(57)【要約】  本発明は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法であって、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する該被験体を治療するのに有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤を該被験体に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法に関する。
2013503158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法であって、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する該被験体を治療するのに有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤を該被験体に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法。
【請求項２】
前記被験体が炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病態を治療的に有効な量の前記ＧＡＰＤＨ阻害剤の投与によって治療する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体に炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体に予防的に有効な量の前記ＧＡＰＤＨ阻害剤を投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＡＰＤＨ阻害剤が抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記病態が虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス(sepsis)、敗血症(septicemia)、内毒素性ショック、悪液質、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、寄生虫感染、細菌感染、ウイルス感染、自己免疫疾患、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、蕁麻疹、疣贅、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、脳梗塞、脳塞栓、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、ビュルガー病、ライター症候群並びにホジキン病からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記病態が虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶反応並びに移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記病態がセプシスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記病態が敗血症である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記病態が内毒素性ショックである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であるか否かを判定する方法であって、候補化合物を、該候補化合物がＧＡＰＤＨと複合体を形成することを可能にする条件下でＧＡＰＤＨと接触させることを含み、該複合体の形成が、前記候補化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であることを意味する、化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であるか否かを判定する方法。
【請求項１５】
前記病態が虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、寄生虫感染、細菌感染、ウイルス感染、自己免疫疾患、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、蕁麻疹、疣贅、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、脳梗塞、脳塞栓、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、ビュルガー病、ライター症候群並びにホジキン病からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記病態が虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶反応並びに移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記病態がセプシスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記病態が敗血症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記病態が内毒素性ショックである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性サイトカインによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療するためのＧＡＰＤＨ阻害剤の使用。
【請求項２１】
炎症性サイトカインによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する薬物の調製のためのＧＡＰＤＨ阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＰＤＨ阻害剤を用いた炎症性障害の治療に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００９年８月２６日付けで出願された米国特許仮出願第６１／２７５，１９９号（該出願の内容全体は参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
セプシスは、臨床的には感染に対する全身炎症反応と特徴付けられるが、外傷又は損傷から生じる場合もある［１〜５］。セプシスは、臨床的には感染に対する全身炎症反応と特徴付けられるが、外傷又は損傷から生じる場合もある［１〜５］。セプシスは、世界的に集中治療室（ＩＣＵ）における患者の主な死亡原因となっており、満たされていない重大な要求を伴う深刻な医学的問題及び科学的挑戦である。死亡率はセプシスの２０％から、重症セプシスの４０％、敗血症性ショックの６０％超にまで及ぶ［２〜４］。現行の療法はセプシスの症状を標的とし、心臓血管機能及び呼吸機能をサポートすることを対象としているが、調節不全の又は十分にバランスの取れていない先天性炎症反応を伴う炎症性疾患の根本原因に特異的に対処するものではない［１、４、１０、１２］。対症的な集中治療の大幅な進歩にもかかわらず、セプシス生存率の改善が全面的に欠如していることは、効果的な標的指向性の抗セプシス療法における満たされていない要求を示している。
【０００４】
セプシスは、感染又は損傷に対する先天性免疫反応における恒常性バランスの喪失によって引き起こされる［１、２］。先天性免疫反応は主に、環境に対する身体のバリアの完全性を伝えるために免疫系の細胞によって用いられるシグナル伝達分子（サイトカインと総称される）によって開始される。サイトカインは通常、病原体関連分子（ＰＡＭＰ）又はダメージ関連分子（ＤＡＭＰ）に応答して免疫細胞によって産生され、他の免疫細胞を活性化して身体の免疫反応を増大させる。臨床的に関連するサイトカインには、炎症を活性化し、増幅させる炎症誘発性メディエーターと、炎症反応を妨げ、そのバランスを保つ抗炎症性メディエーターという２つの主な分類がある。無制限な炎症誘発性メディエーターカスケードが疾患を引き起こすということが免疫学者の間で有力な意見である［１、２、４〜１２］。疾患をもたらす炎症誘発性サイトカインの調節不全の流れは、１つのサイトカインが通常、複数の他のサイトカインの産生をもたらし、免疫反応を増強及び増幅させるため、「サイトカインストーム」［１３］又は「炎症カスケード」［１４］と称されている。
【０００５】
炎症誘発性メディエーターは、早期メディエーターと後期メディエーターという２つの亜群に更に分けることができる［１、２、１９、２０］。早期メディエーター（腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、インターロイキン−６等）は、患者が病院を訪れ、医学的処置を受けるまでの期間内に消散してしまうため、恒常性バランスを回復するのに十分な治療標的ではない［１、１０〜１２、１８、１９］。一方で、後期メディエーターは「炎症カスケード」の後期、患者が病気になったと自覚した後に低下するため、治療標的とすることができる。治療効果のために後期メディエーターを標的とすることの有望な例は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）を伴う［２、１０〜１２、１５〜２０］。
【０００６】
ＨＭＧＢ１は、多くの炎症性疾患の病因において重要な役割を果たす強力な後期作用サイトカインである。様々な異なる方法によるＨＭＧＢ１のサイトカイン活性の遮断によって、セプシス、関節リウマチ及び他の炎症性疾患の動物モデルにおける転帰が改善される［１５、１６］。しかしながら、ＨＭＧＢ１は創傷治癒及び炎症の消散を促進する上でも重要な役割を有しているため、治療標的としてのその価値が潜在的に損なわれる［１５、１７］。したがって、炎症性疾患における治療標的として、潜在的に多面的効果のより少ない他の後期作用炎症性サイトカインを探し出す必要があった。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法であって、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する該被験体を治療するのに有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤を該被験体に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法に関する。
【０００８】
本発明は、化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であるか否かを判定する方法であって、候補化合物を、該候補化合物がＧＡＰＤＨと複合体を形成することを可能にする条件下でＧＡＰＤＨと接触させることを含み、該複合体の形成が、前記候補化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であることを意味する、化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であるか否かを判定する方法にも関する。
【０００９】
さらに本発明は、炎症性サイトカインによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療するためのＧＡＰＤＨ阻害剤の使用に関する。
【００１０】
本発明は更に、炎症性サイトカインによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する薬物の調製のためのＧＡＰＤＨ阻害剤の使用に関する。
【００１１】
本発明の更なる目的は、以下の記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＬＰＳでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７細胞が、ＧＡＰＤＨ（すなわち、図面中ではＦ３５０と表示される）放出の遅延を示すことを示す図である。
【図２】ＧＡＰＤＨ処理（すなわち、図面中ではＦ３５０処理）が、ＲＡＷ２６４．７細胞からＴＮＦ反応を誘発することを示す図である。
【図３】ＴＬＲ４受容体を欠損したマクロファージが、ＧＡＰＤＨ（すなわち、図面中ではＦ３５０）に対して有意な反応を開始しないことを示す図である。
【図４】ＧＡＰＤＨ（すなわち、図面中ではＦ３５０）が、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞におけるＴＬＲ４受容体を介した炎症性シグナル伝達経路を活性化することを示す図である。
【図５】α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８ポリクローナル抗体（すなわち、図面中ではα−Ｆ３５０  ＃４４１８ポリクローナル抗体）が、ヒト全血アッセイにおいてＧＡＰＤＨ（すなわち、図面中ではＦ３５０）を中和することを示す図である。
【図６】精製組み換えＧＳＴ−ＧＡＰＤＨ（すなわち、図面中ではＧＳＴ−Ｆ３５０）が安定な四量体であることを示す図である。
【図７】精製ＧＳＴ−ＧＡＰＤＨが培養マクロファージから炎症反応を誘発することを示す図である。
【図８】精製ＧＳＴ−ＧＡＰＤＨがヒト全血から炎症性サイトカイン反応を誘発し、ＧＡＰＤＨに対する炎症反応がＬＰＳと相乗作用を示すことを示す図である。
【図９】精製組み換えＧＳＴ−ＧＡＰＤＨによるチャレンジがマウスにおいて病気を引き起こすことを示す図である。
【図１０】ＧＡＰＤＨ炎症活性がタンパク質分解断片によって維持されることを示す図である。
【図１１】同様にＧＡＰＤＨ炎症活性がタンパク質分解断片によって維持され、その大きな断片がプロテイナーゼＫ処理後でも無傷のままであることを示す図である。
【図１２】ＧＡＰＤＨ抗体がｃａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡにおいて機能することを示す図である。
【図１３】抗ＧＡＰＤＨ  ４４１８抗体がヒト全血アッセイにおいて中和作用を有することを示す図である。
【図１４】抗ＧＡＰＤＨ  ４４１８抗体が、マウスにおける致死性内毒素血症中の生存を改善することを示す図である。
【図１５】ＴＬＲ４  ＫＯマクロファージがＧＡＰＤＨ（すなわち、図面中ではＦ３５０）に対して反応を示さないことを示す図である。
【図１６】ペプチド４抗血清に由来するＩｇＧ（ウサギ４４１８）が、ＲＡＷ細胞抽出物に対して高い特異性及び感受性を有することを示す図である。
【図１７】ヒトマクロファージからのＧＡＰＤＨ放出の半定量的ウエスタンブロット分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上記で論考したように、本発明は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法であって、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する該被験体を治療するのに有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤を該被験体に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがあるか、又はその病態を有する被験体を治療する方法に関する。本発明の方法に従うと、被験体が炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態を有する場合、治療的に有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤の投与によって病態を治療する。被験体に炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態のリスクがある（at risk for）場合、予防的に（prophylactically）有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤を被験体に投与するのが好ましい。本明細書中で使用される場合、「治療的に有効な量」は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態を治療、軽減又は調節するのに有効な量である。本明細書中で使用される場合、「予防的に有効な量」は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態を発症するリスクがある患者において、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態を予防するか、又は最低でもその重症度を減少させるのに有効な量である。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態」は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス(sepsis)、敗血症(septicemia)、内毒素性ショック、悪液質、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、寄生虫感染、細菌感染、ウイルス感染、自己免疫疾患、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、蕁麻疹、疣贅、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、脳梗塞、脳塞栓、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、ビュルガー病、ライター症候群並びにホジキン病からなる群から選択される病態である。
【００１５】
好ましい実施形態では、炎症性サイトカインによって媒介される病態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶反応並びに移植片対宿主病からなる群から選択される病態である。最も好ましくは、炎症性サイトカインによって媒介される病態はセプシス、敗血症又は内毒素性ショックである。
【００１６】
好ましい実施形態では、ＧＡＰＤＨ阻害剤は、ＧＡＰＤＨに特異的に結合する抗体結合部位を含む作用物質、例えば抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）、抗体のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ）2断片である。かかる作用物質は既知の方法によって作製することができ、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号及び同第４，８１６，３９７号（参照により援用される））、ヒト化抗体（米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，５６５，３３２号（参照により援用される））、一本鎖Ｆｖ（米国特許第４，９４６，７７８号（参照により援用される））、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ複合体（例えば、二量体及び三量体）及びミニボディ等の改変抗原結合分子を含む。非限定的な方法としては、ＧＡＰＤＨ（又はその断片）による動物の免疫化、続く血清からの抗ＧＡＰＤＨ抗体の単離、若しくは脾細胞と骨髄腫細胞との融合によって作製されたハイブリドーマからの抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体の産生；又はファージ提示法若しくは他の組み換え方法が挙げられる。好ましくは、モノクローナル抗体は治療を受ける種に合うように選択するか、又は適合させる。例えば、ヒトの治療については、抗ＧＡＰＤＨ抗体（又はその抗原結合断片）はヒト抗体又はヒト化抗体である。かかる抗原特異的なヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の様々な方法によって開発することができる。
【００１７】
他の実施形態では、ＧＡＰＤＨ阻害剤は、米国特許出願公開第２００６／０２９３３２５号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のＧＡＰＤＨ阻害剤等の当該技術分野で既知のＧＡＰＤＨ阻害剤であり得る。
【００１８】
炎症性サイトカインによって媒介される病態の治療（又は炎症性）サイトカインによって媒介される病態のリスクがある被験体の治療）にＧＡＰＤＨ阻害剤を使用する場合、ＧＡＰＤＨ阻害剤が単位投与形態において薬学的に許容可能な担体中に配合された物の調製にＧＡＰＤＨを使用することができることは本発明の範囲内である。この点において、これらの実施形態に有用な医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物への投与のための過度の実験を行うことなく、所望の投与方法に応じて適切に配合することができる。さらに、組成物の適当な投与量は、過度の実験を行うことなく、標準的な用量反応プロトコルを用いて決定することができる。
【００１９】
例えば、経口投与、舌側（lingual）投与、舌下投与、頬側投与及び口腔内（intrabuccal）投与用に設計された医薬組成物は、過度の実験を行うことなく、当該技術分野で既知の手段、例えば不活性希釈剤又は食用担体を用いて作製することができる。組成物をゼラチンカプセル内に封入しても、又は圧縮して錠剤にしてもよい。治療的な経口投与の目的で、本発明の医薬組成物を賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤、チューインガム等の形態で使用してもよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、結合剤、レシピエント、崩壊剤、滑沢剤、甘味料及び香料を含有していてもよい。結合剤の幾つかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としては、デンプン又はラクトースが挙げられる。崩壊剤の幾つかの例としては、アルギン酸、コーンスターチ等が挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カリウムが挙げられる。流動促進剤の一例はコロイド状二酸化ケイ素である。甘味料の幾つかの例としては、スクロース、サッカリン等が挙げられる。香料の例としては、ペパーミント香料、サリチル酸メチル、オレンジ香料等が挙げられる。これらの様々な組成物を調製するために使用される材料は、薬学的に純粋でかつ使用される量で非毒性であるものとする。
【００２０】
本発明に有用な医薬組成物は、非経口的に、例えば静脈注射、筋肉注射、髄腔内注射又は皮下注射によっても投与することができる。非経口投与は、本発明の組成物を溶液又は懸濁液中に組み入れることによって達成することができる。かかる溶液又は懸濁液としては、注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒等の滅菌希釈剤を挙げることもできる。非経口製剤は、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム等の酸化防止剤、及びＥＤＴＡ等のキレート剤を含んでいてもよい。酢酸緩衝剤（acetates）、クエン酸緩衝剤（citrates）又はリン酸緩衝剤（phosphates）等の緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の等張化剤（agents for the adjustment of tonicity）を添加してもよい。非経口調製物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多人数用バイアルに封入することができる。
【００２１】
直腸投与は、医薬組成物を直腸又は大腸に投与することを含む。これは坐薬又は浣腸剤を用いて達成することができる。坐薬製剤は当該技術分野で既知の方法によって容易に作製することができる。例えば、坐薬製剤は、グリセリンを約１２０℃まで加熱し、組成物をグリセリンに溶解させ、加熱したグリセリンを混合し（その後精製水を添加してもよい）、加熱混合物を坐薬鋳型内に注ぎ入れることによって調製することができる。
【００２２】
経皮投与は、皮膚を通した組成物の経皮吸収を含む。経皮製剤としては、パッチ（既知のニコチンパッチ等）、軟膏剤、クリーム、ジェル、軟膏等が挙げられる。
【００２３】
本発明は、経鼻投与に好適な担体中に配合したＧＡＰＤＨ阻害剤を哺乳動物に経鼻投与することも含む。本明細書中で使用される場合、「経鼻投与する」又は「経鼻投与」は、組成物を患者の鼻道又は鼻腔の粘膜に投与することを含む。本明細書中で使用される場合、「組成物の経鼻投与のための医薬組成物」は、例えば鼻腔用スプレー、点鼻薬、懸濁液、ジェル、軟膏、クリーム又は粉末として投与されるように既知の方法によって調製した組成物中に配合された治療的に有効な量のＧＡＰＤＨ阻害剤を含む。組成物の投与は、鼻タンポン又は鼻スポンジを用いて行なってもよい。
【００２４】
多くの実施形態について、最大限の抗炎症効果を達成するためには、ＧＡＰＤＨ阻害剤が血流中に可能な限り迅速に導入されるように、ＧＡＰＤＨ阻害剤を非経口的に、好ましくは静脈内に投与することが所望されると予想される。
【００２５】
本発明は、化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であるか否かを判定する方法にも関する。該方法は、候補化合物を、該候補化合物がＧＡＰＤＨと複合体を形成することを可能にする条件下でＧＡＰＤＨと接触させる工程を含む。複合体の形成は、候補化合物が炎症性サイトカインによって媒介される病態を調節する上で潜在的に有効であり、炎症性サイトカインによって媒介される病態の治療、又は炎症性サイトカインによって媒介される病態のリスクがある被験体の治療に使用することができることを意味する。接触は、当該技術分野で既知の標準的な手順を用いて行われる。
【００２６】
ＧＡＰＤＨの阻害剤である潜在的な薬剤又は化合物のスクリーニングに関して、炎症性サイトカインによって媒介される病態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、寄生虫感染、細菌感染、ウイルス感染、自己免疫疾患、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、蕁麻疹、疣贅、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、脳梗塞、脳塞栓、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、ビュルガー病、ライター症候群並びにホジキン病からなる群から選択される病態である。
【００２７】
好ましい実施形態では、ＧＡＰＤＨ阻害剤のスクリーニングの目的で、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される病態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎及び虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶反応並びに移植片対宿主病からなる群から選択される病態である。最も好ましくは、ＧＡＰＤＨ阻害剤のスクリーニングの目的で、炎症性サイトカインによって媒介される病態は、セプシス、敗血症又は内毒素性ショックである。
【００２８】
本発明は、以下の実験の詳細からより良く理解される。しかしながら、論考される具体的な方法及び結果が、その後に続く特許請求の範囲においてより十分に記載される本発明の単なる例示に過ぎないことを当業者は容易に理解するであろう。
【実施例】
【００２９】
実験の詳細
方法
ＧＡＰＤＨのホモログが研究対象のあらゆる界及び門で同定されているように、ＧＡＰＤＨは高度の進化的保存性を有するため、これを候補炎症性サイトカインとして研究に選択した。ヒトＧＡＰＤＨホモログと、ヒト疾患を引き起こす溶血性大腸菌（Escherichia coli）、チフス菌（Salmonella typhii）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）等を含む幾つかの細菌において見られるＧＡＰＤＨホモログとの間に相当なアミノ酸配列同一性が存在するため、ＧＡＰＤＨは特に関心が持たれていた。ヒトＧＡＰＤＨホモログと比較した、選択された種において見られるＧＡＰＤＨホモログの同一性（％）及び類似性（％）を下記表１に示す。
【００３０】
【表１】
2013503158.tif 000003
【００３１】
ＧＡＰＤＨタンパク質配列アラインメント
ＧＡＰＤＨタンパク質配列を、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧＡＰＤＨタンパク質配列アラインメントデータベースから入手した。タンパク質配列アラインメントを、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のＴ−Ｃｏｆｆｅｅ多重配列アラインメントサーバー［http://www.ebi.ac.uk/Tools/t-coffee/index.html］を用いて行い、ＧＡＰＤＨホモログ間の同一性（％）及び類似性（％）を、これらのアラインメントの結果に基づいて算出した。
【００３２】
細胞培養
マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞を、アメリカンタイプティッシュコレクション（ＡＴＴＣ）から入手した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（BioWhittaker）、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（全てSigma製）を添加したダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）（Gibco）中で培養した。Ｒａｗ２６４．７培養物を５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベートした。細胞周期を遅らせて細胞集団を同調させる目的で、細胞を１％ＦＢＳ培地中で血清除去した。細胞の血清除去はまた、利用可能な成長因子を制限し、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの活性化につながる経路における細胞内シグナル伝達のレベルを最小限に抑える。興味深いことには、細菌内毒素（ＬＰＳ）等の免疫チャレンジによってもＭＡＰキナーゼが活性化され、炎症反応が生じ、それにより高レベルのＦＢＳのために、本研究の調査対象の特異的な免疫チャレンジによって誘発されるＭＡＰキナーゼシグナルの検出が妨げられる恐れがある。ＲＡＷ２６４．７細胞はおよそ７０％コンフルエンスで使用し、全ての処理を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地中で行った。
【００３３】
野生型のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、ＴＬＲ４又は終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）欠損マウスから採取した腹腔マクロファージを、１０％ＦＢＳ、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Gibco）に再懸濁し、２４ウェルＰｒｉｍａｒｉａ組織培養プレート（Falcon）に１×１０6細胞／ウェルでプレーティングした。培養物を５％ＣＯ2下、３７℃で２４時間維持した。実験の３０分前に培養培地を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地に交換し、全ての処理を記載の通りに無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地中で行った。
【００３４】
ＧＡＰＤＨ産生のためにＬＰＳでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７細胞
およそ７０％コンフルエンスのＲＡＷ２６４．７細胞を、処理前に無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Gibco）中で２０分間維持した。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma）（使用前におよそ３０分間超音波処理した）によって、４つの時点（２４時間、２１時間、１８時間及び１６時間）からなる時間経過でチャレンジした。次いで、培地サンプルを管に移し、細胞をＭ細胞溶解試薬（Sigma）で溶解した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce）を細胞溶解物に対して行い、その結果を用いて、ウエスタンブロットによって培地中で検出されたＧＡＰＤＨレベルに寄与する細胞の量について標準化した。サンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Biorad）に転写した。膜を５％ミルクで２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴ中１０００倍の希釈率のＦ３５０に指向性を有するウサギ抗血清から精製したＩｇＧで２時間プロービングした。結合した抗Ｆ３５０抗体を、２．５％ミルクで２０００倍に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Abcam）で１時間検出した。ブロットを増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（Pierce）で展開し、高感度Ｘ線フィルム（Kodak）に感光させることによって視覚化した。
【００３５】
サイトカイン誘発のためにＧＡＰＤＨでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７細胞
およそ７０％コンフルエンスのＲＡＷ２６４．７細胞を、処理前に無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中で２０分間維持した。細胞を或る濃度範囲の精製組み換えＧＡＰＤＨ（その場で産生された）でチャレンジして、炎症メディエーター産生の濃度依存的反応性を判定した。濃度範囲は、５倍希釈系列での７つのＧＡＰＤＨ濃度（５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌ）からなるものであった。細胞を３７℃及び５％ＣＯ2で４時間インキュベートした（ＴＮＦ）。処理後、培地を採取して管に移し、Ｍ細胞溶解試薬を細胞にアプライした。タンパク質アッセイを細胞溶解物に対して行い、このデータを用いて、ＴＮＦ放出に寄与する細胞の量について標準化した。培地サンプルを、マウスＴＮＦに指向性を有する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）に供した（全てのＥＬＩＳＡ試薬はR+D systemsから入手した）。これらのＥＬＩＳＡプレートは、製造業者の推奨に従って準備し、実行した。簡潔に述べると、サンプルをロッカー上、４℃で一晩ＥＬＩＳＡプレートにおいてインキュベートした。プレートを、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０を添加したリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２０００倍に希釈した検出抗体をプレートに２時間アプライした。プレートを再度上記の通りに洗浄し、１％ＢＳＡで２０００倍に希釈したストレプトアビジン（streptavidin）−ＨＲＰをプレートに１５分間アプライした。プレートを再度上記の通りに洗浄した後、基質試薬を各々のウェルにアプライすることによって展開した。標準曲線が明らかになった時点で（通常は８分〜１０分）、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加することによって反応を停止した。
【００３６】
シグナル伝達経路活性化のためにＧＡＰＤＨ又はＬＰＳでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７細胞
およそ７０％コンフルエンスのＲＡＷ２６４．７細胞を、処理前に無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中で２０分間維持した。細胞をＧＡＰＤＨ又はＬＰＳのいずれかによって、７つの時点（１８０分、１２０分、６０分、３０分、１５分及び０分）を含む時間経過でチャレンジした。ＧＡＰＤＨ処理は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉで５０μｇ／ｍｌに希釈した精製ＧＡＰＤＨによるものであった。ＬＰＳ処理は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉで２０ｎｇ／ｍｌに希釈したＬＰＳ（使用前におよそ３０分間超音波処理した）によるものであった。経時的実験に用いた処理は、時点間の培養温度を維持するために３７℃の水浴中でインキュベートし、使用前に５分間超音波処理するものであった。処理が終了した後、プレートを氷上に置き、培地をウェルから吸引し、即座に氷冷細胞溶解バッファー［１％ＳＤＳ、０．１％ＮａＮ３、及びＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Pierce）に添加したＭ細胞溶解試薬］に交換した。細胞にアプライすると、バッファーは瞬間的かつ完全な細胞溶解に起因する高粘性溶液を形成する。溶解物を擦り取り、小ゲージ（２６ｇ）針を有する１ｍｌ容滅菌注射器を用いてサンプルを管に移した。溶解物をホモジナイズするために、サンプルをおよそ２０回注射器に出し入れした。次いで、サンプルを１４０００回転毎分（ｒｐｍ）で５分間、微量遠心機で遠沈した後、ホモジナイズしたチャレンジ細胞の溶解物に対しＢＣＡタンパク質アッセイを行った。次いで、これらのタンパク質アッセイによる結果を用いて、４０μｌの最終容量でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各々のウェルにロードしたタンパク質のレベルを標準化した。次いで、ゲルをＰＶＤＦ膜に転写した後、これを５％ミルクで２時間ブロッキングした。次いで、２．５％ミルクを添加したＰＢＳＴで１０００倍に希釈した、Ｂ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー核因子阻害剤α（ＩκＢα）又はｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化形態のいずれかに指向性を有する特異的抗体（Cell Signaling Technologies）で膜をプロービングし、ロッカー上、４℃で一晩インキュベートした。結合したＩκＢα抗体を、２．５％ミルク中でのＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧの２０００倍希釈物を用いて検出し、結合したＪＮＫ抗体を、２．５％ミルク中でのＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧの２０００倍希釈物を用いて検出した。この二次抗体とともに膜を２時間インキュベートした。ブロットを、電気化学発光ＥＣＬ検出試薬を用いて展開し、Ｘ線フィルムに感光させることによって視覚化した。
【００３７】
ヒト全血アッセイにおけるα−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗体の中和活性
ヒト全血を、ロングアイランド血液サービスの匿名提供者から得た。血液を４８ウェルプレートに２５０μｌ／ウェルで分注した。次いで、アリコートを記載の通りに３７℃で４時間処理した。サンプルを室温、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して血漿を分離した。血漿中のＴＮＦレベルを上記のようにＥＬＩＳＡによって決定した。
【００３８】
プロテインＡ／Ｇセファロース（Pierce）を用いて、α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗血清に由来するＩｇＧを精製した。精製ＩｇＧを用いて、ＧＡＰＤＨ活性を中和するα−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８の能力について試験した。ＧＡＰＤＨ（１０ｕｇ／ｍｌ）単独、ＧＡＰＤＨ＋非特異的ウサギＩｇＧ（１００ｕｇ／ｍｌ）、ＧＡＰＤＨ＋α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８（１００ｕｇ／ｍｌ）、α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８単独、非特異的ウサギＩｇＧ単独という６つの条件を試験した。ＧＡＰＤＨ＋α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８処理については、混合物を全血にアプライする前に室温で３０分間プレインキュベートした。
【００３９】
結果及び考察
ＬＰＳでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７細胞はＧＡＰＤＨ放出の遅延を示す
サイトカインは、感染又は損傷等の免疫学的チャレンジに応答して免疫細胞によって放出されるシグナル伝達分子である。したがって、免疫細胞を細菌内毒素（ＬＰＳ）チャレンジによって活性化すると、免疫細胞はサイトカイン反応を開始するはずである。したがって、ＧＡＰＤＨがサイトカインとして機能する場合、ＧＡＰＤＨはＬＰＳ活性化マクロファージによって時間依存的に誘発されるはずであると推論した。この仮説を検証するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳでチャレンジし、培養上清中のＧＡＰＤＨを種々の時点で測定した。図１に示されるように、結果はＧＡＰＤＨが活性化免疫細胞から時間依存的に放出されることを示す。ＬＰＳ処理の１６時間後では、培養上清が検出可能なＧＡＰＤＨを示さなかったことを見出した。処理の１８時間後にＧＡＰＤＨが培養上清中に現れ、処理の２４時間後までに徐々に増加した。非チャレンジ細胞は、２４時間後に培養上清中に微量のＧＡＰＤＨしか示さなかった。これは、ＧＡＰＤＨがＬＰＳ刺激後遅くに先天性免疫細胞から放出されることを示し、ＧＡＰＤＨが免疫チャレンジ中に後期作用サイトカインとして機能することができ、したがって早期サイトカインメディエーターとは対照的に、病的炎症状態において治療標的とすることができることを示唆しているため、重要である。
【００４０】
ＧＡＰＤＨ処理は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞からサイトカイン反応を誘発する
サイトカインは炎症性疾患を媒介し得る。マクロファージ等の先天性免疫細胞は、炎症誘発性サイトカインに遭遇すると、異物の侵入から身体を防御する準備をすることによって反応する。この反応の重要な一面は、より多くの炎症誘発性サイトカインを放出することによって、より多くの免疫細胞に体内の危険について警告を発することである。したがって、ＧＡＰＤＨが炎症性サイトカインとして作用する場合、マクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞がＧＡＰＤＨ処理に応答して、炎症性疾患の早期サイトカインメディエーターである［１、２、８、９、２７］、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を産生すると仮定した。ＴＮＦは通常、処理のおよそ４時間後に免疫細胞の順化培地において相当量測定される。ＲＡＷ２６４．７細胞を、５倍希釈系列（５０μｇ／ｍｌ〜０．０１６μｇ／ｍｌ）の精製組み換えヒトＧＡＰＤＨで処理し、続いてＴＮＦの産生及び培地への放出をＥＬＩＳＡによって測定した。ＧＡＰＤＨ処理の４時間後、順化培地を採取し、ＴＮＦのレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。これらの結果を細胞溶解物中の細胞タンパク質の量に対して標準化した。これを図２に示す。ＧＡＰＤＨは実際に、ＲＡＷ２６４．７細胞からＴＮＦを濃度依存的に誘導する。５０μｇ／ｍｌのＧＡＰＤＨで処理した細胞は、細胞タンパク質１ｍｇ当たりおよそ２２５０ｐｇのＴＮＦ放出を引き起こした。この反応は１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでの処理に相当していた。したがって、本発明者らの仮説と合致して、ＧＡＰＤＨは細胞の炎症誘発性メディエーターの放出を促進することによって先天性免疫反応を誘導し、ＧＡＰＤＨが病的炎症の炎症誘発性サイトカインメディエーターとして機能することができることが示される。
【００４１】
ＧＡＰＤＨは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞におけるＴＬＲ４受容体を介した炎症性シグナル伝達経路を活性化する
先天性免疫細胞活性化は、炎症反応に至る細胞内シグナル伝達経路を開始する細胞表面受容体に対する微生物産物（ＰＡＭＰ）、内因性危険シグナル伝達分子（ＤＡＭＰ）又は炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−６等）の作用に起因する。様々なサイトカインによって利用される細胞表面受容体が多く存在するが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）がＰＡＭＰ及びＤＡＭＰを認識する上で中心的な役割を果たす。ＴＬＲ及びその下流のシグナル伝達成分は、ホモログが脊椎動物のみならず無脊椎動物においても見られるため、後生動物の進化において高度に保存されている。哺乳動物においては、各々がＰＡＭＰ類又はＤＡＭＰ類を認識する能力が異なる、１１個ものＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０及びＩＬ−１受容体を含む）が存在する［２２〜２５］。例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６はアシル化リポタンパク質を認識し、ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は一本鎖ウイルスＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は細菌ＣｐＧ  ＤＮＡを認識し、ＴＬＲ４は主要な細菌内毒素（ＬＰＳ）受容体である。ＴＬＲ２及びＴＬＲ４は、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）及びＨＭＧＢ１を含む様々なＤＡＭＰの認識にも関与していた［２２〜２６］。ＨＭＧＢ１のようなシグナル伝達タンパク質は、炎症進行の後期に活性化免疫細胞から分泌されるとサイトカインとしても機能するため、ＧＡＰＤＨが同様に、ＤＡＭＰ又はサイトカインとしてＴＬＲ受容体媒介経路を介して炎症シグナル伝達を活性化すると推論した。したがって、ＧＡＰＤＨが、ＨＭＧＢ１シグナル伝達活性にも関与していたＴＬＲ２、ＴＬＲ４又は終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）が欠損した動物から採取したマクロファージから炎症反応を活性化し得るか否かを試験した。
【００４２】
図３に示すように、野生型マクロファージは、５０μｇ／ｍｌのＧＡＰＤＨでの処理に対して盛んに反応し、細胞タンパク質１ｍｇ当たりおよそ６０００ｐｇのＴＮＦを放出した。ＲＡＧＥ又はＴＬＲ２のいずれかを欠損した細胞も、５０μｇ／ｍｌのＧＡＰＤＨでの処理に対して盛んに反応し、細胞タンパク質１ｍｇ当たりおよそ４５００ｐｇ及び５０００ｐｇのＴＮＦをそれぞれ放出し、野生型対照とは有意に異ならなかった。対照的に、ＴＬＲ４を欠損したマクロファージはＧＡＰＤＨに対する有意な反応を開始しなかった。このデータは、ＴＬＲ４がＧＡＰＤＨの主要な細胞表面受容体であることを示し、ＧＡＰＤＨが、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を活性化することによってマクロファージから炎症反応を誘発することを示唆している。
【００４３】
ＴＬＲ４が主要な受容体（それを介してＧＡＰＤＨが炎症反応を誘発する）であることと合致して、ＧＡＰＤＨでのＲＡＷ２６４．７細胞の処理によって、ＴＬＲ４の下流にあるシグナル伝達経路が活性化されることを見出した。ＴＬＲ４受容体シグナル伝達経路の活性化は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化につながる。ＮＦ−κＢは、ＴＬＲ活性化に応答した炎症メディエーターの産生に必要とされる転写因子である［２１］。ＮＦ−κＢは、免疫細胞の細胞質においてＢ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー核因子阻害剤α（ＩκＢα）によって不活性形態で維持される。したがって、ＩκＢα分解（細胞溶解物中のレベルの低下としてウエスタンブロット分析によって容易に検出される）は、ＮＦ−κＢの活性化に直接対応する。加えて、ＴＬＲ４受容体の刺激によって、マイトジェンに対して反応を示し、多くの細胞活性を調節するセリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼであるマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼが活性化される。かかるＭＡＰキナーゼの１つは、ＴＬＲ４シグナル伝達によって強く活性化されるｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）である［２２、２４］。したがって、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞においてＩκＢαの分解及びＪＮＫの活性化を引き起こすＧＡＰＤＨ処理の能力を測定した。
【００４４】
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞を、５０μｇ／ｍｌのＧＡＰＤＨ又は２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかによって、１８０分〜０分の範囲にわたる６つの時点からなる時間経過でチャレンジした。処理が完了した後、培地を吸引し、細胞溶解バッファーを細胞にアプライした。分離用のＳＤＳＰＡＧＥゲルの各々のウェルにロードしたタンパク質の量を標準化するために、細胞溶解物に対してタンパク質アッセイを行った。次いで、ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、ＧＡＰＤＨ又はＬＰＳでチャレンジした細胞に由来する溶解物に対してウエスタンブロット分析を行った。図４に示されるように、ＧＡＰＤＨ処理によってＮＦ−κＢ及びＪＮＫのシグナル伝達経路が活性化されることを見出した。ＬＰＳでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞では、ＩκＢαの基礎レベルは時間とともに低下して、ゆっくりとベースラインまで戻り、このことからＮＦ−κＢ経路の一時的活性化が示唆された。ＲＡＷ２６４．７細胞をＧＡＰＤＨでチャレンジすると、ＩκＢαの基礎レベルが劇的に低下し、処理の３０分後までにはほとんど検出不能になり、次いでゆっくりとベースラインまで戻った。このほぼ量的なＩκＢα分解は、ＧＡＰＤＨ処理の３０分後のＮＦ−κＢ経路の非常に強力な活性化を示唆している。
【００４５】
ＲＡＷ２６４．７細胞では、ＪＮＫ経路の基礎活性は最初のうちは低かった。しかしながら、ＬＰＳチャレンジ後にＪＮＫ活性化が急速に刺激され、３０分後には約２倍にまで増加した。ＬＰＳ処理の６０分後には、ＪＮＫ活性化は約７倍にまで増加した。興味深いことに、細胞をＧＡＰＤＨで処理した場合、活性化ＪＮＫのレベルははるかに速い速度で増加した。ＧＡＰＤＨチャレンジの３０分後には、活性化ＪＮＫレベルのおよそ８倍の増加が観察され、６０分後にはおよそ１５倍の増加にまで上昇した。これらの結果から、ＧＡＰＤＨが、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ及び炎症誘発性サイトカイン等の炎症分子によって刺激される細胞内シグナル伝達経路を活性化することが示される。これらの発見は、ＧＡＰＤＨが、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を活性化する内因性炎症メディエーターであるという仮説を支持するものである。
【００４６】
α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８ポリクローナル抗体は、ヒト全血アッセイにおいてＧＡＰＤＨを中和する
先述の通り、ＧＡＰＤＨでチャレンジしたＲＡＷ２６４．７マクロファージ様マウス細胞は、ＴＮＦ及びＩＬ−６等の炎症誘発性サイトカインメディエーターを放出する。本発明者らは究極的にはヒト炎症性疾患に関心を持っていたため、次にＧＡＰＤＨがｅｘ  ｖｉｖｏのヒト全血からも炎症反応を誘発し得るか否かを試験した。また、ＧＡＰＤＨに指向性を有する抗体がヒト全血においてその炎症活性を中和し得るか否かを試験するために、このアッセイシステムを使用した。図５に示されるように、精製組み換えＧＡＰＤＨは、ヒト全血から強いＴＮＦ反応を誘発する。ＧＡＰＤＨ処理の４時間後、サンプルを回収し、血漿を遠心分離によって分離した。次いで、血漿ＴＮＦレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、１０μｇ／ｍｌのＦ３５０でのチャレンジがおよそ４５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを生じたことが示された。次に、精製組み換えＧＡＰＤＨをα−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗血清に由来する精製ＩｇＧで前処理した。次いで、この混合物を全血にアプライした。α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８でのＧＡＰＤＨの前処理によって、ＧＡＰＤＨでチャレンジしたヒト全血から誘発されるＴＮＦレベルがおよそ５０％低下した。しかしながら、α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗体はアフィニティー精製されず、ウサギ抗血清に由来する全ＩｇＧのごく一部しかＧＡＰＤＨに指向性を有しなかった。したがって、アフィニティー精製抗体がより強い中和をもたらすと仮定される。ＧＡＰＤＨ炎症活性を中和するα−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗体の能力は、ヒト炎症性疾患における治療標的としてのＧＡＰＤＨの有効性を示すため、重要な観察項目である。
【００４７】
α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗体単独で処理した血液サンプルは、約６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを生じた。α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗体を、Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶解物アッセイ（ＬＡＬ）によってＬＰＳ混入について試験すると、タンパク質１ｍｇ当たり８ｐｇ〜２０ｐｇのＬＰＳを含有することが見出された（データは示さない）。このことは、α−ＧＡＰＤＨ  ＃４４１８抗体のみで処理した血液におけるＴＮＦ反応に寄与するようである。未刺激の全血が通常は検出可能なＴＮＦを含有しないことに留意されたい（データは示さない）。
【００４８】
更なる実験
更なる実験を行った。これらの実験の結果を図６〜図１７に示す。注目すべきことに、精製ＧＳＴ−ＧＡＰＤＨがヒト血液から炎症性サイトカイン反応を誘発することが見出され、ＧＡＰＤＨに対する炎症反応はＬＰＳと相乗作用を示した（図８を参照されたい）。加えて、或る特定の臨床スコアリングパラメータ（すなわち、立毛、閉眼、下痢、振戦、活動、相対温度（最大９点／マウス；ｎ＝６／群））の評価に基づき、精製組み換えＧＳＴ−ＧＡＰＤＨによるチャレンジがマウスにおいて病気を引き起こすことが見出された（図９を参照されたい）。ＧＡＰＤＨ炎症活性がタンパク質分解断片によって維持されることも見出された（図１０及び図１１を参照されたい）。更なる実験において、抗ＧＡＰＤＨ  ４４１８抗体がヒト全血アッセイにおいて中和作用を有することが見出され（図１３を参照されたい）、抗ＧＡＰＤＨ  ４４１８抗体の投与によってマウスにおける致死性内毒素血症中の生存が改善されることが見出された（図１４を参照されたい）。
【００４９】
結論
セプシスに対する現行の療法の大半は効果がない。セプシスの発症は非常に急速に起こる可能性があり、患者が気付かない場合もある。生物学的には、「サイトカインカスケード」が始まった矢先に、知覚される障害（すなわち感染、外傷、損傷）に対する身体の免疫系の反応が開始される。患者が病気であると認識する頃には、ＴＮＦ及びＩＬ−１のような早期炎症誘発性メディエーターが既に経過をたどっており、それらの標的化は効果がなくなっている［１、１０〜１２、１８、１９］。しかしながら、ＨＭＧＢ１等の病的炎症の後期メディエーターは、免疫細胞から未だ誘発されていない可能性がある。ただし、ＨＭＧＢ１は創傷治癒及び炎症の消散の促進にも関与するため、困難な状況をもたらす。その機能する能力を低減することは、不適切に標的化された場合に生物に悪影響をもたらす場合がある。したがって、活性範囲がＨＭＧＢ１ほど多面的ではない可能性がある、ＧＡＰＤＨ等の新規の後期炎症メディエーターを同定することが重要である。
【００５０】
ＧＡＰＤＨが炎症のメディエーターとして機能し得ることを示した。内毒素で処理した先天性免疫細胞は、サイトカインを放出し、病原体に対する身体の反応を増大させることによって反応する。ＧＡＰＤＨがマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞において内毒素処理の１６時間〜１８時間後に放出されることが見出された。炎症性サイトカインは、より多くの炎症性サイトカイン及び他の炎症メディエーターを免疫細胞から誘発する。このことはＧＡＰＤＨの場合にも当てはまっていた。ＧＡＰＤＨ処理をＲＡＷ２６４．７細胞に適用した場合、細胞は、２つの炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦ及びＩＬ−６を産生することによって反応した。炎症性サイトカインは、細胞内シグナル伝達経路を用いて免疫細胞を誘導し、適切に反応する。ＩκＢα分解及びＪＮＫ活性化は、炎症を促進する分子（すなわち、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、炎症誘発性サイトカイン）による炎症経路刺激の分子マーカーである。ＧＡＰＤＨ処理は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞に由来する溶解物において、ＩκＢαの分解及びＪＮＫの活性化の両方を引き起こし、炎症経路シグナル伝達を刺激し得ることが示される。興味深いことに、マクロファージからサイトカインを誘発するＧＡＰＤＨの能力は、ＨＭＧＢ１等の他の内因性メディエーターの炎症活性に関与していたパターン認識受容体である、ＴＬＲ４受容体に依存していた［２６］。
【００５１】
更なる実験では、精製組み換えＧＳＴ−ＧＡＰＤＨによるチャレンジが、マウスにおいて病気を引き起こすことが示され、ＧＡＰＤＨが病原性炎症の致死的進行において果たし得る役割が更に支持される。重要なことには、ＧＡＰＤＨに対して生成されたポリクローナル抗体（すなわち、抗ＧＡＰＤＨ  ４４１８抗体）は、ヒト全血アッセイにおいて中和作用を有することが見出され、抗ＧＡＰＤＨ  ４４１８抗体の投与は、マウスにおいて致死性内毒素血症の生存を改善することが見出された。このことから、ＧＡＰＤＨが炎症性疾患における臨床転帰を改善する治療標的として有用であること、並びにＧＡＰＤＨ阻害剤がセプシス及び関連病態等の炎症性疾患の治療に潜在的に有用であることが実証される。
【００５２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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