(57)【要約】  本発明は、タンパク質をコードするヌクレオチドであって、当該タンパク質が、配列番号１（Ｅｇｒ３ＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、治療における使用のための、ヌクレオチド、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードするヌクレオチドであって、前記タンパク質が、配列番号１（Ｅｇｒ３ＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、治療における使用のための、ヌクレオチド。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号５（ΔＥｇｒ３）に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号４（Ｅｇｒ３）に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のヌクレオチド。
【請求項４】
前記相同性が１００％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
【請求項５】
治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
アデノウィルスである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記治療が、神経再生が有益である状態に関するものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヌクレオチド、タンパク質またはベクター。
【請求項９】
前記状態が、末梢性神経障害、神経損傷、脊髄損傷または脳卒中である、請求項８に記載のヌクレオチド、タンパク質またはベクター。
【請求項１０】
前記治療が、血管新生疾患に関するものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヌクレオチド、タンパク質またはベクター。
【請求項１１】
前記血管新生疾患が、がん、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症または関節リウマチである、請求項１０に記載のヌクレオチド、タンパク質またはベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｇｒ転写因子、および治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｅｇｒ３は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）によりアップレギュレートされるジンクフィンガーＥｇｒ転写因子サブファミリーのメンバーである。ＲＮＡ干渉によるＥｇｒ３遺伝子発現の阻害により、内皮の増殖、遊走および管形成が抑制される。
【０００３】
初期成長応答（Early Growth Response；Ｅｇｒ）サブファミリーのジンクフィンガー
転写因子は、初めは、成長因子に応答してアップレギュレートされる、細胞の成長および分化の制御に関与する遺伝子として発見された。このサブファミリーには、Ｅｇｒ１、Ｅｇｒ２、Ｅｇｒ３およびＥｇｒ４という４つのメンバーが含まれ、これらは、それぞれ、Ｅｇｒ応答エレメント（Egr response element；ＥＲＥ）である同一の９塩基対のＤＮＡセグメントを認識する高度に保存されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含有する。Ｅｇｒは、ひとたび標的遺伝子のプロモーターに結合すると、標的遺伝子の発現を制御して、細胞機能に関与する。しかしながら、Ｅｇｒにより制御される細胞機能を媒介するメカニズムについてはほとんど知られていない。
【０００４】
Ｅｇｒ３は、神経の成長および分化に関係し、また、神経成長因子（ＮＧＦ）により媒介される細胞シグナル伝達に関係する。Ｅｇｒ３は、褐色細胞腫１２（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｃｙｔｏｍａ  １２；ＰＣ１２）細胞において神経成長因子（ＮＧＦ）によって最も強くアップレギュレートされる遺伝子であり、ドミナントネガティブＥｇｒ３の過剰発現は、ＰＣ１２細胞において、ＮＧＦ誘導性神経突起伸長を阻害した。Ｅｇｒ３欠損マウスは、運動または感覚軸索による神経支配を受ける被包性筋線維からなる骨格筋感覚器である筋紡錘の発生の欠如に起因する歩行失調を示したが、これは、Ｅｇｒ３が、筋紡錘の形態形成の際に、感覚軸索と筋管との相互作用の制御において中心的な役割を果たしている、ということを指し示している。最近の研究では、Ｅｇｒ３欠損マウスが異常な交感神経系発生を示すこと、および、生理学的な自律神経障害（dysautonomia）を呈したとのことも示され、これは、Ｅｇｒ３が、正常な標的組織神経支配および機能のために交感神経ニューロン遺伝子発現を制御するＮＧＦシグナル伝達エフェクターであるとのことを指し示している。また、Ｅｇｒ３は、運動ニューロン障害である孤発性筋萎縮性側索硬化症では、運動ニューロンにおいてダウンレギュレートされる。
【０００５】
Ｅｇｒ３は、胸腺細胞の増殖および生存も制御する。Ｅｇｒ３欠損マウスでは、不十分な増殖の結果として、野生型マウスに比べ、胸腺細胞の数の減少がみられた。しかしながら、Ｅｇｒ３を恒常的に発現するトランスジェニックマウスでも、胸腺細胞充実性（thymic cellularity）は、Ｂｃｌ‐ＸＬの発現の減少に伴う不十分な生存に起因して減少していた。
【０００６】
興味深いことに、最近の研究により、Ｅｇｒ３が、乳がん細胞における、エストロゲンにより誘導される遺伝子であるとのことが明らかにされた。乳がん細胞株ＭＣＦ７におけるＥｇｒ３の過剰発現により、ＮＡＢ２が、Ｅｇｒ３の標的遺伝子の１つであると同定された。さらに、Ｅｇｒ３免疫活性は、乳癌組織の半分以上において検出され、また、リンパ節状態、遠隔転移およびエストロゲン受容体発現に明らかに関連していた。Ｅｇｒ３を発現する形質転換乳がん細胞では、遊走および浸潤特性が亢進した。
【０００７】
神経細胞およびリンパ球におけるＥｇｒ３の役割は比較的よく特徴づけがなされている
が、血管系におけるＥｇｒ３の機能はよく分かっていない。以前の研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cell；ＨＵＶＥＣｓ）において、ＶＥ
ＧＦ処理後にＥｇｒ３が一過性に、かつ、強く発現した、とのことが報告された。Ｅｇｒ３ノックダウンでは、ＲＮＡ干渉により、増殖、遊走および管形成を含むＶＥＧＦにより媒介されるいくつかの重要な機能が阻害されたとのことも示されている。しかしながら、Ｅｇｒ３が内皮機能を媒介するメカニズムは不明である。
【０００８】
ＵＳ５８３７６９２では、腫瘍の成長を阻害するための、ウィルスベクターにより送達されるＥｇｒ‐１の使用が開示されている。この実験データは、ヒト腫瘍細胞株ではなくマウス線維芽細胞モデルを用いて得られたものであった。マウス線維芽細胞モデルは、ヒトにおける実際の治療効果に関する信頼のある指標ではない。
【発明の概要】
【０００９】
２つのアデノウィルスベクターを作製した；１つは全長ヒトＥｇｒ３をコードするもの（Ａｄ‐Ｅｇｒ３）であり、また、１つは両トランス活性化ドメインの欠失を有するＮ末端が切断されたＥｇｒ３（N-terminal truncated Egr3）をコードするもの（Ａｄ‐ΔＥ
ｇｒ３）である。Ｅｇｒ３の過剰発現は、その、Ｅｇｒ応答エレメントへの結合を増加させ、公知のＥｇｒ３標的遺伝子であるＮＡＢ２の発現を誘導した。当該野生型Ａｄ‐Ｅｇｒ３では内皮遊走が増加し、一方、Ａｄ‐ΔＥｇｒ３感染細胞では、ＥｇｒＤＮＡ結合が増加したが、ＮＡＢ２遺伝子発現および細胞遊走は誘導されなかった。また、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞からの条件培地は、非感染ＨＵＶＥＣ細胞の遊走を刺激したが、これは、Ｅｇｒ３が、化学誘引物質（chemoattractant）の産生を誘導したとのことを指し示してい
る。Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞のアフィメトリクス社オリゴヌクレオチドマイクロアレイスクリーニングにより、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの細胞遊走に関与する、アップレギュレートされたいくつかの遺伝子が同定された。さらに、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞からの条件培地は、ＨＧＦ受容体であるｃ‐Ｍｅｔのリン酸化を活性化することが可能であった。Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染より前のＨＧＦｍＲＮＡのノックダウンにより、Ａｄ‐Ｅｇｒ３により誘導されるＨＧＦ産生および細胞遊走は減少した。加えて、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞の形態は、丸石（cobblestone）形状から紡錘形状へと変わった。この研究におい
ては、ＨＧＦのＥｇｒ３依存性オートクリン産生およびｃ‐Ｍｅｔ受容体の活性化を含む、Ｅｇｒ３により媒介される内皮細胞の細胞遊走についての新規の下流のメカニズムが同定された。
【００１０】
この研究では、さらに下流の効果が多数観察されたが、これにより、Ｅｇｒ３およびΔＥｇｒ３が有用である数多くの状態について、予測し、かつ、続いて試験する、ということが可能となった。
【００１１】
第一の局面によれば、本発明は、タンパク質をコードするヌクレオチドであって、当該タンパク質が、配列番号１（Ｅｇｒ３ＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、治療における使用のための、ヌクレオチド、である。
【００１２】
第二の局面によれば、本発明は、治療における使用のための、上記で定義されたヌクレオチドを含むベクター、である。
【００１３】
第三の局面によれば、本発明は、治療における使用のための、上記で定義されたタンパク質、である。
【００１４】
配列表の説明
配列番号１はヒトＥｇｒ３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）である。
配列番号２はマウスＥｇｒ３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）である
配列番号３はマウスＥｇｒ３である。
配列番号４はヒトＥｇｒ３である
配列番号５はヒトΔＥｇｒ３である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、タンパク質をコードするヌクレオチドであって、当該タンパク質が、配列番号１（Ｅｇｒ３ＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、治療における使用のための、ヌクレオチド、である。
【００１６】
好ましくは、当該相同性は、９６％、９７％、９８％または９９％である。より好ましくは、当該相同性は１００％である。言い換えれば、本発明のヌクレオチドは、治療における使用のためにタンパク質をコードしており、当該タンパク質は、Ｅｇｒ３ＤＮＡ結合ドメインまたは実質的に同じ活性を有するその変異体を含む。
【００１７】
Ｅｇｒ３の下流効果は多数発見されている。Ｅｇｒ３の過剰発現によりＨＧＦ産生が促進されるということが発見されている。これには、ＨＧＦが造血幹細胞の分化および増殖を促進することから、造血幹細胞分化における、可能性のある用途がある。
【００１８】
Ｅｇｒ３の過剰発現により、ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ‐１抗体に対する抗原）の発現も増加する。したがって、Ｅｇｒ３の発現が減少するΔＥｇｒ３（またはＥｇｒ３ＤＢＤ）は、急性前骨髄球白血病のがんの治療において有用であり得る。Ｅｇｒ３ＤＢＤまたはΔＥｇｒ３は、悪性の、特にメラノーマの浸潤および転移の阻害にも有用であり得る。
【００１９】
Ｅｇｒ３が過剰発現する際に、ＡＰＯＥの発現の増加も観察されており、これは、Ｅｇｒ３が、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病の治療に有益であり得るということを意味する。
【００２０】
Ｅｇｒ３が有用性を有し得る他の状態は、神経再生が有益である疾患である。したがって、好ましくは、当該治療は、末梢性神経障害、神経損傷、脊髄損傷または脳卒中に関するものである。Ｅｇｒ３の減少は、血管新生状態において有益であり得る。したがって、好ましくは、当該治療は、がん、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症または関節リウマチに関するものである。Ｅｇｒ３の正常な効果および遺伝子転写をブロックする本発明のヌクレオチドは、ΔＥｇｒ３およびＥｇｒ３ＤＢＤである。
【００２１】
本発明には、本発明のヌクレオチドの活性断片または変異体、すなわち、Ｅｇｒ３受容体において本発明のヌクレオチドと実質的に同じ生物学的活性を有するＥｇｒ３ヌクレオチドの断片または変異体、が含まれる。目的の断片は、例えば、少なくとも１５個のアミノ酸の長さで、例えば４０個以上までのアミノ酸である。
【００２２】
本発明における使用のためのＤＮＡ配列は、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡであってもよく、またはゲノムＤＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッドであってもよく、また、合成もしくは半合成のものであってもよい。本発明のヒトヌクレオチドをコードするＤＮＡが好ましいが、任意の種を起源とするものであってもよい。一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００２３】
本発明における使用のためのＤＮＡ配列は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により、本発明の当該配列と異なっていてもよいが、但し、それらは、Ｅｇｒ３活性を有するタンパク質をコードするものとする。同様に、それらは、切断されていても、１つ以上のヌクレオチドにより伸長されていてもよいが、但し、それらは、Ｅｇｒ３活性
を有するタンパク質をコードするものとする。
【００２４】
ＲＮＡ配列も本発明の実施に適している。本発明は、これらの配列に関係するＲＮＡ配列の、上記でＤＮＡ配列について記載されたあらゆる様式においての使用も提供する。本発明のためのＲＮＡ配列は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明のＲＮＡは、任意の起源のものであってもよい。例えば、ヒトヌクレオチドをコードするＲＮＡが好ましいが、任意の種を起源とするものであってもよい。また、合成ＤＮＡを用いてもよく、同様に、半合成ＲＮＡを用いてもよい。さらには、細菌プラスミドからｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＤＮＡを用いてもよい。
【００２５】
当業者は、本発明の実施に適したＲＮＡ配列ではＴ残基はＵに置き換えられることとなるとのことを理解するであろう。
【００２６】
本発明には、配列番号１に対して少なくとも９５％の相同性、および好ましくは１００％の相同性を有する、治療における使用のための、タンパク質も含まれる。本発明のタンパク質または核酸は、好ましくは、薬剤的に許容できる担体を含む医薬製剤の形で送達される。任意の適切な医薬製剤を用いてもよい。
【００２７】
もう１つの好ましい実施形態においては、ウィルスベクターは、上記で定義されたようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。当該ウィルスベクターは、ヌクレオチドを開放創へと送達するのに適した任意のベクターであってもよい。当該ウィルスベクターは、レンチウィルスベクターであっても、バキュロウイルスであっても、アデノウィルスであってもよい。
【００２８】
本発明のウィルスベクターは、好ましくは無力化されており、例えば複製欠損性のものである。すなわち、それらは、それらの複製に必要な１つ以上の機能的遺伝子を欠き、このことにより、制御されないｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの増殖が防がれ、ウィルス感染の、望ましくない副作用が回避される。好ましくは、Ｅｇｒ３核酸をウィルスコートまたはキャプシド中へと組み込んでウィルスゲノムをパッケージングするのに必要な最小限のゲノムエレメント以外のすべてのウィルスゲノムを除去する。例えば、末端反復配列（Long
Terminal Repeat；ＬＴＲ）およびパッケージングシグナル以外のすべてのウィルスゲノムを欠失させることが望ましい。アデノウィルスの場合には、欠失は、典型的には、Ｅ１領域においてなされ、また、所望により、Ｅ２領域、Ｅ３領域および／またはＥ４領域のうちの１つ以上においてなされる。
【００２９】
本発明のウィルスは、任意の適切な技術により無力化されていてもよい。例えば、ゲノム欠失は、複製に必要な遺伝子の完全除去を含むものであってもよく、または、部分的除去のみを含むものであってもよい。完全除去が好ましい。通常は、好ましい欠失は、ウィルス遺伝子の初期転写に必要な遺伝子についてのものである。
【００３０】
また、複製可能な自己限定的（self-limiting）または自滅的（self-destructing）ウ
ィルスベクターを用いてもよい。
【００３１】
通常は、本発明における使用のための核酸は、好ましくは上記で定義されたようなベクターにより、動脈へと送達された後にそれらのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を保証するような発現構築物内に含まれることとなる。このような構築物は、典型的には、Ｅｇｒ３核酸の発現を方向づけることができるプロモーター（および所望によりそのプロモーターのレギュレーター）、翻訳開始コドン、および、そのプロモーターに機能的に連結された本発明の核酸、を含む。好ましくは、これらの構成要素は、５’‐３’方向に配列されている。
【００３２】
また、当該構築物は、他の任意の適切な構成要素を含んでいてもよい。例えば、当該構築物は、本発明の核酸に対して、翻訳された際に、発現したＥｇｒ３タンパク質を所定の細胞型または細胞区画へと方向づけることができるような位置に配置されたシグナル配列をコードする核酸を含んでいてもよい。このようなシグナル配列は、いずれも、典型的には、そのシグナル配列およびＥｇｒ３タンパク質が、そのＣ末端またはＮ末端にそのシグナル配列を有する単一の融合タンパク質として翻訳されるよう、Ｅｇｒ３核酸のすぐ３’またはすぐ５’の位置に配置されることとなる。
【００３３】
また、当該構築物は、プロモーターにより提供される発現の度合いを亢進するエンハンサーを含んでいてもよい。選択されたプロモーターにより提供される発現を亢進する任意のエンハンサーを用いることができる。例えば、ＣＭＶ初期遺伝子プロモーターの場合には、ＣＭＶ初期遺伝子エンハンサーを用いてもよい。
【００３４】
所望により、当該構築物は、本発明の核酸の３’に転写ターミネーターを含んでいてもよい。任意の適切なターミネーターを用いることができる。
【００３５】
所望により、当該構築物は、本発明の核酸の３’に機能的に連結されたポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。
【００３６】
所望により、当該構築物は、例えば抗生物質耐性等の、培養物中の形質転換細胞の選択を可能にする、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。例えば、抗生物質耐性について細胞を順次選択してもよい。
【００３７】
所望により、当該構築物は、１つ以上のイントロン、または他の非コード配列を、例えばＥｇｒ３核酸の３’または５’に含んでいてもよい。
【００３８】
任意の適切なプロモーターを用いて、本発明の核酸の発現をコントロールしてもよい。通常は、ウィルスのプロモーターまたは治療しようとする対象の種において機能するよう適合させたプロモーターを用いることが好ましい。よって、ヒト対象の場合には、ウィルスのプロモーター、特に、ヒトに感染するウィルス由来のプロモーター、またはヒト遺伝子由来のプロモーターを用いることが好ましい。所望により、プロモーターは、任意の適切なエンハンサーと組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
望ましくは、「強い」プロモーター、すなわち、本発明のＥｇｒ３タンパク質の、高いレベルの発現を確保するようなもの、を用いる。当該Ｅｇｒ３タンパク質の過剰発現を達成するようなプロモーターが望ましい。好ましいプロモーターとしては、所望によりＣＭＶエンハンサーと組み合わせた、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター；ヒトβ‐アクチンプロモーター；シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）初期遺伝子プロモーター；ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター；およびレトロウィルスの末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。
【００４０】
プロモーターおよび他の構築物構成要素はＥｇｒ３核酸に機能的に連結される。よって、それらは、それらが、Ｅｇｒ３核酸の発現に対して効果を発揮することができるように配置される。例えば、プロモーターの場合には、Ｅｇｒ３核酸の発現を方向づけることができるよう、Ｅｇｒ３核酸に対してプロモーターを配置する。望ましくは、構築物構成要素は、それらが発現に対して最大限の効果を発揮することができるよう配置する。
【００４１】
本発明において用いられる核酸または構築物は、当該分野において公知の任意の適切な手段によりウィルスゲノム中に組み込まれてもよい。ウィルスゲノムは、その後、任意の適切な手順によりウィルスコートまたはキャプシド中へとパッケージングされてもよい。
特に、任意の適切なパッケージング細胞株を用いて、本発明のウィルスベクターを作製してもよい。これらのパッケージング株は本発明の複製欠損性ウィルスゲノムを補完するが、これは、それらが、典型的にはそれらのゲノム中に組み込まれて、当該複製欠損性ゲノムから欠失した遺伝子を含んでいるためである。このように、パッケージング株の使用により、本発明のウィルスベクターが培養物中で産生されることが可能となる。
【００４２】
当該タンパク質、核酸およびベクターは、任意の適切な用量で、および、任意の適切な投与体制を用いて送達されてもよい。当業者は、この投与量および投与体制が、多数の因子に応じて、治療しようとする特定の状態の最適な治療を保証するよう適合され得る、とのことを理解するであろう。そのような因子のいくつかは、治療しようとする対象の、年齢、性別および臨床的状態、であってもよい。
【００４３】
例えば、ウィルスベクターは、１０4〜１０14ｃｆｕまたはｐｆｕ／ｍｌ、例えば１０4〜１０6、１０6〜１０8、１０8〜１０10、１０10〜１０12または１０12〜１０14ｃｆｕまたはｐｆｕ／ｍｌ、の投与量で送達されてもよい。１０5〜１０9ｃｆｕまたはｐｆｕ／ｍｌの領域の投与量が好ましい。ｐｆｕ（plaque-forming unit；プラーク形成単位）とい
う語は、アデノウィルスを含む特定のウィルスに適用されるものであり、ウィルス溶液の感染力に対応するものであり、適切な細胞培養物の感染および通常４８時間後の感染細胞のプラークの数の測定により決定される。ｃｆｕ（colony-forming unit；コロニー形成
単位）という語は、レトロウィルスを含む他のウィルスに適用されるものであり、当該分野において公知の手段により、通常１４日のインキュベーション後に、選択可能なマーカーを用いて決定される。ウィルス溶液のｃｆｕまたはｐｆｕ力価を決定するための技術は、当該分野において周知である。
【００４４】
レトロウィルスについては、１０5〜１０6ｃｆｕ／ｍｌの領域の用量が特に好ましい。シュードタイプのレトロウィルスについては、約１０７ｃｆｕ／ｍｌの用量が特に好ましい。アデノウィルスについては、約１０９ｐｆｕ／ｍｌの用量が特に好ましい。
【００４５】
以下の研究により、本発明を説明する。
本研究においては、アデノウィルスベクターを用いて、野生型Ｅｇｒ３（Ａｄ‐Ｅｇｒ３）および切断されたＥｇｒ３変異体（ΔＥｇｒ３）を、ＨＵＶＥＣｓ中で過剰発現させた。Ａｄ‐Ｅｇｒ３発現細胞は、Ａｄ‐ΔＥｇｒ３、Ａｄ‐ｌａｃＺの感染細胞および非感染細胞と比較すると、高い運動性を有し、また、ＨＧＦおよび他のケモカインの分泌も増加していた。Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染より前のＲＮＡ干渉によるＨＧＦ発現の阻害は、Ｅｇｒ３により媒介されるＨＧＦ発現を抑制し、非感染内皮細胞における化学走性を弱化させた。これにより示されるのは、成年期の疾患および胚発生における血管新生に重要なプロセスである、オートクリンＨＧＦ産生およびｃ‐Ｍｅｔのリン酸化を含む、Ｅｇｒ３により媒介される細胞遊走の新規のメカニズムである。
【００４６】
材料および方法
ヒト組換えＣＣＬ２５、ＣＸ3ＣＬ１、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ１４、ＨＧＦ、およびＶＥ
ＧＦは、Ｒ＆Ｄシステムズ社から購入した。
【００４７】
組換えアデノウィルスＥｇｒ３およびΔＥｇｒ３構築物の作製
アデノウィルスのＥｇｒ３およびＮ末端が切断されたＥｇｒ３は、メーカーの指示書に従ってＧａｔｅｗａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて作製した。簡単に言うと、Ｅｇｒ３の全長オープンリーディングフレームをコードするか、または、そのオープンリーディングフレームの最初の２１４個のアミノ酸の欠失を有するＥｇｒ３をコードする二本鎖ＤＮＡを化学的に合成し、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（米国）によりｐＥＮＴＲベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。ｐＥＮＴＲ‐Ｅｇｒ３およびｐＥ
ＮＴＲ‐ΔＥｇｒ３の、デスティネーションベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５‐ＤＥＳＴ（インビトロジェン社）へのＬＲ組換えは、メーカーの指示書に従って、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩミックス（インビトロジェン社）を用いて行なった。次いで、このｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５‐Ｅｇｒ３およびｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５‐ΔＥｇｒ３を、細菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）に形質転換し、増幅させた。精製したｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５‐Ｅｇｒ３およびｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５‐ΔＥｇｒ３は、ＰａｃＩで消化し、アデノウィルス産生株である細胞株２９３Ａ中へのトランスフェクションの前にウィルスの逆位末端配列に曝露させた。最終的なアデノウィルスのＥｇｒ３（Ａｄ‐Ｅｇｒ３）およびＮ末端が切断されたＥｇｒ３（Ａｄ‐ΔＥｇｒ３）を増幅させ、２９３Ａ細胞から精製し、プラークアッセイにより力価測定（titrate）した。コントロールアデノウィルスｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ
５／ｌａｃＺは、インビトロジェン社から購入し、増幅、精製および力価測定（titrate
）を並行して行なった。
【００４８】
細胞培養およびアデノウィルス感染および条件培地の回収
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）は、英国バッキンガムシャーのＴＣＳ  ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ社から購入した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍｌヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、１２μｇ／ｍｌウシ脳抽出物、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩および５０ｎｇ／ｍｌアムホテリシンＢを添加した内皮基本培地（endothelial basal medium；ＥＢＭ）（Ｃａｍｂｅｘ社、英国）中で培養した。
サブコンフルエントなＨＵＶＥＣｓにおけるアデノウィルスの感染は、ＭＯＩ１００にてウィルスを増殖培地中へと添加し、指示された実験期間にわたり細胞と共にインキュベートすることにより行なった。
条件培地の回収の２４時間前に、細胞を、無血清（serum free；ＳＦ）ＥＢＭに移した。上清条件培地を、４℃、４０分間の、アミコンウルトラ遠心式フィルターデバイス（ミリポア社、アイルランド）中での４０００ｒｐｍでの遠心分離により濃縮した。その結果として生じた条件培地を、−２０℃で保存するか、または、すぐにＥＬＩＳＡもしくは細胞遊走アッセイに適用するか、のいずれかを行なった。
【００４９】
低分子干渉（small interfering；ｓｉ）ＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションのために、ヒトＨＧＦに対する化学的合成二重鎖ｓｉＲＮＡ（Ｊ‐００６６５０‐０５）および非標的ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（ドイツ）から購入した。２００ｎＭのｓｉＲＮＡを、１４４０μｌの最終体積にて、ＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロジェン社）で希釈した。８０μｌのオリゴフェクトアミン（インビトロジェン社）および８０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン社）を、別のチューブ中で予め混合した。両混合物を、室温で１０分間インキュベートしておき、その後、混合し、２５分間室温でインキュベートした。Ｔ７５フラスコ中のコンフルエントな細胞を、ＯｐｉｔＭＥＭで１回洗浄し、６．４ｍｌの新しいＯｐｔｉＭＥＭへと移した。
次いで、このｓｉＲＮＡ‐オリゴフェタミン混合物を、細胞の上に液滴状に乗せ、４ｍｌの３０％ＦＣＳ／ＯｐｔｉＭＥＭの添加の前に、４時間インキュベートした。２４時間後、培地を、アデノウィルスを含有する、または含有しない、完全なＥＢＭで置き換えた。
【００５０】
遊走アッセイ
細胞遊走はトランスウェルアッセイにより測定した。トランスウェル（孔径８μｍ、ベクトン・ディッキンソン社）を、因子の存在する、または存在しない７５０μｌの基本ＥＢＭを含有する２４ウェルプレート中に置いた。２．５×１０5個の細胞をトリプシン処
理し、トリプシン中和溶液で中和し、トランスウェル上で、０．１％ＢＳＡを含有する５００μｌ体積の基本ＥＢＭ中で懸濁した。３７℃で４時間、細胞を遊走させておいた。トランスウェル膜の上面上の遊走しなかった細胞を綿棒で除去した。細孔を通って遊走し、
膜の底面側に付着していた細胞を、メーカーの指示書に従ってＲｅａｓｔａｉｎ  Ｑｕｉｃｋ−Ｄｉｆｆ  Ｋｉｔで染色した。当該ＰＥＴ膜の中心の同じ大きさの４つのフィールドからの細胞を、×１００の倍率にて、接眼レンズインデックス付き目盛板（eyepiece indexed graticule）を用いてカウントした。それぞれの処理は、２回重複して行なった。
【００５１】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ
細胞を、Ａｄ‐Ｅｇｒ３もしくはＡｄ‐ｌａｃＺを用いて、またはこれらを用いずに、４８時間処理した。５μｇの全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｎ試薬（インビトロジェン社）を用いて細胞から抽出し、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を用いて精製した。ＲＮＡは、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ‐Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アフィメトリクス社）を用いて指示通りにビオチン標識ｃＲＮＡへと変換し、メーカーの指示書に従ってアフィメトリクス社のヒトＵ１３３  ２．０アレイにハイブリダイズさせた。ＧｅｎｅＣｈｉｐを、アフィメトリクス社からのプロトコルに従って洗浄および染色し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（アフィメトリクス社）上でスキャンした。データは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ）を用いることにより収集し、正規化の前に１００にスケーリングし（ＧＣＯＳ）、また、差次的遺伝子発現は、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ｖ７．３（アジレント社、米国）を用いて分析した。遺伝子は、その遺伝子の平均相対値が、両比較、すなわちＥｇｒ３  対  非トランスフェクションおよびＥｇｒ３  対  ｌａｃＺ、において、２倍より大きく変化した場合に、差次的に発現した、とみなした。
【００５２】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いることにより抽出し、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（キアゲン社）で、１５分間、室温で処理して、ＤＮＡを除去した。一本鎖ｃＤＮＡは、２μｇの全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）12-18プライマーを用い、２０μｌの反
応体積で、ＲＴ‐ＰＣＲ用のスーパースクリプトファーストストランド合成システム（SuperScript First-Strand Synthesis System）（インビトロジェン社）を用いて合成した
。プライマー対は、Ｐｒｉｍｅ３ソフトウェア（frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3#www.cgi）を用いてデザインし、シグマジェノシスにより合成した。リアルタイムＰＣＲは、メーカーのプロトコルに従って、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ‐ＦａｓｔＳｔａｒｔ
ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ＫｉｔおよびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて行なった。ＰＣＲは、各試料について２回重複して行ない、また、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲには、少なくとも３つの独立した実験からのＲＮＡ調製物を用いた。データは、参照遺伝子であるグリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に正規化した。データは、ＬａｃＺコントロールと比較した平均倍率変化（mean fold change）±標準誤差、として提示する。
【００５３】
免疫ブロッテイング
細胞を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌおよび１％□‐メカプトエンタノール（mecaptoenthanol））で溶解した。等
量のタンパク質を、１０％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）により分離し、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene difluoride）膜（ミリポア社
）に電気転写（electro-transfer）させた。これらの膜を、ＰＢＳ／３％ＢＳＡで１時間、撹拌しながら室温にてブロッキングし、次いで、一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。膜を、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄し、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（Ｄａｋｏ社）と共に、１時間、室温でインキュベートした。免疫反応バンドは、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ試薬（アマシャム社）を用いて、化学発光により検出した。
【００５４】
ｃ‐Ｍｅｔ受容体の活性化
Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞からの上清は、上記で記載されているようにして回収した。細胞を、ポジティブコントロールとしての２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび細胞上清と共にそれぞれ１０分間インキュベートした。細胞溶解物は、メーカーの指示書に従って調製した。ｃ‐Ｍｅｔ受容体のリン酸化は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ社からの高感度かつ特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＰａｔｈＳｃａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（登録商標）Ｍｅｔチロシン１２３４／１２３５）を用いて定量的に決定した。リン酸化ｃ‐Ｍｅｔレベルは、総ｃ‐Ｍｅｔレベルについて正規化した（ＰａｔｈＳｃａｎ  Ｔｏｔａｌ  ｍｅｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）。データは、未処理細胞にスケーリングした活性化倍率（fold activation）として表した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡ
細胞培養上清条件培地は、上記で記載されているようにして回収した。成長因子およびサイトカインのレベルは、メーカーの指示書に従って、特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。
【００５６】
核抽出物の調製およびＥｇｒＤＮＡ結合アッセイ
核抽出物は、メーカーの指示書に従って、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベルギー  リクサンサールのアクティブ・モティフ社）を用いて調製した。簡単に言うと、指示通りに処理した細胞を、かきとることにより回収し、５分間、４℃での５００ｒｐｍの遠心分離によりペレット状にした。この細胞ペレットを、低張緩衝液中で再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。核を、３０秒、１３０００ｒｐｍの遠心分離によりペレット状にした。その上清（細胞質分画）を除去し、かつ、核を、完全溶解緩衝液中で再懸濁し、１５０ｒｐｍのロッキングプラットフォーム上に４℃で３０分間置いた。この核抽出物を、１３０００ｒｐｍにて、１０分間、４℃で遠心し、その上清分画は、タンパク質濃度をバイオ・ラッド・プロテインアッセイキットを用いて測定した後に、分注して−８０℃で凍結した。ＥｇｒＤＮＡ結合は、メーカーの指示書に従って、ＮｏＳｈｉｆｔ  ＩＩ転写因子アッセイ（ノバジェン社）によって調べた。簡単に言うと、等量の核抽出物を、２０分間、室温で、ビオチン標識コンセンサスＥＧＲ応答エレメント（ＥＲＥ）オリゴヌクレオチドを含有する結合溶液と共にインキュベートし、その後に、非結合オリゴヌクレオチドを除去するための、ヌクレアーゼ消化緩衝液中での２０分間の室温でのさらなるインキュベーションが続いた。次いで、これら試料を、Ｅｇｒコンセンサスオリゴの尾部に相補的なオリゴを含有する９６ウェル捕捉プレート中へと移した。これら試料を、室温で４５分間、この捕捉プレート中へとハイブリダイズし、次いで、ストレプトアビジン‐アルカリホスファターゼを含有する検出溶液と共に、３０分間、室温でインキュベートした。これら試料を、マイクロプレートルミノメーターにおける測定の前に、化学発光基質と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＥｇｒＤＮＡ結合活性は、ｌａｃＺコントロールに対する増加倍率（fold increase）として表した。
【００５７】
タイムラプス顕微鏡観察
細胞を、Ａｄ‐Ｅｇｒ３で２４時間感染させた。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する２％ＦＣＳ／基本ＥＢＭ中、２０，０００個の細胞／ｍｌの濃度の、１ミリリットルの単一細胞懸濁液は、２０時間にわたって１０分のタイムラプスインターバルを用いてのビデオ顕微鏡観察のための顕微鏡チャンバーに移す前の４時間の間、フィブロネクチンでコーティングされた１２ウェルプレート上に濃度１０μｇ／ｍｌで播いた。細胞が伸展した面積および細胞伸長を分析するために、ビデオ顕微鏡により取得した画像を、ＬａｓｅｒＰｉｘソフトウェア（バイオ・ラッド社）で分析した。細胞伸長は、Dunn and Brown (1986)により記述されているようにして算出したが、これは、細胞の長軸の、細胞の最短軸
に対する割合、であった。データは、３つの独立した実験の、平均＋／−標準誤差、として提示する。
【００５８】
結果
Ｅｇｒ３の過剰発現はＥｇｒ３ＤＮＡ結合を亢進し、ＮＡＢ２発現を誘導する
ＨＵＶＥＣｓにおけるＥｇｒ３のアデノウィルス感染は、Ｃ末端抗体およびＮ末端抗体の両方により検出されたＥｇｒ３タンパク質の時間依存的な発現を誘導した。Ｅｇｒ３タンパク質、すなわち４３ｋＤａのバンドは、９時間の感染後に増加し始め、１５時間にプラトーに達した。Ａｄ‐Ｅｇｒ３タンパク質の発現の増加は５日間持続した。Ｎ末端が切断されたＥｇｒ３の発現は、Ｃ末端抗体により、１９ｋＤａのバンドとして検出されたが、Ｎ末端抗体によっては検出されなかった。
ｍＲＮＡ発現の経時的研究により、Ａｄ‐Ｅｇｒ３遺伝子発現が、タンパク質発現に先立って、感染の５時間後に増加し始めたとのことが明らかとなった。ΔＥｇｒ３はトランス活性化ドメインを欠失していたがＤＮＡ結合ドメインを保持していたため、予想されるように、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞およびＡｄ‐ΔＥｇｒ３感染細胞の両方においてＥｇｒＤＮＡ結合活性の増加がみられた。このＥｇｒＤＮＡ結合の増加は、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染の２４時間後に始まった。一方、公知のＥｇｒ３標的遺伝子であるＮＡＢ２の発現は、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染の２４時間後に増加し始めたが、Ａｄ‐ΔＥｇｒ３による感染によっては影響を受けず、これは、ΔＥｇｒ３は、ＥＧＲＲＥには結合するものの、転写活性を増加させはしなかったとのことを示唆している。これらの知見が指し示していたのは、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染が、内皮細胞において、Ｅｇｒ３の発現および転写活性を増加させる、とのことであった。
【００５９】
Ｅｇｒ３の過剰発現は内皮細胞において細胞遊走を増加させる
Ａｄ‐Ｅｇｒ３が、応答エレメントへのＥｇｒ３結合を著しく亢進し、下流の標的遺伝子の発現を誘導したことから、我々は、次いで、内皮細胞におけるＡｄ‐Ｅｇｒ３の機能を調査した。機能研究は、すべて、転写活性が最大に達した感染の４８時間後に行なった。Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞およびＡｄ‐ΔＥｇｒ３感染細胞は、補足資料においてみられるような細胞の増殖および生存の有意な変化を示さなかった。しかしながら、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞は、ウィルス用量依存的に細胞遊走について目立った増加を示し、一方、Ａｄ‐ΔＥｇｒ３感染細胞は、細胞遊走を誘導せず、これは、野生型Ｅｇｒ３の過剰発現が、内皮細胞運動性を増加させた、とのことを指し示している。トランスウェルプレートの下側のウェルへのＶＥＧＦの添加は、すべてのウィルス投与量において、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞の遊走のさらなる増加を引き起こした。
【００６０】
Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞の条件培地は化学走性活性を誘導する
Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞が、分泌因子または細胞遊走の増加を刺激し得る因子を産生するかどうかを調査するために、Ａｄ‐Ｅｇｒ３およびＡｄ‐ｌａｃＺの感染細胞ならびに非感染細胞からの上清条件培地を回収し、濃縮し、次いで、トランスウェル遊走アッセイにて試験した。非感染細胞およびＡｄ‐ｌａｃＺ感染細胞からの条件培地と比較して、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞からの条件培地へと向かう細胞遊走では有意な増加がみられたが、これは、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞が、化学走性活性を増加させたとのことを指し示している。
【００６１】
Ａｄ‐Ｅｇｒ３は化学走性因子および他の遺伝子の発現をアップレギュレートする
Ｅｇｒ３により誘導される細胞遊走の、根底にあるメカニズムを理解するために、Ａｄ‐Ｅｇｒ３、Ａｄ‐ｌａｃＺにより感染させた細胞および非感染ＨＵＶＥＣｓからのＲＮＡを抽出し、遺伝子発現をアフィメトリクス社オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析により調べた。ＨＵＶＥＣｓにおけるＥｇｒ３の過剰発現は、複数の遺伝子を誘導およびダウンレギュレートした。これらの遺伝子には、細胞分化、形態形成、化学走性および遊走、細胞接着、細胞シグナル伝達、神経系発生における感覚認知、代謝、転写制御ならびにイオン輸送に関与する遺伝子が含まれる。選択した遺伝子を、定量的リアルタイムＲＴ‐
ＰＣＲにより検証した。これらの因子ＨＧＦ、ＣＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１４、ＣＣＬ２５の発現の増加はＱ‐ＰＣＲにより確認された。しかしながら、Ｑ‐ＰＣＲによって調べたＶＥＧＦ遺伝子の発現には差次的結果がみられた。ＶＥＧＦのすべてのアイソフォームを検出するプライマー対により、ＶＥＧＦ発現において１６倍の増加が確認され、一方、分泌型である１６５および１２１のみに存在するエキソン６に対するプライマー対では、たった２．５倍の増加が同定されたのみであった。基質タンパク質である１型コラーゲンのα１およびラミニンのα１の遺伝子発現も増加した。興味深いことに、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染は、造血幹細胞マーカーであるＣＤ５２およびＴｈｙ１ならびに内皮前駆細胞により高発現される遺伝子ＡＰＯＥの遺伝子発現も誘導したが、一方、成熟内皮細胞の公知のマーカーであるＣＤ３１は、強くダウンレギュレートされた。
【００６２】
Ａｄ‐Ｅｇｒ３はＨＧＦタンパク質放出およびｃ‐Ｍｅｔ受容体活性化を誘導する
オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびＱ‐ＰＣＲ分析の結果は、増加したＥｇｒ３発現により、１種類以上の化学走性因子の、増加したオートクリン産生を通じて、内皮細胞遊走が刺激されるかもしれない、という可能性を提起するものであった。いずれの化学誘引物質がＡｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞遊走を媒介していたのかを決定するために、我々は、まず、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞の条件培地中の分泌タンパク質を、ＥＬＩＳＡにより調べた。ＣＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、およびＨＧＦタンパク質が、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞の条件培地中に検出された。ＨＧＦタンパク質は、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞からの条件培地では、Ａｄ‐ｌａｃＺ感染細胞からよりも１２倍高く、Ｅｇｒ３ＤＮＡ結合の増加と同時に感染の２４時間後に急速に増加したが、これは、ＨＧＦ発現が、Ｅｇｒ３転写活性の増加の結果起こった可能性がある、とのことを指し示している。従って、これにより、Ａｄ‐Ｅｇｒ３により誘導されたＨＧＦが、その受容体を活性化する生物学的活性を有していたのかどうかというもう１つの疑問が提起された。Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞からの条件培地は、また、非感染細胞においてｃ‐Ｍｅｔ受容体のリン酸化も刺激し、ＰａｔｈＳｃａｎ
Ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＭｅｔサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定したＡｄ‐ｌａｃＺ感染細胞からの細胞溶解物と比較したチロシン１２３４／１２３５は１．８倍増加した。
【００６３】
ＨＧＦは内皮遊走を媒介し、ＨＧＦ発現の阻害は、Ａｄ‐Ｅｇｒ３により媒介される内皮遊走を抑制する
次いで、我々は、トランスウェル勾配アッセイの下側のウェルにおける組換えタンパク質の添加による、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１４、ＣＸ3ＣＬ１、およびＨＧＦの
、細胞遊走における化学誘引物質としての能力を試験した。ＣＣＬ１、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１４およびＣＸ３ＣＬ１に応答した遊走については有意な増加はみられなかった。一方、ＨＧＦへと向かう細胞遊走については、ＶＥＧＦのそれに類似の効果と共に、投与量依存的な増加がみられた。
Ａｄ‐Ｅｇｒ３により誘導されるＨＧＦの、化学走性活性に対する効果を決定するべく、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染により誘導される合成ＨＧＦｍＲＮＡの発現を阻害するために、細胞を、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染の２４時間前に、ＨＧＦ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染の２４時間後に、ＨＧＦｓｉＲＮＡは、非標的コントロールｓｉＲＮＡと比較して、ＨＧＦｍＲＮＡの、目立った阻害を生じさせた。これらの結果は、ＨＧＦｓｉＲＮＡが、Ａｄ‐Ｅｇｒ３により誘導されるＨＧＦ発現を防ぐのに効果的であった、とのことを指し示した。ＨＧＦ遺伝子発現の阻害が、ＨＧＦタンパク質の放出を抑制したかどうかを決定するために、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染後のＨＧＦｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞からの上清を回収し、ＨＧＦタンパク質の発現についてＥＬＩＳＡにより調べた。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡおよびＡｄ‐Ｅｇｒ３で処理した細胞と比較して、ＨＧＦｓｉＲＮＡおよびＡｄ‐Ｅｇｒ３で処理した細胞においては、ＨＧＦ産生の目立った減少がみられた。また、同じバッチの上清を、遊走アッセイにおいて化学誘引物質として用いたところ、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較して、ＨＧＦｓｉＲＮＡを含有するＡｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞から回収した条件培
地へと向かう化学走性の有意な減少がみられたが、これは、Ｅｇｒ３により誘導される細胞遊走が、ＨＧＦのアップレギュレーションおよびオートクリン産生を通じて生じたとのことを指し示している。
【００６４】
Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染は内皮の形状および極性の変化を誘導する
コーティングされていないプレートおよびフィブロネクチンでコーティングされたプレート上にて、低密度で培養した細胞は、減少した細胞伸展面積を示し、伸長状態になり、間葉系形態（mesenchymal morphology）を獲得した。非感染細胞およびＡｄ‐ｌａｃＺ感染細胞の動きは、主として、優先的な方向のない、前方の葉状仮足の突出を伴い、その後に、細胞体の残りの部分の収縮と、最終的な後方からの減縮（detracting）とが続く、典型的な内皮の動きを示すものであった。次の動きのために、細胞は、突出をランダムに開始し、同じプロセスを繰り返した。一方、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞は、両端の糸状仮足の突出で開始した。その動きは、細胞の長軸に平行に前方および後方である。細胞は、非感染細胞およびＡｄ‐ｌａｃＺ感染細胞よりも極性があるように見えた。
【００６５】
これらの結果が明らかに指し示しているのは、Ａｄ‐Ｅｇｒ３による感染により誘導される内皮の化学走性は、ＨＧＦのオートクリン産生を介するものであるということである。両トランス活性化ドメインの欠失を有する切断されたＡｄ‐□Ｅｇｒ３は、Ｅｇｒ‐ＤＮＡ結合を増加させることはできたが、ＮＡＢ２遺伝子発現および細胞遊走を誘導しなかったことから、Ｅｇｒ３により媒介される遺伝子発現および細胞遊走は、Ｅｇｒ３特異的転写活性化を介して媒介される、とのことを強く示唆している。
【００６６】
Ｅｇｒ３の過剰発現は、内皮細胞における化学走性因子の産生を誘導したのみならず、基本ＥＢＭへと向かう細胞遊走の増加がみられたことから判断すると内皮細胞の本来備わっている運動性を亢進しもした。Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞は、伸長した状態かつ極性のある状態になり、その形態は、典型的な丸石形状から紡錘形状へと変わり、間葉系細胞のように見えた。しかしながら、Ａｄ‐Ｅｇｒ３感染細胞に関する遺伝子アレイデータでは、例えばビメンチン、ＣＤ２９およびＣＤ１０５などの間葉系細胞マーカーにおける増加は明らかにはならなかった。
【００６７】
Ｔｈｙ‐１、ＣＤ５２、およびＡＰＯＥを含む、造血細胞および内皮前駆細胞に対するマーカーとして公知のいくつかの遺伝子の誘導ならびに内皮マーカーＣＤ３１のダウンレギュレーションが示唆しているのは、Ｅｇｒ３の過剰発現は、内皮細胞の分化の状態を、より前駆細胞様である特性を有する表現型へと調整することができる、ということである。高いレベルのＥｇｒ３が、胚発生中の中枢神経系および他の組織のいくつかの領域において見い出されている。
【配列表】
2013502917000001.app
【国際調査報告】
2013502917.tif 000002
2013502917.tif 000003
2013502917.tif 000004