(57)【要約】  対象におけるインスリン分泌を増加させることを目的とした、Ｐ２Ｘ３アゴニストなどのＰ２Ｘプリンアゴニストを含む医薬組成物、その使用方法、および、関連する化合物および作用物質をスクリーニングする方法。
2013522324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン分泌を必要とする対象においてインスリン分泌を増加させる方法であって、
Ｐ２Ｘプリンアゴニストの有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象はヒトである
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象は、真性糖尿病を患っている
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記真性糖尿病は２型糖尿病である
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、Ｐ２Ｘ３アゴニストである
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ、およびα，β−メチレンＡＴＰからなる群から選択される
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、標的組織において約１０μＭから１ｍＭの間、例えば約１０μＭから１００μＭの間の濃度になる用量で投与される
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
インスリン分泌を必要とする対象においてインスリン分泌を増加させるための医薬組成物における、Ｐ２Ｘプリンアゴニストの使用。
【請求項９】
前記対象は、真性糖尿病を患っている
請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記真性糖尿病は２型糖尿病である
請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ、およびα，β−メチレンＡＴＰからなる群から選択される
請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
糖尿病の治療のためにインスリン分泌を刺激するためのＰ２Ｘプリンアゴニストの有効量を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、Ｐ２Ｘ３アゴニストである
請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記Ｐ２Ｘ３アゴニストは、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ、およびα，β−メチレンＡＴＰからなる群から選択される
請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
霊長類におけるインスリン分泌を増加させるために効果的な化合物／作用物質のためのスクリーニング方法であって、
テスト化合物をＰ２Ｘ３受容体に接触させることと、受容体の活性を測定することとを含み、
前記受容体の活性の増加が、インスリン分泌を増加させる効果のある候補化合物を示す、方法。
【請求項１６】
前記Ｐ２Ｘ３受容体は細胞上にある
請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記活性は、前記細胞由来のインスリン分泌を測定することにより測定される
請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、膵島細胞である
請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記霊長類はヒトである
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓β細胞におけるインスリン分泌を高めるためのＰ２Ｘプリン受容体アゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病は、高血糖およびインスリン調整の欠陥を特徴とする広汎な代謝障害である。多くの治療法が利用可能であるが、多くの患者においてその病気の十分な制御はされてない状態である。したがって、プライマリ（主要な）またはアジュバント（補助の）治療法として使用するための新たな治療法および効果的な新たな医薬化合物が求められている。
【０００３】
グルコース恒常性は、膵臓内分泌部であるランゲルハンス島からのホルモン分泌により厳しく制御されている。血漿中のたとえ小さな生理的な偏り（例えば１０％）でさえも、膵島ホルモンであるインスリンまたはグルカゴンの分泌の急な増加（例えば３倍）により効果的に相殺される（１）。膵島内のオートクリン（自己分泌）およびパラクリン（傍分泌）シグナル伝達は、膵島の適切な機能のために極めて重要なメカニズムであって、血漿中のグルコース変動に対する膵島細胞の感度および反応性を極めて高くする。膵島ホルモン放出のオートクリンレギュレータおよびパラクリンレギュレータとして、ギャバ（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸塩、Ｚｎ２＋、インスリン、およびＡＴＰなど、種々の化合物の役割が広く検討されてきた（２〜８）。ホルモン放出を調整すると考えられる種々の因子の中で、細胞外ＡＴＰが重要であるように思われる。なぜなら、細胞外ＡＴＰは、インスリン含有顆粒に存在するとともに、グルコースの刺激中にＡＴＰ受容体を刺激する十分量で放出されるからである。細胞外ＡＴＰは、脳内ならびに血管、内分泌、および免疫細胞における重要な神経伝達物質シグナルである（１３〜１５）。プリン作動性システムは、細胞外ＡＴＰおよびアデノシンのそれぞれの受容体として、Ｐ２受容体およびＰ１受容体を含む。Ｐ２プリン受容体は、２つのカテゴリー、すなわち、向代謝性のＰ２Ｙ受容体（Ｇタンパク質共役型）と、向イオン性のＰ２Ｘ受容体（リガンド依存性イオンチャネル）とに分類されることができる（１６）。向イオン性のＰ２Ｘファミリーには、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋を透過させるカチオンチャネルを開口することにより細胞機能を調整するＰ２Ｘ１〜Ｐ２Ｘ７と呼ばれる７つのサブタイプが含まれる（１５，１７）。これらのチャネルの活性化により、カルシウムの流入を通じて直接的に、または膜の脱分極およびこれによる活動電位の誘導を促すことを通じて、神経伝達物質およびホルモンの放出が調整される（１８〜２１）。
【０００４】
膵島の生理学におけるプリン作動性シグナル伝達の役割は、齧歯類モデルにおいて研究されてきたが、文献での結果は矛盾している（２２〜２８）。ラット膵島において、プリンアゴニストはインスリン分泌を増加させると報告されてきた（２２，２８）。これは、細胞外ＡＴＰが、興奮性だけではなく抑制性のインスリン分泌フィードバックループを提供することを示すラット膵島に関する報告と対照をなす（２３）。マウス膵島では、細胞外ＡＴＰは、グルコース誘導性のインスリン分泌を減少させると一貫して報告されてきた（２４〜２６）。ヒト膵島に関する２つの報告では、プリンアゴニストはβ細胞の内向き電流を引き起こすとともにインスリン放出を刺激することが示されたが（２９，３０）、関与する受容体は同定されなかった。さらに重要なことには、これらの受容体が活性化される生理的状況については調査されていない。
【０００５】
齧歯類の膵島において、インスリン顆粒はＡＴＰを含み、ＡＴＰは、高グルコース刺激
時にインスリンと共に放出されてその細胞外濃度が２５μＭを超えるまでになる（９〜１２，３３）。最近の論文は、キス・アンド・ラン（ｋｉｓｓ−ａｎｄ−ｒｕｎ）開口放出メカニズムによってＡＴＰなどのより小さな分子は放出されうる一方、インスリンは顆粒中にとどまるという証拠を提供している（１２，３４）。さらに、ヒト膵島におけるインスリン分泌の活性化閾値はマウス膵島よりも低いことが示されており、３ｍＭのグルコースにおいてすでに少量のインスリンの分泌増加が生じる（図６、参考文献３５）。そのため、比較的低いグルコース濃度においてＡＴＰがインスリンと共に放出されている可能性がある。したがって、ＡＴＰは、閾値あたりのグルコース増加に対するβ細胞の応答性を調節するための優れたシグナル伝達の候補である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＡＴＰは、低グルコース濃度でヒト膵島により分泌されるとともに、グルコース刺激中、インスリン分泌を増大する。（Ａ）エクトヌクレオシダーゼ阻害剤であるＡＲＬ６７１５６（５０μＭ）は、低グルコース濃度（３ｍＭ；緑の記号）において、インスリン分泌を増加させた。アピラーゼ（５Ｕ／ｍＬ）は、基礎量のインスリン分泌を変化させなかった（赤の記号）。インスリン分泌の平均トレース（ｎ＝４  ペリフュージョン）が示されている。コントロール、黒の記号。横棒（バー）は、薬剤適用を示している。すべての図のデータは、平均値±標準誤差で提示されている。（Ｂ）Ａで示された結果の定量化。Δ［インスリン］（μＵ／μｇＤＮＡ）は、前刺激レベルからのインスリン分泌における変化を示す。（Ｃ）グルコースを３ｍＭから１１ｍＭに（黒の記号）上げることにより誘導されるインスリン分泌は、アピラーゼ（５Ｕ／ｍＬ；赤の記号）の存在で低下された。インスリン分泌の平均トレースが示されている（ｎ＝４  ペリフュージョン）。１１Ｇは、高められたグルコース（１１ｍＭ）の１０分を示す。（Ｄ）Ｃで示された結果の定量化。アピラーゼ（５Ｕ／ｍＬ）での細胞外ＡＴＰの低下は、グルコース誘導性のインスリン放出を１５％まで減少させた。アデノシンを分解するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ；１Ｕ／ｍＬ）の添加は、グルコース刺激性のインスリン分泌に対するアピラーゼの影響を変化させなかった。コントロールは、グルコースを３ｍＭから１１ｍＭに高めることにより誘導されたインスリン分泌である。アスタリスクは、統計的有意性を意味する（ＡＮＯＶＡに続きボンフェローニｔ検定での多重比較対対照群を実行；Ｐ＜０．０５）。
【図２】内因性放出されたＡＴＰは、ヒト膵島でのグルコース誘導性のインスリン分泌を、Ｐ２Ｘ受容体を通じて増大した。（Ａ）３ｍＭから１１ｍＭまでグルコースを上げることにより誘導されたインスリン分泌は、Ｐ２Ｘ受容体のアンタゴニストである、イソ−ＰＰＡＤＳ（５０μＭ；赤の記号）、およびｏＡＴＰ（５００μＭ；緑の記号；少なくとも３回のペリフュージョンの代表のトレース）の存在で低下された。横棒は、アンタゴニストの適用を意味する。１１Ｇは、高められたグルコース（１１ｍＭ）の１０分を示す。（Ｂ）結果の定量化は、スラミン（１００μＭ）、イソ−ＰＰＡＤＳ（５０μＭ）、ｏＡＴＰ（５００μＭ）、ＭＲＳ２１５９（１０μＭ）、ブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ；１μＭ）、ＫＮ−６２（１μＭ）、リアクティブブルー２（ＲＢ２；５０μＭ）、およびＭＲＳ２１７９（１０μＭ）の、グルコース誘導性インスリン応答の程度に対する影響を示す（ピークの大きさ；ｎ３）。スラミン、イソ−ＰＰＡＤＳ、およびｏＡＴＰは、インスリン放出を、それぞれ４０％、３０％、および６５％まで低下させた。アンタゴニストの特異性は、パネルの上部に示されている。アスタリスクは、統計的有意性を意味する（ＡＮＯＶＡに続きボンフェローニｔ検定での多重比較対対照群を実行；Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）インスリン分泌についてのＡＴＰ濃度−応答関係であって、ヒト（ｎ＝３  膵島調製物；黒および青の記号は、それぞれ３ｍＭおよび１１ｍＭグルコースを示す）におけるインスリン分泌についてのもの、およびラットの膵島（ｎ＝３；赤の記号）におけるインスリン分泌についてのものが示されている。コントロールは、刺激されていない基礎量のインスリン分泌である。（Ｄ）プリンアゴニストのＡＴＰ（１００μＭ）、ＡＴＰγＳ（５０μＭ）、ＢｚＡＴＰ（５０μＭ）、およびＡＤＰ（１００μＭ）は、低グルコース濃度（３ｍＭ）でヒト膵島でのインスリン分泌応答を引き出した。Ｐ２ＹアゴニストのＵＴＰ（１００μＭ）、およびＰＩ受容体アゴニストのアデノシン（Ａｄｏ；１００μＭ）は、強力なインスリン応答を引き起こさなかった（ｎ≧３  膵島調製物）。
【図３】ヒト膵島におけるＰ２Ｘ発現プロファイル。（Ａ）ヒト膵臓切片における、すべてのＰ２Ｘ受容体に対するリボプローブでのイン・サイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションは、膵島におけるＰ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ５、およびＰ２Ｘ７のｍＲＮＡの発現を示した（上方）。Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ６に対しては、ハイブリダイゼーションのシグナルが検出されなかった。Ｐ２Ｘ３に対するシグナルは、インスリン免疫反応とともに配置した（下方）（スケールバー，５０μｍ）。イメージは、３つのヒト膵臓の代表のものである。（Ｂ）膵島でのＰ２Ｘ３に対する免疫反応を示すヒト膵臓切片の共焦点イメージ。インスリン発現β細胞［赤；右、左に示された領域の高倍率イメージ］に配置されたＰ２Ｘ３免疫反応（緑）が示されている。細胞核は、灰色で示されている。イメージは、５つのヒト膵臓の代表のものである（スケールバー、２０μｍ）。（Ｃ）ヒト膵島（ＨＩ）、およびマウス脳（ＭＢ）各由来の溶解物（ライセート）、ポジティブコントロールとしてのヒト脳（ＨＢ）およびマウス脳（ＭＢ）各由来の溶解物（ライセート）のウエスタンブロッティング分析。Ｐ２Ｘ３受容体のバンドは、〜６５ｋＤａに見られる（上方）。特異的なバンドは、それらの同系のタンパク質とともに一次抗体が前吸収された時に消失した（下方）。矢印は、５０ｋＤａの分子量（ｎ＝３  膵島調製物）を示す。分子マーカーは、同時に流された。（Ｄ）ＡＴＰＳ（５０μＭ）は、フラ−２（Ｆｕｒａ−２）でロードされた個々のヒト膵島細胞において［Ｃａ２＋］ｉ応答を誘導した。これらの細胞は、高グルコースでの刺激に応答した（１１ｍＭ；黒のトレース、８細胞の代表のもの）。α細胞のほとんどは、カイネート（１００μＭ）に対するそれらの応答により識別されるが、ＡＴＰＳに対して応答しなかった（灰色のトレース；２５細胞の代表のもの）。横棒は、刺激期間を示す。グラフ（右）は、グルコース応答細胞集団（１１Ｇ；ｎ＝８）、およびカイネートー応答細胞集団（Ｋａｉ；ｎ＝２５）における、ＡＴＰＳに応答した細胞の割合を示している。低グルコース濃度（３ｍＭ）で記録された。
【図４】ヒトβ細胞によるＡＴＰ誘導性のインスリン分泌は、Ｐ２Ｘ受容体活性化と、電位作動型Ｃａ２＋チャネルを通じたＣａ２＋流入とを必要とする。（Ａ）ＡＴＰ（１０μＭ）により誘導されるインスリン分泌は、イソ−ＰＰＡＤＳ（５０μＭ）の存在で阻害された。イソ−ＰＰＡＤＳと共にインキュベートされた（赤の記号）、共にインキュベートされていない（黒の記号）、３つの膵島調製物由来の平均のトレース±標準誤差。横棒は、薬剤またはアンタゴニスト適用を示す。（Ｂ）ＡＴＰ（１０μＭ）により誘導されるインスリン分泌は、名目上０のＣａ２＋（＋１ｍＭ  ＥＧＴＡ；赤の記号）で、またはＣａ２＋チャネルブロッカーＣｄ２＋（２００μＭ；青の記号）の存在で、またはニフェジピン（Ｎｉｆｅ；１０μＭ；灰色の記号）により低下された。サプシガルジン処理（Ｔｈａｐｓｉ；１μＭ；緑の記号）は、インスリン応答に影響しなかった。処理前（左）および処理中（右）の、３つの膵島調製物の平均のインスリン応答（±標準誤差）。Ｃｏｎ、ＡＴＰに対するコントロールのインスリン応答（黒の記号）。（Ｃ）イソ−ＰＰＡＤＳは、ヒトβ細胞においてＡＴＰγＳ（５０μＭ）により誘導される［Ｃａ２＋］ｉ応答を低下した。高グルコース（１６ｍＭ）に対して応答する膵島細胞のみが調べられた。横棒は、刺激またはアンタゴニストの適用期間を示す。平均トレースは、７細胞±標準誤差である。（Ｄ）ＡＴＰγＳ（５０μＭ）により誘導される［Ｃａ２＋］ｉ応答は、名目上０のＣａ２＋（＋１ｍＭ  ＥＧＴＡ）で、またはニフェジピンの存在で低下された。ＡＴＰγＳに対する［Ｃａ２＋］ｉ応答は、サプシガルジン（１μＭ）の存在する状態において減少されなかった。３つの膵島調製物の３つの細胞の平均のピーク応答大きさ±標準誤差があった。アスタリスクは、統計的有意性を意味する（ＡＮＯＶＡに続きボンフェローニｔ検定での多重比較対対照群を実行；Ｐ＜０．０５）。Ｃｏｎ、ＡＴＰγＳ処理前のコントロール［Ｃａ２＋］ｉ応答；ＡＵＣは、「曲線下の領域」を示す。
【図５】ヒトβ細胞においてＡＴＰにより仲介される正オートクリンフィードバックループの提案モデル。ＡＴＰは、インスリンとともに放出され、β細胞の形質膜の向イオン性Ｐ２Ｘ３受容体を活性化する。これは、カチオン選択性のＰ２Ｘ３チャネル孔を開放し、Ｎａ＋、Ｃａ２＋を細胞内に流入させる（１）。結果の膜脱分極および活動電位の周波数の増加は、高電位作動型Ｃａ２＋チャネルを通じたＣａ２＋流入を増加させる。増加された［Ｃａ２＋］ｉは、インスリン分泌を刺激する（２）。Ｐ２Ｘ３活性化の非存在で、インスリン分泌は消滅される（右）。
【図６】インスリン分泌のわずかな増加が低グルコース濃度で生じる。グルコース濃度を１ｍＭから３ｍＭに上げることにより、ヒト膵島においてインスリン分泌が刺激された。インスリン分泌の平均のトレースが示されている（ｎ＝８  ペリフュージョン）。
【図７】ＡＴＰ誘導性のインスリン分泌における種の違い。サル膵島（黒の記号）は、ヒト膵島のようにＡＴＰの濃度の増加に対して応答した。マウス膵島（赤の記号）、ラット膵島（青の記号）、またはブタ膵島（黒の記号）では、テストされた濃度範囲（１〜１，０００μＭ）において、ＡＴＰに対する応答は観察されなかった。代表の実験（一つの種につき、ｎ≧３の調製物）が示されている。
【図８】ＡＴＰは、グルカゴン分泌において小さな増加を引き出した。（左）ＡＴＰに対するグルカゴン応答は、サル膵島（青の記号）およびヒト膵島（黒の記号）において小さく、マウス膵島（赤の記号）またはブタ膵島（緑の記号）では見つけることが困難であった。一つの種につき２以上の膵島調製物由来の代表の実験が示されている。（右）Ｐ２Ｘ３免疫反応は、α細胞において存在しなかった（グルカゴン免疫染色；赤）（左側に示す）。α細胞においてＰ２Ｘ４（緑）に対して免疫反応を示すヒト膵臓切片の共焦点イメージは右側である（スケールバー、２０μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
それぞれ異なった種由来の膵島は、構造および機能に関して著しく異なる。また、膵島生物学におけるプリン作動性シグナル伝達に関するデータは明確ではない。そのため、我々は、ヒトβ細胞におけるプリン作動性シグナル伝達の役割を詳細に研究することにした。我々は、特に、グルコース濃度の増加に伴うβ細胞の刺激時において内因性放出されるＡＴＰの役割を明確にすることに関心があった。我々は、動的な（ダイナミック）ホルモン放出アッセイの実施、細胞質内の遊離したカルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）のイメージ化、ＲＴ−ＰＣＲ、および免疫組織化学により、ＡＴＰシグナル伝達の効果について検討した。我々の結果は、ヒトβ細胞がＣａ２＋流入とインスリン分泌とを誘導するＰ２Ｘ受容体を発現していることを示している。こうしたＣａ２＋流入およびインスリン分泌は、グルコース誘導性のインスリン放出時に自己分泌ポジティブフィードバックを促進する。
【０００８】
したがって、β細胞のＰ２Ｘ受容体は、インスリン分泌を高めるための医薬品に関する理にかなったターゲットである。他の治療法とは反対に、β細胞の活性時、すなわち、適切な生理的状況において、Ｐ２Ｘ受容体の活性化は、内因性のインスリン分泌を高める可能性がある。我々は、β細胞におけるＰ２Ｘ受容体の調節が、薬物治療された糖尿病の管理における補助療法（アジュバント療法）になることを期待している。
【０００９】
Ｐ２Ｘ受容体活性の調節は、下部尿路機能傷害および過敏性腸症候群などの疾患の治療的介入における可能性のあるポイントとして現れた。我々の研究由来の情報は、２型糖尿病の状況で血糖コントロールを改善するべく、Ｐ２Ｘ受容体が、単独で、または経口の血糖降下剤（例えば、スルホニルウレア）との組み合わせで、または基礎的なインスリン補充とともに、使用され得る医薬品の理にかなったターゲットであることも示唆している。我々は、２型糖尿病を持つ人々における糖尿病の罹患率をこの治療が低下させることを期待している。
【００１０】
Ｐ２Ｘ受容体のポジティブモジュレータを使用することにより、我々は、インスリン分泌を増大させる天然のメカニズムに介入する。インスリン分泌は、糖尿病において損なわ
れるものである。現在のアプローチとは対照的に、我々の治療法は、適切な生理的な状況において内因性のインスリン分泌を高める。
【００１１】
したがって、本発明は、Ｐ２Ｘプリンアゴニスト（例えば、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、ベンゾイルベンゾイルＡＴＰ、例えば、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）ＡＴＰ、α、β−メチレンＡＴＰ、２−ｍｅＳＡＴＰ、α，β−メチレンＡＴＰ、またはＢｚＡＴＰ（２’（３’）−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）ＡＴＰ））の有効量を投与することにより、インスリン分泌を、それを必要とする対象において増加させる方法を提供する。ＢｚＡＴＰは、これらプリンアゴニストの中で最も有害性が低いと考えられうる。
【００１２】
対象は、インスリン分泌の増加が望ましい状態にあるいかなる哺乳類であることができ、特にヒトなどの霊長類でありうる。一実施形態では、対象は、２型糖尿病などの真性糖尿病を患っている。ある好ましい実施形態では、Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、Ｐ２Ｘ３アゴニストであって、例えば、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）ＡＴＰ、及びα、β−メチレンＡＴＰである。
【００１３】
Ｐ２Ｘプリンアゴニストの適切な用量は、当業者による通常の実験により決定されうる。一実施形態では、用量は、標的組織での濃度がおよそ１０μＭ〜１ｍＭ、例えば、およそ１０μＭ〜１００μＭになることが期待される用量である。
【００１４】
また、インスリン分泌を、それを必要とする対象において増加させるための医薬組成物でのＰ２Ｘプリンアゴニストの使用が提供される。対象は、例えば、２型糖尿病などの真性糖尿病を患っているヒトである。一実施形態では、Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、Ｐ２Ｘ３アゴニストであって、例えば、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）ＡＴＰ、及びα、β−メチレンＡＴＰからなる群から選択される。
【００１５】
また、Ｐ２Ｘプリンアゴニストの有効量を含む医薬組成物が提供される。Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、例えば、Ｐ２Ｘ３アゴニストであって、糖尿病治療のためにインスリン分泌を刺激する。Ｐ２Ｘ３アゴニストは、例えば、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）ＡＴＰ、及びα、β−メチレンＡＴＰからなる群から選択されうる。
【００１６】
本発明に従い投与される医薬組成物は、薬学分野において慣例であるように、任意で、薬学的に許容される希釈剤、キャリヤ、および賦形剤を含む。
本発明はまた、本発明の方法で使用される薬剤／化合物のためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、β細胞のＰ２Ｘ３受容体に特異的に作用する能力について、テスト化合物をスクリーニングすることによる。化合物は、Ｐ２Ｘ３アゴニストとしての活性について、本明細書で説明される方法に従ってスクリーニングされうる。そして、そうした活性を示す化合物は、それらがインスリン分泌を増加する医薬品として優れた候補であるか否かを決定するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのさらなるテストのために選択されうる。したがって、哺乳類、特にヒトなどの霊長類においてインスリン分泌を増加する効能を持つ化合物／作用物質を検出するためのスクリーニング方法も提供される。この方法は、化合物をＰ２Ｘ３受容体と接触させること、受容体の活性を測定することを含み、これは例えば、受容体を産生する細胞のインスリン分泌の増加／減少を測定することによる。Ｐ２Ｘ３受容体活性を刺激する化合物／作用物質は、インスリン分泌を増加させる潜在的な化合物として、また医薬化合物に含められるものとして考慮されるだろう。
【００１７】
定義
本明細書で使用されるように、「約」は、±１０％を意味すると意図されている。
「薬学的に許容される希釈剤、キャリヤ、および賦形剤」により、本発明にかかる医薬化合物に適合するとともに、動物、特にヒトや他の霊長類への局所または全身投与に好適なものとして当業者に知られているような化合物が表される。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「治療」「治療する」などの用語は、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを意味する。効果とは、病気または疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するといった予防的なものであってもよく、および／または、病気または疾患および／または病気または疾患に起因するいかなる悪影響を部分的にまたは完全に治癒する治療的なものであってもよい。したがって、「治療」とは、例えば、（ａ）病気または疾患にかかりやすい傾向にあるが未だそれを持っていると診断されていない個体において、その病気または疾患が生じることを予防すること；（ｂ）その病気または疾患を抑制すること、例えば、その進行を止めることなど；および（ｃ）その病気または疾患の緩和、軽減、改善すること、例えば、医師により診断されるなど、その病気または疾患で苦しむ個体（個人）のその病気または疾患を軽減することなど、を含む。
【００１９】
「標的組織」により、本発明の化合物が治療効果を発揮する組織または細胞であって、例えば、膵臓、または膵臓の膵島細胞が表される。
「薬学的に許容されるキャリヤ」との用語は、任意の従来のタイプの無毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入剤、または製剤助剤を意味する。「薬学的に許容されるキャリヤ」は、使用される用量および濃度において受容者に対して無毒であり、製剤の他の成分に適合する。例えば、本発明の治療用化合物および組成物を含む製剤用のキャリヤは、それらに有害であると知られている酸化剤や他の化合物を含まないことが望ましい。好適なキャリヤとしては、これに限定されないが、水、デキストロース、グリセロール、生理的食塩水、エタノール、バッファ、ジメチルスルホキシド、クレマホール（Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ）ＥＬ、およびこれらの混合物を含む。キャリヤは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの追加の薬剤を含みうる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定剤など他の物質、および同様の薬剤は、必要に応じて添加されうる。
【００２０】
本明細書において薬学的に許容される塩は、酸付加塩（例えば、遊離アミノ基と形成される）を含み、無機酸（限定されないが、塩酸またはリン酸を含む）、または、酢酸、マンデル酸、シュウ酸、酒石酸のような有機酸と形成される。また、遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基由来であったり、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、およびヒスチジンのような有機塩基由来であったりすることができる。
【００２１】
「薬学的に許容される賦形剤」との用語は、ビヒクル（ｖｉｈｉｃｌｅ）、アジュバント、または希釈剤、または他の補助物質を含み、例えば当技術分野で通常のものであって、一般に容易に入手可能なものである。例えば、薬学的に許容される補助物質には、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤などが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用されるところでは、文脈において別途明確に定められていない限り、「１つの」、「それの」などの単数表現は複数表現を含む。したがって、例えば「１つの化合物」との言及は、複数のそうした化合物を含む。
【００２３】
上述したとおり、医薬化合物の有効量が、個体に投与される。この「有効量」は、所望の結果を生み出すために十分な用量を意味する。いくつかの実施形態では、所望の結果と
は、インスリン分泌を所望のレベルにまで刺激することである。投与される治療剤の量は、投与方法、対象／患者の年齢および体重、および対象の症状や病気に応じて変化する。化合物は、付随する副作用が最小で、医療目的を最も良く達成する用量で投与される。
【００２４】
典型的には、本発明で使用される組成物は、約１％未満から約９９％までの有効成分を含む。投与される適切な用量は、対象の全体の健康、対象の年齢、疾患や病気の状態、対象の重さなど、治療される対象に依存する。
【００２５】
薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、キャリヤ、または希釈剤などであるが、当技術分野で通常のものである。好適な賦形剤のビヒクルは、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノール等、およびこれらの混合物を含む。さらに、必要に応じて、ビヒクルは、少量の補助物質、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤を含みうる。そうした剤形を用意する実際の方法は、当業者に知られており、または明らかであろう。例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン、第１７版、１９８５年、を参照されたい。いずれにしても、投与される組成物または製剤は、治療される個体において所望の状態を達成するために十分な量の作用物質を含むであろう。
【００２６】
治療用化合物は、水性または非水性の溶剤中にそれらが溶解、懸濁、乳化されることにより、注射液として配合されうる。水性または非水性の溶剤中とは、例えば、植物油または他の同様の油などであって、コーン油、ヒマシ油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルを含む。また、必要ならば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、保存料などの通常の添加物がともに配合されうる。
【００２７】
投与の通常の経路は、熟練技能者には明らかであろう。これらは、例えば、経口または皮下投与を含む。投与の他の経路としては、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、呼吸器（吸入装置を介してなど）、鼻腔内、などが含まれる。
【００２８】
有効量は、日常的な通常の手順により決定されうる。例えば、ＢｚＡＴＰまたはα、β−メチレンＡＴＰは、約５０μＭの濃度で投与されうる。
本実施形態で引用される特許および他の刊行物は、参照により援用される。
【００２９】
実験手順
膵島の単離。膵島を、先に述べたようにして単離した（５７）。サル膵島を、先に述べたようにして（５８）、膵臓入手の時点で４歳を超えたカニクイザル（マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））から単離した。ブタ膵臓を、地元の屠殺場から入手した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびラット（ルイスラット；ハーラン（Ｈａｒｌａｎ））膵島を、齧歯類−膵島単離技術（５９）を使用して単離した。すべての動物プロトコルは、マイアミ大学の管理使用委員会（Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｉｔｔｅｅ）により承認された。ヒト膵島を、糖尿病研究所（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のヒト膵島細胞処理施設（Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ），マイアミ大学ミラー医学校（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から、または、膵島細胞資源基本科学膵島配布プログラム（Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｂａｓｉｃ
ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｓｌｅｔ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ），膵島細胞資源センターコンソーシアム（ＩＣＲｓ；Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ），臨床研究部門，国立研究資源センター，国立衛生研究所、から入手した。ヒト膵島を、酵素フリーの細胞分離バッファ（インビトロジ
ェン）を用いて単一細胞に分離した。すべての種由来（Ｑ：１）の膵島および膵島細胞を、ＣＭＲＬ培地−１０６６（インビトロジェン）、ナイアシンアミド（１０ｍＭ；シグマ）、ＩＴＳ（ＢＤバイオサイエンス）、Ｚｎ２ＳＯ４（１５μＭ、シグマ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２ｍＭ；インビトロジェン）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（２５ｍＭ；シグマ）、ＦＢＳ（１０％；インビトロジェン）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ；インビトロジェン）中で同様に（３７℃、５％ＣＯ２）培養した。
【００３０】
［Ｃａ２＋］ｉイメージング。［Ｃａ２＋］ｉイメージングを先に述べたようにして実施した（８，３６）。分散された細胞を、ヘペスバッファ溶液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．９ｍＭ  ＫＣｌ，２．５６ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２５ｍＭ  ヘペス，および０．１％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に浸漬した。グルコースを、終濃度が３ｍＭになるように添加した。膵島または分散された膵島を、Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（２μＭ；１時間）中でインキュベートし、閉鎖小容積イメージングチャンバ（ワーナー・インスツルメント）に置いた。刺激を、ベイジング溶液（ｂａｔｈｉｎｇ  ｓｌｏｌｕｔｉｏｎ）とともに適用した。Ｆｕｒａ−２でロードされた膵島を、モノクロメータ光源（ケルン・リサーチ・オプトスキャン・モノクロメータ（Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｔｏｓｃａｎ  Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｒ）；ケルン・リサーチ社）で、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍにおいて選択的に励起した。イメージを、ツァイス・アキシオベルト２００（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００）顕微鏡（カールツァイス）に取り付けられた浜松カメラ（浜松）で取得した。キネティックイメージングＡＱＭアドバンスソフトウェア（キネティックイメージング）を用いて、ある期間にわたる３４０／３８０蛍光発光比の変化を個々の膵島および分散された細胞において分析した。蛍光比のピークの変化は、応答増幅を構成した。β細胞を、高グルコース濃度に対するそれらの［Ｃａ２＋］ｉ応答により、他の内分泌細胞と区別した。また、α細胞を、カイニン酸（グルタミン酸塩受容体アゴニスト）に対するそれらの［Ｃａ２＋］ｉ応答により識別した（８，３６）。
【００３１】
インスリンおよびグルカゴン分泌。インスリンおよびグルカゴン分泌を、先に述べたようにして測定した（８，３６）。高容量自動ペリフュージョン（ｐｅｒｉｆｕｓｉｏｎ）システムを、膵島からのホルモン分泌を動的に測定するために開発した。ヘペスバッファ溶液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．９ｍＭ  ＫＣｌ，２．５６ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ
ＭｇＣｌ２，２５ｍＭ  ヘペス，および０．１％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４、ペリフュージョン速度１００μＬ／分）を、バイオゲルＰ−４ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４  Ｇｅｌ）（バイオ・ラッド）に固定された１００個の膵島を含むカラムに、低拍動性蠕動ポンプ（ペリスタポンプ）により通過させた。他に述べられていない限り、すべての実験においてグルコース濃度を３ｍＭに調整した。刺激を、ペリフュージョンバッファとともに適用した。潅流液（ｐｅｒｉｆｕｓａｔｅ）を、９６−ウェルプレート形式用に設計された自動フラクションコレクタに回収した。膵島および潅流液を含むカラムを３７℃で維持し、コレクションプレート内の潅流液を４℃未満で維持した。潅流液を１分ごとに回収した。潅流液中のホルモン放出を、ヒトおよびマウス内分泌ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（登録商標）キットを用いて使用説明書（リンコリサーチ（Ｌｉｎｃｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に従い決定した。ヒト膵島の調製物は、それらの質において著しく異なった。したがって、種々の刺激に対する応答の程度を、同一の記録と比較し、または同一の調製物由来の記録を用いて比較した。
【００３２】
免疫組織化学。切片（１４μｍ）を、抗Ｐ２Ｘ受容体抗体（１〜７；アロモネ・ラボ（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ））、抗インスリン抗体（１：５００；アキュレイト・ケミカル・アンド・サイエンティフィック（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗グルカゴン抗体（１：４，０００；シグマ）、および／または抗ソマトスタチン抗体（１：１，０００；アキュレイト・ケミカル・アンド・サイエンティフ
ィック）とともに、オーバーナイトでインキュベートした。ネガティブコントロールとして、精製ペプチド（５０μｇ）を、プリン受容体の一次抗体（１μｇ）とともに、１時間プレインキュベートした（室温）。膵島を含む膵臓の切片を、ツァイスＬＳＭ５１０走査型共焦点顕微鏡を用いて調べた（２０倍および４０倍の拡大で観察した）。
【００３３】
イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション。ヒトＰ２ＸＲ（１〜７）のｍＲＮＡ検出のためのＤＩＧラベルされたＲＮＡプローブ（Ｑ：３）を用いたイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを、先に述べたようにして実施した（６０）。合計３０ｎｇのＤＩＧラベルされたプローブを、１５０μｌのハイブリダイゼーションバッファで希釈し、スライドに適用し、オーバーナイト７０℃でハイブリダイズさせた。その後、０．２ＳＳＣ溶液（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標））（Ｑ：４）−アプライドバイオシステムズ）で、スライドを７０℃で１時間洗い、アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ羊抗体（ロシュ）とともに、オーバーナイト４℃でインキュベートした。アルカリホスファターゼ反応を、２００μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１４０μｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰストック（ロシュ）を含むポリビニルアルコール（ＰＶＡ）中で（Ｑ：５）実行した。センス鎖（Ｑ：６）を、それぞれのＰ２ＸＲについてのネガティブコントロールとして使用した。抗原の免疫蛍光局在、二重標識免疫蛍光法、共焦点顕微鏡検査を、先に述べたようにして実行した（６０）。使用した抗体は、抗インスリンマウス抗体（１／１０００；シグマ）、抗グルカゴンモルモット抗体（１／５０；ダコ（Ｄａｋｏ））、アレキサ・フルオル（Ａｌｅｘｉａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標））４８８結合ヤギ抗マウス抗体（１／４００；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、およびアレキサ・フルオル５６８結合ウサギ抗モルモット抗体（１／４００；モレキュラー・プローブ）であった。ＤＡＰＩを、核の対比染色として使用した。クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）シグナルをＲＧＢスケールでのカラーシグナルにデジタル変換することにより、ハイブリダイゼーションシグナルと免疫蛍光シグナルとを合わせた。ハイブリダイゼーションシグナルを、赤で擬似的に着色した（Ｑ：７）。その後、このシグナルを、インスリンシグナル（緑）と合わせた。フォトショップ（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標））を用いて両方の変換を実行した。
【００３４】
ウエスタンブロッティング。免疫ブロット分析を、Ｐ２Ｘ免疫組織化学のために使用される抗体を用いて（１：１０００）、標準的な方法により実行した。コントロール実験として、一次抗体を、対応するコントロールペプチド（アロモネ・ラボ）とともに、５０μｇ抗原ペプチド／１μｇ抗体の割合で、５時間室温でインキュベートした。
【００３５】
統計分析。統計比較のため、我々は、スチューデントｔ検定、または一元分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用し、続いてボンフェローニｔ検定で多重比較手法を実行した。適用を通して、データを、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。
【００３６】
実施例１
オートクリン／パラクリンシグナルとしてのＡＴＰの役割を推定するため、我々は、ＡＴＰ分解を操作するとともに、これにより単離ヒト膵島において内因性放出されるＡＴＰの濃度を操作し、ホルモン分泌における変化を、動的な分泌応答のペリフュージョンアッセイを使用することにより記録した（３６）。放出されたＡＴＰは、ＡＴＰをアデノシンに変換するアピラーゼなどの膜エクト（ｅｃｔｏ）ＡＴＰアーゼにより迅速に除去される（３７，３８）。エクトＡＴＰアーゼは、プリンシグナル伝達の持続期間および程度において極めて重要である。機能的なアピラーゼ（ＣＤ３９）は、ヒトβ細胞に発現されていることが示されてきた。アピラーゼ阻害剤であるＡＲＬ６７１５６（５０μＭ）の適用は（４１，４２）、低グルコース濃度（３ｍＭ；図１Ａ、１Ｂ）でインキュベートされた膵島からの基礎量のインスリン分泌を増加させ、ヒト膵島細胞がＡＴＰを放出したことを示していた。これらの条件下において、内因性のエクトＡＴＰアーゼは、完全に有効的である。これは、外因的に添加されたアピラーゼ（５Ｕ／ｍＬ）が基礎量のインスリン分泌を
低下させなかった（図１Ａ、１Ｂ）理由を説明する。
【００３７】
実施例２
ＡＴＰは、低グルコース濃度においてすでに放出されてインスリン分泌を促す可能性を有しているため、我々は、ＡＴＰが、グルコース誘導性のインスリン分泌を早期に増強するとの仮説を立てた。それゆえ外因的に添加されたアピラーゼ（５Ｕ／ｍＬ）は、３ｍＭから１１ｍＭへのグルコース濃度のステップ増加の間、インスリン放出を〜１５％低下させ（図１Ｃ、１Ｄ）、内因性のＡＴＰ放出が、β細胞応答に寄与していたことを示唆した。しかしながら、グルコース刺激の間における競合的なアピラーゼ阻害剤であるＡＲＬ６７１５６の添加は、β細胞応答を増大させず（図１Ｄ）、内因性のＡＴＰ放出が、ＡＴＰの増強効果を飽和させるのに十分高いものであることを示唆した。さらに、グルコース濃度が増加される際における外因的なＡＴＰによる刺激により、インスリン応答は追加されなかった。
【００３８】
アピラーゼは、細胞外ＡＴＰを減少させることにより、または、インスリン放出を阻害するようにＰ１受容体に作用しうるアデノシンを増加させることにより、グルコース誘導性のインスリン放出を低下させている可能性がある（４３）。アデノシンデアミナーゼでアデノシンを分解しても、グルコース誘導性のインスリン分泌に対するアピラーゼの効果は変化しなかった（図１Ｄ）。これは、アデノシンがインスリン応答の阻害に寄与していないことを示唆した。したがって、Ｐ１受容体のアンタゴニストであるＣＧＳ１５９４３（１０μＭ）、およびアデノシン（１００μＭ）のいずれも、グルコース誘導性のインスリン分泌を変更しなかった（論考）。神経は分断されており、ＡＴＰの追加の供給源または標的になりうるニューロンの残部は我々の実験条件下において残存しないため（３２，４４）、最も確実らしい解釈は、β細胞から分泌されたＡＴＰは、インスリン分泌を増大するためのオートクリンフィードバックループを提供するというものである。
【００３９】
実施例３
オートクリンフィードバックループに関連する受容体を調べるため、我々は、グルコース濃度を３ｍＭから１１ｍＭまで増加させる刺激の間、特異的な受容体アンタゴニストでプリン受容体をブロックした（図２Ａ）。グルコース刺激に対するインスリン分泌の応答は、スラミン（５０μＭ；Ｐ２受容体の広範なアンタゴニスト）、イソ−ＰＰＡＤＳ（Ｑ：９）（５０μＭ；Ｐ２Ｘ１受容体、Ｐ２Ｘ２受容体、Ｐ２Ｘ３受容体、およびＰ２Ｘ５受容体のアンタゴニスト）、酸化ＡＴＰ（ｏＡＴＰ；５００μＭ；Ｐ２Ｘ２受容体、Ｐ２Ｘ３受容体、およびＰ２Ｘ７受容体のアンタゴニスト）の存在により、それぞれ４０％、３０％、および６５％まで低下した（図２Ｂ）。グルコース刺激に対するインスリン分泌の応答は、特異的なＰ２Ｘ１アンタゴニストであるＭＲＳ２１５９（１０μＭ）、および２種のＰ２Ｘ７受容体アンタゴニストであるブリリアントブルーＧ（１μＭ）およびＫＮ−６２（１μＭ）の存在により、有意な低下は生じなかった（図２Ｂ）。Ｐ２Ｙ受容体に対するアンタゴニスト［リアクティブブルー２（５０μＭ）およびＭＲＳ２１７９（１０μＭ）；Ｐ２Ｙ１受容体に対して特異的；図２Ｂ］、またはＰ１受容体に対するアンタゴニストは［ＣＧＳ１５９４３（１０μＭ）］、グルコース誘導性のインスリン放出を阻害しなかった。
【００４０】
実施例４
インスリン分泌に対するプリン受容体活性化の直接的な効果を決定するため、我々は、外因性のＡＴＰおよび他のアゴニストを適用した。ヒト膵島では、Ｐ２プリン受容体の一般的なアゴニストであるＡＴＰの適用は、低グルコース濃度（３ｍＭ）および高グルコース濃度（１１ｍＭ）において同様な閾値で、濃度依存的にインスリン放出を刺激した（図２Ｃ）。濃度―応答関係は、ヒトＰ２Ｘ３受容体について報告されたＥＣ５０（〜０．３９μＭ）に好対照の高親和性成分（〜０．５μＭ）と、Ｐ２Ｘ７受容体（ＥＣ５０〜１０
０μＭ）の活性化に相当しうる１００μＭと１０００μＭとの間の第２の増加とを示した（４５）。１ｍＭを超えて細胞外ＡＴＰを増加させることにより、インスリン放出がさらに増加することはなかった（図２Ｃ）。ＡＴＰに対するインスリン応答は、グルコースにより刺激された応答と同様に、基礎量を超えた増加を示した。ＡＴＰ（１ｍＭ）により引き出された増加と比較して、高グルコース（１１ｍＭ）に対する応答は、１０１％±３０％、または、ほぼ同一であった。同様の結果が、サル膵島を使用して取得された。対照的に、ブタ膵島、マウス膵島、およびラット膵島においてテストされたＡＴＰおよび他のいずれのプリンアゴニストにより、インスリン放出は刺激されなかった（図２Ｃ、Ｓ２）。ラット膵島では、高濃度のＡＴＰ（１ｍＭ）でのみ、インスリン放出の小さな増加が誘導された（図２Ｃ）。
【００４１】
ＡＴＰγＳ（５０μＭ；非加水分解性のＡＴＰアナログ）、特異的なＰ２Ｘ受容体アゴニストであるＢｚＡＴＰ（５０μＭ）、およびＰ２Ｘ１アゴニストおよびＰ２Ｘ３アゴニストであるα，β−メチレンＡＴＰ（５０μＭ）は、強いインスリン応答を引き出した（図２Ｄ）。Ｐ２Ｙ受容体は、グルコース刺激の間、内因性放出されるＡＴＰに対する応答には関連しなかったが、選択的アゴニストのＵＴＰ（１００μＭ；Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６のアゴニスト）およびＡＤＰ（１００μＭ；Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３のアゴニスト）により、インスリン放出を増加するように直接的に活性化されることができた（図２Ｄ）。これは、ヒトβ細胞における複数のＡＴＰ受容体サブタイプの存在を示唆した。アデノシンは、インスリン放出に対して小さな効果しか持たなかった。これは、Ｐ１受容体は、あまり関連しないことを示唆した（図２Ｄ）。高グルコース（１１ｍＭ）に維持された膵島における、ＡＴＰ（１００μＭ）、ＡＴＰγＳ（５０μＭ）、ＢｚＡＴＰ（５０μＭ）、ＵＴＰ（１００μＭ）、およびＡＤＰ（１００μＭ）に対するインスリン応答の程度は、低グルコース濃度に維持された膵島で記録されたこれらのアゴニストに対するインスリン応答の程度と同様であった。これは、プリン受容体活性化の効果が、高グルコースレベルにおいても変更されないことを示唆している。
【００４２】
実施例５
我々の結果は、ヒト膵島が、活性化により強力にインスリン分泌を刺激するＰ２Ｘ受容体を発現していることを示唆している。ＲＴＰＣＲを用いることにより、我々は、すべてのＰ２Ｘ受容体遺伝子がヒト膵島において発現されていることを発見し、β細胞生物学コンソーシアムデータベース（Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ
ｄａｔａｂａｓｅ）（ウェブサイト：ｂｅｔａｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄａｔａ／ｅｐｃｏｎｄｂ／）からの結果を確証した。膵島におけるＰ２Ｘ受容体発現部位を特定するために、我々は、ヒト膵島切片についてイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを実施した。ヒト膵島において強力なハイブリダイゼーションシグナルが、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ５、および、Ｐ２Ｘ７に対して検出された（図３Ａ）。膵島ホルモンに対する免疫蛍光に、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを組み合わせることにより、我々は、これらの受容体はβ細胞において発現されていることを発見した（図３Ａ）。Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ６、またはコントロールのセンスリボプローブに対してはシグナルが検出されなかった。免疫蛍光とウエスタンブロットとはさらに、Ｐ２Ｘ３タンパク質がβ細胞に存在することを示した（図３Ｂ、３Ｃ）。Ｐ２Ｘ５およびＰ２Ｘ７の免疫活性は膵島において見られたが、それらは、コントロールペプチドの前吸着によりブロックされなかった。したがって、その染色が、Ｐ２Ｘ５およびＰ２Ｘ７受容体タンパク質の発現についての信頼しうる示唆であると考えられるのか否かを決定することができなかった。単離されたヒト膵島細胞は、［Ｃａ２＋］ｉの測定を用いて、機能的なＰ２Ｘ受容体の存在について調べられた。β細胞は、高グルコース（１１ｍＭまたは１６ｍＭ）に対するそれらの応答により識別され（８）、ＡＴＰγＳ（５０μＭ）およびＢｚＡＴＰ（５０μＭ）に対して、迅速な［Ｃａ２＋］ｉ増加で応答した（図３Ｄ）。α細胞特異的刺激であるカイニン酸（１００μＭ）に応答した細胞のフラクション（３０％）は、ＡＴ
ＰγＳ（５０μＭ）およびＢｚＡＴＰ（５０μＭ）に対して、迅速な［Ｃａ２＋］ｉ増加で応答した（図３Ｄ）。これらの結果に一致して、ＡＴＰは、ヒト膵島、サル膵島、およびマウス膵島におけるグルカゴン分泌の小さな増加を刺激し、ヒトα細胞のサブセットは、Ｐ２Ｘ４受容体を発現した（図Ｓ３）。
【００４３】
実施例６
ＡＴＰがヒトβ細胞においてインスリン分泌を誘導するメカニズムは何であろうか。ＡＴＰ（１０μＭ）に対するインスリン応答は、一般的なＰ２受容体アンタゴニストであるスラミン（１００μＭ）、および特異的なＰ２Ｘアンタゴニストであるイソ−ＰＰＡＤＳ（５０μＭ；〜９８％阻害；図４Ａ）により、阻害された。名目上細胞外のＣａ２＋がない状態では、ＡＴＰに対するインスリン応答（図４Ｂ）およびα，βｍｅＡＴＰ（１００μＭ）に対するインスリン応答は、強力に減少された。対照的に、細胞内蓄積からのＣａ２＋放出の寄与をサプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）（１μＭ）でブロックすることは、ＡＴＰに対するインスリン応答に影響を与えなかった（図４Ｂ）。ＡＴＰ誘導性インスリン分泌のために必要とされるＣａ２＋は、Ｐ２Ｘ受容体の孔か、電位依存性Ｃａ２＋チャネルを通じて入った可能性がある。電位依存性Ｃａ２＋チャネルは、Ｐ２Ｘ受容体介在性の膜脱分極の結果として活性化される。広範囲の電位作動型Ｃａ２＋チャネルのブロッカーであるＣｄ２＋（１００μＭ；Ｐ２Ｘ受容体を通じたＣａ２＋の流入には影響しない濃度）（４６，４７）およびＬ型Ｃａ２＋チャネルブロッカーであるニフェジピン（１０μＭ）は、ＡＴＰ（図４Ｂ）またはα，βｍｅＡＴＰに対するインスリン応答性を消滅させた。
【００４４】
実施例７
Ｃｄ２＋またはニフェジピンの存在でＡＴＰがインスリン分泌を増加できなかったことは、Ｐ２Ｘ受容体の活性化による十分な脱分極が、電位依存性Ｃａ２＋チャネル（１５，１７，４７）、特に、ヒトβ細胞における潜在的な発射（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｉｒｉｎｇ）に重要なＬ型Ｃａ２＋チャネル（４８）の活性化を引き起したことを示唆している。ＡＴＰ、およびＰ２Ｘ受容体アゴニストであるＢｚＡＴＰならびにα，βｍｅＡＴＰは、グルコースまたはＫＣｌ刺激に対する応答に匹敵する、繰り返すことのできる［Ｃａ２＋］ｉ応答をβ細胞において引き出した（図４Ｃ）。ＡＴＰに対する［Ｃａ２＋］ｉ応答は、イソＰＰＡＤによりヒトβ細胞において８０％にまでブロックされた（図４Ｃ）。サプシガルジン（１μＭ）は、ＡＴＰに対する［Ｃａ２＋］ｉ応答に影響しなかった。これは、細胞内蓄積からのＣａ２＋放出の寄与がほとんどないことを示唆している。名目上細胞外にＣａ２＋がない状態、またはニフェジピンの添加（１０μＭ）は、ＡＴＰに対する［Ｃａ２＋］ｉ応答を低下させた（図４Ｄ）。これは、β細胞の形質膜を通じた主要なＣａ２＋流入を示唆している。
【００４５】
論考
上で詳述された結果は、インスリン分泌のために極めて重要な正オートクリンフィードバックループを仲介するため、ヒトβ細胞が、細胞外ＡＴＰのための受容体を発現していることを示すものである。我々は、このオートクリンフィードバックループが、ヒトおよび非ヒト霊長類の膵島においては存在するが、我々が調べた他の種における膵島においては存在しないことの証拠を示してきた。これらの結果は、霊長類では、グルコース濃度の増加に迅速に応答してインスリンの分泌を増大させるといったＡＴＰ（プリン）シグナル伝達経路において、Ｐ２Ｘ受容体が優勢を占めているとの結論を支持している。
【００４６】
我々の発見は、ヒトβ細胞におけるＡＴＰのためのシグナル伝達経路を明らかにした。我々は、低グルコース濃度においてＡＴＰがすでに放出されることを発見した。これは、インスリン保持中の分泌顆粒からＡＴＰが放出されうることを示した最近の齧歯類の研究と一致している（１２，３４）。したがって、ＡＴＰシグナル伝達は、インスリンの分泌
に先行し、グルコース刺激に適切に応答するためにβ細胞を感作するのかもしれない。この見解は、シナプス前神経終末における神経伝達物質の放出をＡＴＰが促進することを示す研究結果と一致している（４９，５０）。我々の結果は、さらに、ＡＴＰ放出は、グルコース濃度の急増時に最も強力らしいことを示唆している。外因性のＡＴＰは、一定のグルコース濃度（３ｍＭまたは１１ｍＭ）に保持された膵島において強力な応答を増進させたが、グルコース濃度の急増中では効果的ではなかった。これは、これらの条件下において、内因性放出されたＡＴＰにより、受容体が完全に活性化されたことを示唆している。
【００４７】
したがって、我々は、グルコース刺激に続いて起こるインスリン放出のためのオートクリン正フィードバックループにおいて、ＡＴＰがシグナルサービング（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｒｖｉｎｇ）であることを示した。ＡＴＰシグナル伝達に関してヒトβ細胞と齧歯類β細胞との間にかなりの違いを示した我々の結果は、ヒト膵島の構造および機能が他のものと区別を示すものであることを繰り返し述べた（３１，３２）。我々の研究は、ＡＴＰが霊長類の膵島におけるインスリン放出の刺激物質としての可能性を持つが、他の調べた種の膵島においては可能性を持たないことを明らかにした。我々は、テストされたすべての種について同一の技術的なアプローチを用いたため、最も確実らしい説明は、ＡＴＰシグナル伝達は、種の間で異なるということである。
【００４８】
プリン作動性シグナル伝達の違いは、それぞれ異なる種のβ細胞が、異なるサブセットのプリン受容体を発現していることを示唆している。我々の結果は、Ｐ２Ｘ受容体とＰ２Ｙ受容体との両方がヒトβ細胞において活性化されうるが、Ｐ２Ｘ受容体により仲介される応答が優勢を占めていることを示している。マウスでは、ＡＴＰは、Ｐ２Ｘ受容体ではなくＰ２Ｙ受容体を通じたβ細胞での［Ｃａ２＋］ｉ応答を優勢的に引き出した（２６，５１）。いかなる種の膵臓内分泌部においても、Ｐ２Ｘ受容体の発現について調べた研究はほんのわずかである。最近、単離された単一マウスβ細胞において、Ｐ２Ｘ１受容体およびＰ２Ｘ３受容体が同定された（３０）。また、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、およびＰ２Ｘ６が、マウスおよびラットの膵臓において検出された（２８，５２，５３）。
【００４９】
本発明のメカニズムに関するいかなる理論にも縛られるものではないが、Ｐ２Ｘ３受容体は、ヒトβ細胞の電気的活動の形成に対して寄与している可能性が最も高い。３ｍＭグルコースでのＡＴＰの直接適用は、大量のインスリンと［Ｃａ２＋］ｉ応答とを引き出し、これは、高グルコースまたはＫＣｌの脱分極により引き出されるものに匹敵した。Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストでのＡＴＰ受容体のブロッキングは、高グルコースに対するインスリン応答を６５％にまで低下させ（図２）、応答に対してＡＴＰ受容体活性化が強く寄与していることを明らかにした。
【００５０】
我々の結果は、さらに、ＡＴＰに対するヒトβ細胞応答のほとんどは、イオンチャネル型Ｐ２Ｘ受容体により仲介されることを示唆した（図４）。この活性化は、非常に大きな内向き電流をｎＡレンジで促進し、これにより、β細胞の膜を脱分極させる。結果として、増加された電気的活動が生じる（３０）。しかしながら、電流の正確な程度は、放出されたＡＴＰの量、受容体の密集状態、および／またはそれらの配置に依存するだろう。技術的なアプローチの組み合わせを用いることにより、我々は、一貫して、ヒトβ細胞においてＰ２Ｘ３受容体を同定した。Ｐ２Ｘ１受容体、Ｐ２Ｘ２受容体、Ｐ２Ｘ４受容体、およびＰ２Ｘ６受容体は、齧歯類β細胞において発現されていると報告されたが（２８，３０，５２，５３）、ヒトβ細胞では検出できなかった。対照的に、我々の研究は、Ｐ２Ｘ５およびＰ２Ｘ７の存在を明らかにした。したがって、ヒトβ細胞でのＰ２Ｘ受容体は、モノマー、またはＰ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ５、およびＰ２Ｘ７の組み合わせのヘテロマーとして存在している可能性がある。ヒトＰ２Ｘ５遺伝子の重要な位置での多型の存在は、ヒトの少数のサブセットのみが（〜１４％）、機能的なタンパク質を処理および翻訳するもので
あり（５４，５５）、ほとんどのヒト（人間）ではβ細胞でのＡＴＰシグナル伝達に対してＰ２Ｘ５が寄与することを除外していることを示唆している。Ｐ２Ｘ７受容体は、Ｐ２Ｘ３とのヘテロ型の受容体を形成することはなさそうだが、ホモ型の受容体として働く可能性はある。しかしながら、ホモ型のＰ２Ｘ７受容体は、通常のβ細胞の生理機能に参加しなさそうである。それは、それらの活性化が１００μＭを超えるＡＴＰ濃度を必要とするからである（１７）。これは、Ｐ２Ｘ７受容体アンタゴニストが、ＡＴＰにより仲介される正オートクリンフィードバックループに影響しなかったことを示す我々の結果に一致する。生理的な条件下において、最も確実らしいシナリオは、Ｐ２Ｘ３のホモ型の受容体が、我々が述べているインスリン放出のための正オートクリンフィードバックループを仲介しているというものである。
【００５１】
正フィードバックのオートクリンループにより、細胞は、外部からの刺激に対するシグナル伝達応答の大きさおよび期間を調節することができる（５６）。血糖の増加により活性化されるとβ細胞分泌応答に対する速さおよび感度が増す自動調節システムにおいてＡＴＰが機能することが考えられる。  グルコース濃度の増加時に、β細胞はインスリンに加えてＡＴＰを分泌する。放出されたＡＴＰは、その後、β細胞形質膜のＰ２Ｘ３受容体を活性化する。Ｐ２Ｘ３受容体の活性化は、Ｃａ２＋およびＮａ＋の流入により仲介される膜の脱分極と（１７）、それに続いて起こる電位作動型のＣａ２＋チャネルの開口とを引き起こす。これは、［Ｃａ２＋］ｉを増加させ、インスリン分泌を高める結果となる。この正フィードバックにより、β細胞は、血漿中のグルコース濃度の小さな変化をインスリン放出の大きな変化へと転換することができる。したがって、正ＡＴＰオートクリンシグナル伝達は、血液グルコース濃度のあまり大きくはない生理的な変化に対する応答において、どのようにして適切で素早いインスリン放出が達成されるのかを説明し得る。
【００５２】
参考文献
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年10月17日(2012.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン分泌を必要とする対象においてインスリン分泌を増加させるための医薬を製造するための、Ｐ２Ｘプリンアゴニストの使用。
【請求項２】
前記対象はヒトである
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記対象は、真性糖尿病を患っている
請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記真性糖尿病は２型糖尿病である
請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、Ｐ２Ｘ３アゴニストである
請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ、およびα，β−メチレンＡＴＰからなる群から選択される
請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、標的組織において１０μＭから１ｍＭの間の濃度になる用量で投与される
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、標的組織において１０μＭから１００μＭの間の濃度になる用量で投与される
請求項７に記載の使用。
【請求項９】
インスリン分泌を必要とする対象においてインスリン分泌を増加させるためのＰ２Ｘプ
リンアゴニストの有効量を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｐ２Ｘプリンアゴニストは、Ｐ２Ｘ３アゴニストである
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記Ｐ２Ｘ３アゴニストは、２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ｍｅＳＡＴＰ）、５−ブロモウリジン５−トリホスフェート、３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ、およびα，β−メチレンＡＴＰからなる群から選択される
請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
霊長類におけるインスリン分泌を増加させるために効果的な化合物／作用物質のためのスクリーニング方法であって、
テスト化合物をＰ２Ｘ３受容体にインビトロで接触させることと、前記受容体の活性を測定することを含み、
前記受容体の活性の増加が、インスリン分泌を増加させる効果のある候補化合物を示す、方法。
【請求項１３】
前記Ｐ２Ｘ３受容体は単離された細胞上にある
請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記活性は、前記細胞由来のインスリン分泌を測定することにより測定される
請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は、膵島細胞である
請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記霊長類はヒトである
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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