(57)【要約】  本発明は、分子生物学分野に、そしてより具体的には、増幅プロセスにおいて使用するための核酸構築物に関する。より正確には、本発明は、二本鎖核酸の伸長を防止する能力を有する分子で修飾されている二本鎖オリゴヌクレオチドによって、核酸増幅の特異性を増進させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅において使用するためのブロッキング二本鎖核酸複合体であって；
ここで当該複合体が：
ａ．以下を含む単離二本鎖核酸分子：
ｉ．約９〜約４０核酸塩基の間を含む第一の配列を有する第一の核酸鎖、および
ｉｉ．第一の配列に相補的な約９〜約４０核酸塩基の間を含む第二の配列を有する核酸第二鎖、ここで、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が各々３’端および５’端を有し、
二本鎖核酸分子が約５０％〜約７０％の間の範囲のシトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）のパーセンテージを有する；ならびに
ｂ．第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、または両方の３’端または５’端に共有結合したブロッキング分子；
を含む、前記ブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項２】
二本鎖核酸分子が、約２５℃〜約９０℃の間の範囲の融点を有する、請求項１のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項３】
複合体がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項４】
ブロッキング分子が：デオキシチミジン、ジデオキシヌクレオチド、３’リン酸化、ヘキサンジオール、スペーサー分子、１’２’−ジデオキシリボース、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、およびロックド核酸（ＬＮＡ）からなる群より構成される、請求項１のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項５】
ブロッキング分子が：
【化１】
2013509885.tif 000005
を含む、請求項１のブロッキング二本鎖核酸分子複合体。
【請求項６】
第一の配列または第二の配列が、１またはそれより多いウラシル塩基をさらに含む、請求項１のブロッキング二本鎖核酸分子複合体。
【請求項７】
核酸増幅において使用するためのブロッキング二本鎖核酸複合体であって；
ここで当該複合体が：
ａ．以下を含む単離二本鎖核酸分子：
ｉ．約９〜約４０核酸塩基の間を含む第一の配列を有する第一の核酸鎖、および
ｉｉ．第一の配列に相補的な約９〜約４０核酸塩基の間を含む第二の配列を有する核酸第二鎖、ここで、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が各々３’端および５’端を有し、
二本鎖核酸分子が約２５℃〜約９０℃の間の範囲の融点を有する；ならびに
ｂ．第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、または両方の３’端または５’端に共有結合したブロッキング分子；
を含む、前記ブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項８】
ブロッキング分子が：デオキシチミジン、ジデオキシヌクレオチド、３’リン酸化、ヘキサンジオール、スペーサー分子、１’２’−ジデオキシリボース、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、およびＬＮＡからなる群より構成される、請求項７のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項９】
核酸増幅において使用するためのブロッキング二本鎖核酸複合体であって；
ここで当該複合体が：
ａ．以下を含む単離二本鎖核酸分子：
ｉ．第一の核酸鎖であって：
ａ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはその組み合わせ；
ｂ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはその組み合わせの相補体；あるいは
ｃ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはその組み合わせにハイブリダイズする配列；
を含む配列と約７０％より大きいかまたは約７０％に等しい同一性の第一の核酸配列を有する前記の第一の核酸鎖；および
ｉｉ．第一の核酸配列に相補的な約９〜約４０核酸塩基の間を含む第二の配列を有する第二の核酸鎖、ここで、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が各々３’端および５’端を有し、
二本鎖核酸分子が約２５℃〜約９０℃の間の範囲の融点を有する； 
ｂ．第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、または両方の３’端または５’端に共有結合したブロッキング分子；
を含む、前記ブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項１０】
第一および第二の核酸鎖の３’端がブロッキング分子を含み、ブロッキング二本鎖核酸複合体が核酸ポリメラーゼと相互作用した際、それによって非特異的増幅産物が減少する、請求項９のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項１１】
複合体が約４８．９℃の融点を有する、請求項９のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項１２】
第一の配列または第二の配列が、１またはそれより多いウラシル塩基をさらに含む、請求項９のブロッキング二本鎖核酸複合体。
【請求項１３】
核酸増幅のための組成物であって；組成物が：
ａ．緩衝剤；
ｂ．請求項１のブロッキング二本鎖核酸複合体、および
ｃ．熱安定性ポリメラーゼ
を含む、前記組成物。
【請求項１４】
ポリメラーゼが、群：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＢＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ；およびＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ；からなるＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３の核酸増幅のための組成物。
【請求項１５】
濃度範囲が、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬごとに約２μＭ核酸複合体から、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬごとに２ｍＭ核酸複合体の間である、請求項１３の核酸増幅のための組成物。
【請求項１６】
緩衝剤が、ＴＲＩＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ、またはＨＥＰＥＳ緩衝剤を含む、請求項１３の核酸増幅のための組成物。
【請求項１７】
ターゲット核酸分子を増幅する方法であって：
ターゲット核酸分子をＤＮＡポリメラーゼおよび請求項１の二本鎖核酸複合体と接触させる工程を含む、ここで、二本鎖核酸複合体は、約２５℃〜約９０℃の範囲の温度でＤＮＡポリメラーゼに結合し；
増幅されたターゲット核酸分子を得て、そして１またはそれより多い非特異的増幅産物または二次産物が、二本鎖核酸複合体と接触させなかったものに比較した際、減少する
前記方法。
【請求項１８】
二本鎖核酸複合体と接触させなかったターゲット核酸分子に関するポリメラーゼ活性に比較した際、約２０℃〜２５℃の間の温度でのポリメラーゼ活性が減少する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
約５０％〜約９０％の間の範囲で、約２０℃〜２５℃の間の温度でのポリメラーゼ活性が減少する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
増幅されるターゲット核酸分子の量が、二本鎖核酸複合体と接触させなかった場合に得られるターゲット核酸分子の量と比較した際、増加する、請求項１７の方法。
【請求項２１】
得られる増幅されたターゲット核酸の量が、約２Ｘ〜約２０Ｘの間の範囲で増加する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
ターゲット核酸分子を増幅させる方法であって：
ターゲット核酸分子を、古細菌の種由来のＤＮＡポリメラーゼおよび請求項６の二本鎖核酸複合体と接触させる工程を含む、ここで、二本鎖核酸複合体は、約２５℃〜約９０℃の範囲の温度でＤＮＡポリメラーゼに結合し；
増幅されたターゲット核酸分子を得て、そして１またはそれより多い非特異的増幅産物または二次産物が、二本鎖核酸複合体と接触させなかったものに比較した際、減少する
前記方法。
【請求項２３】
二本鎖核酸複合体と接触させなかったターゲット核酸分子に関するポリメラーゼ活性に比較した際、約２０℃〜２５℃の間の温度でのポリメラーゼ活性が減少する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
約５０％〜約９０％の間の範囲で、約２０℃〜２５℃の間の温度でのポリメラーゼ活性が減少する、請求項２３の方法。
【請求項２５】
ターゲット核酸分子を増幅させる方法であって：
ａ．緩衝剤、ターゲット核酸分子、１またはそれより多いプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの供給、ならびに請求項１の二本鎖核酸複合体を混合し；
ｂ．１またはそれより多いサイクルで、温度を増加させることによって、ターゲット核酸分子の増幅を可能にする工程を含む、ここで、温度は、約２５℃〜約９０℃の範囲であり、
増幅されたターゲット核酸分子を得て、そして１またはそれより多い非特異的増幅産物または二次産物が、二本鎖核酸複合体と接触させなかったものに比較した際、減少する
前記方法。
【請求項２６】
二本鎖核酸複合体と接触させなかったターゲット核酸分子に関するポリメラーゼ活性に比較した際、約２０℃〜２５℃の間の温度でのポリメラーゼ活性が減少する、請求項２５の方法。
【請求項２７】
増幅されるターゲット核酸分子の量が、二本鎖核酸複合体と接触させなかったターゲット核酸分子と比較して、増加する、請求項２５の方法。
【請求項２８】
核酸増幅のためのキットであって；キットが：
ａ．請求項１のブロッキング二本鎖核酸複合体、および
ｂ．ポリメラーゼ
を含む、前記キット。
【請求項２９】
ポリメラーゼが、群：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＢＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ；およびＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ；からなるＤＮＡポリメラーゼである、請求項２８のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｐｉｃｏｎｅらによる、２００９年１１月６日に出願された米国仮出願第６１／２５８，６８４号、表題“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ａ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”の優先権を請求する。
【０００２】
上記出願が教示する事項の全体は、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドの核酸鎖への重合を触媒する酵素である。ポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅、すなわちＤＮＡ鎖をコピーするかまたは増幅するプロセスを含む、多様なＤＮＡ技術において用いられる。特定のＰＣＲ法に伴う大きな問題は、非特異的増幅産物の生成（例えば望ましくないＤＮＡ鎖の生成）である。多くの場合、これは、実際の熱サイクリング法自体の前の、副反応の非特異的オリゴヌクレオチド・プライミングおよび非ターゲット・オリゴヌクレオチドの産生、例えば、バックグラウンドＤＮＡのミスプライミングおよび／またはプライマー・オリゴマー化およびそれに続くプライマー伸張事象のためである。これはしばしば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが周囲温度で中程度に活性であるために起こる。
【０００４】
この問題を最小化するため、「ホットスタート」ＰＣＲとして知られる方法が実行可能である。ホットスタートＰＣＲにおいて、増幅反応に必須の１つの構成要素が、反応混合物から分離されているか、または反応混合物の温度が最初に上昇するまで、不活性状態で維持される。ポリメラーゼはこれらの条件下で機能不能であるため、プライマーが非特異的に結合可能である期間の間、プライマー伸張はより少ない。この効果を達成するため、いくつかの方法が適用されてきている：ＤＮＡポリメラーゼの物理的分離（例えば固形ワックスのバリアを用いて、ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物から分離する）、ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾（例えばＤＮＡポリメラーゼが可逆的に不活性化される）、以下：ポリメラーゼＤＮＡ抗体（例えば抗体は周囲温度で結合し、そして増幅中のより高い温度で解離する）、核酸添加物、アプタマー（例えばループ、シュードノット、および抗体のように働く複雑な三次構造を形成するヌクレオチドの一本鎖型）、ブロック化プライマー等、によるＤＮＡポリメラーゼ阻害、が適用されてきている。これらの方法のいくつかは、不都合であるか、または働かず、それと同時に、非特異的増幅を最小化することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、増幅プロセス自体の前だけでなく、熱サイクリング・プロセス中もまた、非特異的プライミングおよびプライマー伸張の阻害を可能にする、増幅反応のためのユニークでそして代替となる組成物および方法が存在する必要がある。より具体的には、ホットスタートＰＣＲのための代替となるそして改善された組成物および方法が存在する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核酸増幅において使用するためのブロッキング二本鎖核酸複合体（ＤＳＣ）に関する。１つの態様において、複合体には、単離二本鎖核酸分子であって、約９〜約４０核酸塩基の間を含む第一の配列を有する第一の核酸鎖、および第一の配列に相補的な約９〜約４０核酸塩基の間を含む第二の配列を有する核酸第二鎖を有する、ここで、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が各々３’端および５’端を有し、そして二本鎖核酸分子が約５０％〜約７０％の間の範囲のシトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）のパーセンテージを有する、前記二本鎖核酸分子が含まれる。二本鎖核酸複合体にはまた、第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、または両方の３’端または５’端に共有結合したブロッキング分子もまた含まれる。１つの側面において、二本鎖核酸分子（例えばＤＮＡ、またはＲＮＡ）は、約２５℃〜約９０℃の間の範囲の融点を有する。１つの態様において、本発明のＤＳＣには、ウラシル塩基の導入がさらに含まれる。１またはそれより多いウラシル塩基をＤＳＣに付加すると、古細菌の種由来のＤＮＡポリメラーゼを用いた際、室温でのポリメラーゼ活性がさらに減少する。特に、ＤＳＣの第一の配列または第二の配列は、１またはそれより多いウラシル塩基をさらに含む。
【０００７】
ブロッキング分子の例には、デオキシチミジン、ジデオキシヌクレオチド、３’リン酸化、ヘキサンジオール、スペーサー分子、１’２’−ジデオキシリボース、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および／またはロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。１つの態様において、ブロッキング分子は以下の構造を有する：
【０００８】
【化１】
2013509885.tif 000002
【０００９】
本発明はまた、核酸増幅において使用するためのブロッキング二本鎖核酸複合体であって；複合体が、単離二本鎖核酸分子であって、約９〜約４０核酸塩基の間を含む第一の配列を有する第一の核酸鎖、および第一の配列に相補的な約９〜約４０核酸塩基の間を含む第二の配列を有する核酸第二鎖を有する、ここで、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が各々３’端および５’端を有する、前記単離二本鎖核酸分子を含み、そして二本鎖核酸分子が約２５℃〜約９０℃の間の範囲の融点を有する、前記複合体にも関する。この態様には、第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、または両方の３’端または５’端に共有結合したブロッキング分子が含まれる。１つの側面において、第一の配列または第二の配列は、１またはそれより多いウラシル塩基をさらに含む。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明のブロッキング二本鎖核酸複合体は、以下の配列：配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはその組み合わせ；配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはその組み合わせの相補体；あるいは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはその組み合わせにハイブリダイズする配列の１つと約７０％より大きいかまたは約７０％に等しい同一性の第一の核酸配列を有する第一の核酸鎖を有する単離二本鎖核酸分子を含む複合体を有する。該複合体にはさらに、第一の核酸配列に相補的な約９〜約４０核酸塩基の間を含む第二の配列を有する第二の核酸鎖が含まれ、ここで、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖は各々３’端および５’端を有し、二本鎖核酸分子は約２５℃〜約９０℃の間の範囲の融点を有する。該複合体はまた、第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、または両方の３’端または５’端に共有結合したブロッキング分子も有する。１つの側面において、第一および第二の核酸鎖の３’端はブロッキング分子を含み、そしてブロッキング二本鎖核酸複合体が核酸ポリメラーゼと相互作用した際、それによって非特異的増幅産物が減少する。好ましい態様において、複合体は約４８．９℃の融点を有する。
【００１１】
本発明にはまた、核酸増幅のための組成物も含まれる。特定の態様において、組成物には、緩衝剤、本明細書記載のブロッキング二本鎖核酸複合体、および熱安定性ポリメラーゼが含まれる。ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＢＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ；またはＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼであってもよい。濃度範囲は、例えば、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬごとに約２μＭ核酸複合体から、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬごとに２ｍＭ核酸複合体の間であってもよい。緩衝剤は、ＴＲＩＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ、またはＨＥＰＥＳ緩衝剤であってもよい。ターゲット核酸分子を増幅する方法が、本発明にさらに含まれる。該方法には、ターゲット核酸分子をＤＮＡポリメラーゼおよび本明細書記載の二本鎖核酸複合体と接触させる、ここで、二本鎖核酸複合体は、約２５℃〜約９０℃の範囲の温度でＤＮＡポリメラーゼに結合する工程が含まれる。１またはそれより多い非特異的増幅産物または二次産物は、二本鎖核酸複合体と接触させなかったものに比較した際、減少する。二本鎖核酸複合体と接触させなかったターゲット核酸分子に関するポリメラーゼ活性に比較した際、室温（例えば約２０℃〜２５℃の間）でのポリメラーゼ活性は、約５０％〜約９０％の間の範囲で減少する（例えば約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少）。さらに、本発明の方法は、１つの側面において、より高い収量を提供する。特定の態様において、該二本鎖核酸複合体と接触させていないターゲット核酸分子に関して得られる量と比較した際、増幅されるターゲット核酸分子の量は、約２Ｘ〜約２０Ｘの間の範囲で増加する（例えば２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘまたは２０Ｘの増加）。方法が、古細菌の種由来のＤＮＡポリメラーゼおよび１またはそれより多いウラシル塩基を有するＤＳＣを利用する、さらに別の態様において、本明細書に記載するように、室温でのポリメラーゼ活性もまた減少する。
【００１２】
本発明によって具現化されるさらなる方法には、緩衝剤、ターゲット核酸分子、１またはそれより多いプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの供給、ならびに本明細書記載の二本鎖核酸複合体を混合することによって、ターゲット核酸分子を増幅する工程が含まれる。工程にはさらに、１またはそれより多いサイクルで、温度を増加させることによって、ターゲット核酸分子の増幅を可能にする工程も含まれ、ここで、温度は、約２５℃〜約９０℃の範囲である。該方法は、１またはそれより多い非特異的増幅産物または二次産物の産生が、該二本鎖核酸複合体と接触させなかったものに比較した際、減少することを可能にする。１つの態様において、本明細書にさらに記載するように、室温でのポリメラーゼ活性が減少し、そして／または収量増加が得られる。
【００１３】
本発明には、さらに、核酸増幅のためのキットが含まれる。こうしたキットまたは系には、本明細書記載のブロッキング二本鎖核酸複合体、およびポリメラーゼが含まれる。ポリメラーゼは、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＢＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ；またはＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼであってもよいＤＮＡポリメラーゼである。
【００１４】
好適には、請求する本発明は、ホットスタートＰＣＲ増幅プロセスを改善するための組成物および方法を提供する。具体的には、本発明は、増幅プロセス前およびプロセス中の非特異的プライミングおよびプライマー伸張を阻害する組成物を提供する。さらに、本発明は、驚くべきことに、有意な量の非特異的増幅産物を伴わずにＰＣＲ反応が起こることを可能にし、そしてＰＣＲを実行するための改善された組成物を提供する。
【００１５】
図面の簡単な説明
特許または出願ファイルは、着色された図を少なくとも１つ含有する。着色図を含むこの特許または特許出願刊行物のコピーは、要望があり、そして必要な料金の支払いがあれば、特許局によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｐＵＣ１９プラスミドの１．１ｋｂ領域の増幅を示す。レーン１および２には、それぞれＰＣＲ緩衝液ＩおよびＩＩ中での３’端キャップ化プライマーを用いた反応が含まれ、オリゴヌクレオチドの３’端で取り込まれた阻害性分子が、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を効果的に防止することを示す。レーン３および４は、増幅産物を生じる、非修飾プライマーを用いた反応を示す。レーンＭは、ＤＮＡ標準マーカーを示す。
【図２】図２は、反応プライマーとして同じ配列を有する、ブロッキング剤を含む二本鎖核酸分子の存在下および非存在下での、ｐＵＣ１９プラスミドの１．１ｋｂ領域のＰＣＲ産物増幅を示す。レーン１および２には、ＰＣＲ緩衝液Ｉ中で行った反応が含まれ、レーン３および４は、ＰＣＲ緩衝液ＩＩ中で行われた。レーンＭは、ＤＮＡ標準マーカーを示す。
【図３】図３は、ＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を例示する。すべての反応は、競合外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡとして、１ｎｇの大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを含有する。奇数レーンは、ラムダ・テンプレートＤＮＡを含み（レーン１１を除く）、一方、偶数レーンはテンプレートＤＮＡを含有しない。反応１１は、緩衝液Ｉ、ＤＮＴＰを有するが、ＤＳＣ分子、テンプレート、および酵素を含まない陰性対照である。レーンＭは、ＤＮＡ標準マーカーを示す。
【図４】図４は、ラムダＤＮＡからの１．９ｋｂ領域の増幅における比較を示す。レーン１〜４は、ＤＳＣ分子の存在下での、Ｔａｑ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ビバリー））およびＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（貯蔵緩衝液中の−および＋安定化剤）を含有する。レーン５〜７は、商業的に入手可能なホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。すべてのＰＣＲ反応をラムダＤＮＡおよび１ｎｇの混入大腸菌ゲノムＤＮＡの存在下で行った。レーンＭは、ＤＮＡ標準マーカーを示す。
【図５Ａ】図５ＡおよびＢは、ＤＳＣ分子の存在下でのラムダＤＮＡの１．９ｋｂ領域の増幅を強調する。Ａにおいて、順方向５’ＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１７）および逆方向５’ＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１８）プライマーを用いて；Ｂにおいて、順方向５’ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１９）および逆方向５’ＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。０．５２３ｐｇのラムダＤＮＡおよび１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行った。２つ組で反応を行った（図５Ａ中、レーン１および２、３および４；図５Ｂ中、レーン１および３、２および４）。
【図５Ｂ】図５ＡおよびＢは、ＤＳＣ分子の存在下でのラムダＤＮＡの１．９ｋｂ領域の増幅を強調する。Ａにおいて、順方向５’ＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１７）および逆方向５’ＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１８）プライマーを用いて；Ｂにおいて、順方向５’ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１９）および逆方向５’ＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。０．５２３ｐｇのラムダＤＮＡおよび１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行った。２つ組で反応を行った（図５Ａ中、レーン１および２、３および４；図５Ｂ中、レーン１および３、２および４）。
【図６】図６は、多様な融点（レーン１〜１０）および阻害性ブロッキング分子（レーン１５〜１７）を持つＤＳＣ分子の存在下での、ヒト胎盤ＤＮＡのβ−アクチン遺伝子の６５３ｂｐ断片の増幅を示す。
【図７Ａ】図７ＡおよびＢは、オリゴヌクレオチド混合物Ｂを用いたＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜３は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン４は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン５における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは１０００コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は０．４μＭである。図７Ａ中のＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。
【図７Ｂ】図７ＡおよびＢは、オリゴヌクレオチド混合物Ｂを用いたＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜３は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン４は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン５における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは１０００コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は０．４μＭである。図７ＢにおけるＰＣＲ増幅は、２３℃の周囲温度で２４時間インキュベーションした後、行われた。
【図８】図８は、オリゴヌクレオチド混合物Ｂを用いたＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜４は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン５は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン６における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。レーン１および３におけるＤＳＣ分子の最終濃度は０．４μＭであり、一方、レーン２および４におけるＤＳＣ分子の最終濃度は０．４μＭである。ＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。
【図９】図９は、オリゴヌクレオチド混合物Ｂを用いたＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を例示する。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。レーン１〜５におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。ＰＣＲ増幅は、２３℃の周囲温度で２４時間インキュベーションした後、行われた。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｃは、それぞれ、オリゴヌクレオチド混合物Ａ、Ｂ、およびＣを用いたＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣからの１００〜１２０ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのＰＣＲ増幅反応は５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。ＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｃは、それぞれ、オリゴヌクレオチド混合物Ａ、Ｂ、およびＣを用いたＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣからの１００〜１２０ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのＰＣＲ増幅反応は５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。ＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｃは、それぞれ、オリゴヌクレオチド混合物Ａ、Ｂ、およびＣを用いたＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣからの１００〜１２０ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのＰＣＲ増幅反応は５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。ＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃは、それぞれ、オリゴヌクレオチド混合物Ａ、Ｂ、およびＣを用いたＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。図７ＢにおけるＰＣＲ増幅は、２３℃の周囲温度で２４時間インキュベーションした後、行われた。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃは、それぞれ、オリゴヌクレオチド混合物Ａ、Ｂ、およびＣを用いたＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。図７ＢにおけるＰＣＲ増幅は、２３℃の周囲温度で２４時間インキュベーションした後、行われた。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、それぞれ、オリゴヌクレオチド混合物Ａ、Ｂ、およびＣを用いたＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。レーン１〜５は、異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅を示す。レーン６は、本発明のＤＳＣ分子の非存在下での増幅結果を示す。レーン７における増幅は、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われる。レーンＭはＤＮＡ標準マーカーを示す。すべてのレーンは５コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。各反応におけるＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである。図７ＢにおけるＰＣＲ増幅は、２３℃の周囲温度で２４時間インキュベーションした後、行われた。
【図１２】図１２は、ＣＹ５蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｃからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。１２８０〜５コピーのＤＮＡ  Ｃを含有する反応を、４つ組で行った。各コピーレベルに関する平均Ｃｔ値±標準偏差を示す。０．６を越える標準偏差を太字で示す。等式線に関するＲ二乗値とともに、全体のＰＣＲ効率もまた示す。結果を斜線の印で示す。
【図１３】図１３は、ＨＢＢ２オリゴ混合物を用いた、ヒト胎盤ＤＮＡからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。１２８０〜５コピーのＤＮＡ  Ｃを含有する反応を、４つ組で行った。各コピーレベルに関する平均Ｃｔ値±標準偏差を示す。０．６を越える標準偏差を太字で示す。等式線に関するＲ二乗値とともに、全体のＰＣＲ効率もまた示す。結果を斜線の印で示す。
【図１４Ａ】図１４ＡおよびＢは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する反応を、４つ組で行った。各コピーレベルに関する平均Ｃｔ値±標準偏差を示す。図１４Ａは、２．５ＵのＴａｑ−Ｂおよび０．４μＭ最終濃度のＤＳＣ１を含む２５μＬ反応における産物の増幅を示す。
【図１４Ｂ】図１４ＡおよびＢは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する反応を、４つ組で行った。各コピーレベルに関する平均Ｃｔ値±標準偏差を示す。図１４Ｂは、２．５ＵのＴａｑ−Ｂおよび０．２μＭ最終濃度のＤＳＣ１を含む５０μＬ反応における産物の増幅曲線を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｃは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する反応を、４つ組で行った。反応中のＤＳＣ５分子の最終濃度を、１ｘ〜２０ｘで示し、ここで１ｘは０．２μＭであり、そして２０ｘは４μＭである。１ｘのＤＳＣ１は、反応中の０．２μＭ最終濃度を示した。ＤＳＣ分子を含まないＴａｑ−ＢおよびＦａｓｔＳｔａｒｔもまた示した。図１５Ａは、各カテゴリーにおける各コピーレベルに関する平均Ｃｔ値を示す。全ＰＣＲ効率を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｃは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する反応を、４つ組で行った。反応中のＤＳＣ５分子の最終濃度を、１ｘ〜２０ｘで示し、ここで１ｘは０．２μＭであり、そして２０ｘは４μＭである。１ｘのＤＳＣ１は、反応中の０．２μＭ最終濃度を示した。ＤＳＣ分子を含まないＴａｑ−ＢおよびＦａｓｔＳｔａｒｔもまた示した。図１５Ｂは、Ｔａｑ−ＢおよびＦａｓｔＳｔａｒｔのみとともに、各Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ組み合わせに関する増幅曲線を例示する。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する反応を、４つ組で行った。反応中のＤＳＣ５分子の最終濃度を、１ｘ〜２０ｘで示し、ここで１ｘは０．２μＭであり、そして２０ｘは４μＭである。１ｘのＤＳＣ１は、反応中の０．２μＭ最終濃度を示した。ＤＳＣ分子を含まないＴａｑ−ＢおよびＦａｓｔＳｔａｒｔもまた示した。図１５Ｃは、各カテゴリーにおける各コピーレベルに関する最終振幅を示す。結果を斜線の印で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の好ましい態様の説明は以下の通りである。
本発明は、増幅反応において使用するための核酸複合体、該核酸複合体を用いる方法、ポリメラーゼおよび核酸複合体を含有する緩衝液、ならびに核酸複合体およびポリメラーゼを含有するキットに関する。本明細書に記載するように、本発明には、増幅反応を改善する核酸複合体が含まれる。核酸複合体は、ブロッキング分子を含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。本発明の核酸複合体はまた、二本鎖複合体（ＤＳＣ）としても知られる。
【００１８】
特に、本発明は、各鎖の末端でブロッキング分子に共有結合された短い二本鎖オリゴヌクレオチドで作製される核酸複合体を用いる。他の態様において、ブロッキング分子は、核酸複合体の任意の部分（例えば中央部分）に分散されるかまたは付着されていてもよい。核酸複合体は、ポリメラーゼに結合し、そして増幅反応の性能を増進させる。核酸リガンドは、増幅反応の性能を改善する一方、それ自体は、反応中、ターゲット配列または別の非特異的配列の増幅のためのプライマーとしては作用不能であるように注意深く設計される。
【００１９】
以下のいくつかの組み合わせ：ＤＳＣおよびその誘導体、多数のＤＮＡポリメラーゼ、多数のブロッキング分子、および多数の濃度の核酸複合体を用いて、実施例セクションに記載する、やはり詳述する実験を行った。本発明の方法および組成物は、他の核酸複合体および他のポリメラーゼと適合させて、核酸増幅反応の性能を改善させることも可能である。
【００２０】
本発明にしたがって、核酸複合体は、最高約９０℃の融点を有してもよい。核酸複合体に関する融点の範囲は、約２５℃より高く、例えば約４５℃〜約７５℃、または例えば約４５℃〜約５５℃（例えば約２５℃〜約９０℃の間の範囲）であってもよい。最も好ましい態様において、核酸複合体は、約４８．９℃の融点を有する。この融点範囲は、当業者に知られ、そして本明細書に示すような多様な増幅反応において有用である。
【００２１】
本明細書に援用される、Ｏｗｃｚａｒｚｙ，  Ｒ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００４  Ｍａｒ  ３０；４３（１２）：３５３７−５４、およびＯｗｃｚａｒｚｙ，  Ｒ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００８  Ｍａｙ  １３；４７（１９）：５３３６−５３に記載されるような計算を用いて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １７１０  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐａｒｋ，  Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ  ５２２４１  ＵＳＡによって提供されるような最近接熱力学的パラメータを用いて、核酸複合体の融点（Ｔｍ）を計算する。
【００２２】
核酸複合体は、多様な適用における使用のため、ある範囲の濃度を有してもよい。核酸複合体に関する濃度範囲は、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬに対して約２μＭ  ＤＳＣより大きく、最大では、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬごとに２ｍＭ  ＤＳＣであってもよい。より好ましくは、範囲は、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬに対して約２０μＭ  ＤＳＣから、最大では、ポリメラーゼ５，０００Ｕ／ｍＬごとに２００μＭ  ＤＳＣである。１つの態様において、ポリメラーゼに対するＤＳＣの最も好ましい濃度は、２００μＭ  ＤＳＣに対するＴａｑ約５，０００Ｕ／ｍＬである。
【００２３】
２倍連続希釈法を用いて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの比活性を測定した。減少グリセロール（５％）含有Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ貯蔵溶液中で、酵素希釈を作製し（［Ｔａｑ−Ｂ］ｆ＝０．００９〜０．０００１μｇ／μＬ）、そして１２．５μｇウシ胸腺ＤＮＡ、２５ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＣｉ／ｍＬ  ３Ｈ−ｄＴＴＰおよび２００μＭ  ｄＮＴＰを含有する５０μＬ反応に添加した。反応を７５℃で１０分間インキュベーションし、氷中に突っ込み、そしてＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｖ３，  ２００１，  ｐｐ．  Ａ８．２５−Ａ８．２６）の方法を用いて分析した。
【００２４】
本発明は、例えばブロッキング分子を伴う二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに由来する、新規単離核酸複合体、表１を提供する。核酸複合体は、バックグラウンドＤＮＡのミスプライミングおよび／またはプライマー・オリゴマー化などの副反応による、非特異的増幅産物の産生または非ターゲット・オリゴヌクレオチドの増幅を阻害する能力を示す。核酸複合体を含有する増幅反応は、ターゲット・オリゴヌクレオチドの産生を増進させることが見出された。さらに、表１の核酸複合体は、互いに３０％の配列同一性を有する。
【００２５】
表１
【００２６】
【表１】
2013509885.tif 000003
【００２７】
１つの態様において、本発明に含まれる好ましい核酸複合体の配列を表１に示す。表中で用いる略語は：「ＩｎｖＴ」＝反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）デオキシチミジン（ｄＴ）；「ホスホ」＝リン酸基である。核酸複合体は、多くの配列に類似性を示し、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０（１９９０））を用いた類似性検索において同定されるような、１未満のＥ値を有する。
【００２８】
用語「核酸複合体」および「二本鎖複合体」（ＤＳＣ）は、本明細書において、同じ意味を有し、そして交換可能に用いられる。
本発明はさらに、核酸複合体であって、長さ約１６ヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドが、いずれかの端に付着したブロッキング分子を伴い、最適な融点のための配列で作製される一方で、二本鎖核酸のいずれかの端で高いＧＣヌクレオチド・パーセンテージを有する、前記核酸複合体に関する。本発明は、以下の方式の１またはそれより多くで修飾されている核酸複合体に関する：増幅反応における伸長を防止する方式、非特異的増幅産物の産生を防止する融点を有する方式、いずれかの端で、ＡＴ結合より高い融点を有し、そしてその結果、核酸複合体を二本鎖としてよりよく維持可能であるＧＣを高いパーセンテージで有する方式。本発明はさらに、ブロッキング分子を伴う二本鎖核酸、およびポリメラーゼを含有する貯蔵緩衝液に関し；そしてまた、核酸複合体を含む反応緩衝液に関する。
【００２９】
二本鎖核酸複合体の増進された安定性によって、他のホットスタート法が使用不能（ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｖｅ）であろう条件下での使用が可能になるが、これは、該二本鎖核酸複合体が、上昇した温度で不可逆的に変性せず、それによって該核酸複合体を使用して、非特異的増幅産物を減少させることが可能な機会が増加するためである。例えば、多数の特異的プライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける増幅では、非特異的増幅産物に有利な状況が反応収量に負の影響を有するが、化学修飾タイプおよび抗体タイプのホットスタート法が、最初の変性加熱工程後に、大部分、非活性化される一方、本発明の核酸複合体は、反応混合物が非特異的プライミングに対して最も脆弱な時点である最初の数周期の増幅中に相互作用し続けるであろう。さらに、該核酸複合体を、限定されるわけではないが、多様な数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、長鎖ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ライゲーション仲介ＰＣＲ、およびメチル化特異的ＰＣＲで用いてもよい。
【００３０】
ホットスタートＰＣＲ反応において二本鎖核酸複合体を使用すると、驚くべきことに、所望のターゲット配列の増幅収量が改善される一方、また、望ましくない配列のオフ−ターゲット増幅が有意に減少する。これは、室温でのポリメラーゼ活性を減少させることによって達成され；以上はどちらも本明細書に開示するようなＤＳＣ技術を使用しない、典型的なホットスタートＰＣＲ反応に比較した場合である（実施例５および図１４〜１５を参照されたい）。１つの態様において、ホットスタートＰＣＲ反応におけるＤＳＣの使用は、収量の少なくとも２倍（２Ｘ）の改善を提供する。別の態様において、こうした使用は、収量の少なくとも５倍（５Ｘ）の改善を提供し、一方、別の態様において、こうした使用は、収量の７倍（７Ｘ）または１０倍（１０Ｘ）あるいはそれより高い改善を提供する。１つの態様において、収量の増加する量は、本発明の方法または組成物に供されていない増幅ターゲット核酸分子の量に比較した際、約２Ｘの増加から約２０Ｘの増加（例えば２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘまたは２０Ｘ増加）の範囲である。同様に、１つの態様において、ホットスタートＰＣＲ反応におけるＤＳＣの使用は、室温（例えば約２０℃〜約２５℃の間）でのポリメラーゼ活性における少なくとも５０％の減少を提供する。さらに別の態様において、こうした使用は、室温でのポリメラーゼ活性における少なくとも７０％の減少を提供し、一方、さらに別の態様において、こうした使用は、室温でのポリメラーゼ活性における８０％またはそれより高い減少を提供する。１つの側面において、本発明は、約２０℃〜２５℃の間の温度でポリメラーゼ活性の減少を提供し、ここで、減少は、ターゲット核酸分子が本発明のＤＳＣに供されていないポリメラーゼ活性に比較した際、約５０％〜約９０％の間（例えば約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の減少）の範囲である。ポリメラーゼ活性を評価するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、標識ヌクレオチド取り込みアッセイが含まれる。簡潔には、検出可能標識が核酸分子内に取り込まれることも可能であり、そしてアッセイを行って、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）の、例えば蛍光に基づく自動化配列決定装置上で、ポリメラーゼ活性を測定することも可能である。検出可能標識の例には、蛍光色素、ストレプトアビジン・コンジュゲート、磁気ビーズ、デンドリマー、放射標識、酵素、比色標識、ジゴキシゲニン、ビオチン、ナノ粒子、および／またはナノ結晶が含まれる。標識を取り込むための方法は、当該技術分野に知られる。ポリメラーゼアッセイを測定するためのいくつかのアッセイが存在する。一例には、上述のように、ＤＮＡポリメラーゼアッセイが、新鮮に合成されるＤＮＡ内に修飾ヌクレオチドを取り込むＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの能力を利用する、標識ヌクレオチド取り込みアッセイが含まれる。特定のアッセイは、放射性である一方、他のものは非放射性標識を用いる（例えばカタログ番号１  ６６９  ８８５  Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａ���  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）。最適化された比の標識ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって、同じＤＮＡ分子内に取り込まれる。ＤＮＡポリメラーゼ活性に関するパラメータとして、任意の数の検出法を用いて、合成されたＤＮＡの検出および定量化を評価することも可能である。
【００３１】
同様に、ＰＣＲ反応収量を評価するための方法が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法が含まれる。例えば、収量を標識してもよく、そしてＰＣＲの各サイクル後、リアルタイムＰＣＲ装置が、標識（例えば蛍光）のレベルを測定してもよい。既知の量の連続希釈（例えば未希釈、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲによって、産生される標準曲線に結果を比較することによって、収量を決定することも可能である。Ｎｏｌａｎ，  Ｔａｎｉａら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１５５９−１５８２（２００６）。
【００３２】
用語「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸張産物の合成が誘導される条件下で、ＤＮＡ合成の開始ポイントとして作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。
【００３３】
本発明の核酸複合体は、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。本発明の別の態様において、核酸複合体のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドまたは合成核酸分子で構成されていてもよい。修飾には、限定されるわけではないが、さらなる電荷、極性、水素結合、静電相互作用、および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込む他の化学基を核酸または核酸複合体全体に提供するものが含まれる。修飾には、限定されるわけではないが、主鎖修飾、メチル化、３’および５’修飾が含まれる。１つの側面において、ブロッキング分子は、修飾塩基、修飾糖、およびまたは修飾リン酸基を持つ１またはそれより多いヌクレオチド類似体を含む。
【００３４】
別の態様において、複合体の核酸は、例えば、限定されるわけではないが、無塩基性部分、反転無塩基性部分、反転ヌクレオチド部分、反転デオキシヌクレオチド３’・３’連結、二糖ヌクレオチド、ロックド核酸、２’−アミノピリミジン、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ボラノリン酸ヌクレオチド間連結、５修飾ピリミジン、４’−チオピリミジン、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結、を伴う修飾核酸である。
【００３５】
別の態様において、核酸複合体のヌクレオチドは合成オリゴヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドは、多様な分野で広く使用されており、例えば遺伝子操作を含む分子生物学において；療法において、例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチド用に；診断のために、そしてリボザイムとしての触媒を作製するために使用されてきている。例えば、ＰＣＲ技術は、遺伝物質の増幅のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドをルーチンに使用し、そして合成遺伝子は、効率的な発現のためにコドン使用を最適化することを含めて、多様な目的のために作製される。有用な合成オリゴヌクレオチドには、天然リボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドを含有するポリマー、ならびに塩基修飾、糖修飾およびリン酸基修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含有するポリマーが含まれる。
【００３６】
好ましくは、核酸複合体は、長さ約９〜４０ヌクレオチド、そしてよりさらに好ましくは長さ約１４〜２０ヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドで構成される。最も好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ１６〜１９ヌクレオチドである。
【００３７】
古細菌の種から単離されるＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、読み取るヌクレオチド配列中でウラシル（Ｕ）塩基と出会うと、しばしば、失速（活性が）する。例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９：５９６−６０２（２００２）；  Ｆｏｇｇら，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ９（１２）：９２２−９２７（２００２）を参照されたい。したがって、本発明にしたがって、本明細書に開示する二本鎖核酸複合体内に１またはそれより多いウラシル（Ｕ）塩基を導入すると、古細菌の種由来のＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、（ＰＣＲ反応開始前の）室温での望ましくないポリメラーゼ活性が有意に減少する。したがって、本発明の１つの態様において、本明細書に開示するような二本鎖核酸分子であるが、さらに少なくとも１つのウラシル（Ｕ）塩基をさらに含む、二本鎖核酸分子を提供する。別の態様において、本明細書に開示する方法は、こうしたウラシル塩基を含むＤＳＣ、および古細菌の種由来の少なくとも１つの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。１つの態様において、ホットスタートＰＣＲ反応におけるウラシル含有ＤＳＣのこうした使用は、室温でのポリメラーゼ活性において、少なくとも５０％の減少を提供する。さらに別の態様において、こうした使用は、室温でのポリメラーゼ活性において、少なくとも７０％の減少を提供し；一方、さらに別の態様において、こうした使用は、室温でのポリメラーゼ活性において、８０％またはそれより高い減少を提供する。１つの側面において、ウラシル含有ＤＳＣの本発明の使用は、約２０℃〜２５℃の間の温度でのポリメラーゼ活性減少を提供し、ここで、その範囲は、ターゲット核酸分子が本発明のＤＳＣに供されていない場合のポリメラーゼ活性と比較した際、約５０％〜約９０％の範囲である（例えば約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少）。ポリメラーゼ活性を評価するための方法は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、標識ヌクレオチド取り込みアッセイが含まれる。
【００３８】
本発明のＤＳＣは、少なくとも２つの阻害法を有すると考えられる。第一に、ＤＳＣは、反転ｄＴを伴わずに、そのままで、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤として有効に作用する。ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液において、ＤＮＡポリメラーゼは、本発明のＤＳＣに自然に結合するが、いくつかの二本鎖ＤＮＡ配列は、他のものより有効な阻害を提供するようである。Ｋａｉｎｚら  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：２７８−２８２（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０００）を参照されたい。第二に、ＰＣＲ反応が第一の周期を開始する際、ＤＳＣは、各鎖が分離する際に、ＤＮＡポリメラーゼから除去されることも可能であり、これは、反応温度がＤＳＣの融点を超えるためである。冷却されると、ＤＳＣの各鎖は、典型的には、再編成されて、その相補体とハイブリダイズし、この場合は、ＤＮＡポリメラーゼの重合活性を阻害する。しかし、ＤＳＣが偶然、ターゲット・テンプレートＤＮＡとハイブリダイズした場合でも、反転ｄＴの存在によって、ＤＮＡポリメラーゼが伸長してそして競合性二次産物を形成するのが有効に阻害されるであろうし、これは、ＤＮＡポリメラーゼがさらなるヌクレオチドを付加するために必要な３’ヒドロキシル基が、反転ｄＴには欠けているためである。さらに、反転ｄＴは、エキソヌクレアーゼから保護される。その異常な構造のため、エキソヌクレアーゼは、反転ｄＴを除去することが不可能であり、そうでなければ、反転ｄＴが分解されて、ＤＳＣが非特異的にアニーリングしてそしてＤＮＡ伸長のプライマーとして作用することが可能になるであろう。
【００３９】
１つの態様において、本発明の核酸分子は「単離」されており；本明細書において、「単離」核酸分子またはヌクレオチド配列は、通常ならば（天然に）（ゲノム配列におけるように）該遺伝子またはヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に隣接されておらず、そして／または他の転写される配列から完全にまたは部分的に精製されている、核酸分子またはヌクレオチド配列を意味するよう意図される。例えば、本発明の単離核酸は、天然に存在する複雑な細胞環境に関して、実質的に単離されていてもよい。いくつかの場合、単離物質は、組成物、緩衝系または試薬混合物の一部を形成するであろう。したがって、核酸複合体の単離核酸分子またはヌクレオチド配列には、化学的にまたは組換え手段によって合成された核酸分子またはヌクレオチド配列が含まれてもよい。また、単離ヌクレオチド配列には、溶液中の部分的にまたは実質的に精製された核酸分子が含まれる。
【００４０】
本発明には、１つの態様において、共有結合したブロッキング分子を含む配列番号１〜１６のいずれか１つの核酸配列；配列番号１〜１６のいずれか１つの隣接ヌクレオチドの約８０％〜約１００％の間を有する核酸配列；配列番号１〜１６のいずれか１つの約７〜約２０の間の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列；その相補体；およびその組み合わせを有する、単離核酸分子が含まれる。
【００４１】
本明細書において、用語「ＤＮＡ分子」または「核酸分子」には、センスおよびアンチセンス鎖両方、ｃＤＮＡ、相補ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、完全または部分的合成核酸分子、ＰＮＡおよび他の合成ＤＮＡ相同体が含まれる。ヌクレオチド「変異体」または「誘導体」は、該分子がＰＣＲ中の非特異的増幅を遮断する限り、１またはそれより多いヌクレオチド欠失、置換または付加を有する点で、引用されるヌクレオチド配列とは異なる配列である。
【００４２】
やはり本発明に含まれるのは、核酸配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡまたは他のＤＮＡ類似体であって、実質的にＤＮＡ配列に相補的であるものである。本明細書に定義するように、実質的に相補的な類似体または誘導体は、核酸が本発明の配列の正確な配列を反映する必要はないが、高ストリンジェンシー条件下で、配列が、本発明の核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にするために十分に類似でなければならないことを意味する。配列がＰＣＲ中の非特異的増幅を減少させるために十分な数の塩基を有するならば、例えば、非相補的塩基がヌクレオチド配列中に分散していてもよいし、あるいは配列が本発明の核酸配列よりも長くてもまたは短くてもよい。
【００４３】
別の態様において、本発明には、本明細書記載の任意の核酸分子の、そして好ましくは配列番号１〜１６の長さ少なくとも約７〜約２０（例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の隣接ヌクレオチドを含有する分子が含まれる。あるいは、本発明の分子には、本明細書記載の配列のいずれか１つの、そして好ましくは配列番号１〜１６の長さの約６０％〜約１００％の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列が含まれる。
【００４４】
本発明はまた、本明細書記載の核酸複合体の配列と実質的な同一性を有する核酸複合体にも関し；特に好ましいのは、本明細書記載のヌクレオチド配列と、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、そしてさらにより好ましくは９５％の同一性を有するヌクレオチド配列である。この例において特に好ましいのは、本明細書記載の核酸複合体の活性を有する核酸複合体である。
【００４５】
２つの核酸複合体の同一性パーセントを決定するため、最適比較目的のために配列を整列させる（例えば第一のヌクレオチド配列の配列中にギャップを導入してもよい）。次いで、対応するヌクレオチド位でヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位が第二の配列中の対応する位と同じヌクレオチドで占められる場合、分子はその位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、該配列によって共有される同一の位の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の位の数／位の総数Ｘ１００）。
【００４６】
本明細書記載の核酸複合体（例えば表１に示すような核酸複合体）は、増幅反応、例えばＰＣＲ中の非特異的増幅を減少させる際に有用である。一般的には、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ監修，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  １９９２）；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ，  １９９０）；  Ｍａｔｔｉｌａら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９，  ４９６７（１９９１）；  Ｅｃｋｅｒｔら，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，  １７（１９９１）；  ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら監修，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい。
【００４７】
用語「増幅する」は、特定のまたはターゲット・ポリヌクレオチドのコピー数を増加させることを指す。例えば、ＰＣＲは、ポリメラーゼ、および一方は増幅しようとする配列の一方の端で２つのポリヌクレオチド鎖の一方に相補的であり、そしてもう一方は他方の端で２つのポリヌクレオチド鎖のもう一方に相補的である２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ポリヌクレオチド配列を増幅するための方法である。新規に合成されるＤＮＡ鎖は、続いて、同じプライマー配列のためのさらなるテンプレートとして働きうるため、プライマー・アニーリング、鎖伸長、および解離の連続周期によって、所望の配列の迅速でそして非常に特異的な増幅が生じる。また、ＰＣＲを用いて、ＤＮＡ試料における定義された配列の存在を検出することも可能である。１つの態様において、ＰＣＲを用いて試料のＤＮＡを増幅するかまたは複製する。ＰＣＲ法は、当該技術分野に知られ、そして例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２５６：５６−６５（１９９０）に記載される。
【００４８】
簡潔には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用してＰＣＲを行い、そして該酵素には例えば、遺伝子操作された細菌から単離されるものが含まれる。好ましいポリメラーゼ酵素は、熱安定性生物、例えばサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来（Ｔａｑ）である。さらなるポリメラーゼが本明細書に記載され、そしてこれは、熱安定性古細菌ポリメラーゼを含む。プライマー、本発明のＤＳＣ複合体、および４つのヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）の供給とともに、ポリメラーゼを提供する。特定の条件下で（例えば９５℃３０秒間）、ＤＮＡを変性させて、鎖が分離するのを可能にする。ＤＮＡ溶液が冷却されるにつれて、プライマーがＤＮＡ鎖に結合し、そして次いで、溶液を加熱して、Ｔａｑポリメラーゼが効力を生じるのを促進する。Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２５６：５６−６５（１９９０）。
【００４９】
他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ４：５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１：１０７７（１９８８）を参照されたい）、転写増幅（Ｋｗｏｈら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９））、および自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：１８７４（１９９０））、および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。後者の２つの増幅法は、等温転写に基づく等温反応を伴い、これは増幅産物として、それぞれ約３０または１００対１の比で、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を生じる。
【００５０】
増幅されたＤＮＡを放射標識して、そしてライブラリーまたは他の適切なベクターをスクリーニングするためのプローブとして用いて、相同ヌクレオチド配列を同定してもよい。当該技術分野に認識される方法によって、対応するクローンを単離してもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ切除後にＤＮＡを得てもよく、そしてクローニングした挿入物をいずれかまたは両方の方向で配列決定して、適切な分子量のタンパク質をコードする正しいリーディングフレームを同定してもよい。例えば、本発明の相同核酸分子のヌクレオチド配列の直接分析は、ジデオキシ鎖終結法またはマクサム・ギルバート法のいずれかを用いて達成可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，  ＣＳＨＰ，  ニューヨーク  １９８９）；  Ｚｙｓｋｉｎｄら，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）を参照されたい）。これらのまたは類似の方法を用いて、タンパク質（単数または複数）および該タンパク質をコードするＤＮＡを単離し、配列決定し、そしてさらに性質決定してもよい。
【００５１】
また、本発明の核酸複合体を、ＲＮＡの増幅、例えば対応するｃＤＮＡの合成を含むｍＲＮＡの増幅法に用いてもよい。
さらなる態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼから選択される。古細菌の種由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、商業的に入手可能であり（例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）、そしてこれには、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００５２】
１つの態様において、核酸複合体は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに結合する。第二の態様において、核酸複合体は、ＤＮＡポリメラーゼには瞬間的にしか結合せず、ＤＮＡポリメラーゼは迅速に未結合となり、そして同じ核酸複合体または別の核酸複合体のいずれかに再結合する。別の態様において、核酸複合体は、核酸の融点未満の温度で、増幅反応における非特異的増幅産物の量を減少させる。別の態様において、核酸複合体は、増幅反応において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害させるＤＮＡ構築物であり、ここで、該ＤＮＡ構築物は、およそ５１．５℃の融点を有するか、または該ＤＮＡ構築物は、非特異的増幅産物の量を減少させる。
【００５３】
さらに、核酸複合体の核酸は、ブロッキング分子を含む。好ましい態様において、ブロッキング分子は、ポリメラーゼによる核酸複合体の伸長を防止する。別の態様において、ブロッキング分子は、特定のポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止する。ブロッキング分子を、核酸の５’または３’端のいずれに付着させてもよい。別の好ましい態様において、ブロッキング分子は、５’および／または３’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を提供する。最も好ましい態様において、ブロッキング分子は、３’末端に共有結合した反転デオキシチミジンであり、そして熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止し、そして３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供する。
【００５４】
１つの態様において、方法および試薬は、３’ヒドロキシル末端でブロッキングされた二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる。好ましい態様において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、ブロッキング分子でキャップ化された二本鎖オリゴヌクレオチドと組み合わせる。ブロッキング分子をオリゴヌクレオチドに共有結合させる。ブロッキング分子は、上昇した温度での増幅反応におけるインキュベーションによっては除去不能である。二本鎖オリゴヌクレオチドおよびブロッキング分子の組み合わせは、本明細書において、二本鎖複合体（ＤＳＣ）と称される。ブロッキング分子があるため、１つの態様において、ＤＳＣはいかなる混入３’エキソヌクレアーゼによっても分解されず、またはポリメラーゼによって核酸が伸長されることも不可能である。偶然、ＤＳＣの一本鎖が反応プライマーまたはテンプレートにハイブリダイズした場合でも、ブロッキング分子によって、ＤＳＣが意図されないプライマーとして作用してそして競合性混入産物を形成することが防止される。したがって、本発明は、核酸増幅反応の性能を改善するための手段を提供する。本発明は、限定されるわけではないが、ＤＮＡポリメラーゼに結合し、そして非特異的増幅産物の産生を防止する、二本鎖オリゴヌクレオチドで構成される核酸複合体に関する。二本鎖核酸複合体の各鎖はブロッキング分子を含み、該ブロッキング分子は、核酸複合体をエキソヌクレアーゼ分解から防御し、そしてまた、核酸複合体自体が非特異的オリゴヌクレオチド・プライミングの供給源となることも防止する。
【００５５】
ブロッキング分子は、ポリメラーゼによる核酸複合体の伸長を防止する任意の分子を含むように定義される。ブロッキング分子はまた、エキソヌクレアーゼ分解にも耐性であってもよい。さらなる好ましい態様において、ブロッキング分子は、ポリメラーゼによる伸長を防止するとともに、エキソヌクレアーゼによる切除も防止する。ブロッキング分子は、核酸複合体の３’または５’末端のいずれにも配置可能である。最も好ましい態様において、ブロッキング分子は反転ｄＴである。反転ｄＴは、デオキシチミジンの合成ヌクレオチドであり、該ヌクレオチドのリボース構造およびチミジン塩基間の結合は、標準的なデオキシチミジンから反転した位置にある：
【００５６】
【化２】
2013509885.tif 000004
【００５７】
ブロッキング分子の例には、限定されるわけではないが、デオキシチミジン、ジデオキシヌクレオチド、３’リン酸化、ヘキサンジオール、スペーサー分子、１’２’−ジデオキシリボース、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および核酸複合体の伸長を防止し、そして／またはエキソヌクレアーゼによる切除に対して耐性である、合成または天然分子が含まれる。
【００５８】
本発明はまた、貯蔵緩衝剤を含む溶液中に、本発明の単離核酸分子を含む、ＤＮＡ構築物にも関する。こうした貯蔵緩衝剤には、例えば、ＴＲＩＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ、またはＨＥＰＥＳ緩衝剤が含まれる。さらに、本発明は、本発明の核酸複合体およびＤＮＡポリメラーゼを含む貯蔵緩衝液にも関する。
【００５９】
したがって、本発明の核酸分子は、１つの態様において：
ａ）デオキシリボ核酸で構成される核酸；
ｂ）核酸中央にブロッキング分子を含む核酸；
ｃ）核酸のいずれかの端に付着したブロッキング分子を含む核酸；
ｄ）核酸の３’端に付着したブロッキング分子を含む核酸；
ｅ）非特異的増幅を減少させる核酸；
ｆ）表１由来の任意の配列の核酸配列を含む核酸；
ｇ）およそ４８．９℃〜５１．５℃の融点を有する核酸；
ｈ）およそ６４．３％のＧＣ含量を有する核酸；
ｉ）１またはそれより多い修飾ヌクレオチドを有する核酸；
ｊ）１またはそれより多い人工的核酸が含有される核酸；
ｋ）ブロッキング分子がスペーサー分子である核酸；
ｍ）ブロッキング分子が反転ヌクレオチドである核酸；
ｎ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）の断片または誘導体
からなる群より選択される、付着したブロッキング分子を含む二本鎖核酸構築物である。
【００６０】
別の態様において、本発明は、単離核酸自体、および多様な組成物中の単離核酸、例えば：
ａ）ＤＳＣ１の配列を含む核酸；
ｂ）ＤＳＣ１の核酸を含有する貯蔵緩衝液；
ｃ）ＤＳＣ１の核酸を含有する反応緩衝液；または
ｄ）ＤＳＣ１の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ構築物；および
ｅ）ａ）、ｂ）またはｃ）の断片または誘導体
に関する。
【００６１】
実施例１（図１）は、本発明のＤＳＣがＤＮＡポリメラーゼによる伸長を有効に防止することを立証する、ＰＣＲ増幅を記載する。オリゴヌクレオチドの３’端に取り込まれた阻害性分子は、未結合（ｆｒｅｅ）ヒドロキシル端をキャップ化し、産物増幅を生じない。
【００６２】
実施例１（図２）はまた、本発明のＤＳＣが、ｐＵＣ１９プラスミドの１．１ｋｂ領域の増幅成功を阻害しないことを立証する、ＰＣＲ増幅も記載する。順方向および逆方向反応プライマーと同じ配列を有する、キャップ化３’端を持つ二本鎖分子の存在は、反応結果を阻害しない。
【００６３】
実施例２は、標準的ＰＣＲ、商業的に入手可能なホットスタートＰＣＲ、およびマニュアルホットスタート条件を伴わない、本発明の二本鎖複合体の存在下のＰＣＲを含む、いくつかのＰＣＲ増幅を記載する。実施例２は、競合外来ＤＮＡとして、大腸菌ゲノムＤＮＡの存在下でのラムダファージＤＮＡの１．９ｋｂ領域の検出を記載する。
【００６４】
図３は、ＤＳＣ１、ＤＳＣ２、ＤＳＣ３、ＤＳＣ３−１分子の存在下でのＰＣＲ増幅の結果を例示する。奇数レーンにおいて、１０，０００コピーのラムダファージＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。すべての反応は、競合外来ＤＮＡとして、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを含有する。ＤＳＣ分子を添加しない反応では、産物の増幅は達成されなかった。レーン１、５、７においてＤＳＣ分子を添加した場合、産物増幅が達成され、そして収量には、非特異的増幅は含まれなかった。ＤＳＣ分子の存在によって、収量を損なうことなく、ターゲットバンドの検出が促進される。
【００６５】
図４は、ラムダＤＮＡからの１．９ｋｂ領域の増幅における比較を示す。すべてのＰＣＲ反応をラムダＤＮＡおよび１ｎｇの混入大腸菌ゲノムＤＮＡの存在下で行った。レーン１〜４は、ＤＳＣ分子の存在下で、ＴａｑおよびＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた産物増幅を例示する。Ｔａｑ−Ｂは、貯蔵緩衝液中に安定化剤を有する。レーン５〜７において、商業的に入手可能な化学修飾ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて、増幅を行った。ＤＳＣ分子の存在下での増幅産物の収量は、化学修飾Ｔａｑで得られる収量に匹敵するか、またはこれより大きい。
【００６６】
図５ＡおよびＢは、ＤＳＣ分子の存在下でのラムダＤＮＡの１．９ｋｂ領域の増幅を強調する。図５Ａにおいて、図３および４で用いるプライマーよりも低い融点を有する、順方向５’ＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１７）および逆方向５’ＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１８）プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。図５Ｂにおいて、図３および４で用いるプライマーよりも高い融点を有する、順方向５’ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１９）および逆方向５’ＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）プライマーを用いて、増幅を行った。０．５２３ｐｇのラムダＤＮＡおよび１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行った。反応条件は、９５℃５分間での最初の変性、その後、９５℃４０秒間、４８℃または６１℃いずれかの３０秒間、７２℃２分間を４０周期、７２℃７分間での最終伸長であった。結果は、産物の増幅が、ＤＳＣ１分子の存在下で達成されたことを示す。反応プライマーの融点、およびより低い／高い温度でのアニーリングは、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣの性能に影響を及ぼさなかった。
【００６７】
実施例３は、標準的ＰＣＲ、マニュアルホットスタートＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、およびＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲにおける、ヒト胎盤ＤＮＡのβ−アクチン遺伝子の６５３ｂｐ断片の増幅を記載する（図６）。通常のＰＣＲ下では、望ましいバンドの収量は、非特異的バンドの増幅によって損なわれる（図６、レーン１１）。
【００６８】
マニュアルホットスタート条件下では、収量は増加したが、ＰＣＲ特異性は増加しない（図６、レーン１２および１３）。化学修飾ポリメラーゼは特異的であり、そして頑強なバンドを増幅する（図６、レーン１４）。レーン１〜１０において、ＤＳＣ分子の融点は、各連続レーンにおいて、約５℃ずつ増加する。低融点のＤＳＣ分子の存在下で行った増幅では、望ましいバンドが低収量であることがわかった（図６、レーン１〜４）。中程度の融点のＤＳＣ分子の存在下で行った増幅の結果は、マニュアルホットスタート下での増幅で得られたものと類似である（図６、レーン５〜７）。高融点のＤＳＣ分子を付加すると、反応の特異性が増加し、そして頑強な所望のバンドが生じた（図６、レーン８〜１０）。ブロッキング分子の相違もまた、所望のバンドの増幅に影響を及ぼした。図６、レーン１６および１７で用いたＤＳＣ分子は、３’端で、異なるブロッキング分子でキャップ化されており、これがおそらく、反応の増幅成功に干渉した。
【００６９】
実施例４は、１０００コピー〜５コピーのＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣの１００〜１２０ｂｐ断片を増幅する、一連のＰＣＲ反応を記載する。標準ＰＣＲ下、化学修飾酵素を用いたホットスタートＰＣＲ下、および本発明のＤＳＣ分子の存在下の非ホットスタート条件下で、ＰＣＲ増幅を行った。セットアップ直後に行ったＰＣＲ増幅反応を、周囲温度で２４時間のインキュベーション期間後に行ったものに比較した。
【００７０】
図７Ａは、オリゴヌクレオチド混合物Ｂを用いたＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を示す。すべてのＰＣＲ増幅は、１０００コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する。図７Ａ中のＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。反応中に存在するＤＮＡの量は、収量を損なうことなく、ポリメラーゼが特異的に増幅するために十分である（図７Ａ、レーン１〜５）。すべてのレーンにおいて、所望の産物の増幅に対応する単一バンドが存在する。図７Ａにおけるセットアップ下、ホットスタート条件下でＰＣＲ増幅を行う必要はない。
【００７１】
図７Ｂにおいて、ＰＣＲ増幅は、２３℃の周囲温度で２４時間インキュベーションした後、行われた。通常のＰＣＲ条件下では、所望のバンドの増幅は、図７Ａ中のレーン４における同じ増幅に比較して、非常に減少する。本発明のＤＳＣ分子を反応に添加した際、結果は、明らかに異なる。反応中のＤＳＣ分子の存在は、増幅収量を改善する（図７Ｂ、レーン１〜３）。
【００７２】
図８は、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を例示する。すべてのＰＣＲ増幅は、５コピーのＤＮＡを用いて行われた。ＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。レーン１および３において、ＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭであり、一方、レーン２および４において、ＤＳＣ分子の最終濃度は０．４μＭである。より高濃度のＤＳＣは、増幅結果を阻害しない。どちらの濃度のＤＳＣを含有する反応も、優れた量の産物を増幅する。
【００７３】
図９は、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の増幅を例示する。すべてのＰＣＲ増幅は、５コピーのＤＮＡ  Ｂを用いて行われた。ＰＣＲ増幅は、周囲温度で２４時間、ベンチトップでインキュベーションした後、行われた。標準的ＰＣＲ条件下、インキュベーション期間によって、所望の産物の増幅成功が妨げられた（図９、レーン６）。レーン１〜５は、最終濃度４μＭの異なるＤＳＣ分子の存在下でのＰＣＲ増幅の結果を示す。ＤＳＣ１の存在下での増幅収量（図９、レーン１）は、化学修飾酵素で得られる収量（図９、レーン７）に匹敵する。ＤＳＣ５およびＤＳＣ１２で得られる収量（図９、レーン２および３）は、化学修飾酵素で得られる収量（図９、レーン７）より多い。ＤＳＣ１３およびＤＳＣ１４の存在下で行った増幅の結果は、標準的条件下でＰＣＲによって得られるものと類似である。
【００７４】
図１０Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＤＮＡ  Ａ〜Ｃからの１００〜１２０ｂｐ産物の増幅を例示する。すべてのＰＣＲ増幅は、５コピーのＤＮＡを用いて行われた。ＰＣＲ増幅は、ベンチトップでのプレインキュベーションを伴わず、セットアップ直後に行われた。ＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである（図１０Ａ〜Ｃ、レーン１〜５）。ＤＳＣの濃度がより高くても、増幅結果は阻害されない（図１０Ａ〜Ｃ、レーン１〜３）。これらの反応において、所望の産物の増幅に対応する単一バンドがある。ＤＳＣ１３およびＤＳＣ１４の存在下で行われるＰＣＲの結果は、産物増幅を生じず、これはおそらくこれらの長さのためである。標準的ＰＣＲ条件下で、所望の産物の増幅に対応する単一バンドがある（図１０Ａ〜Ｃ、レーン６）。ＰＣＲ増幅をセットアップ直後に行うため、ホットスタート条件下でＰＣＲを行う必要はなかった（図１０Ａ〜Ｃ）。
【００７５】
図１１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＤＮＡ  Ａ〜Ｃからの１００〜１２０ｂｐ産物の増幅を示す。すべてのＰＣＲ増幅は、５コピーのＤＮＡを用いて行われた。ＰＣＲ増幅は、２３℃で２４時間、ベンチトップでインキュベーションした後、行われた。ＤＳＣ分子の最終濃度は４μＭである（図１１Ａ〜Ｃ、レーン１〜５）。ＤＳＣ分子の非存在下で行われたＰＣＲ増幅の結果では、産物の増幅がなかった（図１１Ａ〜Ｃ、レーン６）。ＤＳＣ１３およびＤＳＣ１４の存在下で行われた増幅の結果は、非ホットスタート条件下のＰＣＲによって得られるものと類似である（図１１Ａ〜Ｃ、レーン５および６）。
【００７６】
図１１Ａにおいて、ＤＳＣ１およびＤＳＣ１２の存在下での増幅収量は、化学修飾ポリメラーゼで得られるものと類似である（図１１Ａ、レーン１、３および７）。ＤＳＣ５の存在下で得られる収量は増加している（図１１Ａ、レーン２）。
【００７７】
図１１Ｂにおいて、ＤＳＣ１の存在下での増幅は産物形成を生じない（図１１Ｂ、レーン１）。しかし、ＤＳＣ５およびＤＳＣ１２の存在下での増幅は、ターゲット産物に対応する単一バンドの検出を生じる（図１１Ｂ、レーン２および３）。
【００７８】
図１１Ｃにおいて、ＤＳＣ１、ＤＳＣ５、およびＤＳＣ１２の存在下での増幅は、化学修飾ポリメラーゼで得られるものに匹敵する収量の産物形成を生じる（図１１Ｃ、レーン１〜３）。しかし、ＤＳＣ５およびＤＳＣ１２の存在下での増幅は、ターゲット産物に対応する単一バンドの検出を生じる。
【００７９】
図１０および１１に例示するアッセイにおける本発明のＤＳＣ５の存在下での増幅は、最適な全体結果を提供する。
実施例５は、１２８０コピー〜５コピーのＤＮＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、およびヒト胎盤ＤＮＡの１００〜１２０ｂｐ断片を増幅させる、一連のｑＰＣＲ反応を記載する。標準的ＰＣＲ下、化学修飾酵素を伴うホットスタートＰＣＲ下、および本発明のＤＳＣ分子の存在下での非ホットスタート条件下で、ＰＣＲ増幅を行った。
【００８０】
図１２は、ＣＹ５蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｃからの１２０ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。並べた比較を行って、商業的に入手可能な化学修飾Ｔａｑに対してＴａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１を評価した。各反応におけるＤＳＣの最終濃度は０．４μＭである。１２８０〜５コピーのＤＮＡ  Ｃを含有するｑＰＣＲ増幅を、４つ組で行った。Ｔａｑ  ＤＳＣ１に関する平均Ｃｔ値は、各コピーレベルで、化学修飾Ｔａｑで得られるものより低い。標準偏差は、Ｔａｑ  ＤＳＣ１に関してわずかにより高く、１０コピーレベルで最高である。全ＰＣＲ効率およびＲ二乗値を伴ったものは、Ｔａｑ  ＤＳＣ１および化学修飾Ｔａｑの両方に関して匹敵する。
【００８１】
図１３は、ヒト胎盤ＤＮＡからのＨＢＢ２の１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。並べた比較を行って、商業的に入手可能な化学修飾Ｔａｑに対してＴａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１を評価した。各反応におけるＤＳＣ１の最終濃度は０．４μＭである。１２８０〜５コピーのヒト胎盤ＤＮＡを含有するｑＰＣＲ増幅を、４つ組で行った。Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１に関する平均Ｃｔ値は、各コピーレベルで、化学修飾Ｔａｑで得られるものより低い。標準偏差は、やはり、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１に関してわずかに低い。１０コピーで、化学修飾Ｔａｑは０．６の許容値より高い標準偏差を有し、一方、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１に関しては、これは５コピーで生じる。全ＰＣＲ効率およびＲ二乗値を伴ったものは、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１および化学修飾Ｔａｑの両方に関して匹敵する。
【００８２】
図１４ＡおよびＢは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。図１４Ａは、２．５ＵのＴａｑ−Ｂおよび０．４μＭ最終濃度のＤＳＣ１を含む２５μＬ反応における産物の増幅を示す。図１４Ｂは、２．５ＵのＴａｑ−Ｂおよび０．２μＭ最終濃度のＤＳＣ１を含む５０μＬ反応における産物の増幅曲線を示す。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する増幅反応を、４つ組で行った。反応体積を増加させることによって、各コピーレベルでの最終振幅が、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１および化学修飾Ｔａｑ両方に関して増加し、より少ない単位／ｍＬ酵素を使用する必要があることが示唆された。増加は、１０コピーレベルのＴａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１に関してより劇的である。これらの反応において（図１４Ａ）、図１４Ｂにおいては値が測定可能であるのに比較して、検出可能なＣｔ値はない（閾値未満の増幅）。
【００８３】
図１５Ａ〜Ｃは、ＨＥＸ蛍光色素による検出を用いた、ＤＮＡ  Ｂからの１００ｂｐ産物の形成のリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。１０００、１００、および１０コピーのＤＮＡ  Ｂを含有する反応を、４つ組で行った。このアッセイにおいては、Ｔａｑ−Ｂ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ１、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ５、および化学修飾Ｔａｑを用いて行ったｑＰＣＲ増幅を比較する。反応中のＤＳＣ５分子の最終濃度を、１ｘ〜２０ｘで示し、ここで１ｘは０．２μＭであり、そして２０ｘは４μＭである。ＤＳＣ１の最終濃度は０．２μＭである。
【００８４】
図１５Ａは、各コピーレベルに関して各酵素の組み合わせを用いることによって得られる平均Ｃｔ値を示す。１０コピーレベルで、ＤＳＣ分子を含まないＴａｑ−Ｂは検出可能なＣｔ値を持たない。ＤＳＣ分子の存在下で行われるｑＰＣＲ増幅は、化学修飾Ｔａｑで得られるものと匹敵する、測定可能なＣｔ値を有する。Ｃｔ値はまた、ＤＳＣ濃度増加に伴っても減少する。ＤＳＣ濃度を増加させると、より高いＰＣＲ効率が達成される。
【００８５】
図１５Ｂは、Ｔａｑ−ＢおよびＦａｓｔＳｔａｒｔのみとともに、各Ｔａｑ−Ｂ  ＤＳＣ組み合わせに関する増幅曲線を例示する。ＤＳＣ濃度を増加させるとより高い振幅が達成される。１０ｘでのＴａｑ−Ｂ  ＤＳＣ５配合は、化学修飾Ｔａｑの性能を超える。
【００８６】
図１５Ｃは、各コピーレベルでの各組み合わせに関する最終振幅を示す。全体として、１０ｘ濃度でのＤＳＣ５分子の存在下で、最適な性能が達成される。
句「本質的にからなる」または「本質的にからなること」は、本明細書記載の任意の態様において、請求する発明が働くかまたは作動するのに本質的であるかまたは必要とされる、請求する発明の要素を指す。例えば、１つの態様において、本発明のブロッキング二本鎖核酸複合体は、どちらも本明細書に記載するような、二本鎖核酸複合体およびブロッキング分子から本質的になる。同様に、本発明の組成物、方法、キットまたは系は、本明細書記載のＤＳＣとともに、やはり本明細書に記載するような、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの供給、ならびにプライマーから本質的になる。
【実施例】
【００８７】
実施例１
ｐＵＣ１９プラスミドの１．１ｋｂ領域を増幅する系を用いて、Ｔａｑ−Ｂポリメラーゼに触媒されるＰＣＲを行った（図１および２）。３’ＯＨ修飾を伴うおよび伴わないプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。１つのプライマーセットには、未結合３’ＯＨ基を有する５’−ＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＴ−３’（配列番号２１）および５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号２２）が含まれた。第二のプライマーセットにおいて、３’ＯＨ基の利用可能性は、反転ｄＴ修飾によってブロッキングされており、５’ＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣ／反転Ｔ／−３’（配列番号２３）および５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ／反転Ｔ／−３’（配列番号２４）であった。反応は、１ｘＰＣＲ緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  ＫＣ１、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．６）または１ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣ１、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０％グリセロール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．８）のいずれかを含有した。各反応は、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、各０．２μＭのプライマー、４ｎｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡ、および５ＵのＴａｑ−Ｂポリメラーゼを含有した。すべてのＰＣＲ反応は、２７２０  ＰＣＲサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上、１００μＬ体積で行われた。反応条件は以下の通りであった：９５℃３分間での最初の変性、その後、９５℃２０秒間、５５℃２０秒間、６８℃１分１５秒間を３５周期、６８℃７分間での最終伸長。ＰＣＲ後、２０μＬの各試料を１％アガロースゲル上に装填し、そしてＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ＨＰ、２４０１  Ｍｅｒｃｅｄ  Ｓｔ．  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，  ＣＡ  ９４５７７  ＵＳＡを用いて、ＵＶ光下で可視化した。Ｔａｑ−Ｂポリメラーゼ、パーツ番号Ｐ７２５Ｌは、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．  １００  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓｕｉｔｅ  ３３６Ｈ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ  ０１９１５  ＵＳＡより入手可能である。ＤＮＡ標準マーカーは、１ｋｂ  ＤＮＡラダー、カタログ番号Ｎ３２３２Ｓであり、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ２４０  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｒｏａｄ  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ  ０１９３８  ＵＳＡより入手可能であった。
実施例２
図３〜５に示す実験で用いるＰＣＲ増幅プロトコルには、１００μＬ反応体積中、１ｘＰＣＲ緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  ＫＣ１、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．６）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、および５ＵのＴａｑポリメラーゼが含まれた。各０．２μＭの順方向５’ＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’（配列番号２５）および逆方向５’ＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２６）プライマーを用いて、競合外来ＤＮＡとしての１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡの存在下、１０，０００コピーのラムダファージＤＮＡから１．９ｋｂ領域を増幅するＰＣＲ増幅を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０サーマルサイクラー上でＰＣＲ実験を行った。反応条件は、９５℃５分間での最初の変性、その後、９５℃４０秒間、５６℃３０秒間、７２℃２分間を４０周期、７２℃７分間での最終伸長であった。ＰＣＲ後、２０μＬの各試料を１％アガロースゲル上に装填し、そしてＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ＨＰを用いてＵＶ光下で可視化した。用いた商業的に入手可能なホットスタートＤＮＡポリメラーゼには、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．の一部門であるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ５７９１  Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ  Ｗａｙ  ＰＯ  Ｂｏｘ  ６４８２，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ  ９２００８  ＵＳＡより入手可能なＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ、パーツ番号Ｎ８０８０２４６や、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  ５０４１４，  ９１１５  Ｈａｇｕｅ  Ｒｏａｄ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ  ４６２５０−０４１４  ＵＳＡより入手可能なＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、カタログ番号１２０３２９０２００１が含まれた。ラムダＰＣＲプロトコルは、ＫｏｕｋｈａｒｅｖａおよびＬｅｂｅｄｅｖ（２００９）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８１：１２より適合され、そして該文献は、その全体が本明細書に援用される。
【００８８】
実施例３
図６において、ヒト胎盤ＤＮＡからβ−アクチン遺伝子の６５３ｂｐ断片を増幅した。すべての１００μＬ  ＰＣＲ反応は、１ｘＰＣＲ緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  ＫＣ１、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．６）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、各０．５μＭの順方向５’ＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号２６）および逆方向５’−ＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２６）プライマー、１００ｎｇのテンプレート、および５ＵのＴａｑポリメラーゼが含まれた。熱サイクリング条件は、９４℃２分間での最初の変性、その後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃４５秒間を３５周期、７２℃７分間での最後の伸長であった。ＰＣＲ後、２０μＬの各試料を１％アガロースゲル上に装填し、そしてＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ＨＰを用いてＵＶ光下で可視化した。β−アクチンのためのＰＣＲプロトコルは、Ｌｅｂｅｄｅｖら（２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：２０から適合され、そして該文献は本明細書に援用される。
【００８９】
実施例４
図７〜１１に示す実験で用いるＰＣＲ増幅プロトコルには、２５μＬ反応体積中、１ｘｑＰＣＲ緩衝液、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼが含まれた。１０００コピー〜５コピーで、それぞれＤＮＡ  Ａ、Ｂ、およびＣの１００〜１２０ｂｐ断片を増幅する、１ｘ各オリゴ混合物、Ａ−ＦＡＭ、Ｂ−ＨＥＸ、およびＣ−ＣＹ５を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。ｑＰＣＲ反応緩衝液中で、ＤＮＡターゲット連続希釈を調製した。ｄＮＴＰ、トレハロース、Ｔａｑ酵素およびオリゴ混合物を含有するアッセイ混合物をまず５μＬ最終体積で調製し、そこに２０μＬのターゲット混合物を添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０サーマルサイクラー上でＰＣＲ実験を行った。反応条件は、９５℃１０分間の最初の変性、その後、９５℃３０秒間、５６℃１分間を４０周期であった。ＰＣＲ後、２０μＬの各試料を３％アガロースゲル上に装填し、そしてＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ＨＰを用いてＵＶ光下で可視化した。ＤＮＡ標準マーカーは、１００ｂｐ  ＤＮＡラダー、カタログ番号Ｎ３２３１Ｓであり、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ２４０  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｒｏａｄ  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ  ０１９３８  ＵＳＡより入手可能であった。
【００９０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ検出を用いたリアルタイムＰＣＲ実験
実施例５
図１２〜１５に示す実験で用いるＰＣＲ増幅には、２５μＬ反応体積中、１ｘｑＰＣＲ緩衝液、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼが含まれた（図１４Ｂでは２５および５０μＬ反応体積）。１２８０コピー〜５コピーで、それぞれＤＮＡ  Ａ、Ｂ、Ｃおよびヒト胎盤ＤＮＡの１００〜１２０ｂｐ断片を増幅する、１ｘ各オリゴ混合物、Ａ−ＦＡＭ、Ｂ−ＨＥＸ、Ｃ−ＣＹ５、およびＨＢＢ２を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。ｑＰＣＲ反応緩衝液中で、ＤＮＡターゲット連続希釈を調製した。ｄＮＴＰ、トレハロース、Ｔａｑ酵素およびオリゴ混合物を含有するアッセイ混合物をまず５μＬ最終体積で調製し、そこに２０μＬのターゲット混合物を添加した。反応条件は、９５℃１０分間での最初の変性、その後、９５℃３０秒間、５６℃１分間を４０周期であった。
【００９１】
本明細書に引用するすべての参考文献、特許および／または特許出願の適切な解説は、その全体が本明細書に援用される。
本発明は、その特定の態様に関連して、具体的に示され、そして記載されてきているが、当業者には、付随する請求項に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細において多様な変化を作製可能であることが理解されるであろう。
【図２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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