(57)【要約】  本発明は、特異的にニコチンに結合する抗体のインビボでの産生に使用することができる新規ニコチンハプテン化合物およびニコチン免疫抱合体を提供する。本発明はまた、能動免疫化または受動免疫化プロトコルにおけるニコチン免疫抱合体を含むワクチンを使用する方法も提供する。本発明の組成物および方法はニコチン中毒の予防および治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１３】
2013504618.tif 000017
のハプテンであって、式中、Ｘがチオール基を含まないリンカー部分である前記ハプテン。
【請求項２】
Ｘが：
【化１４】
2013504618.tif 000018
2013504618.tif 000019
からなる群より選択される請求項１記載のハプテンであって、式中、ｎが約１〜約２０の整数であり；ｍが約０から約６の整数であり；ｋが約０から約２０の整数であり；ｐが約０から約６の整数であり；ｒが約１から約２０の整数であり；Ｚが−Ｏ−、−ＣＨ２−および−ＮＨ−から成る群より選択され；Ｒ１およびＲ２が−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨ−、−ＮＨＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨＣＯ−および−Ｓ−Ｓ−から成る群より独立して選択され；Ｙが−Ｈ、−ＯＨ、＝ＣＨ２、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、アシル、２−ニトロ−４−スルホベンゾエート、Ｎ−オキシスクシンイミデート、Ｎ−マレイミド、イミノアシレート、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、ビニルスルホン、イミドエステル、フェニルグリオキサレート、ヒドラジド、アジド、アミノおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミデートから成る群より選択される前記ハプテン。
【請求項３】
請求項１記載のハプテンであって、式中、Ｒが−Ｚ（ＣＨ２）ｎＹであり、ここでｎが約１から約２０の整数であり、Ｚが−Ｎ−、−ＣＨ２−および−Ｏ−から成る群より選択され、およびＹが−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＣＯＯＨ、アシル、アリール、アルキル、Ｎ−マレイミド、イミノアシレート、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホメート、ビニルスルホン、イミドアシレート、フェニルグリオキサレート、ヒドラジド、アルキニル、アジド、アミノおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミデートから成る群より選択される前記ハプテン。
【請求項４】
Ｚが−ＣＨ２−であり、およびｎが３である請求項３記載のハプテン。
【請求項５】
Ｙが−ＣＯＯＨである請求項３記載のハプテン。
【請求項６】
式（ＩＩ）：
【化１４】
2013504618.tif 000020
の免疫抱合体であって、式中、Ｗがキャリア部分Ｒに共有結合しているリンカー部分であり、ここで当該共有結合がチオエーテル結合でない前記免疫抱合体。
【請求項７】
Ｗが次の群：
【化１５】
2013504618.tif 000021
2013504618.tif 000022
より選択される請求項６記載の免疫抱合体であって、式中、ｎが約１〜約２０の整数であり；ｍが約０から約６の整数であり；ｋが約０から約２０の整数であり；ｐが約０から約６の整数であり；ｒが約１から約２０の整数であり；Ｚが−Ｏ−、−ＣＨ２−および−ＮＨ−から成る群より選択され；Ｒ１およびＲ２が−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨ−、−ＮＨＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨＣＯ−および−Ｓ−Ｓ−から成る群より独立して選択され；Ｙが−Ｏ−、＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＯＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ−、−Ｓ−Ｓ−、ハロゲン、アシル、２−ニトロ−４−スルホベンゾエート、Ｎ−オキシスクシンイミデート、Ｎ−マレイミド、イミノアシレート、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホメート、ビニルスルホン、イミドエステル、フェニルグリオキサレート、ヒドラジド、アジド、アミノおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミデートから成る群より選択される前記免疫抱合体。
【請求項８】
請求項６記載の免疫抱合体であって、式中、Ｗが−Ｚ（ＣＨ２）ｎＹであり、ここでｎが約１から約２０の整数であり、Ｚが−ＮＨ−、−Ｏ−および−ＣＨ２−から成る群より選択され、およびＹが−Ｏ−、＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＯＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ−、−Ｓ−Ｓ−から成る群より選択される前記免疫抱合体。
【請求項９】
Ｚが−ＣＨ２−であり、並びにｎが３である請求項８記載の免疫抱合体。
【請求項１０】
Ｙが−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である請求項８記載の免疫抱合体。
【請求項１１】
請求項６記載の免疫抱合体であって、式中、Ｒがキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ），エデスチン、チログロブリン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ赤血球、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド、コレラトキソイド、ポリアミン酸、Ｄ−リジン、Ｄ−グルタミン酸、細菌毒素のＬＴＢファミリー構成員、レトロウイルス核タンパク質（レトロＮＰ）、狂犬病リボ核タンパク質（狂犬病ＲＮＰ）、水泡性口内炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＶＳＶ−Ｎ）、組換ポックスウイルスサブユニットおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から成る群より選択される前記免疫抱合体。
【請求項１２】
請求項６記載の免疫抱合体であって、式中、キャリア部分が破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリア毒素交差反応性変異体１９７（ＣＲＭ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＢＳＡである前記免疫抱合体。
【請求項１３】
免疫学的に有効な量の請求項６記載の免疫抱合体および生理学的に許容可能なベヒクルを含む組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
免疫学的に有効な量の請求項１３記載の組成物により対象を免疫することを含む対象において抗ニコチン免疫応答を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法であって、式中、Ｘが−（ＣＨ２）４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、およびキャリア部分が破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリア毒素交差反応性変異体１９７（ＣＲＭ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＢＳＡである前記方法。
【請求項１７】
式ＩＩＩ：
【化１６】
2013504618.tif 000023
の免疫抱合体の調製方法であって、式中、Ｙがキャリア部分への結合を促進する官能基であり、Ｒがキャリア部分であり並びにｎが約３から約８の整数であり、当該方法が
（ａ）化合物Ａ：
【化１７】
2013504618.tif 000024
を化合物Ｂ：
【化１８】
2013504618.tif 000025
へ変換すること、並びに
（ｂ）化合物Ｂを式ＩＩＩの免疫抱合体へ変換すること
を含む前記調製方法。
【請求項１８】
ｎが５であり、並びにＹが−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法であって、ここでキャリア部分が破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリア毒素交差反応性変異体１９７（ＣＲＭ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＢＳＡである前記方法。
【請求項２０】
請求項６記載の免疫抱合体に結合する抗体。
【請求項２１】
ニコチンに結合する請求項２０記載の抗体。
【請求項２２】
約１５０μＭないし約１０μＭの解離定数でニコチンに結合する請求項２０記載の抗体。
【請求項２３】
請求項２０記載の抗体および生理学的に許容可能なベヒクルを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（ｅ）に基づき、出願人は、本情報開示の一部が著作権保護を受ける資料を含むことに特に言及する。本著作権者は、何人による本特許書類又は本特許の情報開示の複写複製に対しても、それが特許商標局の特許ファイル又は記録中に出現する場合には異議を唱えないが、その他の場合には全ての著作権を留保する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
本特許出願は、米国仮出願第６１／２７６，６７９号（出願日２００９年９月１４日）による優先権の利益を主張する。優先権基礎出願の全ての情報開示は、参照することにより、そっくりそのまま、すべての目的のために本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ニコチン、（Ｓ）−（−）−１−メチル−２−（３−ピリジル）ピロリジンは、紙巻きタバコ、葉巻、パイプタバコおよび噛みタバコに豊富に含まれる依存性物質である。紙巻きタバコ、葉巻およびパイプタバコの喫煙は、米国内および世界的に蔓延している問題である。ニコチンは、中脳辺縁系ドーパミン経路を標的にし、ニコチン様アセチルコリン受容体に結合し生理的な依存を引き起こす。依存性喫煙者におけるニコチンの精神薬理作用には、精神安定、体重減少、易刺激性の低減、喫煙欲求の減少、覚醒亢進および認知動作の改善が含まれる。ニコチン欠乏は禁断症状およびニコチン探索行動の活発化を引き起こす。
【０００４】
現在、いくつかの治療法がニコチン中毒を治療及び予防するために利用可能である。これらの治療法は、通常、援助の無い喫煙制御またはリハビリテーションのためのニコチン自体の投与にもっぱら頼っているが、大部分が効果がない。例えば、最も汎用される２つの治療法、即ち、ニコチン経皮パッチおよびニコチンチューインガムによる長期間の成功率は、２０％未満の不十分なものでしかなかった。また他の問題または副作用がこれらの治療法に付随することも知られている。特に、ニコチンの血流への浸透が低く、そのために喫煙の欲求が高まる。例えば、口内炎、顎の不快感、悪心、等の問題がニコチンガムの使用に付随してきた。例えば、皮膚炎、睡眠障害および神経過敏等の問題がニコチンパッチの使用に付随してきた。
【０００５】
ニコチン中毒を治療するためのより良い方法が当該技術分野において必要とされる。本発明は、当該方法および当該技術分野で実現されていない他のニーズを扱う。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において本発明は式（Ｉ）：
【化１】
2013504618.tif 000002
のハプテン化合物を提供し、式中、Ｘはチオール基を含まないリンカー部分である。
【０００７】
他の態様において本発明は式（ＩＩ）：
【化２】
2013504618.tif 000003
の免疫抱合体を提供し、式中、Ｗはキャリア部分Ｒに共有結合的に結合したリンカー部分であり、ここで当該共有結合はチオエーテル結合でない。また本発明において提供されるのは、免疫学的に有効な量の免疫抱合体および生理学的に許容可能なベヒクルを含む医薬組成物でもある。医薬組成物は適当なアジュバントをさらに含むことができる。
【０００８】
関連した態様において本発明は、対象における抗ニコチン免疫応答を誘導する方法を提供する。当該方法では、本明細書で開示する免疫学的に有効な量の免疫抱合体または医薬組成物により対象を免疫することを伴う。
【０００９】
他の態様において本発明は、式ＩＩＩ：
【化３】
2013504618.tif 000004
の免疫抱合体を調製する方法を提供し、式中、Ｙはキャリア部分への結合を促進する官能基であり、Ｒはキャリア部分であり並びにｎは約３から約８の整数である。当該方法は、化合物Ａ：
【化４】
2013504618.tif 000005
の化合物Ｂ：
【化５】
2013504618.tif 000006
への最初の変換を含む。
【００１０】
その後、化合物Ｂは式ＩＩＩの免疫抱合体へ引き続き変換される。
【００１１】
さらに他の態様において本発明は、本明細書に開示する免疫抱合体に結合する抗体を提供する。さらに提供されるのは、抗体および生理学的に許容可能なキャリアまたはベヒクルを含む医薬組成物である。
【００１２】
明細書の以下の部分および特許請求の範囲を参照することによって、本発明の本質および優位性に関しさらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ニコチンハプテンＡＭ１の合成および適当なハプテン−タンパク質抱合体の産生のスキームを示す。
【図２】図２は、自己投与期間に誘発されたラット（ｎ＝５）の平均ＮＩＣ−ＢＳＡ力価を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図３】図３は、ワクチン接種強化群および対照群に関するＦＲ１−ＴＯ−２０ｓスケジュール下で行われた平均注入回数を示す。＃ｐ≦０．１０；＊ｐ＜０．０５。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
Ｉ．概要
【００１５】
本発明は、発明者らによって作製されニコチン中毒の治療用の免疫薬理療法に有用な、新規クラスのニコチンハプテンおよびハプテン−キャリア免疫抱合体に一部を基づいている。免疫薬理療法は、高度に特異的な抗体を使用し、脳中への薬の通過を鈍らせ、従って中枢神経系の報酬経路への強化効果を最小化することを目標としている。ニコチンおよびその代謝物コチニンは、低分子量の分子であり、免疫応答を誘発するためには高分子に付加される必要がある。これらの構造の双方とも付加のための適当な官能基を有さないので、適当なリンカーを用いて標的スカフォールドに官能性を付与しなければならない。リンカー−ニコチンの位置化学的付加は、誘発される抗体量並びに望ましい抗体特異性を獲得することの双方の観点から適切な免疫刺激にとってきわめて重要であることが証明された。ニコチンについては、数種のリンカー付加部位が研究されてきたが、特記すべきはＬａｎｇｏｎｅらのものである（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５０２５−５０３０、１９７３）。原報においては、トランス−３‘−スクシニルメチルニコチンが作製され、他の高分子とカップリングされた。アルビノのウサギへの完全フロイントアジュバントとの製剤によるこれら抱合体のワクチン接種は、コチニンの存在下でさえも抗体の検知可能な交差反応性を有さない、種々の組織および生物体液におけるピコモルレベルのニコチン検出を可能とする、抗体を産生した。Ｌａｎｇｏｎｅの原報以来、同じ一般構造の、すなわち３’位置に官能性をもたせる構造の多くのハプテンが、全てのニコチンハプテンの中で最も広く調製され研究された分子となった（例えば、Ｈｉｅｄａら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：８０９−８１９、２０００）。しかしながら、ニコチンハプテンに付随する種々の問題が当該技術分野で報告されてきた。例えば、ハプテンの低い安定性、ニコチンの標的構造以外の追加の免疫原の部分および抗体力価の高変動、等である。例えば、Ｈｉｅｄａら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：８０９−８１９、２０００）によって獲得された抗体力価の範囲は、少なくとも１０倍までの範囲で大きくばらつく。ニコチン断ちの成功は、体内循環する抗体量と直接関係していることから、力価が大きくばらつくことによって、禁煙率が大きくばらつく原因となっている。このため、力価の大きなばらつきは重要な因子である。
【００１６】
発明者らは、当該技術分野において既知のニコチンハプテンより優れた性質を有するニコチン誘導化合物を設計し合成した。本発明のハプテン化合物に基づくハプテン−タンパク質免疫抱合体は、ハプテンに安定性を与え、またニコチンに対する良好な力価並びに親和性および特異性を有する抗体を動物中で産生するのに有効である。さらに、ニコチン依存症の動物の免疫抱合体によるワクチン接種は、禁ニコチンを援助する免疫抱合体の有効性を示唆する特定の行動変化を首尾よく誘発することができる。具体的にいうと、以下の実施例で詳述する通り、本発明の免疫抱合体は、マウスおよびラット双方の齧歯類のモデルにおいて高レベルの抗ニコチン抗体を誘発することができた。ハプテンの未変性の抗原性は、非免疫ニコチンアナログ（ＮＩＣ）との交差反応性をチェックするときに、キャリアタンパク質に関係なく高抗体力価レベルが得られたという事実によって脚光をあびている。さらに、免疫抱合体によるワクチン接種が、ラットにおいて高用量の未処理薬剤の自己投与を同時併用しても、ニコチン特異的抗体の産生を可能とすることが証明された。この結果は、ヘビースモカーにおいてさえ、ワクチンの免疫原性に影響を与えることなしに、禁煙を始める前にワクチン接種を開始することができることを示唆する。さらに、これら抗ニコチン抗体が存在することにより、ワクチン接種を受けた対象における静脈内自己投与パターンが大きく変化しており、ワクチン接種による防御効果が薬剤摂取量の増加に反映されている。
【００１７】
これらの発見に従って本発明は、新規ニコチンハプテン化合物および当該ハプテンを含む免疫抱合体を提供する。本発明はまた、当該免疫抱合体を産生する方法およびニコチン依存症又は中毒の対象を治療するために当該免疫抱合体を使用する治療方法を提供する。
【００１８】
以下の節で本発明を実施するためのより詳細なガイダンスを提供する。
ＩＩ．定義
【００１９】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が関連する当該技術分野における当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、技術者に本発明で使用する多数の用語の一般的な定義を供給する。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｏｒｒｉｓ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（第１版、１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｍｉｔｈ、（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（改訂版、２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｋｕｍａｒ（編）、Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（第３版、２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈｕｎｔ（編）、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（第１版、１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｈｌｅｒ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（編）、Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（第４版、２０００）。さらに、読者の本発明の実施を助けるために以下の定義を提供する。
【００２０】
本明細書で使用する用語「アジュバント」とは、それ自体はいかなる特異的な抗原効果を有せずに、対象の免疫系を刺激しワクチンへの応答を増強することのできる免疫学的薬剤をいう。アジュバントには、特異的なワクチン抗原と組み合されて使用されたときに抗原特異的な免疫応答を促進、延長又は亢進するように作用するいかなる物質も含まれる。従って、本発明に適したアジュバントは、本明細書に記載の免疫抱合体に対する免疫応答を亢進することができる。
【００２１】
本明細書および当該技術分野で使用する用語「ハプテン」とは、キャリア部分に結合すると検出可能な免疫応答を誘発する小分子をいう。免疫抱合体として構築されるとき、ハプテンは免疫抱合体の特異性決定部として特徴づけられる。本発明の免疫抱合体によるワクチン接種に応答して産生された抗体は、また遊離状態のハプテンまたはニコチンと反応することもでき、従って種々のアッセイに有用である。
【００２２】
「能動免疫」とは、抗原、例えば、免疫抱合体を与えることによる対象における免疫応答の誘導をいう。免疫抱合体は、免疫学的に有効な量の免疫抱合体を対象にデリバーすることのできるように、生理学的に許容可能なベヒクル又はキャリアを含有する医薬組成物に適切に含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する「キャリア部分」とは、ハプテンの免疫原性を亢進することのできる抱合パートナーをいう。キャリア部分は当該技術分野で周知であり、一般的にはタンパク質である。
【００２４】
「免疫学的に有効な量」とは、免疫原に対する免疫応答を誘導することのできるおよび／または対象とする免疫原、例えば、ニコチンの免疫学的特徴を共有する免疫原又は他の薬剤に特異的な抗体を産生することのできる免疫原（例えば、本明細書に記載の免疫抱合体）の量を意味する。
【００２５】
「受動免疫」とは、対象へ抗体を移入することによって短期間に達成される免疫をいう。
【００２６】
「生理学的に許容可能な」ベヒクルとは、インビボでの投与（例えば、経口、経皮、筋肉内または腸管外投与）またはインビトロでの使用、即ち細胞培養に適した任意のベヒクル又はキャリアである。
【００２７】
用語「対象」とは、脊椎動物、適切には哺乳動物、より適切にはヒトをいう。
【００２８】
ワクチンとは、対象に投与されたときに、作動物質（例えば、ニコチン）に対し免疫応答（特異抗体の産生を含む）を誘発するまたは特定の疾病に対する免疫を改善する生物学的製剤をいう。ワクチンは典型的には、対象の作動物質または微生物に免疫学的に類似する少量の免疫原（例えば、ニコチン誘導体）を含有する。免疫原は、体の免疫系を刺激して当該作動物質を異物として認識させ、当該作動物質を破壊させ、さらに「記憶」させるため、その結果免疫系は、後に遭遇すると当該作動物質をより容易に認識し破壊することができる。
ＩＩＩ．ニコチンハプテンおよび免疫抱合体の設計および合成
【００２９】
ニコチンは本質的に非免疫原性であるために、発明者らは、これらの化合物に対する抗体がニコチンと交差反応するように、ニコチンの構造的および立体化学的な特徴を有する化合物を設計した。本発明に従ってハプテンは、原料から新規にまたはニコチン関連化合物から合成することができる。いくつかの実施態様において、ニコチンまたはニコチン誘導化合物がハプテン合成の出発原料として用いられる。他の実施態様においてニコチンハプテンは、当該技術分野で周知の標準的な化学的方法に従ってデノボ合成によって産生することができる。本発明のハプテンは、対象における免疫応答の亢進を誘発することができるようにキャリアタンパク質とカップルすることができる。免疫応答には、ニコチンと交差反応することができるハプテン特異的な抗体の産生が含まれる。
【００３０】
本発明に従って、いくつかのハプテンは式（Ｉ）：
【化６】
2013504618.tif 000007
に示す構造を有し、式中、Ｘはリンカー部分である。式Ｉのハプテンは、ニコチンの分子的特徴を模倣するように合成的に誘導することができる。上記の通りハプテンは、合成経路において反応物としてニコチンまたはニコチン誘導体を使用して、又は使用せずに合成することができる。式（Ｉ）のハプテンを産生する代表的な方法は、下記の実施例に記載する。当該ハプテン構造の重要な側面は、ニコチンハプテンの設計において一般に使用されるアミド部分とは対照的に単純エーテル結合を使用することである。本明細書の実施例において証明するとおり、エーテル付加物は、ハプテンの安定性を提供するだけでなく、免疫応答を望ましいニコチン標的に集中させる「マスクされた」付加部位を提供する。このような構造設計を有するハプテンは、インビボで有効な抗ニコチン抗体を産生することができる。ＡＭ１と命名した、本発明のニコチンハプテンの具体的な例を図１に示す。
【００３１】
本発明のハプテンは、上記の通りニコチン免疫抱合体を産生するためにキャリア部分と結合することができる。免疫抱合体は、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して容易に産生することができる。免疫抱合体を産生するために、ニコチンハプテンは共有結合的または非共有結合的にキャリア部分に抱合することができる。いくつかの実施態様においてニコチンハプテンは、チオエーテル結合でない結合によってキャリア部分に抱合する。いくつかの実施態様においてリンカー部分Ｘは、共有結合によってキャリア部分に抱合する。リンカー部分Ｘおよびキャリア部分の官能基に依存して、ニコチンハプテンをキャリア部分に抱合するために種々の共有結合を使用することができる。いくつかの実施態様においてリンカー部分は、共有結合を形成するためにキャリア部分のアミノ酸残基と容易に反応することができる官能基を作成するために最初に活性化される。このように作成した免疫抱合体の具体例は、下記の実施例で例証する。いくつかの実施態様においてキャリア部分は、ニコチンハプテンと反応するための官能基を作成するために誘導体化分子またはスペーサ―分子によって修飾することができる。本発明を実施するために適した誘導体化分子は、当該技術分野で周知である。
【００３２】
種々のキャリア部分を本発明の免疫抱合体を産生するために用いることができる。いくつかの好ましい実施態様においてキャリア部分はタンパク質である。例えば、細菌またはウイルス由来のタンパク質、例えば、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイドまたは関連タンパク質、例えば、ジフテリアトキシン交差反応変異体１９７（ＣＲＭ）、コレラトキソイド、細菌毒素のＬＴＢファミリー構成員、レトロウイルス核タンパク質（レトロＮＰ）、狂犬病リボ核タンパク質（狂犬病ＲＮＰ），水泡性口内炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＶＳＶ−Ｎ）、組換ポックスウイルスサブユニット、等々を使用することができる。他の適したキャリア部分には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）等の赤血球、並びにポリアミノ酸、例えば、ポリ（Ｄ）リジン、ポリ（Ｄ）グルタミン酸等が含まれる。ポリマー、例えば、デキストラン、マンノース又はマンナン等の炭水化物も使用することができる。
【００３３】
ハプテンをキャリア部分に結合するために利用可能な方法は広範囲にわたって存在し、その任意のものが本発明の使用に好適に用いられる。上記の通り、本発明のいくつかのニコチンハプテンは、リンカー部分Ｘに連結する単純エーテル基を含有する。リンカー部分は、キャリア部分がリンカー部分に共有結合的に結合しているかどうかに依存して１価または２価であることができる。いくつかの実施態様においてリンカー部分は、チオ基を含有しない。いくつかの実施態様においてリンカー部分は、活性型アシルである。リンカー部分の長さおよび性質は、ハプテンがインビボでハプテンに対する適した抗体応答を誘発するためにキャリア部分から十分な距離ずれるようにする。適したリンカー部分には：
【化７】
2013504618.tif 000008
2013504618.tif 000009
が含まれ、式中、ｎは約０〜約２０、又はいくつかの実施態様において約１から約１２、約２から約１０、または約３〜約６の整数であり；ｍは約０から約６の整数であり；ｋは約０から約２０の整数であり；ｐは約０から約６の整数であり；ｒは約１から約２０の整数であり；Ｚは−Ｏ−、−ＣＨ２−および−ＮＨ−から成る群より選択され；Ｒ１およびＲ２は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨ−、−ＮＨＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨＣＯ−および−Ｓ−Ｓ−から成る群より独立して選択され；Ｙは−Ｈ、−ＯＨ、＝ＣＨ２、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、アシル、活性型アシル、２−ニトロ−４−スルホベンゾエートおよびＮ−オキシスクシンイミデート等、アルキル、Ｎ−マレイミド、イミノアシレート、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、ビニルスルホン、イミドエステル、フェニルグリオキサレート、ヒドラジド、アルキニル、アジド、アミノ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデート、−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−および−Ｃ≡Ｃ−から成る群より選択される。本発明について十分な長さおよび柔軟性を有する適切な他のリンカーも使用することができる。広範囲の試薬および／または活性基をキャリア部分へのハプテンの架橋結合を促進するために使用することができる。
【００３４】
ハプテンへの抱合を促進するために、キャリア部分を当業者に既知の方法、例えばサクシニル化によって修飾することができる。約１ないし約１００のハプテンをキャリア部分に抱合することができ、より好ましくは１〜７０、１〜５０または１〜２５のハプテンをキャリア部分にカップルすることができる。
【００３５】
関連する態様において本発明は式（ＩＩ）：
【化８】
2013504618.tif 000010
の免疫抱合体を提供し、式中、Ｗはキャリア部分への結合を促進する官能基またはリンカー部分であり並びにＲはキャリア部分である。Ｗは、−Ｈ、−ＯＨ、＝ＣＨ２、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、アシル、活性型アシル、２−ニトロ−４−スルホベンゾエートおよびＮ−オキシスクシンイミデート等、アルキル、Ｎ−マレイミド、イミノアシレート、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、ビニルスルホン、イミドエステル、フェニルグリオキサレート、ヒドラジド、アルキニル、アジド、アミノ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデート、−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｍ−（ここで、ｍは約１から約２０の整数）、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−および−Ｃ≡Ｃ−から成る群より選択することができる。また他の十分な長さと柔軟性を有する適切なリンカーも本発明に使用することができる。広範囲の試薬および／または活性基をキャリア部分へのハプテンの架橋結合を促進するために使用することができる。
【００３６】
いくつかの好ましい実施態様においてリンカー基Ｗは、共有結合によってキャリア部分Ｒに結合している。いくつかのこれらの実施態様において共有結合は、チオエーテル結合ではない。リンカー部分とキャリア部分の間で共有結合が形成されるとき、式（ＩＩ）の免疫抱合体に含まれるリンカー部分Ｗは、上記のリンカー部分Ｘに対応する活性化された部分である。従って、免疫抱合体のリンカー部分Ｗは、
【化９】
2013504618.tif 000011
2013504618.tif 000012
であることができ、式中、ｎは約０〜約２０の整数であり；ｍは約０から約６の整数であり；ｋは約０から約２０の整数であり；ｐは約０から約６の整数であり；ｒは約１から約２０の整数であり；Ｚは−Ｏ−、−ＣＨ２−および−ＮＨ−から成る群より選択され；Ｒ１およびＲ２は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨ−、−ＮＨＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨＣＯ−および−Ｓ−Ｓ−から成る群より独立して選択され；Ｙは−Ｏ−、＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＯＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ−、−Ｓ−Ｓ−、ハロゲン、アシル、２−ニトロ−４−スルホベンゾエート、Ｎ−オキシスクシンイミデート、Ｎ−マレイミド、イミノアシレート、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、ビニルスルホン、イミドエステル、フェニルグリオキサレート、ヒドラジド、アジド、アミノおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミデートから成る群より選択される。
【００３７】
本発明のいくつかの免疫抱合体は、下記の式ＩＩＩ：
【化１０】
2013504618.tif 000013
に示す構造を有し、式中、Ｙはキャリア部分への結合を促進する官能基であり、Ｒはキャリア部分であり並びにｎは約１から２０、好ましくは約３から約８の整数である。上記または当該分野においてハプテンに免疫原性を与えるものとして既知のいかなるキャリア部分も、これらの免疫抱合体に使用することができる。ニコチンハプテンとキャリア部分の間の結合は、共有結合的でも非共有結合的であってもよい。いくつかの好ましい実施態様において官能基Ｙとキャリア部分Ｒの間の結合は、共有結合である。いくつかのこれらの実施態様において、共有結合はチオエーテル結合ではない。
【００３８】
いくつかの好ましい実施態様において、本発明の免疫抱合体は、下記の式ＩＶ：
【化１１】
2013504618.tif 000014
に示す構造を有し、式中、ｎは約１から約２０、好ましくは約３から約８の整数であり並びにＲはキャリアタンパク質である。これらの実施態様においてニコチンハプテンは、キャリアタンパク質にアミド結合によって共有結合している。いくつかのより好ましい実施態様において、式ＩＶ中のｎは５であり並びにキャリアタンパク質はＴＴ、ＣＲＭまたはＫＬＨである。
【００３９】
本明細書に記載する免疫抱合体の産生方法もまた本発明に包含される。上記の通り、特定のニコチンハプテンおよびキャリア部分に依存して、本発明の免疫抱合体を合成するために種々の方法を用いることができる。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は式ＩＩＩの免疫抱合体を調剤する方法を提供する。典型的には、当該方法は、下記に示す式Ａの化合物の式Ｂの化合物への最初の変換：
【化１２】
2013504618.tif 000015
を必要とする。
この段階において化合物Ａは、キャリア部分Ｒと反応することのできる官能基Ｙにより誘導体化される。免疫抱合体を合成するために、次に化合物Ｂ中の官能基Ｙが活性化される。ハプテン化合物はその後、活性化された官能基Ｙをキャリア部分と反応させることによって、式ＩＩＩの免疫抱合体へさらに変換することができる。上記の通り、本発明の免疫抱合体を産生するために種々のリンカー基を使用することができる。従って、化合物Ａを活性化するために使用される官能基Ｙは、本明細書に開示するリンカー部分に含まれる任意の反応基であることができる。
【００４０】
官能基を含むリンカーによる化合物Ａの誘導体化およびそのキャリア部分へのさらなる抱合は、標準的な化学反応または本明細書に開示する合成方法によって実施することができる。例えば、下記の実施例において証明する通り化合物Ａは、カルボン酸基を提供するためのブロム化リンカーの付着によって誘導体化することができる。化合物Ｂ中のカルボン酸基は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）により、次に活性化される。活性化されたハプテン化合物はその後、キャリア部分（例えば、キャリアタンパク質）とさらに反応し、免疫抱合体を産生することができる。
ＩＶ．ニコチン免疫抱合体を含むワクチンおよび免疫療法のためのその使用
【００４１】
本発明の免疫抱合体は、能動免疫プロトコルに適したワクチンを調製するために使用することができる。本発明の免疫抱合体を含有する組成物は、インビボでの使用、例えば、対象への治療的または予防的投与のために製剤することができる。いくつかの特別な実施態様において免疫抱合体は、ワクチン組成物として製剤される。
【００４２】
有効成分として免疫抱合体を含有するワクチンの調製は、一般的に当該技術分野において十分に理解されている。典型的には、当該ワクチンは注射可能な液体溶液かまたは懸濁液として調製される。また注射に先立つ溶液または懸濁液への製剤に適した固形剤も調製することができる。また調剤薬は乳化されてもよい。免疫抱合体は、薬学的に許容可能で有効成分と適合性のある賦形剤と混合することができる。適した賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール等、およびその組合せである。さらにもし望むならばワクチンは、少量の補助剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または下記に記載する通りワクチンの効力を増強するアジュバントを含んでもよい。本発明の免疫抱合体を含有するいくつかの医薬組成物（例えば、ワクチン）において所期の免疫応答は、アジュバント物質を含むことによって増強される。アジュバントおよびその使用は当該技術分野で周知である。アジュバントの例には、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム）等の無機アジュバント、スクアレン、油を含むアジュバント、および膜結合型血球凝集素およびインフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを含有するビロソーム等の有機アジュバントが含まれる。アジュバント効果を達成する種々の方法も既知である。一般的な原理および方法は、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５、Ｄｕｎｃａｎ  Ｅ．Ｓ．Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ、ＩＳＢＮ  ０−４７１−９５１７０−６、および「Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇら、（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５２８３−９に詳述されており、双方とも参照して本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【００４３】
ワクチンは従来法で対象に投与することができる。好ましくは、それらは注射により非経口的に、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）もしくは筋肉内、または本発明に適した任意の他の経路により投与される。他の投与方法に適した別の製剤には、坐剤および場合によっては、経口剤、頬側剤、舌下剤、腹腔内剤、膣内剤、硬膜外剤、脊髄剤、および頭蓋内剤が含まれる。
【００４４】
理解される通り本発明の組成物は、剤型に適合した方法で投与すべきであり、並びに予防的にまたは治療的に有効および免疫原性である量で投与すべきである。投与すべき分量は、例えば、免疫応答を開始するための個体の免疫系の能力、並びに望ましい保護程度を含んで、治療すべき対象に依存する。適切な服用量の範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、約５００μｇ／ｋｇ体重から約１０００μｇ／ｋｇ体重の範囲である。例えば、服用量の範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７５ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重または約２ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約７．５ｍｇ／ｋｇ体重、または約５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。初期投与および追加免疫のための好適な投与スケジュールも意図し、それは後の接種又は他の投与を伴う初期投与によって典型的に表される。
【００４５】
本発明のいくかの実施態様は、対象において抗ニコチン免疫応答を誘導する方法を提供する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物、すなわち動物モデルのマウスもしくはラットであることができる。抗ニコチン免疫応答とは、具体的には対象の免疫系によって媒介される治療的または予防的なニコチン封鎖効果の誘導をいう。当該免疫応答は、対象におけるニコチンまたはニコチン誘導体の排除又は免疫制御を適切に促進する。いくつかの実施態様において、抗ニコチン免疫応答は抗体応答である。抗体応答は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ抗体の適切な産生であってよい。抗ニコチン免疫応答は、当該技術分野で既知の方法、例えば、抗ニコチン抗体用ＥＬＩＳＡによって適切に評価される。本発明に従った対象における抗ニコチン免疫応答の誘導は、上記の免疫抱合体組成物を対象に投与することによって達成してもよい。
【００４６】
いくつかの実施態様において本発明の方法は、対象における免疫系全体に対する効果を提供する抗ニコチン免疫応答を誘導することに向けられている。当該免疫系全体に対する効果には、制限されるものではないが、例えば喫煙欲求、易刺激性、不安、情動不安、抑うつ気分、嗜眠状態、集中力欠如、不眠、身体病訴、食欲亢進および体重増加を含む、ニコチン禁断症状の減少が含まれ得る。
Ｖ．ニコチンハプテン特異抗体
【００４７】
本発明はまた、本発明のハプテンと免疫反応する抗体も提供する。いくつかの実施態様において本発明の抗体は、ニコチンとも交差反応する。特別な実施態様において当該抗体は、Ｒ−（＋）ニコチンとではなくＳ−（−）ニコチンと交差反応する。抗体は免疫グロブリンのサブタイプであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭのいずれであってもよい。抗体は当該技術分野で既知の任意の方法によって産生され、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ファージディスプレイ抗体および／またはヒト組換抗体であり得る。組換抗体は、例えばニコチンハプテンまたはニコチン等の抗原に対するその親和性または結合活性を改良するために操作又は変異することができる。当該操作方法は、当該技術分野で周知である。
【００４８】
いくつかの実施態様において、ヒト抗体またはヒト化抗体を受動免疫プロトコルにおいて使用してもよい。数種の技法によってマウスモノクローナル抗体をヒト化する方法を使用することができ、当該技術分野で周知である。さらにコンビナトリアルライブラリーから望みの特異性を有する抗体を選択する方法論がヒトモノクローナル抗体を直接利用可能とする。必要に応じて、タンパク質工学を用いて、対象者の受動免疫等の臨床応用のためのヒトＩｇＧ構築物を調製してもよい。受動免疫において、短期の免疫化が対象への抗体の移入によって達成される。抗体は任意の適した経路、例えば静脈内（ＩＶ）または筋肉内（ＩＭ）経路によって投与することのできる生理学的に許容可能なベヒクルで投与することができる。本明細書に記載する本発明の任意の抗体、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は適切に使用することができる。
【００４９】
抗ニコチン抗体の受動投与は、血清レベルを減少し「毒性」（心血管性、代謝性、内分泌性）効果を減弱するために有益であることが判明するであろう。受動投与はまた、禁煙プログラムの間に薬物療法で毎週又は隔週使用することもできる。薬物療法では、抗体の高循環濃度を維持するためにｍＡｂの自己注射を含むことができる。意義深いことに、ユーザーにとってより快適な方法においては、エアロゾル化した免疫グロブリンの使用によって呼吸器におけるニコチンに対する受動粘膜保護を確立することが可能である（例えば、Ｃｒｏｗｅ  ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１３８６−１３９０、１９９４を参照）。大多数のユーザーは喫煙によってニコチンを摂取しているので、本法はとりわけニコチン依存の問題に適用できるであろう。
【００５０】
いくつかの実施態様において能動免疫（免疫抱合体ワクチン）および受動免疫（抗体）は、対象において併用して使用してもよい。免疫抱合体ワクチンまたは抗体のいずれかの有効な用量は、単独で投与されたときのいずれかの有効な用量であり得る。いくつかの実施態様において、他方との併用における一方の有効な用量は、当該一方を単独で使用した場合に治療的に有効である量より少ないかもしれない。
【００５１】
本発明のいくつかの実施態様は、対象におけるニコチンの禁断症状を減少する方法を提供する。ニコチンの禁断症状の減少には、限定されるものではないが、対象における喫煙欲求、易刺激性、不安、情動不安、抑うつ気分、嗜眠状態、集中力欠如、不眠、身体病訴、食欲亢進または体重増加に対する減少が含まれ得る。禁断症状の減少方法は、受動免疫または禁煙で使用される他の補助治療と併用して上記の免疫抱合体組成物を対象に投与することによって達成してもよい。
【００５２】
当業者に周知である通り、いかなる場合であっても投与される免疫抱合体または抗体の具体的な服用量が、対象の容態および免疫抱合体もしくは抗体の活性または対象の応答を変更する他の関連性のある医学的な要因に従って調節されることは、理解されることであろう。例えば個々の患者に対する具体的な服用量は、年齢、体重、健康状態、食事、投与時期および投与方法、排泄の割合および併用して使用する薬剤に依存する。所定の対象に対する服用量は、従来の検討を行って、例えば適当な従来法の薬学的プロトコルによって決定することができる。
【００５３】
本発明のいかなる方法または組成物に関するいかなる実施態様も、本発明のいかなる他の方法又は組成物とともに使用され得ることを明確に意図している。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する通り単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段のはっきりした指示がない限り複数の指示対象を含む。従って例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含有する組成物への言及には、２以上の抗体の混合物が含まれる。なお用語「又は」は、一般的にその内容について別段のはっきりした指示がない限り、意味において「及び／又は」を含むことにも注意すべきである。また本明細書で列挙されたいかなる数値にも、より小さな値からより大きな値までの全ての値が含まれること、すなわち列挙された最小値と最大値の間の全ての可能な数値の組み合せが本出願で明確に主張されると考えなければならいことも明確に理解されるであろう。例えば範囲が１％から５０％と記載された場合、２％から４０％、１０％から３０％または１％から３％等々の値を本明細書において明確に列挙することを意図している。
［実施例］
【００５４】
下記の実施例は本発明をさらに説明するために提供するものでありその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５５】
実験材料、化合物合成およびプロトコル
実験材料。特に記述しない限りは、全ての反応は乾燥した試薬、溶媒および火炎乾燥したガラス器具を用い不活性雰囲気下で実施した。（−）−ニコチンおよび（−）−コチニンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。トランス−３’−ヒドロキシメチルニコチンはＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅａｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ、ＯＮ）から購入した。全て他の化学薬品は主要なサプライヤーから購入し、さらに精製せずに使用した。化合物は逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｇｒａｃｅ、Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ  Ｃ１８  １０〜１５μｍ）によって精製した。全ての化合物はＢｒｕｋｅｒ  ５００  ＭＨｚ  ＮＭＲ装置およびＡｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）質量分析計を使用してキャラクタリゼーションを行った。
【００５６】
ニコチンハプテン。ラセミ体ＮＩＣニコチンハプテン（スキーム１）を、既に報告されている通り適当なリンカーとノルニコチンの反応によって調製した。ＡＭ１ニコチンハプテンをスキーム２に従って合成した。ＮａＨ（８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を含有する冷却し撹拌する乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、市販のトランス３’−ヒドロキシメチルニコチン（２０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、６−（メチルスルホニルオキシ）ヘキサン酸エチルを水なしで添加し、混合液を室温で１０時間撹拌した。次に混合液を０℃に冷却し、１Ｍ  ＨＣＬの添加により反応を停止した。水層をジエチルエーテルで２回抽出し、ＨＰＬＣによる精製［Ａ（水相）＝０．１％ＴＦＡ  Ｈ２Ｏ、Ｂ（有機相）＝０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル；λ＝２５４ｎｍ；溶媒グラジエントは１５分間で１％Ｂから１５％Ｂ、２５分間で１５％Ｂから９５％Ｂ］の前に引き続きろ過した。興味のある２ピークを得た。１の主ピークは最終産物ＡＭ１−ＣＯＯＨに相当し、一方２番目のより小さいピークは保護エステルに相当した。減圧下でアセトニトリルを除去した後、純粋な画分を凍結乾燥し、淡黄色の油としてＡＭ１−ＣＯＯＨを得た（１７．４２ｍｇ、収率５４．７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ  ９．１８（ｓ、１Ｈ）、８．９４（ｄ、Ｊ＝５．５、１Ｈ）、８．８３（ｄ、Ｊ＝７．３、１Ｈ）、８．１１（ｍ、１Ｈ），４．６１（ｄ、Ｊ＝９．７、１Ｈ）、３．９６（ｄ、Ｊ＝１８．４、１Ｈ）、３．５３（ｍ、２Ｈ）、３．４２（ｍ、１Ｈ）、３．３５（ｍ、３Ｈ）、３．０７（ｓ、１Ｈ）、２．８５（ｓ、２Ｈ）、２．４７（ｍ、１Ｈ）、２．２７（ｄｔ、Ｊ＝１５．８、７．３、２Ｈ）、２．１３（ｍ、１Ｈ）、１．５２（ｄｄ、Ｊ＝１５．３、７．６、２Ｈ）、１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．１９（ｄｄ、Ｊ＝１４．７、７．１、２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ  １７７．７７、１４７．４３、１４６．３３、１３６．８４、１３４．３７、１２８．９２、１０１．３５、７２．４２、７１．６８、５７．２２、３９．６０、３５．１１、３４．９８、３０．５８、２７．１２、２６．３９、２６．０９。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：計算値Ｃ１７Ｈ２６Ｎ２Ｏ３＝３０７．１９；実測値３０７．２。
【００５７】
ハプテン−タンパク質免疫抱合体。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートの被覆のみを目的として、ラセミ体ＮＩＣをＢＳＡに抱合した。ＡＭ１ハプテンに対しては、免疫性を与えるためにＫＬＨ、ＴＴおよびＣＲＭ抱合体を調製した。ＤＭＦ中で標準的なＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ（各々１．３当量）カップリングプロシージャ―を使用して、ＡＭ１を室温で６時間活性化した。減圧下でＤＭＦを除去した後、残渣をｐＨ＝７．２の０．１Ｍ  ＭＯＰＳ生理食塩水に溶解し、相当する量のタンパク質（１ｍｇハプテン：１ｍｇタンパク質）を添加し４℃で１２時間放置した。発明者らはＭＯＰＳ緩衝液がＰＢＳよりもタンパク質のアンフォールディングを防止することを見出した。直接分析することができないＫＬＨを除いて、カップリング効率はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用してモニターした。リジン残基数が直接カップリングに影響を与えるので、大体においてＴＴがその高分子量に即して多数のハプテンコピーを産出した。
【００５８】
マウス研究用の能動免疫プロトコル。ｎ＝４の１２９ＧＩＸマウス群（６〜８週令、２３〜２８ｇ）を０、７および１３３日目に、ＡＳ−０３アジュバント（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（登録商標））と製剤したＡＭ１−ＴＴ、ＡＭ１−ＫＬＨまたはＡＭ１−ＣＲＭ（０．１ｍｇ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の懸濁液により腹腔内投与により免疫した。７、１４および１４０日目に後眼窩穿刺によって血清（０．１ｍＬ）を採取し、ＥＬＩＳＡによって力価を測定した。採取した全ての生体試料は、完全性を維持するために使用まで−８０℃に保存した。
【００５９】
自己投与のためのラットのワクチン接種。マウス実験における成績に基づいて、ＡＭ１−ＴＴをラットの行動試験に進めた。ウィスター系雄性ラット（ｎ＝５〜６、２５０〜３００ｇ）をＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）から購入し、ＡＭ１−ＴＴワクチン群かＴＴ単独対照群に割り当てた。ラットにＡＳ−０３アジュバントと製剤した免疫抱合体０．１ｍｇを３部位（皮下２；腹腔内１）で接種した。試験期間中に合計４回、０、１４、２８および５３日目に接種を実施した。２７、４１および７２日目にヘパリン処理したミクロ遠心チューブにおよそ０．０５ｍＬの血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって当日現在の免疫応答を測定した。
【００６０】
イムノアッセイ。ニコチン特異的ＩｇＧの産生を、被覆抗原としてＮＩＣ−ＢＳＡ抱合体を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。力価は、希釈が最大値の５０％となる吸光度の読みに相当する、対数希釈に対する吸光度のプロットから計算した。ＮＩＣ−ＢＳＡは、免疫化したハプテンについての力価測定の偏りを防止するための最上の抗原であった。発明者らは、力価測定およびニコチン結合定数の決定のためにＮＩＣ−ＢＳＡを使用することの適合性を以前証明した。ＮＩＣ−ＢＳＡおよびタンパク質単独の対照をＣＯＳＴＡＲ３６９０マイクロタイタープレートに加え３７℃で一晩乾燥させた。メタノール固定に引き続いて、非特異的結合を３７℃で０．５時間、５％脱脂粉乳添加のＰＢＳ溶液によりブロックした。次に、マウス血清を１％ＢＳＡ溶液でプレートにまたがって連続的に希釈し、湿室中３７℃で１〜２時間インキュベートした。その後プレートを脱イオン水で洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ抗体により３７℃で０．５時間処理した。再度洗浄サイクルを経たのち、プレートをＴＭＢ２−ｓｔｅｐ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により展開した。自己投与ラット血清の場合、得られた絶対的な力価はニコチンの同時投与により「マスクされる」と思われる。
【００６１】
ニコチンおよびコチニン、ニコチン主要代謝物に対する抗体親和性は、競合ＥＬＩＳＡ法によって測定した。プレートのインキュベーション前にマウス血清と共に望ましい競合物（ニコチンまたはコチニン）を同時に添加することを除いては、上記と同じプロシージャ―に従って行った。
【００６２】
さらに抗体親和性およびニコチン結合能力の正確な値を、水溶性相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって発明者らのラット行動試験サンプルに対し測定した。血清中の特的抗体の親和定数および濃度の双方の測定が可能であるので、修正マラー法（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９２：５８９−６０１、１９８３）を引き続いて行った。結合したおよび遊離のＬ−［Ｎ−メチル−３Ｈ］−ニコチントレーサー（比放射能＝８１．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））の容易な分離を可能とするために、ＲＩＡは９６ウェル平衡透析装置ＭＷＣＯ５０００Ｄａ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）中で実施した。手短に言えば、約２４０００ｄｅｃｙｓ／ｍｉｎの３Ｈ−ニコチントレーサーの４０％に結合する濃度まで、ラット血清をＲＩＡ緩衝液（ろ過滅菌ＢＳＡ２％添加一倍ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４））で希釈した。血清の一部５０μＬを放射標識したトレーサー１０μＬ（約２４０００ｄｅｃａｙｓ／ｍｉｎ）およびＲＩＡ緩衝液の種々の濃度の非標識（−）−ニコチン５０μＬと合併し、溶媒室にＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）１１０μＬを添加し、プレート回転板（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）上室温で少なくとも２２時間かけて、サンプルを平衡状態にした。各々のサンプル／溶媒室から一定分量の７０μＬをゆっくりと吸引し、５ｍＬのシンチレーション液（Ｅｃｏｌｉｔｅ、ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）に懸濁し、各サンプルの放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。これらのサンプルは、同時にラット血清サンプルの定量的ＥＬＩＳＡで使用するための標準曲線を作成するために使用した。
【００６３】
ニコチン自己投与。上記の通り、最も有望な免疫抱合体をラット行動モデルへと前進させた。ウィスター系雄性ラット（ｎ＝５〜６、２５０〜３００ｇ）をＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）から購入し、２個体の群で飼育し温調した環境下、１２時間：１２時間の照明サイクルに維持した。実験室に到着した際、動物は１週間の馴化期間中、食餌および水を自由に摂取させた。全ての動物飼育および動物実験はＮＩＨガイドラインに従い、並びに動物実験委員会によって承認されたプロトコルを順守して実施した。食事トレーニングおよびニコチンの自己投与は、防音箱に収納した標準的なＣｏｕｌｂｏｕｒｎのシングルレバーオペラントチャンバーで行った。ラットの各セットは、自己投与に先立つレバー押しを確立するために、５日間通して続く食事トレーニングセッションを受けた。初めのうちラットは、一日の食事を１５ｇ（自由摂取体重の約８５％）に制限された。食事制限の二日目後に、１秒のタイムアウト（ＴＯ−１ｓ）を有する固定比率１（ＦＲ１）の強化スケジュール（すなわちレバー押し当たり１食餌ペレット）下で食事を求めて応答するようにラットを訓練した。トレーニングセッションを一日に３０分間続け、一旦安定したベースラインが確立したならば、頸静脈カテーテル挿入手術に備えてラットを自由摂食に戻した。
【００６４】
手術を成功裡に完了するために、自己投与セッションを開始する前にラットを３〜５日間回復させた。回復期間中、ラットは食事に自由にアクセスさせ、血液凝固および感染を防止するためにカテーテル系統を毎日フラッシュした。静脈内注入液（０．１ｍＬ）は、１秒以上の間隔で注入ポンプ（Ｒａｚｅｌ、ＣＴ）によってデリバーする。順調な回復に引き続き、ニコチン自己投与セッションに備えてラットを再び食事制限した。安定した応答が達成されるまで、ＦＲ１−ＴＯ−２０ｓスケジュール下、５日／週の１時間の自己投与の間、対象を０．０３ｍｇ／ｋｇ／注入の服用量でニコチンを静脈内に自己投与するように訓練した。安定した応答は、連続する３セッションにわたる２０％未満の変動性と定義した。ベースラインの確立に引き続いて既述の通り試験ワクチンを投与した。
【００６５】
ワクチン接種の間に、ＦＲ−１−ＴＯ−２０ｓかまたは累進比率（ＰＲ）強化スケジュールにより３〜４日／週の１時間セッションでラットを試験した。ラットは、各セッションの開始前にカテーテルの開通性を保証するために生理食塩水でフラッシュし、各セッションの後に血液凝固および感染を防止するために再び生理食塩水およびチメンチンを受けた。カテーテルの開通性を失ったラットは、その後実験から除いた。データは、複数のオペラントチャンバーからオンラインで同時に収集した。オペラントプロシージャ―の結果は、ニコチンを求める平均バー押し積算回数として報告する。
【実施例２】
【００６６】
ニコチンハプテンＡＭ１および免疫抱合体の合成
ＡＭ１は図１に示す通り、３’−置換型の一般構造を伴う非拘束性のハプテンである。ＡＭ１は、ＬａｎｇｏｎｅおよびＰｅｎｔｅｌ（Ｌａｎｇｏｎｅ  ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５０２５−５０３０、１９７３；およびＨｉｅｄａ  ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：８０９−８１９、２０００）によって発表されたものに優る有利なハプテン設計を有している。Ｌａｎｇｏｎｅ設計中のフェノール性のエステル結合の存在は、結果的にキャリアタンパク質からの抗原の自発的な脱離となり、従って抗ニコチン免疫原性の損失となり、当該設計ではモノクローナル抗体の産生が不可能ではないものの、能動ワクチンの有効性に大きな影響を与え得るだろう。生理的条件下での自発的なエステル加水分解は既知の現象であり、エステル−アミド交換反応によるハプテン安定性の増強については、コカインの免疫薬理学的治療的な試みに対し以前成功裡に研究された（Ｃａｒｒｅｒａ  ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９８；１９８８−１９９２、２００１）。これによって、なぜＰｅｎｔｅｌがＬａｎｇｏｎｅの設計に前記修正をおこなったのかを説明することができた（Ｈｉｅｄａ  ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：８０９−８１９、２０００）。特異的なプロテアーゼが存在しなければアミド結合は加水分解に耐性であり、そのことが免疫化の間にハプテン部分（ｃａｒｇｏ）を失う可能性を顕著に最小化する。しかしながら、ペプチド結合はハプテンに安定性を与える一方で、またそれは標的構造に追加の免疫原性部分をも導入することとなる。
【００６７】
ニコチンハプテン合成の詳しいステップは上記の通りである。ＡＭ１の場合において発明者らは、ハプテン安定性を提供するだけでなく、免疫応答を望ましいニコチン標的に集中させる「マスクされた」付加部位をも可能とする、単純エーテル付加物によりアミド部分を置換した。実際上、エーテル結合は脂質構造に似ているために、卓越した非免疫原性特質および低い細胞毒性を有している。従ってそれは、免疫学的観点から不活性な（muted）リンカー付着部位を可能とする。
【００６８】
ハプテン設計の確認のために、発明者らは提案した構造の作製に着手した。ＡＭ１の最初の合成の試みは、市販の３’−ヒドロキシメチルニコチンをブロム化したリンカーと反応することから成ったが、ＡｇＯ２又はヨウ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）の添加による条件を至適化するための複数の試みにも拘わらず、反応は低収率に進行した。より求電子性のメシレート脱離基による臭素部分の置換により、最終的に収率５４％で望みの産物を得た（スキーム１）。
【００６９】
免疫化のための最適なキャリアベヒクルを解明する試みにおいて、ＡＭＩを三つの異なるキャリアタンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風オキソイド（ＴＴ）およびジフテリア毒素交差反応性変異株１９７（ＣＲＭ）と抱合した。各タンパク質は、強力な免疫応答を解明するためのその能力に基づいて選択した。カップリングは、２ステップのヘテロライゲーション法を使用して行った。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）によるハプテンの活性化とそれに続くキャリアタンパク質の付加は、リジン残基による活性化カルボン酸への攻撃を促進し、所望のハプテン−タンパク質抱合体を形成させた（スキーム１）。カップリング効率は、ＭＳを使用しては直接分析することのできないＫＬＨを除いては、ＭＡＬＤＩ質量分析法を使用してモニターした。各タンパク質上のリジン数が付着することのできるハプテンコピー数を直接決定することはあきらかであり、従ってＴＴがそのより高い分子量により、概してＣＲＭよりも多数のハプテン分子を産出した。
【実施例３】
【００７０】
ニコチンハプテンＡＭ１を含む免疫抱合体の免疫原性
本実施例は、ニコチンハプテン免疫抱合体およびマウスで産生した抗体の免疫原性について記載する。免疫化のための最適のキャリアベヒクルを解明する試みにおいて、ＡＭ１ハプテンを三つの異なるキャリアタンパク質、すなわちＫＬＨ，ＴＴおよびＣＲＭと抱合した。全てのＡＭ１ハプテン−タンパク質免疫抱合体の有効性は、標準的な免疫化プロトコルを使用し１２９ＧＩｘマウスへのワクチン接種によって評価した。具体的には、ハプテン抱合体１００μｇを望ましいアジュバントと混合し、直ちにマウスに注射した（腹腔内投与、ハプテン抱合体群当たりｎ＝４）。３試験群には、ＡＭ１−ＫＬＨ、ＡＭ１−ＴＴおよびＡＭ１−ＣＲＭがふくまれ、加えて三つのキャリア単独の対照群が含まれた。全ての場合においてワクチンは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＬｌｉｎｅ独自の乳液ベースのアジュバントであるＡＳ−０３を用いて調剤した。免疫スケジュールは以下の通りに定めた。注射は、ｔ＝０、ｔ＝１４日およびｔ＝１３３日に実施し瀉血は、各注射の１週間後すなわちｔ＝７日、ｔ＝２１日およびｔ＝１４０日に行った。全てのケースにおいて免疫抱合体は、マウスにおいて毒性又は標準からの偏差を示さなかった。採取した全ての生体試料は、その完全性を維持するために使用まで−８０℃で保存した。
【００７１】
所定のハプテンの免疫原性を直接測定するものであるため、抗体力価は、ワクチン候補の前臨床の評価にとって重要である。ワクチン接種の間に産生された抗体の大きさ（力価）並びに平均親和力（Ｋｄ）および特異性を評価するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングの間の力価測定結果の偏りを防止するために、非免疫性抗原すなわちＮＩＣ−ＢＳＡをマイクロタイタープレートの被覆に使用した。発明者らは、力価測定およびニコチン結合定数の測定のためにＮＩＣ−ＢＳＡ免疫抱合体を使用することの適合性を以前に証明している（Ｍｅｉｊｌｅｒ  ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２５：７１６４−７１６５、２００３）。本ハプテンは溶液中の遊離ニコチンに厳密に類似するという本明細書での発明者らの論拠は、その分子構造がピロリジンＮ−メチル基による結合を有する未変性のニコチン核の構造だからである。発明者らの以前の研究においては鏡像異性的に純粋なＮＩＣ−ＢＳＡを使用したが、しかし本ハプテンの産生が合成的に苛酷であり費用がかかるので、発明者らはノルニコチンおよび発明者らが以前報告したβ―アラニンリンカーから１段階で本ハプテンのラセミ体バージョンを調製した。ラセミ体のＮＩＣ−ＢＳＡがその鏡像異性的に純粋なカウンターパートと同等に有効であることが見出された（データ省略）。
【表１】
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【００７２】
ｔ＝７日に１回のみ注射した後に試験群から得られた瀉血は、有意な力価を示さなかったのでそれ以上の分析に不適当であるとみなした。対照のタンパク質単独群からの全ての瀉血について同様な結果が得られた。文献においては、最も成功したワクチンでさえ、十分な刺激のためには複数回の接種が必要であることがよく確立されている（Ｌｕ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：３４６−３５１、２００９）。抗原と免疫系との間の相互作用時間が増加するので、余分の注射による追加の誘発がより強い応答を与えることが期待される。従って二つの注射後に有意な応答が観察されたと同時に、約４か月「休止」後の３回目の注射の効果も評価した。得られた結果を表１に要約する。三つの試験群全てに関し力価の増強が観察されたと同時に、免疫原性における最も顕著な改善がＡＭ１−ＴＴに関し認められ、ここで力価の測定値は３回目の注射後に約１：１００、０００の力価レベルに達するまで、３倍以上に増加した。
【００７３】
抗体力価のデータがきわめて有望でありワクチン候補の総体的な免疫原性を明らかにすることができるとしても、有効性を予測するうえで同等に重要なパラメータは、その望ましい抗原、本ケースではニコチンに結合するポリクローナル抗体レスポンスの能力である。競合ＥＬＩＳＡによって測定される結合定数が本質的に平均した定数であり、従って他のより正確な方法、例えば放射性標識した薬剤による平衡透析（Ｍｅｉｊｌｅｒ  ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２５：７１６４−７１６５、２００３）により観測されるだろう定数よりも高いということに注意することが重要である。分析の簡便性より、発明者らは我々の目的のために分析の最初の手段として競合ＥＬＩＳＡを使用した。発明者らは、モノクローナル抗体に関し典型的に観察される１０μＭ対サブμＭないしｎＭオードの結合定数を示す生存可能な活性ワクチン候補を期待している。発明者らの分析にとって、ＮＩＣ−ＢＳＡに対する測定可能な力価は、これこそが発明者らが測定しようとする関連する競合であるので（すなわちＮＩＣ−ＢＳＡ対溶液中の遊離ニコチン）、ニコチン結合定数を測定するために存在しなければならない。既述の通り、最初の瀉血並びに対照群に対するいかなる競合データも入手できな。２回目の瀉血データはニコチンに対する幾分かの親和性を示すが、しかし３回目の注射まで容認できるレベルは達成されなかった。特にＴＴおよびＣＲＭ群において、ニコチンに対する親和性が二つのデータ地点の間で少なくとも１０倍増加するので、追加の接種から大きな利益を得るように思われる。重要なことに、Ｈｉｅｄａら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：８０９−８１９、２０００によって類似するハプテンに関し報告されたことと一致して、ニコチンの主要代謝物であるコチニンに対する結合定数が無視できるままであったように、これは特異性を失うことなく達成された。
【実施例４】
【００７４】
ニコチンハプテンＡＭ１を含む免疫抱合体の行動的影響
本実施例は、ニコチンを静脈内に自己投与する訓練を受けたラットにＡＭ１を含む免疫抱合体の免疫化によって誘導される行動変化の評価を記載する。マウス実験の成績に基づいて、ＡＭ１−ＴＴハプテン−タンパク質抱合体を当該行動的研究に進めた。ラットは、その神経化学的な経路、特に脳の辺縁系および動機づけの部分が定性的にヒトのそれに相当する、特徴のはっきりした中枢神経系を有する。その行動的範囲は十分に特徴づけられており、長期投与の間に特徴的な依存症候群を示す。
【００７５】
ラットを１時間のセッションの間に０．０３ｍｇ／ｋｇ／注入の服用量でニコチンを静脈内に自己投与するように訓練した。自己投与実験の目的は、ラットへのワクチン接種によって誘導される行動変化を評価することであった。この服用量は、時間当たり０．０３ｍｇ／ｋｇがおよそヒトにおける２本の紙巻きタバコのニコチン注入に等しいので（Ｈｉｅｄａら、２０００）、ヘビースモカーの摂取量を模倣するために使用した。試験には２群、ＴＴ−タンパク質単独の対照群（ｎ＝６）およびＡＭ１−ＴＴ群（ｎ＝５）を含んだ。ｎ＝５〜６のセルサイズは薬物効果の信頼できる推定値を提供するのに十分であると考えた。ウィスター系雄性ラット（２５０〜３００ｇ）を２グループに分けて飼育し、１２時間：１２時間の照明サイクルの温度調節環境下に維持した。実験室に到着すると動物は、１週間の馴化期間のあいだ食事及び水に自由にアクセスさせた。本研究において使用する動物は、実験動物の実験と飼育に関する現行のＮＩＨガイドライン、および適用できる全ての地方、州および連邦政府の規則およびガイドラインに従って取扱い、飼育しおよび屠殺した。
【００７６】
食事トレーニングおよびニコチン自己投与は防音箱に収納した標準的なＣｏｕｌｂｏｕｒｎのオペラントチャンバーで行った。オペラントチャンバーは、チャンバーの後壁上に、床上２ｃｍに据え付けられたシングルレバーおよびレバー上２ｃｍに据え付けられたきっかけ表示灯を備え付けている。食事トレーニングのために、フードホッパーをレバーの左、後壁の中央に設置した。ラットは実験試験前の数日間、ハンドリングストレスに対し脱感作するために、毎日操作した。ラットの各セットは、薬剤自己投与に先立つレバー押しを確立するために、その後５日間通して続く食事トレーニングセッションを受けた。初めのうちラットを一日当たり１５グラムの食事（自由摂取体重の約８５％と同等）に制限した。食事制限の二日目後に、１秒間のタイムアウトを（ＴＯ−１ｓ）を有する固定比率１（ＦＲ１）の強化スケジュール（すなわちレバー押し当たり１食餌ペレット）下で食事を求めて応答するようにラットを訓練した。トレーニングセッションを一日に３０分間続け、一旦ラットがＦＲ１−ＴＯ−２０ｓスケジュールに応答する安定したベースラインを獲得したならば、頸静脈カテーテル挿入手術に備えてラットを自由摂食に戻した。
【００７７】
手術を成功裡に完了するために、自己投与セッションを開始する前にラットを３〜５日間回復させた。回復期間中、ラットは食事に自由にアクセスさせ、血液凝固および感染を防止するためにカテーテル系統を毎日フラッシュした。静脈内注入液を、輸液ポンプ（Ｒａｚｅｌ，ＣＴ）によって１秒以上の間隔で容量０．１ｍＬをデリバーする。順調な回復に引き続き、ラットを自由摂取体重の８５％に再び食事制限した。いったん自己投与セッションを始めると、安定した応答が達成されるまで、ＦＲ１−ＴＯ−２０ｓ強化スケジュール下、５日／週の１時間の自己投与セッションの間、対象を０．０３ｍｇ／ｋｇ／注入の服用量でニコチンを静脈内に自己投与するように訓練した。安定した応答は、連続する３セッションにわたる２０％未満の変動性と定義した。安定した応答が達成された後、標準的な免疫化プロシージャ―に従って試験ワクチンを投与した。すなわち、免疫抱合体１００μｇをＡＳ−０３アジュバントを含む乳化液と混合し、３部位に投与した（皮下投与２および腹腔内投与１）。ＡＭ１−ＴＴ免疫抱合体を上記の通り産生し、２１から２２のハプテンコピーを備えた良好なカップリング効率を見出した。合計４注射を以下の通り投与した。ｔ＝０、ｔ＝１４日、ｔ＝２８日およびｔ＝５３日。ラットを、各注射のおよそ２週間後、ｔ＝２７日、ｔ＝４１日およびｔ＝７２日に、ヘパリン処理したミクロ遠心チューブに瀉血させた。
【００７８】
自己投与の過程の間に採取した血清は、ＮＩＣ−ＢＳＡ被覆マイクロタイタープレート上でニコチン特異的抗体の存否を試験した。重要なことであり予期されたことであるが、ＴＴ単独免疫化の対照由来の全てのサンプルはＮＩＣ−ＢＳＡに関する力価を示さなかった。ＡＭ１−ＴＴワクチン接種群から採取したサンプルでは、各追加免疫後に時間とともに安定した力価の増加を示し、達成された最大平均レベルは最後の瀉血による１：３０、０００であった（図２）。最後の瀉血の時点で、ニコチンに対するＫｄは、水溶性ＲＩＡによる計算で５．６８±０．８０ｎＭであった。これらのデータから計算されたニコチン結合能力は、５．３６±１．２０ｘ１０−７Ｍであったが、これはニコチン特異的ＩｇＧの４０．２６±８．９７μｇ／ｍＬと同等である。ＩｇＧは、１５０ｋＤａの分子量および分子当たり２個のニコチン結合部位を有すると想定された。このニコチン特異的なＩｇＧの血清中の濃度は、血清中のニコチン結合能力８７．１０±１９．４０ｎｇ／ｍＬに相当する。
【００７９】
重要なことには、３回目の瀉血の時点で発明者らは、力価の激しい変化を見出していない。例えば、Ｈｉｅｄａら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：８０９−８１９、２０００で報告された１０倍と対照的に、高レスポンダーおよび低レスポンダー間の差異は４倍であった（最小力価の値１：１２、８００；最大力価の値１：５１、２００）。力価の中央値は１：２５、６００であった。優位差を両側ステューデントｔ−検定を使用して決定した。これらのデータは発明者らの有利なハプテン設計に関する仮説を支持している。
【００８０】
測定された結合定数は、マウスにおいて観察されたよりもやや高いニコチンに対する中位の親和性を示した。３回目の瀉血に対する平均ニコチン結合定数は、６６．０４±３４．１９μＭであった（対してマウス中では約１５μＭ）。にもかかわらず、解明された抗体はニコチンに対する良好な特異性を保持し、ニコチンの主要な代謝物であるコチニンには結合することができなかった。
【００８１】
発明者らは次に、ラットにおけるニコチン自己投与の行動的影響を試験した。ワクチン接種の間に、ＦＲ−１−ＴＯ−２０ｓかまたは累進比率（ＰＲ）強化スケジュールにより３〜４日／週の１時間セッションでラットを試験した。ラットは、各セッションの開始前にカテーテルの開通性を保証するために生理食塩水でフラッシュし、各セッションの後にカテーテルの中の血液凝固および感染を防止するために再び生理食塩水およびチメンチンを受けた。もはや開通性のないカテーテルを有するラットは、その後実験から除いた。データは、複数のオペラントチャンバーからオンラインで同時に収集した。オペラントプロシージャ―の結果は、ニコチンを求める平均バー押し積算回数として報告する。ＴＴ免疫化ラットは低ないし無ＮＣＩ−ＢＳＡ力価群を代表し、一方、ＡＭ１−ＴＴラットは中位ないし高力価対象に相当する。
【００８２】
高力価でないとき、ワクチン接種の保護効果が行動変化に反映されないことは十分に実証されている（Ｃａｒｒｅｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９７：６２０２−６２０６，２０００）。マウスで見出されたのと同程度高い力価または親和性を獲得し損なったにもかかわらず、ＡＭ１−ＴＴ免疫抱合体によるラット対象のワクチン接種は、群の間に観察される自己投与パターンが分離する結果となった（図３）。後期の自己投与セッションでは、ＡＭ１−ＴＴ免疫群は二コチンレバー押し回数に中位の穏やかな増加が見られた。力価の情報に基づいて発明者らは、二つの群の間の変化を予測し、この変化の優位差を計算するためには片側スチューデントｔ検定が適当であるとみなした。図３に示す結果は、観察された行動的影響が中程度に優位差のあることを表す（セッション２２〜２５の平均ｐ値＝０．０９）。発明者らは、この分離が追加抗原注射に伴うＮＩＣ−ＢＳＡ力価の安定した増加の結果であると考えている。また、より大規模なサンプルセットを使用しまたはより長期のワクチン接種スケジュールを使用するならば、この分離に対する高レベルの有意差（ｐ＜０．０５）を達成することができるであろう。
【００８３】
これらの結果のありそうな一つの解釈は、ラットがそのＳＡ行動を修正することによって応答し、より高い薬物摂取量によってこれらの保護効果を克服しようとしたというものである。ＡＭ１−ＴＴ免疫動物は、報酬効果に誘導されてニコチンを得るために効率的に「より勤勉に働く」ようになった。薬剤の競合的拮抗の間の逆Ｕ字型の機能シフトを明らかにしたコカイン自己投与実験の間に、同様の結果が得られている（Ｃａｒｒｅｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９７：６２０２−６２０６、２０００）。すなわち、コカインのより低い服用量は生理食塩水（非強化子）濃度までは同様に自己投与され、より高い服用量はより短い注射間隔によってさらに自己投与されるだろう。自己投与用のコカインの単位服用量が減少するときに動物がＦＲスケジュール下で応答率を増すことが通常観察されるが、このことは動物が注射当たりのコカイン単位量の減少を注入率の増加によって償うことを示唆する。それ故に、免疫化によるＦＲスケジュール下でのコカインを求める応答の増加は、ラットがＣＮＳへのコカインデリバリーの部分的な遮断を抗体の存在下にコカイン自己投与率を増加することによって償うことを示唆するのかもしれない。ヒトのニコチン中毒に言い換えると、免疫された対象は喫煙の費用が非常に増したことに気づくであろう（紙巻きタバコ箱の価格があたかも２倍になったかのように）。
【００８４】
最後に、本研究はハプテン−タンパク質抱合体の耐容性を誘発することを試みたわけではなかったが、発明者らは全ての動物が免疫化において生存し、どれも実験期間中の注射由来の副作用を引き起こさなかったことに気づいた。対象の総合的な健康を評価するために、全動物の体重を研究期間中モニターした。発明者らは、ＡＭ１−ＴＴ免疫動物が対照よりもやや低い体重であることを見出した。ｔ＝７２日に、ＡＭ１−ＴＴ免疫動物はＴＴ単独対照群の体重よりも平均１０％体重が少なかった（データ省略）。
【００８５】
上記の発明は理解を明瞭にする目的で説明および実施例を通して詳細に記載してきたが、特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に一定の変更および修正を成し得るということは、本発明の教示に照らして当業者にとって容易に明らかであろう。
【００８６】
本明細書で引用した、全ての刊行物、データベース、ジェンバンク配列、特許および特許出願は、各々が具体的および個別的に参照することにより援用されることを示すかのように、参照することにより本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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