(57)【要約】  本発明は、遺伝子の心臓特異的発現を増強し得る核酸調節因子、これらの調節因子を使用する方法、およびこれらの因子の使用に関する。これらの核酸調節因子を含む発現カセットおよびベクターも開示する。本発明は、遺伝子治療を用いる用途に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはこれらの機能性断片からなる群から選択される配列を含む、心臓特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチド以下の核酸調節因子。
【請求項２】
配列番号１、これに対して９５％の同一性を有する配列、またはこれらの機能性断片を含む、請求項１に記載の核酸調節因子。
【請求項３】
請求項１に記載の調節因子またはこの相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、６００ヌクレオチド以下の核酸調節因子。
【請求項４】
２５０ヌクレオチド以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸調節断片。
【請求項５】
プロモーターおよび導入遺伝子に機能的に連結された請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸調節因子を含む、核酸発現カセット。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載の２つ以上の核酸調節因子を含む、請求項５に記載の核酸発現カセット。
【請求項７】
２つ以上の調節因子が同一である、請求項６に記載の核酸発現カセット。
【請求項８】
プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項５から７のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項９】
プロモーターがミオシン重鎖遺伝子、特にミオシン重鎖α（αＭＨＣ）遺伝子由来である、請求項８に記載の核酸発現カセット。
【請求項１０】
βグロビンイントロンをさらに含む、請求項５から９のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１１】
導入遺伝子が、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦなどの血管形成因子、ＳＥＲＣＡ２ａなどのＡＴＰアーゼ、イオンチャネル、サイトカインおよび成長因子からなる群から選択される治療用タンパク質をコードする、請求項５から１０のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか一項に記載の調節因子を含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項５から１１のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
ウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターである、請求項１２または１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
遺伝子治療における、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸調節因子の使用。
【請求項１７】
請求項５から１１のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを心臓細胞内に導入する段階；
導入遺伝子タンパク質産物を心臓細胞内で発現させる段階
を含む、心臓細胞においてタンパク質を発現させるための方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の核酸発現カセット、または請求項１１に記載の核酸発現カセットを含むベクターを被験体の心臓内に導入する段階；
治療量のタンパク質を肝臓内で発現させる段階
を含む、遺伝子治療を必要とする被験体に対する遺伝子治療の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の心臓特異的発現を増強し得る核酸調節因子、これらの調節因子を使用する方法、およびこれらの因子の使用に関する。これらの核酸調節因子を含む発現カセットおよびベクターも開示する。本発明は、遺伝子治療を用いる用途に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
心臓関連の問題は依然として、高い罹患率、臨床転帰の不良および大きな医療費負担を伴う主な国民の健康問題である（Ｋｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。主なおよび最終的な結末である心不全は、高い罹患率および死亡率をもたらす。心不全の原因となる大部分の症候群の主要な原因としては主に、高血圧症、冠動脈疾患、心筋症、置換性線維形成の入り交じったものを有する心筋をもたらす浸潤性症候群または炎症、および糖尿病が挙げられる。これらの病態は処置可能であるが、これらは治療を構成せず、最終的には致死的な心不全をもたらす疾患の進行を遅らせるだけである（ＬａＰｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。最近では、分子心臓病学の進歩によって、最も一般的な心疾患の誘導および進行に関係する分子経路が解明され、これらの疾患に関連する多くの原因遺伝子およびタンパク質が同定された。遺伝子治療は、このようなタンパク質の産生を制御し、心疾患を予防および処置する有望な手段を示す（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０００３】
遺伝子治療は、心筋機能障害を処置する代替戦略の可能性を提供し（Ｆｏｍｉｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００８）、これによって治療遺伝子は心臓に送達され、指示された期間にわたって治療反応をもたらすのに十分高いレベルで発現する（ＬａＰｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。遺伝子治療の標的となっている心臓関連病態には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）（Ｂｏｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００９）、肥大型心筋症（Ｊａｃｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００８）および糖尿病性心筋症（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９）のような遺伝的心筋症がある。過去１０年間にわたって、遺伝子治療は、不整脈、再狭窄（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７）、虚血および低酸素症（Ｆｏｍｉｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００８）などの心不全を処置するための動物モデルの前臨床試験で有望な結果を示した。例えば、血管形成因子（例えば、血管内皮成長因子またはＶＥＧＦ）をコードする遺伝子を過剰発現させることによって心虚血を処置する遺伝子治療により、治療的血管形成が検討されている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。加えて、遺伝子治療は、移植心臓内に免疫特権部位を作り出して、臓器移植患者における免疫拒絶を防ぐ戦略の可能性を提供する（Ｖａｓｓａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。心疾患に対する遺伝子治療の臨床的成功は、遺伝子導入効率に伴う課題：標的組織への送達不足、治療効果の消失および用量を制限する宿主の免疫系との相互作用により、当初予測されていたよりも遅れている（Ｓａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。送達の問題は、これらの中で最大の課題である。報告されている心筋送達の方法としては、心筋内注射、冠動脈カテーテル法、心膜送達（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、大動脈遮断中の心室腔注入および心肺バイパス中の潅流が挙げられる（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｓａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【０００４】
プラスミド／ネイキッドＤＮＡの使用が、動物モデルおよび難治性の心筋虚血を有する患者において治療効果をもたすことが実証されている。しかし、ネイキッドＤＮＡは十分な効率で細胞に自然に入ることができないので、ネイキッドＤＮＡの全身注射は、心筋遺伝子送達には非効率的な技術である。ネイキッドＤＮＡがリポソーム、コレステロールリポポリマー、ポロキサミンナノスフィア（ｐｏｌｏａｘｉｍｅ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）およびゼラチンのような化合物と結合している場合、トランスフェクション効率は典型的には高められ得るが、これらの化合物は心筋特異性を高めない（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。従って、心臓へのネイキッドＤＮＡ送達は、直接的な心筋内注射（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７）によってまたはソノポレーションもしくは（ＵＴＭＤ）超音波標的微小気泡破壊（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって実施しなければならないが、トランスフェクション効率は依然として限定的である（Ｄｉｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０００５】
非ウイルスベクターおよびプラスミドＤＮＡは安全でありまた比較的低コストであるが、これらは宿主ゲノムに組み込まれるか、またはエピソームの形態で存続することができないで、これらは一過性のトランスフェクションをもたらすだけである。これが、これらを、心筋症のような心疾患または遺伝性心疾患において必要とされる長期遺伝子発現に不適なものにしているが、これらは、一過性である血管形成関連の用途には好適であり得る（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。これらは、プラスミドＤＮＡが心筋遺伝子送達および発現において非能率であることを示す（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０００６】
４個のクラスのウイルスベクターが、心筋遺伝子送達に主に使用されている：レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターおよびＡＡＶベクター（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。これらの中で、ＡＡＶは、他のベクターと比較して、心臓に形質導入するのにより効率的であることが証明されている。アデノウイルスベクターもまた心臓に形質導入することが示されているが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いた心筋形質導入は比較的非効率的である。ほとんどの治験責任医師は、長期発現を達成し、Ａｄに伴う炎症の性質を克服するために、ＡＡＶに切り替えている（Ｓａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＡＡＶに関連して明らかな病状は認められておらず（Ｇｏｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、これは、ＡＡＶベクターによって送達された遺伝子の数ヶ月間の持続発現に一致している（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０００７】
ＡＡＶベクターは、動物モデルの心臓およびヒトの骨格筋における長期遺伝子導入を可能にするが、特異性は転写ターゲティングによって高められ得る（Ｇｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。心臓において、ＡＡＶ２ベクターは、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ヒト線維芽細胞成長因子受容体１およびインテグリンαｖβ５／α５β１などの特定の細胞表面受容体を利用して、受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞に入る。これらは、血管内送達の後、内皮障壁を横断して心筋細胞に到達するために、内皮細胞のトランスサイトーシス輸送経路（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）を利用する。遺伝子治療に使用される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は心筋細胞のゲノムに組み込まれず、むしろエピソーム性ＤＮＡとして存在する（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０００８】
現在同定されている１２個の抗原型クラスのＡＡＶの中で、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９が、心臓遺伝子治療のための別の候補ベクターよりも高い心筋指向性を有することが認められている。また、これら４個の中で、ＡＡＶ９が、心臓遺伝子送達に最も効率的なベクターであった（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。マウスモデルにおいて、レポーター遺伝子を保有するＡＡＶ９の単回静脈投与量だけを投与した後に、比較的心臓指向性であるＡＡＶ１と比較して、心筋形質導入効率の２２０倍の上昇が得られた（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０００９】
遺伝子治療のためのｒＡＡＶベクターの使用の成功にもかかわらず、幾つかの障害が依然として存在する。ベクターカプシドに対する中和抗体の問題は、同じ抗原型のＡＡＶベクターの投与を妨げる主な障害の１つである（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８））。さらに、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣ−Ｉ）と結合して形質導入標的細胞の表面上に提示されたＡＡＶカプシド抗原に対するＴ細胞免疫応答は、長期遺伝子発現を抑制し得る。他の問題としては、ヘパラン硫酸に結合する抗原型に関する限定的な組織指向性が挙げられる；幹細胞などの抵抗性細胞型（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ）の感染不良；特定の細胞集団への高効率標的遺伝子送達に伴う課題（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７）；比較的限定的な包装容量および非効率的な大規模生産（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）；おそらく細胞質輸送、ベクターの脱殻および一本鎖ゲノムの二本鎖ＤＮＡへの変換により遺伝子発現の開始が比較的遅いこと（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｄｏｕａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。特定の問題は、心臓特異的であり続ける高い発現レベルを達成することである。これは心臓特異的プロモーターの使用によって解決することができるが、多くのベクターは限られたクローニングスペースおよび／または強力な（ウイルス）プロモーター（例えば、遺伝子治療プロトコールにおいて広く使用されているサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列または長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター配列）と比較して低い活性を有するので、これらの欠点としては、これらのプロモーターの大きなサイズが挙げられ得る。
【００１０】
他の組織（例えば、骨格筋または肝臓（Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８，ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））の形質導入を回避するために、転写ターゲティングを使用して、心臓特異的実験に対するベクターの特異性を高めることができる（Ｇｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。非特異的プロモーターは、特に静脈内のベクター用途（Ｇｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９）に関してベクタープラスミドに対する免疫応答（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ，２００２）を潜在的に引き起こすことができるので、組織特異的プロモーターは、特異性を保持しており、従ってウイルスベクターに良いプロモーターである（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。組織特異的プロモーターは、内因性または外因性因子によって同様に誘導され得るので（Ｖｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７）、誘導性プロモーターとも考えられ得ることにも注目すべきである。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｆｏｍｉｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２）、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）２ｖプロモーター（Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２００４）、αミオシン重鎖プロモーター（Ｂｏｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ａｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００２）などの多くのプロモーターが心臓送達に関する遺伝子治療研究に使用されてきた。αミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーターは、最も一般的に使用されている心筋特異的プロモーターであり（Ｂｕｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、ほとんどの研究において心臓で高特異的および強いレベルの発現を示している。（ＭＬＣ）２ｖプロモーターもまた、様々な心臓遺伝子治療研究によって使用されてきたが、肝臓において部分的な発現を有することが認められている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。ＡＡＶ９ベクターにおける５個の異なる組織特異的プロモーターの比較研究が、Ｐａｃａｋらによって行われ、比較分析により、αＭＨＣプロモーターが最も心臓特異的な発現をもたすことが明らかになった（Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。これにもかかわらず、遺伝子治療ベクターとの関連で使用されてきたプロモーターの選択は、依然として比較的限られている。さらに、多くの現在使用されている心臓特異的プロモーターのロバスト性は、さらに増大することができる。
【００１１】
臨床効果を達成するために必要なウイルスベクターの量を減少させるための方法としては、組織特異的導入遺伝子発現の増強が望ましい。活性を増強するために、シス作用性調節因子の使用が提示されている。典型的には、これはエンハンサー配列［即ち、配向には無関係に、比較的長い距離にわたる（標的プロモーターから最大数キロベースまで離れている）場合であっても、プロモーターの活性を増強し、シスで作用する可能性を有する核酸配列］に関係している。しかし、エンハンサー機能は必ずしもこのような長い距離に限定されるわけではない。これらは、与えられたプロモーターの近くにおいても機能し得るからである。ＣＭＶ、αＭＨＣ、ラウス肉腫ウイルスゲノムの長い末端反復（ＲＳＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）および筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）のような幾つかのエンハンサーは、様々なベクターおよびトランスジェニック動物において広く使用されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｓａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ほとんどの研究者は、ヒトＣＭＶ前初期エンハンサーを、導入遺伝子を発現させるのに使用してきた（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｇｒｕｈ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｒａａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【００１２】
より大きな効果のために、異なる起源に由来するエンハンサー／プロモーター単位を交換することによってキメラエンハンサー／プロモーターが構築されることもある。最も広く使用されているこのようなキメラは、ＣＭＶ前初期エンハンサー、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターおよびウサギβグロビンスプライスアクセプターまたはイントロンの組み合わせから生じるＣＡＧプロモーターであり、これは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを通じて幾つかの組織における遺伝子発現を強く駆動する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。しかしながら、このようなエンハンサーは心臓組織に限定的ではないので、特異性を高めない。
【００１３】
導入遺伝子産物の治療レベルを長期間にわたってもたらし得るためには、遺伝子導入ベクターは、好ましくは、特異的に調節された高い発現を可能にすると同時に、導入遺伝子が挿入されるのに十分なクローニング空間を保有する。即ち、高度および組織特異的な発現を達成するために使用される調節因子は、好ましくは、限られた長さのものであるに過ぎない。しかし、これまでに開示されている遺伝子治療用ベクターはいずれも、全てのこれらの基準を満たしているわけではない。実際、遺伝子治療用ベクターは、所望の標的細胞、特に心臓細胞における発現レベルおよび／または発現特異性の点で十分に強固ではない。プロモーター／エンハンサーのサイズの減少は、しばしば、発現レベルおよび／または発現特異性を妨げたが、より大きな配列の使用は、しばしば、ベクター機能、パッケージングおよび／またはトランスフェクション／形質導入効率の阻害により遺伝子送達の効率を損なう。従って、有効な遺伝子治療のための心臓における導入遺伝子発現の治療レベルを達成するベクターが当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｋｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献２】ＬａＰｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２
【非特許文献３】Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献４】Ｆｏｍｉｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献５】Ｂｏｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献６】Ｊａｃｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献７】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献８】Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７
【非特許文献９】Ｆｏｍｉｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献１０】Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献１１】Ｖａｓｓａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献１２】Ｓａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００７
【非特許文献１３】Ｄｉｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００３
【非特許文献１４】Ｇｏｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６
【非特許文献１５】Ｇｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献１６】ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献１７】Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献１８】Ｄｏｕａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１
【非特許文献１９】Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献２０】Ｇｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献２１】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００１
【非特許文献２２】Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ，２００２
【非特許文献２３】Ｖｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７
【非特許文献２４】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２
【非特許文献２５】Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００４
【非特許文献２６】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２００４
【非特許文献２７】Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００２
【非特許文献２８】Ａｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００２
【非特許文献２９】Ｂｕｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６
【非特許文献３０】Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献３１】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２００１
【非特許文献３２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献３３】Ｓａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００７
【非特許文献３４】Ｇｒｕｈ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【非特許文献３５】Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００
【非特許文献３６】Ｒａａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
遺伝子治療に使用される構築物の心臓特異的発現の効率を特にインビボで増加させることが本発明の目的である。同時に、高度の構造的密集性を有する構築物を使用してこれを達成することが本発明の目的である。
【００１６】
従って、組織特異的調節因子を設計および選択するのに合理的な方法を使用して、非常に効率的な遺伝子送達システムに関する強力な組織特異的プロモーターを得た。距離差行列（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｒｉｘ）（ＤＤＭ）ならびに合理的なインシリコ設計および分析に基づくデータマイニングアルゴリズムに関する多専門的方法を使用することによって、特定の染色体コンテクスト（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔ）に配置された心臓転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）において非常に豊富に存在する強力な心臓特異的「レギュロン」を同定した。心臓特異的プロモーターと呼応するこれらのレギュロンは、インビボにおいても高いレベルの心臓特異的発現を指示する強力な心臓特異的合成プロモーター／エンハンサーであることが示された。上記の目的は、組織特異性を保有または増強さえする一方でプロモーター発現を増強する特異的調節因子を提供することにより達成される。特に重要なのは、これらの調節因子サイズが小さいことであり、これは、この転写制御単位を、大きなエフェクター遺伝子と組み合わされている場合であっても任意のタイプのウイルスまたは非ウイルスベクター内に収容することを可能にする。これらの限られた長さにもかかわらず、本発明で提供される調節因子は、遺伝子治療において使用される、より長い通常の核酸発現カセットと比較して類似したレベル、および典型的にはより一層高いレベルまで、導入遺伝子の発現を増強し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、第一の態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片からなる群から選択される配列を含む、肝臓特異的遺伝子発現を増強するための７００ヌクレオチド以下の核酸調節因子を提供する。特定の実施形態によれば、調節因子はさらにより短く、特に４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、さらにより特には２５０ヌクレオチド以下、最も特には２２０ヌクレオチド以下または２００ヌクレオチド以下である。
【００１８】
さらなる特定の実施形態によれば、核酸調節因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片からなる群から選択される配列を含む。さらなる特定の実施形態によれば、核酸調節因子は、配列番号１、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片を含む。別の実施形態によれば、核酸調節因子は、配列番号５、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片を含む。
【００１９】
別の実施形態によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片からなる群から選択される配列を含む調節因子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする６００ヌクレオチド以下の核酸調節因子を提供する。
【００２０】
さらなる別の実施形態によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８およびこれらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列の少なくとも２つの断片を含む６００ヌクレオチド以下の核酸調節因子を提供する。さらなる特定の実施形態によれば、これらの断片の少なくとも２つは互いに異なる。さらなる特定の実施形態によれば、全ての断片は互いに異なる。別の特定の実施形態によれば、少なくとも２つの断片は同一である。別の具体的な実施形態によれば、少なくとも２つの断片の少なくとも１つは機能性断片である。さらなる具体的な実施形態によれば、全ての断片は、挙げられている配列の機能性断片である。
【００２１】
さらなる態様では、調節因子は、遺伝子または導入遺伝子を発現させるために使用される。従って、プロモーターに機能的に連結された、本明細書において記載される核酸調節因子を含む核酸発現カセットを提供する。この態様のさらなる実施形態によれば、核酸発現カセットの核酸調節因子はプロモーターおよび導入遺伝子に機能的に連結されている。
【００２２】
具体的な実施形態によれば、２つ以上の核酸調節因子を含む核酸発現カセットを提供する。この場合、これらの２つ以上の核酸調節因子はプロモーターに、また場合によっては導入遺伝子に機能的に連結されている。さらなる具体的な実施形態によれば、これらの２つ以上の調節因子の少なくとも２つは同一または実質的に同一（例えば、９０％または９５％同一）である。さらなる具体的な実施形態によれば、これらの２つ以上の調節因子の全ては同一または実質的に同一である。別の具体的な実施形態によれば、これらの２つ以上の調節因子の少なくとも２つは互いに同一でない。
【００２３】
特定の実施形態によれば、提供する核酸発現カセット内に含まれるプロモーターは心臓特異的プロモーターである。さらなる特定の実施形態によれば、心臓特異的プロモーターはミオシン重鎖遺伝子に由来する。さらなる特定の実施形態によれば、ミオシン重鎖プロモーターはミオシン重鎖α（αＭＨＣ）、最も特にはＰａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に定義されている３６３ｂｐプロモーターに由来する。
【００２４】
別の特定の実施形態によれば、提供する核酸発現カセットはβグロビンイントロンをさらに含む。
【００２５】
核酸発現カセット内に含まれ得る導入遺伝子は、ＲＮＡまたはポリペプチド（タンパク質）のような遺伝子産物を典型的にコードする。具体的な実施形態によれば、導入遺伝子は治療用タンパク質をコードする。さらなる具体的な実施形態によれば、治療用タンパク質は血管形成因子（例えば、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦ）、ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、イオンチャネル、サイトカインおよび成長因子からなる群から選択される。
【００２６】
本明細書において記載される核酸発現カセット、および調節因子でさえも、そのまま使用され得る。しかし、典型的な実施形態では、発現カセットは核酸ベクターの一部となる。従って、さらなる態様では、本明細書において記載される調節因子を含むベクターを提供する。特定の実施形態によれば、ベクターは、本出願において開示される核酸発現カセットを含む。
【００２７】
具体的な実施形態によれば、提供するベクターはウイルスベクター、特にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはＡＡＶベクター、より特には、レンチウイルスまたはＡＡＶベクターである。特に想定される実施形態によれば、ベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２／９などのＡＡＶベクターである。別の実施形態によれば、ベクターは非ウイルスベクターである。さらに別の実施形態によれば、ベクターはウイルス因子および非ウイルス因子の両方を含む。
【００２８】
心臓特異的調節因子、核酸発現カセットおよびこれらのいずれかを含むベクターは遺伝子治療目的に使用され得ることが当業者に明らかである。従って、遺伝子治療における、本明細書において記載される核酸調節因子の使用が想定される。別の特定の実施形態によれば、遺伝子治療における、本明細書において開示される核酸発現カセットの使用を開示する。さらなる特定の実施形態によれば、本出願は、遺伝子治療のための、本明細書において記載されるベクターの使用を想定している。特定の実施形態によれば、想定される遺伝子治療は心臓特異的遺伝子治療である。別の特定の実施形態によれば、遺伝子治療は、心臓において生じた疾患に対する遺伝子治療である。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、
本明細書において記載される核酸調節因子がプロモーターおよび導入遺伝子に機能的に連結された核酸発現カセットを心臓細胞内に導入する段階；
導入遺伝子産物を心臓細胞内で発現させる段階
を含む、心臓細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法を提供する。
【００３０】
さらなる特定の実施形態によれば、導入遺伝子産物はタンパク質である。さらなる特定の実施形態によれば、タンパク質は治療用タンパク質である。別の実施形態によれば、導入遺伝子産物はＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）である。別の特定の実施形態によれば、方法をインビトロで行う。別の特定の実施形態によれば、方法をエクスビボで行う。別の特定の実施形態によれば、方法をインビボで行う。
【００３１】
遺伝子治療を必要とする被験体における遺伝子治療の方法も本発明において提供する。これらの方法は、典型的には、
核酸発現カセットを被験体の心臓内に導入する段階であって、ここで、本明細書において記載される核酸調節因子は、プロモーター、および治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に機能的に連結されている段階；
治療量の（治療用）タンパク質を心臓内で発現させる段階
を含む。
【００３２】
核酸発現カセットこれ自体を導入する代わりに、方法は、核酸発現カセットを含むベクターを被験体の心臓内に導入することも可能であり、ここで、本明細書において記載される核酸調節因子は、プロモーター、および治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に機能的に連結されている。幾つかの疾患は、遺伝子治療を用いた処置に関して想定されるが（例えば、血管形成不全、心不全など）、例は本出願において提供される。一般に、これを必要とする被験体は哺乳動物、最も特にはヒトである。典型的には、これを必要とする被験体は、ある症状、最も特には、疾患に特徴的な症状を有する。さらなる特定の実施形態によれば、方法は、治療量の治療用タンパク質を発現させることにより、症状の改善を必要とする被験体の症状を改善する段階をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】αミオシン重鎖エンハンサー／プロモーター（αＭＨＣ）の転写因子結合部位（調節因子のカタログ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ＭＴＩＲ／ＭＨＣａ−ｓｉｔｅｓ．ｈｔｍｌ＃ＭＡＲＫＥＲ−ＭＨＣａ＿ｓｅｑ１）を示す。
【図２】ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェアツールを使用して理論上の配列から作製したプラスミドベクターを示す。各制限部位を使用して、様々な因子をクローニングした。最初にｈｒＧＦＰがクローニングされ、次いでαＭＨＣｐがクローニングされた。最後に、βグロビンイントロンをクローニングして、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ［Ａ］を作製した。次いで、プラスミドを配列決定し、続いてプラスミド［Ａ］中のＡｃｃ６５Ｉクローニング部位にレギュロンをクローニングして、ｐＡＡＶ−Ｒｅｇ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを作製した。レギュロンを有する各プラスミドに名前をつけた。レギュロンの名前の後ろに各レギュロンを有する新たに作製した各構築物を指定した。例えば、Ｃａｓｑ２ｅ２レギュロンをｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡプラスミドにクローニングすると、ｐＡＡＶ−Ｃａｓｑ２ｅ２−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ［Ｂ］とした。各クローニングの後にスクリーニングをして、細菌形質転換から生じたコロニーから陽性クローンを選択した。Ｒｅｇは、レギュロン（Ｍｙｌ３、Ｂｒｄ７、Ｍｙｌ２、Ｃａｓｑ２ｅ１、Ｃａｓｑ２ｅ２、Ａｎｋｒｄ１ｅ１、Ａｎｋｒｄ１ｅ２およびＡｎｋｒｄ１ｅ３）に対応する。ａＭＨＣｐおよびｂＧｌｎｔｒｏｎ（βＧＩ）は、αＭＨＣｐおよびβグロビンイントロンにそれぞれ対応する。
【図３】αＭＨＣｐおよびＴＦＢＳに非常に豊富に存在する心臓特異的レギュロンの組み合わせから生じた、過活性を高めるための過活性心臓特異的プロモーターを示す。この場合、αＭＨＣｐを使用して、各レギュロンから発現カセットを作製した。従って、クローニングによって合計８個の発現カセットを作製した。
【図４】ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製を示す。ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位に隣接する増幅ｈｒＧＦＰ挿入物とのライゲーションを可能にするＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素分解を使用して、第一のベクター断片を作製し、ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ［Ａ］を得た。次いで、Ａｃｃ６５ＩおよびＮｈｅＩ制限酵素を用いて、ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡベクターを分解し、Ａｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩ部位に隣接するαＭＨＣｐとライゲーションした。今度はＮｈｅＩ制限酵素を用いて、この得られたｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ［Ｂ］を分解した。βグロビンイントロン（βＧＩ）とのライゲーション後に得られたベクタープラスミドが、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ［Ｃ］であった。
【図５】ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製における確認制限に関する電気泳動の画像を示す。ｈｒＧＦＰをＡＡＶベクターにライゲーションした後に得られたクローンを、ＢｇｌＩＩ制限酵素と一緒にＮｈｅＩを用いて１回の反応で確認した。この制限は、ベクター［Ａ］から７１６ｂｐのｈｒＧＦＰ断片を切り出した。同様に、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを、ＮｈｅＩと一緒にＡｃｃ６５Ｉを用いて１回の反応で確認して、αＭＨＣｐの断片長３６３ｂｐを切り出した。ＮｏｔＩ−ＮｄｅＩ制限を用いたさらなる確認により、αＭＨＣｐの３３６ｂｐ部分を取り出した［Ｂ］。ＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩを用いた確認制限は１２４６ｂｐ断片を生成するが、ＮｈｅＩ−Ａｃｃ６５Ｉは８６７ｂｐ断片を生成し、ベクター構築物中のβＧＩの存在を確認する［Ｃ］。全てのラダーに使用した標準染料は、ＷｅｓｔｂｕｒｇのＴｒｙＤｙｅ  ２Ｌｏｇであった。
【図６】ｐＡＡＶ−Ｒｅｇ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製を示す。各レギュロンは両端のＡｃｃ６５Ｉ制限部位に隣接しており、Ａｃｃ６５Ｉ制限酵素を用いてｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡベクターを分解した後にクローニングした。この酵素はＬ−ＩＴＲの下流に位置するＡｃｃ６５Ｉ部位を切断するので、８個のレギュロンのクローニングから生じた８個の発現カセットそれぞれが、このレギュロンをＬ−ＩＴＲとαＭＨＣｐ領域との間に有していた［Ａ］。［Ｂ］Ａｃｃ６５Ｉおよびホスファターゼによる処理後のベクター（Ｖ＝ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ）にクローニングする前の８個のレギュロン（ウェル番号１から８）全てを示す電気泳動写真（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｇｒａｍ）。［Ｃ］レギュロンをセンスまたはアンチセンス方向に有するベクタークローンを決定するのに、ＭｌｕＩ−ＮｄｅＩ制限を使用した。赤色囲み線＝センス断片のバンド、黄色囲み線＝アンチセンス方向の断片のバンド、青色囲み線＝レギュロン中のＮｄｅＩ部位の存在から生じたバンド。［Ｄ］ＭｌｕＩの処理後、全てのクローンは１個のバンドだけを示したが、これは、クローンのいずれもがレギュロンをタンデムに有していなかったことを意味している。［Ｅ］選択した陽性クローン中の正しいレギュロンを確認するために、Ａｃｃ６５Ｉ制限を実施した（１から５→試験したレギュロンを有するベクター：１＝Ｂｒｄ７；２＝Ｃａｓｑ２ｅ１、３＝Ａｎｋｒｄ１ｅ１、４＝Ａｎｋｒｄ１ｅ２および５＝Ａｎｋｒｄ１ｅ３）。同じ標準染料を全てのラダーに使用し、これはＷｅｓｔｂｕｒｇのＴｒｙＤｙｅ  ２Ｌｏｇであった。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクション効率を示す。［Ａ］蛍光顕微鏡下で見たトランスフェクション後２４時間におけるｈｒＧＦＰの発現。［Ｂ］通常の白色光を用いた微鏡下のトランスフェクト２９３細胞は、約９９％コンフルエントの細胞を示している。このバックグラウンドは、トランスフェクション効率の控除を可能にした。［Ｃ］ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション後４８時間のｈｒＧＦＰ発現は、約９５％のトランスフェクション効率を示している。
【図８】Ｑ−ＰＣＲによる４個のベクターの力価測定を示す。ＡＢＩ（ＰＥＲＫＩＭ  ＥＬＭＥＲ）Ｑ−ＰＣＲマスターミックスおよび導入遺伝子ＤＮＡ標的配列としてのウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨポリＡ）を専ら検出するためのＴＡＱＭＡＮプローブおよびプライマーを使用して、ＡＢＩ７５００  ＦＡＳＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのシーケンサー検出器単位、フォスター、カリフォルニア州、米国）でＱ−ＰＣＲを実施した。一定の標準規格を調製して標準曲線を得、各試料でシグナルを計算し、今度はこれを、各ベクターのゲノムコピー数を測定するのに使用した。
【図９】ｐＡＡＶ−Ｃａｓｑ２ｅ１−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡによる選択的心臓特異的発現を示す。半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、注射したマウス全ての心臓におけるＧＦＰ発現を確認した。Ｃａｓｑ２ｅ１ベクターの心臓は、心臓におけるＧＦＰ転写産物の比較的強い発現に対応する目立つバンドを示していた。αＭＨＣｐおよびＭｙＩ２を注射したマウスの心臓は、より少量のＧＦＰ転写産物を示していた。脾臓においてＧＦＰは認められなかった［Ａ］。０．８ｋｂ  ＧＡＰＤＨは、内部対照遺伝子としての役割を果たした。［Ｂ］。ｈｒＧＦＰを増幅したプラスミドを連続的に希釈したものを基準に使用した。ラダーに使用した標準染料は、ＷｅｓｔｂｕｒｇのＴｒｙＤｙｅ  ２Ｌｏｇであった。
【図１０Ａ】長期心臓特異的ＧＦＰ発現の比較分析を示す。中投与量のＡＡＶ−Ｃａｓｑ２ｅ１−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（即ち、エンハンサー４、配列番号１を使用して）（Ａ）、ＡＡＶ−Ａｎｋｒｄ１ｅ２−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（即ち、エンハンサー７、配列番号５を使用して）（Ｂ）および高投与量の参照ベクターＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（Ｃ）で注射したマウスの心臓を示す共焦点顕微鏡検査データ。
【図１０Ｂ】長期心臓特異的ＧＦＰ発現の比較分析を示す。中投与量のＡＡＶ−Ｃａｓｑ２ｅ１−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（即ち、エンハンサー４、配列番号１を使用して）（Ａ）、ＡＡＶ−Ａｎｋｒｄ１ｅ２−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（即ち、エンハンサー７、配列番号５を使用して）（Ｂ）および高投与量の参照ベクターＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（Ｃ）で注射したマウスの心臓を示す共焦点顕微鏡検査データ。
【図１０Ｃ】長期心臓特異的ＧＦＰ発現の比較分析を示す。中投与量のＡＡＶ−Ｃａｓｑ２ｅ１−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（即ち、エンハンサー４、配列番号１を使用して）（Ａ）、ＡＡＶ−Ａｎｋｒｄ１ｅ２−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（即ち、エンハンサー７、配列番号５を使用して）（Ｂ）および高投与量の参照ベクターＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（Ｃ）で注射したマウスの心臓を示す共焦点顕微鏡検査データ。
【図１１】定量的ＲＴ−ＰＣＲによる長期心臓特異的ＧＦＰ発現の比較分析を示す。図１０にあるように、ＡＡＶ−Ｃａｓｑ２ｅ１−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡおよびＡＡＶ−Ａｎｋｒｄ１ｅ２−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを参照ベクターＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡと比較している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本発明は特定の実施形態に関しておよびある図面を参照して以下に説明されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求のみによって限定される。特許請求の範囲におけるいずれの引用表示も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。記載されている図面は概要図に過ぎず、限定的なものではない。図面においては、因子の幾つかのサイズは誇張されていることがあり、例示を目的として、実物大では描かれていないことがある。「含む」という用語が本明細書および特許請求の範囲において用いられている場合、これは他の因子または段階を除外しない。例として「ａ」「ａｎ」、「ｔｈｅ」のついた単数形の名詞が用いられている場合、特に示されていない限り、複数形の名詞を含む。
【００３５】
さらに、本明細書および特許請求の範囲における第一、第二、第三などの語は、類似因子を区別するために用いられており、必ずしも、連続的または時間的順序を示すために用いられているわけではない。このように用いられる用語は適切な状況下で互換可能であり、本明細書において記載される本発明の実施形態は、本明細書において記載または例示されているもの以外の他の順序においても実施可能であると理解されるべきである。
【００３６】
以下の用語または定義は専ら本発明の理解を補助するために記載されている。本明細書中に特に示されていない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本発明の当業者に認識されているものと同じ意義を有する。当技術分野における定義および用語に関しては、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）が実施者に参考になる。本明細書において記載される定義は、当業者に理解されているものより狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００３７】
本明細書において使用される「調節因子」は、遺伝子の転写、特に遺伝子の組織特異的転写を調節および／または制御し得る転写制御因子、特に非コード化シス作用性転写制御因子を意味する。調節因子は、少なくとも１つの転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、より特には、組織特異的転写因子に対する少なくとも１つの結合部位、最も特には、心臓特異的転写因子に対する少なくとも１つの結合部位を含む。典型的には、本明細書において使用される調節因子は、プロモーター駆動性遺伝子発現を、調節因子を伴わないプロモーター単独の遺伝子転写と比較して増加または増強する。従って、調節因子は特にエンハンサー配列を含む。もっとも、転写を増強する調節因子は典型的な遠上流エンハンサー配列に限定されるものではなく、これが調節する遺伝子から任意の距離において存在し得ると理解されるべきである。実際、転写を調節する配列は、インビボでこれが調節する遺伝子の上流（例えば、プロモーター領域）または下流（例えば、３’ＵＴＲ内）に位置することが可能であり、遺伝子の至近距離または遥か遠くに位置し得ることが、当技術分野において公知である。注目すべきことに、本明細書において開示される調節因子は、典型的には、天然に存在する配列、このような調節因子の（部分の）組み合わせ、または調節因子の幾つかのコピーである。即ち、天然に存在しない配列自体も調節因子として想定される。本明細書において使用される調節因子は、転写制御に関与する、より大きな配列の一部、例えば、プロモーター配列の一部であり得る。しかし、典型的には、調節因子のみでは、転写を開始させるのに十分ではなく、この目的にはプロモーターを必要とする。
【００３８】
本出願において使用される「心臓特異的（ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）発現」または「心臓特異的（ｈｅａｒｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）発現」は、他の組織と比較した場合の心臓（または心臓組織）における（ＲＮＡおよび／またはポリペプチドとしての）（トランス）遺伝子の優先的または優勢な発現を意味する。特定の実施形態によれば、（トランス）遺伝子発現の少なくとも５０％が心臓内で生じる。より特定の実施形態によれば、（トランス）遺伝子発現の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または１００％が心臓内で生じる。特定の実施形態によれば、心臓特異的発現は、他の臓器、例えば肝臓、非心筋、肺、腎臓および／または脾臓への、発現された遺伝子産物の漏出が存在しないことを必要とする。従って、特定の実施形態によれば、１０％未満、５％未満、２％未満またはさらに１％未満の（導入）遺伝子発現は、心臓以外の臓器または組織内において起こる。変更すべきところは変更して、心筋細胞特異的発現にも同じことが当てはまり、これは心臓特異的発現の特定の形態とみなされ得る。本出願の全体において、心臓特異的が発現の文脈において言及される場合、心筋細胞特異的発現も明らかに想定される。同様に、本出願において組織特異的発現が用いられている場合、組織を主として構成する細胞型の細胞型特異的発現も想定される。
【００３９】
本出願において使用される「機能性断片」という用語は、心臓特異的発現を調節する能力を保有する、本明細書において開示される配列の断片を意味する。即ち、これらは尚も組織特異性をもたらし、これらは、これらが由来する配列と同様に（しかし、おそらくは同じ度合ではないが）、（トランス）遺伝子の発現を調節し得る。断片は、これらが由来する配列からの少なくとも１０個の連続的ヌクレオチドを含む。さらなる特定の実施形態では、断片は、これらが由来する配列からの少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０個の連続的ヌクレオチドを含む。
【００４０】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（する）」という用語およびこの文法的等価体は、温度および塩濃度の一定条件下、標的核酸分子に核酸分子がハイブリダイズし得ることを意味する。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然二重鎖の融解温度（Ｔｍ）よりせいぜい２５℃から３０℃（例えば、２０℃、１５℃、１０℃または５℃）低い温度である。Ｔｍを計算するための方法は当技術分野でよく知られている。非限定的な具体例を挙げると、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するための代表的な塩および温度条件は６５℃における１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳである。ＳＳＣなる略語は、核酸ハイブリダイゼーション溶液中で使用されるバッファーを意味する。１リットルの２０×（２０倍濃度）ストックＳＳＣバッファー溶液（ｐＨ７．０）は１７５．３ｇの塩化ナトリウムおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを含む。ハイブリダイゼーションを達成するための典型的な時間は１２時間である（全般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７を参照）。
【００４１】
本明細書において使用される「核酸発現カセット」という用語は、１つ以上の所望の細胞型、組織または器官において（トランス）遺伝子発現を導く１つ以上の転写制御因子（限定的なものではないが例えば、プロモーター、エンハンサーおよび／または調節因子、ポリアデニル化配列およびイントロン）を含む核酸分子を意味する。核酸発現カセットは、核酸配列が挿入されている細胞における内因性遺伝子の発現を導くことも想定されるが、典型的には、これらは導入遺伝子をも含む。
【００４２】
本明細書において使用される「機能的に連結」という用語は、種々の核酸分子因子が機能的に連結されており互いに相互作用し得るような、それぞれに対する核酸分子因子の配置を意味する。このような因子には、プロモーター、エンハンサーおよび／または調節因子、ポリアデニル化配列、１つ以上のイントロンおよび／またはエキソン、ならびに発現されるべき関心遺伝子のコード配列（即ち、導入遺伝子）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。これらの核酸配列因子は、適切に配向しているまたは機能的に連結されている場合には、互いの活性をモジュレーションするように一緒に作用し、最終的には導入遺伝子の発現のレベルに影響を及ぼし得る。モジュレーションは、特定の因子の活性のレベルの増加、減少または維持を意味する。他の因子に対する各因子の位置は各因子の５’末端および３’末端として表されることが可能であり、いずれかの特定の因子の間の距離は、これらの因子間の介在ヌクレオチドまたは塩基対の数により示され得る。
【００４３】
本出願において使用される「プロモーター」という用語は、これが機能的に連結されている対応核酸コード配列（例えば、導入遺伝子または内因性遺伝子）の転写を直接的または間接的に調節する核酸配列を意味する。プロモーターは、転写を調節するよう単独で機能し得る。またはプロモーターは１つ以上の他の調節配列（例えば、エンハンサーまたはサイレンサー）と共に作用し得る。本出願の文脈においては、プロモーターは、典型的には、導入遺伝子の転写を調節するよう調節因子に機能的に連結される。本明細書において記載される調節因子がプロモーターおよび導入遺伝子の両方に機能的に連結されている場合、調節因子は、（１）導入遺伝子の有意な度合の心臓特異的発現をインビボ（および／または心筋細胞／心臓由来細胞系でインビトロ）でもたらすことが可能であり、および／または（２）心臓（および／またはインビトロで心筋細胞／心臓細胞系）における導入遺伝子の発現のレベルを増加させることが可能である。本明細書において使用される「最小プロモーター」は、発現を尚も導き得るが（例えば組織特異的）発現の調節に寄与する配列の少なくとも一部を欠く、完全サイズのプロモーターの一部である。この定義は、遺伝子の発現を導き得るが組織特異的にこの遺伝子を発現する能力を喪失している、（組織特異的）調節因子が欠失しているプロモーターと、遺伝子の（おそらくは低下した）発現を駆動し得るが組織特異的にこの遺伝子を発現する能力を必ずしも喪失していない、（組織特異的）調節因子が欠失しているプロモーターとの両方を含む。最小プロモーターは当技術分野において詳細に記載されており、本明細書には最小プロモーターの非限定的な一覧が記載されている。
【００４４】
本明細書において使用される「導入遺伝子」という用語は、核酸配列が挿入された細胞において発現されるべきポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードする特定の核酸配列を意味する。しかし、導入遺伝子は、典型的には、核酸配列が挿入された細胞における特定のポリペプチドの量を制御する（例えば、減少させる）ために、ＲＮＡとして発現されることも可能である。これらのＲＮＡ分子には、ＲＮＡ干渉により機能を果たす分子（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、マイクロ−ＲＮＡ調節（ｍｉＲ）（これは、特異的遺伝子発現を制御するのに使用され得る。）、触媒性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸配列をどのようにして細胞内に導入するかは本発明にとって本質的ではなく、これは、例えば、ゲノム内へのまたはエピソーム性プラスミドとしての組込みによるものであり得る。注目すべきことに、導入遺伝子の発現は、核酸配列が挿入された細胞の小集団に限局され得る。「導入遺伝子」という用語は、（１）細胞において天然では見出されない核酸配列（即ち、異種核酸配列）、（２）これが導入された細胞において天然で見出される核酸配列の突然変異形態である核酸配列、（３）これが導入された細胞において天然で見出される同じ（即ち、相同）または類似した核酸配列の追加的コピーを付加するよう働く核酸配列、または（４）これが導入された細胞において発現が誘導される、天然に存在するまたは相同なサイレント核酸配列を含むと意図される。「突然変異形態」は、野生型または天然に存在する配列とは異なる１つ以上のヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。即ち、突然変異核酸配列は１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含む。幾つかの場合には、導入遺伝子は、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるよう、リーダーペプチドまたはシグナル配列をコードする配列を含み得る。
【００４５】
本出願において使用される「ベクター」という用語は、別の核酸分子（挿入核酸分子）、例えばｃＤＮＡ分子（これに限定されるものではない。）が挿入されていることが可能である、核酸分子、通常は二本鎖ＤＮＡを意味する。ベクターは、挿入核酸分子を適切な宿主細胞内に運搬するために使用される。ベクターは、挿入核酸分子を転写するのを可能にする、場合によっては転写産物をポリペプチドに翻訳するのを可能にする必要な因子を含み得る。挿入核酸分子は宿主細胞に由来することが可能であり、または異なる細胞または生物に由来することが可能である。ベクターは、宿主細胞内に入ると、宿主染色体ＤＮＡからは独立してまたはこれと同時に複製されることが可能であり、ベクターおよびこの挿入核酸分子の幾つかのコピーが産生され得る。従って、「ベクター」という用語は、標的細胞内への遺伝子導入を促進する遺伝子送達ビヒクルとしても定義され得る。この定義は非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの両方を含む。非ウイルスベクターはカチオン脂質、リポソーム、ナノ粒子、ＰＥＧ、ＰＥＩなどを包含するが、これらに限定されるものではない。ウイルスベクターはウイルスに由来し、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスベクターなどを包含するが、これらに限定されるものではない。必ずしもそうであるわけではないが典型的には、ウイルスベクターは複製欠損型であり、この場合、複製に必須のウイルス遺伝子がウイルスベクターから除去されているため、ベクターは、与えられた細胞における複製能を喪失している。しかし、幾つかのウイルスベクターは、与えられた細胞（例えば、癌細胞）において特異的に複製するよう適合化されることが可能であり、典型的には、（癌）細胞特異的（癌）細胞溶解を誘発するために使用される。
【００４６】
本発明の第一の態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８からなる群から選択される配列を含む７００以下、特に６００ヌクレオチド以下の、肝臓特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節因子を提供する。具体的な実施形態によれば、核酸調節因子は、これらの配列のいずれかに対して８０％の配列同一性、より特には８５％の配列同一性、より一層特には９０％の配列同一性、さらに特には９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。別の具体的な実施形態によれば、核酸調節因子は、これらの配列の（またはこれらの配列に対して高い比率の配列同一性を共有する配列の）機能性断片を含む。心臓特異的遺伝子発現に関与する配列の特定方法は実施例の節に概説されている。
【００４７】
本明細書において記載される調節因子が、限られた長さしか有さないのに完全に機能性であることは、相当な利点である。これは、ベクターまたは核酸発現カセットにおいて、これらの負荷容量を不適切に制限することなく、調節因子の使用を可能にする。従って、核酸調節因子は７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５５０ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、４５０ヌクレオチド長以下、より特には４００ヌクレオチド長以下、３５０ヌクレオチド長以下、３００ヌクレオチド長以下、さらに一層より特には２５０ヌクレオチド長以下、２００ヌクレオチド長以下、１７５ヌクレオチド長以下、１５０ヌクレオチド長以下、１２５ヌクレオチド長以下、１１０ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下である。しかし、開示されている核酸調節因子は調節活性を（即ち、転写の特異性および／または活性に関して）保有しており、従ってこれらは特に、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３５ヌクレオチドまたは１５０ヌクレオチドの最小長を有すると理解されるべきである。
【００４８】
さらに、特定の実施形態によれば、肝臓特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチド以下の核酸調節因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはこれらの機能性断片から実質的になる。即ち、調節因子は、例えば、クローニング目的に使用される配列（任意例に関しては、配列番号９から１６として記載されている配列を参照）をさらに含み得るが、前記配列は調節因子の必須部分を構成する。例えば、これらは、より大きな調節領域（例えば、プロモーター）の部分を構成しない。さらなる特定の実施形態によれば、肝臓特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチド以下の核酸調節因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはこれらの機能性断片からなる。
【００４９】
核酸配列は二本鎖または一本鎖分子としてのＤＮＡまたはＲＮＡとして提供され得る。配列が一本鎖核酸として提供される場合、相補鎖は、開示されている配列番号と同等であるとみなされ、同様に、本明細書において記載される核酸構築物および方法ならびにこれらの使用において使用されると想定される。従って、具体的な実施形態によれば、核酸調節因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片の相補鎖を含む。さらなる具体的な実施形態によれば、調節因子は前記配列の相補鎖から実質的になる。さらなる具体的な実施形態によれば、調節因子は、挙げられている配列の相補鎖からなる。
【００５０】
さらに、本明細書中に挙げられている配列にハイブリダイズする、特に、本明細書において開示される配列の相補体にハイブリダイズする配列も、核酸調節因子として使用され得ると想定される。ハイブリダイズ（する）は、典型的には、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（する）」ことを意味する。挙げられている配列にハイブリダイズする配列は、これらがハイブリダイズする配列と等しい長さである必要はない。しかし、核酸調節因子として使用されるこれらのハイブリダイズする配列は、特に、本明細書において記載される調節因子のサイズ限界を超えないことに注目されるべきである。さらに、具体的な実施形態によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはこれらの機能性断片にハイブリダイズする核酸のサイズは、これがハイブリダイズする配列と、長さにおいて２５％以上、特に長さにおいて２０％以上、より特には、長さにおいて１５％以上、最も特には、長さにおいて１０％以上は異ならない。
【００５１】
本明細書において開示される配列の幾つかは長さにおいて非常に制限されており、また、幾つかは他のものより相当に短い。従って、より短い配列の場合には特に、同一配列の２つ以上のコピーを含む調節配列、またはさらには、挙げられている配列の２つの異なる配列を含む調節因子を製造することが可能である。幾つかの配列（または同一配列のコピー）をモジュラー的に組み合わせることも全ての配列に関して勿論可能であるが、本明細書において定められている調節因子のサイズを超えない、即ち、７００ヌクレオチドを超えない（またはより特には６００ヌクレオチドを超えない、またはさらに特には５００または４５０ヌクレオチドを超えない）配列の組み合わせが特に想定される。
【００５２】
非常に具体的な実施形態によれば、本明細書において開示される核酸調節因子は、新規（人工的）調節配列を製造するために組み合わされる挙げられている配列の少なくとも２つの機能性断片を含む。さらなる具体的な実施形態によれば、これらの少なくとも２つの機能性断片は非同一断片である。別の実施形態によれば、これらの少なくとも２つの機能性断片の少なくとも２つは互いに同一である。別の非常に具体的な実施形態によれば、新規（人工的）調節配列を製造するために、挙げられている配列の２つの断片（このうちの少なくとも１つはこれ自体は機能性ではない。）を組み合わせる。
【００５３】
本明細書において開示される配列は、インビボで心臓特異的遺伝子の転写を制御する、特に、以下の遺伝子を制御する調節配列である：ＰＤＩＢ２、ＦＬＪ２６３２１、ＦＬＪ９３５１４またはＣＡＳＱ２としても知られているカルセクエストリン２（心筋）（ヒト遺伝子に関してはＣＡＳＱ２；ＧｅｎｅＩＤ  ８４５）；心臓アンキリン反復タンパク質としても知られているアンキリン反復ドメイン１（心筋）；サイトカイン誘導核タンパク質；肝臓アンキリン反復ドメイン１（ヒト遺伝子に関してはＡＮＫＲＤ１；ＧｅｎｅＩＤ  ２７０６３）；ミオシン、軽鎖３、アルカリ；心室遅骨格（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ，ｓｋｅｌｅｔａｌ，ｓｌｏｗ）（ヒト遺伝子に関してはＭＹＬ３；ＧｅｎｅＩＤ  ４６３４）；ＢＰ７５、ＣＥＬＴＩＸ１、ＮＡＧ４としても知られている含有ブロモドメイン７（ヒト遺伝子に関してはＢＲＤ７；ＧｅｎｅＩＤ  ２９１１７）。具体的な実施形態によれば、調節因子は、ＣＡＳＱ２調節因子、即ち、インビボでＣＡＳＱ２遺伝子、特に配列番号１の発現を制御する調節因子を含む。別の（しかし限定的でない）具体的な実施形態によれば、調節因子は、配列番号３、配列番号１、配列番号２から選ばれるＡＮＫＲＤ１調節配列、特に配列番号５を含む。
【００５４】
本明細書において詳述されるように、調節配列は典型的には、心臓特異的転写因子結合部位において豊富に存在する。具体的な実施形態によれば、低酸素応答因子（ＨＲＥ）は、本明細書において使用される調節配列として想定されない。これは、これらの因子が典型的には、スイッチとして作用し、低酸素条件下で発現を増強するだけであるからである（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。当然ながら、低酸素条件下で発現を増強することだけが望ましい場合の別の実施形態に関しては、ＨＲＥを調節配列として含むことは依然として想定され得る。
【００５５】
本明細書において開示される核酸調節因子は核酸発現カセットにおいて使用され得る。従って、本発明のある態様によれば、本明細書において記載される調節因子がプロモーターに機能的に連結されている核酸発現カセットを提供する。さらなる実施形態によれば、調節因子はプロモーターおよび導入遺伝子に機能的に連結されている。
【００５６】
当業者に理解されている通り、機能的に連結（されている）は、機能的活性を有することを意味し、天然の位置的連結には必ずしも関連していない。実際、核酸発現カセットにおいて使用される場合、調節因子は、典型的には、プロモーターの直上流に位置するが（これが一般的な場合であるが、核酸発現カセット内の位置の限定または除外として解釈されるべきではない。）、これが必ずしもインビボで当てはまるわけではない。例えば、遺伝子の下流に天然で存在し、この転写に影響を及ぼす、ある調節因子配列は、プロモーターの上流に位置する場合と同様に機能し得る。従って、具体的な実施形態によれば、調節配列の調節または増強効果は位置に非依存的である。さらに、調節配列は、個々のプロモーターまたは遺伝子配列に非依存的に、発現に対するこれらの効果をもたらし得る。
【００５７】
従って、これらは、これらの天然プロモーターと共に、および別のプロモーターと共に、核酸発現カセットにおいて使用され得る。心臓特異的ＴＦＢＳにおける豊富さは原則として、調節因子が、これ自体が心臓特異的ではない（または最小プロモーターの場合、これを肝臓特異的にするのに寄与する因子を欠く）プロモーターからでさえも、組織特異的発現を導くことを可能にするが、心臓特異的プロモーターが特に想定される。これは、心臓特異性を増強し、および／または他の組織における発現の漏出を回避する。心臓特異的プロモーターは心筋細胞特異的プロモーターであることが可能であり、またはそうでないことも可能である。導入遺伝子はこれ自身のプロモーターから転写されることが可能であるが、プロモーターは核酸発現カセットにおける導入遺伝子のプロモーターである必要はない。特定の実施形態によれば、核酸発現カセットは遺伝子治療に使用される。この実施形態によれば、プロモーターは同種（相同）（即ち、核酸発現カセットでトランスフェクトされるべき動物（特に哺乳動物）と同じ種からのもの）または異種（非相同）（即ち、発現カセットでトランスフェクトされるべき哺乳動物の種とは異なる起源からのもの）であり得る。従って、本明細書において記載される調節因子と組み合わされた場合にプロモーターが機能的である限り、プロモーターの起源は任意のウイルス、任意の単細胞原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物または任意の植物であることが可能であり、またはさらには合成プロモーター（即ち、非天然配列を有するもの）であり得る。具体的な実施形態によれば、プロモーターは哺乳類プロモーター、特にマウスまたはヒトプロモーターである。さらなる具体的な実施形態によれば、プロモーターは哺乳類心臓特異的プロモーターである。さらなる具体的な実施形態によれば、プロモーターはヒト心臓特異的プロモーターである。別の実施形態によれば、プロモーターはウイルスプロモーターである。さらなる実施形態によれば、ウイルスプロモーターは心臓特異的ウイルスプロモーターである。プロモーターは誘導性または構成的プロモーターであり得る。
【００５８】
核酸発現カセットの長さを最小にするために、調節因子は最小プロモーターまたは短縮した型の心臓特異的プロモーターに連結されることが特に想定される。特定の実施形態によれば、使用されるプロモーターは１０００ヌクレオチド長以下、９００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド長以下、または２５０ヌクレオチド長以下である。使用され得るプロモーターの具体例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーター、特にＭＬＣ２、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、特にαＭＨＣ、デスミンプロモーター、心筋トロポニンＣプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターの幾つかは、Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に記載されている。これらのプロモーターはいずれも、最小プロモーターとして使用されることが可能であり、これらは当技術分野において記載されている。時には、最小プロモーターは基礎またはコアプロモーターと称される。これらは、どの配列がプロモーターにおいて欠けているかに関して若干異なり得るが、これらの調節配列（の部分）を欠く全てのこのようなプロモーターが最小プロモーターの定義の範囲内で想定される。特に想定される最小プロモーターはαＭＨＣ最小プロモーターであり、より特には、Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８において定義されている３６３ｂｐ配列；または図１に示されているプロモーターである。
【００５９】
本明細書において開示される調節配列は核酸発現カセットにおいて使用され得る。特定の実施形態によれば、ただ１つの調節因子が発現カセット内に含まれる。別の特定の実施形態によれば、２つ以上の調節因子が核酸発現カセット内に含まれる。即ち、これらは、これらの調節（および／または増強）効果を増強するためにモジュラー的に組み合わされる。さらなる特定の実施形態によれば、同一調節因子の２つ以上のコピーが核酸発現カセットにおいて使用される。例えば、調節因子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピーが縦列反復として提供され得る。別のさらなる特定の実施形態によれば、核酸発現カセットに含まれる２つ以上の調節因子は少なくとも２つの異なる調節因子を含む。両方の実施形態は互いに排他的ではなく、本明細書において記載される核酸発現カセットにおいて両方の同一または非同一調節因子を互いに組み合わせることが可能である。調節因子の組み合わせは核酸発現カセットにおける１つの調節因子として機能するため、この実施形態は１つの調節因子における配列の組み合わせと概ね同等である。しかし、これらの配列のそれぞれは調節因子自体として機能するため、これらを調節配列の組み合わせと称するのが、および２つ以上の調節配列を含む核酸発現カセットと称するのが好ましい。理論上は、（クローニングの実施可能性以外の点では）発現カセット内に含まれ得る調節因子の数に上限は存在しないが、ある実施形態によれば、核酸発現カセット内の全調節因子の長さは１０００ヌクレオチドを超えないことが特に想定される。さらなる特定の実施形態によれば、調節因子の全長は９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、５５ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチドを超えない。しかし、調節因子に関して定められる最小長は、核酸発現カセットにおいて使用される調節因子またはこの組み合わせにも適用される。
【００６０】
核酸発現カセットの負荷はプロモーターおよび調節因子の両方に影響されるため、特定の実施形態によれば、核酸発現カセットにおけるプロモーターおよび調節因子の全長は１０００ヌクレオチド長以下、９００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７５０ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５５０ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、４５０ヌクレオチド長以下、４００ヌクレオチド以下、３５０ヌクレオチド長以下、３００ヌクレオチド長以下、またはさらには２５０ヌクレオチド長以下であると想定される。
【００６１】
非常に具体的な実施形態によれば、核酸調節因子は核酸発現カセットにおける唯一の調節（および／または増強）因子であり、例えば、プロモーター内にはこれ以外に存在する調節因子は存在せず、または構築物内には追加的なエンハンサーは存在しない。さらなる具体的な実施形態によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはこれらの機能性断片からなる群から選択される配列は、調節因子または核酸発現カセットのいずれかにおいて存在する唯一の調節（および／または増強）配列である。即ち、調節因子は他の調節または増強配列を含まない。
【００６２】
既に示されている通り、調節配列は、個々のプロモーターまたは（トランス）遺伝子配列に非依存的に、発現に対するこれらの効果をもたらし得る。従って、機能的に連結されたプロモーターおよび調節因子が成功裡に配列を転写する限り、（トランス）遺伝子の性質は本発明において重要ではない。特定の実施形態によれば、核酸発現カセットは遺伝子治療において使用され、導入遺伝子は主として心臓において発現される。幾つかの場合には、遺伝子産物は合成後に血流中にも分泌され得る。従って、血流中に循環されるべき核酸（例えば、ＲＮＡ）および／またはポリペプチドをコードする任意の導入遺伝子が本出願の範囲内に含まれる。
【００６３】
導入遺伝子は、プロモーター（および／または、核酸発現カセットが遺伝子治療に使用される場合には、これが導入される動物、特に哺乳動物）と同種または異種であり得る。また、導入遺伝子は完全長ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列またはこれらの任意の断片、サブユニットもしくは突然変異体（少なくとも何らかの生物活性を有するもの）であり得る。さらに導入遺伝子は、小型遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）、即ち、このイントロン配列の一部分、大部分または全部を欠く遺伝子配列であり得る。従って、導入遺伝子は、場合によっては、イントロン配列を含み得る。場合によっては、導入遺伝子は、ハイブリッド核酸配列、即ち、同種および／または異種ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列であり得る。導入遺伝子はまた、場合によっては、１つ以上の天然に存在するｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列の突然変異体であり得る。
【００６４】
導入遺伝子は、当技術分野でよく知られた１つ以上の方法を用いて、適切な量で単離され、入手され得る。これらの方法および導入遺伝子の単離に有用な他の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）およびＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８７）に記載されている。
【００６５】
導入遺伝子突然変異配列の使用も本出願において想定される。突然変異導入遺伝子は、野生型配列と比較して１つ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を含む導入遺伝子である。ヌクレオチド置換、欠失および／または挿入は、アミノ酸／核酸配列において野生型アミノ酸／核酸配列とは異なる遺伝子産物（即ち、タンパク質またはＲＮＡ）を与え得る。このような突然変異体の製造は当技術分野でよく知られている。
【００６６】
特定の実施形態によれば、導入遺伝子によりコードされる産物はタンパク質である。さらなる特定の実施形態によれば、産物は治療用タンパク質である。
【００６７】
本出願において想定される導入遺伝子（および治療用タンパク質）の非網羅的でありまた非限定的なリストは、治療的血管形成のための血管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ）または誘導分子（例えば、エフリン、セマホリン、スリットおよびネトリンまたはこれらの同族受容体）；サイトカインおよび／または成長因子（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、単球誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、カルシウム処理に関連するタンパク質（例えば、ＳＥＲＣＡ（筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ））、カルシニューリン、抗体をコードする導入遺伝子、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、抗ウイルスドミナントネガティブタンパク質、およびこれらの断片、サブユニットまたは突然変異体を含む。
【００６８】
非常に具体的な実施形態によれば、核酸発現カセットは導入遺伝子を含まないが、プロモーターに機能的に連結された調節因子を使用して内因性遺伝子（従って、これは増強および／または組織特異的発現の点で導入遺伝子と等価である。）の発現を駆動させる。核酸発現カセットは細胞のゲノム内に組み込まれるか、またはエピソーム状態で維持され得る。
【００６９】
他の配列（例えば、イントロンおよび／またはポリアデニル化配列）も、典型的には導入遺伝子産物の発現をさらに増強または安定化させるために、核酸発現カセット内に組み込まれ得る。本明細書において記載される発現カセットにおいては任意のイントロンが使用され得る。「イントロン」という用語は、核スプライシング装置により認識されスプライシングされるのに十分な程度に大きな、イントロン全体の任意の部分を含む。典型的には、発現カセットの構築および操作を促進する発現カセットのサイズを可能な限り小さく維持するためには、短い機能性イントロン配列が好ましい。幾つかの実施形態によれば、イントロンは、発現カセット内のコード配列によりコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得られる。イントロンはコード配列の５’側、コード配列の３’側、またはコード配列内に位置し得る。コード配列の５’側にイントロンが位置する利点は、ポリアデニル化シグナルの機能をイントロンが妨げる可能性を最小にすることである。
【００７０】
特定の実施形態によれば、核酸発現カセットは、βグロビンイントロンを含む。ヒトβグロビン遺伝子に由来するβグロビンイントロン（βＩＶＳ−ＩＩ）は、安定的な細胞質ｍＲＮＡの蓄積に重要であり、効率的な３’末端分解およびポリアデニル化のための効率的な３’末端形成の促進に関与している。βグロビン遺伝子は、２つのイントロン配列ＩＶＳ−ＩおよびＩＶＳ−ＩＩを有し、これらの各々は、イントロンを含まない遺伝子の発現を元の状態に戻し得る。ＩＶＳは、転写が低レベルのｍＲＮＡをもたらさない正確で効率的な３’末端形成に必要である（Ａｎｔｏｎｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【００７１】
ポリＡ尾部の合成を導く任意のポリアデニル化シグナルが、本明細書において記載される発現カセットにおいて有用であり、これらの具体例は当業者によく知られている（例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）。他のものとしては、ＳＶ４０後期遺伝子に由来するポリＡ配列および最小ウサギβグロビン（ｍＲＢＧ）遺伝子が挙げられるが（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２００１）、これらに限定されない。
【００７２】
本出願において記載される発現カセットは、例えば、通常は心臓において発現され利用されるタンパク質を発現させるために、または心臓において発現され次いで他の身体部分への輸送のために血流へと輸出されるタンパク質を発現させるために使用され得る。従って、幾つかの特定の実施形態によれば、本発明の発現カセットは、疾患の症状を改善する治療量のポリペプチド（または他の遺伝子産物、例えばＲＮＡ）を発現させるために使用され得る。原理的には、内因性遺伝子の発現を増強することも可能であるが、典型的には、遺伝子産物は発現カセット内のコード配列（即ち、導入遺伝子）によりコードされる。本明細書において使用される「治療量」は、疾患の症状を改善する量である。このような量は、典型的には、遺伝子産物および疾患の重症度に左右されるが、おそらくは通常の実験により、当業者により決定され得る。実施例の節には、治療量の因子ＩＸの発現がどのようにして達成されるかが記載されている。
【００７３】
特定の実施形態によれば、本明細書において記載される発現カセットを使用した（即ち、少なくとも１つの心臓特異的エンハンサーを用いた）場合に発現される遺伝子産物の量は、同一の発現カセットを使用するがこの中にエンハンサー配列が含まれていない場合よりも高い。より特には、エンハンサーを含まない同じ構築物と比較した場合、発現は、少なくとも２倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、少なくとも２０倍高く、少なくとも３０倍高く、少なくとも４０倍高く、最も特には少なくとも５０倍高く、またはさらに少なくとも６０倍高い（例えば、図１１を参照）。さらなる実施形態によれば、より高い発現は、依然として心臓に特異的のままである。
【００７４】
特定の実施形態によれば、本出願において記載される発現カセットは、長期にわたり、コード配列によりコードされる遺伝子産物の治療量の発現を導く。実際、治療レベルが達成される限り、新たな治療は必要でない。典型的には、治療的発現は少なくとも２０日間、少なくとも５０日間、少なくとも１００日間、少なくとも２００日間、また幾つかの場合には、３００日間以上持続すると想定される。コード配列によりコードされる遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）の発現は、例えば遺伝子産物の治療的発現が達成されたかどうかを評価するために、当技術分野において認識されているいずれかの手段、例えば、抗体に基づくアッセイ、例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイにより測定され得る。遺伝子産物の発現は、遺伝子産物の酵素活性または生物活性を検出するバイオアッセイにおいても測定され得る。
【００７５】
さらなる態様では、本出願は、本明細書において記載される調節因子を含むベクターを提供する。さらなる特定の実施形態によれば、ベクターは、本明細書において記載される発現カセットを含む。ベクターはエピソーム性ベクター（即ち、宿主細胞のゲノム内に組み込まれないベクター）であることが可能であり、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれるベクターであることが可能である。エピソーム性ベクターの具体例には、（染色体外）プラスミド、および発現カセットのみから構成され細菌配列を欠くいわゆるミニサークルが含まれ、宿主細胞ゲノム内に組み込まれるベクターの具体例には、ウイルスベクターが含まれる。
【００７６】
代表的なプラスミドベクターには、ｐＵＣベクター、ブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター（ｐＢＳ）およびｐＢＲ３２２、または細菌配列を欠くこれらの誘導体（ミニサークル）が含まれる。プラスミドベクターの幾つかは、トランスフェクトされた細胞におけるエピソーム性プラスミドの持続性を増強する因子を組み込むために適合化され得る。このような配列は、転写単位に連結されたスカフォールド／マトリックス結合領域モジュールに対応するＳ／ＭＡＲが含まれる（Ｊｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｎｚｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００７７】
代表的なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスに由来するベクターが含まれる。または、ウイルス成分および非ウイルス成分を組み合わせるために、遺伝子送達系が使用され得る（例えば、ナノ粒子またはウイロソーム）（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００７８】
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、感染後に自分自身の遺伝子を宿主細胞染色体内に挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を欠くが、細胞に感染し標的細胞の染色体内に自分自身の遺伝子を挿入する能力を保有するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターが開発されている（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。レンチウイルスと古典的なモロニー−マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターとの相違は、レンチウイルスベクターは分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入し得るが、ＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターは分裂細胞にしか形質導入できないことである。
【００７９】
アデノウイルスベクターは、生きた被験体に直接投与されるように設計される。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターゲノムのほとんどは宿主細胞の染色体内に組み込まれない。実際、アデノウイルスベクターを使用して細胞内に導入された遺伝子は、長期にわたって存続する染色体外因子（エピソーム）として核内に維持される。アデノウイルスベクターは、気道上皮細胞、内皮細胞、肝細胞および種々の腫瘍を含む多種多様な組織における分裂細胞および非分裂細胞に形質導入する（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，１９９３）。
【００８０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび幾つかの他の霊長類種に感染する小さなｓｓＤＮＡウイルスであり、疾患を引き起こすことは知られておらず、結果的に非常に軽度な免疫応答を引き起こす。ＡＡＶは分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することが可能であり、このゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込み得る。ＡＡＶベクターのクローニング容量は比較的限られたものではあるが、これらの特徴は、ＡＡＶを、遺伝子治療用のウイルスベクターを作製するための非常に魅力的な候補にする。
【００８１】
もう１つのウイルスベクターは、大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルスに由来する。もう１つのｄｓＤＮＡであるワクシニアウイルスの組換え形態は大きなインサートを収容することが可能であり、相同組換えにより作製される。
【００８２】
特定の実施形態によれば、ベクターはウイルスベクターである。さらなる特定の実施形態によれば、ベクターはＡＡＶベクターである。別の実施形態によれば、ベクターはレンチウイルスベクターである。他のＡＡＶ型と比較してＡＡＶ９血清型が優れたカルジオトロピズム（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｓｍ）を示すことが示されたので（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２／９ベクターの使用が特に想定される。
【００８３】
さらなる特定の形態によれば、本明細書において記載される核酸調節因子、核酸発現カセットおよびベクターは遺伝子治療において使用され得る。標的細胞においてインビトロで、また、特にインビボで、治療用遺伝子産物の発現を達成するよう意図された遺伝子治療プロトコールは、当技術分野において詳細に記載されている。これらには、プラスミドＤＮＡ（裸またはリポソーム内）の筋肉内注射、間質注射、気道内点滴、内皮への適用、肝実質内への投与、および静脈内または動脈内投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。標的細胞に対するＤＮＡの利用可能性を向上させるための種々の装置が開発されている。単純な方法は、ＤＮＡを含むカテーテルまたは移植可能な物質と標的細胞とを物理的に接触させることである。もう１つの方法は、高圧下で標的組織内に液体のカラムを噴射する無針ジェット注射装置を使用することである。これらの運搬法は、ウイルスベクターを運搬するためにも用いられ得る。標的化遺伝子送達に対するもう１つの方法は、細胞への核酸の特異的標的化のための核酸−またはＤＮＡ−結合性物質が結合しているタンパク質または合成リガンドからなる分子コンジュゲートの使用である（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【００８４】
特定の実施形態によれば、肝細胞の遺伝子治療のための、本明細書において記載される核酸調節因子、核酸発現カセットまたはベクターの使用が想定される。さらなる特定の実施形態によれば、調節因子、発現カセットまたはベクターの使用はインビボでの遺伝子治療のためのものである。
【００８５】
哺乳類心筋細胞内への遺伝子導入は、エクスビボ法およびインビボ法の両方を用いて行われ得る。エクスビボ法は、心臓細胞の回収、長期発現ベクターでのインビトロ形質導入、および循環系への心筋細胞の再導入を必要とする。しかしながら、インビボ標的化は典型的には、静脈内投与または動脈内投与を介することがより想定される。
【００８６】
当業者であれば、心臓特異的エンハンサー、発現カセットおよびベクターの使用が遺伝子治療以外の意味（例えば、幹細胞の心筋芽細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）への誘導性分化（ｃｏａｘｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、心臓におけるタンパク質の過剰発現に関するトランスジェニックモデル、心臓毒性スクリーニングに関するモデルなど）を明らかに有することを理解している。
【００８７】
さらなる態様によれば、心臓細胞内でタンパク質を発現させるための方法を提供する。方法は、本明細書において記載される核酸発現カセット（またはベクター）を心臓細胞内に導入し、心臓細胞内で導入遺伝子タンパク質産物を発現させる段階を含む。これらの方法はインビトロおよびインビボの両方で行われ得る。
【００８８】
遺伝子治療を必要とする被験体に対する遺伝子治療方法も提供する。方法は、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを被験体の心臓内に導入し、治療量の治療用タンパク質を心臓内で発現させる段階を含む。
【００８９】
さらなる実施形態によれば、方法は、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含むベクターを被験体の心臓内に導入し、治療量の治療用タンパク質を心臓内で発現させる段階を含む。
【００９０】
別の態様によれば、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットと医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態によれば、医薬組成物は、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含むベクターと医薬上許容される担体とを含む。
【００９１】
医薬組成物はまた、キットの形態でも提供され得る。
【００９２】
これらの医薬組成物の製造のための、本明細書において開示される調節因子の使用も想定される。
【００９３】
本明細書においては本発明の装置に関する特定の実施形態、特定の構成および配置ならびに物質が記載されているが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく形態および詳細における種々の変更または修飾が施され得ると理解されるべきである。以下の実施例は、特定の実施形態をさらに例示するために記載されており、これらは本出願を限定するものとみなされるべきではない。本出願は特許請求の範囲のみにより限定される。
【実施例】
【００９４】
材料と方法
レギュロンの同定
距離差行列（ＤＤＭ）アルゴリズム（Ｄｅ  Ｂｌｅｓｅｒ，２００７）と称される新規で有効なデータマイニングアルゴリズムを、専ら心臓において高く独占的に発現しており、シス作用調節因子の組み合わせに比較的豊富に存在しているプロモーターを同定するのに使用した。簡潔に説明すると、ある与えられた刺激に対する、示差的に調節される肝臓特異的遺伝子のプロモーターの２つのセットの応答性は、プロモーターの両セットにより共有される転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）により説明され得ると予想され得る。もっとも、これは応答の方向性を説明しないかもしれない。ＴＦＢＳの共通セットと並んで、プロモーターの各セットは、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子群のプロモーターに、より特徴的な１つ以上のＴＦＢＳを含む可能性があり、観察される示差的挙動を少なくとも部分的に説明し得る。これらの「示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）」ＴＦＢＳは、以下の手法を用いて見出され得る。第一に、Ｍａｔｃｈ（商標）プログラム（Ｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、または位置特異的重み行列（ＰＷＭ）のプレコンパイル化ライブラリーを使用してプログラム上でＴＦＢＳを予測するいずれかの他の類似プログラムのための入力として、各セットの各プロモーターを使用する。プロモーター当たりのＰＷＭ当たりの予測ＴＦＢＳの数（さらに、カウントと称される。）であるこの結果を、各行がプロモーター配列に対応し列が使用ＰＷＭに対応する行列の形態で集める。列はさらに、ＰＷＭ−ベクトルと称され、ＰＷＭを、プロモーター当たりの予測ＴＦＢＳのこの数により特徴づけるものである。プロモーター当たりのＰＷＭ当たりの予測ＴＦＢＳの総数を用いる選択は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の調節領域が多コピーの強固モチーフおよびより弱いコピーを含むというＰａｐａｔｓｅｎｋｏら（Ｐａｐａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の観察により動機づけられる。一般に、転写因子に対する複数の結合部位の存在は重要な役割を果たしていると考えるのが合理的である。さらに、ＴＦＢＳのペアを共有するプロモーターを伴う遺伝子は、ただ１つのＴＦＢＳを共通に有するプロモーターを伴う遺伝子よりも、共発現される可能性が有意に高いことが、酵母において示された（Ｐｉｌｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この観察に沿って、複合エンハンサー因子を得るための単一肝臓特異的ＴＦＢＳの単なる組み合わせは、失望させる結果を生み出した（Ｌｅｍｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＤＤＭ法は過剰発現および関連性の両方を考慮するものであるため、プロモーター当たりの複数のマッチを考慮することは、過剰発現による推定機能性ＴＦＢＳを発見するのを助け得る。２つのＴＦＢＳは、行列内のこれらの対応列が類似している場合に、相関しているとみなされる。これらの列の間の類似性は、距離関数を用いて測定され得る。この方法を用いて、プロモーターの両セットにおけるＴＦＢＳに関して、全てのＴＦＢＳ関連性を要約する距離行列を構築する。最後に、ＤＤＭを計算し、この行列上で多次元尺度法（ＭＤＳ）を行って二次元におけるこの含量を可視化することにより、観察���れた示差的遺伝子発現に寄与しないＴＦＢＳ（これらはＤＤＭ−ＭＤＳプロットの原点付近に位置づけられる。）を、観察された示差的遺伝子発現をもたらす可能性のある「偏向」ＴＦＢＳから区別することが可能である。ＭＤＳ法は、強く関連しているＴＦＢＳを、より弱く関連しているＴＦＢＳよりも密集してプロットするため、これは、他の方法を用いた場合にはしばしば曖昧となるプロモーターデータベース内のＴＦＢＳ間の相互作用のほとんどを際立たせて表示する。または、結果は表において要約され得る。
【００９５】
この手法の原理は、（他方の条件と比較した場合の一方の条件の）個々の過剰発現および関連性に基づく。実際、多数の転写因子は肝臓内で特異的にアップレギュレーションされることが公知であるが、これは、これらがインビボでの遺伝子発現のアップレギュレーションに関与していることを必然的に示唆するものではない。一方の条件においては重要であるが他方の条件においては重要でないモジュールは、これらを構成するＴＦＢＳの過剰発現により特徴づけられ、関連づけられる。これは２つの関連ＴＦＢＳに関しては低いＤＤ値を与え、一方、過剰発現されたＴＦＢＳおよび共通のＴＦＢＳに関するＤＤ値は高くなる。ＴＦＢＳ（およびモジュール）がプロモーターの第一または第二セットのいずれかに典型的なものであるかどうかは、元のＤＤＭの列値の和の符号から推論され得る。
【００９６】
ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５４７２４およびＤｅ  Ｂｌｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されているように、アップレギュレーションされる遺伝子のゲノムコンテクストもまた考慮した。これは、複数の種にわたって保存されている結合部位、および単一結合部位ではなくモチーフの組み合わせに関するものである；このため、特定された配列が遺伝子発現の調節に実際に関与している確率は増加する。実際、ある与えられたプロモーターにおける転写因子結合部位の単なる存在または非存在は、高レベルの組織特異的発現をもたらすのに十分なものではないことが、十分に確認されている。高レベルの組織特異的発現をもたらす鍵となるのは、特定の染色体コンテクストにおける「レギュロン」としてのＴＦＢＳの組み合わせである。この方法は、表１に要約されている、前記転写因子結合部位において豊富に存在する８個の調節配列の同定をもたらした。
【００９７】
これらの調節因子は、進化的な分岐種の間で高度に保存されていた（これは、高いレベルの発現を維持する強い選択圧を示唆している。）。転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）において豊富に存在しており、高いレベルの心臓特異的発現を指示することができる８個のレギュロンを同定した。これらの組織特異的エンハンサーモジュールを発見および特性決定するのに、計算論的方法を使用した。これらが含むモチーフの予備知識は不要である。この方法は、以下の後続段階からなる：（１）正常組織のマイクロアレイ発現データの統計分析に基づく高発現している組織特異的遺伝子の同定、（２）公的に利用可能なゲノムデータベースからの対応するプロモーター配列の抽出、および（３）新規な距離差行列（ＤＤＭ）法を使用した、これらが含む調節モジュールおよびモチーフの同定。ＤＤＭ法を用いて、本発明者らは、エンハンサーおよびサイレンサーを検出することができ、これらが含むモチーフのセットとしてこれらをモデル化することができる。（４）次いで、本発明者らは、これらのセットの一部であるモチーフのクラスターに関して、高発現している組織特異的遺伝子のゲノムコンテクストを検索する。これらのクラスターが幾つかの種内で高度に保存されている領域と一致する場合、これらの領域は、推定エンハンサーモジュールと考えられる。これらのシス作用レギュロンおよびこれらのサイズを以下の表１に示す。これらの異なるレギュロンを、両末端にＡｃｃ６５Ｉ隣接制限部位を有するように合成した（表１）。これらは、レギュロンのＡＡＶベクターへの容易なクローニングを可能にする。配列番号１から８はイタリック体で示される調節配列に対応し、配列番号９から１６は制限部位を有する配列を含む。
【００９８】
【表１】
2013509168.tif 000002
2013509168.tif 000003
【００９９】
ベクターを作製するための断片の増幅
ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素に基づくＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＰＣＲ反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３０サイクルの増幅で本研究に関する全てのＰＣＲを実施した。
【０１００】
マウスαミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーターの増幅
αミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーターは、他の心臓特異的プロモーターの中で、導入遺伝子の広範囲で非常に高いレベルの心臓特異的発現をもたらすことが示されているので（Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００８）、本プロジェクトに関してはαミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーターを選択した。
【０１０１】
本発明者らの研究室により提供されたマウスの肝臓から得られたマウスゲノムからαＭＨＣプロモーターを増幅した。調節因子のカタログであるＰａｃａｋらにより提供されるリンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ＭＴＩＲ／ＴＯＣ．ｈｔｍｌ）からの配列を参照して、プライマーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに発注および設計した。使用したプライマーを以下に示す。Ａｃｃ６５Ｉ制限部位を有するフォワードプライマー（４４塩基）：５’から３’−ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡ（配列番号２０）およびＮｈｅＩ制限部位を有するリバースプライマー（３３塩基）：５’から３’−ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＣＴ（配列番号２１）
【０１０２】
ヒト化組換え緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）の増幅
標準条件を使用して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプラスミド構築物ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰから、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したプライマーを使用してｈｒＧＦＰを増幅した。使用したプライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したものであり、以下に列挙する。２個の制限部位ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩをプライマー中に組み込んで、増幅した断片に隣接させた（ＮｈｅＩ制限部位を有するフォワードプライマー（４０塩基）：５’から３’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  Ｃ（配列番号２２）；ＢｇｌＩＩ制限部位を有するリバースプライマー（３６塩基）：５’から３’−ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ（配列番号２３））。
【０１０３】
ベータグロビンイントロン（βグロビンイントロン）の増幅
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したプライマーを使用して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプラスミド構築物（ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ）からベータグロビンイントロン（βグロビンイントロン）を増幅した。他の構築物と同じように標準的な手順に従って、この増幅を実施した。使用したプライマーは以下の通りである。
【０１０４】
ＸｂａＩ制限部位を有するフォワードプライマー（２５塩基）：５’から３’−ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  Ｇ（配列番号２４）。  ＮｈｅＩ制限部位を有するリバースプライマー（３６塩基）：５’から３’−ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ  ＣＣＣ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ（配列番号２５）。
【０１０５】
増幅した断片の精製および制限
Ｑｉａｇｅｎのゲル抽出キットに従って、スピンカラムを使用して、αＭＨＣ、ｈｒＧＦＰおよびβグロビンイントロンの得られた増幅断片を精製した。溶離後、Ａｃｃ６５ＩおよびＮｈｅＩ制限酵素を用いてαＭＨＣを分解し、ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素を用いてｈｒＧＦＰを分解し、ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ制限酵素を用いてβグロビンイントロンを分解した。分解は、ベクターへのライゲーションを可能にするために断片の付着末端を作製することを目的としていた。次いで、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出アッセイキットにおけるスピンカラムを用いて、断片を精製した。必要とするまで、断片を−２０℃の冷凍庫に保管した。
【０１０６】
心臓特異的レギュロンの、αＭＨＣｐ−βグロビンイントロン−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを含むＡＡＶベクターへのクローニング
構築物（ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βグロビンイントロン−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ）（図４［Ｃ］）の作製は、以下に記載される４個のサブクローニングを含んでいた。このベクターをクローニングし、配列決定によって確認するとすぐに、８個の同定したレギュロンをこの汎用ＡＡＶ構築物に続いてクローニングした。
【０１０７】
ベクターの骨格の作製
本研究において使用したプラスミド構築物の骨格は、アンピシリン選択マーカー遺伝子、ＡＡＶ２ウイルス遺伝子のＬ−およびＲ−ＩＴＲセグメントならびにウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）ｃＤＮＡを含んでいた（図４［Ａ］）。本発明者らの研究室からのプラスミド構築物ｐＡＡＶ−ＴＴＲｓｅｒｐ−ＦＩＸＩＡ−ｐＡから、このプラスミド骨格を作製した。プラスミド中の３個の特徴的な制限部位（ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ）によって、３個の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩを用いて断片を作製した。ＢｇｌＩＩ制限部位はｐＡのすぐ下流に位置し、ＮｈｅＩ部位はＬ−ＩＴＲ部位に隣接しこの下流でもあり、ＸｂａＩ部位はＢｇｌＩＩとＮｈｅＩ部位との間の中ほどに位置していた。ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ付着末端に隣接する作製したより大きい骨格断片を、他の２個のより小さい断片（一方の断片は各制限部位のＮｈｅＩおよびＸｂａＩ付着末端に隣接し、他方は各制限部位のＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩ付着末端に隣接する。）から容易に分離することが可能なので、これらの部位を使用した。
【０１０８】
１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動を使用して、目的の断片のサイズに対応するバンドを反応混合物の残りから分離した。次いで、Ｑｉａｇｅｎプラスミドゲル抽出キットに添付のプロトコールに従って、断片をゲルから精製した。必要とするまで、精製した断片を−２０℃の冷凍庫に保管した。
【０１０９】
ｈｒＧＦＰのクローニング
ｈｒＧＦＰおよびＩＴＲを含むベクターの骨格、選択可能なマーカー遺伝子ならびにｐＡを一緒にライゲーションした。これが可能だったのは、ｈｒＧＦＰおよび骨格が両方とも、末端のライゲーションを仲介することができるＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限付着末端を有していたからである。ライゲーション反応物を一晩培養した後、新たに作製した構築物ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを、アンピシリンを含むＬＢ寒天固形培地上に置いて一晩培養したＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＸＬ−１０ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞を形質転換するのに使用した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＭｉｎｉｐｒｅｐアッセイキットを使用して、２０個のコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。次いで、ＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩ制限酵素を使用して、陽性クローンに関して得られたＤＮＡをスクリーニングした。
【０１１０】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡのクローニング
２個の付着末端をｈｒＧＦＰの上流に作り出すＡｃｃ６５ＩおよびＮｈｅＩ制限酵素を用いて、ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡプラスミド構築物を最初に制限した。次いで、上記のようにこれらの２個の制限酵素を用いて制限したαＭＨＣｐを、Ａｃｃ６５ＩおよびＮｈｅＩ制限部位の付着末端に隣接する開環ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡとライゲーションした。次いで、得られたプラスミドｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡをＸＬ−１０ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞に形質転換した。αＭＨＣｐのサイズに対応する３６３ｂｐのバンドを示す構築物の残りからαＭＨＣｐを除去するＡｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩ制限を使用して、陽性クローンをスクリーニングした。ＮｏｔＩはプロモーター領域内部に位置しているので、制限においてＮｏｔＩ−Ｎｄｅを一緒に使用してさらなる確認試験を実施したところ、これがαＭＨＣｐの３２９ｂｐ断片を切り出した。
【０１１１】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βグロビンイントロン−ｈｒＧＦＰ−ｐＡのクローニング
このクローンを得るために、ＮｈｅＩ制限酵素を用いてｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ選択クローンを分解して、αＭＨＣｐ遺伝子とｈｒＧＦＰ遺伝子との間に位置するＮｈｅＩ部位に１個の制限を作り出した（図４［Ｃ］）。制限反応中、ホスファターゼを制限反応物に添加して、制限した断片から５’リン酸基を除去した。これは、開環プラスミドベクターの再ライゲーションを防ぐために行った。次いで、Ｑｉａｇｅｎプラスミドゲル抽出キットを使用して、断片を精製した。
【０１１２】
ゲル電気泳動を実施し、これによってベクター断片ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ（開環）を挿入物βグロビンイントロンと並べて流して、両方の相対濃度を測定した。標準的なライゲーション反応は挿入物対ベクターが３：１である濃度比を必要とするので、これは、ライゲーション反応に関して各断片から取り出す適切な量の評価を可能にするためのものであった。
【０１１３】
ベクターと挿入物との効果的なライゲーションを可能にするために、使用する各断片の量を評価した後にライゲーション反応を行い、室温で培養した。得られた混合物を、ＸＬ−１０ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞を形質転換するのに使用し、ＬＢアンピシリン固形培地で一晩培養した。１回の制限反応でＮｈｅＩ−Ａｃｃ６５Ｉを使用して、陽性クローンに関して得られたコロニーをスクリーニングした。ＮｄｅＩ−ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩ−Ａｃｃ６５Ｉ制限反応を含む３個の他のセットの制限を使用して、選択した陽性クローンをさらに確認した。ＮｈｅＩ部位をＸｂａＩ部位とライゲーションしたライゲーション反応により、βグロビンイントロンの上流のＮｈｅＩ部位を破壊したことに注目すべきである。これは、ライゲーション反応後に１個の活性ＮｈｅＩ部位だけがβグロビンイントロンの下流に依然として位置していたことを意味する。ＮｄｅＩ制限部位はαＭＨＣｐ中に位置し、ＮｏｔＩ部位は、プロモーター部位の上流にあったＡｃｃ６５Ｉ部位の前方のＬ−ＩＴＲのすぐ下流に位置していたのに対して、ＢｇｌＩＩはｈｒＧＦＰ遺伝子の下流にあった。
【０１１４】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡプラスミドベクターの製造
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡプラスミドの選択および確認した陽性クローンを、ＸＬ−１０ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞における形質転換に使用した。一晩培養した後、１個のコロニーだけを注意深く採取したものを培養チューブ中の２ｍｌＬＢアンピシリン固形培地に入れて、前培養を行った。培養物をｌ５０ｒｐｍ、３７℃培養にさらした。培養物を、ＬＢアンピシリン培地２リットル（Ｌ）の培養フラスコを播種するのに使用した。このフラスコを、３７℃およびｌ５０ｒｐｍのインキュベーター中で振動させながら約１３時間培養（一晩放置）した（ただし、細菌増殖が、吸光度２８０ｎｍにおいて１．６から１．９の間の光学密度（ＯＤ）に達するまで）。このＯＤにおいて、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＭａｘｉｐｒｅｐアッセイキットを使用してプラスミドＤＮＡを抽出した。エタノール沈殿および精製した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックランド、デラウェア州、米国）を使用して純プラスミドの濃度を測定し、濃度を１．０μｇ／μｌに調整した。ＡＡＶベクターの製造に必要とするまで、精製プラスミドを−２０℃で保管した。対照配列決定から得られた結果により、ベクターｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡが全てのクローニングした断片を適切な方向（即ち、センス方向）で含むことが明らかになった。
【０１１５】
レギュロンのｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡプラスミドベクターへのクローニング
合成した８個のレギュロン全て：Ｍｙｌ３、Ｂｒｄ７、Ｍｙｌ２、Ｃａｓｑ２ｅ１、Ｃａｓｑ２ｅ２、Ａｎｋｒｄ１ｅ１、Ａｎｋｒｄ１ｅ２およびＡｎｋｒｄ１ｅ３をベクターにクローニングして、合計８個の異なる発現カセットを得、ｐＡＡＶ−Ｒｅｇ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡと指定した新たな構築物を得た（図６［Ａ］、Ｒｅｇ＝レギュロンの位置）。レギュロンをαＭＨＣｐの上流にクローニングした。
【０１１６】
陽性クローンに関して８個のレギュロン構築物のそれぞれをスクリーニングし、ウイルスベクターの製造のための大規模なプラスミド抽出に使用する前に他の制限酵素を用いてさらに確認した。
【０１１７】
プラスミドの製造
この製造は、レギュロン１個当たり１個の選択した陽性クローンの増大を伴った。プラスミドを、ＸＬ−１０ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞を形質転換および培養するのに使用した。一晩培養した後、１個のコロニーを注意深く採取したものを培養チューブ中の２ｍｌＬＢアンピシリン液体培地に入れて、前培養を行った。次いで、培養物をｌ５０ｒｐｍ、３７℃で培養にさらし、ＬＢアンピシリン培地２リットル（Ｌ）の培養フラスコを播種するのに使用した。これらのフラスコを、３７℃およびｌ５０ｒｐｍのインキュベーター中で振動させながら約１３時間（通常は一晩）培養した（ただし、細菌増殖が、吸光度２８０ｎｍにおいて１．６から１．９の間の光学密度（ＯＤ）に達するまで）。このＯＤにおいて、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＭａｘｉｐｒｅｐアッセイキットを使用してプラスミドＤＮＡを抽出して、非常に純粋なプラスミドベクターを得、これをトランスフェクションの準備ができるまで−２０℃で保管した。ＡＡＶベクターの製造に使用する前に、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ、ＭｌｕＩ−ＮｄｅＩ制限酵素を使用して、制限により各精製プラスミドを再確認した。
【０１１８】
ＡＡＶの製造
リン酸カルシウムトランスフェクション
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって提供される２９３細胞と称される特別なＡＡＶ製造細胞株をリン酸カルシウムトランスフェクションに使用した。このトランスフェクションは、３個のプラスミド、製造したＡＡＶベクター（３．３．５節）、プラスミド構築物中のＡＡＶ９ｒｅｐ／ｃａｐヘルパー遺伝子およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手したアデノウイルスヘルパー遺伝子を含む３個のプラスミド成分系であった。キットのＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）によって提供される塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）およびリン酸塩の添加によって、アデノウイルスヘルパー遺伝子１０４μｇを含むＤＮＡならびにＡＡＶベクターおよびＡＡＶ９ｒｅｐ／ｃａｐヘルパー遺伝子各５０μｇを沈殿させ、調製したＨＥＫ２９３細胞にリン酸カルシウムトランスフェクションによって取り込ませた。
【０１１９】
トランスフェクションの準備において、２９３細胞のマスターストックを播種し、７５ｃｍ２フラスコ中で７０％コンフルエントまで培養した。これを３個のフラスコに分割し、７０％まで増殖させ、続いてトレイに分割した。所望の量の細胞を得るまで、分割および増殖のこの過程を繰り返した。次いで、細胞を２５％の分割量で冷凍保存し、こうしてこれが製造全体のワーキングストックとしての役割を果たした。トランスフェクションの各ラウンドの前に、ワーキングストックを得、分割し、トランスフェクションに使用する前に５０％コンフルエントに増殖させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるリン酸カルシウムトランスフェクションキットに添付のプロトコールに従って、全てのトランスフェクションを実施した。ＡＡＶベクタープラスミド中のＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰを、トランスフェクションの各ラウンドの対照として常に使用した。
【０１２０】
トランスフェクション後４８時間に細胞を回収した。手順は、細胞を培養プレートから擦り取ることおよび氷上で遠心分離ボトルに収集することを含んでいた。３４００ｒｐｍの速度および４℃の温度において、遠心分離し上清を廃棄した後１５分に細胞を培養培地から採取した。次いで、細胞を１０ｍｌＡＡＶ緩衝液を用いて−８０℃ですぐに保管し、精製を待った。
【０１２１】
ＡＡＶウイルスの精製
ＡＡＶはこの宿主を溶解しないので、細胞の冷凍および解凍の過程後の超音波処理によって、宿主細胞からウイルス粒子を回収した。次いで、超遠心分離機中で１８から２０時間の間の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離を３回（３Ｘ）することによって、細胞溶解物中の放出されたウイルス粒子を精製した。ＣｓＣｌ勾配の設定において、最初に０．４５４ｇＣｓＣｌ／ｍｌ細胞溶解物の混合物を作った後、１．３１ｇ／ｍｌＣｓＣｌ、１．４１ｇ／ｍｌＣｓＣｌおよび１．６１ｇ／ｍｌＣｓＣｌを含む異なる勾配のＣｓＣｌ溶液を続いて添加した。アッベ屈折計を使用して、スピンからのフラクションの屈折率（ＲＩ）を測定し、１．３６５０から１．３７６０の間のＲＩを有していたものをスピンの後続ラウンドのために一緒に取り出した。次いで、最終的に得られた純粋なベクター懸濁液を４℃で保管した。
【０１２２】
ＡＡＶウイルスベクターの力価測定
最初に、精製ｒＡＡＶベクター懸濁液４μｌをＤＮａｓｅで処理し、９９℃で５分間培養した。この段階は、トランスフェクションに使用したか、またはトランスフェクションに使用した細胞のゲノムに由来するあらゆる残存ＤＮＡを含むＡＡＶ９ウイルス粒子の外部に存在するあらゆるベクターＤＮＡを破壊するのに必要であった。これは、リアルタイムまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）中にウイルス粒子の内部のＤＮＡだけが力価測定されたことを意味する。この温度はまた、ウイルス粒子を破裂させて、これらのベクターＤＮＡを溶液に放出することを可能にする。
【０１２３】
ＡＢＩ（ＰＥＲＫＩＭ  ＥＬＭＥＲ）Ｑ−ＰＣＲマスターミックスおよびＴＡＱＭＡＮプローブおよびウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨｐＡ）を遺伝子導入ＤＮＡ標的配列として専ら検出するためのプライマーを使用して、ＡＢＩ７５００  ＦＡＳＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのシーケンサー検出器単位、フォスター、カリフォルニア州、米国）でＱＰＣＲを実施した。一定の標準規格を調製（希釈１０８から１０２）して、各試料でシグナルの測定を可能にした標準曲線を得た。プラスミドのサイズおよびアボガドロ数に基づいて、プラスミドＤＮＡのμｇを標的ＤＮＡの特定のコピー数に相関させることができた。
【０１２４】
ポリＡを検出するために、フォワードおよびリバースプライマーである特定のプライマーをプローブと一緒に使用した。使用したフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ、ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号２６）およびＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ（配列番号２７）であった。使用したプローブは、ＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣ（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ）（配列番号２８）であった。ＡＢＩ  ＱＰＣＲ反応ミックス、プライマー、プローブ、ＲＯＸおよび必要量までつぎ足すための水を含む反応混合物を各反応ウェル中に入れた。試料、基準および非鋳型対照（水）を９６ウェルＱＰＣＲプレートに入れた後、ＡＢＩ７５００標準ラン：５０℃で１０分間、９５℃で２分間、ならびにその後の９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルからＱＰＣＲをランし、各ランを約１時間３５分継続した。
【０１２５】
インビボ実験
ＡＡＶ９ウイルスベクターの注射
表２に要約したように、合計１１匹の２３日齢ＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ欠損マウスに特定の組換え（ｒ）ＡＡＶ９を尾静脈注射によって静脈注射した。ウイルスベクターをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、１．２５ｘ１０１１ｖｇ（ベクターゲノム）の注射量を得た。
【０１２６】
【表２】
2013509168.tif 000004
【０１２７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、全てのマウスに由来する組織においてｈｒＧＦＰのｍＲＮＡ量を検出するのに使用した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ精製システムキットに添付のプロトコールに従って、マウスの心臓および脾臓組織から総ＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡまたはベクターＤＮＡを分解するためにＤＮａｓｅ処理段階が含まれた。この後、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎスーパースクリプトＶＩＬＯｃＤＮＡ合成キットおよびこれに添付のプロトコールを使用して、２μｇの総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡにおけるｈｒＧＦＰのレベルを検出するために、１００ｎｇの総ｃＤＮＡをＰＣＲを実施するのに使用した。これは、ｈｒＧＦＰ特異的プライマー（上記と同じもの）を使用して行った（フォワードプライマー：５’から３’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  Ｃ（配列番号２２）およびリバースプライマー：５’から３’−ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ（配列番号２３））。サーマルサイクラー中で増幅を行った。グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡは、試料注入の標準化に関する内部対照遺伝子としての役割を果たした。ＧＡＰＤＨに関して使用したプライマーは、フォワードプライマーとしてＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ（配列番号２９）、およびリバースプライマーとしてＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ（配列番号３０）であった。基準に使用したプラスミドは、ｈｒＧＦＰに関してｐＡＶＶ−ｈｒＧＦＰ、およびＧＡＰＤＨに関してｐＧＥＭＴイージー−マウスＧＡＰＤＨであった。
【０１２８】
［実施例１］
距離差行列（ＤＤＭ）法による過活性心臓特異的レギュロンの作製
ＴＦＢＳが単に存在するだけではなく、「レギュロン」と定義される転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の特定の組み合わせが、高いレベルの組織特異的発現を指示するのに重要であることが知られている。ＤＤＭに基づく新規なデータマイニングアルゴリズムを使用して、ＴＦＢＳに非常に豊富に存在する８個の心臓特異的レギュロンを同定し、各配列を表１に示した。ＤＤＭ法の原理は、ヒトゲノム上のＭＹＬ３エンハンサーのマッピングの例によって例示することができる。遺伝子ミオシン軽鎖３は心臓において特異的に発現しており、このエンハンサー領域は、Ｓｏｘ５、Ｐａｘ４、ＲＲＥＢ１などの幾つかの心臓特異的転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む。さらに、これらのＴＦＢＳは幾つかの種内で高度に保存されており、これは、対応する転写因子のこれらのＤＮＡ結合部位への結合が強い進化的圧力の下にあることを示している。このような相互作用を変化させる突然変異が起こると、この結果として生じた遺伝子発現における変化は生存に不適合であり得る。このＤＤＭ法によって同定した８個のレギュロン、即ち：Ｍｙｌ２、Ｂｒｄ７、Ｍｙｌ３、Ｃａｓｑ２ｅ１、Ｃａｓｑ２ｅ２、Ａｎｋｒｄ１ｅ１、Ａｎｋｒｄ１ｅ２およびＡｎｋｒｄ１ｅ３は、アカゲザル、マウス、アルマジロ、イヌ、ウマ、トカゲ、ニワトリなどの異なる種間で強い相同性を示した。
【０１２９】
ＭＹＬ３（参照配列：ＮＭ＿０００２５８）は、ミオシン軽鎖３（文献において心室アイソフォームおよび遅骨格筋アイソフォームとも称されるアルカリ軽鎖）をコードする。ＭＹＬ３における突然変異は、中間左室腔（ｍｉｄ−ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）型肥大型心筋症の原因として同定されている。
【０１３０】
Ａｎｋｒｄ１遺伝子（参照配列：ＮＭ＿０１４３９１）によってコードされるタンパク質は内皮細胞の核に局在しており、ＩＬ−１およびＴＮＦα刺激によって誘導される。ラット心筋細胞における研究は、この遺伝子が転写因子として機能することを示唆している。このタンパク質と筋節タンパク質ミオパラジン（ｍｙｏｐａｌｌａｄｉｎ）およびチチンとの間の相互作用は、これが筋線維伸縮センサーシステムにも関与し得ることを示唆している。
【０１３１】
ＣＡＳＱ２遺伝子（参照配列：ＮＭ＿００１２３２）によってコードされるタンパク質は、カルセクエストリンファミリーの心筋ファミリーメンバーを指定している。カルセクエストリンは、心臓の遅骨格筋細胞において筋小胞体に局在している。タンパク質は、カルシウムを筋機能のために貯蔵するカルシウム結合タンパク質である。
【０１３２】
ＭＹＬ２（参照配列：ＮＭ＿０００４３２）は、心臓ミオシンβ（または遅）重鎖関連調節軽鎖をコードする。Ｃａ＋は調節軽鎖のリン酸化を引き起こし、これが次々に収縮を引き起こす。ＭＹＬ２における突然変異は、中間左室腔型肥大型心筋症に関連している。
【０１３３】
次いで、強力な心臓特異的プロモーターおよびＴＦＢＳに豊富に存在する心臓特異的レギュロンの組み合わせが、過活性心臓特異的発現を指示すると仮定した。図３に示されるように、これらの心臓特異的レギュロンと組み合わせたαＭＨＣｐが、過活性心臓特異的プロモーター（ＣＳＰ）をもたらして、心臓における強発現を指示すると仮定した。次いで、これらを、ＡＡＶベクター中に発現カセットを作製してこのロバスト性を試験するのに使用した。
【０１３４】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製
安全性プロファイルおよび心筋遺伝子導入における改善に関して、遺伝子治療のためのＡＡＶの使用における最近の進歩（Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）は、心臓を標的とする本プロジェクトにＡＡＶベクターを選択した理由であった。本研究で使用したＡＡＶ発現カセットの作製において、ＡＡＶ２をＡＡＶ９カプシドにシュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）することによって、組換えＡＡＶを作った。これは、ＡＡＶ９が他の抗原型と比較して最も高い心臓指向性を有し（Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、ｒＡＡＶ２／９媒介性遺伝子送達が強い心臓遺伝子送達をもたらした（Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００８）という事実と合致していた。ベクタープラスミドの特異性を高めるために、αミオシン重鎖プロモーター（αＭＨＣｐ）をカセットに組み込んで、ｈｒＧＦＰ導入遺伝子の発現を促進させた。ｈｒＧＦＰ導入遺伝子の高いレベルの発現を指示するために、ベータグロビンイントロン（βグロビンイントロン）も含まれていた（Ｂｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【０１３５】
ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製
アンピシリン耐性遺伝子およびｂｇｈポリＡを含むｐＵＣベクターをｈｒＧＦＰ断片とライゲーションすることによって、ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを得た（図４［Ａ］）。スクリーニングした後、ライゲーションを行った制限部位であるＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩを使用して、最良のクローンを選択した。図５［Ａ］における電気泳動の画像で認められるように、この制限は、ｈｒＧＦＰのサイズである７１６ｂｐ断片サイズを生成した。ＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限はベクターからｈｒＧＦＰ断片を切り出すので、これは予想されていた。これは、ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ選択ベクターがｈｒＧＦＰ断片の正しい挿入物を含んでおり、さらにこのベクターを使用してクローニングが続いて行われ得たことの証拠であった。
【０１３６】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製
次の段階は、選択したｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ陽性クローンにαミオシン重鎖プロモーター（αＭＨＣｐ）をクローニングすることであった。ベクターおよび増幅したαＭＨＣｐの両方において存在するＡｃｃ６５ＩならびにＮｈｅＩ制限部位を利用することによって、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡベクターを得た（図４［Ｂ］）。Ａｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩを用いてこのベクターの正確性を確認したところ、αＭＨＣｐのサイズに対応する３６３ｂｐの断片サイズを得た（図５［Ｂ］左側のラダー）。ＮｏｔＩ−ＮｄｅＩ制限を使用して、プロモーターの３２９ｂｐ部分を切断するさらなる確認試験を実施した（図５［Ｂ］最右側５個のウェルのラダー）。これは、ＮｄｅＩ制限部位がプロモーター領域の内部約２０ｂｐからプロモーター配列の末端に位置していたので、マウスゲノムからのプロモーター増幅の有効性および存在を試験するためのものであった。この２０ｂｐ未満の完全なプロモーター領域により、Ａｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩ制限から生成されたバンドと比較して小さい、ＮｏｔＩ−ＮｄｅＩ制限で生成されたバンドが説明される（図５［Ｂ］）。
【０１３７】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製
レギュロンをクローニングする前の最終構築物は、ベータグロビンイントロン（βグロビンイントロン）をｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡベクターにクローニングして、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを得るためのものであった。図４［Ｃ］に示されるように、Ｎｈｅｌ制限酵素を用いて前記ベクター（即ち、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ）を分解して、プロモーターとベクターのｈｒＧＦＰ領域との間にシングルカットを得た。ベクターの再ライゲーションを防ぐために、制限した断片の５’末端からリン酸基を除去するホスファターゼを用いてこの制限反応物を処理した。βグロビンイントロン断片はＸｂａＩ部位に隣接する１個の末端を有していたが、ＮｈｅＩ制限酵素を用いて切断したベクターにこれを上手くクローニングすることができた。これは、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩエンドヌクレアーゼそれぞれが、これらのエンドヌクレアーゼによって生成された断片の間でライゲーションを可能にする異なる認識配列（ＸｂａＩに関して５’−ＴＣＴＡＧＡ、およびＮｈｅＩに関して５’−ＧＣＴＡＧＣ）を有するが、これらは両方とも制限後に５’−ＣＴＡＧオーバーハングを生成するからである。
【０１３８】
一方、ライゲーション後にプロモーターとイントロンとの間に作ったＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位はＮｈｅＩとＸｂａＩのどちらにも認識され得ないので、非確認制限を実施して、ベクターからβグロビンイントロンを切り出すことができた。従って、ＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩ−Ａｃｃ６５Ｉ分解を使用して、別の制限を行った。図５［Ｃ］における電気泳動の画像において得られたように、ＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩ制限酵素を用いてｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡベクターを分解すると１２４６ｂｐのバンドが生じたが、これは、ｈｒＧＦＰ（７１６ｂｐ）、たった今クローニングしたβグロビンイントロン（４９２ｂｐ）およびαＭＨＣｐの末端部分２０ｂｐ、ならびにαＭＨＣｐ−βＧＩとβＧＩ−ｈｒＧＦＰとの間に介在する２個の制限部位の存在を示している。後続確認試験は、挿入したβグロビンイントロンの方向がセンス方向かを試験するためのものであった。Ａｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩの使用では、イントロンをセンス方向に有するベクターが、図５［Ｃ］右のパネルに示される電気泳動図においてまさに認められたものであった１個の介在する制限部位（ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位）を有する、βグロビンイントロンおよびαＭＨＣｐを構成する約８６７ｂｐのバンドを生成することが予想された。他方、イントロンをセンス方向に有するベクターにおいて認められたβグロビンイントロンとαＭＨＣｐとの間の代わりにβグロビンイントロンとｈｒＧＦＰとの間に、破壊されたＮｈｅＩ／ＸｂａＩが存在する場合、イントロンをアンチセンス方向に有するベクターは、αＭＨＣｐのバンド３６３ｂｐを単独で生成したと考えられる。
【０１３９】
ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの配列決定
前節において記載したように得た電気泳動の画像に基づいて、ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを得るための全てのクローニングおよびスクリーニングが成功したと判断した。配列決定のためのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ビッグダイ（商標）ターミネーターサイクル配列決定キットと組み合わせてキャピラリーシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ分析器）を使用するＶＩＢサービス設備を使用して、ベクタープラスミドｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡが配列決定されたかを検証した。２個のフォワードプライマーおよび２個のリバースプライマーを、プラスミドベクター中のαＭＨＣｐおよびβグロビンイントロンを配列決定するのに使用した。ＣＬＵＳＴＡＬ２．０．１１多配列アライメントツールを使用して、配列決定から得られた結果を、作製した理論上の配列ｒＡＡＶ９とアライメントした（添付物２における完全なアライメント）。以下に示されるように、プロモーターを配列決定するためにプライマー１および２を設計したのに対して、βグロビンイントロンに関してプライマー４および５を設計した。ｒＡＡＶ９は、Ｌ−ＩＴＲからＲ−ＩＴＲまでの配列を表しているので、プロモーター、イントロン、ｈｒＧＦＰおよびＢＧＨｐＡ配列を含んでいる。配列が正しいか確認した。
【０１４０】
ｐＡＡＶ−Ｒｅｇ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡの作製
本研究のための最終構築物は、レギュロンを有する発現カセットの作製であった（図６［Ａ］）。レギュロンを、Ｌ−ＩＴＲとαミオシン重鎖プロモーターとの間にクローニングした。Ａｃｃ６５Ｉを用いた制限後のベクター断片の両末端は、互いに非常にライゲーションしやすい付着末端を生成するので、上述のように、ホスファターゼを用いてベクターを処理して、ベクターの再ライゲーションを防いだ。図６［Ｂ］は、クローニング前の８個のレギュロン全ておよびベクターｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡのサイズを示す電気泳動の画像である。得られたバンドは、これら理論上の配列の長さに非常によく対応している。ウェルが番号付けられた順番に、１から８の数字がＭｙｌ３（１５０ｂｐ）、Ｂｒｄ７（６８９ｂｐ）、Ｍｙｌ２（１８３ｂｐ）、Ｃａｓｑ２ｅ１（２１９ｂｐ）、Ｃａｓｑ２ｅ２（１１７ｂｐ）、Ａｎｋｒｄ１ｅ１（２９９ｂｐ）、Ａｎｋｒｄ１ｅ２（２７７ｂｐ）およびＡｎｋｒｄ１ｅ３（３９７）にそれぞれ対応する。
【０１４１】
陽性クローン（即ち、センス方向のレギュロンおよびタンデムリピートではないレギュロンの予想断片サイズを含むクローン）に関する各クローニングの後、２０個の得られたクローンをスクリーニングした。図６［Ｃ］における電気泳動の図は、センス方向のクローンを選択するための、クローニング後のこのようなスクリーニングの結果である。各レギュロンがこの末端にＭｌｕＩ制限部位１２ｂｐ、およびプロモーターの末端２０ｂｐに位置するＮｄｅＩ部位を有していたので、センス方向にクローニングしたレギュロンを有していたあらゆるベクターが、ＭｌｕＩ−ＮｄｅＩ制限酵素を用いてベクターを分解した場合に、レギュロンのサイズに関係なく約３５５ｂｐのバンドを生成することが予想された。この観察は、図６［Ｃ］の赤い囲み線で示される２個のバンドにおいて見られる。他方、レギュロンがアンチセンス方向にあった場合、異なるベクターのクローンから異なるバンドが予想された。この場合、ＭｌｕＩ部位はレギュロンの開始から１２ｂｐに位置し、これは、ＭｌｕＩ−ＮｄｅＩエンドヌクレアーゼを用いた制限が、特定のレギュロンおよびプロモーターの全長の大部分を切断することを示唆している。８個のレギュロンそれぞれが異なるサイズを有するので、これは、異なるベクターから生成されたバンドにおける変化をもたらす。図６［Ｃ］におけるこの特定の画像は、Ａｎｋｒｄ１ｅ１レギュロンをベクターｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡにクローニングした後の結果であった。ｐＡＡＶ−Ａｎｋｒｄ１ｅ１−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡベクタークローンでのＭｌｕＩ−ＮｄｅＩ制限によって、レギュロンをアンチセンス方向に有するクローンは、約６４１ｂｐのバンド（図６［Ｃ］黄色の囲み線）を生成したが、Ａｎｋｒｄ１ｅ１レギュロンは２９９ｂｐのサイズを有し、プロモーターは３６３ｂｐのサイズを有するので、これは予想していたものである。これにおける青色の囲み線中の２個のバンドは、Ａｎｋｒｄ１ｅ１レギュロンの内部に位置するＮｄｅＩ制限部位の結果物であった。全てのレギュロンの配列のＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア制限分析によって明らかになったように、これはＮｄｅＩ制限部位を含んでいたレギュロンだけであった。約１００ｂｐである第二のバンドは、ベクター中の２個のＮｄｅＩ部位（即ち、プロモーター領域中の１個のＮｄｅＩ部位、およびレギュロン中の第二のＮｄｅＩ部位）の間にあった断片から生じた。ＭｌｕＩ−ＮｈｅＩなどの他の制限酵素を用いて、このレギュロンを有するベクターをさらにスクリーニングした。
【０１４２】
センス方向に基づいてベクタークローンをスクリーニングした後、レギュロンがタンデムに存在したか否かを検査するために、ＭｌｕＩエンドヌクレアーゼを使用して選択したクローンを試験した。図６［Ｄ］は、ＭｌｕＩを用いて陽性クローンを試験した後に得られた１つの結果を示す。選択した陽性クローンのいずれもがレギュロンをタンデムに有していなかったことがここで認められ得る。いずれかがタンデムに存在していた場合、ベクター中の特定のレギュロンのサイズの大部分となる第二のバンドが認められる。
【０１４３】
図６［Ｅ］における電気泳動の画像は、各ベクター中に含まれるべき正しいレギュロンの存在を確認するために８個のベクターのうちの５個から選択した陽性クローンの複製物を示す。Ａｃｃ６５Ｉ制限によって、各ベクターが、ベクター中の特定のレギュロンのサイズに対応するバンドを生成することが予想された。予想されるバンドサイズは、（１）６８９ｂｐサイズのＢｒｄ７；（２）Ｃａｓｑ２ｅ１、２１９ｂｐ；（３）Ａｎｋｒｄ１ｅ１、２９９ｂｐ；（４）Ａｎｋｒｄ１ｅ２、２７７ｂｐ；および（５）Ａｎｋｒｄ１ｅ３、３９７であった。これは、３番目のウェルにおけるクローン１を除く全ての陽性クローンにおいて認められた。この結果は、確認試験の重要性を示す。Ａｃｃ６５ＩおよびＫｐｎＩ制限酵素は両方とも同じ認識配列５’−ＧＧＴＡＣＣ−３’を有するが、Ａｃｃ６５ＩはＧ−Ｇの間を切断し、ＫｐｎＩはＣ−Ｃの間を切断するので、ＫｐｎＩ制限もまた、Ａｃｃ６５Ｉよるものと同じサイズのバンドを生成したことに注目すべきである。従って、確認試験の最後に選択した陽性クローンは、正しい順序、方向およびサイズであることが証明され、従ってＡＡＶベクターの製造に展開された。
【０１４４】
［実施例２］
ｒＡＡＶ２／９ベクターの製造および力価測定
ベクターのトランスフェクション効率
レギュロンを含む８個のＡＡＶプラスミドベクター（ｐＡＡＶ−Ｒｅｇ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ）のそれぞれ、およびいかなるレギュロンも有しない別の対照ベクター（ｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡ）をＭａｘｉＰｒｅｐアッセイキットによって抽出し、その後これらの精製プラスミドをＡＡＶベクターの製造に使用した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＧＦＰをコードするＡＡＶベクターを、ＡＡＶベクターの製造におけるトランスフェクションおよび力価測定対照として使用した。リン酸カルシウム沈殿によって、９個のベクターのそれぞれを、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびＡＡＶ９ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドと一緒に、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（この高いトランスフェクション効率およびタンパク質産生、ならびに翻訳後修飾を行う能力が知られている、Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）にトランスフェクションした。全てのベクターのレポーター遺伝子ｈｒＧＦＰの発現に基づくトランスフェクション効率を、トランスフェクション後２４時間および４８時間に測定した。トランスフェクションした細胞の量（蛍光顕微鏡の下で観察されるトランスフェクション効率と称される。）によって、全てのベクター構築物の有効性を、このレベルのトランスフェクションにおいて確認した。図７および表３に示されるように、全てのトランスフェクションは、トランスフェクション後４８時間に約９０パーセント（９０％）または９５パーセント（９５％）の高いトランスフェクション率（細胞をほとんど全て緑色に見せている。）をもたらした。このようなトランスフェクション効率は非常に高いと考えられ、従ってトランスフェクションの成功を表し、全てのプラスミドベクター構築物の有効性を裏付けている。
【０１４５】
Ｑ−ＰＣＲによるベクター力価の測定
ＡＡＶは製造からのこの低い力価が知られており、これが力価測定を、ＡＡＶベクターの製造の非常に重要な構成因子にする。基準グラフ（図８）および得られたＣｔ値によって、各試料のゲノムコピー数を評価することができた。２０ウェルプレートを利用するリアルタイムＰＣＲによって、コピー数が１０１１から１０１３ｖｇ／ｍｌの範囲であると予想した。得られた全ての値（表３）はこの範囲内であり、従ってインビボ実験に使用することができた。
【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
［実施例３］
ｒＡＡＶ９ベクターのインビボ検証
８個の異なるレギュロンを含むＡＡＶベクターおよび対照構築物（レギュロンを有しないαＭＨＣプロモーターによって駆動されるＧＦＰを有する。）：比較的良好なベクター力価を有するｐＡＡＶ−αＭＨＣｐ−βＧＩ−ｈｒＧＦＰ−ｐＡを成功裡に製造した（表３）。予備実験として、本発明者らは、マウス１匹当たり１．２５×１０１１ｖｇの低投与量だけを試験した。これらのベクターのそれぞれを、成体γＣＮｏｄ−ＳＣＩＤ欠損マウスに尾静脈を通じて静脈注射した（表２）。ＡＡＶベクターで注射したマウスに由来する異なる臓器のＧＦＰ発現を検出するのに、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用した。マウスの心臓および脾臓からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、ｈｒＧＦＰ特異的プライマーを、ＧＦＰｃＤＮＡを逆転写および増幅するのに使用した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で可視化した（図９）。Ｃａｓｑ２ｅ１レギュロン含有ベクターの心臓組織からＧＦＰに対応する７１６ｂｐの目立つバンドが検出され、レギュロンを有しないベクターの心臓組織は心臓組織におけるごく微量のＧＦＰｃＤＮＡを示したが、脾臓においてはいずれのベクターもいかなる発現も示さなかった（図９［Ａ］）。レギュロンを有しない対照ベクターと比較して、Ｍｙｌ２レギュロン含有ベクターは、ＧＦＰｍＲＮＡのわずかな増加を示した。
【０１４８】
内部対照遺伝子グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）によって、試験を標準化した。ＧＡＰＤＨによる標準化後のバンド強度の定量化は、新規なＣａｓｑ２ｅ１レギュロンによるＧＦＰ発現の非常に顕著な増加を示した。Ｃａｓｑ２ｅ１レギュロンはＧＦＰ発現の約１４倍の増加をもたらしたが、Ｍｙｌ２レギュロンはＧＦＰ発現の約２倍の増加をもたらした。ここで示したデータは、配列番号１および２をそれぞれ有するエンハンサーに関するものだけであるが、レギュロンを含むことは、αＭＨＣプロモーターからのＧＦＰ発現の増大を一貫してもたらしていた。この結果は、ＤＤＭデータマイニング法によるレギュロンの予測の成功をさらに立証している。この結果はまた、αＭＨＣプロモーターと組み合わせたレギュロンが心臓特異的発現をもたらすことも示している。
【０１４９】
長期追跡調査
エンハンサー因子が心臓特異的発現を増加させただけでなく、依然として組織特異的であり続ける持続的（即ち、長期の）発現も保証したか否かを評価するために最初の実験を設定し、この実験で、新生仔免疫不全ＮＯＤＳＣＩＤ／γ欠損マウスにおいて２．５×１０１０ＡＡＶベクターゲノムの注射（静脈）後１ヶ月にＧＦＰ発現を評価した。ベクター注射後１ヶ月に、落射蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰ蛍光を評価した（データは示さない。）。配列番号６（Ａｎｋｒｄ１ｅ３）をエンハンサーとして使用した。
【０１５０】
高いレベルの心臓のＧＦＰ発現が示され得たが、本発明者らは、いかなる他の組織においてもＧＦＰ発現を検出しなかった。従って、発現レベルおよび特異性は両方とも、長期間にわたって維持されている。
【０１５１】
８個のエンハンサー因子（上記表３）それぞれのロバスト性および特異性を確認するために、異なる投与量（低：１０１１、中：３×１０１１および高：１０１２）を使用したさらなる実験を実施した。これらのエンハンサー因子それぞれに関するＡＡＶ抗原型９ベクターを製造し、力価測定し、２から３日齢新生仔Ｃ５７Ｂｌ６マウスに静脈注射した。注射後６週間にマウスを屠殺して、αＭＨＣプロモーター上のエンハンサー因子それぞれの効果を測定した。対照ベクターは、エンハンサー因子を有しないαＭＨＣプロモーターから駆動されるＧＦＰ遺伝子を含む。全ての他のベクターは、１個のエンハンサー因子がαＭＨＣプロモーターの上流にクローニングされているαＭＨＣプロモーターから駆動されるＧＦＰ遺伝子を含む。６週間後、１７から２１グラムの間の体重を有する動物を、頸椎脱臼によって安楽死させ、マウス１匹ごとに異なる臓器を分析した（心臓、筋肉、肝臓、腎臓、脳、脾臓および横隔膜）。落射蛍光顕微鏡を使用して、異なる暴露時間値における完全心の写真を撮影した。幾つかの典型的な写真を図１０に示し、データは利用可能であるが示さない。全ての臓器を幾つかの切片に切断し、９６ウェルプレートに分配して、共焦点顕微鏡下で分析した。顕微鏡分析により、発現が心臓特異的であった（即ち、全てのエンハンサーに関して、心臓以外の臓器においてＧＦＰが検出されないか、または非常に限られた量のＧＦＰだけが検出された）ことが明らかになった（データは示さない。）。
【０１５２】
これは、新たに同定した心臓のエンハンサー因子（別名レギュロン）が心臓特異的であり、心臓における高いレベルの導入遺伝子発現を可能にすることを示す有力な証拠を提供している。
【０１５３】
考察
レギュロンを含む８個の異なるＡＡＶ構築物およびレギュロンを含まない１個を成功裡にクローニングし、続いて対応するＡＡＶ９ベクターを製造した。多制限酵素分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、全てのクローンを十分に検査および確認した。ＤＮＡ配列決定によって、陽性クローンをさらに確認した。ＡＡＶベクターの製造中、トランスフェクション後４８時間に９０％のトランスフェクション効率を達成したが、これは、プラスミドＤＮＡ抽出が上手く行われて、トランスフェクションのための高純度のＤＮＡが得られたことを示している。この段階は、製造後の高いＡＡＶベクター力価を達成するのに重要である。全てのＡＡＶ９ベクターの力価測定分析は、高いベクター力価を示したが（表３およびデータは示さない。）（範囲：３×１０１１から１０１３ｖｇ／ｍｌ）、これは、過去に報告された研究（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と一致している。これらのベクター投与量は、マウスモデルにおける予備インビボ実験を開始するのに十分であった。インビトロの結果からインビボ観察を常に推定することはできないので、本発明者らは、心臓細胞株におけるいかなるインビトロ予備検証研究も行わないことを選択したが、この代わりにインビボにおける直接的なＡＡＶ９遺伝子送達に焦点を合わせた。
【０１５４】
最初の予備実験において、免疫不全マウス（即ち、ＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ−／−）を使用した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ−／−マウスを使用する論理的根拠は、形質導入心筋細胞に対するあらゆる免疫応答を回避するために正当化される。
【０１５５】
本研究において、マウス１匹当たり１．２５×１０１１ｖｇＡＡＶ９の低投与量を、マウスに全身投与した。共焦点顕微鏡分析を使用して、肝臓、脳および筋肉などの他の臓器ではなく心臓においてインビボＧＦＰ発現を検出した。
【０１５６】
この最初の実験において、心臓特異的プロモーターから促進されるＧＦＰをコードする３個の異なるＡＡＶ構築物を試験した。ｒＡＡＶ９−Ｃａｓｑｅ１−αＭＨＣおよびｒＡＡＶ９−Ｍｙ１２−αＭＨＣとして指定したレギュロンを含む２個の構築物を試験し、レギュロンを含まない基本的なαＭＨＣプロモーターだけを有する１個の対照構築物を比較に使用した（ｒＡＡＶ９−αＭＨＣ）。ＲＴ−ＰＣＲのデータは、Ｃａｓｑ２ｅ１およびＭｙｌ２レギュロンをαＭＨＣプロモーターの上流に含むことがプロモーターの発現を増大させ（図９）、Ｃａｓｑ２ｅ１が最も強いレギュロンであることを示している。本発明者らのデータはまた、距離差行列（ＤＤＭ）に基づく新規なデータマイニングアルゴリズムにより、新規な心臓特異的ＴＦＢＳ結合を同定し、心臓特異的レギュロンを選択することができたことも示唆している。高発現している心臓特異的遺伝子の間の共通点として、これらの「レギュロン」は、心臓特異的ＴＦＢＳ結合を高い割合で含む。さらに、これらのレギュロンは分岐種の間で進化的に保存されており、これは、心臓高発現に関するこれらの特定のＴＦＢＳの組み合わせを維持する強いダーウィンの選択圧を示唆している。ＲＴ−ＰＣＲによってレギュロンの心臓特異性も確認したが、これは、いかなる他の組織でもなく心臓における選択的ＧＦＰｍＲＮＡ発現を示している（図９）。長期追跡調査において、この効果は維持されている（データは示さない。）。
【０１５７】
後続実験において、より低い（マウス１匹当たり２×１０１０ｖｇＡＡＶ９）投与量およびより高い（マウス１匹当たり３×１０１１ｖｇＡＡＶ９）投与量のウイルス構築物を両方とも使用した。また、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの代わりにＣ５７Ｂｌ６マウスを使用した。対照と比較して、８個のエンハンサー全てがインビボ発現の強い増加を示した（図１０および１１ならびにデータは示さない。）。３つの異なる濃度（マウス１匹当たり２×１０１０ｖｇＡＡＶ９、マウス１匹当たり３×１０１１ｖｇＡＡＶ９およびマウス１匹当たり１×１０１２ｖｇＡＡＶ９）で対照（エンハンサーを有しないαＭＨＣプロモーターを含む。）を使用したところ、エンハンサーを有するベクターが、より大量の対照ベクターと比較した場合でさえ、ＧＦＰ導入遺伝子のより高い発現をもたらした（図１０ＡからＣ）。ＧＦＰデータは、少なくとも２匹のマウスの代表的なものである。８個のエンハンサー全てがプロモーター発現を顕著に増加させたが、２個のエンハンサーが他のものよりも再現性良く機能した。異なる投与量を使用したこれらの実験全てにおいて、エンハンサーＣａｓｑ２ｅ１は、全ての試験したマウスにおいて最も強いＧＦＰ発現（図１０Ａ）を一貫してもたらした。２番目に強いＧＦＰ発現はＡｎｋｒｄ１ｅ２エンハンサーによってもたらされており、試験した８個のエンハンサーの中で一貫して２番目に良いものである（図１０Ｂ）。これら２個のエンハンサー−プロモーターの組み合わせによって駆動されるＧＦＰ発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量化し、対照と比較した。結果を図１１に示す。これらのデータは１匹のマウスに由来するものだけであるが（これが、蛍光データとは対照的に、Ｃａｓｑ２ｅ１エンハンサー（エンハンサー４）よりもＡｎｋｒｄ１ｅ２エンハンサー（エンハンサー７）がわずかによく機能しているように見える理由を説明する。）、発現カセットを含むエンハンサーは両方とも、エンハンサーを有しない同じベクターよりも６０倍以上のＧＦＰを発現している。
【０１５８】
これらのデータはエンハンサーを有するベクターの効率の上昇を実証しており、より低いベクター投与量が心臓における効率的なインビボ遺伝子導入を達成するのに必要とされているので、これらのエンハンサー配列の使用がより経済的であるだけでなく、より良い安全性プロファイル有する可能性が高いことを証明している。さらに、全てのエンハンサーに関して、発現のこの増加は心臓特異的であり、他の臓器において顕著な発現は見られなかった（即ち、「漏れ」は認められなかった。）。これは、肝臓、肺、腎臓、筋肉、脾臓および横隔膜における発現を見ることによって測定した（データは示さない。）。
【０１５９】
本研究は、ディファレンシャルスクリーニング、理論的なインシリコプロモーター解析および設計後の半ハイスループットインビボスクリーニングを組み合わせた統合的方法が、異なる標的組織およびベクターに一般的に適用可能な強力な組織特異的遺伝子送達ベクターをもたらし得ることを実証している。
【０１６０】
ＧＦＰ導入遺伝子産物は異物（異種抗原）であるので、形質導入心筋細胞におけるこの発現は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と結合して提示されたＧＦＰ抗原ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を潜在的に引き起こし得る。これらの免疫応答は、最終的には、形質導入心筋細胞の排除をもたらし、異なるレギュロンを比較する関連データの解釈を歪曲し得る。これは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ−／−マウスをここで最初に使用したからである。従って、本研究において、細胞免疫応答がＧＦＰ形質導入心筋細胞の程度および持続性に影響を与えた可能性は少ない。同じ理由により、抗ＡＡＶ抗体がＡＡＶ形質導入を妨げた可能性も排除することができる。これらの結果は、非免疫不全マウスにおいて再現可能であった。
【０１６１】
結論として、本研究は、ＡＡＶ９ベクターによって送達されるαＭＨＣプロモーターと組み合わせた新規なレギュロンが、導入遺伝子を心臓に強制的に発現させることができることを示唆している。従って、心臓における限定的な発現は、ＡＡＶ９（心臓指向性）の使用に起因するだけではなく、心筋に対して導入遺伝子発現の制限を可能にする心臓特異的レギュロンとともにαＭＨＣ（心臓特異的）の使用も必要とする。
【０１６２】
重要なことには、本結果の一部は免疫不全マウスを用いて得られたが、これは、発現タンパク質の異種性を考慮しただけであった。（例えば、（ウイルス）ベクターに対する反応により形質導入効率を妨げることを回避するために同時免疫抑制した方が良いと想定されるが）、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける実験によって示されるように、異物ではない物質（例えば、治療用タンパク質）を形質導入する場合、本明細書において記載される方法を実施するために、免疫応答を抑制することは必ずしも必要とされない。
【０１６３】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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