(57)【要約】本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するのに有用な方法及び試薬、及び治療的抗ＩｇＥ抗体の投与に対するアナフィラキシーのリスクを評価するための方法を提供する。【選択図】図７
2013508740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である、工程；及び
（ｂ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項２】
ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性が、治療的抗ＩｇＥ抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約５％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性が、治療的抗ＩｇＥ抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約２．５％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性が、治療的抗ＩｇＥ抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１％以下である、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
相対的結合親和性が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＩｇＥへの結合を比較することにより測定される、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの活性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの活性の約１０％以下である、工程；及び
（ｂ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項７】
ミュータント治療抗体が、治療的抗ＩｇＥ抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ配列において１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸変異を含む、請求項１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
治療的抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブであり、ミュータント治療抗体が軽鎖の第１のＣＤＲにおいて１、２又は３つのアミノ酸変異を含む、請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ミュータント治療抗体が配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、位置３０、３２及び３４におけるアミノ酸Ａｓｐが軽鎖において置換されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ミュータント治療抗体が配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び位置３０、３２及び３４においてＡｓｐからＡｌａへのアミノ酸置換を有する配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ミュータント治療抗体が表面に接続されている、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ミュータント治療抗体が表面に直接固定されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ミュータント治療抗体が標識され、標識に特異的に結合する捕捉剤により表面に接続されており、捕捉剤が表面に固定されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
標識がビオチンであり、捕捉剤がストレプトアビジンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標識がジゴキシゲニンであり、捕捉剤が抗ジゴキシゲニン抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
試料を、表面に接続されたミュータント治療抗体に接触させる、請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
試料を、ミュータント治療抗体を表面に接続させる前にミュータント治療抗体に接触させる、請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合が検出剤で検出される、請求項１ないし１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
検出剤が、ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識されている、請求項１９ないし２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウム、放射線標識、フォトルミネセンス標識、化学発光標識、蛍光標識、電気化学発光標識及び酵素標識からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識が、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する第二の検出剤により検出される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療的抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブである、請求項１ないし７、１１ないし２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
試料がヒト血清又は血漿を含む、請求項１ないし２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
血清又は血漿が治療抗体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
血清又は血漿が治療抗体を含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）で検出される抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を基準と比較する工程をさらに含む、請求項１ないし２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
基準が、ミュータント治療抗体とコントロール抗体との間で検出された結合である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
コントロール抗体が、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ポジティブコントロール抗体が、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項３４】
検出剤が、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含むＦｃεＲＩαポリペプチドである、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む、請求項３３ないし３５の何れか一項に記載のキット。
【請求項３７】
ポジティブコントロール抗体が、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性が、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項３９】
検出剤が、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含むＦｃεＲＩαポリペプチドである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む、請求項３８ないし４０の何れか一項に記載のキット。
【請求項４２】
ポジティブコントロール抗体が、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する及びＦｃεＲＩαポリペプチドとを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；
（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び
（ｃ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【請求項４４】
工程（ａ）においてＦｃεＲＩαポリペプチドの過剰量を試料と接触させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ａ）においてＦｃεＲＩαポリペプチドの少なくとも約１０倍の過剰量を試料と接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＦｃεＲＩαポリペプチドがＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項４３ないし４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ミュータント治療抗体が標識され、標識に特異的に結合する捕捉剤により表面に接続されている、請求項４３ないし４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
標識がビオチンであり、表面がストレプトアビジンで被覆されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合が、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体により検出される、請求項４３ないし４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合がＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤により検出される、請求項４３ないし４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性が、ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチド
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項５２】
抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
抗ヒトＩｇＥ抗体が標識されている、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識されている、請求項５１ないし５３の何れか一項に記載のキット。
【請求項５５】
ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤をさらに含む、請求項５１ないし５４の何れか一項に記載のキット。
【請求項５６】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドとプレインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含む治療的抗ＩｇＥ抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して減少している工程；及び
（ｃ）抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項５７】
ミュータント治療抗体が治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ａ）においてＦｃεＲＩαポリペプチドの少なくとも約１０倍の過剰量を試料と共にプレインキュベートする、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体を、工程（ｂ）における試料とのインキュベートの前又は後に表面に接続する、請求項５６ないし５８の何れか一項に記載の方法。
【請求項６０】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体を、工程（ｂ）における試料とのインキュベートの前に表面に直接固定する、請求項５６ないし５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体が標識されており、標識に特異的に結合する固定された捕捉剤により表面に接続させる、請求項５６ないし５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体がビオチンで標識されており、ストレプトアビジンで被覆された表面に接続されている、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合がＨＲＰでコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体により検出される、請求項５６ないし６２の何れか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合が標識を検出することにより検出される、請求項５６ないし６２の何れか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ＦｃεＲＩαポリペプチドがジゴキシゲニンで標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合がＨＲＰでコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体により検出される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＦｃεＲＩαポリペプチドがルテニウムで標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合が電気化学発光を介して検出される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体又はそのミュータント治療抗体であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性はヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチド
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項６８】
抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
抗ヒトＩｇＥ抗体が標識されている、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識されている、請求項６７ないし６９の何れか一項に記載のキット。
【請求項７１】
ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤をさらに含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び
（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項７３】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び
（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項７４】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である工程；
（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項７５】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項７６】
以下の工程を含む、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療する方法：
（ａ）患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルを測定する工程；
（ｂ）試料中の抗薬剤抗体のレベルが、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない場合、ＩｇＥ媒介性疾患を治療するために患者に治療的抗ＩｇＥ抗体の有効量を投与する工程。
【請求項７７】
試料中の抗薬剤抗体のレベルが以下の工程を含む方法により測定される、請求項７６に記載の方法：
（ａ）患者の試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び
（ｂ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項７８】
試料中の抗薬剤抗体のレベルが以下の工程を含む方法により測定される、請求項７６に記載の方法：
（ａ）患者の試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び
（ｂ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項７９】
試料中の抗薬剤抗体のレベルが以下の工程を含む方法により測定される、請求項７６に記載の方法：
（ａ）患者の試料を（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び
（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項８０】
試料中の抗薬剤抗体のレベルが以下の工程を含む方法により測定される、請求項７６に記載の方法：
（ａ）患者の試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は２００９年１０月２６日に出願の米国仮出願番号第６１／２５５，０５２号の優先権の利益を請求し、その全てが本願明細書に出典明示により援用されるものとする。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、治療的抗ＩｇＥ抗体に対する、ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法及び試薬及びアナフィラキシーのリスクを評価するための方法の分野に関連する。
【０００３】
背景
ＩｇＥは、アレルギー反応（例えば広範囲にわたって患われる喘息、食物アレルギー、Ｉ形過敏症及びよく知られている副鼻腔炎）を媒介する免疫グロブリンファミリーのメンバーである。ＩｇＥは、Ｂ細胞又はＢリンパ球により分泌され、その表面に発現する。ＩｇＥは、そのＦｃ領域のＦｃεＲＩＩとして知られる低親和性ＩｇＥ受容体への結合を介して、Ｂ細胞（単核細胞、好酸球性及び血小板も同様）に結合する。アレルゲンへの哺乳動物の暴露により、抗原に特異的な表面結合ＩｇＥ抗体を生じるＢ細胞は、「活性化され」、ＩｇＥを分泌するプラズマ細胞となる。生じたアレルゲン特異的なＩｇＥは、血流を循環し、ＦｃεＲＩとして知られる高親和性受容体を介して、組織中でマストセル表面に、血液中で好塩基球表面に結合する。マストセル及び好塩基球は、それによりアレルゲンに感作される。アレルゲンへの後の暴露によって、これらの細胞の脱顆粒及び臨床過敏症及びアナフィラキシーの原因となるヒスタミン、ロイコトリエン及び血小板活性化因子、好酸球性及び好中球走化性因子及びサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦの放出を引き起こす好塩基球及びマスト細胞ＦｃεＲＩの架橋結合が生じる。
【０００４】
ＩｇＥ−受容体複合体形成をブロックするアンタゴニストは、アレルギー反応を予防するための治療剤として有用である。いくつかの治療的抗ＩｇＥ抗体が開発された。これらの抗ＩｇＥ抗体は、好塩基球及びマストセルに見いだされる高親和性受容体ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合をブロックし、それによって、ヒスタミン及び病的状態を引き起こす他のアナフィラキシー因子の放出を予防する。
【０００５】
アナフィラキシーは、オマリズマブなどの抗ＩｇＥ抗体（例えばＸｏｌａｉｒ（登録商標））を受けた後に患者において発生することが報告された。アナフィラキシーは、急性全身性（マルチシステム）及び非常に重度のＩ型過敏症アレルギー反応である。それは、マストセル及び好塩基球の脱顆粒によって生じ、ＩｇＥによって媒介される。２００６年まで、５７，２６９人の喘息患者のうちの１２４人（約０．２％）が、オマリズマブ投与後にアナフィラキシーを有した。オマリズマブの結果としての致命的なアナフィラキシーの報告はないが、いくつかのケースは重篤で、潜在的に生死にかかわるものであった。このために、ＦＤＡはオマリズマブを受けている患者をオマリズマブ投与後しばらくの間診療室において監視することを推奨しており、オマリズマブを投与する健康管理提供者は生死にかかわり得るアナフィラキシーを管理するために準備されるべきである。事例の６０パーセント（１２４）で、オマリズマブの最初の２回の投与後であったことが報告されている。したがって、薬剤の投与後に起こる抗薬物反応とは対照的に、反応は患者中に先に存在したオマリズマブ上のエピトープを認識する抗体によるものかもしれない。アナフィラキシーがＩｇＥアイソタイプの抗体と関連しているように、好ましくは抗ＩｇＥ抗体治療前にアナフィラキシーのリスクを評価し、ハイリスクな患者を同定するために、治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的な患者のＩｇＥ量を検出及び定量するためのアッセイを開発するというニーズが存在する。
【０００６】
本願明細書に引用される特許出願及び刊行物を含む全ての文献は、その全てが出典明示により援用されるものとする。
【０００７】
発明の要約
一つの態様では、本発明は、以下の工程を含む、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と、抗薬剤抗体を含み得る試料とを接触させる工程であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的な結合親和性の約１０％以下である工程；及びｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【０００８】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的な結合親和性の約７．５％以下、約５％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．５％以下、約０．２５％以下、約０．１％以下である。
【０００９】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、試料中で治療的抗ＩｇＥに結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と、抗薬剤抗体を含み得る試料とを接触させる工程であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の活性は、ＩｇＥに対する治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及びｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００１０】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体の活性は、治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約７．５％以下、約５％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．５％以下、約０．２５％以下、約０．１％以下である。
【００１１】
本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ配列中に１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント治療抗体はオマリズマブの軽鎖の第１のＣＤＲにおいて１、２又は３つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント治療抗体はオマリズマブの軽鎖（配列番号：１）の位置３４（Ａｓｐ）にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、軽鎖の位置３０（Ａｓｐ）及び３４（Ａｓｐ）、又は３２（Ａｓｐ）及び３４（Ａｓｐ）のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、位置３０、３２及び３４のアミノ酸Ｄ（Ａｓｐ）が軽鎖において置換されている。いくつかの実施態様において、アミノ酸Ａｓｐは、Ａｌａで置換される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖の位置３０、３２及び３４のＡｓｐのＡｌａへの置換を伴った配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント治療抗体はオマリズマブの重鎖の第３のＣＤＲにおいて１、２又は３つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、重鎖（配列番号：２）の位置１０１（Ｈｉｓ）、１０５（Ｈｉｓ）及び１０７（Ｈｉｓ）のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施態様において、アミノ酸Ｈｉｓは、Ａｌａで置換される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、重鎖の位置１０１、１０５及び１０７のＨｉｓからＡｌａへのアミノ酸置を伴った換配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、表面に固定又は接続される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、表面に直接固定される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は標識にコンジュゲートされ、標識に特異的に結合する捕捉剤により表面に固定又は接続されており、捕捉剤は表面に固定される。いくつかの実施態様において、標識はビオチンであり、捕捉剤はストレプトアビジンである。いくつかの実施態様において、標識はジゴキシゲニンであり、捕捉剤は抗ジゴキシゲニン抗体である。
【００１３】
いくつかの実施態様において、試料を表面に固定又は接続されたミュータント治療抗体と接触させる。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体を表面に接続させる前に、試料をミュータント治療抗体と接触させる。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、試料をミュータント治療抗体と接触させた後、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する前に、表面に接続させる。
【００１４】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合は、検出剤で検出される。いくつかの実施態様において、検出剤は、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドである。本願明細書において提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている。いくつかの実施態様において、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウム、放射線標識、フォトルミネセンス標識、化学発光標識、蛍光標識、電気化学発光標識及び酵素標識からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはビオチンで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はストレプトアビジン−ＨＲＰによって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはジゴキシゲニンで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはルテニウムで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合は電気化学発光アッセイによって検出される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、試料はヒト血清又は血漿を含む。いくつかの実施態様において、試料は治療的抗ＩｇＥ抗体を含む。いくつかの実施態様において、試料は治療的抗ＩｇＥ抗体を含まない。いくつかの実施態様において、血清又は血漿はオマリズマブを含む。他の実施態様において、血清又は血漿はオマリズマブを含まない。
【００１６】
いくつかの実施態様において、方法は、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を基準と比較する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、基準は、ミュータント治療抗体とコントロール抗体との間の検出された結合である。いくつかの実施態様において、コントロール抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体である。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、ヒトＩｇＥの重鎖及び軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である抗体；及びｂ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、検出剤はＦｃεＲＩαポリペプチドである。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドがキットに包含されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウムなどによる標識）。いくつかの実施態様において、キットはストレプトアビジン−ＨＲＰ又はＡｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰをさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、ジゴキシゲニン標識ＦｃεＲＩαポリペプチドを検出するためのＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、ヒトＩｇＥの重鎖及び軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の活性は、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である抗体；及びｂ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、検出剤は、ＦｃεＲＩαポリペプチドである。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドがキットに包含されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウム、などによる標識）。いくつかの実施態様において、キットはストレプトアビジン−ＨＲＰ又はＡｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰをさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、ジゴキシゲニン標識ＦｃεＲＩαポリペプチドを検出するためのＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、ヒトＩｇＥの重鎖及び軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する及びＦｃεＲＩαポリペプチドとを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び（ｃ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００２０】
いくつかの実施態様において、工程（ａ）で過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドを試料と接触させる。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドの少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍の過剰量を、工程（ａ）において試料と接触させる。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。ＦｃεＲＩαポリペプチドは、標識されていても、されていなくてもよい。
【００２１】
本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、標識され、標識に特異的に結合する捕捉剤によって表面に接続される。いくつかの実施態様において、標識はビオチンであり、表面はストレプトアビジンで被覆されている。いくつかの実施態様において、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合は、標識抗ヒトＩｇＥ抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されており、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはジゴキシゲニンで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはルテニウムで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合は電気化学発光アッセイによって検出される。
【００２２】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性がＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である抗体；及びｂ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。本願明細書に記載されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドがキットに提供される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている。いくつかの実施態様において、キットは、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤をさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、抗ヒトＩｇＥ抗体は標識されている。
【００２３】
別の態様においては、本発明は、以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドとプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して減少している工程；及び（ｃ）抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【００２４】
本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍の過剰なＦｃεＲＩαポリペプチドが工程（ａ）において試料と共にプレインキュベートされる。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。
【００２６】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、工程（ｂ）における試料とのインキューベーションの前又は後に、表面に接続される。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、工程（ｂ）における試料とのインキューベーションの前に、表面に直接固定される。
【００２７】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は標識され、標識に特異的に結合する固定された捕捉剤によって表面に接続される。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、ビオチンで標識され、ストレプトアビジン被覆表面に接続される。
【００２８】
いくつかの実施態様において、抗薬剤抗体の治療抗体又はミュータント治療抗体への結合は、ＨＲＰがコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合は標識を検出することによって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはジゴキシゲニンで標識されており、抗薬剤抗体の治療抗体又はミュータント治療抗体への結合はＨＲＰでコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはルテニウムで標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合は電気化学発光アッセイによって検出される。
【００２９】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体又はそのミュータント治療抗体であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性はヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、抗体；及び（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、キットは抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、抗ヒトＩｇＥ抗体は標識されている。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている。いくつかの実施態様において、キットは、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤をさらに含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３１】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３２】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３３】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートされた試料を治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３４】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療する方法を提供する：（ａ）患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルを測定する工程；（ｂ）試料中の抗薬剤抗体のレベルが、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない場合、患者に治療的抗ＩｇＥ抗体の有効量を投与する工程。抗薬剤抗体のレベルは、本願明細書で提供されるいかなる方法によって測定されてもよい。
【００３５】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥにおいて少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含みうる試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３６】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥにおいて少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体抗体の使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含みうる試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３７】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドの使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ＦｃεＲＩαポリペプチドを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である、工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続する工程；及び（ｃ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３８】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における（ｉ）治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ工程において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体、及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドの使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び（ｃ）治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３９】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥ工程において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性が前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４０】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥ工程において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性が前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４１】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における（ｉ）ミュータント治療抗体、及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドの使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ＦｃεＲＩαポリペプチドを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である、工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続する工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であった、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルが、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４２】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における（ｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチド、及び（ｉｉ）治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料を過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートされた試料を治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４３】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体を含むＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療するための組成物であって、患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルが測定され、試料の抗薬剤抗体のレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない、組成物を提供する。別の態様においては、本発明は、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療するための治療的抗ＩｇＥ抗体であって、患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルが測定され、試料の抗薬剤抗体のレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない、治療的抗ＩｇＥ抗体を提供する。
【００４４】
本明細書に記載される様々な実施態様の特性の一つ、一部又は全ては、本発明の他の実施態様と組み合わせてもよいことは理解されるべきである。本発明のこれら及び他の態様は、当業者にとって明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
図１Ａは、抗体Ｅ２５の軽鎖アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。図１Ｂは、抗体Ｅ２５の重鎖アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。Ｋａｂａｔに定義されるＣＤＲ領域が括弧で表されているのに対して、Ｃｈｏｔｈｉａに定義されるＣＤＲ領域はボールドで示されている。
【００４６】
図２Ａは、精製されたヒトＩｇＥへのＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合親和性を比較するＥＬＩＳＡアッセイの図表示である。図２Ｂは、ヒトＩｇＥへのＥ２５の結合と比較したヒトＩｇＥへのＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合を示すグラフである。Ｅ２５−ＡＡＡミュータントは、ＩｇＥに対してＥ２５より約１００ｘ少ない親和性を有した。
【００４７】
図３は、治療的抗ＩｇＥ抗体についての活性アッセイの図表示である。
【００４８】
図４Ａは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ２の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ２の結合を示すグラフである。図４Ｂは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ１０の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ１０の結合を示すグラフである。図４Ｃは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ１の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ１の結合を示すグラフである。図４Ｄは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ７の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ７の結合を示すグラフである。図４Ｅは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ９の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ９の結合を示すグラフである。図４Ｆは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ１３の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ１３の結合を示すグラフである。図４Ｇは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ４の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ４の結合を示すグラフである。図４Ｈは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ５の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ５の結合を示すグラフである。
【００４９】
図５は、アッセイ系のポジティブコントロール抗体として設計されたＥ２５特異的なＩｇＥキメラ抗体を示す。キメラ抗体の可変領域は、Ｅ２５のＦａｂ断片に特異的に結合する抗体ＡＭＥ２からのものであり、キメラ抗体の定常領域はヒトＩｇＥ抗体からのものである。
【００５０】
図６Ａは、Ｅ２５抗体又はＥ２５−ＡＡＡミュータント抗体へのキメラＥ２５特異的ＩｇＥポジティブコントロール抗体の結合を試験するためのアッセイ系の図表示である。図６Ｂは、キメラＥ２５特異的なＩｇＥポジティブコントロール抗体が同程度の親和性でＥ２５及び２５−ＡＡＡミュータントと結合することを示すグラフである。
【００５１】
図７は、Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体を用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５−特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５２】
図８は、Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体を用いたＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの感度を測定するためのＥ２５特異的ＩｇＥ標準曲線を示す。この図は、図７に記載されるアッセイフォーマットを用いた結果を示す。
【００５３】
図９は、漸増濃度のＥ２５存在下で、Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体を用いたＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの薬剤耐性を示す。
【００５４】
図１０は、半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５５】
図１１は、半均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５６】
図１２は、「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５７】
図１３は、「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５８】
図１４は、均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５９】
図１５は、半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。図１５の左パネルは、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。図１５の右パネルは、Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。
【００６０】
図１６は、半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。図１６の左パネルは、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。図１６の右パネルは、Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。
【００６１】
図１７は、半均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。図１７の左パネルは、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。図１７の右パネルは、Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。
【発明の詳細な説明】
【００６２】
本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体（例えばオマリズマブ、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））に特異的なＩｇＥアイソタイプ抗薬剤抗体を検出するのに有用な方法及び試薬を提供する。内因性ＩｇＥが治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥの検出を干渉することから、そのようなアッセイの開発に伴う課題には、内因性ＩｇＥ（抗ＩｇＥ治療抗体による結合に利用可能なＦｃ領域を有するＩｇＥ）と治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥとを区別することの困難性が含まれる。本発明は、内因性ＩｇＥと、治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥとを識別することができ、治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥを特異的に検出することができる方法及び試薬を提供する。
Ａ．一般的な技術
保存的アミノ酸置換
2013508740.tif 000003
表１．霊長類ＦｃεＲＩα成熟配列
2013508740.tif 000004
ｐＲＫｇＤ  ｃｙｎｏＦｃεＲＩ．６ｘＨｉｓＴｙｒ１６０
2013508740.tif 000005
ｒｈｅｓｕｓＳＳｃｙｎｏＦｃｅＲＩ．６ｘｈｉｓ  ｔｙｒ１６０
2013508740.tif 000006
ｃｙｎｏ  Ｆｃ  Ｒ１  （１−１７６）  ｈｉｓモノマー
2013508740.tif 000007
2013508740.tif 000008
ｇＤｃｙｎｏ  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６ＸＨｉｓ
2013508740.tif 000009
ｇＤｒｈｅｓｕｓ  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６ＸＨｉｓ
2013508740.tif 000010
ｇＤｃｈｉｍｐ  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６ＸＨｉｓ
2013508740.tif 000011
2013508740.tif 000012
ＩｇＧのＦｃ領域
2013508740.tif 000013
ｒｈｅｓｕｓ  （１−１４１）／ｃｙｎｏ  （１４２−１７１）  ＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質（１−１７１）
2013508740.tif 000014
ｒｈｅｓｕｓ／ｃｙｎｏ  ＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質（１−１７８）
2013508740.tif 000015
ｃｙｎｏ／Ｈｕｍａｎ  ＦｃεＲＩα−ＩｇＧ  （１−１７８）
2013508740.tif 000016
【実施例】
【００６３】
実施例１．抗ＩｇＥ抗体オマリズマブのミュータント抗体の調製
抗体オマリズマブ（Ｅ２５又はｒｈｕＭＡｂＥ２５）は、米国特許出願公開第２００５／０１５８３０３号明細書及び米国特許第６，１７２，２１３号明細書に記載されるヒト化抗ヒトＩｇＥ抗体である。Ｅ２５の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は米国特許第６，１７２，２１３号明細書の図２において提供され、Ｅ２５の重鎖及び軽鎖の完全長アミノ酸配列は米国特許第６，１７２，２１３号明細書の図１２において提供される。抗体Ｅ２５の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、図１Ａ及び１Ｂに示される。Ｅ２５−ＡＡＡミュータントと称され、軽鎖ＣＤＲ１において３つのアミノ酸置換を含むミュータントＥ２５が生成された。変異は、配列番号：１に示される位置３０、３２、３４におけるＤからＡへの置換である。このミュータント抗体は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３−２６３２，  １９９３に記載される。
【００６４】
Ｅ２５と比較したヒトＩｇＥへのミュータント抗体の結合親和性は、図２Ａに示すように試験された。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントは、ＥＬＩＳＡプレートに固定され、漸増濃度の精製されたヒトＩｇＥはプレートに添加された。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントへのヒトＩｇＥの結合は、ＨＲＰでコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＥによって検出された。４５０ｎｍにおけるＯＤが測定された。これらの実験は、公知の方法を用いて実施された。例えばＥｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：８７１−４，  １９７１；  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３−２６３２，  １９９３を参照。図２Ｂに示すように、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントは、ヒトＩｇＥに対してＥ２５よりも約１００倍少ない結合親和性を有する。
【００６５】
Ｅ２５−ＡＡＡミュータントとＥ２５の一次構造を比較するために、Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングが用いられた。３つのアミノ酸置換の全てが同じペプチド内（軽鎖１−４３）となるように、Ｌｙｓ−Ｃ酵素は消化のために用いられた。ペプチドマッププロファイルは、ミュータントにおいて２つのピークの相違、親ペプチドＬＣ１−４３の消失及びＥ２５には存在しない新しいピーク、のみを示した。ＬＣ−ＭＳは実行され、ミュータントにおける新しいピークの主要部が３つのＡｓｐを置換した３つのＡｌａを有するＬＣ１−４３として確認された。したがって、この解析により、ＬＣにおける３つのＡｓｐを置換した３つのＡｌａを除いて、ミュータントがＥ２５の同じ一次構造を有することが確認された。
【００６６】
Ｅ２５−ＡＡＡミュータントの電荷分布も研究された。モノクローナル抗体の電荷分布は、通常分子特異的である。ミュータントにおけるアミノ酸置換が分子のｐＩを有意に（７．６から９まで）変化させた場合、ミュータントの移動時間は非常に異なった。さらに、プロファイルの相違は、Ｅ２５の電荷分布の不均一性に寄与する（異性化する）Ａｓｐ３２の置換によるものであると予測される。酸性及び塩基性変異体の同程度の量について、Ｅ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントのｉＣＩＥＦ（イメージキャピラリー等電点電気泳動）プロファイルは同程度であったが同一ではなかった。
【００６７】
実施例２．Ｅ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントへの抗薬剤抗体の結合の比較
Ｅ２５に特異的なミューリンモノクローナル抗体が生成された。下記の表２に示すように、ＡＭＥ１、ＡＭＥ７、ＡＭＥ９、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ１３、ＡＭＥ４及びＡＭＥ５はＥ２５に結合する抗体である。ＡＭＥ１、ＡＭＥ７、ＡＭＥ９、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ４及びＡＭＥ５はマウスＩｇＧ１であり、ＡＭＥ１３はマウスＩｇＧ２抗体である。Ｅ２５は、実施例１及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３−２６３２，  １９９３に記載されるように、ＭＡＥ１１から誘導されたヒト化抗体である。ＭＡＥ１は、コントロール抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体であって、ＭＡＥ１１とは異なるＣＤＲを有する。ＭＡＥ１及びＭＡＥ１１はマウスＩｇＧ抗体である。コントロール抗体（完全長）は、Ｅ２５に類似するフレームワーク残基を有するＩｇＧ抗体であるが、異なる抗原に結合する。ＭＡＥ１へのネガティブ結合は、ＡＭＥがＥ２５配列のみに特異的であることを証明した。これらの抗薬剤抗体がＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントに対して同様によく結合するかどうかを試験するために、結合アッセイは公知技術の方法を用いて実施された。例えばＥｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：８７１−４，  １９７１を参照。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントはＥＬＩＳＡプレートに固定され、漸増濃度の精製された抗薬剤抗体（ＡＭＥ１、ＡＭＥ７、ＡＭＥ９、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ１４、ＡＭＥ４又はＡＭＥ５）はプレートに添加された。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントへの抗薬剤抗体の結合は、ＨＲＰがコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体によって検出された。４５０ｎｍにおけるＯＤが測定された。下記の図４Ａ−４Ｈ及び表２に示すように、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ４及びＡＭＥ５はＥ２５Ｆａｂ及びＥ２５フレームワーク領域に特異的である；ＡＭＥ１、ＡＭＥ７及びＡＭＥ９は、Ｅ２５ＣＤＲに特異的である；ＡＭＥ１３は、Ｅ２５フレームワーク領域に特異的である。ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ１３、ＡＭＥ４、ＡＭＥ５及びＡＭＥ７がＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントの両方に結合するので、これらの抗体は本願明細書に記載されるアッセイにおいて用いられ得るミュータント抗ＩｇＥ抗体を試験し、スクリーニングするために用いられてもよい。
表２．Ｅ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントに結合するマウス抗体
2013508740.tif 000017
【００６８】
実施例３．Ｅ２５特異的ＩｇＥポジティブコントロール抗体の調製
図５は、本願明細書に記載されるアッセイ系で用いられ得るポジティブコントロール抗体を示す。この抗体は、ＡＭＥ２の重鎖及び軽鎖可変領域及びヒトＩｇＥの定常領域を有する。
【００６９】
ポジティブコントロール抗体は、図６Ａに示されるアッセイを用いて試験された。ＥＬＩＳＡプレートの表面をヒトＦｃεＲＩα  ＩｇＧキメラ受容体で被覆した。Ｅ２５特異的ＩｇＥポジティブコントロール抗体をプレートに添加し、固定された受容体に結合できるようにインキューベートした。漸増濃度のＥ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントの何れかをプレートに添加し、Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合を可能とするためにインキューベートした。プレートへのＥ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合は、ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて測定された。結果を図６Ｂに示す。実験は、図３に示されるポジティブコントロール抗体がＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントに同様によく結合することを示し、アッセイ又はさらなるミュータント抗体のスクリーニングのためのポジティブコントロールとして本明細書に記載されるアッセイ系で用いられてもよい。
【００７０】
実施例４．直接的ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の検出
図７は、Ｅ２５特異的ＩｇＥを検出するためのアッセイ系を示す。Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体は、ＥＬＩＳＡプレートの表面を被覆するために用いられる。あるいは、ミュータント抗体は、セルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）ｄｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｄｉａ）の表面に固定される。患者血清試料は表面に添加され、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのあらゆるＥ２５特異的ＩｇＥの結合を可能とする条件下でインキューベートされた。ビオチン標識ヒトＦｃεＲＩα−ＩｇＧキメラ受容体（例えば国際公開第０８／０２８０６８号に記載される）は、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントに結合するあらゆるＥ２５特異的なＩｇＥを検出するために、ＥＬＩＳＡプレート（又はＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標））に添加される。ＳＡ−ＨＲＰ（ストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート）は、ビオチン−ＦｃεＲＩ−ＩｇＧを検出するために添加される。
【００７１】
あるいは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＥ２５特異的ＩｇＥの結合を検出するために他の検出系が用いられる。以下の工程が直接的ＥＬＩＳＡアッセイのために用いられる：ａ）Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆する工程；ｂ）プレートにアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）を添加し、撹拌させながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）プレートにＥ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む１：２希釈血清試料を添加し、撹拌させながら室温、オーバーナイトでインキューベートする工程；ｄ）プレートにビオチン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｅ）プレートにＡｍｄｅｘ−ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｆ）プレートにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）プレートに１Ｍリン酸を添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートは、工程ｆ）の前に、各々の工程間で３回洗浄される。
【００７２】
実施例５．半均一系及び均一系アッセイを用いた試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の検出
図１０は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５−特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を、ビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントと共に、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）ストレプトアビジンで被覆したプレートにアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）を添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする、又は、プレブロックしたストレプトアビジンで被覆したプレート（例えばＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  （ＨＢＣ）  Ｃｌｅａｒ  ９６−ｗｅｌｌ  ＰｌａｔｅとＳｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を用いる工程；ｃ）プレートにプレインキュベートされた血清試料を添加し、撹拌しながら室温で０．５−２時間（例えば１時間）インキューベートする工程；ｄ）プレートにジゴキシゲニン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｅ）プレートにＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｆ）プレートにＴＭＢ基質を添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）プレートに１Ｍリン酸を添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｅ）の各工程の後に３回洗浄する。
【００７３】
例えば、アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）中の１μｇ／ｍｌビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを、ヒト血清で１：１に希釈し、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。１：２のプレインキューベートされた血清試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）に添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートし、次いで洗浄した。結合したＥ２５特異的ＩｇＥは、撹拌しながら室温で１時間、アッセイ希釈液中で、２５０ｎｇ／ｍＬのＤＩＧ標識ＦｃｅＲ１−ＩｇＧと共にインキュベートすることにより検出される。プレートを洗浄し、〜１：６０００のＨＲＰ標識マウス抗ＤＩＧ  ＭＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）と共に、アッセイ希釈液中で撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを最後に洗浄し、発色現像及び測定のためにＴＭＢ基質と共に１５−３０分間インキューベートした。
【００７４】
図１１は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを示す。以下のの工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）と共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をＭＳＤストレプトアビジンで被覆したプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （ＭＳＤ），  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）に添加し、浸透しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、浸透しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ルテニウム標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧを添加し、浸透しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；及びｅ）ＭＳＤ  ＴＰＡリードバッファーを添加し、直ちにシグナルを読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｄ）の各工程後に洗浄する。
【００７５】
図１２は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）及び１０倍以上の過剰なＦｃεＲ１−ＩｇＧと共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＴＭＢ基質をプレートに添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｆ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｄ）の各工程後に洗浄する。
【００７６】
図１３は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）及び１０倍以上過剰なジゴキシゲニン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＴＭＢ基質をプレートに添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｆ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｄ）の各工程後に洗浄する。
【００７７】
図１４は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための均一系「ブロッキング」ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）及び１０倍以上過剰なルテニウム標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ＭＳＤ  ＴＰＡリードバッファーを添加し、直ちにシグナルを読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｃ）の各工程後に洗浄する。
【００７８】
図１５は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系「ブロッキング」ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆するか（図１５、右パネル）、又はビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を予め被覆されたストレプトアビジンプレートに添加し（図１５、左パネル）、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を１０倍以上過剰な非標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共にプレインキュベートし、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキュベートする工程；ｄ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｆ）ＴＭＢ基質をプレート添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばａ）、ｂ）、ｄ）及びｅ）の各工程後に洗浄する。
【００７９】
図１６は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系「ブロッキング」ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆するか（図１６、右パネル）、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を予め被覆されたストレプトアビジンプレートに添加し（図１６、左パネル）、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を１０倍以上過剰なジゴキシゲニン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共にプレインキュベートし、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキュベートする工程；ｄ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｆ）ＴＭＢ基質をプレート添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばａ）、ｂ）、ｄ）及びｅ）の各工程後に洗浄する。
【００８０】
図１７は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するために半均一系「ブロッキング」ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆するか（図１７、右パネル）、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を予め被覆されたストレプトアビジンプレートに添加し（図１７、左パネル）、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を１０倍以上過剰なルテニウム標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共にプレインキュベートし、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキュベートする工程；ｄ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；及びｅ）ＭＳＤ  ＴＰＡリードバッファーを添加し、直ちにシグナルを読みとる工程。プレートを工程間、例えばａ）、ｂ）及びｄ）の各工程後に洗浄する。
【００８１】
実施例６．ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤特異的抗体のアッセイ感度
実施例４（図７）に記載されるアッセイ系のＥ２５特異的ＩｇＥ抗体の感度が測定された。マイクロタイタープレートを、０．０５ＭＮａ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中のＥ２５−ＡＡＡミュータントを用いて４℃、オーバーナイトで被覆し、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、次いで室温で２時間、アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）でブロッキングした。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（図５に示されるポジティブコントロール）標準曲線は、０．４−１０００ｎｇ／ｍｌのポジティブコントロール（ＰＣ）を正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加し、標準試料をアッセイ希釈液で１：２に希釈することによって調製された。１：２ポジティブコントロール標準曲線試料を、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。
【００８２】
アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）で希釈されたビオチン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧを、マイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたＡｍｄｅｘストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰ）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。
【００８３】
Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ＰＣ）標準曲線を図８に示す。Ｅ２５特異的ＩｇＥ抗体の最小定量化可能濃度（ＭＱＣ）は、このアッセイ系では０．２ＩＵ／ｍｌ（０．４８ｎｇ／ｍｌ）であった。
【００８４】
図１０に記載されるアッセイ系のＥ２５特異的ＩｇＥ抗体の感度が測定された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（図５に示されるポジティブコントロール）標準曲線は、正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に０．１−１００ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を添加し、次いで１μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２にそれぞれの標準試料を希釈することによって調製された。１：２のポジティブコントロール標準曲線試料を、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５１２５）は、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄された。プレインキューベートされた１：２のポジティブコントロール標準曲線試料を、ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈した抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−Ａｎｔｉ−ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）を、マイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ＰＣ）標準曲線を下記の表３に示す。Ｅ２５特異的ＩｇＥ抗体の最小定量化可能濃度（ＭＱＣ）は、このアッセイ系では０．１ＩＵ／ｍｌ（０．２４ｎｇ／ｍｌ）であった。以下の表４の方法は、以下の変更を伴うが上記表３と同じである：１）Ｅ２５特異的ＩｇＥ（図５に示されるポジティブコントロール）標準曲線は、正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に、０．１−１００ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）の代わりに０．１−６．４ＩＵ／ｍＬを添加することによって調製された；及び２）予め被覆したストレプトアビジンプレートは、Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５１２５の代わりにＰｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００であった。
表３．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの感度
2013508740.tif 000018
約１５９ＩＵ  ／ｍｌの総ＩｇＥを含むＮＨＳプールの標準曲線。
表４．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの感度
2013508740.tif 000019
実施例７．ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤特異的抗体の検出のためのアッセイ系の薬剤耐性
実施例４（図７）に記載されるアッセイ系の薬剤耐性は、０．８ＩＵ／ｍｌ（２ｎｇ／ｍｌ）のポジティブコントロール（図５に示されるＥ２５特異的ＩｇＥ）及び漸増濃度のＥ２５の存在下で試験された。マイクロタイタープレートを、実施例６に記載されるように、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントで被覆した。Ｅ２５薬剤耐性試験試料は、１−１０００ｎｇ／ｍＬのＥ２５を２ｎｇ／ｍＬのＰＣを含むニートＮＨＳプールに添加し、次いで各々の薬剤耐性試料をアッセイ希釈液で１：２に希釈することによって調製された。１：２のＥ２５薬剤耐性試料を、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、さらに実施例６に記載されるように、Ｅ２５特異的抗体を検出するように処理した。このアッセイの結果を図９に示す。０．８ＩＵ（２ｎｇ／ｍｌ）のＥ２５特異的抗体の存在下では、アッセイのＥ２５耐性度は〜１３０ｎｇ／ｍｌのＥ２５であった。
【００８５】
図１０に記載されるアッセイ系の薬剤耐性は、０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌ（０．４８、２．４及び１２ｎｇ／ｍｌ）のポジティブコントロール（図５に示されるＥ２５特異的ＩｇＥ）及び０、１０、５０及び１５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＥ２５の存在下で試験された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ポジティブコントロール）標準曲線は、０．１−６．４ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加することによって調製された。Ｅ２５薬剤耐性試験試料は、０、１０、５０及び１５０ｎｇ／ｍＬのＥ２５を、ニートＮＨＳプール又は０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌのＰＣを含む８１２ＩＵ／ｍｌまでの非特異的ＩｇＥを含む３人のアレルギー性喘息ヒト血清に添加することによって調製された。標準曲線及び薬剤耐性試料は、１ｕｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２に希釈された。１：２の試料は、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。プレインキュベートされた１：２の試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈された抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−抗ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。このアッセイの結果を以下の表５に示す。０．２ＩＵ（０．４８ｎｇ／ｍｌ）のＥ２５−特異的抗体の存在下では、アッセイのＥ２５耐性度は〜５０ｎｇ／ｍｌのＥ２５であった。
表５．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの薬剤耐性
2013508740.tif 000020
【００８６】
図１０に記載されるアッセイ系の総ＩｇＥ干渉も試験された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ポジティブコントロール）標準曲線は、０．１−６．４ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加することによって調製された。アレルギー性喘息と診断された個体からの９つのヒト血清試料（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ社から提供された血清）及び１０７−２４４６ＩＵ／ｍＬの様々なＩｇＥレベルを有する正常ヒト血清プールからなる１０の総ＩｇＥ干渉試料が、解析のために選択された。標準曲線及び１０の総ＩｇＥ干渉試料は、１μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２に希釈された。１：２の試料を、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。プレインキュベートされた１：２の試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈された抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−抗ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。
【００８７】
以下の表６は、試料中の総ＩｇＥが８００ＩＵ／ｍｌ以下である場合、総ＩｇＥ干渉がなかったことを示す。
表６．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマット総ＩｇＥ干渉
2013508740.tif 000021
【００８８】
図１０に記載されるアッセイ系の精度も試験された。図１０に記載されるアッセイ系の精度は、０、０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌ（０．４８、２．４及び１２ｎｇ／ｍｌ）のポジティブコントロール（図５に示されるＥ２５特異的ＩｇＥ）存在下で試験された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ポジティブコントロール）標準曲線は、０．１−６．４ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を、正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加することによって調製された。精度試験試料は、０、０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌのＰＣをニートＮＨＳプール又は８１２ＩＵ／ｍｌまでの非特異的ＩｇＥを含む３個体のアレルギー性喘息ヒト血清に添加することによって調製された。標準曲線及び精度試料は、１μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２に希釈された。１：２の試料を、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。プレインキュベートされた１：２の試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈された抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−抗ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。結果を以下の表７に示す。総ＩｇＥレベルの増加に伴って、ＩｇＥの過剰回収の傾向があるようである。
表７．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの精度
2013508740.tif 000022
【００８９】
個体のアレルギー性喘息血清の総ＩｇＥ（非特異的ＩｇＥ）レベルは、Ｐｈａｄｉａの市販用総ＩｇＥアッセイを用いて血清ベンダー（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）で測定された。
【００９０】
ＮＨＳプールの総ＩｇＥレベルは、ヒト血清試料中の総遊離ＩｇＥを検出するための方法を用いて測定された。Ｅ２５の投与の前に抽出された試料を、ｒｈｕＦｃεＲＩ−ＩｇＧで被覆されたプレートと共にインキューベートした。試料のＩｇＥとｒｈｕＦｃεＲＩ−ＩｇＧとの間の結合は、プレートにビオチンがコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体を添加し、ストレプトアビジンがコンジュゲートされたβ−ガラクトシダーゼ試薬を添加することによって検出された。プレートを洗浄し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５中の０．３４ｍｇ／ｍＬＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−ガラクトシド）と共にインキューベートした。この反応を０．３Ｍグリシン、ｐＨ１０．５の添加により停止し、蛍光シグナルを読みとった。シグナルは、血清試料中のＩｇＥレベルと相関する。
【００９１】
前述の発明は明確な理解のために図と例とを挙げて詳細に記載されているが、記載及び例は発明を限定するように解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2013508740.tif 000023
【図１Ｂ】
2013508740.tif 000024
【図２Ａ】
2013508740.tif 000025
【図２Ｂ】
2013508740.tif 000026
【図３】
2013508740.tif 000027
【図４Ａ−Ｂ】
2013508740.tif 000028
【図４Ｃ−Ｄ】
2013508740.tif 000029
【図４Ｅ−Ｆ】
2013508740.tif 000030
【図４Ｇ−Ｈ】
2013508740.tif 000031
【図５】
2013508740.tif 000032
【図６Ａ】
2013508740.tif 000033
【図６Ｂ】
2013508740.tif 000034
【図７】
2013508740.tif 000035
【図８】
2013508740.tif 000036
【図９】
2013508740.tif 000037
【図１０】
2013508740.tif 000038
【図１１】
2013508740.tif 000039
【図１２】
2013508740.tif 000040
【図１３】
2013508740.tif 000041
【図１４】
2013508740.tif 000042
【図１５】
2013508740.tif 000043
【図１６】
2013508740.tif 000044
【図１７】
2013508740.tif 000045
【配列表】
2013508740000001.app
【国際調査報告】
2013508740.tif 000046
2013508740.tif 000047
2013508740.tif 000048