(57)【要約】  本明細書において開示されるのは、多重モード検出剤の組成物およびそれを製作する方法である。多重モード検出剤は、ポリマー担体の表面へ付加された複数の金属ナノ粒子を含む。検出剤は、金属ナノ粒子またはポリマー担体へ付加された１種以上の標的特異的結合剤をさらに含む。
2013522653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー担体の表面へ付加された複数の金属ナノ粒子を含む多重モード検出剤であって、前記金属ナノ粒子または前記ポリマー担体へ付加された１種以上の標的特異的結合剤をさらに含む、前記検出剤。
【請求項２】
前記金属ナノ粒子が、金、銀、コバルト、マンガンおよび鉄からなる群から選択される１種以上の金属および金属酸化物を含む、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項３】
前記金属ナノ粒子が金を含む、請求項２に記載の多重モード検出剤。
【請求項４】
前記ポリマー担体がポリ（ε−カプロラクトン）を含む、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項５】
前記ポリマー担体がポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含む、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項６】
前記１種以上の標的特異的結合剤が、抗体、Ｆａｂ断片またはその結合断片である、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項７】
前記１種以上の標的特異的結合剤がＥＧＦＲ特異的抗体である、請求項６に記載の多重モード検出剤。
【請求項８】
前記１種以上の標的特異的結合剤が、細胞表面受容体を特異的に標的化するペプチド配列である、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項９】
前記１種以上の標的特異的結合剤が、ＥＧＦＲを特異的に標的化するペプチド配列である、請求項８に記載の多重モード検出剤。
【請求項１０】
前記１種以上の標的特異的結合剤が、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩トリペプチドである、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項１１】
前記１種以上の標的特異的結合剤が、α−Ｖ−βＩＩＩインテグリン受容体に結合する、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項１２】
前記ポリマー担体が修飾されたポリ（ε−カプロラクトン）を含む、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項１３】
前記ポリマー担体が露出したチオール基を有するゼラチンの少なくとも１つの層を含む、請求項１２に記載の多重モード検出剤。
【請求項１４】
前記金属ナノ粒子が金を含む、請求項１３に記載の多重モード検出剤。
【請求項１５】
前記金属ナノ粒子が約２ナノメートル〜約３０ナノメートルである、請求項１４に記載の多重モード検出剤。
【請求項１６】
前記ポリマー担体が約５００ナノメートル〜約１０ミクロンである、請求項１または１５に記載の多重モード検出剤。
【請求項１７】
前記標的特異的結合剤が、抗体およびペプチド配列からなる群から選択される、請求項１６に記載の多重モード検出剤。
【請求項１８】
前記ポリマー担体が画像化剤をカプセル化する、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項１９】
前記画像化剤が、蛍光団、放射標識、Ｘ線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される、請求項１８に記載の多重モード検出剤。
【請求項２０】
前記画像化剤が近赤外蛍光色素である、請求項１９に記載の多重モード検出剤。
【請求項２１】
前記金属ナノ粒子が約１０〜約２０ｎｍである、請求項１５に記載の多重モード検出剤。
【請求項２２】
前記ポリマー担体が約１．５ミクロンである、請求項１６に記載の多重モード検出剤。
【請求項２３】
前記標的特異的結合剤が前記金属ナノ粒子へ付加される、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項２４】
前記標的特異的結合剤が前記金属ナノ粒子および前記ポリマー担体へ付加される、請求項１に記載の多重モード検出剤。
【請求項２５】
多重モード画像化剤を製造する方法であって、
（ａ）ポリマーコア粒子を製作する工程と；
（ｂ）前記ポリマーコア粒子に少なくとも１つのコーティングを添加してポリマー担体を形成する工程と；
（ｃ）１種以上の金属ナノ粒子を前記コーティングへ付加する工程と；
（ｄ）前記少なくとも１つのコーティングまたは１種以上の金属ナノ粒子を標的特異的結合剤により官能化する工程と
を含む方法。
【請求項２６】
前記ポリマーコア粒子がポリ（ε−カプロラクトン）を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１種以上の金属ナノ粒子が、金、銀および鉄からなる群から選択される１種以上の金属および金属酸化物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記金属ナノ粒子が金を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記金属ナノ粒子が約２ナノメートル〜約３０ナノメートルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマー担体が約５００ナノメートル〜約１０ミクロンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的特異的結合剤がＥＧＦＲ特異的抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的特異的結合剤が、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩トリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的特異的結合剤がα−Ｖ−βＩＩＩインテグリン受容体に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマー担体が約１．５ミクロンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリマーコア粒子の製作が、前記ポリマーコア粒子内に画像化剤をカプセル化することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記画像化剤が、蛍光団、放射標識およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのコーティングがチオールで修飾したゼラチンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記金属ナノ粒子が約１０〜約２０ｎｍである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的特異的結合剤が、抗体、Ｆａｂ断片またはその結合断片である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年３月２４日に出願された米国仮出願第６１／３１７１２３号に関連し、それに対する優先権を主張し、その内容全体は参照として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は医学分野に関連する。より具体的には、本発明はマイクロ粒子および蛍光ガイド散乱技術を利用する癌治療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
１年あたり１５０万を超える癌の新規症例が診断され、いくつかのタイプの癌についての死亡率は依然として非常に高い。その発端での腫瘍病巣の診断、ならびに外科手術、放射線および化学療法による早期診療は、通常その疾患の転帰において正の効果を有する。
【０００４】
現在の口腔癌診断は疾患の進行期における組織変成に基づき、それは生検および病理学的分析によって確認される。ルーチンの歯科検診において使用できる前癌性病巣に特異的な早期診断技術は臨床転帰に有利な影響を提供するだろう。同様に、結腸内視鏡検査、ＣＴなど等の現在の結腸癌スクリーニング試験は、既に進行期にある癌をのみ検出することができる。この段階で、患者は、既に用便習慣の変化、血便および腹痛等の病徴を示す。早期の診断および診療は疾患の完全治癒を多くの場合もたらすので、良好な診断方法が実際必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
この開示は癌性病巣の検出のための多重モード技術に関する。本明細書において開示される組成物は、ポリマーの担体の表面へ付加された複数の金属ナノ粒子を含む多重モード検出剤を含む。検出剤は、金属ナノ粒子またはポリマー担体へ付加された１種以上の標的特異的結合剤をさらに含む。この技術において、標的特異的結合剤（すなわち標的化リガンド）は、対象となる細胞または組織へのマイクロ粒子の結合を特異的に支援する。組織形態の検出に画像化技術（ＯＣＴ等）が使用される。
【０００６】
本明細書において開示される組成物の態様は多重モード検出剤を含む。検出剤は、ポリマー担体の表面へ付加された複数の金属ナノ粒子を含む。検出剤は、金属ナノ粒子またはポリマー担体へ付加された１種以上の標的特異的結合剤をさらに含む。
【０００７】
特定の実施形態において、金属ナノ粒子は金、銀、コバルト、マンガンおよび鉄からなる群から選択される１種以上の金属および金属酸化物を含む。特定の実施形態において、金属ナノ粒子は金を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ポリマー担体はポリ（ε−カプロラクトン）を含み、他の実施形態において、ポリマー担体はポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含む。いくつかの実施形態において、１種以上の標的特異的結合剤は抗体、Ｆａｂ断片またはその結合断片である。特定の実施形態において、１種以上の標的特異的結合剤はＥＧＦＲ特異的抗体である。より特定の実施形態において、１種以上の標的特異的結合剤は細胞表面受容体を特異的に標的化するペプチド配列である。さらにより特定の実施形態において、１種以上の標的特異的結合剤はＥＧＦＲを特異的に標的化するペプチド配列である。他の実施形態において、１種以上の標的特異的結合剤はアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩トリペプチドである。さらに他の実施形態において、１種以上の標的特異的結合剤はα−Ｖ−βＩＩＩインテグリン受容体へ結合する。
【０００９】
特定の実施形態において、ポリマー担体は修飾したポリ（ε−カプロラクトン）を含む。いくつかの実施形態において、ポリマー担体は、露出したチオール基を有する少なくとも１つのゼラチンの層を含む。他の実施形態において、金属ナノ粒子は金を含む。
【００１０】
特定の態様において、金属ナノ粒子は約２ナノメートル〜約３０ナノメートルである。特定の実施形態において、ポリマー担体は約５００ナノメートル〜約１０ミクロンである。
【００１１】
他の実施形態において、標的特異的結合剤は抗体およびペプチド配列からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ポリマー担体は画像化剤をカプセル化する。なおさらなる実施形態において、画像化剤は、蛍光団、放射標識、Ｘ線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される。さらなる実施形態において、画像化剤は近赤外蛍光色素である。なおさらなる実施形態において、金属ナノ粒子は約１０〜約２０ｎｍである。特定の実施形態において、ポリマー担体は約１．５ミクロンである。
【００１２】
特定の実施形態において、標的特異的結合剤は金属ナノ粒子へ付加される。特定の実施形態において、標的特異的結合剤は金属ナノ粒子およびポリマー担体へ付加される。
【００１３】
本明細書において開示される態様は、多重モード画像化剤を製造する方法を含む。方法は、ポリマーコア粒子を製作すること、およびポリマーコア粒子へ少なくとも１つのコーティングを添加してポリマー担体を形成することを含む。追加の態様において、方法は１種以上の金属ナノ粒子をコーティングへ付加すること、および少なくとも１つのコーティングまたは１種以上の金属ナノ粒子を標的特異的結合剤により官能化することを含む。
【００１４】
特定の実施形態において、ポリマーコア粒子はポリ（ε−カプロラクトン）を含む。他の実施形態において、１種以上の金属ナノ粒子は金、銀および鉄からなる群から選択される１種以上の金属および金属酸化物を含む。特定の実施形態において、金属ナノ粒子は金を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、金属ナノ粒子は約２ナノメートル〜約３０ナノメートルである。特定の実施形態において、ポリマー担体は約５００ナノメートル〜約１０ミクロンである。
【００１６】
特定の実施形態において、標的特異的結合剤はＥＧＦＲ特異的抗体である。より多くの特定の実施形態において、標的特異的結合剤はアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩トリペプチドである。より特定の実施形態において、標的特異的結合剤はα−Ｖ−βＩＩＩインテグリン受容体へ結合する。
【００１７】
特定の実施形態において、ポリマー担体は約１．５ミクロンである。
【００１８】
他の実施形態において、ポリマーコア粒子の製作はポリマーコア粒子内に画像化剤をカプセル化することをさらに含む。さらなる実施形態において、画像化剤は、蛍光団、放射標識およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される。
【００１９】
特定の実施形態において、少なくとも１つのコーティングはチオールで修飾したゼラチンである。さらなる実施形態において、金属ナノ粒子は約１０〜約２０ｎｍである。他の実施形態において、標的特異的結合剤は抗体、Ｆａｂ断片またはその結合断片である。
以下の図は、イラストの目的のためのみ示され、限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】近赤外蛍光色素を取り込むポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）マイクロ粒子へ共有結合で付加されたコロイド金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）上に吸着された標的特異的リガンドからなる多重モード技術の組立てを示す流れ図を示す図示である。使用される標的化リガンドは、それぞれ、前癌性結腸上皮細胞上で過剰発現されるα−Ｖ−β−ＩＩＩ（αvβ3）インテグリン受容体を効果的に標的化するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ＲＧＤ）トリペプチド、または口腔における前癌性病巣を標的化する表皮増殖因子（ＥＧＦＲ）抗体である。７５０ｎｍの吸収スペクトルを持つ親油性ＤＩＤ色素アナログからなる近赤外色素コアは、前癌性病変の蛍光ガイドＯＣＴ画像化のために使用される。
【図２】近赤外色素コアを持つＡｕナノ粒子でコートされたＰＣＬマイクロ粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す画像説明である。マイクロ粒子のおよそのサイズは直径で１．６μｍである。Ａｕ  ＮＰによるＰＣＬマイクロ粒子表面の被覆を拡大画像（中央）および後方散乱画像（右側）において示す。
【図３】αvβ3インテグリン受容体を発現するＨＴ２９（Ａ、Ａ’）およびＳＷ４８０（Ｂ、Ｂ’）結腸癌細胞におけるＲＧＤで官能化したＡｕ−ＰＣＬ−ＤｉＲマイクロ粒子の結合効率のインビトロ研究を示す画像説明である。明視野（左側）および蛍光（右側）画像は１００倍の油浸Ｏｌｙｍｐｕｓの対物レンズで撮影した。
【図４】ｎｕ／ｎｕマウスにおける皮下異種移植モデルから得られた正常組織およびＨＴ  ２９腫瘍組織におけるＲＧＤで官能化したＡｕ−ＰＣＬ−ＤｉＲマイクロ粒子の結合効率を示すエクスビボ研究を示す画像説明である。Ａ、Ｂ−正常な線維組織および脂肪組織の明視野像；Ａ’、Ｂ’−対応する蛍光画像；Ｃ、Ｄ−腫瘍組織の明視野像；Ｃ’、Ｄ’−対応する蛍光画像。画像は１００倍の油浸Ｏｌｙｍｐｕｓの対物レンズで撮影した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．組成物
本明細書において開示されるのは多重モード検出剤およびそれを作製する方法である。かかる薬剤は、口腔癌、食道癌、胃癌および結腸癌等の表在性腫瘍病巣のより効果的な早期診断を促進する。本明細書において開示される検出剤の態様は多重モード検出剤であり、各々はポリマー担体の表面に付加された複数の金属ナノ粒子を含む。各検出剤は、金属ナノ粒子またはポリマー担体へ付加された１種以上標的特異的結合剤をさらに含む。
【００２２】
多重モード技術は、多重モード検出剤への標的特異的結合剤の局所投与に部分的に基づく。本明細書において使用される時、「標的特異的結合剤」という用語は、標的の分子または構造への親和性を有し、ファンデルワールス力、ロンドン力、共有結合、イオン結合、水素結合またはこれらの相互作用の組み合わせを介して標的分子または化合物と相互作用または会合する分子または化合物を意味する。
【００２３】
本明細書において開示される組成物は１種以上の画像化剤もカプセル化することができる。本明細書において使用される時、「カプセル化する」という用語は、ポリマー担体内に封入されることまたはポリマー担体と会合することを意味する。カプセル化は、ポリマー担体の表面でのまたはポリマー担体内での分子または化合物の会合を含むことができる。かかる画像化剤は、蛍光団、放射標識、Ｘ線造影剤、ＲＡＭＡＮ分光法用薬剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤を含む。蛍光団の例は、ローダミン、フルオレセイン、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレサミンおよび金属キレートを含む。放射標識の例は、3Ｈ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、36Ｃｌ、57Ｃｏ、55Ｆｅ、59Ｆｅ、90Ｙ、99ｍＴｃ（テクネチウム９９の準安定異性体）、および75Ｓｅを含む。さらに、Ｘ線造影剤は、ディアトリゾエート（Ｈｙｐａｑｕｅ  ５０）、メトリゾアート（Ｉｓｏｐａｑｕｅ  ３７０）、イオキサグラート（Ｈｅｘａｂｒｉｘ）、イオパミドール（Ｉｓｏｖｕｅ  ３７０）、イオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ  ３５０）、イオキシラン（Ｏｘｉｌａｎ  ３５０）、イオプロミド（Ｕｌｔｒａｖｉｓｔ  ３７０）およびイオジキサノール（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ  ３２０）を含む。他の薬剤は、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）基、ＤＩＤ蛍光色素アナログ、および全重水素化したアルキルホスホニウム基またはアリールホスホニウム基を含む。粒子内に画像化剤をカプセル化する方法は当該技術分野において公知である。例えば、溶媒置換方法は核酸、低分子およびペプチドのカプセル化に使用されている（例えばＯｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００６）１１１（３）：３７１−３８１；Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ  ２２（１）：１２−１７を参照されたい）。
【００２４】
ポリマー担体は任意の構造であり、画像化剤のカプセル化および金属ナノ粒子の付加を可能にする材料から構成され得る。特定の実施形態において、ポリマー担体は、１種以上のシリカ、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、および／またはその修飾物を含むコア粒子から構築することができる。コア粒子は色素または他の画像化剤の凝集でもあり得る。コア粒子の生産のために有用な他の材料は、ポリチオラート、システイン含有ペプチド、ポリアクリレート、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヌクレオチド、ポリ（ヒドロキシエチルオキサゾリン）、ポリ核酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアリルアミンおよびポリアミノ酸、多糖（特にキトサン）、カルボフィル、カルボマーおよびカルボポール、ポリ（ジメチルアミノアルキルメタクリレート）およびポリ（ジメチルアミノアルキルアクリレート）等のポリマー、ならびにコポリマーのポリ（ジメチルアミノアルキルメタクリレート−コ−トリメチルアミノアルキルメタクリレート）およびポリ（ジメチルアミノアルキルアクリレート−コ−トリメチルアミノアルキルアクリレート）を含む。担体を生産する方法は、当該技術分野において公知であり、単一エマルジョン方法および溶媒置換方法を含む（例えばＦｕｒｔａｄｏ  Ｍｏｓｑｕｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ：Ｐａｐｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  １９９９  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（２０００）８９（５）：６１４−６２６；Ｒｏｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００４）９９（２）：２７１−２８０を参照されたい）。
【００２５】
多重モード検出剤の特定の態様は、ポリマー担体のコア粒子に付加されるかまたはポリマー担体のコア粒子と会合する１種以上のゼラチン層を含む。本明細書において使用される時、「ゼラチン」という用語は、水溶液を吸収することができ、ゲルを形成できる任意の親水性物質または材料を意味する。例示的なゲル化材料は、ゼラチン、多糖、セルロース、コラーゲン、ケラチンおよびポリケタールおよびβ−ラクトグロブリンを含む。特定の実施形態において、ゲル化材料は生体分解性または生体適合性である。ポリマー材料を調製する方法は、当該技術分野において周知である（例えばＰａｐｉｓｏｖ  Ｍ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００５）６：２６５９−２６７０；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（１９９７）３８６：４１０−４１４；Ｔｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．（２００１）３（１）：Ａｒｔｉｃｌｅ  １１を参照されたい）。
【００２６】
ゼラチン層またはコア粒子は標的特異的結合剤を含む様々な基により誘導体化することができる。有機ポリマーの誘導体化を実行して、それらの表面で選択された反応基を曝露することができる（例えばＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００７）２８（３４）：５１７６−５１８４；Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）１８（４）：１０８７−１０９４；ａｎｄ  Ｇｉｎｄｙ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＭＳＥ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ（２００６）９５：９８９−９９０を参照されたい）。さらに、タンパク質、ペプチド、抗体および低分子等の標的特異的結合剤をポリマーへ付加することは、当該技術分野において公知である（例えば米国特許第７，０２２，３３６号；Ｂｕｍｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００９）１３７（２）：９０−７；Ｓｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１０）３１（１８）：４９８７−９４；Ｂａｌｍａｙｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（２０１１）１０．１０９８／ｒｓｉｆ．２０１０．０５３１を参照されたい）。標的特異的結合剤は、標的、リガンド、ペプチド（例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（「ＲＧＤ」）トリペプチド）、タンパク質、抗体、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片およびペプチド模倣物化合物を結合する低分子であり得る。例示的な標的は、受容体（例えばα−Ｖ−βＩＩＩインテグリン受容体およびＥＧＦＲ受容体）、リン脂質、糖タンパク質およびタンパク質を含む。
【００２７】
特定の態様において、多重モード検出剤は、ポリマー担体の表面へ付加された金属ナノ粒子を含む。ポリマー担体の表面は、本明細書において記載されるようなコア粒子、またはコア粒子の表面に付加されるゼラチン層のどちらかであり得る。金属ナノ粒子の多様性は組成物における使用のために好適である。特定の実施形態において、好適なナノ粒子は本質的に球形の形態である。他の実施形態において、他の形態が使用される。ナノ粒子は金属からなる。特異的実施形態において、金属ナノ粒子は、金、銀および鉄の金属および金属酸化物を含む。金属ナノ粒子は均質、または２つ以上の金属からブレンドされ得る。ナノ粒子の表面は、標的特異的結合剤による官能化のために好適な１種以上の化学的反応基を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子の表面は単一タイプの複数の均一に分布した反応基を含む。使用のために好適なナノ粒子のいくつかの非限定例は、金、チオール残基、架橋された鉄、アミノプロピルシリル酸化アシル（ＣＬＩＯ）保護基、銀、アミン有機ポリマー、ＣＯＯＨまたはＮＨ2またはＣＯＯＨの量子ドットである。
【００２８】
金属ナノ粒子のサイズ（例えば平均（中間）直径）は、約２ｎｍ〜約１００ｎｍ；約５ｎｍ〜約５０ｎｍ；約２ｎｍ〜約３０ｎｍ；および約１０ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲である。１セットのナノ粒子内のサイズ分布は正規分布であるが、しかしながら、特定の適用のために、セットは二峰性タイプまたは他のタイプの分布等の他のサイズ分布を有することができる。ナノ粒子のサイズ分布および平均直径は、光散乱、電子顕微鏡法およびサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない当該技術分野において公知のいずれか方法によって測定することができる。
【００２９】
特異的実施形態において、多重モード検出剤は、ポリ（ε−カプロラクトン）へ吸着されたコロイド金（Ａｕ−ＰＣＬ）またはシリカマイクロ粒子および蛍光ガイド散乱技術を含む。造影が促進された蛍光画像は疑わしい病巣の局在の良好な決定を支援するが、ＯＣＴは蛍光ガイダンス下で使用されて、組織形態を可視化し、従って、新生物疾患のための確認ツールとして役立つ。
【００３０】
本明細書において開示される多重モード検出剤は公知の画像化技法において有用である。例えば、多重モード検出剤は光干渉断層撮影法（「ＯＣＴ」）画像化において使用することができる。他の検出方法は、蛍光顕微鏡検査法、電子常磁性共鳴法、ラマン分光法およびポジトロン放出断層撮影法を含む。
【００３１】
特定の実施形態において、多重モード技術はコア材料としてＰＣＬまたはシリカのマイクロスフェアを使用して構築される。コア材料は図１において示されるように近赤外蛍光色素をさらに取り込む。単一エマルジョン方法を用いて色素をカプセル化するコア粒子を形成することができる。図１中に示される実施形態において、取り込みはセチルトリエチルアンモニウムブロミドの存在下において実行される。図１において、近赤外コア粒子１０を含み、アミンで修飾したＰＣＬ粒子（すなわちポリマー担体）は、単一エマルジョン方法に従って構築される。ＰＣＬポリマー担体１０は公知の技法に従ってチオール化されてチオールで官能化したポリマー担体２０を形成する。図１中に示される実施形態において、陽イオン性ＰＣＬマイクロ粒子表面をチオール化したゼラチンで修飾して、コロイド金ナノ粒子３０（１０ｎｍ〜２０ｎｍ）の共有結合による付加を可能にする。Ａｕ−ＰＣＬマイクロ粒子４０の表面は、ＥＧＦＲ特異的抗体５０等の標的特異的結合剤で修飾することができる。特定の実施形態において、標的特異的結合剤はα−Ｖ−β−ＩＩＩ（αvβ3）インテグリン受容体の標的化のためのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ＲＧＤ）トリペプチドである。図１において示される実施形態において、７５０ｎｍの吸収スペクトルを持つＤＩＤ蛍光色素アナログは近赤外色素として前癌性病巣の蛍光ガイドＯＣＴ画像化のために使用される。
【００３２】
多重モード検出剤は、局所投与に際して、特異的に特定の細胞へ結合することができる。特定の実施形態において、細胞は前癌性であり、かかる癌細胞上で過剰発現される受容体とＲＧＤおよびＥＧＦＲの相互作用を介して結合される。かかる結合が起こる場合、ＰＣＬコアから生じる蛍光造影は病巣の局在の良好な決定を支援する。次いで、ＯＣＴは蛍光ガイダンス下で使用されて、組織形態を可視化し、従って、癌存在のための早期診断ツールとして役立つ。
【００３３】
本明細書において開示される組成物は、薬学的に許容される不活性担体物質中で、ルーチンの方法によって、経口、局所、または非経口（例えば鼻腔内、皮下、筋肉内、静脈内、または動脈内）投与することができる。組成物は、０．２５μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量、および１μｇ／ｋｇ／日〜５００μｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与することができる。投与の最適な投薬量およびモードは、容易に従来のプロトコルによって決定することができる。
【００３４】
２．製作の方法
本明細書において開示される態様は、多重モード画像化剤を製造する方法を含む。特に、方法はポリマーコア粒子の製作を含む。例えば、コア粒子は画像化剤の存在下において、溶媒（例えばジクロロメタン）中にＰＣＬ等のポリマーを溶解することによって生産される。かかる混合物は、溶媒中でポリマーの混合物および画像化剤が水相と乳化される単一エマルジョン方法を行って、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンを生産することができる。検出剤のコア粒子はコア粒子内にカプセル化された画像化剤により形成される。画像化剤は検出剤をＰＥＴ装置等の検出装置において可視化する。
【００３５】
さらに開示された方法の特定の態様は、ポリマーコア粒子へ少なくとも１つのコーティングを添加してポリマー担体を形成することを含む。例えば、かかるコーティングはゼラチンを含む。コア粒子の表面はチオール化したゼラチンにより修飾することができる。チオール化のために、ゼラチンの溶液はチオール化剤（例えば２−イミノチオラン）中で調製することができる。チオール化したゼラチンのチオール官能基（ＳＨ−）を、使用されるポリマーのアミノ基の表面へ容易に付加して、検出剤のコア粒子を作製することができる。
【００３６】
特定の態様において、方法は１種以上の金属ナノ粒子を多重モード検出剤へ付加することをさらに含む。これは、例えば、生物学的システムにおいて反応しない金属（例えば金、銀、酸化鉄）を使用して達成することができ、粉砕されてナノメートルサイズの粒子を生産する。かかる粒子は当該技術分野において公知の様々な手技から得ることができる（例えばＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．（２００４）８１（４）：５４４Ａ；Ｌｕｎａ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｆｏｒｕｍ：Ａｄｖ．Ｅｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ．Ｎａｎｏｍａｔ．（２０１０）６４４：５１−５５；Ｇａｒｄｅａ−Ｔｏｒｒｅｓｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）１（３）：３９７−４０４；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．（１９９９）１１（９）：２３１０−２３１２を参照されたい）。ナノ粒子は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＮａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ＆  Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から市販で得ることもできる。多重モード検出剤は、クエン酸ナトリウムによるテトラクロロ金酸の還元（多重モード検出剤の表面へ付加される２０〜３０ｎｍ金粒子の形成をもたらす）による金ナノ粒子のコーティング等の公知の手技を使用して、金属ナノ粒子により覆うことができる。２ｎｍ〜１０ｎｍの金ナノ粒子については、水素化ホウ素ナトリウムを使用する。特定の実施形態において、金属ナノ粒子を使用して標的特異的結合剤付加を促進することができ、それは光を強く反射することによって画像化造影を促進するだろう。ナノ粒子の表面は、公知の方法論を用いて合成することができる直線状のペプチド配列（例えばＡＣＤ／ＣＲＧ／ＤＣＦ／ＣＧＧ／ＧＧＧ／ＣＯＯＨ）等の標的特異的結合剤により官能化することができる。
【００３７】
３．キット
多重モード検出剤の調製に必要な１種以上の成分は、キットの形態で都合よく提供することができる。キットは、開示された方法に従って官能化された多重モード検出剤を調製するために成分の使用説明書に加えて、カップリング反応、ブロッキング反応または非ブロッキング反応のいずれかの実行に有用な１種以上の試薬を含むことができる。キットは包装材料も含むことができる。
【００３８】
開示は以下の実施例によってさらに説明される。実施例は説明の目的のためのみに提供される。それらは開示の範囲または内容を限定するものとして決して解釈されるべきでない。
【実施例】
【００３９】
実施例１
早期結腸癌のより効果的な診断のためのナノテクノロジーベースの多重モードアプローチ
１．５μｍの平均サイズを持つ近赤外蛍光色素で標識したＰＣＬマイクロ粒子は、単一エマルジョンプロセスによって製作され、チオールで修飾したゼラチンコート上への吸着によって２０ｎｍのコロイド金により表面コートされた。次いで、これらの粒子をシステイン基を有するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ＲＧＤ）トリペプチドにより官能化して、チオール−金共有結合を使用して金表面へ付加し、α−Ｖ−β−ＩＩＩ（αvβ3）インテグリン受容体（前癌性上皮細胞上で過剰発現される）を効果的に標的化する。官能化効率の予備的な試験を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）からのＨＴ２９およびＳＷ４８０結腸癌細胞株で実行した（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ，１１１：１２９９２−１２９９９）。以下は使用した方法論の簡潔な記述である。
【００４０】
高度に操作されたＡｕ−ＰＣＬマイクロスフェアを製造して造影剤として使用した。金ナノ粒子（２０ｎｍのサイズ）を使用してＲＧＤ付加を促進し、光を強く反射することによってＯＣＴ画像化造影を促進する。ナノ粒子の表面は、Ｔｕｆｔｓ大学（ＭＡ、ＵＳＡ）の研究中核施設で合成された、直線状の配列（ＡＣＤ／ＣＲＧ／ＤＣＦ／ＣＧＧ／ＧＧＧ／ＣＯＯＨ）を持つＲＧＤにより官能化された。このペプチドは、前癌性の上皮細胞によって過剰発現されるａｎｂ３−インテグリン受容体を特異的に認識する。他の配列を同様に試験したが、この配列は、最近の研究において使用される４つの癌細胞株（ヒト結腸腺癌グレードＩＩ−ＨＴ  ２９、ヒト結腸腺癌ＳＷ４８０、ヒト子宮頸癌ＨｅＬａおよびヒト食道癌ＨＥＴ１Ａ）に対して最も高い親和性を示した。ＮＩＲ蛍光色素（Ｄ−１２７３１［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ］、ＤｉＲとしても公知）を使用して、これらのマイクロ粒子を標識し、装置の蛍光チャンネルにおいて可視化する。
【００４１】
簡潔には、１ｇのＰＣＬを１６．７ｍｌのジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）中に溶解し、次いでＤｉＲ色素（１０μＭの濃度）を添加した。生じた油相混合物を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｌｔｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を８０００ｒｐｍおよび室温で５分間使用して、３３３ｍｌの脱イオン水（抵抗：１８．２ＭＷ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）中の１ｇの臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）の水相と乳化して、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンを生産した。次いでエマルジョンを室温で２４時間撹拌して、ジクロロメタンを蒸発させ、ＰＣＬマイクロ粒子を形成（凝固）させた。生じたマイクロ粒子懸濁物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを水で２〜３回洗浄して過剰なＣＴＡＢを取り除き、次いで冷凍乾燥した。次いで、マイクロ粒子を、クエン酸ナトリウムによるテトラクロロ金酸の還元（２０〜３０ｎｍ金粒子の形成をもたらす）による標準的手技を使用して製作された金ナノ粒子で覆った。
【００４２】
クエン酸金ナノ粒子を付加するために、ＰＣＬ粒子の表面をチオール化ゼラチンにより最初に修飾した。チオール化のために、ゼラチン溶液を調製し、２−イミノチオラン（酸性および中性のｐＨで安定した環状チオイミダート化合物）と共にインキュベーションした。全体では、１ｇのゼラチンを１００ｍｌの蒸留水中に溶解し、次いで変動量の２−イミノチオラン（１０〜１００ｍｇ／ゼラチンｇ）と共に室温で１５時間インキュベーションした。２リットルビーカー中で繰り返し水を取り替えて、５ｍＭ塩酸、続いて１ｍＭ塩酸溶液に対して繰り返し透析を各々２４時間行って未反応イミノチオランを取り除いた。精製したチオール化ゼラチンをさらなる使用のために冷凍乾燥し、４℃で保存した。チオール化ゼラチンのチオール官能基（ＳＨ−）は、ＰＣＬマイクロ粒子の上のＣＴＡＢのアミノ基の表面へ容易に付加することができる。これを達成するために、１ｇのＰＣＬ−ＣＴＡＢマイクロ粒子を３５０ｍｌの精製水中に分散させ、２０ｍｌの１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液中の１００ｍｇのチオール化ゼラチンを添加した。次いで反応混合物を４℃で１日間強く撹拌した。過剰なチオール化ゼラチンは、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってチオ官能化ＰＣＬ粒子から除去した。
【００４３】
水による２回の洗浄後に、ペレットを１５０ｍｌの水中に再分散した。５％湿重量の金ナノ粒子を迅速に撹拌されているチオ官能化ＰＣＬ粒子の中へ１滴ずつ徐々に（２〜３時間）添加し、次いで４℃へ移して一晩穏やかに撹拌した。この後、サンプルを遠心分離し、ペレットを水中に再び分散させ、冷凍乾燥した。
【００４４】
次いでＲＧＤペプチドをマイクロ粒子へ付加した。ＲＧＤ（０．１ｎＭ）を２ｍｌの蒸留水で希釈した。合計で２００ｍｇの十分に特徴づけられたＡｕ−ＰＣＬナノ粒子を５０ｍｌの脱イオン水中に分散させた。この分散は、１００ｍｌの分散させたＡｕ−ＰＣＬナノ粒子を含有する２つの三角フラスコへと分けられた。両方の三角フラスコをアルミニウムフォイルにより包んで、光曝露を阻害した。１つの三角フラスコ中に、１．５ｍｌのＲＧＤを添加し、４℃で４８時間撹拌した（暗所において）。他のフラスコ中に、同じ条件下で１．５ｍｌのＲＧＤを添加し、次いで２０ｍｇのＴｒｏｕｔ試薬を添加し、４℃で４８時間撹拌した。続いて反応混合物を遠心分離してＲＧＤ結合ナノ粒子を回収し、蒸留水で２回洗浄し、遠心分離した。次いで５ｍｌの水をマイクロ粒子へ添加し、凍結乾燥して、精製した粒子を得た。
【００４５】
製作後に、金ナノ粒子でコートされたＰＣＬマイクロ粒子を、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、サイズおよびサイズ分布について特徴づけた。この装置は、電解質溶液中の非伝導性粒子によって生産された電気抵抗の変化を測定する。マイクロ粒子を水で希釈し、希釈した懸濁物を、粒子サイズ測定に好適な濃度が得られるまで、標準的電解質溶液を含有するガラスビーカーへ添加した。測定はすべて室温で実行した。１．６μｍの平均サイズで０．５μｍの標準偏差が観察された。マイクロ粒子の走査電子顕微鏡画像を図２中に示す。２０ｋＶの加速電圧のＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４８００（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）電界放出走査顕微鏡を使用した。冷凍乾燥したマイクロ粒子の金でコートされた表面形態を反射モードで観察した。蛍光チャンネルを備えた特注の倒立顕微鏡を、細胞培養で、および研究の後の期間で組織の薄いサンプル（５０μｍの厚さ）で、画像化造影剤を予備的に試験するために使用した。倒立顕微鏡プラットフォームはＬｅｉｔｚ  Ｌａｂｏｒｌｕｘ正立顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ、ドイツ）の修飾によって構築された。
【００４６】
キセノンアークランプは光の連続的な広いバンドを提供し、照射源として蛍光励起のために使用され、ハロゲンランプは照射源として明視野画像化のために使用された。光ガイドファイバー束およびリレー光学を使用して、Ｎｉｋｏｎ対物レンズ（１００×油浸；１．２５開口数［ＮＡ］）へキセノンランプから励起光線を送った。サンプルからの蛍光シグナルは同じ対物レンズによって集められ、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ（Ｒｏｌｅｒａ  ＸＲ；Ｑ−Ｉｍａｇｉｎｇ、ＢＣ、カナダ）へリレーされた。蛍光モードでは、ＮＩＲフィルタ（モデル４１０３７；Ｃｈｒｏｍａ、ＶＴ、ＵＳＡ）をＣＣＤカメラの前に置いて、サンプルからの後方反射シグナルを却下し、蛍光色素からの放射のみがＣＣＤセンサに到達することを可能にする。明視野画像化において、コンデンサレンズを使用して、ハロゲン源からサンプルへ照射光線を送る。画像は同じ対物レンズによって拡大され、ＣＣＤセンサへリレーされた。
【００４７】
先にＰｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭＡ、ＵＳＡ）で構築された、スペクトル領域（ＳＤ）アプローチに基づく既存のＯＣＴ画像化システムを、ＯＣＴ画像化のために使用した。蛍光チャンネルを装置のプローブへ追加した。
【００４８】
データ収集ソフトをアップグレードして、同時ＯＣＴ蛍光画像を可能にした。ＳＤ−ＯＣＴ／蛍光画像システムは、光源（８３５および１３１０ｎｍ）、光ファイバー干渉計（２×２ファイバースプリッター、サーキュレーター、ならびにリファレンスおよびサンプルのアームオプティックス）、スペクトル検出ユニット（回折格子、分光計レンズ系およびデジタルＩｎＧａＡｓカメラ）、画像化プローブ、およびデータ収集および処理装置（コンピューター、カメラボードおよびディスプレイ）の５つのサブシステムからなる。画像化プローブは、ＯＣＴおよび蛍光画像の両方を可能にする２つのチャンネルを有する。このプローブは、ＮＩＲ色素を励起する７４５ｎｍのレーザーダイオード（モデルＱＦＬＤ  ７４５；ＱＰｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＭＩ、ＵＳＡ）を使用する励起ポート、およびＯＣＴ画像化ポートを有する。ＯＣＴチャンネルは、光線コリメーター、ＯＣＴラスターを生成する２つの走査ミラーおよび５×走査レンズ（モデルＬＳＭ０３；Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）からなる。
【００４９】
カスタムダイクロイックフィルター（Ａｎｄｏｖｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、サンプル上でＯＣＴおよび蛍光励起光線を組み合わせて、同時にＯＣＴおよび蛍光画像の両方を採取する。ＮＩＲ促進応答カメラ（Ｒｏｌｅｒａ  ＸＲ）を蛍光画像のために使用する。励起光は、ＮＩＲフィルタ（モデル、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ＶＴ、ＵＳＡ  ４１０３７）によって遮断される。ベンチトップ型画像化プローブは、組織において約１０μｍの距離分解能でラスターＯＣＴ画像（最大７×７  ｍｍ）、および比較的高いフレームレート（２０フレーム／秒以上、画像解像力に依存して）の比較的大きな視野の蛍光画像（２５×２５ｍｍ）を採取することができる。
【００５０】
上で生産された多重モード検出剤の試験は、ｎｕ／ｎｕヌードマウス中のＨＴ２９結腸癌異種移植モデルで実行された。マウスの左脇腹下に細胞を接種し、腫瘍塊は約１０日間増殖させた。屠殺に続いて、腫瘍を採取し、対照（非修飾）Ａｕ−ＰＣＬマイクロ粒子およびＲＧＤ修飾したＡｕ−ＰＣＬマイクロ粒子により処理した。腫瘍組織および正常組織の切片は、腫瘍標本については１０スライドおよび正常組織サンプルについては１０スライド上に２０μｍ厚で切断した。組織サンプルを組織包埋媒質（ＴＥＭ）中で維持し、ＰＢＳで洗浄して包埋媒質を除去した。５０ｍｇのＤＩＲ−ＰＣＬ  Ａｕ粒子（冷凍乾燥した）を対照粒子（非修飾）として使用した。それらを２ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中で分散した。凝集があれば、４℃で３０分間撹拌を実行した。５０ｍｇのＲＧＤ修飾ＤＩＲ−ＰＣＬ−Ａｕ粒子懸濁物は、２５ｍｌの水中の５０ｍｇのＤＩＲ−ＰＣＬ−Ａｕ粒子への２ｍｇの純粋なＲＧＤの添加によって作製した。このサンプルを４０００ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを２ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に分散させた。次いで切片を得て、ＯＣＴおよび蛍光顕微鏡検査法を使用して画像化した。
【００５１】
ＲＧＤで官能化したマイクロ粒子の強い結合および官能化していないマイクロ粒子の弱い結合が、ＨＴ２９およびＳＷ４８０の結腸細胞株において観察された。正常組織および腫瘍組織の両方のサンプルでのインキュベーション前後に撮影されたＯＣＴおよび蛍光画像の両方は、腫瘍組織サンプルに対して造影の増加（それぞれ散乱および蛍光造影の促進）を示した。
【００５２】
これらの結果は、蛍光ガイドＯＣＴ画像化と組み合わせたＲＧＤで官能化したマイクロ粒子の局所投与が、早期結腸癌の局在のより効果的な決定を支援することを示す。
【００５３】
実施例２
口腔前癌病巣の検出のためのＥＧＦＲ標的化金ナノ粒子でコートされたポリ（ε−カプロラクトン）マイクロ粒子の開発
現在の口腔癌診断は、生検および病理学的分析によって確認される組織変成に基づく。ルーチンの歯科検査において使用できる前癌性病巣に特異的な早期検出技術は、好ましい臨床転帰を提供する。
【００５４】
この実施例の主な目的は、口腔中の前癌性病巣の二重検出技術として、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）標的化金ナノ粒子でコートされたポリ（ε−カプロラクトン）（Ａｕ−ＰＣＬ）マイクロスフェアを開発することであった。
【００５５】
蛍光色素をカプセル化したＰＣＬマイクロ粒子（直径２ｍｍ〜３ｍｍ）は、セチルトリエチルアンモニウムブロミドの水溶液と有機溶媒中のポリマーを混合し、制御された撹拌下で乳化する単一エマルジョン方法を使用して形成された。生じたマイクロ粒子のサイズおよび表面形態は、ポリマー濃度、水相に対する有機相の比、添加率、および撹拌速度によって規定される。これらのパラメータを至適化して、直径１μｍ〜５μｍで正に荷電した表面を有するＰＣＬマイクロスフェアを生成した。正に荷電した（陽イオン性）マイクロスフェア表面をチオール化ゼラチンにより修飾して、チオール−金リンケージを介する金ナノ粒子（２０ｎｍ〜４０ｎｍ）の共有結合を可能にした。次いでＡｕ−ＰＣＬマイクロスフェアの表面を、水溶液からの吸着によってＥＧＦＲ抗体により修飾した。処方は、サイズ、表面電荷および形態について特徴づけられた。微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡、共焦点反射顕微鏡、および２光子蛍光顕微鏡を使用して、ＥＧＦＲ特異的相互作用を確認する細胞結合研究を実行する。
【００５６】
結果から、陽イオン性ＰＣＬマイクロ粒子が成功して疎水性の蛍光色素をカプセル化でき、金ナノ粒子およびＥＧＦＲ特異的抗体により官能化できたことが示される。ＥＧＦＲ標的化マイクロ粒子は、非修飾マイクロ粒子と比較して、ＨＣＰＣ−１を含むＥＧＦＲを過剰発現する癌細胞株への非常に効果的な結合も示した。過剰量の可溶性抗体によってＥＧＦＲ特異的結合を置き換えることができた。
【００５７】
ＥＧＦＲ標的化Ａｕ−ＰＣＬマイクロスフェアは、ＥＧＦＲを過剰発現する口腔前癌性病巣の検出における反射画像および蛍光画像のための有用なプラットフォームを提供する。インビトロおよびエクスビボのデータ（図３および４）から、リガンド特異的受容体を過剰発現する前癌性細胞へこの多重モード技術が効率的に結合し、促進された蛍光造影を生産して影響を受けた領域の局在を決定し、続いてＯＣＴ画像化を行い癌存在を確認できることが示される。
【００５８】
出版物、特許出願、特許、および本明細書において言及される他の参照はすべて、それらの全体を参照として援用される。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うものとする。加えて、材料、方法、および実施例は、単に説明的なものであり、限定を意図したものではない。特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または等価である方法および材料を、本発明の実行または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載される。
【００５９】
同等物
当業者は、単なるルーチンの実験作業を使用するだけで、本明細書において特に記載された特定の実施形態に対する多数の同等物を認識または確認することができよう。かかる同等物は、以下の請求項の範囲内に包含されることが意図される。
【図１】
2013522653.tif 000003
【図２】
2013522653.tif 000004
【図３】
2013522653.tif 000005
【図４】
2013522653.tif 000006
【配列表】
2013522653000001.app
【国際調査報告】
2013522653.tif 000007