(57)【要約】  新規なコンジュゲート並びにレナリドマイドに由来する免疫原及びこれらの免疫原によって産生される抗体は、体液中のサリドマイド及びレナリドマイドを定量及びモニタリングするためのイムノアッセイにおいて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサリドマイドを検出するためのイムノアッセイであって、前記試料と、薬学的に活性な化学療法薬であるレナリドマイド及びサリドマイドの混合物と選択的に反応性であり且つ薬学的に活性な化学療法薬の前記混合物とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、サリドマイドとの反応性を有する抗体と、次式を有するリガンド：
【化１】
2013522594.tif 000019
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、担体に結合することができる末端官能基である］
との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中のサリドマイド及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合している又は結合していない前記混合物中の前記コンジュゲートを測定し、それによって前記試料中のサリドマイドの存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。
【請求項２】
前記試料がヒト試料である、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項３】
前記ヒト試料が、サリドマイドで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって前記試料中のサリドマイドの量を測定する、請求項２に記載のイムノアッセイ。
【請求項４】
前記抗体が、前記化学療法薬（複数）とのその反応性に基づいて最少１０％の、サリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項３に記載のイムノアッセイ。
【請求項５】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化２】
2013522594.tif 000020
［式中、Ｙ及びＢは、上記の通りであり、Ｘは、ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］
とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項６】
前記抗体が固体支持体に結合されている、請求項５に記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項６に記載のイムノアッセイ。
【請求項８】
前記固体支持体がナノ粒子である、請求項６に記載のイムノアッセイ。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒツジ又はラットに由来する、請求項９に記載のイムノアッセイ。
【請求項１１】
試料中のレナリドマイドを検出するためのイムノアッセイであって、前記試料と、レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体と、次式を有するリガンド：
【化３】
2013522594.tif 000021
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、担体に結合することができる末端官能基である］
との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中のレナリドマイド及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合している又は結合していない前記混合物中の前記コンジュゲートの量を測定し、それによって前記試料中のレナリドマイドの存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。
【請求項１２】
前記試料がヒト試料である、請求項１１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１３】
前記ヒト試料が、レナリドマイドで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって前記試料中のレナリドマイドの量を測定する、請求項１２に記載のイムノアッセイ。
【請求項１４】
前記抗体が、前記化学療法薬（複数）とのその反応性に基づいて約１００％の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項１３に記載のイムノアッセイ。
【請求項１５】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化４】
2013522594.tif 000022
［式中、Ｙ及びＢは、上記の通りであり、Ｘは、ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］
とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項１１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１６】
前記抗体が固体支持体に結合されている、請求項１５に記載のイムノアッセイ。
【請求項１７】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項１６に記載のイムノアッセイ。
【請求項１８】
前記固体支持体がナノ粒子である、請求項１６に記載のイムノアッセイ。
【請求項１９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のイムノアッセイ。
【請求項２０】
前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒツジ又はラットに由来する、請求項１９に記載のイムノアッセイ。
【請求項２１】
レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、薬学的に活性な前記化学療法薬の薬学的に活性でない代謝産物と１２％を超えない交差反応性を有し、前記交差反応性が、薬学的に活性な前記化学療法薬に対する前記抗体の結合に相対したものである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化５】
2013522594.tif 000023
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、ポリアミンに結合することができる末端官能基である］
とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、マウス、ヒツジ、ウサギ又はラットに由来する、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、前記化学療法薬（複数）とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、サリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、前記化学療法薬（複数）とのその反応性に基づいて４８％の、サリドマイドとの反応性を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化６】
2013522594.tif 000024
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］
とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体がレナリドマイドと選択的に反応性である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３２】
前記抗体が、前記化学療法薬（複数）とのその反応性に基づいて少なくとも２０％の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、前記化学療法薬（複数）とのその反応性に基づいて約１００％の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化７】
2013522594.tif 000025
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］
とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３６】
次式の化合物：
【化８】
2013522594.tif 000026
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］。
【請求項３７】
ｐが０である、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｘが
【化９】
2013522594.tif 000027
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｘが
【化１０】
2013522594.tif 000028
である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｘが
【化１１】
2013522594.tif 000029
であり、Ｒ３が水素である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｘが
【化１２】
2013522594.tif 000030
であり、Ｒ３が反応性エステルを形成している、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４２】
形成されているエステルが、低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルである、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
ｐが１である、請求項３６に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｂが−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｘが
【化１３】
2013522594.tif 000031
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｙが、１個から１０個までの炭素原子を含むアルキレン、
【化１４】
2013522594.tif 000032
［式中、ｎ及びｏは、０から６までの整数であり、ｍは、１から６までの整数である］
である、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｙが、１個から６個までの炭素原子を含む低級アルキレンである、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｘが
【化１５】
2013522594.tif 000033
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４９】
ＯＲ３がヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５０】
Ｙが
【化１６】
2013522594.tif 000034
［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｘが
【化１７】
2013522594.tif 000035
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５２】
ＯＲ３がスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】
次式のリガンド：
【化１８】
2013522594.tif 000036
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、担体に連結することができる末端官能基である］
とコンジュゲートした担体を含むコンジュゲート。
【請求項５４】
前記担体がポリアミンポリマーを含む免疫原性担体であり、Ｘは前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
ｐが０である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
Ｘが
【化１９】
2013522594.tif 000037
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項５５に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
ｐが１である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
Ｙが、１個から１０個までの炭素原子を含むアルキレン、
【化２０】
2013522594.tif 000038
又は
【化２１】
2013522594.tif 000039
［式中、ｎ及びｏは、０から６までの整数であり、ｍは、１から６までの整数である］
である、請求項５７に記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
Ｘが
【化２２】
2013522594.tif 000040
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに付加された酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項５８に記載のコンジュゲート。
【請求項６０】
前記担体が、ポリアミンポリマーを含む免疫原性担体であり、Ｘが、前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である、請求項５７に記載のコンジュゲート。
【請求項６１】
Ｙが、１個から６個までの炭素原子を含むアルキレンである、請求項６０に記載のコンジュゲート。
【請求項６２】
Ｘが
【化２３】
2013522594.tif 000041
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項６１に記載のコンジュゲート。
【請求項６３】
Ｙが
【化２４】
2013522594.tif 000042
［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
である、請求項６０に記載のコンジュゲート。
【請求項６４】
Ｘが
【化２５】
2013522594.tif 000043
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項６３に記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
患者の試料中のサリドマイドの存在を決定するためのキットであって、別々の容器中にパッケージングされた別々の試薬を含み、前記試薬のうちの一方が、次式のリガンド：
【化２６】
2013522594.tif 000044
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、担体に結合することができる末端官能基である］
との担体のコンジュゲートであり、他方の試薬が、薬学的に活性な化学療法薬であるレナリドマイド及びサリドマイドの混合物と選択的に反応性であり且つ薬学的に活性な化学療法薬の前記混合物とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、サリドマイドとの選択的反応性を有する抗体であるキット。
【請求項６６】
ｐが１である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
Ｙが低級アルキレンである、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
Ｘが
【化２７】
2013522594.tif 000045
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに付加された酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
Ｘが
【化２８】
2013522594.tif 000046
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
Ｙが
【化２９】
2013522594.tif 000047
である、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
Ｙが
【化３０】
2013522594.tif 000048
［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
である、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
患者の試料中のレナリドマイドの存在を決定するためのキットであって、別々の容器中にパッケージングされた別々の試薬を含み、前記試薬のうちの一方が、次式のリガンド：
【化３１】
2013522594.tif 000049
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、担体に結合することができる末端官能基である］
との担体のコンジュゲートであり、他方の試薬が、レナリドマイド、及びサリドマイドとレナリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体である、キット。
【請求項７３】
ｐが１である、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
Ｙが低級アルキレンである、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
Ｘが
【化３２】
2013522594.tif 000050
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに付加された酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
Ｘが
【化３３】
2013522594.tif 000051
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
Ｙが
【化３４】
2013522594.tif 000052
である、請求項７３に記載のキット。
【請求項７８】
Ｙが
【化３５】
2013522594.tif 000053
［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
である、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
Ｘが
【化３６】
2013522594.tif 000054
［式中、Ｒ３は、水素であるか、又はそれに付加された酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
Ｘが
【化３７】
2013522594.tif 000055
であり、Ｒ３が上記の通りである、請求項７９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療期間中の最適薬物濃度を迅速に決定するためにヒト体液においてレナリドマイド及びサリドマイドの存在の決定及び／又は量の定量をするためのイムノアッセイの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、身体の一部にある細胞が制御を外れて増殖し始めたときに発症するという共通した特性を共有する、一群の悪性腫瘍を説明するのに使用される用語である。多くの癌は、腫瘍として形成されるが、血液中にも出現することがあり、他の組織を循環してそこで増殖する恐れがある。悪性の癌は、最も一般的には、外科手術、化学療法、及び／又は放射線療法の組合せで治療される。特定の癌を治療するために使用される治療の種類は、悪性癌の型及びそれが診断されたときのその段階を含むいくつかの因子に依存する。
【０００３】
一般化学名がサリドマイドである化学療法薬は、次式を有する：
【化１】
2013522594.tif 000002
【０００４】
一般化学名がレナリドマイドである化学療法薬は、次式を有する：
【化２】
2013522594.tif 000003
【０００５】
サリドマイドは、免疫調節性、抗炎症性及び抗血管新生性を有する。この免疫調節性及び抗炎症性は、腫瘍壊死因子をコードしているｍＲＮＡの分解を通した、過剰な腫瘍壊死因子−アルファ産生の抑圧に関連している可能性がある（Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７７（６）：１６７５−８０，１９９３）。サリドマイドの他の免疫調節性及び抗炎症性としては、プロスタグランジン合成におけるマクロファージ関連の抑圧、並びに末梢血単核細胞によるインターロイキン−１０及びインターロイキン−１２の産生の調節等が挙げられる。この抗炎症性と抗血管新生性との組合せにより、サリドマイドは、多種多様な疾患を治療するのに重大な潜在可能性を有する新規な治療薬となっている（Ｔｅｏ，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，４３（５）：３１１−２７，２００４）。最近のいくつかの臨床試験により、多発性骨髄腫、腎癌又は多形神経膠芽腫を有する患者においてサリドマイドの治療効果が実証されている（Ｓｉｎｇｈａｌ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４１（２１）：１５６５−７１，１９９９；Ｍａｒｘ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ，５４（１）：３１−８，２００１）。現在、サリドマイドは、新たに診断された多発性骨髄腫を有する患者の治療用及び癩性結節性紅斑の急性治療用に承認されている（Ｐａｃｋａｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ−Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ，Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，２００９）。
【０００６】
レナリドマイドは、免疫調節性、抗増殖性、及び抗血管新生性を有するサリドマイド誘導体である。レナリドマイドは、細胞周期停止及びアポトーシスを誘導することによって多発性骨髄腫細胞に対して直接に抗増殖性効果を発揮する（Ａｒｍｏｉｒｙ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ，３３（３）：２１９−２６，２００８）。レナリドマイドは、多発性骨髄腫又は欠失５ｑ染色体異常に関連した骨髄異形成症候群を有する患者の治療用に承認されている（Ｐａｃｋａｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ−Ｒｅｖｌｉｍｉｄ，Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，２００９）。
【０００７】
サリドマイド及びレナリドマイドの作用機序及び代謝経路は、まだ完全には特徴付けられていない。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、いずれの薬剤も、多数の代謝産物を生じる非酵素的加水分解及び酵素代謝を受けるが、これらの化合物のうちでサリドマイドの治療効果の原因となるものは見出されていない（Ｌｅｐｐｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ，７（６）：６７７−８５，２００６）。
【０００８】
サリドマイド及びレナリドマイドは、血漿中濃度において顕著な変動性を示す。ＨＩＶ患者におけるサリドマイドの薬物動態学的作用の第一相試験により、広範囲にわたる最高血中濃度Ｃｍａｘ（２．８±２．６ｍｇ／Ｌ）及び半減時間ｔ１／２（５．９±２．３時間）が実証されている（Ｗｏｈｌ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１８５（９）：１３５９−６３，２００２）。健常被験者に対するサリドマイドの投与により、結果としてＣｍａｘにおいて最高５２％の変動性及びｔ１／２において最高３７％の変動性が生じた（Ｐａｃｋａｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ−Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ，Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，２００９）。中枢神経系腫瘍を有する患者におけるレナリドマイドの第一相試験により、Ｃｍａｘにおいて最高７８％の変動性及びｔ１／２において最高１２２％の変動性が認められている（Ｆｉｎｅ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１３（２３）：７１０１−６，２００７）。
【０００９】
サリドマイド及びレナリドマイドの効力はより高い濃度レベルで増大し、この薬剤は広範囲にわたる患者内及び患者間薬物動態学的変動を示すので、血液中のこれらの薬剤の濃度をモニタリングして目標レベルに調整することは、効力を増大させて毒性を最小限に抑えるのに重要なはずである。サリドマイド及びレナリドマイドの、個体内及び個体間の薬物動態学的変動の程度は、以下を含む多くの因子によって影響される：
○年齢
○体重
○臓器機能
○薬剤−薬剤相互作用
○遺伝的調節
○コンプライアンス
【００１０】
この変動の結果として、異なる個体における等用量の同一薬剤によって臨床転帰が劇的に異なる結果となり得る。同一投与量のサリドマイド及びレナリドマイドの有効性は、患者における個々の薬物クリアランス及び最終的な血清中薬物濃度に基づいて著しく変化する。治療薬管理により、臨床医が薬剤投与の際の患者の変化を洞察できるようになるはずである。治療薬管理を行えば、薬剤投与量を患者に合わせて個別化することができ、望ましくない副作用なく該障害を有効に治療する可能性がかなり高くなるであろう。
【００１１】
サリドマイド及びレナリドマイドの日常的な治療薬管理には、一般実験機器に適合可能な簡単な自動化された試験を利用できることが必要とされるであろう。ヒトの血液中及び血漿中のサリドマイド及びレナリドマイドの濃度を決定するための、ＵＶ検出又は質量分光検出を用いた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の使用は、記載されている（Ｔｏｈｎｙａ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，  ８１１（２）：１３５−４１，２００４：Ｃｈｅｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ４７（１２）：１４６６−７５，２００７：Ｔｅｏ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３９（１１）：１１６２−８，１９９９）。これらの方法は、労働集約的であり、液液抽出又は固相抽出を必要とするので、高価な装置を使用し、日常的な臨床検査での使用に受け入れられるものではない。現在までのところ、レナリドマイド及び／又はサリドマイドを、これらの化学療法剤で治療した患者のヒト体液中で測定するためのイムノアッセイはない。
【００１２】
上記からわかるように、ヒト体液においてサリドマイド及び／又はレナリドマイドの存在の決定及び／又は量の定量をするためのイムノアッセイはない。イムノアッセイによるサリドマイド及びレナリドマイドの日常的な治療薬管理により、標準実験機器に適合した簡単な自動化された試験が可能となるはずである。しかし、こうしたイムノアッセイを可能にするためには、サリドマイド及びレナリドマイドに特異的な抗体を作製する必要がある。このアッセイにおいて使用される誘導体及び免疫原は、作製された対応するそれらの抗体を通して、サリドマイド及びレナリドマイドに対する特異的反応性を付与しなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、サリドマイド及びレナリドマイドに対して実質的に反応性であり、これらの化学療法薬で治療した患者の試料におけるサリドマイド及びレナリドマイドの存在の決定及び／又は量の定量をするための同一のイムノアッセイにおいて使用することができる、新しい一クラスの抗体が作製されている。
【００１４】
ポリアミンポリマーを含む免疫原性担体と次式の化合物：
【化３】
2013522594.tif 000004
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］
とのコンジュゲートである免疫原を使用することによって、レナリドマイド並びにレナリドマイドとサリドマイドとの混合物に特異的であって、サリドマイド及びレナリドマイドの双方の薬学的に不活性な代謝産物とは反応も結合もしない抗体が産生されることが見出されている。
【００１５】
レナリドマイド又はサリドマイドとレナリドマイドとの混合物のいずれかと選択的に反応性である、これらの抗体の提供により、サリドマイド又はレナリドマイドのいずれかで治療している患者の体液試料中のサリドマイド及びレナリドマイドをモニタリングするために特異的に検出及び定量することができるイムノアッセイを行うことが可能となる。本発明にさらに含まれるのは、前記イムノアッセイ用の試薬及びキットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明によれば、レナリドマイド又はレナリドマイドとサリドマイドとの混合物に選択的に結合し、サリドマイド及びレナリドマイドのいずれの薬学的に不活性な代謝産物とも交差反応性でない、新しい一クラスの抗体が得られる。式ＩＩＩのレナリドマイドのこれらの誘導体を免疫原として使用することによって本発明の新しい一クラスの抗体が得られることが発見された。これらの抗体を使用することにより、血液、血漿又は他の体液の試料中のサリドマイド及びレナリドマイドを検出及び／又は定量するためのこうしたイムノアッセイ用の試薬及びキットを含めて、イムノアッセイが開発された。
【００１７】
本発明によれば、試料中のサリドマイド又はレナリドマイドを検出及び／又は定量するためのこれらのイムノアッセイのいずれにおいても使用することができる、新しい一クラスの試薬が得られる。この試薬は、担体と次式を有するリガンド：
【化４】
2013522594.tif 000005
［式中、Ｂ、Ｙ及びＰは、上記の通りであり、Ｘ２は、前記担体に結合することができる末端官能基である］
とのコンジュゲートである。
【００１８】
このイムノアッセイを使用することにより、いずれかの治療薬で治療している患者の体液試料中のサリドマイド又はレナリドマイドの存在及び量を検出及び／又は定量することができる。この方法では、サリドマイド又はレナリドマイドで治療している患者を療法期間中にモニタリングすることができ、式ＩＩＩの免疫原及び式ＩＩＩ−Ａのコンジュゲートによって産生される抗体を使用することによって前記モニタリングに従ってその治療を調整することができる。本発明により、治療薬としてサリドマイド又はレナリドマイドのいずれかで治療している患者におけるサリドマイド及びレナリドマイドの治療薬管理が実現する。検出及び／又は定量される治療薬は、式Ｉのサリドマイド及び式ＩＩのレナリドマイドである。
【００１９】
イムノアッセイにおける試薬としての式ＩＩＩ−Ａのコンジュゲート及び免疫原性担体とコンジュゲートした式ＩＩＩの免疫原の提供は、化学療法薬のレナリドマイド及びサリドマイドを検出及び／又は定量するためのイムノアッセイにおいて利用することができる抗体及び試薬を提供する。本発明に従って作製されるこれらの試薬及び抗体は、レナリドマイド又はサリドマイドを検出及び定量するためのイムノアッセイの双方において利用することができる。一般に、患者は、これらの化学療法薬の双方ではなく一方で治療される。したがって、レナリドマイド及びサリドマイドの双方に対して選択的に反応性である抗体又は試薬は、レナリドマイド又はサリドマイドのいずれかを検出するためのこれらのイムノアッセイにおいて利用することができる。レナリドマイドで治療される患者は、一般にサリドマイドでは治療されず、サリドマイドで治療される患者は、一般にレナリドマイドでは治療されないので、これは本当である。したがって、本発明の試薬及び抗体は、これらの２種の化学療法薬を別々に検出及び／又は定量するためのこれらの２種のイムノアッセイのいずれにおいても使用することができる。
【００２０】
本明細書中で前記したように、式ＩＩＩの免疫原によって作製することができる抗体は、レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物と選択的に反応性であり、サリドマイド又はレナリドマイドのイムノアッセイのいずれにおいても使用することができる。これらの抗体はサリドマイド及びレナリドマイドの双方と選択的に反応性であるが、サリドマイドのイムノアッセイにおいて使用するためには、その抗体が、サリドマイド及びレナリドマイドの双方とのその合計の反応性に基づいて、サリドマイドについて少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約４０％の選択的反応性を有していなければならない。本発明によれば、式ＩＩＩの免疫原を利用して、レナリドマイド及びサリドマイドの双方とのその反応性に基づいて、少なくとも約１０％、多くとも約５０％の、サリドマイドとの反応性を有する抗体を作製することができる。
【００２１】
一方、レナリドマイドのイムノアッセイにおいて抗体を利用するためには、式ＩＩＩの免疫原によって産生され、レナリドマイドとの又はレナリドマイド及びサリドマイドの双方との選択的反応性を有するあらゆる抗体を使用することができる。本発明によれば、サリドマイド及びレナリドマイドとのその反応性に基づいてレナリドマイドと選択的に反応性である抗体、又はレナリドマイド及びサリドマイドの双方と選択的に反応性である抗体を、式ＩＩＩの免疫原によって作製することができる。本発明によれば、レナリドマイドと選択的に反応性であってサリドマイドとはそうでない抗体、すなわち、レナリドマイド及びサリドマイドの双方とのその選択的反応性に基づいて１００％のレナリドマイドとの選択的反応性を有する抗体を、式ＩＩＩの免疫原を使用することによって作製することができる。レナリドマイドのイムノアッセイにおける使用には、レナリドマイドと実質的に１００％の選択的反応性を有し、サリドマイドとの選択的反応性が実質的にない抗体が特に好ましい。
【００２２】
本発明のアッセイにおいて利用される試薬は、ポリマー担体と式ＩＩＩ−Ａの化合物とのコンジュゲートである。これらのコンジュゲートは、本発明の抗体との結合について、試料中に存在するサリドマイド及びレナリドマイドと競合的な結合パートナーである。したがって、該抗体に結合するコンジュゲート試薬の量は、試料中のサリドマイド及びレナリドマイドの量に反比例することになる。本発明によれば、該アッセイは、該抗体に結合している又は結合していない前記コンジュゲートの量を検出及び測定するための従来の任意の測定方法を利用する。前記方法の使用により、結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することができる。一般に、試料中のサリドマイド及びレナリドマイドの量は、試料中のサリドマイド及びレナリドマイドによって得られる、結合している又は結合していないコンジュゲートの測定量を、既知量のサリドマイド又はレナリドマイドを含有する試料で得られた標準曲線又は較正曲線から決定された、結合している又は結合していないコンジュゲートの値と関連付けることによって決定され、この既知量は、試験する試料について予想される範囲内にある。較正曲線を作成するためのこれらの試験は、試料に使用したのと同様のイムノアッセイ法を使用して決定される。
【００２３】
該コンジュゲート、並びに該免疫原は、式ＩＩＩの化合物から調製される。コンジュゲート又は免疫原におけるときには、担体及びポリアミンポリマーは、式ＩＩＩの化合物のリガンド部分に連結され、このリガンド部分は次式を有する：
【化５】
2013522594.tif 000006
［式中、Ｘ’は、−ＣＨ２−又は官能リンカー基であり、
Ｙ、ｐ及びＢは、上記の通りである］。
【００２４】
このリガンド部分は、コンジュゲート又は免疫原の担体上の１つ又は複数の活性部位に連結され得る。一般に、これらの担体には、ポリマー、最も好ましくは、反応性アミノ基を有するポリアミンポリマーが含まれる。該コンジュゲート、特に該免疫原を形成する際に、Ｘ’は、アミノ基と反応可能な官能基であることが好ましい。しかし、該イムノアッセイにおいて使用される試薬に関して、Ｘ’は、任意の従来の担体と反応可能ないかなる官能基であってもよい。免疫原を作製するために式ＩＩＩの化合物が使用されるときには、式ＩＩＩの化合物中のＸ’は、ポリアミンポリマーに結合又は連結することができる任意の官能基であることが好ましい。
【００２５】
定義
本明細書の全体にわたり、以下の定義を理解しておくべきである：
【００２６】
「アルキレン」という用語は、１から１０個までの炭素原子を含む２価の飽和した直鎖又は分岐鎖の炭化水素置換基を意味する。
【００２７】
「免疫原」及び「免疫原性」という用語は、生物において免疫応答を誘発、生成、又は発生させることができる物質を指す。
【００２８】
「コンジュゲート」という用語は、２つの部分を結合させて一緒にすることから形成されるあらゆる物質を指す。本発明による代表的なコンジュゲートとしては、式ＩＩＩの化合物又は式ＩＩＩ−Ａの化合物のような小分子と、担体、好ましくはポリアミンポリマーを含む担体、特に、タンパク質のような大分子とを結合させて一緒にすることによって形成されるものが挙げられる。該コンジュゲートにおいて、小分子は、大分子上の１つ又は複数の活性部位で結合又は連結され得る。コンジュゲートという用語には、免疫原という用語も含まれる。試薬として使用されるコンジュゲートにおいて、担体は、いかなる担体であってもよく、Ｘは、担体に連結可能ないかなる官能基であってもよい。免疫原において、担体は、ポリアミンポリマーであり、Ｘは、ポリアミンポリマーに連結可能ないかなる官能基であってもよい。
【００２９】
「ハプテン」は、部分的又は不完全な抗原である。これらは、タンパク質を含んでいない物質、大抵は低分子量の物質であり、抗体形成を刺激することはできないが、抗体と反応する。後者は、ハプテンを高分子量の免疫原性担体にカップリングさせることと、次いで、このカップリングされた生成物、すなわち、免疫原をヒト又は動物の対象に注射することとによって形成される。本発明のハプテンは、レナリドマイド（ＩＩ）である。
【００３０】
本明細書において、「スペーサー基」又は「スペーサー」とは、ハプテン、担体、免疫原、標識、又はトレーサーのような２つ以上の部分構造をＣＨ２又は官能リンカー基を通して連結する化学構造の一部を指す。これらのスペーサー基については、本出願において以下に列挙することになる。スペーサー基の原子及びスペーサー基中の鎖の原子は、それら自体が化学結合によって連結されている。中でも好ましいスペーサーは、直鎖又は分岐状の、飽和又は不飽和の炭素鎖である。これらの炭素鎖は、鎖中又は鎖の末端に１つ又は複数のへテロ原子も含み得る。「ヘテロ原子」とは、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される炭素以外の原子を意味する。スペーサー基は、鎖の一部として又は鎖中の原子のうちの１個の上にある置換基として環状又は芳香族の基も含み得る。
【００３１】
該スペーサー基中の原子の数は、水素以外の原子を計数することによって決定される。スペーサー基中の鎖中の原子の数は、連結されている部分構造間の最短経路に沿った水素以外の原子の数を計数することによって決定される。官能リンカー基は、ハプテンと標識又は担体若しくはポリアミンポリマーとのコンジュゲートを合成するためのハプテン又はスペーサー基を活性化するために、例えば、その上に利用可能な官能部位を提供するために、使用され得る。
【００３２】
本明細書において、「免疫原性担体」という用語は、この場合にはレナリドマイド又は上で説明したレナリドマイド誘導体である、ハプテンと結合することができ、それによってこれらのハプテン誘導体が免疫応答を誘導してこれらのハプテン及びサリドマイドと特異的に結合できる抗体の産生を誘発するのを可能にする、一般的にはタンパク質である、免疫原性物質である。免疫原性担体及びリンカー基については、本出願において以下に列挙することになる。免疫原性担体物質には、異物として認識され、それによって宿主からの免疫応答を誘発する、タンパク質、糖タンパク質、複合ポリアミノ−多糖、粒子、及び核酸が含まれる。ポリアミノ−多糖は、その調製で知られている従来の方法のうちの任意のものを使用して多糖から調製することができる。
【００３３】
多様なタンパク質の型も、ポリ（アミノ酸）免疫原性担体として用いられ得る。こうした型としては、アルブミン、血清タンパク質、リポタンパク質等が挙げられる。例示的なタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシサイログロブリン（ＢＴＧ）等が挙げられる。代替的に、合成ポリ（アミノ酸）が利用され得る。
【００３４】
免疫原性担体には、単糖の繰り返し縮合によって構築された高分子量ポリマーである、ポリアミノ−多糖も含まれ得る。多糖の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアガムのような炭水化物ガム、及び寒天等である。多糖には、ポリ（アミノ酸）残基及び／又は脂質残基も含まれる。
【００３５】
免疫原性担体は、単独のポリ（核酸）、又は上述のポリ（アミノ酸）若しくは多糖のうちの一方とコンジュゲートしたポリ（核酸）のいずれかであってもよい。
【００３６】
免疫原性担体は、固体粒子も含み得る。該粒子は、一般に、直径が、少なくとも約０．０２ミクロン（μｍ）であり、約１００μｍを超えず、通常は、約０．０５μｍから１０μｍまでである。該粒子は、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、多孔性又は非多孔性であってもよく、最適には、水に近い、一般に約０．７から１．５ｇ／ｍＬまでの密度を有し、透明、部分的に透明、又は不透明であり得る物質を含んでいてもよい。該粒子は、赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びウィルス等の非限定的な例を含む、細胞及び微生物のような生体物質であってもよい。該粒子は、有機及び無機のポリマー、リポソーム、ラテックス、リン脂質小胞、又はリポタンパク質も含み得る。
【００３７】
「ポリ（アミノ酸）」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されたポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、分子量の上限を有さず、一般に約２，０００の分子量からの範囲に及ぶことになり、普通は１０，０００，０００未満、通常は約６００，０００ダルトン未満である。免疫原性担体又は酵素が含まれているかどうかによって、通常は異なる範囲もあろう。
【００３８】
「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２個以上のアミノ酸の結合によって形成されたあらゆる化合物であり、通常は、各アミノ酸残基のα−カルボキシル基が隣の残基のα−アミノ基に直鎖状に結合しているα−アミノ酸のポリマーである。ペプチド、ポリペプチド及びポリ（アミノ酸）という用語は、本明細書において、大きさについて限定することなくこのクラスの化合物を言及するのに同義的に使用される。このクラスの中で最も大きなものはタンパク質と呼ばれる。
【００３９】
「標識」、「ディテクター分子」、又は「トレーサー」は、検出可能なシグナルを生成するか、又はその生成を誘導することができるあらゆる分子である。標識は、検体、免疫原、抗体に、又は別の分子、例えば受容体若しくは受容体に結合可能な分子、例えばリガンド、特にハプテン等にコンジュゲートさせることができる。標識の非限定的な例としては、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、フルオロフォア、色素、化学発光体、発光体、又は増感剤；非磁性粒子若しくは磁性粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、又は受容体等が挙げられる。
【００４０】
「抗体」という用語は、抗原の特異的タンパク質結合パートナーを指し、他の物質を排除して抗原に対して特異的な結合親和性を有する、あらゆる物質、又は物質群である。抗体という総称には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗体フラグメントが含まれる。
【００４１】
「誘導体」という用語は、１つ又は複数の化学反応によって親化合物から生成された化学的な化合物又は分子を指す。
【００４２】
「担体」という用語は、固体粒子及び／又は、例えば、上述のもののような免疫原性ポリマー等の、高分子ポリマーを指す。担体が固体粒子の場合には、式ＩＩＩの化合物中の末端官能基Ｘに結合するための１つ又は複数の反応部位を提供するために、好ましくはポリアミンポリマーである高分子材料が、固体粒子に結合、コーティング、又はそれ以外では付加されていてもよい。
【００４３】
「試薬キット」、又は「試験キット」という用語は、アッセイを行う際に使用される材料の集合体を指す。試薬は、それらの交差反応性及び安定性に依存して、同一又は別々の容器中に、液体又は凍結乾燥された形態でパッケージングされた組合せで提供されてもよい。キットで提供する試薬の量及び比率は、特定の用途で最適の結果が得られるように選択することができる。本発明の特徴を実現する試薬キットは、式Ｉ及び式ＩＩの化合物に特異的な抗体を含む。キットは、検体のリガンド並びに較正物質及び対照物質をさらに含んでいてもよい。試薬は、液体の形態のままであってもよく、又は凍結乾燥されていてもよい。
【００４４】
「較正物質及び対照物質」という語句は、既知量の測定する薬剤を含有するあらゆる標準物質又は参照物質を指す。薬剤の濃度は、未知の試料で得られた結果を標準物質で得られた結果と比較することによって算出される。これは、一般的には、較正曲線を作成することによって行われる。
【００４５】
「生体試料」という用語は、生物又は元生物からの任意の量の物質を含むが、これらに限定されない。こうした生物としては、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、ウマ、及び他の動物等が挙げられるが、これらに限定されない。こうした物質としては、血液、血清、血漿、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ液、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、内皮細胞、及び皮膚等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
試薬及び免疫原
イムノアッセイの構築において、式ＩＶの化合物のコンジュゲートは、試料中でその抗体上の結合部位について式Ｉ又は式ＩＩの化合物と競合するように構築される。本発明のイムノアッセイにおいて、試薬は、担体と式ＩＶの化合物とのコンジュゲートである。式ＩＶの化合物において、リンカースペーサーは、この分子の「−Ｂ−（Ｙ）ｐ−Ｘ’−」部分を構成する。このリンカーＸ’及びスペーサー「−Ｂ−（Ｙ）ｐ−」は、コンジュゲート及び免疫原を調製する際の従来型である。イムノアッセイ用のコンジュゲート及び免疫原を調製するのに利用される従来のスペーサー−リンカー基のうちの任意のものを、式ＩＶの化合物において利用することができる。こうした従来のリンカー及びスペーサーは、米国特許第５，５０１，９８７号及び米国特許第５，１０１，０１５号に開示されている。
【００４７】
好ましいスペーサー基の中には、本明細書中で前述したスペーサー基が含まれる。特に好ましいスペーサー基は、１から１０までの炭素原子を含むアルキレン、
【化６】
2013522594.tif 000007
［式中、ｍ及びｏは、０から６までの整数であり、ｎは、１から６までの整数であり、アルキレンがあれば特に好ましいスペーサー基となる］
等の基である。これらの式において、ｍは０であり、ｎは好ましくは１から６までの整数、最も好ましくは１又は２であり、ｏは好ましくは０又は１である。
【００４８】
式ＩＶの化合物において、Ｘ’は、担体、好ましくは高分子担体上のアミン基に、スペーサーを結合している−ＣＨ２−又は官能基である。基Ｘ’は、担体に、好ましくは担体中に存在する又は免疫原として使用されるポリアミンポリマー中のアミノ基に、結合することができる、式ＩＩＩの化合物中の末端官能基Ｘの結果である。担体に結合することができ、好ましくはアミンと反応することができるいずれの末端官能基も、式ＩＩＩの化合物中の官能基Ｘとして利用することができる。Ｘ中に含まれていることが好ましいこれらの末端官能基は、以下のものである：
【化７】
2013522594.tif 000008
［式中、Ｒ３は、水素であるか、又は結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］。
【化８】
2013522594.tif 000009
基は、イソシアネート又はイソチオシアネートであってもよい。ＯＲ３によって形成される活性エステルとしては、例えばＮ−ヒドロキシスクシンアミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びｐ−ニトロフェニルエステルのような、イミドエステル等が挙げられる。しかし、アミン基と反応可能なあらゆる活性エステルを使用することができる。
【００４９】
カルボン酸基及び活性エステルは、従来の方法によって担体又は免疫原性ポリマーに結合される。タンパク質等の、ポリアミンポリマー上のアミン基は、本発明のポリマー、免疫原又は担体及び／又はコンジュゲートにスペーサーを連結するアミド基を生成する。一方、担体は、リガンド部分に連結するためのアミノ基を供給するために、ポリアミンポリマーでコーティングされていてもよい。
【００５０】
本発明の免疫原及びコンジュゲートにおいて、カルボキシル基を含むハプテンなどの式ＩＩＩの化合物と、担体又は免疫原のポリアミンポリマー上のアミノ基との間の化学結合は、当業者に知られている多様な方法を使用して作製され得る。アミド結合の形成が好ましいことが多い。アミド結合は、まず、式ＩＩＩの化合物中のハプテンのカルボン酸部分を活性化し、次いで、このカルボキシ基を脱離基試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｏ−ニトロフェノール若しくはｐ−ニトロフェノール、又はクロロギ酸ｏ−ニトロフェニル若しくはクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル）と反応させることによって形成される。ジシクロヘキシルカルボジイミド、及びジイソプロピルカルボジイミド等の活性化試薬を使用することができる。次いで、式ＩＩＩのハプテン中の活性化型のカルボキシル基を、タンパク質担体を含有する緩衝溶液と反応させる。ハプテンと担体とを結合する多様な方法は、米国特許３，９９６，３４４及び米国特許４，０１６，１４６にも開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれている。
【００５１】
式ＩＩＩの化合物において、Ｘが、末端のイソシアネート基又はイソチオシアネート基である場合、これらの基は、ポリアミンポリマーの遊離アミンと反応したときに、Ｘ’が、
【化９】
2013522594.tif 000010
である、式ＩＶのハプテンのコンジュゲート又は免疫原を生成する。
【００５２】
式ＩＶのリガンドにおいて、Ｘ’は、ハプテンを、担体を含むポリアミン上の又は免疫原性ポリペプチド上のアミノ基と機能的に連結する。
【００５３】
式ＩＩＩの化合物中の、Ｘがアルデヒド基を含む場合、これらの化合物を、還元的アミノ化によるアミン結合を通してポリアミンポリペプチドのアミノ基又は担体に連結することもできる。アルデヒドをアミンと縮合させるあらゆる従来法、例えば還元的アミノ化を通したものなどを、この結合を形成するのに使用することができる。この場合には、式ＩＶのリガンド部分中のＸ’は、−ＣＨ２−である。反応性カルボニルをアミン基と縮合させるあらゆる従来法を、この縮合反応を行う際に使用することができる。
【００５４】
式ＩＩＩの化合物は、Ｂが次式のメチレンカルボニル：
【化１０】
2013522594.tif 000011
であるときに、式ＩＩの化合物中のアミン基を次式の塩化アシル：
Ｃｌ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−（Ｙ）ｐ−Ｘ  Ｖ
と縮合させることによって生成される。
【００５５】
第一級アミンを塩化アシルと反応させるあらゆる従来法を、この縮合法において使用することができる。式ＩＩＩの化合物において、Ｙが低級アルキレンであり、Ｂが上記のメチレンカルボニル基である場合、この化合物は、式ＩＩの化合物をグルタル酸無水物のようなジカルボン酸の無水物と処理することによって生成される。無水物を第一級アミン基と縮合させるあらゆる従来法を、この縮合反応を行う際に使用することができる。
【００５６】
式ＩＩＩの化合物は、Ｂが−ＣＨ２−であるとき、式Ｉの化合物を次式のハロゲン化アルキル：
ハロＣＨ２−（Ｙ）ｐ−Ｘ  ＶＩＩ
［式中、Ｙ、ｐ及びＸは、上記の通りである］
と反応させることによって生成され得る。
【００５７】
ハロゲン化アルキルを第一級アミン基と縮合させるあらゆる従来法を、この縮合反応を行う際に使用することができる。
【００５８】
式中のＢが−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２である式ＩＩＩの化合物は、従来法を利用して式ＩＩの化合物をハロゲン化物又は次式：
【化１１】
2013522594.tif 000012
［式中、Ｙ、ｐ及びＸは、上記の通りである］
と縮合させることによって生成され得る。
【００５９】
式中のＢが−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−である式ＩＩＩの化合物は、従来法を利用して式ＩＩの化合物を次式の化合物：
【化１２】
2013522594.tif 000013
［式中、Ｙ、ｐ及びＸは、上記の通りである］
と縮合させることによって生成され得る。
【００６０】
式Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、及びＩＸの化合物に反応性アミノ基並びに反応性カルボキシル基が含まれる場合には、式ＩＩＩの化合物を形成するための反応中にアミン又はエステルの保護基を使用することが必要である。典型的には、これらのアミンは、対応するＮ−トリフルオロアセトアミド、Ｎ−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルウレタン（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃウレタン）、Ｎ−カルボベンジルオキシウレタン又は同様の構造を形成することによって保護される。一度、上記のような、式Ｉの構造との縮合反応が完了すれば、このアミン又はエステルの保護基を、それ以外にはコンジュゲートの構造を変えない試薬を使用して除去することができる。こうした試薬及び方法は、当業者に知られており、水性又は無水の弱酸又は強酸、水性又は無水の弱塩基又は強塩基、水素化物を含有する試薬、例えば、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウム等、及び接触水素化などが挙げられる。
【００６１】
式ＩＩＩの化合物は、この化合物を担体、好ましくはポリアミンポリペプチド、又は上で説明したようにポリアミンポリペプチドでコーティングされた担体、と反応させることによって本発明の免疫原及び／又はコンジュゲート試薬に変換することができる。ポリアミン又はポリペプチドが免疫学的に活性であるならば、同一のポリペプチドを、本発明の免疫原において担体として、また免疫原性ポリマーとして利用することができる。しかし、イムノアッセイにおいて試薬として使用するコンジュゲートを形成するために、これらのポリマーは、免疫原に必要とされるような免疫学的応答を生成する必要はない。本発明によれば、式ＩＩＩの化合物中でＸによって表される多様な官能基は、担体に官能基を付加する従来の方法によって、担体にコンジュゲートさせることができる。好ましい一実施形態によれば、式ＩＩＩの化合物において、Ｘは、カルボン酸基又は活性カルボキシル基である。
【００６２】
抗体
本発明は、新規な抗体、特に、上述の免疫原を利用することによって産生することができる、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物並びにそれらの混合物に対するモノクローナル抗体にも関する。本発明に従って作製されるこれらの抗体は、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物並びにこれらの混合物と選択的に反応性であることが見出されている。これらの抗体は、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物のいずれについてのイムノアッセイとも干渉するはずである、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物の薬学的に不活性でない代謝産物とは反応しない。これらの不活性な代謝産物とは反応しない本発明の抗体の能力により、これらの抗体は、式Ｉの化合物又は式ＩＩの化合物のいずれかについてのイムノアッセイを行う際に特に有用とされる。
【００６３】
本発明は、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物並びにそれらの混合物に対して選択的に反応性であるこれらの新規抗体に関する。本発明の抗血清は、本発明の免疫原で宿主動物を免疫化することによって都合よく作製することができる。好適な宿主動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯動物、又はヤギ、ヒツジ、ウマ等の高等哺乳動物等が挙げられる。初回投与、採血及び追加抗原注射は、動物において免疫応答を誘発するための受け入れられているプロトコルに従って行うことができる。定期的な採血を通して、免疫化したマウスの血液試料で、従来のイムノアッセイを利用して式Ｉ及び式ＩＩの化合物に対する免疫応答の獲得が認められた。これらの方法により、所望の活性を有する抗血清を産生する宿主及び抗体をスクリーニングする便利な方法が可能となる。
【００６４】
レナリドマイドと実質的に１００％の選択的反応性を有し、サリドマイドとの選択的反応性が実質的にないか、又はサリドマイド及びレナリドマイドの双方と実質的に選択的に反応性である抗体は、式ＩＩＩの免疫原を利用して、以下に開示しているスクリーニング法によって作製することができる。このスクリーニング法を使用して、レナリドマイド及びサリドマイドの化学療法剤の双方と反応性がある抗体を得ることができ、これは、これらの化学療法剤について任意の望ましい相対反応性を有するレナリドマイド及び抗体に対して特異的且つ選択的な抗体である。
【００６５】
これらの抗体の調製において、免疫原性担体を、式ＩＩＩの免疫原とコンジュゲートさせることができ、マウス、ウサギ、ヒツジ、又はラット等の宿主動物の免疫化に使用することができる。式ＩＩＩの化合物に対する免疫応答の獲得は、ＢＳＡと式ＩＩＩの化合物とのコンジュゲートをコーティングしたマイクロタイタープレートを利用してＥＬＩＳＡによってモニタリングすることができる。一度免疫応答が十分に獲得されれば、宿主動物の脾細胞を単離して、不死化された細胞系と融合させることができる。モノクローナル抗体の作製に関して、この融合細胞を、９６ウェルプレート上に播種して、ハイブリドーマ細胞を選択するための選択培地の存在下で培養することができる。ハイブリドーマ上清及び抗血清を、ＥＬＩＳＡによって抗レナリドマイド抗体の存在について試験することができる。陽性のＥＬＩＳＡ結果が得られたウェルからの抗体を、間接的競合マイクロタイタープレートアッセイによってレナリドマイド及びサリドマイドの結合について試験することができる。レナリドマイド、サリドマイド及びこれらの代謝産物等の検体のＩＣ５０値を、このアッセイから算出することができる。アッセイにおける検体のＩＣ５０（５０％での阻害濃度）は、阻害アッセイにおいてアッセイでのシグナルが検体の存在しないアッセイでの総シグナルの５０％であるときの試料中のその検体の濃度である。検体の選択的反応性は、％として表されるＩＣ５０の以下の比率から算出される：１００％−（［ＩＣ５０−検体／（ＩＣｌ５０−レナリドマイド＋ＩＣｌ５０−サリドマイド）］×１００）。レナリドマイドと実質的に１００％の選択的反応性を有し、サリドマイドとの選択的反応性が実質的にない抗体では、この値が１００％に近づくことになる。ＩＣ５０の計算は、Ｄ．Ｗｉｌｄによって編集され、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍによって２００５に出版された、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐｐ１０８−１１０，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ中で見出される方法に従って行われる。上記の式からわかるように、検体のＩＣ５０は、検体の反応性に反比例する。レナリドマイド及びサリドマイドの双方と望ましい相対反応性を有するウェルからの細胞をスクリーニングして限界希釈によってサブクローン化することによって得て、サリドマイド及びレナリドマイドと望ましい反応性を有するモノクローナル抗体を産生している個々のクローンを単離することができる。
【００６６】
モノクローナル抗体は、スケジュールに従ってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、その後、このマウスに追加の免疫原を、細胞融合の３日前から始めて連続して３日間、腹腔内又は静脈内に注射することによって作製するのが好都合である。抗体の技術分野においてよく知られている他のプロトコルも、当然同様に利用することができる。本明細書中で詳述している完全な免疫化プロトコルは、式Ｉ及び式ＩＩの化合物に対する抗体の血清抗体応答に最適なプロトコルを実現した。
【００６７】
宿主の脾臓、末梢血、リンパ節又は他の組織から得られるＢリンパ球を、モノクローナル抗体産生細胞として使用することもできる。最も好ましいのは、脾臓から得られるＢリンパ球である。本発明の所望のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマは、こうしたＢリンパ球を、ハイブリッド細胞に長期間の組織培養安定性を付与する細胞系である不死細胞系と融合することによって得られる。本発明の好ましい実施形態において、不死細胞は、リンパ芽球腫細胞又は形質細胞腫細胞、例えば、骨髄腫細胞等であってもよい。レナリドマイド及びサリドマイドモノクローナル抗体を産生する、ネズミ科動物のハイブリドーマは、マウスの骨髄腫細胞と、上記免疫原性コンジュゲートに対して免疫化されたマウスからの脾細胞との融合によって形成される。キメラなヒト化モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞からの遺伝子を発現する抗体をクローン化し、当技術分野で現在よく知られている組換えＤＮＡ法を用いて、マウスの可変領域の部分配列をヒトの定常領域に結合するか、又はヒトのフレームワーク領域をドナーのマウス又はラットの免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）と結合するかのいずれかによって作製することができる。親和性が高められた抗体を提供する、ネズミ科動物のモノクローナル抗体をヒト化するための改良された方法は、国際特許出願ＷＯ９２／１１０１８に記載されている。
【００６８】
一次抗体構造の一部のみを含むポリペプチド断片を作製することもでき、この断片は１種又は複数の免疫グロブリン活性を有する。これらのポリペプチド断片は、当技術分野においてよく知られている方法により、完全な抗体をタンパク分解で切断することによって、又はＦａｂフラグメント又は（Ｆａｂ’）２フラグメントを作製するための部位特異的変異生成を使用して、抗体遺伝子を含む発現ベクター内の所望の位置に終止コドンを挿入することによって作製することができる。単鎖抗体は、ＶＬ領域及びＶＨ領域をＤＮＡリンカーと結合することによって作製することができる（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３（１９８８）及びＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照されたい）。
【００６９】
本発明に従って作製された抗体は、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物の薬理学的、治療的に活性でない代謝産物とのいかなる実質的な交差反応性も有することなく、式ＩＩの化合物、又は式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物の双方と選択的に反応性であり得る。実質的な交差反応性を有さないこととは、本発明の抗体が、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物とのその双方の反応性に相対して、１０％未満、好ましくは５％未満の交差反応性を有することを意味する。
【００７０】
本発明によれば、レナリドマイドと選択的に反応性であって、サリドマイドとの選択的反応性を有さない抗体を作製することができる。レナリドマイドについての選択的反応性を有し、サリドマイドとの選択的反応性がない抗体とは、その抗体が、サリドマイド及びレナリドマイドの双方とのその反応性又は結合に基づいて、レナリドマイドについて少なくとも９５％の活性を有することを意味する。サリドマイドイムノアッセイにおいて利用するためには、その抗体が、レナリドマイド及びサリドマイドの双方と選択的に反応性であり、式Ｉ及び式ＩＩの双方の化合物とのその反応性に基づいて１０％未満の、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物の薬理学的、治療的に活性でない上述の代謝産物との交差反応性を有し、サリドマイド及びレナリドマイドの双方とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、サリドマイドとの反応性を有していなければならない。レナリドマイドイムノアッセイにおいて利用するためには、レナリドマイドと選択的に反応性であるか又はレナリドマイド及びサリドマイドの双方と選択的に反応性であり、式Ｉ及び式ＩＩの双方の化合物とのその反応性に基づいて１０％未満の、式Ｉの化合物及び式ＩＩの化合物の薬理学的、治療的に活性でない上述の代謝産物との交差反応性を有する、任意の本発明の抗体を使用することができる。
【００７１】
イムノアッセイ
本発明によれば、該コンジュゲート及び式ＩＩＩの化合物の免疫原から産生される該抗体は、患者の試料中の式Ｉ及び式ＩＩの化合物の決定のための試薬として利用することができる。この決定は、イムノアッセイによって行われる。患者の試料中の式Ｉ又は式ＩＩの化合物の存在を決定するために、式ＩＩＩの化合物から形成される試薬コンジュゲートが、本発明に従って作製された抗体上の結合部位について、試料中の式Ｉ又は式ＩＩの化合物と競合するあらゆるイムノアッセイを利用することができる。レナリドマイド又はサリドマイドを含有すると考えられる試料において式Ｉ及び式ＩＩの化合物についてのこうしたアッセイを行う方法には、（ａ）水性媒体試料、（ｂ）本発明に従って作製された、式Ｉ及び式ＩＩの化合物に対する抗体、及び（ｃ）式ＩＩＩの化合物から形成される該コンジュゲートを組み合わせることが含まれる。試料中の式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、該試料と抗体との混合物に添加された既知量のコンジュゲートの特異的抗体に対する結合の阻害を測定することによって決定することができる。既知量のコンジュゲートのこうした結合の、未知の試料による阻害の結果を、同様のアッセイにおいて式Ｉ又は式ＩＩの化合物の既知の標準溶液を利用することによって得られる結果と比較する。未知の試料中の式Ｉ又は式ＩＩの化合物の量を決定する際には、該試料、式ＩＩＩの化合物から形成される該コンジュゲート、及び該抗体を、任意の順序で添加することができる。
【００７２】
抗体に結合した、式ＩＩＩの化合物から形成されたコンジュゲートの量を測定するために、多様な方法を利用することができる。１つの方法は、コンジュゲートが抗体に結合することにより、フルオロフォアコンジュゲートの回転速度の低下が引き起こされるものである。液体混合物中のフルオロフォアコンジュゲートの回転速度の低下量は、米国特許第４，２６９，５１１号及び米国特許第４，４２０，５６８号に開示されているような蛍光偏光技術によって検出することができる。
【００７３】
一方、該抗体は、ナノ粒子上にコーティング又は吸収されていてもよく、その結果、これらの粒子が式ＩＩＩの化合物から形成される式Ｉ又は式ＩＩの化合物及びコンジュゲートと反応するときにこれらのナノ粒子が集合体を形成するようになる。しかし、抗体をコーティング又は吸収したナノ粒子が試料中のサリドマイド又はレナリドマイドと反応するときには、これらのナノ粒子に結合した試料からのサリドマイド又はレナリドマイドは抗体ナノ粒子の集合を引き起こさない。この集合又は凝集の量は、アッセイ混合物において吸光度によって測定することができる。
【００７４】
一方、これらのアッセイは、抗体又は式ＩＩＩの化合物のいずれかを、固体支持体、例えばマイクロタイタープレート、又は固体粒子等の他の従来の固体支持体に結合させることによって行うことができる。抗体及びタンパク質をこうした固体粒子に結合させることは、当技術分野においてよく知られている。こうした結合の実施には、任意の従来の方法を使用することができる。多くの場合、測定を補助するために、該抗体と結合している又は結合していない、式ＩＩＩの化合物から形成されるコンジュゲートの量を検出する際の補助として、抗体、コンジュゲート又は固体粒子上に、放射性標識又は酵素標識のような標識をつけることもできる。他の好適な標識としては、発色団、フルオロフォア等が挙げられる。
【００７５】
便宜上、本発明のアッセイ構成材料は、式Ｉ又は式ＩＩの化合物についてのアッセイに使用される所定量の新規試薬を含むパッケージングされた組合せである、キットで提供される。これらの試薬には、本発明の抗体、並びに、式ＩＩＩの化合物から形成されたコンジュゲートが含まれる。本発明に従ってイムノアッセイを行う際に、所定のイムノアッセイにおいて使用される、試薬と、抗体を形成する免疫原とにおいて、基ｐ、Ｘ、Ｙ及びＢは、これらの基のそれぞれについて定義される基の範囲内で、同一の置換基であってもよく、又は異なる置換基であってもよい。したがって、基ｐ、Ｘ、Ｙ、及びＢの定義は、コンジュゲート試薬と免疫原とで同一であるが、これらの基によって示される特定の置換基は、所定のアッセイにおいて免疫原とコンジュゲート試薬とで異なっていてもよい。
【００７６】
これらの必要な試薬に加えて、補助的な試薬のような添加物、例えば、安定剤、緩衝液等が含まれていてもよい。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適にする試薬の溶液中濃度を得るために幅広く変えることもできる。試薬は、溶液で又は、溶解時に、アッセイを行うのに適切な濃度を有する試薬溶液を提供することになる添加剤を含む、通常は凍結乾燥した、乾燥粉末として提供され得る。
【実施例】
【００７７】
実施例において、以下のものを指すのに以下の略語を使用する：
ＨＡＴＵ  Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＰＥＡ  Ｎ−Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＣＨ２Ｃｌ２  ジクロロメタン
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＮＨＳ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ｓ−ＮＨＳ  スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＥＤＣ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
ＫＬＨ  キーホールリンペットヘモシアニン
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＮａＣｌ  塩化ナトリウム
ＨＲＰ  ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＡＮＳ  ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸
ＴＭＢ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
ＴＲＩＳ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド
ｄｉＨ２Ｏ  脱イオン水
リン酸緩衝液の組成には、
１５．４ｍＭ  二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）
４．６ｍＭ  一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）
ｐＨ＝７．２±０．１０
を含有する水溶液がある。
【００７８】
実施例において、以下のスキーム１〜２は、実施例における番号によって参照される、調製した特定の化合物を示している。これらのスキームは、以下の通りである：
【化１３】
2013522594.tif 000014
【化１４】
2013522594.tif 000015
【００７９】
（例１）
レナリドマイド誘導体のカルバモイルペンタント（ｐｅｎｔａｎｔｏｉｃ）酸誘導体［３］の調製（スキーム１）
レナリドマイド［１］（１．０ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）及びグルタル酸無水物［２］（０．４８ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）の無水トルエン中の混合物を窒素下で３．５時間加熱還流した。別のグルタル酸無水物［２］（０．１８ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物をさらに２時間加熱して［３］を生成させた。この混合物を０℃まで冷却し、［３］を沈澱させた。この沈澱した固体を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して１．５５ｇの粗化合物［３］を得た。この粗化合物をエタノール（２０ｍＬ）／Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）から再結晶化させて、純粋な［３］（１．３０ｇ、９０％）を白色固体として得た。
【００８０】
（例２）
レナリドマイド誘導体のカルバモイル−ブチリルアミノ−安息香酸メチル誘導体［７］の調製（スキーム２）
例１において生成した化合物［３］（８００ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）を窒素下で無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解して、これに、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．２７ｍＬ、７．２７ｍｍｏｌ）及びアミン［１０］（７００ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）を添加し、その後、ＨＡＴＵ（１．８８ｇ、４．９３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を２５℃で２４時間撹拌して、［６］を生成させた。フラスコの内容物を酢酸エチルで希釈した。その有機相（酢酸エチル）を、１Ｍの塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。次いで、この酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、これを濾過して取り除いた。酢酸エチル溶媒の除去によって粗生成物［６］が得られ、これを１００％のＥｔＯＡｃ及び１〜２％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純生成物［６］（６８０ｍｇ、５７％）を白色固体として得た。
【化１５】
2013522594.tif 000016
【００８１】
この白色固体［６］（６７６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）中に溶解した。この化合物［６］の溶液にＮ２下０℃でＴＦＡ（３ｍＬ）を添加して、［７］を生成させた。ジクロロメタンを減圧下で除去して、得られた残留物［７］をエーテルで粉末化して粗酸を単離した。この物質をＥｔＯＨ水から再結晶化して、純粋な［７］（５０７ｍｇ、８３％）を得た。
【００８２】
（例３）
ＮＨＳ／ｓ−ＮＨＳで活性化された薬剤誘導体を、対応する酸［３］及び［７］から調製する一般的な方法
レナリドマイド酸誘導体［３］をＥＤＣ及びＮＨＳで活性化して、タンパク質に対する最終的な結合（例４及び５ａ）のための、ＮＨＳで活性化されたレナリドマイドのエステル［４］を作製した。レナリドマイド酸誘導体［７］をＥＤＣ及びｓ−ＮＨＳで活性化して、最終的にタンパク質に結合させるための（例５ｂ）、ｓ−ＮＨＳで活性化されたレナリドマイドのエステル［８］を作製した。
【００８３】
（例３ａ）
ＮＨＳで活性化されたレナリドマイドカルバモイルペンタン酸誘導体［４］の調製
レナリドマイド誘導体［３］、例１、スキーム１、（６７．６２ｍｇ）を、７ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、これに、ＮＨＳ（５９．６０ｍｇ）及びＥＤＣ（９３．００ｍｇ）を添加した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、周囲温度で２０時間撹拌して、ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体のエステル［４］を作製した。この反応混合物を、例４及び５ａにおいて直接使用した。
【００８４】
（例３ｂ）
ｓ−ＮＨＳで活性化されたエステルレナリドマイドカルバモイル−ブチリルアミノ−メチル−安息香酸誘導体［８］の調製
レナリドマイド誘導体［７］、例２、スキーム２（１６．３ｍｇ）を、１．６ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、これに、ｓ−ＮＨＳ（２５．３ｍｇ）及びＥＤＣ（１８．１ｍｇ）を添加した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、周囲温度で２０時間撹拌して、ｓ−ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体のエステル［８］を作製した。この反応混合物を、例５ｂにおいて直接使用した。
【００８５】
（例４）
活性化ハプテン［４］を有するＫＬＨ免疫原の調製
３００ｍｇのＫＬＨを１５ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解することによってＫＬＨのタンパク質溶液を調製し、その後、１．５ｍＬのＤＭＳＯ及び例３ａにおいて調製した、ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体［４］を３．５０ｍＬ添加した。ＫＬＨと、活性化されたレナリドマイド誘導体［４］とのこの反応混合物を、室温で２０時間撹拌させてレナリドマイド−ＫＬＨコンジュゲート［５］を作製した。次いで、このレナリドマイド−ＫＬＨコンジュゲート［５］を、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の１０％ＤＭＳＯに対する透析によって室温で精製した。その後、レナリドマイド−ＫＬＨコンジュゲート［５］を、室温でリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に対して透析した。最後の透析は、４℃でリン酸緩衝液に対して行った。このレナリドマイド−ＫＬＨコンジュゲート［５］を、紫外−可視分光法（ＵＶ／ＶＩＳ）によって特徴付けした。このコンジュゲートを希釈して、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中２ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。
【００８６】
（例５ａ）
活性化ハプテン［４］を有するＢＳＡコンジュゲートの調製
１ｇのＢＳＡをリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解して５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にすることによってＢＳＡのタンパク質溶液を調製した。このＢＳＡのタンパク質溶液に、氷上で撹拌しながらゆっくりとＤＭＳＯ（３．３ｍＬ）を添加し、その後、例３ａにおいて調製した、ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体［４］を０．６０ｍＬ添加した。ＢＳＡのタンパク質溶液に添加する、ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体［４］の量は、レナリドマイド［４］の誘導体とＢＳＡとの間で１：１のモル比で算出した。ＢＳＡと、活性化されたレナリドマイド誘導体［４］とのこの混合物を、室温で１８時間撹拌させて、活性化されたレナリドマイドエステル［４］とＢＳＡとのコンジュゲートを作製した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の１０％ＤＭＳＯに対する透析によって室温で精製した。その後、レナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［５］を、室温でリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に対して透析した。最後の透析は、４℃でリン酸緩衝液に対して行った。精製したレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［５］を、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって特徴付けした。
【００８７】
（例５ｂ）
活性化されたハプテン［８］を有するＢＳＡコンジュゲートの調製
０．５ｇのＢＳＡをリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解して５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にすることによってＢＳＡのタンパク質溶液を調製した。このＢＳＡのタンパク質溶液に、例３ｂにおいて調製した、ｓ−ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体［８］を、氷上で撹拌しながらゆっくりと添加した。ＢＳＡのタンパク質溶液に添加する、ｓ−ＮＨＳで活性化されたレナリドマイド誘導体［８］の量は、レナリドマイドの誘導体［８］とＢＳＡとの間で１：１のモル比で算出した。ＢＳＡと、活性化されたレナリドマイド誘導体［８］とのこの混合物を、室温で１８時間撹拌させて、活性化されたレナリドマイドエステル［８］とＢＳＡとのコンジュゲートを作製した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の１０％ＤＭＳＯに対する透析によって室温で精製した。その後、レナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］を、室温でリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に対して透析した。最後の透析は、４℃でリン酸緩衝液に対して行った。精製したレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］を、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって特徴付けした。
【００８８】
（例６ａ）
レナリドマイド［３］に対するポリクローナル抗体の調製
１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中に乳化させた、例４において調製したような、１００μｇ／マウスのレナリドマイド−ＫＬＨ免疫原［５］で腹腔内に免疫化した。これらのマウスに、初回注射の４週間後に、不完全フロイントアジュバント中に乳化させた１００μｇ／マウスの同一の免疫原で追加免疫を１回行った。追加免疫の２０日後に、ポリクローナル抗体を含有する、各マウスからの試験採血を眼窩出血によって得た。レナリドマイド抗体を含有する、これらの試験採血からの抗血清を、例８及び９において評価した。
【００８９】
（例６ｂ）
レナリドマイド［３］に対するモノクローナル抗体の調製
例４において調製したレナリドマイド−ＫＬＨコンジュゲート［５］で免疫化した例６ａからのマウスを、モノクローナル抗体の産生に使用した。モノクローナル抗体の場合は、融合の３日前から始めて、例４において調製した、ＰＢＳ中の４００μｇ（融合の３日前）、２００μｇ（融合の２日前）、及び２００μｇ（融合の１日前）のレナリドマイド−ＫＬＨコンジュゲート［５］を該マウスに腹腔内注射した。脾細胞を、選択したマウスから単離して、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２．５．１−２．５．８，（１９９２），Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹの方法に従って、５０％のポリエチレングリコール１５００を用いて２×１０７のＳＰ２／０細胞で融合させた。この融合細胞を、１０枚の９６ウェルプレート上の、２０％のＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ  Ｉ、２％のＬ−グルタミン（１００ｍＭ）及び２％の５０ＸＨＡＴを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中に播種した。２週間から３週間後に、このハイブリドーマ上清を、（例８ｂにおけるような）ＥＬＩＳＡによって抗レナリドマイド抗体の存在について試験した。陽性のＥＬＩＳＡ結果が得られたウェルからの細胞を、２４ウェルプレートに展開した。これらのモノクローナル抗体を、例９に記載のような間接的競合マイクロタイタープレートアッセイによって、レナリドマイド及びサリドマイドの結合について試験した。ＥＬＩＳＡによって陽性のクローンを、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２．５．８−２．５．１７，１９９２，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ中に開示されている方法に従って、限界希釈によって少なくとも１回サブクローン化した。
【００９０】
（例７ａ）
レナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［５］でのマイクロタイタープレート感作方法
レナリドマイド濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合用に最適化されており、プレートあたり９６個のウェルを含む、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ８  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅｓ）中で行った。各ウェルを、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中に１０μｇ／ｍＬのレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［５］を３００μＬ添加して、室温で３時間インキュベートすることによって、（例５ａにおけるように調製した）レナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［５］でコーティングした。これらのウェルを０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６で洗浄し、次いで、３７５μＬの５％ショ糖、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロッキングした。後からコーティングした溶液を除去した後に、このプレートを３７℃で一晩乾燥させた。
【００９１】
（例７ｂ）
レナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］でのマイクロタイタープレート感作方法
レナリドマイド濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合用に最適化されており、プレートあたり９６個のウェルを含む、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ８  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅｓ）中で行った。各ウェルを、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中に１０μｇ／ｍＬのレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］を３００μＬ添加して、室温で３時間インキュベートすることによって、（例５ｂにおけるように調製した）レナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］でコーティングした。これらのウェルを０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６で洗浄し、次いで、３７５μＬの５％ショ糖、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロッキングした。後からコーティングした溶液を除去した後に、このプレートを３７℃で一晩乾燥させた。
【００９２】
（例８ａ）
抗体スクリーニング法−力価（タイター）
この方法は、例９におけるような置換について試験する抗体の希釈率を見出すためのものである。（例６において作製した）レナリドマイド抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡ法を、例７ａ及び７ｂにおいて調製したレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲートで感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。抗体スクリーニングアッセイは、ポリクローナルレナリドマイド抗体を含有する、（例６ａにおけるような）試験採血からのネズミ科動物の血清を、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で１：２，０００、１：６，０００、１：１８，０００及び１：５４，０００（容積／容積）に希釈することによって行った。（例７ａ及び７ｂにおいて調製した）レナリドマイド−ＢＳＡで感作したウェルの各ウェルに、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有する５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水及び５０μＬの希釈した抗体を添加し、振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウェル中に受動的に吸収されたレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート（例７ａ及び７ｂ）に結合する。プレートのウェルを、０．０２ＭのＴＲＩＳ、０．９％のＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．００１％のチメロサール、ｐＨ７．８で３回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。ウェル中でレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲートに結合したレナリドマイド抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質（本例ではＴＭＢ）と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＡＮＳ、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳ中で特定の活性（約１／３０００）まで希釈して、これを各ウェルに１００μＬ添加した。振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートがウェル中でレナリドマイド抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び３回洗浄して、結合していないヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦｘ）を１００μＬ添加して、振盪しながら室温で１０分間インキュベートしている間に発色させた。発色のためのインキュベート後に、５０μＬの停止液（ｄｉＨ２Ｏ中１．５％のフッ化ナトリウム）を各ウェルに添加して発色を停止させ、２０秒間振盪した後に、６５０ｎｍにおいて吸光度を決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。１ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例し、希釈率（力価）として表され、１．５の吸光度という結果になった。力価は、測定された抗体の抗体希釈率（ｘ軸）対吸光度６５０ｎｍ（ｙ軸）をグラフ化して、１．５の吸光度における力価を補間することによって決定した。１．５の吸光度が得られたこの力価により、例９に記載の間接的競合マイクロタイタープレートアッセイにおいて使用する抗体の濃度（希釈率）を決���した。
【００９３】
（例８ｂ）
抗体スクリーニング法−モノクローナルスクリーニング
（例８ｂにおいて作製した）レナリドマイドモノクローナル抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡ法を、例７ｂに記載のレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］で感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。（例７ｂにおいて調製した）レナリドマイド−ＢＳＡで感作したウェルの各ウェルに、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有する５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水及び次いで５０μＬのモノクローナル培養液上清を添加し、振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウェル中でレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲートに結合する。プレートのウェルを、０．０２ＭのＴＲＩＳ、０．９％のＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．００１％のチメロサール、ｐＨ７．８で３回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。ウェル中のレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲートに結合したレナリドマイド抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質（本例ではＴＭＢ）と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＡＮＳ、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳ中で１／３０００に希釈して、これを各ウェルに１００μＬ添加した。振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートがウェル中でレナリドマイド抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び３回洗浄して、結合していないヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦｘ）を１００μＬ添加して、振盪しながら室温で１０分間インキュベートしている間に発色させた。発色のためのインキュベート後に、５０μＬの停止液（ｄｉＨ２Ｏ中１．５％のフッ化ナトリウム）を各ウェルに添加して発色を停止させ、１０秒間振盪した後に、６５０ｎｍにおいて吸光度を決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。１ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例した。バックグラウンドの３倍より大きい吸光度を有する試料が陽性であるとされた。例８ｂに記載のように、０．４を超える吸光度を有する試料を２４ウェルプレートに展開した。
【００９４】
（例９）
間接的競合マイクロタイタープレートイムノアッセイ法
レナリドマイドに対する抗体のＩＣ５０の決定
ＩＣ５０値を決定するためのＥＬＩＳＡ法を、例７ｂに記載のレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲート［９］で感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。検体、すなわちレナリドマイド及びサリドマイドをＤＭＳＯ中に溶解し、１から１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって、ｄｉＨ２Ｏ中に希釈した。それぞれのアッセイは、５０μＬの検体溶液を、例４（レナリドマイド）の免疫原で例６ａにおいて産生されたポリクローナル抗体から選択される抗体のうちの１種の５０μＬ及び例８ｂ（レナリドマイド及びサリドマイド）において産生されたモノクローナル抗体から選択されるうちの１種の５０μＬと共にインキュベートすることによって行った。これらのアッセイはすべて、ウェルのそれぞれにおいて、抗体の濃度を、例８ａにおいて決定された力価に希釈することによって行った。（振盪しながら室温で）１０分間のインキュベート中に、（例７ｂにおいて作製した）ウェル中のレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲートと、溶液中の検体とに対する抗体結合の競合が生じる。このインキュベート後に、プレートのウェルを、０．０２ＭのＴＲＩＳ、０．９％のＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．００１％のチメロサール、ｐＨ７．８で３回洗浄し、結合しなかった物質をすべて除去した。（例７ｂにおいて作製した）ウェル中のレナリドマイド−ＢＳＡコンジュゲートに結合したレナリドマイド抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質（本例ではＴＭＢ）と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＡＮＳ、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳ中で予め決定された特定の活性（約１／３０００）まで希釈して、これを各ウェルに１００μＬ添加した。振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートがウェル中でレナリドマイド抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び３回洗浄して、結合していない二次コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦｘ）を１００μＬ添加して、振盪しながら室温で１０分間のインキュベートにおいて発色させた。発色のためのインキュベート後に、５０μＬの停止液（ｄｉＨ２Ｏ中１．５％のフッ化ナトリウム）を各ウェルに添加して発色を停止させ、２０秒間振盪した後に、６５０ｎｍにおいて吸光度を決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。１ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例し、試料中のレナリドマイド又はサリドマイドの量に反比例した。レナリドマイド及びサリドマイドのＩＣ５０値は、ウェル中の吸光度をウェル中の検体濃度に対してプロットした、用量反応曲線を構築することによって決定した。検体を含有するウェルにおける色の吸光度を、検体を含まないものと比較して、標準曲線を作成した。所与の検体のＩＣ５０値は、検体を含有しないウェルの吸光度の５０％を有するのに必要な検体の濃��として定義された。下記の表Ｉに、レナリドマイドに対するポリクローナル抗体についての結果がある。下記の表ＩＩに、レナリドマイドに対するモノクローナル抗体についての結果がある。
【表１】
2013522594.tif 000017
【表２】
2013522594.tif 000018
【００９５】
これらの表からわかるように、本発明の抗体は、レナリドマイド及びサリドマイドと実質的に反応性である。
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月14日(2012.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサリドマイドを検出するためのイムノアッセイであって、前記試料と、薬学的に活性な化学療法薬であるレナリドマイド及びサリドマイドの混合物と選択的に反応性であり且つ薬学的に活性な化学療法薬の前記混合物とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、サリドマイドとの反応性を有する抗体と、次式を有するリガンド：
【化１】
2013522594.tif 000056
［式中、Ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
ｐは、０から１までの整数であり、
Ｘは、担体に結合することができる末端官能基である］
との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中のサリドマイド及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合している又は結合していない前記混合物中の前記コンジュゲートを測定し、それによって前記試料中のサリドマイドの存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。
【請求項２】
試料中のレナリドマイドを検出するためのイムノアッセイであって、前記試料と、レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体と、次式を有するリガンド：
【化２】
2013522594.tif 000057
［式中、Ｂ、Ｙ、ｐ及びＸは請求項１に記載の定義のとおりである］
との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中のレナリドマイド及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合している又は結合していない前記混合物中の前記コンジュゲートの量を測定し、それによって前記試料中のレナリドマイドの存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。
【請求項３】
ｐが０である、請求項１または２に記載のイムノアッセイ。
【請求項４】
ｐが１である、請求項１または２に記載のイムノアッセイ。
【請求項５】
Ｙが、１個から１０個までの炭素原子を含むアルキレン、
【化３】
2013522594.tif 000058
［式中、ｎ及びｏは、０から６までの整数であり、ｍは、１から６までの整数である］
である、請求項４に記載のイムノアッセイ。
【請求項６】
Ｙが、１個から６個までの炭素原子を含む低級アルキレンである、請求項５に記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
Ｙが
【化４】
2013522594.tif 000059
［式中、ｍ及びｏは、請求項５に記載の定義の通りである］
である、請求項５に記載のイムノアッセイ。
【請求項８】
Ｘが
【化５】
2013522594.tif 000060
［式中、Ｒ３は、水素又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ４は、酸素又は硫黄である］
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。
【請求項９】
Ｘが
【化６】
2013522594.tif 000061
である、請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
Ｘが
【化７】
2013522594.tif 000062
であり、
Ｒ３が水素であるか；又は
反応性エステル、好ましくは低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルを形成している、
請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１１】
Ｘが
【化８】
2013522594.tif 000063
であり、
ＯＲ３がヒドロキシスクシンイミドエステル又はスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する、請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１２】
Ｂが−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。
【請求項１３】
前記試料がヒト試料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。
【請求項１４】
前記ヒト試料が、サリドマイドで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって前記試料中のサリドマイドの量を測定する、請求項１３に記載のイムノアッセイ。
【請求項１５】
前記抗体が、前記化学療法薬とのその反応性に基づいて最少１０％の、サリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項１４に記載のイムノアッセイ。
【請求項１６】
前記ヒト試料が、レナリドマイドで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって前記試料中のレナリドマイドの量を測定する、請求項１３に記載のイムノアッセイ。
【請求項１７】
前記抗体が、前記化学療法薬とのその反応性に基づいて約１００％の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項１６に記載のイムノアッセイ。
【請求項１８】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化９】
2013522594.tif 000064
［式中、Ｙ、ｐ及びＢは、請求項１〜７及び１２のいずれか１項に記載の定義の通りであり、Ｘは、ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である］
とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。
【請求項１９】
前記抗体が固体支持体、好ましくはマイクロタイタープレート又はナノ粒子に結合されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。
【請求項２０】
レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性があり、好ましくは薬学的に活性な前記化学療法薬の薬学的に活性でない代謝産物と１２％を超えない交差反応性を有する抗体であって、前記交差反応性が、薬学的に活性な前記化学療法薬に対する前記抗体の結合に相対したものである、抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、次式のリガンド：
【化１０】
2013522594.tif 000065
［式中、Ｂ、Ｙ、ｐ及びＸは、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の定義の通りである］とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、前記化学療法薬とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも４０％の、サリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項２０又は２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、前記化学療法薬とのその反応性に基づいて少なくとも約２０％の、好ましくは約１００％の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、モノクローナル抗体であり、好ましくはマウス、ヒツジ、ウサギ又はラットに由来する、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
次式の化合物：
【化１１】
2013522594.tif 000066
［式中、Ｂ、Ｙ、ｐ及びＸは、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の定義の通りである］。
【請求項２６】
次式のリガンド：
【化１２】
2013522594.tif 000067
［式中、Ｂ、Ｙ、ｐ及びＸは、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の定義の通りである］とコンジュゲートした担体を含むコンジュゲート。
【請求項２７】
前記担体がポリアミンポリマーを含む免疫原性担体であり、Ｘは前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
患者の試料中のサリドマイドの存在を決定するためのキットであって、別々の容器中にパッケージングされた別々の試薬を含み、前記試薬のうちの一方が、次式のリガンド：
【化１３】
2013522594.tif 000068
［式中、Ｂ、Ｙ、ｐ及びＸは、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の定義の通りである］との担体のコンジュゲートであり、他方の試薬が、薬学的に活性な化学療法薬であるレナリドマイド及びサリドマイドの混合物と選択的に反応性であり且つ薬学的に活性な化学療法薬の前記混合物とのその反応性に基づいて少なくとも１０％の、サリドマイドとの選択的反応性を有する抗体であるキット。
【請求項２９】
患者の試料中のレナリドマイドの存在を決定するためのキットであって、別々の容器中にパッケージングされた別々の試薬を含み、前記試薬のうちの一方が、次式のリガンド：
【化１４】
2013522594.tif 000069
［式中、Ｂ、Ｙ、ｐ及びＸは、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の定義の通りである］との担体のコンジュゲートであり、他方の試薬が、レナリドマイド、及びサリドマイドとレナリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体である、キット。
【国際調査報告】
2013522594.tif 000070