(57)【要約】フローサイトメトリーシステムは、細胞が流動流体で運ばれるフロー要素を含む。フロー要素は、壁部によって画成された穴部を含む。光源は、細胞を照らすように構成されている。光学系は、細胞から放射される光を受光し、受光した光の少なくとも一部を光センサへ案内する。光学系は、フロー要素の壁部に開口数増加レンズを含む。受光した光の少なくとも一部は、開口数増加レンズを通過する。また、フローサイトメトリーシステムは、２つの波長帯域の光が、異なる経路を通って、異なる検出位置に選択的に到達するように、放射光の２つの波長帯域を案内するビームスプリッタも含むことができる。システムは、経路の一方に配置されて、影響を受ける経路の焦点位置をシフトして開口数増加レンズの色収差を補正する光学素子も含むことができる。
2013535687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が流動流体で運ばれるフロー要素であって、前記フロー要素は、壁部によって画成された穴部を備え、前記壁部の少なくとも一部が実質的に透明である、フロー要素と、
前記細胞を照らすように構成された光源と、
光センサと、
照らした細胞から放射される光を受光し、受光した光の少なくとも一部を前記光センサへ案内する光学系であって、その光学系が、前記フロー要素の壁部に開口数増加レンズを備え、前記受光した光の少なくとも一部は前記開口数増加レンズを通過する光学系と
を備えるフローサイトメトリーシステム。
【請求項２】
前記開口数増加レンズは、固体開口数増加レンズである、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項３】
前記光学系は、前記細胞からの反射によって放射される光を受光して案内する、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項４】
前記光学系は、前記細胞からの蛍光によって放射される光を受光して案内する、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項５】
前記開口数増加レンズは、前記フロー要素の壁部と一体に形成される、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項６】
前記光センサは、電子光センサから構成される請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項７】
前記光センサは、線形電子光センサから構成される請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項８】
前記フローサイトメトリーシステムは、前記細胞の断面撮像を処理する請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項９】
前記光源はレーザから構成される請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１０】
前記光センサが第１の光検出位置を備え、前記フローサイトメトリーシステムは、
一方の波長帯域の光が、第１の経路を通って第１の光検出位置に選択的に到達し、かつ、他方の波長帯域の光が、第２の経路を通って第２の光検出位置に選択的に到達するように、前記放射される光の２つの波長帯域を案内するビームスプリッタを備える、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１１】
第１および第２の光検出位置は同一平面上にある、請求項１０に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１２】
第１および第２の光検出位置は、前記光センサ上に別々の位置を備える請求項１０に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１３】
第１の経路または第２の経路のいずれかに配置された光学素子であって、前記光学素子が、前記経路の一方の焦点位置をシフトすることにより、前記開口数増加レンズの色収差を補正するように構成されている光学素子をさらに備える、請求項１０に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１４】
前記光学素子は、透過性の平板である請求項１３に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１５】
前記光学素子はレンズである、請求項１３に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１６】
フローサイトメトリー用フロー要素であって、
前記フロー要素を貫通する穴部を画成する壁部であって、前記壁部の少なくとも一部が実質的に透明である壁部と、
前記壁部における開口数増加レンズと、
を備えるフロー要素。
【請求項１７】
前記開口数増加レンズは、前記壁部と一体に形成される請求項１６に記載のフロー要素。
【請求項１８】
前記穴部は、実質的に円筒形である請求項１６に記載のフロー要素。
【請求項１９】
前記穴部は、少なくとも１つの実質的に平坦な面を備える請求項１６に記載のフロー要素。
【請求項２０】
前記開口数増加レンズは、前記壁部からの半球状突出部を備える請求項１６に記載のフロー要素。
【請求項２１】
前記開口数増加レンズは、前記フロー要素の内面が、前記開口数増加レンズの無収差面に実質的に相当するように構成される、請求項１６に記載のフロー要素。
【請求項２２】
フローサイトメトリーを実行する方法であって、
壁部によって画成された穴部を備えるフロー要素を設けることと、
前記フロー要素を介して細胞を運ぶことと、
光源を用いて前記細胞を照らすことと、
光学系を用いて、前記照らした細胞から放射される光を受光することであって、前記光学系は、前記フロー要素の壁部に開口数増加レンズを備え、前記受光した光は、前記開口数増加レンズを通過することと、
前記受光した光を光センサへ案内することと
を含む方法。
【請求項２３】
処理装置において、前記光センサに当たる光の強度を示す前記光センサからの信号を受け取ることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記信号を解釈して、前記細胞に関する情報を識別することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記受光した光を少なくとも２つの波長帯域に分割するビームスプリッタを設けることであって、前記２つの波長帯域の光が、異なる経路を通って異なる検出位置に選択的に到達することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
光学素子を前記経路の一方に挿入して、前記経路の焦点位置をシフトし、前記開口数増加レンズによって導入される色収差を補正することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
サイトメトリーを実行するためのシステムであって、細胞と検出位置との間に相対運動を生じさせる機構と、
前記細胞を照らすように構成された光源と、
光センサと、
前記照らした細胞から放射される光を受光し、受光した光の少なくとも一部を前記光センサへ案内する光学系であって、その光学系は開口数増加レンズを備え、前記受光した光の少なくとも一部が前記開口数増加レンズを通過する光学系と
を備えるシステム。
【請求項２８】
前記細胞と走査位置との間に相対運動を生じさせる機構は、前記細胞が通過するフロー要素を備え、前記細胞は、流動流体中に懸濁されている、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記細胞と走査位置との間に相対運動を生じさせる機構は、前記細胞を担持するプレートを備える、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
前記プレートはディスクから構成される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記システムは、前記開口数増加レンズと前記プレートとの間に結合液をさらに備える、請求項２９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は固体開口数増加レンズを備えたサイトメトリーシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメトリーは、生体細胞の計数および特性評価に関する専門技術である。図１は、イメージングフローサイトメトリーとして知られている方法を実行するためのシステムの単純化した図を示す。イメージングフローサイトメトリーの基本的な構成において、細胞１０１は、流体中に懸濁され、一列になって狭い透明チューブ１０２内に取り込まれている。その取り込みは、流体力学的絞込みを含むいくつかの方法のうちのいずれかによって実施することができる。光源１０３は、各細胞１０１が測定位置を通過する際に、その細胞を照らす。光源１０３は、例えば、レーザである。光源１０３からの光は、測定されている細胞１０１によって散乱される。一部の光１０５は、対物レンズ１０６によって集光されて、光センサ１０７で結像するために方向を変えられる。光センサ１０７は、例えば、顕微鏡またはカメラのコンポーネントである。例えば、部分反射ミラー１０８および追加レンズ１０９を含む様々な光学素子が、光１０５をセンサ１０７へ向かわせる際に、対物レンズ１０６と協働する可能性がある。センサ１０７からの出力信号は、処理装置１１０へ送られ、その装置は、それらの信号を記憶および解析して、各細胞に関する情報、例えば、そのサイズ、およびその内部構造に関するいくつかの情報を識別することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
研究用途においては、サイトメトリーシステムは、非常に高い解像度および倍率のイメージを生成することが好ましい。例えば、細胞質におけるウイルス輸送を研究している研究者は、非常に小さな生体を撮像する必要がある可能性がある。顕微鏡または他の撮像装置の分解能は、基本的には、対物レンズの開口数（ＮＡ：  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ）と、該レンズによって集光される光の波長とに関連する回折限界またはレイリー限界によって制限される。したがって、高分解能を実現するには、非常に高いＮＡが好ましい。
【０００４】
いくつかの用途においては、１つ以上の光波長が対象となる。例えば、蛍光サイトメトリーにおいて、細胞構造は、光源による励起時に蛍光によって光を発する蛍光色素分子で標識することができる。異なる蛍光色素分子は、異なる波長帯域の光を発することができ、それに伴って、撮像対物レンズは、色収差を補正しなければならず、その結果、詳細なイメージを、１つ以上の光波長で同時に収集することができる。
【０００５】
倍率、解像度および色収差補正のためのこれらの撮像要件は、従来は、作動距離が非常に短い、高機能で高価な対物レンズを必要とした可能性がある。例えば、対物レンズの前面は、観察する対象物の１ミリ以下にする必要があるであろう。この限定された作動距離は、特に、フローサイトメトリーにおいて問題があり、この場合、細胞の取り扱いに必要なその構造は、対物レンズの作動距離内で容易に適合しない可能性がある。
【０００６】
分解能を犠牲にすれば、より長い作動距離を有するレンズを用いることもできるが、より長い作動距離は、より小さなＮＡを必要とするであろう。十分な分解能がない場合、サイトメトリーシステムは、細胞内構造を認識できない可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するため、本発明によれば、いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーシステムは、細胞が流動流体で運ばれるフロー要素を備える。該フロー要素は、壁部によって画成された穴部を備え、該壁部の少なくとも一部は、実質的に透明である。また、該フローサイトメトリーシステムは、該細胞を照らすように構成された光源と、光センサと、照らされた細胞から放射される光を受光して、受光した光の少なくとも一部を該光センサへ向ける光学系とを備えている。該光学系は、該フロー要素の壁部に、開口数増加レンズを備え、受光した光の少なくとも一部が該開口数増加レンズを通過する。いくつかの実施形態において、該開口数増加レンズは、固体開口数増加レンズである。該光学系は、該細胞からの反射によって放射される光を受光して案内する。該光学系は、該細胞からの蛍光によって放射される光を受光して案内する。該開口数増加レンズは、該フロー要素の壁部と一体形成することができる。該光センサは、電子光センサを備えることができる。該光センサは、線形電子光センサを備えることができる。該フローサイトメトリーシステムは、該細胞の断面撮像を処理することができる。該光源は、レーザを備えることができる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、該光センサは、第１の光検出位置を備え、該フローサイトメトリーシステムは、一方の波長帯域の光が、第１の経路を通って第１の光検出位置に選択的に到達し、かつ、他方の波長帯域光が、第２の経路を通って第２の光検出位置に選択的に到達するように、放射光の２つの波長帯域を案内するビームスプリッタをさらに備えている。第１の光検出位置と第２の光検出位置とは、同一平面上にあってもよい。第１および第２の光検出位置は、該光センサ上の別々の位置を備えていてもよい。いくつかの実施形態において、該フローサイトメトリーシステムは、第１の経路または第２の経路のいずれかに配置された光学素子を備え、該光学素子は、該経路の一方の焦点位置をシフトすることにより、該開口数増加レンズの色収差を補正するように構成されている。該光学素子は、透過性の平板から構成することができる。該光学素子は、レンズであってもよい。
【０００９】
他の実施形態においては、フローサイトメトリーのためのフロー要素は、該フロー要素が通る穴部を画成する壁部で少なくとも一部が実質的に透明である壁部と、該壁部における開口数増加レンズとを備えている。該開口数増加レンズは、該壁部と一体形成することができる。該穴部は、実質的に円筒形であってもよい。該穴部は、少なくとも１つの実質的に平坦な面を備えていてもよい。該開口数増加レンズは、該壁部からの半球状突出部を備えていてもよい。該開口数増加レンズは、該フロー要素の内面が、該開口数増加レンズの無収差面に実質的に相当するように構成することができる。
【００１０】
他の実施形態において、フローサイトメトリーを実行する方法は、フロー要素を設けることであって、該フロー要素が、壁部によって画成された穴部を備えることと、該フロー要素を介して細胞を運ぶことと、光源を用いて該細胞を照らすことと、光学系を用いて、照らした細胞から放射される光を受光することであって、該光学系が、該フロー要素の壁部に開口数増加レンズを含み、および受光した光が、該開口数増加レンズを通過することとを含む。これらの実施形態において、該方法は、受光した光を光センサに案内することをさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法は、処理装置において、該光センサに当たる光の強度を示す、該光センサからの信号を受け取ることをさらに含む。該方法は、該信号を解釈して、該細胞に関する情報を識別することをさらに含んでいてもよい。該方法は、受光した光を、少なくとも２つの波長帯域に分割するビームスプリッタを設けることをさらに含み、該２つの波長帯域の光は、異なる経路を通って異なる検出位置に選択的に達する。該方法は、光学素子を該経路の一方に挿入して、該経路の焦点位置をシフトし、該開口数増加レンズによって導入される色収差を補正することをさらに含んでいてもよい。
【００１１】
他の実施形態によれば、サイトメトリーを実行するシステムは、細胞と検出位置との間に相対運動を生じさせる機構と、該細胞を照らすように構成された光源と、光センサと、照らした細胞から放射される光を受光し、受光した光の少なくとも一部を該光センサへ案内する光学系とを含む。該光学系は、開口数増加レンズをさらに含み、該受光した光の少なくとも一部が該開口数増加レンズを通過する。いくつかの実施形態において、該細胞と走査位置との間に相対運動を生じさせる該機構は、該細胞が通過するフロー要素を含み、該細胞は、流動流体中に懸濁されている。いくつかの実施形態において、該細胞と該走査位置との間に相対運動を生じさせる該機構は、該細胞を担持するプレートを含んでいる。該プレートは、ディスクを含んでいてもよい。該システムは、該開口数増加レンズと該プレートとの間に結合液をさらに含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】イメージングフローサイトメトリーとして知られている方法を実行するためのシステムの単純化した図を示す。
【図２】本発明の一実施形態によるサイトメトリーシステムを示す。
【図３】図２のサイトメトリーシステムの部分断面図を示す。
【図４】開口数増加レンズの一実施例の構成を示す。
【図５Ａ】開口数増加レンズの補助を利用していない場合の直径が２．５μｍの蛍光ビーズの一群の実際のイメージを示す。
【図５Ｂ】開口数増加レンズの補助を利用した場合の直径が２．５μｍの蛍光ビーズの一群の実際のイメージを示す。
【図６】本発明の別の実施形態によるサイトメトリーシステムを示す。
【図７】別の実施形態によるフロー要素を示す。
【図８】本発明の他の実施形態によるサイトメトリーを実行するためのシステムの一部を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図２は、本発明の一実施形態によるサイトメトリーシステム２００を示す。サイトメトリーシステム２００は、フロー要素２０１を含み、細胞１０１は、そのフロー要素２０１を通過する流動流体で運ばれる。フロー要素２０１の少なくとも一部は実質的に透明であるため、照射光は細胞１０１に到達することができ、かつ、細胞１０１から放射される光を、フロー要素２０１の外部で検出することができる。実施例のフロー要素２０１は、壁部２０３によって画成された穴部２０２を備えている。実施例のフロー要素２０１において、穴部２０２は、平坦な側面を備えているが、他の形状も可能である。例えば、穴部２０２は、実質的に円筒形であってもよい。サイトメトリーシステム２００は、開口数増加レンズ、この実施例においては、固体開口数増加レンズ（ＳＮＡＩＬ：Ｓｏｌｉｄ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ−Ａｐｅｒｔｕｒｅ−Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｌｅｎｓ）２０４も含んでいる。ＳＮＡＩＬ２０４は、例えば、成形によって、壁部２０３と一体に形成された半球状突出部である。また、ＳＮＡＩＬ２０４は、フロー要素２０１とは別に形成して壁部２０３に取付けてもよく、または、別の方法でフロー要素２０１の壁部の定位置に配置してもよい。
【００１４】
サイトメトリーシステム２００は細胞１０１を照らし、同じ方向より細胞１０１から放射される光を捉える。光源１０３からの光は、部分反射ミラー１０８、対物レンズ１０６およびＳＮＡＩＬ２０４を通過して、細胞１０１に到達する。細胞１０１から放射される光は、ＳＮＡＩＬ２０４および対物レンズ１０６を通過して、ミラー１０８によりその方向が第２のレンズ１０９および光センサ１０７の方へ実質的に変えられる。また、ミラー１０８は、該光を濾波することもできる。例えば、サイトメトリーシステム２００が、蛍光によって放射された光波長におけるイメージ細胞を意図している場合、ミラー１０８は、蛍光によって該細胞から放射された光を選択的に反射するとともに、該細胞から反射された光を選択的に通過させることができる。当業者は、添付クレームの範囲内で、他の構成も可能であることを認識するであろう。例えば、光源１０３は、対物レンズ１０６の光軸と位置合わせされていない異なる方向から細胞１０１を照らすように配置してもよい。
【００１５】
ＳＮＡＩＬ２０４の機能は、対物レンズ１０６を含む該システムのＮＡを有効に増加させ、それによって、そうではない場合に実現可能な作動距離よりも長い作動距離を有しながらも、非常に高い分解能撮像を実現できる対物レンズの使用を可能にすることである。
【００１６】
図３は、図２に示すＺ方向から見れば分かるように、対物レンズ１０６が、図の下部にあり、かつ、フロー要素２０１が上部にあるように配置されたサイトメトリーシステム２００の部分断面図を示す。図３は、ＳＮＡＩＬ２０４の機能を示している。ＳＮＡＩＬ２０４は、ソリッドイマージョンレンズ（ＳＩＬ：Ｓｏｌｉｄ  Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  Ｌｅｎｓ）の実例である。光学系のＮＡおよびしたがって実現可能な分解能もまた、該光学系の他の部分がその光学系中で作動する媒質よりも高い屈折率を有する媒質中に、観察すべき対象物を浸漬することによって、有効に増加させることができる。図３において、対物レンズ１０６は、屈折率が本質的に１．０である空気中にある。フロー要素２０１およびＳＮＡＩＬ２０４は、高い屈折率を有する１つの材料または複数の材料、例えば、公称屈折率が約１．５１８のＢＫ７ガラス、または、公称屈折率が約１．５８４のポリカーボネート、または、公称屈折率が約１．７８５のＳＦ１１ガラスで形成することができる。（以下で詳細に議論するように、光学材料に固有の分散により、材料の実際の屈折率は波長に依存する。）フロー要素２０１のＳＮＡＩＬ２０４と壁部２０３とは、屈折率が一致していることが望ましいが、このことは、必ずしも必要なことではない。フローサイトメトリーにおいては、細胞１０１もまた、空気の屈折率よりも高い屈折率を有する媒質、例えば、公称屈折率が約１．３３３の水に液浸される。他の液状媒質を用いてもよい。該液状媒質と、フロー要素２０１の壁部２０３は、屈折率が厳密に一致していることが望ましいが、このこともまた、必ずしも必要なことではない。
【００１７】
図３を見て分かるように、ＳＮＡＩＬ２０４は、細胞１０１から放射される光を、細胞１０１が空気中にある場合よりもかなり大きな円錐状範囲で、対物レンズ１０６によって捉えられるようになっている。実際に、屈折率がｎのＳＩＬは、光学系のＮＡを係数ｎ２倍程度増加させることが可能である。例えば、ＳＮＡＩＬ２０４が、屈折率１．７８５のＳＦ１１ガラスで形成され、および対物レンズ１０６が、０．３のＮＡで作動する場合には、該システムの効果的な該ＮＡは（１．７８５）２×０．３＝０．９５程度に高くすることができ、これは、ＳＮＡＩＬの利点を伴わずに作動する非常に高品質で高倍率の対物レンズよりも高い可能性がある。
【００１８】
好ましくは、ＳＮＡＩＬ２０４の寸法は、ＳＮＡＩＬ２０４が、必要以上の収差を該光学系に導入しないように選択される。図４は、表面半径がＲの半球状のＳＮＡＩＬ２０４の場合の一実施例の構成を示す。距離Ｔは、ＳＮＡＩＬ２０４の頂点から壁部２０３の内面４０１までの距離を示す。距離Ｔが、Ｔ＝Ｒ（１＋１／ｎ）であるように選択され、ただし、ｎはＳＮＡＩＬ２０４および壁部２０３の屈折率である場合、内面４０１は、ＳＮＡＩＬ２０４のいわゆる無収差面に相当し、およびＳＮＡＩＬ２０４は、本質的に面４０１にあり、および該光学系の光軸近くにある細胞１０１等の対象物を撮像するための幾何収差を、たとえあったとしても、ほとんど導入しない。ＳＮＡＩＬ２０４は、図４において、半球状に図示されているが、非球面形状を代替的に用いてもよい。
【００１９】
ＳＮＡＩＬ２０４を該光学系内に含んでいるという利点は重要である。例えば、ＳＮＡＩＬ２０４を用いない場合、満足なシステム分解能を実現するには、６０倍の対物レンズを必要とする可能性があるが、その６０倍の対物レンズは、フローサイトメトリーのための適切な作動距離を有していない可能性がある。ＳＮＡＩＬ２０４の導入は、６０倍の対物レンズの何分の１かのコストで、かなり長い作動距離を有する１０倍の対物レンズの使用を可能にするであろう。増加したＮＡは、システム分解能を向上させるだけではなく、試料からの、低ＮＡのシステムの場合よりも多くの光子の捕捉ももたらし、このことは、蛍光サイトメトリーや他の微光用途にとって著しく有利である可能性がある。加えて、該システムの倍率は、約ｎ２倍も増加する。図５Ａおよび図５Ｂは、各々が２．５μｍの直径を有する蛍光ビーズの一団の実際のイメージを示す。両イメージとも、０．３の公称ＮＡを有する１０倍の対物レンズを用いて撮ったものである。図５Ａは、ＳＮＡＩＬの利点なしで撮ったものであり、一方、図５Ｂのイメージを撮るのに用いたシステムは、ＳＮＡＩＬを含んでいる。倍率および分解能の両方の増加が容易に分かる。
【００２０】
再び図２を参照すると、光センサ１０７は、特定の用途に適したどのような種類の光センサであってもよい。例えば、光センサ１０７は、ピクセルと呼ばれる感光性部位からなるアレイを備える電子光センサとすることができ、かつ、該ピクセルに当たる光の強度を示す電気信号を生成することができ、その信号から、細胞のディジタルイメージを生成することができる。光センサ１０７は、ピクセルからなる２次元アレイ、ピクセルからなる線形アレイ、ピクセルからなる多重線形アレイ、または単一の光検出器を備えることができる。
【００２１】
ＳＮＡＩＬ２０４等のＳＮＡＩＬを用いる光学系は、ライン走査または断面サイトメトリーシステム、例えば、２００９年３月２０日に出願された“Ｌｉｎｅ−Ｓｃａｎ  Ｃａｍｅｒａ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”というタイトルの米国仮特許出願第６１／１６２，０７２号明細書、２００９年８月７日に出願された“Ｓｅｒｉａｌ−Ｌｉｎｅ−Ｓｃａｎ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”というタイトルの同第６１／２３２，１１３号明細書および２００９年８月２０日に出願された“Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ”というタイトルの同第６１／２３５，６０８号明細書に記載されているシステムに特に適している可能性があり、これらの開示全体は、参照によって本願明細書に組み込まれる。ライン走査および断面撮像方法は、２次元センサを利用するシステムよりも小さな視野を用いることができる。例えば、フルイメージングサイトメトリーシステムは、２００μｍ×２００μｍの視野を有することができる。多くの種類およびサイズの細胞を、サイトメトリーシステム２００等のシステムによって観察することができるが、典型的な細胞は、直径が約１０μｍであろう。ライン走査および断面撮像方法は、細胞が、その視野の中心付近、例えば、該システムの光軸を中心とする約５０μｍ×５０μｍの領域内にある場合にのみ、該細胞を撮像することができる。したがって、ＳＮＡＩＬ２０４によって、または、フロー要素２０１のＳＮＡＩＬ２０４、壁部２０３と、細胞が懸濁されている液体との間の屈折率の不一致によって導入されるいかなる収差も、著しく相当に小さくすることができる。
【００２２】
ＳＮＡＩＬ２０４によって導入される幾何収差は、許容できる程度に小さくすることができるが、ＳＮＡＩＬ２０４は、色収差も該光学系に導入する可能性がある。どのような光学材料の屈折率も本質的に波長依存であるため、異なる波長の光は、特定の光学系によって同じ位置で焦点を合わせる必要はない。このイメージ品質に関する波長依存効果は、色収差と呼ばれている。高機能レンズは、（異なる分散特性を有する）異なる材料からなる多数の光学素子と、色収差の影響に少なくとも部分的に対抗するような選択された能力とを用いて色収差を低減するようにデザインされる。例えば、図２に示すレンズ１０６および１０９は、色に関して補正することができる。ＳＮＡＩＬ２０４、すなわち、シンプルでモノリシックの素子の導入は、ある程度の色収差を該光学系に再導入する可能性がある。多色撮像を実行しなければならない用途の場合、この色収差は、他の何らかの方式の補正が施されない限り、該光学系が、対象の全ての色において十分な分解能を得るための能力を著しく低減する可能性がある。
【００２３】
多色撮像は、蛍光によって対象の細胞から放射される光を検出する用途において、特に有用である可能性がある。例えば、試料中の異なる細胞または細胞特性は、異なる蛍光色素分子マーカーによって標識することができる。異なるマーカーは、同じかまたは異なる光源によって励起することができるが、異なる波長帯域の蛍光によって光を放射することができる。該マーカーは、例えば、Ｃｙ３やＣｙ５のシアニン染料とすることができる。Ｃｙ３は、最大で５５０ｎｍで励起され、および最大で５７０ｎｍで放射する。Ｃｙ５は、最大で６４９ｎｍで励起され、および最大で６７０ｎｍで放射する。
【００２４】
対象の多数の波長帯域を伴う試料の撮像に関する一つのアプローチは、各カメラが、そのそれぞれの色範囲に適切に焦点を合わせるように調整された異なるカメラで異なる色を撮像することである。
【００２５】
図６は、本発明の別の実施形態によるサイトメトリーシステム６００を示す。実施例のサイトメトリーシステム６００において、光源１０３は、フロー要素２０１を通って運ばれる細胞１０１を照らす。光源１０３は、レーザ、または、他の種類の光源によって構成することができる。図示されているように、光源１０３は、ビームを対物レンズ１０６、ＳＮＡＩＬ２０４を介して細胞１０１に案内する。該ビームは、他の素子も同様に通過することができ、または、他の何らかの適切な照明構成を用いてもよい。光源１０３による照明の結果として、光が、例えば、反射、蛍光またはその両方によって細胞１０１から発せられる。図６に実線および破線で示されている多数の波長帯域を含む光が発せられる可能性がある。例えば、光源１０３が広帯域光源である場合、広帯域光が細胞１０１から反射される可能性がある。光源１０３が、狭帯域光源、または、本質的にレーザ等の単色光源である場合には、多数の光色が、異なる種類の蛍光マーカーの蛍光によって、細胞１０１から生じる可能性がある。
【００２６】
発せられる光は、最終的に第２のレンズ６０５によって光源６０６に再び焦点が合わせられるように、ＳＮＡＩＬ２０４によって方向が変えられ、対物レンズ１０６によって集光される。対物レンズ１０６及び第２のレンズ６０５は、無限補正光学系に含まれ、それらの間への様々な他の光学部品の挿入を可能にする。光センサ６０６は、ピクセルと呼ばれる感光性部位からなるアレイを備える電子光センサから構成することができ、かつ、該ピクセルに当たる光の強度を示す電気信号を生成することができる。該信号は、処理装置６０９へ送られ、その処理装置は、細胞のディジタルイメージを生成することができる。光センサ６０６は、ピクセルからなる２次元アレイ、ピクセルからなる１つの線形アレイ、ピクセルからなる多数の線形アレイ、または、個別の感光性部位を備えることができる。光センサ６０６は、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）センサ、電荷結合素子（ＣＣＤ：Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）センサ、１つ以上の光電子増倍管（ＰＭＴ：ＰｈｏｔｏＭｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）または他の種類のセンサとすることができる。
【００２７】
ミラーおよびフィルタの配置は、一方の波長帯域の光が、第１の経路を通って第１の光検出位置に選択的に到達し、かつ、他方の波長帯域の光が、第２の経路を通って第２の光検出位置に選択的に到達するように、放射される光の２つの波長帯域を案内する例示的なビームスプリッタを構成する。例えば、ミラー６０１は、（図６に実線で図示されている）特定の波長帯域の光を選択的に反射し、かつ、その特定の波長帯域ではない光を選択的に通過させるように構成されたダイクロイックミラーとすることができる。ミラー６０２は、シンプルな部分反射ミラーとすることができ、または、濾波特性を有していてもよいが、いずれにしても、（破線で図示されている）第２の波長帯域を実質的に反射する。したがって、細胞１０１から発せられる光は分割され、一部の波長は主に一方の経路をたどり、他の波長帯域は、主に異なる経路をたどる。
【００２８】
任意の追加的なフィルタ６０７および６０８はさらに、例えば、２つの検出経路間のクロストークを低減するように、２つの異なる経路をたどる光のスペクトル成分を調整することができる。ミラー６０３および６０４は、該光を第２のレンズ６０５を介して光センサ６０６へ案内することができる。図６に示す実施例において、２つの光路は、同じ光センサ６０６上の異なる検出位置に至る。したがって、光センサ６０６によって生成された信号は、異なる色の光で形成され、かつミラー６０１および６０２を備えるビームスプリッタによって空間的にシフトされた２つのイメージを示すことになる。別法として、該異なる検出位置は、２つの異なるイメージを受け取るために設けられた異なるセンサ上にあってもよい。
【００２９】
光センサ６０６は実質的に平らであるため、かつ該光学系の色収差のために、該２つのイメージはともに、ある種の補正なしでは光センサ６０６に焦点が合わない可能性がある。システム６００において、その補正は、追加的な光学素子６１１を一方の経路に挿入することによって実行できる。光学素子６１０は、一方の波長帯域の光の焦点位置をシフトすることによって、ＳＮＡＩＬ２０４の色収差を補正するように構成されている。図６に示すように、光学素子６１０は、影響を受ける経路が短くなるように、最長の焦点距離を有する経路に挿入された正レンズである。他の種類の光学素子を用いてもよい。例えば、光学素子６１０は、シンプルで平坦な透過性の平板であってもよく、または、負レンズを、他方の光路を長くするために該他方の光路中に配置してもよい。
【００３０】
図７は、フロー要素２０１に対する代替的な実施形態を示す。この実施形態において、フロー要素２０１Ａは、壁部２０３Ａによって画成された概して円筒形の穴部２０２Ａを有している。本発明の実施形態の使用に適しているフロー要素は、多くの方法のうちのいずれかで形成することができる。単に例として、ＳＮＡＩＬ２０４または２０４Ａを含むフロー要素２０１または２０１Ａ等のフロー要素は、ガラスまたはポリマー等の透明材料から一体装置として成形することができるであろう。別法として、該フロー要素の壁部および穴部を押し出し成形によって形成し、および該ＳＮＡＩＬを別に形成して、後で接着剤を用いて取り付けてもよい。その接着剤は、接合される該壁部およびＳＮＡＩＬに一致する屈折率であることが好ましい。これらまたは他の製造方法は、フローサイトメトリーシステムの交換可能または使い捨ての部材とすることができる低コストの装置をもたらすことができる。また、要素２０１または２０１Ａ等のフロー要素は、フローサイトメトリーシステムの他の部分、例えば、取付け面またはラグ、ボルト孔、ホース継手または他の形状構成への接続を容易にするための形状構成を含んでもよい。
【００３１】
図８は、本発明の他の実施形態による、サイトメトリーを実行するためのシステム８００の一部を示す。システム８００は、細胞１０１と検出位置８０１との間に相対運動を生じさせる機構を備えている。検出位置８０１は、例えば、ＳＮＡＩＬ８０２と協働するレンズ８０６等の対物レンズの焦点の近くにあってもよい。対物レンズ８０６およびＳＮＡＩＬ８０２は、一定の関係で保持されることが好ましい。光源および光センサ（図示せず）は、細胞１０１を照らし、細胞１０１から発せられる光を受光する。細胞１０１および他の細胞は、プレート８０３に付着するか、または、該プレートによって担持される。プレート８０３は、例えば、顕微鏡スライドまたはディスクとすることができる。細胞１０１と検出位置８０１との間の相対運動は、プレート８０３を動かすことにより、対物レンズ８０６およびＳＮＡＩＬ８０２を動かすことにより、または、両者を異なる速度で動かすことにより、生じさせることができる。一実施形態において、対物レンズ８０６とＳＮＡＩＬ８０２とは、静止して保持されるが、回転ディスク状のプレート８０３は、動かされる。別の実施形態の構成においては、レンズ８０６およびＳＮＡＩＬ８０２は、細胞１０１および他の細胞がその上に付着され、または担持される回転ディスクに関して、径方向に動くことができる。
【００３２】
細胞１０１は、流体内に、例えば、流体チャンバ８０４内に懸濁させることができる。好ましくは、高屈折率環境中で細胞１０１の浸漬を維持するために、ＳＮＡＩＬ８０２とプレート８０３との間には、結合液８０５が存在している。その浸漬に伴う材料の屈折率は、例えば、プレート８０３およびＳＮＡＩＬ８０２が作られている材料と、細胞１０１が懸濁されている流体と、もしあれば、結合液８０５とに適合されることが理想的である。しかし、実際には、屈折率の完全な適合は、ほとんどの場合、恩恵を得るのに必要ない。
【００３３】
システム８００は、プレート８０３の下にＳＮＡＩＬ８０２と対物レンズ１０３とを備えている状態で図示されているが、該システムは、ＳＮＡＩＬ８０２と対物レンズ１０３とがプレート８０３の上にあるように逆にすることも可能である。その他の構成も同様に可能である。本発明の実施形態によるシステムは、ＳＮＡＩＬ８０２なしで同等の画質を実現するのに必要なレンズと比べて、より低コストの対物レンズ８０６を用いることができ、また、軸合わせおよび焦点調節に対して緩い要件を有することができる。
【００３４】
本発明の実施形態を、直線状チューブ内に閉じ込められるか、または、プレートによって担持された細胞を走査する場合について説明してきたが、当業者は、本発明の実施形態を、電気泳動、圧力駆動流、光ピンセット、電動移転ステージおよびその他の方法を含む様々な細胞配送方法のうちのいずれかを用いるシステムに利用できることを認識するであろう。細胞は、油乳剤中、電子ウェッティングで作用する液滴中、または、電磁ビーズ標識によって支援される磁気輸送によるペイロードとして運ぶことができる。クレームは、利用する細胞配送方法によって限定されないことが意図されている。
【００３５】
本願明細書に添付されているクレームにおいて、「一つの」という用語は、「１つ以上」を意味するように意図されている。「備える、含む」という用語、および「備えている、含んでいる」等のその変形は、ステップまたは要素の記述に先行する場合に、さらなるステップまたは構成要素の追加が任意であり、および排除されないことを意味するように意図されている。これまで、本発明を明確にし、および理解するために詳細に記載してきた。しかし、当業者は、添付クレームの範囲内で、いくらかの変形および変更を実施できることを正しく認識するであろう。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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