(57)【要約】  本発明は、核酸と結合することができる固相、例えば磁性ガラス粒子を使用して核酸を分離する方法である。ここで前記固相への核酸の結合は、エチレン−アミン化合物の存在によって高められる。本発明は、エチレン−アミン化合物を含む核酸を単離するための反応混合物、及び前記方法を実施するためのキットをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する試料溶液から核酸を分離する方法であって、以下のステップ：
ａ．核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含む結合混合物と、前記試料溶液とを接触させ；
ｂ．前記核酸が前記固相と結合し得る条件下、前記固相を含有する前記試料溶液をインキュベートし；そして
ｃ．前記溶液から前記固相を分離すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記固相に結合した核酸を洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相から核酸を溶出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料溶液が細胞の溶解によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料溶液が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スタヒロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるグラム陽性細菌の溶解によって得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップａにおける前記結合混合物が、金属イオンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップａにおける前記結合混合物が、マグネシウムイオン又はマンガンイオンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップａにおける前記結合混合物が、アルカリ金属の水酸化物及び洗剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップａにおける前記結合混合物が、溶液１（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ１２＋）及び溶液２（１０〜６５ｍＭエチレン−アミン、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５〜２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．５）の、等しい体積での混合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸と結合することができる前記固相が、磁性コア、及びシリカを含む外層を有する粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
固相を使用して試料から核酸を分離するための反応混合物であって：核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含む、前記反応混合物。
【請求項１２】
アルカリ金属の水酸化物及び洗剤をさらに含む、請求項１１に記載の反応混合物。
【請求項１３】
金属イオンをさらに含む、請求項１１に記載の反応混合物。
【請求項１４】
マグネシウムイオン又はマンガンイオンを含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
核酸と結合することができる前記固相が、磁性コア、及びシリカを含む外層を有する粒子を含む、請求項１１に記載の反応混合物。
【請求項１６】
固相を使用して試料から核酸を分離するためのキットであって：核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含む、前記キット。
【請求項１７】
溶解試薬、中和試薬、洗浄試薬及び溶出試薬の１つ又は２つ以上をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
核酸と結合することができる前記固相が、磁性コア、及びシリカを含む外層を有する粒子を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記溶解試薬がアルカリ金属の水酸化物及び洗剤を含み、中和試薬がエチレン−アミン化合物、マグネシウムイオン又はマンガンイオン、及び緩衝液を含む、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸単離の分野に関し、具体的には、固相担体を使用した核酸の単離の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸の単離は、分子診断における重要なステップである。試料から単離される核酸の質及び量は、下流における診断応用の成功に大きく影響を及ぼす。臨床及びフィールド応用においても、迅速であって且つ自動化になじみやすいことが単離手順に要求される。
【０００３】
種々の生物及び組織からの核酸を単離するために、多くの手順が存在する。幾つかの種類の臨床試料及び環境試料により、核酸の成功した単離のための特別な課題が提起される。例えば、骨のような特定の組織は、核酸を入手する前に除去することが必要である多量の細胞外材料を含む。幾つかの生物、例えば真菌、植物及び細菌は、細胞壁又は厳しい化学処理を必要とする外膜を有する。厳しい処理において使用される試薬は、単離された核酸を利用する、下流応用のための課題を提示する。さらに、厳しい処理の間における標的核酸の分解により、下流の検出アッセイにおける偽陰性の結果がもたらされる。さらに、臨床において適用可能となるためには、診断手順が十分な感受性を有さなければならず、すなわち、患者試料における偽陰性の結果を避けなければならない。したがって分子診断の分野において、診断手順を感度が高く、信頼性があり、かつ容易に実施できるものとするために、核酸を単離する方法の改善が必要である。
【０００４】
成功した核酸ベースの診断試験のための前提条件は、分解されない、阻害剤が含まれない核酸の単離である。同時に、単純で自動化に適した核酸単離手順に対する需要が存在する。固相担体、例えば球形微小粒子を用いて核酸を単離することが近年一般的となっている。「磁性ガラス粒子（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｇｌａｓｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）」又は「ＭＧＰ」と一般的に呼ばれる、ガラス様物質を含有する又は当該物質で被覆された磁性微小粒子が特に一般的である。ＭＧＰを使用する核酸単離手順は、比較的少ないステップを必要とし、容易に自動化できる。ゾル−ゲル法によって製造されるＭＧＰが特に一般的であり、それはＥＰ１１５４４４３又は米国特許第６，２５５，４７７号及び第６，８７０，０４７号明細書に記載されている。
【０００５】
ゾル−ゲル法によって製造されるＭＧＰの一般的記載及び具体例は、文献中で容易に利用可能である（例えばＥＰ１１５４４４３参照）。これらのＭＧＰは、シリカ系ガラス様材料で被覆された強磁性コアからなる。当該強磁性コアは通常、酸化鉄、例えばＦｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３を含む。当該コアは、鉄単体のコアであってもよく、又は合成材料から製造されてもよい。当該コアはまた、酸化鉄が埋め込まれた、結晶、セラミック又はガラス様構造からなることができる。当該ガラス被覆は、酸化ケイ素を含む非晶質材料からなってもよく、１又は２以上の追加の金属酸化物、例えば、酸化ホウ素（Ｂ２Ｏ３）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、酸化バリウム（ＢａＯ）、酸化カリウム（Ｋ２Ｏ）、酸化ナトリウム（Ｎａ２０）、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）又は酸化鉛（Ｐｂ２０３）をさらに含んでもよい。幾つかの実施形態において、ガラスは酸化ケイ素であり、そして１又は２以上の以下の化合物を以下の濃度範囲で含んでもよい；Ｂ２Ｏ３（０〜３０％）、Ａｌ２Ｏ３（０〜２０％）、ＣａＯ（０〜２０％）、ＢａＯ（０〜１０％）、Ｋ２Ｏ（０〜２０％）、Ｎａ２Ｏ（０〜２０％）、ＭｇＯ（０〜１８％）、Ｐｂ２Ｏ３（０〜１５％）。ガラスはまた、より少ないパーセンテージ（０〜５％）の多くの他の酸化物、例えば、Ｍｎ２Ｏ３、ＴｉＯ２、Ａｓ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｕＯ及びＣｏＯを含んでもよい。ホウケイ酸ガラスの組成物から作られる表面は、特に効果的であることが分かった。ホウケイ酸ガラスは、２５％超の酸化ホウ素を有する。例えば、ＳｉＯ２／Ｂ２Ｏ３の組成が、７０／３０である。
【０００６】
磁性粒子は時折、核酸の結合を容易とする官能基で修飾される。かかる基は、限定されないが、ポリ−Ａ含有核酸の捕獲用にポリ−Ｔオリゴヌクレオチドを含み、ビオチン標識された核酸の捕獲用にストレプトアビジンを含み、そしてプローブに相補的な固有配列を含有する核酸の捕獲用に特定のプローブ配列を含む。しかし配列に関係なく、試料中に存在する任意の核酸を単離することができる未修飾の表面を有する磁性粒子が、最も普遍的に有用である。
【０００７】
ＭＧＰを使用する典型的な核酸単離手順において、核酸を放出させるために、細胞又は組織の破壊を開始する。一般的に使用される組織破壊手順は、化学的、酵素的又は物理的性質のものである。それらは、超音波、高圧、せん断力、強塩基、洗剤若しくはカオトロピック剤、プロテアーゼ若しくはリパーゼを含む。化学的及び酵素的溶解のために、溶解剤は典型的には緩衝剤、塩、１若しくは２以上の変性剤、及びカオトロピック物質、プロテーゼ、及び場合により、ヌクレアーゼ阻害剤及び保存剤を含む。溶解試薬は、タンパク質の消化、ヌクレアーゼの阻害並びに、脂質、リポタンパク質などの可溶化を引き起こす。例えば緩衝剤はＴｒｉｓであってもよく、塩はナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩又はマグネシウム塩であってもよく、例えば塩化物塩若しくは酢酸塩であってもよく、洗剤はドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ又はＴｗｅｅｎであってもよく、カオトロピック試薬は尿素、チオ尿素、ヨウ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｔｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジウムチオシアネート、グアニジウムイソチオシアネート若しくは次亜塩素酸グアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｔｅ）であってもよく、ヌクレアーゼ阻害剤はキレート剤、例えばＥＤＴＡであってもよく、保存剤は金属アジドであってもよく、そしてプロテアーゼはプロテイナーゼＫであってもよい。典型的には、試料は溶解試薬と共に、７０〜１００℃で、例えば９０〜９５℃でインキュベートされる。
【０００８】
大部分の試料にとって、上記の溶解試薬及び条件は、細胞の溶解及び核酸の溶液への放出を達成するために十分である。残念ながら幾つかの種類の試料にとって、溶解には大きな課題が存在する。幾つかの細胞、生命体及び組織は、細胞壁若しくは組織を破壊するために、及び細胞含有物を放出するために厳しい溶解条件を必要とする。例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のようなグラム陽性病原菌は、脂質に富んだペプチドグリカンの細胞壁を有する。Ｍ．ツベルクローシス及び他のマイコバクテリアを検出する迅速な方法に関する世界的な需要が存在する。しかし核酸の単離は通常、所望のレベルのアッセイ感受性を達するための限定要因である。Ｎｅｏｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７５：１１１を参照。現在、マイコバクテリアの検出における所望の感受性は、繰り返しの洗浄ステップ及び遠心分離ステップを含む、多段階の核酸単離手順を用いて達成される。Ｓｈａｍｐｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，ＡＰＭＩＳ，１２２：７２８を参照。しかしかかる手順は自動化可能なものではなく、大部分の利用者にとって実用的ではない。
【０００９】
ＭＧＰを使用する核酸の典型的な単離方法において、試料中の細胞区画が破壊されて核酸が放出された後、ＭＧＰへの核酸の結合を達成するために、当該試料をＭＧＰと接触させる。溶解の前にＭＧＰを試料へと添加してもよい。例えばＭＧＰは、初期試料が添加される容器中に存在し得る。ＭＧＰの存在は、試料の溶解に影響を与えないことが明らかとなっている。或いは試料を最初に溶解し、溶解ステップが完了した後にのみＭＧＰが導入されてもよい。
【００１０】
ＭＧＰへの結合を達成するために、典型的には試料はＭＧＰと混合され、結合が起こるのに十分な時間この結合混合物中でインキュベートされる。このステップは、磁性ガラス粒子の表面上に固定化された核酸の量を異なる時点で測定することによって、又は以下の異なるインキュベーション時間で核酸収量を測定することによって、容易に最適化され得る。一般的に、１０秒〜３０秒のインキュベーション時間が核酸にとって好適である。
【００１１】
ほとんどの場合において、溶解試薬を含む放出された核酸は、ＭＧＰへの結合が起こるために適した環境である。しかし幾つかの場合において、溶解試薬は当該環境を、磁性ガラス粒子の表面への核酸の結合にとって不適切なものとする。特に、磁性ガラス粒子が未修飾の表面を有する場合において、核酸と粒子表面との間の結合は、ｐＨ及び結合混合物のイオン強度などの条件に依存する。ＭＧＰへの核酸の最大結合は、低いｐＨで、例えばｐＨ５以下で起こることが明らかとなっている。しかし幾つかの応用に関して、結合混合物のかかる低いｐＨは達成されないかもしれない。例えば、マイコバクテリアを溶解するための溶解試薬は、１２以上のｐＨ値を有する。マイコバクテリアの核酸を単離するための典型的な手順において、細胞溶解に続く中和ステップの間に、ｐＨ９未満とされることはないが、ｐＨは低下される。ｐＨ９以上において、核酸の磁性ガラス粒子への結合は効率的ではない。現時点まで、結合におけるこの非効率性は、延長されたインキュベーション時間によって克服されている。当該課題を解決するためのこの方法は、臨床応用のためには実用的ではない。さらに、延長されたインキュベーションによって、核酸鋳型、特にＲＮＡ鋳型の安定性が脅かされる。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明は、核酸を含有する試料溶液から核酸を分離する方法であって、以下のステップ：核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含む結合混合物と、前記試料溶液とを接触させ；前記核酸が前記固相と結合し得る条件下、前記固相を含有する前記試料溶液をインキュベートし；そして前記溶液から前記固相を分離することを含む、前記方法である。本発明は場合により、溶出に先立ち、結合した核酸を洗浄するステップを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、単離後に核酸を検出することを含む。本発明は、核酸を単離するための反応混合物をさらに含み、前記混合物は、核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含有する。本発明はまた、核酸を試料から分離するためのキットであって：核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含む前記キットを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、用語「エチレン−アミン化合物」は、一般式（ＮＨ２−ＣＨ２＝ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは１〜１０又はそれ以上である）を有する分子のことである。本発明において有用であるエチレン−アミン化合物は、限定されないが、エチレン−ジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレン−トリアミン（ＤＥＴＡ）、トリエチレン−テトラミン（ＴＥＴＡ）、テトラエチレン−ペンタミン（ＴＥＰＡ）及びペンタエチレン−ヘキサミン（ＰＥＨＡ）を含む。当業者であれば、他のエチレン−アミン化合物が本発明に有用であると認識し得る。
【００１４】
本明細書において、用語「試料」は、対象物質、例えば核酸を含有する混合物又は溶液のことである。当該試料は、固体又は液体組織、体液、真核細胞（植物、真菌、動物又はヒト細胞を含む）の培養液若しくは懸濁物、原核細胞（細菌細胞を含む）の培養液若しくは懸濁物を含み得る。当該試料はウィルスを含んでもよい。当該試料はまた、対象物質を含む無細胞の溶液を含んでもよい。試料の性質に応じて、試料からの対象物質の単離を容易とするための化学的若しくは物理的処理をそれは必要としてもよい。例えば試料は、細胞区画及び細胞内区画から核酸を放出させるための処理を必要としてもよい。
【００１５】
本明細書において、生物学的試料の「成分」なる用語は、分子の１分類のこと（例えばタンパク質、核酸など）であるか、又は検出が望まれる特定の標的、例えば特定のタンパク質又は核酸配列のことである。
【００１６】
本明細書において、用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）のポリマー（すなわちＤＮＡ）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）（すなわちＲＮＡ）、並びに他の、プリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾プリン若しくはピリミジン塩基、又はそれらの組み合わせのＮ−グリコシド類縁体のことである。
【００１７】
本発明の方法において、核酸は磁性ガラス粒子を使用して試料から単離され、ここで核酸の磁性ガラス粒子への結合は、１又は２以上のエチレン−アミン化合物の存在によって向上される。
【００１８】
幾つかの実施形態において、当該試料は全細胞を含む。細胞区画及び細胞内区画から核酸を放出させるために、細胞膜及び、存在する場合には細胞壁を破壊するために適した溶解試薬を使用して、細胞は溶解される。細胞及び組織を破壊する種々の方法が当技術分野で既知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１））に、多くの方法が参照され、記載されている。
【００１９】
幾つかの実施形態において、試料はグラム陽性細菌を含有する。強い化学塩基（例えば水酸化アルカリ）、洗剤及び塩を含み、かつｐＨが１２超である溶解試薬を使用して、グラム陽性細菌は溶解される。幾つかの実施形態において、グラム陽性細菌を含有する試料は、８０℃〜１００℃で、通常９５℃で加熱され、そして５〜３０分間、通常約１５分間インキュベートされる。
【００２０】
本発明において、細胞区画及び細胞内区画から放出された核酸を含有する試料は、核酸が磁性ガラス粒子と結合するために適した条件下で、磁性ガラス粒子と接触される。結合混合物へのエチレン−アミン化合物の添加によって、磁性ガラス粒子表面への核酸の結合の効率が大きく増加することが発見された。この現象は、高いｐＨで特に利益がある。結合効率は、結合混合物中における金属塩、例えばマグネシウム塩若しくはマンガン塩、例えば塩化物塩若しくは酢酸塩の存在によってさらに増大する。
【００２１】
幾つかの実施形態において、エチレン−アミン化合物の濃度は１０〜６５ｍＭ、例えば１６ｍＭである。
【００２２】
結合ステップの後に、結合された核酸を有する磁性ガラス粒子は、エチレン−アミン化合物を含有する溶液から分離され得る。磁性ガラス粒子の大きさ及び種類に依存して、当該粒子はインキュベーション期の間に液体から分離されるか、又はインキュベーション後に懸濁液中に残存して更なる分離を必要とする。分離ステップが必要である場合、結合された核酸を有する粒子は、磁場の適用によって試料溶液から分離される。例えば磁性ガラス粒子は、インキュベーションが行われた試料容器の壁へと引っ張られ得るか、又は当該容器の底へと引っ張られ得る。試料中に存在する、任意の未結合の物質及び混入物を含有する液体はその後、ピペッティング又はアスピレーションにより試料容器から除去され得る。
【００２３】
結合した核酸を有する磁性ガラス粒子は、１又は２回以上、１又は２以上の洗浄溶液を用いて場合により洗浄されてもよい。洗浄溶液は、核酸の磁性粒子表面からの放出を引き起こさないが、核酸又は磁性ガラス粒子になおも結合している所望ではない混入物を洗い流す組成を有する。幾つかの実施形態において、最初の洗浄溶液はアルコール、例えばエタノール又はイソプロパノールを含む。当該洗浄溶液はまた、カオトロピック塩及び緩衝液を含んでもよい。幾つかの実施形態において、その後に続く洗浄溶液はアルコールを含まないが、塩、緩衝液を含み、及び場合により保存剤を含む。この洗浄ステップは、洗浄溶液を核酸が結合している磁性ガラス粒子と共にインキュベートすることにより行われてもよい。当該磁性粒子は、洗浄液体との最大接触が達成されるために、このステップの間に再度懸濁されてもよい。汚れた洗浄溶液をその後試料容器から除去する。
【００２４】
最後の洗浄ステップの後、結合した核酸を有する磁性ガラス粒子が真空中で短時間乾燥され得るか、又は残余の洗浄液体が留去され得る。所望であれば、核酸は磁性粒子から分離され得、場合により、当該磁性粒子を残したまま当該粒子を含有する容器から除去され得る。核酸は、低い塩含量の緩衝液を使用して磁性ガラス粒子から溶出され得る。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液はＴｒｉｓを含む。場合により、溶出緩衝液は保存剤及びヌクレアーゼ阻害剤、例えばＥＤＴＡのようなキレート剤を含有してもよい。他の実施形態において、溶出緩衝液は保存剤を含有する水か、又は含有しない水である。
【００２５】
幾つかの実施形態において、核酸は下流応用の間、磁性粒子と結合されたままであってもよい（例えば、米国特許出願第２００４００１４０７０号を参照）。他の実施形態において、核酸は磁性ガラス粒子から除去されるが、当該粒子は下流応用のために核酸と共に容器中に残存したままである。例えば、米国特許出願第２００４００１４０７０号明細書は、ゾル−ゲル法によって製造される磁性ガラス粒子は、ＰＣＲによる核酸の増幅の効率を向上させることを教示している。他の例において、核酸は、溶出後に磁性ガラス粒子から分離されてもよい。典型的には、核酸を含有する溶液は、磁性ガラス粒子を含有する容器から除去される。
【００２６】
幾つかの実施形態において、核酸を単離する方法は、単離された標的核酸の増幅及び検出をさらに含む。例えば、増幅及び検出はＰＣＲを使用して行われる。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）を参照のこと。増幅及び検出は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（米国特許第５，１８５，２４３号、第５，６７９，５２４号及び第５，５７３，９０７号明細書）を通じて、又は任意の他の適切な核酸増幅技術を通じて行われてもよい。任意の下流における分析が、本発明の単離法と適合可能であるが、本発明の溶解溶液及び結合溶液の組成は、下流のＰＣＲ応用と特に適合性がある。
【００２７】
リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、標識されたプローブによって生じるシグナルは、投入された標的核酸の量と比例する。投入量が多いほど、より速く蛍光シグナルが既定の閾値（Ｃｔ）と交差する。したがって、試料を互いに比較することによって、又は既知の核酸量を有する対照試料と比較することによって、標的核酸の相対量又は絶対量が決定され得る。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は核酸を単離するための反応混合物である。反応混合物は：溶解試薬；１又は２以上の洗剤を含む試薬；エチレン−アミン化合物；及び場合により金属塩、例えばマグネシウム若しくはマンガン塩；１若しくは２以上の保存剤；及び／又は１若しくは２以上のキレート剤を含む。幾つかの実施形態において、溶解試薬は１２以上のｐＨ値を有する。幾つかの実施形態において、反応混合物中の溶解試薬は、１又は２以上の洗剤を１〜１０％の濃度で、１又は２以上のＥＤＴＡのようなキレート剤を０．５〜２ｍＭの濃度で、１又は２以上のアジ化ナトリウムのような保存剤を０．０１〜０．１％の濃度で、エチレン−アミン化合物を１０〜６５ｍＭの濃度で、及び金属塩、例えばマグネシウム塩若しくはマンガン塩、例えば塩化物塩若しくは酢酸塩を５〜２５ｍＭの濃度で含む。
【００２９】
幾つかの実施形態において、反応混合物は、単離されるべき核酸を含む試料をさらに含有する。幾つかの場合において、当該試料は溶解されたグラム陽性細菌を核酸源として含む。さらに他の実施形態において、反応混合物は磁性ガラス粒子を含む。幾つかの場合において、米国特許第６，８７０，０４７号明細書及びその中で引用された参考文献中に記載されたゾル−ゲル法によって当該粒子は製造される。
【００３０】
さらに別の実施形態において、本発明は、磁性ガラス粒子を使用して核酸を単離するためのキットである。当該キットは：溶解試薬；１又は２以上の洗剤を含む試薬；及び場合により１又は２以上の保存剤；エチレン−アミン化合物；並びに場合により、マグネシウム塩又はマンガン塩を含む。幾つかの実施形態において、溶解試薬、エチレン−アミン化合物及び、マグネシウム塩又はマンガン塩は、分離したコンテナで提供される。幾つかの実施形態において、溶解試薬は１２以上のｐＨを有してもよい。幾つかの実施形態において、キット中に含まれる溶解試薬は、１又は２以上の洗剤を１〜１０％の濃度で、１又は２以上のＥＤＴＡのようなキレート剤を０．５〜２ｍＭの濃度で、１又は２以上のアジ化ナトリウムのような保存剤を０．０１〜０．１％の濃度で、エチレン−アミン化合物を１０〜６５ｍＭの濃度で、及び金属塩、例えばマグネシウム塩若しくはマンガン塩、例えば塩化物塩若しくは酢酸塩を５〜２５ｍＭの濃度で含む。当該キットは、磁性ガラス粒子をさらに含んでもよい。磁性ガラス粒子は、溶解試薬中に組み込まれてもよく、キット中の分離したコンテナ中に存在してもよい。磁性ガラス粒子が分離した容器中に存在するとき、当該粒子はアルコール、例えばイソプロパノール中で懸濁されてもよい。幾つかの場合において、本発明のキットに含まれる磁性粒子は、米国特許第６，８７０，０４７号明細書及びその中で引用された参考文献中に記載されたゾル−ゲル法によって製造される。幾つかの実施形態において、キットは中和試薬、洗浄試薬及び溶出試薬を場合により含む。中和試薬は、緩衝液、塩及び保存剤を含んでもよく、ｐＨ６〜８であってもよく、最も好ましくはｐＨ７．５であってもよい。幾つかの実施形態において、緩衝液はＴｒｉｓであってもよく、塩は塩化マグネシウムであってもよく、そして保存剤はアジ化ナトリウムであってもよい。洗浄試薬はアルコールを含有してもよい。溶出試薬は緩衝剤及び保存剤を含んでもよく、ｐＨ８．５であってもよい。
【実施例】
【００３１】
実施例
本発明の範囲を限定するものではなく、説明のみのために、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴＢ）からの核酸の単離に本発明が適用された。
【００３２】
実施例１：
溶解のために、１００μＬのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ＭＴＢ）細胞懸濁物、又は同量のＭＴＢ  ＤＮＡを含む試料の６７  ｍＭホスフェートｐＨ６．８溶液を、４００μｌの溶解試薬（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ１２＋）と混合し、１５分間９５℃でインキュベートした。その後、４００μＬの中和試薬（８〜６４ｍＭエチレン−アミン、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８〜２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２又はＭｇ（ＯＡｃ）２、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．５）を加えた。その後、１００μＬの磁性ガラス粒子（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）を加え、そして当該試料を５〜３０分間室温若しくは３７℃でインキュベートした。磁性ガラス粒子をその後、上清を除去することによって分離し、７．５ｍＭクエン酸ナトリウム二水和物、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭＩＴ、ｐＨ４．１で２回洗浄した。５０〜１００μＬの溶出試薬（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．２％ｗ／ｖ  ４−ヒドロキシ安息香酸メチル（メチルパラベン）、０．０９％ＮａＮ３）を用いて核酸を溶出させた。溶解後の手順を、手動で、又はＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｔａｒ装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖ．）によって自動的に行った。
【００３３】
５０μＬの溶出液、及び５０μＬの以下のものを含むマスター混合物を用いたリアルタイムＰＣＲとしても知られる定量的ＰＣＲによって、単離された核酸を試験した：１５４ｍＭトリシン、１１０ｍＭ水酸化カリウム、１９０ｍＭ酢酸カリウム、１９％グリセロール（ｖ／ｖ）、２．３％ＤＭＳＯ、１．１６ｍＭ  ｄＡＴＰ、１．１６ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．１６ｍＭ  ｄＧＴＰ、１．１６ｍＭ  ｄＵＴＰ、上流及び下流プライマー、標的プローブ、内部対照プローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、ウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼ、０．０９％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）、ｐＨ８．５０、及び２０コピー／反応の内部対照ＤＮＡ。ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）４８アナライザーにおける増幅条件は以下の通りであった：５分、５０℃、その後２サイクルの９８℃、２０秒、６１℃秒及び７０℃秒、その後５５サイクルの９５℃、２５秒、６１℃４０秒、及び７０℃２０秒。
【００３４】
「サイクル閾値（ｃｙｃｌｅｓ−ｔｏ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」（Ｃｔ）（試料からの蛍光がバックグラウンドの蛍光を超え、したがって「閾値を横切る」、サイクル数）として、結果を表現する。Ｃｔは、核酸鋳型の開始量を反映する。より低いＣｔ値は、反応における核酸鋳型のより多くの開始量を示すが、より高いＣｔ値は、反応における核酸鋳型のより少ない開始量を示す。表１〜３は、本発明の方法を使用して単離された核酸を含む、各々のＰＣＲ反応に関するＣｔ値を示す。
【００３５】
【表１】
2013516185.tif 000002
【００３６】
【表２】
2013516185.tif 000003
【００３７】
【表３】
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【００３８】
固相担体、例えば磁性ガラス粒子を使用する核酸の回収を、エチレン−アミン化合物が改善することを、当該結果は実証している。当該改善は、金属塩、例えばマグネシウム塩若しくはマンガン塩、例えば塩化物塩若しくは酢酸塩の存在によってさらに高められる。
【００３９】
本発明は、具体例に関して詳細に記載されたが、種々の改変が本発明の範囲内でなされ得ることは当業者にとって明らかである。したがって、本発明の範囲は本明細書に記載された実施例によって限定されるべきではなく、以下に記載された特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月15日(2011.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、用語「エチレン−アミン化合物」は、一般式ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは０〜１０又はそれ以上である）を有する分子のことである。本発明において有用であるエチレン−アミン化合物は、限定されないが、エチレン−ジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレン−トリアミン（ＤＥＴＡ）、トリエチレン−テトラミン（ＴＥＴＡ）、テトラエチレン−ペンタミン（ＴＥＰＡ）及びペンタエチレン−ヘキサミン（ＰＥＨＡ）を含む。当業者であれば、他のエチレン−アミン化合物が本発明に有用であると認識し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する試料溶液から核酸を分離する方法であって、以下のステップ：
ａ．核酸と結合することができる固相、及びエチレン−アミン化合物を含む結合混合物と、前記試料溶液とを接触させ；
ｂ．前記核酸が前記固相と結合し得る条件下、前記固相を含有する前記試料溶液をインキュベートし；そして
ｃ．前記溶液から前記固相を分離すること
を含み、ここで、核酸と結合することができる前記固相が、磁性コア、及びシリカを含む外層を有する粒子を含み、そして前記エチレン−アミン化合物は、一般式ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは０〜１０又はそれ以上である）を有する、前記方法。
【請求項２】
前記固相に結合した核酸を洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相から核酸を溶出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料溶液が細胞の溶解によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料溶液が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スタヒロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるグラム陽性細菌の溶解によって得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）における前記結合混合物が、金属イオンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）における前記結合混合物が、マグネシウムイオン又はマンガンイオンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）における前記結合混合物が、アルカリ金属の水酸化物及び洗剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）における前記結合混合物が、溶液１（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ１２＋）及び溶液２（１０〜６５ｍＭエチレン−アミン、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５〜２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．５）の、等しい体積での混合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
固相を使用して試料から核酸を分離するための反応混合物であって：核酸と結合することができる固相であって、磁性コア、及びシリカを含む外層を有する粒子を含む前記固相、及び、エチレン−アミン化合物であって、一般式ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは０〜１０又はそれ以上である）を有する前記エチレン−アミン化合物、及び金属イオンを含む、前記反応混合物。
【請求項１１】
アルカリ金属の水酸化物及び洗剤をさらに含む、請求項１０に記載の反応混合物。
【請求項１２】
マグネシウムイオン又はマンガンイオンを含む、請求項１０に記載の反応混合物。
【請求項１３】
固相を使用して試料から核酸を分離するためのキットであって：核酸と結合することができる固相であって、磁性コア、及びシリカを含む外層を有する粒子を含む前記固相、及び、エチレン−アミン化合物であって、一般式ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは０〜１０又はそれ以上である）を有する前記エチレン−アミン化合物を含み、並びに、溶解試薬、中和試薬、洗浄試薬及び溶出試薬の１つ又は２つ以上を含み、ここで前記溶解試薬はアルカリ金属の水酸化物及び洗剤を含み、中和試薬は前記エチレン−アミン化合物の１つ、マグネシウムイオン又はマンガンイオン、及び緩衝液を含む、前記キット。
【国際調査報告】
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