(57)【要約】  本発明は、部位特異的エンドヌクレアーゼのDNA標的部位に先行するゲノム領域及び後続するゲノム領域に相同な少なくとも２つの部分を有し、また、該相同部分が介在するネガティブ選択及びポジティブ選択マーカーの両方、並びに興味対象の配列をポジティブ選択マーカーに隣接してクローニングすることができる領域を含んでなる第１の組換え誘発性構築物(ｉ)；とメガヌクレアーゼを含んでなる第２の構築物(ii、iii又はiv)とを少なくとも含んでなる遺伝子構築物のセットに関する。本発明はまた、これら構築物を含んでなるキット及びこの構築物セットを、標的細胞、組織又は生物のゲノム中に興味対象の配列を導入するために使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)少なくとも下記の成分を含んでなる核酸分子によってコードされた構築物(ｉ)：
(N)n-HOMO1-P-M-HOMO2-(N)m (ｉ)
(式中、ｎ及びｍは整数であって、０又は１を表し、但し、ｎ＝１のときｍ＝０であり、ｎ＝０のときｍ＝１であり；よって成分Ｎは、HOMO1の前又はHOMO2の後のいずれかに配置され得、成分Ｐ及びＭはP-M又はM-Pの順で配置され得;
式中、Ｎは、成分(PROM1)-(NEG)-(TERM1)を含んでなり；Ｐは成分(PROM2)-(POS)-(TERM2)を含んでなり、Ｍは成分(PROM3)-(MCS)-(TERM3)を含んでなり；
式中、PROM1は第１の転写促進配列であり；NEGはネガティブ選択マーカーであり；TERM1は第１の転写終止配列であり；HOMO1は、ヌクレアーゼDNA標的配列に先行するゲノム部分に相同な部分であり；PROM2は第２の転写促進配列であり；POSはポジティブ選択マーカーであり；TERM2は第２の転写終止配列であり；PROM3は第３の転写促進配列であり；MCSは多重クローニング部位であり；TERM3は第３の転写終止配列であり；HOMO2は、前記ヌクレアーゼDNA標的配列に後続するゲノム部分に相同な部分である)；
ｂ)少なくとも下記の成分を含んでなる核酸分子によってコードされた構築物(ii)又は(iii)を含んでなる群より選択される少なくとも１つの構築物：
PROM4-NUC1 (ii)；
NUC2 (iii)；
又は、本セットはまた、少なくとも下記の成分を含んでなる単離タンパク質又は組換えタンパク質である配列(iv)を含んでなり：
NUC3 (iv)；
(式中、PROM4は第４の転写促進配列であり；NUC1はメガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNのオープンリーディングフレーム(ORF)であり；MEGA2は前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNのメッセンジャーRNA(mRNA)形態であり；MEGA3は前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNの単離タンパク質又は組換えタンパク質であり；ここで、構築物(ii)若しくは(iii)又は配列(iv)からの前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNは、前記ヌクレアーゼDNA標的配列を認識、切断し；構築物(ii)若しくは(iii)又は配列(iv)は、少なくとも１つの標的細胞中に構築物(ｉ)と同時トランスフェクトされるように構成される)
を含んでなる遺伝子構築物のセット。
【請求項２】
構築物(ｉ)の前記成分HOMO1及びHOMO2が、前記ヌクレアーゼDNA標的配列に隣接する標的細胞ゲノムの部分に相同な少なくとも200bpで6000bpより多くない配列を含んでなる、請求項１に記載の構築物セット。
【請求項３】
構築物(ｉ)の前記成分HOMO1及びHOMO2が、前記ヌクレアーゼDNA標的配列に隣接する標的細胞ゲノムの部分に相同な少なくとも1000bpで2000bpより多くない配列を含んでなる、請求項１又は２に記載の構築物セット。
【請求項４】
前記成分(POS)が群：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子, nptl(配列番号３)；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子, hph(配列番号４)；ピューロマイシンＮ-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子, pac(配列番号５)；ブラスティシジンＳデアミナーゼ耐性遺伝子, bsr(配列番号６)；ブレオマイシン耐性遺伝子, sh ble(配列番号７)から選択される、請求項１、２又は３に記載の構築物セット。
【請求項５】
前記成分(NEG)が群：CpGアイランドが欠失した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子, HSV TK DelCpG(配列番号８)；CpGアイランドが欠失したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子にカップリングしているシトシンデアミナーゼ, CD:UPRT DelCpG(配列番号９)から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築物セット。
【請求項６】
前記エレメントPROM1、PROM2、PROM3及びPROM4が、群：サイトメガロウイルス前初期プロモーター, pCMV(配列番号10)；シミアンウイルス40プロモーター, pSV40(配列番号11)；ヒト伸長因子1αプロモーター, phEF1α(配列番号12)；ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター, phPGK(配列番号13)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター, pmPGK(配列番号14)；ヒトポリユビキチンプロモーター, phUbc(配列番号15)；ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーター, pHSV-TK(配列番号16)；ヒト成長停止特異的５プロモーター, phGAS5(配列番号17)；テトラサイクリン応答性エレメント, pTRE(配列番号18)；脳症心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)配列, IRES EMCV(配列番号19)、口蹄疫ウイルス由来のIRES配列, IRES FMDV(配列番号20)、SV40から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の構築物セット。
【請求項７】
前記エレメントTERM1、TERM2、TERM3及びTERM4が、群：ポリアデニル化シグナル, SV40 pA(配列番号21)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル, BGH pA(配列番号22)から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の構築物セット。
【請求項８】
前記エレメントMCSが5'又は3'末端にインフレームのペプチドタグを含んでなり、該ペプチドタグが、群：FLAG(配列番号23)、FLASH/REASH(配列番号24)、IQ(配列番号25)、ヒスチジン(配列番号26)、STREP(配列番号27)、ストレプトアビジン結合性タンパク質, SBP(配列番号28)、カルモジュリン結合性タンパク質, CBP(配列番号29)、ヘマグルチニン, HA(配列番号30)、c-myc(配列番号31)、V5タグ配列(配列番号32)、ヌクレオプラスミンからの核局在化シグナル(NLS)(配列番号33)、SV40由来のNLS(配列番号34)、NLSコンセンサス(配列番号35)、トロンビン切断部位(配列番号36)、P2A切断部位(配列番号37)、T2A切断部位(配列番号38)、E2A切断部位(配列番号39)から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の構築物セット。
【請求項９】
前記エレメントMCSが、群：ホタルルシフェラーゼ遺伝子(配列番号40)、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(配列番号41)、β-ガラクトシダーゼ遺伝子, LacZ(配列番号42)、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子, hSEAP(配列番号43)、マウス分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子, mSEAP(配列番号44)から選択されるレポーター遺伝子を含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の構築物セット。
【請求項１０】
構築物(ｉ)が配列番号45又は配列番号46を含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の構築物セット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子構築物のセットと；該遺伝子構築物セットを用いる形質転換細胞の作製のための指示書とを含んでなる、GOIをコードする配列を少なくとも１つの細胞中に導入するためのキット。
【請求項１２】
CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞を含んでなる群より選択される少なくとも１つの標的細胞を更に含んでなる請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ａ)興味対象の遺伝子をコードする配列を、請求項１〜９のいずれか１項の構築物(ｉ)の位置MCS中にクローニングする工程；
ｂ)標的細胞を、工程ｂ)の前記構築物(ｉ)及び請求項１〜９のいずれか１項の構築物(ii)、(iii)又は配列(iv)の少なくとも１つで同時トランスフェクトする工程；
ｃ)前記標的細胞から、成分(POS)の存在及び成分(NEG)の不存在に基づいて少なくとも１つの細胞を選択する工程
を含んでなる、少なくとも１つの細胞を相同組換えにより形質転換する方法。
【請求項１４】
工程ｃ)の選択が(POS)及び(NEG)によりコードされている遺伝子産物の活性について逐次に行われる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃ)の選択が(POS)及び(NEG)によりコードされている遺伝子産物の活性について同時に行われる請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞のゲノム中の特定部位へのDNA配列の導入を可能にする試薬セットに関する。より詳細には、このDNA配列は遺伝子をコードし、誘導した相同組換え(HR)事象を介して標的細胞中に導入される。本発明はまた、メガヌクレアーゼのゲノム標的部位に隣接する部分に相同な２つの部分とポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーとを少なくとも含んでなる遺伝子構築物のセット、及び標的細胞のゲノム中にDNA配列を導入する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
25年以上も前の酵母における最初の遺伝子標的化実験(Hinnenら，1978；Rothstein, 1983)以来、相同組換え(HR)は、種々の細胞におけるゲノム配列の挿入、置換又は欠失に使用されてきた(Thomas及びCapecchi, 1987；Capecchi, 2001；Smithies, 2001)。標的化された事象は哺乳動物細胞では非常に低頻度で生じる。このことが、先天性のHRの使用を非実用的としている。相同組換えの頻度は、或る遺伝子座での特異的なDNA二本鎖破断(DSB)により顕著に増大させることができる(Rouetら，1994；Choulikaら，1995)。このようなDSBは、大きなDNA認識標的部位(12〜30bp)を認識する配列-特異的エンドヌクレアーゼであるメガヌクレアーゼによって誘導することができる。
【０００３】
メガヌクレアーゼは、DNA標的に対して高い特異性を示し、これらタンパク質は独特な染色体配列を切断することができ、したがって全体的なゲノムの完全性に影響を及ぼさない。天然のメガヌクレアーゼは、真核生物、細菌及び古細菌(archae)中に見出される広範なクラスのタンパク質であるホーミングエンドヌクレアーゼによって本質的に代表される(Chevalier及びStoddard, 2001)。I-SceI及びHOホーミングエンドヌクレアーゼの初期の研究により、これらタンパク質の切断活性を使用して生存中の細胞においてHR事象を開始する方法が示され、染色体DSBの組換え誘発特性(recombinogenic properties)が証明された(Dujonら，1986；Haber, 1995)。以来、メガヌクレアーゼ-誘導相同組換えは、細菌(Posfaiら，1999)、哺乳動物細胞(Sargentら，1997；Donohoら，1998；Cohen-Tannoudjiら，1998)、マウス(Goubleら，2006)及び植物(Puchtaら，1996；Siebert及びPuchta, 2002)においてゲノム工学目的に成功裡に使用されている。
【０００４】
より最近には、TALエフェクターエンドヌクレアーゼ(TALEN)が、DNA標的を高い特異性で認識、切断するように操作された。これらTALENは、ヌクレアーゼドメイン(例えば；FokI)に融合されたTAL(転写活性化因子様)エフェクターDNAドメインを含んでなる(Christianら，2010)。
更なるクラスのヌクレアーゼも、ゲノム標的を切断し、そうしてDSBを誘導するために使用することができる。この更なるクラスのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)と呼ばれ、ジンクフィンガーDNA-結合性ドメインをDNA-切断ドメインに融合することによって生成した人工の制限酵素である。TALに類似する様式で、ジンクフィンガードメインは、任意のDNA配列を標的化するように操作することができる(Kimら，1996)。
【０００５】
標的細胞のゲノム中の特異点でDSBを誘導することができる材料の利用可能性が増大しても、標的細胞集団をルーチーン的で再現可能に形質転換する方法及び材料を開発する努力は、未だ進展していない。これには、原核生物又はより特には真核生物のゲノムの特有な複雑性を含む多くの理由が存在する。研究者らは、次第に、ゲノムが損傷に抵抗する驚くべき能力を有すること(DSBは本質的にはどんなものであるか)が分かってきた。加えて、全ての形質転換法に当てはまる技術的限界、すなわち背景の非形質転換細胞集団から稀な形質転換体をルーチーン的に同定する能力は、形質転換法の創出において問題を提示し続けている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
標的細胞又は生物のゲノム中の任意の点への興味対象の配列の導入にHRの能力を利用する方法であって、これまでに可能とされていたものより詳細なゲノム操作を可能にする方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ここに、
ａ)少なくとも下記の成分を含んでなる核酸分子によってコードされた構築物(ｉ)：
(N)n-HOMO1-P-M-HOMO2-(N)m (ｉ)
(式中、ｎ及びｍは整数であって、０又は１を表し、但し、ｎ＝１のときｍ＝０であり、ｎ＝０のときｍ＝１であり；よって成分Ｎは、HOMO1の前又はHOMO2の後のいずれかに配置され得、成分Ｐ及びＭは、HOMO1とHOMO2との間にP-M又はM-Pの順で配置され得;
式中、Ｎは、成分(PROM1)-(NEG)-(TERM1)を含んでなり；Ｐは成分(PROM2)-(POS)-(TERM2)を含んでなり、Ｍは成分(PROM3)-(MCS)-(TERM3)を含んでなり；
式中、PROM1は第１の転写促進配列であり；NEGはネガティブ選択マーカーであり；TERM1は第１の転写終止配列であり；HOMO1は、ヌクレアーゼDNA標的配列に先行するゲノム部分に相同な部分であり；PROM2は第２の転写促進配列であり；POSはポジティブ選択マーカーであり；TERM2は第２の転写終止配列であり；PROM3は第３の転写促進配列であり；MCSは多重クローニング部位であり、ここには興味対象の遺伝子(GOI)が挿入されていてもよく；TERM3は第３の転写終止配列であり；HOMO2は、メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNの前記DNA標的配列に後続するゲノム部分に相同な部分である)；と
ｂ)下記の成分の少なくとも１つを含んでなる核酸分子によってコードされた構築物(ii)又は(iii)を含んでなる群より選択される少なくとも１つの構築物：
PROM4 - NUC1 (ii)；
NUC2 (iii)、又は、
本セットはまた、下記の成分を少なくとも含んでなる単離タンパク質又は組換えタンパク質である配列(iv)を含んでなる：
NUC3 (iv)
(式中、PROM4は第４の転写促進配列であり；NUC1はメガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNのオープンリーディングフレーム(ORF)であり；NUC2は前記メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNのメッセンジャーRNA(mRNA)形態であり；NUC3は前記メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNの単離タンパク質又は組換えタンパク質であり；ここで、構築物(ii)若しくは(iii)又は配列(iv)からの前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNは、前記DNA標的配列を認識、切断し；構築物(ii)若しくは(iii)又は配列(iv)は、少なくとも１つの標的細胞中に構築物(ｉ)と同時トランスフェクトされるように構成されている)と
を含んでなる新たな遺伝子構築物セットを開発した。
【０００８】
より一般的には、ゲノム標的を特異的に切断し、そうしてDSBを誘導することができ、12〜45bpの二本鎖DNA標的配列を有する任意のヌクレアーゼを本発明において使用することができる。本発明に包含されるヌクレアーゼの非限定的な例は、メガヌクレアーゼ、TALEN、ZFNであるが、本発明はまた、ゲノム標的を切断し、そうしてDSBを誘導することができ、12〜45bpの二本鎖DNA標的配列を有する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを含んでなる任意の融合タンパク質として規定されるキメラエンドヌクレアーゼを用いても機能し得る。
特定のゲノム標的でDSBを誘導することができるヌクレアーゼに加えて、本発明はまた、12〜45bpの特定ゲノム標的配列で一本鎖破断(SSB)を誘導することができるヌクレアーゼの使用も包含する。SSBはまたニックとしても知られ、このようなニックを生じるヌクレアーゼは、本発明に明示的に包含される。
【０００９】
本発明に従う構築物は、図１に非限定的な様式で説明されている。組込みマトリクス[構築物(ｉ)]及びヌクレアーゼ発現プラスミド[構築物(ii)]は、細胞中に同時トランスフェクトされる。同時トランスフェクションにより、操作されたヌクレアーゼが発現し、内因性の認識部位を認識し、これに結合し、この正確な部位でDNA二本鎖破断を誘導する。
細胞はDNA損傷を察知し、相同組換えを誘引し、同時トランスフェクトされた組込みマトリクスをDNA修復マトリクスとして用いて損傷を修復する。なぜならば、組込みマトリクスが、破断したDNAの周囲に相同な領域を含有するからである。ポジティブ選択マーカー(POS)及びGOI(これらは組込みマトリクス中、相同性領域間にクローニングされている)が、この組換え事象の間にメガヌクレアーゼ認識部位で組み込まれる。よって、安定な標的化細胞クローンを、薬物耐性及び興味対象の組換えタンパク質の発現について選択することができる。
【００１０】
本発明に従う構築物において使用することができる遺伝子エレメントのタイプの例を、下記に提供する。これら例は例示に過ぎず、本発明の範囲を如何なる様式でも制限するものではないとみなされるべきである。
ポジティブ及びネガティブ選択マーカー遺伝子の一覧を下記の表Ｉに提供する。
【表１】
2013520165.tif 000002
表Ｉ
【００１１】
下記の表IIは、cis-活性プロモーター配列の一覧を提供する。各細胞タイプの本来の転写特異性に依存して、種々のプロモーター配列及び/又は内部リボソーム侵入部位(IRES)を、(ｉ)カスタムメガヌクレアーゼオープンリーディングフレーム、(ii)選択マーカー遺伝子及び興味対象の遺伝子(GOI)の発現を駆動するために使用することができる。この表に提供された例に加えて、転写発現レベルを増強するため(すなわちエンハンサー)及び/又は感受性の転写サイレンシングを減少させるため[すなわち、足場/マトリクス付着領域(S/MAR)のようなサイレンサー]に、追加のcis-活性調節配列もまたメガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクスに挿入することができる。
【表２】
2013520165.tif 000003
表II
【００１２】
表IIIは、種々のタグエレメントの一覧を提供する。これら種々のタイプのタグ配列は、GOIクローニング後にＮ-末端及びＣ-末端融合物を処分するために、組込みマトリクスの多重クローニング部位(MCS)に挿入することができる。
【表３】
2013520165.tif 000004
表III
【００１３】
表IVは、最も一般に使用されるレポーター遺伝子の一覧を提供する。種々のタイプのレポーター遺伝子が、ポジティブコントロールを処分するため、組込みマトリクスに(MCS配列で、GOIに代えて)導入することができる。
【表４】
2013520165.tif 000005
表IV
【００１４】
本発明において、転写促進配列は、オープンリーディングフレームをコードする第２のヌクレオチド配列と組み合わせて配置されたとき、該オープンリーディングフレームの転写を引き起こすヌクレオチド配列である。加えて、RNA分子の場合、プロモーターは、該RNA分子の翻訳レベルを増大させるように作用する非コーディング配列をいうこともある。
本発明において、転写終止配列は、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の後に配置されたとき、該オープンリーディングフレームの転写終了を引き起こすヌクレオチド配列である。
【００１５】
本発明において、相同部分は、別のヌクレオチド配列と共通してヌクレオチド残基を有するヌクレオチド配列であって、これら配列間に相同組換えを導くヌクレオチド配列であり、より具体的には少なくとも95％の同一性、好ましくは97％の同一性、より好ましくは99％の同一性を有するヌクレオチド配列をいう。構築物(ｉ)の第１及び第２の相同部分(HOMO1及びHOMO2)は、標的細胞ゲノム中のヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFN)標的DNA配列に隣接する配列と100％同一であることも、示されるような100％未満の同一性であることもできる。
【００１６】
具体的には、構築物(ｉ)の部分HOMO1及びHOMO2と宿主細胞ゲノムの相同部分との間のオーバーラップは、少なくとも200bpで6000bpを超えず、好ましくはこのオーバーラップは1000bpと2000bpとの間である。
したがって、具体的には、構築物(ｉ)の成分HOMO1及びHOMO2は、それぞれ、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも200bpで6000bpを超えない配列を含んでなる。
最も具体的には、構築物(ｉ)の成分HOMO1及びHOMO2は、それぞれ、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1000bpで2000bpを超えない配列を含んでなる。
【００１７】
効率的レベルの相同組換えを可能にするに必要なオーバーラップの量は、当該分野において公知である(Perezら，(2005))；これら公知レベルから出発して、本発明者らは、本発明に従う構築物セットとの使用のための最も効率的なオーバーラップ範囲を特定した。
本発明において、メガヌクレアーゼ標的DNA部位又はメガヌクレアーゼ認識部位は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより認識、切断される22〜24bpの二本鎖パリンドローム状、部分的パリンドローム状(偽-パリンドローム状)又は非パリンドローム状ポリヌクレオチド配列を意味するものと意図される。これら用語は、メガヌクレアーゼにより二本鎖破断(切断)が引き起こされる独特なDNA位置、好ましくはゲノム位置をいう。
メガヌクレアーゼ標的DNA部位は、野生型メガヌクレアーゼ(例えばI-CreI又はI-DmoI)により認識、切断されるDNA配列であり得る。
或いは、メガヌクレアーゼDNA標的部位は、異なるDNA標的配列を認識し切断する改変メガヌクレアーゼにより認識され切断されるDNA配列であり得る。
【００１８】
Ｎ-末端I-DmoIドメインとI-CreI単量体との融合による機能的なキメラメガヌクレアーゼの作製(Chevalierら，Mol. Cell., 2002, 10, 895-905；Epinatら，Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2952-62；国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)もまた記載されている。
本発明者等は、メガヌクレアーゼが異なるDNA標的を認識するように操作することができることを示した。I-CreI酵素は特に広範に研究され、異なるグループが半-合理的アプローチを使用して、I-CreI(Seligmanら，Genetics, 1997, 147, 1653-1664；Sussmanら，J. Mol. Biol., 2004, 342, 31-41；国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156；Arnouldら，J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458；Rosenら，Nucleic Acids Res., 2006, 34, 4791-4800；Smithら，Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)、I-SceI(Doyonら，J. Am. Chem. Soc, 2006, 128, 2477-2484)、PI-SceI(Gimbleら，J. Mol. Biol., 2003, 334, 993-1008)及びI-MsoI(Ashworthら，Nature, 2006, 441, 656-659)の特異性を局所的に変更した。
【００１９】
加えて、半-合理的アプローチと高スループットスクリーニングとを組み合わせることによって、局所的に変更された特異性を有する何百ものI-CreI誘導体が操作された：
−  I-CreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77を変異誘発し、DNA標的の±３〜５位(5NNN DNA標的)で変更された特異性を有する変形体の集団をスクリーニングによって同定した(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853；Arnouldら，J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458；Smithら，Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。
−  I-CreIの残基K28、N30及びQ38、又はN30、Y33及びQ38、又はK28、Y33、Q38及びS40を変異誘発し、DNA標的の±８〜10位(10NNN DNA標的)で変更された特異性を有する変形体の集団をスクリーニングによって同定した(Smithら，Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149；国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。
【００２０】
２つの異なる変形体が組み合わされて、各々の変形体DNA標的配列の２つの異なる半分の融合から生じるキメラ標的を切断することができる機能的なへテロ二量体エンドヌクレアーゼに組み立てられた(Arnouldら，前掲；国際PCT出願WO 2006/097854及びWO 2007/034262)。
更に、I-CreIの残基28〜40及び44〜77が、ホーミングエンドヌクレアーゼ半-部位の別個の部分に結合することができる２つの分離可能な機能的サブドメインを形成することが示された(Smithら，Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149；国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。
【００２１】
I-CreIの同一単量体内の２つのサブドメインの変異の組合せにより、各サブドメインが結合する±３〜５位及び±８〜10位のヌクレオチドを含んでなるパリンドローム状の組合せDNA標的配列を切断することができる新規キメラ分子(ホモ二量体)の設計が可能になった(Smithら，Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149；国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。
メガヌクレアーゼ変形体を製造する方法及び哺乳動物細胞又は酵母細胞における切断-誘導組換えに基づくアッセイ(変更された特異性を有する変形体をスクリーニングするために使用される)は、国際PCT出願WO 2004/067736；Epinatら，Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962；Chamesら，Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら，J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458に記載されている。これらアッセイは、標準的な方法によりモニターすることができる機能的なLacZレポーター遺伝子を生じる。
【００２２】
前の２つの工程の組合せにより、４つの異なるサブドメインを含むより大きなコンビナトリアルアプローチが可能になる。この異なるサブドメインは、選択された特異性を有する全体的に再設計されたメガヌクレアーゼ変形体(へテロ二量体又は単鎖分子)を取得するために、別々に改変されて組み合わされる。第１の工程において、新規なメガヌクレアーゼの二者一組が、切断が望まれる標的に由来するパリンドローム状標的を切断する新たな分子(「半-メガヌクレアーゼ」)に組み合わされる。その後、この「半-メガヌクレアーゼ」を組み合せることで、興味対象の標的を切断するへテロ二量体種が生じ得る。４セットの変異の、モデル標的配列又はヒトRAG1、XPC及びHPRT遺伝子からの配列を切断するへテロ二量体エンドヌクレアーゼへの組立てが、Smithら(Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)、Arnouldら(J. Mol. Biol., 2007, 371, 49-65)及びWO2008/059382にそれぞれ記載されている。メガヌクレアーゼの他の例、例えばヒトデュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD21、配列番号56)遺伝子中の標的又はヒトカルパイン小サブユニット１(human Calpain, small subunit 1；CAPNS1、配列番号57)遺伝子中の標的を切断するものを本発明で使用することができる。
【００２３】
このような変形体メガヌクレアーゼ及びこれらが認識、切断する変形体DNA標的は全て、本特許出願に含まれる。特定のメガヌクレアーゼとその標的の任意の組合せを、標的細胞ゲノム中に存在し且つ構築物(ｉ)のHOMO1及びHOMO2と相同なゲノム部分が隣接しているメガヌクレアーゼ標的配列として使用することができる。
同様に、TALEN及びZFNのような他のヌクレアーゼは、特定のDNA標的配列を認識、切断するように操作することができ、本特許出願に含まれる。TALEN及び/又はZFNのような特定のヌクレアーゼとその標的の任意の組合せを、標的細胞ゲノム中に存在し且つ構築物(ｉ)のHOMO1及びHOMO2と相同なゲノム部分が隣接しているヌクレアーゼ標的配列として使用することができる。
【００２４】
本発明において、マーカー遺伝子は、発現したときに該マーカー遺伝子を発現する細胞又は細胞集団と、該マーカー遺伝子を発現しない細胞又は細胞集団との弁別を可能にする遺伝子産物である。
ポジティブ選択マーカーは、該マーカーを含んでなる細胞を、毒素の補充のような選択工程から回復又は救出する性質を与える。
ネガティブ選択マーカーは、本来的に毒性であるか、又はプロトキシン(pro-toxin)の補充のような選択工程後に該マーカーを含んでなる細胞に死をもたらす。ここで、ネガティブマーカーはプロトキシンに作用して毒素を形成する。
細胞の生存能を利用する選択に加えて、マーカー遺伝子発現に基づく細胞ソーティングのような他の選択手段も本発明に包含される。
【００２５】
本発明において、多重クローニング部位は、該多重クローニング部位を含んでなるプラスミド中への興味対象のフラグメントのサブ-クローニングを可能にするように、幾つかの制限部位を含有する短いDNAセグメントである。
本発明において、メガヌクレアーゼは、12〜45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意味するものと意図される。これは、メガヌクレアーゼ、例えばI-CreI又はI-DmoIの野生型形態であってもよいし、これら酵素の１つの上記のような遺伝子操作形態又は１以上のメガヌクレアーゼの部分を含んでなる融合タンパク質であってもよい。
本発明者らは、この系が多くのGOIに関して多くの多様なモデル哺乳動物細胞株で作用できることを示した。
【００２６】
本発明の更なる観点によれば、成分(POS)は、群：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子, nptl(配列番号３)；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子, hph(配列番号４)；ピューロマイシンＮ-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子, pac(配列番号５)；ブラスティシジンＳデアミナーゼ耐性遺伝子, bsr(配列番号６)；ブレオマイシン耐性遺伝子, sh ble(配列番号７)から選択される。
好ましくは、成分(NEG)は、群：CpGアイランドが欠失した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子, HSV TK DelCpG(配列番号８)；CpGアイランドが欠失したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子にカップリングしたシトシンデアミナーゼ, CD:UPRT DelCpG(配列番号９)から選択される。
【００２７】
組込みマトリクスのランダムな細胞内(in cellulo)線状化は、宿主ゲノム中への該構築物のランダムな組込みを導くことがある。線状化がネガティブマーカー内で生じ、そうしてその機能を不活化する場合には、これらランダム組込み事象は、細胞のプロドラッグ処理で消去されない。
したがって、本発明の更なる観点に従えば、少なくとも２つの(Ｎ)成分を含んでなる形態の構築物(ｉ)が提供される。組込みマトリクス上の２つのネガティブ選択発現カセットの存在(１つはHOMO1領域の上流、１つはHOMO2領域の下流)はこの問題を克服する。
【００２８】
好ましくは、エレメントPROM1、PROM2、PROM3及びPROM4は、群：サイトメガロウイルス前初期プロモーター, pCMV(配列番号10)；シミアンウイルス40プロモーター, pSV40(配列番号11)；ヒト伸長因子１αプロモーター, phEF1α(配列番号12)；ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター, phPGK(配列番号13)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター, pmPGK(配列番号14)；ヒトポリユビキチンプロモーター, phUbc(配列番号15)；ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーター, pHSV-TK(配列番号16)；ヒト成長停止特異的５プロモーター, phGAS5(配列番号17)；テトラサイクリン-応答性エレメント, pTRE(配列番号18)；脳症心筋炎ウイルス(encephalopathy myocarditis virus)由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)配列, IRES EMCV(配列番号19)、口蹄疫ウイルス由来のIRES配列, IRES FMDV(配列番号20)、SV40から選択される。
【００２９】
好ましくは、エレメントTERM1、TERM2、TERM3及びTERM4は群：ポリアデニル化シグナル, SV40 pA(配列番号21)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル, BGH pA(配列番号22)から選択される。
好ましくは、エレメントMCSは、5'又は3'末端にインフレームのペプチドタグを含んでなる。ここで、前記ペプチドタグは、群：FLAG(配列番号23)、FLASH/REASH(配列番号24)、IQ(配列番号25)、ヒスチジン(配列番号26)、STREP(配列番号27)、ストレプトアビジン結合性タンパク質, SBP(配列番号28)、カルモジュリン結合性タンパク質, CBP(配列番号29)、ヘマグルチニン, HA(配列番号30)、c-myc(配列番号31)、V5タグ配列(配列番号32)、ヌクレオプラスミンからの核局在化シグナル(NLS)(配列番号33)、SV40由来のNLS(配列番号34)、NLSコンセンサス(配列番号35)、トロンビン切断部位(配列番号36)、P2A切断部位(配列番号37)、T2A切断部位(配列番号38)、E2A切断部位(配列番号39)から選択される。
【００３０】
検出可能なペプチドタグ、核局在化シグナル及び精製タグに加えて、MCSはまた、他の有用な追加の配列、例えば細胞透過性ペプチド、検出可能な化合物(例えば、フルオロフォア又は放射性核種)をキレートするペプチドを含むことができる。
本発明の更なる特定の観点に従えば、MSCは、群：ホタルルシフェラーゼ遺伝子(配列番号40)、ウミシイタケ(renilla)ルシフェラーゼ遺伝子(配列番号41)、β-ガラクトシダーゼ遺伝子, LacZ(配列番号42)、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子, hSEAP(配列番号43)、マウス分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子, mSEAP(配列番号44)から選択されるレポーター遺伝子を含んでなり得る。このような形態の構築物(ｉ)は、本発明に従う構築物セットを用いるHRによる、このようなレポーター遺伝子の挿入から生じる遺伝子発現のレベルを決定するためのポジティブコントロールとして使用することができる。
具体的には、構築物(ｉ)は配列番号45又は配列番号46を含んでなる。
【００３１】
本発明の第２の観点に従えば、GOIをコードする配列を少なくとも１つの細胞中に導入するためのキットが提供される。該キットは、本発明の第１の観点に従う遺伝子構築物セットと、該遺伝子構築物セットを用いる形質転換細胞の作製のための指示書とを含んでなる。
具体的には、前記キットは、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；Jurkat細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞を含んでなる群より選択される少なくとも１つの標的細胞を更に含んでなる。
【００３２】
本発明の第３の観点に従えば、少なくとも１つの細胞を相同組換えにより形質転換する方法が提供される。該方法は以下の工程を含んでなる：
ａ)興味対象の遺伝子をコードする配列を、構築物(ｉ)のMCS位置中にクローニングする工程；
ｂ)標的細胞を、工程ａ)の前記構築物(ｉ)と上記で規定される構築物(ii)、(iii)又は(iv)の少なくとも１つとで同時トランスフェクトする工程；
ｃ)前記標的細胞から少なくとも１つの細胞を成分(POS)の存在及び成分(NEG)の不存在に基づいて選択する工程。
【００３３】
具体的には、工程ｃ)の選択は、(POS)及び(NEG)によってコードされている遺伝子産物の活性について逐次に行われる。
或いは、工程ｃ)の選択は、(POS)及び(NEG)によってコードされている遺伝子産物の活性について同時に行われる。
【００３４】
定義
−  ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称される。一文字コードでは、例えば、ＱはGln又はグルタミン残基を意味し、ＲはArg又はアルギニン残基を意味し、ＤはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
−  ヌクレオチドは下記のとおり指称される：一文字コードはヌクレオシドの塩基を指称するために使用される：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、ｒはｇ又はａ(プリンヌクレオチド)を表し、ｋはｇ又はｔを表し、ｓはｇ又はｃを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｙはｔ又はｃ(ピリミジンヌクレオチド)を表し、ｄはｇ、ａ又はｔを表し、ｖはｇ、ａ又はｃを表し、ｂはｇ、ｔ又はｃを表し、ｈはａ、ｔ又はｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔ又はｃを表す。
【００３５】
−  「メガヌクレアーゼ」により、12〜45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼが意図される。例としては、I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-MsoIが挙げられる。
−  「ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ」により、単一のLAGLIDADGモチーフを有し、パリンドローム状DNA標的配列を切断する野生型ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばI-CreI若しくはI-MsoI又はそれらの機能的変形体が意図される。
【００３６】
−  LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変形体」又は「ZFN変形体」又は「TALEN変形体」又は「変形体」により、それぞれLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ配列又はTALEN配列又はZFN配列の少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置換して得られるタンパク質が意図される。
−  「機能的変形体」により、DNA標的、好ましくは野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はTALEN又はZFN変形体によっては切断されない新たなDNA標的を切断することができるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変形体又はTALEN変形体又はZFN変形体が意図される。例えば、このような変形体は、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接に相互作用する位置でアミノ酸変化を有する。
【００３７】
−  「新規な特異性を有するヌクレアーゼ変形体」により、親ヌクレアーゼのものとは異なる切断標的パターン(切断プロフィール)を有する変形体が意図される。変形体は、親ヌクレアーゼより少ない標的を切断してもよいし(制限されたプロフィール)、多い標的を切断してもよい。好ましくは、変形体は、親ヌクレアーゼにより切断されない少なくとも１つの標的を切断することができる。
用語「新規な特異性」、「改変された特異性」、「新規な切断特異性」、「新規な基質特異性」(これらは互いに相当する用語であり、区別なく使用される)は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変形体の特異性をいう。
−  「I-CreI」により、SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型I-CreIが意図される。
【００３８】
−  「ドメイン」又は「コアドメイン」により、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なαββαββαフォールドである、約100アミノ酸残基の配列に相当する「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」が意図される。前記ドメインは、逆平行β-シート(これがDNA標的の一方の半分と相互作用する)に折りたたまれた４つのβ-鎖を含んでなる。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと組み合わせて、前記DNA標的を切断することができる機能的エンドヌクレアーゼを形成することができる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI(163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは残基６〜94に相当する。単量体ホーミングエンドヌクレアーゼの場合、２つのこのようなドメインがエンドヌクレアーゼの配列中に見出される；例えば、I-DmoI(194アミノ酸)では、第１のドメイン(残基７〜99)及び第２のドメイン(残基104〜194)が短いリンカー(残基100〜103)で隔てられている。
【００３９】
−  「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半-部位の別個の部分と相互作用する、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域が意図される。２つの異なるサブドメインは独立して又は部分的に独立して挙動し、一方のサブドメイン中の変異は、他方のサブドメインの結合及び切断特性を変更しないか、又は多くの場合で該特性を変更しない。したがって、２つのサブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半-部位の別個の部分に結合する。
−  「β-ヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されている、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行β-シートの２つの連続したβ-鎖が意図される。
【００４０】
−  「単鎖メガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」、「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」により、ペプチド性スペーサーにより連結された２つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼが意図される。単鎖メガヌクレアーゼは、各々の親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。
−  「切断活性」により、本発明の変形体の切断活性は、PCT出願WO 2004/067736；Epinatら，Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962；Chamesら，Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら，J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458に記載されるように、レポーターベクターを用いる酵母又は哺乳動物細胞における直接反復組換えアッセイにより測定され得る。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた、レポーター遺伝子の２つの短縮型非-機能的コピー(直接反復)とその介在配列内にキメラDNA標的配列とを含んでなる。DNA標的配列は、親ホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位から、少なくとも１つのヌクレオチドの異なるヌクレオチドによる置換によって誘導される。好ましくは、DNA切断部位の１以上の位置での４塩基(ｇ、ａ、ｃ、ｔ)の異なる組合せであるパリンドローム状又は非-パリンドローム状DNA標的のパネルが試験される(ｎ個の変異位置に関して4n個のパリンドローム状標的)。変形体の発現は、DNA標的配列を切断することができる機能的エンドヌクレアーゼを生じる。この切断は直接反復間の相同組換えを誘導して機能的レポーター遺伝子を生じ、この発現は適切なアッセイによりモニターすることができる。
【００４１】
−  「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的-部位」、「標的」、「部位」；「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼによって認識、切断される、22〜24bpの二本鎖パリンドローム状、部分的パリンドローム状(偽-パリンドローム状)又は非-パリンドローム状ポリヌクレオチド配列が意図される。これら用語は、エンドヌクレアーゼによって二本鎖破断(切断)が誘導されるべき独特なDNA位置、好ましくはゲノム位置をいう。DNA標的は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'→3'配列によって規定される。或いは、「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的-部位」、「標的」、「部位」；「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」は、ヌクレアーゼ(例えばTALEN又はZFN)によって認識、切断される二本鎖パリンドローム状、部分的パリンドローム状(偽-パリンドローム状)又は非-パリンドローム状ポリヌクレオチド配列を意図する。
−  「DNA標的半-部位」、「半切断部位」又は「半-部位」により、各ヌクレアーゼドメイン(例えば、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン)又は各TAL若しくは各ジンクフィンガードメインが結合するDNA標的の部分が意図される。
【００４２】
−  「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、２つの親ヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体が意図される。加えて、前記標的の少なくとも一方の半分は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ標的の場合、隔てられているサブドメインによって結合されるヌクレオチドの組合せを含んでなり得る(組合せのDNA標的)。
−  「変異」により、核酸/アミノ酸配列中の１以上のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失及び/又は付加が意図される。
−  「ヌクレアーゼ」により、特定のゲノムDNA標的を切断し、そうしてDSB又はSSBを誘導することができ、12〜45bpの二本鎖DNA標的配列を有する、任意の天然に存在するか又は人工的な酵素、分子又は他の手段を意味するものと意図される。
−  「相同」により、別の配列と配列間の相同組換えを導くに十分な同一性、より具体的には少なくとも95％の同一性、好ましくは97％の同一性、より好ましくは99％の同一性を有する配列が意図される。
【００４３】
−  「同一性」は、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、各配列(比較のために整列されてもよい)中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められているとき、その位置で該分子同士は同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における同一の又は匹敵するヌクレオチド数の関数である。FASTA又はBLAST(GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として入手可能である)を含む種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラムを、２つの配列間の同一性を計算するために使用してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。
−  「個体」は、哺乳動物及び他の脊椎動物(例えば、鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用する場合、子に授乳し、子を出産するか(真獣類又は胎盤哺乳動物)又は産卵する(後獣類又は無胎盤哺乳動物)任意の脊椎動物(単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含む)をいう。哺乳動物種の例としては、ヒトその他の霊長類(例えば、モンキー、チンパンジー)、げっ歯類(例えば、ラット、マウス、モルモット)及び反芻動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ)が挙げられる。
−  「興味対象の遺伝子」又は「GOI」は、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。
【００４４】
−  「遺伝子疾患」は、１又は幾つかの遺伝子の異常に、部分的又は完全に、直接的又は間接的に起因する任意の疾患をいう。前記異常は変異、挿入又は欠失であり得る。前記変異は点状変異(punctual mutation)であり得る。前記異常は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。前記異常は、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造若しくは安定性に影響することがある。この遺伝子疾患は劣性でも優性でもあり得る。このような遺伝子疾患は、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症(LDLレセプター欠損)、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝臓代謝障害、レッシュ‐ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、色素性網膜炎、毛細管拡張性運動失調、ブルーム症候群、網膜芽腫、デュシェーヌ筋ジストロフィー及びテイ‐サックス病であり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
−  「ベクター」：本発明において、例えば上記で規定する構築物(ii)又は(iii)として使用することができるベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター又は線状若しくは環状DNA若しくはRNA分子(染色体、非染色体、半-合成又は合成核酸からなり得る)を含むがこれらに限定されない。好適なベクターは、自律複製(エピソームベクター)及び/又は連結されている核酸の発現(発現ベクター)が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。
【００４６】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルス及びセンダイウイルス)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス(アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルスタイプ１及び２、エプスタイン-バールウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘ウイルス)を含む)が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例には、トリ白血症-肉腫、哺乳動物Ｃ-タイプ、Ｂ-タイプウイルス、Ｄタイプウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Fundamental Virology, 第３版, B. N. Fields,ら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)が挙げられる。用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。好適なベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好適なベクターは、自律複製及び/又は連結されている核酸の発現が可能なものである。作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。本発明に従うベクターは、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター又は線状若しくは環状DNA若しくはRNA分子(染色体、非染色体、半-合成又は合成DNAからなり得る)を含むがこれらに限定されない。一般に、組換えDNA技術に利用される発現ベクターは、しばしば、「プラスミド」(これは、一般には、ベクター形態で、染色体に結合していない環状二本鎖DNAループをいう)の形態である。多数の適切なベクターが当業者に公知である。
【００４７】
ベクターは、選択マーカー、例えば：真核細胞培養用には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiae用にはTRP1；E. coliではテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含んでなり得る。これら選択マーカーはまた、本発明に従う構築物(ｉ)及び(ii)の一部分として使用することもできる。
好ましくは、前記ベクターは、本発明のポリペプチドをコードする配列が適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されており、前記タンパク質の産生又は合成を可能にする発現ベクターである。したがって、前記ポリヌクレオチドは発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、前記コーディングポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、リボソーム部位、RNA-スプライシング部位(ゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含んでなる。これはまた、エンハンサー又はサイレンサーエレメントを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。
【００４８】
本発明をより良く理解するため、及び本発明を実施する方法を示すために、ここで、添付の図面を参照して、本発明に従う具体的な実施形態、方法及びプロセスを示すが、これらは例示にすぎない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１：メガヌクレアーゼ-媒介標的化組込みプロセスの概略図。組込みマトリクス及びメガヌクレアーゼ発現プラスミドを真核細胞中に同時トランスフェクトする。同時-トランスフェクションにより、操作されたメガヌクレアーゼが発現され、内因性の認識部位を認識し、これに結合して、この正確な部位でDNA二本鎖破断を誘導する。細胞はDNA損傷を察知し、相同組換えを誘引し、同時トランスフェクトされた組込みマトリクス(これは、破断したDNAの周囲に相同な領域を含有するので、DNA修復マトリクスとして使用される)を用いて損傷を修復する。(組込みマトリクスの多重クローニング部位(MCS)中、相同性領域の間にクローニングされている)選択マーカー及び興味対象の遺伝子(GOI)が、この組換え事象の間にメガヌクレアーゼ認識部位で組み込まれる。
【図２】図２：メガヌクレアーゼをコードするプラスミドの説明。２つの異なるストラテジーを利用して、すなわち２つの別個のプラスミド(ケース１)中又は単量体サブユニットを単鎖形態で発現する独特なプラスミド(ケース２)中に各単量体のオープンリーディングフレームを導入することによって、メガヌクレアーゼ単量体サブユニットの発現を駆動することができる。
【図３】図３：汎用組込みマトリクスの説明。汎用組込みマトリクスに導入される種々の遺伝子エレメントの概略図。第１に、ポジティブ及び選択マーカー遺伝子を２つの異なる場所に付加する：前者は組換え誘発性エレメント中に挿入し、後者は該エレメントの外に挿入する。第２に、種々の制限部位を導入する：任意のタイプの組込み座用の左右の相同性アームをクローニングするための８bp切断部位、任意のGOIを挿入するための多重クローニング部位(MCS)及び追加のエレメント(すなわち、エンハンサー、サイレンサー)をクローニングする場合には他の制限部位。
【図４】図４：汎用組込みプラスミドマップ。ポジティブ選択マーカー遺伝子のタイプ[すなわち、例として、ネオマイシン(NeoR)及びハイグロマイシン(HygroR)]及びネガティブ選択マーカー遺伝子のタイプ(すなわち、HSV TK DelCpG及びCD:UPRT DelCpG)を変更することで、２例の汎用組込みマトリクスが示される。興味対象の遺伝子(GOI)のクローニング用の多重クローニング部位(MCS)が示されている。これらプラスミド骨格は、AscI部位に左相同性アームを、FseI又はSbfI部位に右相同性アームを挿入することで、任意のタイプの染色体座でのHRに役立ち得るという点で汎用である。このような８bpカッターの選択は、古典的な６bpカッターより、増幅させるべき所望の染色体領域中に部位を見出す確率が減少するという利点が得られる。
【図５】図５：メガヌクレアーゼ-媒介標的化組込みプロセス(対抗選択)の概略図。ポジティブ選択プロセス後、期待した遺伝子座での望まないランダム組込み及び/又は結果として起こるプラスミドベースのコンカテマー多重組込みは、対抗選択プロセスを用いることで排斥することができる。組換え誘発性エレメント外の自殺遺伝子マーカーの存在は、最終の選択された細胞クローンを、使用する自殺遺伝子マーカーのタイプに依存するプロドラッグ(すなわち、例として、HSV TKについてはガンシクロビル、CD:UPRTについては５-フルオロシトシン)により処理することで回避することができる。アイソジェニック(単コピー)組込みはプロドラッグ耐性である一方、他の全てのタイプの組込み体(ランダム又はコンカテマー)はプロドラッグ感受性である。
【図６】図６：ヒトRAG1遺伝子座を標的化するための組込みプラスミドマップ。ヒトRAG1遺伝子座の左右の相同性アームがpIM-Universal-TK-Neoプラスミド中にクローニングされている。
【図７】図７：HEK 293における標的化されたクローンの選択プロセスの説明。HEK293をRAG1メガヌクレアーゼ発現及び組込みマトリクスでトランスフェクトする。トランスフェクションの３日後、2,000のトランスフェクト細胞を10cm培養皿に播種する。トランスフェクションの10日後、G418の存在下にクローンを７日間培養することによってネオマイシン-耐性クローンを同定する。トランスフェクションの17日後、ガンシクロビルを５日間加えてネオマイシン-及びガンシクロビル-耐性クローンを単離する。この選択プロセスの終時に、二重耐性クローンを96-ウェルプレートに再配置する。PCRによるスクリーニングのためにクローンの96-ウェルプレートを２組作成する。
【図８】図８：HEK293における標的化されたクローンのスクリーンPCR。Ａ．標的化された組込み後のRAG1遺伝子座の概略図。PCRプライマーの位置が示されている。Ｂ及びＣ．臭化エチジウム染色した(PCRポジティブクローンが同定された)96-ウェルアガロースゲルのUV光写真。ゲルあたり、16ウェルの６列をロードすることができる。各列の各側に、DNAマーカーラダー(Ｌ)がロードされる。DNAバンドサイズは(上から下へ)：10kb、８kb、２kb、0.8kb、0.4kbである。
【図９】図９：HEK293における標的化されたクローンの分子特徴付け(サザンブロット)。Ａ．HindIII制限酵素で消化したgDNAについてのゲノムプローブのハイブリダイゼーション。Ｂ．EcoRV制限酵素で消化したgDNAについてのネオマイシンプローブのハイブリダイゼーション。Ｃ．HindIII制限酵素で消化したgDNAについてのネオマイシンプローブのハイブリダイゼーション。Ｄ．単コピー標的化組込み後のヒトRAG1遺伝子座の概略図及び推定バンドサイズ。Ｅ．多重コピー標的化組込み後のヒトRAG1遺伝子座の概略図及び推定バンドサイズ。略号：GCV R；ガンシクロビル-耐性、GCV S；ガンシクロビル-感受性、C-；非トランスフェクトHEK293細胞、C+；ポジティブ標的化HEK293クローン、kb；キロベース、HIII；HindIII、EV；EcoRV、LH；左相同性アーム、RH；右相同性アーム、Neo；ネオマイシン耐性遺伝子、Luc；ルシフェラーゼレポーター遺伝子、HSV TK；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。
【図１０】図10：ヒトRAG1-標的化HEK293クローンにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の安定性。Ａ．選択剤の存在下での20継代にわたるルシフェラーゼの発現(４つのルシフェラーゼ標的化クローンについての平均値)。Ｂ．選択剤の不在下での20継代にわたるルシフェラーゼの発現(４つのルシフェラーゼ標的化クローンについての平均値)。
【図１１】図11：ヒトRAG1-標的化HEK293クローンにおける３つの異なるプロモーターの制御下でのTagGFP2レポーター遺伝子の安定性。20継代にわたるEFIa(四角)、CMV(三角)又はGAS5(丸)プロモーターの制御下でのTagGFP2の発現(GFP X-mean)。
【図１２】図12：標的化HCT 116クローンにおける単対立遺伝子及び二対立遺伝子RAG1破壊遺伝子のサザンブロット分析。左パネル：NeoRGCVRPCR+クローンからのHindIII制限酵素で消化したgDNAについてのゲノムプローブのハイブリダイゼーション。コントロールレーン(天然型HCT 116からのgDNA)。黒星印(第２の標的化実験に使用したD12クローン)。右パネル：HygroRGCVRPCR+クローンからのHindIII制限酵素で消化したgDNAについてゲノムプローブのハイブリダイゼーション。Ｔ：標的化された対立遺伝子、WT：野生型対立遺伝子。
【実施例】
【００５０】
ここで、本発明者らが企図した具体的な態様を例として記載する。下記の説明では、十分な理解のための多くの具体的詳細が記載される。しかし、本発明がこれら具体的詳細に制限されることなく実施され得ることは、当業者に明らかである。説明が不必要にぼやかされないように、周知の方法及び構造は記載していない。
【００５１】
実施例１：メガヌクレアーゼをコードするプラスミドの設計
本発明者らを含む幾つかのグループは、特に興味対象たる天然ゲノムDNA配列を標的化するためにメガヌクレアーゼの認識能力を改変した。これら新たに開発された酵素は、天然に存在するメガヌクレアーゼに応じて設計された；本出願人らは、それらを、所与の適用のために十分に規定されたDNA配列を標的化するために使用した。本出願人らは、メガヌクレアーゼ用の高スループットスクリーニングプラットフォームを開発して、「DNA鋏」の膨大なコレクションを創出し、それらを改変特異性技術と組み合わせた。
改変された認識特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼに関して、本発明で挙げられる例は、I-CreIの元々の骨格からのタンパク質改変体に関する。しかし、本発明は、任意の他のメガヌクレアーゼ骨格、例えばI-SceI、I-CreI、I-MsoI、PI-SceI、I-AniI、PI-PfuI、I-DmoI、I-CeuI、I-Tsp0611、又は機能的ハイブリッドタンパク質(例えばI-CreIペプチドと融合したI-DmoI成分)に適用することができる。
【００５２】
ほとんどのメガヌクレアーゼタンパク質は、実際には単量体であるにもかかわらず、二重内部対称性を保存しており、各々が標的DNAの半分と相互作用する２つのDNA結合性半-部位を有する。このことは、２つの隔てられたサブユニットから構成され、したがって各サブユニットが認識遺伝子座の半-部位を認識するへテロ二量体組成物を形成している、I-CreI-由来の操作されたメガヌクレアーゼには当てはまらない。本出願人らは、機能的切断活性を維持しながら両単量体を融合することが、それらを短いペプチド配列で連結することによって可能であることを既に示した(すなわち、染色体外及び染色体内の標的配列で証明された)。この最初の理論的枠組みから、そして図２に示されるように、I-CreI-由来の操作されたメガヌクレアーゼの発現は、下記を使用して行うことができる：
−  各単量体成分を発現する、２つの別々のDNAプラスミド/同じプラスミド中の２つの別々の配列により；
−  両単量体成分の融合体から構成される単鎖形態を用いることにより同じプラスミドから。
【００５３】
他の発現カセットを含有する組込みマトリクスについての場合のように、メガヌクレアーゼのオープンリーディングフレームの転写を駆動するcis-活性DNAエレメント(すなわち、プロモーター配列及びポリアデニル化シグナル)は、標的細胞株及びその中の遺伝子エレメントの相対的性質に依存して変更することができる。
【００５４】
実施例２：組込みマトリクスの設計
任意の細胞タイプにおけるメガヌクレアーゼ駆動HRを可能にするために、汎用プラスミド骨格を設計し、構築した(図３)。組込みマトリクスにクローニングされる或る種の遺伝子エレメント(例えば、相同性アーム、選択カセット及びGOI発現カセット)は必須である。
相同性アームは、特異的な遺伝子標的化を達成するために必要である。これらは、ｉ)メガヌクレアーゼ標的部位の上流のゲノム領域(左相同性アーム)及びii)メガヌクレアーゼ標的部位の下流のゲノム領域(右相同性アーム)に特異的なプライマーを用いるPCR増幅により作製される。
相同性アームの長さは、500bpと２kbの間、通常1.5kbである。
【００５５】
ポジティブ選択カセットは、プロモーター領域及びターミネーター配列によって制御される耐性遺伝子から構成される。このことはまた、対抗(ネガティブ)選択カセットについても当てはまる。汎用組込みマトリクスに挿入されるこれらタイプの遺伝子エレメントについてのプラスミドマップの例[pIM-Universal-TK-Neo(配列番号１)、pIM-Universal-CD:UPRT-Hygro(配列番号２)]を図４に示す。図４には、ポジティブ(ネオマイシン又はハイグロマイシン)及びネガティブ(HSV TK又はCD:UPRT)選択マーカー遺伝子が示されている。ポジティブ及び対抗(ネガティブ)選択に関与する遺伝子の一覧を表Ｉに示す。そのような遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子, nptl(配列番号３)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子, hph(配列番号４)、ピューロマイシンＮ-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子, pac(配列番号５)、ブラスティシジンＳデアミナーゼ耐性遺伝子, bsr(配列番号６)、ブレオマイシン耐性遺伝子, sh ble(配列番号７)、CpGアイランドが欠失した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子, HSV TK DelCpG(配列番号８)、CpGアイランドが欠失したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子にカップリングしたシトシンデアミナーゼ, CD:UPRT DelCpG(配列番号９)が挙げられる。
【００５６】
発現カセットは、多重クローニング部位(MCS)から構成され、MCSに、GOIが古典的な分子生物学技法を用いてクローニングされる。MCSには、プロモーター(上流)及びターミネーター(下流)配列が隣接する。このような遺伝子エレメントの一覧を表IIに示す。そのような遺伝子エレメントとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター, pCMV(配列番号10)、シミアンウイルス40プロモーター, pSV40(配列番号11)、ヒト伸長因子１αプロモーター, phEF1α(配列番号12)、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター, phPGK(配列番号13)、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター, pmPGK(配列番号14)、ヒトポリユビキチンプロモーター, phUbc(配列番号15)、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーター, pHSV-TK(配列番号16)、ヒト成長停止特異的５プロモーター, phGAS5(配列番号17)、テトラサイクリン応答性エレメント, pTRE(配列番号18)、脳症心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)配列, IRES EMCV(配列番号19)、口蹄疫ウイルス由来のIRES配列, IRES FMDV(配列番号20)、SV40ポリアデニル化シグナル, SV40 pA(配列番号21)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル, BGH pA(配列番号22)が挙げられる。
【００５７】
この基本足場から、多くの組込みマトリクスを誘導できる。例えば、IRES配列で隔てられた二重MCSを導入して、２つのGOIを発現させることができる。MCSは、GOIのタグ化を可能にするインフレームの短い配列(Ｎ-末端又はＣ-末端)を備えることができる。この場合、付着させるタグのタイプに応じて多くの応用を考案することができる(イメージング、精製、免疫検出、細胞アドレッシング)。
表IIIは、組込みベクターに導入することができる任意付加の遺伝子エレメントの概要を示す。そのような遺伝子エレメントとしては、FLAG(配列番号23)、FLASH/REASH(配列番号24)、IQ(配列番号25)、ヒスチジン(配列番号26)、STREP(配列番号27)、ストレプトアビジン結合性タンパク質, SBP(配列番号28)、カルモジュリン結合性タンパク質, CBP(配列番号29)、ヘマグルチニン, HA(配列番号30)、c-myc(配列番号31)、V5タグ配列(配列番号32)、ヌクレオプラスミンからの核局在化シグナル(NLS)(配列番号33)、SV40からのNLS(配列番号34)、NLSコンセンサス(配列番号35)、トロンビン切断部位(配列番号36)、P2A切断部位(配列番号37)、T2A切断部位(配列番号38)、E2A切断部位(配列番号39)が挙げられる。
【００５８】
加えて、レポーター遺伝子(一覧を表IVに示す)もまた、MCS中にクローニングすることができ、想定された染色体遺伝子座での標的化された組込み後の発現レベルを評価するためのポジティブコントロールとして役立てることができる。これらには、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(配列番号40)、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(配列番号41)、β-ガラクトシダーゼ遺伝子, LacZ(配列番号42)、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子, hSEAP(配列番号43)、マウス分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子, mSEAP(配列番号44)が含まれる。
最後に、メガヌクレアーゼ-誘導標的化組込みは、時に、望まない事象(例えば、宿主ゲノムへの組込みマトリクスのランダム挿入)を伴うことがある。通常、この現象には、プラスミド骨格の配列を含む組込みマトリクスの完全な挿入が関係する。この現象を少なくとも部分的に回避するために、対抗(ネガティブ)選択マーカーが、例えばKhanahmadら，2006及びJinら，2003に記載されるように、プラスミドの骨格部分(すなわち、相同性アームの外側)に存在する。
【００５９】
メガヌクレアーゼ-駆動標的化組込みに関するこのタイプの自殺遺伝子発現系の使用は、潜在的なランダム挿入を伴う標的化細胞クローンの除去に特に関連する。
組込みマトリクスの細胞内線状化もまた、宿主ゲノムにおけるランダム組込みを導くことがある。線状化は、ネガティブマーカー内で起きれば、その機能を不活化し、ランダム組込み事象は、細胞のプロドラッグ処理では除去されない。この欠点を迂回するために、本発明者らは、組込みマトリクス上に２つのネガティブ選択発現カセットが存在する組込みマトリクスを提案する；例えば、１つはHOMO1領域の上流、１つはHOMO2領域の下流。本発明者らは、少なくとも１つのネガティブ選択発現カセットの使用により多コピー標的化組込みが防止されることを示した。以前には、対抗ネガティブ選択マーカーの使用は、ランダム組込みの防止について記載されていた。本発明者らは、ここで、これらマーカーはまた多コピー標的化組込みの防止も可能にすることを示した。
【００６０】
プラスミド骨格中、組換え誘発性エレメントの外に自殺遺伝子発現カセットを含有する組込みマトリクスにより、想定した染色体遺伝子座での組込み事象に富んだ標的化細胞クローンの選択が可能になる。幾つかの標的化細胞クローンでの自殺遺伝子発現カセットの維持は、望まない組込み事象である。なぜならば、正確な標的化プロセスは、通常、組換え誘発性エレメントの外側に位置するプラスミド-ベース配列の組込みを排斥するからである。したがって、細胞クローンを、自殺遺伝子系に関連する毒性プロドラッグで処理することで、このようなタイプの組込み体を含有するものを殺傷することができる(図５)。
或る染色体遺伝子座での標的化組込みのための本発明は、古典的なプラスミド-ベース系以外のタイプのDNA起源からの組込みマトリクスを用いても得ることができる。これらには、DNA中間体が生成される任意のタイプのウイルスベクター、例えば、1LTR及び2LTRを利用する非-組込みレトロウイルス及びレンチウイルス、環状プロウイルス、エピソームDNAウイルスベクター(アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含む)、並びにエピソーム複製状態を有する他のタイプのDNAウイルスが含まれる。
【００６１】
実施例３：トランスフェクション及び選択
本実施例では、我々は、RAG1ヒト遺伝子に位置する標的に特異的なメガヌクレアーゼを用いる、GOIの標的化された組込みの同定を導く技術的プロセスを提示する。下記の立証に使用されたRAG1-特異的組込みマトリクスに関するプラスミドマップ[pIM-RAG1-MCS(配列番号45)、pIM-RAG1-Luc(配列番号46)]を図６に示す。この操作されたメガヌクレアーゼはヒトRAG1遺伝子内を認識、切断することができるので、標的化組込みを実質的に全てのヒト細胞系統で得ることができる。プラスチックに接着する細胞の能力に依存して、トランスフェクション及び選択手順は異なるが、共に標的化細胞クローンの効率的な同定を導く。
【００６２】
組込みマトリクス及びメガヌクレアーゼ発現ベクターを、細胞中に公知の技法を用いてトランスフェクトする。外来DNAを真核細胞中に導入する種々の方法が存在し、多くの材料がトランスフェクションのキャリアとして使用されている。トランスフェクション用キャリアは３種類に分類することができる：(カチオン性)ポリマー、リポソーム及びナノ粒子。他のトランスフェクション法としては、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション(例えばCyto Pulse(Cellectis))、熱ショック、マグネトフェクション及び専売のトランスフェクション試薬(例えば、Lipofectamine、Dojindo Hilymax、Fugene、JetPEI、Effectene、DreamFect、PolyFect、Nucleofector、Lyovec、Attractene、Transfast、Optifect)が挙げられる。
【００６３】
3.1  接着性HEK-293細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、Lipofectamine(登録商標)を用いるHEK-293(ヒト接着性細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する(図７)。
材料及び方法
トランスフェクションの１日前に、HEK-293細胞を10cm組織培養皿に播種する(106細胞/皿)。トランスフェクション当日(Ｄ)に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス(pIM-RAG1-MCS(配列番号45)及びそれから誘導したGOI-含有プラスミド(MCSの代わりにGOIを有する)又はポジティブコントロールとしてのpIM-RAG1-Luc(配列番号46))を300μlの血清フリー培地に希釈する。他方で、10μlのLipofectamine(登録商標)試薬を290μlの血清フリー培地に希釈する。両方のミックスを５分間室温でインキュベートする。その後、希釈DNAを希釈Lipofectamine(登録商標)試薬に加える(決して逆の様式ではない)。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、20分間室温でインキュベートする。次いで、このトランスフェクションミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。翌日、トランスフェクション培地を新鮮な完全培地と交換する。
【００６４】
トランスフェクションの３日後、細胞を採集し、計数する。次いで、細胞を、10cm組織培養皿中、200細胞/mlの密度で総容量10mlの完全培地に播種する。10cm組織培養皿を37℃、５％CO2で計７日間インキュベートする。７日間の終時に、単一細胞コロニーが見られる。
トランスフェクションの10日後(又はプレーティングの７日後)、培養培地を、選択剤(すなわち、組込みマトリクスに存在する耐性遺伝子に対応する)を補充した新鮮培地と交換する。本実施例では、組込みマトリクスは、全長のネオマイシン耐性遺伝子を含有する(図６)。したがって、クローンの選択は、G418スルフェートを0.4mg/mlの濃度で用いて行う。培地の交換は２日毎又は３日毎に計７日間行う。この選択期の終時に、耐性細胞を、96-ウェルプレートに単離することも、対抗選択のために10cm培養皿(接着性細胞)に維持するか又は新たな96-ウェルプレート(懸濁細胞)に再配置することもできる。
【００６５】
HSV TK対抗選択マーカーが組込みマトリクスに存在する(図６)ので、耐性細胞又はコロニーを10μMのガンシクロビル(GCV)の存在下で培養して、ランダム挿入及び多コピー標的化組込みのような望まない組込み事象を除去することができる。GCVの存在下での５日間の培養後、更なる特徴付けのために二重耐性(G418R-GCVR)細胞コロニーを単離することができる。
この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R-GCVR)細胞コロニーを単離することができる。
【００６６】
3.2  接着性U-2 OS細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、Amaxa(登録商標) Cell Line Nucleofector(登録商標) Kit V試薬(Lonza)を用いるU-2 OS(ヒト接着性細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する。
材料及び方法
トランスフェクション当日(Ｄ)に、細胞は80％コンフルーエントを超えていてはならない。細胞をサブクローニング容器(T162 Tissue Culture Flask)からトリプシン処理によって採集し、15mlコニカルチューブに集める。採集した細胞を計数する。トランスフェクションポイントあたり106細胞が必要である。細胞を300ｇで５分間遠心分離し、Cell Line Nucleofector(登録商標) Solution Vに106細胞/100μlの濃度で再懸濁する。Amaxaエレクトロポレーションキュベットを、ｉ)興味対象の遺伝子を含有するhsRAG1組込みマトリクスCMV Neo(pIM.RAG1.CMV.Neo 配列番号58)又はhsRAG1組込みマトリクスCMV Neo Luc(pIM.RAG1.CMV.Neo.Luc 配列番号59)とhsRAG1メガヌクレアーゼプラスミド(配列番号60)((Endofree品質の調製物)、ii)100μlの細胞懸濁物(106細胞)を加えることにより調製する。細胞及びDNAを穏やかに混合し、Amaxa(登録商標)プログラムX-001を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、予め加温した完全培地を細胞に加え、細胞懸濁物を、５mlの37℃に予熱した完全培地を含む２つの10cm培養皿に分割する(５ml/皿)。次いで、10cm培養皿を37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。
【００６７】
トランスフェクションの２日後(D+2)、完全培養培地を、0.4mg/mlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計７日間繰り返す。D+9で、0.4mg/ml G418を補充した完全培養培地を、0.4mg/mlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計５日間繰り返す。D+14で、G418及びGCV耐性クローンを96-ウェルプレートに採取する。この工程で、細胞を0.4mg/mlのG418のみを補充した完全培地で維持する。
この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R-GCVR)細胞コロニーを単離することができる。
【００６８】
3.3  接着性HCT116細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、FuGENE(登録商標) HD(Promega)を用いるHCT 116(ヒト接着性細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する。
材料及び方法
トランスフェクションの１日前に、HCT 116細胞を10cmの組織培養皿に播種する(５×105細胞/皿)。トランスフェクション当日(Ｄ)に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス(pIM-RAG1-MCS(配列番号45)及びそれから誘導したGOI-含有プラスミド(MCSの代わりにGOIを有する)又はポジティブコントロールとしてのpIM-RAG1-Luc(配列番号46))を500μlの血清フリー培地に希釈する。次いで、15μlのFuGENE(登録商標) HD試薬をこのDNAミックスに希釈する。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、15分間室温でインキュベートする。次いで、このトランスフェクションミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。
【００６９】
トランスフェクションの翌日(D+1)、完全培養培地を、0.4mg/mlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計７日間繰り返す。D+9で、0.4mg/ml G418を補充した完全培養培地を、0.4mg/mlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計５日間繰り返す。D+14で、G418及びGCV耐性クローンを96-ウェルプレートに採取する。この工程で、細胞を0.4mg/mlのG418のみを補充した完全培地で維持する。
この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R-GCVR)細胞コロニーを単離することができる。
【００７０】
3.4  接着性HepG2細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、FuGENE(登録商標) HDを用いるHepG2(ヒト接着性細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する。
材料及び方法
トランスフェクションの１日前に、HCT 116細胞を10cm組織培養皿に播種する(106細胞/皿)。トランスフェクション当日(Ｄ)に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス(pIM-RAG1-MCS(配列番号45)及びそれから誘導したGOI-含有プラスミド(MCSの代わりにGOIを有する)又はポジティブコントロールとしてのpIM-RAG1-Luc(配列番号46))を500μlの血清フリー培地に希釈する。次いで、15μlのFuGENE(登録商標) HD試薬をこのDNAミックスに希釈する。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、15分間室温でインキュベートする。次いで、このトランスフェクションミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。
【００７１】
トランスフェクションの３日後(D+3)、トランスフェクト細胞をトリプシン処理により採集し、２つの10cm培養皿に分割する。完全培養培地を、0.8mg/mlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を３日毎に計10日間繰り返す。D+13で、0.8mg/ml G418を補充した完全培養培地を、0.8mg/mlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計５日間繰り返す。D+18で、細胞を、0.8mg/mlのG418を補充した新鮮な完全培地で培養する。D+24で、G418及びGCV耐性クローンを96-ウェルプレートに採取する。この工程で、細胞を0.8mg/mlのG418のみを補充した完全培地で維持する。
この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R-GCVR)細胞コロニーを単離することができる。
【００７２】
3.5  接着性MRC-5細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、PolyFect(登録商標)(Qiagen)を用いるMRC-5(ヒト接着性細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する。
材料及び方法
トランスフェクションの１日前に、MRC-5細胞を10cm組織培養皿に播種する(2.5×105細胞/皿)。トランスフェクション当日(Ｄ)に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス(pIM-RAG1-MCS(配列番号45)及びそれから誘導したGOI-含有プラスミド(MCSの代わりにGOIを有する)又はポジティブコントロールとしてのpIM-RAG1-Luc(配列番号46))を275μlの血清フリー培地に希釈する。次いで、50μlのPolyFect(登録商標) HD試薬をこのDNAミックスに希釈する。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、10分間室温でインキュベートする。700μlの完全培地をこのトランスフェクションミックスに加え、その後、最終ミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。
【００７３】
トランスフェクションの３日後、細胞を採集し、計数する。次いで、細胞を10cm組織培養皿中、1000細胞/mlの密度で総容量10mlの完全培地に播種する。10cm組織培養皿を37℃、５％CO2で計７日間インキュベートする。７日間の終時に、単一細胞コロニーが見られる。トランスフェクションの10日後(又はプレーティングの７日後)、培養培地を、G418スルフェートを0.4mg/mlの濃度で補充した新鮮培地と交換する。培地の交換は２日毎又は３日毎に計７日間行う。D+13で、0.4mg/ml G418を補充した完全培養培地を、0.4mg/mlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計５日間繰り返す。
この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R-GCVR)細胞コロニーを単離することができる。
【００７４】
3.6  懸濁Jurkat細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、Amaxa(登録商標) Cell Line Nucleofector(登録商標) Kit V(Lonza)を用いるJurkat細胞(ヒトリンパ芽球細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する。
材料及び方法
トランスフェクション当日(Ｄ)に、Jurkat細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。トランスフェクションポイントあたり２×106細胞が必要である。細胞を300ｇで５分間遠心分離し、Cell Line Nucleofector(登録商標) Solution Vに２×106細胞/100μlの濃度で再懸濁する。Amaxaエレクトロポレーションキュベットを、ｉ)興味対象の遺伝子を含有するhsRAG1組込みマトリクスCMV Neo(pIM.RAG1.CMV.Neo 配列番号58)又はhsRAG1組込みマトリクスCMV Neo Luc(pIM.RAG1.CMV.Neo.Luc 配列番号59)とhsRAG1メガヌクレアーゼプラスミド(配列番号60)((Endofree品質の調製物)、ii)100μlの細胞懸濁物(２×106細胞)を加えることにより調製する。細胞及びDNAを穏やかに混合し、Amaxa(登録商標)プログラムX-001を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、予め加温した完全培地を細胞に加え、細胞懸濁物を、2.4mlの予め加温した完全培地を含む６ウェルプレートのウェル中に移す。次いで、６ウェルプレートを37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。
【００７５】
トランスフェクションの３日後(D+2)、完全培養培地を、0.7mg/mlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計17日間繰り返す。この選択期の後、耐性細胞を、丸底96ウェルプレート中、10細胞/ウェルの密度で0.7mg/mlのG418を補充した完全培地に採集し、クローニングする。十分な増殖(10〜15日)後、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R)細胞クローンを単離することができる。
Jurkat細胞の場合、対抗選択プロセス(ガンシクロビル)は適用しない。なぜならば、Jurkat細胞株は、非常に低濃度でさえこの薬物に極端に感受性であるからである。
【００７６】
3.7  懸濁K-562細胞のトランスフェクション及び選択
ここでは、例として、Amaxa(登録商標) Cell Line Nucleofector(登録商標) Kit V(Lonza)を用いるK-562細胞(ヒトリンパ芽球細胞株)のトランスフェクションに使用する手順を記載する。
材料及び方法
トランスフェクション当日(Ｄ)に、K-562細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。トランスフェクションポイントあたり106細胞が必要である。細胞を300ｇで５分間遠心分離し、Cell Line Nucleofector(登録商標) Solution Vに106細胞/100μlの濃度で再懸濁する。Amaxaエレクトロポレーションキュベットを、ｉ)興味対象の遺伝子を含有するhsRAG1組込みマトリクスCMV Neo(pIM.RAG1.CMV.Neo 配列番号58)又はhsRAG1組込みマトリクスCMV Neo Luc(pIM.RAG1.CMV.Neo.Luc 配列番号59)とhsRAG1メガヌクレアーゼプラスミド(配列番号60)((Endofree品質の調製物)、ii)100μlの細胞懸濁物(106細胞)を加えることにより調製する。細胞及びDNAを穏やかに混合し、Amaxa(登録商標)プログラムX-001を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、予め加温した完全培地を細胞に加え、細胞懸濁物を、2.4mlの予め加温した完全培地を含む６ウェルプレートのウェル中に移す。次いで、６ウェルプレートを37℃、５％CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。
【００７７】
トランスフェクションの３日後(D+3)、完全培養培地を、0.5mg/mlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計７日間繰り返す。D+10で、0.4mg/ml G418を補充した完全培養培地を、0.5mg/mlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を２日毎又は３日毎に計５日間繰り返す。
この選択期の後、耐性細胞を、丸底96ウェルプレート中、10細胞/ウェルの密度で0.5mg/mlのG418を補充した完全培地に採集し、クローニングする。十分な増殖(10〜15日)後、PCRによる分子スクリーニング(3.8章を参照)のために耐性(G418R-GCVR)細胞クローンを単離することができる。
【００７８】
3.8  PCRスクリーニング
一旦、選択及び任意の対抗選択が達成されると、96-ウェルプレートに再配置した耐性コロニー又はクローンは、96-ウェル形式で維持する。耐性細胞からのゲノムDNAを作製するために、プレートの複製をする。次いで、PCRを実行して、標的化組込みを同定する。
材料及び方法
ゲノムDNAの調製：二重耐性細胞クローンからのゲノムDNA(gDNA)を、ZR-96 Genomic DNA Kit(登録商標)(Zymo Research)を製造業者の推奨に従って用いて調製する。
【００７９】
PCRプライマーの設計：本実施例(ヒトRAG1遺伝子座)では、PCRプライマーを以下のルールに従い、図８のパネルＡに示されたとおりに選択する。フォワードプライマーは、異種配列(すなわち、相同性アーム間)に位置する。例えば、フォワードPCRプライマーは、GOIの転写を終止させるBGH polyA配列(配列番号22)中に位置する。リバースPCRプライマーはRAG1遺伝子座内であるが右相同性アーム外に位置する。したがって、PCR増幅は、特定の標的化組込みが生じるときにのみ、可能である。更に、この組合せのプライマーは、組み込まれるべきGOIとは独立に、標的化された事象のスクリーニングに使用することができる。
F_HS1_PCRsc：GGAGGATTGGGAAGACAATAGC    (配列番号47)
R_HS1_PCRSC：CTTTCACAGTCCTGTACATCTTGT  (配列番号48)
【００８０】
PCR条件：PCR反応は、最終容量25μl中５μlのgDNAについて、0.25μMの各プライマー、10μMのdNTP及び0.5μlのHerculase II FusionDNA polymerase(Stratagene)を用いて行う。
【表５】
2013520165.tif 000006
【００８１】
結果
ヒトRAG1系における標的化された事象についてのPCRスクリーニングプロセスの例を図８に示す。パネルＡには、標的化された組込み後のRAG1遺伝子座の概略図を、スクリーニングPCRプライマーの位置及び予測されるバンドサイズと共に示す。パネルＢ及びＣには、上記のプロセスにより取得したG418R-GCVR標的化細胞クローンからのgDNAについてのPCRスクリーニングの結果を示す。二重耐性クローンは96-ウェルプレートに再配置されている。数日の培養後、96-ウェルプレートを複製し、複製の一方はgDNA調製に使用し、他方の対応する96-ウェルプレートは培養で維持する。gDNAをPCR増幅に供し、10μlのPCR反応物を0.8％アガロースゲルにロードし、電気泳動に供する。泳動後、PCRポジティブクローンを同定するために、ゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光に露光させる。パネルＢで、我々は、96のうち、特異的なDNAバンドが現れる８クローンを同定した。このことは、成功率が8.3％であることを表す。パネルＣでは、96のうち20クローンが同定される。成功率は20.8％である。
【００８２】
PCRによるこの分子スクリーニングに従って、種々のヒト細胞株のhsRAG1遺伝子座中への標的化された組込み(このための具体的プロトコールを開発した(3.1章〜3.7章を参照))の結果を表Ｖに要約する。特異的な標的化組込みのレベルは、７％〜44％であり、cGPSカスタム系の有効性が証明される。このことは、本発明が任意の種類の細胞株(接着性、懸濁、初代細胞株)に適用し得ることを示している。
【００８３】
【表６】
2013520165.tif 000007
表Ｖ：種々の細胞株における標的化組込みの要約
これらポジティブクローンを更に特徴付けるために、培養で維持される対応するウェルからの細胞を、個々に、96-ウェルプレート形式から10cm培養皿形式に拡張させる。
【００８４】
3.9  分子特徴付け(サザンブロット)
二重耐性クローンにおける正確な標的化挿入は、サザンブロット分析により分子レベルで容易に同定することができる(図９)。
材料及び方法
標的化クローンからのgDNAを、107細胞(10cm培養皿でのほぼコンフルーエント程度)からBlood and Cell culture DNA midi kit(Qiagen)を用いて精製した。５〜10μgのgDNAを、10倍過剰の制限酵素で、一晩のインキュベーションにより消化する(ここでは、HindIII又はEcoRV制限酵素)。消化したgDNAを0.8％アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上に移す。次いで、ナイロンメンブレンを、ネオマイシン遺伝子又は3'相同性アームの外側に位置するRAG1特異的配列に特異的な32P DNAプローブを用いて探索する(図９のパネルＤ及びＥ)。適切な洗浄後、オートラジオグラフィーによりプローブの特異的ハイブリダイゼーションを明らかにする(図９のパネルＡ〜Ｃ)。
【００８５】
結果
ここに提示した実施例で、我々は、異なる表現型(パネルＡの上部に示す)を有するG418Rクローンのハイブリダイゼーションパターンを比較した。G418R-PCR+細胞クローンからの10のGCVR及び６つのGCVS標的化細胞クローンを分析し、G418R-PCR-表現型からの４つのG418R細胞クローンもサザンブロッティングで特徴付けた。これらクローンからのgDNAをHindIII制限酵素(パネルＡ及びＣ)又はEcoRV(パネルＢ)で消化し、RAG1ゲノムプローブ(パネルＡ)又はネオマイシンプローブ(パネルＢ及びＣ)とハイブリダイズさせた。RAG1標的化遺伝子座の概略図及び制限酵素消化に応じた予想バンドサイズ及び及び使用したプローブをパネルＤに示す。全てのG418R-GCVR-PCR+クローンは、アイソジェニック(単コピー)組込みという当初の予測に一致する分子遺伝学的パターンを示す。パネルＡでは、RAG1ゲノムプローブを使用したので、標的化されていないRAG1対立遺伝子の１つに対応する5.2kbに別のバンドが現れた。このバンドはまた、ネガティブコントロール(C-：非トランスフェクトHEK293細胞)並びにG418R-GCVS-PCRポジティブ及びネガティブクローンにも存在する。これら結果は、全てのG418R-GCVR-PCR+クローンについて、ヒトRAG1遺伝子座の１つの対立遺伝子がメガヌクレアーゼ誘導相同組換えにより標的化されたことを証明している。
【００８６】
対照的に、G418R-GCVS-PCR-クローンは、標的化された事象を示唆する特異的なバンドを示さない。ネオマイシンプローブで特異的バンドは得られるが、そのサイズは予想サイズと一致しない。これらクローンは、宿主ゲノムへの組込みマトリクスのランダム組込みに起因する。HSV TKのような対抗選択マーカーとそのGCV活性プロドラッグとの使用により、このような望まない事象の排除が可能になる。
加えて、G418R-GCVS-PCR+クローンは、G418R-GCVR-PCR+ポジティブクローンとは僅かに異なる遺伝子パターンを示す。事実、G418R-GCVS-PCR+ポジティブクローンは、パネルＥに示された多コピー標的化組込みと矛盾しないパターンを示す。多コピー標的化組込みは、HSV TK遺伝子(組込みマトリクスのプラスミドDNA骨格に由来)の組込みが関与し、したがって細胞をGCVに対して感受性にする。
【００８７】
本実施例で提示した全てのデータによって、頑強な選択プロセスと組み合わせたカスタムメガヌクレアーゼ誘導遺伝子標的化技術の使用が、標的化された事象の効率的な同定を導くことが証明される。このような標的化された事象は、開発された頑強な対抗選択プロセスを介して弁別することができる単コピー-又は多コピー-標的化組込みのいずれかであり得る。類似する様式で、この対抗選択プロセスはまた、染色体にランダム-関連組込みを有する細胞クローンの排斥を可能にする。
【００８８】
実施例４：GOI発現及び安定性
4.1  ルシフェラーゼ発現
本実施例では、本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する４つの標的化クローンの発現レベルをモニターした。ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子(配列番号40)をpIM-RAG1-MCS(配列番号45)にクローニングした。得られるベクター(pIM-RAG1-Luc, 配列番号46)を、実施例３に記載のプロトコルに従ってHEK293細胞にトランスフェクトした。実施例３に記載された選択及び対抗選択プロセスを生き残る標的化細胞クローンを、3.7章及び3.8章に従って単離し、特徴付ける。
４つのHEK293ルシフェラーゼ-標的化クローンを20継代にわたって培養で維持した(週あたり２継代)。各クローンを選択薬(G418：0.4mg/ml)の存在下で培養した。更に、本発明者らは、レポーター遺伝子の発現を同じクローンについて選択薬なし(すなわち、完全DMEM培地中)で20継代に相当する期間にわたって評価した。
【００８９】
材料及び方法
ルシフェラーゼ発現：標的化クローンからの細胞をPBS中で２回洗浄し、その後５mlのトリプシン-EDTA溶液とインキュベートする。37℃にて５分間のインキュベーション後、細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。
次いで、細胞を完全DMEM培地中に50,000細胞/mlの密度で再懸濁する。100μl(5,000細胞)を白色96-ウェルプレート(Perkin-Elmer)に３連で小分けする。ウェルあたり100μlのOne-Glo試薬(Promega)を加え、短いインキュベーションの後、プレートをマイクロプレートルミノメータ(Viktor, Perkin-Elmer)で読み取ることができる。
【００９０】
結果
データを図10に示す。パネルＡ及びＢには、４つのルシフェラーゼ標的化クローンについての平均ルシフェラーゼ発現レベルを、選択剤の存在下又は不在下のそれぞれで時間の関数として示す。これらデータは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が、長期間の培養後でさえ顕著に安定であることを示す。更に、選択剤の存在は、導入遺伝子の長期持続性発現の確保に必須ではない。なぜならば、レポーター発現の安定性は、標的化クローンが選択剤なしで培養されたときも変わらないからである。
【００９１】
4.2  GFP発現及び安定性
本実施例では、本発明者らは、Aequorea macrodactyla由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子(TagGFP2 Evrogen 配列番号49)を発現する標的化クローンの発現レベルをモニターした。TagGFP2レポーター遺伝子(配列番号49)を、pIM-RAG1-MCS(配列番号45)、pIM.RAG1.EFIa.MCS(配列番号50)及びpIM.RAG1.GAS5.MCS(配列番号51)にクローニングした。得られるベクター(pIM-RAG1-TagGFP2, 配列番号52、pIM.RAG1.EF1a.TagGFP2, 配列番号53及びpIM.RAG1.GAS5.TagGFP2, 配列番号54)を、実施例3.1に記載のプロトコルに従ってHEK293細胞にトランスフェクトした。実施例３に記載の選択及び対抗選択プロセスを生き残った標的化細胞クローンを、3.7章及び3.8章に従って単離し、特徴付ける。
３つの構築物の各々からの１つのHEK293 TagGFP2-標的化クローンを20継代にわたって培養で維持した(週あたり２継代)。選択圧は発現維持に必須ではないことが示された(4.1章を参照)ので、各クローンを選択薬(G418)の不在下で培養した。
【００９２】
材料及び方法
Tag2GFP発現：標的化クローンからの細胞をPBS中で２回洗浄し、その後５mlのトリプシン-EDTA溶液とインキュベートする。37℃にて５分間のインキュベーション後、細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。
次いで、細胞を完全DMEM培地中に50,000細胞/mlの密度で再懸濁する。次いで、細胞サンプルを、MACSQuantデバイス(Miltenyi Biotec)を用いるフローサイトメトリにより分析する。蛍光を緑色チャンネルを用いて集光し、平均蛍光単位として表す。
【００９３】
結果
データを図11に示す。３つの異なるTagGFP2標的化クローンについてのTagGFP発現の平均蛍光レベルを時間の関数として示す。これらデータは、３つの異なるプロモーターの制御下でのTagGFP2レポーター遺伝子の発現が、選択剤の不在下でさえ、長期間(10週間)の培養後にも顕著に安定であることを示す。
プロモーター配列に応じて、平均蛍光レベルは変動する。EF1aプロモーターは最も強いTagGFP2発現をもたらす一方、GAS5プロモーターはより弱い発現をもたらす。この結果は、TagGFP2発現が、異なるプロモーターの使用によって変調され得ることを示す。
【００９４】
4.3  融合タンパク質発現
実施例５：標的化された組込みによる遺伝子不活化(ノックアウト)
本実施例では、本発明者らは、RAG1遺伝子座が、ｉ)ネオマイシン耐性遺伝子を有するRAG1組込みマトリクス(pIM-RAG1-Luc, 配列番号46)及びii)ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するRAG1組込みマトリクス(pIM-RAG1-Hygro, 配列番号55)の逐次のhs RAG1メガヌクレアーゼ-駆動標的化組込みにより崩壊した証拠を示す。
【００９５】
材料及び方法
HCT 116細胞を3.3章に記載のプロトコルに従ってトランスフェクトした。NeoR-GCVR耐性クローンを3.8章に記載したPCRによりスクリーニングした。NeoR-GCVR-PCR+クローンをサザンブロットにより分析した(3.9章を参照)。RAG1対立遺伝子の１つについて同定した標的化クローンのうち、１つのクローン(D12)を選択し、拡大させた。このクローンについて、第２の標的化実験を、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するRAG1組込みマトリクス(配列番号55)を使用したことを除いて3.3章に記載されたように行った。結果として、クローンの選択は、ネオマイシンの代わりにハイグロマイシン(0.6mg/ml)に基づいた。3.8章及び3.9章に記載のように、HygroRクローンをPCRによりスクリーニングし、PCRポジティブクローンをサザンブロットにより分析した。
【００９６】
結果
図12の左パネルに、第１の標的化実験後に得られたneoR-GCVR-PCR+クローンのハイブリダイゼーションパターンを示す。ハイブリダイゼーションは、ゲノムDNAのHindIII消化後に、ゲノムプローブで行う(図９参照)。コントロールレーン(HCT 116)に示されるように、非標的化RAG1遺伝子座は5.2kbバンドで同定される。このバンドは、全ての標的化クローンに、第２のバンド(9.6kb)に加えて存在する。このことにより、RAG1遺伝子の一方の対立遺伝子は標的化されている(Ｔ)が、他方の対立遺伝子は野生型(WT)であることが示される。これらクローンの１つ(クローンD12、黒星印で示す)を、第２のRAG1対立遺伝子の標的化を目的とする第２の実験に使用した。ハイブリダイゼーションパターンを図12の右パネルに示す。再び、ハイブリダイゼーションは、ゲノムDNAのHindIII消化後に、ゲノムプローブで行う(図９参照)。全ての標的化クローンで、5.2kb WTバンドはもはや見えない。事実、組込みマトリクスに存在する異種配列の標的化された組込みに特異的な9.6kbの独特なバンドは、２つを除いて全てのクローンで観察される。これら結果は、RAG1対立遺伝子が共に崩壊してRAG1遺伝子の完全な不活化が導かれたことを証明する。遺伝子不活化のためのこの逐次アプローチは、他のメガヌクレアーゼを用いて他の遺伝子座に適用することも可能である。
【００９７】
参考文献
【表７−１】
2013520165.tif 000008
【表７−２】
2013520165.tif 000009
【表７−３】
2013520165.tif 000010
【図１】
2013520165.tif 000011
【図２】
2013520165.tif 000012
【図３】
2013520165.tif 000013
【図４】
2013520165.tif 000014
【図５】
2013520165.tif 000015
【図６】
2013520165.tif 000016
【図７】
2013520165.tif 000017
【図８】
2013520165.tif 000018
【図９】
2013520165.tif 000019
【図１０】
2013520165.tif 000020
【図１１】
2013520165.tif 000021
【図１２】
2013520165.tif 000022
【配列表】
2013520165000001.app
【国際調査報告】
2013520165.tif 000023
2013520165.tif 000024
2013520165.tif 000025