(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つのリジン残基を含むポリペプチド中の特定のリジン残基を修飾する方法であって、（ａ）第１の保護基によって保護された標的リジン残基及び少なくとも１つのさらなるリジン残基を含むポリペプチドを用意するステップと、（ｂ）前記ポリペプチドを処理して、前記（１又は２以上の）さらなるリジン残基を保護するステップであって、前記さらなるリジン残基の保護基が前記標的リジン残基の保護基とは異なるステップと、（ｃ）前記標的リジン残基を選択的に脱保護するステップと、（ｄ）（ｃ）の脱保護されたリジン残基を修飾するステップとを含む方法に関する。
2013522352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのリジン残基を含むポリペプチド中の特定のリジン残基を修飾する方法であって、
（ａ）第１の保護基によって保護された標的リジン残基及び少なくとも１つのさらなるリジン残基を含むポリペプチドを用意するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを処理して、前記（１又は２以上の）さらなるリジン残基を保護するステップであって、前記さらなるリジン残基の保護基が前記標的リジン残基の保護基とは異なるステップと、
（ｃ）前記標的リジン残基を選択的に脱保護するステップと、
（ｄ）（ｃ）の脱保護されたリジン残基を修飾するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドの作製が、
（ｉ）標的リジンをコードする直交性コドンを含む、前記ポリペプチドをコードする核酸を用意するステップと、
（ii）前記直交性コドンを認識でき且つ第１の保護基によって保護された標的リジン残基を前記ポリペプチド鎖に取り込むことができる直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対の存在下において、前記核酸を翻訳するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
直交性コドンがＴＡＧを含み、ｔＲＮＡがＭｂｔＲＮＡＣＵＡを含み、ｔＲＮＡシンセターゼがＭｂＰｙｌＲＳを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の保護基によって保護された標的リジン残基が、Ｎε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
さらなるリジン残基の保護基が、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、ポリペプチドを塩基性ＤＭＳＯ中のＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ）で処理することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が、ポリペプチドを、水中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｄ）の修飾が、
（ｉ）チオエステルを、Ａｇ（Ｉ）の存在下におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換によって活性化するステップと、
（ii）接続されるポリペプチドを標的リジンに加えるステップと、
（iii）インキュベートして、特異的なイソペプチド結合を形成させるステップと
を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）の修飾を、標的リジン残基のε−アミノ基上で実施する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）において標的リジンに対して複数の修飾を行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（１又は２以上の）さらなるリジン残基を脱保護するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）が、ポリペプチドを、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：硫化ジメチル（ＤＭＳ）の１：３：６の比の混合物で処理することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）が、第１の保護基によって保護された標的リジン残基を、ポリペプチド鎖にその翻訳中に遺伝的に取り込むことによって、ポリペプチドを作製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドがユビキチンである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）の修飾が、さらなるポリペプチド鎖の、標的リジンへの共有結合である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
さらなるポリペプチド鎖がユビキチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）〜（ｄ）を繰り返して、リジン残基を介する共有結合によって接続されたポリペプチドの鎖を作製する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって作製されたポリペプチド。
【請求項１９】
Ｋ−結合ユビキチン鎖を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
Ｋ−結合がＫ６又はＫ２９結合である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
Ｋ２９脱ユビキチン化酵素としてのＴＲＡＢＩＤの使用。
【請求項２２】
Ｋ２９結合ユビキチンをＴＲＡＢＩＤと接触させることを含む、Ｋ２９結合ユビキチンの切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の合成及び修飾に関する。詳細には、本発明は、リジン−結合タンパク質修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
リジン残基は、タンパク質翻訳後修飾の重要な決定基（determinant）であり、ユビキチン化、メチル化及びアセチル化などの重要な翻訳後修飾におけるそれらの使用は周知である。タンパク質内で特定のリジン残基を選択的に修飾することは、依然として課題のままである。
【０００３】
ユビキチン化は、アクセプタータンパク質中の特定のリジン残基がユビキチンドナーのＣ末端とイソペプチド結合を形成する、可逆的な翻訳後修飾である。プロテアソーム標的化によるタンパク質安定性の調節におけるユビキチン化の役割は確立されており、一方、ユビキチンは、細胞シグナリング、細胞内輸送及びＤＮＡ損傷に対する応答を含む生物学のほぼ全ての態様に関与することが明らかになりつつある（Chen, Z.J. & Sun, L.J., Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol Cell 33 (3), 275-286 (2009)、Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009)）。ユビキチンは、そのリジン残基（Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８又はＫ６３）の各々を介して又はそのＮ−末端を介して共有結合鎖を形成する。多様な生物学的プロセスにおいてユビキチンによって媒介される異なる機能は、種々のユビキチン鎖の異なる性質においてコード化されている可能性があることが提唱されている（Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009)、Ikeda, F. & Dikic, I., Atypical ubiquitin chains: new molecular signals. 'Protein Modifications: Beyond the Usual Suspects' review series. EMBO Rep 9 (6), 536-542 (2008)）。
【０００４】
プロテオミクス研究により、全ての鎖型がインビボで存在することが明らかにされているが（Peng, J. et al., A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nat Biotechnol 21 (8), 921-926 (2003)、Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009)）、知られているのはほとんど、プロテアソームの分解及び細胞シグナリングにおいてそれぞれ重要なＫ４８鎖及びＫ６３鎖についてである（Chen, Z.J. & Sun, L.J., Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol Cell 33 (3), 275-286 (2009)、Hershko, A. & Ciechanover, A., The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479 (1998)）。その一方、他のいわゆる「非定型の」結合についてはほとんど知られていないが、それらが、プロテオミクスデータが存在するモデル微生物で見出されるユビキチン結合の過半数を占める（Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009)）。特定のユビキチン鎖の役割研究における中心的な課題は、規定された結合を有する均一な鎖を合成することである。
【０００５】
本発明は、先行技術と関連した（１又は２以上の）課題の解決を目指す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chen, Z.J. & Sun, L.J., Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol Cell 33 (3), 275-286 (2009)
【非特許文献２】Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009)
【非特許文献３】Ikeda, F. & Dikic, I., Atypical ubiquitin chains: new molecular signals. 'Protein Modifications: Beyond the Usual Suspects' review series. EMBO Rep 9 (6), 536-542 (2008)
【非特許文献４】Peng, J. et al., A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nat Biotechnol 21 (8), 921-926 (2003)
【非特許文献５】Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009)
【非特許文献６】Hershko, A. & Ciechanover, A., The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479 (1998)
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、ポリペプチド鎖内の個々のリジン残基を特異的に修飾の標的とするという課題を解決した。これの一態様は、（１又は２以上の）標的リジンの化学的保護を遺伝的にコードすることである。これは、ポリペプチド鎖内の（１又は２以上の）特定の残基の部位特異的な保護を可能にする。
【０００８】
より重要なことに、発明者らは、ポリペプチド中のリジンを差次的に保護する技術を開発した。具体的には、発明者らは、遺伝的にコードされた保護とは異なる化学的保護の使用を教示する。
【０００９】
このように、残基の保護を遺伝的にコードすることによって、標的リジンが部位特異的に保護されたポリペプチドを作製することができる。次いで、部位特異的保護リジンを有するこのポリペプチドを化学的に処理して、残りの（保護されていない）リジン残基の各々を種々の化学的保護基で保護することができる。この２段アプローチには、完成ポリペプチドがそのリジン上に２つの異なる型の化学的保護を有するという利点がある。このため、最初の標的リジンは、他のリジン上の他の保護基を未変化のまま残す化学反応によって選択的に脱保護することができる。このように、標的リジンを、部位特異的に脱保護し、したがって、他のリジンが影響を受けないまま修飾し得る。
【００１０】
最後に未修飾のリジンは全て、必要に応じて、ネーチャーアイデンチカル（nature-identical）のリジン残基を残すように脱保護してもよい。
【００１１】
本発明は、ポリペプチド配列中の（１又は２以上の）標的リジンの選択的な保護／脱保護のためのこのような独創的で差次的な化学的アプローチに基づく。
【００１２】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも２つのリジン残基を含むポリペプチド中の特定のリジン残基を修飾する方法であって、
（ａ）第１の保護基によって保護された標的リジン残基及び少なくとも１つのさらなるリジン残基を含むポリペプチドを用意するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを処理して、前記（１又は２以上の）さらなるリジン残基を保護するステップであって、前記さらなるリジン残基の保護基が前記標的リジン残基の保護基とは異なるステップと、
（ｃ）前記標的リジン残基を選択的に脱保護するステップと、
（ｄ）（ｃ）の脱保護されたリジン残基を修飾するステップと
を含む方法を提供する。
【００１３】
好適には、ポリペプチドの作製は、
（ｉ）標的リジンをコード化する直交性（orthogonal）コドンを含む、前記ポリペプチドをコード化する核酸を用意するステップと、
（ii）前記直交性コドンを認識でき且つ第１の保護基によって保護された標的リジン残基を前記ポリペプチド鎖に取り込むことができる直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対の存在下において、前記核酸を翻訳するステップと
を含む。
【００１４】
好適には、直交性コドンはＴＡＧを含み、ｔＲＮＡはＭｂｔＲＮＡＣＵＡを含み、ｔＲＮＡシンセターゼはＭｂＰｙｌＲＳを含む。
【００１５】
好適には、第１の保護基によって保護された標的リジン残基は、Ｎε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンからなる群から選択される。
【００１６】
好適には、第１の保護基によって保護された標的リジン残基は、Ｎε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンである。
【００１７】
好適には、さらなるリジン残基の保護基は、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ，N-(benzyloxycarbonyloxy) succinimide）からなる群から選択される。さらなるリジン残基の保護基がＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ）である場合には、好適には、それは塩基性ＤＭＳＯ中において供給される。
【００１８】
好適には、さらなるリジン残基の保護基は、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ）である。
【００１９】
好適には、ステップ（ｂ）は、ポリペプチドを塩基性ＤＭＳＯ中のＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ）で処理することを含む。
【００２０】
好適には、使用するＣｂｚ−ＯＳｕの量は、［処理されるポリペプチドの量に相当するモル量］×［ポリペプチド中の保護されるリジンの数＋１］として求められる。これは、保護されるリジンとの反応に対してわずかに過剰の保護基を有利に提供し、したがって、反応を完了（飽和／均一性）の方向へ推進するのを役立つ。
【００２１】
好適には、ステップ（ｃ）は、ポリペプチドを水中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，trifluoroacetic acid）で処理することを含む。
【００２２】
好適には、ステップ（ｄ）の修飾は、
（ｉ）チオエステルを、Ａｇ（Ｉ）の存在下におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換によって活性化するステップと、
（ii）接続すべきポリペプチドを標的リジンに加えるステップと、
（iii）インキュベートして、特異的なイソペプチド結合を形成させるステップと
を含む。
【００２３】
好適には、ステップ（ｄ）の修飾は、標的リジン残基のε−アミノ基上で実施する。
【００２４】
好適には、ステップ（ｄ）において標的リジンに対して複数の修飾を行うことができる。
【００２５】
好適には、前記方法は、（１又は２以上の）さらなるリジン残基を脱保護するステップ（ｅ）をさらに含む。好適には、ステップ（ｅ）は、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ，trifluoromethanesulfonic acid）：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：硫化ジメチル（ＤＭＳ，dimethylsulfide）の１：３：６の比の混合物でポリペプチドを処理することを含む。
【００２６】
修飾の完了後のように残りのリジンを全て脱保護する１つの利点は、ポリペプチドをその天然の形態にできるだけ近い形態で復元することである。
【００２７】
好適には、ステップ（ａ）は、第１の保護基によって保護された標的リジン残基を、ポリペプチド鎖にその翻訳の間に遺伝的に取り込むことによって、ポリペプチドを作製することを含む。
【００２８】
好適には、ポリペプチドはユビキチンである。
【００２９】
好適には、ステップ（ｄ）の修飾は、さらなるポリペプチド鎖の、標的リジンへの共有結合である。好適には、さらなるポリペプチド鎖はユビキチンである。この実施形態において、本発明は、（１又は２以上の）ポリペプチドのユビキチン化に有利に適用することができる。
【００３０】
一部の実施形態において、ポリペプチドはユビキチンであり、さらなるポリペプチド鎖はユビキチンである。これらの実施形態において、本発明は、ユビキチン鎖の製造に有利に適用される。これらの鎖は、単に第１のポリペプチド中における標的化に適切なリジン残基を選択することによって、Ｋ−結合型のユビキチン（例えば、Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８又はＫ６３結合ユビキチン）のいずれかで作ることができる。
【００３１】
複数の修飾を行う場合には、ステップ（ｃ）〜（ｄ）を繰り返して、リジン残基を介する共有結合によって接続されたポリペプチドの鎖を作製することができる。この作製は、一連の修飾において次の反応へ進む前に、修飾の各ラウンドの最後に反復脱保護を伴い得ることは明らかである。あるいは、その後の修飾に使用される反応化学が（１又は２以上の）前の修飾ラウンドからの標的リジン（又は修飾標的リジン）に対して既に特異的である場合には、その後の修飾に保護／脱保護が必要ないこともある。
【００３２】
本発明はまた、前述のようにして作製される（１又は２以上の）ポリペプチドを提供する。前記（１又は２以上の）ポリペプチドは、Ｋ−結合ユビキチン鎖を含み得る。前記Ｋ−結合は、Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８又はＫ６３結合であることができる。好適には、Ｋ−結合は、Ｋ６又はＫ２９結合である。
【００３３】
別の態様において、本発明は、Ｋ２９脱ユビキチン化酵素としてのＴＲＡＢＩＤの使用に関する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、Ｋ２９結合ユビキチンをＴＲＡＢＩＤと接触させることを含む、Ｋ２９結合ユビキチンの切断方法に関する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの保護されたリジン残基を含むユビキチンポリペプチドに関する。ユビキチンポリペプチドは、Ｋ６Ｂｏｃ及びＫ２９Ｂｏｃの１又は２以上を含む。
【００３６】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのリジンコドンが直交性コドンに置き換えられているユビキチンをコードする核酸に関する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、例えば、ＤＮＡ損傷への応答の活性化若しくは促進に使用するための、及び／又は早期発症乳癌若しくは卵巣癌などの癌の予防若しくは治療に使用するための、本発明のＫ−結合ユビキチンの使用に関する。このような使用は、医学の分野で有利に応用にされる可能性がある。
【００３８】
本発明の好ましい方法はまた、以下の明細書中で、ＧＯＰＡＬ（遺伝的にコードされた直交性保護及び活性化連結，Genetically-encoded Orthogonal Protection and Activated Ligation）と称することができる。
【００３９】
好適には、本発明による方法における標的化反応は、タンパク質同士を結合させるのに使用する。
【００４０】
本発明の別の態様において、前記方法から得られるタンパク質を提供する。好適には、タンパク質はユビキチンである。
【００４１】
本発明の別の態様において、ユビキチンポリペプチドが６位及びＣ末端でリジンアミノ酸残基によって結合されている、均一に結合されたユビキチン鎖を提供する。前記ユビキチン鎖は、ＤＮＡ損傷への応答の活性化又は促進に、したがって、癌の予防又は治療に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
次に、本発明を図面に関して記載する。
【図１】Ｋ６−結合ジユビキチンの合成について例証される、部位特異的イソペプチド結合形成のＧＯＰＡＬストラテジーを示す図である。１は、Ｎε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンである（青で示される）。Ｃｂｚ−ＯＳｕは、タンパク質中のリジンのＮε−アミンと反応してＮε−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンを生じるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）スクシンイミドである。ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、ＨＯＳｕはＮ−（ヒドロキシ）スクシンイミドであり、ＴＦＭＳＡはトリフルオロメタンスルホン酸であり、ＤＭＳは硫化ジメチルである。
【図２】ＵＣＨ−Ｌ３によるＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６からのヘキサヒスチジンタグの切断を示す図である。
【図３】イソペプチド結合形成のためのドナー及びアクセプターユビキチン反応パートナーの特性決定を示すグラフである。Ａ．アクセプターユビキチンのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）。６位に１が遺伝的に取り込まれたユビキチン（ＵｂＢｏｃＫ６、緑のトレース、ｉ）。ＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６のＣ末端Ｈｉｓタグを、ＵＣＨ−Ｌ３で除去した（観測質量＝８６６５Ｄａ、計算質量＝８６６５Ｄａ）。ｉａはＮａ＋付加物である。青色のＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、遊離アミンがＣｂｚで化学的に保護され且つ６位の１のＢｏｃ保護基が選択的に脱保護された、ＵｂＢｏｃＫ６を示す。iiは、ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７）（観測質量＝９５０１．５Ｄａ、計算質量＝９５０３Ｄａ）であり、iiａはＵｂＫ６（Ｃｂｚ７）＋Ｎａ＋であり；iiiはＵｂＫ６（Ｃｂｚ８）（観測質量＝９６３６．５Ｄａ、計算質量＝９６３７Ｄａ）であり、iiiａは、ＵｂＫ６（Ｃｂｚ８）＋Ｎａ＋である。iiａ及びiiａはそれぞれ、ＴＦＡによる１のＢｏｃ基の不完全な脱保護によって生じる少量のＵｂＢｏｃＫ６（Ｃｂｚ７）及びＵｂＢｏｃ６（Ｃｂｚ８）に相当する。Ｂ．精製ユビキチン−ＭＥＳチオエステル（ＵｂＳＲ、オレンジ色のトレース、ｉ）。観測質量＝８６９０Ｄａ、計算質量＝８６８９Ｄａ。青色のＥＳＩ−ＭＳトレースは、遊離アミンがＣｂｚ保護基で化学的に保護されているＵｂＳＲを示す。iiは、ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８）（観測質量＝９７６０Ｄａ、計算質量＝９７６１Ｄａ）であり、iiiは、ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ９）（観測質量＝９８９５Ｄａ、計算質量＝９８９５Ｄａ）である。
【図４】Ｋ６−及びＫ２９−結合ジユビキチンの合成、精製及び特性決定を示す図である。Ａ．ＵｂＢｏｃＫ６（Ｃｂｚ７−８）とＵｂＳＲ（Ｃｂｚ７−８）との間のイソペプチド形成反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーンＭ、広範囲分子量マーカー（Bio-Rad社）；レーンｉ、濃度基準化ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ７−８）インプット；レーンii、濃度基準化ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７−８）インプット；レーンiii、１６時間後のＫ６イソペプチド結合形成反応混合物。Ｂ．MonoS陽イオン交換クロマトグラフィー後の純粋なＵｂＫ６２の溶出画分。Ｃ．精製Ｋ６−結合ジユビキチン（ＵｂＫ６２）のＥＳＩ−ＭＳ分析は、イソペプチド結合の形成を実証している（観測質量＝１７１１３、計算質量＝１７１１２）。Ｄ．精製Ｋ２９−結合ジユビキチン（ＵｂＫ２９２）のＥＳＩ−ＭＳ分析。ｉは、イソペプチド結合（観測質量＝１７１１１、計算質量＝１７１１２）の形成であり、iiは、硝酸塩（観測質量＝１７１７４、計算質量＝１７１７５Ｄａ）である。Ｅ．トリプシンＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｋ６が、精製Ｋ６−結合ジユビキチン試料中のイソペプチド結合形成部位であることを裏付けている。ペプチドＭＱＩＦＶＫ（ＧＧ）ＴＬＴＧＫは、アクセプターユビキチンに付着されたドナーユビキチンからの２つのグリシン残基を含有している。Ｆ．ＡＫ（ＧＧ）ＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲのトリプシンＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｋ２９が、精製Ｋ２９−結合ジユビキチン試料中のイソペプチド結合形成部位であることを裏付けている。
【図５】（ＵｂＫ６）２の精製を示す図である。Ａ．再び折り畳まれた粗（ＵｂＫ６）２についての１回目のイオン交換クロマトグラフィー。緩衝液Ａは、ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）である。緩衝液Ｂは、ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）、１Ｍ  ＮａＣｌである。Ｂ．２回目のイオン交換クロマトグラフィーであり、純粋なＫ６−結合ジユビキチンを生じる。緩衝液Ａは、ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）である。緩衝液Ｂは、ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）、１Ｍ  ＮａＣｌである。
【図６】Ｋ６−結合ジユビキチンの構造を示す図である。Ａ．キー残基がボール−スティック表示で示される略画表示での、結晶構造に由来するコンパクトなＫ６−結合ジユビキチン分子の２つの図。遠位分子（黄色）がそのＣ末端を介して近位部分（オレンジ色）のＬｙｓ６に結合されている。疎水表面残基がそれぞれ、青色（Ｉｌｅ４４、Ｖａｌ７０）及び緑色（Ｌｅｕ８）で色づけされ、ユビキチン分子のＮ末端及びＣ末端が示されている。Ｂ．Ａの場合と同じ図中のＫ６−結合ジユビキチンが、表面表示で示されている。遠位分子の露出したＩｌｅ４４、Ｖａｌ７０が青色で示されている。Ｃ．Ｋ６−結合二量体のユビキチン−ユビキチン界面のクローズアップ図。Ａの場合と同様に色づけされたユビキチン主鎖が幅広のリボンとして示され、界面の残基は、スティック表示で示されている。近位界面を形成している疎水残基（Ｉｌｅ４４、Ｖａｌ７０、Ａｒｇ４２）は青色、遠位界面の疎水残基（Ｌｅｕ７１、Ｌｅｕ８、Ｉｌｅ３６）は緑色である。Ｇｌｎ４９ｐｒｏｘとＴｈｒ９ｄｉｓｔとの界面水素結合は、灰色の点線として示されている。Ｄ．Ｋ４８−結合ジユビキチンの構造からの遠位ユビキチン分子（ピンク色、ｐｄｂ−ｉｄ  １ａａｒ（Cook, W.J., Jeffrey, L.C., Carson, M., Chen, Z., & Pickart, C.M., Structure of a diubiquitin conjugate and a model for interaction with ubiquitin conjugating enzyme (E2). J Biol Chem 267 (23), 16467-16471 (1992)））は、Ａの場合と同様に、Ｋ６−結合ジユビキチンからの遠位ユビキチン（黄色／オレンジ色）上に重なっている。Ｋ４８−結合ジユビキチン及び大部分のユビキチン複合体（ubiquitin complex）構造において、Ｌｅｕ８は一般に、Ｉｌｅ４４パッチの疎水性に寄与する。Ｋ６−結合ジユビキチン中のＬｅｕ８−ループのコンフォメーション変化によりＩｌｅ４４−表面からＬｅｕ８が除去され、垂直なＩｌｅ３６表面においてＫ６−相互作用に関与する。Ｅ．Ｋ６−、Ｋ４８−、Ｋ６３−及び直鎖状ジユビキチン構造の比較。Ｆ．Ｋ６−結合ジユビキチンの非対称界面のため、Ｋ６−接触の伝搬が可能である。Ｇ．二量体の近位ユビキチン部分が、連続して遠位ユビキチン上に重なっているＫ６−結合ユビキチン六量体のモデル化。これは、細長いＫ６−結合鎖が、５回らせん軸（five-fold screw axis）を有するらせん状フィラメントを形成し得ることを明らかにしている。ユビキチン単位のこの配列において、鎖中の個々のユビキチン分子間に衝突はなく、鎖中のＵｂ＋２及びＵｂ−２（Ｃ：Ａ及びＣ：Ｅの分子間は８３Å２）への追加の界面が形成され得る（分子Ｃに関して示された値）。
【図７】（ＵｂＫ６）２、（ＵｂＫ２９）２及び（ＵｂＫ６３）２に対するＤＵＢ活性のプロファイリングを示す図である。Ａ．脱ユビキチン化酵素に対してプロファイリングされたＫ６−結合ジユビキチン（ＵｂＫ６）２が、ゲルの上に示されている。試料は、１０分後及び６０分後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。脱ユビキチン化酵素ファミリーが、ゲルの上に示されている。脱ユビキチン化酵素アッセイは、以前に記載されたようにして実施した（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。３０μＬの反応において、３μｇのジユビキチンを、示されている脱ユビキチン化酵素と共にインキュベートした。反応生成物をクエンチし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードして、脱ユビキチン化酵素によって媒介された切断によって生じたモノユビキチン（Ｕｂ）からジユビキチンを分離させた。高活性のＵＳＰ２、ＵＳＰ５及びＵＳＰ２１の場合は、ＤＵＢは反応当たり酵素０．２μｇで用いた。我々は、０．１μｇのCezanneを使用した。これはＫ１１−結合ジユビキチンの完全な加水分解に充分である（Bremm, A., Freund, S.M.V. & Komander, D. Lys11-linked ubiquitin chains adopt compact conformations and are preferentially hydrolysed by the deubiquitinase Cezanne. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 939-947 (2010)、データは示さず）。他の全てのＤＵＢには、２μｇの酵素を使用した。Ｂ及びＣ．Ｋ２９−結合ジユビキチン及びＫ６３−結合ジユビキチンをそれぞれ、Ｋ６の実験に使用した同じ脱ユビキチン化酵素に対してプロファイリングした。
【図８】Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの合成について例証される、部位特異的イソペプチド結合形成のＧＯＰＡＬストラテジーを示す図である。１は、Ｎε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンである（青で示される）。Ｃｂｚ−Ｏｓｕは、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）スクシンイミドであり、タンパク質中のリジンのＮε−アミンと反応してＮε−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンを生じる。ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、ＨＯＳｕはＮ−（ヒドロキシ）スクシンイミドであり、ＴＦＭＳＡはトリフルオロメタンスルホン酸である。
【図９】Ｌｙｓ６−結合ユビキチン及びＬｙｓ２９−結合ユビキチンの合成及び特性決定を示す図である。（ａ）アクセプターユビキチンのＥＳＩ−ＭＳ。緑のトレースにおいて、６位に１が遺伝的に取り込まれているユビキチン（ＵｂＢｏｃＬｙｓ６）は「ｉ」であり（観測質量＝８，６６５Ｄａ、計算質量＝８，６６５Ｄａ）、「ｉａ」は、Ｎａ＋付加物である。青色のトレースは、Ｃｂｚによる化学的保護及び６位の１のＢｏｃ保護基の選択的脱保護後のＵｂＢｏｃＬｙｓ６である。「ii」は、ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７）（観測質量＝９，５０１．５Ｄａ、計算質量＝９，５０３Ｄａ）であり；「iiａ」は、ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７）＋Ｎａ＋であり；「iii」は、ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ８）（観測質量＝９，６３６．５Ｄａ、計算質量＝９，６３７Ｄａ）であり；「iiiａ」は、ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ８）＋Ｎａ＋である。「ii＋Ｂｏｃ」及び「iii＋Ｂｏｃ」はそれぞれ、残りの微量のＵｂＢｏｃＬｙｓ６（Ｃｂｚ７）及びＵｂＢｏｃＬｙｓ６（Ｃｂｚ８）に相当する。（ｂ）精製ユビキチン−ＭＥＳチオエステル（ＵｂＳＲ、オレンジ色のトレース、「ｉ」、観測質量＝８，６９０Ｄａ、計算質量＝８，６８９Ｄａ）。青色のトレースは、Ｃｂｚ保護後のＵｂＳＲを示す。「ii」は、ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８）（観測質量＝９，７６０Ｄａ、計算質量＝９，７６１Ｄａ）であり；「iii」は、ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ９）（観測質量＝９，８９５Ｄａ、計算質量＝９，８９５Ｄａ）である。（ｃ）精製Ｌｙｓ６−結合ジユビキチン（ＵｂＬｙｓ６２）のＥＳＩ−ＭＳ分析は、イソペプチド結合（観測質量＝１７，１１３Ｄａ、計算質量＝１７，１１２Ｄａ）の形成を示している。（ｄ）精製Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチン（ＵｂＬｙｓ２９２）のＥＳＩ−ＭＳ分析。「ｉ」は、イソペプチド結合（観測質量＝１７，１１１Ｄａ、計算質量＝１７，１１２Ｄａ）の形成であり；「ii」は、Ｎａ＋、Ｋ＋付加物（観測質量＝１７，１７４Ｄａ、計算質量＝１７，１７２Ｄａ）である。（ｅ、ｆ）トリプシンＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｌｙｓ６及びＬｙｓ２９がそれぞれ、精製Ｌｙｓ６及びＬｙｓ２９連結試料中のイソペプチド結合形成部位であることを裏付けている。ｄｉＵｂ、ジユビキチン。
【図１０】Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの構造を示す図である。（ａ）Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの２つの図であり、遠位分子が黄色、近位部分がオレンジ色である。疎水表面残基が、青色（Ｉｌｅ４４、Ｖａｌ７０）及び緑色（Ｌｅｕ８、Ｉｌｅ３６、Ｌｅｕ７１）で色づけされている。イソペプチド結合は、フレキシブルであり、Ｇｌｙ７６は無秩序である（補足図３ａを参照のこと）。（ｂ）表面表示で示されたＬｙｓ６−結合ジユビキチン。遠位分子の露出したＩｌｅ４４及びＶａｌ７０が青色で示されている。（ｃ）非対称Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの概略図。（ｄ）Ｌｙｓ６−結合ジユビキチン界面のクローズアップ図。近位界面を形成している残基は青色であり、遠位界面を形成している残基は緑色である。Ｇｌｎ４９ｐｒｏｘとＴｈｒ９ｄｉｓｔとの界面の水素結合は、灰色の点線として示されている。（ｅ）Ｌｙｓ４８−結合ジユビキチンの構造からの遠位ユビキチン分子（灰色、ＰＤＢ：１ａａｒ（Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, 2nd ed. (Academic Press, 2008)））は、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンからの遠位ユビキチン（黄色及びオレンジ色、ａの場合と同様）上に重なっている。Ｌｙｓ４８−結合ジユビキチン中のＩｌｅ４４パッチのＬｅｕ８は、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンのコンフォメーション変化を受けて、Ｉｌｅ３６表面及びＬｙｓ６−二量体界面に関与する。（ｆ）Ｌｙｓ６−、Ｌｙｓ１１−（ＰＤＢ、２ｘｅｗ（Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007)））、Ｌｙｓ４８−（ＰＤＢ、１ａａｒ（Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, 2nd ed. (Academic Press, 2008)））及びＬｙｓ６３−結合（ＰＤＢ、２ｊｆ５（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)））ジユビキチン及び直鎖状ジユビキチン（ＰＤＢ、２ｗ９ｎ（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)））構造の比較。近位分子が薄い色で示され、Ｉｌｅ４４、Ｖａｌ７０及びＬｅｕ８が青色に色づけされている。
【図１１】（ＵｂＬｙｓ６）２、（ＵｂＬｙｓ２９）２及び（ＵＬｙｓ６３）２に対する脱ユビキチン化酵素活性のプロファイリングを示す図である。各結合を、ゲルの上に示した脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）に対してプロファイリングした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、１０分後及び６０分後に銀染色を行った。脱ユビキチン化酵素ファミリーが、脱ユビキチン化酵素の上に示されている。脱ユビキチン化酵素アッセイは、補足的方法に記載したようにして実施した。完全なゲルは補足図４に示されている。
【図１２】（ＵｂＬｙｓ２９）２に対するＴＲＡＢＩＤの特異性定数が、定量的ウェスタンブロットで測定した場合に、（ＵｂＬｙｓ６３）２に対するよりも４０倍高いことを示す図である。（ａ）代表的な定量的ウェスタンブロット。反応に関与するAlexa-BSAの蛍光を用いて、ロード量を標準化した。上部２つのブロットは、１．３μＭ  ＴＲＡＢＩＤによるものであり、下部のブロットは１３０ｎＭのＴＲＡＢＩＤによるものである。Ｌｙｓ２９結合に対する１．３μＭのＴＲＡＢＩＤの０時点のレーンは、他の時点と同じゲルからのものであるが、介在する無関係なレーンを除いてある。（ｂ、ｃ）ＴＲＡＢＩＤによる（ＵｂＬｙｓ６３）２及び（ＵｂＬｙｓ２９）２切断の少なくとも３つの独立した試験の反応進行曲線を、補足的方法に記載したようにして適合させて、特異性定数を得た。エラーバーは、標準誤差を表す。完全なゲルは補足図７に示されている。Ｕｂ、ユビキチン。
【図１３】略図及び写真である。
【図１４】ＰｙｌＳ配列のアラインメントを示す図である。
【図１５】ＰｙｌＳ配列の配列同一性を示す図である。
【図１６】ＰｙｌＳ配列の触媒ドメインのアラインメント（３５０〜４８０、図１４のアラインメントからのナンバリング）を示す図である。
【図１７】ＰｙｌＳ配列の触媒ドメインの配列同一性を示す図である。
【図１８】Ｍ．バーケリＰｙｌＳ又はＭ．マゼイＰｙｌＳに基づく移植変異（transplanted mutation）を有するシンセターゼのアラインメントを示す図である。赤い星印は、変異位置を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
ポリペプチド中の標的リジンの保護基と（１又は２以上の）他のリジンの保護基が異なることは、本発明に不可欠である。差次的な脱保護化学反応が、標的残基の特異的又は選択的脱保護、その結果として修飾によってその標的残基を特異的又は選択的に修飾できるのは、これらの保護基の化学的な差異による。
【００４４】
好適には、ステップ（ｄ）における所望の反応は、リジン残基のε−アミノ基に対して実施する。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）で保護すべき他のリジン側鎖もまた、ε−アミノ基である。このような場合、前記方法は、ポリペプチド鎖の末端アミノ基にも適用される。
【００４６】
本発明による方法において、前記遺伝的取り込みは好ましくは、リジン側基鎖が保護されている特定のリジン残基をコードするように１又は２以上の特異的な直交性コドンが割り付けられている直交性又は拡張した遺伝子コードを使用し、その結果、直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対を用いることによってこのような保護リジン残基を遺伝的に取り込むことができる。直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対は原則として、保護リジンをｔＲＮＡにチャージでき且つ直交性コドンに応答してその保護リジンをポリペプチド鎖に取り込むことができる、任意のこのような対であることができる。
【００４７】
直交性コドンは、直交性のアンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン又は四塩基コドンであることができる。コドンは、保護リジン分子の運搬に用いられる直交性ｔＲＮＡに対応しさえすればよい。好ましくは、直交性コドンはアンバーコドンである。
【００４８】
本明細書中で示す具体例は、アンバーコドン及び対応するｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンセターゼを使用していることに留意すべきである。前述のように、これらは多様であることができる。あるいは、保護されたリジンを処理できる代替ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンセターゼ対をわざわざ使用又は選択することなく他のコドンを使用するためには、ｔＲＮＡのアンチコドン領域を、最適のコドンに望ましいアンチコドン領域と単に交換するだけでよい。アンチコドン領域は、ｔＲＮＡのチャージ機能又は取り込み機能にも、ｔＲＮＡシンセターゼによる認識にも関与しないので、このような交換は完全に、熟練した操作者の技術の範囲内である。
【００４９】
したがって、代替直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、必要に応じて使用できる。
【００５０】
好ましくは、直交性シンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）MSピロリジン（pyrrolysine）ｔＲＮＡシンセターゼ（ＭｂＰｙｌＲＳ）とその同族アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ）である。
【００５１】
メタノサルシナ・バーケリＰｙｌＴ遺伝子は、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ  ｔＲＮＡをコードする。メタノサルシナ・バーケリＰｙｌＳ遺伝子は、ＭｂＰｙｌＲＳ  ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質をコードする。数値アドレスを使用して特定のアミノ酸残基を示す場合、ナンバリングは、参照配列としてＭｂＰｙｌＲＳ（メタノサルシナ・バーケリピロリジル（pyrrolysyl）−ｔＲＮＡシンセターゼ）アミノ酸配列（すなわち、公表されている野生型メタノサルシナ・バーケリＰｙｌＳ遺伝子受入番号Ｑ４６Ｅ７７によってコード化されている）を用いて行う：
MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELS KQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREWGIDK PWIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL。
【００５２】
前記配列には、明細書中、以下において配列番号１を付してある。
【００５３】
必要ならば、当業者は、ＭｂＰｙｌＲＳ  ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質を、変異させることによって、使用される特定の保護側鎖を有するリジン種に対して最適化されるように適合させることができる。変異の必要性は、使用されるリジン残基及び保護／ケージ化基（caging group）によって決まる。ＭｂＰｙｌＲＳ  ｔＲＮＡシンセターゼを変異させる必要がない一例は、ステップ（ａ）において使用される保護側鎖を有するリジン残基がＮε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンである場合である。ＭｂＰｙｌＲＳ  ｔＲＮＡシンセターゼを変異させる必要があると考えられる一例は、ステップ（ａ）のリジン側基鎖が感光性ケージ化基などのより大きい化学基によって保護されている場合である。
【００５４】
このような変異は、ＭｂＰｙｌＲＳ  ｔＲＮＡシンセターゼ中の以下の位置：Ｍ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３の１又は２以上に変異を導入することによって実施できる。好ましくは、変異は、Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍを含むことができる。
【００５５】
ｔＲＮＡシンセターゼ
本発明のｔＲＮＡシンセターゼは、多様であることができる。例中では特定のｔＲＮＡシンセターゼ配列を使用していると考えられるが、本発明を、これらの例にのみ限定することを意図としない。
【００５６】
原則として、本発明においては、同じｔＲＮＡチャージ機能（アミノアシル化）を示す任意のｔＲＮＡシンセターゼを使用できる。
【００５７】
例えば、ｔＲＮＡシンセターゼは、任意の好適な種、例えば、古細菌、例えば、メタノサルシナ・バーケリMS、メタノサルシナ・バーケリ株フサロ（Fusaro）、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）Gol、メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）C2A、メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）又はメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）に由来することができる。あるいは、ｔＲＮＡシンセターゼは、細菌、例えば、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）DCB-2、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスY51、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスPCP 1、デスルフォトマクルム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）DSM 771に由来することができる。
【００５８】
これらの微生物の例示的な配列は、公表されている配列である。以下の例を、ピロリジンｔＲＮＡシンセターゼの例示的な配列として示す。
【００５９】
＞Ｍ．バーケリＭＳ／１〜４１９／
メタノサルシナ・バーケリＭＳ
バージョンＱ６ＷＲＨ６．１  ＧＩ：７４５０１４１１
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
【００６０】
＞Ｍ．バーケリＦ／１〜４１９／
メタノサルシナ・バーケリ株フサロ
バージョンＹＰ＿３０４３９５．１  ＧＩ：７３６６８３８０
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
【００６１】
＞Ｍ．マゼイ／１〜４５４
メタノサルシナ・マゼイＧｏｌ
バージョンＮＰ＿６３３４６９．１  ＧＩ：２１２２７５４７
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
【００６２】
＞Ｍ．アセチボランス／１〜４４３
メタノサルシナ・アセチボランスＣ２Ａ
バージョンＮＰ＿６１５１２８．２  ＧＩ：１６１４８４９４４
MDKKPLDTLISATGLWMSRTGMIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGERLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCRHCRVSDEDINNFLTKTSEEKTTVKVKVVSAPRVRKAMPKSVARAPKPLEATAQVPLSGSKPAPATPVSAPAQAPAPSTGSASATSASAQRMANSAAAPAAPVPTSAPALTKGQLDRLEGLLSPKDEISLDSEKPFRELESELLSRRKKDLKRIYAEERENYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINSDTELSKQVFRIDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIITEFLNHLGIDFEIIGDSCMVYGNTLDVMHDDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRAARSESYYNGISTNL
【００６３】
＞Ｍ．サーモフィラ／１〜４７８
メタノサルシナ・サーモフィラ、バージョンＤＱ０１７２５０．１  ＧＩ：６７７７３３０８
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGKLHKIRHHEVSKRKIYIEMECGERLVVNNSRSCRAARALRHHKYRKICKHCRVSDEDLNKFLTRTNEDKSNAKVTVVSAPKIRKVMPKSVARTPKPLENTAPVQTLPSESQPAPTTPISASTTAPASTSTTAPAPASTTAPAPASTTAPASASTTISTSAMPASTSAQGTTKFNYISGGFPRPIPVQASAPALTKSQIDRLQGLLSPKDEISLDSGTPFRKLESELLSRRRKDLKQIYAEEREHYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPMEYIERMGIDNDKELSKQIFRVDNNFCLRPMLAPNLYNYLRKLNRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIIKDFLDYLGIDFEIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPVPMDRDWGINKPWIGAGFGLERLLKVMHNFKNIKRASRSESYYNGISTNL
【００６４】
＞Ｍ．ブルトニイ／１〜４１６
メタノコッコイデス・ブルトニイＤＳＭ６２４２、バージョンＹＰ＿５６６７１０．１  ＧＩ：９１７７４０１８
MEKQLLDVLVELNGVWLSRSGLLHGIRNFEITTKHIHIETDCGARFTVRNSRSSRSARSLRHNKYRKPCKRCRPADEQIDRFVKKTFKEKRQTVSVFSSPKKHVPKKPKVAVIKSFSISTPSPKEASVSNSIPTPSISVVKDEVKVPEVKYTPSQIERLKTLMSPDDKIPIQDELPEFKVLEKELIQRRRDDLKKMYEEDREDRLGKLERDITEFFVDRGFLEIKSPIMIPFEYIERMGIDKDDHLNKQIFRVDESMCLRPMLAPCLYNYLRKLDKVLPDPIRIFEIGPCYRKESDGSSHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENMEALIDEFLEHLGIEYEIEADNCMVYGDTIDIMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGVNKPWMGAGFGLERLLKVRHNYTNIRRASRSELYYNGINTNL
【００６５】
＞Ｄ．ハフニエンス＿ＤＣＢ−２／１〜２７９
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＤＣＢ−２
バージョンＹＰ＿００２４６１２８９．１  ＧＩ：２１９６７０８５４
MSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
【００６６】
＞Ｄ．ハフニエンス＿Ｙ５１／ｌ〜３１２
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＹ５１
バージョンＹＰ＿５２１１９２．１  ＧＩ：８９８９７７０５
MDRIDHTDSKFVQAGETPVLPATFMFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
【００６７】
＞Ｄ．ハフニエンスＰＣＰｌ／１〜２８８
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス
バージョンＡＹ６９２３４０．１  ＧＩ：５３７７１７７２
MFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEKLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIFDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
【００６８】
＞Ｄ．アセトキシダンス／１〜２７７
デスルフォトマクルム・アセトキシダンスＤＳＭ  ７７１
バージョンＹＰ＿００３１８９６１４．１  ＧＩ：２５８５１３３９２
MSFLWTVSQQKRLSELNASEEEKNMSFSSTSDREAAYKRVEMRLINESKQRLNKLRHETRPAICALENRLAAALRGAGFVQVATPVILSKKLLGKMTITDEHALFSQVFWIEENKCLRPMLAPNLYYILKDLLRLWEKPVRIFEIGSCFRKESQGSNHLNEFTMLNLVEWGLPEEQRQKRISELAKLVMDETGIDEYHLEHAESVVYGETVDVMHRDIELGSGALGPHFLDGRWGVVGPWVGIGFGLERLLMVEQGGQNVRSMGKSLTYLDGVRLNI
【００６９】
ｔＲＮＡシンセターゼを変異させることによって特定のｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能をもたらす場合、別の野生型ｔＲＮＡ配列、例えば、上記から選択されるものを使用するだけでは適切でない場合がある。その場合は、同じｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能を保存することが重要となる。これは、例示的なｔＲＮＡシンセターゼ中の（１又は２以上の）変異を代替ｔＲＮＡシンセターゼ主鎖、例えば、上記から選択されるものに転移させることによって行う。
【００７０】
このように、選択された変異を、対応するｔＲＮＡシンセターゼ配列、例えば、例示的なＭ．バーケリ及び／又はＭ．マゼイ配列以外の他の微生物に由来する対応ｐｙｌＳ配列に転移させることができるはずである。
【００７１】
標的ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質／主鎖は、例示的なＭ．バーケリ及び／又はＭ．マゼイ配列などの既知のｔＲＮＡシンセターゼとのアラインメントによって選択できる。
【００７２】
次に、このテーマを、ｐｙｌＳ（ピロリジンｔＲＮＡシンセターゼ）配列を参照することによって説明するが、この原理は対象のｔＲＮＡシンセターゼに等しく適用される。
【００７３】
例えば、図１４は、全てのＰｙｌＳ配列のアラインメントを示している。これらは、全体的な配列同一性％が低い。したがって、使用されている配列が実際にｔＲＮＡシンセターゼであることを確実にするために、既知のｔＲＮＡシンセターゼとの配列のアラインメントによるなどして（単に低い配列同一性スコアを使用するのではなく）、配列を研究することが重要である。
【００７４】
したがって好適には、配列同一性を考慮する場合には、図１４に示されるようなｔＲＮＡシンセターゼ全体にわたって考慮するのが好適である。好適には、同一性％は、図１４から規定されるものであることができる。図１５は、ｔＲＮＡシンセターゼ間の配列同一性の略図を示している。好適には、同一性％は、図１５から規定されるものであることができる。
【００７５】
触媒領域に的を絞るのが有用であると考えられる。図１６は、まさに触媒領域のアラインメントである。これの目的は、同一のｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能、例えば、新しい又は非天然のアミノ酸認識をもたらすように移植される変異の受容に好適な主鎖骨格（backbone scaffold）を捕捉／同定するために、高い同一性％を規定できるｔＲＮＡ触媒領域を提供することである。
【００７６】
したがって好適には、配列同一性を考慮する場合には、図１６に示されるような触媒領域全体にわたって考慮するのが好適である。好適には、同一性％は、図１６から規定されるものであることができる。図１７は、触媒領域間の配列同一性の略図を示している。好適には、同一性％は、図１７から規定されるものであることができる。
【００７７】
代替ｔＲＮＡシンセターゼ主鎖への変異の「転移（transferring）」又は「移植（transplanting）」は、ｔＲＮＡシンセターゼ主鎖をコードしているヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発によって行うことができる。この技術は、当業界で周知である。本質的には、主鎖ｐｙｌＳ配列を選択し（例えば、前述の活性部位アラインメントを用いて）、選択された変異を、対応する／相同的な位置に転移させる（すなわち、そのような位置に作る）。
【００７８】
数値アドレスを使用して特定のアミノ酸残基を示す場合、明白でない限り、ナンバリングは、参照配列としてＭｂＰｙｌＲＳ（メタノサルシナ・バーケリピロリジル−ｔＲＮＡシンセターゼ）アミノ酸配列（すなわち、公表されている野生型メタノサルシナ・バーケリＰｙｌＳ遺伝子受入番号Ｑ４６Ｅ７７によってコード化されている）を用いて行う：
MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELS KQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREWGIDK PWIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL
【００７９】
これは、対象の残基を位置づけるために当業界でよく理解されているようにして使用すべきである。これは、必ずしも厳密な計数作業ではない−構成又はアラインメントに留意しなければならない。例えば、対象のタンパク質がわずかに異なる長さを有する場合には、（例えば）Ｌ２６６に相当するその配列中での正しい残基の位置づけには、対象の配列の２６６番目の残基を単に取るのではなく、配列をアラインメントして、等しい又は相当する残基を選ぶことが必要と考えられる。これは、熟練した解読者の技術の範囲内である。
【００８０】
本明細書中で使用する変異の表示法は、当業界における標準である。例えば、Ｌ２６６Ｍは、野生型配列の２６６位のＬに相当するアミノ酸がＭと置き換えられていることを意味する。
【００８１】
ここで、代替ｔＲＮＡ主鎖間への変異の移植を、例示的なＭ．バーケリ及びＭ．マゼイ配列に関して説明するが、同じ原理が他の主鎖への又は他の主鎖からの移植にも等しく適用される。
【００８２】
例えば、Ｍｂ  ＡｃＫＲＳは、ＡｃＫの取り込みのための改変シンセターゼである。
親タンパク質／主鎖：Ｍ．バーケリＰｙｌＳ
変異：Ｌ２６６Ｖ、Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ａ、Ｃ３１７Ｆ
【００８３】
Ｍｂ  ＰＣＫＲＳ：ＰＣＫの取り込みのための改変シンセターゼ
親タンパク質／主鎖：Ｍ．バーケリＰｙｌＳ
変異：Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ、Ｌ２７４Ｍ
【００８４】
Ｍ．マゼイＰｙｌＳにこれらの変異を移植することによって、同じ基質特異性を有するシンセターゼを得ることができる。これら２つのシンセターゼの配列相同性は、図１８において見ることができる。したがって、Ｍｂ主鎖からの変異をＭｍ  ｔＲＮＡ主鎖に移植することによって、以下のシンセターゼ：
変異Ｌ３０１Ｖ、Ｌ３０５Ｉ、Ｙ３０６Ｆ、Ｌ３０９Ａ、Ｃ３４８ＦをＭ．マゼイＰｙｌＳに導入するＭｍ  ＡｃＫＲＳ、及び
変異Ｍ２７６Ｆ、Ａ３０２Ｓ、Ｙ３０６Ｃ、Ｌ３０９ＭをＭ．マゼイＰｙｌＳに導入するＭｍ  ＰＣＫＲＳ
を作成できる。
【００８５】
これらの例示的な移植変異シンセターゼの完全長配列を以下に示す。
>Mb_PylS/1-419
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
>Mb_AcKRS/1-419
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSGEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMVAPTIFNYARKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFFQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
>Mb_PCKRS/1-419
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERFGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLSPTLCNYMRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
>Mm_PylS/1-454
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
>Mm_AcKRS/1-454
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMVAPNIFNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
>Mm_PCKRS/1-454
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERFGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLSPNLCNYMRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
【００８６】
同じ原理が、他の変異及び／又は他の主鎖にも等しく適用される。
【００８７】
このようにして作製された移植ポリペプチドは、有利には、所望の機能／基質特異性が保存されていることを確実にするために試験すべきである。
【００８８】
前述の方法のために対象のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、複製可能な組換えベクターに取り込むことができる。ベクターは、適合宿主細胞中で核酸を複製するのに使用できる。したがって、さらなる一実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター中に導入し、前記ベクターを適合宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによる、本発明のポリヌクレオチドを作るための方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌（E.coli，Escherichia coli）などの細菌が挙げられる。
【００８９】
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコード配列の発現を実現できる制御配列に操作可能に結合される。すなわち、ベクターは発現ベクターである。用語「操作可能に結合される」とは、記載された成分が、意図された方法で機能できる関係にあることを意味する。コード配列に「操作可能に結合される」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。
【００９０】
本発明のベクターを、記載したような好適な宿主細胞中に形質転換又は形質移入させて、本発明のタンパク質の発現を実現することができる。この方法は、タンパク質をコードするコード配列のベクターによって発現を実現する条件下で、前述のようにして発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、任意選択で発現タンパク質を回収するステップとを含むことができる。ベクターは、例えば、複製起点、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び任意選択で前記プロモーターのレギュレーターを備えているプラスミド又はウィルスベクターであることができる。ベクターは、１又は２以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含有することができる。ベクターは、例えば、宿主細胞を形質移入又は形質転換するために使用できる。
【００９１】
本発明のタンパク質をコードする配列に操作可能に結合される制御配列としては、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルが挙げられる。これらの制御配列は、発現ベクターが使用されるように設計されている宿主細胞と適合するように選択できる。用語「プロモーター」は当業界において周知であり、サイズ及び複雑さが最小のプロモーターから上流の要素及びエンハンサーを含むプロモーターに及ぶ核酸領域を包含する。
【００９２】
標的リジンは、保護基によって保護する（例えば、この方法のステップ（ａ））。前記保護基は、（１又は２以上の）さらなるリジンの保護に使用する保護基とは異なる（例えば方法のステップ（ｂ））。方法のステップ（ｃ）において標的リジンから保護基を選択的に除去するのに使用する脱保護方法は、（１又は２以上の）さらなるリジンを同時に脱保護しないように実施しなければならない。リジン側鎖の化学的保護剤は多様であり、使用する脱保護方法の型に応じて、当業者によって選択されることができる。しかし、前記保護剤は好適には、リジン残基が遺伝的に取り込まれ、したがってそれが直交性シンセターゼ／ｔＲＮＡ対によって細胞中に取り込まれるように、選択する。
【００９３】
好適には、ステップ（ａ）において使用する保護剤は本明細書中に記載する通りである。より好適には、ステップ（ａ）において使用する保護剤を有するリジンアミノ酸は、Ｎε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンである。
【００９４】
別の実施形態は、感光性ケージ化基で保護されているリジンアミノ酸を使用する。これは、化学的脱保護より容易であることができる光脱ケージ化（脱保護）を可能にするという利点を有する。
【００９５】
さらなるリジン残基及び任意選択でＮ末端アミノ基は、それらの側鎖が、標的リジンの特異的な修飾を可能にするように保護されている。これは有利には、保護基がポリペプチド鎖中に存在するさらなるリジン残基の飽和（１００％）に達することができるか又は少なくともそれに近づくことができる反応を使用して行う。
【００９６】
タンパク質としての性質を失うことなく、容易に変性及び復元できるポリペプチドを使用するのが有利である。その際、本発明によるポリペプチドが小タンパク質であるならば、有利であると考えられる。ポリペプチドは、例えばグリコシル化などの翻訳後修飾をほとんど又は全く有さないのがさらに有利である。
【００９７】
修飾される例示的なポリペプチドには、ヒストン及び／又は小さい転写因子が含まれる。好適には、修飾されるポリペプチドは、大きすぎない。「大きすぎない」とは、長さが好適にはアミノ酸数百個以下、好適にはアミノ酸４００個以下、より好適にはアミノ酸約３００個以下であることを意味する。多ドメインタンパク質は、（１又は２以上の）他のドメイン（例えば、多タンパク質複合体の他のメンバー）との相互作用に影響を及ぼす可能性が増加するため、修飾にはあまり魅力的でない。
【００９８】
好適には、使用する保護基は、本明細書中に記載したものであることができる。さらに好適には、保護剤はＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−Ｏｓｕ）である。好適には、これは塩基性ＤＭＳＯ中で使用することができる。
【００９９】
代替の又は追加の保護基及びそれらの操作（例えば、それらの付加／除去のための化学反応）については後述する。
【０１００】
ＢｏｃＬｙｓは、"Genetic incorporation of Nε-(t-butyloxycarbonyl)-L-lysine (BocLys)" (YANAGISAWA, T., ISHII, R., FUKUNAGA, R., KOBAYASHI, T., SAKAMOTO, K. & YOKOYAMA, S. (2008) Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chem Biol, 15, 1187-97)に記載されている。
【０１０１】
オフ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
【０１０２】
【化１】
2013522352.tif 000003
【０１０３】
Ｘが以下の場合にタンパク質アミンに穏やかに付着され得る直交性保護基
【０１０４】
【化２】
2013522352.tif 000004
【０１０５】
１．ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）
オン−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド
（Kawakami, T. et al. Polypeptide synthesis using an expressed peptide as a building block for condensation with a peptide thioester: application to the synthesis of phosphorylated p21Max protein(1-101). J. Pept. Sci. 7, 474-487 (2001)）
オフ−ＨＦ/ＤＭＳ、ＴＦＭＳＡ/ＴＦＡ/ＤＭＳ、触媒水素化
（TAM, J., HEATH, W. & MERRIFIELD, R. (1983) SN2 DEPROTECTION OF SYNTHETIC PEPTIDES WITH A LOW CONCENTRATION OF HF IN DIMETHYL SULFIDE - EVIDENCE AND APPLICATION IN PEPTIDE-SYNTHESIS. Journal of the American Chemical Society, 105, 6442-6455）
（Tam, J.P., Heath, W.F., & Merrifield, R.B., Mechanisms for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethanesulfonic acid trifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. Journal of the American Chemical Society 108 (17), 5242-5251 (1986)）
Greene's Protective Groups in Organic Synthesis
【０１０６】
【化３】
2013522352.tif 000005
【０１０７】
２．ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル
オン−Ｎ−（ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド
オフ−ｈｖ約３６５ｎｍ、ａｑ．Ｎａ２Ｓ２０４（１，４−脱離）
【０１０８】
【化４】
2013522352.tif 000006
【０１０９】
３．ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル
オン−Ｎ−（ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド
オフ−ａｑ．Ｎａ２Ｓ２０４（１，６−脱離）
【０１１０】
【化５】
2013522352.tif 000007
【０１１１】
４．トリフルオロアセチル（ＴＦＡｃ）
オン−トリフルオロ酢酸無水物
オフ−Ｋ２ＣＯ３／水性ＭｅＯＨ、ｐＨ＞９
Greene's Protective Groups in Organic Synthesis
【０１１２】
【化６】
2013522352.tif 000008
【０１１３】
５．フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）
オン−Ｎ−（フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド
オフ−塩基
任意の１級アミンによって除去され得るので、この保護基を使用する場合には、条件に適切な注意が払われなければならない。
Greene's Protective Groups in Organic Synthesis
【０１１４】
【化７】
2013522352.tif 000009
【０１１５】
６．アリールジチオエチルオキシカルボニル（Ａｒｄｅｃ）
（LAPEYRE, M., LEPRINCE, J., MASSONNEAU'LD, M., OULYADI, H., RENARD, P., ROMIEU, A., TURCATTI, G. & VAUDRY, H. (2006) Aryldithioethyloxycarbonyl (Ardec): A new family of amine protecting groups removable under mild reducing conditions and their applications to peptide synthesis. Chem-Eur J, 12, 3655-3671）
オン−Ｎ−（アリールジチオエチルオキシカルボニル）スクシンイミド
オフ−穏やかな還元（ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、ＢＭＥ）
【０１１６】
Ｎε−（トリフルオロアセチル）−Ｌ−リジン（ＴＦＡｃＬｙｓ）の遺伝的取り込み
【０１１７】
【化８】
2013522352.tif 000010
【０１１８】
オフ−Ｋ２ＣＯ３／水性ＭｅＯＨ、ｐＨ＞９
【０１１９】
Ｘが以下の場合にタンパク質アミンに穏やかに付着され得る直交性保護基
【０１２０】
【化９】
2013522352.tif 000011
【０１２１】
１．シトラコニル
オン−シトラコン酸無水物／水性緩衝液ｐＨ８
オフ−ｐＨ３〜４
（BLAKE, J. & LI, C. (1981) New segment-coupling method for peptide synthesis in aqueous solution: application to synthesis of human [Gly 17]-beta-endorphin. Proc Natl Acad Sci U S A, 78, 4055-8）
【０１２２】
【化１０】
2013522352.tif 000012
【０１２３】
２．ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ，t-butyloxycarbonyl）
オン−Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド
オフ−ＴＦＡ
【０１２４】
Ｃｂｚ、光ケージ及びＡｒｄｅｃもまた、遺伝的にコードされたＴＦＡｃ保護と共に使用できる。
【０１２５】
Ｎε−（ｏ−ニトロピペロニルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＯＮＰＯＣ）の遺伝的取り込み
（GAUTIER, A., NGUYEN, D. P., LUSIC, H., AN, W., DEITERS, A. & CHIN, J. W. (2010) Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society, 132, 4086-8）
【０１２６】
オフ−ｈｖ約３６５ｎｍ
【０１２７】
【化１１】
2013522352.tif 000013
【０１２８】
塩基切断可能な保護基及び穏やかな酸切断可能な保護基と適合するとみなされる。Ａｒｄｅｃもまた、本発明に応用できる。
【０１２９】
Ｎε−（アリルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＡｌｌｏｃＬｙｓ）の遺伝的取り込み
（YANAGISAWA, T., ISHII, R., FUKUNAGA, R., KOBAYASHI, L, SAKAMOTO. K. & YOKOYAMA, S. (2008) Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chem Biol 15, 1187-97）
【０１３０】
【化１２】
2013522352.tif 000014
【０１３１】
オフ−Ｎｉ（ＣＯ）４、（ＰｄＰｈ３Ｐ）４／Ｂｕ３ＳｎＨ／ＡｃＯＨ
【０１３２】
これは、触媒脱保護以外のすべてと直交性であり且つおそらくＨＦ／ＴＦＭＳＡでないという利点を有する。
【０１３３】
別の実施形態において、さらなるリジン側鎖を、感光性ケージ化リジンで保護できる。この実施形態において、標的リジンを感光性基によってさらに保護する場合には、（１又は２以上の）標的リジンの保護は、第２の保護基を放出しない周波数の放射線で放出される感光性基によらなければならない。
【０１３４】
本方法は、組換え体技術による特異的反応及び化学選択的タンパク質化学反応によって、ポリペプチド鎖の内に存在する（１又は２以上の）特定のリジンを標的化できる。好適には、この方法はインビトロ法である。有利には、本発明のポリペプチドは、インビトロ又はインビボで適用できる。
【０１３５】
本発明の利点は、ポリペプチド及びタンパク質中におけるリジンの修飾の効果を研究する方法を提供することである。（１又は２以上の）リジンのこのような修飾ジメチル化の一例。これは、タンパク質におけるリジンのジメチル化の効果の研究に応用される。
【０１３６】
別の好ましい例において、ステップ（ｄ）の反応は、リジン残基を別のタンパク質に共有結合させることである。ステップ（ｃ）における脱保護後に特定のリジン側鎖はε−アミノを生じるので、反応はペプチド結合形成であるのが好ましい。このような場合、他のタンパク質もリジン側鎖を示す可能性があり、したがって、他のタンパク質が、ステップ（ｂ）の場合と同様にポリペプチド鎖の他のリジン残基と共に保護されれば好ましい。好適には、修飾ポリペプチド全体を、合成後に脱保護する。
【０１３７】
前述のように、本発明は、（１又は２以上の）ポリペプチドのユビキチン化及び／又はその研究に有用である。したがって、そのポリペプチド及び／又は他のポリペプチドがユビキチンを含むならば、好ましい。ユビキチンは、容易に変性及び復元される小タンパク質であり、本発明の方法による遺伝子組換え及び選択的タンパク質化学反応による作製が容易である。
【０１３８】
したがって、本方法は、任意のタンパク質を特異的にユビキチン化できる強力なツールである。例えばユビキチンポリペプチドのＫ４８によって結合されたポリユビキチンにタンパク質を結合させることなどにより、このようなユビキチン化の効果が知られる場合、これは、それらのプロテアソーム分解の研究に役立ち得る。
【０１３９】
別の例において、方法を繰り返して、１つのタンパク質をいくつかのタンパク質に結合させることができる。ポリペプチド鎖とタンパク質が共にユビキチンである場合には、本発明を使用して、例えば均一に及び／又は不均一に結合されたユビキチン鎖を作製することができる。
【０１４０】
したがって、本発明の別の態様は、本発明による方法から得ることができる、結果として生じるポリペプチド鎖、好適には、イソペプチド結合によってタンパク質に特異的に結合したポリペプチド鎖である。このような一例は、ユビキチン化タンパク質であり、この場合、ステップ（ｄ）の反応は、ペプチド結合の形成によってユビキチンを別のタンパク質に結合させることである。
【０１４１】
別のこのような例は、この方法によって得られる均一に結合されたユビキチン鎖である。以下に示すように、均一に結合されたユビキチン鎖を、この方法によって得ることができ、共有結合は、６位又は２９位のリジンアミノ酸残基と別のユビキチンポリペプチドのＣ末端との間のイソペプチド結合である。この鎖は、本発明の方法によってさらに得ることができる、さらなる均一の結合によって続けることができることを理解すべきである。
【０１４２】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られる、均一に結合したユビキチンであり、共有結合は、６位のリジンアミノ酸残基と別のユビキチンポリペプチドのＣ末端との間のイソペプチド結合である。結合は、３つ以上が結合されるまで続けることができる。
【０１４３】
前記ユビキチン鎖は、医薬品として使用できる。これは、ＤＮＡ損傷への応答の活性化又は促進に使用できる。これらの鎖は、ＢＲＣＡ１／Ｂａｒｄ１  Ｅ３リガーゼ複合体に結合されることが示されている。したがって、これらのユビキチン鎖は、好ましくは癌が早期発症乳癌又は卵巣癌である場合に、癌の予防又は治療に使用できる。
【０１４４】
したがって、これらのユビキチン鎖は、腫瘍薬とみなすことができ、医薬組成物中に使用でき、腫瘍薬学の分野で周知の手段によって投与できる。
【０１４５】
以下の非限定的な例は、本発明を例証する。
【０１４６】
１つのユビキチン（ドナー）のＣ末端と別のユビキチン（アクセプター）の特定のリジン残基のアミンとの間にイソペプチド結合を特異的に形成するには、これらの官能基を、両ユビキチン分子中の他のカルボン酸及びアミンと差別化することが必要である（図１）。アクセプターユビキチンに本発明による方法を適用し、ドナーユビキチンにステップ（ｂ）を適用することによって、これを行った。このアプローチの普遍性を例証するために、ユビキチン二量体を、ドナーユビキチンのＣ末端とアクセプターユビキチンのリジン残基（Ｋ６又はＫ２９のいずれか）のε−アミノ基との間の特異的なイソペプチド結合を介して結合させることを目指した。各ユビキチンは７個のリジンを含有するので、この系によって、我々のアプローチの特異性は厳しく試験される。
【実施例１】
【０１４７】
本発明の方法によるアクセプターユビキチンの調製
本実施例は、アクセプターユビキチン（後の逐次イソペプチド結合のための）である本発明の方法によるユビキチン分子の調製である。この方法は、図１の右側によって部分的に示されている。
【０１４８】
使用したプロトコールは、
アクセプターユビキチン（ＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６及びＵｂＴＡＧ２９−Ｈｉｓ６）のクローニング
である。NcoI及びXhoI制限部位並びにＣ末端Ｈｉｓ６タグとそれに続く終止コドンを導入する、順方向５’−CG CGC GCC ATG GAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GG−３’プライマー及び逆方向５’−GCC GGA TCT CCG CTC GAG TTA GTG GTG ATG ATG GTG ATG CCC ACC TCT GAG ACG GAG GAC−３’プライマーを用いて、ヒトＵＢＣユビキチン遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をNcoI及びXhoIで消化し、同じように処理したpCDF-PylTプラスミド（Ｉｐｐプロモーター及びｒｒｎＣターミネーター上でＭｂｔＲＮＡＣＵＡをコード化し、スペクチノマイシン耐性マーカーを有する（Neumann, H., Peak-Chew, S.Y., & Chin, J.W., Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4 (4), 232-234 (2008)、Neumann, H. et al., A method for genetically installing site-specific acetylation in recombinant histones defines the effects of H3 K56 acetylation. Mol Cell 36 (1), 153-163 (2009)）に連結した。順方向プライマーは第２のユビキチンコドンの変異を押し進め、したがって、第２のユビキチン残基を元のＧｌｎに変異させるには、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発が必要であった。次に、第２ラウンドのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発を用いて、Ｋ６位又はＫ２９位にＴＡＧコドンを導入した。最終プラスミドをそれぞれ、pCDF-pylT-UbTAG6-His6及びpCDF-pylT-UbTAG29-His6と命名した。
【０１４９】
アクセプターユビキチン（ＵｂＢｏｃＫ６及びＵｂＢｏｃＫ２９）の調製
pBPylS（大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーター上にＭｂＰｙｌＲＳをコード化するカナマイシン耐性プラスミド）及びpCDF-pylT-UbTAG6-His6を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Merck biosciences社）を終夜増殖させた（３７℃、２３０ｒｐｍ、ＬＢ−ＫＳ（スペクチノマイシン５０μｇ  ｍＬ−１及びカナマイシン５０μｇ  ｍＬ−１を含有するＬＢ培地）中）。培養物を、新鮮なＬＢ−ＫＳ  ２Ｌ中で１：５０に希釈し、インキュベートした（３７℃、２３０ｒｐｍ）。ＯＤ６００＝０．６において、激しく撹拌しながら２００ｍＭの１（２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中１０ｍＬ）の溶液を細胞に加え、培養物を５Ｍ  ＨＣｌ（４ｍＬ）で直ちに中和した。３０分後に、イソプロピル−βＤ−チオガラクトピラノシドを０．５ｍＭまで加えることによって、タンパク質発現を誘導した。インキュベーション（３７℃、２３０ｒｐｍ、３時間）後、遠心分離によって細胞を収集し、５０ｍＬの氷冷溶解用緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭイミダゾール）中に再懸濁させ、必要になるまで−８０℃で凍結した。細胞を氷上で解凍し、リゾチーム（０．５ｍｇ  ｍＬ−１）及びＤＮＡｓｅＡ（５０μｇ  ｍＬ−１）を加えた。３０分後に、細胞を超音波処理し、遠心分離（３９０００×ｇ、３０分）によって清澄化した。清澄化された溶解産物（lysate）を、重力流によって、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（３ｍＬ、Qiagen社）を含有するカラム上にロードした。樹脂を溶解用緩衝液（９０ｍＬ）で洗浄し、タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出させた。ＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、プールし、Amicon Ultra-15 3kDa MWCO遠心濾過装置（Millipore社）で９ｍＬ未満まで濃縮した。次いで、試料を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．６に対して３時間透析した。１ｍＭ  ＤＴＴをＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６試料に加え、続いて、ＵＣＨ−Ｌ３を最終濃度１５μｇ  ｍＬ−１で加えた。試料を、３７℃で１時間インキュベートして、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを除去した。サイズ−排除クロマトグラフィーによってHiLoad26/60 Superdex 75 Prep Gradeカラム（GE Life Sciences社）を使用して２ｍＬ  ｍｉｎ−１の流速で、ＵｂＢｏｃＫ６を単離した。ＵｂＢｏｃＫ６を含有する画分をプールし、２．５ｍＬまで濃縮した。試料を、PD-10カラム（GE Life Sciences社）を使用してＨ２Ｏ中に脱塩し、溶出物を凍結乾燥させて、ＵｂＢｏｃＫ６約２０ｍｇを得た。細胞を、pCDF-pylT-UbTAG29-His6で形質転換した以外は同様にして、ＵｂＢｏｃＫ２９を調製した。ＵｂＢｏｃＫ２９の収量は、８ｍｇであった。
【０１５０】
Ｃｂｚ−ＯＳｕによるＵｂＢｏｃＫ６及びＵｂＢｏｃＫ２９の全般的保護
凍結乾燥ＵｂＢｏｃＫ６（２０ｍｇ、２．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．７ｍＬ）中に溶解させ、続いてＤＩＥＡ（６７μＬ）を加えた。撹拌しながら、Ｃｂｚ−ＯＳｕ（４．８１ｍｇ、１９．３μｍｏｌ）を反応生成物に加えた。２５℃において２時間撹拌後、反応生成物を冷エーテル（１７ｍＬ）中に移し、短時間ボルテックスした。沈殿物を遠心分離によって集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル（１７ｍＬ）で洗浄し、次いで風乾した。ＵｂＢｏｃＫ２９については、ＵｂＢｏｃＫ２９−Ｈｉｓ６の発現収率の低下を考慮して、この操作と以後の操作を案分して繰り返した。
【０１５１】
Ｂｏｃ保護基の除去
ＵｂＢｏｃＫ６  １０ｍｇから得られた、乾燥全般的保護ペプチド、ＵｂＢｏｃＫ６（Ｃｂｚ７−８）を冷ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ  ９：６（１．２８ｍＬ）中に溶解させ、４℃において１時間インキュベートした。次いで、選択的に脱保護されたペプチドを沈殿させ、氷冷エーテル（２×１３ｍＬ）で洗浄した。水層及びエーテル層を除去し、ペプチドを風乾させた。
【０１５２】
結果
保護されたリジンをユビキチンの６位に部位特異的に入れるために、我々は、メタノサルシナ・バーケリMSピロリジンｔＲＮＡシンセターゼ（ＭｂＰｙｌＲＳ）とその同族アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ）を利用した（Srinivasan, G., James, C.M., & Krzycki, J.A., Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296 (5572), 1459-1462 (2002)）。この同族アンバーサプレッサーｔＲＮＡは、大腸菌中でアンバーコドンに応答して組換えタンパク質へのＮε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（１）の効率的な取り込みを指示する（Ambrogelly, A. et al., Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (9), 3141-3146 (2007)、Neumann, H., Peak-Chew, S.Y., & Chin, J.W., Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4 (4), 232-234 (2008)、Polycarpo, C.R. et al., Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 580 (28-29), 6695-6700 (2006)）。我々は、ユビキチン発現コンストラクトを作成した。このコンストラクトにおいて、ユビキチン遺伝子は６位にリジンコドンの代わりにＴＡＧコドンを含有し、ユビキチン遺伝子には３’Ｈｉｓ６タグコード配列（ＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６）が隣接している。我々は、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ対及び１（２ｍＭ）を含有する細胞中でＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６を発現することによって、ＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６（６位に１を含有するユビキチン−ｈｉｓ６）を作製した。ＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６の作製は、１の添加に厳密に依存する。ＵｂＢｏｃＫ６−Ｈｉｓ６を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製し、Ｈｉｓ６タグをユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ−Ｌ３（ＵＣＨ−Ｌ３）での処理によって除去して、ＵｂＢｏｃＫ６を得た（図２）。次に、タグなしのＵｂＢｏｃＫ６をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製し、脱塩し、凍結乾燥させた。精製した物質を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって特性決定した（図３Ａ）。この操作により、培養物２Ｌから精製ＵｂＢｏｃＫ６を１７ｍｇ得た。
【０１５３】
Ｃｂｚ基でＵｂＢｏｃＫ６中の６個のＮε−Ｌｙｓアミノ基及びＮ末端アミンを保護するために、我々は、タンパク質を、塩基性ＤＭＳＯ中で７当量のＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−ＯＳｕ）と反応させた（Kawakami, T. et al., Polypeptide synthesis using an expressed peptide as a building block for condensation with a peptide thioester: application to the synthesis of phosphorylated p21Max protein(1-101). J Pept Sci 7 (9), 474-487 (2001)）。２時間の保護後（図３Ａ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析は、７又は８個のＣｂｚ基がＵｂＢｏｃＫ６に付加されていることを示している。７個のＣｂｚ基の付加は、ＵｂＢｏｃＫ６中の全ての遊離アミノ基の保護に相当する。観察される追加のＣｂｚ基は、ユビキチン内の１つのヒスチジン（ｈｉｓ６８）残基の部分保護に相当する可能性が高かった。この保護はその後の脱保護条件下で可逆的であるので、過剰保護は問題にならない。我々は、沈殿及び冷エーテルでの洗浄並びに風乾によって、Ｂｏｃ及びＣｂｚ保護ユビキチンを効率的に回収した。
【０１５４】
イソペプチド結合形成のために、所望に応じてＫ６の１つの遊離Ｎε−ｌｙｓアミノ基を露出させるために、我々は、１に存在するＢｏｃ保護基を、水中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、Ｃｂｚ保護をそのまま残した（図３Ａ）。ＵｂＢｏｃＫ６からのこのすぐ連結できる物質（ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７−８））の全収率は、約８５％であった。
【実施例２】
【０１５５】
本発明の方法のステップ（ｂ）によるドナーユビキチンの調製
前述のように、他のタンパク質（この場合、ドナーユビキチン）がリジン側鎖も示し、反応が別のタンパク質へのポリペプチド鎖の結合に関与する場合には、タンパク質上に存在するリジン側鎖を保護するのが有利である。この方法は、図１の左側によって、部分的に示されている。
【０１５６】
ドナーユビキチンＵｂ１−７６−チオエステルのクローニング
それぞれNdeI及びSapI制限部位を導入する順方向５’−GGT GGT CAT ATG CAG ATC TTC GTC AAG ACG TTA ACC−３’プライマー及び逆方向５’−GGT GGT TGC TCT TCC GCA CCC GCC ACG CAG TCT TAA GAC CAG ATG−３’プライマーを用いて、Ｕｂ１−７５を含有するプラスミドからユビキチン遺伝子をＰＣＲ増幅した。逆方向プライマーはまた、Ｇｌｙ７６のコドンを挿入した。ＰＣＲ産物を、NdeI制限酵素及びSapI制限酵素で二重消化し、同様に処理したpTXB1ベクター（NEB社）に連結して、pTXB1-Ub1-76を作成した。
【０１５７】
ドナーユビキチンＵｂ１−７６−チオエステルの調製
ＥＲ２５６６大腸菌細胞（５０μＬ）（NEB社）をpTXB1-Ub1-76で形質転換し、Ｓ．Ｏ．Ｂ．培地（２５０μＬ）で回収した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、回収した細胞（２００μＬ）を、アンピシリン（１００μｇ  ｍＬ−１）を含有するＬＢ培地（１００ｍＬ）に接種し、培養物を３７℃において振盪しながら（２３０ｒｐｍ）終夜インキュベートした。終夜インキュベートした培養物（６０ｍＬ）を、アンピシリン（１００μｇ  ｍＬ−１）を含有するＬＢ培地（２Ｌ）に接種し、３７℃で振盪しながら（２３０ｒｐｍ）インキュベートした。ＯＤ６００約０．４において、細胞を２５℃のインキュベーターに移し、３０分後に細胞をＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）で誘導した。５時間後、細胞を収集し、溶解用緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）６０ｍｌ中に懸濁させ、凍結した。融解した細胞を、氷上で超音波処理することによって溶解させ、遠心分離（３９０００×ｇ、３０分）によって清澄化した。空のXK26/20カラムにキチンビーズ（２０ｍＬ）（NEB社）を充填し、溶解用緩衝液で平衡化した。４℃において、清澄化した溶解液を、AKTA FPLCシステムを用いてカラムにロードした（流速０．５ｍＬ  ｍｉｎ−１）。次いで、カラムを溶解用緩衝液（約４００ｍＬ）で洗浄し、切断用緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯＰ４  ｐＨ６、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭＥＳＮａ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）６０ｍＬで平衡化させた。次いで、流れを止め、カラムを４℃において６６時間インキュベートして、ユビキチンチオエステル（ＵｂＳＲ）を切断させた。切断されたＵｂＳＲを、溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ６、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶出した。ＵｂＳＲを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、次いでプールし、Amicon Ultra-15遠心濾過装置（Millipore社）で約５ｍＬまで濃縮した。次いで、タンパク質を、Phenomenex  ２５０ｍｍ×１０ｍｍ、Ｃ１８、３００Å、１０μｍカラムを用いて半分取ＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。１０％緩衝液Ａから７５％緩衝液Ｂへの勾配を、３０分にわたって５ｍＬ  ｍｉｎ−１の流速で適用した（緩衝液Ａ＝Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ＝ＭｅＣＮ中１０％緩衝液Ａ）。ユビキチンチオエステルを含有する画分を、ＥＳＩ−ＭＳによって検証し、凍結乾燥させた。
【０１５８】
Ｃｂｚ−ＯＳｕによるＵｂ−ＭＥＳチオエステルの全般的保護
凍結乾燥ＵｂＳＲ（１０ｍｇ、１．１５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８３３μＬ）中に溶解させ、続いてＤＩＥＡ（１７μＬ）を加えた。撹拌しながら、Ｃｂｚ−ＯＳｕ（２．７５ｍｇ、１１．５μｍｏｌ）を反応生成物に加えた。反応生成物を、２５℃において２時間撹拌し、次いで冷エーテル（８．５ｍＬ）中に移し、短時間ボルテックスした。沈殿物を遠心分離によって集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル（８．５ｍＬ）で洗浄し、風乾した。
【０１５９】
結果
ドナーユビキチン分子を、インテイン融合によるチオリシス（Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007)）によって生合成的にＣ末端チオエステル（ＵｂＳＲ）として、培養物１Ｌ当たり６ｍｇの精製収量で調製した（図３Ｂ、オレンジ色）。イソペプチド結合形成への、ＵｂＳＲ中の７個のリジン残基又はＮ末端アミンの関与を回避するために、我々は、ＵｂＢｏｃＫ６に関して記載した条件を用いて、遊離アミンを８当量のＣｂｚ−ＯＳｕで保護した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（図３Ｂ、青色）によって判断すると、保護は２時間以内に完了し、ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９）を得た。これをエーテル沈殿によって単離した。
【実施例３】
【０１６０】
ドナー及びアクセプターユビキチン間における特異的なイソペプチド結合の形成
ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７−８）（２．１ｍｇ、２２０ｎｍｏｌ）及びＵｂＳＲ（Ｃｂｚ７−８）（３．３ｍｇ、３３６ｎｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（９０μＬ）中に溶解させた。ＤＩＥＡ（４μＬ）、Ｈ−ＯＳｕ（０．３９ｍｇ、３．３６μｍｏｌ）及びＡｇＮＯ３（５７μｇ、３３６ｎｍｏｌ）を加えた。反応生成物を、暗所で２５℃において１６時間インキュベートした。粗混合物を冷エーテル（１ｍＬ）で沈殿させ、冷エーテル（１ｍＬ）で洗浄し、風乾した。タンパク質を、５５％ＴＦＡ、３５％ＤＭＳ及び１０％ＴＦＭＳＡからなる氷冷カクテル（５ｍｇ／ｍＬ）中に溶解させた。０℃で９０分間撹拌後、タンパク質を、１０倍容量の冷エーテルで、続いて０．５％（ｖｏｌ）ピリジンで沈殿させた。重い沈殿物が形成され、これを冷エーテルで洗浄し、集め、乾燥させた。乾燥沈殿物を緩衝液（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４、８Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に約０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で溶解させ、3kDa MWCO膜（Spectrum Labs社）を用いて、同じ緩衝液（１Ｌ）に対して終夜透析した。次いで、試料を新鮮な透析膜に移し、フォールディング用緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して終夜透析した。タンパク質を、Amicon Ultra-15 3kDa MWCO遠心濾過装置（Millipore社）を用いてIEX緩衝液Ａ（酢酸アンモニウムｐＨ４．５）に緩衝液交換した。試料を濾過し（０．４５μＭ）、AKTA FPLCシステムを用いて０．５ｍＬ／分の流速で、予め平衡化させたMonoS 5/50 GLカラム（GE Life Sciences社）にロードした。流量を２ｍＬ／分まで増加させ、１０分間にわたって６０％  IEX緩衝液Ｂ（酢酸アンモニウム  ｐＨ４．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）に達する勾配を適用した。画分（０．５ｍＬ）を集め、Ｋ６−結合ジユビキチンを含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。それらの画分をプールし、遠心濾過装置を用いて、再びIEX緩衝液Ａに交換した。試料を、平衡化されたMonoSカラムに再適用し、２ｍＬ／分の流速で、４５分にわたって６０％緩衝液Ｂに達する勾配を適用した。画分を１ｍＬの容量で集め、純粋なＫ６−結合ジユビキチンを含有する画分をプールし、１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（２００〜３００μｇ、収率５〜８％）。次いで、Ｋ６−結合ジユビキチンを、Dispo Biodialyzer 5kDa MWCO（The Nest Group Inc.）を用いて保存用緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）に対して終夜透析した。Ｋ６−結合ジユビキチン試料を、保存のために−２０℃において凍結させた。イソペプチド結合形成反応においてＵｂＫ２９（Ｃｂｚ７−８）を用いる以外は、Ｋ６−結合ジユビキチンに関して記載したようにして、Ｋ２９−結合ジユビキチンの調製を実施した。
【０１６１】
結果
チオエステルは、Ａｇ（Ｉ）の存在下におけるその場での活性化及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換が可能であり、アミンによる選択的アシル化を可能にする（Aimoto, S., Polypeptide synthesis by the thioester method. Biopolymers 51 (4), 247-265 (1999)、Tan, Z., Shang, S., Halkina, T., Yuan, Y., & Danishefsky, S.J., Toward Homogeneous Erythropoietin: Non-NCL-Based Chemical Synthesis of the Gln(78)-Arg(166) Glycopeptide Domain. J Am Chem Soc 131 (15), 5424-5431 (2009)）。我々は、この化学反応を、ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７−８）とＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９）との間の特異的イソペプチド結合の形成に適用できることに気付いた。我々は、ＤＭＳＯ中、ＤＩＥＡ、硝酸銀（ＡｇＮＯ３、３．７５ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｈ−ＯＳｕ、３７．５ｍＭ）の存在下において、ドナーユビキチンチオエステル（ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７−８））をＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９）とモル比１：１．５で混合した（図４Ａ）。室温で１６時間後、粗連結反応生成物を沈殿させ、冷エーテルで洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、ユビキチンモノマー（ＵｂＫ６（Ｃｂｚ７−８）＆ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９））を含有するタンパク質バンドの約３０％が、Ｃｂｚで保護された連結生成物に相当するより高分子量の種に転換されていることが明らかである。
【０１６２】
Ｃｂｚ基を除去するために、我々は、１：３：６のトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：硫化ジメチル（ＤＭＳ）からなる切断用カクテルを０℃において１時間使用した（Tam, J.P., Heath, W.F., & Merrifield, R.B., Mechanisms for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethanesulfonic acid trifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. Journal of the American Chemical Society 108 (17), 5242-5251 (1986)）。脱保護されたユビキチン鎖を沈殿させ、洗浄し、８Ｍ尿素を含有するＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させて、折り畳まれていないユビキチン鎖を形成した。ユビキチンは可逆的に折り畳め、酵素的に合成されたＫ４８−及びＫ６８−結合ユビキチン鎖はインビトロで変性物質から精製され、再び折り畳まれる（Pickart, C.M. & Raasi, S., Controlled Synthesis of Polyubiquitin Chains. Methods in Enzymology 399, 21-36 (2005)）ので、我々が非定型のユビキチン鎖を再び折り畳めることは妥当であると思われた。したがって、我々は、タンパク質を、尿素を含まないＰＢＳ緩衝液中に透析して、結合ジユビキチンをゆっくり復元させた。その後の陽イオン交換により、残りのモノユビキチン種を除去でき、高純度のＫ６−結合ジユビキチンが得られた（図４Ｂ、図５Ａ＆Ｂ）。
【０１６３】
Ｋ２９−結合ユビキチンを合成するために、我々は、ＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６の代わりに、２９位にアンバーコドンが存在するＵｂＴＡＧ２９−Ｈｉｓ６を用いる以外は、前記操作を単純に繰り返した。ＵｂＢｏｃＫ２９の調製の場合は、２Ｌの培養物から８ｍｇの収量が得られた。
【実施例４】
【０１６４】
Ｋ６−結合ジユビキチンの特性決定＆構造
本発明による方法を用いて合成した精製Ｋ６−及びＫ２９−結合ジユビキチンが、遺伝的に指示された部位においてイソペプチド結合を介して結合され、完全に脱保護されたことを実証するために、我々は、ＥＳＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳシーケンシングを使用した。
【０１６５】
エレクトロスプレーイオン化方式のＬＣＴ飛行時間型質量分析計（Micromass社）でタンパク質の総質量を決定した。試料を、１％蟻酸を含有する１：１のアセトニトリル／Ｈ２Ｏに溶解させた。Ｃｂｚ保護ペプチドの場合には、試料を４：３：３の酢酸／アセトニトリル／Ｈ２Ｏに溶解させた。試料は１０μｌ  ｍｉｎ−１で注入し、較正は、ウマ心臓ミオグロビンを用いて正イオンモードで行った。３０回の走査を平均し、MassLynxバージョン４．１（Micromass社）を用いて最大エントロピー解析（maximum entropy deconvolution）によって分子質量を得た。Protparam（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）を用いて野生型タンパク質の理論的質量を算出し、非天然アミノ酸含有タンパク質の理論的質量を手動で調整した。
【０１６６】
ＭＳ／ＭＳ分析のために、試料を、３７℃においてトリプシンで終夜消化した。次いで、試料を脱塩し、LTQ Orbitrap Mass Spectrometer（Thermo Scientific社）を用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。標的ペプチドを、衝突活性化解離法によって断片化した。
【０１６７】
ＥＳＩ−ＭＳは、精製タンパク質の単一の質量ピークを示している。このピークは、イソペプチド結合され、定量的に脱保護されたジユビキチンに相当する。（Ｋ６−結合ジユビキチンの観測質量＝１７１１３Ｄａ、Ｋ２９−結合ジユビキチンの観測質量＝１７１１１Ｄａ，ジユビキチンの計算質量＝１７１１２Ｄａ、図４Ｃ＆４Ｄ）。イソペプチド結合がＫ６位及びＫ２９位に形成されることを実証するために、我々は、結合ジユビキチンについてＭＳ／ＭＳシーケンシングを行った。これは、９５％を超えるフィデリティ（fidelity）で、Ｋ６及びＫ２９イソペプチド結合（図４Ｅ及び４Ｆ）の特異的形成を検証する。
【０１６８】
我々は、Ｘ線結晶構造解析によって、Ｋ６−結合ジユビキチンの構造を解析することができた。
【０１６９】
Ｋ６ジユビキチンは、１９〜２０％のＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍ酢酸亜鉛に対して平衡化された懸滴中で、１〜２ｍｇ  ｍＬ−１のタンパク質濃度で立方の形態で結晶化した。窒素クリオ流（cryostream）中で凍結させる前に、結晶を、１５％  ＰＥＧ  ４００を補充した母液中に浸漬した。最大結晶（３０μｍ）を、European Synchrotron Radiation Facility（ESRF）においてビームラインＩＤ１４−２で３Åまで回折した。初期位相は、Ｋ６３ジユビキチン構造の登録座標（deposited coordinate）からの１つのユビキチン部分を用いて分子置換によって得た（ｐｄｂ−ｉｄ  ２ＪＦ５、（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。PHENIXを用いて構造精密化を行い（Adams, P.D. et al., PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58 (Pt 11), 1948-1954 (2002)）、COOT内でモデル構築を行った（Adams, P.D. et al., PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58 (Pt 11), 1948-1954 (2002)）。最終回の精密化において、ＴＬＳ温度因子精密化を行った。PHENIXにおける幾何学的重量最適化により、最低Ｒ／Ｒｆｒｅｅ因子を有するモデルが得られた。データ収集及び精密化の統計値を、表１に示す。
【０１７０】
結晶を、２０％  ＰＥＧ  ３３５０及び２００ｍＭ  ＺｎＡｃから成長させ、立方空間群（cubic space group）（Ｐ４３３２）で形成し、３．０Åの解像度で回折した。Ｋ６−結合ジユビキチンの構造を、分子置換によって解析し、その後に精密化し（精密化に関する統計値を表１に示す）、非対称単位中の１つのＫ６−結合ジユビキチン分子が示された。各ユビキチンは天然のコンフォメーションを取り、ＧＯＰＡＬにおける再折り畳みステップの成功を裏付けている。ＥＳＩ及びＭＳ／ＭＳは、Ｋ６イソペプチド結合の形成を実証したが、電子密度図では柔軟なイソペプチド結合は十分に解像されず、Ｇｌｙ７６は識別可能な電子密度を示してない。このことは、ポリユビキチン構造において、結合の柔軟性が高いために、以前に観察されている。
【０１７１】
Ｋ６−結合ジユビキチンの構造は、Ｋ６−結合ジユビキチンが前述のユビキチン鎖構造とは異なる非対称のコンパクトなコンフォメーションを取ることを明らかにしている（図６ａ＆６ｅ）。近位ユビキチン部分（アクセプターユビキチンから生じ、イソペプチド結合に寄与するＬｙｓ６を含有する）は、Ｉｌｅ４４及びＶａｌ７０を取り囲む疎水性表面を介して遠位ユビキチン（Ｃ末端をイソペプチド結合に関与させるドナーユビキチンから生じる）に結合する。Ｌｅｕ７１、Ｉｌｅ３６及びＬｅｕ８を含有する第２の異なる疎水性パッチ（以下、Ｉｌｅ３６パッチと称する）は、遠位ユビキチン分子上で疎水性カウンターパートとして作用する。拡張された非対称界面が、コンパクトなジユビキチン分子をもたらす（図６ｂ）。さらなる界面残基は、相互作用面に寄与する近位ユビキチン中のＡｒｇ４２、及び遠位ユビキチン中のＧｌｎ４９と水素結合を形成する近位ユビキチン中のＴｈｒ９である（図６ｃ）。
【０１７２】
Ｋ６ユビキチン−ユビキチン相互作用界面は、前述されていないいくつかの特徴を示す。Ｉｌｅ４４−パッチは、ユビキチン結合ドメイン及び脱ユビキチン化酵素との相互作用の大部分において観察される、一般的なユビキチン相互作用界面である（Dikic, I., Wakatsuki, S., & Walters, K.J., Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (10), 659-671 (2009)、Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009)）。この相互作用において、パッチＶａｌ７０及びＬｅｕ８は、中央のＩｌｅ４４残基に隣接し、拡張された疎水性界面を提供している（図６ｄ）。Ｋ６−結合ジユビキチンにおいては、Ｉｌｅ４４−パッチはこれより小さい。これは、Ｌｅｕ８がコンフォメーション変化を受けて、異なる、ほぼ垂直な界面に関与するためである。この新規界面はまた、Ｌｅｕ７１及びＩｌｅ３６を含有し、それらは一緒になって、約４８０Å２の無極性表面を形成し（我々はこれをＩｌｅ３６パッチと称する）、近位分子のＩｌｅ４４／Ｖａｌ７０残基と相互作用する。次に、この非対称相互作用は、遠位分子のＩｌｅ４４／Ｖａｌ７０パッチを露出したまま、Ｋ６を介する鎖伸長のために又はユビキチン結合ドメインとの結合のために利用できる状態で残す（図６ｂ）。
【０１７３】
我々は、１つの二量体の近位ユビキチン部分を第２の二量体の遠位ユビキチン上に反復して重ねて（Coot（Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004)）において）新しい遠位部分を生成することによって、非対称Ｋ６二量体からモデル六量体を構築することができた（図６ｆ）。六量体中のユビキチン分子に立体的な衝突は観察されない。むしろ、PISAサーバーにおける分析によって明らかなように、ｎ＋２ユビキチン分子とｎ−２ユビキチン分子との間（すなわち、図５ｇのＡ−Ｃ及びＣ−Ｅの分子間）の新規なより小さい相互作用（約８３Å２）が促進される。より重要なことに、生成されるＫ６−六量体モデルは、５回対称らせんフィラメントに折り畳める（図６ｇ）。６個の分子が、２回転のらせんを形成し、分子Ａと分子Ｆは、相対的配向性が等しく、らせん軸に沿って６２Åで翻訳される。この対称性は結晶又は格子の接触によっては生成されないので、我々のモデルは、Ｋ６−結合ユビキチン鎖が対称な生体分子を形成する可能性があることを示唆している。
【実施例５】
【０１７４】
Ｋ６−＆Ｋ２９−結合ユビキチンに対する脱ユビキチン化酵素のプロファイリング
ＤＵＢの生成及び脱ユビキチン化酵素アッセイ
pRSET-UCHL3プラスミドは、Keith D. Wilkinsonから惜しみなく寄贈されたものであり、これを用いて、以前に記載されたようにして純粋なＵＣＨ−Ｌ３を調製した（Larsen, C.N., Price, J.S., & Wilkinson, K.D., Substrate binding and catalysis by ubiquitin C-terminal hydrolases: identification of two active site residues. Biochemistry 35 (21), 6735-6744 (1996)）。ＯＴＵＢ１発現ベクターは、Benedikt Kessler（Oxford）によって快く提供されたものであり、タンパク質は、（Edelmann, M.J. et al., Structural basis and specificity of human otubain 1-mediated deubiquitination. Biochem J 418 (2), 379-390 (2009)）に従って精製した。ＵＳＰ２１は、Sylvie Urbe（Liverpool）によって快く提供されたプラスミドからクローン化した。残りの脱ユビキチン化酵素の精製については、（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）に記載されている。ＵＳＰ２、ＵＳＰ１５及びＢＡＰ１は、ENZO LifeSciences社又はBoston Biochem社から購入した。ＤＵＢアッセイは、以前に記載されたようにして行った（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。
【０１７５】
結果
脱ユビキチン化酵素は、特定の鎖結合を優先し得る（Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009)）。しかし、大部分のユビキチン鎖型は合成されていないので、脱ユビキチン化酵素特異性プロファイリングは不完全である。遠位及び近位分子中に他のリジン残基をアルギニンに変異させる、Ｋ６−結合ジユビキチン分子とＫ２９−結合ユビキチン分子との混合物が、ＯＴＵファミリーの脱ユビキチン化酵素、ｈＯｔｕ１及び２つのＪＡＭＭ脱ユビキチン化酵素複合体による切断について調べられた（Wang, T. et al., Evidence for bidentate substrate binding as the basis for the K48 linkage specificity of otubain 1. J Mol Biol 386 (4), 1011-1023 (2009)、Cooper, E.M. et al., K63-specific deubiquitination by two JAMM/MPN+ complexes: BRISC-associated Brcc36 and proteasomal Poh1. EMBO J (2009)）。これらの脱ユビキチン化酵素はいずれの鎖型も切断しないことがわかったが、変異したユビキチン鎖が天然の鎖の性質を反映するか否かは不明であるので、これらの実験は問題を含んでいる。脱ユビキチン化酵素は、特に遠位ユビキチン分子上の大きい表面積をカバーし（Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009)）、表面Ｌｙｓ残基のＡｒｇへの変異が、脱ユビキチン化酵素の結合を妨げる可能性がある。我々は、既知のヒト脱ユビキチン化酵素の約１０％に相当し、４つの脱ユビキチン化酵素ファミリー−ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ，ubiquitin C-terminal hydrolase）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ，ubiquitin specific protease）、卵巣腫瘍（ＯＴＵ，ovarian tumor）脱ユビキチン化酵素及びＪＡＭＭ／ＭＰＮ＋脱ユビキチン化酵素−を包含する１２種の脱ユビキチン化酵素を、インビトロ脱ユビキチン化酵素アッセイにおいてＫ６−及びＫ２９−結合ジユビキチンを切断する能力について分析した（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。対照実験において、我々は、同じアッセイを用いて、酵素的に構築したＫ６３−結合ジユビキチンを切断した。ＵＣＨ酵素は、ユビキチンのＣ末端からの小さい不定形の（unstructured）ペプチド（例えば、Ｈｉｓ−タグ、図２）の切断において高効率であり、又は不定形のタンパク質／ループからユビキチンを加水分解するが、天然のＫ６３−、Ｋ４８−及び直鎖状ユビキチン鎖は加水分解しない（Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009)、Popp, M.W., Artavanis-Tsakonas, K., & Ploegh, H.L., Substrate Filtering by the Active Site Crossover Loop in UCHL3 Revealed by Sortagging and Gain-of-function Mutations. J Biol Chem 284 (6), 3593-3602 (2009)）。ＵＣＨ−Ｌ３及びＢＡＰ１は、Ｋ６−及びＫ２９−結合ジユビキチン分子を切断できなかった（図７）。このことは、これらの結合を有するユビキチンポリマーがこれらのＵＣＨ酵素の基質である可能性がないことを実証している。
【０１７６】
ＵＣＨ酵素とは対照的に、ＵＳＰ脱ユビキチン化酵素は、ユビキチンポリマーの切断において高活性であるが、明らかな結合特異性がないことが多い（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。例外は、腫瘍抑制因子ＣＹＬＤであり、そのＵＳＰドメインは、Ｋ４８−結合よりＫ６３−結合を優先する（Komander, D. et al., The structure of the CYLD USP domain explains its specificity for Lys63-linked polyubiquitin and reveals a B box module. Mol Cell 29 (4), 451-464 (2008)）。Ｋ６−結合ジユビキチンを用いて試験すると、４つのＵＳＰドメイン（ＵＳＰ２、ＵＳＰ５、ＵＳＰ１５、ＵＳＰ２１）は、Ｋ６３−結合鎖と同程度に効率的にこの鎖型を分解した（図７）。Ｋ２９−結合ユビキチンは、ＵＳＰ５によって急速に切断されたが、Ｋ６−及びＫ６３−結合ユビキチンよりも、ＵＳＰ２、ＵＳＰ１５及びＵＳＰ２１による加水分解に対してかなり高い抵抗性を示した。ＵＳＰ５は、乱雑な（promiscuous）ＤＵＢであり、遊離ユビキチン鎖のＣ末端を特異的に認識し（Reyes-Turcu, F.E. et al., The ubiquitin binding domain ZnF UBP recognizes the C-terminal diglycine motif of unanchored ubiquitin. Cell 124 (6), 1197-1208 (2006)）、非付着性のユビキチン鎖を加水分解することによってユビキチンプールを補充する働きをする（Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009)）。これに対して、ＣＹＬＤは、その好ましいＫ６３−結合と比較して、Ｋ６−及びＫ２９−結合に対して著しく低下した活性を示した。これは、ＣＹＬＤが、Ｋ６−及びＫ２９−結合並びにＫ４８−結合よりも、Ｋ６３−結合を優先することを実証している（図７）。
【０１７７】
ＯＴＵドメイン脱ユビキチン化酵素はポリユビキチン鎖を加水分解するが、いくつかのメンバーはＫ４８−及びＫ６３−結合間において顕著な選択性を示す。Ａ２０及びＯＴＵＢ１は、Ｋ４８−結合鎖に特異的であって、Ｋ６３−結合鎖又は直鎖状鎖を加水分解しない（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)、Wang, T. et al., Evidence for bidentate substrate binding as the basis for the K48 linkage specificity of otubain 1. J Mol Biol 386 (4), 1011-1023 (2009)）が、ＴＲＡＢＩＤは、Ｋ６３−結合特異的である（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)、Tran, H., Hamada, F., Schwarz-Romond, T., & Bienz, M., Trabid, a new positive regulator of Wnt-induced transcription with preference for binding and cleaving K63-linked ubiquitin chains. Genes Dev 22 (4), 528-542 (2008)）。試験したＯＴＵドメイン（Ａ２０、ＴＲＡＢＩＤ、Cezanne及びＯＴＵＢ１）は、Ｋ６−結合ジユビキチンを切断せず、Ａ２０、Cezanne及びＯＴＵＢ１はまた、それらがその優先する鎖型を完全に加水分解する濃度でＫ２９−結合を切断しなかった（図７）が、より高い酵素濃度では、全ての結合に対してはっきりと認識できる活性が観察された。これは、以前に報告されたこれらの酵素に関する特異性を、Ｋ６−結合及びＫ２９−結合に関する特異性に拡張する。興味深いことに、ＴＲＡＢＩＤは、Ｋ６３−結合と比較して高くないにせよ類似の活性で、Ｋ２９−結合を切断する。これは、この酵素が二重特異性を持つ、すなわち、Ｋ２９及びＫ６３結合をＫ４８及びＫ６結合より優先することを示している。ＯＴＵドメインが結合のサブセットに対して本質的に特異的であるようであることを考慮すると、他のファミリーメンバーが、特に他の非定型のユビキチン鎖を切断し得る可能性がある。我々のアプローチの拡張により、これらの活性を発見できるはずである。
【０１７８】
ＪＡＭＭドメイン脱ユビキチン化酵素もまた、Ｋ６３−結合特異的であることが報告されており（Cooper, E.M. et al., K63-specific deubiquitination by two JAMM/MPN+ complexes: BRISC-associated Brcc36 and proteasomal Poh1. EMBO J (2009)、McCullough, J., Clague, M.J., & Urbe, S., AMSH is an endosome-associated ubiquitin isopeptidase. J Cell Biol 166 (4), 487-492 (2004)）、Ｋ６３−結合を認識するための分子的基盤が、Ｋ６３−結合ジユビキチンと複合したＡＭＳＨの最近の結晶構造において明らかになった（Sato, Y. et al., Structural basis for specific cleavage of Lys 63-linked polyubiquitin chains. Nature 455 (7211), 358-362 (2008)）。ＡＭＳＨは、伸長されたＫ６３−結合ジユビキチン分子と結合し、Ｌｙｓ６３を取り囲む残基と特異的に接触する。我々は、ＡＭＳＨはＫ６−及びＫ２９−結合ジユビキチンに対して不活性であるが、同一反応条件下でＫ６３−結合ジユビキチンを高い活性で切断することに気付いている。
【０１７９】
【表１】
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【実施例６】
【０１８０】
改変ユビキチン合成は、ＯＴＵ脱ユビキチン化酵素のＬｙｓ２９−イソペプチド特異性を明らかにする。
ユビキチン化は、無数の真核生物機能を調節する可逆的な翻訳後修飾である。ユビキチン化の効果を研究する我々の能力は、均一にユビキチン化されたタンパク質にアクセスしにくいことによって制限されることが多い。特に、ユビキチンポリマーの大部分を占める、いわゆる「非定型の」ユビキチン鎖（Ｌｙｓ４８−又はＬｙｓ６３−結合ユビキチン以外の鎖）の役割の解明は、それらの生合成のための酵素が知られていないため、難しい。ここで、我々は、遺伝子コードの拡張、インテインの化学反応及び化学選択的連結を組み合わせて、「非定型の」ユビキチン鎖を合成する。我々は、構造的に特徴づけられたユビキチン鎖とは異なるＬｙｓ６−結合ジユビキチンの結晶構造を解析して、この結合が調節し得る種々の生物学的機能の分子的基盤を提供する。さらに、我々は、Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ユビキチンに対して、既知のヒト脱ユビキチン化酵素の１０％を含むパネルをプロファイリングし、ＴＲＡＢＩＤがＬｙｓ２９結合を、Ｌｙｓ６３結合の４０倍効率的に切断することを発見する。
【０１８１】
ユビキチン化は、可逆的な翻訳後修飾であり、アクセプタータンパク質中の特定のリジン残基がユビキチンドナーのＣ末端とイソペプチド結合を形成する。プロテアソーム標的化によるタンパク質安定性の調節におけるユビキチン化の役割は確立されており、一方、ユビキチンは、細胞シグナリング、細胞内輸送及びＤＮＡ損傷に対する応答を含む生物学のほぼすべての態様に関与することが明らかになりつつある（Chen, Z.J. & Sun, L.J., Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol Cell 33 (3), 275-286 (2009)、Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009)）。ユビキチンは、その７個のリジン残基（Ｌｙｓ６、Ｌｙｓ１１、Ｌｙｓ２７、Ｌｙｓ２９、Ｌｙｓ３３、Ｌｙｓ４８又はＬｙｓ６３）の各々を介して又はそのＮ−末端を介して共有結合鎖を形成する。多様な生物学的プロセスにおいてユビキチンによって媒介される異なる機能は、種々のユビキチン鎖の異なる性質においてコードされる可能性があることが提唱されている（Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009)、Ikeda, F. & Dikic, I., Atypical ubiquitin chains: new molecular signals. 'Protein Modifications: Beyond the Usual Suspects' review series. EMBO Rep 9 (6), 536-542 (2008)）。
【０１８２】
プロテオミクス研究により、全ての鎖型がインビボで存在することが明らかにされているが（Peng, J. et al., A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nat Biotechnol 21 (8), 921-926 (2003)、Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009)）、我々が知っているのは、ほとんどが、プロテアソームの分解及び細胞シグナリングにおいてそれぞれ重要なＬｙｓ４８−結合鎖及びＬｙｓ６３−結合鎖についてである（Chen, Z.J. & Sun, L.J., Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol Cell 33 (3), 275-286 (2009)、Hershko, A. & Ciechanover, A., The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479 (1998)）。その一方、他のいわゆる「非定型の」結合についてはほとんど知られていないが、それらが、モデル微生物サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で見出されるユビキチン結合の過半数を占める（Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009)）。特定のユビキチン鎖の役割研究における中心的な課題は、規定された結合を有する均一な鎖を合成することである。実際に、インビトロにおける特異的な生合成を可能にする細胞機構（Ｅ１、特異的Ｅ２及びＥ３酵素）の同定によるＬｙｓ４８−及びＬｙｓ６３−結合ユビキチンへのアクセスが、それらの生物学的役割の特性決定を可能にした（Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009)）。これらの鎖の構造は異なる特徴を示しており、それらは、種々の鎖を特異的な脱ユビキチン化酵素又はユビキチン結合ドメインによって認識する分子的基盤を提供できる（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)、Dikic, I., Wakatsuki, S., & Walters, K.J., Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (10), 659-671 (2009)）。さらに、均一な鎖へのアクセスは、結合特異的な抗体の生成を容易にし（Wang, H. et al., Analysis of nondegradative protein ubiquitylation with a monoclonal antibody specific for lysine-63-linked polyubiquitin. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (51), 20197-20202 (2008)、Newton, K. et al., Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell 134 (4), 668-678 (2008)）、特異的な鎖型の役割をインビボで究明することが可能になった。全般的に見れば、Ｌｙｓ４８−及びＬｙｓ６３−結合ユビキチン鎖を合成できることにより、これらの鎖型が特異的に認識及び調節されて、異なる生物学的プロセスを媒介する仕組みについての我々の理解が大いに増し、我々は最近、Ｌｙｓ１１−結合鎖の生合成を報告した。これは、この結合へのさらなる洞察を与えるはずである（Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007)）。
【０１８３】
残念ながら、非定型のユビキチン結合の合成に必要な特異的酵素は全く知られておらず、これらの鎖型の構造及び機能を研究する我々の能力をひどく制限している。原理上は、化学的連結アプローチを使用して、ユビキチン鎖が合成される可能性もある。実際に、連結補助剤を含有するリジン誘導体が、隣接残基を変異させずにヒストンとユビキチンとの間に天然のイソペプチド結合を生成させるのに使用されている（McGinty, R., Kim, J., Chatterjee, C., Roeder, R., & Muir, T., Chemically ubiquitylated histone H2B stimulates hDot1L-mediated intranucleosomal methylation. Nature (2008)、Yang, R., Pasunooti, K., Li, F., Liu, X., & Liu, C., Dual Native Chemical Ligation at Lysine. Journal of the American Chemical Society (2009)）。しかし、このストラテジーは、複数回の天然の化学的連結及び選択的脱保護を伴い、得られる物質量が少なく、標的タンパク質の末端に近い連結部位には最適である。イソペプチド結合を生じる他の連結補助剤も報告されているが（Ajish Kumar, K.S., Haj-Yahya, M., Olschewski, D., Lashuel, H.A., & Brik, A., Highly efficient and chemoselective peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 48 (43), 8090-8094 (2009)、Li, X., Fekner, T., Ottesen, J.J., & Chan, M.K., A pyrrolysine analogue for site-specific protein ubiquitination. Angew Chem Int Ed Engl 48 (48), 9184-9187 (2009)）、天然のイソペプチド結合を介するタンパク質全体の連結に対するそれらの有用性は、実証されていない。さらに、これらの補助剤は、一般に、ドナーユビキチンのＣ末端において、痕跡型（nontraceless）の連結反応を介して、グリシンのアラニンへの変異又はグリシンのシステインへの変異を引き起こす（Ajish Kumar, K.S., Haj-Yahya, M., Olschewski, D., Lashuel, H.A., & Brik, A., Highly efficient and chemoselective peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 48 (43), 8090-8094 (2009)、Hodgins, R.R., Ellison, K.S., & Ellison, M.J., Expression of a ubiquitin derivative that conjugates to protein irreversibly produces phenotypes consistent with a ubiquitin deficiency. J Biol Chem 267 (13), 8807-8812 (1992)）。これらの変異は一部の研究にとっては重要でないと考えられるが、脱ユビキチン化酵素の作用を抑止することが知られており（Tran, H., Hamada, F., Schwarz-Romond, T., & Bienz, M., Trabid, a new positive regulator of Wnt-induced transcription with preference for binding and cleaving K63-linked ubiquitin chains. Genes Dev 22 (4), 528-542 (2008)）、予測不可能な方法で結合の構造及び動態を変える可能性がある。
【０１８４】
ここで、我々は、特定のユビキチン鎖をその合成のための細胞機構がない場合に特定の鎖を合成できる、均一に連結されたユビキチン鎖の合成のための新しいアプローチを報告する。我々のアプローチは、我々がＧＯＰＡＬ（遺伝的コード化直交性保護及び活性化連結）と称する、遺伝子コードの拡張と化学選択的タンパク質化学反応との強力な組み合わせを使用する。我々は、酵母中のユビキチン結合の１０％及び３％をそれぞれ構成するＬｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ユビキチン鎖の調製によってＧＯＰＡＬの普遍性を実証する（Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009)）。我々は、ＧＯＰＡＬによって合成されるＬｙｓ６−結合ジユビキチン分子の結晶構造を解析し、この分子が、Ｌｙｓ４８−又はＬｙｓ６３−結合鎖の構造とは異なるコンパクトなコンフォメーションを取ることを明らかにする。さらに、Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンへのアクセスにより、我々は、１１種の脱ユビキチン化酵素（ヒト脱ユビキチン化酵素の約１０％を構成する）のパネルをこれらの結合を切断する能力に関してプロファイリングすることが可能になる。卵巣腫瘍（ＯＴＵ）ファミリー脱ユビキチン化酵素ＴＲＡＢＩＤは、Ｌｙｓ４８−結合ユビキチンよりもＬｙｓ６３−結合ユビキチンに対して高い特異性を有することが以前に示されているが（Srinivasan, G., James, C.M., & Krzycki, J.A., Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296 (5572), 1459-1462 (2002)）、我々は、定量的脱ユビキチン化酵素アッセイを用いて、ＴＲＡＢＩＤがＬｙｓ２９結合に対してＬｙｓ６３結合の４０倍の特異性を有することを明らかにする。
【０１８５】
結果
特異的なイソペプチド結合形成に対するストラテジー
１つのユビキチン（ドナー）のＣ末端と別のユビキチン（アクセプター）の特定のリジン残基のアミンとの間にイソペプチド結合を特異的に形成するには、これらの官能基を、両ユビキチン分子中の他のカルボン酸及びアミンと差別化することが必要である（図８）。我々は、特異的なイソペプチド結合の形成を、一連のステップで、（ｉ）ドナーユビキチン上の全てのリジン及びＮ末端並びにアクセプターユビキチン上の１つを除く全てのリジン及びＮ末端を保護して、アクセプターユビキチン上に１つの遊離アミンを生じるステップと、（ii）ドナーユビキチンのＣ末端をチオエステルとして特異的に活性化するステップと、（iii）前記遊離アミンと前記チオエステルとを選択的にカップリングさせることによって、ドナーユビキチンとアクセプターユビキチンとの間に特異的なイソペプチド結合を形成するステップと、（iv）全ての保護基を除去して、ユビキチンコンジュゲートを露出させるステップと、（ｖ）ユビキチン鎖を再び折り畳むステップとによって達成できることに気付いた。このアプローチの普遍性を例証するために、我々は、ユビキチン二量体を、ドナーユビキチンのＣ末端とアクセプターユビキチン上のリジン残基のε−アミノ基（Ｌｙｓ６又はＬｙｓ２９のいずれか）との特異的なイソペプチド結合によって結合させることを目指した。各ユビキチンが７個のリジン及びＮ末端アミノ基を含有するので、この系によって、我々のアプローチの特異性は厳しく試験される。
【０１８６】
ユビキチン連結前駆体の生成
タンパク質中の１つを除く全てのリジン残基の保護には、化学的に同一のアミノ酸側鎖の差別化が必要である。実際に、１つの型の残基に特異的ないくつかの反応が知られているが、多くの化学的に同一の残基の存在下において１つの残基上でタンパク質を部位特異的に修飾することは難しい。この課題は、保護されたリジンの部位特異的取り込みを遺伝的にコードすることによって解決できることに、我々は気付いた。その後にタンパク質中の他の全てのアミンを、化学的に直交する保護基で保護し、遺伝的にコードされた保護基を特異的に除去することにより、保護リジンが遺伝的にコード化された部位に遊離アミンを有するリジンが得られるはずである（図８）。
【０１８７】
保護されたリジンをユビキチンの６位に部位特異的に設置するために、我々は、メタノサルシナ・バーケリＭＳピロリジンｔＲＮＡシンセターゼ（ＭｂＰｙｌＲＳ）とその同族アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ）を利用した（Ambrogelly, A. et al., Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (9), 3141-3146 (2007)）。この同族アンバーサプレッサーｔＲＮＡは、大腸菌中でアンバーコドンに応答して組換えタンパク質へのＮε−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（１）の効率的な取り込みを指示する（Neumann, H., Peak-Chew, S.Y., & Chin, J.W., Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4 (4), 232-234 (2008)、Polycarpo, C.R. et al., Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 580 (28-29), 6695-6700 (2006)、Kawakami, T. et al., Polypeptide synthesis using an expressed peptide as a building block for condensation with a peptide thioester: application to the synthesis of phosphorylated p21Max protein(1-101). J Pept Sci 7 (9), 474-487 (2001)）。我々は、ユビキチン発現コンストラクトを作製した。このコンストラクトにおいて、ユビキチン遺伝子は６位にリジンコドンの代わりにＴＡＧコドンを含有し、ユビキチン遺伝子には３’Ｈｉｓ６タグコード配列が隣接している（ＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６）。我々は、ＭｂＰｙｌＲＳとＭｂｔＲＮＡＣＵＡの対及び１（２ｍＭ）を含有する細胞中でＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６を発現することによって、ＵｂＢｏｃＬｙｓ６−Ｈｉｓ６（６位に１を含有するユビキチン−Ｈｉｓ６）を作製した。ＵｂＢｏｃＬｙｓ６−Ｈｉｓ６の作製は、１の添加に厳密に依存した（データは示さず）。ＵｂＢｏｃＬｙｓ６−Ｈｉｓ６を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製し、Ｈｉｓ６タグを、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ−Ｌ３（ＵＣＨ−Ｌ３）での処理によって除去して、ＵｂＢｏｃＬｙｓ６を得た（補足図１）。次に、タグなしのＵｂＢｏｃＬｙｓ６をさらに、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、脱塩し、凍結乾燥させた。精製された物質を、ＥＳＩ−ＭＳによって特性決定した（図９ａ）。この操作により、２リットルの培養物から１７ｍｇの精製ＵｂＢｏｃＬｙｓ６を得た。
【０１８８】
Ｃｂｚ基でＵｂＢｏｃＬｙｓ６中の６個のＮε−Ｌｙｓアミノ基及びＮ末端アミンを保護するために、我々は、タンパク質を、塩基性ＤＭＳＯ中で７当量のＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ−ＯＳｕ）と反応させた（Aimoto, S., Polypeptide synthesis by the thioester method. Biopolymers 51 (4), 247-265 (1999)）。２時間の保護後（図９ａ）、ＥＳＩ−ＭＳを行い、７又は８個のＣｂｚ基がＵｂＢｏｃＬｙｓ６に付加されていることが示された。７個のＣｂｚ基の付加は、ＵｂＢｏｃＬｙｓ６中の全ての遊離アミノ基の保護に相当する。観察される追加のＣｂｚ基は、ユビキチン内の１つのヒスチジン（Ｈｉｓ６８）残基の部分保護に相当する可能性が高かった。この保護はその後の脱保護条件下で可逆的であるので、過剰保護は問題にならない。我々は、沈殿及び冷エーテルでの洗浄並びに風乾によって、Ｂｏｃ−及びＣｂｚ−保護ユビキチンを効率的に回収した。Ｌｙｓ６において、イソペプチド結合形成に望ましい１つの遊離Ｎε−Ｌｙｓアミノ基を露出させるために、我々は、水中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって、１に存在するＢｏｃ保護基を除去し、Ｃｂｚ保護を未変化のまま残した（図９ａ）。ＵｂＢｏｃＬｙｓ６からのこのすぐ連結できる物質（ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７−８））の全収率は、約８５％であった。
【０１８９】
ドナーユビキチン分子を、インテイン融合のチオリシス（McGinty, R., Kim, J., Chatterjee, C., Roeder, R., & Muir, T., Chemically ubiquitylated histone H2B stimulates hDot1L-mediated intranucleosomal methylation. Nature (2008)）によってＣ末端チオエステル（ＵｂＳＲ）として、培養物１Ｌ当たり６ｍｇの精製収量で生合成的に調製した（図９ｂ、オレンジ色及び補足図２）。イソペプチド結合形成への、ＵｂＳＲ中の７個のリジン残基又はＮ末端アミンの関与を回避するために、我々は、ＵｂＢｏｃＬｙｓ６に関して記載した条件を用いて、遊離アミンを８当量のＣｂｚ−ＯＳｕで保護した。ＥＳＩ−ＭＳ（図９ｂ、青色）によって判断すると、保護は２時間以内に完了し、ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９）を得た。これをエーテル沈殿によって単離した。
【０１９０】
特異的な、酵素非依存的イソペプチド結合形成
チオエステルは、Ａｇ（Ｉ）の存在下におけるその場での活性化及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換が可能であり、アミンによる選択的アシル化を可能にする（Tan, Z., Shang, S., Halkina, T., Yuan, Y., & Danishefsky, S.J., Toward Homogeneous Erythropoietin: Non-NCL-Based Chemical Synthesis of the Gln(78)-Arg(166) Glycopeptide Domain. J Am Chem Soc 131 (15), 5424-5431 (2009)、Tam, J.P., Heath, W.F., & Merrifield, R.B., Mechanisms for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethanesulfonic acid trifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. Journal of the American Chemical Society 108 (17), 5242-5251 (1986)）。我々は、この化学反応を、ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７−８）とＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９）との間の特異的イソペプチド結合の形成に適用できることに気付いた。我々は、ＤＭＳＯ中で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３、３．７５ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｈ−ＯＳｕ、３７．５ｍＭ）の存在下において、ドナーユビキチンチオエステル（ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７−８））をＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９）とモル比１：１．５で混合した（補足図２）。室温で１６時間後、粗連結反応生成物を沈殿させ、冷エーテルで洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、ユビキチンモノマー（ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７−８）＆ＵｂＳＲ（Ｃｂｚ８−９））を含有するタンパク質バンドの約３０％が、Ｃｂｚで保護された連結生成物に相当する、より高分子量の種に転換されていることが明らかになった（補足図２）。
【０１９１】
Ｃｂｚ基を除去するために、我々は、１：３：６のトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ＤＭＳからなる切断用カクテルを０℃において１時間使用した（Pickart, C.M. & Raasi, S., Controlled Synthesis of Polyubiquitin Chains. Methods in Enzymology 399, 21-36 (2005)）。脱保護されたユビキチン鎖を沈殿させ、洗浄し、８Ｍ尿素を含有するＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させて、折り畳まれていないユビキチン鎖を形成した。ユビキチンは可逆的に折り畳まれ、酵素的に合成されたＬｙｓ４８−及びＬｙｓ６８−結合ユビキチン鎖はインビトロで変性物質から精製され、再び折り畳まれる（Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009)）ので、我々が非定型のユビキチン鎖を再び折り畳めることは妥当であると思われた。したがって、我々は、タンパク質を、尿素を含まないＰＢＳ緩衝液中に透析して、結合ジユビキチンをゆっくり復元させた。その後の陽イオン交換により、残りのモノユビキチン種を除去でき、高純度のＬｙｓ６−結合ジユビキチンが得られた（補足図２）。
【０１９２】
Ｌｙｓ２９−結合ユビキチンを合成するために、我々は、ＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６の代わりに、２９位にアンバーコドンが存在するＵｂＴＡＧ２９−Ｈｉｓ６を用いる以外は、前記操作を単純に繰り返した。ＵｂＢｏｃＬｙｓ２９の調製の場合は、２Ｌの培養物から８ｍｇの収量が得られた。Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチンの生成におけるその後のステップは、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの調製のために詳述したステップに匹敵する効率で進行した。
【０１９３】
Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンの特性決定
ＧＯＰＡＬを用いて合成された精製Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンが、遺伝的に指示された部位でイソペプチド結合を介して結合され、完全に脱保護されたことを実証するために、我々は、ＥＳＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳシーケンシングを使用した。ＥＳＩ−ＭＳは、イソペプチド結合され、定量的に脱保護されたジユビキチンに相当する、精製タンパク質の単一質量ピークを示した（Ｌｙｓ６−結合ジユビキチン、観測質量＝１７，１１３Ｄａ；Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチン、観測質量＝１７，１１１Ｄａ；ジユビキチン計算質量＝１７，１１２Ｄａ；図９ｃ、ｄ）。イソペプチド結合がＬｙｓ６位及びＬｙｓ２９位で形成されることを実証するために、我々は、結合ジユビキチン分子について、ＭＳ／ＭＳシーケンシングを行った。これは、Ｌｙｓ６及びＬｙｓ２９イソペプチド結合の特異的な形成（図９ｅ、ｆ）を、９５％を超える忠実度で検証する方法である。
【０１９４】
Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの結晶構造
我々は、Ｘ線結晶構造解析によってＬｙｓ６−結合ジユビキチンの構造を決定することができた。結晶を、２０％  ＰＥＧ  ３３５０及び２００ｍＭ  ＺｎＡｃから成長させ、立方空間群（Ｐ４３３２）で形成し、３．０Åの解像度で回折した。Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの構造を、分子置換によって解析し、その後に精密化し（統計値については補足表１を参照のこと）、非対称単位中の１つのＬｙｓ６−結合ジユビキチン分子が示された。各ユビキチンは天然のコンフォメーションを取り、再折り畳みステップの成功を裏付けている。ＥＳＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳは、Ｌｙｓ６イソペプチド結合の形成を実証したが、電子密度図では柔軟なイソペプチド結合は十分に解像されず、Ｇｌｙ７６は識別可能な電子密度を示してない。このことは、ポリユビキチン構造において、結合の柔軟性が高いために起こることが以前に観察されている（補足図３ａ）。
【０１９５】
Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの結晶構造は、前述のユビキチン鎖構造とは異なる非対称のコンパクトなコンフォメーションを示している（図１０）。近位ユビキチン部分（アクセプターユビキチンから生じ、イソペプチド結合に寄与するＬｙｓ６を含有する）は、Ｉｌｅ４４及びＶａｌ７０を取り囲む疎水性表面を介して遠位ユビキチン（Ｃ末端がイソペプチド結合に寄与するドナーユビキチンから生じる）に結合する。Ｌｅｕ７１、Ｉｌｅ３６及びＬｅｕ８を含有する第２の異なる疎水性パッチ（以下、Ｉｌｅ３６パッチと称する）は、遠位ジユビキチン分子上で疎水性カウンターパートとして作用する。拡張された非対称界面が、コンパクトなジユビキチン分子をもたらす（図１０ｂ、ｃ）。さらなる界面残基は、近位ユビキチン中のＡｒｇ４２及びＧｌｎ４９、並びに近位ユビキチン中のＧｌｎ４０及びＴｈｒ９である。Ｔｈｒ９とＧｌｎ４９との間に水素結合が形成される（図１０ｄ）。
【０１９６】
Ｌｙｓ６ユビキチン−ユビキチン相互作用界面は、前述されていないいくつかの特徴を有する。Ｉｌｅ４４を取り囲んでいる疎水性パッチは、ユビキチン結合ドメイン及び脱ユビキチン化酵素との相互作用の大部分において観察される、一般的なユビキチン相互作用界面である（Dikic, I., Wakatsuki, S., & Walters, K.J., Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (10), 659-671 (2009)、Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004)）。この相互作用パッチにおいて、Ｖａｌ７０及びＬｅｕ８は、中央のＩｌｅ４４残基に隣接し、拡張された疎水性界面を提供している（図１０ｅ）。Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンにおいては、Ｉｌｅ４４−パッチはこれより小さい。これは、Ｌｅｕ８がコンフォメーション変化を受けて、異なる、ほぼ垂直な界面に関与するためである。この新規界面はまた、Ｌｅｕ７１及びＩｌｅ３６を含有し、それらは一緒になって、約４８０Å２の無極性表面（Ｉｌｅ３６パッチと称する）を形成する。これが、近位分子のＩｌｅ４４及びＶａｌ７０残基と相互作用する。次に、この非対称相互作用は、遠位分子のＩｌｅ４４及びＶａｌ７０パッチを露出したまま、ユビキチン結合ドメインとの結合のために利用できる状態で残す（図１０ｂ、１０ｄ）。加えて、このジユビキチンモデルは、非対称界面を介する鎖伸長を可能にする。ジユビキチン構造に基づくより長いＬｙｓ６−結合ユビキチン鎖の反復モデル化は、伸長されたＬｙｓ６−結合ポリマーのらせんフィラメントの形成を示唆している（補足図３）。
【０１９７】
Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの構造は、以前に観察されたジユビキチンの構造とは異なり（図１０ｆ）、界面の両側にＩｌｅ４４表面を伴う対称相互作用を仮定する、最近示唆された計算モデル（Wang, T. et al., Evidence for bidentate substrate binding as the basis for the K48 linkage specificity of otubain 1. J Mol Biol 386 (4), 1011-1023 (2009)）とも異なる。しかし、溶液中におけるポリユビキチン鎖の動的な性質のため、異なる界面及び／又はそれほどコンパクトでないコンフォメーションを取ることが可能である。Ｌｙｓ６−結合ポリユビキチンの構造的特徴をさらに理解するためには、核磁気共鳴による、単一分子レベルでの今後の研究が必要となる。
【０１９８】
Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ユビキチンに対する脱ユビキチン化酵素のプロファイリング
脱ユビキチン化酵素は、特定の鎖結合を優先し得る（Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004)）。しかし、大部分のユビキチン鎖型は合成されていないので、脱ユビキチン化酵素特異性プロファイリングは不完全である。以前の研究では、遠位分子及び近位分子中に存在するさらなるリジン残基をアルギニンに変異させる、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチン分子とＬｙｓ２９−結合ジユビキチン分子との混合物が、ｈＯｔｕ１、ＯＴＵファミリーの脱ユビキチン化酵素及び２つのＪＡＭＭ／ＭＰＮ＋脱ユビキチン化酵素複合体による切断について調べられた（Cooper, E.M. et al., K63-specific deubiquitination by two JAMM/MPN+ complexes: BRISC-associated Brcc36 and proteasomal Poh1. EMBO J (2009)、Popp, M.W., Artavanis-Tsakonas, K., & Ploegh, H.L., Substrate Filtering by the Active Site Crossover Loop in UCHL3 Revealed by Sortagging and Gain-of-function Mutations. J Biol Chem 284 (6), 3593-3602 (2009)）。これらの脱ユビキチン化酵素はいずれの鎖型も切断しないことがわかったが、変異したユビキチン鎖が天然の鎖の性質を反映するか否かは不明であるので、これらの実験は問題を含んでいる。大部分の脱ユビキチン化酵素は、遠位ユビキチン分子と広範に相互作用し（Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004)）、表面リジン残基のアルギニンへの変異が、脱ユビキチン化酵素の結合を妨げる可能性がある。
【０１９９】
我々は、既知のヒト脱ユビキチン化酵素の約１０％に相当し、４つの脱ユビキチン化酵素ファミリー−ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）、ＯＴＵ脱ユビキチン化酵素及びＪＡＭＭ／ＭＰＮ＋脱ユビキチン化酵素−を包含する１１種の脱ユビキチン化酵素を、インビトロ脱ユビキチン化酵素アッセイにおいてＬｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンを切断する能力について分析した（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。対照実験において、我々は、同じアッセイを用いて、酵素的に構築したＬｙｓ６３−結合ジユビキチンを切断した。Ｌｙｓ６３−、Ｌｙｓ４８−若しくはＬｙｓ１１−結合又は直鎖状鎖に優先してＬｙｓ６−又はＬｙｓ２９−ジユビキチンを切断する酵素を発見するために、我々は、酵素がこれらの以前に分析した鎖型のうち１つを効率的に切断する条件下でアッセイを行った。これらの条件下でＬｙｓ６−又はＬｙｓ２９−結合ジユビキチンを切断しない酵素は、基質のレパートリー内にこれらの結合を有する可能性がない。しかし、Ｌｙｓ６−又はＬｙｓ２９−結合ジユビキチンがこれらの条件下で効率的な基質であるならば、酵素の基質特異性は、さらなる検討に値する。
【０２００】
ＵＣＨ酵素は、ユビキチンのＣ末端からの小さい不定形のペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ、補足図１）の切断又は不定形のタンパク質若しくはループからのユビキチンの加水分解において高効率であるが、天然のＬｙｓ６３−、Ｌｙｓ４８−若しくはＬｙｓ１１−結合又は直鎖状ユビキチン鎖は加水分解しない（Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007)、Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004)、Komander, D. et al., The structure of the CYLD USP domain explains its specificity for Lys63-linked polyubiquitin and reveals a B box module. Mol Cell 29 (4), 451-464 (2008)）。ＵＣＨ−Ｌ３及びＢＡＰ１は、Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチン分子を切断できなかった（図１１及び補足図４）。このことは、これらの結合を有するユビキチンポリマーがこれらのＵＣＨ酵素の基質である可能性がないことを裏付けている。
【０２０１】
ＵＣＨ酵素とは対照的に、ＵＳＰ脱ユビキチン化酵素は、ユビキチンポリマーの切断において高活性であるが、明らかな結合特異性がないことが多い（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。ＵＳＰ２は、Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ６３−結合ジユビキチンをＬｙｓ２９−結合ジユビキチンよりも速く切断した（図１１並びに補足図５及び６）。ＵＳＰ５は、乱雑な脱ユビキチン化酵素であり、遊離ユビキチン鎖のＣ末端を特異的に認識し（Reyes-Turcu, F.E. et al., The ubiquitin binding domain ZnF UBP recognizes the C-terminal diglycine motif of unanchored ubiquitin. Cell 124 (6), 1197-1208 (2006)）、非付着性のユビキチン鎖を加水分解することによってユビキチンプールを補充する働きをする（Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004)）。ＵＳＰ５は、試験した全ての鎖型を急速に切断し、我々は、この酵素のアッセイにおいてほとんど識別を観察していない（図１１並びに補足図５及び６）。同様に、ＵＳＰ２１も試験全ての鎖型を急速に切断する（図１１並びに補足図５及び６）。これに対して、腫瘍抑制因子ＣＹＬＤは、そのＵＳＰドメインが、Ｌｙｓ４８結合よりＬｙｓ６３結合を優先することが知られおり（McCullough, J., Clague, M.J., & Urbe, S., AMSH is an endosome-associated ubiquitin isopeptidase. J Cell Biol 166 (4), 487-492 (2004)）、Ｌｙｓ６及びＬｙｓ２９結合に対してはほとんど又は全く活性を示さないが、その好ましいＬｙｓ６３結合を効率的に切断する。これは、ＣＹＬＤが、Ｌｙｓ６及びＬｙｓ２９結合よりもＬｙｓ６３−結合ユビキチンを優先することを実証している（図１１）。
【０２０２】
ＪＡＭＭドメイン脱ユビキチン化酵素もまた、Ｌｙｓ６３−結合特異的であることが報告されており（Popp, M.W., Artavanis-Tsakonas, K., & Ploegh, H.L., Substrate Filtering by the Active Site Crossover Loop in UCHL3 Revealed by Sortagging and Gain-of-function Mutations. J Biol Chem 284 (6), 3593-3602 (2009)、Sato, Y. et al., Structural basis for specific cleavage of Lys 63-linked polyubiquitin chains. Nature 455 (7211), 358-362 (2008)）、Ｌｙｓ６３結合を認識するための分子的基盤が、Ｌｙｓ６３−結合ジユビキチンと複合したＡＭＳＨ−ＬＰの最近の結晶構造において明らかになった（Wu-Baer, F., Lagrazon, K., Yuan, W., & Baer, R., The BRCA1/BARD1 heterodimer assembles polyubiquitin chains through an unconventional linkage involving lysine residue K6 of ubiquitin. J Biol Chem 278 (37), 34743-34746 (2003)）。ＡＭＳＨは、伸長されたＬｙｓ６３−結合ジユビキチン分子と結合し、Ｌｙｓ６３を取り囲む残基と特異的に接触する。我々は、ＡＭＳＨはＬｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンに対して不活性であるが、同一反応条件下でＬｙｓ６３−結合ジユビキチンを高い活性で切断することに気付いている。
【０２０３】
ＯＴＵドメイン脱ユビキチン化酵素はポリユビキチン鎖を加水分解するが、いくつかのメンバーはＬｙｓ４８結合及びＬｙｓ６３結合間において顕著な選択性を示す。Ａ２０及びＯＴＵＢ１は、Ｌｙｓ４８−結合鎖に特異的であって、Ｌｙｓ６３−結合鎖又は直鎖状鎖を加水分解しない（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)、Cooper, E.M. et al., K63-specific deubiquitination by two JAMM/MPN+ complexes: BRISC-associated Brcc36 and proteasomal Poh1. EMBO J (2009)）が、ＴＲＡＢＩＤは、Ｌｙｓ６３結合を優先する（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)、Srinivasan, G., James, C.M., & Krzycki, J.A., Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296 (5572), 1459-1462 (2002)）。同様に、Cezanneは、Ｌｙｓ４８及びＬｙｓ６３結合よりもＬｙｓ１１結合を優先する（Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007)）。試験したＯＴＵドメイン（Ａ２０、ＴＲＡＢＩＤ、Cezanne及びＯＴＵＢ１）は、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンを切断せず、Ａ２０、Cezanne及びＯＴＵＢ１はまた、これらの酵素がその優先する鎖型を完全に加水分解するアッセイ条件下Ｌｙｓ２９−結合を切断しなかった（図１１）。これは、以前に報告されたこれらの酵素の特異性を、Ｌｙｓ６結合及びＬｙｓ２９結合に関して拡張する。我々の定性的測定（図１１）は、ＴＲＡＢＩＤが、Ｌｙｓ６３結合よりもＬｙｓ２９結合を急速に切断することを示した。
【０２０４】
ＴＲＡＢＩＤによるユビキチン鎖加水分解の動態
ＴＲＡＢＩＤの特異性をより定量的に検討するために、我々は、定量的脱ユビキチン化酵素アッセイを開発した。以前の研究は一般に、種々の酵素濃度での一定濃度のジユビキチンの切断（Nishikawa, H. et al., BRCA1-associated protein 1 interferes with BRCA1/BARD1 RING heterodimer activity. Cancer Res 69 (1), 111-119 (2009)）、又は時間の関数としての高濃度のユビキチン鎖の切断（Venkitaraman, A.R., Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2. Cell 108 (2), 171-182 (2002)）を追跡している。これらの実験は、特異性の定性的な基準を提供するが、定量的な動態パラメーターの抽出には適合しない。ジユビキチンに関する動力学的パラメーターの抽出方法は報告されているが、ユビキチン鎖の１２５Ｉ標識を必要とする（Al-Hakim, A.K. et al., Control of AMPK-related kinases by USP9X and atypical Lys(29)/Lys(33)-linked polyubiquitin chains. Biochem J 411 (2), 249-260 (2008)、Chastagner, P., Israel, A., & Brou, C., Itch/AIP4 mediates Deltex degradation through the formation of K29-linked polyubiquitin chains. EMBO Rep 7 (11), 1147-1153 (2006)）。ＴＲＡＢＩＤの特異性を特性決定するために、Ｌｙｓ６３−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンの切断後に、我々は、各基質に対してＴＲＡＢＩＤのＫｍ未満の基質濃度で定量的ウェスタンブロット法を行った（図１２及び補足図７）。（我々は、Ｌｙｓ６３−結合ジユビキチンのＴＲＡＢＩＤ切断のｋｃａｔ及びＫｍを独立して、蛍光標識Ｌｙｓ６３−結合ジユビキチンの異方性の変化を用いて初速度法によって決定した。Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチンのＴＲＡＢＩＤの切断のＫｍは、競合実験によって得られる。補足的方法及び補足図８を参照のこと。）このアプローチにより、我々は、Ｌｙｓ６３−結合ジユビキチンのＴＲＡＢＩＤ切断に関する特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を２．５（±０．４）×１０３Ｍ−１ｓ−１（蛍光異方性によって独立して得られたもの、１．７（±２．０）×１０３Ｍ−１ｓ−１に匹敵する）と、Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチンのＴＲＡＢＩＤ切断に関する特異性定数を１．０（±０．２）×１０５Ｍ−１ｓ−１と決定できた。これらのデータは、Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチンが、Ｌｙｓ６３−結合ジユビキチンより４０倍良好な、ＴＲＡＢＩＤの基質であることを実証し、Ｌｙｓ２９−結合ユビキチンがインビボでＴＲＡＢＩＤの好ましい基質であり得ることを示唆している。ＴＲＡＢＩＤ以外のＯＴＵドメイン含有タンパク質が結合のサブセットに本質的に特異的であるようであることを考慮すると、他のファミリーメンバーが、Ｌｙｓ６−結合鎖を含む他の非定型のユビキチン鎖を特異的に切断し得る可能性もある。我々のアプローチの拡張により、これらの活性を発見できるはずである。
【０２０５】
実施例６に関する考察
我々は、ＧＯＰＡＬ、遺伝子コードの拡張と化学選択的化学反応との強力な組み合わせを用いて、特異的なイソペプチド結合によって結合されるタンパク質を合成できることを実証した。我々は、この方法を用いてＬｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンを合成し、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの構造的特性決定及びＬｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ユビキチン切断特異性に関する脱ユビキチン化酵素のプロファイリングを初めて可能にした。
【０２０６】
総合すれば、これらの脱ユビキチン化酵素アッセイは、Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンが、ＵＳＰファミリー脱ユビキチン化酵素によって認識され、効率的に加水分解されることを実証している。これらのデータは、脱ユビキチン化酵素特異性の特性決定を拡張し、他のこれまで合成可能な結合（例えば、ＯＴＵＢ１、Ａ２０）よりもＬｙｓ４８に特異的な脱ユビキチン化酵素が、Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンに関してこの特異性を保持することを実証している。しかし、我々は今回、ＴＲＡＢＩＤは、Ｌｙｓ６３−結合ユビキチンよりもＬｙｓ２９−結合ユビキチンに対して４０倍活性であるが、Ｌｙｓ６結合に対しては不活性であることを明らかにしている。これは、Ｗｎｔシグナリングなどの生物学的経路におけるＬｙｓ２９結合の役割の研究に弾みを与える（Srinivasan, G., James, C.M., & Krzycki, J.A., Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296 (5572), 1459-1462 (2002)）。ＴＲＡＢＩＤがＬｙｓ２９−修飾基質を有するかどうかについて分析することは、興味深い。ＯＴＵドメインに加えて、ＴＲＡＢＩＤはまた、Ｌｙｓ６３−結合及び直鎖状ユビキチン鎖に結合する３つのＮ末端Ｎｐｌ４−型ＺｎＦ（ＮＺＦ）ドメインを含有する（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）。ＮＺＦドメインはまた、インビボで、Ｌｙｓ２９−結合鎖と結合するか、又はＬｙｓ６３結合とのＴＲＡＢＩＤ相互作用を調節することが可能である。全般的に見れば、脱ユビキチン化酵素プロファイリングからの観察は、脱ユビキチン化酵素の特異性が本質的に高いという見解を裏づけている。Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ジユビキチンは、これらの結合に対するさらなる脱ユビキチン化酵素を特定するのに重要なツールとなる。
【０２０７】
Ｌｙｓ６−及びＬｙｓ２９−結合ユビキチン鎖へのアクセスにより、我々は、それらの細胞内役割をさらに理解するためにこれらの新しい結合に対する抗体を生成する（Wang, H. et al., Analysis of nondegradative protein ubiquitylation with a monoclonal antibody specific for lysine-63-linked polyubiquitin. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (51), 20197-20202 (2008)、Newton, K. et al., Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell 134 (4), 668-678 (2008)）ことが可能になると考えられる。種々のユビキチン鎖を識別する特異的なユビキチン結合ドメイン（ＵＢＤ）は記載されている（Dikic, I., Wakatsuki, S., & Walters, K.J., Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (10), 659-671 (2009)）。Ｌｙｓ６及びＬｙｓ２９結合を合成できることにより、これらの結合を特異的に認識できるＵＢＤの発見が促進されるはずである。
【０２０８】
Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの結晶構造は、近位ユビキチン部分と遠位ユビキチン部分が異なった残基を介して相互作用する新しいコンパクトな非対称のコンフォメーションを明らかにしている（図１０）。このコンフォメーションは、結合ユビキチン分子のＩｌｅ４４パッチが互いに相互作用する、Ｌｙｓ４８−結合ユビキチンのコンパクトな対称のコンフォメーションとは異なり（Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, 2nd ed. (Academic Press, 2008)）（図１０ｆ）、Ｉｌｅ４４領域に関与しない、Ｌｙｓ１１−結合ジユビキチンのコンパクトな非対称のコンフォメーションとも異なる（Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007)）。Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンの結晶構造は、個々のユビキチン分子間に相互作用がない開いたコンフォメーションを取る、Ｌｙｓ６３−結合又は直鎖状ユビキチン鎖の結晶構造とも異なる（Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009)）（図１０ｆ）。しかし、この結晶構造は動的なジユビキチン分子の静的画像を示し、Ｌｙｓ６結合は、他の結合（Neumann, H. et al., A method for genetically installing site-specific acetylation in recombinant histones defines the effects of H3 K56 acetylation. Mol Cell 36 (1), 153-163 (2009)）と同様に、溶液中でさらなるコンフォメーションを取り得る。それでも、Ｌｙｓ６−結合ユビキチン鎖の独特な構造によって、細胞におけるこの結合型の、提唱されている独特の生物学的機能が説明され得る（Larsen, C.N., Price, J.S., & Wilkinson, K.D., Substrate binding and catalysis by ubiquitin C-terminal hydrolases: identification of two active site residues. Biochemistry 35 (21), 6735-6744 (1996)、Edelmann, M.J. et al., Structural basis and specificity of human otubain 1-mediated deubiquitination. Biochem J 418 (2), 379-390 (2009)）。
【０２０９】
ＧＯＰＡＬは、ＳＵＭＯ化及びＮＥＤＤ化されたタンパク質標的を含む、他のイソペプチド−結合タンパク質の合成に適用し得るが、この方法は、現在の形態では、タンパク質が可逆的に再折り畳まれ得ることを必要とする。より広く見れば、保護アミノ酸の部位特異的コード化、他に存在するアミノ酸の化学的保護及びコード化された保護アミノ酸の脱保護によってタンパク質中の化学的に同一の残基を差別化するストラテジーにより、長年にわたって開発されてきた、タンパク質及びペプチドの化学の一連の残基選択的及び化学選択的反応（Adams, P.D. et al., PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58 (Pt 11), 1948-1954 (2002)）を、部位選択的タンパク質修飾に応用できるようになる。この方法は、遺伝的コード化を使用して修飾又は連結の部位を規定するので、それは、タンパク質中の任意の部位の修飾に適用できる。
【０２１０】
方法
Ｃｂｚ−ＯｓｕによるＵｂＢｏｃＬｙｓ６及びＵｂＢｏｃＬｙｓ２９の全般的保護。  凍結乾燥ＵｂＢｏｃＬｙｓ６（２０ｍｇ、２．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．７ｍｌ）中に溶解させ、ＤＩＥＡ（６７μｌ）を加えた。混合物を撹拌しながら、Ｃｂｚ−ＯＳｕ（４．８１ｍｇ、１９．３μｍｏｌ）を反応生成物に加えた。２５℃において２時間攪拌後、反応生成物を冷エーテル（１７ｍｌ）に移し、短時間ボルテックスした。遠心分離によって沈殿物を集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル（１７ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾した。ＵｂＢｏｃＬｙｓ２９については、ＵｂＢｏｃＬｙｓ２９−Ｈｉｓ６の発現収率の低下を考慮してこの操作と以後の操作を案分して繰り返した。
【０２１１】
Ｂｏｃ保護基の除去。  ＵｂＢｏｃＬｙｓ６  １０ｍｇから得られた、乾燥全般的保護ペプチド、ＵｂＢｏｃＬｙｓ６（Ｃｂｚ７−８）を冷９：６ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（１．２８ｍｌ）中に溶解させ、４℃において９０分間インキュベートした。次いで、選択的に脱保護されたペプチドを沈殿させ、氷冷エーテル（２×１３ｍｌ）で洗浄した。水層及びエーテル層を除去し、ペプチドを風乾させた。
【０２１２】
Ｃｂｚ−ＯＳｕによるＵｂ−ＭＥＳチオエステルの全般的保護。  凍結乾燥ＵｂＳＲ（１０ｍｇ、１．１５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８３３μｌ）中に溶解させ、ＤＩＥＡ（１７μｌ）を加えた。混合物を撹拌しながら、Ｃｂｚ−ＯＳｕ（２．７５ｍｇ、１１．５μｍｏｌ）を反応生成物に加えた。反応生成物を、２５℃において２時間撹拌し、次いで冷エーテル（８．５ｍｌ）中に移し、短時間ボルテックスした。沈殿物を遠心分離によって集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル（８．５ｍｌ）で洗浄し、風乾した。
【０２１３】
特異的なイソペプチド結合形成。  ＵｂＬｙｓ６（Ｃｂｚ７−８）（２．１ｍｇ、２２０ｎｍｏｌ）及びＵｂＳＲ（Ｃｂｚ７−８）（３．３ｍｇ、３３６ｎｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（９０μｌ）中に溶解させた。ＤＩＥＡ（４μｌ）、Ｈ−ＯＳｕ（０．３９ｍｇ、３．３６μｍｏｌ）及びＡｇＮＯ３（５７μｇ、３３６ｎｍｏｌ）を加えた。反応生成物を、暗所で２５℃において１６時間インキュベートした。粗混合物を冷エーテル（１ｍｌ）で沈殿させ、冷エーテル（１ｍｌ）で洗浄し、風乾した。タンパク質を、５５％ＴＦＡ、３５％ＤＭＳ及び１０％ＴＦＭＳＡからなる氷冷カクテル（５ｍｇ  ｍｌ−１）に溶解させた。０℃で９０分間撹拌後、タンパク質を、１０倍容量の冷エーテル及び０．５％（ｖ／ｖ）ピリジンで沈殿させた。重い沈殿物が形成され、これを冷エーテルで洗浄し、集め、乾燥させた。乾燥沈殿物を緩衝液（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４、８Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に約０．５ｍｇ  ｍｌ−１のタンパク質濃度で溶解させ、3kDa MWCO膜（Spectrum Labs社）を用いて、同じ緩衝液（１リットル）に対して終夜透析した。次いで、試料を新鮮な透析膜に移し、フォールディング用緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して終夜を透析した。タンパク質を、Amicon Ultra-15 3kDa MWCO遠心濾過装置（Millipore社）を用いてIEX緩衝液Ａ（酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。試料を濾過し（０．４５μＭ）、AKTA FPLCシステムを用いて０．５ｍｌ  ｍｉｎ−１の流速で、予め平衡化させたMonoS 5/50GLカラム（GE Life Sciences社）にロードした。流量を２ｍＬ  ｍｉｎ−１まで増加させ、１０分間にわたって６０％  IEX緩衝液Ｂ（酢酸アンモニウム  ｐＨ４．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）に達する勾配を適用した。画分（０．５ｍＬ）を集め、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンを含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。それらの画分をプールし、遠心濾過装置を用いて、再びIEX緩衝液Ａに交換した。試料を、平衡化されたMonoSカラムに再適用し、２ｍｌ  ｍｉｎ−１の流速で、４５分にわたって６０％緩衝液Ｂに達する勾配を適用した。画分を１ｍｌの容量で集め、純粋なＬｙｓ６−結合ジユビキチンを含有する画分をプールし、１ｍｇ  ｍｉｎ−１まで濃縮した（２００〜３００μｇ、収率５〜８％）。次いで、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンを、Dispo Biodialyzer 5kDa MWCO（The Nest Group Inc.）を用いて保存用緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）に対して終夜透析した。Ｌｙｓ６−結合ジユビキチン試料を、保存のために−２０℃において凍結させた。イソペプチド結合形成反応においてＵｂＬｙｓ２９（Ｃｂｚ７−８）を用いる以外は、Ｌｙｓ６−結合ジユビキチンに関して記載したようにして、Ｌｙｓ２９−結合ジユビキチンの調製を実施した。
【０２１４】
他の方法。  アクセプターユビキチン（ＵｂＴＡＧ６−Ｈｉｓ６及びＵｂＴＡＧ２９−  Ｈｉｓ６）のクローニング、ドナーユビキチンＵｂｌ−７６−チオエステルのクローニング、ドナーユビキチンＵｂｌ−７６−チオエステルの調製、脱ユビキチン化酵素生成及びＬｙｓ６３二量体生成、並びにアクセプターユビキチン（ＵｂＢｏｃＬｙｓ６及びＵｂＢｏｃＬｙｓ２９）の調製のための詳細な方法は、補足的方法中に見出すことができる。これは、銀染色と定量的ウェスタンブロット並びに動態データを分析するための分析操作を用いる、定性的及び定量的脱ユビキチン化酵素アッセイであることができる。（ＵｂＬｙｓ６）２結晶化、構造の決定及び精密化並びにタンパク質の質量分析のための方法も同様に、補足的方法中に見出すことができる。
【受託番号】
【０２１５】
受入コード。  Ｌｙｓ６結合ジユビキチンのコーディネートは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（受入コード２ｘｋ５）に寄託済みである。
（参考文献）
<jrn>1. Chen, Z.J. & Sun, L.J. Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol. Cell 33, 275-286 (2009). Medline</jrn>
<jrn>2. Komander, D. The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem. Soc. Trans. 37, 937-953 (2009). Medline</jrn>
<jrn>3. Ikeda, F. & Dikic, I. Atypical ubiquitin chains: new molecular signals. 'Protein modifications: beyond the usual suspects' review series. EMBO Rep. 9, 536-542 (2008). Medline</jrn>
<jrn>4. Peng, J. et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nat. Biotechnol. 21, 921-926 (2003). Medline</jrn>
<jrn>5. Xu, P. et al. Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137, 133-145 (2009). Medline</jrn>
<jrn>6. Hershko, A. & Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998). Medline</jrn>
<jrn>7. Komander, D. et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep. 10, 466-473 (2009). Medline</jrn>
<jrn>8. Dikic, I., Wakatsuki, S. & Walters, K.J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 659-671 (2009). Medline</jrn>
<jrn>9. Wang, H. et al. Analysis of nondegradative protein ubiquitylation with a monoclonal antibody specific for lysine-63-linked polyubiquitin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 20197-20202 (2008). Medline</jrn>
<jrn>10. Newton, K. et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell 134, 668-678 (2008). Medline</jrn>
<jrn>11. Bremm, A., Freund, S.M.V. & Komander, D. Lys11-linked ubiquitin chains adopt compact conformations and are preferentially hydrolysed by the deubiquitinase Cezanne. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 939-947 (2010) </jrn>
<jrn>12. Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P. & Muir, T.W. Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew. Chem. Int. Edn Engl. 46, 2814-2818 (2007). Medline</jrn>
<jrn>13. McGinty, R.K., Kim, J., Chatterjee, C., Roeder, R. & Muir, T. Chemically ubiquitylated histone H2B stimulates hDot1L-mediated intranucleosomal methylation. Nature 453, 812-816 (2008). Medline</jrn>
<jrn>14. Yang, R., Pasunooti, K., Li, F., Liu, X. & Liu, C. Dual native chemical ligation at lysine. J. Am. Chem. Soc. 131, 13592-13593 (2009). Medline</jrn>
<jrn>15. Ajish Kumar, K.S., Haj-Yahya, M., Olschewski, D., Lashuel, H.A. & Brik, A. Highly efficient and chemoselective peptide ubiquitylation. Angew. Chem. Int. Edn Engl. 48, 8090-8094 (2009). Medline</jrn>
<jrn>16. Li, X., Fekner, T., Ottesen, J.J. & Chan, M.K. A pyrrolysine analogue for site-specific protein ubiquitination. Angew. Chem. Int. Edn Engl. 48, 9184-9187 (2009). Medline</jrn>
<jrn>17. Hodgins, R.R., Ellison, K.S. & Ellison, M.J. Expression of a ubiquitin derivative that conjugates to protein irreversibly produces phenotypes consistent with a ubiquitin deficiency. J. Biol. Chem. 267, 8807-8812 (1992). Medline</jrn>
<jrn>18. Tran, H., Hamada, F., Schwarz-Romond, T. & Bienz, M. Trabid, a new positive regulator of Wnt-induced transcription with preference for binding and cleaving K63-linked ubiquitin chains. Genes Dev. 22, 528-542 (2008). Medline</jrn>
<jrn>19. Srinivasan, G., James, C.M. & Krzycki, J.A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-1462 (2002). Medline</jrn>
<jrn>20. Ambrogelly, A. et al. Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA104, 3141-3146 (2007). Medline</jrn>
<jrn>21. Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat. Chem. Biol. 4, 232-234 (2008). Medline</jrn>
<jrn>22. Polycarpo, C.R. et al. Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett. 580, 6695-6700 (2006). Medline</jrn>
<jrn>23. Kawakami, T. et al. Polypeptide synthesis using an expressed peptide as a building block for condensation with a peptide thioester: application to the synthesis of phosphorylated p21Max protein(1-101). J. Pept. Sci. 7, 474-487 (2001). Medline</jrn>
<jrn>24. Aimoto, S. Polypeptide synthesis by the thioester method. Biopolymers 51, 247-265 (1999). Medline</jrn>
<jrn>25. Tan, Z., Shang, S., Halkina, T., Yuan, Y. & Danishefsky, S.J. Toward homogeneous erythropoietin: non-NCL-based chemical synthesis of the Gln(78)-Arg(166) glycopeptide domain. J. Am. Chem. Soc. 131, 5424-5431 (2009). Medline</jrn>
<jrn>26. Tam, J.P., Heath, W.F. & Merrifield, R.B. Mechanisms for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethanesulfonic acid trifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. J. Am. Chem. Soc. 8, 5242-5251 (1986).</jrn>
<jrn>27. Pickart, C.M. & Raasi, S. Controlled synthesis of polyubiquitin Chains. Methods Enzymol. 399, 21-36 (2005). Medline</jrn>
<jrn>28. Komander, D., Clague, M.J. & Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 550-563 (2009). Medline</jrn>
<jrn>29. Fushman, D. & Walker, O. Exploring linkage dependence of polyubiquitin conformations using molecular modeling. J. Mol. Biol. 395, 803-814 (2010). Medline</jrn>
<jrn>30. Wang, T. et al. Evidence for bidentate substrate binding as the basis for the K48 linkage specificity of otubain 1. J. Mol. Biol. 386, 1011-1023 (2009). Medline</jrn>
<jrn>31. Cooper, E.M. et al. K63-specific deubiquitination by two JAMM/MPN+ complexes: BRISC-associated Brcc36 and proteasomal Poh1. EMBO J. 28, 621-631 (2009). Medline</jrn>
<jrn>32. Popp, M.W., Artavanis-Tsakonas, K. & Ploegh, H.L. Substrate filtering by the active site crossover loop in UCHL3 revealed by sortagging and gain-of-function mutations. J. Biol. Chem. 284, 3593-3602 (2009). Medline</jrn>
<jrn>33. Reyes-Turcu, F.E. et al. The ubiquitin binding domain ZnF UBP recognizes the C-terminal diglycine motif of unanchored ubiquitin. Cell 124, 1197-1208 (2006). Medline</jrn>
<jrn>34. Komander, D. et al. The structure of the CYLD USP domain explains its specificity for Lys63-linked polyubiquitin and reveals a B box module. Mol. Cell 29, 451-464 (2008). Medline</jrn>
<jrn>35. McCullough, J., Clague, M.J. & Urbe, S. AMSH is an endosome-associated ubiquitin isopeptidase. J. Cell Biol. 166, 487-492 (2004). Medline</jrn>
<jrn>36. Sato, Y. et al. Structural basis for specific cleavage of Lys 63-linked polyubiquitin chains. Nature 455, 358-362 (2008). Medline</jrn>
<edb>37. Winborn, B.J. et al. The deubiquitinating enzyme ataxin-3, a polyglutamine disease protein, edits Lys63 linkages in mixed linkage ubiquitin chains. J. Biol. Chem. 283, 26436-26443 (2008).</edb>
<jrn>38. Komander, D. et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep. 10, 466-473 (2009). Medline</jrn>
<jrn>39. Wang, T. et al. Evidence for bidentate substrate binding as the basis for the K48 linkage specificity of otubain 1. J. Mol. Biol. 386, 1011-1023 (2009). Medline</jrn>
<jrn>40. Cooper, E.M., Boeke, J.D. & Cohen, R.E. Specificity of the BRISC deubiquitinating enzyme is not due to selective binding to Lys63-linked polyubiquitin. J. Biol. Chem. 285, 10344-10352 (2010). Medline</jrn>
<jrn>41. Cook, W.J., Jeffrey, L.C., Carson, M., Chen, Z. & Pickart, C.M. Structure of a diubiquitin conjugate and a model for interaction with ubiquitin conjugating enzyme (E2). J. Biol. Chem. 267, 16467-16471 (1992). Medline</jrn>
<jrn>42. Eddins, M.J., Varadan, R., Fushman, D., Pickart, C.M. & Wolberger, C. Crystal structure and solution NMR studies of Lys48-linked tetraubiquitin at neutral pH. J. Mol. Biol. 367, 204-211 (2007). Medline</jrn>
<jrn>43. Wu-Baer, F., Lagrazon, K., Yuan, W. & Baer, R. The BRCA1/BARD1 heterodimer assembles polyubiquitin chains through an unconventional linkage involving lysine residue K6 of ubiquitin. J. Biol. Chem. 278, 34743-34746 (2003). Medline</jrn>
<jrn>44. Nishikawa, H. et al. BRCA1-associated protein 1 interferes with BRCA1/BARD1 RING heterodimer activity. Cancer Res. 69, 111-119 (2009). Medline</jrn>
45. Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques 2nd ed. (Academic Press, 2008).
（参考文献）
1  Chen, Z.J. & Sun, L.J., Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling. Mol Cell 33 (3), 275-286 (2009).
2  Komander, D., The emerging complexity of protein ubiquitination. Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953 (2009).
3  Ikeda, F. & Dikic, I., Atypical ubiquitin chains: new molecular signals. 'Protein Modifications: Beyond the Usual Suspects' review series. EMBO Rep 9 (6), 536-542 (2008).
4  Peng, J. et al., A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nat Biotechnol 21 (8), 921-926 (2003).
5  Xu, P. et al., Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137 (1), 133-145 (2009).
6  Hershko, A. & Ciechanover, A., The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479 (1998).
7  Komander, D. et al., Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Rep 10 (5), 466-473 (2009).
8  Dikic, I., Wakatsuki, S., & Walters, K.J., Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (10), 659-671 (2009).
9  Wang, H. et al., Analysis of nondegradative protein ubiquitylation with a monoclonal antibody specific for lysine-63-linked polyubiquitin. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (51), 20197-20202 (2008).
10  Newton, K. et al., Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell 134 (4), 668-678 (2008).
11  Chatterjee, C., McGinty, R.K., Pellois, J.-P., & Muir, T.W., Auxiliary-mediated site-specific peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 46 (16), 2814-2818 (2007).
12  McGinty, R., Kim, J., Chatterjee, C., Roeder, R., & Muir, T., Chemically ubiquitylated histone H2B stimulates hDot1L-mediated intranucleosomal methylation. Nature (2008).
13  Yang, R., Pasunooti, K., Li, F., Liu, X., & Liu, C., Dual Native Chemical Ligation at Lysine. Journal of the American Chemical Society (2009).
14  Ajish Kumar, K.S., Haj-Yahya, M., Olschewski, D., Lashuel, H.A., & Brik, A., Highly efficient and chemoselective peptide ubiquitylation. Angew Chem Int Ed Engl 48 (43), 8090-8094 (2009).
15  Li, X., Fekner, T., Ottesen, J.J., & Chan, M.K., A pyrrolysine analogue for site-specific protein ubiquitination. Angew Chem Int Ed Engl 48 (48), 9184-9187 (2009).
16  Hodgins, R.R., Ellison, K.S., & Ellison, M.J., Expression of a ubiquitin derivative that conjugates to protein irreversibly produces phenotypes consistent with a ubiquitin deficiency. J Biol Chem 267 (13), 8807-8812 (1992).
17  Tran, H., Hamada, F., Schwarz-Romond, T., & Bienz, M., Trabid, a new positive regulator of Wnt-induced transcription with preference for binding and cleaving K63-linked ubiquitin chains. Genes Dev 22 (4), 528-542 (2008).
18  Srinivasan, G., James, C.M., & Krzycki, J.A., Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296 (5572), 1459-1462 (2002).
19  Ambrogelly, A. et al., Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (9), 3141-3146 (2007).
20  Neumann, H., Peak-Chew, S.Y., & Chin, J.W., Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4 (4), 232-234 (2008).
21  Polycarpo, C.R. et al., Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 580 (28-29), 6695-6700 (2006).
22  Kawakami, T. et al., Polypeptide synthesis using an expressed peptide as a building block for condensation with a peptide thioester: application to the synthesis of phosphorylated p21Max protein(1-101). J Pept Sci 7 (9), 474-487 (2001).
23  Aimoto, S., Polypeptide synthesis by the thioester method. Biopolymers 51 (4), 247-265 (1999).
24  Tan, Z., Shang, S., Halkina, T., Yuan, Y., & Danishefsky, S.J., Toward Homogeneous Erythropoietin: Non-NCL-Based Chemical Synthesis of the Gln(78)-Arg(166) Glycopeptide Domain. J Am Chem Soc 131 (15), 5424-5431 (2009).
25  Tam, J.P., Heath, W.F., & Merrifield, R.B., Mechanisms for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethanesulfonic acid trifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. Journal of the American Chemical Society 108 (17), 5242-5251 (1986).
26  Pickart, C.M. & Raasi, S., Controlled Synthesis of Polyubiquitin Chains. Methods in Enzymology 399, 21-36 (2005).
27  Komander, D., Clague, M.J., & Urbe, S., Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (8), 550-563 (2009).
28  Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004).
29  Wang, T. et al., Evidence for bidentate substrate binding as the basis for the K48 linkage specificity of otubain 1. J Mol Biol 386 (4), 1011-1023 (2009).
30  Cooper, E.M. et al., K63-specific deubiquitination by two JAMM/MPN+ complexes: BRISC-associated Brcc36 and proteasomal Poh1. EMBO J (2009).
31  Popp, M.W., Artavanis-Tsakonas, K., & Ploegh, H.L., Substrate Filtering by the Active Site Crossover Loop in UCHL3 Revealed by Sortagging and Gain-of-function Mutations. J Biol Chem 284 (6), 3593-3602 (2009).
32  Komander, D. et al., The structure of the CYLD USP domain explains its specificity for Lys63-linked polyubiquitin and reveals a B box module. Mol Cell 29 (4), 451-464 (2008).
33  Reyes-Turcu, F.E. et al., The ubiquitin binding domain ZnF UBP recognizes the C-terminal diglycine motif of unanchored ubiquitin. Cell 124 (6), 1197-1208 (2006).
34  McCullough, J., Clague, M.J., & Urbe, S., AMSH is an endosome-associated ubiquitin isopeptidase. J Cell Biol 166 (4), 487-492 (2004).
35  Sato, Y. et al., Structural basis for specific cleavage of Lys 63-linked polyubiquitin chains. Nature 455 (7211), 358-362 (2008).
36  Wu-Baer, F., Lagrazon, K., Yuan, W., & Baer, R., The BRCA1/BARD1 heterodimer assembles polyubiquitin chains through an unconventional linkage involving lysine residue K6 of ubiquitin. J Biol Chem 278 (37), 34743-34746 (2003).
37  Nishikawa, H. et al., BRCA1-associated protein 1 interferes with BRCA1/BARD1 RING heterodimer activity. Cancer Res 69 (1), 111-119 (2009).
38  Venkitaraman, A.R., Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2. Cell 108 (2), 171-182 (2002).
39  Al-Hakim, A.K. et al., Control of AMPK-related kinases by USP9X and atypical Lys(29)/Lys(33)-linked polyubiquitin chains. Biochem J 411 (2), 249-260 (2008).
40  Chastagner, P., Israel, A., & Brou, C., Itch/AIP4 mediates Deltex degradation through the formation of K29-linked polyubiquitin chains. EMBO Rep 7 (11), 1147-1153 (2006).
41  Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, 2nd ed. (Academic Press, 2008).
42  Neumann, H. et al., A method for genetically installing site-specific acetylation in recombinant histones defines the effects of H3 K56 acetylation. Mol Cell 36 (1), 153-163 (2009).
43  Larsen, C.N., Price, J.S., & Wilkinson, K.D., Substrate binding and catalysis by ubiquitin C-terminal hydrolases: identification of two active site residues. Biochemistry 35 (21), 6735-6744 (1996).
44  Edelmann, M.J. et al., Structural basis and specificity of human otubain 1-mediated deubiquitination. Biochem J 418 (2), 379-390 (2009).
45  Adams, P.D. et al., PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58 (Pt 11), 1948-1954 (2002).
46  Cook, W.J., Jeffrey, L.C., Carson, M., Chen, Z., & Pickart, C.M., Structure of a diubiquitin conjugate and a model for interaction with ubiquitin conjugating enzyme (E2). J Biol Chem 267 (23), 16467-16471 (1992).
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2013522352.tif 000029
【図１５】
2013522352.tif 000030
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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