(57)【要約】  本発明は、新規なハイブリッドタンパク質を開示するものであり、このタンパク質は、血餅特異的作用を含めた、血管における下層組織損傷に起因する、心筋梗塞、脳卒中等につながるフィブリン塊形成を伴う循環器疾患の治療にとってこのタンパク質を極めて有利なものにするプラスミノーゲン活性化因子及び抗血栓の両方の特性を有する。また、プラスミノーゲンをプラスミン又はトロンビン依存的に活性化することによって血餅の溶解を支援し、また血液凝固の内因的経路を通じてトロンビンの活性及び産生の両方を阻害する新規なタンパク質及びそれを得る方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラタンパク質構築物であって、
ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ並びにこれらの誘導体及び類似体から成る群から選択される血栓溶解タンパク質に融合したトロンボモジュリンの４、５及び６上皮増殖因子様ドメイン（ＥＧＦ４、５、６）を含むことを特徴とするキメラタンパク質構築物。
【請求項２】
前記トロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインが、前記血栓溶解タンパク質又はその誘導体若しくは類似体に、前記血栓溶解タンパク質又はその誘導体若しくは類似体のＮ末端、Ｃ末端又はＮ及びＣの両方の末端で融合する、請求項１に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項３】
前記血栓溶解タンパク質が１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失又は切断を有するストレプトキナーゼを含み、また前記構築物がプラスミノーゲン活性化、トロンビン阻害及び抗凝固タンパク質Ｃ経路活性化活性を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項４】
前記トロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインが前記ストレプトキナーゼのアルファドメインとベータドメインとの間又はベータドメインとガンマドメインとの間、あるいはストレプトキナーゼ誘導体又は類似体のアルファドメインとベータドメインとの間又はベータドメインとガンマドメインとの間で融合し、前記ストレプトキナーゼ誘導体又は類似体が１つ以上の変異、付加、挿入又は切断を含み、また前記構築物がプラスミノーゲンを活性化し、トロンビンを阻害し、抗凝固タンパク質Ｃ経路を活性化する、請求項１に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項５】
前記ＥＧＦ４、５、６ドメインがストレプトキナーゼ又はストレプトキナーゼ誘導体若しくは類似体に、ストレプトキナーゼＮ末端、ストレプトキナーゼＣ末端、Ｎ及びＣの両方のストレプトキナーゼ末端又はストレプトキナーゼのドメイン間位置から選択される１つ以上の位置にてインフレームで融合する、請求項２に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項６】
前記ストレプトキナーゼ誘導体が残基５〜３８３又は５〜４１４に及ぶ、請求項５に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項７】
前記ストレプトキナーゼ誘導体が残基１６〜３８３に及ぶ、請求項６に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項８】
前記ＥＧＦ４、５、６ドメインがストレプトキナーゼＮ末端、ストレプトキナーゼＣ末端又はＮ及びＣの両方のストレプトキナーゼ末端から選択される１つ以上の位置にてインフレームで融合し、前記ＥＧＦ４、５、６ドメインのＭｅｔ４１がバリン、アラニン又はグルタミンに置き換えられ、あるいはＣ末端Ｍｅｔ４３５がバリン、アラニン又はグルタミンに置き換えられ、あるいは同時Ｎ及びＣ末端融合構築物において、Ｍｅｔ４１及びＭｅｔ４３５が独立してバリン、アラニン又はグルタミンに置き換えられる、請求項２に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項９】
トランスグルタミナーゼ認識配列を更に含む、請求項１に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１０】
前記ＥＧＦ４、５、６ドメインと前記血栓溶解タンパク質又はその誘導体若しくは類似体との接合部に１つ以上のトロンビン切断可能配列を更に含む、請求項１に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１１】
哺乳動物において血栓症を治療する方法であって、
治療を必要とする該哺乳動物に治療有効量の請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
キメラタンパク質構築物であって、
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）誘導体、類似体又はフラグメントに、前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントのＮ末端で融合、前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントのＣ末端で融合、前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントの両方の末端で融合、あるいは前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメント内で内的に融合したトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインを含むことを特徴とするキメラタンパク質構築物。
【請求項１３】
前記ＥＧＦ４、５、６ドメインと前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントとの融合が１つ以上のリンカーフラグメントを更に含む、請求項１２に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１４】
前記１つ以上のリンカーフラグメントが構築物の柔軟性を促進する１つ以上のアミノ酸を含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１５】
前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントが１つ以上の変異、付加、挿入又は切断を含み、前記ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントがプラスミノーゲンを活性化し、トロンビンを阻害し、抗凝固タンパク質Ｃを活性化させる、請求項１２に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１６】
１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに融合した組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のフラグメント又はその切断若しくは修飾形態を含むため、ｔＰＡのＥＧＦドメインが前記１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられ、また抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化の両方の活性を有する、請求項１２に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１７】
１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに融合した組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のフラグメント又はその切断若しくは修飾形態を含むため、ｔＰＡのクリングル１及びＥＧＦドメインが前記１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられ、また抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化の両方の活性を有する、請求項１２に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１８】
前記ｔＰＡ  ＥＧＦドメイン及びクリングル１ドメインが前記ｔＰＡフラグメントのＮ末端又はＣ末端で１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられる、請求項１７に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項１９】
１つ以上のリンカーフラグメントを前記ｔＰＡフラグメント又はその切断若しくは修飾形態と前記トロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインとの間に更に含み、前記リンカーフラグメントが、構築物がトロンビン阻害、タンパク質Ｃ活性化及びプラスミノーゲン活性化能を有するように構築物の柔軟性を促進するアミノ酸残基を含む、請求項１７又は１８のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項２０】
前記ＥＧＦ４、５、６成分のメチオニン４１がアラニン、バリン又はグルタミンに置き換えられる、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項２１】
キメラタンパク質構築物であって、
スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）のＮ末端側又はＣ末端側の端にインフレームで融合したトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインを含むことを特徴とするキメラタンパク質構築物。
【請求項２２】
前記トロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインのメチオニン４１がアラニン、バリン又はグルタミンに置き換えられる、請求項２１に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項２３】
トロンビン切断可能配列を前記ＳＡＫと前記ＥＧＦ４、５、６ドメイン領域との間に更に含む、請求項２１又は２２のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項２４】
トランスグルタミナーゼ架橋配列を更に含む、請求項２２〜２３のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項２５】
水溶液又は生理食塩水に可溶性である、請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項２６】
トロンビンを阻害する方法であって、
請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物の使用を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
タンパク質Ｃを活性化する方法であって、
請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物の使用を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化の両方をもたらす方法であって、
請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物の使用を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
医薬製剤であって、
薬学的有効量の請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物を含むことを特徴とする医薬製剤。
【請求項３０】
哺乳動物における血栓溶解の方法であって、
それを必要とする該哺乳動物に治療有効量の請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物をそれを必要とする患者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
細菌系における発現によって調製される、請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラ構築物。
【請求項３２】
真核生物系における発現によって調製される、請求項１〜１０又は１２〜２４のいずれかに記載のキメラ構築物。
【請求項３３】
前記真核生物発現系が、動物細胞、ピチア・パストリス及び真菌から成る群から選択される、請求項３２に記載のキメラ構築物。
【請求項３４】
細胞外媒体に分泌される、請求項３３に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項３５】
１つ以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ及びＬｙｓから成る群から選択される、請求項１３に記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項３６】
核酸配列であって、
請求項１〜１０、１２〜２５又は３１〜３５のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物をコードしていることを特徴とする核酸配列。
【請求項３７】
ベクターであって、
請求項３６に記載の核酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３８】
宿主細胞であって、
請求項３７に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項３９】
宿主細胞発現系における前記タンパク質をコードしている核酸配列の発現によって調製される、請求項１〜１０、１２〜２５又は３１〜３５のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物。
【請求項４０】
請求項１〜１０及び１２〜２５又は３１〜３５のいずれかに記載のキメラタンパク質構築物を調製する方法であって、
宿主細胞発現系における該タンパク質をコードしている核酸配列の発現によることを特徴とする方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞発現系が真核生物発現系である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞発現系が細菌発現系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細菌が大腸菌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記真核生物発現系が動物細胞又は酵母細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵母がピチア・パストリスである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記キメラタンパク質構築物が前記宿主細胞から細胞外媒体に分泌される、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓溶解タンパク質及びトロンボモジュリンの４、５、６上皮増殖因子様ドメイン（ＥＧＦ４、５、６）を含むキメラ融合タンパク質を含む血栓溶解剤に関する。本発明の融合タンパク質は、プラスミノーゲン活性化、トロンビン阻害及び抗凝固タンパク質Ｃ経路活性化活性を有する。本発明の融合タンパク質は、血栓を砕き、血餅の部位での再閉塞を防止する治療的可能性を有する。
【背景技術】
【０００２】
血管系内での血餅又は血栓の形成及び成長である血栓症は、出血時に起きるならば命を救う過程であるが、別の時に起きると命を脅かす場合がある。血栓は血管をブロックし、臓器又は他の身体部位への血液供給を停止させてしまう。血管からはがれると、血栓は塞栓となり、最初の部位から離れた位置にある血管を閉塞させてしまう可能性がある。血栓疾患は今や、世界中の発展途上国及び先進国の両方における主な死亡原因の１つである。依然として血栓性循環障害に対する最も好まれる救急（ＳＯＳ）薬物療法でありながら、プラスミノーゲン活性化因子タンパク質薬（ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等）はその優位性を、富裕国においては緊急心臓インターベンション（ステント留置、バイパス手術等）に明け渡しつつある。これはそれらの使用に関連して出血のリスクがあり、またトロンビン活性及び／又はトロンビンの新たな産生による、血管損傷部位と同じ部位での血餅の再形成という問題に直面することが多いからである。このため、血餅特異性及び抗血栓特性等の追加の特徴を備えたより洗練され且つより効果的な血栓溶解剤を早急に開発する必要がある。
【０００３】
血餅の形成は、複雑な一連のカスケード反応の結果であり、幾つかの生化学的な事象が損傷部位での封止又は修復を引き起こす（Ｂｕｔｅｎａｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ２００２）。血液凝固のカスケード開始に基づいて、外因性経路と内因性経路とに経路を分類しており、外因性経路は組織因子（ＴＦ）の曝露によって開始され、内因性経路は第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＫ）又はプレカリクレインによって開始される。しかしながら、両方のカスケード経路は最終的には第Ｘａ因子産生地点で合流し、続いて共通するトロンビンが介在するフィブリン産生をたどる（Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｃｙ  １９９５）。
【０００４】
トロンビン産生は、脊椎動物における血液凝固過程の中心的なステップである。トロンビン産生過程においては、少量のトロンビンがフィブリン塊／網にその拡大と共に取り込まれ、このプロテアーゼの触媒部位（この吸収されたトロンビン中で遊離である）は、血餅の成長を増幅することができる（Ｌｉｕ，Ｎｏｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７９；Ｖａｌｉ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒａｇａ  １９８８）。トロンビンは多様な基質と相互作用し、また幾つかの血餅形成促進因子を活性化し、例えば（ａ）同種の受容体の切断による血小板の活性化を引き起こす、（ｂ）第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸＩのフィードバック活性化を引き起こす、（ｃ）トランスグルタミナーゼ（transglutminase）、第ＸＩＩＩ因子の活性化を引き起こす、（ｄ）フィブリノゲンをフィブリンに変換する。一旦血餅が形成され、ストランド間の架橋により安定すると、病的状況下、血餅は血管内での正常な血流を妨げ、これが動脈及び静脈の封鎖につながる。
【０００５】
動物／ヒトにおける、病的血栓形成から生じる循環障害（心筋梗塞等）に対する最も一般的且つ好まれる薬物療法の１つが、血栓溶解剤の静脈内注入である（Ｌｉｊｎｅｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｎ  １９８８；Ｃｏｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｊｎｅｎ  １９９０；Ｆｒａｎｃｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｄｅｒ  １９９１）。使用できる血栓溶解剤（ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等）は本質的に同じプラスミン依存性の機構を通じて作用し（これらはプラスミノーゲン活性化因子であるため）、これらの血栓溶解剤は、プラスミノーゲンの残基５６１と５６２との間の切断しやすいペプチドを切断し、プラスミノーゲンをそのタンパク質分解性の活性型であるプラスミンに変換する。組織型プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナーゼは、ヒトプラスミノーゲンにおける切断しやすいペプチド結合を特異的に認識するプロテアーゼ（直接的な活性化因子）であり、ストレプトキナーゼ及びスタフィロキナーゼ（プロテアーゼというよりタンパク質「補助因子」であるため、「間接的な」活性化因子である）（（Ｄｅ  Ｒｅｎｚｏ，Ｂｏｇｇｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９６７；Ｂｕｃｋ，Ｈｕｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９６８；ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ  １９７１を参照のこと）はまずプラスミン又はプラスミノーゲンと緊密な１：１の複合体を形成し、その結果としてのタンパク質分解性活性複合体が、他の「遊離の」プラスミノーゲン分子の切断しやすいペプチド結合を切断し、プラスミンを指数関数的に産生させる（（Ｗｏｈｌ，Ｓｕｍｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９７８；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ  １９８１；Ｗｏｈｌ，Ｓｉｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８３；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９０による再考察）。現行の全ての血栓溶解剤、すなわちプラスミノーゲン活性化因子タンパク質製剤の中でも、ストレプトキナーゼが最も高い血栓溶解力を示すが、（ＳＡＫのように）細菌由来であるため、ごく一部の患者において免疫反応を起こさせる制約がある。それでもなお、ストレプトキナーゼは、ｔＰａ及びＵＫより比較的低コストであるため、手ごろな価格の血栓溶解剤として広く使用されている。
【０００６】
効果的な血栓溶解療法は正常な血流の維持に役立ち、またかなりの数の患者の生存率を改善する（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、１９９０）が、多くの場合は同じ部位での早期再閉塞又は再血栓症が、血栓溶解剤の投与の成功を制限し続けてきた。幾つかの研究は、血栓溶解療法後、最高で３０％の患者において早期再閉塞が起きることを実証している（Ｏｈｍａｎ，Ｃａｌｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。再血栓症又は早期再閉塞の原因は、血液の過剰な凝固性を高めるプラスミン活性によって説明される（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍｉｌｅｔｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。プラスミンが接触因子（Ｅｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  １９９５）、第Ｖ因子（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  １９８９）、そしておそらくはプロトロンビンをも（Ｓｅｉｔｚｅｔ  ａｌ．，１９９３）活性化するとの説がある。唱えられている別の原因は、血餅に結合したトロンビンの後者の溶解に続く露出であり、これによってより多くのトロンビンが産生され、フィブリンに結合したトロンビンは比較的、抗トロンビン阻害薬に耐性である（Ｈｏｇｇ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  １９８９；Ｗｅｉｔｚ，Ｈｕｄｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。「放出された」トロンビンは再度、局所的に凝血原活性を活性化し、また血小板を活性化し始め（Ｋｕｍａｒ，Ｂｅｇｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４、Ｐｕｒｉ，Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）、これによって再血栓症につながる生化学的な事象のサイクルが促進される。このため、トロンビンを損傷部位で直接、またその凝血原活性の「二次」レベルで阻害することが、上記の望ましくない一連の事象を大きく妨げるはずである。このような特性を血栓溶解剤と同じ分子にうまく組み込めたら、助かる命という観点から有利であることは明白である。
【０００７】
プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンのプラスミンへの酵素的な変換を特徴的に触媒するプロテアーゼ類である。ＴＰＡ、プラスミノーゲンをプラスミンへと１つのアルギニン／バリン結合の加水分解を通じて酵素的に変換。
【０００８】
組織プラスミノーゲン活性化因子（フィブリノキナーゼ、外因性プラスミノーゲン活性化因子、ｔ−ＰＡ又はＴＰＡとしても知られる）は糖タンパク質であり、また約７０，０００ダルトン（６８，０００ダルトン）のおおよその分子量（ＭＷ）を有する。プロ酵素プラスミノーゲンの活性な酵素プラスミンへの１つのアルギニン／バリン結合の加水分解による酵素的な変換を触媒するのはセリンプロテアーゼである。ｔ−ＰＡの触媒部位はアミノ酸Ｈｉｓ−３２２、Ａｓｐ−３７１及びＳｅｒ−４７８から構成される。ｔ−ＰＡは、フィブリン不在下では不良なプラスミノーゲン活性化因子である。アミノ末端領域は幾つかのドメインから構成され、これらのドメインは他のタンパク質に相同である。これらの異なるドメインは酵素の幾つかの機能に関係していて、フィブリンへの結合、フィブリン特異性プラスミノーゲン活性化、内皮細胞受容体への結合及び生体内での迅速なクリアランスが含まれる。アミノ酸残基を５０〜８７個含むこのようなドメインの１つ（Ｅドメイン）はヒト上皮増殖因子に相同であり、またフィブリン結合、フィブリン親和性及び生体内でのクリアランスに関与していると考えられる。ｔ−ＰＡ  ｃＤＮＡをクローニングし、続いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。
【０００９】
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、フィブリン塊に関係したプラスミノーゲンの特異的活性化に関与する哺乳動物の線維素溶解系の成分である（すなわち、血餅を溶解可能である）。組織プラスミノーゲン活性化因子が仲介する血餅溶解では、血漿中でのフィブリノペプチドＡのレベルの上昇が見られ、この上昇が血餅に結合したトロンビンの直接的なマーカーである（Ｗｅｉｔｚ，Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。組織プラスミノーゲン活性化因子と現在知られている抗トロンビン剤（ヘパリン、ヒルジニス（ｈｉｒｕｄｉｎｉｓ）との組み合わせを薬物療法で使用することが多いが、この抗トロンビン剤は遊離のトロンビンにしか作用せず、血餅に結合したトロンビンは、ヘパリン及び他の阻害薬に対してその低親和性から耐性である。加えて、これらの薬剤は、更なるトロンビン産生の間接的な促進因子に影響しない（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子）。このため、プラスミノーゲンを活性化し、それと同時に血餅に結合したトロンビン及びトロンビンの間接的な促進因子（第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子等）を阻害する新規なキメラタンパク質を設計する必要がある。
【００１０】
血栓溶解後のプラスミン活性及びその結果としてのトロンビン産生についての研究は、病理学的な血餅が血栓溶解剤で除去された場合であっても凝固経路の再活性化につながる強力な因子があることをはっきりと示唆している。加えて、産生されたトロンビンは、それ自体が強力な凝固経路活性化因子である。トロンビンが抗凝固機能も果たすことは注目に値し、血管系全体を通して凝固が「暴走する」ことのない止血系の「自己制限的」制御機構の見事な例である。遊離のトロンビンは、細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンと１：１の高親和性の非共有結合複合体を形成する（Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｇａｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）。トロンビン／トロンボモジュリン複合体が一旦形成されると、その基質特異性の凝血原モードから抗凝固モードへの方向転換が行われて、タンパク質Ｃ抗凝固経路が活性化される。このため、トロンビンだけでタンパク質Ｃを活性化できるが、トロンビンが一旦トロンボモジュリンと複合体を形成すると、タンパク質Ｃ活性化が約１０００倍加速される（Ｅｓｍｏｎ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  １９８１；Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｅｓｍｏｎ  １９８１））。
【００１１】
成熟したトロンボモジュリンは、異なる機能、すなわちトロンビン阻害及びタンパク質Ｃ活性化を担う異なるドメインを含有し、これらのドメインは、この大きなタンパク質の上皮増殖因子様ドメイン内に存在する。上皮増殖因子様（ＥＧＦ）ドメイン５、６は主にトロンビン親和性に関与し、ＥＧＦ４、５、６ドメインは共にタンパク質Ｃを活性化する（Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｓｔｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８８；Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｋｕｒｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。トロンボモジュリン又はその単離したＥＧＦドメイン４、５、６は、タンパク質Ｃを中心とした抗凝固経路を活性化し、またトロンビンの活性を直接阻害すると知られており、ただしそれ自体はフィブリン塊を溶解させることができない。このため、血栓溶解剤が必要となる。どちらのタイプの薬剤も、互いに独立して、心血栓症に使用することができる。しかしながら、両方のタイプの特質を備えた１つの薬剤（これはこれまで発表されたことがない）の利点は明らかである。
【００１２】
用語「止血」とは、血液／血管系における抗凝固活性と凝固促進活性とのバランスのことであり、通常、血液成分、特に血小板は、血管の内壁と異常な相互作用を起こさない。損傷又は疾患状態では血小板が付着傾向を示し、その結果、血液凝固因子が蓄積し始め、この損傷部位で活性化され、損傷部位で修復を開始させるための応答ではあるものの、これが血管の閉塞をもたらし、この結果、血栓形成の危機を促進することが多い。
【００１３】
血管内部での血液凝固及び血餅の溶解は両方共、正常な止血にとって必要な生理学的過程である。血管内部での血餅の形成及び溶解の機構は文献で周知であり、異なる凝固促進タンパク質（凝血促進）及び抗凝固タンパク質の役割も現在、十分に研究されている。血餅の形成は一連の複雑な反応の結果であり、反応においてはトロンビンがその開始及び凝固カスケードの加速において中心的な役割を果たしており、最終的に安定したフィブリンの網目構造が出現する。
【００１４】
全ての最新の血栓溶解／線維素溶解療法において通常、抗血栓薬（アスピリン、ヘパリン等）も組み合わせ、これは血餅溶解中の凝固促進剤と抗凝固剤との間での正常な平衡を維持するのに必要である。血餅溶解中、一時的に放出されるトロンビンは自己産生ループを開始させて血餅の成長を増幅する。これは血餅の再形成へと平衡をシフトさせてしまう又は凝血源／血餅形成促進因子を活性化してしまう場合がある。
【００１５】
血栓溶解剤は、循環器系において内因性プラスミノーゲンを活性化させることによって病理学的な血餅を溶解させる。入手可能且つ治療的に有用な血栓溶解剤の中でも、ストレプトキナーゼは最も高い血栓溶解能を示すが、血餅特異性がないことから、薬物療法中の出血につながる場合もある。この問題は、他の血栓溶解剤（ｔＰＡ及びＳＡＫ）には比較的関係がない。これはこれらの血栓溶解剤のフィブリン塊特異性が比較的高いからであるが、これらの血栓溶解剤の他の短所は低い線維素溶解能及び生体内での短い半減期である。全ての血栓溶解剤は本質的に同じ血栓溶解機構（プラスミノーゲン活性化）を有するが、同じ問題も共有しており、血栓溶解後、産生されたトロンビンが、血液凝固第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子によって制御されるフィードバック機構によりトロンビン産生を更に増幅する場合がある。血栓溶解工程において、血餅に結合したトロンビンも循環中に放出され、このトロンビンは元々生体が有する抗トロンビン物質及び他の外部から供給されたトロンビン阻害剤に比較的耐性がある。「元々の」損傷の近辺に存在している、この血餅に結合したトロンビンもまた、血餅／損傷部位の近辺でのより多くのトロンビンの産生を、特に血餅の不完全な除去の後に支援し、これが臨床的に重篤な早期再閉塞問題につながる。
【００１６】
血餅溶解中のトロンビン産生及び他の内因性の凝血源の活性化は、止血の平衡の正常な一過程である。ヘパリン、ヒルジン及び化学合成薬等の抗トロンビン剤はトロンビンを阻害し且つその続く一時的な作用（血小板形成工程の応答性亢進の抑制、フィブリノゲンからフィブリンへの変換及び血液における凝固性亢進を惹起する他の血栓形成促進活性の阻害等）を防止することができる。しかしながら、とりわけ、これらの直接的な阻害薬は全て、一時的に産生されたトロンビンに作用するものであり、トロンビンの産生を実際に加速させ且つ凝固促進経路において重要な役割を果たす因子には作用しない。このため、これらの薬剤はどれも血液凝固第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子（トロンビン産生及び早期再閉塞において極めて重要な役割を果たす）に望ましい有効性でもって作用はしない。
【００１７】
トロンビンと１：１の複合体を形成し、また凝固促進機能を強力な抗凝固物質、すなわちタンパク質Ｃ活性化因子に向ける周知の細胞表面分子トロンボモジュリン。活性化されたタンパク質Ｃとタンパク質Ｓの両方が、活性化された第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子を分解する（Ｅｓｍｏｎ  １９８９）。
【００１８】
利用できる全ての血栓溶解剤が血餅溶解能を有し、またその機構は文献で明らかになっているにも関わらず、血餅溶解中、血餅及びプラスミンの残遺物はトロンビンの産生につながる。同時に、これらの薬剤は血餅の溶解中に一時的に出現するトロンビンを不活性化しないため、血栓溶解療法の後に再閉塞が起きるという同じ問題を抱えることになる。これまで、再血栓症に大きく関与している「真犯人」を不活性化するために血栓溶解特性及び抗トロンビン特性、特には凝固促進活性を合わせ持った抗トロンビン剤はでていない。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、プラスミノーゲンの活性化が可能であることとは別に、トロンビン産生阻害能も示す改善された血栓溶解剤の設計に関する。同じ分子におけるこれらの２つの特性の存在は、血栓溶解療法後の早期再閉塞問題を最小限に抑えるのに役立つことから、潜在的に臨床的に極めて有益である。本発明は戦略的に設計されたキメラポリペプチドを開示するものであり、トロンボモジュリン由来の抗トロンビン特性を有するドメイン／セグメントを様々な血栓溶解タンパク質に融合させているため、得られる融合／キメラポリペプチドは、血餅溶解（血栓溶解）及び抗トロンビン特性を同時に示す。これらの新規な融合構築物は、血栓溶解系をプラスミン及び／又はトロンビンに依存した形で活性化する能力を有する（このことが構築物を血餅特異性にする。これはフィブリン塊がプラスミン及びトロンビンを多く含有し、遊離のプラスミン及びトロンビンが循環においては短命であり、α−２抗プラスミン、抗トロンビン等のセルピンによって速やかに不活性化されるからである）。同時に、これらの構築物は血餅溶解中に放出される一時的に産出されるトロンビンも阻害し、また脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症等の血栓疾患の事象時のこれらの薬剤での薬物療法中に、生体が持つ（内因性の）抗凝固性のタンパク質Ｃ経路も開始させる。
【００２０】
現行の血栓溶解剤とは異なり、本発明は、凝固カスケードの第Ｖａ及びＶＩＩＩａ因子を標的とし（プラスミン依存性血栓溶解経路活性化能に加えて）、また内因性の生体が有する抗凝固タンパク質Ｃ経路も標的とすることができる新規な血栓溶解構築物を開示するものであり、同じ薬剤の分子中に幾つかの所望の能力が共存することで、その全体的な有効性が向上し、本発明の血栓溶解構築物は、命を危険にさらす可能性が最も高い血栓溶解後の事象の１つ、すなわち凝固過程の再発を最小限に抑えながら病理学的な血餅を溶解させることができる。
【００２１】
抗トロンビン特性及び血栓溶解特性の両方を備えた融合タンパク質を設計し、試験し、その形成を検証するアプローチをとる。ＥＧＦ４、５、６を血栓溶解分子にうまく「機能的に」融合させることで、潜在的に、前者が本来有しているトロンビン親和性から後者の標的をトロンビン高含有血餅とすることができる。同時に、この融合により、２つの元々「独立した」親生物学的活性（すなわち、抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化因子活性）の保持とは別に、プロドラッグ的性質が全身的にではなく血餅近辺で優先的に活性化されるハイブリッド分子に付与されるのならば、これもまた、その標的とする作用の性質により極めて有用且つ有利な特徴となる。
【００２２】
本発明においては、現行の血栓溶解剤の有効性を大きく改善し、また血栓症再発現象の防止を支援するために、同じ分子内への効果的な組み込みによって、血栓溶解特性、トロンビン阻害及びタンパク質Ｃ活性化能を合わせ持つ幾つかのハイブリッドタンパク質分子の官能化に成功した。同じ薬剤／分子内にこれらの特性を全て組み込んだことによって、様々な血栓を原因とした病理学的症候群において、閉塞を起こしているフィブリン血塊でリアルタイム（一時的な）及び空間的（インシチュでの）の両方で有益な作用が得られるからである。
【００２３】
本発明においては、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子及びスタフィロキナーゼをＥＧＦ４、５、６と融合させることによって、プラスミン依存性血栓溶解系及びトロンビン介在タンパク質Ｃ抗凝固経路を開始させる特性の両方を有するキメラ分子を創り出した。更に、本発明の一部の実施形態においては、これまで報告されたことのない、血栓溶解、血餅特異性及び抗トロンビン活性をうまく統合することも成し遂げた。
【００２４】
異なる融合構築物において、血栓溶解剤とＥＧＦドメインとの融合接合部（junction）をリンカー中の様々な好ましいアミノ酸残基を使用して慎重に設計し、異なるトロンビン及び／又はプラスミン切断可能部位を導入し、キメラからのＥＧＦ４、５、６のタンパク質分解による放出に起因するインビトロでの異なる時間依存性プラスミノーゲン活性化動力学及びその結果としての血栓溶解成分の活性化が得られた。血栓溶解剤とＥＧＦ４、５，６との接合部での異なるトロンビン切断可能部位の存在により、これらの２つを互いに、局所的に存在する酵素（トロンビン又はプラスミン）によりトロンビン高含有血餅の近辺で分離することが可能になる。このため、切断後、各ドメインはその機能を独立して果たす。更に、一部の融合構築物においては、トランスグルタミナーゼを認識可能な架橋配列を、キメラポリペプチドにおける戦略的な位置で導入しているため、活性化されたドメインは血餅の残遺物に、上皮組織内外（そもそもこの上皮細胞の損傷が血餅の発生につながった）で、血液トランスグルタミナーゼ（transglutminase）の作用により共有結合し、これによって最初の血餅が溶解した後も長い間、プラスミノーゲン活性化及びトロンビン阻害の両方の観点から局所的に作用し続ける。このことが薬剤の「治癒」効果につながるのは明らかであり、現在使用されているどの血栓溶解タンパク質製剤でも得られない特性である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】異なるインフレーム遺伝子融合構築物の概略図であり、トロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子又はスタフィロキナーゼをコードしているＤＮＡに、三重グリシン（ＧＧＧ）、ハイブリッドタンパク質と他の組織又はフィブリン塊との凝固第ＸＩＩＩ因子触媒共有結合架橋を促進するトランスグルタミナーゼ認識シグナル（ＴＧ）、トロンビン切断可能配列（ＴＣＳ）を有するものを含めたドメイン間リンカーをコードしているインフレーム融合配列と共に融合する。
【図１Ａ】概略設計図であり、ＡはＳＫ（ストレプトキナーゼ）のＮ末端でのＥＧＦ４、５、６融合をコードしているＤＮＡ配列を表す。
【図１Ｂ】概略設計図であり、Ｂは柔軟性促進残基（例えば、三重グリシン列ＧＧＧ）を含有する適切なリンカーを介したＳＫのＣ末端でのＥＧＦ４、５、６融合を表す。
【図１Ｃ】概略設計図であり、Ｃはトランスグルタミナーゼ認識部位／残基列を伴ったＳＫのＮ及びＣ末端での同時のＥＧＦ融合を表す。
【図１Ｄ】概略設計図であり、ＤはＥＧＦ４、５、６ドメインのＳＫのＣ末端での融合を表し、ＳＫの５個のアミノ酸が欠失している。
【図１Ｅ】概略設計図であり、ＥはＳＫのＮ及びＣ末端でのＥＧＦ４、５、６の同時融合を表し、トロンビン認識及び切断可能配列（ＴＣＳ）がＥＧＦ及びＳＫの接合部に存在している。
【図１Ｆ】概略設計図であり、ＦはＳＫのＮ及びＣ末端でのＥＧＦ４、５、６の同時融合を表し、トロンビン認識配列はＥＧＦ及びＳＫの接合部に存在し、トランスグルタミナーゼ認識配列はＥＧＦの最初の部分（Ｎ末端）に存在する。
【図１Ｇ】概略設計図であり、ＧはＳＫのα及びβドメインの接合部でのＥＧＦドメインの融合を表す。
【図１Ｈ】概略設計図であり、ＨはＳＫのβ及びγドメインの接合部で示されるようなＥＧＦドメインの融合を表す。
【図１Ｉ】概略設計図であり、ＩはｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）のＮ及びＣ末端での同時のＥＧＦドメイン融合を表す。全ての図及び明細書中でそのような用語が出現する場所において、「ｅｇｆ」とはｔＰＡのＥＧＦ様ドメインのことであり、「ＥＧＦ４５６」とはトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインのことである。
【図１Ｊ】概略設計図であり、ＪはｔＰＡのＣ末端でのＥＧＦ４、５、６ドメイン融合を表す。
【図１Ｋ】概略設計図であり、ＫはｔＰＡのＮ末端でのＥＧＦ４、５、６ドメイン融合を表す。
【図１Ｌ】概略設計図であり、ＬはｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）のＮ及びＣの両方の末端でのＥＧＦ４、５、６ドメインの融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆは欠失している。
【図１Ｍ】概略設計図であり、ＭはｔＰＡのＮ末端でのＥＧＦ４、５、６融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆは欠失している。
【図１Ｎ】概略設計図であり、ＮはｔＰＡのＮ末端でのＥＧＦ４、５、６融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１は欠失している。
【図１Ｏ】概略設計図であり、ＯはｔＰＡのＣ末端でのＥＧＦ融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆは欠失している。
【図１Ｐ】概略設計図であり、ＰはｔＰＡのＣ末端でのＥＧＦドメイン４、５、６融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１は欠失している。
【図１Ｑ】概略設計図であり、ＱはｔＰＡとのＥＧＦ４、５、６ドメイン融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆはＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられる。
【図１Ｒ】概略設計図であり、ＲはｔＰＡとのＥＧＦ融合を表し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１はＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられる。
【図１Ｓ】概略設計図であり、ＳはＳＡＫのＣ末端でのＥＧＦドメインの融合を表す。
【図１Ｔ】概略設計図であり、ＴはＳＡＫのＮ末端でのＥＧＦドメインの融合を表す。
【図２】異なる融合構築物の調製に使用するＰＣＲ法及びクローニングスキームの概略図である。
【図２Ａ】概略設計図であり、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ融合遺伝子ブロックの構築に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｂ】概略設計図であり、ＳＫ＿ＥＧＦ融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｃ】概略設計図であり、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ融合遺伝子ブロックの形成に使用する制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｄ】概略設計図であり、ドメイン間ＳＫ＿ＥＧＦ（ＳＫのα及びβドメイン間に融合したＥＧＦ４、５、６）融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｅ】概略設計図であり、ドメイン間ＳＫ＿ＥＧＦ（すなわち、ＳＫのβ及びγドメイン間に融合したＥＧＦ４、５、６）融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｆ】概略設計図であり、ｔＰＡ遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｇ】概略設計図であり、Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ及びｔＰＡ＿ＥＧＦ融合遺伝子ブロックの形成に使用する制限酵素消化及びクローニング戦略を示す。
【図２Ｈ】概略設計図であり、ｔＰＡ＿ＥＧＦ融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１ドメインは選択的に欠失している。
【図２Ｉ】概略設計図であり、Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１ドメインは欠失している。
【図２Ｊ】概略設計図であり、ｔＰＡ＿ＥＧＦ融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆドメインはＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられる。
【図２Ｋ】概略設計図であり、ｔＰＡ＿ＥＧＦ融合遺伝子ブロックの形成に使用するＰＣＲ、制限酵素消化及びクローニング戦略を示し、ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１ドメインはＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられる。
【図３】プラスミノーゲン活性化（吸光度４０５ｎｍ）の分光光度走査は、Ｎ末端融合ＥＧＦ４、５、６及びＳＫ構築物による遅延したプラスミノーゲン活性化及び微量のプラスミンの存在下でのラグの減少を示す（詳細については、「実施例で用いた一般的な方法」を参照のこと）。未変性のＳＫはプラスミノーゲン活性化において著しいラグを示さないことに留意すること。
【図４】表記したような異なる融合構築物及びコントロールの量を変化させる（６０〜１８０ｎｍ）ことによる増加トロンビン凝固時間アッセイを表す。
【図５】表記したような異なるＳＫ及びＥＧＦ融合構築物並びに適切なコントロールの存在下でのタンパク質Ｃ活性化プロファイル（詳細については、「一般的な方法」を参照のこと）。
【図６】表記したような異なるｔＰＡ融合構築物（等モル、２ｎｍ）及びコントロールでの凝固時間アッセイ。
【図７】表記したような様々なｔＰＡ融合構築物及びコントロールでの可溶性フィブリンの存在及び不在下でのプラスミノーゲン活性化。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、現在入手可能な形態（すなわち、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＳＫ、ＳＡＫ、これらの誘導体／改良形）よりはっきりとした機能的利点を示す新規な血栓溶解融合ポリペプチドの設計及び調製に関する。現行の形態はプラスミノーゲン活性化を通じてフィブリン塊を溶解させるだけで、本質的にトロンビン産生による血栓溶解療法中の早期再閉塞問題につながる血栓溶解後の結果を防止することができないからである。
【００２７】
本発明は、プラスミノーゲンを活性化するだけではなくトロンビンを直接阻害し、またトロンビンが介在する抗凝固経路を通じたタンパク質Ｃ活性化の能力を保持する能力を保持する、トロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６番ドメインと融合させた直接及び間接的なプラスミノーゲン活性化因子で融合構築物を形成する方法を開示する。
【００２８】
タンパク質のアミノ酸配列に関係した用語「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」、「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」、「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」又は「類似体（ａｎａｌｏｇ）」には、得られるタンパク質又は（ポリ）ペプチドが無修飾のタンパク質の活性と同等の活性を有する限り、配列からの又は配列への１つ（又は１つ以上）のアミノ酸の置換、変更、修飾、置き換え、欠失又は付加が含まれる。特に、用語「相同体」には、構造及び／又は機能についての相同性が含まれる。配列相同性に関しては、無修飾のタンパク質の配列に対して好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％の相同性がある。好ましくは、無修飾のタンパク質の配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【００２９】
典型的には、本発明のバリアント、相同体、誘導体、フラグメント又は類似体に関して、行い得るアミノ酸置換のタイプは、アミノ酸配列の疎水性／親水性を維持すべきである。アミノ酸置換は、修飾された配列が本発明に従って作用する能力を保持する限り、例えば１、２又は３〜１０、２０又は３０の置換から行われ得る。アミノ酸置換には、例えば治療を目的として投与するポリペプチドの血漿中半減期を延ばすために非天然の類似体を使用することが含まれ得る。
【００３０】
保存的な置換は、例えば以下のように行われ得る。同じ行にあるアミノ酸を互いに置換し得る。
脂肪族、非極性：Ｇ  Ａ  Ｐ  Ｉ  Ｌ  Ｖ  
極性、無荷電：Ｃ  Ｓ  Ｔ  Ｍ  Ｎ  Ｑ  
極性、荷電：Ｄ  Ｅ  Ｋ  Ｒ  芳香族Ｈ  Ｆ  Ｗ  Ｙ  
【００３１】
上述したように、本発明のタンパク質は典型的には、例えば本明細書に記載するような組み換え手法及び／又は固相合成等の当業者に周知の合成手法を利用して行われる。
【００３２】
本明細書において、「欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」とは、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれ不在である、ヌクレオチド又はアミノ酸配列における変更として定義される。
【００３３】
本明細書において、「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）」又は「付加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）」とは、天然のタンパク質と比較して、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基それぞれの追加に至ったヌクレオチド又はアミノ酸配列における変更である。
【００３４】
本明細書において、「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、異なるヌクレオチド又はアミノ酸それぞれによる１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置き換えによって起きる。
【００３５】
本明細書において、用語「４、５及び６上皮増殖因子様ドメイン」又は「ＥＧＦ４、５、６」はトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５又は６ドメインのいずれにもなり得て、あるいはペプチド又はペプチドフラグメントとして共に共有結合したトロンボモジュリンの３つのＥＧＦ４、５及び６ドメインの全てのことになり得る。４、５及び６上皮増殖因子様ドメインはそれぞれ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）タンパク質の１つ以上のドメインに対する相同性を有する。
【００３６】
本発明は、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ並びにこれらの誘導体及び類似体から成る群から選択される血栓溶解タンパク質に融合させたトロンボモジュリンの４、５、６上皮増殖因子様ドメイン（ＥＧＦ４、５、６）を含むキメラタンパク質構築物を開示するものである。
【００３７】
本発明の実施形態においてキメラタンパク質構築物を開示し、トロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインは、血栓溶解タンパク質又はその誘導体若しくは類似体に血栓溶解タンパク質又はその誘導体若しくは類似体のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端及びＣ末端の両方で融合している。
【００３８】
本発明は、血栓溶解タンパク質のＮ末端をコードしている部分で血栓溶解タンパク質（ＳＫ、ｔＰＡ又はＳＡＫ）と融合した、ＥＧＦの最小限で必須の抗血栓部を有する遺伝子構築物の設計も開示するものであり、翻訳（得られる「キメラ」ＯＲＦにおいて）はＥＧＦの４番ドメインで始まり、血栓溶解ポリペプチド合成をコードしている部位が続く。このため、成熟したポリペプチド又はフォールドされたタンパク質は２種類の異なるタイプのタンパク質を含有するだけではなく両方の機能性も有する。血栓溶解タンパク質とのこれらの構築物をＥＧＦ  Ｎ末端融合構築物と称する。
【００３９】
別の実施形態において、まず翻訳が血栓溶解タンパク質で開始され、ＥＧＦの６番ドメインで終了するように関連する部位（血栓溶解剤−ＥＧＦ４、５、６）をコードするオリゴヌクレオチドブロックを融合させ、次にオリゴヌクレオチドハイブリッドブロックを発現系で発現させ、ハイブリッドを精製し、プラスミノーゲン活性化及びトロンビン阻害等について試験することによる、血栓溶解タンパク質のＣ末端側で融合したＥＧＦドメインの設計原理及び構築方法を定義した。ここで、翻訳されたポリペプチドは機能的に活性な血栓溶解タンパク質から開始し、またＥＧＦドメインをＣ末端に有するため、抗トロンビン及びタンパク質Ｃ活性化能も有する。機能性ポリペプチドの調製につながる設計も開示されており、キメラポリペプチドは最初は不活性だが、そのプラスミノーゲン活性化能を、プラスミン又はトロンビンでのタンパク質分解切断時に獲得する。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失又は切断を有するストレプトキナーゼを含む血栓溶解タンパク質を開示し、構築物は、プラスミノーゲン活性化、トロンビン阻害及び抗凝固タンパク質Ｃ経路活性化活性を有する。
【００４１】
別の実施形態はＮ及びＣ末端融合構築物の作製方法を含み、血栓溶解タンパク質は、血栓溶解タンパク質のＮ及びＣ末端に３個のＥＧＦドメインを同時に含有する。これらの構築物は、共通の制限部位を介して接合されたＮ末端及びＣ末端ＥＧＦ４、５、６融合構築物を有するオリゴヌクレオチドブロックの発現並びに定評のある遺伝子クローニング法等を用いたその発現の支援により設計された。
【００４２】
更に別の実施形態において、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子等の血栓溶解剤内にＥＧＦドメインを有するタンパク質内融合の設計を開示する。
【００４３】
別の実施形態において、ハイブリッド／融合構築物は、ＥＧＦ４、５、６ドメインがｔＰＡのクリングル１ドメインにとってかわった組織プラスミノーゲン活性化因子を有した。この構築物は良好なプラスミノーゲン活性及び抗トロンビン特性を示した。
【００４４】
別の実施形態は、ＥＧＦ４、５、６のメチオニンをバリン、アラニン又はグルタミンアミノ酸残基に、上のセクションで記載の血栓溶解剤（ＳＫ、ｔＰＡ、ＳＡＫ）とのＮ末端、Ｃ末端及びＮ＆Ｃ末端（同時）融合構築物において、定評のある部位特異的変異誘発法により置き換えたＥＧＦドメインの酸化耐性形態を開示する。
【００４５】
本発明の更に別の実施形態において、ストレプトキナーゼのアルファとベータ又はベータとガンマドメインの間、あるいはストレプトキナーゼ誘導体又は類似体のアルファとベータ又はベータとガンマドメインの間で融合したトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインを開示し、ストレプトキナーゼ誘導体又は類似体は１つ以上の変異、付加、挿入又は切断を含み、構築物はプラスミノーゲンを活性化し、トロンビンを阻害し、抗凝固タンパク質Ｃ経路を活性化する。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６ドメインがインフレームでストレプトキナーゼ又はストレプトキナーゼ誘導体若しくは類似体に、ストレプトキナーゼＮ末端、ストレプトキナーゼＣ末端、Ｎ及びＣの両方のストレプトキナーゼ末端又はストレプトキナーゼのドメイン間位置（inter-domain position）から選択される１つ以上の位置で融合する構築物を開示する。
【００４７】
本発明の更に別の実施形態において、ストレプトキナーゼ誘導体が残基５〜３８３又は５〜４１４に及ぶキメラタンパク質構築物を開示する。
【００４８】
本発明の更なる実施形態において、ストレプトキナーゼ誘導体が残基１６〜３８３に及ぶキメラタンパク質構築物を開示する。
【００４９】
本発明の更に別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６ドメインがインフレームでストレプトキナーゼＮ末端、ストレプトキナーゼＣ末端又はＮ及びＣの両方のストレプトキナーゼ末端から選択される１つ以上の位置で融合するキメラタンパク質構築物を開示し、ＥＧＦ４、５、６ドメインのＭｅｔ４１はバリン、アラニン又はグルタミンに置き換えられる、あるいはＣ末端Ｍｅｔ４３５はバリン、アラニン又はグルタミンに置き換えられ、あるいは同時Ｎ及びＣ末端融合構築物（simultaneous N- and C-terminal fusion construct）において、Ｍｅｔ４１及びＭｅｔ４３５は独立してバリン、アラニン又はグルタミンに置き換えられる。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、トランスグルタミナーゼ認識配列を更に含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００５１】
本発明の更なる実施形態において、ＥＧＦ４、５、６ドメインと血栓溶解タンパク質又はその誘導体若しくは類似体との接合部に１つ以上のトロンビン切断可能配列を更に含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００５２】
別の実施形態において、ハイブリッド／融合構築物は、ＥＧＦ４、５、６とその酸化耐性形態との接合部にトロンビン切断可能部位を含む。
【００５３】
別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６ドメイン含有ハイブリッド／融合構築物は、メチオニン酸化及びその結果としてのその調製中の活性の喪失による酸化耐性を有するように変異させられる。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）誘導体、類似体又はフラグメントにｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントのＮ末端で、ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントのＣ末端で、ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントの両方の末端で、あるいはｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメント内で内的に融合したトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインを含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００５５】
本発明の更に別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６ドメインとｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントとの融合が１つ以上のリンカーフラグメントを更に含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００５６】
本発明の更なる実施形態において、１つ以上のリンカーフラグメントが、構築物の柔軟性（flexibility）を促進する１つ以上のアミノ酸を含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００５７】
本発明の更に別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ及びＬｙｓから成る群から選択されるキメラタンパク質構築物を開示する。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントが１つ以上の変異、付加、挿入又は切断を含むキメラタンパク質構築物を開示し、ｔＰＡ誘導体、類似体又はフラグメントはプラスミノーゲンを活性化し、トロンビンを阻害し、抗凝固タンパク質Ｃを活性化する。
【００５９】
本発明の更に別の実施形態において、１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに融合した組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のフラグメント又はその切断若しくは修飾形態を含み、ｔＰＡのＥＧＦドメインが１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられるキメラタンパク質構築物を開示し、構築物は抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化の両方の活性を有する。
【００６０】
本発明の更なる実施形態において、１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに融合した組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のフラグメント又はその切断若しくは修飾形態を含み、ｔＰＡのクリングル１及びＥＧＦドメインが１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられるキメラタンパク質構築物を開示し、構築物は抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化の両方の活性を有する。
【００６１】
本発明の更に別の実施形態において、ｔＰＡ  ＥＧＦドメイン及びクリングル１ドメインが１つ以上のトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインにｔＰＡフラグメントのＮ末端又はＣ末端で置き換えられるキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、ｔＰＡフラグメント又はその切断若しくは修飾形態とトロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインとの間に１つ以上のリンカーフラグメントを更に含むキメラタンパク質構築物を開示し、リンカーフラグメントは、構築物がトロンビン阻害、タンパク質Ｃ活性化及びプラスミノーゲン活性化能を有するように構築物の柔軟性を促進するアミノ酸残基を含む。
【００６３】
本発明の更に別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６成分のメチオニン４１がアラニン、バリン又はグルタミンに置き換えられるキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６４】
本発明の更なる実施形態において、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）のＮ末端又はＣ末端にインフレームで融合したトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインを含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６５】
本発明の更に別の実施形態において、トロンボモジュリンＥＧＦ４、５、６ドメインのメチオニン４１がアラニン、バリン又はグルタミンに置き換えられるキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、ＳＡＫとＥＧＦ４、５、６ドメイン領域との間にトロンビン切断可能配列を更に含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６７】
本発明の更に別の実施形態において、トランスグルタミナーゼ架橋配列を更に含むキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、水溶液又は生理食塩水に可溶性のキメラタンパク質構築物を開示する。
【００６９】
本発明において、別の実施形態において、組み換えキメラタンパク質を、厳格に調節されたプロモーターの制御下、プラスミドにより発現させる。
【００７０】
本発明の実施形態において、様々なキメラ構築物を、組み換えＤＮＡ技術を通じて細菌、真菌、酵母又は動物細胞等の適切な宿主において発現させた。
【００７１】
本発明の別の実施形態において、細胞外媒体に分泌されるキメラタンパク質構築物を開示する。
【００７２】
別の実施形態において、組織プラスミノーゲン活性化因子及びＥＧＦ４、５、６融合構築物を、原核生物及び真核生物宿主において発現させ、そこからポリペプチドを収穫して活性ハイブリッド構築物を純粋な形態で得た。
【００７３】
別の実施形態において、ＥＧＦとの様々な組織プラスミノーゲン活性化因子融合構築物を、発現カセットが宿主ゲノムに組み入れられた又は細胞質中にエピソーム体として留まる動物細胞株、酵母発現系及び植物細胞等の真核生物系においても発現させた。発現させたハイブリッドタンパク質は、発現に使用した宿主に応じてグリコシル化又は非グリコシル化になり得る。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、哺乳動物における血栓症の治療方法を開示し、この方法は治療を必要とする哺乳動物に治療有効量のキメラタンパク質構築物を投与することを含む。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、トロンビンの阻害方法を開示し、この方法はキメラタンパク質構築物の使用を含む。
【００７６】
本発明の更なる実施形態において、タンパク質Ｃの活性化方法を開示し、この方法はキメラタンパク質構築物の使用を含む。
【００７７】
本発明の更に別の実施形態において、抗トロンビン及びプラスミノーゲン活性化の両方をもたらす方法を開示し、この方法はキメラタンパク質構築物の使用を含む。
【００７８】
本発明の別の実施形態において、薬学的有効量のキメラタンパク質構築物を含む医薬製剤を開示する。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、哺乳動物における血栓溶解方法を開示し、この方法はそれを必要とする哺乳動物に治療有効量のキメラタンパク質構築物を投与することを含む。
【００８０】
別の実施形態において、ハイブリッド構築物のコード化ＤＮＡ配列は適切な発現宿主に合わせて最適化された。
【００８１】
別の実施形態において、上記のキメラタンパク質構築物をコードしている核酸配列。
【００８２】
別の実施形態において、核酸配列を含むベクター。
【００８３】
別の実施形態において、ベクターを含む宿主細胞。
【００８４】
別の実施形態において、キメラタンパク質構築物を、宿主細胞発現系におけるタンパク質をコードしている核酸配列の発現により調製する。
【００８５】
別の実施形態において、宿主細胞発現系におけるタンパク質をコードしている核酸配列の発現によるキメラタンパク質構築物の調製方法。
【００８６】
別の実施形態において、宿主細胞発現系が真核生物発現系である方法。
【００８７】
別の実施形態において、宿主細胞発現系が細菌発現系である方法。
【００８８】
別の実施形態において、細菌が大腸菌である方法。
【００８９】
別の実施形態において、真核生物発現系が動物細胞又は酵母細胞である方法。
【００９０】
別の実施形態において、酵母がピスチア・パストリス（Ｐｉｓｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である方法。
【００９１】
別の実施形態において、キメラタンパク質構築物が宿主細胞から細胞外媒体に分泌される方法。
【００９２】
別の実施形態において、精製した構築物は、様々な血栓状態を有する哺乳動物を治療するための治療薬として及び医薬組成物において有用である。哺乳動物は、ヒト、げっ歯類又は家畜になり得る。
【００９３】
別の実施形態において、精製した構築物を、追加の安定剤及び賦形剤と共に又は伴うことなく、様々な循環器疾患を緩和するための治療薬として使用した。
【００９４】
本発明の別の実施形態において、精製した構築物を１種以上の医薬組成物に製剤する。１種であれ複数であれ、精製した構築物を含有する医薬組成物を、固体の形態（すなわち、バイアル内で凍結乾燥させて、後に適切な溶液中で再構成する）又は液体の形態の両方に製剤することができる。
【００９５】
１つの特定の実施形態において、精製した構築物を含有するこれらの組成物は血栓溶解療法又は治療用のキットを構成し、このキットは任意で他の構成要素、例えば有効成分の再構成用の溶液の入った容器、カニューレ、静脈内投与のための生理学的血清の入った点滴バッグ、使用説明書等を含み得る。
【００９６】
薬学的組み合わせを、組み合わせた形態（すなわち、全ての有効成分を組み合わせて１つの製剤とする）又は個々の形態（すなわち、有効成分を組み合わせて１つの製剤にしない（又は全て組み合わせない））で、経口投与用の錠剤、カプセル、エリキシル製剤、直腸内投与用の座薬、注射による投与用の滅菌溶液、懸濁液等として製剤し、また使用し得る。用量及び投与方法を最適な有効性が得られるように調整し得るが、患者の体重、食事、並行して受けている薬物療法等の要因及び医療技術者ならわかるその他の要因に左右される。
【００９７】
一般に、本発明の精製した構築物に関し（使用、方法、医薬組成物及び製品を含む）、使用する精製した構築物の効力に応じて、０．１〜１０００ｍｇの量を投与する（必要に応じて１回の量として又は複数回の投与で）。
【００９８】
好ましい実施形態には、本明細書に記載されるような治療有効量の精製構築物又は精製構築物の濃縮組成物を薬学的許容可能な担体又は希釈剤中に含む、保管及びそれに続く投与のために調製した医薬組成物が含まれる。治療用の許容可能な担体又は希釈剤は製薬分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
【００９９】
保存料、安定剤、着色料、更には着香料をこの医薬組成物に配合し得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを保存料として添加し得る。加えて、酸化防止剤及び懸濁剤を使用し得る。
【０１００】
精製構築物又はその医薬組成物若しくは製品を併用療法においてインビボで使用するにあたって、組成物／製品を哺乳動物に様々なやり方で投与することができ、非経口的投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、結腸内投与、直腸内投与、経鼻投与、頬側投与、経皮投与、腟内投与、腹腔内投与）が含まれ、多種多様な剤形を用いる。
【０１０１】
当業者には極めて明白なように、有用な生体内投与量及び特定の投与方法は治療対象である哺乳動物の種、使用する特定の組成物及びこれらの組成物の具体的な用途に応じて変化する。有効投与レベル、すなわち所望の成果を得るのに必要な投与レベルの決定は当業者の領域内にある。典型的には、組成物の投与を低投与レベルで開始し、所望の効果が得られるまで投与レベルを上昇させる。
【０１０２】
一般に、本発明の方法を行うにあたって、精製構築物又は医薬組成物の投与量は所望の効果及び治療適応に応じて大きく変化し得る。典型的には、精製構築物の適切な投与量は約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０〜１５０ｍｇ、最も好ましくは約１０〜１２０ｍｇである。投与は好ましくは非経口、例えば静脈内投与である。また、投与は好ましくは必要に応じて単回投与又は複数回投与である。投与は好ましくは非経口、例えば静脈内投与である。また、投与は好ましくは必要に応じて単回投与又は複数回投与である。
【０１０３】
注射剤を、溶液若しくは懸濁液、注射前は溶液若しくは懸濁液に適した固体の形態又はエマルションの慣用の形態に調製することができる。適切な賦形剤は、例えば水／生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩等である。加えて、望ましいならば、注射可能な医薬組成物は少量の非毒性の補助物質（潤滑剤、ｐＨ緩衝剤等）等を含有し得る。望ましいならば、吸収強化製剤（例えば、リポソーム）を利用し得る。
【０１０４】
非経口投与の場合、本発明に従って使用するゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコール中の薬学的に活性な剤の溶液を利用し得る。水溶液は必要に応じて適切に緩衝剤で処理され得て（好ましくはｐＨ４〜９）、希釈液がまず等張性にした。例えばＮＩＦをｐＨ約７の水溶液で使用する。しかしながら、ＮＩＦはもっと低いｐＨ約４の水溶液で安定である。好ましい「パートナー化合物（ｐａｒｔｎｅｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」、ｔ−ＰＡ（又はそのバリアント）は一般にｐＨ約５の水溶液で使用される。これらの水溶液は静脈内注射の目的に適している。油性溶液は関節内、筋肉内及び皮下注射の目的に適している。これらの溶液全ての滅菌条件下での調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法で容易に成し遂げられる。
【０１０５】
本発明の医薬組成物及び製品を、当業者に周知の方法を利用して、再構成及びその後の投与の前の保管のために凍結乾燥し得ることに留意すべきである。凍結乾燥されようと別の形で保管されようと、本発明の組み合わせの有効成分を凍結乾燥前又は再構成後に（後の同時投与のために）混合し得る、あるいは（後に同時に、別々に又は連続して投与するために）個別に保管し得る。
【０１０６】
１つの特定の実施形態において、投与は、例えば静脈注射による又は血餅の近辺においてインシチュで投与するためのカテーテル留置での局所投与による非経口投与である。
【０１０７】
本発明で提供する薬学的組み合わせの組成物に存在し得る精製構築物の量は広い範囲で変化し得るが、常に治療有効量である。
【０１０８】
本発明の薬学的組み合わせの組成物を使用した各血栓溶解治療プロトコルの投与量は、各ケースにおける患者の年齢、病状、治療対象である臨床症状の重症度、投与する精製構築物の投与経路、投与頻度を含めた数多くの要因に左右される。
【０１０９】
一態様において、本発明は、既に説明したように、血栓溶解療法用の本発明の薬学的組み合わせ又はキットに関する。
【０１１０】
別の追加の態様において、本発明は治療及び血栓溶解療法の方法にも関係し、患者に治療有効量の１つ以上の精製構築物を投与することから成る。この関係で、本発明の組成物は、発病において炎症反応、組織の虚血、血栓症による血液レオロジー及び血管微小循環の障害が起きる虚血性心疾患、その合併症、虚血性脳卒中、リウマチ様疾患及び他の病態の治療に特に適格である。
【０１１１】
本発明は、６つのアミノ酸を含むリンカー配列を有するトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインとの組織プラスミノーゲン活性化因子の融合構築物を開示する。このリンカー配列の長さ及びアミノ酸配列順序を、両方の特性の機能を更に最適化するために変更又は調節することができる。最初に設計したリンカー配列のない構築物をリンカーを設計した構築物と比較したところ、最適化したリンカーを含有する異なる構築物におけるタンパク質Ｃ活性のごくわずか約２０〜２５％しか示さなかった。
【０１１２】
別の実施形態において、本発明は、非天然の融合タンパク質コード化遺伝子ブロック及びそのバリアントの標準的な遺伝子工学法による作製を開示する。
【０１１３】
更に、タンパク質Ｃ結合及び活性化において重要な役割を果たすＥＧＦの４番ドメインに必要な柔軟性を付与するために、タンパク質間融合リンカー配列は優先的に３個以上のグリシンアミノ酸残基をＥＧＦ４、５、６ドメインのプラスミノーゲン活性化因子成分との接合部位に含有した。同様に、リンカーを、トロンビン結合が促進されるようにと、ｔＰＡのＮ末端領域で融合させる場合にＥＧＦの６番ドメインのすぐ後に置いた。これはＥＧＦ４、５、６を組織プラスミノーゲン活性化因子の秩序だった構造／ドメイン間に導入する場合に特にあてはまった。このため、リンカーの役割は、２つのパートナーを融合させて両方のパートナータンパク質の機能性を維持しようとする場合に明らかであった。
【０１１４】
リンカー配列は、１つの正に帯電したアミノ酸（リジン又はアルギニン）がＶａｌ残基とタンデムとなるが２又は３個のグリシン残基の前に置かれるように選択されるため、溶解中に一時的にトロンビンが形成される可能性が極めて高い血餅の近辺でプラスミンにより切断することができ、両方のドメインは損傷部位において独立してその役割を果たすことができる。
【０１１５】
リンカーは１つのプロリンアミノ酸も含有し、このアミノ酸は実際にＥＧＦ４、５、６ドメインがトロンビン及び活性化タンパク質Ｃに結合しながら最適に作用することができるようにＥＧＦ４、５、６ドメインの方向を変更するのに役立つ。
【０１１６】
別の実施形態において、設計された構築物リンカー長さを延長又は短縮することができ、またアミノ酸の配列を天然及び非天然のアミノ酸で変更することによって活性化速度を変更することができる。
【０１１７】
別の実施形態において、トロンビン切断可能配列、トランスグルタミナーゼ認識配列及び他の血液プロテアーゼ感受性部位を、線維素溶解及び抗血栓機能に影響を与えることなくリンカーに導入することができる。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明は、様々な融合ポリペプチド及びそのより良好なバリアントの発現及び精製方法を開示する。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、血栓溶解剤の特性と抗トロンビン及びタンパク質Ｃ抗凝固特性を合わせ持つ様々な非天然のポリペプチドを開示する。
【０１２０】
別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６の酸化耐性形態を、未変性のｔＰＡと比較して変異による変化を有する組織プラスミノーゲン活性化因子の機能的に改善されたバリアントに融合させた（例えば、ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ２０）。
【０１２１】
別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６の酸化耐性形態をストレプトキナーゼのプラスミン耐性形態に融合させた。
【０１２２】
別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６の酸化耐性形態を１つ以上のシステイン残基が遊離の血栓溶解タンパク質に融合させた。
【０１２３】
別の実施形態において、発現した融合ポリペプチドを心血管疾患の治療に使用する。
【０１２４】
別の実施形態において、適切な医薬組成物は、ＦＤＡが認可した化学的安定剤、例えばマンニトール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等及び可溶化剤等と共に発現した融合ポリペプチドを有する。
【０１２５】
ヒトに静脈内投与するための発現した融合構築物製剤はＦＤＡが認可した安定剤を含有し得る。
【０１２６】
別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６及びそのバリアントを、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子と融合することができる。
【０１２７】
別の実施形態において、異なるＥＧＦ融合構築物を、ＳＫ、ｔＰＡ及びＳＡＫと７５〜１００％の相同性を示し、また未変性のタンパク質と比較して５０〜１００％のプラスミノーゲン活性化能を示すタンパク質で作製することができる。
【０１２８】
別の実施形態において、ＥＧＦ４、５、６バリアントが独立して発現させた未変性のＥＧＦ４、５、６ドメインと比較して７５〜１００％の相同性／類似性並びに５０〜１００％の抗トロンビン及びタンパク質Ｃ活性を示す、ＳＫ、ｔＰＡ及びＳＡＫと融合させたＥＧＦ４、５、６のバリアント。
【０１２９】
試薬
遺伝子構築物：
ＥＧＦ４、５、６ドメイン配列は、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における最適な発現のために商業的にカスタム合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ、米国）されたヒトトロンボモジュリンｃＤＮＡのものであった。合成遺伝子セグメントを正しい順序でライゲーションし、細菌プラスミドでクローニングした。一方のトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインと血栓溶解剤（例えば、ＳＡＫ、ＳＫ又はｔＰＡ（又はこれらの誘導体／変異体））との融合構築物を本質的に、（ａ）化学的手法を用いたカスタム遺伝子合成と、（ｂ）適切なプラスミドから特異的に設計したプライマーを使用して選択された遺伝子セグメントを得るための定評のあるＰＣＲ技術の使用（以下の実施例で用いた方法を参照のこと）とを組み合わせ、続いてＰＣＲで得られた遺伝子セグメントブロックを単離し、これらをオーバーラップエクステンションＰＣＲ等の特殊なＰＣＲ法を用いてインフレームで「融合」することによって行った。一般に、通常のＰＣＲは、適切な高処理能力の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ  Ｉｎｃ．又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）又は高フィデリティｐｆｕターボ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）酵素を使用して行われた。ハイブリッドＤＮＡ構築物を、タンパク質の同時発現のないルーチンのプラスミドサブクローニングのための適切な大腸菌株ＸＬ−Ｂｌｕｅ及びＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌプロモーター下でのタンパク質発現のための株ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、マディソン、ＷＩ、米国から調達）への形質変換によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをベースとした発現ベクターｐＥＴ２３−ｄにおいてクローニング／発現させ、またベクターｐＰＩＣ−９Ｋにインフレームα交配因子シグナル配列を有するメタノール誘導性プロモーター下で酵母（ピチア・パストリス）において発現させ、ＧＳ１１５細胞を発現に使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア、米国）。様々な制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び他のＤＮＡ修飾酵素をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ビバリー、ＭＡ）から入手した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｂｉｏｂａｓｉｃ，Ｉｎｃ．（カナダ）から入手した。ＤＮＡの精製及びＰＣＲ増幅産物のアガロースゲルからの抽出を、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ（ドイツ）から入手可能なキットを使用して行った。蛍光色素を使用した自動ＤＮＡシーケンシングを、１６本のキャピラリのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザで行った。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ペンツベルク、ドイツ）から購入するか、アフィニティクロマトグラフィによりヒト血漿から精製した（Ｄｅｕｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍｅｒｔｚ、１９７０）。ヒトタンパク質Ｃ、トロンビン、ヒルジンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国）から購入し、ウサギの標準トロンボモジュリン及び組み換えトロンボモジュリンを両方共、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．（米国）から購入した。Ｎ末端気相アミノ酸シーケンシングを���Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシーケンサーモデル４９１を使用して行った。ウロキナーゼ、ＥＡＣＡ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びＬ−リジンをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（セントルイス、米国）から購入した。フェニルアガロース６ＸＬ及びＤＥＡＥセファロース（ファストフロー）をＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ（ウプサラ、スウェーデン）から調達し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズをＱｉａｇｅｎから調達した。他の試薬は全て入手可能な範囲で最高の分析グレードであった。
【０１３０】
実施例で用いた一般的な方法：
１．組み換えＤＮＡ融合方法：
まとめて組み換えＤＮＡ技術と称される様々な方法は分子生物学の分野で今や周知である。幾つかの技法、標準的なプロトコル及びこれらの変形は幾つかの参考文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＩＩnd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．，１９８９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｑｕｉｒｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｒ．，［Ｅｄ．］ＰＣＲ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．，１９９１）．に詳しく記載されている。しかしながら、幾つかの変更が融合構築物の設計で必要であり、発行された文献から異なる刊行物を特定の用途に合わせて引用する。本発明において、発明者は２個の遺伝子を融合させたが、Ｈｏら（Ｈｏ，Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）及びＭｅｈｔａ及びＳｉｎｇｈ（Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ  １９９９）のオーバーラップエクステンションＰＣＲとして知られる方法に頼った。２Ｋｂまでの小さい構築物の増幅には、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．、米国）を使用し、点変異構築用に高フィデリティのポリメラーゼ作用が必要とされるより長いＰＣＲには、ｐｆｕターボ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を長さ６〜７Ｋｂのフラグメント増幅の増幅及び部位特異的変異誘発に使用した（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｃｏｌｍ  １９９９）。
【０１３１】
２．制限酵素切断及びライゲーション：
制限酵素切断及びライゲーション用の酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国）から入手し、Ｆｅｒｍａｎｔａｓ  Ｉｎｃ．の「消化が速い」制限酵素を製造者のプロトコルに従って使用した。ほぼ全てのキメラ融合構築物例について述べるように、ライゲーションは、ＸｈｏＩ（四塩基カッター）及びＮｏｔＩ（六塩基カッター）で消化されたベクターとインサートとの間で行われ、定方向クローニングの機会を最大にした。
【０１３２】
３．大腸菌ＸＬ  １Ｂコンピテント細胞におけるライゲーション混合物の電気穿孔及びｐＰＩＣ−９Ｋにおけるベクター含有直線化インサートの形質転換：
反応用のライゲーション混合物をＸＬ  １Ｂコンピテント細胞に電気穿孔した（Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ  １９９６）。ＱｉａｇｅｎのＭｉｄｉ  ｐｒｅｐキットで指示に従って調製した多量のＤＮＡ。Ｍｉｄｉ調製の最終ステップにおいて、ＤＮＡを高塩分濃度で溶出させ、ここで発明者はｐＨ５の０．３Ｍの酢酸ナトリウムを最終濃度で使用し、７０％のエタノールを消化反応を妨害し得る余分な塩の除去に使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。この工程により、発明者は５０〜６０μｇのＤＮＡを得て、ＤＮＡはＢｇ１  ＩＩ酵素を使用した直線化ステップに供され、消化後、再度酢酸ナトリウム及びエタノール沈殿ステップに供され、最後に乾燥させたペレットを７〜８μｌのオートクレーブした塩非含有水に溶解させ、１〜３μｇ／μｌのＤＮＡが得られた。ここで７〜１０μｇのＤＮＡをピチア・パストリスのＨｉｓ−ＧＳ１１５細胞のエレクトロコンピテント細胞における形質転換に使用し、最後にＭＤ培地上に蒔き、Ｈｉｓ＋形質転換体だけがプレート上で成長した。プラスミドｐＰＩＣ−９ｋは、ＡＯＸ１プロモーターを使用した相同組み換えを通じて所望の遺伝子のマルチコピー挿入が可能となるような形で設計される（Ｒａｍｃｈｕｒａｎ，Ｍａｔｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。マルチコピーターゲット遺伝子挿入は、細菌カナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ９０３）を介し、抗生物質濃度の上昇に伴うゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）耐性個体群をモニタすることによってモニタすることができる。ピチアはそのままでゲンチシン耐性０．２５ｍｇ／ｍｌに耐えるが、０．５ｍｇ／ｍｌ及び４ｍｇ／ｍｌは１〜２コピー及び７〜１２コピー挿入をそれぞれ示す。ゲンチシン耐性は所望の遺伝子の複数挿入と直接の相関関係にある。遺伝子量効果により、所望の遺伝子産物の分泌量の多さはより多い挿入数に対応すると推論することができる（Ｎｏｒｄｅｎ，Ａｇｅｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【０１３３】
４．融合構築物の封入体の発現、単離及びリフォールディング
ＥＧＦ−ＳＡＫ、ＳＡＫ−ＥＧＦ等の一部の構築物を、ｐＥＴ２３−ｄ下で発現させ、キメラタンパク質は宿主である大腸菌Ｂｌ  ２１−ＤＥ３細胞において封入体の形態で蓄積した。封入体が形成された場合は、最大量の過剰発現タンパク質が得られた（Ｍｉｓａｗａ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｇａｉ  １９９９；Ｚｈａｎｇ，Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３細胞をキメラ融合タンパク質の封入体の産生に使用し、一晩増殖させたＢＬ２１  ＤＥ３細胞培養物からの２５ｍｌのＬＢ（ルリアベルターニ）を一次接種材料として使用し、５００ｍｌのＬＢ（二次培養物）培地に移した。ＯＤ600が一旦０．６〜０．８に達したら、タンパク質生成を１ｍＭのＩＰＴGの助けを借りて誘導した。誘導後、細胞を振盪条件下で６時間にわたって４０℃で維持した。６時間のインキュベーション後、細胞を６０００ｒｐｍでの１０分間にわたる４℃での遠心分離により収穫した。最後に、収穫した細胞を５０ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ溶液で洗浄して細胞塊から培地成分を除去した。洗浄後、細胞を最終ＯＤ600３５〜４０まで洗浄液に懸濁させた。この希釈で、細胞をプローブタイプのソニケーターでの超音波処理に供し、３０秒のオン／オフサイクルを４５分間にわたって行った。溶解サイクルの完了後、細胞ペレットを１２，０００ｒｐｍでの１５分間にわたる遠心分離により収穫した。得られたペレットを２回、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び２Ｍの尿素含有溶液で洗浄した。再度、これらの封入体を溶液に再懸濁させ、１２０００ｒｐｍでの１５分間にわたる遠心分離により収穫した。収穫したペレットを２回、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．４）及び１ｍＭのＥＤＴＡ溶液で洗浄すると、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が除去された。最後に、ペレットを８Ｍの尿素（２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ中で調製、ｐＨ７．４）及び１ｍＭのＤＴＴに２時間にわたって再懸濁させた。この溶液中の溶解した封入体の殆どが、１２０００ｒｐｍでの２０分間にわたる遠視分離によりペレットから分離し、最終的な上清は最大量のキメラ融合タンパク質を含有していた。ここで、このタンパク質画分をリフォールディングのために供し、最高０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、以下の条件下でリフォールドした：５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、２％のグリセロール中の２Ｍの尿素、酸化／還元グルタチオンモル比１．５：０．５、ごく軽く撹拌しながら４℃で３６時間。このリフォールディングステップの完了後、混合物を２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭの尿素に対して４８時間にわたって透析し、透析した反応混合物を疎水及びイオン交換クロマトグラフィを用いたタンデムクロマトグラフィによる精製に供した。ジスルフィド結合形成を、ジスルフィド結合形成及びリフォールディングの直接的な指標であるＤＴＮＢ反応によりモニタした（Ｒｉｅｎｅｒ，Ｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。最後に、精製したタンパク質を様々な活性アッセイに供した。
【０１３４】
５．プラスミノーゲン活性化検出のためのカゼイン／プラスミノーゲンオーバーレイ：
融合構築物においては、予備レベルにおいて、プラスミノーゲン活性化をこの方法でスクリーニングし、５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを１５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓを１％のアガロースと共に含有している水中で沸騰させる。冷却後、約２００〜４００μｇのプラスミノーゲンをこの混合物に添加し、スクリーニング対象であるコロニー／クローンの入ったＬＢアンピシリン含有プレートにオーバーレイした（Ｍａｌｋｅ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  １９８４）。プラスミノーゲン活性化能を有する全ての融合組み換えタンパク質は、１〜２時間から最高１８時間にわたるインキュベーション後、カゼインを分解し、白色の背景に対して見えやすいクリアランス領域を生じさせるプラスミンの生成に起因する加水分解領域から容易に検出された。
【０１３５】
６．プラスミノーゲン活性化プロファイルをチェックすることによる最良のプロデュースクローンのスクリーニング：
ゲンチシン耐性マーカーを使用してより多いコピー数を含有する形質転換体を選択した後、最良のプロデューサークローンの実際のスクリーニングに供した。この方法では、一次培養物は２．５ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１Ｘグリセロール、１Ｘアミノ酸非含有酵母ニトロゲンベース及び１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５）において、３０℃で１６〜１８時間にわたって培養した。一旦光学密度（ＯＤ600）が最高３〜４単位に達したら、７．５ｍｌのＢＭＭＹ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１Ｘメタノール、１Ｘアミノ酸非含有酵母ニトロゲンベース及び１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５）を添加することによって培養物を誘導した。これらの培養物を、組み換え産物の産生のために最終の０．５ｖ／ｖ％メタノールで５日間にわたって更に誘導すると、組み換え融合タンパク質が強力なメタノール誘導性プロモーターの影響下で産生された。
【０１３６】
７．酵素電気泳動：
プラスミノーゲン活性化能を有する細胞外分泌産物及び関心の対象である所望のバンドはこの方法により検出され、１０〜１２．５％ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを非還元サンプルバッファー中で行った。完了後、余分なドデシル硫酸ナトリウムを２．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液中での洗浄により除去した。次に、このゲルを２〜３回、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）ですすいだ。この洗浄したゲルをスキムミルクアガロース及びプラスミノーゲン含有固形物面（寒天ゲル）上に置いた。５〜７時間にわたるインキュベーション後、加水分解領域が広がって目に見えるようになり、分解されたタンパク質におけるプラスミノーゲン活性化能を表している。
【０１３７】
８．ウェスタンブロット技法：
所望のタンパク質の検出は、ウェスタンブロット法の助けを借りて行われた。ピチア・パストリス細胞からの細胞外媒体に分泌された全ての融合構築物を６０００ｒｐｍでの遠心分離により分離し、上清を所望の産物の同定のために取り出した。上清をウェスタンブロット法のためにそのままで直接取り出した。あるいはまず５ＫＤａ又は１０ＫＤａのカットオフ範囲のコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。あるいは、トリクロロ酢酸沈殿に供し、アセトンで洗浄し、１０〜１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に置いた。タンパク質を、２５ｍＭのトリス、１７５ｍＭのグリシン及び２０％のメタノールを含有する転写バッファーの助けを借りてニトロセルロース膜上で転写した。膜上でのゲルブロッティングを２５０ｍＡで３５分間にわたって行った。ブロットした膜を１０％のスキムミルクで一晩、４℃で浸漬させ、あるいは３７℃で２時間にわたってインキュベートした。このブロットを更に０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、これにより余分なスキムミルクが除去された。その後、ブロットを一次抗体又はポリセラ（ｐｏｌｙｓｅｒａ）に推奨される希釈で１時間にわたって浸し、Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。更に、このブロットをＨＲＰコンジュゲート二次抗体でインキュベートし、続いてＰＢＳ洗浄を３回行った。最後に、ブロットをＤＡＢ（ジアミノベンジジン）溶液の添加により現像した。
【０１３８】
９．リジン／アガロースクロマトグラフィ：
ＥＧＦ４、５、６との様々な組織プラスミノーゲン活性化因子融合構築物は、リジン残基への親和性で知られるクリングルドメインを含有する（ＭｃＣａｎｃｅ，Ｍｅｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｙｅ，Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。この方法においては、組織プラスミノーゲン活性化因子融合ポリペプチドを有する、ピチア・パストリス発酵から得られた上清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して３〜４時間にわたって透析し、リン酸緩衝液で事前に平衡化したリジン／セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデンから購入）に約０．５ｍｌ／分のゆっくりとした流速で装填した。装填完了後、カラムを再度４〜５ベッド体積のリン酸緩衝液で洗浄すると、最終的にタンパク質が０．３Ｍのε−アミノカプロン酸及び１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に溶出された（Ｑｉｕ，Ｓｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【０１３９】
１０．トロンビンアフィニティクロマトグラフィ：
トロンビンカップリングを、上述の手順により臭化シアン活性化ビーズで行った（Ｓａｌｅｍ，Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。ここで、異なる精製ステップで得られたタンパク質を最終的に、カラムが５０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．４）で平衡化されたトロンビンアフィニティに供し、約０．５ｍｌ／分のゆっくりとした流速での装填に使用した５０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。装填完了後、カラムを同じ緩衝液で洗浄した。最後に、ＮａＣｌの勾配を上昇させることによってタンパク質を溶出させた（Ｓａｌｅｍ，Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。次に、異なるタンパク質画分をタンパク質Ｃ活性化能について試験した。
【０１４０】
１１．疎水性相互作用クロマトグラフィ：
ＥＧＦ−ＳＫ、ＥＧＦ−ｔＰＡ及びＥＧＦ−ＳＡＫの異なる融合遺伝子構築物の精製を異なるクロマトグラフィ法で行い、疎水及びイオン交換クロマトグラフィを異なる融合ポリペプチドの頻回の精製に用いた（Ｇｏｙａｌ，Ｓａｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。疎水クロマトグラフィにおいては、平均粒径１００〜３００μＭ直径のフェニルセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）６％架橋ビーズをカラムの準備に使用した。単純なＸＫ１６／２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を蠕動ポンプの助けを借りてパックし、約２５ｍｌのフェニルセファロースベッドを形成し、４〜５ベッド体積の０．３ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓで平衡化し、ピチア・パストリス発酵中に得られた、所望の融合構築物を含有する隣接する上清を平衡化緩衝液と同じ緩衝強度及び塩の組成物に透析により維持した。平衡化された上清をパックされたカラムに流速４０ｍｌ／時間で装填し、上清の装填完了後、４〜５ベッド体積の平衡化緩衝液を通して培地成分及び非特異的に結合した不純物を除去すると、最終的に所望の融合ポリペプチドが水に溶出した。溶出したタンパク質を２回目の精製に供し（以下を参照のこと）、プラスミノーゲン活性化及びトロンビン阻害及びタンパク質Ｃ活性化アッセイについて試験した。
【０１４１】
１２．ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）イオン交換クロマトグラフィ：
このクロマトグラフィ手順においては、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフローをＸＫ１６／２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）にパックし、概して、製造者の説明書に従い、殆どの場合、２０ｍｌの膨潤マトリックスをパッキングに使用した。このカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し、ピチア・パストリスから得られた上清を、２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して十分に透析した後、平衡化したカラムに装填し（別々に実行）、あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィによる精製後（上記）、またそのイオン強度を平衡化緩衝液と同じに維持したまま、それぞれのカラムに装填した。装填完了後、各カラムを４〜５ベッド体積の平衡化緩衝液で洗浄し、この洗浄は非特異的に又は緩く結合した不純物及びポリペプチドの除去に役立つ。タンパク質の溶出を、１ＭのＮａＣｌの上昇勾配を５ベッド体積のマトリックスにかけて行った。タンパク質量子化（quantization）をブラッドフォード法の助けを借りて行い（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １９７６）、ＢＳＡの標準曲線と比較した。最後に、精製したタンパク質を２０ＫＤａのカットオフ値のコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、様々な分析及び機能アッセイに使用した。
【０１４２】
１３．ＥＦＧ−血栓溶解性融合構築物のプラスミノーゲン活性化アッセイ：
全てのキメラ融合ポリペプチド構築物は血栓溶解成分（ＳＫ、ＳＡＫ、ｔＰＡ）を含有した為、これらの構築物のプラスミノーゲン活性化能をプラスミン用の発色性ペプチド基質からの色素の放出によって測定した。ストレプトキナーゼ及び全ての融合構築物の一段階アッセイを２μＭのヒトプラスミノーゲン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０５％のＢＳＡ及び５ｍＭの発色基質を使用する条件下で行い、発色基質の放出を時間の関数として分光光度的にモニタする。次に非線形回帰を行い、吸光度と時間2との間のプロットは直線方程式に従った。ストレプトキナーゼは速やかにプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を開始し、また事実上、活性化における遅延を示さないが、一部の融合構築物の場合、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化するのに長い時間がかかる。これはプラスミノーゲンのプラスミンへの酵素前駆体活性化（経路Ｉ）がアクティブではなく、微量のプラスミンが活性複合体を形成することを示した。このことは、微量（ナノモル）の外部プラスミンの段階的な添加によりラグタイムが段階的に短くなった時、確認された。組織プラスミノーゲン活性化因子によるプラスミノーゲン活性化の場合は、迅速且つ単純な分光光度法に従い、単純な発色ペプチド（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｓ−２２５１、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．から購入）を、組織プラスミノーゲン活性化因子の作用によって形成されるプラスミンの検出に使用した（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ，Ｍｕｌｌａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８２）。この方法を、フィブリン及び組織プラスミノーゲン活性化の存在下での強化されたプラスミノーゲン活性化の検証にも用いた（ｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ｖｅｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）。この活性化アッセイにおいては、２μＭのプラスミノーゲン、０．０５ＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％及び０．５ｍＭのＳ−２２５１とインキュベートした異なる精製量のタンパク質を可溶性フィブリン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国から購入）の存在下及び不在下及びフィブリンなしで使用した。１分の間隔で最高２時間にわたって４０５でモニタした吸光度。
【０１４３】
１４．異なる融合構築物での凝固時間実験：
異なるキメラ構築物の存在下でのトロンビン誘導血餅形成への作用を観察するために、異なるトロンビン濃度の標準曲線を作成し、６．６ＩＵのトロンビンでの２０秒の凝固時間を得た。次に、同量のトロンビンを構築物の濃度を上昇させながらインキュベートすることによって凝固時間がコントロールの２倍になる濃度を測定した（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【０１４４】
１５．異なる融合／キメラ構築物によるタンパク質Ｃ活性化：
組織プラスミノーゲン活性化因子、スタフィロキナーゼ及びストレプトキナーゼの異なる融合構築物を用量依存的にトロンビン介在タンパク質Ｃ活性化アッセイに供した。このアッセイでは、異なる量のタンパク質（ｎＭレンジ）を１０ｎＭのトロンビンと、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０５％のＢＳＡの存在下、３７℃で２０分間にわたってインキュベートした。その後、０．５μＭのタンパク質Ｃをウェルに添加し、２０分間にわたって２５℃でインキュベートした。その後、０．５ｍＭのヒルジンを添加することによってトロンビンを阻害し、インキュベーションを５分間にわたって２５℃で継続し、次に発色基質を０．５ｍＭの最終濃度で添加し、着色されたｐＮＡの放出を４０５ｎｍで上で詳述したように時間に対してモニタした（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍｉｌｅｔｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８８；Ｅｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  １９９５；Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｄａｈｌｂａｃｋ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌｏｕｔｒｅｉｘ  ２００５）。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであるため、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１４６】
実施例１
ストレプトキナーゼとＥＧＦ４、５、６ドメインとの様々な融合遺伝子の調製：
（ｉ）ＳＫコード化オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流にインフレームで融合したＥＧＦドメインの発現のためのハイブリッド遺伝子構築物：
ＥＧＦ−ＳＫタンパク質融合をコードしている二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡブロック（ＥＧＦ４、５、６コード化配列をインフレームでＳＫ  ＯＲＦのＮ末端コード化側に融合させた）を、プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ  Ｆｐ１及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ  Ｒｐ２（プライマーの配列に関しては表１を参照のこと）を使用して構築した。細菌発現ベクターｐＥＴ２３−ｄ＿ＳＫの設計及び構築はＮｉｈａｌａｎｉら（１９９８）により記載されている。構築は、ｐＢＲ３２２におけるストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｈ４６ＡからのＳＫ遺伝子のクローニングを伴い（Ｐｒａｔａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ファージＴ７主要カプシドタンパク質からの高効率リボソーム結合部位を含有する発現ベクターであるｐＥＴ−２３ｄへのサブクローニング（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ，１９８６）及び二次構造体形成の傾向を最小限に抑えるための遺伝子の５’端の更なる修飾が続いた。ｐＥＴ２３−ｄ＿ＳＫ構築物から発現したストレプトキナーゼはＭｅｔ−ＳＫである。更なる詳細は米国特許第７１６３８１７号明細書に記載される。この構築物を、ＳＫ遺伝子増幅のためのテンプレートとして使用した（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１３）。
【０１４７】
ＥＧＦ４、５、６ドメインに対応する二本鎖ポリヌクレオチドブロック（ＳＥＱ  ＩＤ  ２、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１１）を、テンプレートとして配列ＩＤ２に対応する合成遺伝子（ＤＮＡポリヌクレオチド）を使用して選択的に増幅し、合成遺伝子はカスタムＤＮＡ合成により調製され、ｐＥＴ２３−ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターにおけるクローニング後、配列ＩＤ２に対する自動ＤＮＡシーケンシングにより検証された。プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ  Ｆｐ１はまた（プライマーの詳細については表１を参照のこと）ＰＣＲ後に得られる遺伝子ブロックを酵母発現プラスミドにドッキングできるようにＸｈｏＩ制限部位をその５’端に含有した。プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ  Ｒｐ２は５’端に（ＥＧＦ４、５、６の６番ドメインの端部とハイブリダイズしているヌクレオチドに加えて）配列、またＳＫ遺伝子ＯＲＦの５側とアニールする追加のヌクレオチドを含有した。ＰＣＲサイクル条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、９５℃での４５秒間にわたる変性、続く４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長（全部で２８サイクル）及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の増幅の完了。ＳＫ遺伝子ブロックの増幅に関しては、プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ  Ｆｐ３（上流）及びプライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿Ｒｐ４（下流プライマー）（プライマーの詳細については表１を参照のこと）を使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。ＰＣＲ条件：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での３分間にわたる伸長（全部で２８サイクル）及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完全増幅。両方のＰＣＲ産物をゲル抽出精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりアガロースゲルからゲル精製した。これらの２つの精製ＰＣＲ産物をスプライスオーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲ（詳細については、上の「実施例で用いた一般的な方法」のセクションを参照のこと）に供することによってＥＧＦ４、５、６コード化配列が終止コドンで終了するＳＫ遺伝子コード化配列とインフレームで融合した隣接ＥＧＦ４、５、６−ＳＫハイブリッド遺伝子構築物を構築した。この遺伝子ブロックをアガロースゲルから精製された形態で単離し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素（Ｒ．Ｅ．酵素）で消化し、同様にカットしたｐＥＴ２３−ｄプラスミドベクターにライゲーションし（図１Ａ及び図２Ａを参照のこと）、次に大腸菌ＸＬ１Ｂ（ｒｅｃＡ-及びｅｎｄＡ-）細胞に形質転換させ、この細胞中、ポリペプチドは発現しないが、プラスミドＤＮＡは増殖する。このプラスミドを、正しく融合したＥＧＦ＆ＳＫ成分のＤＮＡ配列を検証するためにサンガーのジデオキシシーケンシング法に供した（ＳＥＱ  ＩＤ  ４、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１２）。この構築物において、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化したカセットをアガロースゲルから単離し、ｐＰＩＣ−９Ｋに「ドッキング」した。この得られた構築物において、上流ＥＧＦ４、５、６配列はα−分泌シグナル配列及���Ｋｅｘ２プロセシング部位とインフレームに置かれ、ハイブリッド遺伝子構築物ＥＧ−４、５、６−ＳＫは、ピチア・パストリス（株ＧＳ１１５）においてベクター中に位置するアルコールオキシダーゼプロモーターからその宿主ゲノムへの組み込み後に発現する（Ｎｏｒｄｅｎ，Ａｇｅｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。この発現ベクターから発現したハイブリッドポリペプチドは効率的に膜を越えて輸送されもし（以下の実施例を参照のこと）、また純粋な形で単離することができる。
【０１４８】
（ｉｉ）ＥＧＦ４、５、６コード化ドメインがＳＫコード化遺伝子の下流／Ｃ末端コード化端でインフレームで融合したＳＫ−ＥＧＦ４、５、６コード化遺伝子構築物の構築
ＳＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１（上流）及びＳＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２（下流）プライマー（プライマー配列については表１を参照のこと）セットを使用することによって、ＳＫに対応するヌクレオチド配列（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１４）をｐＥＴ２３−ｄ−ＳＫプラスミドをテンプレートとして使用して増幅した（「実施例で用いた一般的な方法」を参照のこと）。プライマーＳＫ＿ＥＧＦ  ＦｐｌはＸｈｏＩ制限部位をその５’端に含有し、ＳＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２はその５’端にＳＫ配列を最高１１４９ｂｐまで含有し、三重グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）コード化セグメント及びトランスグルタミナーゼ認識コード化配列が続き、最後にＥＧＦ４、５、６の４番ドメインをコードする５’端とオーバーラップする配列で終了している。得られる遺伝子ブロックは同じＸｈｏＩ制限部位をその５’端を含有し、下流（３’端）は４番ドメインのためのオーバーラップヌクレオチド配列を含有する。第２のＰＣＲにおいて、ＳＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ３及びＳＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ４（プライマー配列については表１を参照のこと）のプライマーセットを、テンプレートとしてのｐＥＴ２３−ｄ＿ＥＧＦ４、５、６（ＥＧＦ４、５、６のための合成カスタムメイド遺伝子を含有する）からのＥＧＦ４、５、６ドメインの増幅に使用した。プライマーＳＫ＿ＥＧＦ＿Ｆｐ３はＳＫの下流配列、最高１１４９ｂｐを含有し、三重グリシンコドンセグメント、トランスグルタミナーゼ認識部位コード化配列がその５’端に向って続いた。もう一方のプライマー、すなわちＳＫ＿ＥＧＦ＿Ｒｐ４は、その５’端にＥＧＦ４、５、６の６番ドメインの端部の部分配列及びＮｏｔＩ制限部位を含有した。ＰＣＲ後、このプライマーセットを使用して得られた遺伝子ブロック２はその５’端に（ＳＫの上流１１４９番ｂｐ、続いて三重グリシンコード化及びトランスグルタミナーゼ認識コード化配列を含有し、他方、その３’端にＮｏｔＩ制限部位を含有してｐＥＴ２３−ｄベクターへのクローニングを促進する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、次に２８サイクルの：９５℃での４５秒間、４５℃での４５秒間にわたるプライマーのアニーリング及び７２℃での１分間、最後に７２℃での１０分間にわたる伸長により部分長ＰＣＲ産物を完了させる。
【０１４９】
両方のＰＣＲブロック（ＳＫのＰＣＲブロック及び部分オーバーラップ配列を有するＥＧＦ４、５、６をコードするＰＣＲブロック）を、ＱＩａｇｅｎゲル抽出キットを使用してゲルから精製した。これらの精製ＰＣＲ産物をスプライスオーバーラップエクステンションＰＣＲに供して隣接ＳＫ＿ＧＧＧ＿トランスグルタミナーゼ＿ＥＧＦ４、５、６ハイブリッド遺伝子構築物を構築し、最後にＳＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１及びＳＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ４（プライマーの配列については表１を参照のこと）「エンド」プライマーセットの助けを借りて増幅した。最終的なＰＣＲ産物を次にＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した（図１Ｂ及び図２Ｂを参照のこと）。ゲルからの精製後、最終的な消化及び精製済みのＰＣＲブロックをｐＥＴ２３−ｄ（事前に同様にＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、ゲル精製した）にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＥＴ２３−ｄ＿ＳＫ＿ＧＧＧ＿ＴＧ＿ＥＧＦと称し、大腸菌ＸＬ１Ｂ（ｒｅｃＡ-、ｅｎｄＡ-）細胞で増殖させた。このプラスミドをサンガーのジデオキシチェーンターミネーション法に供し、また完全クローニングされたインサート配列を検証した（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ６、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１４）。このプラスミド構築物から、Ｘｈｏ１及びＮｏｔ１酵素を使用して、ハイブリッド遺伝子構築物を単離し、ｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、上流ＸｈｏＩ部位はＳＫ−ＧＧＧ−ＴＧ−ＥＧ４、５、６ブロックの発現プラスミドにおけるハイブリッド遺伝子の上流でα−分泌シグナル配列へのインフレームでのドッキングを支援した。このハイブリッド遺伝子構築物をピチア・パストリス（ＧＳ１１５）においてアルコールオキシダーゼプロモーターの制御下、宿主ゲノムへのその組み込み及び機能的スクリーニングによるプラスミノーゲン活性化因子陽性クローンの選択後、発現させた。
【０１５０】
（ｉｉｉ）ＥＧＦ４、５、６ドメインのストレプトキナーゼコード化遺伝子セグメントへのインフレーム挿入のためのＤＮＡハイブリッド遺伝子の構築：
ハイブリッド遺伝子構築物を得るための、ＥＧＦ４、５、６の配列を翻訳的にインフレームなやり方でＳＫの配列内に散在させた「ドメイン間ＳＫ」−ＥＧＦ構築物の構築も設計し、次に適切なプライマーを使用して形成した（プライマーの配列については表１を参照のこと）。ＥＧＦ配列を、ドメイン間フレキシブルセグメント（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｙａｄａｖ＆Ｓａｈｎｉ，２００９）をコードしているＳＫ遺伝子の領域、すなわち一方でαドメインとβドメインとの間、あるいは他方でβドメインとγドメインとの間に挿入した。これを目的として、ＳＫのα−ドメインをコードしているＤＮＡの増幅を最初に行い、プライマーセットＩＤα．Ｆｐ１及びＩＤα  Ｒｐ２を使用した（配列の詳細については、表１を参照のこと）。プライマーＩＤα．Ｆｐ１はＸｈｏＩ制限部位をその５’端に含有し、他方、プライマーＩＤα  Ｒｐ  ２はＥＧＦの４番ドメインのためのオーバーラップ配列をその５’端に含有する。この反応のために、以下のＰＣＲ条件を用いた：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、続く２８サイクルの９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１．５分間にわたる伸長及び最後に不完全なＰＣＲ産物を完成させるための７２℃での１０分間にわたる「伸長セグメント」。ＥＧＦ４、５、６をコードしているＤＮＡブロックも別々にプライマーセットＩＤ  ＥＧＦ  Ｆｐ３及びＩＤ  ＥＧＦ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）を使用して増幅した。このプライマーセットを使用して、ＥＧＦ４、５、６配列をコードしているＤＮＡブロックを得て、５’端に向かう上流配列はＳＫのα−ドメインの下流配列と部分的にオーバーラップした。同様に、このブロックの３’端はＳＫβ−ドメインの上流配列とオーバーラップしている配列を含有した。ＳＫのβ及びγドメインの両方をコードしている第３のＰＣＲブロックを、プライマーセットＩＤ  βＦｐ５及びＩＤ  γＲｐ６（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）を使用してＰＣＲにより得た。この反応に関しては、以下のＰＣＲ条件を用いた：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、続く９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１．５分間にわたる伸長（全部で２８サイクル）及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完全増幅。５’端がＥＧＦの６番ドメインの下流配列と相同となるようにＩＤ  βＦｐ５プライマーを設計し、下流プライマーＩＤ  γＲｐ６は終止コドン、それに続くＮｏｔＩ制限部位を含有した。３個の遺伝子ブロック全てをアガロースゲルからゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）の助けを借りて精製し、ワンポットスプライスオーバーラップエクステンション反応に供して１つの隣接遺伝子産物を得て、遺伝子セグメントの順序は以下の通りであった：ＳＫα−ＥＧＦ４、５、６−ＳＫβ−ＳＫγ。単純なＰＣＲ反応において３個のセグメント全てを１：１：１のモル比で添加し、最初の１０サイクルはプライマーなしで行い、次の１８サイクルをそれぞれ最終濃度０．６μＭのＩＤαＦｐ１及びＩＤγＲｐ６を添加して行うことによって３フラグメントＳＯＥ中間体を更に増幅した。この反応のために、以下のＰＣＲ条件を用いた：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、それに続く（各サイクルにおいて）９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での３分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完成。最終ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した（図１Ｇ及び図２Ｄを参照のこと）。このハイブリッド遺伝子構築物を次にｐＥＴ２３−ｄベクターにライゲーションし、大腸菌ＸＬ１Ｂ（ｒｅｃＡ-及びｅｎｄＡ-）コンピテント細胞に形質転換させ、ＤＮＡはタンパク質発現を起こすことなく増殖でき（宿主が必要とするファージコード化ＲＮＡポリメラーゼを提供しなかった為）、これをいわゆるジデオキシチェーンターミネーション法でのサンガーの自動シーケンシングに供した（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ３、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１６）。結果によりハイブリッド遺伝子構築物が完全に検証された。その後、ハイブリッド遺伝子カセットをｐＥＴ２３−ｄドメイン間ＳＫ＿ＥＧＦプラスミドから、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素での消化により単離した。このカセットを次にα−分泌シグナル配列の上流且つインフレームでｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、ピチア・パストリス（ＧＳ１１５）に形質転換させ、クローニングし、前回のようにプラスミノーゲン活性化についての機能性スクリーニングにより選択し、発現は、方法のセクションで詳述しているように、宿主ゲノムにおける組み込み後、メタノール誘導後、ベクターのアルコールオキシダーゼプロモーターの影響下にあった。
【０１５１】
（ｉｖ）ＳＫ成分がＥＧＦ４、５、６コード化ドメインによって両側でフランキングされているハイブリッドＳＫ−ＥＧＦ遺伝子の構築：
ＳＫコード化配列がインフレームで融合したＥＧＦ４、５、６ドメインによって両側でフランキングされている別の構築物も、ｐＥＴ２３−ｄ  Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫプラスミド構築物をとり（上のサブセクションｉ及びｉｉを参照のこと）、これをＸｈｏＩ及びＡｆｌＩＩ（ｐＥＴ２３−ｄ  Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ構築物に特有の部位）による消化に供することによって構築され、同じ処理をｐＥＴ２３−ｄ−ＳＫ＿ＥＧＦ構築物にも行って、両方の消化産物がアガロースゲル上で分離した。Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ構築物から得られたＸｈｏＩ及びＡｆｌ−ＩＩセグメントをＳＫ＿ＥＧＦ消化の大きいほうのフラグメントにライゲーションするとＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ７、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１５）がｐＥＴ２３−ｄベクター中に得られた（図１Ｃ及び図２Ｃを参照のこと）。このプラスミドからの発現カセットをＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ消化により単離し（この構築物は前回のようにまずＤＮＡシーケンシングにより検証される）、ＥＧＦ−ＳＫ−ＥＧＦハイブリッドカセットの上流でα−分泌シグナル配列とインフレームでｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、前回のように、宿主ゲノムにおける組み込み後、機能的スクリーニング後（以下を参照のこと）、アルコールオキシダーゼプロモーターの制御下、ピチア・パストリスにおいて発現させた。
【０１５２】
（ｖ）ＥＧＦ４、５、６に対応する酸化耐性ポリペプチドセグメントをコードしている配列を含有するＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ、ＳＫ＿ＥＧＦ及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦコード化遺伝子セグメントの構築：
Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ、ＳＫ＿ＥＧＦ及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦポリペプチドにおいて、それぞれＥＧＦ４、５、６ドメインの４１番アミノ酸残基又はＳＫ＿ＥＧＦの４３４番アミノ酸残基並びにＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦの４１番及び４３４番アミノ酸位置に存在するメチオニン残基は、ＥＧＦ４、５、６ドメインの一部として、その酸化傾向で知られており、これらのドメインの抗トロンビン活性、特にはタンパク質Ｃ活性化機能を妨げる。このため、このことに留意しつつ、様々なＳＫ−ＥＧＦ融合／遺伝子融合セグメントの設計において、発明者はこのメチオニンをバリン／アラニン／グルタミンアミノ酸残基に遺伝子レベルで置き換えた。この目標は、前回のように、高フィデリティ酵素ｐｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の使用及び適切なプライマーを使用した異なるテンプレートにおける部位特異的変異の導入によって達成された（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｃｏｌｍ  １９９９）。これらの構築物を形成するために、３セットのプライマーを設計し、これらのプライマーがバリン、アラニン又はグルタミンを別々に異なる構築物に遺伝子構築物のＥＧＦ４、５、６ドメイン／セグメントの本来のＭｅｔ残基の位置に組み込むことを可能にする。プライマーセットを以下のように命名した。
ｉ．Ｍ  ｒｅｐ  Ｖ  Ｆｐ及びＭ  ｒｅｐ  Ｖ  Ｒｐ（プライマーの配列については表１を参照のこと）
ｉｉ．            Ｍ  ｒｅｐ  Ａ  Ｆｐ及びＭ  ｒｅｐ  Ａ  Ｒｐ（プライマーの配列については表１を参照のこと）
ｉｉｉ．Ｍ  ｒｅｐ  Ｑ  Ｆｐ及びＭ  ｒｅｐ  Ｑ  Ｒｐ（プライマーの配列については表１を参照のこと）
【０１５３】
次のステップにおいて、ｐＥＴ２３−ｄ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ及びｐＥＴ２３−ｄ＿ＳＫ＿ＥＧＦプラスミドを上記のプライマーセットと共にテンプレートとして使用した。各プライマーセットに関し、ＰＣＲサイクルスキームは以下の通りであった：９５℃での完全変性、続く９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、６８℃での７分間にわたる伸長（２８サイクル）及び更に１０分間にわたる７２℃での伸長。この反応で得られた最終ＰＣＲブロックをＤｐｎＩ制限酵素で消化し、この酵素はメチル化ＤＮＡを切断し、形質転換後に陽性クローンを得る可能性を上昇させる。このＰＣＲ産物を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換させ、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に蒔き、３７℃で１６〜１８時間にわたってインキュベートした。幾つかのクローンをランダムに選択し、アンピシリン含有ＬＢ培地において７〜１０ｍｌの培養物に成長させた。プラスミドを単離し、所望の変異の存在を検証するためにシーケンシングした。この手順を採用することによって、メチオニンがバリン、アラニン又はグルタミンアミノ酸に遺伝子レベルで両方の構築物において置き換えられた。これらの構築物を使用して、標準的なサブクローニング手順により、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ遺伝子におけるバリン、アラニン及びグルタミン変異を形成した。最後に、これらの変異体をｐＰＩＣ−９Ｋに移し、その発現を、ピチア・パストリスのＧＳ１１５株においてチェックした（「実施例で用いた一般的な方法」を参照のこと）。
【０１５４】
（ｖｉ）５個のアミノ酸を欠失したＳＫのＮ末端とのΔＳＫ＿ＥＧＦ構築物の構築：
この構築物において、最終的な目的はＳＫのＮ末端領域での５個のアミノ酸の除去であった。これらの５個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを、ＰＣＲプライマーΔＳＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１及びΔＳＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）の助けを借り、ｐＥＴ２３−ｄ＿ＳＫ＿ＧＧＧ＿ＴＧ＿ＥＧＦ（酸化耐性。ＥＧＦ４、５、６セグメントのｍｅｔ４１番をバリンで置き換えた。上記を参照のこと）をテンプレートとして使用して除去した。プライマーΔＳＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１はＸｈｏＩ制限部位及び１６番塩基対から始まるＳＫのオーバーラップ配列をその５'端に含有する。ΔＳＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２はＥＧＦ４、５、６の６番ドメインの配列及びＮｏｔＩ部位をその５'端に含有する。ＰＣＲサイクルをこの反応に以下のようにして用いた：９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間にわたる変性、５５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での３分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完全増幅。最終ＰＣＲ産物をゲル溶出させ、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、ｐＥＴ２３−ｄベクターにライゲーションし、完全且つ正しいオープンリーディングフレームの検証のためにシーケンシングした。最後に、ΔＳＫ＿ＥＧＦ（図１Ｄを参照のこと）カセットをｐＰＩＣ−９Ｋにおいてライゲーションし、上述したような標準化手順でその発現についてチェックした。
【０１５５】
（ｖｉｉ）酸化耐性Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦコード化遺伝子ブロックの接合部でのトロンビン切断可能部位をコードするＤＮＡ配列のインフレーム導入：
Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫの発現、精製及びプラスミノーゲン活性化の動態解析から（プラスミノーゲン活性化が遅れることを証明した）、未変性／無修飾ＳＫとは異なり、この構築物は直接、ヒトプラスミノーゲンを活性化できなかったが、事前に生成されたプラスミンの存在を必要としたことが明らかであった。これによって自動的にこのような構築物における血餅特異的な活性化の利点がもたらされる。これは生体内の血餅はプラスミンを多く含有するが、プラスミンは全身循環においては迅速に不活性化されるからである。同様に、フィブリン塊もトロンビンを多く含有する。このため、発明者は構築物中の適切な部位を変異させて構築物をトロンビン活性化可能にもした。これを行うために、発明者はトロンビン切断可能部位によりＥＧＦ及びＳＫのドメイン間接合領域を変異させ、この結果、プラスミノーゲン活性化におけるトロンビン切断可能活性化スウィッチが得られる。このことは漸増的に少量のトロンビンを添加し、（上述した同様のプラスミン富化実験の場合と同様に）、Ｎ末端ＥＧＦ４、５、６融合ＳＫ構築物のプラスミノーゲン活性化におけるラグの段階的な減少を観察することによって一段階アッセイでモニタすることができる。第ＸＩ因子のトロンビン切断可能配列をＥＧＦ及びＳＫ遺伝子構築物の接合部に導入した。これはオーバーラップエクステンションＰＣＲで達成され、オーバーラップ配列及びトロンビン切断可能アミノ酸コード化ヌクレオチドを含有するジャンクションプライマーを使用した。最初のＰＣＲ反応において、プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ  Ｆｐ１及びＮ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ  Ｒｐ２（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）をＥＧＦ４、５、６ドメインの増幅に使用した。プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ  Ｆｐ１はＸｈｏＩ制限部位及びＥＧＦの４番ドメインの配列をその５'端に含有し、他方、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ  Ｒｐ２はＥＧＦの６番ドメインの配列、それに続くトロンビン切断可能部位コード化配列及びそれに続くＳＫの上流部を含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる変性、次の２８サイクルにおいて９５℃での４５秒間にわたる変性、５０℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲフラグメントの完成。この反応によって得られたＰＣＲブロックはＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、トロンビン切断可能コード化ヌクレオチド配列及びＳＫのオーバーラップ部を３'端に含有する。次のＰＣＲ反応において、ＴＣＳ＿ＳＫ  Ｆｐ３及びＳＫ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）を使用し、上流プライマー（ＴＣＳ＿ＳＫ  Ｆｐ３）は６番ドメインの配列、ＥＧＦ４、５、６のオーバーラップ部、トロンビン切断可能コード化ヌクレオチド配列及びＳＫコード化ヌクレオチド配列を５'から３'の順序で含有する。他方、ＳＫ  Ｒｐ４はＮｏｔＩ切断可能部位をその５'端に含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる変性、次の２８サイクルにおいて９５℃での４５秒間にわたる変性、５０℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃��の１０分間にわたる最終伸長による部分長娘フラグメントの合成の完了。得られたＰＣＲブロックは６番ドメインのオーバーラップ配列及びトロンビン切断可能コード化ヌクレオチドを上流に含有するはずであり、下流においてはＮｏｔＩ制限部位を含有するはずである。両方のＰＣＲブロックをゲル精製し、１：１のモル比でシングルポット反応において混合し、エンドプライマーＴＣＳ  Ｆｐ１及びＳＫ  Ｒｐ６により増幅すると、必要とするＮ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ  ＰＣＲブロックが得られ（図１Ｅを参照のこと）（ＴＣＳ：トロンビン切断可能配列）、これをゲル精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、最後に同様に消化したｐＥＴ２３−ｄに標準的な手順でライゲーションした。この構築物配列を、大腸菌ＸＬ  Ｂｌｕｅにおけるサブクローニング後、オープンリーディングフレームについて検証した。これにより、ＥＧＦ４、５、６及びＳＫの接合部に以下のアミノ酸配列を有する第ＸＩ因子トロンビン切断可能部位が遺伝子中に創り出されたことが証明された：Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ。この配列において、トロンビン特異性はアルギニンとイソロイシンとの接合部での切断につながり、トロンビンの作用後、１つのアミノ酸がＳＫのＮ末端から除去された。また第２のアミノ酸がバリンに変更され得る（未変性のＳＫにおいて、Ｎ末端残基はＩｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−である）。その後、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫカセットをｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、その発現をピチア・パストリスで行った。トロンビンでの処理後、トロンビン切断が精製構築物において本当であると確かに判明し、Ｎ末端タンパク質シーケンシングにより確認された。
【０１５６】
（ｖｉｉｉ）ＳＫのβ及びγドメインの接合部で翻訳的にインフレームで融合したＥＧＦ４、５、６ドメイン
これを目的として、β−ドメインの増幅をプライマーＩＤ  αβＦｐ１及びＩＤ  αβＲｐ２（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）を利用し、ｐＥＴ２３−ｄ＿ＳＫをテンプレートとして使用して行った。プライマーＩＤ  αβＦｐ１はＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、他方、ＩＤ  αβＲｐ２はＳＫのβドメインの下流配列及びＥＧＦ４、５、６の４番ドメインの部分オーバーラップ配列を含有する。これらのプライマーセットで得られたＰＣＲブロックはＸｈｏＩ制限部位を上流配列に含有し、下流にはβ−ドメインの末端配列及びＥＧＦの４番ドメインのオーバーラップ配列を含有する。次のステップにおいて、ＥＧＦ４、５、６をコードするＰＣＲブロック２をＩＤＥ４Ｆｐ３及びＩＤＥ６Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）プライマーセットを使用して単離した。プライマーＩＤＥ４Ｆｐ３はＳＫのβ−ドメインの下流配列をその５'端に含有し、ＩＤＥ６Ｒｐ４はγドメイン上流オーバーラップ配列をその５'端に含有する。これらのプライマーセットで得られたＰＣＲブロック２は下流β−ドメインのオーバーラップ配列を５'端に含有し、他方の端はγドメインの上流配列を含有する。この増幅のためのＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２７サイクル：９５℃での４５秒間、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。次のステップにおいて、ＳＫのγドメインをＩＤ  γＦｐ５及びＩＤ  γＲｐ６（これらのプライマーの配列については表１を参照のこと）プライマーセットを使用して単離した。ＩＤ  γＦｐ５’の５'端がＥＧＦ４、５、６の６番ドメインの相同下流配列を含有するようにプライマーＩＤ  γＦｐ５を設計し、ＩＤ  γＲｐ６は終止コドンとそれに続くＮｏｔＩ制限部位を含有する。以下のｐｃｒスキームをブロック３の増幅に用いた：９５℃での５分間にわたるホットスタート、９５℃での４５秒間にわたる変性、４７℃での４５秒間にわたるアニーリング及び７２℃での１．５分間にわたる伸長。全部で２８サイクルを行い、７２℃での１０分間にわたる最終伸長により不完全な増幅産物を完成させた。得られた全てのＰＣＲ産物をゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりゲル精製し、Ａ260により分光光度的に定量化した。最終ｐｃｒ反応において、３個の遺伝子ブロックの全てをシングルポットでスプライスオーバーラップエクステンション反応に供して１個の隣接遺伝子ブロックを得て、得られた構築物の順序は以下：ＳＫα−ＳＫβ−ＥＧＦ４、５、６−ＳＫγであり、３個のｐｃｒ産物の全てが１：１：１のモル比でポリメラーゼ連鎖反応において混合され、最初の１０サイクルはプライマーなしで行われ、次の１８サイクルは最終濃度０．６μＭのＩＤαβＦｐ１及びＩＤγＲｐ６プライマーを添加して行われ、３フラグメント中間体完全遺伝子ブロックを増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたるホットスタート、９５℃での４５秒間にわたる変性（donaturation）、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での３分間にわたる伸長。全部で２８サイクルを行い、最初の１０サイクルをプライ��ーなしで行い、最終増幅を７２℃で１０分間にわたって行った。最終的に得られた遺伝子ブロックはＸｈｏＩ部位をその５'端に含有し、ＮｏｔＩ部位をその３'端に含有する。この遺伝子ブロックをＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、ｐＥＴ２３−ｄ及びｐＰＩＣ９Ｋにクローニングした。その発現、精製及びキャラクタリゼーションをピチア・パストリスにおいてチェックした。この遺伝子ブロックはＥＧＦ４、５、６ドメインをＳＫのβ及びγドメインの間に含有する（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ５、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２９；図１Ｈ及び図２Ｅを参照のこと）。
【０１５７】
（ｉｘ）Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫハイブリッド遺伝子ブロックのＮ末端コード化端でのトランスグルタミナーゼ認識配列の組み込み（メチオニン酸化耐性変異を含有）：
ＥＧＦ−ＳＫ構築物におけるＥＧＦ４、５、６ドメインの４番のドメインの始まり又は前にトランスグルタミナーゼ認識配列を組み込むために、プライマーＴＧ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿Ｆｐ１及びＡｆｌ  ＩＩ  Ｒｐ２（プライマーの詳細な配列については表１を参照のこと）を設計し、ＴＧ  Ｆｐ１はＸｈｏＩ制限部位及び第ＸＩＩＩ血液因子トランスグルタミナーゼ認識アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をその上流領域に含有し、プライマーＡｆｌ  ＩＩ  Ｒｐ２はＡｆｌ  ＩＩ制限消化部位を含有するその領域のヌクレオチド配列を含有する（ＳＫの１６５〜１７０番ヌクレオチドはこのプライマーの中心に位置するＡｆｌ  ＩＩ制限部位を含有する）。これらのプライマーから、ＰＣＲにより、発明者はＸｈｏＩ制限部位、トランスグルタミナーゼ認識コード化ヌクレオチド及びＥＧＦ４、５、６の４番ドメインの配列を含有する遺伝子ブロックを得て、このブロックの下流部はＡｆｌ  ＩＩ制限部位を含有する。この遺伝子ブロック（酸化耐性及びトロンビン切断可能配列含有）をゲルから抽出した。プラスミドｐＥＴ２３−ｄＮ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ及びｐＥＴ２３−ｄＮ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ＿ＥＧＦをＸｈｏＩ及びＡｆｌ  ＩＩで消化した。この結果、両方のプラスミド構築物からＸｈｏＩ及びＡｆｌ  ＩＩ遺伝子ブロック及び大小の部位が得られた。消化された遺伝子ブロックを構築物の大きいほうの部位とライゲーションし、大腸菌ＸＬ  Ｂｌｕｅに形質転換させてＴＧ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ及びＴＧ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ＿ＥＧＦ含有プラスミドが得られた（図１Ｆを参照のこと）。これらを、正しいオープンリーディングフレーム、すなわち上述のＥＧＦ−ＳＫ構築物との関連でトランスグルタミナーゼコード化配列の存在についてシーケンシングし、検証した。両方のカセットを次にピチア・パストリスにおいてライゲーションし、これらの構築物の発現についてチェックした（「実施例で用いた方法」を参照のこと）。
【０１５８】
表１．様々なＥＧＦ４、５、６及びストレプトキナーゼ遺伝子融合構築物の調製に使用するプライマー
【表１−１】
2013535211.tif 000002
【表１−２】
2013535211.tif 000003
【表１−３】
2013535211.tif 000004
【表１−４】
2013535211.tif 000005
【０１５９】
実施例２
様々なＥＧＦ−ＳＫハイブリッドポリペプチドの発現及び機能的キャラクタリゼーション
実施例１に記載の異なる遺伝子ブロック、例えばＮ＿ＥＧＦ−ＳＫ、ＳＫ−ＥＧＦ及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ並びに別種のドメイン間融合構築物、例えばドメイン間ＥＧＦ＿αβＳＫ、ドメイン間ＥＧＦ＿βγＳＫ、切断ΔＳＫ＿ＥＧＦ並びにＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ、ＳＫ＿ＥＧＦ及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦの酸化耐性形態（トランスグルタミナーゼ及びトロンビン切断部位等が組み込まれ、また全て発現ベクターｐＰＩＣ−９Ｋにおいてクローニングされ、またそれぞれの遺伝子融合体の配列から期待される発現した機能的に活性なハイブリッド遺伝子産物に関して検証した）を次に比較的多量の培養物からその更なるキャラクタリゼーションに先立って単離した。実施例１に記載したように、ピチアクローンを最初にルーチンでカゼインオーバーレイ法によりプラスミノーゲン活性化能について試験し、幾つかの（それぞれ１０〜２０）陽性のものを次にＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ培地（ＢＭＧＹ＝１％酵母抽出物、２％ペプトン、１Ｘグリセロール、１Ｘアミノ酸非含有酵母ニトロゲンベース及び１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５、ＢＭＭＹ＝１％酵母抽出物、２％ペプトン、１Ｘメタノール、１Ｘアミノ酸非含有酵母ニトロゲンベース及び１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５）上で成長させ、次に「方法」で前述したようにメタノールで誘導し、細胞非含有上清をカゼインオーバーレイアッセイ（再確認のために）及びペプチド発色基質の存在下でのプラスミノーゲン活性化（分光光度）アッセイに使用した。比較的高いプロデューサーであると判明したものを次に１リットルレベルで成長させ、タンパク質を疎水性相互作用（例えば、フェニル−アガロース）及びイオン交換（ＤＥＡＥ−アガロース）クロマトグラフィのタンデムで精製した（詳細は「実施例で用いた一般的な方法」のセクションに記載）。これら２種類の精製方法で得られたハイブリッドＳＫ−ＥＧＦポリペプチドは概してＳＤＳ−ＰＡＧＥで９０〜９５％純粋であった。精製された全ての構築物をプラスミノーゲン活性化能（ヒトプラスミノーゲンを使用した一段階アッセイ）について試験し、凝固時間を測定するためにトロンビン阻害アッセイを行い、タンパク質Ｃ活性化について発色アッセイを行った（「実施例で用いた方法」を参照のこと）。ＳＫ＿ＥＧＦ及び酸化耐性ＳＫ＿ＥＧＦはＳＫと極めて似た、ただし活性化動態における２〜３分多いラグを伴ったＰＧ活性化動態を示したが、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ並びに酸化耐性Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ及びＴＧ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫの場合、活性化におけるラグはかなり大きく（２０〜２５分）、その後、プラスミノーゲン活性化動態は未変性のＳＫ様であった。これは構築物によるＰＧの初期活性化が遅延したが、無修飾のＳＫの場合は事実上、即時であることを示唆した。しかしながら、一旦ＳＫ構築物が活性化されると、ラグの後ではあるが、完全なプラスミノーゲン活性化特性を示した。若干大きいラグ（３０〜３５分）が双極性ＥＧＦ融合タンパク質、すなわちＮ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ、酸化耐性Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ＿ＥＧＦ及びそのバリアントＴＧ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＫ＿ＥＧＦにおいて見られた。しかしな��ら、上述したように、ラグの消失後、タンパク質１ミリグラムあたりのプラスミノーゲン活性化率（比活性）は無修飾のＳＫのものと同様であった。Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ及び同様の種類の構築物におけるラグの理由は酵素前駆体の自己活性化機構の喪失であると判明した（Ｂａｊａｊ  ａｎｄ  Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  １９７７；Ｂｏｘｒｕｄ，Ｖｅｒｈａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ａｎｅｊａ，Ｄａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。このことは、少量の（ナノモル量）プラスミンを反応アッセイに若干添加することによるラグの漸進的な喪失があったという観察結果により証明された。加えて、これらの構築物の事前に生成されたプラスミン複合体をアッセイで使用した場合はラグがなく、これはＳＫで観察された即時のプラスミノーゲン活性化機構のかわりに、ラグのある融合構築物が今はプラスミンと複合体を一旦形成しさえすればプラスミノーゲン活性化可能であることをはっきりと示唆している。同様のプラスミン依存性活性化が、ドメイン間αβＥＧＦ＿ＳＫ構築物においても見られた。しかしながら、活性化後、その総比活性は無修飾のストレプトキナーゼのものの４０〜５０％にすぎないことが判明した。特筆すべきことに、ＥＧＦ４、５、６セグメントがＳＫのβ及びγドメインの接合部に置かれた他方のドメイン間構築物の場合、精製されたタンパク質は無修飾のＳＫと比較して５％未満のプラスミノーゲン活性を示した。このことは、ＥＧＦのＳＫとの融合が自動的に機能性となるわけではなく、正しく設計したものだけがそうなることをはっきりと示している。正しく設計されたものは、プラスミノーゲン活性化、トロンビン阻害等についての、高スループットスクリーニングシステムに簡単に適合させ得るプレート／分光光度アッセイを利用してスクリーニング（設計が実験に基づいて又は構造的な仮定により行われた時）することによって選択することができる。このため、設計されたＳＫの部位特異的置換、欠失又はドメイン付加変異体あるいはストレプトキナーゼの天然のバリアントを使用し、ここで採用するアプローチにより同様のＳＫ−ＥＧＦタンパク質を得ることができる。
【０１６０】
また、精製された構築物を、ヒト血液因子を使用した凝固時間アッセイによりトロンビン阻害の測定について試験した（上述の実施例で用いた方法を参照のこと）。特筆すべきことに、構築物は全て、これらのアッセイにおいて、構築物を有さない又は別のコントロールとしての未変性のＳＫを有するコントロールアッセイのものと比較して凝固時間において著しい増加（約２．５〜３倍）を示した。更に、凝固時間の増加は低ナノモル濃度範囲で線形用量依存性挙動に従うと判明しており、これは陽性コントロールとして使用したピチアにおける発現で得られたＥＧＦ４、５、６ドメインで観察されたものと極めて似ていた。これらの結果はプラスミノーゲン活性化能を有するＥＧＦ融合構築物（また、極めて低い活性を有するものとして）が強力なトロンビン阻害能も示したことを証明した。
【０１６１】
実施例３
様々なＥＧＦ４、５、６及びＴＰＡハイブリッド遺伝子をコードするＤＮＡの構築：
コード化ｔｐＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ９、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２０）及びインフレームで融合したＥＧＦ４、５、６をコードしているＤＮＡの別のセグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ８、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１１）にインフレームで融合したＥＧＦ４、５、６配列をコードしているＤＮＡセグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ２、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１１）を化学的に合成、精製及びｐＵＣ１９においてクローニングした。シーケンシングにかけることによってその妥当性（ＳＥＱ  ＩＤ  ８、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１１）を証明した。この構築物をＥＧＦ−ｔｐＡ−ＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  １０、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２１）と称する。ＥＧＦ４、５、６ドメイン遺伝子コード化セグメントがｔＰＡのＮ末端部位で融合した（ＳＥＱ  ＩＤ  １１、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ１２２）又はｔｐＡのＣ末端で融合した（ＳＥＱ  ＩＤ  １２、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２３）この遺伝子構築物に加えて。ｔＰＡコード化配列をまずプライマーｔＰＡＦｐ１及びｔＰＡＲｐ２プライマーで増幅した（プライマー配列については表２を参照のこと）。この反応で用いたＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、９５℃での４５秒間にわたる変性、５５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での４分間にわたる伸長（全部で２８サイクル）及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完全増幅。このため、この反応に使用したプライマーｔＰＡＦｐ１はＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、ｔＰＡＲｐ２はＮｏｔＩ制限部位を含有する。得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐＥＴ２３−ｄにライゲーションした。この工程で形成された最終構築物をｐＥＴ２３−ｄ  ｔＰＡと称し（図２Ｆを参照のこと）、シーケンシングによりｔＰＡオープンリーディングフレームを検証した。Ｎ末端（Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ）及びＣ末端（ｔＰＡ＿ＥＧＦ）融合体を形成するために、単純な制限酵素消化及びライゲーションスキームに従った。両方の構築物を１つのステップで形成するために、ｐＥＴ２３−ｄ  ｔＰＡ及びｐＵＣ−１９＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ＿ＥＧＦを共に特有のカッターであるＸｈｏＩ及びＢＳｒＧＩで切断した。これにより小さいフラグメント及び大きいフラグメントが得られた。小さいフラグメントのｐＵＣ−１９＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ＿ＥＧＦ消化物はＮ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ配列を含有し、ｐＥＴ２３−ｄ＿ｔＰＡの大きいフラグメントにライゲーションされ、このステップによりＮ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １１、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２２）構築物が得られた。ｔＰＡ＿ＥＧＦ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １２、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２３）構築物は、ｐＵＣ−１９＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ＿ＥＧＦの大きいフラグメントとｐＥＴ２３−ｄ＿ｔＰＡの小さいフラグメントとのライゲーションにより形成され、この構築についてｔＰＡ＿ＥＧＦ（図１Ｊを参照のこと）が得られた。Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ（図１Ｋを参照のこと）及びｔＰＡ＿ＥＧＦ（図２Ｇを参照のこと）をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、単��したインサートフラグメントをｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、構築物はα−分泌シグナル配列にインフレームで置かれた。全てのこれらの構築物を、ピチア・パストリス（ＧＳ１１５）においてベクター内に置かれたメタノール誘導性プロモーターの影響下で宿主ゲノムへの組み込み後に発現させた。
【０１６２】
表２．様々なＥＧＦ４、５、６及び組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子融合構築物の調製に使用するプライマー
【表２−１】
2013535211.tif 000006
【表２−２】
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【表２−３】
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【０１６３】
実施例４
組織プラスミノーゲン活性化因子とヒトトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインとの様々なハイブリッド遺伝子の構築
（ｉ）ドメイン間ＥＧＦ４、５、６−ｔＰＡ構築物の構築
組織プラスミノーゲン活性化因子は異なるドメインを以下の順序：Ｎ末端ペプチド−フィンガードメイン−ＥＧＦ様ドメイン−クリングル１−クリングル２−触媒ドメインで含有する。新規な非天然のハイブリッド設計を遺伝子レベルで構築し、ｔＰＡの内因性ＥＧＦドメインをトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインで置き換えた。これらの構築物を他のハイブリッド遺伝子の産生に関して上で用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲ戦略により形成した。
【０１６４】
（ａ）ｔＰＡの内因性ｅｇｆドメインをヒトトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインで置き換えたハイブリッド遺伝子ブロックの構築
この構築物を形成するために、ｐＥＴ２３−ｄ＿ｔＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ９、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２０）を、内因性ｅｇｆコード化領域が１８７ｂｐから２９７ｂｐまでの基準として使用した。第１のステップにおいて、フィンガードメインコード化ＤＮＡを以下のプライマー：Ｆｉｎ  Ｆｐ１及びＦｉｎ  Ｒｐ２（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）を使用して単離し、上流プライマーはＸｈｏＩ制限部位をその５'末端に含有し、他方、第２プライマーは、ＥＧＦ４、５、６ドメインの４番ドメインのためのオーバーラップ配列と共にフィンガードメインをコードする下流配列を含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、続く次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。第２のＰＣＲにおいて、ＥＧＦ４、５、６ドメインセグメントを増幅し、ＥＧＦ  Ｆｐ３及びＥＧＦ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）プライマーセットを使用した。プライマーＥＧＦ  Ｆｐ３はＥＧＦのフィンガードメインの下流配列及びＥＧＦの４番ドメインを含有し、他方、下流プライマーＥＧＦ  Ｒｐ４はクリングル１のオーバーラップ配列をその５'末端に含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、続く次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長、最後に７２℃での１０分間にわたる伸長セグメントで終了。このプライマーセットで得られた遺伝子ブロックはフィンガードメイン配列を５'末端に、またその３'端にクリングル１のオーバーラップ配列を含有する。第３のＰＣＲ反応において、クリングル１を触媒ドメインの最後までコードしている配列を、Ｋ１  Ｆｐ５及びＣＤ  Ｒｐ６（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）プライマーセットの使用により選択的に増幅した。プライマーＫ１  Ｆｐ１はＥＧＦ４、５、６の６番ドメインのオーバーラップ配列をその５'末端に含有し、プライマーＣＤ  Ｒｐ６は終止コドン及びＮｏｔＩ制限部位を５'端に含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、続く次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での３分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による全ての部分長フラグメントの合成完了。この反応で得られた遺伝子ブロックはＥＧＦ６番ドメインオーバーラップ配列を５'末端に、また触媒ドメインコード化配列、終止コドン及びＮｏｔＩ部位をその３'端に含有する。３個のＰＣＲ産物の全てをゲル精製し、シングルポットＳＯＥに供することによって完全ハイブリッド遺伝子構築物を増幅し、アセンブリの順序は以下の通りであった：フィンガードメイン−ＥＧＦ４、５、６ドメイン−クリングル１−クリングル２及びｔＰＡ（図１Ｑ及び図２Ｊを参照のこと）。触媒ドメイン。これをＦｉｎ  Ｆｐ１及びＣＤ  Ｒｐ６（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）プライマーセットを使用して行った。最終ＰＣＲ��件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での４分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長（単一セグメント）。この遺伝子ブロックを、上述したように、ゲル抽出で精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、同様に消化及び精製したｐＥＴ２３−ｄベクターとライゲーションし、大腸菌ＸＬ  Ｂｌｕｅにクローニングした。幾つかのランダムに選択したクローンを、完全インサート／遺伝子ブロックについてサンガー法によるシーケンシングに供し、ｔＰＡのものへのＥＧＦ４、５、６ドメインの正しいインフレームでの組み込みを検証した（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １３、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２４）。この遺伝子ブロックを次に、前回のようにｐＰＩＣ−９Ｋベクターに移し、ピチア・パストリスへとクローニングし、「実施例で用いた一般的な方法」に記載したように高レベルのプラスミノーゲン活性化因子活性についてスクリーニングした。
【０１６５】
（ｂ）ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１ドメインがヒトトロンボモジュリンのＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えられたドメイン間ｔＰＡ及びＥＧＦハイブリッド遺伝子構築物の構築：
この構築物を形成するために、３つの異なるＰＣＲを別々に行い、得られた遺伝子ブロックはオーバーラップ配列を各遺伝子ブロックの末端に含有し、次にこれらをシングルポットＳＯＥ反応で増幅して以下のハイブリッド構築物：ｔＰＡフィンガードメイン−ＥＧＦ４、５、６−ｔＰＡクリングル２−ｔＰＡ触媒（セリンプロテアーゼ）ドメイン（図１Ｒ及び図２Ｈを参照のこと）を形成した。この構築物を形成するために、ｐＥＴ２３−ｄ＿ｔＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ９、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２０）を内因性ｅｇｆ及びクリングル１コード化ヌクレオチド領域が１８７ｂｐから５６４ｂｐまでのテンプレートして使用した。第１のステップにおいて、フィンガードメインコード化セグメントを以下のプライマー：Ｆｇ  Ｆｐ１及びＦｇ  Ｒｐ２（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）を使用して単離し、上流プライマーはＸｈｏＩ制限部位を５'末端に含有し、他方、第２プライマーはフィンガードメインの下流配列及びＥＧＦ４、５、６ドメインの４番ドメインのオーバーラップ配列を含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。第２のＰＣＲにおいて、ＥＧＦ４、５、６ドメインをプライマーＥＦＩ  Ｆｐ３及びＥＦＩ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）で増幅した。プライマーＥＦＩ  Ｆｐ３はフィンガードメインの下流配列及びＥＧＦの４番ドメインを含有し、他方、下流プライマーはクリングル２のオーバーラップ配列をその５'末端に含有した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。このプライマーセットで得られた遺伝子ブロックはフィンガードメイン配列を５'末端に含有し、クリングル２のオーバーラップ配列をその３'端に含有した。第３のＰＣＲ反応において、クリングル２からｔＰＡ触媒ドメインへの配列を、Ｋ２  Ｆｐ５及びＫ２  ＣＤ  Ｒｐ６（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）の２個のプライマーのセットを使用して増幅した。プライマーＫ２  Ｆｐ５はＥＧＦ４、５、６の６番ドメインのオーバーラップ配列をその５'末端に含有し、プライマーＫ２  ＣＤ  Ｒｐ６は終止コドン及びＮｏｔＩ制限部位を５'端に含有する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性による「ホットスタート」、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での３分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。この反応で得られた遺伝子ブロックは６番ドメインオーバーラップ配列をその５'末端に、また触媒ドメインコード化配列、続く終止コドン及びＮｏｔＩ部位をその３'端に含有した。３個のＰＣＲ産物の全てをゲル精製し、Ｆｇ  Ｆｐ１及びＫ２ＣＤ  Ｒｐ６プライマーセット（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）によるシングルポットＳＯＥ反応に供して増幅して完全ハイブリッド遺伝子構築物を得て、様々なタンパク質コード化セグメントのアセンブリの順序は以下の通りであった（最終的にクローニング後にＤＮＡシーケンシングにより確認された）：フィンガードメイン−ＥＧＦ４、５、６ドメイン−クリングル２及び触媒ドメイン（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １４、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２６）。最終ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４８℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での４分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。この遺伝子ブロックをゲル抽出により精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、ｐＥＴ２３−ｄベクターとライゲーションし、大腸菌ＸＬ  Ｂｌｕｅにおいてクローニングし、完全遺伝子ブロックを次にシーケンシングし、部分切断ｔＰＡ遺伝子へのＥＧＦ４、５、６ドメインの正しいインフレーム組み込みについて検証した。上述したように、この最終ハイブリッド遺伝子ブロックをｐＰＩＣ−９Ｋベクターに移し、ピチア・パストリスにおけるそのＯＲＦ発現を標準化手順を用いてチェックした。
【０１６６】
（ｃ）ＥＧＦ４、５、６コード化セグメントがインフレームでｔＰＡのＮ末端及びＣ末端コード化端で融合したｔＰＡの切断型をコードするハイブリッド遺伝子ブロックの構築：
これらの構築物を、事前に形成したｐＥＴ２３−ｄＮ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  １１、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２１）及びｐＥＴ２３−ｄ＿ｔＰＡ＿ＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  １２、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２３）をテンプレートとして使用して調製した。両方の構築物において、内因性ｅｇｆ及びクリングル１ドメインをオーバーラップＰＣＲスキームの助けを借りて除去した。ｔＰＡの内因性ｅｇｆ及びクリングル１ドメインをＮ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ構築物から除去するために（図１Ｎを参照のこと）、２セットのプライマーを設計した。第１のプライマーセットＮ＿ＥｔＰＡ  Ｆｐ１及びＮ＿ＥｔＰＡ  Ｒｐ２（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）をＥＧＦ４、５、６ドメイン及びｔＰＡフィンガードメインの隣接ヌクレオチド配列の増幅に使用した。この場合、上流プライマーはＥＧＦの４番ドメイン配列及びＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、プライマーＮ＿ＥｔＰＡ  Ｒｐ２はｔＰＡクリングル２のオーバーラップ配列を含有した。第２のプライマーセット、すなわちＥＫ２  ＣＤ  Ｆｐ３及びＫ２  ＣＤ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）をｔＰＡのクリングル２及び触媒ドメインの増幅に使用した。プライマーＥＫ２  ＣＤ  Ｆｐ３はフィンガードメインの下流オーバーラップ配列を５'端に含有し、もう一方のプライマーはｔＰＡ触媒ドメインの下流配列及びＮｏｔＩ制限部位を含有する（ＰＣＲ条件：９５℃での５分間にわたるホットスタート、２８サイクルの９５℃での４５秒間、５２℃での４５秒間、７２℃での２分間及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長）。この反応で得られた遺伝子ブロックはｔＰＡフィンガードメインオーバーラップ配列をその５'端に、ＮｏｔＩ制限部位をその３'端に含有した。両方のＰＣＲ産物をゲル精製し、完全遺伝子ブロックの構築に供し、内因性ｅｇｆ及びクリングル１をプライマーＮ＿ＥｔＰＡ  Ｆｐ１及びＫ２  ＣＤ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）プライマーセットの助けを借りて欠失させた。得られた遺伝子ブロックを精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐＥＴ２３−ｄベクターにライゲーションし、大腸菌においてサブクローニングし、ｔＰＡ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １５、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２６；図２．Ｉ）コード化遺伝子ブロックからのｅｇｆ及びクリングル１の除去後の正しいインフレーム接合についてＤＮＡシーケンシングした。遺伝子ブロックの正しいオープンリーディングフレームについてシーケンシングによる検証後、このカセットをｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、前回のようにピチアに形質転換させ、活性についてスクリーニングし、細胞外発現についてチェックした。同様のやり方で、内因性ｅｇｆ及びクリングル１を構築物ｔＰＡ＿ＥＧＦ中のｔＰＡコード化遺伝子ブロックから欠失させた（図１Ｐ及び図２Ｈを参照のこと）。ここで、ｐＥＴ２３−ｄ−ｔＰＡ＿ＥＧＦプラスミドＤＮＡを切断ｔＰＡヌクレオチド配列増幅用のテンプレートとして使用した。フィンガードメインの増幅にフィンガーＦｐ１及びフィンガーＲｐ２のプライマーセットを使用し（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）、フィンガーＦｐ１プライマーはＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、もう一方のプライマーフィンガーＲｐ２はフィンガードメインの下流配列及びｔＰＡのクリングル２のオーバーラップ配列を含有した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、続く３０サイクルの：９５℃での４５秒間にわたる変性、４４℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による終了。これによりｔＰＡフィンガードメインオーバーラップ配列、続くＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有する遺伝子ブロックが得られ、その３'端はクリングル２オ−バーラップ配列を含有した。第２のプライマーセットをクリングル２触媒コード化ドメイン及びＥＧＦ４、５、６ドメインの増幅に使用した。第１のプライマーＫ２  ＣＤ  Ｆｐ３（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）はｔＰＡフィンガードメインの下流端及びクリングル２の小部分までのオーバーラップ配列を含有した。他方、第２のプライマーＥＧＦ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）はＥＧＦの下流配列及びＮｏｔＩ制限部位を含有した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる完全変性、３０サイクルの：９５℃での４５秒間にわたる変性、４４℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長。両方の遺伝子ブロックをゲルから精製し、プライマーフィンガーＦｐ１及びＥＧＦ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）の存在下でのオーバーラップエクステンション反応に供し、この反応から得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、前回のようにｐＥＴ２３−ｄ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １６、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２７）に大腸菌においてライゲーションし、シーケンシングして完全遺伝子ブロックを検証した。最後に、この遺伝子ブロックをｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションし、上述したように発現及び機能的特性のスクリーニングのためにピチア・パストリスに形質転換させた。
【０１６７】
（ｄ）様々なＥＧＦ含有組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子構築物における異なる変異の組み込み：
上述のＥＧＦ４、５、６及びｔＰＡの異なる融合構築物において、以下のアミノ酸変更を行った：スレオニン１１５番アミノ酸をアスパラギン（Ｔ１１５Ｎ）に変更し、アスパラギン１２９番アミノ酸をグルタミン（Ｎ１２９Ｑ）に変更し、ｔＰＡ３０８〜３１１のＫＨＲＲコード化領域を、４重アラニン変異列（ＫＨＲＲ（３０８−３１１）ＡＡＡＡ）で置き換えた（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ２０、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １２８）。これらの変異により追加のフィブリン特異性が得られる分子に付与され、生体内でのｔＰＡの半減期が上昇することが知られている（Ｋｅｙｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。これらの変異を導入するために、発明者は部位特異的変異誘発アプローチ（「実施例で用いた方法」を参照のこと）を用いて、これらの変更を酸化耐性（ＥＧＦ４、５、６ドメインの１２９番メチオニンをバリン／アラニン／グルタミンに置き換えた）遺伝子テンプレートにも組み込んだ。以下のプライマーを部位特異的変異誘発に使用した：１．Ｔ１１５  Ｎ  Ｆｐ及びＴ１１５  Ｎ  Ｒｐ（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）、２．Ｎ１２９  Ｑ  Ｆｐ及びＮ１２９  Ｑ  Ｒｐ（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）。
【０１６８】
ｔＰＡ変異ＫＨＲＲ（ｔＰＡの残基３０８〜３１１が４重アラニンアミノ酸残基に置き換えられた）の場合、ＫＨＦｐ１及びＫＨＲｐ２をエンドプライマー（これらのプライマーの配列については表２、すなわち３７、３８番を参照のこと）として使用したオーバーラップエクステンションＰＣＲ（実施例で用いた方法を参照のこと）を長さ１〜９３３ｂｐのポリヌクレオチドの増幅に使用し、ＫＨＦｐ１プライマーはＸｈｏＩ制限部位及びｔＰＡの上流配列を含有し、他方、プライマーＫＨＲｐ２は４重アラニン変異をその５'端に含有する。以下のＰＲＣ条件を用いた：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、続く９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１．５分間にわたる伸長（全部で２８サイクル）及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完全増幅。最後に、この方法で得られた遺伝子ブロックはＸｈｏＩ制限部位を５'端に含有し、その３'端は４重アラニン変異を含有した。別のＰＣＲ反応セットにおいて、ＫＨＦｐ３及びＫＨＲｐ  ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）を、ｔＰＡの９１８番ｂｐから１６１７番ｂｐの間のＤＮＡの増幅に使用した。プライマーＫＨＦｐ３は４重アラニン変異をその５'端に含有し、第２のプライマーＫＨＲｐ４はＸｈｏＩ制限部位を含有する。以下のＰＣＲ条件を反応に用いた：９５℃での５分間にわたるホットスタート、完全変性、続く９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１．５分間にわたる伸長（全部で２８サイクル）及び７２℃での１０分間にわたる最終伸長による不完全なＰＣＲ産物の完全増幅。得られた遺伝子ブロックは４重アラニン変異をその５'端に含有し、その３'端はＮｏｔＩ制限部位を含有する。両方のＰＣＲ産物をゲル精製し、一般的な「オーバーラップ」ＰＣＲ反応シングルポットで混合し、ＫＨＦｐ１及びＫＨＲｐ４（これらのプライマーの配列については表２を参照のこと）を全遺伝子ブロックの増幅に使用した。最後に、得られた遺伝子ブロックをｐＥＴ２３−ｄに移し、ＤＮＡ配列及び正しいオープンリーディングフレームの検証後、ｐＰＩＣ９Ｋに移し、ハイブリッドポリペプチドを発現させ、ピチアにおいて標準条件によりチェックした（「実施例で用いた方法」を参照のこと）。
【０１６９】
実施例５
スタフィロキナーゼとトロンボモジュリンドメインＥＧＦ４、５、６とのハイブリッド遺伝子の構築：
ＳＡＫ＿ＥＧＦ及びＥＧＦ＿ＳＡＫコード化ハイブリッド遺伝子ブロックの構築
ＥＧＦ−ＳＡＫ融合体の構築のために、ＥＧＦ４、５、６ＰＣＲブロックをＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｆｐ１及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｒｐ２プライマーセット（これらのプライマーの配列については表３を参照のこと）の助けを借りて単離し、ｐＥＴ２３−ｄ＿ＥＧＦ４、５、６（Ｓｅｑ  ＩＤ  ２、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１１）をテンプレートとして使用した。ここでＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｆｐ１はＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｒｐ２はＳＡＫヌクレオチドのオーバーラップ配列を５'端に含有した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：第１の（ホットスタート）サイクルにおける９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間にわたる変性、５０℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終ステップによる不完全なＰＣＲ産物の完成。ＰＣＲ産物はＸｈｏＩ制限部位をその５'端に含有し、３'端はＳＡＫのオーバーラップ配列を含有した。第２のステップにおいて、ＳＡＫ  ＰＣＲブロックをＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｆｐ３及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｒｐ４プライマーセットの助けを借りて増幅し、ｐＧＭＥＸ＿ＳＡＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  １７、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １３０）構築物をテンプレートとして使用した。この反応において、プライマーＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｆｐ３はＥＧＦ４、５、６の６番ドメインの下流オーバーラップ配列を含有し、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｒｐ４は終止コドンとそれに続くＮｏｔＩ制限部位を含有した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃での５分間にわたる１サイクルの完全変性、続く２８サイクルの９５℃での４５秒間にわたる変性、５０℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終ステップによる不完全なＰＣＲ産物の完成。これによって６番ＥＧＦドメインオーバーラップ配列を５'端に有する遺伝子ブロックが得られ、３'端は終止コドンとそれに続くＮｏｔＩ制限部位を含有した。両方のＰＣＲ産物をゲル精製キットの助けを借り得てゲル抽出及び精製し、ハイブリッド遺伝子中間体（オーバーラップエクステンションで得られる）増幅に使用するＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ上流Ｆｐ１及びＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ  Ｒｐ４下流プライマーとモル比１：１でシングルＳＯＥ  ＰＣＲ反応において混合した。この結果、Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １８、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１８）配列を含有する隣接遺伝子フラグメントが得られた。この遺伝子ブロックを次にＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＰＩＣ−９Ｋベクターに移した。ＤＮＡシーケンシングによりＥＧＦ＿ＳＡＫ（図１Ｔを参照のこと）構築物で期待されるインフレーム融合及び他の変異の不在を検証した。この構築物をピチア・パストリスのＧＳ１１５株に形質転換させ、前回のように、宿主ゲノムへの組み込み後、アルコールオキシダーゼプロモーターの影響下での発現についてチェックした。
【０１７０】
ＳＡＫ＿ＥＧＦ（図１Ｓを参照のこと）構築物の構築を同様に行い、ＥＧＦ４、５、６ドメインセグメントをＳＡＫのＣ末端で融合した。第１のステップにおいて、ＳＡＫ遺伝子ブロックをＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１及びＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２プライマーセットの助けを借りて単離した。プライマーＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１はＸｈｏＩ制限部位を５'端に含有し、他方、ＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２はＥＧＦ４、５、６の４番ドメインのオーバーラップ配列を含有する。得られた遺伝子ブロックは、その上流配列中のＸｈｏＩ部位及びその下流配列中のオーバーラップ４番ドメインＥＧＦ配列を含有する。第２のステップにおいて、ＳＡＫ遺伝子ブロックをＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ３及びＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ４プライマーを使用して単離し、ＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ３はＳＡＫのオーバーラップ配列を含有し、ＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ４は終止コドン及びＮｏｔＩ制限部位を含有する。これらのプライマーセットを使用してＰＣＲから単離した遺伝子ブロックはＳＡＫオーバーラップ配列を上流に、また終止コドン及びＮｏｔＩ部位をその下流端に含有した。両方の遺伝子ブロックをアガロースゲルから精製し、ＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１及びＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ４とシングルＳＯＥ反応において混合して完全ＳＡＫ＿ＥＧＦ（ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  １９、対応するタンパク質ＳＥＱ  ＩＤ  １１９）遺伝子ブロックを得た。このため、最終ＰＣＲ産物はＳＡＫ＿ＥＧＦ配列を含有するハイブリッド遺伝子ブロックをもたらし、ゲルから精製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐＰＩＣ−９Ｋに移し、シーケンシング後、正しいインフレーム検証が行われた。この構築物をピチア・パストリスのＧＳ１１５株に形質転換させ、標準化手順によるゲノム組み込み後、発現プラスミドｐＰＩＣ−９Ｋに位置するアルコールオキシダーゼプロモーターの影響下のその発現（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びカゼイン−オーバーレイプラスミノーゲン活性化因子アッセイによりチェックした）。ＳＡＫ＿ＥＧＦ構築物全体を、α−分泌シグナル配列の上流にインフレームで組み込んだ。これがハイブリッド遺伝子産物の膜を越えての媒体への輸送を支援する。
【０１７１】
Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ及びＳＡＫ＿ＥＧＦの細菌発現：
上記のＮ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ及びＳＡＫ＿ＥＧＦ  ＤＮＡ構築物をまた、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの影響下で発現させた。これらの構築物を作製するために、ｐＰＩＣ−９Ｋ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ及びｐＰＩＣ−９Ｋ＿ＳＡＫ＿ＥＧＦプラスミドをテンプレートとして使用した。
【０１７２】
（ｉ）Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ遺伝子ブロックの細菌発現カセットの構築：
Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ遺伝子ブロックをまずＢａｃ  Ｆｐ１及びＢａｃ  Ｒｐ２プライマーの助けを借り、ｐＰＩＣ−９Ｋ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫをテンプレートとして使用して増幅した。Ｂａｃ  Ｆｐ１プライマーはＮｃｏＩ部位をその５'端に、必要するＡＵＧコドンを遺伝子ブロックの最初に配置するのを支援するために、またイニシエーターＭｅｔ残基コード化コドンをｍＲＮＡに配置するために含有した。プライマーＢａｃ  Ｒｐ２はＸｈｏＩ制限部位を含有し、６ヒスチジンアミノ酸コード化ヌクレオチドを転写したｍＲＮＡの端部に遺伝子産物の検出及びその精製に役立つ終止コドンの前にインフレームで導入することを促進した。この遺伝子ブロックをゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化し、最後にＴ７プロモーターをベースとしたｐＥＴ２３−ｄベクターとライゲーションし、大腸菌に形質転換させた。特有であるこれらの２つの部位は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの影響下でのハイブリッド遺伝子構築物の挿入に役立つ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ，１９８６）。この構築物ｐＥＴ２３−ｄ＿Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫをＸＬ１Ｂ細胞に形質転換させ（ｒｅｃＡ-及びｅｎｄＡ-）、プラスミドは増殖し、シーケンシングにかけられた。ここでこのプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（発現宿主）に移し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの誘導をＩＰＴＧにより行い、封入体として細胞内形態で発現させた（発現条件、封入体の単離及びリフォールディングプロトコルに関しては「実施例で用いた方法」を参照のこと）。最後に、リフォールディングしたタンパク質をクロマトグラフィにより高精製形態で得て、活性アッセイに供した。
【０１７３】
（ｉｉ）細菌発現のためのＳＡＫ＿ＥＧＦ遺伝子ブロックの構築：
ＳＡＫ＿ＥＧＦ構築物をＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｆｐ１及びＳＡＫ＿ＥＧＦ  Ｒｐ２プライマーの助けを借りて調製し、ｐＰＩＣ−９Ｋ＿ＳＡＫ＿ＥＧＦを増幅のためのテンプレートに使用した。プライマーＳＡＫ＿ｂａｃ  Ｆｐ１はＮｃｏＩ制限部位を５'端に含有し、ＡＵＧコドンの導入を支援した。他方、ＳＡＫ＿ｂａｃ  Ｒｐ２はＸｈｏＩ制限部位を含有し、６ヒスチジンアミノ酸コード化ヌクレオチドの意図したＳＡＫ＿ＥＧＦ遺伝子構築物の下流端の終止コドンに先立っての導入を促進した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：第１サイクルにおける９５℃での５分間にわたる完全変性、次の２８サイクル：９５℃での４５秒間にわたる変性、５０℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１．５分間にわたる伸長及び７２℃での１０分間にわたる最終ステップによる部分長ＰＣＲ産物の完成。得られた遺伝子ブロックはＮｃｏＩ部位をその上流端に含有し、ＸｈｏＩ部位はその下流端に存在し、ゲル抽出により精製し、ｐＥＴ２３−ｄベクターにライゲーションした。このライゲーション産物を電気穿孔法により大腸菌ＸＬ１Ｂ細胞に形質転換し（ｒｅｃＡ-及びｅｎｄＡ-）、得られたプラスミドを正しいオープンリーディングフレームの検証のためにシーケンシングした。プラスミドの増殖はＸＬ１Ｂ細胞で行われたが、ハイブリッド遺伝子産物の発現のために、プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）に形質転換した。最後に、タンパク質をＩＰＴＧの存在下で発現させ、封入体が形成され、これらを単離し、「実施例で用いた方法」で詳述したように酸化／還元グルタチオンの存在下でリフォールディングし、上記のＥＧＦ＿ＳＡＫ構築物についてのプラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン阻害活性アッセイに供した。
【０１７４】
（ｉｉｉ）ＥＧＦとＳＡＫとの接合部でのトロンビン切断可能配列の導入：
トロンビン切断可能配列を、Ｎ末端融合構築物においてＥＧＦとＳＡＫとの接合部で導入した。この構築物に関し、プラスミドｐＥＴ−２３−ｄにおけるＥＧＦ＿ＳＡＫ  ＤＮＡをＥＧＦ及びＳＡＫの増幅ためのテンプレートとして使用した。トロンビン切断可能プライマーを設計した。ＥＧＦ増幅のために、指定のＥ４  Ｆｐ１及びＥ６  Ｒｐ２（これらのプライマーの配列については表３の番号１３、１４を参照のこと）プライマーを使用した。Ｅ４  Ｆｐ１プライマーはＸｈｏＩ制限部位及びＥＧＦ４、５、６ドメインの上流配列をその５'端に含有し、他方、Ｅ６  Ｒｐ２はＥＧＦ４、５、６の下流配列及びトロンビン切断可能ヌクレオチド配列をその５'端に含有する。以下のＰＣＲ条件を増幅に用いた：９５℃での完全変性、続く次の２８サイクル：９５℃での４５秒間、４５℃での４５秒間のアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び最後に７２℃での更に１０分間にわたる伸長。このＰＣＲ反応で得られた遺伝子ブロックはＥＧＦの４番ドメインをインフレームでコードしている配列をその５'端に含有し、その３'端はＥＧＦ４、５、６の下流配列及びトロンビン切断可能配列を含有する。第２のＰＣＲ反応において、ＳＡＫ遺伝子ブロックをＴＣＳ  ＳＡＫ  Ｆｐ３及びＴＣＳ  ＳＡＫ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表３、すなわち配列番号１５、１６を参照のこと）の助けを借りて増幅した。ＴＣＳ  ＳＡＫ  Ｆｐ３はトロンビン切断可能配列及びＳＡＫヌクレオチドの上流配列を含有する。同様に、他方のプライマーＴＣＳ  ＳＡＫ  Ｒｐ４はＳＡＫの下流配列及び終止コドン、それに続くＮｏｔＩ制限部位を含有する。得られる増幅された遺伝子ブロックはトロンビン切断可能ヌクレオチド配列をその５'端に、また終止コドン及びＮｏｔＩ部位をその３'端に含有する。以下のＰＣＲ条件をＳＡＫ遺伝子ブロックの増幅に用いた：９５℃での完全変性、続く以下の通りの次の２８サイクル：９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での１分間にわたる伸長及び７２℃での更に１０分間にわたる最終伸長。両方のＰＣＲ産物をゲル溶出させ、Ｅ４  Ｆｐ１及びＴＣＳ＿ＳＡＫ  Ｒｐ４（これらのプライマーの配列については表３、すなわち表の配列番号１３及び１６番を参照のこと）の助けを借りた、ＥＧＦ＿ＴＣＳ＿ＳＡＫ遺伝子ブロックの増幅のための一般的なオーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に以下の条件下で供した：９５℃での完全変性、続く９５℃での４５秒間にわたる変性、４５℃での４５秒間にわたるアニーリング、７２℃での２分間にわたる伸長（２８サイクル）及び７２℃での更に１０分間にわたる最終伸長。得られた遺伝子ブロックはＸｈｏＩ制限部位をその５'端に、またＮｏｔＩ部位をその３'端に含有した。このＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、ｐＥＴ２３−ｄにおけるクローニングに続くトロンビン切断可能配列の正しいインフレーム挿入についてシーケンシングした後、ｐＰＩＣ−９Ｋにライゲーションした。
【０１７５】
表３．様々なＥＧＦ４、５、６及びＳＡＫ融合構築物の調製に使用するプライマー
【表３−１】
2013535211.tif 000009
【表３−２】
2013535211.tif 000010
【表３−３】
2013535211.tif 000011
【表３−４】
2013535211.tif 000012
【０１７６】
実施例６
ＴＰＡ−ＥＧＦ及びＳＡＫ−ＥＧＦ融合構築物の生物学的活性：
ＥＧＦとｔＰＡとの異なるハイブリッド遺伝子構築物（化学的に合成した（Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ＿ＥＧＦ）ハイブリッドｔＰＡ融合構築物（ＥＧＦ４、５、６を挿入してｔＰＡの内因性ドメイン、すなわちｅｇｆ及びクリングル１を置き換えた）、内的欠失型のｔＰＡとＥＧＦとの融合体（内因性ｅｇｆ及びクリングル１が欠失し、ＥＧＦ４、５、６はＮ又はＣ末端（at either N and C terminii）で融合）及び上記の構築物の酸化耐性バリアント）を、本質的に上述したようにｐＰＩＣ−９Ｋベクターのα−分泌シグナル配列の上流でインフレームでクローニングした。各構築物を制限エンドヌクレアーゼにより別々にチェックし、またＤＮＡシーケンシングにより検証した。これらの構築物全てを個々にピチア・パストリス（ＧＳ１１５）に電気穿孔法により移した（「実施例で用いた一般的な方法」のセクションを参照のこと）。個々のクローンをＢＭＧＹ及びＢＭＭＹ培地
（ＢＭＧＹ＝１％酵母抽出物、２％ペプトン、１Ｘグリセロール、１Ｘアミノ酸非含有酵母ニトロゲンベース及び１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５、ＢＭＭＹ＝１％酵母抽出物、２％ペプトン、１Ｘメタノール、１Ｘアミノ酸非含有酵母ニトロゲンベース及び１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５）上で５日間にわたって、メタノールで誘導しながら成長させ、上清をカゼインオーバーレイ法によりプラスミノーゲン活性化能について試験した（「実施例で用いた方法」のセクションを参照のこと）。これとは別に、各陽性クローンの上清をプラスミノーゲン活性化について一段階アッセイにおいて試験した。次に、各高活性クローンを１リットルレベルで成長させ、各タンパク質中のｔＰＡポリペプチドの存在をウェスタンブロット法により検証し、リジン親和性及びイオン交換クロマトグラフィが続いた（詳細なプロトコルについては「実施例で用いた方法」を参照のこと）。クロマトグラフィにより得られた異なる融合構築物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９２〜９５％純粋であった。これらの精製されたタンパク質をプラスミノーゲン活性化アッセイに供した。精製された各タンパク質の比活性はピチア由来の未変性の組織プラスミノーゲン活性化因子と極めて似ていた。しかしながら、フィンガー、ｅｇｆ、クリングル１及びクリングル２ドメインを欠失させてＥＧＦ４、５、６ドメインに置き換えた構築物はカゼインオーバーレイ法では比較的弱い加水分解領域を示し、また概して、プラスミノーゲン及び発色基質を使用した定量的マイクロタイタープレートをベースとしたアッセイでは比較的低いプラスミノーゲン活性化因子活性を示した。更に、内的に欠失した構築物における可溶性フィブリンの存在下で見られる活性における刺激の程度は、ＥＧＦの融合がｔＰＡの末端であったｔＰＡ／ｔＰＡ変異体と比較してはるかに低かった。ｔＰＡ変異体（アスパラギンに変更となったスレオニン１１５番アミノ酸（Ｔ１１５Ｎ）、グルタミンに変更となったアスパラギン１２９番アミノ酸（Ｎ１２９Ｑ）及びｔＰＡのＫＨＲＲコード化領域、すなわち４重アラニン変異列に置き換えられた残基３０８〜３１１（ＫＨＲＲ（３０８〜３１１→ＡＡＡＡ、上の実施例を参照のこと））を含有）の場合、プラスミノーゲン活性化因子活性は「基礎」活性及び可溶性フィブリンの存在下でのその刺激の両方の観点で未変性様であった。同時に、この構築物は、トロンビン阻害及びタンパク質Ｃ活性化の明確に定義されたアッセイにおいて最も高いトロンビン阻害特性を示した（「実施例で用いた方法」のセクションを参照のこと）。対照的に、凝固時間アッセイでチェックするトロンビン阻害（高マイクロモル濃度にのぼる未変性のｔＰＡの存在又は不在下のフィブリン網形成）は本質的に緩衝液のコントロールと比較して変化せず、ナノモル濃度の、上記の「四重アラニン」変異体あるいはＥＧＦ４、５、６をｔＰＡに異なる場所に内的に又は端部で組み込むこんだことを含めた異なる精製キメラ構築物の添加により凝固時間が用量依存的に著しく増加した。凝固における観察された増加は、いずれかの端部で融合したＥＧＦドメインと比較してＮ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ＿ＥＧＦ構築物においてより顕著であった。このタイプの作用はトロンビン介在タンパク質Ｃ活性化アッセイでも観察され、Ｎ＿ＥＧＦ＿ｔＰＡ＿ＥＧにより産生されたタンパク質Ｃの量は１つのＥＧＦ４、５、６ドメインを含有するｔＰＡ融合構築物及び内的に融合したＥＧＦ−ｔＰＡ構築物より概して２〜４倍高かった。別の結果では、ＥＧＦ−ｔＰＡ融合体のＥＧＦ部位にメチオニン置換がある酸化耐性形態をそのトロンビン介在タンパク質Ｃ活性化能について比較した場合、メチオニンをバリンで置き換えた酸化耐性形態は常に１５〜２０％高いタンパク質Ｃ活性化を示した。
【０１７７】
同様に、スタフィロキナーゼ及びＥＧＦ融合構築物を調製し、ピチア・パストリス及びＢｌ２１  ＤＥ３細胞において発現させた。ピチア・パストリスにおけるストレプトキナーゼ発現及びその２６番アミノ酸のグリコシル化は文献において報告されており、このグリコシル化はプラスミノーゲン活性化機能を妨げるようであり、ただし培養物をツニカマイシン含有培地の存在下で成長させると、未変性の細菌精製ＳＡＫと同様のプラスミノーゲン活性化プロファイルが得られる。この事実を考慮して、同じ遺伝子ブロックを細菌及びピチアの両方の発現について調製及び設計した。Ｎ末端及びＣ末端でのＳＡＫ−ＥＧＦ融合のためにＳＡＫ及びＥＧＦ融合遺伝子ブロックを使用し、初期発現を大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ細胞において行い、ポリペプチド合成を１ｍＭ濃度のＩＰＴＧで誘導した（「実施例で用いた方法」を参照のこと）。最後に、ＥＧＦ＿ＳＡＫ及びＳＡＫ＿ＥＧＦが封入体の形態で得られ、これらのポリペプチドのためのリフォールディング条件を異なる比の酸化／還元グルタチオン及び他の溶液条件で最適化した（「実施例で用いた方法」を参照のこと）。並行させて、両方の構築物をピチア・パストリスにおいてツニカマイシンの存在下で発現させた。最後に、両方の方法を通じて得られた融合ポリペプチドを精製し、プラスミノーゲン活性化、トロンビン阻害及びタンパク質Ｃ活性化アッセイに供した。一方のピチア由来構築物のプラスミノーゲン活性化、他方の大腸菌封入体から得られたリフォールディングされた融合構築物は本質的に同じであるが、トロンビン阻害及びタンパク質Ｃ活性化の場合、ピチア由来ＥＧＦ＿ＳＡＫ及びＳＡＫ＿ＥＧＦポリペプチドは大腸菌由来タンパク質と比較して約２倍、活性が高いだけであった。背景にある原因、すなわち酸化条件の存在下、特にはリフォールディング中のＥＧＦのメチオニン酸化を定量アミノ酸分析により検証した。酸化及び活性の減退（dimunition）問題は、上の実施例で記載したように、ハイブリッドのＥＧＦセクションにおける部位特異的変異誘発によりメチオニンの代わりにバリンを置くことによって解決した。
【０１７８】
本発明の利点
本発明は、当該分野で使用されている抗トロンビン血栓溶解剤より有利である。組織プラスミノーゲン活性化因子のクリングル、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を含有するペプチド配列並びにヒルジンの抗トロンビン部をスタフィロキナーゼのＣ末端に導入して抗トロンビン血栓溶解剤を作ろうとの試みがこれまでなされてきて、これはこの形態のスタフィロキナーゼが、「ＲＧＤペプチド」、ｔＰＡ由来クリングルによるフィブリン親和性上昇及び早期の一時的に生成されるトロンビンの阻害を通じて抗トロンビン特性を付与するトロンビン不活性化ヒルジン部による血小板阻害に役立つということを前提としている（Ｓｚｅｍｒａｊ，Ｗａｌｋｏｗｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。血栓溶解後の再閉塞問題に対抗するために、組織因子及び第ＶＩＩ因子を阻害する組み換えリポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ）を通じた試みもなされた（Ｈａｓｋｅｌ，Ｔｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）。これは組織因子との不活性複合体の形成に役立つが、一時的な血餅に結合したトロンビンを妨害することはできない。
【０１７９】
しかしながら、本発明において、両方の種類（早期の一時的なトロンビン、また凝血原産生タンパク質Ｃ経路）のプラスミノーゲン活性化及びトロンビン阻害特性を有する戦略的に設計した新世代の血栓溶解剤を設計し、検証した。
【０１８０】
心筋梗塞／循環器疾患に現在適用できる薬物療法では、ヘパリン、ヒルジン及び他のトロンビン阻害剤の同時投与を必要とするが、入手可能な／市販のトロンビン阻害剤は一時的に産生されたトロンビンを標的としており、トロンビンのフィードバック産生を阻害しない。
【０１８１】
現在利用できる薬物療法とは対照的に、発明者は、新種の改善された血栓溶解剤を戦略的に設計した。この血栓溶解剤はトロンビン阻害機能を同時に、そのプラスミノーゲン活性化特性特異性とは別に発揮することができるため、フィブリン強化（ｔＰＡの場合のように）等の本来の特性を損なわないことだけでなく追加の特性（「親」分子に何も存在しない場合のプラスミン及びトロンビン依存性活性化等）も伴うことなく血餅溶解中の望ましくない副作用を防止するのに役立つ。元々の分子に非特異的プラスミノーゲン活性化がある場合（ストレプトキナーゼの場合のように）、発明者は、抗トロンビン特性とは別に血餅特異性を示すハイブリッド構築物を設計した。
【０１８２】
本発明において、発明者はストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子等の血栓溶解剤の非天然のキメラ型を開示し、これらは線維素溶解及び抗トロンビンの両方の能力を有する。既に知られている、第２及び第３世代組み換え物を含むこれらの構築物の「親」分子は血餅を溶解させることはできるが、再血栓症の主な原因であるトロンビンの活性を抑制することはできない。本発明の構築物はフィブリン塊を溶解させるだけではなく、直接トロンビンを抑制し、またトロンビンが平衡を内因性トロンボモジュリン触媒抗凝固経路を通じてシフトさせる場合にタンパク質Ｃを活性化する。
【０１８３】
本発明において、一実施形態において、ＥＧＦ４、５、６ドメインをストレプトキナーゼ分子内の異なるドメイン接合部に、適切なリンカーの配置の後に又は天然のドメイン間リンカーの代わりに導入した。異なる活性構築物を次にプラスミノーゲン活性化プロファイル及びトロンビン阻害特性に基づいて選択した。同様に、様々な組み合わせ／モチーフのＥＧＦドメインと融合したＳＫの様々なムテインを創り出し、発現させ、次に単純なアッセイ系を用いてスクリーニングし、所望の特性を有する機能的に存続しているキメラを選択した。
【０１８４】
ＥＧＦ４、５、６をそのＮ末端で融合させた場合のストレプトキナーゼ（最も高い血栓溶解能を有する薬剤分子）で観察される興味深くも有用な現象は、キメラ構築物が遅延したプラスミノーゲン活性化動態を示し、この活性化の遅延が、少量のプラスミンが反応混合物中に存在する場合に著しく減少したことである。これらのキメラ構築物がプラスミン依存性活性化（無修飾の未変性のストレプトキナーゼによるプラスミノーゲンの「自発的な」酵素原活性化とは反対に）を示したという偶然の観察結果は、得られた分子を血餅特異性にもし、最初は不活性な状態で循環するが（抗プラスミンセルピンによって迅速に不活性化されるため、通常、血中に遊離のプラスミンはないため）、血餅に結合したプラスミンに遭遇すると、そのプラスミン依存性作用機序により活性化される。この結果、ＳＫの出血リスクが大きく抑制され、またＥＧＦドメインの機能的融合によって付与されるものに加えて、広く使用されている薬剤に更なる利点が加わる。
【０１８５】
本発明による他の興味深い構築物は、一方でストレプトキナーゼのアルファ（α）及びベータ（β）ドメイン、また他方でベータ（β）及びガンマ（γ）ドメインのドメイン間接合部でのＥＧＦ４、５、６ドメインの融合によって得られた。これらの構築物の中でも、発明者は、ＥＧＦをαドメインとβドメインとの間に融合した場合にのみプラスミノーゲン活性化及び抗トロンビン活性を発見した。興味深いことに、ＥＧＦドメインをβドメインとγドメインとの間に導入した融合構築物はプラスミン活性を示さなかった。これらの結果は、所定のドメイン融合設計により「親」特性が共存できるか否かは、実際に実験により試験しない限り、アプライオリに予測できないことを示唆している。
【０１８６】
Ｎ末端ＥＧＦ−ＳＫ融合構築物及び短縮ＳＫ（残基５〜３８３）とのＥＧＦドメインのＮ末端融合構築物で観察された利点は、トロンビン不活性化に加えたそのはっきりとしたプラスミン依存性活性化特性であり、これは血餅特異的な血栓溶解及びトロンビン不活性化にとって潜在的に大きな利点である。
【０１８７】
ＥＧＦ４、５、６ドメインをスタフィロキナーゼのＮ末端及びＣ末端領域と融合させた場合、Ｎ末端部が１：１プラスミン複合体の形成中に除去されることが観察された。これは溶解中のＥＧＦドメインの独立した機能及び高レベルの血餅特異性を生み出すことにおいて有用であると考えられる。Ｃ末端ＥＧＦ融合の場合、ＳＡＫに付着したままでであることが判明した。このため、両方のケースにおいて、プラスミノーゲン活性化及び抗血栓特性はキメラポリペプチドにうまく組み込まれたと判明した。
【０１８８】
本発明の化合物を含む組成物はプロドラッグ形態をとり得る。本発明の化合物のプロドラッグは本発明の方法において有用である。生体内で変換されて本発明の化合物の生物学的、薬学的又は治療的に活性な形態になる化合物がプロドラッグである。プロドラッグの様々な例及び形態が当該分野で周知である。前駆体タンパク質又は前駆体核酸等の生体分子がプロドラッグになり得る。プロドラッグの例は、とりわけ、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編集のＤｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５）、Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒらが編集のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．３０９−３９６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５）、Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄが編集のＡ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄによる”Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，”ｐｐ．１１３−１９１，１９９１、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１−３８（１９９２）、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．２８５（１９８８）及びＮｏｇｒａｄｙ（１９８５）Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３８８−３９２に記載される。
【０１８９】
本発明を様々な具体的且つ好ましい実施形態及び技法を参照しながら説明してきた。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内に留まりながらも多くの変更及び修正を加え得ることを理解すべきである。当業者には、本明細書で具体的に記載したもの以外の組成物、方法、デバイス、デバイス構成要素、材料、手順及び技法を、過度に実験をしなくても本明細書において広く開示した本発明の実施に適用できることが明らかである。本明細書に記載の組成物、方法、デバイス、デバイス構成要素、材料、手順及び技法の当該分野で公知の全ての機能的均等物が本発明に含まれるとする。範囲を開示する場合、全ての部分範囲及び個々の値が含まれるとする。図面において図示した又は明細書において例示したもの全てを含め、本発明は開示の実施形態によって限定されることがなく、これらは例として又は図解として提供され、限定のためのものではない。本発明の範囲は請求項によってのみ限定される。
【０１９０】
参考文献
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2013535211.tif 000014
2013535211.tif 000015
2013535211.tif 000016
2013535211.tif 000017
2013535211.tif 000018
【０１９１】
（配列表）
Ｓｅｑ  ＩＤ  １＝ＳＫ
2013535211.tif 000019
Ｓｅｑ  ＩＤ  ２＝ＥＧＦ
2013535211.tif 000020
Ｓｅｑ  Ｉｄ  ３＝ドメイン間ＳＫ＿ＥＧＦ
アルファ／ベータ間
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Ｓｅｑ  ＩＤ  ４＝Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ
2013535211.tif 000022
ＳＥＱ  ＩＤ  ５＝ドメイン間ベータ／ガンマ
2013535211.tif 000023
ＳＥＱ  ＩＤ  ６＝ＳＫ＿ＥＧＦ
2013535211.tif 000024
ＳＥＱ  ＩＤ  ７＝Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＫ＿ＥＧＦ
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2013535211.tif 000026
ＳＥＱ  ＩＤ  ８＝ＥＧＦ４５６人工
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ＳＥＱ  ＩＤ  ９＝人工合成ＴＰＡ
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ＳＥＱ  ＩＤ  １０＝Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＰＡ＿ＥＧＦ
2013535211.tif 000029
2013535211.tif 000030
ＳＥＱ  ＩＤ  １１＝Ｎ＿ＥＧＦ＿ＴＰＡ
2013535211.tif 000031
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ＳＥＱ  ＩＤ  １２＝ＴＰＡ＿ＥＧＦ
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2013535211.tif 000034
ＳＥＱ  ＩＤ  １３＝ＩＤ  ＥＧＦ  ＴＰＡ（ｅｇｆ欠失）
2013535211.tif 000035
2013535211.tif 000036
ＳＥＱ  ＩＤ  １４＝ＩＤ  ＥＧＦ  ＴＰＡ（ｅｇｆ、Ｋ１欠失）
2013535211.tif 000037
ＳＥＱ  ＩＤ  １５＝Ｎ＿ＥＧＦ（ｅｇｆ、ｋ１欠失）
2013535211.tif 000038
ＳＥＱ  ＩＤ  １６＝ＴＰＡ＿ＥＧＦ（ｅｇｆ、ｋ１欠失）
2013535211.tif 000039
ＳＥＱ  ＩＤ  １７＝ＳＡＫ
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ＳＥＱ  ＩＤ  １８＝Ｎ＿ＥＧＦ＿ＳＡＫ
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ＳＥＱ  ＩＤ  １９＝ＳＡＫ＿ＥＧＦ
2013535211.tif 000042
ＳＥＱ  ＩＤ  ２０＝ｔＰＡのバリアント
（テネクテプラーゼ）
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2013535211.tif 000050
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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