(57)【要約】本発明は、マイクロパターン化された核形成部位を用いてアクチンフィラメントの成長および組織化をコントロールするための装置および方法、ならびにアクチンのネットワーク形成を研究するため、薬物をスクリーニングするため、または複合構造を調製するためのそれらの使用に関する。
2013535689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ドットがアクチン核形成剤を含み、該ドットが、２個の隣合うドットから重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にあり、該アクチン核形成剤が、ＷＡＳＰ／ＳＣＡＲファミリーのメンバー、そのＰＷＡフラグメントおよびそのＶＡＣドメイン、そのＡｃｔａＡ、ＩｓｃＡおよびＣ末端領域から成る群より選択され、好ましくは該アクチン核形成剤がＰＷＡである、アクチン核形成剤を含む線を含むパターンまたは少なくとも２個のドットを含むパターンがその上に配された表面を含む装置。
【請求項２】
表面が、複数のパターン、好ましくは複数のアドレス指定可能なパターンをその上に配されている、請求項１記載の装置。
【請求項３】
パターンが、複数のドットまたは線を含み、該ドットまたは線が、２個の隣合うドットまたは線から重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にあり、好ましくはその距離が、１、２、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロンである、請求項１〜２のいずれか一項記載の装置。
【請求項４】
パターンが：
−  １個の円もしくは複数の入れ子になった円；および／または
−  ２本以上の線；および／または
−  ドットの配列
を含む、請求項１〜２のいずれか一項記載の装置。
【請求項５】
パターンが、２〜５個の円を含み、該円が、異なる直径を有し、同心または偏心であり、より小さな円がより大きな円の中に入っている、請求項１〜３のいずれか一項記載の装置。
【請求項６】
パターンが、２本以上の線、好ましくは直線を含み、該線が、相互に：
−  ２５°以下の角；
−  ２５°よりも大きく１１０°未満の角；または
−  １１０°よりも大きく１５０°未満の角
を形成する、請求項１〜４のいずれか一項記載の装置。
【請求項７】
パターンが、放射状パターンを形成するように配置された複数の線を含む、請求項１〜４および６のいずれか一項記載の装置。
【請求項８】
表面が平面状である、請求項１〜７のいずれか一項記載の装置。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の装置と、アクチンの重合を誘導するために十分な成分、特にアクチンモノマー、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体、場合によりプロフィリンを含むアクチン重合溶液またはアクチン重合混合物とを含むキット。
【請求項１０】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項記載の装置を提供すること；ｂ）パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびに場合によりｃ）該重合溶液もしくは重合混合物を除去することおよび／または得られたアクチンフィラメントを表面から除去することを含む、アクチンフィラメントのネットワークを調製または製造するための方法。
【請求項１１】
−  アクチンフィラメントにコーティングすること、特に金などの伝導性物質をコーティングすること；および／または
−  アクチンフィラメントを、特にファスシンもしくはα−アクチニンなどのアクチン架橋剤で処理すること
を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項記載の装置を提供すること；ｂ）パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびに、ｃ）フィラメントのネットワークを観察することを含む、アクチンフィラメントのネットワークの空間的組織化を研究するための方法。
【請求項１３】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項記載の装置を提供すること；ｂ）パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによってアクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびにｃ）アクチンフィラメントのネットワークを観察することを含む、被験分子がアクチンフィラメントのネットワークをモデュレーションする能力について該被験分子をスクリーニングするための方法であって、該被験分子が、アクチン重合の前、途中および／またはアクチン重合の後に添加され、アクチンフィラメントのネットワークに対する該被験分子の作用が決定される方法。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項記載の装置を提供すること；ｂ）パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによってアクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびにｃ）重合したアクチンフィラメントの構造、相互作用および／または変形を観察することを含む、ミオシンなどの分子モーターを研究するための方法であって、該分子モーターが、アクチン重合の前、途中および／またはアクチン重合の後に添加される方法。
【請求項１５】
重合溶液または重合混合物が、少なくとも３０nMのＡｒｐ２／３複合体を含有する、請求項１０〜１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アクチンフィラメントのネットワークの組織化をコントロールするための、それによりアクチンフィラメントのネットワークの組織化を研究するための、アクチンのネットワークの組織化をモデュレーションする能力について化合物をスクリーニングするための、またはアクチン系成分を製造するための、特にさらなるナノエンジニアリング工程用のテンプレートとしてアクチンのネットワークを使用するための、装置および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
アクチンフィラメントは、細胞の細胞骨格の主成分の一つを構成する。アクチンフィラメントは、細胞内に入るとアクチンモノマーから自然に自己集合するポリマーである。アクチンフィラメントは、複雑な細胞内構造を形成し、細胞の形をレギュレーションするための機械的支持体となる。アクチンフィラメントは、束状に集合して糸状仮足またはストレスファイバーになって、細胞の形態形成、接着および運動の際に中心的な役割を果たす。束の出現は、in vivoで特異的アクチンレギュレーターに幅広く関係している。そのような動的モデュレーションは、バルク溶液中の、またはバイオミメティック装置を用いたアクチンネットワークの集合の生化学的再構成によっても浮き彫りとなった。しかしながら、細胞内で出会うような幾何学的境界がアクチンの高次構造の動的形成にどのように影響するかという疑問は検討されていない。
【０００３】
アクチンモノマーは、濾過された細胞ホモジェネートから単離および精製することができる。in vitroでは、これらのモノマーは核形成タンパク質およびＡＴＰ（エネルギー源）の存在下で重合して新しいアクチンフィラメント（Ｆ−アクチン）を形成することができる。細胞内の集合とは逆に、in vitroで形成した場合、フィラメントのネットワークは特定の構造を持たない。in vitroでアクチンのネットワークを再現するためにいくつかの方法が記載されている（Haraszti et al, 2009）。
【０００４】
最初のアプローチでは、アクチンフィラメントのin vitro重合は、精製モノマーから溶液中で行われる（例えばUS2004/0038323、US2006/0003399）。しかしながら、この種の再構成は、フィラメントのネットワークの自然でランダムな組織化に見舞われ、特に開始領域の幾何学的コントロールの完全な欠如を来す。
【０００５】
第２のアプローチでは、アクチンの重合は、溶液中に分散した核形成タンパク質をコーティングされたビーズを用いて行われる（Michelot et al, 2007）。しかしながら、これらのコーティングされたビーズの主な限界の一つは、溶液中のビーズの相対位置がランダムになることである。
【０００６】
第３のアプローチでは、フィラメントの組織化は、溶液中でフィラメントを重合後にコントロールされる。
【０００７】
例えば、フィラメントを柱状ネットワーク上に固定化することができる（すなわち、アクチンフィラメントを、柱状ネットワークと線状に繋ぐ）（Roos et al., 2003）。高さ２０ミクロンの柱状物の上端に幅２ミクロンの金ディスクの配列を組立てた。これらのドットを使用してミオシンを接合し、それによってアクチンフィラメント取付けた。次に、取付けたフィラメントを、アクチンモノマーを含む溶液を使用して伸長させた。ドットから成長する長いフィラメントは定方向を向かず、ネットワークが空間中で自然に組織化するわけではなかった。しかし、アクチン関連タンパク質であるフィラミンの添加によって、フィラメントの束を強制的に形成させることで、ドット間に架橋を形成することができた。この組織化は、長さがフィラメントの長さを超えなければならないマイクロ柱状体の上端にフィラメントがアンカーしている場合にのみ起こることができた。柱状体の上端ではなく、平坦な表面上にあるドットの同じ配列は、フィラミンの存在下であっても不明確なネットワークの形成を促進するだけである。
【０００８】
光学トラップを備えるビーズが配置されたチャンバー内にフィラメントを送ることもできる（Uhrig et al., 2009）。
【０００９】
しかしながら、これらの二事例では、アクチンフィラメントのネットワークは自己集合せず；流体の流れによって、またはビーズの位置を捕獲することによって外部から配向される。最終的な構築は、アクチンフィラメントの集合および相互作用の生物学的性質に依存しないので、これらの方法は、これらの性質を試験するために使用することができない。加えて、外部から配向されたフィラメントの束では、個々のフィラメントの極性はコントロールされない。したがって、これらのネットワークの正確な構築は、高度にはコントロールされない。
【００１０】
第４のアプローチでは、フィラメントの組織化は、表面にアクチン核形成部位およびアクチン捕獲部位を導入することによって固体支持体上でコントロールされる（US20050106629）。これら２種のアンカー点を用いてフィラメントの組織化をコントロールすることができる。しかしながら、その構造は自己集合するのではなく、核形成部位および捕獲部位の場所をコントロールすることによって外部から整えられる。特に、核形成部位は、ある核形成部位からのアクチンフィラメントが別の核形成部位からのアクチンフィラメントと相互作用しないように支持体上に配置される。加えて、核形成部位からのフィラメントの成長は、配向しないので、ビーズによって外部から操縦するか、または磁気もしくは光学トラップによって操作しなければならない。
【００１１】
これらのアプローチのどれも、秩序化されたアクチンフィラメントのネットワークの自己集合を、再現性があり、コントロールされた形状で提供することができない。
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、初めて、核形成の形状自体がアクチンフィラメントの構築の主要な決定因子でありうると実証した。本発明者らは、アクチンフィラメントの組織化に向けた規則（第１の規則は、核形成部位に関するアクチンフィラメントの放射状成長である）を定義した。本発明者らは、アクチン核形成部位のマイクロパターンを開発し、関心が持たれる、再現性のあるアクチンフィラメントのネットワーク構造を調製できるようにした。特に、核形成領域の形、配向およびそれらの間の距離は、フィラメントの配向および長さ、フィラメント間の相互作用ならびに糸状仮足様の束形成（平行な束）またはストレスファイバー様の束形成（反平行な束）をコントロールする。
【００１３】
したがって、本発明は、アクチン核形成剤を含む線（例えば少なくとも１本の線）を含むパターン、好ましくはナノパターンもしくはマイクロパターン、または少なくとも２個のドットを含むパターンを上に配された表面を含む装置を提供し、ここで、各ドットは、アクチン核形成剤を含み、それらのドットは、２個の隣合うドットから重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にある。好ましくは、線は、最小１５、２０、２５または３０ミクロンの、好ましくは１５または２０ミクロンの長さを有する。好ましくは、ドットは、１〜１０μm、好ましくは２〜７μm、より好ましくは約５μmの直径を有する。好ましくは、表面は、複数のパターン、好ましくは複数のアドレス指定可能なパターンをその上に配されている。
【００１４】
好ましくは、アクチン核形成剤は、ＷＡＳＰ／ＳＣＡＲファミリーのメンバー、そのＰＷＡフラグメントおよびそのＶＡＣドメイン、そのＡｃｔａＡ、ＩｓｃＡおよびＣ末端領域から成る群より選択される。より好ましくは、アクチン核形成剤はｐＷＡである。場合により、該ｐＷＡは、１または２個のタグ（例えば、ＧＳＴタグおよび／またはＨｉｓタグ）と結合または融合している。より詳細には、該ｐＷＡは、そのＮ末端でＧＳＴタグに、そしてそのＣ末端でＨｉｓタグに結合または融合している。
【００１５】
好ましくは、パターンは、複数のドットまたは線を含み、そのドットまたは線は、２個の隣合うドットまたは線から重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にある。したがって、パターンは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０本の線またはドットを含む場合があり、特に２、３、４、５、６、７、８、９または１０本の線またはドットを含む場合がある。好ましくは、２本の隣合う線またはドット（すなわち、２本の隣合う線の近位の末端）の間の距離は、１、２、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは５、１０、１５または２０ミクロン、より好ましくは約１０ミクロンである。
【００１６】
好ましくは、パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンは：
−  １個もしくは複数の円、好ましくは入れ子になった円；および／または
−  ２本以上の線、および／または
−  ドットの配列
を含む。
【００１７】
好ましい一態様では、パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンは、２〜５個の円を含み、該円は、異なる直径を有し、同心または偏心である。好ましくは、円は入れ子になっている。言い換えると、より小さな円がより大きな円の中に入っている。
【００１８】
第１の代替的な好ましい一態様では、パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンは、平行であるか、または相互に２５°以下、好ましくは相互に２２°以下、より好ましくは相互に１０°以下の角を形成する２本以上の線、特に２本以上の直線を含む。
【００１９】
第２の代替的な好ましい一態様では、パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンは、相互に２５、３０、３５、４０または４５°よりも大きく１１０°未満の角、好ましくは相互に４５°から９０°の間の角を形成する２本以上の線、特に２本以上の直線を含む。場合により、パターンは２本の線、好ましくは２本の直線を含む。場合により、パターンは、放射状パターンを形成するように配置された複数の線を含む。
【００２０】
第３の代替的な好ましい一態様では、パターン、好ましくはナノパターンまたはマイクロパターンは、相互に１１０°よりも大きく１５０°、１４０°または１３０°未満、好ましくは１１０°から１２０°の間の角を形成する２本以上の線、特に２本以上の直線を含む。場合により、パターンは、２個の線状アクチン核形成部位、好ましくは２個の直線状アクチン核形成部位を含む。場合により、パターンには、放射状パターンを形成するように配置された複数の線状アクチン核形成部位を含む。
【００２１】
好ましくは、表面は、シリコン、歪シリコン、多結晶シリコン、多結晶シリコン、二酸化ケイ素、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、ガラス、プラスチック、セラミック、または金属である。好ましい一態様では、表面はガラスである。より好ましい一態様では、表面は平面状である。
【００２２】
本発明は、また、本明細書開示の装置と、アクチンの重合を誘導するために十分な成分を含むアクチン重合混合物とを含むキットに関する。それらの成分は、アクチンモノマー（１種または複数）、ＡＴＰ、Ａｒｐ２／３複合体、アクチンフィラメントおよび二価陽イオンを含む。場合により、アクチン重合混合物は、さらにプロフィリンを含みうる。場合により、重合混合物は、ラベルされたアクチンモノマー（１種または複数）、特に蛍光色素もしくは蛍光タンパク質でラベルされたアクチンモノマー（１種または複数）および／または金属原子、特に金と結合したアクチンモノマー（１種または複数）を含む。
【００２３】
本発明は、さらに、ａ）本明細書開示の装置を提供すること；ｂ）該パターン、好ましくは該ナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー（１種または複数）、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによってアクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびに場合によりｃ）重合溶液または重合混合物を除去することを含む、アクチンフィラメントのネットワークを調製または製造するための方法に関する。その方法は、さらに、得られたアクチンフィラメントを表面から除去するステップを含んでもよい。その方法は、さらに、アクチンフィラメントにコーティングすること、特に金などの伝導物質をコーティングすること；および／またはアクチンフィラメントを、特にファスシンもしくはα−アクチニンなどのアクチン架橋剤で処理することを含みうる。好ましくは、重合溶液または重合混合物は、臨界密度のアクチンフィラメントの重合を誘導するために十分な量のＡｒｐ２／３複合体、特に少なくとも３０nMのＡｒｐ２／３複合体を含有する。
【００２４】
加えて、本発明は、アクチンフィラメントのネットワークの空間的組織化を研究するための方法であって、ａ）本明細書開示の装置を提供すること；ｂ）該パターン、好ましくは該ナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー（１種または複数）、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびに、ｃ）アクチンフィラメントのネットワークを観察することを含む方法を提供する。好ましくは、重合溶液または重合混合物は、臨界密度のアクチンフィラメントの重合を誘導するために十分な量のＡｒｐ２／３複合体、特に少なくとも３０nMのＡｒｐ２／３複合体を含有する。
【００２５】
本発明は、また、被験分子がアクチンフィラメントのネットワークをモデュレーションする能力についてその被験分子をスクリーニングするための方法であって、ａ）本明細書開示の装置を提供すること；ｂ）該パターン、好ましくは該ナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー（１種または複数）、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびに、ｃ）アクチンフィラメントのネットワークを観察することを含む方法に関し、ここで、被験分子は、アクチン重合の前、途中および／またはアクチン重合の後に添加され、アクチンフィラメントのネットワークに対する被験分子の作用が決定される。好ましくは、重合溶液または重合混合物は、臨界密度のアクチンフィラメントの重合を誘導するために十分な量のＡｒｐ２／３複合体、特に少なくとも３０nMのＡｒｐ２／３複合体を含有する。
【００２６】
最終的に、本発明は、分子モーター、例えばミオシンを研究するための方法であって、ａ）本明細書開示の装置を提供すること；ｂ）該パターン、好ましくは該ナノパターンまたはマイクロパターンを、アクチンモノマー（１種または複数）、ＡＴＰ、二価陽イオン、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体を含む重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびに、ｃ）重合したアクチンフィラメントの構造、相互作用および／または変形を観察することを含む方法に関し；ここで、分子モーターは、アクチン重合の前、途中および／またはアクチン重合の後に添加される。好ましくは、重合溶液または重合混合物は、臨界密度のアクチンフィラメントの重合を誘導するために十分な量のＡｒｐ２／３複合体、特に少なくとも３０nMのＡｒｐ２／３複合体を含有する。場合により、被験分子も、分子モーターと同時にまたは連続して添加してもよく、重合したアクチンフィラメントの構造および変形に対する被験分子の作用が観察される。場合により、その方法は、さらに、分子モーターの活性およびそれとアクチンフィラメントとの相互作用をモデュレーションできる被験分子を選択することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】アクチンの核形成および成長の幾何学的コントロールを示す図である。図１ａ、表面マイクロパターン形成法。図１ｂ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントおよびｐＷＡコーティング不在下における溶液中のフィラメントの自然重合の落射蛍光顕微鏡画像。図１ｃ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上のアクチンフィラメントの核形成および成長。図１ｄ、蛍光画像をフィルター処理し、アクチンフィラメントと、棒状マイクロパターンの主軸の間の角度を、棒に沿った位置（ｘ）を基準に手作業で測定した。スケールバーは、１０μmを示す。
【図１ｂ】アクチンの核形成および成長の幾何学的コントロールを示す図である。図１ａ、表面マイクロパターン形成法。図１ｂ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントおよびｐＷＡコーティング不在下における溶液中のフィラメントの自然重合の落射蛍光顕微鏡画像。図１ｃ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上のアクチンフィラメントの核形成および成長。図１ｄ、蛍光画像をフィルター処理し、アクチンフィラメントと、棒状マイクロパターンの主軸の間の角度を、棒に沿った位置（ｘ）を基準に手作業で測定した。スケールバーは、１０μmを示す。
【図１ｃ】アクチンの核形成および成長の幾何学的コントロールを示す図である。図１ａ、表面マイクロパターン形成法。図１ｂ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントおよびｐＷＡコーティング不在下における溶液中のフィラメントの自然重合の落射蛍光顕微鏡画像。図１ｃ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上のアクチンフィラメントの核形成および成長。図１ｄ、蛍光画像をフィルター処理し、アクチンフィラメントと、棒状マイクロパターンの主軸の間の角度を、棒に沿った位置（ｘ）を基準に手作業で測定した。スケールバーは、１０μmを示す。
【図１ｄ】アクチンの核形成および成長の幾何学的コントロールを示す図である。図１ａ、表面マイクロパターン形成法。図１ｂ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントおよびｐＷＡコーティング不在下における溶液中のフィラメントの自然重合の落射蛍光顕微鏡画像。図１ｃ、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン上のアクチンフィラメントの核形成および成長。図１ｄ、蛍光画像をフィルター処理し、アクチンフィラメントと、棒状マイクロパターンの主軸の間の角度を、棒に沿った位置（ｘ）を基準に手作業で測定した。スケールバーは、１０μmを示す。
【図２ａ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図２ｂ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図２ｃ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図２ｄ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図２ｅ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図２ｆ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図２ｇ】フィラメントの数および長さの生化学的コントロールを示す図である。図２ａ、エバネッセント波顕微鏡観察によって追跡した、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターンに沿ったアクチン−ａｌｅｘａ５６８の集合の開始および伝播。図２ｂ、媒質中に存在するモノマー性アクチン濃度の変動。核形成領域から伸長しているアクチンフィラメントは、アクチン濃度が増加するほど長くなった。図２ｃ、核形成因子であるＡｒｐ２／３複合体の濃度の変動。核形成領域から伸びている（escape）アクチンフィラメントは、Ａｒｐ２／３複合体の濃度が増加するほど短くなった。図２ｄ、ヘテロ二量体性キャッピングタンパク質である反矢じり端キャッパーに対する応答。核形成領域から伸びているアクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質の濃度が増加するほど短縮した。図２ｅ、生理学的に関連する形態であるアクチンモノマー−Ｍｇ−ＡＴＰに比べたアクチンモノマー−Ｃａ−ＡＴＰの重合。アクチン集合の標準条件では、カルシウム性アクチンフィラメントは核形成マイクロパターン形成表面から撹乱されない形態で成長した。図２ｆ。０．２５％メチルセルロース存在下のアクチン重合。図２ｇ。１％メチルセルロース存在下のアクチン重合。両方の場合でフィラメントは束に集合する性質を保った。スケールバーは２０μmである。
【図３ａ】フィラメントの長さが、密なアクチンのネットワークをフィラメントが交差する能力をコントロールすることを示す図である。図３ａ、核形成円の上に形成したアクチン構造の蛍光顕微鏡画像。図３ｂ、複数の画像を重ねて平均化することによって（第１欄）、およびアクチンフィラメントの成長の数的シミュレーションから（第３および４欄）計算されたアクチンネットワークの密度マップ。核形成領域を表示する。本発明者らは、差込み画像のように、内側の円および外側の円に沿った線スキャンの蛍光比を測定した（第２欄、破線の円）。点は実験的密度マップの比に対応する（第２欄）；線は、アクチンフィラメントが密なアクチンネットワークと公差できるまたは公差できない場合（第３および第４欄）の数的シミュレーションの比を表す。スケールバーは１０μmを示す。
【図３ｂ】フィラメントの長さが、密なアクチンのネットワークをフィラメントが交差する能力をコントロールすることを示す図である。図３ａ、核形成円の上に形成したアクチン構造の蛍光顕微鏡画像。図３ｂ、複数の画像を重ねて平均化することによって（第１欄）、およびアクチンフィラメントの成長の数的シミュレーションから（第３および４欄）計算されたアクチンネットワークの密度マップ。核形成領域を表示する。本発明者らは、差込み画像のように、内側の円および外側の円に沿った線スキャンの蛍光比を測定した（第２欄、破線の円）。点は実験的密度マップの比に対応する（第２欄）；線は、アクチンフィラメントが密なアクチンネットワークと公差できるまたは公差できない場合（第３および第４欄）の数的シミュレーションの比を表す。スケールバーは１０μmを示す。
【図４ａ】核形成領域の配向が束の形成をコントロールすることを示す図である。図４ａ、１２０°のＶ型核形成ゾーン上に核形成したアクチンフィラメントの核形成、伸長および変形。図４ｂ、４個の異なる角度を有するＶ型ゾーン上に形成したアクチン構造の蛍光顕微鏡画像。図４ｃ、各角度について３０画像の平均蛍光投射。図４ｄ、マイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントの相互作用に起因する束形成の図示。平均画像に行った線スキャン（点線）に沿った蛍光強度の分布。ｃ欄の矢印は最大蛍光を示す。スケールバーは１０μmを示す。
【図４ｂ】核形成領域の配向が束の形成をコントロールすることを示す図である。図４ａ、１２０°のＶ型核形成ゾーン上に核形成したアクチンフィラメントの核形成、伸長および変形。図４ｂ、４個の異なる角度を有するＶ型ゾーン上に形成したアクチン構造の蛍光顕微鏡画像。図４ｃ、各角度について３０画像の平均蛍光投射。図４ｄ、マイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントの相互作用に起因する束形成の図示。平均画像に行った線スキャン（点線）に沿った蛍光強度の分布。ｃ欄の矢印は最大蛍光を示す。スケールバーは１０μmを示す。
【図４ｃ】核形成領域の配向が束の形成をコントロールすることを示す図である。図４ａ、１２０°のＶ型核形成ゾーン上に核形成したアクチンフィラメントの核形成、伸長および変形。図４ｂ、４個の異なる角度を有するＶ型ゾーン上に形成したアクチン構造の蛍光顕微鏡画像。図４ｃ、各角度について３０画像の平均蛍光投射。図４ｄ、マイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントの相互作用に起因する束形成の図示。平均画像に行った線スキャン（点線）に沿った蛍光強度の分布。ｃ欄の矢印は最大蛍光を示す。スケールバーは１０μmを示す。
【図４ｄ】核形成領域の配向が束の形成をコントロールすることを示す図である。図４ａ、１２０°のＶ型核形成ゾーン上に核形成したアクチンフィラメントの核形成、伸長および変形。図４ｂ、４個の異なる角度を有するＶ型ゾーン上に形成したアクチン構造の蛍光顕微鏡画像。図４ｃ、各角度について３０画像の平均蛍光投射。図４ｄ、マイクロパターン上に核形成したアクチンフィラメントの相互作用に起因する束形成の図示。平均画像に行った線スキャン（点線）に沿った蛍光強度の分布。ｃ欄の矢印は最大蛍光を示す。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ａ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｂ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｃ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｄ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｅ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｆ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｇ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図５ｈ】アクチンフィラメントの固有特性および集合が平行な束形成をレギュレーションすることを示す図である。図５ａ、８本に枝分かれした放射状配列上のアクチンフィラメントの核形成および伸長の経時的な獲得を示す図である。図５ｂ、アクチン集合の定常状態における３サイズの放射状配列の蛍光画像。図５ｃ、平均蛍光投射。図５ｄは図５ｂの拡大である。図５ｅ、棒の基部と遷移点の位置の間の距離ｄは三つのサイズの放射状配列の間で変化しなかった。図５ｆ、モデルによる仮定：アクチンフィラメントの確率的振舞いはそれらの局所環境に依存する。図５ｇ、左：三つの異なるサイズの放射状配列に関する図５ｅからの実験測定値を一緒にしたもの。右：確率Ｑ（ｙ）およびＸ軸に沿った正規変動性から計算した２万個の遷移点。中央：遷移点の位置の実験的測定値とモデル関数Ｑ（ｙ）の比較。図５ｈ、左：大型放射状配列の各セクターの平均蛍光投射。右：関数Ｑ（ｙ）により発生した、束を構成している１００００本の平行なフィラメントの計算蛍光強度。中央：実験的画像の平均（点）およびモデルから得られた解析式に関する二等分線に沿った蛍光強度の比較。スケールバーは１０μmを示す。
【図６ａ】幾何学的に誘導されたアクチンネットワークに対する束形成タンパク質のディファレンシャルな作用。図６ａ。パターン形成表面上に予備形成したフィラメント構造にα−アクチニンまたはファスシンを添加する作用。アクチンフィラメントの組織化を撹乱することなくタンパク質を導入するために、特別な設定を使用した。フローセルを作る代わりに、マイクロパターン形成されたカバースリップ上にアクチン重合混合物を直接滴下し、加湿チャンバー中に保存した。次に、束形成タンパク質の液滴をその上に静かに添加することができた。この１μM α−アクチニンの添加は、秩序化された構築内で隣合うフィラメントが束形成することに繋がり（拡大画像）、一方で１μMファスシンは変化を誘導しない。図６ｂ、最初からα−アクチニンを添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、高濃度で消失する。図６ｃ、α−アクチニンはアクチンフィラメントを束形成する。表示のようにα−アクチニンの存在下または不在下で２０℃、１時間定常状態まで集合させた４μMアクチンを用いて、低速ペレット化アッセイを４℃、１３krpmで行った。束形成していないアクチンフィラメントは上清中に残った（レーン１および２）が、一方でα−アクチニンで束形成したフィラメントはペレットに移行した（レーン３〜１２）。α−アクチニンの濃度の関数として低速ペレット中に回収されたアクチンフィラメントの率は、α−アクチニンが２０nMという見かけのＫｄでアクチンフィラメントに結合することを示している。図６ｄ、最初からファスシン（１００nM）を添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、この濃度で消失している。
【図６ｂ】幾何学的に誘導されたアクチンネットワークに対する束形成タンパク質のディファレンシャルな作用。図６ａ。パターン形成表面上に予備形成したフィラメント構造にα−アクチニンまたはファスシンを添加する作用。アクチンフィラメントの組織化を撹乱することなくタンパク質を導入するために、特別な設定を使用した。フローセルを作る代わりに、マイクロパターン形成されたカバースリップ上にアクチン重合混合物を直接滴下し、加湿チャンバー中に保存した。次に、束形成タンパク質の液滴をその上に静かに添加することができた。この１μM α−アクチニンの添加は、秩序化された構築内で隣合うフィラメントが束形成することに繋がり（拡大画像）、一方で１μMファスシンは変化を誘導しない。図６ｂ、最初からα−アクチニンを添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、高濃度で消失する。図６ｃ、α−アクチニンはアクチンフィラメントを束形成する。表示のようにα−アクチニンの存在下または不在下で２０℃、１時間定常状態まで集合させた４μMアクチンを用いて、低速ペレット化アッセイを４℃、１３krpmで行った。束形成していないアクチンフィラメントは上清中に残った（レーン１および２）が、一方でα−アクチニンで束形成したフィラメントはペレットに移行した（レーン３〜１２）。α−アクチニンの濃度の関数として低速ペレット中に回収されたアクチンフィラメントの率は、α−アクチニンが２０nMという見かけのＫｄでアクチンフィラメントに結合することを示している。図６ｄ、最初からファスシン（１００nM）を添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、この濃度で消失している。
【図６ｃ】幾何学的に誘導されたアクチンネットワークに対する束形成タンパク質のディファレンシャルな作用。図６ａ。パターン形成表面上に予備形成したフィラメント構造にα−アクチニンまたはファスシンを添加する作用。アクチンフィラメントの組織化を撹乱することなくタンパク質を導入するために、特別な設定を使用した。フローセルを作る代わりに、マイクロパターン形成されたカバースリップ上にアクチン重合混合物を直接滴下し、加湿チャンバー中に保存した。次に、束形成タンパク質の液滴をその上に静かに添加することができた。この１μM α−アクチニンの添加は、秩序化された構築内で隣合うフィラメントが束形成することに繋がり（拡大画像）、一方で１μMファスシンは変化を誘導しない。図６ｂ、最初からα−アクチニンを添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、高濃度で消失する。図６ｃ、α−アクチニンはアクチンフィラメントを束形成する。表示のようにα−アクチニンの存在下または不在下で２０℃、１時間定常状態まで集合させた４μMアクチンを用いて、低速ペレット化アッセイを４℃、１３krpmで行った。束形成していないアクチンフィラメントは上清中に残った（レーン１および２）が、一方でα−アクチニンで束形成したフィラメントはペレットに移行した（レーン３〜１２）。α−アクチニンの濃度の関数として低速ペレット中に回収されたアクチンフィラメントの率は、α−アクチニンが２０nMという見かけのＫｄでアクチンフィラメントに結合することを示している。図６ｄ、最初からファスシン（１００nM）を添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、この濃度で消失している。
【図６ｄ】幾何学的に誘導されたアクチンネットワークに対する束形成タンパク質のディファレンシャルな作用。図６ａ。パターン形成表面上に予備形成したフィラメント構造にα−アクチニンまたはファスシンを添加する作用。アクチンフィラメントの組織化を撹乱することなくタンパク質を導入するために、特別な設定を使用した。フローセルを作る代わりに、マイクロパターン形成されたカバースリップ上にアクチン重合混合物を直接滴下し、加湿チャンバー中に保存した。次に、束形成タンパク質の液滴をその上に静かに添加することができた。この１μM α−アクチニンの添加は、秩序化された構築内で隣合うフィラメントが束形成することに繋がり（拡大画像）、一方で１μMファスシンは変化を誘導しない。図６ｂ、最初からα−アクチニンを添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、高濃度で消失する。図６ｃ、α−アクチニンはアクチンフィラメントを束形成する。表示のようにα−アクチニンの存在下または不在下で２０℃、１時間定常状態まで集合させた４μMアクチンを用いて、低速ペレット化アッセイを４℃、１３krpmで行った。束形成していないアクチンフィラメントは上清中に残った（レーン１および２）が、一方でα−アクチニンで束形成したフィラメントはペレットに移行した（レーン３〜１２）。α−アクチニンの濃度の関数として低速ペレット中に回収されたアクチンフィラメントの率は、α−アクチニンが２０nMという見かけのＫｄでアクチンフィラメントに結合することを示している。図６ｄ、最初からファスシン（１００nM）を添加する作用を示す画像。フィラメントの標準的な組織化は、この濃度で消失している。
【図７】ＴＩＲＦ顕微鏡法によって観察された平行および反平行なフィラメントのネットワークの形成のリアルタイム獲得を示す図である。アクチンフィラメントの集合は２本の核形成棒から開始した（点状卵形領域）。線は、核形成領域上で開始した分岐アクチンネットワークから発散しているアクチンフィラメントの配向を強調している。小さな逆さ矢じり印は、伸長している矢じり端位置を示す。大きな矢印は、反平行（２００ｓ）または平行（３６０ｓ）なアクチンフィラメントのネットワーク形成を示す。
【図８】ドット配列のアクチンフィラメントのネットワークを示す図である。アクチンフィラメントの集合を、アクチン核形成剤ｐＷＡのドット配列から開始させた。ドットの直径は５ミクロンであり、ドットの間隔は２０ミクロンである。ドット配列の使用は、特異的で再現性のあるアクチンフィラメントのネットワークに繋がる。アクチンフィラメント束は、反平行な配置のアクチンフィラメントである。
【図９】放射状パターンの核形成剤を基礎とするアクチンフィラメントのネットワークに及ぼす分子モーターの作用の研究を示す図である。角度４５°を成す放射状パターンの８本の棒に重合混合物を添加した。アクチンフィラメントは、棒の近位部分に予想どおりの反平行な束を形成し、遠位部分に平行な束を形成した。分子モーターであるミオシンＶＩが、予備形成した構造に果たす役割を試験するために、フィラメントが完全に重合した後に、二つの頭部をもつ１０nM精製ミオシンＶＩ（DeLaCruz et al., 2001）をその混合物に添加した。経時的ビデオ顕微鏡法でAlexa488ラベル化アクチンフィラメントの画像を毎分１枚取得することによって作用をモニターした。画像は、構造の基部の収縮を示し、反平行なフィラメントが分子モーターによって相互に沿ってスライドしたことを示唆している。次に、２、３分後に収縮が残りの構造に伝播する結果、全てのフィラメントが平行な束だけからできた純粋に放射状の構造に凝集する。この実験は、アクチンフィラメントに対するミオシンＶＩの実際の収縮作用およびそれが構造を完全に変形することができる強い力を生み出せることを強調している。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、アクチンフィラメントの空間的自己組織化に向けた規則（第１の規則は、核形成部位に関する、反矢じり端を遠位に配向したアクチンフィラメントの放射状成長である）を定義した。本発明者らは、アクチン核形成部位のマイクロパターンを開発し、関心が持たれる、再現性のあるアクチンフィラメントのネットワーク構造の調製できるようにした。特に、核形成領域の形、配向およびそれらの間の距離は、フィラメントの配向および長さ、フィラメント間の相互作用ならびに糸状仮足様またはストレスファイバー様の束形成をコントロールする。
【００２９】
「自己組織化」は、本明細書においてアクチンフィラメントの固有の物理化学的性質がそれらの相互作用および空間再配置を促進することを意味する。フィラメントはその本来の配向と交差または本来の配向から変化し、平行または反平行に整列する。アクチンフィラメントのこれらの配向プロセスは、外部（実験者、外部物質、またはアクチン捕獲部位）からの介入を必要としない。
【００３０】
そのパターンは、アクチンフィラメントを極性化させる。全てのアクチンフィラメントについて、反矢じり端は遠位に配向している。
【００３１】
「アクチンフィラメントのネットワーク」、「アクチンフィラメントのネットワーク構築」または「アクチンフィラメントの組織化」は、本明細書において相互に関するアクチンフィラメントの空間的位置付け、すなわちそれらが形成するネットワーク中のフィラメントが採る形状を意味する。アクチンフィラメントの相互作用によって、それらは、アクチンフィラメントの束を形成した。特に、パターンに応じて、それは、平行なアクチンフィラメント、反平行なアクチンフィラメント、平行なアクチンフィラメントの束、反平行なアクチンフィラメントの束などを提供する。「アクチンフィラメントの平行な相互作用」は、フィラメントが同じ極性を示すことを意味する。「アクチンフィラメントの反平行な相互作用」は、フィラメントが逆の極性を示すことを意味する。加えて、束の配向はパターンによってコントロールすることができる。したがって、これらのパターンは、再現性のある、予測可能なアクチンフィラメントの構造またはネットワークを提供するので、非常に有用である。
【００３２】
本発明は、アクチンフィラメントを調製するのに適した表面およびそれらを使用する方法に関する。パターンの形に応じて、本明細書開示の表面は、非常に細い構造（単一のアクチンフィラメントと同じ細さ、約７〜８nm）を形成することができ、またはそのパターンがアクチンフィラメントの束をもたらす場合はより大きな構造（例えば９０〜１００nm）を形成することができる。追加的に、複数のフィラメントを有する構造を形作って、例えばカラムを形成させることができる。したがって、本発明は、製造および他の目的でミクロンおよびナノメートル単位の多様な秩序化構造を形成させるための方法および組成物を提供する。
【００３３】
本発明は、アクチン核形成剤を含む線（例えば少なくとも１本の線）を含むパターン、好ましくはナノパターンもしくはマイクロパターン、またはアクチン核形成剤を含む少なくとも２個のドットを含むパターンをその上に配された表面を含む装置を提供し、ここで、それらのドットは、２個の隣合うドットから重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にある。特に、その表面は、複数のパターン、好ましくは複数のアドレス指定可能なパターンをその上に配されている。複数のアドレス指定可能なパターンは、表面上に記録され、アクセスできる別個の既知の位置をそのパターンが有することを意味する。各パターンの位置の正確な位置が分かっていることで、これらの「アドレス指定可能な」パターンは高処理アッセイに有用になる。好ましくは、パターンは、ナノパターンまたはマイクロパターンである。より好ましくは、パターンはマイクロパターンである。好ましくは、表面上のパターンは同一である。または、表面は、複数の系列の異なるパターンも含んでもよい。好ましくは、表面が複数のパターンを含む場合、それらのパターンは、二つのパターンの間にアクチンフィラメントの相互作用がないような距離で表面上に配される。
【００３４】
パターン
まず最初に、パターンは、ナノメートルまたはマイクロメートル単位のパターンを意味する。したがって、パターンという用語を、ナノパターンまたはマイクロパターンによって置き換えることができる。より好ましくは、パターンはマイクロパターンである。
【００３５】
本発明において表面上にアクチン捕獲部位が必要ないことに留意することが重要である。実際、アクチンフィラメントの組織化および相互作用ならびにそれに伴い形成される構造は、アクチン核形成剤のパターンの形状によってコントロールされる。したがって、好ましい一態様では、表面は、アクチン捕獲部位がその上に配されていない。アクチン捕獲部位は、特に、ミオシン、Ｎ−エチルマレイミド−ミオシン、ファロイジン、α−アクチニン、およびファスシンの群より選択されるアクチン捕獲剤を意味する。
【００３６】
第１の態様では、表面は、その上に配された、アクチン核形成剤を含むまたはアクチン核形成剤から作られた一つまたは複数の線を含むパターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンを有しうる。線は直線もしくは曲線、またはその組合せでありうる。線は、開いている場合も、閉じている場合もある。開いた線または閉じた線は、任意の幾何学的形または図形を形成しうる。もちろん、一部の幾何学的形または図形は、他のものよりも関心が持たれる特性を示すことがある（例えばアクチンフィラメントのネットワーク構造に関して）。円、正方形、菱形、三角形、楕円およびその組合せを形成するまたは含むパターンを考えることができる。線は、最小１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは１５または２０ミクロンの長さを有する。線であるために、長さは幅の少なくとも３倍である。パターンが複数の線を包む場合、線は、重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離で配される。
【００３７】
線の太さは、当業者が適応させることができ、例えば０．０５〜１００μmでありうる。太さ５０〜１００nmの線は、より正確な構造を提供しうる。太さの大きな線も考えることができる。しかしながら、適切な太さは、１〜１０μm、好ましくは２〜７μm、より好ましくは約５μmでありうる。
【００３８】
特に、線状のパターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、１個または複数の円を含む。複数の円を有するパターンは、内向きに成長しているフィラメントと外向きに成長しているフィラメントの間に相互作用を提供することによって、隣合う円の間に短く細い反平行な束を形成する。核形成領域の間の距離は、偏心円を使って変動させることもでき、同心円を用いて一定に保つこともできる。この種のマイクロパターンの例証は、実施例の部に詳述し、図３に示す。場合により、パターン、より正確には、ナノパターンまたはマイクロパターンは、１個の円から形成される。または、パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、複数の円（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の円）から形成される。特に、パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、２、３または４個の円、好ましくは３個の円から形成される。好ましくは、円は、異なる直径を有し、より小さな円がより大きな円の中に入っている。円は同心でありうる。または、円は偏心でありうる。パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、また、同心円および偏心円の混合から形成されていてもよい。好ましくは、同心円または偏心円は、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは１０、１５または２０ミクロン、なおより好ましくは約１５ミクロンの間隔である。好ましくは、円または最も小さな円は、最小直径１５、２０または２５ミクロン、好ましくは２０ミクロンを有する。
【００３９】
別の特定の態様では、線状パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、２本以上の線（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０本の線）、特に２本以上の直線を含有する。線は、任意の好都合な長さを有しうる。特に、線は、１０〜１００ミクロン、好ましくは２０〜５０ミクロン、より好ましくは２０〜３０ミクロンの長さを有しうる。
【００４０】
線状パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、１本の線を含有しうる。このパターンは、アクチンフィラメントの平行なネットワークを得ることを可能にする。この種のマイクロパターンの例証は、実施例の部に詳述し、図１ｂ〜ｄおよび２ａ〜ｅに示す。
【００４１】
２本以上の線、特に２本以上の直線は、平行またはほぼ平行でありうる（すなわち、２５°以下、好ましくは１０°未満の角）。そのようなパターンの線が短く細い反平行な束となる、フィラメントの会合をもたらすことが、本発明者らによって決定された。この種のマイクロパターンの例証は、実施例の部に詳述し、図４ｂ〜ｄ、５ｆに示す。特に、２本以上の線、特に２本以上の直線は、相互に関して１０〜２５°の角を形成しうる。非常に特別な一態様では、２本以上の線、特に２本以上の直線は、相互に対して約２２°の角を形成する。特に、パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、２本の線、好ましくは２本の直線を含む。それらの線は、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは５、１０、１５または２０ミクロン、より好ましくは約１０ミクロンの間隔である。
【００４２】
または、２本以上の線、特に２本以上の直線は、相互に２５、３０、３５、４０または４５°よりも大きく１１０°未満の角を形成しうる。好ましい一態様では、その角は、相互に４５°から９０°の間である。そのようなパターンの線が、異なる２種類の組織化を有する混合構造を提供することが、すなわち線の近位部で短く細い反平行な束に会合したフィラメントおよび遠位部で特に隣合う線の間の二等分線上にフィラメントの平行な束を提供することが、本発明者らによって決定された。それらの線は近位部で１、２、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは５、１０、１５または２０ミクロン、より好ましくは約１０ミクロンの間隔である。この種のマイクロパターンの例証は、実施例の部に詳述し、図４ｂ〜ｄ、５、６および７に示す。特に、パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、２本の線、好ましくは２本の直線を含む。パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、また、放射状パターンを形成するように配置された複数の線を含みうる。したがって、そのような放射状パターンは、４〜９本の線、好ましくは４〜８本の線を含みうる。好ましくは、放射状パターン中の２本の隣合う線の間の角は、ほぼ同じである（例えば、角度９０°の４分岐放射状配列、角度７２°の５分岐放射状配列、角度６０°の６分岐放射状配列、角度５１°の７分岐放射状配列、角度４５°の８分岐放射状配列）。または、放射状パターン中の２本の隣合う線の間の角は、異なりうる。場合により、それらは異なるが、同じ範囲の角度に留まりうる（すなわち、２５、３０、３５、４０または４５°から１１０°の間、好ましくは４５°から９０°の間）。場合により、それらは、異なる種類の組織化または構造を含むように異なりうる。したがって、放射状パターンは、２５、３０、３５、４０または４５°から１１０°の間、好ましくは４５°から９０°の間の角度を有する線を含みうる。
【００４３】
追加的に、２本以上の線、特に２本以上の直線は、１１０°よりも大きな角を形成しうる。しかしながら、その角は、好ましくは１５０°、１４０°または１３０°未満である。そのようなパターンの線が、隣合う線の間の二等分線上に、むしろ平行なフィラメント束を提供することが本発明者らによって決定された。この種のマイクロパターンの例証は、実施例の部に詳述し、図４に示す。好ましい一態様では、その角は相互に１１０°から１２０°の間である。特に、パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、２本の線、好ましくは２本の直線を含む。パターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンは、また、放射状パターンを形成するように配置された複数の線を含みうる。例えば、そのような放射状パターンは、３本の線を含みうる。好ましくは、放射状パターン中の２本の隣合う線の間の角は、ほぼ同じである（例えば１２０°）。それらの線は、それらの近位部で１、２、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは５、１０、１５または２０ミクロン、より好ましくは約１０ミクロンの間隔である。
【００４４】
場合により本発明は、また、異なる種類の組織化または構造を含むように異なる、２本の隣合う線の間の角を有する放射状パターンに関する。したがって、放射状パターンは、第１の種類の角を有する（すなわち２５°以下の角を有する）線および／または第２の種類の角を有する（すなわち２５、３０、３５、４０もしくは４５°から１１０°の間、好ましくは４５°から９０°の間の角を有する）線および／または第３の種類の角を有する（すなわち１１０°よりも大きな角を有する）線を含みうる。
【００４５】
第２の態様では、表面は、その上に配された、アクチン核形成剤を含むまたはアクチン核形成剤から作られた少なくとも２個のドットを含むパターン、より正確にはナノパターンまたはマイクロパターンを有する場合があり、それらのドットは、２個の隣合うドットから重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にある。好ましくは、ドットは、１〜１０μm、好ましくは２〜７μm、より好ましくは約５μmの直径を有する。好ましくは、そのパターンは、複数のドットを含み、それらのドットは、２個の隣合うドットから重合したアクチンフィラメントを相互作用させるのに適した距離にある。したがって、そのパターンは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のドットを含む場合があり、特に２〜１，０００個のドット、１０〜１００個のドットを含みうる。好ましくは、２個の隣合うドットの間の距離は、１〜４０ミクロン、例えば１、２、５、１０、１５、２０、２５または３０ミクロン、好ましくは５、１０、１５または２０ミクロン、より好ましくは約１０ミクロンである。好ましい一態様では、そのパターンはドットの配列である。好ましくは、ドットは、同じ直径を有し、配列の形状は規則的である。ドットの配列の例を図８に示す。この種のパターンは、反平行な束のネットワークをもたらす。そのような構築のアクチンフィラメントのネットワークは、電子分野において特別な関心を集めうる。
【００４６】
本発明は、これらの特別なパターンに限定されない。関心が持たれる問題に応じて、当業者は他のパターンをデザインすることができる。実際に、本発明者らの寄与はそれに限定されないが、それは、アクチン核形成剤の形態および配置がアクチンの重合によって形成される構造のコントロールを可能にすること、すなわちコントロールされた位置、長さおよび配向の、平行および反平行なアクチンフィラメントの束を可能にすることを、本発明者らが最初に立証したからである。
【００４７】
表面
表面は、本明細書開示のアクチン核形成剤のパターン、好ましくは複数の線状パターン、より好ましくは複数のアドレス指定可能なパターンをその上に配するために十分な面積を有する任意の固体支持体でありうる。本発明の装置および方法は、曲がった表面またはその他の形の表面上で使用することができるものの、いくつかの態様では、その表面は平坦または平面状と見なすことができる。
【００４８】
好ましい一態様では、表面は平面状または本質的に平面状である。したがって、この態様では、表面はビーズではなく、特にその上に本明細書開示のアクチン核形成剤のパターンを配するために十分な面積を提供するには小さすぎる直径を有するビーズではない。
【００４９】
パターンを形成するアクチン核形成剤を結合させるのに適した任意の表面は、本明細書開示の装置および方法に使用することができる。
【００５０】
好ましい一態様では、アクチン核形成剤のパターンを除いて、表面は不活性表面である。適切な不活性表面の一例は、ポリエチレングリコール誘導体に被覆された表面である。しかしながら、当業者は、不活性表面を調製するための他の代替物を知っている。例えば、表面は、非誘導体化シランであってもよく、または脱脂乳、ウシ血清アルブミン、およびヒト血清アルブミンなどの、非特異的結合を減少させるために免疫アッセイに通常使用される他の分子によって表面をコーティングしてもよい。
【００５１】
表面は、一般に、マイクロ単位またはナノ単位の適用に使用される任意の表面でありうる。例えば、表面は、シリコン、歪シリコン、多結晶シリコン、多結晶シリコン、二酸化ケイ素、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、ガラス、プラスチック、セラミック、または金属でありうる。好ましい一態様では、表面はガラスである。
【００５２】
好ましい一態様では、表面は、共焦点顕微鏡法、光学顕微鏡法および／または蛍光顕微鏡法に、特に落射蛍光顕微鏡法および全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法に好都合な支持体でありうるとはいえ、本発明は、良好な光学的品質を否定された（例えば電子顕微鏡法に適した）支持体も考えている。より好ましい一態様では、プレートは、酸化ポリスチレンの薄層で被覆されている可能性のあるガラスである。例えば、本発明による好都合なプレートは、カバースリップまたはスライドである。プレートは、また、プラスチック製スライド、プラスチック皿またはペトリ皿であってもよい。
【００５３】
本発明は、また、上記と同義の複数の表面を含む、または上記と同義の表面と他の要素との組合せを含むシステムに関する。したがって、複数の表面を有するシステムは３Ｄ構造を形成する。表面は、各表面のアクチン核形成部位から成長しているアクチンフィラメントが相互に相互作用できるように位置付けられる。表面は、相互に平行であってもよく、または角を形成しても、例えばウェルの隣合う側面であってもよい。
【００５４】
装置を調製するための方法
本発明は、本明細書開示の表面を調製するための方法に関する。特に、本発明は、上記に開示のパターンを得るために、単離されたアクチン核形成剤を有する表面をパターン形成するための方法に関する。その方法は、アクチン核形成剤を用いて表面上に配された線状パターン、好ましくは複数の線状パターン、より好ましくは複数のアドレス指定可能なパターンを調製するステップを少なくとも含む。
【００５５】
マイクロパターン形成およびナノパターン形成のために、マイクロコンタクトプリンティング、フォトリソグラフィー、レーザーアブレーション、ＵＶに基づくマイクロパターン形成アプローチ（Azioune et al, 2009）、ディップペン（Ginger et al, 2004）、原子間力顕微鏡法（「ＡＦＭ」）サブトラクション（Wadu-Mesthrige et al, 2001）およびプラズマ蒸着などの様々な方法を使用することができる。例えば、マイクロメートルの水準の構造について、コンタクトプリンティングによる作業表面のマイクロパターン形成は、マイクロパターン形成されたスタンプにアクチン核形成剤をコーティングしたものに作業表面を押付けることによって成し遂げることができる。タンパク質沈着用のスタンプは、典型的には、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）基板上にフォトリソグラフィーを使用して、今日標準的な手法であるものにしたがって行われる。スタンプは、受動吸着されるタンパク質を直接「インクとして塗る」ことができ、またはそのタンパク質を、通例の手順を用いて基板に共有結合させることができる。
【００５６】
特に、アクチン核形成剤で被覆されるべきパターンは、表面を不活性にするコーティングを有さないことが望ましい。これを実施する方法はいくつかある。例えば、核形成剤を表面上に適用することができ、次に表面を不活性にするコーティングを適用する。または、除去可能な物質で表面を被覆してから、その表面を不活性にするコーティングとその表面を接触させることができ、その物質を除去し、コーティングを有さずアクチン核形成剤を有する部位を残す。しかしながら好ましくは、これらの部位でコーティングを除去することによって、アクチン核形成剤のパターンでコーティング材料を有さない領域を作り出すことができる。コーティング物質はレーザで焼いて除去することも、接触モードで使用したＡＦＭニードルを使用して削り取るもしくは押しのけることも、または保護マスクを通したＵＶもしくはプラズマ処理によって除去することもできる。好都合なプロトコールは、実施例の部に詳述し、図１ａに図示する。
【００５７】
複数のパターンのアクチン核形成剤を、表面上に位置付けることができる。パターンの秩序化配列（したがってフィラメント）は、例えば、一連のパターンのアクチン核形成剤を所望の配列にすることによって提供することができる。好ましくは、アクチン核形成剤のパターンは、表面上で相互に十分に離れていることにより、ある配列パターンからの１本または複数のフィラメントは、別の配列パターンからの１本または複数のフィラメントに到達しない。アクチン核形成部位のパターンの対を隔てる距離は、容易に決定することができる。
【００５８】
アクチン核形成剤または核形成促進因子
アクチン核形成剤は、アクチンモノマー（１種または複数）およびＡＴＰ、ならびに場合により追加的な要素の存在下でアクチン重合を開始することができるタンパク質またはそのフラグメントである。アクチン核形成剤は、多くの場合に当技術分野において「核形成促進因子」（ＮＰＦ）と呼ばれる。特に、アクチン核形成剤は、例えばＡｃｔＡ（アクチン集合誘導タンパク質）、ＩｓｃＡ、ＲｉｃｋＡ、ＷＡＳｐ（Wiskott-Aldrich症候群タンパク質）、Ｎ−ＷＡＳＰ、ＳＣＡＲ（ｃＡＲサプレッサー）、ＶＣＡドメイン（Verprolin相同Cofilin相同酸性領域）またはＷＡ領域、ｐＷＡ領域でありうる。アクチン核形成剤には、また、アクチン重合を開始することができるアナログ（キメラ形態または突然変異体）およびそのフラグメントが挙げられる。アクチン核形成剤は、US2006/0003399およびUS2005/0106629に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み入れられる。他の適切なアクチン核形成剤もまた、以下の参考文献に開示されている：Pollardら、２０００；HiggsおよびPollard、２００１。
【００５９】
アクチンモノマー（１種または複数）およびＡＴＰに加えて、アクチン核形成剤は、アクチンの重合、特にＡｒｐ２／３複合体とアクチンフィラメントの重合を開始させるために必要な他の要素をさらに必要としうる。特に、アクチン核形成剤は、装置の表面にコーティングされ、一方でアクチンの重合を開始させるために必要な他の要素、特にアクチンモノマー、ＡＴＰ、アクチンフィラメントおよびＡｒｐ２／３複合体が、重合溶液または重合混合物中に提供される。
【００６０】
アクチン核形成剤は、さらに、アクチンの重合を開始させるためにＡｒｐ（アクチン関連タンパク質）２／３複合体を必要とする。アクチン核形成剤は、Ａｒｐ２／３複合体のコンフォメーションを変化させることによってＦ−アクチン二量体に類似するようになり、それによってアクチンの重合を開始することによって作用する。したがって、アクチンの重合は、Ａｒｐ２／３依存的に開始する。
【００６１】
重合溶液または重合混合物中に提供されたアクチンフィラメントに関して、このアクチンフィラメントは長くないことに留意することが重要である。実際に、アクチン核形成剤、Ａｒｐ２／３およびアクチンフィラメントを含む三元複合体が形成される。次に、この三元複合体は、アクチンフィラメントの重合を開始することができ、新合成されたフィラメントが三元複合体のアクチンフィラメントの枝として成長する。したがって、核形成剤は、最初のアクチンフィラメントから数百本のアクチンフィラメントの重合を促進することによって、高密度の成長途中のアクチンフィラメントに達する。
【００６２】
加えて、ＡｃｔＡ、ＩｓｃＡ、ＲｉｃｋＡ、ＷＡＳｐ、Ｎ−ＷＡＳＰおよびＳＣＡＲのようないくつかのアクチン核形成剤は、Ｃｄｃ４２、ＰＩＰ２、ＮｃｋおよびＲａｃ１などの追加的な調節タンパク質または調節エレメント（上流レギュレーターとも呼ばれる）を必要としうる。それらの必要性は、当技術分野において周知であり、例えばUS2006/003399ならびにHiggsおよびPollard、２００１に詳述されている。
【００６３】
好ましい一態様では、アクチン核形成剤はＷＡＳＰ／Ｓｃａｒタンパク質由来のＣ末端ドメインであるｐＷＡである。ｐＷＡは、ＷＡＳＰまたはＳＣＡＲのプロリンリッチドメイン、アクチンモノマー結合性Ｗドメイン、およびｐ２１結合性Ａドメインを含む。特に、ｐＷＡは、ヒトＳｃａｒタンパク質のアミノ酸１７２〜５５９（配列番号１）を含むまたはそれから成りうる。アクチン核形成剤は、また、有利にはＶＣＡドメインであってもよい。
【００６４】
実際に、ｐＷＡドメインまたはＶＣＡドメインの使用は、他のアクチン核形成剤よりも有利であり、それは、それが上流のレギュレーターの必要性を伴わないからである。より好ましい一態様では、アクチン核形成剤はｐＷＡである（特に、Machesky et al, 1999に詳細に開示されている）。
【００６５】
アクチン核形成剤は、好ましくはアミノ末端および／またはカルボキシル末端に結合または融合した、１種または複数のタグを含みうる。タグは、発現を改善、溶解性を改善、精製を援助および／または表面への結合を促進するために利用される。非限定的に：１）グルタチオン−アガロースに結合させるために使用することができるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ；２）固定化金属イオンカラム（例えばニッケル）に結合させるために使用できるＨｉｓ６タグ（または簡単にはＨＩＳタグ）；３）カルモジュリン−アガロースカラムに結合するカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ；４）エピトープタグに特異的な結合親和性を有する抗体と結合させるために使用することができるエピトープタグ（例えばヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、またはＦＬＡＧタグ）；および５）融合タンパク質の溶解性を増加させるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグが含まれる、多様なタグを使用することができる。これらのタグは、また、アミノ末端に融合した１個または複数のタグおよびカルボキシル末端に融合した１個または複数の追加的なタグと組合せて使用することができる。特定の一態様では、アクチン核形成剤は、２種のタグに、特にＧＳＴタグおよびＨｉｓタグに、より詳細にはそのＮ末端でＧＳＴタグおよびＣ末端でＨｉｓタグに結合したｐＷＡである。２種のタグを有するｐＷＡの配列を表示する。
【００６６】
重合溶液または重合混合物
重合溶液または重合混合物は、アクチンの重合を誘導および維持するために十分な成分を含む。重合溶液または重合混合物の要件は、当技術分野において周知である。特に、当業者は、重合混合物の成分の適切な濃度を知っている。
【００６７】
重合溶液または重合混合物は、ＡＴＰ、モノマー性アクチン（Ｇ−アクチン）、二価陽イオンおよびＡｒｐ２／３複合体を含む。好ましくは、重合溶液または重合混合物は、さらにアクチンフィラメントを含む。
【００６８】
精製されたモノマー性アクチンを調製するための方法は、当技術分野において長い間周知である（MacLean-Fletcher & Pollard, 1980; Spudich & Watt, 1971）。実際に、アクチンおよびその重合は、ほぼ５０年間研究されている。加えて、精製されたモノマー性アクチンも市販されている（例えばInvitrogen:カタログ番号Ａ１２３７５）。
【００６９】
好ましくは、モノマー性アクチンには、ラベル化モノマー性アクチンが含まれる。実際に、モノマー性アクチンは、好ましくは、蛍光タンパク質または蛍光色素によってラベルされる。蛍光タンパク質または蛍光色素の例には、非限定的に、Alexa Fluor色素（例えばAlexa 350、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568、およびAlexa 594色素）、シアニン色素（例えばＣｙ３およびＣｙ５）、テキサスレッド、アクリロダン（acyrolodan）、ピレンなどの蛍光色素、ならびにＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質が挙げられる。好ましくは、蛍光色素が使用される。いくつかの蛍光ラベル化アクチンモノマーは、市販されている（例えば、非網羅的にInvitrogen：Alexa 488コンジュゲート（カタログ番号：Ａ１２３７３）、Alexa 568コンジュゲート（カタログ番号：Ａ１２３７４）、Alexa 594コンジュゲート（カタログ番号：Ａ３４０５０）およびAlexa 647コンジュゲート（カタログ番号：Ａ３４０５１））。他の適切な蛍光ラベルは、当業者に明らかであろう。好ましくは、重合溶液または重合混合物は、ラベル化アクチンモノマーと非ラベル化アクチンモノマーの混合物を含む。
【００７０】
特定の一態様では、モノマー性アクチンには、代替的にまたはさらに、金属原子、特に金と結合したモノマー性アクチンが挙げられうる。金でラベルされたアクチンモノマー（１種または複数）の調製は、Patolskyら、２００４に詳述されている。重合溶液または重合混合物は、金属原子、特に金でラベルされたアクチンモノマー（１種または複数）だけを含む場合があり、または非ラベル化アクチンモノマーと金属原子、特に金でラベルされたアクチンモノマーとの混合物を含む場合もある。
【００７１】
Acanthamoeba castellaniから最初に単離された「Ａｒｐ２／３複合体」は、７種のポリペプチド、すなわち２種のアクチン関連タンパク質Ａｒｐ２およびＡｒｐ３；ならびに５種の他のタンパク質ｐ４０、ｐ３５、ｐ１９、ｐ１８、およびｐ１４から成る。ヒト複合体は、アクチン関連タンパク質Ａｒｐ２およびＡｒｐ３、ならびにｐ４１−Ａｒｃ、ｐ３４−Ａｒｃ、ｐ２１−Ａｒｃ、ｐ２０−Ａｒｃ、およびｐ１６−Ａｒｃと呼ばれる他の５種を含む７種のサブユニットから成る。７種のサブユニット全ての予測されるアミノ酸配列が決定されている。Saccharomyces cerevisiaeにおけるＡｒｐ２／３複合体は、６種のサブユニットから成る。研究から、複合体の核形成活性および組織化活性は分離可能であると判定されている。したがって、本発明の方法によって考えられる核形成活性に、Ａｒｐ２／３複合体の全てのサブユニットが必要なわけではないおそれがある。したがって、本明細書に使用される「Ａｒｐ２／３複合体」の言及は、全６もしくは７成分の複合体を表すか、または全６もしくは７タンパク質複合体の言及が文脈により必要とされるものの、アクチン重合の核形成に必要な複合体成分の集合体を表す。任意の起源の任意のＡｒｐ２／３複合体を、本明細書開示の重合混合物、方法およびキットに好都合に使用することができる。例えば、特許出願US2006/0014266は、Ａｒｐ２／３複合体を精製するための方法を開示している（その開示は、参照により本明細書に組入れられる）。
【００７２】
任意のアクチンフィラメントが適切である。例えば、適切なアクチンフィラメントは、３０〜１００nmの長さを有しうる。
【００７３】
好ましくは、重合溶液または重合混合物は、さらにプロフィリンを含みうる。実際、プロフィリンは、自然なアクチン重合を阻害させる。アクチン核形成剤がｐＷＡである場合、重合混合物または重合溶液中にプロフィリンが存在することは、全く適切である。
【００７４】
特定の一態様では、重合混合物または重合溶液は、細胞抽出物（Theriot et al, 1992）または卵抽出物（例えば、xenopus抽出物）（Marchand et al, 1995）であってもよい。
【００７５】
キット
本発明は、アクチンフィラメント、特に所定の組織化がなされたアクチンフィラメントを調製するための、またはアッセイもしくはスクリーニング法を行うためのキットに関する。
【００７６】
本発明は、また、本明細書開示の装置と、その装置上で使用されたアクチン核形成の存在下でアクチンの重合を誘導するために十分な成分を含むアクチン重合溶液またはアクチン重合混合物、特に上記に開示の重合混合物とを含むキットに関する。キットには、キットの使用方法を説明する印刷物が入っている場合がある。キットは、さらに、アクチンフィラメントのネットワーク、アクチンフィラメントの相互作用および／または構造に対して十分に特徴づけられた作用を有する対照分子を含む場合がある。そのような分子は、ミオシン、α−アクチニンまたはファスシンでありうる。
【００７７】
使用および方法
本明細書開示の装置は、アクチンフィラメントのネットワーク、特にアクチンフィラメントの再現性のある（すなわち予測可能な）構造、組織化および／または相互作用を有するネットワークを調製または製造するために有用である。したがって、本発明は、アクチンフィラメントのネットワークを調製または製造するための、本明細書開示の装置の使用に関する。本発明は、アクチンフィラメントのネットワーク、特にアクチンの二次元または三次元構造を調製または製造するための方法に関する。特に、本発明は、ａ）本明細書開示の装置を提供すること；ｂ）該パターン、好ましくは該ナノパターンまたはマイクロパターンを重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；および場合によりｃ）重合溶液または重合混合物を除去することを含む、アクチンフィラメントのネットワークを調製または製造するための方法を提供する。
【００７８】
好ましい一態様では、その方法は、以下の態様の一つまたは複数を含む：ａ）アクチン核形成剤はｐＷＡであり；かつ／またはｂ）表面は平面状であり；かつ／またはｃ）重合混合物は、アクチンモノマー（１種もしくは複数）、ＡＴＰ、二価陽イオン、Ａｒｐ２／３複合体、好ましくはラベル化アクチンモノマー（１種もしくは複数）、好ましくは蛍光ラベル化アクチンモノマー（１種もしくは複数）もしくはＡｕなどの金属原子に結合したアクチンモノマー（１種もしくは複数）を含む。
【００７９】
核形成領域からの、核形成領域の端部に対して垂直なフィラメントの配向成長は、密なネットワーク中のフィラメント間の反発に起因すると考えられる。低密度のフィラメントでは、核形成領域からの配向成長は生じないであろう。フィラメントが十分に充填されると、それらの立体反発によって、フィラメントが核形成領域端部に対して垂直に配列することが誘導される。特に、アクチンフィラメントの最小密度は、１μm2あたりフィラメント１０本と見なすことができる。好ましくは、１μｍ２あたりのアクチンフィラメントの密度は、少なくとも２０、３０、４０または５０本である。核形成領域がＮＰＦ（核形成促進因子）（本明細書においてアクチン核形成剤とも呼ばれる）で、例えばｐＷＡで完全にコーティングされている場合、フィラメントの密度は、重合混合物または重合溶液中のＡｒｐ２／３複合体の濃度だけに依存する。実際、核形成はｐＷＡ−Ａｒｐ２／３−アクチンフィラメント三量体の形成によって誘導される。アクチンモノマーは、アクチンの重合を誘導および維持するために十分な適切な濃度（例えば最小濃度０．０１mg/ml）で使用される。しかしながら、アクチンモノマーは、好ましくは、フィラメントを重合させる条件において大過剰で使用される。それで、三量体の形成はＡｒｐ２／３複合体の存在度だけに依存する。濃度１０nMのＡｒｐ２／３複合体は、フィラメントが成長する間にそれらを平行に配列させる、フィラメントの臨界密度を誘導するためには十分でない。Ａｒｐ２／３複合体が３０nMを超えると、フィラメントは、核形成領域の端部に対して垂直になって、平行に成長するために十分な密度である。したがって、アクチン核形成剤のパターンと接触している重合溶液または重合混合物は、少なくとも３０nMのＡｒｐ２／３複合体を含有する。
【００８０】
その方法は、さらに、アクチンフィラメントをコーティングするステップまたはアクチンフィラメントを処理するステップを含みうる。特に、アクチン重合の後またはアクチン重合の途中に、アクチンフィラメントをさらに処理またはコーティングしてもよい。場合により、さらなる処理またはコーティングは、重合溶液の除去後に実施される。
【００８１】
第１の態様では、アクチンフィラメントは、アクチンフィラメントと架橋結合するタンパク質でさらに処理される。実際、この追加的な処置はアクチンフィラメントによって形成される構造、特にアクチン束の強度を増大させることがある。この処置は、より強固な構造の調製を可能にする。下記にさらに言及するように、細胞内でアクチンフィラメントと結合、束形成、または架橋結合する多数のタンパク質が公知である。例えばアクチン架橋タンパク質は、α−アクチニン、ファスシン、ＥＦ−１、スクルイン、ビリン、デマチン、フィンブリン、スペクトリン、ジストロフィン、ＡＢＰ１２０またはフィラミンでありうる（Lodish et al., Molecular Cell Biology, W. H. Freeman and Company, N.Y., N.Y.(2000), Table 18.1）。例示的な架橋タンパク質は、あるフィラメントの各サブユニットを近隣フィラメント中のサブユニットと結合させるために使用することができるファスシンである（Matsudaira et al, 1994）。同様に、タンパク質α−アクチニンは、フィラメントを結合させるために使用することができる。ファスシンおよびα−アクチニンの両方は、フィラメントを平行に並べ、フィラメントを結合させるが、ファスシンの方が堅固にフィラメントを結合させる。アクチン架橋タンパク質を用いた追加的な処理は、結合タンパク質を含む溶液中でアクチン構造物を洗浄または浸漬することによって実施することができる。それは、アクチンの重合を行ったならば、またはアクチン重合プロセスの途中に実施することができる。ファスシンまたはα−アクチニンなどの架橋タンパク質を用いた処理が、特にアクチン重合プロセスの際に、得られた構造または組織化を改変しうることが観察されている。例えば、アクチンの重合プロセスの際に多量のファスシン（例えば１００nM）またはα−アクチニン（例えば５００nM）を添加すると、アクチン核形成部位に対する平行なアクチンフィラメントの高い剛性のせいで、平行な束の形成が阻害されるおそれがある（実験の部および図６参照）。加えて、得られる作用は、ファスシンまたはα−アクチニンなどの架橋タンパク質の使用量に応じて変化しうる（実験の部および図６ａ参照）。
【００８２】
第２の態様では、アクチンフィラメントは、キャッピングタンパク質でさらに処理される。実際、キャッピングタンパク質は、アクチンフィラメントの長さをコントロールするために使用することができる。キャッピングタンパク質は、当技術分野において公知であり、例えばＣＡＰＺＡ１（Ｆ−アクチン−キャッピングタンパク質サブユニットα−１）またはＣＡＰＺＢである。加えて、キャッピングタンパク質とコフィリンとの組合せの使用は、動的構造につながることによって、成長しているアクチンフィラメントを維持することができる。
【００８３】
第３の態様では、アクチンフィラメントは、さらに、物質でコーティングされている。特にアクチンフィラメントは、伝導性物質でコーティングされていてもよい。好ましくは、伝導性物質は、金属原子、より好ましくは金でありうる。または、その物質はカーボンナノチューブでありうる。特定の一態様では、アクチンフィラメントは、すでに、金とコンジュゲーションしたアクチンを含み、金コーティングは金の沈着を強化する（例えばPatolsky et al, 2004参照）。そのため、本発明は、アクチン系金属線、特に金線を調製する方法を提供する。したがって、本発明は、ナノスケール回路の製作に有用でありうる、特にナノバイオテクノロジーの分野の、伝導性マイクロワイヤーまたはナノワイヤーを調製するための方法に関する。
【００８４】
加えて、本発明は、アクチンフィラメント、特に所定の組織化をされたアクチンフィラメントを調製または製造するための方法であって、さらに、得られたアクチンフィラメントを表面から除去することを含む方法を提供する。場合により、アクチンフィラメントは、また、アクチンフィラメントを表面から除去した後に、上記のように処理またはコーティングすることができる。
【００８５】
別の特定の態様では、本発明は、物質で表面にパターン形成するための方法を提供する。この方法では、表面上のアクチンフィラメントは、物質を表面にコーティングするためのマスクとして使用される。特に、その方法は、ａ）本発明のナノパターンまたはマイクロパターンをその上に有する表面を提供すること、ｂ）該ナノパターンまたはマイクロパターンを重合溶液と接触させることによってアクチンフィラメントの重合を誘導すること、ｃ）その表面に物質をコーティングすること、およびｄ）その表面からアクチンフィラメントを（例えばアクチンフィラメントの脱重合によって）除去することによって、その表面上にコーティングされた物質を所望のパターンに残すことを含む。例えば、表面のコーティングは、化学蒸着によって実施することができる。その物質は、シリコン、ポリシリコン、二酸化ケイ素、カーボンファイバー、カーボンナノファイバー、フィラメント、カーボンナノチューブ、ＳｉＯ２、シリコン−ゲルマニウム、タングステン、炭化ケイ素、窒化ケイ素、酸窒化ケイ素、窒化チタン、金属および多様な高誘電率（high-k）誘電体より選択することができる。または、コーティングは、スピンコーティングによって実施してもよく、その物質は、ポリスチレンなどのポリマー、またはポリスルホンもしくはポリエーテルイミドなどのより極性の高いポリマーでありうる。それは、また、フォトポリマーフィルムレジストを調製するために使用することができる。
【００８６】
代替的な特定の一態様では、本発明は、表面を物質でエッチングするための方法を提供する。この方法において、表面上のアクチンフィラメントは、表面を物質でエッチングするためのマスクとして使用される。特に、その方法は、ａ）本発明のナノパターンまたはマイクロパターンをその上に有する表面を提供すること、ｂ）該ナノパターンまたはマイクロパターンを重合溶液と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること、ｃ）その表面をエッチングすること、およびｄ）その表面からアクチンフィラメントを（例えばアクチンフィラメントの脱重合によって）除去することを含む。実際、アクチンフィラメントは、表面を被覆するためのマスクとして役立つ一方、アクチンフィラメントで被覆されていない表面はエッチングされる。例えばチップの製造では、金属箔が、典型的にはシリコンなどの半導体上に配され、その金属が所望のパターンでマスクされ、マスクされていない金属はエッチングされて除かれる。本発明の方法は、金属層上の所望のパターンをアクチンフィラメントでマスクし、次にアクチンフィラメントによってマスクされていない金属をエッチングすることを可能にする。
【００８７】
本発明のパターン、特にナノパターンまたはマイクロパターンは、アクチンフィラメントの相互作用を研究するため、および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造を研究するために有用である。したがって、本発明は、アクチンフィラメントの相互作用を研究するため、および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造を研究するための、本明細書開示の装置の使用に関する。本発明は、さらに、アクチンフィラメントの相互作用を研究するため、および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造を研究するための方法であって、上記に開示のアクチンフィラメントを調製または製造することを含む方法に関する。特にその方法は、ａ）本明細書開示の装置を提供すること；ｂ）該パターン、好ましくは該ナノパターンまたはマイクロパターンを重合溶液または重合混合物と接触させることによって、アクチンフィラメントの重合を誘導すること；ならびにｃ）アクチンフィラメントの構造および／または相互作用を観察することを含む。特に、観察ステップは、アクチンフィラメントの成長およびそれらの組織化を観察することを含みうる。観察は、特定の瞬間に、連続する特定の瞬間にまたはビデオによって行うことができる。アクチンフィラメントの相互作用は、平行または反平行でありうる。アクチンフィラメント束の形成などの特定構造の形成を観察することができる。アクチンフィラメントが重合したならば、アクチンの脱重合も研究することができる。
【００８８】
アクチンフィラメントおよびそれらの組織化は、好ましくは蛍光顕微鏡法によって観察することができる。したがって、アクチンフィラメントは、重合ステップの途中に蛍光ラベル化アクチンモノマー（１種または複数）を使用することによってラベルしてもよく、またはアクチンフィラメントは、重合したならば蛍光ラベル化ファロイジンでラベルしてもよい。いくつかの蛍光ラベル化ファロイジンが市販されている（例えば、ローダミン−ファロイジン（Molecular Probes）；テキサスレッド−ファロイジン（Molecular Probes）など）。
【００８９】
特に他の分子または条件がアクチンの重合および／またはアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークに及ぼす影響を研究するために、ステップｂ）の途中、ステップｂ）からｃ）の間、またはステップｃ）の途中に、マイクロパターンをさらにこれらの他の分子または条件と接触させることもできる。
【００９０】
開示の装置は、また、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造に対する被験分子の作用を評定または決定するために使用することができる。したがって、本発明は、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造に対する被験分子の作用を評定または決定するための、本明細書開示の装置の使用に関する。本発明は、また、被験分子がアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークをモデュレーションするかどうかを判定するための方法であって、上記に開示のアクチンフィラメントを調製または製造すること、そのアクチンフィラメントを被験分子と接触させること、ならびにアクチンの重合、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークに対する被験分子の作用を決定することを含む方法に関する。特にその方法は、ａ）本発明のナノパターンまたはマイクロパターンを提供すること、ｂ）該マイクロパターンを重合溶液と接触させること、ｃ）アクチンフィラメントの構造および／または相互作用を観察することによって、被験分子がアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造をモデュレーションするかどうかを判定することを含み；ここで、被験分子はアクチン重合の前、途中、および／またはアクチン重合の後に添加される。好ましい一態様では、被験分子は、アクチン重合の途中に、例えば重合混合物または重合溶液と同時に添加される。代替的な好ましい一態様では、被験分子は、アクチンフィラメントが重合したならば、例えば重合混合物または重合溶液の除去後に添加される。好ましくは、被験分子の存在下で観察されたアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークが、被験分子の不在下で観察されたアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークと比較される。本明細書開示のパターンの利点は、本発明の装置で得られたアクチンフィラメントの相互作用およびアクチンフィラメントのネットワーク構造に再現性があることである。したがって、被験分子の存在下および不在下のアクチン重合、アクチンフィラメントの相互作用およびアクチンフィラメントのネットワーク構造の比較が可能であり、精密である。
【００９１】
被験分子は、様々な起源、性質および組成でありうる。それは、単離された物質中のまたは他の物質と混合された、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子、薬物などの任意の有機物または無機物でありうる。例えば、被験化合物は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡｉでありうる。分子は、例えば生成物のコンビナトリアルライブラリーの全てまたは一部でありうる。
【００９２】
「モデュレーションする」は、被験分子がアクチン重合を阻害または活性化しうることを意味する。または被験分子は、アクチンフィラメントの組織化、特にアクチンフィラメントの相互作用およびアクチンフィラメントのネットワーク構造またはネットワークを妨害するおそれもある。
【００９３】
実験の部において、上記に開示の装置を用いたアクチンの重合および重合したアクチンフィラメントに対するいくつかの分子の作用を試験した（α−アクチニンおよびファスシンの作用が研究された図６参照）。本発明のパターンが、再現性があり予測可能なアクチンフィラメントの組織化を提供することによって、アクチンフィラメントの組織化に対する被験分子の作用を観察可能にすることを観察することができる。特に、アクチン重合の間の作用、および選択されたパターンによってアクチンフィラメントが重合および組織化した後の作用も観察することができる。
【００９４】
被験分子がアクチンの重合および／またはアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークに及ぼす作用を評定または決定するための方法は、いくつかの有用性を示す。
【００９５】
第１の特定の態様では、この方法は、求められる作用に応じて、アクチンの重合、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークをモデュレーションできるまたはできない分子をスクリーニングするために、および被験分子を同定するために使用することができる。本明細書開示のスクリーニング法は、分子がアクチン重合に関して阻害活性を示す場合に、腫瘍転移、血栓症もしくは骨粗鬆症の処置に、または血管新生の阻害に有用でありうる分子、および分子がアクチンの重合に関してアクチベーター活性を示す場合に、創傷治癒の改善または神経発生の促進に有用でありうる分子の同定を可能にする。
【００９６】
第２の態様では、この方法は、分子の毒性、特に分子のアクチン毒性を評価するために有用でありうる。この毒性は、分子がアクチン重合もしくはアクチン脱重合を阻害する能力によって、または正常なアクチンフィラメントのネットワーク形成を阻止することによって評価することができる。
【００９７】
開示の装置は、また、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造に対する特定の細胞抽出物の作用を評定または決定するために使用することができる。したがって、本発明は、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造に対する特定の細胞抽出物の作用を評定または決定するための、本明細書開示の装置の使用に関する。本発明は、また、特定の細胞抽出物がアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークをモデュレーションするかどうかを判定するための方法であって、上記に開示のアクチンフィラメントを特定の細胞抽出物を用いて調製または製造すること、ならびに参照細胞抽出物と比較することによって、アクチン重合、アクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造もしくはネットワークに対する特定の細胞抽出物の作用を決定することを含む方法に関する。特に、その方法は、ａ）本発明のナノパターンまたはマイクロパターンを提供すること、ｂ）該マイクロパターンを特定の細胞抽出物と接触させること、ｃ）参照細胞抽出物と比較することによってアクチンフィラメントの構造および／または相互作用を観察することによって、特定の細胞抽出物がアクチンフィラメントの相互作用および／またはアクチンフィラメントのネットワーク構造をモデュレーションするかどうかを判定することを含む。本明細書開示のパターンの利点は、本発明の装置を用いて得られたアクチンフィラメントの相互作用およびアクチンフィラメントのネットワーク構造に再現性があることである。したがって、参照細胞抽出物と比較した、特定の細胞抽出物存在下のアクチンの重合、アクチンフィラメントの相互作用およびアクチンフィラメントのネットワーク構造の比較が可能であり、精密である。特に、参照細胞抽出物は、健康な細胞から提供され、特定の細胞抽出物は、欠陥を有する細胞、特にアクチンフィラメントに関する欠陥を有する細胞から提供される。
【００９８】
本発明は、また、ミオシンなどの分子モーターを研究するために好都合である。分子モーターは、重合混合物中に添加してもよく、またはすでに重合したアクチンフィラメントを有する表面に添加してもよい。分子モーターの作用によって、アクチン構造は曲がるか、または歪む。アクチン構造の変形を研究することによって、変形領域の水準を定義することによって、ならびに変形の速度および配向を測定することによって、分子モーターがどのようにアクチンフィラメントと相互作用するかを検討することができる。加えて本発明は、また、分子モーターの活性または分子モーターとアクチンフィラメントの間の相互作用をモデュレーションすることができる分子を同定するための方法を提供する。本明細書開示の装置がなければ、分子モーターのin vitro研究は、非常に困難または不可能であり、この研究は、一般に、構造が予測不可能で複雑な細胞の状況に限定される。細胞の状況で構造が複雑なことに加えて、アクチンと相互作用している多数のタンパク質も存在する。したがって、この複合体では、アクチンフィラメントの明らかに同定可能で測定可能な変形を観察および定量することができない。同様に、ゲルまたは他のアクチン構造中で分子モーターを研究することでは、分子モーターの相互作用前後の構造を比較することは不可能または困難である。それは、アクチンフィラメントのネットワーク構造がランダムであることから、全てが異なり、比較不可能であるからである。本発明の装置は、これらの欠点を克服できるようにし、分子モーターを好都合に研究できるようにする。
【００９９】
定義
本発明に使用されるタンパク質の起源は影響を与えない。任意の起源のタンパク質を使用することができ、特に多様な起源のタンパク質を一緒に使用することができる。
【０１００】
本明細書に使用される「約」という用語は、±１０％、好ましくは±５％を意味する。もちろん数値に付随する場合、この用語は取去ることができ、本明細書において正確な値が常に考えられている。
【０１０１】
本発明のさらなる局面および利点が、以下の実験の部に開示されるが、それは、例示と見なすべきであり、本出願の範囲を限定するものと見なしてはならない。
【０１０２】
実施例
アクチンフィラメントは、細胞の細胞骨格の主成分の一つを構成する。分岐ネットワークまたは平行なフィラメント束などの特異的なアクチンの細胞骨格構造は、確定した細胞機能を強力にした。バルク溶液中のまたはバイオミメティック装置を用いた精製タンパク質からのアクチンネットワークの集合の生化学的再構成は、細胞の複雑さを回避し、アクチンの集合を支配している分子メカニズムを解読するための強力なツールとなってきた。これらのアプローチは、アクチン結合タンパク質が動的ネットワーク内でアクチンフィラメントの成長および相互作用にどのように影響するかを強調した。しかしながら、細胞中で遭遇するような幾何学的境界が高度に秩序化されたアクチン構造の動的形成にどのように影響するかという問題は、あまり研究されないままである。
【０１０３】
本発明者らは、ここに、核形成の形状自体がアクチンのネットワークの構築の主要な決定因子でありうると実証する。本発明者らは、in vitroアッセイのためにアクチン核形成部位を空間コントロールさせるマイクロパターン形成法を開発した。特に、本発明者らは、細胞の寸法に対応する単位で核形成部位の位置付けをモデュレーションした。核形成領域の形、配向およびそれらの間の距離は、フィラメントの配向および長さ、フィラメント間の相互作用ならびに糸状仮足様の束形成をコントロールする。フィラメントの成長および相互作用のモデル化によって、基本的な機械的法則および確率法則が高次構造のアクチン集合を支配することが実証された。
【０１０４】
最初のステップとして、そしてアクチン核形成部位の位置をin vitroで正確にレギュレーションするために、本発明者らは、最近開発されたＵＶ系マイクロパターン形成アプローチ（Azioune et al, 2009）を用いて核形成促進因子（ＮＰＦ）であるｐＷＡの配置用のテンプレートを作った（図１ａ）。ｐＷＡ（配列番号１）は、Ａｒｐ２／３複合体およびアクチンモノマーの存在下で既存のアクチンフィラメント上にアクチン重合を開始するタンパク質の遍在ファミリーであるＷＡＳＰ／Ｓｃａｒタンパク質由来のＣ末端ドメインを含む（Blanchoin et al, 2000 ; Machesky et al, 1999; Mullins et al, 1998）。アクチン重合用の最小セットの精製タンパク質から作られた少量の溶液（２μMアクチンモノマー（７％がAlexa-568でラベル化）、６μMプロフィリンおよび３０nM Ａｒｐ２／３複合体）を、ｐＷＡコーティングされたマイクロパターン形成スライドとガラス支持体の間に入れた。機能付与されたマイクロパターンは、その表面上でアクチンフィラメントの核形成を特異的に開始し、アクチンフィラメントの２Ｄ成長を促進する（図１ｂ）。対照として、本発明者らは、ｐＷＡコーティングの不在下で、棒形マイクロパターンが溶液中で自然に集合したアクチンフィラメントを全く動員しないことを実証した（図１ｂ）。これは、機能付与されたマイクロパターンがその表面上で特異的にアクチンフィラメントの核形成を開始することを確認している。アクチンフィラメントの核形成および成長のリアルタイムの視覚化は、ネットワーク形成の自己触媒過程を強調した（図２）。これらのネットワークは、成長の速い反矢じり端を外側に配向して、ｐＷＡコーティングされた領域から成長しているフィラメントによって発生した（図１ｃ）。ガラス棒上のアクチンフィラメントの成長と一致して、核形成の波が伝播するにつれ、マイクロパターン上に密で相互に結合したネットワークが形成した（図２）。まとめると、この密な網目構造から発しているアクチンフィラメントは、棒末端近くの狭い領域内を除き、普通はマイクロパターンの端部に自己組織化した（図１ｃ−ｄ）。平行なネットワークに密に組織化したものの、これらのフィラメントは、さらに、架橋因子の添加によってより大きな束に集合することができ、したがって、本発明者らは束ではなくフィラメントと呼んだ。本発明者らは、その後の架橋剤の添加によって影響されない構造を束と名付けた（図６参照）。本発明者らは、マイクロパターン上のフィラメントの成長が公知の生化学的パラメーターに感受性であった、すなわちフィラメントの長さはＧ−アクチンの濃度と共に増加し、Ａｒｐ２／３またはキャッピングタンパク質の濃度が増加すると共に減少し、α−アクチニンまたはファスシンによって束形成したことを検証した（図２）。
【０１０５】
本発明者らは、相互に向かって成長している２セットのアクチンフィラメントの間の相互作用を検討するためにアクチン成長の幾何学的コントロールを利用した。したがって、本発明者らは、個別の同心円または偏心円からのアクチンの成長を分析した。長さ２０〜３０ミクロンのアクチンフィラメントは放射状に内向きおよび外向きに成長した（図３ａ）。驚くことに、間隔１５ミクロンの３個の同心円によって発生したネットワークは、単に重なり合うわけではなく、平行な束の求心性配置は消失した。その代わりに、内向き成長フィラメントと外向き成長フィラメントの間の相互作用によって、隣合う円の間に短く細い反平行な束が形成した。関心が持たれることに、アクチンフィラメントの伸長は、隣合う円上に形成される密なアクチンネットワークの存在によって遮断されるように見えた。これを検証するために、本発明者らは、等しいマイクロパターンに関して別々に取得したいくつかの画像を平均化することによって局所アクチンネットワークの密度を定量した（図３ｂ）。加えて、アクチンフィラメントの成長がどのようにこれらのアクチンの密度プロファイルをもたらすことができたかを理解するために、本発明者らは、アクチンフィラメントが円に沿って一定の線密度で核形成した場合の数的シミュレーションを行った。フィラメントは、普通は円から成長し、その長さは生化学条件によって決定された。次に、アクチンフィラメントに、隣接する核形成領域を交差させ、または交差しないようにさせ、シミュレーションされたアクチンフィラメントの局所密度から理論的密度マップを得た（図３ｂ）。数的シミュレーションから、同心円上で、フィラメントは、その経路上にある密なネットワーク領域と交差しなかったことが示された。逆に、異なる核形成領域の間の距離を縮小した場合、偏心円の場合と同様、内側の円内の密度はもはや等方性ではなくなった。数的シミュレーションから、追加的なフィラメントがこの最内側領域に進入して蛍光強度を局所的に増大させることが確認された（図３ｂ）。このことから、短い、したがって剛性のあるフィラメントが密なネットワークを通過して成長することができ、一方でより長くより柔軟なフィラメントが絡み合い、隣接するアクチンネットワークによって遮断されることが実証された。結果として、生化学的手掛かりに加えて物理的制約がアクチンフィラメントの長さをレギュレーションする。
【０１０６】
アクチンフィラメントの相互作用およびそれらの結果としてのネットワーク構造に関する幾何学的パラメーターの役割をさらに調べるために、本発明者らは、様々な角度で強制的にフィラメント間の接触を起こした。２本の短い棒から核形成した場合、フィラメントは、始め棒に対して垂直に成長し、次に相互作用してファスナーのように閉じ、糸状仮足様の平行な束を形成したが（図４ａ、図７）、これは、in vivoで示されたことを思い出させる。この相互作用は、フィラメントを強制的に曲げたので、束形成はフィラメントがそれらの成長方向を変化させる能力に依存した。本発明者らは、２本の短い棒の間の角度を変動させることによってこのパラメーターを試験し（図４ｂ）、平行な束の形成を定量した（図４ｃ）。２２°近くの核形成棒の角について、フィラメントは短く細い逆平行な束に会合する。平行な束は、２２°から４５°の間の臨界角を超えた場合にのみ形成し始め、平均画像解析から、平行な束への多数のフィラメントの凝集を促進する最適角の存在を確認した（図４ｄ）。
【０１０７】
本発明者らは、フィラメントの長さおよび剛性が、それらとアクチンフィラメントのネットワークとの相互作用をモデュレーションすることを実証したので、本発明者らは、２個の核形成領域の間で所与の角度で距離を変化させることが束形成に影響するかどうかを検討した。このために、本発明者らは、８本に分岐した放射状配列をデザインし、その配列で射線を起点から内外に移動させた。予想どおり、フィラメントは、各射線から外側に成長し、隣合う射線の間の二等分線上に平行な束を形成した（図５ａ、ｂおよび図７）。十分に離れた射線の場合、短い平行な束が正確に二等分線に沿って形成し、この配向を維持した。射線の間の距離が減少するにつれ、束はより長くなり、位置がずれ、曲がった（図５ｂ、ｃ）。全ての場合で、射線の近位部分における反平行な束の集合と遠位部分における平行な束の集合の間の遷移は、極めて多様な位置で起こった（図５ｄ、ｅ）。結果として、被験範囲における核形成部位間の距離は、最終構造の発生に重大ではなかった。反平行な束から平行な束への遷移の位置は、フィラメントの固有の性質および全体的な集合の結果としてモデル化することができた（図５ｆ）。フィラメントがネットワークの近位部分において専ら反平行な束に集合した場合、相互に接触するフィラメントは、平行な束に集合する確率ｐを有する。この固有の確率ｐは、フィラメントの配向だけに、したがって射線に沿ったフィラメントの位置に依存する（図１ｄ）。フィラメントが近位のネットワークにおいて平行な束を形成した場合、出会いつつあるフィラメントは強制的に曲げられ、この平行な束の原因となる。したがって、平行な束を形成する確率Ｑは、
【０１０８】
【数１】
2013535689.tif 000003
によって与えられ、その解は、
【０１０９】
【数２】
2013535689.tif 000004
となる。式中、ｙは、二等分軸に沿った位置を特徴づける離散変数である。確率関数Ｑから得られる遷移位置は、実験データと正確に一致した（図５ｇ）。遷移点が全て遠位のフィラメントから作られた平行な束を発生するので、本発明者らは、各遷移点に関連する束のサイズおよび蛍光強度を計算した。このモデルは、フィラメントの束への集合による蛍光増加および束内の多様な長さのフィラメントによる蛍光の減少の両方を精密に説明した（図５ｈ）。これらの幾何学的に媒介された束は、２種の異なるアクチン架橋剤の存在下でもなお濃度依存的に発生する（図６）。これは、束の出現がアクチンフィラメントの機械的性質によって緊密にコントロールされることを確認している。
【０１１０】
本発明者らによって行われたような糸状仮足様の束の再構成は、密なアクチンネットワークから発しているアクチンフィラメントの崩壊およびさらなる凝集によって形成された、隣接する伸長中のフィラメントが系統的に収束する前駆構造の自然形成に依存する。関心が持たれることに、in vivoで観察される広がった糸状仮足の根に対応するΛ前駆体のような前駆体によって開始されるこのアクチンフィラメントの伝播性凝集は、細胞中の密な周辺ネットワークから平行な束が出現することを説明している。そのうえ、この伝播過程は、膜状仮足の先導端に存在する高い反矢じり端キャッピング活性に一致して、束内に短いアクチンフィラメントが存在することを説明している。
【０１１１】
本発明の革新的な方法は、アクチン結合タンパク質の混合物には依存せずに、核形成形状がアクチンフィラメントのネットワーク構築の決定に主要な役割を果たすことを実証した。隣接する核形成ゾーンのそれぞれの位置付けの結果、アクチンフィラメントのネットワークへの絡み合いおよびそれらの長さのコントロールが生じる。アクチンフィラメントの配向は、それらが近隣物と相互作用し、束を形成する能力を決定する。根本的に、基本的な力学法則および確率的法則が、所定の幾何学的境界条件に応答した反平行なフィラメントおよび糸状仮足様の平行なフィラメントの空間配置を支配している。生存細胞に拡張することによって、本研究は、特異的なアクチンネットワーク構築を生じている、したがって力発生位置をコントロールしている核形成領域の時空間的組織化の重要性を強調している。アクチン成長の時空間的レギュレーションは細胞の形に影響することが知られているが、本研究は、定量的に見て、相互に物理的な境界が細胞内または細胞周囲でアクチン細胞骨格の構築をコントロールすることを明らかにした。
【０１１２】
材料および方法
タンパク質の発現および精製：アクチンは、ウサギ骨格筋アセトン粉末から精製した（MacLean-Fletcher & Pollard, 1980; Spudich & Watt, 1971）。Isambertら（１９９５）にしたがって、アクチンのリシンをAlexa-488でラベル化した。Egileら（１９９９）にしたがって、Ａｒｐ２／３複合体をウシ脳抽出物から精製した。ＧＳＴ−ｐＷＡ、ヒトプロフィリン、およびマウスキャッピングタンパク質を発現させ、以前に記載されたように精製した（Almo et al, 1994; Falck et al, 2004; Machesky et al, 1999）。
【０１１３】
マイクロパターン形成：ガラス製カバースリップを酸素プラズマで酸化し（１０ｓ、３０Ｗ、Harrick Plasma, Ithaca, NY）、１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で０．１mg/mlのポリリシン−Ｌ−ｇ−ポリエチレングリコール（ＰＬＬ−ＰＥＧ）と共に１時間インキュベーションした（JenKem Technology, TX）。ＰＥＧ化されたカバースリップを、自家製真空ホルダーを使用してクロム人工水晶フォトマスク（Toppan Photomasks, Corbeil, France）上に置いた。フォトマスクのクロム層は幅３μmの透明マイクロパターンを含有した。次に、マスクで被覆されたカバースリップに深ＵＶ線（ｌ＜２００nm、UVO Cleaner, Jelight Company, Irvine, CA）を５分間露光し、核形成促進因子ｐＷＡの０．５μM溶液を１５分間コーティングした。
【０１１４】
アクチンの重合：１０mMイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５０mM ＫＣｌ、１mM ＭｇＣｌ２、１００mMジチオトレイトール、３mg/mlグルコース、２０μg/mlカタラーゼ、１００mg/mlグルコースオキシダーゼおよび０．５％メチルセルロースを含有する、新鮮調製した蛍光緩衝液中にタンパク質混合物を希釈して、アクチンの重合を誘導した。アクチンの重合は、２μMアクチンモノマー（７％がAlexa568またはAlexa488でラベル化されている）および６μMプロフィリン、および３０nM Ａｒｐ２／３複合体を含有する溶液中で誘導した。
【０１１５】
画像獲得：画像は、４０×乾燥対物レンズ（ＵＰＬＦＬＮ、ＮＡ＝０．７５）、自動ＸＹステージ（Marzhauser, Germany）およびCoolSnap HQ2カメラ（Roper Scientific, GmbH, Germany）を備えるBX61 Olympus正立顕微鏡を使用して取得した。顕微鏡および装置は、MetaMorph（Molecular Devices, downington, PA）によって駆動した。
【０１１６】
画像処理：全ての画像は同じ光強度および露出時間で取得した。しかしながら、重ね合わせおよび平均化の前に、画像のグレースケールを同じ最小および最大グレー値を有するように調整した。表示された画像を、Image Jソフトウェアからの「アンシャープマスク」フィルターおよび「ガウスぼかし」フィルターを使用してフィルター処理してフィラメントをバックグラウンドから強調した。
【０１１７】
全反射照明蛍光顕微鏡法：全反射照明蛍光の獲得は、５０mW ４８８nmレーザおよびQuantEM 512SC定量ＥＭＣＣＤカメラ（Roper Scientific）を備えるNikon TE2000E倒立顕微鏡で行った。
【０１１８】
【表１】
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【図１ｃ】
2013535689.tif 000006
【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｅ】
2013535689.tif 000009
【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図３ａ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
2013535689.tif 000015
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｆ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ｂ】
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【図４ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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