(57)【要約】  本発明はインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、特にＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する、フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質に関する。本発明はまた、自己免疫疾患を治療するための治療的適応における革新的なタンパク質の使用に関する。本発明はさらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞、およびこの革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
2013520426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、ここに該１０Ｆｎ３ドメインは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、該ポリペプチドは５００ｎＭ未満のＫｄでＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、ここに該１０Ｆｎ３ドメインは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、該ポリペプチドはＩＬ−２３のｐ１９サブユニットの構造的エピトープに結合する、ポリペプチド。
【請求項３】
ＢＣループが配列番号２〜６から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＤＥループが配列番号７〜４８から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＦＧループが配列番号４９〜５９から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループのアミノ酸配列が、配列番号２〜５９のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６０〜１００のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６０〜１００のアミノ酸３〜９６と少なくとも９０％同一である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＢＣループの配列モチーフが、Ｘ１がメチオニンまたはロイシンのいずれかであり、Ｘ２がイソロイシンまたはバリンのいずれかである、配列番号２５７で示されるＧＨＹＰＸ１ＨＸ２である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＦＧループの配列モチーフが、Ｘ３が任意のアミノ酸であり得る、配列番号２５８で示されるＹＹＸ３Ｘ３Ｘ３Ｘ３ＹＸ３Ｘ３Ｉである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃ断片、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される一以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＰＫ部分がポリエチレングリコールである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
システインリンカーをさらに含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
システインリンカーが、配列番号１０１に示されるアミノ酸ＧＳＧＣおよび配列番号１０２に示されるアミノ酸ＥＩＤＫＰＣＱからなる群から選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
組成物が本質的にエンドトキシンを含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬上許容される組成物。
【請求項１６】
内因性ＩＬ−２３のＴｈ１７細胞との反応を干渉するために効果的な量で、ＩＬ−２３と請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドを接触させることを含む、Ｔｈ１７細胞の病原性を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、特にＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する、フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質に関する。本発明はまた、自己免疫疾患を治療するための治療的適応における革新的なタンパク質の使用に関する。本発明はさらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞、およびこの革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
ＩＬ−２３はＩＬ−１２ヘテロ二量体サイトカインファミリーのメンバーである。それはＩＬ−１２に共通しているｐ４０サブユニットおよび固有のｐ１９サブユニットを含有する。ＩＬ−２３はＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−２３からなるヘテロ二量体受容体複合体を通ってシグナルを送る（Ａｇｇａｒｗａｌ，  Ｓら，  “Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８：１９１０−１９１４  （２００３））。ＩＬ−２３は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬およびクローン病などの慢性炎症性疾患の標的候補である。
【０００３】
フィブロネクチンをベースとする足場は、対象とする任意の化合物と結合するよう進化させることができるタンパク質のファミリーである。通常、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）またはＦｎ３様ドメインに由来する足場を使用するこれらのタンパク質は、天然の抗体または操作された抗体（すなわち、ポリクローナル、モノクローナルまたは一本鎖抗体）に特徴的な形で機能し、さらに、構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、普通は抗体における構造および機能の喪失につながる条件下でも、フォールディング、安定性および溶解性が最適となるように設計されている。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の一例として、アドネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ，ａ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）がある。
【０００４】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ベータまたはベータ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；ベータまたはベータ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；ベータまたはベータ様鎖Ｃ；ループＣＤ；ベータまたはベータ様鎖Ｄ；ループＤＥ；ベータまたはベータ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；ベータまたはベータ様鎖Ｆ；ループＦＧ；およびベータまたはベータ様鎖Ｇを含む。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたはすべてが、標的結合に関与し得る。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造上および機能上の両面で類似している。米国特許第７，１１５，３９６号には、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＴＮＦαバインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質が記載されている。米国公開第２００７／０１４８１２６号には、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＶＥＧＦＲ２バインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
自己免疫疾患の治療法のための改善されたフィブロネクチンドメイン足場タンパク質を得ることは有利であろう。インターロイキン−１７を産生するエフェクターＴ細胞のサブセット（ＩＬ−１７；「Ｔｈ１７細胞」）は非常に炎症性であり、激しい自己免疫を誘導する。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞に比べて、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−２２、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆと同様にケモカイン受容体ＣＣＲ６を含む、異なるサイトカインおよびケモカインのサブセットを発現する。ＩＬ−２３は活性化Ｔ細胞によるＩＬ−１７の産生を促進させ（Ａｇｇａｒｗａｌ，  Ｓら，  “Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８：１９１０−１９１４  （２００３））、かつ、ＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するための重要なサイトカインである。ＩＬ−２３への暴露は、Ｔｈ１７細胞の病原性を決定する重要な特徴であるように思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願は、ヒトＩＬ−２３特異的ｐ１９サブユニットに対するアドネクチン商標を提供する。本発明の一態様は、一以上の溶媒接触可能ループが無作為化されまたは変異した、Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に由来するＦｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、本発明の１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインと、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される一以上のループが、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して伸長または短縮されてもよい。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここに１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；かつ、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を備える、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも一つのループを有するものである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のＢＣループは、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のＤＥループは、配列番号７〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のＦＧループは、配列番号４９〜５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、アミノ酸置換、挿入、もしくは欠失で開始および／または終止してもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２〜６に示されるＢＣループ配列からの一つのループ配列、配列番号７〜４８に示される一つのＤＥループ配列、および配列番号４９〜５９に示される一つのＦＧループ配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２〜５９のいずれか一つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは配列番号６０〜１００のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは配列番号６０〜１００のいずれか一つの３〜９６位由来のＦｎ３ドメインアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号６０〜１００のいずれか一つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一態様では、抗ＩＬ−２３アドネクチンはさらに、薬物動態（ＰＫ）部分を含む。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００２０】
一態様では、本出願は自己免疫疾患の治療において有益な抗ＩＬ−２３アドネクチンを提供する。
【００２１】
一態様では、本発明はフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインおよび抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む融合ポリペプチドを提供し、ここに前記１０Ｆｎ３ドメインは１ｕＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合するものである。特定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは配列番号１０３と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。一の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１０４に説明されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１０５に説明されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１０６に説明されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。別の実施態様では、１０Ｆｎ３ドメインは、一以上の、配列番号１０４に説明されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１０５に説明されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１０６に説明されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。
【００２２】
一の実施形態では、融合ポリペプチドの１０Ｆｎ３ドメインはまた、一以上のアカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはマウス血清アルブミン（ＭｕＳＡ）に結合する。他の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは一以上のＲｈＳＡ、ＣｙＳＡ、またはＭｕＳＡと交差反応しない。
【００２３】
特定の実施形態では、融合ポリペプチドの１０Ｆｎ３ドメインは１ｕＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは５００ｎＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。他の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは少なくとも２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫｄでＨＳＡに結合する。
【００２４】
他の実施形態では、融合ポリペプチドの１０Ｆｎ３ドメインはＨＳＡのドメインＩまたはＩＩに結合する。一の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインはＨＳＡのドメインＩおよびＩＩの両方に結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは５．５から７．４のｐＨ範囲でＨＳＡに結合する。他の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインはｐＨ５．５で２００ｎＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。別の実施形態では、５．５から７．４のｐＨ範囲で少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫｄでＨＳＡに結合する。一の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインはｐＨ５．５で少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫｄでＨＳＡに結合する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、血清アルブミン存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は、血清アルブミン非存在下での前記ポリペプチドの血清半減期より少なくとも５倍長い。特定の実施形態では、血清アルブミン存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は、血清アルブミン非存在下での前記ポリペプチドの血清半減期より少なくとも２倍、５倍、７倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、または３０倍長い。いくつかの実施形態では、血清アルブミンはＨＳＡ、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡ、またはＭｕＳＡのいずれか一つである。
【００２６】
特定の実施形態では、血清アルブミン存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は少なくとも２０時間である。特定の実施形態では、血清アルブミン存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は少なくとも１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、４０時間、５０時間、７５時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１５０時間、１７０時間、または２００時間である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清半減期は霊長類（例えば、ヒトもしくはサル）またはマウスにおいて観察される。
【００２７】
前述の態様および実施形態のいずれにおいても、１０Ｆｎ３ドメインは配列番号１０７、１１１、１１５、１１９、および１２３〜１４３から選択される配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の抗ＩＬ−２３アドネクチンの全長ＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【００２９】
【図２】図２は、実施例２において記載されるように、ｐＢＭＳ２００８／ＡＴＩ００１０４４タンパク質発現ベクターを示す。
【００３０】
【図３】図３は、本発明の抗ＩＬ−２３アドネクチンの全長アミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３１】
【図４】図４は、実施例４において記載されるように、抗ＩＬ−２３アドネクチンによるＰＢＭＣ  ｐＳＴＡＴ３阻害由来の代表的なＩＣ５０曲線を示す。
【００３２】
【図５】図５は、実施例４において記載されるように、抗ＩＬ−２３アドネクチンおよび抗ｐ４０モノクローナル抗体（ＭＡＢ１５１０）によるＩＬ−２３依存性ＩＬ−１７Ａの阻害に対する代表的なＩＣ５０曲線を示す。
【００３３】
【図６】図６は、ドナー２２８（実施例４において記載されるように試験された４ドナーの一つ）のＰＢＭＣによるＩＬ−２３誘導性ＩＬ−１７産生のＡＴＩ００１０４５阻害を示す。
【００３４】
【図７】図７は、抗ＩＬ−２３アドネクチンに対する代表的な選択性データを示す。実施例４において記載されるように、回収されたＡＴＩ００１０１６に結合する１０ｎＭ  ＩＬ−２３および１ｕＭ  ＩＬ−１２の結合相および解離相を示すバッファー除去センサーグラムが示される。
【００３５】
【図８】図８は、実施例４において記載されるように、抗ＩＬ−２３アドネクチンがＮＫ−９２細胞におけるＩＬ−１２誘導性ＩＦＮ−γ産生を阻害しないことを示す。
【００３６】
【図９Ａ】図９Ａは、実施例４において記載されるように、ＡＴＩ００１０４５がマウス薬力学的モデルにおいて血清ＩＬ−１７レベルを阻害することを示す。
【００３７】
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例４において記載されるように、マウス薬力学的モデルにおける抗ＩＬ−２３アドネクチンの阻害活性の比較を示す。
【００３８】
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例４において記載されるように、ヒトＩＬ−２３誘導表皮肥厚におけるＡＴＩ０００９３４用量反応を示す。
【００３９】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例４において記載されるように、ヒトＩＬ−２３誘導表皮肥厚におけるＡＴＩ００１０４５用量反応を示す。
【００４０】
【図１１】図１１は、マウスにおけるインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のＨＳＡ半減期を示す。ＨＳＡは２０ｍｇ／ｋｇ（図１１Ａ）または５０ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｂ）でマウスへ注射された。
【００４１】
【図１２】図１２Ａ−Ｄは、マウスにおけるＳＡＢＡ１−ＳＡＢＡ４の半減期決定を示す。
【００４２】
【図１３】図１３Ａは、ＨＳＡと同時注射した際のＳＡＢＡ１−４のマウスにおける半減期増強のグラフの概要を示す。図１３ｂは、カニクイザルおよびマウス由来のデータを比較する。
【００４３】
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．１およびＳＡＢＡ５．１に対する半減期決定を示す。
【００４４】
【図１５】図１５は、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイによるヒト、マウス、およびラット由来のアルブミンに結合するＳＡＢＡ１．２を示す。
【００４５】
【図１６】図１６は、ＳＡＢＡ１．１およびＨＳＡの化学量（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）の決定を示す。
【００４６】
【図１７】図１７は、ＨＳＡの組換えドメイン断片に結合するＳＡＢＡ１．２のビアコア解析を示す。
【００４７】
【図１８】図１８は、１ｍｐｋおよび１０ｍｐｋで投与されたサルにおけるＳＡＢＡ１．２に対する薬物動態プロファイルを示す。
【００４８】
【図１９】図１９は、１ｍｐｋで静脈内投与または皮下投与されたサルにおけるＳＡＢＡ１．２に対する薬物動態プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
定義
「ポリペプチド」によって、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、二以上のアミノ酸の任意の配列が意味される。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用される。ポリペプチドは、出典明示により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５５９，１２６号に記載されるものなどの天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい（例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい；カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい；またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期を増大するよう修飾されていてもよい）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの、環状化合物または他の分子などの別の構造の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を含み得、また一以上のアミノ酸を変化した立体配置（すなわち、ＲもしくはＳ；または、ＬもしくはＤ）で含有するポリペプチドを含み得る。本発明のポリペプチドは、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合するよう修飾された、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来するタンパク質であり、本明細書において「アドネクチン」または「抗ＩＬ−２３アドネクチン」と呼ばれる。
【００５０】
用語「ＰＫ」は、「薬物動態（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃ）」の頭字語であり、例として、被験体による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を包含する。「ＰＫ調節タンパク質」または「ＰＫ部分」とは、生物学的に活性な分子と融合されるか、一緒に投与される場合に、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を指す。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例として、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バインダー（米国公開第２００５／０２８７１５３号および同２００７／０００３５４９号に開示されるような）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃ断片、および糖（例えば、シアル酸）が挙げられる。
【００５１】
本明細書において、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列同一性の一部として保存的置換は全く考慮することなく、最大配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的上、アラインメントは、当技術分野における技術の範囲内の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ登録商標）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成できる。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定できる。
【００５２】
「単離された」ポリペプチドとは、同定および分離および／またはその天然環境の成分から回収されているものである。その天然環境の夾雑成分とは、ポリペプチドの診断または治療的使用を干渉する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を挙げることができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定される、９５重量％を超える、最も好ましくは、９９重量％を超えるポリペプチドに、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも残基（複数）を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルーもしくは、好ましくは、銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性に精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないので、組換え細胞内でインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でのポリペプチドを含む。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００５３】
アミノ酸配列または化合物の「半減期」は、通常、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でポリペプチドの血清濃度が、例えば、天然の機序による、配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離によって５０％低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、薬物動態分析によってなど、それ自体公知の任意の方法で決定できる。適した技術は、当業者には明らかであり、例えば、通常、本発明のアミノ酸配列または化合物の適した用量を霊長類に適宜投与する工程；前記霊長類から定期的に血液サンプルまたは他のサンプルを採取する工程；前記血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのように得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与時の初期レベルと比較して５０％低減されるまでの時間を算出する工程を含み得る。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ａ  ら，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  Ａ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ  および  Ｌｅｅ，  Ｐ．  Ｉ．  Ｄ．  ら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９９６）などの標準的なハンドブックが参照される。Ｇｉｂａｌｄｉ  Ｍ．  ら，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  ２ｎｄ  Ｒｅｖ．  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  刊行（１９８２）もまた参照される。
【００５４】
半減期は、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表現され得る。本明細書において、「半減期の増大」とは、これらのパラメータのうちいずれか１つ、これらのパラメータのうちいずれか２つ、またはこれらのパラメータのうち３つ全ての増大を指す。「半減期の増大」とは、特に、ｔ１／２−アルファおよび／またはＡＵＣまたは両方の増大を伴うか、または伴わない、ｔ１／２−ベータの増大を指す。
【００５５】
概説
本出願は、ヒトＩＬ−２３特異的ｐ１９サブユニットに対するアドネクチンを提供する。ＩＬ−２３特異的アンタゴニストを同定するために、抗ｐ４０モノクローナル抗体を使用して、ＩＬ−２３をアドネクチンの大規模合成ライブラリーへ提示した。ＩＬ−２３  ｐ１９サブユニットに結合するアドネクチンは、ヒトＩＬ−２３との結合、ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ相互作用の競合、およびＴ細胞株におけるＩＬ−２３誘導性シグナル伝達の阻害に関してスクリーニングされた。抗ＩＬ−２３アドネクチンは、標的濃度を低下させ、遅い解離速度（ｓｌｏｗ  ｏｆｆ−ｒａｔｅ）で抗ＩＬ−２３アドネクチンを選択することによる、さらなる選択圧に供された。この最適化工程から、アドネクチンのファミリーが、好ましい生化学的および生物物理学的特性を備えるＩＬ−２３特異的阻害剤として同定された。
【００５６】
フィブロネクチンベースの足場
本出願の一態様は、一以上の溶媒接触可能ループが無作為化または変異した、Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に由来するＦｎ３ドメイン：ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）である。上記の１０Ｆｎ３配列において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループには下線が引かれている。
【００５７】
種々の変異１０Ｆｎ３足場が報告されている。一態様では、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３の一以上が、例えば、負の電荷を有さないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓ等）などの別のアミノ酸によって置換されている。これらの突然変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨでの変異１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０４５２３参照）。有益または中立のいずれかである１０Ｆｎ３足場における種々のさらなる変化が開示されている。例えば、Ｂａｔｏｒｉ  ら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  １５（１２）：１０１５−１０２０  （Ｄｅｃ．  ２００２）；  Ｋｏｉｄｅ  ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４０（３４）：１０３２６−１０３３３  （Ａｕｇ．  ２８，  ２００１）参照。
【００５８】
変種および野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方とも、同一構造、すなわち、ＡからＧと表される７つのβ鎖ドメイン配列および７つのβ鎖ドメイン配列を接続する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧルー
プ）を特徴とする。Ｎ末端およびＣ末端の最も近くに位置するβ鎖は、溶液中でβ様コンホメーションをとり得る。配列番号１中、ＡＢループは、残基１５〜１６に対応し、ＢＣループは、残基２１〜３０に対応し、ＣＤループは、残基３９〜４５に対応し、ＤＥループは、残基５１〜５６に対応し、ＥＦループは、残基６０〜６６に対応し、ＦＧループは、残基７６〜８７に対応する（Ｘｕ  ら，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ９：９３３−９４２  （２００２））。
【００５９】
いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ポリペプチドは、配列番号１に示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインと、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一であり得る。変異性の多くは、通常、一以上のループ中で起こる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのβ鎖またはβ様鎖の各々は、このような変動が、生理学的条件におけるポリペプチドの安定性を乱さないという条件で、本質的に、配列番号１の対応するβ鎖またはβ様鎖の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からなり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示内容は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含むものであり、かつ、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＢＣおよびＦＧループが変化し、いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが変化している、すなわち、Ｆｎ３ドメインが、天然に存在しないループを含む。「変化した」とは、（ヒトフィブロネクチンドメインに対応する）鋳型配列に対する一以上のアミノ酸配列の変化を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列の変化は、通常、核酸コード配列の意図的な、盲検的な（ｂｌｉｎｄ）または自発的な配列変動によって達成され得、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラー−プローンＰＣＲまたは化学的ＤＮＡ合成によって起こり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される一以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いくつかの実施形態では、ループの長さは、２〜２５アミノ酸によって伸長され得る。いくつかの実施形態では、ループの長さは、１〜１１アミノ酸によって減少され得る。したがって、抗原結合を最適化するために、抗原結合において最大のあり得る可動性および親和性を得るよう、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さを、長さにおいて、ならびに、配列において変化させてもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含み、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変化している。いくつかの実施形態では、変化したＢＣループは、最大１０のアミノ酸置換、最大４のアミノ酸欠失、最大１０のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、変化したＤＥループは、最大６のアミノ酸置換、最大４のアミノ酸欠失、最大１３のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、ＦＧループは、最大１２のアミノ酸置換、最大１１のアミノ酸欠失、最大２５のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のＢＣループは、ＧＨＹＰＭＨＶ（配列番号２）、ＧＨＹＰＬＨＶ（配列番号３）、ＧＨＹＰＭＨＩ（配列番号４）、ＧＨＹＰＬＨＩ（配列番号５）およびＧＨＹＰＬＨＬ（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のＤＥループは、ＨＲＴＨ（配列番号７）、ＹＹＨＹ（配列番号８）、ＳＫＱＨ（配列番号９）、ＳＮＶＨ（配列番号１０）、ＮＲＡＨ（配列番号１１）、ＲＫＴＹ（配列番号１２）、ＲＳＲＹ（配列番号１３）、ＳＲＹＹ（配列番号１４）、ＰＨＲＹ（配列番号１５）、ＲＳＴＨ（配列番号１６）、ＳＲＩＹ（配列番号１７）、ＨＱＲＹ（配列番号１８）、ＫＱＶＹ（配列番号１９）、ＡＨＲＹ（配列番号２０）、ＲＳＲＨ（配列番号２１）、ＡＲＱＹ（配列番号２２）、ＲＴＱＹ（配列番号２３）、ＰＲＹＨ（配列番号２４）、ＭＲＱＨ（配列番号２５）、ＳＲＫＹ（配列番号２６）、ＲＱＫＹ（配列番号２７）、ＨＡＫＹ（配列番号２８）、ＳＮＲＹ（配列番号２９）、ＮＴＳＨ（配列番号３０）、ＳＱＶＹ（配列番号３１）、ＮＲＶＹ（配列番号３２）、ＰＲＳＨ（配列番号３３）、ＲＴＫＹ（配列番号３４）、ＳＲＹＨ（配列番号３５）、ＰＲＲＹ（配列番号３６）、ＲＱＫＹ（配列番号３７）、ＲＹＫＹ（配列番号３８）、ＶＰＲＨ（配列番号３９）、ＴＰＫＨ（配列番号４０）、ＲＳＫＹ（配列番号４１）、ＳＲＫＹ（配列番号４２）、ＶＰＲＹ（配列番号４３）、ＰＲＲＹ（配列番号４４）、ＲＭＲＨ（配列番号４５）、ＰＰＲＨ（配列番号４６）、ＲＱＩＹ（配列番号４７）、およびＭＲＱＨ（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のＦＧループは、ＹＹＮＥＡＤＹＳＱＩ（配列番号４９）、ＹＹＱＥＹＥＹＲＹＩ（配列番号５０）、ＹＹＭＥＥＫＹＡＶＩ（配列番号５１）、ＹＹＡＱＥＮＹＫＥＩ（配列番号５２）、ＹＹＫＥＡＮＹＲＥＩ（配列番号５３）、ＹＹＡＱＥＥＹＨＩＩ（配列番号５４）、ＹＹＫＥＡＤＹＳＱＩ（配列番号５５）、ＹＹＥＱＶＥＹＲＥＩ（配列番号５６）、ＹＹＥＱＰＩＹＡＴＩ（配列番号５７）、ＹＹＥＱＶＥＹＲＥＩ（配列番号５８）およびＹＹＳＥＥＬＹＫＹＩ（配列番号５９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６６】
１０Ｆｎ３ドメインは、アミノ酸変異で始まってもよい。例えば、Ｆｎ３ドメインのＮ末端に、さらなるＭＧ配列が配置されてもよい。Ｍは、通常、切断除去され、Ｎ末端にＧが残る。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に、配列が配置されていてもよい。例えば、ＧＳＧＣ（配列番号１０１）などのシステイン含有リンカーがＣ末端へ付加される、部位特異的ＰＥＧ化において。あるいは、システイン含有リンカーＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号１０２）のため、セリンをシステインに変更することによって変異させられた、天然に存在するＣ末端テールのＰＥＧ化。ＧＳＧＣリンカーを含む本発明の抗ＩＬ−２３アドネクチンの例として、ＡＴＩ００１０１４、ＡＴＩ００１０１５、ＡＴＩ００１０１６、ＡＴＩ００１０４４、ＡＴＩ００１０４５およびＡＴＩ００１０４７が挙げられる。ＡＴＩ０００９３４は、ＥＩＤＫＰＣＱリンカーを含む本発明の抗ＩＬ−２３アドネクチンの例である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２〜６に示されるＢＣループ配列からの一のループ配列、配列番号７〜４８に示される一のＤＥループ配列、および配列番号４９〜５９に示される一のＦＧループ配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２〜５９のいずれか一つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
【００６８】
さらに、当業者であれば、配列番号２〜６に示されるＢＣループ配列が、Ｘ１がＭまたはＬのいずれかであり、Ｘ２がＩまたはＶのいずれかである共通の配列モチーフＧＨＹＰＸ１ＨＸ２（配列番号２５７）を共有し、かつ、配列番号４９〜５９に示されるＦＧループが、Ｘ３が任意のアミノ酸である共通の配列モチーフＹＹＸ３Ｘ３Ｘ３Ｘ３ＹＸ３Ｘ３Ｉ（配列番号２５８）を共有することを認識するであろう。それゆえ、コンセンサス配列ＧＨＹＰＸ１ＨＸ２に適合するＢＣループを備え、かつ／または、配列番号４９〜５９に明確に示されるものの域を超えて、パターンＹＹＸ３Ｘ３Ｘ３Ｘ３ＹＸ３Ｘ３Ｉに適合する他のＦＧループを備える、ＩＬ−２３に結合するさらなるアドネクチンを生成することが可能であろう。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは配列番号６０〜１００のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは配列番号６０〜１００のいずれか一つの３〜９６位由来のＦｎ３ドメインアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号６０〜１００のいずれか一つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号６０〜１００のいずれか一つの３〜９６位由来のアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンはＰＥＧ化され、かつ／またはｈｉｓタグを含有してもよい。本明細書において用いる場合、ＡＴＩ０００９３４は、ループ配列が構築体１５７１Ｇ０６（配列番号８７）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＥＩＤＫＰＣＱ残基を含み、ＰＥＧ化され、かつｈｉｓタグを含有する。ＡＴＩ００１０１４は、ループ配列が構築体１５７１Ｇ０４（配列番号８６）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＧＳＧＣリンカーを含み、ＰＥＧ化され、かつｈｉｓタグを含有する。ＡＴＩ００１０１５は、ループ配列が構築体１５７２Ｇ０６（配列番号９１）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＧＳＧＣリンカーを含み、ＰＥＧ化され、かつｈｉｓタグを含有する。ＡＴＩ００１０１６は、ループ配列が構築体１４９０Ｂ０３（配列番号７９）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＧＳＧＣリンカーを含み、ＰＥＧ化され、かつｈｉｓタグを含有する。ＡＴＩ００１０４４は、ループ配列が構築体１４９０Ｂ０３（配列番号７９）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＧＳＧＣリンカーを含むが、前記タンパク質はＰＥＧ化されておらず、かつｈｉｓタグが存在しない。ＡＴＩ００１０４５は、ループ配列が構築体１４９０Ｂ０３（配列番号７９）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＧＳＧＣリンカーを含み、ＰＥＧ化されているが、ｈｉｓタグが存在しない。ＡＴＩ００１０４７は、ループ配列が構築体１５７１Ｇ０４（配列番号８６）のものと同一であるタンパク質を指し、前記タンパク質はＣ末端でＧＳＧＣリンカーを含み、ＰＥＧ化されているが、ｈｉｓタグが存在しない。
【００７１】
フィブロネクチンは、そのインテグリン結合モチーフ、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を介して特定の種類のインテグリンと天然に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフを欠く１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【００７２】
薬物動態部分
一態様では、本出願は、薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む抗ＩＬ−２３アドネクチンを提供する。改善される薬物動態は、認識される治療的必要性に従って評価できる。おそらくは、タンパク質が、投与後の血清において利用可能なままである時間を増大することによって、生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を増大すること、および／または用量間の時間を増大することが望ましいことが多い。場合によっては、経時的なタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること（例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の相違の減少）が望ましい。抗ＩＬ−２３アドネクチンは、哺乳類（例えば、マウス、ラットまたはヒト）においてポリペプチドのクリアランス速度を、修飾されていないアドネクチンと比較して３倍超低減する部分に結合させてもよい。改善される薬物動態の他の尺度として、血清半減期を挙げることができ、これはアルファ相およびベータ相に分けられることが多い。いずれかの相または両方の相が、適当な部分の付加によって大幅に改善され得る。
【００７３】
本明細書において「ＰＫ部分」と呼ばれる、血液からのタンパク質のクリアランスを遅延させる傾向がある部分として、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）および耐容性良好であるタンパク質部分（例えば、Ｆｃ、Ｆｃ断片、トランスフェリンまたは血清アルブミン）が挙げられる。アドネクチンは、米国公開第２００７／００４８２８２号に記載される、アルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変種と融合させてもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、例えば米国公開第２００７／０１７８０８２号および同２００７／０２６９４２２号に記載されるものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、例えば米国公開第２００７／０１７８０８２号に記載されるものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、アドネクチンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一以上のＰＥＧ分子を、タンパク質上の異なる位置に結合してもよく、このような結合は、アミン、チオールまたは他の適した反応性基を用いる反応によって達成できる。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのＮ末端に見られる第一級アミンまたはリシンもしくはアルギニンなどのアミノ酸中に存在するアミン基であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は：ａ）Ｎ末端；ｂ）Ｎ末端と最もＮ末端側のβ鎖またはβ様鎖との間；ｃ）標的結合部位と反対側のポリペプチドの面上に位置するループ；ｄ）Ｃ末端と最もＣ末端側のβ鎖またはβ様鎖との間；およびｅ）Ｃ末端、からなる群から選択されるポリペプチド上の位置に結合している。
【００７７】
ＰＥＧ化は、部位特異的ＰＥＧ化によって達成でき、この方法においては、ＰＥＧ化が優先的に起こる部位を作り出すために、適した反応性基がタンパク質に導入される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、所望の位置にシステイン残基を導入するよう修飾され、システイン上で部位特異的ＰＥＧ化が可能となる。ＰＥＧは、分子量が大きく変わってもよく、分岐または直鎖であってもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、アドネクチンは、Ｆｎ３ドメインおよびＰＫ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ポリペプチドの血清半減期を、Ｆｎ３ドメイン単独と比較して、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００、１０００％以上を超えて増大する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はポリマー糖である。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はポリエチレングリコール部分である。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は血清免疫グロブリン結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はトランスフェリンである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は血清タンパク質に対して特異的な別のアドネクチンである。
【００８０】
生化学的および生物物理学的特性
本出願は、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合するＦｎ３ドメインを含むアドネクチンを提供する。表１および実施例４に示されるように、標的分子に結合するポリペプチドは、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）に関して、および速度定数（例えば、結合速度定数（ｏｎ−ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）、Ｋｏｎおよび解離速度定数（ｏｆｆ−ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）、Ｋｏｆｆ）の点で評価できる。アドネクチンは通常、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ未満のＫＤで標的分子と結合するが、Ｋｏｆｆが十分に低い、またはＫｏｎが十分に高い場合には、より高いＫＤ値も許容され得る。
【００８１】
本発明の抗ＩＬ−２３アドネクチンのファミリーのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列は、対応する全長配列番号と共に下記の表１に提示される。
【表１−１】
2013520426.tif 000003
【表１−２】
2013520426.tif 000004
【表１−３】
2013520426.tif 000005
【００８２】
抗ＩＬ−２３アドネクチンのさらなる特性は表２に記載される。
【表２】
2013520426.tif 000006
(ｎ．ｄ．  検出不可) (詳細な方法は実施例４に記載される)。
【００８３】
核酸−タンパク質融合技術
一態様では、本出願は、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットと結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的結合特性を有するＦｎ３ドメインを、迅速に生成し、試験する一つの方法は、Ａｄｎｅｘｕｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙの核酸−タンパク質融合技術である。この開示内容は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）発現および核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を利用してタンパク質との結合にとって重要である、新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎと呼ばれるタグ技術を利用する。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報と共有結合によってカップリングする技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースの足場タンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細な説明については、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｓｔａｋ  ら，米国特許第６，２５８，５５８号、同６，２６１，８０４号、同６，２１４，５５３号、同６，２８１，３４４号、同６，２０７，４４６号、同６，５１８，０１８号、同６，８１８，４１８号；およびＲｏｂｅｒｔｓ  ら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：１２２９７−１２３０２（１９９７），  参照。
【００８４】
ベクターおよびポリヌクレオチド実施形態
本明細書に開示される種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成されてもよい。コドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）は、細胞における発現を改善するよう選択されてもよい。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞種に依存する。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のため、特定化されたコドン使用パターンが開発されている。例えば、 Ｍａｙｆｉｅｌｄ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １００（２）：４３８−４４２  （Ｊａｎ．  ２１，  ２００３）；  Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．，  ２６（Ｉ）：９６−１０５  （Ｏｃｔ．  ２００２）；  Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｎ．Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １２（５）：４４６−４４９  （Ｏｃｔ．  ２００１）；  Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ら，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６０（３）：５１２−５３８  （Ｓｅｐｔ．  １９９６）；  および  Ｓｈａｒｐ  ら，  Ｙｅａｓｔ，  ７（７）：６５７−６７８  （Ｏｃｔ．  １９９１）  参照。
【００８５】
核酸操作の一般的な技術は、例えば、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｓ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｕｂｌ．  （１９８９），  またはＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  ら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｕｂｌ．  （１９８７）および定期的更新に記載されている。通常、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適した転写または翻訳調節エレメントと作動可能なように連結されている。このような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写を制御するための所望によるオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。宿主において複製する能力は、通常、複製起点によって付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれる。
【００８６】
本明細書に記載されるタンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えによって生成してもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであることが好ましい。
【００８７】
天然シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換される。
【００８８】
酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）アルファ因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されるシグナルによって置換してもよい。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレームでタンパク質をコードするＤＮＡとライゲートしてもよい。
【００８９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、両者とも、ベクターが一以上の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。通常、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌にとって適しており、２ミクロンのプラスミド起点が酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳類細胞中のクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０起点は、通常、単に、それが初期プロモーターを含むために使用され得る）。
【００９０】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。通常の選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは利用できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードするものであり、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００９１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースの足場タンパク質をコードする核酸と作動可能なように連結しているプロモーターを含有する。原核生物宿主とともに使用するのに適したプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知細菌プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと作動可能なように連結しているシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。真核生物のためのプロモーター配列は公知である。実質的にすべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域である（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）。ほとんどの真核細胞遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてが、真核細胞発現ベクターに適宜挿入される。
【００９２】
酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列の例として、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のプロモーターが挙げられる。
【００９３】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られたプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するならば、制御され得る。
【００９４】
高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大されることが多い。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）に由来する多数のエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製起点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関しては、Ｙａｎｉｖ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照。エンハンサーは、ペプチドをコードする配列の５’または３’側の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、プロモーターの５’側に位置することが好ましい。
【００９５】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物に由来する有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のために、またｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有する。このような配列は通常、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、および場合により、３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。一つの有用な転写終結成分として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域がある。ＷＯ９４／１１０２６およびそこで開示される発現ベクターを参照。
【００９６】
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するのに有用であり得る任意の種類のタンパクン質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例として、それだけには限らないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主とともに使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８５））中に見ることができ、その関連の開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
発現コンストラクトは、当業者には明らかであるように、宿主細胞にとって適当な方法を使用して宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法が当技術分野で公知であり、これらには限らないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性物質である）が挙げられる。
【００９８】
適した宿主細胞として、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。適した細菌として、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌またはバチルス種が挙げられる。好ましくは、サッカロミセス種に由来する酵母、例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も、ポリペプチドの生成のために使用してよい。種々の哺乳類または昆虫細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現することもできる。昆虫細胞において異種タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６：４７（１９８８））に総説されている。適した哺乳類宿主細胞株の例として、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製ポリペプチドは、組換えタンパク質を発現するのに適した宿主／ベクター系を培養することによって調製される。多数の適用のために、本明細書に開示される小さいサイズの多数のポリペプチドは、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現を行う。次いで、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
【００９９】
タンパク質生成
宿主細胞は、タンパク質生成のために本明細書に記載される発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に改変された従来の栄養培地で培養される。本明細書に示される実施例では、ハイスループットタンパク質生成（ＨＴＰＰ）および中規模生成のために使用される宿主細胞は、ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙＳ−細菌株であった。本発明のタンパク質を生成するために使用される宿主細胞は、Ｈａｍら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ５８：４４  （１９７９）、Ｂａｒｉｔｅｓら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５  （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同４，６５７，８６６号、同４，９２７，７６２号、同４，５６０，６５５号、同５，１２２，４６９号、同６，０４８，７２８号、同５，６７２，５０２号または米国特許第ＲＥ３０，９８５号に記載されるものなどの、種々の培地で培養してもよい。任意の他の必要な栄養補助剤を、当業者に公知である適当な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどといった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１００】
本明細書に開示されるタンパク質はまた、細胞−翻訳系を使用して生成できる。このような目的上、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写を可能にしてｍＲＮＡを生成し、使用されている特定の無細胞系（哺乳類または酵母などの真核細胞を含まない翻訳系または細菌などの原核細胞を含まない翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするよう改変されなければならない。
【０１０１】
本発明のタンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ，  ｐｕｂｌ．  （１９８４）に記載される方法によって）生成できる。タンパク質への修飾も化学合成によって生成できる。
【０１０２】
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られている、タンパク質の単離／精製法によって精製できる。非限定的な例として、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドを、これらには限らないが、濾過および透析を含む、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって、異なるバッファーに交換してもよく、かつ／または、濃縮してもよい。
【０１０３】
精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは医薬製剤として使用するのに十分に純粋である。
【０１０４】
プラットフォーム製造工程（ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を使用して、抗ＩＬ−２３アドネクチンを調製した。実施例１には製造工程の一例が記載されている。アドネクチンは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生成された。大腸菌ＭＧ１６５５細胞を、封入体として不溶型でタンパク質を生成する発現ベクター（ｐＢＭＳ２００８／ＡＴＩ００１０４４）で形質転換した。組換え株を撹拌式発酵タンク内で生育させる。発酵終了時に、精製に向けて、封入体を回収し、可溶化し、かつリフォールドさせた。精製したアドネクチンを、マレイミドリンカーを用いて４０ｋＤａの分岐メトキシＰＥＧへコンジュゲートした。次いで、コンジュゲート化物質を再精製し、遊離ＰＥＧ、遊離アドネクチン、および製品に関連する不純物を除去した。品質管理テストをバルク薬剤原料に対して行った。
【０１０５】
治療的インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）使用
一態様では、本出願は、狼蒼（たとえば、紅斑性狼蒼、腎炎性狼蒼）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（たとえば、インスリン依存型糖尿病、Ｉ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感神経性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（たとえば、関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症および混合性結合組織病などの、自己免疫疾患の治療において有用である抗ＩＬ−２３アドネクチンを提供する。
【０１０６】
本出願はまた、被験体に抗ＩＬ−２３アドネクチンを投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、哺乳類、特に、ヒトにとって医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、本質的にエンドトキシンを含まない、または極めて低いエンドトキシンレベルを有するなどの、著しく有害な医学的結果を伴わずに動物に投与されるポリペプチドを指す。
【０１０７】
製剤および投与
本出願はさらに、本明細書に記載される抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む医薬上許容される組成物を提供し、該組成物は本質的にエンドトキシンを含まない。抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する記載されるアドネクチンを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、水溶液、凍結乾燥された、または他の乾燥された製剤の形態で、保存のために調製される（Ｏｓｏｌ，  Ａ．，  ｅｄ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８０））。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、これらの例として、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ登録商標またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１０８】
また、本明細書において製剤とは、治療されている特定の適応症にとって必要な二以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的上効果的である量の組合せで適宜存在する。
【０１０９】
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通した濾過によって容易に達成される。
【０１１０】
当業者ならば、各治療薬の用量が、薬剤の独自性によって決まることを理解するであろう。
【０１１１】
治療適用のためには、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、医薬上許容される剤形で被験体に投与される。それは、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）として、または一定時間にわたる連続注入によって静脈内に、または皮下経路によって投与され得る。適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状況が必要とする際に、当業者によって決定され得る。適した担体、希釈剤および／または賦形剤の例として、（１）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、（２）０．９％生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられる。
【０１１２】
本発明の方法は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）またはエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で実施できる。
【０１１３】
抗ＩＬ−２３アドネクチンおよび一以上のさらなる治療薬の投与は、同時投与されるか逐次投与されるかにかかわらず、治療適用のために、上記のように起こり得る。同時投与に適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は、投与されている特定の治療薬の独自性によって決まる、と当業者に理解されるであろう。
【０１１４】
凍結乾燥されているのではなく水性の剤形で存在する場合には、タンパク質は、通常、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されるが、これらの範囲の外側の広い変動も容認される。疾患の治療のための、抗ＩＬ−２３アドネクチンの適当な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、アドネクチンが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、これまでの治療の経過、患者の病歴およびアドネクチンに対する反応、ならびに主治医の裁量によって決まるであろう。タンパク質は、１回で、または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。
【０１１５】
血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）の融合
特定の態様では、本出願は、ヒト血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインに融合した抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む融合タンパク質（血清アルブミン結合アドネクチン  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ（１０Ｆｎ３ドメイン）またはＳＡＢＡ）を提供する。このような融合タンパク質は、抗ＩＬ−２３アドネクチン単独に比べて、アルブミン存在下で延長した半減期を有する。
【０１１６】
特定の態様では、本出願は、融合タンパク質のｔ１／２を延長するため、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０１１７】
特定の実施形態では、ＳＡＢＡに融合された抗ＩＬ−２３アドネクチンの血清半減期は、ＳＡＢＡへコンジュゲートされなかった場合の抗ＩＬ−２３アドネクチンの血清半減期と比べて増大する。特定の実施形態では、ＳＡＢＡ融合体の血清半減期は、ＳＡＢＡに融合されなかった場合の抗ＩＬ−２３アドネクチンの血清半減期と比べて、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００、または３０００％長い。他の実施形態では、ＳＡＢＡ融合体の血清半減期は、ＳＡＢＡに融合されなかった場合の抗ＩＬ−２３アドネクチンの血清半減期より、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍大きい。いくつかの実施態様では、ＳＡＢＡ融合体の血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
【０１１８】
従って、本明細書に記載されるＳＡＢＡ融合分子は、抗ＩＬ−２３アドネクチンおよびＳＡＢＡ間の融合体の構築によって抗ＩＬ−２３アドネクチンの半減期を増大させるために有用である。このような融合分子を使用して、ＩＬ−２３の生物活性へ応答する症状を治療してもよい。本発明は、ＩＬ−２３の異常調節によって引き起こされる疾患におけるＳＡＢＡ融合分子の使用を企図する。
【０１１９】
融合体は、抗ＩＬ−２３アドネクチンをＳＡＢＡ分子の末端のいずれかへ付着させることこと、すなわち、ＳＡＢＡ−抗ＩＬ−２３アドネクチン配置または抗ＩＬ−２３アドネクチン−ＳＡＢＡ配置で付着させることによって、形成される。
【０１２０】
一態様では、本開示は血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインを含む抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む融合タンパク質を提供する。例示的な実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、３ｕＭ、２．５ｕＭ、２ｕＭ、１．５ｕＭ、１ｕＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫｄでＨＳＡに結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、２５℃または３７℃で、５．５から７．４のｐＨ範囲で、３ｕＭ、２．５ｕＭ、２ｕＭ、１．５ｕＭ、１ｕＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫｄでＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、７．４以上のｐＨでのＨＳＡに対する結合親和性と比較して、ｐＨ７．４未満でより強くＨＳＡに結合する。
【０１２１】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインを含む融合タンパク質はまた、サル、ラット、またはマウスの一以上に由来する血清アルブミンにも結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、３ｕＭ、２．５ｕＭ、２ｕＭ、１．５ｕＭ、１ｕＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫｄで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に結合する。
【０１２２】
特定の実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインを含む融合タンパク質は、ＨＳＡのドメインＩおよび／またはドメインＩＩに結合する。一の実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインを含む融合タンパク質は、ＨＳＡのドメインＩＩＩに結合しない。
【０１２３】
特定の実施形態では、融合タンパク質の血清アルブミン結合１０Ｆｎ３部分（ＳＡＢＡ）は、野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または８５％同一性を有する配列を含む。一の実施形態では、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比べて、ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループのうち少なくとも１つが修飾されている。別の実施形態では、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比べて、ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループのうち少なくとも２つが修飾されている。別の実施形態では、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比べて、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのうち３つ全てが修飾されている。他の実施形態では、ＳＡＢＡは、表３に示される２６のコア（ｃｏｒｅ）ＳＡＢＡ配列（すなわち、配列番号１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、および１２３〜１４３）のいずれか１つ、または、表３に示される伸長したＳＡＢＡ配列（すなわち、配列番号１８８〜２１５、６×ＨＩＳタグを引く）のいずれか１つと、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性を有する配列を含む。
【０１２４】
特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。例示的な実施態様では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、以下表３に示されるＨＳＡバインダーのいずれかに由来するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列（すなわち、表３の配列番号１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、および１２３〜１４３）を含むポリペプチドで置換される。
【０１２５】
特定の実施形態では、ＳＡＢＡ（例えば、ＳＡＢＡコア配列または上述のそれらに由来する配列）は、Ｎ末端伸長配列および／またはＣ末端伸長配列を含むように改変されてもよい。例示的な伸長配列は、表３に示される。例えば、ＳＡＢＡ１．１として表される配列番号１８８は、Ｎ末端配列ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥ（配列番号１４４，ＡｄＮＴ１と表す）およびＣ末端配列ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号１５３）を備える、コアＳＡＢＡ１配列（配列番号１０３）を含む。ＳＡＢＡ１．１はさらにＨｉｓ６タグをＣ末端で含む、しかしながら、Ｈｉｓ６タグは完全に任意であり、Ｎ−またはＣ−末端伸長配列内のどこにでも設置されうる。さらに、表３に提供される例示的なＮ−またはＣ−末端伸長配列（配列番号１４４〜１６３）およびそれらの変種のいずれかを使用して、表３に提供される任意の与えられるＳＡＢＡコア配列を修飾することができる。
【０１２６】
他の実施形態では、ＳＡＢＡ融合分子を設計する場合に必要であれば、テール配列は他の知られたリンカー配列（例えば、表３、配列番号１６４〜１８７）と結合させてもよい。
【０１２７】
コンジュゲーションリンカー
ＳＡＢＡ融合体は共有結合的に、または非共有結合的に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３は、直接的にまたは間接的に、ポリペプチドリンカーを介して抗ＩＬ−２３アドネクチンに連結された。Ｆｎ３の連結のための適したリンカーは、分離されたドメインが、標的分子に結合する高い親和性を可能にするような三次元構造の形成をお互い独立してフォールドできるようにするものである。
【０１２８】
本開示はこれらの必要条件を満たす多数の適したリンカーを提供し、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、ならびにアミノ酸配列ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号１８４）を有するリンカーが挙げられる。本明細書に記載される実施例では、ポリペプチドリンカーを介して連結されたＦｎ３ドメインが、その標的結合機能を保持することを実証する。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびセリン残基を含み、８から５０、１０から３０、および１０から２０個の間のアミノ酸の長さであり得る。例として、アミノ酸配列（ＧＳ）７（配列番号１７１）、Ｇ（ＧＳ）６（配列番号１６６）、およびＧ（ＧＳ）７Ｇ（配列番号１６８）を有するリンカーが挙げられる。他のリンカーはグルタミン酸を含有し、例えば、（ＧＳＥ）５（配列番号１７３）およびＧＧＳＥ  ＧＧＳＥ（配列番号１７７）が挙げられる。他の例示的なグリシン−セリンリンカーとして、（ＧＳ）４（配列番号１７０）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号１７９）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１８０）、および（ＧＧＧＧＳ）３Ｇ（配列番号１８１）が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、３から３０、１０から３０、および３から２０個の間のアミノ酸の長さであり得る。例として、（ＧＰ）３Ｇ（配列番号１８２）および（ＧＰ）５Ｇ（配列番号１８３）を有するリンカーが挙げられる。他の実施形態では、リンカーは３から３０、１０から３０、および３から２０アミノ酸の間の長さを有するプロリン−アラニンベースのリンカーであってもよい。プロリン−アラニンベースのリンカーの例として、例えば、（ＰＡ）３（配列番号１８５）、（ＰＡ）６（配列番号１８６）および（ＰＡ）９（配列番号１８７）が挙げられる。最適リンカー長およびアミノ酸組成は、当技術分野で周知の方法によって日常的な実験によって決定され得ると考えられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合体は、血液または標的組織においてプロテアーゼによって切断可能であるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介して連結される。このような実施形態を使用して、より良好なデリバリーまたは治療的特性、またはより効率的な生成のために、治療用タンパク質を放出できる。
【０１３０】
さらなるリンカーまたはスペーサーは、Ｆｎ３ドメインのＣ末端において、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入され得る。さらなるリンカーまたはスペーサーは、Ｆｎ３ドメインのＮ末端において、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入され得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、治療的部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）は、ポリマーリンカーを介して直接的または間接的にＳＡＢＡに連結されてもよい。ポリマーリンカーを使用して、以下の特徴のうち一以上を有するタンパク質融合体を作り出すために、融合体の各構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）間の距離を最適に変えることができる：１）対象とするタンパク質との結合時の、一以上のタンパク質ドメインの結合の立体障害の低減または増大、２）タンパク質安定性または溶解度の増大、３）タンパク質凝集の減少、および４）タンパク質の全結合力または親和性の増大。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、治療的部分は、重合糖などの生体適合性ポリマーを介してＳＡＢＡに連結している。重合糖は、血液または標的組織において酵素によって切断可能である酵素切断部位を含み得る。このような実施形態を使用して、より良好なデリバリーまたは治療的特性、またはより効率的な生成のために、治療用タンパク質を放出できる。
【０１３３】
血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）配列の概要
本願で参照されるＳＡＢＡ配列の多くは、以下の表３に要約される。特別の定めのない限り、全てのＮ末端伸長は下線で示され、全てのＣ末端テール／伸長は二重下線で示され、リンカー配列は囲まれている。ループ領域ＢＣ、ＤＥおよびＦＧは、各コアＳＡＢＡ配列に対して網掛けされている。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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実施例
【実施例１】
【０１３４】
製造過程
発酵および集菌
生産発酵（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は無菌の基礎培地で調製される。バイアルを融解して、成長培地を含む移動容器に接種するために使用する。接種材料は直ちに生産発酵へ移される。培養は撹拌して３４℃の温度で維持され、ＯＤ６００が５〜１０（１ＯＤ単位は約１ｘ１０９細胞／ｍＬ）に到達するまで生育させる。流加培地の添加はこのＯＤで開始する。発酵は、培養がイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりアドネクチンを生成するために誘導される点である、ＯＤ６００＝２５まで継続する。容器の温度は誘導の際、３４℃から３９℃へ上昇される。サンプルは毎時間、無菌的に採取され、細胞密度を試験する。
【０１３５】
９〜１２時間の誘導発酵の後、２５℃へ温度を低下させ、終濃度１０ｍＭでエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加し、水酸化ナトリウムの添加によりｐＨを上昇させ、かつ、撹拌を弱めることにより、容器を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）のために準備する。一時間の保持期間（ｈｏｌｄ  ｐｅｒｉｏｄ）の後、発酵容器内容物を集菌容器へ流し入れる。
【０１３６】
封入体の調製
回収プールの細胞破砕は、細胞を破砕してその内容物を放出させるＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ登録商標に通すことによって行う。細胞破砕に続いて、非常に強い遠心力により、連続工程で、固体および液相を分離するための、ディスクスタック遠心分離機を使用して、封入体が回収される。次いで封入体を、バッファー（２０〜２５℃）で２回、水（２０〜２５℃）で２回、洗浄する。封入体を洗浄するたび、遠心分離によって回収する。洗浄された封入体をスラリーとして回収する。
【０１３７】
封入体の可溶化およびタンパク質リフォールディング
可溶化バッファーを封入体スラリーへ添加し、続いて室温で１時間撹拌する。ＯＤ２８０＝２０（総タンパク質）がこの工程の間の目標とされる。
【０１３８】
タンパク質リフォールディングは二段階希釈工程を使用して実行する。希釈バッファーを、可溶化封入体一部に対して希釈バッファー二分の一部の比率（ｖ／ｖ）で、可溶化封入体へ添加する。第二の希釈は、ＯＤ２８０＝０．７（総タンパク質）を目標として、可溶化封入体をリフォールドバッファーへ添加することにより実行する。前記の希釈は室温で撹拌しながら実行する。一時間の混合を実行し、撹拌を止め、タンパク質溶液を室温で一晩保つ。可溶化されリフォールディングされたアドネクチンは、０．８μｍ〜２２μｍのフィルターに通され、Ａ２８０およびＲＰ−ＨＰＬＣによりタンパク質含有量に関して試験される。
【０１３９】
精製およびＰＥＧへのコンジュゲーション
リフォールドされフィルター処理されたアドネクチンは、初期回収（ｉｎｉｔｉａｌ  ｃａｐｔｕｒｅ）のため、陽イオン交換（ＣＥＸ１）カラムへ直接ロードされる。結合した物質を洗浄バッファーで洗浄し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１．５％プロピレングリコール、ｐＨ５．５で溶出する。溶出プールを、純度、同一性、濃度、およびエンドトキシンに関して測定する。
【０１４０】
回収クロマトグラフィー（ｃａｐｔｕｒｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）からの溶出物をさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して精製する。ＣＥＸ１溶出物をＨＩＣカラムへ直接ロードし、洗浄し、続いて５０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０％プロピレングリコール、ｐＨ５．５で溶出する。溶出プールを、純度、同一性、および濃度に関して測定する。
【０１４１】
精製されたアドネクチンはその後、４０ｋＤａの分岐ＰＥＧのマレイミド誘導体（ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ）で直接整形（ｆｏｒｍａｔ）される。ＨＩＣ溶出物は室温で撹拌され、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬが添加される。室温で１時間混合後、反応混合液を同じ温度で一晩インキュベートしてもよい。次いで、ＰＥＧ化溶液を最終ＣＥＸカラム（ＣＥＸ２）へと進める。サンプルはタンパク質含量、純度、およびエンドトキシンのために採取される。
【０１４２】
ＰＥＧ化溶液のｐＨおよび伝導度は、再精製のため、最終陽イオン交換カラム（ＣＥＸ２）へロードするより前に、７５ｍＭ酢酸でそれぞれ４．０および１．０ｍＳ／ｃｍに調節される。一度ロードしたら、結合した物質を洗浄バッファーで洗浄し、続いて５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０で溶出する。サンプルはタンパク質含量、純度、およびエンドトキシンのために採取される。
【０１４３】
ＣＥＸ２溶出物は、Ｖ−スクリーンを有する３０ｋＤａの名目分子量カットオフメンブレンを備えるタンジェンシャルフロー濾過ユニットで、１５ｍｇ／ｍＬへ濃縮される。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中のバルク薬剤原料を０．２２μｍのフィルターに通し、−８０℃で凍結した。
【実施例２】
【０１４４】
遺伝子、ベクターおよび宿主細胞
Ｔ７プロモーターの制御下でタンパク質をコードするプラスミドを、株構築（ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）での使用のために生成した。このプラスミドＤＮＡを使用して、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５コンピテントセル（Ｆ−ラムダ−、ｉｌｖＧ−ｒｆｂ−５０  ｒｐｈ−１）を形質転換させた。宿主株はＩＰＴＧの添加で遺伝子からの発現の誘導ができるように設計された。形質転換されたＭＧ１６５５株はカナマイシンに対して耐性である。タンパク質発現ベクターは図２に示される。プレートからのシングルコロニー選択を使用して、発酵培養物を接種し、その後それを分注し、研究細胞バンクとして使用するため凍結させた。
【実施例３】
【０１４５】
生物物理学的特性評価および生化学的特性評価
本発明のタンパク質の構造および品質は、数種の総合的解析方法により試験した。
【０１４６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ
質量スペクトルプロファイルはＭＡＬＤＩによって解析した。サンプル上のＭＡＬＤＩ解析の正確さを評価するため、各サンプルに対してスチールプレート上に２０の個別のスポットを設置し、連続して解析した。合計２０スペクトルが生成された。
【０１４７】
ペプチドマッピングを使用して、本発明のタンパク質並びに対応する非ＰＥＧ化タンパク質に関して、ｃＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸（第一構造）の正確な発現を確認した。完全な配列カバー率を得るために、トリプシン（Ｌｙｓ残基およびＡｒｇ残基のＣ末端側への切断）およびエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｇｌｕ残基のＣ末端側への切断）を採用して、ペプチド断片の２つのオーバーラップするセットを得た。ペプチドマッピングを使用して、共有結合的な翻訳後修飾として挙げられる残存Ｎ末端メチオニン、ジスルフィド結合、アスパラギンの脱アミノ化、メチオニン酸化（等）も決定した。ペプチドは、分子量による液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、および衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって部分的な配列情報を提供するタンデム質量分析（ＭＳＭＳ）により、同定され、かつ特徴づけられた。
【０１４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化の抗ＩＬ−２３アドネクチンの分子量バンドパターンを可視化した。サンプルは、還元剤有りまたは無しのサンプルバッファー中に調製された。ＳＤＳ中で加熱の後、サンプルおよび分子量マーカーを、プレ−キャストのグラジエント（４−２０％）ポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動的に解析した。電気泳動後、ゲルを固定し、クーマシーブルーを使用して染色した。サンプルのバンドパターンの同等性を視覚的に評価した。
【０１４９】
サイズ排除クロマトグラフィー／マルチアングル光散乱（ＳＥＣＭＡＬＳ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、高分子量（ＨＭＷ）種および低分子量（ＬＭＷ）種のモノマーの定量的解析のために使用した。続くＳＥＣ分離で、分離された種の分子量を、示差屈折率計を並んで備えるマルチアングル光散乱により決定した。
【実施例４】
【０１５０】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）非臨床薬理
ＳＰＲによるＫＤ
結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により特徴づけられる。ヒトＩＬ−２３を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＲＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）チップ表面の一次元に２から４レベルで固定化し、同じＳＰＲチップ表面の他の次元で６種の異なる濃度の抗ＩＬ−２３アドネクチンへと暴露させた。これにより再生無しで速度論的定量が可能となった。二重の（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）チップを２５℃および３７℃での速度論的定量のために使用した。速度論的パラメータの評価は、ラングミュア相互作用モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）およびＰｒｏｔｅＯｎマネージャーソフトウェアに適合する（ｆｉｔ  ｗｉｔｈ）定数パラメータを用いて行った。
【０１５１】
以下表４に示されるように、これらの抗ＩＬ−２３アドネクチンに対する解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、２５℃では遅い（約１０−５ｓ−１）。３７℃でさえ、その解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）はＳＰＲ技術の検出限界に近かかったので、報告された解離定数測定は過小評価であるかもしれない。
【表４】
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【０１５２】
溶液相親和性
ヒトＩＬ−２３に対するＡＴＩ００１０４５の溶液相親和性を、カイネティックエクスクルージョンアッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＫｉｎＥｘＡ）を用いて測定した。一形式において、ｈＩＬ−２３の二重滴定は３つの濃度各々に対して行った。相対非結合ＡＴＩ００１０４５濃度をヒトＩＬ−２３固体マトリックス上への回収によって測定し、続いてアドネクチン足場を認識する蛍光標識抗体で検出した。技術的な制限により、試験できる最小の濃度は０．７５ｎＭであった。それゆえ、表５に示す包括的なＫＤ解析はＫＤに対して５１ｐＭの見積もりを与えるものの、親和性は９５％信頼区間で、１桁ｐＭまで低く、あるいは、１５０ｐＭまで高くなり得る。
【表５】
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【０１５３】
ヒトＩＬ−２３に対するＡＴＩ００１０４５およびＡＴＩ００１０４７の溶液親和性は、ＫｉｎＥｘＡにおいて代替形式を使用して測定された。アドネクチンの二重滴定は、３つの濃度（ＡＴＩ００１０４５）または単一の濃度（ＡＴＩ００１０４７）のヒトＩＬ−２３の各々に対して行われた（最も低い濃度に対しては４重測定）。相対非結合ヒトＩＬ−２３濃度を非ＰＥＧ化ＡＴＩ００１０４５固体マトリックス上への回収によって測定し、続いてｈＩＬ−２３のｐ４０サブユニットを認識する蛍光標識抗体で検出した。表６に示す包括的なＫＤ解析は、ＡＴＩ００１０４５に関して９５％信頼区間で２２〜２．４ｐＭの、９．４ｐＭのＫＤを与え、９５％信頼区間で６０．１から１９．４ｐＭの、３６．３ｐＭのＫＤを与える。
【表６】
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【０１５４】
Ｋｉｔ２２５細胞でのＳＴＡＴ３リン酸化
Ｐａｒｈａｍら  （“Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＩＬ−２３  ｉｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ＩＬ−１２Ｒｂｅｔａ１  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ，  ＩＬ−２３Ｒ”，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６８（１１）：５６９９−５７０８  （Ｊｕｎ．  １，  ２００２））は、ヒトＩＬ−２依存性Ｔ細胞株、Ｋｉｔ２２５からＩＬ−２３Ｒをクローン化した。これらの細胞は、ＩＬ−１２ＲＢ１ならびにＩＬ−２３Ｒの両方の発現に対してＦＡＣＳ解析により特徴づけられ、かつ、ｐＳＴＡＴ３の刺激によるＩＬ−２３ならびにｐＳＴＡＴ４の刺激によるＩＬ−１２に応答した。Ｋｉｔ２２５細胞を９６ウェルプレートへ播種し、３７℃で３時間、ＦＢＳおよびＩＬ−２の非存在下で静置した（ｑｕｉｅｓｃｅｄ）。このインキュベートに続き、ヒト組換えＩＬ−２３（または、１時間アンタゴニストとプレインキュベートしたＩＬ−２３）を添加し、ＳＴＡＴ３のリン酸化（ｐ−ＳＴＡＴ３として略される）を刺激するために、細胞を３７℃で１５分間、インキュベーターへ戻した。各条件を９６ウェルプレートにて二重測定で測定した。刺激は細胞の氷上静置および氷冷ＰＢＳの添加により停止させた。最後に、標準的なプロトコールに従って細胞をペレット化および溶解し、ＥＬＩＳＡによってｐＳＴＡＴ３生成を検出した。
【０１５５】
刺激のためのＩＬ−２３の最適濃度は３５ｐＭであった。ＩＬ−２３誘導性ｐＳＴＡＴ３の阻害は、抗ｐ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ１５１０）ならびに抗ｐ１９ポリクローナル抗体（ＡＦ１７１６）の滴定によって実証した。ＡＴＩ００１０４５、ＡＴＩ００１０４７、ＡＴＩ００１０１４およびＡＴＩ００１０１６は、抗ｐ１９ポリクローナル抗体よりも約１５０倍強力な、〜３００ｐＭのＩＣ５０を備える同等の活性を有した一方、ＡＴＩ００１０１５は、抗ｐ１９ポリクローナル抗体よりも約４０倍強力な、〜１．２ｎＭのＩＣ５０を有した。アドネクチンＡＴＩ０００９３４は、１ｎＭのＩＣ５０を備え、ＡＴＩ００１０４５の１／３の効力である（表７）。
【表７】
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【０１５６】
ヒトＰＢＭＣでのＳＴＡＴ３リン酸化
二代細胞をベースとする確認測定は、初代ヒト細胞における作用メカニズムとして、ＳＴＡＴ３のリン酸化を評価する目的で開発された。健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、低レベルのＩＬ−２３Ｒを名目上発現し、外因性ＩＬ−２３で刺激された場合ほとんど応答しない、ナイーブで休眠状態のＴ細胞から主として成る。しかしながら、ＩＬ−２でのナイーブＰＢＭＣのポリクローナルな活性化は、その後ＩＬ−２３Ｒの発現を増大させる、ナイーブＴ細胞の活性化および分化を引き起こす。これらの活性化した細胞はその後、ＳＴＡＴ３のリン酸化を引き起こすＳＴＡＴ経路を活性化する、外因性ＩＬ−２３での刺激の影響を受けやすい。
【０１５７】
市販の抗体（ＡＦ１７１６、抗ｐ１９  ｐＡｂおよびｍＡｂ１５１０、抗ｐ４０  ｍＡｂ、両者ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を、ＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害のための陽性対照として使用した。６種のアドネクチンの阻害活性を、多数のドナー由来の血液を使用する１０の別実験において比較した（表８で要約する）。サブセットに関する例示的データを図４に示す。抗ＩＬ−２３アドネクチンは、ＳＴＡＴ３リン酸化において抗ｐ１９よりも著しく強力（＞１５０倍）であったが、抗ｐ４０モノクローナル抗体より５倍弱い効力と同様であった。
【表８】
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【０１５８】
マウス脾細胞によるＩＬ−２３誘導性サイトカイン産生
初代細胞を用いる初代細胞アッセイ（ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｓｓａｙ）を設計し、抗ＩＬ−２３アドネクチンの、マウスＴｈ１７細胞からのＩＬ−２３依存性サイトカイン分泌を阻害する能力を評価した。解析のためのマウスＴｈ１７細胞を分化させるために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気ビーズで濃縮し、照射した脾細胞（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）と共培養し、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６ならびにＩＬ−４およびＩＦＮ−γに対する中和抗体の存在下、抗ＣＤ３で活性化させた。６日間の培養後、極性化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）Ｔｈ１７細胞を回収し、９６ウェルプレートへ再播種し、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−２３および５ｎｇ／ｍｌ  マウスＩＬ−２で刺激した。ＩＬ−２の添加は、細胞生存を維持するために必要とされ、ＩＬ−２３に応答して強力なサイトカイン産生を可能にするが、単独でＩＬ−１７ＡあるいはＩＬ−２２産生を強く誘導はしなかった。ＩＬ−２は低レベルのサイトカイン分泌を誘導するので、各サンプルセットには、ＩＬ−２３の非存在下で産生されたサイトカインのベースラインレベルに関して調整するために、ＩＬ−２単独で刺激された細胞を含めた。ＩＬ−２３依存性応答は、ＩＬ−２およびＩＬ−２３の組合せにより誘導されたサイトカインのレベルと、ＩＬ−２単独により誘導されたベースラインレベルの違いを計算することによって評価した。アドネクチンの用量範囲は、その抑制可能性を試験するために、ＩＬ−２およびＩＬ−２３でのＴｈ１７細胞の再刺激の間、追加された。ヒト抗ｐ４０抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ１５１０）の用量範囲は、ＩＬ−２３阻害を評価するための陽性対照として、同時に実施された。各条件を９６ウェルプレートにて三重測定で試験した。４日後、三重測定からの馴化培地をプールし、細胞残渣を除去し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１７Ａ濃度およびＩＬ−２２濃度の両方を測定した。
【０１５９】
ＩＬ−２およびＩＬ−２３でのＴｈ１７細胞の刺激は、ＩＬ−２単独により誘導されたレベルと比較して、２から３倍のＩＬ−１７Ａの増加、および、少なくとも５倍のＩＬ−２２の増強を誘導した。ＡＴＩ０００９３４、ＡＴＩ００１０１４、ＡＴＩ００１０１５、ＡＴＩ００１０１６、ＡＴＩ００１０４５および陽性対照の抗ｐ４０モノクローナル抗体は、ＩＬ−２３依存性ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２２分泌において、用量依存的減少を調節した。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２２分泌の両方の阻害に対するＩＣ５０値は、各アドネクチンならびに抗ｐ４０対照に対して計算され、これらのデータは表９に要約される。試験された全てのアドネクチンは、ＩＬ−２３依存性ＩＬ−１７Ａ分泌の阻害に対して抗ｐ４０対照の２倍以内で強力であり、ＩＬ−２３依存性ＩＬ−２２産生の阻害に対して２から３倍以内で強力であった。
【表９】
2013520426.tif 000023
【０１６０】
ヒトＴ細胞によるＩＬ−２３誘導性サイトカイン産生
ＰＢＭＣは、健常ドナー由来のＥＤＴＡ処理全血の密度勾配分離によって獲得した。Ｔ細胞は、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）と共にロゼット形成したＰＢＭＣのＥ＋画分から調製した。このＴ細胞を９６ウェル平底プレートへ１ウェルあたり１００，０００細胞で播種し、３７℃で１時間、抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌでのＯＫＴ）で覆い、ＰＢＳで洗浄した。抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌでの９．３）およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β＋ＩＬ−２３（１ｎｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地の混合物を調製した。このサイトカインの組合せは、ヒトＴ細胞のＩＬ−１７分泌Ｔ細胞への分化を促進するということが示されている。開始濃度（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）１μｇ／ｍｌのＡＴＩ００１０４５をＩＬ−１β＋ＩＬ−２３を含有する混合物へ添加した。ＩＬ−１７はＤＵＯＳＥＴ登録商標  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、上清中に検出した。ＡＴＩ００１０４５は、バックグラウンドとしてＩＬ−１β単独を使用して、２．０±１．６ｎＭのＥＣ５０でＩＬ−１７産生を阻害した（ｎ＝４人の異なるドナー）。市販の抗ｐ４０抗体（ＭＡＢ１５１０）が内部標準として使用され、２．２±１．４ｎＭのＥＣ５０でＩＬ−１７産生を阻害した（ｎ＝３）。ドナー２２８からの例示的データを図６に示す。
【０１６１】
ＩＬ−１２を超えるＩＬ−２３に対する抗ＩＬ−２３アドネクチンの選択性
表２に示されるアドネクチンならびにＡＴＩ００１０１６を使用して、ＩＬ−２３／ＩＬ−１２に対する生化学的選択性を試験した。結合解析には、固定化抗Ｈｉｓ抗体での抗ＩＬ−２３アドネクチンの回収、続いてアドネクチン上へのＩＬ−２３またはＩＬ−１２の流入が含まれた。ＩＬ−２３に対するアドネクチンの選択性は、ＩＬ−２３よりも１００倍高い濃度のＩＬ−１２に対する結合シグナルを比較することによって評価した。表７に示す例示的データは、ＡＴＩ００１０１６は１０ｎＭ  ヒトＩＬ−２３に対して強力な結合（〜４０ＲＵ）を示すが、一方で、１μＭ  ヒトＩＬ−１２に対しては検出可能な結合は観察されなかったことを示す。
【０１６２】
ＮＫ−９２細胞は、ＩＦＮ−γを分泌することによりＩＬ−２依存的にＩＬ−１２に応答することが知られているヒトナチュラルキラー細胞株である。細胞を典型的に洗浄してＩＬ−２を除去し、次いで９６ウェルプレートへ播種し、その後２５ｐＭの組換えヒトＩＬ−１２（または、アンタゴニストとプレインキュベートしたＩＬ−１２）で処理し、さらに２０時間インキュベートした。清澄化された上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γに関して測定した。
【０１６３】
４点の５μＭで開始する５倍希釈系列を、表２に示されるアドネクチンクローン各々について調製し、ＮＫ−９２細胞への添加の前に、３７℃で３０分間２５ｐＭ  ＩＬ−１２とインキュベートした。１２点の５μＭのＡＴＩ００１０４５およびＡＴＩ００１０１６で開始する５倍希釈系列を、ＮＫ−９２細胞への添加の前に、３７℃で３０分間２５ｐＭ  ＩＬ−１２とインキュベートした。表２に示されるクローンもＡＴＩ００１０４５あるいはＡＴＩ００１０１６も、これらの抗ＩＬ−２３アドネクチンは、ＮＫ−９２細胞表面上の受容体とのＩＬ−１２の相互作用を阻害しないことを示し、試験されたいずれの濃度でも、ＩＦＮ−γ分泌を検出可能に阻害しなかった。それらは、陰性対照および１００ｎＭ  抗ｐ１９ポリクローナル抗体と同等であるようである。陽性対照として、抗ｐ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ１５１０）はＩＬ−１２誘導性ＩＦＮ−γ分泌を０．０７ｎＭのＩＣ５０で阻害した（図８）。
【０１６４】
抗ＩＬ−２３アドネクチンは薬力学的モデルにおいてＩＬ−２３誘導性ＩＬ−１７を阻害（ｂｌｏｃｋ）する
以下のスケジュールに従って、メスＣ５７Ｂｌ／６マウスに組換えマウスＩＬ−２およびヒトＩＬ−２３を腹腔内（ＩＰ）注射した。
【表１０】
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【０１６５】
全てのマウスを、ＩＬ−２およびＩＬ−２３の最終投与の７−８時間後、時間＝３０ｈで安楽死させた。血清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１７およびＩＬ−２３に関して測定した。
【０１６６】
ヒトＩＬ−２３はマウス受容体に結合し、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２などのサイトカインの産生を誘導する。ＩＬ−２およびヒトＩＬ−２３を腹腔内（ＩＰ）投与された動物由来の脾細胞は、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養において抗マウスＣＤ３ｅで刺激された時、ＩＬ−１７を分泌する。ＩＬ−１７の著しいレベルが表１０に記載される処置計画に供された動物の血清中に検出でき、ここで、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、２４時間のさらなる期間にわたるＩＬ−２＋ＩＬ−２３の３回の二重注射（ｄｕａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の前に、ＩＬ−２で２４時間、前処理した。おそらく、ＩＬ−２はポリクローナルに活性化し、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でＴｈ集団を拡大させ、ＩＬ−２３受容体の発現を上方制御する。これは、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）環境における、薬物作用のメカニズムおよび薬物濃度と効果の間の関係を調査することができる方法を提供する。このモデルは、抗ｐ４０モノクローナル抗体、ｍＡｂ１５１０で確認された（データは示さず）。８つの別実験において、８つの別の実験でのＩＬ−２＋ＩＬ−２３の初回投与（ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｏｓｅ）の２時間前に、０．５、０．１５、０．０５および０．０１５ｍｇ／ｋｇで、皮下（ＳＣ）投与した場合に、５種の抗ＩＬ−２３アドネクチンを、マウスＩＬ−１７の産生を阻害する能力に関して試験した。ＡＴＩ００１０４５に対する例示的な用量反応データを図９ａに示す（０．０３ｍｇ／ｋｇの計算上の平均ＥＤ５０）。抑制範囲はアドネクチン全体で可変的であるが、試験された全ての抗ＩＬ−２３アドネクチンは、血清中のヒトＩＬ−２３  マウスＩＬ−１７産生の用量依存的阻害を示した。
【０１６７】
ＩＬ−２３誘導性皮膚表皮肥厚モデルにおける抗ＩＬ−２３アドネクチンの活性
マウスの背中の皮膚または外耳介（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅａｒ  ｐｉｎｎａ）へのＩＬ−２３の皮内注射は、皮膚炎症および表皮の過形成（表皮肥厚）を誘発する（Ｚｈｅｎｇ，  Ｙ．，  “Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２，  ａ  ＴＨ１７  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＩＬ−２３−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｒｍａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ”，  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．  ４４５／８  （Ｆｅｂ．  ２００７））。これらの研究では、組換えヒトＩＬ−２３（ｒＨｕＩＬ−２３）がマウスの耳へ注射され、異常な皮膚ＩＬ−２３暴露の下流の結果が調査された。
【０１６８】
６から８週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対し、５μｇの二重鎖、組換え、ヒトＩＬ−２３を一日おきに１２日目まで、右耳へ注射した。ＰＢＳを対照として反対側の耳に注射した。一試験では、ＡＴＩ００１０４５での処置は、最初のＩＬ−２３注射の約２時間前に開始し、１週間あたり３回、１２日目まで継続した。ＡＴＩ００１０４５は、０．１、０．３、１、３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下（ＳＣ）投与された。第二の試験では、媒体またはＡＴＩ０００９３４−１２３  （１７５３Ｅ０２）を、ＩＬ−２３投与の１時間前に、１、３または１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ＩＰ）投与し、その後１週間あたり３回、１０日目まで投与した。抗ＨｕＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ｐ４０抗体（Ｒ＆Ｄ  ｍＡｂ１５１０）を１０ｍｇ／ｋｇで、陽性対照として０および４日目にＩＰで与えた。耳の厚さを（千分の１インチ単位で）、次の投与の前に、ＭＩＴＵＴＯＹＯ登録商標（＃２４１２Ｆ）ダイヤルキャリパーを使用して、一日おきに測定した。耳の厚さは、各動物に対し、ＩＬ−２３注射された耳の測定結果から対照の耳の値を引くことによって計算した。試験の最後（ＡＴＩ００１０４５に対して１４日目、およびＡＴＩ０００９３４に対して１２日目）に、ＣＯ２ガスでの安楽死に続いて、耳を生え際で切除し、ホルマリン固定／パラフィン包埋組織をＨ＆Ｅ染色したスライドで組織学的に観察した。
【０１６９】
全体としては、この試験において、１、３および１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＴＩ０００９３４は、同様のレベルのＩＬ−２３誘導性の耳肥厚の阻害を提供した（図１０）。抗ｐ４０群を含む、全ての処置群における耳の厚さは、５日目から試験の最後の１２日目にかけて、媒体よりも著しく薄かった（ｐ＜０．０１  ＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ）。１２日目、最終的な血漿サンプルを最終投与４８時間後に獲得し、ＡＴＩ０００９３４の血中濃度（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）について解析し、それぞれ１１、１８、３６μｇ／ｍｌであると決定された。
【０１７０】
１２日目の最終測定に続いて、１群あたり１０動物から、所定の組織学的検査のために剖検で耳を回収した。ＡＴＩ０００９３４を投与された動物の大部分は、表皮肥厚および浸潤を有したが、組織学的重症度スコアは、媒体処置動物で観察されたものからは減少した。明らかな用量反応は見られなかった。抗ｐ４０を投与された全ての動物もまた、表皮肥厚および浸潤を有したが、組織学的重症度スコアは、媒体処置動物で観察されたものからは減少した。
【０１７１】
ＡＴＩ００１０４５（１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）は、５日目から１４日目にかけて、媒体（ＰＢＳ）処置動物と比較して、用量依存的に耳の厚さを減少させた（ｐ＜０．０１  対媒体  ＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ、図１０）。対照的に、０．１ｍｇ／ｋｇの用量レベルでは、どの試験日でも、媒体処置と統計的に違いはなかった（ｐ＞０．０５）。０．３ｍｇ／ｋｇでの処置は、５日目、７日目、９日目において媒体よりも統計的に弱い、中間的な減少（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を提供した。最終投与４８時間後に回収された血漿サンプルを、ＡＴＩ００１０４５の血中濃度（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ）について評価し、０．１、０．３、１、３ｍｇ／ｋｇの用量に対し、それぞれ０．６９８、２．７２、８、２２．５μｇ／ｍｌであると決定された。組織学的解析から、ＡＴＩ００１０４５の投与が、ＩＬ−２３誘導性細胞性浸潤および耳の厚さのスコアに相関する表皮肥厚の用量依存的減少をもたらした、ということが明らかとなった。
【実施例５】
【０１７２】
本明細書で使用される材料および方法
ハイスループットタンパク質生成（ＨＴＰＰ）
選択されたバインダーをｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙｓＳ株へ形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する５ｍｌのＬＢ培地に２４ウェルフォーマットで播種し、３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物から２００μｌを吸引することおよび適当なウェルに分配することにより、誘導性発現のための新鮮な５ｍＬのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン）培養物を調製した。培養物を３７℃でＡ６００  ０．６〜０．９まで増殖させた。１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した後、培養物を、３０℃で６時間発現させ、４℃で２７５０ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。
【０１７３】
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット中）を、４５０μｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｘコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  イミダゾール、１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、３０μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌ  アプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１〜３時間振盪することによって溶解した。溶解物を清澄化し、９６ウェル、１．２ｍｌキャッチプレートが取り付けられた９６ウェルワットマンＧＦ／Ｄユニフィルタ登録商標に移すことによって９６ウェルフォーマットに再び入れ、陽圧によって濾過した。清澄化した溶解物を、平衡バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化された９６ウェルのＮｉ−キレートプレートへ移し、５分間インキュベートした。非結合物質を陽圧により除去した。樹脂を、洗浄バッファー＃１（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて、２ｘ  ０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、各洗浄液を陽圧により除去した。溶出に先立って、各ウェルを５０μｌ  溶出バッファー（ＰＢＳ  ＋  ２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、洗浄液を陽圧により廃棄した。各ウェルにさらなる１００μｌの溶出バッファーを注ぐことによってタンパク質を溶出した。室温で３０分インキュベートした後、プレート（単数または複数）を、２００ｇで５分間遠心分離にかけ、溶出されたタンパク質を、溶出に先立って溶出キャッチプレートの底に加えた５μｌの０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する９６ウェルキャッチプレート中に回収する。溶出したタンパク質を、ＳＧＥをタンパク質標準として用いる総タンパク質アッセイ（ＢＣＡ）を使用して定量した。
【０１７４】
不溶性のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質バインダーの中規模発現および精製
発現のために、ＨＩＳ６タグが続く、選択されたクローン（単数または複数）を、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙｓＳ株中で発現させた。２０ｍｌの種菌培養物（単一プレーティングされたコロニーから作製した）を使用して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含有する１リットルのＬＢ培地またはＴＢ−オーバーナイト発現培地（自己誘導）に播種した。ＬＢ培地での培養物は、３７℃でＡ６００  ０．６〜１．０までインキュベートし、その時点でイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、３０℃で４時間増殖させた。ＴＢ−オーバーナイト発現培地で増殖させた培養物は、３７℃で５時間インキュベートし、その時点で温度を１９時間、１８℃へ下げた。培養物を４℃で≧１０，０００ｇでの３０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ登録商標ホモジナイザー（ＩＫＡ  ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｘコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ登録商標（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００  ｐｓｉ）によって達成した。不溶性画分を、４℃で≧２３，３００ｇでの３０分間の遠心分離によって分離した。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。ペレットを、超音波処理を用いて２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４中、６．０Ｍ  塩酸グアニジンに再可溶化し、続いて３７度で１〜２時間インキュベートした。再可溶化されたペレットを０．４５μｍで濾過し、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／６．０Ｍ  グアニジン  ｐＨ７．４バッファーで平衡化したＨＩＳＴＲＡＰ登録商標カラムにロードした。ローディング後、カラムを同一のバッファーを用いて、さらなる２５カラム容量（ＣＶ）に対して洗浄した。結合したタンパク質を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／６．０Ｍ  Ｇｕａｎ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、５０ｍＭ  イミダゾールを用いて溶出した。精製されたタンパク質は、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ４．５またはＰＢＳ、ｐＨ７．２に対する透析によって、リフォールディングされた。
【０１７５】
可溶性のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質バインダーの中規模発現および精製
不溶性バインダーの精製の代替として、可溶性バインダーの精製を使用してもよい。発現のために、ＨＩＳ６タグが続く、選択されたクローン（単数または複数）を、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙｓＳ株中で発現させた。２０ｍｌの種菌培養物（単一プレーティングされたコロニーから作製した）を使用して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含有する１リットルのＬＢ培地またはＴＢ−オーバーナイト発現培地（自己誘導）に播種した。ＬＢ培地での培養物は、３７℃でＡ６００  ０．６〜１．０までインキュベートし、その時点でイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、３０℃で４時間増殖させた。ＴＢ−オーバーナイト発現培地で増殖させた培養物は、３７℃で５時間インキュベートし、その時点で温度を１９時間、１８℃へ下げた。培養物を４℃で≧１０，０００ｇでの３０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ登録商標ホモジナイザー（ＩＫＡ  ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｘコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）中に再懸濁する。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ登録商標（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００  ｐｓｉ）によって達成される。可溶性画分を、４℃で≧２３，３００ｇで３０分間の遠心分離によって分離する。上清を０．４５μｍフィルターへ通して清澄化する。清澄化された溶解物を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４で事前に平衡化されたＨＩＳＴＲＡＰ登録商標カラム（ＧＥ）にロードする。次いでカラムを、２５カラム容量の同一のバッファーで洗浄し、続いて２０カラム容量の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／２５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４、その後３５カラム容量の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／４０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４を用いて洗浄する。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４で溶出し、Ａ２８０での吸光度に基づいて画分をプールし、１ｘ  ＰＢＳ、５０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５または５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析する。いかなる沈殿物も０．２２μｍでの濾過によって除去される。
【０１７６】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質（アドネクチン）は、種々の大きさおよび種類のＰＥＧを用いてＰＥＧ化させることができる。ＰＥＧ化を可能にするために、１０ＦＮ３タンパク質のＣ末端で見られる天然に存在する残基ＥＩＤＫＰＳＱが、アミノ酸の、典型的にはセリンのシステインへの、単一点突然変異によって、修飾される。単一のシステイン残基におけるタンパク質のＰＥＧ化は、種々のマレイミド誘導体化されたＰＥＧの形をコンジュゲートすること、ＰＥＧ試薬をタンパク質溶液と組み合わせること、およびインキュベートすることによって達成される。代替方法は、ＥＩＤＫＰＳＱテールをＧＳＧＣリンカーで置換し、同様にシステイン残基をＰＥＧ化のために使用することである。操作されたシステイン残基を含有するアドネクチンを、マイケル付加反応を介して、システイン上のチオール基とＰＥＧ試薬のマレイミド官能基の間でＰＥＧとコンジュゲートした。簡単に説明すると、４０ｋＤａのＰＥＧを、弱酸性から中性条件下で、タンパク質溶液へ、過剰のモル濃度で添加する。反応は、２時間から一晩、室温で続行することができる。次いで反応をイオン交換カラムへ供し、ＰＥＧ化アドネクチンを未反応のＰＥＧ−マレイミドおよび非ＰＥＧ化アドネクチンから分離する。ＳＥ／ＨＰＬＣ方法が使用されてもよい。精製されたＰＥＧ化アドネクチンは典型的にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって解析される。
【実施例６】
【０１７７】
候補血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）のスクリーニングおよび選択
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎとして知られる選択技術（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４（２３）：１２２９７−１２３０２  （１９９７）および  ＷＯ  ２００８／０６６７５２参照）が、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに設計された可変領域を有するＤＮＡライブラリーへ適用された。１０１３分子を越えるランダムライブラリーがこの設計から作り出され、所望の結合特性を備える候補血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）を単離するために、ＨＳＡのビオチン化形態に対して、選択圧が適用された。
【０１７８】
ハイスループットタンパク質生成（ＨＴＴＰ）工程
様々なＨＳＡ結合アドネクチンがハイスループットタンパク質生成（ＨＴＰＰ）を使用して精製された。選択されたバインダーを、ＨＩＳ６タグを含有するｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ形質転換した。形質転換された細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する５ｍｌのＬＢ培地に２４ウェルフォーマットで播種し、３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物から２００μｌを吸引することおよび適当なウェルに分配することによって、誘導性発現のために、新鮮な５ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン）培養物を調製した。培養物は３７℃でＡ６００  ０．６〜０．９まで増殖させた。１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した後、培養物を、３０℃でさらに４時間発現させ、４℃で３２２０ｘ  ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを−８０度で凍結した。
【０１７９】
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット中）を、４５０μｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｘコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  イミダゾール、１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、３０μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌ  アプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１時間振盪することによって溶解した。溶解物を清澄化し、９６ウェル、６５０μｌキャッチプレートが取り付けられた９６ウェルワットマンＧＦ／Ｄユニフィルタ登録商標へ移すことによって９６ウェルフォーマットに再び入れ、２００ｘ  ｇで５分間遠心分離した。清澄化した溶解物を、平衡バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化された９６ウェルＮｉ−キレートプレートに移し、５分間インキュベートした。非結合物質を除去した。樹脂を、洗浄バッファー＃１（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて、２ｘ  ０．３ｍｌ／ウェルで洗浄した。次いで、樹脂をＰＢＳを用いて３ｘ  ０．３ｍｌ／ウェルで洗浄した。溶出に先立って、各ウェルを５０μｌ  溶出バッファー（ＰＢＳ  ＋  ２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、洗浄液を真空により廃棄した。各ウェルにさらなる１００μｌの溶出バッファーを注ぐことによってタンパク質を溶出した。室温で３０分インキュベートした後、プレート（単数または複数）を、２００ｘ  ｇで５分間遠心分離にかけ、溶出されたタンパク質を、溶出キャッチプレートの底に加えた５μｌの０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する９６ウェルキャッチプレート中に回収した。溶出されたタンパク質を、ＳＧＥ（対照アドネクチン）をタンパク質標準として用いるＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量した。ＳＧＥアドネクチンは、インテグリン結合ドメイン（７８〜８０位のアミノ酸ＲＧＤ）がＳＧＥで置換された、野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）である。
【０１８０】
ＨＳＡ、ＲｈＳＡおよびＭｕＳＡ直接結合ＥＬＩＳＡ
ＨＳＡへの直接的なバインダーをアッセイするために、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）を４℃で一晩、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ  ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で覆い、続いてカゼインブロックバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）中で１〜３時間、室温でブロッキングを行った。シングルポイントスクリーニングアッセイのため、精製されたＨＴＰＰアドネクチンをカゼインブロックバッファー中に１：２０で希釈し、室温で１時間、各ウェル内でＨＳＡに結合させた。用量反応アッセイのため、０．１ｎＭから１μＭの範囲の濃度が使用された。非結合アドネクチンを除去するためのＰＢＳＴでの洗浄の後、カゼインブロックバッファー中に１：２５００で希釈された抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＭＮ）を、室温で１時間、結合されたＨｉｓタグ化アドネクチンへ添加した。過剰のコンジュゲートはＰＢＳＴを用いる洗浄によって除去され、製造業者の使用説明書に従い、ＴＭＢ検出試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、結合アドネクチンを検出した。
【０１８１】
候補血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）の同定
ＨＳＡ／ＲｈＳＡ／ＭｕＳＡ結合基準および生物物理学的基準に関するスクリーニングの結果を受けて、４つの特有の血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）を同定し、それらの半減期をマウスで評価させるために選択した。インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での特性評価を行うために、４つのＳＡＢＡについて中規模生成が行われた。表３は、ＳＡＢＡ１〜２６と表される、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎから同定された２６の特有のＳＡＢＡコア配列の配列を提供する。ＳＡＢＡ４は中規模生成に先立って固定の足場変異を有した。ＳＡＢＡ４の足場完全型はＳＡＢＡ５である。ＳＡＢＡ４およびＳＡＢＡ５はＢＣ、ＤＥおよびＦＧループにおいて同一配列を有する。
【実施例７】
【０１８２】
候補ＳＡＢＡの生成および製剤処方（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）
ＳＡＢＡの中規模タンパク質生成
Ｈｉｓ６タグが続く選択されたＳＡＢＡを、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株中で発現させた (ＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１およびＳＡＢＡ５．１と表される、各Ｈｉｓタグ化ＳＡＢＡ配列に関する表３を参照）。２０ｍｌの種菌培養物（単一プレーティングされたコロニーから作製した）を使用して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含有する１リットルのＬＢ培地に播種した。培養物を３７℃でＡ６００  ０．６〜１．０まで増殖させた。１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した後、培養物を、３０℃でさらに４時間増殖させ、４℃で≧１０，０００ｘ  ｇでの３０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ登録商標ホモジナイザー（ＩＫＡ  ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｘコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ登録商標（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００  ｐｓｉ）によって達成した。可溶性画分を、４℃で２３，３００ｘ  ｇでの３０分間の遠心分離によって分離した。上清を０．４５μｍフィルターへ通して清澄化した。清澄化された溶解物を、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で事前に平衡化されたＨＩＳＴＲＡＰ登録商標カラム（ＧＥ）にロードした。次いでカラムを、２５カラム容量の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で、続いて、２０カラム容量の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７．４、次いで、３５カラム容量の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７．４を用いて洗浄した。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７．４で溶出し、Ａ２８０での吸光度に基づいて画分をプールし、１ｘ  ＰＢＳ、５０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．５または５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析した。いかなる沈殿物も０．２２μｍでの濾過によって除去された。
【０１８３】
中規模発現および精製は、可溶型で発現され、細菌性サイトゾルの可溶性画分から精製された、高純度かつ活性なアドネクチンを生じた。１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＳＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の移動相でのＳＵＰＥＲＤＥＸ登録商標  ２００またはＳＵＰＥＲＤＥＸ登録商標  ７５  １０／３０ＧＬでのＳＥＣ解析は、大部分、単量体アドネクチンを示した。
【０１８４】
ＳＡＢＡ１．２の製剤処方（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）
一つの具体的なＳＡＢＡ、ＳＡＢＡ１．２（配列番号１８０）、が、初期製剤処方（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）スクリーニングのために選択された。ＳＡＢＡ１．２は、１０Ｆｎ３の「コア１」配列上に（ＥＤ）５伸長を含む。ＳＡＢＡ１．２に対して、ｐＨ６．０で１０ｍＭ  コハク酸、８％  ソルビトール、５％  グリセリン、かつ製品濃度５ｍｇ／ｍＬでの、安定な製剤処方が同定された。この製剤処方において、１．２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用して、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定されたタンパク質の融点は７５℃であった。この製剤処方は、４℃および２５℃で、１．２％の初期凝集濃度（ｉｎｉｔｉａｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｌｅｖｅｌ）を有し、十分な物理的安定性および化学的安定性をもたらした。一ヶ月の静置の後、凝集のレベルは非常に低かった（４℃で１．６％かつ２５℃で３．８％）。該タンパク質はまた、この製剤処方において、−８０℃および−２０℃から外気温へ推移させる５回の凍結融解後も安定であった。加えて、このＳＡＢＡ１．２製剤処方は、４℃および外気温で、沈殿もしくは凝集の増加も無く、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で可溶性であった。
【実施例８】
【０１８５】
候補ＳＡＢＡの生物物理学的特性評価
サイズ排除クロマトグラフィー
標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を中規模工程によって生じる候補ＳＡＢＡに対して行った。中規模物質のＳＥＣは、Ａ２１４ｎｍならびにＡ２８０ｎｍでのＵＶ検出器付き、および蛍光検出器（励起＝２８０ｎｍ、蛍光＝３５０ｎｍ）付きのＡｇｉｌｅｎｔ  １１００もしくは１２００  ＨＰＬＣシステム上で、ＳＵＰＥＲＤＥＸ登録商標  ２００  １０／３０またはＳＵＰＥＲＤＥＸ登録商標  ７５  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。ＳＥＣカラムの適した流量で、１００ｍＭ  硫酸ナトリウム、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーが採用された。ゲル濾過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）が分子量校正のために使用された。
【０１８６】
中規模精製ＳＡＢＡでのＳＥＣの結果は、大部分、単量体アドネクチンを、および、示されるように、球状ゲル濾過標準（ＢｉｏＲａｄ）に対しておよそ１０ｋＤａの範囲での溶出を示した。
【０１８７】
耐熱性
中規模ＳＡＢＡの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）解析を行って、それらのそれぞれのＴｍを決定した。１ｍｇ／ｍｌの溶液を、３ａｔｍ圧力下、１分あたり１℃の速度で、５℃から９５℃へ温度を上昇させる（ｒａｍｐｉｎｇ）ことにより、Ｎ−ＤＳＣ  ＩＩ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ）でスキャンした。データを、Ｏｒｇｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＯｒｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ）を使用する適合度（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ）を用いて、適切なバッファーの対照測定（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｕｎ）に対して解析した。ＳＥＣ解析およびＤＳＣ解析の結果を表１１に要約する。
【表１１】
2013520426.tif 000025
【実施例９】
【０１８８】
血清アルブミンに結合する候補ＳＡＢＡ１の特性評価
ＨＴＰＰおよび／または中規模物質から精製された選択されたＳＡＢＡクローンの動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を、Ｂｉａｓｅｎｓｏｒ  ＣＭ５チップの表面上にそれぞれの血清アルブミン（ＨＳＡ／ＲｈＳＡ／ＭｕＳＡ）を捕捉すること、および参照フローセルおよび捕捉されたアルブミンの両方にわたってＳＡＢＡの濃度系列を流すことにより決定した。加えて、アルブミンとの結合を、ｐＨ５．５からｐＨ７．４にわたる様々なｐＨ条件下で実行した。ＨＳＡ結合アドネクチン、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、ＳＡＢＡ４．１（ＳＡＢＡ５．１）＆ＳＡＢＡ１．１は、ＲｈＳＡへ公差反応したが、ＭｕＳＡへは公差反応しなかった。ＳＡＢＡ２およびＳＡＢＡ４結合はｐＨ感受性である一方、クローンＳＡＢＡ３はｐＨ６．０に至るまでＨＳＡとのｐＨ耐性結合を明示した。ＳＡＢＡ１．１はｐＨ５．５に至るまでｐＨ耐性および親和性／動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に関する生化学的基準に適合する。
【０１８９】
ドメインマッピングはビアコアにより決定した。ＨＴＰＰおよび／または中規模物質から精製された選択されたＳＡＢＡクローンは、Ｂｉａｓｅｎｓｏｒ  ＣＭ５チップの表面上にＨＳＡ、またはＨＳＡ−ドメインＩ＆ＩＩあるいはＨＳＡ−ドメインＩＩＩのみから成る構築物を捕捉すること、および参照フローセルおよび捕捉されたアルブミンの両方にわたってＳＡＢＡの濃度系列を流すことにより決定した。クローンＳＡＢＡ２＆ＳＡＢＡ１はＨＳＡおよびＨＳＡ−ドメインＩ−ＩＩ構築物と結合し、ＨＳＡ−ドメインＩＩＩ構築物とは結合しなかった。クローンＳＡＢＡ３＆ＳＡＢＡ４はＨＳＡと結合したが、ＨＳＡ−ドメインＩ−ＩＩ構築物またはＨＳＡ−ドメインＩＩＩ構築物のいずれとも結合しなかった。結果を表１２に要約する。
【表１２】
2013520426.tif 000026
【実施例１０】
【０１９０】
候補ＳＡＢＡのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ｔ１／２の調査
ＨＳＡ結合アドネクチンはＭｕＳＡと交差反応しないため、マウスでのＨＳＡ結合アドネクチンの評価を可能にするために、マウスにおけるＨＳＡの半減期を決定した。ＨＳＡを、２０ｍｇ／ｋｇ用量（図１１Ａ）および５０ｍｇ／ｋｇ用量（図１１Ｂ）で、約６週齢のＮｃｒヌードメスマウスの尾静脈へ注射し、注射後周期的に採取した血液サンプル中のＨＳＡ濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。２０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇでマウスに注射されたＨＳＡのｔ１／２は、それぞれ、〜２４時間および〜２０時間であると決定された。
【０１９１】
マウスでのＳＡＢＡ１〜４の半減期決定
１リットルのＨＳＡ結合クローンＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１およびＳＡＢＡ４．１の大腸菌増殖液を調製し、精製し、エンドトキシンを除去した。各ＳＡＢＡ変種をマウスの尾静脈へ注射し、注射後周期的に採取した血液サンプル中の濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１９２】
各ＳＡＢＡの薬物動態プロファイルを、約６週齢のＮｃｒヌードメスマウスで、ＨＳＡの存在下または非存在下において比較した。結合クローンはＨＳＡおよびＲｈＳＡに対して選択性であり、マウス血清アルブミンとは結合しなかったため、ＨＳＡを同時注射されたマウスは、ＨＳＡを各ＳＡＢＡと予め混合させた（３〜４モル濃度過剰のＨＳＡ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ１．１の半減期は０．５６時間であるのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ１．１の半減期は５．６時間、半減期において〜１０倍増加していた（図１２Ａ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ２．１の半減期０．２４時間であるのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ２．１の半減期は２．８時間、半減期において〜１２倍増加していた（図１２Ｂ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ３．１の半減期は０．２８時間であるのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ３．１の半減期は０．５３時間、半減期において〜２倍増加していた（図１２Ｃ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ４．１の半減期は０．６６時間であるのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ４．１の半減期は４．６時間、半減期において〜７倍増加していた（図１２Ｄ）。本実施例の概要を図１３Ａに示す。
【０１９３】
カニクイザルでのＳＡＢＡ１．１およびＳＡＢＡ５．１の半減期決定
ＳＡＢＡ１．１およびＳＡＢＡ５．１の三週間単回投与概念実証試験（ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ）をカニクイザルで実施し、２匹のカニクイザルにおける１ｍｇ毎ｋｇ（ｍｐｋ）用量、ＩＶでの薬物動態を評価した。薬物動態は、血漿サンプル中のアドネクチンを検出するために開発された定量的ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイを使用して評価した。ＳＡＢＡ１．１は９６〜１３７時間の範囲の半減期を有する。ＳＡＢＡ５．１は約１２時間の半減期を有し、唯一１２０時間までＥＬＩＳＡで測定可能であった。図１４ＡおよびＢは、これらのクローンに対するデータを要約し、カニクイザルからのデータを比較するものである。
【実施例１１】
【０１９４】
血清アルブミンと結合するＳＡＢＡ１の特性評価
ＳＡＢＡ１．１およびＳＡＢＡ１．２はＨＳＡおよびＲｈＳＡと結合する
ＳＡＢＡ１．２、（ＥＤ）５伸長（配列番号１９０）を含む「コア１」１０Ｆｎ３、は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、中性ｐＨかつ２５℃で、８．２１Ｅ＋０３  Ｍ−１ｓ−１の平均結合速度定数（ｋａ）、かつ４．４３Ｅ−０４  ｓ−１の平均解離速度定数（ｋｄ）、５５．３  ｎＭの計算平均Ｋｄで結合した（表１３）。アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）に対しては、測定された平均結合速度定数は６．６Ｅ＋０３  Ｍ−１ｓ−１であり、解離速度定数は３．７８Ｅ−０３  ｓ−１であり、５８０  ｎＭの計算平均Ｋｄを提供した。１μＭに至るまで、ＳＡＢＡ１．２とマウスまたはラット血清アルブミンの間に測定可能な相互作用は観察されなかった（表１３および図１５）。３７℃で、ｋａおよびｋｄは２から５倍増加し、ＨＳＡに対する親和性において〜２倍の増加およびＲｈＳＡに対して１／２の親和性をもたらした（表１３）。
【表１３】
2013520426.tif 000027
【０１９５】
さらに、熱量滴定を行い、ＳＡＢＡ１およびＨＳＡの間の化学量論組成（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）を決定した。この試験では、ＳＡＢＡ１．１、Ｈｉｓ６伸長（配列番号１８９）を含む「コア１」１０Ｆｎ３、が使用された。ＨＳＡ（１１５μＭのタンパク質溶液の注射あたり１０μｌ）を、８．１μＭの濃度でＳＡＢＡ１．１を含有する熱量測定セル（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ）へ注入した。実験はＰＢＳバッファーｐＨ７．４中、３７℃にて行った。図１６はＳＡＢＡ１．１がＨＳＡと１：１の化学量論組成で結合することを示す。
【０１９６】
ＳＡＢＡ１．２は低ｐＨでＨＳＡと強く結合する
アルブミンの長い半減期（例えば、ＨＳＡのｔ１／２は１９日である）は、主に、それらがエンドソームの内側に存在する低ｐＨ条件下で、新生児型Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎ、に結合することにより、エンドサイトーシス経路からリサイクルされる、という事実に起因している。表１４に示されるように、エンドソームｐＨ５．５でＨＳＡと強く結合したＳＡＢＡ１．２は、ＳＡＢＡ１のｔ１／２を示唆し、一度ＨＳＡに結合すると、ＦｃＲｎリサイクル機構の利益を享受する。
【表１４】
2013520426.tif 000028
【０１９７】
ＳＡＢＡ１．２はＨＳＡのドメインＩおよびＩＩと結合するが、ドメインＩＩＩとは結合しない
アルブミン上のＳＡＢＡ１．２結合部位は、組換えＨＳＡ断片を使用して、Ｎ末端ドメインＩまたはＩＩへマッピングされ、ドメインＩＩＩとの検出可能な結合は無かった（図１７）。ドメインＩＩＩは、最初にＦｃＲｎと相互作用するＨＳＡのドメインであるため、ＳＡＢＡ１．２は、ＦｃＲｎへのＨＳＡ結合と競合する可能性が低く、半減期を増強するためのリサイクル機構を十分に活用する可能性をかさねて増大させる。
【実施例１２】
【０１９８】
ＳＡＢＡ１．２のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）薬理
ＳＡＢＡ１．２の四週間単回投与前毒性試験（ｐｒｅ−ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｓｔｕｄｙ）をカニクイザルで実施し、二つの異なる用量レベルで薬物動態および免疫原性を評価した。薬物動態および免疫原性はまた、静脈投与群および皮下投与群の両者を含む、三週間単回投与前毒性試験においても評価した。さらに、ＳＡＢＡ１．２の薬物動態を、血漿サンプル中のＳＡＢＡ１．２を検出するために開発された定量的ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイを使用して、カニクイザルで、二つの別個の単回投与前毒性試験においても評価した。
【０１９９】
ＳＡＢＡ１．２を１ｍｐｋおよび１０ｍｐｋ、ＩＶでサルへ投与した。図１８および下記に記載されるパラメータに示されるように、ＣｍｘおよびＡＵＣは、用量とともにほぼ直線的に増加した。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ登録商標ソフトウェアを使用して、ノンコンパートメント解析を行い、薬物動態パラメータを評価した。１０ｍｐｋでのＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は、０．１５ｍｌ／時／ｋｇ、ベータ相半減期（ｔ１／２）は１４３時間、分布容積（Ｖｚ）は３０ｍＬ／ｋｇ、そして、総薬物暴露量（ｔｏｔａｌ  ｄｒｕｇ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）（ＡＵＣaｌｌ）は５，６０９，４５７時＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１５）。１ｍｐｋでのＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は、０．４ｍｌ／時／ｋｇ、半減期（ｔ１／２）は１２４時間、分布容積（Ｖｚ）は７２ｍＬ／ｋｇ、そして、総薬物暴露量（ＡＵＣaｌｌ）は２１４，６３６時＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１５）。
【０２００】
ＳＡＢＡ１．２のＳＣまたはＩＶ投与の後、ベータ相薬物動態プロファイルは類似していた（図１９）。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ登録商標ソフトウェアを使用して、ノンコンパートメント解析を行い、薬物動態パラメータを評価した。１ｍｐｋ  ＩＶでのＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は、０．２２ｍｌ／時／ｋｇ、ベータ相半減期（ｔ１／２）は１２５時間、分布容積（Ｖｚ）は４０ｍＬ／ｋｇ、そして、総薬物暴露量（ＡＵＣaｌｌ）は３５７，９９３時＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１５）。１ｍｐｋ  ＳＣでのＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は、０．３２ｍｌ／時／ｋｇ、ベータ相半減期（ｔ１／２）は１３４時間、分布容積（Ｖｚ）は６２ｍＬ／ｋｇ、そして、総薬物暴露量（ＡＵＣaｌｌ）は２５１，３３９時＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１５）。ＩＶに比べてＳＣの相対的生物学的利用能（Ｆ）は０．７であった。
【表１５】
2013520426.tif 000029
【図１−１】
2013520426.tif 000030
【図１−２】
2013520426.tif 000031
【図１−３】
2013520426.tif 000032
【図１−４】
2013520426.tif 000033
【図１−５】
2013520426.tif 000034
【図１−６】
2013520426.tif 000035
【図２】
2013520426.tif 000036
【図３−１】
2013520426.tif 000037
【図３−２】
2013520426.tif 000038
【図４】
2013520426.tif 000039
【図５】
2013520426.tif 000040
【図６】
2013520426.tif 000041
【図７】
2013520426.tif 000042
【図８】
2013520426.tif 000043
【図９Ａ】
2013520426.tif 000044
【図９Ｂ】
2013520426.tif 000045
【図１０Ａ】
2013520426.tif 000046
【図１０Ｂ】
2013520426.tif 000047
【図１１Ａ】
2013520426.tif 000048
【図１１Ｂ】
2013520426.tif 000049
【図１２Ａ】
2013520426.tif 000050
【図１２Ｂ】
2013520426.tif 000051
【図１２Ｃ】
2013520426.tif 000052
【図１２Ｄ】
2013520426.tif 000053
【図１３Ａ】
2013520426.tif 000054
【図１３Ｂ】
2013520426.tif 000055
【図１４Ａ】
2013520426.tif 000056
【図１４Ｂ】
2013520426.tif 000057
【図１５】
2013520426.tif 000058
【図１６】
2013520426.tif 000059
【図１７】
2013520426.tif 000060
【図１８】
2013520426.tif 000061
【図１９】
2013520426.tif 000062
【配列表】
2013520426000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月16日(2012.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013520426000001.app
【国際調査報告】
2013520426.tif 000063
2013520426.tif 000064
2013520426.tif 000065