(57)【要約】  【解決手段】  ＡＤＨＤの検出および治療のための組成物および方法が提供される。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験被験者における注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）を発症するリスクの上昇を検出する方法であって、
ａ）前記被験者から核酸試料を取得する工程および前記試料がＡＤＨＤ関連コピー数多型（ＣＮＶ）の存在を示す少なくとも１つのインフォーマティブＳＮＰを含有するか否かを判定する工程であって、前記ＳＮＰが検出された場合に前記患者がＡＤＨＤ発症のリスクの上昇を有し、前記ＳＮＰ含有核酸が表１３に提供されるものから成るＳＮＰの群から選択されるものである、前記判定する工程を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記標的核酸は検出前に増幅されるものである方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記ＳＮＰの存在を検出する工程が特異的ハイブリダイゼーションの検出、アレルサイズの測定、制限断片長多型解析、アレル特異的ハイブリダイゼーション解析、単一塩基プライマ伸長反応、および増幅ポリヌクレオチドの配列決定から成る群から選択される過程を使用して行われるものである方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記標的核酸はＤＮＡである方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記ＳＮＰを含む核酸はヒト試験被験者の単離細胞から取得されるものである方法。
【請求項６】
神経シグナル伝達および／または神経細胞形態を改変する治療剤を同定する方法であって、
ａ）請求項１記載の少なくとも１つのＣＮＶ含有核酸を発現する細胞を提供する工程と；
ｂ）工程ａ）のＣＮＶ含有核酸に対応する同種の野生型配列を発現する細胞を提供する工程と；
ｃ）工程ａ）およびｂ）の細胞を試験薬剤と接触させる工程と；
ｄ）前記薬剤が工程ａ）の細胞の神経シグナル伝達および／または形態を工程ｂ）の細胞と比較して改変するかどうかを分析する工程であって、これにより神経シグナル伝達および形態を改変する薬剤を同定するものである、前記分析する工程とを有する方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記薬剤はｍＧｌｕＲポジティブ・アロステリック・モジュレータ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ：ＰＡＭ）、ｍＧｌｕＲネガティブ・アロステリック・モジュレータ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：ＮＡＭ）、およびタキキニン−３／ニューロキニン−３受容体（ＴＡＣＲ３／ＮＫ３Ｒ）アンタゴニストから成る群から選択されるものである方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記ｍＧｌｕＲ  ＰＡＭはＡＭＮ０８２、ＡＤＸ６３３６５、ＡＤＸ５０９３８、およびＡＤＸ７１１４９から成る群から選択されるものである方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、前記ｍＧｌｕＲ  ＮＡＭはＬＹ３４１４９５およびＡＤＸ４８６２１から成る群から選択されるものである方法。
【請求項１０】
請求項７記載の方法において、前記ＴＡＣＲ３／ＮＫ３ＲアンタゴニストはＧＳＫ１１４４８１４およびＳＢ２２３４１２（タルネタント）から成る群から選択されるものである方法。
【請求項１１】
請求項６記載の方法において、前記治療剤はＡＤＨＤまたは他の関連神経発達障害の治療に効力を有するものである方法。
【請求項１２】
ＡＤＨＤの治療を必要とする患者におけるＡＤＨＤを治療する方法であって、請求項６によって同定された薬剤の有効量の投与を有するものである方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記薬剤は代謝型グルタミン酸受容体遺伝子の活性を調節するものである方法。
【請求項１４】
多重ＳＮＰパネルであって、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶの存在について情報を与える核酸を有し、前記パネルは表１３に提供される核酸を含有するものである方法。
【請求項１５】
請求項１４記載のＳＮＰ含有核酸の少なくとも１つを有するベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４記載のＡＤＨＤ関連ＳＮＰ含有核酸を有する固体支持体。
【請求項１８】
請求項１記載の方法を行うためのキットであって、単離された核酸試料中でのＡＤＨＤ関連ＣＮＶの存在について情報を与える核酸を有する多重ＳＮＰパネルを有し、前記パネルは表１３に提供される核酸を含有するものであるキット。
【請求項１９】
請求項１８記載のキットにおいて、前記パネルは固体支持体に固定されているものであるキット。
【請求項２０】
請求項１８記載のキットにおいて、前記パネルはインシリコで提供されるものであるキット。
【請求項２１】
ＡＤＨＤ関連コピー数多型の存在を示す少なくとも１つの一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を有すると判定されたヒト被験者において、注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）を治療する方法であって、前記少なくとも１つのＳＮＰは表１３に示されるＳＮＰから成る群から選択され、表１に示される薬剤の少なくとも１つの治療的有効量を前記ヒト被験者に投与する工程を有するものである方法。
【請求項２２】
ＡＤＨＤ関連コピー数多型の存在を示す少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を有すると判定されたヒト被験者において注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）を治療する方法であって、前記少なくとも１つのＳＮＰは表１３に示されるＳＮＰから成る群から選択され、ピラセタム系向知性剤の少なくとも１つの治療的有効量を前記ヒト被験者に投与する工程を有するものである方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２記載の方法において、前記ＳＮＰは代謝型グルタミン酸受容体５（ＧＲＭ  ５）、代謝型グルタミン酸受容体７（ＧＲＭ  ７）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ  ８）の少なくとも１つの欠失である方法。
【請求項２４】
請求項２１または２２記載の方法において、前記ＳＮＰは代謝型グルタミン酸受容体１の重複である方法。
【請求項２５】
請求項２１または２２記載の方法において、前記向知性剤はピログルタミドである方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、前記ピログルタミドは（＋）−５−オキソ−Ｄ−プロリンピペリジンアミド１水和物（ＮＳ−１０５）である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝学の分野および注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）の診断に関するものである。さらに詳細には、本発明は、ＡＤＨＤの診断および治療に有用な組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの刊行物および特許文献は、本発明の属する技術分野の状態を記述するため、明細書に引用されている。これらの引用はそれぞれ完全にこの参照により組み込まれる。
【０００３】
注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）は、遺伝率推定値が３０から９０％に及ぶ一般的な精神神経障害である（Ｄｅｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｈａｂｅｒｓｔｉｃ，ｅｔ  ａｌ．２００８）。大半の神経発達障害はゲノムワイド関連（ＧＷＡ）手法に抵抗性であったが、近年、自閉症で進歩が見られた（Ｇｌｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｄｅｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｗｏｄ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｈａｂｅｒｓｔｉｃ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９）。ＧＷＡ研究はＡＤＨＤにおいて、国際多施設間ＡＤＨＤ遺伝学（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ＡＤＨＤ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＩＭＡＧＥ）研究を通じて募集した両親と子供の３人１組、計９５８組によるコホートを利用して報告されている。この研究の結果によって、ゲノムワイド有意レベルでの関連は一切報告されなかった（Ｆｒａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｎｅａｌｅ，ｅｔ  ａｌ．２００８）。Ｌａｓｋｙ−Ｓｕおよび共同研究者らは、ＡＤＨＤの定量的な尺度を使用して、ＣＤＨ１３（ｒｓ６５６５１１３）およびＧＦＯＤ１（ｒｓ５５２６５５）に位置するタギングＳＮＰｓのＰＢＡＴ解析による名目上の証拠を最近報告した（Ｌａｓｋｙ−Ｓｕ，ｅｔ  ａｌ．２００８）。ＣＤＨ１３に影響するｒｓ６５６５１１３との強い連鎖不平衡にあるＳＮＰも、ＡＤＨＤ成人の個別の試料のＧＷＡ研究で報告された（Ｌｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．２００８）。出願人は、我々が募集した最初のＡＤＨＤ症例３３５名で観察したコピー数多型（ＣＮＶ）遺伝子座について以前報告した（Ｅｌｉａ，ｅｔ  ａｌ．２００９）。その研究で検出したＣＮＶ遺伝子座のいずれも有意基準を満足していなかったが、注目すべきことに、１つのファミリが、罹患した父親からの遺伝による３人の罹患児すべてに影響するＧＲＭ５欠失を有することが観察された。ＡＤＨＤを有する１ファミリで、ＧＲＭ７欠失がさらに検出された（Ｅｌｉａ，ｅｔ  ａｌ．２００９）。代謝型グルタミン酸受容体（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｍＧｌｕＲ）のＣＮＶｓは、ＡＤＨＤにおけるＮＫ３遺伝子の発見に加えて、ＡＤＨＤ治療の新たな治療的手法を示唆している。
【０００４】
関連する遺伝的改変に基づくこの障害のための、改良された正確な診断試験の開発は、非常に望ましい。このような試験によって、確定診断が容易となり、ＡＤＨＤの治療に効力を有する治療剤の開発のための手段が提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明により、ＡＤＨＤの診断および治療のための方法が提供される。例示的な方法は、標的ポリヌクレオチド内で少なくとも１つのＣＮＶの存在を検出することを伴い、前記ＣＮＶ（ｓ）が存在する場合、前記患者はＡＤＨＤを発症するリスクが高い。
【０００６】
本発明の一観点において、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を発症する傾向を、これを必要とする患者において検出する方法が提供される。例示的な方法は、標的ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのＳＮＰを含む核酸の存在の検出を伴い、前記ＳＮＰはＡＤＨＤ関連コピー数多型（ＣＮＶ）の存在について情報を与え、前記ＳＮＰが存在する場合、前記患者はＡＤＨＤを発症する高いリスクを有し、前記ＳＮＰを含有する核酸は、表１３に提供される。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、神経シグナル伝達および／または形態を変化させる薬剤を同定する方法が提供される。このような方法は、本発明のＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓを含む少なくとも１つの核酸を発現する細胞を提供する工程（工程ａ）と、ＣＮＶが欠失した同種の野生型配列を発現する細胞を提供する工程（工程ｂ）と、各試料由来の細胞を試験薬剤と接触させる工程と、前記薬剤が工程ａ）の細胞の神経シグナル伝達および／または形態を工程ｂ）の細胞と比較して改変するかどうかを分析して、これにより神経シグナル伝達および形態を改変する薬剤を同定する工程とを含む。好ましい実施形態において、前記試験薬剤は代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）遺伝子活性を調節する。別の実施形態において、前記試験薬剤は、ｍＧｌｕＲポジティブ・アロステリック・モジュレータ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ：ＰＡＭ）（たとえばｍＧｌｕＲ５  ＰＡＭ、ｍＧｌｕＲ７  ＰＡＭ）、ｍＧｌｕＲネガティブ・アロステリック・モジュレータ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：ＮＡＭ）（たとえばｍＧｌｕＲ２／３  ＮＡＭ）、およびタキキニン−３／ニューロキニン−３受容体（ＴＡＣ３／ＮＫ３Ｒ）アンタゴニストから成る群から選択される。別の実施形態において、前記試験薬剤は、ＡＤＸ６３３６５、ＡＤＸ５０９３８、ＡＤＸ７１１４９、ＡＤＸ４８６２１、ＡＭＮ０８２、１−（ヘテロ）アリール−３−アミノ−ピロリジン誘導体（たとえば米国特許出願２００８／０３００２６６号で提供されているもの）、ＬＹ３４１４９５、ＧＳＫ１１４４８１４、およびＳＢ２２３４１２から成る群から選択される。ＡＤＨＤ患者を治療する方法であって、これを必要とする患者において本明細書に記載する方法を使用して同定された試験薬剤の投与によってＡＤＨＤ患者を治療する方法も、本発明に含まれる。本発明は、表１３に挙げた群より選択される、少なくとも１つの単離されたＡＤＨＤ関連ＳＮＰ含有核酸も提供する。一実施形態において、表１３からのインフォーマティブＳＮＰｓすべてを含有する多重ＳＮＰパネルが提供される。ＡＤＨＤ関連ＣＮＶ（ｓ）の存在を示すこのようなＳＮＰ含有核酸は、神経細胞中での発現のための好適な発現ベクターに選択的に含有されることができる。または、これらは固形支持体に固定化することができる。なお別の代案において、パネルはインシリコで提供することができる。
【０００８】
本発明のなお別の観点により、以下に記載するようなＡＤＨＤ関連コピー数多型の存在を示す少なくとも１つの規定された一塩基多型を有すると判定された患者において、患者にピラセタム系向知性剤の少なくとも１つのメンバの治療的有効量を投与することにより、ＡＤＨＤを治療する方法が提供される。本方法は試験および治療のパラダイムを提供し、このパラダイムにより、患者の遺伝的プロフィールを使用して、ＡＤＨＤを示す個人に見出される特異的な神経生理学的欠陥を標的とする治療剤による治療をパーソナライズする。このような試験および治療モデルは、非パーソナライズ治療よりも高い効力および少ない副作用で、ＡＤＨＤ患者の最大５０％に恩恵をもたらす可能性がある。このため、グルタミン酸作動性シグナル伝達の改変を示すいずれの患者も、このような遺伝的改変の存在について試験を行って、次に上に挙げた薬剤などの適切な医薬品によって治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、対照（下パネル）と比較した、個別の症例ごとのＣＮＶコールのグラフ分布（上パネル）である。
【図２】図２は、正規化ＳＮＰレベルＰｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋデータのグラフ表示である。Ｘ軸は、染色体１１上のメガベースでの塩基対位置を示す。適応ＰｅｎｎＣＮＶ−Ａｆｆｙプロトコルによって正規化されたＩＭＡＧＥ  Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋデータによる５つの試料のＧＲＭ５欠失を示すＳＮＰレベル未加工データ。Ｂアレル頻度（Ｂ−ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＢＡＦ）と呼ばれる遺伝子型データおよびＬｏｇ  Ｒ比（Ｌｏｇ  Ｒ  Ｒａｔｉｏ：ＬＲＲ）と呼ばれる強度データがプロットされている。
【図３】図３は、フルＳＮＰレベルデータ：Ａ）正規化Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋデータ、Ｂ）正規化Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １Ｍ  ＰＵＷＭａデータ、およびＣ）正規化Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５．０  ＩＭＡＧＥ  ＩＩデータのグラフである。
【図４】図４は、ＩＭＡＧＥ  Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋ独立妥当性確認データのグラフ表示である。Ｒｏｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプローブを使用する蛍光プローブベースｑＰＣＲアッセイは、各候補ＣＮＶを完全に独立した試験によって妥当性確認するために設計された（報告された遺伝子座について複製ＣＮＶコールを持つ１４のＩＭＡＧＥ試料のうち１１が妥当性確認に利用可能であり、すべてが対照対と比較して妥当性確認された；他の３の遺伝子座は目視で妥当性確認された）。エラーバーは、４回の実験の標準偏差を示す。Ｄｅｌ、欠失；Ｄｕｐ、重複。
【図５】図５は、Ｅｉｇｅｎｓｔｒａｔ主成分分析の図示である。症例対照ＣＮＶ関連における集団下部構造を最小化するために、症例および対照を同時に分析した。示されたコーカサスクラスタから逸脱する試料は除去した。Ｐｌｉｎｋ内のゲノムインフレーション因子（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｆｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＩＦ）は、許容されるレベルであった（ＧＩＦ＝１．０２４０９）。我々はペアワイズ集団一致も確認して、欧州の超階層化亜集団に特異的な低頻度ＣＮＶｓを生じさせることがある潜在的血縁度を調査および除外した。
【図６】図６は、適用されたＳＮＰベース統計値および得られた最高有意性領域Ｃａｌｌｅｄの例である。ｃｈｒ３からの例を示す：Ａ）１，３２７，９６３〜２，３７６，０９５およびＢ）１，８４７，０００〜１，８６２，２６１。複雑なＣＮＶ重複は、ＳＮＰベース統計値を生成することにより単純化される。欠失した症例および欠失した対照のプロットで見られるように、各ＳＮＰは特異的な数のＣＮＶｓを有する。症例および対照をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定と比較して、負のｌｏｇ  Ｐ値を第３のプロットに示す。１０の累乗以内に及ぶ有意性の領域が報告され、１ＭＢ以内の最高有意性の領域（極少Ｐ値）が報告されている。ＩＭＡＧＥ症例欠失プロットは、残りの赤色領域３’が親であるため、１症例の試料＃１１９３９のみ示している。
【図７】図７は、ｑＰＣＲを使用するＣＨＯＰ  ＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨａｐ５５０独立妥当性確認である。Ｒｏｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプローブを使用する蛍光プローブベースｑＰＣＲアッセイは、各候補ＣＮＶを完全に独立した試験によって妥当性確認するために設計された（症例および対照対の各遺伝子座について示されている代表的なシリーズ）。エラーバーは、４回の実験の標準偏差を示す。Ｄｅｌ、欠失；Ｄｕｐ、重複。
【図８】図８は、Ｂアレル頻度（ＢＡＦ）およびＬｏｇ  Ｒ比（ＬＲＲ）に基づくＣＮＶ観察の例である。
【図９】図９は、ＡＤＨＤ症例に限定されている、ならびにＩＭＡＧＥおよびＰＵＷＭａで複製された、ＧＲＭ５に直接影響する欠失の図示である。４つのＣＨＯＰ  ＡＤＨＤ症例のＧＲＭ５の半接合欠失は、ＩＭＡＧＥおよび１  ＰＵＷＭａ欠失にて見出された２つの欠失および３つのより大規模な欠失によって複製された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ５５０ｋ、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００ｋ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １Ｍ、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５．０アレイのＳＮＰ範囲は青色の縦線として示す。
【図１０】図１０は、ＡＤＨＤにおいて影響を受けるＧＲＭ受容体遺伝子の相互作用ネットワークの図示である。ＧＲＭ受容体遺伝子は大きな菱形のノードとして示すが、２度以内の他の相互作用遺伝子は相互作用の場合、より小さい円形ノードとして示す。ノードは、ＣＮＶｓの濃縮を表すために着色されている：暗赤色は、症例にて濃縮された欠失であり、薄赤色は対照にて濃縮された欠失であり、暗緑色は症例にて濃縮された重複であり、薄緑色は対照にて濃縮された重複であり、灰色は２倍体でＣＮＶｓを持たない。青色太破線は、少なくとも１つのＧＲＭ遺伝子に関連付けられた端部を強調しているが、灰色細点線は、他のすべての遺伝子相互作用を表す。有意な機能アノテーションのために、濃縮された高度に関連付けられたモジュールは、青色斜線付き楕円形によって強調表示されている。
【図１１】図１１は、機能的有意性について、ＡＤＨＤにて影響を受けるＧＲＭ受容体と濃縮された遺伝子モジュールとの相互作用を示す概略図である。ＧＲＭ受容体遺伝子は、緑色または赤色菱形として示され、症例で濃縮された重複および欠失をそれぞれ表す。ボックスは、ＧＯアノテーションのための、有意に濃縮された相互作用遺伝子のネットワークによって定義される機能モジュールを強調表示する。機能モジュールは、重要な機能アノテーションについて記載し、クラスタ名およびカッコ内のコンポーネント遺伝子の数が表示されている。ＡＤＨＤの根底にある病態生理に特に関連する機能アノテーションは、太字とする。ネットワークの端部は、ＧＲＭ受容体遺伝子を機能モジュールに関連付けており、実線は、機能モジュール内のＧＲＭ相互作用遺伝子のメンバーシップを示し、点線は、ＧＲＭ受容体遺伝子と機能モジュールの少なくとも１つのコンポーネント遺伝子との第１度関係を示す。
【図１２】図１２は、ＣＮＶペニンシュラ偽陽性関連の例である。ｃｈｒ  ２による例を示す（位置５１、７７７、６１６−５１、７８４、０３３）。すべての重要なＣＮＶＲｓが、境界切断における不確定性を示すＣＮＶペニンシュラについて検討されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）は、病因が不明である一般的な遺伝性の精神神経障害である。近年、我々は、自閉症における学習、挙動、シナプス伝達および中枢神経系の発達に関与する遺伝子の低頻度変異体の濃縮について報告して１、低頻度遺伝性構造変異体も関連精神神経障害であるＡＤＨＤの病因で役割を果たす可能性があることを示唆した。
【００１１】
この研究を追跡するために、我々は、５５０，０００個のＳＮＰマーカーによって遺伝子型が同定されたヨーロッパ系のＡＤＨＤ症例１，０１３名および健常小児４，１０５名のコホートで、全ゲノムＣＮＶ研究を実施した。総計でヨーロッパ系のＡＤＨＤ症例２，４９３名および対照９，２２２名となる複数の独立したコホートで陽性所見を評価し、各症例−対照コホートには対応プラットフォームで遺伝子型を同定した。
【００１２】
我々の結果は、すべての独立コホートにわたって有意に濃縮された代謝型グルタミン酸受容体遺伝子に影響する複数のＣＮＶｓを同定した（Ｐ＝２．１×１０−９）。このうち、ＧＲＭ５（代謝型グルタミン酸受容体５）における欠失は、３つの独立コホートにわたる症例１０名および対照被験者１名のみで発生した（Ｐ＝１．３６×１０−６）。加えて、ＧＲＭ７における欠失は症例６名で、ＧＲＭ８における欠失は症例８名で発生し、どちらも対照の頻度はゼロであった。ＧＲＭ１は症例８名で重複しており、対照を超えて顕著に濃縮された頻度である。観察された変異体は、定量ＰＣＲを使用して実験的に妥当性確認を行った。続いての遺伝子ネットワーク解析によって、対照と比較して、症例ではＧＲＭ受容体と相互作用する遺伝子は、ＣＮＶｓが有意に濃縮され（Ｐ＝４．３８×１０−１０）、本研究においてはＡＤＨＤ症例の約１０％に集団的に影響していることが示された。さらに我々は、ＧＲＭｓが相互作用遺伝子の高度に連結されたモジュールを調整する重要なハブとして作用して、相互作用遺伝子の多くがＣＮＶｓを持ち、シナプスおよび神経生物機能が濃縮されていることを見出した。
【００１３】
以下の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
Ｉ．定義：
本発明の目的のために、「ａ」または「ａｎ」要素は、その要素の１若しくはそれ以上を指す。たとえば「ｃＤＮＡ」は、１若しくはそれ以上のｃＤＮＡまたは少なくとも１つのｃＤＮＡを指す。したがって、「ａ」または「ａｎ」、「１若しくはそれ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用できる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語が互換的に使用できることにも留意する。さらに、「から成る群から選択される」化合物は、２若しくはそれ以上の化合物の混合物（すなわち配合物）を含む、以下のリスト内の１若しくはそれ以上の化合物を指す。本発明により、単離された、または生物学的に純粋な分子は、その天然環境から除去された化合物である。したがって、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、化合物が精製された程度を必ずしも反映しているわけではない。本発明の単離された化合物はその天然源から入手することができるか、実験室合成方法を使用して産生できるか、またはこのような化学合成経路のいずれによっても産生できる。
【００１４】
「遺伝的改変」という用語は、本明細書で使用する場合、１若しくはそれ以上の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を指す。遺伝的改変は制限なく、既知配列の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドの塩基対の置換、付加および欠失を含む。
【００１５】
「一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）」は、ＤＮＡ中の単一の塩基がその位置の通常の塩基とは異なっている変化を指す。このような単一の塩基の変化は、ＳＮＰｓまたは「ｓｎｉｐｓ」と呼ばれる。ヒトゲノムには数百万個のＳＮＰｓが記載されている。鎌状赤血球を引き起こすような一部のＳＮＰｓは、疾患に関与する。他のＳＮＰは、ゲノムにおける正常な変異である
「コピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＮＶ）」は、個人のゲノムにおける特定の遺伝子またはそのセグメントのコピー数を指す。ＣＮＶｓは、ヒトの表現型多様性の主要な遺伝的コンポーネントを表す。遺伝的障害に対する感受性は、一塩基多型（ＳＮＰ）だけではなく、ＣＮＶｓを含む構造的および他の遺伝的変異にも関連していることが公知である。ＣＮＶは、約１キロベース（ｋｂ）若しくはそれ以上であるＤＮＡ断片を包含するコピー数の変化を表す（Ｆｅｕｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６ａ）。本明細書に記載するＣＮＶｓは、今後のＣＮＶ解析の複雑性を最小限に抑えるために、転移性因子（たとえば約６ｋｂ  ＫｐｎＩ反復）の挿入／欠失から生じる変異体を含んでいない。ゆえにＣＮＶという用語は、大規模コピー数変異体（ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ：ＬＣＶｓ；Ｉａｆｒａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、コピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＣＮＰｓ；Ｓｅｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、および中型変異体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｓｉｚｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ：ＩＳＶｓ；Ｔｕｚｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５）などの以前に導入された用語を含むが、レトロポゾン挿入は含まない。「重複含有ＣＮＶ」も、提供したＣＮＶの定義と一致して、以下で使用される。
【００１６】
「ＡＤＨＤ関連ＳＮＰ」または「ＡＤＨＤ関連特異的マーカー」またはＡＤＨＤ関連情報配列分子」は、ＡＤＨＤを発症するリスクの上昇または低下に関連して、この疾患を有さない通常の患者には見出されない、ＳＮＰまたはマーカー配列である。このようなマーカーは、これに限定されるものではないが、核酸、核酸によってコードされたタンパク質、または他の小分子を含む。このため、「ＡＤＨＤ関連ＳＮＰ含有核酸」という語句は、上の説明に含まれる。
【００１７】
「固体マトリックス」という用語は、本明細書で使用する場合、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェル若しくは試験管の表面、またはディップスティック若しくはフィルタなどのいずれの形式も指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースである。
【００１８】
「本質的に〜から成る」という表現は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を指す場合、所与の配列ＩＤ番号の特性を有する配列を意味する。たとえば、アミノ酸配列に関して使用する場合、この語句は、配列の機能的および新規特徴に影響しない配列それ自体および分子修飾を含む。
【００１９】
「部分インフォーマティブＣＮＶ」という語句は、染色体上に重複を含む配列にハイブリダイズする核酸を指すために本明細書で使用するが、部分インフォーマティブＣＮＶは、重複と同一でない可能性があり、むしろＣＮＶは、重複の一部のみに一致する可能性があるが、それでもなおそれについて情報を与える。
【００２０】
「標的核酸」は、本明細書で使用する場合、複合核酸混合物中に存在する核酸の以前に定義された領域を指し、ここで定義された野生型領域は、ＡＤＨＤに関連する可能性があるが、または関連する可能性がないが、ＡＤＨＤのリスクについて情報を与える、少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異を含有する。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニング若しくはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離するか、または手動で合成することができる。核酸分子は、トリエステル合成方法によって手動で、またはＤＮＡ自動合成装置によって合成することができる。
【００２１】
本発明で使用する核酸に関して、「単離核酸」という語が時折用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用する場合、ＤＮＡ分子であって、このＤＮＡ分子が由来する生物の自然発生ゲノム内で（５’方向および３’方向に）直接隣接する配列から分離されるＤＮＡ分子を指す。たとえば「単離された核酸」は、プラスミド若しくはウイルスベクターなどのベクター中に挿入された、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡ分子を含む可能性がある。「単離された核酸分子」は、ｃＤＮＡ分子も含む可能性がある。ベクター中に挿入された、単離された核酸分子は本明細書で場合により、組み換え核酸分子とも呼ばれる。
【００２２】
ＲＮＡ分子に関して、「単離された核酸」という用語は、上で定義したような単離されたＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を主に指す。またこの用語は、ＲＮＡ分子が「実質的に純粋な」形で存在するように、ＲＮＡ分子の自然の状態で（すなわち細胞または組織内で）結合されているＲＮＡ分子から、十分に分離されたＲＮＡ分子を指す可能性がある。
【００２３】
核酸に関して「濃縮」という語の使用により、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常な細胞中または配列が採取された細胞中と比べて、興味のある細胞または溶液中に存在するすべてのＤＮＡまたはＲＮＡを著しく高い割合（２〜５倍）で構成することを意味する。濃縮は、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡ量の優先的減少によって、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ量の優先的増加によって、または２つの組み合せによって、人為的に引き起こすことができる。しかし、「濃縮」は、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するのではなく、興味のある配列の相対的な量が著しく増加したことを単に示唆していることに留意すべきである。
【００２４】
目的によっては、ヌクレオチド配列は精製形であることも好都合である。核酸に関して「精製された」という用語は、（均質調製のような）完全な純度を要求するのではない。代わりに、この用語は、その配列が自然環境中と比べて比較的純粋である（自然レベルと比べて、たとえば、ｍｇ／ｍｌで少なくとも２〜５倍であるべきである）という指摘を表す。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々のクローンは、電気泳動によって均質になるまで精製することができる。これらのクローンから得られる請求項に係るＤＮＡ分子は、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは、自然発生はしないが、むしろ部分精製された自然発生物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作によって好ましくは得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の生成を包含していて、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリを運搬する細胞のクローン選択によって合成ライブラリから単離できる。このため、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築および別個のｃＤＮＡクローンの単離を含むこの工程によって、未変性メッセージのおよそ１０−６倍の精製を生じる。このため、少なくとも１桁分の、好ましくは２桁または３桁分の、およびさらに好ましくは４桁または５桁分の精製が明示的に考えられる。このため、「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０〜６０重量％の興味のある化合物（たとえば核酸、オリゴヌクレオチドなど）を含む調製物を指す。さらに好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％の、および最も好ましくは９０〜９９重量％の興味のある化合物を含む。純度は、興味のある化合物に適した方法によって測定する。
【００２５】
「相補的」という用語は、互いに複数の好適な相互作用を形成できる２つのヌクレオチドを示す。たとえば、アデニンおよびチミンは２個の水素結合を形成できるので、アデニンはチミンに対して相補的である。同様に、グアニンおよびシトシンは３個の水素結合を形成できるため、グアニンおよびシトシンは相補的である。このため、核酸配列が以下のチミン、アデニン、グアニンおよびシトシンの塩基配列を含有する場合、この核酸分子の「補体」は、チミンの代わりにアデニン、アデニンの代わりにチミン、グアニンの代わりにシトシン、およびシトシンの代わりにグアニンを含有する分子である。この補体は、親核酸分子との最適な相互作用を形成する核酸配列を含有できるため、このような補体は、その親分子と高い親和性で結合できる。
【００２６】
１本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当分野において一般に使用される所定の条件下で、このようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な（場合により「実質的に相補的と呼ばれる）配列の２個の１本鎖ヌクレオチド分子間の結合を指す。特にこの用語は、オリゴヌクレオチドと本発明の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含有されている実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドと非相補的配列の１本鎖核酸とのハイブリダイゼーションの実質的な排除を指す。たとえば、特異的ハイブリダイゼーションは、いずれのＡＤＨＤ特異的マーカー遺伝子または核酸にもハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしない配列を指すことができる。また「特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる表に示すＡＤＨＤ特異的マーカーなどの神経特異的な特異的マーカーのみにハイブリダイズすることができる。様々な相補性の１本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当分野で周知である。
【００２７】
例として、特定の配列相同性の核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密性条件を計算するための一般的な式を以下に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／２本鎖中の塩基対の数
上の式の例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを、４２％のＧＣ含有率および２００塩基の平均プローブサイズと共に使用すると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ２本鎖のＴｍは、相同性が１％低下するごとに、１〜１．５℃低下する。このため、配列同一性が約７５％を超える標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用して観察される。
【００２８】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳密性は、主に溶液の塩濃度および温度に依存している。一般に、プローブの、その標的によるアニーリングの速度を最大限にするために、ハイブリダイゼーションは通常、計算されたハイブリッドの温度Ｔｍより２０〜２５℃低い塩および温度条件下で行われる。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性度のために可能な限り厳密であるべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりおよそ１２〜２０℃低くなるように選択される。本発明の核酸に関して、中程度の厳密性ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃でのハイブリダイゼーションと定義され、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で５５℃にて１５分洗浄される。高厳密性ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃でのハイブリダイゼーションと定義され、１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６５℃にて１５分洗浄される。超高厳密性ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃でのハイブリダイゼーションと定義され、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６５℃にて１５分洗浄される。
【００２９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、２若しくはそれ以上、好ましくは３を超えるリボまたはデオキシリボヌクレオチドから成る核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多様な因子およびオリゴヌクレオチドの特定の用途および使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、プローブおよびプライマを含むが、３ヌクレオチドから核酸分子の全長までの任意の長さであることが可能であり、３ヌクレオチドからポリヌクレオチドの全長までの隣接する核酸の考えられるいずれの数も明示的に含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約１０ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００３０】
「プローブ」という用語は、本明細書で使用する場合、精製された制限酵素による消化においてのように天然に発生するか、または合成により産生されるかにかかわらずに、プローブに相補的配列を持つ核酸とアニーリングすることができる、またはこの核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＲＮＡ若しくはＤＮＡのどちらかの核酸を指す。プローブは、１本鎖または２本鎖のどちらかである。プローブの正確な長さは、温度、プローブ源、および方法の使用を含む、多くの因子に依存する。たとえば診断用途では、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは通例、１５〜２５若しくはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、このプローブはより少ないヌクレオチドを含有することができる。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的であるように選択される。このことは、プローブが、一連の所定の条件の下でプローブの各標的鎖に特異的にハイブリダイズできるように、またはその標的鎖とアニーリングできるように、十分に相補的でなければならないことを意味する。ゆえに、プローブ配列は、標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチド断片は、プローブの５’または３’末端に結合され、プローブ配列の残りの部分は標的鎖に相補的である。また、プローブ配列が標的核酸と特異的にアニーリングするために標的核酸の配列との十分な相補性を有しているならば、非相補的塩基またはより長い配列をプローブ中に分散させることができる。
【００３１】
「プライマ」という用語は、本明細書で使用する場合、生物系に由来する、制限酵素消化によって生成された、または合成的に産生された、ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかの、１本鎖または２本鎖のどちらかのオリゴヌクレオチドであって、適正な環境に置かれると、テンプレート依存性核酸合成のイニシエータとして機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドである。適切な核酸テンプレート、核酸の好適なヌクレオシド３リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補因子および好適な温度およびｐＨなどの条件と共に与えられると、プライマは、ポリメラーゼの作用または同様の活性によるヌクレオチドの添加によって３’末端にて伸長して、プライマ伸長生成物を生じることができる。プライマは、用途の特定の条件および要求事項に応じて長さが変わる可能性がある。たとえば診断用途では、オリゴヌクレオチドプライマの長さは、通例１５〜２５ヌクレオチド若しくはそれ以上である。プライマは、所望の伸長生成物の合成をプライミングするために、すなわちポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用するためにプライマの３’ヒドロキシル部分を適切な近位に提供するのに十分な様式で、所望のテンプレート鎖によってアニーリングできるようにするために、所望のテンプレートに十分に相補性でなければならない。プライマ配列が所望のテンプレートの正確な補体になることは要求されない。たとえば非相補的ヌクレオチド配列は、それ以外では相補的なプライマの５’末端に結合することができる。また、プライマ配列が所望のテンプレート鎖の配列と十分な相補性を有して伸長生成物の合成のためのテンプレート−プライマ複合体を機能的に提供するならば、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマ配列中に分散させることができる。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、第４，８００，１９５号明細書および第４，９６５，１８８号明細書に記載され、その全体の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
「ベクター」という用語は、細胞中に感染、トランスフェクト若しくは形質転換させて、独立して、または宿主細胞ゲノム内で複製することができる、１本鎖または２本鎖環状核酸分子に関する。環状２本鎖核酸分子は、制限酵素による処理時に、切断されることによって線形化することができる。各種のベクター、制限酵素、および制限酵素によって標的とされるヌクレオチド配列の情報は、当業者には容易に利用可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ若しくはウイルスなどのレプリコンを含み、これに別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡ若しくはＲＮＡのどちらか）を結合させて、結合配列若しくは要素の複製を引き起こすことができる。ベクターを制限酵素で切断し、２片を共にライゲートすることによって、本発明の核酸分子をベクター中に挿入することができる。
【００３４】
当業者は、原核生物若しくは真核生物中への発現構築物の形質転換、トランスフェクション、または形質導入を促進するための多くの技法を利用できる。「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」という用語は、核酸および／または発現構築物を細胞または宿主生物中に挿入する方法を指す。これらの方法は、細胞を高濃度の塩、電場、または界面活性剤で処理して宿主細胞外膜または壁を興味のある核酸分子に対して透過性にすること、微量注入法、ＰＥＧ融合法などの様々な技術を包含する。
【００３５】
「プロモータ要素」という用語は、適切な細胞内部に入ると、転写因子および／またはポリメラーゼの結合ならびにその後のベクターＤＮＡの一部のｍＲＮＡ中への転写を促進できる、ベクター中に組み入れられるヌクレオチド配列を表す。一実施形態において、本発明のプロモータ要素はＡＤＨＤ特異的マーカー核酸分子の５’末端の前にあるので、ＡＤＨＤ特異的マーカー核酸分子はｍＲＮＡ中に転写される。宿主細胞機構は次に、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。
【００３６】
当業者は、核酸ベクターが、プロモータ要素およびＡＤＨＤ特異的マーカー核酸分子以外の核酸要素を含有可能であることを認識するであろう。これらの他の核酸要素は、これに限定されるものではないが、複製起点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、若しくはポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列を含む。
【００３７】
「レプリコン」は、任意の遺伝要素、たとえばプラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージまたはウイルスであり、主にそれ自体の制御下で複製可能である。レプリコンは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡのどちらかであり、１本鎖または２本鎖である。
【００３８】
「発現オペロン」は、転写および翻訳制御配列、たとえばプロモータ、エンハンサ、翻訳開始シグナル（たとえばＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネータなどを所有することができ、宿主細胞または生物中のポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸セグメントを指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」という用語は、核酸が、発現された場合に、たとえば生物学的検定法、免疫測定、放射免疫測定、若しくは比色法、蛍光法、化学発光法または他の方法によって容易に測定可能であるレポーターシグナルを産生する産物をコードする遺伝子を含む、操作可能な遺伝子系を意味するものとする。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、線状または環状、１本鎖若しくは２本鎖、アンチセンスまたはセンス極性のどちらかであり、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素に操作可能に連結することができる。必要な制御要素は、レポーター系の性質、およびレポーター遺伝子がＤＮＡまたはＲＮＡの形であるかどうかによって変化するが、これに限定されるものではないが、プロモータ、エンハンサ、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素を含む。
【００４０】
導入された核酸は、受容細胞若しくは生物の核酸中に組み込まれる（共有結合される）可能性もあるか、または組み込まれない可能性もある。細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞において、たとえば導入された核酸をエピソーム要素または独立レプリコン、たとえばプラスミドとして維持することができる。また、導入された核酸は、受容細胞若しくは生物の核酸中に組み入れられ、この細胞若しくは生物中で安定して維持されて、受容細胞若しくは生物の子孫細胞若しくは生物にさらに伝えられるかまたは遺伝する可能性がある。最後に、導入された核酸は、一時的にのみ受容細胞または宿主生物に存在できる。
【００４１】
「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、発現された場合に、形質転換細胞に選択可能な表現型、たとえば抗生物質耐性を付与する遺伝子を指す。
【００４２】
「操作可能に連結された」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を行うためにコーティング配列に対して適切な位置のＤＮＡ分子に位置していることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写単位および他の転写制御要素（たとえばエンハンサ）の配置にも場合により適用される。
【００４３】
「組み換え生物」または「トランスジェニック生物」という用語は、遺伝子若しくは核酸分子の新規組み合せを有する生物を指す。遺伝子若しくは核酸分子の新規組み合せを、当業者に利用可能な多様な核酸操作手法を用いて生物中に導入することができる。「生物」という用語は、少なくとも１つの細胞から成るいずれかの生き物に関する。生物は、１つの真核細胞のように単純であることも、または哺乳動物のように複雑であることも可能である。ゆえに「組み換え生物」という語句は、組み換え細胞、ならびに真核生物および原核生物を含む。
【００４４】
「単離されたタンパク質」若しくは「単離および精製されたタンパク質」という用語が、本明細書で場合により使用される。この用語は主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。またこの用語は、「実質的に純粋な」形で存在するように、これが自然に結合されるであろう他のタンパク質から十分に分離されているタンパク質を指す可能性がある。「単離された」は、他の化合物若しくは物質との人工若しくは合成混合物、または基本的な活性を妨害せず、たとえば、不完全な精製、安定剤の添加、またはたとえば免疫原性調製物若しくは医薬的に許容される調製物中への配合によって存在する可能性がある不純物の存在を排除することを意味しない。
【００４５】
「特異的結合対」は、相互に特定の特異性を有し、通常条件下では他の分子に優先して相互に結合する、特異的結合メンバ（ｓｂｍ）および結合パートナー（ｂｐ）を含む。特異的結合対の例は、抗原および抗体、リガンドおよび受容体ならびに相補的ヌクレオチド配列である。当業者は、多くの他の例を認識している。さらに「特異的結合対」という用語は、特異的結合メンバおよび結合パートナーのいずれかまたは両方が大分子の一部を含む場合にも適用できる。特異的結合対が核酸配列を含む実施形態において、これらは、アッセイ条件下で相互にハイブリダイズする長さ、好ましくは１０ヌクレオチドを超える長さ、さらに好ましくは１５または２０ヌクレオチドを超える長さである。
【００４６】
「試料」または「患者試料」または「生体試料」とは一般に、特定の分子、好ましくはＡＤＨＤ特異的マーカー分子、たとえば以下で説明するマーカーについて試験することができる試料を指す。試料は、これに限定されるものではないが、細胞、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、涙液、胸膜液などを含む体液を含む。
【００４７】
「薬剤」および「試験化合物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または細菌、植物、真菌、若しくは動物（特に哺乳動物）細胞若しくは組織などの生体材料から作製される抽出物を示す。生体高分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および本明細書に記載するＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸またはそのコードされたタンパク質の活性を調節する能力を呈するいずれの核酸ベース分子も挙げられる。薬剤および化合物は、以下に記載するスクリーニングアッセイへの組み入れによって、潜在的な生物活性について評価される「試験薬剤」または「試験化合物」と呼ぶこともできる。
【００４８】
「調節する」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載するＣＮＶ含有分子またはそれによりコードされるタンパク質の正常な活性に関連する特定の細胞、生物またはシグナル伝達機能の上昇／促進または低下／阻害を指す。たとえば調節するという用語は、試験化合物または試験薬剤が本発明の遺伝子またはタンパク質のシグナル伝達または活性を妨害する能力を指す。
ＩＩ．ＡＤＨＤ発症の傾向を診断するためにＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓおよび／またはＳＮＰｓを使用する方法
本発明は、患者のＡＤＨＤを診断する方法またはＡＤＨＤを発症するリスクが上昇した患者を同定する方法を提供する。診断としては、本明細書で使用する場合、患者における本明細書に記載する遺伝的改変に関連するＡＤＨＤの初期同定だけでなく、ＡＤＨＤを有しているまたは有しやすいと以前に同定された患者における確認試験またはスクリーニングも挙げられる。前記方法は、患者からの生体試料を提供する工程と、生体試料、好ましくは組織および／または血液血漿試料中に存在する、特定のセットのまたはありとあらゆるＡＤＨＤ関連マーカー（表１３）の量を測定する工程と、既知の結果の患者コホートで同定されたＡＤＨＤマーカー発現レベルと比較して判定されたＡＤＨＤマーカー発現レベルの量および／またはタイプに基づいて、患者が有するＡＤＨＤの可能性がより高いか否かを判定する工程とを含む。試料が以前にＡＤＨＤと診断された患者に関連するＣＮＶマーカー発現プロファイルを有する場合に、患者はＡＤＨＤを有する可能性がより高い。本発明の組成物および方法は、ＡＤＨＤの予後および診断および管理に有用である。
【００４９】
別の態様において、患者試料は以前に遺伝子型が同定されている可能性があり、このため医師が試料の遺伝子発現プロファイルを利用できる。したがって本方法は、参照ＡＤＨＤ関連マーカー配列情報、すなわち本明細書の表に記載されるようなより好ましいまたはより好ましくない予後に統計的に関連するようなＣＮＶ、およびコンピュータでの比較遺伝解析の性能をデータベースに格納する工程と、これによりＡＤＨＤのリスクが上昇した患者を同定する工程とを含む。
【００５０】
これに限定されるものではないが、以下に挙げるものを含むＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸は、本発明による様々な目的のために使用することができる。ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ含有ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその断片は、ＡＤＨＤ特異的マーカーの存在および／または発現を検出するプローブとして使用することができる。ＡＤＨＤ特異的マーカー核酸をこのようなアッセイのためのプローブとして利用できる方法は、これに限定されるものではないが、（１）インサイチュハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション、および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの各種の増幅反応を含む。
【００５１】
さらに、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓまたはＳＮＰｓを検出するためのアッセイを、これに限定されるものではないが、体液（血液、尿、血清、胃洗浄液、脳脊髄液を含む）、任意の種類の細胞（脳細胞、白血球、単核細胞、母体循環系中の胎児細胞など）または体組織を含む、いずれの種類の生体試料にも行うことができる。
【００５２】
明らかに、本発明のＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸、これを発現するベクター、ＡＤＨＤ  ＣＮＶまたはＳＮＰ含有マーカータンパク質および抗ＡＤＨＤ特異的マーカー抗体を使用して体組織、細胞、または体液中のＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓまたはＳＮＰｓを検出して、ＡＤＨＤの発症に関与する遺伝子およびタンパク質相互作用を評価する目的で、ＡＤＨＤ  ＣＮＶまたはＳＮＰ含有マーカータンパク質発現を改変することができる。
【００５３】
ＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓまたはＳＮＰｓをスクリーニングするための大半の実施形態において、試料中のＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸は、試料中に存在する他の配列と比べてテンプレートの量を増加させるために、たとえばＰＣＲを使用して最初に増幅される。これにより標的配列は、試料中に存在する場合に、高度の感受性で検出されるようになる。この初期工程は、当分野で重要な高感受性アレイ技法を使用することによって回避できる。
【００５４】
また、新規検出技術によって、この制限が克服され、わずか１μｇの全ＲＮＡという少量の試料の分析も可能になる。共鳴光散乱（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＲＬＳ）技術を使用すると、これまでの蛍光技法とは対照的に、複数回の読取りにより、ビオチン標識ハイブリダイズ標的および抗ビオチン抗体を使用して、少量のｍＲＮＡｓを検出することができる。ＰＣＲ増幅のもう１つの別法には、信号対雑音比を上昇させ、バックグラウンド干渉を低減する、平面導波路（ｐｌａｎａｒ  ｗａｖｅ  ｇｕｉｄｅ：ＰＷＧ）技術が含まれる。どちらの技法もＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（米国）より市販されている。
【００５５】
上記の技法のいずれを使用しても、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰマーカー発現を検出または定量することができ、したがってＡＤＨＤを診断することができる。
ＩＩＩ．キットおよび製造品
上記の生成物のいずれも、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶ若しくはＳＮＰ特異的マーカーポリヌクレオチドまたはＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐに固定された１若しくはそれ以上のこのようなマーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、標識、マーカー、リポーター、医薬的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、容器、投与用管、アッセイ基質、または任意の組み合せを含有することができるキットに組み入れることができる。
ＩＶ．治療剤開発のためにＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓおよび／またはＳＮＰｓを使用する方法
本明細書で同定したＣＮＶｓおよびＳＮＰｓはＡＤＨＤの病因に関連付けられているため、このようなＣＮＶｓおよび／またはＳＮＰｓを含有する遺伝子およびそのコード生成物の活性を調節する薬剤を同定する方法によって、この障害の治療に有効な治療剤が生成されるはずである。
【００５６】
ヒトゲノムのいくつかの領域によって、治療剤を合理的に設計するために好適な標的が提供される。これらの領域に対応する小核酸分子またはペプチド分子を使用すると、コードされたタンパク質の活性を効果的に調節する治療剤を設計するのに役立つ。
【００５７】
分子モデリングによって、機能に必要な立体構造または重要なアミノ酸残基に基づいてＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸によってコードされたタンパク質の活性部位に結合する能力を持つ、特異的有機分子の同定が促進されるはずである。コンビナトリアルケミストリー手法の使用により、最大活性を持つ分子が同定され、次にさらなるスクリーニングサイクルのために、このような分子が繰り返して開発されるであろう。このスクリーニングアッセイで利用できるいくつかの分子は、この方法に限定されるものではないが、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）ポジティブ・アロステリック・モジュレータ（ＰＡＭ）、ネガティブ・アロステリック・モジュレータ（ＮＡＭ）、およびタキキニン−３／ニューロキニン−３受容体（ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ−３／ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＡＣＲ−３／ＮＫ３Ｒ）アンタゴニストを含む。詳細なリストは、ＡＤＸ６３３６５、ＡＤＸ５０９３８、ＡＤＸ７１１４９、ＡＤＸ４８６２１、ＡＭＮ０８２，１−（ヘテロ）アリール−３−アミノ−ピロリジン誘導体（たとえば米国特許出願２００８／０３００２６６号で提供されているもの）、ＬＹ３４１４９５、ＧＳＫ１１４４８１４、およびＳＢ２２３４１２（表１）を含む。
表１．コンビナトリアルケミストリー手法で利用できる分子および治療剤
【００５８】
【表１】
2013535985.tif 000002
【００５９】
薬剤スクリーニングアッセイに用いられるポリペプチドまたは断片は、溶解状態で遊離されていること、固体支持体にまたは細胞内に固定されていることのどちらかが可能である。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたは断片を発現する組み換えポリヌクレオチドにより安定的に形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイで利用する。このような細胞は、生存形または固定形のどちらでも、標準結合アッセイに使用できる。たとえばリペプチドまたは断片と被検薬剤との間での複合体の形成を判定すること、またはポリペプチドまたは断片と既知の基質との間での複合体の形成が被検薬剤により妨害される程度を検査することができる。
【００６０】
薬剤スクリーニングの別の技法により、コードされたポリペプチドに好適な結合親和性を有する化合物についての高スループットスクリーニングが提供され、この技法は１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎ、ＰＣＴ公開出願ＷＯ  ８４／０３５６４号パンフレットに詳細に記載されている。
【００６１】
簡潔に述べると、上記のものなどの多数の各種の小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたはその他のある表面などの固体基質上で合成する。ペプチド試験化合物を標的ポリペプチドと反応させて、洗浄する。次に、結合したポリペプチドを当分野で周知の方法によって検出する。
【００６２】
薬剤スクリーニングのさらなる技法は、非機能性または改変ＡＤＨＤ関連遺伝子を有する宿主真核細胞株または細胞（上記のものなど）を使用することを包含する。宿主細胞株または細胞は、ポリペプチドレベルで欠損がある。宿主細胞株または細胞を薬物化合物の存在下で培養する。宿主細胞の改変されたグルタミン酸作動性機能を測定して、化合物が欠損細胞においてこの機能を調節できるか否かを判定する。本発明での使用が考えられる宿主細胞は、これに限定されるものではないが、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および植物細胞を含む。しかし、哺乳動物細胞、特に神経細胞が好ましい。ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰコードＤＮＡ分子をこのような宿主細胞中に単独でまたは組み合せて導入すると、このような発現によって与えられる細胞の表現型を評価することができる。ＤＮＡ分子を導入する方法も当業者に周知である。このような方法はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．１９９５に示され、その開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本発明の新規ＤＮＡ配列を発現するように修飾できる多種多様の発現ベクターが利用できる。本明細書に例示する特異的ベクターは、単に説明のためであって、本発明の範囲を限定することを意図していない。発現方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．３−１７．４４（１９８９）によって記載されている。サッカロミセス属における発現方法も、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載されている。
【００６４】
本発明の実施に使用するための好適なベクターは、原核生物ベクター、たとえばｐＮＨベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，１１０９９  Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｄ．，カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、９２０３７）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，５６５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、５３７１１）、およびｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、０８８５４）を含む。本発明の実施に有用な真核生物ベクターの例は、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、およびｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１５８８  Ｓｏｒｒｅｎｔｏ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｄ．，カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、９２１２１）；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５&Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；バキュロウイルスベクター、たとえばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、またはｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ならびに酵母ベクター、たとえばＹＲＰ１７、ＹＩＰ５、およびＹＥＰ２４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ならびにｐＲＳ４０３およびｐＲＳ４１３  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）；ピキア属ベクター、たとえばｐＨＩＬ−Ｄ１（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｃｏ．，オクラホマ州Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、７４００４）；レトロウイルスベクター、たとえばＰＬＮＣＸおよびｐＬＰＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ならびにアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターを含む。
【００６５】
本発明の発現ベクターで使用するためのプロモータは、原核生物細胞または真核生物細胞中で操作可能であるプロモータを含む。原核生物細胞において操作可能であるプロモータは、ラクトース（ｌａｃ）制御要素、バクテリオファージラムダ（ｐＬ）制御要素、アラビノース制御要素、トリプトファン（ｔｒｐ）制御要素、バクテリオファージＴ７制御要素、およびそのハイブリッドを含む。真核生物細胞において操作可能であるプロモータは、エプスタイン・バー・ウイルス・プロモータ、アデノウイルスプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）プロモータ、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモータなどのバキュロウイルスプロモータ、アルコール・オキシダーゼ・プロモータなどのピキア属プロモータ、ならびにｇａｌ４誘導プロモータなどのサッカロミセス属プロモータ、およびＰＧＫ構成的プロモータならびに神経細胞特異的血小板由来成長因子プロモータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、Ｔｈｙ−１プロモータ、ハムスターおよびマウス・プリオン・プロモータ（ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＭｏＰｒＰ）、およびグリア細胞における導入遺伝子の発現のためのグリア線維性酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＡＰ）を含む。
【００６６】
加えて、本発明のベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を容易にするいくつかの多様なマーカーのいずれか１つを含有することができる。このようなマーカーは、温度感受性、薬剤耐性に関連する遺伝子、または宿主生物の表現型の特徴に関連する酵素を含む。
【００６７】
本発明のＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓおよび／若しくはＳＮＰｓまたはその機能性断片を発現する宿主細胞は、ＡＤＨＤの発症を調節する能力を持つ可能性がある化合物または薬剤をスクリーニングする系を提供する。このため一実施形態において、本発明の核酸分子を使用して、ＡＤＨＤおよび異常なグルタミン酸作動性機能に関連する細胞代謝の態様を調節する薬剤を同定するアッセイで使用するための組み換え細胞株を作製することができる。ＣＮＶおよびＳＮＰ含有核酸によってコードされたタンパク質の機能を調節することができる化合物をスクリーニングする方法も提供される。
【００６８】
別の手法は、ＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸によってコードされたポリペプチドの断片をファージ表面に発現するよう設計されたファージディスプレイライブラリの使用を含む。次に、このようなライブラリをコンビナトリアルケミカルライブラリと、発現されたペプチドとケミカルライブラリの構成要素と間の結合親和性が検出できる条件の下で接触させる。米国特許第６，０５７，０９８号明細書および第５，９６５，４５６号明細書は、このようなアッセイを行うための方法および装置を提供する。
【００６９】
合理的な薬剤設計の目標は、たとえばポリペプチドのより高い活性形若しくは安定形である、またはたとえばポリペプチドの機能を生体内で向上させる若しくは妨害する薬剤を構築するために、興味のある生物活性ポリペプチドの、またはそれらが相互作用する小分子（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害物質）の構造的類似体を産生することである。たとえばＨｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１を参照。上で議論した１つの手法において、興味のあるタンパク質の、またはたとえばタンパク質−基質複合体の３次元構造は、ｘ線結晶解析によって、核磁気共鳴によって、コンピュータモデル化によって、または最も典型的には、手法の組み合せによって解析される。頻度は低いが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性タンパク質の構造に基づくモデリングによって得ることができる。合理的な薬剤デザインの例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５２７−５３３）。加えて、ペプチドをアラニンスキャンによって解析することができる（Ｗｅｌｌｓ，（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３９０−４１１）。この技法では、アミノ酸残基をＡｌａで置換して、ペプチドの活性に対するその効果を決定する。この方式でペプチドの各アミノ酸残基を解析して、そのペプチドの重要な領域を決定する。
【００７０】
機能アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離して、次にその結晶構造を解析することも可能である。原則として、この手法によってファーマコフォアを得て、続いて薬剤設計はこれに基づいて行うことができる。
【００７１】
機能性薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｎｔｉ−ｉｄｓ）を生成することによって、タンパク質の結晶解析をすべて回避することができる。ａｎｔｉ−ｉｄｓの結合部位は、鏡像の鏡像として、元の分子の類似体であることが予測される。次にこのａｎｔｉ−ｉｄを使用して、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。選択されたペプチドは次に、ファーマコフォアとして作用する。
【００７２】
このため、たとえばポリペプチドの活性若しくは安定性が改善されている、またはポリペプチド活性の阻害物質、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬剤を設計することができる。本明細書に記載するＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸配列が利用できることによって、Ｘ線結晶解析などの解析的研究を行うために十分な量のコードされたポリペプチドを利用できるようになる。加えて、本明細書で提供するタンパク質配列の情報は、Ｘ線結晶解析の代わりに、またはそれに加えて、コンピュータモデルリング技法を用いる人々の指針となるであろう。
【００７３】
別の実施形態において、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸が利用できることによって、本発明のＡＤＨＤ関連ＳＮＰｓまたはＣＮＶｓを有する実験用マウス系統を産生できるようになる。本発明のＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰを発現するトランスジェニックマウスは、ＡＤＨＤの発症および進行におけるＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸によってコードされたタンパク質の役割を調べるためのモデルシステムを提供する。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者に公知である。３つの一般的な方法として、１．興味のある外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの初期胚への組み込み、２．新たな受精卵の前核へのＤＮＡの注入、および３．遺伝子操作された胚性幹細胞の、初期胚への取り込みが含まれる。上記のトランスジェニックマウスを作製することにより、異常なグルタミン酸作動性機能、改変された向神経活性リガンド受容体シグナル伝達および異常な神経伝達、または改変された神経形態および神経突起伸長を含む多様な細胞代謝過程において標的タンパク質が果たす役割の分子的解明が容易になる。このようなマウスは、全動物モデルで推定治療薬を研究するための生体内スクリーニングツールを提供し、本発明に含まれる。
【００７４】
「動物」という用語は、本明細書では、ヒトを除くすべての脊椎動物を含むように使用する。「動物」は、胚期および胎仔期を含む、発達におけるすべての期の個々の動物も含む。「トランスジェニック動物」は、標的組み換えまたはマイクロインジェクションまたは組み換えウイルスによる感染などによる細胞下レベルでの意図的な遺伝子操作によって、直接または間接的に改変または受容された遺伝情報を持つ１若しくはそれ以上の細胞を含有する任意の動物である。「トランスジェニック動物」という用語は、古典的な異種交配または体外受精を含むことを意図しないが、むしろ１若しくはそれ以上の細胞が組み換えＤＮＡ分子によって改変されるまたは組み換えＤＮＡを受容する動物を含むことを意図する。この分子は、定義された遺伝子座を特異的に標的とすること、染色体内に無作為に組み込まれること、または染色体外で複製することができる。「生殖細胞系列トランスジェニック動物」という用語は、遺伝的改変または遺伝情報が生殖系列細胞に導入されたことにより、この遺伝情報を子孫に伝達する能力が与えられるトランスジェニック動物を指す。このような子孫が実際にその改変または遺伝情報の一部またはすべてを所有する場合、子孫もトランスジェニック動物である。
【００７５】
遺伝情報の改変は、レシピエントが属する種にとって外来性であるか、特定のレシピエント個体のみに外来性であるか、またはレシピエントがすでに所有する遺伝情報である可能性がある。遺伝情報の改変がレシピエントがすでに所有する遺伝情報である場合には、改変または導入された遺伝子が未変性遺伝子とは異なって発現される可能性がある。このような改変または外来性遺伝情報は、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ含有ヌクレオチド配列の導入も含む。
【００７６】
標的遺伝子の改変に使用されるＤＮＡは、これに限定されるものではないが、ゲノム源からの単離、単離されたｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接合成、またはその組み合せを含む多種多様の技法によって得ることができる。
【００７７】
導入遺伝子の導入に好ましい種類の標的細胞は、胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｓｔｅｍ：ＥＳ）細胞である。ＥＳ細胞は、体外培養された着床前胚から得ることができる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９０６５−９０６９）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションなどの標準的な技術によって、またはレトロウイルス媒介形質導入によって、ＥＳ細胞中に効率的に導入できる。得られた形質転換ＥＳ細胞はその後、ヒト以外の動物の胚盤胞と組み合せることができる。導入されたＥＳ細胞はその後、胚にコロニーを形成して、得られたキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【００７８】
個々の遺伝子およびその発現産物の寄与を決定する問題に対する手法の１つは、単離したＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ遺伝子を挿入カセットとして使用して、全能性ＥＳ細胞（上記のものなど）中の野生型遺伝子を選択的に不活性化し、次にトランスジェニックマウスを作製することである。遺伝子標的トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ＥＳ細胞の使用は、別の箇所にて記載および総説されている（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：１４５−１４７；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４−５３９）。
【００７９】
標的相同組み換えを使用して染色体対立遺伝子に特異的変化を挿入することによって、任意の遺伝子領域を不活性化または改変して所望の突然変異を生じさせる技法を利用することができる。しかし、１００％に近い頻度で起こる染色体外相同組み換えと比べて、プラスミド−染色体相同組み換えは、当初はわずか１０−６〜１０−３の頻度で検出されることが報告された。プラスミド−染色体非相同相互作用は、比較可能な相同挿入よりも１０５倍〜１０２倍高いレベルで、より頻繁に起こる。
【００８０】
マウスＥＳ細胞におけるこのように低い標的組み換え率を克服するために、低頻度の相同組み換えを検出または選択する多様な戦略が開発されてきた。相同改変事象を検出する１つの手法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、相同挿入について形質転換細胞のプールをスクリーニングして、続いて個々のクローンをスクリーニングする。また、ポジティブ遺伝子選択手法が開発されており、この手法では、相同挿入が起こった場合にのみ活性となり、これらの組み換えが直接選択されるようにするマーカー遺伝子が構築される。相同組み換えを選択するために開発された最も強力な手法の１つとして、改変の直接選択が存在しない遺伝子のために開発されたポジティブ−ネガティブ選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＮＳ）法がある。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子が独自のプロモータを有するため、高レベルで発現されない遺伝子を標的とする場合に、より効率的である。非相同組み換え体は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用することと、ガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ：ＧＡＮＣ）または（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの効果的なヘルペス治療薬によって非相同挿入を不利に選択することによって、不利に選択される。この対抗選択によって、生存する形質転換体中の相同組み換え体の数を増加させることができる。ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ−含有核酸を標的挿入カセットとして利用することにより、たとえばＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰ核酸によってコードされたポリペプチドに免疫特異的な抗体に対する免疫反応性の獲得によって可視化されるように、挿入が成功したことを検出して、ゆえに所望の遺伝子型を持つＥＳ細胞のスクリーニング／選択を容易にする手段が提供される。
【００８１】
ノックイン動物とは、本明細書で使用する場合、マウス内在性遺伝子が、たとえば本発明のヒトのＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはそのインフォーマティブ断片またはＳＮＰ含有核酸で置換された動物である。このようなノックイン動物は、ＡＤＨＤの発症を研究するための理想的なモデルシステムを提供する。
【００８２】
本明細書で使用する場合、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶ若しくはＳＮＰ含有核酸、その部分インフォーマティブＣＮＶ断片、またはＣＮＶまたはＳＮＰがコードされているＡＤＨＤ関連融合タンパク質の発現は、ＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰのすべてまたは一部をコードする核酸配列が、特定の組織または細胞型においてコードされたタンパク質の発現を指示する調節配列（たとえばプロモータおよび／またはエンハンサ）に操作可能に連結されているベクターを使用して、「組織特異的方式」または「細胞型特異的方式」で標的にすることができる。このような調節要素は、生体外および生体内用途の両方に役立てるために使用できる。組織特異的タンパク質を指示するためのプロモータは、当分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【００８３】
本発明のＡＤＨＤ関連ＣＮＶまたはＳＮＰをコードする核酸配列は、トランスジェニック動物における発現のために、多様な各種のプロモータ配列に操作可能に連結させることができる。このようなプロモータは、これに限定されるものではないが、米国特許第５，８７７，３９９号明細書およびＢｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１３（６）（１９９６）１５９−１６３ページに記載されている、ハムスターおよびマウス・プリオン・プロモータ（ＭｏＰｒＰ）などのプリオン遺伝子プロモータ；米国特許第５，６１２，４８６号および第５，３８７，７４２号明細書に記載されている、ラット神経細胞特異的エノラーゼプロモータ；米国特許第５，８１１，６３３号明細書に記載されている、血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモータ；米国特許第５，８４９，９９９号に記載されている、脳特異的ジストロフィンプロモータ；Ｔｈｙ−１プロモータ；ＰＧＫプロモータ；ＣＭＶプロモータ；神経細胞特異的血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモータ；ＮＥＧＲ１プロモータ、ＧＲＭ５プロモータ、下の表に挙げた任意の遺伝子のプロモータ、ならびにグリア細胞における導入遺伝子の発現のためのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータを含む。
【００８４】
本発明のトランスジェニックマウスのための使用方法も、本明細書で提供されている。ＡＤＨＤ関連ＣＮＶ若しくはＳＮＰを含有する核酸またはそのコードされたタンパク質が導入されたトランスジェニックマウスは、たとえば治療剤をスクリーニングしてＡＤＨＤの発症を調節できる治療物質を同定するためのスクリーニング法を開発するのに有用である。
【００８５】
Ｖ．医薬品およびペプチド療法
本明細書に記載するＡＤＨＤ関連ＣＮＶｓおよびＳＮＰｓが向神経活性リガンド受容体シグナル伝達において果たす役割を解明することによって、ＡＤＨＤの治療および診断に有用な医薬組成物の開発が容易になる。これらの組成物は、上記の物質の１つに加え、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含むことができる。このような物質は、非毒性であるべきで、有効成分の効力を妨害すべきでない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、たとえば経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存する。
【００８６】
ポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または本発明による他の医薬的に有用な化合物のいずれが個人に投与されようと、投与は、好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」（場合によっては、予防を療法と見なすことができる）であり、これは個人に恩恵を示すのに十分な量である。
【００８７】
後述する物質および方法は、以下の実施例の実施を容易にするために提供されている。
ＣＮＶ発見のためのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ
我々は、ＩｎｆｉｎｉｕｍＩＩ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、ＣＨＯＰのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて高スループットゲノムワイドＳＮＰ遺伝子型同定を行った。遺伝子型データ内容は遺伝子型同定アレイによって提供される強度データと共に、ＣＮＶコールについて高い信頼性を提供する。重要なのは、同じ実験環境での強度データおよび遺伝子型データの同時分析によって、正常２倍体状態およびその任意の逸脱が高い精度で定義される。ＣＮＶｓをコールするために、我々は、各ＳＮＰマーカーにおけるＬｏｇ  Ｒ比（ＬＲＲ）およびＢアレル頻度（Ｂ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＢＡＦ）を含む複数の情報源を組み合せるＰｅｎｎＣＮＶアルゴリズムを、ＣＮＶコールを作製するためのＳＮＰスペーシングおよびＢアレルの集団頻度と共に用いた。複製患者および対照コホートは、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １Ｍ、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５．０アレイを用いて、ゲノムワイドＳＮＰ遺伝子型同定を利用した。未加工のＸおよびＹ値をｌｏｇ（１０）によって正規化し、クラスタ化して、ＰｅｎｎＣＮＶ−Ａｆｆｙプロトコルを用いてＢＡＦおよびＬＲＲを確立した（表２）。低頻度反復性ＣＮＶｓは、我々の研究の焦点であった。
【００８８】
表２．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌｓ出力形式に適合させるためのＰｅｒｌｅｇｅｎデータ再フォーマットファイル試料
Ａ）遺伝子型コールファイル（０＝ＡＡ、１＝ＡＢ、２＝ＢＢ、−１＝コールなし）
【表２−１】
2013535985.tif 000003
【００８９】
Ｂ）遺伝子型コール信頼性スコア（すべて１に設定）
【表２−２】
2013535985.tif 000004
【００９０】
Ｃ）強度サマリ（−Ａ＝ｌｏｇ１０（Ｘ）、−Ｂ＝ｌｏｇ１０（Ｙ）（ｄｂＧａＰ単一試料最終レポートファイルからのＸおよびＹ値）
【表２−３】
2013535985.tif 000005
【００９１】
ＣＮＶコールおよび重要な遺伝子座の検討
追加の「ＣＮＶ負荷」は症例対対照では観察されず、むしろ作製されたコールの分布が高度に比較可能であった（図１）。我々は、メンデル遺伝パターンを観察することによって、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰｅｒｌｅｇｅｎデータでＣＮＶコール信頼性を確立した。３人組を最初に遺伝子型遺伝によって検証および解析し、観察された遺伝に基づいてＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰｅｒｌｅｇｅｎプラットフォームの両方からのＣＮＶコールの品質を確立した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＣＨＯＰデータから３人組においてコールされたすべてのＣＮＶコールに基づき、子孫において観察された８，６４７のＣＮＶｓが親から遺伝したが、４３７のＣＮＶｓは、デノボ率が４．８１１％である、推定的デノボであった。Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ＩＭＡＧＥデータから３人組においてコールされたすべてのＣＮＶコールに基づき、子孫において観察された１，８６２のＣＮＶｓが親から遺伝したが、５０５のＣＮＶｓは、デノボ率が２１．３３５％である、推定的デノボであった。５１のＩＭＡＧＥ症例、２２の欠失遺伝子座、および５の複製遺伝子座が低いデータ品質のために複数のデノボ事象を有し、域外値として除外された。ひとたび除外されると、７８５のＣＮＶｓが遺伝して、６３がデノボであり、これにより観察されたデノボ率は許容可能なレベルの７．４２９％まで低下した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＣＨＯＰデータからの親において観察されたＣＮＶｓに基づき、９，３０５のＣＮＶｓが小児に遺伝したが、７，４３２のＣＮＶｓは遺伝せず、５５．５９５％の遺伝率を生じた。Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ＩＭＡＧＥデータからの親において観察されたすべてのＣＮＶｓに基づき、２，１１４のＣＮＶｓが小児に遺伝したが、３，７８９のＣＮＶｓは遺伝せず、３５．８１２％の遺伝率を生じた。我々は、子孫に遺伝していない２０若しくはそれを超えるＣＮＶｓを持つ域外値である６５の親試料を除外し、これらの試料を除去した結果、１，２０４のＣＮＶｓが小児に遺伝したが、１，２２１は遺伝せず、４９．６５０％の遺伝率が生じ、これによりこのＣＮＶコールセットの信頼性が確立された。
【００９２】
すべてのＰｅｎｎＣＮＶコールを検討することは困難であり、サイズ閾値より小さいＣＮＶｓを除外することは無駄が多い。代わりに、我々は検出されたすべてのＣＮＶｓに基づいて遺伝子座を統計的にスコア化して、これらの名目上関連するＣＮＶＲ遺伝子座を適切なオーバーラップ、シグナル品質、およびメンデル遺伝について検討した。表３に示すように、報告されたすべての遺伝子座は、親から遺伝したＣＮＶを持つ少なくとも１の症例を示し、このような症例では、両親とも有効であった。
【００９３】
表３．ＡＤＨＤ親において過剰発現された新規ＣＮＶＲｓ
Ａ）ＡＤＨＤと有意に関連する遺伝子座
【表３−１】
2013535985.tif 000006
【００９４】
Ｂ）名目上の有意性を持つＡＤＨＤ遺伝子座
【表３−２】
2013535985.tif 000007
【００９５】
＊（１３）に示された症例；‡３症例は同一ファミリ内に存在する；†２症例は同一ファミリ内に存在する；「遺伝（Ｉｎｈ）」列は、親からの各ＣＮＶの症例への遺伝パターンを形式<母親から遺伝>：<父親から遺伝>：<デノボ>で示す。遺伝パーセンテージを以下に示す。親はすべての症例について必ずしも有効ではなかったことに留意する。対照の頻度と比べてＡＤＨＤ症例において反復性であり、濃縮することが観察され、複数の独立コホートで検出された低頻度の変異体について報告する。すべてのＧＲＭ遺伝子は、ＣＮＶＲによって直接影響される。示した領域は、方法に記載するように、症例の最適オーバーラップおよび対照に対する有意性を表す。各ＣＮＶＲ遺伝子座に対して最も近接した遺伝子が示されているのは、この遺伝子が最も影響されると考えられるためである。寄与する各プロジェクトからの詳細な数については、表１６を参照。＊直接影響される遺伝子はないため、最も近い近接遺伝子を示した。個々のＣＮＶ境界を表１７に与える。ＯＲ：オッズ比  ＣＩ：信頼区間。複製は、組み合せされたＩＭＡＧＥ、ＰＵＷＭａ、ＩＭＡＧＥＩＩ、ＮＩＭＨ、およびＵｔａｈを表す。
【００９６】
合計で症例３，５０６名および対照１３，３２７名であり、３倍を超える大量の対照試料となり、ＣＮＶｓが存在しない、または症例試料よりも頻度が低いことが確実に定義される。１試料につき検出されたＣＮＶｓの数は７０という多さであったが、正常２倍体（ＣＮ＝２）コールが実際に推測されるため、各試料が等価となっている。このＣＮＶｓはきわめて低頻度であるため、観察されたＣＮＶコールの数はサンプルによって変動する。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によるＣＮＶ妥当性確認
ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒ  ｖ２．４１ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ；Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）プローブを選択した。定量ＰＣＲは、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔまたはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）で行った。各試料は、反応混合物２５μｌ（２５０ｎＭプローブ、９００ｎＭ各プライマ、ＲｏｃｈｅによるＦａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ、および１０ｎｇゲノムＤＮＡ）または反応混合物１０μｌ（１００ｎＭプローブ、２００ｎＭ各プライマ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＲＯＸを含む１×白金定量ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ：ＵＤＧ）、および２５ｎｇゲノムＤＮＡ）中で４回ずつ分析した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェアｖ２．２．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）を使用して、値を評価した。ΔΔＣＴ法を使用して、データ分析をさらに行った。ＣＯＢＬ、ＧＵＳＢ、およびＳＮＣＡから選んだ参照遺伝子を最小変動係数に基づいて含め、次にデータを正常対照を値１に設定することによって正規化した。
【００９７】
ＰｅｒｌｅｇｅｎプラットフォームでのＣＮＶコーリングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアレイで使用されたアルゴリズムに良く似たアルゴリズムを使用したが、シグナル前処理は異なる。正規化されたシグナル強度（Ｌｏｇ  Ｒ比およびＢアレル頻度）をＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアから直接エクスポートできるＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームとは異なり、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ６００Ｋプラットフォームのこれらのシグナル強度基準は、未加工のＸおよびＹ値に基づいて遺伝子型が同定された試料の収集から計算する必要がある。遺伝子型同定実験で生成された未加工最終レポートファイルからのデータ正規化およびシグナル抽出を行うために、我々は最初に、ｄｂＧａＰからのデータをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌｓ：ｂｉｒｄｓｅｅｄ．ｃａｌｌｓ．ｔｘｔ、ｂｉｒｄｓｅｅｄ．ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ、およびｑｕａｎｔ−ｎｏｒｍ．ｐｍ−ｏｎｌｙ．ｍｅｄ−ｐｏｌｉｓｈ．ｅｘｐｒ．ｓｕｍｍａｒｙ．ｔｘｔによって産生されたフォーマットに再フォーマットした（表２を参照）。ｄｂＧａＰからレポートファイルに基づいて試料中に提供されたＸおよびＹ値を、対数底１０を取ることによって、より限定された範囲に縮小した。我々は、次に各ＳＮＰマーカーについて、遺伝子型同定したすべての試料でＡＡ、ＡＢおよびＢＢ遺伝子型のアレル特異的シグナル強度に依拠して、Ｉｌｌｕｍｉｎａクラスタリング生成手法に似た極座標シータおよびＲに、３つの基準遺伝子型クラスタを構築した。「−ｃｏｎｆ２」オプションがｇｅｎｅｒａｔｅ＿ａｆｆｙ＿ｇｅｎｏ＿ｃｌｕｓｔｅｒ．ｐｌの実行に含まれていたのは、１が最良スコアとしてコードされたためである。基準遺伝子型クラスタが構築されたら、次に我々はｎｏｒｍａｌｉｚｅ＿ａｆｆｙ＿ｇｅｎｏ＿ｃｌｕｓｔｅｒ．ｐｌを使用して、各ＳＮＰのシグナル強度値をＬｏｇ  Ｒ比（ＬＲＲ）およびＢアレル頻度（ＢＡＦ）値に変換した。さらなる技術詳細事項については、ｗｗｗ．ｏｐｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｅｎｎｃｎｖ／ｐｅｎｎｃｎｖ＿ｔｕｔｏｒｉａｌ＿ａｆｆｙ＿ｇｗ６．ｈｔｍｌを参照。
【００９８】
隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ：ＨＭＭ）を最適化するために、我々は３０の３連続バッチにおいて、ベースライン基準ファイルｈｈ５５０．ｈｍｍを使用して、ＰｅｎｎＣＮＶの「−ｔｒａｉｎ」を実行した。最初の訓練ではＬＲＲの標準偏差が最低の試料を使用したが、他の２回の実行には、新たな基準として作成したファイルを使用して、より無作為な典型的試料を含めた。我々は、観察されたＰｅｒｌｅｇｅｎデータに特異的に適合したＣＮＶコーリングをさらに通知するために、ＳＮＰ間距離および集団ｂ−アレル頻度を提供する定義ファイルも作成した。これによって、ＣＮＶコールが２，７８９のＰｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋ試料のうち１，８８７（症例６４２名および親１，２４５名）で利用できるようになった。ＬＲＲの全体の標準偏差は試料の大半（８４％）で０．２より低かったが、強度データは、コールされたＣＮＶの領域で著しくノイズが多く、おそらく実験室での処理中のＰＣＲ飽和のために、欠失シグナルを識別できないＳＮＰの亜集団を示すことが多かった。それにもかかわらず、欠失および重複特徴は、同じＳＮＰｓについてそれぞれ示したホモ接合体およびＡＡＢ／ＡＢＢ遺伝子型の確認によって、なお検出された（図２および図３を参照）。
【００９９】
最後に、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ＣＮＶコールを、ＣＨＯＰ  Ｉｌｌｕｍｉｎａデータに基づいて関連する１１の遺伝子座とのオーバーラップについてスクリーニングした。シグナル品質をクリアにするために、各ＣＮＶコールの基礎を成すＳＮＰレベルデータを検討した。検出された各ＣＮＶが真のＤＮＡの特徴であり、決して使用したＰｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋアレイまたは我々によるデータのバイオインフォマティクス操作のアーチファクトでないことを裏付けるために、我々はｑＰＣＲを用いて独立研究機関にて各ＣＮＶに妥当性確認を行った（図４を参照）。
ＣＮＶ品質管理
我々は、低品質のＤＮＡ試料および偽陽性ＣＮＶｓを除外するために、統計的分布に基づいて我々のＨｕｍａｎＨａｐ５５０  ＧＷＡＳデータの品質管理（ＱＣ）基準を計算した。第１の閾値は、正常に遺伝子型が同定された、試行ＳＮＰｓのパーセンテージである。コールレートが９８％を超える試料のみを含めた。ゲノムワイド強度シグナルのノイズは、可能な限り少なくなければならない。正規化強度の標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）（ＬＲＲ）が０．３５より小さい試料のみを含めた。すべての試料は主成分分析に基づいてコーカサス民族性を有する必要があり（図５）、他の試料はすべて除外した。さらに、群間のゲノムインフレーション因子（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｆｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＩＦ＝１．０２４）を計算することによって、症例および対照マッチングを確保した。低い全長ＤＮＡ量のハイブリダイゼーションバイアスから生じるＧＣ含有率にほぼ相関する波状アーチファクトは、コピー数多型の正確な推定を妨害することが公知である４３。波モデルに対するＬＲＲの波因子が−０．５<ｘ<０．６の間に及ぶ試料のみが許容された。ＰｅｎｎＣＮＶが行ったＣＮＶコールの数が７０を超える場合（図１）、通常、ＤＮＡ品質は低い。このため、ＣＮＶコール数が７０より小さい試料のみを含めた。いずれの重複試料（一卵性双生児など）も一方の試料が除外された。表４は、各品質管理基準について除外された試料の数を与える。
【０１００】
表４．品質管理基準に基づく試料の除外
【表４】
2013535985.tif 000008
【０１０１】
低品質のＤＮＡ試料および偽陽性ＣＮＶｓを除外するために、統計的分布に基づいて我々のＨｕｍａｎＨａｐ５５０  ＧＷＡＳデータの品質管理（ＱＣ）基準に基づいて除外された試料。
【０１０２】
ＣＮＶｓの統計解析
各ＳＮＰにおける症例と対照と間のＣＮＶ頻度を、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して評価した。我々は、症例（ＣＨＯＰ発見コホート中の症例はＩＭＡＧＥ、ＰＵＷＭａ、若しくはＩＭＡＧＥ  ＩＩで複製された同じ変異を有した）と対照との間で名目上有意（ｐ<０．０５）である、またはいずれの対照被験者でも観察されなかった遺伝子座のみを考慮して、独立した方法を用いて妥当性確認を行った。我々は、相互の１Ｍｂ以内に存在するＳＮＰｓを含む名目上有意な領域に対する関連性を低下させる統計的極小を報告している（図４）。得られた名目上有意なＣＮＶＲｓは、以下の基準のいずれかを満たす場合に除外した。ｉ）テロメアまたはセントロメア近位サイトバンド上に存在する、ｉｉ）ＣＮＶコーリングの境界切断における変異から発生する一般的なＣＮＶの「ペニンシュラ」にて発生する（図７）、ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションバイアスを産生するＧＣ含有率の極値を持つゲノム領域、またはｉｖ）複数のＣＮＶＲｓに寄与する試料。我々は、症例の血縁度を並べ替えによって統計的に調整した（１０００ｘ）。３通りの証拠すなわち、独立した複製ｐ<０．０５、観察結果の並び替え、および対照濃縮有意性を持つ遺伝子座が観察されないこと、によって統計的有意性が確立される。我々は、ＤＡＶＩＤ（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）４４を使用して、独立して関連するＣＮＶ結果のＩｎｔｅｒＰｒｏカテゴリへの機能アノテーションクラスタリングの有意性を評価した。
【０１０３】
血縁度に対する有意性を調整するための並べ替え
最初のＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で血縁のある個人が制御されないのは、我々の主な目的は血縁度とは無関係に、複数の試料中でＣＮＶｓを検出することであるためである。この最初のスクリーンを受けるＣＮＶＲｓは、血縁のある個人が同じレベルを有さねばならないという条件で、すべての試料の症例および対照のラベルを無作為に並べ替える、並べ替えＰ値に基づいて統計的有意性がスコア化される。非血縁の個人はそれぞれ、症例または対照ラベルが割り当てられ、その血縁のある同胞には同じラベルが割り当てられる。無作為に割り当てられた「症例」および「対象」においてＣＮＶＲが計算されている試料の数に基づいて、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定のＰ値が割り当てられる。等しい若しくはそれ以上の有意性（より低いＰ値）を持つ仮説的シナリオの数によって、血縁度を補正する並べ替えＰ値が提供される。透明性のために、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定のＰ値ならびに各ＣＮＶＲを持つ症例および対照の数が提供される。
【０１０４】
遺伝子型コールのゲノムワイド関連解析
フルスケール遺伝子型ゲノムワイド関連を行い、ゲノムインフレーション因子（ＧＩＦ）は、許容されるレベルであった（ＧＩＦ＝１．０２４０９）。我々はペアワイズ集団一致も確認して、欧州の超階層化亜集団に固有の低頻度ＣＮＶｓを生じさせることがある潜在的血縁度を調査および除外した。我々は、Ｐｌｉｎｋを使用して、ＡＤＨＤ症例３９７名に両親と共にＣＨＯＰ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０遺伝子型データについて、伝達不平衡試験（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｔｅｓｔ：ＴＤＴ）統計を行った（表５）。領域において１を超える有意ＳＮＰを持つ最高の結果は、ｃｈｒ４ｐ１２  Ｐ（ｒｓ１０１８１９９）＝２．７１×１０−５およびＰ（ｒｓ１１７２４３４７）＝６．１９×１０−５であり、これはＴＥＣに影響する。我々はまた症例：対象遺伝子型ゲノムワイド関連を症例７３５名および対照２，２９８名に対して、同じＩｌｌｕｍｉｎａデータセットを用いて行った（表６）。最強のシグナルは、ＺＮＦ６６とＺＮＦ８５との間に存在するｃｈｒ１９ｐ１２  Ｐ（ｒｓ２０８１０５１）＝４．６０×１０−６およびＰ（ｒｓ３９９６８６）＝４．７２×１０−６であった。最後に、ＴＤＴ統計により、ＡＤＨＤ症例６２３名を両親と共にＩＭＡＧＥ  Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋデータについて解析した（表７）。最も有意なシグナルは、ｃｈｒ５ｑ２３．１  Ｐ（ｒｓ１７１４４３０８）＝９．７０×１０−６およびＰ（ｒｓ２０４３０５３）＝３．３６×１０−５であり、これは最も近い近接遺伝子ＤＴＷＤ２から２３７ｋｂである。まとめると、コンタクチン３（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ  ３：ＣＮＴＮ３）のエキソン４周囲に存在するＳＮＰｓは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ統計値とＰｅｒｌｅｇｅｎ  ＡＤＨＤ  ＴＤＴ統計値との間で最も一貫して複製すると思われる。ＳＮＰ  ｒｓ１２４８８０３０は、プラットフォームＰ＝２．５１×１０−３ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰ＝４．９７×１０−３Ｐｅｒｌｅｇｅｎに共通である。また有意性を示す２つのサポーティングＳＮＰｓが近接しており、Ｉｌｌｕｍｉｎａ：Ｐ（ｒｓ４０７３９４２）＝２．７８×１０−３およびＰ（ｒｓ９８６９８２８）＝８．６１×１０−３、さらにＰｅｒｌｅｇｅｎ：Ｐ（ｒｓ１１９１５７１３）＝１．８６×１０−５およびＰ（ｒｓ７３７２９７５）＝７．５９×１０−５である。
【０１０５】
表５．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＨ５５０チップ上でＣＨＯＰ遺伝子型同定されたＡＤＨＤ症例３９７名および親のＴＤＴ解析
【表５】
2013535985.tif 000009
【０１０６】
ＣＨＲ：染色体番号、ＳＮＰ：ＳＮＰ識別子、Ａ１：マイナー・アレル・コード、Ａ２：メジャー・アレル・コード、Ｔ：伝達マイナーアレル数、Ｕ：非伝達アレル数、ＯＲ：ＴＤＴオッズ比、ＣＨＩＳＱ：ＴＤＴカイ二乗統計量、Ｐ：ＴＤＴ漸近Ｐ値
【０１０７】
表６．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＨ５５０チップ上でＣＨＯＰ遺伝子型同定されたＡＤＨＤ症例７３５名および非血縁対照２，２９８名の症例：対照解析
【表６】
2013535985.tif 000010
【０１０８】
ＣＨＲ：染色体、ＳＮＰ：ＳＮＰ  ＩＤ、ＢＰ：物理的位置（塩基対）、Ａ１：マイナーアレル名（全試料に基づく）、Ｆ＿Ａ：症例におけるこのアレルの頻度、Ｆ＿Ｕ：対照におけるこのアレルの頻度、Ａ２：メジャーアレル名、ＯＲ：推定オッズ比（Ａ１のための、すなわちＡ２は参照である）、ＣＨＩＳＱ：基本アレル検定カイ二乗（１ｄｆ）、Ｐ：この試験のための漸近Ｐ値。
【０１０９】
表７．Ｐｅｒｌｅｇｅｎプラットフォームで遺伝子型同定されたＩＭＡＧＥからのＡＤＨＤ症例６２３名および親のＴＤＴ解析
【表７】
2013535985.tif 000011
【０１１０】
ＣＨＲ：染色体番号、ＳＮＰ：ＳＮＰ識別子、Ａ１：マイナー・アレル・コード、Ａ２：メジャー・アレル・コード、Ｔ：伝達マイナーアレル数、Ｕ：非伝達アレル数、ＯＲ：ＴＤＴオッズ比、ＣＨＩＳＱ：ＴＤＴカイ二乗統計量、Ｐ：ＴＤＴ漸近Ｐ値
【０１１１】
ＩＭＡＧＥへの組み入れ研究基準
プロバンド診断：混合型サブタイプＡＤＨＤ。
６〜１７歳（６歳と１７歳を含む）の小児。
同じ年齢範囲の１名以上の同胞。
両親ともＤＮＡ試料を提供できる、または一方の親に加えて２名以上の同胞が提供できる。
７０を超えるＩＱ。
ＡＤＨＤと関連することが公知である単一遺伝子疾患（たとえば脆弱Ｘ、フェニルケトン尿症、高カルシウム血症、甲状腺ホルモン不応症）がないこと。
神経疾患および障害（たとえば片麻痺および他の脳性麻痺、てんかん、水頭症、脳炎後症候群、精神病、感覚運動障害）がないこと。
少なくとも１名の生物学上の親および１名の完全同胞と同居していること。
自閉症またはアスペルガー症候群の基準を満たしていないこと。
【０１１２】
ＩＭＡＧＥ  ＩＩへの組み入れ研究基準
プロバンド診断：ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲによるＡＤＨＤ
半構造化診断面接：ＫＳＡＤＳ−ＰＬまたはＫｉｎｄｅｒ−ＤＩＰＳ
子どもの行動チェックリスト、コナーズ（Ｃｏｎｎｅｒｓ）親と教師の評価尺度またはＤＳＭ−ＩＶによるＡＤＨＤ症状に関するドイツ教師報告書（Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｅａｃｈｅｒｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＡＤＨＤ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ＤＳＭ−ＩＶ）
６〜１８歳の小児（８歳を超えるインデックス患者）。
７０を超えるＩＱ；出生体重>２０００ｇ；妊娠中に主要医療事象なし；妊娠中に母親の薬物乱用なし
ＡＤＨＤと関連することが公知である単一遺伝子疾患（たとえば脆弱Ｘ、フェニルケトン尿症、高カルシウム血症、甲状腺ホルモン不応症）がないこと。
神経疾患および障害（たとえば片麻痺および他の脳性麻痺、てんかん、水頭症、脳炎後症候群、運動ニューロン障害など）がないこと。
自閉症またはアスペルガー症候群、統合失調症、双極性障害、原発性大うつ病エピソード、および不安障害、トゥーレット症候群の基準を満たしていないこと。
【０１１３】
ＩＭＡＧＥ  ＩＩの対照
使用した対照被験者は、ＮＩＭＨジェネティクスリポジトリからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ６．０遺伝子型同定被験者から抜き取った。被験者は、米国国内代表調査パネル（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｕｒｖｅｙ  ｐａｎｅｌ）（１回に成人約６０，０００名、常時入れ替えあり）で無作為番号ダイアルを通じて収集した。参加者は、精神病および双極性障害のスクリーニングを行った。対照参加者は、ＡＤＨＤのスクリーニングを行わなかった。血液試料は、ＵＳ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｙ  ｓｅｒｖｉｃｅを通じて収集した。対照参加者は、生体物質がＮＩＭＨの判断で医学研究のために使用されることについて、書面による同意を提出した。対照は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ６．０アレイを使用して、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓにて遺伝子型同定された。遺伝子型コールは、ＢＩＲＤＳＵＩＴＥパッケージのモジュールである、ＢＩＲＤＳＥＥＤプログラムを用いて作成した。
【０１１４】
ネットワーク解析
我々は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェア４７を使用して、併合ヒトインタラクトームに基づいて、２親等以内の２２８の遺伝子を８つのＧＲＭ遺伝子まで同定した。我々は、ＦＡＧ−ＥＣアルゴリズムをデフォルトパラメータで使用するソフトウェアのＣｌｕｓｔｅｒＶｉｚプラグインを使用するネットワークトポロジーのみに基づいて、この遺伝子ネットワークを１７の別個のモジュラークラスタにクラスタ化した。１７モジュールそれぞれのコンポーネント遺伝子をＤＡＶＩＤ４４に提出して、ホモサピエンスＧＯアノテーションを使用して機能的濃縮の有意性を評価した。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を例証するために提供されている。実施例は、本発明を決して限定するものではない。
【実施例１】
【０１１６】
ＡＤＨＤに関連する代謝型グルタミン酸受容体遺伝子の改変
発達脳および正常脳機能の重要な媒介物である、グルタミン酸作動性神経伝達に関与する遺伝子に影響する、複数の独立したＡＤＨＤコホートにおいて過剰提示されるいくつかの低頻度反復性ＣＮＶｓが同定されている。これらの結果は、ＡＤＨＤの遺伝的感受性への寄与因子としての脳のグルタミン酸作動性遺伝子ネットワークに関わる変異を示唆している。
【０１１７】
研究の参加者
発見コホートには、フィラデルフィア小児病院（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＣＨＯＰ）にて遺伝子型が同定された、北欧家系のＡＤＨＤ症例計１，０１３名が含まれていた。この症例は、ＣＨＯＰにて募集した、親のない症例６６４名および３人揃った組からの症例３４９名から構成された（表８および表９を参照）。
【０１１８】
表８．研究参加者の臨床的人口統計値
【表８】
2013535985.tif 000012
【０１１９】
ＰＡＣＳ：ペアレント・アカウント・オブ・チャイルド・シンプトム（Ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａｃｃｏｕｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ）；Ｃｏｎｎｅｒｓ：行動評定尺度（Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｒａｔｉｎｇ  ｓｃａｌｅｓ）；ＳＤＱ：強さと困難さアンケート（Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）；ＷＩＳＣ：ウェクスラー児童用知能検査（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ：ＷＩＳＣ−ＩＶ）；ＫＳＡＤＳ−ＩＶＲ：学童ＩＶＲのための感情障害および統合失調症用面接基準（Ｓｃｈｅｄｕｌｅ  ｆｏｒ  Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｆｏｒ  Ｓｃｈｏｏｌ−Ａｇｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ−ＩＶＲ）；ＤＩＣＡ：小児および青年のための診断面接（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ）；Ｋｉｎｄｅｒ−ＤＩＰＳ：小児の精神障害のための診断面接（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ  ｆｏｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）、Ｋ−ＡＢＣ：Ｋａｕｆｍａｎ−ＡＢＣ知能スケール。ＷＲＡＡＤＤＳ＝Ｗｅｎｄｅｒ−Ｒｅｉｍｈｅｒｒ成人期注意欠陥障害スケール（Ａｄｕｌｔ  Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ｓｃａｌｅ）；ＷＵＲＳ＝Ｗｅｎｄｅｒ  Ｕｔａｈ評価スケール；ＰＲＳ＝親評価スケール（Ｐａｒｅｎｔ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）。
【０１２０】
表９．不注意、衝動性、および過活動ドメインにおけるＣＨＯＰ研究参加者のＫ−ＳＡＤＳ  ＡＤＨＤ重要度
【表９】
2013535985.tif 000013
【０１２１】
＊集中力  記録１件を紛失  †衝動的発言  記録３件を紛失。スコア１および２は、症状が正常範囲内であることを意味するが、スコア３および４は過剰である。
【０１２２】
複製に対処するため、我々は遺伝関連情報ネットワーク（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＧＡＩＮ）の一部であるＩＭＡＧＥコホートにアクセスした。この研究の品質管理基準を満足するＩＭＡＧＥ試料が６２４個あった。ＩＭＡＧＥ用のこれらの遺伝子型および強度データへのアクセスは、遺伝子型および表現型のデータベース（ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ：ｄｂＧａＰ）を通じて提供された。Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓのカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、およびワシントン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ｓｔ．ＬｏｕｉｓからのＰＵＷＭａコンソーシアムは、ＡＤＨＤ症例８６４名および親１，２５８名を提供した。ＩＭＡＧＥ  ＩＩコンソーシアムは、ＡＤＨＤ症例７８７名および非血縁対照８９８名を提供した。さらに、ＮＩＭＨにて募集した症例１２８名およびユタ大学（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ）にて募集した症例９０名も複製のために供給された。ＣＨＯＰ、ＮＩＭＨ、およびＵｔａｈコホートからのＤＮＡ試料は、ＣＨＯＰにてＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐを使用して遺伝子型を同定した。ＩＭＡＧＥコホートは、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００Ｋプラットフォームを使用して遺伝子型を同定した。ＰＵＷＭａコホートは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １Ｍ  ＢｅａｄＣｈｉｐで遺伝子型を同定した。ＩＭＡＧＥ  ＩＩコホートは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５．０アレイで遺伝子型を同定した。アレイ間のＣＮＶ検出の相違を処理するために、我々は、ＣＨＯＰからのＩｌｌｕｍｉｎａ  ５５０ｋ  ４，１０５名、ＧＡＩＮ乾癬およびうつ病プロジェクトからのＰｅｒｌｅｇｅｎ  ６００ｋ  ３，２９７名、ＰＵＷＭａ親およびＳＡＧＥからのＩｌｌｕｍｉｎａ  １Ｍ  ３，４６９名、ならびにＮＩＭＨジェネティクスリポジトリおよびＡＧＲＥ親からのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５．０および６．０対照２，４５６名を含む、症例プラットフォームに対応するプラットフォームで遺伝子型が同定された対照を使用した。
【０１２３】
症例および対照におけるＣＮＶのサイズおよび数
新規ＣＮＶｓを検索するために、我々は、すべて欧州系統である対照小児４，１０５名と比較して、ＣＨＯＰ症例１，０１３名を発見コホートとして解析した。ＩＭＡＧＥ、ＰＵＷＭａ、ＩＭＡＧＥ  ＩＩ、ＮＩＭＨ、およびＵｔａｈコホートからのデータを、同じプラットフォームで遺伝子型が同定された９，２２２名の独立した対照コホートと共に複製に使用した。このため、対照ＣＮＶ頻度は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームに基づいて複数の大型独立コホートにおいて確実にキャラクタリゼーションされる。我々は、ｄｂＧａＰで利用可能な２，７１３個（症例９３４名）のＩＭＡＧＥ試料のうち、１，８８６個（症例６２４名）が厳密に確立されたＣＮＶｓのデータ品質閾値を満足したことに着目した。
【０１２４】
ＰｅｎｎＣＮＶソフトウェアを使用して、前述されているような１０症例および対照のＣＮＶコールを産生した。コホートの大部分の分布から指数関数的に逸脱したカウントＣＮＶコール品質測定での実質的な域外値を除外することを含む品質標準を満たした、被験者のＣＮＶ頻度によって、８〜４５のＣＮＶコールを有する被験者が９３％となった（図１）。我々は、３，１７２のホモ接合欠失（コピー数、すなわちＣＮ＝０）、２７，８１０の半接合欠失（ＣＮ＝１）、１４，８０６の１コピー重複（ＣＮ＝３）、および５８１の２コピー重複（ＣＮ＝４）を含む、４つの異なるコピー数状態をコールした。図８は、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアで参照した未加工Ｉｌｌｕｍｉｎａデータおよび生じたＣＮＶコールの例を示す。ＣＮＶコールは３〜５９８ＳＮＰｓに及び、ＣＮＶコールに付き平均１４ＳＮＰｓであり、最大ＣＮＶは２．２Ｍｂ、および平均ＣＮＶサイズは６２ｋｂであった。可変プローブカバー範囲によって、少なくとも３つのＳＮＰｓが存在するという条件で、物理サイズの小さいＣＮＶｓまで検出することが可能となり、ＣＮＶｓはｑＰＣＲを使用して実験的に妥当性確認された。
【０１２５】
調査した対照個人も、８〜４５のＣＮＶコールを持つ被験者が９３％であった（図１）。ＣＮＶコールのうち、我々は、４，４７１のホモ接合欠失（ＣＮ＝０）、４９，７２６の半接合欠失（ＣＮ＝１）、２７，０３２の１コピー重複（ＣＮ＝３）、および１，４８０の２コピー重複（ＣＮ＝４）を同定した。ＣＮＶコールは３〜７０８のＳＮＰｓに及び、ＣＮＶコールに付き平均１２．８のＳＮＰｓであり、最大ＣＮＶは２．９Ｍｂ、および平均ＣＮＶサイズは５３．６ｋｂであった。
【０１２６】
ＳＮＰ関連試験
我々は発見コホートにＧＷＡ解析を行ったが、我々はゲノムワイド有意性の統計的基準を満足するいずれの単一ＳＮＰ遺伝子型関連シグナルも検出しなかった（ｐ<５×１０−８）（表５、表６、および表７を参照）。しかし、我々は、ＴＤＴ（ｒｓ１８６６８６３、ｒｓ９３７００２０、ｒｓ２２５４２９２、およびｒｓ２４３９５６５のＰ値範囲＝８×１０−４〜１×１０−２）を使用して、ＣＨＯＰファミリにおいてＧＦＯＤ１遺伝子内にいくつかの末端エキソンＳＮＰｓの複製の証拠を観察した。我々は加えて、以前報告された他のＳＮＰｓ（Ｌｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．２００８）について観察した有意性を収束的証拠と共に表１０に報告する。
【０１２７】
表１０．ＬｅｓｃｈおよびＺｈｏｕにより報告された上位のＡＤＨＤ関連ＳＮＰｓのＳＮＰ  ＧＷＡＳ有意性。Ａ）ＡＤＨＤ  ＴＤＴ  ＣＨＯＰ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ５５０ｋデータ；Ｂ）ＡＤＨＤ症例：対照ＣＨＯＰ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ５５０ｋデータ；Ｃ）ＡＤＨＤ  ＩＭＡＧＥ  Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００ｋデータ
Ａ）
【表１０−１】
2013535985.tif 000014
【０１２８】
Ｂ）
【表１０−２】
2013535985.tif 000015
【０１２９】
Ｃ）
【表１０−３】
2013535985.tif 000016
【０１３０】
ＣＮＶｓのセグメントベース比較解析
ＡＤＨＤに潜在的に寄与するＣＮＶｓを持つ新規ゲノム遺伝子座を同定するために、我々は我々が以前記載したように、対照と比較して症例においてより高頻度のコピー数変化を持つ連続ＳＮＰｓのゲノムをスキャンする、セグメントベースのスコア化手法を利用した（Ｇｌｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００７）。これらの連続ＳＮＰｓのゲノムスパンは、一般的なコピー数変異領域、すなわちＣＮＶＲｓを示す。ＣＨＯＰコホートにおいて、我々は対照では観察されず、複数の症例で観察された１０のＣＮＶＲｓ、ならびに対照と比較して症例にてより高い頻度を有する２のＣＮＶＲｓを同定した。我々のＣＮＶ検出法の信頼性を確保するために、我々は、ＣＮＶｓの独立妥当性確認のために一般に使用される方法である、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してすべてのＣＮＶＲｓを実験的に妥当性確認した（図７）。このため、我々は積極的な確認を行うために、報告したすべてのＣＮＶｓに別個の妥当性確認技法を利用した。この手法を使用して、我々は、ＡＤＨＤ症例のみで観察されたか、またはＡＤＨＤ症例で過剰提示されたかのどちらかの合計１２のＣＮＶ遺伝子座を同定および実験的に妥当性確認して、このＡＤＨＤ症例について続いて独立研究コホートにおける複製を進めた。
【０１３１】
複製解析は、ＩＭＡＧＥ、ＰＵＷＭａ、ＩＭＡＧＥ  ＩＩ、ＮＩＭＨ、およびＵｔａｈからのＡＤＨＤ被験者を含む５つの独立コホートで行った。発見コホートからの症例１０名に特異的なＣＮＶｓに基づいて、３つ、特にＧＲＭ７、ＧＲＭ８およびＮＥＧＲ１が複製コホート症例に限定され、ＧＲＭ８およびＧＲＭ７の生じた組み合せＰ値はそれぞれ３．５２×１０−６および８．１４×１０−５であった（表３Ａ）。第３のＧＲＭ遺伝子、ＧＲＭ５は、ＡＤＨＤ症例１０名（１０／３，５０６）および１の対照（１／１３，３２７）で観察され、Ｐ＝１．３６×１０−６が生じた（表３Ａ）。ＧＲＭ１は、症例８名および対照２名で観察され、Ｐ＝１．０５×１０−４であった。オッズ比（ＯＲｓ）がＧＲＭ７およびＧＲＭ８について推定することができなかったのは、これらのＣＮＶｓが対照被験者に存在しなかったためであるが、ＧＲＭ５およびＧＲＭ１のＯＲｓはそれぞれ３８．１２および１５．２４に達し（表３）、これらのＣＮＶｓのＡＤＨＤ表現型への寄与が潜在的に高いことが示唆された。このため、これらの４つのＧＲＭ遺伝子は、ＡＤＨＤと関連するＣＮＶｓによって影響を受けて、独立ＡＤＨＤコホートにて正しく複製されたが（表３および表１１）、他のＣＮＶ遺伝子座は、名目的に有意なＰ値であるが、ＡＤＨＤ症例で濃縮されたことも観察された（表３ｂおよび表１１）。
【０１３２】
表１１．ＣＮＶ領域の発見、複製、および組み合せ有意性
【表１１】
2013535985.tif 000017
【０１３３】
上位４つの最も有意な遺伝子座を太字で示す。
【０１３４】
図１は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（１２）をヒトゲノムのＢｕｉｌｄ  ３６と共に使用して、ＧＲＭ５遺伝子座にて観察されたＣＮＶ欠失を示す（症例１０名対対照１名）。ｑＰＣＲをＲａｗ  ＢＡＦおよびＬＲＲプロットと共に使用したＩＭＡＧＥ、ＰＵＷＭａ、ＩＭＡＧＥ  ＩＩ、ＮＩＭＨ、およびＵｔａｈのＣＮＶｓの実験による妥当性確認を表２〜４に示す。
【０１３５】
まとめると、我々は代謝型グルタミン酸受容体遺伝子ファミリ（ＩｎｔｅｒＰｒｏカテゴリ「ＧＰＣＲ、ファミリ３、代謝型グルタミン酸受容体」；Ｐ＝２．１×１０−９）に属する複数の独立コホートにおいてＣＮＶＲｓに直接影響された４つの遺伝子を見出した。ＧＲＭ２およびＧＲＭ６のどちらもＩＭＡＧＥ  ＩＩコホートにおける単一ＡＤＨＤ症例の欠失により影響されることが見出され、対照被験者には存在しないことも注目に値する。我々は加えて、同じコホートでＴＤＴを使用してＧＲＭ遺伝子の有意性を評価し、ＧＲＭ７について最良の裏付けが観察された、Ｐ＝８．３５×１０−５（表１２）。さらに、ＣＨＯＰファミリ３１１およびＩＭＡＧＥファミリ４２２のファミリベースのサブセットにおける伝達不平衡およびデノボイベントに基づいてファミリベースのＣＮＶ統計値を処理するために、解析も行った（表１２および１４）。
【０１３６】
表１２．グルタミン酸作動性遺伝子のＡＤＨＤ遺伝子型ＧＷＡＳ。８つのＧＲＭ遺伝子領域それぞれにおける最も高い有意性のＳＮＰ遺伝子型の関連性。Ａ）ＡＤＨＤ  ＴＤＴ  ＣＨＯＰ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ５５０ｋ  Ｂ）ＡＤＨＤ症例：対照ＣＨＯＰ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ５５０ｋ  Ｃ）ＡＤＨＤ  ＩＭＡＧＥ  Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ６００ｋ
Ａ）
【表１２−１】
2013535985.tif 000018
【０１３７】
Ｂ）
【表１２−２】
2013535985.tif 000019
【０１３８】
Ｃ）
【表１２−３】
2013535985.tif 000020
【０１３９】
上の所見を考慮して、我々は、ＧＲＭ受容体遺伝子と相互作用する遺伝子が、健常対照と比較してＣＮＶｓが濃縮された症例をより多く有するであろうという仮説を立てた。我々は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｈａｎｎｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２００３）によって提供された併合ヒトインタラクトームに基づいて、ＧＲＭ遺伝子に２親等以内の２２８の遺伝子を同定した。我々は、１，２３１のＡＤＨＤ症例試料および４，１０５の対照試料においてこれらの遺伝子を評価し、試料はすべて、ＣＨＯＰにて同じプラットフォームでＡＤＨＤ症例試料における濃縮の証拠のために遺伝子型が同定された（Ｐ<０．０５）。我々は、対照における１６の遺伝子と比較して、症例において６７のＣＮＶｓが濃縮されたＧＲＭ受容体相互作用遺伝子を検出して、ＡＤＨＤ症例におけるこの遺伝子ネットワーク内でのＣＮＶｓの３倍を超える濃縮を確認した（Ｐ＝４．３８×１０−１０、図１０）。
【０１４０】
我々は続いて、上の２親等ＧＲＭ受容体遺伝子相互作用ネットワークをクラスタ化してネットワークトポロジーに基づいて遺伝子の高度に相互連結されたモジュールを定義し、これらのモジュール内で遺伝子オントロジー（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ＧＯ）アノテーションの濃縮を探した。図１１に示すように、ＧＲＭｓは多数の相互作用を形成しないが、重要なことには、他のセットの遺伝子の機能モジュールを調整する役割を果たす。たとえば、ＧＲＭ１は、ＡＤＨＤ症例において有意に濃縮された重複を持ち、ハウスキーピング機能、たとえば炭水化物代謝、リン酸化、アポトーシス、およびイオン結合に関与する機能モジュールを調整する役割を果たす。ＧＲＭ５およびＧＲＭ７はどちらも、症例で有意に濃縮された欠失を持ち、シナプス伝達および選択的スプライシングに関与する機能モジュール内でクラスタ化する。特にＧＲＭ５は、選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）とシナプス伝達およびシナプス後膜肥厚における他の神経学的過程とを調整する役割を果たすが、ＧＲＭ７は、神経学的過程およびシナプス活動をハウスキーピング機能、たとえば細胞骨格形成およびアポトーシスと統合する機能モジュールを調整する。ＧＲＭ８も症例で有意に濃縮された欠失を持ち、それ自体はシナプス伝達および神経発生に関与する機能モジュール内に含有される。ＧＲＭ３は、症例では有意に濃縮されていないが、症例においてより高頻度に観察される重複を有し、ユビキチン化経路、ＲＮＡ結合、スプライシング、およびプロセシング、ならびにニューロン移動と、行動および認知の効果を伴うシナプス伝達を含む神経学的過程とを調整する役割を果たす。
【実施例２】
【０１４１】
ＡＤＨＤ診断のための多重ＳＮＰパネル
実施例１に記載したように、複数の遺伝的改変がＡＤＨＤ表現型と関連していることが見出された。本明細書で上述した情報は、ＡＤＨＤ発症の感受性の上昇の診断、および治療的介入のために患者に臨床的に利用することができる。本発明の好ましい実施形態は、本明細書で上述した情報の患者への臨床的利用を含む。マイクロアレイを含む診断用組成物、および方法は、本明細書に記載する患者からの核酸内の遺伝的改変を同定して、ＡＤＨＤ発症の感受性を評価するように設計することができる。これは患者が診療所に到着した後に行うことができる。患者から血液を採取し、本明細書に記載する診断方法を使用して、臨床医は下の表１３Ａおよび１３Ｂに挙げる遺伝子領域でＳＮＰを検出することができる。スクリーニングされる患者の代表的な年齢範囲は、１〜１２歳である。患者試料（たとえば核酸）から得た情報は、評価前に選択的に増幅することが可能であり、ＡＤＨＤ発症の感受性が上昇または低下した患者を診断するために使用できる。本発明の診断方法を行うためのキットも、本明細書で提供される。このようなキットは、本明細書で提供するＳＮＰｓの少なくとも１つを含むマイクロアレイおよび上記の患者試料を評価するために必要な試薬を含む。別の実施形態において、多重ＳＮＰパネルが用いられ、患者試料は下の表に挙げるすべてのＳＮＰｓの存在または非存在が評価される。
【０１４２】
表１３Ａは、開示されたＡＤＨＤマーカーのすべての遺伝子、物理的なゲノム範囲、およびＳＮＰ範囲を提供する。表１３Ｂは、ＦＤＡによって承認された技術であるベラコードなどの「診断アレイ」の最小セットである「ＳＮＰＬｉｓｔ」を提供する。最適には、これらのＣＮＶｓに対するフランキングＳＮＰｓが介入ＳＮＰｓと同様に含まれているため、これらはすべてを使用してＣＮＶを取り込むことができる。
【０１４３】
我々が試験を行う場合、クラスタ化アルゴリズムＧｅｎＣａｌｌが試料セットに対して実行され、クラスタ化が不十分であるまたはＨａｒｄｙ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡から有意に逸脱しているＳＮＰｓは検討される。コピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ：ＣＮＶｓ）は、我々のＰｅｎｎＣＮＶ隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）コピー数多型アルゴリズムを使用して検出される。デフォルトである中央値正規化が停止されているのは、分散されたゲノムワイドの代わりに標的領域のデータによって、中央値正規化に十分な情報が提供されないためである。最適化のために、ＨＭＭを、特異的アレイ観察値に適した高品質のデータによって訓練することができる（コールレート>９８％およびｌｏｇ  ｒ比の標準偏差<０．３）。ＰｅｎｎＣＮＶは、欠失を示す０以下となる傾向がある、または重複を示す０を超える傾向がある強度（ｌｏｇ  Ｒ比）を持つ隣接するＳＮＰｓの領域を検出する。このような傾向が観察されない場合、正常な２倍体状態を示すＣＮＶコールは生成されない。同時に、遺伝子型データは、欠失を示すホモ接合遺伝子型または対照マイナーアレル頻度への正の相関に重み付けされた重複を示すＡＡＢおよびＡＢＢ遺伝子型の連続した物理的位置において評価される。
【０１４４】
ＡＤＨＤに関与する遺伝子の同定および患者の結果によって、存在する変異体が示され、ＡＤＨＤ発症のリスクの改変を所有するものが同定される。本明細書で提供する情報によって、以前に起こる可能性があった疾患進行への早期の治療的介入が可能となる。本明細書で上述したように、ＧＲＭ受容体ファミリは、ＡＤＨＤの治療に有効な新しい治療剤の開発のための新規標的を提供する。特に、この疾患を発症する傾向がより高い患者におけるこのような遺伝子の発現を調節することが望ましい。
【０１４５】
表１３Ａ．多重ＳＮＰパネル
【表１３Ａ】
2013535985.tif 000021
2013535985.tif 000022
【０１４６】
表１３Ｂ．診断アレイにおける実行に利用できるＳＮＰのリスト
【表１３Ｂ】
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【０１４７】
追加の研究において、我々は、我々の以前のＣＮＶｓのＧＲＭネットワーク解析を、ＡＤＨＤの有意性を示す３３５の遺伝子のより包括的なネットワークにまで拡張した。元のｍＧｌｕＲネットワークは、ヒトインタラクトームによって定義された１および２親等相互作用遺伝子を含む、２７１の遺伝子から生成された。解析の更新により、遺伝子のＧＲＭｓとの機能相互作用をより良好に取り込むための、ｍＧｌｕＲネットワーク定義のより包括的な更新が提供される。
【０１４８】
これらの追加の標的を生成するために、以下のデータデータベースを用いた：
１．生物学的相互作用および機能アノテーションのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ。各Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙの相互作用は、専門の科学者たちが特定の相互作用分子を裏付ける刊行物を用いて手作業で作成している。
２．遺伝子関連性およびヒトゲノム疫学の統合された検索可能な知識ベースである、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ（ＨｕＧＥ）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで報告されている公開ＧＷＡＳの結果。
３．ｍＧｌｕＲ遺伝子との相互作用に関する我々のＰｕｂＭｅｄの文献総説。
４．パブリックドメインでは見出されないＡＤＨＤ患者の配列決定からの低頻度変異体。
【０１４９】
これらの更新されたネットワークを使用して、神経学的に正常な対照７４４９名と比較して、ＡＤＨＤ症例１２９２名を解析した。負の対照を使用して、発生経路（ＨＯＸ  ｇｅｎｅｘｅｓ）、癌（肺癌経路）、およびＡＤＨＤに関係していない神経シグナル伝達（ＧＡＢＡ）などの生物関連予測におけるＣＮＶ解析アルゴリズムを妥当性確認した。ネットワークは非常に有意であり、ＣＮＶｓは症例全体の１７％および対照の９％で同定され、ＯＲ  ２．１およびＰ＝６．５×１０−１７である。表１３Ｃは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェアを使用して同定した、提示されている２７１の遺伝子に加えて、６４の追加の遺伝子の名称を示す（合計３３５）。解析の更新によって、生物学的相互作用および機能アノテーションのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅに基づく、遺伝子のＧＲＭｓとの機能的相互作用が提供される。各Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙの相互作用は、専門の科学者たちが特定の相互作用分子を裏付ける刊行物を用いて手作業で作成している。
【０１５０】
拡張ＣＮＶ解析による結果は以下の通りである：
【０１５１】
2013535985.tif 000028
【０１５２】
表１３Ｃ．３３５の標的を以下に挙げる（表１３Ａからの２７１の標的を含む）
【表１３Ｃ】
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【０１５３】
本発明により、ＡＤＨＤ患者の１０％が代謝型グルタミン酸受容体遺伝子（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｍＧｌｕＲｓ）をコードする遺伝子の突然変異の特異的な種類を保有することが見出されている。これらの突然変異は、ｍＧｌｕＲ経路の欠陥によるＡＤＨＤを選択および治療するための感受性および特異的なバイオマーカーである。さらに本発明者らは、ｍＧｌｕＲｓを特異的に活性化して、ｍＧｌｕＲ遺伝子のＧＲＭファミリに突然変異を持つＡＤＨＤ患者において正常な神経生理を回復する可能性がある薬剤候補を同定した。表１を参照。
【０１５４】
たとえば、本明細書に記載する試験および治療パラダイムを実施する際に投与される可能性のある化合物は、Ｆ．Ｇｕａｌｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，８：１２５−３８（２００２）に記載されているようなピラセタム系向知性剤を含む。さらに好ましくは、治療剤はピログルタミドである。本発明の実施に使用することができるピログルタミドの調製および製剤に関する詳細事項は、Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，１０２，８８２号で提供されている。ＡＤＨＤ関連コピー数多型の存在を示す１若しくはそれ以上のＳＮＰｓを有することが判定された患者でのＡＤＨＤの治療に特に好ましい薬剤は、表１３に示されているように、（＋）−５−オキソ−Ｄ−プロリンピペリジンアミド１水和物（ＮＳ−１０５）である。
【実施例３】
【０１５５】
ＡＤＨＤの病因に関与する、上で同定したＣＮＶ含有ｍＧｌｕＲ遺伝子は、ＡＤＨＤの治療に有効な新たな治療剤の開発のための新規標的も提供する。このために、ｍＧｌｕＲタンパク質相互作用および関連する病態を調節する候補薬剤（薬剤または化合物）のスクリーニング方法を、本明細書で提供する情報に基づいて行うことができる。代表的な候補薬剤は、核酸、ポリペプチド、小分子化合物およびペプチド模倣薬を含む。
【０１５６】
いくつかの症例において、遺伝因子は、酵母細胞に遺伝子をコードする核酸構築物と接触させることによってスクリーニングすることができる。たとえば、多種多様の遺伝子を発現するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、このような相互作用を調節する他の遺伝子を同定することができる。たとえば、同定された薬剤は、グルタミン酸関連神経シグナル伝達、細胞下タンパク質局在および／または神経細胞形態または生存能を調節することができる。したがって、正確な作用機序とは無関係に、本明細書に記載するスクリーニング法によって同定された薬剤は、ＡＤＨＤに苦しむ患者に治療的利益を提供することが予想される。
【０１５７】
好適なスクリーニング法は、ＡＴＣＣから入手可能な多種多様の神経細胞型を用いることができる。候補薬剤は、合成または天然化合物の大規模なライブラリからスクリーニングすることができる。１つの実施例は、ＦＤＡ承認のヒトが使用できる化合物のライブラリである。加えて、化合物ライブラリは、これに限定されるものではないが、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（英国コーンウォール州Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（コネチカット州、Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（スイスＢａｓｅｌ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（フランスＰａｒｉｓ）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ａｕｒｏｒａ（オーストリアＧｒａｚ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｂｉｏｎｅｔ（英国Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ（カリフォルニア州ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ＣｈｅｍＤｉｖ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ  Ｌｔ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｔｄ（ロシアＯｂｎｉｎｓｋ）、Ｅｎａｍｉｎｅ（ウクライナＫｉｅｖ）、Ｅｖｏｔｅｃ（ドイツＨａｍｂｕｒｇ）、Ｉｎｄｏｆｍｅ（ニュージャージー州Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランスＭｏｎｔｌｕｃｏｎ）、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ．（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｏｔａｖａ（オンタリオ州Ｔｏｒｏｎｔｏ）、ＰｈａｒｍＥｘ  Ｌｔｄ．（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ニュージャージー州Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ニューハンプシャー州Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｓｓｉｐｅｅ）、Ｓｐｅｃｓ（オランダＤｅｌｆｔ）、ＴｉｍＴｅｃ（デラウェア州Ｎｅｗａｒｋ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（オンタリオ州Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ウクライナＫｉｅｖ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、およびＢｉｃｏｌｌ（中国Ｓｈａｎｇｈａｉ）を含むいくつかの企業より市販されている。コンビナトリアルライブラリは、入手可能であり、調製することができる。細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形の天然化合物のライブラリは市販されているか、または当分野で周知の方法によってただちに調製できる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物源などの天然源から単離された化合物、ならびに海洋試料は、潜在的に有用な医薬品の存在について候補としてアッセイすることが提案されている。スクリーニングされる医薬品は、化学組成物または人工化合物からの誘導または合成も可能であることが理解される。
【０１５８】
たとえば、神経細胞を試験化合物、たとえばピログルタミド（たとえば米国特許第５，１０２，８８２号明細書）およびピラセタム系向知性剤の他のメンバの存在下または非存在下でインキュベートして、その後、グルタミン酸シグナル伝達に対する化合物の効果を評価することができる。このように同定された薬剤は次に、ＡＤＨＤの全動物モデルでの試験を行って、生体内有効性を評価することができる。
【０１５９】
本明細書に記載するスクリーニングアッセイを使用して同定された薬剤も、本発明に含まれる。
【０１６０】
考察
現在、ＡＤＨＤにおけるゲノムワイド関連性研究はきわめて不十分であり、ＡＤＨＤに有意に関連しているＣＮＶｓについて報告した研究はない。したがって、我々の研究は、ＡＤＨＤにおけるＣＮＶｓの最初の大規模な偏りのない２段階ゲノムワイドスキャニングに相当する。小児３名が罹患した１つのＡＤＨＤのファミリおよびＧＲＭ７が欠失した１つのファミリでのＧＲＭ５欠失を、５７の他の非ＧＲＭ受容体遺伝子と共に以前報告したが、その大半は単一事象であり１３、代謝型グルタミン酸受容体ファミリの遺伝子（ＧＲＭ５、ＧＲＭ７、ＧＲＭ８およびＧＲＭ１）は、ＡＤＨＤに有意に関連するＣＮＶｓに影響されることが示され、複数の独立した症例対照データセットでの複製が観察されたのが初めてである。
【０１６１】
代謝型グルタミン酸受容体（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＧＲＭｓまたはｍＧｌｕＲｓ）は、神経系における興奮性シナプス伝達の調節に関与する７回膜貫通領域を所有するＧタンパク質共役受容体のクラスである１４。配列相同性、推定シグナル伝達機構、および薬理学的特性に基づいて、３つの受容体群がある１５。ＧＲＭ５およびＧＲＭ１は、ＡＤＨＤに関連する脳領域である基底核および小脳で特に発現されるグループＩのメンバである１６。これらの受容体はホスホリパーゼＣを活性化することが示されて、嗜癖、不安および行動障害において役割を果たす可能性があることが仮定されている１７。ＧＲＭ７およびＧＲＭ８は、サイクリックＡＭＰカスケードの阻害に関連する、グループＩＩＩのメンバである。ＧＲＭ７は、不安に関連していて１８、各種の哺乳動物種ですべてのｍＧｌｕＲサブタイプの中で最も高度に保存されている１９。
【０１６２】
ＡＤＨＤにグルタミン酸作動性が関与する証拠は、多様な分野から生じている。グルタミン酸作動性受容体およびトランスポータ中の変異体を調べる関連研究によって、相容れない結果が報告されているが２０−２３、ＡＤＨＤ小児におけるメチルフェニデートに対する応答を調べるゲノムワイド関連研究によって、ＧＲＭ７（ｒｓ３７９２４５２）内のＳＮＰｓを含む複数のＳＮＰｓの関連についての名目上の証拠が検出された２４。ＧＲＩＮ２Ａは遺伝的連鎖研究でＡＤＨＤと関連することが報告され２０、ＧＲＩＮ２ＢはＴＤＴによって関連付けられていた２５。磁気共鳴分光研究によって、ＡＤＨＤ被験者の前頭および線条体脳領域におけるグルタミン酸作動性緊張の上昇が示され２６−２８、この上昇は刺激薬およびアトモキセチンによって正常化する２９。ＡＤＨＤ動物モデルであるＳＬＣ６Ａ３−ＫＯ（ＤＡＴ−ＫＯ）マウスは、ドーパミントランスポータの欠乏にもかかわらずメチルフェニデートになお反応性であり３０、これらのマウスの多動性は、ＮＭＤＡ受容体遮断薬によって上昇させることができ、グルタミン酸作動性伝達を向上させる薬物によって抑制することができる３１。中脳ＳＬＣ６Ａ３およびＤＲＤ４発現の増加は、線条体におけるグルタミン酸トランスポータの増加が見出されたラットで報告され３２、ドーパミンの減少がグルタミン酸シグナル伝達を改変する可能性があることが示唆される。また、グルタミン酸受容体サブユニット遺伝子（ＧＲＩＮ２Ａ）の破壊によって、マウスの前頭皮質および線条体におけるＤＡおよびセロトニン代謝が増加して、ドーパミンまたはセロトニン受容体アンタゴニストによって低減された自発運動活性が上昇した３３。その上、グルタミン作動性（ｇｌｕｔａｍｅｔｅｒｇｉｃ）経路における遺伝子の調節不全発現は、ＳＨＲ３４−３７において、およびＡＤＨＤのＰＣＢ曝露ラットモデルにおいて３６観察されている。グルタミン酸レベルの上昇は、ＡＤＨＤ脳の神経代謝で報告され、ＡＤＨＤではグルタミン酸伝達の改変が重要であることを示唆している２８。我々の研究におけるＡＤＨＤに関連したグルタミン酸受容体は、３つの例では欠失していて、１つの例では重複していたが、欠失症例におけるグルタミン酸シグナル伝達で生じた摂動は、送達および受容された神経伝達シグナルの不一致を補償しようとして、追加のグルタミン酸を放出するフィードバックループを通じてＡＤＨＤを促進する可能性がある。
【０１６３】
遺伝子のＧＲＭファミリとは別に、我々は８つの他の遺伝子座とＡＤＨＤとの関連を検出し、その４つは遺伝子に影響を及ぼす（表３Ｂ）。これらの中には、ＡＤＨＤに関して興味深い生態を持つ遺伝子がある。ＤＰＰ６は以前、ゲノムワイド関連研究において筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）と関連していて３８，３９、ＤＰＰ６に影響を及ぼすＣＮＶｓが自閉症と関連付けて報告されている４０。（我々の関連はＣＴＮＮＡ２に直接影響を及ぼさないが）ＤＰＰ６およびＣＴＮＮＡ２は、以前のＡＤＨＤＳＮＰ遺伝子型ＧＷＡＳによって関係付けられている９。ＮＬＮは、神経ペプチド、たとえば以前にＡＤＨＤに関係していたニューロペプチドＹ（ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ：ＮＰＹ）などの神経ペプチドの代謝不活性化に関与する興味深い候補である４５，４６。ＳＬＣ７Ａ１０は、グルタミン酸作動性シナプスにてＤ−セリンの動員を通じて、グルタミン酸作動性伝達の調節で役割を果たすことが示されている。ＬＡＲＰ７は、転写後スプライシングに関与するタンパク質複合体である、ｓｎＲＮＰの完全性にとって重要である。ＮＥＧＲ１は、哺乳動物脳での再生軸索出芽および神経細胞成長において神経細胞接着分子および経神経成長促進因子をコードする。興味深いことに、この神経細胞遺伝子は近年、肥満と関連していた４１。
【０１６４】
ＣＨＯＰ発見コホートにおいて、ファミリ２３０は、そのファミリのＡＤＨＤ症例３名すべてが母親から遺伝したＧＲＭ５欠失および父親から遺伝したＮＥＧＲ１重複の両方に影響を受けている。優れたＩＱレベルにもかかわらず、これらの小児３名は重篤な機能障害を有していた。これは、３名すべてのファミリ性症例で観察され、対照では観察されない唯一のＣＮＶ領域であった。成人ＡＤＨＤセルフ・レポート・スケール（Ｓｅｌｆ−Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｃａｌｅ）４２を使用した母親の評価によって、ＡＤＨＤの可能性が指摘された。
【０１６５】
これらの領域で各遺伝子を直接破壊する８つのＣＮＶＲｓが示されているが（ＧＲＭ５、ＧＲＭ７、ＧＲＭ８、ＧＲＭ１、ＮＥＧＲ１、ＤＰＰ６、ＳＧＴＢ／ＮＬＮおよびＬＡＲＰ７を含む）、残りは最も近いものによってアノテーションされている（表３Ａおよび３Ｂ）。さらに、ＧＲＭ８、ＧＲＭ１、ＳＧＴＢ／ＮＬＮ、およびＬＡＲＰ７  ＣＮＶｓはエキソン性である。ＡＤＨＤ表現型に関係する関連遺伝子の機能を十分にキャラクタリゼーションするためのさらなる機能研究が行われる。このため、複数の独立コホートにおけるゲノム全体を評価する我々の偏りのない手法によって、ＡＤＨＤにおける脳に対するいずれの潜在的な生物学的および生理学的影響についても以前に研究されていない新規遺伝子中のＣＮＶｓが明らかとなり、さらなるキャラクタリゼーションが待たれている。
【０１６６】
ＡＤＨＤの病因で報告された４つのＧＲＭ受容体遺伝子の有意性および各遺伝子座におけるＣＮＶｓの低頻度を考慮すると、我々は、ＧＲＭ受容体相互作用遺伝子を、症例および対照におけるＣＮＶ観察の頻度について評価することにした。ＧＲＭ受容体遺伝子ファミリの強い関連が以前に知られていることを考慮すると、このことにより有意傾向の遺伝子座を含めることができる。ＣＮＶｓは所与の遺伝子座において非常に低頻度であることが多いが（<１％）、その印象的な効果量によって証明されるように、その関連性によって、疾患状態に対して共通変異体よりも強い直接相関が提供される（表３のＯＲｓを参照）。個々の有意な遺伝子座のみに基づいて、３．６６％のＡＤＨＤ症例は、発見されたＣＮＶｓと強く相関している。信頼できるＧＲＭファミリによる結果をＧＲＭ受容体相互作用／シグナル伝達遺伝子の遺伝子ネットワークに拡張することにより、対照の頻度について調整した後に、９．９４％のＡＤＨＤ症例にその疾患の遺伝的キャラクタリゼーションが提供される（すなわち、症例における正味の影響）。このネットワークを裏付ける主要な拠点は、以前に統合失調症およびてんかんと関連付けられた、ＴＮＩＫ４８、ＧＮＡＱ４９、およびＣＡＬＭ１５０（図１１）を含む。興味深いことに、ＧＲＭ受容体ネットワーク遺伝子のＧＲＩＫ１は、ＡＤＨＤの過活動／衝動的症状とも関連付けられている８。
【０１６７】
まとめると、我々のＣＮＶの解析およびＧＲＭ受容体遺伝子相互作用ネットワークの機能的濃縮によって、ＧＲＭｓは多数の相互作用を形成しないが、他のセットの遺伝子の機能モジュールを調整する役割を果たすことが示唆される。励みになることには、これらのモジュールのいくつかは、シナプス伝達の過程、神経発生、およびＡＤＨＤにて欠陥があると考えられる他の神経学的過程において重要である。このため、ＡＤＨＤに影響を及ぼすＣＮＶｓのネットワーク解析を通じて、我々は、脳特異的シナプス活動に影響することが示されている、ＲＮＡ結合、プロセシング、および選択的スプライシングなどの過程で重要であるモジュールを同定している５１，５２。また我々は、我々が以前自閉症と結び付けた過程であるユビキチン化に関与する機能モジュールを同定し１、自閉症はＡＤＨＤとある表現型特徴を共有している。さらに、異常機能脳接続性は、ＡＤＨＤを含む認知障害と関連する発育性脳障害における候補因子である５３，５４。このため、受容体のＧＲＭファミリのうち影響するＣＮＶＲｓ、特にＧＲＭ５およびＧＲＭ７は、ＡＤＨＤの根底にある分子的病因にとって重要である。
【０１６８】
結論として、我々は、高分解能ＣＮＶ検出のための２段階ゲノムワイド関連手法を使用して、対照と比較してＡＤＨＤ症例においてＣＮＶｓの濃縮を示す１２の遺伝子座を同定し、症例および対照に適合した３つの異なるプラットフォームで遺伝子型が同定されたＡＤＨＤ症例および健常対照の独立したデータセットを使用して、遺伝子座のうち４つの複製に成功した。影響された遺伝子のうち４つは、代謝型グルタミン酸受容体ファミリに属している。グルタミン酸受容体と相互作用する２００を超える遺伝子のネットワークは、ＣＮＶｓによって集合的に影響を及ぼされ、すべてのＡＤＨＤ症例のおよそ１０％の遺伝的多様性を取り込む。さらに、代謝型グルタミン酸受容体と相互作用する遺伝子のこのネットワークは、重要な神経細胞機能を持つ機能モジュールのセットを定義し、その神経細胞機能の欠陥は、ＡＤＨＤおよび他の神経発達障害の根底にあると考えられている。したがって、ＡＤＨＤに関連するＣＮＶｓについてのこの分子系内での遺伝子の濃縮によって、疾患に対する新規感受性機構が示唆され、これらの分子ネットワーク内の候補遺伝子における構造的変異および単一塩基変化を含む、追加の変異の評価が促進されるであろう。我々の結果により、これらの候補遺伝子中のＣＮＶｓの生物学的効果を評価するための発現および他の機能アッセイが必要とされる。
【０１６９】
表１４．ＡＤＨＤＣＮＶファミリベースの伝達不平衡およびデノボ統計試験。
Ａ）遺伝で濃縮されたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＨＯＰ欠失
【表１４−１】
2013535985.tif 000030
【０１７０】
Ｂ）遺伝で濃縮されたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＨＯＰ重複
【表１４−２】
2013535985.tif 000031
【０１７１】
Ｃ）デノボで濃縮されたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＨＯＰ欠失
【表１４−３】
2013535985.tif 000032
【０１７２】
Ｄ）デノボで濃縮されたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＨＯＰ重複
【表１４−４】
2013535985.tif 000033
【０１７３】
Ｅ）遺伝で濃縮されたＰｅｒｌｅｇｅｎ  ＩＭＡＧＥ欠失
【表１４−５】
2013535985.tif 000034
【０１７４】
Ｆ）遺伝で濃縮されたＰｅｒｌｅｇｅｎ  ＩＭＡＧＥ重複
【表１４−６】
2013535985.tif 000035
【０１７５】
Ｇ）デノボで濃縮されたＰｅｒｌｅｇｅｎ  ＩＭＡＧＥ欠失
【表１４−７】
2013535985.tif 000036
【０１７６】
Ｈ）デノボで濃縮されたＰｅｒｌｅｇｅｎ  ＩＭＡＧＥ重複
【表１４−８】
2013535985.tif 000037
【０１７７】
表１５．ＡＤＨＤ  ＣＮＶファミリベースの伝達不平衡およびデノボ統計試験
【表１５】
2013535985.tif 000038
【０１７８】
表１６．影響するＣＮＶ遺伝子座に対する試料源の寄与
【表１６】
2013535985.tif 000039
【０１７９】
表１７．表１Ａおよび１Ｂにおける個々のＣＮＶｓの境界
【表１７】
2013535985.tif 000040
2013535985.tif 000041
【０１８０】
＊エキソン距離「０」は、エキソンがＣＮＶの影響を受けていることを示す。
＾ｑＰＣＲ妥当性確認に利用できない試料（Ｂｅａｄ  Ｓｔｕｄｉｏにて目視で妥当性確認された試料）。
【０１８１】
表１８．ＡＤＨＤ症例および対照のＧＲＭ受容体相互作用遺伝子中のＣＮＶｓの頻度
【表１８】
2013535985.tif 000042
2013535985.tif 000043
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【０１８２】
表１９．相互作用遺伝子のネットワークに基づく遺伝子クラスタ
【表１９】
2013535985.tif 000048
【実施例４】
【０１８３】
ＧＲＭ５遺伝子の１コピー中に大規模な欠失を持つＡＤＨＤ患者のファミリにおいて同定されたＧＲＭ５  ＣＮＶ（欠失）の生物学的効果を、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ、ＥＢＶ）によって形質転換されたＰＢＭＣ由来細胞株中で調べた。文献ではＰＢＭＣ細胞がｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５の両方を発現して、ｍＧｌｕＲｓがＴ細胞活性化で役割を果たす可能性があることが報告されている。我々は最初に、健常被験者に由来するＥＢＶ形質転換細胞株中のｍＧｌｕＲ５の発現をｑＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって調べた。結果によりｍＧｌｕＲ５の発現が確認された。我々は次に、フローサイトメトリーでの蛍光シグナルの定量分析によって、ＡＤＨＤファミリに由来する４つの細胞株を４つの対照細胞株と比較した。ｍＧｌｕＲ５  Ａｂ染色と対照Ａｂ染色との間の蛍光値の比を計算した。ＡＤＨＤ群の平均比は４．６（±０．４）であったのに対して、対照の平均は７．３（±１．７）であった。差は統計的に有意であり（ｔ検定、ｐ＝０．０２４）、欠失症例でｍＧｌｕＲ５発現が約３６％低下したことを示している。この結果により、ＧＲＭ５遺伝子中のこのＣＮＶがｍＧｌｕＲ５発現の低下を引き起こすという最初の証拠が提供される。
【０１８４】
以下の物質および方法は、実施例４の実施を容易にするために提供されている。
【０１８５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ。ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号Ｈｓ００１６８２７５−ｍ１）より購入した。７９００ＨＴｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、３４８のウェルプレートでリアルタイムＰＣＲを行った。テンプレートは、ＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３７４８６７）を使用して、全ＲＮＡおよび無作為のプライマからｃＤＮＡ合成した。ＲＮＡを１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した細胞から単離した。
【０１８６】
フローサイトメトリー。細胞をパラホルムアルデヒドで固定して、特異的ｍＧｌｕＲ５モノクローナル抗体（Ｒ&Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ４５１４）またはアイソタイプマッチ対照抗体（Ｒ&Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ００２）、続いてフィコエリトリンコンジュゲート抗マウス抗体によって染色した。染色した細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータを使用して分析した。
【０１８７】
結果
各被験者の細胞を３つの試料に分けた。そのうち１つを染色を用いてバックグラウンド対照として使用し、そのうち２つをｍＧｌｕＲ５  Ａｂおよび対照Ａｂによってそれぞれ染色した。各被験者のｍＧｌｕＲ５  Ａｂおよび対照Ａｂで染色した細胞の平均蛍光を表Ａに示す。ｍＧｌｕＲ  Ａｂ染色および対照Ａｂ染色の比を計算して、再び表１に示す。ＡＤＨＤ群の平均比は４．６（±０．４）であったのに対して、対照の平均は７．３（±１．７）であった。差は統計的に有意であり（ｔ検定、ｐ＝０．０２４）、ｍＧｌｕＲ５発現が約３６％低下したことを示している。
【０１８８】
これらのデータによって、本明細書で提供する多様な遺伝子標的におけるＣＮＶｓの生物学的な重要性が、生物系において実験的に決定および検証され、このことによりこれらの欠失の結果として失われた生物活性をたとえば回復することができる有益な治療剤の同定およびキャラクタリゼーションが容易になることが示されている。
【０１８９】
表Ａ．ＰＢＭＣ由来細胞株のフローサイトメトリー分析の結果
【表Ａ】
2013535985.tif 000049
【０１９０】
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【０１９１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態が上で記載され、特に例示されたが、本発明がこのような実施形態に限定されることは意図されていない。以下の請求項に記載されているように、本発明の範囲から逸脱することなく、多様な変更および修正が行えることが当業者に明らかになるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
2013535985.tif 000052
【図３Ａ−２】
2013535985.tif 000053
【図３Ａ−３】
2013535985.tif 000054
【図３Ｂ−１】
2013535985.tif 000055
【図３Ｂ−２】
2013535985.tif 000056
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2013535985.tif 000062
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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