(57)【要約】薬学的組成物およびワクチン組成物は、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素と、ＧＬＡを含有するアジュバントとを含有する。特に関係のあるプレパンデミックインフルエンザウイルスはＨ５Ｎ１である。これらの組成物を使用するキットおよび方法も提供される。本発明は、ワクチンとして使用するための組成物、および対象にワクチンを予防接種する方法に関し、該ワクチンは、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスおよびアジュバント由来の組換え赤血球凝集素を含有する。【選択図】図３Ａ
2013522231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物であって、
（ａ）プレパンデミック（世界的流行前）またはパンデミック（世界的に流行している）インフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、
（ｂ）アジュバントであって、前記アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、前記非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、前記還元末端の６’位の炭素に結合され、前記二糖は、前記非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、前記エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、前記脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する、アジュバントと、
を含有し、前記薬学的組成物の一回の注射によって、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する予防接種を必要としている対象に、予防接種を行う方法で使用するための、薬学的組成物。
【請求項２】
前記組成物の投与は、前記一回の注射後に集団の少なくとも５０％に血清転換を実現する、請求項１に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項３】
前記組成物は乳剤を含まない、先行する請求項のいずれか１項に記載の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項４】
前記組成物は油分を含まない、先行する請求項のいずれか１項に記載の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項５】
前記アジュバントはＧＬＡである、先行する請求項のいずれか１項に記載の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項６】
プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する予防接種を必要としている対象に、予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物であって、前記組成物は、
（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、
（ｂ）アジュバントであって、前記アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、前記非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、前記還元末端の６’位の炭素に結合され、前記二糖は、前記非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、前記エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、前記脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有し、前記組成物は、投与量を節約する、アジュバントと、を含有する、薬学的組成物。
【請求項７】
前記ｒＨＡは、用量を節約する量で存在する、請求項６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項８】
前記ｒＨＡは、アジュバントがない場合は防御免疫を提供しない濃度で存在する、請求項６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物は、単一の組換えタンパク質を含有する、請求項６〜８のいずれか１項に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項１０】
一用量当たりの前記ｒＨＡ量は、約１５〜約１μｇの範囲である、請求項６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントはＧＬＡであり、前記ｒＨ５はＨ５Ｎ１インフルエンザの病原性株に由来する、請求項６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究に関する声明
本発明は、米国立アレルギー感染病研究所によって付与された第５Ｒ４３ＡＩ０８１３８３−０２号の下、政府の支援を受けて実施された。連邦政府は発明の特定の権利を有する場合がある。
【０００２】
本特許出願は、概して、鳥インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１）、豚インフルエンザ（例えば、Ｈ１Ｎ１）、Ｈ７Ｎ７、およびＨ９Ｎ２等のプレパンデミック（世界的流行前）またはパンデミック（世界的に流行している）インフルエンザのワクチンとして使用するための組成物に関する。本組成物は、概して、候補インフルエンザウイルス由来の組換え赤血球凝集素およびアジュバントを含有する。
【背景技術】
【０００３】
パンデミックとは、新たな病気が勃発し、ヒトに感染して重篤な病状を生じさせ、ヒトからヒトへと感染が拡大しやすい場合に蔓延する伝染性疾患の世界的流行である。インフルエンザのパンデミックは、インフルエンザウイルスの新しい株または亜型が、別の種類の動物（例えば、鳥または豚）から、関連ウイルスの事前の暴露による免疫を持たないヒトの集団に伝染する場合に、生じ得る。インフルエンザのパンデミックは最も古いもので１５００年代後半から見られ、それ以来、定期的に発生しており、一番最近のものに、１９５７年の「アジア型インフルエンザ」（Ｈ２Ｎ２）、１９６８年の「香港型インフルエンザ」（Ｈ３Ｎ２）および２００９年の「豚インフルエンザ」（Ｈ１Ｎ１）がある。１９９０年代に発生したＨ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」ウイルスは、ヒトに感染したが、ヒトからヒトへの感染効率が低かったため、これまでのところパンデミックには至っていない。国から国への移動や、都市化が進むにつれて、新たなウイルスによって生じるインフルエンザの流行の拡大は、非常に短い期間でパンデミックを引き起こすと予測されている（ＷＨＯ、「Ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ」）。
【０００４】
鳥インフルエンザは、分節ＲＮＡゲノムを含有するオルトミクソウイルスによって引き起こされる。感染は、ウイルス性赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質が宿主細胞上のシアル酸結合糖タンパク質に結合することで生じる。赤血球凝集素タンパク質は、抗原および配列の特性に基づき、１６の亜型に分割できる。ＨＡに加えて、インフルエンザウイルスは、さらなる表面タンパク質、感染後の細胞からのウイルスの放出に伴われるノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する。ノイラミニダーゼタンパク質は、現在、９の亜型に分割される。１６ＨＡおよび９ＮＡの亜型の全ての考えられる組み合わせは、野鳥（例えば、アヒル）が無症候性ウイルス保有宿主の役割を果たす自然界に存在すると考えられている。時により、インフルエンザウイルスは、野鳥から家畜の鳥類に伝染し、２つの病気の形式について記述する。一つの形式は通常見られるものであるが症状は軽く、もう一方の形式は稀であるが非常に致死率が高い。鳥類における非常に病原性の強い鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩ）の感染は、通常、Ｈ５およびＨ７亜型によって生じる。ＨＰＡＩウイルスのＨＡタンパク質は、ＨＡ切断部位内の一組の塩基性アミノ酸によって、他のより病原性の弱いＨ５およびＨ７の亜型ＨＡタンパク質とは区別される。
【０００５】
特定のＨＰＡＩウイルスによる鳥類の一定の感染、および鳥類ならびにヒトの相対的に近接性により、鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、およびＨ９Ｎ２）の４つの亜型がヒトへ感染するに至った。Ｈ７またはＨ９亜型ウイルスのヒトへの感染は、概して、軽度の非致命的な病気を引き起こす。対照的に、Ｈ５亜型ウイルスのヒトへの感染は、重度で、多くの場合、致命的な病気を引き起こす（２０１０年２月１７日にＷＨＯに報告された、「Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｏｍｆｉｒｍｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／（Ｈ５Ｎ１）」、ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ）。
【０００６】
野鳥および家畜用の鳥類のウイルスの地理的拡大に関連する、Ｈ５Ｎ１ウイルスのヒトへの感染が継続することによって、Ｈ５Ｎ１ウイルスは遺伝的に進化しており、現在では、遺伝的および抗原的に、明確なクレードおよびサブクレードに分類が可能である（非特許文献１）。万一、これらの新規ウイルスのいずれかがヒト間で容易に伝染可能になった場合には、Ｈ５Ｎ１インフルエンザのパンデミックの可能性は高い。Ｈ５Ｎ１感染と関連付けられる高い死亡率のため、こうしたパンデミックと関連付けられる潜在的な世界規模の影響は極めて深刻になる可能性がある。そのため、ＷＨＯは、パンデミック警戒のプロセスを開始した。
【０００７】
インフルエンザのパンデミックに効くワクチンの開発は、ＷＨＯおよび多くの政府にとって、インフルエンザのパンデミック対策計画の土台となる。米国および世界の他の国における潜在的需要を満たすためには、膨大な数の安全かつ効果的なパンデミックワクチン用量が必要である。現在広まっているプレパンデミック株に対するワクチンの備蓄が、現在のパンデミック予防策の重要な要素である。これらのワクチンは、新たに勃発したパンデミックウイルスと同一ではない可能性があっても十分な予防効果があると見込まれているが、より特化した、株に一致したワクチンの製造が進められている。現在までに、３つのＨ５Ｎ１ワクチン（２つのスプリットビリオンおよび一つの全ビリオン）が法的な認可を受けており、さらに、いくつかのワクチンが開発の最終段階にある。
【０００８】
現在、多くの国がこうしたワクチンを備蓄しており、米国の当面の目標は、２千万人の治療に十分なワクチンを蓄えることである。しかしながら、数多くの科学的、技術的、および経済的課題が、世界的なインフルエンザのパンデミックに対する備えを複雑化している。重要な点として、従来の卵由来の方法によるプレパンデミックまたはパンデミックワクチンの製造は、時間がかかりすぎ、高価であり、世界中の高リスクの個人に予防接種を行う十分なワクチン用量を製造するためには何億という卵を必要とする。弱毒化ウイルスを製造するための細胞を基本とした代替的な戦略が開発中であるが、これらの再集合体ウイルスは、典型的には、比較的低いワクチン抗原レベルを含有している。鳥類のＨ５赤血球凝集素は、他の亜型からのＨＡよりも、ヒトにおいて本質的により少ない低い免疫原性を有するらしいことから、この低抗原収率が、Ｈ５Ｎ１ワクチンに関連して特に懸念されている。そのため、季節性インフルエンザワクチンに対する抗体反応を誘発するためには、より多い抗原用量が必要とされる。さらに、ヒトはＨ５赤血球凝集素に対する免疫を持っていないため、一用量の予防接種スケジュールでは予防効果が得られない可能性がある。これらの点を説明するために、Ｈ５クレード１ウイルス（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）に基づく最初のＦＤＡ認可ワクチンは、研究の参加者の５４％のみに「予防的」中和力価を誘導し、季節性ワクチンのＨＡ含有量の１２倍である、９０μｇのＨＡの二用量を必要とした（非特許文献２）。
【０００９】
Ｈ５Ｎ１免疫原性を高めると同時に、ワクチン製造能力を大幅に向上可能な、さらなる技術が必要である。プレパンデミックワクチンの理想的なプロファイルは、容易な方法かつ低コストで製造され、保存可能期間が長いということである。重要な点としては、最小限の抗原を用いて着実な予防的免疫反応を生じさせる必要があり、遺伝的に明確なウイルス、および理想的には、異なるクレードによるウイルスに対する交差防御を提供する。加えて、ワクチンは安全でなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＷＨＯ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓ  １１：１５１５−１５２１，２００５
【非特許文献２】Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５４：１３４３−１３５１，２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ワクチンとして使用するための組成物、および対象にワクチンを予防接種する方法に関し、該ワクチンは、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスおよびアジュバント由来の組換え赤血球凝集素を含有する。一実施形態では、アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖として記述される合成物（ＤＳＬＰ合成物）であり、ここで、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかによって還元末端の６’位で炭素へ結合され、二糖は、非還元末端の４’炭素によってリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合によって複数の脂質基へ結合され、ここで、エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は脂質基へ直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する。特定の組成物および方法では、アジュバントは、種々の実施形態において、水中油型乳剤として処方されるまたはカリ明礬、アルミニウム塩等の他のアジュバントで処方される、オイルフリーであり得る、ＧＬＡである（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号を参照）。特定の目的のための赤血球凝集素は、非常に病原性の強いＨ５Ｎ１ウイルス由来のＨ５およびＨ１Ｎ１（「豚インフルエンザ」）パンデミックインフルエンザ由来のＨ１を含む。組成物は用量を節約するものであり得る、および／または組換え赤血球凝集素は、用量を節約する量で存在し得る。方法は、組成物の複数の注射ではなく一回の注射で対象に予防接種を行うことを含み得る。例えば、組成物は、以下の、ｒＨＡは用量を節約する量で存在する、ｒＨＡは免疫アジュバントがない予防免疫を提供しない濃度で存在する、ｒＨＡは鳥インフルエンザの病原性株に由来する、ｒＨＡはＨ５Ｎ１インフルエンザの病原性株に由来する、ｒＨＡはクレード１またはクレード２に由来する、ｒＨＡはパンデミック豚インフルエンザウイルス株に由来する、ｒＨＡはパンデミックＨ１Ｎ１株に由来する、組成物は、単一の、つまり一つ以下の明確な組換えタンパク質を含有する、一用量のｒＨＡの量は約１５〜約０．１μｇの範囲である、ｒＨＡは、好適なレベルの糖鎖を実現するために昆虫または哺乳類細胞のいずれかから発現される、ｒＨＡは融合タンパク質として表される、アジュバントはＧＬＡにすぎないまたはＧＬＡを含む、アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬにすぎないまたは３Ｄ−ＭＰＬを含む、組成物はオイルフリーである、組成物は、約１％ｖ／ｖ未満の油または約０．１％ｖ／ｖ未満の油を含有する、アジュバントは抗原と組み合わせる前に、水溶液として処方される、アジュバントは、抗原と組み合わせる前に、リポゾーム含有組成物中に処方される、組成物はさらに、アルミニウム塩またはサポニンを含有する、の１つ以上（つまりいずれかの組み合わせ）によって定義され得る。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、（ｂ）アジュバントであって、アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、還元末端の６’位の炭素に結合され、二糖は、非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する、アジュバントと、を含有し、投与は、一回の注射後に血清変換を実現する、薬学的組成物の一回の注射によって、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザのウイルスに対する予防接種を必要としている対象に、予防接種を行う方法を提供する。個別にまたはいずれかの組み合わせにおいて発明をさらに定義し得る種々の実施形態において、組成物は、乳剤を含まず、アジュバントはＧＬＡであり、アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００１３】
例えば、発明は、一実施形態では、薬学的組成物の一回の注射によって、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する予防接種を必要としている対象に、予防接種を行う方法で使用するために、（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、（ｂ）アジュバントであって、アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、還元末端の６’位の炭素に結合され、二糖は、非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、組成物の投与により、一回の注射後に集団の少なくとも５０％、または少なくとも６０％以上において血清変換を実現する、集団に、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスの予防接種を行う方法で使用し得る。一態様では、薬学的組成物は油分を含まない、つまりオイルフリーである、または組成物の血清変換有効性に影響しない最小限の油分量を含有し、油分含有乳剤は含まない。これらの実施形態のいずれかとの組み合わせにおいて、発明の一態様は、アジュバントとしてＧＬＡを使用することである。別の態様では、３Ｄ−ＭＰＬは、アジュバントとして使用し得る。
【００１４】
別の実施例として、発明は、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する予防接種を必要としている対象に予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物を提供し、（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、（ｂ）アジュバントであって、アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、還元末端の６’位の炭素に結合され、二糖は、非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有し、組成物は、用量を節約する、アジュバントと、を含有する。対象者にプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスの予防接種を行う方法で使用するための薬学的組成物、ｒＨＡは、用量を節約する量で存在する。個別にまたはいずれかの組み合わせで発明をさらに定義する種々の実施形態において、ｒＨＡは、アジュバントがない予防免疫を提供しない濃度で存在し、単一の、つまり１つ以下の組換えタンパク質を含有し、一用量のｒＨＡ量は約１５〜約１μｇの範囲であり、アジュバントはＧＬＡであり、ｒＨ５はＨ５Ｎ１インフルエンザの病原性株に由来する。
【００１５】
これらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照により、明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ｒＨ５／ＧＬＡ−ＳＥワクチンの一回の注射は、マウスのＨ５Ｎ１感染を予防する。（Ａ）マウス（５／群）に、２％ｖ／ｖのＳＥ乳剤またはＧＬＡ−ＳＥアジュバント（２０μｇＧＬＡ）に処方された５０、１５０、４５０、９００、または２７００ｎｇのｒＨ５（ＶＮ）で、一度、予防接種を行い、次いで、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃した（ＩＮ）。群毎の最大体重減少割合の平均を、二週間にわたって、各群で決定した。曲線下の領域（経時的体重減少（％））が、ｒＨ５の各用量について決定された。（Ｂ）ウイルス攻撃後の連続した日におけるマウスの体重減少（％）。マウスは、ＳＥのみまたはＧＬＡ−ＳＥアジュバントで、またはタンパク質がないＧＬＡ−ＳＥまたはＳＥで処方された５０ｎｇのｒＨ５がワクチン投与された。各データポイントは、群＋／−平均値の標準誤差毎の平均の体重減少を表す。（Ｃ）ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるアジュバント媒介ｒＨ５保護。マウス（５／群）に、ＧＬＡ−ＳＥのみ、または２％ｖ／ｖのＳＥのみ、５μｇのＧＬＡのみ、または５μｇのＧＬＡ−ＳＥで処方された５０ｎｇのｒＨ５（ＶＮ）で一度ワクチン投与した。マウスは、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃され（ＩＮ）、生存および体重減少がモニターされた。各データポイントは、群毎の平均の体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。
【図１Ｂ】ｒＨ５／ＧＬＡ−ＳＥワクチンの一回の注射は、マウスのＨ５Ｎ１感染を予防する。（Ａ）マウス（５／群）に、２％ｖ／ｖのＳＥ乳剤またはＧＬＡ−ＳＥアジュバント（２０μｇＧＬＡ）に処方された５０、１５０、４５０、９００、または２７００ｎｇのｒＨ５（ＶＮ）で、一度、予防接種を行い、次いで、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃した（ＩＮ）。群毎の最大体重減少割合の平均を、二週間にわたって、各群で決定した。曲線下の領域（経時的体重減少（％））が、ｒＨ５の各用量について決定された。（Ｂ）ウイルス攻撃後の連続した日におけるマウスの体重減少（％）。マウスは、ＳＥのみまたはＧＬＡ−ＳＥアジュバントで、またはタンパク質がないＧＬＡ−ＳＥまたはＳＥで処方された５０ｎｇのｒＨ５がワクチン投与された。各データポイントは、群＋／−平均値の標準誤差毎の平均の体重減少を表す。（Ｃ）ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるアジュバント媒介ｒＨ５保護。マウス（５／群）に、ＧＬＡ−ＳＥのみ、または２％ｖ／ｖのＳＥのみ、５μｇのＧＬＡのみ、または５μｇのＧＬＡ−ＳＥで処方された５０ｎｇのｒＨ５（ＶＮ）で一度ワクチン投与した。マウスは、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃され（ＩＮ）、生存および体重減少がモニターされた。各データポイントは、群毎の平均の体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。
【図１Ｃ】ｒＨ５／ＧＬＡ−ＳＥワクチンの一回の注射は、マウスのＨ５Ｎ１感染を予防する。（Ａ）マウス（５／群）に、２％ｖ／ｖのＳＥ乳剤またはＧＬＡ−ＳＥアジュバント（２０μｇＧＬＡ）に処方された５０、１５０、４５０、９００、または２７００ｎｇのｒＨ５（ＶＮ）で、一度、予防接種を行い、次いで、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃した（ＩＮ）。群毎の最大体重減少割合の平均を、二週間にわたって、各群で決定した。曲線下の領域（経時的体重減少（％））が、ｒＨ５の各用量について決定された。（Ｂ）ウイルス攻撃後の連続した日におけるマウスの体重減少（％）。マウスは、ＳＥのみまたはＧＬＡ−ＳＥアジュバントで、またはタンパク質がないＧＬＡ−ＳＥまたはＳＥで処方された５０ｎｇのｒＨ５がワクチン投与された。各データポイントは、群＋／−平均値の標準誤差毎の平均の体重減少を表す。（Ｃ）ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるアジュバント媒介ｒＨ５保護。マウス（５／群）に、ＧＬＡ−ＳＥのみ、または２％ｖ／ｖのＳＥのみ、５μｇのＧＬＡのみ、または５μｇのＧＬＡ−ＳＥで処方された５０ｎｇのｒＨ５（ＶＮ）で一度ワクチン投与した。マウスは、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃され（ＩＮ）、生存および体重減少がモニターされた。各データポイントは、群毎の平均の体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。
【図２】ＧＬＡ−ＳＥアジュバントは、不均質Ｈ５Ｎ１ウイルスによる攻撃後にワクチン投与されたマウスの生存を向上させる。マウス（５／群）に、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントで処方された５０ｎｇの同種（ＶＮ）ｒＨ５、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント中に処方された５０ｎｇまたは２００ｎｇの不均質（Ｉｎｄｏ）ｒＨ５、または２００ｎｇの不均質ｒＨ５のみあるいはＳＥ乳剤で処方されたｒＨ５をワクチン投与した。マウスは、１４日目に、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）で攻撃され（ＩＮ）、生存および体重減少をモニターした。各データポイントは、群毎の平均の体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。
【図３Ａ】ＧＬＡ−ＳＥは、抗原特異的免疫の誘導および病気からの回復を促進する。（Ａ）攻撃前のワクチン投与された日数の関数としてのマウスの生存率。マウスは、５０ｎｇのｒＨ５のみ、またはＳＥあるいはＧＬＡ−ＳＥで処方されたｒＨ５、またはＧＬＡ−ＳＥのみで予防接種を行い、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によるワクチン接種後、０、２、４、６、８、１０、または１２日目に（ＩＮ）を攻撃した。（Ｂ）ウイルス性攻撃前６日目または１４日目における、５０ｎｇのｒＨ５のみ、またはＳＥあるいはＧＬＡ−ＳＥで処方されたｒＨ５がワクチン投与されたマウスにおける経時的体重減少（％）。（Ｃ）観察的スコアシステムに基づく（Ｂ）からのマウスの全体的な健康状態の変化（０＝普通、１＝病気の疑いあり、２＝症状は軽いが病気である、３＝中程度の症状の病気、４＝死に瀕するほどの深刻な病気。
【図３Ｂ】ＧＬＡ−ＳＥは、抗原特異的免疫の誘導および病気からの回復を促進する。（Ａ）攻撃前のワクチン投与された日数の関数としてのマウスの生存率。マウスは、５０ｎｇのｒＨ５のみ、またはＳＥあるいはＧＬＡ−ＳＥで処方されたｒＨ５、またはＧＬＡ−ＳＥのみで予防接種を行い、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によるワクチン接種後、０、２、４、６、８、１０、または１２日目に（ＩＮ）を攻撃した。（Ｂ）ウイルス性攻撃前６日目または１４日目における、５０ｎｇのｒＨ５のみ、またはＳＥあるいはＧＬＡ−ＳＥで処方されたｒＨ５がワクチン投与されたマウスにおける経時的体重減少（％）。（Ｃ）観察的スコアシステムに基づく（Ｂ）からのマウスの全体的な健康状態の変化（０＝普通、１＝病気の疑いあり、２＝症状は軽いが病気である、３＝中程度の症状の病気、４＝死に瀕するほどの深刻な病気。
【図３Ｃ】ＧＬＡ−ＳＥは、抗原特異的免疫の誘導および病気からの回復を促進する。（Ａ）攻撃前のワクチン投与された日数の関数としてのマウスの生存率。マウスは、５０ｎｇのｒＨ５のみ、またはＳＥあるいはＧＬＡ−ＳＥで処方されたｒＨ５、またはＧＬＡ−ＳＥのみで予防接種を行い、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によるワクチン接種後、０、２、４、６、８、１０、または１２日目に（ＩＮ）を攻撃した。（Ｂ）ウイルス性攻撃前６日目または１４日目における、５０ｎｇのｒＨ５のみ、またはＳＥあるいはＧＬＡ−ＳＥで処方されたｒＨ５がワクチン投与されたマウスにおける経時的体重減少（％）。（Ｃ）観察的スコアシステムに基づく（Ｂ）からのマウスの全体的な健康状態の変化（０＝普通、１＝病気の疑いあり、２＝症状は軽いが病気である、３＝中程度の症状の病気、４＝死に瀕するほどの深刻な病気。
【図４Ａ】ＧＬＡベースのｒＨ５ワクチンは、同種および不均質のウイルス攻撃後のマウスの恒久的予防御免疫を提供する。（Ａ）マウス（５／群）は、それのみまたは説明のように処方された５０ｎｇの同種（ＶＮ）ｒＨ５をワクチン投与され、４６日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によって攻撃した。マウスは、攻撃後２週間、毎日、体重変化をモニターされた。各データポイントは、群毎の平均体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。（Ｂ）マウス（５／群）は、それのみまたは説明のように処方された５０ｎｇの不均質（Ｉｎｄｏ）ｒＨ５でワクチン投与され、４６日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によって攻撃された。マウスは、攻撃後、二週間にわたり、毎日、体重の変化をモニターされた。各データポイントは、群毎の平均体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。（Ｃ）攻撃後３日目または６日目に、示された処方の同種（ＶＮ）または不均質（Ｉｎｄｏ）のｒＨ５をワクチン投与されたマウスにおいて、ウイルス負荷量が決定された。
【図４Ｂ】ＧＬＡベースのｒＨ５ワクチンは、同種および不均質のウイルス攻撃後のマウスの恒久的予防御免疫を提供する。（Ａ）マウス（５／群）は、それのみまたは説明のように処方された５０ｎｇの同種（ＶＮ）ｒＨ５をワクチン投与され、４６日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によって攻撃した。マウスは、攻撃後２週間、毎日、体重変化をモニターされた。各データポイントは、群毎の平均体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。（Ｂ）マウス（５／群）は、それのみまたは説明のように処方された５０ｎｇの不均質（Ｉｎｄｏ）ｒＨ５でワクチン投与され、４６日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によって攻撃された。マウスは、攻撃後、二週間にわたり、毎日、体重の変化をモニターされた。各データポイントは、群毎の平均体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。（Ｃ）攻撃後３日目または６日目に、示された処方の同種（ＶＮ）または不均質（Ｉｎｄｏ）のｒＨ５をワクチン投与されたマウスにおいて、ウイルス負荷量が決定された。
【図４Ｃ】ＧＬＡベースのｒＨ５ワクチンは、同種および不均質のウイルス攻撃後のマウスの恒久的予防御免疫を提供する。（Ａ）マウス（５／群）は、それのみまたは説明のように処方された５０ｎｇの同種（ＶＮ）ｒＨ５をワクチン投与され、４６日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によって攻撃した。マウスは、攻撃後２週間、毎日、体重変化をモニターされた。各データポイントは、群毎の平均体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。（Ｂ）マウス（５／群）は、それのみまたは説明のように処方された５０ｎｇの不均質（Ｉｎｄｏ）ｒＨ５でワクチン投与され、４６日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３ウイルス（１０００×ＬＤ５０）によって攻撃された。マウスは、攻撃後、二週間にわたり、毎日、体重の変化をモニターされた。各データポイントは、群毎の平均体重減少＋／−平均値の標準誤差を表す。（Ｃ）攻撃後３日目または６日目に、示された処方の同種（ＶＮ）または不均質（Ｉｎｄｏ）のｒＨ５をワクチン投与されたマウスにおいて、ウイルス負荷量が決定された。
【図５Ａ】ＧＬＡベースのｒＨ５ワクチンの一回の接種は、フェレットをＨ５Ｎ１の感染から予防する。フェレット（４／群）は、０．５μｇのｒＨ５抗原のみ、または示された処方により、一回、接種が行われ、２８日目に、Ｈ５Ｎ１ＶＮ１２０３（０．７５×１０６ｐｆｕ）の鼻内感染で攻撃された。（Ａ）体重変化（％）。各データ点は、フェレット＋／−平均値の標準誤差の平均を示すが、例外として、ＧＬＡ−ＳＥおよびｒＨ５のグループは、それぞれ、１匹および２匹の生き残ったフェレットによる結果を示す。（Ｂ）観察的スコアシステムに基づく、全体的な健康の変化：０＝普通、１＝病気の疑いあり、２＝症状は軽いが病気である、３＝中程度の症状の病気、４＝死に瀕するほどの深刻な病気。
【図５Ｂ】ＧＬＡベースのｒＨ５ワクチンの一回の接種は、フェレットをＨ５Ｎ１の感染から予防する。フェレット（４／群）は、０．５μｇのｒＨ５抗原のみ、または示された処方により、一回、接種が行われ、２８日目に、Ｈ５Ｎ１ＶＮ１２０３（０．７５×１０６ｐｆｕ）の鼻内感染で攻撃された。（Ａ）体重変化（％）。各データ点は、フェレット＋／−平均値の標準誤差の平均を示すが、例外として、ＧＬＡ−ＳＥおよびｒＨ５のグループは、それぞれ、１匹および２匹の生き残ったフェレットによる結果を示す。（Ｂ）観察的スコアシステムに基づく、全体的な健康の変化：０＝普通、１＝病気の疑いあり、２＝症状は軽いが病気である、３＝中程度の症状の病気、４＝死に瀕するほどの深刻な病気。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、ワクチンとして使用するための組成物およびワクチンを対象に予防接種する方法を提供し、ワクチンは、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスによる組換え赤血球凝集素を含有し、アジュバントワクチンは、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスを予防し、概して、体液性および細胞性免疫の両方をもたらし、記憶免疫細胞を生じさせる。
【００１８】
本明細書に記載されるワクチンおよび薬学的組成物は、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの赤血球凝集素（ＨＡ）およびＤＳＬＰアジュバント、例えば、ＧＬＡであり得る、化学式（１）に従うアジュバントを含有しプレパンデミックおよびパンデミックの段階においてヒトがこのウイルスに罹患することを予防することを目的とする。さらに、組成物は、アジュバント（用量または抗原を節約する）がない場合に必要であるよりもより少ないワクチン接種（用量を節約する）および／またはより低いＨＡ投与量で、関連するウイルスに対する免疫反応を増強させ、関連するウイルスに対する交差再活性をもたらすという利点を提供する。
【００１９】
Ａ．赤血球凝集素の調製
１．ＨＡ源
少なくとも４つの異なるインフルエンザＡウイルス、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、およびＨ９Ｎ２について、現在、プレパンデミックまたはパンデミックの懸念がある。
【００２０】
インフルエンザＡウイルス亜型Ｈ５Ｎ１は、ヒトおよび多くの他の動物の種において病気を引き起こし得るインフルエンザウイルスの亜型である。Ｈ５Ｎ１（ＨＰＡＩＨ５Ｎ１）の非常に病原性の強い株は、「鳥類インフルエンザ」または「鳥インフルエンザ」の原因となる。現在では鳥類の疾患であるが、感染した鳥と広範囲に物理的に接触したほとんどまたは全てのヒトに感染する可能性がある。パンデミックの全ての条件が満たされているわけではないため、Ｈ５Ｎ１はプレパンデミックウイルスとして分類され、最も留意すべき点として、ウイルスはヒト同士で容易にかつ持続的に拡大しない。
【００２１】
Ｈ５Ｎ１型の鳥類インフルエンザ（本明細書では「Ｈ５Ｎ１」と称する）は、アジアで最初に発生し、世界中に広まった。Ｈ５Ｎ１ウイルスは進化しつつあり、それらのＨＡ分子の抗原および配列特性に基づいて、明確なクレードおよびサブクレードに分類できる。「クレード」は、共通の祖先に由来する関連する有機体を指す。ヒトにおいてＨ５Ｎ１感染が２００３年の再出現以来、いくつかの異なるクレードが、ヒト疾患の３００ケースよりも多くから、分離されている。ＷＨＯ（世界保健機関）は、非常に病原性の強いＨ５Ｎ１鳥類インフルエンザウイルスの命名法システムの統一化に着手した（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ３：５９−６２，２００９、Ｄｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１４：ｅ１，２００８、さらに、「Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｈ５Ｎ１  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔも参照）。２００９年３月の時点で、１０の明確なウイルスクレード（０〜９番）が特定された。
【００２２】
主に東南アジアおよびアジアで分離されてきたクレード１およびクレード２ウイルスは、最も多く、ワクチン開発の対象となっている。最初のＦＤＡ認可Ｈ５Ｎ１ワクチンは、Ｈ５クレード１ウイルスに基づく従来のワクチンであったが、研究参加者の約半分のみにおいては、予防レベルの中和力価を誘導し、さらに、大量のＨＡを二用量、必要とした。試験における組換えワクチンは、同様の結果をもたらした（Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１７３２−１７３７）。パンデミックに対処可能なワクチンは、より多くの個人を予防するだけでなく、用量節約および投与量節約の両方の改善点を必要とする。
【００２３】
ＮＣＢＩの「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ」（２０１０年１月１４日アクセス）において、およそ１３３５の独自の全長Ｈ５配列が存在する。これらのＨ５配列のいずれも使用可能である。ＨＡ配列は、いずれのクレードまたはサブクレードに由来してもよい。最も多いものとして、ＨＡは、クレード１または２に由来する。ＷＨＯの参照Ｈ５  ＨＡ抗原は、主にクレード２であるが、さらに、クレード１、４、および７のＨＡを含む（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔでアクセスされる、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」２００９年２月）。参照抗原は、以下の表に示される抗原を含む。
【００２４】
【数１】
2013522231.tif 000003
＊全てのＧｅｎＢａｎｋ受託番号および参照における配列は、それらの全体が組み込まれる。
【００２５】
パンデミックが懸念されている別の亜型は、Ｈ１Ｎ１パンデミックウイルス（「豚インフルエンザ」ウイルス）、つまり２００９年のインフルエンザパンデミックおよび１９１８年のスペイン型インフルエンザの元になった型である。２００９年のパンデミックを引き起こした株は、パンデミックＨ１Ｎ１  ２００９ウイルスと呼ばれる。２０１０年２月１８日現在、９００を超えるＨＡの非冗長タンパク質配列が、ＮＣＢＩおよびインフルエンザ研究データベース（ｆｌｕｄｂ．ｏｒｇ）において利用可能である。米国では、Ａ／カリフォルニア／４／２００９（その全体が組み込まれる、受託番号ＡＣＰ４１１０５）およびＡ／カリフォルニア／７／２００９（その全体が組み込まれる、受託番号ＡＣＱ５５３５９）は、ワクチンを作成するために使用される株である。他の株によるＨＡも適している。
【００２６】
他の可能性のあるインフルエンザのパンデミックウイルスは、オランダで発生したＨ７Ｎ７および中国で発生したＨ９Ｎ２を含む。２００３年以来、オランダは、鳥類における別の非常に病原性の強い鳥インフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ７）の発生を報告している。仕事で鳥類を扱う人および家族の間で、約９０人のヒトの感染が確認されており、ウイルスの抗体は、感染した鳥類と接触しなくても、感染した個人との家庭内の近接した接触によって、ヒト同士で広範囲に広がっていることがわかり、これにより高レベルのヒト間感染が示唆されている。Ｈ９Ｎ２は、中国におけるヒト疾患を生じさせたことがわかった別の鳥インフルエンザウイルスである。米国立アレルギー感染病研究所は、パンデミックの可能性のあるウイルスとしてＨ９Ｎ２を特定している。いくつかの適した株には、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）およびＡ／ＮＬ／２０９／０７（Ｈ７Ｎ７）を含む。
【００２７】
薬学的組成物およびワクチン用の赤血球凝集素タンパク質は全長であり得るが、前駆タンパク質、断片、融合タンパク質の一部、またはペプチドでもあり得る。全長タンパク質は成熟タンパク質を指し、例えば、赤血球凝集素タンパク質の場合、成熟タンパク質は、ビリオンでみられる形態である（例えば、リーダーペプチドが欠けている、ＨＡ０からＨＡ１およびＨＡ２へ開裂され得る）。前駆体タンパク質（プレタンパク質）は、処理が生じる前の発生期の翻訳されたタンパク質、または部分的に処理されたタンパク質である。融合タンパク質の一部として、ＨＡタンパク質は、前駆または全長タンパク質あるいはタンパク質断片またはペプチドとして存在し得る。タンパク質の断片またはペプチドは免疫的であることが必要であり、免疫反応をもたらす１つ以上のエピトープを含有する。
【００２８】
ペプチドは、Ｔ細胞受容体への結合のためにＭＨＣ分子と複合するように選択され、概して最大で約３０のアミノ酸長さ、または最大で約２５のアミノ酸長さ、または最大で約２０のアミノ酸長さ、または最大で約１５のアミノ酸長さ、最大で約１２のアミノ酸長さ、最大で約９のアミノ酸長さ、最大で約８のアミノ酸長さである。概して、より短いペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合するまたはこれを関連付け、より長いペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するまたはこれを関連付ける。適したペプチドは、多数の生物情報プログラムのいずれかを使用して予測でき、公知の方法を用いて試験できる。
【００２９】
本明細書に記載されるように、適したタンパク質は、前駆タンパク質、成熟タンパク質、断片、融合タンパク質およびペプチドを含む。１つよりも多いＨＡは、組成物に存在し得る。複数のＨＡタンパク質が使用される場合、ＨＡタンパク質は、同じウイルス、または異なるウイルスに由来し得る。さらに、複数のタンパク質は、同じ形態またはこれらの形態の混合物として存在し得る。例えば、ＨＡタンパク質は、成熟タンパク質としておよび断片としての両方で、存在し得る。
【００３０】
典型的には、薬学的またはワクチン組成物におけるＨＡは、リーダー配列を有する糖タンパク質の真核生物の発現によって、典型的には、リーダー配列が存在しない成熟タンパク質（シグナルペプチドとしても公知である）が生じるため、前駆タンパク質以外になる。ＨＡの疎水性リーダー配列の長さは、分離株同士でいくらか異なり得るが、典型的には約１８のアミノ酸長さである。しかしながら、組換え発現のために、シグナルペプチドは、前駆タンパク質の一部であってもよい。シグナルペプチドは、ＨＡの天然配列または当該技術で公知の他の配列を含む。
【００３１】
タンパク質断片は、免疫原性である必要がある。いくつかのケースにおいて、断片は、免疫優勢ペプチド配列を含有する。免疫原性ペプチド配列は、ＢまたはＴ細胞（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞）によって識別されるものである。ペプチド配列は、概して一連の重複するペプチドを使用して、完全な配列に由来するペプチドのスクリーニングによって識別できる。種々のアッセイを、ＢまたはＴ細胞がペプチドに識別および反応するかどうかを決定するために使用できる。例えば、クロム放出細胞毒性法（アッセイの方法のために、本方法に組み込まれるＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１：６６０４−６６１５、２００８）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色法およびＭＨＣ多量体染色（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：Ｒ６３−Ｒ６７，１９９９，Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６、１９９６）、ＥＬＩＳアッセイ、キャリアに結合されたペプチドによるマウスの予防接種後の他の種類の抗体測定が、適したアッセイである。免疫原性ペプチドも、生物情報ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．４０９，２００７の「Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」方法）によって予測できる。いくつかの例示的なプログラムおよびデータベースは、ＦＲＥＤ（Ｆｅｌｄｇｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：２７５８−９，２００９）、ＳＶＭＨＣ（ＤoｎｎｅｓおよびＫｏｈｌｂａｃｈｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：Ｗ１９４０１９７，２００６）、ＡｎｔｉｇｅｎＤＢ（Ａｎｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８：Ｄ８４７−８５３，２０１０）、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｂｉａｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：４６８−４７５，２００４）を含む。
【００３２】
ＨＡは、融合タンパク質の一部として組み込み可能である。他の融合パートナーまたはパートナーは、インフルエンザノイラミニダーゼ等の別のＨＡタンパク質または非ＨＡタンパク質にすることができる。融合タンパク質を使用するためのいくつかの共通の理由は、発現を向上させるまたは生成されたタンパク質の精製を支援することである。例えば、発現システムの宿主細胞に調整されたシグナルペプチド配列は、ＨＡタンパク質に結合できる、またはタンパク質精製で使用するためのタグ配列を結合でき、従って、切断配列も組み込まれる場合に開裂できる。タンパク質のうちの１つ以上からの複数のペプチドエピトープを融合することができる、またはタンパク質のうちの１つ以上からの断片を融合することができる。複数のペプチドエピトープは、いずれかの順序にできる。
【００３３】
組成物におけるＨＡの他の適した源は、ＨＡを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）（その全体が組み込まれる、米国特許第２００５００９００８号）、核酸エンコーディングＨＡ（全て、その全体が組み込まれる、米国特許第２００３０４５４９２号、米国特許第７５３７７６８号、国際公開第ＷＯ０９０９２０３８号、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｊａｎ  ２９，２０１０）、さらに、弱毒化および不活性化ウイルス（全て、その全体が組み込まれる、米国特許第６０２２７２６号、米国特許第７３１６８１３号、米国特許第２００９０１０９６２号、国際公開第ＷＯ９９／５７２８４号、米国特許第２００８２５４０６０号）を含む。
【００３４】
２．組換合成ベクター構成
前駆タンパク質、断片、融合タンパク質およびペプチドを含むＨＡタンパク質は、インキュベート細胞において製造され得る、または化学的に合成され得る。（「ＨＡタンパク質」は、これらの全ての形態を含むために、本明細書において使用されている。）ペプチドは、特に、機械（多くが市販されている）を使用してまたは手で、化学的に便利に合成され得る。あるいは、多様な適した発現システム、原核細胞および真核性システムの両方が公知であり、使用され得る。よく使用され、タンパク質製造に適している宿主細胞は、大腸菌、酵母、昆虫、および哺乳類を含む。発現ベクターおよび宿主細胞が、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）または構成され得る。例示的なベクターは、プロモーターおよび配列が手術的に（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合されるように、対象のタンパク質をエンコーディングする配列のプロモーターおよびクローニング部位を含有する。分泌シグナル配列（リーダー配列と呼ばれることもある）、タグ配列（例えば、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ）、転写終結シグナル、特に、ベクターが染色体外で複製される場合の複製源、および選択可能な生成物をエンコーディングする配列等の、他の要素が存在し得る。選択的な要素が、それらの目的に従ってベクター内に配置される。宿主細胞に核酸を導入するための方法および手順も公知である。
【００３５】
ＨＡは糖鎖タンパク質であるため、最も多くの場合、選択した発現システムは、酵母（例えば、米国特許第５８５６１２３号、米国再発行特許第ＲＥ３５７４９号、米国特許第４９２５７９１号、さらに、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ  ＵＳＡ、クルイベロミセス・ラクチスタンパク質発現キット、ＮＥＢ，ＭＡ，ＵＳＡ）、哺乳類細胞およびバキュロウイルス（米国特許第４７４５０５１号、米国特許第５７６２９３９号、米国特許第５８５８３６８号、米国特許第６１０３５２６号、本明細書において識別される全ての米国特許参照は、その全体が本明細書中に組み込まれる）等のタンパク質を糖化する真核性システムである。
【００３６】
ＨＡのコーディング配列を含むバキュロウイルスが昆虫細胞に感染し、ＨＡを発現させる昆虫発現システムは、特に適した発現システムである。昆虫細胞内の発現は、概して、高い濃度および量のタンパク質を生じさせ、真核性翻訳後修飾（例えば、糖鎖）を有するタンパク質を作り出し、プレパンデミックワクチンで充分なタンパク質を生成する製造レベルまでスケールを拡大することができる。発現システムおよび方法が当該技術で公知であり、例えば、多くの市販のシステムおよびサービスプロバイダーが存在している（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ．ｃｏｍにてベンダーおよびサービスプロバイダーのリストも参照）。
【００３７】
例示的な昆虫発現システムにおいて、主要な遺伝子生成物は、加工されておらず（例えば、全長赤血球凝集素）、分泌されておらず、感染した細胞の表在性膜に関連付けられたままである（米国特許第５７６２９３９号）。感染後数日目に、組換えＨＡ（ｒＨＡ）を表在性膜から抽出できる（米国特許第５８５８３６８号、ｒＨＡの抽出および精製について組み込まれた参照文献）。適した一抽出方法は、非変性、非イオン性洗浄剤または他の公知の技術の使用を伴う。出現されたタンパク質は、「そのまま」使用してもよい、またはより典型的には、分析およびさらに精製してもよい。さらなる精製を、例えば、親和性クロマトグラフィ、ゲルクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたは当業者に公知の他の同等の方法によって行うことができる。ｒＨＡは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度に精製される。
【００３８】
純度または数量を決定するための典型的な手順は、ゲル電気泳動、ウェスタンブロット法、質量分析法、およびＥＬＩＳＡを含む。タンパク質の活性は、概して、実施例に記載されているもの等の生物学的アッセイで査定される。必要な場合または所望の場合には、タンパク質は、さらに精製してもよい。多くの精製方法が公知であり、サイズクロマトグラフィ、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、析出、免疫析出等を含む。タンパク質の意図的な使用は、典型的には、最も高いレベルの純度を必要とする可能性のあるヒトにおける使用について、精製の程度を決定する。
【００３９】
Ｂ．アジュバント
本発明は、アジュバントを含むおよび／または利用する組成物、キット、方法等を提供する。アジュバントは、ＤＳＬＰとして示される群から選択される１つ以上の合成物である。ＤＳＬＰ合成物は、グルコースおよびアミノ置換グルコースから選択される２つの単糖群の結合によって形成される二糖（ＤＳ）基を含有するという特徴を共有し、ここで、二糖は、リン酸（Ｐ）基および複数の脂質（Ｌ）基の両方に化学的に結合する。特に、二糖は、それぞれ、６つの炭素を有する２つの単糖ユニットから形成されるものとして視覚化され得る。二糖において、単糖のうちの１つは還元端を形成し、他の単糖は、非還元端を形成する。便宜上、還元末端を形成する単糖の炭素は、従来の炭水化物番号指定命名法に従う、１、２、３、４、５、および６位に位置するものとして示されるが、非還元末端を形成する単糖の対応する炭素は、１’、２’、３’、４’、５’、および６’位に位置するものとして示される。ＤＳＬＰにおいて、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、還元末端の６’位の炭素に結合される。リン酸基は、好適には非還元末端の４’炭素を介して、二糖に結合される。脂質基のそれぞれは、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）のいずれかを介して二糖と結合し、ここで、カルボニル基は脂質基と結合する。二糖は、アミドまたはエステル基、すなわち、非還元末端の２’、３’、および６’位、ならびに還元末端の１、２、３、および４位に結合され得る、７つの位置を有する。
【００４０】
脂質基は、少なくとも６つの炭素、好適には少なくとも８つの炭素、およびより好適には少なくとも１０の炭素を有し、ここで、各ケースにおいて、脂質基は、好適には２４以下の炭素、好適には２２以下の炭素、およびより好適には２０以下の炭素を有する。一態様において、共に取られる脂質基は、６０〜１００の炭素、好適には７０〜９０の炭素を提供する。脂質基は、炭素および水素原子のみで構成されていてもよい、つまり、ヒドロカルビル脂質基であってもよい、または１つのヒドロキシル基を含有してもよい、つまりヒドロキシル置換脂質基であってもよい、あるいは、エステル基のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、つまりエステル置換脂質を介して、ヒドロカルビル脂質またはヒドロキシル置換脂質基に結合される、エステル基を含有してもよい。ヒドロカルビル脂質基は飽和または不飽和であってもよく、不飽和ヒドロカルビル脂質基は、隣接する炭素原子の間の１つの二重結合を有する。
【００４１】
ＤＳＬＰは、３、または４、または５、または６または７つの脂質を含有する。一態様では、ＤＳＬＰは、３つから７つの脂質を含有し、一方で、別の態様では、ＤＳＬＰは、４〜６つの脂質を含有する。一態様では、脂質は、ヒドロカルビル脂質、ヒドロキシル置換脂質、およびエステル置換脂質から独立して選択される。一態様では、１、４’および６’位はヒドロキシルによって置換される。一態様では、単糖ユニットはそれぞれグルコサミンである。ＤＳＬＰは、自由酸の形態、または塩の形態であってもよい（例えば、アンモニウム塩）。
【００４２】
一態様では、ＤＳＬＰ上の脂質は、次のように記述できる。つまり、３’位は−Ｏ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒａ）（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ）によって置換され、２’位は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒａ）（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ）によって置換され、３位は、−Ｏ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒａ）によって置換され、２位は、−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒａ）によって置換される。ここで、ＲａおよびＲｂのそれぞれは、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシルから選択され、ここで、これらの用語はそれぞれ、飽和ヒドロカルビル基を指す。一実施形態では、Ｒａは、ウンデシルであり、Ｒｂはトリデシルであり、ここで、このアジュバントは、例えば米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号において「ＧＬＡ」と記述される。ＲａがウンデシルでありＲｂがトリデシルである合成物は、例えばＰＨＡＤ（登録商標）アジュバントとしてＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒから利用可能なものとして、立体化学的に定義された形態で使用され得る。
【００４３】
別の態様では、ＤＳＬＰは、３Ｄ−ＭＰＬとして公知の天然由来の合成物の混合物である。３Ｄ−ＭＰＬアジュバントは、それらのＭＰＬ（登録商標）アジュバントとしてＧａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙによる薬学的グレード形態で商業的に製造される。３Ｄ−ＭＰＬは、科学文献および特許文献において広範囲に記載されており、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２１  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ：  ｐａｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｕｌｒｉｃｈ，Ｊ．Ｔ．ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ、Ｋ．Ｒ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）および米国特許第４，９１２，０９４号を参照されたい。
【００４４】
別の態様では、ＤＳＬＰアジュバントは、（ｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン１位および還元末端グルコサミンのヘキソサミン６位の間のエーテル結合を介して、非還元末端グルコサミンに結合される還元末端グルコサミンを有するジグルコサミン主鎖、（ｉｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン４位に結合するＯ−ホスホリル基、および（ｉｉｉ）最大で６つの脂肪アシル鎖を含有するものとして記載され得る。ここで、脂肪アシル鎖のうちの１つがエステル結合を介して還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシに結合し、脂肪アシル鎖のうちの１つがアミド結合を介して非還元末端グルコサミンの２−アミノに結合し、エステル結合を介して１２よりも多い炭素原子のアルカノイル鎖に結合するテトラデカノイル鎖を含有し、脂肪アシル鎖のうちの１つがエステル結合を介して非還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシに結合し、エステル結合を介して、１２よりも多い炭素原子のアルカノイル鎖に結合するテトラデカノイル鎖を含有する。例として、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号を参照されたい。
【００４５】
別の態様では、本発明に記載されるアジュバントは、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号に記載されるように、６つの脂質基を有する合成二糖であってもよい。
【００４６】
別の態様では、本発明で使用されるアジュバントは、化学式（１）によって識別され得る。
【００４７】
【化１】
2013522231.tif 000004
化学式（１）において、部分Ａ１およびＡ２は、水素、リン酸、およびリン酸塩の基から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。好適にはリン酸基であるＡ１Ｏ−基は、非還元末端の４’位で二糖に結合する。非還元末端は、その１位を介してエーテル基に結合され、これは、次に、還元末端の６’位に結合される。化学式（１）の合成物は、それぞれ、部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの１つを組み込む６つの脂質基を有し、ここで、これらのＲ基は、Ｃ３〜Ｃ２３によって表される、３〜２３の炭素を有するヒドロカルビル基から独立して選択される。さらなる理解のために、部分が「複数のメンバーを有する特定の基」から独立して選択される」場合に、最初の部分に選択されたメンバーは、第２の部分について選択されたメンバーの選択に全く影響しないまたは制限しないことを理解されたい。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が結合される炭素原子は非対称であり、このため、ＲまたはＳの立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態では、これらの炭素原子の全てはＲ立体化学であり、一方で、別の実施形態において、これらの炭素原子の全てはＳ立体化学である。
【００４８】
「ヒドロカルビル」は、全て水素および炭素によって形成される化学部分を指し、ここで、炭素原子の構成は直鎖または分岐した、非環状または環状であってもよく、隣接する炭素原子の間の結合は、（飽和ヒドロカルビルを提供するために）完全に単一の結合であってもよく、または、（不飽和ヒドロカルビルを提供するために）いずれか２つの隣接する炭素原子の間に存在する二重または三重の結合であってもよく、ヒドロカルビル基内の炭素原子数は３〜２４の炭素原子である。ヒドロカルビルはアルキルであってもよく、ここで、代表的な直鎖アルキルは、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含む、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を含み、一方で、分岐したアルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等を含む。代表的な飽和環状ヒドロカルビルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含み、一方で、不飽和環状ヒドロカルビルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等を含む。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子の間の少なくとも１つの二重または三重結合を含有する（ヒドロカルビルが非環状である場合、それぞれ、「アルケニル」または「アルキニル」と称され、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合、それぞれ、「シクロアルケニル」および「シクロアルキニル」と称される）。代表的な直鎖および分岐したアルケニルは、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２、３−ジメチル−２−ブテニル等を含み、一方で、代表的な直鎖および分岐したアルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル等を含む。
【００４９】
ＤＳＬＰアジュバントは、当該技術で公知の合成方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９／０３５５２８号、並びに同第ＷＯ２００９／０３５５２８号において特定される公報に開示される合成方法によって取得することができ、これらの公報もそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。化学的に合成されたＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、存在するＤＳＬＰ分子、つまり化学式（１）の合成物に対して、少なくとも８０％、好適には少なくとも８５％、より好適には少なくとも９０％、より好適には少なくとも９５％であり、さらにより好適には少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％純粋である調製を指す、実質的に均質な形態で調製できる。所与のアジュバント調製の純度の決定は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析および／または核磁気共鳴分析法等の適正な分析用化学的方法を専門とする者により、容易に行うことができる。天然材料から得られるＤＳＬＰアジュバントは、典型的には化学的に純粋な形態での製造が容易ではなく、このため合成的に製造されたアジュバントが、本発明の好適なアジュバントである。前述のように、アジュバントの特定のものは、商業的に取得し得る市販されている。好適なアジュバントは、Ａｌａｂａｓｔｅｒ  ＡＬのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓのカタログにおいて識別される製品番号６９９８００であり、以下の、Ｅ１０と組み合わせたＥ１を参照されたい。
【００５０】
発明の種々の実施形態において、アジュバントは化学式（１）の化学構造を有するが、部分Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、これらの部分について以前に提供されるオプションのサブセットから選択され、ここで、これらのサブセットは、Ｅ１、Ｅ２等によって、以下に識別される。
Ｅ１：Ａ１はリン酸またはリン酸塩であり、Ａ２は水素である。
Ｅ２：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ３−Ｃ２１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ５−Ｃ２３ヒドロカルビルである。
Ｅ３：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ５−Ｃ１７アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ７−Ｃ１９ヒドロカルビルである。
Ｅ４：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ７−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
Ｅ５：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ９−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１１−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
Ｅ６：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ９−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１１−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
Ｅ７：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ７−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
Ｅ８：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１−Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１２−Ｃ２０ヒドロカルビルである。
Ｅ９：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１３ヒドロカルビルである。
Ｅ１０：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４はトリデシルである。
【００５１】
特定のオプションでは、Ｅ２〜Ｅ１０のそれぞれは実施形態Ｅ１に組み合わせられ、および／またはＥ２〜Ｅ９のヒドロカルビル基はアルキル基、好適には直鎖アルキル基である。
【００５２】
ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、それぞれ後述のように、選択的にコアジュバントを有する薬学的組成物に処方し得る。これに関し、製剤、例えばＧＬＡアジュバントのための水性製剤（ＡＦ）および安定乳剤製剤（ＳＥ）を提供する米国特許公開第２００８／０１３１４６６号が参照され、化学式（１）のアジュバントを含む、ＤＳＬＰアジュバントのうちのいずれかに、これらの製剤を利用し得る。
【００５３】
ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントを提供する本発明は、本明細書でコアジュバントと称される第２のアジュバントとの組み合わせで利用され得る。発明の３つの実施形態において、コアジュバントは送達システムであってもよく、または免疫増強物質であってもよく、あるいは送達システムおよび免疫増強物質の両方として機能する組成物であってもよい（例えば、Ｏ‘Ｈａｇａｎ  ＤＴ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ．，Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（９）：１５１９−３０（２００４）を参照されたい。コアジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリー生体分子のメンバーによって作動する免疫増強物質であり得る。例えば、コアジュバントは、ＴＬＲ４作動薬、またはＴＬＲ８作動薬あるいはＴＬＲ９作動薬として、その主要な作用モードのために選択され得る。あるいは、または補足として、コアジュバントは、そのキャリアの性質について選択し得る（例えば乳剤、リポゾーム、微粒子、またはカリ明礬にし得る）。
【００５４】
一態様では、コアジュバントはカリ明礬であり、ここで、この用語は、アルミニウムリン酸（ＡｌＰＯ４）および水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）等のアルミニウム塩を指す。コアジュバントとしてカリ明礬が使用される場合、カリ明礬は、約１００〜１、０００μｇ、または２００〜８００μｇ、または３００〜７００μｇまたは４００〜６００μｇの量のワクチン用量で存在し得る。ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、典型的には、カリ明礬未満の量で存在し、種々の態様において、ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、重量ベースで、カリ明礬重量に対して０．１〜１％、または１〜５％、または１〜１０％、または１〜１００％で存在する。
【００５５】
一態様では、コアジュバントは、ワクチンアジュバント性質を有する乳剤である。かかる乳剤は、水中油型乳剤を含む。完全なアジュバント（ＩＦＡ）内のフロイントは、あるかかるアジュバントである。別の適した水中油型乳剤は、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０界面活性剤としても公知の）およびソルビタントリオレエートを含有するＭＦ−５９（登録商標）アジュバントである。スクアレンは、アマランサス種子、米ぬか、小麦胚芽、およびオリーブを含む、植物源（主に植物油）からも利用可能であるが、もともとサメ肝油から得られる天然の有機合成物である。他の適したアジュバントは、好物油ベースのアジュバントであるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ２０６、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＭＳ１３１２を含むＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  ＮＪ）である。鉱物油は、コアジュバントに存在し得るが、一実施形態では、本発明のワクチン組成物の油分成分は、全ての代謝可能な油である。
【００５６】
コアジュバントとしての本発明の実施において利用され得る免疫増強物質の実施例は、３Ｄ−ＭＰＬまたはＭＰＬ（登録商標）アジュバント、ＭＤＰおよび誘導体、オリゴヌクレオチド、二重らせんＲＮＡ、代替病原菌に関連する分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、サポニン、小分子免疫増強剤（ＳＭＩＰ）、サイトカイン、およびケモカインを含む。
【００５７】
一実施形態では、コアジュバントは３Ｄ−ＭＰＬまたはＭＰＬ（登録商標）アジュバントであり、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａが開発元であるが、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって市販されている。例えば、Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ２１  ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ、ｅｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照されたい。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントに関連し、本発明のコアジュバントとして適しているのは、ＡＳ０２（登録商標）アジュバントおよびＡＳ０４（登録商標）アジュバントである。ＡＳ０２（登録商標）アジュバントは、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびＱＳ−２１（登録商標）アジュバント（本明細書の他の部分にて記載されるサポニンアジュバント）の両方を含有する水中油型乳剤である。ＡＳ０４（登録商標）アジュバントは、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびカリ明礬を含有する。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、ＵｌｒｉｃｈおよびＭｙｅｒｓによる記事によってより完全に記載されているように、弱酸性のＬＰＳの処理および変性ＬＰＳの精製後の塩基加水分解によって、サルモネラ・ミネソタＲ５９５のリポ多糖（ＬＰＳ）から調製される。
【００５８】
一実施形態では、コアジュバントは、キラヤ・サポナリア樹木種の木の皮に由来するもの等のサポニン、または変性サポニンであり、例えば、米国特許番号第５，０５７，５４０号、５，２７３，９６５号、第５，３５２，４４９号、第５，４４３，８２９号、および第５，５６０，３９８号を参照されたい。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡによって販売される製品の、ＱＳ−２１（登録商標）アジュバントは、ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントと共に使用し得る例示的なサポニン含有コアジュバントである。サポニンに関連するものは、Ｉｓｃｏｔｅｃ（スウェーデン）が開発元であるアジュバントのＩＳＣＯＭ（登録商標）ファミリー、および典型的には、全てハニカム状構造に形成された、キラヤ・サポナリアまたは合成類似化合物、コレステロール、およびリン脂質に由来するサポニンから形成される。
【００５９】
一実施形態では、コアジュバントは、コアジュバントとして機能するサイトカインであり、例えば、Ｌｉｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ。Ｄｉｓ．２１（６）：１４３９−１４４９（１９９５）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３（９）：３２４１〜３２４４（１９９５）、およびＥｇｉｌｍｅｚ，Ｎ．Ｋ．，Ｃｈａｐ．１４ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００７）を参照されたい。種々の実施形態において、サイトカインは、例えば、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であってもよく（例えば、Ｃｈａｎｇｅ  Ｄ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９（３）：２０７−２１５（２００４）、Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８８：１４７−１５４（２００２）、および米国特許第５，６７９，３５６号を参照）、またはタイプＩインターフェロン（例えばインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）またはインターフェロン−β（ＩＦＮ−β））あるいはタイプＩＩインターフェロン（例えばインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ））等のインターフェロン（例えば、Ｂｏｅｈｍ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７４９−７９５（１９９７）およびＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０７−３３６（２００５）を参照）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を特に含むインターロイキン（例えばＮｅｌｓｏｎ，Ｂ．Ｈ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（７）：３９８３−３９８８（２００４）を参照）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（例えば、Ｐｏｒｔｉｅｌｊｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２（３）：１３３−１４４（２００３）およびＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ．Ｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（２）：１３３−１４６（２００３）を参照）、インターロイキン−１５（Ｉｌ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であってもよい。ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、ワクチン抗原、または抗原との組み合わせ前にサイトカインによって共処方されてもよく、ＤＳＬＰアジュバント、例えば、化学式（１）のアジュバントおよびサイトカインのコアジュバントは、別々に処方され、次いで、組み合わせてもよい。
【００６０】
一実施形態では、コアジュバントは、本明細書に記載されるインフルエンザ抗原に選択的共役される非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドである。
【００６１】
コアジュバントがＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントとの組み合わせで利用される場合、２つのアジュバントの相対的量は、抗原のみに対するアジュバントを含有するワクチン組成物の所望のパフォーマンスの性質を実現するように選択され得る。例えば、アジュバントの組み合わせは、抗原の抗体反応を高める、および／または対象の先天性免疫システム反応を高めるために選択し得る。ケモカインおよびサイトカインの製造における先天性免疫システム結果の活性化により、次に、適応（獲得された）免疫反応が活性化される。適応免疫反応の活性化の重要な結果は、宿主が抗原に再び遭遇する場合に、より迅速かつ概してより良い質で免疫反応が起こるようにする、記憶免疫細胞の形成である。
【００６２】
ワクチンアジュバントの組み合わせは、プレパンデミックおよびパンデミックインフルエンザの制御に必要な免疫反応の数量および質の両方を調整するために戦略的に使用可能である。水および油分乳剤ベースのアジュバントによって、Ｔｈ２Ｔ細胞免疫が誘導される。それらの使用は、ウイルス感染の予防を行う中和抗体の製造を実行する上で重要であるが、これらの乳剤は、細胞媒介免疫の刺激において効果的ではない。パンデミックの発生のために、Ｔｈ１Ｔ細胞の誘発は、宿主内の病状の進行を制限し、集団内のウイルス感染を減らすために重要である。Ｔｈ１Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの製造によって、ヒトインフルエンザウイルスの直接の抗ウイルス性の役割を果たす（Ｋａｎｎａｇａｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉ８１：８４６８−８４７６，２００７）。これらは、さらに、（マウスのＩｇＧ２ａ）高いウイルス中和活性がない場合でも、インフルエンザを予防する抗体のサブクラスの製造を刺激すると共に、ウイルス排除に重要な抗ウイルス性ＣＤ８細胞傷害Ｔ−リンパ球の拡大、維持、および復活を調整する（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：９８１−９９０，２００６）。Ｔｈ１反応を誘発するための最も直接的な方法は、病原菌由来の糖、タンパク質、脂質、および核酸を認識および結合するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化を伴う。Ｔｏｌｌ様受容体は、樹状細胞成熟を刺激し、通常の先天性および適応性の免疫に必要とされる。ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントのみがこれらの種々の目標のそれぞれを実現し得るが、本発明は、一実施形態において、アジュバント組み合わせは、これらの目標を実現するために、パンデミックインフルエンザ抗原と組み合わせて利用し得ることを規定する。しかしながら、別の実施形態では、ワクチン内に存在するアジュバントのみが、その種々の実施形態を含むＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントであり、ここで、ＧＬＡは、化学式（１）の好適なＤＳＬＰアジュバントである。
【００６３】
さらに、水中油型乳剤内のＧＬＡは、抗原特異的抗体およびＨＡＩ力価の増加によって計測される際に、マウス内のＦｌｕｚｏｎｅワクチンの免疫原性を大幅に向上させ、用量を節約し、インフルエンザの抗原泳動株（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｒｉｆｔｅｄ  ｓｔｒａｉｎ）に対する交差再活性を広げた。これらの同じ実験では、抗原特異的ＩｇＧ２ａ力価およびＩＦＮγ製造における劇的な増加によって示されるように、ＧＬＡは、Ｔｈ１  Ｔ細胞反応を誘導した。
【００６４】
Ｃ．薬学的組成物、ワクチン、およびそれらの利用
１．製剤
薬学的組成物は、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザおよびＤＳＬＰアジュバント、例えばＧＬＡ等の化学式（１）のアジュバントからの組換え赤血球凝集素（ＨＡ）を含有する。ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、３つの例として、水中油型乳剤内に、水性溶液として、またはリポゾーム内に処方され得る。組成物は、さらに、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザのノイラミニダーゼ等の他のタンパク質、アルミニウム塩（例えば、カリ明礬）またはサポニンおよびサポニン誘導体等の他のアジュバント、α−トコフェロールまたは誘導体等の賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤、結合剤、チメロサール等の保存剤、界面活性剤等を含有する。
【００６５】
ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントは、それのみで使用できる、または、２つの選択肢として、アジュバントが油相に組み込まれる水中油型乳剤に処方できる。それのみで使用される場合、つまり乳剤と組み合わせる利点がない場合、アジュバントは、典型的には完全にオイルフリーである、または約１％ｖ／ｖ未満の油分を含有する組成物内に存在する。オイルフリーの組成物、水、アジュバント（例えば、ＧＬＡは好適なアジュバントである）および界面活性剤を調製するために、例えばリン脂質、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＰＯＰＣ）を組み合わせてもよい。組成物は、ＧＬＡの事前重量測定された量に、エタノールおよびＰＯＰＣの溶液を添加することで、調製され得る。この湿潤ＧＬＡは、できる限りＧＬＡを拡散させるために、１０分間、超音波分解される。次いで、ＧＬＡは窒素ガスによって乾燥される。乾燥したＧＬＡおよびＰＯＰＣは、分量を修正するために、ＷＦＩ（水−ｆｏｒ−注射）で再構成される。この溶液は、全てのＧＬＡおよびＰＯＰＣが溶解するまで、１５〜３０分間、６０℃で超音波分解される。長期保存のためには、ＧＬＡ−ＡＦ製剤を凍結乾燥する必要がある。凍結乾燥プロセスは、全量の２％になるまで、グリセロールを溶液に添加することで構成される。次いで、溶液は、１〜１０ｍｌ量のバイアルに入れられる。バイアルは、溶液を凍結させ、および次いで、昇華によって凍結水をなくすために、真空下にされることで構成される、凍結乾燥プロセスが行われる。
【００６６】
アジュバントが油と組み合わせられる場合、ヒトでの使用のため、油分は好適には代謝可能である。油分は、植物油、魚油、動物油または合成油であってもよく、油分は、摂取対象にとって有毒であるべきではなく、代謝による形態変換が可能である。ナッツ（ピーナツオイル等）、種、および穀物は、植物油の通常の原料である。特に適した代謝可能な油は、多くの異なる油に見られ、サメ肝油に多く見られる不飽和油であるスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサミン）を含む。スクアレンは、コレステロールの生体合成の中間体である。さらに、水中油型乳剤は、典型的には、α−トコフェロール（ビタミンＥ、米国特許第５，６５０，１５５号、米国特許第６，６２３，７３９号）等の抗酸化剤を含有する。また、トリグリセリド等の安定剤、等張性をもたらす材料、および他の材料を追加し得る。
【００６７】
油の液滴の平均の大きさは、典型的には１ミクロン未満であり、３０〜６００ｎｍの範囲、および通常は約８０〜約１２０ｎｍまたは約１５０ｎｍ未満であり得る。油の液滴の大きさは、光子相関分光法によって計測し得る。典型的には、油の液滴の少なくとも約８０％は、所望の範囲内、または少なくとも約９０％あるいは少なくとも約９５％にすべきである。乳剤の油分の一部は、概して２〜１０％の範囲であり（例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％および約１０％）、約２〜約１０％のα−トコフェロール、および約０．３〜３％の界面活性剤等の抗酸化剤の一部である。好適には、より適した乳剤を提供するため、油：αトコフェロールの比率は１以下である。ソルビタントリオレエート（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）８５）は、約１％のレベルでも存在し得る。いくつかのケースでは、本発明のワクチンはさらに安定剤を含有することが有利であり得る。
【００６８】
水中乳剤内の油分を製造する方法が、当該技術の業者に公知である。通常、方法は、ホスファチジルコリン、ブロック共ポリマー、またはＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液等の界面活性剤と油相を混合し、ホモジナイザーを用いて均質化を行うことを含む。例えば、注射器針によって一度、二度またはより多くの回数、混合物を排出させることを含む方法は、少量の液体を均質化するために適している。同様に、マイクロフルイダイザーによる入荷プロセス（Ｍ１１０Ｓマイクロ流体力学装置、最大で５０回排出、最大圧力入力６バール（出力圧力約８５０バール）において２分間）は、より少量またはより多量の乳剤を製造するように適合できる。この適合は、必要な直径の油の液滴によって調製が実現されるまで、生成された乳剤の測定を含むルーティンの実験によって実現できる。乳剤を生成するために、他の装置またはパラメータも使用し得る。
【００６９】
スクアレンを使った例示的な水中油型乳剤が、「ＳＥ」として公知であり、α−トセラフォール（ｔｏｃｅｒａｐｈｏｌ）を有するアンモニウムリン酸緩衝液ｐＨ５．１内の界面活性剤として、スクアレン、グリセロール、ホスファチジルコリンまたはレシチンまたは他のブロック共ポリマーを含有する。ＤＳＬＰとしてＧＬＡが使用される場合、生成される組成物は、ＧＬＡ−ＳＥとも称される。かかる組成物を作製するために、ＧＬＡ（１００マイクログラム、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ、製品番号６９９８００）は、抗酸化剤として０．５ｍｇ  Ｄ，Ｌ−α−トコフェロールを選択的に使用する２５ミリモルアンモニウムリン酸緩衝液中に（ｐＨ＝５．１）、グリセロール（２２．７ｍｇ）、ホスファチジルコリンまたはレシチン（７．６４ｍｇ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）または同様のブロック共ポリマー（０．３６４ｍｇ）により、スクアレン（３４．３ｍｇ）において乳化される。混合物は、分離しない、１８０ｎｍ未満の平均粒子サイズを有する乳剤が形成されるまで、高圧で処理される。次いで、乳剤は、ガラス製の単回用量バイアルへと殺菌過され、より長期間の保存のために密閉される（ｃａｐｐｅｄ）。２〜８℃で保存される場合、少なくとも３年間、この調製を使用し得る。本明細書に記載されるように、ＤＳＬＰおよびタンパク質を含む他の油分含有組成物は、米国特許第５，６５０，１５５号、第５，６６７，７８４号、第５，７１８，９０４号、第５，９６１，９７０号、第５，９７６，５３８号、第６，６３０，１６１号、および第６，５７２，８６１号に記載されるように調製されたこれらの組成物と同様に調製し得る。
【００７０】
いくつかの特定の組成物およびワクチンは、プレパンデミックＨ５Ｎ１ウイルス由来のｒＨ５を含有する。ワクチンに適したｒＨＡの種々の形態が前述されているが、簡潔に言うと、これらは、全長ｒＨＡ、ｒＨＡの断片、ｒＨＡを含有する融合タンパク質、またはペプチドを含む。さらに、１つよりも多いｒＨＡを共に使用可能である、またはノイラミニダーゼ等の他のタンパク質と共に、組成物およびワクチン内にあってもよい。１つよりも多いｒＨＡ形態、またはｒＨＡ配列、あるいはその両方は、本発明の組成物に組み込まれてもよい。
【００７１】
ワクチン内のｒＨＡタンパク質の量は、典型的には、例えば約０．１μｇ〜約１５μｇの低用量である。この低用量は、０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、または１５μｇのいずれかのｒＨＡタンパク質であり得る。ｒＨＡタンパク質の低用量は、以下に詳述するように、有効性の国際的（例えば、ＥＵまたはＦＤＡ）基準に適合するワクチン製剤を可能にするならば、実際にできる限り低用量にし得る。用量は、典型的には、活性、意図される投与数、およびサイズならびに対象条件によって決定される。
【００７２】
タンパク質は溶液として提供し得るが、乾燥した（例えば、水分除去した）で形態提供することもでき、この場合、使用者は、必要な液体を添加する。典型的には、緩衝液、安定剤、保存剤、賦形剤、キャリア、および他の非活性材料等の添加剤も存在する。添加剤は、典型的には、薬学的に受容可能かつ生体適合可能である。
【００７３】
ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントを、溶液として提供する、水分除去または乳化する、適した水中油型乳剤として便利な方法で提供し得る。ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバントに加えて、アジュバント含有組成物は、緩衝液、安定剤、賦形剤、保存剤、キャリア、または他の非活性材料も含有し得る。添加剤は、典型的には薬学的に受容可能および生体適合可能である。本明細書の他の部分により詳細に記載されるように、さらなるアジュバントも存在し得る。これらのコアジュバントは、２’−５’オリゴＡ、細菌内毒素、ＲＮＡ二本鎖、単一のらせんＲＮＡ、リポタンパク質、ペプチドグリカン、フラジェリン、ＣｐＧＤＮＡ、リポ多糖、ＭＰＡ（モノホスホリル脂質Ａ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ、リポ多糖、ＱＳ２１（サポニン）、水酸化カリ明礬物（「カリ明礬」）および他の鉱物塩、油分乳剤（例えば、ＭＦ５９（登録商標）、Ｒ８４８および他のイミダゾキノリン、ウィロゾームおよび他の微粒子アジュバント（その全体が組み込まれる、Ｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ，“Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖｖａｃｃｕｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：１４１−２２８，１９９５を参照）を含む。
【００７４】
量ＤＳＬＰアジュバント、例えば、化学式（１）のアジュバント、例えば、ワクチンとして有用な抗原も含有する、本発明の組成物の用量に使用されるＧＬＡ（用量は、その必要とされる対象に投与される組成物の量）は、一実施形態では、約０．５μｇ〜約５０μｇであり、別の実施形態では、約１．０μｇ〜２５μｇであり、本発明の種々の他の実施形態では、約１μｇ、約２μｇ、約２．５μｇ、約５μｇ、約７．５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇまたは約２５μｇであり得る。用量内の組成物の全量は、典型的には、０．５ｍｌ〜１．０ｍｌの範囲である。ＳＥ等の乳剤は、組成物に存在してもよく、種々の実施形態において、乳剤の油分成分は、組成物の全量の約０．１％、約０．５％、約１．０％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約７．５％または約１０％を構成する。
【００７５】
ＤＳＬＰアジュバント、例えば化学式（１）のアジュバント、およびタンパク質は、別の容器で提供され、その場で混合されるまたは事前に混合され得る。加えて、タンパク質は、別の容器に存在し得る、または単一の容器に組み合わせ得る。容器は、バイアル、アンプル、管、または多重ウェル型装置のウェル、保有宿主、注射器またはいずれかの他の種類の容器にすることができる。容器または容器は、キットとして提供し得る。容器のうちの１つ以上が、水分除去材料を含有する場合、再構成のための液体は、キット内にも提供され得る、または使用者によって提供され得る。各容器内の溶液量または各容器に追加される量は、投与の経路および各容器内の用量に相応する。注射によって与えられるワクチンは、典型的には約０．１ｍｌ〜約１．０ｍｌであり、一方で、経口投与によるワクチンは、例えば、約１ｍｌ〜約１０ｍｌのより多い分量にし得る。適した分量は、対象の大きさおよび年齢に従って変動し得る。
【００７６】
組成物は、概して殺菌して提供される。典型的な殺菌方法は、ろ過、照射およびガス処理を含む。
【００７７】
２．投与
ワクチンは、皮内、粘膜（例えば、経鼻投与、経口投与）、筋肉内、皮下、舌下、直腸、膣内等の適した送達経路によって投与できる。他の送達経路も当該技術で公知である。
【００７８】
筋肉内投与経路は、ワクチン組成物の適した一経路である。適したｉ．ｍ．送達デバイスは、インシュリンまたはエピネフリンの送達のために自宅で自己注射で使用されるもの等の針および注射器、針のない注射デバイス（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ，Ｂｉｏｊｅｃｔ，ＯＲ  ＵＳＡ）、またはペンインジェクタデバイスを含む。皮内および皮下送達が、他の適した経路である。適したデバイスは、注射器および針、短い針の注射器、およびジェット注射デバイスを含む。
【００７９】
ワクチンは、粘膜経路によって、例えば経鼻投与的に投与され得る。多くの経鼻投与送達デバイスが利用可能であり、当該技術で公知である。噴霧デバイスが、かかるデバイスの一つである。経口投与は、対象に、飲み込むための溶液を提供するだけの簡単なものである。
【００８０】
単一の部位または複数の部位にワクチンを投与し得る。複数の部位における場合、投与の経路は各部位において同じであり得る（例えば異なる筋肉内の注射）、または異なり得る（例えば筋肉および鼻内噴霧内の注射）。さらに、単一の時点または複数の時点においてワクチンを投与し得る。概して、複数の時点で投与する場合、投与間の時間は、免疫反応を向上させるために決定されている。
【００８１】
病気または感染の症状を予防または低減させるために、有利な免疫反応に効果を及ぼすために十分な用量でワクチンが投与される。有利な反応の一指針は、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスの抗体の開発、特に、中和抗体の開発である。他の指針は、ウイルスに対するＣＤ８またはＣＤ４Ｔ細胞の増加した分量または機能あるいは頻度、およびウイルス感染の低減を含む。
【００８２】
ＥＬＩＳＡおよびウイルス感染（中和）アッセイの阻害を含む抗体を検出および定量化するために、多くの公知の手順が利用可能である。一実施例では、ＥＬＩＳＡアッセイは、ＨＡタンパク質で多重ウェルプレートのウェルをコーティングし、血清からプレートへＨＡ特異的抗体を捕捉する、標識が付けられる抗ヒト抗体を有するＨＡ特異的抗体を検出し、次に、標識の読み出しを行うことによって実施される。標識は放射性にすることができるが、より普通には、物質を比色分析で検出可能なものに変換する、ホースラディッシュのペルオキシダーゼ等の酵素である。
【００８３】
例示的なインフルエンザ中和アッセイは、感染性の阻害によって中和抗体が検出されるプラークアッセイに基づく。ウイルス中和試験は、非常に繊細なものであり、動物およびヒト内のインフルエンザウイルス特異的抗体を識別するための特定のアッセイである。中和試験は、次の２つの段階、つまり、（１）ウイルスが血清の希釈と混合され、ウイルスへの抗体結合を可能にするためにインキュベートされるウイルス抗体反応ステップ、および（２）混合物は、適正な宿主システムに接種される（例えば、ＭＤＣＫ細胞、孵化した卵、または動物等の細胞培養）接種ステップで実行される。細胞が使用される場合、ウイルス感染した細胞は、ミクロン中立化アッセイで次の日に検出される。細胞が固定され、感染した細胞内のインフルエンザＡウイルス核酸タンパク質（ＮＰ）の存在がＥＬＩＳＡによって検出される。ＮＰの検出は、その血清希釈における中和抗体の欠如を示す。感染性がないということは、陽性の中和反応を構成し、血清サンプル内のウイルス特異的抗体の存在を示す。（“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，”ＣＤＣ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ＬＰ−００４，Ｒ−２（Ｋ  Ｈａｎｃｏｃｋ）２００９年１０月１９日に有効）インフルエンザウイルスの他の中和試験は、ＭＤＣＫ細胞培養の細胞変性効果（ＣＰＥ）形成の阻害に基づく（Ｓｉｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｍｅｅ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．４８：１−１６、２０００を参照）。
【００８４】
別の公知のアッセイは、インフルエンザウイルスＨＡに対する免疫反応を査定する血球凝集阻害アッセイである。ウイルス表面上のＨＡタンパク質は、赤血球（赤血球、ＲＢＣ）を凝集させる。ＨＡの抗体がＨＡに結合する場合、凝集は阻害される。概して、ＨＡ抗原の標準化された分量が連続的に希釈された血清サンプルと混合され、赤血球が添加され、凝集の程度が査定される。血清内の凝集の非特定の阻害因子は、最初にＲＢＣ上の血清の吸収によって除去される（“Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｕｒｋｅｙ  ＲＢＣｓ，”ＣＤＣ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ＬＰ−００３，Ｒ−１（Ｋ  Ｈａｎｃｏｃｋ）２００９年１０月２日に有効）。
【００８５】
製造された抗体の型および亜型も、決定し得る。ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＧ亜型、ならびにＩｇＡを決定するためのアッセイが当該技術で公知である。通常使用されているアッセイは、ＥＬＩＳＡである。簡潔に言うと、マイクロタイタープレートは、抗原、例えばｒＨＡまたは活性化されていない完全ウイルスによってコーティングされる。タンパク質を含有する溶液内でのブロック後に（例えば、１％ウシ血清アルブミン）、血清サンプルの連続希釈がウェルに添加され、次に、免疫グロブリンイソ型特異の二次抗体で処理される。抗イソ型抗体は標識が付けられる、または標識抗体結合分子が添加される。標識の量が決定される。
【００８６】
プレパンデミックワクチンについてのＦＤＡに対する基準は、交差反応性である免疫を誘導するための能力であり、ワクチンが異なるクレードおよびサブ−クレードからの遺伝的に明確なウイルスに対する免疫を誘導することを意味する。交差再活性は、本明細書に記載される抗体アッセイのいずれかまたは当該技術で公知の他のアッセイによって試験できる。例示的なアッセイでは、血清は、免疫ＨＡを含有するウイルスを含む、多様なウイルスからのＨＡへの抗体について試験される。これらのアッセイについて、ＨＡタンパク質または完全ウイルス（好適には不活性化された）を使用可能である。
【００８７】
Ｔ細胞機能のアッセイは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）を含む。いくつかのサイトカインのためにサイトカイン製造を計測することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロファイルを確立できる特に、望ましいパターンは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２製造が増加し、ＩＬ−５およびＩＬ−４製造が減少することである。インターフェロン−γを検出するＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、候補ワクチンへのＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞反応を量子化するために幅広く使用される。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、固定化した抗体によって捕捉され、かつ、酵素結合された第２の抗体によって視覚化されるサイトカインのＥＬＩＳＡ検出抗原誘導分泌の法則に基づく。ＩＣＳは、Ｔ細胞表面分子の抗体またはＭＨＣクラス分子を結合させるペプチド等の、作動薬による刺激後にサイトカイン発現によって細胞傷害Ｔ細胞による定量化のために通常使用される方法である。ＩＣＳおよびＥＬＩＳＰＯＴの例示的な手順を、以下の実施例に記載する。
【００８８】
抗原特異的Ｔ細胞機能も計測可能である。共にＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦを発現させるインフルエンザ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、単一のサイトカインを製造する細胞に対して可能性のあるより良い機能活性および共刺激を有する。このため、複数のサイトカイン製造ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導が望ましい。抗原特異的Ｔ細胞刺激アッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、およびフローサイトメトリーによるその組み合わせを製造するＣＤ４Ｔ細胞の頻度を推定するために使用し得る。このアッセイへのＩＬ−５の追加は、Ｔｈ２ＣＤ４＋細胞に対してＴｈ１を区別するために使用できる。予防接種後３、６、１２、および２４週の経時変化による実験が、長期にわたるＴ細胞反応を決定するために実施される。フローサイトメトリーは、エフェクター記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＥＭ：ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＣＲ７−ＩＦＮγ＋）および中央記憶ＣＤ４Ｔ（ＴＣＭ：ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＩＬ２＋ＩＦＮγ＋／−）細胞の生成を計測および区別するために使用することもできる。ＩＦＮγ、ＴＮＦおよびＩＬ−２の製造を誘導し、ＣＤ４ＣＭを増加させるワクチン製剤が望ましい。細胞傷害ＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらに、ウイルス負荷を除去し、病気の進行を制限する役目を果たす。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を引き出すワクチンが望ましい。
【００８９】
一態様において、本発明は、ウイルスに接触する可能性があるヒト集団にプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスの予防接種を行う方法を提供する。本方法は、薬学的組成物の一回の注射を投与することを含み、ここで、この一回の注射により、一回の注射を受ける集団の少なくとも５０％に血清変換が実施される。薬学的組成物は、（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザのウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、（ｂ）ＤＳＬＰアジュバントであって、該アジュバントは、例えば、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有する、ＤＳＬＰアジュバントと、を含有し、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、還元末端の６’位の炭素に結合され、二糖は、非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する。種々の実施形態において、組成物は乳剤を含まない、または油、例えばスクアレンを含まない。オイルフリーの組成物は、医療従事者から、副作用を引き起こしにくいと考えられている。例えば、乳剤は、油分が存在する場合、ワクチンは、注射を受ける対象に刺激および痛みを生じさせる可能性があるという点で、ワクチン組成物を反応原性にする傾向があることに懸念が高まっている。乳剤フリーの組成物の別の利点は、典型的な使用において、ワクチン組成物は２つの成分、つまり、抗原含有組成物およびアジュバント含有組成物から作成され、最終的なワクチンを調製するためにこれらの２つの組成物が混合される。組成物のそれぞれの安定性は、好適には、長期にわたって高い。アジュバントまたは抗原のキャリアとしての乳剤の一つの問題は、乳剤が、長期にわたり安定しない傾向がある、またはそれらの安定性を維持するために特別な条件または化学物質を必要とするということである。本発明は、一実施形態では、良好な安定性および良好な有効性をもたらす、オイルフリーの（例えば乳剤を含有しない）組成物を提供する。好適な実施形態において、ＤＳＬＰアジュバントはＧＬＡであり、より好適には、ある期間において保存可能な、オイルフリーのキャリア内のＧＬＡ（または他のＤＳＬＰアジュバント）（例えば、アジュバントおよび界面活性剤のみで構成される凍結乾燥された形態、例えば、リン脂質）であり、次いで、効果的なワクチンを提供するためにキャリアおよび抗原と混合される。
【００９０】
ワクチンの他の望ましい態様は、用量および投与量を節約する性質を含む。投与量の節約とは、所望のまたは効果的な免疫反応をさらに上げるために人に投与され得る通常よりも少ない用量である。用量の節約は、そうでなければ所望のまたは効果的な免疫反応を上げるためにより少ない量の抗原が必要であることを意味する。用量および投与量の節約は、ヒトにおいて鳥類または豚ウイルスのＨＡをもたらす弱い免疫反応等の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対するワクチンの開発に関連付けられる技術的な問題を克服することを意味する。以前のパンデミックインフルエンザワクチンの開発中に、大きな多中心トライアルにより、ヒトの５４％のみが予防されていれば、２８日の間隔で、９０μｇのＨ５の注射を二回行うべきであることがわかっている（Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５４：１３４３−１３５１，２００６）。世界中において、現在、所望の期間内に、９０μｇの注射を二回投与されるパンデミックインフルエンザのワクチンは、７千万分の用量のみを製造可能であると推定されている（Ｐｏｌａｎｄ，Ｇ．Ａ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５４：１４１１−１４１３，２００６）。好適なワクチン製剤は、（用量または投与量の節約によって血清変換を実行するための）ワクチン接種に必要なタンパク質量を減少させる。
【００９１】
本明細書に記載されるアッセイのいずれかを、用量および／または投与量節約を検証するために使用可能である。用量および投与量の節約を検証するための例示的なアッセイは、ワクチン接種に対する血清抗体反応を測定する血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイである。ＦＤＡは、４０以上のＨＡＩ力価が、自然の感染からの防御を予測するための適した免疫学的パラメータであることを述べるパンデミックインフルエンザワクチンの評価ガイドラインを確立している（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ２００７  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ：季節性不活性化インフルエンザワクチンの免許下付のサポートに必要な臨床データを参照）。本明細書に記載されるように、４０以上のＨＡＩ力価を有するヒトは、血清変換を実行したヒトと考えられる。抗原の例示的な用量は、一回、つまり一度だけ、抗原製剤がワクチン投与された個人の約５０％における、約４０のＨＡＩ力価を実現するために効果のあるワクチン製剤内の抗原の量である。抗原の別の例示的な用量は、抗原製剤で一回ワクチン投与された個人の約７０％における、約４０のＨＡＩ力価を実現するために効果的なワクチン製剤内の抗原の量である。抗原の別の例示的な用量は、抗原製剤で一回ワクチン投与された個人の約８０％において約４０のＨＡＩ力価を実現するために効果的なワクチン製剤内の抗原の量である。
【００９２】
本明細書に記載される薬学的組成物、ワクチン組成物、およびキットは、インフルエンザ感染を防止または予防する、または感染後の病気の治療のために、個人に投与され得る。投与は、プレパンデミックの段階またはパンデミック時に実施され得る。
【００９３】
本組成物を受ける対象は、病気または死んだ動物（例えば鳥（Ｈ５Ｎ１ウイルス））と身近に接触するまたは身近に接触する可能性がある人々、パンデミックの「対処の」ために選択された集団、子供、年配者、妊婦、特定の慢性病または免疫抑制症状を抱える人々等の高リスクの個人、および理想的には世界人口を含む。
【００９４】
インフルエンザは、単一の用量（例えば、注射）としてまたは複数の用量としての組成物の投与によって回避し得る。複数の用量が投与される場合、ある時間間隔後に、概して、二回目および以降の用量が投与される。多くの場合、初期の用量の投与は、免疫反応の「準備刺激」と呼ばれ、以降の用量の投与は、免疫反応の「追加免疫」と呼ばれる。より短いまたはより長い期間も使用し得るが、典型的には、第１および第２の投与の間の期間は少なくとも２週間である。前の投与後少なくとも２−４週間でさらなる用量が投与され得る、また、いくつかのケースでは、前の用量後、長期間の後（例えば、１年）で、投与され得る。インフルエンザ感染後の用量の投与は、疾患の治療上、役立つ。
【００９５】
パンデミックウイルスのＨＡ配列は泳動することができるため、および、プレパンデミック段階において、可能性のあるウイルスのどれがパンデミックかがわかっていないため、関連するウイルスに対して幅広い範囲を提供するワクチンを投与することが望ましい。本明細書に示すように、関連するウイルスの抗体は、あるｒＨＡタンパク質の投与から得られた。幅広い範囲を得るための別の方法は、あるｒＨＡで刺激し、異なるｒＨＡで追加免疫することであってもよい。
【００９６】
組成物は、他の抗ウイルス性薬剤と共に投与し得る。抗ウイルス性薬剤は、ウイルスの増殖阻止に直接作用する薬、ドラッグ、ハーブ等である。いくつかの公知の抗ウイルス性薬剤は、タミフル（登録商標）（オセルタミビル）、アマンタジン（シンメトレル（登録商標））、リマンタジン（フルマジン（登録商標））、ザナミビル（リレンザ（登録商標））、ペラミビル、ラニナミビルを含む。他のノイラミニダーゼ阻害因子およびＭ２阻害因子も利用可能であり得る。組成物と共に中国漢方も投与され得る。他の薬剤は、咳用シロップ等の症状を治療するものを含み、アスピリン、イブプロフェン等のＮＳＡＩＤも提供され得る。
【００９７】
例示として以下の実施例を示すが、これらに制限されない。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
マウスにおける一回の注射のＲＨ５／ＧＬＡ−ＳＥインフルエンザワクチンの有効性
この実施例は、組換えインフルエンザＨ５（ｒＨ５）タンパク質による一回のワクチン接種により、Ｈ５Ｎ１ウイルスの高い力価で攻撃されたマウスの予防的抗ウイルス免疫反応を効果的に刺激できることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（５／群）を、ｒＨ５タンパク質（Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３由来、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴから販売されている）のみ、またはＧＬＡ−ＳＥアジュバントで処方した、増加する量（０、５０、１５０、４５０、９００、または２７００ｎｇ）のｒＨ５タンパク質（２０μｇの２％ＳＥのＧＬＡ）を、一回、筋肉内に（ＩＭ）注射した。マウスを、１４日後に、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３（１０００×ＬＤ５０）の経鼻投与により攻撃した。毎日、マウスの体重減少をモニターし、体重の減少が２０〜３０％よりも多い場合には安楽死させた。アジュバントがないｒＨ５を接種された全てのマウスは、ウイルス攻撃後に自然に死んだか（２５匹中１８匹）、または高い疾病率を示し、安楽死させられた（２５匹中７匹）ため、ｒＨ５タンパク質のみによるワクチン接種は予防免疫を提供しなかった。しかしながら、最も低用量のｒＨ５タンパク質の投与であっても、ｒＨ５＋ＧＬＡ−ＳＥアジュバントでワクチン投与された全てのマウスは生き残った（２５匹中２５匹）。これらの結果から、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントが処方されている場合、組換えサブユニットインフルエンザワクチンの一回の注射で、マウスに予防免疫をもたらし得ることがわかる。この予防免疫は、抗原用量を５０倍低下させた場合でも観察された。
【００９９】
ｒＨ５ワクチンにＧＬＡアジュバントを添加する利点は、ウイルス攻撃後にワクチン投与されたマウスの体重減少を精査することにより、さらに高まった。Ｂａｌｂ／ｃマウス（５／群）に、ｒＨ５タンパク質のみの増加する量（０、５０、１５０、４５０、９００、または２７００ｎｇ）、または、２０μｇのＧＬＡ−ＳＥアジュバントまたはＳＥ乳剤のみ（１００μＬの２％溶液）で処方されたｒＨ５タンパク質を、一回、注射した。マウスは、１４日後にＨ５Ｎ１ベトナム１２０３（１０００×ＬＤ５０）で攻撃され、攻撃後１４日目に体重を測定した。ｒＨ５タンパク質のみでワクチン投与されたマウスはウイルス攻撃後に大きく体重が減少し、最も高用量をワクチン投与したものであっても、回復することなく死んだ。対照的に、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントが処方されたｒＨ５タンパク質をワクチン投与した全てのマウスは、ウイルス攻撃後も生き残り、以前の体重まで増加した。ＳＥ乳剤のみで処方されたｒＨ５タンパク質がワクチン投与されたマウスも、ウイルス攻撃から回復し、体重が増加した。
【０１００】
これらの２つの群の間の回復の差を定量化するために、全ての群における、１４日間の試験期間にわたる平均体重変化割合を、２週間の試験期間における毎日の体重変化を表す曲線下の領域を計測することにより、計算した。図１Ａにこれらの値を表す棒グラフが示され、これは、ＧＬＡ−ＳＥが処方されたｒＨ５が接種されたマウスが、ＳＥ乳剤のみが処方されたｒＨ５処方が接種されたマウスよりも、体重減少が大幅に小さいことを示す。これらの結果は、ＧＬＡアジュバントが処方されたｒＨ５が、全ての抗原用量において優れた予防効果を誘導することを示す。このため、ｒＨ５タンパク質へのＧＬＡアジュバントの添加によって、マウスの一回の低用量注射として投与される場合に予防免疫を確立する、大幅に改善したワクチンが得られる。これらの結果は、ＧＬＡアジュバントの処方が、組換えタンパク質ベースのパンデミックインフルエンザのワクチン開発に関連付けられた攻撃のうちのいくつかに対する効果の高い可能性のある溶液を提供する、すなわち、一回のワクチン注射のみで予防免疫が確立される、抗原免疫原性の増強を示唆する。ワクチンの用量節約は、考えられるインフルエンザパンデミックの備えにおける、公的医療機関の緊急の優先事項である。
【０１０１】
ＧＬＡアジュバントで構成されるｒＨ５ワクチンの改善した性質が、ウイルス攻撃後のワクチン投与されたマウスにおける動態学的体重変化を計測することにより、さらに精査された。上記のように、Ｂａｌｂ／ｃマウス（５／群）に、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントまたはＳＥ乳剤のみに処方された５０ｎｇのｒＨ５タンパク質が、一回、注射され、次いで、１４日後に、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３（１０００×ＬＤ５０）で攻撃された。対照として、マウスに、ｒＨ５タンパク質がない、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントまたはＳＥ乳剤がワクチン投与された。マウスについて、ウイルス攻撃の翌日以降、毎日、体重測定をし、攻撃前のマウスの体重に対する体重減少（％）が決定された。この攻撃モデルにおいて、予防接種を行っていない、無処置のマウスは、急速な体重減少が見られた後で死亡することによって裏付けられるように、ウイルス攻撃から回復していない。図１Ｂに示されるように、それらの体重は、最初に、予防接種を行っていない、対照群で観察されるものと同一の割合で減少したため、ウイルス攻撃で生き残った全てのマウスは感染の症状を示していた。しかしながら、ウイルス攻撃後１０〜１２日目に、ワクチン接種前レベルに戻った体重増加によって示されるように、ＧＬＡ−ＳＥが処方されたｒＨ５を予防接種されたマウスはウイルス攻撃から回復した。ＳＥ乳剤のみが処方されたｒＨ５を予防接種去れたマウスも回復したが、それらの回復率は、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントで処方されたｒＨ５がワクチン投与されたマウスで観察されるものに対して、大幅に遅かった。ＧＬＡ−ＳＥアジュバントまたはＳＥ乳剤のみが予防接種されたマウスは、無処置のマウスのものと同様にウイルス性攻撃に反応したことから、この予防効果はｒＨ５タンパク質に依存していた。重要な点として、これらのデータは、一回の注射の有効性の向上、低用量ｒＨ５ワクチンが、ｒＨ５タンパク質およびＧＬＡアジュバントの組み合わせられた活性に依存することを示す。
ＧＬＡアジュバント注に処方されたｒＨ５ワクチンの改善した有効性に必要な要素をさらに定義するために、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントのみ、ｒＨ５タンパク質＋ＳＥのみ、ｒＨ５＋ＧＬＡのみ、またはｒＨ５＋ＧＬＡ−ＳＥをワクチン投与したマウスにおいて、体重変化の動態を測定した。図１Ｃに示されるように、予防接種をしていない対照マウスおよびｒＨ５タンパク質がないＧＬＡ−ＳＥの予防接種が行われたマウスは、体重が劇的に減少し、上述のように、ウイルス攻撃後に死んだ。対照的に、ｒＨ５およびＧＬＡ−ＳＥの組み合わせで予防接種を行ったマウスは、ウイルス攻撃から回復し、完全に体重が戻った。ＳＥのみまたはＧＬＡのみが処方されたｒＨ５の予防接種を行ったマウスも回復したが、これらの２つの群で観察される回復率は、ｒＨ５＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンを接種されたマウスの回復率に対して大きな遅れがある。これらのデータは、ＳＥ乳剤内のｒＨ５およびＧＬＡアジュバントの組み合わせが、いずれかの個々の成分の性質に対し、優れた性質を示すことを示す。
【０１０２】
（実施例２）
一回の注射として投与される場合に、ＲＨ５／ＧＬＡ−ＳＥインフルエンザワクチンはマウスにおける均質免疫をもたらす
この実施例では、不均質なウイルス攻撃に対する、ＧＬＡアジュバントが処方された組換えワクチンの予防有効性が示された。これらの実験で、マウスは、Ｈ５Ｎ１インドネシア（クレード２．３）から分離されたｒＨ５タンパク質分離株の一回の注射によって予防接種が行われ、次に、上記のようにＨ５Ｎ１ＶＮウイルスの攻撃が行われた。陽性対照として、マウスは、Ｈ５Ｎ１ベトナムからの同種のｒＨ５タンパク質がワクチン投与され、一方で、陰性対照として、マウスは、ＨＳＶ−２ウイルス性タンパク質（ｒＧ０１３）でワクチン投与された。表１に示されるように、タンパク質／アジュバントの処方に関係なく、ＨＳＶ−２タンパク質がワクチン投与されたマウスは全て死んだ。５０ｎｇの同種のｒＨ５ＶＮタンパク質のみがワクチン投与されたマウスは全て死んだが、一方で、以前の所見と同様に、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントが処方されたｒＨ５ＶＮをワクチン投与されたマウスは、全て生き残った。重要な点として、ＧＬＡ−ＳＥが処方された５０ｎｇまたは２００ｎｇの不均質ｒＨ５Ｉｎｄｏタンパク質を接種されたマウスは全て生き残り、ＧＬＡ−ＳＥが交差クレード予防免疫を効果的に増大させることが示された。興味深いことに、投与された最低量の用量のｒＨ５  Ｉｎｄｏ（５０ｎｇ）において、ＳＥのみを有するタンパク質の処方は、ウイルス攻撃からマウスを保護できず（マウスは一匹も生存しなかった）、一方で、ＳＥ乳剤がないＧＬＡの処方は、マウス（２／５）の４０％において防御を示した。
【０１０３】
【表１】
2013522231.tif 000005
図２に示されるように、さらに、ウイルス攻撃後に、体重減少の回復がモニターされた場合に、ＧＬＡアジュバントを処方された場合の改善した有効性ｒＨ５Ｉｎｄｏワクチンが観察された。以前の実験で観察されるように、ｒＨ５タンパク質のみがワクチン投与されたマウスはウイルス攻撃から回復せず、一方で、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントが処方されたｒＨ５を接種されたマウスは、急速に回復し、攻撃前のレベルに体重が戻った。ＧＬＡ−ＳＥアジュバント中に処方された不均質ｒＨ５  Ｉｎｄｏタンパク質がワクチン投与されたマウスは、さらに、組換えタンパク質の用量に依存した動態で、迅速に回復した。こうして、ＧＬＡ−ＳＥは、同種および不均質組換えインフルエンザワクチンの両方の有効性を向上させる。用量および投与量を節約するワクチンによる交差クレード予防免疫の確立は、候補パンデミックインフルエンザワクチンの特に有利な性質である。
【０１０４】
（実施例３）
ＧＬＡ−ＳＥがマウスの抗原特異的免疫の確立を促進する
この実施例は、予防接種後、毎日、インフルエンザウイルスでマウスを攻撃することにより、マウス予防モデルの免疫を確立させるための一時的な要件を示す。上述のように、マウスは、ＳＥのみまたはＧＬＡ−ＳＥアジュバントが処方された低用量のｒＨ５タンパク質の一回の注射でワクチン投与された。対照として、マウスは、ｒＨ５タンパク質またはＧＬＡ−ＳＥのみがワクチン投与された。マウスは、ワクチン接種後の、様々な日数後（０、２、４、６、８、１０、または１２日目）に攻撃され、１４日目後に生存率が判断された。図３Ａに示されるように、ＧＬＡアジュバントで処方されたｒＨ５タンパク質は、ワクチン接種後４〜６日目以内に予防免疫を確立した。予想されたように、これらの成分のいずれも持たないワクチンを接種されたマウスは全て死んだことから、この効果は、組換えタンパク質およびＧＬＡ−ＳＥの両方に依存していた。この群における予防免疫の獲得は、ｒＨ５＋ＧＬＡ−ＳＥ群で観察されたものに対して、一日以上遅れがあったが、ＳＥのみに処方されたｒＨ５を接種されたマウスは、ウイルス攻撃からの予防効果を示した。
【０１０５】
以下に記載するように、体重減少の動態が、予防接種後６日目または１４日目のいずれかにウイルスによって攻撃されたマウスにおいて、計測された。図３Ｂに示されるように、予防接種後６日目にマウスが攻撃された場合、ｒＨ５＋ＳＥ乳剤のみの群は、ｒＨ５＋ＧＬＡ−ＳＥアジュバントを接種された群と比べて、より体重減少が大きかった。群の間で観察されるこの差は、ワクチン接種後１４日目に対する攻撃の遅れについて、小さくならなかった（図３Ｂを参照）。これらのデータは、ＧＬＡアジュバント内に処方されたｒＨ５によるワクチン接種がウイルス攻撃後の体重減少の低下につながるだけではなく、マウスの回復を大幅に短縮させる。全体的な健康において同様の傾向が、臨床スコア方法（図３Ｃを参照）を用いて観察された。ｒＨ５＋ＧＬＡ−ＳＥで治療されたマウスは、ワクチン接種の時期に関わらず、ｒＨ５＋ＳＥのみの群よりも病状が軽く、より早く回復したようであった。このように、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントは、ＳＥ乳剤のみに対する抗原特異的免疫の確立を促進する。予防免疫を迅速に誘発するための用量および投与量を節約する組換えワクチンの能力は、パンデミックインフルエンザワクチンの非常に望ましい性質であり、予期しなかった幅広く迅速なウイルス性感染に対して効果的である。
【０１０６】
（実施例４）
ＧＬＡ−ＳＥ内に処方されたＲＨ５タンパク質によるワクチン接種により、マウスについて非常に恒久的な防御免疫を確立する
この実施例では、低用量の同種（ｒＨ５ＶＮ）または不均質（ｒＨ５Ｉｎｄｏ）抗原で一回、マウスに予防接種を行い、４６日目にＨ５Ｎ１ＶＮでウイルス攻撃を行うことにより、アジュバント依存防御の永続性が評価された。表２に示されるように、ＧＬＡアジュバントが処方された組換えＨ５抗原をワクチン投与された全てのマウスが、ワクチン接種が同種または不均質のどちらのｒＨ５タンパク質に由来するかに関わらず、ワクチン接種後４６日目において、ウイルス攻撃後も生き残っていた。さらに、図４およびＢに示されるように、この群のマウスは、ウイルス攻撃から非常に迅速に回復し、体重減少はほとんどなかった。図４Ｃは、これらの群のウイルス負荷量も低下していることを示す。重要な点として、これらの結果は、低用量のｒＨ５タンパク質およびＧＬＡアジュバントの組み合わせで構成されたワクチンが、マウスのインフルエンザウイルスに対する効果的かつ恒久的な交差クレード防御をもたらすことを示す。
【０１０７】
【表２】
2013522231.tif 000006
（実施例５）
フェレットにおけるＲＨ５／ＧＬＡ−ＳＥインフルエンザワクチンの一回の注射の有効性
この実施例に記載されている実験は、インフルエンザワクチン開発の適した臨床前宿主である、フェレットの低用量ｒＨ５ワクチンの一回の注射によって、予防免疫が確立されるかどうかを説明する。６〜１２か月のオスのケナガイタチ（Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆ  Ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）を、全ての実験で使用した。接種前、全てのフェレットは、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）アッセイにより、流行している季節性インフルエンザ（インフルエンザＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびインフルエンザＢ）について血清学的に陰性であることが確認された。全ての実験で、フェレットは、Ｄｕｏ−Ｆｌｏ  Ｂｉｏｃｌｅａｎ移動式クリーンルーム内に閉じ込められたケージに収容された（Ｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）。感染前のおよそ３日間、毎日、基礎血清、体温および体重のデータが取られた。体温は、皮下移植可能体温トランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅａｆｏｒｄ  ＤＥ）を使用して計測された。フェレット（群につき４匹）に、それのみまたはアジュバントと共に、０．５μｇのｒＨ５ＶＮが一回、ワクチン投与され、次いで、ワクチン接種後２８日目にＨ５Ｎ１ＶＮで攻撃された。全量１ｍｌの、Ａ／ＶＮ／１２０３／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスの７．５×１０５ＰＦＵが、フェレットに対し、鼻腔内に接種された。感染後１日目に開始し、７日間継続して、２４時間毎に、全てのフェレットから鼻腔器具（Ｎａｓａｌ  ｗａｓｈ）が回収された。神経的症状がみられる、または瀕死の状態であると判断される、０日目に体重の２５％以上が減少したフェレットは、人道的に安楽死させられた。表３に示されるように、ｒＨ５、さらにＳＥ、ＧＬＡ、またはＧＬＡ−ＳＥを接種された全てのフェレットはウイルス攻撃に対して生き残り、一方でアジュバントがないｒＨ５タンパク質またはインフルエンザ抗原がないのＧＬＡ−ＳＥアジュバントのワクチン接種は、全てのフェレットをウイルスから保護することができなかった。ウイルス攻撃後の体重減少の動態が計測された際、ｒＨ５のみまたはＳＥ乳剤中に処方されたｒＨ５（図Ａ５を参照）がワクチン投与されたフェレットとは対照的に、ＧＬＡアジュバントが処方されたｒＨ５ワクチンがワクチン投与されたフェレットでは体重の減少はほとんどないことが観察された。この動物モデルにおいて、フェレットにおけるｒＨ５＋ＧＬＡワクチンの最適な有効性のために、ＳＥ乳剤は不要であるように考えられる。この傾向は、図５Ｂに示されるように、各群の臨床スコアが決定された際に要約された。ＧＬＡアジュバント内に処方されたｒＨ５を接種されたフェレットは、ｒＨ５のみを接種されたフェレットとは対照的に、臨床観察に基づいて正常であると考えられる。総じて、これらの結果から、ＧＬＡアジュバントを含有する低用量ｒＨ５ワクチンの一回の注射が、フェレットのＨ５Ｎ１感染を効果的に予防していることが示される。このように、一回の注射の有効性を大幅に向上させるＧＬＡアジュバントの能力、低用量の組換えＨ５ワクチンが、防御免疫の２つの異なる動物モデルにおいて示されている。
【０１０８】
【表３】
2013522231.tif 000007
上記の記述から、例示のために特定の実施形態が本明細書に記載されているが、発明の精神および範囲を逸脱しない限り、種々の修正を行い得ることが理解されよう。従って、本発明は、添付される請求項による場合を除いて、制限されるものではない。
【図１Ｂ】
2013522231.tif 000008
【図１Ｃ】
2013522231.tif 000009
【図２】
2013522231.tif 000010
【図３Ｂ】
2013522231.tif 000011
【図３Ｃ】
2013522231.tif 000012
【図４Ｃ】
2013522231.tif 000013
【図５Ａ】
2013522231.tif 000014
【図５Ｂ】
2013522231.tif 000015
【図１Ａ】
2013522231.tif 000016
【図３Ａ】
2013522231.tif 000017
【図４Ａ】
2013522231.tif 000018
【図４Ｂ】
2013522231.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月13日(2012.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスに対する免疫化を必要としている対象に、免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物であって、前記組成物は、
（ａ）インフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、
（ｂ）アジュバントであって、前記アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、前記非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、前記還元末端の６’位の炭素に結合され、前記二糖は、前記非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、前記エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、前記脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有し、前記組成物は、投与量を節約する、アジュバントと、を含有する、薬学的組成物。
【請求項２】
薬学的組成物であって、
（ａ）インフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、
（ｂ）アジュバントであって、前記アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、前記非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、前記還元末端の６’位の炭素に結合され、前記二糖は、前記非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、前記エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、前記脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する、アジュバントと、
を含有し、前記薬学的組成物の一回の注射によって、インフルエンザウイルスに対する免疫化を必要としている対象に、免疫化を行う方法で使用するための、薬学的組成物。
【請求項３】
一用量当たりの前記ｒＨＡ量は、約１５〜約０．１μｇの範囲である、インフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための請求項１〜２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
一用量当たりの前記ｒＨＡ量は、約１０〜約０．５μｇの範囲である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
一用量当たりの前記ｒＨＡ量は、約５〜約１μｇの範囲である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
インフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための請求項１、２または３のいずれか一項に記載の薬学的組成物であって、前記アジュバントはＧＬＡであり、前記ｒＨＡは、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに由来するｒＨ５である、組成物。
【請求項７】
Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、およびＨ３Ｎ２、鳥インフルエンザ、Ｈ５、Ｈ５  クレード１、Ｈ５  クレード２、Ｈ５  クレード４、およびＨ５  クレード７ウイルスからなる群から選択されるインフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記インフルエンザは、Ｈ５である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ｒＨＡは、アジュバントがない場合は防御免疫を提供しない濃度で存在する、インフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、単一の組換えタンパク質を含有する、インフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための請求項３〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
インフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための請求項３〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物であって、前記組成物は、第二のインフルエンザウイルス由来のｒＨＡタンパク質を含む、組成物。
【請求項１２】
前記組成物の投与は、前記一回の注射後に集団の少なくとも５０％に血清転換を実現する、請求項２または３に記載のインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項１３】
前記組成物は乳剤を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は油分を含まない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【請求項１５】
前記アジュバントはＧＬＡである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
別の実施例として、発明は、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する免疫化を必要としている対象に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物を提供し、（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、（ｂ）アジュバントであって、アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、還元末端の６’位の炭素に結合され、二糖は、非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有し、組成物は、用量を節約する、アジュバントと、を含有する。対象者にプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスの免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物、ｒＨＡは、用量を節約する量で存在する。個別にまたはいずれかの組み合わせで発明をさらに定義する種々の実施形態において、ｒＨＡは、アジュバントがない予防免疫を提供しない濃度で存在し、単一の、つまり１つ以下の組換えタンパク質を含有し、一用量のｒＨＡ量は約１５〜約１μｇの範囲であり、アジュバントはＧＬＡであり、ｒＨ５はＨ５Ｎ１インフルエンザの病原性株に由来する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
薬学的組成物であって、
（ａ）プレパンデミック（世界的流行前）またはパンデミック（世界的に流行している）インフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、
（ｂ）アジュバントであって、前記アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、前記非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、前記還元末端の６’位の炭素に結合され、前記二糖は、前記非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、前記エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、前記脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有する、アジュバントと、
を含有し、前記薬学的組成物の一回の注射によって、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する免疫化を必要としている対象に、免疫化を行う方法で使用するための、薬学的組成物。
（項目２）
前記組成物の投与は、前記一回の注射後に集団の少なくとも５０％に血清転換を実現する、項目１に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目３）
前記組成物は乳剤を含まない、先行する項目のいずれか１項に記載の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目４）
前記組成物は油分を含まない、先行する項目のいずれか１項に記載の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目５）
前記アジュバントはＧＬＡである、先行する項目のいずれか１項に記載の、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、集団に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目６）
プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対する免疫化を必要としている対象に、免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物であって、前記組成物は、
（ａ）プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスからの組換え赤血球凝集素（ｒＨＡ）と、
（ｂ）アジュバントであって、前記アジュバントは、グルコシルおよびアミノ置換グルコシルからそれぞれ独立して選択される還元末端および非還元末端を有する二糖を含有し、前記非還元末端の１位の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを介して、前記還元末端の６’位の炭素に結合され、前記二糖は、前記非還元末端の４’炭素を介してリン酸基へ、かつ、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）および／またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）結合を介して、複数の脂質基へ結合され、前記エステルまたはアミド結合のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）基は、前記脂質基に直接結合され、各脂質基は、少なくとも８つの炭素を含有し、前記組成物は、投与量を節約する、アジュバントと、を含有する、薬学的組成物。
（項目７）
前記ｒＨＡは、用量を節約する量で存在する、項目６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目８）
前記ｒＨＡは、アジュバントがない場合は防御免疫を提供しない濃度で存在する、項目６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目９）
前記組成物は、単一の組換えタンパク質を含有する、項目６〜８のいずれか１項に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目１０）
一用量当たりの前記ｒＨＡ量は、約１５〜約１μｇの範囲である、項目６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
（項目１１）
前記アジュバントはＧＬＡであり、前記ｒＨ５はＨ５Ｎ１インフルエンザの病原性株に由来する、項目６に記載のプレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルスに対して、対象に免疫化を行う方法で使用するための薬学的組成物。
【国際調査報告】
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