(57)【要約】本発明は、試料からのウイルスの単離のための方法およびキットに関する。試料を、少なくとも二価の塩化物塩を含む抽出溶液および／またはイオン液体で処理する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを複合試料から単離する方法であって、以下の工程：
ａ）複合試料を提供すること、
ｂ）前記試料を、少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む抽出溶液と共にインキュベートすること、
ｃ）前記ウイルスを工程ｂ）の混合物から単離すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
複合試料が、食物または臨床試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出溶液が、ＭｇＣｌ２を０．５〜６Ｍの濃度で含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）において、ウイルスが混合物から遠心分離および／または沈殿によって単離されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）の前に、試料に規定量の対照ウイルスを添加することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料を、少なくとも１種のバイオポリマー分解酵素とともにさらにインキュベートすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
さらなる工程ｄ）において、細胞計数によって、ＰＣＲ法によって、レクチンを用いることによって、あるいはウイルスに選択的に結合する抗体またはタンパク質または前記ウイルス粒子の表面構造に向けられたアプタマーを用いる方法によって、ウイルスを分析することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）において、ウイルスおよび細胞壁に囲まれている細胞を、並行したまたは後続する単離工程により単離することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程ｃ）において、少なくとも２つの後続する遠心分離工程を行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）で単離されるウイルスが、１０〜１００ｎｍの直径を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料からのウイルス単離のための方法およびキットに関する。試料を、ウイルスの単離をもたらす、少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む抽出溶液で処理する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスの同定もしくは特徴づけのための、または単にさらなるプロセシングのための複合試料(complex samples)からのウイルスの単離、特に、試料、例えば食物試料または血液、組織もしくは糞便のような臨床試料のような試料における病原体の同定は、ますます重要になっている。しかし、試料中に含まれるウイルスを明確に同定するため、また任意に定量するためには、それらの単離のための方法を提供しなければならない。
【０００３】
その検出前に増殖させることができる細菌細胞のような他の微生物とは異なり、ほとんどのウイルス粒子は、それぞれの試料中に存在する量で直接検出する必要がある。このため、試料中の単一のウイルスのごく少数のコピーの検出および同定を可能とする非常に高感度な方法を生むことがさらに重要となる。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲは、一般的に分子生物学における定量的手段としての、ならびに微生物またはウイルス、特に病原体の定量および同定のためのＰＣＲの適用分野を大幅に増強した。リアルタイムＰＣＲによって、ＰＣＲ試料あたり単一の核酸標的に至るまでの信頼性のある検出および定量が可能になるが、高度に精製された鋳型核酸が必要である。特に、食物のような複雑な環境における細胞またはウイルスの日常的な診断および定量的検出となると、これら環境の構成要素によって引き起こされた阻害効果が、ＰＣＲ反応に影響するかまたはさらに阻害し得るため、これらの要件は重要な役割を果たす。
【０００５】
さらに、食物などの複合試料からの標的生物の単離に用いる、信頼性のある、効率的な回収方法を用いることが重要である。食物のような試料は一般的に大きい試料容積を伴うため、通常は微生物学的方法を、微生物の単離および濃縮のために用いる。これらの方法は、「至適基準（golden standard）」の方法を表し、それらと比較して新たな代替の技術を評価しなければならない。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲおよび微生物の下流解析（downstream analysis）のための他の分子的方法の厳しい要件を満たす、食物からの微生物、例えば細菌の分離のための方法を確立する主要な努力がなされてきた。
【０００７】
また、核酸の食物からの直接的な単離が、分子生物学において一般的に用いられている核酸単離方法を用いて試行されてきた。他の方法は、微生物の表面構造に対する生体分子の親和性を利用し、ここで前記生体分子は、例えば、任意に磁気ビーズ、シラン化(silanized)ガラススライドまたは直接的コロニーブロットと組み合わせた、抗体、ファージからの細菌結合タンパク質および抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）であり得る。例えば、リステリア菌（Listeria monocytogenes）の直接的検出のために、水性二相分離系を用いることができる(Lantz et al. Appl Environ Microbiol. (1994) 60:3416-3418)。
【０００８】
これらの方法のほとんどは、処理される試料容積の不適切な大きさ、高い検出限界、低い回収率、細胞の定量的でない単離、時間のかかる手順および高いコストのような欠点を有する。さらに、これらの方法の適用は、ほとんどの場合において１種のみの、または限定された数の異なる食物のマトリックスに限定されている。（ｉ）大きい試料容積、（ｉｉ）広範囲の標的濃度にわたる再現可能な回収率および（ｉｉｉ）下流解析のための代替の分子的方法を補助するための阻害剤の除去である、食物中の病原体の直接的な定量のための要件に基づいて、ウイルスや細菌などの病原体の単離のための新たなプロトコルを、提供しなければならない。
【０００９】
WO 2008/017097には、細胞壁に囲まれている細胞を食料のような複合マトリックスから単離する方法が開示されている。この方法は、カオトロピック剤を界面活性剤と組み合わせて含む抽出緩衝液を用いる。
【００１０】
上述の公知の方法から分かるように、ほとんどの方法は、細菌細胞のようなより大きい微生物の単離に向けられている。
細菌細胞は、極めて簡単に追跡および試料から回収することができる極めて大きいオブジェクトであるのに対し、公知の手順のいずれも、ウイルスのような小さなオブジェクトを単離するための簡単かつ効果的な方法を提供しない。
【００１１】
L. Croci et al., Food Anal. Methods (2008), 1, 73-84において、著者は食品試料からウイルスを抽出し濃縮するための様々な試みを論じている。彼らは、ウイルス汚染が、ノロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ロタウイルスやエンテロウイルスによって引き起こされる病気のような、食品によって伝播する病気の原因としてますます同定されていると結論付けた。それにもかかわらず、ウイルスを抽出するためにいくつかの試みがなされてきたものの、より高感度、信頼性のあるおよび標準化された方法が必要であると結論づけられる。
【００１２】
したがって、食物および臨床試料などの複合マトリックスからのウイルス単離のための、定量的であり、再現可能な方法について明確な必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１３】
発明の簡単な説明
少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む緩衝液を用いて、ウイルスを容易に、かつ極めて効率的に複合マトリックスから単離することができることが見出された。驚くべきことに、上述の物質の添加は、試料マトリックスに典型的に「くっつく（stick）」傾向があるウイルスまでをも単離することができるような効果的な溶解をもたらす。
【００１４】
したがって、本発明は、ウイルスを複合試料から単離する方法であって、以下の工程：
ａ）複合試料を提供すること、
ｂ）前記試料を、少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む抽出溶液と共にインキュベートすること、
ｃ）前記ウイルスを工程ｂ）の混合物から、好ましくは遠心分離、アフィニティー結合および／または濾過によって単離すること
を含む、前記方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、ウイルスを複合試料から単離するためのキットであって、
・少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む抽出溶液ならびに
・少なくとも１種の生分解(biodegrading)酵素
を含む、前記キットに関する。
【００１６】
発明の説明
驚くべきことに、複合試料を少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む抽出溶液と共にインキュベートすると、ウイルス粒子まで破壊されることなく解放されるような効果的な試料の分解（dissolution）がもたらされることが判明した。
【００１７】
本発明による方法は、ウイルス（ウイルス粒子とも呼ばれる）を単離するために使用してもよい。ウイルスは、当業者に知られている。完全なウイルス粒子は、キャプシドと呼ばれるタンパク質の保護膜で囲まれた核酸からなる。これらは典型的にはキャプソメアと呼ばれる同一のタンパク質サブユニットから形成される。キャプシドの形状は、ウイルスを形態学的に区別するための基礎としての役割がある。一般的には、４つの主要な形態学的ウイルスタイプがある。
・螺旋状
タバコモザイクウイルスは、螺旋状のウイルスの一例である。
・正二十面体状
・エンベロープ
インフルエンザウイルスおよびHIVはこの方式（strategy）を用いている。
・複雑型
ウイルスの異なる種類は当業者に知られている。
【００１８】
本発明は、一般的にウイルスの、好ましくは食物と病原体ウイルス、特に人間にとって関連があるもの、例えば、人間の食物に潜在的にいるもの、または臨床的関連のある病原体、との単離を可能にする。
特に興味深い例示的なウイルスを以下に列挙する。
それらは、インフルエンザ（オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae））、ＨＩＶ１＋２（オルソレトロウイルス科（Orthoretroviridae））、ポックス（ポックスウイルス科（Poxviridae）、オルソポックスウイルス科（Orthopoxviridae））、コロナ（コロナウイルス科（Coronaviridae）、ニドウイルス目（Nidovirales））、フラビウイルス、ポリオーマウイルスまたはパピローマウイルスのような疫学的に重要であるもののいずれかであるか、あるいはそれらは、アデノウイルス（アデノウイルス科（Adenoviridae））、ロタウイルス（レオウイルス科（Rheoviridae））、エンテロウイルス、ノロウイルス、ノーウォーク／ノーウォーク様ウイルス（カリシウイルス科（Caliciviridae））、Ａ型肝炎ウイルス（ピコルナウイルス科（Picornaviridae））、Ｅ型肝炎ウイルス（ヘペウイルス科（Hepeviridae））やアストロウイルスのような、特に食物試料中の汚染物質として発見されることもできる。
【００１９】
本発明によって単離されるウイルス粒子のサイズ（＝直径）は、典型的には１０〜５００ｎｍであり、好ましくは１０〜２００ｎｍであり、より好ましくは１０〜１００ｎｍである。
【００２０】
用語「複合試料」は、主として有機的な起源のより多数種の、またはより少数種の異なる化合物を含む試料または試料マトリックスを指し、それらは液体および／または固体であり得る。本発明の複合試料は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（また酵素を含む）、炭水化物（複合および単純糖質）、脂質、脂肪酸、脂肪、核酸などを含むマトリックスを典型的に含む。「複合試料」は、例えば、ウイルス核酸の増幅を阻害することによってウイルスの単離および/または検出を妨害する１種または２種以上の物質を含むことができる。
【００２１】
例示的な複合試料は、これに限定するものではないが、食物（例えば雌ウシ、ヒツジ、雌ヤギ、ウマ、ロバ、ラクダ、ヤク、水牛およびトナカイの乳、乳製品、ウシ、ヤギ、子羊、マトン、ブタ、カエル脚、子牛、げっ歯動物、ウマ、カンガルー、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ハト(pigeon)もしくはハト(dove)、ダチョウ、エミューを含む家禽の肉、魚(finfish)、例えばサケおよびテラピア、ならびに甲殻類(shellfish)、例えば軟体動物および甲殻類(crusta cean)および巻貝(snail)を含む海産食品、肉製品、植物製品、種子、トウモロコシ、小麦、米、大麦、ソルガムおよびキビを含むイネ科植物の穀物、ソバ、アマランスおよびキノアを含む非イネ科植物からの穀物、
【００２２】
マメ、ピーナッツ、エンドウおよびレンティルを含むマメ科植物、アーモンド、クルミおよび松の実を含むナッツ、ヒマワリ、セイヨウアブラナおよびゴマを含む油糧種子、例えばジャガイモ、キャッサバおよびカブを含む根菜、アマランス、ホウレンソウおよびケールを含む葉菜、ダルス、コンブおよびバダーロックスを含む海草、タケノコ、ノパレスおよびアスパラガスを含む茎菜、グローブアーティチョーク(globe artichoke)、ブロッコリーおよび萱草を含む花序野菜、ならびにカボチャ、オクラおよびナスを含む果菜などの野菜、果実、薬草および香辛料、全血、尿、痰、嘔吐物、唾液、羊水、血漿、血清、肺洗浄および、これに限定するものではないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓などを含む組織を含む。当業者は、さらに、上記の例示的な試料または前記例示的な試料の混合物または前記例示的な試料の１種または２種以上を含む組成物のいずれかから得られた溶解物、抽出物または（ホモジナイズされた）材料がまた、本発明の範囲内の試料であることを認識する。
【００２３】
本発明によると、用語「二価の塩化物塩」は、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＭｎＣｌ２のような二価の陽イオンの塩化物を意味する。最も好ましい二価の塩化物塩は、ＭｇＣｌ２およびＺｎＣｌ２である。
【００２４】
本明細書中で用いる用語「緩衝液」または「緩衝溶液」は、酸または塩基を溶液または組成物に加えた場合にｐＨの変化に抗う水溶液または組成物を指す。ｐＨ変化に対するこの抵抗は、そのような溶液の緩衝特性のためである。したがって、緩衝活性を示す溶液または組成物は、緩衝液または緩衝溶液と呼ばれる。緩衝液は、一般的に溶液または組成物のｐＨを維持する無制限の能力を有しない。むしろ、それらは、典型的には、ある範囲内のｐＨ、例えばｐＨ７〜ｐＨ９を維持することが可能である。
【００２５】
典型的には、緩衝液は、それらのｐＫａより１対数高い、および低い範囲内のｐＨを維持することが可能である（例えば、C . Mohan, Buffers, A guide for the preparation and use of buffers in biological systems, CALBIOCHEM, 1999を参照）。緩衝液および緩衝溶液は、典型的には緩衝塩から、または好ましくは非イオン性緩衝構成成分、例えばＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳから作製される。抽出溶液に加えられた緩衝液は、マトリックス分解の間のｐＨ値が安定化されることを保証する。安定化されたｐＨ値は、単離された細胞の再現可能な結果、効率的な溶解および保存に寄与する。
【００２６】
本明細書において、「界面活性剤」は親油性ならびに親水性（つまり、両親媒性）特性を有する分子をさす。本発明による界面活性剤は、例えば、脂肪酸残基および親水性（例えば、アニオン性またはカチオン性）部分を含み得る。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、試料は、食物試料、糞便、体液、特に血液、血漿または血清、水または組織試料である。
特に好ましい試料は、複合マトリックス（即ちなかでもタンパク質、脂質、炭水化物などを含む）および／または高い粘度を有する試料である。
【００２８】
食物試料は、好ましくは乳製品、好ましくは牛乳、特に生乳、粉乳、ヨーグルト、チーズまたはアイスクリーム、魚加工品、好ましくは生魚、肉製品、好ましくは生肉、肉リンス（meat rinse）またはソーセージ、サラダリンス（salad rinse）、チョコレート、卵またはマヨネーズなどの卵製品、サラダ、魚介類、好ましくはムール貝、果物、好ましくは、ベリー類、およびペッパー類である。
【００２９】
本発明の方法において用いる特に好ましい食物試料は、通常潜在的に病原性ウイルスを含むことが知られており、それからウイルスが、複合マトリックスのために、当該分野において知られている方法でほとんど抽出または検出可能ではない試料である。特に、チーズは、複合マトリックスおよび高い粘性を有する食物として知られている。
特に好ましい臨床試料は糞便および血液である。
他の好ましい試料は細胞培養試料である。
【００３０】
本発明によれば、マトリックスの溶解システムとして用いる抽出溶液は、二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む。試料の種類に依存して、およびウイルスの種類に依存して、抽出溶液の異なる組成物が最も適していることが判明した。
例えば、より温和な条件下で溶解または抽出することができる、複雑なマトリックスを有する乳製品は、好ましくはＭｇＣｌ２を含む抽出溶液で処理される。
より高いデンプン量（５％ｗ／ｗ以上）を有する試料またはまたは肉の試料は、好ましくは、５〜１０Ｍの濃度のＺｎＣｌ２を含む抽出溶液で抽出または可溶化される。
【００３１】
ＭｇＣｌ２のような二価の塩化物塩が存在する場合は、これは通常は０．５〜６Ｍ、好ましくは０．５〜４Ｍ、より好ましくは１と２Ｍとの間の濃度で存在する。
ＺｎＣｌ２もまた、その非常に高い水溶性のために、より高い濃度で用いることができる。それは最大濃度約１５Ｍまで用いることができる。好ましいＺｎＣｌ２の濃度は、１〜１０Ｍである。これは、非常に特異的な抽出条件を作成し、勾配遠心分離のために抽出溶液を直接用いる可能性を提供する。ＺｎＣｌ２を伴う抽出プロトコルの例を図２に示す。ＺｎＣｌ２を含む抽出溶液とともに試料をインキュベーションした後、混合物の密度を水の添加により勾配遠心分離に適した大きさに調整する。
試料の残骸およびその他の不純物を取り除くためのこの最初の遠心分離工程の後、残りの試料を別の遠心分離工程の密度を調整するために再び希釈することができ、あるいは代替的に濾過工程に供することができる。
【００３２】
イオン液体は（存在する場合には）典型的には、混合物の重量を基準として０．５〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％、より好ましくは７〜４０重量％の濃度で存在する。イオン液体は、１種のイオン液体または２種もしくは３種以上のイオン液体の混合物であり得る。
【００３３】
二価の塩化物塩および／またはイオン液体の最良の濃度は、主として分解するべき試料および単離するべきウイルス種に依存する。これらのパラメーターは、当業者によって容易に試験され得る。
【００３４】
本発明の抽出溶液は、通常、１種または２種以上の有機溶媒、好ましくは、エタノールおよびメタノールなどの１種または２種以上の水混和性溶媒を含み得、少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体をもまた含む水溶液および／または緩衝溶液である。それは、通常、５より大きく１１未満、好ましくは６より大きく９未満、より好ましくは６．５と７．５との間のｐＨ値を有する。好ましくは、抽出溶液は、水、緩衝溶液、あるいは、水または緩衝溶液と最大５０％（ｖ／ｖ）の１種または２種以上の水混和性有機溶媒との混合物ならびに少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む。
【００３５】
本発明の方法において用いてもよい緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ＴＲＩＳ）緩衝液、ＴＲＩＳ生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ）、ＴＲＩＳ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＡＣＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびトリシンの群から選択される。好ましい緩衝液はＰＢＳおよびトリシンである。
【００３６】
さらに試料のよりよい分解を達成するために、試料をさらに少なくとも１種の界面活性剤、好ましくはアニオン性界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤および／または非イオン性界面活性剤と共にインキュベートしてよい。界面活性剤を、混合物中で最終濃度が０．０１〜５％、好ましくは０．１〜３％、より好ましくは、０．２％〜２％（重量％）に達するように試料に添加することができる。
【００３７】
アニオン性界面活性剤は、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）またはデオキシコール酸（ＤＯＣ）である。
両性イオン界面活性剤は、好ましくは３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【００３８】
非イオン性界面活性剤は好ましくは、好ましくはＣ１３〜Ｃ１５の脂肪族アルコールを含有するエトキシル化脂肪族アルコールである。かかるエトキシル化脂肪族アルコールは、Lutensolとして知られている。適切な非イオン性界面活性剤は、具体的には、アシル−、アルキル−、オレイル−およびアルキルアリールエトキシレートである。これらの製品は、例えば、GenapolまたはLutensolの商品名で市場から入手可能である。
【００３９】
これは、例えば、エトキシル化モノ−、ジ−およびトリアルキルフェノール（ＥＯ（エチレンオキシ基）度：３〜５０、アルキル置換ラジカル：Ｃ４〜Ｃ１２）および、またエトキシル化脂肪アルコール（ＥＯ度：３〜８０；アルキルラジカル：Ｃ８〜Ｃ３６）、特に、Ｃ１２〜Ｃ１４−脂肪アルコール（３〜８）エトキシレート、Ｃ１３〜Ｃ１５−オキソアルコール（３〜３０）エトキシレート、Ｃ１６−Ｃ１８−脂肪アルコール（１１〜８０）エトキシレート、Ｃ１０−オキソアルコール（３〜１１）エトキシレート、Ｃ１３−オキソアルコール（３〜２０）エトキシレート、２０のエチレンオキシド基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、最小で１０重量％エチレンオキシド含有量を有するエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体、オレイルアルコールポリエチレンオキシド（４〜２０）エーテルおよびノニルフェノールのポリエテンオキシド（４〜２０）エーテルである。かかる非イオン性界面活性剤の混合物の用途もまた利用される。      
【００４０】
１種または２種以上の追加の物質、例えば特定の試料中に存在する物質を分解するのを補助する不安定化剤またはバイオポリマー分解酵素を抽出溶液に加えることは、当然可能である。以下に検討するように、１つの例は、大量のコラーゲンおよび／またはデンプンを含む食物試料へのデンプン分解酵素の添加である。
【００４１】
インキュベーションを、典型的には１８℃〜９８℃の温度にて、好ましくは２５℃〜８０℃にて、より好ましくは３５℃〜７０℃にて行う。
試料を、典型的には１０分〜６時間、好ましくは２０分〜１時間の時間にわたり抽出溶液と共にインキュベートする。
【００４２】
試料をさらにより効率的に、かつ低減された時間において分解するために、インキュベーションを高温にて行うことが有利である。
【００４３】
驚くべきことに、本発明によるマトリックスの溶解は、溶解後のウイルスの単離を可能にするのに十分効率的であることが判明した。ウイルスは、任意の公知の方法によって単離することができる。好ましい方法は、遠心分離、濾過、篩い、ゲル電気泳動、ゲル濾過、誘電泳動、ポリエチレングリコールとの沈殿または免疫沈澱のような沈殿、溶媒抽出（２または３相）および、例えば、好ましくは例えばビーズ上に固定化される、抗体、レクチン、タンパク質結合ウイルス、またはアプタマーを用いる超音波または親和性結合である。      
【００４４】
本方法を組み合わせることもできる。好ましくは、ウイルスを第一に濾過、篩い、または遠心分離によって、最も好ましくは、遠心分離によって単離する。必要に応じて、遠心分離工程の後に、ウイルスを最終的に沈殿により単離することができる。
一態様において、これは、遠心分離のような最初の単離工程を実施し、そして、例えば適切な抗体を添加することによってウイルスを凝集してクラスターを形成し、その後沈殿によりウイルスを単離することによって行われる。
【００４５】
遠心分離を、通常、５００〜３００，０００ｇ、より好ましくは１，０００ｇより大きく、さらにより好ましくは、２０，０００ｇより大きいもので行う。
好ましい態様において、段階的な遠心分離手順を行う。典型的には１００〜３，５００ｇの遠心分離を伴う最初の遠心分離工程において、試料マトリックスおよび細菌細胞のような追加の成分のほとんどが除去される。少なくともウイルス粒子を含む残りの上清をさらに遠心分離してウイルス粒子を単離することができる。これは通常、大きさやウイルスの種類に応じて、１０，０００〜３００，０００ｇでの遠心分離によって行われる。
【００４６】
代替的に、試料マトリックスおよび追加成分の除去（例えば、遠心分離による）後、残りの上清を、ウイルスを沈殿させるのに適した成分で処理することができる。かかる成分の例としては、Ａｌ２（ＳＯ４）３、クーマシーブリリアントブルー（ＲまたはＧ）、ＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＰＯ４、ＺｎＳＯ４、塩化アンモニウムまたはポリエチレングリコールである。その後クラスター化されたウイルスを、典型的には１，０００〜２０，０００ｇで遠心分離により単離することができる。本発明による方法では、ＭｇＣｌ２および特にＺｎＣｌ２が、ウイルスの沈殿のための好ましい成分であることが見出された。当業者であれば、ウイルスを沈殿させるために必要な成分の量を容易に決定することができる。ＺｎＣｌ２およびＭｇＣｌ２を、通常３モル／ｌより大きい、好ましくは４〜５モル／ｌ程度の濃度となる量で適用する。
【００４７】
細菌細胞およびウイルス粒子が並行して単離されなければならない場合、試料を、試料マトリックスを除去すべく低速（典型的には１００〜５００ｇ）で遠心分離することができる。そして上清を、ウイルスを沈殿させるのに適した成分で処理することができる。その後、クラスター化されたウイルスおよび細菌細胞を、典型的には１，０００〜２０，０００ｇで遠心分離により単離することができる。
【００４８】
段階的な遠心分離法は、ウイルスを単離するためだけでなく、細菌細胞または細胞壁に囲まれた細胞および一試料からのウイルスを単離するための、本発明の方法を使用するための一つの好ましい方法である。
細胞壁に囲まれた細胞およびウイルスは全く異なる性質を有するが、本発明による方法は、両方の種を並行して単離できる可能性を、但しこれらを順々にまたは同時に一緒に単離する可能性とともに、初めて提供することが見出された。
【００４９】
本発明に係る抽出溶液はまた、好ましくは細菌細胞のような細胞壁で囲まれた細胞の単離にも適している。二価の塩化物塩、好ましくはＭｇＣｌ２、および／またはイオン液体を含む抽出溶液は、生菌細胞を単離する可能性をを提供する。
【００５０】
用語「細胞壁で囲まれた細胞」は、環境への障壁として細胞壁を有するまたは含むことが知られている全ての細胞をさす。細胞壁を有する生物または細胞の例としては、細菌、古細菌、真菌、植物および藻類である。これに対して、動物やその他の多くの原生生物は細胞壁に囲まれるていない細胞膜を有する。
本明細書で用いられる場合、「生細胞」には、活性な代謝を有する細胞、好ましくは繁殖可能な、特に、複製可能な細胞が含まれる。
【００５１】
本発明の方法で単離される細菌細胞は、例えば、グラム陰性またはグラム陽性細胞、最も好ましくは、リステリア属、S. aureus、P. paratuberculosis、サルモネラ属またはC. jejuniからなる群から選択される。
【００５２】
試料／抽出溶液混合物を濾過するまたは篩にかける場合には、フィルター、篩またはゲルの孔のサイズを分離すべきウイルス粒子のサイズに適合させる際に、ウイルスを、前記フィルターの表面上に保持する。当然、また、様々な孔のサイズを有する異なるフィルターを用いた２以上の濾過工程を適用することが可能である。濾過工程の後に、ウイルスを、フィルター表面から洗浄することができる（例えばStevens KA and Jaykus L-A, Crit Rev Microbiol (2004) 30:7-24を参照）。溶解した試料の濾過は、複合試料が本発明の方法でほとんど溶解されないかまたは溶解されない材料を含む場合に特に求められる。
典型的に、これらの材料は、デンプンおよび／または繊維を含む。
【００５３】
しかし、ウイルスを溶解混合物から単離するための好ましい方法は、遠心分離または沈殿と組み合わされた遠心分離である。
【００５４】
当然、ウイルスを遠心分離工程の後に生成した分解ペレットから、単離されるウイルス上に存在するエピトープに対する抗体であって、特にビーズ、好ましくは磁気ビーズ上に固定したものを伴う免疫学的方法によって単離することもまた可能である。ウイルスを単離するための抗体ビーズを用いると、いくつかの場合において低下した回収率がもたらされるため、そのような方法を、好ましくは、主として定性的単離のために用いてもよい。      
【００５５】
試料の分解を促進するために、前記試料を、抽出溶液と共にインキュベーションする前に、例えばストマッカーを用いてホモジナイズすることができる。当該分解は、試料／抽出溶液混合物をインキュベーションの間に撹拌する場合、さらに支援および／または促進される。
【００５６】
インキュベーション工程を−試料マトリックスに依存して−１回または数回、例えば２回、３回、４回、５回または１０回繰り返してもよい。これらのインキュベーション工程の間に、ウイルスおよび残部試料マトリックスを上清から、例えば遠心分離によって分離してもよい。
【００５７】
本発明の方法を用いて単離されたウイルスを、試料中のウイルスを定量的におよび／または定性的に決定するために用い得る。これは、例えば、細胞計数によって、ＰＣＲ法によって、特にリアルタイムＰＣＲによって、レクチンを用いることによって、あるいはウイルスに選択的に結合する抗体、タンパク質または前記ウイルス粒子の表面構造に向けられたアプタマーを用いる方法（例えば粒子特異的ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ）によって達成することができる。
【００５８】
単離工程の後に、ウイルスを、好ましくは水、緩衝溶液および／または界面活性剤含有溶液で洗浄する。しかし、洗浄緩衝液に、１種または２種以上の追加の物質を加えることは、当然可能である。洗浄工程は、数回（例えば２回、３回、４回、５回もしくは１０回）繰り返してもよいし、または１回のみでもよい。洗浄工程の間に、ウイルスを、典型的には緩衝液中に再懸濁させ、次に濾過するかまたは遠心分離する。不溶性粒子が分解した試料中に存在する場合には（例えばチーズのリン酸カルシウム粒子）、前記粒子を、より低い回転速度における遠心分離によって、または粒子を長時間にわたって沈降させることによって除去することができる（ウイルスは、両方の場合において上清中に残留する）。
【００５９】
ウイルスをまた、界面活性剤含有溶液で洗浄してもよい。これによって、細胞懸濁液中に潜在的に含まれる脂肪残部をさらに除去することが可能になる。この方法工程において用いるべき好ましい界面活性剤は、脂肪除去のために通常用いられる界面活性剤である。      
【００６０】
本発明の好ましい態様において、試料中のウイルスの量を決定する。
試料中のウイルスの量を、当該分野において知られている任意の方法によって、特に例えば希釈系列、ファージ計数、リアルタイムＰＣＲ／リアルタイムＲＴ  ＰＣＲなどの方法によって決定することができる。
【００６１】
本発明の他の好ましい態様において、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡを単離する。
ウイルスに依存して、様々な方法を用いて、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、プラスミド）またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を抽出してもよい。すべてのこれらの方法は、当該分野において知られており、単一のプロトコルは、主として溶解するべきウイルスに依存する。      
【００６２】
単離手順の効率を決定するかまたはモニタリングするために、試料に、定められた量の対照ウイルスを添加することができる。対照ウイルスは、典型的には不活化ウイルス粒子である。好ましくは、それらは、試料中に存在すると推測されるウイルスに類似するが、それらは、好ましくは試料中に存在すると推測されるウイルスと同一ではない。回収した添加した対照ウイルスの量によって、本発明の方法の効率を決定することが可能になり、また最初の試料中に存在する、単離し、決定するべき細胞の量が示され得る。
【００６３】
本発明の１つの態様において、試料を、少なくとも１種のバイオポリマー分解酵素と共にさらにインキュベートする。
【００６４】
ウイルスを単離するいくつかの試料は、抽出溶液を加えることによって溶解され得ないかまたは非効率的な方式で溶解され得るに過ぎないバイオポリマーの構造を含む。試料、特に食物試料が、例えばコラーゲンおよび／またはデンプンを、例えば１０％を上回る量において含む場合には、前記試料を、それを本発明のマトリックス溶解系と共にインキュベートする前に、コラーゲンおよびデンプン内容物を少なくとも部分的に分解することが可能である物質で処理してもよい。
【００６５】
したがって、試料を、好ましくは少なくとも１種のバイオポリマー分解酵素と共にさらにインキュベートする。好ましくはバイオポリマー分解酵素と共にインキュベートする試料は、例えば肉、魚などである。アイスクリーム、卵、血液、牛乳、乳製品などは、通常はバイオポリマー分解酵素を加えることを必要としない。驚くべきことに、酵素を用いることのみによっては、ウイルスの単離は可能にならないことが判明した。
【００６６】
本明細書中で用いる用語「バイオポリマー」は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、セルロース、デンプンおよびグリコーゲンのような多糖類などを指す。したがって、「バイオポリマー分解酵素」は、水性緩衝液に不溶であり得るバイオポリマー（例えばデンプン、セルロース）を、低分子量の物質に、またはさらにモノマーに分解することができる酵素である。
【００６７】
バイオポリマー分解酵素が、特定のｐＨおよび温度条件下で活性であり得るため（特定の緩衝液の使用はまた、役割を果たし得る）、任意の条件下で前記酵素と共にインキュベーションを行うことが有利である。これらの条件は、用いる酵素に依存し、当該分野において知られている。また、インキュベーション時間は、外因性要因、例えばｐＨおよび温度に依存する。したがって、インキュベーション時間は、１０秒から６時間まで、好ましくは３０秒から２時間まで変動し得る。
【００６８】
バイオポリマー分解酵素は、好ましくはプロテアーゼ、セルラーゼおよびアミラーゼからなる群から選択される。これらの酵素の例は、Savinase 24 GTT(Subtilin)、Carenzyme 900T、Stainzyme GTである。デンプン分解酵素は、例えばシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼおよびイソアミラーゼ、特にα−アミラーゼである。
【００６９】
カオトロピック剤および界面活性剤を含む緩衝液を用いる既知の方法においては、カオトロープおよび界面活性剤が酵素活性に悪影響を及ぼし得、したがってバイオポリマーが断片またはモノマーに効率的に分解されないため、バイオポリマー分解酵素を、マトリックス溶解工程の間に加えることはできない。
【００７０】
これとは対照的に、抽出溶液中に二価の塩化物塩および／またはイオン液体が用いられる本発明の方法においては、バイオポリマー分解酵素を、工程ｂ）の前に、および／または工程ｂ）の間に、および／または工程ｃ）の後に、試料と共にインキュベートすることができる（工程ｂ）は、試料を抽出溶液と共にインキュベートする溶解工程であり、工程ｃ）は、単離工程である）。
【００７１】
本発明の方法を、数時間以内に、典型的には１〜６時間以内に行うことができる。
本発明において用いるイオン液体または液体塩は、有機カチオンおよび一般的には無機のアニオンからなるイオン種である。それらは、いかなる中性分子をも含まず、通常３７３Ｋより低い融点を有する。
【００７２】
イオン液体の分野は、潜在的な適用が多種多様であるため、現在集中的に研究されている。イオン液体に関する総説は、例えばR. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407；M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future”, Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398；P. Wasserscheid, W. Keim "Ionische Fluessigkeiten - neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids - Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945；T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis”, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083またはR. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227)である。
【００７３】
一般的に、当業者に知られている一般式Ｋ＋Ａ−で表されるすべてのイオン液体、特に水と混和性であるものは、本発明の方法において好適である。
【００７４】
イオン液体のアニオンＡ−は、好ましくはハライド、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、シアナミド、チオシアネートまたは一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−で表される、もしくは一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−で表されるイミドを含む群から選択され、ここでＲｆは、１〜８個のＣ原子を有する部分的に、または完全にフッ素置換されたアルキルを示し、Ｘは、ＳＯ２またはＣＯを示す。ここでのハロゲン化物アニオンは、塩化物、臭化物およびヨウ化物アニオンから、好ましくは塩化物および臭化物アニオンから選択され得る。イオン液体のアニオンＡ−は、好ましくはハロゲン化物アニオン、特に臭化物もしくはヨウ化物アニオン、またはテトラフルオロボレートもしくはシアナミド、もしくはチオシアネートであり、最も好ましくは、チオシアネートである。
【００７５】
イオン液体のカチオンＫ＋の選択に関しては制限自体がない。しかし、好ましいのは、有機カチオン、特に好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジニウムカチオンまたは複素環式カチオンである。
【００７６】
アンモニウムカチオンを、例えば式（１）
［ＮＲ４］＋      （１）
によって記載することができ、ここで
Ｒは、各々の場合において、互いに独立して以下のものを示す、
Ｈ、ここですべての置換基Ｒは、同時にはＨではない、
ＯＲ’、ＮＲ’２、ただし、式（１）中の置換基Ｒは、最大で１つのＯＲ’、ＮＲ’２である、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する直鎖状または分枝状アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する直鎖状または分枝状アルキニル、
【００７７】
１〜６個のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７個のＣ原子を有する飽和の、部分的に、または完全に不飽和のシクロアルキル、ここで１つまたは２つ以上のＲは、ハロゲンによって、特に−Ｆおよび／もしくは−Ｃｌによって部分的に、もしくは完全に、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって部分的に置換されていてもよく、またここで、α位にはないＲ中の１つまたは２つの隣接していない炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択された原子および／または原子団によって置き換えられていてもよく、ここで−Ｒ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルであり得、Ｘ＝ハロゲンであり得る。
【００７８】
ホスホニウムカチオンを、例えば式（２）
［ＰＲ２４］＋      （２）
によって記載することができ、ここで
Ｒは、各々の場合において、互いに独立して以下のものを示す、
Ｈ、ＯＲ’またはＮＲ’２を示し、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する直鎖状または分枝状アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する直鎖状または分枝状アルキニル、
【００７９】
１〜６個のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７個のＣ原子を有する飽和の、部分的に、または完全に不飽和のシクロアルキル、ここで１つまたは２つ以上のＲ２は、ハロゲンによって、特に−Ｆおよび／もしくは−Ｃｌによって部分的に、もしくは完全に、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって部分的に置換されていてもよく、またここで、α位にはないＲ２中の１つまたは２つの隣接していない炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択された原子および／または原子団によって置き換えられていてもよく、ここで−Ｒ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルであり、Ｘ＝ハロゲンである。
【００８０】
しかし、すべての４つまたは３つの置換基ＲおよびＲ２がハロゲンによって完全に置換されている、式（１）および（２）で表されるカチオン、例えばトリス（トリフルオロメチル）メチルアンモニウムカチオン、テトラ（トリフルオロメチル）アンモニウムカチオンまたはテトラ（ノナフルオロブチル）アンモニウムカチオンは、除外される。
【００８１】
ウロニウムカチオンを、例えば式（３）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋      （３）
によって記載することができ、チオウロニウムカチオンを、式（４）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋      （４）
によって記載することができ、ここで
Ｒ３〜Ｒ７は、各々、互いに独立して以下のものを示す、
水素、ここで水素は、Ｒ５については除外される、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する直鎖状または分枝状アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する直鎖状または分枝状アルキニル、
【００８２】
１〜６個のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７個のＣ原子を有する飽和の、部分的に、または完全に不飽和のシクロアルキル、ここで１つまたは２つ以上の置換基Ｒ３〜Ｒ７は、ハロゲンによって、特に−Ｆおよび／もしくは−Ｃｌによって部分的に、もしくは完全に、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって部分的に置換されていてもよく、またここで、α位にはないＲ３〜Ｒ７中の１つまたは２つの隣接していない炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択された原子および／または原子団によって置き換えられていてもよく、ここで−Ｒ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルであり、Ｘ＝ハロゲンである。
【００８３】
グアニジニウムカチオンを、式（５）
［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋      （５）
によって記載することができ、ここで
Ｒ８〜Ｒ１３は、各々、互いに独立して以下のものを示す、
水素、−ＣＮ、ＮＲ’２、−ＯＲ’
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する直鎖状または分枝状アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する直鎖状または分枝状アルキニル、
【００８４】
１〜６個のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７個のＣ原子を有する飽和の、部分的に、または完全に不飽和のシクロアルキル、ここで１つまたは２つ以上の置換基Ｒ８〜Ｒ１３は、ハロゲンによって、特に−Ｆおよび／もしくは−Ｃｌによって部分的に、もしくは完全に、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって部分的に置換されていてもよく、またここで、α位にはないＲ８〜Ｒ１３中の１つまたは２つの隣接していない炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択された原子および／または原子団によって置き換えられていてもよく、ここで−Ｒ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルであり、Ｘ＝ハロゲンである。
【００８５】
さらに、一般式（６）
［ＨｅｔＮ］＋      （６）、
式中
ＨｅｔＮ＋は、以下の群
【化１】
2013502206.tif 000002
【００８６】
【化２】
2013502206.tif 000003
から選択された複素環式カチオンを示す、
で表されるカチオンを用いることが可能であり、
【００８７】
ここで、置換基
Ｒ１’〜Ｒ４’は、各々、互いに独立して
水素、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する直鎖状または分枝状アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する直鎖状または分枝状アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有し、１〜６個のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、飽和の、部分的に、または完全に不飽和のシクロアルキル、
飽和の、部分的に、または完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル
を示し、
【００８８】
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’は、一緒にまた環系を形成してもよく、
ここで、１つまたは２つ以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、ハロゲン、特に−Ｆおよび／もしくは−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって部分的に、または完全に置換されていてもよいが、ここでＲ１’およびＲ４’は、同時にはハロゲンによって完全には置換され得ず、またここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロ原子に結合していない１個または２個の隣接していない炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択された原子および／または原子団によって置き換えられていてもよく、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルであり、Ｘ＝ハロゲンである。
【００８９】
本発明の目的のために、完全に不飽和の置換基はまた、芳香族置換基を意味するものと解釈される。
本発明において、式（１）〜（５）で表される化合物の好適な置換基ＲおよびＲ２〜Ｒ１３は、水素以外には、好ましくは以下のものである：Ｃ１〜Ｃ２０、特にＣ１〜Ｃ１４アルキル基、およびＣ１〜Ｃ６アルキル基によって置換されていてもよい飽和の、または不飽和の、即ちまた芳香族のＣ３〜Ｃ７シクロアルキル基、特にフェニル。
【００９０】
式（１）または（２）で表される化合物中の置換基ＲおよびＲ２は、ここで同一であっても異なっていてもよい。置換基ＲおよびＲ２は、好ましくは異なっている。
置換基ＲおよびＲ２は、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルまたはテトラデシルである。
【００９１】
グアニジニウムカチオン［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋の４つまでの置換基はまた、単環式、二環式または多環式カチオンを形成するように、対になって結合していてもよい。
【００９２】
一般性を制限せずに、そのようなグアニジニウムカチオンの例は、以下のものであり：
【化３】
2013502206.tif 000004
式中、置換基Ｒ８〜Ｒ１０およびＲ１３は、上記に示した意味または特に好ましい意味を有することができる。
【００９３】
所望により、上記に示したグアニジニウムカチオンの炭素環式または複素環式環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２Ｘ’またはＳＯ３Ｈによって置換されていてもよく、ここでＸおよびＲ’は、上記に示した意味、置換されたか、もしくは非置換のフェニルまたは非置換の、もしくは置換された複素環を有する。
【００９４】
ウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋またはチオウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋の４つまでの置換基はまた、単環式、二環式または多環式カチオンを形成するように、対になって結合していてもよい。
【００９５】
一般性を制限せずに、そのようなカチオンの例を、以下に示し、式中Ｙ＝ＯまたはＳであり：
【化４】
2013502206.tif 000005
式中、置換基Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、上記に示した意味または特に好ましい意味を有することができる。
【００９６】
所望により、上記に示したカチオンの炭素環式または複素環式環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２Ｘ’もしくはＳＯ３Ｈまたは置換された、もしくは非置換のフェニル、または非置換の、もしくは置換された複素環によって置換されていてもよく、ここでＸおよびＲ’は、上記に示した意味を有する。
【００９７】
置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、各々、互いに独立して、好ましくは１〜１０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル基である。式（３）〜（５）で表される化合物中の置換基Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ１０およびＲ１１ならびにＲ１２およびＲ１３は、同一であっても異なっていてもよい。Ｒ３〜Ｒ１３は、特に好ましくは、各々、互いに独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フェニルまたはシクロヘキシル、極めて特に好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチルである。
【００９８】
本発明において、式（６）で表される化合物の好適な置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、水素以外には、好ましくは以下のものである：Ｃ１〜Ｃ２０、特にＣ１〜Ｃ１２アルキル基、およびＣ１〜Ｃ６アルキル基によって置換されていてもよい飽和の、または不飽和の、即ちまた芳香族のＣ３〜Ｃ７シクロアルキル基、特にフェニル。
【００９９】
置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、各々、互いに独立して、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。それらは、極めて特に好ましくはメチル、エチル、ｎ−ブチルまたはヘキシルである。ピロリジニウム、ピペリジニウムまたはインドリニウム化合物中で、２つの置換基Ｒ１’およびＲ４’は、好ましくは異なっている。
【０１００】
置換基Ｒ２’またはＲ３’は、各々の場合において、互いに独立して、特に水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。Ｒ２’は、特に好ましくは水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。Ｒ２’およびＲ３’は、極めて特に好ましくは水素である。
【０１０１】
Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基は、例えばメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、さらにまたペンチル、１−、２−もしくは３−メチルブチル、１，１−、１，２−もしくは２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルである。任意にジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピルまたはノナフルオロブチルである。
【０１０２】
複数の二重結合がまた存在してもよい、２〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルケニルは、例えばアリル、２−または３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに４−ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、−Ｃ９Ｈ１７、−Ｃ１０Ｈ１９〜−Ｃ２０Ｈ３９；好ましくはアリル、２−または３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに好ましくは４−ペンテニル、イソペンテニルまたはヘキセニルである。
【０１０３】
複数の三重結合がまた存在してもよい、２〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキニルは、例えばエチニル、１−または２−プロピニル、２−または３−ブチニル、さらに４−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、−Ｃ９Ｈ１５、−Ｃ１０Ｈ１７〜−Ｃ２０Ｈ３７、好ましくはエチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、４−ペンチニル、３−ペンチニルまたはヘキシニルである。
【０１０４】
アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、例えばベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチルまたはフェニルヘキシルを示し、ここでフェニル環およびまたアルキレン鎖は共に、上記のようにハロゲン、特に−Ｆおよび／もしくは−Ｃｌによって部分的にもしくは完全に、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって部分的に置換されていてもよい。
【０１０５】
３〜７個のＣ原子を有する、非置換の飽和の、または部分的に、もしくは完全に不飽和のシクロアルキル基は、したがってシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタ−１，３−ジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサ−１，３−ジエニル、シクロヘキサ−１，４−ジエニル、フェニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタ−１，３−ジエニル、シクロヘプタ−１，４−ジエニルまたはシクロヘプタ−１，５−ジエニルであり、その各々は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基によって置換されていてもよく、ここでシクロアルキル基またはＣ１〜Ｃ６アルキル基によって置換されたシクロアルキル基は、同様にまたハロゲン原子、例えばＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、特にＦもしくはＣｌによって、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２によって置換されていてもよい。
【０１０６】
置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’において、ヘテロ原子に対してα位において結合していない１つまたは２つの隣接していない炭素原子はまた、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択された原子および／または原子団によって置き換えられていてもよく、ここでＲ’＝フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルである。
【０１０７】
一般性を制限せずに、このようにして修飾された置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３およびＲ１’〜Ｒ４’の例は、以下のものである：
−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４ＳＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−Ｏ−Ｃ４Ｈ９、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−Ｃ４Ｆ９、−Ｃ（ＣＦ３）３、−ＣＦ２ＳＯ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ４Ｎ（Ｃ２Ｆ５）Ｃ２Ｆ５、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ２Ｈ３、−Ｃ３ＦＨ６、−ＣＨ２Ｃ３Ｆ７、−Ｃ（ＣＦＨ２）３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５またはＰ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２。
【０１０８】
Ｒ’において、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルは、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。
【０１０９】
Ｒ’において、置換フェニルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈによって置換されているフェニルを示し、ここでＸ’は、Ｆ、ＣｌまたはＢｒを示し、Ｒ’’は、Ｒ’について定義したようにフッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキル、例えばｏ−、ｍ−またはｐ−メチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメチル）フェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメチルスルホニル）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ヨードフェニル、
【０１１０】
さらに好ましくは２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジヒドロキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジブロモフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメトキシフェニル、５−フルオロ−２−メチルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニルまたは２，４，５−トリメチルフェニルを示す。
【０１１１】
Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロアリールは、５〜１３個の環要素を有する飽和の、または不飽和の単環式の、または二環式の複素環式ラジカルを意味するものと解釈され、ここで１個、２個もしくは３個のＮおよび／または１個もしくは２個のＳもしくはＯ原子が、存在してもよく、複素環式ラジカルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈによって単置換または多置換されていてもよく、ここでＸ’およびＲ’’は、上記に示した意味を有する。
【０１１２】
複素環式ラジカルは、好ましくは置換されているか、または非置換の２−または３−フリル、２−または３−チエニル、１−、２−または３−ピロリル、１−、２−、４−または５−イミダゾリル、３−、４−または５−ピラゾリル、２−、４−または５−オキサゾリル、３−、４−または５−イソキサゾリル、２−、４−または５−チアゾリル、３−、４−または５−イソチアゾリル、２−、３−または４−ピリジル、２−、４−、５−または６−ピリミジニル、
【０１１３】
さらに好ましくは１，２，３−トリアゾール−１−、−４−もしくは−５−イル、１，２，４−トリアゾール−１−、−４−もしくは−５−イル、１−もしくは５−テトラゾリル、１，２，３−オキサジアゾール−４−もしくは−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−もしくは−５−イル、１，３，４−チアジアゾール−２−もしくは−５−イル、１，２，４−チアジアゾール−３−もしくは−５−イル、１，２，３−チアジアゾール−４−もしくは−５−イル、２−、３−、４−、５−もしくは６−２Ｈ−チオピラニル、２−、３−もしくは４−４Ｈ−チオピラニル、３−もしくは４−ピリダジニル、ピラジニル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチエニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−１Ｈ−インドリル、１−、２−、４−もしくは５−ベンズイミダゾリル、１−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾピラゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾキサゾリル、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンズイソキサゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチアゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンズイソチアゾリル、４−、５−、６−もしくは７−ベンズ−２，１，３−オキサジアゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キノリニル、１−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−イソキノリニル、１−、２−、３−、４−もしくは９−カルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−もしくは９−アクリジニル、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−シンノリニル、２−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キナゾリニルまたは１−、２−もしくは３−ピロリジニルである。
【０１１４】
ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルと同様に、例えばピリジニルメチル、ピリジニルエチル、ピリジニルプロピル、ピリジニルブチル、ピリジニルペンチル、ピリジニルヘキシルを意味するものと解釈され、ここで上記の複素環式ラジカルは、さらにこのようにしてアルキレン鎖に結合していてもよい。
【０１１５】
ＨｅｔＮ＋は、好ましくは
【化５】
2013502206.tif 000006
であり、
【０１１６】
ここで置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、各々、互いに独立して上記の意味を有する。モルホリニウムおよびイミダゾリウムカチオンは、本発明において特に好ましく、ここで前記カチオン中のＲ１’〜Ｒ４’は、特に、各々の場合において互いに独立して、水素、１〜２０個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、ここで１つまたは２つ以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、−ＯＨまたは−ＯＲ’によって部分的に置換されていてもよく、ここでＲ１’＝フッ素化されていない、部分的にフッ素化された、またはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、非置換の、または置換されたフェニルである。
【０１１７】
本発明のイオン液体のカチオンは、好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウムまたはモルホリニウムカチオンであり、最も好ましいのはイミダゾリウムカチオンである。
【０１１８】
好ましいアンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウムまたはモルホリニウムカチオンの極めて特に好ましい置換基Ｒ、Ｒ２、Ｒ１’〜Ｒ４’は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、デシル、ドデシル、オクタデシル、エトキシエチル、メトキシエチル、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基から選択される。
【０１１９】
イミダゾリウムカチオンが、官能基によって、例えば、様々な酸化状態が可能である窒素、硫黄および／またはリンを含む基によってそれら自体置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アリールおよび／またはアラルキル基によって置換されているのが好ましい。本発明のこれらの官能基の好ましい例は、以下のものである：アミン、カルボキシル、カルボニル、アルデヒド、ヒドロキシ、サルフェート、スルホネートおよび／またはホスフェート基。
【０１２０】
イミダゾリウム環のＮ原子の一方または両方は、同一であるかまたは異なる置換基によって置換され得る。好ましくは、イミダゾリウム環の両方の窒素原子は、同一であるかまたは異なる置換基によって置換されている。
また、本発明において、イミダゾリウム塩が、１個または２個以上のイミダゾリウム環の炭素原子にてさらに、または独占的に置換されている（exclusively substituted）のが、可能であるかまたは好ましい。
【０１２１】
置換基として好ましいのは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよび／またはイソブチル基である。また好ましい置換基は、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル基、例えばエチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレンおよび／またはイソブチレンであり、また４個より多いＣ原子を有するアルキルおよびアルケニル置換基が含まれ、ここで例えばまたＣ５〜Ｃ１０アルキルまたはアルケニル置換基が、なお好ましい。イオン液体の可溶性のために、これらのＣ５〜Ｃ１０アルキルまたはアルケニル基が、１つまたは２つ以上の他の置換基、例えばホスフェート、スルホネート、アミノおよび／またはホスフェート基を、それらのアルキルおよび／またはアルケニル基にて有することが、好ましい場合がある。
【０１２２】
アリール置換基として、本発明において、単環式および／または二環式アリール基、フェニル、ビフェニルおよび／またはナフタレン、ならびにヒドロキシ、スルホネート、サルフェート、アミノ、アルデヒド、カルボニルおよび／またはカルボキシ基を担持するこれらの化合物の誘導体が好ましい。好ましいアリール置換基の例は、フェノール、ビフェニル、ビフェノール、ナフタレン、ナフタレンカルボン酸、ナフタレンスルホン酸、ビフェニロール(biphenylol)、ビフェニルカルボン酸、フェノール、フェニルスルホネートおよび／またはフェノールスルホン酸である。
【０１２３】
イミダゾリウムチオシアネート、ジシアナミド、テトラフルオロボレート、ヨウ化物、塩化物、臭化物またはヘキサフルオロホスフェートは、本発明の方法において極めて特に好ましく用いられ、ここで１−デシル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムヨージド、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムヨージド、
【０１２４】
１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムヨージド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムヨージド、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、
【０１２５】
１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヨージド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムヨージド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミドは、本発明の方法において特に好ましい。
【０１２６】
最も好ましいのは、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミドである。
【０１２７】
本発明において用いるイオン液体は、好ましくは液体であり、即ち、好ましくは、それらは、室温（約２５℃）にてイオン性である液体である。しかし、また室温にて液体でないが、本発明の方法を行う温度において液体形態で存在するか、または抽出溶液に可溶であるようなイオン液体を用いることができる。
【０１２８】
本発明の他の側面は、細胞を複合マトリックスから単離するための抽出溶液であって、少なくとも：
・二価の塩化物塩および／またはイオン液体
を典型的には水および／または水性緩衝液中に含む、前記抽出溶液に関する。
【０１２９】
ＭｇＣｌ２などの二価の塩化物塩は−存在する場合には−典型的に、０．５〜６Ｍ、好ましくは０．５〜４Ｍ、より好ましくは１〜２Ｍの濃度で存在する。
【０１３０】
ＺｎＣｌ２もまた、その非常に高い水溶性のために、より高い濃度で用いることができる。それは最大濃度約１５Ｍまで用いることができる。好ましいＺｎＣｌ２の濃度は、１〜１０Ｍである。これは、非常に特異的な抽出条件を作成し、勾配遠心分離のために抽出溶液を直接用いる可能性を提供する。
【０１３１】
イオン液体は−存在する場合には−典型的に、混合物の重量を基準として０．５〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％、より好ましくは７〜４０重量％の濃度において存在する。イオン液体は、１種のイオン液体または２種もしくはそれ以上のイオン液体の混合物であることができる。
【０１３２】
本発明の抽出溶液は、水溶液または緩衝溶液である。それは、通常、５より大きく１１未満、好ましくは６より大きく９未満、より好ましくは６．５と７．５との間のｐＨ値を有する。抽出溶液は、さらに、エタノールのような１種または２種以上の水混和性有機溶媒を最大２０％までさらに含み得る。
抽出溶液はまた、例えば界面活性剤のような追加の成分もまた含んでもよい。
【０１３３】
本発明の緩衝液は、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ＴＲＩＳ）緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ）、ＴＲＩＳ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＡＣＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびトリシンの群から選択される。好ましい緩衝液はＰＢＳおよびトリシンである。
【０１３４】
さらに、本発明の他の側面は、ウイルスを複合マトリックスから単離するためのキットであって、以下のもの：
・本発明の抽出溶液および
・少なくとも１種のバイオポリマー分解酵素（上記を参照）
を含む、前記キットに関する。
【０１３５】
本発明の好ましい態様において、少なくとも１種のバイオポリマー分解酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼおよびアミラーゼ、好ましくはα−アミラーゼからなる群から選択される。
【０１３６】
本発明の方法およびキットは、極めて穏やかであり、有効なマトリックス溶解系を提供する。抽出溶液は、標的ウイルスに影響せずに、例えば食物分析において典型的な、ほとんどの複合試料のマトリックスを有効に溶解する。かなり穏やかなマトリックス溶解条件にもかかわらず、極めて小さいウイルスさえも複合試料から単離することができる。
【０１３７】
公知の単離方法とは対照的に、本発明に係る方法は、試料が固相に結合されまたは追加の抽出試薬で処理する如何なる追加の工程も含まない。特に、本発明に係る方法には、ウイルス粒子および／またはマトリックスが固相に結合される工程を含まない。唯一の除外は、例えば、遠心分離による抽出および単離後にウイルスを固相へ結合する可能性である。      
【０１３８】
それは、本発明の方法が、好ましくは以下の工程のみを有することを意味する：
ａ）複合試料を提供すること、
ｂ）前記試料を少なくとも二価の塩化物塩および／またはイオン液体を含む抽出溶液でインキュベートすること、
ｃ）好ましくは遠心分離、親和性結合および／または濾過により、工程ｂ）の混合物からウイルスを単離すること、
ここで、工程ａ）と工程ｂ）との間、工程ｂ）と工程ｃ）との間には、固相への結合、追加の抽出溶液または試薬を用いた処理などの工程が行われない。
【０１３９】
したがって、本発明の方法およびキットは、ウイルスを複合試料から単離する単純かつ迅速な方法を提供し−高感度の検出方法、例えばリアルタイムＰＣＲ、と組み合わせて−食物、臨床的な、および他の複合試料中の病原体の迅速かつ高感度の検出が可能になる。
【０１４０】
本発明の方法は、典型的には、１０％より多い回収率を有する。これは、典型的には試料中に存在するウイルスの１０％より多くが、本発明に係る方法により単離することができることを意味する。手順の最適化は、容易に２０％以上の回収率につなげられる。本発明に係る方法を行う前に、定められた量のウイルスを試料へ添加することにより、回収率を決定することができる。
【０１４１】
本発明による方法の一つの重要な利点は、試料マトリックスの量が有意に低減されることにある。複合試料の試料マトリックスには、例えば１種または２種以上の以下の構成要素を含んでもよい：ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（酵素をも含む）、炭水化物（複合および単純糖質）、脂質、脂肪酸、脂肪、核酸など。複合試料マトリックスは、しばしば分析方法を妨害するか、試料を分析するための分子生物学的方法の適用を不可能にもする。本発明による方法を用いて、試料マトリックスの少なくとも部分的な溶解が可能であり、試料マトリックスの量の低減がウイルス汚染のさらなる分析を実行する可能性を提供する。  
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
本発明を、以下の図面および例によってさらに例示するが、それには限定されない。
【図１】図１は、本発明の方法を、複合試料、例えば食物試料中のウイルスを（定性的におよび／または定量的に）検出するために用いる場合に行うことができる手順の工程について、１つの例示的なフロースキームを示す。
【０１４３】
【図２】図２は、本発明の方法において、ＺｎＣｌ２を含む抽出溶液を適用する場合に行うことができる手順の工程について、１つの例示的なフロースキームを示す。
【０１４４】
【図３】図３は、本発明の方法において、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネートのようなイオン液体を含む抽出溶液を適用する場合に行うことができる手順の工程について、１つの例示的なフロースキームを示す。
【０１４５】
本明細書中で引用したすべての出願、特許明細書および刊行物、ならびに２００９年８月１７日に出願した対応するＥＰ出願EP 09010584.2の開示全体は、本出願中に参照によって組込まれる。
【０１４６】
例
例Ｉ：チーズ試料からのバクテリオファージＭＳ２の分離
Dreierらに従い、バクテリオファージＭＳ２と病原性ロタウイルスおよびノロウイルスとの物理的および化学的性質の類似性のために、バクテリオファージＭＳ２をノロウイルスおよびロタウイルスのモデル粒子として用いた。病原性ウイルスとは対照的に、ＭＳ２は取り扱いが容易であり、特別な安全要求事項は必要なく、ノロウイルスおよびロタウイルスには必要である真核生物の細胞株のための細胞培養において用いられるような特殊な装置は、大腸菌の繁殖では必要とされない。
【０１４７】
マトリックスの溶解およびウイルス分離
チーズ（ゴーダ）３グラムを、５００μＬ  ＭＳ２−ファージ溶液（１０１０  ＰＦＵ  ｍｌ−１）を接種する。溶解緩衝液（１Ｍ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリシン）を２５ｍｌの最終容量まで添加する。試料をストマッキングすることでホモジナイズし、３７℃で３０分間インキュベートし、残りの食物の残骸を分離すべく４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。ＭｇＣｌ２を４Ｍの最終濃度になるように上清７５０μｌに添加する。試料をボルテックスすることにより混合し、１時間１４０００ｒｐｍで遠心分離する。得られたペレットを、ＲＮＡ単離のために用いる。
【０１４８】
PureLink（登録商標）Viral RNA/ DNA Mini Kit（Invitrogen）を製造元の指示に従って用いる。溶解を増強するために、プロテイナーゼＫ工程を一晩行う。シリカに結合したＲＮＡを２０μｌの水で溶出する。プロセス対照およびリアルタイムＰＣＲの標準として、ＲＮＡの１５μｌ  ＭＳ２−ファージ溶液（１０１０  ＰＦＵ  ｍｌ−１）を単離する。
【０１４９】
ｃＤＮＡ合成のために、製造元の指示に従って、ＲＮＡ１μｌをクローン化ＡＭＶ逆転写酵素（Invitrogen）で転写する。１０μｌの合計容量の代わりに、２０μｌが生成される。
逆転写（ＭＳ２−ＴＭ−Ｒ）に用いられたプライマーおよびＰＣＲに用いられたプライマーは、ＭＳ２のレプリカーゼ遺伝子特異的であり、Dreier et al. 2005に記載されたものである。
【０１５０】
TaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲのために、ｃＤＮＡの１：２希釈５μｌを、１×ＰＣＲ緩衝液（Invitrogen）、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｎＭのプライマー（Dreier et al. 2005に記載されたＭＳ２−ＴＭ−Ｆ、ＭＳ２−ＴＭ−Ｒ）、２５０ｎＭ  ＦＡＭ標識化TaqMan（登録商標）プローブ（Dreier et al. 2005、但しＦＡＭ標識化されている）、０．８ｍＭ  ＮＴＰ（Thermo Scientific）および０．２μｌPlatinum TaqＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を含む反応混合物２０μｌに追加する。リアルタイムＰＣＲを、以下のようにＭＸ３０００Ｐ（Stratagene）サーモサイクラーで行う：９４℃で５分間変性、その後９４℃で２０秒を４５サイクル、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、そして７２℃で２分間の最終伸長工程。試料、対照および陰性対照を、二重で行う。
【０１５１】
対照として、段階希釈（１０−１〜１０−３）を用いる。
実験データ分析のため、プロセス対照および試料のＣｔ−値を比較する。試料および対照のＣｔ−値を表１に示す。１対数は約３．５Ｃｔ値なので、ＭＳ２の回収は１／２対数に相当する。対照および試料の違いは、約２５％の回収に相当する。
【表１】
2013502206.tif 000007
溶解緩衝液（１Ｍ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭトリシン）における溶解工程の間の、適用食物マトリックス（ゴーダチーズ）の当初３グラムからの減少で、遠心分離後に約１５〜２５μｌ容量のペレットを生じた。
【０１５２】
例ＩＩ：チーズ試料からのバクテリオファージＭＳ２の分離
マトリックスの溶解およびウイルスの単離
６．５グラムのチーズ（ゴーダ）の試料の接種のために、１ｍｌ  ＭＳ２−ファージ（１０１０  ＰＦＵ  ＭＬ−１）を用いる。溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、７．５％  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート）を４５ｍｌの最終容量まで添加する。試料をストマッキングすることによりホモジナイズし、３７℃で３０分間インキュベートして、３２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
４Ｍ  ＭｇＣｌ２の０．５ｍｌの量を、上清１ｍｌに添加する。試料を、ボルテックスすることにより混合し、１時間１４０００ｒｐｍで遠心分離する。得られたペレットをＲＮＡ単離のために用いる。
【０１５３】
PureLink（登録商標）Viral RNA/ DNA Mini Kit（Invitrogen）を製造元の指示に従って用いる。溶解を増強するために、プロテイナーゼＫ工程を一晩行う。シリカに結合したＲＮＡを２０μｌの水で溶出する。プロセス対照およびリアルタイムＰＣＲの標準として、ＲＮＡの２２．２μｌ  ＭＳ２−ファージ溶液（１０１０  ＰＦＵ  ｍｌ−１）を単離する。
ｃＤＮＡ合成のために、製造元の指示に従って、ＲＮＡ１μｌをクローン化ＡＭＶ逆転写酵素（Invitrogen）で転写する。逆転写（ＭＳ２−ＴＭ−Ｒ）に用いられたプライマーおよびＰＣＲに用いられたプライマーは、ＭＳ２のレプリカーゼ遺伝子特異的であり、Dreier et al. 2005に記載されたものである。
【０１５４】
ｃＤＮＡ５μｌを、１×ＰＣＲ緩衝液（Invitrogen）、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｎＭのプライマー（Dreier et al. 2005に記載されたＭＳ２−ＴＭ−Ｆ、ＭＳ２−ＴＭ−Ｒ）、２５０ｎＭ  ＦＡＭ標識化TaqMan（登録商標）プローブ（Dreier et al. 2005、但しＦＡＭ標識化されている）、０．８ｍＭ  ＮＴＰ（Thermo Scientific）および０．２μｌPlatinum TaqＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を含む反応混合物２０μｌに追加する。リアルタイムＰＣＲを、以下のようにＭＸ３０００Ｐ（Stratagene）サーモサイクラーで行う：９４℃で５分間変性、その後９４℃で２０秒を４５サイクル、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、そして７２℃で２分間の最終伸長工程。試料、対照および陰性対照を二重に用いる。
【０１５５】
実験データ分析のため、プロセス対照および試料のＣｔ−値を比較する。試料および対照のＣｔ−値を表２に示す。１対数は約３．５Ｃｔ値なので、対照および試料の違いは、約１７％の回収に相当する。
【表２】
2013502206.tif 000008
溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、７．５％１−エチル−３−メチルイミダゾリウムチオシアネート）における溶解工程の間の、適用食物マトリックス（ゴーダチーズ）の当初３グラムからの減少で、遠心分離後に約５０〜１００μｌ容量のペレットを生じた。
【０１５６】
例ＩＩＩ：卵試料からのバクテリオファージＭＳ２の分離
溶解緩衝液（１Ｍ  ＭｇＣｌおよび５０ｍＭトリシン）および卵試料６．５グラムの最終的なボリューム４５ｍｌをストマッキングにより混合する。混合物５００μＬを６００μｌのＭＳ２−ファージ溶液（１０１０  ＰＦＵ  ＭＬ−１）とともに接種し、３７℃で３０分間インキュベートし、３２００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。その後、ＺｎＣｌ２（２Ｍ最終濃度）を上清に添加し、３０℃で１５分間インキュベートする。試料を、１４０００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、得られたペレットをＲＮＡ単離のために用いる。
【０１５７】
PureLink（登録商標）Viral RNA/ DNA Mini Kit（Invitrogen）を、ペレットのＲＮＡの単離およびプロセス対照のために、製造元の指示に従って用いる。シリカに結合したＲＮＡを２０μｌの水で溶出する。ｃＤＮＡ合成のために、製造元の指示に従って、ＲＮＡ１μｌをクローン化ＡＭＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で転写するが、２０μｌのｃＤＮＡの代わりに、８μｌの合計量が生成された。逆転写（ＭＳ２−ＴＭ−Ｒ）に用いられたプライマーおよびＰＣＲに用いられたプライマーは、ＭＳ２のレプリカーゼ遺伝子特異的であり、Dreier et al. 2005に記載されたものである。
【０１５８】
TaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲのために、ｃＤＮＡ  ５μｌを、１×ＰＣＲ緩衝液（Invitrogen）、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｎＭのプライマー（Dreier et al. 2005に記載されたＭＳ２−ＴＭ−Ｆ、ＭＳ２−ＴＭ−Ｒ）、２５０ｎＭ  ＦＡＭ標識化TaqMan（登録商標）プローブ（Dreier et al. 2005、但しＦＡＭ標識化されている）、０．８ｍＭ  ＮＴＰ（Thermo Scientific）および０．２μｌPlatinum TaqＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を含む反応混合物２０μｌに追加する。
【０１５９】
リアルタイムＰＣＲを、以下のようにＭＸ３０００Ｐ（Stratagene）サーモサイクラーで行う：９４℃で５分間変性、その後９４℃で２０秒を４５サイクル、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、そして７２℃で２分間の最終伸長工程。試料、対照および陰性対照を二重で用いる。
【０１６０】
実験データ分析のため、プロセス対照および試料のリアルタイムＰＣＲ後に得られた複製数を比較する。試料において１．９４Ｅ＋０８複製数が見られ、プロセス対照において７．３７Ｅ＋０８複製数が見られた。したがって、プロセス対照と比較した試料の回収率は２６．３％である。
溶解緩衝液（１Ｍ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭトリシン）における溶解工程の間の、適用食物マトリックス（卵）の当初６．５グラムからの減少で、遠心分離後に約１５〜２５μｌ容量のペレットを生じた。
【図１】
2013502206.tif 000009
【図２】
2013502206.tif 000010
【図３】
2013502206.tif 000011
【国際調査報告】
2013502206.tif 000012
2013502206.tif 000013
2013502206.tif 000014
2013502206.tif 000015