(57)【要約】【課題】本発明は、複数のウイルスを標的とするまたは複数の腫瘍抗原に特異的である、細胞傷害性Ｔリンパ球の作製と使用のための方法および組成物を包含する。【解決手段】特定の実施形態では、この作製方法は、活性化Ｔ細胞集団での増殖を促進し、細胞死を減少させるための特定のサイトカイン類の使用を採用し、および／またはガス透過性膜を有する特定のバイオリアクターを採用する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製する方法において、
（１）個体からの樹状細胞（ＤＣ）の集団を複数のプラスミドでヌクレオフェクションし、ここで、複数の各プラスミドは、２つ以上のウイルスの１つからの少なくとも１つの抗原をコードし、それによって、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を発現し、そして提示する樹状細胞の集団を生成する工程；または、
（２）個体からのＤＣの集団をペプチドのライブラリーと接触させ、ここで、前記ペプチドは、全ウイルス抗原の一部または全部をスパンする配列において重複し、それによって、２つ以上の異なる抗原からの少なくとも１つのエピトープを提示するＤＣ（ＡＰＣ）の集団を生成する工程；および
個体からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、ヌクレオフェクションされたＤＣ（ＡＰＣ）と接触させて、２つ以上のウイルスからの少なくとも１つの抗原に応答することのできる抗原特異的Ｔリンパ球を生成する工程；および
気体透過性膜を有する容器内の培地中で、抗原特異的Ｔリンパ球を培養し、ここで、培地成分が、ＩＬ−４とＩＬ−７を含み、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成する工程；
のいずれかを含む方法。
【請求項２】
前記ＣＴＬが、免疫不全の個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体が、同種間幹細胞移植を受けた、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫ、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、西ナイルウイルス、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、注射で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記注射が、静脈内である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の腫瘍抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製する方法において、
（１）個体からのＤＣの集団を複数のプラスミドでヌクレオフェクションし、ここで、複数の各プラスミドは、１つ以上の腫瘍抗原の少なくとも１つのエピトープをコードし、それによって、２つ以上の腫瘍抗原から少なくとも１つのエピトープを発現し、そして提示するＤＣ（ＡＰＣ）の集団を生成する工程；または、
（２）個体からのＤＣの集団を、ペプチドのライブラリーと接触させ、ここで、前記ペプチドは、全抗原の一部または全部をスパンする配列において重複し、それによって、２つ以上の異なる抗原からの少なくとも１つのエピトープを提示するＤＣ（ＡＰＣ）の集団を生成する工程；および
個体からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＡＰＣと接触させて、２つ以上の腫瘍抗原からの少なくとも１つのエピトープに応答することのできる抗原特異的Ｔリンパ球の集団を生成する工程；および
気体透過性膜を有する容器内の培地中で、Ｔリンパ球を培養し、ここで、前記培地成分が、ＩＬ−７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、およびＩＬ６またはＩＬ２７のいずれかを含む工程；
のいずれかを含む方法。
【請求項８】
前記個体が、リンパ腫または白血病に罹患している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ−リンパ球が、個体に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、注射によって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記注射が、静脈内である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００９年８月２４日に出願された米国仮特許出願番号第６１／２３６、２６１号に基づく優先権を主張し、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の支援による研究または開発に関する記述
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ−ＮＣＩ助成金番号Ｐ５０  ＣＡ１２６７５２の下で連邦政府の援助によってなされた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的に細胞生物学、免疫学、分子生物学、および医学の分野に関するものである。特定の実施形態において、本発明は、一般的に癌の免疫療法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
免疫不全宿主におけるウイルス感染の予防および／または治療のための複数ウイルス特異的Ｔ細胞
ウイルス感染は、免疫不全宿主、例えば、同種幹細胞移植（ＳＣＴ）を受けた患者におけるかなりの罹患率および死亡率を占める。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および単純ヘルペスウイルスなどの永続的ヘルペスウイルス、同様に呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザ、およびインフルエンザなどの呼吸器系ウイルスによって引き起こされる感染症は、よく知られているが、アデノウイルス（Ａｄｖ）、ＢＫウイルス、およびヒトヘルペスウイルス−６に起因する感染症の重要性がごく最近になって認識されてきている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｋａｄａｋｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９９６；Ｃｏｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６；ｄｅ  Ｐａｇｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。薬剤はいくつかの感染症の標準的治療法であるが、それらは相当な毒性を有し、耐性変異体を作製し、しばしば有効ではない。
【０００５】
ウイルス特異的免疫を復元する免疫療法戦略は、魅力的な治療の選択肢を提供する。ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、抗原の供給源としてＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶＬＣＬ）を用いて調製されており、これらの細胞株の注入は、同種間造血ＳＣＴ（ＨＳＣＴ）後のＥＢＶ駆動Ｂ細胞リンパ増殖性疾患（ＥＢＶ−ＬＰＤ）を最小の毒性（Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）で予防し、治療した（Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｏｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００７）（Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００６】
同様に、ＣＭＶ−ペプチド、細胞溶解液、またはベクター導入抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて作製された養子移入ドナー由来のＣＭＶ特異的ＣＴＬは、このウイルスに対する免疫応答を再構築することができ、ＣＭＶ疾患の発症や後の再発に対して患者を防御することができた（Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｅｉｎｓｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｅｉｎｓｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２ｂ；Ｐｅｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｍｉｃｋｌｅｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｍｉｃｋｌｅｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。より最近では、ＥＢＶ、ＣＭＶ、およびＡｄｖを標的とする３種ウイルス反応性ＣＴＬは、導入遺伝子としてＣＭＶ−ｐｐ６５を発現するキメラアデノウイルスベクターを用いて単球とＥＢＶ−ＬＣＬを遺伝的に修飾することにより製造された。
【０００７】
わずか２×１０５／ｋｇの３種ウイルス特異的ＣＴＬは、ＨＳＣＴレシピエントに注入した後、いくつかのログで増殖し、３種のすべてのウイルスによってもたらされた疾患に対してレシピエントを防御するように見えた（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの有望な臨床結果にもかかわらず、Ｔ細胞免疫療法の広範な実現は、（ｉ）ＣＴＬの作製に一般的に必要な感染性ウイルス物質（ＥＢＶ／ＣＭＶ／Ａｄｖ）、（ｉｉ）抗原提示用の臨床グレードのベクターの製造費用、および（ｉｉｉ）アロ反応性Ｔ細胞を除くために必要とされる培養（１０〜１２週の製造工程）の延長期間、によって制限され、それに伴い技術的なスキルと時間を必要とする。この後者の問題に対処するために、いくつかのグループは、抗原特異的Ｔ細胞選択のためのより迅速なアプローチを評価してきている。
【０００８】
Ｃｏｂｂｏｌｄおよび協力者は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ペプチド４量体、磁気ビーズでの選択を使用して、幹細胞移植ドナーの血液からＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、選択された細胞の少数を注入（中央値８．６×１０３／ｋｇ）後、感染をクリアした９人の治療患者のうちの８人に印象的な臨床効果を見た（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。抗原への曝露後インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌するＴ細胞の選択（ＩＦＮ−γ捕捉アッセイ）は、また、ウイルスペプチドによるインビトロ刺激の後で末梢血から直接Ａｄｖ−特異的Ｔ細胞を特異的に選択し、少数の細胞（１．２〜５０×１０３／ｋｇ）が、安全で、防御的であり、かつインビボで有効であったことを証明したＦｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒおよび協力者によって臨床的に使用されている（Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
参考文献
本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。本明細書中の全ての特許および刊行物は、それぞれの個々の刊行物が具体的且つ個別にその全体が引用により取り込まれることが示されているのと同程度に引用により本明細書に取り込まれる。
【００１０】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、これらのアプローチはともに、高価であり、大量の原材料の血液を必要とし、それは常に入手可能ではなく、特に適合非血縁ドナーの設定において大量の血液を必要とする。４量体試薬は、限られた既知のエピトープであり、ＣＤ８選択に制限される。γ捕捉は、γ−インターフェロンを分泌するＴ細胞への注入を制限する。他の機能を有する抗原特異的Ｔ細胞は、失われる可能性がある。これまでのところ、それらの使用は緊急医療の必要性の制限された症例に限られている。
【００１２】
当該分野は、免疫療法の目的のために少量の血液から複数ウイルス特異的ＣＴＬの迅速な作製を可能にするために、３つすべての制限（容量、時間、および感染因子）を克服する代替の良好な製造実施を順守する方法を必要とする。本発明は、樹状細胞（ＤＣ）を免疫優性および準優性ウイルス抗原の範囲をコードするＤＮＡプラスミドでヌクレオフェクションすることができ、複数の共通のウイルスからの抗原において複数の異なるエピトープを１０日以内に標的とする複数ウイルス反応性ＣＴＬを作製するためのインビトロＴ細胞刺激因子として使用する方法を提供する（Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。
【００１３】
癌の予防および／または治療のための複数腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）Ｔ細胞
例えば、ＥＢＶは、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫ならびに上咽頭癌に関係している。これらのケースでは、腫瘍細胞は、約９０のエプスタイン−バーウイルス抗原のうち３つを発現する。ＣＴＬの抗原標的を最適化するために、我々のグループは、樹状細胞（ＤＣ）と、次いでＬＭＰｌとＬＭＰ２（３つの抗原のうち２つ）を過剰発現して、患者またはＨＬＡ適合同種ドナーからのＬＭＰ−特異的ＣＴＬを再活性化し、増殖するように遺伝子的に改変されたＥＢＶ−ＬＣＬを順次使用することにより、その特異性が３つの発現されたウイルス抗原に向けられたＣＴＬを調製した。ＬＭＰ抗原は、アデノウイルスベクターから発現された。ＨＬとＮＨＬでは、臨床結果は有望であったし、リスクの高いＨＬの寛解治療の１７人の患者のうち１６人は、寛解された状態であったが、進行中の再発性疾患を有する１５人の患者のうち１２人は、腫瘍応答があった。しかし、我々の研究で参照される患者の＞７０％が、ＥＢＶ陰性リンパ腫であり、ＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の対象とはならない。
【００１４】
非ウイルス性癌に対する養子免疫療法の課題の１つは、強い免疫原性標的抗原の識別が残されている。モデル腫瘍抗原は、付随的被害を制限するために、特異的に、かつ普遍的に腫瘍細胞で発現すべきであり、理想的には、腫瘍の発癌性表現型の維持に必須でなければならない。しかし、抗原の大部分はこれらの基準を満たしていないが、それは、必ずしも抗原が癌細胞に独自に存在するネオ抗原ではなく、むしろ、正常な細胞でも発現され、抗原に対して末梢血Ｔ細胞が寛容化され、除去される抗原であるからである。しかし、本質的に腫瘍特異的抗原が識別されているが、発現された腫瘍抗原のパターンは、非常に腫瘍タイプ依存性である。これは、「自己」抗原に対してＴ細胞寛容性を確立するメカニズムを克服するために、正常な組織で発現されないか、または低発現される適切な抗原を識別すること、および腫瘍特異的ＣＴＬ生産のための細胞培養条件を最適化することの重要性を強調している。
【００１５】
非ウイルス性腫瘍抗原に対するＴ細胞免疫療法は、いくつかの研究で有望な臨床結果とともに記載されている。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇおよび協力者は、メラノーマ特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と高用量インターロイキン２（ＩＬ−２）との一緒の注入が、転移性メラノーマ患者の約３５％で臨床応答をもたらしたことを報告した。注入された細胞の特異性は、分析されなかったが、それらは複数のエピトープ／腫瘍関連抗原を標的にしたようである。より有望な結果は、その後、養子導入細胞の増殖と持続性を向上させるために、ＣＴＬ注入の前にリンパ球枯渇ステップを組み込んだ修正治療プロトコルを使用して達成された。標準治療に不応性の転移性メラノーマの９３人の患者は、免疫除去化学療法−／＋全身照射と、次いで、非常に選択された、ＴＩＬ由来の腫瘍反応性Ｔ細胞と高用量ＩＬ−２（寛容まで７２０，０００ＩＵ／ｋｇを８時間置きに）の養子移入を受けた。９３人の患者のうち５２人は、大きなかさばる腫瘍の退縮を含む治療に対して客観的な臨床応答を有した（３９人のＰＲ、１２人のＣＲ）。しかし、自己ＴＩＬの採取は、ほとんどの腫瘍に対してすることができない。さらに、多数のインビトロ腫瘍特異的Ｔ細胞（＞１０１０のＣＴＬ）の増殖は、複雑で高価な手順である。同じグループはまた、メラノーマ関連抗原ｇｐ１００＋／−ＩＬ−２の単一のエピトープを標的とするように指向されたＴ細胞クローンを注入したが、１つの小さな応答と１つのまちまちの応答だけを有する不良な臨床応答を報告し、細胞がインビボで生着あるいは永続することができないことを示した。これらの研究は、癌を除去するための養子移入抗原特異的Ｔ細胞の潜在性を示すが、最適な臨床結果を生成するために複数のエピトープ／抗原を標的とすることの重要性を強調している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の簡単な要約
本発明は、複数の腫瘍抗原または複数の病原体（例えば、ウイルスや細菌を含む）のいずれかを標的とするＣＴＬの作製に関する。
【００１７】
ＣＴＬは、本明細書で提供される新規な改良により、従来の方法よりもより迅速に作製される。このような改善は、ベクター（例えば、プラスミド）の特定のタイプまたは特定のペプチドライブラリーからの抗原の供給源の少なくとも使用を含む。他の改良は、細胞増殖培地中の特定のサイトカイン類や細胞培養環境の使用を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、複数のウイルス感染（例えば、同種幹細胞移植後の複数のウイルス感染を有する個体など）の個体、または特定の腫瘍関連抗原を有する癌に罹患した個体を治療するための複数ウイルス特異的ＣＴＬを作製する方法を提供する。複数ウイルスと腫瘍関連抗原の両方の場合の実施形態では、抗原の供給源は、プラスミドまたはペプチドライブラリーのいずれであってよい。複数ウイルスと腫瘍関連抗原の両方の場合の実施形態では、ＣＴＬは、気体透過性膜を有する容器中で培養することが可能である。複数ウイルス実施形態の特定の実施形態では、培地は、ＩＬ４およびＩＬ７を含む。腫瘍関連抗原の実施形態の特定の実施形態では、培地は、ＩＬ−７、ＩＬ１２、ＩＬ１５を含み、ＩＬ６またはＩＬ２７のどちらかを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、複数ウイルスＣＴＬ株または複数ＴＡＡのＣＴＬ株の作製を記述する。複数ウイルスＣＴＬの作製については、樹状細胞は、ウイルス抗原をスパニングするｐｅｐｍｉｘでパルスされてもよく、あるいはＤＣは、ウイルス抗原をコードするプラスミドでヌクレオフェクションされて抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生成し得る。代わりに、ＰＢＭＣは、ｐｅｐｍｉｘで直接刺激されることができ、抗原特異的細胞を活性化することができる。これらの戦略は、アデノウイルスベクターおよびＥＢＶ形質転換ＡＰＣ（ＬＣＬ）を使用する必要がなくなる。複数ＴＡＡのＣＴＬの作製については、ＤＣは、標的抗原をスパニングするｐｅｐｍｉｘでパルスされてもよいし、あるいはＤＣは、腫瘍抗原の少なくとも一部をコードするプラスミドでヌクレオフェクションされてもよい。さらなる実施形態は、インビトロでの最適なＴ細胞の増殖を促進するために、活性化Ｔ細胞集団における増殖を促進し、細胞死の低減に作用する特定のサイトカイン（複数可）の使用、およびＧ−Ｒｅｘバイオリアクターなどのバイオリアクターでの細胞培養の使用を含む。
【００２０】
ウイルス感染に対する複数ウイルス特異的Ｔ細胞
【００２１】
本発明の特定の態様では、広範なエピトープ反応性を有する複数ウイルス特異的ＣＴＬを作製するための迅速かつ効果的な方法がある。特定の例において、本発明は、様々なウイルスまたは他の病原体に由来する免疫優性および防御抗原をコードするプラスミドを使用して生成することができる「広域スペクトル」特異性のＣＴＬの作製に適用することができる。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態では、免疫不全の個体の感染（固形臓器移植、ＨＩＶ感染症、化学療法、遺伝性免疫不全）の予防および／または治療のための複数ウイルス特異的ＣＴＬの調製および／または投与がある。個体は、何らかの理由で免疫不全となり得るが、特定のケースでは、同種幹細胞移植後である。ウイルス感染は、どんな種類（複数可）であってもよく、特定の実施形態では、それは、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫ、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、および西ナイルウイルスである。
【００２３】
複数ウイルス特異的ＣＴＬに関連する特定の実施形態では、本発明は、活性化Ｔ細胞集団における増殖を促進し、細胞死を減少させるために作用するＩＬ−４およびＩＬ−７の特定のサイトカインの組み合わせを採用している。
【００２４】
特定の態様では、複数ウイルス特異的ＣＴＬは、典型的なウイルスタンパク質を発現する以下のプラスミドを使用して発育させる：（ｉ）アデノウイルスヘキソンおよび／またはペントン；（ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期１（ＩＥ１）および／またはｐｐ６５；および（ｉｉｉ）エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２、および／またはＢＺＬＦ１。特定の実施形態では、広範囲のＣＴＬは、３種のウイルス特異的細胞を作るために使用される発現ベクターのすべてを取り入れ、加えて、特定の実施形態では、例えば、以下のウイルスタンパク質を発現するさらなるプラスミドを取り込む：（ｉ）ＢＫポリオーマウイルスラージＴ抗原および／またはＶＰ１；および／または（ｉｉ）ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）前初期１（ＩＥ１）および／またはテグメントタンパク質Ｕ９０、Ｕ１１、Ｕ１４、および／またはＵ７１；および／または（ｉｉｉ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、Ｍおよび／またはＮタンパク質；および／または（ｉｖ）パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆ、ＨＮ、および／またはＮＰタンパク質。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態では、そのような治療を必要とする対象におけるウイルス感染および／または再活性化の治療および／または予防のために、ドナー由来の複数ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製するための方法があり、この方法は、以下のステップの少なくとも１つ以上を含む：（ｉ）ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離すること；（ｉｉ）細胞培養基板に付着する能力を選択し、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ４を含む培地で培養することにより、ＰＢＭＣから樹状細胞と呼ばれる抗原提示細胞（ＡＰＣ）を作製すること；（ｉｉ）以下のように、少なくとも２つのウイルスからの少なくとも１つのウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ発現ベクターでＤＣを別々にヌクレオフェクションすること：（ａ）免疫優性アデノウイルス抗原ヘキソンとペントンをコードする発現プラスミド；（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期１（ＩＥ１）とｐｐ６５；（ｃ）エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、およびＢＺＦＬ１；（ｄ）ＢＫポリオーマウイルスラージＴ抗原とＶＰ１；（ｅ）ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）前初期１（ＩＥ１）およびテグメントタンパク質Ｕ９０、Ｕ１１、Ｕ１４、およびＵ７１；（ｆ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、Ｍ、およびＮＰタンパク質；（ｇ）パラインフルエンザウイルス（ΡＩＶ）Ｆ、ＨＮ、およびＮＰタンパク質；（ｉｉｉ）非接着性のＰＢＭＣ画分から保持されたＴ−細胞とヌクレオフェクションされたＤＣを共培養すること；（ｉｖ）９〜１２日間の範囲の期間、添加ＩＬ７＋ＩＬ４を含む培地で刺激されたＴ細胞を培養すること；（ｖ）最適な増殖を支持するＧ−Ｒｅｘ装置中でＣＴＬを増殖すること；（ｖｉ）抗原特異性と刺激されたＴ細胞のアロ反応性の欠如を検証すること。
【００２６】
ウイルス関連ではなく、免疫応答性の個体で発生する標的腫瘍に対するＴ細胞を使用するためには、非ウイルス性腫瘍発現抗原を標的とすることができる。腫瘍細胞上で発現または過剰発現されるこれらの抗原は、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ２、およびＳＳＸ４（例として）を含み、これらは、ＨＬとＮＨＬで一般に発現され、特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞に対する標的である。この目的のために、本発明者らは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞腫瘍特異的Ｔ細胞をプライムするために、例えば、ＳＳＸ２、サバイビン、およびＭＡＧＥＡ４をスパニングするｐｅｐｍｉｘのマスターミックスでパルスされたＤＣを用いて、複数の腫瘍抗原に対する同時の特異性を有するポリクローナルＣＴＬ株を作製するためのプロトコルを開発した。複数の抗原を同時に標的とするこの戦略は、ＣＴＬの有効性を最大化し、腫瘍免疫エスケープを最小限にする必要がある。インビトロでの増殖について、本発明者らは、株のマルチ特異性を維持しながら、最大の特定の増殖を促進するために最適化されたサイトカインカクテルを定めた。得られたＣＴＬは、インビトロで機能的であり、ＥＬＩｓｐｏｔと細胞内サイトカイン分析において、ＴＡＡ  ｐｅｐｍｉｘで刺激される場合、および具体的には、伝統的なＣｒ［０００１］５１放出アッセイにおいて、溶解されたｐｅｐｍｉｘでパルスされた全抗原発現標的細胞で刺激される場合、ＩＦＮγとＴＮＦαを生成した。本発明者らは、自己腫瘍物質を溶解することができたかなり前処置されたＨＬ患者から単離されたＰＢＭＣからＴＡＡ−ＣＴＬの作製に成功した。
【００２７】
癌の複数腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、例えば、ＭＡＧＥ１、３、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１を含む腫瘍細胞上で高発現されるＴＡＡを標的とするＣＴＬが、開発されている（下記参照）。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、ＥＢＶ陰性の腫瘍を含む特定の腫瘍の治療のためのＣＴＬ療法に関するものである。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍抗原に対するＣＴＬの作製に関する。本発明は、肺、胸、脳、胃、卵巣、膵臓、腎臓、肝臓、骨、子宮頸部、子宮、精巣、前立腺、頭頸部などのいかなる腫瘍に対しても利用することが可能であり、特定の実施形態では、本発明は、血液や骨髄に関連する癌のために利用される。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、ＣＴＬ生成物は、個体の腫瘍によって示される抗原の発現パターンに具体的に対応するように設計されている。したがって、現在、複数の抗原発現ベクターをＤＣにヌクレオフェクションすることができるとすると、個体の腫瘍の独自の抗原の兆候に応答する単一のＣＴＬ製品が生成されるルートが提供される。
【００３２】
この目的のために、本発明者らは、最初の９日間、ＩＬ７、１２、１５およびＩＬ６またはＩＬ２７のどちらかのサイトカインカクテルの存在下で刺激として興味のある抗原をスパニングするｐｅｐｍｉｘでパルスした樹状細胞で刺激することによって、同時に複数の腫瘍抗原に対する反応性のＣＴＬ株を作製するためのアプローチを開発し、それは、本発明者らによって、複数抗原特異性を有するＣＴＬ株を作製するために不可欠であることを示している（図１４）。その後、ＣＴＬは、同じｐｅｐｍｉｘでパルスされたＤＣを用いて再刺激され、ＩＬ７とＩＬ２で培養される。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製する方法があり、それは、以下のステップを含む：
個体からの樹状細胞（ＤＣ）の集団を複数のプラスミドでヌクレオフェクションし、ここで、複数の各プラスミドは、２つ以上のウイルスの１つからの少なくとも１つの抗原をコードし、それによって、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を発現および提示する樹状細胞の集団を作製すること；個体からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をヌクレオフェクションされたＤＣ（ＡＰＣ）と接触させて、２つ以上のウイルスからの少なくとも１つの抗原に応答することのできる抗原特異的Ｔリンパ球の集団を作製すること；および気体透過性膜を有する容器内の培地中で、抗原特異的Ｔリンパ球を培養し、ここで、培地成分は、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製すること。特定の実施形態では、ＣＴＬは、免疫不全の個体に投与される。いくつかの症例では、個体は、同種幹細胞移植を受けていた。特定の症例では、ウイルスが、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫ、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、西ナイルウイルス、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、細胞は、静脈注射などの注射により投与される。
【００３４】
特定の実施形態では、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製する方法において、（１）個体からの樹状細胞（ＤＣ）の集団を複数のプラスミドでヌクレオフェクションし、ここで、複数の各プラスミドは、２つ以上のウイルスの１つからの少なくとも１つの抗原をコードし、それによって、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を発現し、そして提示する樹状細胞の集団を生成する工程；または、（２）個体からのＤＣの集団をペプチドのライブラリーと接触させ、ここで、前記ペプチドは、全ウイルス抗原の一部または全部をスパンする配列において重複し、それによって、２つ以上の異なる抗原からの少なくとも１つのエピトープを提示するＤＣ（ＡＰＣ）の集団を生成する工程；および、個体からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、ヌクレオフェクションされたＤＣ（ＡＰＣ）と接触させて、２つ以上のウイルスからの少なくとも１つの抗原に応答することのできる抗原特異的Ｔリンパ球を生成する工程；および、気体透過性膜を有する容器内の培地中で、抗原特異的Ｔリンパ球を培養し、ここで、培地成分が、ＩＬ−４とＩＬ−７を含み、２つ以上のウイルスから少なくとも１つの抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成する工程；のいずれかを含む方法がある。
【００３５】
いくつかの実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製する方法において、（１）個体からのＤＣの集団を複数のプラスミドでヌクレオフェクションし、ここで、複数の各プラスミドは、１つ以上の腫瘍抗原の少なくとも１つのエピトープをコードし、それによって、２つ以上の腫瘍抗原から少なくとも１つのエピトープを発現し、そして提示するＤＣ（ＡＰＣ）の集団を生成する工程；または、（２）個体からのＤＣの集団を、ペプチドのライブラリーと接触させ、ここで、前記ペプチドは、全抗原の一部または全部をスパンする配列において重複し、それによって、２つ以上の異なる抗原からの少なくとも１つのエピトープを提示するＤＣ（ＡＰＣ）の集団を生成する工程；および、個体からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＡＰＣと接触させて、２つ以上の腫瘍抗原からの少なくとも１つのエピトープに応答することのできる抗原特異的Ｔリンパ球の集団を生成する工程；および、気体透過性膜を有する容器内の培地中で、Ｔリンパ球を培養し、ここで、前記培地成分が、ＩＬ−７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、およびＩＬ６またはＩＬ２７のいずれかを含む工程；のいずれかを含む方法がある。特定の実施形態では、前記個体が、リンパ腫または白血病に罹患している。特定の実施形態では、前記Ｔ−リンパ球が、静脈内注射を含む注射のような方法によって個体に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、健康なドナーのＴＡ−特異的ＣＴＬ株の作製を示す。（Ａ）ＣＴＬは、ｐｅｐｍｉｘでパルスされたか、またはプラスミドでトランスフェクトされたかのいずれかによるＤＣをＡＰＣとして使用して作製された。ＣＴＬは増強サイトカインの組み合わせ、例えば表１で示されたものの存在下にて培養された。（Ｂ）抗原供給源としてｐｅｐｍｉｘ（左パネル）またはＤＮＡプラスミド（右パネル）のいずれかを使用して作製されたＣＴＬ株のＩＦＮ−γのＥＬＩｓｐｏｔ分析。（Ｃ）サイトカインＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、およびＩＬ６の組み合わせは、ＩＦＮ−γのＥＬＩｓｐｏｔで測定されるように、例えば、ＳＳＸ２、サバイビン、およびＭＡＧＥ−Ａ４に対する同時特異性を有する複数ウイルス特異的ＣＴＬを生成した。
【図２】図２は、健康なドナーの機能的ＴＡ−特異的ＣＴＬ株の作製を示す。サバイビンとＳＳＸに対する特異性を有するＴＡＡ−ＣＴＬは、４時間クロム放出アッセイにおいてｐｅｐｍｉｘでパルスされた自己ＡＰＣを殺すことができた。
【図３】図３は、当該分野での従前の方法による３種ウイルス特異的ＣＴＬの生成を示す。
【図４】図４は、本発明の少なくとも特定の方法に基づく複数ウイルス特異的ＣＴＬの典型的な生成を示す。
【図５】図５は、抗原供給源としてのプラスミドおよびサイトカインＩＬ４とＩＬ７の添加およびＧ−Ｒｅｘバイオリアクターにおける培養などの他の典型的な改良を使用して複数ウイルスＣＴＬを作製するための新しいプロトコルの１つの実施形態を例示する。
【図６】図６は、ＩＬ４とＩＬ７の添加による、より高いＣＴＬ特異性を例示する。
【図７】図７は、初期刺激に対するＤＣ：ＰＢＭＣの播種密度の最適化を示し、少なくとも１：２０の比が、最適な活性化に必要であることが示された。
【図８】図８は、ｒＣＴＬが、従来のプロトコルを使用して作製されたものに特異性で同等であることを例示している。
【図９】図９は、プラスミドまたはｐｅｐｍｉｘを使用したＣＴＬの作製の比較を例示する。
【図１０】図１０は、ＣＴＬ特異性に対するプラスミド対ｐｅｐｍｉｘの比較を示す。
【図１１】図１１は、ｐｅｐｍｉｘでの広範なエピトープ・スペクトルを示す。
【図１２】図１２は、ｐｅｐｍｉｘ／バイオリアクターを用いたＣＴＬの作製を例示する。
【図１３】図１３は、例えば、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、およびＩＬ２７のサイトカインカクテルが、複数腫瘍ＣＴＬの抗原特異性スペクトルを広げることを示している。
【図１４】図１４は、ＣＴＬ株が、２つ以上の抗原に対する同時特異性を示すことを例示する。
【図１５】図１５は、腫瘍ＣＴＬが、トランスジェニックＩＬ７受容体により形質導入されることができることを示す。
【図１６】図１６は、トランスジェニックＩＬ７受容体が、機能的であることを示す。
【図１７】図１７は、図１７の腫瘍ＣＴＬが、抗原特異性を維持することを示す。
【図１８】図１８は、本発明のシステムの１つの実施形態の複数構成要素を含む臨床ｒＣＴＬの作製手順の結果を示す。
【図１９】図１９は、５つの典型的なウイルス（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ａｄｓ、ＢＫおよびインフルエンザ）に対する応答を示す。使用されたウイルスの各々からの抗原は凡例にあり、凡例が上から下に進むにつれて、バーは左から右に並べられている。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
長年の特許法の慣例に沿って、用語「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて請求項を含む本明細書中で使用される場合、「１つまたは複数」を意味する。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法のステップ、および／または方法からなることができるか、あるいは本発明の１つまたは複数の要素、方法のステップ、および／または方法から本質的になることができる。本明細書中に記載のどんな方法または組成物も、本明細書に記載の他のどんな方法または組成物に関しても実施することができると考えられる。
【００３８】
２００９年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２６７，７６１号「Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ」、および２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６１，８１４号の両出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
Ｉ．本発明の一般的な実施形態
【００４０】
本発明は、複数の病原体（例えば、ウイルスや細菌を含む）を標的とする、または、複数の腫瘍抗原を標的とするＣＴＬの作製に関するものである。ＣＴＬは、本発明によって提供される改良点を用いることにより、従来の方法よりも迅速に作製される。改良点は、ベクターの特定のタイプまたは抗原供給源としてのペプチドの特定のライブラリーの使用、および細胞増殖培地中の特定のサイトカインの使用、ならびに最適な細胞培養の増殖と拡大を支持するための特定の細胞培養装置の使用を含む。
【００４１】
特に、本発明は、複数のウイルス感染（同種幹細胞移植後の複数のウイルス感染など）に罹患した個体や特定の腫瘍関連抗原を有する癌に罹患した個体を治療するための複数ウイルス特異的ＣＴＬを作製する方法を提供する。複数ウイルスおよび腫瘍関連抗原の両方のケースの実施形態では、抗原の供給源は、プラスミドまたはペプチドライブラリーのいずれであってもよい。両方のケースの実施形態では、ＣＴＬは、気体透過性膜を有する容器で培養することができる。複数ウイルス実施形態の特定の実施形態では、培地は、ＩＬ４とＩＬ７を含む。腫瘍関連抗原の実施形態の特定の実施形態では、培地は、ＩＬ−７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、およびＩＬ６またはＩＬ２７のいずれかを含む。
ＩＩ．典型的な細胞培養装置と試薬
【００４２】
本発明の特定の実施形態において、どの細胞も所望の細胞の増殖を促進する条件下で培養される。特定のケースでは、細胞は、２００９年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２６７，７６１号「Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ」、および２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６１，８１４号（引用により両出願はその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された条件下で培養される。本発明の特定の実施形態では、細胞は、気体透過性細胞培養装置で培養される。特定のケースでは、細胞培養装置は、細胞培養技術者の一部の操作を飛躍的に削減しながら、Ｔ細胞が高密度に増殖できるようにする。いくつかの実施形態では、この装置は、気体透過性の底部を介して酸素とアクセスするために細胞が底部に動くのを可能とする。
【００４３】
本発明の特定の実施形態では、複数の側面により結合された上部と底部から構成される気体透過性細胞培養装置が利用され、ここで、底部は気体透過性材料を含み、側面の少なくとも一部は、装置が垂直および水平の少なくとも２つの位置に配向された場合、細胞を培養することができるように気体透過性材料から構成されている。特定の実施形態では、気体透過性装置があり、細胞培養の方法が開示され、それは、高さおよび培地容積に対する気体透過性表面積の特定の比を含む細胞培養装置と方法を含む。これらの装置および方法は、細胞培養の効率とスケールアップ効率における改良を可能にする。
【００４４】
本明細書に開示された特定の実施形態は、いろいろな新しい特質を統合することができる気体透過性装置を作製することで、先の装置および方法の限界を克服する、より効率的な細胞培養装置および方法を提供する。これらの様々な特質は、気体／液体界面に依存しないガス交換、増加した培地の高さ、培地容積に対する減少した気体透過性表面積の比、装置を介してのガス交換、側壁、伝統的な素材で構成されている細胞を支持する足場、および増加した気体透過性材料の厚さを含む。特定の実施形態では、下方気体透過性材料からなる気体透過装置の場合、細胞培養培地中の基質の対流が一役担うように、市販の装置で、世間一般の通念によって規定される培地の高さ、あるいは市販の装置での高さを超えて培地の高さを増加させることは有益である。
【００４５】
培地容積に対する気体透過性表面積の比率を、先の細胞培養装置や方法では考慮されなかった比率に減らすこともまた、培養効率を向上させることができる。それは、装置の長さや幅の対応する増加なしで培地の高さを増加させることができる。好ましい実施形態では、培地の高さを増加させたり、あるいは培地容積に対する気体透過性表面積の比率を減少させたりする、のどちらかを可能とする条件が作成される。培地の高さを増加させる、そして培地容積に対する気体透過性表面積の比率を減少させる、のいずれかを可能とする条件もまた作ることが可能である。
【００４６】
世間一般の通念に比べて、培地容積に対する気体透過性表面積の比率を低減させることが設計目的である場合は、気体透過性装置および方法に対する様々な実施形態が可能である。それらは先の装置の形態、または全く新しい形の形態を取ることができる。その形態が、直径５０ｍｍ以下までの気体透過性シャーレであれば、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、２．７４ｃｍ２／ｍｌ以下である必要がある。その形態が、直径５０ｍｍ以上の気体透過性シャーレの場合は、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、１．９６ｃｍ２／ｍｌ以下である必要がある。形態が３８４ウェル以上を有する複数ウェルの組織培養プレートである場合、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、１．１０ｃｍ２／ｍｌ以下でなければならない；２４ウェル未満から３８４ウェル未満の場合には、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、１．０３ｃｍ２／ｍｌ以下でなければならない。２４ウェル以下の場合には、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、０．９７ｃｍ２／ｍｌより下でなければならない。形態が気体透過性のカートリッジ（当該カートリッジの２つの側面は、気体透過性である）の場合は、培地容積に対する表面積の比率は、好ましくは、０．７９ｃｍ２／ｍｌ以下でなければならない。細胞培養バッグの形態では、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、１．０ｃｍ２／ｍｌより下でなければならない。形態が区分装置であり、装置内のすべての培地が半透膜の上に完全に残る場合は、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、１．７４ｃｍ２／ｍｌより下でなければならない。形態が区分装置であり、装置内のすべての培地が半透膜の上に完全に残らない場合は、培地容積に対する気体透過性表面積の比率は、好ましくは、０．３１ｃｍ２／ｍｌより下でなければならない。
【００４７】
下方気体透過性の材料は、シリコーン、フルオロエチレンポリプロピレン、ポリオレフィン、およびエチレン酢酸ビニル共重合体などの気体透過性の細胞培養装置に使用される任意の膜、フィルム、または材料とすることができる。細胞培養における気体透過性材料とそれらの使用について知るための広範囲の情報源は、その全体が本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願第１０／４６０，８５０号を含んでさらなるガイダンスのために使用することができる。単語のフィルムおよび膜の使用は、気体透過性の材料間の非常に薄い距離を意味し、本発明者らは、説明した装置および方法の気体透過性材料が、フィルムおよび膜に関連付けられる厚さを超えている場合、本発明の実施形態が機能することを知見した。したがって、培養のガス交換に寄与する装置の一部は、本明細書では気体透過性材料と呼ばれる。当業者は、気体透過性材料は、気体透過性、透湿度、細胞との所望の細胞相互作用のために変更することができる能力、光学的透明度、物理的強度などを含むさまざまな特性に基づいて選択されるべきであることを認識するであろう。細胞培養に成功裏に使用されてきた気体透過性材料の種類を記述するさまざまな情報が存在する。シリコーンは、多くの場合良い選択である。それは優れた酸素透過性を有し、光学的観察を可能とし、簡単には穴をあけられず、一般的に細胞をシリコーンに結合させないし、多種多様の形状に簡単に製造することができる。シリコーンが使用される場合は、ガス移動が望まれる領域で、約０．２インチ未満であり、約０．１インチ、約０．０５インチ、または約０．０３０インチであってよい。
【００４８】
装置の壁の高さは、装置のスケールアップ効率で重要な役割を果たしている。本発明の目的は、増加した培地の高さを提供することにあり、それによって装置の効率を高める。壁の高さは、装置内で培地がどの程度まで存在するのを許されるかを規定することができる。培地の添加は、基質の大規模な供給源と廃棄物に対する大きなシンクを提供する。より多くの培地がスケールアップ時に必要とされる場合、壁の高さを増加させることにより、装置の幾何学的形状は、インキュベーター、フローフード、およびバイオハザード廃棄袋の形状との互換性が一層ある。さらに、細胞が存在する表面積に比べて容積の増加は、細胞あたりの培地をさらに存在させることができる。それは、供給頻度を低減させる効果を有し、それによって労働と汚染リスクを低減することができる。それはまた、装置の設置面積の平方センチメートルあたりに存在する細胞の数を増加させる効果を有することができる。培地容積の増加を可能にする壁を構築することは、また、培地蒸発の影響を減少させる有益な効果を有することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、壁は、気体／液体界面に依存する装置の高さを上回る高さで培地を存在させることができ、より好ましくは、典型的な静的気体透過性装置の高さを上回る高さで培地を存在させることができる。例えば、壁の高さは、３ｍｍを超え、いくつかのケースでは、２．０ｃｍを超え、その結果利点を提供する。先のガス透過性装置よりも装置により多くの培地を添加する選択肢を装置の使用者に提供することにより、１装置当たりより多くの細胞を収容する能力、装置への栄養供給頻度の低減、そして、設置面積を増加させることなく装置をスケールアップさせることを含む多くの利点が生じる。壁は、任意の生体適合性材料から構成することができ、液密シールを形成するように下方気体透過性物質と結合させる必要がある。壁と下方気体透過性材料を結合させる方法としては、接着結合、ヒートシール、圧縮収縮、および一般に部品間のシールを作製するために使用される他の方法が含まれる。選択肢として、壁および下方気体透過性材料は、同一の材料で形成され、単一体として製造することができる。
【００５０】
特定の実施形態では、プレートなどの複数ウェルの組織培養装置があり、これは、複数のウェルが各々、気体透過性材料を含むウェル底部からなり、そのウェルの側壁が、一定の高さを超え、例えば、５ｍｍ、７ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、１０．５ｍｍ、１０．７ｍｍ、１０．９ｍｍ、１１ｍｍ、１１．１ｍｍ、１１．５ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍ、１５ｍｍ、１６ｍｍ、１６．５ｍｍ、１７ｍｍ、１８ｍｍ、などの高さを超える。特定の実施形態では、細胞培養室（例えば、ウェル底部と側壁（複数可））の容積に対する気体透過性材料の表面積の比は、特定のサイズより小さく、例えば、３、２、１、０．５８、０．９４、０．９１ｃｍ２／ｍｌ未満である。
【００５１】
特定の実施形態では、気体透過性カートリッジが本発明で使用され、ここで、カートリッジは、気体透過性材料から構成される下方壁、上方壁で構成され、ここで、下方壁と上方壁は、細胞培養室を形成する中間の側壁に固定されており、ここで、中間の側壁は、高さが０．５ｃｍ、０．７５ｃｍ、０．９ｃｍ、１．０ｃｍ、１．２ｃｍ、１．２７ｃｍ、１．３ｃｍ、１．４ｃｍ、１．５ｃｍ、および１．６ｃｍを超える。
【００５２】
特定のケースでは、静的細胞培養容器から本質的に成る本発明に用いられる気体透過性の細胞培養装置があり、そこでは、細胞培養容器は、頂部、底部、および側壁を含み、そこでは、少なくとも底部は、非多孔性の気体透過性の材料の少なくとも一部（底部は湾曲されていない）、細胞培養容器へのアクセスポート、および底部表面からの一定量より大きい高さ、例えば、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、５．２ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍなどより大きい高さで存在する少なくとも側壁の一部、から構成されている。
【００５３】
いくつかの実施形態では、静的細胞培養容器を含む気体透過性の細胞培養装置があり、そこでは、細胞培養容器は、頂部、底部、および側壁を含み、そこでは、少なくとも底部は、非多孔性の気体透過性の材料の一部（底部は湾曲されていない）と細胞培養容器へのアクセスポートから構成されており、そして、混合装置は含まず、ここで、側壁は、頂部が完全に気体透過性の材料から構成されていない場合、底部からの一定量の高さ（例えば、１ｃｍ、１．５ｃｍ、２．０ｃｍ、２．５ｃｍ、２．６ｃｍ、２．７ｃｍ、２．８ｃｍ、３．０ｃｍなど）より少なくとも下の、あるいは頂部が完全に気体透過性の材料から構成されている場合、底部からの一定量の高さ（例えば、１．５ｃｍ、１．７ｃｍ、１．８ｃｍ、１．９ｃｍ、２．０ｃｍ、２．１ｃｍ、２．２ｃｍ、２．３ｃｍなど）より少なくとも超えてのアクセスポートによって中断されていない。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞の培養方法が挙げられ、この方法は、気体透過性の底部を含む細胞培養容器を形成すること；そして、細胞培養培地や細胞培養容器内で予め定められた細胞培養細胞型や予め定められた量の播種細胞を、細胞培養容器内で細胞型や細胞培養培地が存在するように添加すること；最初の細胞表面密度を確立するために、予め定められた量の細胞を気体透過性の底部に引き寄せることを可能にすること（最初の細胞表面密度は、細胞が細胞培養の播種段階でその上に存在する容器表面積の１平方センチメートル当たりの細胞として定義される）；そして、最初の細胞表面密度は、細胞／ｃｍ２に正規化された場合、フラスコまたは複数のウェルプレートで培養し、細胞培養培地を混合しない場合、所定の細胞型を培養する従来の方法により確立した最初の細胞表面密度より小さく、その細胞型を第２の細胞表面密度まで成長させることを可能とすること；そして、第２の細胞表面密度は、従来法の達成できる最大の細胞表面密度を超えていること；を含む
【００５５】
複数ウイルスＣＴＬの作製について、１：１０〜２０のＤＣ：ＰＢＭＣの比を用いることができる。細胞は、培地＋ＩＬ４＋ＩＬ７の３０ｍｌの量でＧ−Ｒｅｘ４０中で培養することが可能である。５〜７日目には、細胞はカウントされ、＞５×１０７の細胞がある場合には、培養物は、１：１に分割され、特定の実施形態では、細胞数が少ないときは、新鮮な培地を添加する。
【００５６】
ＩＩＩ．腫瘍抗原
【００５７】
複数ＴＡＡ特異的ＣＴＬが、癌の治療および／または予防のために採用される実施形態では、様々なＴＡＡが標的とされ得る。腫瘍抗原は、宿主の免疫応答を誘発する腫瘍細胞で産生された物質である。
【００５８】
典型的な腫瘍抗原としては、少なくとも以下のものを含む：腸癌のための癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；卵巣癌のためのＣＡ−１２５；乳癌のためのＭＵＣ−１または上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）もしくはＣＡ１５−３；チロシナーゼまたは悪性黒色腫のためのメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）；および様々な種類の腫瘍のためのｒａｓ、ｐ５３の異常な生成物；肝癌、卵巣癌、または精巣癌のためのアルファフェトプロテイン；精巣癌の男性のためのｈＣＧのβサブユニット；前立腺癌のための前立腺特異的抗原；多発性骨髄腫のための、およびいくつかのリンパ腫でのβ２ミクログロブリン；結腸直腸癌、胆管癌、および膵臓癌のためのＣＡ１９−９；肺癌および前立腺癌のためのクロモグラニンＡ；黒色腫、軟部組織肉腫ならびに乳癌、結腸癌、および肺癌のためのＴＡ９０。腫瘍抗原の例は、当技術分野において、例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９で公知であり、これは、引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００５９】
腫瘍抗原の具体例としては、例えば、少なくともＣＥＡ、ＭＨＣ、ＣＴＬＡ−４、ｇｐ１００、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＰ１、ＣＤ４０、ＥＧＦＰ、Ｈｅｒ２、ＴＣＲα、ｔｒｐ２、ＴＣＲ、ＭＵＣ１、ｃｄｒ２、ｒａｓ、４−１ＢＢ、ＣＴ２６、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＴＧＦ−β、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３の非変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３の変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精液タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、およびＦｏｓ関連抗原１が挙げられる。
ＩＶ．ＰＥＰＭＩＸライブラリーの作製
【００６０】
本発明で利用されるＰｅｐｍｉｘは、１５アミノ酸の長さと、特定の態様では、１１個のアミノ酸によって互いに重複しているペプチドで構成された市販のペプチドライブラリーからのものであってよい。例としては、ＪＰＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓやＭｉｌｔｅｎｙｉからのものが含まれる。特定の実施形態では、ペプチドは、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５個のアミノ酸、またはそれより多いアミノ酸の長さであり、そして、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４個のアミノ酸の長さで重複している。
【００６１】
Ｖ．併用療法
【００６２】
本発明の特定の実施形態では、臨床的側面のための本発明の方法は、抗癌剤などの過剰増殖性疾患の治療に有効な他の薬剤と組み合わされる。「抗癌剤」は、例えば、癌細胞を殺す、癌細胞にアポトーシスを誘導する、癌細胞の増殖率を低下させる、転移の発生率や数を減らす、腫瘍の大きさを減らす、腫瘍の成長を阻害する、腫瘍または癌細胞への血液供給を減少させる、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進させる、癌の進行を予防または阻害する、または癌に罹患した対象の寿命を増加させる、ことにより対象の癌に否定的に影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞の増殖を殺すまたは阻害するのに効果的な併用された量で提供されるであろう。このプロセスは、癌細胞を発現構築物と薬剤（複数可）または複数の因子と同時に接触させることを含むことができる。これは、細胞を単一の組成物または両方の薬剤を含む医薬製剤と接触させることにより、または２つの別個の組成物または製剤と細胞を同時に接触させることにより達成することが可能であり、ここで１つの組成物は、発現構築物を含み、他の組成物は、第２薬剤（複数可）を含む。
【００６３】
化学療法剤と放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学の主要な問題を表している。現在の癌研究の１つの目標は、遺伝子治療を組み合わせることで化学療法と放射線療法の有効性を改善する方法を見つけることである。例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系で脳腫瘍に送達されると、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を誘発するのに成功した（Ｃｕｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。本発明の文脈において、細胞療法は、他のアポトーシス促進剤や細胞周期調節剤に加えて、化学療法、放射線療法、または免疫療法の介入と組み合わせて同様に使用することができることが企図される。
【００６４】
あるいはまた、本発明の治療は、数分から数週間の間隔で、他の薬剤での処置前または処置後になされてよい。他の薬剤および本発明が個別に個体に適用される実施形態では、薬剤および本発明の治療が細胞に対して有利に併用効果をなお発揮できるように、各送達の時間の間でかなりの時間が経過しないことを一般的に確実にする。このような場合、細胞を両方の治療法と互いの約１２〜２４時間以内に、より好ましくは、互いの約６〜１２時間以内に、接触させ得ることが企図される。いくつかの状況では、治療のための期間を大幅に延長することが望ましい場合があるが、それぞれの投与の間、数日（２日、３日、４日、５日、６日または７日）から数週間（１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週または８週）が経過する。
【００６５】
様々な組み合わせを用いることができ、本発明を「Ａ」、放射線療法または化学療法などの二次的薬剤を「Ｂ」とする：
【００６６】
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【００６７】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  
【００６８】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【００６９】
治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが期待される。また、各種標準療法と同様に、外科的介入が、本発明の細胞療法との併用で適用され得ることが企図される。
【００７０】
Ａ．化学療法
【００７１】
癌の治療法はまた、化学および放射線ベースの治療の両方の様々な併用療法を含む。併用化学療法としては、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデックス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または任意の類似体または上記の誘導変異体が挙げられる。
【００７２】
Ｂ．放射線療法
【００７３】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲に使用されているその他の因子は、γ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の指向送達として一般的に知られているものを含む。マイクロ波およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も意図される。これらの因子すべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に対する広範囲の損傷を生じさせる可能性が高い。Ｘ線についての線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までに及ぶ。放射性同位体についての線量範囲は広く変動し、その同位体の半減期、放射される放射線の強さおよび種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００７４】
細胞に適用される場合の「接触させた」および「曝露させた」という用語は、治療構築物と化学療法剤もしくは放射線治療薬が標的細胞に送達される過程、または標的細胞と直接並置される過程を記述するために本明細書で使用される。細胞の死滅または静止を達成するために、両方の薬剤は、細胞を死滅させるまたは細胞が分裂するのを妨げるのに有効な併用量で細胞に送達される。
【００７５】
Ｃ．免疫療法
【００７６】
免疫療法は、一般に、癌細胞を標的とし、破壊する免疫エフェクター細胞および分子の使用に基づく。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独で治療のエフェクターとして働き得るか、または実際に細胞の死滅を生じさせる他の細胞を動員し得る。抗体はまた、薬剤または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合されてもよく、単に標的化剤としても役立ち得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【００７７】
それゆえ、免疫療法は、本細胞療法と共に、併用療法の一部として使用され得る。併用療法のための一般的なアプローチを以下で論じる。一般に、腫瘍細胞は、標的としやすい、すなわち大部分の他の細胞上には存在しない何らかのマーカーを担持しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが本発明の文脈では、標的に適し得る。一般的な腫瘍マーカーは、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５を含む。
【００７８】
Ｄ．遺伝子
【００７９】
さらに別の実施形態では、第２の治療は遺伝子療法であり、遺伝子療法では、本発明の臨床実施形態の前、後またはそれと同時に投与される。様々な発現産物は、細胞増殖の誘発剤、細胞増殖の阻害剤、またはプログラム化された細胞死の調節因子を含んで本発明に包含される。
【００８０】
Ｅ．手術
【００８１】
癌を有する人々の約６０％が、何らかのタイプの手術を受け、それには予防的、診断的または病期分類的、治癒的および緩和的手術が含まれる。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法などの他の療法と組み合わせて使用され得る癌治療である。
【００８２】
治癒的手術は、癌組織の全部または一部を物理的に除去する、切除する、および／または破壊する切除術を含む。腫瘍切除術は、少なくとも腫瘍の一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による治療は、レーザー手術、凍結手術、電気外科手術、および顕微鏡下手術（モース手術）を含む。本発明は、表在癌、前癌病変、または偶発的量の正常組織の除去と共に使用され得ることがさらに企図される。
【００８３】
癌細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の切除後、体内に腔が形成される場合がある。治療は、灌流、直接注入または付加的な抗癌治療によるその領域の局所適用によって達成され得る。そのような治療は、たとえば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日ごとに、または１、２、３、４、および５週間ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月ごとに反復され得る。これらの治療は、様々な用量で可能である。
【００８４】
Ｆ．他の作用物質
【００８５】
他の作用物質も、治療効果を改善するために本発明と組み合わせて使用され得ることが企図される。これらの付加的な作用物質は、免疫調節剤、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を及ぼす物質、細胞増殖抑制剤、および分化因子、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める物質を含む。免疫調節剤は、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、βおよびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン類；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインを含む。細胞表面受容体またはＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４もしくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬなどのそれらのリガンドの上方制御は、過剰増殖性細胞への自己分泌またはパラ分泌作用の確立によって本発明のアポトーシス誘導能力を強化することがさらに企図される。ギャップ結合の数を増加させることによる細胞内シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団への抗過剰増殖作用を高める。他の実施形態では、細胞増殖抑制物質または分化因子が、治療の抗過剰増殖効果を改善するために本発明と組み合わせて使用され得る。細胞接着の阻害剤は、本発明の効果を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。ｃ２２５抗体などの、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の作用物質も、治療効果を改善するために本発明と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。
【００８６】
ホルモン療法も、本発明と共に、または先に述べた任意の他の癌治療と組み合わせて使用され得る。ホルモンの使用は、テストステロンまたはエストロゲンなどの特定のホルモンのレベルを低下させるまたはその作用をブロックするために乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸癌などの特定の癌の治療において使用され得る。この治療は、治療の選択肢としての、または転移のリスクを減らすために、少なくとも１つの他の癌治療と組み合わせてしばしば使用される。  
【００８７】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤。典型的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、例えば、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシンおよびジヒドロ−５−アザシチジンを含む。典型的なＨＤＡＣ阻害剤としては、トリコスタチンＡなどのヒドロキサム酸類；環状テトラペプチド（トラポキシンＢなど）、およびデプシペプチド；ベンズアミド類；求電子性ケトン類；フェニルブチラートやバルプロ酸などの脂肪族酸の化合物が挙げられる。
【実施例】
【００８８】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、それらは、本発明の広い範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
Ａ．複数ウイルス特異的ＣＴＬ
【００８９】
図３は、養子移入のためにウイルス特異的（例えば）ＣＴＬを作製するための従来のアプローチを提供する。ドナー由来のＢ細胞は、まず抗原提示細胞として使用するためにＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）で形質転換された。一旦確立した（４〜６週間かかる）ドナーＰＢＭＣは、ＣＭＶから免疫優性ｐｐ６５抗原を発現するアデノウイルスベクターで形質導入される。ＰＢＭＣ中の単球は、優先的に遺伝子導入され、ウイルス特異的Ｔ細胞を刺激し、次に、このＴ細胞は、同じベクターで形質導入された、ＡＰＣとしてのＬＣＬを使用して、刺激の追加のラウンドで増殖される（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。このプロセスは、時間がかかり、高価である（臨床グレードのＡｄベクターとＥＢＶウイルスの生産のために）。本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞刺激のための抗原の供給源としてＡｄベクターとＥＢＶウイルスを使用する代替として、複数ウイルス特異的ＣＴＬの作製（図４）がある。ＥＢＶ、ＣＭＶ、およびＡｄ（例えば）からのウイルス抗原をコードするＤＮＡプラスミドが作製された。これらは、ヌクレオフェクションによってＡＰＣで発現させることができ、次いでＡＰＣはプールされ、Ｔ細胞を刺激するために使用することができる（Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。本発明において、本発明者らは、抗原の供給源としてプラスミドまたはｐｅｐｍｉｘを使用して、複数ウイルスＣＴＬを作製するための新規なプロトコルを、この度、開発し、特定の実施形態では、ＣＴＬが培養される細胞培養培地にサイトカインＩＬ４およびＩＬ７の添加などのその他の改良点を開発した。このような実施形態は、ＣＴＬ株の反応性の幅を維持することに役立ち、そして、Ｇ−Ｒｅｘバイオリアクターでの培養は、最大のＴ細胞増殖を支持する（図５）。
【００９０】
ＩＬ４とＩＬ７の存在下で作製したＣＴＬは、標的抗原／ウイルスからのペプチドの幅広いレパートリーを認識し（図９、１０、１１）、最小限のアロ反応性を有する−すなわち、潜在的なレシピエントからの正常な細胞を認識しない（図１２）。このように、本発明で製造されるＣＴＬは、非常にウイルス特異的であり、目的のレシピエントの非感染細胞を認識しないため、注入後の移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を誘発してはならない。
【００９１】
複数ウイルス特異的ＣＴＬのための典型的なプラスミドの場合、標的ウイルスのＡｄ、ＥＢＶ、およびＣＭＶ（例えば）から、（例えば）２つもしくは３つまたはそれより多い免疫原性遺伝子を発現するマルチシストロン性プラスミドを採用することができる。１つの典型的なアデノウイルス構築物（７９７０ｂｐ）は、ヘキソン：ＩＲＥＳ：ペントン（２８５８ｂｐのヘキソンおよび１７１５ｂｐのペントン）で構成されている。１つの典型的なＥＢＶ構築物（６６４１ｂｐ）は、ΕΒΝΑ１ΔＧＡＬＭＰ２：ＩＲＥＳ：ＢＺＬＦ１（１９２６ｂｐのΕΒΝΑ１Δ；ＬＭＰ２に対して１４９３ｂｐ；そして、ＢＺＬＦ１に対して７３７ｂｐ）で構成されている。１つの典型的なＣＭＶ構築物（６５８３ｂｐ）は、ＩＥ１：ＩＲＥＳ：ｐｐ６５（ＩＥ１に対して１４７１ｂｐとｐｐ６５に対して１６８６ｂｐ）で構成されている。バイシストロン性プラスミドは、Ｔ細胞を活性化する際に効率的であった。プラスミドの作製については、以下の特徴の１つ以上が特定の態様において有用であろう：可能な限り小さいバックボーン（例えば、２．８〜３ｋｂｐ）；ＣＭＶプロモーターなどの最適化されたプロモーター（ＳＶ４０エンハンサー）；抗生物質耐性遺伝子でないこと；およびヒトのゲノムＤＮＡとの相同性がないこと。いくつかのケースでは、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、プラスミドは、スクロースを介する細菌の選択を含む（レバンスクラーゼ（ＳａｃＢ）は、細菌では条件致死的である）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００９２】
本発明の特定の実施形態では、ＣＴＬ株は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の混合物である。いくつかのケースでは、異なる標的抗原に対する再活性化細胞の予想されるプロファイルは次のとおりである。
【００９３】
抗原          主なＴ細胞の制限
ＩＥ１         ＣＤ８
ｐｐ６５       ＣＤ８
ＥＢＮＡ１     ＣＤ４
ＬＭＰ２       ＣＤ４＋ＣＤ８
ＢＺＬＦ１     ＣＤ８
ヘキソン       ＣＤ４
ペントン       ＣＤ４
【００９４】
図６のサイトカイン類に関して、ＩＬ４および／またはＩＬ７は、少なくとも特定の培養でウイルス反応性細胞の頻度を高めた。図７は、初期刺激に対するＤＣ：ＰＢＭＣの播種密度の最適化を示し、少なくとも１：２０の比率が最適な活性化に必要であったことを示した。
【００９５】
図１８は、本発明のシステムの１つの実施形態の複数の構成要素、例えば以下のものを含む臨床ｒＣＴＬ作製手順の結果を示す：１）ＤＣヌクレオフェクション；２）ＥＢＶ、ＣＭＶ、Ａｄｖ−抗原プラスミド；３）ＩＬ４／ＩＬ７のサイトカインの添加；４）Ｇ−ＲｅｘでのＴ細胞の増殖；および５）ＤＣの生成。図８では、発明者らが、従来のプロトコルを使用して、しかし短時間で作製されたものに類似した特性を有するＣＴＬを作製することができたことが示される。これらの細胞は、インビボで安全であり、かつクロム放出アッセイにより評価されるように最小のアロ反応性に関連付けられるべきである。
【００９６】
迅速な複数ウイルスｒＣＴＬの作製のために、ＤＣのヌクレオフェクションは、例えばＡｍａｘａ（登録商標）ヌクレオフェクションシステムまたはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）のヌクレオフェクションシステムを含む当該分野における任意の有用な手段によって起こり得る。複数ウイルスＣＴＬは、また、標的抗原をスパニングするｐｅｐｍｉｘでＤＣをパルスすることにより、あるいは、ＰＢＭＣを目的の抗原で直接刺激することにより迅速に作製することができる。
【００９７】
リンパ腫で発現されるモデル抗原としては、例えば、ＳＳＸ２、サバイビン、ＭＡＧＥ−４、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１が挙げられる。白血病で発現されるモデル抗原は、例えば、サバイビン、ＷＴ１、プロテイナーゼ３、およびＰＲＡＭＥを含む。特定の実施形態では、全体の抗原供給源は、ペプチドの重複ライブラリーであるＰｅｐＭｉｘ、例えば、１５量体のペプチド（そしてＨＬＡの制限を付与しないという利点がある）を含む。
【００９８】
実施例１
ＣＴＬ刺激のための樹状細胞の作製とＤＮＡヌクレオフェクション
【００９９】
樹状細胞は、公知の最も強力な抗原提示細胞である。抗原を発現する成熟樹状細胞（ＤＣ）による末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞の刺激は、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の再活性化につながることができる。ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４での培養により、接着性のＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ）から分化することができる。抗原（複数可）は、ＤＮＡプラスミドによるヌクレオフェクションでＤＣに導入することができ、次いで、ＤＣは、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＴＮＦα、およびＰＧＥ−２を含むサイトカインカクテルでの培養によって成熟することができる。
【０１００】
この実施例では、典型的な手順は、治療Ｔ細胞の作製に必要な構成要素として、樹状細胞を調製し、ヌクレオフェクションするために提供される。特定の実施形態における検体は、患者やドナー（または以前に凍結したＰＢＭＣ）からのヘパリン化末梢血を含んでもよい。感染症の検査は、採血後７日以内に実施され得る。
【０１０１】
新鮮な血液からのＰＢＭＣの調製（凍結保存血液を使用する場合は、後述するように進行させる）が実施される。周囲温度（室温）でＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０の等量にヘパリン化末梢血（理想的には６０ｍｌ）を希釈する。５０ｍｌの遠心管で、希釈血液の約２０ｍｌを用いて、約１０ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に慎重に重層する。使用可能なすべての細胞を利用するために必要に応じて調整する。周囲温度で４０分間４００×Ｇで遠心する。３×１ｍｌの血漿アリコートを保存し、−８０℃で貯蔵する。ＰＢＭＣ界面をＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０の等量に採取する。周囲温度で１０分間、４５０×Ｇで遠心分離する。上清を吸引除去する。「指フリック」によりペレットを緩め、Ｄ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０の２０ｍｌに再懸濁する。細胞の２０μ１を取り除く。５０％赤血球溶解緩衝液２０μ１を添加し、血球計を使用してカウントする。
【０１０２】
先に凍結したＰＢＭＣの調製のために、細胞を３７℃で解凍し、凍結細胞の１ｍＬ当たり１０ｍＬの温かいＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＤＣ培地で希釈し、細胞をカウントする。ＤＣのイニシエーションのために、以下の手順に従う。利用可能なすべてのＰＢＭＣを使用するために、プレート当たり〜１０×１０６（７〜１４×１０６の範囲）のＰＢＭＣで播種された６ウェルプレート（複数可）の３５ｍｍウェルの数を計算する。周囲温度で５分間、４００×Ｇで遠心分離する。播種すべきプレート当たり２ｍｌに細胞を再懸濁する。３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに２時間移し、ＤＣ前駆体を付着させる。Ｄ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩの１０ｍｌで３回ウェルを濯ぎ、ＰＢＭＣ非接着性画分を含む上清を合わせる。残存接着細胞に、１ウェルにつきＩＬ−４の１ｍｌ当たり１０００単位および１ウェルにつきＧＭ−ＣＳＦの１ｍｌ当たり８００単位を含むＤＣ培養培地の２ｍｌを添加する。フラスコ／プレート（複数可）を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに戻す。先に凍結保存されていない場合は、非接着細胞は、将来の使用の応答性Ｔ細胞のために凍結保存されてもよい。
【０１０３】
未成熟ＤＣが供給される。３日目または４日目に、ＩＬ−４を１０００単位／ｍｌに、ＧＭ−ＣＳＦを８００単位／ｍｌに補充する。２０×のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含むＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地を作り、１ウェルあたり１００μｌを添加する。
【０１０４】
ＤＣの成熟した時点で、未成熟のＤＣを５日目または６日目に穏やかな再懸濁によって採取する（今ごろは、フラスコに付着しているほんの少しの細胞があるはずである）。残りの接着細胞を除去するために、約１分間、冷Ｄ−ＰＢＳの５ｍｌを加え、穏やかに再懸濁し、未成熟ＤＣと一緒にする。血球計を用いて細胞数を測定する。大樹状細胞のみをカウントする。ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地に１ｍＬ当たり２×１０６個のＤＣを再懸濁し、２４ウェルプレートのウェル当たり１ｍＬにアリコートする。未使用のウェルに滅菌水を添加する。サイトカインの成熟カクテルを含むＤＣ培地１ｍｌを添加する。
【０１０５】
サイトカイン        最終濃度
ＧＭ−ＣＳＦ       ８００Ｕ／ｍｌ
ＩＬ−４           １０００ Ｕ／ｍｌ
ＴＮＦ−α         １０ ｎｇ／ｍｌ
ＰＧＥ−１         １ μｇ／ｍｌ
ＩＬ−１β          １０ ｎｇ／ｍｌ
ＩＬ−６           １００ ｎｇ／ｍｌ
【０１０６】
ＤＣを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で２０〜２８時間インキュベーションする。３ｍｌの全容ピペットで穏やかな再懸濁によって２０〜２８時間後に２４時間成熟ＤＣを採取する。血球計を用いて細胞数のカウントを実施する。大樹状細胞のみをカウントする。樹状細胞のヌクレオフェクションのために、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで６ウェルプレート中、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ培地４ｍｌを予め温める。採取した樹状細胞を３つ（チューブ１〜３）の１５ｍｌ遠心チューブに分割する。ＤＣ細胞数／チューブは、０．５×１０６よりも少なくすべきでなく、そして２×１０６よりも多くすべきではない。ＤＣを２００ｇで１０分間、遠心分離する。上清を吸引除去し、５μｇ／チューブの最終濃度でＤＣペレットにＤＮＡプラスミドを加える。ＤＮＡプラスミドＮＴＣ  ＩＥ１−ｐｐ６５をチューブ１に加え、ＤＮＡプラスミドＮＴＣ  Ｅ１ｄＧＡＬＭＰ２−ＢＺＬＦｌをチューブ２に加え、そして、ＤＮＡプラスミドＮＴＣヘキソン−ペントンをチューブ３に加える。ＤＣとＤＮＡをヌクレオフェクション溶液１００μｌで再懸濁し、十分に混合し、ヌクレオフェクション・キュベットに移す。キュベットをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒに置き、プログラムＵ２を選択し、スタートボタンを押すことによって、ヌクレオフェクションを開始する。ヌクレオフェクション直後にキュベットに予め温めておいた培地５００μｌを追加し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターにキュベットを移す。１０分後、ヌクレオフェクションされたＤＣを１２ウェル組織培養処理プレートに移し、サイトカイン成熟カクテルを含むＤＣ培地１．５ｍｌを加える。
【０１０７】
サイトカイン      最終濃度
ＧＭ−ＣＳＦ      ８００Ｕ／ｍｌ
ＩＬ−４          １０００  Ｕ／ｍｌ
ＴＮＦ−α        １０  ｎｇ／ｍｌ
ＰＧＥ−１        １  μｇ／ｍｌ
ＩＬ−１β        １０  ｎｇ／ｍｌ
ＩＬ−６          １００  ｎｇ／ｍｌ
【０１０８】
３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で、１２〜１８時間インキュベーションする。
【０１０９】
ＤＣを回収し、ＡＰＣとして使用するために照射される。採取しカウントする。ＡＰＣとして使用するためにＤＣを３０Ｇｙで照射する。培地１０ｍｌで１回洗浄する。ＣＴＬ培養培地で１ｍＬ当たり２または１×１０５で再懸濁する。ＤＣはＰＢＭＣまたはＣＴＬの刺激物質として使用するための準備が今では整っている。
【０１１０】
実施例２
プラスミドでヌクレオフェクションされた樹状細胞を用いる抗原特異的細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の作製
【０１１１】
本実施例は、抗原特異的細胞傷害性リンパ球の代表的な製造法に関する。この手順は、抗原提示細胞としてプラスミドでヌクレオフェクションされたＤＣを使用するプロトコルのための細胞を調製するために使用することが可能である。特定のケースでは、ＤＣは、例えば、ヘキソン−ＩＲＥＳ−ペントン、ＩＥ１−ＩＲＥＳ−ｐｐ６５、およびＥ１ｄＧＡＬＭＰ２−ＩＲＥＳ−ＢＺＬＦｌをコードするプラスミドでヌクレオフェクションされる。
【０１１２】
抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞株（ＣＴＬ）は、ＤＮＡプラスミドからの抗原を発現する自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激することよって作製することができる。ＡＰＣは、本発明の特定の実施形態では、樹状細胞（ＤＣ）である。樹状細胞は、効率的にヌクレオフェクションされることができ、患者からのウイルス特異的Ｔ細胞を作製するために使用される強力なＡＰＣである。特定の実施形態では、プラスミドでヌクレオフェクションされた樹状細胞は、第２またはそれ以降の刺激のために使用することができる。採用された培養条件下で、大きく成長するＴ細胞株は、目的の抗原（ＣＭＶ−ＩＥ１とｐｐ６５、アデノウイルス抗原とＥＢＶ抗原）に特異的なＴ細胞を含んでいる必要がある。サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−７）は最初の刺激で添加される。
【０１１３】
ヘパリン化末梢血は、患者から使用されるか、または以前に凍結した患者のＰＢＭＣから使用されてもよい。感染症の検査は採血の７日以内（特定のプロトコルに依存する）で実施され得る。プラスミドでヌクレオフェクションされた樹状細胞（ＤＣ）は、患者またはドナーから調製される。
【０１１４】
最終的に増殖した必要なＴ細胞数は、計算することが可能である。十分な細胞は、患者の体表面積、予想される用量レベル、および追加用量が可能かどうかに応じて患者用量とＱＣテストに必要である。特定の実施形態では、患者が予想よりも高用量レベルで登録され得る機会を可能とする。特定のケースでは、ＤＣは、ウシ胎児血清抗原を提示しないことを確実とするためにＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地で調製する必要がある。ＣＴＬのイニシエーションは、ＦＣＳの存在下で行われる。
【０１１５】
新鮮な血液から単核球「応答性」細胞の調製が、（冷凍血液については、下記を参照）実施される。周囲温度（室温）においてＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０の等量でヘパリン化末梢血（例えば、６０ｍｌ）を希釈する。５０ｍｌの遠心管において、約２０ｍｌの希釈血液で約１０ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを慎重に重層する。使用可能なすべての細胞を利用するために必要に応じて調整する。周囲温度で４０分間４００×Ｇで遠心分離する。３×１ｍｌの血漿アリコートを保存し、−８０℃で貯蔵する。ＰＢＭＣ界面をＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０の等量に採取する。室温で１０分間、４５０×Ｇで遠心分離する。上清を吸引除去する。「指フリック」によりペレットを緩め、Ｄ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０の２０ｍｌに再懸濁する。細胞の２０μ１を取り除く。５０％赤血球溶解緩衝液２０μ１を加え、血球計を使用してカウントする。適切な場合は、プレートやバイオリアクターにおける樹状細胞によるＰＢＭＣの刺激に進むことができる。
【０１１６】
必要な場合は、以前に凍結したＰＢＭＣまたは非接着性単核細胞からの応答性細胞の調製を実施することができる。３７℃で細胞を解凍し、凍結細胞１ｍＬ当たり温かい培地１０ｍＬに希釈する。細胞をカウントする。
【０１１７】
適切な状況においては、例えば、プレートやバイオリアクターにおいて、樹状細胞によるＰＢＭＣの刺激まで進むことができる。室温で５分間４００×ＧでＰＢＭＣを遠心する。上清みを除去し、ＣＴＬ培地＋ＩＬ４（１０００Ｕ／ｍｌ−最終濃度）とＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ−最終濃度）に１ｍＬ当たり２×１０６個の細胞を再懸濁する。２４ウェルのウェル当たり細胞１ｍｌにアリコートし、プレートをインキュベーターに戻すか、あるいはＧＰ４０バイオリアクター中で５〜７．５ｍＬ（１０〜１５×１０６）のＰＢＭＣにアリコートし、そしてインキュベーターに戻す。調製したプラスミドでヌクレオフェクションされたＤＣを得て、３０Ｇｙで照射し、４回洗浄する。ＤＣに対するＰＢＭＣの１０：１または２０：１の比率に対して、２×ｌ０５〜１×１０５（ＤＣ）細胞／ｍｌで、抗原提示細胞を再懸濁する。ＰＢＭＣウェルに１ｍｌのＤＣをアリコートするか、またはバイオリアクターに７．５ｍＬのＤＣをアリコートし、３０ｍＬに培地を添加する。３７℃、５％ＣＯ２の空気中で７日間培養する。７日目：＜３×ｌ０６個の細胞／ウェルが存在する場合は、半分の培地の変更を実行する。ウェル当たり培地の〜１ｍＬを除き、新鮮なＣＴＬ培地＋サイトカイン類の〜１ｍＬで置き換える。７日目：＞３×ｌ０６個の細胞／ウェルの場合、ＣＴＬを分割し、栄養補給する；ＣＴＬの〜１ｍｌを新しいウェルに移す；新鮮なＣＴＬ培地＋サイトカイン類の〜１ｍＬで栄養補給する。７日目：バイオリアクター中で＜５０×ｌ０６個の細胞の場合は、１０ｍｌの培地を除き、新鮮な培地＋サイトカイン類を補給する。７日目：バイオリアクター中で＞５０×ｌ０６個の細胞の場合は、１５ｍｌのＣＴＬを新しいバイオリアクターに移し、新鮮な培地＋サイトカイン類との両方を補充する。さらに４〜６日間、培養する。臨床凍結保存については、十分な細胞が得られた場合は、細胞を凍結保存し、特徴を明らかにする。ＣＴＬの凍結１週間以内に、細胞毒性アッセイは、５×１０６〜１×１０７個の細胞で設定する必要があり、表現型解析は、特定のプロトコル要件に応じて２×１０６個の細胞で行われる必要がある。
【０１１８】
特定の実施形態では、細胞は次のような特徴を有することが可能であり、特定の実施形態では：１）適切な用量レベル（その時点で決定される）での患者の注入および全てのＱＣの要件のための十分なＣＴＬの数；２０：１（もし、同種間であるならば）でのレシピエントのＰＨＡ芽球の＜１０％の殺害；３）＜２％ＣＤ８３＋／ＣＤ３細胞（ＤＣの除外）。
【０１１９】
実施例３
同種幹細胞移植後のＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス感染症の予防と治療のための複数ウイルス特異的ＣＴＬ
【０１２０】
本明細書に例示されたものだけでなく、ウイルスの任意の組み合わせをも対象とする複数ウイルス特異的Ｔ細胞産物を作製するために本実施例の方法論を使用することができる。本発明の特定の実施形態では、３つの典型的なウイルス：ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルスに対する抗ウイルス活性を有する、ドナー由来複数ウイルス特異的ＣＴＬ株が迅速に作製される。しかし、複数ウイルスＣＴＬは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのウイルス対して向けられてもよい。標的としてのＥＢＶ、ＣＭＶ、および／またはアデノウイルスに加えて、ＣＴＬは、例えば、１つ以上のＨＨＶ−６、ＢＫ、ＲＳＶ、インフルエンザ、またはパラインフルエンザに向けられてもよい（図１９を参照）。
【０１２１】
本実施例では、同種幹細胞移植後にＣＭＶ、アデノウイルスまたはＥＢＶ感染症を発症するリスクのある患者におけるドナー由来の迅速に作製された複数ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ｒＣＴＬ）の安全性と毒性を評価するための代表的な第Ｉ相、第ＩＩ相の研究を説明する。まず、第Ｉ相の用量増量研究は、４つの代表的なｒＣＴＬの用量レベルの安全性に対処し、最大耐量（ＭＴＤ）のレベルを決定するために採用される。用量を制限する毒性は、４２日以内のグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発症として定義されるか、または任意の器官系におけるｒＣＴＬに起因することができるが、既存のものではなく、そして内在する悪性腫瘍によるものでもない、あるいはＣＴＬ投与後３０日以内に再発するＮＣＩグレード３〜５の注入関連有害事象として定義される。
背景
【０１２２】
ドナー由来のＣＴＬによる抗ウイルス免疫の再構築は、移植後のＣＭＶ、ＥＢＶ、およびアデノウイルス感染症の予防と治療に有用である（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、従来のプロトコルを使用して、Ｔ細胞免疫療法の広範な実施は、ＣＴＬが推測により十分に前もって調製されない限り、（ｉ）生産費用（ｉｉ）生産制限スケーラビリティの複雑さ、および（ｉｉｉ）コストと複雑さの一因となるだけでなく、重病患者の緊急治療を排除するＣＴＬ生産に必要な時間、によって制限される。
【０１２３】
ＣＭＶ、アデノウイルスまたはＥＢＶ感染症などの発症の危険がある、または初期感染症の同種間造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のレシピエントへの注入のためのドナー由来複数ウイルス特異的ＣＴＬ（ｒＣＴＬ）を作製するための迅速なプロトコルが、本明細書で提供される。特定の実施形態では、活溌なウイルス再活性化または感染を発症する危険にさらされている、またはそれに罹患したＨＳＣＴレシピエントにおける抗ウイルス活性を調停するために、迅速に作製されたドナー由来複数ウイルス特異的ＣＴＬの投与がある。
【０１２４】
患者は、任意の種類の同種間移植の後に初期感染の予防および／または治療として細胞を投与され得る。患者が移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療または他の理由からステロイドを投与されている場合は、投与量は、≦０．５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾン（または同等のもの）に漸減しなければならない。本発明の特定の態様では、患者は、以前の２８日間の間に、ＡＴＧ、またはＣａｍｐａｔｈまたは他の免疫抑制モノクローナル抗体を投与されていてはならない。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態では、患者は、用量漸増の安全性試験の期間の単回注入で５×ｌ０６個と５×１０７個の間のｒＣＴＬ／ｍ２、および固定用量の第ＩＩ相有効成分のために５×１０７個のｒＣＴＬ／ｍ２の投与を受ける。患者が部分的な寛解（定義されているように）を有するか、注入Ｔ細胞を除去することができる注入後治療を受ける場合、彼らは、例えば、２つの追加の用量まで受けることができる。個体は、ウイルス負荷のＰＣＲ分析が続けられ、定められた間隔で記録されたＧｖＨＤのスコアを有することができる。
【０１２６】
本実施例では、ｒＣＴＬが安全であり、３つの代表的なウイルスＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルスに対して活性を有するか否かが判定される。患者は、以下の特性を１つまたは複数を有している場合がある：１）骨髄またはＰＢＳＣのいずれかを使用した、既往歴の同種造血幹細胞移植；２）≧５０のＫａｒｎｏｆｓｋｙ／Ｌａｎｓｋｙスコア；３）５００／μＬよりも大きいＡＮＣ；４）ビリルビン＜２×、ＡＳＴ＜３×、血清クレアチニン＜２×正常の上限値、Ｈｇｂ＞８．０；６）室内空気で＞９０％のパルスオキシメトリー；７）負の妊娠検査（妊娠の可能性のある女性の場合）；および８）利用できる３種ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球。
【０１２７】
代表的な臨床プロトコルでは、第Ｉ相試験の成分の主要エンドポイントは、４２日目までの急性ＧｖＨＤ、および最後のＣＴＬ注入の３０日以内の注入関連の有害事象または非血液有害事象を含む安全性を網羅している。第ＩＩ相試験の成分のための代表的な主要エンドポイントは、安全性と抗ウイルス応答が含まれる。第Ｉ相試験および第ＩＩ相試験のための代表的な副次的エンドポイントは、感染症患者におけるウイルス負荷に対するｒＣＴＬの効果；１、２、４、６、および８週間、ならびに３ヶ月での抗ウイルス免疫の再構築；および／または３カ月以内のウイルスの再活性化が含まれる。
【０１２８】
移植後のウイルス感染
【０１２９】
造血肝細胞移植（ＨＳＣＴ）後の免疫の回復期間の課程で、Ｔ細胞免疫によって通常コントロールされるウイルス感染症は、罹患率と死亡率の重要な原因となる。感染の危険の程度は、ドナーとレシピエント間の組織不適合の程度、および免疫抑制の結果の程度によって、そしてドナーの免疫状態によって規定される。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などの潜在的なウイルスの再活性化は、一般的であり、しばしば症候性疾患を引き起こす。例えば、アデノウイルス、インフルエンザ、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの呼吸器系ウイルスは、また、しばしば感染症を引き起こす。抗ウイルス性の薬理学的薬剤は、これらのウイルスの一部に対してのみ有効である；それらの使用は高価であり、かなりの毒性や薬剤耐性変異体の作製に関連している。ウイルス特異的細胞性免疫応答の回復の遅れが、これらの患者のウイルスの再活性化と疾患に明らかに関連しているので、ウイルス特異的免疫を回復する細胞免疫療法は、３つの代表的な一般的なウイルス；ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびアデノウイルスを標的とするために有用である。
【０１３０】
ＣＭＶ
【０１３１】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、通常、免疫応答性の個人に無症候性感染を引き起こす潜在的なβ−ヘルペスウイルスである。それは健康な成人の約７０％に存続し、上皮細胞、線維芽細胞および単球で複製される。幹細胞のレシピエントにおけるＣＭＶの再活性化は、間質性肺炎、胃腸炎、発熱、肝炎、脳炎および網膜炎（Ｂｏｅｃｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）などの臨床症状で、かなりの罹患率と死亡率をもたらす可能性がある。細胞媒介性免疫は、ＣＭＶ感染を制御する最も重要な要因とみなされ、ＣＭＶ−特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球は、一次感染とその後の再活性化の両方の免疫防御において重要な役割を果たしている。予防的治療または先制治療のために最も頻繁に使用される薬剤は、ガンシクロビルおよびホスカルネットである。これらの薬剤は、ＣＭＶ疾患に関連する死亡率を減少させ、そして静脈内免疫グロブリンとの併用により早期ＣＭＶ疾患の予防に成功している。しかし、両方とも好中球減少症と腎毒性を含む重大な副作用を有する。
【０１３２】
エプスタイン−バーウイルス
【０１３３】
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、世界の人口の９５％超に感染するγ−ヘルペスウイルスである。主要な感染症は、通常、穏やかな自己限定的疾患をもたらし、それは、Ｂ細胞における潜在的な感染、Ｂ細胞および粘膜上皮における生産性の複製が続く。ウイルス潜伏には、少なくとも４つのタイプがある：タイプ１、ウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ１）のみを発現する；タイプ２、ＥＢＮＡ１に加えて、潜在的な膜タンパク質ＬＭＰ１とＬＭＰ２を発現する；およびタイプ３、免疫優性ＥＢＮＡ３ウイルス抗原を含む７つすべての潜在性関連タンパク質を発現する（Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ，２００４）。これらのタイプの潜在性において、ウイルスゲノム（ＢＡＲＴ）のＢａｍＨＩ  Ａ領域からの転写と同様にウイルスの小さなＲＮＡとＥＢＥＲは、豊富に発現される。健常人のＢ細胞の循環の大部分で見られる第４のタイプの潜在性において、ウイルスＲＮＡの発現は検出できない。免疫不全宿主では、ウイルス特異的Ｔ細胞に高感受性であるタイプ３の潜在性を発現するＢ細胞の増殖は、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）の発症につながる可能性がある。ＨＳＣＴ後のＰＴＬＤの全体の発生率は、１％未満であるが、免疫不全の根本的な診断を有するレシピエントでは、そして、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を防止するためにＴ細胞を選択的に枯渇させた移植片を受ける、非血縁のドナーまたはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合ドナーからの幹細胞のレシピエントに対しては、その発生は増加する。（Ｃｕｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１３４】
ガンシクロビルの様なヌクレオシド類似体は、ウイルスの複製サイクルを阻害するけれども、小さな分子の薬剤が、既にＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞に対して何らかの効果を有することは少ない。化学療法は、稀に効果的であり、かなりの毒性と関連付けられる。ＨＳＣＴ後のＰＴＬＤの予防と治療のための１つの選択肢は、リツキシマブであり、これはＢ細胞表現型抗原、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体である。５５％と１００％の間でのリツキシマブに対する応答割合は、さまざまなシリーズで報告されている（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｋｅｕｈｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｏｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ただし、すべての患者が応答するというわけではなく、そして、リツキシマブは６カ月よりも長い期間、正常なＢ細胞を枯渇させるが、それは既に免疫抑制された患者集団では問題になり得る。
【０１３５】
アデノウイルス
【０１３６】
アデノウイルスは、非エンベロープ溶解性ＤＮＡウイルスである。ヒトは、組織特異性と病原性が異なる６つの異なる種（Ａ〜Ｆ）を形成するアデノウイルスの５１の血清型による感染症に罹患しやすい。急性的に感染するウイルスであるけれども、アデノウイルスは、病気の快復後、何カ月も持続することがあるので、ドナーまたはレシピエントにより気付かれずに移植組織にしばしば運び込まれる。健康な成人では、急性感染症が致命的であることは稀であるが、それは肺炎、出血性膀胱炎、腎炎、大腸炎、肝炎、および脳炎をもたらし得る免疫不全の個体での罹患率および死亡率の大きな原因となる。アデノウイルスは、小児ＨＳＣＴ後に特に高い発症率を有する（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。アデノウイルス感染症のクリアランスは、アデノウイルス特異的Ｔ細胞の検出と関連付けられており（Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、適合非血縁ドナーのレシピエントおよびＣａｍｐａｔｈなどの強い免疫抑制を受けるハプロタイプ一致の移植においては、回復が大幅に遅れることがいくつかの報告で示されている（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。病気の治療のために最も頻繁に使用される薬剤は、シドフォビルであるが、関連腎毒性は主要な懸念事項であり、前向き無作為化比較試験の不在下では、その薬剤の有効性は不確かである。
【０１３７】
ウイルス特異的ＣＴＬによる養子免疫療法
【０１３８】
ウイルス特異的Ｔ細胞の採取は、明らかにこれらのウイルスの各々の感染からの防御に関連付けられているので（Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃｗｙｎａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、免疫再構築までの時間を短縮する養子免疫療法は、魅力的なアプローチである。ウイルス抗原を発現する抗原提示細胞での反復刺激により作製されたウイルス特異的Ｔ細胞は、免疫不全宿主でのウイルス感染の予防と治療をするための臨床試験で評価されている（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｅｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。このアプローチでは、アロ反応性Ｔ細胞を除く。
【０１３９】
ウイルス特異的ＣＴＬをエクスビボで作製するためのプロトコルを開発する際には、いくつかの考慮点がある。標的ウイルスに特異的な防御Ｔ細胞を誘導する免疫優性抗原についての知識は必要とされ、抗原を効果的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に移す送達系が識別されなければならない。ＡＰＣは、自家でなければならず、関連ウイルス由来のペプチドと、同様にＴ細胞の活性化と増殖を誘導するのに十分な共刺激分子を提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原を発現しなければならない。これらの試薬は、すべてＧＭＰ製造に適している必要があり、それは、抗原のいくつかの種類と供給源の使用を制限する。
【０１４０】
ＣＭＶのためのＴ細胞療法
【０１４１】
養子移入Ｔ細胞が、抗ウイルス免疫を再構築することができたかどうかを評価する最初の研究は、ＣＭＶを標的とした。この研究では、ＣＭＶ−特異的Ｔ細胞クローンは、ＣＭＶでパルスされた自己線維芽細胞による刺激後、兄弟ドナーに由来した（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。副作用はなかったし、ＣＭＶ特異的免疫応答は再構築され、患者は誰もＣＭＶ疾患または遅発性再発を発症しなかった。しかし、ＣＤ４＋ＣＭＶ特異的Ｔ細胞応答を発生しなかったレシピエントでは、抗ＣＭＶ活性が低下したが、このことは、ＣＤ４Ｔ細胞が、特定の症例では、長期的な持続性のために必要であり得ることを示している。別の予防の研究では、Ｐｅｇｇｓらは、ＣＭＶに感染したヒト肺線維芽細胞株に由来するＣＭＶ抗原でパルスした樹状細胞で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激することによって、ＣＭＶ−特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を作製した（Ｐｅｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＴＬの小用量は、ＣＭＶ特異的ＣＴＬのインビボでのかなりの増殖により免疫を再構築することができた。Ｔ細胞製造の間、生きているＣＭＶの使用を避けるために、より多くの最近の研究では、サイトメガロウイルスｐｐ６５タンパク質（Ｍｉｃｋｌｅｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に由来するＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＮＬＶでパルスした樹状細胞によりＣＴＬを刺激した。このアプローチはまた、有効性が示唆されながら、注入されたＣＴＬの制限された特異性が懸念されるが、その理由は、単一のエピトープを標的にすることは、エスケープ変異体を可能とし、ＨＬＡ−Ａ２陽性である患者への試験を制限するからである。
【０１４２】
ＣＭＶ特異的ＣＴＬは、また、抗ウイルス薬による長期間の治療にもかかわらず、持続性または再発性のＣＭＶ感染症の患者で治療的に使用されている（Ｅｉｎｓｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。結果は、７名中６名の対象でウイルス再活性化の抑制が促進された。本研究では、抗原の供給源は、ＣＭＶ溶解物であるが、これは、広範な免疫応答を生じるという利点を有するが、溶解物中の生きたウイルスからの感染の危険性のため、第ＩＩＩ相試験には不向きである。
【０１４３】
上記ＣＴＬ療法のすべては、重要な規制をサポートする専門化したＧＭＰ設備での長時間の活性化と増殖を必要とするＴ細胞の生産方法を採用した。これらの要件は、養子免疫療法の実用性を減らすが、その理由は、ＣＴＬ株は、病気のずっと前に作らなければならず、細胞のこのタイプの処理に必要な施設やインフラを有するセンターは少ないからである。末梢血から直接にＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞の４量体の選択を使用した最近報告された臨床試験は、エクスビボでの増殖や生きたウイルス抗原の両方を回避した。ＣＤ８＋Ｔ細胞だけが注入されたが、それらは注入後、いくつかのログで増殖し、９症例中、８症例が感染をクリアした（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかし、このアプローチは、まれなＨＬＡタイプの４量体の限られた入手可能性およびクラスＩＩの４量体の不足によって妨げられている。
【０１４４】
ＥＢＶに対するＴ細胞療法
【０１４５】
ＰＴＬＤの増殖したＥＢＶ感染Ｂ細胞は、ＥＢＶの実験室株で末梢血Ｂ細胞を感染させることによって作製されるＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と同じ表現型とウイルス抗原の発現を有する。ＬＣＬは、任意のドナーから容易に調製することができるので、それらは、ＥＢＶ特異的ＣＴＬを評価する臨床試験でのＡＰＣとして使用される（Ｃｏｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｇｕｓｔａｆｓｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この方法を用いて作製されたＥＢＶ特異的ＣＴＬは、ポリクローナルであり、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の両方を含み、複数の潜在性および溶解性ウイルス抗原を認識する。養子移入ＥＢＶ特異的ＣＴＬは、少なくとも８年間は生き残り、注入後２〜４ログまで増殖し、患者の約２０％で観察される高いウイルス負荷を軽減する（Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ハイリスク患者集団を標的とする最近の３つの研究のレビューでは、予防としてＥＢＶ  ＣＴＬの投与を受けた１０１人の患者は、誰もＰＴＬＤを発症しなかった（Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。注入時点で進行中のＰＴＬＤ患者１３例のうち、ドナー由来ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株は、１１症例で寛解を誘発したが（Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、一方、非応答者の１人において、腫瘍ウイルスは、注入されたエフェクターＴ細胞の標的であったＥＢＮＡ３での免疫優性エピトープを欠失していた（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。他の研究では、移植後のＥＢＶ特異的ＣＴＬの活性を確認した（Ｃｏｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１４６】
アデノウイルスに対するＴ細胞療法
【０１４７】
Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒらは、アデノウイルス抗原によるインビトロの短い刺激、続いてγ−インターフェロン分泌細胞の選択の後に、ドナーから単離されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋アデノウイルス特異的Ｔ細胞を用いて、アデノウイルス感染症の患者を治療した（Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。少数のアデノウイルス特異的ドナーＴ細胞は、ＨＳＣＴ後の全身性アデノウイルス感染症の９人の子供に注入された。アデノウイルス特異的免疫応答は、６人の評価可能な患者のうち５人に認められ、ウイルス負荷および感染のクリアランスの持続的な減少を伴った（Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１４８】
複数ウイルス特異的Ｔ細胞
【０１４９】
上記の戦略は、それぞれ、１つのウイルスのみを標的とする。幹細胞レシピエントの単一のＣＴＬ株の特異性を広げて最も一般的な３つのウイルス性病原体を含めるために、本発明者らは、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５をコードする組換えアデノウイルスベクターにより形質導入された単核細胞を用いてＣＭＶとアデノウイルス特異的Ｔ細胞を再活性化した。同じベクターでともに形質導入されたＥＢＶ−ＬＣＬによるその後の刺激は、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を再活性化し、活性化アデノウイルスとＣＭＶ特異的Ｔ細胞の増殖を維持した。この方法は、３つすべてのウイルスに対して特異的な細胞傷害性機能を備えたＣＴＬを確実に作製し、それらは第Ｉ相予防試験での１４人の幹細胞レシピエントに注入された。すべての患者ではＣＭＶとＥＢＶに対する免疫の回復はあったが、アデノウイルス特異的Ｔ細胞の増加は、前注入のアデノウイルス感染を証明した患者においてのみ見られた（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。アデノウイルス特異的Ｔ細胞の頻度が、注入されたＣＴＬで増加したというフォローアップ研究は、同様の結果をもたらし、このようにインビボで注入されたＴ細胞の増殖を促進する内因性抗原の重要性を強調した（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。それにもかかわらず、前注入ＣＭＶ、アデノウイルスまたはＥＢＶの感染や再活性化の両方の臨床試験ではすべての患者は、換気のサポートを必要とする重篤なアデノウイルス性肺炎患者１人を含めて、感染をクリアすることができた（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。複数の抗原を認識するＣＴＬは、したがって、３つすべてのウイルスに対して臨床的に適切な効果をもたらすことができる。
【０１５０】
現在のＣＴＬ作製プロトコルの制限
【０１５１】
ＣＴＬの養子移入は、従来の治療法に受け入れられないウイルス感染や血液悪性腫瘍を治療することができることは今や明らかである。利点が長期的に持続され、細胞は最小限の毒性を生じるため、このアプローチは、潜在的に優れた薬理学的−経済学的プロファイルを有する。残念なことに、より広い適用は、（ｉ）ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）の初期の製造および臨床グレードのアデノウイルスベクターの製造と試験を必要とする製造コスト、（ｉｉ）毎週のＣＴＬ刺激のためのＡＰＣの作製と遺伝子改変、開放培養系の繰り返しの栄養供給、および複数の熟練した「主観的判断」を必要とするＣＴＬ製造の複雑さ、それによりスケーラビリティを制限すること、および（ｉｉｉ）ＣＴＬ生産に必要な時間；ＥＢＶ−ＬＣＬの初期作製のための４〜６週間に、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を増加させ、アロ反応性Ｔ細胞を除去するために必要な、さらなる４〜８週間のＣＴＬの活性化および増殖期間を加えなければならない。この遅れはコストと複雑さに寄与するのみならず、ＣＴＬが予測的に十分事前に調製されない限り、重病患者の緊急治療を排除する。
【０１５２】
複数ウイルス特異的ＣＴＬの迅速な作製
【０１５３】
ＡＰＣとしてＤＮＡプラスミドでヌクレオフェクションされたＤＣを用いる複数ウイルス特異的ＣＴＬの作製
複数ウイルスＣＴＬをより迅速に製造するために、本発明者らは、複数のウイルス抗原をコードするＤＮＡプラスミドで、Ａｄ５ｐｐ６５ベクター（ＡｄｖとＣＭＶ特異性）およびＥＢＶ−ＬＣＬ（ＥＢＶ特異性）の両方を置き換えるプロトコルを開発した。これらのＤＮＡプラスミドは、臨床的に適用されるＬｏｎｚａ／ＡＭＡＸＡヌクレオフェクションシステムを使用して、単球やＤＣなどのＡＰＣの核に導入することができる。導入後に、高レベルの導入遺伝子の発現が、Ｔ細胞の活性化期間中に良好な標的細胞の生存率で達成される（Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。プラスミドは、非感染性、非複製であり、トランスフェクトされた細胞のゲノムに不充分に統合される。臨床グレードのＤＮＡは、優れた長期安定性を備え、迅速に、コスト的に効率よくスケーラブルな量で製造できる。プラスミドの置換は、プラスミド試験のコストがアデノウイルスベクター試験の約１０分の１であるため、ＣＴＬの製造の時間および免疫検査の程度を低減することにより、５０％を超えて製造コストを削減する。
【０１５４】
これらのプラスミドＤＮＡによりコードされた防御的および免疫原性ＡｄｖおよびＣＭＶ抗原の評価は、Ａｄｖ−ヘキソンとペントン、およびＣＭＶ１−Ｅ１とＣＭＶ−ｐｐ６５に向けられたＴ細胞は、インビボで防御的であることを示す有望な臨床結果に基づくことができる（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＭＶ−ＩＥ１−特異的Ｔ細胞は、潜在期間からＣＭＶを再活性化する細胞を標的とすることができ、一方、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞は、新たに感染した細胞を標的とする。免疫原の各ウイルスの２つのタンパク質の包含は、潜在的な標的エピトープの数と、したがってＴ細胞ドナーのＨＬＡ型に関係なく、Ｔ細胞が再活性化される確率を増加させる。一旦投与されると、ポリエピトープ特異的ＣＴＬは、感染細胞のエピトープ変異により免疫回避の結果、失敗する可能性が低くなる。ＥＢＶについて、ＥＢＮＡ１は、すべてのＥＢＶ関連悪性腫瘍および通常のＥＢＶ感染Ｂ細胞で発現される免疫優性ＣＤ４＋Ｔ細胞標的抗原である。ＬＭＰ２は、複数のＨＬＡタイプにわたって免疫原性であり、ほとんどのＥＢＶの悪性腫瘍で発現し、一方、ＢＺＬＦ１は、大抵の個体からのＣＤ＋４とＣＤ８＋の両方のＴ細胞を刺激する免疫優性の即時型早期溶菌サイクルの抗原をコードする。
【０１５５】
成長促進サイトカイン類を使用しての複数ウイルス特異的ＣＴＬの作製
【０１５６】
本発明者らは、ウイルス特異的ＣＴＬが、効率的かつ迅速に増強サイトカイン類ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（１，０００Ｕ／ｍｌ）の存在下に増殖できることを実証した。これらのサイトカイン類は、サイトカインの非存在下で作製された同じ患者からのＴ細胞に比べて、応答性抗原特異的Ｔ細胞の頻度とレパートリーを増やすのにそれに応じて有用な抗原特異的Ｔ細胞の活性化誘導細胞死を減らす。さらに、これらのサイトカイン類を我々の培養物に添加することにより、単一刺激の後でさえ、無視し得るアロ反応性のＣＴＬ株を生成する。このように、臨床グレードの試薬として利用できるこれらのサイトカイン類を我々のＣＴＬ培養物に補完することは、ＣＴＬ製造の時間を減少させることにより、＞５０％の製造コストを削減する。
【０１５７】
最適化された培養装置を用いる複数ウイルス特異的ＣＴＬの作製
【０１５８】
現在、ＣＴＬは毎週再刺激して、従来の組織培養処理２４ウェルプレートで漸進的増殖によって作製されなければならない。このシステムは、非常に労働集約的であり、高度に熟練を要し、スケールアップするのに困難である。たとえ２４ウェルプレートでの細胞培養が、栄養レベルと廃棄物の除去を最適化するために、しばしば培地の変更と操作を必要とするとしても、抗生物質が使用されていないので、Ｔ細胞はかなりの細胞死を受けるが、一方、感染はすべてのほとんどの熟練した組織培養技術者に常に存在するリスクである。残念なことに、広く臨床細胞培養システムの他のタイプで使用されている密閉型スケーラブル・バイオリアクター・システムを置き換えるこれまでの努力は、失敗した。得られたＣＴＬ生成物は、機能しないか、または非特異的のどちらかであった。
【０１５９】
本発明者らは、培養中にＴ細胞のアポトーシスを劇的に減少させ、インビトロでのより効率的な増殖をもたらす、新たなガス透過性の迅速な増殖装置（Ｇ−Ｒｅｘ）を利用する。ガス交換（０２を中へ、Ｃ０２を外へ）は、フラスコの底面でガス透過性シリコーン膜全体に起こり、細胞上の培地の深さを大きくすることを可能にし、より多くの栄養素を提供し、廃棄物を希釈しながら、低酸素症を防止する。これらの培養条件は、物理的破壊によって邪魔されずに進行するためにＣＴＬ生産にとって必須の安定な細胞：細胞の相互作用を可能とし、技術者の時間を＞１０倍削減し、細胞の生産を＞３倍増加し、ＣＴＬの表現型や機能に影響を与えることなく、ＣＴＬ製造時間を＞２倍に加速する（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１６０】
全体的に、これらの３つの新規な手順を組み合わせることによって、我々は簡単なワンステップ手順を使用して、アロ反応性細胞のない大量の複数ウイルスＣＴＬを作製することができ、それは、伝統的なＣＴＬのプロトコルに関連するコスト、複雑さ、および時間を劇的に削減する。
【０１６１】
本発明の特定の実施形態の設計
【０１６２】
本発明の特定の態様では、ＥＢＶ、ＣＭＶまたはアデノウイルス感染症を発症する危険性がある、または早期の再活性化を有するＨＳＣＴ患者での迅速に作製された３種ウイルス特異的株（ｒＣＴＬ）の実現可能性、安全性および有効性が評価される。
【０１６３】
研究設計のための主要目的と理論的根拠
【０１６４】
研究の主要目的は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはアデノウイルス感染の危険にさらされている、または早期の再活性化や感染症を有する移植患者にｒＣＴＬを投与する安全性を評価することである。我々は、５×１０６から始めて、１×１０７、２×１０７、そして最終用量５×１０７のｒＣＴＬ／ｍ２の４つの異なる用量レベルを使用することを選択した。我々の以前の手法によって製造されたＣＴＬは、最大１０８個の細胞／ｋｇの用量で安全であった（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、製造方法が修正されたので、いくつかのケースでは、本発明者らは、５×１０６個の細胞／ｍ２の低用量で本研究を始める。特定のケースでは、１用量の服用後、部分寛解を有する被験者において、または注入されたＣＴＬの持続性や機能に影響を及ぼす可能性がある他の療法を受ける被験者において、さらなる用量（同じレベルで）の投与がある。
【０１６５】
実現可能性／安全性の研究の患者は、本明細書で定義される予防として、または早期再活性化についてＣＴＬの服薬を受けるために、任意のタイプの同種間移植に従うのに適格であり、それは、例えば、１）早期治療が、単一または複数の感染症（１つの再活性化と１つの制御感染のある複数の感染症患者が含まれ得る）の適格患者に与えられ得る；２）０．５ｍｇ／ｋｇ／日未満のプレドニゾンにステロイドを漸減できる登録時の臨床状態；３）適用可能であれば、女性患者の陰性妊娠テスト（用量減量前処置を受けた人の出産可能性）；４）１２カ月以内に骨髄または末梢血幹細胞のいずれかを使用する、骨髄破壊的または骨髄非破壊的前処置による同種造血幹細胞移植；５）ＣＭＶ、アデノウイルスまたはＥＢＶ感染のリスクがある患者のための予防；６）詳細に記述された各ウイルスの特定の実施形態について定義されている再活性化および感染症の早期治療、を含む。
【０１６６】
ＣＭＶ（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｊｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）
【０１６７】
ＣＭＶ抗原血症は、移植後少なくとも毎週モニタリングされる。早期の再活性化は、＜１０白血球陽性でＣＭＶ抗原血症と定義される。どんな患者でも、ＣＴＬ注入の前または後のいずれかで、ＣＭＶ抗原血症（＞１０白血球陽性の場合）またはＣＭＶ感染症の臨床的所見（内臓部位からの生検標本によるＣＭＶの証拠として定義される（培養または組織学によって））を発症するならば、ガンシクロビルおよび／またはホスカルネット、ならびに免疫グロブリンによる標準治療が開始される。患者は、内臓の感染なしに、抗原血症または高められたＰＣＲ用のＣＴＬを服用することが可能である。
【０１６８】
アデノウイルス
【０１６９】
アデノウイルス感染症は、糞便や血液や尿や鼻咽頭などの１つの部位からＰＣＲまたは培養により検出されるアデノウイルス陽性の存在として定義される。アデノウイルス疾患は、糞便や血液や尿や鼻咽頭などの２個所以上の部位からの培養によって検出されるアデノウイルス陽性の存在として定義される。疾患の基準を満たす患者では、対象が腎毒性のためにこの薬剤に耐えることができなかった場合を除き、シドフビルを加えることが可能である。患者は、血液や糞便の高められたＰＣＲ用にＣＴＬを服用し得る。
【０１７０】
ＥＢＶ
【０１７１】
ＥＢＶ−ＬＰＤは、生検によって定義される、証明されたＥＢＶ−ＬＰＤとして、または生検確証のない臨床症状（画像診断でのリンパ節腫脹または発熱または腫瘤）と関連した高いＥＢＶのＤＮＡレベルとして定義される、可能性のあるＥＢＶ−ＬＰＤとして、最近のガイドライン（Ｓｔｙｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）に従って定められる。ＥＢＶのＤＮＡの再活性化のみを有する患者は、研究でＣＴＬを服用し得る。証明されたＥＢＶ−ＬＰＤの、または可能性のあるＥＢＶ−ＬＰＤの患者は、また、リツキサンを服用する必要がある。
【０１７２】
設計の特定の態様では、特定の患者は除外される場合がある：１）登録のためのスクリーニングの２８日以内に、ＡＴＧもしくはキャンパスまたは他の免疫抑制Ｔ細胞モノクローナル抗体を服用している患者；２）他の制御されていない感染症患者（細菌感染症について、患者は、根治治療を受けていなければならず、登録前７２時間、感染の進行の徴候がない必要がある；真菌感染症の患者は、根治性の全身抗真菌治療を受けていなければならず、登録前１週間、感染の進行の徴候がない必要がある；進行性の感染症は、敗血症または新しい徴候に起因している血行動態不安定、感染に起因している悪化している身体的徴候またはＸ線画像所見として定義される。）（他の徴候や症状を伴わない持続性発熱は、進行性感染として解釈されることはない）；３）２８日以内にドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）を受けた患者；４）活動性の急性ＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶの患者；５）活動性で制御されていない悪性腫瘍の再発。
【０１７３】
ドナー
【０１７４】
同種（すなわち、ＨＬＡ適合もしくは不適合の血縁または非血縁の）幹細胞移植のドナーは、以下の完全な病歴と身体検査を含んで評価され得る；ＣＢＣ、血小板、鑑別；電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、グルコース、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ、血清タンパク電気泳動（示されている場合）、ＨＩＶ−１抗体、ＨＩＶ−２抗体、ＨＩＶ  ＮＡＴ、ＨＴＬＶ−１／２抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ  ＮＡＴ、ＣＭＶ抗体、ＲＰＲ、西ナイルウイルスＮＡＴ、およびＣｈａｇａｓ試験；ＡＢＯおよびＲｈタイピング；ヘモグロビン電気泳動、または鎌状赤血球形成試験（示されている場合）；完全な尿検査。
【０１７５】
治療計画
【０１７６】
ＣＴＬ株
【０１７７】
３種ウイルス特異的ＣＴＬ株は、迅速なプロトコル、例えば、プラスミドでヌクレオフェクションされたＤＣ、成長促進サイトカイン類およびＴ細胞の増殖用に最適化されたＧ−Ｒｅｘの培養装置を使用して作製され得る。
【０１７８】
３種ウイルス特異的ＣＴＬ株をイニシエーションするには、単球由来のＤＣが、２時間のプラスチック接着、ＩＬ４＋ＧＭ−ＣＳＦでの５日間の培養、およびＰＧＥ１、ＴＮＦａを使用する１日の成熟化を使用して作製される。成熟化の２４時間後、ＤＣは、例えば、ＧＭＰ互換性Ｌｏｎｚａ／ＡＭＡＸＡシステムを使用して、ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルスの防御性および免疫原性ウイルス抗原を発現するＤＮＡプラスミドでヌクレオフェクションされる。ＩＲＥＳ配列によってそれぞれがリンクされている、１）ＣＭＶ−ｐｐ６５とＩＥ１および２）Ａｄｖヘキソンとペントンをコードする２シストロン性プラスミドが構築される。ＥＢＶの場合は、３つのＥＢＶ抗原であるＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２、およびＢＺＬＦ１をコードする構築物が作製される。次に、ヌクレオフェクションされたＤＣは、非接着性ＰＢＭＣ画分から保持されたウイルス特異的Ｔ細胞を、１：１０の刺激因子／レスポンダーの比率で刺激するために使用される。
【０１７９】
複数ウイルス異的Ｔ細胞のアポトーシスを抑制し、増殖を促進するために、サイトカインＩＬ７とＩＬ４が、刺激当日にそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌと１，０００Ｕ／ｍｌの濃度で添加される。Ｔ細胞の刺激および増殖は、複数ウイルス特異的Ｔ細胞の製造のために検証された最適化ＧＭＰ互換性Ｇ−Ｒｅｘ装置で行われる（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，印刷中）。
【０１８０】
ＣＴＬ培養期間（９〜１２日間）の終わりに、それぞれのウイルスと抗原に対する特異的Ｔ細胞の頻度は、例えば、多量体試薬を用いて測定される。ＣＴＬの機能的抗原特異性を試験するために、ＣＭＶ−ｐｐ６５とＩＥ１、Ａｄｖ−ヘキソンとペントン、およびＥＢＶ−ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２とＢＺＬＦ１をスパニングするＩＦＮｇのＥＬＩｓｐｏｔアッセイの刺激因子として、オーバーラップするペプチドライブラリー（ｐｅｐｍｉｘ）を使用することができる。ＥＢＶ反応性を測定するための刺激因子としての自己および同種ＬＣＬを使用することもできる。細胞毒性アッセイは、残留アロ反応性の尺度としてレシピエントのＰＨＡ芽球を使用して実施され、ＬＣＬを単独で使用して、または３つの刺激プラスミドでヌクレオフェクションして抗原特異的Ｔ細胞殺害を試験することができ、そしてｐｐ６５、ＩＥ１、ヘキソン、ペントン、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２およびＢＺＬＦ１をスパニングするｐｅｐｍｉｘでパルスされたレシピエントのＰＨＡ芽球を使用して、共有対立遺伝子により提示された抗原の死滅を評価することができる。
【０１８１】
ＣＴＬ株は、同一性、表現型および無菌性をチェックされ、特定の実施形態では、ＳＯＰに従って投与前に凍結保存される。患者にＣＴＬを投与するための放出判定基準は、生存率＞７０％、少なくとも７日間の細菌とカビについての陰性の培養、エンドトキシン試験≦５ＥＵ／ｍｌ、マイコプラズマに対する陰性結果、＜２％のＣＤ８３陽性細胞、Ｃｒ５１放出アッセイにおける２０：１の比率でのレシピエントのＰＨＡ芽球の＜１０％の死滅、およびＨＬＡの同一性である。
【０１８２】
投与およびモニタリング
【０１８３】
複数ウイルス特異的Ｔ細胞を解凍し、例えば、静脈注射で投与する。患者は、ベナドリル０．２５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（最大２５ｍｇ）静注とタイレノール５〜１０ｍｇ／ｋｇ（最大６５０ｍｇ）経口を前投薬されてもよい。患者は、血液製剤の投与のための機関の基準に従ってモニタリングされることが可能であり、最低限、以下に従ってモニタリングされる：患者は、例えば、少なくとも３０分間連続的なパルスオキシメトリーのために残される場合がある。バイタルサインは、注入の終了時、それから３０分および６０分の時点でモニタリングされる。患者は、血液成分や抗生物質、および必要に応じて他の介入を含む急性または慢性毒性のための支持療法を受けることができる。患者が、部分寛解（ウイルス負荷の５０％の減少と定義される）を有するか、あるいは注入されたＣＴＬの持続性や機能に影響を与える可能性がある薬物療法（ステロイドなど）を受ける場合、彼らは同じ初回用量で最大さらに２用量を服用するのに適格である。
【０１８４】
ＧＶＨＤの発症の可能性は、注入後６週間モニタリングされる。毎週のＧＶＨＤ臓器の病期スコア、全体的な臨床グレード、ＧＶＨＤに対する生検情報および関連鑑別診断が記録される。毎週のスコアは、最後の評価以降のすべての情報を包含し得る。臓器の関与、生検の情報、病期分類、鑑別診断、およびＧＶＨＤ治療が文書化される。慢性ＧＶＨＤの明確な症状は、強皮症（表在性または筋膜炎）、扁平苔癬、白斑、瘢痕性脱毛症、毛孔性過角化症、皮膚の不動状態による拘縮、爪床形成異常；非感染性潰瘍、角膜びらん／非感染性結膜炎；食道狭窄、脂肪便、膣狭窄、非敗血症性関節炎、筋炎、筋無力症、多発性漿膜炎、関節不動による拘縮、および閉塞性細気管支炎を含む。慢性ＧＶＨＤの可能性のある症状は、湿疹様発疹、乾燥皮膚、斑点状丘疹、色素沈着過度、脱毛；口腔乾燥症、乾性角結膜炎；食欲不振、吸収不良、体重減少、下痢、腹痛；アルカリホスファターゼの上昇、高トランスアミナーゼ血症、胆管炎、高ビリルビン血症；非感染性腟炎、膣萎縮；関節痛；血小板減少症、好酸球増加症、自己免疫性血球減少症、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、および間質性肺炎を含む。ＣＴＬは、１〜２ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるステロイドによる殺傷に感受性である。これは、ＧＶＨＤの標準的な治療法であり、レシピエントがＣＴＬ投与におそらく関連すると考えられる合併症を発症する場合にも、投与され得る。
【０１８５】
主要エンドポイント
【０１８６】
第１相の成分の主要目的は、実現可能性と安全性である。第ＩＩ相の成分の主要エンドポイントは、抗ウイルス有効性である。ＣＴＬの投与の安全性は、ＧＶＨＤについては４２日間であり、他の毒性については３０日間である。安全性エンドポイントは、最後のＣＴＬ投与の４２日以内の急性ＧｖＨＤのグレードＩＩＩ〜ＩＶとして、または最後のＣＴＬ投与の３０日以内のグレード３〜５の注入関連有害事象として、または最後のＣＴＬ投与の３０日以内のグレード４〜５の非血液有害事象として定義され、それらは、ＮＣＩの有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン４．０で定義される既存の感染症や原発巣の悪性腫瘍や既存の併発症によるものではない。考慮すべき毒性は、ＧＩ毒性、腎毒性、出血性毒性、心血管系毒性（低血圧、不整脈および左心室収縮機能障害）、神経毒性（傾眠と発作）、凝固毒性、血管毒性と肺毒性を含む。
【０１８７】
急性ＧＶＨＤの病期分類と悪性度分類
【０１８８】
急性ＧＶＨＤの病期分類は、コンセンサス会議の基準によって実施することが可能である（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【表１】
2013502235.tif 000003
【０１８９】
急性ＧＶＨＤ＊の悪性度分類指数
【表２】
2013502235.tif 000004
【０１９０】
抗ウイルス活性
【０１９１】
ウイルス負荷は、ＣＭＶ、ＥＢＶおよびアデノウイルスについてモニタリングされる。治療中の感染に関しては、ウイルス負荷の応答は、以下のように定義される：
【０１９２】
完全寛解：使用される特定のアッセイおよび臨床徴候と症状によって定義される正常範囲への回帰。
【０１９３】
部分寛解：ベースラインから少なくとも５０％のウイルス負荷の減少または臨床徴候と症状の５０％の改善
【０１９４】
混合寛解：１つの感染に対してベースラインから少なくとも５０％のウイルス負荷の減少および２次感染に対するウイルス負荷の増加または無変化（ベースライン時に２つの感染症を有する患者にのみ適用可能）。
【０１９５】
安定疾患：部分寛解または進行を適格とするには不十分な変化。
【０１９６】
進行：ベースラインから少なくとも５０％のウイルス負荷の増加または病気の他の部位への転移。
抗ウイルス免疫の再構築
【０１９７】
患者は、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイまたは適切なウイルス特異的ペプチド混合物による多量体アッセイを用いてモニタリングされる。
ウイルス感染の臨床症状に及ぼす影響
【０１９８】
患者が臓器障害を有する場合、臨床応答がモニタリングされる。ＥＢＶリンパ腫と測定可能な疾患を有する患者では、応答はＲＥＣＩＳＴ基準によって評価される。
【０１９９】
生存
【０２００】
ＣＴＬ注入の６カ月と１２カ月後の時点での全生存数が計算される。
慢性ＧＶＨＤ
【０２０１】
慢性ＧＶＨＤは、ＣＴＬ注入の３、６および１２カ月後の時点で評価される。
ウイルスの再活性化
【０２０２】
ＣＴＬ注入の３カ月以内に起こるＣＭＶ、ＥＢＶ、またはアデノウイルスのすべての再活性化が収集される。
２次移植片不全
【０２０３】
２次移植片不全は、初期の好中球の生着に続いて、異なる日の３連続測定値について、＜５００／ｍｍ３へのＡＮＣのその後の低下として定義され、再発などの既知の原因の非存在下で少なくとも１４日間継続する成長因子療法に対して不応である。２次移植片不全は、ＣＴＬ注入後３０日で評価される。
【０２０４】
患者の評価
フォローアップスケジュール
【０２０５】
予定された研究訪問のフォローアップスケジュールは、以下に概説される。フォローアップ訪問のタイミングは、ＣＴＬ注入の日付に基づく。患者が複数のＣＴＬ投与をされる場合は、スケジュールは、最初に再びリセットし、フォローアップはその最後のＣＴＬ投与に関係する。
【０２０６】
フォローアップスケジュール
評価時間          目標日数１
（登録後日数）
１週間            ７日
２週間            １４日
３週間            ２１日
４週間            ２８日
５週間            ３５日  週の間（for weekly）
６週間            ４２日
８週間            ５６日
９０週間          ９０日
６月間            １８０日
１２月間          ３６５日
【０２０７】
目標日数範囲１＝登録後、±２日間の最大８週間、および±１４日間の９０日間、１２０日間、および±２８日間の６カ月と１２カ月。
評価
【０２０８】
すべての評価は、“＊”によって以下に識別されない限り、ケア標準とみなされる。
【０２０９】
注入前、評価は病歴と身体検査を含めることができ，それらは、身長と体重、ＥＢＶ、アデノウイルス、ＣＭＶのウイルス負荷；完全な急性ＧＶＨＤの病期分類と悪性度分類の情報（発疹、下痢、悪心／嘔吐、体重、および肝機能検査の評価を含む）；較差のある血小板数を有するＣＢＣ；肝機能検査（ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ）とクレアチニン；タクロリムス／シクロスポリンのレベル（これらの薬剤に関する場合）；出産可能性があり、低強度の移植レジメンを受けたのであれば、＊＊妊娠検査；および／または研究室での試験のための＊＊サンプルを含み得る。注入後、評価は、１、２、３、４、６、および８週の時点で毎週、および３カ月の時点で、ＣＭＶ、ＥＢＶ、アデノウイルスのウイルス負荷；完全な急性ＧＶＨＤの病期分類と悪性度分類の情報（発疹、下痢、悪心／嘔吐、体重、および４２日目まで毎週の肝機能検査の評価を含む）；３、６、１２カ月間の慢性ＧＶＨＤの評価（存在する場合）；１、２、３、４、６、８週間の時点、および３カ月の時点での較差のある血小板数を有するＣＢＣ；１、２、３、４、６、および８週の時点、ならびに３カ月の時点での肝機能検査（ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ）とクレアチニン；２４時間内の注入関連毒性および３０日目までの毎週の毒性評価、ならびに４５日目までの急性ＧＶＨＤ；４２日目、および３、６、９カ月までの毎週のステロイド投与；１、２、３、４、６、８週間、および３カ月の研究室での試験のための＊＊サンプル；および／または３カ月にわたるウイルスの再活性化を含む。
【０２１０】
研究室の試験では、ＥＬＩｓｐｏｔまたは多量体アッセイによって測定されたＣＴＬのレベルに基づいて、ウイルス特異的免疫の評価を含む。安全のための初期のフォローアップの後、毒性については３０日の時点で、ＧＶＨＤについては４２日の時点で完了し、患者は移植後、日常的な臨床ケアに対して従うことを継続する。３、６および１２カ月の時点での臨床と研究室の記録は、研究の遺伝子移入成分に起因するどんな長期的な効果をも評価するために査定される。
【０２１１】
評価は、以下の１つ以上を含むことが可能である：病歴と身体検査；ＣＭＶ、ＥＢＶ、アデノウイルスの負荷；急性ＧＶＨＤ評価；慢性ＧＶＨＤ評価；較差のある、血小板数を有するＣＢＣ；基礎化学（クレアチニン）；肝機能検査（アルカリホスファターゼ、ビリルビン、ＡＳＴ、ＡＬＴ）；毒性評価；ステロイド投与；補助的な実験室での研究のための血液および血清；感染症。
【０２１２】
第１相試験の完了時に、初期第ＩＩ相試験での抗ウイルス活性の臨床エンドポイントを評価するために、最大耐量（ＭＴＤ）のレベルに関して、追加の患者が生じる。安全性データに従い、第１相試験のための最大サンプルサイズは、１８名である。ＭＴＤの用量レベルで処置された６人の被験者を含めて、さらなる１０名の被験者が、初期第ＩＩ相試験に加えられる。第Ｉ／ＩＩ相試験の最大サンプルサイズは２８人の患者である。
【０２１３】
サンプルサイズの決定と設計特性
【０２１４】
用量増量は、ｒＣＴＬのＭＴＤを決定するために修正連続再評価法（ｍＣＲＭ）によって導かれる（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。養子移入ｒＣＴＬがＧＶＨＤを生じるリスクは、非常に低い。許容毒性のターゲット確率は、適格例の２０％より下に設定される。ＭＴＤは、このように、用量制限毒性（ＤＬＴ）の確率がせいぜい２０％である用量として定義される。以前の試験に基づいて、本発明者らは、浅い投与毒性曲線を予想する。４つの用量レベル、すなわち、５×ｌ０６、ｌ×ｌ０７、２×ｌ０７、５×１０７は、それぞれ３％、５％、１０％、２１％と推定される毒性の事前確率で、評価される。この試験では、ｍＣＲＭは、サイズ２のコホートの指数用量毒性モデルに基づいて実施される。許容されない毒性の用量レベルで患者を治療する確率を減らすためには、元のＣＲＭに対する修正を採用することができる（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。具体的には、各コホートで治療を受けた２人の被験者があり、用量増量は、１用量レベル以下に限られており、患者登録は、ＨＳＣＴ後のＣＴＬについての以前の研究で安全であることが示された最低用量レベルで開始される（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２１５】
各用量レベルでの患者の毒性応答に応じて、最大１８人の患者が、この第Ｉ相試験に加えられる。２人の患者は、最初は最低用量のコホートに割り当てられ、ＧｖＨＤと注入関連毒性を含むＤＬＴの評価のため、ＣＴＬ注入後４２日間追跡される。最低用量レベルで１つまたは複数のＤＬＴがある場合は、試験は中止される。それ以外の場合は、２人の患者は、次の用量レベルで登録される。中間用量レベルについては、いずれかまたは両方の患者がＤＬＴを発現するならば、毒性の確率を推定することによって次の用量レベルを導く。用量は、ＭＴＤの現在の推定確率に応じて、同じかまたは減量される。２人以上の患者が、ｍＣＲＭが推奨する用量レベルで募集される。以前の治療用量レベルが選択され、患者のうちの誰もがＤＬＴを発現した場合、試験は中止され；それ以外の場合、２名の患者は、次の用量レベルで登録される。患者のいずれもが、ｍＣＲＭ推奨用量レベルでＤＬＴを発現しない場合は、２人の患者は、次の用量レベルに進む。用量の選択プロセスは、ＭＴＤまたは最高用量レベルに達するまで繰り返される。
【０２１６】
最終的なＭＴＤは、目標とされた２０％の毒性確率に最も近い確率での用量レベルである。任意の用量レベル（その用量レベルで治療されるすべての患者を考慮して）のＤＬＴの推定確率が２０％より大きくなった場合、用量は、減量される。用量増量アルゴリズムにより、各用量レベルで、多くても２つのコホートがある。本発明者らは、いずれの用量レベルでも、任意のＣＴＬ関連ＡＥを見ることを予期しない。したがって、用量増量の完了時に、すべての３つの用量レベルは、特定の実施形態では、安全である。このような場合、少なくとも１２人の患者は、ＭＴＤレベルで加えられた合計６人の患者と共に治療される。１つまたは複数のＤＬＴ事象がある場合は、本発明者らは、この試験に登録される最大で１８人の患者を期待する。
【０２１７】
シミュレーションは、提案された設計の動作特性を決定するために１万の複製で実行され、本発明者らは、これを標準の３＋３用量増量設計と比較した。提案された設計は、ＭＴＤとして適切な用量レベルを宣言する高い確率に基づくＭＴＤの良好な推定値を提供し、低用量レベルで得られる少ない数の患者を供給し、試験に必要な低い平均総患者数を維持した。上記のように、最初の用量レベルは、ＨＳＣＴ後のＣＴＬの以前の研究で使用されたのと同じであり、最高用量は、以前の試験の半分未満である（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。特定の実施形態では、用量の範囲にわたり浅い用量−毒性曲線である。
【０２１８】
最初の注入後４２日以内に発生するＤＬＴは、その後のコホートの推奨用量を決定するためにＣＲＭの計算に反映され、次のコホートは、４２日間のＤＬＴの評価が完了するまで待機する。試験期間中、患者の毒性結果のリアルタイムのモニタリングは、用量−毒性曲線を推定するために行われ、用量レベルは、事前に特定された用量レベルのいずれかを使用して次の患者コホートのために決定される。
【０２１９】
ＭＴＤを決定した後、さらなる患者は、さらにその抗ウイルス活性を評価するために、ＭＴＤレベルで治療される。それはウイルス負荷の治療応答率が６５％より高くなることができるかどうかが試験される。治療応答は、完全寛解、部分寛解および混合寛解として定義される。特定の実施形態では、ｒＣＴＬのＭＴＤは、応答率が３０％より低い場合は有効ではない。ワンアーム型２項サンプルサイズの計算では、追加の１０人の患者は、ＭＴＤレベル（安全配慮のための第Ｉ相試験で治療を受けた６人を含む合計１６人）で治療され得る。１６名のサンプルサイズは、０．０５の第一種過誤のために、３０％の興味の薄い変化率と比較して、仮定された６５％の割合を検出するための正確な８４．１％のパワーを提供する。第Ｉ／ＩＩ試験では、最大２８人の被験者が獲得される。
【０２２０】
Ｂ．複数腫瘍抗原特異的ＣＴＬ
【０２２１】
腫瘍が免疫系を回避することができるいろいろなメカニズムがあり、それは抗原発現の抑制、陰性の免疫調節性サイトカインの分泌などを含む。複数の腫瘍抗原を同時に標的とするパワーは、腫瘍が低レベルのその抗原を発現するならば、単一の抗原に対して指向させたＣＴＬ生成物が有効でないかもしれないが、しかし、複数の抗原が単一のＣＴＬ生成物において同時に標的とされるならば、強い抗腫瘍応答を刺激する可能性が増加するように、腫瘍による抗原発現の抑制を克服し、補償するための戦略を与えることである。
【０２２２】
特定の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍抗原に対するＣＴＬの作製に関する。本発明は、肺、乳房、脳、胃、卵巣、膵臓、腎臓、肝臓、骨、子宮頸部、子宮、精巣、前立腺、頭頸部などの腫瘍を含むどの癌のためにも利用することが可能であるけれども、特定の実施形態では、本発明は、血液や骨髄に関連する癌のために利用される。
【０２２３】
ホジキン病。ホジキン病（ＨＤ）は、リンパ細網細胞由来の悪性新生物であり、大きな単核ホジキンリンパ腫（Ｈ）と巨大な多核Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（ＲＳ）細胞の存在によって特徴付けられ、総称してＨｏｄｇｋｉｎおよびＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞（ＨＲＳ）と呼ばれる（Ａｎａｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｈａｒｒｉｓ，１９９９）。３０代で最も高い発生率でもって、約７，５００の新たな症例が、毎年米国で診断されている。化学療法や放射線療法の組み合わせが有効であり、全生存率は高いが、長期罹患率と治療に起因する死亡率は重大な問題のままである。したがって、成果を向上させ、治療に関連した合併症を減らす新規な治療法を開発することが望ましい（Ｙａｚｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２２４】
再発したホジキン病のエピジェネティック療法。ホジキンリンパ腫（ＨＬ）の病因が遺伝子プロモーターのＤＮＡハイパーメチル化とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の異常なエピジェネティックな変化による遺伝子サイレンシングを含むという証拠が揃いつつある。これらの効果は、腫瘍細胞株における脱メチル化剤とＨＤＡＣ阻害剤によってインビトロで逆転されており、これらの薬剤を用いた臨床研究では、再発ＨＬ患者で客観的な応答をもたらした（Ｂｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。観察された利点は、一部は悪性細胞における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の誘導が原因である可能性があり、応答被験者の我々の研究は、これらの新たに発現した後成的に調節される遺伝子に対する抗原特異的Ｔ細胞の活性の増加を示している。上方制御発現は、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−２、ＮＹＥＳＯ−１、およびサバイビンなどを含むいくつかのＴＡＡについて報告されている（Ｓｈｉｃｈｉｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。本発明の特定の態様では、ＴＡＡ−発現プロファイルが、エピジェネティック療法の前および後で採取された生検では異なり、いくつかの症例では、発現抗原に対するＣＴＬが、療法の前と後で単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からエクスビボで作製することができるかどうかが評価される。
【０２２５】
養子免疫療法−ウイルス関連悪性腫瘍。再発または難治性ＨＬ患者に対する別の治療法の選択肢は、養子Ｔ細胞移入である。＞１００人の幹細胞のレシピエントにおける我々の研究は、ドナー由来のエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）−ＣＴＬ株が、ＥＢＶ誘導リンパ腫の発症に対して、安全に患者を防御し、さらに巨大な確立した疾患を有する患者でさえ治療することができることを示した（Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。また、このアプローチは、免疫応答性の個体で発生するＥＢＶ関連腫瘍の治療のための見込みも示している（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｂｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。最近の第Ｉ相試験では、ＥＢＶＩＬＭＰ２特異的ＣＴＬを注入された再発性ＥＢＶ＋ｖｅ  ＨＬまたはＮＨＬ患者の６例中５例は、腫瘍応答を有し、４例では完全寛解であった。ＥＢＶ−ＣＴＬの早期遺伝子マーキング研究と組み合わされたこれらの研究は、機能的ＥＢＶＩＬＭＰ２特異的Ｔ細胞が、注入（インビボでの増殖を意味する）した後、患者の血液での頻度が増加し、腫瘍組織に帰巣し、腫瘍細胞を排除した（Ｓｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。しかし、我々の研究で参照される患者の＞８０％は、ＥＢＶ陰性の腫瘍を有し、それは、我々がＣＴＬ療法のための代替的な腫瘍標的を検討することを導いてきた。
【０２２６】
養子免疫療法−ウイルス非依存性の悪性腫瘍。免疫応答性宿主におけるウイルス非依存性の１つまたは複数の癌の標的療法のために、インビトロでの増殖ＣＴＬを開発する努力は、（ｉ）腫瘍生検サンプル上でのＴＡＡ発現に関する限られた情報、および（ｉｉ）ＴＡＡ指向ＣＴＬ株を作製するための再現性のある方法の欠如、によって妨げられてきた。
【０２２７】
非ウイルス性腫瘍関連抗原−癌精巣抗原（ＣＴＡ）は、識別される最初の非ウイルス性ＴＡＡの１つであり、最初は、メラノーマに存在することが示された（Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｃａｒｒｅｌ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９３）。その後、他の多くの腫瘍は、ＭＡＧＥ、ＳＳＸ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥおよびサバイビンを含むＴＡＡを発現することが示された（Ｍａｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｃｈａｍｂｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。サバイビンは、胎児の発育中に発現されるが、最後に分化した正常組織では検出されない。しかし、それは種々の腫瘍組織および細胞株で豊富に発現される。重要なのは、ＣＴＡ−特異的Ｔ細胞とサバイビン−特異的Ｔ細胞の両方は、様々な腫瘍患者から分離され、腫瘍ターゲットを認識し、殺すことが示されている（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍａｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＴＡＡの発現は、ＨＬで報告されており、それらの免疫原性とインビトロおよびインビボにおける反応性ＣＴＬの効力が評価される。
【０２２８】
インビトロでのＴＡＡ特異的ＣＴＬの作製−ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）およびウイルス抗原を過剰発現するアデノウイルスベクター形質導入単球／ＤＣを使用して、ポリクローナルウイルス特異的ＣＴＬをインビトロで作製した（Ｂｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｏｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、ＥＢＶとＡｄｖ抗原が、ＴＡＡよりもかなり免疫原性であるため、このアプローチは、ＴＡＡ−ＣＴＬを作製するために使用することはできない。現在までに、ＴＡＡ−ＣＴＬの作製は、抗原供給源としての単一のエピトープペプチドの使用と強化サイトカイン類の存在下でのＣＴＬ株の培養を必要とする（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。後述するように、このプロセスは、ＡＰＣとして全抗原（例えば、ｐｅｐｍｉｘまたはＴＡＡをコードするプラスミド）を発現するＤＣを用いて、患者ＰＢＭＣからのＴＡＡ−ＣＴＬの再現性の作製および最適なサイトカインの組み合わせの存在下での共培養を可能にするために最適化される。
【０２２９】
本発明が癌のために採用される他のケースでは、それは頭頸部腫瘍のために利用されることがある。頭頸部腫瘍の大部分を占める扁平上皮癌（ＳＣＣ）は、５０％以下の５年生存率を継続しており、これは、４０年間変わらない数字である（Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｕｐｐａｌｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。治療の改善の１つの潜在的な手段は、病気の生物学についての我々の理解に基づいており、腫瘍指向免疫療法として細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を使用する。
【０２３０】
このアプローチは、ウイルス関連悪性腫瘍を標的とするのに成功して使用されてきており、免疫能のあるＥＢＶ陽性ホジキン病患者における我々の研究は、再発した抵抗性疾患を有する患者においてでさえ、高い完全な持続的な寛解率をもたらした（Ｂｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに、メラノーマ関連腫瘍抗原を標的とするＴ細胞の抗腫瘍活性は、繰り返し実証されており（Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＳＣＣ腫瘍サンプルにおける腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在は、より良い臨床結果と相関している（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓｂｒａｎｄｗｅｉｎ−Ｇｅｎｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。本発明の特定の症例では、腫瘍に向けたＣＴＬが、頭と首のＳＣＣを治療するために採用されている。いくつかの研究は、潜在的なＴ細胞の標的であるＭＡＧＥ１，３、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−Ｉを含む、中咽頭や口腔に局在するＳＣＣの腫瘍が、いくつかの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現することを確認した。さらに、発現率は、進行した病期の腫瘍（分析された試料のＴ４−１００％）を有する人で一般的に広範囲であったし、その人には、２≧のＴＡＡ遺伝子が、一般的に検出された（Ｋｉｅｎｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍｏｌｌａｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍａｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２３１】
再活性化Ｔ細胞は、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−６とＩＬ−２７のいずれかの存在下で培養され得るが、それは、これらのサイトカイン類が、インビトロでのＴＡＡ特異的ＣＴＬの活性化に有用であることが証明されたためである（図１３）。図１４は、２つ以上の抗原の同時特異性を示すＣＴＬ株を記述する。そのような株は、ＴＡＡに対する特異的活性とＣＤ４とＣＤ８のＴ細胞区画の特異性を示す。腫瘍ＣＴＬのインビボでの効率は、インビボでの持続性に密接に関連付けられ、そして、本発明の特定の態様において、抗腫瘍ＣＴＬは、インビボでの生存と持続性を高めるために遺伝的に改変されることができる。例えば、腫瘍ＣＴＬは、トランスジェニックＩＬ７受容体（図１５）で形質導入することができ、トランスジェニックＩＬ７受容体は、その中で機能的であり（図１６）、これらの腫瘍ＣＴＬは、それらの抗原特異性を維持する（図１７）。
【０２３２】
実施例１
ＰＥＰＭＩＸでのパルスまたはＡＰＣとしてのＴＡＡの発現を用いる健康なドナーからのＴＡＡ特異的ＣＴＬの作製
【０２３３】
健康なドナーからのＴＡ−特異的ＣＴＬの作製。ＴＡＡ ｐｅｐｍｉｘでパルスされた、またはプラスミドでトランスフェクトされたＤＣは、１０：１の比で腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を再活性化するために使用された（図１Ａ）。ＰＢＭＣは、ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ１５（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養された。ＩＬ−７を添加してプラスミドでトランスフェクトされた／ｐｅｐｍｉｘでパルスされたＤＣによる９日目の第２刺激は、培養物中の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を再刺激し、それは、その後１２日目から週２回、ＩＬ−２が供給される。増殖したＴＡＡ−ＣＴＬ株の特異性は、１６〜１７日目にＩＦＮ−γのＥＬＩｓｐｏｔにより評価された。２名の健康なドナーからの結果を図２Ｂに示す；左のパネルは、ＡＰＣとしてＳＳＸ２のｐｅｐｍｉｘでパルスされたＤＣを使用して作製された株のＣＴＬ特異性を示し、一方、右のパネルは、刺激因子としてサバイビンをコードするプラスミドでトランスフェクトして作製されたＤＣ株の特異性を示す。同時に複数の異なるＴＡＡに対する特異性を有するＣＴＬ株の作製を可能にするＣＴＬ作製プロトコルを最適化するために、異なるサイトカインの組み合わせが検討された。ＡＰＣとしてＳＳＸ２、サバイビン、およびＭＡＧＥＡ４をスパニングするｐｅｐｍｉｘのマスターミックスでパルスされ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＩＬ６（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で共培養されたＤＣを用いて、本発明者らは、刺激抗原の３つすべてに対して同時特異性を有するＴＡＡ−ＣＴＬを成功して作製することができた（図１Ｃ）。重要なのは、抗原の同じ供給源を使用して同じドナーから作製され、ＩＬ７、ＩＬ１２およびＩＬ１５の存在下で培養されたＣＴＬは、ＳＳＸ２に対して指向された単一の特異的ＣＴＬを生成したが、このようにＴＡＡ−ＣＴＬ作製のための抗原供給源およびサイトカインの組み合わせの両方を最適化することの重要性を実証した。マルチ特異的ＣＴＬは、細胞毒性アッセイに示すように、インビトロで機能的であった（図２）。
【０２３４】
実施例２
代表的な実験設計と方法
【０２３５】
いくつかの実施形態では、複数のリンパ腫に関連した標的抗原に特異的な腫瘍特異的ＣＴＬの作製が提供される。養子免疫移入のために、再発性／難治性ＨＬの被験者から単独でまたはエピジェネティックな薬物療法との組み合わせにより、ＴＡＡ−ＣＴＬを増殖することができるかどうかを判断できる。
【０２３６】
これらのマルチ特異的ＣＴＬは、本発明の特定の態様では、腫瘍免疫サーベイランスの回避メカニズムが最小化されるので、インビボでより効果的である。
【０２３７】
代表的な方法の実施形態について、２つの抗原の供給源：（ｉ）ＴＡＡをスパニングするｐｅｐｍｉｘ（例えば、１１個のアミノ酸で重複する１５量体）、および（ｉｉ）ＴＡＡをコードするＤＮＡプラスミド、を比較することができ、ＤＣは刺激のためのＡＰＣである。両方の抗原供給源を使用して健康なドナーから作製されたＴＡＡ−ＣＴＬを示す研究が、図１Ｂに示される。マルチＴＡＡ−ＣＴＬを作製するために、最も頻繁に発現する抗原をスパニングする３以上のｐｅｐｍｉｘのマスターミックスを作製することができるか、あるいは、同時に複数のプラスミドでＤＣをトランスフェクトすることができるが（図１Ｃ）、しかし、いくつかのケースでは、各プラスミドを別途にヌクレオフェクトし、その後ヌクレオフェクトされたＤＣをプールすることができる。再活性化Ｔ細胞は、インビトロでのＴＡＡ特異的ＣＴＬの活性化に必須であることが証明されている強化サイトカイン類の存在下で培養される（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。増殖した細胞は、ＴＡＡ  ｐｅｐｍｉｘでパルスされたまたはトランスフェクトされたＤＣのいずれかを用いて９日目に再刺激され、ＩＬ７と共に、そして１２日目からは週２回ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）と共に培養された。特異性は、１６日目にＩＦＮ−γのＥＬＩｓｐｏｔにより評価される。概略図が図１Ａに示される。
【０２３８】
特定の実施形態では、ＴＡＡ−ＣＴＬは、患者のＰＢＭＣ、特にエピジェネティック治療（すなわち、例えば、デシタビンおよびＨＤＡＣ阻害剤を服用する患者）後に採取されたものから容易に作成される。再現性のある方法は、ポリクローナルマルチ特異的ＴＡＡ−ＣＴＬを作製するために提供され、これは、特定の実施形態において、主にＣＤ８＋であり、中枢（ＣＤ６２Ｌ＋）とエフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ−）の集団の両方に由来するＴ細胞を含み、特定の態様では、コグネイト抗原（複数可）によって刺激されるとき、ＩＦＮγ（および他のＴｈ１サイトカイン類）を生成する。
【０２３９】
本発明の特定の実施形態では、最適化されたサイトカインの組み合わせを用いて、図１Ｃに示すように、株内のマルチ特異性を維持することができる。従って、本発明は、複数の腫瘍抗原内の複数のエピトープ特異性を有するポリクローナルＣＴＬを製造するための再現可能な技術を提供する。これらは適正製造規範（ＧＭＰ）の生産に変換可能なプロトコルを採用しているため、これらの方法は、臨床のスケールアップに受け入れられる。
【０２４０】
インビトロおよびインビボでのＴＡ−特異的ＣＴＬ株の特異性と機能は、評価されることができる。本明細書に記載され、作製したＴＡＡ−ＣＴＬの増殖と同様に、特異性と機能を測定することができる。インビトロ−ＣＴＬの増殖は、特定のケースでは、臨床使用（または、例えば、用量増量試験（４×１０７〜２×１０８細胞／ｍ２における）のための十分なＴＡＡ−ＣＴＬを作製することが再現できることを確認するためにトリパンブルー排除法を使用して毎週の計数により評価することができる。細胞傷害性機能は、例えば、ＴＡＡ発現ＡＰＣと標的としての自己腫瘍を用いたＣｒ５１放出アッセイにより評価することが可能である。サイトカイン産生能は、蛍光活性化細胞選別によって評価し得る。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞からの細胞内ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−２は、抗原刺激の後に測定される。インビボの態様では、ＴＡＡ−ＣＴＬが、インビトロで腫瘍標的を認識し、殺すことが一旦確立されたら、例えば、ＴＡＡを発現する異種移植片モデルでの活性を検証することができる。ＴＡＡ−ＣＴＬの抗腫瘍活性が、単剤療法として一旦評価されれば、ＴＡＡ−ＣＴＬをエピジェネティック治療と順番に組み合わせることが、インビボでの効果を増強するかどうかを特徴付けることができる。
【０２４１】
本発明の特定の実施形態では、増殖した細胞は、例えば、フローサイトメトリー、ＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔ、および細胞溶解アッセイによって測定される刺激抗原のすべてに対する特異性と活性を保持し、ＣＴＬは、インビトロとインビボで腫瘍抗原を殺す。
【０２４２】
本発明者らは、一般的に１６日間の培養期間で、ＴＡＡ−ＣＴＬの２０〜４０倍の増殖を一貫して実現している。ただし、増殖に問題がある場合は、ＩＬ１５の代わりにＩＬ２を採用することができ、それは抗原特異性を消失することなく、増殖を増強することが可能である（Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、抗アポトーシス／生存経路（例えば、ｂｃｌ−２）を活性化することが可能であり、その結果、ＣＴＬの殺害に抵抗する。これが起こるとすれば、部分的または不完全である可能性があり、これは、単一の抗原特異性を有する株よりも、むしろ複数の抗原に対する特異性を有するＣＴＬを注入することによって克服することができる。さらに、特定の実施形態では、エピジェネティック療法（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）とＣＴＬ療法の併用は、抗腫瘍応答を増強するために使用することができる。代表的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、例えば、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシンおよびジヒドロ−５−アザシチジンを含む。典型的なＨＤＡＣ阻害剤としては、トリコスタチンＡなどのヒドロキサム酸；環状テトラペプチド（トラポキシンＢなど）、およびデプシペプチド；ベンズアミド、求電子性ケトン類；ならびにフェニルブチラートおよびバルプロ酸などの脂肪族酸化合物が挙げられる。
【０２４３】
本発明の特定の実施形態では、例えば、脱メチル化剤とＴＡＡ−ＣＴＬの併用は、バイスタンダー臓器に限定された毒性を有する非常に絞られた腫瘍の死滅を提供する。本発明は、腫瘍関連抗原を発現する癌、例えば、腫瘍関連抗原を発現する血液学的な固形の悪性腫瘍を含む癌の治療のためのエピジェネティック薬物療法を単独または組み合わせて投与することができる。
【０２４４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＳＣＣの生検サンプルにおけるＴＡＡの発現パターンは、例えば、ＩＲＣとＲＴ−ＰＣＲによるＳＣＣの生検サンプルでのＴＡＡの発現を確立するために検討される。代表的な方法により、３つの異なる患者グループから腫瘍を分析することができる；ｉ）上皮内癌またはＴＩの癌患者、ｉｉ）Ｔ２−３、およびｉｉｉ）Ｔ４。これらのグループの分類は、ＴＡＡの発現が局所的な転移のみと相関することを研究は示しているように、腫瘍の鑑別（病期分類）、リンパ節転移、転移、あるいは原発腫瘍の場所（口腔、下咽頭、喉頭など）とは無関係である（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。例えば、２０サンプル／グループを分析することができる。ＴＡＡ抗原の発現は、ＩＨＣとＲＴ−ＰＣＲの両方を使用して、生検試料中で測定される（例えば、限定されることはないが、ＭＡＧＥ−１、２、３、４、ＭＡＧＥＣＩ、ＭＡＧＥＣ２、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびサバイビンを含んで測定される）。特定の実施形態では、以下の２つの基準を使用して独立した組織学者によりＩＨＣスライドの病期の分類が可能である：（ｉ）陽性細胞の数および（ｉｉ）抗原発現の強度。
【０２４５】
転移の程度とは無関係に、患者サンプルの大部分で少なくとも１つのＴＡＡの発現が検出され、Ｔ４のＳＣＣ患者の特定の症例では、これが２つ以上のＴＡＡの検出で１００％に増加する（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。階層構造は、頻度とＴＡＡの発現強度の両方に関して定義される。先行研究は、腫瘍の大部分は、ＭＡＧＥ１または３に対して陽性であることを示している。ＰＲＡＭＥは、約４０％、そしてＮＹ−ＥＳＯ−１は、約１０％で発見されている（Ｋｉｅｎｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍｏｌｌａｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍａｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。本発明の特定の態様において、最も頻繁に発現する抗原物質は、ＣＴＬ作製の刺激因子として利用することができる。
【０２４６】
特定の実施形態では、ＨＮＳＣＣ生検サンプルでのＴＡＡ発現プロファイルが得られ、これらのＴＡＡが反応性Ｔ細胞をインビトロで誘導するかどうかについて述べている。複数のＳＣＣ−ＴＡＡに対する腫瘍特異的ＣＴＬの特異性と機能を生み出し、評価することができる。ＴＡＡ−ＣＴＬが、将来の養子移入のためにＨ＆ＮのＳＣＣの被験者から増殖され得るか否かが決定される。最初に単一の抗原特異性を有するＴＡＡ−ＣＴＬを作製することができ、次いで、複数の頻繁に発現されるＴＡＡに指向された特異性を有するＣＴＬ株を製造することができる。本発明の特定の実施形態では、これらのマルチＴＡＡ特異的ＣＴＬは、インビボでより効果的であるが、これは、抗原欠損変異体によって媒介される腫瘍免疫回避を最小限に抑えるからである。
【０２４７】
代表的な方法では、ＡＰＣおよび応答性Ｔ細胞の供給源である患者血液の４０〜５０ｍｌを得ることができる。血液は、本明細書に記載され、分析されたのと同じ３グループでの新たに診断された患者から採取され得る（Ｔ１、Ｔ２〜３、Ｔ４）。特定のケースでは、同じ患者からの腫瘍や血液のマッチングがある。刺激のために、２つの抗原供給源：（ｉ）ＴＡＡをスパニングするｐｅｐｍｉｘ（例えば、１１個のアミノ酸で重複する１５量体）および（ｉｉ）ＴＡＡをコードするＤＮＡプラスミド、を比較し、利用することもできる。患者のＤＣは、刺激のために調製される。マルチＴＡＡ−ＣＴＬを作製するために、マスターミックスは、最も頻繁に発現する抗原をスパニングする３つ以上のｐｅｐｍｉｘから作製されるか、または同時に複数のプラスミドでＤＣをトランスフェクトすることができる（Ｇｅｒｄｅｍａｎｎら  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。再活性化Ｔ細胞は、特定のケースでは、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−６の存在下で培養されるが、その理由は、これらのサイトカイン類がインビトロでのＴＡＡ特異的ＣＴＬの活性化に不可欠であることが実証されているからである（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２４８】
増殖した細胞は、ＴＡＡ  ｐｅｐｍｉｘでパルスされた、またはヌクレオフェクトされたＤＣのいずれかで９日目に再刺激され得て、ＩＬ７と共に、そして１２日目からは週２回ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）と共に培養される。ＣＴＬの増殖と生存率は、臨床使用のために、または、例えば、用量増量試験（４×１０７〜２×１０８細胞／ｍ２）のために、十分なＴＡＡ−ＣＴＬをルーチン的に作製できることを保証するために、例えば、トリパンブルー排除法により毎週評価される。３つの刺激後、細胞溶解機能が、ＴＡＡ発現ＡＰＣおよびＨＬＡ適合ＳＣＣ細胞株（例えば、標的としてＨＳＣ−２、ＨＳＣ−３、ＨＮＥＣ、ＢＨＹおよびＨＮ２３；２４など）を使用してＣｒ５１放出アッセイによって評価される。サイトカインの作製は、ＦＡＣＳによって評価される。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞からの細胞内ＴＮＦ−α、ＩＮＦγ、およびＩＬ−２は、抗原刺激後に測定することが可能である。
【０２４９】
再現性のある方法は、ポリクローナルマルチＴＡＡ−ＣＴＬを作製するために開発されており、それは、いくつかのケースでは、主にＣＤ８＋であり、中枢（ＣＤ６２Ｌ＋）およびエフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ−）Ｔ細胞の両方を含み、コグネイト抗原（複数可）で刺激される場合、ＩＦＮγ（および例えば、他のＴｈ１サイトカイン類）を作製する。増殖ＣＴＬは、特定の態様において、フロー、ＩＦＮ−γのＥＬＩｓｐｏｔ、および細胞毒性アッセイ（複数可）によって測定される刺激抗原に対する特異性と活性を保持している。
【０２５０】
すべての腫瘍抗原が、同等に免疫原性であるというわけではなく、そして、抗原性の競合と特異性の損失が刺激の複数のラウンドにわたって、より弱い抗原に対してあるならば、株の中でマルチ特性を維持するための最適化されたサイトカインの組み合わせを使用することができる。本発明者らは、１６日間の培養期間中に、ＴＡＡ−ＣＴＬの２０〜４０倍の増殖を一貫して達成するので、インビトロでのＴＡＡ−ＣＴＬの不十分な増殖があるであろうというのは疑わしい。増殖に問題がある場合は、ＩＬ１５は、抗原特異性の喪失なしで増殖を増強する可能性があるので、ＩＬ２の代わりにＩＬ１５で置き替えることができる（Ｔｅａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。腫瘍細胞が抗アポトーシス／生存経路（例えば、ｂｃｌ−２）を活性化し、その結果としてＣＴＬの殺害に抵抗するなら、それは部分的または不完全である可能性があり、これは、例えば、単一の抗原特異性を有する株よりも、むしろ複数の抗原に対する特異性を有するＣＴＬを注入することによって克服されるであろう。
【０２５１】
実施例３
活動性または再発性ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫の患者に対する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の投与
【０２５２】
本実施例は、活動性または再発性ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫の個体に対するＴＡＡ特異的ＣＴＬの投与のための代表的な実施形態を考察するが、しかし、当業者は、これらの実践が任意の他の種類の癌に適用される、および／または適合させることができることを認識している。
【０２５３】
特定の実施形態では、本発明は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の個体における自己または同種ＴＡＡ特異的ＣＴＬの注射（静脈注射など）に関する。
ＥＢＶ＋ｖｅＨＬとＮＨＬに対してＥＢＶ特異的Ｔ細胞を用いる免疫療法
【０２５４】
ＥＢＶは免応答性の患者でのＨＬとＮＨＬに関連付けられ、これらのケースでは、腫瘍細胞は、約９０のＥＢウイルス抗原のうち３つを発現する。免疫免応答性の被験者にＨＬ／ＮＨＬに対して向けられたＣＴＬの抗原の標的化を最適化するために、本発明者らは、患者やそのＨＬＡ適合同種ドナーからのＬＭＰ特異的ＣＴＬを再活性化し、増殖するためにＬＭＰ１およびＬＭＰ２を過剰発現するように、樹状細胞（ＤＣ）とそれから遺伝的に改変されたＥＢＶ−ＬＣＬを順次に使用して、その特異性が３つの（代表的な）発現されたウイルス抗原に向けられたＣＴＬを調製した。ＬＭＰ抗原は、アデノウイルスベクターから発現された。臨床試験の結果は、印象的であったし、リスクの高いＨＤの寛解治療の１７例のうち１６例は、寛解の状態であったが、しかし、活動性の再発疾患を有する１５例のうち１２例は、腫瘍の応答を有した。しかし、試験で参照される患者の＞７０％は、ＥＢＶ陰性リンパ腫を有し、ＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の対象とはならない。
【０２５５】
ＥＢＶ−ｖｅＨＬとＮＨＬに対する養子免疫療法
【０２５６】
非ウイルス性の癌に対する養子免疫療法の課題の１つは、強い免疫原性の標的抗原の識別が残されている。モデル腫瘍抗原は、副次的損傷を制限するために、瘍細胞上で特異的に、および普遍的に発現されるべきであり、いくつかのケースでは、腫瘍の発癌性表現型の維持に不可欠である場合がある。しかし、抗原の大部分は、これらの基準を満たしていないが、その理由は、癌細胞に独自に存在するネオ抗原である必要は必ずしもなく、むしろ、それらが正常な細胞でも発現され、それに対して末梢血Ｔ細胞が寛容化され、除去される抗原であるからである。しかし、本質的に腫瘍特異的である抗原は、後述するように識別されたにもかかわらず、発現された腫瘍抗原のパターンは、高い腫瘍タイプ依存性である。これは、「自己」抗原に対するＴ細胞寛容を確立するメカニズムを克服するために、通常の組織上で発現されないか、または不十分に発現される適切な抗原を特定することの重要性および腫瘍特異的ＣＴＬ生産のための細胞培養条件を最適化することの重要性を強調している。
【０２５７】
腫瘍抗原とＴ細胞の免疫原性
【０２５８】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、それらの発現と組織分布に基づいて４つの主要なグループに分類することができる。
【０２５９】
（Ｉ）ユニークな抗原（例えば、ＭＵＭ１）は、腫瘍であって、患者特異的である単一の突然変異から生じて、したがって、新生物細胞のみで発現される。それらは、しばしば免疫療法のために理想的とみなされるが、その理由は、腫瘍細胞が、近隣の正常組織を破壊することなく、特異的に標的とされることができ、そして、それらが比較的に強い抗原となり得るからである。しかし、それらはまた、通常、患者特異的であるから、変異遺伝子の同定、および同定された抗原を標的とする個別化ＣＴＬ生成物の作製は、非常な手間とコストがかかる。
【０２６０】
（ＩＩ）共有された血統の拘束性抗原は、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００またはＭｅｌａｎ−Ａなどの起源のそれらの正常組織上だけでなくメラノーマ細胞上で発現した。これらの抗原はまた、弱いウイルス抗原とほとんど同じくらいに強い免疫賦活性であり、健康なドナーと患者からの有効で比較的簡単な腫瘍特異的Ｔ細胞の作製と増殖を最小限のインビトロ操作で可能にしている。しかし、通常のメラニン細胞のＴ細胞によって媒介される破壊は、メラノーマ特異的ＣＴＬやＴＩＬで処置された患者における眼のおよび全身的な自己免疫と同様に、白斑をもたらした。
【０２６１】
（ＩＩＩ）共有の腫瘍特異的ＴＡＡ（例えば、癌精巣抗原［ＣＴＡ］−ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ、ＰＲＡＭＥ）は、複数の腫瘍で発現されるが、免疫特権を有し、したがってＴ細胞の攻撃に影響を受けない生殖系列組織を除いて、健康な臓器では発現されない。ＣＴＡは、ＣＴＬの最適な標的であるが、これは、これらが種々の腫瘍に対して広域スペクトルの防御を提供するために大規模に製造することができるからである。ＣＴＡは、ワクチンおよびＴ細胞療法のプロトコルの両方で標的とされ、臨床的に有効であることが証明されている。
【０２６２】
（ＩＶ）後者のグループは、多くの異なる腫瘍で過剰発現される抗原であるが、健常組織では低レベルで発現される抗原である（例えば、ｈＴＥＲＴ、ＣＥＡ、およびサバイビン）。これらの抗原を標的とするＴ細胞は、抗原（例えば、ＣＥＡと正常胆管上皮）を共発現する正常組織へのいくらかの副次的損傷を誘発する危険を伴い、そして、これらの抗原をインビボで標的とする安全性に関して、利用できる限られた臨床データがある。しかし、サバイビン−およびＣＥＡ−特異的Ｔ細胞は、腫瘍をクリアした患者の末梢血から単離されており、腫瘍溶解性ウイルスを受けている患者におけるサバイビン特異的Ｔ細胞の増加は、それらが、毒性を伴わずに患者で効果を有することができることを示唆していると報告されている。
【０２６３】
ＴＡＡを標的とするＴ細胞免疫療法
【０２６４】
非ウイルス性腫瘍抗原に対するＴ細胞免疫療法は、いくつかの研究で有望な臨床結果と共に記載されている。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇと協力者は、高用量インターロイキン２（ＩＬ−２）と一緒のメラノーマ特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の注入は、転移性メラノーマ患者の約３５％で臨床効果をもたらしたことを報告した。注入された細胞の特異性は、分析されなかったが、それらが複数のエピトープ／腫瘍関連抗原を標的にした可能性がある。より有望な結果は、その後、養子移入細胞の増殖と生着を向上させるために、ＣＴＬ注入の前にリンパ球枯渇のステップを組み込んだ修正治療プロトコルを使用して達成された。標準治療に対して難治性の転移性メラノーマ患者９３人は、免疫枯渇化学療法−／＋全身照射、次いで、非常に選択された、ＴＩＬ由来の腫瘍反応性Ｔ細胞と高用量ＩＬ−２（７２万ＩＵ／ｋｇ、耐容まで８時間ごと）の養子移入を受けた。９３人の患者のうち５２人は、大きなかさばる腫瘍の退縮を含む治療に対して客観的な臨床応答（３９人のＰＲ、１２人のＣＲ）を有した。しかし、自己ＴＩＬの採取は、ほとんどの腫瘍に対してすることができない。さらに、多数の腫瘍特異的Ｔ細胞（＞１０１０のＣＴＬ）のインビトロでの増殖は、複雑で高価な手順である。
【０２６５】
同じグループはまた、メラノーマ関連抗原ｇｐ１００＋／−ＩＬ−２の単一のエピトープを標的とするＴ細胞クローンを注入したが、１つの小さな応答と１つのまちまちの応答のみを有する不良な臨床応答を報告し、細胞がインビボで移植または生着することができないことを示した。これらの研究は、最適な臨床結果をもたらすために複数のエピトープ／抗原を標的とすることの重要性を強調している。
【０２６６】
ＥＢＶ−ｖｅＨＬとＮＨＬを治療するための養子免疫療法アプローチの開発
【０２６７】
ＨＬとＮＨＬで発現されたＴＡＡの選択。ＣＴＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥ−Ａ４およびＳＳＸ２は、ホジキンリード・スタンバーグ細胞の最大５５％で発現される。さらに、サバイビンは、ＣＴＬに対する良い標的であり、これは癌患者および健常ドナーからインビトロで増殖することができる（Ｐｉｓａｒｅｖ，２００３）。ＨＬとＮＨＬにおけるこれらの腫瘍抗原の発現およびそれらの明白な免疫原性は、それらをＣＴＬ療法のための有用な標的とする。本発明の特定の実施形態では、すべての患者に対して複数の抗原を標的とする広域スペクトルの抗原特異的Ｔ細胞を作製することができる。
【０２６８】
Ｔ細胞を刺激する手段として、例えば、全配列のＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、サバイビン、ＰｒａｍｅおよびＭＡＧＥＡ４をスパニングする１１個のアミノ酸で重複する１５量体ペプチドを含む臨床的に適用可能なペプチド混合物（ｐｅｐｍｉｘ）を使うことができる。これらのペプチドライブラリーは、それぞれのタンパク質のすべての可能なＨＬＡクラスＩエピトープを包含する。ｐｅｐｍｉｘは、Ｔ細胞刺激のためにプールされ、それにより、すべてのそれらの抗原からの複数のエピトープに対する特異性を有するＴ細胞が、ＨＬＡ表現型に関係なく、すべての患者やドナーから製造することができる。個々のペプチドは、長さが１５アミノ酸であるので、いくつかのケースでは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞が活性化される。
【０２６９】
ＡＰＣとしてＤＣを用いる腫瘍特異的ＣＴＬの作製
【０２７０】
Ｔ細胞刺激のための最適な腫瘍抗原の選択に加えて、本発明者らは、樹状細胞（ＤＣ）が、患者での最も強力な抗原提示細胞であると判断したが、それは、共刺激と適切なエフェクター経路（Ｔｃ１／Ｔｈ１）に沿ってＴ細胞の分化を駆動するサイトカイン類（例えば、ＩＬ−１２）を提供するからである。
【０２７１】
Ｔｈ１分極化／増殖促進性サイトカイン類を用いるＴＡＡ特異的ＣＴＬの作製
【０２７２】
本発明者らは、細胞の抗腫瘍免疫の効果的な誘導は、また、免疫調節性および成長促進性のサイトカイン類にも依存することを示した。全血または腫瘍生検サンプルから単離された腫瘍特異的Ｔ細胞は、不十分な増殖機能を有し、しばしばアネルギー化／寛容化される。この制限を克服し、マルチ抗原特異性を有する腫瘍特異的ＣＴＬ株を再現可能な方法で作製するために、外因性のＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−６（特定の場合）でＣＴＬの培養を補うことができる；ＩＬ−１５は、共通のγ鎖のサイトカインであり、これは、Ｔｒｅｇの増殖を促進することなく、腫瘍特異的ＣＴＬのＴ細胞寛容を克服する；ＩＬ−７は、ナイーブな記憶および活性化腫瘍特異的Ｔ細胞の生存を向上させる；ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γの生産、増殖、および抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害性機能を強化するために相加的／相乗的な様式で作用するＴｈ１／Ｔｃ１の分極化サイトカインである。ＩＬ−６はまた、Ｔｒｅｇの形成を妨げながらナイーブＣＤ４をＴｈ１７Ｔ細胞へスキューすることができるので、ＴＡＡのＣＴＬの作製に有効である。
【０２７３】
最適化された培養装置を用いる腫瘍特異的ＣＴＬの作製
【０２７４】
抗原提示細胞上に発現する抗原による毎週の再刺激を使用して、現在、ＣＴＬは、伝統的な組織培養処理された２４ウェルプレートで漸進的な増殖によって製造されている。このシステムは、労働集約的で、熟練した技術者を必要とし、拡大することは困難である。頻繁な培地の交換、細胞数と栄養素レベルを最適化するための分割、および廃棄物の除去にもかかわらず、Ｔ細胞は、増殖期間の過程でかなりの細胞死を起こし、一方、操作されるプレートの数と共に感染のリスクが増加する。臨床細胞培養システムの他のタイプで広く使用されている密閉されたスケーラブルなバイオリアクターシステムを置き換えるための努力は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の生産について失敗した。得られたＴ細胞生成物は、非機能的または非特異的のどちらかであった。
【０２７５】
特定の実施形態では、培養中にＴ細胞のアポトーシスを劇的に減少させる新たなガス透過性の急速増殖装置（Ｇ−Ｒｅｘ）が、採用されており、インビトロでより効率的な増殖をもたらす。ガス交換（Ｏ２を中へ、ＣＯ２を外へ）は、フラスコの底面でガス透過性シリコン膜全体に起こり、細胞上の培地の深さを大きくすることを可能にし、より多くの栄養素を提供し、廃棄物を希釈しながら、低酸素症を防止する。これらの培養条件は、物理的破壊によって邪魔されずに進行するためにＣＴＬ生産にとって必須の安定な細胞対細胞の相互作用を可能とし、技術者の時間を＞１０倍削減し、細胞の生産を＞３倍増加し、ＣＴＬの表現型や機能に影響を与えることなく、ＣＴＬ製造時間を＞２倍に加速する（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２７６】
正常組織で発現される自己抗原を標的とするＴ細胞の注入が、注入後の炎症反応を誘発する事象では、例えば、肺症状の回復を達成するためにステロイドを投与することができ、それにより、急速に、そして効果的に関連毒性を制御することができる。
【０２７７】
ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫と診断され、そして活動的な疾患を有するか、あるいは再発中であるか、あるいは自己または同系ＳＣＴ後であるか、あるいは同種ＳＣＴ後である；寿命が＞６週間である；Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ／Ｌａｎｓｋｙスコアが＞５０である；入手時（自家製品の場合−患者はＨＩＶ陰性でなければならない）にＨＩＶ陰性である；同種ＳＣＴ後の場合、末梢血または骨髄のいずれかで５０％未満のドナーキメラを有しなければならない；ビリルビン＜３×正常、ＡＳＴ＜５×正常、ヘモグロビン＞８．０を有する；クレアチニン＜２×正常（年令に対して）；試験に参加する前１カ月間は、他の治験治療を休止している；本試験に参加する前少なくとも１週間は、従来の治療を休止している；これらの患者は、本明細書に記載される研究に含めることが可能である。ＨＩＶ陽性であり、ＧＶＨＤ＞グレードＩＩを有する重篤な併発感染症に罹患している患者は除外される。
【０２７８】
代表的なプロトコル
ＣＴＬのための血液調達と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作製
【０２７９】
腫瘍特異的ＣＴＬ株の作製は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からいくつかの異なる成分を作製する必要がある。ＣＴＬ株は、代表的な腫瘍関連抗原ＳＳＸ２、ＭＡＧＥＡ４、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１（他の腫瘍抗原および組み合せが使用可能であるが）をスパニングするｐｅｐｍｉｘのマスターミックスでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の刺激により、患者（またはドナー）からの末梢血Ｔ細胞に由来し得る。最初の刺激は、Ｔｈ１／増殖促進性サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ６の存在下で実施され、特定の実施形態では、細胞は、ＩＬ−２の存在下で増殖される。腫瘍特異的Ｔ細胞を刺激し、増殖するために使用されるＡＰＣは、患者の単核細胞由来の樹状細胞である。
【０２８０】
ＣＴＬの作製については、単核細胞アフェレーシス採取手順（ＡＬＣ＜５００の患者のために）を使用することができるか、または、例えば、２００ｍｌの合計最大容量に対する１００ｍｌ末梢血の最大採血×２を要求することができる、のいずれかである。血液は、患者や同種幹細胞ドナー（被験者は少なくとも１２キロまたは２４ポンドある必要がある）から採取可能である。＜１８才のドナーや患者については、３ｍｌ／ｋｇの最大血液量が、８週間の期間で採取される。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール勾配を用いて全血から分離される。Ｔ細胞と単球由来樹状細胞（ＤＣ）は、新鮮な、あるいは凍結保存されたＰＢＭＣから調製することができる。
【０２８１】
腫瘍特異的ＣＴＬ株をイニシエートするために、サイトカイン類（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４）でのＰＢＭＣ由来の単球の培養、続いて、標準的なＤＣの成熟カクテル（一例として、ＩＬ−１β、ＩＬ６、ＴＮＦαおよびＰＧＥ２）での成熟によりＤＣを作ることができる。これらの成熟樹状細胞は、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥＡ４、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１をスパニングするｐｅｐｍｉｘのマスターミックスで、各ペプチドの最終濃度が５０ｎｇ／ｔｕｂｅとなるように、３０〜６０分間パルスされる。その後、ＤＣは１回洗浄され、Ｔ細胞活性化カクテル（ＩＬ−７、ＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ−６）の存在下、レスポンダー：刺激因子が１０：１の比率でＰＢＭＣ由来のＴ細胞を刺激するために使用される。イニシエーションのために、ＤＣは、血液の約６０ｍＬから調製され、Ｔ細胞は、例えば、血液の２０〜４０ｍＬから派生する。
【０２８２】
腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖するために、ｐｅｐｍｉｘでパルスされたＤＣを第２の、そしてその後の刺激のために使用することができ、細胞はＩＬ−２の存在下に培養される。少なくとも１００×１０６の単核細胞が、ＤＣの第２バッチを作製するために必要である。
【０２８３】
培養期間の終わりには、ＣＴＬは凍結保存することができ、アリコートは、表現型、機能、特異性、同一性、および無菌性について試験された。腫瘍特異的ＣＴＬの頻度は、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、および入手可能であればＨＬＡ−ペプチド４量体を使用して決定される。エフェクター記憶表現型とＴ細胞サブセットは、フローサイトメトリーによって分析される。
【０２８４】
放出基準は、同一性、＞７０％生存率、７日後の細菌やカビの陰性培養、エンドトキシン試験≦５ＥＵ／ｍｌ、マイコプラズマに対する陰性結果、２０：１の比率（同種生成物の場合）での患者のＰＨＡ芽細胞や皮膚線維芽細胞の＜１０％の殺害、＜２％のＣＤ８３陽性／ＣＤ３陰性細胞、およびＨＬＡ同一性を含み得る。
【０２８５】
抗原供給源としてｐｅｐｍｉｘ（例えば、ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造された）を使用することができる。これらのｐｅｐｍｉｘは、関心のある抗原のそれぞれの全配列をスパニングするペプチドライブラリー（１１個のアミノ酸が重複する１５量体）と重複している。各ペプチドは、例えば、少なくとも＞９０％の純度で化学的に合成されている。
【０２８６】
投与とモニタリング
【０２８７】
患者は、病院で評価され、特定のケースでは、ＣＴＬの２用量が、２週間離れて投与される。患者は、ＮＣＩの共通毒性規準スケールで臨床毒性をモニタリングされる。表現型とＣＴＬ頻度を含む免疫学的パラメータもＥＬＩｓｐｏｔにより、そして４量体が利用できるＨＬＡ型に罹患している患者での４量体の研究により分析することができる。機能解析（抗原特異的な細胞毒性とサイトカイン放出）は、それぞれ、クロム放出アッセイおよびＥＬＩｓｐｏｔ／細胞内サイトカイン染色によって実行される。注入前と注入後の血清サイトカイン類のレベルが比較される。例えば、６週間の期間は、臨床上の安全性モニタリングのための時間を構成する。患者が、部分寛解を示し、安定した病気に罹患している場合、彼らはＣＴＬの更なる最大６用量の服薬を受けるのに適しており、それらの各々は、それらの２回目の注射と同じ数から成ることが可能である。
治療計画
【０２８８】
次の代表的な用量を用いることが可能である：５×ｌ０６細胞／ｍ２；１×１０７細胞／ｍ２、２×１０７細胞／ｍ２；および４×１０７細胞／ｍ２。
【０２８９】
４つの代表的な投与スケジュールが評価される。２〜６人の患者が、それぞれの投与スケジュールで評価される。このプロトコルは、第Ｉ相試験として設計される。それぞれの患者には、以下の投与スケジュールに従って、１４日間、間隔をあけて２回注射される。
【０２９０】
投与レベル１：
０日目          ５ｘ１０６細胞／ｍ２
１４日目        ５ｘ１０６細胞／ｍ２
投与レベル２：
０日目          １ｘ１０７細胞／ｍ２
１４日目        １ｘ１０７細胞／ｍ２
投与レベル３：
０日目          ２ｘ１０７細胞／ｍ２
１４日目        ２ｘ１０７細胞／ｍ２
投与レベル４：
０日目          ４ｘ１０７細胞／ｍ２
１４日目        ４ｘ１０７細胞／ｍ２
【０２９１】
進行中の疾患を有する患者が、それらの８週間目の時点で、またはそれ以降の評価においてＲＥＣＩＳＴ基準により、安定した疾患または部分寛解を有する場合、彼らは毎月の間隔で、ＣＴＬの最大６回の追加投与を受けることができ、それらの各々は、それらの２回目の注射と同じ細胞数から成ることが可能である。初期の安全性プロファイルが、２回目の注入後６週間で完了するまで、患者は追加投与を受けることはできない。
【０２９２】
患者は、ベナドリル１ｍｇ／ｋｇ静注（最大５０ｍｇ）とタイレノール１０ｍｇ／ｋｇ経口（最大６５０ｍｇ）を前投薬されてもよい。細胞投与に関しては、腫瘍特異的Ｔ細胞は、末梢静脈ラインあるいは中心静脈ラインのいずれかを介して１〜１０分の間、静脈注射で投与され得る。モニタリングは、注射が医師によって与えられることを除いて、血液製剤の投与のための機関の基準に従って実施することが可能である。患者は、血液成分や抗生物質、および必要に応じて、他の介入を含む急性または慢性毒性のための支持療法を受けることが可能である。
【０２９３】
患者の評価
【０２９４】
以下の治験は、注入前に、注入後２、４、６週間の時点で、そして、３、６、９、１２カ月の時点で得ることが可能である：ＣＢＣと鑑別、ＢＵＮ、クレアチニン、ビリルビン、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、アルカリホスファターゼ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＣＯ２、アルブミン、および／または総タンパク質。
【０２９５】
画像診断（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、核画像）および／または血液検査（血清サイトカイン類）は、注入前と２回目の注入後６週目の時点での測定可能な疾患と治療に対する応答を記録するために用いることが可能である。画像診断の研究は、この研究で治療中または治療後のいずれかの他の時間で実施される場合、そのデータが収集され、得られた情報が使用される。患者が延長投与を受ける場合、画像化は、最後の注入後１〜３カ月で行われる。
【０２９６】
以下の治験は、注入前に、注入後１、２、４、６週間の時点で、３、６、９、１２カ月の時点で、そして、その後毎年、１年間の時点で得ることが可能である。防腐剤のないヘパリンとＡＣＤ（酸性クエン酸ブドウ糖）抗凝固剤（２０〜４０ｍｌ）中の末梢血。この血液は、ＨＬＡ−ペプチド４量体解析およびＥＬＩｓｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色および細胞毒性アッセイを含む免疫機能アッセイを用いて、末梢血Ｔ細胞の表現型解析とＣＴＬ応答の特異性の解析のために使用され得る。
【０２９７】
患者は、最初の２回の注入後に細胞の追加の注射をされる場合、これらの試験は、各注入前に、各注入の終わりに、各注入後の３〜４日目（患者の選択に応じて任意の日）、および各注入後の１、２週目に行われる。フォローアップは、その後月に３回続けることができ、最後の注入後、１２カ月まで続けることができ、それからは、その後毎年１年間続けることができる。いくつかの症例では、研究特定的血液検査は、（患者が追加の注射を受けた場合）２年後には行われないが、長期的疾患の応答をフォローする患者との接触を保つために継続することができる。
【０２９８】
患者が最初の年の期間中の任意の病期での腫瘍の生検を必要とする症例では、生検サンプルは、腫瘍抗原の発現プロファイルを評価するために使用され得る。患者のヘモグロビンは、評価時間のいずれにおいても８．０ｇ／ｄｌ未満であるならば、評価のための採血量は、必要に応じて、複数の穿刺により減らされて、入手することが可能である。モニタリングパラメータは、例えば、注入腫瘍ＣＴＬ、ＣＢＣ鑑別、電解質と肝機能検査、画像試験、表現型解析、および免疫機能試験を含めることができる。
【０２９９】
試験期間中の評価
【０３００】
フォローアップ間隔については、患者は、最初の８週間は２週間隔で、そして、３、６、９、１２カ月の間隔で、その後は毎年１年間間隔で評価され得る（診療所で診察されるか、あるいは研究コーディネーターにより連絡される）。臨床的に示されるように、あるいは、患者が２回より多くの注入をしているならば、さらなる往診が得られるかもしれない。研究の早期終了と薬剤投与量の修正については、２〜６人の患者が、各グループ内の各用量レベルに入れられた場合、この研究は、完了したと見なすことができる。用量制限毒性が観察されている場合は、個々の患者の治療は、終結することができる。本研究の目的のために、用量制限毒性は、不可逆的であり、生命を脅かす、またはＣＴＬ注入に主に関連すると考えられるグレード３〜４の任意の毒性として定義され得る。
【０３０１】
用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されている場合、個々の患者のための治療は終了することができる。この研究の目的のために、ＤＬＴは、次のように定義される：グレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤまたは毒性の発生。ＮＣＩの共通毒性規準スケールに記載されている基準は、毒性の等級付けに使用され得る。ＧＶＨＤは、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）の方法によって，等級付けが可能である。２番目の注入後の６週間の期間は、臨床毒性を評価することができるコースを構成することが可能であり、ＣＴＬの注入後６週間の期間は、抗腫瘍活性の評価のために必要とされ得る。応答は、この試験の主要エンドポイントではないが、測定可能な疾患の患者は、標準的な基準によって評価される。腫瘍の大きさの評価は、治療開始の２週間以内と、２回目の注射後６週間以内に実行される。最初の注入を受けるすべての患者は、応答性の評価が可能である。患者の長期的全体の、無増悪生存期間も１年間の時点で評価され得る。
【０３０２】
検出可能な腫瘍および／またはリンパ節腫脹の患者では、応答と進行は、固形腫瘍委員会の応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）により提案された国際的な基準を使用して、本研究で評価することができる。腫瘍性病変の唯一の最大直径（一次元測定値）の変化が、ＲＥＣＩＳＴ基準で使用されている。測定可能病変は、少なくとも１つの次元（記録される最も長い直径）で従来の技術＞２０ｍｍ（ＣＴ、ＭＲＩ、Ｘ線）としてあるいはスパイラルＣＴスキャンで＞１０ｍｍとして正確に測定することができるものとして定義される。治験責任医師は、応答のために追従される最大１０の測定可能病変を識別し得る。連続測定は、ＣＴまたはＭＲＩで行うべきである。同様の評価方法は、ベースライン時およびフォローアップ時にそれぞれ識別されて報告された病変を特徴づけるために使用されるべきである。
【０３０３】
完全寛解（ＣＲ）は、すべての標的病変の消失として定義される。部分寛解（ＰＲ）は、ベースライン合計ＬＤを参照として取り、標的病変の最長径（ＬＤ）の合計で少なくとも３０％の減少として定義される。進行性疾患（ＰＤ）は、治療開始以降に記録された最小の合計ＬＤまたは１つまたは複数の新しい病変の出現を参照として取り、標的病変のＬＤの合計の少なくとも２０％の増加として定義される。安定した病気は、治療が開始されてから最小の合計ＬＤを参照として取り、ＰＲの資格には充分でない退縮として、またはＰＤの資格には充分でない増加として定義される。本発明の特定の実施形態では、個体は、ＣＲまたはＰＲまたは安定した疾患を有する場合がある。
【０３０４】
本発明およびその利点を詳述しているが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明から逸脱することなく、種々の変化、置換、および変更をここに行うことができると理解すべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書中に記載のプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、および工程の特定の実施形態に制限されることを意図しない。当業者は、本開示から、本明細書中に記載の対応する実施形態と実質的に同一の機能を発揮するか、実質的に同一の結果を達成する、既存またはその後に開発されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程を使用することができると容易に認識するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、かかるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程がその範囲内に含まれることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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