(57)【要約】  １６個のアミノ酸または１７個のアミノ酸を含み、Ｃ末端カルボキシル基および／またはＮ末端アミノ基を有しない環式有機化合物であって、任意選択で、アミノ酸の１つが非天然アミノ酸であり、閉環があるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のＣ末端との間で形成されるか、または閉環が非天然アミノ酸によって行われる環式有機化合物、その生成プロセス、ならびにベクトルイオンチャネルを調節するための、肺機能に関連した疾患を処置するための、および浮腫を処置するためのその使用。【選択図】図１
2013517224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６個のアミノ酸または１７個のアミノ酸を含み、Ｃ末端カルボキシル基および／またはＮ末端アミノ基を有さず、
任意選択で、アミノ酸の１つが非天然アミノ酸であり、
閉環があるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のＣ末端との間で形成されるか、または閉環が非天然アミノ酸によって行われることを特徴とする環式有機化合物。
【請求項２】
アミノ酸配列ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹに加えて１つまたは２つのさらなるアミノ酸を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
非天然アミノ酸が、オルニチンまたはω−アミノ酸、特にω−アミノ−（Ｃ3〜12）−アルカン酸から、特に３−アミノ−プロパン酸、γ−アミノ酪酸、５−アミノ−ペンタン酸、６−アミノ−ヘキサン酸および７−アミノ−へプタン酸から選択され、特に非天然アミノ酸はアミド結合を介して結合していることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
閉環が、あるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のＣ末端との間、特にオルニチンまたはリシンの側鎖と天然アミノ酸、特にグリシンのＣ末端との間に形成されることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
下記式の化合物である、請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【化１】
2013517224.tif 000007
【化２】
2013517224.tif 000008
【請求項６】
塩の形態である、請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
薬物として使用するための、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
ベクトルイオンチャネル、特に肺内のイオンチャネルを調節するための、肺機能に関連した疾患を処置するための、特に急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、肺炎、インフルエンザおよびＲＳＶ感染症などのウイルス性肺炎を処置するための、多臓器不全の場合、呼吸誘導肺障害、肺移植、輸血関連肺障害、ＩＬ−２の治療的投与、または喘息の場合の処置のための、および浮腫を処置するための、特に肺水腫を処置するための薬物を製造するための、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
ベクトルイオンチャネル、特に肺内のイオンチャネルを調節するための、肺機能に関連した疾患を処置するための、および浮腫を処置するための、特に肺水腫を処置するためのプロセスであって、そのような処置を必要とする患者に有効量の請求項１から６のいずれかに記載の化合物を投与することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれかに記載の化合物を、特に、担体または希釈剤などの少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて、特に、１つまたは複数の充填剤、結合剤、崩壊剤、フロー調整剤、滑沢剤、香味剤、糖または甘味料、香料、防腐剤、安定効果を有する物質、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液（混合物）と組み合わせて含むことを特徴とする医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクトルイオンチャネル（ｖｅｃｔｒｉａｌ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｅｌ）の調節、肺機能に関連した疾患の調節、および浮腫の処置に適した有機化合物およびその医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞層および組織を通る体液輸送は、主に、ベクトルイオン輸送、例えばナトリウム輸送による浸透勾配に基づく。この体液輸送は、例えば上皮ナトリウムチャネル複合体（ＥＮａＣ）などの厳密に調節された極めて重要なイオンチャネルによって主に行われる（Ｗａｒｅ  Ｌ．Ｂ．およびＭａｔｔｈａｙ  Ｍ．Ａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００１；３４２／１８：１３３４〜１３５９。Ｍａｔｔｈａｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９６；２７０：Ｌ４８７〜Ｌ５０３；Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ  Ｙ．およびＭａｔｔｈａｙ  Ｍ．Ａ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ＆Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５９（２００７）３５０〜３５９）。水は、とりわけ、水チャネルのアクアポリンＶなどの特定の水チャネルを通って、この勾配に受動的に従う。したがって、細胞および組織を通るベクトルイオン輸送の薬物調節によって、組織の体液含有量を制御するだけでなく、組織内での体液の貯留に関連した疾患を予防的または治療的に処置することも可能となる。
【０００３】
浮腫とは、例えば肺だけでなく脳または皮膚などの臓器内での体液の病的な貯留を意味する。肺での浮腫は肺水腫と呼ばれる。肺水腫はほとんどの場合、体液溢出と体液再吸収との間のアンバランスに基づく。肺組織の透過性が損傷することも多く、それによって体液の供給が増加し、体液が肺胞内に貯留する。
【０００４】
肺胞から間質へ戻る体液輸送が不十分であることで生じる肺水腫は、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、肺炎、インフルエンザ、ならびに他のバクテリア誘導およびウイルス誘導の肺疾患にとって特に重大である。しかし、肺水腫はまた、呼吸誘導肺傷害（ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ）、肺移植、輸血関連肺傷害、ＩＬ−２の治療的投与または喘息などの他の肺疾患にも重要な役割を果たす。
【０００５】
組織または臓器、例えば肺内での体液貯留が増加すると、必要なガス交換が妨げられるか、または完全に制限される。呼吸空気からの酸素が血液に到達しなくなると、酸素欠乏により致命的な臓器損傷が起こることがある。
【０００６】
Ｌｕｃａｓら（Ｌｕｃａｓ  Ｒら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４、２６３：８１４）は、腫瘍壊死因子のＳｅｒ（９９）からＧｌｕ（１１６）の領域に由来し、肺胞中の体液含有量を制御するとされているペプチドについて記載している。
【０００７】
配列ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＫＰＷＹＣを含む前記ペプチドは、ＷＯ００／０９１４９の主題でもある。
【０００８】
肺胞中の体液含有量を制御し、配列ＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣを含むペプチドはまたＥＰ２００９０２３に含まれ、配列ＬＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥを含むペプチドはＷＯ２００９／０７３９０９に含まれる。
【０００９】
これまで、細胞および組織内のベクトルイオンチャネルを調節する、特に肺組織のベクトルイオンチャネルを調節する選択的および医学的に使用可能な治療または処置はなかった。肺のベクトルイオン輸送を調節する、特に肺水腫を処置する選択的治療もこれまでなかった。肺水腫を患う患者に人工呼吸を施して、血液への、ひいては臓器への酸素の供給を確保しようとすることが極めて一般的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、イオンチャネルのベクトル活性化（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に適した有機生理活性物質を提供するという目的に基づく。特に、本発明は、肺内の上皮ナトリウムイオンチャネルの活性化および肺水腫の選択的処置に使用できる有機生理活性物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、提議された課題を解決するのに適した有機化合物がここで見出された。
【００１２】
一態様において、本発明は、１６個のアミノ酸または１７個のアミノ酸を含み、Ｃ末端カルボキシル基および／またはＮ末端アミノ基を有さず、
任意選択で、アミノ酸の１つが非天然アミノ酸であり、
閉環があるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のＣ末端との間で形成されるか、または閉環が非天然アミノ酸によって行われることを特徴とする環式有機化合物を提供する。
【００１３】
本発明により提供される１つまたは複数の環式有機化合物は、本出願において「本発明による化合物」とも称される。
【００１４】
本発明による化合物は、あらゆる形態、例えば遊離の形態および共結晶の形態、例えば塩の形態、または溶媒和物の形態、または塩と溶媒和物との形態の化合物を含む。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、塩の形態の本発明による化合物を提供する。
【００１６】
好ましくは、このような塩は薬学的に許容される塩を含むが、薬学的に許容されない塩が、例えば本発明の化合物を製造、単離、精製する目的で含まれる。例えば、本発明は、例えば本発明の化合物を製造する際に生じる可能性のある、本発明の化合物の、トリフルオロ酢酸との塩を含む。
【００１７】
塩の形態の本発明による化合物は、金属塩または酸付加塩を含む。金属塩は、例えばアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を含み、酸付加塩は本発明による化合物の、酸との塩を含む。
【００１８】
遊離の形態、任意選択で溶媒和物の形態の本発明による化合物は、塩の形態、非溶媒和物の形態または溶媒和物の形態の適切な化合物に変換することができ、逆にも変換できる。
【００１９】
本発明による化合物において、これまでにペプチドでは知られていない閉環と組み合わせた特定のアミノ酸配列は、驚くべきことに環式有機化合物となり、同時に、これまでにペプチドでは知られていない分子内アミド結合を形成し、ここで、このような化合物は、全く予期せぬことに、細胞および組織内のベクトルイオンチャネルを調節することができ、例えば、本発明の化合物は、既に知られているが構造が異なるペプチドよりもある程度大きく上皮ナトリウムチャネル複合体を調節することができる。
【００２０】
驚くべきことに、本発明による化合物がアミノ酸配列ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹを含むことが判明した。
【００２１】
別の態様において、本発明は、アミノ酸配列ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹを含む本発明による化合物を提供する。
【００２２】
本発明による化合物中の非天然アミノ酸は、好ましくは、オルニチンまたはω−アミノ酸、特にω−アミノ−（Ｃ3〜8）−アルカン酸から、特に３−アミノ−プロパン酸、γ−アミノ酪酸、５−アミノ−ペンタン酸、６−アミノ−ヘキサン酸および７−アミノ−へプタン酸から選択され、特に非天然アミノ酸はアミド結合を介して結合している。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、非天然アミノ酸がオルニチンまたはω−アミノ酸から選択される本発明による化合物を提供し、特に非天然アミノ酸はアミド結合を介して結合している。
【００２４】
本発明による化合物において、閉環は、好ましくはあるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のＣ末端との間、特にオルニチンまたはリシンの側鎖と天然アミノ酸、特にグリシンのＣ末端との間に形成される。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、閉環があるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のＣ末端との間に形成されることを特徴とする、本発明による化合物を提供する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、下記のアミノ酸配列を含む本発明による化合物を提供する。
【００２７】
【化１】
2013517224.tif 000003
【００２８】
【化２】
2013517224.tif 000004
【００２９】
配列番号１｛［ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ］（シクロＫε１−Ｇ１７）｝の配列の化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のリシン（Ｋ）までペプチド結合しており、Ｎ末端アミノ酸のリシン（Ｋ）は、Ｃ末端アミノ酸グリシン（Ｇ）と、リシンの側鎖のε−アミノ基の窒素とグリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＣ末端カルボキシル基を有しない。
【００３０】
配列番号２｛［オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ］（シクロＯｒｎ−δ１−Ｇ１７）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のオルニチン（Ｏｒｎ）までペプチド結合しており、Ｎ末端アミノ酸のオルニチン（Ｏｒｎ）は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）と、オルニチンの側鎖のδ−アミノ基の窒素とグリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＣ末端カルボキシル基を有しない。
【００３１】
配列番号３｛［５−アミノ−ペンタン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ］（シクロ１−１７）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）までペプチド結合しており、Ｎ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）と、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と５−アミノ−ペンタン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合を介して、他方において５−アミノ−ペンタン酸の５−アミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＣ末端カルボキシル基を有しない。
【００３２】
配列番号４｛［γ−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ］（シクロ１−１７）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）までペプチド結合しており、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）は、Ｎ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）と、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素とγ−アミノ酪酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合を介して、他方においてγ−アミノ酪酸のアミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＣ末端カルボキシル基を有しない。
【００３３】
配列番号５｛［γ−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ−ＯＨ］（シクロ１−Ｄγ１７）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アスパラギン酸（Ｄ）からＮ末端アミノ酸のグリシンまでペプチド結合しており、Ｃ末端アスパラギン酸（Ｄ）は、Ｎ末端アミノ酸のグリシンと、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素とγ−アミノ酪酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合を介して、他方においてγ−アミノ酪酸のアミノ基の窒素とＣ末端アスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＮ末端アミノ基を有しない。
【００３４】
配列番号６｛［３−アミノ−プロパン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ−ＯＨ］（シクロ１−Ｅδ１７）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端グルタミン酸（Ｅ）からＮ末端アミノ酸のグリシンまでペプチド結合しており、Ｃ末端グルタミン酸（Ｅ）は、Ｎ末端アミノ酸のグリシンと、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と３−アミノ−プロパン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合を介して、他方において３−アミノ−プロパン酸のアミノ基の窒素とＣ末端グルタミン酸の側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＮ末端アミノ基を有しない。
【００３５】
配列番号７｛［７−アミノ−へプタン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ］（シクロ１−１６）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のチロシンからＮ末端アミノ酸のグリシンまでペプチド結合しており、Ｃ末端アミノ酸のチロシンは、Ｎ末端アミノ酸のグリシンと、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と７−アミノ−へプタン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合を介して、他方において７−アミノ−へプタン酸のアミノ基の窒素とＣ末端チロシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＮ末端アミノ基もＣ末端カルボキシル基も有しない。
【００３６】
配列番号８｛［６−アミノ−ヘキサン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ］（シクロ１−１７）｝の配列を含む化合物において、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシンからＮ末端アミノ酸のグリシンまでペプチド結合しており、Ｃ末端アミノ酸のグリシンは、Ｎ末端アミノ酸のグリシンと、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と６−アミノ−ヘキサン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合を介して、他方において６−アミノ−ヘキサン酸のアミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合を介して結合しており、それによって化合物はＮ末端アミノ基もＣ末端カルボキシル基も有しない。
【００３７】
本発明による化合物は、好適な様式、例えば、公知のプロセスに類似した様式で、もしくは本明細書に記載されているように、例えば化学合成によって、または微生物プロセスを用いて生成することができ、ここで特に、遊離アミノ基と遊離カルボキシル基の間のアミド結合は、好適な様式、例えば、公知のプロセスに類似した様式で、または本出願に記載されているように導入することができる。
【００３８】
本発明による化合物は興味深い薬理活性を示し、したがって薬物として使用可能であることが判明した。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、薬物として使用するための本発明による化合物を提供する。
【００４０】
ヒト細胞に対する生物学的試験によって、本発明による化合物には炎症性または毒性がないことが示されている。このために、ヒト上皮細胞を一般的な研究用細胞培養で培養し、本発明による化合物を添加する。本発明による化合物を添加しても、ヒト細胞において毒性反応または炎症反応は観察されなかった。
【００４１】
化合物によるイオンチャネルのベクトル調節の検出は、研究では一般的な方法に従って、例えばＣｌｕｎｅｓ  Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏ．（２００４）５５７．３：８０９〜８１９）に従って、パッチクランプ実験により行うことができる。イオンチャネルのパッチクランプ試験において、ガラスカニューレを薄く伸ばし、中性緩衝液を充填する。ガラスカニューレ（パッチクランプピペット）を無傷の（ｉｎｔａｃｔ）上皮細胞上に注意深く押し付ける。一片の膜をピペットの下に配置する。それによって、ピペットの内部と外液との間に電気抵抗が生じる。高感度増幅器に取り付けられた電極をピペット溶液に浸す。
【００４２】
ベクトル上皮イオンチャネルの調節は、定電圧での電流強度の変化によって検出される。
【００４３】
このようにして、驚くべきことに、本発明の化合物はベクトル上皮イオンチャネルの調節を示すことが判明した。
【００４４】
特に驚くべきことは、本発明による化合物、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列を含む化合物では、既に文献から知られているペプチドＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＫＰＷＹＣ（Ｌｕｃａｓら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４、およびＷＯ００／０９１４９）、ＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣ（ＥＰ２００９０２３の配列番号２）ならびにＬＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ（ＰＣＴ  ＡＴ２００８４４８の配列番号２）よりも、ベクトルイオン電流の活性化が非常に高くなることであった。
【００４５】
したがって、本発明による化合物は、例えば、ベクトルイオンチャネル、特に肺内のイオンチャネルを調節するための、および浮腫を処置するための、特に肺水腫を処置するための薬物の製造に使用することができ、さらなる態様において、本発明は、ベクトルイオンチャネル、特に肺内のイオンチャネルを調節するための、肺機能に関連した疾患を処置するための、および浮腫を処置するための、特に肺水腫を処置するための薬物を製造するための本発明による化合物を提供する。
【００４６】
肺機能に関連した疾患の処置として、例えば、上皮イオンチャネルの活性化、肺機能の改善、および／または肺水腫などの浮腫の処置、
さらには
−  急性肺傷害（ＡＬＩ）、
−  急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、
−  重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、
−  肺炎、
−  インフルエンザおよびＲＳＶ感染症などのウイルス性肺炎、
−  多臓器不全の場合、
−  呼吸誘導肺傷害、肺移植、輸血関連肺傷害、ＩＬ−２の治療的投与、または喘息の場合
の処置が挙げられる。
【００４７】
別の態様において、本発明は、ベクトルイオンチャネル、特に肺内のイオンチャネルを調節するための、肺機能に関連した疾患を処置するための、および浮腫を処置するための、特に肺水腫を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする患者に有効量の本発明による化合物を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００４８】
本明細書で使用される患者には、哺乳動物、例えばヒトが含まれる。
【００４９】
本発明による化合物は、医薬製剤の形態で投与することができる。
【００５０】
別の態様において、本発明は、本発明による化合物を、例えば、担体または希釈剤などの少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて、例えば、１つまたは複数の充填剤、結合剤、崩壊剤、フロー調整剤（ｆｌｏｗ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、滑沢剤、香味剤（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、糖または甘味料、香料（ｆｒａｇｒａｎｃｅ）、防腐剤、安定効果を有する物質、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液（混合物）と組み合わせて含むことを特徴とする医薬製剤を提供する。
【００５１】
疾患を処置するための本発明による化合物の適量は、当然ながら、異なるパラメータ、例えば使用する化合物の化学的性質および薬物動態、個々の患者、処置すべき疾患、適用の種類に強く依存するものであるが、大型哺乳動物にとっての適切な１日用量として、例えば０．０００１ｇ〜１．５ｇの範囲の量、例えば０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量が挙げられる。
【００５２】
本発明による化合物は、遊離の形態または塩の形態、任意選択で溶媒和物の形態で投与することができる。塩の形態、任意選択で溶媒和物の形態である本発明による化合物は、遊離の形態、任意選択で非溶媒和の形態である本発明の化合物と本質的に同じ活性を示す。
【００５３】
本発明による化合物またはその医薬製剤は、好ましくは肺内投与または非経口投与することができ、特に好ましくは肺内投与である。
【００５４】
本発明による医薬製剤は、好適な様式、例えば公知の方法に類似した様式、例えば、混合、顆粒化、コーティング、溶解、凍結乾燥法によって生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図２】配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図３】配列番号３のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図４】配列番号４のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図５】配列番号５のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図６】配列番号６のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図７】配列番号７のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図８】配列番号８のアミノ酸配列を含む化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、吸収（ｍＡＵ＝ミリ吸収単位（Ｍｉｌｌｉ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ））をｙ軸にプロットし、時間（分）をｘ軸にプロットする。
【図９】配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１０】配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１１】配列番号３のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１２】配列番号４のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１３】配列番号５のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１４】配列番号６のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１５】配列番号７のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【図１６】配列番号８のアミノ酸配列を含む化合物のパッチクランプ測定のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムにおいて、電流強度（ｐＡ＝ピコアンペア）をｙ軸にプロットし、時間（ｓｅｃ＝秒）をｘ軸にプロットする。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００５６】
配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物を、表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００５７】
【表１】
2013517224.tif 000005
【００５８】
閉環は、Ｎ末端リシンの側鎖のε−アミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００５９】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１８８６．１であった。
【実施例２】
【００６０】
配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００６１】
閉環は、Ｎ末端オルニチンの側鎖のδ−アミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００６２】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１８７２．４であった。
【実施例３】
【００６３】
配列番号３のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号３のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００６４】
閉環は、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素とアミノ−ペンタン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合の形成によって、かつ他方においてアミノ−ペンタン酸のアミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００６５】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１８５７．０であった。
【実施例４】
【００６６】
配列番号４のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号４のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００６７】
閉環は、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素とγ−アミノ酪酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合の形成によって、かつ他方においてγ−アミノ酪酸のアミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００６８】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１８４３．０であった。
【実施例５】
【００６９】
配列番号５のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号５のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００７０】
閉環は、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素とγ−アミノ酪酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合の形成によって、かつ他方においてγ−アミノ酪酸のアミノ基の窒素とＣ末端アスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００７１】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１９０１．０であった。
【実施例６】
【００７２】
配列番号６のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号６のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００７３】
閉環は、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と３−アミノ−プロパン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合の形成によって、かつ他方において３−アミノ−プロパン酸のアミノ基の窒素とＣ末端グルタミン酸の側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００７４】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１９０１．０であった。
【実施例７】
【００７５】
配列番号７のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号７のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００７６】
閉環は、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と７−アミノ−へプタン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合の形成によって、かつ他方において７−アミノ−へプタン酸のアミノ基の窒素とＣ末端チロシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００７７】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１８２８．０であった。
【実施例８】
【００７８】
配列番号８のアミノ酸配列を含む化合物の合成
配列番号８のアミノ酸配列を含む化合物を、実施例１の表１に記載される工程でＦｍｏｃ固相合成法により完全に自動的に合成した。
【００７９】
閉環は、一方においてＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と６−アミノ−ヘキサン酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合の形成によって、かつ他方において６−アミノ−ヘキサン酸のアミノ基の窒素とＣ末端グリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合の形成によって行った。
【００８０】
続いて、逆相ＨＰＬＣによってペプチドを調べた。純度は９５％を上回った。分子量は１８７３．０であった。
【実施例９】
【００８１】
パッチクランプ実験
９ａ．細胞培養
電気生理学実験をヒトＡ５４９細胞（ＡＴＴＣ番号ＣＣＬ−１８５）に行った。Ａ５４９細胞は、ヒト肺上皮細胞であり、この細胞は肺における水および電解質の拡散に関与する。細胞を、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｒ６５０４）に懸濁させ、プラスチック製細胞培養容器に移し、９５％空気および５％ＣＯ２で３７℃のインキュベータで培養した。培地は週に２〜３回交換した。細胞は、約２２時間以内に倍増するが、７×１０4個／ｃｍ2を超える細胞密度には至らなかった。
【００８２】
９ｂ．化合物の添加
顕微鏡で細胞を観察した。観察することで、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む化合物のそれぞれの添加が形態または細胞増殖に全く変化を及ぼさず、それぞれの添加によって細胞死が起こらないことが判明した。
【００８３】
９ｃ．パッチクランプ実験
パッチクランプ実験のために、細胞を小さなガラス板上に移した。
【００８４】
９ｄ．パッチクランプ測定
「ホールセル（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）」構造の「パッチクランプ」技法（Ｈａｍｉｌｌら、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．１９８１、３９１（２）：８５〜１００．、１９８１）において、Ａ５４９細胞から巨視的電流が放電された。「ホールセル」構造での電流散逸には、以下の槽溶液および電極溶液を用いた。
【００８５】
槽溶液：１３５ｍＭメタンスルホン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．５ｍＭグルコース、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４。
【００８６】
電極溶液：１２０ｍＭメタンスルホン酸カリウム、１５ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｍｇ２ＡＴＰ、２ｍＭ  Ｎａ３ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ７．２）。
【００８７】
細胞が培養されているカバーガラスを１ｍｌの容量の試験槽（ｔｅｓｔ  ｂａｔｈ）に移し、顕微鏡台（Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００、倍率４００倍）上に固定し、上記の槽溶液で細胞を灌流した。その後すぐに、（カバーガラスに付着した）適切な細胞から電流が放電された。このため、電解質溶液が充填された微小電極（３〜５Ωの電極チップの抵抗に相当する、約１〜３μｍの規定の加熱研磨（ｈｅａｔ−ｐｏｌｉｓｈ）された先端開口部を有するガラス毛管）を細胞上に配置し、膜を吸引して、漏れ電流を最小限に抑えるために膜と電極との間に「ギガオームシール」を形成した。「ホールセル」構造において、膜は電極チップの真下を貫通するので、細胞の全てのイオンチャネルを流れる電流を測定することができた。ギガオームシールを得ると、膜を保持する規定の電位を前置増幅器（ＣＶ−４  Ｈｅａｄｓｔａｇｅ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）および増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  １Ｄ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒ．）を介して適用し、それによってイオンチャネルを流れる電流を測定した。
【００８８】
パルスプロトコル（ｐｕｌｓｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、５秒間−１００ｍＶまで細胞膜が過分極し、その後２０ｍＶずつ＋１００ｍＶまで徐々に脱分極することから構成された。
【００８９】
このプロトコルは、環状有機分子の添加前（対照）および添加後に行った。このようにして得られた電流散逸はプログラムＰＣＬＡＭＰ６．０によって記憶され分析された。このために、アミロライドの存在下で得られた電流散逸が先に記録された電流から差し引かれ、それによって上皮ナトリウムチャネルを通るアミロライド感受性ナトリウム電流を決定することができた。
【００９０】
９ｄ．結果
本発明による化合物によるナトリウムイオンチャネルの調節
パッチクランプ測定を用いて、ベクトルイオンチャネルを調節する能力について本発明による化合物を試験した。それによって、本発明による化合物にはベクトルイオンチャネルを調節する能力があることが明らかになった。
【００９１】
さらに、本発明による化合物を文献により公知のペプチドと比較し、公知のペプチドの活性と比較した本発明による化合物の活性を決定した。
【００９２】
結果を表２にまとめる。
【００９３】
【表２】
2013517224.tif 000006
【００９４】
表２から分かるように、本発明による化合物の活性は、構造が異なる公知のペプチド化合物の活性よりも驚くほど高い。
【図１】
2013517224.tif 000009
【図２】
2013517224.tif 000010
【図３】
2013517224.tif 000011
【図４】
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【図５】
2013517224.tif 000013
【図６】
2013517224.tif 000014
【図７】
2013517224.tif 000015
【図８】
2013517224.tif 000016
【図９】
2013517224.tif 000017
【図１０】
2013517224.tif 000018
【図１１】
2013517224.tif 000019
【図１２】
2013517224.tif 000020
【図１３】
2013517224.tif 000021
【図１４】
2013517224.tif 000022
【図１５】
2013517224.tif 000023
【図１６】
2013517224.tif 000024
【配列表】
2013517224000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月14日(2012.9.14)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2013517224.tif 000025
2013517224.tif 000026
2013517224.tif 000027
2013517224.tif 000028
2013517224.tif 000029
2013517224.tif 000030
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