(57)【要約】  本発明は、細胞基材及び／又は組織基材に結合した抗体と、特定の抗原で覆われた微粒子又はビーズ等の合成基材に結合した抗体とを同時に検出する疾病診断のための方法及びシステムに関するものであり、それによって、低い特異性（細胞又は組織）及び高い特異性（抗原）の両方において疾病に関連した抗体を同時に検出及び特性評価するための「ワンステップ」の方法を提供する。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の細胞基材に結合した抗体と１つ以上の合成基材に結合した抗体との同時検出を含む疾病診断方法であって、該方法は、
ａ）細胞基材と合成基材との混合物を提供するステップと、
ｂ）検出しようとする抗体を含むサンプルを、前記基材混合物と共にインキュベートするステップと、
ｃ）蛍光顕微鏡を使用して、前記細胞基材及び前記合成基材と、前記基材に結合した抗体とを検出及び／又は識別するステップと、
ｄ）好ましくは自動パターン認識判定システムを使用して、免疫蛍光画像データを評価するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞基材が、ＨＥｐ−２細胞、ヒト顆粒細胞、及び／又は、有機組織であり、好ましくは膵臓組織であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記合成基材が、精製された天然抗原及び／又は組み換え抗原でコーティングされた微粒子であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記合成基材の抗原コーティングが、疾病の存在に関連した抗体によって結合されることを特徴とする請求項の１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記基材を識別するために、前記基材の視覚的特性、蛍光的特性、及び／又は、物理的特性を使用することを特徴とする請求項の１〜４のいずれか１項に記載の方法。。
【請求項６】
前記合成基材を識別するために、蛍光色素分子濃度（例えば、ローダミン濃度）の蛍光特性、及び／又は、サイズの物理的特性が使用され、前記微粒子のサイズが好ましくは１μｍ〜１００μｍであることを特徴とする請求項の１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基材及び／又は前記結合した自己抗体を識別するために複数色蛍光顕微鏡検査法が使用され、前記基材及び／又は前記結合した抗体が異なる蛍光色、好ましくは、青、緑、及び赤を示すことを特徴とする請求項の１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞基材が、例えばＤＡＰＩ等の青色発色を有する蛍光染料で標識され、前記合成基材が、例えばローダミン又はＦＩＴＣ等の緑色発色を有する蛍光染料で標識され、及び／又は、特異的に結合した抗体が、例えば、Ｃｙ５及び／又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）等の赤色発色を有する蛍光染料で標識された抗ヒト免疫グロブリン特異的抗体によって検出されることを特徴とする請求項の１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記疾病が自己免疫性疾患又は伝染性疾患であり、好ましくは、前記疾病が全身性リューマチ病状、自己免疫性肝疾患、１型糖尿病、ライム病又は単純疱疹ウイルスであることを特徴とする請求項の１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
検出しようとする抗体が、抗核抗体（ＡＮＡ）又は抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）であることを特徴とする請求項の１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
抗核抗体（ＡＮＡ）の染色を分析するために、ＨＥｐ−２細胞を使用することを特徴とする請求項の１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
疾病診断において、表３、表４及び／又は表５に示されている抗核抗体（ＡＮＡ）の細胞染色パターン、対応する抗原、及び、関連疾患が使用されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の染色を分析するために、ヒト顆粒細胞を使用することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＮＣＡ細胞染色パターン、対応する抗原及び表１及び／又は表２において示されるような関連疾患が疾病診断の中で使用されることを特徴とする請求項の１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）が、ヒト顆粒細胞の核周囲染色（ｐＡＮＣＡ）又は斑点状細胞質染色（ｃＡＮＣＡ）を示すことを特徴とする請求項１３又は１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）タンパク若しくはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）タンパク又はそれらの抗原に対するものであることを特徴とする請求項の１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒト顆粒細胞の斑点状細胞質染色（ｃＡＮＣＡ）を示し、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）に結合し、それによってプロテイナーゼ３タンパク又はその抗原が前記合成基材表面に提供され、したがって、ヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）の診断が提供されることを特徴とする請求項の１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ヒト顆粒細胞の核周囲染色（ｐＡＮＣＡ）を示し、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に結合し、それによってミエロペルオキシダーゼ・タンパク又はその抗原が前記合成基材表面に提供され、したがって、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＳＶ）の診断が提供されることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、被検体から得た血液、血清、脳脊髄液、関節液又は唾液を含むことを特徴とする請求項の１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記判定システムが、装置及びオートフォーカス制御用モジュール、画像取得、画像分析及び／又はパターン認識アルゴリズムからなる専用設計されたソフトウェアによって制御されることを特徴とする請求項の１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
免疫蛍光画像データを評価するために、下記順序：
ｉ）陽性染色シグナル；
ｉｉ）好ましくは細胞基材又は合成基材中の染色パターンの分類による染色の位置特定；
ｉｉｉ）細胞パターンの判定、好ましくは、顆粒細胞に対する核周囲パターン及び／又は細胞質パターン；ＨＥｐ−２細胞に対する有糸核分裂細胞パターンの核、細胞質、及び／又は、染色体
に従って前記判定システムを使用することを特徴とする請求項の１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
染色パターンの細胞基質又は合成基質への分類、及び、細胞パターンの決定は、各パターンのルールの組を定義することによって、免疫蛍光画像の構造的特性とテクスチャ特性との組み合わせによって達成されることを特徴とする請求項の１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項の１〜２２のいずれか１項に記載の方法に従って、１つ以上の細胞基材に結合した抗体と、１つ以上の合成基材に結合した抗体とを同時に検出するためのシステムであって、該システムは、
ａ）カメラ、電動走査ステージ、及び、マルチチャンネル発光ダイオード（ＬＥＤ）を有する蛍光顕微鏡と、
ｂ）装置及びオートフォーカス制御用モジュール、自動化された画像取得、自動化された画像分析、及び、好ましくは青、緑、及び赤の三色チャネルを分析する自動化されたパターン認識アルゴリズムからなるソフトウェアを有する計算装置とを有することを特徴とするシステム。
【請求項２４】
請求項１−２１のいずれか１項に記載の方法に従って、１つ以上の細胞基材に結合した抗体と、１つ以上の合成基材に結合した抗体とを同時に検出するためのキットであって、該キットは、
ａ）抗原をコーティングした合成基材を混合した固定した細胞基材を有するスライドであって、前記細胞基材が好ましくはＨＥｐ−２細胞及び／又はヒト顆粒細胞であり、前記合成基材がその視覚的特性、蛍光的特性、及び／又は、物理的特性によって互いに識別されものであるスライドと、
ｂ）好ましくはＦＩＴＣ、Ｃｙ５及び／又はＡＰＣ等の蛍光標識と結合した免疫グロブリン特異的抗体を有する複合体と、
ｃ）選択的に、洗浄バッファ、カバーグラス、カバー媒体、蛍光標識された若しくは蛍光標識されていない非コーティング合成基材、又は、合成基材のためのさらなる蛍光標識とを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞基材及び／又は組織基材に結合した抗体と、特定の抗原で覆われた微粒子又はビーズ等の合成基材に結合した抗体とを同時に検出する疾病診断のための方法及びシステムに関するものであり、それによって、低い特異性（細胞又は組織）及び高い特異性（抗原）の両方において疾病に関連した抗体を同時に検出して特性評価するための「ワンステップ」の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
複数の抗原ソースとして異なる細胞組織及び組織基材を使用した間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）による抗体の検出が、ルーチン的診断において確立されてきた。ＨＥｐ−２細胞を使用した抗核抗体（ＡＮＡ）の検出等のような細胞ベースの免疫蛍光法試験が、業界標準として臨床検査薬及び研究において広く使用されている（Tan EM, Adv.Immunology 1982;33:167-240、Costes SVら, Radiat Res.2006;165(5):505-15, Sack U, et al., Ann N Y Acad Sci 2009;1 173:166-73, Conrad K, et al., Ann N Y Acad Sci 2009; 1 173:180-185)。間接免疫蛍光法に基づいたアプローチを用いて自己免疫疾患を分析する方法が当業界において知られている。ＷＯ９７／０６４４０は、患者の体液サンプル中における、微小管形成中心又はそこから延在する微小管に対する抗体の存在によって慢性関節リウマチを診断する方法を開示している。基材として使用される細胞株は、好ましくはＩＴ−１マクロファージ細胞株である。この細胞株は、患者のサンプル中に存在する自己抗体が結合する基材として使用されている。
【０００３】
規格化及び費用対効果において優れる蛍光パターンの自動的な測定及び判断の需要増加は、現在利用可能な最新のパターン認識ソフトウェア及び完全自動リーディング装置によって満たせるようになっている(Hou YN, et al., Radiat Res. 2009; 171 (3):360-7, Hiemann R, et al., Ann N Y Acad Sci 2007; 1 109:358-71 , Bocker W, et al., Radiat Res. 2006;165(1 ):1 13-24. Hiemann R, et al., Autoimmun Rev. 2009;9:17-22)。さらに、間接免疫蛍光法は、抗体力価を決定するための量的及び半量的アプローチにおいて、例えば、自己抗体の存在及び／又は量によって特徴付けられる疾患の診断に適用されてきた（ＷＯ２００９／０６２４７９Ａ２）。
【０００４】
しかしながら、分析法開発及び組み換え技術における進歩によって、個々の抗原ターゲットに対する自己抗体特異性の検出への道が開かれ、それによって、抗体検査の診断力が向上した。伝染性疾患及びリウマチ性疾患等の様々な病気においてみられる抗体の多様性の増大により、単一抗体検出の欠点を克服し、かつ、結果を報告するための費用及び時間を低減する革新的技術の必要性が生じた。従って、近年、１つのサンプルにおいていくつかの抗体特異性を同時に測定するという要求を満たすための多重プラットフォームが開発されている。蛍光ビーズをベースとした流動細胞計測法及びマイクロアレイシステムに基づいた多重分析は、患者サンプルの情報量がより多い分析及びより包括的な検査を支援する強力な手段であることがわかった(Avaniss-Aghajani Eら、Clin Vaccine Immunol. 2007;14:505-9、及び、Lai Gら、J Immunol Methods 2005;296:135-47)。同様に、コンピュータ支援されたパターン認識は、疾患関連抗原のパネルに結合する抗体を検出して特定の疾病診断と関連付けることができるように抗原配列を分析するために使用されてきた(Binder SR ら、Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology、Dec. 2005、1353-1357)。更に、リウマチ性疾患に特異的な抗体を検査するために、多色蛍光を使用して蛍光コーティングした固定マイクロビーズによる多重検出を使用することができる。パターン検出アルゴリズムを用いたこの多色蛍光分析は、抗核抗体のスクリーニングのための共通の土台技術を提供する(GroBmann Kら、Cytometry A、2011年2月、79(2):1 18-25)。
【０００５】
一例として、疾患特異的自己抗体（ＡＡＢ）は、全身性リューマチ症状及び自己免疫性肝臓疾患障害の血清学的現象である。特に、間接免疫蛍光法による自己抗体の検出は、全身性リウマチ性疾患の血清学的診断用のルーチン的研究において使用可能な最初の技術の１つであった。疾患特異的自己抗体を検出するための酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）及び多重化技術の発展にもかかわらず、間接免疫蛍光分析による抗核抗体のスクリーニングは、いまなお現行の多段階診断アプローチにおける標準的方法である。組み換えた抗原又は精製した抗原をビーズ上に提供することができる。次に、選択した抗原に特異的に結合する抗体について、酵素免疫測定法を使用してそれらのビーズを分析する。しかしながら、そのようなアプローチには、異なる抗原間において著しく異なる感度及び特異性のせいで、著しい不都合がある(Hayashi Nら、2001, Clinical Chemistry、47:9 1649-1659)。細胞ベースの自己抗体診断法との妥当な相関を示す多重ビーズをベースとした蛍光分析が公表されている(Smith J, et al, 2005, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1050: 286-294)。ただし、その分析において間接免疫蛍光法のポジティブコントロールのサンプルを識別する感度が低いことは、ＩＩＦアプローチがいまなお好ましい方法であることを示している(Nifli AP, et al, Journal of Immunological methods 31 1 (2006), 189-197)。
【０００６】
抗核抗体の間接免疫蛍光分析用にいくつかの基材が提案されているが、ＨＥｐ２細胞に対する臓器非特異的な自己抗体のスクリーニングは、最も確立された方法である。一般に、抗核抗体の評価は、例えば、精製された天然抗原又は組み換え抗原を使用した免疫測定法による抽出核抗原（ＥＮＡ）及び細胞質抗原に対する特定の自己抗体の検出後に行われる。この二段階のアプローチは下記のメリットがある。
（ｉ）最も頻度の高い臨床的に意義のある臓器非特異的自己抗体の非常に感度が良いスクリーニング
（ｉｉ）検出された間接免疫蛍光法パターン及び発症が疑われるとの診断に基づいた自己抗体反応性の下流における識別鑑定のための他の分析技術（例えば、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ及びＳＳ−Ｂ／Ｌａ）との最適な組み合わせ
（ｉｉｉ）さらなる試験（例えば、抗動原体自己抗体）を必要としない臨床的に意義のある自己抗体の評価
（ｉｖ）自己抗原のターゲットが未知である場合又は商業的に利用できる分析がない場合に間接免疫蛍光法だけで検出できる自己抗体の評価
【０００７】
他の例は、全身性血管炎を鑑別診断するための抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の検出である(Bosch Xら、Lancet 2006;368:404-18)。これらの全身性自己免疫疾患におけるＡＮＣＡの発生により、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＳＶ）という用語がこれらの臨床的概念として造語された。ＡＮＣＡは間接免疫蛍光法によって発見されたが、間接免疫蛍光法は、いまなおこれらの抗体反応性を検出するための推奨される方法である。ＡＮＣＡは、一般に、間接免疫蛍光法において、固定された顆粒細胞の２つの異なる染色パターン：斑点状の細胞質パターン（ｃＡＮＣＡ）及び核周囲パターン（ｐＡＮＣＡ）を示す。ヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）の患者において頻繁にみられるｃＡＮＣＡは、他のターゲットに加えて、主としてプロテイナーゼ３（ＰＲ３）をターゲットとする。一方で、主として顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）において生じるｐＡＮＣＡは、他のターゲットに加えて、主としてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）をターゲットにする(Van der Woude FJら、Lancet 1985;1 :425-9; Csernok E, et al., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Apr;2(4): 174-5)。
【０００８】
抗体濃度の評価は、これらの臨床的概念の診断及び処置において有用であることが提案されてきた。抗体価は、一般に、疾病の重症度に関係している(Cohen Tervaert JWら、Arch Intern Med 1989;149: 2461-5)。しかしながら、間接免疫蛍光法において、非ＡＡＳＶ患者においてみられる上記ＡＮＣＡに対する他のターゲット抗原が存在している(Savige Jら、Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. 19: 263-76、Savige Jら、Am J Clin Path 2003;120:312-8)。従って、近年確立された合意ガイドラインに従って、抗核抗体を検出するための間接免疫蛍光法に加えて、ＥＬＩＳＡ等の他の異なる技術が推奨される。
【０００９】
しかしながら、上述した二段又は多段のアプローチによっていくつかの抗体を決定するために使用される技術は、別々に名前が付けられた複数の構成試験を含んでいる。費用対効率に優れる血清学的診断法の点において、細胞及び組織の抗原性ターゲットに対する抗体の検出、及び、他方ではそれらの精製されたタンパク及び特性を明らかにしたタンパクに対する抗体の検出を、１つの名称を有する単一の方法に合体させるというはっきりとした需要がある。
【００１０】
マイクロアレイ技術による現代のタンパク特性評価は、それ単独では満足な解決方法を提供しない。一度のマイクロアレイにおいて試験する抗原性ターゲットの数が増えるにつれて、関連する生産設備、小型化、特殊材料及び取り扱いの必要性が、そのようなマイクロアレイの生産をますます複雑にしかつ過剰に費用がかかるものとなる。酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、発色分析(chromogenic assay)、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を含む他の技術は、同時に評価することができる抗原形態の分析物の数が制限されるというデメリットを有する。また、これらの技術は、時間がかかり、高価な設備を必要とする。対照的に、抗核抗原を検出するためにＨＥｐ−２細胞基材を使用することは、抗体識別のための１２００個を超える抗原性ターゲットを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記先行技術を鑑みて、本発明の基礎となる技術的問題は、多段階の診断をワンステップにする疾病診断用の方法を提供することである。この問題は、本願の独立請求項に記載の特徴によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項によって提供される。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、細胞基材及び／又は組織基材に結合した抗体を検出し、それと同時に、特定の精製された天然の抗原及び／又は特定の組み換え抗原で覆われた微粒子等の合成基材に結合した抗体を検出する疾病診断のための方法及びシステムを提供し、それによって、低い（細胞特異的又は組織特異的）特異性及び高い（抗原特異性）特異性の両方で疾病に関連する抗体を同時に検出するための「ワンステップ」方法を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の方法を実行するための装置及びキットに関する。上記方法は、任意の数の特定の抗原に対する反応性について複数の患者の血清を試験することができるスクリーニング法にも適している。
【００１４】
したがって、本発明は、１つ以上の細胞基材に結合した抗体及び１つ以上の合成基材に結合した抗体の同時検出を含む疾病診断のための方法であって、ａ）細胞基材と合成基材との混合物を提供するステップと、ｂ）検出される抗体を含むサンプルと共に前記基材混合物を培養するステップと、ｃ）蛍光顕微鏡を使用して、前記細胞基材及び合成基材と、これらの基材に結合した抗体とを検出及び／又は識別するステップと、ｄ）好ましくは自動パターン認識解釈システムを使用して、免疫蛍光法のイメージデータを評価するステップとを含む方法を提供することを目的とする。
【００１５】
上記細胞基材は、哺乳動物細胞等の抗原結合のための生物学的基材であって、異なる組織種の組み合わせ又は細胞の組み合わせを適用することができるものを表す。上記組織基材は、有機組織から得られる類似種の複数の細胞から構成されるものであり、本発明の方法において「細胞基材」として使用することもできる。
【００１６】
上記方法の好ましい一実施形態において、上記細胞基材又は上記組織基材は、ＨＥｐ−２細胞、ヒト顆粒細胞、及び／又は、有機組織（好ましくは膵臓組織）であってもよい。
【００１７】
好ましい一実施形態において、上記合成基材は、精製された天然抗原及び／又は組み換えられた抗原で覆われた微粒子又はビーズである。抗原は、タンパク、ペプチド、ＤＮＡ等の核酸、動原体等の複数分子細胞構造、タンパク複合体、若しくは、タンパク膜構造、又は、抗体が結合し得る実質的にすべての他の細胞成分であってもよい。上記合成基材は、特定の精製された抗原若しくは特定の組み換えた抗原のためのキャリア、又は、それらの特定の抗原の混合物のためのキャリアとして作用するように意図されている。本発明の方法に適した様々な物質及び材料からなる微粒子及びビーズのキャリアは、当業界において知られており、例えば、天然若しくは人工のポリマー、セファロース、セルロース、ガラス、又は、金属酸化物からなる微粒子、粒子又はビーズである。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態において、上記疾病診断の方法は、合成基材の抗原コーティングに対して、疾病の存在に関連した抗体が結合することを特徴とする。合成基材を覆う抗原は、既知の疾病とのその関連性によって選択される。したがって、特定の抗原に結合する抗体の識別は、細胞基材及び／又は組織基材に結合した抗体の「低い特異性」の検出に加えて、「高い特異性」を有する疾病の診断を可能にする。
【００１９】
本発明の基材は、１つ以上の特有な特徴又はパラメータによって検出及び／又は識別されるように意図されている。一実施形態において、本発明の方法は、前記基材を検出及び／又は識別するために、基材の視覚的特性、蛍光的特性、又は、物理的特性を使用することを特徴とする。例えば、顕微鏡分析において、それらの基材の大きさ、形状、蛍光的特性又は他のパラメータによって、各種基材を識別することができる。これらの各種パラメータは、各種基材のために組み合わされてもよく、それによって、基材、抗原及び／又は抗体を識別するための一種のコードを表す。
【００２０】
本発明の一実施形態において、上記方法は、合成基材を識別するために、蛍光色素分子濃度（例えば、ローダミン濃度）の蛍光特性及び／又は、大きさの物理的特性を使用することを特徴とする。ビーズ又は微粒子の大きさは、好ましくは１〜１００μｍであり、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、９５μｍ若しくは１００μｍであるか、又は、任意の同様の値である。異なるサイズの複数のビーズ又は微粒子を組み合わせることができ、それによって、ビーズの各サイズは異なる抗原でコーティングされる。その結果、複数の抗原に対して、細胞基材を用いて同時にアレイ様のアプローチを適用することができる。
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態において、前記基材及び／又は結合した自己抗体を識別するために、複数色の蛍光顕微鏡検査法が使用され、それによって、基材及び／又は結合した抗体が、好ましくは青、緑及び赤等の異なる蛍光色を示す。
【００２２】
本発明の一実施形態において、上記細胞基材が青色発光（例えば、ＤＡＰＩ）を有する蛍光染料で標識され、上記合成基材が緑色発光（例えばローダミン、ＦＩＴＣ）を有する蛍光染料で標識され、及び／又は、特異的に結合した抗体が、例えば、Ｃｙ５及び／又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）等の赤色発光を有する蛍光染料で標識された抗ヒト免疫グロブリン特異的抗体によって検出される。
【００２３】
本発明の方法は、特に、抗体検出によって有効な診断が提供される疾患又は病気に関する。好ましい一実施形態において、上記方法は、前記疾患が自己免疫性又は感染性の疾患であり、好ましくは、前記疾患が全身性リューマチ症状、自己免疫性肝臓疾患、１型糖尿病、ライム病又は単純疱疹ウイルスであることを特徴とする。
【００２４】
自己免疫性疾患は診断するのが難しいが、細胞基材に対する自己抗体の結合パターンに加えて、自己抗体が結合する１つ以上の特定の抗原を識別することによって、以前に知られていたものより短時間でより正確な診断が可能になる。本発明は、アレイをベースとしたアプローチと細胞をベースとしたアプローチとを組み合わせた診断方法を可能にする。この方法は現在まで可能であるとは考えられていなかったものである。
【００２５】
本発明の一実施形態において、検出される抗体は、抗核抗体（ＡＮＡ）又は抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）である。
【００２６】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、抗核抗体（ＡＮＡ）の染色を分析するためにＨＥｐ−２細胞を使用することを特徴とする。
【００２７】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、疾病診断において、表３、表４及び／又は表５に示されている抗核抗体の細胞染色パターン、対応する抗原、及び、関連する疾患を使用することを特徴とする。
【００２８】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の染色を分析するためにヒト顆粒細胞を使用することを特徴とする。
【００２９】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、疾病診断において、表１及び／又は表２に示されているＡＮＣＡ細胞染色パターン、対応する抗原、及び、関連疾患を使用することを特徴とする。
【００３０】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）が、ヒト顆粒細胞の核周囲染色（ｐＡＮＣＡ）又は斑点状細胞質染色（ｃＡＮＣＡ）を示すことを特徴とする。
【００３１】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、抗体が、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）タンパク若しくはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）タンパク又はこれらの抗原をターゲットとすることを特徴とする。
【００３２】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、抗体がヒト顆粒細胞の斑点状細胞質染色（ｃＡＮＣＡ）を示し、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）に結合し、それによって、これらのタンパク又は抗原が合成基材上に提供され、したがって、ヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）の診断を提供することを特徴とする。
【００３３】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、抗体がヒト顆粒細胞の核周囲染色（ｐ−ＡＮＣＡ）を示し、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に結合し、それによって、そのタンパク又は抗原が合成基材上に提供され、したがって、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＳＶ）の診断を提供することを特徴とする。
【００３４】
本発明のさらなる一実施形態において、上記方法は、サンプルが、被検体から得られた血液、血清、脳脊髄液、関節液又は唾液を含み、それによって、上記被検体が本発明の方法を使用して診断しようとする疾病又は病気を有すると疑われる患者として判断されることを特徴とする。
【００３５】
本発明は、本発明の方法における用途のために専用に開発されたソフトウェア等の特別設計されたソフトウェアによって判定システムを制御する方法を包含する。専用に開発されたソフトウェアは、装置及びオートフォーカスの制御用モジュール、画像取得、画像分析、及び／又は、パターン認識アルゴリズムからなる。
【００３６】
一実施形態において、本発明の方法は、下記順序に従って免疫蛍光法イメージデータを評価するために、上記判定システムを使用することを特徴とする。
ｉ）ポジティブ染色シグナル
ｉｉ）染色の位置特定、好ましくは、細胞基材又は合成基材への染色パターンの分類
ｉｉｉ）細胞パターンの判定、好ましくは、顆粒細胞に対する核周囲パターン及び／又は細胞質パターン；ＨＥｐ−２細胞に対する有糸核分裂細胞パターンの核、細胞質、及び／又は、染色体
【００３７】
この順序は、得られる顕微鏡画像の素早く正確な分析を可能にする。したがって、免疫蛍光検査法のデータ中の複数のパラメータに基づいた診断が可能になる。
【００３８】
一実施形態において、本発明の方法は、染色パターンを細胞パターン又は合成パターンに分類するステップを含み、その該細胞パターンの分類は、各パターンの一組のルールを定義することによって、免疫蛍光画像の構造特性と表面模様特性との組み合わせによって決定されることを特徴とする。この分類は、本発明の方法における用途のために専用に開発されたソフトウェア等のような特別に設計されたソフトウェアによって実行することができる。
【００３９】
本発明のさらなる一態様は、１つ以上の細胞基材に結合した抗体及び１つ以上の合成基材に結合した抗体を上記方法によって同時に検出するためのシステムであって、ａ）カメラと、走査ステージと、多重チャンネル発光ダイオード（ＬＥＤ）とを有する蛍光顕微鏡、及び、ｂ）装置及びオートフォーカスの制御用モジュール、自動画像取得、自動画像分析、及び、自動化されたパターン認識アルゴリズムからなるソフトウェアを有し、それによって三色チャネル（好ましくは青、緑、及び赤）を分析する計算装置を含むシステムに関する。
【００４０】
本発明のシステムは、本発明の疾病診断の方法における用途のために特別に開発されたものである。そのようなシステムは、パソコン等のデータ処理コンピュータに連結した蛍光顕微鏡を有していてもよい。
【００４１】
さらに、本発明の一態様は、１つ以上の細胞基材に結合した抗体及び１つ以上の合成基材に結合した抗体を上記方法によって同時に検出又は識別するためのキットであって、該キットは、ａ）抗原をコーティングした合成基材と混合した細胞基材を固定したスライドであって、上記細胞基材は、好ましくはＨＥｐ−２細胞及び／又はヒト顆粒細胞であり、上記合成基材は、それらの視覚的特性、蛍光的特性、又は、物理的特性によって互いに識別されるスライドと、ｂ）好ましくはＦＩＴＣ、Ｃｙ５及び／又はＡＰＣ等の蛍光標識と結合した免疫グロブリン特異的抗体を有する複合体と、ｃ）選択的に、洗浄バッファ、カバーグラス、カバー媒体、蛍光標識された又はされていない非コーティング合成基材、及び／又は、合成基材のためのさらなる蛍光標識とを含む。
【００４２】
本発明のキットは、当業界において公知の標準的方法と比較して非常に単純化されかつ経済的な診断方法を可能にする。キットスライドは、アレイに基づいたアプローチを細胞基質によるアプローチに本質的に組み合わせて、複数のエピトープを有する複数の合成基材を含んでいてもよい。したがって、経済的に実現可能なコンパクトな形態で存在する当業界で公知のあらゆるものよりもより完全でかつより効率的な診断手段を提供する。
【００４３】
本発明の詳細な説明
本発明の方法は、通常は多段階の診断が必要とされる疾患の診断を可能にする。特異性を高めながら抗体結合を評価する複数の診断のステップをこの方法と組み合わせて、単一の診断解析において、素早く、より効率的で、かつ、より正確な診断を提供する。
【００４４】
この方法は、特に、感染症及び自己免疫障害等のように抗体検出によって有効な診断が提供される疾患又は病気に関する。この方法は、細胞又は組織に対する抗体結合の存在及びパターンのスクリーニングを可能にするだけでなく、抗体が対象とする各抗原に関するより多くの明確な情報を提供することができる。これによって、ワンステップの方法においてはっきりとした病気の診断が可能になる。
【００４５】
診断という用語は、患者の特性を評価することを通じて疾病の性質又は原因を識別及び／又は判断することを指す。本発明は、実行された時に患者に存在する特定の疾病又は疾患の指標を提供する診断法を提供する。例えば、複数の自己免疫疾患が１つの被検体に存在する可能性がある。そのため、例えば、本発明の方法は、１つの疾病の識別によって他の疾患の存在を除外しない。本発明の方法を使用して複数の疾患を同時に又は別々に検出又は分析することができる。
【００４６】
本発明の方法は、特に、自己免疫性全身性血管炎等の全身性リューマチ性炎症性疾患の診断に適している。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体に関係する顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）等のような、顆粒細胞（ＡＮＣＡ）内の抗原に対する抗体に関連した疾患、及び、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）に対する抗体に関係するヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）は、本発明の方法の使用を用いて診断することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡに対する抗体に関係している場合には、全身性エリテマトーデスを診断することができる。例えば、ｔＲＮＡ合成酵素等のように、ＨＥｐ−２細胞内の抗原に対する抗体に関係してる場合には、本発明を使用して多発筋炎を診断することもできる。
【００４７】
例えば、ＨＥｐ−２細胞内の抗原に対する抗体に関係している場合には、本発明を用いて自己免疫性肝炎等の自己免疫性肝疾患を診断することができる。線維状アクチン、アシアロ糖蛋白受容体、又は、肝細胞内の他の抗原に対する抗体に関連した疾患を診断することもできる。
【００４８】
表１に示されているのは、関連性のある抗好中球細胞質抗体の種類、及び、顆粒細胞における関連する細胞パターンのリストである。表１は、抗体、染色パターン、及び、それらの関連する臨床的関連の例を提供する。この表は、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【００４９】
【表１】
2013520664.tif 000002
【００５０】
本発明の合成基材に塗布することができる適切な抗原の一覧を表２に示す。この一覧は、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。表１から、各細胞パターンについて、複数の疾患を示すことができることは明らかである。より具体的な診断を提供するためには、自己抗体が結合する特定の抗原に関するより多くの詳細な情報が必要とされる。特定の抗原のそれぞれが疾病との密接な関連を示していることは、表２から明らかである。そのため、本発明の方法におけるそのような抗原についての陽性シグナルは、細胞パターンと組み合わせて、当業界において公知の技術と比較して優れた診断を可能にする。
【００５１】
したがって、本発明は、改良された診断を提供するために、分析方法の新規な組み合わせを提示する。本発明は、各構成要素の新規性は重要ではないいものの、特許請求の範囲に記載されている特定の組み合わせが驚くべき結果や相乗効果をもたらす組み合わせ発明に関する。本発明は、構成要素間の相乗効果を示す。それによって、低い特異性（細胞又は組織）及び高い特異性（抗原）の両方における患者抗体の同時分析は、先行技術における公知の方法と比較して格段に速い方法及びより具体的な診断を提供する。
【００５２】
【表２】
2013520664.tif 000003
【００５３】
表３に示されているのは、関連性のある抗核抗体、及び、関連性のある臨床的関連の一覧である。この一覧は、本発明の範囲を限定するものではない。全身性自己免疫疾患における抗核抗体の発生率が示されている。抗核抗体の発生率及び特定の疾患とのそれらとの関連は当業界において公知である(Arbuckle MR et al. New Engl J Med 2003;349: 1226-33, Bradwell AR and Hughes RG. Atlas of HEp-2 patterns. 3rd ed. 2007, Dalakas MC et al. Lancet 2003, 362:971 -82, Fox Rl. Lancet 2005;366:321-31 , Rahman A et al. New Engl J Med 2008;358:929-39, Tan EM et al. Arthritis Rheum 1997;40:1601-1 1 , Ziswiler H-R et al. Swiss Med Wkly 2007;137:586-90)。
【００５４】
略語
ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）
ＭＣＴＤ：混合結合組織病(mixed connective tissue disease)(Sharp-Syndrome)
ＤＭ／ＰＭ：皮膚筋炎／多発筋炎（dermato-/polymyositis）
ＲＡ：リウマチ性関節炎
ＳＳｃ：全身性硬化症／強皮症
ＬＳＳＣ：局所的全身性強皮症（クレスト症候群）
ＬＥ：薬物誘導性の紅斑性狼瘡(medicament-induced lupus erythematosus)
ＡＩＣ：自己免疫性胆管炎(autoimmune cholangitis)
ＰＢＣ：原発性胆汁性肝硬変症(primary biliary cirrhosis)
【００５５】
表１−表４に与えられている疾患は、本発明の方法によって診断される病気、症状及び／又は疾患の例として意図されている。
【００５６】
【表３】
2013520664.tif 000004
【００５７】
表３の説明
a   特異性９５％
b.  Ｕ１・ｓｎＲＮＰ複合体：Ｓｍ及び／又はＵ１・ｓｎＲＮＰ ｐ６８／Ａ及び／又は第３のエピトープに対するＩｇＧ
c.  最大で５％のケースにおいて房室ブロックを伴う新生児ループスにおける発病有意性。ＳＳ−Ａ／Ｒｏ５２ ＩｇＧは、心臓の５−ＨＴ４セロトニン作動性受容体を認識し、セロトニン活性化Ｌ型を介してカルシウムストリームを阻害する（ＩＣａ）。
d.  炎症性筋疾患においては、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ  ｐ５２  ＩｇＧとＪｏ−１  ＩｇＧ
e.  ｒＲＮＰ：リボソームＲＮＰと、タンパクＰ０、タンパクＰ１、及びタンパクＰ２
f.  全身性硬化症／強皮症(SSc)を伴う皮膚筋炎／多発性筋炎(DM/PM)において
【００５８】
表４は、ＨＥｐ−２細胞に結合した時の抗核抗体の核パターン（ＩＩＦ）を示している。表４から、異なる疾患について類似又は同様の細胞パターン／核パターンがみられることがわかる。表５は、ＨＥｐ−２細胞に結合した抗体のさらなる細胞パターン（細胞質）を示している。細胞分析は、自己免疫疾患の存在又は不存在の証拠又は裏付けを与えることができるが、細胞基材だけを用いた間接免疫蛍光法は、最適な具体的診断を与えることができない。また、表４及び表５に与えられているのは、本発明の合成基材に塗布することができた特定の抗原の一覧である。細胞パターン（核間期、有糸分裂及び細胞質）と特定の抗原（免疫原）との組み合わせによって、病気又は病状の改良されたより確かな診断がもたらされる。
【００５９】
【表４】
2013520664.tif 000005
【００６０】
【表５】
2013520664.tif 000006
【００６１】
例えば、膵臓の膵島細胞、グルタミン酸デカルボキシラーゼ又はチロシンホスファターゼＩＡ−２に対する抗体に関係している場合には、本発明を用いて１型糖尿病を診断することもできる。
【００６２】
本発明の方法で診断することができるさらなる疾患の種類は、感染症に関するものである。そのような疾患には、ボレリア症又はライム病が含まれる。これらの疾患は、ｐ２１、ｐ４１、ｐ１００、ＯＳＰＣ又はＯＳＰＡ等のボレリア又はボレリアタンパクに対する抗体に関係している。
【００６３】
単純疱疹ウイルスは、例えば、単純疱疹ウイルスタイプ１（口唇ヘルペス）及びタイプ２（陰部ヘルペス）に対する抗体に関係している場合には、本発明を用いて診断することができるもう１つの感染症である。ヘルペス感染細胞は、タイプ１に対するｇＧ１及びｇＣ１、タイプ２に対するｇＧ２等のような特定のヘルペス抗原を含む合成基材と共に、細胞基材として使用され得る。
【００６４】
それら自身の視覚的特性若しくは物理的特性によって又は情報分子を付着させることによってコード化された微小粒子等のような、抗原をコーティングした小さい支持体の使用は、１つの試験環境において細胞基材及び／又は組織基材と共に、驚くべきことに、上記複数段階アプローチに概説されている複数の抗体活性の同時評価のための適切な基礎を与える。
【００６５】
そのような検出技術のための最適な報告方法は、複数色蛍光である。複数色蛍光は、粒子のコード化と、複数の特定の抗体・抗原の相互作用を評価するためのラベルとしての両方において同時に、容易に使用することができる。パターン認識ソフトウェアを備えた完全に自動化された顕微鏡は、粒子、細胞基材、及び／又は、組織基材の表面の対象に結合した抗体の検出から生じる蛍光シグナルに加えて、種々の特定の抗原でコーティングされた粒子をコードする蛍光シグナルを判読する。
【００６６】
パターン認識ソフトウェアは、細胞基材及び／又は組織基材と、合成基材との両方の同時定量を可能にする。各パターン（細胞／組織パターンと、基材パターンとの両方）のルールの定義された集合によって、上記ソフトウェアが特定の基材に対応する各蛍光シグナルを識別することが可能になる。これは、異なる基材のユニークな視覚的特性、蛍光的特性、又は、物理的特性を通じて可能になる。これらの特性は、抗体がどの基材に（したがって、どの特定の抗原に）結合したかをソフトウェアが認識するためのコードとして機能する。ＭＰＡ及びＷＧについて上述されているように、特定の細胞パターン（顆粒細胞の核周囲及び細胞質；ＨＥｐ−２細胞の有糸核分裂細胞の核、細胞質、斑点状細胞質、クロマチン）の自動判定は、疾病の診断に結びつく付加情報を提供する。
【００６７】
高性能のパターン認識を使用することによって、人員を高度に訓練し、いくつかの異なるシステム構成を理解させる必要性がなくなり、また、特定の抗体に対する特異的な蛍光パターンの必要もなくなる。そのような要件は、通常、人員訓練において莫大な費用を必要とする。品質規格及び検証仕様の点において、多くの場合、反復実験を行うことが必要であり、科学者又は高度に訓練された人員による監督が必要である。細胞ベースの間接免疫蛍光法には、一貫した再現性及び高品質が特に必要とされる。免疫蛍光法パターンの判断は、調査者の知識及び個々の技術によって影響される。したがって、研究室内及び研究室間で非常にばらつきがあるのが普通であり、特に専門でない研究所において大きな診断上の問題を提示する。
【００６８】
自動化された判読システム及びインテリジェントパターン認識による細胞及び精製された抗原ターゲットに対する抗体を検出するための免疫蛍光法パターン自動判読は、特に多数のサンプルを有する研究所のための、費用効率に優れた血清学的診断方法の信頼できる基礎を与える。近代的な電子データ分析及び処理を適用する機会は、そのような研究所における負担の多い仕事を著しく和らげることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
本発明を図面によってさらに説明する。これらの図面は、本発明の範囲を限定するように意図されたものではない。図１は、ＡＮＣＡ及びＭＰＯに対する抗体の免疫蛍光検査法による同時分析である。図２は、ＡＮＣＡ及びＰＲ３に対する抗体の免疫蛍光検査法による同時分析である。
【００７０】
図１：ＡＮＣＡ及びＭＰＯに対する抗体の免疫蛍光検査法による同時分析の結果は、図１に示されている。ＭＰＯでコーティングした微小粒子と共にヒト顆粒細胞を用いて、ｐＡＮＣＡ（ＭＰＯ）について陽性であると既に評価された１つの血清サンプル、及び、ｃＡＮＣＡ（ＰＲ３）について陽性であると既に評価された他の１つの血清サンプルをスライド上で試験した。スライド上の顆粒細胞の位置は、ＤＡＰＩ染色法によって検出した。抗原をコーティングした微粒子は、ローダミン又はＦＩＴＣ蛍光によって評価した。ｐＡＮＣＡ陽性血清は、固定された顆粒細胞と、ＭＰＯでコーティングした微粒子との両方と陽性シグナルを示した。顆粒細胞内に局在して前記粒子（矢印で示されている）の表面に固定されたＭＰＯに結合した抗体は、Ｃｙ５複合体による特異的な染色によって示されている。対照的に、ｃＡＮＣＡ陽性の血清は、顆粒細胞のみと陽性反応を生じた。
【００７１】
図２：ＡＮＣＡ及びＰＲ３に対する抗体の免疫蛍光検査法による同時分析の結果は、図２に示されている。ＰＲ３をコーティングした微粒子と共にヒト顆粒細胞を用いて、ｃＡＮＣＡ（ＰＲ３）に対して陽性であると既に評価された１つの血清サンプル、及び、ｐＡＮＣＡ（ＭＰＯ）に対して陽性であると既に評価された１つの血清サンプルをスライド上で試験した。ＤＡＰＩ染色法によって顆粒細胞の位置を検出した。ローダミン蛍光又はＦＩＴＣ蛍光によって、抗原でコーティングした微粒子を評価した。ｃＡＮＣＡ陽性の血清は、固定された顆粒細胞と、ＰＲ３でコーティングした微粒子との両方と陽性シグナルを示した。顆粒細胞に局在して前記粒子（矢印で示されている）の表面に固定化されているＰＲ３に結合した抗体は、Ｃｙ５複合体によって特異的な染色によって示されている。対照的に、ｐＡＮＣＡ陽性の血清は、顆粒細胞のみと陽性反応を生じた。
【００７２】
実施例
実施例に示されているように本発明の実施において下記方法を使用する。それらは、実用例として本発明をさらに説明するように意図されたものであり、本発明を限定するものではない。
【００７３】
患者：
１１ＦにおいてｃＡＮＣＡに対して陽性（ＰＲ３陽性）のヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）を有する１０人の患者、及び、ｐＡＮＣＡに対して陽性（ＭＰＯ陽性）の他のＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＳＶ）を有する１０人の患者から血清サンプルを回収し、−２０℃で保存した。ヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）の診断は、ＷＧ用のチャペルヒル・コンセンサス・デフィニション(Chapel Hill Consensus Definitions)に基づいた。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断基準に適合する１０人の患者を、研究における疾病コントロールとして登録した。健康なコントロールとして、１０人の献血者から得た血清を使用した。すべてのサンプルは同意及び登録時に得た。
【００７４】
従来の間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）による抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の検出：
供給業者(GA Generic Assays GmbH、Dahlewitz、ドイツ)の推奨に従ってエタノール及びホルマリンで固定したヒト顆粒細胞の表面に患者サンプルを流すことによって、ＡＮＣＡを検出した。簡潔に説明すると、固定した顆粒細胞を、１：２０の稀釈から始めて連続的に希釈した血清の２５μｌと共に、湿室において室温（ＲＴ）で３０分間培養した。洗浄後に、そのサンプルを、フルオレセイン標識したヒツジの抗ヒトＩｇＧと共に室温において３０分間インキュベートすることによって、抗原抗体複合体を検出した。次に、サンプルを洗浄し、埋め込み、蛍光顕微鏡によって手作業で分析した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡによるＭＰＯ抗体及びＰＲ３抗体の検出：
供給業者(GA Generic Assays GmbH、Dahlewitz、ドイツ、及び、Aesku. Diagnostics GmbH、Wendelsheim、ドイツ)の推奨に従って、精製されたヒトＰＲ３及びＭＰＯを固体相抗原として使用する異なる世代のＥＬＩＳＡをそれぞれ使用して、患者血清中のプロテイナーゼ３自己抗体及びＭＰＯ自己抗体を検出した。
【００７６】
ＡＮＣＡと、ＭＰＯに対する抗体及びＰＲ３に対する抗体との同時検出：
ヒト顆粒細胞を密度勾配によって単離した。顆粒細胞を多く含むバンドを回収した。赤血球を溶解させた後に、ＰＢＳで顆粒細胞を洗浄した。分離した顆粒細胞をローダミン標識したＭＰＯ又はＰＲ−３でコーティングしたビーズと混ぜた。この混合物を６ウェル診断用スライドガラスの表面に固定した。エタノールを用いてこのスライドを固定した。間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）のために、１：２０に希釈した２５μｌの血清と共に、混合した顆粒細胞／ビーズのスライドを湿室で室温（ＲＴ）において３０分間培養した。洗浄後、そのサンプルを、Ｃｙ５で標識したヤギの抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、Hamburg、ドイツ）と共に室温において３０分間インキュベートすることによって、結合した抗原抗体複合体を検出した。次に、サンプルを、洗浄し、埋め込み、蛍光シグナルの自動パターン認識用システムによって分析した（下記参照）。
【００７７】
蛍光シグナルの自動パターン認識：
電動走査ステージ（ＩＭ１２０、Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ、ドイツ）、４００ｎｍ、４９０ｎｍ、５２５ｎｍ及び６３５ｎｍの発光ダイオード（ＬＥＤ）（ｐｒｅｃｉｓＥｘｃｉｔｅ、ＣｏｏｌＬＥＤ、英国）、及び、グレースケールのカメラ（ＰＳ４、Ｋａｐｐａ、ドイツ）を備えた電動倒立型顕微鏡顕微鏡（オリンパス１Ｘ８１、オリンパス社、日本）を使用して、細胞の抗原に結合した抗体と、微粒子の表面にコーティングした抗原に結合した抗体とを同時に多重検出するための血清サンプルの蛍光パターンを自動的に評価した。判定システムは、装置及びオートフォーカス制御用モジュール、画像分析、及び、パターン認識アルゴリズムからなる専用に設計されたソフトウェアによって制御される。グレースケール遷移よる対象のＨａｒａｌｉｃｋ画像特性に基づいた新規なオートフォーカスは、対象を認識及びフォーカスするための蛍光染料として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用した。人工産物を除去するために、画像を等しい大きさの部分対象に分割することによって、さらなる定性画像分析を実行した。
【００７８】
ヒストグラムに基づいた閾値アルゴリズムを使用し、その後にウォータシェッド・トランスフォーメーション(watershed transformation)を使用して、対象の分割を実施した。分割された対象を、局所的記号、形態的記号、及び、テクスチャ／表面記号によって特性を記述した。１４００個超の対象描写基準を実施した。
【００７９】
免疫蛍光法の画像データを以下の順序で評価した。
ｉ）陽性染色シグナル
ｉｉ）染色の位置特定（細胞又は微粒子）
ｉｉｉ）細胞染色パターンの判定（核周囲、細胞質）
【００８０】
ＤＡＰＩ染色によって細胞を識別し、ローダミン蛍光によって微粒子を識別した。合成基材を識別するためにＦＩＴＣ蛍光も使用した。抗体の特異的結合について第３の蛍光チャネルにおいてＣｙ５特異的免疫蛍光を分析した。各対象のルールの定義による構造特性とテクスチャ特性との組み合わせによって区別を行った。
【００８１】
画像データを評価するために、絶対的画像強度、コントラスト、及び、画像全体のグレースケールレベルの数を組み合わせることによって、反応性指数（ＲＩ）を算出した。ＲＩは露光時間によって影響され、露光時間は人工産物を除去した後の最も高い画像シグナルに依存するので、弱い絶対シグナルを有するパターンでさえも検出可能である。陽性シグナルを区別するための閾値の決定は、２００人の正常な献血者のＲＩ値に基づいて行った。
【００８２】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。これらは、本発明の範囲を限定するように意図されていない。
【００８３】
実施例１：ＡＮＣＡとＭＰＯに対する抗体との同時検出
ＡＮＣＡとＭＰＯに対する抗体とを同時に検出するために、ＭＰＯでコーティングしたビーズと共に浮遊させたヒト顆粒細胞を、６ウェル診断用スライドガラスのウェル中に固定した。ＤＡＰＩで染色することによって顆粒細胞の核を検出した。ローダミン標識によってコーティングしたビーズの位置を特定した。間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）を行うために、１：２０で希釈した血清と共に、混合された顆粒細胞／ビーズのスライドをインキュベートした。洗浄後に、Ｃｙ５標識したヤギの抗ヒトＩｇＧと共にそのサンプルをインキュベートすることによって、形成された抗原抗体複合体を検出した。
【００８４】
顆粒細胞とＭＰＯでコーティングしたビーズとを有するスライドを分析した（図１）。上側のパネルにおいて、ＤＡＰＩ（左側）、ＦＩＴＣ／ローダミン（中央）、及び、Ｃｙ５（右側）について３つの異なるチャネルで得られたｐＡＮＣＡ血清の染色画像が示されている。下側のパネルにおいて、上述の混合スライドは、ｃＡＮＣＡ血清によって染色された。ｐＡＮＣＡ血清によって染色された画像だけが、特定のＣｙ５チャネルにおいてＭＰＯでコーティングした粒子に対する陽性染色を示した。したがって、ＭＰＯ抗体に特徴的な顆粒細胞の核周囲染色は、ＭＰＯをコーティングしたビーズの染色によって確認された。
【００８５】
実施例２：ＡＮＣＡとＰＲ３に対する抗体との同時検出
ＡＮＣＡとＰＲ３に対する抗体とを同時に検出するために、浮遊したヒト顆粒細胞を、ＰＲ３をコーティングしたビーズと共に、６ウェルの診断用スライドガラスのウェル中に固定した。顆粒細胞の核は、ＤＡＰＩで染色することによって検出した。コーティングしたビーズは、ローダミンラベリングによって位置を特定した。間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）を行うために、混合した顆粒細胞／ビーズのスライドを、１：２０に希釈した血清と共にインキュベートした。洗浄した後に、そのサンプルを、Ｃｙ５で標識したヤギの抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートすることによって、形成された抗原抗体複合体を検出した。
【００８６】
顆粒細胞とＰＲ３をコーティングビーズとを有するスライドを分析した（図２）。上側のパネルにおいて、ＤＡＰＩ（左側）、ＦＩＴＣ／ローダミン（中央）及びＣｙ５（右側）について３つの異なるチャネルで得られたｐＡＮＣＡ血清の染色画像が示されている。下側のパネルにおいて、上述の混合スライドがｃＡＮＣＡ血清で染色された。図２は、実施例１におけるＭＰＯをコーティングした微粒子に代えて、ＰＲ３をコーティングした微粒子を用いた染色画像を示している。実施例１とは対照的に、ｃＡＮＣＡ血清は、下側のパネルにおいて、ＰＲ３をコーティングしたビーズと陽性反応を示している。したがって、ＰＲ３をコーティングしたビーズの染色によって、ＰＲ３抗体に特徴的な顆粒細胞の細胞質染色が確認された。
【００８７】
実施例３：
疾患特異的及びコントロール血清の評価
顆粒細胞と抗原コーティングした微粒子との両方を有するスライドを用いた間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）によるＡＮＣＡ、抗ＰＲ３抗体及び抗ＭＰＯ抗体の検出の特異性を試験するために、１０人の抗ＰＲ３陽性のＷＧ患者の血清、１０人の抗ＭＰＯ陽性のＡＡＳＶ患者の血清、１０人のＳＬＥ患者の血清、及び、１０人の献血者の血清を評価した。ヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）の診断は、ＷＧ用のチャペルヒル・コンセンサス・デフィニション(Chapel Hill Consensus Definitions)に基づいた。この研究における疾病のコントロールとして、ＳＬＥの診断基準に適合する１０人の患者を登録した。１０人の献血者から得た血清を健康なコントロールとして使用した。
【００８８】
ＡＮＣＡ反応性は、陽性顆粒細胞染色の免疫蛍光法パターンに従って決定した。ＭＰＯ又はＰＲ３をコーティングした微粒子に対する反応性は、陽性微粒子染色の検出によって同時に評価した。
【００８９】
間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）においてｃＡＮＣＡに対して陽性であったＷＧ血清のほとんどすべてが、ＰＲ３コーティングしたビーズと陽性の反応性を示し（９０％）、また、上述の混合スライドの固定した顆粒細胞とｃＡＮＣＡパターンを示した（１００％）。対照的に、間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）においてｐＡＮＣＡに対して陽性であったＡＡＳＶ血清のすべてが、ＭＰＯコーティングしたビーズと陽性の反応性を示し、また、固定した顆粒細胞とｐＡＮＣＡパターンを示した。すべてのコントロール患者は、固定した顆粒細胞又は抗原コーティングした微粒子のいずれかと陰性であった。これらの結果を表６に示す。
【００９０】
抗核抗体（ＡＮＡ）に関連する疾患を分析するために本発明の方法を使用したさらなる研究は、同様に有効な結果を示す。
【００９１】
【表６】
2013520664.tif 000007
【図１】
2013520664.tif 000008
【図２】
2013520664.tif 000009
【国際調査報告】
2013520664.tif 000010
2013520664.tif 000011
2013520664.tif 000012