(57)【要約】  本発明は、薬剤としての、特に、蠕虫感染または免疫疾患を治療および／または予防するための、グリカン結合ポリペプチドおよびグリカンの使用に関する。さらに、本発明は、単離されたグリカンおよび／またはグリカン結合ポリペプチドを含む、対応する医薬組成物、食品および動物飼料を対象とする。さらに、本発明は、抗蠕虫炭水化物結合ポリペプチドを同定するため、蠕虫のグリカンおよびグリカンにより媒介される毒性に関与する遺伝子標的を同定するため、グリカンにより媒介される毒性に感受性のある蠕虫を同定するため、ならびに抗蠕虫および抗アレルギー物質を同定するための方法を教示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤としてのグリカン結合ポリペプチドの使用。
【請求項２】
グリカン結合ポリペプチドがＮ−グリカン結合ポリペプチドから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｎ−グリカン結合ポリペプチドが、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質と結合する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｎ−グリカン結合ポリペプチドが、フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質と結合する、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
グリカン結合ポリペプチドがＯ−グリカン結合ポリペプチドから選択され、Ｏ−グリカン結合ポリペプチドがガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物と結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
グリカン結合ポリペプチドが、リポグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質と結合するものから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
ポリペプチドが、好ましくは、毛様線虫科（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａｅ）、好ましくは、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、蛇状毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）、テラドルサジア・サークムシンクタ（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ  ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、クーペリア・オンコフォラ（Ｃｏｏｐｅｒｉａ  ｏｎｃｏｐｈｏｒａ）、ネマトディルス・バッタス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ  ｂａｔｔｕｓ）、オステルタジア・レプトスピアリアス（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｌｅｐｔｏｓｐｉａｒｉａｓ）、大口腸線虫（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ  ｏｖｉｎａ）、ブタ腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ  ｄｅｎｔａｔｕｍ）、ならびに線虫種の旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｕｒｉａ）、住血線虫（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｖａｓｏｒｕｍ）、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、セイロン鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、肺虫種（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ブタ回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、ロア糸状虫（Ｌｏａ  ｌｏａ）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）および糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）から選択される線虫により産生される少なくとも１つの線虫グリカンと結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ポリペプチドがレクチン、抗体、抗体のフラグメントまたは機能的誘導体および抗体様結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ポリペプチドが多価であり、従って少なくとも２つ以上のグリカンと結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
レクチンが真菌レクチン、好ましくは、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、キッコウアワタケ（Ｘｅｒｏｃｏｍｕｓ  ｃｈｒｙｓｅｎｔｅｒｏｎ）、シバフタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）またはソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のレクチン、より好ましくは、ＣＧＬ１、ＣＧＬ２、ＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ１、ＸＣＬ、ＭＯＡ、ＡＡＬおよびＴＡＰ１からなる群から選択されるレクチンの群から選択される、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
蠕虫感染、好ましくは線虫感染または免疫疾患を治療および／または予防するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
蠕虫感染、好ましくは線虫感染が、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される蠕虫によって起こる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
免疫疾患がアレルギー、好ましくは植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくはクローン病からなる群から選択される、請求項１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から好ましく選択されるＮ−グリカンの使用。
【請求項１５】
フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から好ましく選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物から好ましく選択される、Ｏ−グリカンの使用。
【請求項１７】
薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質から好ましく選択される、リポグリカンの使用。
【請求項１８】
（ｉ）グリカンが細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の表面に展示されるか、または（ｉｉ）グリカンが、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２およびアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）などの軟体動物のヘモシアニン、これらのいずれかの機能的フラグメントまたは機能的誘導体からなる群から好ましく選択される糖タンパク質の一部である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
蠕虫感染、好ましくは線虫感染または免疫疾患を治療および／または予防するための請求項１４〜の１８いずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
蠕虫感染、好ましくは、線虫感染が、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される蠕虫によって起こる感染である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
免疫疾患がアレルギー、好ましくは植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくはクローン病からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
グリカン結合ポリペプチドがＮ−グリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質と結合する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
グリカン結合ポリペプチドが、フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択されるＮ−グリカンと結合する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
グリカン結合ポリペプチドが、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物からなるＯ−グリカンの群から好ましく選択されるＯ−グリカンと結合する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
グリカン結合ポリペプチドが、リポグリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質と結合する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
グリカン結合ポリペプチドが、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生される少なくとも１つの線虫グリカンと結合する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
ポリペプチドがレクチン、抗体、抗体のフラグメントまたは機能的誘導体および抗体様結合タンパク質からなる群から選択される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
ポリペプチドが多価であり、従って少なくとも２つ以上のグリカンと結合する、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
ポリペプチドが、真菌レクチン、好ましくは、ウシグソヒトヨタケ、キッコウアワタケ、シバフタケ、ヒイロチャワンタケまたはソルダリア・マクロスポラ由来のレクチン、より好ましくは、レクチンＣＧＬ１、ＣＧＬ２、ＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ１、ＸＣＬ、ＭＯＡ、ＡＡＬおよびＴＡＰ１の群から選択されるレクチンである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
グリカン結合ポリペプチド（ｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅｓ）が細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、ヒト腸内細菌細胞、最も好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に提示される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質から選択されるＮ−グリカンを含む、薬組成物。
【請求項３３】
グリカンがフコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｏ−グリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
リポグリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
グリカンまたはリポグリカンが、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生されるものである、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
（ｉ）グリカンが細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に展示されるか、または（ｉｉ）グリカンが、好ましくは、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ凝集素（ＵＥＡ）、ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２およびアメリカカブトガニなどの軟体動物のヘモシアニン、これらのいずれかの機能的フラグメントまたは機能的誘導体からなる群から選択される糖タンパク質の一部である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
単離されたグリカン、複合糖質および／またはグリカン結合ポリペプチドを含む、食品。
【請求項３９】
単離されたグリカン、複合糖質および／またはグリカン結合ポリペプチドを含む、動物飼料。
【請求項４０】
寄生性蠕虫の組換えまたは天然消化性プロテアーゼ（その機能的フラグメントおよび機能的誘導体を含む）を含む、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の組成物、請求項３８に記載の食品、または請求項３９に記載の動物飼料。
【請求項４１】
グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを含む蠕虫、好ましくは、線虫を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、真菌、細菌および／または植物グリカン結合タンパク質、および任意選択の蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、最も好ましくは、該少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞を準備すること；
（ｂ）（ａ）の少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドおよび任意選択の蠕虫食餌細胞と、対象とする蠕虫細胞または蠕虫、好ましくは、線虫細胞または線虫とを、（ｉ）グリカン結合ポリペプチドが蠕虫細胞に結合することを可能とし、かつ／または（ｉｉ）蠕虫細胞または蠕虫に任意選択の食餌細胞を摂食させることを可能とする条件下で接触させること；および
（ｃ）死滅した蠕虫細胞または蠕虫を同定すること；
（ｄ）任意選択により、（ａ）の少なくとも１つの毒性グリカン結合ポリペプチドを同定すること；
（ｅ）任意選択により、少なくとも１つの毒性グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを同定すること
を含む、方法。
【請求項４２】
ステップａ）の少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドが蠕虫食餌細胞、好ましくは、大腸菌によって、より好ましくは、細胞質において活性型で発現される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
グリカン結合タンパク質と結合した際のグリカンにより媒介される毒性に関与する蠕虫遺伝子標的、好ましくは、線虫遺伝子標的、好ましくは、蠕虫グリカンおよび複合糖質の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子標的を同定する方法であって、
（ａ）グリカン特異性を有するグリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する特異的グリカンを産生する、ランダム突然変異および／または標的突然変異を有する蠕虫細胞または蠕虫、および任意選択の野生型蠕虫細胞または蠕虫を準備すること；
（ｂ）（ａ）の蠕虫細胞または蠕虫と、該グリカン特異性を有する少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドとを、任意選択により、蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、好ましくは、該少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞の存在下で接触させること；および
（ｃ）（ｂ）におけるグリカン結合ポリペプチドの接触から生き残る（ａ）の蠕虫細胞または蠕虫における突然変異遺伝子を同定すること
を含む、方法。
【請求項４４】
ステップｂ）の少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドが蠕虫食餌細胞、好ましくは、大腸菌によって、より好ましくは、細胞質において活性型で発現される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の毒性を媒介する遺伝子標的を同定する方法であって、毒性関連グリカンを同定する、好ましくは、
（ｄ．ｉ）ステップ（ｃ）の突然変異遺伝子と、特徴的な遺伝子、好ましくは、グリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、より好ましくは、蠕虫のグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とを比較するステップ；
（ｄ．ｉｉ）（ｃ）で同定された突然変異体のＮ−グライコーム、Ｏ−グライコームまたはリポグライコームと、野生型蠕虫のグライコームとを、好ましくは、個々の複合糖質の生化学的単離とクロマトグラフィーおよび質量分析によるそれらの分析によって比較するステップ；
（ｄ．ｉｉｉ）ステップ（ｃ）の遺伝子を異種系、例えば、昆虫細胞、好ましくは、ＳＦ９細胞において発現させ、その遺伝子産物の生化学的活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてアッセイするステップ
の１以上を包含するステップ（ｄ）をさらに含む、方法。
【請求項４６】
抗蠕虫物質、好ましくは、抗線虫物質を同定する方法であって、
（ａ）グリカンにより媒介される毒性に関与することが知られているグリカンを準備すること；
（ｂ）（ａ）のグリカンと対象物質とを接触させること；
（ｃ）（ａ）のグリカンと結合する対象物質を潜在的抗蠕虫物質、好ましくは、潜在的抗線虫物質として同定すること
を含む、方法。
【請求項４７】
（ａ）のグリカンが細胞、好ましくは、細胞表面の一部を形成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）のグリカンを含む細胞への対象物質の取り込みが増孔剤および／または該細胞に対する食餌細胞によって補助される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
グリカンが単離される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤としての、特に、蠕虫感染または免疫疾患を治療および／または予防するための、グリカン結合ポリペプチドおよびグリカンの使用に関する。さらに、本発明は、単離されたグリカンおよび／またはグリカン結合ポリペプチドを含む、対応する医薬組成物、食品および動物飼料を対象とする。さらに、本発明は、抗蠕虫炭水化物結合ポリペプチドを同定するため、蠕虫のグリカンおよびグリカンにより媒介される毒性に関与する遺伝子標的を同定するため、グリカンにより媒介される毒性に感受性のある蠕虫を同定するため、ならびに抗蠕虫および抗アレルギー物質を同定するための方法を教示する。
【背景技術】
【０００２】
寄生虫または蠕虫は、それらの宿主内で生き、生きた細胞を餌とする真核生物寄生体である。それらは条虫、吸虫および線虫に分類される。蠕虫により媒介される典型的疾患は、回虫症、メジナ虫症、象皮症、鉤虫症、リンパ管フィラリア症、糸状虫症、住血吸虫症および鞭虫症である。「回虫」または「線虫」は、最も多様な偽体腔動物門であり、あらゆる動物のうち最も多様なものの１つである。線虫種は識別が難しいが、８０，０００を超えるものが記載されており、そのうち１５，０００を超えるものが寄生性である。回虫種の総数は５００，０００を超えるものと推計されている。線虫は淡水、海水および陸上環境に遍在している。それらのほとんどは細菌および真菌の捕食者である。寄生形態には、植物、動物およびまたヒトの病原体も含む。
【０００３】
カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｃ．エレガンス）はモデル線虫であり、無体節、虫状、左右対称であり、角皮、４つの主要な表皮帯（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｏｒｄｓ）および体液で満たされた偽体腔を有する。野生では、Ｃ．エレガンスは、植物質の腐食時に増える細菌を餌とする。生物の糖生物学は盛んに研究されている（非特許文献１；非特許文献２に総説）。特に、Ｃ．エレガンスのＮ−グリコシル化パターンは十分に特性決定され、最近、非特許文献３に総説された。線虫（および軟体動物）のＮ−グリカンの特徴的な修飾として、非特許文献４は、Ｎ−グリカンコアのＮ−結合ＧｌｃＮＡｃ残基におけるＤ−ガラクトピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ−Ｆｕｃ）エピトープを単離し、構造的に特徴付けた。
【０００４】
捕食者、寄生体および病原体に対するレクチンに基づく防護系は自然界で広く用いられている。レクチンは、標的生物に対するそれらの毒性によって直接的エフェクターとして、または他のエフェクター分子もしくはエフェクター細胞のために標的生物を標識することによってオプソニンとして防護機能を果たす。前者の機構は草食動物に対する植物レクチンに一般的であり、後者の機構は病原体に対する動物レクチンに一般的である。最近、細菌および真菌に対する直接的エフェクターとして働く動物レクチンのいくつかの例が報告された（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
真菌は、特異性および折りたたみの異なる多数のレクチンを含む（非特許文献７）。これらのレクチンの多くは生殖器官である子実体で特異的に産生され、分泌のための従来のシグナル配列を欠く。これらの子実体レクチンの生理的な役割はまだ明らかでない。個々の遺伝子またはｍＲＮＡが不活性である場合には子実体表現型が無いことは、発生におけるこれらのレクチンの内因的役割に反論を投げかけている（非特許文献８；非特許文献９）。いくつかの生物（昆虫、線虫、アメーバー）および真菌を餌とする近縁種に対するこれら種々のレクチンの毒性は、子実体レクチンが捕食者および寄生体からの真菌の防護に役割を持つ可能性があることを示唆している（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００６】
線虫および植物はＮ−グリカンコアのＮ−結合ＧｌｃＮＡｃ残基にα−１，３−フコシル化を共通に持つ。このグリコエピトープは花粉の主要なアレルゲンの１つである（非特許文献１２）。第一世界の人々は、今日の衛生基準にあっては、線虫を含む蠕虫に曝されることが減ったというのが花粉および他の種のアレルギーを有する人の数が増えている理由の１つであると推測される（「衛生仮説」）。患者に比較的害の無い寄生性線虫を一時的に感染させることによるこのようなアレルギーの治療における最近の成功はこの仮説を裏付けるが、他の理由も持つ可能性がある（非特許文献１３）。いくつかの寄生性蠕虫では、Ｆｕｃ−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃエピトープもＮ−グリカンアンテナに存在し、宿主の免疫抑制に関連づけられている（非特許文献１４）。
【０００７】
特許文献１は、単糖β−チベロースが少なくとも１つのさらなる糖類と結合して、少なくとも１つのβ−チベロース末端残基を有するオリゴ糖を形成したものを、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）感染を検出する診断目的で、末端β−チベロースを認識する抗体に該オリゴ糖を提示するための担体と結合させて含む、診断試薬の使用を教示している。この筆者らはまた、「β−チベロースが旋毛虫寄生体において産生されるという知見に基づく治療薬」を極めて概略的に企図している。
【０００８】
特許文献２および特許文献３（双方ともＬ．Ｈ．  Ｓｅｍｐｒｅｖｉｏによる）には、１個の脂質基、１個以上のフコース基、フコース１個当たり３〜５個のガラクトサミン基、フコース１個当たり２〜４個のグルコサミン基、フコース１個当たり１〜２個のガラクトース基、フコース１個当たり１〜２個のグルコース基、フコース１個当たり１〜２個のラムノース基およびフコース１個当たり１〜３個のマンノース基を含む真核生物表面リポグリカンから得られたオリゴ糖に結合された担体基を含む、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、条虫類（ｃｅｓｔｏｉｄｅａｎ）、原虫病原体および潜在的病原性線虫に対する防護ワクチンが記載されている。線虫に関する概念実証は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，７０７，８１７号
【特許文献２】米国特許出願第２００２／０１６００２１  Ａ１号
【特許文献３】米国特許第７，０６３，８４８  Ｂ２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，  Ｗｏｒｍｂｏｏｋ，  １−２２，  ２００６
【非特許文献２】Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：６０７，  ２００４
【非特許文献３】Ｐａｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，  ３４３：２０４１，  ２００８）
【非特許文献４】Ｈａｎｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １６：８７４，  ２００６）
【非特許文献５】Ｃａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１３：１１２６，  ２００６
【非特許文献６】Ｋｏｈａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７７：４７１８，  ２００６
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｌｅｃｔｉｎｓ，  ｉｎ：  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ：  Ｆｒｏｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｔｄ．  ２００７
【非特許文献８】Ｎｏｗｒｏｕｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ５：６４，  ２００５
【非特許文献９】Ｗａｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｃｅｌｌ，  ５：７３２−７４４，  ２００６
【非特許文献１０】Ｔｒｉｇｕｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＢＡ，  １６２１：２９２−２９８，  ２００３
【非特許文献１１】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ２８：２６５−２６８，  ２００９
【非特許文献１２】Ｗｉｃｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３８５：３９７，  ２００４
【非特許文献１３】Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄ，  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １０４：２１７，  ２００９
【非特許文献１４】ｖａｎ  Ｄｉｅ  ａｎｄ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０：２，  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、蠕虫感染、特に、線虫感染および／または免疫疾患を治療および／または予防するための新たな手段を提供することである。さらに、本発明の目的は、蠕虫感染、特に、線虫感染および／または免疫疾患を治療および／または予防するための機能的食品および動物飼料を提供することである。さらに、蠕虫、特に、線虫において毒性媒介標的を同定する、および抗蠕虫および抗アレルギー物質を同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚くことに、グリカン結合ポリペプチドが、薬剤として、好ましくは、蠕虫感染、特に、線虫感染および／または免疫疾患を治療および／または予防するために使用可能であることが見出された。
【００１３】
よって、第１の態様において、上記の目的が、グリカン結合ポリペプチドの薬剤としての使用、すなわち、薬剤を製造するためのその使用によって解決される。
【００１４】
本明細書においてグリカンとは、単糖構成ブロックの結合、置換、修飾または属性に関してホモまたはヘテロな組成の単糖、オリゴ糖または多糖を指す。本来、グリカンは、結合および複合成分の種類、例えば、ポリペプチドまたは脂質によってＮ−グリカン、Ｏ−グリカンまたはリポグリカンに分類される。
【００１５】
本明細書において複合糖質とは、グリカンと、例えば、タンパク質、脂質、他の任意の分子種およびまた細胞から選択される担体分子との酵素的（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）または化学的に生産された複合体を指す。細胞グリカン複合体は好ましくは細胞表面に提示される。複合糖質の典型的な実施形態は、グリカンと、担体タンパク質、例えば、不活化細菌毒素またはキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、それらのリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）の一部として特異的グリカンを展示する遺伝子組み換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏ-ｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株との化学複合体である。
【００１６】
従って、本発明によるグリカン結合ポリペプチドは、少なくとも１つのグリカンと特異的に結合する、アミノ酸結合およびペプチド結合に基づく任意の化合物である。この用語は、オリゴペプチド、ならびにポリペプチドおよびオリゴペプチドの化学誘導体、例えば１以上のアミノ酸類似体を含むオリゴ／ポリペプチド、ならびにオリゴ／ポリペプチドとアミノ酸以外に基づく化学部分との複合体を包含する。この用語の範囲は、グリカン結合が本質的にペプチド成分により媒介されなければならないという必要性によって制限される。グリカン結合ポリペプチドの典型的な実施形態は、レクチン、抗体、抗体のフラグメントまたは機能的誘導体および抗体様結合タンパク質である。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明による医学的使用のためのグリカン結合ポリペプチドはＮ−グリカン結合ポリペプチドから選択される。
【００１８】
より好ましい実施形態では、医学的使用のためのＮ−グリカン結合ポリペプチドは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質と結合する。このようなＮ−グリカン結合ポリペプチドの例はレクチンＣＧＬ２であり、以下にさらに詳細に記載する。
【００１９】
より好ましい実施形態では、医学的使用のためのＮ−グリカン結合ポリペプチドは、フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質と結合する。このようなＮ−グリカン結合ポリペプチドの例はレクチンＲｅｄＡであり、以下にさらに詳細に記載する。
【００２０】
さらなる好ましい実施形態では、医学的使用のためのグリカン結合ポリペプチドは、Ｏ−グリカン結合ポリペプチドから選択される。
【００２１】
より好ましい実施形態では、医学的使用のためのＯ−グリカン結合ポリペプチドは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物と結合する。このようなＯ−グリカン結合ポリペプチドの例はレクチンＸＣＬおよびＴＡＰ１であり、双方とも以下にさらに詳細に記載する。
【００２２】
さらなる好ましい実施形態では、医学的使用のためのグリカン結合ポリペプチドは、リポグリカン結合ポリペプチドから選択される。
【００２３】
より好ましい実施形態では、医学的使用のためのリポグリカン結合ポリペプチドは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質と結合する。このようなリポグリカン結合ポリペプチドの例はＭＯＡ凝集素であり、以下にさらに詳細に記載する。
【００２４】
驚くことに、蠕虫グリカン、特に、線虫グリカンは、蠕虫感染および／または免疫疾患を治療および／または予防するため医学的有用性を有するグリカン結合ポリペプチドの標的として特によく適していることが見出され、実験的に実証された。
【００２５】
よって、好ましい実施形態では、本発明による医学的使用のためのグリカン結合ポリペプチドは、好ましくは、毛様線虫科（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａｅ）、好ましくは、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、蛇状毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）、テラドルサジア・サークムシンクタ（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ  ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、クーペリア・オンコフォラ（Ｃｏｏｐｅｒｉａ  ｏｎｃｏｐｈｏｒａ）、ネマトディルス・バッタス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ  ｂａｔｔｕｓ）、オステルタジア・レプトスピアリアス（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｌｅｐｔｏｓｐｉａｒｉａｓ）、大口腸線虫（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ  ｏｖｉｎａ）、ブタ腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ  ｄｅｎｔａｔｕｍ）、ならびに線虫種の旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｕｒｉａ）、住血線虫（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｖａｓｏｒｕｍ）、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、セイロン鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、肺虫種（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ブタ回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、ロア糸状虫（Ｌｏａ  ｌｏａ）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）および糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）から選択される線虫によって産生される少なくとも１つの線虫グリカンと結合することを特徴とする。
【００２６】
グリカン結合ポリペプチドの上記定義に関して、医学的使用のためのポリペプチドは、好ましくは、レクチン、抗体、レクチンおよび抗体のフラグメントまたは機能的誘導体、ならびに抗体様結合タンパク質からなる群から選択される。
【００２７】
本明細書において「レクチン」とは、炭水化物に対して特異的結合親和性を有する、アミノ酸結合およびペプチド結合に基づく任意の化合物を包含する。一般に、「レクチン」とは、特異的な炭水化物結合を特徴とする、自然界に見られる非抗体ポリペプチドに関する。「レクチン」とは、その機能的フラグメントおよび誘導体を含み、これらの用語は以下に抗体に関して用いられる同じ用語と同様に定義される。
【００２８】
さらに、一態様において本発明は、上記で定義される医学的使用のための、グリカンと特異的に結合する抗体、その機能的フラグメントおよび機能的誘導体に関する。これらは、標的グリカン抗原が利用可能となれば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７，  １９７５）、抗体ファージディスプレー（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２，  ４３３−４５５，  １９９４）、リボソームディスプレー（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２３１，  １１９−１３５，  １９９９）および反復コロニーフィルタースクリーニング（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９，  Ｅ２７，  ２００１）によって慣用することができる。抗体を機能的産物へと断片化するための典型的なプロテアーゼは周知である。他の断片化技術は、得られたフラグメントが特異的高親和性と、好ましくはマイクロモル〜ピコモルの範囲の解離定数を有する限り、同様に使用可能である。グリカン結合抗体の例としては、「抗ペルオキシダーゼウサギ抗血清のＩｇＧ画分（ＩｇＧ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ’  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）」（カタログ番号２００−４１３８、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，  米国）および「ウサギで生産された抗ペルオキシダーゼ抗体」（カタログ番号Ｐ７８９９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，  米国）がある。
【００２９】
グリカン結合適用に極めて便利な抗体フラグメントは、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがポリペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖフラグメントである。本発明によるグリカンと結合させるための他の抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、ミニ抗体（小免疫タンパク質（ｓｍａｌｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）とも呼ばれる）、タンデムｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合物、ならびに好適なドメインとの（例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分との）ｓｃＦｖ融合物が挙げられる。ある種の抗体形式に関する総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ，  Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ．  （Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２３：１１２６−３６，  ２００５）を参照。
【００３０】
本発明で用いるための抗体の「機能的誘導体」とは、誘導体がその元の抗原と実質的に同じ結合親和性を有し、好ましくは、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲の解離定数を有する限り、そのアミノ酸配列が、例えば、アミノ酸残基の付加、置換および／または欠失によって化学的もしくは遺伝的に修飾され、かつ／またはその原子および／もしくは機能的化学基の少なくとも１つが、例えば、付加、欠失、再配列、酸化、還元などによって化学的に修飾されている、抗体またはそのフラグメントを含むものとする。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明で用いるための抗体、そのフラグメントまたは機能的誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、Ｆｖ−フラグメント、Ｆａｂ−フラグメントおよびＦａｂ２−フラグメントからなる群から選択されるものである。
【００３２】
抗体様結合タンパク質の総説としては、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  ｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２３：１２５７−１２６８，  ２００５を参照。「アプタマー」とは、高親和性を有するポリペプチドと結合する核酸を表す。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ４５：１６２８−１６５０，  １９９９；  Ｋｌｕｇ  ａｎｄ  Ｆａｍｕｌｏｋ，  Ｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．，  ２０：９７−１０７，  １９９４；米国特許第５，５８２，９８１号参照）などの選択方法によって、種々の一本鎖ＲＮＡ分子の大きなプールから単離することができる。アプタマーはまた、例えば、Ｌ−リボヌクレオチドとして、それらの鏡像形態で合成および選択することもできる（Ｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：１１１６−１１１９，  １９９６；  Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：１１１２−１１１５，  １９９６）。このようにして単離された形態には、天然に存在するリボヌクレアーゼによっては消化されず、従ってより大きな安定性を持つという利点がある。
【００３３】
別の抗体様結合タンパク質および従来の抗体の代替が、いわゆる「タンパク質スキャフォールド」、例えば、リポカリンに基づくアンチカリンである（Ｂｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  米国，  ９６：１８９８−１９０３，  １９９９）。リポカリンの、例えば、レチノール結合タンパク質またはビリン結合タンパク質の天然リガンド結合部位は、例えば、「コンビナトリアルタンパク質デザイン」アプローチを用いることにより、それらが選択されたハプテンと結合するように変化させることができる（Ｓｋｅｒｒａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４８２：３３７−３５０，  ２０００）。他のタンパク質スキャフォールドについても、抗体の代わりとなることが知られている（Ｓｋｅｒｒａ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，  １３：１６７−２８７，  ２０００）（Ｈｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２３：５１４−５２２，  ２００５；  ＥＰ  １８９２２４８  Ａ１／「ｆｙｎｏｍｅｒｓ」）。
【００３４】
要するに、抗体様結合タンパク質とは、標的、好ましくは、医学的使用のためのグリカンを特異的に認識する、上記のタンパク質由来の抗体代替物、例えばアフィリン、アプタマーおよびフィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）を含むものとする。
【００３５】
さらなる態様は、医学的使用に関して上記で定義されたグリカンと結合するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株に関する。
【００３６】
驚くことに、多価グリカン結合ポリペプチドには、例えば、蠕虫疾患、好ましくは、線虫疾患および免疫疾患を治療および／または予防するための薬剤において有効成分として用いる場合、対応する一価ポリペプチドよりも蠕虫に対する毒性が強いなどの利点があることが判明した。特定の理論に縛られるものではないが、現在のところ、多価結合は表面露出グリカンの架橋をもたらし、これがエンドサイトーシスによるグリカン結合ポリペプチドの取り込みを誘発し、かつ／またはシグナルカスケードの活性化をもたらすものと推測される。レクチンにより媒介される細胞毒性はレクチンの多価性に依存していることがすでに実証されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３８７：６９４−７０５，  ２００９）。多価グリカン結合ポリペプチド上の結合部位は、同じグリカンを対象とすることもできるし、違うグリカンを対象とすることもできる。後者のタイプの多価グリカン結合ポリペプチドの例がＸＣＬであり、以下にさらに詳細に記載する。
【００３７】
上記のために、本発明の好ましい実施形態は、上記で定義された、好ましくは、少なくとも２つ以上、より好ましくは３つ以上、最も好ましくは４つ以上のグリカンと結合するための結合部分を有する多価グリカン結合ポリペプチドの医学的使用を対象とする。
【００３８】
特許請求される医学的有用性は、いくつかのレクチン、特に、真菌レクチンに関して実証された。最も好ましい実施形態では、本発明は、真菌レクチン、好ましくは、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、キッコウアワタケ（Ｘｅｒｏｃｏｍｕｓ  ｃｈｒｙｓｅｎｔｅｒｏｎ）、シバフタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）またはソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のレクチン、より好ましくは、ＣＧＬ１、ＣＧＬ２、ＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ１、ＸＣＬ、ＭＯＡ、ＡＡＬおよびＴＡＰ１から選択されるレクチンからなる群から好ましく選択されるレクチンの医学的使用を対象とする。
【００３９】
ウシグソヒトヨタケ由来のガレクチンＣＧＬ１およびＣＧＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＦ３４７３１およびＡＡＦ３４７３２）は、保存された炭水化物結合ドメインを有するβ−ガラクトシド結合レクチンである（Ｌｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．，  １９：４３３，  ２００４）。動物ガレクチンはおそらく、損傷および病原体に関連する分子パターンの認識によって動物の先天免疫に二重の役割を持っている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．，  ２３０：１７２，  ２００９）。真菌ガレクチンは、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）とともに、この生物群のモデルとして研究に慣用されている２つの真正担子菌のうちの１つであるウシグソヒトヨタケ（ｉｎｋｙ  ｃａｐ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ）に関して最初に報告された。ウシグソヒトヨタケゲノムは最近配列決定されたが、２つのイソガレクチンＣＧＬ１とＣＧＬ２、およびガレクチン関連タンパク質ＣＧＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＤ６４６７５）をコードしている。これらのタンパク質は子実体形成中に高レベルに誘導される（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １８４１−１８５３，  ２０００）。ＣＧＬ１およびＣＧＬ２のｍＲＮＡを同時にサイレントにしても、子実体形成に明白な欠陥は現れなかった（Ｗａｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ，  ５：７３２−７４４，  ２００６）。ＣＧＬ１とＣＧＬ２は双方とも、単一の食餌源としてレクチン発現大腸菌細胞を用いた毒性アッセイにおいて、Ｃ．エレガンスに対して高い毒性を示すが、ＣＧＬ３はそうではない（下記実施例、図１および２を参照）。順遺伝学スクリーンを用い、利用可能なＣ．エレガンスのグリコシル化突然変異体を調べたところ、Ｃ．エレガンスにおいてＣＧＬ２によって認識される標的グリカンは、Ｎ−グリカンコアのＡｓｎ結合ＧｌｃＮＡｃ残基上のＧａｌ−β−１，４−Ｆｕｃ−α−１，６として同定された（図３〜７、下表１）。ＣＧＬ２はまた、寄生性線虫である捻転胃虫の細菌接触段階にも毒性が強いが、ＣＧＬ３はそうではない（下記実施例、図１２参照）。
【００４０】
レクチンＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＤ８８７５０）は、ウシグソヒトヨタケ子実体抽出物から、固定化された、植物糖タンパク質であるセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって単離された（Ｗａｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  未発表）。その後の分析では、それは、子実体形成中に強く誘導され、植物Ｎ−グリカンコア上のＦｕｃ−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃと特異的に結合する細胞質タンパク質であることが示された（図１１参照）。ＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）はＣ．エレガンス（図１参照）および捻転胃虫（図１２参照）に対して毒性がある。利用可能なＣ．エレガンスのグリコシル化突然変異体を調べたところ、この線虫毒性がＮ−グリカンコアのＮ−結合ＧｌｃＮＡｃ残基上のＦｕｃ−α−１，３に依存していることが明らかになった（図８、表１参照）。同じ生物からのイソレクチンＣＣＬ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＨＱ２６７７０３）も分析したところ、本質的に、グリカン結合および毒性に関してＲｅｄＡと同じ特性が示された（データは示されていない）。
【００４１】
レクチンＡＡＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＡＡ００４５１）は、子嚢菌ヒイロチャワンタケ由来のβ−プロペラレクチンである。このタンパク質は、各サブユニット上にα−１，２結合かα−１，３結合のいずれかで末端フコースに対する５つの結合部位を含むホモ二量体である（Ｗｉｍｍｅｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８：-２７０５９，  ２００３）。他の子嚢菌由来のオーソログは、末端フコース残基の結合に関する指向性に若干の違いがある（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３８６：２１７，  ２００９）。ＡＡＬ発現大腸菌の摂食は、Ｃ．エレガンス（図１）および捻転胃虫（図１２参照）に対して毒性がある。利用可能なＣ．エレガンスのグリコシル化突然変異体を調べたところ、この線虫毒性がＧＤＰ−フコース生合成に依存していることが明らかになった（図１０、表１）。
【００４２】
凝集素ＭＯＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＬ４７６８０）は、推定触媒ドメイン（同時に二量体化ドメインでもある）を有する真正担子菌シバフタケに由来するホモ二量体レクチンである（Ｇｒａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３９０：４５７，  ２００９）。レクチンドメインはリシンＢ−フォールド（ｒｉｃｉｎＢ  ｆｏｌｄ）を採用し、異種移植エピトープＧａｌ−α−１，３−Ｇａｌに対する３つの結合部位を含む。このエピトープは、数種のＣ．エレガンスグリコスフィンゴ脂質（Ｇｒｉｆｆｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３０７：９２２，  ２００５のＤ種）に見られる。レクチンは、レクチンドメインの炭水化物結合特異性が若干異なる他の真菌類にもホモログを有する（Ｔａｔｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３８２：６６７，  ２００４）。ＭＯＡ発現大腸菌の摂食は、Ｃ．エレガンス（図１参照）および捻転胃虫（図１２参照）に対して毒性がある。Ｃ．エレガンスのグリコシル化突然変異体を調べたところ、この線虫毒性が、線虫毒性バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶性毒素ＣＲＹ５Ｂによって認識されるものとは異なる特異的グリコスフィンゴ脂質種の生合成に依存していることが明らかになった（Ｇｒｉｆｆｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３０７：９２２，  ２００５；図９、表１参照）。Ｇａｌ−α−１，３−ＧａｌＮＡｃ特異的抗体は、最近、捻転胃虫からのヒツジの保護に関連付けられた（ｖａｎ  Ｓｔｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，  ４０：２１５，  ２０１０）。
【００４３】
キッコウアワタケ由来のレクチンＸＣＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＬ７３２３５）およびソルダリア・マクロスポラ由来のレクチンＴＡＰ１（Ｇｅｎ-ｂａｎｋ  ＣＡＨ０３６８１）は、多くの真菌およびまた下等植物にオーソログを有する二重特異性レクチンである（Ｐｅｕｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １４４：６３７，  ２００７）。ＸＣＬはホモ四量体であり、各サブユニットにＧａｌ−β−１，３−ＧａｌＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃに対する結合部位１つとＧｌｃＮＡｃに対する結合部位を１つ有する可能性がある（Ｂｉｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３４４：１４０９，  ２００４；  Ｌｅｏ-ｎｉｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３６８：１１４５，  ２００７）。前者のグリコエピトープはＣ．エレガンスおよびまた哺乳類のＯ−グリカンで見られる。ＸＣＬは殺虫活性を有する（Ｔｒｉｇｕｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＢＡ，  １６２１：２９２，  ２００３）。ＸＣＬおよびＴＡＰ１は双方とも、Ｃ．エレガンス（図１参照）および捻転胃虫（図１２参照）に給餌すると強い線虫毒性を示す。
【００４４】
本発明のグリカン結合ポリペプチド、例えばレクチン（図１および１２参照）およびグリカン結合抗体（図１３参照）は、毒性アッセイにおいて蠕虫、特に、線虫に対して毒性を示した。
【００４５】
患者に比較的無害な寄生性線虫を一時的に感染させることによるアレルギー治療の最近の成功は、免疫疾患を治療および／または予防するための線虫成分の有用性を実証した（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄ，  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １０４：２１７，  ２００９）。本発明によれば、積極的免疫調節を担う成分となるのは蠕虫、好ましくは、線虫のグリカンである。
【００４６】
よって、好ましい実施形態では、上記のグリカン結合ポリペプチドが蠕虫感染、好ましくは、線虫感染だけではなく免疫疾患を治療および／または予防するためにも医学的有用性を有することを特許請求する。
【００４７】
より好ましくは、前記蠕虫感染、好ましくは、線虫感染は、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される蠕虫によって起こる感染である。
【００４８】
また、より好ましくは、本発明によるグリカン結合ポリペプチドの投与によって治療および／または予防される免疫疾患は、アレルギー、好ましくは、植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくは、クローン病からなる群から選択される。
【００４９】
上述のように、特に、抗体は、特許請求される医学的有用性を有するグリカン結合ポリペプチドとして機能し得る。これらの抗体は、治療を受ける脊椎動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで生成され得る。
【００５０】
これに関し、本発明のさらなる態様は、薬剤としての、グリカン、好ましい実施形態では、Ｎ−グリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択されるＮ−グリカンの使用に関する。
【００５１】
さらに好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択される。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物からなる群から選択されるＯ−グリカンの使用に関する。
【００５３】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質から好ましく選択されるリポグリカンに関する。
【００５４】
医学的有用性に関して、上記グリカンは処置された動物またはヒトにおいてグリカン特異的抗体に基づく免疫応答を惹起するように処方されるべきである。例えば、グリカン特異的抗体の免疫原性は免疫アジュバントとの結合またはその同時処方によって達成することができる。あるいは、グリカンは、グリカンを提示する不活化細胞もしくは生細胞内もしくは細胞上、好ましくは、細胞表面上に、またはそのホモジネートの形態で、または免疫増強細胞との混合物中で提示させることができる。本発明を実施するためには、これらのグリカンは、細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌によって提示される、好ましくはその表面に展示されることが好ましい。
【００５５】
これらのグリカンはグリカン特異的抗体の免疫原性が生じるように処方されるので、それらは、結果として生じる抗体によっても、上記グリカン結合ポリペプチドに関して特許請求されるものと同じ医学的効果を惹起する。従って、本発明はまた、蠕虫感染、好ましくは、線虫感染または免疫疾患を治療および／または予防するための上記グリカンの使用に関する。
【００５６】
本発明のグリカンによる治療または予防に好ましい蠕虫感染、好ましくは、線虫感染は、グリカン結合ポリペプチドに関して上記で挙げたものと同じである。
【００５７】
本発明のグリカンによる治療または予防に好ましい免疫疾患は、アレルギー、好ましくは、植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくは、クローン病からなる群から選択される。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、Ｎ−グリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択されるＮ−グリカンと結合するものを含む医薬組成物に関する。
【００５９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＮ−グリカン結合ポリペプチド、好ましくは、フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質と結合するものを含む医薬組成物に関する。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＯ−グリカン結合ポリペプチド、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物と結合するものを含む医薬組成物に関する。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質から好ましく選択される少なくとも１つのリポグリカンを含む医薬組成物に関する。
【００６２】
さらに、グリカン結合ポリペプチドは、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生される少なくとも１つの線虫グリカンと結合することが好ましい。
【００６３】
より好ましくは、本医薬組成物のグリカン結合ポリペプチドは、レクチン、抗体、抗体のフラグメントまたは機能的誘導体および抗体様結合タンパク質からなる群から選択される。
【００６４】
より好ましくは、本医薬組成物のグリカン結合ポリペプチドは多価であり、従って、少なくとも２つ以上、好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ以上のグリカンと結合する。
【００６５】
最も好ましくは、本医薬組成物のグリカン結合ポリペプチドは、真菌レクチン、好ましくは、ウシグソヒトヨタケ、キッコウアワタケ、シバフタケ、ヒイロチャワンタケまたはソルダリア・マクロスポラ由来のレクチン、より好ましくは、レクチンＣＧＬ１、ＣＧＬ２、ＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ１、ＸＣＬ、ＭＯＡ、ＡＡＬまたはＴＡＰ１の群から好ましく選択されるレクチンである。
【００６６】
医薬組成物の場合、グリカン結合ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅｓ）が細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、ヒト腸内細菌細胞、最も好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に展示されることが好ましい。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−１，４含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなるＮ−グリカン群から好ましく選択されるＮ−グリカンを含む医薬組成物に関する。
【００６８】
好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質から選択される。
【００６９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物からなるＯ−グリカン群から好ましく選択されるＯ−グリカンを含む。
【００７０】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質から好ましく選択されるリポグリカンを含む。
【００７１】
好ましくは、該ポリペプチド結合または脂質結合グリカンは、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生されるものである。
【００７２】
本発明の医薬組成物では、該ポリペプチド結合または脂質結合グリカンは、好ましくは、細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、ヒトまたは家畜腸内細菌細胞、最も好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に展示される。
【００７３】
本発明のさらなる態様は、単離されたグリカン、複合糖質および／またはグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび／またはリポグリカン、好ましくは、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび／またはリポグリカンを含む複合糖質、好ましくは、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび／またはリポグリカン結合ポリペプチド、より好ましくは、上記の治療的および／または予防的医学的効果、特に、抗蠕虫効果および免疫刺激または抑制効果を提供するための上記のグリカン、複合糖質およびグリカン結合ポリペプチドを含む食品または動物飼料に関する。好ましくは、本発明は、上記で定義されたような単離されたグリカン、複合糖質および／またはグリカン結合ポリペプチドと生理学上許容される賦形剤および／または栄養素、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、ヒトまたは家畜腸内細菌細胞、最も好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌とを含む、ヒトまたは動物、好ましくは、家畜用の食品または飼料に関する。例えば、このような食品または飼料は、ヒトまたは家畜のそれぞれにおいて蠕虫の定着を大幅に減らし、かつ／または蠕虫関連抗原に対する免疫系を刺激もしくは抑制する。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、グリカン結合ポリペプチドにより媒介される毒性に感受性のある蠕虫を同定する方法に関する。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明は、グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを含む蠕虫、好ましくは、線虫を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、真菌、細菌および／または植物グリカン結合タンパク質（いわゆるレクチン）、および任意選択の蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、好ましくは、該少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞を準備すること；
（ｂ）（ａ）の少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドおよび任意選択の蠕虫食餌細胞と、対象とする蠕虫細胞または蠕虫、好ましくは、線虫細胞または線虫とを、（ｉ）グリカン結合ポリペプチドが蠕虫細胞に結合することを可能とし、かつ／または（ｉｉ）蠕虫細胞または蠕虫に任意選択の食餌細胞を摂食させることを可能とする条件下で接触させること；および
（ｃ）死滅した蠕虫細胞または蠕虫を同定すること
を含む方法を対象とする。
【００７６】
ステップａ）の少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを、任意選択の蠕虫食餌細胞の一部として、好ましくは、腸内細菌食餌細胞の一部として、より好ましくは、大腸菌、最も好ましくは、蠕虫食餌細胞、例えば、細胞質において活性型でグリカン結合ポリペプチドを発現する大腸菌の一部として提供することが最も好ましい。
【００７７】
ステップ（ａ）において、少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドは、特異的炭水化物結合を示す、天然起源または人工起源の任意のポリペプチド、例えば、天然に存在するレクチンまたはその機能的フラグメントおよび／または誘導体、抗体および／またはその機能的フラグメントもしくは誘導体、抗体様結合タンパク質であり得る。好ましくは、２以上の、好ましくは、多数のグリカン結合ポリペプチドの混合物が炭水化物の結合の機会を増やすために提供される。
【００７８】
本明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる「特異的結合」とは、多くのまたはほとんどの炭水化物および／または非炭水化物化合物と非特異的に結合する化合物を排除するものとする。
【００７９】
この任意選択の蠕虫食餌細胞の存在は、ステップ（ｂ）において、蠕虫による単離されたグリカン結合ポリペプチドの摂取を助け、従って、グリカン結合ポリペプチドと蠕虫細胞との結合を助ける。当然のことながら、グリカン結合ポリペプチドがすでに任意選択の食餌細胞、好ましくは、その細胞質の一部をなしている場合には、ポリペプチドの摂取は極めて効率的である。蠕虫食餌細胞の好ましいタイプは、用いる蠕虫のタイプによって異なる。より好ましくは、それは腸内細菌、最も好ましくは、大腸菌である。蠕虫に食餌細胞を摂食させることを可能にする条件は、用いる蠕虫のタイプによって異なる。蠕虫が食餌細胞を摂食する限り、当業者に公知の従来のいずれの設定を行ってもよい。
【００８０】
死滅した蠕虫細胞または蠕虫を同定すれば、それはそのまま、グリカン結合ポリペプチドと蠕虫細胞との結合が死に至らせたことを示す。言い換えれば、蠕虫細胞または蠕虫の死滅により、死滅した蠕虫が、それがグリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを含むことが確認される。（ｉ）毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを有する蠕虫と、（ｉｉ）少なくとも１つの対応する毒性グリカン結合ポリペプチドからなる、同定された系はさらに、アッセイ前に毒性グリカン結合ポリペプチドおよび／またはその炭水化物特異性が未知である場合には、
（ｄ）任意選択により、（ａ）の少なくとも１つの毒性グリカン結合ポリペプチドを同定するため、および／または
（ｅ）任意選択により、少なくとも１つの毒性グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを同定するため
に使用することができる。
【００８１】
（ｉ）毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを有する蠕虫と、（ｉｉ）少なくとも１つの対応する毒性グリカン結合ポリペプチドからなる系が、例えば上記の方法によってひと度同定されれば、この系をグリカンにより媒介される毒性に関与する蠕虫遺伝子を同定するために使用することができる。
【００８２】
従って、好ましい実施形態では、本発明は、グリカン結合タンパク質と結合した際にグリカンにより媒介される毒性に関与する蠕虫遺伝子標的、好ましくは、線虫遺伝子標的、好ましくは、蠕虫グリカンおよび複合糖質の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子標的を同定するさらなる方法であって、
（ａ）グリカン特異性を有するグリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する特異的グリカンを産生する、ランダム突然変異および／または標的突然変異を有する蠕虫細胞または蠕虫、および任意選択の野生型蠕虫細胞または蠕虫を準備すること；
（ｂ）（ａ）の蠕虫細胞または蠕虫と、該グリカン特異性を有する少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドとを、任意選択により、蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、好ましくは、該少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞の存在下で接触させること；および
（ｃ）（ｂ）におけるグリカン結合ポリペプチドの接触から生き残る（ａ）の蠕虫細胞または蠕虫における突然変異遺伝子を同定すること
を含む方法に関する。
【００８３】
ステップｂ）の少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドを、任意選択の蠕虫食餌細胞の一部として、好ましくは、腸内細菌食餌細胞の一部として、より好ましくは、大腸菌、最も好ましくは、蠕虫食餌細胞、例えば、細胞質において活性型でグリカン結合ポリペプチドを発現する大腸菌の一部として提供することが最も好ましい。
【００８４】
蠕虫細胞または蠕虫の突然変異体は、従来技術または以下の実施例に記載されている通りにランダム突然変異誘発または標的突然変異誘発によって作出することができる。これらの突然変異のいくつかはグリカンにより媒介される毒性に関与する遺伝子に影響を及ぼすという合理的な機会がある。任意選択により、比較により変異型蠕虫における変化をより良く同定するために参照蠕虫細胞または蠕虫もまた提供することができる。ステップ（ｂ）において、ランダム突然変異および／または標的突然変異を有する蠕虫細胞／蠕虫および任意選択の野生型蠕虫細胞／蠕虫を、それらの蠕虫のグリカン特異性を有する少なくとも１つのグリカン結合ポリペプチドと接触させる。任意選択により、グリカン結合ポリペプチドの摂取を助ける、従って、グリカン結合ポリペプチドと蠕虫細胞との結合を助けるために、食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌が存在する。グリカン結合ポリペプチドによるグリカン媒介性の毒性に関与する蠕虫遺伝子の突然変異は変異型蠕虫の生存をもたらし得るが、残りの変異型蠕虫または野生型参照蠕虫はグリカン結合ポリペプチドの毒性作用のために死滅する。単離された生存蠕虫と野生型ゲノムを遺伝的に比較する手段によって、細胞の生存をもたらす突然変異遺伝子を同定することができる。
【００８５】
グリカンにより媒介される毒性に関与する遺伝子は、抗蠕虫化合物の潜在的標的として極めて適切である。従って、野生型蠕虫におけるその構造、その発現の調節およびその産物の機能を決定することは重要である。
【００８６】
同定された遺伝子産物の機能から、毒性を媒介するグリカンを同定することができる。より好ましい実施形態では、本発明の毒性媒介遺伝子標的を同定する上記の方法は、毒性関連グリカンを同定するステップ（ｄ）、好ましくは、
（ｄ．ｉ）ステップ（ｃ）の突然変異遺伝子と、特徴的な遺伝子、好ましくは、グリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、より好ましくは、蠕虫のグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とを比較するステップ；
（ｄ．ｉｉ）（ｃ）で同定された突然変異体のＮ−グライコーム、Ｏ−グライコームまたはリポグライコームと、野生型蠕虫のグライコームとを、好ましくは、個々の複合糖質の生化学的単離とクロマトグラフィーおよび質量分析によるそれらの分析によって比較するステップ；
（ｄ．ｉｉｉ）ステップ（ｃ）の遺伝子を異種系、例えば、昆虫細胞、好ましくは、ＳＦ９細胞において発現させ、その遺伝子産物の生化学的活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてアッセイするステップ
の１以上を包含するステップ（ｄ）をさらに含む。
【００８７】
毒性媒介グリカンがひと度同定されれば、本発明により抗蠕虫化合物の同定が可能となる。これに関し、本発明はまた、抗蠕虫物質、好ましくは、抗線虫物質を同定する方法であって、
（ａ）グリカンにより媒介される毒性に関与することが知られているグリカンを準備すること；
（ｂ）（ａ）のグリカンと対象物質とを接触させること；
（ｃ）（ａ）のグリカンと結合する対象物質を潜在的抗蠕虫物質、好ましくは、潜在的抗線虫物質として同定すること
を含む方法を対象とする。
【００８８】
ステップ（ａ）のグリカンは、好ましくは、細胞、好ましくは、細胞表面の一部を形成する。組換え生産および任意選択の表面ディスプレーは、多くの炭水化物構造に対する慣例の選択肢である。グリカンディスプレーに適した細胞としては、細菌、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌、または酵母、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
【００８９】
グリカンが細胞の一部をなし、グリカンが内因的に産生される場合、対象とする物質の取り込みを可能とするために増孔剤および／または食餌細胞を加えることが好ましい。
【００９０】
最も好ましい実施形態では、本方法は、グリカンにより媒介される毒性に関与することが知られている単離されたグリカンを用いる。例えば、グリカンは多数の個々のウェルを有するスクリーニングプレートに結合させることができる。対象物質によるグリカンの結合は、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどの従来の手段によって判定することができる。対象物質の結合は、グリカン特異性を有する抗体またはレクチンとの結合を遮断することができ、このレクチンまたは抗体は従来のマーカー物質を含むことができる。抗体またはレクチンの結合の欠如または結合の減少は、対象物質による干渉を示す。
【００９１】
要するに、本発明は、（ｉ）グリカン結合ポリペプチドによる結合の際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを有する蠕虫を同定することを可能とする方法、（ｉｉ）毒性を媒介するグリカンの同定をもたらす、従前に同定された蠕虫／グリカン系を用いて、グリカンにより媒介される毒性に関与する蠕虫遺伝子標的を同定する方法、および（ｉｉｉ）抗蠕虫物質、好ましくは、抗線虫物質を同定するスクリーニング方法を提供する。
【００９２】
さらなる態様において、本発明は、蠕虫感染、好ましくは線虫感染および／または免疫疾患を治療および／または予防する方法であって、本発明のグリカン、グリカン結合ポリペプチド、医薬組成物、食品または飼料をそれを必要とするヒトまたは動物に生理学上有効な量で投与することを含む方法に関する。
【００９３】
治療的および／または予防的使用に関して、本発明の医薬組成物は、従来の任意の投与形で従来の任意の方法で投与することができる。投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、滑液嚢内、注入、舌下、経皮、経口（例えば、錠剤、経管栄養）、局所または吸入が挙げられる。好ましい投与様式は、経口、静脈内および鼻腔内であり、経口および鼻腔内が最も好ましい。
【００９４】
本発明のグリカンおよびグリカン結合ポリペプチドは単独で、または医学上有効な化合物の安定性および／または免疫原性を増強し、それらを含有する医薬組成物の投与を容易にし、溶解または分散の増大をもたらし、波及性の活性を増大させ、例えば、医学上有効な化合物を産生する細胞などの細胞が含まれる場合には、他の有効成分を含む補助療法などを提供するアジュバントと組み合わせて投与してもよい。
【００９５】
これまでのところ、寄生性蠕虫の組換え消化性プロテアーゼによる動物の免疫誘導は、糞便中の卵総数および動物の虫体数の減少については部分的な成功を見た（例えば、Ｒｅｓｚｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｘｐ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，  １１７：２０８，  ２００７；  Ｌｏｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２：ｅ２９５，  ２００５参照）。しかしながら、これらの治験は数種の天然消化管プロテアーゼによる免疫誘導によって達成される保護の程度に達しなかった（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３９１：９０１，  ２０１０に総説）。この違いは一つには、これらの組換えタンパク質における線虫特異的グリコシル化の欠如によるものであると推測される。
【００９６】
寄生性蠕虫の組換えまたは天然消化性プロテアーゼ、好ましくは、動物寄生性線虫の消化管プロテアーゼ、より好ましくは、捻転胃虫のアミノペプチダーゼＨ１１またはイヌ鉤虫のアスパラギン酸プロテアーゼＡＰＲ−１は、上述の、または本発明の方法によって同定されたグリカンまたはグリカン結合ポリペプチドと組み合わせることができる。好ましくは、消化性プロテアーゼ、より好ましくは、寄生性蠕虫の組換え消化性プロテアーゼを、例えば、異種発現系、好ましくは、線虫グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現する昆虫細胞、より好ましくは、Ｃ．エレガンス由来のＧＡＬＴ−１またはＦＵＴ−１を過剰発現するＳＦ９細胞（ＳＦ９細胞におけるＧＡＬＴ−１の機能的発現は従前に実証されている：ＰＣＴ５００８６）を使用することにより、Ｎ−グリカン、より好ましくは、ＭＭＦ６ＧａｌまたはＭＭＦ３と組み合わせる。前記消化性プロテアーゼおよびグリカンエピトープおよび／またはグリカン結合ポリペプチドを組み合わせたこのような組成物は、有効な薬剤、好ましくは、ワクチン、特に、寄生性蠕虫に対するものを提供する。
【００９７】
よって、好ましい実施形態では、本発明はまた、（ｉ）グリカン結合ポリペプチドおよび／またはグリカンを、組換えまたは天然消化性プロテアーゼ、好ましくは、寄生性蠕虫の組換え消化性プロテアーゼ（その機能的フラグメントおよび機能的誘導体、すなわち、元のプロテアーゼ活性の少なくとも一部をなお含むフラグメントおよび誘導体を含む）とともに含む、組成物、好ましくは、医薬組成物、食品および／または動物飼料を対象とし、ならびに（ｉｉ）好ましくは蠕虫感染を治療および／または予防するための、これらの組成物、食品および飼料の対応する使用を対象とする。
【００９８】
いくつかの市販の糖タンパク質は、天然の状態で、グリカンにより媒介される線虫毒性に関与するとして本発明によって同定されたグリカンのいくつかを展示する。同時にこれらの糖タンパク質は免疫原性が高いことが知られている。これらのタンパク質には、Ｎ−グリカンがそのコア上にＧａｌ−β−１，４−Ｆｕｃ−α−１，６エピトープを（Ｗｕｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３７８：６２５，  ２００４）、そして、そのアンテナ上にＦｕｃ−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃエピトープを有する（Ｇｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８０：４０７３１，  ２００５）キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ならびにＮ−グリカンがそのコア上にＦｕｃ−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃエピトープを有する（Ｗｕｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＢＢＡ，  １７２３：２２９，  ２００５）セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が含まれる。天然の状態で、グリカンにより媒介される線虫毒性に関与するとして本明細書によって同定されたグリカンのいくつかもまた展示する、さらなる市販の糖タンパク質としては、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２ならびにアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）などの軟体動物のヘモシアニンがある。上記のものは全て、本発明の種々の態様および実施形態に関して有用性を有するＮ−グリカンを少なくとも含む。特に、これらの糖タンパク質は、寄生性蠕虫に対する免疫誘導のため、より好ましくは、寄生性線虫に対する家畜の免疫誘導のため、最も好ましくは、捻転胃虫に対するヒツジの免疫誘導のための医学的用途を有する。
【００９９】
よって、好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）好ましくは蠕虫感染、好ましくは、寄生性蠕虫感染を治療および／または予防するための薬剤を製造するための、ＫＬＨ、ＨＲＰ、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ凝集素（ＵＥＡ）、ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２およびアメリカカブトガニなどの軟体動物のヘモシアニン、これらの機能的フラグメントまたは機能的誘導体、すなわち、上記で同定されたグリコエピトープの少なくとも１つをなお含むフラグメントおよび誘導体の使用、ならびに（ｉｉ）これらを含む対応する組成物、好ましくは、医薬組成物、食品および／または動物飼料に関する。
【０１００】
本明細書に記載のグリカンおよびグリカン結合ポリペプチドの医薬投与形は、当業者に公知の薬学上許容される担体および／またはアジュバントを含む。これらの担体およびアジュバントとしては、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、バッファー物質、水、塩、電解質、セルロースに基づく物質、ゼラチン、水、ワセリン（ｐｒｅｔｒｏｌａｔｕｍ）、動物油もしくは植物油、鉱油もしくは合成油、生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類、およびエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール化合物、抗酸化剤、乳酸塩などが挙げられる。好ましい投与形としては、錠剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、エマルション、再構成可能な粉末および経皮パッチが挙げられる。投与形の製造方法は周知であり、例えば、Ｈ．  Ｃ．  Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｇ．  Ｐｏｐｏｖｉｓｈ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ  （１９９０）および特に、Ｐａｓｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｍａｒｃｈ  １９９９を参照。用量レベルおよび要件は当技術分野でよく認識されており、当業者ならば、特定の患者に適した利用可能な方法および技術から選択することができる。当業者が認識しているように、特定の因子に応じて、より低用量または高用量が必要な場合もある。例えば、具体的な用量および治療計画は、患者（ヒトまたは動物）の健康状態、患者の障害またはそれに対する素因の重篤度および経過、ならびに治療に当たる医師または獣医の判断などの因子によって異なる。
【０１０１】
以下、本発明を具体的図面および実験的実施形態を参照しつつ説明するが、これらの図面および実施形態は、添付の特許請求の範囲に示されている本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】Ｃ．エレガンスに対する種々の真菌レクチンの毒性を示す棒グラフである。Ｃ．エレガンス野生型（Ｎ２）およびｐｍｋ−１変異型の線虫を、試験手順に記載のように、レクチン発現細菌上でＬ１期からＬ４期への発達に関して分析した。ｙ座標は、Ｘ座標のレクチンを発現する細菌の存在下でＬ４期に達した線虫の割合である。分析した真菌レクチンには、ウシグソヒトヨタケ・ガレクチンＣＧＬ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＦ３４７３１）およびＣＧＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＦ３４７３２）、ガレクチン関連レクチンＣＧＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＤ６４６７５）およびレクチンＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＤ８８７５０）、キッコウアワタケ・レクチンＸＣＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＬ７３２３５）およびソルダリア・マクロスポラ由来のそのオーソログＴＡＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＨ０３６８１）、ヒイロチャワンタケ・レクチンＡＡＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＡＡ００４５１）およびシバフタケ凝集素ＭＯＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＬ４７６８０）を含んだ。
【図２Ａ】Ｃ．エレガンスに対するウシグソヒトヨタケ・ガレクチンＣＧＬ２の用量依存的および炭水化物結合依存的毒性を示す。全ての実験で、野生型ＣＧＬ２または炭水化物結合欠損変異型ＣＧＬ２-（Ｗ７２Ｇ）のいずれかを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または対照形質転換体をＣ．エレガンス野生株Ｎ２に与えた。  Ａは、ＣＧＬ２によるＣ．エレガンス発達の阻害を示す。Ｃ．エレガンスＬ１期幼虫を上記の細菌叢に載せるか（パネル左）、または液体培養にて漸増濃度の精製ＣＧＬ２と等量のエンプティーベクター含有ＢＬ２１（ＤＥ３）とともに与え（パネル右）、およびそれぞれ７２時間および９６時間までにＬ４期まで発達した割合を評価した。柱はそれぞれ６回および１２回の独立した実験の平均値を表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２Ｂ】Ｃ．エレガンスに対するウシグソヒトヨタケ・ガレクチンＣＧＬ２の用量依存的および炭水化物結合依存的毒性を示す。全ての実験で、野生型ＣＧＬ２または炭水化物結合欠損変異型ＣＧＬ２-（Ｗ７２Ｇ）のいずれかを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または対照形質転換体をＣ．エレガンス野生株Ｎ２に与えた。Ｂは、レクチンＣＧＬ２によるＣ．エレガンスの繁殖の阻害を示す。Ｃ．エレガンス成虫（雌雄同体）に上記の細胞を与え、雌雄同体１個体当たりの後代総数を評価した。各データ点について、雌雄同体８〜１０個体の同腹子の平均をとった。標準偏差を示す。野生型ＣＧＬ２上の後代で、孵化後９６時間以内に成虫まで発達したものは無かった。
【図２Ｃ】Ｃ．エレガンスに対するウシグソヒトヨタケ・ガレクチンＣＧＬ２の用量依存的および炭水化物結合依存的毒性を示す。全ての実験で、野生型ＣＧＬ２または炭水化物結合欠損変異型ＣＧＬ２-（Ｗ７２Ｇ）のいずれかを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または対照形質転換体をＣ．エレガンス野生株Ｎ２に与えた。Ｃは、ＣＧＬ２がＣ．エレガンスの腸に損傷を与えることを示す。Ｃ．エレガンスＬ４期幼虫にＣＧＬ２発現細胞（パネルｄ〜ｆ）および対照大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（パネルａ〜ｃ）を与え、２４時間後に実体顕微鏡（パネルａ、ｄ）、および微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡（パネルｂ、ｅ）、および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（パネルｃ、ｆ）で観察した。パネルｃおよびｆのサイズバーは２００ｎｍである。
【図３Ａ】ＣＧＬ２耐性Ｃ．エレガンス突然変異体に関する順遺伝学スクリーンの結果と用いた手順のフローチャートを示す。  Ａは、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路に欠陥があるｐｍｋ−１、ｓｅｋ−１およびｎｓｙ−１変異線虫のＣＧＬ２感受性試験のグラフである。示された遺伝子型のＬ４期幼虫１０個体をＣＧＬ２発現大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞叢に載せた。これらのプレートを、示された時点で線虫が生存しているかどうか確認した。データ点は独立した１０回の試験の平均値を表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３Ｂ】ＣＧＬ２耐性Ｃ．エレガンス突然変異体に関する順遺伝学スクリーンの結果と用いた手順のフローチャートを示す。  Ｂは、ＣＧＬ２高感受性ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）バックグラウンドに、Ｍｏｓ１トランスポゾンアレイｏｘＥｘ２２９およびＭｏｓ１トランスポゼースアレイｆｒＥｘ１１３を有する線虫を作出するための、Ｍｏｓ１挿入突然変異誘発の作業の流れを示す。
【図３Ｃ】Ｃは、単離および構築されたＣ．エレガンス突然変異体の、ＣＧＬ２により媒介される毒性に対する耐性を示す。示された遺伝子型のＣ．エレガンス突然変異体を、上記で概略を示したように、Ｌ１期からＬ４期への発達に関して分析した。遺伝子付記（ｏｐ）およびヒストグラムの上の括弧は、Ｍｏｓ１スクリーンにおいて単離された突然変異体を示す。他の突然変異体は交雑によって構築した。
【図３Ｄ】Ｄは、ＣＧＬ２耐性突然変異体におけるＭｏｓ１要素の挿入部位を示す。Ｍｏｓ１要素の上の矢印は、突然変異体ライゼートのｉＰＣＲ産物を配列決定するために用いたＭｏｓ１プライマーｏＪＬ１１５の配向を示す。太字はＣ．エレガンスのゲノム配列を示し、その後にＭｏｓ１配列が続く。遺伝子モデルはＷｏｒｍＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＷＳ２０２から採用したものである。ｂｒｅ−１（ｏｐ５０９）突然変異体は、翻訳開始コドンの１８４ｂｐ上流に位置する、Ｃ５３Ｂ４．７ａ１の５’−ＵＴＲにＭｏｓ１挿入を有する。ｇｅｒ−１（ｏｐ４９９）突然変異体は、翻訳開始コドンの５０ｂｐ下流に位置する、Ｒ０１Ｈ２．５の第１エキソンにＭｏｓ１挿入を有する。ｇｌｙ−１３（ｏｐ５０７）突然変異体は、Ｂ０４１６．６の第１エキソンに隣接する保存されたスプライシング供与部位にＭｏｓ１挿入を有する。ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）突然変異体は、Ｃ１０Ｆ３．６の第８エキソンにＭｏｓ１挿入を有する。Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）突然変異体は、Ｍ０３Ｆ８．４の第２エキソンにＭｏｓ１挿入を有する。
【図４】種々のＣ．エレガンスグリコシル化突然変異体のＣＧＬ２感受性を示すグラフである。Ｘ座標に示された遺伝子型のＣ．エレガンス突然変異体を、下記の試験手順に記載されるように、ＣＧＬ２発現大腸菌上でＬ１期からＬ４期への発達に関して分析した。種々のＣ．エレガンス遺伝子によりコードされているグリコシル化プロセスについては下記の表１を参照。
【図５】Ｃ．エレガンスにおいてＣＧＬ２により認識されるグリコエピトープのｉｎ  ｓｉｔｕ局在を示す４枚の写真である。Ｃ．エレガンスＣＧＬ２感受性ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）およびＣＧＬ２耐性ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）虫にＴＡＭＲＡで標識したＣＧＬ２を与え、微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡および赤色蛍光（ＲＦ）顕微鏡で観察した。
【図６Ａ】ＣＧＬ２耐性Ｃ．エレガンス二重突然変異体ｐｍｋ−１；ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）（上の出力）およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）（中央の出力）および同質遺伝子型ＣＧＬ２高感受性単一突然変異株ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）（下の出力）におけるＮ−グライコームの比較分析を示す。  ＡおよびＢは、放出された蛍光標識Ｎ−グリカンのＨＰＬＣ実験の蛍光曲線を示す。酵素的放出（ここでは、ＰＮＧアーゼＦ耐性であるが、ＰＮＧアーゼＡ感受性のグライコーム画分を示す）および蛍光標識の際には、Ｎ−グリカンを順相ＨＰＬＣによって分離し、質量分析によって分析した（Ａ）。
【図６Ｂ】ＣＧＬ２耐性Ｃ．エレガンス二重突然変異体ｐｍｋ−１；ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）（上の出力）およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）（中央の出力）および同質遺伝子型ＣＧＬ２高感受性単一突然変異株ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）（下の出力）におけるＮ−グライコームの比較分析を示す。放出された蛍光標識Ｎ−グリカンのＨＰＬＣ実験の蛍光曲線を示す。保持時間の類似した画分（例えば、点線の四角）はさらに逆相ＨＰＬＣによって分離し、得られた純粋なグリカンを質量分析（ＭＳ）により、また、選択された画分についてはＭＳ／ＭＳにより分析した（Ｂ）。
【図６Ｃ】Ｃは、選択された単離ピークの構造的特性決定の結果を示す。ｐｍｋ−１株には見られるが、２つの二重突然変異株には見られないピークＡを、β−１，４−ガラクトシダーゼ（β−１，４−Ｇａｌアーゼ）およびα−フコシダーゼ（α−Ｆｕｃアーゼ）で処理した。反応生成物を逆相ＨＰＬＣとＭＳおよびＭＳ／ＭＳによって分析した。一番下のＨＰＬＣ出力は、グリカン標品をグルコース単位（ＧＵ）で表す。単糖は記号：Ｍａｎ（濃いグレーの丸）、Ｇａｌ（薄いグレーの丸）、ＧｌｃＮＡｃ（四角）、Ｆｕｃ（三角）、Ｈｅｘ（白丸）で表す。
【図７】等温滴定熱量測定法によって測定された、ウシグソヒトヨタケ・ガレクチンＣＧＬ２と化学合成Ｇａｌ−β−１，４−Ｆｕｃ−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−ＮＨ２とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合のグラフを示す。未加工データを上のパネルに示す。Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウエアを用いてこのデータを変換すると滴定曲線（下のパネル）が得られ、この曲線から解離定数（Ｋｄ＝８６．９±３．２×１０−６Ｍ）および結合のエントロピー（ＴΔＳ＝−３．３１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を算出した。
【図８】種々のＣ．エレガンスグリコシル化突然変異体のＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）感受性を示す棒グラフである。示された遺伝子型のＣ．エレガンス突然変異体を、下記の試験手順に記載されるように、ＲｅｄＡ発現大腸菌上でＬ１期からＬ４期への発達に関して分析した。まだ分析されていない突然変異体はｎ．ｄ．として示す。種々のＣ．エレガンス遺伝子によりコードされているグリコシル化プロセスについては下記の表１を参照。
【図９】種々のＣ．エレガンスグリコシル化突然変異体のＭＯＡ感受性試験を示す棒グラフである。示された遺伝子型のＣ．エレガンス突然変異体を、下記の試験手順に記載されるように、ＭＯＡ発現大腸菌上でＬ１期からＬ４期への発達に関して分析した。まだ分析されていない突然変異体はｎ．ｄ．として示す。種々のＣ．エレガンス遺伝子によりコードされているグリコシル化プロセスについては下記の表１を参照。
【図１０】種々のＣ．エレガンスグリコシル化突然変異体のＡＡＬ感受性を示す棒グラフである。示された遺伝子型のＣ．エレガンス突然変異体を、下記の試験手順に記載されるように、ＡＡＬ発現大腸菌上でＬ１期からＬ４期への発達に関して分析した。種々のＣ．エレガンス遺伝子によりコードされているグリコシル化プロセスについては下記の表１を参照。
【図１１】新たに特性決定された真菌レクチンウシグソヒトヨタケＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）およびＳ．マクロスポラＴＡＰ１ならびに従前に特性決定されているキッコウアワタケ・レクチンＸＣＬの炭水化物結合特異性を示す２つのグラフに関する。組換えタンパク質を蛍光標識し、米国糖鎖コンソーシアム（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）（ＣＦＧ）によって、グリカンアレイとの結合に関して分析した。
【図１２】捻転胃虫に対する種々の真菌レクチンの毒性を示す棒グラフである。線虫を、試験手順に記載されているように、レクチン発現細菌上でＬ１期からＬ３期への発達に関して分析した。ｙ座標は、Ｘ座標のレクチンを発現する細菌の存在下でＬ３期に達した線虫の割合である。分析した真菌レクチンには、ウシグソヒトヨタケ・ガレクチンＣＧＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＦ３４７３２）、ガレクチン関連レクチンＣＧＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＤ６４６７５）、レクチンＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＤ８８７５０）、キッコウアワタケ・レクチンＸＣＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＬ７３２３５）およびソルダリア・マクロスポラ由来のそのオーソログＴＡＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＨ０３６８１）、ヒイロチャワンタケ・レクチンＡＡＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＡＡ００４５１）およびシバフタケ凝集素ＭＯＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＬ４７６８０）を含んだ。
【図１３】ウサギ抗ペルオキシダーゼ抗血清の市販のＩｇＧ画分（カタログ番号２００−４１３８、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，米国；抗ＨＲＰ）および精製ＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）の、捻転胃虫幼虫のＬ１期からＬ３期への発達に対する影響を示す棒グラフである。この抗体およびレクチンは、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ならびに線虫糖タンパク質のＮ−グリカンに存在する同じエピトープＦｕｃ−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃと結合し、２つの異なる濃度で試験した。１ｍｇ／ｍｌ濃度の非グリカン結合ウサギＩｇＧを対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例では、（ｉ）グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも１つのグリカンを有する蠕虫を同定することを可能とする本発明の方法、（ｉｉ）毒性を媒介するグリカンの同定をもたらす、従前に同定された蠕虫／グリカン系を用いて、グリカンにより媒介される毒性に関与する蠕虫遺伝子標的を同定する方法、および（ｉｉｉ）抗蠕虫物質、好ましくは、抗線虫物質を同定するスクリーニング方法を記載する。
【０１０４】
さらに、これらの実施例では、毒性を媒介するグリコエピトープ／グリカン／-複合糖質が同定されたモデル線虫Ｃ．エレガンスに対して毒性がある真菌レクチンの同定を記載する。これらの医学的に有用なレクチンは、
（ｉ）Ｃ．エレガンスＮ−グリカンコアのＡｓｎ結合ＧｌｃＮＡｃ上のＧａｌ−β−１，６−Ｆｕｃ−α−１，６と結合するウシグソヒトヨタケ由来のＣＧＬ２（図１〜７参照）、
（ｉｉ）Ｃ．エレガンスＮ−グリカンコアのＡｓｎ結合ＧｌｃＮＡｃ上のＦｕｃ−α−１，３と結合するウシグソヒトヨタケ由来のＲｅｄＡ（ＣＣＬ２）（図８および１１）、
（ｉｉｉ）線虫グリコスフィンゴ脂質上のＧａｌ−α−１，３−ＧａｌＮＡｃ−β−ｘ，ｙと結合するシバフタケ由来のＭＯＡ（図９参照）、
（ｉｖ）おそらく線虫Ｏ−グリカン上のＧａｌ−β−１，３−ＧａｌＮＡｃと結合する、それぞれキッコウアワタケおよびソルダリア・マクロスポラ由来のＸＣＬおよびＴＡＰ１（グリカンアレイデータ［図１１］参照）、
（ｖ）まだ同定されていない線虫複合糖質上の末端Ｆｕｃと結合するヒイロチャワンタケ由来のＡＡＬ（図１０参照）
である。
【０１０５】
一般的試験手順
株および培養条件
大腸菌株ＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれプラスミドのクローニングおよび増幅と、タンパク質の細菌発現に用いた。大腸菌をＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｗ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている標準培地で培養した。カエノラブディティス・エレガンス株は線虫増殖培地（ＮＧＭ）で維持し、Ｓｔｉｅｒｎａｇｌｅ，  Ｔ．  （２００６）  ＷｏｒｍＢｏｏｋ，  １−１１に記載されているように大腸菌株ＯＰ５０を与えた。Ｂｒｉｓｔｏｌ単離株Ｎ２を野生株として用いた。ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）、ｂｒｅ−１（ｙｅ４）、ｂｒｅ−２（ｙｅ３１）、ｂｒｅ−３（ｙｅ２６）、ｂｒｅ−４（ｙｅ２７）、ｂｒｅ−５（ｙｅ１７）、ｆｕｔ−１（ｏｋ８９２）、ｆｕｔ−２（ｇｋ３６０）、ｆｕｔ−２（ｏｋ５０９）、ｆｕｔ−３（ｇｋ１０３）、ｆｕｔ−４（ｇｋ１１１）、ｆｕｔ−５（ｏｋ２４２）、ｆｕｔ−６（ｏｋ４７５）、ｆｕｔ−８（ｏｋ２５５８）、ｇｌｙ−２（ｑａ７０３）、ｇｌｙ−１２（ｉｓ４７）、ｄｐｙ−６（ｅ１４）；ｇｌｙ−１３（ｏｋ７１２）、ｇｌｙ−１４（ｉｄ４８）、ｇｌｙ−２０（ｏｋ８２６）株はミネソタ大学（米国）のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ）から入手した。２つの染色体外構築物ｆｒＥｘ１１３［ｈｓｐ：：Ｍｏｓトランスポゼース；Ｐｃｏｌ１２：：ＤｓＲｅｄ］およびｏｘＥｘ２２９［Ｍｏｓ１；Ｐｍｙｏ−２：：ｇｆｐ］を有する株は、Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｅｗｂａｎｋから厚意により提供されたものである。Ｍｏｓ１により媒介される突然変異誘発のために、本発明者らは、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｒＥｘ１１３株およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｏｘＥｘ２２９株を作出した。Ｍｏｓ１により媒介される突然変異誘発およびその後の他殖から得られた株は、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｇｅｒ−１（ｏｐ４９９）、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｇｌｙ−１３（ｏｐ５０７）およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｂｒｅ−１（ｏｐ５０９）であった。
【０１０６】
クローニングおよび発現
真菌レクチンの細菌発現のためのプラスミドは、ｃＤＮＡまたは利用可能なプラスミドから個々のオープンリーディングフレームを増幅させ、得られたフラグメントを、導入された制限部位を用いてｐＥＴ２４ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結することによって構築した。液体培養におけるＣＧＬ２およびＣＧＬ２（Ｗ７２Ｇ）の発現は、ＣＧＬ３に関してＷａｌｔｉ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７９，  １４６−１５９に記載されている通りに行った。Ｃ．エレガンスのバイオアッセイについては、個々のＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の一晩培養物３００μｌを、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＮＧＭプレートに拡げ、２３℃で一晩インキュベートした後に線虫を加えた。レクチンの発現は、導入されたＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の全細胞抽出物を、クーマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離すること、および利用できるのであれば特異的抗血清を用いて免疫ブロットを行うことによって確認した（データは示されていない）。
【０１０７】
ＣＧＬ２の精製および標識
細菌細胞ペレットを、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）［３０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．３、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］に再懸濁させ、フレンチプレスを用いて破砕した。細胞残渣を１２０００ｇで１５分および２７０００ｇで３０分の２回の連続する遠心分離工程で除去した。上清をラクトシル−セファロースとともに４℃で１時間インキュベートし、ＣＧＬ２を最終的に、室温で、２００ｍＭラクトースを含有するＰＢＳで溶出した。ＰＢＳで平衡化したセファロース６  １０／３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィー後に、該タンパク質を含有する画分をプールし、分子量カットオフが１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、光路長１ｃｍで２８０ｎｍでの吸光度１単位に対して１．２５ｍｇ／ｍｌ−１の関係を仮定することにより計算した。精製ＣＧＬ２とテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の結合はＷａｌｓｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ  ４２，  ２９３−３０５に記載されている通りに行った。
【０１０８】
Ｃ．エレガンス光学顕微鏡観察
一般的な線虫の取扱いでは、Ｌｅｉｃａ  ＭＺ１２．５実体顕微鏡を用いた。ダブルアレイを持つ線虫（ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｏｘＥｘ２２９；ｆｒＥｘ１１３）を選択するためには、適当なフィルターセット（ＤｓＲｅｄフィルターとＧＦＰフィルター）を備えたＬｅｉｃａ  ＭＺ１６ＦＡ実体顕微鏡を用いた。Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘ  ９９０デジタルカメラで写真を撮影した。
【０１０９】
ＤＩＣおよび蛍光顕微鏡観察では、線虫を、Ｍ９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ，  ２００１）中の２％アガロースパッド上に置き、レバミゾール（３〜５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）で麻酔し、カバーガラスをかけ、ＤＩＣ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学系を備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ−ＲＡまたはＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡、およびＴＡＭＲＡの検出のためのＤｓＲｅｄフィルターセットを備えた標準的な落射蛍光で観察した。浜松ＯＲＣＡ−ＥＲカメラで写真を撮影した。画像はＯｐｅｎＬａｂソフトウエアを用いて偽着色した。
【０１１０】
ＣＧＬ２−リガンドのｉｎ  ｓｉｔｕ局在では、Ｌ４期のＣ．エレガンスを、Ｓ培地（Ｓｕｌｓｔｏｎ  ＆  Ｈｏｄｇｋｉｎ，  １９８８）、エンプティーＫａｎＲ−ベクターを担持するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌、カナマイシンおよびクロラムフェニコール各３０μｇ／ｍｌ、ならびにＴＡＭＲＡ標識ＣＧＬ２  １００μｇ／ｍｌを含むウェルに入れた。２４時間後、線虫を標準的なＯＰ５０プレートに移し、その２時間後にＴＡＭＲＡ蛍光をスクリーニングした。
【０１１１】
Ｃ．エレガンスの電子顕微鏡観察
電子顕微鏡観察では、線虫を記載されている２段階の化学的固定（Ｈａｌｌ，  １９９５）によって処理した。サンプルの固定および薄層切片化は、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （チューリッヒ大学，スイス連邦）にてＧａｒｒｙ  Ｂａｒｍｅｔｔｌｅｒにより、厚意によって行われた。これらのサンプルを、サイドマウントデジタルカメラ（Ｇａｔａｎ）を備えたＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１００透過型電子顕微鏡を用いて観察した。
【０１１２】
実施例１−Ｃ．エレガンス毒性アッセイ
プレートアッセイ
Ｃ．エレガンスに対する野生型および変異型ＣＧＬ２の毒性を調べるためにプレートアッセイを考案した。ＮＧＭプレートに、上記のように、野生型ＣＧＬ２かまたは変異型ＣＧＬ２（Ｗ７２Ｇ）のいずれかを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を播種した。対照として、プレートにベクターｐＥＴ２４ａを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を播種した。これらのプレートを２３℃で一晩インキュベートし、種々の毒性アッセイのために、同調したＣ．エレガンス集団を載せた（Ｂａｒｒｏｗｓ，  Ｂ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４１７，  ３４０−３５８参照）。
【０１１３】
表現型分析
Ｃ．エレガンスに対するＣＧＬ２の毒性作用の表現型分析のため、Ｌ４期の線虫をプレートに載せ、２３℃で２４時間後に観察した。
【０１１４】
発達アッセイ
Ｃ．エレガンス発達に対するＣＧＬ２の作用に関する定量的データは、示された遺伝子型の、新たに孵化したＬ１期幼虫５０〜１００個体をプレートに置くことによって得た。７２時間後、Ｌ４期に達した線虫の割合を求めた。
【０１１５】
同腹子数アッセイ
Ｃ．エレガンスの繁殖に対するＣＧＬ２の作用は、個々のＬ４期野生型雌雄同体をプレートに採取することによってアッセイした。その後、その母虫が子孫を産むのを止めるか、または死に至るまで、毎日、母虫を新しいプレートに移した。翌日に前日のプレートの後代を計数した。種々のプレートからの後代数を足して最終的な同腹子数とした。
【０１１６】
実施例２−ＣＧＬ２最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定
ＭＩＣを、５０％を超える個体が液体培養中で９６時間以内に第４期幼虫（Ｌ４）に達することができない毒素濃度と定義した。Ｌ１期Ｃ．エレガンス野生型線虫２０個体を、Ｓ培地（Ｓｕｌｓｔｏｎ  ＆  Ｈｏｄｇｋｉｎ  （１９８８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ｉｎ  Ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  （Ｗｏｏｄ，  Ｗ．  Ｂ．  ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ｐｐ  ５８７−６０６参照）、ＫａｎＲ遺伝子を有するエンプティーベクターｐＥＴ２４ａを含む食餌源としての大腸菌ＢＬ２１、カナマイシンおよびクロラムフェニコール（各３０μｇ／ｍｌ）、ならびに示された濃度の精製ＣＧＬ２タンパク質を含むウェルに入れた。９６時間後、線虫をＮＧＭプレートに移し、Ｌ４期に達した線虫の数を求めた。
【０１１７】
実施例３−高感受性試験
示された遺伝子型のＬ４期Ｃ．エレガンス１０個体をＣＧＬ２プレートに移した。２４時間おきに、これらのプレートの生存個体を確認した。線虫は、ワームピックで触っても反応しなかった場合に死滅と見なした。
【０１１８】
実施例４−Ｍｏｓ１挿入突然変異誘発を用いたＣＧＬ２耐性Ｃ．エレガンス突然変異体のスクリーニング
Ｍｏｓ１挿入突然変異誘発は基本的にＢｏｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂｅｓｓｅｒｅａｕ（２００７）  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２，  １２７６−１２８７に公開されている通りに行った。染色体外アレイｆｒＥｘ１１３（熱ショックプロモーターの制御下にＭｏｓ１トランスポゼースを有する）およびｏｘＥｘ２２９（基質Ｍｏｓ１トランスポゾンの多重コピーを有する）を用いた。この２つの染色体外構築物をＣＧＬ２高感受性ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）線虫と交雑させ、スクリーニングのための２つの始原株ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｒＥｘ１１３およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｏＥｘ２２９を作出した。二重アレイを有する個体を作出するために、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｏｘＥｘ２２９雄とＬ４  ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｒＥｘ１１３雌雄同体とを交雑させた。咽頭におけるＧＦＰ（Ｐｍｙｏ−２：：ｇｆｐ、ｏｘＥｘ２２９に含まれる）と体腔細胞におけるＤｓＲｅｄ（Ｐｃｏｌ１２：：ＤｓＲｅｄ、ｆｒＥｘ１１３に含まれる）を同時に発現することで認識される二重アレイを含む後代をおよそ６世代、繁殖させた後、それらに熱ショックを施した。１回の突然変異誘発につき数百の二重トランスジェニック個体に３３℃１時間、２０℃１時間、および３３℃１時間の熱ショックを施し、その後、２０℃で一晩回復させた。Ｐ０を９０ｍｍ  ＮＧＭプレートに分配し、熱ショック１２〜４０時間後に卵を回収した。その後、Ｐ０を取り出した。３日後、妊娠個体Ｆ１をＭ９バッファーで洗浄してプレート成分を除去し、Ｓｔｉｅｒｎａｇｌｅ，  Ｔ．  （２００６）  ＷｏｒｍＢｏｏｋ，  １−１１に記載されているように、Ｆ２卵を分離した。同調したＦ２  Ｌ１個体の集団を、ＣＧＬ２発現大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む３０枚のプレートに分配した。３〜７日後、これらのプレートを、成虫に達したＣＧＬ２耐性個体に関してスクリーニングした。冗長なＭｏｓ１挿入を避けるため、耐性個体を含む各プレートは個別処理とした。候補線虫をＣＧＬ２発現大腸菌上で繁殖させ、耐性表現型を確認した。耐性が確認されれば、染色体外Ｍｏｓ１担持アレイを欠損した突然変異体と２〜６回他殖させた後、Ｍｏｓ１要素の存在をアッセイし、挿入部位の位置決定を試みた。Ｍｏｓ１要素をまだ含んでいた突然変異体について、本発明者らは、Ｂｏｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂｅｓｓｅｒｅａｕ  （２００７）  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２，  １２７６−１２８７に公開されているように、線虫ライゼートに対する逆ＰＣＲによって挿入部位を決定した。
【０１１９】
合計およそ５００，０００のハプロイドゲノムがスクリーニングされた。転位効率は５０％と評価された。合計１４個体のＣＧＬ２耐性線虫が単離された。そのうち、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）、ｇｅｒ−１（ｏｐ４９９）；ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｇｌｙ−１３（ｏｐ５０７）およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｂｒｅ−１（ｏｐ５０９）の５個体のみがＭｏｓ１トランスポゾン挿入を含んでいた。
【０１２０】
実施例５−Ｃ．エレガンスのＮ−グリカンの単離
Ｃ．エレガンス株ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）、ｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）およびｐｍｋ−１（ｋｍ２５）；ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）を、室温で５日間、大腸菌ＯＰ５０とともに液体培養で増殖させ、その後、３０％（ｗ／ｖ）スクロース勾配遠心分離（Ｓｔｉｅｒｎａｇｌｅ，  Ｔ．  （２００６）  ＷｏｒｍＢｏｏｋ，  １−１１参照）によって細菌および残渣から分離した。Ｎ−グリカンの調製は、Ｐｏｌｔｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｆｅｂｓ．  Ｊ．  ２７４，  ７１４−７２６に従前に記載されているように、コアα１，３−フコシル化グリカンを他のコアフコシル化グリカンから分離するために、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧアーゼ）Ｆ、次いで、ＰＮＧアーゼＡを用い、部分的に精製されたグリコペプチドからグリカンを酵素的に遊離させることによって行った。要するに、およそ３ｇの線虫（湿重）をボイルした後に摩砕した。この抽出物を５％（ｖ／ｖ）のギ酸を含むように調整し、３ｍｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃で一晩インキュベートした。１５，０００ｇで１５分遠心分離した後、上清を、２％酢酸で平衡化した１５ｍｌ  Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ＷＸ２に適用した。グリコペプチドを酢酸アンモニウム（０．６Ｍ、ｐＨ６）で溶出させた。オルシノール陽性画分をプールし、一晩凍結乾燥した。次に、セファデックスＧ２５カラムに適用することでこれらのサンプルを脱塩し、１％酢酸で溶出させた。オルシノール陽性画分を再びプールし、凍結乾燥した。これらのサンプルを２５０μｌの水に溶かした。９５℃で５分間熱処理をして残留しているペプシンを不活化した後、サンプルをプールし、その後、２５０μｌの炭酸アンモニウムバッファーｐＨ８および３ＵのＰＮＧアーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。次に、これらのサンプルを４００μｌの１０％酢酸で酸性化し、５ｍｌ  Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ＷＸ２に適用した。保持されなかった遊離グリカンは凍結乾燥し、次の蛍光標識のために乾燥させ、一方、保持されたオルシノール陽性画分は、酢酸アンモニウム（０．６Ｍ、ｐＨ６）で溶出させ、上記のように脱塩し、酢酸アンモニウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ５）に溶かし、３７℃で一晩、ＰＮＧアーゼＡ（０．６ｍＵ）で処理した。再び、これらのサンプルを４００μｌの１０％酢酸で酸性化し、５ｍｌ  Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ＷＸ２に適用した。保持されなかった遊離グリカンを凍結乾燥し、また、次の蛍光標識のために乾燥させた。
【０１２１】
実施例６−Ｃ．エレガンスＮ−グリカンの標識および構造分析
Ｎ−グリカンの蛍光標識は、２−アミノ−ピリジン（ＰＡ）を用い、従前に記載されている通りに行った。ＰＮＧアーゼＡまたはＦのいずれかによって遊離され、ピリジルアミノ化されたグリカンの完全なＮ−グライコームを、室温にて、島津ＨＰＬＣシステム（Ｃｌａｓｓ−ＶＰソフトウエア（Ｖ６．１３ＳＰ２）を用い、パーソナルコンピューターによって制御される、ＳＣＬ−１０Ａコントローラー、２基のＬＣ１０ＡＰポンプおよびＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光検出器からなる）および蛍光検出（３１０または３２０ｎｍで励起、３８０または４００ｎｍで発光を検出）を用いる２Ｄ−ＨＰＬＣによって分画した。Ｎ−グリカンは、順相ＨＰＬＣ（Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫゲルアミド−８０、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ；流速１ｍｌ／分、溶出：７１．３％ＭｅＣＮ無勾配で５分、７１．３％から６１．８％ＭｅＣＮの勾配で１０分、６１．８％ＭｅＣＮ無勾配で２５分、６１．８％から５４．２％ＭｅＣＮで１５分、ギ酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ７）をバッファーとして使用）にて最初に分画された。これらの画分を凍結乾燥し、逆相ＨＰＬＣ（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ  Ｃ−１８；４×２５０ｍｍ、５μｍ；流速１．５ｍｌ／分、３０分にわたって０〜３０％ＭｅＯＨの勾配、ギ酸アンモニウム（０．１Ｍ、ｐＨ４）をバッファーとして使用）にてさらに分画した。ＨＰＬＣクロマトグラムを、オープンソースプログラムＰＬＯＴ（Ｗｅｓｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｔｈｉｊｓｓｅによるバージョン０．９９７）を用いて可視化した。各画分に対し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦを、マトリックスとしての２，５−ジヒドロキシ安息香酸とともに用いて、モノアイソトピックＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを行った。一般に、フコース含有Ｎ−グリカンを含む全ての画分に対してＭＳ／ＭＳを行い、それらの組成を明らかにした。ペプチド標品混合物（Ｂｒｕｋｅｒ）を外部較正に用いた。ＭＳデータは、ＢｒｕｋｅｒソフトウエアおよびｍＭａｓｓ  Ｖ２．４ソフトウエアパッケージを用いて分析した（Ｓｔｒｏｈａｌｍ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍ．  （２００８）  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２２，  ９０５−９０８参照）。
【０１２２】
選択された単離Ｎ−グリカンに関して、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）β１，４−ガラクトシダーゼ（２７ｍＵ、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）（Ｇｕｔｔｅｒｎｉｇｇ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２，  ２７８５−２７８４０参照）で３７℃にて２日間処理することにより末端β−ガラクトシドの存在を調べるか、またはウシ腎臓α−フコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、１５ｍＵ、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５）の使用によって末端α−フコシドの存在を調べた。次に、消化産物に関して、変化した構造的特徴をＲＰ−ＨＰＬＣ（上記参照）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０１２３】
実施例７−等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法
試験は、精製ＣＧＬ２（ＴＢＳ中３００μＭ）を用い、２５℃でＶＰ−ＩＴＣ等温滴定熱量測定計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，マサチューセッツ州，米国）にて行った。Ｇａｌ−β−１，４−Ｆｕｃ−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−ＮＨ２をＴＢＳ中に、１Ｈ−ＮＭＲによる純度評価値に基づいて補正した１．６ｍＭの濃度で溶かした（およそ５０〜６０％）。このリガンドを、タンパク質溶液を含有するセル中へ、２μｌ  １回の注入の後、６μｌ  ４８回の注入によって滴定した。注入は全て、２７０ｒｐｍで攪拌しながら、３分間隔で行った。試験データを、Ｍｉｃｒｏｃａｌによって供給されているＭＣＳ−ＯＲＩＧＩＮソフトウエアを用い、理論的滴定曲線に当てはめた。１タンパク質モノマーにつき１リガンド結合部位のモデルを用い、結合部位の数（Ｎ＝０．９７７±０．００４）、会合定数（Ｋａ＝１．１５±０．０４４×１０４Ｍ−１）およびエンタルピー変化（ΔＨ＝−８．８５±０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を得た。
【０１２４】
実施例８−捻転胃虫毒性アッセイ
上述の寄生性線虫に対する毒性を、９６ウェル細胞培養プレートを用いた液体アッセイで評価した。捻転胃虫の卵を感染したヒツジの糞便から分離し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびアムホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）を含む水−寒天プレート上で孵化させた。およそ３０固体のＬ１幼虫を回収し、各ウェルの総容量１５０μｌの０．１×Ｅａｒｌｓ溶液中に移した。食餌源として、レクチン発現大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞かまたは大腸菌ＯＰ５０のいずれか（ＯＤ６００＝１）を、種々の濃度の精製抗体またはレクチンと組み合わせて加えた。プレートを暗所、２８℃でインキュベートし、Ｌ３期へ発達した幼虫のパーセンテージを７日後に求めた。
表１：Ｃ．エレガンスグリコシル化突然変異体の比較。コードされている酵素の機能はｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ．から引用した。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
本発明を好ましい実施形態および実施例を強調して記載してきたが、当業者には、好ましい実施形態の変形が使用可能であること、本発明が本明細書に具体的に記載されたもの以外の方法でも実施可能であることが意図されることが自明であろう。さらに、以上の実施例は単に例示のために含められているものであり、いずれの点からも本発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。よって、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内に包含されるあらゆる改変を含む。
【図２Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月8日(2012.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−グリカンがＤ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択される、薬剤としてのＮ−グリカンの使用。
【請求項２】
フコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から好ましく選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ化合物から好ましく選択される、薬剤としてのＯ−グリカンの使用。
【請求項４】
ガラクトシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−α−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質から好ましく選択される、薬剤としてのリポグリカンの使用。
【請求項５】
（ｉ）グリカンが細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の表面に提示されるか、または（ｉｉ）グリカンが、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２およびアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）などの軟体動物のヘモシアニン、これらのいずれかの機能的フラグメントまたは誘導体からなる群から好ましく選択される糖タンパク質の一部である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
蠕虫感染、好ましくは線虫感染または免疫疾患を治療および／または予防するための請求項１〜の５いずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
蠕虫感染、好ましくは、線虫感染が、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される蠕虫によって起こる感染である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
免疫疾患がアレルギー、好ましくは植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくはクローン病からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンがＤ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１０】
グリカンがフコシド含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、より好ましくは、Ｌ−フコピラノシル−α−１，３−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ３含有および／またはＭＭＦ３含有オリゴ糖および複合糖質から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
グリカンが、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生されるものである、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｉ）グリカンが細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に展示されるか、または（ｉｉ）グリカンが、好ましくは、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ凝集素（ＵＥＡ）、ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２およびアメリカカブトガニなどの軟体動物のヘモシアニン、これらのいずれかの機能的フラグメントまたは誘導体からなる群から選択される糖タンパク質の一部である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択される単離されたＮ−グリカンを含む食品。
【請求項１４】
Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、好ましくは、Ｄ−ガラクト−ピラノシル−β−１，４−Ｌ−フコピラノシル−α−１，６−ＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ／多糖および／または複合糖質、最も好ましくは、ＧｎＧｎＦ６Ｇａｌ含有および／またはＭＭＦ６Ｇａｌ含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択される単離されたＮ−グリカンを含む動物飼料。
【請求項１５】
寄生性蠕虫の組換えまたは天然消化性プロテアーゼ（その機能的フラグメントおよび機能的誘導体を含む）を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物、請求項１３に記載の食品、または請求項１４に記載の動物飼料。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｄ】  Ｄは、ＣＧＬ２耐性突然変異体におけるＭｏｓ１要素の挿入部位を示す。Ｍｏｓ１要素の上の矢印は、突然変異体ライゼートのｉＰＣＲ産物を配列決定するために用いたＭｏｓ１プライマーｏＪＬ１１５の配向を示す。太字はＣ．エレガンスのゲノム配列を示し、その後にＭｏｓ１配列が続く。遺伝子モデルはＷｏｒｍＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＷＳ２０２から採用したものである。ｂｒｅ−１（ｏｐ５０９）突然変異体は、翻訳開始コドンの１８４ｂｐ上流に位置する、Ｃ５３Ｂ４．７ａ１の５’−ＵＴＲにＭｏｓ１挿入Ａ（配列番号１）を有する。ｇｅｒ−１（ｏｐ４９９）突然変異体は、翻訳開始コドンの５０ｂｐ下流に位置する、Ｒ０１Ｈ２．５の第１エキソンにＭｏｓ１挿入（配列番号２）を有する。ｇｌｙ−１３（ｏｐ５０７）突然変異体は、Ｂ０４１６．６の第１エキソンに隣接する保存されたスプライシング供与部位にＭｏｓ１挿入（配列番号３）を有する。ｆｕｔ−８（ｏｐ４９８）突然変異体は、Ｃ１０Ｆ３．６の第８エキソンにＭｏｓ１挿入（配列番号４）を有する。Ｍ０３Ｆ８．４（ｏｐ４９７）突然変異体は、Ｍ０３Ｆ８．４の第２エキソンにＭｏｓ１挿入（配列番号５）を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｄ】
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【国際調査報告】
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