(57)【要約】  本発明は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはフラグメントの組成物および使用方法を提供する。好ましくは、この抗体はＩＧＦ−１Ｒに結合するが、ＩＲには結合せず；ＩＧＦ−１Ｒのアゴニストではなく；単離されたＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合をブロックせず；無傷細胞におけるＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化を効果的に中和し；ＩＧＦ−１ＲへのＲ１抗体の結合をブロックする。この抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＤＹＹＭＹ（配列番号：１）、ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号：２）およびＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ（配列番号：３）および軽鎖ＣＤＲ配列ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ（配列番号：４）、ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号：５）およびＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号：６）を含む、マウスＲ１抗体、キメラＲ１抗体、ヒト化Ｒ１抗体またはヒトＲ１抗体とすることができる。好ましくは、この抗体は、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部（残基１５１−２２２）を含む、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、癌などの種々の疾患の診断または治療に利用することができる。【選択図】図１３Ｂ
2013516996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基１５１から２２２の間のＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する抗ＩＧＦ−１Ｒ（インスリン様増殖因子１型受容体）抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体が、（ｉ）ヒトＩＧＦ−１Ｒには結合するが、ヒトインスリン受容体
（ＩＲ）には結合しない；（ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒのアゴニストではない；（ｉｉｉ）ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の単離されたＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックしない；
（ｉｖ）無傷細胞において、ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化を中和する；および（ｖ）可変領域配列の配列番号：９および配列番号：１０を含むｈＲ１抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックする、から成る群から選択される機能特性を少なくとも１つ発揮する請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、単離されたＩＧＦ−１Ｒへの結合について、
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体２４−３１、２４−５７、１７−６９、１−２、１Ｈ７、２Ｃ８または３Ｂ７と競合しない、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、単離されたヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基１−１５０、２２３−２７４、１８４−２８３、
２８３−４４０、４４０−５１４、５１４−５８６ または１３２３−１３３７に結合しない、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、重鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、
配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、
配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２
（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３ （ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）、ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、 配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、 配列番号：６）を含む、Ｒ１抗体の単離されたヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックする、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基１５１から２２２の間の、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する、請求項６に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記抗体が、（ｉ）ヒトＩＧＦ−１Ｒには結合するが、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）には結合しない；（ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒのアンタゴニストではない；（ｉｉｉ）単離されたＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合をブロックしない；（ｉｖ）無傷細胞においてＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化を中和する、から成る群から選択される機能的特性を少なくとも１つ発揮する、請求項６に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
前記抗体またはフラグメントが、裸の抗体またはフラグメントであるか、あるいは少なくとも１つの診断薬または治療薬にコンジュゲートしている、請求項６に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、
配列番号：３）ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３ (ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、 配列番号：６）を含む、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体が、（ｉ）ヒトＩＧＦ−１Ｒには結合するが、ヒトインスリン受容体 (IR)には結合しない；（ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒのアゴニストではない；（ｉｉｉ）単離されたＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合をブロックしない；（ｉｖ）無傷細胞におけるＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化を中和する；（ｖ）可変領域配列の配列番号：９および配列番号：１０を含むｈＲ１抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックする；および（ｖｉ）ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基１５１から２２２の間のＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する、から成る群から選択される機能的特性を少なくとも１つ発揮する、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒト抗体由来のフレームワークおよび定常領域配列を含むヒト化抗体である、請求項１２に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
前記ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、配列番号：９（ｈＲ１  ＶＨ）および配列番号：１０（ｈＲ１  ＶＫ）のアミノ酸配列を含むヒト化Ｒ１（ｈＲ１）抗体である、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】
前記ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の可変領域配列が、配列番号：９および
配列番号：１０に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有する、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
配列番号：９および配列番号：１０の配列において保存的アミノ酸置換が２０個以下である場合を除き、前記ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の可変領域配列が、配列番号：９および配列番号：１０のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒト抗体定常領域配列に付加された配列番号：７（Ｒ１  ＶＨ）および配列番号：８（Ｒ１  ＶＫ）のアミノ酸配列を含むキメラＲ１（ｃＲ１）抗体である、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
前記キメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の可変領域配列が、配列番号：７および
配列番号：８に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有する、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号：７および 配列番号：８の配列において保存的アミノ酸置換が２０個以下である場合を除き、前記キメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の可変領域配列が、配列番号：７および
配列番号：８のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
前記抗体が裸の抗体である、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
前記抗体が（ｉ）少なくとも１つの治療薬、（ｉｉ）少なくとも１つの診断薬、または（ｉｉｉ）少なくとも１つの治療薬と少なくとも１つの診断薬である、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項２２】
前記治療薬が、放射性核種、免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、アポトーシス促進剤、干渉ＲＮＡ、光活性治療薬、細胞毒性剤、
化学療法剤および毒物から成る群から選択される、請求項２１の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項２３】
前記診断薬が、放射線同位体、色素、放射線造影剤、超音波造影剤、蛍光標識、化学発光標識、酵素、増強剤および常磁性イオンから成る群から選択される、請求項２１の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項２４】
前記抗体がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体の定常領域配列を含む、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体。
【請求項２５】
請求項１の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質。
【請求項２６】
少なくとも１つの他の抗体またはそのフラグメントに付加された請求項１の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントを含む、多重特異性抗体。
【請求項２７】
他方の抗体が腫瘍関連抗原に結合する、請求項２６に記載の多重特異性抗体。
【請求項２８】
前記腫瘍関連抗原が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、
ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０, ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０L、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６a-e、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、
ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、因子Ｈ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、
ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１.２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、 ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ, ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、 ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、 ＭＩＰ−１Ａ、
ＭＩＰ−１Ｂ、 ＭＩＦ、 ＭＵＣ１、 ＭＵＣ２、 ＭＵＣ３、
ＭＵＣ４、 ＭＵＣ５、ＰＡＭ４ 抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＡＦＰ、Ｉａ、ＨＭ１.２４, ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ 抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、
ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２)、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子 Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、および癌遺伝子産物から成る群から選択される、請求項２７に記載の多重特異性抗体。
【請求項２９】
他方の抗体が標的化可能な構築体上のハプテンに結合する、請求項２６に記載の多重特異性抗体。
【請求項３０】
他方の抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２６に記載の多重特異性抗体。
【請求項３１】
他方の抗体が、ｈＰＡＭ４、ｈＡ２０、ｈＡ１９、ｈＩＭＭＵ３１, ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＭｕ-９、ｈＬ２４３、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＭＮ−３、ｈＲＳ７、ｈ６７９およびｈ７３４ 抗体から成る群から選択される、請求項２６に記載の多重特異性抗体。
【請求項３２】
多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項２６に記載の多重特異性抗体。
【請求項３３】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する癌を罹患した個人への、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、癌の診察または治療の方法。
【請求項３４】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、 配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、 配列番号：３）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、 配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、
配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、配列番号：９ （ｈＲ１  ＶＨ）および 配列番号：１０（ｈＲ１  ＶＫ）のアミノ酸配列を含むヒト化Ｒ１抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が裸の抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が癌の治療方法であり、少なくとも１つの他の治療薬を個人に投与することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの他の治療薬が、放射性核種、 免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性
治療薬、 細胞毒性剤、 化学療法剤、抗体、抗原結合抗体フラグメントおよび毒物から成る群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの他の治療薬が、ＥＧＦＲ阻害剤、エルロチニブ、抗ＥＧＦＲ抗体、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤、トリホスチン、ＡＧ１０２４、
ＡＧ５３８、ピロロ［２，３−ｄ］−ピリミジン誘導体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１および第２の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体から成る群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの他の治療薬が、５‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、コックス−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアン−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシン・グルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロジェン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロキシウリジン（ＦＵｄＲ）、３′，５′−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド、ＤＴＩＣ、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイドから成る群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が癌治療方法であり、前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が少なくとも１つの治療薬に付加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が癌の診断方法であり、前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が少なくとも１つの診断薬に付加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記診断薬が、放射線同位体、色素、放射線造影剤、超音波造影剤、蛍光標識、化学発光標識、酵素、増強剤および常磁性イオンから成る群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントが融合タンパク質または二重特異性抗体の一部になっている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
免疫調節剤が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよび「Ｓ１因子」と命名された肝細胞増殖因子から成る群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、メラノーマ、膠芽細胞腫、胸部、結腸、直腸、胃、前立腺、肝臓、腎臓、胆管、膵臓、肺、子宮内膜、頸部、卵巣、食道、甲状腺髄様、膀胱、頭頸部、皮膚癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、星状細胞腫および神経膠腫から成る群から癌が選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する癌を罹患した個人への、請求項６に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、癌の治療方法。
【請求項４９】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する前癌または異形成病変を罹患した個人への、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、前癌または異形成病変の治療方法。
【請求項５０】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する癌を罹患した個人への、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、癌の治療方法。
【請求項５１】
請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする単離された核酸。
【請求項５２】
配列番号：９および配列番号：１０の配列をコードする、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５３】
請求項５１に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５５】
ａ）請求項５３に記載の発現ベクターを含む宿主を取得すること；および
ｂ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはフラグメントを発現するために培地で宿主細胞を培養すること
を含む、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年１月１９日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／２１３４５号の優先権を請求し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、。
【０００２】
配列一覧
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて提出され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１０年３月９日作成の前記ＡＳＣＩＩコピーはＩＭＭ３１６ＷＯ２．ｔｘｔと命名され、サイズは１９，１５２バイトである。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ型受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）には結合するが、インスリン受容体（ＩＲ）には結合しない抗体および抗原結合抗体フラグメントに関する。好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体はＩＧＦ−１Ｒのアゴニストではない。より好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、アミノ酸残基１５１から２２２の間のＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する。最も好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が単離されたＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックしないが、無傷細胞または組織においてｉｎ  ｓｉｔｕでＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化を効果的に中和する。その他の実施形態において、Ｒ１と呼ばれるマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、重鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む。より好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ｈＲ１と呼ばれるヒト化Ｒ１抗体、キメラＲ１抗体またはヒトＲ１抗体であり、以上で挙げたＣＤＲ配列を含む。最も好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−Ｒ１抗体は、上記のＣＤＲ配列ならびにヒト抗体定常配列およびフレームワーク（ＦＲ）領域配列を含むヒト化抗体である。
【０００４】
このような抗体およびフラグメントは、以下に限定されないが、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、 神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、メラノーマ、膠芽腫、皮膚、胸部、頭頸部、結腸、 直腸、胃、食道、卵巣、膀胱、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓および／または肺の癌、ならびにリンパ腫、白血病および骨髄腫を含め、ＩＧＦ−１Ｒの発現が、癌細胞の形質転換、増殖、生存、転移または他の治療薬に対する抵抗に重要となる多種多様な癌の検出および／または治療に有用である。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体および／または抗体フラグメントは、単独で、またはその他の細胞毒性薬、たとえば癌化学療法剤、アポトーシス促進剤、放射性核種、ＥＧＦＲ阻害剤（たとえば、エルロチニブまたは抗ＥＧＦＲ抗体）、抗血管形成剤（たとえば、抗Ｖたとえば、Ｆ
および抗Ｐ１ＧＦペプチドまたは抗体）および／またはトリホスチン（たとえば、ＡＧ１０２４、ＡＧ５３８）、ピロロ［２，３−ｄ］−ピリミジン誘導体（たとえば、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１）もしくはその他の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体などのその他のＩＧＦ−１Ｒ阻害剤、またはその他の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体などと組み合せて組成物中および治療方法として使うことができる。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体
は、裸の抗体であってもよく、あるいは１つまたは複数の治療薬および／または診断薬とコンジュゲートさせてもよい。抗体はマウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とすることができる。
【０００５】
他の実施形態は、場合によっては別の異なる抗体またはフラグメントと併用される、少なくとも１つの抗ＩＧＦ−１Ｒ、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）またはそのフラグメントを含む多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントに関しうる。抗体、フラグメントまたは抗体融合タンパク質は治療イムノコンジュゲートとして単独で投与されることも、１つまたは複数の治療薬、他の裸の抗体またはイムノコンジュゲートと組み合せて投与することもできる。さらに他の実施形態は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗体融合タンパク質をコード化しているＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を作製する方法に関する。さらなる実施形態は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、融合タンパク質および／またはそれらのフラグメントを組み込むドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）技術を用いて作製される多価多重特異性および／または多機能の構築体に関する。
【０００６】
インスリン様増殖因子Ｉ型受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、多種多様な細胞内経路を調節するチロシンキナーゼ受容体という大きなクラスに所属する。ＩＧＦ−１Ｒは構造的にインスリンに類似したポリペプチドホルモン、ＩＧＦ−１に結合する（Ｌａｒｏｎ、Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ、２００１、５４：３１１−１６）。ＩＧＦ−１受容体はインスリン受容体（ＩＲ）と相同であり、ＩＲと全体で配列相同性の約７０％を共有している（ＲｉｅｄｅｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１３：Ｓ３３−４３）。驚くにはあたらないが、ＩＧＦ−１Ｒ
に対抗するために開発された阻害剤はインスリン受容体との交差反応性を示す傾向があり、この種の化合物の毒性プロフィールの少なくとも一部の原因となっている（ＭｉｌｌｅｒおよびＹｅｅ、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：１０１２３−２７；ＲｉｅｄｅｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、２００６）。
【０００７】
ＩＧＦ系は細胞の増殖、分化、アポトーシスおよび形質転換の調節に重要な役割を果たす（Ｊｏｎｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖ．１９９５、１６：３−３４）。ＩＧＦ系は、２つの受容体、すなわちインスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ；、ＣＤ２２１）およびインスリン様増殖因子受容体２ (ＩＧＦ−２Ｒ；、ＣＤ２２２）；２つのリガンド、すなわちインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）およびＩＧＦ−２；ならびに複数のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦＢＰ−６）から成る。さらに、ＩＧＦＢＰプロテアーゼ
（たとえば、カスパーゼ、メタロプロテイナーゼ、前立腺特異抗原）の大きなグループはＩＧＦに結合したＩＧＦＢＰを加水分解し、遊離ＩＧＦを放出するが、その後、遊離ＩＧＦはＩＧＦ−１Ｒ
およびＩＧＦ−２Ｒと相互作用する。
【０００８】
ＩＧＦ−１Ｒは、２つの細胞外αサブユニット （１３０−１３５ｋＤ）と細胞質チロシンキナーゼドメインを含む２つの膜貫通βサブユニット（９５ｋＤ）とから成る。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩＲ）同様、共有結合二量体（α２β２）構造を有している点で、他の受容体チロシンキナーゼファミリーメンバーとは異なる。ＩＧＦ−１Ｒは、キナーゼドメインにおいてＩＲに対して８４％の配列同一性を有し、膜およびＣ−末端領域ではそれぞれ６１％と４４％ の配列同一性を有する（Ｕｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯＪ．、１９８６、５：２５０３−１２；Ｂｌａｋｅｓｌｅｙら、サイトカイン  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、１９９６、７：１５３−５６）。
【０００９】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２ は、ＩＧＦ−１Ｒの活性化リガンドである。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がα鎖に結合すると、構造変化が引き起こされ、その結果、特定のチロシン残基で各β鎖の自己リン酸化が起こり、受容体が脱リン酸化された不活性状態からリン酸化された活性状態へと変化する。キナーゼドメインの活性化ループにおける３つのチロシン残基
（１３１、１１３５および１１３６のＴｙｒ残基）の活性化により、 触媒効果が増加し、ＩＲＳ−１およびＳｈｃアダプタータンパク質などの基質のドッキングとリン酸化が引き起こされる。これらの基質の活性化は、生存（ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＴＯＲ、Ｓ６）および／または
増殖（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ｐ４２／ｐ４４）のシグナル伝達系に関与する他のタンパク質のリン酸化を引き起こす（Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４、４：５０５−５１６；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７．１３３２：Ｆ１０５−Ｆ１２６；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３、１０７：８７３−７７）。
【００１０】
ＩＧＦ−１Ｒ は正常細胞と癌細胞の両方において抗アポトーシス効果を持つ（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：２４６３−６９；Ｋａｎｇら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００３、２８５：Ｆ１０１３−２４；ＲｉｅｄｅｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、２００６）。ＩＧＦ−１Ｒの活性は、
化学療法剤、放射性核種およびＥＧＦＲ阻害剤など、多種多様な細胞毒性薬に対する抵抗の発現が顕著であることが報告されている（Ｊｏｎｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４、１１：７９３−８１４；Ｗａｒｓｈａｍａｎａ−Ｇｒｅｅｎｅら、２００５、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１１：１５６３−７１；ＲｉｅｄｅｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、２００６；Ｌｌｏｒｅｔら、２００７，Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ、１０６：８−１１）。ＩＧＦ−１Ｒは、メラノーマ、神経芽細胞腫、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および膵臓癌など、広い範囲の
腫瘍株で過剰発現される（Ｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．５２：１７５−８４；ｖａｎ  Ｇｏｌｅｎら、２０００、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：６５４−６５；Ｚｈａｎｇら、２００１、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１７０−７５；Ｊｏｎｅｓら、２００４；ＲｉｅｄｅｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、２００６）。機能性ＩＧＦ−１Ｒ
は形質転換に必要であり、癌細胞の増殖、生存および転移を促進する（ＲｉｅｄｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、２００６）。  
【００１１】
チルホスチン、ピロロ［２，３−ｄ］−ピリミジン誘導体、ノルジヒドログアイアレチン酸類似体、ジアリール尿素、ＡＧ５３８、ＡＧ１０２４、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、ＮＶＰ−ＡＤＷ７４２、ＢＭＳ−５３２６９２４、ＢＭＳ−５５４４１７、ＯＳＩ−９０６、ＩＮＳＭ−１８、ルテオリン、シンバスタチン、シリビニン、紅茶ポリフェノール、
ピクロポドフィリン（picropodophyllin）、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体 およびｓｉＲＮＡ阻害剤など、抗癌剤として使用する目的でＩＧＦ−１Ｒ阻害剤を開発する試みが行なわれてきた（Ａｒｔｅａｇａら、１９９８、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、８４：１４１８−２３；Ｗａｒｓｈａｍａｎａ−Ｇｒｅｅｎｅら、２００５；Ｋｌｅｉｎ
およびＦｉｓｃｈｅｒ、２００２、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２３：２１７−２１；Ｂｌｕｍら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１５７０５−１２；Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−３９；Ｇａｒｂｅｒ、２００５、ＪＮＣＩ９７：７９０−９２；Ｂｅｌｌら、２００５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：９３０−４０；Ｗｕら、２００５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：３０６５−７４；Ｗａｎｇら、２００５、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ４：１２１４−２１；Ｓｉｎｇｈおよび
Ａｇａｒｗａｌ、２００６、Ｍｏｌ  Ｃａｒｉｎｏｇ、４５：４３６−４２；Ｇａｂｌｅら、２００６、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ５：１０７９−８６；Ｎｉｕら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．、２００７、３１：１５６−６４；Ｂｌｅｃｈａら、２００７、Ｂｉｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ、１７：４０２６−２９；Ｑｉａｎら、２００７、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｙｓ  Ｓｉｎ、３９：１３７−４７；Ｆａｎｇら、２００７、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２８：７１３−２３；Ｃｏｈｅｎら、２００５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２０６３−７３；Ｓｅｋｉｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００８、２５：３５６−６１；Ｈａｌｕｓｋａら、２００８、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２６：５月２０日増補；アブストラクト１４５１０；米国特許公報第２００６−２３３８１０号
、その各々の実施例のセクションを参照により本明細書に組み込む）。通常、これらの薬剤は、ＩＧＦ−１Ｒ
とＩＲの両方に程度の差はあれ、交差反応し、および／または ＩＧＦ−１Ｒアゴニストとして作用する傾向を示した。癌治療にこのような薬剤を利用することは、それらの毒性によって制限を受けてきた（ＲｉｅｄｅｍａｎｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、２００６）。当分野では、（ｉ）インスリン受容体と交差反応しない；（ｉｉ）より低い毒性プロフィールを示す；（ｉｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞においてＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の効果を中和する；（ｉｖ）好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒアゴニストとして効果しない；および（ｖ単離したＩＧＦ−１Ｒへの結合にＩＧＦ−１
またはＩＧＦ−２と競合しなくてよい抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の必要が存在している。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの組成物および使用方法を提供する。好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体はＩＧＦ−１Ｒには結合するが、ＩＲには結合しない。より好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体
はＩＧＦ−１Ｒのアゴニストではない。最も好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体はヒトＩＧＦ−１Ｒ配列のアミノ酸残基１５１から２２２の間のＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する（たとえば、Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５７：１０５０−９３、２０００；ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ２２２１５を参照されたい）。フューリンによるプロテアーゼ開裂は、残基１−７０６から成るα鎖と残基
７１１−１３３７から成るβ鎖との産生をもたらす。 残基１５１−２２２は、システインリッチドメイン（残基１５１−３００）のＮ末端側の半分から成る。
【００１３】
好ましくは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、 配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖ＣＤＲ
配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、 配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、 配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。代替実施形態では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、同一のエピトープに結合するおよび／または重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、
配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、 配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、マウスＲ１抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックするキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、裸の抗体であっても、少なくとも１つの治療薬および／または診断薬に結合したイムノコンジュゲートであってもよい。
【００１４】
種々の実施形態は、少なくとも１つの抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは第１の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂもしくはそのフラグメントと第２のＭＡｂとを含む、多重特異性抗体、二重特異性抗体または抗体融合タンパク質に関しうる。その他の実施形態は、第１の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂまたはそのフラグメントと第２のＭＡｂの癌治療に使用するための薬学的組成物または使用方法に関しうる。第２のＭＡｂは、たとえば、標的設定可能な構築体上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、すなわちハプテンと結合することができる。当該技術分野では種々の腫瘍関連抗原が知られており、そのような既知のＴＡＡはいずれも、以下に限定されないが、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、因子Ｈ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１、２４、インスリン様増殖因子１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、
ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、 ＭＡＧＥ、 ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、 ＭＩＰ−１Ｂ、 ＭＩＦ、 ＭＵＣ１、
ＭＵＣ２、 ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、
ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、
Ｔ１０１、 ＴＡＣ、 Ｔｎ 抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ 抗原、 腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子
Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物を含め、第２の ＭＡｂによって標的にすることができる。
【００１５】
第２のＭＡｂは、以下に限定されないが、列挙された各特許または出願の本文が図および実施例のセクションに関して、参照により本明細書に組み込まれる、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第
７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲ１（米国特許仮出願第６１／１４５，８９６号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、
ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５およびＰＴＡ−４４０６として預けられている米国特許出願第１１／９８３，３７２号）およびＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）を含め、当業で公知の多種多様の抗癌抗体のいずれもから選択することができ、第２のＭＡｂは、以下に限定されないが、その各々の本文が参照により本明細書に組み込まれる、ｈ６７９（米国特許第７，４２９，３８１号）および７３４（米国特許第７，４０５，３２０号）または
ｈ７３４も含め、当業で公知の抗ハプテン抗体から選択することができる。特定の実施形態においては、臨床開発中の任意の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体など、異なる抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使用することができる（たとえば、ＲｙａｎおよびＧｏｓｓ、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、２００８、１３：１６−２４を参照されたい）
【００１６】
他の実施形態は、少なくとも１つの治療薬または少なくとも１つの診断薬に結合した抗ＩＧＦ−１Ｒ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質の治療または診断のコンジュゲートに関する可能性がある。同一または異なる種類の複数の治療薬を有する抗体および融合タンパク質も含有される。これに代わる実施形態では、抗体、フラグメントまたは融合タンパク質は、たとえば、一方の腕が腫瘍関連抗原に特異的に結合し、別の腕が１つまたは複数の診断薬または治療薬に結合する標的設定可能な構築体に結合する二重特異性抗体を使って、治療または診断するプレターゲット法で使うことができる。二重特異性抗体を用いるプレターゲット方法は当業で周知である（たとえば、その各々の実施例のセクションが本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第７，３００，６４４号；第７，１３８，１０３号；第７，０７４，４０５号；第７，０５２，８７２号；第６，９６２，７０２号，第６，４５８，９３３号を参照されたい）。
【００１７】
様々な実施形態は、単独または１つもしくは複数の他の治療薬と組み合せて、治療または診断の目的に抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質を使用する方法に関する。抗ＩＧＦ−１Ｒ
ＭＡｂは、裸の抗体として、または１つもしくは複数の治療薬および／または診断薬に結合したイムノコンジュゲートとして使うことができる。裸の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂまたはイムノコンジュゲートは、１つまたは複数の他の治療薬の前、同時または後に投与される併用療法で使うことができる。以下でより詳細に論じるとおり、当業で公知の治療薬であればいずれも、以下に限定されないが、放射性核種、免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性治療薬、細胞毒性薬、化学療法剤、毒素、その他の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含め、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂと組み合せてまたは結合して活用することができる。好ましい実施形態において、
他の治療薬はＥＧＦＲ阻害剤（たとえば、エルロチニブまたはエルビタックスなどの抗ＥＧＦＲ抗体）および／またはトリホスチン（たとえば、ＡＧ１０２４、ＡＧ５３８）、ピロロ［２，３−ｄ］−ピリミジン誘導体（たとえば、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１）またはその他の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体などの他のＩＧＦ−１Ｒ
阻害剤とすることができる。
【００１８】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する癌細胞または異常細胞は、以下に限定されないが、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、皮膚、胸部、結腸、直腸、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓および／または肺の癌、ならびにリンパ腫、白血病および骨髄腫も含め、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使って治療および／または診断することができる。その他の治療できる癌の型としては、以下に限定されないが、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、
慢性骨髄性白血病、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、神経膠腫および膀胱癌が挙げられる。
【００１９】
特定の実施形態は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、キメラＲ１抗体、ヒト化Ｒ１抗体またはヒトＲ１抗体の治療および／または診断用途を含みうる。
キメラ抗体はマウス抗体ほど強いヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を引き起こさないため、キメラ抗体の使用が好ましい。ＨＡＭＡ反応を引き起こす可能性をさらに減少させるためには、ヒト化抗体の使用がさらにいっそう好ましい。以下で論じるように、マウスフレームワークと定常領域との配列を対応するヒト抗体フレームワークと定常領域との配列で置換することにより、マウス抗体をヒト化する技法は、当業で周知であり、数多くのマウス抗癌抗体に適用されてきた。抗体のヒト化には、１つまたは複数のヒトフレームワークアミノ酸残基を親マウスフレームワーク領域配列からの対応する残基で置換することも必要とする場合もある。
【００２０】
さらに他の実施形態は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体または 抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を作製する方法に関する。好ましい実施形態において、ＤＮＡ配列は、ｈＲ１  ＶＨ（配列番号：９）およびｈＲ１  ＶＫ（配列番号：１０）可変領域アミノ酸配列をコードする配列を含むことができる。さらなる実施形態は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、
融合タンパク質および／またはそのフラグメントを組み込む、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）技術を用いて作成される多価で、多重特異性および／または多機能の構築体に関する。ＤＮＬ構築体の製造および使用のための組成物および方法は報告されている（たとえば、米国特許第
７，５２１，０５６号；第７，５５０，１４３号；第７，５３４，８６６号；第７，５２７，７８７号および２００７年１０月２６日出願の米国特許出願連番第１１／９２５，４０８号および２００９年４月６日出願の第１２／４１８，８７７号を参照されたい。この各々の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる）。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】プラスミドｃＲ１ｐｄＨＬ２の回路図である。
【図２】固定化した組換えヒトＩＧＦ−１Ｒおよび組換えヒトＩＲに対するキメラＲ１（ｃＲ１）抗体の結合特異性。ｃＲ１は２つの異なるクローン、すなわち、７０９．２Ｄ２と７１０．２Ｇ２とから獲得した。ｃＲ１抗体はヒトＩＧＦ−１Ｒには結合するが、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）には結合しない。
【図３】固定化した組換えヒトＩＧＦ−１ＲへのｃＲ１の結合親和性。
【図４】マウスＲ１（ＭＬ０４Ｒ１）およびキメラＲ１（ｃＲ１）抗体の固定化した組換えヒトＩＧＦ−１Ｒへの競合結合。
【図５】ヒト化Ｒ１（ｈＲ１）、キメラＲ１（ｃＲ１）およびマウスＲ１（ＭＬ０４Ｒ１）抗体の固定化した組換えヒト ＩＦ−１Ｒへの結合の比較。
【図６】キメラＲ１（ｃＲ１）はＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が固定化した組換えヒト ＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックしない。１２５Ｉで標識をつけたＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を非標識のＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはｃＲ１を使って培養した。
【図７】ヒト化Ｒ１（ｈＲ１）およびマウスＲ１は、ＩＧＦ−１が固定化した組換えヒトＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックしない。１２５Ｉで標識をつけたＩＧＦ−１を非標識のＩＧＦ−１、ＭＡＢ３９１、ｈＲ１またはＲ１を使って培養した。
【図８】Ｒ１抗体の結合は、ＭＡＢ３９１と競合しない。蛍光標識したＲ１抗体 （Ａ）またはＭＡＢ３９１（Ｂ）の固定化したｒｈＩＧＦ−１Ｒへの結合を、ＣＤ２０に結合する、競合するマウスＲ１抗体（ＭＬ０４Ｒ１）、ＭＡＢ３９１または対照非特異的抗体ｈＡ２０の存在下で測定した。Ｒ１抗体はＩＧＦ−１Ｒへの結合に対して、ＭＡＢ３９１と競合しなかった。
【図９】ヒト化Ｒ１は、ＩＧＦ−１Ｒ受容体のアゴニストではない。ＩＧＦ−１とは異なり、ｈＲ１は無血清培地においてＭＣＦ−７細胞の増殖を促進しなかった。
【図１０】Ｚｅｎｏｎ標識抗体を使って、Ｇｕａｖａ   Ｅｘｐｒｅｓｓ分析により求めた細胞株中のＩＧＦ−１Ｒ発現。ＩＧＦ−１Ｒの発現は、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＣａＰａｎ１（膵臓癌）およびＤＵ−１４５（前立腺癌）へのｈＲ１の結合により確認された。
【図１１】Ｒ１抗体またはそのＦａｂフラグメントを含むＤＮＬ構築体のＩＧＦ−１Ｒを発現している細胞株への結合。Ｈｅｐ  Ｇ２肝臓癌細胞をＤＮＬ構築体ＴＦ−１８（ヒト化抗ＡＦＰ）、１Ｒ−３１（ヒト化抗ＡＦＰ／ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ）、１Ｒ１５（ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ／ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ６）、３１−１Ｒ（ヒト化抗ＡＦＰ  ＩｇＧおよびｈＲ１−ＩｇＧ−ＡＤ２）を使って培養した。
【図１２Ａ】ＤＮＬ構築体のＭＣＦ−７細胞 （Ａ）ＤＵ−１４５細胞（Ｂ）またはＭＥ−１８０細胞（Ｃ）への結合をＤＮＬ構築体または無傷抗体を使ってＦＡＣＳｃａｎ上で測定した。Ｈｅｘは六価のＤＮＬ構築体を意味する。ｈＲＳ７はヒト化抗ＥＧＰ−１抗体である。
【図１２Ｂ】ＤＮＬ構築体のＭＣＦ−７細胞 （Ａ）ＤＵ−１４５細胞（Ｂ）またはＭＥ−１８０細胞（Ｃ）への結合をＤＮＬ構築体または無傷抗体を使ってＦＡＣＳｃａｎ上で測定した。Ｈｅｘは六価のＤＮＬ構築体を意味する。ｈＲＳ７はヒト化抗ＥＧＰ−１抗体である。
【図１２Ｃ】ＤＮＬ構築体のＭＣＦ−７細胞 （Ａ）ＤＵ−１４５細胞（Ｂ）またはＭＥ−１８０細胞（Ｃ）への結合をＤＮＬ構築体または無傷抗体を使ってＦＡＣＳｃａｎ上で測定した。Ｈｅｘは六価のＤＮＬ構築体を意味する。ｈＲＳ７はヒト化抗ＥＧＰ−１抗体である。
【図１３Ａ】ＩＧＦ−１ＲとＥＧＰ−１の両方を発現しているＤＵ−１４５（Ａ）およびＭＥ−１８０（Ｂ、Ｃ）細胞中のＩＧＦ−１の増殖促進効果の中和についてのＤＮＬ構築体の効果。抗ＩＧＦ−１Ｒを含有するＨｅｘ−ｈＲ１構築体は、ＤＵ−１４５（Ａ）およびＭＥ−１８０（Ｂ）の増殖を抑制した。抗ＩＧＦ−１Ｒおよび抗ＥＧＰ−１を含有する１Ｒ−Ｅ１構築体は、ＭＥ−１８０（Ｃ）の増殖を抑制した。
【図１３Ｂ】ＩＧＦ−１ＲとＥＧＰ−１の両方を発現しているＤＵ−１４５（Ａ）およびＭＥ−１８０（Ｂ、Ｃ）細胞中のＩＧＦ−１の増殖促進効果の中和についてのＤＮＬ構築体の効果。抗ＩＧＦ−１Ｒを含有するＨｅｘ−ｈＲ１構築体は、ＤＵ−１４５（Ａ）およびＭＥ−１８０（Ｂ）の増殖を抑制した。抗ＩＧＦ−１Ｒおよび抗ＥＧＰ−１を含有する１Ｒ−Ｅ１構築体は、ＭＥ−１８０（Ｃ）の増殖を抑制した。
【図１３Ｃ】ＩＧＦ−１ＲとＥＧＰ−１の両方を発現しているＤＵ−１４５（Ａ）およびＭＥ−１８０（Ｂ、Ｃ）細胞中のＩＧＦ−１の増殖促進効果の中和についてのＤＮＬ構築体の効果。抗ＩＧＦ−１Ｒを含有するＨｅｘ−ｈＲ１構築体は、ＤＵ−１４５（Ａ）およびＭＥ−１８０（Ｂ）の増殖を抑制した。抗ＩＧＦ−１Ｒおよび抗ＥＧＰ−１を含有する１Ｒ−Ｅ１構築体は、ＭＥ−１８０（Ｃ）の増殖を抑制した。
【図１４】ｈＲ１、ＭＡＢ３９１および２４−６０の抗体で処置したが、ｈＬＬ２対照抗体では処置していないＭＣＦ−７およびＨＴ−２９細胞中のＩＧＦ−１Ｒの下方制御。
【図１５Ａ】（Ａ）Ｈｅｘ−ｈＲ１で処理したＭＣＦ−７およびＤＵ−１４５細胞；（Ｂ）Ｈｅｘ−ｈＲ１および１Ｒ−Ｅ１  ＤＮＬ構築体で処理したＭＣＦ−７、ＤＵ−１４５およびＬＮＣａＰ細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの下方制御。
【図１５Ｂ】（Ａ）Ｈｅｘ−ｈＲ１で処理したＭＣＦ−７およびＤＵ−１４５細胞；（Ｂ）Ｈｅｘ−ｈＲ１および１Ｒ−Ｅ１  ＤＮＬ構築体で処理したＭＣＦ−７、ＤＵ−１４５およびＬＮＣａＰ細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの下方制御。
【図１６】Ｈｅｘ−ｈＲ１は、ＭＣＦ−７細胞においてＥＲＫ１／２リン酸化のＩＧＦ−１活性化をブロックする。Ｈｅｘ−ｈＲ１および対照ＤＮＬ構築体Ｈｅｘ−ｈＲＳ７を、１００  ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−１で処理した細胞に１０ｎＭで添加した。
【図１７】１Ｒ−Ｅ１、Ｅ１−１ＲおよびｈＲ１は、ＭＥ−１８０細胞においてＩＧＦ−１Ｒリン酸化のＩＧＦ−１活性化をブロックする。指示された濃度のＤＮＬ構築体１Ｒ−Ｅ１、Ｅ１−Ｒ１、ｈＲ１および対照ｈＲＳ７抗体を１００ｎＭ  ＩＧＦ−１で処理した細胞に添加した。
【図１８】Ｈｅｘ−ｈＲ１は、ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化のＩＧＦ−１活性化をブロックする。指示された濃度のＤＮＬ構築体Ｈｅｘ−ｈＲ１、対照Ｈｅｘ−ｈＲＳ７またはｈＲ１抗体を１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−１で処置した細胞に添加した。
【図１９】二重特異性六値構築体の１Ｒ−Ｅ１またはＥ１−１Ｒ は、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ−１で刺激したＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害する。
【図２０】Ｈｅｘ−ｈＲ１は、１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−１で刺激したＤＵ−１４５細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ、Ａｋｔ and ＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害する。
【００２２】
定義
本明細書で用いるように、用語「１つの（ａ、ａｎ）」および「該（ｔｈｅ）」は、文脈で単数を意味していることが明らかにされている場合を除き、単数と複数のいずれも意味しうる。
【００２３】
本明細書で用いる用語「約」は、値の＋１０パーセントまたは−１０パーセント（１０％）を意味する。たとえば、「約１００」は９０から１１０までのどの数をも意味する。
【００２４】
本明細書で用いるように、抗体とは完全長（すなわち、天然に生じる、もしくは正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組換え法により形成される）の免疫グロブリン分子（たとえばＩｇＧ抗体）または抗体フラグメントのように、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分をいう。
【００２５】
抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の一部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは、無傷抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。たとえば、抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体フラグメントはＩＧＦ−１Ｒに結合する。また、用語「抗体フラグメント」には、重鎖および軽鎖の可変領域と軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって結合されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）から成る「Ｆｖ」フラグメントなどの、単離されたフラグメントも含まれる。本明細書で用いられるように、用語「抗体フラグメント」には、
抗原結合活性がない抗体の部分、たとえばＦｃフラグメントまたは単一のアミノ酸残基などは含まれない。
【００２６】
裸の抗体または裸の抗体フラグメントとは、治療薬にコンジュゲートしていない抗体またはその抗体結合フラグメントをいう。裸の抗体としては、マウスモノクローナル抗体ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体などのような組換え抗体を挙げることができる。
【００２７】
治療薬は、個別に、同時にまたは経時的に、抗体部分とともにまたは抗体部分（すなわち抗体もしくは抗体フラグメント）とコンジュゲートさせて投与される分子または原子であり、疾患の治療に有用である。治療薬の非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫刺激剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、オリゴヌクレオチド（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ）および放射性同位元素が挙げられる。
【００２８】
診断薬は、疾患または病状に関連する細胞、組織、病原またはその他の標的に送達するための抗体、抗体フラグメント、標的可能な構築体または他の
部分にコンジュゲートすることのできる、検出可能な分子または原子である。有用な診断薬としては、以下に限定されないが、放射性同位元素、色素、造影剤、蛍光化合物もしくは蛍光性分子および増強剤（たとえば磁気共鳴画像法用の常磁性イオン）が挙げられる。ある種の実施形態において、診断薬は
Ｆ−１８標識化部分とすることができる（たとえば、米国特許出願第１１／９６０，２６２号；第１２／１１２，２８９号；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／６２１０８号；その各々の実施例のセクションを参照により本明細書に組み込む）。
【００２９】
イムノコンジュゲートは、抗体成分と、少なくとも１つの治療薬または診断薬とのコンジュゲートである。抗体成分は、イムノコンジュゲートを形成するために、複数の治療薬および／または診断薬とコンジュゲートされてもよい。
【００３０】
用語「抗体融合タンパク質」は、同一もしくは異なる特異性を有する１つ以上の同一もしくは異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換えで作製された抗原結合分子を指すことができる。融合タンパク質の原子価は、融合タンパク質が１つの抗原またはエピトープに対していくつの結合腕もしくは結合部位を有しているか；すなわち、一価、二価、三価、または多価を表す。抗体融合タンパク質の多原子価は、それが抗原と結合する際に複数の相互作用を活用可能なこと、したがって、抗原に結合する結合活性の増加を意味する。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープに結合することができるか；すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を表す。これらの定義を用いると、たとえばＩｇＧなどの自然抗体は結合腕を２本有するため、二価であるが、この抗体は１つのエピトープに結合するため、単一特異性である。単一特異性で、多価の融合タンパク質は、エピトープに対して２つ以上の結合部位を有するが、１つのエピトープのみに結合する。融合タンパク質は、１つの抗体成分、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組み合わせ、または同一の抗体成分の複数のコピーを含みうる。融合タンパク質は、さらに、抗体または抗体フラグメントおよび治療薬を含みうる。この融合タンパク質に適した治療薬の例としては、免疫調節剤および毒素が挙げられる。１つの好ましい毒素としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組換えＲＮａｓｅが挙げられる。ただし、この用語は非制限的であり、種々のタンパク質またはペプチドエフェクターも融合タンパク質に含みうる。もう１つの非制限的な例では、下記のように、ＤＮＬ構築体を製造するためのＡＤまたはＤＤＤ配列も含みうる。
【００３１】
多重特異性抗体は、構造の異なる少なくとも２つの標的、たとえば２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープ、または１つのハプテンおよび／または１つの抗原もしくは１つのエピトープに同時に結合可能な抗体である。１つの特異性は、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、骨髄系細胞抗原、形質細胞抗原またはマスト細胞抗原もしくはエピトープに対することもある。別の特異性は、Ｂ細胞上のＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＭＵＣｌおよびＣＤ２２などの同じ細胞型上の異なる抗原に対することもある。しかし、第２の抗原は非制限的であり、他の有用な標的抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン、因子Ｈ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ,
ＩＬ−６,
ＩＬ−８,
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、 ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１,
ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９００、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＡＦＰ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、 ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物から成る群から選択することができる。多重特異性で多価の抗体は、結合部位を複数有する構築体であり、それらの結合部位は異なる特異性を有する。
【００３２】
種々の実施形態において、本発明は、哺乳類の被験者、ヒトおよび家畜の治療に有用な、単体で、コンジュゲートとして、または、他の裸の抗体および抗体治療的用コンジュゲートを含む、他の治療薬と組み合わせて投与されるヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、キメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体およびその抗体融合タンパク質を提供する。
【００３３】
好ましくは、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、以下から成る群から選択される１つまたは複数の機能特性を発揮する：（ｉ）ＩＧＦ−１Ｒには結合するが、ＩＲには結合しない；（ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒのアゴニストではない；（ｉｉｉ）単離したＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合をブロックしない；（ｉｖ）無傷細胞または組織においてＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化を効果的に中和する；
および（ｖ）ヒトＩＧＦ−１Ｒ配列のアミノ酸残基１５１から２２２の間のＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメインの前半部を含む、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープに結合する。
【００３４】
その他の好ましい実施形態において、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂまたはそのフラグメントは、重鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）および
軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１ (ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む。最も好ましい実施形態において、
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントはｈＲ１である。
【００３５】
ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂまたはそのフラグメントは、親マウスの抗ＩＧＦ−１Ｒ   ＭＡｂのＩＧＦ−１Ｒ標的特性を保持しつつ、マウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂのＣＤＲならびに１つまたは複数のヒト抗体の軽鎖および 重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）および 定常領域を含んでもよい。ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂまたはそのフラグメントは、親マウスＭＡｂの対応するＦＲからの少なくとも１つのアミノ酸をさらに含んでもよい。マウスのフレームワークアミノ酸残基は、適切な結合を維持するため、またはＩＧＦ−１Ｒ
抗原への結合を増強するために必要な場合は、可変の軽鎖および重鎖のヒトＦＲ 領域 で置換することができる。より好ましくは、ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂまたはそのフラグメントは、ｈＲ１  ＶＨ（配列番号：９）およびｈＲ１  ＶＫ（配列番号：１０）のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
キメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、ヒト抗体定常領域配列に結合された、マウスの
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の可変領域配列を含んでもよい。好ましい実施形態において、キメラ 抗ＩＧＦ−１Ｒ ＭＡｂは、マウスＲ１  ＶＨ（配列番号：７）および Ｒ１  ＶＫ（配列番号：８）の重鎖および 軽鎖可変領域配列を含む。
【００３７】
特定の実施形態は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、
配列番号：６）を含む、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト 抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックする抗ＩＧＦ−１Ｒ ＭＡｂまたはそのフラグメントに関しうる。
【００３８】
他の実施形態は、上述のように、少なくとも１つの抗ＩＧＦ−１Ｒ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含む、抗体融合タンパク質を含有してもよい。抗体融合タンパク質は、少なくとも１つの
第１の 抗ＩＧＦ−１Ｒ ＭＡｂまたはそのフラグメントと少なくとも１つの第２のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでもよい。より好ましくは、第２のＭＡｂは、Ｂ７、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８
、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９, ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２b、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０L、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６６ａ−３、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＰＡＭ４抗原、ＰＳＭＡ、ＡＦＰ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＭＩＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、
ＭＵＣ３、 ＭＵＣ４、 ＭＵＣ５、ＮＣＡ−９０、 ＮＣＡ-９５、Ｉａ、ＨＭ１.２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、 Ｆｌｔ−３、ＩＬＧＦ、補体因子Ｃ５、および癌遺伝子産物から成る群から選択される抗原に結合する。あるいは、第２のＭＡｂは、本明細書に記述の抗ＩＧＦ−１Ｒ
ＭＡｂとは異なる抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂとすることもできる。
【００３９】
アミノ酸置換
ある種の実施形態において、開示した方法および組成物は、１つまたは複数の置換アミノ酸残基を有する抗体またはその抗原結合フラグメンットの製造および使用を含んでよい。後述するように、実質的にどのような標的抗原に対してもモノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野で周知である。通常、これらの方法は標的抗原に対するマウス抗体の産生をもたらす。当該技術分野で周知のように、マウスモノクローナル抗体の抗原結合特異性は、主に超可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列で決定される。マウス抗体は、一般に、抗体軽鎖上に３つ、重鎖上に３つの計６つのＣＤＲ配列を含む。以下に詳細に述べるように、マウス抗体のキメラバージョン、ヒト化バージョンまたはヒトバージョンは、たとえば、ヒト抗体フレームワーク領域配列および定常領域配列にマウスＣＤＲ配列を挿入するＣＤＲ移植などの技法によって、またはマウス可変領域配列全体をヒト抗体定常領域配列に結合させることによって構築されてもよい。代替実施形態では、抗体の可変領域配列は、たとえば、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域全体をコードするオリゴヌクレオチドを化学合成し組立てることよって構築されうる。
【００４０】
種々の実施形態において、自然抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の構造特性、物理特性および／または治療上の特性は、１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって最適化されうる。たとえば、ヒト化抗体の機能的特性は、限定された数のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸を親マウス抗体の対応するＦＲアミノ酸で置換することにより改善されうる。
これはフレームワーク領域アミノ酸残基がＣＤＲ残基の近傍にあるときに、特にあてはまる。
【００４１】
他の場合において、標的抗原に対する結合親和性、抗体のその標的抗原からの乖離速度、すなわちｏｆｆ速度、またはさらには、抗体によるＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）の誘導の有効性など、抗体の治療上の特性は、限定された数のアミノ酸置換により最適化されうる。このような置換は、たとえば、抗体のＣＤＲ部で行なわれてもよい。ただし、アミノ酸置換は抗体のＣＤＲまたはフレームワーク領域配列に制限されず、たとえば、抗体のＦｃ部で行なってもよい。
【００４２】
通常、アミノ酸置換は、アミノ酸を比較的類似した特性を有する別のアミノ酸とを置換すること（すなわち同類アミノ酸置換）を一般的に含むことを当業者は承知しているであろう。種々のアミノ酸の特性およびアミノ酸置換のタンパク質構造ならびに機能への影響は、当該技術分野で広範囲にわたる研究の主題および知識となっている。
【００４３】
たとえば、アミノ酸のハイドロパシックインデックスを考えてもよい（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、ひいてはこのタンパク質と他の分子との相互作用を定義する。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシックインデックスが割り当てられており（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）、これらは以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。同類置換を行なう際、ハイドロパシックインデックスが±２以内のアミノ酸を使用することが好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内がさらにより好ましい。
【００４４】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れてもよい（たとえば米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値はアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０）；グルタミン酸塩（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋‐．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は類似の親水性を有する他のアミノ酸との置換が好ましい。
【００４５】
他に考慮すべきこととして、アミノ酸側鎖の大きさが挙げられる。たとえば、アミノ酸をグリシンもしくはセリンなど、小型の側鎖と置換する、または、たとえば、アミノ酸をトリプトファン、チロシンなど、大きな側鎖と置換することは通常好ましくないであろう。種々のアミノ酸残基のタンパク質二次構造への影響も、考慮すべきことである。実証的研究を通して、タンパク質ドメインがαヘリカル、βシートまたは折り返しの二次構造を取り入れる傾向への異なるアミノ酸残基の影響は、決定されており、当該技術分野において既知である（たとえば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２−２４５；１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１−２７６；１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４を参照されたい）。
【００４６】
こうした考慮すべきことと広範囲な実証的試験とに基づき、同類アミノ酸置換の表が作成され、当該技術分野で既知となっている。たとえば：アルギニンとリジン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。あるいは：Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。
【００４７】
アミノ酸置換について考慮すべきその他の事柄には、残基がタンパク質の内部に位置しているかどうかまたは溶媒露出であるかどうかがある。ＣＤＲ
残基の場合、遊離抗体中の残基は、通常、想定されるであろう。内部残基の場合、同類置換として以下が挙げられる：ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＴｈｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＩｌｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；
ＬｅｕおよびＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐ。（ たとえば、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイトを参照されたい）。溶媒露出残基の場合、同類置換として以下が挙げられる：ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；
ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＩｌｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒ（同書）。ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックスなど、種々のマトリックスが構築され、アミノ酸置換の選択に役立っている（同書）。
【００４８】
アミノ酸置換を決定する際に、正に帯電した残基 (たとえば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に帯電した残基（たとえば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）との間のイオン結合（塩橋）または近傍のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成など、分子間または分子内の結合の存在も考慮する必要がある。
【００４９】
たとえば、部位特異的突然変異誘発法により、またはアミノ酸置換をコードして発現ベクター構築体に挿入するオリゴヌクレオチドの合成および組み立てにより、コードされたタンパク質配列内の任意の他のアミノ酸を置換する方法は、周知であり、当業者にとって日常的に実験する事柄である。
【００５０】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体も含めた、モノクローナル 抗体の調製
実質的にいかなる標的抗原に対するモノクローナル 抗体を調製する技法も当該技術分野で周知である。 たとえば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）およびＣｏｌｉｇａｎら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第１巻、２．５．１−２．６．７頁 （Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡単に言うと、モノクローナル 抗体は、抗原を含有する組成物をマウスに注射し、脾臓を摘出して、Ｂリンパ球を得、得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを作製し、作製したハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより取得することができる。
【００５１】
ＭＡｂは、多種多様な十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離し、精製することができる。このような分離技法としては、タンパク質−Ａまたは
タンパク質−Ｇ  セファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１−２．７．１２頁および２．９．１−２．９．３頁を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓら「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）」、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第１０巻、７９−１０４頁（Ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．  １９９２）も参照されたい。
【００５２】
免疫原に対する抗体をまず育成した後、配列を決定し、続いて組換え技法により調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、下記のように、当業者には周知である。
【００５３】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、たとえば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域と置換された組換えタンパク質である。被験者への投与時、キメラ抗体は免疫原性の低下と安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングするための一般的な技法は、たとえば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築する技法は、当業者に周知である。１つの例としては、Ｌｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４））は、マウスＬＬ２のＶκおよびＶHドメインをコードするＤＮＡ配列、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体とヒトκおよびＩｇＧ１それぞれの定常領域ドメインとを組み合わせることによってＬＬ２キメラを作製した。
【００５４】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを作製する技法は、当該技術分野で周知ある（たとえば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１２：４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ、１５０：２８４４（１９９３）を参照されたい）。キメラモノクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインに移入することによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒトＦＲ配列とも置換される。単純にマウスＣＤＲをヒトＦＲに移入するだけでが、抗体親和性の減少または損失さえもたされることが多いため、マウス抗体の本来の親和性を回復させるためにさらなる修飾を必要とすることもある。この修飾は、その抗体のエピトープに良好な結合親和性を有する抗体を得るため、１つ以上のヒト残基の一部をＦＲ領域にてマウスのそれらのカウンターパートと置換することで達成される。たとえば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。置換のための好ましい残基としては、ＣＤＲの１、２または３オングストローム内に位置するＦＲ残基、ＣＤＲ配列に隣接する位置に存在するＦＲ残基、またはＣＤＲ残基と相互作用することが予想されるＦＲ残基が挙げられる。
【００５５】
ヒト抗体
組み合わせのアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である（たとえば、Ｍａｎｃｉｎｉ
ら、２００４、Ｎｅｗ   Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２７：３１５−２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ、２００５、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ
Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅおよび Ｌｏｓｅｔ、２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ、３：５４４−５０）。完全ヒト抗体も、遺伝子または染色体のトランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技法によって構築されうる。これらの方法はすべて、当該技術分野で既知である。たとえば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ
ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりさらに少ない副効果を示し、かつｉｎ
ｖｉｖｏで本質的に内在性のヒト抗体として機能することが期待される。
【００５６】
１つの代替実施形態において、ファージディスプレイ技法を用いて、ヒト抗体を作製することもできる（たとえば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ、４：１２６−４０）。ヒト抗体は、正常なヒトから、または、癌など特定の病態を示すヒトから作製することができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。罹患した個人に由来するヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏る可能性があるということである。
【００５７】
この方法論の非限定例の１つでは、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）が、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。一般に、全ＲＮＡは、循環血液リンパ球から得られた（同書）。組換えＦａｂは、μ鎖、γ鎖およびκ鎖の抗体レパートリーからクローン化し、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（同書）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変えて使用し、重鎖免疫グロブリン配列および軽鎖免疫グロブリン配列に対して特定のプライマーを用いてＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを作製した（Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−９７）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００、Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂａｒｂａｓら（編）、第１版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、９．１頁−９．２２頁）に従って行なわれた。最終的なＦａｂフラグメントを、制限酵素で消化し、バクテリオファージゲノムに挿入してファージディスプレイライブラリーを作製した。当該技術分野で既知のように、このライブラリーは標準ファージディスプレイ方法でスクリーニングすることができる。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行なうことができ、フォーマットのレビューに関しては、たとえば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。
【００５８】
ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞によって作製することもできる。米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい。その各々の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、これらの技法が例示的なものであり、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製しスクリーニングするための既知のいかなる方法も利用されうることを理解するであろう。
【００５９】
別の代替実施形態において、ヒト抗体を作製するために遺伝子組換えが行なわれたトランスジェニック動物を用いて、標準免疫方法により本質的にどのような免疫原標的に対してでも抗体を作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ、７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ、６：５７９（１９９４）に開示されている。この系の非限定例として、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が挙げられる（たとえば、Ｇｒｅｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３、参照により本明細書に組み込まれる）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および同様の動物において、マウス抗体遺伝子は不活性化され、機能的ヒト抗体遺伝子により置換されているが、マウス免疫系の残りの部分は無傷のままである。
【００６０】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子および制御配列とともに可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨおよびＩｇｋａｐｐａ遺伝子座の部分を含む生殖細胞形成ＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質変換された。ヒト可変領域レパートリーを用いて、既知の技法によってハイブリドーマにプロセシングされうる抗体産生Ｂ細胞を作製してもよい。標的抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によってヒト抗体を産生する。このヒト抗体は、上述の標準技法によって収集および／または作製されうる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の種々の系統は入手可能であり、その各々は異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子導入で作製されたヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態特性を保持する一方で、治療可能性を有することが示される（Ｇｒｅｅｎら、１９９９）。当業者は、特許請求する組成物および方法がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されることなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えが行なわれたいずれのトランスジェニック動物も利用できることを理解する。
【００６１】
抗体フラグメントの製造
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法によって作製することができる。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって作製することができ、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって作製することができる。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７４−１２８１）することで、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの同定が迅速かつ簡単に実施される。
【００６２】
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。ＶＬおよびＶＨのドメインは、結合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によってさらに共有結合的に結合される。ｓｃＦＶ分子を作製し、適切なペプチドリンカーを設計する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ および Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ、"Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ．"ＦＡＳＥＢ第９巻：７３−８０（１９９５）およびＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ、"Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ"、ＴＩＢＴＥＣＨ、第９巻：１３２−１３７（１９９１）に記述されている。
【００６３】
抗体フラグメントは、完全長の抗体のタンパク質加水分解によって、または、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは別の宿主内で該フラグメントをコードするＤＮＡの発現によって調製されうる。抗体フラグメントは、従来の方法により完全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得られる。たとえば、パパインを用いる酵素切断によって、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントが作製される。これらの方法は、たとえば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号ならびにそれらに含まれている文献に記載されており、両特許は参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎら、
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ第１巻、４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、ならびにＣｏｌｉｇａｎ、２．８．１−２．８．１０頁および２．１０．−２．１０．４頁を参照されたい。
【００６４】
二重特異性および多重特異性抗体
二重特異性抗体は、多くの生物医学的用途において有用である。たとえば、腫瘍細胞表面抗原の結合部位およびＴ細胞表面受容体の結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞によって特定の腫瘍細胞の溶解を導くことができる。Ｔ細胞上でグリオーマおよびＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体を用いた、ヒト患者の脳腫瘍治療は成功を収めている（Ｎｉｔｔａら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９０；３５５：３６８−３７１）。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または他の疾患標的のための少なくとも１つの結合部位、ならびに治療薬または診断薬にコンジュゲートした標的設定可能な構築体のための少なくとも１つの結合部位を含む二重特異性抗体によるプレターゲッティング法は、当該技術分野でも周知ある（たとえば、米国特許第７，３００，６４４号；第７，１３８，１０３号；第７，０７４，４０５号；第７，０５２，８７２号；第６，９６２，７０２号；第６，４５８，９３３号を参照されたい。各特許の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６５】
たとえば、米国特許第７,４０５,３２０号（この実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているとおり、二重特異性または
多重特異性抗体を産生するための数多くの方法が周知である。二重特異性抗体は、各々が異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を包含するクアドローマ法により産生されうる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
およびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【００６６】
二重特異性抗体を産生するための別の方法は、ヘテロ二機能性架橋剤を用いて、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に結びつける（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５；３１４；６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体は、２つの親モノクローナル抗体の各々をそれぞれの半分子に低減し、これを次に混合して、再酸化させて、ハイブリッド構造を獲得することによっても産生されうる（ＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替法は、適切なリンカーを用いて２または３つの別々に精製されたＦａｂ’フラグメントを化学的に架橋することを包含する（例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号を参照されたい）。  
【００６７】
他の方法は、レトロウイルス由来シャトルベクターを介して、別個の選択可能なマーカーをそれぞれの親ハイブリドーマ中に遺伝子移入し、その後、これを融合することにより（ＤｅＭｏｎｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９０、８７：２９４１−２９４５）；あるいは異なる抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を含む発現プラスミドを用いたハイブリドーマ細胞系統のトランスフェクションにより、ハイブリッドハイブリドーマ生成の効率を改善することを包含する。
【００６８】
同族ＶＨおよびＶＬドメインは、適切な組成および長さのペプチドリンカー（通常、１２個より多いアミノ酸残基から成る）と連結されて、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖの製造方法は、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，１３２，４０５号（各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。１２個未満のアミノ酸残基へのペプチドリンカー長の低減は、同一鎖上でのＶＨおよびＶＬドメインの対合を防止し、他の鎖上でのＶＨおよびＶＬドメインと相補的ドメインとの対合を強いて、機能性多量体を形成する。３〜１２個のアミノ酸残基のリンカーと連結されるＶＨおよびＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（ダイアボディと呼ばれる）を形成する。０〜２個のアミノ酸残基のリンカーでは、三量体（トリアボディと呼ばれる）および四量体（テトラボディと呼ばれる）が選択されるが、しかしオリゴマー化の正確なパターンは、リンカー長のほかに、Ｖドメインの組成ならびに配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に依っていると思われる。
【００６９】
多重特異性または二重特異性抗体を産生するためのこれらの技法は、当該技法の低収率、精製の必要性、低安定性または労働集約性に関して種々の困難を示
す。さらに近年、以下でさらに詳細に考察される「ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）」として知られている技法は、効果的に任意の所望の抗体、抗体フラグメントおよび
その他のエフェクター分子の組合せを産生するために利用されてきた（例えば、米国特許第７,５２１,０５６号；第７,５５０,１４３号；第７,５３４,８６６号；第７,５２７,７８７号および２００７年１０月２６日出願の米国特許出願第１１/９２５,４０８号および２００９年４月６日出願の米国特許出願第１２/４１８,８７７号を参照されたい；これらの各々の 実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる）。この技法は、アンカードメイン（ＡＤ）と称される相補的タンパク質結合ドメインおよび二量体形成ドメインならびにドッキングドメイン（ＤＤＤ）を利用する。これらは互いに結合して、二量体から三量体、四量体、五量体および六量体に及ぶ複合構造の構築を可能にする。これらは、大量の精製を必要とせず、高収率で安定な複合体を形成する。ＤＮＬ技法は、裸の抗体部分として、または、たとえば、免疫調節剤、酵素、化学療法剤、ケモカイン、サイトカイン、診断薬、治療薬、放射性核種、造影剤、抗血管新生剤、増殖因子、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ペプチド、毒素、プロアポトーシス剤もしくはそれらの組み合わせなどの広範な他のエフェクター分子との組み合わせとしてのいずれかで、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体の構築を可能にする。二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野で既知のどのような技法も、現在特許請求する方法を実施する際に利用することができる。
【００７０】
二重特異性または多重特異性抗体は。治療上有用な既知の任意の抗体を組み込むこともできる。有用な抗体は幅広い既知のソースから市販されている。たとえば、ハイブリドーマ系統を分泌する種々の抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から市販されている。種々の疾患標的に対する多数の抗体は、腫瘍関連抗原を含むがこれに限定されることなく、ＡＴＣＣに寄託されおよび／または可変領域配列を公開されており、ならびに本明細書にて特許請求する方法および組成物での使用に利用できる。たとえば
米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６,７２０,１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２，８５６号；
第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第
６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号；第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号；第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号；第５，５２５，３３８号を参照されたい（その各々の図および実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる）。これらは単に例示的なものであって、種々の他の抗体およびそれらのハイブリドーマが、当該技術分野において既知である。当業者は、関心の対象である、選択した疾患関連標的に対する抗体についてＡＴＣＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースを簡単に検索するだけで、いずれの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマのほとんどを得られることを理解する。クローン化抗体の抗原結合ドメインを、当該技術分野で周知の標準的技法を用いて、増幅し、切除し、発現ベクターに連結し、適合した宿主細胞に導入し、タンパク質産生のために使用することができる。
【００７１】
ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）
好ましい実施形態において、二重特異性または多重特異性抗体または他の構築物を、ドック・アンド・ロック技法を用いて産生し得る（たとえば、米国特許第７,５２１,０５６号；第７,５５０,１４３号；第７,５３４,８６６号；第７,５２７,７８７号および２００７年１０月２６日出願の米国特許出願第１１/９２５,４０８号および２００９年４月６日出願の米国特許出願第１２/４１８,８７７号を参照されたい；これらの各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に起こる特異的タンパク質／タンパク質相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００５；５７９：３２６４；ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００４；５：９５９）。二次メッセンジャーｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により誘発される最良の試験されたシグナル伝達経路のうちの１つにおいて中心的役割を果たすＰＫＡは、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態で保持される２つの触媒性サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９８９
；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２つの型のＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）と一緒に見出され、各型は、αおよびβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ＴｈｅＲ１９９１；５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは最初の４４個のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。ｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合は、広範囲のセリン／トレオニンキナーゼ活性に関する活性触媒性サブユニットの放出をもたらし、これは、ＡＫＡＰとのそのドッキングを介してＰＫＡを区画分けすることにより選定基質に向けられる（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５：２１５６１）。
【００７２】
微小管関連タンパク質−２である最初のＡＫＡＰが１９８４年に特性化されて以来（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリアおよび小胞体を含めて、種々の細胞成分部位に局在する５０を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトまでの範囲の種において、多様な構造で同定されてきた（ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ、
Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性らせんである（Ｃａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰの間でかなり異なり、ＲＩＩ二量体に関して報告された結合親和性は２−９０ｎＭの範囲である（Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。興味深いことに、ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットのみと結合する。ヒトＲＩＩαに関しては、ＡＤは、２３アミノ末端残基により形成される疎水性表面と結合する（ＣｏｌｌｅｄｇｅおよびＳｃｏｔｔ、
Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインはどちらも、本明細書中でＤＤＤと呼ばれる同一のＮ末端４４アミノ酸配列内に位置する（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；Ｎｅｗｌｏｎら、ＥＭＢＯＪ．２００１；２０：１６５１）。
【００７３】
任意の２つの存在物（本明細書中で以後、ＡおよびＢと呼ぶ）を非共有結合複合体にドッキングするためのリンカーモジュールの優れた一対として、ヒトＲＩＩαのＤＤＤ配列（たとえば、配列番号：１５および配列番号：１６）およびＡＫＡＰのＡＤ配列（たとえば、配列番号：１７および 配列番号：１８）を利用するためのプラットフォーム技術をわれわれは開発してきた。ドッキングしたＡおよびＢは、さらに、ジスフィルド結合の形成を促すために、戦略位置でＤＤＤとＡＤの両方にシステイン残基を導入することにより、安定係留構造中にロックできるようにもなる。「ドック・アンド・ロック」アプローチの一般的方法を、以下に示す。ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結して、以後ａと呼ばれる第１の構成成分を生じさせることにより、存在物Ａを構築する。ＤＤＤ配列は二量体の自発的形成を引き起こすため、Ａはａ２から成る。ＡＤ配列をＢの前駆体に連結して、以後ｂと呼ばれる第２の構成成分を生じることにより、存在物Ｂを構築する。ａ２中に含入されるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含入されるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位を作製し、したがって、ａ２およびｂの即時会合を促して、ａ２ｂで構成される二元性三量体複合体を形成する。この結合事象は、ジスルフィド架橋を介して２つの存在物を共有的に固定するその後の反応で不可逆にされる。これは、初期結合相互作用が、ＤＤＤおよびＡＤの両方の上に置かれた反応性チオール基を近接させて（Ｃｈｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲーションするはずであるため、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こる。
【００７４】
２つの前駆体の官能基から離れてＤＤＤおよびＡＤを付着することにより、このような部位特異的なライゲーションは、２つの前駆体の元の活性を保存することも予期される。このアプローチは、効果的にモジュラーであり、広範囲の活性を有する広範囲の物質、たとえば、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメントおよびその他のエフェクター部分を、部位特異的に、かつ共有的に連結する目的に潜在的に適用され得る。以下の実施例に記載されるＡＤおよびＤＤＤ共役エフェクターを構築する融合タンパク質法を用いて、実質的に任意のタンパク質またはペプチドがＤＮＬ構築体中に組み入れられうる。しかしながら、当該技法は、非限定的であり、他の種類の分子を連結するために他の共役方法が利用されうる。
【００７５】
関心のある融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生するために、融合タンパク質を製造するための種々の方法が、核酸合成、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅を含めて知られている。このような二本鎖核酸は、標準分子生物学的技法により、融合タンパク質産生のために発現ベクター中に挿入されうる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９を参照されたい）。このような好ましい実施形態においては、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれにも付着されうる。しかしながら、当業者は、エフェクター部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の付着の部位は、エフェクター部分の化学的性質ならびにその生理学的活性に関与するエフェクター部分の一部（単数または複数）によって変わりうると理解する。種々のエフェクター部分の部位特異的付着は、当該技術分野で既知の技法を用いて、たとえば、二価架橋試薬および／またはその他の化学的共役技法の使用により、実施されうる。
【００７６】
ＤＮＬ配列バリアント
代替実施形態において、ＤＮＬ複合体の構築にＡＤ部分および／またはＤＤＤ部分の配列バリアントを活用してもよい。ＡＤおよびＤＤＤドメインの構造と機能の関係は、調査の対象になってきた（たとえば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏら、２００５、タンパク質  Ｓｃｉ  １４：２９８２−９２；
Ｃａｒｒら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２-３８； Ａｌｔｏら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０；
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６； Ｓｔｏｋｋａら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ ４００：４９３−９９；
Ｇｏｌｄ ら、２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、
２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８を参照されたい）。
【００７７】
たとえば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を調べ、ヒトＤＤＤ配列には、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかに重要な保存アミノ酸残基（以下の配列番号：１５の下線部）が数多く含まれていると結論づけた（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６の図１を参照されたい）。当業者は、ＤＤＤ配列の配列バリアントを設計する際、二量体化およびＡＫＡＰ結合に対して重要度の低い 残基については、保存アミノ酸置換を行なうこともありうるが、下線を引かれた残基については、どれも変更することは避けた方が望ましいことを理解する。
プロテインキナーゼＡ由来のヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１５）
【００７８】
Ａｌｔｏら（２００３）は、ＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号：１７）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を、ＤＤＤに対する結合定数０.４ ｎＭで設計するために、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティック分析を実施した。このＡＫＡＰ-ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチドアンタゴニストとして設計された。置換によって、ＤＤＤへの結合が減少した傾向を示したＡＫＡＰ−ＩＳ配列中の残基には、配列番号：１７の中で下線が引かれている。
AKAP-IS配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：１７）
【００７９】
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６）は、結晶学およびペプチドスクリーニングを活用して、ＲＩイソフォームと比較して、ＰＫＡのＲＩＩイソフォームに対して５桁大きな選択性を示す、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号：３９）を開発した。下線を引いた残基は、ＡＫＡＰ-ＩＳ配列と比較して、ＲＩＩαのＤＤＤ部分への結合が増加したアミノ酸置換の位置を表している。この配列では、Ｎ末端のＱ残基は残基番号４が付与されており、Ｃ末端のＡ残基は残基番号２０である。  ＲＩＩαに対する親和性に影響を及ぼすために置換を行なうことのできる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９および２０（Ｇｏｌｄら、２００６)だった。  特定の代替実施形態においては、ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部配列をＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列で置換し、ＤＮＬ構築体を調整することもありうると考えられる。ＡＫＡＰ-ＩＳ  ＡＤ配列を置換できる可能性のある代替配列が、配列番号：４０−４２に示されている。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に比較した置換に下線を引いてある。配列番号：１８に示されているように、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号：１７）の場合と同様、ＡＤ部分には、追加のＮ末端残基のシステインおよびグリシン、ならびにＣ末端残基のグリシンおよびシステインを挿入することもありうると予測される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号：３９）
代替ＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号：４０）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号：４１）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ （配列番号：４２）
【００８０】
Ｓｔｏｋｋａら（２００６）も、配列番号：４３−４５に示される、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合の競合ペプチドを開発した。 ペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号：４３）、ＲＩＡＤ（配列番号：４４）およびＰＶ−３８（配列番号：４５）と命名された。Ｈｔ３１ペプチドは 、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより高い親和性を発揮し、ＲＩＡＤおよびＰＶ−３８はＲＩに対してより高い親和性を示した。.
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号：４３）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号：４４）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号：４５）
【００８１】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）は、ＰＫＡのＲＩＩ型のＤＤＤに対する結合定数を最低０．４  ｎＭにして、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合に対するさらに他の競合ペプチドを開発した。様々なＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列が Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらによる表１（参照により本明細書に組み込む）に示されている。ＡＫＡＰ  ＩＳ配列と比較して、異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメインの間で高度に保存された残基は、以下に下線で示されている。Ｃ末端アラニン残基が追加されているが、この残基は、Ａｌｔｏら（２００３）が観察したものと同じである（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）による図４を参照されたい）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対して特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、配列番号：４６−４８に示されている。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：１７）
ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号：４６）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号：４７）
ＡＫＡＰ７δ−L３０８D−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号：４８）
【００８２】
Ｃａｒｒら（２００１）は、ヒトおよびヒト以外のタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の度合いを調べ、異なるＤＤＤ部分の間で最も高度に保存されていると見えるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらは、配列番号：１５のヒトＰＫＡ  ＲＩＩαＤＤＤ配列と比較して、以下で下線を付けて示されている。特に保存度の高かった残基はさらにイタリックで示されている。これらの残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ
ら（２００６）がＡＫＡＰタンパク質への結合に重要であると示唆した残基と重なるが、同一ではない。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１５）
【００８３】
当業者は、本明細書に記載のＡＤおよび／またはＤＤＤ配列の配列バリアントを製造するには、一般に、異なるタンパク質由来のＤＤＤおよびＡＤ配列で高度に保存されるアミノ酸残基はアミノ酸置換を行なう際に一定のまま維持した方が好ましい可能性があるが、保存される程度がより低い残基はより容易に変化させうると認識するであろう。
【００８４】
ｓｃＦｖベースのＡＤモジュール
代替実施形態は、より小さいＤＮＬコンジュゲートを産生する目的でのＤＤＤ２（配列番号：１６）をベースとするサイトカインまたはＲＮａｓｅとの対合のためのｓｃＦＶベースのＡＤモジュールの使用に関しうる。サイズのより小さいＤＮＬ構築体は、固形腫瘍への浸透を促進する可能性がある。われわれは、各ポリペプチド鎖のカルボキシル末端において、６−Ｈｉｓタグ（配列番号：５１）を有する相補可変ドメインを含む、２つの別個のポリペプチド鎖を発現することにより、ｓｃＦｖベースの二重特異性抗体を数種類製造した。同一のアプローチを使って、一方または両方の６−Ｈｉｓタグ（配列番号：５１）をＡＤ配列またはＡＤ−ＨＨＨＨＨＨ配列（配列番号：５１）のいずれかで置換することにより、ｓｃＦｖベースのＡＤモジュールを生成してもよい。われわれは、さらに、各ポリペプチド鎖を異なるＡＤ配列（たとえば、ＡＤ２（配列番号：１８） and ＡＤ３（配列番号：４９））に融合することもできる。融合した場合、その同族配列により特定の認識が可能となり、したがって、最終的なＤＮＬコンジュゲートの複雑性がさらに増加する。以下の表１に、このようなｓｃＦｖベースのＤＮＬ構築体を列挙するが、すべてを完全に包括したリストではない。
【表１】
2013516996.tif 000003
【００８５】
Ｉ型は、１対のＤＤＤ２（配列番号：１６）モジュールを連結するように設計されている。ＩＩ型は、２対の同一または異なるＤＤＤ２モジュールを連結するように設計されている。ＩＩＩ型は、１対のＤＤＤ２モジュールと１対のＤＤＤ３
（配列番号：５０）モジュールを連結するように設計されている。２つのポリペプチド鎖は、逆平行な形で結び付くように設計されている。
【００８６】
プレターゲッティング
二重特異性抗体または多重特異性抗体を、プレターゲッティング技法で利用してもよい。プレターゲッティングは当初は、直接、抗体を標的設定する遅い血液クリアランスを解決するために開発された多段階方法である。この遅れは骨髄など正常組織に対する望ましくない毒性の一因となる。プレターゲッティングでは、血液から数分内に除去される小型の送達分子（標的可能な構築体または標的可能な構築体）に、放射性核種または他の治療薬を付着させる。標的可能な構築体ならびに標的抗原との結合部位を有するプレターゲッティング二重特異性抗体または多重特異性抗体が最初に投与されることで、遊離抗体が血液循環から除去され、次いで標的可能な構築体が投与される。
【００８７】
プレターゲッティング法は、当該技術分野で周知の方法であり、たとえば、Ｇｏｏｄｗｉｎら、米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６、１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４、１９８７；Ｏｅｈｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８、１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖ
ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６、１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１、１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０、１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１、１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０、１９９１；Ｙｕａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９、１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；第７,０１１,８１２号；第７,３００,６４４号；第７,０７４,４０５号；第６,９６２,７０２号；第７,３８７,７７２号；第７,０５２,８７２号；第７,１３８,１０３号；第６,０９０,３８１号；第６,４７２,５１１号；第６,９６２,７０２号；第６,９６２,７０２号；第７,０７４,４０５号；および米国特許出願第１０／１１４,３１５（現在、放棄された）に開示されている；これらの各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
被験者における疾患または障害を治療または診断するプレターゲッティング法は、以下によってもたらされうる：（１）被験者に二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメントを投与すること；（２）被験者に除去組成物を随意に投与して、該組成物が血液循環から該抗体を除去するのを可能にすること；および（３）１つ以上のキレート化したもしくは化学結合した治療薬または診断薬を含む標的可能な構築体を被験者に投与すること。標的可能な構築体にコンジュゲートされた酵素を投与し、該酵素によって活性型に変えられるプロドラッグを投与することによって、この技法を抗体依存性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に利用してもよい。
【００８９】
アビマー
ある種の実施形態において、本明細書に記載の結合部分は、１つまたは複数のアビマー配列を含んでもよい。アビマーは、種々の標的分子に対する親和性および特異性において、抗体とやや類似する結合タンパク質の１つのクラスである。アビマーはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエキソン・シャッフリングおよびファージ提示法により、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。得られる多ドメイン・タンパク質は、複数の独立した結合ドメインを含むことができ、単一エピトープ結合タンパク質に比較して、親和性（場合によっては、サブナノモル）および特異性に改善が見られる可能性がある（同書）。種々の実施形態において、アビマーは、特許請求された方法および組成物で使用するための、たとえば、ＤＤＤおよび／またはＡＤ配列に付加してもよい。アビマーの構築および使用の方法に関する補足詳細情報は、たとえば、米国特許出願第２００４０１７５７５６号（現在、放棄されている）、第２００５００４８５１２号（現在、放棄されている）、第２００５００５３９７３号（現在、放棄されている）、第２００５００８９９３２号および２００５０２２１３８４号（現在、放棄されている）に開示されている。これらの各々の実施例のセクションは、引用により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ファージ提示法
特許請求対象の組成物および／または方法の特定の実施形態は、種々の標的分子、細胞または組織の結合ペプチドおよび／またはペプチド模倣薬に関しうる。結合ペプチドは、ファージ提示法を含め（ただし、これに限定されない）、当業で既知の任意の方法によって同定することができる。ペプチドの多種多様なペプチド群を製造するための種々のファージ提示法および技法が当業で周知である。たとえば、米国特許第５,２２３,４０９号；第５,６２２,６９９号および第６,０６８,８２９号は、ファージライブラリーを作製するための方法を開示している。ファージ提示技法は、一般に、小型ペプチドがバクテリオファージの表面上に発現できるようにバクテリオファージを操作することを伴う（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９９３、
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８−２５７）。ペプチド以外に、一本鎖抗体などの、より大型のタンパク質をファージ分子の表面上に提示することもできる（Ａｒａｐら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０）。 
【００９１】
所定の器官、組織、細胞型または標的分子に対して選択的な標的設定アミノ酸配列を、パニングにより単離することもできる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、
１９９９、Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２）。簡単に説明すると、推定標的設定ペプチドを含むファージのライブラリーを無傷の器官または単離された器官、組織、細胞型または標的分子に投与し、結合したファージを含む試料を採取する。標的に結合したファージを標的器官、組織、細胞型または標的分子から溶出した後、宿主細菌中で増殖することにより、増幅させることができる。
【００９２】
特定の実施形態において、ファージは１回のパニングから次のパニングの間に宿主細菌中で増殖することもありうる。ファージによって溶解させる代わりに、細菌は特定のインサートを提示するファージのコピーを多数分泌することがありうる。望ましい場合は、増幅したファージを標的器官、組織、細胞型または標的分子に再度暴露し、追加のパニングのために採取してもよい。選択的または特定的バインダーが獲得できるまで、パニングは繰り返し実行してもよい。ペプチドのアミノ酸配列はファージゲノム中の標的設定ペプチドインサートに対応するＤＮＡ配列を決定することにより求めることができる。同定された標的設定ペプチドは、その後、標準的なタンパク質化学技法により合成ペプチドとして製造されうる（Ａｒａｐら、１９９８、Ｓｍｉｔｈら、１９８５）。 
【００９３】
いくつかの実施形態において、バックグラウンドファージ結合をさらに減少させるために、減算プロトコルを使うこともありうる。減算の目的は、関心の対象である標的以外の標的に結合するファージをライブラリーから除去することである。代替実施形態において、対照細胞、組織または器官に対して、ファージライブラリーのプレスクリーニングを行なうこともできる。たとえば、対照正常細胞系列に対してライブラリーをプレスクリーニングした後に、腫瘍結合ペプチドを同定してもよい。減算後、ライブラリーを関心対象の分子、細胞または組織に対してスクリーニングしてもよい。たとえば、米国特許第５,８４０,８４１号、第５,７０５,６１０号、第５,６７０,３１２号および第５,４９２,８０７号で開示されているように、減算プロトコルは他の方法も知られており、本特許請求された方法の実践に使ってもよい。
【００９４】
アプタマー
ある種の実施形態において、有用な標的設定部分はアプタマーになりうる。アプタマーの結合特性を構築および決定する方法は、当業で周知である。たとえば、そのような技法が米国特許第５，５８２，９８１号、
第５，５９５，８７７号および第５，６３７，４５９号に記載されており、その各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。関心対象の特定の標的に結合するアプタマーを調製およびスクリーニングするための方法は周知であり、たとえば、米国特許第
５,４７５,０９６号および米国特許第５,２７０,１６３号に記載されており、その各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
アプタマーは、合成、組換えおよび精製方法を含め、任意の既知の方法により調製してよく、単独で使用しても、同一の標的に特異的なほかのリガンドと組み合せて使用してもよい。一般に、特定の結合を生じさせるには、最低でおよそ３個のヌクレオチド、好ましくは５個のヌクレオチドが必要である。ヌクレオチドの数が１０、２０、３０または４０のアプタマーが好ましい場合があるが、１０塩基より短い配列のアプタマーも可能である。
【００９６】
アプタマーは、通常のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として、単離、配列決定および／または増幅または合成することができる。あるいは、関心対象のアプタマーは、修飾されたオリゴマーを含み得る。通常、アプタマーに存在しているヒドロキシ基のいずれもホスホン酸基、リン酸基による置換、標準の保護基による保護を受けるか、活性化されて、他のヌクレオチドへのさらなる結合を準備する、または固体支持体にコンジュゲートされることもありうる。Ｒが、Ｈまたはアルキル (１−２０Ｃ）であり、Ｒ’がアルキル （１−２０Ｃ）である場合、Ｐ（Ｏ）ＯがＰ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＮＲ２で置換されるなど、１つまたは複数のホスホジエステル結合が代替結合基により置換されうる；さらに、この基は、ＯまたはＳを通じて隣接するヌクレオチドに結合されうる。オリゴマーの結合のすべてが同一である必要はない。
【００９７】
治療薬および診断薬
ある種の実施形態において、本明細書に記述した抗体、 抗体フラグメントまたは
融合タンパク質は単独で、「裸の」抗体フラグメントまたは 融合タンパク質として投与することができる。代替実施形態において、抗体フラグメントまたは 融合タンパク質は少なくとも１つの他の治療薬の投与前、同時または投与後のいずれかに投与することができる。その他の実施形態では、 抗体フラグメントまたは融合タンパク質は、治療薬および／または診断薬と共有または非共有結合させ、イムノコンジュゲートを形成することができる。.
【００９８】
治療薬は、好ましくは、放射性核種、免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、アポトーシス促進剤、干渉ＲＮＡ、光活性治療薬、細胞毒性薬（
化学療法剤または毒素、およびその組合せとすることができる）から成る群から選択される。
使用する薬物は、抗有糸分裂、 抗キナーゼ、アルキル化、代謝拮抗、抗生、アルカロイド、
抗血管形成、アポトーシス促進、およびこれらの組合せから成る群から適切に選択される薬物学的性質を所有しうる。 
【００９９】
有用な薬物の例は、以下に限定されないが、有用で例示的な薬物は、以下を含むがこれらに限定されない：５‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、コックス−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアン−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシン・グルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロジェン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロキシウリジン（ＦＵｄＲ）、３′，５′−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイド。
【０１００】
有用な毒素としては、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（たとえば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅ
Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素が挙げられる。
【０１０１】
有用な免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、トロンボポエチンおよびそれらの組み合わせから選択されてもよい。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−βまたは−γなどのインターフェロン、および「Ｓ１因子」と名付けられたものなど幹細胞増殖因子である。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；上皮小体ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨形成誘導因子；インターフェロン−α、−βおよび−γなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＬＩＦ、キットリガンドまたはＦＬＴ−３、Ｆｌｔ−１、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ならびにＬＴが挙げられる。本明細書に用いるように、用語サイトカインという用語は自然源由来のまたは組換え細胞培養由来のタンパク質および天然配列サイトカインの生物活性等価物を含む。
【０１０２】
有用なケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＰ−１０が挙げられる。
【０１０３】
患部組織の治療に有用な放射性同位元素としては、以下に限定されないが、：１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７ＳＣ−１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２ＰＲ１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３ＰＲ１４９Ｐｍ、１６９ＥＲ１９４ＩＲ１９８Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが挙げられる。治療用放射性核種は、Ａｕｇｅｒエミッタの場合は２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータエミッタの場合は１００〜２，５００ｋｅｖＶの範囲、アルファエミッタの場合は４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲で崩壊エネルギーを有することが好ましい。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、Ａｕｇｅｒ放出粒子により実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。たとえば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、ｌ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩＲ１９２。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、および最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、アルファ粒子の生成によって実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。これらの放射性核種としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。さらに有用で有望な放射性同位元素として、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５ＢＲ１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７ＢＲ１１３mＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１mＴｅ、１２２mＴｅ、１２５mＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２ＰＲ１４３ＰＲ１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６ＢＲ１６９Ｙｂ等が挙げられる。有用な診断核種のいくつかとしては、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４mＴｃ、９９mＴｃまたは１１１Ｉｎが挙げられる。ある種の実施形態において、ｈＲ１などの
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、放射線治療の腫瘍の感作のための治療用放射性核種と組み合せることで有用になりえる（たとえば、Ａｌｌｅｎら、２００７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７：１１５５を参照されたい）。
【０１０４】
治療薬は、光活性剤または色素を含んでもよい。蛍光色素などの蛍光組成物、および他の色源体、または可視光に感受性のあるポルフィリンなどの色素を用いて、病変に適切な光を向けることによって病変を検出し、治療してきた。治療において、これは光放射、光線療法、または光線力学療法と称されてきた。Ｊｏｒｉら（編）、ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ
ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）；ｖａｎ ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ、Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６），２２：４３０を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体は光線療法を達成するために、光活性化色素に結合されてきた。Ｍｅｗ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）、１３０：１４７３；（同書）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８５）、４５：４３８０；Ｏｓｅｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．．ＵＳＡ（１９８６）、８３：８７４４；（同書）、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８７）、４６：８３；Ｈａｓａｎら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９８９），２８８：４７１；Ｔａｔｓｕｔａ
ｅｔ ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．（１９８９）、９：４２２；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９１）、６７：２５２９を参照されたい。
【０１０５】
副腎皮質ホルモンは他の化学療法剤の効果を増加することが可能で、したがって、併用療法で多用される。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、副腎皮質ホルモンの例である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、血管新生阻害剤は、たとえばアンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）ペプチドおよび抗体、抗血管増殖因子抗体（抵ＶＥＧＦおよび抗ＰＩＧＦなど）、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドチリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサン多硫酸塩、アンジオポエチン−２、インターフェロンα、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子またはミノサイクリンが有用であろう。
【０１０７】
他の有用な治療薬は、オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは癌遺伝子および癌遺伝子産物（ｂｃｌ−２など）に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。
【０１０８】
診断薬は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される。このような診断薬は公知であり、任意のこのような既知の診断薬を使用しうる。診断薬の非限定的な例として、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４‐１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒあるいはその他のガンマ、ベータまたは陽電子放射体を挙げられる。有用な常磁性イオンとして、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）またはエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられる。金属造影剤として、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）またはビスマス（ＩＩＩ）を挙げられる。超音波造影剤には、ガス封入リポソームのようなリポソームが包含されうる。放射線不透過性の診断薬は、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物のような化合物から選択されうる。広範な種々の蛍光標識が当該分野で公知であり、フルオレセインイソチアシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ‐フタルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられるが、これらに限定されない。有用な化学発光標識として、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルを挙げられる。
【０１０９】
イムノコンジュゲート
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメントまたは抗体融合タンパク質のいずれも、１つまたは複数の治療薬または診断薬とコンジュゲートしてよい。複数の治療薬は同一である必要はなく、たとえば、薬物と放射性同位元素のように、異なっていてもよい。たとえば、１３１Ｉを抗体または融合タンパク質のチロシン中に組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に付加してもよい。治療薬および診断薬を、たとえば、還元ＳＨ基および／または炭化水素側鎖に付加してもよい。治療薬または診断薬と抗体または融合タンパク質との共有結合的または非共有結合的コンジュゲートを作製するための多くの方法が当該分野で公知であり、任意のこのような既知の方法を用いてもよい。
【０１１０】
治療薬または診断薬を、ジスルフィド結合形成を介して、還元抗体成分のヒンジ領域に付加してもよい。あるいは、このような薬剤を、Ｎ‐スクシニル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて付加してもよい（Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５６：２４４（１９９４））。このようなコンジュゲーションのための一般的技術は、当該分野で公知である。例えば、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
ＯＦ タンパク質 ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ‐ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｂｉｒｃｈら編、（Ｗｉｌｅｙ‐Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９５）に掲載の、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  
Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８７頁‐２３０頁；ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，
ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ
ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、Ｒｉｔｔｅｒら編、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）に掲載の、Ｐｒｉｃｅ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ‐Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
、６０頁‐８４頁 を参照されたい。あるいは、治療薬または診断薬を、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を介して、コンジュゲートしてもよい。チオール基と結合した同一薬剤の装薬量を増大させるために炭水化物基を用いてもよく、あるいは異なる治療薬または診断薬を結合させるために炭水化物部分を用いてもい。
【０１１１】
ペプチドを、抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にコンジュゲートするための方法は、当業者に公知である。たとえば、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４６：１１０１（１９９０）；Ｓｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般的な方法として、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、遊離アミン官能基を少なくとも１つ有する担体ポリマーと反応させることが挙げられる。この反応により、まずシッフ塩基（イミン）結合が形成され、これを第２級アミンに還元することで安定化させて、最終的なコンジュゲートを形成する。
【０１１２】
イムノコンジュゲートの抗体成分として用いられる抗体が、抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域が欠如することもありうる。しかし、炭水化物部分を完全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。たとえば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５９１９（１９９５）；米国特許第５，４４３，９５３号および第６，２５４，８６８号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。改変された炭水化物部分を用いて、治療薬または診断薬が付加される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、キレート剤を抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質または標的設定可能構築体に付加して、放射性核種のような治療薬または診断薬をキレート化するために使用してもよい。キレート剤の例として、ＤＴＰＡ（Ｍｘ‐ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡまたはＮＯＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。コンジュゲーション法ならびにキレート剤を使用して、金属またはその他のリガンドをタンパク質に付加する方法は、当該分野で公知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第７，５６３，４３３を参照されたい）。
【０１１４】
特定の実施形態において、放射性金属または常磁性イオンを、イオンを結合させるための多様なキレート基を付加することのできる長い尾部を有する試薬と反応させて、タンパク質またはペプチドに付加してもよい。このような尾部は、ポリリジン、多糖または、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス‐チオセミカルバゾン、ポリオキシムおよびこの目的に有用であると知られている同様な基のようなキレート基が結合可能なペンダント基を有する他の誘導体化されたまたは誘導体化可能な鎖のような、ポリマーであってよい。
【０１１５】
キレートを、たとえば、米国特許第４，８２４，６５９号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、抗体またはペプチドに直接結合させることもありうる。特に有用な金属−キレートの組合せとして、１２５１、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴＣ−１１Ｃ、１３Ｎ、１５０、７６Ｂｒのような一般的エネルギー範囲が６０〜４０００ｋｅＶの診断用アイソトープとともに放射性イメージングに用いられる、２‐ベンジル‐ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレートが、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体化した場合は、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような大環状キレートは、様々な金属および放射性金属とともに、最も具体的には、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともに用いられる。このような金属キレート錯体は、対象とする金属に環のサイズを合わせることにより、非常に安定させることができる。ＲＡＩＴに対する２２３Ｒａなど、安定な結合核種のために興味深い、大環状ポリエーテルなど、他の環型キレートが包含される。
【０１１６】
ごく最近では、ＰＥＴスキャン技術で使用される１８Ｆ標識の方法、たとえば、Ｆ‐１８とアルミニウムのような金属または他の原子との反応による方法が開示されている。１８Ｆ‐Ａｌコンジュゲートは、抗体に直接付加する、またはプレターゲティング法において標的となりうる構築体を標識するために使用される、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡまたはＮＥＴＡのようなキレート基と錯体化されることもありうる。このようなＦ‐１８標識技術は、米国特許第７,５６３,４３３号（その実施例のセクションが、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１１７】
治療処置方法
種々の実施形態は、ヒト、家畜、コンパニオンペット（イヌおよびネコなど）を含む哺乳類などの被験者における癌を治療する方法に関し、この方法には該被験者に治療有効量の抗体、フラグメントまたは融合タンパク質を投与することを含む。好ましい実施形態において、この抗体またはフラグメントは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂである。特定の実施形態においは、治療は、治療薬が結合されていない「裸の抗体」を利用することもある。
【０１１８】
「裸の」抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の投与は、標的細胞の表面上で別の抗原と結合もしくは反応する別の「裸の抗体」の治療有効量を同時にまたは経時的に投与することによって補充されうる。好ましい追加のＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ−３、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物、またはこれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つのヒト化ＭＡｂ、キメラＭＡｂまたはヒトＭＡｂを含む。
【０１１９】
単体でもしくは他の裸のＭＡｂとの組み合わせでの裸の抗ＩＧＦ−１Ｒ治療のいずれも、上述のように少なくとも１つの治療薬を同時にまたは経時的に投与することでさらに補充されうる。集学的治療は、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ４６、抗ＭＩＦ、抗ＥＧＰ−１、抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＣＥＡＣＡＭ６、ＰＡＭ４、または抗ＨＬＡ−ＤＲ（インバリアント鎖を含む）抗体を、裸の抗体または融合タンパク質の形状で、あるいはイムノコンジュゲートとして投与することで補充される裸の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体による治療を含んでもよい。さらに、裸の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントは、ＭＵＣ１またはＭＵＣ５抗原に対する裸の抗体で補充されてもよい。抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体および抗ＣＤ２２抗体など、有用な種々の抗体が当業者には周知である。たとえば、Ｇｈｅｔｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ. ４８:２６１０ (１９８８)； Ｈｅｋｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２:３６４ (１９９１)； Ｌｏｎｇｏ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：３５３（１９９６）、米国特許第５,７９８,５５４号；第６,１８７,２８７号；第６,３０６,３９３号；第６,６７６,９２４号；第７,１０９,３０４号；第７,１５１,１６４号；第７,２３０,０８４号；第７,２３０,０８５号；第７,２３８,７８５号；第 ７,２３８,７８６号；第 ７,２８２,５６７号；第７,３００,６５５号；第７,３１２,３１８号；第７,６１２,１８０号；第７,５０１,４９８号および米国特許出願第２００８０１３１３６３号；第２００８００８９８３８号；第２００７０１７２９２０号；第２００６０１９３８６５号；および第２００８０１３８３３３号を参照されたい。その各々のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
もう１つの集学的療法の形態では、被験者は、標準的な癌化学療法と併せて、裸の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体および／またはイムノコンジュゲートを投与される。たとえば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ2シクロホスファミド、２００−４００ｍｇ／ｍ2エトポシド、および１５０−２００ｍｇ／ｍ2カルムスチン）は、非ホジキンリンパ腫を治療するのに用いられるレジメンである。Ｐａｔｔｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５１：１８（１９９３）。他の適切な併用化学療法レジメンは、当業者に周知である。たとえば、Ｈｏｌｌａｎｄら（編）のＣＡＮＣＥＲ
ＭＥＤＩＣＩＮＥ，第２、３版２０２８頁−２０６８頁に掲載されたＦｒｅｅｄｍａｎら"Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ"（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９３）を参照されたい。例示として、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）治療のための第一世代の化学療法レジメンには、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）が挙げられる。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）であリ、適切な第三世代のレジメンは、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）である。さらなる有用な薬物として、フェニル酪酸塩、ベンダムスチンおよびブリオスタチン−１が挙げられる。好ましい集学的療法では、化学療法薬およびサイトカインのどちらも、本発明に従って、抗体、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質と共投与される。サイトカイン、化学療法薬および抗体またはイムノコンジュゲートは、どのような順序でも、または一緒に投与されてもよい。
【０１２１】
イムノコンジュゲートまたは裸の抗体は、薬学的に有用な組成物を製造するための既知の方法によって製剤化されえ、それによってイムノコンジュゲートまたは裸の抗体は、混合物として薬学的に適切な賦形剤と組み合わせられる。無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に周知である。たとえば、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、第５版（ＬｅａおよびＦｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ′Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）およびその改訂版を参照されたい 
【０１２２】
本発明のイムノコンジュゲートまたは裸の抗体は、たとえばボーラス注射または持続注入を介する静脈内投与用に製剤化されうる。好ましくは、この抗体は約４時間未満の時間をかけて、より好ましくは、約３時間未満の時間をかけて注入される。たとえば、最初の２５−５０ｍｇは、３０分以内に、好ましくは１５分以内に注入され、残りは次の２−３時間にわたって注入されてもよい。注射用の製剤は、保存剤を添加して、単位投薬形態、たとえば、アンプルで、または多回投与用容器で提供することができる。組成物は、油性溶媒または水性溶媒中の懸濁剤、溶液剤または乳剤などの形状をとってよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に、無菌の発熱性物質除去蒸留水などの適切な溶媒との組成のための粉末形態を取ることもできる。
【０１２３】
さらなる製薬方法を用いて、治療用または診断用のコンジュゲートもしくは裸の抗体の作用持続時間を制御することができる。イムノコンジュゲートまたは裸の抗体を複合化するまたは吸着するために、ポリマーを用いることによって徐放製剤を調製することができる。たとえば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ酸無水物共重合体のマトリックスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。イムノコンジュゲートまたはそのようなマトリックス由来の抗体の放出速度は、イムノコンジュゲートまたは抗体の分子量、イムノコンジュゲートの量、マトリックス内の抗体、および分散粒子径に依る。Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら（上記参照）。他の固体剤形については、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ
ＳＹＳＴＥＭＳ、第５版（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０），およびＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ′Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）およびその改訂版に記載がある。
【０１２４】
イムノコンジュゲート、抗体融合タンパク質、または裸の抗体は、皮下経路もしくは他の非経口経路で、哺乳類に投与されてもよい。さらに、この投与は持続注入による、または、単回もしくは複数回のボーラスによるものであってもよい。好ましくは、この抗体は約４時間未満の時間をかけて、およびより好ましくは、約３時間未満の時間をかけて注入される。
【０１２５】
一般に、ヒトに投与されるイムノコンジュゲート、融合タンパク質または裸の抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状および病歴などの要因に応じて変化する。単回静脈注入として約１ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇまでの範囲にあるイムノコンジュゲート、抗体融合タンパク質または裸の抗体の投与量をレシピエントに供給することが望ましいこともあるが、状況に応じてより低いまたはより高い投与量が投与されることもある。たとえば、投与量が１−２０ｍｇ／ｋｇならば、体重７０ｋｇの患者の場合は７０−１，４００ｍｇ、あるいは身長が１．７ｍの患者の場合は４１−８２４ｍｇ／ｍ２になる。この投与量はたとえば４−１０週間毎週１回、８週間毎週１回、４週間毎週１回のように、必要に応じて繰り返すことができる。さらに、維持療法の必要に応じて、投与は、数カ月間は隔週、または何カ月間は毎月１回もしくは３カ月ごとに１回など、より低い頻度で与えられてもよい。 
【０１２６】
あるいは、裸の抗ＩＧＦ−１Ｒなどの抗体は、２週または３週ごとに１つの投与量として投与され、合計少なくとも３回の投与量で繰り返されてもよい。また、抗体は４−６週間の間は毎週２回投与されてもよい。投与量を約２００−３００ｍｇ／ｍ2（身長１．７ｍの患者に対して１投与につき３４０ｍｇ、または体重７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）まで下げる場合、この投与量を４−１０週間は毎週１回または２回投与されてもよい。あるいは、投与計画は減少させてもよい、すなわち２−３カ月間は２週ごとまたは３週ごとに１回としてもよい。ただし、１週間に１回または２−３週間に１回２０ｍｇ／ｋｇを投与するなどの、より高い投与量でも、反復投与サイクルの間、速度の遅い点滴で投与することができる。投薬計画は、場合により他の間隔で繰り返してよく、投与量を投与回数および計画を適切に調整することで、種々の非経口経路を介して与えてもよい。
【０１２７】
好ましい実施形態において、 抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
癌の治療に有用である。 癌の例としては、
以下に限定されないが、癌腫、リンパ腫、膠芽細胞腫、 メラノーマ、肉腫および白血病、骨髄腫または リンパ性悪性疾患が挙げられる。このような癌のより具体的な例を下記で言及し、以下が含まれる：扁平上皮癌（たとえば、扁平上皮細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃の癌つまり胃癌、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、
結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌つまり腎癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。用語「癌」には、原発性悪性細胞または腫瘍（たとえば、細胞が元々悪性または腫瘍である部位以外の被験者の身体部位に遊走しなかった細胞または腫瘍）、および二次的な悪性細胞または腫瘍（たとえば、転移により発症した腫瘍、最初の腫瘍部位と異なる二次的部位への悪性細胞または腫瘍細胞の転移）を含む。本発明の治療方法の対象となる癌には、ＩＧＦ−１Ｒを発現する、過剰発現する、または異常に発現する細胞が必要である。 
【０１２８】
癌または悪性腫瘍の他の例は、以下に限定されないが、急性小児急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄（性）白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、
成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄（性）白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、
成人原発性肝臓癌、成人軟部肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、
膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂癌および尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ性白血病、小児急性骨髄（性）白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児急性リンパ性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膵内分泌部島細胞細胞腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分泌膵癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆汁膀胱癌、胃癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆汁膀胱癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞性腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内メラノーマ、島細胞癌、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性潜在性原発性の扁平上皮性頸部癌、転移性原発性の扁平上皮性頸部癌、転移性の扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄性の白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性の扁平上皮性頸部癌、中咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉種／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉種／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、パラプロテイン血症、真性多血症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌および尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、移行細胞性腎盂癌および尿管癌、移行性腎盂癌および尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂の細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部性神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに、腫瘍症に加え、先に記載した臓器系にある、他の任意の過剰増殖性疾患を含む。 
【０１２９】
本明細書に記述し、請求する方法および組成物は、限定されるものではないが、先に説明した疾患悪性状態または前癌状態を治療し、腫瘍性状態または悪性状態の進行を防ぐために使用することができる。そのような使用とは、公知の状態、または進行に先立って、腫瘍症または癌、特に、過形成、化生、または最も具体的には、異形成から成る非腫瘍性細胞増殖が発症したと予想される状態での使用を指す（そのような異常な増殖状態の概説は、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ
Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、６８頁−７９頁（１９７６）を参照されたい）。 
【０１３０】
異形成は、癌の前兆であることが頻繁にあり、主に上皮に認められる。これは最も秩序の無い非腫瘍性細胞増殖の形態であり、各細胞の均一性および細胞の構造上の位置の欠損を伴う。特徴的な異形成は、慢性的な刺激つまり炎症の存在によって生じる。治療できる異形成疾患としては、以下に限定されないが、無汗性外胚葉異形成症、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指状異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、
頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨軟骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳−眼部異形成、骨端欠損異形成、多発性骨端、点状軟骨異形成症、上皮異形成、顔面生殖異形成、下顎の家族性線維性異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨の線維性異形成、セメン
ト質骨異形成、遺伝性腎臓−網膜異形成、発汗外胚葉性異形成、無汗性外胚葉異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形
成、Ｍｏｎｄｉｎｉ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯原性異形成、眼下
顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成、多発性線維性異形成、偽軟骨発育不全性脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、および心室橈骨異形成が挙げられる。 
【０１３１】
治療できるさらなる前腫瘍疾患としては、以下に限定されないが、良性悪性増殖疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫の皮膚病（Ｆａｒｍｅｒ’ｓＳｋｉｎ）、日光口唇炎、および日光性角化症が挙げられる。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、癌、詳細には先に記載した癌の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用される。
【０１３３】
さらなる過剰増殖疾患、疾患および／または状態としては、以下に限定されないが、白血病（急性白血病（たとえば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む）、慢性白血病（たとえば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病））、真性多血症、リンパ腫（たとえば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病などの悪性腫瘍および関連疾患、以下に限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺細胞腫、嚢腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、および網膜芽細胞腫のような肉腫および細胞腫を含む固形腫瘍の進行および／または転移が挙げられる。
【０１３４】
キット
種々の実施形態は、患者における患部組織の治療または診断に適した成分を含むキットに関することがある。例示的なキットは、本明細書に記述するように、少なくとも１つの抗体、フラグメントまたは融合タンパク質を含んでもよい。投与のための成分を含む組成物が、経口送達によるなど消化管を介する送達用に製剤化されていない場合、別の経路を介してキット成分を送達しうる装置を含むこともできる。非経口送達などの適用の場合、装置の１つの種類は、組成物を被験者の体内に注射するために用いられる注射器である。吸入装置を用いてもよい。
【０１３５】
キット成分はまとめて包装する、または２つ以上の容器に分けてもよい。一部の実施形態では、この容器は、再構成に適した組成物の無菌の凍結乾燥製剤を含むバイアルであってもよい。キットは、また、再構成に適した１つ以上の緩衝剤および／または他の試薬の希釈物を含んでもよい。用いてもよい他の容器としては、以下に限定されないが。ポーチ、トレー、箱、管などが挙げられる。キット成分を、包装しても、容器内に無菌で保持してもよい。もう１つキットに含めてもよい要素としては、キット使用者向けの説明書がある。
【０１３６】
発現ベクター
さらに他の実施形態は、抗体、フラグメント、融合タンパク質または二重特異性抗体をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関することがある。コードされて発現されうる例示的な配列として、抗ＩＧＦ−１Ｒ−ＭＡｂもしくはそのフラグメント、少なくとも１つの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体もしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質、少なくとも１つの第１の抗体もしくはフラグメントおよび少なくとも１つの第２の抗体もしくはフラグメントを含む融合タンパク質が挙げられる。第１の抗体および第２の抗体は、抵ＩＧＦ−１Ｒ抗体、腫瘍関連抗原に対する抗体、および／または標的設定可能な構築体上のハプテンを含んでもよい。融合タンパク質は、下記の実施例でより詳細に論じるように、ＤＮＬ構築体の形成に活用するＡＤおよびＤＤＤペプチドなど、異なるペプチドまたはタンパク質に付加された抗体または抗体フラグメントを含んでもよい。
【０１３７】
種々の実施形態は、コードＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。このベクターは、キメラ、ヒト化もしくはヒト可変領域配列が付加されうる、ヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域をコードする配列を含んでもよい。ベクターは、選択した宿主細内でＭＡｂを発現させるプロモーター、免疫グロブリンエンハンサーおよびシグナル配列またはリーダー配列をさらに含んでもよい。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳである。より好ましくは、軽鎖定常領域および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域が、ヒトＥＵ骨髄腫免疫グロブリンに由来していて、アロタイプ部位で少なくとも１つのアミノ酸を、異なるＩｇＧ１アロタイプに見られるアミノ酸に任意に変えることができ、かつＥＵ番号付与体系に基づくＥＵの重鎖のアミノ酸２５３を場合によりアラニンと置換することもできる。Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５（１９６９）を参照されたい。他の実施形態においては、ＩｇＧ１配列は下記のように、ＩｇＧ４配列に変換されうる。
【０１３８】
また、抗体もしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質を発現させる方法も包含する。発現構築体を遺伝子改変し、宿主細胞へ挿入して改変タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で周知であり、日常的な実験の問題であると、当業者は理解するであろう。宿主細胞およびクローン化抗体またはフラグメントの発現方法は、たとえば、米国特許第７,５３１,３２７号；第７,５３７,９３０号；および第７,６０８,４２５号に記載されており、その各々の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の構築のための一般技法
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＶκ （可変軽鎖）およびＶH (可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよびＣＤＮＡライブラリースクリーニングなどの多種多様な分子クローニング手法により獲得することができる。マウス抗ＩＧＦ−１Ｒ
ＭＡｂを発現する細胞由来の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂの Ｖ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によりクローニングし、配列を決定することができる。配列の確実性を確認するために、クローン化したＶＬ
およびＶＨ遺伝子をＯｒｌａｎｄｉら (Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６：３８３３（１９８９））が記述しているように、キメラＡｂとして細胞培養中で発現させることができる。その後、Ｖ遺伝子配列に基いて、ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ
ＭＡｂを 、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１４１３（１９９５））によって記述されているように、設計して構築することができる。
【０１４０】
マウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂを産生するいかなる既知のハイブリドーマ系列または形質移入細胞株からも、ｃＤＮＡは一般の分子クローン技術によって調製されうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９））。ＭＡｂのためのＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）またはＬｅｕｎｇら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５：２８６（１９９３））によって記述された伸長プライマーセットを用いて増幅することができる。ＶH配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨＩＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）またはＬｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））によって記述されたマウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。 
【０１４１】
第１ストランドｃＤＮＡ産物を１０μＬ、１０ＸＰＣＲ緩衝液を１０μＬ［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、各ｄＮＴＰを２５０μＭ、プライマーを２００ｎＭ、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  
Ｃｅｔｕｓ）を５単位含有するＰＣＲ反応混合物を，３０サイクルのＰＣＲにかけることができる。各ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、および７２℃で１．５分間の重合で構成されることが好ましい。増幅したＶκおよびＶＨのフラグメントは２％アガロース上で精製することができる（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）。Ｌｅｕｎｇ
ら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１４１３（１９９５））によって記述されているように、ヒト化Ｖ遺伝子は長いオリゴヌクレオチド鋳型合成とＰＣＲ増幅との組み合わせによって構築することができる。 
【０１４２】
ＶκのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列およびＶκ
ＰＣＲ産物のインフレームライゲーションを容易にする便利な制限酵素認識部位を含む、ｐＢＲ３２７をベースとするステージングベクター、ＶＫｐＢＲなどのステージングベクター中にサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをベースとするＶＨｐＢＳなど同様のステージングベクター中にサブクローニングすることができる。それぞれのＰＣＲ産物を含んでいる個々のクローンは、たとえば、Ｓａｎｇｅｒ
ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４：５４６３（１９７７））の方法によって配列を決定することができる。
【０１４３】
Ｖκ配列およびＶＨ配列を含む発現カセットは、プロモーター配列およびシグナルペプチド配列と一緒に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして二重制限消化によってそれぞれ、ＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから切除することができる。このＶκおよびＶＨの発現カセットは、それぞれ、ｐＫｈおよびｐＧ１ｇなど適切な発現ベクターにライゲーションすることができる（Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））。発現ベクターは、たとえば骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４（ＡＴＣＣ、ＶＡ）の適切な細胞に同時導入することができ、ハイグロマイシン耐性に関してコロニーを選択し、およびキメラ、ヒト化またはヒト抗ＩＧＦ−１Ｒの産生に関して、たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイによって上澄みをモニタリングすることができる。あるいは、Ｇｉｌｌｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ   １２５：１９１（１９８９）、ＬｏｓｍａｎらのＣａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７）にも示されている）によって記述されているように、ＶκおよびＶＨ発現カセットを、修飾したステージングベクター、ＶＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２中で組み立て、それぞれ、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切除し、ｐｄＨＬ２など単一の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。Ｂａｒｎｅｓら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３２：１０９−１２３（２０００）に記述されるように、有用な別のベクターは、ＧＳベクターである。他の適切な哺乳類発現系は、Ｗｅｒｎｅｒら、Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４８（ＩＩ）、Ｎｒ．８、８７０−８８０（１９９８）に記述されている。
【０１４４】
同時トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンに関するアッセイは、以下のように実施することができる。ＣｏらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９（１９９２）に従って、５×１０６ＳＰ２／０骨髄腫細胞をエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によってトランスフェクトするために、約１０μｇのＶＫｐＫｈ（軽鎖発現ベクター）および２０μｇのＶＨｐＧ１ｇ（重鎖発現ベクター）を用いることができる。トランスフェクトした後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で、９６ウェルのマイクロタイタープレートで完全ＨＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させてもよい。選択プロセスは２日後、ハイグロマイシン選択培地（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ハイグロマイシンの最終濃度５００単位／ｍＬで加えることによって、開始することができる。コロニーは、通常、エレクトロポレーションから２−３週間後に出現する。次いでこの培養物をさらなる分析のために成長させることができる。キメラ重鎖、ヒト化重鎖またはヒト重鎖の分泌に陽性のトランスフェクトーマクローンをＥＬＩＳＡアッセイによって同定することができる。
【０１４５】
抗体は以下のようにして培地から単離することができる。トランスフェクトーマ培養物は、無血清培地に適応している。キメラ抗体を作製するために、ＨＳＦＭを用いることによってローラーボトル中で５００ｍＬの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分離し、上清を０．２μ膜で濾過する。濾過した培地を、１ｍＬ／分の流速で、タンパク質Ａカラム（１×３ｃｍ）に通過させる。次いで、この樹脂を約１０カラム容積のＰＢＳで洗浄して、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）によってタンパク質Ａ結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍＬの画分を、１０μＬの３Ｍ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）を含む管に収集し、タンパク質濃度を、２８０／２６０ｎｍの吸光度で測定する。ピーク画分をプールして、ＰＢＳに対して透析し、抗体を、たとえばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ
３０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で濃縮する。抗体濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、ＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍＬに調整する。アジ化ナトリウム（０．０１％（ｗ／ｖ））を、保存剤として試料に加えると都合が良い。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
実施例１  抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体: Ｒ１、ｃＲ１およびｈＲ１の生成および初期特性化
完全フロイントアジュバント中にヒトＩＧＦ−１Ｒの処理済みおよび未処理
の両方の細胞外ドメインの混合物を含む、１５ μｇの組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃３９１−ＧＲ）をＢＡＬＢ／ｃマウス３匹のそれぞれの腹腔内に接種し、免疫を施した。初回免疫の１４日後、２１日後および２８日後に、不完全フロイントアジュバントで追加免疫を施した。標準プロトコルに従い、
免疫を施したマウスからの脾細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８.６５３細胞と融合し、ハイブリドーマを生成した。 抗ＩＧＦ−１Ｒ活性を発現しているが、抗ＩＲ（インスリン受容体）活性は発現していない１つのクローン（Ｃ−１１）を単離し、培地で展開させ、ＭＬ０４Ｒ１またはＲ１と命名されたマウス抗体を取得した。このマウス抗体は、市販のマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＭＡＢ３９１に匹敵する、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７Ｌ（ＭＣＦ−７のサブライン）を発現しているＩＧＦ−１Ｒ
への放射性ヨウ化ＩＧＦ−１の結合を阻害する能力を有するＩｇＧ１／ｋ
であることが明らかになった（表２）。
【表２】
2013516996.tif 000004
ａ
Ｒ＆Ｄクローン３３２５５．１１１
【０１４７】
ｃＲ１を取得するために、Ｒ１のマウス−ヒトキメラＭＡｂ、Ｒ１のＶＨ
および ＶＫ
遺伝子のクローニングを５’−ＲＡＣＥにより行なった。 くローン化したＶＨ および ＶＫ 遺伝子の信頼性は、ＤＮＡ配列から推定される対応するアミノ酸と最初の１５個のＮ末端アミノ酸が正確に一致することを示すＮ末端
タンパク質配列決定により確認された（表３）。クローン化したＶH および
ＶK 遺伝子をｐｄＨＬ２ ベクターに挿入し、 ｃＲ１ｐｄＨＬ２ （図１）、ｃＲ１の発現ベクターを生成した。
【表３】
2013516996.tif 000005
ａ精製したＲ１ を、Ｎ末端 タンパク質配列決定（１５サイクル）に供した。エドマン分解のサイクルが１回終了するごとに２つの残基を検出した。
ｂＤＮＡ配列から推定。
【０１４８】
ＳｐＥ−２６（たとえば、
米国特許第７,５３１,３２７号）、成長特性の改善を示したＳｐ２／０−Ａｇ１４のバリアントを宿主細胞として使って、ｃＲ１産生クローンを精製した。簡単に説明すると、およぞ３０
μｇのｃＲ１ｐｄＨＬ２をＳａｌＩ 制限エンドヌクレアーゼを使用して消化により線形化し、エレクトロポレーションにより、ＳｐＥ−２６細胞に導入した。トランスフェクタントを０.０７５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を使って選択し、ヒトＦｃ結合活性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。比較的高い産生クローンをさらに展開し、２つの最も良いクローン（７０９．２Ｄ２および７１０．２Ｇ２）を選び、それらをもとにｃＲ１をバッチ培地で産生させ、タンパク質Ａで精製し、各々が図３に示すように、固定化したｒｈＩＧＦ−１Ｒに同じく高い親和性（ＫＤ
〜０.１ ｎＭ）を持って、図２に示すように、固定化したｒｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するが、固定化したｒｈＩＲには結合しないことが、ＥＬＩＳＡにより確認された。驚くべきことに、様々な濃度のｃＲ１または
Ｒ１の存在下で 、蛍光プローブでタグを付けたＲ１の結合をフローサイトメトリーで測定した競合アッセイ（図４）で示されているように、ｃＲ１は、ポリスチレンビーズに固定化したｒｈＩＧＦ−１Ｒに対して、Ｒ１より高い親和性を有するように見える。
【０１４９】
ｃＲ１のｈＲ１へのヒト化は、
特定のヒトフレームワーク残基を対応する位置でＲ１のマウスの対応残基で置換する、ｈＭＮ−１４のヒトフレームワーク
領域へのＣＤＲの移植（米国特許第５,８７４,５４０号および第６,６７６,９２４号；各々の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる）により成功した。他の選択した残基をクローニングの目的のために置換し、ｈＲ１  ＶＨおよび
ｈＲ１  ＶＫのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：９および配列番号：１０で示されているとおりになった。続いて、ｈＲ１  ＶＨおよび
ｈＲ１  ＶＫをコードしている遺伝子を合成し、ｐｄＨＬ２に操作し、ｈＲ１ｐｄＨＬ２（ｈＲ１の発現ベクター）を得た。ｈＲ１の産生クローン（７１１．３Ｃ１１）を確保するためにその後、行なった努力は、ｃＲ１について上述した内容と同様だった。ｒｈＩＧＦ−１Ｒへの結合活性について陽性クローンを選別した。  図５に示すように、ｈＲ１は、 ポリスチレンビーズ上に固定化されたｒｈＩＧＦ−１Ｒに対して、ｃＲ１とほぼ同じ結合親和性を示した。
【０１５０】
ｃＲ１がＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合をブロックできるかどうかを判断するために、ＩＧＦ−１Ｒを発現している細胞のサロゲートとして、ｈＩＧＦ−１Ｒで固定化されたポリスチレンビーズを使い、以下の要領でビーズ競合アッセイを実施した。簡単に説明すると、ｃＲ１の濃度を様々に変えて（０〜６７０ｎＭ）、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を一定量の１２５Ｉ−ＩＧＦ−１または１２５Ｉ−ＩＧＦ−２と混合した。次いでｒｈＩＧＦ−１でコーティングしたビーズを加え、１時間、室温でそっと揺らしながら培養し、洗浄して、
放射能をカウントした。図６に示す結果は、ｃＲ１は上記の条件のもとで、このような固定化されたｒｈＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２のいずれの結合もブロックできなかったことを示している。図７に示す同様の実験の結果も、ビーズに固定化したＩＧＦ−１Ｒへの１２５Ｉ−ＩＧＦ−１の結合はＩＧＦ−１または
ＭＡＢ３９１によって効果的にブロックされたが、ｈＲ１またはＲ１ではブロックされなかったことを示している。これらの発見は、ＩＧＦ−１および
ＭＡＢ３９１は同一のエピトープに結合するか、あるいはＩＧＦ−１Ｒにオーパーラップするエピトープを有しているが、ｈＲ１
は ＭＡＢ３９１またはＩＧＦ−１とは異なるＩＧＦ−１Ｒの領域を標的にしていることを示唆している。ＩＧＦ−１に対するＩＧＦ−１Ｒの第１の結合部位は、アミノ酸（ａａ）２２３から２７４までのシステインリッチ（ＣＲ）ドメインに位置し、同一の領域（ａａ２２３〜２７４）がαＩＲ−３へのエピトープとして割り当てられていて、ＭＡＢ３９１と同様、ＩＧＦ−１結合で競合することが報告されている（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ＴＡ、Ｒｕｔｔｅｒ  ＷＪ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  
Ｃｈｅｍ  １９９０；２６５：１８６６３−７）ため、ＭＡＢ３９１も同一の領域に結合するか、あるいは近傍の部位と相互作用するようだった。
【０１５１】
実施例２  Ｒ１、ｃＲ１およびｈＲ１のエピトープマッピング研究
ｈＲ１が結合するＩＧＦ−１Ｒの領域をさらに特定するために、ＩＧＦ−１Ｒへのエピトープがマッピングされている市販の抗ＩＧＦ−１Ｒ
ＭＡｂのパネルについて、ＩＧＦ−１Ｒをコーティングしたビーズへの結合を互いにクロスブロックする能力を評価した。代表的な２つの実験の結果を図８Ａ（蛍光プローブ（ＰＥ）でタグを付けたＲ１の結合は、１００μｇ／ｍLでもＭＡＢ３９１による影響を受けなかったことを示している）および図８Ｂ（ＰＥでタグ付けされたＭＡＢ３９１の結合は、１００μｇ／ｍLでＲ１により一部だけ（５０〜６０％）阻害されたことを示している）で提供する。表３Ａに要約した追加結果は、Ｒ１のエピトープがａａ１５１から２８２までのＣＲドメインに位置し、ａａ１５１から２２２までのＣＲドメインの前半部にあるとさらに詳しく特定できることを表している（表３Ｂ）。
【表４】
2013516996.tif 000006
【表５】
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【０１５２】
実施例３  Ｒ１、ｃＲ１およびｈＲ１の追加特性化
ＩＧＦ−１は、無血清培地で生育されたＭＣＦ−７細胞の増殖を刺激し、４８時間目に未処置の対照と比較すると、１００
ｎｇ／ｍＬで生存細胞数を最大５０％増加する効果を達成するのに対し、ｈＲ１はそうしない（図９）。
したがって、ｈＲ１は、ＩＧＦ−１Ｒへの結合時にアゴニスト的ではない。ｈＲ１のＭＣＦ−７への内在化は３７℃で観察されたが、４℃では観察されなかった（図示されていない）。
【０１５３】
実施例４  ｈＲ１−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）バリアントに対する発現ベクターの構築 
ＩｇＧ４遺伝子を含有するＢ１３−２４
細胞をＡＴＣＣ （ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１３９７）から購入し、ゲノムＤＮＡを単離した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳを使って洗浄し、
消化緩衝液（ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ（ｐＨ８.０）、ＥＤＴＡ  ２５ ｍＭの（ｐＨ８.０）、０.５％  ＳＤＳ、プロテイナーゼＫ  ０.１ ｍｇ／ｍＬ）で再懸濁し、５０℃で
１８時間培養した。 試料を等容量のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールで抽出し、
７.５ＭのＮＨ４Ａｃ／１００％エタノールを使って沈殿させた。ゲノムＤＮＡを遠心分離で回収し、ＴＥ緩衝液に溶解した。ゲノムＤＮＡを鋳型として使い、ＩｇＧ４遺伝子を以下のプライマーを使ってＰＣＲで増幅した。
プライマー−ＳａｃＩＩ
ＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣ（配列番号：１１） 
プライマー−ＥａｇＩ： 
ＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号：１２）
【０１５４】
増幅したＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ＴＡ配列決定ベクター
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｈＲ１ｐｄＨＬ２にＩｇＧ１の重鎖定常領域を含むＳａｃＩＩ−ＥａｇＩ フラグメントをＴＯＰＯ−ＴＡ−ＩｇＧ４プラスミドのＳａｃＩＩ−ＥａｇＩで置換し、ｈＲ１−ｐｄＨＬ２−ＩｇＧ４（ｈＲ１ｐｄＨＬ２-γ４）ベクターを生成した。
ＩｇＧ４−プロリン変異
【０１５５】
半分子の形成を回避するために、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異をＩｇＧ４のヒンジ領域に導入した。変異したヒンジ領域５６ｂｐフラグメント（ＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ）を合成した。
上部
ＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧ（(配列番号：１３）； 
下部：
ＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号：１４） 
アニールして、ＩｇＧ４のＰｓｔＩ−ＳｔｕＩフラグメントで置換した。この構築の結果、最終的にベクターｈＲ１ｐｄＨＬ２-γ４Ｐが生成された。
【０１５６】
実施例５  ＤＮＬによる 多価 ｈＲ１ベース 抗体の生成
ＤＮＬ技法を使って、様々なフォーマットで単一特異性または二重特異性のいずれかの多価ｈＲ１ベース抗体を作製することができる。特定の好ましい実施形態において、Ｆａｂ抗体フラグメントをＤＤＤ配列またはＡＤ配列のいずれかを含む融合タンパク質として製作することができる。二重特異性抗体は、最初の抗体のＦａｂ−ＤＤＤ
融合タンパク質をもう１つの抗体のＦａｂ-ＡＤ 融合タンパク質と組み合せることで形成することができる。あるいは、ＩｇＧ−ＡＤモジュールを
融合タンパク質として製作し、同一または異なる特異性のＦａｂ−ＤＤＤモジュールと組み合わせる。抗体の標的化能力を任意の他のタンパク質またはペプチドのエフェクター機能と併せ持つ追加の種類の構築体を作製することもできる。 
【０１５７】
独立したトランスジェニック細胞株を、ＤＤＤまたはＡＤ融合タンパク質の各々向けに開発する。モジュールはいったん製作した後、望ましい場合は精製するか、または培養上清液に保持することができる。
製作後、Ｆａｂ−ＤＤＤモジュールのどれもＡＤモジュールのどれと組み合せてもよい。ＤＤＤモジュールＡＤモジュールは、ＡＤ配列をポリエチレングリコールに、またはＤＤＤ配列
をオリゴヌクレオチドに連結するなど、合成的に製造することができる。異なる種類の構築体に対して、異なるＡＤ配列またはＤＤＤ配列を利用することができる。
ＤＤＤ１：ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１５）
ＤＤＤ２：ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１６）
ＡＤ１：ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：１７）
ＡＤ２：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号：１８）
【０１５８】
プラスミドベクターｐｄＨＬを使って、数多くの抗体および抗体ベースの構築体が製作されてきた。. Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９）、１２５：１９１−２０２；Ｌｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７）、８０：２６６０−６を参照されたい。
２シストロン性哺乳類発現ベクターは、 ＩｇＧの重鎖および軽鎖の合成を指示する。ベクター配列は多数の異なるＩｇＧ-ｐｄＨＬ２構築体に対してほとんど同一であり、可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列のみに違いが存在する。当業者に公知の分子生物学ツールを使って、Ｆａｂ−ＤＤＤ１およびＦａｂ−ＡＤ１について以下で詳しく記述するように、これらのＩｇＧ
発現ベクターをＦａｂ−ＤＤＤ、Ｆａｂ-ＡＤまたはＩｇＧ−ＡＤ発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ１の発現ベクターを生成するには、重鎖のヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのコード配列をヒンジ部の最初の４
残基、１４ 残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、およびＤＤＤ１ (ヒトＲＩＩαの最初の４４ 残基）をコードする配列で置換する。Ｆａｂ−ＡＤ１の発現ベクターを生成するには、ＩｇＧのヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの配列をヒンジの最初の４
残基、１５ 残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、およびＡＤ１（ＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基合成ＡＤ）をコードする配列で置換する。このＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基合成ＡＤは、バイオインフォマティックとペプチドアレイ技術を使って生成され、ＲＩＩα二量体を極めて高い親和性（０.４ ｎＭ）で結合することが示されている。Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ（２００３）、１００：４４４５−５０）を参照されたい）。 
【０１５９】
後述のように、ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターからＦａｂ−ＤＤＤ１またはＦａｂ−ＡＤ１のいずれかの発現ベクターへの変換を容易にするために、２つのシャトルベクターを設計し、構築した。
【０１６０】
ＣＨ１の調製
ｄＨＬ２プラスミドベクターを鋳型として使い、ＣＨ１ドメインをＰＣＲで増幅した。左側のＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）端部とＳａｃＩＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位とから成る。これはＣＨ１のコード配列の５’である。右側のプライマーは、ヒンジ部（ＰＫＳＣ）の最初の４残基をコードする配列と、これに続くグリシン４個とセリン１個から成り、最後の２つのコドン（ＧＳ）には、ＢＡＭ  ＨＩ制限酵素認識部位を含まれる。
５’側のＣＨ１左側プライマー
５’ＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧ−３’（配列番号：１９）
ＣＨ１＋Ｇ４Ｓ−Ｂａｍ 右側（「Ｇ４Ｓ」は配列番号：５４として開示されている）
５’ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号：２０）
【０１６１】
４１０  ｂｐ  ＰＣＲ
アンプライマーをｐＧｅｍＴ  ＰＣＲ クローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）内にクローニングし、
Ｔ７（５’）の配向にある挿入についてクローンのスクリーニングを行なった。
【０１６２】
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１の構築
（「（Ｇ４Ｓ）２」は 配列番号：５５として開示されている）
最初の２つのコドンにＢａｍＨＩ制限酵素認識部位が含まれる状態で、リンカーペプチドの１１残基の下流に、ＤＤＤ１のアミノ酸配列がコードするように、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ、ＵＫ）
によってニ本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１（「（Ｇ４Ｓ）２」は
配列番号：５５として開示されている）と命名した。終始コドンおよびＥａｇＩ制限酵素認識部位を３’末端に付加した。コードしたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ
（配列番号：２１）
【０１６３】
ＲＩＩＡ１−４４上部およびＲＩＩＡ１−４４下部と命名した、３’末端部において３０塩基対が重なっている２つのオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、１７４
ｂｐのＤＤＤ１配列の中心にある１５４塩基対を含むように結合した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔａｑポリメラーゼによるプライマー伸張反応に供した。
ＲＩＩＡ１−４４上部
５’ＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：３４）
ＲＩＩＡ１−４４下部
５’ＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号：３５）
【０１６４】
プライマー伸張の後、以下のプライマーを使って二本鎖をＰＣＲで増幅した：
Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ−左側（「Ｇ４Ｓ」は配列番号：５４として開示されている）
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号：３６）
１−４４ 終止 Ｅａｇ右側
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号：３７）
【０１６５】
このアンプライマーをｐＧｅｍＴ内にクローニングし、Ｔ７（５’）の配向にある挿入についてクローンのスクリーニングを行なった。
【０１６６】
（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１の構築（「（Ｇ４Ｓ）２」は配列番号：５５として開示されている）
最初の２つのコドンにＢａｍＨＩ制限酵素認識部位が含まれる状態で、リンカーペプチドの１１残基の下流に、ＡＤ１のアミノ酸配列がコードするようにニ本鎖オリゴヌクレオチド合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１（「Ｇ４Ｓ２」は、配列番号：５５として開示されている）と命名した。
終始コドンおよびＥａｇＩ制限酵素認識部位を３’末端に付加した。コードしたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（(配列番号：３８）
【０１６７】
ＡＫＡＰ−ＩＳ 上部およびＡＫＡＰ−ＩＳ下部と命名する２種類の重なる相補的なオリゴヌグレオチドを合成した。
ＡＫＡＰ−ＩＳ上部
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号：２２）
ＡＫＡＰ−ＩＳ下部
５’ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴGＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号：２３）
【０１６８】
ニ本鎖を以下のプライマーを使ってＰＣＲで増幅した：
Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ−左側 （「Ｇ４Ｓ」は配列番号：５４として開示されている）
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号：２４）
ＡＫＡＰ−Ｓ 終止 Ｅａｇ右側
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ−３’（配列番号：２５）
【０１６９】
このアンプライマーをｐＧｅｍＴベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）の配向にある挿入についてクローンのスクリーニングを行なった。
【０１７０】
ＤＤＤ１の ＣＨ１とのライゲーション
ＤＤＤ１配列をコードしている１９０ｂｐフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を使ってｐＧｅｍＴから切り離した後、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴ内の同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
【０１７１】
ＡＤ１のＣＨ１とのライゲーション
ＡＤ１配列を含有する１１０ｂｐフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を使ってｐＧｅｍＴから切り離した後、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴ内の同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
【０１７２】
ｐｄＨＬ２をベースとするベクターへのＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のクローン化
このモジュラー設計を利用して、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１は任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２
ベクターに組み込むことができる。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ−ＥａｇＩ制限フラグメント（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、それをＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ−ＥａｇＩ
フラグメント（それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り離す）で置換することにより、重鎖定常ドメイン全体を上記の構築体の１つで置換する。
【０１７３】
ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１−ｐｄＨＬ２
ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１−ｐｄＨＬ２は、
ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１の産生の発現ベクターである。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１は、１４アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを通じて、Ｆｄのカルボキシル末端に付加されたＤＤＤ２の二量化およびドッキングドメイン配列を有している。 
【０１７４】
発現ベクターを下記のように設計した。リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、
配列番号：２６）の一部およびＤＤＤ２の残基１−１３をコードする配列を含む、２種類の重なる相補的オリゴヌクレオチドを合成的に作製した。オリゴヌクレオチドをアニールして、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化した結果、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
およびＰｓｔＩで消化されるＤＮＡとのライゲーションに適合する５末端と３末端にオーバーハングが生じた。
Ｇ４Ｓ−ＤＤＤ２上部 (（「Ｇ４Ｓ」は 配列番号：５４として開示されている）
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ−３’（配列番号：２７）
Ｇ４Ｓ−ＤＤＤ２下部 (（「Ｇ４Ｓ」は 配列番号：５４として開示されている）
５’ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号：２８）
【０１７５】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化して調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴとライゲーションし、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。５０７ｂｐフラグメントを、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴから切り離し、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩで消化して調製したＩｇＧ
発現ベクターｈＲ１ｐｄＨＬ２ とライゲーションした。最終発現構築体は、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１−ｐｄＨＬ２である。
【０１７６】
ＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９−ｐｄＨＬ２の生成
ＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９−ｐｄＨＬ２は、ＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９の産生のための発現ベクターであり、ＡＤ２をコードするＤＮＡ配列の鋳型として有用である。この発現ベクターは下記のように設計する。ＡＤ２をコードする配列およびリンカー配列の一部を含む、２種類の重なる相補的オリゴヌクレオチド (ＡＤ２上部およびＡＤ２下部）を合成的に作製した。オリゴヌクレオチドをアニールし、
Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼでリン酸化した結果、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
およびＰｓｔＩで消化されるＤＮＡとのライゲーションに適合する５末端と３末端にオーバーハングが生じた。
ＡＤ２上部
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号：２９）
ＡＤ２下部
５’ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号：３０）
【０１７７】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化して調製したシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴにライゲーションし、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。ＣＨ１およびＡＤ２のコード配列を含む４２９塩基対フラグメントをＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限酵素でシャトルベクターから切り離し、同じ２つの酵素で消化して調製したｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクター
とライゲーションし、その結果、ＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９−ｐｄＨＬ２を生じた。
【０１７８】
ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧを発現させるためのCH３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２の生成
ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュール
には、９アミノ酸残基ペプチドリンカーを通じて、ＩｇＧの重鎖のカルボキシル末端にＡＤ２ペプチドが融合されている。ＡＤ２ペプチド（ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ、配列番号：１８）が後に続くリンカーペプチドのＤＮＡコード配列（ＧＳＧＧＧＧＳＧＧ、
配列番号：３１）を標準組換えＤＮＡ方法でＣＨ３（重鎖定常ドメイン３）コード配列の３’末端に連結し、連続的なオープン・リーディング・フレームを生成した。重鎖ＡＤ２ポリペプチドを軽鎖ポリペプチドと共発現させると、ＩｇＧ分子が形成され、２つのＡＤ２ペプチドが処理され、したがって、２つのＦａｂ−ＤＤＤ２二量体を結合することができる。ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールは任意のＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールと組み合わせることができ、Ｆｃフラグメント１個とＦａｂフラグメント６個とから成る、
種々多様な六価構造体を生成することができる。ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールおよびＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールが同一の親モノクローナル抗体（ＭＡｂ）に由来する場合、生じる複合体は単一特異性となり、同一抗体への結合腕を６本有する。モジュールが２つの異なるＭＡｂに由来する場合、生じる複合体は二重特異性となり、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの特異性に対応する結合腕を２本とＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールの特異性に対応する結合腕を４本有する。
【０１７９】
任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２
ベクターのＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を容易にするために、プラスミドシャトルベクターを製造した。鋳型としてｐｄＨＬ２
ベクターを、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＦｃ  ＢｇｌＩＩ左側とＦｃ  Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ右側 を使って、Ｆｃの遺伝子（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を増幅した。
Ｆｃ  ＢｇｌＩＩ 左側
５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ−３’ (配列番号:３２)
Ｆｃ  Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ 右側
５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：３３）
【０１８０】
アンプライマーをｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター中でクローニングした。Ｆｃ挿入フラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ
制限酵素を使ってｐＧｅｍＴから切り離し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを使ってＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９−ｐｄＨＬ２を消化することで調製したＡＤ２−ｐｄＨＬ２
ベクターとライゲートし、シャトルベクターＦｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１８１】
任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２
発現ベクターをＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限フラグメントを前者から切り離し、Ｆｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターから切り離した９５２ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限フラグメントで置換した。ＢｓｒＧＩは、ＣＨ３ドメイン中にカットインし、ＮｄｅＩは発現カセットの下流（３’）をカットする。
【０１８２】
Ｈｅｘ−ｈＲ１の生成
ＤＮＬ法を用いて、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧｈＲ１をＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１と組み合せることにより。１つのＦｃと６つのＦａｂを有する単一特異性
抗ＩＧＦ−１ＲであるＨｅｘ−ｈＲ１を作製した。  Ｈｅｘ−ｈＲ１ は４工程で作製した。
工程１  組合せ：  ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１上の各ＡＤ２につき２つのＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１が存在するように、モル比４．２で、ｐＨ
７.４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１を１ｍＭのＥＤＴＡと混合し、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１をある程度過剰にすることで、結合反応が確実に完了するようにした。
工程２   穏やかな還元：  還元型のグルタチオン（ＧＳＨ）を１ ｍＭの終濃度で添加し、この溶液を室温（１６−２５℃）で１−２４時間保持した。
工程３  穏やかな酸化：  還元の後、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＨ）を２
ｍＭの終濃度で反応混合物に直接加え、この溶液を室温で１−２４時間保持した。
工程４  ＤＮＬ産物の単離：  酸化の後、反応混合物を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム上に直接ローディングした。カラムをＰＢＳで洗浄し、Ｈｅｘ−ｈＲ１を０.１ Ｍのグリシン（ｐＨ ２.５）で溶離した。反応しなかったＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲ１を結合していない部分中の所望の生成物から除去した。他の六価のＤＮＬ構築体も、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ
とＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂの選択した対を混合することにより同様に調製することができる。
【０１８３】
本発明に関するこのようなＤＮＬ構築体および構造的コントロールの一覧を表４に示す。これらの構築体の各々は、構成要素である抗体の結合活性を維持することが示された。
【表６】
2013516996.tif 000008
【０１８４】
実施例７  癌細胞株におけるＩＧＦ−１Ｒ発現
Ｚｅｎｏｎ標識を付けた種々の親抗体ならびにこれらの抗体から派生した多価抗体を使って、Ｇｕａｖａ計器でフローサイトメトリーを実施し、複数の癌細胞株の同種抗原の発現レベルを評価した。図１０に示すように、ＩＧＦ−１Ｒの発現はｈＲ１のＭＣＦ−７（乳癌）、ＣａＰａｎ１（膵臓癌）およびＤＵ−１４５（前立腺癌）への結合により確認した。図１１では、ヒト化抗ＡＦＰ
ＩｇＧおよびＴＦ１８（ｈＡＦＰの２つのＦａｂフラグメントが含まれるように、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＡＦＰをＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９
と組み合せることで作製した）の結合ならびにｈＲ１−ＩｇＧ−ＡＤ２（ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１の二量体）および１Ｒ−３１の結合増加により、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）におけるＩＧＦ−１Ｒ
およびＡＦＰの二重発現も示されており、これらの多価ＤＮＬ構築体は親和性が高くなることを示唆している。Ｈｅｐ  Ｇ２におけるＣＥＡＣＡＭ６の発現を、１Ｒ１５の結合増加を観察することにより認識した。図１２に、ＦＡＣＳｃａｎ上でＭＣＦ−７、ＤＵ−１４５およびＭＥ−１８０（子宮頸癌）を使って実施した追加調査を示してあり、表５はその調査の要約である。これらは多価の
ＤＮＬ構築体はそれぞれの親抗体に比較して、標的細胞株に対して結合増加を示すという、Ｇｕａｖａによる発見を裏付けている。興味深いことに、
多価二重特異性構築体は、問題の抗原を種々のレベルで発現している細胞株において、それぞれの対応する多価単一特異性構築体に比べて、より高い親和性で結合するように見える。 
【表７】
2013516996.tif 000009
【０１８５】
実施例８  Ｈｅｘ−ｈＲ１および１Ｒ−Ｅ１の中和活性
ＤＵ−１４５およびＭＥ−１８０（どちらもＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＰ−１を発現する）において、ＩＧＦ−１の増殖刺激活性を中和するＨｅｘ−ｈＲ１または１Ｒ−Ｅ１の効果を測定するために次の実験を実施した。標的細胞を２０００／ウェルで９６ウェルプレート内に播種し、完全培地で一晩培養した。細胞を無血清培地で２回洗浄し、０．８、
４、２０および１００μｇ／ｍＬで、無血清培地で２時間、選択した多価抗体に暴露した後、ＩＧＦ−１を添加して、最終濃度を１０ｎｇ／ｍＬにした。細胞を７２時間培養した後、ＭＴＳアッセイに供した。以上の条件下では、Ｈｅｘ−ｈＲ１はＤＵ−１４５（図１３Ａ）およびＭＥ−１８０（図１３Ｂ）の増殖を用量依存的に、統計的有意に抑止した。ＭＥ−１８０で１Ｒ−Ｅ１を使った場合も、同様の結果を得た（図１３Ｃ）。
【０１８６】
実施例９  ＩＧＦ−１Ｒの下方制御 
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体により誘導される抗癌効果の１つの主要な機構は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がアゴニストとアンタゴニストのいずれであるかに関係なく、エンドサイトーシスを通じてＩＧＦ−１Ｒ
を下方制御し、後にエンドソーム小胞において分解を引き起こすことである。図１４に示すように、ＭＣＦ−７またはＨＴ−２９（結腸直腸癌）におけるＩＧＦ−１Ｒ
の効率的な下方制御が、１００ｎＭでのｈＲ１、ならびに陽性対照として使われる市販の２つの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＭＡＢ３９１および２４−６０）によって明確に示されたが、抗ＣＤ２２抗体であるｈＬＬ２（エプラツズマブ）では示されなかった。ｈＬＬ２は陰性対象として使われる。さらなる研究によって、Ｈｅｘ−ｈＲ１および１Ｒ−Ｅ１は、図１５ＡおよびＢで示すように、ＭＣＦ−７、ＤＵ−１４５およびＬｎＣａｐ（アンドロゲン依存性前立腺癌）において、最低０.１ｎＭの濃度でＩＧＦ−１Ｒのレベルを実質的に減少させることが可能であることが明らかになった。
【０１８７】
実施例１０  ＩＧＦ−１により誘導されるシグナル伝達経路のブロック
ｈＲ１は、ビーズに固定されたｒｈＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１の結合を防止していないように見えるかもしれないが、図１６から２０にまとめて示してあるように、リン酸化ＩＧＦ−１Ｒ（ｐＩＧＦ−１Ｒ）、リン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）のレベルを減少させ、ＩＧＦ−１が３つの細胞株（ＭＣＦ−７、ＤＵ−１４５および
ＭＥ−１８０）で種々の信号伝達分子を活性化するのを効果的にブロックしている。 
【０１８８】
記載した方法および組成物は、前立腺癌の治療に有用である。上に開示した実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果であり、ｈＲ１ならびにＤＮＬを使って作製したその六価誘導体（Ｈｅｘ−ｈＲ１、Ｒ−Ｅ１およびＥ１−１Ｒ）は、ＩＧＦ−１Ｒを効果的に下方制御し、ＩＧＦ−１がアンドロゲン非依存性ＤＵ−１４５細胞の増殖を刺激するのを阻害することを示している。ＤＮＬ構築体について観察されたより高い有効性は、細胞上で標的化可能抗原の増加が示されていることから、親和性の高まりが原因と推測され、これは対応する二重特異性抗体の場合にさらに増幅する可能性がある。ＩＧＦ−１Ｒは種々の固形腫瘍および悪性血液疾患で発現するため、当業者は、本特許請求の組成物および方法は、多発性骨髄腫および肝癌など、ＩＧＦ−１Ｒを発現するその他の既知の癌の治療にも有用であることを認識するであろう。ｈＲ１を
抗ＥＧＦＲ（Ｃ２５）または抗ＨＥＲ２（ハーセプチン）などの他の抗体と併用することも、上記のように、治療的に有用である。
【０１８９】
実施例１１  ＭＣＦ−７
乳癌異種移植モデルにおける種々のｈＲ１ 構築体の効果
４週齢の雌の 無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、０．５ｍｇの１７βエストラジオールの６０日放出ペレットを移植し（Ｓａｃｈｄｅｖら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：６２７−３５）
、その後、１，０００万個のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を皮下注射した。腫瘍容積を測定し、平均２００ｍｍ３
に達したら、連続４週間にわたり、１週間に２回、以下の薬剤を投与する腹腔内治療の対象として９匹のマウスの群をランダム抽出した：（１）試験物質と同量の対照生理食塩水；（２）４００μｇのｈＲ１
ＩｇＧ；（３）８００μｇのｈＲ１  ＩｇＧ； （４）４００μｇのｈＲＳ７  ＩｇＧ（抗−ＥＧＰ−１）；（５）８００μｇのｈＲＳ７  ＩｇＧ；（６）３００μｇの１Ｒ−Ｅ１  六価構築体（ｈＲ１
ＩｇＧ−ｈＲＳ７−４個のＦａｂ）；（７）６００μｇの１Ｒ−Ｅ１；および（８）８００μｇの１Ｒ−Ｅ１。腫瘍容積の測定は、ランダム抽出と治療を実施した日から始めて、週に２回、測径器を使って双方向で測定した；動物の体重も週に２回測定した。マウスが瀕死状態になるか、２０％を超える体重減があったとき、または腫瘍の大きさが２．５ｃｍ３達したときに、マウスを犠牲にし、腫瘍および正常組織を除去し、組織学的および免疫組織化学的分析のために、ホルマリンで保存した。６０日目までに実験は終了し、対照群での継続的な腫瘍増殖が明らかになった。対照群は治療の開始後、最も早いマウスは５週目で、その後も次の２週のうちに犠牲になった。腫瘍増殖の阻害の証拠は、治療終了後１週間で、第１群については（対照を基準として）２０％、第２群については３５％、第３群については５４％、第４群については１１％、第５群については２６％、第６群については３２％、第７群については５１％、第８群については６８％
と測定された。これらの結果は、以上の用量のｈＲ１抗体 は、ｈＲＳ７ （抗−ＥＧＰ−１）抗体よりも腫瘍増殖の阻害性があることを示しているが、後者の抗体もある程度の抗癌活性を示した。しかし、ｈＲ１
およびｈＲＳ７の六価の二重特異性抗体構築体は、比較的低い用量で、対応する親抗体に匹敵またはそれより高い抗癌効果を示し、ＤＮＬを使って作製される二重特異性抗体構築体のより高い有効性を示唆している。治療に関係する毒性、特に２０％を超える体重減は治療群では観察されなかった。
【０１９０】
生理食塩水の代わりに、無関係なアイソタイプ対照抗体を使って、４週間にわたり、週に２回、それぞれ４００μｇおよび８００μｇ
の用量で腹腔投与する、六価ｈＲ１群および六価ｈＲＳ７群を入れて、同一の実験をＭＣＦ−７を有する同様のマウスで繰り返し、腫瘍増殖阻害は、六価ｈＲ１の場合は２５−４６％、六価ｈＲＳ７の場合は２０−３３％の範囲であることを算出した。これは６価構築体は、対応する２価の親抗体よりも有効性が高いことを示唆している。
【０１９１】
実施例１２  ＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌とＣｏｌｏ２０５
ヒト 結腸癌の異種移植におけるｈＲ１構築体の効果
５−６週齢の雌のｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスの腫瘍異種移植片に、マトリゲルで混合した２００万個のＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌またはＣｏｌｏ２０５
ヒト 結腸癌の細胞を皮下注射し、大きさが約２００ｍｍ３
になるまで放置し、各々１１匹の群にランダムに分類した。連続する４週間にわたり、週に２回、様々な用量で食塩水ビヒクル（対照）または試験物質をマウスの腹腔注射することにより処置した。直前の実施例と同じように、腫瘍を測定し、動物の体重を測定し、観察した。腫瘍モデルのそれぞれにつき、以下の用量を投与した。腫瘍増殖阻害率ＧＩ（腫瘍増殖の進行のために対照群の２０％を超えるマウスが犠牲になる前の処置群対対照群の平均容積を比較している）を括弧内に示す：

ＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌モデル
（１）０．５ｍｇのｈＲ１（３９％ＧＩ）
（２）１．０ｍｇのｈＲ１（６８％ＧＩ）
（３）０．５ｍｇのｈＰＡＭ４（１５％ＧＩ）
（４）１．０ｍｇのｈＰＡＭ４ (２４％ＧＩ）
（５）０．５ｍｇのｈＲＳ７（１８％ＧＩ）
（６）１．０ｍｇのｈＲＳ７（２９％ＧＩ）
（７）０．５ｍｇの１Ｒ−Ｅ１（６３％ＧＩ）
（８）０．５ｍｇの１Ｒ−１M（４８％ＧＩ）
（９）１．０ｍｇのｈＬＬ２（抗ＣＤ２２  ＩｇＧ）アイソタイプ対照
【０１９２】
以上の結果は、ヒト膵臓癌異種移植片の増殖を阻害する上でのｈＲ１の用量依存的な効果を示唆しており、ｈＲＳ７抗体またはｈＰＡＭ４抗体よりも優れているように見えるが、ｈＲ１およびｈＲＳ７（１Ｒ−Ｅ１）の二重特異性構築体は、別々に投与された同一用量の親抗体に比べて、増加した活性およびｈＲ１およびｈＰＡＭ４（１Ｒ１Ｍ）の二重特異性抗体に対してはやや低い増加効果を示すように見える。

Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸癌モデル
（１）  ０．５ｍｇのｈＲ１（４６％ＧＩ）
（２）  １．０ｍｇのｈＲ１（７０％ＧＩ）
（３）  ０．５ｍｇのｈＭＮ−１４（１４％ＧＩ)
（４）  １．０ｍｇのｈＭＮ−１４（２９％ＧＩ)
（５）  ０．５ｍｇの１４−１Ｒ（５８％ＧＩ）
（６）  １．０ｍｇの１４−１Ｒ (８３％ＧＩ)
（７）  １．０ｍｇのｈＬＬ２対照.
【０１９３】
抗ＩＧＦＲ１および抗ＣＥＡＣＡＭ５（ｈＭＮ−１４）ヒト化抗体の両方について、用量に依存する増殖阻害が観察され、このモデルにおいて前者がより効果的であったが、ＤＮＬにより作製されたそれぞれの二重特異性抗体構築体は、相当する用量の二価親抗体に比べて、効果の改善を示している。
【０１９４】
実施例１３  多発性骨髄腫異種移植片モデルにおけるｈＲ１構築体の単独およびボルテゾミブとの併用での効果
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から入手した６−８週齢の雌のＳＣＩＤマウスに移植するために、１００万個の細胞を収穫できる密度まで、ＡＧヒト骨髄腫細胞を細胞培養で増殖した。Ｓｔｅｉｎら（Ｂｌｏｏｄ、２００４；１０４：３７０５−１１）が記述しているように、５−１０ｘ１６６
の骨髄腫細胞を静脈注射する３日前に、マウスにはフルダラビンおよびシクロホスファミドで事前に処置を施し、免疫を抑制した。マウスは毎日検査して、苦痛または後ろ肢麻痺の兆候がないかを調べ、毎週、体重を測定した。後ろ肢麻痺または
> ２０％の体重減を生存終点として用い、その状態になると、動物を安楽死させた。８−１０匹のマウスから成る群を使った。ｈＲ１の用量を１００、
３００、６００および１,０００μｇとして、４週間にわたり、週に２回、 ｈＲ１を腹腔内投与する用量反応研究では、生理食塩水ビヒクルまたは未反応性のアイソタイプ対照抗体を使って処置されたマウス（平均生存期間は４０日だった）に比べて生存の大幅な向上（Ｐ＜０．０３）が見られた。ｈＲ１で処置したマウスの平均生存期間は８０日から１００日に及び、用量反応を示している。ｈＲ１とボルテゾミブを併用する効果について、同じ骨髄腫モデルで評価した。骨髄腫細胞の注入後５日目から開始して、３週間にわたり、週に２回、腹腔投与として処置を施した。
単一薬剤として与えた場合、０．５ｍｇ／ｋｇボルテゾミブでは体重減が起こらず、良好に耐えられた。未処置の対照マウスにおける平均生存期間は３３日で、ボルテゾミブのみを４０日間与えた場合は４０日（２１．２％の増加）だった。３週間、週に２回、マウス１匹につき０．６ｍｇでｈＲ１での処置を繰り返した群では、平均生存期間は６０日に増加した。ボルテゾミブとｈＲ１の処置を併用した群では、０．５ｍｇのボルテゾミブ＋０．６ｍｇのｈＲ１の場合、平均生存期間はさらに７９日という有意な増加（ｐ=０．０４）を示した。したがって、骨髄腫の治療において活性のある薬剤は、この抗ＩＧＦＲ１抗体と併用することにより、活性の増加を示す。
【０１９５】
実施例１４  膵臓癌におけるゲミシタビンおよび抗ＩＧＦＲ１抗体（ｈＲ１）免疫治療と９０Ｙ−ｈＰＡＭ４ 放射免疫治療の併用療法の効果
ＹＳは、２ヵ月前に、ステージＩＩＩ／ＩＶの転移性で手術不可能な膵臓腺癌と診断された６１歳の男性で、膵臓の先端部に直径６ｃｍの膵臓病変と肝臓に直径約３ｃｍと約４ｃｍの２つの転移がある。この患者はＣＡ１９．９の滴定濃度の上昇（７,２００）を示しているが、他の臨床検査値のほとんどは境界線または正常範囲内にある。男性は活発だが、疲労しやすく、
最小量の薬物投与を必要とする腹痛に時々襲われ、診断以降、体重が約１０ｋｇ減少した。男性は、１週間に１回２００ｍｇ／ｍ２でゲミシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））を静脈から注入すること、免疫シンチグラフィーによって抗体局在を評価するために、（Ｓｈａｒｋｅｙらによる［Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００３年１２月；４４（１２）：２０００−１８］の記述に従って標識を付けた）１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｈＰＡＭ４抗体も１週目に注入した後、次の連続する３週間、毎週（Ｓｈａｒｋｅｙらによる同書の記述に従って標識を付けた）１２ｍＣｉ／ｍ２の９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｈ  ＰＡＭ４を注入することから成る、４週間の治療を必要とする治験中の治療を選んだ。１日目、７日目、１４日目および２１日目に、ｈＲ１を
１０ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１６ ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量で 静脈注入した。患者はグレード１−２の悪心、背痛、低血圧、食欲不振および疲労を注入の各回後に経験したが、回を重ねるごとに重症度は減少し、軽度だった。これは注入反応を抑制するために、５０ｍｇのヒドロコルチゾン、アセトアミノフェンおよびジフェニルヒドラミンを前投与しておいたことによる。治療後４週間目に、患者にＦＤＧ−ＰＥＴおよびＣＴスキャンを実施し、治療前と治療後の膵臓癌病変の代謝および大きさを比較し、血液を採取して、ＣＡ１９−９腫瘍バイオマーカー滴定濃度を測定した。原発癌のＳＵＶは、８．９から３．３に変化し、肝臓の２箇所の転移性病変はそれぞれ６．１と５．３から５．３と３．５にそれぞれ大幅に減少していた。ＣＴの測定値は、原発腫瘍は１ｃｍの減少を、２箇所の肝臓転移性病変は約３３％の減少を示した。このとき、ＣＡ１９．９の滴定濃度は９３０で、７,２００から大きく低下したことを示した。４週間後の経過観察では、ＳＵＶ値の連続した低下および腫瘍の大きさの安定化または多少の減少がＣＴ測定により確認された。患者の疾患が安定していたため、３ヶ月後、治療を繰り返し、患者は良好に耐え、再度安定した疾患を示し、
次の４週後の経過観察でＣＡ１９．９の滴定濃度の増加は見られなかった。この併用療法は、最低でも、疾患を安定化させ、腫瘍の代謝活性を低下させ、膵臓癌の血液バイオマーカーであるＣＡ１９−９を著しく減少させると結論づけられる。この患者はこの期間、通常、活発であり、疲労または苦痛を感じず、体重を４ｋｇ取り戻した。血液学的異常もその他の検査所見の異常もなかった。
【０１９６】
実施例１５  ｈＲ１との転移性結腸直腸癌の併用ＦＯＬＦＩＲＩ療法 
ＲＳは、重病歴のない７１歳の女性で、６ヶ月前のＳ状結腸Ｂ３腺癌の切除後に転移性結腸癌を示していた。女性は術後の放射線療法も化学療法も拒否していた。女性の血液ＣＥＡ滴定濃度は１１ｎｇ／ｍＬで上昇していた。ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ撮影で、原発切除部位での再発は見つからなかったが、肝臓の右葉に別々の病変３つ（直径２−４ｃｍ）と肝臓の左葉に比較的大きな病変（６ｃｍ）１つが見つかった。サルベージ肝臓切除の候補ではなかったため、患者はｈＲ１治療と組み合わせたＦＯＬＦＩＲＩ併用療法を受けた。１日目に、１, １８０ｍｇ／ｍ２のイリノテカンを２時間の注入で、５００ｍｌの生理食塩水で与え、１日目および２日目に、４００ｍｇ／ｍ２
のフォリン酸を２時間かけて、静脈内ボーラスで注入した後、２週間ごとに、連続４６時間注入で
フルオロウラシル（２,４００ｍｇ／ｍ２）を投与した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、ｈＲ１を１０ｍｇ／ｋｇで、２週間、週に１回、遅い注入速度で与え、直前の患者の実施例と同様、前投薬も行なった。この併用療法を８サイクル実施した。治療完了の６週間後、ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴスキャンによって、左葉の転移病変の大きさは６０％減少して、ＳＵＶも減少し、右葉の３つの転移病変のうちの２つは直径１ｃｍに見え、３つ目の病変は大きさが変わっていないことが分かった。３つの病変のうち、２つのＳＵＶ値はほぼ０まで減少し、３つ目は３．２になった。ＣＥＡの循環に変化は見られなかった。さらに６週間後、右葉の転移病変の３つのうちの２つは見えなくなり、３つ目は直径約１．５ｃｍになった。左葉の腫瘍は、現在、直径３ｃｍと測定される。この患者は、部分反応状態にあるとみなされ、治療終了の８ヶ月後、この状態が継続している。
【０１９７】
実施例１６  肝細胞癌患者の放射線標識ｈＲ１モノクローナル抗体による治療 
黄疸、不快感、体重減、全身の脱力感のある５７歳の男性が、コンピュータ断層撮影により、手術不可能な肝細胞癌と診断された。癌は肝臓の右葉に直径約６ｃｍに及ぶように見え、左葉にも３ｃｍの病変と見えるものが１つあった。右葉の病変は生検により肝細胞癌と確認された。 
【０１９８】
この患者に、Ｓｈａｒｋｅｙら（Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００３年１２月；４４（１２）：２０００−１８）の記述に従って、９０Ｙを有するＤＯＴＡでコンジュゲートしたｈＲ１モノクローナル抗体の２サイクルを与え、２５ｍＣｉ（１００ｍｇ抗体タンパク質）の治療用量ごとに、投入するようにした。初回の治療は、外来診療の場で実施し、６週間後に繰り返した。治療の各回に先立って、腫瘍の標的化を実施し、腫瘍に届く放射線量と肝臓、腎臓、骨髄などの他の正常組織に届く放射線量を概算し、耐容可能とみなされる（たとえば、腎臓には２０００ｃＧｙ）範囲を超えて正常組織／器官に毒性を引き起こすことがないように、１週間後に与える９０Ｙによる治療用量を調節できるように、抗体にＤＯＴＡでコンジュゲートしたの診断用量の１１１Ｉｎ（標識化についても、Ｓｈａｒｋｅｙらの２００３の同書に記述されている）も注入した。
患者はこの後、治療後４−８週間ごとに、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを繰り返し、さらに血中ＡＦＰ、ビリルビン、アミノ酸転移酵素およびＬＤＨの濃度により、反応をモニタリングした。 
【０１９９】
９０Ｙで標識を付けた抗体を２回目に治療投与した８週間後に、患者のビリルビン、アミノ酸転移酵素およびＬＤＨの血中濃度は正常値の約２０％上まで低下し、血中ＡＦＰ滴定濃度の測定値は６０
ｎｇ／ｍＬで、これも改善していた。肝臓疾患のＣＴ測定では、左葉病変のほぼ完全な消失と右葉の比較的大きな塊の４０％の減少が示された。左葉に残っている小さな病変は癌ではなく、瘢痕組織であると判断されるため、この後、患者は右葉の外科的切除の候補になった。 
【０２００】
実施例１７  裸のｈＲ１抗体と組み合わせた９０Ｙ標識ｈＲ１抗体による患者の治療
６２歳の男性は、３年前にデュークスＣ直腸癌を切除した後、放射線治療および５−フルオロウラシル／フォリン酸化学療法を受けた病歴を持つ。患者は血漿ＣＥＡ
滴定濃度の上昇を示し始めていて、濃度は３０ｎｇ／ｍＬに到達しようとしている。再発が疑われるため、患者に様々な診断手順を実施した。コンピュータ断層撮影により、肝臓に転移病変が２つあり、一方は右葉に存在し、直径３ｃｍに及び、他方は左葉で、葉間間膜付近に存在し、多少小さいことが分かった。患者には、まず１０ｍｇ／ｋｇのｈＲ１抗体を週に１回、３回投与した後、裸のｈＲ１治療の３週目、３回目のｈＲ１注入の前に、ｈＲ１抗体にコンジュゲートした用量の２５ｍＣｉの９０Ｙを、５０ｍｇのタンパク質量で２時間かけて、静脈内注入によって投与した。この治療を２ヵ月後に繰り返した。最後の治療注入の２−４週後に測定したところ、患者は白血球の数と血小板の低下を示したが、
治療８週間後の評価では回復していた。治療の３ヶ月後でのコンピュータ断層撮影では、肝臓の右葉の一番大きな腫瘍転移は４０％縮小し、左葉の腫瘍もそれより低い割合で縮小していることが分かった。
【０２０１】
６ヶ月後の経過観察で、患者の癌病変は２倍（two-diameter）ＣＴ測定で約７０パーセント減少しており、血中ＣＥＡは８ｎｇ／ｍＬで、全般的な病状が改善し、治療に関係する明らかな毒性も副作用も見られなかった。
【０２０２】
実施例１８  乳癌患者のＹ-９０  ｈＲ１  ＭＡｂと裸のｈＲ１  ＭＡｂによる治療
乳腺癌の再発歴がある５６歳の女性が、頸部リンパ節および左肺に転移を示している。女性は化学療法とホルモン療法の後に２回、再発した。その後、女性には１００ｍｇの抗体のタンパク質量で、各々１５ｍＣｉの９０Ｙの投与量で、９０ＹにコンジュゲートしたｈＲ１
ＭＡｂをそれぞれ１週間の間隔をあけて、３回治療的に静脈内注入した。治療の４週間後、女性の白血球および血小板の数は約５０％減少したが、治療の９週間後に回復した。治療の１２週間後の再ステージング（restaging）では、肺および節の転移病変は、コンピュータ断層撮影で、約３０％減少していると測定された。したがって、患者は各々４時間をかけて、裸のｈＲ１抗体の注入を週に１回、４回受けた。患者は一時的にやや悪寒や寒気を感じたことを除き、治療に良好に耐え、血球の数にも、血液の化学的性質にも一切副作用はなかった。１回に注入する裸の抗体の用量は１２ｍｇ／ｋｇであった。約８週間後、コンピュータ断層撮影による再ステージングでは、測定可能な病変が約２０パーセントさらに縮小したことが示された。３ヶ月後の追跡検査で、患者の疾患は安定しているように見えた（すなわち、追加的増殖および進行的増殖の証拠はなかった）。 
【０２０３】
本明細書に開示し、特許請求する組成物および方法はすべて、本開示を踏まえて、不当な実験を行なうことなく、製作および使用することができる。組成物および方法は好ましい実施形態の観点から記述されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、該組成物および該方法に、本明細書に記載された方法の工程でまたは一連の工程で変化を加えることが可能であることは、当業者には明白である。より具体的には、化学的と物理的の療法で関係する特定の薬剤は、本明細書で記載した薬剤の代わりに使っても同一または同様の結果を達成できる可能性がある。そのような当業者には明白な類似の置換および改変は、付属する請求項によって定義されているように、本発明の精神、範囲および概念の中に入るものと見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月7日(2013.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、
配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、
配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはフラグメントが、裸の抗体またはフラグメントであるか、あるいは少なくとも１つの診断薬または治療薬にコンジュゲートしている、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
前記ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、配列番号：９および配列番号：１０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
前記キメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、配列番号：７および配列番号：８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
前記治療薬が、放射性核種、免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、アポトーシス促進剤、干渉ＲＮＡ、光活性治療薬、細胞毒性剤、
化学療法剤および毒物から成る群から選択される、請求項２に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
前記診断薬が、放射線同位体、色素、放射線造影剤、超音波造影剤、蛍光標識、化学発光標識、酵素、増強剤および常磁性イオンから成る群から選択される、請求項２に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記抗体がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体の定常領域配列を含む、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質。
【請求項１０】
少なくとも１つの他の抗体またはそのフラグメントに付加された請求項１に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントを含む、多重特異性抗体。
【請求項１１】
他方の抗体が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、
ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０, ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０L、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６a-e、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、
ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、因子Ｈ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、
ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１.２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、 ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ, ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、 ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、 ＭＩＰ−１Ａ、 ＭＩＰ−１Ｂ、 ＭＩＦ、 ＭＵＣ１、 ＭＵＣ２、 ＭＵＣ３、 ＭＵＣ４、 ＭＵＣ５、ＰＡＭ４ 抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＡＦＰ、Ｉａ、ＨＭ１.２４, ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ 抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、 ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２)、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子 Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、および癌遺伝子産物から成る群から選択される腫瘍関連抗原に結合する請求項１０に記載の多重特異性抗体。
【請求項１２】
重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＤＹＹＭＹ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＹＩＴＮＹＧＧＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ、
配列番号：２）およびＣＤＲ３（ＱＳＮＹＤＹＤＧＷＦＡＹ、配列番号：３）ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＥＶＧＴＡＶＡ、
配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＨＴ、配列番号：５）およびＣＤＲ３（ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ、配列番号：６）を含む、抗体の単離されたヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合をブロックする抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、そのフラグメント、融合タンパク質、または多重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
癌治療のために用いられることを特徴とする、請求項１〜１２の何れか１項に記載の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、そのフラグメント、融合タンパク質、または多重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
前記治療薬が、ＥＧＦＲ阻害剤、エルロチニブ、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤、トリホスチン、ＡＧ１０２４、
ＡＧ５３８、ピロロ［２，３−ｄ］−ピリミジン誘導体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、５‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、コックス−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアン−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシン・グルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロジェン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロキシウリジン（ＦＵｄＲ）、３′，５′−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド、ＤＴＩＣ、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよび「Ｓ１因子」と命名された幹細胞増殖因子から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
2013516996.tif 000052
2013516996.tif 000053
2013516996.tif 000054
2013516996.tif 000055