(57)【要約】  本発明は、ＣＴ造影剤の有効成分として使用することができるヨードを含有した放射形状の高分子化合物、その製造方法及びそれを含有する造影剤組成物に関するもので、本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物は、既存のヨードを含有した低分子造影剤化合物に比べて造影効果持続時間が顕著に向上して、中心核表面近くに置換された毒性と各種異常反応を起こす素地があるヨード含有化合物を比較的長さが長い生体適合性高分子鎖の層で取り囲む保護膜を形成して、それらの外部環境への露出を防止することによって体内毒性を減少させるだけでなく、大食細胞による早期の吸収を防止して体内循環時間を延長させて、体外排出が体内注入後の適切な時間が経過後になされて、製造方法及び精製方法が非常に簡単で高収率及び低費用で大量生産が可能であり、多分散性が非常に低くて製造と効果面で再現性が高く、製造されるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の構造が、すべて共有結合からなって構造的にも非常に安定であるので、ＣＴ用造影剤の製造に有用に用いることができる。【選択図】図３
2013535560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核、
前記中心核に直接またはペプチドを通じて結合されるヨード含有化合物、及び
前記中心核に直接またはペプチドを通じて結合されるか、または前記中心核に結合されたヨード含有化合物に直接結合される生体適合性高分子
を含有してなり、
前記中心核及びヨード含有化合物が生体内で露出しないように前記生体適合性高分子が保護膜を形成する構造を有する、ヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項２】
前記中心核を構成する円形または球形の対称形低分子化合物が、
α−、β−及びγ−シクロデキストリン、グルコース、ガラクトース、マンノース及びそれらの誘導体からなる群から選択されるいずれか１種の炭水化物、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）及びその誘導体、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）及びその誘導体、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システイン、及びチロシンからなる群から選択されるいずれか１種以上のペプチドが２〜４個集まって形成された環状ペプチド及びそれらの誘導体からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする、請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項３】
前記中心核を構成する放射形の高分子化合物が、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリグルタミン酸デンドリマー、ポリアスパラギン酸デンドリマー、ポリグリセロ−ルデンドリマー及びポリメラミンデンドリマーからなる群から選択されるいずれか１種のデンドリマー、ポリリジン、ポリエステル、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及びポリグリセロ−ルからなる群から選択されるいずれか１種の高次分枝型高分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその共重合体誘導体からなる群から選択されるいずれか１種の星形の高分子及びそれらの誘導体からなる群から選択される１種であることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項４】
前記ヨード含有化合物が、下記の化学式２、３、４及び１０からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物：
【化１】
2013535560.tif 000038
【化２】
2013535560.tif 000039
【化３】
2013535560.tif 000040
【化４】
2013535560.tif 000041
（前記化学式２〜４または化学式１０において、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、または選択的に、−ＮＨ２、−ＮＨＲ４、−ＮＲ４２、−ＮＨＮＨ２、−ＮＨＮＨＲ４、−ＮＨＮＲ４２、−ＯＨ、−ＯＲ４、−ＳＨまたは−ＳＲ４で、
Ｒ４は、−Ｈ、−Ｂｏｃ、Ｃ１−６の置換または置換されない直鎖または分枝鎖アルキルまたはヘテロアルキル、または置換または置換されないＣ５−７のアリールまたはヘテロアリールで、
Ｒ５は、Ｒ４と同じか、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＲ４または−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ４２である）。
【請求項５】
前記化学式２、３、４及び１０のヨード含有化合物が、下記の化学式１及び化学式９で表されるヨード化合物を前駆体とすることを特徴とする請求項４に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物：
【化５】
2013535560.tif 000042
【化６】
2013535560.tif 000043
【請求項６】
前記生体適合性高分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、ヘパリン及びそれらの誘導体からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項７】
前記ペプチドが、ジリジン、トリリジン、テトラリジン、ジグルタミン酸、トリグルタミン酸、テトラグルタミン酸、ジアスパラギン酸、トリアスパラギン酸、テトラアスパラギン酸、ジシステイン、トリシステイン、テトラシステイン、ジセリン、トリセリン、及びテトラセリンからなる群から選択される１種の繰り返し単位が２〜４個であるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項８】
前記中心核、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子間の結合の連結部位が、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−または
【化７】
2013535560.tif 000044
であることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項９】
前記連結部位の両末端が追加的に各々、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ３−２０のシクルロアルキル−（ＣＨ２）ｍ−、Ｃ４−２０のアリール−（ＣＨ２）ｍ−及び−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−からなる群から独立的にまたは選択的に選択されるいずれか一つを通じて前記中心核、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子と連結され、ここで前記ｍは、０〜１０の整数であることを特徴とする請求項８に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項１０】
前記中心核が、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子と結合することができるアミン基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアミン基、カルボキシル基、カルボキシヒドラジド基、ヒドラジン基、チオール基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン基、アルデヒド基、ケトン基、エポキシ基、３−カルボメトキシピロリジノン基、およびトリ−（Ｃ１−４のアルコキシ）−シリル基からなる群から選択される１種以上の表面作用基を有することを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項１１】
平均分子量が、８，０００〜１５０，０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項１２】
前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物が、下記の化学式５ないし化学式８の構造を有することを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物：
【化８】
2013535560.tif 000045
【化９】
2013535560.tif 000046
【化１０】
2013535560.tif 000047
【化１１】
2013535560.tif 000048
（前記化学式５ないし化学式８において、
前記中心核は、α−、β−及びγ−シクロデキストリン、グルコース、ガラクトース及びマンノースからなる群から選択されるいずれか１種の環状炭化水素、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）及びその誘導体、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）及びその誘導体、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システイン、及びチロシンからなる群から選択されるいずれか１種以上のペプチドが２〜４個連結して形成された環状ペプチド、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリグルタミン酸デンドリマー、ポリアスパラギン酸デンドリマー、ポリグリセロ−ルデンドリマー及びポリメラミンデンドリマーからなる群から選択されるいずれか１種のデンドリマー、ポリリジン、ポリエステル、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及びポリグリセロ−ルからなる群から選択されるいずれか１種の高次分枝型高分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその共重合体誘導体からなる群から選択されるいずれか１種の星形の高分子及びそれらの誘導体で、
Ｔ１及びＴ２はヨード含有化合物であって、Ｔ１は、
【化１２】
2013535560.tif 000049
【化１３】
2013535560.tif 000050
【化１４】
2013535560.tif 000051
または
【化１５】
2013535560.tif 000052
で、Ｔ２は
【化１６】
2013535560.tif 000053
または
【化１７】
2013535560.tif 000054
で、ここで前記Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立的にまたは選択的に、
−ＮＨ−、−ＮＲ４−、−ＮＮＨ２−、−ＮＮＨＲ４−、−ＮＮＲ４２−、−Ｏ−または−Ｓ−で、Ｒ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ４、−ＮＲ４２、−ＮＨＮＨ２、−ＮＨＮＨＲ４、−ＮＨＮＲ４２、−ＯＨ、−ＯＲ４、−ＳＨまたは−ＳＲ４で、前記Ｒ４は、−Ｈ、−Ｂｏｃ、Ｃ１−６の直鎖または分枝鎖アルキル、または置換または置換されないＣ５−７のアリールまたはヘテロアリールで、前記Ｒ５はＲ４と同じか、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＲ４または−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ４２で、
Ｄは、ペプチドであって、ジリジン、トリリジン、テトラリジン、ジグルタミン酸、トリグルタミン酸、テトラグルタミン酸、ジアスパラギン酸、トリアスパラギン酸、テトラアスパラギン酸、ジシステイン、トリシステイン、テトラシステイン、ジセリン、トリセリン、及びテトラセリンからなる群から選択される１種の繰り返し単位が２〜４個であるペプチドで、
Ｐは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、ヘパリンまたはそれらの誘導体で、
Ｘは、前記中心核の表面作用基であって、
アミン基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアミン基、カルボキシル基、カルボキシヒドラジド基、ヒドラジン基、チオール基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン基、アルデヒド基、ケトン基、エポキシ基、３−カルボメトキシピロリジノン基、トリ−（Ｃ１−４のアルコキシ）−シリル基で、
Ｌ１及びＬ２は、前記中心核、ヨード含有化合物（Ｔ１またはＴ２）、ペプチド（Ｄ）または生体適合性高分子（Ｐ）の間の連結部位として、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−または
【化１８】
2013535560.tif 000055
で、前記連結部位の両末端は追加的にそれぞれ、
−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ３−２０のシクルロアルキル−（ＣＨ２）ｍ−、Ｃ４−２０のアリール−（ＣＨ２）ｍ−及び−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−からなる群から独立してまたは選択的に選択されるいずれか一つを通じて前記中心核、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子と連結され、ここで前記ｍは、０〜１０の整数で、
ａ及びｂはそれぞれ独立してまたは選択的に、０または１の整数で、
ｃは２〜４の整数で、
ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ及びｉはそれぞれ独立してまたは選択的に、２ないし６０の整数で、
ｊは１〜１０の整数である）。
【請求項１３】
前記生体適合性高分子がＰＥＧの場合、中心核から外部に向かう末端が、Ｃ１−４のアルコキシ基であることを特徴とする請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物。
【請求項１４】
円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核の表面作用基の一部に生体適合性高分子が結合するように反応させる工程（工程１）、及び
前記工程１の中心核で未反応の表面作用基にヨード含有化合物が直接またはペプチドを通じて結合するように反応させる工程（工程２）を含有する請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法。
【請求項１５】
円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核の表面作用基の一部にヨード含有化合物が結合するように反応させる工程（工程１）、及び  前記工程１で中心核に結合したヨード含有化合物に生体適合性高分子が結合するように反応させる工程（工程２）を含有する請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法。
【請求項１６】
ヨード含有化合物が生体適合性高分子とペプチドを通じて結合するように反応させる工程（工程１）、及び
前記工程１でペプチドを通じて生体適合性高分子に結合したヨード含有化合物が円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核の表面作用基に結合するように反応させる工程（工程２）を含有する請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法。
【請求項１７】
前記ヨード含有化合物が、下記の化学式１、２、３、４、９及び１０からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする、請求項１４ないし請求項１６のいずれか一項に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法：
【化１９】
2013535560.tif 000056
【化２０】
2013535560.tif 000057
【化２１】
2013535560.tif 000058
【化２２】
2013535560.tif 000059
【化２３】
2013535560.tif 000060
【化２４】
2013535560.tif 000061
（前記化学式２〜４または化学式１０において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ５は、請求項４で定義したのと同様である）。
【請求項１８】
請求項１に記載のヨードを含有した放射形状の高分子化合物を有効成分として含有するＣＴ用造影剤組成物。
【請求項１９】
前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物は、ヨードの含量が１５〜５０％であることを特徴とする請求項１８に記載のＣＴ用造影剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＴ造影剤の有効成分に使用することができるヨードを含有した放射形状の高分子化合物、その製造方法及びそれを含有するＣＴ用造影剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＣＴ（computed tomography、コンピュータ断層撮影）というのは人体の目的部位を多くの方向から照射して透過したＸ線を検出器で収集して、その部位に対するＸ線の吸収差をコンピュータが数学的技法を用いて再構成する撮影技法のことをいう。すなわち、体の周囲をカメラが３６０゜回転して色々と異なる角度から撮した多数の２次元Ｘ線写真を、コンピュータープログラムで組換えて３次元画像にする画像技法である。
【０００３】
したがって、このようなＸ線に基づいた画像は一般的に骨を主とした画像を具現する。原子番号が比較的高いバリウムやヨード系の造影剤を、生きている動物や人の血管に注入してＣＴ画像を撮影する場合、体の中でそれら物質が存在する所では光電子効果にしたがって、Ｘ線がよく透過することができずに吸収されて骨（非常に明るい白）と類似に他の部位に比べてもう少し明るい白または灰色系列の画像が得られるようになる。一般的に、Ｘ線が吸収される程度（α）は、原子番号（Ｎ）とＸ線の波長（λ）にそれぞれ比例する。すなわち、Ｘ線が吸収される程度（α）はＸ線のエネルギーに反比例する。
【０００４】
（数１）
α＝Ｎ５λ７／２
【０００５】
ＣＴは、ＭＲＩ（magnetic resonance imaging）とともに解剖学的な情報を提供するが、このような面で生理学的／生化学的機能に関する情報を提供するＰＥＴ（positron emission tomography）またはＳＰＥＣＴ（single photon emission computed tomography）画像技法と差別化される。また、ＭＲＩに比べて、ＣＴの解像度が低いにもかかわらず、ＣＴは病院になくてはならない重要な位置を占めている。その主要原因としては、短時間内の撮影が容易なこと、検査費用が比較的安いことであり、大部分の病院が備えていて装備への接近性が容易いであるいうことである。すなわち、ＣＴ撮影時間がＭＲＩに比べて１０分の１程度またはそれ以下で、短時間に早く診断を下さなければならない特に、寸時を争う脳の部位に致命的損傷を被った患者にとって必須不可欠な診断装備であるとみなされていて、ＭＲＩ撮影時に発生する騒音と長期間の撮影による患者の不便さを減少させることができ、装備への接近性が容易なことと、撮影費用もＭＲＩに比べて１０分の１程度にしかならないので、患者の負担になることが少ない。
【０００６】
現在まで知られている臨床に適用されたヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤は、大きく分けてイオン性物質と非イオン性物質に分けられる。
【０００７】
【化１】
2013535560.tif 000003
【０００８】
前記化合物の中で非イオン性物質がイオン性物質より副作用がさらに少ないので、現在、患者には大部分の場合、非イオン性ＣＴ用造影剤が投与されている。また、ベンゼン環がひとつの既存のヨードを含有した低分子非イオン性ＣＴ用造影剤２〜３個を共有結合で連結して分子量を増加させて、既存の単一ベンゼン環基盤の非イオン性造影剤に比べて、体内滞留時間をもう少し延長させることができる。しかし、このようなヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤は、一般的に体内滞留時間（半減期）が非常に短くて、適切な水準のＣＴ画像を得るために１回のＣＴ撮影時に、成人の体重にしたがって多い時は８０〜９０ｇ以上の過量を投与しなくてはならず、アレルギーやショックなどの異常反応が一部の患者において度々示されて、極めて珍しい場合には生命に支障をきたし得るという問題点がある。このような現象は、特に心臓部位など主に心血関係疾患の効果的な診断のために必須な十分な造影時間の確保のために、非常に過量の造影剤を投与しなければならない場合に、さらによく発生するようになる。したがって、このような問題を克服するために、さらに安全で比較的少量のＣＴ用造影剤の投与だけでも一定時間優れた造影効果を維持する化合物の開発が急がれなければならない。その他にも、現在このようなヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤の問題点としては、低いＬＤ５０値、高い滲透圧と粘度などを挙げることができる。
【０００９】
最近は、このようなヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤が有する限界を克服するために、高分子物質に基盤を置いた新しいヨードを含有したＣＴ用造影剤の開発に関する報告が登場している。例えば、高分子物質骨格に低分子ヨード化合物多数を共有結合で置換するとか、またはリポソーム、ミセル、その他ナノ粒子のような高分子化合物骨格に市販中の低分子ヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤化合物またはその誘導体を物理的に含有（physical encapsulation）させる方式がある。
【００１０】
非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３及び非特許文献４では、市販中のヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤化合物またはその誘導体を高分子化合物基盤リポソームに含有する方法が開示されている。
【００１１】
非特許文献５、非特許文献６では、市販中のヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤化合物またはその誘導体を高分子化合物基盤ミセルに含有する方法が開示されている。
【００１２】
非特許文献７では、市販中のヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤化合物またはその誘導体を高分子化合物基盤ナノ粒子に含有する方法が開示されている。
【００１３】
前記非特許文献７の場合、ヨード化合物のカルボン酸末端をアルキル基でキャッピング（capping）して疎水性を増加させることで、ナノ粒子の内部によく含まれるようにした。このようなヨードを含有したナノ粒子が血管に注入されると、一般的に容易に大食細胞に吸収されて体内循環時間を増やすことができ、時間が経過するにつれて大食細胞が相対的に多く分布する炎症、癌、動脈硬化などの部位に蓄積されて、結果的にＣＴ撮影を通じた関連疾患の診断を容易にした。一方、前記の非特許文献５の場合、親水性でありながら体内循環時間を延長させることができるＰＥＧ（ポリエチレングリコール）鎖の末端に疎水性のヨードを含有した低分子化合物多数を、共有結合で置換してミセル構造を形成することができた。しかし、このような自己組み立て（self-assembly）に基づいたリポソームやミセルのような構造は、体内環境にしたがっていつでも粒子の形態が解けて内部に含有された有毒性のヨードを含有した低分子造影物質が一時にすべて放出されたり一部が漏出したりする恐れがある。
【００１４】
したがって、このような低分子ヨード化合物を含まなくても、自体として造影効果を示す金属ナノ粒子を基盤にしたＣＴ用造影剤が開発され報告された。
【００１５】
特許文献１では、表面がＰＥＧに置換された金（Ａｕ）ナノ粒子基盤のＣＴ用造影剤に関して開示している。
【００１６】
非特許文献８では、ヘパリンでコーティングされた金ナノ粒子基盤のＣＴ用造影剤に関して開示している。
【００１７】
非特許文献９では、ＰＥＧと蛍光物質で置換された均一な大きさの酸化タンタルナノ粒子基盤のＣＴ用造影剤に関して開示している。
【００１８】
前記金属ナノ粒子を基盤にしたＣＴ用造影剤は、高い原子番号を有する金属（Ａｕ、Ｔａなど）自体が造影剤の役割（Ｘ線を吸収）をする原理で、ナノ粒子の表面をＰＥＧやヘパリンでコーティングして生体適合性を向上させながら、それぞれ体内循環時間の増加を通じた円滑なＣＴイメージングまたは肝臓での蓄積による特定部位の造影効果増大を図った。
【００１９】
しかし、前記で説明したさまざまな高分子基盤の造影剤は、費用が高いという問題だけでなく、円滑な排泄が行なわれないで生体内に長期間蓄積される（すなわち、数年〜数十年以上の半減期）ことによる安全性の限界、または化合物構造の安全性、すなわち自己組み立て構造体が、体内環境でも安定に元々の構造を維持して、製造時にいつも同一な分子量分布を示す高分子混合物を得て、同一な性能を有するようにする再現性確保のける困難があることが予想される。また、このような高分子混合物を基盤にした人体内投与用素材の場合、現在まで、いまだに毒性試験基準が全世界的に確立されておらず、実質的に臨床試験を経て商業化するまでに色々な難関があるように見える。
【００２０】
一方、リポソーム形態としてヨードを含有した低分子造影物質を含有する現在常用化されたＣＴ用血管造影剤では、Fenestra（カナダのＡＲＴ社）とｅＸＩＡ１６０（カナダのBinitio Biomedical社）を挙げることができるが、ともに動物用のみが販売されている。前記リポソーム形態のＣＴ用血管造影剤は、マウスまたはラットに５〜１０回注入する量のバイアル一個（２．５ｍｌ）の価格が、１００万ウォン程度で価格が非常に高く、このような小型動物の尾静脈を通じた造影剤注入が容易ではなく、マイクロＣＴ撮影をしなければならない基礎医学研究の従事者が使用するには、なお一層負担が大きい。また、小型動物を用いたマイクロＣＴ撮影に人体用低分子造影剤を投与する場合、造影剤注入直後に動物をＣＴ撮影台に移して、ソフトウェアで機器を作動してＣＴ撮影を始めるまで最小限１〜３分程度の時間が必要となり、その間にすでに低分子造影剤は大部分が腎臓を通じて膀胱に排出されるので、実質的に適切な水準の造影が不可能である。したがって、先に言及した現在のヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤をヒトに過量投与してこそ適切な水準のＣＴ画像が確保される心血関係疾患の診断のみならず、小型動物を用いた実験を正しく行なうためには、価格が安くて過量投与する必要なしに比較的長期間の循環後に円滑な排出がなされるＣＴ用血管造影剤の開発が切実に求められている実情である。
【００２１】
このような周知によって、１９９０年頃から少しずつ高分子の骨格にデンドリマーを用いたヨードを含有したＣＴ用造影剤に対する論文及び特許が登場し始めた。すなわち、単一分子であるデンドリマーを高分子の骨格に用いる場合（下記の内容参照）、製造及び性能における再現性を確保することができ、金属ナノ粒子または線形高分子を基盤した造影剤に比べて、大きさが非常に小さくて体内蓄積の心配なしに一定時間の循環後の円滑な排出を期待することができる。
【００２２】
デンドリマーは、たいてい直径１０ｎｍ以下の比較的小さな放射形（treelikeまたはradial-shape)高分子であって、一層ずつ段階別に反復的な有機合成と精製を通じて得られる純粋単一分子である。大部分の他の典型的な高分子（多分散混合物）とは異なりデンドリマーは、特定環境（溶媒、ｐＨ、温度など）での大きさがいつも一定であり、ある程度の予測が可能で、特に高分子基盤粒子の溶液内の大きさに敏感な多様な応用研究分野において、選択的に目的に合わせた適用が可能であるので非常に有利である。具体的なデンドリマーの長所としては、化学構造上の完全性、適用する有機合成法にしたがっていくらでもデンドリマーを構成する作用基とそれに伴う物理化学的性質の変形ができること、さまざまな機能単位物質（例えば、低分子薬物、標的物質、表面改質剤など）をデンドリマーの内部と表面に容易に置換することができ、そして生物分野に応用する場合、重要な生体内酵素による破壊の可能性がほとんどないことなどを挙げることができる。
【００２３】
デンドリマーがバイオ医薬分野に適用された例としては、多価陽イオン性デンドリマーを用いて陰イオン性の遺伝子と電荷複合体を成して、効果的に細胞内に運搬するする例；薬物伝達媒介体に使用されたデンドリマーが薬物を運搬する方式において、特定刺激（ｐＨ、光、酵素など）によって患部にのみ薬物が放出されるように、薬物分子をデンドリマー内の透過性空間に物理的に含有させるか、前駆薬物の形態でデンドリマーに共有結合で置換する例；デンドリマー運送体の構造変形を通じて薬物を標的指向または制御された放出速度で伝達する例；多重置換効果を用いてタンパク質（レクチン）と炭水化物リガンド間の細胞の外壁において相互作用時の結合力を大幅に増大させる例；低分子化合物基盤イメージング製剤をデンドリマー骨格に多重置換して信号を増幅させることによって、より効果的な医学的診断を可能にする例；生体適合性及び生分解性デンドリマー骨格を基盤した人工組織を製造して適用した例などを挙げることができる。
【００２４】
デンドリマーは、１９７０年代後半にデンケウォルターによって合成されたポリリジンデンドリマーとして初めて登場して以来、新しいデンドリマーの分子設計とその合成法、その物理化学的特性研究とそれを基にした基礎的応用事例（例えば、自己組み立て、生体模倣システムなど）、その素材と医療分野への応用に対する研究が活発に進行されてきた。デンケウォルターによって合成されたポリリジンデンドリマー構造の例を、下記に示す（特許文献２）。
【００２５】
【化２】
2013535560.tif 000004
【００２６】
また、デンドリマーの種類の中で、ＰＡＭＡＭ（poly(amidoamine)）デンドリマーは、ドナルド・トマリア氏が１９８０年代ダウケミカル社に在職していた当時に開発した物質であって、内部構造は、脂肪族アミン基または脂肪族アミド基で構成されていて、その表面はアミン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基などさまざまな作用基からなっている。例として、コアがエチレンジアミンで、表面がアミン基からなる１〜４世代（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、及びＧ４）ＰＡＭＡＭデンドリマーの構造を下記に示す。
【００２７】
【化３】
2013535560.tif 000005
【００２８】
【化４】
2013535560.tif 000006
【００２９】
【化５】
2013535560.tif 000007
【００３０】
ＰＡＭＡＭデンドリマーは、常用化されたデンドリマーの中で最も生体内適用に相応しいことが知られていて、バイオ医薬分野で多く応用されている。一方、段階別の有機合成と精製過程を通じて合成されるデンドリマーは、原則的に単一分子でなければならないのに、市販中（Dendritech社製造、Sigma-アルドリッチ社販売）のＰＡＭＡＭデンドリマーは、発散（分岐）合成方法で反応物（試薬）を過量投与して透析方法だけで非常に簡略に精製して大量生産されたもので、残余反応物によって目的物と類似の所望しない副産物が比較的多く生成されて、化学構造上不完全で異質性（polydispersity index(PDI),ca.1.01~1.1）の問題のため、単一分子水準の正確な構造分析が不可能である。したがって、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、該当の生物分野の応用研究の目標に符合する最適の生体適合性単一分子デンドリマーを設計して合成する以前に、デンドリマーの導入可能性を速かに打診するための基本検証の次元で使用することが適切であると思われる。
【００３１】
現在まで、デンドリマー基盤のヨード系ＣＴ用造影剤の例は多く知られていないが、それは製造方法がとても長くて複雑であり、費用が多くかかって、比較的毒性がひどく、低分子物質に比べて所望する程度の造影効果の持続時間が長く延長されず、造影効果もそれほど優秀ではないからであると推定される（非特許文献１０、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【００３２】
一方、類似の脈絡によってデンドリマー基盤ＭＲＩ用造影剤は、さらに多くの研究が行なわれてきて、参考に現在病院で患者に投与される代表的な単一低分子化合物のＭＲＩ血管造影剤であるＧｄ−ＤＴＰＡ（gadopentetate dimeglumine；商標名：マグネビスト（Magnevist））を開発したバイエルシェリング社は、最も先にデンドリマーを基盤にしたＭＲＩ用血管造影剤を開発して特許を出願（特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３）し、現在「Gadomer-17」（あるいは、「Gd-DTPA-17」または「SH L643A」と呼ばれる；非特許文献１３、非特許文献１４）に対する臨床試験が進行中である。
【００３３】
したがって、現在臨床で使用されるヨードを含有した低分子ＣＴ用造影剤が有した問題点を解決することができ、製造方法が比較的簡単であり、費用が安くて、造影剤として相応しい物理化学的特性を有していて、毒性がほとんどなくて、造影時間が充分に確保されて心血関係疾患診断に有利で、適切な時点に安全な経路で大部分の体外排出が成され、造影効果が優れたヨードを含有した放射形状の高分子化合物を含有するＣＴ用造影剤の開発が切実に求められている。
【００３４】
それで、本発明者は前記問題点を解決するＣＴ用造影剤に関して研究中、生体適合性高分子が、中心核及び内部に置換されたヨード含有化合物を取り囲む保護膜を形成することを特徴とする、ヨードを含有した放射形状の高分子化合物が既存のヨードを含有した低分子造影剤化合物に比べて、造影効果持続時間が顕著に向上して、中心核の表面近くに置換された毒性と各種異常反応を起こす素地があるヨード含有化合物を、比較的長さが長い生体適合性高分子鎖の層で取り囲む保護膜を形成して、それらの外部環境への露出を防止することによって体内毒性を減少させるだけでなく、大食細胞による早期の吸収を防止して体内循環時間を延長して、体内注入後の適切な時間の経過後に体外排出がなされて、製造方法及び精製方法が非常に簡単で高収率及び低費用で大量生産が可能であり、多分散性が非常に低くて製造と効果面で再現性が高く、製造されるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の構造が、すべて共有結合からなっていて構造的にも非常に安定していることを確認して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３５】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００３４５２号公報書
【特許文献２】米国特許第４，４１０，６８８号明細書
【特許文献３】ＰＣＴ／ＥＰ９４／０４２４５号公報
【特許文献４】ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２４５０号公報
【特許文献５】ＰＣＴ／ＦＲ９２／０１１３５号公報
【特許文献６】ＰＣＴ／ＥＰ９４／６４８２０３号公報
【特許文献７】ＰＣＴ／ＥＰ９５／７３０５７３号公報
【特許文献８】ＰＣＴ／ＥＰ９５／７８２６３号公報
【特許文献９】欧州特許第４３０８６３号明細書
【特許文献１０】国際公開第９７／０２０５１号公報
【特許文献１１】国際公開第９８／２４７７５号公報
【特許文献１２】国際公開第９８／２４７７４号公報
【特許文献１３】米国特許第５９１１９７１号明細書
【非特許文献】
【００３６】
【非特許文献１】J. Zhengら, Mol. Pharmaceutics, 2009年, 第6巻, p.571-580
【非特許文献２】A. Sachseら, Invest. Radiol. 1997年, 第32巻, p.44-50
【非特許文献３】E. Sameiら, Int. J. Nanomedicine, 2009年, 第4巻, p.277-282
【非特許文献４】C.-Y. Kaoら, Acad. Radiol. 2003年, 第10巻, p.475-483
【非特許文献５】V. S. Trubetskoyら, J. Drug Target. 1997年, 第4巻, p.381-388
【非特許文献６】V. P. Torchilinら, Acad. Radiol. 1999年, 第6巻, p.61-65
【非特許文献７】F. Hyafilら, Nat. Med. 2007年, 第13巻, p.636-641
【非特許文献８】I.-C. Sunら, Chem. Eur. J. 2009年, 第15巻, p.13341-13347
【非特許文献９】M. H. Ohら, J. Am. Chem. Soc. 2011年, 第133巻, p.5508-5515
【非特許文献１０】W. Krauseら, Top. Curr. Chem. 2000年, 第210巻, p.261-308
【非特許文献１１】A. T. Yordanovら, Nano Lett. 2002年, 第2巻, p.595-599
【非特許文献１２】Y. Fu.ら, Bioconjugate Chem. 2006年, 第17巻, p.1043-1056
【非特許文献１３】K. Naelら, J. Magn. Reson. Imaging, 2007年, 第25巻, p.66-72
【非特許文献１４】B. Misselwitzら, Magn. Reson. Mater. Phys. Biol. Med. 2001年, 第12巻, p.128-134
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
本発明の目的は、ヨードを含有した放射形状の高分子化合物を提供することである。
【００３８】
本発明の他の目的は、前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供することである。
【００３９】
本発明のまた他の目的は、前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物を含有するＣＴ用造影剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
前記目的を達成するために、本発明は円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物で構成される中心核、前記中心核に直接またはペプチドを通じて結合されるヨード含有化合物、及び前記中心核に直接またはペプチドを通じて結合されるか、または前記中心核に結合されたヨード含有化合物に直接結合される生体適合性高分子を含有し、前記中心核及びヨード含有化合物が生体内で露出しないように前記生体適合性高分子が保護膜を形成する構造を有するヨードを含有した放射形状の高分子化合物を提供する。
【００４１】
また、本発明は円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物で構成される中心核の表面作用基の一部に生体適合性高分子が結合されるように反応させる工程（工程１）、及び前記工程１の中心核で未反応の表面作用基にヨード含有化合物が直接またはペプチドを通じて結合されるように反応させる工程（工程２）を含む前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供する。
【００４２】
さらに、本発明は円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物で構成される中心核の表面作用基の一部にヨード含有化合物が結合されるように反応させる工程（工程１）、及び前記工程１で中心核に結合されたヨード含有化合物に生体適合性高分子が結合されるように反応させる工程（工程２）を含む前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供する。
【００４３】
また、本発明はヨード含有化合物が生体適合性高分子とペプチドを通じて結合されるように反応させる工程（工程１）、及び前記工程１でペプチドを通じて生体適合性高分子に結合されたヨード含有化合物が円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物で構成される中心核の表面作用基に結合するように反応させる工程（工程２）を含む前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供する。
【００４４】
さらに、本発明は前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物を有効成分として含むＣＴ用造影剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物は、既存のヨードを含有した低分子造影剤化合物に比べて造影効果の持続時間が顕著に向上して、中心核の表面近くに置換された毒性と各種異常反応を起こす素地があるヨード含有化合物を比較的長さが長い生体適合性高分子鎖の層で取り囲む保護膜を形成して、それらの外部環境への露出を防止することによって体内毒性を減少させるだけでなく、大食細胞による早期の吸収を防止して体内循環時間を延長し、体内注入後の適切な時間の経過後に体外排出がなされて、製造方法及び精製方法が非常に簡単で高収率及び低費用で大量生産が可能であり、多分散性が非常に低くて製造と効果面で再現性が高く、製造されるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の構造がすべて共有結合からなっていて構造的でも非常に安定であるので、ＣＴ用造影剤の製造に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の一実施例による化合物の細胞毒性を測定したグラフである。（ａ：実施例１、ｂ：実施例２、ｃ：実施例３、ｄ：実施例４）
【図２】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤の２Ｄ  Ｘ線瞬間撮影画像である。
【図３】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの冠状面を０〜４時間間隔でマイクロＣＴを用いて撮影したイメージである。
【図４】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの冠状面を８〜４８時間間隔でマイクロＣＴを用いて撮影したイメージである。
【図５】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの矢状面を０〜４時間間隔でマイクロＣＴを用いて撮影したイメージである。
【図６】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの矢状面を８〜４８時間間隔でマイクロＣＴを用いて撮影したイメージである。
【図７】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの胸部と腹部の冠状面をマイクロＣＴを用いて撮影した画像で、大静脈及び肝臓部位での信号強度の推移を比較するためのイメージである。
【図８】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの胸部と腹部の冠状面をマイクロＣＴを用いて撮影した画像で、心臓部位での信号強度の推移を比較するためのイメージである。
【図９】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの脳部位の冠状面をマイクロＣＴを用いて撮影したイメージである。
【図１０】本発明の一実施例による化合物を含有したＣＴ用造影剤を投与したネズミの脳部位の矢状面をマイクロＣＴを用いて撮影したイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００４８】
本発明は、円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物で構成される中心核；
前記中心核に直接またはペプチドを通じて結合されるヨード含有化合物、及び
前記中心核に直接またはペプチドを通じて結合されるか、または前記中心核に結合されたヨード含有化合物に直接結合される生体適合性高分子を含有するが、前記中心核及びヨード含有化合物が生体内に露出しないように前記生体適合性高分子が保護膜を形成する構造を有する、ヨードを含む放射形状の高分子化合物を提供する。
【００４９】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物において、前記中心核を構成する円形または球形の対称形低分子化合物は、α−、β−及びγ−シクロデキストリン、グルコース、ガラクトース、マンノース及びそれらの誘導体からなる群から選択されるいずれか１種の炭水化物、ポルフィリン（porphyrin）及びその誘導体、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）及びその誘導体、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システイン、及びチロシンからなる群から選択されるいずれか１種以上のペプチドが２〜４個連結して形成された環状ペプチド及びそれらの誘導体を使用することができ、
前記中心核を構成する放射形の高分子化合物は、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリグルタミン酸デンドリマー、ポリアスパラギン酸デンドリマー、ポリグリセロ−ルデンドリマー及びポリメラミンデンドリマーからなる群から選択されるいずれか１種のデンドリマー、ポリリジン、ポリエステル、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及びポリグリセロ−ルからなる群から選択されるいずれか１種の高次分枝型高分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその共重合体誘導体からなる群から選択されるいずれか１種の星形の高分子及びそれらの誘導体を使用することができる。
【００５０】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物において、前記ヨード含有化合物の好ましい例として、下記の化学式２、３、４及び１０で表される化合物を使用することができる。
【００５１】
【化６】
2013535560.tif 000008
【００５２】
【化７】
2013535560.tif 000009
【００５３】
【化８】
2013535560.tif 000010
【００５４】
【化９】
2013535560.tif 000011
【００５５】
前記化学式２〜４または化学式１０において、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、または選択的に、−ＮＨ２、−ＮＨＲ４、−ＮＲ４２、−ＮＨＮＨ２、−ＮＨＮＨＲ４、−ＮＨＮＲ４２、−ＯＨ、−ＯＲ４、−ＳＨまたは−ＳＲ４で、
Ｒ４は、−Ｈ、−Ｂｏｃ、Ｃ１−６の置換または置換されない直鎖または分枝鎖アルキルまたはヘテロアルキル、または置換または置換されないＣ５−７のアリールまたはヘテロアリールで、
Ｒ５は、Ｒ４と同じか、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＲ４または−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ４２である。
【００５６】
ここで、前記化学式２、３及び４のヨード含有化合物は、下記の化学式１及び化学式９で表されるヨード化合物を前駆体にして製造することができる。
【００５７】
【化１０】
2013535560.tif 000012
【００５８】
【化１１】
2013535560.tif 000013
【００５９】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物において、前記生体適合性高分子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、ヘパリン及びそれらの誘導体を使用することができる。
【００６０】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物において、前記ペプチドは、ジリジン、トリリジン、テトラリジン、ジグルタミン酸、トリグルタミン酸、テトラグルタミン酸、ジアスパラギン酸、トリアスパラギン酸、テトラアスパラギン酸、ジシステイン、トリシステイン、テトラシステイン、ジセリン、トリセリン、及びテトラセリンからなる群から選択される１種の繰り返し単位が２〜４個であるペプチドである。
【００６１】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物において、前記中心核、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子が互いに連結される場合、前記連結部位は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−または
【００６２】
【化１２】
2013535560.tif 000014
【００６３】
を挙げることができる。
【００６４】
さらに、前記連結部位の両末端は追加的にそれぞれ独立してまたは選択的に、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ３−２０のシクルロアルキル−（ＣＨ２）ｍ−、Ｃ４−２０のアリール−（ＣＨ２）ｍ−及び−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−からなる群から選択されるいずれか一つを通じて前記中心核、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子と連結することができ、ここで前記ｍは、０〜１０の整数であるものを使用することができる。
【００６５】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物において、前記中心核はペプチド、ヨード含有化合物または生体適合性高分子と結合することができるアミン基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアミン基、カルボキシル基、カルボキシヒドラジド基、ヒドラジン基、チオール基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン基、アルデヒド基、ケトン基、エポキシ基、３−カルボメトキシピロリジノン（3-carbomethoxypyrrolidinone）基、トリ−（Ｃ１−４のアルコキシ）−シリル（tri-(C1-4 alkoxy)-silyl）基などの表面作用基を一つ以上有する。
【００６６】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物は、平均分子量が８，０００〜１５０，０００Ｄａであることが好ましい。万一、平均分子量が８，０００Ｄａ未満の場合には、血管内の長期間循環が充分に成り立たないで低分子化合物と類似に腎臓を通じて比較的早く排出される心配があり、１５０，０００Ｄａを超過する場合には、高い粘度による血管での注入時の難しさと体内異常反応（ショック、アレルギーなど）の発生可能性が増加、高い毒性による肝臓での蓄積増加、体外排出の難しさ（非常に長い半減期）などの問題がある。
【００６７】
本発明の実施例１〜４で作られたＧ１、Ｇ２、Ｇ３、及びＧ４ＰＡＭＡＭデンドリマーを中心核に使用した高分子化合物１ｃ、２ｃ、３ｃ、及び４ｃの１Ｈ  ＮＭＲ及びＩＣＰ−ＭＳによるヨード含量を根拠した理論的な平均分子量が、それぞれおおよそ１０，０００、１８，０００、４０，０００、及び８６，０００Ｄａで、多分散性のＰＡＭＡＭデンドリマーとＰＥＧを含有した最終化合物であることを考慮する時（実施例１〜４のＭＡＬＤＩ−ＭＳ参照）、８，０００〜１５０，０００Ｄａで範囲とすることが妥当である。
【００６８】
参考に、実施例の中で最も分子量が小さな実施例１の化合物１ｃの場合、図３に示されたように造影剤注入後の比較的早い時間内に（１時間経過参照）すでに相当量が腎臓で見られ、最も分子量が大きい実施例４の化合物４ｃの場合、注入時に実施例２の化合物２ｃや実施例３の化合物３ｃに比べて造影剤溶液がもう少しどろどろしているように感じられ、前記造影剤を作った濃度で緩衝液に溶解するのも、化合物１ｃ、２ｃ、及び３ｃに比べてずっと難しく、ここで相対的にさらに多くの熱を発生しながらさらに長い時間超音波粉砕処理をしなければならず、本発明と類似の方式にしたがって化合物４ｃよりさらに分子量が大きい高分子化合物を作ることは、ＣＴ用造影剤として相応しくないと判断される。
【００６９】
実際、Ｇ５ＰＡＭＡＭデンドリマーを基盤にした物質を製造し、合成と物質分析は行なったが、造影剤として使用するために緩衝液に該当の濃度で溶解させるのには困難が多く、実際の注入実験に使用することができなかった。また、ＰＤＩ（polydispersity index）が相対的に非常に高く、化合物の均一度が下がってそれほど有用ではない物質であると判断された。
【００７０】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の好ましい例として、化学式５ないし８で表される化合物を使用することができる。
【００７１】
【化１３】
2013535560.tif 000015
【００７２】
【化１４】
2013535560.tif 000016
【００７３】
【化１５】
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【００７４】
【化１６】
2013535560.tif 000018
【００７５】
前記化学式５ないし化学式８において、
前記中心核は、α−、β−及びγ−シクロデキストリン、グルコース、ガラクトース及びマンノースからなる群から選択されるいずれか１種の環状炭化水素、ポルフィリン及びその誘導体、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）及びその誘導体、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システイン、及びチロシンからなる群から選択されるいずれか１種以上のペプチドが２〜４個連結して形成された環状ペプチド、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリグルタミン酸デンドリマー、ポリアスパラギン酸デンドリマー、ポリグリセロ−ルデンドリマー及びポリメラミンデンドリマーからなる群から選択されるいずれか１種のデンドリマー、ポリリジン、ポリエステル、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及びポリグリセロ−ルからなる群から選択されるいずれか１種の高次分枝型高分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその共重合体誘導体からなる群から選択されるいずれか１種の星形の高分子及びそれらの誘導体で、
Ｔ１及びＴ２はヨード含有化合物であって、Ｔ１は
【００７６】
【化１７】
2013535560.tif 000019
【００７７】
【化１８】
2013535560.tif 000020
【００７８】
【化１９】
2013535560.tif 000021
【００７９】
または
【００８０】
【化２０】
2013535560.tif 000022
【００８１】
で、Ｔ２は
【００８２】
【化２１】
2013535560.tif 000023
【００８３】
または
【００８４】
【化２２】
2013535560.tif 000024
【００８５】
で、ここで前記Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立してまたは選択的に、
−ＮＨ−、−ＮＲ４−、−ＮＮＨ２−、−ＮＮＨＲ４−、−ＮＮＲ４２−、−Ｏ−または−Ｓ−で、Ｒ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ４、−ＮＲ４２、−ＮＨＮＨ２、−ＮＨＮＨＲ４、−ＮＨＮＲ４２、−ＯＨ、−ＯＲ４、−ＳＨまたは−ＳＲ４で、前記Ｒ４は、−Ｈ、−Ｂｏｃ、Ｃ１−６の直鎖または分枝鎖アルキル、または非置換または置換されたＣ５−７のアリールまたはヘテロアリールで、前記Ｒ５はＲ４と同じか、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ４、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＲ４または−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ４２で、
Ｄは、ペプチドであって、ジリジン、トリリジン、テトラリジン、ジグルタミン酸、トリグルタミン酸、テトラグルタミン酸、ジアスパラギン酸、トリアスパラギン酸、テトラアスパラギン酸、ジシステイン、トリシステイン、テトラシステイン、ジセリン、トリセリン、及びテトラセリンからなる群から選択される１種の繰り返し単位が２〜４個であるペプチドで、
Ｐは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、ヘパリンまたはそれらの誘導体で、
Ｘは、前記中心核の表面作用基であって、
アミン基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアミン基、カルボキシル基、カルボキシヒドラジド基、ヒドラジン基、チオール基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン基、アルデヒド基、ケトン基、エポキシ基、３−カルボメトキシピロリジノン（3-carbomethoxypyrrolidinone）基、トリ−（Ｃ１−４のアルコキシ）−シリル（tri-(C1-4 alkoxy)-silyl）基で、
Ｌ１及びＬ２は、前記中心核、ヨード含有化合物（Ｔ１またはＴ２）、ペプチド（Ｄ）または生体適合性高分子（Ｐ）の間の連結部位として、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−または
【００８６】
【化２３】
2013535560.tif 000025
【００８７】
で、前記連結部位の両末端は追加的にそれぞれ、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ３−２０のシクルロアルキル−（ＣＨ２）ｍ−、Ｃ４−２０のアリール−（ＣＨ２）ｍ−及び−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−からなる群から独立してまたは選択的に選択されるいずれか一つを通じて前記中心核、ヨード含有化合物、ペプチドまたは生体適合性高分子と連結され、ここで前記ｍは、０〜１０の整数で、
ａ及びｂはそれぞれ独立してまたは選択的に、０または１の整数で、
ｃは２〜４の整数で、
ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ及びｉはそれぞれ独立してまたは選択的に、２ないし６０の整数で、
ｊは１〜１０の整数である。
【００８８】
ここで、前記化学式７及び化学式８の場合、前記生体適合性高分子がＰＥＧの場合には、中心核から外部に向かう末端が、Ｃ１−４のアルコキシ基であるものを使用することが好ましい。
【００８９】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の好ましい例として、前記化学式５ないし８で表される化合物をさらに具体的に説明するため、下記のそのイメージを示した。
【００９０】
【化２４】
2013535560.tif 000026
【００９１】
前記のイメージで、
Ａの場合には、中心核（灰色の大きい円）にそれぞれヨード含有化合物（赤色の小さい円）と生体適合性高分子（緑の長い波線）を結合させることで化学式５の化合物をイメージ化したもので、
Ｂの場合には、中心核に結合されたヨード含有化合物に生体適合性高分子を結合させることで化学式６の化合物をイメージ化したもので、
Ｃの場合には、２〜４個のヨード含有化合物が束で置換されたペプチド（青色の短い波線）及び生体適合性高分子を中心核に独立的に結合させることで化学式７の化合物をイメージ化したもので、
Ｄの場合には、中心核に結合された２〜４個のヨード含有化合物が束で置換されたペプチドに生体適合性高分子を結合させることで化学式８の化合物をイメージ化したものである。
【００９２】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物は、既存のヨードを含有した低分子造影剤化合物と比較して造影効果の持続時間が顕著に向上し、中心核表面近くに置換された毒性と各種異常反応を起こす素地があるヨード含有化合物を、比較的長さが長い生体適合性高分子鎖の層で取り囲む保護膜を形成して、それらの外部環境への露出を防止することによって体内毒性を減少させるだけでなく、大食細胞による早期の吸収を防止して体内循環時間を延長して、体内注入後の適切な時間の経過後に体外排出がなされて、製造方法及び精製方法が非常に簡単で高収率及び低費用で大量生産が可能であり、多分散性が非常に低くて製造と効果の面で再現性が高く、製造されるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の構造が、すべて共有結合で成り立っていて構造的にも非常に安定であるので、ＣＴ用造影剤の製造に有用に用いることができる。
【００９３】
また、本発明は円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核の表面作用基の一部に生体適合性高分子が結合するように反応させる工程（工程１）、及び
前記工程１の中心核で未反応の表面作用基にヨード含有化合物が直接またはペプチドを通じて結合するように反応させる工程（工程２）を含有する、前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供する。
【００９４】
さらに、本発明は円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核の表面作用基一部にヨード含有化合物が結合するように反応させる工程（工程１）；及び
前記工程１で中心核に結合されたヨード含有化合物に生体適合性高分子が結合するように反応させる工程（工程２）を含有する前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供する。
【００９５】
また、本発明はヨード含有化合物が生体適合性高分子とペプチドを通じて結合するように反応させる工程（工程１）；及び
前記工程１でペプチドを通じて生体適合性高分子に結合されたヨード含有化合物が円形または球形の対称形低分子化合物、または放射形の高分子化合物からなる中心核の表面作用基に結合するように反応させる工程（工程２）を含有する前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法を提供する。
【００９６】
本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物の製造方法において、前記円形または球形の対称形低分子化合物、放射形の高分子化合物、表面作用基、ヨード含有化合物、ペプチド、生体適合性高分子の例は上述したとおりである。
【００９７】
本発明の一実施例による製造方法において、中心核の表面作用基の一部に生体適合性高分子を約１５〜５０％程度に結合させた後、過量のヨード含有化合物を投与して反応しないで残っている中心核の表面作用基に結合させて、放射形状の高分子化合物中のヨード含量が約１５〜５０％程度になるように調節することができる。
【００９８】
また、本発明は前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物を有効成分として含有するＣＴ用造影剤組成物を提供する。
【００９９】
ここで、前記ヨードを含有した放射形状の高分子化合物は、ヨード含量が１５〜５０％であることが好ましい。万一、ヨードを含有した放射形状の高分子化合物中のヨード含量が１５％未満の場合には造影効果が十分ではなく、過量の造影剤を投与しなければならないので、生体内注入時の異常反応発生の可能性が高いという問題があり、５０％を超過する場合には毒性が増加して生体注入用として使用し難いという問題がある。
【０１００】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するためのみに提供するものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。
【０１０１】
＜製造例１＞環化された中性のフタルイミド誘導体（８）の製造
【０１０２】
【化２５】
2013535560.tif 000027
【０１０３】
化合物６（ＴＩＰＮ，２．４０ｇ，３．６８ｍｍｏｌ）及び化合物７（Ｎ−ターシャリ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン，２００ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．０ｍｌ）に溶解して、そこにトリエチルアミン（０．５０ｍｌ，３．５９ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を４０℃で１６時間撹拌した。前記未精製反応生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ３６ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）でＤＭＦでろ過してＤＭＳＯを除去して、減圧下で溶媒を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（１０：１  ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン）を行って目的化合物８を黄色い粉末で得た（６０．１ｍｇ，７５．７μｍｏｌ，６％）。
【０１０４】
Rf:0.63[シリカゲル,10:1 CH2Cl2/アセトン];
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 6.89 (t, 1H, J = 6.4 Hz, H3), 3.60 (t, 2H, J = 5.6 Hz, H1), 3.14 (q, 2H, J = 5.8 Hz, H2), 1.29 (s, 9H, H4);
13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) d 164.1, 155.7, 135.4, 134.4, 104.0, 77.7, 38.9, 37.5, 28.1;
HRMS (ESI) Calcd for C15H14N2O4I4Na (M + Na)+: 816.7030, Found: 816.7028。
【０１０５】
＜製造例２＞環化された中性のフタルイミド誘導体（１０）の製造
【０１０６】
【化２６】
2013535560.tif 000028
【０１０７】
化合物６（ＴＩＰＮ，３．８４ｇ，５．８９ｍｍｏｌ）及び化合物９（エチルアルコールアミン、３００ｍｇ，４．９１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８ｍｌ）に溶解させた溶液にトリエチルアミン（０．８２ｍｌ，５．８８ｍｍｏｌ）を添加して、５０℃に加熱して１９時間撹拌した。前記反応混合物からＤＭＳＯ溶媒を除去するために、移動相にＤＭＦを使用したＳＥＣカラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ３６ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）で分離して、減圧下で濃縮させて得た生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１０：１  ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン）で精製して、化合物１０を黄色い粉末で得た（１．１１ｇ，１．６０ｍｍｏｌ，３３％）。
【０１０８】
化合物６（ＴＩＰＮ，３．８４ｇ，５．８９ｍｍｏｌ）及び化合物９（エチルアルコールアミン，３００ｍｇ，４．９１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８．０ｍｌ）に溶解して、そこにトリエチルアミン（０．８２ｍｌ，５．８８ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を５０℃で１９時間撹拌した。前記未精製反応生成物をＳＥＣカラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ３６ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）でＤＭＦでろ過してＤＭＳＯを除去して、減圧下で溶媒を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（１０：１  ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン）を行って目的化合物１０を黄色い粉末で得た（１．１１ｇ，１．６０ｍｍｏｌ，３３％）。
【０１０９】
Rf:0.37 [silica gel,10:1 CH2Cl2/アセトン];
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 3.62 (t, 2H, J = 5.8 Hz, H1), 3.55 (q, 2H, J = 5.8 Hz, H2);
13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) d 164.2, 135.5, 134.4, 104.0, 57.5, 41.3。
【０１１０】
＜実施例１＞Ｇ１  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（１ｃ）の製造
【０１１１】
【化２７】
2013535560.tif 000029
【０１１２】
工程１：Ｇ１  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００結合体（１ｂ）の製造
【０１１３】
【化２８】
2013535560.tif 000030
【０１１４】
アルドリッチ社から購入したＧ１  ＰＡＭＡＭデンドリマー（１ａ）を真空状態で乾燥してメタノールを除去した。前記化合物１ａ（１．３１ｇ，０．９１６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍｌ）に溶解させて、撹拌中の前記溶液にｍＰＥＧカーボネート化合物５（４．９５ｇ，２．２７ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌した後、メタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO1000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣカラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）でＤＭＦで精製して、真空状態で乾燥して化合物１ｂを溶媒の一部が含まれたまま得た（５．６５ｇ）。
【０１１５】
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 8.12-7.87 (m, NHG0 and NHG1), 7.22 (br s, 2.94H, NHPEG of major isomer), 6.80 (br s, 0.34H, NHPEG of minor isomer), 4.04 (t, 6.17H, J = 4.7 Hz, Hh), 3.62-3.39 (m, 667.57H, Hi, Hj, and Hk), 3.24 (s, Hl), 3.10-2.99 (m, 33.53H, Hd, Hf, HfPEG, and HgPEG), 2.66-2.58 (m, 33.08H, Hb and Hg), 2.43 (m, 11.86H, He and Ha), 2.19 (m, 24.00H, Hc);
MS (MALDI-TOF, DHB matrix) Mn 7698.11, Mw 7747.40, PDI 1.01;
MS (MALDI-TOF, THAP matrix) Mn 7757.35, Mw 7795.41, PDI 1.00。
【０１１６】
工程２：Ｇ１  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（１ｃ）の製造
前記工程１で得た化合物１ｂ溶液（５．６５ｇ）及び４，５，６，７−テトラヨードベンゾフラン−１，３−ジオン（６）（ＴＩＰＮ，５．９０ｇ，９．０５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍｌ）に溶解して、そこにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，２．４０ｍｌ，１３．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌して、そこに追加でＴＩＰＮ（３．００ｇ，４．６０ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、反応混合物を常温で２４時間撹拌した。前記反応混合物をメタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO1000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣ（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）で精製した。前記で精製された生成物を合わせてＳＥＣカラム（Sephadex LH-20，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．３．０ｃｍ）でろ過して残っているＤＭＦを除去して、エチルアルコール（８０ｍｌ）に溶解してシリンジフィルター（モデル：Puradisc25 Syringe Filter，細孔サイズ０．４５μｍ，ＰＴＦＥ，製造社：ワットマン）で滅菌ろ過した後、真空状態で３日間乾燥させて目的化合物１ｃを得た（３．８９ｇ）。
【０１１７】
ヨード含量（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ＩＣＰ−ＭＳ）：２０．７％。
【０１１８】
＜実施例２＞Ｇ２  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（２ｃ）の製造
【０１１９】
【化２９】
2013535560.tif 000031
【０１２０】
工程１：Ｇ２  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００コンジュゲート（２ｂ）の製造
【０１２１】
【化３０】
2013535560.tif 000032
【０１２２】
アルドリッチ社から購入したＧ２  ＰＡＭＡＭデンドリマー（２ａ）を真空状態で乾燥してメタノールを除去した。前記化合物２ａ（１．３２ｇ，０．４０５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（９０ｍｌ）に溶解させて、撹拌中の前記溶液にｍＰＥＧカーボネート化合物５（３．９４ｇ，１．８１ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌した後、メタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO3500，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣカラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）でＤＭＦで精製して、真空状態で乾燥して化合物２ｂを溶媒の一部が含まれたまま得た（５．２０ｇ）。
【０１２３】
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 8.03-7.83 (m, NHG0, NHG1, and NHG2), 7.21 (br s, 4.50H, NHPEG of major isomer), 6.80 (br s, 0.60H, NHPEG of minor isomer), 4.04 (t, 8.61H, J = 4.6 Hz, Hh), 3.62-3.39 (m, 925.04H, Hi, Hj, and Hk), 3.24 (s, Hl), 3.10-3.00 (m, 70.07H, Hd, Hf, HfPEG, and HgPEG), 2.65 (m, 52.49H, Hb), 2.57 (m, 19.21H, Hg), 2.43 (m, 27.58H, He and Ha), 2.20 (m, 56.00H, Hc);
MS (MALDI-TOF, THAP matrix) Mn 11742.14, Mw 11785.30, PDI 1.00。
【０１２４】
工程２：Ｇ２  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（２ｃ）の製造
前記工程１で得た化合物２ｂ溶液（５．２０ｇ）及びＴＩＰＮ（６）（１．８９ｇ，２．９０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（９４ｍｌ）に溶解して、そこにＤＩＥＡ（０．８０ｍｌ，４．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌して、そこに追加でＴＩＰＮ（９９０ｍｇ，１．５２ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、反応混合物を常温で２４時間撹拌した。前記反応混合物をメタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO8000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣ（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ  ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）で精製した。前記で精製された生成物を合わせてＳＥＣカラム（Sephadex LH-20，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．３．０ｃｍ）でろ過して残っているＤＭＦを除去して、エチルアルコール（８０ｍｌ）に溶解してシリンジフィルター（モデル：Puradisc25 Syringe Filter，細孔サイズ０．４５μｍ，ＰＴＦＥ，製造社：ワットマン）で滅菌ろ過した後、真空状態で３日間乾燥させて目的化合物２ｃを得た（３．０４ｇ）。
【０１２５】
ヨード含量（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ＩＣＰ−ＭＳ）：２３．０％。
【０１２６】
＜実施例３＞Ｇ３  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（３ｃ）の製造
【０１２７】
【化３１】
2013535560.tif 000033
【０１２８】
工程１：Ｇ３  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００コンジュゲート（３ｂ）の製造
【０１２９】
【化３２】
2013535560.tif 000034
【０１３０】
アルドリッチ社から購入したＧ３  ＰＡＭＡＭデンドリマー（３ａ）を真空状態で乾燥してメタノールを除去した。前記化合物３ａ（１．１６ｇ，０．１６８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１１２ｍｌ）に溶解させて、撹拌中の前記溶液にｍＰＥＧカーボネート化合物５（３．２７ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌した後、メタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO1000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣカラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）でＤＭＦで精製して、真空状態で乾燥して化合物３ｂを溶媒の一部が含まれたまま得た（３．２９ｇ）。
【０１３１】
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 8.13-7.83 (m, NHG0, NHG1, NHG2, and NHG3), 7.22 (br s, 8.98H, NHPEG of major isomer), 6.80 (br s, 1.16H, NHPEG of minor isomer), 4.04 (t, 17.51H, J = 4.5 Hz, Hh), 3.62-3.39 (m, 1846.66H, Hi, Hj, and Hk), 3.24 (s, Hl), 3.10-2.99 (m, 149.85H, Hd, Hf, HfPEG, and HgPEG), 2.66-2.59 (m, 146.61H, Hb and Hg), 2.43 (m, 56.55H, He and Ha), 2.20 (m, 120.00H, Hc);
MS (MALDI-TOF, DHB matrix) Mn 21045.06, Mw 22307.71, PDI 1.06。
【０１３２】
工程２：Ｇ３  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（３ｃ）の製造
前記工程１で得た化合物３ｂ溶液（３．２４ｇ）及びＴＩＰＮ（６）（３．８６ｇ，５．９２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍｌ）に溶解して、そこにＤＩＥＡ（１．５０ｍｌ，８．６１ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌して、そこに追加でＴＩＰＮ（１．９３ｇ，２．９６ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、反応混合物を常温で２４時間撹拌した。前記反応混合物をメタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO1000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣ（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）で精製した。前記で精製された生成物を合わせてＳＥＣカラム（Sephadex LH-20，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．３．０ｃｍ）でろ過して残っているＤＭＦを除去して、エチルアルコール（８０ｍｌ）に溶解してシリンジフィルター（モデル：Puradisc25 Syringe Filter，細孔サイズ０．４５μｍ，ＰＴＦＥ，製造社：ワットマン）で滅菌ろ過した後、真空状態で３日間乾燥させて目的化合物３ｃを得た（３．３２ｇ）。
【０１３３】
ヨード含量（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ＩＣＰ−ＭＳ）：２６．５％。
【０１３４】
＜実施例４＞Ｇ４  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（４ｃ）の製造
【０１３５】
【化３３】
2013535560.tif 000035
【０１３６】
工程１：Ｇ４  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００結合体（４ｂ）の製造
【０１３７】
【化３４】
2013535560.tif 000036
【０１３８】
アルドリッチ社から購入したＧ４  ＰＡＭＡＭデンドリマー（４ａ）を真空状態で乾燥してメタノールを除去した。前記化合物４ａ（５７９ｍｇ，０．０４０７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２７ｍｌ）に溶解させて、撹拌中の前記溶液にｍＰＥＧカーボネート化合物５（１．９４ｇ，０．８９０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌した後、メタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO1000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣカラム（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）でＤＭＦで精製して、真空状態で乾燥して化合物４ｂを溶媒の一部が含まれたまま得た（１．６７ｇ）。
【０１３９】
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 8.04-7.81 (m, NHG0, NHG1, NHG2, NHG3, and NHG4), 7.22 (br s, 20.62H, NHPEG of major isomer), 6.81 (br s, 2.90H, NHPEG of minor isomer), 4.03 (t, 39.80H, J = 4.5 Hz, Hh), 3.62-3.39 (m, 4330.96H, Hi, Hj, and Hk), 3.24 (s, Hl), 3.11-2.99 (m, 310.94H, Hd, Hf, HfPEG, and HgPEG), 2.68-2.61 (m, 299.21H, Hb and Hg), 2.43 (m, 104.94H, He and Ha), 2.20 (m, 248.00H, Hc);
MS (MALDI-TOF, DHB matrix) Mn 44435.05, Mw 46195.16, PDI 1.04。
【０１４０】
工程２：Ｇ４  ＰＡＭＡＭ−ｍＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（４ｃ）の製造
前記工程１で得た化合物４ｂ溶液（１．６３ｇ）及びＴＩＰＮ（６）（１．３５ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（３２ｍｌ）に溶解して、そこにＤＩＥＡ（０．５４ｍｌ，３．１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にアルゴンガスを満たした後、前記反応混合物を常温で２日間撹拌して、そこに追加でＴＩＰＮ（６７７ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、反応混合物を常温で２４時間撹拌した。前記反応混合物をメタノール相で６時間撹拌して透析（モデル：Spectra/Por Regenerated Cellulose(RC)membrane,MWCO1000，製造社：スペクトラムラボラトリーズ）を２回実施した。次に、減圧下で溶媒を除去して得られた未精製生成物をＳＥＣ（モデル：Bio-Beads S-X1，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．４．５ｃｍ，製造社：バイオ・ラッド）で精製した。前記で精製された生成物を合わせてＳＥＣカラム（Sephadex LH-20，Ｈ４０ｃｍ×Ｏ．Ｄ．３．０ｃｍ）でろ過して残っているＤＭＦを除去して、エチルアルコール（８０ｍｌ）に溶解してシリンジフィルター（モデル：Puradisc25 Syringe Filter，細孔サイズ０．４５μｍ，ＰＴＦＥ，製造社：ワットマン）で滅菌ろ過した後、真空状態で３日間乾燥させて目的化合物４ｃを得た（１．２７ｇ）。
【０１４１】
ヨード含量（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ＩＣＰ−ＭＳ）：２５．２％。
【０１４２】
＜実験例１＞細胞毒性試験
細胞毒性試験に使用したＨｅＬａ細胞株は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, Manassas,ＶＡ）から購入し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified eagle medium，Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）の雰囲気下の条件で保存した。
【０１４３】
実施例１〜４で製造した真空状態で乾燥した固体のＰＡＭＡＭ−ＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体１ｃ〜４ｃ各１０ｍｇを１．０ｍｌの３次蒸留水（Millipore Milli-Q）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌ濃度の母液を製造した。それぞれの母液は、短く超音波処理して均質化した。次に、無血清ＤＭＥＭ溶液を使用して、１、５、１０、５０、１００及び５００μｇ／ｍｌの濃度で段階的に希釈したサンプルを準備した。ＨｅＬａ細胞は、ウェル当り１×１０３の密度で細胞が存在する９６ウェルプレート（Corning Costar,Cambridge,MA）で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下の条件で２４時間培養した。細胞は、各ウェル当り１００μｌの前記希釈液または１００μｌの無血清ＤＭＥＭ（対照群）で処理して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下の条件でそれぞれ２４、４８及び７２時間培養した。前記製剤は、５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を溶解した無血清ＤＭＥＭに交換して、細胞を追加で４時間培養した。ＭＴＴを吸入除去してＤＭＳＯ（１００μｌ）を各ウェルに加えてホルマザン（formazan）結晶を溶解させた（Mosmann, T., J. Immunol. Methods 1983年,第65巻,Ｐ.55-63）。吸光度は、５７０ｎｍでマイクロプレートリーダー（モデル：BioRad microplate reader，製造社：バイオ・ラッド）を用いて測定し、その結果を図１に示した。前記分析は４回ずつ反復測定した。
【０１４４】
図１に示されたように、実施例１〜４で製造した４種のＣＴ用造影剤化合物１ｃ、２ｃ、３ｃ、及び４ｃは、実施した細胞毒性テスト環境の中で最も極限の条件（５００μｇ／ｍｌの造影剤濃度下で７２時間培養）でも、それぞれ順に８８．５％、８８．４％、８８．４％、及び８７．９％の非常に高い細胞生存率を示し、細胞に対する毒性がほとんどないことが示された。
【０１４５】
したがって、本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物を含有するＣＴ用造影剤の体内安全性が非常に優れていることが分かる。
【０１４６】
＜実験例２＞生体外（インビトロ）マイクロＣＴ撮影評価
実施例１〜４で製造した化合物１ｃ〜４ｃを有効成分として含む造影剤組成物で、生体外マイクロＣＴを撮影した場合の造影効果を調べるために、次のように実験した。
【０１４７】
準備工程：ＣＴ用造影剤組成物の製造
実施例１〜４で製造したそれぞれのＰＡＭＡＭ−ＰＥＧ２０００−ＴＩＰＡＡ結合体（化合物１ｃ、２ｃ、３ｃ、及び４ｃ）を滅菌処理された２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４，０．１ｍｇ／ｍｌ、ＥＤＴＡ含有）に溶解して、２５０ｍｇ／ｍｌ溶液を作った。前記溶液を短く超音波処理して均質化し、すぐ使用しない場合は４℃で保管した。前記溶液を動物に注入する前に、前記溶液を冷蔵庫から取り出しておいて室温に合わせてボルテックス（vortex）でよく振った。
【０１４８】
下記の表１に本発明のＣＴ用造影剤の粘度（３０℃）及び滲透圧の測定結果を整理した。
【０１４９】
【表１】
2013535560.tif 000037
【０１５０】
前記表１で、測定値は平均±標準偏差で示した。それぞれ同一条件下で５回ずつ測定して、最高値と最低値を除いた残り３個のデータに対する平均と標準偏差を求めた。
【０１５１】
生体外（インビトロ）マイクロＣＴ撮影評価
前記準備工程で製造した実施例１〜４の化合物１ｃ、２ｃ、３ｃ、または４ｃを含有するＣＴ用造影剤（２５０ｍｇ／ｍｌ）を生体内に注入するまえに、予備点検でそれらのＸ線吸光度を市販中の人体用及び動物用ＣＴ用造影剤と比較するためにチューブ上で２Ｄ  Ｘ線瞬間撮影画像を得る下記のような実験を行なった。
【０１５２】
ここで、陽性成対照群では血管内注入時に急速な排出がなされる低分子化合物基盤人体用ＣＴ用造影剤である「Iobrix」（テジュン製薬）と血管内注入時に比較的長期間循環が可能なエマルジョンナノ粒子基盤の動物用ＣＴ用造影剤である「Fenestra VC」（ＡＲＴ，カナダ）を使用した。すなわち、それぞれの２５０μｌチューブに前記準備工程で製造したＣＴ用造影剤４種と「Fenestra VC」、「Iobrix」そして、陰性対照群として２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＴＡ含有）各２５０μｌずつを入れ、また空のチューブ一つも陰性対照群として準備した。前記８個のチューブをNFR Polaris-G90インビボマイクロＣＴスキャナー（製造社：NanoFocusRay）の撮影用ベッドに、一列に並べて乗せて、２Ｄ  Ｘ線瞬間撮影画像を撮って［画像パラメーター：60kVp,60mA,500ms exposure time, field of view (FOV) 80.00 × 83.71mm2, 1.4 × magnification］、その結果を図２に示した。
【０１５３】
図２に示されたように、陰性対照群に使用した２０ｍＭトリス緩衝液（Ｘ線透過信号強度：１３５９．５）及び空のチューブ（Ｘ線透過信号強度：１６７６．５）に比べて、すべてのＣＴ用造影剤のＸ線透過率（Ｘ線吸光度に反比例）がずっと低い値を示し、この中で、急速な排出がなされる人体用ＣＴ用造影剤である「Iobrix」が最も高いＸ線吸光度（Ｘ線透過信号強度：１９８．０）を示し、動物用ＣＴ用造影剤である「Fenestra VC」（Ｘ線透過信号強度：８６６．０）と実施例１〜４で製造した化合物１ｃ、２ｃ、３ｃ、及び４ｃを含有したＣＴ用造影剤（Ｘ線透過信号強度：順に９０４．５、８３８．０、８２６．５、及び８２７．０）は、生体外チューブ２Ｄ  Ｘ線瞬間撮影画像においてすべて類似な水準のＸ線吸光度を示した。
【０１５４】
したがって、本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物を含有するＣＴ用造影剤は、造影効果が十分であることが分かる。
【０１５５】
＜実験例３＞生体内（インビボ）マイクロＣＴ撮影評価
実施例１〜４で製造した化合物１ｃ〜４ｃを有効成分として含有した造影剤組成物で生体内マイクロＣＴを撮影した場合の造影効果を調べるために、小型動物用マイクロＣＴ機器を用いて次のように実験した。
【０１５６】
具体的に、実験動物には、１５〜２２ｇの６〜８週齢の元気な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（オリエント・バイオ、韓国）を使用した。マウスは、造影剤を注入の１２時間前から注入後  ４時間経過後まで水と餌を与えないで、造影剤注入後から４時間経過後のＣＴ撮影が終わった直後から水と餌を一緒に与えた。造影剤注入前の陰性対照群として造影剤の注入なしにマウスを３％のイソフルランを含有した酸素雰囲気下の誘導チャンバに５分程度入れて置いて痲酔させた後、マウスをNFR Polaris-G90インビボマイクロＣＴスキャナー（NanoFocusRay，韓国）の撮影用ベッド（bed）に背を上に向けるようにして載せて、１．５％イソフルランを含有した酸素雰囲気下で痲酔状態を維持しながらベースライン（すなわち、precontrast）ＣＴスキャンをした［画像パラメーター：60kVp,60μA,500ms exposure time,360゜scan angle,600scan number,512slices(i.e., image number); FOV:80.00×83.71mm2 for low resolution whole-body imaging (1.4×magnification),33.94×35.52mm2 for mid resolution chest and abdominal imaging(3.3×magnification)、及び26.67×27.90mm2 for high resolution brain imaging(4.2×magnification)］。以後、ベースラインＣＴスキャンを行なったマウスを１．５％イソフルランを含有した酸素雰囲気下で痲酔状態を維持しながら、マウスの尾を温い水に３０〜６０秒ほど浸けて血管を拡張させた後、各造影剤を該当容積程度（実施例１〜４の化合物を含有した造影剤の場合、１５ｍｌ／ｋｇ、陽性対照群「Fenestra VC」の場合は１０ｍｌ／ｋｇ、そして陽性対照群「Iobrix」の場合は２．５ｍｌ／ｋｇ）マウスの尾静脈を通じて徐々に注入した。造影剤注入直後、直ちにマウスをマイクロＣＴ器機の撮影用ベッドに背を上に向けるようにして載せて、１．５％イソフルランを含有した酸素雰囲気下で痲酔状態を維持しながら該当の解像度（low, mid,またはhigh）でＣＴスキャンを行なった。それが注入前のＣＴ画像（０時間）に該当する。
【０１５７】
その後、同じ方式で追加的造影剤の注入なしに各マウスに対するＣＴスキャンを造影剤注入後、１、２、４、８、２４、及び４８時間経過時点で行なった。ＣＴスキャンをしない間は各マウスを徹底的に統制された恒温恒湿環境（２２〜２５℃及び５０〜６０％湿度）の個別ケージに移して回復させた。各造影剤に対して、３〜６匹のマウスを使用して前記記述した注入後の経過時点に全身ＣＴスキャンを行ない、各造影剤別に一匹に対して注入後７日経過後のＣＴスキャンを行なって、この地点で大部分の造影剤が体外に排出されたかどうかを確認した。
【０１５８】
また、本発明によるＣＴ用造影剤に対して１〜２匹のマウスを使用して胸部と腹部（mid resolution）、そして脳部位（high resolution）に対するＣＴスキャンを前述した画像パラメーターで行なって、より高い解像度で本発明のＣＴ用造影剤の造影効果を検討した。各ＣＴスキャン後に得られたロー（raw）画像ファイルは、スキャン終了直後、断面画像の間違いの有無を確認するために、すぐに５１２×５１２ピクセルのＤＩＣＯＭ（digital imaging and communications in medicine）ファイルフォーマットに組換えした。また、Ｌｕｃｉｏｎソフトウエア（Infinitt Healthcare,韓国）を用いて、ＤＩＣＯＭファイルから３Ｄ  ＣＴ画像を得た。
【０１５９】
本発明によるＣＴ用造影剤と陽性対照群に使用した「Fenestra VC」及び「Ｉｏｂｒｉｘ」をマウスの尾静脈を通じて注入した後、時間の経過にしたがって撮った何種類かの関心部位を示す冠状面（coronal）及び矢状面（sagittal）の全身ＣＴ断面画像を図３〜４（冠状面）及び図５〜６（矢状面）にそれぞれ示した。
【０１６０】
また、本発明によるＣＴ用造影剤をマウスの尾静脈を通じて注入した後、時間の経過にしたがって撮った胸部と腹部（mid resolution）及び脳部位（high resolution）のＣＴ断面画像を図７〜８（胸部と腹部）、図９〜１０（脳部位）にそれぞれ示した。
【０１６１】
図３ないし図６に示されたように、ＣＴ用造影剤が注入されたマウスの血管部位は明るい灰色で示された（骨は非常に明るい白部分で示され）。ここで、陽性対照群に使用した低分子化合物基盤人体用ＣＴ用造影剤である「Iobrix」は、注入直後数分以内（注入後０時間経過ＣＴスキャン参照）に、非常に早い速度で腎臓を通じて排出されたとみなすことができ、エマルジョンナノ粒子基盤の動物用ＣＴ用造影剤である「Fenestra VC」は、本発明の実施例１〜４で製造した化合物を含有したＣＴ用造影剤と同様に、造影剤注入後の約２〜４時間までは注入直後とほとんど同一な強度の血管内造影効果を示すなど、初期には類似の様相で時間帯別の体内分布を示したが、注入後２４時間が経過しながら本発明によるＣＴ用造影剤に比べて、相対的に肝臓への分布がより多くなって毒性がさらに強いことが推定される。
【０１６２】
図７ないし図１０に示されたように、本発明の実施例１〜４で製造した化合物を含有したＣＴ用造影剤の場合、分子量（すなわち、大きさ）が増加するにしたがって相対的に血管に循環する時間が長くなる様相を示し、体外排出経路も比較的分子量が小さな実施例１で製造した化合物を含有した造影剤の場合、大部分が腎臓（注入後１時間のＣＴ画像参照）を経て膀胱に排出されることが示された一方、分子量が大きくなるほど（実施例２＜実施例３＜実施例４）膀胱とともにますます肝臓への相対的分布がさらに増加し、「Fenestra VC」に比べて造影剤注入後２４時間経過時点までも、心臓部位での画像信号が相対的に段々強く感知された。また、本発明のＣＴ用造影剤を注入してＣＴスキャンを実施する間にネズミは死ななかったし、ＣＴスキャンが終わった後に実施した剖検結果の肝臓、腎臓などの臓器に全く損傷を与えないことを確認した。
【０１６３】
したがって、本発明によるヨードを含有した放射形状の高分子化合物を含有するＣＴ用造影剤は、造影効果が十分でかつ造影時間が持続するだけでなく、体外排出も適切になされることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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