(57)【要約】  本発明は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性を欠く酵母細胞系、特にピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において治療用タンパク質を製造するための方法および組成物に関する。ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２が欠失するようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を遺伝的に修飾することにより、ＤＡＰ活性は遺伝的に排除されている。
2013509181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性を欠く酵母宿主細胞における組換えタンパク質の製造方法であって、
ａ．ＤＡＰ活性が排除されている遺伝的に修飾された酵母細胞を、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、
ｂ．該タンパク質の発現を誘導する条件下、該形質転換宿主細胞を培養し、
ｃ．該形質転換宿主細胞または培地から該タンパク質を単離することを含む製造方法。
【請求項２】
該酵母細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酵母細胞ゲノムからのＳＴＥ１３およびＤＡＰ２遺伝子の欠失または破壊によりＤＡＰ活性が排除されている、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
該宿主細胞が、ヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１記載の酵母。
【請求項５】
該ヒト様Ｎ−グリカンが、ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンからなる群から選択される、請求項４記載の酵母。
【請求項６】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように該宿主細胞が遺伝的に操作されている、請求項１記載の酵母。
【請求項７】
該酵母が更に、ヒト糖タンパク質を発現する、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２をコードするゲノムＤＮＡが酵母細胞ゲノムから欠失または破壊されている酵母細胞系を含む、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性を欠く遺伝的に修飾された酵母細胞。
【請求項９】
該酵母細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項８記載の酵母細胞。
【請求項１０】
該宿主細胞が、ヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項６記載の製造方法。
【請求項１１】
該ヒト様Ｎ−グリカンが、ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンからなる群から選択される、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように該宿主細胞が遺伝的に操作されている、請求項６記載の製造方法。
【請求項１３】
該タンパク質がヒト糖タンパク質である、請求項６記載の製造方法。
【請求項１４】
Ｎ末端認識部位Ｘａａ−ＰｒｏまたはＸａａ−Ａｌａ（ここで、Ｘａａはいずれかのアミノ酸を表す）を有する治療用タンパク質の、酵母細胞における製造方法であって、
ａ．ＤＡＰ活性が排除されている遺伝的に修飾された酵母細胞を、Ｘａａ−ＰｒｏおよびＸａａ−Ａｌａからなる群から選択されるＮ末端認識部位を有する該治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、
ｂ．該治療用タンパク質の発現を誘導する条件下、該形質転換宿主細胞を培養し、
ｃ．該形質転換宿主細胞から該治療用タンパク質を単離することを含む製造方法。
【請求項１５】
該酵母細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１６】
酵母細胞ゲノムからのＳＴＥ１３およびＤＡＰ２の欠失または破壊によりＤＡＰ活性が排除されている、請求項１４または１５記載の製造方法。
【請求項１７】
該宿主細胞が、ヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１８】
該ヒト様Ｎ−グリカンが、ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンからなる群から選択される、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように該宿主細胞が遺伝的に操作されている、請求項１４記載の製造方法。
【請求項２０】
該タンパク質がヒト糖タンパク質である、請求項１４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物治療用物質として有用である糖タンパク質の、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性を有さない酵母細胞系における製造のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は組換えタンパク質の製造のための重要な生産媒体である。酵母は真核生物であるため、それは、分泌経路で生じる翻訳後修飾の多くを含め、より高等な真核生物のものと共通の進化的過程を共有している。糖操作における最近の進歩は、ヒトにおける糖タンパク質の過程によく似た一連の酵素反応を可能にする遺伝的に修飾されたグリコシル化経路を有する酵母株ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞系を生み出している。例えば、ヒト対応物と実質的に同一である組換え糖タンパク質の、下等真核宿主細胞における製造方法を記載している米国特許第７，０２９，８７２号および第７，３２６，６８１号を参照されたい。前記方法からピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されるようなヒト様シアル酸化二分岐複合体Ｎ−結合グリカンは治療用糖タンパク質の製造のための有用性を実証している。
【０００３】
高等真核生物と同様に、酵母も多数のプロテアーゼを発現し、それらのうちの多くは分泌経路に局在化し、あるいはそれを通過してそれらの最終目的地へと向かう。その結果、幾つかの組換えタンパク質の望ましくないタンパク質分解が生じる可能性があり、該特異的切断は、関与するプロテアーゼのクラスに左右される。ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）は、タンパク質のＮ末端から２つのアミノ酸ペプチドを除去するタンパク質分解酵素のクラスである。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、酵素ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２の遺伝子がＤＡＰ活性を有するものとして特定されている。Ｊｕｌｉｕｓら，Ｃｅｌｌ，３２：８３９−８５２，１９８３；Ｒｅｎｄｕｅｌｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９：４０４１−４０４８，１９８７を参照されたい。本出願者は、完全長治療用タンパク質の製造を可能にする、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＤＡＰ活性の排除のための方法を開発した。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概括
１つの実施形態においては、本発明は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性を欠く酵母細胞系における治療用タンパク質の製造方法である。この実施形態は、ＤＡＰ活性が排除されている遺伝的に修飾されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を、該治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、該形質転換細胞を培養して該治療用タンパク質を得ることを含む。ＤＡＰ活性は、ＳＴＥ１３、ＤＡＰ２およびＤＰＰＩＩＩが欠失または破壊されるようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を修飾することにより排除されうる。もう１つの実施形態においては、ＤＡＰ活性は、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２が欠失または破壊されるようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を修飾することにより排除される。
【０００５】
１つの実施形態においては、本発明は、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２の欠失により組換え的に修飾されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を含む、治療用タンパク質の製造に使用されうる、ＤＡＰ活性を欠く遺伝的に修飾された酵母細胞系である。
【０００６】
更に他の実施形態においては、本発明は、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ、すなわち、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合した腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲＩＩ）のエクトドメインを含む組換え融合タンパク質（ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ）、または顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）の分泌血漿形態を含む組換えＧＣＳＦポリペプチドのような、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からの治療用タンパク質の製造方法である。
【０００７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる「ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性」または「ＤＡＰ活性」なる語は、ＳＴＥ１３、ＤＡＰ２またはＤＰＰＩＩＩと称される遺伝子により産生されるポリペプチドの酵素的切断を意味する。
【０００８】
本明細書中で用いる「ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性の排除」または「ＤＡＰ活性の排除」なる語は、ＳＴＥ１３、ＤＡＰ２またはＤＰＰＩＩＩと称される遺伝子により生じる酵素活性の非存在を意味する。
【０００９】
本明細書中で用いる「治療用タンパク質」なる語は、動物またはヒトにおける疾患または状態を治療するための治療用物質として使用されうる完全長（すなわち、非トランケート化形態）の生物学的に活性なポリペプチドを意味する。本明細書中で用いられるこの用語の具体例としては、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲＩＩ）とＩｇＧ１のＦｃ領域（Ｆｃ）とを含む融合タンパク質ＴＮＦＲＩ−Ｆｃ、および組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質が挙げられる。
【００１０】
本明細書中で用いる「Ｎ末端認識部位」なる語は、モチーフＸ−ＰｒｏまたはＸ−Ａｌａ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｎ末端に対して２番目の位置はプロリンまたはアラニンである）のＮ末端配列を有するポリペプチドを意味する。
【００１１】
本明細書中で用いる「糖操作（された）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株」なる語は、ヒト糖タンパク質を発現するように操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。代表的な株には、ＹＪＮ２０１（Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ，１００（９）：５０２２−５０２７，２００３）；ＹＳＨ４４（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１（５６３７）：１２４４−１２４６，２００３）；ＲＤＰ３６−１（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（４）：１−９，２００４）；ＰＢＰ６−５（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（９）：７５７−７６６，２００４）；ＹＳＨ５９７（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３（５７９２）：１４４１−１４４３，２００６）が含まれる。
【００１２】
本明細書中で用いる「野生型株」なる語は、遺伝子ＳＴＥ１３、ＤＡＰ２またはＤＰＰＩＩＩがゲノムから改変、破壊または欠失されていない糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。
【００１３】
本明細書中で用いる「欠失株」なる語は、機能性ＤＡＰ活性を排除するために１つ、２つ又は全てのＤＡＰ遺伝子（すなわち、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２およびＤＰＰＩＩＩ）のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ホモログがゲノムレベルで修飾されている糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。これは、該遺伝子（プロモーター、オープンリーディングフレームおよびターミネーターを含む）の完全または部分的な欠失、該遺伝子またはコード化ｍＲＮＡのそれぞれ転写または翻訳を改変する１以上の突然変異の導入、および該タンパク質活性を不活性化する１以上の突然変異の導入を含むが、これらに限定されるものではない。そのような欠失株の一例はＹＧＬＹ８０８４である。
【００１４】
本明細書中で用いる「欠失または破壊された」および「欠失または破壊」なる語は、酵母細胞ゲノムから産生される酵素の活性の抑制を意味し、該酵素活性の抑制は、基質タンパク質が無傷Ｎ末端を保有するまでのものに限られる。酵母宿主細胞において該酵素活性が阻害または破壊されうる具体例としては以下のものが含まれる（それらに限定されるものではない）、１）該遺伝子の発現を制御する上流または下流調節配列の欠失または破壊（これらに限定されるものではない）；２）該遺伝子を非機能性にする、該酵素活性をコードする遺伝子の突然変異（ここで、「突然変異」は、該遺伝子に関する酵素活性を不能にする該遺伝子内への欠失、置換、挿入または付加を含む）；３）化学的インヒビター、ペプチドインヒビターまたはタンパク質インヒビターによる該酵素活性の阻害または破壊；４）核酸に基づく発現インヒビター（例えば、アンチセンスＤＮＡおよびｓｉＲＮＡ）による該酵素活性の阻害または破壊；５）転写インヒビター、または該酵素活性をコードする遺伝子の発現を制御もしくは調節する調節因子の発現もしくは活性のインヒビターによる該酵素活性の阻害または破壊；および６）得られる産物が、たとえ発現されたとしても、該分泌タンパク質と同一ではない、および機能が低下している、いずれかの手段。
【００１５】
略語
以下の略語が本明細書に全体において使用される。
ＵＲＡ５：オロタートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴアーゼ）アイソザイム
ＳｃＳＵＣ２：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ
ＯＣＨ１：アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ
ＫｌＧｌｃＮＡｃＴｒ：ケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体
ＢＭＴ２：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース排除）
ＭＮＮ４Ｂ：ＭＮＮ４Ａ様遺伝子（電荷排除）
ＭｍＧｌｃＮＡｃＴｒ：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ
ＰＮＯ１：Ｎ−グリカンのホスホマンノシル化（電荷排除）
ＭＮＮ４Ａ：マンノシルトランスフェラーゼ（電荷排除）
ＡＤＥ１：Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボチドシンテターゼ
ＭＮＳ１：ＳｃＳＥＣ１２リーダーに融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン
ＧｎＴＩ：ＰｐＳＥＣ１２リーダーに融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン
ＨＩＳ１：ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ
ＧａｌＴＩ：ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化ヒトガラクトシルトランスフェラーゼ１触媒ドメイン
ＧａｌＥ：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ
ＵＤＰ−ＧａｌＴｒ：ＵＤＰ−ガラクトース輸送体
ＡＲＧ１：アルギノスクシナートシンテターゼ
ＭＮＳＩＩ：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン
ＧｎＴＩＩ：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン
ＰＲＯ１：ガンマ−グルタミルキナーゼ
ＴｒＭＮＳ１：ＳｃαＭＡＴに融合した分泌性ティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）マンノシダーゼＩ触媒ドメイン
ＡＯＸ１：アルコールオキシダーゼＩ
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ：ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したヒト腫瘍壊死因子受容体ＩＩ
Ｚｅｏ：ゼオシン耐性マーカー
ＳＴＥ１３：ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＤＡＰ２：ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＤＰＰＩＩＩ：ジペプチジルアミノペプチダーゼ
Ｎａｔ：ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性マーカー。
【００１６】
酵母における治療用タンパク質の製造
ヒトまたは他の動物から単離されるタンパク質の大部分はグリコシル化されている。治療に使用されるタンパク質のうちの約７０％はグリコシル化されている。治療用タンパク質が酵母のような微生物宿主において産生され、内在性経路を用いてグリコシル化される場合、典型的には、その治療効力は著しく低下する。それにもかかわらず、そのような糖タンパク質はヒトにおいて免疫原性であり、投与後のインビボにおける半減期の減少を示す（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：Ｓ２９−Ｓ３５，１９９７）。
【００１７】
ヒトおよび動物における特定の受容体は末端マンノース残基を認識し、血流からの該タンパク質の迅速なクリアランスを促進しうる。他の有害作用には、タンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識またはアレルゲン性の変化が含まれうる。したがって、グリコシル化のパターンが、ヒトまたは意図される被投与種において生じるものと同じ又は少なくとも類似した動物宿主系において治療用糖タンパク質を産生させることが必要である。ほとんどの場合、哺乳類宿主系、例えば哺乳類細胞培養が使用される。使用される系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、トランスジェニック動物、植物または昆虫細胞が含まれる。そのような系において発現される組換えヒトタンパク質には更に、非ヒトグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）が含まれうる（Ｒａｊｕら，Ａｎｎａｌｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８３（２）：１２３−１３２，２０００）。これらの系の全ては重大な欠点を有する。それらの欠点には、ある治療用タンパク質だけが動物または植物系における発現に適していること、該細胞培養系は典型的には非常に遅いこと、タンパク質収率が微生物発酵法に比べて低く、複雑で高価な栄養または添加物を要しうること、またはそのような系は汚染されやすいことが含まれる（これらに限定されるものではない）。
【００１８】
したがって、適当な発現の欠如は、あらゆる治療用糖タンパク質の製造に対する障害となっている。微生物の発酵による糖タンパク質の製造は、高濃度のタンパク質の迅速な製造、無菌の十分に制御された製造条件または化学的に規定された増殖培地が使用可能であること、多種多様なタンパク質の発現が可能であること、および該治療用タンパク質の容易な回収（これらに限定されるものではない）を含む、既存の系に比べた場合の利点をもたらすであろう。しかし、前記のとおり、細菌系は真核生物のようにはグリコシル化治療用タンパク質を産生しない。その目的のために、ヒト糖タンパク質を産生する遺伝的に修飾されたグリコシル化経路を有する酵母細胞系、特にピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が開発されている。例えば、対応ヒト対応物と実質的に同一である組換え糖タンパク質の、下等真核宿主細胞における製造方法を記載している米国特許第７，０２９，８７２号および第７，３２６，６８１号ならびにＵＳ  ２００６−０２８６６３７を参照されたい。前記方法によりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されるようなヒト様シアル酸化二分岐複合Ｎ−結合グリカンは治療用糖タンパク質の製造のための有用性を示している。
【００１９】
前記ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系は、タンパク質を治療用物質としての使用に適したものにするヒト様グリコシル化パターンを有するタンパク質を産生しうるが、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における治療用タンパク質の発現は必ずしも、完全長ポリペプチドの産生をもたらさない。酵母発現系を効率的に使用するためには、治療用タンパク質をトランケート化するタンパク質分解のような望ましくない酵素活性が排除される必要がある。
【００２０】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を欠くピチアにおける治療用タンパク質の製造方法
酵母細胞系ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から分泌される組換え融合タンパク質ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃのペプチド配列（その配列は図３（配列番号３）に示されている）の分析は、産生されるペプチドの全てがＮ末端において２アミノ酸だけトランケート化されていたことを示した。本出願人は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系における２つの遺伝子ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２が全てのＤＡＰ活性を排除し、完全長ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの産生をもたらすことを確認した。出願人はまた、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が第３のジペプチジルアミノペプチダーゼＤＰＰＩＩＩを有することを確認している。したがって、１つの実施形態においては、本発明は、ＤＡＰ活性を欠く酵母細胞系における治療用タンパク質の製造方法である。この実施形態は、ＤＡＰ活性が排除された遺伝的に修飾されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、該形質転換宿主細胞を培養して、該治療用タンパク質を産生させることを含む。ＤＡＰ活性は、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２および／またはＤＰＰＩＩＩが欠失または破壊されるようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を修飾することにより排除される。本発明の特定の実施形態においては、ＤＡＰ活性は、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２が欠失または破壊されるようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を修飾することにより排除された。
【００２１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２遺伝子が欠失または破壊され全ての生じるＤＡＰ活性が排除されるように組換え的に修飾されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を含む、治療用タンパク質の製造に使用される酵母細胞系である。
【００２２】
更に他の実施形態においては、本発明は、ポリペプチドのＮ末端に対して２番目の位置にアミノ酸プロリンまたはアラニンを有する治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載されているＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質またはＧＣＳＦタンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からの製造方法である。
【００２３】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性
ポリペプチドのアミノ末端から２つのアミノ酸をトランケート化することが知られているプロテアーゼのサブクラスであるジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）の活性に関連した遺伝子が酵母において特定されている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非接合性アルファ−細胞突然変異体は、アルファ接合因子フェロモンの不完全なプロセッシングによるものであると考えられている（Ｊｕｌｉｕｓら，Ｃｅｌｌ，３２（３），８３９−５２，１９８３）。更に、Ｓｔｅ１３ｐ活性を欠損したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）突然変異株をスクリーニングすることにより、第２のジペプチジルペプチダーゼＤａｐ２ｐが特定された（Ｓｕａｒｅｚ  ＲｅｎｄｕｅｌｅｓおよびＷｏｌｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９（９），４０４１−４８，１９８７）。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＴＥ１３のピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ホモログのノックアウトが、Ｎ末端にアミノ酸ＨＧ（Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）を有するタンパク質のインビボでのタンパク質切断を妨げ、完全長インスリン指向性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドの産生を可能にしたことも報告されている（Ｍｅｌａｒｋｏｄｅら，ＷＯ  ２００７／１４８３４５；Ｐｒａｂｈａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６４，１５５−１６１，２００９）。逆に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＡＰ２ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ホモログの破壊はＮ末端タンパク質分解切断を妨げなかった（Ｍｅｌａｒｋｏｄｅら，ＷＯ  ２００７／１４８３４５；Ｐｒａｂｈａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６４，１５５−１６１，２００９）。
【００２４】
Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐは、モチーフＸ−Ｐ／Ａ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、２番目の位置はプロリン（Ｐ）またはアラニン（Ａ）である）を有するＮ末端ペプチドを切断することが別々に示されている（ＭｉｓｕｍｉおよびＩｋｅｈａｒａ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｖｍｅｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１９１０−１９１１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２００４）。本発明を例示するために本明細書中で用いるＴＮＦＲＩＩ−ＦｃおよびＧＣＳＦタンパク質は、保存されたＸ−Ｐｒｏ  Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐモチーフに合致しており、このことは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における治療用タンパク質の製造のためには、Ｓｔｅ１３ｐまたはＤａｐ２ｐのＤＡＰ活性が排除される必要があることを示唆している。これとは対照的に、Ｍｅｌａｒｋｏｄｅら，ＷＯ  ２００７／１４８３４５のインスリン指向性ペプチドは、Ｓｔｅ１３ｐのみにより認識されるＨｉｓ−Ｇｌｙモチーフを有する新規非保存性Ｎ末端を有する。
【００２５】
本出願人により本明細書中で示されているとおり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｓｔｅ１３ｐ活性の排除はＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質に対するＤＡＰ活性の部分的低下をもたらしたに過ぎず、産生されたＴＮＦＲＩＩ−ＦＣタンパク質の半分より幾らか多くが完全長配列を有していた。驚くべきことに、本出願人は、ＤＡＰ活性の完全な排除、すなわち、完全長ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質の１００％の産生のためには、Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐの両方の活性がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系から排除される必要があることを見出した。同様に、両方のＤＡＰ遺伝子がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から排除された場合にのみ、本出願人は組換えＧＣＳＦタンパク質の完全な産生を観察した。したがって、Ｎ末端Ｘ−Ｐ／Ａモチーフを有する完全長タンパク質の産生のためにはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＳｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐ活性の両方の排除を要する点で本発明は先行技術とは異なる、と当業者は認識し理解するであろう。
【００２６】
公知ＤＡＰ遺伝子における相同性に基づいて、当業者はＰＣＲプライマー（それらの具体例を表１に示す）を設計し、あるいは標的生物のＤＮＡライブラリーにおけるホモログを特定するためのプローブとして遺伝子または遺伝子断片を使用することが可能である。ＤＡＰ活性を有するホモログを特定するためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムの本出願人の分析は、それぞれＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２（図８Ａおよび８Ｂ、配列番号３７および３８、ならびに図９Ａおよび９Ｂ、配列番号３９および４０）と称される、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２のホモログの特定をもたらした。Ｍｅｌａｒｋｏｄｅら，ＷＯ  ２００７／１４８３４５は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＥ１３ホモログのＤＮＡ配列を記載しており、一方、Ｐｒａｂｈａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６４：１５５−１６１，２００９は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐホモログのタンパク質配列を記載している。出願人により本発明において作製されたＳｔｅ１３ｐホモログは、Ｍｅｌａｒｋｏｄｅらにおいて既に報告されているものに合致しているようである。本出願人により本発明において作製されたＤａｐ２ｐタンパク質配列の大部分は、Ｐｒａｂｈａらにより報告されているものに合致しているが、本明細書中に特定されているＤａｐ２ｐホモログはＣ末端において異なる。本出願人のホモログは以下のＣ末端配列を含有する：ＧＬＥＮＹＤＩＨＶＦＰＤＳＤＨＳＩＲＹＨＮＧＮＶＩＶＹＤＫＬＦＨＷＩＲＲＡＦＫＡＧＫ（配列番号４６）。一方、Ｐｒａｂｈａらのホモログは以下のＣ末端配列を有する：ＧＬＥＮＹＤＩＨＶＦＰＤＴＩＰＬＤ（配列番号４７）。前記Ｃ末端配列の下線部分までの及びそれを含むＮ末端配列は両方のホモログにおいて保存されている。
【００２７】
表１は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるノックアウトベクターの作製に使用される代表的プライマーの配列を示す。該プライマー配列における下線領域は、遺伝子ノックアウト断片の作製を促進するために導入された制限酵素認識部位を表す。導入された特異的制限酵素認識部位が隣のプライマー説明の欄に挙げられている。表２は、表１におけるプライマーを使用して作製されたノックアウトベクターでの形質転換の後のゲノムからのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２のノックアウトを確認するために使用されるプライマーを示す。該５’および３’プライマーセットが所望のサイズのＰＣＲ産物を与え、該ノックアウトプライマーセットが産物を与えない場合に、欠失の成功が確認される。
【００２８】
【表１】
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2013509181.tif 000005
【００２９】
【表２】
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ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃで観察されるＮ末端トランケート化に関するこれらの遺伝子のそれぞれの役割を評価するために、ゲノムのＤＡＰ２またはＳＴＥ１３遺伝子座の破壊に該ベクターを標的化するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２またはＳＴＥ１３遺伝子の５’および３’領域を有する、ＵＲＡ５遺伝子を含有するノックアウトベクターを設計した（図１Ａおよび１Ｂ）。これらのノックアウトベクターを、組換え融合タンパク質ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを発現する同じｕｒａマイナス親株（ＹＧＬＹ７４０６）内に形質転換した。該形質転換体のＰＣＲスクリーニングの後、Ｐｐｓｔｅ１３およびＰｐｄａｐ２ノックアウト株（それぞれＹＧＬＹ８０８４およびＹＧＬＹ８０９０）を特定した。二重ノックアウト株、すなわち、同じ株におけるＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２の両方のノックアウト体を作製するために、Ｐｐｓｔｅ１３欠失株ＹＧＬＹ８０８４をＰｐＤＡＰ２ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）ドミナントマーカーノックアウトベクターｐＧＬＹ５０１９（図１Ｄ）で形質転換した。該形質転換体のＰＣＲスクリーニングの後、Ｐｐｓｔｅ１３：：ＵＲＡ５バックグラウンド親株において幾つかのＰｐｄａｐ２ノックアウト体を得た。代表的なＰｐｓｔｅ１３／Ｐｐｄａｐ２二重ノックアウト株をＹＧＹ８０９６と命名した。
【００３０】
これらの株のそれぞれから分泌されたＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃのペプチド分析は、このポリペプチドのタンパク質分解においてＳｔｅ１３ｐは重要な役割を果たしているが、ＤＡＰ活性を排除するためには両方のＤＡＰ遺伝子の欠失が必要であることを示している。該野生型株では、産生されるタンパク質の１００％がＮ末端において２アミノ酸だけトランケート化された。ＳＴＥ１３の単一欠失は、無傷Ｎ末端を有するペプチド集団を５９％を与え、一方、ＤＡＰ２の欠失は、無傷ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの集団を与えたが、それは遥かに低い度合であり、該分泌ポリペプチドの１５％しか完全長配列を有していなかった。二重ノックアウト株ＹＧＬＹ８０９６から分泌されたＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの分析は、該ペプチド集団の１００％が無傷Ｎ末端を有することを示した。表３は、単離された完全長ペプチドに対するトランケート化ペプチドのモル％を示すこの分析から得られたデータの要約である。データは各株に関する３つの重複サンプルの代表例である。ｕｒａマイナス株は組換えタンパク質の不良分泌体であるため、ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２遺伝子がどちらも妨げられていない株から物質を産生させるためにＹＧＬＹ７４０６の原栄養性親株ＹＧＬＹ６６４６を使用した。この株の遺伝子型は、無傷ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２遺伝子座の両方に関して野生型として表３に記載されている。
【００３１】
【表３】
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この分析に基づいて、本出願人は、ＰｐＳｔｅ１３ｐおよびｐｐＤａｐ２ｐが、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現される組換えＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのＮ末端タンパク質分解に関与する唯一のプロテアーゼであり、ＤＡＰ活性を排除するためには両方の欠失が必要であると判定した。同様に、野生型顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）ポリペプチド（図５におけるタンパク質配列；配列番号６）がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現された場合、そのＮ末端はトランケート化されていた。この物質のＮ末端配列決定は、それがＮ末端の２アミノ酸を欠くことを示した（図４Ａおよび４Ｂ、それぞれ配列番号４および５）。また、ＧＣＳＦのこのトランケート化形態の産生は、二重ΔＰｐｓｔｅ１３／Ｐｐｄａｐ２ノックアウトバックグラウンドにおいてＧＣＳＦを産生させることにより完全に排除された（図６）。どちらの場合にも、これらの組換えタンパク質（ＴＮＦＲＩＩ−ＦｃおよびＣＳＦ）の切断は、該ポリペプチドの（Ｎ末端に対して）２番目の位置のプロリン残基のＣ末端において生じる。本明細書に示されているとおり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における両方のＤＡＰ関連遺伝子の欠失は、ポリペプチドのＮ末端から２番目の位置にプロリンを有する治療用タンパク質のトランケート化を妨げ、ＤＡＰ活性の排除のためにはｐｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２のその欠失が必要であった。
【００３２】
前記のどちらの治療用タンパク質の例もＮ末端モチーフＸａａ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸でありうる）を有する。前記のとおり、Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐは、モチーフＸａａ−Ａｌａ（ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、アラニン（Ａｌａ）は２番目のアミノ酸である）を同様に有するＮ末端ペプチドを切断することが別々に示されている（ＭｉｓｕｍｉおよびＩｋｅｈａｒａ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１９１０−１９１１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２００４）。Ｘａａ−Ａｌａモチーフを有するタンパク質のトランケート化を防ぐためにはＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２の両方のノックアウトが必要であることを実証するために、当業者は、ＴＮＦＲ−Ｆｃの分泌形態における２番目のアミノ酸をプロリンからアラニンへと突然変異させることが可能である。本明細書における結果に基づけば、ＰｐＳＴＥ１３またはＰｐＤＡＰ２の欠失が、観察されるＮ末端切断の比率を減少させるらしい。ＤＡＰ活性の完全な排除および生じる１００％の無傷タンパク質は二重ΔＰｐｓｔｅ１３／Ｐｐｄａｐ２ノックアウト宿主株（すなわち、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２の両方をノックアウトするための突然変異）のみから観察されるであろう。
【００３３】
ＰｐＳｔｅ１３ｐおよびＰｐＤａｐ２ｐの組合せ排除は、無傷Ｎ末端を有する治療用タンパク質の産生を示しているが、本出願人は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が、本明細書中でＰｐＤＰＰＩＩＩと称される第３のジペプチジルアミノペプチダーゼを有することを見出した。この酵素はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムのアノテーションにより特定され、ヒト酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（ＤｐｐＩＩＩｐ）に対して４３％の配列同一性を有する。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤｐｐＩＩＩｐホモログは未だ特徴づけられていないが、ＰｐＳｔｅ１３およびＰｐＤａｐ２ｐとは配列レベルで異なり、それぞれ１０％および１２％の配列同一性を有するに過ぎない。このＤＡＰ遺伝子は完全には特徴づけられていないが、ＰｐＤｐｐＩＩＩｐが、適切な条件下で発現されると、本明細書において評価されている条件下で活性が観察されないにもかかわらず、トランケート化タンパク質を与える、と本出願人は考えている。他の増殖条件下または他のレポータータンパク質との発現により、ＰｐＤｐｐＩＩＩｐ活性が証明されうる、と当業者は認識し理解するであろう。したがって、他の適当な条件またはレポーターにおいて、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＤＡＰ活性を完全に排除するためには、ＰｐＤｐｐＩＩＩが単独で或いはｐｐＳｔｅ１３ｐおよび／またはＰｐＤａｐ２ｐ活性と共に欠失または排除される必要がありうる。当業者であれば、本明細書の実施例に記載されている方法、特に実施例５の方法により、ｐｐＤＰＰＩＩＩを欠失または破壊させることが可能であろう。
【００３４】
ＤＡＰ活性の排除のためのピチア株
商業的に入手可能な任意のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株、例えばＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，カタログ番号７６２７３）が本発明に使用可能であるが、好ましい実施形態においては、本発明に使用される株は、糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株、例えば、実施例３に記載されているＧＳ５．０株、または後記の糖操作された株（これは、発現に際してヒト様グリコシル化プロファイルを与える修飾を含む）であろう。例えば、実施例３のＧＳ５．０株の場合、そのような修飾には、Δｏｃｈ１、Δｐｎｏ１、Δｍｎｎ４Ｂ、Δｂｍｔ２およびΔｕｒａ５の欠失、またはケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）およびエム・ムスクルス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、エム・ムスクルス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）α−１，２−ＭｓｎＩ、ホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ１活性、アール・ノルベギクス（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＭｎｓＩＩ活性、エス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）Ｇａｌエピメラーゼ、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体およびホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の挿入のために行われるものが含まれる。ＧＳ５．０株は、ガラクトースを末端とするＮ−グリカン、例えばＧａｌＧｌｃＮＡｃ２ＭＡＮ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはそれらの混合物を有する糖タンパク質を産生しうる。他の代表的な糖操作株には、ＹＪＮ２０１（Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ，１００（９）：５０２２−５０２７，２００３）、ＹＳＨ４４（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１（５６３７）：１２４４−１２４６，２００３）、ＲＤＰ３６−１（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（４）：１−９，２００４）、ＰＢＰ６−５（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｏｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（９）：７５７−７６６，２００４）、ＹＳＨ５９７（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３（５７９２）：１４４１−１４４３，２００６）が含まれる。
【００３５】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に加えて、本発明において有用な宿主細胞には、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２およびＳＴＥ１３遺伝子のホモログを発現する酵母が含まれる。そのような酵母は以下のものから選択されうる：ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）。種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が細胞培養に特に適している。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。
【００３６】
酵母は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質を発現するように、遺伝的に修飾されうる。このようにして、特定の所望のグリコフォームが組成物において優勢である糖タンパク質組成物が製造されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または該宿主細胞を遺伝的に操作し、および／または外在性酵素を供与して、哺乳類グリコシル化経路の全部または一部を模擬することにより（ＵＳ  ２００４／００１８５９０に記載されているとおり）、それは達成されうる。所望により、該グリコシル化の追加的遺伝的操作を行って、該糖タンパク質が、コアフコシル化を伴って又は伴わないで産生されうるようにすることが可能である。下等真核宿主細胞の使用は更に有利である。なぜなら、これらの細胞は糖タンパク質の高度に均一な組成物を産生することが可能であり、該糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％超（すなわち、３０モル％を超えて）で存在することが可能となるからである。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％超、５０モル％超、６０モル％超、７０モル％超、最も好ましくは８０モル％超で存在しうる。
【００３７】
酵母は、該グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように、遺伝的に修飾されうる。ヒト様またはヒト化Ｎ−グリカンには、ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンの両方が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国公開出願第２００４／００１８５９０に記載されているとおり、選択された内因性グリコシル化酵素を排除し、および／または外因性酵素を供給することにより、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が喪失するよう選択され又は操作されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または外在性酵素を供与することにより（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ  ２００４００１８５９０に記載されているとおり）、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くように選択または操作されうる。
【００３８】
１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。
【００３９】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ハイブリッドＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００４０】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、複合ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００４１】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、複合ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００４２】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、複合ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ１）もしくは複合Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ２）グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生させることが可能である。
【００４３】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、複合ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくは複合ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生する。該宿主細胞は、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００４４】
前記宿主細胞はいずれも、米国公開特許出願第２００４／０７４４５８号および第２００７／００３７２４８号に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ  ＩＩＩ）および／または多分岐（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩおよびＧｎＴ  ＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。
【００４５】
更に詳細な実施形態においては、ハイブリッドＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ハイブリッドＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生する。
【００４６】
更に詳細な実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ハイブリッドＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生する。
【００４７】
種々の前記宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体［例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体］、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体［例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体］およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含む。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。
【００４８】
宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）の１以上を欠失させ又は破壊することにより、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を排除するように米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）、ならびにホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失させ又は破壊することにより、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するように（米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）、遺伝的に操作された下等真核細胞［例えば、酵母、例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）］が含まれ、これは、更に詳細な実施形態においては、ＭＮＮ４Ａ遺伝子の欠失または破壊をも含みうる。破壊は、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームの破壊、あるいは該オープンリーディングフレームの発現の破壊、あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用する、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳の阻害を含む。該宿主細胞は更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかを含みうる。
【００４９】
宿主細胞は更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ［Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子］（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）の１以上を欠失させ又は破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ２００７０６１６３１に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはアルファ−マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞［例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）］を含む。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームの破壊、あるいは該オープンリーディングフレームの発現の破壊、あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用する、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳の阻害を含む。該宿主細胞は更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかを含みうる。
【００５０】
Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用されうるベンジリデンチアゾリジンジオンの具体例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。
【００５１】
特定の実施形態においては、少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失される。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失され、あるいは該宿主細胞は１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養される。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞は１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼをも発現する。
【００５２】
ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占有を低減することにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるアルファ−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占有および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、個々の異種糖タンパク質（例えば、抗体）は種々の度合の効率で発現されゴルジ装置から輸送される可能性があり、したがって、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびアルファ−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せを要しうるため、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびアルファ−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。もう１つの態様においては、１以上の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与と組合されることが可能であり、あるいは分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与の代わりに行われうる。
【００５３】
したがって、該宿主細胞は、糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾された任意の宿主細胞であることが可能であり、この場合、該主要Ｎ−グリカンは、複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択され、ここで、複合Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡＣ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され、ハイブリッドＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され、高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される。Ｎ−グリカン構造の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ３Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ４Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【００５４】
以下の実施例においては、糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を排除するために修飾した。一般に、Ｓｔｅ１３ｐおよび／またはＤａｐ２ｐ活性は、本明細書に記載されている方法を用いて、任意のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株から排除されうる。ただし、選択に使用されるマーカーが該株と共に使用されうる。あるいは、選択を可能にする別の栄養要求性またはドミナントマーカーが代用されうる。例えば、ベクターｐＧＬＹ５０１８（実施例２Ｃ）および選択マーカーとしてのナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）を使用して、商業的に入手可能な株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０からＳＴＥ１３を欠失させることが可能である。後記のＤＡＰ２ノックアウトベクター（実施例２Ｂ）のいずれのマーカーもＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０に和合性でないため、ｐＡＧ３２から１６５４ｂｐのＨｙｇマーカーを増幅するためにプライマーＳＨ８０６およびＳＨ８０７（表１）の斜字表示断片に対応するプライマー（それぞれ配列番号４８および配列番号４９）を使用してｐＡＧ３２（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ，１５（６）：５０７−５１１，１９９９；Ｅｒｒａｔｕｍ：Ｙｅａｓｔ，１５（１２）：１２９７，１９９９）からヒグロマイシン標識ベクターを作製することが可能である。ついで、この後者の断片を、ｐＧＬＹ５０１９の作製に関する実施例２Ｃに記載されているとおりに、ＤＡＰ２  ５’およびＤＡＰ２  ３’フランキング領域に融合させることが可能である。ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）での消化の後、該ベクターをＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０またはそのｓｔｅ１３ノックアウト誘導体内に形質転換し、ヒグロマイシン含有プレート上で選択して、それぞれ単一ｄａｐ２Δまたは二重Δｓｔｅ１３／ｄａｐ２ノックアウト株を得ることが可能である。本明細書に記載されている方法を用いてＤｐｐＩＩＩｐジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を排除するために修飾された糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を当業者がどうのようにして使用しうるのかに関する一例も示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】図１は、本発明における方法において使用されるベクターの図示である。Ｕｒａ５標識ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ノックアウトベクターが、それぞれ図１Ａおよび１ＢにｐＧＬＹ４５２０およびｐＧＬＹ４５２１として示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）標識ベクターが、それぞれ図１Ｃおよび１ＤにｐＧＬＹ５０１８およびｐＧＬＹ５０１９として示されている。形質転換体におけるノックアウト断片を切り出すために用いられるＳｆｉＩ制限部位が下線で示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２フランキング領域が黒で太く表示されている。
【図１Ｂ】図１は、本発明における方法において使用されるベクターの図示である。Ｕｒａ５標識ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ノックアウトベクターが、それぞれ図１Ａおよび１ＢにｐＧＬＹ４５２０およびｐＧＬＹ４５２１として示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）標識ベクターが、それぞれ図１Ｃおよび１ＤにｐＧＬＹ５０１８およびｐＧＬＹ５０１９として示されている。形質転換体におけるノックアウト断片を切り出すために用いられるＳｆｉＩ制限部位が下線で示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２フランキング領域が黒で太く表示されている。
【図１Ｃ】図１は、本発明における方法において使用されるベクターの図示である。Ｕｒａ５標識ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ノックアウトベクターが、それぞれ図１Ａおよび１ＢにｐＧＬＹ４５２０およびｐＧＬＹ４５２１として示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）標識ベクターが、それぞれ図１Ｃおよび１ＤにｐＧＬＹ５０１８およびｐＧＬＹ５０１９として示されている。形質転換体におけるノックアウト断片を切り出すために用いられるＳｆｉＩ制限部位が下線で示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２フランキング領域が黒で太く表示されている。
【図１Ｄ】図１は、本発明における方法において使用されるベクターの図示である。Ｕｒａ５標識ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ノックアウトベクターが、それぞれ図１Ａおよび１ＢにｐＧＬＹ４５２０およびｐＧＬＹ４５２１として示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）標識ベクターが、それぞれ図１Ｃおよび１ＤにｐＧＬＹ５０１８およびｐＧＬＹ５０１９として示されている。形質転換体におけるノックアウト断片を切り出すために用いられるＳｆｉＩ制限部位が下線で示されている。ＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２フランキング領域が黒で太く表示されている。
【図２Ａ】図２は、酵母におけるＤＡＰ活性に関連したＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのＮ末端切断の図示である。図２Ａは無傷分泌性ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（配列番号３）の７個のＮ末端アミノ酸（配列番号１）を示し、図２Ｂは該トランケート化産物の５個のＮ末端アミノ酸（配列番号２）を示す。矢印は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＤａｐ２ｐおよびＳｔｅ１３ｐの両方により認識される切断部位を示す。
【図２Ｂ】図２は、酵母におけるＤＡＰ活性に関連したＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのＮ末端切断の図示である。図２Ａは無傷分泌性ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（配列番号３）の７個のＮ末端アミノ酸（配列番号１）を示し、図２Ｂは該トランケート化産物の５個のＮ末端アミノ酸（配列番号２）を示す。矢印は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＤａｐ２ｐおよびＳｔｅ１３ｐの両方により認識される切断部位を示す。
【図３】図３は、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲＩＩ）とＩｇＧ１  Ｆｃ領域（Ｆｃ）とを含む融合タンパク質ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３）である。
【図４Ａ】図４は、酵母におけるＤＡＰ活性に関連したＧＣＳＦのＮ末端切断の図示である。図４Ａは無傷分泌性ＧＣＳＦ（配列番号６）の７個のＮ末端アミノ酸（配列番号４）を示し、図４Ｂは該トランケート化産物の５個のＮ末端アミノ酸（配列番号５）を示す。矢印は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＤａｐ２ｐおよびＳｔｅ１３ｐの両方により認識される切断部位を示す。
【図４Ｂ】図４は、酵母におけるＤＡＰ活性に関連したＧＣＳＦのＮ末端切断の図示である。図４Ａは無傷分泌性ＧＣＳＦ（配列番号６）の７個のＮ末端アミノ酸（配列番号４）を示し、図４Ｂは該トランケート化産物の５個のＮ末端アミノ酸（配列番号５）を示す。矢印は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＤａｐ２ｐおよびＳｔｅ１３ｐの両方により認識される切断部位を示す。
【図５】図５は組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＳＣＦ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）である。
【図６】図６は、ＳＴＥ１３遺伝子もＤＡＰ２遺伝子も欠失も破壊もされていないピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生されたＧＣＳＦ、すなわち、ＤＡＰ切断による低分子量ＧＣＳＦ（レーン２７〜２９）、ならびにそれと比較されている、Ｓｔｅ１３ｐおよびＤａｐ２ｐ活性が排除されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された無傷高分子量ＧＣＳＦ産物（レーン３２〜３４）のウエスタンブロットの表示である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２のノックアウト体の作製（実施例３）に使用される糖操作株ＹＧＬＹ７４０６に関する流れ図を表す。図７Ｃは、単一ノックアウト糖操作株ｓｔｅ１３（ＹＧＬＹ８０８４）およびｄａｐ２（ＹＧＬＹ８０９０）ならびに後続の二重ノックアウト株（ＹＧＬＹ８０９６）に関する流れ図を表す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２のノックアウト体の作製（実施例３）に使用される糖操作株ＹＧＬＹ７４０６に関する流れ図を表す。図７Ｃは、単一ノックアウト糖操作株ｓｔｅ１３（ＹＧＬＹ８０８４）およびｄａｐ２（ＹＧＬＹ８０９０）ならびに後続の二重ノックアウト株（ＹＧＬＹ８０９６）に関する流れ図を表す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２のノックアウト体の作製（実施例３）に使用される糖操作株ＹＧＬＹ７４０６に関する流れ図を表す。図７Ｃは、単一ノックアウト糖操作株ｓｔｅ１３（ＹＧＬＹ８０８４）およびｄａｐ２（ＹＧＬＹ８０９０）ならびに後続の二重ノックアウト株（ＹＧＬＹ８０９６）に関する流れ図を表す。
【図８Ａ−１】図８Ａおよび８Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２のｃＤＮＡ配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図８Ａ−２】図８Ａおよび８Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２のｃＤＮＡ配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図８Ａ−３】図８Ａおよび８Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２のｃＤＮＡ配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２のｃＤＮＡ配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図９Ａ−１】図９Ａおよび９Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＥ１３のｃＤＮＡ配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号０）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図９Ａ−２】図９Ａおよび９Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＥ１３のｃＤＮＡ配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号０）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図９Ａ−３】図９Ａおよび９Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＥ１３のｃＤＮＡ配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号０）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＥ１３のｃＤＮＡ配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号０）である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれｐＧＬＹ４５１１およびｐＧＬＹ４５１２を作製するために増幅されるＰｐＳＴＥ１３に関する５’（配列番号４１）および３’（配列番号４２）ＤＮＡフランキング領域である。該フランキング領域（下線部）自体は、ＰｐＳＴＥ１３  ５’フランキング領域ではＥｃｏＲＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接しており、ＰｐＳＴＥ１３  ３’フランキング領域ではＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接している。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれｐＧＬＹ４５１１およびｐＧＬＹ４５１２を作製するために増幅されるＰｐＳＴＥ１３に関する５’（配列番号４１）および３’（配列番号４２）ＤＮＡフランキング領域である。該フランキング領域（下線部）自体は、ＰｐＳＴＥ１３  ５’フランキング領域ではＥｃｏＲＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接しており、ＰｐＳＴＥ１３  ３’フランキング領域ではＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接している。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれｐＧＬＹ４５１３およびｐＧＬＹ４５１４を作製するために増幅されるＰｐＤＡＰ２に関する５’（配列番号４３）および３’（配列番号４４）ＤＮＡフランキング領域である。該フランキング領域（下線部）自体は、ＰｐＤＡＰ２  ５’フランキング領域ではＥｃｏＲＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接しており、ＰｐＤＡＰ２  ３’フランキング領域ではＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接している。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれｐＧＬＹ４５１３およびｐＧＬＹ４５１４を作製するために増幅されるＰｐＤＡＰ２に関する５’（配列番号４３）および３’（配列番号４４）ＤＮＡフランキング領域である。該フランキング領域（下線部）自体は、ＰｐＤＡＰ２  ５’フランキング領域ではＥｃｏＲＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接しており、ＰｐＤＡＰ２  ３’フランキング領域ではＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を構成するヌクレオチドに隣接している。
【図１２】図１２は、ｐＡＧ２５から増幅されるナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）マーカーカセットのｃＤＮＡ配列（配列番号４５）であり、該ＯＲＦが太字で示されている。
【図１３−１】図１３はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＰＰＩＩＩのｃＤＮＡ（配列番号５４）配列である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【図１３−２】図１３はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＰＰＩＩＩのｃＤＮＡ（配列番号５４）配列である。ＯＲＦが太字で示されている（約１ｋｂのフランキング配列を伴う又は伴わない）。
【実施例１】
【００５６】
株、培養条件および試薬
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を組換えＤＮＡ実験に使用した。制限および修飾酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから入手し、製造業者の指示どおりに使用した。オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから入手した。塩および緩衝剤はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得た。ここで使用した最少培地は１．４％  酵母窒素ベース、２％  デキストロース、１．５％  寒天および４×１０−５％  ビオチンおよびアミノ酸（適宜補足されるもの）を含むものであった。ＹＭＤに富む培地は１％  酵母エキス、２％  マルトン（ｍａｒｔｏｎｅ）、２％  デキストロースおよび１．５％  寒天（プレート用）である。ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）はＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ（カタログ番号Ｎ５３７５−７４）から得られ、ＹＭＤに富む培地に１００μｇ／ｍｌの最終濃度で加えられる。
【実施例２】
【００５７】
ノックアウトベクターの作製
Ａ．ｓｔｅ１３：：ＵＲＡ５ノックアウトベクターの作製
ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）および鋳型としてのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０由来のゲノムＤＮＡを使用して、ＳＴＥ１３オープンリーディングフレームに対応する５’および３’フランキング領域に対応するＤＮＡ断片（配列番号４１および４２）を増幅した。表１に示されているプライマーペアＳＨ７７４（配列番号１３）およびＳＨ７７５（配列番号１４）ならびにＳＨ７７６（配列番号１５）およびＳＨ７７７（配列番号１６）を使用して、それぞれＳＴＥ１３の５’および３’に関する７７１ｂｐおよび９４９ｂｐの断片を増幅した。ＥｘＴａｑ（商標）（ＴａＫａＲａ，Ｂｉｏ．Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）の存在下の７２℃で１０分間のインキュベーションの後、該増幅断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、ＴＯＰ１０コンピテント細胞内に形質転換した。ＤＮＡ配列決定は、ＳＴＥ１３  ５’およびＳＴＥ１３  ３’フランキング領域が正確であることを証明した。得られたベクターをそれぞれｐＧＬＹ４５１１およびｐＧＬＹ４５１２と命名した。
【００５８】
７６３ｂｐのＳＴＥ１３  ５’フランキング領域断片（図１０Ａ、配列番号５０の下線領域により表される）を、ＥｃｏＲＩを使用してｐＧＬＹ４５１１から消化し、同じ制限酵素で予め消化され子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理された、ｐＪＮ３９６（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ，２０，１２７９−１２９０，２００３）に類似したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５−ブラスターベクターｐＧＬＹ１３ｂ内にサブクローニングした。ＵＲＡ５−ブラスターベクターは、５−フルオロオロト酸の存在下の対抗選択によるＵＲＡ５マーカーの回収を促進するためのＬａｃＺ直接反復に隣接したピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＵＲＡ５遺伝子の機能性遺伝子断片を含有するｐＵＣ１９ベクターバックボーンを有する。その新たに連結されたベクターをＸＬ１０  Ｇｏｌｄコンピテント細胞内に形質転換し、制限分析により確認した後、得られたベクターをｐＧＬＹ４５１８と命名した。ベクターｐＧＬＹ４５１２を、ＳＴＥ１３  ３’フランキング領域をコードする９４０ｂｐ（図１０Ｂ、配列番号５１の下線領域により表される）断片を遊離させるためにＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で予め消化されＣＩＡＰ処理されたｐＧＹ４５１８内にサブクローニングした。該連結産物をＸＬ１０  Ｇｏｌｄコンピテント細胞内に形質転換し、制限分析後にｐＧＬＹ４５２０と命名した。この最終的なｓｔｅ１３：：Ｕｒａ５ノックアウトベクターを図１Ａに図示する。
【００５９】
Ｂ．ｄａｐ２：：ＵＲＡ５ノックアウトベクターの作製
表１に示されているプライマーセットＳＨ７８２（配列番号２１）およびＳＨ７８３（配列番号２２）ならびにＳＨ７８４（配列番号２３）およびＳＨ７８５（配列番号２４）を使用して、ＤＡＰ２  ５’および３’フランキング領域（配列番号４３および４４）を、前記のとおりにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡから増幅して、それぞれ１００３ｂｐおよび１１４２ｂｐの断片を得た。ｐＣＲ２．１内へのクローニングおよび配列決定の後、該ベクターをｐＧＬＹ４５１３およびｐＧＬＹ４５１４（それぞれＤＡＰ２  ５’およびＤＡＰ２  ３’領域をコードする）と命名した。前記実施例２Ａに類似したアプローチに従い、９９５ｂｐのＤＡＰ２  ５’領域（図１１Ａ、配列番号５２の下線領域により表される）をＵｒａ５−ブラスターベクターｐＧＬＹ１３ｂ内のＥｃｏＲＩ部位内にサブクローニングして、中間構築物ｐＧＬＹ４５１９を得た。ついで１１３３ｂｐのＤＡＰ２  ３’領域（図１１Ｂ、配列番号５３の下線領域により表される）をｐＧＬＹ４５１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位内にサブクローニングして、ｄａｐ２：：ＵＲＡ５ノックアウトベクターｐＧＬＹ４５２１（図１Ｂに図示されている）を得た。
【００６０】
Ｃ．ドミナントマーカーＳＴＥ１３およびＤＡＰ２ノックアウトベクターの作製
ＰＣＲ融合体を使用して、ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２の両方のノックアウトベクターを作製した。表１に示されているプライマーセットＳＨ７７４（配列番号１３）およびＳＨ８０１（配列番号２９）ならびにＳＨ８０４（配列番号３２）およびＳＨ７７７（配列番号１６）を使用し、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＳＴＥ１３  ５’およびＳＴＥ１３  ３’断片をｐＧＬＹ４５２０から増幅した。アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）転写伸長因子（ＴＥＦ）プロモーターおよびターミネーター（図１２の通常文字により表される）（それぞれ、太字のオープンリーディングフレームの５’および３’側に位置する）の発現制御下でストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）からのナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼのオープンリーディングフレーム（図１２、配列番号５４の太字で表されている）を含有するナーセオスリシン（ＮＡＴＲ）マーカーカセット（配列番号４５）を、プライマーＳＨ８０２（配列番号３０）およびＳＨ８０３（配列番号３１）を使用して、ｐＡＧ２５（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｙｅａｓｔ，１５，１５４１−１５５３，１９９９）から増幅した。該ＰＣＲ反応をＤＮＡアガロースゲル上で行い、それぞれＳＴＥ１３  ５’、ＳＴＥ１３  ３’およびＮａｔマーカーに対応する７７９ｂｐ、９５８ｂｐおよび１２４９ｂｐの断片を単離した。ついでそれぞれ２０ｎｇを合わせ、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーペアＳＨ７７４（配列番号１３）およびＳＨ７７７（配列番号１６）を使用して互いに融合させた。ＥｘＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ，Ｂｉｏ．Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）の存在下の７２℃で１０分間のインキュベーションの後、該増幅（２８９６ｂｐ）断片をｐＣＲ２．１内にクローニングし、ＴＯＰ１０コンピテント細胞内に形質転換した。ＤＮＡ配列決定は、該ｓｔｅ１３：：ＮＡＴＲ融合体が正確であることを証明した。得られたベクターをそれぞれｐＧＬＹ５０１８と命名した。このベクターを図１Ｃに図示する。
【００６１】
同様にして、表１に示されているプライマーセットＳＨ７８２（配列番号２１）およびＳＨ８０５（配列番号３３）、ＳＨ８０８（配列番号３６）およびＳＨ７８５（配列番号２４）、ならびにＳＨ８０６（配列番号３４）およびＳＨ８０７（配列番号３５）を使用して、ＤＡＰ２  ５’、ＤＡＰ２  ３’およびＮＡＴＲマーカーに対応する１０１１ｂｐ、１１５１ｂｐおよび１２４８ｂｐの断片をｐＧＬＹ４５２１およびｐＡＧ２５から増幅した。単離後、各断片の２０ｎｇをプライマーペアＳＨ７８２（配列番号２１）およびＳＨ７８５（配列番号２４）と共に使用して３３２１ｂｐの断片を得、これをｐＣＲ２．１内にクローニングし、配列決定し、ｐＧＬＹ５０１９と命名した。このベクターを図１Ｄに図示する。
【実施例３】
【００６２】
ＳＴＥ１３およびＤＡＰ２ノックアウト株の作製
ＧＳ５．０グリカンを発現するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）栄養要求性糖操作細胞系ＹＧＬＹ７４０６［Δｏｃｈ１、Δｐｎｏ１、Δｍｎｎ４Ｂ、Δｂｍｔ２、Δｕｒａ５、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−ＭｎｓＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＭｎｓＩＩ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  Ｇａｌエピメラーゼ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体およびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ］（例えば、Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（９）：７５７−７６６，２００４；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３（５７９２）：１４４１１−１４４３，２００６）；米国公開出願第２００６００４０３５３号を参照されたい）を全ての操作の出発株として使用した。この株および後続の株をどのようにして作製したかに関する流れ図は、図７（Ａ〜Ｃ）を参照されたい。ＧＳ５．０株は、一方または両方の末端の非還元性末端上のβ−１，４−ガラクトース残基を末端とする二分岐アフコシル化Ｎ−結合グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（９）：７５７−７６６，２００４；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３（５７９２）：１４４１１−１４４３，２００６）。株ＹＧＬＹ７４０６は、ジペプチジルペプチダーエ活性に関するレポータータンパク質として使用される、ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合した完全長ヒト腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ）を発現する。
【００６３】
形質転換のために、２０μｇのベクターｐＧＬＹ４５２０およびｐＧＬＹ４５２１を制限酵素ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で消化して、４０９１ｂｐのＳＴＥ１３：：Ｕｒａ５ノックアウト断片または４５１６ｂｐのＤＡＰ２：：ＵＲＡ５ノックアウト断片を得、これらをＹＧＬＹ７４０６内にエレクトロポレーションにより形質転換して、それぞれＳＴＥ１３またはＤＡＰ２を欠失させ、該形質転換体をｕｒａマイナス最少プレート上で選択した。各遺伝子のノックアウトの成功を、表２に示されている５’、３’およびノックアウトプライマーセットを使用して確認した。ｓｔｅ１３Δおよびｄａｐ２Δノックアウト株を、それぞれＹＧＬＹ８０８４およびＹＧＬＹ８０９０と命名した。ついで、ｓｔｅ１３Δノックアウト株ＹＧＬＹ８０８４を、３２９０ｂｐのＤＡＰ２：：Ｎａｔノックアウト断片を遊離させるためにＳｆｉＩで予め消化されたｐＧＬＹ５０１９で形質転換することにより、二重Δｓｔｅ１３／ｄａｐ２ノックアウト株を作製した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌ  Ｎａｔ  ＹＭＤプレート上でプレーティングし、二重ノックアウトの成功を、表２に示されている５’、３’およびノックアウトプライマーセットを使用して確認した。代表的な二重ノックアウト株をＹＧＬＹ８０９６と命名した。最初にＳＴＥ１３をノックアウトし、ついでＤＡＰ２をノックアウトすることによりこの株を作製したが、本発明者らは、最初にＤＡＰ２遺伝子をノックアウトし、ついでＳＴＥ１３遺伝子をノックアウトした場合に、同じ所望の表現型を有する株が得られうることを実験的に実証している。そのような株を得るために、ｐＧＬＹ５０１８をＳｆｉＩで消化し、生じた２８６５ｂｐのｓｔｅ１３：：ＮＡＴＲノックアウト断片を、ＤＡＰ２遺伝子が既にノックアウトされているＹＧＬＹ８０９０のような株内に形質転換することが可能である。
【実施例４】
【００６４】
レポータータンパク質の作製、単離および分析
１％  酵母エキス、２％  ペプトン、１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％  酵母窒素ベース、０．００００４％  ビオチンおよび１％  グリセロールからなる増殖培地としての２００ｍｌの緩衝化グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）内でタンパク質発現を２６℃で７２時間行った。ＢＭＧＹにおけるグリセロールの代わりに１．５％  メタノールからなる２０ｍｌの緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）内で誘導を４８時間行った。
【００６５】
発現後、２０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により該細胞を除去した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ，Ｃａｔ  ＃１７−１２８１−０１）のＳｔｒｅａｍｌｉｎｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂を使用して、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を上清からアフィニティークロマトグラフィーにより捕捉した。該無細胞上清培地をＳｔｒｅａｍｌｉｎｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＸＫ  １６／２０  １．６ｃｍ×１０．０ｃｍ）上にローディングし、３カラム体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で５．０ｍｌ／分の流量で前平衡化した。該カラムを３カラム体積の同じバッファーで洗浄し、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を７カラム体積の４０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。溶出した融合タンパク質を直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。
【００６６】
ＣＨＴ（登録商標）ヒドロキシアパタイトＩ型４０μｍ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，Ｃａｔ  ＃１５７−００４０）を第２精製工程として使用した。該ヒドロキシアパタイトカラムを３カラム体積の５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化し、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を該平衡化バッファー内にバッファー交換し、該カラムに適用した。ローディング後、該カラムを３カラム体積の該平衡化バッファーで洗浄し、溶出を、０〜１０００ｍＭ  塩化ナトリウムの範囲の２０カラム体積にわたる勾配を展開することにより行った。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は約５５０−６５０ｍＭ  塩化ナトリウムで溶出する。プール化したＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を、０．２μｍ  ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルターを使用して滅菌濾過し、４℃で保存した。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，Ｃａｔ．＃１６１−１１２３）を、それらの２つのカラム精製ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質画分に対して行い、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ（商標）  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ  ＃４００９９４）上に５５ボルトで３０分にわたってトランスファーし、ＰｒｏＢｌｏｔｔ染料（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で染色した。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質に対応するバンドをＰＶＤＦ膜から切り出し、Ｎ末端配列決定のためにＴｕｆｔｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡに送った。
【００６８】
同様にして、完全長組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質の発現を行った。しかし、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを発現させるために使用した前記のＧＳ５．０宿主細胞の代わりに、ＧＣＳＦを発現させるために使用した宿主細胞は、実施例３に記載の方法によりＳＴＥ１３およびＤＡＰ２遺伝子が破壊されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ２．０宿主細胞であった。ＧＳ２．０宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された宿主細胞である。これらの株は、ガラクトースを末端とするＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得ない。そのような株の具体例はＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）；ならびにＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４（２００３）に開示されている。図６は、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを発現するＧＳ５．０に関して前記で示されているとおりにＳＴＥ１３およびＤＡＰ２遺伝子が破壊された場合、これらの宿主細胞が無傷ＧＣＳＦを産生しうることを示している（ＳＴＥ１３／ＤＡＰ２株において産生されたＧＣＳＦを示すレーン２７〜２９を、ｓｔｅ１３／ｄａｐ２ノックアウト株において産生されたＧＣＳＦを示すレーン３２〜３４と比較されたい）。
【実施例５】
【００６９】
ＰｐＤｐｐＩＩＩｐの欠失
同様に、ＰｐＳｔｅ１３ｐおよびＰｐＤａｐ２ｐを排除するための前記実施例に記載されている方法を、ＰｐＤｐｐＩＩＩｐを排除するために用いることが可能である。１つのそのような方法は、実施例２でＰｐＳＴＥ１３およびＰｐＤＡＰ２に関して示されているのに類似した方法でノックアウトベクターを設計することであろう。プライマーは、ＰｐＤＰＰＩＩＩ遺伝子（図１３、配列番号５４）の５’および３’フランキング領域を増幅するように設計されるであろう。なぜなら、ゲノム配列の必須領域、例えば、機能的ＰｐＤｐｐＩＩＩｐ活性に必要な領域は省かれるからである。ＰｐＤｐｐＩＩＩｐ活性は、これらのフランキング領域を選択マーカーと組合せることにより排除されうる。適合性選択マーカーとの組合せにより、ＰｐＤｐｐＩＩＩｐ活性は、個々に、あるいはＰｐＳｔｅ１３ｐおよび／またはＰｐＤａｐ２活性の排除と共に排除されうる。ＰｐＳｔｅ１３ｐ、ＰｐＤａｐ２ｐおよびＰｐＤｐｐＩＩＩｐ活性が排除されている株は、いずれかの潜在的ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を欠く株を与えるであろう。
【００７０】
本発明は、本発明の少数の態様の例示として意図される実施例に開示されている具体的な実施形態によっては限定されず、機能的に同等なあらゆる実施形態が本発明の範囲内である。実際、本明細書に示され記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【図１Ａ】
2013509181.tif 000008
【図１Ｂ】
2013509181.tif 000009
【図１Ｃ】
2013509181.tif 000010
【図１Ｄ】
2013509181.tif 000011
【図２Ａ】
2013509181.tif 000012
【図２Ｂ】
2013509181.tif 000013
【図３】
2013509181.tif 000014
【図４Ａ】
2013509181.tif 000015
【図４Ｂ】
2013509181.tif 000016
【図５】
2013509181.tif 000017
【図６】
2013509181.tif 000018
【図７Ａ】
2013509181.tif 000019
【図７Ｂ】
2013509181.tif 000020
【図７Ｃ】
2013509181.tif 000021
【図８Ａ−１】
2013509181.tif 000022
【図８Ａ−２】
2013509181.tif 000023
【図８Ａ−３】
2013509181.tif 000024
【図８Ｂ】
2013509181.tif 000025
【図９Ａ−１】
2013509181.tif 000026
【図９Ａ−２】
2013509181.tif 000027
【図９Ａ−３】
2013509181.tif 000028
【図９Ｂ】
2013509181.tif 000029
【図１０Ａ】
2013509181.tif 000030
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
2013509181.tif 000032
【図１１Ｂ】
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【図１２】
2013509181.tif 000034
【図１３−１】
2013509181.tif 000035
【図１３−２】
2013509181.tif 000036
【配列表】
2013509181000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月19日(2012.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2013509181.tif 000037