(57)【要約】  ＧＰＲ３５、および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連した疾患の予防および／または治療のための組成物および方法が開示される。例えば、被験体におけるＧＰＲ３５に病態生理学的に関連した疾患を予防および／または治療するための化合物が開示される。
2013535448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化１】
2013535448.tif 000056
を有する化合物またはそれらの薬学的に許容される塩：
［式中、
ＸはＣまたはＮであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択されるか；または、Ｒ3およびＲ4は、環の隣接する炭素原子と一緒に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、縮合している、あるいは縮合していない、単環、二環、または三環式の複素環または炭素環を形成し、
Ｒ5は、ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101、Ｒ102または
【化２】
2013535448.tif 000057
であり、ここで、Ｒ15は、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、ヒドロキシ、シアノ、またはニトロであり；
Ｒ101およびＲ102は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールからなる群より選択され；ここで、Ｒ101およびＲ102は、それぞれ、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲンまたはアルコキシまたはアリールオキシの１つ以上によって随意的に置換されたアルキル、ハロゲンまたはアルコキシまたはアルキルまたはトリハロアルキルの１つ以上によって随意的に置換されたアリール、アリールまたはヘテロアリールまたは＝Ｏまたはヒドロキシによって随意的に置換されたアルキルによって随意的に置換されたヘテロシクロアルキル、ヒドロキシによって随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に１つ以上のハロゲンまたはアルコキシまたはアルキルまたはトリハロアルキルによって置換されたヘテロアリール、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルおよびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールであり;
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択されるか；または、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10のうちのいずれか２つがフェニル環の隣接する炭素原子と一緒に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、縮合している、あるいは縮合していない、単環、二環、または三環式の複素環または炭素環を形成し、
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択され；
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ101およびＲ102のそれぞれは、随意的に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって独立して置換されている］。
【請求項２】
（ａ）ｈＥＲＧを発現する細胞およびｈＥＲＧを発現しない細胞からなる２種類の異なる型の細胞を用いて化合物を個別にインキュベートし；
（ｂ）ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを用いて各細胞型における前記化合物誘発性の細胞応答をモニタリングし；
（ｃ）前記化合物の存在下、ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤を、前記ｈＥＲＧ発現細胞とともにインキュベートし；
（ｄ）前記化合物の存在下、前記ｈＥＲＧ発現細胞における、前記ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤誘発性の細胞応答をモニタリングし；
（ｅ）前記化合物がｈＥＲＧ調節因子であるか否かを示唆する、前記化合物のバイオセンサーインデックスを生成する
各工程を含む、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法。
【請求項３】
ａ）ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を含む組成物を試験薬と接触させ；
ｂ）ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用をアッセイする
ことを含む、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子を同定する方法。
【請求項４】
（ａ）ＧＰＲ３５を発現する細胞を提供し；
（ｂ）前記細胞を化合物と接触させ；
（ｃ）ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを使用して前記化合物をプロファイリングする
各工程を含む、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法。
【請求項５】
前記化合物が、
【化３−１】
2013535448.tif 000058
【化３−２】
2013535448.tif 000059
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５調節因子である、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、米国特許法（３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ.）第１１９条の下、その内容が信頼するに値し、参照することにより全体が本明細書に援用される、２０１０年７月２０日出願の米国仮特許出願第６１／３６５，８６１号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本願は、３７，５９４バイトの容量を有し、２０１１年７月１３日に作成された「２０１１０７１２＿ＳＰ１０＿２０４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて米国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表の電子的提出に起因して、その電子的に提出した配列表は米国連邦規則（ＣＦＲ）第３７部門§１．８２１（ｃ）によって要求される印刷書類および§１．８２１（ｅ）によって要求されるＣＲＦの両方の役割を担う。配列表に含まれる情報は、参照することによって本明細書に含まれ、国際出願書類の開示の範囲を超えない。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、ＧＰＲ３５および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連した疾患の予防および／または治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、薬物標的の最も豊富な群の１つであり、そうであり続けている。これについては少なくとも２つの重要な推進要因が存在する。第一の要因は、オーファン受容体の脱オーファン化が増え続けていることであり、このオーファン受容体の一部は人間の疾病に影響を与える。例として、アルツハイマー病のＧＰＲ３および糖尿病のＧＰＲ４０がある。第二の要因は、ＧＰＣＲが、豊富な数多くの細胞のシグナル伝達経路（すなわち、多面発現性のシグナル伝達）を生じさせる能力があり、リガンドは受容体活性化の動作上の偏り（operational bias）を与えうるという最近の認識に関連している。これらの経路が偏ったリガンドは、創薬の新しい収益をもたらす可能性がある。
【０００５】
ＧＰＲ３５は、１９９８年に初めて同定されたロドプシン様ＧＰＣＲである［非特許文献１］。ヒトＧＰＲ３５遺伝子は、３０９のアミノ酸のタンパク質をコードする。ＧＰＲ３５は、胃腸組織、リンパ系組織、および中枢および末梢の神経組織など、さまざまな哺乳動物組織において発現される。
【０００６】
幾人かの治験医師は、ＧＰＲ３５が、胃癌の進行［非特許文献２］、神経細胞の興奮性およびシナプスの放出の調節［非特許文献３］、痛覚［非特許文献４］、短指症−精神遅滞症候群の発症［非特許文献５］、および血圧の調節［非特許文献６］に関与していることを報告している。
【０００７】
今日までに、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナスト、およびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を含む、４種類のＧＰＲ３５アゴニストが存在している。キヌレン酸およびＬＰＡは両方ともＧＰＲ３５の内因性リガンドであると推測されていた［非特許文献７および８］。キヌレン酸およびＬＰＡは両方とも、ＧＰＲ３５を発現するＨＥＫ２９３細胞および／またはＣＨＯ細胞に幾つかの細胞応答を生じさせる。例えば、ＧＰＲ３５を発現するＨＥＫ２９３細胞では、２−アシルＬＰＡは、ＧＰＲ３５発現細胞におけるＣａ2+応答、ＲｈｏＡの活性化、およびＥＲＫのリン酸化反応を著しく向上させた。２−アシルＬＰＡは受容体分子の内在化も誘発した。それでもなお、キヌレン酸またはＬＰＡがＧＰＲ３５の天然のアゴニストであるか否かははっきりしていない。
【０００８】
ｈＥＲＧ遺伝子は、電位開口型カリウムチャネル（Ｋｖ１１．１）の孔形成αサブユニットをコードしている。ｈＥＲＧチャネルは、心筋細胞、神経細胞、膵β細胞、平滑筋、および一部の癌細胞を含めたさまざまな組織において発現される。一般に、ｈＥＲＧは、活動電位の再分極にとって重要な、心臓における遅延整流電流Ikrの主成分として最も良く知られている。ｈＥＲＧチャネルの遺伝子変異は、患者に突然死を引き起こす恐れがある疾患である、遺伝性のＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）を生じさせることが知られている。ｈＥＲＧ電流を遮断、またはｈＥＲＧチャネルタンパク質輸送を阻害することができる薬物は、後天的なＬＱＴを惹起させる可能性がある。反対に、ｈＥＲＧチャネルタンパク質の変異はＱＴ短縮症候群を生じさせることが報告されている。
【０００９】
心筋細胞において重要な役割を果たすほかに、白血病、結腸癌、胃癌、乳癌および肺癌の細胞を含めた数種類の癌細胞において、ｈＥＲＧチャネルの発現量が上昇したことを示す証拠が増加しつつある。ｈＥＲＧチャネルが癌細胞において過剰に発現された理由は明らかではないが、ｈＥＲＧチャネルは癌細胞の増殖の一因となりうることが示唆されている。
【００１０】
ｈＥＲＧチャネルは、構造的に異なるチャネル遮断薬を収容可能な独特の細孔領域を有する。比較的大きい内部空洞および、チャネルの内部（Ｓ６）らせん上における特定の芳香族アミノ酸残基（Ｙ６５２およびＦ６５６）の存在は、ｈＥＲＧが異種薬物を収容および結合可能にする重要な特徴である。さまざまなｈＥＲＧチャネル遮断薬に加えて、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、マロトキシンおよびＡ−９３５１４２を含む７種類のｈＥＲＧチャネル活性化剤が同定されている（非特許文献９参照）。これらのｈＥＲＧ活性化剤は、多様な化学構造を有し、異なる機構によってｈＥＲＧチャネル活性を増進する。中でも、マロトキシン（ＭＴＸ）およびＡ−９３５１４２は、電位依存性のチャネル活性化を、脱分極がより少ない電位へとシフトさせることができる。電気生理学の研究は、１０μＭのＭＴＸが、５０％活性化電位（Ｖ1/2）を過分極方向に２５ｍＶよりも大きくシフトさせうることを示した。
【００１１】
ｈＥＲＧチャネルは、ある特定の種類の細胞において、β１インテグリン受容体およびＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ−１）を含めた、他の幾つかの受容体とシグナル伝達複合体を形成することが示されている（例えば、非特許文献１０）。しかしながら、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５を含めたＧＰＣＲが互いに物理的に相互作用し、シグナル伝達複合体を形成することを示唆することを報告している文献はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】B.F. O’Dowd, T. Nguyen, A. Marchese, R. Cheng, K.R. Lynch, H.H. Heng, L.F. Kolakowski Jr, S.R. George (1998) Discovery of three novel G-protein-coupled receptor genes, Genomics 47: 310-313
【非特許文献２】S. Okumura, H. Baba, T. Kumada, K. Nanmoku, H. Nakajima, Y. Nakane, K. Hioki, K. Ikenaka (2004) Cloning of a G-protein-coupled receptor that shows an activity to transform NIH3T3 cells and is expressed in gastric cancer cells, Cancer Sci. 95: 131-135
【非特許文献３】J. Guo, D.J. Williams, H.L. Puhl III, S.R. Ikeda (2008) Inhibition of N-type calcium channels by activation of GPR35, an orphan receptor, heterologously expressed in rat sympathetic neurons, J. Pharmacol. Exp. Ther. 324: 342-351
【非特許文献４】H. Ohshiro, H. Tonai-Kachi, K. Ichikawa (2008) GPR35 is a functional receptor in rat dorsal root ganglion neurons, Biochem. Biophys. Res. Commun. 365: 344-348
【非特許文献５】A.E. Shrimpton, B.R. Braddock, L.L. Thomson, C.K. Stein, J.J. Hoo (2004) Molecular delineation of deletions on 2q37.3 in three cases with an Albright hereditary osteodystrophy-like phenotype, Clin. Genet. 66: 537-544
【非特許文献６】K.D. Min, M. Asakura, Y. Liao, K. Nakamaru, H. Okazaki, T. Takahashi, K. Fujimoto, S. Ito, A. Takahashi, H. Asanuma, S. Yamazaki, T. Minamino, S. Sanada, O. Seguchi, A. Nakano, Y. Ando, T. Otsuka, H. Furukawa, T. Isomura, S. Takashima, N. Mochizuki, M. Kitakaze (2010) Identification of genes related to heart failure using global gene expression profiling of human failing myocardium, Biochem. Biophys. Res. Commun. 393: 55-60
【非特許文献７】J. Wang, N. Simonavicius, X. Wu, G. Swaminath, J. Reagan, H. Tian, L. Ling, (2006) Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35, J. Biol. Chem. 281: 22021-22028
【非特許文献８】S. Oka, R. Ota, M. Shima, A. Yamashita, T. Sugiura (2010) GPR35 is a novel lysophosphatidic acid receptor. Biochem. Biophys. Res. Comm. 395: 232-237
【非特許文献９】Su, Z., et al. Biochem Pharm 77:1383, 2009
【非特許文献１０】Pillozzi, S. et al., (2007) Blood. 110: 1238-1250
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＧＰＲ３５、ｈＥＲＧまたはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に関連した病的状態または疾患を患う、またはそれらに罹りやすい被験体を治療するための新しい薬物治療法が非常に必要とされている。特に、現在利用可能なものに関して特性（安全性プロフィール、有効性、または物理的特性など）の１つ以上が改善された新規薬物が、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＧＰＲ３５および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連した疾患の予防および／または治療のための組成物および方法が開示される。例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化１】
2013535448.tif 000003
【００１５】
を有する化合物の類が、それらの化合物の薬学的に許容される塩を含めて開示され、
ここで：
ＸはＣまたはＮであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択されるか；またはＲ3およびＲ4は、環の隣接する炭素原子と一緒に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、縮合している、あるいは縮合していない、単環、二環、または三環式の複素環または炭素環を形成し、
Ｒ5は、ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101、Ｒ102または
【化２】
2013535448.tif 000004
【００１６】
であり、ここで、Ｒ15は、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、ヒドロキシ、シアノ、またはニトロであり；
Ｒ101およびＲ102は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールからなる群より選択され；ここで、Ｒ101およびＲ102は、それぞれ、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲンまたはアルコキシまたはアリールオキシの１つ以上によって随意的に置換されたアルキル、ハロゲンまたはアルコキシまたはアルキルまたはトリハロアルキルの１つ以上によって随意的に置換されたアリール、アリールまたはヘテロアリールまたは＝Ｏまたはヒドロキシによって随意的に置換されたアルキルによって随意的に置換されたヘテロシクロアルキル、ヒドロキシによって随意的に置換されたシクロアルキル、ハロゲンまたはアルコキシまたはアルキルまたはトリハロアルキルの１つ以上によって随意的に置換されたヘテロアリール、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルおよびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールであり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択されるか；またはＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10のうちのいずれか２つが、フェニル環の隣接する炭素原子と一緒に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、縮合している、あるいは縮合していない、単環、二環、または三環式の複素環または炭素環を形成し、
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択され；
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ101およびＲ102のそれぞれは、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換される。
【００１７】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を治療に有効な量で被験体に投与することを含む、被験体におけるＧＰＲ３５および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連した疾患を予防および／または治療する方法もまた開示される。
【００１８】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を治療に有効な量で含む、被験体におけるＧＰＲ３５および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連した疾患を予防および／または治療するための医薬組成物についても開示される。
【００１９】
ＧＰＲ３５および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体の調節因子をスクリーニングする方法についても開示される。
【００２０】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子を分類する方法、およびＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の活性が病態生理学的に関連する疾患の治療的予防または治療のためのＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ調節因子の使用についても開示される。
【００２１】
本明細書に取り込まれ、その一部を構成する添付の図面は幾つかの実施の形態を例証しており、その説明とともに、本開示の組成物および方法を明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９におけるＧＰＲ３５の発現および位置を示す図。（ａ）はＨＴ２９全細胞溶解液におけるＧＰＲ３５の２つのスプライシング変異体であるＧＰＲ３５ａとＧＰＲ３５ｂの発現を示すウェスタンブロット法を示している。
【図１Ｂ】ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９におけるＧＰＲ３５の発現および位置を示す図。（ｂ）は、ＧＰＲ３５が細胞表面において最初に位置する、抗ＧＰＲ３５抗体によるＧＰＲ３５の染色パターンを示す共焦点像を示している。
【図２Ａ】既知のＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストを用いた、ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。（Ａ）は、ＧＰＲ３５のアゴニストであるザプリナストによって活性化されたＧＰＲ３５がＨＴ−２９細胞において内在化を被ることを示す共焦点像を示している。染色は抗ＧＰＲ３５抗体を使用して達成した。
【図２Ｂ】既知のＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストを用いた、ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。（Ｂ）は、ザプリナストによって刺激した際のＨＴ２９細胞の用量依存性のＤＭＲ応答を示している。
【図２Ｃ】既知のＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストを用いた、ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。（Ｃ）は、ザプリナスト用量の関数としてのＨＴ２９におけるザプリナストＤＭＲシグナルのＤＭＲ陽性事象の振幅を示しており、ザプリナストがＨＴ２９における可飽和ＤＭＲシグナルの誘因となり、１３７±１５ｎＭのＥＣ50をもたらすことを示している。
【図３Ａ】アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸（「ＹＥ２１０」）を使用したＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。Ａは、非透過性のＨＴ２９細胞において、アゴニスト６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸で活性化した後に、ＧＰＲ３５のごく一部のみが細胞の原形質表面にとどまっていたことを示す共焦点像である。染色は抗ＧＰＲ３５抗体を使用して達成した。
【図３Ｂ】アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸（「ＹＥ２１０」）を使用したＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。Ｂは、透過性のＨＴ２９細胞において、アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸で活性化した後に、ＧＰＲ３５の一部が内在化（すなわち、細胞内に局在化）を被ったことを示す共焦点像である。染色は抗ＧＰＲ３５抗体を使用して達成した。
【図３Ｃ】アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸（「ＹＥ２１０」）を使用したＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。Ｃは、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸による刺激におけるＨＴ２９細胞の用量依存性のＤＭＲ応答を示している。
【図３Ｄ】アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸（「ＹＥ２１０」）を使用したＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５の薬理学的特徴付けを示す図。Ｄは、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸の用量の関数としての、ＨＴ２９における６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸のＤＭＲシグナルのＤＭＲ陽性事象の振幅であり、これは、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸がＨＴ２９における可飽和のＤＭＲシグナルを誘発し、１６５±４５ｎＭのＥＣ50をもたらしたことを示している。
【図４Ａ】ＨＴ２９細胞における既知のアゴニストであるザプリナストによるＧＰＲ３５の活性化を通じて仲介されたシグナル伝達が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路と関連していることを示す図。Ａは、Ｆｌｕｏ−４アッセイで測定したところ、ＨＴ２９において、１０マイクロモル濃度のザプリナストが、検出可能なＣａ2+動員シグナルを誘発しなかったことを示している。
【図４Ｂ】ＨＴ２９細胞における既知のアゴニストであるザプリナストによるＧＰＲ３５の活性化を通じて仲介されたシグナル伝達が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路と関連していることを示す図。Ｂは、ＨＴ２９における４００ｎＭのザプリナストのＤＭＲシグナルが、ホスホリパーゼＣ阻害剤であるＵ７３１２２（１０マイクロモル濃度）に対し感受性ではないことを示している。ホスホリパーゼＣは、Ｇq介在性のシグナル伝達における下流カスケードタンパク質である。
【図４Ｃ】ＨＴ２９細胞における既知のアゴニストであるザプリナストによるＧＰＲ３５の活性化を通じて仲介されたシグナル伝達が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路と関連していることを示す図。Ｃは、ＨＴ２９における４００ｎＭのザプリナストのＤＭＲシグナルが、コレラ毒素（ＣＴＸ；１マイクログラム／ｍｌ）の前処理に対しても感受性ではないことを示している。細胞は、ザプリナストによる刺激の前にコレラ毒素で一晩前処理した。
【図４Ｄ】ＨＴ２９細胞における既知のアゴニストであるザプリナストによるＧＰＲ３５の活性化を通じて仲介されたシグナル伝達が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路と関連していることを示す図。Ｄは、ＨＴ２９における４００ｎＭのザプリナストのＤＭＲシグナルが、百日咳毒素（ＰＴＸ；１００ナノグラム／ｍｌ）の前処理に対しても感受性ではないことを示している。細胞は、ザプリナストによる刺激の前にＰＴＸで一晩前処理した。
【図４Ｅ】ＨＴ２９細胞における既知のアゴニストであるザプリナストによるＧＰＲ３５の活性化を通じて仲介されたシグナル伝達が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路と関連していることを示す図。Ｅは、ＨＴ２９における４００ｎＭのザプリナストのＤＭＲシグナルが、アクチンフィラメント破壊剤であるサイトカラシンＤ（１０マイクロモル濃度）によって十分に減衰されたことを示している。
【図４Ｆ】ＨＴ２９細胞における既知のアゴニストであるザプリナストによるＧＰＲ３５の活性化を通じて仲介されたシグナル伝達が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路と関連していることを示す図。Ｆは、ＨＴ２９における４００ｎＭのザプリナストのＤＭＲシグナルが、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２（１０マイクロモル濃度）によってある程度減衰されたことを示している。
【図５Ａ】Ｆｌｕｏ−４Ｃａ2+動員アッセイで測定した、改変ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ３５のシグナル伝達を示す図。Ａは、内因性のムスカリン様Ｍ3受容体アゴニストであるカルバコール（１０μＭ）による刺激における改変細胞のリアルタイム反応速度論を示している。ＨＥＫ２９３細胞は一時的にトランスフェクトされ、それぞれ、Ｇqo5（Ｇo）、ＧＰＲ３５（ＧＰＲ３５）、またはＧqo5とＧＰＲ３５の両方（ＧＰＲ３５Ｇo）を発現した。グラフにＡ、Ｂで示すように、各測定は複数回行われた。
【図５Ｂ】Ｆｌｕｏ−４Ｃａ2+動員アッセイで測定した、改変ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ３５のシグナル伝達を示す図。Ｂは、既知のＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナスト（１０μＭ）による刺激における改変細胞のリアルタイム反応速度論を示している。ＨＥＫ２９３細胞は一時的にトランスフェクトされ、それぞれ、Ｇqo5（Ｇo）、ＧＰＲ３５（ＧＰＲ３５）、またはＧqo5とＧＰＲ３５の両方（ＧＰＲ３５Ｇo）を発現した。グラフにＡ、Ｂで示すように、各測定は複数回行われた。
【図５Ｃ】Ｆｌｕｏ−４Ｃａ2+動員アッセイで測定した、改変ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ３５のシグナル伝達を示す図。Ｃは、本開示にしたがって同定されたＧＰＲ３５アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸（１０μＭ）による刺激における、改変細胞のリアルタイム反応速度論を示している。ＨＥＫ２９３細胞は一時的にトランスフェクトされ、それぞれ、Ｇqo5（Ｇo）、ＧＰＲ３５（ＧＰＲ３５）、またはＧqo5とＧＰＲ３５の両方（ＧＰＲ３５Ｇo）を発現した。グラフにＡ、Ｂで示すように、各測定は複数回行われた。
【図６Ａ】ＧＰＲ３５調節因子のスクリーニングを目的とした二段階Ｅｐｉｃ（登録商標）細胞アッセイを示す図。Ａは、アゴニズムモードの例（１０マイクロモル濃度の６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸でＨＴ２９を刺激）を示しており、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸はザプリナストに似たロバスト性ＤＭＲシグナルを誘発し、緩衝液ビヒクル（すなわち陰性対照）は明白なＤＭＲを生じなかった。すべての実験において、４００ナノモル濃度のザプリナストを用いて試験した。
【図６Ｂ】ＧＰＲ３５調節因子のスクリーニングを目的とした二段階Ｅｐｉｃ（登録商標）細胞アッセイを示す図。Ｂは、アンタゴニストモードの例であり、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸による細胞の前処理がザプリナストによる順次刺激に対する細胞の脱感作をもたらしたのに対し、緩衝液ビヒクルは、ザプリナストのＤＭＲにほとんど影響を示さなかった。すべての実験において、４００ナノモル濃度のザプリナストを用いて試験した。
【図６Ｃ】ＧＰＲ３５調節因子のスクリーニングを目的とした二段階Ｅｐｉｃ（登録商標）細胞アッセイを示す図。Ｃは、アゴニズムモードにおける化合物の関数としての、刺激後５分の時点におけるＤＭＲシグナルの振幅を示している。すべての実験において、４００ナノモル濃度のザプリナストを用いて試験した。
【図６Ｄ】ＧＰＲ３５調節因子のスクリーニングを目的とした二段階Ｅｐｉｃ（登録商標）細胞アッセイを示す図。Ｄは、それぞれ１０マイクロモル濃度の化合物で前処理することによって阻害されたザプリナストＤＭＲシグナルのパーセンテージを示している。すべての実験において、４００ナノモル濃度のザプリナストを用いて試験した。
【図７Ａ】ＨＴ２９細胞におけるｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体の特徴付けを示す図。ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５オリゴマーは、抗ＧＰＲ３５抗体（ＩＰ−ＧＰＲ３５）または抗ｈＥＲＧ抗体（ＩＰ−ｈＥＲＧ）を使用してＨＴ２９細胞から免疫沈降させることができる。Ａは、ＧＰＲ３５についてのウェスタンブロットを示している。
【図７Ｂ】ＨＴ２９細胞におけるｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体の特徴付けを示す図。ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５オリゴマーは、抗ＧＰＲ３５抗体（ＩＰ−ＧＰＲ３５）または抗ｈＥＲＧ抗体（ＩＰ−ｈＥＲＧ）を使用してＨＴ２９細胞から免疫沈降させることができる。Ｂは、ｈＥＲＧについてのウェスタンブロットを示している。抗ＩｇＧを用いた免疫沈降を利用して得られた細胞溶解物サンプルを陰性対照として使用した。
【図８】ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。ＮＰＰＢまたはザプリナストで処理した細胞の、その後のザプリナスト（４００ｎＭ）またはＮＰＰＢ（１μＭ）のいずれかによる刺激に対する用量依存性の脱感作。ＮＰＰＢまたはザプリナスト用量の関数としてのＨＴ２９におけるザプリナストＤＭＲシグナルのＤＭＲ陽性事象の振幅。細胞の前処理には、さまざまな用量のＮＰＰＢまたはザプリナストを使用した。
【図９Ａ】自動パッチクランプ法を利用した改変ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＥＲＧ）におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ａは、自動パッチクランプ法のプロトコルを示している。
【図９Ｂ】自動パッチクランプ法を利用した改変ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＥＲＧ）におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ｂは、ｈＥＲＧチャネルの電気生理学的記録を示している。
【図９Ｃ】自動パッチクランプ法を利用した改変ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＥＲＧ）におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ｃは、ｈＥＲＧチャネルのテール電流に与えるザプリナストの影響を示している。
【図１０Ａ】ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを利用した、天然および改変ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ａは、ザプリナスト（１０μＭ）によって誘発されたＨＥＫ２９３のＤＭＲシグナルを示している。
【図１０Ｂ】ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを利用した、天然および改変ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ｂは、ザプリナスト（１０μＭ）によって誘発されたＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞のＤＭＲシグナルを示している。
【図１０Ｃ】ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを利用した、天然および改変ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ｃは、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞におけるｈＥＲＧ活性化剤であるマロトキシンによって誘発されたＤＭＲシグナルに対するザプリナスト（１０μＭ）の影響を示している。緩衝液のみで処理した細胞（緩衝液）を陽性対照として使用した。
【図１１Ａ】ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ａは、ＨＴ２９細胞のマロトキシン（１６μＭ）ＤＭＲシグナルに対するザプリナスト（１０μＭ）の影響を示している。緩衝液のみで処理した細胞（緩衝液）を陽性対照として使用した。
【図１１Ｂ】ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けするアッセイを示す図。Ｂは、ＨＴ２９細胞におけるザプリナスト（４００ｎＭ）ＤＭＲシグナルに対するマロトキシン（１０μＭ）の影響を示している。緩衝液のみで処理した細胞（緩衝液）を陽性対照として使用した。
【図１２】ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体の略図。受容体シグナル伝達複合体は、細胞の原形質膜で形成され、原形質膜に位置している。ｈＥＲＧリガンドによるｈＥＲＧチャネルの活性化はシグナル伝達Ａを発生させるのに対し、ＧＰＲ３５アゴニストによるＧＰＲ３５の活性化はシグナル伝達Ｂを発生させる。ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５アゴニストによるｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体の活性化はシグナル伝達Ｃを発生させる。
【図１３】ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体調節因子の分類を表す図。左から右へ順番に：（１）ＧＰＲ３５アゴニストであり、かつｈＥＲＧ活性化剤であるｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体活性化剤（ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体活性化剤）。（２）ｈＥＲＧチャネルを転写活性化することができる機能的選択性のＧＰＲ３５アゴニスト（ｈＥＲＧ転写活性化ＧＰＲ３５アゴニスト）。（３）ＧＰＲ３５を転写活性化することができる機能的選択性のｈＥＲＧ活性化剤（ＧＰＲ３５転写活性化ｈＥＲＧ活性化剤）。（４）ｈＥＲＧを転写活性化することができないＧＰＲ３５特異的アゴニスト（ｈＥＲＧ非転写活性化ＧＰＲ３５アゴニスト）。（５）ＧＰＲ３５を転写活性化することができないｈＥＲＧ特異的活性化剤（ＧＰＲ３５非転写活性化ｈＥＲＧ活性化剤）である。
【図１４】Ｆｌｕｏ−４Ｃａ2+動員アッセイで測定した、改変ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ３５シグナル伝達を示す図。既知のＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナスト（１０μＭ）による刺激における、改変細胞の代表的なリアルタイム反応速度論。ＨＥＫ２９３細胞は一時的にトランスフェクトされ、それぞれ、Ｇqo5、ＧＰＲ３５、またはＧqo5とＧＰＲ３５の両方を発現した。
【図１５Ａ】ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストに対して応答した、ＨＴ２９細胞の用量依存性のＤＭＲシグナルを示す図。
【図１５Ｂ】ｈＥＲＧ活性化剤であるマロトキシンに対して応答した、ＨＴ２９細胞の用量依存性のＤＭＲシグナルを示す図。
【図１６】ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストが、ＨＴ２９細胞において、ｈＥＲＧ活性化剤であるマロトキシン誘発性のＤＭＲシグナルを、用量依存的にある程度減衰したことを示す図。１６マイクロモル濃度のマロトキシンを用いた。細胞の前処理には、異なる用量のザプリナストを使用した。
【図１７】ｈＥＲＧ活性化剤であるマロトキシンが、ＨＴ２９細胞において、ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナスト誘発性のＤＭＲシグナルを用量依存的に部分的に阻害したことを示す図。４００ナノモルのザプリナストを用いた。細胞の前処理には、異なる用量のマロトキシンを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法を開示し、説明する前に、他に特に規定されない限り、特定の合成方法または特定の処理／治療方法に限定されず、あるいは、他に特に規定されない限り、特定の試薬に限定されず、当然ながら、それ自体は変化しうることが理解されよう。本明細書で用いられる専門用語は、単に特定の実施の形態を説明する目的のためのものであって、限定することは意図されていないこともまた理解されよう。
【００２４】
背景
Ａ．  電位依存性のイオンチャネル
電位依存性のイオンチャネルは、例えば心臓および神経などの興奮組織における細胞表面膜を貫通するタンパク質である。チャネルを通過するイオンは、心筋活動電位の根幹を成している。Ｎａ+およびＣａ2+イオンの流入は、それぞれ、活動電位の脱分極性の立ち上り相およびプラトー相を調節する。Ｋ+イオンの流出は、細胞膜を再分極し、活動電位を終結させ、筋肉の弛緩を可能にする。再分極電流の速い成分は、ヒト・エーテル・ア・ゴー・ゴー関連遺伝子（ｈＥＲＧ）によってコードされたＫ+チャネルを通過する。再分極障害は、活動電位の持続期間を延長し、弛緩を遅延させ、心拍の乱れを促進しうる。活動電位の延長は、心電図（ＥＣＧ）で測定したＱＴ間隔の長期化として臨床的に検出される。薬物誘発性のＱＴの長期化は、再分極障害に起因した薬物の重篤な合併症であり、致命的な心室性不整脈の危険性の増大に関連する。薬物誘発性のＱＴの長期化は、ほとんどの場合、ｈＥＲＧのＫ+チャネルの遮断と関係している。多量の薬物、例えばメタンスルホンアニリド、ドフェチリド、ＭＫ−４９９、およびＥ−４０３１などは、心臓において、ｈＥＲＧなどのＫ+イオンチャネルを遮断し、感受性者に生命を脅かす心室性不整脈および心臓麻痺を引き起こすことが知られている。残念ながら、薬物誘発性の心室性不整脈の発生は、臨床試験で検出するには少なすぎることが多い。
【００２５】
１．  ｈＥＲＧ
ＫＣＮＨ２またはヒト・エーテル・ア・ゴー・ゴー関連遺伝子（ｈＥＲＧ）は、一体化されてＫｖ１１．１ カリウム チャネルを形成する、Ｋｖ１１．１ α−サブユニットをコードする。ｈＥＲＧ遺伝子は、小胞体において、コアがグリコシル化された未成熟の１３５ｋＤａのタンパク質（Ｋｖ１１．１）として翻訳され、ゴルジ装置において複合的にグリコシル化された成熟した１５５ｋＤａのタンパク質へと転化される。Ｗａｒｍｋｅら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. 91(8), 3438-3442；参照することにより援用される）は、ｈＥＲＧ遺伝子の配列および構造およびその野生型の翻訳生成物であるＫｖ１１．１について開示している。ｈＥＲＧタンパク質の配列は（ＮＰ＿００２２９）に開示されている。ｈＥＲＧ遺伝子の配列は（ＮＭ＿００２３８）に開示されている。
【００２６】
例えばテルフェナジン（抗ヒスタミン剤）、アステミゾール（抗ヒスタミン剤）、およびシサプリド（消化管運動）などの非心臓血管薬によるｈＥＲＧチャネルの遮断に起因する突然死は、それら薬剤の市場からの撤退の原因となる。最近、バイオックス、セレブレックスおよびベクストラなどの薬剤も、心臓への危険な副作用に関連する懸念のため、市場から撤収された。その結果、Ｋ+チャネルに関連する心臓安全性は、規制機関の主要な関心事となっている。費用のかかる自然淘汰を未然に防ぐため、できるだけ早急に、最先端の化合物におけるｈＥＲＧチャネルの阻害活性を排除することが、創薬における最優先となってきている。
【００２７】
ｈＥＲＧ遮断活性について、可能性のある薬物分子を試験するための現在の方法は、幾つかの限定を有する。細胞系のパッチクランプ電気生理学または動物実験に基づいた技術は技術的に難しく、臨床前の心臓安全性試験の処理能力および正確さの要件を満たさない。他のアッセイは、結合の検出および定量化のために、放射性同位体でラベル付けした、蛍光性の、染料と結合した、またはビオチニル化した標識を使用する。しかしながら、これらの標識の多くは、標識化後に活性が低下してしまう。加えて、放射性同位体でラベル付けした類似体の使用は、複雑な基幹施設の必要性および放射性活性化合物の操作のための許諾などの実施上の制限をもたらす。本明細書において、ｈＥＲＧ Ｋ+チャネル、またはｈＥＲＧ、またはｈＥＲＧイオンチャネル、またはｈＥＲＧチャネルなどと称される、このチャネルの雑多な性質は、その相互作用から浮上しうる致命的転帰の可能性に関連した、多様な化学構造との結合を生じさせる（Cavalli, A et al., J Med Chem 2002, 45(18), 3844-53）。これらの現実は、すべての新規薬物候補に、天然型または組み換え型で発現したヒトｈＥＲＧタンパク質を使用する機能的パッチクランプアッセイ法の試験を受けさせるという日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（International Congress of Harmonization）および米国食品医薬品局の推奨をもたらす結果となった（Bode, G., et al., Fundam Clin Pharmacol 2002, 16(2), 105-18）。自動化された、高スループットのパッチクランプ法が最近開発されているが、このようなシステムは、特殊なオペレータ、生細胞、およびかなりの資本投資を必要とする（Bridgland-Taylor, M.  et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2006, 54(2), 189-99；Dubin, A. et al., J. Biomol. Screen. 2005, 10, (2), 168-81）。それ以上に重要なことは、これらの電気生理学的なアプローチが、小分子によるｈＥＲＧ変調の、可能性のある機能的結果ではなく、イオン束および膜電位を測定することに限定されることである。したがって、薬物候補などの分子のｈＥＲＧチャネルへの結合を特徴付けおよび定量化するための新しい組成物および方法を開発する必要がある。
【００２８】
Ｂ．  Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）
Ｇタンパク質共役受容体は、受容体の幅広いスーパーファミリーを含めた固有の膜タンパク質である。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーの仲間は、少なくとも２５０も存在する（Strader et al. FASEB J., 9:745-754, 1995；Strader et al. Annu. Rev. Biochem., 63:101-32, 1994）。ヒト遺伝子の１％はＧＰＣＲをコードしうると推定されている。多くのＧＰＣＲは、一般的な分子構造および一般的なシグナル伝達機構を共有する。歴史的には、ＧＰＣＲは６つのファミリーに分類されており、最初は関係がないと考えられていたが、そのうちの３つは脊椎動物で見出されている。最近の研究から、幾つかの新しいＧＰＣＲファミリーが同定されており、それらのすべてについて、一般的な進化上の起源の可能性が示唆されている。
【００２９】
ほとんどのＧＰＣＲについての特徴的特性の１つは、７つの疎水性アミノ酸残基、または膜貫通領域（ＴＭ、７回膜貫通型（７TM）領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７として指定される）が一次構造に配置され、それらの各領域において細胞膜を貫く（貫通する）ことである。ドメインは、３つの細胞内ループ（ｉ１、ｉ２、およびｉ３）、３つの細胞外ループ（ｅ１、ｅ２、およびｅ３）、およびアミノ（Ｎ）−末端およびカルボキシ（Ｃ）−末端のドメインが接続した膜貫通α−ヘリックスを表すと考えられている（Palczewski et al., Science 289, 739-45 (2000)）。ほとんどのＧＰＣＲは、機能性のタンパク質構造を安定化させると考えられるジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループのそれぞれに、単一の保存されたシステイン残基を有する。先に詳しく述べたこれらの構造は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質の中では一般的であり、タンパク質が膜を貫通する領域（膜貫通領域または膜透過領域）に対応するアミノ酸配列、および膜貫通領域に近いアミノ酸配列は、受容体の中でも高度に保存されていることがよく知られている。よって、ＧＰＣＲの高度の相同性に起因して、新しいＧＰＣＲの同定は、このような新しい種類の細胞内部分および細胞外部分の両方における良好な同定として、当業者によって容易に達成される。
【００３０】
１．  ＧＰＲ３５
ＧＰＲ３５は、１９９８年に最初に同定されたロドプシン様ＧＰＣＲである［B.F. O'Dowd, T. Nguyen, A. Marchese, R. Cheng, K.R. Lynch, H.H. Heng, L.F. Kolakowski Jr, S.R. George (1998) Discovery of three novel G-protein-coupled receptor genes, Genomics 47: 310-313］。ヒトＧＰＲ３５遺伝子は、３０９アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＧＰＲ３５は、例えば胃腸組織、リンパ系組織、並びに中枢および末梢の神経組織など、さまざまな哺乳動物組織において発現される。
【００３１】
幾人かの治験医師は、ＧＰＲ３５が、胃癌の進行（Okumura, S., et al., (2004) Cancer Sci, 95: 131-135）、神経細胞の興奮性およびシナプスの放出の調節（J. Guo, et al., (2008) J. Pharmacol. Exp. Ther. 324: 342-351）、痛覚（H. Ohshiro et al., (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 365: 344-348）、短指症−精神遅滞症候群の発症（A.E. Shrimpton, et al., (2004) Clin. Genet. 66: 537-544）、および血圧の調節（K.D. Min, et al., (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 393: 55-60）に関与することを報告している。
【００３２】
ＧＰＲ３５を活性化するＧＰＲ３５リガンド、特に内因性リガンドは、長い間、同定が試みられている。今までに、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナスト、およびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を含めた、４つのＧＰＲ３５アゴニストが報告されている。キヌレン酸とＬＰＡは両方とも、ＧＰＲ３５の内因性リガンドであると推測された［J. Wang, N. Simonavicius, X. Wu, G. Swaminath, J. Reagan, H. Tian, L. Ling, (2006) Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35, J. Biol. Chem. 281: 22021-22028；S. Oka, R. Ota, M. Shima, A. Yamashita, T. Sugiura (2010) GPR35 is a novel lysophosphatidic acid receptor. Biochem. Biophys. Res. Comm. 395: 232-237］。キヌレン酸とＬＰＡは両方とも、ＧＰＲ３５を発現するＨＥＫ２９３細胞および／またはＣＨＯ細胞に幾つかの細胞応答を引き起こす。例えば、ＧＰＲ３５を発現するＨＥＫ２９３細胞では、２−アシルＬＰＡは、ＧＰＲ３５発現細胞におけるＣａ2+応答、すなわち、ＲｈｏＡおよびＥＲＫのリン酸化反応の活性化を著しく高める。２−アシルＬＰＡはまた、受容体分子の内在化を誘発する。それにもかかわらず、キヌレン酸またはＬＰＡがＧＰＲ３５の天然のアゴニストであるか否かは不明確なままである。
【００３３】
ＧＰＲ３５に関連する病的状態または疾患を患う、またはそれらを生じやすい被験体を治療するための新規薬物治療が渇望されている。特に、現在利用可能な薬物に関する特性（安全性プロフィール、有効性、または物理的特性など）の１つ以上が改善された新規薬物が依然として必要とされている。
【００３４】
Ｃ．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体
本発明は、ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体に関する。ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体は、物理的な受容体間の相互作用を介してｈＥＲＧとＧＰＲ３５の間に形成されるシグナル伝達複合体であり、細胞原形質膜に位置している（図１、７、および１２参照）。シグナル伝達複合体は、改変細胞（例えば、組み換えによってｈＥＲＧチャネルおよびＧＰＲ３５を共発現するＨＥＫ−ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５細胞）、または体内に生じた細胞（例えば、結腸癌細胞ＨＴ２９、白血病細胞ＨＬ−６０、または胃癌細胞ＭＫＮ４５、または心不全の種に由来する心筋細胞などの初代心臓細胞）のいずれかに形成される。細胞は、動物細胞またはヒト細胞でありうる。ＨＬ−６０は、主にＧＰＲ３５を発現し、ｈＥＲＧの発現は比較的低い。
【００３５】
材料
Ａ．化合物
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化３】
2013535448.tif 000005
【００３６】
を有する化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩が開示され、
ここで：
ＸはＣまたはＮであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択されるか；またはＲ3およびＲ4は、環の隣接する炭素原子と一緒に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、縮合している、あるいは縮合していない、単環、二環、または三環式の複素環または炭素環を形成し、
Ｒ5は、ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101、Ｒ102または
【化４】
2013535448.tif 000006
【００３７】
であり、ここで、Ｒ15は、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、ヒドロキシ、シアノ、またはニトロであり；
Ｒ101およびＲ102は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールからなる群より選択され；ここで、Ｒ101およびＲ102は、それぞれ、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲンまたはアルコキシまたはアリールオキシの１つ以上によって随意的に置換されたアルキル、ハロゲンまたはアルコキシまたはアルキルまたはトリハロアルキルの１つ以上によって随意的に置換されたアリール、アリールまたはヘテロアリールまたは＝Ｏまたはヒドロキシによって随意的に置換されたアルキルによって随意的に置換されたヘテロシクロアルキル、ヒドロキシによって随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に１つ以上のハロゲンまたはアルコキシまたはアルキルまたはトリハロアルキルによって置換されたヘテロアリール、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルおよびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールであり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択されるか；または、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10のうちのいずれか２つがフェニル環の隣接する炭素原子と一緒に、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基によって随意的に独立して置換された、縮合している、あるいは縮合していない、単環、二環、または三環式の複素環または炭素環を形成し、
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、−ＮＯ2、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より選択され；
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ101およびＲ102のそれぞれは、水素、ハロゲン、シアノ、−ＯＲ101、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ101、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ101、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｒ102、−ＮＲ101Ｓ（Ｏ）2Ｒ102、−ＮＲ101Ｃ（Ｏ）Ｒ102、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ102 、−ＳＲ101、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ101Ｒ102、Ｒ101およびＲ102からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基で随意的に独立して置換されている。
【００３８】
幾つかの形態では、本開示の化合物は、式（Ｉ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である。他の幾つかの形態では、本開示の化合物は、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である。他の幾つかの形態では、本開示の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００３９】
幾つかの形態では、本開示の化合物は、式（Ｉ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、ここで、式（Ｉ）の化合物は、
【化５】
2013535448.tif 000007
【００４０】
からなる群より選択される化合物である。
【００４１】
幾つかの形態では、本開示の化合物は、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、ここで、式（ＩＩ）の化合物は、
【化６】
2013535448.tif 000008
【００４２】
からなる群より選択される化合物である。
【００４３】
幾つかの形態では、本開示の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、ここで、式（ＩＩＩ）の化合物は、
【化７】
2013535448.tif 000009
【００４４】
からなる群より選択される化合物である。
【００４５】
１．  異性体
以下、本開示の化合物と称される、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物に不斉中心が存在するときは、その化合物は光学異性体（エナンチオマー）の形態で存在しうる。幾つかの形態では、本開示の化合物および組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物のラセミ混合物を含めた、エナンチオマーおよび混合物を含みうる。幾つかの形態では、２つ以上の不斉中心を含む式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物について、本開示の化合物および組成物は、化合物のジアステレオマー型（それらの個別のジアステレオマーおよび混合物）を含みうる。式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物がアルケニル基または部分を含むときは、幾何異性体が生じうる。
【００４６】
２．  互変異性型
本開示の組成物および化合物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物の互変異性型を含む。構造異性体が低エネルギー障壁を介して相互変換可能なときは、相互変異性（「互変異性」）が生じうる。これは、例えばイミノ、ケト、またはオキシム基を含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物のプロトン互変異性、または芳香族部分を含む化合物のいわゆる原子価互変異性の形態をとりうる。その結果として、単一の化合物は２種類以上の異性を示す場合がある。固体および液体形態の互変異性体のさまざまな比は、分子におけるさまざまな置換基、ならびに化合物の単離に用いられる特定の結晶化技術に応じて決まる。
【００４７】
３．  塩
本開示の組成物および化合物は、無機酸または有機酸に由来する塩の形態で使用することができる。特定の化合物に応じて、化合物の塩は、さまざまな温度および湿度における薬学的安定性の改善、または水または油中における望ましい溶解性など、１つ以上の塩の物理的特性に起因して有利でありうる。幾つかの事例では、化合物の塩は、化合物の単離、精製、および／または分割における助剤として用いることもできる。
【００４８】
塩を患者に投与することが（例えば、インビトロで使用されるのとは対照的に）意図されている場合、その塩は薬学的に許容されていることが好ましい。「薬学的に許容される塩」という用語は、化合物（本開示の化合物など）を、ヒトがそのアニオンを摂取するのに適していると一般的に考えられている酸、または、ヒトがそのカチオンを摂取するのに適していると一般的に考えられている塩基と組み合わせることによって調製された塩のことを指す。薬学的に許容される塩は、親化合物と比較して水溶解度が大きいことから、本開示の方法の生成物として特に有用である。医薬における使用では、本開示の化合物の塩は、非毒性の「薬学的に許容される塩」である。「薬学的に許容される塩」に包含される塩とは、一般的には、遊離塩基を適切な有機または無機酸と反応させることによって調製された、本開示の化合物の非毒性の塩のことを指す。
【００４９】
本開示の化合物の適切な薬学的に許容される酸付加塩としては、可能な場合には、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、ホウ酸、フルオロホウ酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、カルボン酸、スルホン酸、および硫酸などの無機酸に由来するもの、ならびに、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グリコール酸、イソチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、コハク酸、トルエンスルホン酸、酒石酸、およびトリフルオロ酢酸などの有機酸に由来するものなどが挙げられる。適切な有機酸としては、一般に、例えば、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族（araliphatic）、複素環式（heterocyclylic）、カルボン酸およびスルホン酸の類の有機酸が挙げられる。
【００５０】
適切な有機酸の具体的な例としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、ジグルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸（algenic acid）、β−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、ガラクツロン酸、アジピン酸、アルギン酸、酪酸、カンファー酸、カンファースルホン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ドデシル硫酸、グリコヘプタン酸、グリセロリン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸（naphthalesulfonate）、シュウ酸、パルモ酸（palmoate）、ペクチン酸（pectinate）、３−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、チオシアン酸、トシル酸およびウンデカン酸が挙げられる。
【００５１】
さらには、本開示の化合物が酸部分を有する場合には、それらの薬学的に許容される適切な塩としては、例えばナトリウムまたはカリウム塩などのアルカリ金属塩；例えば銅、カルシウムまたはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；および、例えば第４級アンモニウム塩などの適切な有機リガンドによって形成される塩が挙げられる。幾つかの形態では、塩基性塩は、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、コリン、ジエチルアミン、ジオールアミン、グリシン、リジン、メグルミン、オラミン、トロメタミンおよび亜鉛の塩を含めた非毒性の塩を形成する塩基から形成される。
【００５２】
有機塩は、トロメタミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、およびプロカインなどの第２級、第３級または第４級のアミン塩から形成されうる。塩基性の窒素含有基は、低アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）ハロゲン化物（例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化、臭化、およびヨウ化物）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルの塩化、臭化、およびヨウ化物）、アリールアルキルハロゲン化物（例えば、臭化ベンジルおよび臭化フェネチル）、および他のものなどの薬剤によって４級化されうる。幾つかの形態では、例えばヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩などの酸および塩基のヘミ塩も形成されうる。本開示の化合物は、非溶媒和および溶媒和の両方の形態で存在しうる。本明細書では「溶媒和物」とは、溶媒と溶質、または分散手段と分散相の非共有結合性または易分散性の組合せが存在する、非水溶液または分散質である。
【００５３】
幾つかの形態では、薬学的に許容される塩、特に本明細書に開示される−ＣＯＯＨ含有化合物の塩は、銅（ＩＩ）またはＺｎ（ＩＩ）の基レートの形態をしている。
【００５４】
４．  プロドラッグ
本開示の化合物のいわゆる「プロドラッグ」も開示される。よって、それ自体は薬理学的活性をほとんど有しない、本開示の化合物のある特定の誘導体は、体内または体表面に投与される場合、例えば加水分解などによって、所望の活性を有する本開示の化合物へと変換されうる。このような誘導体は「プロドラッグ」と称される。プロドラッグの使用についてのさらなる情報は、“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” Vol. 14, ACS Symposium Series (T Higuchi and W Stella)および“Bioreversible Carriers in Drug Design,” Pergamon Press, 1987 (ed. E B Roche, American Pharmaceutical Association)に掲載されている。本明細書で開示されるプロドラッグは、例えば、式Ｉの化合物中に存在する適切な官能基を、例えばＨ Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（Elsevier, 1985）による“Design of Prodrugs”に記載される「プロモイエティ」として当業者に知られているある特定の部分と置換することによって生成することができる。
【００５５】
５．  同位体
１つ以上の原子が、通常自然界において見られる原子質量または質量数とは異なった原子質量または質量数を有する原子によって置換されているという事実以外は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）に列挙された化合物に等しい、同位体で標識された化合物もまた開示される。本開示の化合物に導入されうる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、例えば、それぞれ、2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、11Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、18Ｏ、17Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ、および36Ｃｌなどが挙げられる。前述の同位体および／または他の原子の他の同位体を含めた、本開示の化合物、それらのプロドラッグ、および前記化合物または前記プロドラッグの薬学的に許容される塩が意図されている。ある特定の同位体で標識された本開示の化合物、例えば3Ｈおよび14Ｃなどの放射性同位体が導入されたものは、薬物および／または基質の組織分布アッセイに有用である。トリリチウム化した、すなわち3Ｈ、および炭素−１４、すなわち14Ｃの同位体は、調製容易性および可検出性に関して特に好ましい。さらには、重水素すなわち2Ｈなどのより重い同位体による置換は、例えばインビボにおける半減期の増大または必要用量の低減など、より大きい代謝安定性に起因する、ある特定の治療上の利点を提供することができ、したがって、ある状況においては好ましいであろう。同位体で標識された、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物（および他の開示化合物）およびそれらのプロドラッグは、一般に、同位体で標識されていない試薬を容易に利用可能な同位体で標識された試薬に置換することによる、下記のスキームおよび／または実施例および調製に開示される手順を実行することによって、調製することができる。
【００５６】
６．  一般的な合成スキーム
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物（および他の本開示の化合物）、またはそれらの薬学的に許容される塩は、有機化学の分野で知られている合成方法、または当業者によく知られている改質および誘導体化の方法と一緒に、「実施例」のセクションに記載される例によって示される方法で調製することができる。本明細書で用いられる出発物質は市販されているか、または、当技術分野で既知の日常的な方法（COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS, Vol. I-VI（出版：Wiley-Interscience）などの標準参考図書に開示される方法など）によって調製することができる。好ましい方法としては、限定はしないが、下記のものが挙げられる。以下の合成順序のいずれかの間に、関係する分子のいずれかにおける感受性基または反応基を保護することが必要および／または望ましいであろう。これは、参照することにより本明細書に含まれる、例えばT. W. Greene, Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 1981；T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 1991、およびT. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 1999に記載されるものなど、従来の保護基を用いて達成することができる。生成物の単離および精製は、通常の技能を有する化学者に知られている標準的な手順によって達成される。
【００５７】
７．  用語の定義
「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖の飽和ヒドロカルビル置換基（すなわち、炭化水素から水素を除去することによって得られる置換基）のことを指し；前記置換基は、１つの実施の形態では１〜１２個の炭素原子；別の実施の形態では、１〜１０個の炭素原子；別の実施の形態では、１〜６個の炭素原子；別の実施の形態では、１〜４個の炭素原子を含有する。このような置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピルを含む）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含む）、ペンチル、イソアミル、へキシルなどが挙げられる。
【００５８】
「アルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合および２〜２０個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖のヒドロカルビル置換基のことを指し；前記置換基は、別の実施の形態では、２〜１２個の炭素原子；別の実施の形態では、２〜６個の炭素原子；別の実施の形態では、２〜４個の炭素原子を含有する。アルケニルの例としては、エテニル（ビニルとしても知られる）、アリル、プロペニル（１−プロペニルおよび２−プロペニルを含む）およびブテニル（１−ブテニル、２−ブテニルおよび３−ブテニルを含む）が挙げられる。「アルケニル」という用語は、「シス」および「トランス」の幾何学的配置、あるいは、「Ｅ」および「Ｚ」の幾何学的配置を有する置換基を包含する。
【００５９】
「ベンジル」という用語は、フェニルによって置換されたメチルラジカル、すなわち、以下の構造のことをいう：
【化８】
2013535448.tif 000010
【００６０】
「炭素環」という用語は、３〜１４個の炭素環原子（「環原子」とは、結合して環を形成する原子である）を含む、飽和した環、部分的に飽和した環、または芳香環のことを指す。炭素環は、典型的には、３〜１０個の炭素環原子を含む。例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、およびフェニルが挙げられる。あるいは「炭素環系」は、ナフタレニル、テトラヒドロナフタレニル（「テトラリニル」としても知られる）、インデニル、イソインデニル、インダニル、ビシクロデカニル、アントラセニル、フェナントレン、ベンゾナフテニル（「フェナレニル」としても知られる）、フルオレニル、およびデカリニルなど、縮合した２つまたは３つの環でありうる。
【００６１】
「複素環」という用語は、３〜１４個の環原子（「環原子」とは、結合して環を形成する原子である）を含む、飽和した環、部分的に飽和した環、または芳香環のことを指し、前記環原子の少なくとも１つはヘテロ原子、すなわち酸素、窒素、または硫黄であり、残りの環原子は炭素、酸素、窒素、および硫黄からなる群より独立して選択される。
【００６２】
「シクロアルキル」という用語は、３〜１４個の炭素原子を有する飽和炭素環式の置換基のことを指す。１つの実施の形態では、シクロアルキル置換基は３〜１０個の炭素原子を有する。シクロアルキルの例としてはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。
【００６３】
「シクロアルキル」という用語は、このような縮合シクロアルキル基を置換基として有する基がシクロアルキル基の炭素原子に結合した、Ｃ6〜Ｃ10芳香環または５〜１０員環の芳香族複素環に縮合されている置換基も包含する。このような縮合シクロアルキル基が１つ以上の置換基によって置換される場合、その１つ以上の置換基は、他に特に規定されない限り、それぞれ、シクロアルキル基の炭素原子に結合する。縮合したＣ6〜Ｃ10芳香環または５〜１０員環の芳香族複素環は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル、または＝Ｏで随意的に置換されうる。
【００６４】
「シクロアルケニル」という用語は、３〜１４個の炭素原子、典型的には ３〜１０個の炭素原子を有する部分的に不飽和な炭素環式の置換基のことを指す。シクロアルケニルの例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、およびシクロヘキセニルが挙げられる。
【００６５】
シクロアルキルまたはシクロアルケニルは、単環であって差し支えなく、典型的には３〜６個の環原子を包含する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、およびフェニルが挙げられる。あるいは、ビシクロデカニルおよびデカリニルのように２つまたは３つの環が縮合される場合もある。
【００６６】
「アリール」という用語は、１つの環または２つまたは３つの縮合環を含む、芳香族置換基のことを指す。アリール置換基は６〜１８個の炭素原子を有しうる。一例として、アリール置換基は、６〜１４個の炭素原子を有しうる。「アリール」という用語は、フェニル、ナフチルおよびアントラセニルなどの置換基のことを指す。「アリール」という用語は、例えばＣ5またはＣ6炭素環などのＣ４〜Ｃ10炭素環に縮合した、または、４〜１０員環の複素環に縮合した、フェニル、ナフチルおよびアントラセニルなどの置換基も含み、ここで、このような縮合アリール基を置換基として有する基は、アリール基の芳香族炭素に結合する。このような縮合アリール基が１つ以上の置換基によって置換される場合は、その１つ以上の置換基は、他に特に規定されない限り、それぞれ、縮合アリール基の芳香族炭素に結合する。縮合Ｃ４〜Ｃ10炭素環または４〜１０員環の複素環は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル、または＝Ｏで随意的に置換されて差し支えない。したがって、アリール基の例としては、フェニル、ナフタレニル、テトラヒドロナフタレニル（「テトラリニル」としても知られる）、インデニル、イソインデニル、インダニル、アントラセニル、フェナントレニル、ベンゾナフテニル（「フェナレニル」としても知られる）、およびフルオレニルが挙げられる。
【００６７】
幾つかの事例では、ヒドロカルビル置換基（例えば、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールなど）における炭素原子の数は、接頭辞「Ｃx〜Ｃy−」によって示され、ここでｘは、置換基における炭素原子の最小値であり、ｙは最大値である。よって、例えば「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を含むアルキル置換基のことを指す。さらに説明すると、Ｃ3〜Ｃ6−シクロアルキルとは、３〜６個の炭素環原子を含む飽和シクロアルキルのことを指す。
【００６８】
幾つかの事例では、１つ以上のヘテロ原子を含む環状置換基（例えば、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル）における原子の数は接頭辞「Ｘ〜Ｙ員環」によって示され、ここでｘは置換基の環状部分を形成する原子の最小数であり、ｙは最大数である。よって、例えば、５〜８員環のヘテロシクロアルキルとは、ヘテロシクロアルキル環状部分に１つ以上のヘテロ原子を含む、５〜８個の原子を含むヘテロシクロアルキルのことを指す。
【００６９】
「水素」という用語は、水素置換基のことを指し、−Ｈで表されうる。
【００７０】
「ヒドロキシ」という用語は−ＯＨのことを指す。別の用語と組み合わせて用いられる場合、接頭辞「ヒドロキシ」は、接頭辞が付加された置換基が１つ以上のヒドロキシ置換基によって置換されていることを示す。１つ以上のヒドロキシ置換基を有する炭素を有する化合物としては、例えば、アルコール、エノールおよびフェノールが挙げられる。
【００７１】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、少なくとも１つのヒドロキシ置換基によって置換されたアルキルのことを指す。ヒドロキシアルキルの例としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシブチルが挙げられる。
【００７２】
「ニトロ」という用語は−ＮＯ2を意味する。
【００７３】
「シアノ」（「ニトリル」とも称される）という用語は−ＣＮを意味し、次式によっても表されうる：
【化９】
2013535448.tif 000011
【００７４】
「カルボニル」という用語は−Ｃ（Ｏ）−を意味し、次式によっても表されうる：
【化１０】
2013535448.tif 000012
【００７５】
「アミノ」という用語は−ＮＨ2を意味する。
【００７６】
「アルキルアミノ」という用語は、水素原子の代わりに少なくとも１つのアルキル鎖がアミノ窒素に結合したアミノ基のことを指す。アルキルアミノ置換基の例としては、メチルアミノ（式−ＮＨ（ＣＨ3）で表される）すなわち次式：
【化１１】
2013535448.tif 000013
【００７７】
などのモノアルキルアミノ、および、ジメチルアミノ（式−Ｎ（ＣＨ3）2で表される）すなわち次式：
【化１２】
2013535448.tif 000014
【００７８】
などのジアルキルアミノが挙げられる。
【００７９】
「アミノカルボニル」という用語は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2を意味し、次式によっても表されうる：
【化１３】
2013535448.tif 000015
【００８０】
「ハロゲン」という用語は、フッ素（−Ｆと表されうる）、塩素（−Ｃｌと表されうる）、臭素（−Ｂｒと表されうる）、またはヨウ素（−Ｉと表されうる）のことを指す。１つの実施の形態では、ハロゲンは塩素である。別の実施の形態では、ハロゲンはフッ素である。
【００８１】
接頭辞「ハロ」という用語は、接頭辞が付加された置換基が、１つ以上の独立して選択されたハロゲン置換基によって置換されていることを示す。例えば、ハロアルキルとは、少なくとも１つのハロゲン置換基によって置換されたアルキルのことを指す。２つ以上の水素がハロゲンによって置換される場合、そのハロゲンは同一であっても異なっていてもよい。ハロアルキルの例としては、クロロメチル、ジクロロメチル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、トリクロロメチル、１−ブロモエチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロプロピル、およびヘプタフルオロプロピルが挙げられる。さらに説明すると、「ハロアルコキシ」という用語は、少なくとも１つのハロゲン置換基によって置換されたアルコキシのことを指す。ハロアルコキシ置換基の例としては、クロロメトキシ、１−ブロモエトキシ、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ（「ペルフルオロメチルオキシ」としても知られる）、および２，２，２−トリフルオロエトキシが挙げられる。置換基が２つ以上のハロゲン置換基によって置換される場合、それらのハロゲン置換基は同一であっても異なっていてもよい（特に明記しない限り）。
【００８２】
接頭辞「ペルハロ」は、接頭辞が付加された置換基上の各水素置換基が、独立して選択されたハロゲン置換基によって置換されることを示す。すべてのハロゲン置換基が同一の場合、接頭辞によってハロゲン置換基が特定されうる。よって、例えば「ペルフルオロ」という用語は、接頭辞が付加された置換基上の各水素置換基が、フッ素置換基によって置換されていることを意味する。説明の目的で、「ペルフルオロアルキル」という用語は、フッ素置換基が各水素置換基の代替となっているアルキル置換基のことを指す。ペルフルオロアルキル置換基の例としては、トリフルオロメチル（−ＣＦ3）、ペルフルオロブチル、ペルフルオロイソプロピル、ペルフルオロドデシル、およびペルフルオロデシルが挙げられる。さらなる説明を目的として、「ペルフルオロアルコキシ」という用語は、各水素置換基がフッ素置換基によって置換されたアルコキシ置換基のことを指す。ペルフルオロアルコキシ置換基の例としては、トリフルオロメトキシ（−Ｏ−ＣＦ3）、ペルフルオロブトキシ、ペルフルオロイソプロポキシ、ペルフルオロドデコキシ、およびペルフルオロデコキシが挙げられる。
【００８３】
「オキソ」という用語は＝Ｏのことを指す。
【００８４】
「オキシ」という用語はエーテル置換基のことを指し、−Ｏ−とも表されうる。
【００８５】
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−Ｒとしても表されうる、酸素に連結したアルキルのことを指し、ここでＲはアルキル基である。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびブトキシが挙げられる。
【００８６】
「アルキルチオ」という用語は、−Ｓ−アルキルを意味する。例えば「メチルチオ」は−Ｓ−ＣＨ3である。アルキルチオの他の例としては、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、およびへキシルチオが挙げられる。
【００８７】
「アルキルカルボニル」という用語は−Ｃ（Ｏ）−アルキルを意味する。例えば「エチルカルボニル」は次式によっても表されうる：
【化１４】
2013535448.tif 000016
【００８８】
他のアルキルカルボニルの例としては、メチルカルボニル、プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、およびへキシルカルボニルが挙げられる。
【００８９】
「アミノアルキルカルボニル」という用語は−Ｃ（Ｏ）−アルキル−ＮＨ2を意味する。例えば「アミノメチルカルボニル」は、次式によっても表されうる：
【化１５】
2013535448.tif 000017
【００９０】
「アルコキシカルボニル」という用語は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキルを意味する。例えば「エトキシカルボニル」は、次式によっても表されうる：
【化１６】
2013535448.tif 000018
【００９１】
他のアルコキシカルボニルの例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル、およびへキシルオキシカルボニルが挙げられる。別の実施の形態では、カルボニルの炭素原子が第２のアルキルの炭素原子に付加する場合、得られる官能基はエステルである。
【００９２】
「チオ」および「チア」という用語は二価の硫黄原子を意味し、このような置換基は−Ｓ−と表すことができる。例えば、チオエーテルは、「アルキル−チオ−アルキル」、あるいはアルキル−Ｓ−アルキルと表される。
【００９３】
「チオール」という用語はスルフヒドリル置換基のことを指し、−ＳＨと表すことができる。
【００９４】
「チオン」という用語は＝Ｓのことを指す。
【００９５】
「スルホニル」という用語は−Ｓ（Ｏ）2のことを指し、次式によっても表されうる：
【化１７】
2013535448.tif 000019
【００９６】
よって、例えば「アルキル−スルホニル−アルキル」という用語はアルキル−Ｓ（Ｏ）2−アルキルのことを指す。アルキルスルホニルの例としては、メチルスルホニル、エチルスルホニル、およびプロピルスルホニルが挙げられる。
【００９７】
「アミノスルホニル」という用語は−Ｓ（Ｏ）2−ＮＨ2を意味し、次式によっても表されうる：
【化１８】
2013535448.tif 000020
【００９８】
「スルフィニル」または「スルホキシド」という用語は−Ｓ（Ｏ）−を意味し、次式によっても表されうる：
【化１９】
2013535448.tif 000021
【００９９】
よって、例えば「アルキルスルフィニルアルキル」または「アルキルスルホキシドアルキル」とは、アルキル−Ｓ（Ｏ）−アルキルのことを指す。典型的なアルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ブチルスルフィニル、およびへキシルスルフィニルが挙げられる。
【０１００】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、合計で３〜１４個の環原子を含む、飽和または部分的に飽和した環構造のことを指す。前記環原子の少なくとも１つはヘテロ原子（すなわち、酸素、窒素、または硫黄）であり、残りの環原子は炭素、酸素、窒素、および硫黄からなる群より独立して選択される。あるいは、ヘテロシクロアルキルは縮合した２つまたは３つの環を含んでもよく、そのような環の少なくとも１つはヘテロ原子を環原子として含みうる（例えば、窒素、酸素、または硫黄）。ヘテロシクロアルキル置換基を有する基では、基に結合するヘテロシクロアルキル置換基の環原子は少なくとも１つのヘテロ原子であって差し支えなく、または前記環原子は環炭素原子であってもよく、ここで前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子と同一の間に存在していて差し支えなく、あるいは、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子とは異なる環に存在していてもよい。同様に、ヘテロシクロアルキル置換基が同じようにある基または置換基によって置換される場合、前記基または置換基は少なくとも１つのヘテロ原子に結合して差し支えなく、あるいは、前記基または置換基は環炭素原子に結合してもよく、ここで、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子と同一の間に存在して差し支えなく、あるいは、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子とは異なる環に存在していてもよい。
【０１０１】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、Ｃ6〜Ｃ10芳香環または５〜１０員環の芳香族複素環に縮合した置換基も包含し、ここで、このような縮合ヘテロシクロアルキル基を置換基として有する基は、ヘテロシクロアルキル基のヘテロ原子、またはヘテロシクロアルキル基の炭素原子に結合する。このような縮合ヘテロシクロアルキル基が１つ以上の置換基によって置換される場合、その１つ以上の置換基は、他に特に規定されない限り、それぞれ、ヘテロシクロアルキル基のヘテロ原子、またはヘテロシクロアルキル基の炭素原子に結合する。縮合したＣ6〜Ｃ10芳香環または５〜１０員環の芳香族複素環は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル、または＝Ｏで随意的に置換されうる。
【０１０２】
「ヘテロアリール」という用語は、５〜１４個の環原子を含む芳香環構造のことを指し、前記環原子の少なくとも１つはヘテロ原子（すなわち、 酸素、窒素、または硫黄）であり、残りの環原子は炭素、酸素、窒素、および硫黄からなる群より独立して選択される。ヘテロアリールは、単環または２つまたは３つの縮合環でありうる。ヘテロアリール置換基の例としては、ピリジル、ピラジル、ピリミジニル、およびピリダジニルなどの６員環の置換基；トリアゾリル、イミダゾリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、１，２，３−、１，２，４−、１，２，５−、または１，３，４−オキサジアゾリルおよびイソチアゾリルなどの５員環の置換基；ベンゾチオフラニル、イソベンゾチオフラニル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、プリニル、およびアントラニリルなどの６／５員環の縮合環置換基；および、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、および１，４−ベンズオキサジニルなどの６／６員環の縮合環が挙げられる。ヘテロアリール置換基を有する基では、基に結合するヘテロアリール置換基の環原子は少なくとも１つのヘテロ原子であって差し支えなく、あるいは、前記環原子は環炭素原子であってもよく、ここで、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子と同一の環に存在して差し支えなく、あるいは、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子とは異なる環に存在してもよい。同様に、ヘテロアリール置換基が同じようにある基または置換基によって置換される場合、前記基または置換基は、少なくとも１つのヘテロ原子に結合して差し支えなく、あるいは環炭素原子に結合して差し支えなく、ここで、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子と同一の環に存在して差し支えなく、あるいは、前記環炭素原子は少なくとも１つのヘテロ原子とは異なる環に存在してもよい。「ヘテロアリール」という用語は、ピリジルＮ−オキシド、およびピリジンＮ−オキシド環を含有する基も包含する。
【０１０３】
単環ヘテロアリールの例としては、フラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、チオフェニル（「チオフラニル」としても知られる）、ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリル、イソピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イソイミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリニル、イソチアゾリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、チアジアゾリル、オキサチアゾリル、オキサジアゾリル（オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル（「アゾキシミル（azoximyl）」としても知られる）、１，２，５−オキサジアゾリル（「フラザニル」としても知られる）、または１，３，４−オキサジアゾリルを含む）、オキサトリアゾリル（１，２，３，４−オキサトリアゾリルまたは１，２，３，５−オキサトリアゾリルを含む）、ジオキサゾリル（１，２，３−ジオキサゾリル、１，２，４−ジオキサゾリル、１，３,２−ジオキサゾリル、または１，３，４−ジオキサゾリルを含む）、オキサチアゾリル、オキサチオリル、オキサチオラニル、ピラニル（１，２−ピラニルまたは１，４−ピラニルを含む）、ジヒドロピラニル、ピリジニル（「アジニル」としても知られる）、ピペリジニル、ジアジニル（ピリダジニル（「１，２−ジアジニル」としても知られる）、ピリミジニル（「１，３−ジアジニル」または「ピリミジル」としても知られる）、またはピラジニル（「１，４−ジアジニル」としても知られる）を含む）、ピペラジニル、トリアジニル（ｓ−トリアジニル（「１，３，５−トリアジニル」としても知られる）、ａｓ−トリアジニル（１，２，４−トリアジニルとしても知られる）、およびv−トリアジニル（「１，２，３−トリアジニル」としても知られる）を含む）、オキサジニル（１，２，３−オキサジニル、１，３，２−オキサジニル、１，３，６−オキサジニル（「ペントキサゾリル」としても知られる）、１，２，６−オキサジニル、または１，４−オキサジニルを含む）、イソオキサジニル（ｏ−イソオキサジニルまたはｐ−イソオキサジニルを含む）、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、オキサチアジニル（１，２，５−オキサチアジニルまたは１，２，６−オキサチアジニルを含む）、オキサジアジニル（１，４，２−オキサジアジニルまたは１，３，５，２−オキサジアジニルを含む）、モルホリニル、アゼピニル、オキセピニル（oxepinyl）、チエピニル（thiepinyl）、およびジアゼピニルが挙げられる。
【０１０４】
２−縮合環ヘテロアリールの例としては、インドリジニル、ピリンジニル（pyrindinyl）、ピラノピロリル、４Ｈ−キノリジニル、プリニル、ナフチリジニル、ピリドピリジニル（ピリド［３，４−ｂ］−ピリジニル、ピリド［３，２−ｂ］−ピリジニル、またはピリド［４，３−ｂ］−ピリジニルを含む）、およびプテリジニル、インドリル、イソインドリル、インドレニニル（indoleninyl）、イソインダゾリル、ベンズアジニル（benzazinyl）、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾジアジニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンズオキサゾリル、インドキサジニル、アントラニリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンズオキサジニル、ベンズイソオキサジニル、およびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。
【０１０５】
３−縮合環ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルの例としては、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−イミダゾ［４，５，１−ｉｊ］キノリン、４，５−ジヒドロイミダゾ［４，５，１−ｈｉ］インドール、４，５，６，７−テトラヒドロイミダゾ［４，５，１−ｊｋ］［１］ベンズアゼピン、およびジベンゾフラニルが挙げられる。
【０１０６】
縮合環ヘテロアリールの他の例としては、例えば、インドリル、イソインドリル（「イソベンズアゾリル」または「擬イソインドリル」としても知られる）、インドレニニル（「擬インドリル」としても知られる）、イソインダゾリル（「ベンズピラゾリル」としても知られる）、ベンズアジニル（キノリニル（「１−ベンズアジニル」としても知られる）またはイソキノリニル（「２−ベンズアジニル」としても知られる）を含む）、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾジアジニル（シンノリニル（「１，２−ベンゾジアジニル」としても知られる）またはキナゾリニル（「１，３−ベンゾジアジニル」としても知られる）を含む）、ベンゾピラニル（「クロマニル」または「イソクロマニル」を含む）、ベンゾチオピラニル（「チオクロマニル」としても知られる）、ベンズオキサゾリル、インドキサジニル（「ベンズイソオキサゾリル」としても知られる）、アントラニリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾフラニル（「クマロニル（coumaronyl）」としても知られる）、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル（「ベンゾチオフェニル」、「チオナフテニル」、または「ベンゾチオフラニル」としても知られる）、イソベンゾチエニル（「イソベンゾチオフェニル」、「イソチオナフテニル」、または「イソベンゾチオフラニル」としても知られる）、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンズオキサジニル（１，３，２−ベンズオキサジニル、１，４，２−ベンズオキサジニル、２，３，１−ベンズオキサジニル、または３，１，４−ベンズオキサジニルを含む）、ベンズイソオキサジニル（１，２−ベンズイソオキサジニルまたは１，４−ベンズイソオキサジニルを含む）、テトラヒドロイソキノリニル、カルバゾリル、キサンテニル、およびアクリジニルなどのベンゾ−縮合ヘテロアリールが挙げられる。
【０１０７】
「ヘテロアリール」という用語は、Ｃ5またはＣ6炭素環などのＣ４〜Ｃ10炭素環、または４〜１０員環の複素環に縮合する、ピリジルおよびキノリニルなどの置換基も包含し、ここで、このような縮合アリール基を置換基として有する基はヘテロアリール基の芳香族炭素またはヘテロアリール基のヘテロ原子に結合する。このような縮合ヘテロアリール基が１つ以上の置換基によって置換される場合、前記１つ以上の置換基は、他に特に規定されない限り、それぞれ、ヘテロアリール基の芳香族炭素またはヘテロアリール基のヘテロ原子に結合する。縮合Ｃ４〜Ｃ10炭素環または４〜１０員環の複素環は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル、または＝Ｏで随意的に置換されうる。
【０１０８】
「エチレン」という用語は−ＣＨ2−ＣＨ2−基のことを指す。「エチネレン（ethynelene）」という用語は−ＣＨ＝ＣＨ−基のことを指す。「プロピレン」という用語は−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−基のことを指す。「ブチレン」という用語は−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−基のことを指す。「メチレンオキシ」という用語は−ＣＨ2−Ｏ−基のことを指す。「メチレンチオキシ」という用語は−ＣＨ2−Ｓ−基のことを指す。「メチレンアミノ」という用語は−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−基のことを指す。「エチレンオキシ」という用語は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−基のことを指す。「エチレンチオキシ」という用語は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−基のことを指す。「エチレンアミノ」という用語は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−基のことを指す。
【０１０９】
置換基はその置換基が１つ以上の水素原子と結合する少なくとも１つの炭素、硫黄、酸素または窒素原子を含む場合に「置換可能」である。よって、例えば、水素、ハロゲン、およびシアノはこの定義の範囲に含まれない。置換基が「置換」されていると記載される場合、非水素置換基が、水素置換基の代わりに、置換基の炭素、酸素、硫黄または窒素上に存在する。よって、例えば、置換アルキル置換基とは、少なくとも１つの非水素置換基が、水素置換基の代わりにアルキル置換基に存在している、アルキル置換基である。説明の目的で、モノフルオロアルキルとはフルオロ置換基によって置換されたアルキルであり、ジフルオロアルキルとは２つのフルオロ置換基によって置換されたアルキルのことである。置換基に２つ以上の置換が存在する場合には、各非水素置換基は同一であっても異なっていてもよい（特に明記しない限り）ことが理解されよう。
【０１１０】
置換基が「随意的に置換」されていると記載される場合には、その置換基は、（１）置換されていない、または（２）置換されている、のいずれかでありうる。置換基の炭素が、置換基のリストのうちの１つ以上で随意的に置換されていると記載される場合、炭素上の水素の１つ以上（存在する範囲内で）は、独立して選択された随意的な置換基で、別々に、および／または一緒に置換されうる。置換基の窒素が、置換基のリストのうちの１つ以上で随意的に置換されていると記載される場合、窒素上の水素の１つ以上（存在する範囲内で）は、それぞれ、独立して選択された随意的な置換基によって置換されうる。典型的な置換基の１つは−ＮＲ'Ｒ''と表されて差し支えなく、ここで、Ｒ'およびＲ''は、それらが付加する窒素原子と一緒に複素環を形成してもよい。Ｒ'およびＲ''がそれらが付加する窒素原子と一緒に形成する複素環は、部分的または完全に飽和されていて差し支えない。１つの実施の形態では、複素環は３〜７個の原子で構成される。別の実施の形態では、複素環は、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、ピリジルおよびチアゾリルからなる群より選択される。
【０１１１】
本明細書では、「置換基」、「ラジカル」、および「基」という用語は、相互に入れ替え可能に用いられる。置換基の群が、置換基のリストのうちの１つ以上で随意的に置換されていると集合的に記載される場合、その群は、（１）置換不可能な置換基、（２）随意的な置換基によって置換されていない置換可能な置換基、および／または（３）随意的な置換基の１つ以上によって置換された置換可能な置換基を含みうる。置換基が、最大で特定の数までの非水素置換基で随意的に置換されていると記載される場合、その置換基は、（１）未置換であるか、または（２）最大で特定の数までの非水素置換基によって、または、置換基上の置換可能な位置の最大数まで置換されているかのいずれかであって差し支えなく、そのいずれか少ない方である。よって、例えば、置換基が最大で３つの非水素置換基によって随意的に置換されたヘテロアリールとして記載される場合、３つ未満の置換可能な位置を有するヘテロアリールは、ヘテロアリールが有する置換可能な位置と同数の非水素置換基までしか随意的に置換されない。説明の目的で、テトラゾリル（置換可能な位置を１つしか有しない）は、最大で１つの非水素置換基でしか随意的に置換されない。さらなる説明を目的として、アミノ窒素が最大で２つの非水素置換基で随意的に置換されていると記載される場合、アミノ窒素が第１級窒素の場合には、その窒素は最大で２つの非水素置換基で随意的に置換されるのに対し、アミノ窒素が第２級窒素の場合にはアミノ窒素は最大で１つの非水素置換基でしか随意的に置換されない。
【０１１２】
複数部分の置換基に付加された接頭辞は、第１の部分にのみ適用される。説明の目的で、「アルキルシクロアルキル」という用語は、２つの部分、すなわちアルキルとシクロアルキルを含む。よって、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルシクロアルキルにおけるＣ1〜Ｃ6−という接頭辞は、アルキルシクロアルキルのアルキル部分が１〜６個の炭素原子を含むことを意味する；Ｃ1〜Ｃ6−という接頭辞は、シクロアルキル部分についての記載ではない。さらなる説明を目的として、ハロアルコキシアルキルにおける接頭辞「ハロ」は、アルコキシアルキル置換基のアルコキシ部分のみが１つ以上のハロゲン置換基によって置換されていることを示す。ハロゲン置換がアルキル部分でのみ生じうる場合、置換基は「アルコキシハロアルキル」と記載される。ハロゲン置換がアルキル部分とアルコキシ部分の両方で生じうる場合には、その置換基は「ハロアルコキシハロアルキル」と記載される。
【０１１３】
置換基が複数の部分で構成されるときは、他に明記しない限り、その最後の部分は、分子の残りの部分に結合する点としての役割をすることが意図されている。例えば、置換基Ａ−Ｂ−Ｃでは、部分Ｃが分子の残りの部分に結合する。置換基Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄでは、部分Ｄが分子の残りの部分に結合する。同様に、置換基アミノカルボニルメチルでは、メチル部分が分子の残りの部分に結合し、ここで、前記置換基は次のように表されうる：
【化２０】
2013535448.tif 000022
【０１１４】
置換基トリフルオロメチルアミノカルボニルでは、カルボニル部分が分子の残りの部分に結合し、ここで、前記置換基は、次のように表されうる：
【化２１】
2013535448.tif 000023
【０１１５】
置換基が、ある群より「独立して選択」されると記載される場合には、各置換基は他のものとは独立して選択される。したがって、各置換基は、他の置換基と同一であても異なっていてもよい。
【０１１６】
医薬組成物
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を治療に有効な量で含む、被験体を予防および／または治療するための医薬組成物が開示される。幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、化合物またはそれらの薬学的に許容される塩がＧＰＲ３５に病態生理学的に関連した疾患の予防および／または治療に有効な組成物であり、ここで、前記化合物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物である。他の幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、化合物またはそれらの薬学的に許容される塩がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連した疾患の予防および／または治療に有効な組成物であり、ここで、前記化合物は式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物である。他の幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、１種類以上の治療薬をさらに含む組成物である。
【０１１７】
幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、化合物またはそれらの薬学的に許容される塩と１種類以上の治療薬が、被験体におけるＧＰＲ３５および／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連した疾患を予防および／または治療するのに相乗効果を生み出す組成物である。他の幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の、１種類以上の治療薬に対する重量比が、約１：１００〜約１００：１、または約１：５０〜約５０：１、または約１：１０〜約１０：１、または約１：５〜約５：１の範囲の組成物である。
【０１１８】
他の幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、１種類以上の治療薬が、抗炎症薬、抗代謝異常薬（anti-metabolic-disorder agent）、抗鬱血性心不全薬（anti−congestive-heart-failure agent）、抗癌剤、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナストおよびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）からなる群より選択される組成物である。他の幾つかの形態では、本開示の医薬組成物は、被験体が哺乳動物である組成物である。
【０１１９】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子を特定する本開示の方法において特定された分子を治療に有効な量で含む、被験体を治療するための医薬組成物が開示される。
【０１２０】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用を防ぐすることができる、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体関連疾患の治療薬も開示される。ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用を破壊することができる、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体関連疾患の治療薬も開示される。
【０１２１】
幾つかの形態では、上述の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含みうる。「薬学的に許容される」とは、生物学的に望ましくない材料、または他の望ましくない材料ではないことを意味する、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的作用を生じることなく、または、医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方式で相互作用を生じることなく、被験体に投与されうる。担体は、当業者に周知のように、有効成分の分解を最小限に抑え、かつ、被験体における不利な副作用を最小限に抑えるように選択することができる。担体は、固体、液体、またはその両方であって差し支えなく、例えば、０．０５％〜１００％、０．０５％〜９９％、０．０５％〜９８％、０．０５％〜９７％、０．０５％〜９６％、０．０５％〜９５％、０．０５％〜９４％、０．０５％〜９３％、０．０５％〜９２％、０．０５％〜９１％、０．０５％〜９０％、０．０５％〜８５％、０．０５％〜８０％、０．０５％〜７５％、０．０５％〜７０％、０．０５％〜６５％、０．０５％〜６０％、０．０５％〜５５％、０．０５％〜５０％、０．０５％〜４５％、０．０５％〜４０％、０．０５％〜３５％、０．０５％〜３０％、０．０５％〜２５％、０．０５％〜２０％、０．０５％〜１５％、０．０５％〜１０％、０．０５％〜５％、０．０５％〜４％、０．０５％〜３％、０．０５％〜２％、０．０５％〜１％、０．０５％〜０．８％、０．０５％〜０．６％、０．０５％〜０．５％、０．０５％〜０．４％、０．０５％〜０．３％、０．０５％〜０．２％、０．０５％〜０．１％、０．１％〜１００％、０．２％〜１００％、０．３％〜１００％、０．４％〜１００％、０．５％〜１００％、０．６％〜１００％、０．８％〜１００％、１％〜１００％、２％〜１００％、３％〜１００％、４％〜１００％、５％〜１００％、１０％〜１００％、１５％〜１００％、２０％〜１００％、２５％〜１００％、３０％〜１００％、３５％〜１００％、４０％〜１００％、４５％〜１００％、５０％〜１００％、５５％〜１００％、６０％〜１００％、６５％〜１００％、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．８％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％の重量の活性化合物を含みうる、例えば錠剤などの単位用量組成物として、前記化合物とともに製剤化されて差し支えない。本開示の化合物は、標的薬物担体として適切なポリマーと結合させてもよい。他の薬理活性物質も存在して差し支えない。
【０１２２】
適切な投与経路のいずれかを本開示の組成物に使用することができる。適切な投与経路としては、例えば、局所、腸（enteral）、局部、全身、または非経口が挙げられる。例えば、投与は、皮膚上、吸入、浣腸、結膜、点眼、点耳、歯槽、鼻、鼻腔内、膣、膣外、経膣、眼、眼球内、経眼、腸、口腔、口内、経口、腸、直腸、直腸内、経直腸、注射、点滴、静脈内、動脈内、筋肉内、大脳内、心室内、脳室内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、膀胱内、陰茎海綿体内、骨髄内、頭蓋内、経皮、経粘膜、経鼻、嚢内、硬膜外（epidural、peridural）、硝子体内などでありうる。
【０１２３】
適切な担体およびそれらの剤形は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995に記載されている。典型的には、薬学的に許容される塩は、製剤を等張にするために、適正な量で製剤に用いられる。薬学的に許容される担体の例としては、限定はしないが、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、さらに好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、そのマトリクスが、例えば、フィルム、リポソームまたは微小粒子などの成形物品の形態でありうる、例えば抗ウイルス薬を含む、固体の疎水性ポリマーの半透過性のマトリクスなどの持続放出性の製剤が挙げられる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、ある特定の担体がより好ましいであろうことは、当業者にとって明白であろう。医薬担体は当業者に周知である。これらは、最も典型的には、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体であり、例えば、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝液などの溶液が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の例としては、限定はしないが、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存料、界面活性剤などが挙げられる。
【０１２４】
本開示の化合物は、好ましくはこのような経路に適合した医薬組成物形態、および、目的の治療または予防に有効な用量で、いずれかの適切な経路で投与されうる。活性化合物および組成物は、例えば、経口、直腸、非経口、眼、吸入、または局所に投与することができる。
【０１２５】
固体の投与形態の経口投与は、各々が本開示の化合物または組成物の少なくとも１種類を所定の量で含む、例えば、硬カプセルまたは軟カプセル、丸薬、カシェ剤、トローチ剤、または錠剤などの不連続単位で提供されて差し支えない。幾つかの形態では、経口投与は粉末または顆粒の形態であって差し支えない。幾つかの形態では、経口の製剤は、例えばトローチ剤などの舌下剤である。このような固体の投与形態では、式Ｉの化合物は、通常、１つ以上のアジュバントと併用される。このようなカプセルまたは錠剤は、放出制御製剤を含んでいてもよい。カプセル、錠剤、および丸薬の事例では、その投与形態に緩衝剤も含めて差し支えなく、あるいは、腸溶コーティングを用いて調製することもできる。
【０１２６】
幾つかの形態では、経口投与は液体の剤形であってもよい。経口投与のための液体の投与形態としては、例えば、当技術分野で一般的に用いられる不活性の希釈剤（例えば水）を含む、薬学的に許容されるエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられる。このような組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、香味料（例えば甘味料）、および／または香料などのアジュバントも含みうる。
【０１２７】
幾つかの形態では、本開示の組成物は非経口の投与形態を含みうる。「非経口投与」としては、例えば、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および点滴が挙げられる。注射用製剤（例えば、滅菌した注射可能な水性または油性の懸濁液）は、適切な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤されて差し支えない。
【０１２８】
幾つかの形態では、本開示の組成物は、局所投与形態を含みうる。「局所投与」としては、例えば、経皮パッチまたはイオントフォレーシス装置などを介した経皮投与、眼球内投与、または鼻腔内または吸入投与が挙げられる。局所投与用の組成物には、例えば、局所ゲル、スプレー、軟膏、およびクリームも含まれる。局所製剤は、皮膚または他の患部を通じた有効成分の吸収または浸透を高める化合物を含んでいてもよい。化合物および組成物が経皮デバイスによって投与される場合、投与は、液体用容器と多孔質膜タイプのパッチ、または固体マトリクスの種類のパッチのいずれかを使用して達成される。この目的のための典型的な剤形としては、ゲル、ハイドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、粉剤、ドレッシング、フォーム、フィルム、皮膚用パッチ剤、ウェファ、インプラント、スポンジ、ファイバ、包帯およびマイクロエマルションが挙げられる。リポソームも使用することができる。典型的な担体としては、アルコール、水、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。浸透促進剤を導入することもできる。例えば、J Pharm Sci, 88 (10), 955-958, by Finnin and Morgan (October 1999)を参照。
【０１２９】
眼への局所投与に適した剤形としては、例えば、本開示の化合物または組成物を適切な担体に溶解または懸濁した点眼が挙げられる。眼または耳への投与に適した典型的な剤形は、等張のｐＨ調節された滅菌生理食塩水に懸濁または溶解した、微粉化した懸濁液または溶液の点滴剤の形態でありうる。眼および耳への投与に適した他の剤形としては、軟膏、生分解性（例えば吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性（例えばシリコーン）のインプラント、ウェファ、レンズ、および、ニオソームまたはリポソームなどの微粒子またはベシクル系（vesicular systems）が挙げられる。架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはメチルセルロースなどのセルロースポリマー、あるいは、例えばゲランガムなどのヘテロ多糖類ポリマーなどのポリマーを、塩化ベンザルコニウムなどの保存料と一緒に導入することができる。このような剤形は、イオントフォレーシスによって送達させることもできる。
【０１３０】
鼻腔内投与または吸入による投与では、本開示の活性化合物は、患者によって圧迫または送り出されるポンプ式スプレー容器から溶液または懸濁液の形態で、または、適切な推進剤の使用とともに加圧容器またはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で、都合よく送達される。鼻腔内投与に適した製剤は、典型的には、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独で、例えばラクトースとの乾式混合による混合物として、または、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合した混合成分粒子として、のいずれか）の形態で、あるいは、１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンなどの適切な推進剤を使用した、または使用しない、加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは細かい霧状にするために電気流体力学を利用した噴霧器）、またはネブライザーから、エアゾールスプレーとして投与される。鼻腔内用途では、粉末は、例えばキトサンまたはシクロデキストリンなどのバイオ接着剤（bioadhesive agent）を含みうる。
【０１３１】
幾つかの形態では、本開示の組成物は直腸製剤も含みうる。このような直腸製剤は、例えば坐剤の形態でありうる。従来の坐剤ベースはカカオ脂であるが、必要に応じて、さまざまな代替物を利用することができる。
【０１３２】
薬学の分野で知られている他の担体物質および投与方法も利用することができる。本開示の医薬組成物は、有効な剤形および投与方法など、周知の薬学技術のいずれかによって調製されうる。有効な剤形および投与方法に関する上記検討事項は当技術分野で周知であり、標準的な教科書に記載されている。薬物の剤形は、例えば、Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1975；Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；およびKibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (3rd Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999に論じられている。
【０１３３】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の本開示の化合物は、さまざまな病状または病態の治療または予防において、単独で、または他の治療薬と組み合わせて使用することができる。本開示の化合物および組成物と他の治療薬は、同時に（同一の投与形態、または別々の投与形態のいずれかで）、または連続的に投与することができる。典型的な治療薬は、例えば、抗炎症薬、抗代謝異常薬、抗鬱血性心不全薬、抗癌剤、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナスト、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、および本明細書に開示される式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物からなる群より選択されるものでありうる。
【０１３４】
２種類以上の化合物の「組合せ」での投与は、２種類の化合物が、一方の存在により他方の生物学的作用が変わるほど十分に近い時間で投与されることを意味する。２種類以上の化合物は、同時に、並行にまたは連続して投与しても差し支えない。その上、同時投与は、投与前に化合物を混合することにより、もしくは同じ時点であるが異なる解剖学的部位に、または異なる投与経路を使用して、化合物を投与することにより行うことができる。「並行投与」、「共投与」、「同時投与」および「同時に投与した」という句は、化合物が組合せで投与されることを意味する。
【０１３５】
前記化合物および／または前記化合物を含有する組成物の投薬計画は、患者のタイプ、年齢、体重、性別および病状；投与経路；および使用される特定の化合物の活性；を含む様々な容易に基づいて得る。それゆえ、投薬計画は幅広く異なり得る。先に示された状態の治療または予防において、一日での体重１キログラム当たり約０．００１ｍｇから約１００ｍｇの投薬量が有用である。開示された化合物の他の効果的な投薬計画（単剤または分割剤で投与される）は、以下に限られないが、約０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５から約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、および約０．１から約１．０ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられる。投薬単位組成物は、一日の用量を構成するそのような量または約数を含有し得る。多くの場合、化合物の投与は一日に複数回繰り返される。所望であれば、一日の合計用量を増加させるために、一般に、一日に複数の投薬を使用しても差し支えない。
【０１３６】
経口投与について、前記組成物は、患者への投薬量を対症調節するために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０および５００ミリグラムの活性成分を含有する錠剤形態で提供することができる。製剤は一般に、約０．０１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分、または約１ｍｇから約１００ｍｇの活性成分を含有する。静脈内では、用量は、一定速度の注入の最中に、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ／分におよび得る。
【０１３７】
効果的な量の本発明の化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体(clathrate)、またはプロドラッグ；および薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物が開示されている。これらの組成物は、追加の薬剤をさらに含んでもよい。これらの組成物は、ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体の活性を調節し、それゆえ、代謝異常などのｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５関連の人間のかかる病気の予防および治療を改善するのに有用である。
【０１３８】
細胞
外因性ＧＰＲ３５遺伝子および外因性ｈＥＲＧ遺伝子を含む遺伝子操作された細胞(engineered cell)が開示されている。ある形態では、外因性ＧＰＲ３５遺伝子および外因性ｈＥＲＧ遺伝子は、前記細胞中に、宿主細胞とは別の核酸に存在する。ある形態では、外因性核酸が、宿主細胞の核酸と組み換えされる。
【０１３９】
内因性ＧＰＲ３５遺伝子および外因性ｈＥＲＧ遺伝子を含む遺伝子操作された細胞も開示されている。
【０１４０】
外因性ＧＰＲ３５遺伝子および内因性ｈＥＲＧ遺伝子を含む遺伝子操作された細胞も開示されている。
【０１４１】
開示された細胞のある形態において、ＧＰＲ３５遺伝子、ｈＥＲＧ遺伝子または両方の遺伝子は、変異体遺伝子であり得る。その変異体遺伝子は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用を防ぐか、または複合体を形成させるが、下流シグナル伝達経路を抑制または阻害することができる。
【０１４２】
開示された細胞のある形態では、ＧＰＲ３５遺伝子がＧＰＲ３５タンパク質を発現し、ｈＥＲＧ遺伝子がｈＥＲＧタンパク質を発現する。ＧＰＲ３５タンパク質は、ＧＰＲ３５融合タンパク質であり得る。ある形態では、ＧＰＲ３５融合タンパク質は、ｍｙｃ−ＧＰＲ３５であり得る。ＧＰＲ３５融合パートナーは、以下に限られないが、ＧＳＴ、ＨＡ、ＧＦＰ、ＨＰＲ、Ｈｉｓであり得る。この融合パートナーは、以下に限られないが、アフィニティータグまたはビジュアルタグであって差し支えない。
【０１４３】
開示された細胞のある形態では、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧタンパク質は、両方のタンパク質が同じ細胞中で同時発現されるときに、相互作用して、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を形成する。ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体は、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞中の細胞表面でｈＥＲＧチャンネルタンパク質およびＧＰＲ３５タンパク質の間の物理的相互作用によって形成される。
【０１４４】
ある形態では、開示された細胞は、ＧＰＲ３５のコード領域に動作可能に結合した調節可能なプロモータをさらに含む。この調節可能なプロモータは、以下に限られないが、テトラサイクリン誘発性プロモータ、Ｔ−ＲＥｘＴＭプロモータ、熱ショック誘発性プロモータ、重金属イオンプロモータまたは核ホルモン受容体誘発性プロモータ、または条件付きで活性が調節される他のプロモータ要素であり得る。ある形態では、調節可能なプロモータはｔｅｔオペレータを含む。ある形態では、調節可能なプロモータはＣＭＶプロモータ要素を含む。
【０１４５】
ある形態では、開示された細胞は、ｈＥＲＧのコード領域に動作可能に結合した調節可能なプロモータをさらに含む。
【０１４６】
ある形態では、開示された細胞は、選択可能なマーカーをさらに含む。その選択可能なマーカーは、以下に限られないが、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８またはゲンタマイシンであり得る。ある実施の形態において、選択可能なマーカーおよびＧＰＲ３５コード領域は、同じ核酸上にある。本発明のある態様において、ＧＰＲ３５および選択可能なマーカーコード領域は、ＩＲＥＳまたは２Ａ−様配列により動作可能に結合されている。ある実施の形態において、ＧＰＲ３５および選択可能なマーカーコード領域は、異なるプロモータに動作可能に結合されている。本発明のある態様において、選択可能なマーカーおよびＧＰＲ３５コード領域は、異なる核酸上にある。本発明のある態様において、ＧＰＲ３５コード領域は、ｃＤＮＡからのものである。
【０１４７】
開示された細胞のある形態では、その細胞は、以下に限られないが、動物細胞、または哺乳類細胞であり得る。ある形態では、その細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＰＣ１２細胞、ヒトＴリンパ球、Ｃｏｓ７細胞およびマウス細胞またはこれらの細胞のいずれかの誘導体からなる群より選択され得る。
【０１４８】
開示された細胞のある形態では、ＧＰＲ３５遺伝子およびｈＥＲＧ遺伝子は同じ核酸上にある。ある形態では、ＧＰＲ３５遺伝子およびｈＥＲＧ遺伝子は異なる核酸上にある。
【０１４９】
本発明は、ＧＰＲ３５またはｈＥＲＧのいずれかのみ、またはその両方を調節する化合物（例えば、小分子）をスクリーニングするために使用できる細胞株も提供する。本発明の方法および細胞は、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧの間で形成されたシグナル伝達複合体をアッセイし、シグナル伝達複合体に作用する調節因子を分類する方法を提供する。
【０１５０】
本発明は、本発明の細胞を構築するための、関連する細胞、核酸および方法をさらに提供する。
【０１５１】
本発明の１つの実施の形態は、ＧＰＲ３５またはＧＰＲ３５変異体を含む核酸、ｈＥＲＧまたはｈＥＲＧ変異体を含む核酸、またはその任意の組合せを有する細胞を提供する。
【０１５２】
１つの実施の形態において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。１つの実施の形態において、核酸はウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、以下に限られないが、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、または遺伝子を細胞中に送達するための他のウイルスに由来のものが挙げられる。１つの実施の形態において、核酸はプラスミドである。いくつかの実施の形態において、核酸はトランスポゾンを含む。いくつかの実施の形態において、核酸は合成微小染色体である。
【０１５３】
いくつかの実施の形態において、細胞は、ｈＥＲＧのコード領域に動作可能に結合した第２のプロモータを含む核酸をさらに含む。１つの実施の形態において、ＧＰＲ３５コード領域に動作可能に結合した調節可能なプロモータおよびｈＥＲＧのコード領域に動作可能に結合した第２のプロモータは、同じ核酸上にある。１つの実施の形態において、ＧＰＲ３５コード領域に動作可能に結合した調節可能なプロモータおよびｈＥＲＧのコード領域に動作可能に結合した第２のプロモータは、異なる核酸上にある。いくつかの実施の形態において、調節可能なプロモータは、細胞のゲノム中に既存のＧＰＲ３５コード領域に動作可能に結合している。
【０１５４】
いくつかの実施の形態において、本発明の細胞はコード領域を含まない。多くのＧＰＣＲにより、特定のシグナル伝達分子の細胞レベル、例えば、カルシウムおよび／またはｃＡＭＰレベルに検出可能な変化が生じる。その上、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは、刺激の際の細胞応答の、経路不偏であるが経路感受性の手段を提案する。当業者は、コード領域を用いずに、これらの変化を容易に検出することができる。本発明のある態様において、細胞は安定している。本発明の他の実施の形態において、細胞は、少なくとも、１つのシグナル伝達成分（例えば、過渡的にトランスフェクトされたＧＰＲ３５またはｈＥＲＧ）について安定ではない。
【０１５５】
いくつかの実施の形態において、細胞はさらに、ＧＰＲ３５またはｈＥＲＧチャンネルのいずれかに結合することが知られている化合物を含むおよび／または接触させられる。
【０１５６】
複合体
１つ以上のＧＰＣＲおよびｈＥＲＧを含む、単離されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）−ｈＥＲＧ複合体が開示されている。開示された複合体および組成物は、複合体に結合する分子をスクリーニングするために使用することができる。当業者には、単離された複合体またはこの複合体を含む組成物の様々な用途が知られているであろう。
【０１５７】
ここに開示されたＧＰＣＲ−ｈＥＲＧ複合体を含む組成物も開示されている。
【０１５８】
開示された複合体および組成物のある形態では、ＧＰＣＲ−ｈＥＲＧ複合体はＧＰＲ３５−ｈＥＲＧであり得、ＧＰＣＲはＧＰＲ３５である。ある形態では、ＧＰＣＲ−ｈＥＲＧ複合体は標識を含む。その標識は、以下に限られないが、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、またはアフィニティー標識であり得る。
【０１５９】
キット
以下に記載する治療または予防の方法の実施に使用するのに適したキットも開示されている。ある形態では、そのキットは、開示された方法を実施するのに十分な量で、１種類以上の開示された化合物および投薬のための容器を含む第１の投薬形態を含有する。ある形態では、キットは、１種類以上の開示された化合物、および１種類以上の他の治療薬を含み得る。例示の治療薬は、例えば、抗癌剤であり得る。
【０１６０】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧを発現する遺伝子操作された細胞株およびその細胞株を取り扱うための使用説明書を含むキットも開示されている。ある形態では、そのキットは、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を調節する化合物をスクリーニングするための使用説明書をさらに含む。
【０１６１】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧを発現する遺伝子操作された細胞株およびその細胞株を取り扱うための使用説明書を含み、さらに、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子を同定する開示の方法において同定された分子を含む組成物を含むキットも開示されている。
【０１６２】
方法
本発明の方法の全ては、本発明の化合物のみで、もしくは他の薬剤、または他の抗癌剤と組み合わせて、実施されてもよい。
【０１６３】
Ａ．  スクリーニング
１．  ｈＥＲＧ調節因子
ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法であって、（ａ）化合物を、ｈＥＲＧを発現する細胞およびｈＥＲＧを発現しない細胞からなる２種類の異なるタイプの細胞と共に個別にインキュベーションする工程；（ｂ）ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイにより、各細胞タイプについての前記化合物に誘発された細胞応答をモニタする工程；（ｃ）前記化合物の存在下で、ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤をｈＥＲＧ発現細胞と共にインキュベーションする工程；（ｄ）前記化合物の存在下で、前記ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤に誘発された細胞応答をモニタする工程；および（ｅ）前記化合物がｈＥＲＧ調節因子であるか否かを示す、前記化合物のバイオセンサーインデックスを生成する工程を有してなる方法も開示されている。
【０１６４】
ある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、（ｆ）電気生理学的方法を使用して、前記化合物がｈＥＲＧ調節因子であると確認する工程をさらに含む。他のある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤が、ｈＥＲＧ活性化剤、ｈＥＲＧイオンチャンネル活性化剤、またはｈＥＲＧ経路活性化剤である方法である。他のある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ｈＥＲＧ活性化剤が、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、フルフェナム酸、ニフルム酸、およびジフルニサルからなる群より選択される方法である。
【０１６５】
ある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ｈＥＲＧ発現細胞株が、白血病細胞株、胃癌細胞株、神経芽細胞腫細胞株、乳癌細胞株、ヒト結腸癌細胞株、心循環系細胞株、および神経性細胞株からなる群より選択される方法である。他のある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ｈＥＲＧ発現細胞株は、細胞株ＨＬ６０、細胞株ＳＧＣ７９０１、細胞株ＭＧＣ８０３、細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、細胞株ＭＣＦ−７、細胞株ＨＴ−２９、細胞株ＨＣＴ８、および細胞株ＨＣＴ１１６からなる群より選択される方法である。
【０１６６】
他のある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ｈＥＲＧ非発現細胞株が、ヒト胎児由来腎臓細胞株およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株からなる群より選択される方法である。ある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ｈＥＲＧ非発現細胞株が、細胞株ＨＥＫ−２９３および細胞株ＣＨＯ−Ｋ１からなる群より選択される方法である。他のある形態では、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法は、工程（ｅ）が、前記化合物のバイオセンサーインデックスを公知のｈＥＲＧ調節因子のバイオセンサーインデックスと比較する工程を含む方法である。
【０１６７】
２．  ＧＰＲ３５調節因子
ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＧＰＲ３５を発現する細胞を提供する工程；（ｂ）前記細胞を化合物と接触させる工程；および（ｃ）ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを使用して、前記化合物をプロファイルする工程を有してなる方法も開示されている。ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記プロファイルする工程が、前記化合物のバイオセンサーインデックスを生成し、前記化合物がＧＰＲ３５調節因子であるか否かを判定する各工程を含む方法である。
【０１６８】
他のある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記判定する工程が、前記化合物のバイオセンサーインデックスを公知のＧＰＲ３５調節因子のバイオセンサーインデックスと比較する工程を含む方法である。他のある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物がＧＰＲ３５アゴニストである方法である。他のある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物のバイオセンサーインデックスが前記公知のＧＰＲ３５調節因子のバイオセンサーインデックスと類似している場合、前記化合物がＧＰＲ３５調節因子である方法である。
【０１６９】
ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５アゴニストが、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナストおよびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）からなる群より選択される方法である。他のある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、工程（ｂ）が、前記細胞を化合物および公知のＧＰＲ３５アゴニストと接触させる工程を含む方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物のバイオセンサーインデックスが公知のＧＰＲ３５アンタゴニストのバイオセンサーインデックスと類似している場合、前記化合物がＧＰＲ３５アンタゴニストである方法である。
【０１７０】
ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有するＧＰＲ３５調節因子である方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２２】
2013535448.tif 000024
【０１７１】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５調節因子である方法である。
【０１７２】
ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２３】
2013535448.tif 000025
【０１７３】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５調節因子である方法である。
【０１７４】
ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２４】
2013535448.tif 000026
【０１７５】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５調節因子である方法である。
【０１７６】
ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２５】
2013535448.tif 000027
【０１７７】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５調節因子である方法である。
【０１７８】
ある形態では、ＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法は、ＧＰＲ３５がヒトである方法である。
【０１７９】
３．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体調節因子
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、（ａ）化合物がＧＰＲ３５特異的調節因子またはｈＥＲＧ特異的調節因子であるか、もしくはいずれでもないかを判定する工程；および（ｂ）前記化合物がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子であるか否かを判定する工程を有してなる方法も開示されている。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、工程（ａ）が、上述したような、ｈＥＲＧ特異的調節因子をスクリーニングする方法、および／またはＧＰＲ３５特異的調節因子をスクリーニングする方法によるものである方法である。
【０１８０】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、工程（ｂ）が、（ｉ）ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を含む細胞を提供する工程；（ｉｉ）前記細胞を前記化合物と接触させる工程；（ｉｉｉ）１種類以上の適切なアッセイを使用することによって、前記化合物をプロファイルする工程を含む方法である。
【０１８１】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、プロファイルする工程（ｉｉｉ）が、シグナルを前記アッセイで分析し、前記化合物がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子であるか否かを判定する各工程を含む方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記アッセイがラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイである方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記アッセイが交差脱感作ＤＭＲアッセイである方法である。
【０１８２】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体により作用する前記調節因子のアゴニズム作用を判定するために、前記アッセイが行われる方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、ＧＰＲ３５特異的アゴニストマーカーに対する、またはｈＥＲＧ特異的活性化剤マーカーに対する、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体により作用する前記調節因子のアンタゴニズム作用を判定するために、前記アッセイが行われる方法である。
【０１８３】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子がＧＰＲ３５アゴニストであり、かつｈＥＲＧ活性化剤でもある方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が、ｈＥＲＧをトランス活性化させるＧＰＲ３５特異的アゴニストである方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が、ｈＥＲＧをトランス活性化させないＧＰＲ３５特異的アゴニストである方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が、ＧＰＲ３５をトランス活性化させるｈＥＲＧ特異的活性化剤である方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が、ＧＰＲ３５をトランス活性化させないｈＥＲＧ特異的活性化剤である方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が、ＧＰＲ３５アゴニストでも、ｈＥＲＧ活性化剤でもない方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が、上述したような調節因子を調節する補助調節因子である方法である。
【０１８４】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子が前記複合体に作用するときに、シグナル伝達経路が調節される方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記シグナル伝達経路が、ＧＰＲ３５特異的調節因子がＧＰＲ３５のみに作用するときに形成されたシグナル伝達経路に実質的に類似している方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記シグナル伝達経路が、ｈＥＲＧ特異的調節因子がｈＥＲＧのみに作用するときに形成されたシグナル伝達経路に実質的に類似している方法である。
【０１８５】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記シグナル伝達経路が、ＧＰＲ３５特異的調節因子がＧＰＲ３５のみに作用するとき、またはｈＥＲＧ特異的調節因子がｈＥＲＧのみに作用するときに形成されたシグナル伝達経路とは異なる方法である。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記シグナル伝達経路が、ＧＰＲ３５特異的調節因子がＧＰＲ３５のみに作用するときに形成されたシグナル伝達経路と、ｈＥＲＧ特異的調節因子がｈＥＲＧのみに作用するときに調節されたシグナル伝達経路との組合せである方法である。
【０１８６】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有するＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子である方法である。
【０１８７】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２６】
2013535448.tif 000028
【０１８８】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子である方法である。
【０１８９】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２７】
2013535448.tif 000029
【０１９０】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子である方法である。
【０１９１】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２８】
2013535448.tif 000030
【０１９２】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子である方法である。
【０１９３】
ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子をスクリーニングする方法は、前記化合物が、
【化２９】
2013535448.tif 000031
【０１９４】
からなる群より選択される化学構造を有するＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子である方法である。
【０１９５】
開示された組成物および方法は、一部には、シグナル伝達経路の調節因子（例えば、活性化剤、遮断薬、アゴニスト、逆作動薬、またはアンタゴニスト）を同定するためのアッセイ、並びにそのようなアッセイに使用される組成物に関する。詳しくは、開示は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に作用する調節因子を同定し分類するためのアッセイ、並びにそのようなアッセイに使用される組成物に関する。
【０１９６】
ある形態では、開示は、発現生成物の検出を含む。その検出としては、以下に限られないが、対応するｍＲＮＡの発現、タンパク質の発現、タンパク質の位置、およびＧＰＲ３５とｈＥＲＧとの間の相互作用、各成分のシグナル伝達結果および活性化されている全体のシグナル伝達複合体の検出が挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施の形態において、開示は、化合物をシグナル伝達ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体の成分の潜在的な調節因子と接触させ、その後、シグナル伝達経路の下流の活性を測定することにより働くアッセイを含む。測定できる効果の例としては、以下に限られないが、特定の細胞核酸の転写、特定の遺伝子の翻訳および化合物（例えば、カルシウムまたはｃＡＭＰ）の濃度変化、タンパク質の転座、およびラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイにより測定される積分細胞応答が挙げられる。
【０１９８】
開示された、いくつかの実施の形態は、例えば、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の調節因子として作用する小分子のハイスループット・スクリーニングまたは検出のための、機能細胞系アッセイを提供する。本発明のいくつかの実施の形態は、受容体（例えば、ＧＰＲ３５）からのシグナルが、別の受容体（例えば、ｈＥＲＧ）の活性を調節する、および／または変化が測定できる（例えば、カルシウムおよび／またはｃＡＭＰレベル、またはＤＭＲシグナル）細胞応答を調節する、共役反応を提供する。本開示は、ここに記載された様々な方法を提供する。明確にするために、本開示は、シグナル伝達複合体中の任意の成分の調節因子およびその関連経路をスクリーニングするために使用することができる。
【０１９９】
本開示によれば、構成アイソフォーム(constitutive isoform)を含むＧＰＲ３５の任意の変異体が発現され得る。あるいは、ｈＥＲＧチャンネルの任意の変異体が、多くの異なる組合せを達成できるように発現され得る。
【０２００】
ｉ．  分類
本開示は、ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体活性化剤の部類に関する。これらの活性化剤は、（１）ＧＰＲ３５アゴニストであり、かつｈＥＲＧ活性化剤でもあるｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体活性化剤、または（２）ｈＥＲＧトランス活性化ＧＰＲ３５アゴニスト（すなわち、ｈＥＲＧチャンネルをトランス活性化できる機能的に選択的なＧＰＲ３５アゴニスト）；または（３）ＧＰＲ３５トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤（すなわち、ＧＰＲ３５をトランス活性化できる機能的に選択的なｈＥＲＧ活性化剤）；または（４）ｈＥＲＧ非トランス活性化ＧＰＲ３５アゴニスト（すなわち、ｈＥＲＧをトランス活性化できないＧＰＲ３５特異的アゴニスト）；または（５）ＧＰＲ３５非トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤（すなわち、ＧＰＲ３５をトランス活性化できないｈＥＲＧ特異的活性化剤）であり得る（図１２および１３参照）。ｈＥＲＧリガンドによるｈＥＲＧチャンネルの活性化は、同じ複合体中でＧＰＲ３５をトランス活性化するどうか分からないのに対し、ＧＰＲ３５アゴニストによるＧＰＲ３５の活性化は、同じ複合体中のｈＥＲＧチャンネルをトランス活性化するかどうか分からない。ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５アゴニストによるｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体の活性化は、同じ複合体内でｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５の両方の活性化をもたらし得る（図１２）。
【０２０１】
本開示は、ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５シグナル伝達複合体活性化剤を分類する方法に関する。開示の方法は、ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体調節因子の部類を定義するための細胞アッセイのパネルの組合せである（図１から１１、および図１４から１７に示された実施例参照）：（１）ポイント・オブ・コンタクト・アッセイ（例えば、受容体転座、Ｃａ2+動員、ｃＡＭＰ変化、タンパク質ホスホリル化）またはＧＰＲ３５提示細胞中のＧＰＲ３５により作用する調節因子の作用を判定するための統合アッセイ（例えば、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ）を含む細胞アッセイ；（２）ｈＥＲＧ提示細胞中のｈＥＲＧチャンネルにより作用する調節因子の作用を判定するためのパッチクランプ記録；（３）ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞中のｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体により作用する調節因子のアゴニズム作用を判定するための統合アッセイ（例えば、ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ）；および（４）ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞中のｈＥＲＧ活性化剤マーカー、および／またはＧＰＲ３５アゴニストマーカーに対するｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体により作用する調節因子のアンタゴニズム作用を判定するための統合アッセイ。ｈＥＲＧ活性化剤マーカーがマロトキシンであることが好ましいのに対し、ＧＰＲ３５アゴニストマーカーは、ＮＰＰＢ、キヌレン酸、ザプリナスト、またはＹＥ２１０であることが好ましい。
【０２０２】
４．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子を同定する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を含む組成物を試験薬と接触させ、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用をアッセイする各工程を含む方法が開示されている。
【０２０３】
開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用のないことは、試験薬がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子であることを示す。
【０２０４】
開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用をアッセイする工程は、ＧＰＲ３５を単離し、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用を示すｈＥＲＧの存在を検出する各工程を含む。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用をアッセイする工程は、ｈＥＲＧを単離し、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用を示すＧＰＲ３５の存在を検出する各工程を含む。
【０２０５】
開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用をアッセイする工程は、試験薬の存在下対不在下でのＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用を比較する工程を含む。試験薬の不在下と、試験薬の存在下とでのＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用の存在は、その試験薬がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子ではないことを示す。試験薬の不在下でのＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用の存在および試験薬の存在下でのＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用の不在は、その試験薬がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子であることを示す。
【０２０６】
開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を含む組成物は細胞である。ある形態では、その細胞は動物細胞であり得る。例えば、その細胞はヒトまたはマウスであり得る。ある形態では、その細胞は遺伝子組換え操作された細胞である。
【０２０７】
開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子はＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用を防止する。開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子はＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用を妨害する。ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧの相互作用の防止または妨害は様々な様式で起こり得る。この干渉分子は、ｈＥＲＧのＧＰＲ３５結合領域と同一の配列を含み、それゆえ結合に競合し得る。例えば、ＧＰＲ３５におけるｈＥＲＧ結合領域のアミノ酸を含むペプチドは、ＧＰＲ３５とｈＥＲＧとの相互作用を防止または妨害し得る。前記干渉分子は、同一ではないけれども、結合に競合するために、ｈＥＲＧのＧＰＲ３５結合領域またはＧＰＲ３５のｈＥＲＧ結合領域を模倣できる。あるいは、前記干渉分子は、相互作用部位の内の１つを遮断することによって、相互作用を単に遮断し得る。例えば、ＧＰＲ３５におけるｈＥＲＧ結合領域に対する抗体は、ｈＥＲＧのＧＰＲ３５と相互作用する能力を遮断し得る。当業者には、干渉分子の一般的な機構およびこれらをどのように検定するかが知られているであろう。
【０２０８】
開示された方法のある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子は、抗体またはその断片であり得る。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子は、タンパク質またはペプチドであり得る。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子は、化合物、またはその薬学的に許容される塩であり得る。ある形態では、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子は核酸であり得る。
【０２０９】
Ｂ．  治療
上述した化合物および組成物は、ＧＰＲ３５、ｈＥＲＧおよび／またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連する疾患の阻害、低減、予防、および／または治療に有用である。したがって、ある形態では、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を予防および／または治療する方法であって、被験体に治療に有効な量の先に開示された化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示される。
【０２１０】
適切な被験体は、哺乳類の被験体を含み得る。哺乳類としては、以下に限られないが、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類、ウサギ、霊長類などが挙げられ、胎内の哺乳類も包含される。ある形態では、ヒトが被験体である。ヒトの被験体は、いずれの性別であっても、どの成長期であっても差し支えない。
【０２１１】
１．  ｈＥＲＧ調節因子
ｈＥＲＧは、ｈＥＲＧイオンチャンネルの活性を直接的または間接的に調節できる分子である。ｈＥＲＧチャンネルの活性を直接的に調節するｈＥＲＧ調節因子は、ｈＥＲＧチャンネルに結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧによるイオン流束、および／またはｈＥＲＧによる細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性における変化を生じさせ分子である（このタイプの調節因子は、ｈＥＲＧ特異的調節因子と称される）。ｈＥＲＧチャンネルの活性を間接的に調節するｈＥＲＧ調節因子は、細胞中のｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体に結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧによるイオン流束、および／またはｈＥＲＧチャンネルまたはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体による細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性における変化を生じさせ分子である（このタイプの調節因子は、ｈＥＲＧ経路調節因子と称される）。ｈＥＲＧ活性における変化は、調節因子の不在下での細胞中のｈＥＲＧチャンネルまたはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体の基礎活性に対して参照される。
【０２１２】
２．  ＧＰＲ３５調節因子
ある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２１３】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３０】
2013535448.tif 000032
【０２１４】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２１５】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３１】
2013535448.tif 000033
【０２１６】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２１７】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３２】
2013535448.tif 000034
【０２１８】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２１９】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３３】
2013535448.tif 000035
【０２２０】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２２１】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩がＧＰＲ３５調節因子である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩がＧＰＲ３５アゴニストである方法である。
【０２２２】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記ＧＰＲ３５が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ（ＲｈｏＡおよびＲｈｏキナーゼ）経路を通じて細胞のシグナル伝達を媒介する方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記疾患が、炎症、喘息、代謝異常、鬱血性心不全、および癌からなる群より選択される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記代謝異常が、糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、不十分な耐糖能、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満症、老化、シンドロームＸ、アテローム性動脈硬化、心臓病、脳卒中、高血圧症および末梢血管疾患からなる群より選択される方法。
【０２２３】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記癌が、前立腺癌、白血病、ホルモン依存性癌、乳癌、結腸癌、肺癌、表皮癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、脳の癌および腎臓癌からなる群より選択される方法である。
【０２２４】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物がＧＰＲ３５アンタゴニストである方法である。
【０２２５】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、直腸、頬、舌下、静脈内、皮下、皮内、経皮、腹腔内、経口、点眼、腸管外および局所の投与からなる群より選択される１つ以上の経路により投与される方法である。
【０２２６】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の経口剤型を投与することによって行われる方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の注射剤型の投与である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の座剤型の投与である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩のゲル、クリーム、粉末、泡、結晶、リポソーム、スプレーまたは液体の懸濁剤型の術中点滴注入法による投与である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、経皮貼布または経皮パッドの形態にある、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与である方法である。
【０２２７】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、投与日で体重１ｋｇ当たり約０．００１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約０．０１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約０．１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約１から約５０ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約１０から約５０ｍｇの量で投与される方法である。
【０２２８】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、１種類以上の治療薬をさらに含む方法である。ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記治療薬は、抗炎症薬、抗代謝異常薬、抗鬱血性心不全薬または抗癌薬である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記治療薬が、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナストまたはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である方法である。
【０２２９】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が別々の製剤中で投与される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が同じ製剤中で投与される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が同時にまたは順次に投与される方法である。
【０２３０】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が、同じまたは異なる経路により投与される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を予防および／または治療する上で相乗効果を生じる方法である。
【０２３１】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記疾患が、単薬として投与される前記化合物またはその薬学的に許容される塩、または前記１種類以上の治療薬による治療に対して無感応である、耐性がある、または効果がない方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が、各々、正常な個体の治療量の１／１００から１／２未満、または正常な個体の治療量の１／１０から１／４未満の量で投与される方法である。
【０２３２】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記被験体が哺乳類である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記被験体が、前記疾患の治療または前記投与を必要とすると認定されている方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記治療の有効性について前記被験体をモニタする工程をさらに含む方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記被験体をモニタする工程が、その被験体から得た組織サンプルを分析する工程を含む方法である。
【０２３３】
３．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体調節因子
ある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２３４】
ある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３４】
2013535448.tif 000036
【０２３５】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２３６】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３５】
2013535448.tif 000037
【０２３７】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２３８】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３６】
2013535448.tif 000038
【０２３９】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２４０】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３７】
2013535448.tif 000039
【０２４１】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２４２】
他のある形態では、被験体を予防および／または治療する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体に、治療に有効な量の、
【化３８】
2013535448.tif 000040
【０２４３】
からなる群より選択される化学構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む方法が開示されている。
【０２４４】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子である方法である。
【０２４５】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記疾患が、炎症、喘息、代謝異常、鬱血性心不全、および癌からなる群より選択される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記代謝異常が、糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、不十分な耐糖能、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満症、老化、シンドロームＸ、アテローム性動脈硬化、心臓病、脳卒中、高血圧症および末梢血管疾患からなる群より選択される方法。
【０２４６】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記癌が、前立腺癌、白血病、ホルモン依存性癌、乳癌、結腸癌、肺癌、表皮癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、脳の癌および腎臓癌からなる群より選択される方法である。
【０２４７】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、直腸、頬、舌下、静脈内、皮下、皮内、経皮、腹腔内、経口、点眼、腸管外および局所の投与からなる群より選択される１つ以上の経路により投与される方法である。
【０２４８】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の経口剤型を投与することによって行われる方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の注射剤型の投与である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の座剤型の投与である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩のゲル、クリーム、粉末、泡、結晶、リポソーム、スプレーまたは液体の懸濁剤型の術中点滴注入法による投与である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記投与が、経皮貼布または経皮パッドの形態にある、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与である方法である。
【０２４９】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、投与日で体重１ｋｇ当たり約０．００１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約０．０１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約０．１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約１から約１００ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約１から約５０ｍｇ、または投与日で体重１ｋｇ当たり約１０から約５０ｍｇの量で投与される方法である。
【０２５０】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、１種類以上の治療薬をさらに含む方法である。ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記治療薬は、抗炎症薬、抗代謝異常薬、抗鬱血性心不全薬または抗癌薬である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記治療薬が、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、キヌレン酸、ＮＰＰＢ、ザプリナストまたはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である方法である。
【０２５１】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が別々の製剤中で投与される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が同じ製剤中で投与される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が同時にまたは順次に投与される方法である。
【０２５２】
他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が、同じまたは異なる経路により投与される方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が、ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する疾患を予防および／または治療する上で相乗効果を生じる方法である。
【０２５３】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記疾患が、単薬として投与される前記化合物またはその薬学的に許容される塩、または前記１種類以上の治療薬による治療に対して無感応である、耐性がある、または効果がない方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩、および前記１種類以上の治療薬が、各々、正常な個体の治療量の１／１００から１／２未満、または正常な個体の治療量の１／１０から１／４未満の量で投与される方法である。
【０２５４】
ある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記被験体が哺乳類である方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記被験体が、前記疾患の治療または前記投与を必要とすると認定されている方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記治療の有効性について前記被験体をモニタする工程をさらに含む方法である。他のある形態では、先に開示した被験体を予防および／または治療する方法は、前記被験体をモニタする工程が、その被験体から得た組織サンプルを分析する工程を含む方法である。
【０２５５】
開示は、炎症、代謝異常、糖尿病、鬱血性心不全、または癌などのｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体関連疾患の予防および治療を改善するためのｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体調節因子の使用に関する。このｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体調節因子としては、以下に限られないが、式IからＩＩＩに示された分子が挙げられる。
【０２５６】
開示は、代謝異常および癌などのｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５関連ヒト疾患を治療または予防する方法であって、その必要のある被験体に、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体、またはプロドラッグ、もしくは本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体、またはプロドラッグを含む医薬組成物を投与する工程を有してなる方法をさらに包含する。これらの方法は、その被験体に、追加の薬剤を別にまたは本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体、またはプロドラッグと組み合わせた組成物として投与する工程を含んでもよい。
【０２５７】
開示は、有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体、またはプロドラッグ、もしくは有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体、またはプロドラッグを含む医薬組成物を使用して、インビボまたはインビトロで代謝異常および癌などのｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５関連ヒト疾患を治療する方法をさらに包含する。
【０２５８】
４．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連する疾患を有する被験体を治療する方法であって、その被験体に、治療に有効な量の、開示された方法で同定された分子を投与する工程を有してなる方法も開示されている。例えば、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子で被験体を治療することにより、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体シグナル伝達経路に影響し得るＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用を防止または妨害することができる。この経路を必要とする疾患は、そのシグナル伝達経路を遮断することによって治療することができる。
【０２５９】
開示された方法のある形態では、被験体は、その疾患の治療を必要としていると認定されている。開示された方法のある形態では、その方法は、治療の有効性について前記被験体をモニタする工程をさらに含む。
【０２６０】
Ｃ．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体形成の干渉
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体形成を防止する方法であって、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ発現細胞をＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子と接触させる工程を有してなる方法も開示されている。
【０２６１】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体形成を防止する方法であって、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を含む組成物をＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子と接触させる工程を有してなる方法も開示されている。
【０２６２】
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体結合分子を同定する方法であって、単離されたＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体またはそのＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体を含む組成物を試験分子と接触させる工程、およびその試験分子がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に結合しているか否かを判定する工程を有してなる方法も開示されている。ある分子は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体に直接結合せずに、その複合体に影響を与えるまたは調節することができ、ある分子は直接の結合を必要とする。開示された複合体および組成物は、結合研究に使用することができる。分子がＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に結合したか否かを判定した後、次いで、その分子がその複合体を調節するか否かまたはその逆も判定することができる。単離された複合体または組成物を使用することにより、その複合体を含む細胞株を使用するよりも、結合研究のためのより都合が良く、より安価な実験が可能になる。
【０２６３】
開示された方法は、被験体を治療するために、並びにＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体シグナル伝達経路を研究するために、使用することができる。
【０２６４】
Ｄ．  遺伝子操作された細胞の作製および使用
本発明は加えて、様々な関連方法を提供する。本発明の細胞は、様々な方法、例えば、関連アッセイに利用することができる。本発明のある態様は、細胞からＧＰＣＲを発現する方法であって、その細胞に、受容体コード領域に動作可能に結合したプロモータを含む核酸を導入する工程を有してなる方法を提供する。いくつかの実施の形態において、その方法は、前記核酸を、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはウイルスベクターによる感染によって導入する工程を含む。１つの実施の形態において、前記受容体コード領域に動作可能に結合したプロモータは、調節可能なプロモータである。
【０２６５】
本発明のある態様は、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の活性を検出またはモニタする方法であって、（ａ）ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体が存在する条件下で本発明の細胞を培養する工程；および（ｂ）細胞応答を検出する工程を有してなる方法を提供する。
【０２６６】
本発明のある態様は、化合物の、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の活性化に影響を与えるまたは調節する能力を測定する方法であって、（ａ）ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体が存在する条件下で本発明の細胞を培養する工程；（ｂ）その細胞を前記化合物と接触させる工程；および（ｃ）細胞応答を測定する工程を有してなる方法を提供する。
【０２６７】
本発明によれば、構成アイソフォームを含むＧＰＲ３５のどの変異体も発現され得る。あるいは、ｈＥＲＧチャンネルのどの変異体も、多くの異なる組合せが達成できるように発現され得る。
【０２６８】
例えば、ＧＰＲ３５経路の活性化を必要としないｈＥＲＧトランス活性化ＧＰＲ３５アゴニストをスクリーニングするために、活性なＧＰＲ３５アゴニストがＧＰＲ３５経路を刺激するのを防止する変異体ＧＰＲ３５を発現する遺伝子操作細胞を使用することができる。このことは、そのＧＰＲ３５アゴニストのｈＥＲＧトランス活性化能力が、トランス活性化するためのＧＰＲ３５経路以外の何かを使用することを示すであろう。
【０２６９】
Ｅ．  用語の追加の定義
本明細書中、様々な刊行物が引用されている。本出願が関連する技術分野をより十分に説明するために、これらの刊行物の開示は全体として、本明細書中に組み込まれている。開示された引用は、その引用が依拠する文に議論されているその中に含まれる題材について、個別にかつ具体的に引用により含まれる。
【０２７０】
１．  Ａ（冠詞）
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるところの、単数形の“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”およびこれらに類する用語は、文脈が明確にそうでないと指示するのでない限り、複数形を含む。したがって例えば、“ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ（医薬品担体）”への言及は、かかる担体の２種類または３種類以上の混合物等を含む。
【０２７１】
２．  省略形
当業者に周知の省略形が使用される場合がある（例えば、単数または複数の時間について“ｈ”または“ｈｒ”、単数または複数のグラムについて“ｇ”または“ｇｍ”、ミリリットルについて“ｍＬ”、室温について“ｒｔ”、ナノメートルについて“ｎｍ”、モルについて“Ｍ”、その他これらに類する省略形）。
【０２７２】
３．  Ａｂｏｕｔ（約）
例えば、開示される実施態様を説明する際に用いられる、組成物中の成分の量、濃度、体積、処理温度、処理時間、収率、流速、圧力等の数値と、これらの範囲とを修飾する約（Ａｂｏｕｔ）の語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物または使用処方を作るための典型的な測定および取り扱い手順と、これらの手順での故意でないエラーと、本方法を実行するために使用される出発材料または成分の製法、出所または純度の違いと、これらに類する検討とを通じて発生しうる数量変動を意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度または混合を有する組成物または処方のエージングのために異なる量と、特定の初期濃度または混合を有する組成物または処方を混合または処理するために異なる量とをも含む。約という用語で修飾されるか否かに関わらず、本明細書に添付される特許請求の範囲は、これらの量の均等物を含む。
【０２７３】
４．  分析方法
分析方法は、例えば、分子または物質を測定する方法である。例えば、ガスクロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー、高分解能ガスクロマトグラフィー、高分解能質量分析、または質量分析が分析方法である。
【０２７４】
５．  アッセイすること（Ａｓｓａｙｉｎｇ）
アッセイすること、アッセイ、その他これらに類する用語は、例えば分子または細胞のような物の特性、例えば、有無、量、程度、反応速度論、動態か、リガンドまたはマーカーのような１種類以上の外部刺激を用いる刺激に対する細胞の光学的または生体インピーダンス応答のタイプかを測定するための分析を指す。ある刺激に対する細胞の応答のバイオセンサーシグナルを生成することはアッセイの場合がある。
【０２７５】
６．  応答をアッセイすること（Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）
「応答をアッセイすること」、その他これに類する用語は、応答を特徴づけるための手段を使うことを意味する。例えば、ある分子がある細胞と接触される場合に、該分子に曝露された際の該細胞の応答をアッセイするためにバイオセンサーが使用されることがある。
【０２７６】
７．  アゴニズムおよびアンタゴニズムモード
アゴニズムモード等の用語は、細胞がある分子に曝露されて該分子がＤＭＲシグナルのようなバイオセンサーシグナルを誘発する能力があるかどうかを測定するアッセイであるのに対し、アンタゴニズムモードは、ある分子の存在下であるマーカーに曝露されて、該分子が前記マーカーに対応する細胞のバイオセンサーシグナルを調節する能力があるかどうかを測定するアッセイである。
【０２７７】
８．  バイオセンサー
バイオセンサーまたはこれに類する用語は、生物学的な構成要素を物理化学的検出器構成要素と組み合わせる被分析物の検出装置を指す。バイオセンサーは、（組織、微生物、病原体、細胞またはこれらの組合せのような）生物学的構成要素または要素と、（光学的、圧電式、電気化学的、熱量測定式または磁気的手法のような物理化学的手法で作動する）検出器要素と、両方の構成要素と関係する変換器という３つの部分からなるのが典型的である。前記生物学的構成要素または要素は、例えば、生細胞、病原体またはこれらの組合せの場合がある。実施態様では、光学的バイオセンサーは、生細胞、病原体またはこれらの組合せにおける分子識別または分子刺激事象を定量可能なシグナルに変換するための光学的変換器を含む場合がある。ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイに使用される一般的なバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴、プラズモン共鳴イメージング、共鳴導波路グレーティングバイオセンサー、光結晶バイオセンサー、および電気インピーダンスバイオセンサーである。
【０２７８】
９．  バイオセンサー応答
「バイオセンサー応答」、「バイオセンサー出力シグナル」、「バイオセンサーシグナル」またはこれらに類する用語は、細胞を有するセンサーシステムの細胞応答に対するいずれかの反応である。バイオセンサーは、細胞応答を定量可能なセンサー応答に変換する。バイオセンサー応答は、ＲＷＧまたはＳＰＲのような光学的バイオセンサーによって測定される刺激の際の光学的応答であるか、電気的バイオセンサーによって測定される、刺激の際の細胞の生体インピーダンス応答である。バイオセンサー応答は、刺激の際の細胞応答に直接関連するため、バイオセンサー応答および細胞応答は、開示される実施態様では相互に交換可能なように使用される場合がある。
【０２７９】
１０．  バイオセンサーシグナル
「バイオセンサーシグナル」またはこれに類する用語は、刺激の際の応答によって発生し、バイオセンサーで測定される細胞のシグナルを指す。
【０２８０】
１１．  バイオセンサーインデックス
「バイオセンサーインデックス」または類似の用語は、バイオセンサーのデータ集から構成されたインデックスである。バイオセンサーインデックスは、第１プロファイル、または第２プロファイルなどのバイオセンサープロファイル集であり得る。このインデックスは、どのようなタイプのデータからなっていても差し支えない。例えば、プロファイルのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータ点だけからなっていても差し支えなく、Ｐ−ＤＭＲデータ点であっても、またはその両方であっても差し支えなく、もしくはインピーダンスデータ点であっても差し支えない。そのインデックスは、プロファイル曲線に関連するデータ点の全てであっても差し支えない。
【０２８１】
１２．  細胞
ここに用いた「細胞」という用語は、個々の細胞、細胞株、またはそのような細胞に由来する培養物も称する。「培養物」は、同じまたは異なるタイプの単離細胞を含む組成物を称する。共培養という用語は、複数のタイプの細胞が、同じ皿内で互いに完全にまたは部分的に接触しながら一緒に培養される場合を称するために使用される。
【０２８２】
１３．  細胞培養
「細胞培養」または「細胞を培養すること」は、制御された条件下で原核細胞または真核細胞のいずれかが増殖するプロセスを指す。「細胞培養」は、多細胞真核生物、特に、動物細胞由来の細胞を培養することだけでなく、複雑な組織および器官を培養することも指す。
【０２８３】
１４．  細胞パネル
「細胞パネル」またはこれに類する用語は、少なくとも２つのタイプの細胞を含むパネルである。細胞は、本明細書に開示されるいかなるタイプまたは組合せであってもかまわない。
【０２８４】
１５．  細胞応答
「細胞応答」またはこれに類する用語は、刺激に対する細胞によるいずれかの反応である。
【０２８５】
１６．  細胞プロセス
細胞プロセスまたはこれに類する用語は、細胞において、または、細胞によって起こるプロセスである。細胞プロセスの例は、増殖、アポトーシス、ネクロシス、分化、細胞シグナル伝達、極性変化、遊走または形質転換を含むが、これらに限定されない。
【０２８６】
１７．  細胞標的
「細胞標的」またはこれに類する用語は、外部刺激でその活性が修飾される場合のあるタンパク質または核酸のような生体高分子である。細胞標的は、酵素、キナーゼ、イオンチャンネルおよび受容体のようなタンパク質であることが最も一般的である。
【０２８７】
１８．  特徴づけること（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ）
特徴づけることまたはこれに類する用語は、リガンド、分子、マーカーまたは細胞のような物質について、該リガンド、分子、マーカーまたは細胞のプロファイルを得ることのように、前記物質のいずれかの特性についての情報を収集することを指す。
【０２８８】
１９．  化合物の互換性
本開示の目的に関して、「化合物」、「類似体」、および「組成物(composition of matter)」という用語は、全ての鏡像形体、ジアステレオマー形体、塩などの全てを含む、ここに記載された化学物質を等しく同様に表し、「化合物」、「類似体」、および「組成物」という用語は、本明細書中に交換可能に使用されている。
【０２８９】
２０．  含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む」という語と、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”および“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”のようなその変形とは、「含むが、限定されない」ことを意味し、例えば他の追加物、構成要素、整数またはステップを排除することを意図しない。
【０２９０】
２１．  〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ  〜）
実施態様における「〜から実質的になる」とは、例えば、バイオセンサー表面上の表面組成物と、表面組成物、処方または組成物を作成または使用する方法と、本開示の物品（ａｒｔｉｃｌｅ）、機器または装置とを指し、特許請求の範囲に掲げた構成要素またはステップと、さまざまに選択される、特定の反応剤、特定の添加物または成分、特定の薬剤、特定の細胞または細胞株、特定の表面修飾剤または条件、特定のリガンド候補またはこれらに類する構造、材料またはプロセスのように、開示された組成物、物品、装置および製造使用方法の基本的で新規な特性に実質的に影響のない、他の構成要素またはステップとを含む場合がある。開示された構成要素またはステップの基本的特性に実質的に影響を与える場合があるか、本開示に望ましくない特徴を授与する場合がある事項は、例えば、細胞のバイオセンサー表面への親和性の低下と、刺激の細胞表面受容体または細胞内細胞への異常な親和性と、リガンド候補またはこれに類する刺激への応答における変則的または逆方向の細胞活性とを含む。
【０２９１】
２２．  構成要素
開示された組成物を調製するために用いられる構成要素と、本明細書に開示される方法に使用される組成物とが開示される。これらおよびその他の材料は本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されるとき、これらの化合物のそれぞれさまざまな個別および集団の組合せおよび順列は明示的に開示されない場合があっても、それぞれは具体的に企図され本明細書に説明されることが理解される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスとともに開示され、組合せ分子の実施例であるＡ−Ｄが開示される場合には、個別に列挙されない場合であっても、それぞれが個別的かつ集団的に企図された意味の組合せである、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されたと考えられる。同様に、いずれかのサブセットまたは組合せも開示されたと考えられる。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが開示されたと考えられるであろう。このコンセプトは、開示される組成物の製造使用方法におけるステップを含むが、限定されない、本件出願の全ての局面に適用される。したがって、実行可能なさまざまな追加のステップがある場合には、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の実施態様のいずれかの具体的な実施態様か、実施態様の組合せかとともに実行される場合がある。
【０２９２】
２３．  接触させる（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）
接触させるまたはこれに類する用語は、分子相互作用が、分子か、細胞か、マーカーか、少なくとも１種類の化合物または組成物か、少なくとも２種類の組成物か、物品または機械とこれらのいずれかとのような、少なくとも２つの事物（ｔｈｉｎｇ）の間で可能な場合に、分子相互作用が起こりうるように近傍に運ぶことを意味する。例えば、接触することは、混ぜたり触れたりするために近くにいるように、少なくとも２種類の組成物、分子、物品または事物を接触させることを指す。例えば、組成物Ａの溶液と培養細胞Ｂとがあって、組成物Ａの溶液を培養細胞Ｂに注ぐことは、組成物Ａの溶液を培養細胞Ｂと接触させるであろう。細胞をリガンドに接触させることは、該細胞が該リガンドにアクセスできることを確実にするために前記リガンドを前記細胞に運ぶことであろう。
【０２９３】
本明細書に開示されるいかなるものも他のいずれかのものと接触させられる場合があることが理解される。例えば、細胞は、マーカーまたは分子、バイオセンサー等と接触させられる場合がある。
【０２９４】
２４．  化合物および組成物
化合物および組成物は本発明の技術分野における標準的な意味がある。分子、物質、マーカー、細胞または試薬のような特定の指示対象（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）の用いられる場所がどこであれ、これらの指示対象を含む、これらの指示対象からなる、および、これらの指示対象から実質的になる組成物が開示されることを理解すべきである。したがって、特定の指示対象としてマーカーが用いられるところでは、そのマーカーを含む組成物か、そのマーカーからなる組成物か、そのマーカーから実質的になる組成物かも開示されるであろうことが理解される。適切な場合には、特定の指示対象が示されるところでは、その指示対象の化合物も開示されるものと理解される。例えば、ＥＧＦのような具体的な生物学的材料が開示される場合には、化合物形状のＥＧＦも開示される。
【０２９５】
２５．  対照
対照または「対照レベル」または「対照細胞」という用語その他これらに類する用語は、これによって変化が測定される基準として定義され、例えば、対照は実験に従属するのではなく、定義されたパラメーターのセットに従属する、あるいは、対照は処理前または処理後のレベルに基づく。対照は、試験対象の実験作業と並行してか、試行の前または後かに実験作業が進められるか、あるいは、対照は予め定められた標準かの場合がある。
【０２９６】
２６．  包接体(Clathrate)
本発明に使用するための化合物は、溶媒和物とは対照的に、薬物と宿主が化学量論的または非化学量論的な量で中に存在する薬物−宿主封入複合体である、「包接体」などの複合体を形成するかもしれない。ここで称される化合物は、化学量論的または非化学量論的な量であって差し支えない２種類以上の有機および／または無機成分も含有し得る。得られた複合体は、イオン化され得る、部分的にイオン化され得る、またはイオン化され得ない。そのような複合体のレビューについては、see J. Pharm. ScL, 64 (8), 1269-1288, by Haleblian (August 1975)を参照のこと。
【０２９７】
２７．  検出
検出またはこれに類する用語は、分子またはマーカーで誘発される細胞応答を発見または感知して、感知された応答を異なる分子ごとに区別できる本開示の装置および方法の能力を指す。
【０２９８】
２８．  （薬物候補分子の）直接作用
「直接作用」またはこれに類する用語は、（薬物候補分子が）細胞に独立に作用する結果である。
【０２９９】
２９．  ＤＭＲインデックス
「ＤＭＲインデックス」または類似の用語は、ＤＭＲデータ集から構成されたバイオセンサーインデックスである。
【０３００】
３０．  ＤＭＲシグナル
「ＤＭＲシグナル」またはこれに類する用語は、刺激に対する細胞の応答によって発生し、光学的バイオセンサーで測定される、細胞のシグナルを指す。
【０３０１】
３１．  ＤＭＲ応答
「ＤＭＲ応答」またはこれに類する用語は、光学的バイオセンサーを用いるバイオセンサー応答である。ＤＭＲは、動的質量再分配または動的細胞物質再分配を指す。Ｐ−ＤＭＲは陽性ＤＭＲ応答であり、Ｎ−ＤＭＲは陰性ＤＭＲ応答で、ＲＰ−ＤＭＲは回復Ｐ−ＤＭＲ応答である。
【０３０２】
３２．    疾患マーカー
疾患マーカーは、ｈＥＲＧチャンネル関連疾患、またはＧＰＲ３５関連疾患、もしくはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体関連疾患の特定、診断、または予後に使用できる任意の試薬、分子、物質などである。
【０３０３】
３３．  薬物候補分子
薬物候補分子またはこれに類する用語は、薬物またはファーマコフォアとして機能できる能力について試験される試験分子である。この分子はリード分子と考えられる場合がある。
【０３０４】
３４．  有効性
有効性またはこれに類する用語は、理想的または最適な条件下で所望のサイズの効果を起こす能力である。関連する概念である有効性から有効性を区別するのはこれらの条件である。有効性は現実の条件下での変化に関係する。有効性は、受容体占有率と、分子、細胞、組織または全身レベルで応答を開始する能力との間の関係性である。
【０３０５】
３５．  ｈＥＲＧ調節因子
ｈＥＲＧ調節因子は、ｈＥＲＧイオンチャンネルの活性を直接的または間接的に調節できる分子である。ｈＥＲＧチャンネルの活性を直接的に調節するｈＥＲＧ特異的調節因子は、ｈＥＲＧチャンネルに結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧによるイオン流束、および／またはｈＥＲＧによる細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性における変化を生じさせる分子である。ｈＥＲＧチャンネルの活性を間接的に調節するｈＥＲＧ経路調節因子は、細胞中のｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体に結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧによるイオン流束、および／またはｈＥＲＧチャンネルまたはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体による細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性における変化を生じさせる分子である。ｈＥＲＧ活性における変化は、調節因子の不在下での細胞中のｈＥＲＧチャンネルまたはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体の基礎活性に対して参照される。
【０３０６】
３６．  ｈＥＲＧ活性化剤
ｈＥＲＧ活性化剤は、適切な印加電圧でｈＥＲＧチャンネルを通じて電流を増加させる、および／または適切なＫＣｌ濃度の存在下でｈＥＲＧチャンネルを通じてイオン流束を増加させる、および／または細胞中のｈＥＲＧチャンネルまたはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体を通じて細胞シグナル伝達を誘発する分子である。その例には、マロトキシン、フルフェナム酸、およびニフルム酸がある。
【０３０７】
３７．  ｈＥＲＧ経路活性化剤
ｈＥＲＧ経路活性化剤は、細胞中のｈＥＲＧチャンネルまたはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体を通じて細胞シグナル伝達を誘発する分子である。ｈＥＲＧ経路活性化剤は、ｈＥＲＧ電流、および／またはｈＥＲＧによるイオン流束における変化を生じても生じなくてもよい。変化は、増加または減少し得る。その例には、ジフルニサル、ＡＧ１２６、およびチルホスチン５１がある。
【０３０８】
３８．  ｈＥＲＧイオンチャンネル活性化剤
ｈＥＲＧイオンチャンネル活性化剤は、ｈＥＲＧチャンネルに直接結合し、活性化させ、それゆえ、ｈＥＲＧ電流の増加、および／またはｈＥＲＧイオン流束の増加、および／またはｈＥＲＧチャンネルを通じての細胞シグナル伝達をもたらす分子である。その例には、マロトキシン、フルフェナム酸、およびニフルム酸がある。ｈＥＲＧイオンチャンネル活性化剤は、細胞シグナル伝達を誘発してもしなくてもよい。
【０３０９】
３９．  ｈＥＲＧ阻害剤
ｈＥＲＧ阻害剤は、ｈＥＲＧチャンネル、またはｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体中のｈＥＲＧタンパク質に結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流および／またはｈＥＲＧイオン流束を阻害する分子である。
【０３１０】
４０．  ｈＥＲＧ経路阻害剤
ｈＥＲＧ経路阻害剤は、ｈＥＲＧ関連シグナル伝達複合体中のｈＥＲＧタンパク質ではなく受容体に結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流および／またはｈＥＲＧイオン流束を阻害する分子である。その例としては、チルホスチン５１が挙げられる。
【０３１１】
４１．  ｈＥＲＧイオンチャンネル阻害剤
ｈＥＲＧイオンチャンネル阻害剤は、ｈＥＲＧチャンネルに直接結合し、それゆえ、ｈＥＲＧ電流および／またはｈＥＲＧイオン流束を阻害する分子である。その例としては、ドフェチリジが挙げられる。
【０３１２】
４２．  ｈＥＲＧチャンネル関連疾患
ｈＥＲＧチャンネル関連疾患は、その疾患の原因またはその疾患の治療がｈＥＲＧチャンネルの調節により変えられる疾患である。例示の疾患には、白血病、結腸癌、胃癌、乳癌、または肺癌などの癌がある。例示の疾患には、遺伝子突然変異により生じる遺伝性ＱＴ延長性症候群（ＬＱＴＳ）、薬物分子により生じる後天性ＬＱＴＳ、およびクラスＩＩＩ不整脈がある。
【０３１３】
４３．  より高い、阻害これらに類する語
より高い、増大する、上昇するまたは上昇またはこれらに類する用語、もしくはこれらの用語の変形は、基底レベルから上に、すなわち、対照と比較して、増大することを指す。低い、より低い、減少させる。低減するまたは減少またはこれらに類する用語、もしくはこれらの用語の変形は、基底レベルより下に、例えば、対照と比較して、低減することを指す。例えば基底レベルは、アゴニストまたは拮抗物質のような分子の添加の前か、該分子の非存在下かでの正常なｉｎ  ｖｉｖｏのレベルである。阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または動詞ｉｎｈｉｂｉｔの諸語形またはこれらに類する用語は、減少または抑制することを指す。
【０３１４】
４４．  より高い、増大する、上昇する、上昇
「より高い」、「増大する」、「上昇する」、または「上昇」または類似の用語またはこれらの用語の変形は、例えば、対照と比べて、基本レベルを超えた増大を称する。「低い」、「より低い」、「減少する」、「低下する」または「減少」または類似の用語、またはこれらの用語の変形は、例えば、対照と比べて、基本レベルより低下を称する。例えば、基本レベルは、活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストなどの薬剤の添加前、または不在下、またはその添加後の正常なインビボレベルである。例えば、分子の受容体への結合を記載するために、低下または増大を使用することができる。この文脈において、低下は、結合が１０-9ＭのＫｄを有すると定義でき、この相互作用が減少した場合、結合が減少したことを意味し、Ｋｄが１０-6Ｍに減少し得る状況を記載するであろう。これらの用語の内の１つが使用されたときはいつでも、対照からの１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１０００％の増大または低下であり得ることが理解されよう。
【０３１５】
４５．  分子の存在下
「分子の存在下」またはこれに類する用語は、培養細胞に分子を接触または曝露させることを指す。前記接触または曝露は、刺激が細胞と接触される前またはその最中に起こる場合がある。
【０３１６】
４６．  インデックス
インデックスまたはこれに類する用語は、データのコレクションである。例えばインデックスは、１個または２個以上の調節プロファイルを含むリスト、表、ファイルまたはカタログの場合がある。指標は、データのいずれかの組合せから作成できることが理解される。例えばＤＭＲプロファイルは、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲおよびＲＰ−ＤＭＲを有する場合がある。インデックスは、前記プロファイルが完成したデータか、前記Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、ＲＰ−ＤＭＲまたはこれらのうちのいずれかのポイントか、これらまたはその他のデータの組合せかを用いて作成できる。インデックスはかかる情報のいずれかのコレクションである。典型的には、インデックスを比較するとき、前記インデックスは同種のデータ、すなわち、Ｐ−ＤＭＲに対しＰ−ＤＭＲである。
【０３１７】
４７．  阻害する
「阻害する」または類似の用語は、特定の特徴を妨害または抑制することを意味する。これは、概して、ある標準的なまたは予測される値に対する、言い換えれば、相対的であるが、必ずしも、その標準的なまたは予測される値を言及する必要はないと理解される。例えば、「ホスホリル化を阻害する」とは、標準または対照に対して起こるホスホリル化の量を妨害または抑制することを意味する。
【０３１８】
４８．  既知の分子
既知の分子またはこれに類する用語は、正確な作用メカニズムは既知または未知の場合があるが、薬理学／生物学／生理学／病理生理学的活性が既知である分子である。
【０３１９】
４９．  既知の調節因子
既知の調節因子またはこれに類する用語は、少なくとも１種類の標的が既知で、親和性も既知である、調節因子である。例えば、既知の調節因子は、ＧＰＲ３５アゴニスト、ＧＰＲ３５アンタゴニストなどであって差し支えない。
【０３２０】
５０．  既知調節因子バイオセンサーインデックス
「既知調節因子バイオセンサーインデックス」またはこれに類する用語は、既知調節因子について収集されたデータによって作成された調節因子バイオセンサーインデックスである。例えば、既知の調節因子バイオセンサーインデックスは、前記既知調節因子が細胞パネルに作用するプロファイルと、マーカーのパネルに作用する調節プロファイルとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネル中のある細胞についてのものである。
【０３２１】
５１．  既知調節因子ＤＭＲインデックス
「既知調節因子ＤＭＲインデックス」またはこれに類する用語は、既知調節因子について収集されたデータにより作成される調節因子ＤＭＲインデックスである。例えば既知調節因子ＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用する既知調節因子のプロファイルと、マーカーのパネルに対する既知調節因子の調節因子プロファイルとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネル中の細胞についてのものである。
【０３２２】
５２．  ｈＥＲＧ特異的調節因子
ｈＥＲＧ特異的調節因子は、ｈＥＲＧチャンネルへの直接的な結合によりｈＥＲＧイオンチャンネルの活性を調節できる分子である。ｈＥＲＧ特異的調節因子は、ｈＥＲＧ電流、ｈＥＲＧによるイオン流束、および／またはｈＥＲＧによる細胞シグナル伝達などのｈＥＲＧ活性における変化を生じ得る。
【０３２３】
５３．  ｈＥＲＧ発現細胞
ｈＥＲＧ発現細胞は、ｈＥＲＧチャンネルを内生的または組換え的いずれかで発現する細胞である。ｈＥＲＧ発現細胞は、白血病細胞株、胃癌細胞株、神経芽細胞腫細胞株、乳癌細胞株、ヒト結腸癌細胞株、心血管細胞株、およびニューロン細胞株であり得る。ｈＥＲＧを発現する細胞は、ＨＬ６０、細胞株ＳＧＣ７９０１、細胞株ＭＧＣ８０３、細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、細胞株ＭＣＦ−７、細胞株ＨＴ−２９およびＨＣＴ８、並びに細胞株ＨＣＴ１１６であって差し支えない。
【０３２４】
５４．  ｈＥＲＧ非発現細胞
ｈＥＲＧ非発現細胞は、どのような機能的ｈＥＲＧタンパク質も発現しない細胞である。例には、ＨＥＫ−２９３および細胞株ＣＨＯ−Ｋ１などの、ヒト胎児由来腎臓細胞株およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株がある。
【０３２５】
５５．  ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ
ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイまたは類似の用語は、細胞応答を検出またはモニタするためにラベルフリーバイオセンサーを使用する任意のアッセイである。
【０３２６】
５６．  電気生理学方法
電気生理学方法は、生物細胞および組織の電気的性質を研究する任意の方法である。その方法は、単一イオンチャンネルタンパク質から心臓などの全体の臓器までの多種多様な規模で電圧変化または電流の測定を含む。神経科学において、その方法は、ニューロンの電気活性、特に活動電位活性の測定を含む。脳波検査法などの、神経系からの大規模電気シグナルの記録は、電気生理学的記録と称してもよい。
【０３２７】
５７．  既知のｈＥＲＧ調節因子
既知のｈＥＲＧ活性化剤は、アッセイに使用されるときに、何らかで示されるように、ｈＥＲＧ活性化剤であると知られた任意のｈＥＲＧ活性化剤である。既知のｈＥＲＧ遮断薬としては、以下に限られないが、三酸化ヒ素、アステミゾール、ベプリジル、クロロキン、シサプリド、クラリスロマイシン、ジソピラミド、ドフェチリド、ドンペリドン、ドロペリドール、エリスロマイシン、フルオキセチン、フルボキサミン、ハロファントリン、ハロペリドール、イブチリド、レボメタジル、メソリダジン、メタドン、ノルフルオキセチン、ペンタミジン、ピモジド、プロブコール、プロカインアミド、キニジン、スパルフロキサシン、テルフェナジン、フェキソフェナジン、チオリダジン、ベラパミルが挙げられる。既知のｈＥＲＧ活性化剤としては、ＲＰＲ２６０２４３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、マロトキシン、ニフルム酸、フルフェナム酸、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、Ａ−９３５１４２およびＩＣＡ−１０５５７４が挙げられる。
【０３２８】
５８．  ＧＰＲ３５特異的調節因子
ＧＰＲ３５特異的調節因子またはＧＰＲ３５調節因子または類似の用語は、ＧＰＲ３５に直接結合し、それゆえ、ＧＰＲ３５の活性を調節する任意の調節因子である。一般的なＧＰＲ３５特異的調節因子は、３種類の細胞アッセイの内の１つでＧＰＲ３５活性を調節することができる：（１）Ｇqo5を同時発現するしないにかかわらないＨＥＫ−ＧＰＲ３５などの遺伝子操作細胞におけるＣａ2+動員アッセイ。Ｇqo5は、その活性化によりＣａ2+動員がもたらされるＧタンパク質であり、このＧqo5タンパク質は、前記細胞中で発現されたときに非Ｇq共役受容体のアゴニスト誘発活性化により活性化され得る。ＧＰＲ３５は非Ｇq共役受容体であると考えられるので、Ｇqo5の同時発現は、ＧＰＲ３５アゴニスト誘発Ｃａ2+動員シグナルを検出するために必要である。（２）受容体内在化アッセイ。受容体の内在化は、ほとんど全てのＧＰＣＲに対して迅速に普遍的になる。（３）共鳴導波路グレーティングバイオセンサーなどの光学式バイオセンサーにより保証される、ラベルフリー動的質量再配分（ＤＭＲ）アッセイ。ＧＰＲ３５調節因子は、アゴニスト、アンタゴニスト、逆作動薬、および偏ったアゴニズムであり得る。
【０３２９】
５９．  ＧＰＲ３５発現細胞
ＧＰＲ３５発現細胞は、その細胞の細胞膜中で機能的ＧＰＲ３５を生成する任意の細胞である。
【０３３０】
６０．  ＧＰＲ３５アゴニスト
ＧＰＲ３５アゴニストは、細胞中のＧＰＲ３５受容体に結合し、それゆえ活性化させる任意の分子である。本発明におよび／または刊行された文献に開示された例としては、以下に限られないが、ジフニサル、フルフェナム酸、フルンキシン(flunxin)、フロセミド、ニフルム酸、ＮＰＰＢ、トルフェナム酸、ザプリナスト、ＹＥ２１０、またはＤＮＱＸが挙げられる。
【０３３１】
６１．  既知ＧＰＲ３５アゴニスト
既知ＧＰＲ３５アゴニストは、アッセイに使用されるときに、何らかで示されるように、ＧＰＲ３５アゴニストであると知られた任意のＧＰＲ３５アゴニストである。
【０３３２】
６２．  ＧＰＲ３５アンタゴニスト
ＧＰＲ３５アンタゴニストは、ＧＰＲ３５受容体に結合するが、その活性を阻害する任意の分子である。
【０３３３】
６３．  既知ＧＰＲ３５アンタゴニスト
既知ＧＰＲ３５アンタゴニストは、アッセイに使用されるときに、何らかで示されるように、ＧＰＲ３５アンタゴニストであると知られた任意の既知ＧＰＲ３５アンタゴニストである。現在まで、文献に報告されているＧＰＲ３５アンタゴニストはない。
【０３３４】
６４．  ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する
ＧＰＲ３５が、疾患または怪我に関連する、またはそれから生じる体の機能的変化に関与している場合、何かが「ＧＰＲ３５に病態生理学的に関連する」。
【０３３５】
６５．  炎症
炎症は、任意の特異的または非特異的免疫応答である。炎症は、病原体、損傷細胞、または刺激物などの、有害な刺激に対する維管束組織の複雑な生物反応の一部である。炎症は、有害な刺激を除去するための、また治癒プロセスを開始するための、生物による防護の試みである。炎症は、急性または慢性いずれかに分類できる。急性炎症は、有害な刺激に対する体の初期反応であり、リンパ漿および白血球（特に顆粒球）の血液から損傷組織への移動の増加により達成される。たくさんの生化学事象が伝搬し、局所脈管系、免疫系、および損傷組織内の様々な細胞を含む免疫反応を完成させる。慢性炎症として知られている長期化した炎症は、炎症部位に存在する細胞のタイプにおける進行性のシフトをもたらし、同時破壊と炎症プロセスからの組織の治癒により特徴付けられる。
【０３３６】
６６．  代謝異常
代謝異常は、糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、不十分な耐糖能、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満症、老化、シンドロームＸ、アテローム性動脈硬化、心臓病、脳卒中、高血圧症および末梢血管疾患などの代謝の病気である。
【０３３７】
６７．  鬱血性心不全
鬱血性心不全（ＣＨＦ）は、酸素の豊富な血液を体に送達するためのポンプとしての心臓の機能が、体の必要性を満たすのに不十分である状態である。鬱血性心不全は、心筋を弱化させる疾患、または心筋の硬化を生じる疾患、または体組織による酸素の需要を心臓の送達する能力を超えて増加させる疾患により、生じ得る。多くの疾患は、心室のポンプ作用を損ない得る。例えば、心室の筋肉は、心臓発作または感染（心筋炎）により弱化され得る。筋肉の弱化により心室の減少したポンプ能力は、収縮不全と呼ばれる。各心室収縮（収縮期）後、心室の筋肉は、緩和して、血液を心房から心室に充満させる必要がある。心室のこの緩和は拡張期と呼ばれる。ヘモクロマトーシスやアミロイドーシスなどの疾患により、心筋の硬化が生じ、心室の緩和し充満する能力を損ない得る；これは、拡張不全と称される。この最も一般的な原因は、肥厚（肥大）心臓を招く長期間に亘る高血圧である。その上、ある患者では、心臓のポンプ作用および充満能力が正常であるかもしれないが、体組織による高い酸素需要（例えば、甲状腺機能亢進症により）のために、心臓が適切な血流を供給することが困難になるであろう（高拍出性心不全と呼ばれる）。またある患者では、これらの要因の１つ以上が存在して、鬱血性心不全が生じ得る。鬱血性心不全は、体の多くの器官に影響を与え得る。例えば、弱化した心筋は、腎臓に十分な血液を供給できず、次いで、この腎臓は、塩分（ナトリウム）と水を排出する正常な能力を失い始めるかもしれない。この低減した腎臓機能により、体がより多くの流体を維持し得る。肺が、流体により充満され始め（肺水腫）、そのヒトの運動する能力が低減するであろう。流体は同様に肝臓に蓄積し、それによって、体から毒素を除き、必須タンパク質を生成する能力が損なわれるであろう。腸が、栄養素および薬を吸収するのが効率的ではなくなるであろう。やがて、未治療の悪化した鬱血性心不全により、体のほとんど全ての器官が影響を受ける。
【０３３８】
６８．  癌
癌は、前立腺癌、白血病、ホルモン依存性癌、乳癌、結腸癌、肺癌、表皮癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、脳の癌および腎臓癌などの不適切に制御された細胞の分化または分裂の疾患である。癌は、体細胞中の遺伝子変異の進行性の蓄積から生じる多くの疾患である。癌は、経路調節不全疾患とも見られる−少数の主要経路が、癌をもたらす異常な細胞増殖において優位を占める。腫瘍細胞がその隣接細胞より早く成長する能力が、下流のタンパク質の恒常的活性化によりしばしば促進される。数十年に亘る遺伝子研究により、多種多様な腫瘍関連遺伝子とその変異体が発見されてきた。その多くは、少数の経路に関与するシグナル伝達タンパク質に優先的に生じる。遺伝子の突然変異は、たいてい、正の調節ループ（機能の獲得）において強化され、負の調節ループ（機能の損失）ではメチル化された遺伝子が強化され、細胞の正常な協力行動が妨害され、それゆえ、腫瘍の表現型を促進する。癌の兆候における顕著な特徴は、突然変異したタンパク質が、細胞内または細胞間のシグナル伝達ネットワークという背景において、癌細胞のシグナル伝達をどのように変更し、制御するかである。
【０３３９】
６９．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体調節因子（またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子）は、ＧＰＲ３５またはｈＥＲＧのいずれか、もしくはその両方に結合し、よってＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の活性を調節する分子である。ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体調節因子（またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体調節因子）は、ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５同時発現細胞におけるＤＭＲアッセイにおいて交差脱感作を生じることができる。
【０３４０】
７０．  交差脱感作ＭＤＲアッセイ
交差脱感作ＭＤＲアッセイは、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞において、マロトキシンなどのｈＥＲＧ活性化剤またはザプリナストやＹＥ２１０などのＧＰＲ３５アゴニストのいずれかにより媒介される細胞応答を脱感作する分子の能力を測定するラベルフリー光学バイオセンサー細胞アッセイであり、その分子自体も、その細胞中でアゴニズム活性を示す。
【０３４１】
７１．  アゴニズム作用
アゴニズム作用は、分子の受容体への結合であって、その受容体の活性化をもたらし、それゆえ、その受容体の既知のアゴニストに関する細胞応答に類似の細胞応答を引き起こす結合を称する。
【０３４２】
７２．  アンタゴニズム作用
アンタゴニズム作用は、分子の受容体への結合であって、その受容体の阻害をもたらす結合を称する。
【０３４３】
７３．  ｈＥＲＧトランス活性化ＧＰＲ３５アゴニスト
ｈＥＲＧトランス活性化ＧＰＲ３５アゴニストは、ｈＥＲＧチャンネルが、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞においてＧＰＲ３５と複合体を形成したときに、ＧＰＲ３５に一度結合したら、ｈＥＲＧチャンネルをトランス活性化できるＧＰＲ３５アゴニストである。
【０３４４】
７４．  ｈＥＲＧ非トランス活性化ＧＰＲ３５アゴニスト
ｈＥＲＧ非トランス活性化ＧＰＲ３５アゴニストは、ｈＥＲＧチャンネルが、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞においてＧＰＲ３５と複合体を形成したときに、ＧＰＲ３５に一度結合したら、ｈＥＲＧチャンネルをトランス活性化しないＧＰＲ３５アゴニストである。
【０３４５】
７５．  ＧＰＲ３５トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤
ＧＰＲ３５トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤は、ＧＰＲ３５受容体が、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞においてｈＥＲＧと複合体を形成したときに、ｈＥＲＧチャンネルに一度結合したら、ＧＰＲ３５受容体をトランス活性化できるｈＥＲＧ活性化剤である。
【０３４６】
７６．  ＧＰＲ３５非トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤
ＧＰＲ３５非トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤は、ＧＰＲ３５受容体が、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞においてｈＥＲＧと複合体を形成したときに、ｈＥＲＧチャンネルに一度結合したら、ＧＰＲ３５受容体をトランス活性化しないｈＥＲＧ活性化剤である。
【０３４７】
７７．  正常な個々の治療量
ある組成物において、複数の活性治療薬が存在する。これは、複合組成物(combination composition)と呼ばれる。それゆえ、複合組成物内で、正常な個々の治療量は、活性治療薬の１つが単一の活性治療薬として投与される投薬量である。
【０３４８】
７８．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連する
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体が、疾患または怪我に関連する、またはそれから生じる体の機能的変化に関与している場合、何かが「ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に病態生理学的に関連する」。
【０３４９】
７９．  治療薬
治療薬は、治療効果を有すると判定されている任意の薬剤である。
【０３５０】
８０．  抗炎症薬
抗炎症薬は、抗炎症活性を有する任意の薬剤である。抗炎症薬の例には、イブプロフェン、アスピリン、タイレノールなどのＣｏｘ阻害剤、またはＧＰＲ３５アゴニスト、またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体活性化剤がある。
【０３５１】
８１．  抗代謝異常薬
抗代謝異常薬は、代謝異常に関連する疾患を抑制する、低減させる、または予防する効果を有する任意の薬剤である。代謝は、人体が食物からエネルギーを得るまたは生成するために使用するプロセスである。食物は、タンパク質、炭水化物および脂質から構成されている。消化系の化学物質が食物部分を糖類と酸に分解し、それゆえ、燃料を提供する。体はこの燃料を直ちに使用でき、または肝臓、筋肉および体脂肪などの組織中にエネルギーを貯蔵できる。代謝異常は、人体内の異常な化学反応がこのプロセスを妨害するときに起こる。このことが起こると、健康でいるのに必要なある物質を多く摂りすぎ、他の物質を少なくしか摂らないであろう。
【０３５２】
８２．  抗鬱血性心不全薬
抗鬱血性心不全薬は、利尿薬などの、鬱血性心不全に関連する疾患を抑制する、低減させる、または予防する効果を有する任意の薬剤である。
【０３５３】
８３．  抗癌薬
抗癌薬は、ビンブラスチンやタキソールなどの、抗癌効果を有する任意の薬剤である。
【０３５４】
８４．  遺伝子操作細胞
遺伝子操作細胞は、一時的または永久的いずれかの様式で、１つ以上の遺伝子が加えられたか、除去されたか（相同的組換えまたはｓｉＲＮＡプラスミドなどの、遺伝子遮断により）、変更された、任意の細胞である。「遺伝子操作細胞」という用語は、核酸などの外因性物質を含むように操作された細胞を称する。例えば、外因性ＧＰＲ３５、外因性ｈＥＲＧまたはその両方を含むように操作された遺伝子操作細胞が、ここに開示されている。
【０３５５】
８５．  細胞
ここに用いた「細胞」という用語も、個々の細胞、細胞株、またはそのような細胞に由来する培養物を称する。「培養物」は、同じまたは異なるタイプの単離細胞を含む組成物を称する。共培養という用語は、複数のタイプの細胞が、同じ皿内で互いに完全にまたは部分的に接触しながら一緒に培養される場合を称するために使用される。細胞は、外因性核酸を含む、組換え操作された細胞であり得る。
【０３５６】
細胞は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も称する。ある一時的変異(modification)が、突然変異または環境の影響のために後継世代に生じるかも知れないので、そのような子孫は、実際に、親の細胞とは同一ではないかもしれないが、それでも、ここに用いた用語の範囲内に含まれる。
【０３５７】
８６．  融合タンパク質
「融合タンパク質」は、以下の特徴の１つまたはいくつかを助長する、標的タンパク質のＣまたはＮ末端のいずれかに位置するタンパク質またはペプチドである：（１）改善された溶解度−標的タンパク質のＮ末端の可溶性融合パートナーのＣ末端への融合は、たいてい、標的タンパク質の溶解度を改善させる；（２）改善された検出−短いペプチド（エピトープタグ）、もしくは抗体により（ウェスタンブロット分析）または生物理学的方法により（例えば、蛍光によるＧＦＰ）認識されるタンパク質のいずれかの末端への標的タンパク質の融合は、発現または精製中の結果として生じたタンパク質の検出を容易にする；（３）改善された精製−親和性樹脂に特異的に結合するいずれかの末端で使用されたタンパク質に、単純な精製スキームが開発された；（４）局在化−通常は標的タンパク質のＮ末端に位置する、特定の細胞区画にタンパク質を送るためのアドレスとして働くタグ；（５）改善された発現（Ｅ）−高度に発現された融合パートナーのＣ末端への標的タンパク質のＮ末端の融合により、標的タンパク質の高レベル発現がもたらされる。
【０３５８】
「ＧＰＲ３５融合タンパク質」は、標的タンパク質ＧＰＲ３５のＣまたはＮ末端のいずれかに位置するタンパク質またはペプチドを称する。その例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がＧＰＲ３５のＮ末端に位置しているＧＦＰ−ＧＰＲ３５、またＧＦＰがＧＰＲ３５のＣ末端に位置しているＧＰＲ３５−ＧＦＰがある。
【０３５９】
８７．  相互作用する
「相互作用する」、「相互作用」などは、２つ（以上）の分子が、分子間の無作為の接触(contact)のために生じる触れること(touching)を超越する様式で互いに触れることを意味する。「相互作用する」は、２つ以上の分子の間の「結合」と考えられ、したがって、解離定数および結合定数並びに平衡定数を有し得る。
【０３６０】
８８．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧシグナル伝達複合体またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体またはＧＰＲ３５−ｈＥＲＧオリゴマーまたは類似の用語は、ｈＥＲＧおよびＧＰＲ３５同時発現細胞において細胞表面でｈＥＲＧチャンネルタンパク質とＧＰＲ３５タンパク質との間の物理的相互作用により形成された複合体を称する。
【０３６１】
８９．  調節可能なプロモータ
「プロモータ」または類似の用語は、遺伝子転写開始部位（ＴＳＳ）の上流のゲノム配列における領域を称するために使用されるが、ＴＳＳの下流の配列も、転写の開始に影響するであろう。ＴＳＳからの距離に応じて、「近位プロモータ」（ＴＳＳの周りの数百のヌクレオチド）および「遠位プロモータ」（ＴＳＳの上流の数千以上のヌクレオチド）の用語も使用される。近位と遠位のプロモータの両方とも、転写の細胞−、組織−、器官−、成長段階−および環境要因−特異的調節の複雑なプロセスに関与する数組の様々な要素を含む。ＴＳＳ選択を調節するほとんどのプロモータ要素は、近位プロモータに局在化している（ＰｌａｎｔＰｒｏｍ：植物プロモータ配列のデータベース、Shahmuradov et al. (2003) Nucleic Acids Res.31(1): 114-117）。
【０３６２】
調節可能なプロモータは、別の分子により調節され得るプロモータである。例えば、ある分子の存在または不在は、プロモータ活性を開始するか、またはプロモータ活性を妨げ得る。
【０３６３】
９０．  選択可能マーカー
選択可能マーカーは、トランスフェクションプロセスのクローン選択中に外因性遺伝子陽性細胞を選択するために使用される分子である。この選択可能マーカーは、以下に限られないが、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８またはゲンタマイシンであり得る。
【０３６４】
９１．  ラベル
ここに用いたラベルおよびタグという用語は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体などの別の残基に共有結合または非共有結合した部分としての存在を称し、このラベルにより、他の残基の位置および／または活性をモニタすることが可能になる。一例において、ラベルは蛍光性であり得る。
【０３６５】
９２．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体結合分子
「ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体結合分子」という用語は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体に結合できる任意の分子を称する。
【０３６６】
９３．  試験分子
試験分子または試験薬剤などは、１つ以上の活性または特徴がアッセイされている任意の分子である。
【０３６７】
９４．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用
「ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用」という用語は、１つ以上のＧＰＲ３５分子の１つ以上のｈＥＲＧ分子との相互作用を称する。この相互作用は、複数の分子間の無作為の接触のために生じる触れることを超越する容器での触れることの形態である。
【０３６８】
９５．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子
「ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子」という用語は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ相互作用に干渉する任意の分子を称する。例えば、その分子は、その相互作用を防ぐか、またはＧＰＲ３５とｈＥＲＧとの間で既に生じている相互作用を妨害し得る。ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体干渉分子の例は、ＧＰＲ３５上のｈＥＲＧ相互作用部位またはｈＥＲＧ上のＧＰＲ３５相互作用部位いずれかを模倣するペプチドであろう。
【０３６９】
９６．  ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ同時発現細胞
「ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ同時発現細胞」は、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧの両方を発現する細胞である。その細胞は初代細胞であっても、細胞株であっても差し支えない。ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ発現細胞は、外因性のＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ、または外因性ＧＰＲ３５および内因性ｈＥＲＧ（またはその逆）の組合せを発現する組換え操作細胞でもあり得る。ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ同時発現細胞株は、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧの両方を動作可能に発現するように操作された任意の細胞株である。
【０３７０】
９７．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体関連疾患
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体関連疾患は、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体が、その疾患の初発および進行に重要な役割を果たす疾患である。可能性のあるＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体関連疾患としては、代謝異常、鬱血性心不全、炎症（例えば、ウイルス感染誘発炎症、関節炎など）、癌（例えば、結腸癌および胃癌）、および神経障害が挙げられる。
【０３７１】
９８．  ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ発現遺伝子操作細胞株
ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ発現遺伝子操作細胞株は、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧの両方を動作可能に発現するように遺伝子操作された任意の細胞株である。ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ発現遺伝子操作細胞株は、外因性のＧＰＲ３５およびｈＥＲＧの両方、または外因性ＧＰＲ３５および内因性ｈＥＲＧ（またはその逆）の組合せを発現する。
【０３７２】
９９．  ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤
ラベルフリーバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤または類似の用語は、ｈＥＲＧ活性化剤であり、かつラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイを使用して、ｈＥＲＧ発現細胞における検出可能なバイオセンサーシグナルを誘発することができる。このバイオセンサーｈＥＲＧ活性化剤は、ｈＥＲＧ活性化剤、ｈＥＲＧ経路活性化剤、またはｈＥＲＧイオンチャンネル活性化剤であり得る。その例には、マロトキシン、ＲＰＲ２６０２４３、ＮＳ１６４３、ＮＳ３６２３、ＰＤ−１１８０５７、ＰＤ−３０７２４３、Ａ−９３５１４２、フルフェナム酸、ニフルム酸、またはジフルニサルであり得る。
【０３７３】
１００．  リガンド
リガンドまたはこれに類する用語は、生物学的な目的に役立てるために、生体分子と結合して複合体を形成する物質または組成物または分子である。リガンドとその標的分子との間の実際に不可逆的な共有結合は生物学的システムではまれである。受容体へのリガンド結合は受容体タンパク質の立体配座、すなわち、３次元形状を変化させる。受容体タンパク質の配座状態は該受容体の機能状態を決定する。結合の傾向または強度は親和性とよばれる。リガンドは、基質、遮断薬、阻害剤、活性化剤および神経伝達物質を含む。放射性リガンドは、放射性同位元素で標識されたリガンドで、蛍光リガンドは蛍光タグが付いたリガンドで、両方は、受容体生物学および生化学研究用のトレーサーとしてしばしば利用されるリガンドと考えられる場合がある。リガンドと調節因子とは互いに交換可能に用いられる。
【０３７４】
１０１．  ライブラリ
ライブラリまたはこれに類する用語はコレクションである。ライブラリは本明細書に開示されるいずれかのもののコレクションの場合がある。例えば、インデックスのコレクションはインデックスライブラリであり、プロファイルのコレクションはプロファイルライブラリであり、ＤＭＲインデックスのコレクションはＤＭＲインデックスライブラリである。また、分子のコレクションは分子ライブラリで、細胞のコレクションは細胞ライブラリで、マーカーのコレクションはマーカーライブラリである。ライブラリは例えば、ランダム的または非ランダム的の場合があり、決定または未決定の場合がある。例えば、既知調節因子のＤＭＲインデックスまたはバイオセンサーインデックスのライブラリが開示される。
【０３７５】
１０２．  維持する
「維持する」などの単語は、状態を継続することを称する。治療に関して、維持は、基礎レベル、たいてい、治療していないレベルまたはプラセボまたは標準により治療しているレベルなどの対照からの２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％。４％、３％、２％、１％、または０．１％未満を称し得る。
【０３７６】
１０３．  物質
物質は、物理的物体の構成に参加する何かの（化学物質、生化学物質、生物製剤、またはその混合）実体のある部分である。
【０３７７】
１０４．  マーカー
マーカーまたはこれに類する用語は、バイオセンサー細胞アッセイにおけるシグナルを発生するリガンドである。前記シグナルは、少なくとも１種類の特異的標的を通じて媒介される、少なくとも１種類の特異的細胞シグナル伝達経路および／または少なくとも１種類の特異的細胞プロセスの特性であり、でなければならない。前記シグナルは正または負またはいずれかの組合せ（例えば振動）の場合がある。
【０３７８】
１０５．  マーカーパネル
「マーカーパネル」またはこれに類する用語は、少なくとも２種類のマーカーを含むパネルである。前記マーカーは、異なる経路のものであってもよく、同じ経路のものであってもよく、異なる標的のものであってもよく、同じ標的のものであってすらよい。
【０３７９】
１０６．  マーカーバイオセンサーインデックス
「マーカーバイオセンサーインデックス」またはこれに類する用語は、あるマーカーについて収集されたデータによって作成されるバイオセンサー指標である。例えば、バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用するマーカーのプロファイルと、マーカーのパネルに対するマーカーの調節プロファイルとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネルの細胞についてのものである。
【０３８０】
１０７．  マーカーＤＭＲインデックス
「マーカーＤＭＲインデックス」またはこれに類する用語は、あるマーカーについて収集されたデータによって作成されるバイオセンサーＤＭＲインデックスである。例えば、マーカーＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用するマーカーのプロファイルと、マーカーのパネルに作用する前記マーカーの調節プロファイルとでできる場合があり、マーカーの各パネルは前記細胞のパネルの細胞についてのものである。
【０３８１】
１０８．  模倣（ｍｉｍｉｃ）
本明細書で用いられるところの「模倣」またはこれに類する用語は、参照対象の１つまたは２つ以上の機能を実行することを指す。例えば、分子模倣体はある分子の１つまたは２つ以上の機能を実行する。
【０３８２】
１０９．  調節する
調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）または動詞ｍｏｄｕｌａｔｅの諸語形は、細胞標的を通じて媒介される細胞活性の増大、減少または維持のいずれかを意味する。これらの語のうち１つが用いられるところでは、対照から、１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％または１０００％の増大か、１％、５％、１０％、２０％、５０％または１００％の減少かの場合があることも開示されていると理解されよう。
【０３８３】
１１０．  調節する
調節するまたは類似の用語は、増大または減少の標準的な意味を称する。
【０３８４】
１１１．  調節因子
調節因子またはこれに類する用語は、細胞標的の活性を制御するリガンドである。調節因子は、標的タンパク質のような細胞標的と結合するシグナル調節分子である。
【０３８５】
１１２．  調節比較
「調節比較」またはこれに類する用語は、１次プロファイルおよび２次プロファイルを正規化した結果である。
【０３８６】
１１３．  調節因子バイオセンサーインデックス
「調節因子バイオセンサーインデックス」またはこれに類する用語は、調節因子について収集されたデータによって作成されるバイオセンサーインデックスである。例えば、調節因子バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用する調節因子のプロファイルと、マーカーのパネルに対する前記調節因子の調節プロファイルとでできる場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０３８７】
１１４．  調節因子ＤＭＲインデックス
「調節因子ＤＭＲインデックス」またはこれに類する用語は、調節因子について収集されたデータによって作成されるＤＭＲインデックスである。例えば、調節因子ＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用する調節因子のプロファイルと、マーカーのパネルに対する前記調節因子の調節プロファイルとでできる場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０３８８】
１１５．  マーカーのバイオセンサーシグナルを調節する
「バイオセンサーシグナルを調節する」またはこれに類する用語は、マーカーでの刺激に応答してバイオセンサーシグナルまたは細胞のプロファイルの変化を起こすことである。
【０３８９】
１１６．  ＤＭＲシグナルを調節する
「ＤＭＲシグナルを調節する」またはこれに類する用語は、マーカーでの刺激に応答してＤＭＲシグナルまたは細胞のプロファイルの変化を起こすことである。
【０３９０】
１１７．  分子
本明細書で用いられるところの用語「分子」またはこれに類する用語は、化学的分子か、明確な分子量を有する分子かの形状で存在する、生物学的または生化学的または化学的存在を指す。分子またはこれに類する用語は、サイズに関係なく、化学的、生化学的または生物学的な分子を指す。
【０３９１】
多くの分子は有機分子（とりわけ共有結合で連結された炭素原子を含む分子）として言及されるタイプであるが、（分子酸素のような単純な分子気体と、一部の硫黄に基づくポリマーのようなより複雑な分子とを含む）一部の分子は炭素を含まない。一般的な用語「分子」は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド類、有機医薬品、小分子、受容体、抗体および脂質のような多数の記述クラスまたはグループの分子を含む。適切なときは、サブグループへの本方法の分子の適用のため、一般的なクラスである「分子」と、タンパク質のような指名されたサブクラスとの両方をかかる分子に代表させる意図を損なうことなく、これらのより説明的な用語（「タンパク質」のような該用語の多くは、重複するグループの分子を説明する）の１個または２個以上が本明細書で用いられるであろう。具体的に示されない限り、「分子」という語は、特定の分子と、薬学的に許容できる塩のような前記特定の分子の塩とを含むであろう。
【０３９２】
１１８．  分子混合物（ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）
分子混合物またはこれに類する用語は、少なくとも２種類の分子を含む混合物である。前記２種類の分子は、構造的に異なる（すなわち、鏡像異性体）か、組成的に異なる（例えば、タンパク質のアイソフォームか、グリコフォームか、異なるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）修飾を有する抗体か）か、構造的かつ組成的に異なる（例えば、未精製天然抽出物または未精製合成化合物）かの場合があるが、これらに限定されない。
【０３９３】
１１９．  分子バイオセンサーインデックス
「分子バイオセンサーインデックス」またはこれに類する用語は、分子について収集されたデータによって作成されるバイオセンサーインデックスである。例えば、分子バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用する分子のプロファイルと、マーカーのパネルに対する前記分子の調節プロファイルとでできている場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０３９４】
１２０．  分子ＤＭＲインデックス
「分子ＤＭＲインデックス」またはこれに類する用語は、分子について収集されたデータによって作成されるＤＭＲインデックスである。例えば、分子バイオセンサーインデックスは、細胞のパネルに作用する分子のプロファイルと、マーカーのパネルに対する前記分子の調節プロファイルとでできている場合があり、マーカーの各パネルは細胞の前記パネルの細胞についてのものである。
【０３９５】
１２１．  分子インデックス
「分子インデックス」またはこれに類する用語は、分子に関するインデックスである。
【０３９６】
１２２．  分子で処理される細胞
分子で処理される細胞またはこれに類する用語は、分子に曝露されてきた細胞である。
【０３９７】
１２３．  分子調節インデックス
「分子調節インデックス」またはこれに類する用語は、細胞のパネルに作用するマーカーのパネルのバイオセンサー出力シグナルを調節できる分子の能力を示すインデックスである。前記調節インデックスは、分子の存在下でのマーカー刺激に対する細胞の応答の特異的バイオセンサー出力シグナルパラメーターをいかなる分子も存在しないときのマーカー刺激に対する細胞の応答の特異的バイオセンサー出力シグナルパラメーターに対して正規化することによって生成される。
【０３９８】
１２４．  分子薬理学
分子薬理学またはこれに類する用語は、システム細胞生物学か、システム細胞薬理学か、細胞に作用する分子の作用モードかを指す。分子薬理学は、毒性か、特定の細胞プロセス（例えば、増殖、分化、活性酸素種シグナル伝達）に影響を与える能力か、特定の細胞標的を調節できる能力かによって特徴づけられることがしばしばあるが、これらに限定されない。
【０３９９】
１２５．  正規化
正規化またはこれに類する用語は、例えば少なくとも１個の共通変数を除去するように、データ、プロファイルまたは応答を調整することを意味する。例えば、細胞に作用するマーカーの応答と、該細胞に作用するマーカーおよび分子の応答という２個の応答が発生する場合に、正規化は、前記分子非存在下で、前記マーカーで誘発される応答と、前記分子存在下での応答とを比較すること、正規化された応答が前記マーカーに対する前記分子の調節に起因する応答を表すように、前記マーカーに起因する応答を除去することという動作を指すかもしれない。調節比較は、分子の存在下（調節プロファイル）での前記マーカーの１次プロファイルおよび２次プロファイルを正規化することにより作成される。
【０４００】
１２６．  任意的（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）
「任意的」、「任意的に」またはこれらに類する用語は、その後の記述の事象または状況が起こるであろうものも起こらないであろうものもあること、および、前記記述は前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。
【０４０１】
１２７．  または
「または」またはこれに類する用語は、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーのいずれかの組合せも含む。
【０４０２】
１２８．  防止する(prevent)
「防止する」または防止するの他の形態は、特定の特徴または状態を停止することを意味する。防止するは、一般に、例えば、低減するまたは阻害するよりも決定的であるので、対照との比較は必要ない。ここに用いたように、何かは、低減され得るが、阻害や防止はされ得ないが、低減される何かは、阻害も防止もされ得る。同様に、何かは、低減され滑阻害され得るが、防止され得ない。低減する、阻害するまたは防止するが使用されている場合、具体的にそうではないと示されていない限り、他の２つの単語の使用も明白に開示されていると理解される。それゆえ、ホスホリル化を阻害することが開示されている場合、ホスホリル化を低減すること、および防止することも開示されている。
【０４０３】
１２９．  プロファイル
プロファイルまたはこれに類する用語は、細胞のような組成物について収集されたデータを指す。プロファイルは本明細書に説明されるラベルフリーバイオセンサーから収集される場合がある。
【０４０４】
ｉ．  １次プロファイル
「１次プロファイル」またはこれに類する用語は、分子が細胞と接触するときに発生するバイオセンサー応答、バイオセンサー出力シグナルまたはプロファイルを指す。典型的には、１次プロファイルは、初期細胞応答を差し引きゼロのバイオセンサーシグナル（すなわち基線）に対して正規化した後に得られる。
【０４０５】
ｉｉ．  ２次プロファイル
「２次プロファイル」またはこれに類する用語は、分子の存在下でのマーカーに対する細胞のバイオセンサー応答またはバイオセンサー出力シグナルである。２次プロファイルは、分子がマーカーで誘発される細胞応答またはバイオセンサー応答を調節できる能力の指示として使用される場合がある。
【０４０６】
ｉｉｉ．  調節プロファイル
「調節プロファイル」またはこれに類する用語は、分子の存在下でのマーカーの２次プロファイルと、いかなる分子も存在しないときのマーカーの１次プロファイルとの間の比較である。前記比較は、例えば前記２次プロファイルから前記１次プロファイルを減算するか、前記１次プロファイルから前記２次プロファイルを減算するか、前記１次プロファイルに対して前記２次プロファイルを正規化するかによって行われる場合がある。
【０４０７】
１３０．  パネル
パネルまたはこれに類する用語は、予め定められた被検体（例えば、マーカー、細胞または経路）のセットである。パネルは、ライブラリから被検体を選定することから作成される場合がある。
【０４０８】
１３１．  陽性対照
「陽性対照」またはこれに類する用語は、データ収集のための条件がデータ収集につなげられることを示す対照である。
【０４０９】
１３２．  強化する（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）
強化する、強化されたまたはこれらに類する用語は、分子によって起こった、細胞でのマーカーのバイオセンサー応答の特定のパラメーターの増大を指す。マーカーの１次プロファイルを、分子の存在下での同一細胞における同一マーカーの２次プロファイルと比較することによって、マーカーで誘発される細胞のバイオセンサー応答の前記分子による調節を計算することができる。陽性の調節は、前記分子がマーカーによって誘発されるバイオセンサーシグナルの増大を起こすことを意味する。
【０４１０】
１３３．  効力
効力またはこれに類する用語は、所定の程度の効果を発生するために必要な量という観点から表現された、分子活性の尺度である。例えば、非常に効力が強い薬物は、低濃度で大きい反応を起こす。効力は親和性および有効性に比例する。親和性は、薬物分子が受容体と結合する能力である。
【０４１１】
１３４．  刊行物
本件出願を通じて、さまざまな刊行物が引用される。本件出願に関する技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示内容は、それらの全体が引用により本件出願に取り込まれる。開示される引用文献は、引用文献を参照する文中で説明される材料であって、前記引用文献に含まれる材料についても、引用により本明細書に個別具体的に取り込まれる。
【０４１２】
１３５．  範囲
範囲は、「約（ａｂｏｕｔ）」ある特定の数値から、および／または、「約」別の特定の数値までとして本明細書で表現される場合がある。かかる範囲が表現されるとき、ある形態は、前記ある特定の数値から、および／または、前記別の特定の数値までを含む。同様に、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」の使用により数値が近似値として表現されるとき、前記特定の数値は包含された数値の１つ構成することが理解されるべきであろう。前記範囲のそれぞれの端点は、他の端点との関係で、および、該他の端点とは無関係に、の両方で有意であることがさらに理解されよう。本明細書には多数の数値が開示されること、および、それぞれの数値は、該数値自体に加えて、「約」その特定数値としても本明細書に開示されることも理解される。例えば、「１０」という数値が開示される場合、「約１０」も開示される。ある数値が開示されるとき、当業者により適切に理解されるとおり、「当該数値以上」、「当該数値以上」と、数値間の可能な範囲とがともに開示される。例えば、数値「１０」が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」も開示される。本件出願を通じて、データは多数の異なるフォーマットで提供されること、および、このデータは、終点および始点と、該データの点の任意の組合せの範囲とを表すことも理解される。例えば、特定のデータの点「１０」と、特定のデータの点「１５」とが開示される場合、１０と１５の間とともに、１０および１５を超える、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、および１０および１５ちょうども開示されると考えられることが理解される。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３および１４も開示される。
【０４１３】
１３６．  受容体
受容体またはこれに類する用語は、移動可能なシグナル伝達（または「シグナル」）分子が会合することがある、細胞の原形質膜または細胞質のいずれかに包埋されるタンパク質分子である。受容体に結合する分子は「リガンド」とよばれ、（神経伝達物質のような）ペプチド、ホルモン、医薬品または毒素の場合があり、かかる結合が起こるとき受容体は、細胞応答を通常は開始する配座変化を起こす。しかし、一部のリガンドは、いかなる応答も誘発することなく受容体を遮断するにすぎない（例えば、アンタゴニスト）。リガンドで誘発される受容体の変化は、該リガンドの生物活性を構成する生理学的変化をもたらす。
【０４１４】
１３７．  低減する
「低減する」または低減するの他の形態は、ある事象または特徴の低下を意味する。これは、概して、ある標準または予測される値に対するものであり、言い換えれば、相対的であるが、必ずしも、その標準値または相対値が参照される必要はないことが理解される。例えば、「ホスホリル化を低減させる」は、標準または対照に対して行われるホスホリル化の量の低下を意味する。
【０４１５】
１３８．  「ロバストなバイオセンサーシグナル」
「ロバストなバイオセンサーシグナル」は、その振幅がノイズレベルまたは陰性対照応答のいずれかより（３倍、１０倍、２０倍、１００倍または１０００倍のように）顕著に上回るバイオセンサーシグナルである。しばしば陰性対照応答は、アッセイ緩衝溶液（すなわちビヒクル）の添加後のバイオセンサー応答である。前記ノイズレベルは、いかなる溶液をさらに添加しないときの細胞のバイオセンサーシグナルである。細胞はいかなる溶液を添加する前でもいつも溶液に覆われることは特記に値する。
【０４１６】
１３９．  「ロバストなＤＭＲシグナル」
「ロバストなＤＭＲシグナル」またはこれに類する用語は、「ロバストなバイオセンサーシグナル」のＤＭＲ形状である。
【０４１７】
１４０．  応答
応答またはこれに類する用語は、いずれかの刺激に対するいずれかの反応である。
【０４１８】
１４１．  サンプル
サンプルまたはこれに類する用語により意味されるのは、動物、植物、菌類等か、天然産物、天然産物の抽出物等か、動物由来の組織または器官か、（被検者の体内か、被検者から直接取り出されるか、培養で維持される細胞か、培養細胞株由来かのいずれかの）細胞か、細胞溶解液（または溶解液の分画）または細胞抽出物か、（例えばポリペプチドまたは核酸のような）細胞または細胞材料由来の１種類以上の分子を含む溶液かであって、本明細書に説明されるとおりアッセイされるものである。サンプルは、細胞または細胞の構成要素を含む、（例えば、血液、尿、糞便、唾液、涙、胆汁であるが、これらに限定されない）いずれかの体液または分泌物の場合もある。
【０４１９】
１４２．  塩および薬学的に許容される塩
本発明の化合物は、無機または有機酸に由来する塩の形態で使用してもよい。特定の化合物に応じて、その化合物の塩は、様々な温度と湿度における向上した医薬安定性、または水中または油中の所望の溶解度などの塩の物理的性質の１つ以上のために有利であるかもしれない。ある場合には、化合物の塩は、その化合物の単離、精製、および／または分割において補助剤として使用してもよい。
【０４２０】
塩が、患者に投与されることを意図している場合（例えば、インビトロの状況で使用されるのではなく）、その塩は薬学的に許容されることが好ましい。「薬学的に許容される塩」という用語は、式ＩまたはＩＩの化合物を、その陰イオンまたはその陽イオンが、一般に、ヒトの摂取に適していると考えられる酸または塩基と組み合わせることによって調製される塩を称する。薬学的に許容される塩は、親の化合物と比べて大きい水溶解度のために、本発明の方法の生成物として特に有用である。薬に使用するために、本発明の化合物の塩は、非毒性の「薬学的に許容される塩」である。「薬学的に許容される塩」という用語に包含される塩は、一般に、遊離塩基を適切な有機または無機酸と反応させることによって調製される、本発明の化合物の非毒性塩である。
【０４２１】
本発明の化合物の適切な薬学的に許容される酸付加塩としては、可能な場合、塩化水素酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、ホウ酸、ホウフッ化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、炭酸、スルホン酸、および硫酸などの無機酸、並びに酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グリコール酸、イソチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、コハク酸、トルエンスルホン酸、酒石酸、およびトリフルオロ酢酸などの有機酸に由来のものが挙げられる。適切な有機酸の例としては、一般に、脂肪族、脂環式、芳香族、アラリファティック、ヘテロ環式、カルボン酸、およびスルホン酸の部類の有機酸が挙げられる。
【０４２２】
適切な有機酸の特別な例としては、アセテート、トリフルオロアセテート、ホルメート、プロピオネート、スクシネート、グリコレート、ジグリコレート、ラクテート、マレート、酒石酸、シトレート、アスコルベート、グルクロネート、マリエート、フマレート、ピルベート、アスパルテート、グルタメート、ベンゾエート、アントラニル酸、メシレート、ステアレート、サリチレート、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、フェニルアセテート、マンダレート、エンボネート（パモエート）、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、パントテネート、トルエンスルホネート、２−ヒドロキシエタンスルホネート、スファニレート、シクロヘキシルアミノスルホネート、アルゲン酸(algenic acid)、β−ヒドロキシ酪酸、ガラクタレート、ガラクツロネート、アジペート、アルギネート、ブチレート、カンホレート(camphorate)、カンホルスルホネート、シクロペンタンプロピオネート、ドデシルサルフェート、グリコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ニコチネート、２−ナフタレンスルホネート、オキサレート、パルモエート、ペクチネート、３−フェニルプロピオネート、ピクレート、ピバレート、チオシアネート、トシレート、およびウンデカノエートが挙げられる。さらに、本発明の化合物が酸性部位を担持する場合、その適切な薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属塩、すなわち、ナトリウム塩またはカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩またはカリウム塩；および適切な有機リガンドにより形成された塩、例えば、第四級アンモニウム塩が挙げられるであろう。別の実施の形態において、塩基塩は、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、コリン、ジエチルアミン、グリシン、リシン、メグルミン、オラミン、トロメタミン、および亜鉛の塩を含む、非毒性塩を形成する塩基から形成される。
【０４２３】
有機塩は、トロメタミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、およびプロカインなどの第二級、第三級または第四級アミン塩から製造されるであろう。塩基性窒素含有基は、低級アルキル（ＣｒＣ6）ハロゲン化物（例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、硫酸ジアルキル（すなわち、硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミル）、長鎖ハロゲン化物（すなわち、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、アリールアルキルハロゲン化物（すなわち、ベンジルおよびフェネチル臭化物）などの作用物質により第四級化されるであろう。
【０４２４】
１つの実施の形態において、酸および塩基のヘミ塩(hemisalt)は、例えば、ヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩であってよい。
【０４２５】
本発明の化合物およびその塩は、非溶媒和形態と溶媒和形態の両方で存在するであろう。
【０４２６】
１４３．  シグナル伝達経路
「定義された経路」または類似の用語は、シグナル（例えば、外因性リガンド）の受信から細胞応答（例えば、細胞標的の増加した発現）までの細胞の経路である。ある場合には、リガンドの受容体への結合により生じる受容体活性化は、そのリガンドに対する細胞の応答に直接結びつけられる。しかしながら、多くの細胞表面受容体について、リガンドと受容体との相互作用は、細胞の応答には直接的に関係ない。活性化された受容体は、細胞の挙動へのリガンドの最終的な生理的影響が生じる前に、最初に、細胞内の他のタンパク質と相互作用しなければならない。たいてい、いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動は、受容体の活性化後に変えられる。受容体の活性化により誘発される完全に一式の細胞変化は、シグナル伝達機構または経路と呼ばれる。このシグナル伝達経路は、比較的単純または極めて複雑のいずれかであり得る。
【０４２７】
１４４．  相乗作用
ここに用いた「相乗効果(synagistic effect)」または「相乗作用(synergy)」という用語は、２種類以上の薬剤を含む組合せの治療効果が、単一の薬剤が施される治療の治療効果よりも効果的であることを意味する。さらに、２種類以上の薬剤を含む組合せの相乗効果により、１種類以上の薬剤のより少ない投薬量の使用および／または患者へのその薬剤の頻度の少ない投与が可能になる。薬剤の少ない投薬量を使用する能力および／またはその薬剤をより少ない頻度で投与する能力のために、疾患または状態の予防、管理または治療におけるその薬剤の有効性を低減させずに、患者へのその薬剤の投与に関連する毒性が低減する。その上、相乗効果により、疾患または状態の予防、管理または治療におけるその薬剤の有効性を改善することができる。さらに、２種類以上の薬剤の組合せの相乗効果により、いずれの薬剤でも単独の使用に関連する悪影響または望ましくない副作用が避けられるか、低減するであろう。
【０４２８】
本出願中ずっと、様々な用語の定義が開示されている。いくつかの用語は１つの範疇で定義されているが、それらの用語の定義は、開示全体の他の部分にも適用できる。
【０４２９】
１４５．  インデックスの類似性
「インデックスの類似性」または類似の用語は、インデックスのパターン、および／またはスコアのマトリクスに基づく、１つの分子について１つである、２つのインデックス間、または少なくとも３つのインデックスの中での類似性を表現するための用語である。スコアのマトリクスは、対応する細胞中の異なる分子の１次プロファイルのシグネチャ、および各マーカーに対する異なる分子の調節プロファイルの性質と割合などの、それらの対応物に強力に関連している。例えば、より高いスコアがより類似している特徴に与えられ、より低いまたは負のスコアが異なる特徴に与えられる。分子調節インデックスに見つかる調節には、正、負および中性の３種類しかないので、類似性マトリクスは比較的単純である。例えば、単純なマトリックスは、同一の調節（例えば、正の調節）にスコア＋１を割り当て、非同一の調節にスコア−１を割り当てる。
【０４３０】
１４６．  被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）
本明細書を通じて用いられるところの「被験体」は、個体を意味する。したがって、「被験体」は、例えば、ネコ、イヌ等の家畜化された動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）、哺乳類、非ヒト哺乳類、霊長類、非ヒト霊長類、齧歯類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類および他のいずれかの動物を含む場合がある。被験体は、霊長類またはヒトのような哺乳類である。被験体は非ヒトの場合がある。
【０４３１】
１４７．  溶媒和物
本発明の化合物、およびその薬学的に許容される塩は、完全に非晶質から完全に結晶質までに及ぶ固体状態の連続体で存在することもある。それらは、非溶媒和形態および溶媒和形態でも存在することもある。「溶媒和物」という用語は、前記化合物および１種類以上の薬学的に許容される溶媒分子（例えば、ＥｔＯＨ）を含む分子複合体を表す。「水和物」という用語は、溶媒が水である溶媒和物である。薬学的に許容される溶媒和物は、溶媒が同位体置換されていてもよい溶媒物（例えば、Ｄ2Ｏ、ｄ6−アセトン、ｄ6−ＤＭＳＯ）を含む。
【０４３２】
有機化合物の溶媒和物および水和物の現在許容されている分類体系は、孤立部位、チャンネル、および金属イオンが配位された溶媒和物および水和物を区別するものである。例えば、K. R. Morris (H. G. Brittain ed.) Polymorphism in Pharmaceutical Solids (1995)を参照のこと。孤立部位溶媒和物および水和物は、溶媒（例えば、水）分子が、有機化合物の媒介分子により互いが直接接触しないように孤立しているものである。チャンネル溶媒和物において、溶媒分子は、それらが他の溶媒分子に隣接している格子チャンネルにある。金属イオン配位溶媒和物において、溶媒分子は金属イオンに結合している。
【０４３３】
溶媒または水が堅く結合している場合、その複合体は、湿度にかかわらずに明確な化学量論組成を有する。しかしながら、チャンネル溶媒和物および吸湿性化合物におけるように、溶媒または水が弱く結合している場合には、水または溶媒の含有量は、湿度および乾燥状態に依存する。そのような場合、非化学量論組成が基準となる。
【０４３４】
本発明の化合物、およびその薬学的に許容される塩は、その化合物および少なくとも１種類の他の成分が化学量論量または非化学量論量で存在する多成分複合体（塩および溶媒和物以外の）として存在することもある。このタイプの複合体としては、包接体(clathrate)（薬物−宿主包有複合体）および共結晶が挙げられる。後者は、概して、非共有相互作用により互いに結合された中性分子構成要素の結晶質複合体と定義されるが、中性分子の塩との複合体でもあり得る。共結晶は、溶融結晶化により、溶媒からの再結晶化により、または成分を一緒に物理的研削することにより、調製される。例えば、O. Almarsson and M. J. Zaworotko, Chem. Commun., 17:1889-1896 (2004)を参照のこと。多成分複合体の一般評論については、J. K. Haleblian, J. Pharm. Sci. 64(8):1269-88 (1975)を参照のこと。
【０４３５】
１４８．  安定した(stable)
医薬組成物に関して使用した場合、「安定した」または類似の用語は、一般に、当該技術分野において、表示期間に亘る既定の貯蔵条件下で活性成分の損失が、特定の量未満、通常は１０％未満であることを意味するものと理解される。組成物が安定であると考えられるのに必要な時間は、各製品の使用と相対的であり、製品を製造し、品質管理と検査のために製品を保有し、製品を卸売業者または顧客に直接出荷し、そこで最終的に使用される前に再び貯蔵されるという商業上の実用性により決定される。数ヶ月の安全要因を含めると、医薬品の最低製品寿命は通常は一年、好ましくは１８ヶ月超である。ここに用いたように、「安定した」という用語は、これらの市場の実態および２℃から８℃までの冷蔵条件などの容易に達成可能な環境条件で製品を貯蔵し輸送する能力を参照する。
【０４３６】
１４９．  物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）
物質またはこれに類する用語は、いずれかの物理的対象である。材料は物質である。分子、リガンド、マーカー、細胞、タンパク質およびＤＮＡは物質と考えられる場合がある。機械または物品は物質自体であると考えられるよりもむしろ、物質でできていると考えられるであろう。
【０４３７】
１５０．  試験分子
試験分子またはこれに類する用語は、該試験分子についてのなんらかの情報を得る方法に用いられる分子である。試験分子は、未知または既知の分子の場合がある。
【０４３８】
１５１．  組織
組織または類似の用語は細胞の集合を称する。概して、組織は被験体から得られる。
【０４３９】
１５２．  治療する(treating)
「治療する」または「治療」は、疾患、病的状態、または不調を治癒する、改善する、安定化させる、または予防するつもりでの、患者の医学的管理を意味する。これらの用語は、積極的な治療、すなわち、疾患、病的状態、または不調の改善に明確に向けられた治療を含み、また表面的な治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または不調の原因の除去に向けられた治療も含む。これらの用語は、原因となる疾患の徴候が低減すること、および／または、前記徴候を起こす原因となる細胞的、生理学的または生化学的原因またはメカニズムが低減することを意味する。この文脈で用いられる低減は、疾患の生理学的状態だけでなく、疾患の分子的状態を含む、疾患の状態と比較する意味であると理解される。その上、これらの用語は、待期療法、すなわち、疾患、病的状態、または不調の治癒よりもむしろ症状の緩和のために計画された療法；予防的処置、すなわち、関連する疾患、病的状態、または不調の進行を最小にするまたはある程度また完全に阻害することに向けられた処置；および支持療法、すなわち、関連する疾患、病的状態、または不調の改善に向けられた別の特異的療法を補うために用いられる療法を含む。これらの用語は、治癒または緩和目的の治療と予防目的の治療の両方を意味する。この治療は、急性または慢性いずれで行っても差し支えない。治療は、対照に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、１００％の、１つ以上の症状または特徴の低減を意味し得ると理解される。これらの用語の文脈で、予防は、疾患を有すると診断された患者またはそのような疾患を発症する危険のある患者において、ここに特定された疾患を予防する化合物または組成物（開示された化合物および組成物などの）の能力を称する。この文脈において、予防は、対照に対して疾患の兆候を遅らせることを含む。これらの用語は、治療が、意図した結果のいずれを生じるのに実際に効果的であることは必要としない。結果が意図されていることで十分である。
【０４４０】
１５３．  治療薬
治療薬または類似の用語は、治療分野で状態または疾患を予防するまたは治療する上で有用である任意の分子または組成物である。例えば、抗癌剤は、被験体における癌細胞の形成を防ぐ、被験体における癌細胞の数を減らす、または被験体における全ての癌細胞をなくすことができる任意の薬剤であり得る。
【０４４１】
１５４．  治療に有効である
「治療に有効である」という用語は、使用される組成物の量が、ここに定義された被験体を治療するのに十分な量のものであることを意味する。
【０４４２】
１５５．  毒性
毒性は、物質または分子が、その物質または分子に曝露されている、細胞、組織、器官、または生物全体などの何かを損傷させられる程度である。例えば、肝臓、または肝臓中の細胞、肝細胞が、ある物質により損傷を受け得る。
【０４４３】
１５６．  毒性マーカー
毒性マーカーは、例えば、生物または細胞または組織または器官における、ある物質の毒性のレベルを特定する、診断する、予知するために使用できる、任意の試薬、分子、物質などである。
【０４４４】
１５７．  トランス活性化
「トランス活性化」は、細胞中のある受容体の活性化により、同じ細胞中の別の受容体も活性化できるプロセスを称する。そのようなトランス活性化は、直接的（すなわち、療法の受容体がダイマーまたはオリゴマーなどの複合体を形成し、よって、第１の受容体の活性化により、第２の受容体の構造変化が生じ、それにより、第２の受容体が活性化される）であっても、間接的（すなわち、２種類の受容体が必ずしも、シグナル伝達複合体内になくてもよい；しかしながら、第１の受容体の活性化が、経路内のシグナル伝達タンパク質が第２の受容体を活性化させる経路につながる）であっても差し支えない。
【０４４５】
１５８．  誘発する（Ｔｒｉｇｇｅｒ）
誘発するまたはこれに類する用語は、応答のような事象を開始または起動する動作を指す。
【０４４６】
１５９．  値（Ｖａｌｕｅｓ）
構成要素、成分、添加物、細胞タイプ、マーカーおよびこれらに類する局面と、これらの範囲とについて開示される具体的または好ましい値は、例示のためだけである。これらの値は、他の明示された値や明示された範囲内の他の値を排除するものではない。本開示の組成物、装置および方法は、本明細書に説明される値と、具体的な値と、より具体的な値と、好ましい値のうち、いずれかの値またはいずれかの組合せを有するものを含む。
【０４４７】
したがって、開示された方法、組成物、物品および機械は、本明細書に説明されるさまざまなステップ、分子、組成物その他これらに類するものを、含むか、からなるか、から実質的になるやり方で組み合わされる場合がある。例えば、これらは、本明細書で定義されるとおりのリガンドを含む分子を特徴づけるための方法か、本明細書で定義されるとおりのインデックスを作成する方法か、本明細書で定義されるとおりの薬物発見の方法かにおいて使用される場合がある。
【０４４８】
１６０．  未知分子
未知分子またはこれに類する用語は、既知または未知の化学構造を有し、未知の生物学的／薬理学的／生理学的／病理生理学的活性を有する分子である。
【０４４９】
１６１．  重量％
明細書および請求項における、組成物または物品中の特定の要素または構成要素の重量部への言及は、重量部が表現されている組成物または物品中の要素または構成要素と、任意の他の要素または構成要素との間の重量関係を意味する。それゆえ、２重量部の構成要素Ｘおよび５重量部の構成要素Ｙを含有する化合物において、ＸおよびＹは、２：５の重量比で存在し、追加の構成要素がその化合物中に含まれているか否かにかかわらずに、そのような比で存在する。
【０４５０】
構成要素の重量パーセントは、そうではないと具体的に述べられていない限り、その構成要素が含まれる配合物または組成物の総重量に基づく。
【実施例】
【０４５１】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がどのようになされ、評価されるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、純粋に典型例であって、本開示を制限することは意図されていない。数値（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確保するよう努力がなされているが、ある程度の誤差および偏差が考慮されべきである。他に明記されない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧であるかそれに近い。
【０４５２】
Ａ．実施例１
１．式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）および（ＶＩ）の化合物の調製
以下は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物の調製の例である。この実施例は純粋に典型例であって、本開示を制限することは意図されていない。
【化３９】
2013535448.tif 000041
【０４５３】
ｉ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［４'−ｎ−ブチルフェニル］−２，５−ジヒドロフラン
３−ヒドロキシ−３−［４'−ｎ−ブチルフェニル］−２−ブタノン１０．０ｇ（０．０４５５モル）、マロノニトリル６．０ｇ（０．０９１モル）、リチウムエトキシド２．３ｍｌ（２．３ミリモル）、およびＴＨＦ５０ｍｌを混合し、還流下で一晩沸騰させた。エタノール中で再結晶させることにより、純粋な生成物（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［４'−ｎ−ブチルフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量９．９５ｇ、収率６９．１％。融点：１２９．３〜１３０．５℃。1Ｈ ＮＭＲ：δ ７．２５９（ｄ，２Ｈ），７．１１２（ｄ，２Ｈ），２．６３８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2），２．２２５（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），１．９９７（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），１．６０−１．２８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2），０．９３１（ｔ，３Ｈ，ＣＨ3）。13Ｃ ＮＭＲ：１８２．４７６，１７５．７５３，１４５．８４１，１３１．０６９，１２９．６９２（２Ｃ），１２５．０７５（２Ｃ），１１０．９１４，１１０．４０６，１０９．０８８，１０４．７２８，１０１．７２４，５８．８３０，３５．２３６，３３．２７７，２２．３３５（２Ｃ），１４．５５８，１３．８７３。ＨＰＬＣ：１００％。
【０４５４】
ｉｉ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'，４'−ジフルオロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン
３−ヒドロキシ−３−［２'，４'−ジフルオロフェニル］−２−ブタノン８ｇ（０．０４モル）、マロノニトリル５．３ｇ（０．０８モル）、およびリチウムエトキシド２ｍｌ（２ミリモル）を５０ｍｌのＴＨＦ中で一晩還流した。終了後、エタノールから結晶化させることにより、純粋な生成物（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'，４'−ジフルオロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量４．５ｇ、収率３７．９％。融点：２１９．０〜２２１．４℃。1Ｈ ＮＭＲ：δ ７．４４１（ｄ，１Ｈ），７．０６６（ｄｄ，１Ｈ），６．９４５（ｄ，１Ｈ），２．２７４（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），２．０４１（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ）。19Ｆ ＮＭＲ：−１０４．８１（ｄ，１Ｆ），１０７．２９４（ｄ，１Ｆ）。ＨＰＬＣ：１００％。
【０４５５】
ｉｉｉ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−スピロ−シクロヘキシル−２，５−ジヒドロフラン
１−ヒドロキシ−１−シクロヘキシル−エタノン１４．２ｇ（０．１モル）、マロノニトリル１３．２ｇ（０．２モル）、ナトリウムエトキシド１００ｍｌ（０．１モル、１Ｍのエタノール溶液）およびエタノール１００ｍｌを混合し、室温で一晩反応させた。エタノール中で結晶化させることにより、純粋な生成物（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−スピロ−シクロヘキシル−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量１６．１ｇ、収率６７．５％。融点：２３６．５〜２３７．５℃。1Ｈ ＮＭＲ：δ ２．３３７（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），１．８６−１．７０（ｍ，１１Ｈ，ｒｉｎｇ）。13Ｃ ＮＭＲ：１８２．３８７，１７５．２３０，１１０．９８０，１１０．４５８，１０８．９９９，１０４．８８３，１０１．４３７，５８．５７２，３３．１２３（２Ｃ），２３．９１８，２１．２８９（２Ｃ），１４．４９９。ＨＰＬＣ：１００％。
【０４５６】
ｉｖ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−フェニル−５−ペルフルオロメチル−２，５−ジヒドロフラン
３−ヒドロキシ−３−フェニル−４，４，４−トリフルオロ−２−ブタノン１０．０ｇ（０．０４６モル）、マロノニトリル６．１ｇ（０．０９２モル）、リチウムエトキシド２．５ｍｌ（２．５ミリモル）およびＴＨＦ２０ｍｌを混合し、一晩還流させた。カラムクロマトグラフィ（１００％ジクロロメタン、シリカゲル、６０〜２００メッシュ）に通し、純粋な生成物（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−フェニル−５−ペルフルオロメチル−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量３．７５ｇ、収率２５．９％。融点：１３３〜１３５℃。1Ｈ ＮＭＲ：７．５７７−７．５４６（ｍ，３Ｈ，Ａｒ），７．４４４−７．４１０（ｍ，２Ｈ，Ａｒ），２．４７９（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ）。19Ｆ ＮＭＲ：−７２．８５２。13Ｃ ＮＭＲ：１７４．２２４，１７２．１４８，１３１．９０８，１３０．１９１，１２７．４６７，１２５．７４２，１２１．６８２，１０９．７９３，１０９．５１１，１０９．０９８，１０８．０９９，９８．５２１，６２．９３８，１５．４３９。ＧＣ／ＭＳ：３１７［Ｍ＋２］，２４７［Ｍ−ＣＦ3］。ＨＰＬＣ：１００％。
【０４５７】
ｖ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［３'，４'−ジクロロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン
３−ヒドロキシ−３−［３'，４'−ジクロロフェニル］−２−ブタノン１５ｇ（０．０６４モル）、マロノニトリル８．５ｇ（０．１２９モル）およびリチウムエトキシド３．２ｍｌ（３．２ミリモル、１Ｍのエタノール溶液）を８０ｍｌのＴＨＦ溶液中で攪拌し、還流条件下で一晩沸騰させた。真空吸引下、ロータリーエバポレーターでＴＨＦの大部分を除去することにより、溶液を濃縮した。残った残渣を塩化メチレン中に溶解させ、塩水（２×）、続いて脱イオン水（２×）で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を除去した。変性アルコールから粗生成物を再結晶化し、生成物（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［３'，４'−ジクロロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量５．５ｇ、収率２５．９％。融点：２２６．４〜２２８．６℃。1Ｈ ＮＭＲ：δ ７．５７９（ｄ，１Ｈ），７．３２４（ｄ，１Ｈ），７．０７０（ｄｄ，１Ｈ），２．２５４（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），２．００１（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ）。13Ｃ ＮＭＲ：１８０．２５３，１７５．０１５，１３５．６７６，１３４．６３０，１３４．３８２，１３１．９８２，１２７．５５２，１２４．５９５，１１０．５８０，１０９．９６６，１０８．８１０，１０５．８２２，１００．１０７，６０．５７３，２２．８９４，２２．８９４，１４．６３７。ＨＰＬＣ：１００％。
【０４５８】
ｖｉ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−スピロ−フルオレニリデン（fluorenylidine）−２，５−ジヒドロフラン
９−ヒドロキシ−９−アセチル−フルオレン５．０ｇ（０．０２２３モル）、マロノニトリル２．９４ｇ（０．０４４６モル）、無水炭酸カリウム３．１ｇ（０．０２２３モル）、１８−クラウン−６エーテル（触媒量）および乾燥ＴＨＦ５０ｍｌを混合し、一晩還流した。エタノールから結晶化することによって、純粋な生成物（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−スピロ−フルオレニリデン−２，５−ジヒドロフラン）を回収した。収量３．２２g、収率４５．０％。融点：３０２〜３０３℃。1Ｈ ＮＭＲ：δ ７．７６０（ｄ，２Ｈ），７．５６６（ｔ，２Ｈ），７．３９３（ｔ，２Ｈ），７．１８７（ｄ，２Ｈ），１．９３５（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ：１７７．５０４，１４０．４５９。ＨＰＬＣ：１００％。
【０４５９】
ｖｉｉ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５，５−トリメチル−２，５−ジヒドロフラン
スキーム１に従い、エタノール（１２０ｍＬ）溶媒中で、化合物ａ（１４．５９ｇ、１４２．９ミリモル）、マロノニトリル（２９．８７ｇ、４５２．２ミリモル）、およびマグネシウムエトキシド（１８．５ｇ、２ミリモル）を混合し、一晩還流させた。カラムクロマトグラフィの後、純粋な１０（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５，５−トリメチル−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量：８．３０ｇ。収率：２９％。1Ｈ ＮＭＲ：δ ２．３６（ｓ，３Ｈ），（１．６３（ｓ，３Ｈ）；ＧＣ−ＭＳ １９９。純粋な８（２−シアノ−２−（１−アミノ−２，２−ジシアノビニル）メチレン−３−シアノ−４，５，５−トリメチル−２，５−ジヒドロフラン）を副生成物として得た。ＧＣ−ＭＳ ２６５。
【化４０】
2013535448.tif 000042
【０４６０】
ｖｉｉｉ．２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'３'４'５'６'−ペンタフルオロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン
スキーム２に従い、化合物ｂ（１０．０ｇ、０．０４モル）、マロノニトリル（５．３ｇ、０．０８モル）、およびリチウムエトキシド（２ｍＬ、２ミリモル）をＴＨＦ（３０ｍＬ）中で混合し、一晩還流させた。カラムクロマトグラフィ（１００％ジクロロメタン、６０〜２００メッシュのシリカゲル）の後、純粋な９（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'３'４'５'６'−ペンタフルオロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）を得た。収量：２．７ｇ。収率：１９．２％。融点：１７５．５〜１７７．６℃。1Ｈ ＮＭＲ：δ ２．３４０（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），２．１２４（ｔ，３Ｈ，Ｍｅ，Ｆとのカップリング）。19Ｆ ＮＭＲ：−１３８．０４８（ｍ，２Ｆ），−１４８．０５８（ｍ，１Ｆ），−１５８．８９０（ｍ，２Ｆ）。13Ｃ ＮＭＲ：１７７．８９５，１７４．６５１，１４５．９９６（２Ｃ），１４３．００４，１３８．６０１（２Ｃ），１１０．３２７，１０９．８００，１０８．６１８，１０７．９９２，１０６．２７５，９７．５６７，６１．０４４，２４．９８６，１４．３６３。ＨＰＬＣによる純度，λ＝３００ｎｍ，１００％。
【化４１】
2013535448.tif 000043
【０４６１】
ｉｘ．チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸
スキーム３に従い、最初に、コンデンサと添加漏斗を装着した三口フラスコ中で、化合物ｃ（２７ｇ、０．１４１モル）をＫ2ＣＯ3（８２．８０ｇ、０．６０モル）およびＤＭＦ（３００ｍＬ）と混合した。この混合物にメルカプト酢酸エチル（１７．５ｇ、０．１４１モル）を６０〜７０℃で滴下して加えた。この混合物を、出発物質がＧＣ／ＭＳで検出されなくなるまで、６０〜７０℃で一晩加熱した。次に、混合物を水（６００ｍＬ）に注ぎ、ジエチルエーテル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を塩水（３×４００ｍｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、茶色がかった粗目的物を得て、次の反応に十分な純度であることを確認し（７１．０ｇ、１００％）、ＧＣ／ＭＳ ２１２の化合物ｄをもたらした。化合物ｄ（２９ｇ、０．１３７モル）を、ＴＨＦ（２００ｍＬ）、メタノールおよびＬｉＯＨ（１Ｍ、２００ｍＬ）の混合物に溶かした。この混合物を一晩還流させて、濃塩酸（５０ｍＬ）に注いだ。次に、その酸混合物を水で５００ｍＬまで希釈した。固体をろ過し、水で洗浄した（３×１００ｍＬ）。淡黄色の固体の化合物１１をメタノール（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で一晩乾燥させた（２１ｇ、８３％）。ＧＣ−ＭＳ １４０［Ｍ−ＣＯＯＨ］。
【化４２】
2013535448.tif 000044
【０４６２】
ｘ．３−メチル−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸
スキーム４に従い、コンデンサと添加漏斗を装着した三口フラスコ内で、化合物ｅ（１５．００ｇ、０．０７３モル）をＫ2ＣＯ3（４０．３０ｇ、０．２９モル）およびＤＭＦ（２００ｍＬ）と混合した。この混合物に、メルカプト酢酸エチル（９．０６ｇ、０．０７３モル）を６０〜７０℃で滴下して加えた。混合物を、出発物質がＧＣ／ＭＳで検出されなくなるまで、６０〜７０℃で一晩加熱した。次に、混合物を水（４００ｍＬ）に注ぎ、ジエチルエーテル（２×２００ｍｌ）で抽出した。有機層を塩水（３×１５０ｍｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、茶色がかった目的の粗化合物ｆ（１３．１０ｇ）を得、次の反応に十分な純度であることを確認した。化合物ｆ（１３．１０ｇ、０．０５７９モル）をＴＨＦ（１００ｍＬ）、メタノールおよびＬｉＯＨ（１Ｍ、１００ｍＬ）の混合物に溶かした。この混合物を一晩還流し、濃塩酸（３０ｍＬ）に注いだ。次に、この酸混合物を水で４００ｍＬに希釈した。固体をろ過し、水で洗浄した（３×１００ｍＬ）。淡黄色の固体の化合物１２をメタノール（２×３０ｍＬ）で洗浄し、真空下で一晩乾燥させた（９．７３ｇ）。ＧＣ−ＭＳ １５４［Ｍ−ＣＯＯＨ］。
【化４３】
2013535448.tif 000045
【０４６３】
ｘｉ．３，６−ジブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン２−ウンデカノン
スキーム５に従い、０℃において、ＣＨ2Ｃｌ2（７０ｍＬ）を溶媒とした、化合物ｇ（１２．４３ｇ、０．０４１７モル）とＡｌＣｌ3（１２．７８ｇ、０．０９５９モル）の混合物に、窒素流下で、ｎ−塩酸ウンデカノイル（１０．２５ｇ、０．０５００モル）を滴下して加えた。これを、少量の出発物質しかＧＣ／ＭＳで検出されなくなるまで、０℃で約１２時間攪拌した。次に、混合物をＨＣｌ（２００ｍＬ、６Ｍ）に注ぎ、有機物をヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機溶液を合わせて塩水（２×１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水ＭｇＳＯ4上で乾燥後、溶媒を蒸発させた。低融点の固体の化合物１５を回収し、これをＥｔＯＨから再結晶化して精製生成物を得た（１８．３２ｇ、９４％）。ＧＣ−ＭＳ ４６５［Ｍ＋］。
【化４４】
2013535448.tif 000046
【０４６４】
ｘｉｉ．ジエチルジチエノ［３，２−ｂ：２'，３'−ｄ］チオフェン−２，６−ジカルボキシレート
ジエチルジチエノ［３，２−ｂ：２'，３'−ｄ］チオフェン−２，６−ジカルボキシレートを、文献（Frey, Joseph; Bond, Andrew D.; Holmes, Andrew B.  Improved synthesis of dithieno[3,2-b:2',3'-d]thiophene (DTT) and derivatives for cross coupling.    Chemical Communications 2002, 20, 2424-2425）に従って合成した。
【０４６５】
ｘｉｉｉ．Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−［２−（チオフェン−２−イル）ビニル］アニリン
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−［２−（チオフェン−２−イル）ビニル］アニリンを、文献（欧州特許出願公開第６４７８７４号明細書。1995, Jen, K.-Y. A.; Drost, K. J. Preparation of polyimides having nonlinear optical properties.）に従って合成した。
【０４６６】
ｘｉｖ．４−｛［Ｎ−メチル，Ｎ−２−ヒドロキシエチル−アミノ］−フェニレン−チエン−５｝−ホルメート・リチウム塩
スキーム６に従い、Ｎ2保護下で、ヘキサンを溶媒としたｎ−ＢｕＬｉの溶液（８ｍＬ、２．５Ｍ）を、−７８℃で、ＴＨＦ（５０ｍＬ）を溶媒とした化合物ｈ（４．５８ｇ、０．０２０モル）の溶液に滴下して加えた。溶液は緑色に急速に変化した。添加後、この反応溶液を−１０℃までゆっくりと温め、次いで、再び−７８℃まで冷却した。数グラムのドライアイスを素早く加えた。濁った溶液が、黄色っぽい色に変化し、黄色の固体が形成された。次に、この混合物を室温まで温めた。次いで、この混合物に１０ｍｌの水を加えると、澄明な溶液が形成された。ＴＨＦ溶媒の大部分を蒸発させた後、残った濁った溶液中の固体を回収し、ＥＴＯＨから再結晶化することによって化合物２６を得た（２．５０ｇ）。２．５０ｇの乾燥した２６をＭｅＯＨ／Ｈ2ＳＯ4（濃）中で一晩還流させた。水を加えた後、ＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルを用いて所望の生成物２５を抽出した。ＥｔＯＨからの再結晶後、所望の生成物２５を得た（２．４０ｇ）。ＧＣ−ＭＳ ３１７。
【化４５】
2013535448.tif 000047
【０４６７】
ｘｖ．２，２'−ビチオフェン−５−カルボキサルデヒド（化合物３０）および２，２'−ビチオフェン−５−メタノール（化合物２７）
スキーム７に従い、Ｎ2保護下、ＴＨＦ（１００ｍＬ）を溶媒とした、化合物ｉ（４５ｇ、０．１８４モル）とＭｇ（４．４２ｇ、０．１８４モル）の混合物の溶液を数時間還流させた。数ｍｌのＤＭＦを添加し、得られた溶液を一晩攪拌した。反応後、氷水で冷却した塩酸水溶液を、この溶液が酸性になるまで加えた。酢酸エチル（２×１００ｍｌ）を用いて、この酸性水溶液から有機物を抽出した。この有機層をＮａＨＣＯ3水溶液および塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。酢酸エチルを蒸発させた後、残渣を５％酢酸エチル／９５％ヘキサン溶液と混合した。固体の熱ろ過を行った（ジアルデヒド）。ろ液を室温まで冷却し、化合物３０の結晶（３５．６ｇ、６４．６％）を得た。Ｎ2保護下、４．００ｇ（０．１０５モル）のＮａＢＨ4を、３０（４１g、０．２１１モル）のメタノール溶液に少しずつ加えた。この反応を一晩行った。ＭｅＯＨを除去して残渣を得、これを酢酸エチルに溶かした。この酢酸エチルを塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。酢酸エチル溶媒を除去して化合物２７を得た（３５．６ｇ、６４．６％）。1Ｈ ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳにより、的確な化合物であることを確認した。
【化４６】
2013535448.tif 000048
【０４６８】
ｘｖｉ．５−ヒドロキシメチル−５'−ホルミル−２，２'−ビチオフェン
５−ヒドロキシメチル−５'−ホルミル−２，２'−ビチオフェンを、文献（米国特許第５，５０８，４４０号明細書。Chang, C.T.; Lee, C.-T.; Lin, F.-L.  (Hydroxymethyl) polythiophene derivatives useful for preventing inflammation and edema. (1996)）に従って合成した。
【０４６９】
ｘｖｉｉ．５'−｛２−［４−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］フェニル］エテニル］｝−（２，２'−ビチオフェン）−５−ホルメート・ナトリウム塩
スキーム８に従い、Ｎ2保護下、ヘキサンを溶媒としたｎ−ＢｕＬｉの溶液（３．３ｍＬ、２．５Ｍ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）を溶媒とした化合物ｊ（１．００ｇ、２．７ミリモル）の溶液に、−７８℃で、滴下して加えた。添加後、この反応溶液を−１０℃までゆっくりと温め、再び−７８℃まで冷却した。数グラムのドライアイスを急速に加えた。濁った溶液は黄色っぽい色に変化し、黄色い固体を形成した。次に、この混合物を室温まで温めた。次いで１０ｍｌの水をこの混合物に加えると、澄明な溶液が形成された。この溶液に、３０ｍｌのＮａＨＣＯ3水溶液を加えた。ＴＨＦ溶媒の大部分を蒸発させた後、残った濁った溶液中の固体を回収し、ＥＴＯＨから再結晶化させて２９を得た（０．２０ｇ）。
【化４７】
2013535448.tif 000049
【０４７０】
ｘｖｉｉｉ．化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦの合成
これらの化合物を、スキーム９（チオフェン誘導体の一般的な合成戦略）に示すものと同様のプロトコルを用いて合成した。化合物Ａ（「ＹＥ２１０」）の詳細な合成手順を一例として用いた。高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を使用してすべての化合物を精製し、1Ｈ ＮＭＲと13Ｃ ＮＭＲの両方を用いて特徴付けした。
【化４８】
2013535448.tif 000050
【０４７１】
３，４−ジブロモチエニル−２−メチルケトン（４２）の合成
窒素流下、ＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍＬ）を溶媒とした、３，４−ジブロモチオフェン４１（７２．６０ｇ、０．３０モル）とＡｌＣｌ3（９２．４６ｇ、０．６９モル）の混合物の溶液に、０℃で、塩化アセチル（２４．７３ｇ、０．３２モル）を滴下して加えた。これを、出発物質がＧＣ／ＭＳで検出されなくなるまで、２〜３時間攪拌した。次に、混合物をＨＣｌ（５００ｍＬ、６Ｍ）に注ぎ、有機物を、ＣＨ2Ｃｌ2（２×３００ｍＬ）を用いて抽出した。有機溶液を合わせて、塩水（２×１５０ｍＬ）および水（１５０ｍＬ）で洗浄した。無水ＭｇＳＯ4上で乾燥後、溶媒を蒸発させた。低融点の固体を回収した。この固体は、さらなる精製をせずに使用するのに十分な純度であった（８０．８０ｇ、９５％）。融点：７５〜７８℃。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2 ）δ ７．６７（ｓ，１Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2 ）１８９．６，１４０．６，１３０．２，１１８．０，１１７．３，２９．７，ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ［Ｃ6Ｈ4Ｂｒ2ＯＳ］の計算値：２８１．８３００、実測値：２８２．９０００。
【０４７２】
６−ブロモ−３−メチル−エチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボキシレート（４８）の合成
化合物４２（８０．８０ｇ、０．２９モル）を、コンデンサと添加漏斗を装着した三口フラスコ内で、Ｋ2ＣＯ3（１９６．７０ｇ、１．４３モル）およびＤＭＦ（２５０ｍＬ）と混合した。この混合物に、６０〜７０℃で、メルカプト酢酸エチル（３２．８０ｍＬ、０．３０モル）を滴下して加えた。触媒量の１８−クラウン−６（２０ｍｇ）を触媒として使用した。混合物を、出発物質がＧＣ／ＭＳで検出されなくなるまで、６０〜７０℃で一晩加熱した。次に、この混合物を水（１０００ｍＬ）に注ぐと、淡黄色の固体が形成された。ろ過後、固体を水で洗浄し（３×５００ｍＬ）、ろ過した。回収した固体をメタノール（３００ｍＬ）で洗浄し、次の反応に十分な純度であることを確認した（７８．４０ｇ、９０％）。融点：９１〜９２℃。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ ７．４８（ｓ，１Ｈ），４．３６（ｑ，２Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），１．３８（ｔ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2 ）１５９．４，１３７．９，１３７．６，１３５．１，１２５．７，１２４．２，９９．７，５７．８，１１．１，１０．７。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ［Ｃ10Ｈ9ＢｒＯ2Ｓ2］の計算値：３０３．９２００、実測値：３０３．３０００。
【０４７３】
６−ブロモ−３−メチル−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸（Ａ）の合成
化合物４８（７８．４０ｇ、０．２６モル）をＴＨＦ（４００ｍＬ）、メタノール（５０ｍＬ）およびＬｉＯＨ（１００ｍＬ、１０％溶液）の混合液に溶かした。この混合液を一晩還流し、濃塩酸（３００ｍＬ）に注いだ。次にこの酸混合液を水で１０００ｍＬに希釈した。固体をろ過し、水で洗浄した（３×５００ｍＬ）。淡黄色の固体をメタノール（３００ｍＬ）で洗浄し、真空下で一晩乾燥させた（６８．１０ｇ，９６％）。融点２８０〜２８２℃。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ８．０８（ｓ，１Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１６３．６，１４０．７，１４０．１，１３７．７，１２９．７，１２９．２，１０２．１，１４．２。ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ ［Ｃ8Ｈ5ＢｒＯ2Ｓ2−Ｈ2Ｏ ＋Ｈ］の計算値：２５８．８８８７、実測値：２５８．８８８３。
【０４７４】
２．  材料および方法
ｉ．  材料
ザプリナストは、ＢｉｏＭｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州、プリマスミーティング所在）から得た。細胞培養に適合したＥｐｉｃ（登録商標）３８４バイオセンサーマイクロプレートは、コーニング社（ニューヨーク州、コーニング所在）から得た。ＨＥＫ２９３およびＨＴ−２９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（バージニア州、マナッサス所在）から得た。細胞培養培地は以下のとおりであった：（１）１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、およびＨＥＫ２９３の抗生物質が補われたイーグル培地（ＭＥＭ）；および（２）１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、およびヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９の抗生物質が補われたマッコイ５Ａ改変培地。
【０４７５】
ｉｉ．  カルシウムフラックスアッセイ
Ｆｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（スターターパック、カタログ番号Ｆ１０４７１）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞（１５０００細胞／ウェル）およびＨＴ２９細胞（３００００細胞／ウェル）を、ポリＤ−リシン被覆３８４ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号３８４５）に播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、Ｃａ2+フラックスアッセイを、製造業者の使用説明書にしたがって行い、蛍光比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）をＦＤＳＳ（創薬スクリーニングシステム、浜松ホトニクス株式会社、日本国）で測定した。化合物を、Ｃａ2+アッセイ緩衝液中で１０倍株（最終濃度１０μＭ）として調製した。
【０４７６】
９６ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号３６６４）内で、一過性トランスフェクションされた細胞に関するＣａ2+フラックスアッセイを行った。ＨＥＫ２９３細胞（２５０００細胞／ウェル）を１日目に播種した。細胞を２日目に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｍｙｃ−ＧＰＲ３５またはＨＡ−Ｇqo5いずれかでトランスフェクションしたか、または両方のプラスミド（ｍｙｃ−ＧＰＲ３５／ＨＡ−Ｇqo5のＤＮＡ比２：１）で同時トランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、Ｃａ2+フラックスアッセイを行った。
【０４７７】
ｉｉｉ．  ＨＡ−Ｇqo5プラスミドのクローニング
ヒトＧqｃＤＮＡプラスミドをＭｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（www.cDNA.org）から購入した。ＨＡ−タグを、ＰＣＲによりヒトＧqｃＤＮＡのＮ末端に挿入した（J. Takasaki, T. Saito, M. Taniguchi, T. Kawasaki, Y. Moritani, K. Hayashi and M. Kobori (2004) A Novel Gaq/11-selective Inhibitor. J. Biol. Chem. 279: 47438-47445）。最後の５つのアミノ酸を、ＰＣＴによりＧＣＧＬＹと交換して、ＨＡ−Ｇqo5プラスミドを作製した（B. R. Conklin, Z. Farfel, K. D. Lustig, D. Julius, and H. R. Bourne (1993) Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq to that of Gi. Nature 1993, 363: 274-276）。次いで、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にこのＧqo5ｃＤＮＡをサブクローニングした。
【０４７８】
ｉｖ．  ＨＴ２９細胞およびトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を使用したウェスタンブロット
ＨＴ２９細胞（サンプル当たり１０7の細胞）を収穫し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％のＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、１％のＮＰ４０、ｐＨ７．５）中で溶解させた。タンパク質を１５％ＳＤＳゲル上で分離した。膜を、一晩４℃でウサギ抗−ＧＰＲ３５（１：１０００）（Ａｂｃａｍ、Ａｂ７６２１７）でブロットし、次いで、３０分間に亘り、二次ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギまたはウマ抗ヤギ抗体（１：２００００で希釈）でブロットした。Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ニューヨーク州、バルハラ所在）でＥＣＬプラスキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェスタンブロットを展開させた。
【０４７９】
ｖ．  ｃＡＭＰアッセイ
３８４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号３５４６６０）（ＨＥＫ２９３については１００００細胞／ウェル、ＨＴ２９については２００００細胞／ウェル）内に細胞を平板培養した。細胞を一晩、完全増殖培地内で培養した。翌日、製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ１５０２）にしたがって、ｃＡＭＰ−Ｇｌｏアッセイを行った。細胞を、溶解緩衝液を添加する前に、３０分間に亘り、０．５μＭまたは５μＭのフォルスコリンを含む誘導緩衝液または含まない誘導緩衝液中で２０μＭの化合物と共にインキュベーションした。Ｔｅｃａｎ  ＳａｆｉｒｅＩＩリーダーを使用して、蛍光を測定した。
【０４８０】
ｖｉ．  免疫蛍光共焦点イメージング
ＨＴ２９細胞を８ウェルチャンバースライド（１０，０００細胞／ウェル）上で平板培養し、２４時間に亘り３７℃でインキュベーションした。翌日、細胞を１５分間に亘り１×ＰＢＳ内の４％ホルムアルデヒドで固定し、その後、１×ＰＢＳ中に４％のヤギ血清、０．１％のＢＳＡ、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する緩衝液中で２時間に亘りブロッキングし、透過化処理した。ＰＢＳによる５分間の洗浄後、固定細胞を、２４時間に亘り３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において一次抗体抗−ＧＰＲ３５（Ａｂｃａｍ）（１：３００）と共にインキュベーションし、その後、室温で１時間に亘り３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２５０）と共にインキュベーションした。最後に、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、１．５ｍｍの厚いガラスカバースリップで密封した。イメージングまで、乾燥させたスライドを４℃で貯蔵した。共焦点イメージングは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０で行った。ＧＰＲ３５内在化研究については、細胞を２４時間に亘り３７℃でインキュベーションした後、その細胞を、固定する前に、１時間に亘り３７℃でＧＰＲ３５の異なるリガンドで処理した（ザプリナスト、１０μＭ；ニフルム酸、２０μＭ；６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸、２０μＭ；タルニフルメート、２０μＭ；ジクロフェナク、２０μＭ；フロセミド、２０μＭ）。ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（http://www.macbiophotonics.ca/downloads.htm）を使用して、共焦点画像を解析した。
【０４８１】
ｖｉｉ．  その場での「Ｅｐｉｃ」プレート上でのＧＰＲ３５のＲＮＡｉノックダウン
ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５ノックダウンを、ヒトＧＰＲ３５ｍＲＮＡを標的とした一過性トランスフェクションされた小ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡにより、３８４ウェル「Ｅｐｉｃ」プレート上で行った。ＨＴ２９細胞を１日目に２０，０００細胞／ウェルで播種した。２日目に、細胞を、製造業者の使用説明書にしたがって、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＧＰＲ３５を標的とするプラスミドＤＮＡｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳ−ｓｈＲＮＡで一過性トランスフェクションした。細胞を３日目に洗浄し、トランスフェクションの４８時間後である４日目に、「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイを行った。
【０４８２】
ｖｉｉｉ．  光学バイオセンサーシステムおよび細胞アッセイ（ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ）
全細胞検出に、「Ｅｐｉｃ」ベータ版の波長検波システム（コーニング社、ニューヨーク州、コーニング）を使用した。このシステムは、温度制御ユニット、光学検出ユニット、およびロボット式搭載型液体取扱ユニットからなる。この検出ユニットは、集積光ファイバに重点を置き、約１５秒の間隔で細胞応答の速度測定が可能である。また、「Ｅｐｉｃ」リーダーシステムに液体取扱アクセサリが取り付けられた、「Ｅｐｉｃ」工業システムも使用した。
【０４８３】
ＲＷＧバイオセンサーは、センサー表面近くの局所屈折率の微小変化を検出することができる。細胞内の局所屈折率は、生物量（例えば、タンパク質、分子複合体）の密度とその分布の関数であるので、バイオセンサーは、天然細胞におけるリガンド誘発動的質量再配分を非侵襲的に検出するためにエバネッセント波を利用する。エバネッセント波は、細胞中に達し、距離で指数関数的に減少し、約１５０ｎｍの特徴的な検出容積をもたらし、受容体活性化を通じて媒介される光学応答が、エバネッセント波がサンプリングされている細胞の部分について平均を表すだけであることを示す。受容体活性化の下流の多くの細胞事象の合算が、リガンド誘発ＤＭＲの反応速度と振幅を決定する。
【０４８４】
バイオセンサー細胞アッセイについて、細胞は、概して、バイオセンサーマイクロプレート中の５０μｌの対応する培養培地中に懸濁された３から１５継代でウェル当たり約１から２×１０4の細胞を使用して増殖させ、約１日に亘り空気／５％のＣＯ2下３７℃で培養した。アッセイの時点で全ての細胞の培養密度は約９５％から１００％であった。分子溶液を、貯蔵した濃縮溶液をＨＢＳＳ（１×ハンクス平衡塩溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１を添加）で希釈することにより調製し、３８４ウェルのポリプロピレン分子貯蔵プレートに移して、分子源プレートを調製した。二段階アッセイを行う場合、分子源プレートとマーカー源プレートの両方を別々に作製した。並行して、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、３０μｌのＨＢＳＳ中に保持して、細胞アッセイプレートを調製した。次いで、細胞アッセイプレートおよび分子源プレートとマーカー源プレートの両方を前記リーダーシステムの槽内でインキュベーションした。約１時間のインキュベーション後、細胞アッセイマイクロプレート中の全てのバイオセンサーのベースライン波長を記録し、ゼロに正規化した。その後、ベースラインを確立し、細胞が定常状態に到達したことを確実にするために、２から１０分間の連続記録を行った。次いで、搭載型液体取扱機を使用して、１０μｌのマーカー溶液をピペットで細胞アッセイプレートに採取することによって、細胞応答を誘発させた。
【０４８５】
分子のマーカー誘発応答への影響を研究するために、所定の用量（一般にＥＣ８０またはＥＣ１００）でのマーカーによる二次刺激を適用した。二次刺激の直前に、マイクロプレート中の全てのバイオセンサーの共鳴波長を再び正規化して、第２のベースラインを確立した。２つの刺激は、通常、約１時間隔てた。
【０４８６】
全ての研究は、制御温度（２８℃）で行った。各々が少なくとも３回反復した、少なくとも２つの独立した組の実験を行った。アッセイの変動係数が１０％未満であることが分かった。
【０４８７】
３．  結果
ｉ．  ＨＴ２９細胞中のＧＰＲ３５の発現および位置
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞表面タンパク質の最大の群の１つを構成し、現行の治療薬および開発中の薬物の両方の主要標的を表す。多くのｃＤＮＡクローンは、確立されたＧＰＣＲに対して、特に膜貫通領域において、特に高い配列類似性に基づいてＧＰＣＲをコードすることが予測される。そのようなオーファンＧＰＣＲについて、アゴニスト、アンタゴニスト、および情報伝達経路の特定は、新薬標的の発見のための業界による主要な努力を表す。ヒトゲノムＤＮＡスクリーニング中に最初に発見されたオーファンＧＰＣＲであるＧＰＲ３５は、プリン作動性Ｐ２Ｙ受容体、ニコチン酸受容体ＨＭ７４、リゾホスファチジン酸受容体ＧＰＲ２３、およびオーファン受容体であるＧＰＲ５５との配列相同性が限られている。最高レベルのＧＰＲ３５ｍＲＮＡが免疫組織および胃腸組織で見つかり、肺組織と神経組織では発現が限られていた。ＧＰＲ３５の初期の記述後に（今ではＧＰＲ３５ａと示される）、オクムラ等(2004)は、Ｎ末端で追加の３１のアミノ酸をコードしたヒト胃癌ｃＤＮＡライブラリからスプライスバリアント（ＧＰＲ３５ｂ）を単離した（Okumura, S., Baba, H., Kumada, T., Nanmoku, K., Nakajima, H., Nakane, Y., Hioki, K., and Ikenaka, K. (2004) Cloning of a G-protein-coupled receptor that shows an activity to transform NIH3T3 cells and is expressed in gastric cancer cells. Cancer Sci, 95: 131-135）。ＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂのｍＲＮＡレベルは、胃癌組織中で発現上昇され、悪性転換における両方のスプライスバリアントの役割を示唆した。しかしながら、ヒト結腸癌細胞におけるＧＰＲ３５の発現は調査されていなかった。
【０４８８】
ＳＡ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＧＰＲ３５プライマーを使用したリアルタイムＰＣＲは、ＨＴ２９は、少なくともｍＲＮＡレベルで、比較的高いレベルのＧＰＲ３５を発現することを示した。その後のウェスタンブロッティングは、ＨＴ２９溶解産物が、その分子量が、それぞれ、ＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂの両方の予測値に近いＧＰＲ３５アイソフォームを含有することを示した（図１ａ）。ＨＴ２９はヒト結腸腺癌ＩＩ型細胞株である。共焦点像は、ＧＰＲ３５が細胞表面原形質膜に主に位置していることをさらに示した（図１ｂ）。面白いことに、抗ＧＰＲ３５抗体を使用したＧＰＲ３５の染色パターンは、細胞表面で均一に分布する代わりに、あるマイクロドメイン内、ことによると脂質ラフト内に主に位置するおよび／または他の受容体と複合体を形成することを示唆している。それにもかかわらず、これらの結果は、ＨＴ２９は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方で、比較的高いレベルのＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂを発現し；ＧＰＲ３５は、細胞表面に主に位置していることを示唆している。
【０４８９】
ｉｉ．  既知ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストにより生じたＨＴ２９中のＧＰＲ３５のＤＭＲシグナルおよび受容体の内在化
全てのＧＰＣＲにほぼ共通するのは、アゴニスト誘発受容体内在化プロセスである。それゆえ、既知ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストの受容体内在化を生じる能力を最初に調査した。ザプリナストは、既知ｃＧＭＰ依存性ホスホジエステラーゼ阻害剤でもある。図２Ａに示されるように、ザプリナストによる刺激の３０分後のＨＴ２９細胞の共焦点像からも明らかなように、ザプリナストは１０マイクロモル濃度で、実際に、受容体の内在化を生じた。緑色のドットは、受容体が内在化され、エンドソーム粒子と結合していることを示すのに対し、青色のドットは核ＤＡＰＩ染色を示す。
【０４９０】
Ｃａ2+動員アッセイを使用すると、いくつかの研究は、ザプリナスト、ＬＰＡ、ＮＰＰＢおよびキヌレン酸を含む、いくかの既知ＧＰＲ３５アゴニストは、ＧＰＲ３５のみを発現する遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞においてＣａ2+動員を誘発できなく、これらのアゴニストが、ロバストなＧａ2+シグナルを誘発するためには、ＧＰＲ３５およびＧqo5の同時発現が必要であることを示唆している。ここで、Ｆｌｕｏ−４Ｃａ2+アッセイを使用して、ＨＴ２９細胞を調査した。結果は、ザプリナストは、ＨＴ２９細胞において著しいＣａ2+動員を誘発できなかったことを示した（図４Ａ）。
【０４９１】
光学バイオセンサーは主に、細胞応答を特徴付けるために表面に結合した電磁波を利用するので、結果として生じた、ＤＭＲ（動的質量再配分）とも称される光信号は統合応答であり、経路感受性であるが経路不偏である性質の受容体を通じて媒介される細胞シグナル伝達を反映している。それゆえ、ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５シグナル伝達のアッセイを行った。その結果は、ザプリナストがＨＴ２９細胞において用量依存性で飽和可能ＤＭＲシグナルを誘発したことを示した（図２Ｂおよび２Ｃ）。Ｐ−ＤＭＲ事象を生じるＥＣ50が、１３７ｎＭであることが分かった。ＲＮＡｉノックダウンを使用した追跡研究は、ＧＰＲ３５ノックダウンがザプリナストＤＭＲシグナルをある程度抑制したので（データは図示せず）、ザプリナストＤＭＲシグナルがＧＰＲ３５に特異的であることを示唆する。これらの結果は、ザプリナストは、ＨＴ２９において外因性ＧＰＲ３５のアゴニストとして機能し、受容体の内在化および飽和可能なＤＭＲシグナルを生じられることを示唆する。しかしながら、ザプリナストは、ＧＰＲ３５ａ、ＧＰＲ３５ｂ、またはその両方に特異的であることは不明である。
【０４９２】
予測されるように、遺伝子操作したＨＥＫ２９３細胞において、ザプリナストは、Ｇqo5またはＧＰＲ３５のみを発現する細胞において、明白なＣａ2+動員シグナルを生じることができなかったが、ＧＰＲ３５およびＧqo5を同時発現する細胞において、極めて明白なＣａ2+シグナルを誘発した。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、ザプリナストが実際にＧＰＲ３５アゴニストであることを示唆する。
【０４９３】
ｉｉｉ．  「Ｅｐｉｃ」システムを使用した化合物ライブラリスクリーニング
「Ｅｐｉｃ」システムは、ＨＴ２９細胞中でザプリナストＤＭＲシグナルを検出できることが分かり、ザプリナストはＧＰＲ３５に関連しているので、化合物ライブラリをスクリーニングする上で、ＨＴ２９「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイを使用することが興味深いであろう。化合物誘発ＤＭＲシグナルとザプリナストＤＭＲシグナルとの間の類似性に基づいて、式（Ｉ）から（ＶＩ）に示された全ての化合物を含む多数の潜在的なＧＰＲ３５アゴニストを発見した。図６Ａは、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸が１０マイクロモル濃度で、ザプリナストＤＭＲシグナルとほとんど同一のＤＭＲシグナルを生じた実施例を示したのに対し、図６Ｃは、化合物の関数として、刺激の５分後の各化合物により誘発されたＤＭＲシグナルの振幅に基づいて計算したＤＭＲシグナルを示した。これらの結果は、多くの化合物が、振幅が５０ｐｍより大きい、ザプリナストまたはＹＥ２１０誘発ＤＭＲシグナルいずれかと類似のＤＭＲシグナルを誘発したことを示した（図６Ｃ）。アゴニズム活性を示したこれらの化合物のほとんど全てが、ザプリナストによる連続刺激に応答してＨＴ２９細胞の脱感作を生じられることも分かり（一例が、図６ＢおよびＤに示されている）、これの化合物がＧＰＲ３５特異的アゴニストとして働くことを示唆する。
【０４９４】
ｉｖ．  本開示としての式（Ｉ）から（ＶＩ）の化合物の代表的な化合物はＧＰＲ３５アゴニストである
「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイスクリーニングにより同定されたこれらの化合物をさらに特徴付けるために、いくつかのアッセイを使用した。一例が図３に要約されている。共焦点像は、ザプリナストと同様に、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸が受容体の内在化を生じたことを示したが（図３Ｂ）、細胞表面にはいくらかのＧＰＲ３５受容体が残っている（図３Ａ）。６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸は、１６５ｎＭのＥＣ50で、用量依存性の飽和可能なＤＭＲシグナルも誘発した（図３Ｃおよび図３Ｄ）。ＲＮＡｉノックダウン研究も、ＧＰＲ３５のＲＮＡｉノックダウンにより、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸のＤＭＲシグナルがある程度減衰されたことを示した。遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞において、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸がザプリナストと同様に挙動することが分かった−６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸は、Ｇqo5またはＧＰＲ３５のみを発現する細胞において、明白なＣａ2+動員シグナルを生じることができなかったが、ＧＰＲ３５およびＧqo5を同時発現する細胞において、極めて明白なＣａ2+シグナルを誘発した（図５Ｃ）。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸も潜在的なＧＰＲ３５アゴニストとして働くことを示唆する。
【０４９５】
ｖ．  ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５シグナル伝達はＧ12/13−ＲＯＣＫ経路に関連している
ＧＰＲ３５のシグナル伝達経路は、特にＨＴ２９細胞において、現在、大部分は未知である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞などの遺伝子操作された細胞において、受容体のみが発現された場合、発現されたＧＰＲ３５が、Ｃａ2+動員を誘発できないことが分かった。受容体が一度活性化されたら、Ｃａ2+動員を生じるためには、ＧＰＲ３５および雑多な(promiscuous)Ｇタンパク質（Ｇqo5）の両方による細胞の同時トランスフェクションが必要であることが分かった。天然のＨＴ２９細胞において、ザプリナストまたは６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸によるＧＰＲ３５の活性化は、検出可能なＣａ2+シグナルを生じられないことも分かった（図４Ａ）。同じことが、Ｇqo5またはＧＰＲ３５のみを発現する遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞においても当てはまった（図５）。
【０４９６】
面白いことに、「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイは、ザプリナストＤＭＲシグナルは、ホスホリパーゼＣ阻害剤Ｕ７３１２２、またはコレラ毒素（ＣＴＸ）、または百日咳毒素（ＰＴＸ）いずれかによるＨＴ２９細胞の前処理に無感応であることも示した（それぞれ、図４Ｂ〜Ｄ）。ＰＬＣは、Ｇq経路の下流であるが、Ｃａ2+動員の上流の標的である；Ｕ７３１２２によりザプリナストＤＭＲシグナルを調節できないことは、ザプリナストシグナルが大部分はＧq経路によるものではないことを示唆する。ＣＴＸは、Ｇsシグナル伝達経路を絶つことが知られている；ＣＴＸがザプリナストＤＭＲシグナルを減衰できないことは、ザプリナストシグナルがＧs経路によるものではないことを示唆する。ザプリナストも、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸も、Ｇs経路の従来のセカンドメッセンジャー読出しである細胞内ｃＡＭＰ濃度の増加を生じられなかったという観察が一致した。同様に、Ｇi経路キラーＰＴＸも、ザプリナストＤＭＲにほとんど影響がなかった。ザプリナストも、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸も、Ｇiシグナル伝達の従来のセカンドメッセンジャー読出しである、フォルスコリン同時刺激ＨＴ２９細胞における細胞内ｃＡＭＰ濃度の抑制を生じられなかったという観察も、このことに矛盾しない。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、ＧＰＲ３５が、特別な経路を通じてシグナル伝達を媒介することを示唆する。
【０４９７】
面白いことに、アクチンフィラメント破壊剤であるサイトカラシンＤが、ザプリナストＤＭＲシグナルを完全に遮断できることが分かり、ＲＯＣＫ阻害剤のＹ２７６３２がザプリナストシグナルをある程度減衰させた（図４Ｅおよび図４Ｆ）。これらの結果は、ＧＰＲ３５が、Ｇ12/13−ＲＯＣＫ経路を通じて、シグナル伝達を優先的に媒介するであろうことを示唆する。
【０４９８】
同様に、本開示により発見されたＧＰＲ３５アゴニストである６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸も、ＨＴ２９細胞においてＣａ2+シグナルを生じられないことも分かった。ＨＴ２９中の６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸ＤＭＲは、ＰＣＬ素材剤Ｕ７３１２２、ＣＴＸ、またはＰＴＸに対して無感応であることが分かった。しかしながら、６−ブロモ−３−メチルチエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸ＤＭＲは、サイトカラシンＤにより遮断され、Ｙ２７６３２によってある程度減衰された。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、ＧＰＲ３５が、主にＧ12/13−ＲＯＣＫ経路を通じて、シグナル伝達を媒介することを示唆する。
【０４９９】
Ｂ．  実施例２
１．  材料および方法
ｉ．  材料
ザプリナストは、ＢｉｏＭｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州、プリマスミーティング所在）から得た。細胞培養に適合した「Ｅｐｉｃ」３８４バイオセンサーマイクロプレートは、コーニング社（ニューヨーク州、コーニング所在）から得た。
【０５００】
ＨＥＫ２９３細胞およびＨＴ−２９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（バージニア州、マナッサス所在）から得た。細胞培養培地は以下のとおりであった：（１）１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、およびＨＥＫ２９３の抗生物質が補われたイーグル培地（ＭＥＭ）；および（２）１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、およびヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９の抗生物質が補われたマッコイ５Ａ改変培地。
【０５０１】
ＨＥＫ  ｈＥＲＧ安定細胞株（ＨＥＫ−ｈＥＲＧ）およびＣＨＯ  ｈＥＲＧ安定細胞株（ＣＨＯ−ｈＥＲＧ）の両方とも、Ｓｕｎ等（J. Biol. Chem. 2006, 281:5877）にしたがって維持した。細胞を、毎週１〜２回、継代培養し、１５回未満で継代培養された細胞を全ての実験に使用した。
【０５０２】
ｉｉ．  カルシウムフラックスアッセイ
「Ｆｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔ」Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（スターターパック、カタログ番号Ｆ１０４７１）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞（１５０００細胞／ウェル）およびＨＴ２９細胞（３００００細胞／ウェル）をポリＤ−リシン被覆３８４ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号３８４５）に播種し、その細胞を３７℃で一晩培養した。翌日、Ｃａ2+フラックスアッセイを、製造業者の使用説明書にしたがって行い、蛍光比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）をＦＤＳＳ（創薬スクリーニングシステム、浜松ホトニクス株式会社、日本国）で測定した。化合物を、Ｃａ2+アッセイ緩衝液中で１０倍株（最終濃度１０μＭ）として調製した。
【０５０３】
９６ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号３６６４）内で、一過性トランスフェクションされた細胞に関するＣａ2+フラックスアッセイを行った。ＨＥＫ２９３細胞（２５０００細胞／ウェル）を１日目に播種した。細胞を２日目に、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｍｙｃ−ＧＰＲ３５またはＨＡ−Ｇqo5いずれかでトランスフェクションしたか、または両方のプラスミド（ｍｙｃ−ＧＰＲ３５／ＨＡ−Ｇqo5のＤＮＡ比２：１）で同時トランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、Ｃａ2+フラックスアッセイを行った。
【０５０４】
ｉｉｉ．  ＨＡ−Ｇqo5プラスミドのクローニング
ヒトＧqｃＤＮＡプラスミドをＭｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（www.cDNA.org）から購入した。ＨＡ−タグを、ＰＣＲによりヒトＧqｃＤＮＡのＮ末端に挿入した（J. Takasaki, T. Saito, M. Taniguchi, T. Kawasaki, Y. Moritani, K. Hayashi and M. Kobori (2004) A Novel Gaq/11-selective Inhibitor. J. Biol. Chem. 279: 47438-47445）。最後の５つのアミノ酸を、ＰＣＴによりＧＣＧＬＹと交換して、ＨＡ−Ｇqo5プラスミドを作製した（B. R. Conklin, Z. Farfel, K. D. Lustig, D. Julius, and H. R. Bourne (1993) Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq to that of Gi. Nature 1993, 363: 274-276）。次いで、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にこのＧqo5ｃＤＮＡをサブクローニングした。
【０５０５】
ｉｖ．  ＨＴ２９細胞およびトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を使用したウェスタンブロット
ＨＴ２９細胞（サンプル当たり１０7の細胞）を収穫し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％のＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、１％のＮＰ４０、ｐＨ７．５）中で溶解させた。タンパク質を１５％ＳＤＳゲル上で分離した。膜を、一晩４℃でウサギ抗−ＧＰＲ３５（１：１０００）（Ａｂｃａｍ、Ａｂ７６２１７）でブロットし、次いで、３０分間に亘り、二次抗体である、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギまたはウマ抗ヤギ抗体（１：２００００で希釈）でブロットした。Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ニューヨーク州、バルハラ所在）でＥＣＬプラスキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェスタンブロットを展開させた。
【０５０６】
ｖ．  ｃＡＭＰアッセイ
３８４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号３５４６６０）（ＨＥＫ２９３については１００００細胞／ウェル、ＨＴ２９については２００００細胞／ウェル）内に細胞を平板培養した。細胞を一晩、完全増殖培地内で培養した。翌日、製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ１５０２）にしたがって、ｃＡＭＰ−Ｇｌｏアッセイを行った。細胞を、溶解緩衝液を添加する前に、３０分間に亘り、０．５μＭまたは５μＭのフォルスコリンを含む誘導緩衝液または含まない誘導緩衝液中で２０μＭの化合物と共にインキュベーションした。Ｔｅｃａｎ  ＳａｆｉｒｅＩＩリーダーを使用して、蛍光を測定した。
【０５０７】
ｖｉ．  免疫蛍光共焦点イメージング
ＨＴ２９細胞を８ウェルチャンバースライド（１０，０００細胞／ウェル）上で平板培養し、２４時間に亘り３７℃でインキュベーションした。翌日、細胞を１５分間に亘り１×ＰＢＳ内の４％ホルムアルデヒドで固定し、その後、１×ＰＢＳ中に４％のヤギ血清、０．１％のＢＳＡ、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する緩衝液中で２時間に亘りブロッキングし、透過化処理した。ＰＢＳによる５分間の洗浄後、固定細胞を、２４時間に亘り３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において一次抗体抗−ＧＰＲ３５（Ａｂｃａｍ）（１：３００）と共にインキュベーションし、その後、室温で１時間に亘り３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２５０）と共にインキュベーションした。最後に、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、１．５ｍｍの厚いガラスカバースリップで密封した。イメージングまで、乾燥させたスライドを４℃で貯蔵した。共焦点イメージングは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０で行った。ＧＰＲ３５内在化研究については、細胞を２４時間に亘り３７℃でインキュベーションした後、その細胞を、固定する前に、１時間に亘り３７℃でＧＰＲ３５の異なるリガンドで処理した（ザプリナスト、１０μＭ；ニフルム酸、２０μＭ；ＹＥ２１０、２０μＭ；タルニフルメート、２０μＭ；ジクロフェナク、２０μＭ；フロセミド、２０μＭ）。ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（http://www.macbiophotonics.ca/downloads.htm）を使用して、共焦点画像を解析した。
【０５０８】
ｖｉｉ．  その場での「Ｅｐｉｃ」プレート上でのＧＰＲ３５のＲＮＡｉノックダウン
ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５ノックダウンを、ヒトＧＰＲ３５ｍＲＮＡを標的とした一過性トランスフェクションされた小ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡにより、３８４ウェル「Ｅｐｉｃ」プレート上で行った。ＨＴ２９細胞を１日目に２０，０００細胞／ウェルで播種した。２日目に、細胞を、製造業者の使用説明書にしたがって、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＧＰＲ３５を標的とするプラスミドＤＮＡｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳ−ｓｈＲＮＡで一過性トランスフェクションした。細胞を３日目に洗浄し、トランスフェクションの４８時間後である４日目に、「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイを行った。
【０５０９】
ｖｉｉｉ．  光学バイオセンサーシステムおよび細胞アッセイ（ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ）
全細胞検出に、「Ｅｐｉｃ」ベータ版の波長検波システム（コーニング社、ニューヨーク州、コーニング）を使用した。このシステムは、温度制御ユニット、光学検出ユニット、およびロボット式搭載型液体取扱ユニットからなる。この検出ユニットは、集積光ファイバに重点を置き、約１５秒の間隔で細胞応答の速度測定が可能である。また、「Ｅｐｉｃ」リーダーシステムに液体取扱アクセサリが取り付けられた、「Ｅｐｉｃ」工業システムも使用した。
【０５１０】
ＲＷＧバイオセンサーは、センサー表面近くの局所屈折率の微小変化を検出することができる。細胞内の局所屈折率は、生物量（例えば、タンパク質、分子複合体）の密度とその分布の関数であるので、バイオセンサーは、天然細胞におけるリガンド誘発動的質量再配分を非侵襲的に検出するためにエバネッセント波を利用する。エバネッセント波は、細胞中に達し、距離で指数関数的に減少し、約１５０ｎｍの特徴的な検出容積をもたらし、受容体活性化を通じて媒介される光学応答が、エバネッセント波がサンプリングされている細胞の部分について平均を表すだけであることを示す。受容体活性化の下流の多くの細胞事象の合算が、リガンド誘発ＤＭＲの反応速度と振幅を決定する。
【０５１１】
バイオセンサー細胞アッセイについて、細胞は、概して、バイオセンサーマイクロプレート中の５０μｌの対応する培養培地中に懸濁された３から１５継代でウェル当たり約１から２×１０4の細胞を使用して増殖させ、約１日に亘り空気／５％のＣＯ2下３７℃で培養した。アッセイの時点で全ての細胞の培養密度は約９５％から１００％であった。分子溶液を、貯蔵した濃縮溶液をＨＢＳＳ（１×ハンクス平衡塩溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１を添加）で希釈することにより調製し、３８４ウェルのポリプロピレン分子貯蔵プレートに移して、分子源プレートを調製した。二段階アッセイを行う場合、分子源プレートとマーカー源プレートの両方を別々に作製した。並行して、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、３０μｌのＨＢＳＳ中に保持して、細胞アッセイプレートを調製した。次いで、細胞アッセイプレートおよび分子源プレートとマーカー源プレートの両方を前記リーダーシステムの槽内でインキュベーションした。約１時間のインキュベーション後、細胞アッセイマイクロプレート中の全てのバイオセンサーのベースライン波長を記録し、ゼロに正規化した。その後、ベースラインを確立し、細胞が定常状態に到達したことを確実にするために、２から１０分間の連続記録を行った。次いで、搭載型液体取扱機を使用して、１０μｌのマーカー溶液を細胞アッセイプレートにピペットで採取することによって、細胞応答を誘発させた。
【０５１２】
分子のマーカー誘発応答への影響を研究するために、所定の用量（一般にＥＣ８０またはＥＣ１００）でのマーカーによる二次刺激を適用した。二次刺激の直前に、マイクロプレート中の全てのバイオセンサーの共鳴波長を再び正規化して、第２のベースラインを確立した。２つの刺激は、通常、約１時間隔てた。
【０５１３】
全ての研究は、制御温度（２８℃）で行った。各々が少なくとも３回反復した、少なくとも２つの独立した組の実験を行った。アッセイの変動係数が１０％未満であることが分かった。
【０５１４】
ｉｘ．  同時免疫沈降およびウェスタンブロッティング
Ｔ１７５フラスコ内にＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を播種した。製造業者の使用説明書にしたがって、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、これらの細胞にｍｙｃ−ＧＰＲ３５をトランスフェクションした。２４時間のトランスフェクション後、同時免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）研究にその細胞を使用した。
【０５１５】
Ｃｏ−ＰＩ研究のために、ＨＴ２９細胞（サンプル当たり１０7の細胞）を収穫し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％のＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、１％のＮＰ４０、ｐＨ７．５）中で溶解させた。細胞溶解産物を、タンパク質Ａセファロースが結合した(conjugated)ウサギ抗−ＧＰＲ３５（Ａｂｃａｍ、Ａｂ７６２１７）またはウサギ抗−ＨＥＲＧ（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ、ＡＰＣ−０６２）いずれかで、免疫沈降させた。タンパク質を１５％ＳＤＳゲル上で分離し、次いで、膜に移した。この膜を、４℃で一晩、ウサギ抗−ＧＰＲ３５（１：１０００）でブロットし、次いで、３０分間に亘り、二次抗体のＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギまたはウマ抗ヤギ抗体（１：２００００で希釈）でブロットした。Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ニューヨーク州、バルハラ所在）でＥＣＬプラスキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェスタンブロットを展開させた。
【０５１６】
ｘ．  ＩｏｎＷｏｒｋｓを使用した自動化パッチクランプ記録
ＨＥＲＧチャンネルを安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、約７０％の培養密度となるまで、Ｔ１７５フラスコ中で培養した。この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２．５ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを２．５ｍｌのＰＢＳと混合し、このＴ１７５フラスコに加えた。細胞を、３７℃で、希釈したトリプシン／ＥＤＴＡ溶液と共に約２分間インキュベーションし、次いで、室温で約３分間連続してインキュベーションした。２０ｍｌの新たな培地を加えて、細胞を懸濁させ、５０ｍｌの管に移した。細胞を５分間に亘り７５０ｒｐｍで遠心分離した。余計な培地を除去し、６ｍｌの外部緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）内に細胞を再度懸濁させた。次いで、細胞をさらに５分間に亘り４５０ｒｐｍで遠心分離した。最後に、細胞を４ｍｌの外部緩衝液中に再度懸濁させ、血球計を使用して、細胞数を計数した。細胞懸濁液を外部緩衝液で２．５×１０6細胞／ｍｌまで希釈した。４ｍｌの再懸濁細胞を、ＩｏｎＷｏｒｋｓ内の細胞貯留部に加えた。使用した内部溶液は、４０ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのグルコン酸カリウム、３．２ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＣａＣｌ2、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ２．５（ＫＯＨにより調節した）を含有する。２００μｌのＤＭＳＯ株からのアンフォテリシンＢを６５ｍｌの内部溶液に加え、十分に混合して、パッチプレート上の細胞の内部への電気的アクセスを達成した。
【０５１７】
化合物を１０ｍＭのＤＭＳＯ株から調製し、外部緩衝液中で希釈して、３×化合物溶液を製造した。この３×化合物溶液の６０μ／ウェルを３８４ウェルプレートのＡ、Ｂ、ＣおよびＤ列に移した。報告されたＨＥＲＧチャンネル活性化剤であるＰＤ１１８５７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を活性化剤陽性対照として使用した（最終濃度３０および５０μＭ）。ＨＥＲＧ遮断薬ドフェチリド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を遮断薬陽性対照として使用した（最終濃度１００ｎＭ）。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＰａｔｃｈＰｌａｔｅ  ＰＰＣ（カタログ番号９０００−０９０２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）内の最終的なＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。最終的な化合物濃度は５０μＭであった。各化合物を、１つのＰＰＣプレート上の４つのウェルに加えた。
【０５１８】
ＨＥＲＧ電流をＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録した。ＨＥＲＧ電流を記録するために、細胞を最初に−８０ｍＶで保ち、次いで、＋４０ｍＶで５秒間、脱分極させて、そのチャンネルを活性化させた。その後に−３５ｍＶに戻る最中に、末尾電流を測定した。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０．４．４を使用してデータ分析を行った。５０ＭΩ未満のシール抵抗または０．１ｎＡ未満のＨＥＲＧ末尾電流を有するウェルからのデータは除いた。ｈＥＲＧ末尾電流比（後／前−化合物）が平均ＤＭＳＯ対照の平均＋２ＳＤより大きかった場合、活性化剤のヒットを選択した。ｈＥＲＧ末尾電流比（後／前−化合物）が平均ＤＭＳＯ対照の平均−２ＳＤより小さかった場合、阻害剤のヒットを選択した。
【０５１９】
２．  結果
ｉ．  ＨＴ２９細胞は、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧチャンネルの両方を発現する
ＳＡ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＧＰＲ３５プライマーを使用したリアルタイムＰＣＲは、ＨＴ２９は、少なくともｍＲＮＡレベルで、比較的高いレベルのＧＰＲ３５を発現することを示した。その後のウェスタンブロッティングは、ＨＴ２９溶解産物が、その分子量が、それぞれ、ＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂの両方の予測値に近いＧＰＲ３５アイソフォームを含有することを示した（図１ａおよび図７Ａ）。ＨＴ２９は、ｈＥＲＧイオンチャンネルを発現することが公知である。ウェスタンブロッティングの研究は、ＨＴ２９がｈＥＲＧ１ａおよびｈＥＲＧ１ｂの両方を発現することを示す（図７Ｂ）。
【０５２０】
共焦点イメージングは、ＧＰＲ３５が細胞表面原形質膜に主に位置していることをさらに示した（図１ｂ）。面白いことに、抗ＧＰＲ３５抗体を使用したＧＰＲ３５の染色パターンは、細胞表面で均一に分布する代わりに、脂質ラフトなどのあるマイクロドメイン内に主に位置するおよび／または他の受容体と複合体を形成することを示す。それにもかかわらず、これらの結果は、ＨＴ２９は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方で、比較的高いレベルのＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂを発現し；ＧＰＲ３５は、細胞表面に主に位置していることを示す。
【０５２１】
ｉｉ．  ＧＰＲ３５は、ＨＴ２９細胞においてｈＥＲＧイオンチャンネルと物理的に相互作用する
同時免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイは、受容体の対の間の物理的相互作用を判定するための最も基準になる検査として見られてきた。図７に示されるように、抗−ＧＰＲ３５カラムは、ｈＥＲＧ１ｂおよびＧＰＲ３５ａ／ｂの両方を特異的に引き下げることができる。同様に、抗−ｈＥＲＧカラムは、ｈＥＲＧ１ａ／ｂおよびＧＰＲ３５ａ／ｂの両方を特異的に引き下げることができる。これらの結果は、ＨＴ２９において、ｈＥＲＧ１ｂは、ＧＰＲ３５ａおよび／またはＧＰＲ３５ｂに物理的に結合してシグナル伝達複合体となることを示す。
【０５２２】
ｉｉｉ．  ＧＰＲ３５は、遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞においてもｈＥＲＧイオンチャンネルと物理的に相互作用する
ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の特異性をさらに判定するために、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ安定細胞にｍｙｃ−タグ付きＧＰＲ３５で一過性トランスフェクションした。安定株は、比較的高いレベルのｈＥＲＧ１を発現する。ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ１の間の潜在的な相互作用を特徴付けるために、同時免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイをさらに用いた。その結果は、抗−ｍｙｃカラムが、ｈＥＲＧ１ｂおよびＧＰＲ３５の両方を特異的に引き下げられることを示した（データは図示せず）。同様に、抗−ｈＥＲＧカラムは、ｈＥＲＧ１ｂおよびＧＰＲ３５の両方を特異的に引き下げることができる（データは図示せず）。これらの結果は、遺伝子操作されたＨＥＫ細胞において、ｈＥＲＧ１ｂはＧＰＲ３５と物理的に結合していることを示す。
【０５２３】
ｉｖ．  ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けるためのハイコンテントイメージアッセイ
全てのＧＰＣＲにほぼ共通するのは、アゴニスト誘発受容体内在化プロセスである。それゆえ、既知ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストの受容体内在化を生じる能力を調査した。ザプリナストは、既知ｃＧＭＰ依存性ホスホジエステラーゼ阻害剤であり、ＧＰＲ３５アゴニストでもある。図２Ａに示されるように、ザプリナストによる刺激の３０分後のＨＴ２９細胞の共焦点イメージングからも明らかなように、ザプリナストは１０マイクロモル濃度で、実際に、受容体の内在化を生じた。ドットは、受容体が内在化され、エンドソーム粒子と結合していることを示すのに対し、青色は核ＤＡＰＩ染色を示す。これらの結果は、ＧＰＲ３５は、一度活性化されると、内在化を経ることができ、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧ複合体を特徴付けることために、ハイコンテントイメージングまたはスクリーニングアッセイを使用することができる。
【０５２４】
ｖ．  ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けるためのラベルフリーバイオセンサーＤＭＲアッセイ
ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイは、受容体シグナル伝達の非侵襲正の統合手段を提供する。詳しくは、共鳴導波路グレーティングバイオセンサーを含む光学バイオセンサーは、刺激に応答した細胞の動的質量再配分（ＤＭＲ）を測定する。これらのバイオセンサー細胞アッセイは、受容体シグナル伝達の経路不偏であるが経路感受性の手段を提供する。ＧＰＲ３５、特にＧＰＲ３５／ｈＥＲＧ複合体のシグナル伝達の大部分が未知であるが、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けるために、ラベルフリー受容体アッセイを使用することが可能である。その結果は、ザプリナストが、ＨＴ２９細胞において、用量依存性の飽和可能なＤＭＲシグナルを誘発したことを示した（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｐ−ＤＭＲ事象を生じるＥＣ50が、１３７ｎＭであることが分かった。ザプリナストは、２種類の公知のＧＰＲ３５アゴニストである、ザプリナストおよびＮＰＰＢによるその後の刺激に対して、ＨＴ２９の脱感作を用量依存的に生じた（図８）。両方のアゴニストはＥＣ100で調査した。これらの結果は、ザプリナストはＧＰＲ３５アゴニストとして機能し、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を調査するために、ラベルフリー細胞アッセイを使用できることを示す。
【０５２５】
ｖｉ．  ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けるためのパッチクランプアッセイ
ｈＥＲＧは電位型イオンチャンネルであるので、自動化パッチクランプアッセイを行った。その結果は、ザプリナストは、ＣＨＯ−ｈＥＲＧ細胞においてｈＥＲＧ活性の非調節因子（すなわち、活性化剤でも、阻害剤でもない）として働くことを示した（図９）。これらの結果は、ザプリナストは、ｈＥＲＧのチャンネル活性を直接的に調節しないことを示す。
【０５２６】
ｖｉｉ．  ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体を特徴付けるためのＤＭＲアッセイ
「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイを使用して、ザプリナストが、ＨＥＫ−２９３細胞において（図１０Ａ）、並びにＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞（図１０Ｂ）において、ネットゼロＤＭＲシグナルを誘発することが分かった。ザプリナストは、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞において、マロトキシンＤＭＲシグナルにはほとんどまたは全く影響がないことも分かった（図１０Ｃ）。マロトキシンは既知ｈＥＲＧ活性化剤である。これらの結果は、ザプリナストは、ＧＰＲ３５が提示されない場合、ｈＥＲＧのチャンネル活性およびシグナル伝達を直接的に調節しないことをさらに示す。
【０５２７】
面白いことに、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧの両方が内因的に発現されるＨＴ２９細胞において、ザプリナストはマロトキシンＤＭＲシグナルをある程度減衰させることができる（図１１Ａ）。その逆もまた当てはまる−マロトキシンは、ザプリナストＤＭＲシグナルをある程度減少させることができる（図１１Ｂ）。さらに、マロトキシンＤＭＲは、ザプリナストＤＭＲシグナルとは著しく異なることが分かった。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、ザプリナストが、ＧＰＲ３５アゴニスト、ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体アゴニストであるが、直接的なｈＥＲＧ調節因子ではないことを示す。
【０５２８】
Ｃ．  実施例３
１．  材料および方法
ｉ．  材料
ザプリナストは、ＢｉｏＭｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州、プリマスミーティング所在）から得た。細胞培養に適合した「Ｅｐｉｃ」３８４バイオセンサーマイクロプレートは、コーニング社（ニューヨーク州、コーニング所在）から得た。全てのチルホスチン化合物は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス所在）から得た。
【０５２９】
ＨＥＫ２９３細胞およびＨＴ２９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（バージニア州、マナッサス所在）から得た。細胞培養培地は以下のとおりであった：（１）１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、およびＨＥＫ２９３の抗生物質が補われたイーグル培地（ＭＥＭ）；および（２）１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、およびヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９の抗生物質が補われたマッコイ５Ａ改変培地。
【０５３０】
ｉｉ．  カルシウムフラックスアッセイ
「Ｆｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔ」Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（スターターパック、カタログ番号Ｆ１０４７１）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞（１５０００細胞／ウェル）およびＨＴ２９細胞（３００００細胞／ウェル）を、ポリＤ−リシン被覆３８４ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号３８４５）に播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、Ｃａ2+フラックスアッセイを、製造業者の使用説明書にしたがって行い、蛍光比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）をＦＤＳＳ（創薬スクリーニングシステム、浜松ホトニクス株式会社、日本国）で測定した。化合物を、Ｃａ2+アッセイ緩衝液中で１０倍株（最終濃度１０μＭ）として調製した。
【０５３１】
９６ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号３６６４）内で、一過性トランスフェクションされた細胞に関するＣａ2+フラックスアッセイを行った。ＨＥＫ２９３細胞（２５０００細胞／ウェル）を１日目に播種した。細胞を２日目に、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｍｙｃ−ＧＰＲ３５またはＨＡ−Ｇqo5いずれかでトランスフェクションしたか、または両方のプラスミド（ｍｙｃ−ＧＰＲ３５／ＨＡ−Ｇqo5のＤＮＡ比２：１）で同時トランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、Ｃａ2+フラックスアッセイを行った。
【０５３２】
ｉｉｉ．  ＨＡ−Ｇqo5プラスミドのクローニング
ヒトＧqｃＤＮＡプラスミドをＭｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（www.cDNA.org）から購入した。ＨＡ−タグを、ＰＣＲによりヒトＧqｃＤＮＡのＮ末端に挿入した（J. Takasaki, T. Saito, M. Taniguchi, T. Kawasaki, Y. Moritani, K. Hayashi and M. Kobori (2004) A Novel Gaq/11-selective Inhibitor. J. Biol. Chem. 279: 47438-47445）。最後の５つのアミノ酸を、ＰＣＴによりＧＣＧＬＹと交換して、ＨＡ−Ｇqo5プラスミドを作製した（B. R. Conklin, Z. Farfel, K. D. Lustig, D. Julius, and H. R. Bourne (1993) Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq to that of Gi. Nature 1993, 363: 274-276）。次いで、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にこのＧqo5ｃＤＮＡをサブクローニングした。
【０５３３】
ｉｖ．  ＨＴ２９細胞およびトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を使用したウェスタンブロット
ＨＴ２９細胞（サンプル当たり１０7の細胞）を収穫し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％のＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、１％のＮＰ４０、ｐＨ７．５）中で溶解させた。タンパク質を１５％ＳＤＳゲル上で分離した。膜を、一晩４℃でウサギ抗−ＧＰＲ３５（１：１０００）（Ａｂｃａｍ、Ａｂ７６２１７）でブロットし、次いで、３０分間に亘り、二次抗体である、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギまたはウマ抗ヤギ抗体（１：２００００で希釈）でブロットした。Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ニューヨーク州、バルハラ所在）でＥＣＬプラスキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェスタンブロットを展開させた。
【０５３４】
ｖ．  ｃＡＭＰアッセイ
３８４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号３５４６６０）（ＨＥＫ２９３については１００００細胞／ウェル、ＨＴ２９については２００００細胞／ウェル）内に細胞を平板培養した。細胞を一晩、完全増殖培地内で培養した。翌日、製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ１５０２）にしたがって、ｃＡＭＰ−Ｇｌｏアッセイを行った。細胞を、溶解緩衝液を添加する前に、３０分間に亘り、０．５μＭまたは５μＭのフォルスコリンを含む誘導緩衝液または含まない誘導緩衝液中で２０μＭの化合物と共にインキュベーションした。Ｔｅｃａｎ  ＳａｆｉｒｅＩＩリーダーを使用して、蛍光を測定した。
【０５３５】
ｖｉ．  免疫蛍光共焦点イメージング
ＨＴ２９細胞を８ウェルチャンバースライド（１０，０００細胞／ウェル）上で平板培養し、２４時間に亘り３７℃でインキュベーションした。翌日、細胞を１５分間に亘り１×ＰＢＳ内の４％ホルムアルデヒドで固定し、その後、１×ＰＢＳ中に４％のヤギ血清、０．１％のＢＳＡ、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する緩衝液中で２時間に亘りブロッキングし、透過化処理した。ＰＢＳによる５分間の洗浄後、固定細胞を、２４時間に亘り３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において一次抗体抗−ＧＰＲ３５（Ａｂｃａｍ）（１：３００）と共にインキュベーションし、その後、室温で１時間に亘り３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２５０）と共にインキュベーションした。最後に、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、１．５ｍｍの厚いガラスカバースリップで密封した。イメージングまで、乾燥させたスライドを４℃で貯蔵した。共焦点イメージングは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０で行った。ＧＰＲ３５内在化研究については、細胞を２４時間に亘り３７℃でインキュベーションした後、その細胞を、固定する前に、１時間に亘り３７℃でＧＰＲ３５の異なるリガンドで処理した（ザプリナスト、１０μＭ；ニフルム酸、２０μＭ；ＹＥ２１０、２０μＭ；タルニフルメート、２０μＭ；ジクロフェナク、２０μＭ；フロセミド、２０μＭ）。ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（http://www.macbiophotonics.ca/downloads.htm）を使用して、共焦点画像を解析した。
【０５３６】
ｖｉｉ．  その場での「Ｅｐｉｃ」プレート上でのＧＰＲ３５のＲＮＡｉノックダウン
ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５ノックダウンを、ヒトＧＰＲ３５ｍＲＮＡを標的とした一過性トランスフェクションされた小ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡにより、３８４ウェル「Ｅｐｉｃ」プレート上で行った。ＨＴ２９細胞を１日目に２０，０００細胞／ウェルで播種した。２日目に、細胞を、製造業者の使用説明書にしたがって、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＧＰＲ３５を標的とするプラスミドＤＮＡｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳ−ｓｈＲＮＡで一過性トランスフェクションした。細胞を３日目に洗浄し、トランスフェクションの４８時間後である４日目に、「Ｅｐｉｃ」細胞アッセイを行った。
【０５３７】
ｖｉｉｉ．  光学バイオセンサーシステムおよび細胞アッセイ（ラベルフリーバイオセンサー細胞アッセイ）
全細胞検出に、「Ｅｐｉｃ」ベータ版の波長検波システム（コーニング社、ニューヨーク州、コーニング）を使用した。このシステムは、温度制御ユニット、光学検出ユニット、およびロボット式搭載型液体取扱ユニットからなる。この検出ユニットは、集積光ファイバに重点を置き、約１５秒の間隔で細胞応答の速度測定が可能である。また、「Ｅｐｉｃ」リーダーシステムに液体取扱アクセサリが取り付けられた、「Ｅｐｉｃ」工業システムも使用した。
【０５３８】
ＲＷＧバイオセンサーは、センサー表面近くの局所屈折率の微小変化を検出することができる。細胞内の局所屈折率は、生物量（例えば、タンパク質、分子複合体）の密度とその分布の関数であるので、バイオセンサーは、天然細胞におけるリガンド誘発動的質量再配分を非侵襲的に検出するためにエバネッセント波を利用する。エバネッセント波は、細胞中に達し、距離で指数関数的に減少し、約１５０ｎｍの特徴的な検出容積をもたらし、受容体活性化を通じて媒介される光学応答が、エバネッセント波がサンプリングされている細胞の部分について平均を表すだけであることを示す。受容体活性化の下流の多くの細胞事象の合算が、リガンド誘発ＤＭＲの反応速度と振幅を決定する。
【０５３９】
バイオセンサー細胞アッセイについて、細胞は、概して、バイオセンサーマイクロプレート中の５０μｌの対応する培養培地中に懸濁された３から１５継代でウェル当たり約１から２×１０4の細胞を使用して増殖させ、約１日に亘り空気／５％のＣＯ2下３７℃で培養した。アッセイの時点で全ての細胞の培養密度は約９５％から１００％であった。分子溶液を、貯蔵した濃縮溶液をＨＢＳＳ（１×ハンクス平衡塩溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１を添加）で希釈することにより調製し、３８４ウェルのポリプロピレン分子貯蔵プレートに移して、分子源プレートを調製した。二段階アッセイを行う場合、分子源プレートとマーカー源プレートの両方を別々に作製した。並行して、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、３０μｌのＨＢＳＳ中に保持して、細胞アッセイプレートを調製した。次いで、細胞アッセイプレートおよび分子源プレートとマーカー源プレートの両方を前記リーダーシステムの槽内でインキュベーションした。約１時間のインキュベーション後、細胞アッセイマイクロプレート中の全てのバイオセンサーのベースライン波長を記録し、ゼロに正規化した。その後、ベースラインを確立し、細胞が定常状態に到達したことを確実にするために、２から１０分間の連続記録を行った。次いで、搭載型液体取扱機を使用して、１０μｌのマーカー溶液を細胞アッセイプレートにピペットで採取することによって、細胞応答を誘発させた。
【０５４０】
分子のマーカー誘発応答への影響を研究するために、所定の用量（一般にＥＣ８０またはＥＣ１００）でのマーカーによる二次刺激を適用した。二次刺激の直前に、マイクロプレート中の全てのバイオセンサーの共鳴波長を再び正規化して、第２のベースラインを確立した。２つの刺激は、通常、約１時間隔てた。
【０５４１】
全ての研究は、制御温度（２８℃）で行った。各々が少なくとも３回反復した、少なくとも２つの独立した組の実験を行った。アッセイの変動係数が１０％未満であることが分かった。
【０５４２】
ｉｘ．  同時免疫沈降およびウェスタンブロッティング
Ｔ１７５フラスコ内にＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を播種した。製造業者の使用説明書にしたがって、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、これらの細胞にｍｙｃ−ＧＰＲ３５をトランスフェクションした。２４時間のトランスフェクション後、同時免疫沈降研究にその細胞を使用した。
【０５４３】
Ｃｏ−ＰＩアッセイプロトコルを使用した。例えば、ＨＴ２９細胞（サンプル当たり１０7の細胞）を収穫し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％のＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、１％のＮＰ４０、ｐＨ７．５）中で溶解させた。細胞溶解産物を、タンパク質Ａセファロースが結合した(conjugated)ウサギ抗−ＧＰＲ３５（Ａｂｃａｍ、Ａｂ７６２１７）またはウサギ抗−ＨＥＲＧ（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ、ＡＰＣ−０６２）いずれかで、免疫沈降させた。タンパク質を１５％ＳＤＳゲル上で分離した。膜を、４℃で一晩、ウサギ抗−ＧＰＲ３５（１：１０００）でブロットし、次いで、３０分間に亘り、二次抗体のＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギまたはウマ抗ヤギ抗体（１：２００００で希釈）でブロットした。Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ニューヨーク州、バルハラ所在）でＥＣＬプラスキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェスタンブロットを展開させた。
【０５４４】
ｘ．  ＩｏｎＷｏｒｋｓを使用した自動化パッチクランプ記録
ＨＥＲＧチャンネルを安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、約７０％の培養密度となるまで、Ｔ１７５フラスコ中で培養した。この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２．５ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを２．５ｍｌのＰＢＳと混合し、このＴ１７５フラスコに加えた。細胞を、３７℃で、希釈したトリプシン／ＥＤＴＡ溶液と共に約２分間インキュベーションし、次いで、室温で約３分間連続してインキュベーションした。２０ｍｌの新たな培地を加えて、細胞を懸濁させ、５０ｍｌの管に移した。細胞を５分間に亘り７５０ｒｐｍで遠心分離した。余計な培地を除去し、６ｍｌの外部緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）内に細胞を再度懸濁させた。次いで、細胞をさらに５分間に亘り４５０ｒｐｍで遠心分離した。最後に、細胞を４ｍｌの外部緩衝液中に再度懸濁させ、血球計を使用して、細胞数を計数した。細胞懸濁液を外部緩衝液で２．５×１０6細胞／ｍｌまで希釈した。４ｍｌの再懸濁細胞を、ＩｏｎＷｏｒｋｓ内の細胞貯留部に加えた。使用した内部溶液は、４０ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのグルコン酸カリウム、３．２ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＣａＣｌ2、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ２．５（ＫＯＨにより調節した）を含有する。２００μｌのＤＭＳＯ株からのアンフォテリシンＢを６５ｍｌの内部溶液に加え、十分に混合して、パッチプレート上の細胞の内部への電気的アクセスを達成した。
【０５４５】
化合物を１０ｍＭのＤＭＳＯ株から調製し、外部緩衝液中で希釈して、３×化合物溶液を製造した。この３×化合物溶液の６０μ／ウェルを３８４ウェルプレートのＡ、Ｂ、ＣおよびＤ列に移した。報告されたＨＥＲＧチャンネル活性化剤であるＰＤ１１８５７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を活性化剤陽性対照として使用した（最終濃度３０および５０μＭ）。ＨＥＲＧ遮断薬ドフェチリド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を遮断薬陽性対照として使用した（最終濃度１００ｎＭ）。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＰａｔｃｈＰｌａｔｅ  ＰＰＣ（カタログ番号９０００−０９０２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）内の最終的なＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。最終的な化合物濃度は５０μＭであった。各化合物を、１つのＰＰＣプレート上の４つのウェルに加えた。
【０５４６】
ＨＥＲＧ電流をＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録した。ＨＥＲＧ電流を記録するために、細胞を最初に−８０ｍＶで保ち、次いで、＋４０ｍＶで５秒間、脱分極させて、そのチャンネルを活性化させた。その後に−３５ｍＶに戻る最中に、末尾電流を測定した。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０．４．４を使用してデータ分析を行った。５０ＭΩ未満のシール抵抗または０．１ｎＡ未満のＨＥＲＧ末尾電流を有するウェルからのデータは除いた。ｈＥＲＧ末尾電流比（後／前−化合物）が平均ＤＭＳＯ対照の平均＋２ＳＤより大きかった場合、活性化剤のヒットを選択した。ｈＥＲＧ末尾電流比（後／前−化合物）が平均ＤＭＳＯ対照の平均−２ＳＤより小さかった場合、阻害剤のヒットを選択した。
【０５４７】
２．結果
ｉ．化学合成および特徴付け
次の化学物質を合成した：
１．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［４'−ｎ−ブチルフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）
２．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'，４'−ジフルオロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）
３．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−スピロ−シクロヘキシル−２，５−ジヒドロフラン）
４．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−フェニル−５−ペルフルオロメチル−２，５−ジヒドロフラン）
５．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４−メチル−５−スピロ−フルオレニリデン−２，５−ジヒドロフラン）
６．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'，３'，４'−トリクロロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）
７．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［３'，４'−ジクロロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）
８．（２−シアノ−２−（１−アミノ−２，２−ジシアノビニル）メチレン−３−シアノ−４，５，５−トリメチル−２，５−ジヒドロフラン）
９．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５−ジメチル−５−［２'３'４'５'６'−ペンタフルオロフェニル］−２，５−ジヒドロフラン）
１０．（２−ジシアノメチレン−３−シアノ−４，５，５−トリメチル−２，５−ジヒドロフラン）
１１．（チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
１２．（３−メチル−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
１３．（３−メチル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
１４．（６−へキシル−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
１５．（３，６−ジブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−ウンデカノン）
１６．（３−ｎ−ウンデシル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２− カルボン酸）
１７．（３−ｎ−トリデシル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
１８．（３−ｎ−デシル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
１９．（３−ｎ−ペンタデシル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
２０．（３−ｎ−テトラデシル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
２１．（３−ｎ−オクチル−６−ブロモ−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボン酸）
２２．（５−メチル−ジチエノ［３，２−ｂ：２'，３'−ｄ］チオフェン−２−カルボン酸）
２３．（ジエチルジチエノ［３，２−ｂ：２'，３'−ｄ］チオフェン−２，６−ジカルボキシレート）
２４．（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−［２−（チオフェン−２−イル）ビニル］アニリン）
２５．（メチル−５−｛２−［４−（Ｎ−メチル、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−アミノ）フェニル］エテニル｝−チオフェン−２−ホルメート）
２６．（５−｛２−［４−（Ｎ−メチル、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−アミノ）フェニル］エテニル｝−チオフェン−２−ホルメート・リチウム塩）
２７．（２，２'−ビチオフェン−５−メタノール）
２８．（５−ヒドロキシメチル−５'−ホルミル−２，２'−ビチオフェン）
２９．（５'−｛２−［４−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］フェニル］エテニル］｝−（２，２'−ビチオフェン）−５−ホルメート・ナトリウム塩）
３０．（２，２'−ビチオフェン−５−カルボキサルデヒド）
【０５４８】
化合物１、２、３、４、５、および７の合成および特徴付けは、先の特許出願（米国仮特許出願第６１／２９１，７４２号明細書。Fang, Y., He, M.Q., Sun, H., Ferrie, A. M, Tran, E., Wei, Y., Deng, H., Niu, W., "Molecules related hERG ion channels and the use thereof", ２００９年１２月３１日出願；参照することによってその全体が援用される）に詳述されている。
【０５４９】
化学物質１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、および２２の合成および特徴付けは、先の特許出願（米国仮特許出願第６１／２９１７４７号明細書。Fang, Y., He, M., Sun, H., Ferrie, A.M., Tran, E., Deng, H., Niu, W., and Wei, Y. "EGFR/VEGFR dual modulators and methods of using", ２００９年１２月３１日出願；参照することによってその全体が援用される）に詳述されている。
【０５５０】
化合物２３（ジエチルジチエノ［３，２−ｂ：２'，３'−ｄ］チオフェン−２，６−ジカルボキシレート）は、文献（Freyら、Chemical Communications 2002, 20:2424-2425）に従って合成した。
【０５５１】
化合物２４（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−［２−（チオフェン−２−イル）ビニル］アニリン）は、文献（Ｊｅｎら、欧州特許出願公開第６４７８７４号、１９９５年）に従って合成した。
【０５５２】
化合物２８（５−ヒドロキシメチル−５'−ホルミル−２，２'−ビチオフェン）は、文献（Ｃｈａｎｇら、米国特許第５，５０８，４４０号明細書（１９９６年））に従って合成した。
【０５５３】
ｉｉ．  ＨＴ２９細胞は、ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧチャンネルの両方を発現する
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞の表面タンパク質の最大の群の内の１つを構成し、現行の治療薬および開発中の薬物の主要標的を表す。多くのｃＤＮＡクローンは、確立されたＧＰＣＲに対して、特に膜貫通領域において、高い配列類似性に基づいてＧＰＣＲをコードすることが予測される。そのようなオーファンＧＰＣＲについて、アゴニスト、アンタゴニスト、および情報伝達経路の特定は、新薬標的の発見のための業界による主要な努力を表す。ヒトゲノムＤＮＡスクリーニング中に最初に発見されたオーファンＧＰＣＲであるＧＰＲ３５は、プリン作動性Ｐ２Ｙ受容体、ニコチン酸受容体ＨＭ７４、リゾホスファチジン酸受容体ＧＰＲ２３、およびオーファン受容体であるＧＰＲ５５との配列相同性が限られている。最高レベルのＧＰＲ３５ｍＲＮＡが免疫組織および胃腸組織で見つかり、肺組織と神経組織では発現が限られていた。ＧＰＲ３５の初期の記述後に（今ではＧＰＲ３５ａと示される）、オクムラ等(2004)は、Ｎ末端で追加の３１のアミノ酸をコードしたヒト胃癌ｃＤＮＡライブラリからスプライスバリアント（ＧＰＲ３５ｂ）を単離した（Okumura, et al. (2004) Cancer Sci, 95: 131-135）。ＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂのｍＲＮＡレベルは、胃癌組織中で発現上昇され、悪性転換における両方のスプライスバリアントの役割を示唆した。しかしながら、ヒト結腸癌細胞におけるＧＰＲ３５の発現は調査されていなかった。
【０５５４】
ＳＡ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＧＰＲ３５プライマーを使用したリアルタイムＰＣＲは、ＨＴ２９細胞は、少なくともｍＲＮＡレベルで、比較的高いレベルのＧＰＲ３５を発現することを示した（データは図示せず）。その後のウェスタンブロッティングは、ＨＴ２９細胞溶解産物が、その分子量が、それぞれ、ＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂの両方の予測値に近いＧＰＲ３５アイソフォームを含有することを示した（図１ａおよび図７Ａ）。
【０５５５】
ＨＴ２９は、ｈＥＲＧイオンチャンネルを発現することが公知である。ウェスタンブロッティングの研究は、ＨＴ２９がｈＥＲＧ１ａおよびｈＥＲＧ１ｂの両方を発現することを示す（図７Ｂ）。ＨＴ２９は、ヒト結腸腺癌ＩＩ型細胞株である。
【０５５６】
共焦点イメージングは、ＧＰＲ３５が細胞表面原形質膜に主に位置していることをさらに示した（図１ｂ）。面白いことに、抗ＧＰＲ３５抗体を使用したＧＰＲ３５の染色パターンは、細胞表面で均一に分布する代わりに、あるマイクロドメイン内、ことによると脂質ラフト内に主に位置するおよび／または他の受容体と複合体を形成することを示唆している。それにもかかわらず、これらの結果は、ＨＴ２９は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方で、比較的高いレベルのＧＰＲ３５ａおよびＧＰＲ３５ｂを発現し；ＧＰＲ３５は、細胞表面に主に位置していることを示唆している。
【０５５７】
ｉｉｉ．  ＧＰＲ３５は、ＨＴ２９細胞においてｈＥＲＧイオンチャンネルと物理的に相互作用する
同時免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイは、受容体の対の間の物理的相互作用を判定するための最も基準になる検査として見られてきた。図７に示されるように、抗−ＧＰＲ３５カラムは、ｈＥＲＧ１ｂおよびＧＰＲ３５ａ／ｂの両方を特異的に引き下げることができる。同様に、抗−ｈＥＲＧカラムは、ｈＥＲＧ１ａ／ｂおよびＧＰＲ３５ａ／ｂの両方を特異的に引き下げることができる。これらの結果は、ＨＴ２９において、ｈＥＲＧ１ｂは、ＧＰＲ３５ａおよび／またはＧＰＲ３５ｂに物理的に結合してシグナル伝達複合体となることを示す。
【０５５８】
ｉｖ．  ＧＰＲ３５は、遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞においてもｈＥＲＧイオンチャンネルと物理的に相互作用する
ＧＰＲ３５／ｈＥＲＧシグナル伝達複合体の特異性をさらに判定するために、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ安定細胞にｍｙｃ−タグ付きＧＰＲ３５で一過性トランスフェクションした。安定株は、比較的高いレベルのｈＥＲＧ１を発現する。ＧＰＲ３５およびｈＥＲＧ１の間の潜在的な相互作用を特徴付けるために、同時免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイをさらに用いた。その結果は、抗−ｍｙｃカラムが、ｈＥＲＧ１ｂおよびＧＰＲ３５の両方を特異的に引き下げられることを示した（データは図示せず）。同様に、抗−ｈＥＲＧカラムは、ｈＥＲＧ１ｂおよびＧＰＲ３５の両方を特異的に引き下げることができる（データは図示せず）。これらの結果は、遺伝子操作されたＨＥＫ細胞において、ｈＥＲＧ１ｂはＧＰＲ３５と物理的に結合していることを示す。
【０５５９】
ｖ．  ＧＰＲ３５アンタゴニストの同定
利用できる直接結合アッセイがないので、分子のＧＰＲ３５アゴニズム活性を判定するために、３種類の異なる細胞アッセイを使用した。アッセイは：（１）Ｇqo5を同時発現するものとしないＨＥＫ−ＧＰＲ３５などの遺伝子操作された細胞におけるＣａ2+動員アッセイ。Ｇqo5は、その活性化によりＣａ2+動員をもたらすＧタンパク質であり、このＧqo5タンパク質は、細胞中で発現されたときに非Ｇq共役受容体のアゴニスト誘発活性化により活性化させることができる。ＧＰＲ３５は非Ｇq共役受容体であると考えられるので、ＧＰＲ３５アゴニストが誘発したＣａ2+動員シグナルを検出するために、Ｇqo5の同時発現が必要である。（２）受容体内在化アッセイ。受容体内在化は、迅速であり、ほとんど全てのＧＰＣＲにとって普遍的である。（３）共鳴導波路グレーティングバイオセンサーなどの光学バイオセンサーにより見込まれる、ラベルフリー動的質量再配分（ＤＭＲ）アッセイ。ＤＭＲシグナルは、刺激の際に積算された細胞応答を表すので、ＤＭＲアッセイは、積算式細胞アッセイである。ＤＭＲアッセイは、経路感受性であるが、経路不偏である（測定のための所定の経路が必須ではないことを意味する）。
【０５６０】
Ｃａ2+動員アッセイは、既知ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナスト（１０マイクロモル濃度）は、ＧＰＲ３５およびＧqo5の両方を発現する遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞において、検出可能なＣａ2+動員シグナルを誘発するが、親細胞、もしくはＧＰＲ３５またはＧqo5のいずれかを発現する遺伝子操作された細胞のいずれにおいても、誘発しなかったことを示した（図１４）。さらに、ＧＰＲ３５を内因的に発現する天然のＨＴ２９細胞において、ザプリナストは、どのような検出可能なＣａ2+動員シグナルも生じなかった（図４Ａ）。これらのデータは、ザプリナストがＧＰＲ３５特異的アゴニストであり、ＧＰＲ３５は実際に、Ｇq共役受容体ではない。ＨＥＫ−ＧＰＲ３５−Ｇqo5細胞に関するＣａ2+動員アッセイも、以下の化合物が活性であることを示した：ジフルニサル、フルフェナム酸、フルンキシン、フロセミド、ニフルム酸、ＮＰＰＢ、トルフェナム酸、ザプリナスト、ＤＮＱＸ。
【０５６１】
受容体内在化アッセイは、ザプリナスト（４００ナノモル濃度）が、未刺激の細胞と比べて、細胞原形質膜関連蛍光の消失、および細胞内蛍光小胞の出現により示されるように、ＨＴ２９細胞中の著しい受容体内在化をもたらすことを示した（図２Ａ）。ここで、細胞を、３０分間に亘りザプリナストの有無で刺激し、固定し、透過化し、抗ＧＰＲ３５抗体および蛍光二次抗体で染色した後に、共焦点イメージングが得られる。
【０５６２】
ＤＭＲアッセイは、ザプリナストが、用量依存性の飽和可能なＤＭＲシグナルを誘発し、Ｐ−ＤＭＲ事象を生じるそのＥＣ５０が１３７ｎＭであることを示した（図２）。ＧＰＲ３５ノックダウンは、ザプリナストＤＭＲシグナルをある程度抑制したので、ＲＮＡｉノックダウンを使用した追跡研究は、ザプリナストＤＭＲシグナルがＧＰＲ３５に特異的であることを示す（データは図示せず）。これらの結果は、ザプリナストが、ＨＴ２９において内因性ＧＰＲ３５のアゴニストとして働くことを示す。
【０５６３】
ｖｉ．  ｈＥＲＧ調節因子の同定
ｈＥＲＧ調節因子を特定し、確認するために、２種類の異なる細胞アッセイを使用した。第１に、遺伝子操作されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＥＲＧ）においてｈＥＲＧ電流を検出するために、自動化パッチクランプを使用した。ｈＥＲＧは、電位型イオンチャンネルである。その結果は、ザプリナストは、ザプリナストの不在下と存在下で得られた末尾電流に基づいて、ＣＨＯ−ｈＥＲＧ細胞においてｈＥＲＧ活性の非調節因子（すなわち、活性化剤でも、阻害剤でもない）として働くことを示した（図９）。末尾電流値は、前化合物電流で割った後化合物電流の比であった。パッチのシール抵抗に関連する電流の絶対値は、ウェル毎に異なるので、この値は、試験した化合物によるｈＥＲＧ調節により予測的である。これらの結果は、ザプリナストは、ｈＥＲＧのチャンネル活性を直接的に調節しないことを示す。
【０５６４】
第２に、ｈＥＲＧ活性化剤を検出するために、ＤＭＲアッセイを使用した。既知ｈＥＲＧ活性化剤であるマロトキシンにより、ＨＴ２９細胞において用量依存性の飽和可能なＤＭＲシグナルが生じた（図１５）。マロトキシンＤＭＲシグナルは、ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストのＤＭＲシグナルとは異なる。特異性を確認するために、ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞を使用したＤＭＲアッセイを行い、マロトキシンによっても、ｈＥＲＧ１を安定に発現する遺伝子操作されたＨＥＫ−２９３細胞において、類似のＤＭＲシグナルが生じたが、親のＨＥＫ−２９３細胞において、検出可能なＤＭＲシグナル（すなわち、ネットゼロＤＭＲシグナル）はなかったことが示された。これらの結果は、マロトキシンはｈＥＲＧ活性化剤であり、ｈＥＲＧチャンネルの活性化により、細胞（例えば、ＨＴ２９細胞、または遺伝子操作されたＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞）においてシグナル伝達が誘発され得ることを示す。
【０５６５】
ｖｉｉ．  ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５調節因子の同定
上述した方法は、ＧＰＲ３５リガンドまたはｈＥＲＧ調節因子いずれかを同定することができる。ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体調節因子を同定するために、交差脱感作ＤＭＲアッセイを使用した。ここで、最初に、ＨＴ２９細胞におけるｈＥＲＧ活性化剤であるマロトキシン誘発ＤＭＲシグナルを脱感作または減衰させる能力について、分子を調査した。分子が、ｈＥＲＧ活性化剤ではないが、ＧＰＲ３５アゴニストであり、既知マロトキシン誘発ＤＭＲによるその後の刺激に対して細胞を脱感作させることができる場合、その分子は、ｈＥＲＧ−トランス活性化ＧＰＲ３５アゴニストと称される。その一例は、既知ＧＰＲ３５アゴニストのザプリナストである。ＨＴ２９細胞のザプリナストによる前処理により、ｈＥＲＧ活性化剤のマロトキシンによるその後の刺激に応答して、細胞が用量依存的に脱感作された（図１６）。
【０５６６】
第２に、ＨＴ２９細胞におけるＧＰＲ３５アゴニスト誘発ＤＭＲシグナルを脱感作または減衰させる能力について、前記分子を調査した。分子が、ＧＰＲ３５アゴニストではないが、ＧＰＲ３５  ＤＭＲに基づくＧＰＲ３５アゴニストによるその後の刺激に対して細胞を脱感作させることができるｈＥＲＧ活性化剤である場合、その分子は、ＧＰＲ３５−トランス活性ｈＥＲＧ活性化剤と称される。その一例は、既知ｈＥＲＧ活性化剤アゴニストであるが、直接的なＧＰＲ３５アゴニストではないマロトキシンである。ＨＴ２９細胞のマロトキシンによる前処理により、ＧＰＲ３５アゴニストであるザプリナストによるその後の刺激に応答して、細胞が用量依存的に脱感作された（図１７）。
【０５６７】
ｖｉｉｉ．  ｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体調節因子の分類
上述した一連のアッセイを使用して、スキーム１〜６に示された一連の分子を、ｈＥＲＧ特異的調節因子、またはＧＰＲ３５特異的調節因子、もしくはｈＥＲＧ−ＧＰＲ３５複合体調節因子のいずれかとして同定した。表１は、これらの分子の実験データおよび分類を示す。表に列挙された化合物の構造（化学名または参照数字が付与されている）が以下に示されている。
【化４９−１】
2013535448.tif 000051
【化４９−２】
2013535448.tif 000052
【化４９−３】
2013535448.tif 000053
【０５６８】
ＨＥＫ−ＧＰＲ３５−Ｇqo5細胞を使用したＣａ2+動員アッセイ、ＨＴ２９細胞（ｈＥＲＧ１およびＧＰＲ３５を内因的に発現した）を使用したＤＭＲアッセイ、ＣＨＯ−ｈＥＲＧ１細胞を使用した自動化パッチクランプ電気生理学的記録、およびＨＴ２９細胞を使用した交差脱感作アッセイを含む一連のアッセイに基づいて、分類を得た。見つけられたクラスは：クラスＡ：ＧＰＲ３５アゴニストおよびｈＥＲＧ活性化剤、ＧＰＲ３５−ｈＥＲＧ複合体アゴニスト；クラスＢ：ｈＥＲＧトランス活性化ＧＰＲ３５アゴニスト；クラスＣ：ｈＥＲＧ非トランス活性化ＧＰＲ３５アゴニスト；クラスＤ：ＧＰＲ３５トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤；クラスＥ：ＧＰＲ３５非トランス活性化ｈＥＲＧ活性化剤など。ＧＰＲ３５アゴニストが、活性および不活性の、ＨＥＫ−ＧＰＲ３５−Ｇqo5細胞においてＣａ2+動員を誘発する能力に基づく２つのサブタイプに分類できることは、注目に値する。ＧＰＲ３５は非ＧqまたはＧi共役受容体であり、多くのＧＰＣＲリガンドは機能的選択性を示すことが知られているので、このことは意外なことではない。
【表１】
2013535448.tif 000054
【０５６９】
2013535448.tif 000055
【０５７０】
配列
ｉ．ＧＰＲ３５ａのタンパク質配列
ＧＰＲ３５ａのタンパク質配列（配列番号：９）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＣ９７）は次の通りである：
MNGTYNTCGSSDLTWPPAIKLGFYAYLGVLLVLGLLLNSLALWVFCCRMQQWTETRIYMTNLAVADLCLLCTLPFVLHSLRDTSDTPLCQLSQGIYLTNRYMSISLVTAIAVDRYVAVRHPLRARGLRSPRQAAAVCAVLWVLVIGSLVARWLLGIQEGGFCFRSTRHNFNSMAFPLLGFYLPLAVVVFCSLKVVTALAQRPPTDVGQAEATRKAARMVWANLLVFVVCFLPLHVGLTVRLAVGWNACALLETIRRALYITSKLSDANCCLDAICYYYMAKEFQEASALAVAPSAKAHKSQDSLCVTLA
【０５７１】
ｉｉ．ｍＲＮＡ配列 of ＧＯＲ３５ａ
ホモ・サピエンスＧタンパク質共役受容体３５ａ（ＧＰＲ３５ａ）（配列番号：１）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ 参照配列：ＮＭ＿００５３０１．２）は次の通りである：
1 caggccagag tcccagctgt cctggactct gctgtgggga agggctgatg caggtgtgga
61 gtcaaatgtg ggtgcctcct gcagccgggt gccaggaggg gtggaggggc caccctgggc
121 tttgtccggg agcctggtct tcccgtcctt gggctgacag gtgctgctgc ctctgagccc
181 tccctgctaa gagctgtgtg ctgggtaagg ctggtggccc tttgggctcc ctgtccagga
241 tttgtgctct ggagggtagg gcttgctggg ctggggactg gaggggaacg tggagctcct
301 tctgcctcct ttcctgcccc atgacagcag gcagatccca ggagagaaga gctcaggaga
361 tgggaagagg atctgtccag gggttagacc tcaagggtga cttggagttc tttacggcac
421 ccatgctttc tttgaggagt tttgtgtttg tgggtgtggg gtcggggctc acctcctccc
481 acatccctgc ccagaggtgg gcagagtggg ggcagtgcct tgctccccct gctcgctctc
541 tgctgacctc cggctccctg tgctgcccca ggaccatgaa tggcacctac aacacctgtg
601 gctccagcga cctcacctgg cccccagcga tcaagctggg cttctacgcc tacttgggcg
661 tcctgctggt gctaggcctg ctgctcaaca gcctggcgct ctgggtgttc tgctgccgca
721 tgcagcagtg gacggagacc cgcatctaca tgaccaacct ggcggtggcc gacctctgcc
781 tgctgtgcac cttgcccttc gtgctgcact ccctgcgaga cacctcagac acgccgctgt
841 gccagctctc ccagggcatc tacctgacca acaggtacat gagcatcagc ctggtcacgg
901 ccatcgccgt ggaccgctat gtggccgtgc ggcacccgct gcgtgcccgc gggctgcggt
961 cccccaggca ggctgcggcc gtgtgcgcgg tcctctgggt gctggtcatc ggctccctgg
1021 tggctcgctg gctcctgggg attcaggagg gcggcttctg cttcaggagc acccggcaca
1081 atttcaactc catggcgttc ccgctgctgg gattctacct gcccctggcc gtggtggtct
1141 tctgctccct gaaggtggtg actgccctgg cccagaggcc acccaccgac gtggggcagg
1201 cagaggccac ccgcaaggct gcccgcatgg tctgggccaa cctcctggtg ttcgtggtct
1261 gcttcctgcc cctgcacgtg gggctgacag tgcgcctcgc agtgggctgg aacgcctgtg
1321 ccctcctgga gacgatccgt cgcgccctgt acataaccag caagctctca gatgccaact
1381 gctgcctgga cgccatctgc tactactaca tggccaagga gttccaggag gcgtctgcac
1441 tggccgtggc tcccagtgct aaggcccaca aaagccagga ctctctgtgc gtgaccctcg
1501 cctaagaggc gtgctgtggg cgctgtgggc caggtctcgg gggctccggg aggtgctgcc
1561 tgccagggga agctggaacc agtagcaagg agcccgggat cagccctgaa ctcactgtgt
1621 attctcttgg agccttgggt gggcagggac ggcccaggta cctgctctct tgggaagaga
1681 gagggacagg gacaagggca agaggactga ggccagagca aggccaatgt cagagacccc
1741 cgggatgggg cctcacactt gccaccccca gaaccagctc acctggccag agtgggttcc
1801 tgctggccag ggtgcagcct tgatgacacc tgccgctgcc cctcggggct ggaataaaac
1861 tccccaccca gagtc
【０５７２】
ｉｉｉ．ＧＰＲ３５ａのｃＤＮＡ
ＧＰＲ３５ａのｃＤＮＡ配列（配列番号：２）は次の通りである：
...................................ATGAATGGCACCTACAACACCTGTG
26 GCTCCAGCGACCTCACCTGGCCCCCAGCGATCAAGCTGGGCTTCTACGCCTACTTGGGCG
86 TCCTGCTGGTGCTAGGCCTGCTGCTCAACAGCCTGGCGCTCTGGGTGTTCTGCTGCCGCA
146 TGCAGCAGTGGACGGAGACCCGCATCTACATGACCAACCTGGCGGTGGCCGACCTCTGCC
206 TGCTGTGCACCTTGCCCTTCGTGCTGCACTCCCTGCGAGACACCTCAGACACGCCGCTGT
266 GCCAGCTCTCCCAGGGCATCTACCTGACCAACAGGTACATGAGCATCAGCCTGGTCACGG
326 CCATCGCCGTGGACCGCTATGTGGCCGTGCGGCACCCGCTGCGTGCCCGCGGGCTGCGGT
386 CCCCCAGGCAGGCTGCGGCCGTGTGCGCGGTCCTCTGGGTGCTGGTCATCGGCTCCCTGG
446 TGGCTCGCTGGCTCCTGGGGATTCAGGAGGGCGGCTTCTGCTTCAGGAGCACCCGGCACA
506 ATTTCAACTCCATGGCGTTCCCGCTGCTGGGATTCTACCTGCCCCTGGCCGTGGTGGTCT
566 TCTGCTCCCTGAAGGTGGTGACTGCCCTGGCCCAGAGGCCACCCACCGACGTGGGGCAGG
626 CAGAGGCCACCCGCAAGGCTGCCCGCATGGTCTGGGCCAACCTCCTGGTGTTCGTGGTCT
686 GCTTCCTGCCCCTGCACGTGGGGCTGACAGTGCGCCTCGCAGTGGGCTGGAACGCCTGTG
746 CCCTCCTGGAGACGATCCGTCGCGCCCTGTACATAACCAGCAAGCTCTCAGATGCCAACT
806 GCTGCCTGGACGCCATCTGCTACTACTACATGGCCAAGGAGTTCCAGGAGGCGTCTGCAC
866 TGGCCGTGGCTCCCAGTGCTAAGGCCCACAAAAGCCAGGACTCTCTGTGCGTGACCCTCG
926 CCTAA.......................................................
【０５７３】
ｉｖ．ＧＰＲ３５ｂのタンパク質配列
ＧＰＲ３５ｂのタンパク質配列（配列番号：３）（S. Okumura, H. Baba, T. Kumada, K. Nanmoku, H. Nakajima, Y. Nakane, K. Hioki, K. Ikenaka (2004) Cloning of a G-protein-coupled receptor that shows an activity to transform NIH3T3 cells and is expressed in gastric cancer cells, Cancer Sci. 95: 131-135）は次の通りである：
MLSGSRAVPTPHRGSEELLKYMLHSPCVSLTMNGTYNTCGSSDLTWPPAIKLGFYAYLGVLLVLGLLLNSLALWVFCCRMQQWTETRIYMTNLAVADLCLLCTLPFVLHSLRDTSDTPLCQLSQGIYLTNRYMSISLVTAIAVDRYVAVRHPLRARGLRSPRQAAAVCAVLWVLVIGSLVARWLLGIQEGGFCFRSTRHNFNSMAFPLLGFYLPLAVVVFCSLKVVTALAQRPPTDVGQAEATRKAARMVWANLLVFVVCFLPLHVGLTVRLAVGWNACALLETIRRALYITSKLSDANCCLDAICYYYMAKEFQEASALAVAPRAKAHKSQDSLCVTLA
【０５７４】
ｖ．ＧＰＲ３５ｂのｃＤＮＡ
ＧＰＲ３５ｂのｃＤＮＡ配列（配列番号：４）は次の通りである：
1 ATGCTGAGTGGTTCCCGGGCTGTCCCCACTCCACACCGTGGCAGTGAAGAGCTGCTGAAG
61 TACATGCTTCATAGTCCTTGCGTCTCTCTGACCATGAATGGCACCTACAACACCTGTGGC
121 TCCAGCGACCTCACCTGGCCCCCAGCGATCAAGCTGGGCTTCTACGCCTACTTGGGCGTC
181 CTGCTGGTGCTAGGCCTGCTGCTCAACAGCCTGGCGCTCTGGGTGTTCTGCTGCCGCATG
241 CAGCAGTGGACGGAGACCCGCATCTACATGACCAACCTGGCGGTGGCCGACCTCTGCCTG
301 CTGTGCACCTTGCCCTTCGTGCTGCACTCCCTGCGAGACACCTCAGACACGCCGCTGTGC
361 CAGCTCTCCCAGGGCATCTACCTGACCAACAGGTACATGAGCATCAGCCTGGTCACGGCC
421 ATCGCCGTGGACCGCTATGTGGCCGTGCGGCACCCGCTGCGTGCCCGCGGGCTGCGGTCC
481 CCCAGGCAGGCTGCGGCCGTGTGCGCGGTCCTCTGGGTGCTGGTCATCGGCTCCCTGGTG
541 GCTCGCTGGCTCCTGGGGATTCAGGAGGGCGGCTTCTGCTTCAGGAGCACCCGGCACAAT
601 TTCAACTCCATGGCGTTCCCGCTGCTGGGATTCTACCTGCCCCTGGCCGTGGTGGTCTTC
661 TGCTCCCTGAAGGTGGTGACTGCCCTGGCCCAGAGGCCACCCACCGACGTGGGGCAGGCA
721 GAGGCCACCCGCAAGGCTGCCCGCATGGTCTGGGCCAACCTCCTGGTGTTCGTGGTCTGC
781 TTCCTGCCCCTGCACGTGGGGCTGACAGTGCGCCTCGCAGTGGGCTGGAACGCCTGTGCC
841 CTCCTGGAGACGATCCGTCGCGCCCTGTACATAACCAGCAAGCTCTCAGATGCCAACTGC
901 TGCCTGGACGCCATCTGCTACTACTACATGGCCAAGGAGTTCCAGGAGGCGTCTGCACTG
961 GCCGTGGCTCCCAGTGCTAAGGCCCACAAAAGCCAGGACTCTCTGTGCGTGACCCTCGCC
1021 TAA
【０５７５】
ｖｉ．ｈＥＲＧ１ａのタンパク質配列
ｈＥＲＧ１ａのタンパク質配列（配列番号：５）（ＮＣＢＩ 参照配列：ＮＰ＿０００２２９．１）は次の通りである：
MPVRRGHVAPQNTFLDTIIRKFEGQSRKFIIANARVENCAVIYCNDGFCELCGYSRAEVMQRPCTCDFLHGPRTQRRAAAQIAQALLGAEERKVEIAFYRKDGSCFLCLVDVVPVKNEDGAVIMFILNFEVVMEKDMVGSPAHDTNHRGPPTSWLAPGRAKTFRLKLPALLALTARESSVRSGGAGGAGAPGAVVVDVDLTPAAPSSESLALDEVTAMDNHVAGLGPAEERRALVGPGSPPRSAPGQLPSPRAHSLNPDASGSSCSLARTRSRESCASVRRASSADDIEAMRAGVLPPPPRHASTGAMHPLRSGLLNSTSDSDLVRYRTISKIPQITLNFVDLKGDPFLASPTSDREIIAPKIKERTHNVTEKVTQVLSLGADVLPEYKLQAPRIHRWTILHYSPFKAVWDWLILLLVIYTAVFTPYSAAFLLKETEEGPPATECGYACQPLAVVDLIVDIMFIVDILINFRTTYVNANEEVVSHPGRIAVHYFKGWFLIDMVAAIPFDLLIFGSGSEELIGLLKTARLLRLVRVARKLDRYSEYGAAVLFLLMCTFALIAHWLACIWYAIGNMEQPHMDSRIGWLHNLGDQIGKPYNSSGLGGPSIKDKYVTALYFTFSSLTSVGFGNVSPNTNSEKIFSICVMLIGSLMYASIFGNVSAIIQRLYSGTARYHTQMLRVREFIRFHQIPNPLRQRLEEYFQHAWSYTNGIDMNAVLKGFPECLQADICLHLNRSLLQHCKPFRGATKGCLRALAMKFKTTHAPPGDTLVHAGDLLTALYFISRGSIEILRGDVVVAILGKNDIFGEPLNLYARPGKSNGDVRALTYCDLHKIHRDDLLEVLDMYPEFSDHFWSSLEITFNLRDTNMIPGSPGSTELEGGFSRQRKRKLSFRRRTDKDTEQPGEVSALGPGRAGAGPSSRGRPGGPWGESPSSGPSSPESSEDEGPGRSSSPLRLVPFSSPRPPGEPPGGEPLMEDCEKSSDTCNPLSGAFSGVSNIFSFWGDSRGRQYQELPRCPAPTPSLLNIPLSSPGRRPRGDVESRLDALQRQLNRLETRLSADMATVLQLLQRQMTLVPPAYSAVTTPGPGPTSTSPLLPVSPLPTLTLDSLSQVSQFMACEELPPGAPELPQEGPTRRLSLPGQLGALTSQPLHRHGSDPGS
【０５７６】
ｖｉｉ．ｈＥＲＧ１ａのｃＤＮＡ配列
ｈＥＲＧ１ａのｃＤＮＡ配列（配列番号：６）は次の通りである：
..........................................ATGCCGGTGCGGAGGGGC
19 CACGTCGCGCCGCAGAACACCTTCCTGGACACCATCATCCGCAAGTTTGAGGGCCAGAGC
79 CGTAAGTTCATCATCGCCAACGCTCGGGTGGAGAACTGCGCCGTCATCTACTGCAACGAC
139 GGCTTCTGCGAGCTGTGCGGCTACTCGCGGGCCGAGGTGATGCAGCGACCCTGCACCTGC
199 GACTTCCTGCACGGGCCGCGCACGCAGCGCCGCGCTGCCGCGCAGATCGCGCAGGCACTG
259 CTGGGCGCCGAGGAGCGCAAAGTGGAAATCGCCTTCTACCGGAAAGATGGGAGCTGCTTC
319 CTATGTCTGGTGGATGTGGTGCCCGTGAAGAACGAGGATGGGGCTGTCATCATGTTCATC
379 CTCAATTTCGAGGTGGTGATGGAGAAGGACATGGTGGGGTCCCCGGCTCATGACACCAAC
439 CACCGGGGCCCCCCCACCAGCTGGCTGGCCCCAGGCCGCGCCAAGACCTTCCGCCTGAAG
499 CTGCCCGCGCTGCTGGCGCTGACGGCCCGGGAGTCGTCGGTGCGGTCGGGCGGCGCGGGC
559 GGCGCGGGCGCCCCGGGGGCCGTGGTGGTGGACGTGGACCTGACGCCCGCGGCACCCAGC
619 AGCGAGTCGCTGGCCCTGGACGAAGTGACAGCCATGGACAACCACGTGGCAGGGCTCGGG
679 CCCGCGGAGGAGCGGCGTGCGCTGGTGGGTCCCGGCTCTCCGCCCCGCAGCGCGCCCGGC
739 CAGCTCCCATCGCCCCGGGCGCACAGCCTCAACCCCGACGCCTCGGGCTCCAGCTGCAGC
799 CTGGCCCGGACGCGCTCCCGAGAAAGCTGCGCCAGCGTGCGCCGCGCCTCGTCGGCCGAC
859 GACATCGAGGCCATGCGCGCCGGGGTGCTGCCCCCGCCACCGCGCCACGCCAGCACCGGG
919 GCCATGCACCCACTGCGCAGCGGCTTGCTCAACTCCACCTCGGACTCCGACCTCGTGCGC
979 TACCGCACCATTAGCAAGATTCCCCAAATCACCCTCAACTTTGTGGACCTCAAGGGCGAC
1039 CCCTTCTTGGCTTCGCCCACCAGTGACCGTGAGATCATAGCACCTAAGATAAAGGAGCGA
1099 ACCCACAATGTCACTGAGAAGGTCACCCAGGTCCTGTCCCTGGGCGCCGACGTGCTGCCT
1159 GAGTACAAGCTGCAGGCACCGCGCATCCACCGCTGGACCATCCTGCATTACAGCCCCTTC
1219 AAGGCCGTGTGGGACTGGCTCATCCTGCTGCTGGTCATCTACACGGCTGTCTTCACACCC
1279 TACTCGGCTGCCTTCCTGCTGAAGGAGACGGAAGAAGGCCCGCCTGCTACCGAGTGTGGC
1339 TACGCCTGCCAGCCGCTGGCTGTGGTGGACCTCATCGTGGACATCATGTTCATTGTGGAC
1399 ATCCTCATCAACTTCCGCACCACCTACGTCAATGCCAACGAGGAGGTGGTCAGCCACCCC
1459 GGCCGCATCGCCGTCCACTACTTCAAGGGCTGGTTCCTCATCGACATGGTGGCCGCCATC
1519 CCCTTCGACCTGCTCATCTTCGGCTCTGGCTCTGAGGAGCTGATCGGGCTGCTGAAGACT
1579 GCGCGGCTGCTGCGGCTGGTGCGCGTGGCGCGGAAGCTGGATCGCTACTCAGAGTACGGC
1639 GCGGCCGTGCTGTTCTTGCTCATGTGCACCTTTGCGCTCATCGCGCACTGGCTAGCCTGC
1699 ATCTGGTACGCCATCGGCAACATGGAGCAGCCACACATGGACTCACGCATCGGCTGGCTG
1759 CACAACCTGGGCGACCAGATAGGCAAACCCTACAACAGCAGCGGCCTGGGCGGCCCCTCC
1819 ATCAAGGACAAGTATGTGACGGCGCTCTACTTCACCTTCAGCAGCCTCACCAGTGTGGGC
1879 TTCGGCAACGTCTCTCCCAACACCAACTCAGAGAAGATCTTCTCCATCTGCGTCATGCTC
1939 ATTGGCTCCCTCATGTATGCTAGCATCTTCGGCAACGTGTCGGCCATCATCCAGCGGCTG
1999 TACTCGGGCACAGCCCGCTACCACACACAGATGCTGCGGGTGCGGGAGTTCATCCGCTTC
2059 CACCAGATCCCCAATCCCCTGCGCCAGCGCCTCGAGGAGTACTTCCAGCACGCCTGGTCC
2119 TACACCAACGGCATCGACATGAACGCGGTGCTGAAGGGCTTCCCTGAGTGCCTGCAGGCT
2179 GACATCTGCCTGCACCTGAACCGCTCACTGCTGCAGCACTGCAAACCCTTCCGAGGGGCC
2239 ACCAAGGGCTGCCTTCGGGCCCTGGCCATGAAGTTCAAGACCACACATGCACCGCCAGGG
2299 GACACACTGGTGCATGCTGGGGACCTGCTCACCGCCCTGTACTTCATCTCCCGGGGCTCC
2359 ATCGAGATCCTGCGGGGCGACGTCGTCGTGGCCATCCTGGGGAAGAATGACATCTTTGGG
2419 GAGCCTCTGAACCTGTATGCAAGGCCTGGCAAGTCGAACGGGGATGTGCGGGCCCTCACC
2479 TACTGTGACCTACACAAGATCCATCGGGACGACCTGCTGGAGGTGCTGGACATGTACCCT
2539 GAGTTCTCCGACCACTTCTGGTCCAGCCTGGAGATCACCTTCAACCTGCGAGATACCAAC
2599 ATGATCCCGGGCTCCCCCGGCAGTACGGAGTTAGAGGGTGGCTTCAGTCGGCAACGCAAG
2659 CGCAAGTTGTCCTTCCGCAGGCGCACGGACAAGGACACGGAGCAGCCAGGGGAGGTGTCG
2719 GCCTTGGGGCCGGGCCGGGCGGGGGCAGGGCCGAGTAGCCGGGGCCGGCCGGGGGGGCCG
2779 TGGGGGGAGAGCCCGTCCAGTGGCCCCTCCAGCCCTGAGAGCAGTGAGGATGAGGGCCCA
2839 GGCCGCAGCTCCAGCCCCCTCCGCCTGGTGCCCTTCTCCAGCCCCAGGCCCCCCGGAGAG
2899 CCGCCGGGTGGGGAGCCCCTGATGGAGGACTGCGAGAAGAGCAGCGACACTTGCAACCCC
2959 CTGTCAGGCGCCTTCTCAGGAGTGTCCAACATTTTCAGCTTCTGGGGGGACAGTCGGGGC
3019 CGCCAGTACCAGGAGCTCCCTCGATGCCCCGCCCCCACCCCCAGCCTCCTCAACATCCCC
3079 CTCTCCAGCCCGGGTCGGCGGCCCCGGGGCGACGTGGAGAGCAGGCTGGATGCCCTCCAG
3139 CGCCAGCTCAACAGGCTGGAGACCCGGCTGAGTGCAGACATGGCCACTGTCCTGCAGCTG
3199 CTACAGAGGCAGATGACGCTGGTCCCGCCCGCCTACAGTGCTGTGACCACCCCGGGGCCT
3259 GGCCCCACTTCCACATCCCCGCTGTTGCCCGTCAGCCCCCTCCCCACCCTCACCTTGGAC
3319 TCGCTTTCTCAGGTTTCCCAGTTCATGGCGTGTGAGGAGCTGCCCCCGGGGGCCCCAGAG
3379 CTTCCCCAAGAAGGCCCCACACGACGCCTCTCCCTACCGGGCCAGCTGGGGGCCCTCACC
3439 TCCCAGCCCCTGCACAGACACGGCTCGGACCCGGGCAGTTAG..................
【０５７７】
ｖｉｉｉ．ｈＥＲＧ１ｂのタンパク質配列
ｈＥＲＧ１ｂのタンパク質配列（配列番号：７）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿７４２０５３．１）は次の通りである：
MPVRRGHVAPQNTFLDTIIRKFEGQSRKFIIANARVENCAVIYCNDGFCELCGYSRAEVMQRPCTCDFLHGPRTQRRAAAQIAQALLGAEERKVEIAFYRKDGSCFLCLVDVVPVKNEDGAVIMFILNFEVVMEKDMVGSPAHDTNHRGPPTSWLAPGRAKTFRLKLPALLALTARESSVRSGGAGGAGAPGAVVVDVDLTPAAPSSESLALDEVTAMDNHVAGLGPAEERRALVGPGSPPRSAPGQLPSPRAHSLNPDASGSSCSLARTRSRESCASVRRASSADDIEAMRAGVLPPPPRHASTGAMHPLRSGLLNSTSDSDLVRYRTISKIPQITLNFVDLKGDPFLASPTSDREIIAPKIKERTHNVTEKVTQVLSLGADVLPEYKLQAPRIHRWTILHYSPFKAVWDWLILLLVIYTAVFTPYSAAFLLKETEEGPPATECGYACQPLAVVDLIVDIMFIVDILINFRTTYVNANEEVVSHPGRIAVHYFKGWFLIDMVAAIPFDLLIFGSGSEELIGLLKTARLLRLVRVARKLDRYSEYGAAVLFLLMCTFALIAHWLACIWYAIGNMEQPHMDSRIGWLHNLGDQIGKPYNSSGLGGPSIKDKYVTALYFTFSSLTSVGFGNVSPNTNSEKIFSICVMLIGSLMYASIFGNVSAIIQRLYSGTARYHTQMLRVREFIRFHQIPNPLRQRLEEYFQHAWSYTNGIDMNAVLKGFPECLQADICLHLNRSLLQHCKPFRGATKGCLRALAMKFKTTHAPPGDTLVHAGDLLTALYFISRGSIEILRGDVVVAILGMGWGAGTGLEMPSAASRGASLLNMQSLGLWTWDCLQGHWAPLIHLNSGPPSGAMERSPTWGEAAELWGSHILLPFRIRHKQTLFASLK
【０５７８】
ｉｘ．ｈＥＲＧ１ｂのｃＤＮＡ配列
ｈＥＲＧ１ｂのｃＤＮＡ配列（配列番号：８）は次の通りである：
...........................................ATGCCGGTGCGGAGGGG
18 CCACGTCGCGCCGCAGAACACCTTCCTGGACACCATCATCCGCAAGTTTGAGGGCCAGAG
78 CCGTAAGTTCATCATCGCCAACGCTCGGGTGGAGAACTGCGCCGTCATCTACTGCAACGA
138 CGGCTTCTGCGAGCTGTGCGGCTACTCGCGGGCCGAGGTGATGCAGCGACCCTGCACCTG
198 CGACTTCCTGCACGGGCCGCGCACGCAGCGCCGCGCTGCCGCGCAGATCGCGCAGGCACT
258 GCTGGGCGCCGAGGAGCGCAAAGTGGAAATCGCCTTCTACCGGAAAGATGGGAGCTGCTT
318 CCTATGTCTGGTGGATGTGGTGCCCGTGAAGAACGAGGATGGGGCTGTCATCATGTTCAT
378 CCTCAATTTCGAGGTGGTGATGGAGAAGGACATGGTGGGGTCCCCGGCTCATGACACCAA
438 CCACCGGGGCCCCCCCACCAGCTGGCTGGCCCCAGGCCGCGCCAAGACCTTCCGCCTGAA
498 GCTGCCCGCGCTGCTGGCGCTGACGGCCCGGGAGTCGTCGGTGCGGTCGGGCGGCGCGGG
558 CGGCGCGGGCGCCCCGGGGGCCGTGGTGGTGGACGTGGACCTGACGCCCGCGGCACCCAG
618 CAGCGAGTCGCTGGCCCTGGACGAAGTGACAGCCATGGACAACCACGTGGCAGGGCTCGG
678 GCCCGCGGAGGAGCGGCGTGCGCTGGTGGGTCCCGGCTCTCCGCCCCGCAGCGCGCCCGG
738 CCAGCTCCCATCGCCCCGGGCGCACAGCCTCAACCCCGACGCCTCGGGCTCCAGCTGCAG
798 CCTGGCCCGGACGCGCTCCCGAGAAAGCTGCGCCAGCGTGCGCCGCGCCTCGTCGGCCGA
858 CGACATCGAGGCCATGCGCGCCGGGGTGCTGCCCCCGCCACCGCGCCACGCCAGCACCGG
918 GGCCATGCACCCACTGCGCAGCGGCTTGCTCAACTCCACCTCGGACTCCGACCTCGTGCG
978 CTACCGCACCATTAGCAAGATTCCCCAAATCACCCTCAACTTTGTGGACCTCAAGGGCGA
1038 CCCCTTCTTGGCTTCGCCCACCAGTGACCGTGAGATCATAGCACCTAAGATAAAGGAGCG
1098 AACCCACAATGTCACTGAGAAGGTCACCCAGGTCCTGTCCCTGGGCGCCGACGTGCTGCC
1158 TGAGTACAAGCTGCAGGCACCGCGCATCCACCGCTGGACCATCCTGCATTACAGCCCCTT
1218 CAAGGCCGTGTGGGACTGGCTCATCCTGCTGCTGGTCATCTACACGGCTGTCTTCACACC
1278 CTACTCGGCTGCCTTCCTGCTGAAGGAGACGGAAGAAGGCCCGCCTGCTACCGAGTGTGG
1338 CTACGCCTGCCAGCCGCTGGCTGTGGTGGACCTCATCGTGGACATCATGTTCATTGTGGA
1398 CATCCTCATCAACTTCCGCACCACCTACGTCAATGCCAACGAGGAGGTGGTCAGCCACCC
1458 CGGCCGCATCGCCGTCCACTACTTCAAGGGCTGGTTCCTCATCGACATGGTGGCCGCCAT
1518 CCCCTTCGACCTGCTCATCTTCGGCTCTGGCTCTGAGGAGCTGATCGGGCTGCTGAAGAC
1578 TGCGCGGCTGCTGCGGCTGGTGCGCGTGGCGCGGAAGCTGGATCGCTACTCAGAGTACGG
1638 CGCGGCCGTGCTGTTCTTGCTCATGTGCACCTTTGCGCTCATCGCGCACTGGCTAGCCTG
1698 CATCTGGTACGCCATCGGCAACATGGAGCAGCCACACATGGACTCACGCATCGGCTGGCT
1758 GCACAACCTGGGCGACCAGATAGGCAAACCCTACAACAGCAGCGGCCTGGGCGGCCCCTC
1818 CATCAAGGACAAGTATGTGACGGCGCTCTACTTCACCTTCAGCAGCCTCACCAGTGTGGG
1878 CTTCGGCAACGTCTCTCCCAACACCAACTCAGAGAAGATCTTCTCCATCTGCGTCATGCT
1938 CATTGGCTCCCTCATGTATGCTAGCATCTTCGGCAACGTGTCGGCCATCATCCAGCGGCT
1998 GTACTCGGGCACAGCCCGCTACCACACACAGATGCTGCGGGTGCGGGAGTTCATCCGCTT
2058 CCACCAGATCCCCAATCCCCTGCGCCAGCGCCTCGAGGAGTACTTCCAGCACGCCTGGTC
2118 CTACACCAACGGCATCGACATGAACGCGGTGCTGAAGGGCTTCCCTGAGTGCCTGCAGGC
2178 TGACATCTGCCTGCACCTGAACCGCTCACTGCTGCAGCACTGCAAACCCTTCCGAGGGGC
2238 CACCAAGGGCTGCCTTCGGGCCCTGGCCATGAAGTTCAAGACCACACATGCACCGCCAGG
2298 GGACACACTGGTGCATGCTGGGGACCTGCTCACCGCCCTGTACTTCATCTCCCGGGGCTC
2358 CATCGAGATCCTGCGGGGCGACGTCGTCGTGGCCATCCTGGGTATGGGGTGGGGGGCGGG
2418 CACTGGACTGGAAATGCCCTCTGCAGCCTCAAGAGGTGCGAGCCTTCTGAATATGCAGTC
2478 ACTGGGGCTGTGGACCTGGGACTGCCTGCAGGGTCACTGGGCTCCTTTAATTCACCTAAA
2538 CTCAGGCCCTCCAAGCGGGGCCATGGAGAGGAGCCCCACGTGGGGTGAGGCTGCTGAACT
2598 CTGGGGTTCCCACATTCTCCTTCCCTTCAGGATCCGCCACAAACAGACACTTTTTGCTTC
2658 CTTAAAGTAG..................................................
【０５７９】
参考文献
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２．  米国特許出願公開第２００７／０１６１７７６号明細書。He, M., Fused thiophenes, methods for making fused thiophenes, and uses thereof.
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１８．  米国特許第５,５０８,４４０号明細書。C.T. Chang, C.-T. Lee, F.L. Lin  (Hydroxymethyl)polythiophene derivatives useful for preventing inflammation and edema.
【図１Ａ】
2013535448.tif 000060
【図１Ｂ】
2013535448.tif 000061
【図２Ａ】
2013535448.tif 000062
【図２Ｂ】
2013535448.tif 000063
【図２Ｃ】
2013535448.tif 000064
【図３Ａ】
2013535448.tif 000065
【図３Ｂ】
2013535448.tif 000066
【図３Ｃ】
2013535448.tif 000067
【図３Ｄ】
2013535448.tif 000068
【図４Ａ】
2013535448.tif 000069
【図４Ｂ】
2013535448.tif 000070
【図４Ｃ】
2013535448.tif 000071
【図４Ｄ】
2013535448.tif 000072
【図４Ｅ】
2013535448.tif 000073
【図４Ｆ】
2013535448.tif 000074
【図５Ａ】
2013535448.tif 000075
【図５Ｂ】
2013535448.tif 000076
【図５Ｃ】
2013535448.tif 000077
【図６Ａ】
2013535448.tif 000078
【図６Ｂ】
2013535448.tif 000079
【図６Ｃ】
2013535448.tif 000080
【図６Ｄ】
2013535448.tif 000081
【図７Ａ】
2013535448.tif 000082
【図７Ｂ】
2013535448.tif 000083
【図８】
2013535448.tif 000084
【図９Ａ】
2013535448.tif 000085
【図９Ｂ】
2013535448.tif 000086
【図９Ｃ】
2013535448.tif 000087
【図１０Ａ】
2013535448.tif 000088
【図１０Ｂ】
2013535448.tif 000089
【図１０Ｃ】
2013535448.tif 000090
【図１１Ａ】
2013535448.tif 000091
【図１１Ｂ】
2013535448.tif 000092
【図１２】
2013535448.tif 000093
【図１３】
2013535448.tif 000094
【図１４】
2013535448.tif 000095
【図１５Ａ】
2013535448.tif 000096
【図１５Ｂ】
2013535448.tif 000097
【図１６】
2013535448.tif 000098
【図１７】
2013535448.tif 000099
【配列表】
2013535448000001.app
【国際調査報告】
2013535448.tif 000100
2013535448.tif 000101
2013535448.tif 000102
2013535448.tif 000103
2013535448.tif 000104
2013535448.tif 000105
2013535448.tif 000106