バッチ4(R198A及びN2Q)及びバッチ5(R198A及びN58Q)のほうが高かった。バッチ4(R198A及びN2Q)及びバッチ5(R198A及びN58Q)の全身クリアランス(Clp)は、バッチ1及び2(野生型)及びバッチ3(R198A)よりも低かった。バッチ4(R198A及びN2Q)及びバッチ5(R198A及びN58Q)の定常体積(Vss)は、バッチ1及び2(野生型)及びバッチ3(R198A)よりも低かった。
【０３１２】
図11は、上記バッチ1〜5のRAGE融合タンパク質のインビトロ安定性のデータを示す。図11Aはこのデータを表で示すもので、図11Bはグラフで示している。新鮮なマウス血漿(薬物濃度1.0 μg/mL)を37℃でインキュベーションし、0〜48時間で試料を回収した。
【０３１３】
実施例６：突然変異RAGE融合タンパク質のリガンド結合能の測定
各クローンの上澄を使用して、突然変異TTP-4000タンパク質の発現及び発現したタンパク質のRAGEリガンドS100bへの結合を測定した。
【０３１４】
当外結合アッセイは、S100bに結合したRAGEを検出するためのアルカリホスファターゼ標識抗ヒトIgGFc抗体、及びRAGEリガンドとしてS100bを使用する、間接ELISAであった。96ウェルELISAプレートのウェルを、100nMの重炭酸/炭酸被覆緩衝剤(pH9.6)を使用して、4℃で一昼夜、5μg/mlのS100b  100μl/ウェルで被覆した。そして当該プレートを、室温で2時間、300μl/ウェルの1%BSA-TBSTでブロッキングした。次に、100μl/ウェルの培養上澄又は精製した突然変異RAGE融合タンパク質を添加し、そして100μl/ウェルのアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgGFcを1%BSA-TBSTで1：2500に希釈したものを添加した。各インキュベーションの後、0.05%Tween20を含むTBS(TBST)で4回洗浄した。アルカリホスファターゼの基質であるパラニトロフェニルリン酸(pNPP)を添加し、そして405nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて検出し、重量パーセント(wt%)に補正した。図12に結果を示す。
【０３１５】
全ての文献及び特許出願は、それぞれが具体的かつ個別に参照により援用されることが示されているのと同程度に、本明細書中に参照により援用される。
【０３１６】
上記発明は、理解を明確にする目的で、例示及び解説によりある程度詳細に記載されているが、一定の変化及び変更が補足的な態様の範囲内で実施され得ることは明白である。
【図１Ａ】
2013520166.tif 000003
【図１Ｂ】
2013520166.tif 000004
【図１Ｃ】
2013520166.tif 000005
【図１Ｄ】
2013520166.tif 000006
【図１Ｅ】
2013520166.tif 000007
【図１Ｆ】
2013520166.tif 000008
【図１Ｇ】
2013520166.tif 000009
【図１Ｈ】
2013520166.tif 000010
【図１Ｉ】
2013520166.tif 000011
【図１Ｊ】
2013520166.tif 000012
【図１Ｋ】
2013520166.tif 000013
【図１Ｌ】
2013520166.tif 000014
【図１Ｍ】
2013520166.tif 000015
【図２Ａ】
2013520166.tif 000016
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
2013520166.tif 000020
【図５】
2013520166.tif 000021
【図６Ａ】
2013520166.tif 000022
【図６Ｂ】
2013520166.tif 000023
【図６Ｃ】
2013520166.tif 000024
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
2013520166.tif 000030
【図６Ｊ】
2013520166.tif 000031
【図６Ｋ】
2013520166.tif 000032
【図６Ｌ】
2013520166.tif 000033
【図６Ｍ】
2013520166.tif 000034
【図６Ｎ】
2013520166.tif 000035
【図６Ｏ】
2013520166.tif 000036
【図６Ｐ】
2013520166.tif 000037
【図６Ｑ】
2013520166.tif 000038
【図６Ｒ】
2013520166.tif 000039
【図６Ｓ】
2013520166.tif 000040
【図６Ｔ】
2013520166.tif 000041
【図６Ｕ】
2013520166.tif 000042
【図６Ｖ】
2013520166.tif 000043
【図６Ｗ】
2013520166.tif 000044
【図６Ｘ】
2013520166.tif 000045
【図６Ｙ】
2013520166.tif 000046
【図６Ｚ】
2013520166.tif 000047
【図６ＡＡ】
2013520166.tif 000048
【図６ＢＢ】
2013520166.tif 000049
【図６ＣＣ】
2013520166.tif 000050
【図６ＤＤ】
2013520166.tif 000051
【図６ＥＥ】
2013520166.tif 000052
【図６ＦＦ】
2013520166.tif 000053
【図７Ａ】
2013520166.tif 000054
【図７Ｂ】
2013520166.tif 000055
【図８Ａ】
2013520166.tif 000056
【図８Ｂ】
2013520166.tif 000057
【図８Ｃ】
2013520166.tif 000058
【図８Ｄ】
2013520166.tif 000059
【図８Ｅ】
2013520166.tif 000060
【図８Ｆ】
2013520166.tif 000061
【図８Ｇ】
2013520166.tif 000062
【図８Ｈ】
2013520166.tif 000063
【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
2013520166.tif 000070
【図８Ｐ】
2013520166.tif 000071
【図８Ｑ】
2013520166.tif 000072
【図８Ｒ】
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【図８Ｓ】
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【図８Ｔ】
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【図８Ｕ】
2013520166.tif 000076
【図８Ｖ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2013520166000001.app
【国際調査報告】
2013520166.tif 000083
2013520166.tif 000084
2013520166.tif 000085
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