(57)【要約】本発明は、改変酵母宿主細胞、例えばピキア・パストリスにおいて、より高い力価の組換えタンパク質の産生方法であって、改変酵母細胞が、同じ種の未改変酵母宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該方法に関する。特定の実施形態においては、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログコードする遺伝子の欠失又は破壊によって、液胞選別輸送活性が低下又は喪失する。本発明は、本明細書に開示の方法により改変される改変酵母細胞にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ピキア・パストリス細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低いピキア・パストリス細胞であって、前記宿主細胞が、液胞タンパク質選別輸送受容体１０−１（ＶＰＳ１０−１）の機能欠失を含む、ピキア・パストリス細胞。
【請求項２】
異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項１に記載のピキア・パストリス細胞。
【請求項３】
前記異種タンパク質が糖タンパク質である、請求項２に記載のピキア・パストリス細胞。
【請求項４】
グリコシル化パターンがヒト様である糖タンパク質を発現するように改変される、請求項３に記載のピキア・パストリス細胞。
【請求項５】
ＶＰＳ１０−１をコードする遺伝子が欠失し、ＶＰＳ１０−２をコードする遺伝子が欠失していない、請求項１〜４のいずれか一項に記載のピキア・パストリス細胞。
【請求項６】
ＶＰＳ１０−１をコードする遺伝子が、前記コードされたＶｐｓ１０−１タンパク質の液胞選別輸送活性が、非機能性となる又は活性を有さないようにする変異を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のピキア・パストリス細胞。
【請求項７】
Ｖｐｓ１０−１活性の前記機能欠失が、前記ＶＰＳ１０−１遺伝子の上流又は下流制御配列欠失又は破壊、Ｖｐｓ１０−１タンパク質の化学的、ペプチド、又はタンパク質阻害剤による液胞選別輸送活性の阻害、核酸系発現阻害剤による液胞選別輸送活性の阻害、並びに転写阻害剤による液胞選別輸送活性の阻害からなる群から選択される変化を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のピキア・パストリス細胞。
【請求項８】
酵母又は真菌の宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、
ａ．遺伝子操作した酵母又は真菌細胞を、前記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、前記遺伝子操作した酵母又は真菌細胞が、同じ種の未改変の酵母又は真菌の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、
ｂ．発酵条件下で前記タンパク質の発現が誘導される条件における培地中で、前記形質転換した酵母又は真菌の宿主細胞を培養するステップと、及び
ｃ．前記タンパク質を、前記形質転換した宿主細胞又は培地から単離するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
前記酵母又は真菌の宿主細胞が、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニガー、シゾサッカロミセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、ピキア・スチピチス、デバリオマイセス・ハンセニイ、クルイベロミセス・ラクチス、及びハンゼヌラ・ポリモルファからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母又は真菌細胞のゲノムからのＶＰＳ１０又はＶＰＳ１０ホモログをコードする遺伝子を欠失又は破壊によって、液胞選別輸送活性が喪失又は低下している、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母又は真菌の宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＶＰＳ１０ホモログＶＰＳ１０−１が欠失している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ピキア宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、
ａ．遺伝子操作したピキア細胞を、前記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、前記遺伝子操作したピキア細胞が、同じ種の未改変ピキア細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、
ｂ．前記タンパク質の発現が誘導される条件下における培地中で、前記形質転換されたピキア宿主細胞を培養するステップと、
ｃ．前記タンパク質を、前記形質転換された宿主細胞又は培地から単離するステップ
とを含む、方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞がピキア・パストリス宿主細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子操作したピキア・パストリス細胞がＶＰＳ１０−１の欠失を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子操作した宿主細胞が、正常な輸送パターンを変化させるＶｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログの細胞質ドメインの変化を含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＰＹ液胞選別輸送経路に関連する１つ以上の遺伝子の欠失又は破壊によって、液胞選別輸送活性が低下又は喪失しており、前記１つ以上の遺伝子が、Ｇｇａ１、Ｇｇａ２、Ｍｖｐ１、Ｐｅｐ１２、Ｖｐｓ１、Ｖｐｓ８、Ｖｐｓ９、Ｖｐｓ１５、Ｖｐｓ２１、Ｖｐｓ１９、Ｖｐｓ３４、Ｖｐｓ３８、Ｖｐｓ４５、及びＶｔｉ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
Ｖｐｓ１０の後期ゴルジへの再循環に関連するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の欠失又は破壊によって、液胞選別輸送活性が低下又は喪失しており、前記１つ以上の遺伝子が、Ｇｒｄ１９、Ｒｇｐ１、Ｒｉｃ１、Ｖｐｓ５、Ｖｐｓ１７、Ｖｐｓ２６、Ｖｐｓ２９、Ｖｐｓ３０、Ｖｐｓ３５、Ｖｐｓ５１、Ｖｐｓ５２、Ｖｐｓ５３、及びＶｐｓ５４からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＶＢ機能に関連するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の欠失又は破壊によって、液胞選別輸送活性が低下又は喪失しており、前記１つ以上の遺伝子が、Ｃｃｚ１、Ｆａｂ１、Ｈｓｅ１、Ｍｒｌ１、Ｖａｍ３、Ｖｐｓ２、Ｖｐｓ３、Ｖｐｓ４、Ｖｐｓ１１、Ｖｐｓ１３、Ｖｐｓ１６、Ｖｐｓ１８、Ｖｐｓ２０、Ｖｐｓ２２、Ｖｐｓ２３、Ｖｐｓ２４、Ｖｐｓ２５、Ｖｐｓ２７、Ｖｐｓ２８、Ｖｐｓ３１、Ｖｐｓ３２、Ｖｐｓ３３、Ｖｐｓ３６、Ｖｐｓ３７、Ｖｐｓ３９、Ｖｐｓ４１、Ｖｐｓ４３、Ｖｐｓ４４、Ｖｐｓ４６、Ｖｔａ１、及びＹｐｔ７からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現ベクターが糖タンパク質をコードし、前記改変宿主細胞が、前記グリコシル化パターンがヒト様である糖タンパク質を発現するようにさらに改変されている、請求項８又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００９年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２５６，３７９号、及び２０１０年６月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３５０，６６８号の利益を主張し、これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、酵母細胞などの真菌細胞中で、改善された分泌効率で組換えタンパク質を産生するための方法及び組成物に関する。
【０００３】
電子的に提出した配列表の参照
本出願の配列表は、ファイル名「ＧＦＩＭＩＳ０００４＿ＳＥＱＴＸＴ＿１８ＯＣＴ２０１０．ＴＸＴ」、作成日２０１０年、サイズ８６１ＫＢのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されるこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
真核細胞中での組換えのタンパク質の発現は、ＦＤＡが規制する薬物の最も成長の大きい部分となっている生物学的療法に対して現在注目されているために、ますます重要になってきている。産生細胞がＣＨＯ系哺乳動物細胞系であっても、糖鎖工学によって得られたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｄｈｅｉｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３４１−３４６（２００６））のいずれであっても、最大分泌力価が重要となる。タンパク質産生を増加させるための多くの試みは、組換え遺伝子のプロモーター及びコピー数に集中していたが（Ｄａｌｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｎ，Ｊ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１８：１９９９−３８（２００５））、組換えタンパク質が、小胞体（ＥＲ）からゴルジ装置への特定の経路を通過し、続いてトランスゴルジ網を通過して、最後にエキソサイトーシス小胞まで送られて、原形質膜を通過して送達される場合にのみ、効果的な分泌が実現される。組換えタンパク質が、この所望の分泌経路から外れる場合には、その収率が減少する。
【０００５】
糖鎖工学によって得られた酵母は、哺乳動物細胞と比較すると、治療法の開発に関して独特の利点が得られる。例えば、哺乳動物細胞に基づくシステムのグリコシル化特性は不均一となるが（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−１５（２００６））、糖鎖工学によって得られたピキア・パストリスでは均一なグリコシル化が得られることがわかっている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−４３（２００６））。フコースの除去（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−７３（２００３））などの哺乳動物グリコシル化の遺伝子改変は可能であるが、ほとんどのグリコフォームの選択は発酵及び／又は精製段階において行う必要があり、多くの場合で収率が限定される。酵母の遺伝子操作は容易なため、哺乳動物宿主細胞よりも、発酵及び精製から独立したタンパク質収率の改善には好都合である。
【０００６】
酵母中、液胞から送出される内因性タンパク質は、プロテイナーゼによって分解される。酵母の液胞は、哺乳動物のリソソームに類似したオルガネラであり、細胞のホメオスタシスを維持するためのエンドサイトーシス、タンパク質の代謝回転、及び栄養素獲得において非常に重要である。液胞のタンパク質輸送の機構の１つは、タンパク質をトランスゴルジ網（ＴＧＮ）から送達するカルボキシペプチダーゼＹ経路である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＴＧＮ中のカルボキシペプチダーゼＹの初期相互作用に応答可能なタンパク質受容体は、Ｖｐｓ１０（Ｐｅｐ１又はＶｐｔ１としても公知である）、Ｖｔｈ１、及びＶｔｈ２と命名されている。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、液胞に存在するプロテイナーゼを液胞前区画に送達するＶｐｓ１０の機能によって、液胞中でのタンパク質分解が生じる（レビューとして、Ｂｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７４４：４３８−５４（２００５）；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｋａｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９８３：６５０−６６３（２００９），ｅｐｕｂ  Ａｕｇ．２００８が参照される）。
【０００７】
Ｍａｒｃｕｓｓｏｎら（Ｃｅｌｌ  ７７：５７９−５８６（１９９４））には、サッカロマイセス・セレビシエでは、Ｖｐｓ１０は、Ｃｐｙを酵母液胞に選別輸送することが必要なことが示されている。Ｍａｒｃｕｓｓｏｎらは、ＶＰＳ１０遺伝子の変異によって、内因性Ｃｐｙの液胞タンパク質選別輸送に欠陥が生じ、その分泌に欠陥が生じることをさらに示している。しかし、ＶＰＳ１０の破壊及びＶｐｓ１０活性の喪失は、液胞酵素ＰｒＡ及びＰｒＢの選別輸送には全く影響が生じる、これらは、ＶＰＳ１０遺伝子がノックアウトされたＳ．セレビシエ株中の液胞への経路を適切に通過することも示されている。Ｉｗａｋｉら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１５２３−３２（２００６））は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）中のＶＰＳ１０の欠失によって、Ｃｐｙの誤選別及び分泌が生じることも示されており、Ｃｐｙを液胞に選別輸送するためにＶｐｓ１０が必要なことを示唆している。Ｖｐｓ１０選別輸送受容体は、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の場合も類似の方法でＣｐｙを選別輸送する機能が示されている（Ｔａｋｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．４２（５）：２５２−９（２００３）；Ｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２（５）：１５２３−３２（２００６））。
【０００８】
Ｊ．Ｄｅｎｅｃｋｅ（特許文献１）は、ＥＲからのタンパク質の輸送を防止すること、及び／又は液胞選別輸送経路からＥＲ又は細胞表面に戻すことによって、タンパク質分解を制限する方法を開示している。この文献は、液胞選別輸送受容体Ｖｐｓ１０は、タンパク質をＥＲに戻すように改変することができ、それによって異種タンパク質発現を増加可能であることをさらに示唆している。
【０００９】
Ｉｄｉｒｉｓら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８５（３）：６６７−７７（２０１０），Ｅｐｕｂ  ２００９  Ａｕｇ  １１）は、プロテアーゼ欠失のみを有するＡ８株と比較して、ＰＳ１０欠失及び８つのプロテアーゼ遺伝子欠失を含むシゾサッカロミセス・ポンベ株であるＡ８−ｖｐｓ１０Δ株中でのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の分泌が２倍に増加することを記載している。しかし、少量のｒ−ｈＧＨの分泌が細胞内に貯留され、このことは、液胞蓄積経路を完全に遮断するためには、細胞内タンパク質貯留に関連する数個のＶＰＳ遺伝子を欠失させる必要があることを示唆している。
【００１０】
Ｔａｋｅｇａｗａら（Ｔａｋｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．４２（５）：２５２−９（２００３））は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のｖｐｓ１０欠乏株についても記載しており、この変異体ではＣｐｙがその成熟形態にプロセッシングされないことを示している。しかし、この研究には、ｖｐｓ１０Δ株中の治療用異種タンパク質の発現については記載されていない。
【００１１】
Ａｇａｐｈｏｎｏｖら（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：１０２９−１０３５（２００５））は、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のＶＰＳ１０遺伝子を不活性化し、ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の分泌の増加を観察しなかった。この研究では、ＶＰＳ１０欠乏株においてｕＰＡのタンパク質分解プロセッシングの増加が観察された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００１９８５５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｄｈｅｉｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３４１−３４６（２００６）
【非特許文献２】Ｄａｌｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｎ，Ｊ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１８：１９９９−３８（２００５）
【非特許文献３】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−１５（２００６）
【非特許文献４】Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−４３（２００６）
【非特許文献５】Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−７３（２００３）
【非特許文献６】Ｂｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７４４：４３８−５４（２００５）
【非特許文献７】Ｌｉ  ａｎｄ  Ｋａｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９８３：６５０−６６３（２００９），ｅｐｕｂ  Ａｕｇ．２００８
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ  ７７：５７９−５８６（１９９４）
【非特許文献９】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１５２３−３２（２００６）
【非特許文献１０】Ｔａｋｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．４２（５）：２５２−９（２００３）
【非特許文献１１】Ｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２（５）：１５２３−３２（２００６）
【非特許文献１２】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８５（３）：６６７−７７（２０１０），Ｅｐｕｂ  ２００９  Ａｕｇ  １１
【非特許文献１３】ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：１０２９−１０３５（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
液胞選別輸送活性を喪失又は低下させることによる、真菌又は酵母細胞で産生される異種タンパク質の収率を増加させる方法の開発が非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、特に、酵母又は真菌の宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞を、上記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、遺伝子操作した酵母又は真菌細胞が、同じ種の未改変の酵母又は真菌の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、（ｂ）発酵条件下で上記タンパク質の発現が誘導される条件における培地中で、形質転換した酵母又は真菌の宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を、形質転換した酵母又は真菌の宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法に関する。本発明のこの態様のある実施形態では、酵母又は真菌の宿主細胞は、ピキア・パストリス（ピキア・パストリス）、サッカロマイセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、及びハンゼヌラ・ポリモルファ（ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）としても公知である）からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、宿主細胞はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞であり、特定の実施形態では宿主細胞はピキア・パストリスである。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、酵母又は真菌の宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞で組換えタンパク質を発現させるステップであって、遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞が、同じ種の未改変の酵母又は真菌の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、（ｂ）発酵条件下で上記タンパク質の発現が誘導される条件における培地中で、遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を、酵母又は真菌の宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法に関する。
【００１７】
本発明の方法の特定の実施形態では、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０−１などのＶｐｓ１０ホモログをコードする遺伝子を真菌又は酵母の細胞ゲノムから欠失させる、又は破壊することによって、液胞選別輸送活性が喪失又は低下している。
【００１８】
本発明は、ピキア宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作したピキア細胞を、上記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、遺伝子操作したピキア細胞が、同じ種の未改変ピキア細胞に対して液胞選別輸送活性が不足しているステップと、（ｂ）上記タンパク質の発現を誘導する条件における培地中で、形質転換したピキア宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を、形質転換した細胞又は培地から単離するステップとを含む方法にも関する。本発明のこの態様のある実施形態では、宿主細胞はピキア・パストリス細胞である。
【００１９】
本発明は、野生型ピキア・パストリス細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足した、又は液胞選別輸送活性が低下したピキア・パストリス細胞であって、宿主細胞が、液胞タンパク質選別輸送受容体１０−１（Ｖｐｓ１０−１）、例えば配列番号２０に記載のＶｐｓ１０−１タンパク質の機能欠失を含む、ピキア・パストリス細胞をさらに提供する。ある実施形態では、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞は、グリコシル化パターンがヒト様である糖タンパク質を発現するようにさらに改変される。さらに別の実施形態では、Ｖｐｓ１０−１をコードする遺伝子は欠失しており、Ｖｐｓ１０−２をコードする遺伝子は無傷である（すなわち欠失していない）。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なることを意味するのでない限り、複数への参照を含んでいる。
【００２１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、以下の定義及び略語が使用される。
【００２２】
定義：
「『ＱＲＰＬ様』選別輸送シグナル」は、組換えタンパク質をＶｐｓ１０に結合させることができる液胞選別輸送シグナルを意味する。カルボキシペプチダーゼＹ（Ｃｐｙ）においては、配列ＱＲＰＬ（配列番号１７６）がＶｐｓ１０に結合することで、Ｃｐｙが液胞に送られる。「ＱＲＰＬ様」選別輸送シグナルは、ＱＲＰＬ配列との相同性を有し、組換えタンパク質をＶｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログに結合させることができる。「ＱＲＰＬ様」選別輸送シグナルの例としては、限定するものではないが、「ＱＳＦＬ」（配列番号１７９）及び「ＱＶＡＦ」（配列番号１８０）が挙げられる。
【００２３】
「Ｖｐｓ１０−１」は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列によって定義されるＶｐｓ１０−１タンパク質などの、ピキア・パストリス細胞における液胞選別輸送受容体１０−１を意味する。当業者であれば、Ｖｐｓ１０−１配列のわずかな変動が、そのタンパク質の機能を変化させることなく、異なるピキア・パストリス細胞系において生じ得ることを理解されよう。従って、Ｖｐｓ１０−１を参照する場合、配列番号２に記載のタンパク質配列と、に構造的及び機能的に類似し、すなわち同等の方法での機能（例えば液胞選別輸送への関与）を有するタンパク質配列であって、配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％の同一性、少なくとも９４％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９６％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質配列とを含んでいる。
【００２４】
「Ｖｐｓ１０−２」は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列によって定義されるＶｐｓ１０−２タンパク質などの、ピキア・パストリス細胞における液胞選別輸送受容体１０−２を意味する。当業者であれば、Ｖｐｓ１０−２配列のわずかな変動が、そのタンパク質の機能を変化させることなく、異なるピキア・パストリス細胞系において生じ得ることを理解されよう。従って、Ｖｐｓ１０−２は、配列番号２１に記載のタンパク質配列と、構造的及び機能的に類似し、すなわち同等の方法での機能を有するタンパク質配列であって、配列番号２１と少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９２％の同一性、少なくとも９４％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９６％の同一性又は少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質配列とを含んでいる。
【００２５】
本明細書において使用される場合「ホモログ」は、参照配列と構造的及び機能的類似性を共有する遺伝子又はタンパク質配列を意味する。用語「ホモログ」は、共通の祖先からの進化のために構造的に類似している異なる種における配列であるオルソログと、同じゲノム内の類似の配列であるパラログとの両方を含んでいる。
【００２６】
「液胞選別輸送活性の低下」などの「タンパク質機能の低下」は、対象となる改変が行われていない同じ種の宿主細胞に対して、「改変」宿主細胞のタンパク質機能が低下していることを意味する。標準的なアッセイで測定して、未改変タンパク質に対して、改変タンパク質が少なくとも２０％〜５０％低い活性、特定の態様においては、少なくとも４０％低い活性又は少なくとも５０％低い活性を有する場合に、個別のタンパク質の機能が「低下した」と考えられる。当業者であれば、「改変宿主細胞」及び「未改変宿主細胞」の両方が、機能的に評価されるタンパク質とは関連しないさらなる変異を含むことができることは理解されよう。例えば、Ｖｐｓ１０タンパク質機能の低下を評価する場合、Ｖｐｓ１０の欠失を含み、ＢＭＴ１の欠失をさらに含むことで、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を有さない「改変」ピキア・パストリス宿主細胞は、Ｖｐｓ１０欠失は含まないがＢＭＴ１欠失を含む「未改変」宿主細胞と比較される。
【００２７】
「タンパク質機能の喪失」は、評価される特定のタンパク質の改変を含まない同じ種の宿主細胞に対して、「改変」宿主細胞のタンパク質機能又は活性が喪失していることを意味する。特定の実施形態では、上記改変が行われていないタンパク質に対して少なくとも９０％〜９９％低い活性を有する場合に、改変タンパク質の「機能が喪失」したと考えられる。特定の態様では、改変タンパク質は、標準的なアッセイで測定して、少なくとも９５％低い活性、又は少なくとも９９％低い活性を有する。ある態様では、改変タンパク質は、タンパク質活性又は機能を全く有さない。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「欠失した、又は破壊された」及び「欠失又は破壊」、或いは「機能欠失」は、ピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１及びＶｐｓ１０−２タンパク質、サッカロマイセス・セレビシエなどの他の種のＶｐｓ１０ホモログ、或いは液胞選別輸送に関与し酵母細胞ゲノムから産生されるその他のタンパク質などの特定のタンパク質の活性又は機能のあらゆる破壊又は阻害を意味し、タンパク質活性が阻害されることによって、そのタンパク質は、その意図される機能を果たすことができなくなるか、或いは、上記欠失及び破壊を含まない同じ種の未改変酵母細胞と比べて、低い程度でしかその意図される機能を果たすことができなくなる。その例は、液胞選別輸送活性を抑止又は破壊することができる酵母宿主細胞であって、限定するものではないが、１）液胞選別輸送に関与する遺伝子の発現を制御する上流又は下流制御配列の欠失又は破壊、２）タンパク質活性をコードする遺伝子の変異によって、遺伝子を非機能性にすること（この場合、「変異」としては、遺伝子の欠失、置換、挿入、又は付加が挙げられ、それにより、そのコードするタンパク質によって、液胞選別輸送活性を得ることができなくなる）、３）化学的、ペプチド、又はタンパク質の阻害剤による、液胞選別輸送活性の抑止又は破壊、４）アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、及びｓｉＲＮＡなどの核酸系発現阻害剤による、液胞選別輸送活性抑止又は破壊、５）酵素活性をコードする遺伝子の発現を制御又は調節する制御因子の発現又は活性の転写阻害剤又は阻害剤による、液胞選別輸送活性の抑止又は破壊、６）液胞の受容体を飽和させ分泌された組換えタンパク質の選別輸送を減少させる、ＣｐｙなどのＶｐｓ１０に結合することが知られているペプチド又はタンパク質の共発現、７）膜結合性ではない変異したＶｐｓ１０タンパク質、又は正常な液胞選別輸送パターンを妨害する機能を果たすドミナントネガティブなＶｐｓ１０タンパク質の共発現、８）Ｖｐｓ１０結合ドメインがなくなり、液胞選別輸送が阻止される、対象の組換えタンパク質のアミノ酸配列の変異、並びに９）発現したとしても、得られるタンパク質産物が、未改変酵母細胞から得られるタンパク質と同一ではなく、機能が低下するようなあらゆる手段によって、液胞選別輸送活性を抑止又は破壊することができる酵母宿主細胞である。
【００２９】
略語：
Ｖｐｓ１０−１：液胞タンパク質選別輸送受容体１
ＶＰＳ１０−２：液胞タンパク質選別輸送受容体２
ＳｃＳＵＣ２：Ｓ．セレビシエのインベルターゼ
ＯＣＨ１：α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ
Ｋ１ＭＮＮ２−２：Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター
ＢＭＴ１：β−マンノース−トランスファー１（β−マンノース脱離）
ＢＭＴ２：β−マンノース−トランスファー２（β−マンノース脱離）
ＢＭＴ３：β−マンノース−トランスファー３（β−マンノース脱離）
ＢＭＴ４：β−マンノース−トランスファー４（β−マンノース脱離）
ＭＮＮ４Ｌ１：ＭＮＮ４様１（電荷除去）
ＭｍＳＬＣ３５Ａ３：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのマウスホモログ
ＰＮＯ１：Ｎ結合オリゴ糖のホスホマンノシル化（電荷除去）
ＭＮＮ４：マンノシルトランスフェラーゼ（電荷除去）
ＦＢ５３：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したＭｍＭＮＳ１Ａ
ＴｒＭＤＳ１：分泌されたＴ．レセイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）ＭＮＳ１
Ｓｈ  ｂｌｅ：ゼオシン耐性マーカー
ＨＳＡｓｓ：ヒト血清アルブミンシグナル配列
ＤＡＰ２：ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＳＴＥ１３：ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＣＬＰ１：Ｐ．パストリスのセルラーゼ様タンパク質１
５−ＦＯＡ：５−フルオロオロト酸
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ：ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した腫瘍壊死因子受容体２外部ドメイン
ＥＲ：小胞体
ＧＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子
ｒｈＧＣＳＦ：組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ｐＧＬＹ５１９２（ｖｐｓ１０−１ノックアウトプラスミド）及びｐＧＬＹ５１９４（ｖｐｓ１０−２ノックアウトプラスミド）の構造を示している。制限酵素部位及びインサートＤＮＡを含めて、ｐＧＬＹ５１９２及びｐＧＬＹ５１９４の作製に使用した構成要素のプラスミドマップを示している。
【図２Ａ】ｒＨｕＭｅｔＧＣＳＦをコードしピキア・パストリスのＡＯＸ１座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ５１７８（ｒｈＧＣＳＦ発現プラスミド）の構造を示している。制限酵素部位及びインサートＤＮＡを含めて、ｐＧＬＹ５１７８の作製に使用した構成要素のプラスミドマップを示している。
【図２Ｂ】ｒＨｕＭｅｔＧＣＳＦをコードしピキア・パストリスＡＯＸ１座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ５１７８（ｒｈＧＣＳＦ発現プラスミド）の構造を示している。制限酵素部位及びインサートＤＮＡを含めて、ｐＧＬＹ５１７８の作製に使用した構成要素のプラスミドマップを示している。
【図３】ｐＧＬＹ３４６５（ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ発現プラスミド）の構造を示している。ｐＧＬＹ３４６５の作製に使用したプラスミドマップ、制限酵素、及びインサートＤＮＡを記載している。
【図４Ａ】ｙＧＬＹ８５３８、ｒｈＧＣＳＦを発現する糖鎖工学によって得られたピキア・パストリス株ｙＧＬＹ８５３８の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ８５３８は、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）発現株であり、これを使用して後の変異株を使用した。
【図４Ｂ】ｙＧＬＹ８５３８、ｒｈＧＣＳＦを発現する糖鎖工学によって得られたピキア・パストリス株ｙＧＬＹ８５３８の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ８５３８は、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）発現株であり、これを使用して後の変異株を使用した。
【図４Ｃ】ｙＧＬＹ８５３８、ｒｈＧＣＳＦを発現する糖鎖工学によって得られたピキア・パストリス株ｙＧＬＹ８５３８の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ８５３８は、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）発現株であり、これを使用して後の変異株を使用した。
【図４Ｄ】ｙＧＬＹ８５３８、ｒｈＧＣＳＦを発現する糖鎖工学によって得られたピキア・パストリス株ｙＧＬＹ８５３８の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ８５３８は、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）発現株であり、これを使用して後の変異株を使用した。
【図４Ｅ】ｙＧＬＹ８５３８、ｒｈＧＣＳＦを発現する糖鎖工学によって得られたピキア・パストリス株ｙＧＬＹ８５３８の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ８５３８は、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）発現株であり、これを使用して後の変異株を使用した。
【図５Ａ】ｙＧＬＹ９９９３の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ９９９２及びｙＧＬＹ９９９３は、ｙＧＬＹ８２９２の同質遺伝子的なＶｐｓ１０−１変異体である。これらの株は、ゼオシン感受性であり、従ってｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを含有しない。
【図５Ｂ】ｙＧＬＹ９９９３の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ９９９２及びｙＧＬＹ９９９３は、ｙＧＬＹ８２９２の同質遺伝子的なＶｐｓ１０−１変異体である。これらの株は、ゼオシン感受性であり、従ってｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを含有しない。
【図５Ｃ】ｙＧＬＹ９９９３の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ９９９２及びｙＧＬＹ９９９３は、ｙＧＬＹ８２９２の同質遺伝子的なＶｐｓ１０−１変異体である。これらの株は、ゼオシン感受性であり、従ってｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを含有しない。
【図５Ｄ】ｙＧＬＹ９９９３の作製を示している。株の構築には、記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親株及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。遺伝子型に記載される遺伝子の注釈は、発明の概要に記載している。最終株のｙＧＬＹ９９９２及びｙＧＬＹ９９９３は、ｙＧＬＹ８２９２の同質遺伝子的なＶｐｓ１０−１変異体である。これらの株は、ゼオシン感受性であり、従ってｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを含有しない。
【図６】ｙＧＬＹ８５３８変異株の作製を示している。ｒｈＧＣＳＦ発現株ｙＧＬＹ８５３８の遺伝子Ｖｐｓ１０−１（ｙＧＬＹ９９３３）、Ｖｐｓ１０−２（ｙＧＬＹ１０５６６）、又はその両方（ｙＧＬＹ１０５５７）を変異させた。株の構築には、ｙＧＬＹ８５３８に関連して記載されるように、結果として得られる株が正しい遺伝子型を有するように、親プラスミド及び遺伝子変異（プラスミド又は培地の選択によって）を使用した。
【図７】Ｖｐｓ１０活性のｒｈＧＣＳＦ力価（パネルＡ）及び細胞溶解（パネルＢ）に対する影響を示している。実施例１４を参照されたい。記載のデータはＳｉｘｆｏｒｓ（０．５Ｌ）発酵実験によって得られた。パネルＡ：記載の株を、同一条件下で発酵させ、無細胞上澄み液をＥＬＩＳＡによって分析して、ｒｈＧＣＳＦ量を定量化した。それぞれのＥＬＩＳＡ値を親の対照のｙＧＬＹ８５３８ＥＬＩＳＡ値で割ることによって、相対力価を求めた。パネルＢ：記載の株を同一条件下で発酵させ、無細胞上澄み液をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって分析して、二本鎖ＤＮＡ量を定量化した。それぞれのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ値を親の対照のｙＧＬＹ８５３８のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ値で割ることによって、相対細胞溶解値を求めた。
【図８】Ｖｐｓ１０活性のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ力価に対する影響を示している（実施例１５参照）。記載のデータは、９６ウェルの深型ウェル誘導プレート実験から得た。記載の株を、ｐＧＬＹ３４６５で形質転換させており、データは、少なくとも１１の独立したコロニーから得られた相対力価を示している。無細胞上澄み液をＥＬＩＳＡによって分析して、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ量を相対化した。各親株のＥＬＩＳＡ値を平均し、次に親の対照のｙＧＬＹ８２９２の平均ＥＬＩＳＡ値で割ることによって、相対力価を求めた。ｙＧＬＹ９９９２株及びｙＧＬＹ９９９３株の両方は、ｖｐｓ１０−１の独立した変異株である。
【図９Ａ】ピキア・パストリスにおけるＶｐｓ１０活性のモデルを示している。野生型（パネルＡ）及びｖｐｓ１０−１Δ変異（パネルＢ）株の両方におけるＶｐｓ１０受容体機能の概略図である。ｍＲＮＡが核内で転写された後、タンパク質ポリペプチドが翻訳され、小胞体の内腔に移動する。後期ゴルジに輸送された後、ＧＣＳＦが野生型細胞中のＶｐｓ１０−１と相互作用する（Ａ）。Ｖｐｓ１０−１は、細胞質尾部を介して、ゴルジから液胞前区画（ＰＶＣ）に循環され、そこでＧＣＳＦが受容体から分離する。Ｖｐｓ１０−１は循環してゴルジに戻り、ＰＶＣ中のＧＣＳＦは液胞に移動し、タンパク質分解によって分解するのに対し、変異細胞においては（Ｂ）、Ｖｐｓ１０−１タンパク質がないため、より多くのＧＣＳＦが培養上澄み分画に分泌される。
【図９Ｂ】ピキア・パストリスにおけるＶｐｓ１０活性のモデルを示している。野生型（パネルＡ）及びｖｐｓ１０−１Δ変異（パネルＢ）株の両方におけるＶｐｓ１０受容体機能の概略図である。ｍＲＮＡが核内で転写された後、タンパク質ポリペプチドが翻訳され、小胞体の内腔に移動する。後期ゴルジに輸送された後、ＧＣＳＦが野生型細胞中のＶｐｓ１０−１と相互作用する（Ａ）。Ｖｐｓ１０−１は、細胞質尾部を介して、ゴルジから液胞前区画（ＰＶＣ）に循環され、そこでＧＣＳＦが受容体から分離する。Ｖｐｓ１０−１は循環してゴルジに戻り、ＰＶＣ中のＧＣＳＦは液胞に移動し、タンパク質分解によって分解するのに対し、変異細胞においては（Ｂ）、Ｖｐｓ１０−１タンパク質がないため、より多くのＧＣＳＦが培養上澄み分画に分泌される。
【図１０】実施例に記載されるプラスミドの作製に使用したプライマーの配列の一覧である（配列番号１〜１３）。
【図１１】実施例において使用したプラスミド（パネルＡ）及び株（パネルＢ）の一覧である。
【図１２】Ｓ．セレビシエのＶｐｓ１０と比較した場合の真菌Ｖｐｓ１０ホモログ間の長さ、パーセント類似性、及びパーセント同一性の比較を示している。
【図１３Ａ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６１０〜６２３８）、及び下流相同フラグメントを含むピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示している。
【図１３Ｂ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６１０〜６２３８）、及び下流相同フラグメントを含むピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示している。
【図１３Ｃ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６１０〜６２３８）、及び下流相同フラグメントを含むピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示している。
【図１３Ｄ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６１０〜６２３８）、及び下流相同フラグメントを含むピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示している。
【図１３Ｅ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６１０〜６２３８）、及び下流相同フラグメントを含むピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示している。
【図１４Ａ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド８３０〜４５０９）、及び下流相同フラグメントを含めたピキア・パストリスのＶＰＳ１０−２領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示している。
【図１４Ｂ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド８３０〜４５０９）、及び下流相同フラグメントを含めたピキア・パストリスのＶＰＳ１０−２領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示している。
【図１４Ｃ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド８３０〜４５０９）、及び下流相同フラグメントを含めたピキア・パストリスのＶＰＳ１０−２領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示している。
【図１４Ｄ】上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド８３０〜４５０９）、及び下流相同フラグメントを含めたピキア・パストリスのＶＰＳ１０−２領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示している。
【図１５】Ｐ．パストリスのＶｐｓ１０−１のアミノ酸配列（配列番号２０）を示している。
【図１６】Ｐ．パストリスのＶｐｓ１０−２のアミノ酸配列（配列番号２１）を示している。
【図１７】Ｓ．セレビシエのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（Ｐｅｐ１又はＶｐｔ１としても公知である、配列番号２２）を示している。
【図１８】アスペルギルス・ニガーＶのｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号２６）を示している。
【図１９】サッカロマイセス・ポンベのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号２７）を示している。
【図２０】カンジダ・アルビカンスのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号２８）を示している。
【図２１】カンジダ・グラブラタのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号２９）を示している。
【図２２】ピキア・スチピチスのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号３０）を示している。
【図２３】デバリオマイセス・ハンセニイのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号１８１）を示している。
【図２４】クルイベロミセス・ラクチスのＶｐｓ１０のアミノ酸配列（配列番号１８２）を示している。
【図２５】ＣＰＹ液胞選別輸送経路に関連するタンパク質のアミノ酸配列の配列番号を示している。
【図２６】Ｖｐｓ１０のＰＶＣから後期ゴルジへの再循環に関連するタンパク質のアミノ酸配列の配列番号を示している。
【図２７】適切なＭＶＢ機能及び／又は液胞への融合に関連するタンパク質のアミノ酸配列の配列番号を示している。
【図２８】未知の機構を介した適切なＣｐｙ液胞ターゲッティングに関連するタンパク質のアミノ酸配列の配列番号を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、特に、同じ種の未改変の酵母又は真菌の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、酵母又は真菌細胞が、サッカロマイセス・セレビシエのＶｐｓ１０、又は限定するものではないがピキア・パストリスのＶｐｓ１０−１などのＶｐｓ１０ホモログの機能が喪失されるように改変される、産生方法を提供する。本発明のある実施形態では、酵母又は真菌細胞は、後述のように、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログをコードする遺伝子が欠失又は破壊されるように改変される。
【００３２】
真核細胞における組換えタンパク質の効率的で高収率の発現は、多くの生物学的治療用産物の開発において重要である。治療用タンパク質の商業的開発に必要となる高収率のタンパク質を実現するためには、タンパク質の最大分泌力価が得られることが重要である。Ｓ．セレビシエの分泌経路は、解明された多数の遺伝子機能によって十分に特性決定されている。ｍＲＮＡ分子が翻訳され、タンパク質がＥＲ内腔に入った後、アスパラギン結合グリカン（Ｎ結合）、セリン／スレオニン結合マンノース（Ｏ結合）の付加、ＥＲ内在シャペロンに支援される折りたたみ、ジスルフィド結合の形成、ＥＲから逆方向への移動、カーゴレセプターへの結合、ＣＯＰＩＩ小胞を介したゴルジへの輸送などの多数のプロセスが、そのタンパク質に対して起こる。
【００３３】
本発明の目的の１つは、発酵条件での酵母細胞培養などの酵母細胞培養において異種発現した治療用タンパク質の力価を増加させることである。エキソサイトーシスによる異種発現したタンパク質の分泌は、液胞への代替輸送により悪影響が生じる。組換えタンパク質の液胞選別輸送によって、上澄み分画中の分泌収率が低下し得る。酵母又は真菌細胞で発現される組換えタンパク質の分泌を増加させる方法を開発するために、本発明者らは最初に、組換えタンパク質を液胞に向かわせることができる可能性のある３つの代替輸送経路：（１）細胞質から液胞へのターゲッティング（ＣＶＴ）、（２）アルカリホスファターゼ経路（ＡＬＰ）（Ｐｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３８：５３１−４５（１９９７））、及び（３）カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）経路（Ｍａｒｃｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出、及びＣｏｏｐｅｒ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３３：５２９−４１（１９９６））の改良を考慮した。ＣＶＴは、特定の種類のオートファジーの１つであり、それによって、正常な細胞機能では、液胞内在タンパク質が細胞質から、タンパク質合成の後、液胞に向かう。しかし、この経路は、分泌経路に向かう組換えタンパク質とは典型的には相互作用せず、従って、タンパク質収率を増加させる可能性は見られなかった。ＡＬＰ経路は、膜結合ＡＬＰ基質のカルボキシ末端細胞質ドメインにおける特定のシグナリング相互作用によって、ゴルジ中のアルカリホスファターゼなどの膜結合タンパク質を液胞まで輸送する。この経路は、典型的には組換え治療用タンパク質ではない膜貫通タンパク質を液胞に選別輸送するだけであるので、治療用タンパク質産物の分泌収率を増加させる機構にもならなかった。
【００３４】
サッカロマイセス・セレビシエにおける第３の代替選別輸送機構であるＣＰＹ経路は、プロカルボキシペプチダーゼｙ（プロＣｐｙ、Ｐｒｃ１としても公知である）は、後期ゴルジ中の液胞タンパク質選別輸送受容体のＶｐｓ１０（Ｐｅｐ１又はＶｐｔ１としても公知である）と相互作用することによるプロセスである。Ｖｐｓ１０のカルボキシ末端細胞質ドメインを有する多数のタンパク質によって媒介される小胞輸送によって、プロＣｐｙは、液胞前複合体（ＰＶＣ）と呼ばれる（多胞体（ＭＶＢ）としても公知である）中間区画に向かう。ＰＶＣ中のＶｐｓ１０からプロＣｐｙが分離した後、Ｖｐｓ１０は、特定のグループのタンパク質によって後期ゴルジに再循環される。次に、プロＣｐｙを含有するＰＶＣ小胞は液胞に輸送され、さらなるタンパク質成分との融合が起こる。次に、プロＣｐｙは液胞中で成熟して活性Ｃｐｙになり、選別輸送は完了する。最初に考慮した３つの経路の中では、ＣＰＹ経路が、可溶性分泌組換えタンパク質に対して最も妥当である。分泌経路における組換えタンパク質は、後期ゴルジに輸送されてからエキソサイトーシスが起こるため、それらのタンパク質はＶｐｓ１０と相互作用する可能性がある。組換えタンパク質がＶｐｓ１０に結合する配列を含有すれば、その組換えタンパク質はＣＰＹ経路によって液胞又はリソソームに選別輸送され、おそらくはプロテアーゼによって分解され、そのため分泌速度が低下し、力価が限定される。本発明者らは、この経路による液胞選別輸送をなくすことによって、より多くの組換えタンパク質をエキソサイトーシスにより分泌することができ、それによって細胞の生産性を増加させることができるとの仮説を立てた。
【００３５】
Ｓ．セレビシエにおける内因性タンパク質に関する分泌経路に関しては多くが知られているが、本発明の前には、異種発現された組換え治療用タンパク質の力価が、発酵条件でＶｐｓ１０酵母変異体が異種タンパク質をコードする遺伝子を発現することによって改善できるかどうかは知られていなかった。ピキア細胞におけるＶｐｓ１０ホモログの機能欠失によって、細胞中の発現ベクターに含まれる遺伝子がコードする組換えタンパク質の分泌を増加できるかどうかも知られていなかった。
【００３６】
この目的のため、本発明の実施形態は、酵母における組換えタンパク質発現の主要なボトルネックの確認に関する。前述したように、サッカロマイセス・セレビシエでは、Ｖｐｓ１０が、プロＣｐｙの結合、及びそのタンパク質の液胞への局在化の原因となる。ＶＰＳ１０遺伝子２つのホモログがピキア・パストリスにおいて同定され、Ｖｐｓ１０−１及びＶＰＳ１０−２と名付けられた。これら２つの座ｖｐｓ１０−１及びｖｐｓ１０−２のヌル変異体を作製するためのベクターを構築した。プラスミドをＰ．パストリス中で形質転換させて、これらの遺伝子のヌル変異体を作製した。ｖｐｓ１０−１の遺伝的変異体は、ｒｈ−ＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの分泌増加を示した。ｖｐｓ１０−２ノックアウト株では、ｒｈＧＣＳＦの分泌が増加せず、このため、この株ではＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ分泌の試験は行わなかった。本発明者らのデータは、ｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの両方が、ピキア・パストリスのトランスゴルジ網（ＴＧＮ）中のＶｐｓ１０−１に結合することよって、液胞に輸送されて分解されることを示している。従って、本発明では、ピキア宿主細胞にいて、組換え発現タンパク質の一部は、正しい分泌経路から別の経路に移り、Ｖｐｓ１０相互作用によって酵母液胞に輸送されることを示している（Ｍａｒｃｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７７：５７９−８６（１９９４））。タンパク質が液胞又はリソソームに選別輸送されると、それらは分泌経路から離れて、プロテアーゼによって分解し、それによって組換えタンパク質の分泌速度が低下する。ＣＰＹ経路を介した液胞選別輸送をなくすことによって、より多くの組換えタンパク質がエキソサイトーシスによって分泌され、それによって細胞の生産性が増加することを本明細書で示している。
【００３７】
本発明の実施形態によると、ピキア・パストリスのＶＰＳ１０ホモログであるＶＰＳ１０−１の遺伝子不活性化によって、組換えｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの培地中への分泌の顕著な増加が示された。ＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃのアミノ酸配列が公知であることから、これらのタンパク質のアミノ末端不均の配列が、「ＱＲＰＬ」共通Ｖｐｓ１０結合配列に対して高い相同性を有することを同定した（実施例１３、ｖａｎ  Ｖｏｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：８４１−６（１９９６）参照）。さらに、これらのタンパク質について報告される結晶構造（Ｈｉｌｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５１６７−７１（１９９３）、Ｔａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：３１３５−４０（２００６））から、これらが表面露出ペプチドを含有することが示された。これらの観察から本明細書に記載の方法が開発され、その方法では、液胞タンパク質選別輸送受容体Ｖｐｓ１０に結合する「ＱＲＰＬ」様配列を含む組換えタンパク質の分泌速度は、選択した宿主細胞中のＶＰＳ１０又はＶＰＳ１０ホモログの遺伝子変異によって改善できる。
【００３８】
従って、本発明の実施形態は、酵母宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作した真菌又は酵母の宿主細胞を、上記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、遺伝子操作した真菌又は酵母細胞が、同じ種の未改変の真菌又は酵母の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、（ｂ）発酵条件下で上記タンパク質の発現が誘導される条件における培地中で、形質転換した宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を形質転換した宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法を提供する。
【００３９】
本発明は、酵母又は真菌の宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞で組換えタンパク質を発現させるステップであって、遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞が、同じ種の未改変の酵母又は真菌の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、（ｂ）発酵条件下で上記タンパク質の発現が誘導される条件における培地中で、遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を、酵母又は真菌の宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法も提供する。
【００４０】
上記の本発明の方法のある実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ピキア・パストリスなどのピキア細胞である。
【００４１】
本発明は、ピキア宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作したピキア細胞を、上記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、遺伝子操作したピキア細胞が、同じ種の未改変ピキア細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い、当該ステップと、（ｂ）上記タンパク質の発現が誘導される条件における培地中で、形質転換したピキア宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を、形質転換した宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法をさらに提供する。
【００４２】
本発明のこの態様の特定の実施形態では、宿主細胞はピキア・パストリス細胞である。
【００４３】
前述の本発明の方法によると、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０タンパク質ホモログをコードする遺伝子の遺伝子欠失又は破壊によって、選択された宿主細胞の液胞選別輸送活性を喪失又は減少させる。本発明のこの実施形態では、Ｖｐｓ１０タンパク質ホモログは、例えば、公知のＶｐｓ１０又は公知のＶｐｓ１０タンパク質ホモログ配列を使用し、翻訳ヌクレオチドデータベース中の類似のタンパク質を検索するＴＢＬＡＳＴＮなどのコンピューター検索プログラムを使用して、適切な酵母又は真菌のゲノムを検索することによって、所望の宿主細胞において同定される（実施例３参照）。当業者であれば、Ｓ．セレビシエのＶＰＳ１０の公知の配列に基づいてＰＣＲプライマー又はＤＮＡプローブを設計して、所望の宿主のＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の宿主細胞におけるＶＰＳ１０遺伝子ホモログを同定することもできる。Ｓ．セレビシエのＶｐｓ１０のアミノ酸配列を図１７に示している（配列番号２２）。Ｖｐｓ１０タンパク質ホモログが所望の宿主細胞において同定されれば、本明細書に記載のようにＶＰＳ１０遺伝子ホモログの欠失又は破壊によって、その宿主細胞の液胞選別輸送活性を機能的に欠失させることができる。
【００４４】
Ｖｐｓ１０ホモログである多数の従来公知の配列を本明細書に提供しており、Ｐ．パストリスの場合は図１５及び１６（（Ｖｐｓ１０−１及びＶｐｓ１０−２、それぞれ配列番号２０及び２１）、アスペルギルス・ニガーの場合は図１８（配列番号２６）、サッカロマイセス・ポンベの場合は図１（配列番号２７）、カンジダ・アルビカンスの場合は図２０（配列番号２８）、カンジダ・グラブラタの場合は図２１（配列番号２９）、ピキア・スチピチスの場合は図２２（配列番号３０）、デバリオマイセス・ハンセニイの場合は図２３（配列番号１８１）、クルイベロミセス・ラクチスの場合は図２４（配列番号１８２）に示している。従って、液胞選別輸送活性が不足した宿主細胞を得るために、これらのいずれかの配列で適切な宿主細胞で欠失又は破壊を生じさせることができる。本発明の方法において上記宿主細胞を使用することで、組換えタンパク質産物の量が多くなると推測される。
【００４５】
さらに、Ｖｐｓ１０と相同であるＳ．セレビシエ中の他の遺伝子が、類似の機能を果たす場合があり、従って、液胞選別輸送活性を低下させ、異種タンパク質収率を増加させるために、それらを本発明により欠失させたり又は破壊することができる。例えば、Ｓ．セレビシエのＶｔｈ１ｐ（配列番号２３）、Ｓ．セレビシエのＶｔｈ２ｐ（配列番号２４）、及びＳ．セレビシエのＹＮＲ０６５Ｃ（配列番号２５））は、Ｖｐｓ１０と相同であり、Ｖｐｓ１０と類似の方法で機能すると考えられる。
【００４６】
所望の宿主細胞中のＶＰＳ１０又はＶＰＳ１０遺伝子ホモログの遺伝子不活性化は、相同組換えを使用してＶｐｓ１０オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠失させることで行うことができる。或いは、ＶＰＳ１０遺伝子又はＶＰＳ１０遺伝子ホモログは機能欠失を含むこともでき、その場合、完全なＯＲＦは欠失しないが、別の変異が存在するために、Ｖｐｓ１０、１コドン欠失、点突然変異、及び置換などのＶＰＳ１０遺伝子又はホモログの部分欠失などのＶｐｓ１０の機能の抑止又は破壊が生じる。Ｖｐｓ１０の機能を抑止するために使用できる他の方法としては、限定するものではないが、液胞選別輸送に関与する遺伝子の発現を制御する上流又は下流制御配列の欠失又は破壊、２）化学的、ペプチド、又はタンパク質阻害剤による液胞選別輸送活性の抑止又は破壊、３）アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、又はｓｉＲＮＡなどの核酸系発現阻害剤による、液胞選別輸送活性の抑止又は破壊、並びに４）酵素活性をコードする遺伝子の発現を制御又は調節する制御因子の発現又は活性の転写阻害剤又は阻害剤による、液胞選別輸送活性の抑止又は破壊が挙げられる。
【００４７】
例えば、液胞選別輸送活性が不足した酵母細胞において組換えタンパク質ｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの分泌を増加させる方法を本明細書に示しているが、液胞選別輸送活性が不足又は低下した遺伝子操作した真菌の又は酵母宿主細胞を使用して、本発明の方法によって、あらゆる組換えタンパク質の量を、野生型細胞で産生される組換えタンパク質の量よりも多くすることができることは、当業者であれば理解されよう。「ＱＲＰＬ」共通Ｖｐｓ１０結合配列に相同なアミノ酸配列を含む組換えタンパク質は、宿主細胞のＶｐｓ１０に結合できるため、液胞への別の輸送が行われ、最終的にはタンパク質収率が低下する。実施例１３で考察されるように、ｖａｎ  Ｖｏｏｒｓｔ及び共同研究者（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：８４１−６（１９９６））は、アミノ末端付近のＣｐｙ「ＱＲＰＬ」ペプチドの突然変異生成を行うことで、液胞選別輸送の効率のための配列保存の必要条件を求めた。これらの分析によって、Ｇｌｎ２４の位置以外では、Ｖｐｓ１０との相互作用に影響が生じたり誤選別が生じたりすることなく、多重置換を発生させることができることがわかった。従って、宿主細胞中のＶｐｓ１０と相互作用して、収率を低下させるために、組換えタンパク質がＱＲＰＬ共通配列と完全に相同である必要はない。さらに、Ｓ．セレビシエの液胞選別輸送受容体Ｖｐｓ１０は、「ＱＲＰＬ様」選別輸送ドメインが関与しない未知の機構で、大腸菌β−ラクタマーゼなどの組換えタンパク質と相互作用することが示されている（Ｈｏｌｋｅｒｉ  ａｎｄ  Ｍａｋａｒｏｗ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４２９：１６２−６（１９９８））。所望の宿主細胞中のＶｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログと相互作用する組換えタンパク質は幅広い可能性を有するため、本発明の実施形態は、Ｖｐｓ１０の不活性化又は機能欠失によって、治療用又は生物学的なタンパク質産物などの広範囲な組換えタンパク質の組換え収率を増加させる幅広い方法を提供する。
【００４８】
当業者であれば、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを使用して、野生型の酵母又は真菌の宿主細胞と、機能的なＶｐｓ１０タンパク質活性が不足した同じ種の宿主細胞とを形質転換し、例えばＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、機能活性アッセイ、又はあらゆる他の標準的なタンパク質検出アッセイによってタンパク質の発現を試験することによって、タンパク質力価の増加を容易に試験することができる。
【００４９】
本発明のこの実施形態の特定の態様では、Ｖｐｓ１０、及び／又はＰ．パストリスのＶｐｓ１０−１などのＶｐｓ１０ホモログタンパク質の局在性を、後期ゴルジ中でのそれらの作用部位に変化させることによって、所望の宿主細胞の液胞選別輸送活性を喪失させたり低下させたりする。Ｓ．セレビシエでは、タンパク質のカルボキシ末端における細胞質尾部のタンパク質−タンパク質相互作用によって、Ｖｐｓ１０が後期ゴルジに局在化することが知られている（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６０：４６１−９（１９９９）；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０８９−１０２（１９９５）；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３３：５２９−４１，（１９９６）；Ｄｅｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１２２８８−９３（２００２））。従って、本発明によると、Ｖｐｓ１０細胞質尾部中の１つのアミノ酸の変異及び／又は欠失によって喪失させて、Ｖｐｓ１０の局在性を変化させ、組換えタンパク質の液胞への選別輸送を抑制することによって、液胞選別輸送活性を喪失させることができる。
【００５０】
従って、本発明のこの実施形態は、酵母又は真菌の宿主細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、（ａ）遺伝子操作した酵母又は真菌の宿主細胞を、上記タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換して、宿主細胞を産生するステップであって、遺伝子操作した酵母又は真菌細胞が、同じ種の未改変の酵母又は真菌の宿主細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低く、遺伝子操作した宿主細胞が、Ｖｐｓ１０細胞質ドメインの変化を含み、それによってその正常な輸送パターンが変化するステップと、（ｂ）タンパク質の発現が誘導される条件下の培地中で形質転換した宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）上記タンパク質を形質転換した宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法に関する。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態では、ＣＰＹ液胞選別輸送経路に関連するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子、例えば、Ｇｇａ１、Ｇｇａ２（Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４９：８１−９４（２０００））、Ｍｖｐｌ（Ｂｏｎａｎｇｅｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３：２４８６−５０１（２００２））、Ｐｅｐｌ２（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４９３６−４８（１９８８））、Ｖｐｓ１、Ｖｐｓ８、Ｖｐｓ９、Ｖｐｓ１０、Ｖｐｓ１５、Ｖｐｓ２１（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ１９（Ｗｅｉｓｍａｎ，Ｌ．Ｓ．＆  Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：６１８−２３（１９９２））、Ｖｐｓ３４（Ｓｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：８８−９１（１９９３））、Ｖｐｓ３８（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ８：２０５７−６５（１９８９））、Ｖｐｓ４５（Ｂｒｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７６：４３−５２（１９９８））、及びＶｔｉ１（ｖｏｎ  Ｍｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７：１５１１−２４（１９９７））を機能的に欠失させる遺伝子変異によって、宿主細胞の液胞選別輸送活性を低下又は喪失させる。ＣＰＹ液胞選別輸送経路に関連するタンパク質のアミノ酸配列を本明細書に示している（図２５参照）。
【００５２】
本発明のさらなる実施形態では、Ｇｒｄ１９（Ｈｅｔｔｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２：５４８−５７（２００３））、Ｒｇｐ１、Ｒｉｃ１（Ｂｏｎａｎｇｅｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３：２４８６−５０１（２００２））、Ｖｐｓ５、Ｖｐｓｌ７、Ｖｐｓ２６（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４９３６−４８（１９８８））、Ｖｐｓ２９（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ８：２０５７−６５（１９８９））、Ｖｐｓ３０、Ｖｐｓ３５（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ５１（Ｃｏｎｉｂｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４：１６１０−２３（２００３））、Ｖｐｓ５２、Ｖｐｓ５３、及びＶｐｓ５４（Ｃｏｎｉｂｅａｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１：３０５−２３（２０００））などの、ＰＶＣから後期ゴルジへのＶｐｓ１０の再循環に関連するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を機能的に欠失させる遺伝子変異によって、宿主細胞の液胞選別輸送活性を低下又は喪失させる（Ｓｅａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７：７９−９２，（１９９７）；Ｍｕｌｉｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：３３３−４３（２００１））。Ｖｐｓ１０の再循環に関連するタンパク質のアミノ酸配列を本明細書に示している（図２６参照）。
【００５３】
さらなる実施形態では、Ｃｃｚ１（Ｋｕｃｈａｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１３  Ｐｔ２３：４３０１−１１（２０００））、Ｆａｂ１（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：５２５−３９（１９９５））、Ｈｓｅ１（Ｂｉｌｏｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６３：２３７−４３（２００３））、Ｍｒｌ１（Ｂｏｎａｎｇｅｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３：２４８６−５０１（２００２））、Ｖａｍ３（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：１９９−２０２（１９９７））、Ｖｐｓ２、Ｖｐｓ３、Ｖｐｓ４（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ１１（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ１３、Ｖｐｓｌ６、Ｖｐｓｌ８（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ２０（Ｙｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１６：３９５７−７０（２００３））、Ｖｐｓ２２、Ｖｐｓ２３、Ｖｐｓ２４、Ｖｐｓ２５、Ｖｐｓ２７、Ｖｐｓ２８、Ｖｐｓ３１、Ｖｐｓ３２、Ｖｐｓ３３、Ｖｐｓ３６（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ３７、Ｖｐｓ３９（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、Ｖｐｓ４１（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１１３４４−９（１９９７））、Ｖｐｓ４３（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：５３０８−１９（１９９８））、Ｖｐｓ４４（Ｂｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１：４２７７−９４（２０００））、Ｖｐｓ４６（Ａｍｅｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１：３３６５−８０（２０００））、Ｖｔａｌ（Ｙｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、及びＹｐｔ７（Ｔｓｕｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０９（Ｐｔ  １０）：２４７１−８１（１９９６））などの、適切なＭＶＢ機能及び／又は液胞への融合に関連するタンパク質をコードする遺伝子を遺伝的に欠失させる遺伝子変異によって、宿主細胞の液胞選別輸送活性を低下又は喪失させる。適切なＭＶＢ機能及び／又は液胞への融合に関連するタンパク質のアミノ酸配列を本明細書に示している（図２７参照）。
【００５４】
本明細書に記載の方法の別の実施形態では、Ｖｐｓ６１、Ｖｐｓ６２、Ｖｐｓ６３、Ｖｐｓ６４、Ｖｐｓ６５、Ｖｐｓ６６、Ｖｐｓ６８、Ｖｐｓ６９、Ｖｐｓ７０、Ｖｐｓ７１、Ｖｐｓ７２、Ｖｐｓ７３、Ｖｐｓ７４、及びＶｐｓ７５（Ｂｏｎａｎｇｅｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３：２４８６−５０１（２００２））などの、未知の機構による適切なＣｐｙ液胞ターゲッティングに必要なタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を、機能的に欠失させる遺伝子変異によって、宿主細胞の液胞選別輸送活性を低下又は喪失させる。未知の機構による適切なＣｐｙ液胞ターゲッティングに関連するタンパク質のアミノ酸配列を本明細書に示している（図２８参照）。
【００５５】
本発明は、液胞選別輸送活性を喪失又は低下させることによって酵母細胞で産生される異種タンパク質の収率を増加させる方法であって、液胞選別輸送活性が、化学的、ペプチド、又はタンパク質阻害剤によって抑止又は破壊される方法にも関する。本発明のこの態様では、Ｖｐｓ１０、Ｖｐｓ１０−１又はＶｐｓ１０の他のホモログを妨害するペプチド阻害剤を利用することができ、例えば、Ｐｒｏ−Ｃｐｙのペプチドを発現させながら、対象の異種タンパク質を発現させることができる。Ｐｒｏ−Ｃｐｙペプチドは、Ｖｐｓ１０−１に結合して飽和させることによって、異種タンパク質の結合を妨害する。化学的阻害剤も、液胞選別輸送活性を抑止するために有用である。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、化学的阻害剤は、ソーチン（ｓｏｒｔｉｎ）と呼ばれる小さな化学的阻害剤である。ソーチン類は、植物及び酵母のタンパク質の液胞送達に干渉することが知られている（Ｎｏｒａｍｂｕｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：１（２００８）；Ｚｏｕｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  １０１：９４９７−５０１（２００４））。本発明によると、ソーチン類は酵母の発酵中などの細胞培養に加えられ、それによって液胞選別輸送及び分解がなくなることで、対象の異種タンパク質の収率が増加する。治療用タンパク質の産生にこの方法を使用する場合、後に、精製した組換えタンパク質からソーチンを除去すべきであることは、当業者には理解されよう。
【００５６】
本発明は、異種タンパク質産物の収率を増加させる方法であって、異種タンパク質がＶｐｓ１０結合部位を含み、Ｓ．セレビシエのＶｐｓ１０、又はＰ．パストリスのＶｐｓ１０−１などのＶｐｓ１０ホモログへのタンパク質の結合を防止する改変を異種タンパク質のアミノ酸配列に対して導入するステップを含む方法にさらに関する。実施例１３に記載されるように、選別輸送ペプチドが表面に露出している場合、「ＱＲＰＬ様」選別輸送シグナルを含む組換えタンパク質がＶｐｓ１０に結合し、その組換えタンパク質が酵母液胞に輸送されると考えられる。前述の液胞選別輸送活性を喪失させるための従来方法としては、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログをコードする遺伝子の遺伝子不活性化を介してＶｐｓ１０を標的にする方法が挙げられる。本明細書に記載の別の実施形態では、組換えタンパク質、又はその組換えタンパク質自体をコードする遺伝子は、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０−１などのＶｐｓ１０ホモログへの結合を妨害するように変異させる。ｖａｎ  Ｖｏｏｒｓｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：８４１−６（１９９６）による論文と一致するが、Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１７６）Ｖｐｓ１０選別輸送シグナルのＧｌｎ残基は、Ｖｐｓ１０相互作用にこの残基が必要となるため、本発明のこの実施形態における破壊の標的となる。
【００５７】
従って、本発明は、「ＱＲＰＬ様」選別輸送シグナルを含む改変された組換えタンパク質であって、「ＱＲＰＬ様」選別輸送シグナルのＱ残基が、欠失又は置換のいずれかによって改変される組換えタンパク質にも関する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、ＱＲＰＬ様選別輸送シグナルを含む改変組換えタンパク質を、未改変タンパク質よりも多量に産生する方法であって、（１）上記タンパク質の発現に好都合な条件下の培地中で、酵母又は真菌の宿主細胞に、上記タンパク質をコードする改変ヌクレオチド配列を発現させるステップであって、上記ヌクレオチド配列を、組換えタンパク質のＱＲＰＬ様選別輸送シグナルが機能しなくなるように変異させるステップと、（２）上記タンパク質を宿主細胞又は培地から単離するステップとを含む方法に関する。
【００５９】
本発明の方法に使用される遺伝子操作した宿主細胞を作製するために、基本的にはあらゆる真菌株又は酵母株を使用することができる。液胞選別輸送活性の不活性化によって、例えば、Ｖｐｓ１０又はＶｐｓ１０ホモログの機能的欠失によって、例えばＶｐｓ１０又はＶｐｓ１０タンパク質ホモログをコードする遺伝子の欠失又は破壊によって、前記遺伝子操作した宿主細胞が改変される。
【００６０】
本発明の方法に有用な酵母宿主細胞としては、限定するものではないが、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、ピキア・スチピチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア属、サッカロマイセス属、ピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、及びピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）が挙げられる。
【００６１】
本明細書に記載の方法において有用なさらなる真菌宿主細胞としては、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、及びニューロスプラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。
【００６２】
本明細書に記載の方法の好ましい実施形態では、酵母又は真菌の宿主細胞は、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、ピキア・スチピチス、デバリオマイセス・ハンセニイ、クルイベロミセス・ラクチス、及びハンゼヌラ・ポリモルファからなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、宿主細胞はピキア細胞である。ある好ましい実施形態では、宿主細胞はピキア・パストリス又はサッカロマイセス・セレビシエである。特定の実施形態では、宿主細胞はピキア・パストリスである。
【００６３】
別の態様では、本発明は、Ｖｐｓ１０活性の機能欠失又はノックアウトを含む改変真菌宿主細胞であって、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、宿主細胞に関する。
【００６４】
特定の一実施形態では、本発明は、野生型ピキア・パストリス細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低いピキア・パストリス細胞に関し、この宿主細胞は、Ｖｐｓ１０−１タンパク質、例えば配列番号２０に記載されるＶｐｓ１０−１の機能欠失を含む。このピキア・パストリス細胞は、生物学的タンパク質又は治療用タンパク質などの異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞をさらに形質転換することによって、改変宿主細胞を産生することができる。上記細胞は、その分泌効率が向上することにより、異種タンパク質を高い力価で産生するのに有用となる。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、この宿主細胞は、ＶＰＳ１０−２遺伝子を含み、例えば欠失していない配列番号２１に記載のＶＰＳ１０−２を含む。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態では、宿主細胞において産生される異種タンパク質は糖タンパク質である。上記実施形態では、後述のようにグリコシル化パターンがヒト様である糖タンパク質を産生するために、宿主細胞をさらに改変することが有用となり得る。
【００６６】
同じ種の未改変酵母細胞に対して、液胞選別輸送活性が不足している、又は液胞選別輸送活性が低い本発明の改変酵母宿主細胞は、グリコシル化パターンがヒト様である、又はヒト化されている糖タンパク質を発現するためにさらに改変することができる。この方法での酵母宿主細胞の改変は、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓの米国特許第７，０２９，８７２号及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓらの米国特許出願公開第２００４００１８５９０号に記載されるような選択された内因性グリコシル化酵素の除去、及び／又は外因性酵素の供給によって行うことができる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠失されるように（例えばΔＯＣＨＩ）選択又は設計することができる。
【００６７】
一実施形態では、宿主細胞は１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、α１，２−マンノシダーゼ活性が、最適に作用できる場合に宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同第２００５／０１７０４５２号には、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生可能な下等真核生物宿主細胞が開示されている。
【００６８】
さらなる一実施形態では、宿主細胞はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が、最適に作用できる場合に宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同第２００５／０１７０４５２号には、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生可能な下等真核生物宿主細胞が開示されている。
【００６９】
さらに別の一実施形態では、宿主細胞はマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、マンノシダーゼＩＩ活性が、最適に作用できる場合に宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号には、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生可能な下等真核生物宿主細胞が開示されている。
【００７０】
さらなる一実施形態では、宿主細胞はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性が、最適に作用できる場合に宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び第２００５／０１７０４５２号には、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生可能な下等真核生物宿主細胞が開示されている。
【００７１】
さらなる一実施形態では、宿主細胞はガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が、最適に作用できる場合に宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２又はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム、或いはそれらの混合物を含む糖タンパク質を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号には、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを産生可能な下等真核生物宿主細胞が開示されている。
【００７２】
さらなる一実施形態では、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性が、宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム又はＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム、或いはそれらの混合物を主に含む糖タンパク質を産生する。宿主細胞が、Ｎ−グリカンに転移させるためのＣＭＰ−シアル酸を提供する手段をさらに含むと有用である。米国特許出願公開第２００５／０２６０７２９号には、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝子改変する方法が開示されており、及び米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号には、シアル化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝子改変する方法が開示されている。
【００７３】
上記の宿主細胞はいずれも、米国特許出願公開第２００４／０７４４５８号及び第２００７／００３７２４８号に開示されているような二分岐（ＧｎＴ  ＩＩＩ）及び／又は多分岐（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、及びＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生するために、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、及びＧｎＴ  ＩＸからなる群から選択される１つ以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをさらに含むことができる。
【００７４】
さらに別の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が、宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む糖タンパク質を産生する。
【００７５】
さらなる一実施形態では、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに含み、この触媒ドメインは、通常はその触媒ドメインとは関連しない細胞標的シグナルペプチドに融合し、シアリトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性が、宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を標的とするように選択される。これらの宿主細胞は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する。
【００７６】
上記の種々の宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター（例えば、クルイベロミセス・ラクチス及びハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター）、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）、及びＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（例えば、ヒトのシアル酸トランスポーター）などの１つ以上の糖トランスポーターをさらに含む。ピキア・パストリスは上記トランスポーターを有さないため、上記トランスポーターを含むようにピキア・パストリスを遺伝子改変することが好ましい。
【００７７】
宿主細胞タンパク質に対する抗体の検出可能な交差反応性を減少又は喪失させるために、組換え糖鎖工学によって得られた酵母宿主細胞は、遺伝子改変によって、１つ以上のβ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、及びＢＭＴ４）の欠失又は破壊によってα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質をなくすことができ（米国特許出願公開第２００６／０２１１０８５号参照）、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂの一方又は両方の欠失又は破壊によってホスホマンノースを有する糖タンパク質をなくすことができ（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号及び第７，２５９，００７号）、さらなる態様ではＭＮＮ４Ａ遺伝子の欠失又は破壊を含むことができる。破壊としては、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームの破壊、またオープンリーディングフレームの発現の破壊、又はＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡなどを使用した１つ以上のβ−マンノシルトランスフェラーゼ及び／又はホスホマンノシルトランスフェラーゼをコードするＲＮＡの翻訳の抑止が挙げられる。宿主細胞は、特定のＮ−グリカン構造を産生する様に改変された前述の宿主細胞のいずれか１つをさらに含むことができる。
【００７８】
本明細書に開示される方法の実施に使用できる制御配列としては、シグナル配列、プロモーター、及び転写ターミネーター配列が挙げられる。プロモーターの例としては、限定するものではないが、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、エクジソン、レチノイド、甲状腺）、金属調節性プロモーター、病原体調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、及び光調節性プロモーターなどの多数の種からのプロモーターが挙げられる。糖技術分野において公知の調節可能なプロモーターシステムの具体例としては、限定するものではないが、金属誘導性プロモーターシステム（例えば、酵母銅−メタロチオネインプロモーター）、植物除草剤サフナー（ｓａｆｎｅｒ）活性化プロモーターシステム、植物熱誘導性プロモーターシステム、植物及び哺乳動物ステロイド誘導性プロモーターシステム、Ｃｙｍリプレッサー−プロモーターシステム（Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州オールバニー（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ））、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ））、ベンゾエート誘導性プロモーターシステム（国際公開第２００４／０４３８８５号参照）、並びにレトロウイルス誘導性プロモーターシステムが挙げられる。糖技術分野において公知の他の特異的調節性プロモーターシステムとしては、テトラサイクリン調節性システム（例えば、Ｂｅｒｅｎｓ  ＆  Ｈｉｌｌｅｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：３１０９−３１２１（２００３））、ＲＵ  ４８６誘導性システム、エクジソン誘導性システム、及びカナマイシン調節性システムが挙げられる。下等真核生物特異的プロモーターとしては、限定するものではないが、サッカロマイセス・セレビシエのＴＥＦ−１プロモーター、ピキア・パストリスのＧＡＰＤＨプロモーター、ピキア・パストリスのＧＵＴ１プロモーター、ＰＭＡ−１プロモーター、ピキア・パストリスのＰＣＫ−１プロモーター、並びにピキア・パストリスのＡＯＸ−１及びＡＯＸ−２プロモーターが挙げられる。
【００７９】
転写ターミネーター配列の例としては、限定するものではないが、サッカロマイセス・セレビシエのチトクロムＣターミネーター、並びにピキア・パストリスのＡＬＧ３及びＰＭＡ１ターミネーターなどの多数の種及びタンパク質の転写ターミネーターが挙げられる。
【００８０】
酵母選択性マーカーとしては、薬物耐性マーカー、及び酵母宿主細胞がアミノ酸などの必須細胞栄養素を合成できるようにする遺伝子機能が挙げられる。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーとしては、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキサート、Ｇ４１８（ジェネテシン）、Ｚｅｏｃｉｎなどが挙げられる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成できるようにする遺伝子機能遺伝子機能は、対応するゲノム機能に栄養要求性変異を有する入手可能な酵母株とともに使用される。一般的な酵母選択性マーカーでは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１及びＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リジン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１又はＡＤＥ２）などを合成する遺伝子機能が得られる。他の酵母選択性マーカーとしては、Ｓ．セレビシエのＡＲＲ３遺伝子が挙げられ、これは亜ヒ酸塩の存在下で増殖する酵母細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与する（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。
【００８１】
多数の好適な挿入部位としては、米国特許出願公開第２００７／００７２２６２号に列挙されているものが挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ並びにその他の酵母又は真菌に関して知られている遺伝子座のホモログが挙げられる。酵母にベクターを挿入する方法は周知であり、例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、国際公開第２００１３６８６５号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／１３７１９号が参照される。挿入部位の例としては、限定するものではないが、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ遺伝子、ピキアＴＲＰ（ＴＲＰ１からＴＲＰ２を含む）遺伝子、ピキアＭＣＡ遺伝子、ピキアＣＹＭ遺伝子、ピキアＰＥＰ遺伝子、ピキアＰＲＢ遺伝、及びピキアＬＥＵ遺伝子が挙げられる。ピキアＡＤＥ１及びＡＲＧ４遺伝子は、Ｌｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）及び米国特許第４，８１８，７００号に記載されており、ＨＩＳ３及びＴＲＰ１遺伝子は、Ｃｏｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５６１８０に記載されている。
【００８２】
本明細書において記載されるすべての刊行物は、本発明と関連して使用することができる方法及び材料を説明及び開示する目的で、参照により組み入れられる。本発明は本明細書において、先行発明であるとして、このような開示に先行すると見なされるものではない。
【００８３】
添付の図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明がこれらの厳密な実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲及び意図から逸脱せずに、それらの種々の変更及び修正を当業者によって行えることが理解される。
【００８４】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８５】
材料及び方法：
【実施例１】
【００８６】
株及び培地
大腸菌株ＴＯＰ１０を組換えＤＮＡ作業に使用した。この実験に使用される、すべてのプライマー及びプラスミド並びに選択されたピキア・パストリス株を図１０及び１１に列挙している。タンパク質発現は、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）及び緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）を使用して行った。ＢＭＧＹ培地は、増殖培地として、２％マートン（ｍａｒｔｏｎｅ）、ｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１．３４％酵母窒素塩基、０．００００２％ビオチン、２％グリセロールからなった。ＢＭＭＹは、グリセロールの代わりに誘導培地として１％メタノールを使用したことを除けば、ＢＭＧＹと同じ成分を含有した。ＹＭＤ培地は、２％マートン、２％デキストロース、及び２％寒天からなり、寒天プレート上でピキア・パストリス株を増殖させるために使用した。制限酵素及び修飾酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））より購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ））から入手した。塩及び緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス（．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から入手した。
【実施例２】
【００８７】
酵母株の形質転換
発現／挿入ベクターを使用した酵母の形質転換については後述している（Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２３−５２（２０００））。ピキア・パストリス株を５０ｍＬのＹＭＤ培地中で０．２〜６．０の範囲のＯＤまで終夜増殖させた。氷上で３０分間の温置の後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。培地を除去し、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄した。得られた細胞ペレットを次に０．５ｍｌの氷冷滅菌１Ｍソルビトール中に浮遊させた。１０μＬの線状化ＤＮＡ（１−１０μｇ）及び１００μｇの細胞浮遊液をエレクトロポレーションキュベット中で混合し、氷上で５分間温置した。エレクトロポレーションをＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））を使用して行い、続いてプリセットのピキア・パストリスプロトコル（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）を行った。エレクトロポレーションの直後、１ｍＬのＹＭＤＳ回復培地（ＹＭＤ培地＋１Ｍソルビトール）を混合物に加えた。形質転換された細胞を、４時間から終夜までの範囲の時間、室温（２６℃）において回復させた。細胞回復後、細胞を選択培地上に載せた。
【実施例３】
【００８８】
Ｐ．パストリスのＶｐｓ１０ホモログの同定
Ｓ．セレビシエの４つのＶｐｓ１０ホモログ（Ｖｐｓ１０ｐ／Ｐｅｐ１ｐ／Ｖｐｔ１ｐ（配列番号２２）、Ｖｔｈ１ｐ（配列番号２３）、Ｖｔｈ２ｐ（配列番号２４）、及びＹＮＲ０６５Ｃ（配列番号２５））のタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）から入手した。実施例１４で考察したように、４つのＳ．セレビシエタンパク質（前述）を使用して、ＴＢＬＡＳＴＮコンピューター検索で（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５（３）：４０３−１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））所有のピキア・パストリスゲノムに対して行って、可能性のあるＶＰＳ１０遺伝子ホモログをピキア・パストリスにおいて同定した。ＶＰＳ１０−１及びＶＰＳ１０−２と名付けられた２つのピキア遺伝子ホモログを同定した。Ｖｐｓ１０−１（配列番号１４）及びＶＰＳ１０−２（配列番号１５）のゲノムＤＮＡ配列をそれぞれ図１３及び１４に示している。Ｖｐｓ１０−１ｐ（配列番号２０）及びＶｐｓ１０−２ｐ（配列番号２１）の翻訳されたタンパク質配列をそれぞれ図１５及び１６に示している。Ｐ．パストリスＶｐｓ１０ｐホモログのアミノ酸配列と、Ｓ．セレビシエＶｐｓ１０ｐ、及びその他の真菌株との比較を図１２中に示している。
【実施例４】
【００８９】
遺伝子欠失プラスミドの作製
ＶＰＳ１０−１遺伝子のオープンリーディングフレームを欠失させ、液胞選別輸送受容体（Ｖｐｓ１０−１ｐ）活性を欠く酵素株を作製するために、プラスミドｐＧＬＹ５１９２を構築した（図１参照）。ｖｐｓ１０−１ΔノックアウトプラスミドｐＧＬＹ５１９２を作製するために、最初に、通常のＰＣＲ条件を使用し、プライマーＭＡＭ３３８（配列番号１）及びＭＡＭ３３９（配列番号２）、並びにテンプレートとしてのピキア・パストリスＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０株ゲノムＤＮＡを使用して、上流５’フランキング領域を増幅した。上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６１０−６２３８）、及び下流相同フラグメントを含めたピキア・パストリスＶＰＳ１０−１ゲノム領域のヌクレオチド配列を図１３Ａ〜１３Ｇ及び配列番号１４に示している。
【００９０】
この結果得られたＰＣＲフラグメントを、制限酵素ＳａｃＩ及びＰｍｅＩを使用してｐＧＬＹ２２ｂ中にクローン化して、ｐＧＬＹ５１９１を作製した。プライマーＭＡＭ３４０（配列番号３）及びＭＡＭ３４１（配列番号４）、並びにテンプレートとしてのピキア・パストリスＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０株ゲノムＤＮＡを使用して、下流３’フランキング領域を増幅した。この結果得られたフラグメントを、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｗａＩを使用してｐＧＬＹ５１９１中にクローン化して、ｐＧＬＹ５１９２を作製した。忠実度を確認するために、ｐＧＬＹ５１９２の上流５’及び下流３’の両方のフラグメントの配列を決定した。
【００９１】
ＶＰＳ１０−２遺伝子のオープンリーディングフレームを欠失させ、液胞選別輸送受容体ホモログ（Ｖｐｓ１０−２ｐ）活性を欠いた酵母株を作製するために、プラスミドｐＧＬＹ５１９４を構築した（図１参照）。Ｖｐｓ１０−２ΔノックアウトプラスミドｐＧＬＹ５１９４を作製するために、最初に、通常のＰＣＲ条件を使用し、プライマーＭＡＭ４３９（配列番号５）及びＭＡＭ３４３（配列番号６）、並びにテンプレートとしてのピキア・パストリスＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０株ゲノムＤＮＡを使用して、上流５’フランキング領域を増幅した。上流相同フラグメント、プロモーター、オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド８３０−４５０９）、及び下流相同フラグメントを含めたピキア・パストリスＶＰＳ１０−２ゲノム領域のヌクレオチド配列を図１４Ａ〜１４Ｅ及び配列番号１５に示している。
【００９２】
この結果得られたフラグメントを、制限酵素ＳａｃＩ及びＰｍｅＩを使用してｐＧＬＹ２２ｂ中にクローン化して、ｐＧＬＹ５１９３を作製した。プライマーＭＡＭ４４０（配列番号７）及びＭＡＭ３４５（配列番号８）、並びにテンプレートとしてのピキア・パストリスＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０株ゲノムＤＮＡを使用して、下流３’フランキング領域を増幅した。この結果得られたフラグメントを、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳｗａＩを使用してｐＧＬＹ５１９３中にクローン化して、ｐＧＬＹ５１９４を作製した。忠実度を確認するために、ｐＧＬＹ５１９４の上流５’及び下流３’の両方のフラグメントの配列を決定した。
【実施例５】
【００９３】
ＧＣＳＦを発現するピキア・パストリス株の作製
ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）の顆粒球−サイトカイン刺激因子タンパク質（ＧＣＳＦ、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿７５７３７３）をコードするＤＮＡをＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ））によって合成し、ｐＵＣ１９プラスミド中に挿入して、ｐＧＬＹ４３１６の名称のプラスミドを作製した（図２、配列番号１６及び配列番号１６８参照）。
【００９４】
通常のＰＣＲ条件を使用し、プライマーＭＡＭ２２７（配列番号１０）及びＭＡＭ２２８（配列番号１１）を使用して、ｐＧＬＹ４３１６から増幅することによって、ＧＣＳＦを含有する次のプラスミドを構築した。ＰＣＲプライマーＭＡＭ２７は、成熟ＧＣＳＦタンパク質（ＧＣＳＦｐ）をコードするＤＮＡの５’末端にＸｈｏＩ及びＭｌｙＩ制限部位を導入し、ＧＣＳＦｐをコードするＤＮＡの３’末端にＦｓｅＩ部位を導入した。ＧＣＳＦを分泌経路に向かわせる接合因子−ＩＬ１βシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメント（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｉ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８；３３７（２）：５５７−６２．（２００５）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１５（５）：８８４−９０（１９９９））を、ＥｃｏＲＩ及びＭｌｙＩ消化によって、プラスミドｐＧＬＹ４３２１から除去した。ＰＣＲ増幅産物をＦｓｅＩ及びＭｌｙＩで消化し、フラグメントをコードするシグナルペプチドで、ＥｃｏＲＩ及びＦｓｅＩで消化したプラスミドｐＧＬＹ１３４６中にトリプルライゲーション（ｔｒｉｐｌｅ−ｌｉｇａｔｅ）して、プラスミドｐＧＬＹ４３３５が作製され（図２参照）、ここで、成熟ＧＣＳＦをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端は、フレーム中で、シグナルペプチドをコードＯＲＦの３’末端とライゲーションされ、成熟ＧＣＳＦのＮ末端がシグナルペプチドのＣ末端に融合した融合タンパク質が産生される。
【００９５】
プライマーＭＡＭ２８１（配列番号９）及びＭＡＭ２２８（配列番号１１）を使用してＰＣＲによってｐＧＬＹ４３３５からＧＣＳＦオープンリーディングフレームを増幅した。このＰＣＲ増幅産物をＭｌｙＩ及びＦｓｅＩ制限酵素で消化した（図２）。プライマーＭＡＭ２８１は、ＧＣＳＦ  ＯＲＦを有するフレーム中にＡＴＧコドンを有する。従って、この結果得られたＰＣＲで増幅され消化された産物は、成熟ＧＣＳＦをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端にインフレーム付加されたＡＴＧ翻訳開始コドンを有する。この結果得られたフラグメントは、インフレーム付加された「ＡＴＧ」ヌクレオチド（Ｎ末端メチオニンをコードする）を有し、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サウザンドオークス（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ））タンパク質配列（配列番号１７２）と同一である。
【００９６】
Ｐ．パストリスＣＬＰ１遺伝子（配列番号１７）の増幅を、通常のＰＣＲ条件を使用し、ピキア・パストリス株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０の染色体ＤＮＡから、プライマーＭＡＭ３０４（配列番号１２）ＭＡＭ３０５（配列番号１３）を使用して行い、ＥｃｏＲ１及びＳｔｕ１制限酵素で消化した。Ｐ．パストリスのＣＬＰ１（ＰｐＣＬＰｌ）をコードするＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ消化フラグメント、ｒＨｕＭｅｔＧＣＳＦコードするＭｌｙＩ／ＦｓｅＩ消化フラグメント、及びプラスミドｐＧＬＹ１３４６（ＥｃｏＲＩ及びＦｓｅＩで消化）との３片のライゲーション反応を行って、図２に示されるプラスミドｐＧＬＹ５１７８を作製した。忠実度を確認するためにインサートＤＮＡの配列を決定した。
【００９７】
ｐＧＬＹ５１７８プラスミド中には、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）プロモーターも含まれ、これはＣＬＰ１−ＧＣＳＦ融合体の完全なＯＲＦの発現を誘導し、これは、完全なＰｐＣｌｐ１タンパク質配列に続いて、リンカー配列「ＧＧＧＳＬＶＫＲ」（配列番号１７５）及びｒｈＭｅｔ−ＧＣＳＦ（配列番号：１８及び１７０）を含む。メタノール含有培地中でのＤＮＡ転写後、転写されたｍＲＮＡはＣｌｐ１ｐシグナルペプチドによって小胞体に入る。このポリペプチドは、ゴルジ装置中Ｋｅｘ２プロテアーゼによってさらにプロセッシングされ、それによって、リンカー配列中のアルギニン残基の後で開裂し、Ｃｌｐ１及びＭｅｔ−ＧＣＳＦの２つのタンパク質を上澄み分画に放出する（米国特許出願公開第２００６／０２５２０６９号参照）。プロセッシングされ分泌されたＣｌｐ１及びＭｅｔ−ＧＣＳＦのタンパク質配列を配列番号１７１及び１７２に示している。Ｍｅｔ−ＧＣＳＦを発現するために、プラスミドｐＧＬＹ５１７８を制限酵素ＰｍｅＩで線状化し、ロールインシングルクロスオーバー相同組換えによる株ＹＧＬＹ８０６９の形質転換に使用して、株ｙＧＬＹ８５３８を作製した（図４参照）。この株は、ＡＯＸ１座中に挿入されたｒＨｕＭｅｔＧＣＳＦをコードする発現カセットを数コピー含有する。この株はｒＨｕＭｅｔＧＣＳＦを培地中に分泌する。株ＹＧＬＹ８５３８の遺伝子型は、ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１Δ  ｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ  ＰＲＯ１：：ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳＩ／ＦＢ５３  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ  ｄａｐ２Δ：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ  ｓｔｅ１３Δ：：ＮａｔＲ  ＡＯＸ１：Ｓｈ  ｂｌｅ／ＡＯＸ１ｐ／ＣＬＰ１−ＧＧＧＳＬＶＫＲ−ＭｅｔＧＣＳＦである。
【実施例６】
【００９８】
ｙＧＬＹ８５３８変異株の作製
ｙＧＬＹ８５３８（図４参照）からの同質遺伝子の酵母変異株の作製を、前述のような相同組換えによって行った（Ｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９−９０（２００３））。所望のオープンリーディングフレームの上流及び下流に約１０００ｂｐフランキングＤＮＡを含有する線状化プラスミドで、親のｕｒａ５Δ株を形質転換した。変異形質転換体は、ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺカセットを加えたＵＲＡドロップアウトプレート上で選択し（Ｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，前出）、正確な遺伝子プロファイルを確認するためにＰＣＲにより分析した。プラスミドｐＧＬＹ５１９２（ｖｐｓ１０−１Δ）及びｐＧＬＹ５１９４（ｖｐｓ１０−２Δ）をこの実験の突然変異生成のために使用した。変異株の拡大のフローチャートを図６に示す。
【００９９】
株ｙＧＬＹ９９３３及びｙＧＬＹ１０５６６は、ｙＧＬＹ８５３８をそれぞれｐＧＬＹ５１９２（ｖｐｓ１０−１Δ）及びｐＧＬＹ５１９４（ｖｐｓ１０−２Δ）で形質転換することによって得た。さらに、ｙＧＬＹ９９３３の対抗選択によって二重ノックアウト（ｖｐｓ１０−１Δ／ｖｐｓ１０−２Δ）を構築して、ｙＧＬＹ９９８２を作製した。プラスミドｐＧＬＹ５１９４をｙＧＬＹ９９８２中にエレクトロポレーションして、ｖｐｓ１０−１Δ／ｖｐｓ１０−２Δ遺伝子型を有する株ｙＧＬＹ１０５５７を作製した。
【実施例７】
【０１００】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを発現するピキア・パストリス株の作製
腫瘍壊死因子アンタゴニストＴＮＦＲＩＩ−ＦｃコードするＤＮＡ（米国特許出願公開第６１／２５６３６９号）をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（ドイツのレーゲンスブルク（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））によって合成した。全タンパク質を、ＴＯＰＯ  クローン化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）して、ｐＧＬＹ３４５２を作製した。ＴＮＦＰＩＩ−ＦｃのオープンリーディングフレームＰｖｕＩＩ及びＦｓｅＩにより開放し、これを合成オリゴヌクレオチドから得られるＨＳＡシグナルペプチドでクローン化し、ＥｃｏＲＩ及びＭｌｙＩで消化して、プラスミド主鎖ｐＧＬＹ２１９８（ＥｃｏＲＩ及びＦｓｅｌ）を得た。大腸菌のトリプルライゲーション及び形質転換によって、発現プラスミドｐＧＬＹ３４６５を得た（図３参照）。ＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのＤＮＡ配列及びタンパク質配列をそれぞれ配列番号１９及び１７４に示している。
【０１０１】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを発現するために、ｐＧＬＹ３４５６をＳｐｅＩで線形化し、株ｙＧＬＹ８２９２（ＶＰＳ１０−１）、ｙＧＬＹ９９９２（ｖｐｓ１０−１Δ）、及びｙＧＬＹ９９９３（ｖｐｓ１０−１Δ）にエレクトロポレーションした。図５中に示されるようなプラスミドｐＧＬＹ５１９２を使用して、ｙＧＬＹ８２９２から誘導されるｖｐｓ１０−１Δ変異株を作製した。
【実施例８】
【０１０２】
バイオリアクタースクリーニング及び発酵方法
バイオリアクタースクリーニング：ｒｈＧＣＳＦ発現のバイオリアクタースクリーニングは、０．５Ｌの容器中、ＳＩＸＦＯＲＳ多重発酵システム（ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、メリーランド州ローレル（Ｌａｕｒｅｌ、ＭＤ））中で、以下の条件下で行った：６．５ｐＨ、２４℃、０．３標準リットル／分、及び初期撹拌機速度５５０ｒｐｍ。初期作業体積は３５０ｍＬであり、これは、３３０ｍＬのＢＭＧＹ培地及び２０ｍＬの接種材料からなった。ＩＲＩＳ多重発酵槽ソフトウェア（ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、メリーランド州ローレル（Ｌａｕｒｅｌ、ＭＤ））を使用して、接種から１時間後に開始して１０時間かけて撹拌機速度を５５０ｒｐｍから１２００ｒｐｍまで直線的に増加させた。種培養（１Ｌのバッフル付きフラスコ中２００ｍＬのＢＭＧＹ）は、寒天プレートから直接接種した。種フラスコを２４℃で７２時間温置して、光学密度（ＯＤ６００）を９５〜１００の間に到達させた。発酵槽に、遠心分離によって２０ｍＬまで濃縮した２００ｍＬの定常期フラスコ培養を接種した。バッチ段階は、初期投入グリセロール（１８〜２４ｈ）発酵の完了で終了し、続いて、１７ｍＬのグリセロール供給溶液（５０％［ｗ／ｗ］のグリセロール、５ｍｇ／Ｌのビオチン、１２．５ｍＬ／ＬのＰＴＭ１塩（６５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、９ｇ／ＬのＨ２ＳＯ４、６ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、５ｇ／ＬのＨ２ＳＯ４、３ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５００ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ／ＬのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ／Ｌのビオチン、８０ｍｇ／ＬのＮａＩ、２０ｍｇ／ＬのＨ３ＢＯ４））を加えることによって、第２のバッチ段階を開始した。溶存酸素の急激な増加によって示される第２のバッチ段階の終了後、メタノール供給溶液（１００％ＭｅＯＨ  ５ｍｇ／Ｌのビオチン、１２．５ｍＬ／ＬのＰＴＭ１）を０．６ｇ／ｈで３２〜４０時間供給することによって、誘導段階を開始した。培養は、遠心分離によって収穫した。
【０１０３】
プラットフォーム発酵法：バイオリアクター培養を、３Ｌ及び１５Ｌのガラス製バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））、並びに４０Ｌステンレス鋼製定置蒸気滅菌バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。種培養は、１％体積比の凍結ストックバイアルを使用してＢＭＧＹ培地を直接接種することによって調製した。種フラスコを２４℃で４８時間温置すると、２０±５の光学濃度（ＯＤ６００）が得られ、移した後に細胞が指数関数的に増殖したことを確認した。培地は、４０ｇのグリセロール、１８．２ｇのソルビトール、２．３ｇのＫ２ＨＰＯ４、１１．９ｇのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇの酵母抽出物（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））、２０ｇのペプトン（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））、４×１０−３ｇのビオチン、及び１３．４ｇの酵母窒素塩基（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））を１リットル当たりに含有した。バイオリアクターには、種対初期培地が１０％の体積比で接種した。培養は流加培養法により以下の条件で行った：温度は２４±０．５℃に設定し、ＮＨ４ＯＨを使用してｐＨを６．５±０．１に調整し、Ｏ２をカスケード撹拌速度で加えることによって溶存酸素を１．７±０．１ｍｇ／Ｌに維持した。気流速度は０．７ｖｖｍに維持した。初期投入グリセロール（４０ｇ／Ｌ）が消費された後、５０％（ｗ／ｗ）グリセロール溶液（１２．５ｍｌ／ＬのＰＴＭ２塩及び１２．５ｍｌ／Ｌの２５Ｘビオチンを含有）を、５．３３ｇ／Ｌ／ｈｒで開始して（最大増殖速度の５０％）、８時間の間、０．０８ｈ−１の速度で指数関数的に供給した。３０分間の飢餓段階の後、誘導を開始して、メタノール（１２．５ｍｌ／ＬのＰＴＭ２塩及び１２．５ｍｌ／Ｌの２５Ｘビオチンを含有）を指数関数的に供給し、２ｇ／Ｌ／ｈｒで開始して０．０１ｈ−１の比増殖速度を維持した。
【０１０４】
ＹＧＬＹ８５３８の場合、高メタノール供給速度（メタノール供給速度を６時間で２．３３ｇ／Ｌ／ｈｒから６．３３ｇ／Ｌ／ｈｒまで増加させ、誘導時全体で６．３３ｇ／Ｌ／ｈｒを維持した）を使用し、０．６８ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ  ８０をメタノールに加えることによって、ｒＨｕＭｅｔＧＣＳＦを作製した。この株及び後の株でプロセスが改善されるので、発酵ｐＨを５．０まで下げた。
【０１０５】
ＹＧＬＹ９９３３の場合、高メタノール供給速度、０．６８ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ  ８０、発酵ｐＨ５．０を使用した。
【実施例９】
【０１０６】
深型ウェル誘導プレート
深型ウェルプレートスクリーニングを使用して、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの力価の改善を測定した。形質転換体を６００μＬのＢＭＧＹに接種し、２４℃においてマイクロプレートシェーカー中８４０ｒｐｍで２日間増殖させた。この結果得られた５０のμＬの種培養を、ウェル当たり６００μＬのＢＭＧＹが入れられた２つの９６ウェルプレートに移し、前述と同じ培養条件で２日間温置した。２つの増殖プレートを１つのプレートにまとめ、次に１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、ウェル当たり６００μＬのＢＭＭＹ中で２日間誘導して、次に遠心分離して得られた４００μＬの透明上澄み液をＥＬＩＳＡにより分析した。
【実施例１０】
【０１０７】
ＧＣＳＦ力価測定
透明上澄み分画のＧＣＳＦ力価を、標準ＥＬＩＳＡプロトコルで分析した。簡潔に述べると、ポリクローナル抗ＧＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、カタログ番号ＭＡＢ２１４）を、９６ウェル高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、カタログ番号３９２２）上に塗布し、ブロックし、洗浄した。ｒｈＧＣＳＦタンパク質標準物質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、カタログ番号２１４−ＣＳ）及び無細胞上澄み液の連続希釈物を上記プレートに塗布し、１時間温置した。洗浄ステップの後、モノクローナル抗ＧＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、カタログ番号ＡＢ−２１４−ＮＡ）をプレートに加え、１時間温置した。洗浄後、アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、カタログ番号３１３２５）を加え、１時間温置した。プレートを洗浄し、蛍光検出試薬４−ＭＵＰＳを加え、暗所で温置した。蛍光強度を、３４０ｎｍ励起及び４６５ｎｍ発光特性を有するＴＥＣＡＮ蛍光計（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｌｔｄ．、スイスのメンネドルフ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を使用して測定した。
【実施例１１】
【０１０８】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ力価測定
透明上澄み分画のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ力価を、標準ＥＬＩＳＡプロトコルで分析した。簡潔に述べると、モノクローナル抗ヒトｓＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦｌＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、カタログ番号ＭＡＢ７２６）を９６ウェル高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、カタログ番号３９２２）上に塗布し、ブロックし、洗浄した。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質標準物質（市販のＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ、カリフォルニア州サウザンドオークス（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ））及び無細胞上澄み液の連続希釈物を上記プレートに塗布し、１時間温置した。洗浄ステップの後、ポリクローナル抗ヒトｓＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦｌＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、カタログ番号ＡＢ−２６−ＰＢ）をプレートに加え、１時間温置した。洗浄後、アルカリホスファターゼ共役ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（登録商標）、カタログ番号ＳＣ−２０２２）を加え、１時間温置した。プレートを洗浄し、蛍光検出試薬４−ＭＵＰＳを加え、暗所で温置した。蛍光強度を、３４０ｎｍ励起及び４６５ｎｍ発光特性を有するＴＥＣＡＮ蛍光計を使用して測定した。
【実施例１２】
【０１０９】
細胞溶解測定
細胞溶解は、発酵上澄み中の二本鎖ＤＮＡの量を分析することによって測定した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））を使用して、製造者の提案によりｄｓＤＮＡのアッセイを行った。
【０１１０】
結果：
【実施例１３】
【０１１１】
ヒトＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃは正準Ｖｐｓ１０結合配列を有する
サッカロマイセス・セレビシエでは、Ｖｐｓ１０（Ｐｅｐ１又はＶｐｔ１としても公知である）受容体は、「ＱＲＰＬ様」選別輸送シグナル（Ｇｌｎ２４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ〜Ｌｅｕ２７、配列番号１７６）を介してプロカルボキシペプチダーゼｙ（プロＣｐｙ、Ｐｒｃ１としても公知である）の結合、及びプロＣｐｙの液胞への輸送に関与している（Ｍａｒｃｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７７：５７９−８６（１９９４）；Ｖａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４８：８８７−９７（１９８７））。以前の研究は、結合相互作用を調べるためにＳ．セレビシエにおけるＣｐｙの選別輸送に集中していた。これらの研究によって、それぞれが異なるリガンド結合親和性を有する、Ｖｐｓ１０細胞内腔受容体ドメインの２つの領域が同定された（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６０：４６１−９（１９９９）；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０８９−１０２（１９９５）；及びＣｏｏｐｅｒ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３３：５２９−４１（１９９６））。さらに、ｖａｎ  ｖｏｏｒｓｔ及び共同研究者（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：８４１−６（１９９６））は、アミノ末端付近のＣｐｙ「ＱＲＰＬ」ペプチドの突然変異生成を行うことで、液胞選別輸送の効率のための配列保存の必要条件を求めた。これらの分析によって、Ｇｌｎ２４の位置以外では、Ｖｐｓ１０との相互作用に影響が生じたり誤選別が生じたりすることなく、多重置換を発生させることができることがわかった。Ｓ．セレビシエのＶｐｓ１０受容体は、「ＱＲＰＬ様」選別輸送ドメインが関与しない未知の機構で、大腸菌β−ラクタマーゼなどの組換えタンパク質と相互作用することも示されている（Ｈｏｌｋｅｒｉ  ａｎｄ  Ｍａｋａｒｏｗ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４２９：１６２−６（１９９８））。Ｓ．セレビシエでは、以前の研究によって、選別輸送活性を有する可能性があるＶｐｓ１０の３つのさらなるホモログ（Ｖｔｈ１、Ｖｔｈ２、ＹＮＲ０６５Ｃ、図１２参照）が同定されている（Ｃｏｏｐｅｒ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３３：５２９−４１（１９９６）；Ｗｅｓｔｐｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（２０）：１１８６５−７０（１９９６）；Ｔａｒａｓｓｏｖ  Ｋ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０（５８８２）：１４６５−７０（２００８））。
【０１１２】
本発明者らは、Ｖｐｓ１０選別輸送配列の特性を有する、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃのアミノ末端付近の配列を同定した（ｖａｎ  Ｖｏｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９６），前出）。これらの配列は、ＧＣＳＦの場合は「ＱＳＦＬ」（配列番号１７７）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿７５７３７３又は配列番号１６８参照）であり、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの場合は「ＱＶＡＦ」（配列番号１７８）（配列番号１７４参照）である。後述の表１に示されるように、ｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの推定上のＶｐｓ１０結合ドメインの４つのアミノ酸位置のそれぞれを、以前のＣｐｙ液胞ターゲッティングの突然変異生成結果（Ｔａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  １０３：３１３５−４０，１１（２００６）；ｖａｎ  Ｖｏｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），前出）と比較した。ｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの選別輸送ペプチドのアミノ酸を、それぞれの変異プロＣｐｙタンパク質と比較すると、すべての変異で８５％以上の活性が示されたと報告されている（前出のｖａｎ  Ｖｏｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）の図３参照）。これらのデータは、ｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの選別輸送ペプチドが、表面に露出している場合にＶｐｓ１０受容体に結合して、組換えタンパク質を酵母液胞に向かわせる可能性があることを示している。
【表１】
2013509180.tif 000002
【０１１３】
さらに、両方のペプチドは、Ｖｐｓ１０と相互作用可能なそれぞれのタンパク質の表面露出領域に位置する（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５１６７−７１（１９９３）、Ｔａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），前出）。Ｎ末端選別輸送配列及びそれらの表面露出によるＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−ＦＣのＶｐｓ１０受容体への結合の可能性に基づいて、本発明者らは、Ｐ．ｐ．ＶＰＳ１０ホモログ中の変異により、液胞選別輸送を喪失することによって、ｒｈＧＣＳＦ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの分泌収率が改善されると仮定した。
【実施例１４】
【０１１４】
Ｐ．パストリスのＶｐｓ１０のホモログ
ピキア・パストリスのゲノムＤＮＡ配列のＴＢｌａｓｔＮ検索によって、ピキア・パストリス中にＶＰＳ１０の２つの遺伝子ホモログが明らかになり、Ｖｐｓ１０−１及びＶＰＳ１０−２と名付けられた（実施例３参照）。Ｓ．セレビシエ及びＰ．パストリスのＶｐｓ１０タンパク質ホモログの比較を図１２に示している。Ｓ．ｃ．Ｖｐｓ１０が１５７９ａａであるのに対し、Ｐ．ｐ．Ｖｐｓ１０−１は２９．９９％の同一性であり（１５４２ａａ）、Ｐ．ｐ．Ｖｐｓ１０−２は２５．４％の同一性（１５０２ａａ）であった。Ｐ．ｐ．Ｖｐｓ１０−１及びＶｐｓ１０−２タンパク質の間の配列比較によって、４１．０％の類似性及び２６．８％の同一性であることがわかった。Ｓ．ｃ．Ｖｐｓ１０と同様に、両方のＰ．パストリスタンパク質は、小胞体中に入るための予測されたＮ末端シグナルペプチド、２つのＣ末端リッチ領域、及びＣ末端付近に１つの予測される膜貫通ドメインを有する（Ｈｏｒａｚｄｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：５４４−５１（１９９５））（データは示されていない）。
【０１１５】
前述したように、Ｐ．パストリスＶｐｓ１０タンパク質（Ｖｐｓ１０−１及びＶｐｓ１０−ｐ）のＳ．セレビシエＶｐｓ１０に対する配列比較によって、相対的に低い３７〜４３％の同一性が示され、一方、他のＳ．セレビシエＶｐｓ１０ホモログ（Ｖｔｈ１ｐ、Ｖｔｈ２ｐ、ＹＮＲ０６５Ｃ）のＳ．セレビシエＶｐｓ１０に対する配列比較では５８〜７５％の同一性が示された（図１２）。従って、配列分析のみに基づくと、２つのＰ．パストリスＶｐｓ１０ホモログが、Ｓ．セレビシエＶｐｓ１０と類似の機能を有するかどうかは判断できなかった。
【０１１６】
さらなる真菌Ｖｐｓ１０ホモログは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ））により同定されており、Ｓ．セレビシエＶｐｓ１０と配列比較されている（図１２）。以下のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）の登録に基づいて、Ｖｐｓ１０ホモログが指定された：アスペルギルス・ニガー（ＣＡＫ３８４４４、配列番号２６、図１８）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＣＡＡ１６９１４．１、配列番号２７、図１９）、カンジダ・アルビカンス（ＥＡＫ９１５３６、配列番号２８、図２０）、カンジダ・グラブラタ（ＣＡＧ６０８４２．１、配列番号２９、図２１）、ピキア・スチピチス（ＮＣ＿００９０６８．１、配列番号３０、図２２）、デバリオマイセス・ハンセニイ（ＸＰ＿００２７７０４９９．、配列番号１８１、図２３）、及びクルイベロミセス・ラクチス（ＸＰ＿４５４４２５、配列番号１８２、図２４）。Ｓ．ポンベのデータは、Ｖｐｓ１０受容体は、Ｓ．セレビシエＶｐｓ１０に対してわずか２３．６％の同一性であるが、類似の機能を示すことを示している（Ｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１５２３−３２（２００６）；Ｔａｋｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  ２８：３９９−４１７（２００３）；Ｔａｋｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  ４２：２５２−９（２００３））。すべてにおいて、生物情報学的データは２つのＰ．パストリスＶｐｓ１０ホモログが、Ｓ．セレビシエＶｐｓ１０受容体と類似の機能を有し得ることを示唆している。
【実施例１５】
【０１１７】
Ｖｐｓ１０−１活性によってｒｈＧＣＳＦ力価が減少する
親のｒｈＧＣＳＦ発現株ｙＧＬＹ８５３８は、ＡＯＸ１プロモーターを使用してＧＣＳＦを転写する。この親株に、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を使用して対抗選択して、変異株を作製した（図６及び１１Ｂ参照）。Ｐ．ｐ．ｖｐｓ１０−１Δ（ｙＧＬＹ９９３３）及びｖｐｓ１０−Δ（ｙＧＬＹ１０５６６）の同質変異体（ＵＲＡ５＋）を、それぞれプラスミドｐＧＬＹ５１９２及びｐＧＬＹ５１９４のエレクトロポレーションによって作製した（実施例１〜１１、図１参照）。ｖｐｓ１０−１Δ及びｖｐｓ１０−２Δ変異のｒｈＧＣＳＦ分泌に対する影響を、Ｓｉｘｆｏｒｓ発酵槽（ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、メリーランド州ローレル（Ｌａｕｒｅｌ、ＭＤ））及びＧＣＳＦ  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した（実施例１０参照）。
【０１１８】
結果から、ｖｐｓ１０−１Δ変異体ｙＧＬＹ９９３３はｙＧＬＹ８５３８に対して７倍のｒｈＧＣＳＦを分泌することがわかった（図７Ａ）。驚くべきことに、ｖｐｓ１０−２Δ変異体ｙＧＬＹ１０５６６は、検出可能なｒｈＧＳＣＦを分泌しなかった。ｙＧＬＹ１０５６６の発酵上澄みに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うと、全分泌タンパク質の大きな減少が示された（データは示していない）。これらの結果から、Ｖｐｓ１０−１及びＶｐｓ１０−２の機能は、ｒｈＧＣＳＦとの相互作用においては重複していないことがわかる。ｖｐｓ１０−１Δｖｐｓ１０−２Δ二重変異体（ｙＧＬＹ１０５５７）の力価結果は、ｖｐｓ１０−２Δ変異がｖｐｓ１０−１変異よりも優先されることを示しており、そのため、ｒｈＧＣＳＦ（図７Ａ）及び全分泌タンパク質の大部分が大きく減少した（図示せず）。これらの発酵サンプルの細胞溶解についても、上澄み分画中に細胞から放出された二本鎖ＤＮＡによって測定した。本発明者らは、発酵条件における酵母ｖｐｓ１０変異体の開示を全く確認していないので、正常な液胞機能が変化する場合には、高バイオマス発酵条件中に、細胞適合性が低下し得る。このようなことが発生すると、細胞が溶解して、二本鎖ＤＮＡを上澄み分画中に放出することがある。しかし、図７Ｂ中に示されるデータから、ｖｐｓ１０−１Δ及び／又はｖｐｓ１０−２Δの変異によって細胞溶解は誘導されていないことが示されている。
【実施例１６】
【０１１９】
Ｖｐｓ１０−１活性によってＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ力価が減少する
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃも、Ｎ末端中に推定Ｖｐｓ１０結合モチーフを有するので、本発明者らは、機能性Ｖｐｓ１０−１を有する、及び有さない細胞系で発現ベクターｐＧＬＹ３４６５を形質転換した。少なくとも１１ｎ独立した形質転換体について、タンパク質発現を誘導した。ＥＬＩＳＡ力価を個別に計算し、次に各宿主株について平均した。相対ＥＬＩＳＡ力価は、各宿主株の平均ＥＬＩＳＡ力価を野生型親株ｙＧＬＹ８２９２の平均ＥＬＩＳＡ力価で割ることによって求めた（図８）。このデータから、ｖｐｓ１０−１Δ変異株（ｙＧＬＹ９９９２及びｙＧＬＹ９９９３）が、親の野生型株ｙＧＬＹ８２９２よりも約１０倍多いＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ分泌量を示すことが明確にわかる。
【実施例１７】
【０１２０】
ピキア・パストリスＶｐｓ１０−１機能のモデル
データは、Ｖｐｓ１０−１が、ピキア・パストリス中で分泌経路を輸送される組換えタンパク質と相互作用できることを示している。図９Ａは、Ｖｐｓ１０−１の正常な機能による組換えタンパク質の液胞への別の輸送を示しており、ｒｈＧＣＳＦがモデルタンパク質として使用されている。対照的に、図９Ｂは、Ｖｐｓ１０−１の活性が喪失又は低下した場合に、ｒｈＧＣＳＦが上澄み分画中に効率的に分泌されることを示している。従ってＶｐｓ１０−１活性が低下すると、組換えタンパク質分泌に関して細胞はより生産的になる。
【図１】
2013509180.tif 000003
【図２Ａ】
2013509180.tif 000004
【図２Ｂ】
2013509180.tif 000005
【図３】
2013509180.tif 000006
【図４Ａ】
2013509180.tif 000007
【図４Ｂ】
2013509180.tif 000008
【図４Ｃ】
2013509180.tif 000009
【図４Ｄ】
2013509180.tif 000010
【図４Ｅ】
2013509180.tif 000011
【図５Ａ】
2013509180.tif 000012
【図５Ｂ】
2013509180.tif 000013
【図５Ｃ】
2013509180.tif 000014
【図５Ｄ】
2013509180.tif 000015
【図６】
2013509180.tif 000016
【図７】
2013509180.tif 000017
【図８】
2013509180.tif 000018
【図９Ａ】
2013509180.tif 000019
【図９Ｂ】
2013509180.tif 000020
【図１０】
2013509180.tif 000021
【図１１】
2013509180.tif 000022
【図１２】
2013509180.tif 000023
【図１３Ａ】
2013509180.tif 000024
【図１３Ｂ】
2013509180.tif 000025
【図１３Ｃ】
2013509180.tif 000026
【図１３Ｄ】
2013509180.tif 000027
【図１３Ｅ】
2013509180.tif 000028
【図１４Ａ】
2013509180.tif 000029
【図１４Ｂ】
2013509180.tif 000030
【図１４Ｃ】
2013509180.tif 000031
【図１４Ｄ】
2013509180.tif 000032
【図１５】
2013509180.tif 000033
【図１６】
2013509180.tif 000034
【図１７】
2013509180.tif 000035
【図１８】
2013509180.tif 000036
【図１９】
2013509180.tif 000037
【図２０】
2013509180.tif 000038
【図２１】
2013509180.tif 000039
【図２２】
2013509180.tif 000040
【図２３】
2013509180.tif 000041
【図２４】
2013509180.tif 000042
【図２５】
2013509180.tif 000043
【図２６】
2013509180.tif 000044
【図２７】
2013509180.tif 000045
【図２８】
2013509180.tif 000046
【配列表】
2013509180000001.app
【国際調査報告】
2013509180.tif 000047
2013509180.tif 000048
2013509180.tif 000049
2013509180.tif 000050