(57)【要約】  本発明は、カリシウイルスキャプシドタンパク質と１つ以上の異種抗原配列とを含む粒子形成キメラタンパク質を提供する。特定的には、本発明は、修飾キャプシドタンパク質が宿主細胞内で発現されたときにウイルス様粒子形成能を維持するように内部位置に融合された異種エピトープを含有する工学操作されたカリシウイルスキャプシドタンパク質配列を開示する。キメラタンパク質を含むウイルス様粒子およびワクチン製剤も記述する。【選択図】図１４【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ２ドメインを有するカリシウイルスキャプシドタンパク質と少なくとも１つの異種抗原またはその断片とを含むキメラタンパク質であって、前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の前記Ｐ２ドメイン中に挿入され、かつ前記キメラタンパク質が宿主細胞内で発現されたときにウイルス様粒子を形成可能である、キメラタンパク質。
【請求項２】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記Ｐ２ドメインの少なくとも１つの溶媒露出ループ中に挿入される、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸と置き換えられる、請求項２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の約２〜約５０アミノ酸と置き換えられる、請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の約４〜約２０アミノ酸と置き換えられる、請求項４に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の約５アミノ酸と置き換えられる、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記カリシウイルスがノロウイルスである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記キャプシドタンパク質がＶＰ１である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記キャプシドタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が、配列番号１中の２９５位のアスパラギン残基、２９６位のグリシン残基、３０８位のプロリン残基、３３６位のグリシン残基、３３８位のセリン残基、３６２位のアスパラギン残基、３６３位のグリシン残基、３８２位のプロリン残基、３８３位のセリン残基、３９９位のイソロイシン残基、または４０２位のアラニン残基の後に直接挿入される、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が、配列番号１中のアミノ酸２９４〜２９８、アミノ酸３０７〜３１１、アミノ酸３３７〜３４１、アミノ酸３６２〜３６６、アミノ酸３８１〜３８５、またはアミノ酸４０１〜４０５と置き換えられる、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記キャプシドタンパク質がノロウイルスの２つ以上の流行株に由来する複合キャプシドタンパク質である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記複合キャプシドタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記ノロウイルスが遺伝子群Iまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスである、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記ノロウイルスが遺伝子群Ｉ遺伝子型Ｉのノロウイルスまたは遺伝子群ＩＩ遺伝子型４のノロウイルスである、請求項１４に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が約５〜約７０アミノ酸長である、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が抗原エピトープを含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が、ウイルス、細菌、真核病原体、腫瘍関連抗原、またはアレルゲンに由来する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、およびメタニューモウイルスよりなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項１８に記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
請求項１に記載のキメラタンパク質を含むウイルス様粒子。
【請求項２１】
請求項２０に記載のウイルス様粒子を含むワクチン製剤。
【請求項２２】
アジュバントをさらに含む、請求項２１に記載のワクチン製剤。
【請求項２３】
請求項１に記載のキメラタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１に記載のキメラタンパク質を宿主細胞内で発現することと、
ウイルス様粒子が形成される条件で前記宿主細胞を増殖させることと、
を含む、キメラウイルス様粒子の作製方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記Ｐ２ドメインの少なくとも１つの溶媒露出ループに融合される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸と置き換えられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の１〜約５０アミノ酸と置き換えられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の約４〜約２０アミノ酸と置き換えられる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記キャプシドタンパク質の約５アミノ酸と置き換えられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が約５〜約７０アミノ酸長である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が抗原エピトープを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記カリシウイルスがノロウイルスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ノロウイルスが遺伝子群Iまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ノロウイルスが遺伝子群Ｉ遺伝子型Ｉのノロウイルスまたは遺伝子群ＩＩ遺伝子型４のノロウイルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２１に記載のワクチン製剤を被験者に投与することを含む、外来因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片が前記外来因子由来のタンパク質に由来する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月２１日出願の米国仮特許出願第６１／２９７，１０９号（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に基づく利益を請求する。
【０００２】
電子申請テキストファイルに関する記述
添付の電子申請テキストファイル、すなわち、配列リストのコンピューター可読形式コピー（ファイル名:LIG0_023_01 WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１１年１月２１日、ファイルサイズ２０キロバイト）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ウイルス学、分子生物学、およびワクチン開発の分野に関する。特に、本発明は、修飾キャプシドタンパク質から生成されるウイルス様粒子の表面上に異種抗原エピトープを提示できるように、異種抗原エピトープをタンパク質配列中に挿入するように修飾することができるカリシウイルスキャプシドタンパク質に関する。そのような修飾キャプシドタンパク質およびウイルス様粒子は、ワクチン製剤に有用である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
多くの現在のワクチンでは、病原体に対する防御免疫応答を誘導するために弱毒化微生物が利用される。これらのタイプのワクチンは、典型的には、強力な免疫応答を生じるが、病原性微生物に戻る可能性があるので感染の潜在的リスクが存在し、したがって、これらのワクチンは、いくつかの患者集団では禁忌となることもある。組換え抗原を利用した他のワクチンでは、感染のリスクは回避されるが、一般的には、弱毒化生ワクチンよりも弱い免疫応答を生じる。組換え抗原によるそのような弱い免疫応答は、免疫系への抗原提示が効果的でないためと考えられる。したがって、自然感染時に起こる免疫系への抗原提示をより良好に模倣しうるワクチンプラットフォームが必要とされる。
【０００５】
近年、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または偽ビリオンは、効果的な免疫応答を誘導する抗原を提示するために使用されてきている。ＶＬＰおよび偽ビリオンは、構造的には天然に存在する感染性粒子に類似していているが、複製に必要なウイルス遺伝情報を含有していない。ＶＬＰ上または偽ビリオン上に提示される抗原に対する免疫応答は、典型的には、可溶性抗原に対する応答よりもかなり大きい。ＶＬＰは、免疫系に抗原を効果的に提示するのに有用なプラットフォームであるにように思われるが、ＶＬＰの効率的産生は、いくつかのウイルスでは達成困難であることが判明している。さらにまた、ウイルスキャプシドタンパク質配列の操作およびウイルス粒子中への外来抗原タンパク質または断片の組込みにより、多くの場合、インタクトＶＬＰの効率的生成が排除または低減される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、弱毒化生ワクチンに付随するリスクを伴うことなく免疫系に抗原を効果的に提示する実用性のある安全なワクチンプラットフォームを開発することが当技術分野で依然として必要とされている。さらにまた、対象となる任意の抗原またはさまざまな病原性生物に由来する複数の抗原を容易に組み込むことが可能なワクチンプラットフォームが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、一部には、キャプシドタンパク質がＶＬＰ形成能を維持するように異種抗原エピトープをカリシウイルスのキャプシドタンパク質中に挿入可能であるという発見に基づく。したがって、本発明は、カリシウイルスキャプシドタンパク質と少なくとも１つの異種抗原またはその断片とを含むキメラタンパク質を提供する。ただし、このキメラタンパク質は、宿主細胞内で発現されたときにＶＬＰを形成可能である。一実施形態では、少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、カリシウイルスキャプシドタンパク質のＰ２ドメイン中に挿入される。他の実施形態では、少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、カリシウイルスキャプシドタンパク質のＰ２ドメインの１つ以上の溶媒露出ループ中に挿入される。カリシウイルスは、たとえば、ノロウイルス、サポウイルス、ラゴウイルス、またはベシウイルスでありうる。
【０００８】
異種抗原またはその断片は、キャプシド配列からいずれのアミノ酸も欠失させることなくカリシウイルスキャプシド配列のアミノ酸配列中に直接挿入可能である。あるいは、異種抗原または断片は、カリシウイルスキャプシドタンパク質の１つ以上の残基と置き換わる。異種抗原は、ウイルス、細菌、および真核病原体などの種々の病原体に由来しうる。いくつかの実施形態では、異種抗原は、腫瘍関連抗原またはアレルゲンに由来しうる。異種抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞を刺激するエピトープでありうる。
【０００９】
本発明はまた、本発明のキメラキャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子、さらには新規なキメラキャプシドタンパク質をコードする単離された核酸およびベクターを包含する。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、ノロウイルスに由来するキャプシドタンパク質と少なくとも１つの異種抗原またはその断片とを含む。ノロウイルスは、たとえば、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスでありうる。
【００１０】
本発明は、本発明のキメラタンパク質を含有するウイルス様粒子を含むワクチン製剤を提供する。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤はさらに、アジュバントを含む。ワクチン製剤は、液状製剤または乾燥粉末製剤でありうる。本明細書に記載のワクチン製剤を投与することにより外来因子に対する免疫応答を誘導する方法も、本発明に包含される。
【００１１】
本発明はまた、キメラウイルス様粒子の作製方法を包含する。一実施形態では、この方法は、宿主細胞内で本明細書に記載のキメラタンパク質を発現することと、ウイルス様粒子が形成される条件で宿主細胞を増殖することと、を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＧＩ．１ノロウイルスNorwalk  ＶＰ１サブユニット中の溶媒接触（solvent-accessible）Ｐ２ドメインループ。ＧＩ．１  Norwalk  ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）。Ｐ２ドメイン残基は灰色で陰影付けされ、一方、このドメイン内の溶媒接触ループ残基は下線付き太字で示される。
【図１Ｂ】ノロウイルスＧＩＩ．４コンセンサスＶＰ１サブユニット中の溶媒接触Ｐ２ドメインループ。ＧＩＩ．４コンセンサスＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）。Ｐ２ドメイン残基は灰色で陰影付けされ、一方、このドメイン内の溶媒接触ループ残基は下線付き太字で示される。
【図２】同定された溶媒接触Ｐ２ドメインループが強調表示されたノロウイルスＧＩＩ．４コンセンサスＶＰ１サブユニットの構造モデル。
【図３Ａ】テンプレートとしてNorwalk  ＶＰ１原子構造を用いたサポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1サブユニットの構造モデル。
【図３Ｂ】テンプレートとしてＳＭＳＶ  ＶＰ１原子構造を用いたサポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1サブユニットの構造モデル。
【図４Ａ】テンプレートとしてNorwalk  ＶＰ１原子構造を用いたサポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1サブユニット中の溶媒接触Ｐ２ドメインループ。サポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）。Norwalk  ＶＰ１テンプレートに基づいて、Ｐ２ドメイン残基は灰色で陰影付けされ、一方、このドメイン内の溶媒接触ループ残基は下線付き太字で示される。
【図４Ｂ】テンプレートとしてＳＭＳＶ  ＶＰ１原子構造を用いたサポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1サブユニット中の溶媒接触Ｐ２ドメインループ。サポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）。ＳＭＳＶ  ＶＰ１テンプレートに基づいて、Ｐ２ドメイン残基は灰色で陰影付けされ、一方、このドメイン内の溶媒接触ループ残基は下線付き太字で示される。
【図５】ノロウイルスNorwalk（配列番号１）およびベシウイルスSan Miguelアシカ（ＳＭＳＶ；配列番号４）のＶＰ１キャプシドタンパク質間のアミノ酸配列アライメント。アステリスクは同一残基を表し、コロンは保存的置換を表し、ピリオドは半保存的置換を表し、かつ空白スペースは非保存的置換を表す。
【図６】ノロウイルスＧＩ．１  Norwalk  ＶＰ１サブユニット中の外来エピトープの残基置換え部位および残基挿入部位（強調表示）。
【図７】キメラNorwalk  ＶＬＰのエピトープ挿入部位および部分的置換え部位。インフルエンザ赤血球凝集素抗原に由来する９アミノ酸のエピトープ（配列番号５）をNorwalk  ＶＰ１タンパク質配列中の指定のアミノ酸残基の直後に挿入したかまたは指定の残基と置き換えた。
【図８】キメラNorwalk  ＶＬＰ産生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。インフルエンザ赤血球凝集素抗原に由来する９アミノ酸のエピトープをNorwalk  ＶＰ１タンパク質配列中のアミノ酸残基３６２または２９６の直後に挿入した。ウイルス様粒子を修飾ＶＰ１配列から生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。レーン１、分子量標準;レーン２、３６２挿入の遠心分離後の上清;レーン３、３６２の遠心分離ペレット画分；レーン４、３６２挿入の濾液；レーン５、２９６挿入の遠心分離後の上清；レーン６、２９６の遠心分離ペレット画分；およびレーン７、２９６挿入の濾液。約５７ｋＤａのタンパク質バンドは、キメラNorwalk  ＶＰ１タンパク質を表す。
【図９】キメラNorwalk  ＶＬＰ産生のウェスタンブロット解析。赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープを含有するキメラＶＬＰのウェスタンブロットを抗Norwalk抗体（左側パネル）または抗ＨＡ抗体（右側パネル）でプローブした。レーン１、分子量標準;レーン２、ＶＰ１残基３３６にＨＡエピトープ挿入を有するキメラＶＬＰ；レーン３、ＶＰ１残基３３７〜３４１のＨＡエピトープ置換えを有するキメラＶＬＰ；およびレーン４、野生型Norwalk  ＶＰ１。約５７ｋＤａのタンパク質バンドは、キメラNorwalk  ＶＰ1タンパク質を表す。
【図１０】連続流遠心分離（ＣＦＣ）によるキメラNorwalk  ＶＬＰの精製。アステリスクはインタクトキメラNorwalk  ＶＬＰを表す。
【図１１】サイズ排除クロマトグラフィーによるキメラノロウイルスＶＬＰの解析。赤色トレース  −  ２２０ｎｍの吸収；青色トレース  −  ２８０ｎｍの吸収。
【図１２】電子顕微鏡法によるキメラノロウイルスＶＬＰの解析。
【図１３】連続流遠心分離（ＣＦＣ）によるキメラNorwalk  ＶＬＰ（２９残基のＲＳＶ−Ｆタンパク質エピトープを含有する）の精製。アステリスクはインタクトキメラNorwalk  ＶＬＰを表す。
【図１４】電子顕微鏡法によるキメラノロウイルスＶＬＰ（２９残基のRSV-Fタンパク質エピトープを含有する）の解析。
【図１５】血清希釈の関数としてのＯＤの増加倍率。ここでは、６匹の動物のうち２匹が抗ＲＳＶ−Ｆ  ＩｇＧ抗体の4倍超の増加を示した。
【図１６】２つの修飾表面ループを含有するキメラNorwalk  ＶＬＰ産生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ＲＳＶ−Ｆ抗原に由来する９アミノ酸のエピトープを残基３３８および３６３に同時に挿入したか、または残基３３７〜３４１と置き換えかつ同時に残基３６３に挿入した。ウイルス様粒子を修飾ＶＰ１配列から生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。レーン１、分子量標準；レーン２、３３８および３６３挿入の遠心分離後の上清；レーン３、３３８および３６３挿入の遠心分離ペレット画分；レーン４、３３８および３６３挿入の濾液；レーン５、３３７〜３４１置換えかつ３６３挿入の遠心分離後の上清；レーン６、３３７〜３４１置換えかつ３６３挿入の遠心分離ペレット画分;およびレーン7、３３７〜３４１置換えかつ３６３挿入の濾液。約５７ｋＤａのタンパク質バンドは、キメラNorwalk  ＶＰ１タンパク質を表す。
【図１７】ＨＡタンパク質配列をNorwalk  ＶＰ１タンパク質のアミノ酸３３８および３３９の間に挿入したか、またはＶＰ１のアミノ酸３３７〜３４１と置き換えた。０日目および７日目にアジュバントを用いずにＨＡ−ＮＶＬＰを腹腔内投与した。１４日目に血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗原特異的ＩｇＭの存在に関して解析した。群の幾何平均を表す水平バーと共に個別の結果を示す。
【図１８】図１７のマウスに３７日目にＡｌＯＨ／ＭＰＬと共に製剤化されたＨＡ−ＮＶＬＰの追加免疫を施した。６４日目に血清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＨＡ特異的ＩｇＧの存在に関して解析した。群の幾何平均を表す水平バーと共に個別の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、キャプシドタンパク質がＶＬＰ形成能を維持するように異種ペプチドをカリシウイルスキャプシドタンパク質の特定の溶媒露出（solvent-exposed）領域中に挿入可能であるという発見に基づく。本発明者らは、修飾キャプシドタンパク質から形成されるＶＬＰの表面上に１つ以上の異種抗原が効果的に提示されるようにカリシウイルスキャプシドタンパク質を工学操作する有効な戦略を開発した。したがって、本発明は、カリシウイルスに由来するキャプシドタンパク質と少なくとも１つの異種抗原またはその断片とを含む新規なキメラタンパク質を提供する。ただし、このキメラタンパク質は、宿主細胞内で発現されたときにＶＬＰを形成可能である。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「キメラタンパク質」とは、２つ以上の生物に由来するペプチドを含む融合タンパク質を意味する。２つ以上のペプチドは、それらのアミノ末端またはカルボキシ末端で融合可能である。あるいは、１つ以上のペプチドは、他のペプチド中の内部位置で融合可能である。好ましくは、本発明のキメラタンパク質は、カリシウイルスに由来するキャプシドタンパク質またはその一部分を含む。カリシウイルスまたはカリシウイルス科（Caliciviridae）は、ベシウイルス属、ノロウイルス属、ラゴウイルス属、およびサポウイルス属を包含する。本発明のキメラタンパク質のキャプシドタンパク質は、これらの４つの属のいずれかのキャプシドタンパク質に由来しうる。たとえば、いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ベシウイルスのSan Miguelアシカウイルスに由来する。一実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４で示される配列を有する。
【００１５】
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ノロウイルスに由来する。ノロウイルス属は、５つの遺伝子群（ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、およびＧＶ）に分類される。ＧＩ、ＧＩＩ、およびＧＩＶのノロウイルスは、ヒトで感染性であり、一方、ＧＩＩＩのノロウイルスは、主にウシ科動物種に感染する。ＧＶは、最近、マウスから単離された（Zheng et al. (2006) Virology, Vol 346: 312-323）。ＧＩＩＩの代表は、Jena株およびNewbury株であり、一方、Alphatron株、Fort Lauderdale株、およびSaint Cloud株は、ＧＩＶの代表である。ＧＩおよびＧＩＩの群は、遺伝子分類に基づいて遺伝子クラスターまたは遺伝子型にさらに細分可能である（Ando et al. (2000) J. Infectious Diseases, Vol. 181(Supp2):S336-S348; Lindell et al. (2005) J. Clin. Microbial., Vol. 43(3): 1086-1092）。本明細書で用いられる場合、遺伝子クラスターという用語は、遺伝子型という用語と同義的に用いられる。遺伝子群I内には、これまでに知られている８つのＧＩクラスター（プロトタイプウイルス株名で）、すなわち、GI.1 (Norwalk (NV-USA93))、GI.2 (Southhampton (SOV-GBR93))、GI.3 (Desert Shield (DSV-USA93))、GI.4 (Cruise Ship virus/Chiba (Chiba-JPN00))、GI.5 (318/Musgrove (Musgrov-GBR00))、GI.6 (Hesse (Hesse-DEU98))、GI.7 (Wnchest-GBR00)、およびGI.8 (Boxer-USA02)が存在する。遺伝子群ＩＩ内には、これまでに知られている１９のＧＩＩクラスター（プロトタイプウイルス株名で）、すなわち、GII.1 (Hawaii (Hawaii-USA94))、GII.2 (Snow Mountain/Melksham (Msham-GBR95))、GII.3 (Toronto (Toronto-CAN93))、GII.4 (Bristol/Lordsdale (Bristol-GBR93))、GII.5 (290/Hillingdon (Hilingd-GBR00))、GII.6 (269/Seacroft (Seacrof-GBR00))、GII.7 (273/Leeds (Leeds-GBR00))、GII.8 (539/Amsterdam (Amstdam-NLD99))、GII.9 (378 (VABeach-USA01))、GII.10 (Erfurt-DEU01)、GII.11 (SW9180JPN01)、GII.12 (Wortley-GBR00)、GII.13 (Faytvil-USA02)、GII.14 (M7-USA03)、GII.15 (J23-USA02)、GII.16 (Tiffin-USA03)、GII.17 (CSE1-USA03)、GII.18 (QW101/2003/US)、およびGII.19 (QW170/2003/US)が存在する。一実施形態では、キャプシドタンパク質は、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスに由来する。他の実施形態では、キャプシドタンパク質は、遺伝子群Ｉの遺伝子型１（ＧＩ．１）または遺伝子群ＩＩの遺伝子型４（ＧＩＩ．４）のノロウイルスに由来する。
【００１６】
好ましくは、本発明のキメラタンパク質中に組み込まれるノロウイルスキャプシドタンパク質は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２によりコードされる主要キャプシドタンパク質ＶＰ１である。一実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。新規なキメラタンパク質のキャプシドタンパク質成分は、公知のノロウイルス株のいずれかの主要キャプシドタンパク質に由来しうる。たとえば、次のGenBank登録を参照されたい：ノロウイルス遺伝子群１の株Hu/NoV/West Chester/2001/USA, GenBank受託番号AY502016、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA, GenBank受託番号AY502015、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV /Fayette/1999/USA, GenBank受託番号AY502014、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Fairfield/1999/USA, GenBank受託番号AY502013、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Sandusky/1999/USA, GenBank受託番号AY502012、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Canton/1999/USA, GenBank受託番号AY502011、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Tiffin/1999/USA, GenBank受託番号AY502010、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/CS-E1/2002/USA, GenBank受託番号AY50200、ノロウイルス遺伝子群１の株Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA, GenBank受託番号AY502008、ノロウイルス遺伝子群１の株Hu/NoV/CS-841/2001/USA, GenBank受託番号AY502007、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Hiram/2000/USA, GenBank受託番号AY502006、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Tontogany/1999/USA, GenBank受託番号AY502005、Norwalkウイルス, 完全ゲノム, GenBank受託番号NC.sub.--001959、ノロウイルスHu/GI/Otofuke/1979/JPゲノムRNA, 完全ゲノム, GenBank受託番号AB187514、ノロウイルスHu/Hokkaido/133/2003/JP, GenBank受託番号AB212306、ノロウイルスSydney 2212, GenBank受託番号AY588132、Norwalkウイルス株SN2000JA, GenBank受託番号AB190457、Lordsdaleウイルス完全ゲノム, GenBank受託番号X86557、Norwalk様ウイルスゲノムRNA, Gifu'96, GenBank受託番号AB045603、Norwalkウイルス株Vietnam 026, 完全ゲノム, GenBank受託番号AF504671、ノロウイルスHu/GII.4/2004/N/L, GenBank受託番号AY883096、ノロウイルスHu/GII/Hokushin/03/JP, GenBank受託番号AB195227、ノロウイルスHu/GII/Kamo/03/JP, GenBank受託番号AB195228、ノロウイルスHu/GII/Sinsiro/97/JP, GenBank受託番号AB195226、ノロウイルスHu/GII/Ina/02/JP, GenBank受託番号AB 195225、ノロウイルスHu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE, GenBank受託番号AY772730、ノロウイルスHu/NLV/Dresden174/pUS-NorII/1997/GE, GenBank受託番号AY741811、ノロウイルスHu/NLV /Oxford/B2S16/2002/UK, GenBank受託番号AY587989、ノロウイルスHu/NLV/Oxford/B4S7/2002/UK, GenBank受託番号AY587987、ノロウイルスHu/NLV/Witney/B7S2/2003/UK, GenBank受託番号AY588030、ノロウイルスHu/NLV /Banbury/B9S23/2003/UK, GenBank受託番号AY588029、ノロウイルスHu/NLV /ChippingNorton/2003/UK, GenBank受託番号AY588028、ノロウイルスHu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK, GenBank受託番号AY588027、ノロウイルスHu/NLV/Oxford/B8S5/2002/UK, GenBank受託番号AY588026、ノロウイルスHu/NLV /Oxford/B6S4/2003/UK, GenBank受託番号AY588025、ノロウイルスHu/NLV/Oxford/B6S5/2003/UK, GenBank受託番号AY588024、ノロウイルスHu/NLV /Oxford/B5S23/2003/UK, GenBank受託番号AY588023、ノロウイルスHu/NLV/Oxford/B6S2/2003/UK, GenBank受託番号AY588022、ノロウイルスHu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK, GenBank受託番号AY588021、Norwalk様ウイルス単離株Bo/Thirsk10/00/UK, GenBank受託番号AY126468、Norwalk様ウイルス単離株Bo/Penrith55/00IUK, GenBank受託番号AY126476、Norwalk様ウイルス単離株Bo/Aberystwyth24/00IUK, GenBank受託番号AY126475、Norwalk様ウイルス単離株Bo/Dumfries/94/UK, GenBank受託番号AY126474、ノロウイルスNLV /IF2036/2003/Iraq, GenBank受託番号AY675555、ノロウイルスNLV/IF1998/2003/Iraq, GenBank受託番号AY675554、ノロウイルスNLV /BUDS/2002/USA, GenBank受託番号AY660568、ノロウイルスNLV/Paris Island/2003/USA, GenBank受託番号AY652979、Snow Mountainウイルス, 完全ゲノム, GenBank受託番号AY134748、Norwalk様ウイルスNLV/Fort Lauderdale/560/1998/US, GenBank受託番号AF414426、Hu/Norovirus/hiroshima/1999/JP(9912-02F), GenBank受託番号AB044366、Norwalk様ウイルス株11MSU-MW, GenBank受託番号AY274820、Norwalk様ウイルス株B-1SVD, GenBank受託番号AY274819、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Fannington Hills/2002/USA, GenBank受託番号AY502023、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV /CS-G4/2002/USA, GenBank受託番号AY502022、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV /CS-G2/2002/USA, GenBank受託番号AY502021、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/CS-G12002/USA, GenBank受託番号AY502020、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Anchorage/2002/USA, GenBank受託番号AY502019、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN, GenBank受託番号AY502018、ノロウイルス遺伝子群２の株Hu/NoV/Gennanton/2002/USA, GenBank受託番号AY502017、ヒトカリシウイルスNLV/GII/Langen1061/2002/DE, 完全ゲノム, GenBank受託番号AY485642、ネズミノロウイルス1ポリタンパク質, GenBank受託番号AY228235、Norwalkウイルス, GenBank受託番号AB067536、ヒトカリシウイルスNLV /Mex7076/1999, GenBank受託番号AF542090、ヒトカリシウイルスNLV/Oberhausen 455/01/DE, GenBank受託番号AF539440、ヒトカリシウイルスNLV/Herzberg 385/01/DE, GenBank受託番号AF539439、ヒトカリシウイルスNLV/Boxer/2001/US, GenBank受託番号AF538679、Norwalk様ウイルスゲノムRNA, 完全ゲノム, GenBank受託番号AB081723、Norwalk様ウイルスゲノムRNA, 完全ゲノム, 単離株:Saitama U201, GenBank受託番号AB039782、Norwalk様ウイルスゲノムRNA, 完全ゲノム, 単離株:Saitama U18, GenBank受託番号AB039781、Norwalk様ウイルスゲノムRNA, 完全ゲノム, 単離株:Saitama U25, GenBank受託番号AB039780、Norwalkウイルス株:U25GII, GenBank受託番号AB067543、Norwalkウイルス株:U201 GII, GenBank受託番号AB067542、Norwalk様ウイルス株416/97003156/1996/LA, GenBank受託番号AF080559、Norwalk様ウイルス株408/97003012/1996/FL, GenBank受託番号AF080558、Norwalk様ウイルスNLV/Burwash Landing/331/1995/US, GenBank受託番号AF414425、Norwalk様ウイルスNLV/Miami Beach/326/1995/US, GenBank受託番号AF414424、Norwalk様ウイルスNLV/White River/290/1994/US, GenBank受託番号AF414423、Norwalk様ウイルスNLV /New Orleans/306/1994/US, GenBank受託番号AF414422、Norwalk様ウイルスNLV/Port Canaveral/30111994/US, GenBank受託番号AF414421、Norwalk様ウイルスNLV/Honolulu/314/1994/US, GenBank受託番号AF414420、Norwalk様ウイルスNLV/Richmond/283/1994/US, GenBank受託番号AF414419、Norwalk様ウイルスNLV/Westover/302/1994/US, GenBank受託番号AF414418、Norwalk様ウイルスNLV/UK3-17/12700/1992/GB, GenBank受託番号AF414417、Norwalk様ウイルスNLV/Miami/81/1986/US, GenBank受託番号AF414416、Snow Mountain株, GenBank受託番号U70059、Desert ShieldウイルスDSV395, GenBank受託番号U04469、Norwalkウイルス, 完全ゲノム, GenBank受託番号AF093797、Hawaiiカリシウイルス, GenBank受託番号U07611、Southamptonウイルス, GenBank受託番号L07418、Norwalkウイルス(SRSV-KY-89/89/J), GenBank受託番号L23828、Norwalkウイルス(SRSV-SMA/76/US), GenBank受託番号L23831、Camberwellウイルス, GenBank受託番号U46500、ヒトカリシウイルス株Melksham, GenBank受託番号X81879、ヒトカリシウイルス株MX, GenBank受託番号U22498、ミニレオウイルスTV24, GenBank受託番号U02030、およびNorwalk様ウイルスNLV/Gwynedd/273/1994/US, GenBank受託番号AF414409。これらのすべての配列（本出願の出願日までに登録されたもの）は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。このほかのノロウイルス配列は、次の公開特許に開示されている：国際公開第２００５／０３０８０６号、国際公開第２０００／７９２８０号、特開２００２−０２０３９９号、米国特許出願公開第２００３１２９５８８号、米国特許第６，５７２，８６２号、国際公開第１９９４／０５７００号、および国際公開第０５／０３２４５７号（これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）。また、配列比較ならびにノロウイルスの遺伝子多様性および系統発生的解析の考察のために、Green et al. (2000) J. Infect. Dis., Vol. 181(Suppl. 2):S322-330、Wang et al. (1994) J. Viral., Vol. 68:5982-5990、Chen et al. (2004) J. Viral., Vol. 78: 6469-6479、Chakravarty et al. (2005) J. Viral., Vol. 79: 554-568、Hansman et al. (2006) J. Gen. Viral., Vol. 87:909-919、Bullet et al. (2006) J. Clin. Micro., Vol. 44(2):327-333、Siebenga, et al. (2007) J. Viral., Vol. 81 (18):9932-9941、およびFankhauser et al. (1998) J. Infect. Dis., Vol. 178: 1571-1578も参照されたい。
【００１７】
他の実施形態では、キメラタンパク質のキャプシドタンパク質成分は、２つ以上のノロウイルス流行株に由来する複合キャプシドタンパク質である。２つ以上のノロウイルス流行株に由来するアミノ酸配列が組み込まれた複合キャプシドタンパク質配列は、２００９年８月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３２４９号（参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。一実施形態では、複合キャプシドタンパク質は、２つ以上の遺伝子群ＩＩ．４ノロウイルス流行株に由来する。特定の一実施形態では、複合キャプシドタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、サポウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含む。サポウイルス属はさらに、５つの異なる遺伝子群（ＧＩ〜ＧＶ）に分類可能である。キャプシドタンパク質は、５つの遺伝子群のいずれかのサポウイルスのＶＰ１キャプシドタンパク質に由来しうる。たとえば、いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、Sapporoウイルス、London/29845ウイルス、Hu/Yokohama16-4/2007/JPウイルス、Manchesterウイルス、Houston/86ウイルス、Houston/90ウイルス、およびParkvilleウイルスのキャプシドタンパク質に由来する。特定の一実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する。新規なキメラタンパク質のキャプシドタンパク質成分は、公知のサポウイルス株のいずれかの主要キャプシドタンパク質に由来しうる。たとえば、GenBank登録：サポウイルスMc10, GenBank受託番号NC.sub.--010624、サッポロウイルス, GenBank受託番号U65427、サポウイルスM10, GenBank受託番号AY237420、サポウイルスSaKaeo-15/Thailand, GenBank受託番号AY646855、Sapporoウイルス, GenBank受託番号NC.sub.--006269、サポウイルスC12, GenBank受託番号NC.sub.--006554、サポウイルスC12, GenBank受託番号AY603425、サポウイルスHu/Dresden/pJG-Sap01/DE, GenBank受託番号AY694184、ヒトカリシウイルスSLY /cruise ship/2000/USA, GenBank受託番号AY289804、ヒトカリシウイルスSLV/Arg39, GenBank受託番号AY289803、ブタ腸カリシウイルス株LL14, GenBank受託番号AY425671、ブタ腸カリシウイルス, GenBank受託番号NC.sub.--000940、ヒトカリシウイルス株Mc37, GenBank受託番号AY237415、ミンク腸カリシウイルス株Canada 151A, GenBank受託番号AYl44337、ヒトカリシウイルスSLV/Hou7-1181, GenBank受託番号AF435814、ヒトカリシウイルスSLV/Mex14917/2000, GenBank受託番号AF435813、ヒトカリシウイルスSLV/Mex340/1990, GenBank受託番号AF435812、ブタ腸カリシウイルス, GenBank受託番号AF182760、Sapporoウイルス-London/29845, GenBank受託番号U95645、Sapporoウイルス-Manchester, GenBank受託番号X86560、Sapporoウイルス-Houston/86, GenBank受託番号U95643、Sapporoウイルス-Houston/90, GenBank受託番号U95644、およびヒトカリシウイルス株HuCV/Potsdam/2000/DEU, GenBank受託番号AF294739。これらのすべての配列(本出願の出願日までに登録されたもの)は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。配列比較ならびにSapoウイルスの遺伝子多様性および系統発生的解析の考察のために、Schuffenecker et al. (200I) Arch Virol., Vol. I46(I1):2I15-2132; Zintz et al. (2005) Infect. Genet. Evol., Vol. 5:28I-290; Farkas et al. (2004) Arch. Virol., Vol. I49:1309-I323も参照されたい。
【００１９】
カリシウイルスの主要キャプシドタンパク質は、異なるドメイン、すなわち、シェル（shell）または「Ｓ」ドメインおよび突出ドメインまたは「Ｐ」ドメイン（これはＰ１およびＰ２ドメインにさらに細分される）で構成されている。キャプシド単量体の「Ｓ」ドメインは、合体してウイルスコートのシェルを形成し、一方、幹様Ｐ１ドメインおよび球状Ｐ２ドメインは、アーチ状構造をなしてシェルから外向きに突出する。カリシウイルス構造の特徴付けについては、Prasad et al. (2000) Journal of Infectious Diseases, Vol. 181: S317-S321を参照されたい。Ｐ２球状ドメインは、ウイルスキャプシドの表面上に位置しており、抗原決定基を含有しかつ宿主特異性を決定付けると考えられる（たとえば、Crisci et al. (2009) Virology, Vol. 387: 303-312、Kumar et al. (2007) Journal ofVirology, Vol. 81: 1119-1128、Katpally et al. (2008) Journal ofVirology, Vol. 82: 2079-2088を参照されたい）。Ｐ１ドメインおよびＰ２ドメインの一部分は、キャプシド構造を安定化させるのに必要とされる。本発明者らは、キャプシド構造を撹乱せずに異種抗原に由来するアミノ酸配列を挿入可能であるＰ２ドメインの特定の溶媒露出ループ領域を同定した（実施例１参照）。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、カリシウイルスキャプシドタンパク質のＰ２ドメイン中に挿入され、本発明のキメラタンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、カリシウイルスキャプシドのＰ２ドメインの少なくとも１つの溶媒露出ループ中に挿入される。本明細書で用いられる場合、「溶媒露出」または「溶媒接触」とは、単量体がその天然のコンフォメーションに折り畳まれて集合ＶＬＰの形態をとったときに、（疎水性コアやＶＬＰ内部やタンパク質間界面ではなく）キャプシド単量体の外側表面上に位置するアミノ酸残基を意味する。本発明者らは、本明細書に記載されるように配列アライメント、３Ｄ構造解析、および３Ｄ構造モデリングを利用して、カリシウイルスキャプシドタンパク質中のＰ２ドメインさらには溶媒露出ループドメインを同定した（実施例１参照）。類似の方法およびGeno3D2やSwiss PDB viewerなどのソフトウェアアプリケーションを本発明に従って使用してキャプシドタンパク質中の他の好適な溶媒露出ループ残基を同定することが可能である。
【００２０】
特定の実施形態では、異種抗原またはその断片を挿入可能なノロウイルスキャプシドタンパク質中の好適な溶媒露出ループは、配列番号１で示されるアミノ酸２９３〜３００、配列番号１で示されるアミノ酸３０５〜３１３、配列番号１で示されるアミノ酸３３５〜３４２、配列番号１で示されるアミノ酸３４８〜３５１、配列番号１で示されるアミノ酸３６２〜３６８、配列番号１で示されるアミノ酸３８０〜３８６、配列番号１で示されるアミノ酸３９７〜４０５、配列番号２で示されるアミノ酸２９３〜３００、配列番号２で示されるアミノ酸３０６〜３１７、配列番号２で示されるアミノ酸３３８〜３４６、配列番号２で示されるアミノ酸３５４〜３５７、配列番号２で示されるアミノ酸３６６〜３７５、および配列番号２で示される３８８〜４０５のアミノ酸（たとえば、図１ＡおよびＢ中の下線付き太字で示された領域を参照されたい）を含むが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、異種抗原またはその断片を挿入可能なサポウイルスキャプシドタンパク質中の好適な溶媒露出ループは、配列番号３で示されるアミノ酸２９６〜３１５、配列番号３で示されるアミノ酸３２７〜３３４、配列番号３で示されるアミノ酸３５５〜３６３、配列番号３で示されるアミノ酸３７４〜３７７、配列番号３で示されるアミノ酸３８８〜３９４、配列番号３で示されるアミノ酸４０４〜４１０、配列番号３で示されるアミノ酸４１４〜４２９、配列番号３で示されるアミノ酸２８１〜２９７、配列番号３で示されるアミノ酸３０４〜３０７、配列番号３で示されるアミノ酸３１３〜３１７、配列番号３で示されるアミノ酸３２７〜３３９、配列番号３で示されるアミノ酸３４９〜３５４、配列番号３で示されるアミノ酸３６５〜３８９、配列番号３で示されるアミノ酸３９６〜４０２、および配列番号３で示されるアミノ酸４２１〜４２４（たとえば、図４ＡおよびＢ中の下線付き太字で示された領域を参照されたい）を含むが、これらに限定されるものではない。１つ以上の異種抗原またはその断片は、溶媒露出ループ中の１つ以上またはすべてのアミノ酸に挿入可能であるか、またはそれらと置換え可能である。
【００２１】
１つ以上異種抗原またはその断片は、Ｐ２ドメインの複数の溶媒露出ループ中に、たとえば、Ｐ２ドメインの２、３、４、５、６、または７つの溶媒露出ループ中に挿入可能である。同一の異種抗原配列の複数のコピーを種々の溶媒露出ループ中に挿入してもよい。さらにまたはあるいは、さまざまな異種抗原配列をさまざまな溶媒露出ループ中に挿入して、複数の生物に由来するペプチド配列、１つ以上の生物に由来する複数のタンパク質、または１つ以上タンパク質に由来する複数の領域を含有するキメラタンパク質を生成することが可能である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質を形成するために、異種抗原またはペプチドのアミノ酸配列が、キャプシドアミノ酸残基の欠失を伴うことなくカリシウイルスキャプシド配列中に直接挿入される。好ましくは、異種アミノ酸配列は、Ｐ２ドメインの溶媒露出ループ領域内に直接融合される。特定の実施形態では、少なくとも１つの異種抗原配列は、ＧＩ．１  Norwalk  ＶＰ１キャプシド配列（配列番号１）中に挿入される。Norwalk  ＶＰ１キャプシド配列中への異種抗原配列の好ましい挿入部位は、配列番号１で示される２９５位のアスパラギン残基、２９６位のグリシン残基、３０８位のプロリン残基、３３６位のグリシン残基、３３８位のセリン残基、３６２位のアスパラギン残基、３６３位のグリシン残基、３８２位のプロリン残基、３８３位のセリン残基、３９９位のイソロイシン残基、または４０２位のアラニン残基の直後への挿入を含む。
【００２３】
他の実施形態では、異種抗原またはペプチドのアミノ酸配列は、本発明のキメラタンパク質中のカリシウイルスキャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸と置き換わる。たとえば、少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、キャプシドタンパク質の約１〜約５０アミノ酸、約２〜約４０アミノ酸、約４〜約２０アミノ酸、約８〜約１５アミノ酸、または約１０〜約３０アミノ酸と置き換わる。特定の一実施形態では、少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、キャプシドタンパク質の約５アミノ酸と置き換わる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種抗原配列は、Norwalk  ＶＰ１キャプシド配列（配列番号１）の少なくとも１つのアミノ酸と置き換わる。一実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸３３７〜３４１は、異種アミノ酸配列と置き換えられる。他の実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸２９４〜２９８、アミノ酸３０７〜３１１、アミノ酸３６２〜３６６、アミノ酸３８１〜３８５、またはアミノ酸４０１〜４０５は、異種アミノ酸配列と置き換えられる。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、キャプシドタンパク質の溶媒露出ループ中のすべてのアミノ酸と置き換わる。
【００２４】
本発明のキメラタンパク質は、任意選択によりリンカー配列（たとえば、約１〜約１０アミノ酸もしくはそれを超える）を介してまたはキャプシドタンパク質配列もしくはその内部に融合された、少なくとも１つの異種抗原またはその断片を含む。「異種抗原」とは、キャプシドタンパク質の由来源である種と異なる種に由来する免疫原性タンパク質またはペプチドを意味する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、異種抗原またはその断片は、抗原エピトープを含む。「抗原エピトープ」とは、免疫系の抗体または細胞により認識される三次元構造を意味する。本明細書で用いられる場合、抗原エピトープは、Ｔ細胞およびＢ細胞のエピトープさらには抗体結合エピトープを含む。一実施形態では、異種抗原またはその断片は、ミモトープを含む。ミモトープは、エピトープの構造を模倣した線状アミノ酸配列であり、したがって、エピトープに結合する抗体により認識される。他の実施形態では、異種抗原またはその断片は、不連続エピトープを表す複合線状アミノ酸配列または不連続エピトープの一部分を含有する線状アミノ酸配列を含む。たとえば、不連続エピトープの一部分を含む異種抗原配列は、挿入配列が互いに接触して不連続エピトープを生成するように隣接する溶媒露出ループ領域中に挿入可能である。抗原エピトープおよびミモトープは、一般的な病原因子の技術分野で公知である。たとえば、本明細書に記載の本発明に有用なＴ細胞エピトープは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質上の免疫優性Ｔ細胞エピトープ（Levely et al. (1991) Journal of Virology, Vol. 65: 3789-3796）またはＲＳＶに由来する核タンパク質特異的細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ（Venter et al. (2003) Journal of Virology, Vol. 77: 7319-7329）でありうる。当業者であれば、タンパク質マイクロアレイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを用いたエピトープマッピング、ファージディスプレイ解析、ならびに抗原/抗体複合体の構造モデリング（ただし、これらに限定されるものではない）を含む当技術分野の慣用法を用いて、本発明のキメラタンパク質中に挿入するのに好適な他のエピトープを確定することが可能である。
【００２６】
特定の実施形態では、複数のエピトープを本発明のキメラタンパク質中に挿入して、後続のスクリーニングのための１つ以上のエピトープライブラリーを提供することが可能である。
【００２７】
他の実施形態では、カリシウイルスキャプシドタンパク質中に挿入される外来配列は、特定の外来抗原に対する高親和性結合部位を含む。この手法では、高親和性結合部位の認識は、外来抗原の固有の性質でありうるか、または高親和性結合部位を認識するタンパク質に外来抗原が融合された構築物を生成しうる。たとえば、高親和性結合部位は、外来抗原に結合する抗体のパラトープまたは抗原結合部位でありうるか、またはレセプターなどの外来抗原と相互作用するタンパク質の結合領域でありうる。いくつかの実施形態では、高親和性結合部位は、ポリプロリンモチーフ（ＳＨ２ドメインにより認識される）、ロイシンジッパー（同様にロイシンジッパーモチーフを含有する結合パートナーにより認識される）、またはエピトープ（抗体フラグメントの抗原結合部位により認識される）などの短い線状結合モチーフでありうる。そのような実施形態では、外来抗原は、短い線状ペプチド結合モチーフを認識する結合部位に結合され（ＶＰ１サブユニットに工学操作により導入される）、外来抗原結合部位を含有するキメラタンパク質を含むウイルス様粒子に非共有結合される。
【００２８】
異種抗原またはその断片は、任意の長さ、より特定的には約５〜約７０アミノ酸長、約８〜約５０アミノ酸長、約１０〜約４０アミノ酸長、約１５〜約３５アミノ酸長、または約２０〜約３０アミノ酸長でありうる。いくつかの実施形態では、異種抗原またはその断片は、約５〜約２０アミノ酸長である。異種抗原またはその断片は、任意選択のリンカー配列を介してカリシウイルスキャプシド配列に融合可能である。リンカー配列は、約１〜約１０アミノ酸またはそれを超えうる。
【００２９】
異種抗原またはその断片は、ウイルス、細菌、および真核病原体などの種々の病原因子に由来しうる。たとえば、一実施形態では、異種抗原はウイルスに由来する。異種抗原の由来源であるウイルスは、レトロウイルス科（Retroviridae）（たとえば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、もしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとしても参照される）およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離株）、ピコルナウイルス科（Picomaviridae）（たとえば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトCoxsackieウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カリシウイルス科（Calciviridae）（たとえば、Norwalkウイルスおよび関連ウイルスを含む、胃腸炎を引き起こす株）、トガウイルス科（Togaviridae）（たとえば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（Flaviridae）（たとえば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）、コロナウイルス科（Coronoviridae）（たとえば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（Rhabdoviradae）（たとえば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（Filoviridae）（たとえば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（たとえば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス（metaneumovirus））、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（たとえば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス科（Bungaviridae）（たとえば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス（bunga virus）、フレボウイルス、およびナイロウイルス）、アレナウイルス科（Arenaviridae）（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（Reoviridae）（たとえば、レオウイルス、オルビウイルス（orbiviurses）、およびロタウイルス）、ビルナウイルス科（Bimaviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（Parvovirida）（パルボウイルス）、パポバウイルス科（Papovaviridae）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（Adenoviridae）（ほとんどのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）（単純ヘルペスウイルス（HSV）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（Poxviridae）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、およびイリドウイルス科（Iridoviridae）（たとえば、アフリカブタ熱ウィルス）、ならびに未分類ウイルス（たとえば、海綿状脳症の病原因子、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部感染、クラス２＝非経口感染（すなわちC型肝炎）、ならびにアストロウイルスを含む。特定の実施形態では、ウイルスは、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、およびメタニューモウイルス（metaneumovirus）よりなる群から選択される。たとえば、呼吸器合胞体ウイルスFタンパク質に由来する、260LINDMPITN268（配列番号６）または250YMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV278（配列番号７）などの標的配列を用いてキメラカリシウイルスＶＬＰを生成することができる。他の実施形態では、ウイルスはカリシウイルスである。たとえ���、異種抗原は、本明細書に記載のカリシウイルス株のいずれかに由来しうる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、異種抗原は細菌病原体に由来する。異種抗原の由来源でありうる細菌は、病原性パスツレラ属（Pasteurella）の種（たとえば、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida））、スタフィロコッカス属（Staphylococci）の種（たとえば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））、ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種（たとえば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（A群ストレプトコッカス属（Streptococcus））、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）（B群ストレプトコッカス属（Streptococcus））、ストレプトコッカス属（Streptococcus）（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・ファエカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）（嫌気性種）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae））、ナイセリア属（Neisseria）の種（たとえば、ナイセリア・ゴノロエアエ（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis））、エシェリキア属（Escherichia）の種（たとえば、腸毒素原性大腸菌（ETEC）、腸病原性大腸菌（EPEC）、腸管出血性大腸菌（EHEC）、および腸管侵入性大腸菌（EIEC））、ボルデテラ属（Bordetella）の種、カンピロバクター属（Campylobacter）の種、レジオネラ属（Legionella）の種（たとえば、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila））、シュードモナス属（Pseudomonas）の種、シゲラ属（Shigella）の種、ビブリオ属（Vibrio）の種、エルシニア属（Yersinia）の種、サルモネラ属（Salmonella）の種、ヘモフィラス属（Haemophilus）の種（たとえば、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae））、ブルセラ属（Brucella）の種、フランシセラ属（Francisella）の種、バクテロイデス属（Bacterioides）の種、クロストリジウム属（Clostridium）の種（たとえば、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani））、ミコバクテリア属（Mycobacteria）の種（たとえば、Ｍ．ツベルクロシス（M. tuberculosis）、Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．イントラセルラレ（M. intracellulare）、Ｍ．ランサイイ（M. kansaii）、Ｍ．ゴルドナエ（M. gordonae））、ヘリコバクター・ピロリス（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、エンテロコッカス属（Enterococcus）の種、バシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）、エリジペロトリックス・ルシオパチアエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、トレポネマ・パリジウム（Treponema pallidium）、トレポネマ・ペルテヌエ（Treponema pertenue）、レプトスピラ属（Leptospira）、リケッチア属（Rickettsia）、およびアクチノマイセス・イスラエリ（Actinomyces israeli）を含む。
【００３１】
本発明の他の実施形態では、異種抗原またはその断片は、病原性菌類や寄生生物などの真核病原体に由来する。異種抗原の由来源でありうる菌類は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラタム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、アスペルギルス・フミガタ（Aspergillus fumigata）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、およびスポロトリクス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）を含むが、これらに限定されるものではない。異種抗原の由来源でありうる他の真核病原体は、病原性原生動物、蠕虫、マラリア原虫、たとえば、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）、プラスモジウム・マラリアエ（Plasmodium malariae）、プラスモジウム・オバレ（Plasmodium ovale）、およびプラスモジウム・ビバックス（Plasmodium vivax）、トキソプラズマ・ゴンディー（Toxoplasma gondii）、トリパノソーマ・ブルセス（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルーズ（Trypanosoma cruzi）、シストソーマ・ハエマトビウム（Schistosoma haematobium）、シストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）、シストソーマ・ジャポニカル（Schistosoma japonicum）、リーシュマニア・ドノバニ（Leishmania donovani）、ジアルジア・インテスチナリス（Giardia intestinalis）、クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）などを含む。
【００３２】
本発明の特定の実施形態では、異種抗原またはその断片は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する。さまざまな公知の腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）はいずれも、本発明のキメラタンパク質中に組み込まれる１つ以上の異種抗原またはその断片として使用可能である（Hirohashi, et al. (2009) Cancer Sci., Vol. 100(5):798-806）。本発明のキメラタンパク質で使用可能な腫瘍関連抗原（またはそのエピトープ含有断片）は、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＨＥＲ−２、高分子量黒色腫関連抗原ＭＡＡ、ＧＤ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、卵巣関連抗原ＯＶ−ＴＬ３およびＭＯＶ１８、ＴＵＡＮ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０、ＣＡ−１９−９、腎臓腫瘍関連抗原Ｇ２５０、ＥＧＰ−４０（ＥｐＣＡＭとしても知られる）、Ｓ１００（悪性黒色腫関連抗原）、ｐ５３およびｐ２１ｒａｓを含むが、これらに限定されるものではない。以上のいずれかを含む任意のＴＡＡ（またはそのエピトープ）の合成類似体を使用してもよい。
【００３３】
他の実施形態では、異種抗原またはその断片は、アレルゲンに由来する。１つ以上の異種抗原またはその断片の由来源でありうるアレルゲンは、環境空中アレルゲン、ラグウィードなどの植物花粉／枯草熱、雑草花粉アレルゲン、イネ科草本花粉アレルゲン、セイバンモロコシ、樹木花粉アレルゲン、ライグラス、ハウスダストダニアレルゲンなどのクモ形動物アレルゲン（たとえば、Der p I、Der f Iなど）、貯蔵庫ダニアレルゲン、スギ花粉/枯草熱、カビ胞子アレルゲン、動物性アレルゲン（たとえば、イヌ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、マウスなどのアレルゲン）、食物アレルゲン（たとえば、甲殻類、ラッカセイなどのナッツ類、柑橘類のアレルゲン）、昆虫アレルゲン、毒液：（膜翅目（Hymenoptera）、スズメバチ、ミツバチ、カリバチ、クマンバチ、フシアリ）、ゴキブリ、ノミ、カなどに由来する他の環境昆虫アレルゲン、連鎖球菌性抗原などの細菌性アレルゲン、回虫性抗原などの寄生生物アレルゲン、ウイルス性抗原、菌類胞子、薬剤性アレルゲン、抗生物質、ペニシリン類および関連化合物、他の抗生物質、ホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）などの全タンパク質、穀粉（たとえば、小麦粉喘息を引き起こすアレルゲン）、トウゴマ、コーヒー豆などの職業性アレルゲン、ノミアレルゲン、および非ヒト動物中のヒトタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。特定の天然の動物および植物アレルゲンは、次の属に特有のタンパク質：イヌ科動物（カニス・ファミリアリス（Canis familiaris））、ヒョウヒダニ属（Dermatophagoides）（たとえば、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Dermatophagoides farinae））、フェリス（felis）（フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus））、ブタクサ属（Ambrosia）（アンブロシア・アルテミイスフェリア（Ambrosia artemiisfolia））、ドクムギ属（Lolium）（たとえば、ロリウム・ペレンネ（Lolium perenne）またはロリウム・ムルチフロルム（Lolium multiflorum））、スギ属（Cryptomeria）（クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica））、アルテルナリア属（Alternaria）（アルテルナリア・アルテマタ（Alternaria altemata））、ハンノキ類、ハンノキ属（Alnus）（アルナス・グルチノアス（Alnus gultinoas））、カバノキ属（Betula）（ベツラ・ベルコサ（Betula verrucosa））、コナラ属（Quercus）（クエルカス・アルバ（Quercus alba））、オリーブ属（Olea）（オレア・エウロパ（Olea europa））、ヨモギ（アルテミシア・ブルガリス（Artemisia vulgaris））、オオバコ属（Plantago）（たとえば、プランタゴ・ランセオラタ（Plantago lanceolata））、ヒカゲミズ属（Parietaria）（たとえば、パリエタリア・オフィシナリス（Parietaria officinalis）またはパリエタリア・ジュダイカ（Parietaria judaica））、ブラッテラ（Blattella）（たとえば、ブラッテラ・ゲルマニカ（Blattella germanica））、ミツバチ（たとえば、アピス・ムルチフロラム（Apis multiflorum））、イトスギ属（Cupressus）（たとえば、クプレッサス・センペルビレンス（Cupressus sempervirens）、クプレッサス・アリゾニカ（Cupressus arizonica）およびクプレッサス・マクロカルパ（Cupressus macrocarpa））、ビャクシン属（Juniperus）（たとえば、ジュニペラス・サビノイデス（Juniperus sabinoides）、ジュニペラス・ビルギニアナ（Juniperus virginiana）、ジ��ニペラス・コンムニス（Juniperus communis）、およびジュニペラス・アスヘイ（Juniperus ashei））、クロベ属（Thuya）（たとえば、チュヤ・オリエンタリス（Thuya orientalis））、ヒノキ属（Chamaecyparis）（たとえば、カマエシパリス・オブツサ（Chamaecyparis obtusa））、ペリプラネタ（Periplaneta）（たとえば、ペリプラネタ・アメリカナ（Periplaneta americana））、コムギダマシ属（Agropyron）（たとえば、アグロピロン・レペンス（Agropyron repens））、ライムギ属（Secale）（たとえば、セカレ・セレアレ（Secale cereale））、コムギ属（Triticum）（たとえば、トリチカム・アエスチバム（Triticum aestivum））、カモガヤ属（Dactylis）（たとえば、ダクチリス・グロメラタ（Dactylis glomerata））、ウシノケグサ属（Festuca）（たとえば、フェスツカ・エラチオル（Festuca elatior））、イチゴツナギ属（Poa）（たとえば、ポア・プラテンシス（Poa pratensis）またはポア・コンプレッサ（Poa compressa））、カラスムギ属（Avena）（たとえば、アベナ・サチバ（Avena sativa））、シラゲガヤ属（Holcus）（たとえば、ホルカス・ラナタス（Holcus lanatus））、ハルガヤ属（Anthoxanthum）（たとえば、アントキサンタム・オドラタム（Anthoxanthum odoratum））、オオカニツリ属（Arrhenatherum）（たとえば、アレナテラム・エラチウス（Arrhenatherun elatius））、ヌカボ属（Agrostis）（たとえば、アグロスチス・アルバ（Agrostis alba））、アワガエリ属（Phleum）（たとえば、フレウム・プラテンセ（Phleum pratense））、クサヨシ属（Phalaris）（たとえば、ファラリス・アルンジナセア（Phalaris arundinacea））、スズメノヒエ属（Paspalum）（たとえば、パスパラム・ノタタム（Paspalum notatum））、モロコシ属（Sorghum）（たとえば、ソルガム・ハレペンシス（Sorghum halepensis））、およびスズメノチャヒキ属（Bromus）（たとえば、ブロマス・イネルミス（Bromus inermis））を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする単離された核酸およびベクターを包含する。一実施形態では、単離された核酸は、Ｐ２ドメインを有するカリシウイルスキャプシドタンパク質と少なくとも１つの異種抗原またはその断片とを含むキメラタンパク質をコードする。ただと、前記少なくとも１つの異種抗原またはその断片は、前記キャプシドタンパク質の前記Ｐ２ドメイン中に挿入される。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードするベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞でありうる。
【００３５】
本発明のキメラタンパク質およびそれをコードする単離された核酸は、当技術分野で公知の慣用法により調製可能である。キャプシドタンパク質は、天然に存在する特定のカリシウイルスから単離および精製することにより調製可能であるか、または組換え技術により調製可能である。所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列を単離または合成した後、それらは、発現のための任意の好適なベクター中またはレプリコン中にクローニング可能である。多数のクローニング／発現ベクターが当業者に公知であり、適切なクローニング／発現ベクターの選択は、当業者の技能の範囲内である。ＤＮＡ合成、ＰＣＲ突然変異誘発、ならびに制限エンドヌクレアーゼ消化およびそれに続くＤＮＡライゲーションを含む慣用的技術および分子生物学的方法を用いて、１つ以上異種抗原配列をカリシウイルスキャプシドタンパク質配列内の指定位置に挿入することが可能である。
【００３６】
クローニング、突然変異などの本発明に適用可能な分子生物学的技術を記載した一般的テキストとしては、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)、Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook")、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")が含まれる。これらのテキストには、突然変異誘発、ベクター、プロモーターの使用、およびたとえば、キメラキャプシドタンパク質のクローニングおよび発現に関する多くの他の関連トピックスが記載されている。
【００３７】
本発明のキメラタンパク質は、宿主細胞内で発現されたときにウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成可能である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載のキメラタンパク質を含むウイルス様粒子を包含する。本発明者らは、ＶＬＰを形成するキャプシドタンパク質の能力を維持した状態で異種アミノ酸配列を組み込むようにカリシウイルスのキャプシドタンパク質配列を工学操作する独特の戦略を見いだした。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、副次量のキャプシドタンパク質ＶＰ２などのカリシウイルスに由来する１つ以上の構造タンパク質と共に共発現される。追加の構造タンパク質は、キメラタンパク質の由来源と同一のカリシウイルスに由来するか、または異なるカリシウイルスに由来する。
【００３８】
特定の実施形態では、ＶＬＰは、本発明のキメラタンパク質とカリシウイルスに由来する天然のキャプシドタンパク質とを含む。単なる例にすぎないが、ＶＬＰは、キメラタンパク質とNorwalk  ＶＰ１キャプシドタンパク質とを含みうる。ＶＬＰ中のキメラタンパク質と天然のキャプシドタンパク質との比は、ＶＬＰ形成を増強するように調整可能である。たとえば、キメラタンパク質と天然のキャプシドタンパク質との比は、約１：１０〜約１０：１、約１：５〜約５：１、または約１：１でありうる。キメラタンパク質と天然のキャプシドタンパク質との混合物を含有するＶＬＰは、キャプシドタンパク質のそれぞれ（すなわち、キメラおよび天然)を独立して発現させ、タンパク質を精製し、混合ＶＬＰを形成するのに望ましい比で２つの精製キャプシドタンパク質を混合することにより、生成可能である。あるいは、キメラおよび天然のキャプシドタンパク質は、２つの異なるプロモーターから宿主細胞内で共発現させることが可能である。異なる強さのプロモーターを用いることにより、得られるＶＬＰ中のキメラタンパク質と天然のキャプシドタンパク質との比を制御することが可能である。
【００３９】
他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＶＬＰ形成を増強するようにさらに修飾可能である。たとえば、キャプシドアミノ酸配列および／または異種抗原アミノ酸配列の溶媒露出ループ領域は、キメラタンパク質のコンフォメーションを制御する１つ以上のモチーフを含有するように工学操作可能である。そのような安定化用モチーフは、イオン性相互作用（たとえば塩橋）、金属配位（たとえばジンクフィンガー）、疎水性相互作用（たとえばロイシンジッパー）、または共有結合性相互作用（たとえばジスルフィド結合形成）を含む機序を介して所望のタンパク質接触を誘導するように設計可能である。
【００４０】
本発明は、キメラＶＬＰの作製方法を包含する。一実施形態では、この方法は、宿主細胞内で本発明のキメラタンパク質を発現することと、ＶＬＰが形成される条件で前記宿主細胞を増殖することと、を含む。本明細書に記載のキメラタンパク質配列をコードするベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換する。好適な組換え発現系は、細菌（たとえば、Ｅ．コリ（E. coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、およびストレプトコッカス属（Streptococcus））、バキュロウイルス／昆虫、ワクシニア、Semliki森林ウイルス（ＳＦＶ）、アルファウイルス属（Alphavirus）（たとえば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（VEE））、哺乳動物（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（BHK）細胞、マウス骨髄腫（SB20））、およびサル腎臓細胞（COS）、酵母（たとえば、Ｓ．セレビシアエ（S. cerevisiae）、Ｓ．ポンベ（S. pombe）、ピチア・パストリ（Pichia pastori）、および他のピチア属（Pichia）発現系）、植物、およびゼノパス属（Xenopus）発現系、さらには当技術分野で公知の他のものを含むが、これらに限定されるものではない。とくに好ましい発現系は、哺乳動物細胞系、細菌、昆虫細胞、および酵母発現系である。無細胞転写翻訳系は、キメラＶＬＰの産生のためのそのほかの方法を提供する。
【００４１】
特定の実施形態では、キメラＶＬＰは、アエデス・アエギプチ（Aedes aegypti）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ドロソファラ・メラノガステル（Drosophila melanogaster）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）、およびトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）（たとえば、High Five、TniPro）などの昆虫細胞から調製される。昆虫細胞培養でＶＬＰを生成する手順は、当技術分野で周知である（たとえば、米国特許第６，９４２，８６５号（その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）。簡潔に述べると、標的遺伝子をコードする合成またはクローン化のリーディングフレームを挿入することにより、キメラキャプシド配列を有する組換えバキュロウイルスを構築する。次いで、組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞培養物（たとえば、Ｓｆ９、High Five、およびTniPro細胞）に感染させ、キメラＶＬＰを細胞培養物から単離することが可能である。「キメラＶＬＰ」は、本明細書に記載のキメラアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＶＬＰである。
【００４２】
ＶＬＰが細胞内で形成されるのであれば、細胞を溶解するがＶＬＰを実質的にインタクト保持する化学的、物理的、または機械的手段を用いて細胞を破壊する。そのような方法は、当業者に公知のあり、たとえば、Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990)に記載されている。
【００４３】
次いで、粒子は、その完全性を保存する方法を用いて、たとえば、スクロース勾配などの密度勾配遠心分離、ＰＥＧ沈殿、ペレット化など（たとえば、Kim bauer et al. J. Virol. (1993) 67:6929-6936を参照されたい）、さらにはイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を含む標準的精製技術により、単離される（または実質的に精製される）。
【００４４】
いくつかの実施形態では、キメラＶＬＰは、キメラタンパク質をコードする単離された核酸を含むベクターを投与することによりｉｎ  ｖｉｖｏで作製される。好適なベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、およびｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬなどの発現プラスミドを含むが、これらに限定されるものではない。他の好適なベクターは、当業者には自明であろう。
【００４５】
特定の実施形態では、キメラタンパク質中のカリシウイルスキャプシドタンパク質は、ノロウイルスまたはサポウイルスのキャプシドタンパク質である。特定の一実施形態では、キメラタンパク質は、ノロウイルス遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩノロウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含む。他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＧＩ．１またはＧＩＩ．４のノロウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含む。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明の少なくとも１つのキメラＶＬＰを含むワクチン製剤は、アジュバントを含有しない。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤は、アジュバントをさらに含みうる。ほとんどのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するようにデザインされた物質、たとえば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の刺激剤、たとえば、ボルデテラ・ペルツッシス（Bordatella pertussis）またはマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）に由来するタンパク質を含有する。好適なアジュバントは、たとえば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Pifco Laboratories, Detroit, Mich.）、メルクアジュバント６５（Merck Adjuvant 65）（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、およびカルシウム、鉄、または亜鉛の塩を含むミネラル塩、アシル化チロシンアシル化糖の不溶性懸濁液、カチオン誘導体化ポリサッカリドまたはアニオン誘導体化ポリサッカリド、ポリホスファゼン、生分解性マイクロスフェア、およびキルＡ（Quil A）として市販されている。
【００４７】
好適なアジュバントはまた、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳濁液、ビロソーム、コクリエート（cochleate）、ポリ(ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、水中油型乳濁液、ＭＦ５９、およびスクアレンを含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、補助剤は細菌で派生したエキソトキシンである。他の実施形態では、３ＤＭＰＬやＱＳ２１などのＴｈ１型応答を刺激するアジュバントを使用することが可能である。特定の実施形態では、アジュバントは、ＭＰＬと水酸化アルミニウムとの組合せである。
【００４８】
特定の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）である。ＭＰＬは、サルモネラ属（Salmonella）に由来するリピドＡの非毒性誘導体であり、ワクチンアジュバントとして開発されてきた強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines, Vol. 2: 219-229）。前臨床ネズミ試験では、鼻腔内ＭＰＬは、分泌さらには全身的体液性応答を増強することが示されている（Baldridge et al. (2000) Vaccine, Vol. 18: 2416-2425; Yang et al. (2002) Infect Immun., Vol. 70: 3557-3565）。それはまた、１２０，０００名超の患者の臨床試験でワクチンアジュバントとして安全かつ有効であることが明らかにされている（Baldrick et al. (2002) Regul Toxicol Pharmacal, Vol. 35: 398-413）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４レセプターを介する先天性免疫の誘導を刺激するので、グラム陰性およびグラム陽性の両方の細菌、ウイルス、ならびに寄生生物を含む広範にわたる感染性病原体に対する非特異的免疫応答を誘導可能である（Persing et al. (2002) Trends Microbial, Vol. 10: S32-37）。ワクチン製剤中へのＭＰＬの組込みは、自然（innate）応答の急速な誘導を提供し、ウイルスチャレンジからの非特異的免疫応答を誘導する一方、ワクチンの抗原性成分により生成される特異的応答を増強するはずである。いくつかの実施形態では、ＭＰＬは、１つ以上の追加のアジュバントと組み合わせることが可能である。たとえば、ＭＰＬを水酸化アルミニウムと組み合わせて、ワクチン製剤の筋肉内投与に好適なアジュバントを生成することが可能である。
【００４９】
他の実施形態では、アジュバントは、スクアレンなどの天然に存在する油である。スクアレンは、植物により産生されるトリテルペノイド炭化水素油（Ｃ３０Ｈ５０）であり、多くの食品中に存在する。スクアレンはまた、ヒトにより豊富に産生され、ヒトに対して、コレステロールおよびステロイドホルモンの前駆体として機能する。それは、肝臓中および皮膚中で合成され、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）により血液で輸送され、脂腺により大量に分泌される。
【００５０】
スクアレンは、人体の天然成分でありかつ生分解性であるので、ワクチンアジュバントの成分として使用されてきた。これらのスクアレンアジュバントの１つは、Chironにより開発された水中油型乳濁液のＭＦ５９である。ＭＦ５９は、種々前臨床試験および臨床試験で多種多様なワクチン抗原に対する免疫応答を有意に増強することが示されている。ＭＦ５９は、１９９７年以来、欧州諸国で認可されているインフルエンザサブユニットワクチンの一部分である。このワクチンは、２０００万回を超えて投与されてきており、優れた安全性プロファイルを有することが示されている。ＭＦ５９アジュバントを含むワクチンの安全性はまた、生後１〜３日の新生児を含む種々の年齢群で、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウィルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、尿路病原性大腸菌（Escherichia coli）などに由来する組換え抗原を用いて、種々の調査臨床試験により示されている。
【００５１】
「有効アジュバント量」または「アジュバントの有効量」という用語は、当業者であればよくわかるであろう。また、これは、投与された抗原に対する免疫応答を刺激しうる１つ以上のアジュバントの量、すなわち、鼻洗浄液中のＩｇＡレベル、血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭレベル、またはＢ細胞およびＴ細胞の増殖に関して測定したときに、投与された抗原組成物の免疫応答を増大させる量を含む。免疫グロブリンレベルの好適に有効な増加は、いかなるアジュバントも用いない同一の抗原組成物と比較して、５％超、好ましくは２５％超、特定的には５０％超の増加を含む。
【００５２】
本発明の他の実施形態では、ワクチン製剤は、宿主ムコ多糖の部分脱水、送達剤の物理的性質の単独効果もしくは組合せ効果による液体粘度の増加に基づいて、またはデポ効果を提供する暴露部位での送達剤と宿主組織との間のイオン性相互作用を介して（ただし、これらに限定されるものではない）、抗原取込みを増強するように機能する送達剤をさらに含みうる。あるいは、送達剤は、送達部位での抗原保持時間を増大させる(たとえば、抗原放出を遅延する)ことが可能である。そのような送達剤は、生体接着剤でありうる。いくつかの実施形態では、生体接着剤は、グリコサミノグリカン（たとえば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（たとえば、ペクチン、アルギネート、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペンチン、セルロース、キチン、スタキオース、イヌリン、デキストリン、デキストラン）、ポリ(アクリル酸)の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド（ムチン、他のムコ多糖、およびGelSite（登録商標）（アロエ植物から抽出された天然の酸性ポリサッカリド）を含む）、ポリイオン、セルロース誘導体（たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（たとえば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸よりなる群から選択される粘膜付着剤でありうる。一実施形態では、ワクチン製剤は、キトサン、キトサン塩、キトサン塩基、または天然ポリサッカリド（たとえば、GelSite（登録商標））などのポリサッカリドを含む。
【００５３】
甲殻類の外殻中のキチンに由来する正荷電線状ポリサッカリドであるキトサンは、上皮細胞およびそれを覆う粘液層の生体接着剤である。キトサンを含む抗原の製剤では、鼻粘膜との接触時間が増大するので、デポ効果により取込みが増大する（Illum et al. (2001) Adv Drug Deliv Rev, Vol. 51: 81-96、Illum et al. (2003) J Control Release, Vol. 87: 187-198、Davis et al. (1999) Phann Sci Technol Today, Vol. 2: 450-456、Bacon et al. (2000) Infect Immun., Vol. 68: 5764-5770、van der Lubben et al. (2001) Adv Drug Deliv Rev, Vol. 52: 139-144、van der Lubben et al. (2001) Eur J Pharm Sci, Vol. 14: 201-207、Lim et al. (2001) AAPS Pharm Sci Tech, Vol. 2: 20）。キトサンは、動物モデルおよびヒトの両方で、インフルエンザ、百日咳、およびジフテリアを含めて、いくつかのワクチンで経鼻送達系として試験されてきた（Illum et al. (200 1) Adv Drug Deliv Rev, Vol. 51: 81-96、Illum et al. (2003) J Control Release, Vol. 87: 187-198、Bacon et al. (2000) Infect Immun., Vol. 68: 5764-5770、Jabbal-Gill et al. (1998) Vaccine, Vol. 16: 2039-2046、Mills et al. (2003) A Infect Immun, Vol. 71: 726-732、McNeela et al. (2004) Vaccine, Vol. 22: 909-914）。これらの試験では、キトサンは、非経口ワクチン接種と等価なレベルまで全身性免疫応答を増強することが示された。それに加えて、有意な抗原特異的IgAレベルも、粘膜分泌で測定された。したがって、キトサンは、経鼻ワクチンの有効性を大幅に増強しうる。さらには、その物理的特性に起因して、キトサンは、粉末剤として製剤化された鼻腔内ワクチンにとくによく適する（van der Lubben et al. (2001) Eur J Pharm Sci, Vol. 14: 201- 207、Mikszta et al. (2005) J Infect Dis, Vol. 191: 278-288; Huang et al. (2004) Vaccine, Vol. 23: 794-801）。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、とくに、ワクチン製剤は、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基を含む。キトサンの分子量は、１０ｋＤａ〜８００  ｋＤａ、好ましくは２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、より好ましくは１００ｋＤａ〜７００ｋＤａでありうる。組成物中のキトサンの濃度は、典型的には、約８０％（ｗ／ｗ）まで、たとえば、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、または８０％であろう。キトサンは、好ましくは少なくとも７５％脱アセチル化されたものであり、たとえば８０〜９０％、より好ましくは８２〜８８％脱アセチル化されたものであり、特定例では、８３％、８４％、８５％、８６％、および８７％の脱アセチルである。
【００５５】
ワクチン製剤は、薬学的に許容しうる担体をさらに含みうる。任意の好適な希釈剤または賦形剤を含めて、薬学的に許容しうる担体は、それ自体はワクチン製剤を摂取した被験者に有害な免疫応答の生成を誘導せずかつ過度の毒性を伴うことなく投与可能な任意の医薬剤を含む。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容しうる」という用語は、連邦政府または州政府の監督官庁により認可されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは哺乳動物で、より特定的にはヒトで使用するための他の一般に公認された薬局方に列挙されていることを意味する。薬学的に許容しうる担体は、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。薬学的に許容しうる担体、希釈剤、および他の賦形剤についての十分な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. current edition)に示されている。製剤は、投与形態に適したものでなければならない。好ましい実施形態では、製剤は、ヒトに投与するのに好適であり、好ましくは、製剤は、殺菌、非微粒子状、および／または非発熱原性である。ワクチン製剤はまた、所望により、副次量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤を含有しうる。
【００５６】
本発明のＶＬＰまたはキメラタンパク質は、ワクチン製剤または抗原製剤として投与するために製剤化可能である。本明細書で用いられる場合、「ワクチン」という用語は、脊椎動物（たとえば、哺乳動物）に投与可能でありかつ感染の予防および／もしくは改善ならびに／または感染の少なくとも１つの症状の軽減および／または追加用量のＶＬＰもしくはキメラタンパク質の有効性の増強を行う免疫性を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する、上記の本発明のＶＬＰまたはキメラタンパク質を含有する製剤を意味する。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤はアジュバントを含有しない。他の実施形態では、ワクチン製剤は、本明細書に記載のアジュバントを含有しうる。本明細書で用いられる場合、「抗原製剤」または「抗原組成物」という用語は、脊椎動物たとえば哺乳動物に投与したときに免疫応答を誘導する製剤を意味する。本明細書で用いられる場合、「免疫応答」という用語は、体体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を意味する。体液性免疫応答は、Ｂリンパ球による抗体産生の刺激を含み、これにより、たとえば、感染性因子の中和、細胞に進入する感染性因子の阻害、前記感染性因子の複製の阻害、ならびに／または感染および破壊からの宿主細胞の防護が行われる。細胞媒介性免疫応答は、脊椎動物（たとえば、ヒト）が呈する、感染性因子に対する、Ｔリンパ球および／または他の細胞たとえばマクロファージにより媒介される免疫応答を意味し、これにより、感染の予防もしくは改善またはその少なくとも１つの症状の軽減が行われる。特定的には、「防御免疫」または「防御免疫応答」は、脊椎動物（たとえば、ヒト）が呈する、感染性因子に対する免疫または免疫応答の誘導を意味し、これにより、感染の予防もしくは改善またはその少なくとも１つの症状の軽減が行われる。特定的には、ワクチン投与に基づく防御免疫応答の誘導は、キメラタンパク質中に存在する異種抗原の由来源である病原生物に関連する１つ以上の症状の存在の解消または低減によりはっきりと認められる。ワクチン製剤は、Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York)に概説されている。本発明の組成物は、たとえば、粘膜投与経路または非経口投与経路(たとえば、筋肉内、静脈内、皮下、真皮内、真皮下、経真皮)による被験者への投与用に製剤化可能である。そのような粘膜投与は、胃腸、鼻腔内、経口、または膣への送達を介しうるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、ワクチン製剤は、経鼻スプレー剤、点鼻剤、または乾燥粉末剤の形態をとる。他の実施形態では、ワクチン製剤は、筋肉内投与に好適な形態である。
【００５７】
本発明のワクチン製剤は、液状製剤または乾燥粉末製剤でありうる。呼吸器（たとえば鼻）粘膜への送達が意図される組成物の場合、典型的には、エアロゾル剤もしくは点鼻剤として投与するための水性溶液剤として、あるいは、たとえば鼻道内への急速な堆積のための乾燥粉末剤として製剤化される。点鼻剤として投与に供される組成物は、そのような組成物に通常含まれるタイプの１つ以上の賦形剤、たとえば、保存剤、粘度調整剤、等張化剤、緩衝剤などを含有しうる。粘性剤は、微結晶セルロース、キトサン、デンプン、ポリサッカリドなどでありうる。乾燥粉末剤として投与に供される組成物はまた、そのような組成物に通常含まれるタイプの１つ以上の賦形剤、たとえば、粘膜付着剤、増量剤、適切な粉末流動特性およびサイズ特性を供給する作用剤を含有しうる。増量剤および粉末流動剤およびサイズ剤は、マンニトール、スクロース、トレハロース、およびキシリトールを含みうる。
【００５８】
一実施形態では、ワクチン製剤は、免疫原として１つ以上のキメラＶＬＰと、ＭＰＬ（登録商標）、スクアレン、またはＭＦ５９（登録商標）などのアジュバントと、粘膜表面への接着を促進するキトサンまたはGelSite（登録商標）などのバイオポリマーと、マンニトールおよびスクロースなどの増量剤と、を含有する。
【００５９】
たとえば、ワクチンは、本明細書に論述される１つ以上のキメラＶＬＰと、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントと、キトサン粘膜付着剤と、増量剤としてマンニトールおよびスクロースと、を含有し、かつ適正流動特性を提供する、１０ｍｇの乾燥粉末剤として製剤化可能である。製剤は、約７．０ｍｇ（２５〜９０％  ｗ／ｗの範囲）のキトサンと、約１．５ｍｇのマンニトール（０〜５０％  ｗ／ｗの範囲）と、約１．５ｍｇのスクロース（０〜５０％  ｗ／ｗの範囲）と、２５μｇのＭＰＬ（登録商標）（０．１〜５％  ｗ／ｗの範囲）と、約１００μｇのキメラＶＬＰ抗原（０．０５〜５％  ｗ／ｗの範囲）と、を含みうる。
【００６０】
キメラＶＬＰ／抗原は、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約８０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在しうる。一実施形態では、ＶＬＰは、両方の鼻孔中への投与のため（各鼻孔あたり１０ｍｇ）、１０ｍｇの乾燥粉末製剤あたり、約５μｇ、約１５μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、約７５μｇ、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約５００μｇ、および約１ｍｇまたは一方の鼻孔中への投与のため、２０ｍｇの乾燥粉末製剤あたり、約１０μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約４００μｇ、および約１ｍｇ（０．０５、０．１５、０．２５、０．５、１．０、２．０、５．０、および１０．０％ｗ／ｗ）の投与量で製剤化可能である。製剤は、各投与時、一方または両方の鼻孔中に投与可能である。免疫応答を改善するために１回目の投与の１〜１２週間後に追加免疫投与を行ってもよい。ワクチン製剤および抗原製剤中の各ＶＬＰ／抗原の含有量は、１μｇ〜１００ｍｇの範囲内、好ましくは１〜１０００μｇの範囲内、より好ましくは５〜５００μｇ、最も典型的には１０〜２００μｇの範囲内でありうる。各用量で投与される全ＶＬＰ／抗原は、約１０μｇ、約３０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、または約１０００μｇのいずれかでありうる。全ワクチン用量は、一方の鼻孔中に投与可能であるか、または半分にして両方の鼻孔中に投与可能である。乾燥粉末特性として、粒子の１０％未満は直径１０μｍ未満である。平均粒子サイズは、直径で１０〜５００のμｍの範囲内である。
【００６１】
本発明の他の実施形態では、乾燥粉末製剤は、製剤を１回以上投与するために１つ以上のデバイスと組み合わせてもよい。そのようなデバイスは、使い捨ての経鼻投与デバイスでありうる。他の実施形態では、１回以上の用量はユニット用量である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、抗原製剤およびワクチン製剤は、被験者への逐次投与に供される液状製剤である。鼻腔内投与が意図された液状製剤は、キメラＶＬＰ／抗原、アジュバント、およびキトサンなどの送達剤を含であろう。非経口（たとえば、皮下、真皮内、または筋肉内（ｉ．ｍ．））投与に供される液状製剤は、送達剤（たとえばキトサン）を用いずに、キメラＶＬＰ／抗原、アジュバント、および緩衝剤を含むであろう。
【００６３】
好ましくは、以上に記載した抗原製剤およびワクチン製剤は、凍結乾燥されて無水状態で貯蔵され、使用準備が整った時点で希釈剤を用いて再構成される。あるいは、組成物の異なる成分は、キット中に独立して貯蔵可能である（成分はいずれかまたはすべてが凍結乾燥される）。成分は、乾燥製剤では凍結乾燥された形態で維持可能でありまたは液状製剤では再構成可能であり、かつ使用前に混合可能でありまたは患者に独立して投与可能である。乾燥粉末投与では、ワクチン製剤または抗原製剤は、鼻腔内送達デバイス中にあらかじめ充填して使用時まで貯蔵可能である。好ましくは、そのような鼻腔内送達デバイスは、その内容物を保護し安定性を確保するであろう。
【００６４】
本発明は、被験者において外来因子に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、被験者に本明細書に記載のワクチン製剤を投与することを含む。ただし、ワクチン製剤は、キメラタンパク質を含み、キメラタンパク質中に存在する異種抗原またはその断片は、外来因子由来のタンパク質に由来する。被験者は、外来因子の感染を獲得するリスクがあってもよいし、または外来因子の感染の被害を受けていてもよいし、または外来因子により引き起こされた再発感染を有していてもよい。したがって、本発明は、外来因子に由来する異種抗原を含有する本明細書に記載のキメラタンパク質を含む本発明のワクチン製剤または抗原製剤を投与することにより外来因子に関連する感染を予防および治療する方法を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のキメラＶＬＰを含む本発明のワクチン製剤または抗原製剤は、アジュバントを含有しない。他の実施形態では、ワクチン製剤または抗原製剤は、本明細書に記載のアジュバントを含みうる。
【００６５】
次に、以下の実施例に記載の特定の実施形態を参照して、本発明をより詳細に例示する。実施例は、本発明を単に例示することを意図したものであり、なんらその範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１．カリシウイルスＶＬＰ中の抗原挿入部位の同定
ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）のバイオリアクター産生および下流処理は、十分に特徴付けられており、キメラカリシウイルスＶＬＰの生成を実証する初期概念実証試験で使用した。ＧＩ．１  Norwalk  ＶＰ１サブユニットに対して、外来エピトープの挿入に好適な表面露出ループ領域（図１Ａを参照）の同定は、高分解能Ｘ線結晶構造（ＰＤＢコード１ＩＨＭ）の評価により行った。複合ＧＩＩ．４ノロウイルスキャプシドタンパク質（ＧＩＩ．４コンセンサス）の類似の評価は、プログラムGeno3D2を用いて原子構造モデルを作製した後で行った（図１Ｂ参照）。このソフトウェアは、テンプレートとして相同タンパク質（ＧＩＩ．２コンセンサスの場合のＧ１．Ｉ  Norwalk）の原子構造を使用して、十分な配列類似性を有しかつ原子構造データの欠失した任意のカリシウイルスキャプシドタンパク質の構造モデルを生成するために同様に使用される戦略を提供する。
【００６７】
ノロウイルスＧＩ．１  NorwalkおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＰ１サブユニット中のＰ２ドメイン表面露出ループ領域の同定は、Swiss PDB viewerを用いて残基接触度を分析することにより行った。ノロウイルスキャプシドタンパク質のＰ２ドメイン境界は、すでに同定されている（たとえば、Prasad et al. (2000) Journal of lnfectious Diseases, Vol. 181: S317-S321を参照されたい）。同一のソフトウェアを用いた原子構造のマニュアル検査により、Ｐ２ドメイン表面ループの適切な帰属を確認した。図１は、Ｐ２ドメイン残基に灰色で陰影付けしかつこのドメイン内の溶媒接触ループ領域を下線付き太字フォントで記して、ＧＩ．１  Norwalk（１Ａ；配列番号１）およびＧＩＩ．４コンセンサス（１Ｂ；配列番号２）のＶＰ１サブユニットのアミノ酸配列を示している。図２は、溶媒接触Ｐ２ドメインループを強調表示して、ＧＩＩ．４コンセンサス構造モデル（９０°回転）を示している。
【００６８】
以上に概説した方法を他のカリシウイルスに拡張するために、サポウイルスHu/Yokohama16-4/2007/JP VP1サブユニットに対して溶媒接触Ｐ２ドメインループの構造モデリングおよび同定を追加的に行った。この特定のサポウイルスは、ヒト胃腸炎で原因因子になるものとして選択した。カリシウイルス科では、原子構造は、Norwalk（ノロウイルス）およびSan Miguelアシカ（ＳＭＳＶ；ベシウイルス）のＶＰ１キャプシドタンパク質に関して現在入手可能である。図３に示されるように、プログラムGeno3D2を用いたサポウイルスキャプシドタンパク質の評価により、構造テンプレートとしてのNorwalk（図３Ａ）およびＳＭＳＶ（図３Ｂ）のＶＰ１サブユニットの両方から導出される原子構造モデルを生成した。
【００６９】
サポウイルスＶＰ１構造モデルのそれぞれのＰ２ドメイン表面露出ループ領域の同定は、Swiss PDB viewerを用いて残基接触度を解析することにより行った。サポウイルスキャプシドタンパク質のＰ２ドメイン境界は、構造モデリングに使用したテンプレートとの配列アライメントにより規定した。図４は、Ｐ２ドメイン残基に灰色で陰影付けしかつこのドメイン内の溶媒接触ループ領域中にアミノ酸配列を下線付き太字フォントで記して、Hu/Yokohamal6-4/2007/JP VP1サブユニット（配列番号３）を示している。
【００７０】
以上の解析では、モデル生成のためのテンプレートとして使用した原子構造に依存して構造モデルおよび同定された表面Ｐ２ドメインループの両方に実質的な差を生じる。両方のキャプシドタンパク質がカリシウイルス科に属するという事実にもかかわらず、NorwalkおよびＳＭＳＶのＶＰ１サブユニット間の有意な構造差は、配列アライメント中の比較的低い全配列同一性および大きいギャップを考慮すれば予想外なことではない（図５；Ｐ２ドメイン残基は灰色で陰影付けされている）。標的と最大の配列相同性を示す利用可能なテンプレート構造を用いて、追加のカリシウイルスサブユニットの原子構造モデルの生成を行った。あるいは、追加のカリシウイルスサブユニットの構造モデルでは、配列相同性がほぼ等価である場合、多数の利用可能なカリシウイルスＶＰ１構造が用いられる。標的との類似の配列相同性である場合の多数の構造テンプレートの使用を、好適なエピトープ挿入部位をうまく同定できる可能性が増大するように設計する。
【００７１】
実施例２．カリシウイルスＶＰ１オープンリーディングフレーム中への外来エピトープの挿入
ＧＩ．１  Norwalk  ＶＰ１サブユニットの好ましい部位への外来エピトープ挿入の包括的スクリーニングのために、２つの異なる戦略、すなわち、１）Ｐ２ドメインの溶媒接触ループ中の種々の残基位置での単純挿入、および２）Ｐ２ドメインの溶媒接触ループ残基の置換えを利用した。
【００７２】
突然変異原性プライマーとして適切な合成オリゴヌクレオチドを用いて、9アミノ酸のインサートを含む突然変異誘発を行い、一方、遺伝子合成により、より大きいインサートを有する構築物を作製した。より大きいインサートを有するキメラＶＬＰを生成する代替的戦略は、適切なエピトープ配列をコードする合成ＤＮＡまたはＰＣＲ産物のいずれかをライゲートするためにＶＰ１リーディングフレームの所望の領域に独特の制限部位を工学的に導入することを含む。追加のカリシウイルスキャプシドタンパク質中へのエピトープ挿入のために同様の戦略を実施する。
【００７３】
第一世代構築物では、QuickChange Lightning突然変異誘発キット（Stratagene; La Jolla, CA）を用いてＰＣＲ突然変異誘発によりNorwalk  ＶＰ１サブユニット中にモデルエピトープを挿入した。Norwalk  ＶＰ１を含有するシャトルベクターをＤＮＡ鋳型として用いて構築物を作製し、得られたキメラ配列をＰＣＲおよびＤＮＡ塩基配列解析により確認した。次いで、組換えバキュロウイルスの生成を可能にするためにキメラＶＰ１リーディングフレームを導入ベクターｐＶＬ１３９３中にサブクローニングした。サブクローニングのためのインサートを作製する前にＰＣＲ増幅を用いた場合、ＤＮＡ配列解析により最終的リーディングフレームを確認した。この方法では、多数のエピトープ/インサート部位の組合せを迅速かつ効率的に生成することが可能である。より大きいエピトープ挿入を有するキメラＶＰ１リーディングフレームをＤＮＡ合成により作製し、続いて、組換えバキュロウイルスの生成を可能にするために導入ベクターｐＶＬ１３９３中にサブクローニングした。図６は、強調表示された外来抗原と置き換えられた残基を有するNorwalk  ＶＰ１  Ｘ線構造（９０°回転）を示している。図６に示される第一世代構築物は、９アミノ酸のモデルエピトープと置き換えられたＰ２ドメイン中の５つの溶媒露出ループ残基を表している（実施例３参照）。また、図６で強調表示されたループ中の所定の残基間にモデルエピトープの直接挿入を含有する第一世代構築物を作製した（すなわち、ＶＰ１残基をなんら欠失させることなく）。Norwalk  ＶＰ１アミノ酸配列中の溶媒露出残基の位置については実施例１および図１Ａを参照されたい。
【００７４】
実施例３．キメラカリシウイルスＶＬＰの産生
接着性Ｓｆ９昆虫細胞中に導入ベクター（ｐＶＬ１３９３−Norwalk  ＶＰ１）および線状バキュロウイルスＤＮＡを共トランスフェクトし、続いてウイルス増殖を行って高力価ストックを作製することにより、キメラNorwalk  ＶＰ１サブユニットをコードする組換えバキュロウイルスの産生を行った。キメラＶＬＰ産生の初期概念実証スクリーニングとして、インフルエンザ赤血球凝集素抗原に由来するモデルエピトープ（ＨＡエピトープ配列−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号５））をNorwalk  ＶＰ１残基２９６、３３６、３６２、３８３、または３９９の後に直接挿入した。それに加えて、このモデル抗原をNorwalk  ＶＰ１残基３３７〜３４１または残基３６２〜３６６と置き換えた構築物で発現実験を行った。図７は、モデル赤血球凝集素エピトープによる直接挿入を含有するかまたはそれにより置き換えられたNorwalk  ＶＰ１残基を示している。
【００７５】
キメラＶＬＰの産生のために、Ｓｆ９昆虫細胞を５０ｍＬスピンナーフラスコ培養物中で２×１０６細胞／ｍｌまで増殖させ、次いで、推定感染多重度（ＭＯＩ）＝１．０で組換えバキュロウイルスのＰ１ストックを感染させた。感染に続いて、感染後Ｔ＝９６〜１２０時間で低速遠心分離およびそれに続く０．２μｍフィルターを用いた清澄化により、培養物を採取した。この際、ＶＬＰは、自然の細胞溶解の結果として培養上清中に放出された。図８に示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、ＶＰ１残基２９６または３６２の後に挿入されたモデルＨＡ抗原を含有するキメラNorwalk  ＶＬＰの発現試験から得られた結果を示している（レーン1、分子量標準；レーン2、362挿入の遠心分離後の上清; レーン３、３６２の遠心分離ペレット画分；レーン４、３６２挿入の濾液；レーン５、２９６挿入の遠心分離後の上清；レーン６、２９６の遠心分離ペレット画分；およびレーン７、２９６挿入の濾液）。３６２挿入キメラの遠心分離後の上清（レーン２）および濾液（レーン４）の画分中の予測分子量（約５７ｋＤａ）の顕著なNorwalk  ＶＰ１泳動バンドは、天然のNorwalk  ＶＰ１に類似した発現パターンを呈したことから、この溶媒接触Ｐ２ループが外来抗原挿入を効率的に許容する能力が実証される。図８はまた、norwalk  ＶＰ１残基２９６の直後に挿入されたモデルＨＡエピトープを含有する構築物では、以上の画分中でかなり低いＶＰ１発現レベルを示している（レーン５および７）。これらの試験では、２９６挿入構築物の発現低下は、細胞溶解前のＶＰ１サブユニットのタンパク質分解から生じ、これは、おそらく、ＶＰ１サブユニットの一部分のＶＬＰ集合の欠如から生じるので、表面露出ループの同定だけでは、キメラＶＬＰの効率的産生を確認するには十分でない。
【００７６】
以上の戦略を用いてキメラＶＬＰを作製する能力は、ＶＰ１残基３３６の後に挿入されたまたは残基３３７〜３４１と置き換えられたモデルＨＡエピトープを含有するNorwalk  ＶＰ１サブユニットについて、図９で確認される。ウェスタンブロット解析を用いて、抗Norwalkおよび抗ＨＡエピトープのモノクローナル抗体との特異的かつ適切な反応性を示した予測分子量（約５７ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バンドが示された（レーン１、分子量標準；レーン２、ＶＰ１残基３３６にエピトープ挿入を有するキメラＶＬＰ；レーン３、ＶＰ１残基３３７〜３４１のエピトープ置換えを有するキメラＶＬＰ；およびレーン４、野生型Norwalk  ＶＰ１）。
【００７７】
キメラNorwalk  ＶＬＰの小スケールの発現および精製では、Ｓｆ９昆虫細胞をＳｆ９００  ＩＩ培地（１Ｌ振盪フラスコ培養物）中で２×１０６細胞／ｍｌまで増殖させ、次いで、ＭＯＩ＝０．５で組換えバキュロウイルスを感染させた。ＶＬＰ発現に続いて（感染後９６〜１２０時間）、低速遠心分離およびそれに続く０．２μｍフィルターを用いた清澄化により培養物を採取した。集合ＶＬＰは特徴的に高分子量（約１０  ＭＤａ）を有するので、材料は、スクロース勾配遠心分離法およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの表面化学に依存しない方法により、容易に精製可能である。図１０は、連続流遠心分離（ＣＦＣ）によるキメラNorwalk  ＶＬＰ（３３６挿入）の精製を示している。この際、精製出発材料は、ＴＣＦ−３２ローターを用いた約１６時間にわたる１００，０００×ｇでの遠心分離により０〜６０％の直線スクロース勾配で単離された。この解析では、出発馴化培地（ＣＭ）中でのキメラＶＬＰの高レベルの産生およびウイルス様粒子の予測スクロース密度でバンド形成するキメラＶＰ１サブユニットの顕著なピークが示される。
【００７８】
実施例４．キメラカリシウイルスＶＬＰの特徴付け
キメラカリシウイルスＶＰ１サブユニットの適切なタンパク質発現およびＶＬＰ形成を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット解析、高分解能質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー、および電子顕微鏡法を含むいくつかの分析方法を用いて、産生プロセス全体にわたり特徴付けを行った。実施例３では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析の使用に重点を置いた。これらの方法により、キメラNorwalk  ＶＬＰの適切なサブユニット分子量および外来抗原の存在が示された。ノロウイルスＶＬＰは高分子量（＞１０ＭＤａ）であるので、粗精製出発材料でさえも、サイズ排除クロマトグラフィーにより直接解析可能である。ＶＬＰ形成を評価するこの方法の有用性は、図１１で示される。ここでは、Norwalk  ＶＰ１−ＨＡキメラ（３３６挿入）の馴化培地をサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。この試験では、予測保持時間（約８分）を有するピークの存在によりキメラＶＬＰの適切な形成が示された（赤色トレース−２２０ｎｍでの吸収（Ｙ軸上に示される）、および青色トレース−２８０ｎｍでの吸収）。
【００７９】
プール化連続流遠心分離画分（実施例３参照）中のＶＬＰの適切な形成を電子顕微鏡法により追加的に確認した。これにより、ＶＰ１残基３３６の後に挿入されたまたはＶＰ１残基３３７〜３４１と置き換えられたモデルＨＡエピトープを含有するキメラNorwalk  ＶＬＰの約３２ｎｍの予測粒子が示された（図１２）。
【００８０】
実施例５．キメラカリシウイルスＶＬＰのスケールアップバイオリアクター産生および下流処理
Waveバイオリアクタープラットフォームおよびバイオリアクター槽としての使い捨てのWavebagを用いて、キメラＶＬＰの初期スケールアップバイオリアクター産生を行った。これらの試験では、感染前の細胞密度、感染多重度、および採取前の感染時間を含む基本パラメータの最適化に焦点をあてる。初期最適化はまた、複数の昆虫細胞系/培地の組合せおよび培地補充のスクリーニングを含む。これらの試験は、スケーラブル産生戦略の開発および下流処理への材料供給の両方に役立つ。Waveバイオリアクターシステムおよびさまざまな昆虫細胞/無血清培地の組合せを用いて、ノロウイルスＶＬＰについて、＞５０ｍｇ／Ｌの範囲内でバイオリアクター産生性を慣例に従って観測した。
【００８１】
従来のクロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、およびタンジェンシャルフロー濾過を含む十分に確立された測定可能な方法により、採取されたバイオリアクター培養物からキメラＶＬＰの下流処理を行う。クロマトグラフィースクリーニングでは、宿主細胞のタンパク質/核酸に関して、結合/溶離条件の最適化、流量効果の評価、工程回収率の推定、および精製因子の特徴付けを行うために、小スケールで初期パイロット試験を行う。
【００８２】
実施例６．外来エピトープの他の提示方法
実施例１に概説されるように、外来エピトープの好ましい挿入部位は、カリシウイルスＶＰ１原子構造モデルの評価による溶媒接触Ｐ２ドメイン表面ループの同定に基づくものであった。エピトープ挿入の最適位置を同定する相補的方法として、以上の構造解析をアミノ酸配列および生化学的データと組み合わせて許容部位の同定に役立てる。構造解析により同定された表面ループ領域に含まれる超可変Ｐ２ドメイン残基を同定するために、アミノ酸配列データを多重アライメントで用いる。両方の手段により同定された位置は、外来エピトープ配列の直接挿入に最適であると考えられる。同様に、構造解析により同定された単一表面露出ループに含まれる複数の超可変Ｐ２残基を有する位置は、ＶＰ１残基の部分的置換えに最適であると考えられ、ＶＰ１欠失境界を確立する指針を与えるであろう。カリシウイルスエスケープ突然変異体および/または抗体エピトープのＰ２ドメイン残基の同定などの生化学的データの使用は、外来エピトープの挿入に好適な位置を際立たせるのに役立つ。
【００８３】
実施例２〜４に概説されるように、９アミノ酸の外来エピトープ挿入を第一世代キメラNorwalk  ＶＬＰの作製に使用した。ＶＬＰ産生および/または外来エピトープ免疫原性を最適化するために、５〜１０残基、１１〜２０残基、２１〜３０残基、３１〜４０残基、または４１〜５０残基の配列を含む、種々の長さの挿入エピトープ配列を評価する。カリシウイルス残基の欠失が外来エピトープの挿入のきわめて重要な因子になりうるので、５〜１０残基、１１〜２０残基、２１〜３０残基、３１〜４０残基、または４１〜５０残基を含む、種々の長さのＶＰ１欠失を評価する。
【００８４】
キメラＶＬＰの組換え発現は、カリシウイルスＰ２ドメインの２つ以上の溶媒接触ループ中への複数の外来抗原の同時挿入を含みうる。同定されたループのいくつかは、比較的近い空間的近接度で存在するので、挿入配列の直接接触により不連続エピトープを形成するように、複数のループの挿入を工学操作することが可能である。
【００８５】
キメラカリシウイルスＶＬＰを発現するために、標的抗原は、不連続エピトープを示すミモトープ配列または複合線状配列に由来しうる。ミモトープ配列は、高い親和性で中和抗体に結合する線状ペプチドであるが、標的抗原中に見いだされる実際のアミノ酸配列を示さない。この性質の配列は、文献から導出されるか、またはファージディスプレイ解析やコンビナトリアルペプチドライブラリーなどの方法による中和抗体のエピトープマッピングにより決定される。不連続エピトープを示す複合線状配列は、同様に文献から、コンビナトリアル法から、または抗体:抗原複合体の構造解析から導出可能である。
【００８６】
キメラＶＬＰ産生の効率を向上させるために、外来エピトープ配列のコンフォメーション空間を構造的に束縛してカリシウイルスＶＰ１表面ループ境界により良好に適合させるべくプラットフォームをデザインすることが可能である。この目的は、共有結合性または非共有結合性のタンパク質間相互作用モチーフを工学操作によりＶＰ１サブユニットの表面露出ループまたは外来抗原配列のいずれかに導入することにより遂行される。
【００８７】
以上に概説した方法の変法は、ＶＰ１サブユニットの小部分のみがＰ２ドメインの溶媒接触ループ上に外来エピトープを提示するキメラＶＬＰの作製を含む。この戦略は、とくに比較的大きい外来エピトープがＶＰ１サブユニット中で挿入される場合、所望のＶＬＰ集合を維持するうえで重要になることもある。この性質のＶＬＰを作製するために、最初に、ＶＬＰ集合に好適な高精製状態(すなわち、完全変性単量体、天然様二次/三次構造含有単量体、または低次ＶＰ１集合状態)で個別のカリシウイルスＶＰ１サブユニット(天然および修飾の両方)を作製する。次いで、天然サブユニットおよび修飾サブユニットを所望の比で混合して効率的なＶＬＰ集合を促進する条件を確立することにより、キメラＶＬＰを作製する。あるいは、天然サブユニットおよび修飾サブユニットの発現が２つの異なるプロモーターにより調節されるように構築物を作製することにより、この性質のＶＬＰを培養下で直接作製する。この方法を用いる場合、天然のＶＰ１サブユニットは、修飾サブユニットを超える発現レベルになるように比較的強力なプロモーター下に配置される。キメラＶＬＰの集合は、ＶＬＰ表面の小部分上に提示される修飾ＶＰ１サブユニットを有する細胞内で行われる。
【００８８】
より汎用的なディスプレイプラットフォームを形成可能なさらなる変法は、溶媒接触Ｐ２ドメイン表面への所望の外来抗原の特異的高親和性結合を促進する標的配列を含有する（たとえば、相補的結合モチーフを含有する）ノロウイルスＶＬＰの作製を含む。この性質のキメラＶＬＰを作製するために、ノロウイルスサブユニットおよび標的抗原の発現および精製を独立して行い、次いで、結合を可能にする条件下で混合する。この方法を用いる場合、標的抗原は、完全集合ＶＬＰ上のＶＰ１サブユニットに結合されるか、またはＶＬＰ集合前にＶＰ１サブユニットに結合される。最適なＶＬＰ安定性および抗原提示を提供する条件を評価するために、ＶＰ１サブユニットの各コピー上または一部分上のみに標的配列を発現させることにより、キメラＶＬＰを作製する。
【００８９】
実施例７．キメラNorwalk  ＶＬＰによるマウスの免疫化
３０μｇの天然Norwalk  ＶＬＰまたは実施例３に記載のキメラNorwalk  ＶＬＰ（たとえば、Norwalk  ＶＰ１の２９６、３３６、３６２、３８３、もしくは３９９残基の後に挿入されたＨＡエピトープまたはＨＡエピトープによるNorwalk  ＶＰ１残基３３７〜３４１もしくは残基３６２〜３６６の置換え）の１つを用いて、約１０〜１２週齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスを腹腔内免疫する。免疫後２１日目にマウスから採血し、血清を抗原特異的ＥＬＩＳＡで解析して天然およびキメラのNorwalk  ＶＬＰの抗体価を決定する。結果から、キメラＶＬＰが抗Norwalk抗体および抗ＨＡ抗体の両方で有意な力価を生じることが示されると予想される。
【００９０】
実施例８．２９残基の医療適合性外来抗原を含有するキメラカリシウイルスＶＬＰの産生、特徴付け、および免疫原性
より大きい医療適合性外来抗原を含有するキメラノロウイルスＶＬＰを作製するために、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質に由来する２９アミノ酸配列（ＲＳＶ  Ｆエピトープ配列−ＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶ（配列番号７）（これは中和抗体Synagisにより認識される））をNorwalk  ＶＰ１残基３０８、３３８、または３６３の後に直接挿入した。それに加えて、Norwalk  ＶＰ１残基３０７〜３１１、３３７〜３４１、または残基３６２〜３６６と置き換えられたＲＳＶ  Ｆエピトープを含有する構築物を作製した。組換えバキュロウイルスの作製およびＳｆ９昆虫細胞内でのＶＬＰ産生に続いて、キメラＶＬＰを精製し、特徴付けし、免疫原性に関してを調べた。図１３は、連続流遠心分離（ＣＦＣ）によるキメラNorwalk  ＶＬＰ（３０８挿入）の精製を示している。この際、精製出発材料は、ＴＣＦ−３２ローターを用いた約１６時間にわたる１００，０００×ｇでの遠心分離により０〜６０％の直線スクロース勾配で単離された。この解析では、出発馴化培地（ＣＭ）中でのキメラＶＬＰの産生およびウイルス様粒子の予測スクロース密度でバンド形成するキメラＶＰ１サブユニットの顕著なピークが示される。連続流遠心分離により精製された材料でのＶＬＰの形成は、透過型電子顕微鏡法により確認された（図１４）。免疫原性を評価するために、２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ−６．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中２００μｇ／ｍＬで、ＣＦＣ精製キメラＶＬＰを製剤化した。６匹のＢａｌｂ／ｃマウスを試験０日目に２０μｇのキメラＶＬＰ（約１μｇのＲＳＶエピトープ）で免疫し、試験２１日目に追加の２０μｇのキメラＶＬＰで追加免疫した。試験３５日目に血液を採取し、ＲＳＶ−ＦおよびNorwalkタンパク質特異的ＥＬＩＳＡの両方を用いて全ＩｇＧ力価を解析した。この試験では、キメラＶＬＰを投与された６匹の動物のうち２匹はまた、抗ＲＳＶ−Ｆ  ＩｇＧが４倍超の増加を示した（図１５）。
【００９１】
実施例９．多重修飾表面ループを含有するキメラカリシウイルスＶＬＰの産生
多重修飾ループを含有するキメラノロウイルスＶＬＰを作製するために、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の９アミノ酸配列（ＲＳＶ  Ｆエピトープ配列−ＬＩＮＤＭＰＩＴＮ（配列番号６））を同一構築物内の２つのNorwalk  ＶＰ１表面ループに付加した。これらの試験では、残基３３８および３６３への挿入が同時に行われたまたは残基３３７〜３４１との置換えと残基３６３への挿入とが同時に行われたＲＳＶ  Ｆエピトープを含有する構築物を作製した。図１６に示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、９残基のＲＳＶ−Ｆ抗原を含有するキメラNorwalk  ＶＬＰの発現試験の結果を示している（レーン1、分子量標準；レーン２、３３８および３６３挿入の遠心分離後の上清；レーン３、３３８および３６３挿入の遠心分離ペレット画分；レーン４、３３８および３６３挿入の濾液；レーン５、３３７〜３４１置換えかつ３６３挿入の遠心分離後の上清；レーン６、３３７〜３４１置換えかつ３６３挿入の遠心分離ペレット画分；およびレーン７、３３７〜３４１置換えかつ３６３挿入の濾液）。各キメラの遠心分離後上清（レーン２および５）ならびに濾液（レーン４および７）の画分中の予測分子量（約５７ｋＤａ）の顕著なNorwalk  ＶＰ１泳動バンドは、天然のNorwalk  ＶＰ１に類似した発現パターンを呈したことから、この溶媒接触Ｐ２ループが外来抗原挿入を効率的に許容する能力が実証される。これらのキメラでは、粒子形成は、ＳＥＣデータにより示唆され、これらの試験は、実施例６に概説される概念を支持する。
【００９２】
実施例１０．赤血球凝集素エピトープを含有するキメラカリシウイルスＶＬＰの免疫原性。
インフルエンザ赤血球凝集素抗原に由来するモデルエピトープ（ＨＡエピトープ配列−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号５））をＶＰ１上のNorwalk  ＶＰ１残基アミノ酸３３８−３３９間に直接挿入し、本明細書では「ＨＡ挿入」と記した。ＨＡエピトープをＶＰ１中のNorwalk  ＶＰ１残基アミノ酸３３７〜３４１と置き換えた追加の構築物を作製し、本明細書では「ＨＡ置換え」と記した。免疫前に各構築物の全タンパク質含有量を調べた。「ＨＡ挿入」構築物を調べたところ、３４μｇ／ｍｌの全タンパク質を含有し、「ＨＡ置換え」構築物を調べたところ、４２μｇ／ｍｌの全タンパク質を含有していた。各チューブから５０マイクロリットルを取り出して、０および７日目にマウスの腹腔内に注入した。１４日目に血清を採取したが、測定可能な抗原特異的ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡにより検出できなかった。しかしながら、ほぼすべてのマウスで低レベルのＨＡ特異的ＩｇＭを検出することができた（図１７）。キメラＶＬＰのＨＡ含有量は全タンパク質のわずか１．７％にすぎないので、ＩｇＭのみの応答の理由は、低いＨＡ濃度（「ＨＡ挿入」では２９ｎｇのＨＡおよび「ＨＡ置換え」では３６ｎｇのＨＡ）である可能性が高い。アジュバントの存在によりＨＡに対する免疫応答が増強されるかを調べるために、３７日目にＡｌＯＨ／ＭＰＬ上に吸着されたキメラＶＬＰをすでに処置されたマウスに投与した。６４日目に血清を採取し、ＨＡ特異的ＩｇＧに関して解析した（図１８）。アジュバントの添加により、「ＨＡ挿入」で免疫された５匹のマウスのうちの４匹および「ＨＡ置換え」で免疫された５匹のマウスのうちの２匹は、検出可能なＨＡ特異的ＩｇＧ応答を有するようになった。この試験では、マウスはすべて、旧来の値に類似したNorwalk特異的ＩｇＧを産生した。結論として、ＨＡエピトープが提示され、免疫系に認識される。この試験で使用される低濃度のＨＡ抗原では、アジュバントを用いて免疫応答を増大させることが可能である。あるいは、ＨＡエピトープの量を増大させれば、免疫応答が増大するであろう。
【００９３】
本発明の範囲は、本発明の個別の態様の一例であることを意図して記載した特定の実施形態により限定されるものではなく、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内である。実際に、以上の説明および添付の図面から、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に提示および説明した形態に加えて本発明のさまざまな変更形態が当業者に自明なものとなるであろう。そのような変更形態および等価形態は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとみなされる。
【００９４】
本明細書に挙げた出版物、特許、および特許出願はすべて、個々の公開公報、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み入れられたのと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００９５】
本明細書における参考文献の引用または検討は、本発明に対する先行技術であることを承認するものと解釈してはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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