(57)【要約】  本方法は、増幅に必要な異なる温度を通過する循環フローチップ溶液中での増幅および特異的捕捉分子からなるマイクロアレイ上でのリアルタイムな検出によって、可能性がある他の標的に混じって生体試料中に存在する少なくとも１つのポリヌクレオチド標的化合物を同定および／または定量化するための方法に関する。
2013539654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するための方法であって、
ａ）
−０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、
−流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体および前記透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４つ超含むマイクロアレイを有し、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有し、比率Ｖ２／Ｖ１は０．００１から０．５の間にある検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域は流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域は検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域
を含むフローチップデバイスを用意するステップ、
ｂ）体積がＶ３であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）は０．０２より大きく１未満であるステップ、
ｃ）溶液を少なくとも５回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、１回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルは３分未満で実施されるステップ、
ｄ）光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも３回、好ましくは少なくとも５回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるタイミングにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、
ｅ）限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および／または定量するステップ
を含む方法。
【請求項２】
増幅サイクルが２分未満、好ましくは１分未満に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出チャンバーが楕円形、卵形、菱形、六角形、八角形、ダイヤモンド形から選択される形状を有する、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
体積Ｖ１＋Ｖ２＋Ｖ３が気相および液相である２つの相を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
比率Ｖ２／Ｖ１が０．０１から０．１の間にある、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）が０．５超、好ましくは０．７５超、さらには０．９超であり１未満である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
蛍光シグナルを測定するための増幅の異なるタイミングが増幅サイクルに対応している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
増幅サイクルがフローチップセンサーのデータ分析によって決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増幅サイクルがフローチップデバイスの特徴であるＶ１＋Ｖ２および流速から算出される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
増幅が変性、アニーリングおよび伸長ステップを含むＰＣＲによって得られる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光色素標識された増幅前駆体を組み込むことにより、標識された標的ポリヌクレオチド分子が蛍光標識される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出が、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
捕捉分子が、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、および好ましくは４０ヌクレオチド超の長さの配列である少なくとも６．８ｎｍの長さのスペーサーを有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
マイクロアレイが、サイクル１と比較して増幅サイクル３５においてその蛍光を５０％超、好ましくは８０％超、さらに良くは９０％超保っている蛍光標識された捕捉分子を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルの測定が気相で実施される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子の蛍光シグナルの測定が、標識された標的ポリヌクレオチド分子を含有する増幅溶液の存在下で実施される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
検出チャンバーの検出部分の液体の高さが、好ましくは１０から２５０μｍ、好ましくは５０から１５０μｍを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
流路および／または検出チャンバー内の増幅溶液の位置が流路内の液相位置を時間制御することによってわかる、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
液相の位置が、流路の少なくとも１つの位置において気相／液相変化から得られるシグナルの測定からわかり、前記測定が温度シフト、蛍光シグナル変化、電気シグナル、発光または光吸収変化によって得られる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
累積スポット値が増幅サイクルと共にプロットされて、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子が検出および／または定量化される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化が、固定値（ＣＴ）に到達するのに必要な増幅サイクル数を参照ポリヌクレオチド分子のＣＴと比較することによって得られる、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
シグナル値の分析が、増幅前または最初の１０増幅サイクルのうちの１サイクルで撮影された画像の画素値によって補正された画素値を有するマイクロアレイ画像で実施される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
追跡リアルタイムＰＣＲサイクル用マイクロ流体デバイス内の相変化のアッセイ方法であって、
ａ）
−０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、
−流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化されている少なくとも１つの捕捉分子を含む前記透明な固体支持体を有し、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有する検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域
を含むフローチップデバイスを用意するステップ、
ｂ）液体／空気および／または空気／液体の相変化を検出するためのフローチップセンサー、
ｃ）体積がＶ３であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）が０．０２より大きく１未満であるステップ、
ｄ）溶液を少なくとも５回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、１回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルは３分未満で実施されるステップ、
ｅ）フローチップセンサーのデータを分析することによって増幅サイクルを決定するステップ、
ｆ）光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも３回、好ましくは少なくとも５回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるサイクルにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、
ｇ）増幅サイクルを通じて限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および／または定量するステップ
を含むアッセイ方法。
【請求項２４】
サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するためのフローチップデバイスであって、
−基体内に配置された流路であって、０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有し、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、
−流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の１つに、前記表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有し、比率Ｖ２／Ｖ１は０．００１から０．５の間にある検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域は流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域は検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域、
−流路と流体連通している入口であって、これを通って溶液が流路に導入される入口
を含み、
捕捉分子は屈折率１．３超、厚さ少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは少なくとも３ｍｍを有する光学的に透明な固体支持体の表面（Ｓ１）上に固定化されており、前記固体支持体は、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面に対して傾斜している２つの表面（Ｓ２およびＳ３）を有しており、一方の表面（Ｓ２）は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を集光するために使用され、固体支持体表面と対比して９０から６０°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面（Ｓ３）は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているもしくは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われているフローチップデバイス。
【請求項２５】
基体が不透明なポリマーを含む、請求項２４に記載のフローチップ。
【請求項２６】
サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するための装置であって、
ａ）
−０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように流路が構成されている流路、
−流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の１つに、前記表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有し、比率Ｖ２／Ｖ１は０．００１から０．５の間にある検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域は流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域は検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域
を含むフローチップデバイス、
ｂ）フローチップデバイス用ホルダ、
ｃ）少なくとも２つの異なる温度領域の前の加熱システム、
ｄ）少なくとも２つの異なる温度領域内の温度を調節するために配置された温度制御装置、
ｅ）場合によってフローチップセンサー、
ｆ）照射光源、
ｇ）流路を通して流体を輸送するために作動的に配置されたシステム、
ｈ）ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するための検出器であって、限局部位の発光表面が約０．１ｍｍ２から約７５ｍｍ２からなり、標的ポリヌクレオチド分子がハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出は、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる検出器
を含み、
異なる部品が同じ装置へと集積化され、フローチップデバイスの位置が検出器と比較して固定されている装置。
【請求項２７】
請求項２６に記載の装置であって、捕捉分子が屈折率１．３０超、厚さ少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは少なくとも３ｍｍを有する光学的に透明な固体支持体の表面上に固定化されており、前記固体支持体が、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面（Ｓ１）に対して傾斜している２つの表面（Ｓ２およびＳ３）を有しており、一方の表面（Ｓ２）は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を禁制角度（θｏｂｉｎ）で集光するために使用され、固体支持体表面と対比して９０から６０°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面（Ｓ３）は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われており、デバイスが装置上に置かれて、禁制角度（θｏｂｉｎ）で放射される光が傾斜表面Ｓ２を通して検出器に達している、装置。
【請求項２８】
フローチップセンサーが熱検出器、蛍光検出器または光吸収検出器である、請求項２６から２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２９】
請求項２６から２８のいずれか一項に記載の装置であって、
−異なる測定のデータを格納するための記憶装置、
−照射、検出および記憶のステップを繰り返す制御装置、
−フローチップデバイス内の液体の位置を決定するフローチップセンサーのデータ分析、
−データを処理して、増幅の前に溶液中に存在しているポリヌクレオチド分子の量を検出および／または定量化するためのプログラム
をさらに含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチド分子の迅速な検出および／または定量化を実行するための工程に関する。本発明は、好ましくはＰＣＲによって、溶液中に存在する可能性がある複数の標的ポリヌクレオチド分子を迅速に増幅し、マイクロアレイとフロースルーデバイスを組み合わせてそのような標的を定量的リアルタイム増幅する方法に関する。本方法は、分子生物学における複雑なサンプルの診断用途に良く適している。
【０００２】
本発明は、増幅をリアルタイムに追跡することによる複数の標的の迅速な検出および／または定量化に基づく方法を実行するための簡単で安価なデバイスおよび機器も提供する。
【背景技術】
【０００３】
核酸配列の増幅は様々な増幅反応を使用して実施され、中でも最も優れているのはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、特異的な核酸配列を増幅する方法である。増幅工程がリアルタイムにモニタリングされる場合、ＰＣＲは定量分析に使用される。リアルタイムＰＣＲは通常、インターカレート色素、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、モレキュラービーコンなどの蛍光レポーターを溶液中で使用する。いくつかの核酸標的配列がリアルタイムＰＣＲで分析されようとするとき、２つの手法が提案されている。第１の手法は反応を並列に処理することであり、すなわち各反応を別個の区画で行うことである。第２の手法は反応を多重化する、すなわち反応を同じ区画内で行い各反応に対して異なる蛍光色素レポーターを使用することである。この分析は、効果的に判別される蛍光色素の数に制限されている。現在の最高水準の技術は、同じ溶液中で通常２つ、時には４つ、まれに６つの反応がある。
【０００４】
ＰＣＲの間に増幅されたポリヌクレオチドを検出する捕捉分子の使用が、多重化リアルタイムＰＣＲの第３の選択肢として最近提案されている（ＷＯ２００６／０５３７７０）。本方法は、捕捉分子が固定されている光学ブロック表面の使用に基づいている。サイクル毎の出現を検出し、各標的に対するリアルタイム曲線を描画できるように、光学ブロックは異なるＰＣＲサイクルの間で増幅されたポリヌクレオチドを捕捉する。本方法は、工程の４つのステップ（変性、アニーリング、伸長およびハイブリダイゼーション）を作るために異なる温度で連続的に加熱されるカートリッジを使用する。ＰＣＲ工程と表面ハイブリダイゼーション工程の熱条件は、大きく異なっている。ＰＣＲ増幅は、ｄｓＤＮＡの融解温度を上回るために非常に高い温度（約９５℃）の変性ステップを含む温度サイクルを必要としている。一方、表面ハイブリダイゼーションは核酸の融解点より低い正確な温度で起こる必要があり、最適な実施のためには、捕捉プローブ部位での拡散律速によるアンプリコンの局所的な枯渇を避けるべきである。本方法は、ハイブリダイズしたアンプリコンを検出する異なる方法、共焦点スキャン（ＷＯ０６０５３７７０）、エバネセント場（ＷＯ２００８／０３４８９６）および禁制角度（ＷＯ２００９／０１３２２０）と共に提案されてきた。この方法は、約３時間以上で複数の標的アンプリコンを検出できることを示唆している。
【０００５】
必要な感度、再現性および定量性と同時に完全に自動化され、迅速（例えば１または２時間未満）であり、容易な検出を得るためには、複数の標的に対するリアルタイム増幅方法を改良する必要性がある。
【０００６】
単一または少数の標的のＰＣＲは比較的に速いサイクル回数で記述されてきた。例えば、Ｋｏｐｐら、１９９８（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０、１０４６−１０４８頁）は、変性、アニーリングおよび伸長用の３つの異なる温度領域を数回通過する水路を有するフロースルーＰＣＲ用のチップを提案している。水路は、増幅溶液を注入するための入口および増幅された産物を回収するための出口を有し、次いで増副産物はゲル電気泳動など標準的な方法で分析される。さらに、ＵＳ６，９６０，４３７は、回転式マイクロ流体水路およびこの回転式水路に沿って異なる位置に存在する複数個の温度領域を有するマイクロ流体デバイスについて記載している。マイクロ流体水路は、力が加えられると変形するが、その後に力が除かれると当初の形状に戻るエラストマー材料から製造されている。水路を循環することによって、溶液は３つの増幅ステップを通過し、ＰＣＲが実施される。本特許は優れた増幅を得るための循環デバイスの異なる部分および特徴を記述した。検出は、ＴａｑＭａｎプローブ（実施例３）もしくはＳＹＢＲグリーンのいずれかを使用して溶液中でまたはゲル電気泳動後に実施される。本特許は、増幅された標的の検出を実施するために循環水路内に組み込むことができるマイクロアレイの使用に言及している。しかし、そのようなシステムにおいてマイクロアレイ上で検出を実施する方法についての言及も指標もない。
【０００７】
特許出願ＥＰ−Ａ−２１３８５８７は、３つの温度区域に溶液を連続的に通過させることによって核酸配列を増幅させ、捕捉分子が固定化されたマイクロアレイ上で検出を実施することも提案した。本方法およびデバイスは、ハイブリダイゼーションおよび検出が増幅工程とは独立して調整され得るように、指定されたハイブリダイゼーション区域の中でハイブリダイゼーションおよび検出が実施されるという点を特徴としている。本発明は、これら２つの工程を切り離した最適化を提供している。好ましい実施形態は各サイクルに専用のハイブリダイゼーション区域を有し、異なるサイクルに対して異なる水路部分がある一方向性の非循環型フロースルーである。本特許は、異なる温度区域を通過する水路の異なる構成について記述している。好ましくは、サイクル毎に高速スキャンする必要性を避けるために、ＰＣＲアッセイの最後に所与のサイクルに対応する複数のハイブリダイゼーション区域全面に渡って、単回のスキャンが実施される（所与のサイクルおよび所与のハイブリダイゼーション時間にハイブリダイズしたアンプリコンを含むスポットの静止画像）。１つの結果が一方向性フローデバイスのこの工程に表示されている。本文書は、増幅の間にマイクロアレイ表面に存在している異なる別々の領域に渡って均質にハイブリダイゼーションを実施する方法については言及していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０５３７７０号
【特許文献２】国際公開第０６０５３７７０号
【特許文献３】国際公開第２００８／０３４８９６号
【特許文献４】国際公開第２００９／０１３２２０号
【特許文献５】米国特許第６，９６０，４３７号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第２１３８５８７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｏｐｐら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０、１０４６−１０４８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の要旨）
本方法は、増幅に必要な異なる温度を通過する循環フローチップ溶液中での増幅および特異的捕捉分子からなるマイクロアレイ上でのリアルタイムな検出によって、可能性がある他の標的に混じって生体試料中に存在する少なくとも１つのポリヌクレオチド標的化合物を同定および／または定量化するための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１に詳述したように、本発明はサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施する方法であって、
ａ）
−０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、
−流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体および前記透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４つ超含むマイクロアレイを有し、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有し、比率Ｖ２／Ｖ１が０．００１から０．５の間にある検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域が検出チャンバーを含み標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域
を含むフローチップデバイスを用意するステップ、
ｂ）体積がＶ３であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）が０．０２より大きく１未満であるステップ、
ｃ）溶液を少なくとも５回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、１回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルが３分未満で実施されるステップ、
ｄ）光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも３回、好ましくは少なくとも５回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるタイミングにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、
ｅ）限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および／または定量するステップ
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明は、そのような方法を実施するためのデバイスにも関する。本デバイスは、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するためのフローチップデバイスであって、
−基体内に配置された流路であって、０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有し、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、
−流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の１つに、前記表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有し、比率Ｖ２／Ｖ１が０．００１から０．５の間にある検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域、
−流路と流体連通している入口であって、これを通って溶液が流路に導入される入口
を含み、
捕捉分子が屈折率１．３超、厚さ少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは少なくとも３ｍｍを有する光学的に透明な固体支持体の表面（Ｓ１）上に固定化されており、前記固体支持体は、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面に対して傾斜している２つの表面（Ｓ２およびＳ３）を有しており、一方の表面（Ｓ２）は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を集光するために使用され、固体支持体表面と対比して９０から６０°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面（Ｓ３）は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われているフローチップデバイスである。
【００１３】
本発明は、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するための装置であって、
ａ）
−０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように流路が構成されている流路、
−流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の１つに、前記検出チャンバーの表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有し、比率Ｖ２／Ｖ１が０．００１から０．５の間にある検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路に対応した異なる位置に位置しており、１つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域
を含むフローチップデバイス、
ｂ）フローチップデバイス用ホルダ、
ｃ）少なくとも２つの異なる温度領域の前の加熱システム、
ｄ）少なくとも２つの異なる温度領域内の温度を調節するために配置された温度制御装置、
ｅ）場合によってフローチップセンサー、
ｆ）照射光源、
ｇ）流路を通して流体を輸送するために作動的に配置されたシステム、
ｈ）ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するための検出器であって、限局部位の発光表面が約０．１ｍｍ２から約７５ｍｍ２からなり、標的ポリヌクレオチド分子がハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出が、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる検出器
を含み、
異なる部品が同じ装置へと集積化され、フローチップデバイスの位置が検出器と比較して固定されている装置も保護する。
【００１４】
以下は、ほんの一例として図を参照して与えられる本発明の様々な実施形態の説明である。図は、正確に描画されたものではなく、単に例示的な目的を意図するだけである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】増幅ＰＣＲサイクルを通じてマイクロアレイの対応する捕捉プローブ上で増幅された標的（ＧＵＴ）のハイブリダイゼーションの蛍光シグナルの増加を示すグラフである。実施例１に記載のフローチップデバイスを使用してＰＣＲが実施された。標的は、溶液中に１００コピー存在した。ＰＣＲにおいて２つの対照、陰性捕捉プローブ（バックグラウンド）および標識された捕捉プローブ（陽性検出対照）も付随させた。
【図２】マイクロアレイの対応する捕捉プローブ上のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増幅された標的ＤＮＡの蛍光シグナルの発生を局所的バックグラウンドに対して補正した後にＰＣＲサイクルと共に示すグラフである。実施例２に記載のフローチップデバイスを使用して多重化ＰＣＲが実施された。
【図３ａ】マイクロアレイの対応する捕捉プローブ上のＰ３５の増幅された標的ＤＮＡの蛍光シグナルの発生をＰＣＲサイクルと共に示すグラフである。実施例３に記載のフローチップデバイスを使用してＰＣＲが実施された。図３ａは、異なるＰＣＲサイクルで得られた結合している標的Ｐ３５のシグナルを示している。特に、グラフは所与のスポットの画素の生値および標準偏差ならびにその画素の局所的バックグラウンドに対する生値および標準偏差を示している。
【図３ｂ】マイクロアレイの対応する捕捉プローブ上のＰ３５の増幅された標的ＤＮＡの蛍光シグナルの発生をＰＣＲサイクルと共に示すグラフである。実施例３に記載のフローチップデバイスを使用してＰＣＲが実施された。図３ｂは、（Ｍａｘｉｍ  ＤＬ５ソフトウェアの「ピクセルマス（ｐｉｘｅｌ  ｍａｔｈ）」機能を使用して）サイクル毎に異なる画像がサイクル数３の画像を減算してオフセット１５００を加算することによって補正される場合、スポットのシグナル値および局所的バックグラウンド値ならびにスポットのシグナルおよび局所的バックグラウンドの標準偏差を示している。
【図４ａ】本発明による好ましい集積化フローチップデバイス１を示す概略図である。デバイスの上側は、基体３内に配置されている流路２を含む。流路２は、外部加熱システム（図示せず）によって異なる温度で加熱できるように、互いに分離されている４つの異なる温度領域４（変性用の４ａ、アニーリング／ハイブリダイゼーション用の４ｂおよび４ｃならびに伸長用の４ｄ）を含む。デバイスは、ポンプ５用の開口部および水路と検出チャンバーとを連結する開口部７も含む。
【図４ｂ】デバイス１の底面図を概略的に示す図である。デバイス１は、蠕動ポンプ（図示せず）に水路を接続し、サンプル溶液を導入するための開口部５を含む２つの流路端を含む。流路は、連結開口部７によって検出チャンバー６に接続されている。マイクロアレイ８の捕捉分子は、光学的に透明な固体支持体９の表面上に固定化されている。集積化フローチップデバイスの設計は、実施例４に記載されている。
【図５ａ】本発明による好ましい装置２０を示す概略図である。加熱システム１１、その調節システムおよび流路を通して流体を輸送するために配置されたシステム（ポンプ）を示す機器の拡大図が、図５ｂおよび５ｃに表示されている。装置２０は、フローチップデバイス１用のホルダ１０ならびに上側部分１２ａおよび下側部分１２ｂを含む加熱システム１１を含む。上側部分および下側部分１２ａ、１２ｂは、いくつかの加熱ブロック１３で構成されており、この例示的実施形態においては４つであり、加熱ブロック１３はフローチップデバイス１の異なる温度領域の直前に置かれ、一緒にねじ止めされている。加熱システムの温度は、温度制御装置１４によって調節される。各加熱ブロック１３の温度を個々に調節するために１台の温度制御装置１４がある。フローチップデバイスは、ポンプチューブ１６を通して蠕動ポンプ１５に接続されている。フローチップセンサー２１は、気相から液相への変遷を測定するためにポンプチューブに固定されている。フローチップ機器（Ｆ−ＲＡＰ）も、実施例５に記載されている。
【図５ｂ】本発明による好ましい装置２０を示す概略図である。加熱システム１１、その調節システムおよび流路を通して流体を輸送するために配置されたシステム（ポンプ）を示す機器の拡大図が、図５ｂおよび５ｃに表示されている。装置２０は、フローチップデバイス１用のホルダ１０ならびに上側部分１２ａおよび下側部分１２ｂを含む加熱システム１１を含む。上側部分および下側部分１２ａ、１２ｂは、いくつかの加熱ブロック１３で構成されており、この例示的実施形態においては４つであり、加熱ブロック１３はフローチップデバイス１の異なる温度領域の直前に置かれ、一緒にねじ止めされている。加熱システムの温度は、温度制御装置１４によって調節される。各加熱ブロック１３の温度を個々に調節するために１台の温度制御装置１４がある。フローチップデバイスは、ポンプチューブ１６を通して蠕動ポンプ１５に接続されている。フローチップセンサー２１は、気相から液相への変遷を測定するためにポンプチューブに固定されている。フローチップ機器（Ｆ−ＲＡＰ）も、実施例５に記載されている。
【図５ｃ】本発明による好ましい装置２０を示す概略図である。加熱システム１１、その調節システムおよび流路を通して流体を輸送するために配置されたシステム（ポンプ）を示す機器の拡大図が、図５ｂおよび５ｃに表示されている。装置２０は、フローチップデバイス１用のホルダ１０ならびに上側部分１２ａおよび下側部分１２ｂを含む加熱システム１１を含む。上側部分および下側部分１２ａ、１２ｂは、いくつかの加熱ブロック１３で構成されており、この例示的実施形態においては４つであり、加熱ブロック１３はフローチップデバイス１の異なる温度領域の直前に置かれ、一緒にねじ止めされている。加熱システムの温度は、温度制御装置１４によって調節される。各加熱ブロック１３の温度を個々に調節するために１台の温度制御装置１４がある。フローチップデバイスは、ポンプチューブ１６を通して蠕動ポンプ１５に接続されている。フローチップセンサー２１は、気相から液相への変遷を測定するためにポンプチューブに固定されている。フローチップ機器（Ｆ−ＲＡＰ）も、実施例５に記載されている。
【図６ａ】フローチップデバイス１のホルダ１０の上面を示す概略図である。
【図６ｂ】フローチップデバイス１のホルダ１０の底面を示す概略図である。一旦機器に置かれると、検出チャンバーは光源２２からの光照射ビーム１７を受光する方向に向いている外部光学ブロック９表面、およびマイクロアレイ表面の励起光が光放射１８の禁制角度内で検出されるようにスリットを通して検出器２３に向いている側面を有する。
【図７ａ】本発明による好ましい検出チャンバーを示す概略図である。図７ａは、チャンバーの幾何学的形状の正面を概略的に示す。
【図７ｂ】本発明による好ましい検出チャンバーを示す概略図である。図７ｂは、チャンバーの縦軸に沿って、位置に依って高さが異なるチャンバーの横断面を概略的に示す。
【図７ｃ】本発明による好ましい検出チャンバーを示す概略図である。図７ｃは、チャンバー内の連結開口部７の間の液体流束を概略的に示し、開口部７ａが注入連結開口部を表し、開口部７ｂが出力連結開口部を表し、マイクロアレイが参照番号８で示されている。マイクロアレイ側の液体の流束の方向が参照番号１９によって表示されている。
【図８】集積化流体システム内を一定のアンプリコン濃度の溶液が循環される場合に、サイクルを通じて蓄積する蛍光シグナルの発生を示すグラフである。蛍光シグナルは、局所的バックグラウンドに対して補正されている。フローチップ集積化デバイスの実施形態が図４を参照してならびにフローチップ機器（Ｆ−ＲＡＰ）の実施形態が図５および図６を参照して記載されている。ハイブリダイゼーション緩衝液中で異なる２濃度のアンプリコンＧＵＴおよびアンプリコンＡ．バウマニ（Ａ．Ｂａｕｍａｎｉｉ）がフローデバイスに導入され、その溶液が流路およびＰＣＲに必要な異なる温度領域の間にある検出チャンバーを通して循環された。ハイブリダイゼーションは、各サイクルの後にマイクロアレイ上で確認された。異なる濃度での２つのアンプリコンのシグナルの蓄積が観察された。実験は、実施例６に記載されている。
【図９】マイクロ流体システムにおいて異なるＰＣＲサイクルと一緒にリアルタイム検出するための、本発明による工程の異なるステップを示す一般的なフローチャートである。この一般的なフローチャートは実施例７に規定されるように、リアルタイムＰＣＲ装置がプログラム可能なコンピュータによって制御されている実施形態に対応しており、本発明の本文において説明されている。
【図１０ａ】マイクロアレイの対応する捕捉プローブ上のＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の増幅された標的ＤＮＡの蛍光シグナルの発生を局所的バックグラウンドに対して補正した後にＰＣＲサイクルと共に示すグラフである。図４を参照して論じられる集積化フローチップデバイスならびに図５および図６を参照して論じられるフローチップ機器（Ｆ−ＲＡＰ）を使用して、多重化ＰＣＲが実施された。実験は、実施例７に記載されている。
【図１０ｂ】熱電対プローブを使用する増幅サイクルの計数の表示を示す図である。矢印は、蛍光シグナルの測定が実施されるサイクルを指し示している。サイクル２１から、シグナル検出がサイクル毎に実施された。
【図１１】マイクロアレイの対応する捕捉プローブ上のＨ．インフルエンザエの増幅された標的ＤＮＡの蛍光シグナルの発生に対するＰＣＲ溶液の体積の効果を、局所的バックグラウンドに対して補正した後にＰＣＲサイクルと共に示すグラフである。図４を参照して論じられる集積化フローチップデバイスならびに図５および図６を参照して論じられるフローチップ機器（Ｆ−ＲＡＰ）を使用して、多重化ＰＣＲが実施された。検出チャンバーを含めたフローデバイスの全体積は２４０μＬであった。実験は、実施例８に記載されている。
【図１２】フローチップデバイス１の好ましい検出チャンバー６の横断面を示す図である。この検出チャンバーは２つの部品を（例えば溶接によって）接続することによって形成され、図４ａおよび図４ｂに示すように、一方の部品は上側に刻まれた流路を持つ好ましくは黒色の部品であり、底側に空洞を有し、他方の部品は空洞を密閉する光学的に透明な固体支持体（ブロック）である（図６ｂを参照のこと）。図１２は、底部が光学的に透明な固体支持体９である形成された検出チャンバー６を示している。マイクロアレイ８の捕捉分子は、固体支持体の表面Ｓ１上に固定化されている。表面Ｓ４は、光源２２からの光照射ビーム１７を受光する方向に向いている。表面Ｓ２はマイクロアレイの励起光が光放射１８の禁制角度内で検出されるように検出器２３に向いている。固体支持体の表面Ｓ３は黒色である、または黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われており、表面Ｓ２と向かい合っている。チャンバーの上側部分は、検出チャンバー６と流路２との流体接続を可能にする連結開口部７を含む（図示せず）。開口部７および流路２は、カバー２４によってデバイスの外側から隔離されており、カバー２４は薄膜でよく、好ましくはデバイス上で加熱密閉できる透明な薄膜である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される用語と同じ意味を有する。
【００１７】
用語「ヌクレオチド配列、マイクロアレイ、標的（および捕捉）ヌクレオチド配列、実質的な結合、特異的にハイブリダイズする、バックグラウンド、定量化する」は、ＷＯ  ９７／２７３１７に記載の通りであり、その特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
用語「ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチド、プライマー配列」は欧州特許出願ＥＰ１０９６０２４に記載されているものであり、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
用語「遺伝子」は、遺伝の基本的な物理的および機能的単位を意味し、世代から世代へと情報を伝える特異的な機能産物をコードしている染色体上の特異部位に位置するＤＮＡ断片である。ＤＮＡ断片は、転写される領域（コードＤＮＡの前後領域およびエクソン間のイントロン）および転写を可能にする調節配列から構成される。
【００２０】
用語「座位」は、遺伝子配列上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の位置を意味する。
【００２１】
「相同配列」は、対応する位置で、純粋にランダムな整列より高い同一ヌクレオチドのパーセンテージを有するヌクレオチド配列を意味する。比較しようとする２つの配列の一方における付加または欠失（ギャップなど）を考慮して配列が最適に整列された後に、全ヌクレオチドと比較して位置毎に見つかる同一ヌクレオチドのパーセンテージとして定義される相同性（または配列同一性）を２つの配列がその間で最低限示すとき、２つの配列は相同であると見なされる。相同配列はその配列の１箇所だけ、数か所または部分もしくは全長に渡って相同である可能性があるので、相同性（または配列同一性）の程度は大きく変化し得る。１塩基だけが異なるヌクレオチド配列は、相同性の高い配列であり、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と称される。両方の配列において同一である配列の箇所または部分は、保存されていると言われる。保存された三次元構造を示すタンパク質ドメインは、通常相同配列によっておよびさらに多くの場合固有のエクソンによってコードされている。それらの配列において高い不変性を示す配列は、高度に保存されていると言われ、それらは高い相同性を示す。
【００２２】
配列の整列方法は、コンピュータ化された局所的相同性アルゴリズムに基づいており、例えば（これらに限定されないが）Ｃｌｕｓｔａｌ（登録商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＧＡＰ（登録商標）、ＢＥＳＴＦＩＴ（登録商標）、ＦＡＳＴＡ（登録商標）およびＴＦＡＳＴＡ（登録商標）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）またはＢｏｘｓｈａｄｅ（登録商標）として利用可能である。
【００２３】
用語「共通配列」は、検討しようとするいくつかの相同配列を整列した後に決定される配列である（比較され、整列された、相同配列において位置毎に最も共通に見出される塩基として算出される）。
【００２４】
共通配列は、比較された全配列からできるだけ近い一種の「平均」配列を表す。高い相同配列の場合、または共通配列が十分に長く反応条件が厳しすぎない場合、共通配列は全ての相同配列に結合することができる。これは、共通プライマーと呼ばれる同じプライマーを用いる相同配列の増幅に特に有用である。実験的に、上記のプログラムから算出される共通配列は、そのような特性を得るために適合され得る。
【００２５】
「マイクロアレイおよびアレイ」は、単一の捕捉プローブまたは捕捉プローブ種が固定化されて、所与の特異的標的、好ましくはタンパク質または核酸を結合できる固体支持体を意味する。マイクロアレイは、これらに限定されないが、ピンもしくはピンとリングなどを表面に接触させる物理的手段によって、または圧電性もしくはナノディスペンサーなどの方法で溶液の微小液滴を放出することによってなされる基体上での捕捉分子の堆積で優先的に得られる。別法として、基体上での捕捉分子のインサイチュ合成は、所定の位置でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを合成する光空間的分解能を持つ本発明の実施形態の１つであり、例えば、ＵＳ−Ｐ−５，７４４，３０５およびＵＳ−Ｐ−６，３４６，４１３によって提供されている。マイクロアレイは、固体支持体の表面上もしくは内部または固体支持体を覆っている基体上の所与の位置に堆積された捕捉プローブのスポットで選択的に構成されている。しかし、捕捉プローブは様々な形態で固体支持体上に存在でき、スポットに限定されない。好ましくは、捕捉プローブが付着されている固体表面上のスポットの空間分布は、これに限定されないが例えば正方形、長方形またはさらに単列のスポットのような幾何学的な整列である。マイクロアレイの適用のある特定の形態は、１ウェルに１つまたはいくつかの異なる捕捉プローブを有し、同じ支持体の部分であるウェル内の捕捉プローブの存在である。都合の良いことに、異なる支持体が特異的捕捉プローブを含有し互いに区別される限り、マイクロアレイの捕捉プローブも異なる支持体上に形成されて、特異的標的配列の定量化が可能になる。特定の特徴を有し互いに認識され得るビーズの混合物を使用することによってこれが達成されて、結合した分子が定量化される。
【００２６】
用語「捕捉分子」は、所与のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはタンパク質もしくはそれらのファミリーに特異的に結合可能な分子に関する。好ましくは、ポリヌクレオチド結合は、一方が固定化された捕捉プローブまたは捕捉配列であり、他方が検出されようとする標的分子（配列）である２つのポリヌクレオチドの、塩基対合によって得られる。
【００２７】
用語「入射角」は、表面上の入射方向と表面に対して垂直な線、法線と呼ばれる、との入射位置での角度を表す。本発明において、放射光が支持体を通過して検出されるので、入射角は支持体の中（内部）と見なされる。
【００２８】
本発明において用語「臨界角」は、支持体において固体支持体表面に対する法線と対比する度で与えられ、θｃ＝ｓｉｎ−１（ｎ２／ｎ１）によって定義される角度であり、ｎ１は固体支持体の屈折率でありｎ２は外側の屈折率である。本発明において、好ましくは、ｎ２は水溶液（ｎ２約１．３３）である。臨界角は、支持体において全内部反射が起こる入射角の値である。臨界角は同じ方法で算出され、ラジアンで表示され得る。
【００２９】
用語「観察角」（θｏｂｉｎ）は、支持体内の放射光の観察に使用される角度であり、標的分子を有する固体支持体表面に対する支持体内の法線と対比して表現される。
【００３０】
用語「θｏｂｏｕｔ」は、透明な光学ブロックの側面の法線と対比して支持体の外側に位置する検出デバイスに対する観察角である。
【００３１】
本発明の「禁制角度」は、臨界角と所与の溶液が呈する放射光に相当する波長の光線に対して９０°の角度の間にあり、所与の支持体を通して検出される角度である。
【００３２】
用語「エバネセント波結合」または「エバネセント結合」は、エバネセント（または減衰）電磁場を用いて、電磁波がある媒体から別の媒体に伝達される工程である。
【００３３】
一般的な意味において、用語「エバネセント場」または「エバネセント波」は、入射光源によって照射される全内部反射界面の向こう側または遠位側に発生され指数的に減衰する電磁場のことを指す。エバネセント波は、全内部反射される入射光の波長のエネルギーと同じ励起エネルギーを与える。このエネルギーは、全内部反射が起こる表面上で固定された分子を励起させる（誘導されたエバネセント）。エバネセント場は、界面の遠位表面から比較的短い距離にしか有意なエネルギーを伝播しない（例えば、ほぼその波長の長さ程度）。
【００３４】
用語「放射されたエバネセント」または「逆エバネセント」は、誘導されたエバネセントの逆、すなわち全反射している表面の向こう側（支持体の外側）に非常に近い（１波長または数波長以内）物体から放射される光が手前側（支持体内部）に伝達される工程である。
【００３５】
用語「光学的に透明な支持体」は、非常に低い吸収で、光線の均一性に欠陥を起こすこと無く導光する特徴を有する支持体を意味している。好ましくは、「光学的に透明な支持体」は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の光を透過させる支持体を意味している。典型的な光学上透明な支持体は、高品質ガラスまたはＺｅｏｎｅｘもしくはＴｏｐａｓなどの材料で作られている。
【００３６】
蛍光標識には、増幅産物に組み込まれている蛍光標識されたヌクレオチドが含まれる。これは、蛍光標識された核酸プライマーまたは標識されたデオキシリボヌクレオチドのいずれかを使用して達成される。蛍光標識には、ＳＹＢＲグリーンのようなインターカレート蛍光色素も含まれる。
【００３７】
用語「リアルタイムＰＣＲ」は、ＰＣＲサイクルの間にアンプリコンの存在を検出および／または定量化できる方法を意味している。リアルタイムＰＣＲにおいて、アンプリコンの存在は増幅サイクルの少なくとも１つにおいて検出および／または定量される。ＰＣＲサイクルの間に形成されるアンプリコンまたはアンプリコンの量と相関したシグナルの増加は、ＰＣＲ溶液中の所与のヌクレオチド配列の検出および／または定量化に使用される。
【００３８】
本発明において用語「アンプリコン」は、酵素的な核酸増幅の産物である標的ポリヌクレオチド分子のコピーに関する。
【００３９】
「生物学的標的分子」は、生物学的工程に関わる分子を意味している。標的分子は核酸に限定される。
【００４０】
本発明は、完全にオートメーション化されている完結したデバイスにおける複数のポリヌクレオチドの迅速なリアルタイム増幅ならびに直結した検出および／または定量化の完全な解決策を提案している。本発明は、一緒に動作するシステムの異なる部分に規格を与えることによっておよび固定化された捕捉分子を有する検出チャンバーの特異的な特徴によって問題を解決した。本発明は、異なる特徴および制御を含むデバイスに適合された機器において、そのようなデバイスでアッセイを実施するための特定のパラメータを用いて最良に実施される。そのような機器は、アッセイに必要な測定およびデータ分析および／または溶液中に存在する標的の定量化を組み込んでいる適切なソフトウェアによって制御されている。
【００４１】
本方法およびデバイスは、可能性がある複数の標的の検出用である。可能性があるとは、複数の標的がサンプル中に存在するときに、アッセイがそれらを検出できることを意味している。しかし、最も一般的な状況において、所与のサンプル中にはこれら標的の１つだけまたは限られた数しか存在しない。本方法およびデバイスは、標的が所与のサンプル中に存在する場合、１個、より良くは少なくとも４個、さらにより良くは１０個超の異なる標的を検出する。
【００４２】
典型的な３５サイクルの増幅／検出実験が１０５分以内、さらには７０分以内、さらに良くは３５分以内に実施されるように、増幅の１サイクルが３分未満、好ましくは２分未満、さらには１分未満に実施される非常に迅速な方法で全体のアッセイが実施される。増幅された標的を検出するためのハイブリダイゼーションの時間はきわめて短く、好ましくは１サイクルにつき１分未満、またはさらには３０秒未満、またはより良くは２０秒未満なので、そのような複合アッセイにおけるアッセイの速度は予想外であった。通常、その時間は約２秒以上、好ましくは５秒以上である。実施例４に例証されているように、約２４０μＬの容量を有するフローデバイスの場合、マイクロアレイ検出チャンバー内を５０μＬの溶液が通過する時間は、１サイクルにつき約１６秒間である。マイクロアレイの典型的なハイブリダイゼーション時間は、静的マイクロアレイにおいて標準的なプロトコールで１４−１６時間のように、通常数時間より長い。（Ｉｄｅｋｅｒら、２００２年、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗａｓｈｉｎｇ、「ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ｄ．ＢｏｗｔｅｌｌおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２２８−２３９頁）。マイクロアレイのハイブリダイゼーション速度とシグナル強度の両方を、静的ハイブリダイゼーションと比較して改善するカオス的混合器に基づく動的なハイブリダイゼーションによって、反応は増強される（ＭｃＱｕａｉｎら、２００４、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２５、２１５−２２６頁）。しかし動的ハイブリダイゼーションを用いても、必要な時間は１時間以上であり、フロースルーアッセイにおいてはほぼ５−２０分程度である（Ｍｏｃａｎｕら、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３８０、８４−９０頁）。この特徴は、複数の捕捉プローブを持つマイクロアレイを使用することによって複数の標的がリアルタイムに増幅／検出される利点を持ち、溶液中で検出しながら実施される迅速なＰＣＲに対する本アッセイの競争力を高める。これは、本発明の完全な解決策の一部として提案されてきた全体的な特徴によるものである。
【００４３】
短い反応時間に関する１つの特徴は、マイクロアレイがフローシステムの一部なので、溶液の全てがサイクル毎に同じマイクロアレイ上を通過するという事実である。また好ましくは検出チャンバーの体積は限定されており、好ましくは、１μＬから１ｍＬ、好ましくは１から２０μＬ、さらに良くは１から１０μＬからなる体積の溶液を含有するように構成されている。好ましくは、反応チャンバーの高さは１ｍｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である。検出チャンバーの検出部分の液体の高さは、好ましくは、１０から２５０μｍ、好ましくは５０から１５０μｍからなる。また、フローデバイスの異なる固体部分は所与の温度に保たれている。限られた体積の溶液だけがサイクルを通じて加熱および冷却され、迅速な増幅サイクルがもたらされる。
【００４４】
短いハイブリダイゼーション時間は、小さな溶液体積で動作することになる予想外の利点を有する。小さな体積は熱容量が低いので、異なる増幅ステップに必要な要求温度にしたがってある領域から他へ移動する際に、容易に加熱または冷却される。また、小さな体積によりサンプルから取り出される標的を濃縮溶液にすることができ、したがって本方法の感度が高まる。大量にサンプルを希釈すると、ハイブリダイゼーション時間が増加することになるが、本明細書で上述した通りこれは必要とされていない。
【００４５】
本発明の別の利点は、検出が連続工程へと完全に集積化されているという事実である。先行技術に記載されている段階的ＰＣＲ／マイクロアレイに関しては、デバイスの取り扱いおよび時間を必要とするハイブリダイゼーションの特別な別個のステップは存在しない。
【００４６】
本方法により、溶液と捕捉分子とが接触するサイクル毎にマイクロアレイにハイブリダイズされる標的を蓄積できる。予想外なことに、ハイブリダイズした標的は、かなり高いハイブリダイゼーション温度でも、液相を取り除き捕捉プローブを気相中にしてもまた、その捕捉分子に対して安定である。捕捉分子はまた、溶液無しでかなり高い温度の状態を保った後でも、依然として次のサイクルで非常に効率的な方法で標的を固定できる。本発明の１つの特徴は、複数の増幅サイクルが共通のマイクロアレイ表面を共有するので、増幅サイクルを通じて特異的なスポットにハイブリダイズしたアンプリコンが蓄積することである。マイクロアレイの所与の別々の領域（スポット）に存在する特異的な捕捉分子に対する所与の標的アンプリコンの特異的なハイブリダイゼーションに有利に働くような方法で、温度および溶液組成が選択される。所与のポリヌクレオチド配列が別のポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーションするのに有利に働くまたは不利に働く溶液組成の効果には、溶液の厳しさまたは尿素もしくは界面活性剤など特異的な化合物の存在が含まれる。
【００４７】
連続したサイクルの間にハイブリダイゼーションさせるがハイブリダイズしたアンプリコンを除去させないように条件が最良に選択されて、特異的なスポットにハイブリダイズしたアンプリコンが蓄積され、それにより本方法の検出感度が高まる。この特徴は、溶液と捕捉分子との接触が非常に短くても本方法を特に高感度にする。
【００４８】
解決されるＰＣＲに関連する別の問題点は、変性ステップにおいて高温で加熱している間の泡の形成および流体工程の異なる相の温度の変動による圧力変化である。好ましくは、本発明において全体システムは２つの相、好ましくは液相および気相で存在する。泡は、形成された場合、ほとんど気相に入り、液相に干渉せず、その結果全スポットを均質にハイブリダイゼーションできる。また、高温での液体膨張による圧力の増加は、気相の存在により打ち消される。
【００４９】
この好ましい実施形態において、溶液の位置もしくは存在またはその流れもしくは液相／気相の移行相を検出するためのチップセンサーを備え、それによって溶液の存在下または気相のいずれかでアレイを検出するためのタイミングを制御できることにより、本発明は経時的に位置が変化する２つの相を有する流体の不均一性の問題も解決する。センサーシグナルが分析されて、液体の存在もしくは運動または流れと関連した変化が検出され、好ましくは溶液の前部または終端部の流れおよび／または通過の間の移行相が検出される。好ましくは、検出チャンバー内に液体が存在するタイミングは、フローチップ上のセンサーの位置、シグナルが変化するタイミングおよび液体の流速を含めた異なるパラメータの分析から導き出される。液体の体積を使用して、液体が検出チャンバー内に存在する継続時間を決定する。紫外線光による流路の照射下にＤＮＡの吸光度を使用して流れの速度を決定する例が、ＧＢ２４３３２５９に表示されている。
【００５０】
また、センサー位置での液体の通過と関連付けて時間と共に記録しているセンサー内の変動数を決定することによって、センサーはサイクル数を計数できる。好ましくは、液相から気相への移行相の数がサイクル数に対応する。必要に応じて、まず標準化されるデータ処理によって算出に補正が導入される。サイクルを計数することにより、リアルタイム増幅および／または定量化の１要件である、スポット値と増幅サイクルとの関係を得ることができる。好ましくは、標的検出に対応するスポットの値を増幅サイクルの関数として表現することによって、標的の定量化が実施される。
【００５１】
好ましい実施形態において、溶液に由来するバックグラウンドシグナルを下げることができるので、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子の蛍光シグナルの測定は気相で実施される。代替的な実施形態において、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子の蛍光シグナルの測定は、標識された標的ポリヌクレオチド分子を含有する増幅溶液の存在下で実施される。均質な相を有する溶液の存在下でのハイブリダイズした標的のアッセイは、限局部位に対する比較シグナルを与える。好ましくは、検出は均質な溶液相の存在下で実施される。
【００５２】
増幅の間に標的に組み込まれるまたはそれに結合する多量の蛍光色素標識を含有する溶液の存在下でも、サイクル中に増幅された標的を検出できることは別の予想外の結果であった。
【００５３】
本発明の予想外の結果の１つは、非常に高いプローブ安定性である。この安定性は図１に例証されており、かなりの退色をもたらす様々な連続照射に供された場合でも、検出対照スポットのシグナルは、サイクルを通じて非常に安定である。本方法は、この特徴に基づいている先行技術（ＲＡＰ技術）と明らかに区別した。検出対照の安定性は、工程を通じた捕捉分子の安定性の明らかな指標であり、異なる捕捉分子上で得られたシグナルの定量的な比較分析の正当性を示している。
【００５４】
マイクロアレイの特異的な問題の１つは、捕捉分子が固定化された全スポットまたは限局部位が工程の全ステップにおいて同じ方法で処理されて、その結果がマイクロアレイの異なる位置に存在している異なる捕捉分子と関連しなければならないという事実である。本発明は、マイクロアレイ上の液体の連続的な通過に関連する問題を解決する。好ましくは増幅サイクル毎に、全スポットおよび各サイクルに対して同じハイブリダイゼーション時間になるように、液体が同じ時間で異なる限局部位と接触された。好ましくは、マイクロアレイ表面の異なる位置に位置している複製スポットから得られるシグナルの標準偏差は、試験値の２０％未満、さらには１０％未満である。
【００５５】
マイクロアレイの最良の表面分解能を得るために、好ましくは、検出器に対する光学ブロックの位置が一旦作られる（その位置は、毎月のように時々；またはより多くの変動が予想される場合、フローチップ毎に一度またはその間にいつでも点検されてよい）。好ましくは、捕捉分子を有する光学ブロックの厚さは、少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは１ｍｍ、より好ましくは３ｍｍ以上、さらには約５ｍｍ以上である。本発明は、光学ブロックを厚いものにでき、それにより禁制角度での検出を薄いブロックより容易にできるという予測外の優位性を有する。これにより、検出チャンバーの固定温度を得ることができる。一般に、厚さは２０ｍｍ未満、好ましくは１０ｍｍ未満になる。
【００５６】
想定されなかった別の特徴は、異なる捕捉分子を有する限局部位で覆われている検出される表面と比較した検出システムの位置安定性である。この物理的安定性によって、サイクルを通じて同じ幾何学的形状を有する互いに完全に重ね合わされるマイクロアレイ表面の画像がもたらされ、その結果スポットは同じ位置に存在し、異なる画像が容易に比較および分析される。好ましい実施形態の１つにおいて、マイクロアレイ画像のグリッド化が最初に撮影された画像上で一旦実施され、次いで完全に比較されるように、同じグリッドが以後の画像に使用される。これにより、同じ実験の異なる画像に対する異なるグリッド化およびデータ比較における難点を避けることができる。また、画像は画素位置の複雑な補正なしに、容易に重ね合わされるまたは減算される。
【００５７】
本発明の副次的特徴は、液体が閉鎖系である流路およびマイクロアレイを通って循環することである。閉鎖系は、周辺環境における増幅産物の汚染を防ぎ、さらなるアッセイに対する汚染を避ける利点を有する。一旦アッセイが行われると、全デバイスが機器から取り外され、したがって開けずに廃棄される。しかし、必要に応じて、対照またはアッセイの確認のためのように、捕捉分子にハイブリダイズした標的の存在のさらなる読み取りが実施される。
【００５８】
チャンバーおよび流束
デバイスおよび方法の具体的な実施形態において、検出チャンバーは、楕円形、卵形、菱形、六角形、八角形、ダイヤモンド形から選択される形状を有する。チャンバーは、マイクロアレイ上に液体フローの均質な配分を生み出すために、構成されている。チャンバーの設計に際して、液体の流入がマイクロアレイ表面上に均一に分配され、気相が検出チャンバーを通過する間にいかなる液体もチャンバー内に残らないように液体の流出もチャンバーから均一に取り除かれるために、特にチャンバーの幾何学的形状は液体の流束、チャンバーの高さおよびその幅／長さ比を考慮する。チャンバーは、チャンバーの主な方向と比較するマイクロ水路内の液体の角度、液体の流速、チャンバーの高さおよびチャンバー表面の親水性／疎水性を考慮して構成されている。チャンバー表面が高親水性であるとき、溶液は気泡を発生すること無く円滑および迅速にチャンバー内へと流入する。親水性／疎水性は、固体表面上の溶液−気体界面の接触角によって最も良く測定される。マイクロアレイを担持している検出チャンバーの表面は、好ましくは１００°未満、より良くは８０°未満、さらに良くは６０°未満の接触角を有する。
【００５９】
チャンバーの好ましい幾何学的形状は、図７ａに表示されている。好ましくは図７ｂに例示されているように、所与のチャンバー、特定の疎水性を有するマイクロアレイ表面および所与の流速の場合、チャンバーの幅および液体の高さが調整されて、チャンバーの幅に沿って均一に分配された液体／気体正面が得られる。好ましい実施形態において、チャンバー内部の流入方向は、チャンバー縱軸と対比して０°が最良であり、チャンバーの両側は液体流束と比較して対称である。なお好ましい実施形態において、図７ｃに概説した通りチャンバーの注入部分が調整された高さを有して、チャンバー内部の断面と同じ断面を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、検出チャンバーは、コイル形状または直鎖状のいずれかの水路様形態を有する。この具体的な実施形態において、マイクロアレイは水路内部にスポットされている直鎖状アレイである。
【００６１】
好ましくは、溶液がチャンバーに入るとき、全ての限局部位が同じ時間溶液によって覆われている。また好ましくは、各限局部位上の液体のフローは、ある限局部位と他の部位とで同一であるまたは２０％超まで、より良くは１０％までしか変わらない。複製スポット値の再現性は、フローチャンバー内の液体の均質な分配を制御するための最良の方法である。好ましくは、複製スポット値は、増幅のサイクルを通じて２０％超変化しない、より良くは１０％しか変化しない。具体的な実施形態において、検出チャンバー内のフローは層流であり、フローのレイノルズ数は層流と乱流とを区別する固定値より低い。より正確には、レイノルズ数は約２３００未満である。
【００６２】
さらに別の実施形態において、フローチップデバイスは２０μＬから２ｍＬからなる体積の溶液を含有するように構成されている。
【００６３】
流路を通して溶液を繰り返し輸送することによって、溶液の循環が得られる。
【００６４】
増幅溶液は、フローチップデバイスの温度領域の間を一方向性または双方向性で輸送される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、増幅溶液は、循環方式（一方向性）（図４）または往復方式（双方向性）で温度領域の間を転送される。
【００６６】
水路を通して溶液を輸送するための様々な手段が存在する。輸送は、例えば加圧による能動輸送もしくは例えば拡散による受動輸送のいずれかまたは毛管力によって駆動される輸送である。したがって、増幅溶液が温度領域を通過するとき、これは領域を通しての能動的ならびに受動的な輸送を含意している。例えば輸送が対流または拡散などの物理的な効果だけに基づく場合、この文脈における輸送システムとは、例えばフローチップデバイスに本質的に備わっている受動システムである。
【００６７】
マイクロ流体デバイスにおける能動輸送は、流体輸送の２つの方式、圧力駆動フローまたは動電学的駆動フローの一方を利用している。
【００６８】
動電学的輸送とは、電気浸透と電気泳動的輸送の組合せのことを指す。電気浸透とは、外部から印加された電界によって静止固体表面を通り過ぎる水溶液のバルク運動のことを指す。電気浸透は、固液界面に荷電二重層が存在する必要がある。
【００６９】
電気泳動とは、印加電界の作用下で流体中に浸っている荷電表面の運動を表す。
【００７０】
好ましくは、ポンプの動作、圧縮素子、磁気ビーズなどの使用またはその組合せを含むがこれらに限定されない、圧力駆動フローを使用して流路を通して溶液を繰り返し輸送することによって、フローチップデバイス内に溶液の循環が得られる。
【００７１】
好ましくは、ポンプは１から５００ｒｐｍからなる回転数を有する蠕動ポンプである。好ましくは、流路内の液体フローの速度は、６μＬ／分から３０００μＬ／分、好ましくは５０から５００μＬ／分である。なお具体的な実施形態において、液体フローの速度は、実験のタイミングおよびフローデバイス内の液体の位置にしたがって変化する。液体フローを調整して液体と領域との所与の接触時間を得て、ＰＣＲのための変性、アニーリングおよび伸長温度ステップである増幅工程に最適な所与の温度タイミングを調整する。
【００７２】
具体的な実施形態において、液体フローは増幅の特定のサイクルで所与の時間、フローデバイスの特定の領域内に停止する。ＰＣＲにおいて、液体は最初のサイクルにおいて変性領域内に所与の時間停止して、最初のアニーリングステップを開始するのに必要なゲノムＤＮＡの適切な変性を得る。なお具体的な実施形態において、検出チャンバーはアニーリング領域と同じ温度であり、そしてＰＣＲサイクルのアニーリングステップの一部と見なされる。
【００７３】
好ましくは、増幅溶液と接触しているフローチップの表面はブロッキング試薬でコートされて、標的ＤＮＡおよびＰＣＲ試薬（プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ）に対する表面の親和性が減少される。
【００７４】
好ましくは、ブロッキング試薬は、Ｔｗｅｅｎ系表面活性物質（ポリソルベート、ソルビタンエステル、ポリ（オキシ−１，２エタンジイル）誘導体、Ｔｗｅｅｎ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル、（オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、４−オクチルフェノールポリエトキシレート、Ｍｏｎｏ３０、ＴＸ−１００、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、オクトキシノール−９）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および血清アルブミン（ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたはＢＳＡ）からなる群から選択される。
【００７５】
Ｔｗｅｅｎ系表面活性物質（ポリソルベート、ソルビタンエステル、ポリ（オキシ−１，２エタンジイル）誘導体、Ｔｗｅｅｎ）は、ソルビトールのヒドロキシルおよびソルビトールから得られるヘキシトロール無水物（ヘキシタンおよびヘキシド）にポリオキシエチレン鎖を付加し、次いでラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸などの一般的な脂肪酸を用いて部分的にエステル化することによって、六価のアルコール類、アルキレンオキサイドおよび脂肪酸から得られる複合エステルおよびエステル−エーテルからなる水溶性非イオン性ポリマー界面活性剤である。
【００７６】
一実施形態において、Ｔｗｅｅｎ系表面活性物質は、１つまたは複数のＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０またはＴｗｅｅｎ８０から選択され、またポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０として製薬業界に公知である。ポリソルベート２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレン化ソルビタン）はラウリン酸エステルであり、ポリソルベート６０（モノステアリン酸ポリオキシエチレン化ソルビタン）はステアリン酸エステルおよびパルミチン酸エステルの混合物であり、ポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン化ソルビタン）はオレイン酸エステルである。そのようなＴｗｅｅｎ系表面活性物質は市販されており、および／または当該技術分野において公知の技術によって調製される。
【００７７】
好ましい実施形態において、Ｔｗｅｅｎ系表面活性物質は、モノラウリン酸ポリオキシエチレン化ソルビタン（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）である。
【００７８】
好ましくは、ブロッキング試薬の濃度は０．０１から２％からなる。好ましくは、コーティングはこれに制限されないが、コーティング剤としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのタンパク質が０．０１％から０．０５％の範囲の濃度で使用される。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような高分子量分子も、コーティング剤として０．０５％から２％の範囲の濃度で使用される。約０．１％の濃度で使用されるとき、Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００のような界面活性剤がコーティング効果を有する。
【００７９】
好ましい実施形態において、ブロッキング試薬はポリヌクレオチド分子増幅用試薬の一部であり、前記ブロッキング試薬は好ましくはＴｗｅｅｎ系表面活性物質、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＥＧおよび血清アルブミンからなる群から選択される。
【００８０】
別法として、ブロッキング試薬を用いるプレコーティングが増幅前に実施される。ブロッキング溶液は、フローチップデバイスの流路および反応チャンバーを通して循環される。一実施形態において、溶液と接触しているフローチップの表面は、増幅前にＴｗｅｅｎ系表面活性物質、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＥＧおよび血清アルブミンからなる群から選択されるブロッキング試薬を用いて１から９０分間プレコートされる。さらに他の実施形態において、流路およびフローチップはフローチップ製造業者によって前処理されてよく、フローチップは既製品で供給されることができる。
【００８１】
具体的な実施形態において、本発明は追跡リアルタイムＰＣＲサイクル用マイクロ流体デバイス内の相変化のアッセイ方法であって、
ａ）
−０．０１から１０ｍｍ２からなる断面および体積Ｖ１を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、
−流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化された少なくとも１つの捕捉分子を含む前記透明な固体支持体を有し、高さ１ｍｍ未満および体積Ｖ２を有する検出チャンバー、
−温度が調節されている少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、１つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域
を含むフローチップデバイスを用意するステップ、
ｂ）液体／空気および／または空気／液体の相変化を検出するためのフローチップセンサー、
ｃ）体積がＶ３であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、（デバイス内に溶液に加えて空気が存在するように）比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）が０．０２より大きく１未満であるステップ、
ｄ）溶液を少なくとも５回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、１回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルが３分未満で実施されるステップ、
ｅ）フローチップセンサーのデータを分析することによって増幅サイクルを決定するステップ、
ｆ）光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも３回、好ましくは少なくとも５回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるサイクルにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、
ｇ）増幅サイクルを通じて限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および／または定量するステップ
を含む方法を包含する。
【００８２】
特定の適用は、検出チャンバー内のマイクロアレイも含み、前記マイクロアレイは固体支持体の表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を４個超、好ましくは２０個超含む。
【００８３】
好ましくは、増幅溶液は、流路内に気相および液相の２つの相を備えている。具体的な実施形態において、フローシステムの２つの相は、増幅の水性溶液および油相によって構成されている。好ましくは、比率Ｖ２／Ｖ１は０．００１から０．５、より良くは０．０１から０．１からなる。
【００８４】
予想外なことに、図１１に提示されている通りフローチップデバイスが増幅溶液（Ｖ３）でほぼ完全に満たされたとき、小さい体積を使用したときと比較して、標的アンプリコンはより初期のサイクルで検出された。好ましくは、たとえ非常に小さくても、密閉デバイス内に気相は残した。気相が存在することにより、あるサイクルとその他とで液体を物理的に分離することができ、サイクル毎に移行相を検出するセンサーを用いて増幅サイクルを容易に計数できる。
【００８５】
好ましい実施形態において、比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）は０．５超、好ましくは０．７５超、さらには０．９超であり１未満である。好ましくは、１未満の比率Ｖ３／（Ｖ１＋Ｖ２）とは０．９９９未満、好ましくは０．９９未満、例えば０．９５以下などを意味している。
【００８６】
好ましい実施形態において、液体フローは始めから終わりまで一定であり、流路および／または検出チャンバー内の増幅溶液（液相）の位置は流路内の液相位置を時間制御することによってわかる。好ましくは、液相の位置は、流路の少なくとも１つの位置において気相／液相変化から得られるシグナルの測定からわかり、前記測定は温度シフト、蛍光シグナル変化、電気シグナル、発光または光吸収変化によって得られる。
【００８７】
増幅
本方法およびデバイスの具体的な実施形態において、溶液が温度領域を通って輸送されるとき、試薬が標的ポリヌクレオチド分子と接触するように、ポリヌクレオチドの分子増幅に必要な試薬の少なくとも１つが、流路および／または検出チャンバー内に固定化されている。
【００８８】
本発明による方法において使用される増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）を含むがこれに限定されない周知の増幅プロトコールによって有利に得られる。増幅方法は、２つの種類、熱サイクル法（ＰＣＲ、ＬＣＲ）と等温法（ＣＰＴ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、３ＳＲ、ＨＤＡ）にさらに分けられる。また、これら増幅法の変形の適用、例えば逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、非対称ＰＣＲまたはホットスタートＰＣＲも、本発明の方法によってまたは本発明によるデバイス／装置において実施される。
【００８９】
好ましくは、増幅はＰＣＲによって実施され、増幅溶液はＤＮＡポリメラーゼおよび標的ポリヌクレオチド分子に実質的に相補的なプライマーを含む。
【００９０】
好ましい実施形態において、増幅は変性、アニーリングおよび伸長ステップを含むＰＣＲによって得られる。
【００９１】
好ましくは、増幅サイクルに溶液を付するステップの前に、溶液は１分超、好ましくは２分超、さらには４分超の変性ステップに付される。
【００９２】
好ましくは、増幅サイクルは４つの異なる温度ステップ、変性、アニーリング、ハイブリダイゼーションおよび伸長を必要とする。
【００９３】
他の実施形態において、増幅サイクルは３つの温度ステップ、変性、アニーリング／ハイブリダイゼーションおよび伸長を含む。この実施形態において、アニーリングステップはハイブリダイゼーションステップと同じ温度で実施される。好ましくは、アニーリングステップは検出チャンバー内で実施され、アニーリングおよびハイブリダイゼーションステップは同じ温度領域で実施される。
【００９４】
さらに具体的な実施形態において、増幅サイクルは２つの温度ステップ、変性およびアニーリング／ハイブリダイゼーション／伸長を含む。この具体的な実施形態において、アニーリングおよび伸長ステップは、ハイブリダイゼーションステップと同じ温度で実施される。好ましくは、アニーリングおよび伸長ステップは検出チャンバー内で実施され、アニーリング、伸長およびハイブリダイゼーションステップは、同じ温度領域で実施される。
【００９５】
好ましくは、ポリヌクレオチド分子増幅用の試薬は、プライマー、ｄＮＴＰ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液を含む。好ましくは、標識された標的を形成するために、プライマーおよび／またはｄＮＴＰは、蛍光色素標識された増幅前駆体を含む。
【００９６】
好ましくは、蛍光色素標識された増幅前駆体を組み込むことにより、（増幅された）標識された標的ポリヌクレオチド分子が蛍光標識される。好ましくは、増幅前駆体の蛍光色素には、Ａｌｅｘａ誘導体、アミノクマリン、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ７、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、パシフィック  ブルー、パシフィックオレンジ、フィコエリトリン誘導体、シアニン誘導体、アクリジン誘導体またはクマリン誘導体が含まれる。
【００９７】
他の実施形態において、二重らせんの中にインターカレート色素を組み込むことによって、（増幅される）標識される標的ポリヌクレオチド分子が蛍光標識され、蛍光の増加がもたらされる。この具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド分子増幅用の試薬は、好ましくはＳＹＢＲグリーン、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、ＳＹＴＯＸブルーからなる群から選択されるインターカレート蛍光色素を含む。
【００９８】
好ましい実施形態において、標的ポリヌクレオチド分子（生物または生物の一部に特異的なヌクレオチド配列）はＤＮＡヌクレオチド配列である。
【００９９】
代替的な実施形態において、標的ポリヌクレオチド分子は、ＰＣＲの前にｃＤＮＡに逆転写されるｍＲＮＡである。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明の方法は生物学的生物または生物の一部からその生物に特異的なヌクレオチド配列を抽出するステップを含む。
【０１０１】
緩衝液は、好ましくは陽イオンおよび陰イオンから構成される塩を含み、前記陰イオンは２つのカルボキシル基および１つのアミン基を有し、組成物の塩濃度は、１０ｍＭから４００ｍＭからなり、除外薬剤の重量で１％から２０％からなる。陰イオンは、好ましくはグルタミン酸である。
【０１０２】
好ましくは、ポリヌクレオチド分子増幅用の試薬はホットスタートシステムを含む。
【０１０３】
ホットスタートシステムを得るための１つの具体的な方法は、フローチップデバイス内での少なくとも１つのＰＣＲ試薬の物理的な分離による。別法として、ホットスタートシステムが、ホットスタートＴａｑポリメラーゼを使用して得られる。
【０１０４】
別の実施形態において、２５から３００ｍＭからなる塩濃度で、少なくとも１回のＰＣＲサイクルが、活性がある熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用することを含む。好ましい塩類は、グルタミン酸カリウム、塩化カリウムおよび塩化ナトリウムである。好ましくは、ポリメラーゼ酵素は、サーマスアクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素である。熱安定性とは、１回のＰＣＲサイクル後にまだ初期活性の少なくとも５０％を保持していることを意味する。塩の中で活性がある（２５から３００ｍＭからなる塩濃度で）は、２５ｍＭ未満の塩を含む溶液中での活性と比較して、好ましくは少なくとも５％およびより良くは少なくとも２０％、さらにより良くは少なくとも５０％の活性を示す酵素を意味する。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態において、増幅はテイルドプライマー（ｔａｉｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ）および第２プライマーを用いて実施され、両方とも増幅の最初から存在し、テイルドプライマーのどんな滅失も無い。本方法はテイルドプライマーと第２プライマーを適切な割合で使用する必要があり、前者は後者より多くとも１／５未満、好ましくは１／１０未満である。
【０１０６】
本発明の方法は、マイクロアレイ上で実施される多重化リアルタイムＰＣＲ反応の自動化に完全に適合されている。マイクロアレイ上に存在している固定化された捕捉分子の数により、検出される標的の数は非常に多い。
【０１０７】
一実施形態において、マイクロアレイは１つまたは複数のポリヌクレオチド標的分子の増幅を実施するための試薬と接触している。好ましい実施形態において、溶液中に存在する１から４個の標的ポリヌクレオチド分子、好ましくは１から１０個の標的ポリヌクレオチド分子およびより好ましくは１から２０個の標的ポリヌクレオチド分子が、同じアッセイにおいて増幅、検出および／または定量化される。さらなる実施形態において、好ましくは、溶液中に存在する少なくとも２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらにより好ましくは４つ以上の標的ポリヌクレオチドが同じアッセイにおいて増幅および／または定量化される。別の実施形態において、溶液中に存在する２０から１０００個の標的ポリヌクレオチド分子が同じアッセイにおいて増幅、検出および／または定量化される。
【０１０８】
本発明は、Ｃｐ−Ｇジヌクレオチド中に見られるＤＮＡメチル化、特にシトシン−５ＤＮＡメチル化のアッセイにも良く適合している。具体的なアッセイにおいて、ＤＮＡはまず亜硫酸水素塩で処理されて、非メチル化シトシンがウラシルに転換される。配列の判別は、ＰＣＲ増幅のレベルで完全にマッチしたプライマーとミスマッチプライマーとのアニーリングの差に基づいて進められる（Ｅａｄｓら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８、ｅ３３、参照により組み込まれる、を参照のこと）。別の具体的方法において、シトシンにマッチしているプローブおよびウラシルにマッチしている別のプローブを使用して、アレイ上に固定化されたプローブレベルで判別が得られる。この場合、プライマーは両方の配列を増幅し、マッチしたまたはマッチしないアンプリコンの存在によって、２つのプローブそれぞれに対して異なるシグナル強度を得て判別する。
【０１０９】
本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列中のＳＮＰの判別にも特によく適合されている。具体的な実施形態において、アンプリコン中の変異または欠失の存在の決定は、完全にマッチしたプローブまたはマッチしないプローブのいずれかに固定されているアンプリコンの解離の温度の差に対するアッセイに基づいている。好ましくは、解離温度の差はハイブリダイゼーションチャンバー領域を漸次加熱し、マッチするおよびマッチしないプローブ両方のシグナルを記録することによって得られる。その温度にしたがった解離速度および／またはシグナル値の差は、ミスマッチ配列と比較して完全にマッチした配列の溶液中での存在を指し示すことになる。所与の温度において、完全なマッチとミスマッチシグナルとの間に少なくとも４、より良くは１０、より良くは２０の差異が得られる場合、結論が最も良く得られる。
【０１１０】
マイクロアレイ
好ましくは、本方法およびデバイスによるマイクロアレイは、１ｃｍ２につき４個超の捕捉分子、好ましくは１０個超、２０個超、さらには５０個超を含むマイクロアレイの形態で、固体支持体の限局部位に特異的に固定化された捕捉分子を有する低または中密度マイクロアレイである。
【０１１１】
好ましくは、限局部位の表面は１０μｍ２から１ｍｍ２、好ましくは１μｍ２から１００μｍ２からなる。
好ましくは、マイクロアレイは４から１０００００個の捕捉分子、好ましくは１０個超の捕捉分子、さらにより好ましくは２０個超の捕捉分子を含む。好ましくは、マイクロアレイは、例えば１２、２５、４０、８０または１６０個のように約１０００個以下の捕捉プローブ、より好ましくは２００個以下の捕捉プローブを含有する。
【０１１２】
好ましくは、マイクロアレイの密度は１ｃｍ２につき４から１０００００スポット、好ましくは１ｃｍ２につき１０から１０００スポットからなり、各スポットは１種類の捕捉分子に対する限局部位である。好ましくは、支持体に固定化される捕捉分子の量は、１ｃｍ２につき２０から２０００フェムトモルからなる。
【０１１３】
好ましくは、マイクロアレイの表面は、０．１から１０ｃｍ２、より良くは０．２から４ｃｍ２、さらにより好ましくは０．５から２ｃｍ２の間にある。
【０１１４】
好ましい実施形態において、マイクロアレイは２Ｄ−アレイまたは線形アレイである。
【０１１５】
好ましくは、捕捉分子はスペーサー部分と捕捉部分を有する。捕捉分子の捕捉部分だけがアンプリコンに特異的である。スペーサー部分が固体支持体と捕捉部分との間に位置するように、捕捉分子は固体支持体に固定化されている。好ましくは、捕捉分子の捕捉部分は、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、および好ましくは４０ヌクレオチド超の長さ、より好ましくは少なくとも９０ヌクレオチドの配列である少なくとも６．８ｎｍの長さのスペーサー部分によって固体支持体の表面から分離されており、約２０から約１２０塩基からなる。
【０１１６】
スペーサー部分はヌクレオチド配列がより良く、スペーサー部分の遠位端のヌクレオチドを使用して固体支持体に捕捉分子を結合する。この目的のために、スペーサー部分の遠位端のヌクレオチドはアミノ基を持って提供され、そのアミノ基は、例えば前処理された固体支持体の表面に存在するエポキシ基またはアルデヒド基と共有結合を形成する。
【０１１７】
支持体の表面に捕捉分子を固定化する化学反応は、増幅に必要な温度応力に耐えるように十分安定でなければならない。増幅工程の間または後に支持体上に捕捉分子を保持する割合を制御する手段は、蛍光標識された捕捉分子である陽性検出対照をマイクロアレイに組み込むことになる。
【０１１８】
具体的な実施形態において、マイクロアレイはサイクル１と比較して増幅サイクル３５においてその蛍光を５０％超、好ましくは８０％超、さらに良くは９０％超保っている蛍光標識された捕捉分子（陽性検出対照）を含む。
【０１１９】
好ましくは、捕捉分子の捕捉部分はＰＣＲの間に生み出されるアンプリコンに特異的な１０から１００ヌクレオチド、好ましくは１５から４０ヌクレオチド、より好ましくは２０から３０ヌクレオチドを含有する。好ましくは、捕捉分子の捕捉部分は１０から６００塩基、好ましくは２０から５０塩基、より好ましくは１５から４０塩基からなっている。
【０１２０】
特定の実施形態において、捕捉分子はアンプリコンの特異的配列に相補的な１０から１００ヌクレオチドの捕捉部分を含み、その結果前記捕捉部分はアンプリコンの２つの非相補的な末端および少なくとも２０ヌクレオチドを有するスペーサー部分を定義し、アンプリコンの２つの非相補的な末端はスペーサー末端および非スペーサー末端をそれぞれ含み、その結果スペーサー末端は捕捉分子のスペーサー部分に非相補的であり、前記スペーサー末端は前記非スペーサー末端を少なくとも５０塩基上回っている。
【０１２１】
好ましい実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の同定および／または定量化は、少なくとも２サイクルの増幅工程において１つの位置につき少なくとも２回の測定を用いて、マイクロアレイの異なる位置のシグナルをモニタリングすることによって実施される。その後、データが処理される。
【０１２２】
別の実施形態において、生物に特異的なアンプリコンの捕捉分子に対するハイブリダイゼーションは、予め定められた位置に単一スポットのシグナルを形成し、前記単一スポットのシグナルを検出することにより他の生物由来の他の相同なアンプリコンと特異的アンプリコンとを判別できる。
【０１２３】
標識および検出
ハイブリダイズした標的は、ＰＣＲによる制約に適合する限り、本明細書で以下に表示した方法に限定されないが記載されている一連の方法によって、マイクロアレイで検出される。非標識法がマイクロアレイに適用できると提案されてきており、マイクロアレイに適合された質量分析による標的の同定に基づいている（米国特許第５，８２１，０６０号、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む）。
【０１２４】
標識に関連した検出方法は数多くある。異なる標識分子の総説がＷＯ  ９７／２７３１７に示されており、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む。すでに標識されたプライマーを使用して、またはコピーもしくは増幅ステップの間に標識されたヌクレオチドを酵素的に組み込むことによって、または薬剤をインターカレートしその後蛍光検出することによってそれらは得られる（ＷＯ  ９７／２７３２９、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む）。
【０１２５】
最も多用される標識は、マイクロアレイスキャナ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ）を使用してマイクロアレイを分析するのに適しているＣｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７のような蛍光色素である。マイクロアレイ上で得られた標的固定のシグナルは、蛍光、比色、拡散、電子発光、生物−もしくは化学発光、磁気、インピーダンスもしくはボルタンメトリのような電気、（例えば米国特許第５，３１２，５２７号を参照のこと、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む）または放射性検出を使用して検出される。
【０１２６】
好ましい標識は、蛍光検出器を用いて高感度で検出される蛍光色素である。蛍光色素には、市販のマイクロアレイスキャナ（例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍから入手可能）を使用するマイクロアレイの分析に適しているシアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７）が含まれるが、これに限定されるものではない。好ましくは、Ｃｙ３の励起波長は５５０ｎｍにピークを持つ約５４０から５５８ｎｍであり、発光波長は５７０ｎｍにピークを持つ約５６２から５８０ｎｍである。好ましくは、Ｃｙ５の励起波長は６４９ｎｍにピークを持つ約６３９から６５９ｎｍであり、発光波長は６７０ｎｍにピークを持つ約６６５から６８５ｎｍである。好ましくは、Ｃｙ７の励起波長は７４３ｎｍにピークを持つ約７３３から７５３ｎｍであり、発光波長は７６７ｎｍにピークを持つ約７５７から７７７ｎｍである。
【０１２７】
蛍光色素は、標的のアミン基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有する蛍光色素との反応など化学反応によって標的に組み込まれる可能性もある。本発明における他の有用な蛍光色素には、シアニン色素、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質が含まれる。そのような標識の使用を教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態において、捕捉分子に対するアンプリコンの存在に関連した蛍光シグナルの検出から、溶液中の蛍光と比較してマイクロアレイ上でシグナルの増加が得られる。具体的な実施形態において、溶液中で自由に運動する分子と比較して、マイクロアレイ上に存在する蛍光色素の検出の差は、ＤＮＡ二重らせんとして捕捉分子にハイブリダイズした結合分子に関連する蛍光色素の異方性の差に基づいている。異方性は、検出される蛍光色素の可動性および寿命によって決まる。マイクロアレイ上での異方性のアッセイ方法は現在、Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、２３８  Ｅａｓｔ  Ｃａｒｉｂｂｅａｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．９４０８９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｕｅｓｈｉｆｔｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｄｙｎａｍｉｃｆｌ．ｈｔｍｌ）から入手可能である。
【０１２９】
好ましい検出方法は、表面から放射される蛍光（結合した標的）と溶液中に存在する蛍光（遊離標的）とを判別するための禁制角度の使用に基づいている。
【０１３０】
好ましくは、標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出が、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる。
【０１３１】
好ましい実施形態において、シグナルは、禁制角度内の観察角、前記表面に対する法線と対比して９０°＞θｏｂｉｎ＞ｓｉｎ−１（ｎ２／ｎ１）のようなθｏｂｉｎで検出され、この際、光学的に透明な固体支持体は屈折率ｎ１を有し、屈折率ｎ２を有する溶液と接触しており、その際ｎ１＞ｎ２である。
【０１３２】
好ましくは、観察角は臨界角プラス１０°、好ましくはプラス５°、より好ましくはプラス３°の範囲である。
【０１３３】
表面から放射される蛍光（結合した標的）と溶液中に存在する蛍光（遊離標的）とを判別するための別の具体的検出方法は、エバネセント場である。
【０１３４】
そのような具体的な実施形態において、限局部位から放射される蛍光の検出は、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドを有する表面のエバネセント誘起照射の後にアッセイされる。
【０１３５】
エバネセント場を使用する検出は、例えば米国特許出願公開第１１／５２６，１５９号に記載されている。「エバネセント場」または「エバネセント波」は、一般的に理解される意味で本明細書において使用され、すなわち入射光源によって照射される全内部反射界面の向こう側または遠位側に発生され指数的に減衰する電磁場のことを指す。一般に、エバネセント波の励起エネルギーは、全内部反射される入射光の波長のエネルギーと同じである。通常、エバネセント場は、界面の遠位表面から比較的短い距離にしか有意なエネルギーを伝播しない（例えば、ほぼその波長の長さ程度）。
【０１３６】
好ましくは、例えば照射は固定化された捕捉分子を有する固体支持体の表面で全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）および均質なエバネセント場が得られなければならない。好ましくは、励起光源（１）はエバネセント場を生み出す。好ましくは、エバネセント場は、約６０°から９０°からなる入射角で固体支持体の表面を照射する入射光源によって発生される。エバネセント場は標識されたアンプリコンの標識を励起し、放射されたシグナルは検出器によって検出される。
【０１３７】
表面から放射される蛍光（結合した標的）と溶液中に存在する蛍光（遊離標的）とを判別するための別の代わりの検出方法は、表面上に合焦させた照射および／または検出に基づいている。そのような実施形態において、限局部位から放射される蛍光の検出は、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドを有する表面の焦点を合わせた照射の後にアッセイされる。
【０１３８】
好ましくは、励起はマイクロアレイの表面に合焦させたレーザー光によって得られる。レーザー光の合焦を伴うスキャナ法は、ピンホールを含めた共焦点スキャン法を使用した。そのようなスキャナの多くは、ＰＲＯＳＣＡＮＡＲＲＡＹ（登録商標）ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）Ｌｉｆｅのスキャナ品目、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４２８スキャナ、Ｖｉｒｔｅｋ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｈｉｐｒｅａｄｅｒ品目、などから市販されている。蛍光レーザーに基づくいくつかの検出が、現在マルチウエル形式用として使用可能である、例えばＴｅｃａｎのＳａｆｉｒ（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ｗｗｗ．ｔｅｃａｎ．ｃｏｍ）。それらは、本発明に適合され得る。
【０１３９】
具体的な実施形態において、蛍光色素分子の検出は、時間分解法で好ましくは得られる。蛍光分子は、発光工程と関連した蛍光寿命を有する。通常は、フルオレセインおよびローダミンなどの小さい蛍光色素の寿命は、２−１０ナノ秒の範囲にある。時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイは、長寿命（＞１０００ナノ秒）の蛍光色素を使用して、ほとんどの場合１０ナノ秒よりかなり短い寿命を有するマトリックスの自己蛍光または蛍光サンプルの自己蛍光など、短命な干渉とアッセイシグナルとを判別する。１つの特定の実施形態において、蛍光色素の検出はＰＬＥＸＯＲ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施される。
【０１４０】
好ましくは、蛍光発光の波長の差は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって得られる。１つの特定の実施形態において、プライマーは所与の最適な蛍光発光波長を有し、溶液中で、その励起波長で励起されたときに蛍光ドナーとして機能する蛍光色素（Ｆ１）で標識されている。
【０１４１】
好ましい実施形態において、シグナルを検出するためのデバイスは、不溶性固体支持体の側を照射する光源を含む。Ａｕｒｏｒａ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．（２６７９１  Ｗｅｓｔ  Ｌａｋｅｖｉｅｗ、Ｌａｋｅ  Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ；ｉｎｆｏ＠ａｕｒｏｒａｐｈｏｔｏｎｉｃｓ．ｃｏｍ）によって提案されるように、好ましくは、光源は１対の光ファイバーバンドルによる平行でないレーザー光源または発光ダイオードである。
【０１４２】
蛍光特性を有するナノ結晶の粒子などいくつかの蛍光標識は、特に興味深いものである。最も一般的なものは量子ドット（Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９巻、６３１頁、２００１）である。それらは、蛍光性であり、時間と共にまたは照射で退色しない。それらの安定性は、本発明で提案される連続的観察における使用に特に適している。また、蛍光以外の方法も使用して捕捉分子への付着をモニタリングするように、これらの粒子に特異的な特性を与える金属をそれらは含有する。これら粒子の熱加熱は、時間と共に最も良くモニタリングされるパラメータの１つである。金属が光線、好ましくはレーザー光のエネルギーを吸収し、粒子の加熱を誘導するという事実は支持体上の低密度金粒子を検出する基礎として使用されており、単一粒子ですら検出される（Ｂｏｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７巻、１１６０頁、２００２）。本方法は、光熱干渉コントラストと呼ばれている。
【０１４３】
マイクロアレイの捕捉分子に対する標的分子の結合を検出するための直接的な方法は、非線形周波発生分光法（ＧＦＳ）の光学的工程に基づく化学的地図製作である（Ｌ．Ｄｒｅｅｓｅｎら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ、５巻、１７１９頁、２００４）。この技術により、ミクロン以下の空間的分解能で表面および界面の振動特性をリアルタイムに撮影できる。測定は基体表面で２色のレーザー光を混合することによって得られ、一方は可視光（緑色）の固定周波数を有し、他方は赤外線の可変周波数を有する。サンプルによって放射される光を測定することによって、界面での振動の特徴が赤外線レーザー光の周波数の関数の形で得られる。この方法は検出される標的の標識を回避し、したがって具体的な実施形態を表している。ナノ粒子を直接的に測定する別の技術はレイリー散乱である。本方法は、検出される電磁放射が粒子から得られるように適合された光線を使用して、金属粒子に電子の振動を得ることに基づいている（Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００巻、１１３５０頁、２００３）（光導波路を使用する、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上でのＤＮＡハイブリダイゼーションおよび融解のリアルタイム検出）。しかしこれまで、本方法は生体試料に適用するには必要な感度を欠いている。
【０１４４】
別法として、ラマン散乱および表面プラズモン共鳴は本発明に特に適用される方法であり、これらの技術は抗体／抗原結合の検出に広範に使用されてきたが、マイクロアレイの多パラメータ測定および生体試料に必要な感度にもよく適している（Ｔｈｉｅｌら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６９巻、４９４８頁、１９９７）。別の実施形態において、水晶振動子マイクロバランスが適用され、現在１ナノグラム未満の質量変化を測定するのに十分に高感度である（Ｃａｒｕｓｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６９巻、２０４３頁、１９９７を参照のこと）。これは、リアルタイムにマイクロアレイを検出するための１つの提案である。カンチレバーは、マイクロアレイ上のＤＮＡを検出するための別の選択肢である。（ＭｃＫｅｎｄｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９巻、９７８３頁、２００２）。
【０１４５】
また、別の技術はナノ粒子の電気的検出であり、この技術はそれらの金属特性を考慮している。電気化学的検出がまず適用されたが、低感度であった。より高度でありより高感度な方法は、微分パルスボルタンメトリによる検出である（Ｏｚｓｏｚら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７５巻、２１８１頁、２００３）。金属の抵抗度および静電容量特性は、電子チップ上で検出される最良の特性の１つである。金属の抵抗度および静電容量特性も、電子チップ上で検出される最良の特性の１つである。２本の電極間の金属の存在は、抵抗度および静電容量の変化を誘発することになる。捕捉分子が一方の電極に存在するとき、ＤＮＡまたはタンパク質の検出が次いで観察される（Ｍｏｒｅｎｏ−Ｈａｇｅｌｓｉｅｂら、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ、９８、２６９−２７４頁、２００４）。金標識されたＤＮＡの静電容量アッセイが、Ｇｕｉｄｕｃｃｉら、ＥＳＳＤＥＲＣ  ２００２によって記載されている。電子チップはいくつかの区割で作られ得るので、異なる標的が異なる区割上で検出され、抵抗度または静電容量の変化が記録される。この方法がまだ、生体試料に必要とされる高い信頼性および高感度な検出を生み出せないにせよ、それらの一部はリアルタイム検出の要件を満たすことに成功すると予測されている。マイクロアレイの捕捉分子に対する標的分子の結合を測定するための別の有望な技術は、非線形周波発生分光法（ＧＦＳ）の光学的工程に基づく化学的地図製作である（Ｌ．Ｄｒｅｅｓｅｎら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ、５、１７１９−１７２５頁、２００４）。この技術により、ミクロン以下の空間的分解能で表面および界面の振動特性をリアルタイムに撮影できる。測定は基体表面で２色のレーザー光を混合することによって得られ、一方は可視光（緑色）の固定周波数を有し、他方は赤外線の可変周波数を有する。サンプルによって放射される光を測定することによって、界面での振動の特徴が赤外線レーザー光の周波数の関数の形で得られる。この方法により、標的の標識を回避して検出できる。
【０１４６】
好ましい実施形態において、マイクロアレイの異なる位置上でモニタリングされるシグナルは、比色分析、蛍光、時間分解蛍光、光熱干渉コントラスト、レイリー散乱、ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、質量変化、水晶振動子マイクロバランス、カンチレバー、微分パルスボルタンメトリ、非線形周波発生分光法による化学的地図製作、光学的変化、抵抗度、静電容量、異方性、屈折率および／またはナノ粒子計数からなる群から選択される。
【０１４７】
一実施形態において、いくつかの捕捉分子はポリメラーゼによって伸長され、それと同時に他のいくつかの捕捉分子は熱サイクルの間に溶液中に蓄積する増幅産物とハイブリダイズされる。一実施形態において、伸長した捕捉分子は変性の温度ステップの間に検出される。別の実施形態において、伸長した捕捉分子およびその捕捉分子に結合している標識ヌクレオチド分子の両方が、アニーリングおよび／または伸長の温度ステップの間に検出される。
【０１４８】
さらに別の実施形態において、捕捉分子は蛍光消光物質または蛍光アクセプター、および蛍光ドナーの両方を有する。捕捉分子への干渉により消光物質または蛍光アクセプターが放出され、支持体上で蛍光ドナーが検出およびまたは定量化される。好ましくは、消光物質のそのような放出は酵素活性の結果として起こる。好ましくは、酵素は二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡに特異的であり、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、制限酵素、３’，５’エキソヌクレアーゼ、５’，３’エキソヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅＨの活性を有する酵素を含むが、これらに限定されない。好ましくは、酵素は６０℃で、より良くは８０℃で、さらにより良くは９４℃で安定である。
【０１４９】
特定の実施形態において、捕捉分子に対する消光効果は消光物質と蛍光ドナーとの間の短い距離によって得られる。消光物質と蛍光剤が近位で維持されるなら別だが、好ましくは捕捉分子はヘアピンを含む。好ましい実施形態において、消光物質は直径１．４ｎｍの金ナノ粒子であり、蛍光色素はフルオレセイン、ローダミン６Ｇ、テキサスレッドまたはＣｙ５である。好ましくは、消光物質は捕捉プローブの自由末端に位置し、蛍光色素は支持体に固定化された捕捉分子の末端または末端の近くに位置している。
【０１５０】
本発明により、異なる一本鎖捕捉ポリヌクレオチド配列が結合しているマイクロアレイを使用して、捕捉配列と標的配列とが結合した結果得られる単一のシグナルを決定することによって多形性の存在を同定でき、標的配列は鋳型として標的配列を使用して３’５’の方向にその３’末端ヌクレオチドの向こうに少なくとも１つ捕捉配列のヌクレオチドを延長し、前記延長は重合剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で実施され、延長された捕捉配列に組み込まれた少なくとも１つのヌクレオチドは検出可能に修飾されたヌクレオチドである。
【０１５１】
１つの好ましい支持体は、化学的および熱的な安定性、低い蛍光ならびに光学的安定性を有するポリマー、好ましくはＺｅｏｎｅｘ（登録商標）もしくはＺｅｏｎｏｒ（登録商標）（Ｚｅｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）などのシクロ−オレフィンポリマー、またはこれらに限定されないが、Ｔｏｐａｓ、Ｕｄｅｌ、ＲａｄｅｌもしくはＴＨＶを含む。
【０１５２】
データ分析および定量化
分析
好ましい実施形態において、本方法は、増幅の異なるタイミングにマイクロアレイの異なる限局部位において限局部位当たり少なくとも５回測定されるシグナルを、少なくとも５サイクル、好ましくは少なくとも１０サイクルの異なる増幅サイクル、より好ましくは少なくとも２０サイクルの異なる増幅サイクルにおいてモニタリングすることによって実施される。その後データは処理される。特定の実施形態において、工程は２０サイクル超の異なる増幅サイクルを含み、および／または測定は最初の２０増幅サイクルの間は実施されない。好ましい実施形態において、蛍光シグナルを測定するための増幅の異なるタイミングは増幅サイクルに対応している。
【０１５３】
好ましくは、増幅サイクルは、フローチップセンサーのデータ分析によって決定される。センサーシグナルが分析されて、液体の存在もしくは運動または流れと関連した変化が検出され、好ましくは溶液の前部または終端部の流れおよび／または通過の間の移行相が検出される。
【０１５４】
センサー位置での液体の通過と関連付けて時間と共にセンサーによって記録される変動数を決定することによって、センサーはサイクル数を計数できる。好ましくは、液相から気相への移行相の数がサイクル数に対応する。サイクルを計数することにより、リアルタイム増幅および／または定量化の１要件である、スポット値と増幅サイクルとの関係を得ることができる。
【０１５５】
別法として、フローチップデバイス内に気相が無い場合、増幅サイクルはフローチップデバイスの特徴であるＶ１＋Ｖ２および流速から算出される。サイクル継続時間は、溶液が流路および検出チャンバーを通って循環を完了するための時間である。
【０１５６】
増幅サイクルの継続時間は、デバイスＶ１＋Ｖ２（Ｖ１は流路の体積、Ｖ２は検出チャンバーの体積）の特徴にしたがって決定または算出され、その特徴は流路断面およびカートリッジの異なる温度領域内部の流路長ならびに検出チャンバー（Ｖ２）の体積によって主に決まっている。フローデバイス内の流速はポンプ速度またはデバイス内に液体の流れを作るために使用される他のシステムに依存している。好ましくは、標準化工程の一部として所与の作業条件における流速および／または１サイクルを実施するための時間を決定し、その後実験する。
【０１５７】
代わりの実施形態において、シグナルは増幅サイクル当たり少なくとも２回の測定を実施することによって経時的にモニタリングされる。別の実施形態において、増幅は、少なくとも５、より良くは１０、さらに良くは２０増幅サイクルを使用して得られ、各サイクルは変性、アニーリングおよび伸長からなる３つのステップを含み、各サイクルは、３分以内、好ましくは２分以内、さらには１分以内に実施される。
【０１５８】
別の実施形態において、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルの測定は、各限局部位に対するバックグラウンドシグナルの測定および各限局部位に対する蛍光シグナルからのバックグラウンドシグナルの減算をさらに含む。好ましくは、バックグラウンドシグナルは、捕捉分子が結合している限局部位の周りの局所的バックグラウンドである。好ましくは、ｄｅ  Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、２００２、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６４、１３７−１４９頁）によって記載の通り、スポットの定量化および／またはデータ分析が実施される。
【０１５９】
好ましい実施形態において、シグナル値の分析は、増幅前または最初の１０増幅サイクルのうちの１サイクルで撮影された画像（参照画像）の画素値によって補正された画素値を有するマイクロアレイ画像で実施される。好ましくは、画像補正後のシグナル／バックグラウンド比は、２、好ましくは５、さらには１０倍に高められる。好都合なことに、画像補正後のバックグラウンドシグナルは、６５０００階調のグレースケールで５００未満、さらには２００未満である。また利点として、スポットの局所的バックグラウンド内の画素値の標準偏差は、画像補正後には多くとも１／２未満、さらには１／５未満である。参照画像は、所与のデバイスのマイクロアレイ画像であり、その画像は検出対照またはハイブリダイゼーション対照のような全ての参照スポットを含むが、標的に関連するスポットは陰性であり、ブランクと見なされている。標的スポットは、実験の開始前または増幅標的の濃度がまだ低くすぎてスポットのシグナルを得られない数サイクルにおいて陰性である。好ましくは、最初のサイクルはサイクル１であり、サイクル５まではまだサイクルの１つであり、サイクル１０まではまだサイクルの１つである。具体的な実施形態において、参照とはいくつかの画像の合計または平均のような、最初の数サイクルに由来するデータの結果である。試験画像に対して参照画像を減算することにより、具体的な実験においてデバイスから生じた欠損およびほとんどの非特異的シグナルを補正できる。好ましくは、グリッド化は初期のサイクルの画像によって画像を補正した後に実施される。好ましくは、検出器と比較したマイクロアレイ表面の位置は、所与の実験に必要な各画像の間一定に保たれている。また好ましくは、画像のグリッド化調整は一度だけ実施され、１回の実験の間、特定のデバイスで撮影される各画像に対して同じグリッド化パラメータが使用される。次いでデバイスの位置が検出器の位置と比較して固定される。
【０１６０】
さらに好ましい実施形態において、シグナル値の分析がマイクロアレイ上で実施され、増幅サイクルｎのマイクロアレイ画像の画素値が増幅サイクルｎ−１のマイクロアレイ画像の画素値に加算される。好ましくは、分析は連続したサイクルの画像から生じるデータで実施される。好ましい実施形態において、異なる画像の画素値が加算され、得られた累積スポット値は溶液中の所与の標的の状況に対する測定と見なされる。好ましい実施形態において、累積スポット値が増幅サイクルと共にプロットされて、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子が検出および／または定量化される。好ましくは、累積スポット値は増幅サイクルと共にプロットされ、ならびに／またはカットオフ（Ｃｔ）値の決定および標的の定量化に使用される。
【０１６１】
標的の定量化
定量化は、マイクロアレイのハイブリダイゼーション収量および検出尺度（標的および参照配列に対して同一である）だけでなく、抽出、増幅（またはコピー）および標識ステップも考慮に入れなければならない。
【０１６２】
好ましい実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、（異なる位置の）シグナル値を固定値と比較することによって得られる。
【０１６３】
別の実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、固定値（ＣＴ）に到達するのに必要な増幅サイクル数を参照ポリヌクレオチド分子のＣＴと比較することによって得られ、好ましくは参照ポリヌクレオチド分子は同じ溶液中で増幅され、標的ポリヌクレオチド分子と同じマイクロアレイ上で検出されるポリヌクレオチド分子である。別法として、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、固定値（ＣＴ）に到達するのに必要な増幅サイクル数を標準曲線と比較することによって得られ、ＣＴ値が標準濃度に対してプロットされている。
【０１６４】
別の他の実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、少なくとも２サイクルの増幅サイクルのシグナルの速度定数を比較することによって得られる。
【０１６５】
別の実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のコピー数の定量化は、標的ポリヌクレオチド分子のシグナル値を、既知のコピー数で予め定められた数の標準ポリヌクレオチド分子を増幅溶液に添加して得られるシグナル値と比較することによって得られる。好都合なことに、標準ポリヌクレオチド分子は、初発生体試料にまたは抽出ステップの後に添加され、同じプライマーを用いて増幅またはコピーされ、ならびに／または標的ポリヌクレオチド分子と同一の長さおよびＧＣ含有量もしくは２０％以下しか異ならない長さおよびＧＣ含有量を有する。
【０１６６】
好ましくは、標準ポリヌクレオチド分子のハイブリダイゼーション収量（その特異的捕捉分子に対する）は、標的ポリヌクレオチド分子のハイブリダイゼーション収量と同一、または２０％以下異ならない。具体的には、標準ポリヌクレオチド分子は、文書ＷＯ  ９８／１１２５３（その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む）に見られる内部標準の特性を有する競合内部標準として設計されている。そのような標準の使用に基づく定量化は、ＷＯ  ９８／１１２５３にも記載されている。
【０１６７】
前記標準ポリヌクレオチド分子、外部および／または内部標準はおそらく、本発明による異なるステップを実施するために必要な全ての媒体および手段（ハイブリダイゼーションおよび培地、ポリメラーゼおよび他の酵素、標準配列、標識分子など）と一緒に本発明によるキットに含まれても有利である。
【０１６８】
デバイスおよびキット
好ましくは、本発明による工程は、本発明の方法を実施するための手段および媒体を含む、生物学的生物または生物の一部を特異的に同定する（診断および／または定量化）キットを使用して実施される。具体的には、好ましいキットは、本発明の方法によるフローチップデバイス、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液を含めた増幅用試薬を含む。プライマーおよび／またはｄＮＴＰは、増幅された産物を標識するために、蛍光色素で標識された増幅前駆体を含む。
【０１６９】
特に好ましい実施形態において、デバイスは独立して加熱される分離された４つの領域を含む。１つの領域は８５から１００℃、好ましくは９５℃から９９℃の温度でＰＣＲの変性ステップに専用であり、第２領域は３７℃から７０℃、好ましくは５０℃から６５℃の温度でアニーリングステップに専用であり、第３領域は６０℃から８０℃、好ましくは６８℃から７５℃の温度で伸長ステップに使用されている。第４領域は、他の３領域のうちの１つのサイズを変えるためにどんな温度でも加熱される領域である。薄い流路はデバイスの４つの領域を通過し、この水路は１ｍｍ２、好ましくは０．２５ｍｍ２の断面および各領域に特異的な長さを有する。流路の全体積は、２ｍＬから２０μＬ、好ましくは３００μＬから１００μＬである。好ましくは、水路のサイズは、第１領域において全流路サイズの約５−４０％、好ましくは１０−３０％など例えば約２５％であり、第２領域において約１０−６０％、好ましくは２０−５０％など例えば約３５％であり、第３領域において約１０−５０％、好ましくは約１５−４０％など例えば約２５％であり、第４領域において０％から約４０％、好ましくは０％から３０％など例えば約１５％である。第２領域も水路に接続されている検出チャンバーを含有する。この検出チャンバーはスポットされているマイクロアレイを含有する。
【０１７０】
好ましくは、流路が配置されている基体は、不透明なポリマーを含む。
【０１７１】
好ましくは、照射および発光光によって交差される表面を除く検出チャンバーの全ての側面は黒色である、または黒色に色付けされている。
【０１７２】
具体的な実施形態において、溶液と接触しているフローチップデバイスの表面は、シクロオレフィンまたはエラストメリックポリマーにある。好ましくは、シクロオレフィンポリマーは、Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）もしくはＺｅｏｎｏｒ（登録商標）（Ｚｅｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）、Ｔｏｐａｓ、Ｕｄｅｌ、ＲａｄｅｌまたはＴＨＶから選択される。
【０１７３】
さらに別の具体的な実施形態において、検出チャンバーを含む温度領域の表面は温度領域の全表面の少なくとも４０％である。
【０１７４】
キットの好ましい実施形態において、捕捉部分の特異的な配列の長さは、約１０から６００塩基、好ましくは１５から５０塩基、より好ましくは１５から４０塩基からなる。キットの好ましい実施形態において、捕捉分子の特異的な配列（捕捉部分）は、その対応する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、少なくとも６．８ｎｍのスペーサー部分によって固体支持体の表面から分離されている１５から５０塩基の配列を有する。キットの別の実施形態において、スペーサー部分は２０塩基超、好ましくは４０塩基超、より好ましくは９０塩基超のヌクレオチド配列である。
【０１７５】
スポッティング溶液中に約６００から約３，０００ｎＭの捕捉分子濃度が好ましい。しかし、好ましい状況（共有結合固定の収量が高いときまたは検出される標的が一本鎖であり高濃度で存在するとき）では、約１００ｎＭの低濃度でもまだ陽性結果が得られる。そのような低いスポッティング濃度は、１ｃｍ２につき２０フェムトモルの低い捕捉分子密度に相当する。一方、より高密度は、捕捉溶液の濃度によってアッセイが制限されるだけだった。３，０００ｎＭより高い濃度は、優れた結果を与える。
【０１７６】
本発明によるキットにおいて、捕捉分子は、不溶性固体支持体上の１μｍ２から７５ｍｍ２、好ましくは０．００５から０．２ｍｍ２の表面部位を有する限局部位内に存在する。
【０１７７】
好ましい実施形態において、マイクロアレイは１ｃｍ２につき少なくとも２０、好ましくは５０、さらには１００個超の限局部位を含有する。好ましくは、マイクロアレイは約１０００個の限局部位またはより少ない限局部位を含有することになる。マイクロアレイは固体支持体の少なくとも０．１、より良くは１、さらに良くは少なくとも４ｃｍ２の表面を覆っている。一般に、マイクロアレイは約１０ｃｍ２の表面領域またはより少ない表面領域を覆っている。
【０１７８】
具体的な実施形態において、支持体および／またはチャンバー材料はガラス、電子デバイス、シリコン支持体、プラスチック製支持体、シリカ、金属およびその混合物からなる群から選択され、前記支持体は準備されたスライド、ディスク、ゲル層およびマイクロビーズからなる群から選択される形式で準備される。なお特定の実施形態において、支持体および／またはチャンバー材料は、シクロオレフィンポリマー、好ましくはＺｅｏｎｅｘ（登録商標）もしくはＺｅｏｎｏｒ（登録商標）（Ｚｅｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）、Ｔｏｐａｓ、Ｕｄｅｌ、ＲａｄｅｌまたはＴＨＶを含む。
【０１７９】
好ましくは、フローチップデバイスは使い捨てデバイスである。好ましくは、温度制御装置および調整装置、例えば加熱器および／または冷却器は、そのようなデバイス、特に使い捨てデバイスの一部でない。他の実施形態において、加熱器または冷却器はデバイスの一部である。具体的な実施形態において、デバイスは、例えば増幅溶液を調製する（すなわちサンプルを調製する）ための追加的な区画を含む。
【０１８０】
また好ましくは、液体輸送システムまたは輸送システムの一部（例えばポンプ）は、使い捨てデバイスの一部でない。いくつかの実施形態において、液体輸送システムはデバイス内に含まれる。好ましくは、検出チャンバーの温度領域の構造または様式は、温度制御および調整システムの加熱器および／または冷却器の構造または様式に反映されている。また好ましくは、デバイスは熱伝導および／または断熱表面の様式を有する。
【０１８１】
装置
好ましい実施形態において、本発明の方法を実施するための装置は、流路を通して液体を輸送し、デバイス内部に溶液の循環を作るために作動的に配置されたシステムを含む。好ましくは、このシステムは、ポンプ、圧縮素子、磁気ビーズなどまたはその組合せを含む。
【０１８２】
なお好ましい実施形態において、流路内の液体フローの速度は６μＬ／分から３０００μＬ／分、好ましくは５０から５００μＬ／分からなる。
【０１８３】
好ましい実施形態において、装置は、好ましくは熱検出器、蛍光検出器または光吸収検出器であるフローチップセンサーを含む。
【０１８４】
好ましくは、フローチップセンサーはフローデバイス上に固定され、温度、光学密度、光散乱、蛍光、屈折率および電気抵抗を含むがこれらに限らない物理的なパラメータを記録できるセンサーである。
【０１８５】
センサーシグナルが装置によって分析されて、液体の存在または運動と関連した変化が検出され、好ましくは溶液の頭部の流れおよび／または通過の間の移行相が検出される。好ましくは、検出チャンバー内に液体が存在するタイミングは、フローチップ上のセンサーの位置、シグナルが変化するタイミングおよび液体の流速を含めた異なるパラメータの分析から導き出される。液体の体積を使用して、液体が検出チャンバー内に存在する継続時間を決定する。紫外線光による流路の照射下にＤＮＡの吸光度を使用して流れの速度を決定する例が、ＧＢ２４３３２５９に表示されている。好ましくは、サイクル数は、センサー位置での液体の通過と関連付けて時間と共に記録しているセンサー内の変動数を計数することから得られる。
【０１８６】
なお具体的な実施形態において、フローデバイス内の液体の位置は、アッセイのタイミングおよびデバイス内の液体フローの速度から算出される。流束の速度は、デバイス内のフロー位置を算出するために領域の温度に対して時間および距離に照らして補正される。
【０１８７】
好ましい実施形態において、フローチップデバイスの異なる温度領域は、好ましくは空気層を含む二重分離によって互いに分離されている。
【０１８８】
好ましくは、加熱システムはペルティエデバイス、抵抗加熱器、熱交換器および酸化薄インジウム素子からなる群から選択される。好ましくは、増幅ステップの異なる領域は、領域の両側、一方はフローチップ領域の下側に他方は上側に位置する加熱工程によって囲まれている。検出チャンバーは、チャンバーの一方の側によって最も良く加熱され、他方の側はマイクロアレイの照射のために開けられている。具体的な実施形態において、アニーリング領域は検出チャンバーと同じであり、検出用として光照射ビームをマイクロアレイに到達させるという方法でアニーリング領域を覆っている加熱器素子の一方が切り取られている。具体的な実施形態において、単一の温度制御装置が全ての温度領域の温度を調節している。代替的な実施形態において、温度制御装置が複数個の温度制御装置の１つであり、各温度制御装置が１つの温度領域の温度を別々に調節している。温度制御装置は、変性、アニーリングおよび伸長ステップを含むＰＣＲを得るために少なくとも２つの異なる温度領域に温度を調節できる。
【０１８９】
好ましくは、加熱システムは、以下の妥当な構成部分の最も単純な変形で構成されている：熱電対、伝達物質、変換器および加熱器。加熱システムは、デバイスの各温度領域で実質的に一定の温度を発生して、正確に増幅および／またはハイブリダイゼーションできることを目指している。各温度領域において発生した温度は、増幅工程の間実質的に一定に保たれている。熱電対は、加熱される領域のできるだけ近くに定着し、伝達物質を考えた温度を測定する。この温度情報は、変換器を経てコンピュータに出力される。ソフトウェアは、毎秒など通常の間隔で測定された実際の温度を、最終利用者によって要求された設定温度と比較する。測定された温度が要求された温度より高い場合、単に加熱器が止められる。測定された温度が設定点より低い場合、システムは加熱工程を続ける。
【０１９０】
好ましくは、加熱冷却システムにより、１℃未満、より好ましくは０．２５℃未満の温度変動にできる。好ましくは、検出チャンバーの表面上の熱の均一性は、少なくとも１℃好ましくは少なくとも０．１℃である。好ましくは、温度の精度は０．５℃より良く、好ましくは０．１℃より良い。
【０１９１】
加熱システムに加えて、検出は、結合している標識された標的ポリヌクレオチド分子からのシグナルを測定するための照射光源および検出器を必要とする。好ましくは、光源は光線を発生して、反応チャンバーの平面に結合された結合している標識された標的を励起する。検出は、分析されるマイクロアレイによって覆われている全表面上で同じ検出効率を得るような方法で安定させなければならない。この文脈において使用される典型的な検出器は、マイクロアレイ全体の写真を撮影できるＣＣＤカメラである。
【０１９２】
好ましい別の実施形態において、光学的システムの分解能は、０．１ミクロンから５００ミクロン、より好ましくは１０から１００ミクロンである。
【０１９３】
好ましい実施形態において、励起光は好ましくは６３５ｎｍ±５ｎｍの波長を有する（赤色）レーザーダイオードである。レーザーダイオードは、例えば１０から３５℃からなる温度で作動し、１０から２０００ｍＷの出力を有するＰｅａｒｌ（商標）２Ｗ  ６３９ｎｍである。歪を減らすために、好ましくは、レーザーは低温発光成分を有する。好ましくは、照射はマイクロアレイの下側から来る。好ましくはまた、レーザー光は固定されている捕捉分子を有する平面に対して垂直（＋／−１０°）である。好ましくは、レーザー光と平面との間に鏡が設置されて、直線ビーム長が減じられる。
【０１９４】
好ましくは、非特異的な励起と発光との重なりを避けるために、スペクトル線幅は最大５ｎｍ、さらには３ｎｍである。好ましくは、光線はマイクロアレイの全表面、好ましくは例えば２０×１０ｍｍの表面を均一に照射する。照射の均一性は、全表面の少なくとも９５％に渡り、さらには少なくとも９８％に渡るべきである。さらに別の実施形態において、レーザーがマイクロアレイ表面をスキャンする。
【０１９５】
近似ガウスプロファイルは、空間フィルタもしくは単一モード光ファイバーとのカップリングによって、または別法としてＤＰＳＳなどの固体レーザーを使用して得られる。好ましくは、光源によって発生されたレーザー光は、ほとんど平行であり近似ガウスである。好ましい実施形態において、光屈折素子または光拡散素子などの光学素子が使用されて、全マイクロアレイ表面に渡って照度が均質化されている。交換可能な励起フィルタを使用して対象の波長だけを集光している。好ましくは、追加的なフィルタホイールが設置され、減衰フィルタとして使用されて、レーザー強度が正確に調整されている。このフィルタホイールは、可変的な既知の吸収レベルとは異なって遮られている。反射防止コーティングされているレンズを使用して、反応チャンバーの平面上にレーザー光を合焦させる。好ましい実施形態において、検出器は光学レンズを含む。放射光が光学レンズを通して検出器に合焦されて、その中に存在する光子の数が検出される。好ましくは、検出器は冷却ＣＣＤカメラである。好ましくは、カメラは単色ＣＣＤである。好ましくは６７０ｎｍである発光波長で最大量子効率を得るために、カメラが選択される。好ましくは、６７０ｎｍでのＣＣＤ量子効率は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％である。
【０１９６】
好ましくは、画素サイズは８から２４μｍの間にある。ＣＣＤセンサー領域は１：１の比率および最高の画像視野を得るために、少なくとも２０×１０ｍｍである。好ましくは、ＣＣＤカメラは、フルフレームカメラである。好ましくは、十分な定量化レベルを得るために、画像のデジタル化は少なくとも１２ビット、より良くは少なくとも１４ビットである。リアルタイム定量化を可能にするには、好ましくは、露出時間は少なくとも１秒間であり、好ましくは１０秒未満、なお好ましくは５秒未満およびより良くは３秒未満である。好ましくは、鏡が避けられて、塵の蓄積および写真の悪化を防いでいる。好ましくは、レンズは大きなイメージサークル（すなわち直径４３．２ｍｍ）、大きな開口部：ｆ／２．８からｆ／１６、短い焦点距離（すなわち４０ｍｍ）、１０ｃｍ未満の接写能力といった特徴を有しており、１：１のサイズ比に適している。特定の実施形態において、約６６５ｎｍより長い波長を有する光を透過する発光フィルタが追加される。好ましくは、発光フィルタはレンズ上またはレンズ近くに設置されている。好ましくは、発光フィルタは低域通過を備える帯域通過、カットオン周波数６６５ｎｍ、カットオフ７００ｎｍ、帯域幅内の透過率０．８Ｔ超、帯域幅外の透過率０．００１Ｔ未満、５００から６６５ｎｍの透過率０．０００１Ｔ未満、帯域幅精度±３ｎｍといった特徴を有する。好ましい実施形態において、照射光源は反応チャンバーの平面に直接合焦されている励起光を生み出し、励起光は４５から１３５°に含まれる角度の範囲でマイクロアレイ表面に到達する。好ましくは、励起光は約９０°の角度で、したがって垂直に支持体の表面に到達する。法線に照らして算出した場合、この角度は約０°になる。したがって、励起光は、エバネセント波によって得られるような光の内面反射を誘導しない角度の範囲で反応チャンバーの平面に到達する。
【０１９７】
好ましい実施形態において、検出はＷＯ  ２００９／０１３２２０に記載の禁制角度法を使用して実施される。フローチップデバイス（装置に設置されている）は、屈折率１．３０超、厚さ少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは少なくとも３ｍｍを有する光学的に透明な固体支持体の表面上に固定化されている捕捉分子を含み、前記固体支持体は、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面（Ｓ１）に対して傾斜している２つの表面（Ｓ２およびＳ３）を有しており、一方の表面（Ｓ２）は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を禁制角度（θｏｂｉｎ）で集光するために使用され、固体支持体表面と対比して９０から６０°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面（Ｓ３）は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われており、デバイスが装置上に置かれて、禁制角度（θｏｂｉｎ）で放射される光が傾斜表面Ｓ２を通して検出器に達している。好ましくは、観察角は臨界角プラス１０°、好ましくはプラス５°、より好ましくはプラス３°の範囲内である。好ましくは、カメラは、支持体の側面に対する法線と対比して０°＞θｏｂｏｕｔ＞θｃｏｕｔでありθｃｏｕｔ＝Ａｒｃｓｉｎ（ｎ１／ｎ３ｃｏｓ（θｃ））となるような固定観察角θｏｂｏｕｔで装着されている。ｎ１が光学ブロックの屈折率の場合、ｎ２は溶液の屈折率、好ましくは水溶液（ｎ２約１．３３）であり、ｎ３は空気の屈折率である。別の実施形態において、シグナルは結合している標識された標的ポリヌクレオチド分子からの、照射に応答した散乱光である。他の実施形態において、シグナルは結合している標識された標的ポリヌクレオチド分子からの、照射に応答した光回折の結果である。
【０１９８】
好ましい実施形態において、入射光源、固体支持体および検出器は、検出の間互いに相対的に動かない。これは、最も単純なシステムである。ＣＣＤカメラは、固体支持体表面から放射される光を一回の取得で集光する。
【０１９９】
増幅および検出の加熱工程は、集積化されたシステムにおいて実施される。実施例５に記載される具体的な機器において、光源は、熱安定化されたヒーターと接触している表面と向かい合う支持体の表面に向けられる。
【０２００】
本発明はまた、サンプル中に存在する可能性がある（微）生物もしくは生物の一部を、主に診断および／または定量化するための工程の様々なステップを実施するのに必要な機械および装置であって、ａ）マイクロアレイによる特異的な位置で不溶性固体支持体表面に結合している捕捉分子、ｂ）熱調節のためのデバイス、ｃ）アンプリコンと捕捉分子との結合位置で形成されるシグナルを検出するためのデバイス、およびｄ）シグナルをデジタルデータに変換するためのコンピュータプログラムを含む機械および装置を包含する。
【０２０１】
好ましい実施形態において、装置は、
−異なる測定のデータを格納するための記憶装置、
−照射、検出および記憶のステップを繰り返す制御装置、
−フローチップデバイス内の液体の位置を決定するフローチップセンサーのデータ分析、
−データを処理して、増幅の前に溶液中に存在しているポリヌクレオチド分子の量を検出および／または定量化するためのプログラム
も含む。
【０２０２】
別の実施形態において、さらにコンピュータプログラムは、シグナルが形成されるマイクロアレイの位置を認識する。
【０２０３】
装置において、好ましくは、捕捉分子はマイクロアレイの位置で不溶性固体支持体に共有結合している一本鎖の捕捉分子であり、前記捕捉分子は１０から６００塩基の捕捉部分を含み、前記捕捉部分は前記アンプリコンに特異的に結合できる。
【０２０４】
装置は、好ましくは、比色分析、蛍光、時間分解蛍光、光熱干渉コントラスト、レイリー散乱、ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、質量変化、水晶振動子マイクロバランス、カンチレバー、微分パルスボルタンメトリ、非線形周波発生分光法による化学的地図製作、光学的変化、抵抗度、静電容量、異方性、屈折率および／またはナノ粒子計数からなる方法群から選択される検出器を有する。
【０２０５】
具体的な実施形態において、蛍光スキャナは共焦点スキャン法、さらに好ましくはピンホールを含めたレーザー光を使用する。
【０２０６】
具体的な実施形態において、装置は、熱サイクルの定義済みのタイミングに支持体の少なくとも５つの異なる位置に対する異なる測定からのデータを格納するための記憶システム、マイクロアレイの各位置に対する少なくとも１回の熱サイクルにおいて少なくとも１回の検出および記憶ステップを繰り返す制御装置、および／または少なくとも１回の熱サイクルにおいて得たデータを処理して、増幅の前にサンプル中に存在しているヌクレオチド分子の量を検出および／または定量化するためのコンピュータプログラムをさらに含む。
【０２０７】
具体的な実施形態において、装置は、レーザー光源、前記レーザー光源によって生み出されるレーザー光用の合焦デバイス；光電子増倍管およびピンホールをさらに含む。
【０２０８】
別の実施形態において、装置は、ある位置で形成されたシグナルを特定の標的の存在と関連付けられるデータに変換するためのコンピュータプログラムをさらに含む。
【０２０９】
特定の実施形態において、装置は、遺伝子、ＤＮＡおよびポリヌクレオチド配列を増幅および検出するための多機能装置であり、その装置はＰＣＲ増幅、ポリヌクレオチド検出、リアルタイムＰＣＲ、定量化リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ検出および／または定量化ならびにＳＮＰ検出を実施する。
【０２１０】
図９のフローチャートは、リアルタイムＰＣＲ装置がプログラム可能なコンピュータによって制御されている実施形態について記載している。検出器は、レーザーによって照射されている間にマイクロアレイの写真を撮影するための高感度ＣＣＤカメラであり得る。対照は実施例７および図１０に作られている。
ステップ１において、利用者は、
−ＣＣＤカメラの露出時間、
−光源のレーザー強度、
−変性温度、
−アニーリング／ハイブリダイゼーション温度、
−伸長温度、
−ポンプの速度、
−液相または気相における検出（または画像取得）、
−増幅サイクルの継続時間またはセンサーによって計数される増幅サイクルの決定、
−検出器によってマイクロアレイの画像が取得される時点
などの必要なパラメータを記入するよう指示される。
【０２１１】
異なるパラメータの説明：
ＣＣＤカメラの「露出時間」は、検出チャンバー内のマイクロアレイの写真を撮影する時間に対応する。５秒の露出時間が、実施例７において使用されている。
【０２１２】
「レーザー強度」は、検出チャンバー内のマイクロアレイを照射するための光源の強度を定義する。実施例７において、２Ｗの高輝度レーザーが使用されている。
【０２１３】
ＰＣＲ増幅の３つの温度は、以下の方式で設定される。
１．変性温度
機器において、第１加熱ブロック（上部および下部）の温度は、ＰＣＲの変性ステップに対応する固定値に設定されている。その結果、カートリッジの変性の温度領域は「変性温度」へと加熱される。変性温度は、８５から１００℃、好ましくは９５℃から９９℃からなる。実施例７において、９５℃が変性温度として使用されている。
２．アニーリング／ハイブリダイゼーション温度
機器において、第２加熱ブロック（上部および下部）の温度は、ＰＣＲのアニーリング／ハイブリダイゼーションステップに対応する固定値に設定されている。その結果、カートリッジのアニーリング／ハイブリダイゼーションの温度領域は「アニーリング／ハイブリダイゼーション温度」へと加熱される。アニーリング／ハイブリダイゼーション温度は、３７℃から７０℃、好ましくは５０℃から６５℃からなる。実施例７において、５８℃がアニーリング／ハイブリダイゼーション温度として使用されている。
３．伸長温度
機器において、第３加熱ブロック（上部および下部）の温度は、ＰＣＲの伸長ステップに対応する固定値に設定されている。その結果、カートリッジの伸長の温度領域は「伸長温度」へと加熱される。伸長温度は、６０℃から８０℃、好ましくは６８℃から７５℃からなる。実施例７において、７２℃が伸長温度として使用されている。
【０２１４】
各加熱ブロックは、アルミニウム素子の内側に設置された熱電対によって熱的に調節されている。電子デバイスを調節している外部ＰＩＤ（ＯＭＲＯＮ）は、一定間隔で加熱抵抗に電力を送って所望の温度を維持した。
【０２１５】
各加熱アルミニウムブロックに空気パルスラジエータが接続されて、必要なときに妥当な時間で温度を下げられるようにした。
【０２１６】
場合によっては、他の３領域のうちの１つのサイズを変えるために所与の温度で加熱される追加の温度領域がデバイスに組み込まれる。
【０２１７】
「ポンプの速度」は、カートリッジ内の流速を定義する主要なパラメータの１つである。実施例７において、ポンプ速度は１３ｒｐｍに設定されている。
【０２１８】
水路断面、カートリッジの異なる温度領域（温度が調節されている）内部の水路長および検出チャンバー（Ｖ２）の体積によりデバイス体積（Ｖ１＋Ｖ２）の算出が可能になる。ポンプの速度は流速、したがって各増幅ステップ（変性、アニーリング／ハイブリダイゼーションおよび伸長）の継続時間を定義している。
【０２１９】
例えば、クレジットカードの寸法（８０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ）を有する図４に規定されている集積化フローチップデバイスは、４つの異なる温度領域（領域１：２０ｃｍの長さの水路、領域２：４０ｃｍの長さの水路、領域３：１５ｃｍの長さの水路および領域４：２０ｃｍの長さの水路）の内部に流路（水路断面：５００μｍ×５００μｍ）および領域２に相互接続された検出チャンバーを含む。１３ｒｐｍのポンプ速度の場合、４つの温度領域を通って循環を完了する継続時間は約９０秒かかる。好ましくは、１サイクルの継続時間は、所与の動作パラメータを使用するシステムの標準化または較正によって予め決められている。
【０２２０】
デバイスの全体積（Ｖ１＋Ｖ２）と比較してカートリッジに導入される溶液の体積（Ｖ３）に応じて、カートリッジ内に２つの相（気相／液相）または１つの相（液相）だけが存在することになる。
【０２２１】
「気相の存在」は、フローチップデバイスに導入された溶液の体積（Ｖ３）がデバイスの全容積（Ｖ１＋Ｖ２）より少ないことを意味している。
【０２２２】
検出は、液相または気相で実施される。
【０２２３】
デバイス内の気相の存在は、「増幅サイクルの数」（変性、アニーリング／ハイブリダイゼーションおよび伸長を含む）の決定を実験的に可能にする。サイクルの計数は、例えば流路の特定の位置で気相から液相への変遷を検出する熱電対プローブによって実施される。ポンプの速度、およびプローブによって制御される水路の断面に溶液が到達するタイミングを知ることによって、液相または気相のいずれかにおいてマイクロアレイの画像の取得を実施できる。
【０２２４】
プローブでサイクルを計数する代わりに、流路断面、カートリッジの異なる温度領域（温度が調節されている）内部の流路長およびポンプ速度などのフローチップデバイスの特徴によって、「サイクルの継続時間」を算出することもできる。
【０２２５】
ＣＣＤカメラによって「マイクロアレイが検出される時点」は、利用者がアレイの画像を取得したい時点を定義している。それは、毎サイクル（１回もしくは数回）またはセンサーによって計数される予め決められたサイクル数のいずれかまたはサイクル継続時間に対応して予め決められた間隔である。
【０２２６】
実施例７において、検出チャンバーが気相であったとき、画像取得はセンサーによって決定される２、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０サイクルで実施される。このパラメータは、増幅の間に検出器によって取得される画像の数を定義している。
【０２２７】
ステップ２において、システムは初期化される：機器の重要なパラメータが確認される：加熱ブロックの温度、照射光源のレーザー強度、ＣＣＤカメラの温度、センサーおよびポンプ速度。
【０２２８】
ステップ３において、機器内の第１加熱ブロックの所定の変性温度への加熱が起こる。フローチップデバイスにおいて、変性の温度領域は変性温度に加熱される。同じことがアニーリング／ハイブリダイゼーションおよび伸長温度に対して起こる。
【０２２９】
ステップ４において、フローチップデバイスの変性領域を通して液体が流され、変性が起こる。場合によっては、ポンプ速度を下げて、最初の増幅サイクルの変性時間を最大化する。
【０２３０】
ステップ５ａにおいて、アニーリング／ハイブリダイゼーション領域を通して液体が流される。プライマーのアニーリングおよびマイクロアレイ上への標的アンプリコンのハイブリダイゼーションが起こる。
【０２３１】
ステップ５ｂにおいて、場合によってはプログラムにしたがって、マイクロアレイの画像が所与の増幅サイクルに検出器によって取得され、取得した画像が収集されて、支持体上に存在している各標的に対するシグナルおよびバックグラウンド値が定量化および抽出され、サイクルワイズのデータ分析が実施される。
【０２３２】
ステップ６において、伸長領域を通して液体が流されて伸長ステップが実施される。
【０２３３】
ステップ７において、増幅サイクルが決定される。センサー（例えばプローブ熱電対）を用いてサイクルを計数することによって、増幅サイクルも実験的に決定される。センサーデータが記録され、データが分析されてサイクル数が決定される。
【０２３４】
別法として、検出チャンバーを含むフローデバイスの体積およびポンプ速度により、増幅サイクルの継続時間が理論的に決定される。サイクル継続時間は、溶液が流路および検出チャンバーを通って循環を完了するための時間である。さらに別の算出モードにおいて、増幅サイクル時間は公知であり、システムパラメータの一部である。
【０２３５】
取得されるべき数の画像取得が達成されない場合、続いてプログラムサイクルはステップ４に戻る。
【０２３６】
取得されるべき数の画像取得が達成された場合、ステップ８が起こる：結果の全体的検査によってデータ分析が完了され、データ分析は結果の報告を含む。データ分析はスポット位置を決定し、所与の標的に対するスポットと関連した値を決定するためのアレイ表面画像の処理を含む。好ましくは、定量化は様々な補正、Ｃｔ値の決定および出発溶液中に存在する標的の定量化も含む。アレイ分析のための異なる方法は、標的の定量化のためにリアルタイムＰＣＲのデータを処理する方法と同様に公知である（ｄｅ  Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６４、１３７−１４９；Ｍｅｎｅｓｅｓ−Ｌｏｒｅｎｔｅら、２００３、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６、１０７０−１０７７；Ｈａｍｅｌｓら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３１、１３６４−１３７２；ＷＯ  ０２／０９７１３５およびＵＳ２００４／０１６１７６７を参照のこと、参照として本明細書に導入した）。
【０２３７】
本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに例示される。
【実施例】
【０２３８】
［実施例１］：フローチップデバイスのマイクロアレイ上で検出される単一リアルタイムＰＣＲ
使い捨てプラスチック製カートリッジ、可撓性チューブ（参照：Ｃ−ｆｌｅｘ  ０６４２２−２；Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ  ｈｉｌｌｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）、ポンプチューブ（参照：０４９ｅｆ０ａ−０５１、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、および検出チャンバーの組合せによって第１のフローチップデバイスが準備されて、密閉水路ループが作製された。
【０２３９】
使い捨てプラスチック製カートリッジは、成形および溶接されて１ｍｍ２の断面を持つ水路が作製された２片のＴｏｐａｓプラスチックでできていた。３つの異なる水路長：３０ｃｍ（長い）、２０ｃｍ（中間）および１０ｃｍ（短い）を持つ３つのそれぞれ異なる使い捨てプラスチック製カートリッジ（長い、中間、短い）があった。使い捨てプラスチック製カートリッジは、可撓性チューブに接続できる内側開口部および外側開口部を有した。
【０２４０】
検出チャンバーは楕円形を有し、７ｍｍ（幅）×２０ｍｍ（長さ）×１００μｍ（高さ）であった。検出チャンバーは、上側を厚さ１．５ｍｍの黒色のプラスチック製囲いによって、底側を厚さ３．５ｍｍの光学ブロックによって密閉された。検出チャンバーは約１０μＬの溶液を保持するように設計された。光学ブロックは、光学的品質のＺｅｏｎｅｘであった。表面は、かき傷および塵を回避して完全に平滑で平坦であった。光学ブロックは、表面上にエポキシ基を生成するためにプラズマ処理によって活性化された（Ｐ２ｉ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）。捕捉ヌクレオチド配列は、自家製ロボットデバイスを用いて直径２５０μｍのピンを使用して光学ブロック表面上に印刷された。スポットは直径４００μｍを有し、分配された体積は約０．３ｎＬであった。光学ブロックは室温で乾燥され、検出チャンバー上にレーザー溶接され、使用されるまで２０℃で保管された。光学ブロックの観察側とは向かい側の側部は、黒い塗装で覆われた。
【０２４１】
フローチップデバイスは、以下の通り準備された。
【０２４２】
デバイスは４つの領域を含有した：
領域Ａは、１つの中間プラスチック製カートリッジの内側開口部に付着した１５ｃｍの可撓性チューブで作られた。
【０２４３】
領域Ｂは、一方の末端が領域Ａプラスチック製カートリッジの外側開口部に、他方の末端が検出チャンバーの内側開口部に固定された１０ｃｍの可撓性チューブで作られた。検出チャンバーの外側開口部は５ｃｍの可撓性チューブで固定され、次いで１つの長いプラスチック製カートリッジに５ｃｍの可撓性チューブが続いた。
【０２４４】
領域Ｃは、２２ｃｍの可撓性チューブで作られた。
【０２４５】
領域Ｄは、領域Ｃの可撓性チューブの末端および領域Ａの可撓性チューブの起端に接続されて閉鎖ループを作っているポンプチューブ（＃０４９．ＥＦ０Ａ．０５１、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）で作られた。
【０２４６】
フローチップデバイスは領域Ｄおよび領域Ａの接合部で開口でき、フローデバイスへの溶液の導入が可能になる。一旦、液体がフローチップデバイス内になると、このデバイスは密閉され、ポンプチューブが蠕動ポンプ（＃Ｓｅｒｉｅ  １００、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に導入され、液体はフローチップデバイスの閉鎖ループ内を流れることができた。流路および検出チャンバーを含めたフローチップデバイスの全容積量は２ｍＬであった。フローチップデバイスは、フロー機器の内側に設置された。この機器は、異なる温度（９９℃、５８℃および７２℃）で独立に加熱される３つのアルミニウム区域で作られた。フローチップデバイスの領域Ａは、９９℃に加熱されたアルミニウム区域に設置され、領域Ｂは５８℃の区域および領域Ｃは７２℃の区域に設置された。フローチップデバイスとアルミニウムブロックとの熱的接触は、アルミニウム表面とフローチップデバイス底面との間に吸熱化合物（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３４０、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＭＢＨ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の層を使用して作られた。禁制角度を使用して検出チャンバー内のマイクロアレイの写真を作るために、検出チャンバーはレーザーの上、カメラの前に正確に設置された。フローチップデバイスの周りの熱を保つために、３つの加熱区域の上に、３つのアルミニウムカバーが設置された。
【０２４７】
検出チャンバーの光学ブロック上にスポットされたマイクロアレイは、４００μｍが９Ｘ１９スポットであり、Ｃｙ５標識されている検出対照、５’末端アミノ−ポリヌクレオチドのスポットを含有した：検出対照：（配列番号１）
５’ＮＨ２−ＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＡＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＡＴＧ−３’Ｃｙ５。
【０２４８】
この標識された捕捉プローブは、５００ｎＭの濃度でスポットされた。
【０２４９】
マイクロアレイは異なる配列に特異的な未標識の捕捉分子も含有し、これら捕捉分子の１つは捕捉部分およびスペーサー部分（下線を引いた）を含む標的ＧＵＴに特異的である：
ＧＵＴ捕捉プローブ：（配列番号２）
５’ＮＨ２−ＴＴＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＡ−３’
未標識の捕捉プローブは、１２μＭの濃度でスポットされた。
【０２５０】
スポッティングした後、プラスチック製光学ブロックをオーブンの中で湿度下に２０℃で３０分間、次いで湿度下に６０℃で３０分間設置した。次いでプラスチック製光学ブロックを、ＳＳＣ２Ｘ  ｐＨ  ７＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＳＤＳで１×５分間、Ｈ２Ｏで２×１分間および最終的に熱湯で１×３分間洗浄した。洗浄ステップの後、プラスチック製光学ブロックは室温で乾燥され、検出チャンバーの底部に溶接されてマイクロアレイを含有する密閉された検出チャンバーを作製した。
【０２５１】
５’末端がＯｙｓｔｅｒで標識されている１対のプライマーを用いて標的ＧＵＴを特異的に増幅するために、ＰＣＲ混合物が調製された。
【０２５２】
ＰＣＲ緩衝液１Ｘ（５０ｍＭ  Ｔａｐｓ、９５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．０５％ＢＳＡ、各々１μＭの１対のプライマー（５’Ｏｙｓｔｅｒ−ＧＧＧＡＣＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号３）および５’−ＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＧＴＣ−３’（配列番号４））、１Ｕ／５０μＬ  Ｓｕｐｅｒｓａｌｔ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、１００μＭ  ｄＴＴＰおよび３００μＭ  ｄＵＴＰならびに１００コピーのＧＵＴ標的ＤＮＡを含有するＰＣＲ混合物５００μＬが調製された。ＷＯ２００９／０８６６０８に提示されているように、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液はグルタミン酸塩およびデキストランも含有した。
【０２５３】
このＰＣＲ混合物４００μＬが９９℃で５分間インキュベートされ、その後フロー機器内側のフローチップデバイスに入れられ、以下のプログラムを用いて処理された：９９℃の変性ステップ、５８℃のアニーリングステップおよび７２℃の伸長ステップを含む１分２０秒を４０サイクル。
【０２５４】
検出チャンバーが液体を含まないときに、０、１０、１５、２０、２５、３０、３５および４０サイクルに禁制角度内で光学ブロックの側面を通して５秒間の写真が撮影されて、検出チャンバー内のマイクロアレイを検出した。
【０２５５】
これらの生写真の分析は、Ｍａｘｉｍ  ＤＬソフトウェア（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を用いて得られ、３スポット（ＧＵＴ捕捉プローブスポット１つ、このスポットの局所的バックグラウンドスポットおよび検出対照スポット１つ）の生シグナル強度の定量化が実施された。生シグナル強度が、サイクル数に対してプロットされ、結果は図１に提示された。
【０２５６】
対照として、このＰＣＲ混合物１００μＬがＰＣＲチューブでＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で以下のプログラムを用いて処理された：９５℃で５分間それに続いて９５℃で３０秒間の変性ステップ、５８℃で９０秒間のアニーリングステップおよび７２℃で３０秒間の伸長ステップを含む４０サイクル、それに続いて７２℃で１０分間、その後４℃の温度に下げる。
【０２５７】
４０ＰＣＲサイクルの後、チューブ内で実施されたＰＣＲ溶液１μＬ  およびフローチップデバイス内で作られたＰＣＲ溶液１μＬが、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ    ＤＮＡ  ２０００ゲルカートリッジ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａ、ＵＳＡ）にロードされた。ＧＵＴアンプリコンに対応しているバンドの強度が測定され、アンプリコン濃度に変換された。データはフローチップデバイスの場合３４ｎＭおよびＰＣＲチューブの場合３２ｎＭの値を与え、ＰＣＲ収量が同程度であることを示した。
【０２５８】
［実施例２］：フローチップデバイス内のマイクロアレイ上で検出されるリアルタイム多重化ＰＣＲ
実施例１に提示されている通りフローチップデバイスが準備された。
【０２５９】
実施例１の緩衝液中に、Ｓ．アウレウスの増幅用プライマー対（５’Ｏｙｓｔｅｒ−ＴＣＡＧＴＣＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣ−３’（配列番号５）および５’−ＴＧＣＡＣＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号６））を含有する５０ｎＭ／７５ｎＭ（標識されたプライマーの場合）の１６対のプライマー混合物（プライマー混合物３．４）、１Ｕ／５０μＬ  Ｓｕｐｅｒｓａｌｔ  Ｔａｑポリメラーゼ、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１００μＭ  ｄＴＴＰおよび３００μＭ  ｄＵＴＰならびに１，０００，０００コピーのＳ．アウレウス標的ゲノムＤＮＡを含むＰＣＲ混合物５００μＬが調製された。
【０２６０】
このＰＣＲ混合物４００μＬが９９℃で５分間インキュベートされ、その後フロー機器内側のフローチップデバイスに入れられ、以下のプログラムを用いて処理された：９９℃の変性ステップ、５８℃のアニーリングステップおよび７２℃の伸長ステップを含む１分１０秒を４８サイクル。
【０２６１】
フローデバイスは、２ｍＬの全体積を有し、アニーリング区域に検出チャンバーを含有した。この検出チャンバーは、捕捉部分およびスペーサー部分（下線を引いた）を含む標的Ｓ．アウレウスアンプリコンに特異的な捕捉プローブを含む捕捉プローブの（実施例１のような）マイクロアレイを保持している。
Ｓ．アウレウス捕捉プローブ（配列番号７）：
５’ＮＨ２−ＴＴＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡ  ＴＧＴＴＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＴＡＣＣＧＣ−３’
検出チャンバー内に液体無しで、サイクル０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５および４８サイクルに禁制角度内で、この検出チャンバーの５秒間の写真が撮影された。
【０２６２】
これらの生写真の分析は、Ｍａｘｉｍ  ＤＬソフトウェアを用いて得られ、Ｓ．アウレウス捕捉プローブの１スポットに対する生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドの定量化がサイクル数に対してプロットされた。結果は図２に提示された。
【０２６３】
対照として、ＰＣＲ溶液１００μＬがＰＣＲチューブでＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で以下のプログラムを用いて処理された：９５℃で５分間それに続いて９５℃で３０秒間の変性ステップ、５８℃で９０秒間のアニーリングステップおよび７２℃で３０秒間の伸長ステップを含む４８サイクル、それに続いて７２℃で１０分間、その後４℃の温度に下げる。
【０２６４】
４８ＰＣＲサイクルの後、チューブ内で作られたＰＣＲ１μＬおよびフローチップデバイス内で作られたＰＣＲ１μＬが、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ＤＮＡ２０００ゲルカートリッジにロードされた。Ｓ．アウレウスアンプリコンに対応しているバンドの強度が測定され、アンプリコン濃度に変換された（ｎＭ）。データはフローチップデバイスの場合１０ｎＭおよびチューブの場合４１ｎＭの値を与えた。
【０２６５】
［実施例３］：フローチップデバイス内のマイクロアレイ上でのシグナル発生およびリアルタイムＰＣＲシグナルの処理
Ｐ３５増幅用の異なるプライマー対を使用して単一ＰＣＲが実施されたという違いはあるが、アッセイは実施例１と同様に実施された：
−５’Ｃｙ５−ＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧ−３’（配列番号８）および
−５’−ＴＣＴＴＧＣＧＡＡＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号９）。
【０２６６】
この検出チャンバーは、捕捉部分およびスペーサー部分（下線を引いた）を含む標的Ｐ３５アンプリコンに特異的な捕捉プローブを含む捕捉プローブの（実施例１のような）マイクロアレイを保持している：
Ｐ３５捕捉プローブ（配列番号１０）：
５’ＮＨ２−ＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＣＣＴＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＴＡＴ−３’
ＰＣＲは、Ｐ３５標的ＤＮＡ１，０００，０００コピーで実施され、検出チャンバー内に存在する蛍光液体無しで、０、３、６、９、１２、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９および４０サイクルに禁制角度内で、マイクロアレイ上の特異的捕捉分子にハイブリダイズしたＰＣＲ産物の検出が実施された。異なるＰＣＲサイクルで得られた結合している標的Ｐ３５のシグナルを示すグラフが図３ａに示された。グラフは、１スポット（ｎ°２）の生値および標準偏差ならびにその局所的バックグラウンドに対する生値および標準偏差を示している。
【０２６７】
図３ｂは、（Ｍａｘｉｍ  ＤＬ５ソフトウェアの「ピクセルマス（ｐｉｘｅｌ  ｍａｔｈ）」機能を使用して）サイクル毎に異なる画像がサイクル３の画像を減算してオフセット１５００を加算することによって補正される場合、同じスポットのシグナル値および局所的バックグラウンド値ならびにスポットのシグナルおよび局所的バックグラウンドの標準偏差を示している。減算は画素毎に行われた。
【０２６８】
［実施例４］：集積化フローチップデバイスの設計
フローチップデバイスは、図４に表示される使い捨てのプラスチック製カートリッジであった。そのフローチップデバイスはクレジットカードの寸法（８０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ）を有し、４つの異なる温度領域（領域１：２０ｃｍの長さの水路、領域２：４０ｃｍの長さの水路、領域３：１５ｃｍの長さ、および領域４：２０ｃｍの長さの水路）の内部に流路（水路断面：５００μｍ×５００μｍ）および領域２に相互接続された検出チャンバーを含んだ。フロー機器の一部である外部ポンプに、領域１の水路のポンプ開口部および領域４の水路のポンプ開口部を、可撓性ポンプチューブを介して接続した後、液体運動は閉鎖回路であった（＃０４９．ＥＦ０Ａ．０５１、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）。検出チャンバーは六角形の形状を有し、１０ｍｍ（幅）×２０ｍｍ（長さ）×１００μｍ（高さ）であった。検出チャンバーは、上側を厚さ１．５ｍｍの黒色のプラスチック製囲いによって、底側を厚さ３．５ｍｍの光学ブロックによって密閉された。検出チャンバーは約１５μＬの溶液を保持するように設計された。光学ブロックは、光学的品質のＺｅｏｎｅｘであった。表面は、かき傷および塵を回避して完全に平滑で平坦であった。
【０２６９】
フローデバイスへの溶液の導入は、領域１または領域４のポンプ開口部の一方を通して実施された。一旦、液体がフローチップデバイス内になると、このデバイスは密閉され、ポンプチューブが蠕動ポンプ（＃Ｓｅｒｉｅ１００、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に導入され、液体はフローチップデバイスの閉鎖ループ内を流れることができた。流路および検出チャンバーを含めたフローチップデバイスの全容積量は約２４０μＬであった。
【０２７０】
フローチップデバイスは、実施例５に記載され、図５および図６に図式的に提示されているフローＰＣＲ機器の内側に合うように設計された。
【０２７１】
［実施例５］：集積化フローＰＣＲ機器の設計
機器（Ｆ−ＲＡＰ機器）により、実施例４に記載され、図５および図６に示されている増幅のための熱循環とフローチップデバイス内の液体フローとの両方が可能になった。合計８つの物理的に分離された加熱素子が機器内に存在するように、機器はカートリッジの上下両方に位置する４つの加熱ブロックで構成された。カートリッジの４つの温度領域は各々、表面に熱パッド素子を有する１対の加熱アルミニウムブロックの間に挟まれて、アルミニウムブロックとプラスチック製カートリッジの間の伝導性を改善した。熱源は、アルミニウムブロック内側に設置され電源に接続された加熱抵抗であった。
【０２７２】
過度の熱勾配を避けるために、各加熱素子はプラスチック構造および薄い空気層によって互いに分離された。アルミニウムブロックはそのブロックが設置されるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）ポケットより意図的に少し小さく作られて、加熱ブロックとその周囲のホルダの間の伝導性を減少させた。
【０２７３】
各加熱ブロックは、アルミニウム素子の内側に設置された熱電対によって熱的に調節されていた。電子デバイスを調節している外部ＰＩＤ（ＯＭＲＯＮ）は、一定間隔で加熱抵抗に電力を送って所望の温度を維持した。
【０２７４】
各加熱アルミニウムブロックに空気パルスラジエータが接続されて、必要なときに妥当な時間で温度を下げられるようにした。
【０２７５】
弱い圧力を使用して加熱素子間のカートリッジを圧迫し、優れた熱的接触を得た。
【０２７６】
機器は、レンズ付き高輝度レーザー光源（ｎＬｉｇｈｔ  Ｐｅａｒｌ（商標）２Ｗ）、発光フィルタおよびレーザーによって照射されている間にマイクロアレイの写真を撮影するための高感度ＣＣＤカメラ（Ｋｏｄａｋ  ＫＡＦ  ６３０３）から構成される光学的検出システムを含有した。
【０２７７】
レーザー光源がマイクロアレイに到達するように、下からの照射用として１つの開口が下側のカートリッジホルダに作られた。別の開口が照射軸から７６°で作られて、マイクロアレイから発せられる放射光をいわゆる禁制角度内でＣＣＤカメラによって検出可能にした。
【０２７８】
プラスチック製カートリッジ内で流体を移動させるために、チューブの短い断片がカートリッジに接続され加熱システムから突き出した。このチューブは、１から５００ｒｐｍに制御されている（Ｆａｕｌｈａｂｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｅｒｖｏ  ＤＣ  ｍｏｔｏｒ）小さな蠕動ポンプ（Ｍａｒｌｏｗ）の内側に設置された。
【０２７９】
熱電対プローブ（センサー）がチューブ外面に接続されて、通過している流体が検出された。液体は気相より高い熱エネルギーを伝える、それゆえプローブのレベルを通過するときに、その温度プロファイルにスパイクを示した。この温度変化が記録され、検出チャンバー内の液体のタイミングが算出された。センサーによってサイクル数を計数することもできた。
【０２８０】
［実施例６］：サイクルに伴う集積化フローチップデバイス内の捕捉プローブ上でのアンプリコンの蓄積
この実施例において、フローチップデバイスは、図４および実施例４に提示されている使い捨てのプラスチック製カートリッジであった。そのフローチップデバイスはクレジットカードの寸法（８０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ）を有し、４つの異なる温度領域の内側に流路（水路断面：５００μｍ×５００μｍ）を含む。フローチップデバイスは、図５および図６ならびに実施例５に提示される、Ｆ−ＲＡＰ機器に合うように設計された。
【０２８１】
機器（Ｆ−ＲＡＰ）により、増幅のための熱循環とフローデバイス内の液体フローとの両方が可能になる。
【０２８２】
この実験の場合、光学ブロックは異なる捕捉プローブでスポットされていた：これらの捕捉プローブの３つは、
−検出対照：（配列番号１）：５’ＮＨ２−ＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＡＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＡＴＧ−３’Ｃｙ５。
この標識された捕捉プローブは、５００ｎＭの濃度でスポットされた。
−ＧＵＴ捕捉プローブ：（配列番号１１）：５’ＮＨ２−ＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＡＡＣＴＡＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＴＧＡＴＧ−３’
−Ａ．バウマニ捕捉プローブ：（配列番号１２）：５’ＮＨ２−ＴＴＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡ  ＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＧＧＣ−３’
ＧＵＴおよびＡ．バウマニ捕捉プローブは、１２μＭの濃度でスポットされ、スペーサー部分（下線を引いた）を含んだ。
【０２８３】
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ  ２．０（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２０ｎＭのＯｙｓｔｅｒで標識されたＧＵＴ検出プローブ（５’Ｏｙｓｔｅｒ−ＣＡＴＣＡＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡ−３’（配列番号１３））、１ｎＭの精製Ａ．バウマニアンプリコン（プライマー：５’Ｏｙｓｔｅｒ−ＧＣＡＴＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧ−３’、（配列番号１４）およびプライマー：５’−ＴＡＣＣＧＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＡＧ−３’、（配列番号１５）を用いて作製された）を含有するハイブリダイゼーション混合物が調製された。このハイブリダイゼーション混合物５０μＬがフローカートリッジに導入され、次いでそのカートリッジは２つのポンプ開口部をポンプチューブに接続することによって密閉され、Ｆ−ＲＡＰ機器に導入された。４つの下部加熱ブロック（カートリッジの温度領域１、２、３および４）がそれぞれ９５℃、５８℃、５８℃および７２℃に設定され、上部加熱ブロック（カートリッジの温度領域１、２、３および４）がそれぞれ９５℃、５８℃、５８℃および７２℃に設定された。熱電対プローブはポンプチューブ（７２℃に設定された温度領域の直後）に固定され、液体の流れが記録されてハイブリダイゼーションのサイクル数が計数された。ポンプ速度は、１３ｒｐｍ（ｖ２００）に調整された。
【０２８４】
検出チャンバーが気相のとき、０、１、２、３、４、５、６、１０および１５サイクルに５秒間の写真が撮影された。
【０２８５】
これらの生写真の分析は、Ｍａｘｉｍ  ＤＬソフトウェア（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を用いて得られ、ＧＵＴ捕捉プローブの１スポットに対する生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドの定量化がサイクル数に対してプロットされ、Ａ．バウマニ捕捉プローブの１スポットの生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドシグナルの定量化がサイクル数に対してプロットされた。結果は図８に提示された。
【０２８６】
［実施例７］：集積化フローチップデバイス内のマイクロアレイ上で検出されるリアルタイム多重化ＰＣＲ
この実施例において、フローチップデバイスは、図４および実施例４に提示されている使い捨てプラスチック製カートリッジであった。そのフローチップデバイスはクレジットカードの寸法（８０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ）を有し、４つの異なる温度領域の内側に流路（水路断面：５００μｍ×５００μｍ）を含む。フローチップデバイスは、図５−図６および実施例５に提示される、Ｆ−ＲＡＰ機器に合うように設計された。
【０２８７】
機器（Ｆ−ＲＡＰ）により、増幅のための熱循環とフローデバイス内の液体フローとの両方が可能になる。
【０２８８】
フローデバイスは、約２４０μＬの全体積を有し、アニーリング区域に検出チャンバーを含有した。この検出チャンバーは、捕捉部分およびスペーサー部分（下線を引いた）を含む標的Ｈ．インフルエンザエアンプリコンに特異的な捕捉プローブを含む捕捉プローブの（実施例１のような）マイクロアレイを保持している：
−Ｈ．インフルエンザエ捕捉プローブ：（配列番号１６）：５’ＮＨ２−ＴＴＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡ  ＣＴＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡ−３’
１ＸＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔａｐｓ、９５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｈ．インフルエンザエの増幅用プライマー対（５’Ｏｙｓｔｅｒ−ＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＡＣＧＧＣＧＴＴＡＡＡＣＧＴＣＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号１８））を含有する５０ｎＭ／７５ｎＭ（標識されたプライマーの場合）の２９対のプライマー混合物（プライマー混合物４．０）、１Ｕ／５０μＬ  Ｓｕｐｅｒｓａｌｔ  Ｔａｑポリメラーゼ、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１００μＭ  ｄＴＴＰおよび３００μＭ  ｄＵＴＰならびに５  １０５コピーのＨ．インフルエンザエ標的ゲノムＤＮＡを含むＰＣＲ混合物１００μＬが調製された。ＷＯ２００９／０８６６０８に提示されているように、１ＸＰＣＲ緩衝液はグルタミン酸塩およびデキストランも含有した。
【０２８９】
このＰＣＲ混合物１００μＬが９９℃で５分間インキュベートされ、その後フローカートリッジに導入され、次いでそのカートリッジは２つのポンプ開口部をポンプチューブに接続することによって密閉され、Ｆ−ＲＡＰ機器に導入された。４つの下部加熱ブロック（カートリッジの温度領域１、２、３および４）がそれぞれ９５℃、５８℃、５８℃および７２℃に設定され、上部加熱ブロック（カートリッジの温度領域１、２、３および４）がそれぞれ９５℃、５８℃、５８℃および７２℃に設定された。熱電対プローブはポンプチューブ（７２℃に設定された温度領域の直後）に固定され、液体の流れが記録されて増幅のサイクル数が計数された。ポンプ速度は、１３ｒｐｍ（ｖ２００）に調整された。
【０２９０】
検出チャンバーが気相のとき、２、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０サイクルに５秒間の写真が撮影された。
【０２９１】
溶液が熱電対プローブレベルにあるときに、温度プロファイルの中のスパイク数を決定することによって、サイクル数は得られた。
【０２９２】
これらの生写真の分析は、Ｍａｘｉｍ  ＤＬソフトウェア（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を用いて得られ、Ｈ．インフルエンザエ捕捉プローブの１スポットの生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドシグナルの定量化。結果は図１０ａに提示された。Ｈ．インフルエンザエのアンプリコンはサイクル２６で検出される。熱電対プローブによって計数されたサイクル数は図１０ｂに提示された。
【０２９３】
［実施例８］：異なる体積のＰＣＲ溶液を使用する集積化フローチップデバイス内のマイクロアレイ上で検出されるリアルタイム多重化ＰＣＲ
実験は、標的ＤＮＡとして５  １０５コピーのＨ．インフルエンザエゲノムを用いて実施例７に記載の通り実施された。
【０２９４】
異なる体積のＰＣＲ溶液、５０μＬ、１５０μＬまたは２００μＬのいずれかで満たされた３つのフローチップデバイス内でＰＣＲが実施された。ＰＣＲ混合物は９９℃で５分間インキュベートされ、その後フローカートリッジに導入され、次いでそのカートリッジは２つのポンプ開口部をポンプチューブに接続することによって密閉され、Ｆ−ＲＡＰ機器に導入された。４つの下部加熱ブロック（カートリッジの温度領域１、２、３および４）がそれぞれ９５℃、５８℃、５８℃および７２℃に設定され、上部加熱ブロック（カートリッジの温度領域１、２、３および４）がそれぞれ９５℃、５８℃、５８℃および７２℃に設定された。熱電対プローブはポンプチューブ（７２℃に設定された温度領域の直後）に固定され、液体の流れが記録されて増幅のサイクル数が計数された。ポンプ速度は、１３ｒｐｍ（ｖ２００）に調整された。
【０２９５】
溶液が５０μｌのデバイスの場合、検出チャンバーが気相のとき、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０サイクルに５秒間の写真が撮影された。
【０２９６】
溶液が１５０μｌのデバイスの場合、検出チャンバーが気相のとき、１、２、３、４、５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０サイクルに５秒間の写真が撮影された。
【０２９７】
溶液が２００μｌのデバイスの場合、検出チャンバーが液相のとき、３、４、５、６、７、１０、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０サイクルに５秒間の写真が撮影された。
【０２９８】
体積が５０μＬおよび１５０μＬの場合、溶液が熱電対プローブレベルにあるときに、温度プロファイルの中のスパイク数を決定することによって、サイクル数は得られた。スパイクは、溶液の前方がセンサー位置を通過することによって得られ、１つのスパイクは１回の増幅サイクルに対応する。体積が２００μＬの場合、サイクル継続時間はシステムのパラメータ（流路断面、カートリッジの異なる温度領域内部の流路長、検出チャンバーの体積および溶液の流速）によって、１００秒になるように算出された。
【０２９９】
これらの生写真の分析は、Ｍａｘｉｍ  ＤＬソフトウェア（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を用いて得られ、Ｈ．インフルエンザエ捕捉プローブの１スポットの生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドシグナルの定量化。結果は図１１に提示された。ＰＣＲ溶液の体積は、検出サイクルに強い影響があった。予想外なことに、ＰＣＲ溶液の体積が大きいほど、より初期にアンプリコンが検出された。最も大きい２００μＬの体積では最少の検出サイクル（２１サイクル）、次いで１５０μＬの体積では（２２サイクル）および５０μｌでは（３４サイクル）を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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