(57)【要約】  培養中の細胞、特に、治療に使用される細胞を担持することのできる合成表面を製造するための組成物が開示されている。この合成表面は、一方が細胞接着性ペプチドを有し、他方が架橋剤部分を有する、プレポリマーから形成される。それらの表面を製造する方法、並びにその表面上で細胞を培養する方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子細胞培養表面を形成するための組成物であって、第１の高分子主鎖に結合した細胞接着性ペプチドを含む第１のプレポリマー、および第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーを有してなり、
前記第１のプレポリマーの細胞接着性ペプチドが式Ｒm−Ｓp−Ｃapを有し、
式中、
Ｒは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドおよびフマレート並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される重合部分であり、ｍは１より大きい整数であり、
Ｓpは、Ｒ’がＨまたはＣＨ3であり、ｍ２が０から２０までの整数である式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2により表されるポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド；またはＸａａが独立して任意のアミノ酸であり、ｎが０から２０までであるＸａａn；もしくはそれらの任意の組合せを含む随意的なスペーサ部分であり、
Ｃapは、細胞接着性配列を有するペプチドであり、
前記第２のプレポリマーの前記第２の高分子主鎖が、エチレン性不飽和モノマーの重合生成物を含む、組成物。
【請求項２】
前記第１のプレポリマーの前記第１の高分子主鎖が、カルボキシル基を有するエチレン性不飽和モノマーと、カルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーとの重合生成物を含み、前記細胞接着性ペプチドが前記カルボキシル基を通じて前記第１のプレポリマーに結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記第１のプレポリマーのエチレン性不飽和モノマーが親水性である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記第２のプレポリマーのエチレン性不飽和モノマーが親水性である、請求項１から３いずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記第２のプレポリマーが、ポリＨＥＭＡに結合したベンゾフェノン架橋剤部分を含む、請求項１から４いずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、合成細胞培養物品を製造する方法に関する。より詳しくは、本開示は、官能化された細胞結合ペプチドプレポリマーを架橋剤官能化プレポリマーと架橋させて、細胞培養表面に適した架橋ポリマーブレンドを形成することによって、細胞培養物品を製造する方法に関する。その上、本開示は、既知組成培地中の細胞培養物を担持するための合成表面および物品に関する。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含む。配列表に含まれる情報をここに引用する。
【背景技術】
【０００３】
疾患の治療のためにヒトに導入できる細胞である治療用細胞が開発されている。治療用細胞の例としては、３種類の胚葉のいずれかに分化して、人体の任意の成体細胞タイプを生じる能力を有するヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの多能性幹細胞が挙げられる。幹細胞のこの性質は、糖尿病、脊髄損傷、心臓病などの数多くの深刻な細胞変性疾患の新たな治療法を開発するための可能性を提供する。しかしながら、そのようなｈＥＳＣに基づく治療の開発には、依然として障害がある。治療用細胞の培養物を開発し、管理する上で、細胞と組織の培養において適切な数の治療用細胞を得て維持すること、並びにこれらの細胞が、細胞培養中に望ましくない様式で変化しないことを確実にすることが重要である。例えば、ｈＥＳＣ細胞培養物などの幹細胞培養物は、一般に、細胞銀行または細胞株からの少数の細胞により播種され、次いで、所定の治療用途のために分化が望ましくなるまで、未分化状態で増幅される。このことを達成するために、ｈＥＳＣまたはそれらの未分化細胞は現在、支持細胞層、血清、またはニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されているＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの、動物由来成分を含有する培地または表面の存在下で培養されている。培養環境にこれらの動物由来成分を添加すると、患者に移ったり、ｈＥＳＣの全体的な培養と維持を損なったりし得る潜在的に有害なウイルスまたは他の病原菌に、細胞が曝露される。その上、そのような生物学的製品は、バッチ毎のばらつき、免疫応答および限られた貯蔵寿命を被りやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、既知組成培地または無血清培地において、培養中の治療用細胞を含む細胞を担持できる合成細胞培養表面を製造する方法、およびそのように製造された表面が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
態様（１）において、高分子細胞培養表面を形成するための組成物であって、第１の高分子主鎖に結合された(conjugated to)細胞接着性ペプチドを含む第１のプレポリマー、および第２の高分子主鎖に結合された架橋剤部分を含む第２のプレポリマーを有してなる組成物が提供される。態様（２）において、細胞接着性ペプチドがＲＧＤ配列を含む、態様１の組成物が提供される。態様（３）において、細胞接着性ペプチドが、ビトロネクチン、ラミニン、骨シアロタンパク質、コラーゲン、またはフィブロネクチン中に見つかるアミノ酸の配列である、態様１または２の組成物が提供される。態様（４）において、細胞接着性ペプチドが、ＫＧＧＧＱＫＣＩＶＱＴＴＳＷＳＱＣＳＫＳ（配列番号１）、ＧＧＧＱＫＣＩＶＱＴＴＳＷＳＱＣＳＫＳ（配列番号２）、ＫＹＧＬＡＬＥＲＫＤＨＳＧ（配列番号３）、ＹＧＬＡＬＥＲＫＤＨＳＧ（配列番号４）、ＫＧＧＳＩＮＮＮＲＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧＮＭＧＳ（配列番号５）、ＧＳＩＮＮＮＲＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧＮＭＧＳ（配列番号６）、ＫＧＧＴＷＹＫＩＡＦＱＲＮＲＫ（配列番号７）、ＧＧＴＷＹＫＩＡＦＱＲＮＲＫ（配列番号８）、ＫＧＧＴＳＩＫＩＲＧＴＹＳＥＲ（配列番号９）、ＧＧＴＳＩＫＩＲＧＴＹＳＥＲ（配列番号１０）、ＫＹＧＴＤＩＲＶＴＬＮＲＬＮＴＦ（配列番号１１）、ＹＧＴＤＩＲＶＴＬＮＲＬＮＴＦ（配列番号１２）、ＫＹＧＳＥＴＴＶＫＹＩＦＲＬＨＥ（配列番号１３）、ＹＧＳＥＴＴＶＫＹＩＦＲＬＨＥ（配列番号１４）、ＫＹＧＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ（配列番号１５）、ＹＧＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ（配列番号１６）、ＫＹＧＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号１７）、ＹＧＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号１８）、ＣＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号１９）、ＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号２０）、ＣＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＲＡＹ（配列番号２１）、ＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＲＡＹ（配列番号２２）、ＫＹＧＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２３）、ＹＧＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２４）、ＫＧＧＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号２５）、ＧＧＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号２６）、ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号２７）、ＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号２８）、ＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号２９）、ＫＧＧＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ（配列番号３０）、ＧＧＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ（配列番号３１）、ＹａａlＰＱＶＴＲＧＮＶＦＴＭＰ（配列番号３２）、ＲＧＤＹＫ（配列番号３３）、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸の配列である、態様１〜４いずれか１つの組成物が提供される。態様（５）において、第１のプレポリマーが、式Ｒm−Ｓp−Ｃapの官能化細胞接着性ペプチドの重合生成物を含み、式中、Ｒが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドおよびフマレート、並びにそれらの組合せからなる群より選択される重合部分であり、ｍが１より大きい整数であり；Ｓpが、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2を有するポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２が０から２０までの整数である）、またはＸａａn（式中、Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であ���、ｎは０から３までの整数である）、もしくはそれらの組合せを含む随意的なスペーサ部分であり；Ｃapは、細胞接着性配列を含むペプチドである、態様１〜４いずれか１つの組成物が提供される。態様（６）において、第１のプレポリマーが、カルボキシル基を有するエチレン性不飽和モノマーと、カルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーとの重合生成物を含み、細胞接着性ペプチドがこのカルボキシル基を通じて第１のプレポリマーに結合されている、態様１〜５いずれか１つの組成物が提供される。態様（７）において、第１のプレポリマーのエチレン性不飽和モノマーが親水性である、態様６の組成物が提供される。態様（８）において、カルボキシル基を有さない第１のプレポリマーエチレン性不飽和モノマーが親水性である、態様６または７の組成物が提供される。態様（９）において、第２のプレポリマーが、エチレン性不飽和モノマーの重合生成物を含む、態様１〜８いずれか１つの組成物が提供される。態様（１０）において、第２のプレポリマーのエチレン性不飽和モノマーが親水性である、態様９の組成物が提供される。態様（１１）において、第２のプレポリマーが、ポリ−ＨＥＭＡに結合したベンゾフェノン架橋剤部分を含む、態様１０の組成物が提供される。態様（１２）において、第２のプレポリマーが、エチレン性不飽和モノマーの重合生成物である、態様５の組成物が提供される。態様（１３）において、第２のプレポリマーが、エチレン性不飽和モノマーの重合生成物を含む、態様６の組成物が提供される。態様（１４）において、第１のプレポリマーを構成するカルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーおよび第２のプレポリマーを構成するエチレン性不飽和モノマーが同じである、態様１０〜１３いずれか１つの組成物が提供される。態様（１５）において、架橋剤部分が、ベンゾフェノンなどの感光性試薬を含む、態様１〜１４いずれか１つの組成物が提供される。
【０００６】
追加の態様（１６）において、細胞培養物品を製造する方法において、態様１〜１５いずれか１つの第１と第２のプレポリマーを基板に提供する工程、および基板上の第１と第２のプレポリマーを、第１と第２のプレポリマーを互いと基板に架橋させるためのエネルギー源に曝露する工程を有してなる方法が提供される。態様（１７）において、態様１６の方法により製造された細胞培養物品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】細胞接着性ペプチドを含有する第１のプレポリマーの実施の形態である、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）を製造する方法を示す説明図
【図２】最初にＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡを提供し、次いで、ペプチドを結合させて、ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡ−ペプチドを形成することによって、第１のプレポリマーの代わりの実施の形態を形成する反応を示す説明図
【図３】Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡプレポリマーである第２のプレポリマーの実施の形態を製造する方法を示す説明図
【図４】細胞培養表面の実施の形態を製造するためのプレポリマーのＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡおよびポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）の組合せを示す説明図
【図５】細胞培養表面の実施の形態を形成するためのプレポリマーのＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡおよびポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）の架橋を示す別の説明図
【図６】Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡおよびポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡ−ＶＮ）を組み合わせた、架橋済みプレポリマー細胞培養表面の別の実施の形態の説明図
【図７】二成分混合物におけるコポリマーを形成する第２のプレポリマー（光反応性プレポリマー）のパーセントの関数としての固定化された細胞培養コーティングの量を示すグラフ
【図８】コーティングに使用される溶液中のペプチド含有プレポリマーである第１のプレポリマーの濃度（ｍｇ／ｍｌ）の関数としての固定化されたヒドロゲルの量を示すグラフ
【図９】二成分混合物における、ペプチド結合プレポリマーである第２のプレポリマーの質量パーセントの関数としての固定化されたペプチドの量（ピコモル／ｍｍ2）を示すグラフ
【図１０】実施の形態による光ヒドロゲル被覆フラスコおよび未被覆の対照フラスコのコロイド金染色を示す写真
【図１１】本発明の細胞培養表面の実施の形態（Ａ）上および細胞接着性ペプチドを含まない対照表面（Ｂ）上のＨＴ１０８０細胞を示す顕微鏡写真
【図１２】コーニング社からのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図１２Ａ）上、ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ（図１２Ｂ）上、およびＨＥＭ−ＣＥＡ（細胞接着性ペプチドを含まない）（図１２Ｃ）上のＮｕｌｌｉ−ＳＣＣ１細胞を示す顕微鏡写真。図１２Ｄは、図１２Ａ〜Ｃに示された３種類の表面上の細胞増殖のＯＤ測定値を示すグラフである。
【図１３】コーニング社からの「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」（図１３Ａ）上、ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ（図１３Ｂ）上、およびＨＥＭ−ＣＥＡ（細胞接着性ペプチドを含まない）（図１３Ｃ）上のＥＳ−Ｄ３細胞を示す顕微鏡写真。図１３Ｄは、図１３Ａ〜Ｃに示された３種類の表面上の細胞増殖のＯＤ測定値を示すグラフである。
【図１４】ニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」（図１４Ａ）上、ニューヨーク州、コーニング所在のコーニング社から市販されている「Ｓｙｍｔｈｅｍａｘ」（図１４Ｂ）上、高分子コーティングのポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ−ＰＥＧ4−ＭＡＡ−１０％）の実施の形態（図１４Ｃ）上、およびＰｈｏｔｏＨＥＭＡ＋ペプチドの陰性対照（図１４Ｄ）上の４８時間後のＥＳ−Ｄ３マウス胚性幹細胞接着および形態を示す顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【０００８】
実施の形態において、本開示は、合成高分子細胞培養表面を形成するための組成物であって、第１の高分子主鎖に結合した細胞接着性ペプチドを含む第１のプレポリマー、および第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーを有してなる組成物を提供する。実施の形態において、本開示は、細胞培養表面を製造する方法であって、細胞培養基板または基材の存在下で、第１のプレポリマーに第２のプレポリマーを提供する工程、第１のプレポリマーと第２のプレポリマーの混合物をエネルギー源に曝露して、細胞培養基材に結合した反応性ポリマーブレンドを形成する工程を有してなる方法も提供する。追加の実施の形態において、本開示は、前記プレポリマー組成物から製造された合成細胞培養表面、およびそのように製造された合成細胞培養表面上で細胞を培養する方法を提供する。
【０００９】
以下の詳細な説明において、その一部を形成し、装置、システムおよび方法のいくつかの特別な実施の形態が実例としてその中に示されている添付図面を参照する。他の実施の形態も考えられ、本開示の範囲または精神から逸脱せずに製造されるであろうと理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限の意味で解釈すべきではない。
【００１０】
ここに用いた科学用語と技術用語の全ては、別記しない限り、当該技術分野で一般に使用されている意味を有する。ここに与えられた定義は、この中に頻繁に使用されている特定の用語の理解を容易にするためであり、本開示の範囲を制限することは意図されていない。
【００１１】
本明細書および付随の特許請求の範囲に使用されるように、単数形は、明らかにそうではないと内容が指示しない限り、複数の対象を有する実施の形態を包含する。本明細書および付随の特許請求の範囲に使用されるように、「または」という用語は一般に、明らかにそうではないと内容が指示しない限り、「および／または」を含む意味で使用される。
【００１２】
ここに用いたように、「有する(have)(having)」、「含む(include)(including)」、「含む(comprise)(comprising)」などは、制限のない意味で使用されており、一般に、「含むが、それに制限されない」を意味する。
【００１３】
例えば、合成または組換えタンパク質もしくはペプチドを有する表面を含む合成細胞培養表面が、疾患の治療のためにヒトに導入できる細胞を担持するのに適している。合成ペプチドおよびタンパク質は、ＲＧＤなどの細胞接着性配列を含んでよい。ポリペプチド配列は、ここでは、それらの一文字のアミノ酸コードにより、またそれらの三文字のアミノ酸コードにより、言及される。これらのコードは交換可能に使用してよい。ペプチドは高価なことがあり、数少ないペプチドしか必要ない表面はそれほど高価ではないので、培養されている生存細胞を担持するのに必要なペプチドの量を減少させる合成表面が望ましい。その上、製造が容易であり、貯蔵中に安定であり、滅菌手法中ずっと安定であり、水性細胞培養条件への長期の曝露中ずっと安定である合成表面も望ましい。
【００１４】
本発明の実施の形態において、第１の高分子主鎖に結合した細胞接着性ペプチドを含む第１のプレポリマーが提供される。
【００１５】
実施の形態において、第１のプレポリマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレートなどのエチレン性不飽和モノマーを有する重合部分を担持するように修飾すなわち官能化されたペプチドまたはポリペプチドを有し、第１のプレポリマーを形成するために重合されるモノマーから形成される。本開示の目的に関して、「官能化ペプチド」は、アクリレート基、メタクリレート基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、マレイミド基またはフマレート基などの重合部分を有するように修飾されたペプチドを意味する。実施の形態において、これらの重合部分は、随意的な触媒と共にＵＶまたは可視光などの外部エネルギー源の存在下で、または随意的な触媒と共に熱重合により、高分子を形成できる。実施の形態において、官能化ペプチドまたはポリペプチドはスペーサ部分を含有してもよい。
【００１６】
実施の形態において、官能化ペプチドは、式１：
式１：  Ｒm−Ｓp−Ｃap
により記載される。
【００１７】
実施の形態において、Ｒmは、外部エネルギー源の存在下で重合できる、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレートを含むα，β−不飽和基すなわちエチレン性不飽和基である、重合部分である。「ｍ」は、１以上の整数である。実施の形態において、官能化ペプチドは、光重合部分または熱重合部分であってよい重合部分Ｒmを有する。
【００１８】
実施の形態において、Ｓpはスペーサである。実施の形態において、Ｓpは、例えば、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2により表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２は０から２０までの整数である）を含むポリアルキレンオキシドであってよい。このスペーサは、親水性スペーサ、例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であってよい。実施の形態において、スペーサはＰＥＯ4である。実施の形態において、比較的短い鎖のポリアルキレンオキシドが望ましい。例えば、実施の形態において、Ｓpは、ＰＥＧ2、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12、またはＰＰＧ2、ＰＰＧ4、ＰＰＧ6、ＰＰＧ8、ＰＰＧ10、ＰＰＧ12またはＰＰＧ20であってよい。実施の形態において、スペーサは、２０以下の反復単位（すなわち、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12、ＰＥＧ14、ＰＥＧ16、ＰＥＧ18またはＰＥＧ20）を有するポリエチレンオキシドである。実施の形態において、Ｓpは、官能基を有するＰＰＧまたはＰＥＧである。例えば、そのＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、マレイミド、チオール、アミン、シラン、アルデヒド、エポキシド、イソシアネート、アクリレートまたはカルボキシル基を有してよい。実施の形態において、ＰＥＧスペーサは、アミン官能基を有するＰＥＧである、ＪＥＦＦＡＭＩＮＥ（登録商標）である。追加の実施の形態において、そのＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは分岐していてよい。例えば、分岐ＰＥＧまたはＰＰＯは、Ｙ分岐または星形ＰＥＧまたはＰＰＧであってよい。実施の形態において、これらの分岐ＰＥＧまたはＰＰＯは、多数のペプチドを、１つの官能ペプチドを通じて基材に結合させられるであろう。
【００１９】
細胞培養表面が一度形成されたら、スペーサは、ペプチド（Ｃap）を細胞培養表面から離して延ばし、そのペプチドを培養されている細胞に一層アクセス可能にし、細胞培養のための表面の効率を改善するように働くであろう。その上、親水性スペーサは、タンパク質を寄せ付けず、細胞またはタンパク質の官能化ペプチドへの非特異的吸収を防ぐように働くであろう。実施の形態において、細胞培養物品を調製する際のＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）などのスペーサを有する細胞接着性ペプチドを使用すると、全体的に低い濃度の接着性ペプチドを使用して、そのような物品を調製することが可能になる。
【００２０】
実施の形態において、Ｓpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であり、ｎは、０から３０まで、０から１０まで、０から６まで、または０から３までの整数である。例えば、実施の形態において、Ｓpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＧであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＫであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＤであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＥであり、ｎ＝１から２０である。実施の形態において、スペーサＳpは、ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたはＬｙｓＴｙｒＧｌｙなどの３つのアミノ酸配列であってよい。実施の形態において、Ｘａａnは、一連の同じアミノ酸である。実施の形態において、スペーサＳpは、Ｘａａnとポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドとの組合せであってよい。Ｘａａnは、リシン、グリシン、グルミタン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンアミノ酸などの親水性アミノ酸を含んでよい。実施の形態において、Ｘａａnは末端リシンまたはアルギニンを有してもよい。もしくは、実施の形態において、スペーサＳpは、任意の組合せで、ポリエチレンオキシドスペーサとアミノ酸スペーサとを含んでもよい。実施の形態において、Ｓpは、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸またはヘキサエチレンジアミンなどの疎水性スペーサであってよい。実施の形態において、Ｓpはメタクリル酸カルボキシエチルであってよい。
【００２１】
重合部分は、ポリエチレンオキシドを通じて、リシンなどのアミノ酸の側鎖を通じて、またはアミノ酸のＮ末端で、スペーサＳpに結合してよい。アミノ酸Ｘａａnは、それ自体を分解から保護するために、アセチル化および／またはアミド化されてもよい。しかしながら、Ｘａａnがアセチル化されている場合、重合部分は、アミノ酸のＮ末端を通じてＸａａnに結合され得ない。例えば、メタクリル酸は、ＳpがＸａａnであり、Ｘａａがリシンであり、ｎ＝１、およびＲmがメタクリル酸である場合、リシンアミノ酸の側鎖を通じて、リシンアミノ酸に結合されるであろう。
【００２２】
実施の形態において、スペーサＳpはＸａａnであり、Ｘａａは末端のリシンを有する。実施の形態において、Ｘａａnは重合部分Ｒmに結合されていてよい。例えば、Ｘａａnは、（ＭＡＡ）ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたは（ＭＡＡ）ＬｙｓＴｙｒＧｌｙであってよく、式中、ＭＡＡは、末端のリシンアミノ酸の側鎖を通じてＸａａnに結合した重合部分であるメタクリル酸（ＭＡＡ）である。追加の実施の形態において、重合部分は、Ｎ末端がアセチル化されていなければ、Ｘａａnアミノ酸またはアミノ酸鎖のＮ末端に結合されていてよい。各官能化ペプチドは、少なくとも１つの重合部分を有し、複数有していてもよい。Ｃapは、細胞接着性または細胞結合性配列を有するペプチドまたはポリペプチドである。実施の形態において、細胞接着性または細胞結合性配列はＲＧＤである。
【００２３】
実施の形態において、第１のプレポリマーは、上述したように、官能化ペプチドの重合生成物から形成してもよい。追加の実施の形態において、第１のプレポリマーは、追加のモノマーと、例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーとして、任意の形態で共重合された官能化ペプチドの重合生成物から形成してもよい。実施の形態において、これらの追加のモノマーは、例えば、低級アルキル、すなわち、Ｃ1からＣ20アルキルを含む（メタ）アクリレートモノマー、（メタ）アクリレート、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸ｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチルまたは（メタ）アクリル酸ドデシルを含むエチレン性不飽和モノマーである。さらに、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボルニルおよび（メタ）アクリル酸ジシクロペンテニルなどの環式アルキルモノマー種を使用してもよい。メタクリル酸およびアクリル酸などの官能性モノマー、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピルおよび（メタ）アクリル酸ヒドロキシブチルなどの（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノプロピルおよび（メタ）アクリル酸ジエチルアミノプロピルなどの（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキル。（メタ）アクリレートにより、メタアクリレートまたは類似のアクリレートのいずれを使用してもよいことを意味する。実施の形態において、追加のモノマーは非イオン性であってよい。実施の形態において、追加のモノマーは親水性であってよい。
【００２４】
図１は、官能化細胞接着性ペプチドプレポリマーから、第１のプレポリマーの実施の形態であるポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）を製造する方法を示す説明図である。図１に示されるように、官能化ペプチド１０１は、ＰＥＧ4スペーサおよびメタクリル酸（ＭＡＡ）重合部分を有する。式１：Ｒm−Ｓp−Ｃapに戻ると、図１に示された実施の形態によれば、ＲmはＭＡＡであり、ＳpはＰＥＧ4であり、Ｃapは、ＲＧＤ配列を含有する、ＶＮと付された表１に示された配列のいずれであってもよいビトロネクチン配列のＶＮである。図１に示されるように、ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ官能化ペプチドは、熱開始剤であるエタノールの存在下、またはアルゴンまたはＮ2雰囲気下における６８℃で、エチレン性不飽和モノマー１０２、この場合にはＨＥＭＡと反応させられて、第１のプレポリマー１１０の実施の形態である、ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮを形成する。実施の形態において、官能化ペプチドプレポリマーは、１０，０００ダルトン超のＭｎ（一般に２０，０００〜１００，０００）および３０，０００ダルトン超のＭｗ（一般に、５０，０００から３００，０００）を有する。
【００２５】
追加の実施の形態において、第１のプレポリマーである官能化ペプチドプレポリマーは、そのエチレン性不飽和モノマーの１つがカルボキシル官能基を有するものである、複数のエチレン性不飽和モノマーから形成された主鎖を有するプレポリマーから形成される。実施の形態において、第１のプレポリマーを形成するエチレン性不飽和モノマーが、カルボキシル官能基を有してもよい。カルボキシル官能基は、必要以上の実験をせずに、適切な官能基がある、先に列記したエチレン性不飽和モノマーに組み込まれてもよいことが当業者には理解されよう。カルボキシル官能基を有するモノマーの一例はアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＥＡ）であるが、多くのカルボキシル基含有モノマーを提供してもよい。実施の形態において、カルボキシル基を有さない第１のプレポリマーを形成するエチレン性不飽和モノマーは親水性である。実施の形態において、カルボキシル基を有する第１のプレポリマーを形成するエチレン性不飽和モノマーは親水性である。
【００２６】
図２は、第１のプレポリマーの実施の形態を形成するための反応を示す説明図である。図２において、２種類のエチレン性不飽和モノマーである、ＨＥＭＡ２０２およびＣＥＡ２０１が提供される。これらの２種類のモノマーが反応工程２１０において重合させられて（重合開始剤ＰＩ、２０４を添加することにより）、ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマー２０５が形成される。この重合は、紫外線２０３により、重合開始剤（ＰＩ）２０４の存在下で行われる。次いで、ペプチド２２１がＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマー２０５に結合させられて、反応２２２により、ペプチドが結合したＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマー２２０が形成される。適切な技法の１つに、当該技術分野で一般に公知の、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応が挙げられる。アミン反応性ＮＨＳエステルを生成するために、ＥＤＣおよびＮＨＳまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）をＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマーのカルボキシル基と反応させても差し支えない。本発明の実施の形態において、ペプチドとの結合のためのカルボキシル基を有するモノマーを含むことは重要である。ＥＤＣは、ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマーのカルボキシル基と反応して、加水分解を受けやすいアミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を生成する。ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの添加により、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体をアミン反応性ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに転化することによって、この中間体を安定化させて、二段階手法が可能になる。ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマーの活性化後、次いで、ペプチド２２１を加え、このペプチドの末端アミンを前記アミン反応性エステルと反応させて、安定なアミド結合を形成し、それゆえ、ポリペプチドをＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマーに結合させ、ペプチド結合ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡポリマー２２０を形成することができる。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応により、ＮＨＳとＥＤＣの化学的性質を使用したポリペプチドのゼロレングス架橋が生じる。過剰なＣＯＯＨは、例えば、エタノールアミンでブロッキングしてもよい。
【００２７】
実施の形態において、第１のプレポリマーは、カルボキシル基を有するエチレン性不飽和モノマーとカルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーとの重合生成物を含み、細胞接着性ペプチドが、そのカルボキシル基を通じて第１のプレポリマーに結合されている。実施の形態において、第１のプレポリマーを製造するために使用されるカルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーおよび第２のプレポリマーを製造するために使用されるエチレン性不飽和モノマーは同じモノマーである。
【００２８】
実施の形態において、細胞接着性ペプチドまたは細胞接着性ポリペプチド（これらの用語は相互に交換可能である）（Ｃap）は、例えば、インテグリン結合配列またはＲ−Ｇ−Ｄ配列であってよい、細胞結合または細胞接着性配列を有する。実施の形態において、細胞接着性ペプチドは、ビトロネクチン、ラミニン、骨シアロタンパク質、コラーゲン、またはフィブロネクチン中に見つかるアミノ酸の配列である。本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、化学的に合成されても、または組換え方法により製造されてもよいアミノ酸配列である。しかしながら、本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、完全なタンパク質ではなく、タンパク質の断片である。その上、ペプチドまたはポリペプチドは、動物源から単離されない。実施の形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、ｌが０から３までの整数であり、Ｙａａがどのアミノ酸であっても、または、例えば、重合性基の結合を可能にするために末端アミノ酸がリシンまたはアルギニンでなければならないリシンを含んでよい、ビトロネクチンペプチド配列である、ＹａａlＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含んでよい。実施の形態において、前記ペプチドまたはポリペプチドは環式であってよい。例えば、ＲＧＤＹＫ（配列番号３３）は環式ｃ（ＲＧＤｙＫ）であってよい。
【００２９】
実施の形態に使用してよいペプチドの例が表１に列挙されている。
【表１−１】
2013535200.tif 000002
【表１−２】
2013535200.tif 000003
【００３０】
存在するまたは細胞培養表面からアクセスできるペプチドの量は、プレポリマーの組成、スペーサの長さ、およびポリペプチド自体の性質に応じて様々であり得ることが理解されよう。その上、培養中の異なる細胞は、プレポリマーの組成、並びに表面で利用できるペプチドの個性と量に対して異なって応答するであろう。実施例において以下に論じるように、より高密度のペプチドが、例えば、既知組成培地中の未分化幹細胞などの特定の細胞タイプの付着および増殖をよりよく支持できるであろうが、異なるペプチド濃度で、他の細胞タイプがよりうまく増殖するかもしれない。
【００３１】
実施の形態において、第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を有する第２のプレポリマーが提供される。この結合した架橋剤部分は、光反応性部分または熱反応性部分であってよい。例えば、架橋剤部分は、α，β不飽和ケトン光反応性基であってよい。光反応性基は、光に曝露された際に高反応性種を形成する分子または部分である。光反応性基の例としては、アジド、ジアザレン、ベータカルボニルジアゾ、ベンゾフェノン、アセトフェノンおよびそれらの誘導体が挙げられる。反応性種としては、ニトレン、カルベンおよびラジカルが挙げられる。その反応性種は、一般に、共有結合を形成することができる。例えば、実施の形態において、光反応性部分は、ベンゾフェノン含有部分、置換アリールアジド含有部分またはトリフルオロメチルアリールジアジリン含有部分である。実施の形態において、第２のプレポリマーは、「Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ」と称される。本開示の目的に関して、「Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ」は、結合した架橋剤部分を有するポリＨＥＭＡプレポリマーである。例えば、架橋剤部分は、ベンゾフェノン含有部分であってよい。実施の形態において、第２のプレポリマーは、エチレン性不飽和モノマーの重合生成物を含み、架橋剤部分もさらに含む。
【００３２】
図３は、第２のプレポリマー（Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ）の実施の形態を製造する方法を示す説明図である。図３は、ベンゾフェノンモノマー３０１およびＨＥＭＡモノマー３０２を示している。これらのモノマーは、第２のプレポリマー３１０を形成するために、２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）（ＡＭＢＮ）などの開始剤の存在下で重合３０３させてもよい。このＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡプレポリマーは、第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーの実施の形態である。測定値は、Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミドおよびＨＥＭＡの共重合が９０％超であることを示す（結果は示していない）。Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡは、一般に、１０，０００超のＭｎおよび３０，０００超のＭｗを有する。
【００３３】
どのような適切な開始剤を使用してもよい。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。適切な市販の紫外線活性化および可視光活性化光開始剤の例としては、ニューヨーク州、タリタウン所在のＣｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から市販されている、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ６５１、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  １８４、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ３６９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ８１９、ＤＡＲＯＣＵＲ  ４２６５およびＤＡＲＯＣＵＲ  １１７３、およびＢＡＳＦ社（ノースカロライナ州、シャーロット所在）から市販されているＬＵＣＩＲＩＮ  ＴＰＯおよびＬＵＣＩＲＩＮ  ＴＰＯ−Ｌなどの商標名のものが挙げられる。
【００３４】
追加の開始剤としては、例えば、（ＶＡ−０４４）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩；（ＶＡ０４６Ｂ）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二硫化物脱水物；（ＶＡ−５０）２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩；（ＶＡ−０５７）２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］水和物；（ＶＡ−０６０）２，２’−アゾビス｛２−［１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン−２−イル］プロパン｝二塩酸塩；（ＶＡ−０６１）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］；（ＶＡ−０６７）２，２’−アゾビス（１−イミノ−１−ピロリジノ−２−エチレンプロパン）二塩酸塩；（ＶＡ−０８０）２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオンアミド｝；または（ＶＡ−０８６）２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］を含む、熱重合に使用できる水溶性アゾ開始剤が挙げられるであろう。熱重合に、（Ｖ−７０）２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）；（Ｖ−６５）２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）；（Ｖ−６０１）ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）；（Ｖ−５９）２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）；（Ｖ−４０）１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）；（ＶＦ−０９６）２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド］；（Ｖ−３０）１−［（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ］ホルムアミド；（ＶＡｍ−１１０）２，２’−アゾビス（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）；または（ＶＡｍ−１１１）２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）などの油溶性アゾ開始剤を使用してもよい。これらの開始剤は、例えば、バージニア州、リッチモンド所在のＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手できる。その上、ＰＥＧ主鎖を有するアゾ開始剤などの高分子開始剤を熱重合に使用してもよい。
【００３５】
光増感剤が、適切な開始剤系に含まれてもよい。代表的な光増感剤は、カルボニル基または第三級アミノ基もしくはそれらの混合物を有する。カルボニル基を有する光増感剤としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第三級アミンを有する光増感剤としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチルエタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光増感剤としては、英国、クローリー所在のＢｉｄｄｌｅ  Ｓａｗｙｅｒ  Ｃｏｒｐ社からのＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＩＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＱＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＰＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＥＰＤが挙げられる。
【００３６】
一般に、光増感剤または光開始剤の量は、０．０１から１０質量％まで様々であろう。陽イオン性光開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウム陽イオンの塩、並びにイオンアレーン系などの有機金属塩が挙げられる。
【００３７】
実施の形態において、本開示は、細胞培養表面を製造する方法であって、細胞培養基板または基材の存在下で、第１のプレポリマーに第２のプレポリマーを提供する工程、第１のプレポリマーと第２のプレポリマーの混合物をエネルギー源に曝露して、細胞培養基材に結合した反応性ポリマーブレンドを形成する工程を有してなる方法も提供する。追加の実施の形態において、本開示は、プレポリマー組成物から製造された合成細胞培養表面およびそのような製造された合成細胞培養表面上で細胞を培養する方法を提供する。
【００３８】
実施の形態において、本開示は、細胞培養表面を製造する方法であって、式Ｒm−Ｓp−Ｃapの官能化細胞接着性ペプチド（例えば、図１の１０１）の重合生成物を含む第１のプレポリマー（式中、Ｒは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミド、またはフマレートおよびその組合せからなる群より選択される重合部分であり、ｍは１より大きい整数であり；Ｓpは、例えば、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2を有するポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２は０から２０までの整数である）、またはＸａａ（Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から３までの整数である）、もしくはその組合せであり；Ｃapは、細胞接着性配列を含むペプチドである）を、第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーと混合する工程を含む方法を提供する。
【００３９】
実施の形態において、本開示は、細胞培養表面を製造する方法であって、式Ｒm−Ｓp−Ｃapの官能化細胞接着性ペプチドの重合生成物を含む第１のプレポリマー（式中、Ｒは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミド、またはフマレートおよびその組合せからなる群より選択される重合部分であり、ｍは１より大きい整数であり；Ｓpは、例えば、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2を有するポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２は０から２０までの整数である）、またはＸａａ（Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から３までの整数である）、もしくはその組合せであり；Ｃapは、第１の高分子主鎖に結合した細胞接着性配列を含むペプチドである）を、第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーと混合する工程を含む方法を提供する。
【００４０】
図４は、細胞培養表面の実施の形態を製造するためのプレポリマーのポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）１１０およびＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ３１０の組合せを示す。図５は、第１のプレポリマーのポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）を第２のプレポリマーのＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡと基板４００上で組み合わせることによる、細胞培養表面の形成を示す説明図である。ペプチド部分を有する第１のプレポリマーおよび光反応性架橋剤部分を有する第２のプレポリマーの混合物を紫外線に曝露することによって、これらのプレポリマーが互いに架橋し、または基板に固定され、表面４００上に高分子細胞培養コーティング５００が形成される（図５および６を参照）。
【００４１】
図６は、Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ３１０およびポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡ−ＶＮ）２２０を組み合わせた、架橋済みプレポリマー細胞培養表面の別の実施の形態の説明図である。ペプチド部分を有する第１のプレポリマーおよび光反応性架橋剤部分を有する第２のプレポリマーの混合物を紫外線に曝露することによって、これらのプレポリマーが互いに架橋し、または基板に固定され、表面４００上に高分子細胞培養コーティング５００が形成される。
【００４２】
実施の形態において、本開示は、細胞培養物品を製造する方法であって、第１の高分子主鎖に結合した細胞接着性ペプチドを含む第１のプレポリマー、および第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーを提供する工程、および基板上に第１と第２のプレポリマーを熱源に曝露して、第１と第２のプレポリマーを互いと基板に架橋させる工程を有してなる方法を提供する。
【００４３】
実施の形態において、基板は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上のコーティングを含む、細胞を培養するのに適したどのような材料であってもよい。基材は、平らであっても、成形されていてもよい。そのような基材としては、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸塩ガラス、Ｖｙｃｏｒ（登録商標）ガラスまたは石英ガラスなどのガラス材料；シリコン；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、（酢酸ビニル−無水マレイン酸）共重合体、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環式オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー；（酢酸ビニル−無水マレイン酸）共重合体、（スチレン−無水マレイン酸）共重合体、（エチレン−アクリル酸）共重合体またはこれらの誘導体などのコポリマーが挙げられる。ここに用いるように、「環式オレフィンコポリマー」は、少なくとも１種類のモノマー種が環式オレフィンモノマーであり、少なくとも１種類の他のモノマー種が環式オレフィンモノマー種ではない、複数のモノマー種から形成されたポリマーを意味する。多くの実施の形態において、環式オレフィンコポリマーは、エチレンモノマーおよびノルボルネンモノマーから形成される。環式オレフィンコポリマー樹脂は、ケンタッキー州、フローレンス所在のＢｏｅｄｅｋｅｒ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ社からのＴＯＰＡＳ（登録商標）および日本国の日本ゼオンからのＺｅｏｎｏｒの商標名で市販されている。
【００４４】
第１と第２のプレポリマーは、液体分配、回転塗布、吹付け塗布、または他の方法を含む当該技術分野で公知のどのような手段によって、基板の表面に提供してもよい。硬化または重合は、重合部分の性質に応じて、当該技術分野で公知のどのような手段によって行ってもよく、表面への紫外線、可視光、または熱エネルギーの適用を含んでもよい。架橋または硬化工程後、洗浄工程が望ましいであろう。洗浄は、撹拌の有無にかかわらず、液体分配およびインキュベーションを含む当該技術分野で公知のどのような手段により行ってもよく、その液体は、水、低級アルコール、水で希釈した低級アルコール、または他の溶媒であってよい。実施の形態において、合成細胞培養コーティングは、未反応モノマーまたはプレポリマーなどの不純物を除去するために、一回以上溶媒で洗浄してよい。様々な実施の形態において、層は、エタノールまたはエタノール水溶液、例えば、７０％エタノール、９０％超のエタノール、９５％超のエタノールまたは約９９％超のエタノールで洗浄される。７０％エタノール溶媒による洗浄は、細胞毒であるかもしれない不純物を除去するように働くかもしれないだけでなく、細胞のインキュベーション前にその表面を滅菌するように働くことができる。
【００４５】
基材層を形成するプレポリマーに加え、コーティングを形成する組成物は、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、熱開始剤、触媒および活性化剤などの１種類以上の追加の化合物を含んでもよい。
【００４６】
実施の形態において、細胞培養表面は、細胞培養に適したどのような表面上に形成してもよい。細胞培養に適した物品の例としては、６，１２，９６，３８４および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、瓶、ペトリ皿、フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、区画および多区画培養スライドなどのスライド、試験管、カバースリップ、バッグ、膜、中空繊維、ビーズおよびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）(Corning Incorporated)および発酵槽が挙げられる。
【００４７】
図７は、二成分混合物中でコポリマーを形成する第２のプレポリマー（光反応性プレポリマー）のパーセントの関数としての固定化された細胞培養コーティングの量を示すグラフである。数量化は、クリスタル・バイオレット染色によって行われる。図７は、第１の高分子主鎖に結合した細胞接着性ペプチドを含む第１のプレポリマー、および第２の高分子主鎖に結合した架橋剤部分を含む第２のプレポリマーを含む高分子細胞培養表面を形成するための組成物中に存在する第２のプレポリマーのパーセントの関数としてのポリマーコーティングの固定化の用量依存性を示す。
【００４８】
図８は、コーティングに使用した溶液中のペプチド含有プレポリマーである第１のプレポリマーの濃度（ｍｇ／ｍｌ）の関数としての固定化されたヒドロゲルの量を示すグラフである。数量化は、クリスタル・バイオレット染色によって行われる。
【００４９】
図９は、二成分混合物におけるペプチド結合プレポリマーである第２のプレポリマーの質量パーセントの関数としての固定化されたペプチドの量（ピコモル／ｍｍ2）を示すグラフである。数量化は、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州、ロックフォード所在）から得られるビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより行われる。
【００５０】
図１０は、単離と精製後の光反応性ヒドロゲル形成コポリマーのベンゾフェノン含有量を決定できる校正曲線である。この校正曲線により、様々な濃度でのＮ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド（１ｃｍの光路）の溶液の３３６ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）が得られる。２０ｍｇ／ｍｌの光反応性ヒドロゲル形成コポリマー溶液の測定により、ＯＤ＝０．９０７＠３３６ｎｍが得られ、これは、１．３８ｍｇ／ｍｌのＮ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド、それゆえ、光反応性ヒドロゲル形成コポリマー中の６．９質量％のＮ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド（モノマーの供給値からは７．６質量％と予測された）を与える。この結果は、Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミドとＨＥＭＡとの共重合が９０％超であることを示す。
【００５１】
図１０は、本発明の実施の形態により被覆されたフラスコおよび未被覆の対照フラスコの金コロイド染色（カリフォルニア州、ハーキュリーズ所在のＢｉｏ−Ｒａｄから市販されているＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ試薬）を示す写真である。
【００５２】
（ｉ）治験研究に使用するため、または治療用途を開発するために、既知組成培地中の合成表面上で培養される十分な量の未分化幹細胞を得る、（ｉｉ）培養される細胞の治験研究のため、（ｉｉｉ）治療用途を開発するため、（ｉｖ）治療目的のため、（ｖ）例えば、ｃＤＮＡライブラリを作成することによって、遺伝子発現を研究するため、および（ｖｉ）薬物および毒性スクリーニングを研究するため、を含む任意の適切な目的のために、細胞を使用してよい。
【００５３】
本発明の方法の実施の形態により調製される細胞培養物品は、例えば、ＨＴ１０８０細胞、Ｎｕｌｌｉ−ＳＣＣ１細胞、ＥＳ−Ｄ３細胞、幹細胞、成体幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性細胞（ＩＰＣ）を含む任意の関連細胞タイプの成長および増殖を促進するために親水性表面の界面に効果的に提示され得る。実施の形態において、培養されたこれらの細胞を治療用途に使用してもよい。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、培養において未分化状態で連続的に増殖する能力を有するので、本発明に使用するためのｈＥＳＣは、樹立された細胞株から得てもよい。樹立されたヒト胚性幹細胞の例としては、以下に限られないが、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４（ウィスコンシン大学により樹立されたＷｉＣｅｌｌから入手できる）（Thompson (1998) Science 282:1145）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ジョージア州、アセンズ所在のＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（シンガポール国所在のＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（イスラエル国、ハイファ所在のＴｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで誘導された）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5):1517-29, 2005）；株ＨＵＥＳ１−１７（Cowan et al., NEJM 350(13):1353-56, 2004）；および株ＡＣＴ−１４（Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471):1636-41, 2005）が挙げられる。本発明に使用される胚性幹細胞も、初代胚組織から直接得てもよい。一般に、この作業は、そうでなければ廃棄されるであろう、胚盤胞段階の凍結体外受精卵を使用して行われる。
【００５４】
他の適切な幹細胞としては、霊長類の人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本発明によるＯＰＣは、霊長類の人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化されてもよい。ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を得るために核が初期化されるように、例えば、１つ以上の適切なベクターでのトランスフェクションにより、遺伝子操作された、ヒトなどの幼若または成体哺乳類から得た細胞を称する。これらの核が初期化された細胞により得られる表現型の形質は、胚盤胞から単離された形態類似幹細胞、並びに胚性幹細胞から誘導された表面抗原発現、遺伝子発現およびテロメラーゼ活性類似胚盤胞が挙げられる。ｉＰＳは、概して、一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉の各々から少なくとも１種類の細胞タイプに分化する能力を有し、それゆえ、様々な細胞タイプへの分化に適している。ｈＥＳＣなどのｉＰＳ細胞も、免疫不全マウス、例えば、ＳＣＩＤマウスに注入されたときに、奇形腫を形成する（Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science318:5858）。
【００５５】
本発明の実施の形態は、製造コストの全体的に著しい減少をもたらす、対費用効果的な様式で容易な製造プロセスにおいて、ペプチドなどの細胞に結合する接着性リガンドで表面を装飾するための効率的な技法を提供する。実施の形態において、それらの表面は、既知組成培地を使用して多能性（複数の潜在的な成果を有する）状態でヒト胚性幹細胞を含む細胞を培養するための有用な表面である。血清の使用は、治療用途を意図する培養細胞にとって有害であるかもしれない未確定の要因を細胞培養に導入するので、本発明の実施の形態における合成表面と組み合わされた既知組成培地の使用が重要である。
【００５６】
ここに開示されたプレポリマーを使用して調製される細胞培養コーティングには、以前に記載された方法より優れた利点がある。特に、この方法は、モノマーのその場重合と比べて、製造工程が削減され、よって、本発明のプロセスが、以前に開示されたプロセスよりも、制御可能であり、著しく安上がりであると予測される。実施の形態において、ここに開示された被覆プロセスにより、高いスループットで被覆物品を調製することができる。その上、関心のある様々な非処理基板上の細胞培養コーティングの非常に効率的な架橋と固定を行うことができる。それゆえ、この細胞培養コーティングの固定化は頑丈であり、細胞培養中に、コーティングの剥離や溶解は生じない。固定された細胞培養コーティングは、エタノール洗浄に耐え、よって、被覆物品は、エタノール水混合物により消毒することができる。ペプチド密度、架橋密度などのコーティングの性質は、組成物の２種類のプレポリマー成分の間の比率および固体含有量を単に変えることによって、微細に調整することができる。そのような微調整により、同じ原材料から、ペプチド密度、ゲルの厚さ、調整された架橋および剛性などの様々な性質を示す幅広いコーティングを調製することが可能になる。そのプロセスに関して、ポリマーを架橋させ、基板に結合させるために使用される方法は、空気中で行われ、それゆえ、不活性ガスのパージを必要としない（費用の節約）。光硬化条件は、水銀無電極ランプを使用した標準的なＵＶ  Ｆｕｓｉｏｎコンベヤシステムに適合する。本出願人は、意外なことに、本発明の組成物が、被覆すべき物品の壁、上面または下面を構成するポリスチレン材料を通しての紫外線曝露によって、都合よく架橋され、基板に取り付けられることも発見した。その場合、ポリスチレン材料は、非常に効率的な紫外線フィルタの役割を果たし、接着性ペプチドに有害な影響がある短い紫外線波長を遮断する。このことが、さらに組み立てなければならず、プロセスの複雑さを増す、蓋無しフラスコまたは分解された容器を使用する必要なく、組み立てられたフラスコまたは閉じた容器内での曝露を可能にする単純プロセスをもたらす。その上、ペプチドの分解を防ぐために、貯蔵が適切に行われ、光から保護され、温度が適切であり、防腐剤が加えられるという条件で、本発明の組成物により、組成物の有効期限が無制限となる。最後に、本発明の実施の形態により調製されたコーティングは、幹細胞の付着と増殖を支持し、少なくとも１０から１５ピコモル／ｍｍ2の接着性ペプチド密度を有する被覆プラスチック製品を対費用効果的に調製することが可能になる。
【００５７】
以下において、先に議論した物品および方法の様々な実施の形態を記載した非限定的実施例を提示する。
【実施例】
【００５８】
Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミドの調製
工程ａ：塩化４−ベンゾイルベンゾイルの合成  合成は、塩化ベンゾイル1の公知の合成にしたがった。４−ベンゾイル安息香酸（５ｇ）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れた。塩化チオニル（１５ｍｌ）を加えた。この懸濁液を加熱して、１時間に亘り還流し、この最中に全ての固体が溶解した。回転蒸発により、全ての揮発性化合物を除去した。残留物をトルエン中に溶解させ、再び蒸発させた。塩化チオニルを全て除去するために、この操作を二回行った。粗製化合物は、石油エーテルからの再結晶化によりさらに精製できる（溶解度が１００ｍｌ当たり約１ｇであることに留意）。この生成物は白色粉末である、Ｍｐ．９５℃（Ｌｉｔ；：９８〜９９℃）。１Ｈ−ＮＭＲは公開データと合致する。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.20 (d, J = 7.5, 2H), 7.86 (d, J = 7.4, 2H), 7.78 (d, J = 7.4, 2H), 7.61 (d, J = 6.7, 1H), 7.49 (t, J = 7.4, 2H) ppm13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 195.31, 167.85, 143.27, 136.36, 135.75, 133.34, 131.15, 130.09, 130.01, 128.59 ppm。＝Ｏ信号が１７０．４２ｐｐｍである炭素スペクトルに、加水分解が容易に見られることに留意。
【００５９】
工程ｂ：Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミドの合成：  ７３０ｍｇ（４．１ミリモル）のＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩を５０ｍｌの丸底フラスコ内の２５ｍｌのジクロロメタン中に溶解させた。１ｇ（４．１ミリモル）の塩化４−ベンゾイルベンゾイルおよびフェノチアジン（１ｍｇ：重合開始剤として）を固体で加えた。トリエチルアミン（１．３ｍｌ、１０ミリモル）を加えながら、懸濁液を氷浴で冷却した。氷浴を取り外し、３時間に亘り撹拌した。有機相を０．１ＮのＨＣｌで二回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させた。残りの粗生成物を、溶媒として酢酸エチルを使用したフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．５）により精製した。収量は、５１０ｍｇ（３６％）の純粋な化合物であった。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01 (d, J = 7.5, 2H), 7.86 (d, J = 7.4, 2H), 7.80 (d, J = 7.2, 2H), 7.62 (s, 1H), 7.51 (d, J = 7.5, 2H), 5.81 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 3.49 ( 4H), 2.01 (s, 3H), 1.79 (s, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 196.05, 169.53, 166.74, 139.93, 139.52, 137.63, 137.07, 132.79, 130.13, 130.06, 128.39, 127.00, 120.29, 35.98, 29.76, 18.68。
【００６０】
ポリＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡプレポリマーの調製：
図２に示したように、撹拌子を備えた琥珀色のフラスコ内の９０ｇのエタノールに、８．０ｇ（０．０６１ミリモル）のＨＥＭＡおよび２．０ｇ（１３．９ミリモル）のアクリル酸カルボキシエチル（ＣＥＡ）を加えた。次いで、０．３０ｇ（１．５６ミリモル）の２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）を加え、溶解が完了するまで、撹拌した。１分間に亘りアルゴンをパージしながら、この溶液から酸素を除去した。次いで、密封したフラスコを、混合しなから６８℃で２４時間に亘り加熱し、光から保護した。室温まで冷却した後、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡ）ポリマーを、酢酸ブチル中での沈殿反応により単離した。得られた白色固体を酢酸ブチルで三回、ジイソプロピルエーテルで三回洗浄した。
【００６１】
ビトロネクチンペプチド結合コポリマー（ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ）の調製：
これも図２に示されるように、手短に言えば、１００ｍｇのポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡ）を１．５ｍｌの無水ＤＭＦ中に４０℃で混合しながら溶解させた。１．６７ｍｌのＥＤＣ／ＮＨＳ（４００／２００ｍＭ）を加え、３０分間に亘り撹拌して、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＣＥＡ）ポリマーのカルボン酸基を活性化させた。これと同時に、２．６ｍｌのホウ酸緩衝液ｐＨ９．２および２．９０ｍｌのエタノール中に、１００ｍｇのビトロネクチンペプチドおよび１５０μｌ×Ｍのローダミン標識ペプチドの溶液を溶解させた。この溶液をＤＭＦ中のＮＨＳ−活性ポリマーに加え、４５分間に亘り撹拌した。次いで、ホウ酸緩衝液ｐＨ９．２および１．４ｍｌのエタノール中の２ｍｌの１Ｍのエタノールアミンからなる溶液を加え、３０分間に亘り撹拌した、未反応ＮＨＳ基をブロッキングした。このポリマーを、公称３５００ＭＷＣＯを有するＣｅｌｌ  Ｓｕｐ  Ｔ１再生セルロース管状膜を使用して、透析法により精製した。この透析法は、４０％のエタノール／水溶液中で行った。７２時間後、溶液をビーカーに移し、０．０６ミリバール（６Ｐａ）の圧力下において−８９℃で一晩、凍結乾燥させた。結合したポリマーは、エタノール／水混合物、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＦＥ中に非常に可溶性であるピンク色のさらさらした粉末である。
【００６２】
ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ペプチドの調製
ペプチド（ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ配列番号２７）は、以下のプロセスによって、合成され、カリフォルニア州、サニーベール所在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社により提供された。（ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）：ＭＡＡ−ＰＥＯ4−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＮＨ2の調製：このペプチドは、Ｆｍｏｃ化学反応により１ミリモルのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ樹脂上で合成した。アミノ酸に使用した保護基は：ＡｓｐとＴｈｒについてはｔ−ブチル基、ＧｌｎについてはＴｈｒ基、ＡｒｇについてはＰｂｆ、ＬｙｓについてはＢｏｃである。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸はＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した；Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ4−ＯＨは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入した。カップリングおよび開裂(cleavage)のための試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。溶媒はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ペプチド鎖は、Ｆｍｏｃ保護基のそれぞれの除去および保護されたアミノ酸のカップリングによって、樹脂上に作製した。カップリング剤としてＨＢＴＵおよびＨＯＢｔを使用し、塩基としてＮＭＭを使用した。脱Ｆｍｏｃ試薬としてＤＭＦ中２０％のピペリジンを使用した。Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、ＰＥＧ４のアミノ酸にメタクリル酸（ＭＡＡ）をカップリングさせた。最後のカップリング後、開裂および側鎖の保護基の除去のために、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。粗製ペプチドを冷たいエーテルから沈殿させ、濾過により収集した。収量４．０グラム（合成収率２１０．１％）。粗製ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した；９０％超の純度で収集された分画をプールし、凍結乾燥した。最終生成物の収量１．０３５ｇ（精製収率２５．９％）。
【００６３】
生成物は、９０％以上の純度でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社により提供され、さらに精製せずに使用した。このプロセスにおける非反応性希釈液としてエタノールを使用し、これはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【００６４】
官能化細胞接着性ペプチドプレポリマーの調製
図１に示されるように、撹拌子を備えた琥珀色のフラスコ内の７．５ｍｌのエタノールに、６０ｍｇ（０．４６ミリモル）のＨＥＭＡ、１００ｍｇ（０．０５ミリモル）のビトロネクチン−ＰＥＧ4−メタクリレート（通称、ＶＮ−ＰＥＧ4−ＭＡＡ）を加えた。次いで、９ｍｇの２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）を加え、溶解が完了するまで、撹拌した。１分間に亘りアルゴンをパージしながら、この溶液から酸素を除去した。次いで、密封したフラスコを、混合しなから６８℃で２４時間に亘り加熱し、光から保護した。室温まで冷却した後、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮＰＥＧＭＡＡ）ポリマーを、酢酸ブチル中に粗製反応媒質を注ぐことにより単離した。得られた白色固体をジイソプロピルエーテルで三回洗浄し、真空下で乾燥させた。下記に記載するコーティングは、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ−ＰＥＧ4−ＭＡＡ）ポリマーを精製せずに作製したが、未反応のペプチドは、連続または不連続ダイアフィルトレーションプロセスなどのよく知られたプロセスによって、容易に除去できる。特に効率的な未反応ペプチドの除去は、例えば、５，０００  ＭＷＣＯ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｐｉｎ−Ｘ濃縮カラムを使用して、行うことができる。
【００６５】
光反応性プレポリマー（Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ）の調製
Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡを、図３に示された反応にしたがって調製した。手短に言えば、撹拌子を備えた琥珀色のフラスコ内に秤量した１３２．８ｇのエタノールに、１２．３０ｇ（９４ミリモル）のメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ＨＥＭＡを加え、１．０２３ｇ（２．９ミリモル）のＮ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド（先に記載したプロトコルにしたがって調製した）を加え、この溶液に溶解させた。溶解後、０．４８ｇ（２．５ミリモル）の２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）を加え、溶解が完了するまで、撹拌した。１分間に亘りアルゴンをパージしながら、この溶液から酸素を除去した。次いで、密封したフラスコを、混合しなから６８℃で２４時間に亘り加熱し、光から保護した。室温まで冷却した後、このポリマーを、酢酸ブチル中での沈殿反応により単離した。得られた固体を酢酸ブチルで三回、ジイソプロピルエーテルで三回洗浄した。次いで、このポリマーを、２０μｍの多孔質ポリプロピレンフィルタを使用して濾過し、真空下で一晩、乾燥させた。反応工程の全ては、紫外線に直接曝露せずに行われる。
【００６６】
約６モル％のベンゾフェノン含有量を有する光反応性プレポリマー（Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ）の調製
別の実施例において、図３にしたがって、手短に、撹拌子を備えた琥珀色のフラスコ内に秤量した１３２．８ｇのエタノールに、１２．３０ｇ（９４ミリモル）のメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ＨＥＭＡを加え、２．１１ｇ（６ミリモル）のＮ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド（先に記載したプロトコルにしたがって調製した）を加え、この溶液に溶解させた。溶解後、０．４８ｇ（２．５ミリモル）の２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）を加え、溶解が完了するまで、撹拌した。１分間に亘りアルゴンをパージしながら、この溶液から酸素を除去した。次いで、密封したフラスコを、混合しなから６８℃で２４時間に亘り加熱し、光から保護した。室温まで冷却した後、このポリマーを、酢酸ブチル中での沈殿反応により単離した。得られた固体を酢酸ブチルで三回、ジイソプロピルエーテルで三回洗浄した。次いで、このポリマーを、２０μｍの多孔質ポリプロピレンフィルタを使用して濾過し、真空下で一晩、乾燥させた。反応工程の全ては、紫外線に直接曝露せずに行われる。
【００６７】
６−ウェルプレートの被覆：
架橋剤官能化プレポリマーである成分（ｉ）および官能化細胞結合ペプチドプレポリマーである成分（ｉｉ）を、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中で１から１０ｍｇ／ｍｌまでの固体含有量で、様々な比率でブレンドすることによって、配合物を調製した。未処理のＰＳ  ６Ｗ−Ｐ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄプレートを使用した。ウェル当たり２６から３１μｌをアリコートにした（１／４インチ（約６．４ｍｍ）の孔のテンプレートの蓋を使用して手作業で）。この蓋をカバープレートと直ちに交換した。適所にカバープレートを配置して、配合物を縁まで広がらせた（相対湿度に応じて５から１０分間。空気１ｋｇ当たり８〜１０ｇの水が好ましい）。４０℃で１５分間に亘りカバープレートを濾紙と交換することによって、プレートを乾燥させた（または真空乾燥）。紫外線硬化を、「Ｄ」バルブ、８０％の出力、０．５のベールと速度、１回通過で行い、プレートは、逆さまにして曝露される（プレートの底面が、ペプチドを保護する紫外線フィルタの役割を果たす）。プレートを１時間に亘りＰＢＳで洗浄し、窒素を流しながら乾燥させた。必要に応じて、プレートをエタノールまたは水中７０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄した（消毒を確実にするために）。
【００６８】
ＶＮＰＥＧＭＡＡ（プレポリマー１）およびＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ（プレポリマー２）を使用した６ウェルプレートの被覆：
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から得られるトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中の総固体含有量が１０ｍｇ／ｍｌで、成分（ｉ−ｂ）として、１０質量％のＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡおよび成分（ｉｉ−ｂ）として、９０質量％のポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮＰＥＧＭＡＡ）をブレンドすることによって、コーティング配合物を調製した。各ウェル中に３０μｌのコーティング溶液を分配することによって、ＴＣＴ（細胞培養処理）ＰＳ  ６−ＷＰ  Ｃｏｒｎｉｎｇプレートを被覆した。溶液が完全に広がった後、４０℃で１５分間に亘りコーティングを乾燥させた。次いで、このプレートを逆さまにして、Ｆｕｓｉｏｎ「Ｄ」バルブ（８０％の電力および０．６ｍ／分のベルト速度）により提供される光に曝露することによって、コーティングを紫外線架橋させた。次いで、プレートを１時間に亘り１％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、脱イオン水で完全に濯ぎ、最後に、穏やかに乾燥ガス流を流して乾燥させた。このコーティングはＤＨ２１０５−１０Ａと呼ばれる（無血清ＥＳＣ培養データに関する図１２Ｃ参照）；ＢＣＡアッセイにより決定された固定化ペプチド密度が、固定化ペプチド密度が約３０〜３５ピコモル／ｍｍ2であることを示した。細胞培養の前に、プレートを、７０％ｖ／ｖのエタノール水溶液を加えることにより消毒したか、またはガンマ線への曝露により滅菌した（本発明のコーティング組成物は、細胞接着性能を損なわずに、ガンマ線滅菌が可能であることは注目に値する）。
【００６９】
比較例１：  比較例として、トリフルオロエタノール中の総固体含有量が１０ｍｇ／ｍｌで、成分（ｉ）として、１０質量％のＰｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ（６モル％のベンゾフェノン）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ社から受け取ったまま使用した９０質量％のＶＮＰＥＧＭＡＡモノマー（この場合、アクリル化ペプチドはＨＥＭＡと共重合していなかったことに留意）をブレンドすることによって、コーティング配合物を調製した。被覆のコーティングは、Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡ＋ペプチドと称した（図１４Ｄ参照）。図１４Ｄは、アクリル化ペプチドをモノマーとして使用した場合、すなわち、ＨＥＭＡと共重合しなかった場合、細胞はそのコーティングに接着しないことを明らかに示している。このことは、成分（ｉｉ）は、アクリル化ペプチドのカップリングおよびフリーラジカル重合反応の開始が可能であるはずの成分（ｉ）により提供されるベンゾフェノン反応性部分の存在にもかかわらず、モノマーではなく、ポリマーでなければならないことを示す。
【００７０】
細胞培養：
ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１２１）を、１０％のＦＢＳおよびペニシリンストレプトマイシンが補われた培地である、カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のイスコフ改変ダルベッコ培地中で維持した。細胞をトリプシン処理し、飽和密度に到達する前に希釈した。
【００７１】
Ｎｕｌｌｉ−ＳＣＣ１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５６６）をゼラチン被覆プレート上で増殖させ、１０％のＦＢＳおよびペニシリンストレプトマイシンが補われた培地である、カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のイスコフ改変ダルベッコ培地中で維持した。細胞をトリプシン処理し、飽和密度に到達する前に希釈した。
【００７２】
ＥＳ−Ｄ３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１６３２）を、カリフォルニア州、カールズバッド所在のＡＴＣＣにより推奨されるように、１５％のＦＢＳおよび０．１ｍＭのベータメルカプトエタノールが補給された培地である、カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のイスコフ改変ダルベッコ培地中で維持した。細胞をトリプシン処理し、飽和密度に到達する前に希釈した。
【００７３】
短期接着アッセイ(Short term adhesion assay)：  試験すべき表面を、Ｄ−ＰＢＳ中の１％のウシ血清アルブミンと共に１時間に亘りインキュベーションし、次いで、カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
【００７４】
ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、計数し、Ｄ−ＰＢＳ中で洗浄し、血清を含まずに、０．１％のＢＳＡが補われたＤＭＥＭ中に懸濁させた。６ウェルプレートの形式でウェル当たり３×１０5の細胞を、血清を含まない２ｍｌのＤＭＥＭ中に播種し、１時間に亘り３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、培地をホルムアルデヒドで３．７％の最終濃度に調節することによって、細胞を１０分間で固定した。次いで、細胞をＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、代表写真を撮影した。図。次いで、細胞を１０分間に亘り１ｍｌのトリパンブルーで染色し、Ｄ−ＰＢＳ中で三回洗浄し、２００μｌの水中１％のＳＤＳの添加により、溶解させた。次いで、１００μｌの溶解生成物について、５７０ｎｍで光学濃度を測定した。図１１Ａは、ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ基板上のＨＴ１０８０細胞を示している。ペプチドを含まないＨＥＭＡ−ＣＥＡ基板上には、細胞は存在しない（図１１Ｂ）。
【００７５】
長期接着アッセイ(long term adhesion assay)：  長期接着アッセイについて、Ｎｕｌｌｉ−ＳＣＣ１またはＥＳ−Ｄ３を、トリプシン処理により収集し、計数し、Ｄ−ＰＢＳ中で洗浄し、ｍＴｅＳＲ１合成培地（カナダ国、ブリティッシュコロンビア州所在のＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に再懸濁させた。次いで、６ウェルプレートの形式でウェル当たり５×１０5の細胞を、２ｍｌのｍＴｅＳＲ１中に播種し、３７℃でインキュベーションした。細胞形態を毎日調査し、代表写真を撮影した。図。培地を毎日新しくした。４から５日後、生きている細胞の数をＭＴＴアッセイにより評価した。手短に言えば、細胞を、培養培地中５ｍｇ／ｍｌのチアゾリルブルー臭化テトラゾリウム溶液、１ｍｌと共に１時間に亘りインキュベーションし、次いで、Ｄ−ＰＢＳ中で二回洗浄し、２５０μｌの溶解緩衝液（１％のＳＤＳ、ＤＭＳＯ中４ｍＭのＨＣｌ）中で溶解させた。１００μｌの溶解生成物について、５７０ｎｍで光学濃度を測定した。図１２Ａは、コーニング社から市販されている「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」表面上で増殖したＮｕｌｌｉ−ＳＣＣ１細胞を示している（陽性対照）。図１２Ｂは、ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ表面上のＮｕｌｌｉ−ＳＣＣ１細胞を示している。ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ表面上の細胞は、陽性対照と似ているようである。図１２Ｃは、ペプチドを含まないＨＥＭＡ−ＣＥＡ上の細胞を示している。これらの細胞は、細胞培養表面には付着していない。図１２Ｄは、ＭＴＴアッセイの結果を示しており、これは、細胞が、陽性対照（ＰＡＳ−１）およびＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ表面上には存在したが、陰性対照表面（ペプチドを有さないＨＥＭＡ−ＣＥＡ）上には存在しなかったことを示している。同様に、図１３Ａは、コーニング社から市販されている「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」表面上で増殖したＥＳ−Ｄ３細胞を示している（陽性対照）。図１３Ｂは、ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ表面上のＥＳ−Ｄ３細胞を示している。ＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ表面上の細胞は、陽性対照と似ているようである。図１３Ｃは、ペプチドを含まないＨＥＭＡ−ＣＥＡ上のＥＳ−Ｄ３細胞を示している。これらの細胞は、細胞培養表面には付着していない。図１３Ｄは、ＭＴＴアッセイの結果を示しており、これは、細胞が、陽性対照（ＰＡＳ−１）およびＶＮ−ＨＥＭＡ−ＣＥＡ表面上には存在したが、陰性対照表面（ペプチドを有さないＨＥＭＡ−ＣＥＡ）上には存在しなかったことを示している。
【００７６】
図１４Ａ〜Ｄは、ニュージャージー州、フランクリンレイクス所在のＢＤ社から市販されている「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」（図１４Ａ）上、ニューヨーク州、コーニング所在のコーニング社から市販されている「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」（図１４Ｂ）上、ポリマーコーティングのポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ−ＰＥＧ4−ＭＡＡ−１０％）の実施の形態（図１４Ｃ）上、およびＰｈｏｔｏＨＥＭＡ＋ペプチドの陰性対照（図１４Ｄ）（先に議論した）上の、４８時間後のＥＳ−Ｄ３マウス胚性幹細胞の接着および形態を示す顕微鏡写真である。
【００７７】
それゆえ、細胞培養コーティングのためのプレポリマー調製物の実施の形態が開示されている。当業者には、ここに記載されたアレイ、組成物、キット、物品および方法が、開示された実施の形態以外の実施の形態で実施できることが認識されよう。開示された実施の形態は、制限ではなく、説明の目的で提示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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