(57)【要約】  本発明は、グリセロールを利用して３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する新しい方法に関し、より一層詳しくはアデノシルコバラミン生成能を有し、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物に含まれているアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させて得た変異微生物をグリセロール含有培地で培養して３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。本発明によると、アデノシルコバラミンを追加する必要なく、微好気的あるいは好気的条件下でもグリセロールの発酵が可能であるため、３−ヒドロキシプロピオン酸の大量産生のための生物学的工程開発に好適と判断される。
2013509175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法：
（ａ）コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させて得た変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び
（ｂ）生成された前記１，３−プロパンジオールを回収する工程。
【請求項２】
前記コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物は、クレブシエラ（Klebsiella）属微生物であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記（ａ）工程の培地は、コエンザイムＢ１２を含有しないことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物は、グリセロール酸化経路が遮断された微生物であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
下記工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法：
（ａ）グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｈａＤ）、転写活性因子遺伝子（ＤｈａＲ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ＤｈａＴ）及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子ＩＩ遺伝子（ＤｈａＢＡ２）が欠失されているクレブシエラ・ニューモニエ変異体（ＡＫ菌株）に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されていて、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び
（ｂ）生成された前記１，３−プロパンジオールを回収する工程。
【請求項６】
前記（ａ）工程の培地は、コエンザイムＢ１２を含有しないことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が増幅されているクレブシエラ・ニューモニエ変異体。
【請求項８】
グリセロール酸化経路が遮断されていることを特徴とする請求項７に記載のクレブシエラ・ニューモニエ変異体。
【請求項９】
クレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ（ＫＣＴＣ１１５６９ＢＰ）であることを特徴とする請求項８に記載のクレブシエラ・ニューモニエ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロールを利用して３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する新しい方法に関し、より一層詳しくはコエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させた変異微生物をグリセロール含有培地で培養して３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシプロピオン酸は乳酸、コハク酸と共に、バイオマス由来の３大プラットホーム化学原料として注目されている物質として、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、アクリルアミド、マロン酸、パイオポリマー（ポリ−ヒドロキシプロピオン酸）の製造のための原料で活用可能であるが、大量産生技術の開発が大変重要である。
【０００３】
３−ヒドロキシプロピオン酸を製造するための化学工程としては、パラジウム触媒を利用して、１，３−プロパンジオールから製造する方法（ＵＳ５３２１１５６）、パラジウム、白金触媒を利用して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから製造する方法（ＵＳ５８３１１２１）、イオン交換樹脂を利用してアクリル酸から製造する方法（ＪＰ２０００−１５９７２４）、酸あるいは塩基触媒を利用してエポキシド誘導体から製造する方法（ＫＲ１０−０４０８８０６）等が報告されている。
【０００４】
生物学的方法としては、ウィスコンシン大学のＳｕｔｈｅｒｓ等がクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来のグリセロールデヒドラアテーゼ（glycerol dehydratase）遺伝子と大腸菌あるいはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）遺伝子を過発現した組換え大腸菌を利用してグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する方法を報告した（ＵＳ６８５２５１７）。最近では、Ｒａｔｈｎａｓｉｎｇｈ等がグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸産生量が向上した新しい組換え大腸菌について報告した。
【０００５】
しかし、組換え大腸菌を利用して、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する方法は、グリセロールデヒドラターゼ酵素の再活性化のために必要な補助酵素である高価なアデノシルコバラミン（コエンザイムＢ１２）を培養液に供給しなければならない短所がある。
【０００６】
そこで、本発明者等は、高価な添加物を要しないと共に、高い産生性を有する３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法を開発しようと鋭意努力した結果、クレブシエラ・ニューモニエからアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現させる場合、コエンザイム１２を添加しなくても、高い産生率で３−ヒドロキシプロピオン酸を製造できることを確認して本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、高価な添加物を要しないと共に、高い産生性を有する３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は（ａ）コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物からアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させて得た変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び（ｂ）前記の生成された１，３−プロパンジオールを回収する工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｈａＤ）、転写活性因子遺伝子（ＤｈａＲ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ＤｈａＴ）及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子ＩＩ遺伝子（ＤｈａＢＡ２）が欠失されているクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）変異体（ＡＫ菌株）に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されていて、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び前記の生成された１，３−プロパンジオールを回収する工程を含む３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が増幅されているクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）変異体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｈＰＬＣの表面発現様子を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）の結果である。図１は、クレブシエラ・ニューモニエＣｕ菌株代謝産物の液体クロマトグラフィー分析結果を示した（▽：３−ヒドロキシプロピオン酸、▼：１，３−プロパンジオール）。
【図２】クレブシエラ・ニューモニエの３−ヒドロキシプロピオン酸及び１，３−プロパンジオール産生代謝経路を示した。
【図３】組換えプラスミドｐＶＯＨＫ及びｐＶＯＴＨｋの作製過程を示した。
【図４】組換えプラスミドｐＶＯＴの作製過程を示した。
【図５】クレブシエラ・ニューモニエＡＫ変異菌株の作製過程を示した。
【図６】クレブシエラ・ニューモニエＣｕ由来組換え菌株代謝産物の液体クロマトグラフィー分析結果を示した（▽：３−ヒドロキシプロピオン酸、▼：１，３−プロパンジオール）。
【図７】クレブシエラ・ニューモニエＡＫ由来組換え菌株代謝産物の液体クロマトグラフィー分析結果を示した（▽：３−ヒドロキシプロピオン酸、▼：１，３−プロパンジオール）。
【図８】クレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ菌株の５Ｌ−発酵槽培養結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一観点において、本発明は、（ａ）コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させた変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び（ｂ）前記の生成された１，３−プロパンジオールを回収する工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法に関する。
【００１３】
本発明において、前記コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物は、クレブシエラ（Klebsiella）属微生物であることを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物は、クレブシエラ属微生物であることが好ましく、クレブシエラ・ニューモニエであることが最も好ましい。
【００１５】
本発明の一実施例では、クレブシエラ・ニューモニエが、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸を産生することを最初に確認し、クレブシエラ・ニューモニエ菌株の３−ヒドロキシプロピオン酸の生成能を向上させるために、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドで３−ヒドロキシプロピオン酸を生成させるアルデヒドデヒドラターゼをコードする遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ菌株で遺伝子組換えを介して過発現させた組換え菌株を作製して、前記組換え菌株をグリセロール含有培地で培養した結果、野生型菌株に比べて７倍も高収率で３−ヒドロキシプロピオン酸を生成させることを確認した。
【００１６】
本発明において、（ａ）工程の培地は、コエンザイムＢ１２を含有しないことを特徴とする。
【００１７】
本発明において、前記コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物は、グリセロール酸化経路が遮断された微生物であることを特徴とする。
【００１８】
前記グリセロール酸化経路が遮断された微生物は、クレブシエラ・ニューモニエＡＫ菌株（ＫＣＴＣ１１４１９ＢＰ）であることを特徴とする。
【００１９】
他の観点において、本発明は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｈａＤ）、転写活性因子遺伝子（ＤｈａＲ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ＤｈａＴ）及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子ＩＩ遺伝子（ＤｈａＢＡ２）が欠失されているクレブシエラ・ニューモニエ変異体（ＡＫ菌株）に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されていて、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び前記の生成された１，３−プロパンジオールを回収する工程を含む３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。
【００２０】
また他の観点において、本発明は、コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が増幅されているクレブシエラ・ニューモニエ変異体に関する。
【００２１】
本発明において、前記変異体は、グリセロール酸化経路が遮断されていることを特徴とする。
本発明において、前記変異体は、クレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ（ＫＣＴＣ１１５６９ＢＰ）であることを特徴とする。
【００２２】
本発明において、前記変異体の培養液からの３−ヒドロキシプロピオン酸の回収は、通常の分離技術、例えば蒸留、電気透析、蒸発、クロマトグラフィー、溶媒抽出、反応抽出等を利用することができ、通常純度が高い物質を分離するためにこれらを組合せて利用することができる。
【００２３】
本発明において、遺伝子の「増幅」とは、個体の染色体上に存在したりプラスミドに存在する遺伝子を追加で「導入」して過発現できるようにすることであり、本発明で遺伝子の「導入」とは、個体の染色体上に遺伝子を挿入させたり、組換えベクターを利用して遺伝子を個体に形質転換させることを意味する。
【００２４】
本発明において、前記遺伝子を細胞の染色体上に挿入する方法としては、通常知られる遺伝子操作方法を使用でき、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたは、非ウイルス性ベクターを利用する方法が挙げられる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。即ち、下記工程は一つの例示として説明されるだけであり、本発明の範囲がこれらに限定されない。
【００２６】
実施例１：クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）菌株によるグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸の産生
伝統的なグリセロール発酵微生物であるクレブシエラ・ニューモニエでプラスミドをキュアリングさせたクレブシエラ・ニューモニエＣｕ菌株［クレブシエラ・ニューモニエＭＧＨ７８５７８菌株（ＡＴＣＣ７００７２１）からプラスミドがキュアリングされた菌株］をグルコースあるいはグリセロールを唯一炭素源として含む培地５０ｍＬを使って、３７℃で３０時間、１２０ｒｐｍで培養した後、３−ヒドロキシプロピオン酸の産生量をクロマトグラフィーで分析した。
【００２７】
使われた培地の組成は次のとおりである。
０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に２０ｇ／Ｌグリセロールあるいはグルコースを添加した後、２ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．００２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、１ｍＬ鉄溶液［５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、４ｍＬ  ＨＣｌ（３７％、ｗ／ｖ）]及び１ｍＬ微量元素溶液［７０ｍｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２、１００ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２００ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２４Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ、２５ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２６Ｈ２Ｏ、３５ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、４ｍＬ  ＨＣｌ（３７％、ｗ／ｖ）]を添加した。ＩＰＴＧ濃度は、０．５ｍＭにし、抗生剤はテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬにした。
【００２８】
クレブシエラ・ニューモニエでプラスミドをキュアリングさせる方法としては、クレブシエラ・ニューモニエＭＧＨ７８５７８を抗生剤を添加しなかった液状培地で数回繰り返し培養した後、テトラサイクリンが添加、または添加されなかった培地へ接種して、プラスミドＤＮＡが消失して、テトラサイクリンが添加された培地で増殖できないコロニーを選別して、クレブシエラ・ニューモニエＭＧＨ７８５７８Ｃｕと命名した後、３−ヒドロキシプロピオン酸の産生量を確認した。
【００２９】
クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００（ｒｅｆａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＲＩＤ）にＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，３００ｍｍ×７８ｍｍ）コラムを使い、移動相は０．５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）を使い、標準物質は市販の３−ヒドロキシプロピオン酸（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）（図１の一番目のグラフ）を使った。
【００３０】
その結果、図１に示したように、グルコースを含有した培地で培養したクレブシエラ・ニューモニエは、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成しなかったが、グリセロールを含有した培地では３−ヒドロキシプロピオン酸の生成を確認することができた（０．２ｇ／Ｌ）。また、グリセロール含有培地では、１，３−プロパンジオールの産生が確認された。
【００３１】
前記結果から、図２に示したようにクレブシエラ・ニューモニエでグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸の産生のための代謝経路ができたことが類推可能である。
【００３２】
実施例２：グリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸の産生に適合したクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）組換え菌株の開発
（１）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子過発現プラスミドの作製
図２に示したように、クレブシエラ・ニューモニエ菌株でグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸の産生に関与すると判断されるアルデヒドデヒドロゲナーゼをクレブシエラ・ニューモニエで過発現させるためのプラスミドを作製した。
【００３３】
アルデヒドデヒドロゲナーゼを染色体ＤＮＡを鋳型として下記のプライマー配列を使ってアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＨｋ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  Ｎｏ．ＡＢＲ７６４５３）を増幅した後、ｐＧＥＭ  ＴＥａｓｙベクターでクローニングして塩基配列を確認した後、プラスミドＤＮＡを製造した（図３）。
配列番号１：５'−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−３'（ＡｌｄＨｋ−Ｆ）
配列番号２：５'−ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＣ−３'（ＡｌｄＨｋ−Ｒ）
【００３４】
図３に示したように、ｌａｃＺプロモーター下流にクレブシエラ・ニューモニエのアルデヒドデヒドロゲナーゼＡｌｄＨｋ遺伝子を導入した後、ＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子（ｄｈａＴ）が含まれたプラスミド、或いはＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子と１，３−プロパンジオール酸化還元酵素遺伝子（ＤｈａＴ）が含まれたプラスミドに挿入して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＶＯＨｋ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子を含有するプラスミドｐＶＯＴＨｋを作製した。
【００３５】
図４は、ＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子が含まれたプラスミド（ｐＶＯ）、或いはＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子と１，３−プロパンジオール酸化還元酵素遺伝子（ＤｈａＴ）がプラスミドＤＮＡ（ｐＶＯＴ）を作製する過程を示したものであり、ｐＶＯＴはクレブシエラ・ニューモニエに組換えて、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＫ−ＶＯＴ（ＫＣＴＣ１１４２１ＢＰ）として韓国生命工学研究院遺伝資源センターに寄託した。
【００３６】
（２）グリセロール酸化還元経路が欠損されたクレブシエラ・ニューモニエ組換え菌株の作製
プラスミドＤＮＡがキュアリングされたクレブシエラ・ニューモニエＭＧＨ７８５７８菌株（Ｃｕと命名）を母菌株として相同性組換え方法でｄｈａレギュロン（図５）の一つのＤｈａＢ酵素再活性化因子、ＤｈａＴ遺伝子、ＤｈａＲ調節因子及びＤｈａＤ遺伝子をａｐｒａｍｙｃｉｎ耐性遺伝子に置き換えて、酸化還元経路が全部欠損された組換え菌株ＡＫを製造した。
【００３７】
クレブシエラ・ニューモニエＭＧＨ７８５７８菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として、相同性組換え（homologous recombination）用プラスミドを製造するためのＤＮＡ断片を下記のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した。
【００３８】
ｄｈａＢＩ遺伝子断片増幅用プライマー
配列番号３：５'−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴ−３'（ｄｈａＢＩ  ＸｂａＩ−４８０ｂｐＦ）
配列番号４：５'−ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣ−３'（ｄｈａＢＩ  ＢａｍＨＩ−４８０ｂｐＲ）
ｄｈａＫ遺伝子断片増幅用プライマー
配列番号５：５'−ＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＴＧＴＣ−３'（ｄｈａＫ  ＨｉｎｄＩＩＩ−２００−７００  ｂｐＦ）
配列番号６：５'−ＡＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣ−３’（ｄｈａＫ  ＢｇｌＩＩ−２００−７００ｂｐＲ）
ｄｈａＲ遺伝子断片増幅用プライマー
配列番号７：５'−ＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＴＣＧＣＧＡＣＧＧＣＡ−３'（ｄｈａＲ  ｂｇｌＩＩ−２００−７００ｂｐＦ）
配列番号８：５'−ＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＡＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＡＧＧＴＧ−３'（ｄｈａＲ  ＨｉｎｄＩＩＩ−２００−７００ｂｐＲ）
Ａｐｒ遺伝子断片増幅用プライマー
配列番号９：５'−ＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣ−３'Ａｐｒ  ＨｐａＩ  Ｆ
配列番号１０：５'−ＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＧＡ−３'Ａｐｒ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＲ
【００３９】
増幅されたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ  ＴＥａｓｙベクターを利用してクローニングして塩基配列を確認した後、図５に示した通りプラスミドＤＮＡを作製した。
図５に示した方法で、ＡＫ菌株を製造するためのＤｈａＢ遺伝子のアミノ末端（ｄｈａＢ’）−ＬａｃＺ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＰｌａｃＺ）−Ａｐｒａｍｙｃｉｎ耐性遺伝子−ＤｈａＫ遺伝子のアミノ末端（ｄｈａＫ’）が連結されたプラスミドＤＮＡを作製した。
【００４０】
前記プラスミドをＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩで処理して回収したＤＮＡ断片を電気衝撃法でクレブシエラ・ニューモニエＣｕ菌株に導入した後、ａｐｒａｍｙｃｉｎが添加された培地でコロニーを形成する組換え菌株を分離した。その結果、ｄｈａレギュロンのＤｈａＢ酵素再活性化因子、ＤｈａＴ遺伝子、ＤｈａＲ調節因子及びＤｈａＤ遺伝子が除去されてｌａｃＺプロモーターとａｐｒａｍｙｃｉｎ耐性遺伝子が挿入された組換え菌株クレブシエラ・ニューモニエＡＫ菌株（ＫＣＴＣ１１４１９ＢＰ）を収得した。
【００４１】
（３）グリセロール嫌気代謝酸化経路が遮断された変異株でアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の過発現
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＶＯＨｋ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子を含有するプラスミドｐＶＯＴＨｋ及び対照区でＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子あるいはＤｈａＢ再活性化酵素遺伝子と１，３−プロパンジオール酸化還元酵素遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを電気衝撃法でクレブシエラ・ニューモニエＣｕ菌株とＡＫ菌株で導入した。本実施例で作製した組換え菌株ＡＫ−ＶＯＴＨｋは韓国生命工学研究院内遺伝子元センターに寄託した（ＫＣＴＣ１１５６９ＢＰ）。
【００４２】
【表１】
2013509175.tif 000003
【００４３】
実施例２で製造された組換え菌株を実施例１と同様な培地条件（炭素源はグリセロール）で３７℃、１２０ｒｐｍで培養しながら、培養液中の代謝産物を実施例１と同様な条件で分析した。
その結果、２０時間培養したクレブシエラ・ニューモニエＣｕ由来の組換え菌株は、添加したグリセロールを全部消耗しながら１，３−プロパンジオールと３−ヒドロキシプロピオン酸を産生したが、アルデヒドデヒドロゲナーゼａｌｋＨｋ遺伝子の高発現によってその産生量は殆ど影響を受けないことが明らかになった（図６及び表２）。一方、グリセロール発酵代謝酸化経路が遮断された変異株ＡＫ由来の組換え菌株で３−ヒドロキシプロピオン酸産生量は顕著に増加することが確認された（図７）。ＡＫ−ｐＶＯＴＨｋ菌株で３−ヒドロキシプロピオン酸の産生量は、Ｃｕ菌株に比べて７倍以上増加した（表３）。
【００４４】
【表２】
2013509175.tif 000004
【００４５】
【表３】
2013509175.tif 000005
【００４６】
実施例３：クレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ菌株の好気培養を通したグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸の産生
５Ｌ発酵槽を利用してクレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ菌株の増殖程度を調べると共に、培養上澄水のグリセロールの残存量と３−ヒドロキシプロピオン酸、１，３−プロパンジオールをはじめとする代謝産物の生成量をクロマトグラフィー法で分析した。
培地組成は下記の通りである：
２０ｇ／Ｌグリセロール、３．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．００２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、１ｍＬ鉄溶液［５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、４ｍＬ  ＨＣｌ（３７％、ｗ／ｖ）］及び１ｍＬ微量元素溶液［７０ｍｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２、１００ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２００ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２４Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ、２５ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２６Ｈ２Ｏ、３５ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、４ｍＬ  ＨＣｌ（３７％、ｗ／ｖ）]。
【００４７】
【表４】
2013509175.tif 000006
【００４８】
５Ｌ発酵槽に有効容積を２Ｌにし、最終濃度がＩＰＴＧ０．５ｍＭ、テトラサイクリン１０μｇ／Ｌにし、接種量１％、培養温度３７℃、撹拌速度２００ｒｐｍ、空気注入速度は０．５ｖｖｍにした。
その結果、図８に示したように、培養２１時間目にグリセロールを全部消耗しており、この時、３−ヒドロキシプロピオン酸の産生量、転換率及び産生性は各々４．５ｇ／Ｌ、０．２５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、０．２１ｇ／Ｌｈであった。添加したグリセロールが完全に消耗した後にも３−ヒドロキシプロピオン酸の産生量は徐々に増加して最大６．０ｇ／Ｌ水準に達しており、これは生成された１，３−プロパンジオールから転換によるものと見られる。
【００４９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によると、コエンザイムＢ１２を追加する必要なく、微好気的、或いは好気的条件下でもグリセロールの発酵が可能であるため、３−ヒドロキシプロピオン酸の大量産生のための生物学的工程開発に好適と判断される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年7月2日(2012.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
下記工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法：
（ａ）コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させて得た変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び
（ｂ）生成された前記３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
下記工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法：
（ａ）グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｈａＤ）、転写活性因子遺伝子（ＤｈａＲ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ＤｈａＴ）及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子ＩＩ遺伝子（ＤｈａＢＡ２）が欠失されているクレブシエラ・ニューモニエ変異体（ＡＫ菌株）に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されていて、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び
（ｂ）生成された前記３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する工程。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
３−ヒドロキシプロピオン酸は乳酸、コハク酸と共に、バイオマス由来の３大プラットホーム化学原料として注目されている物質として、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、アクリルアミド、マロン酸、パイオポリマー（ポリ−ヒドロキシプロピオン酸）の製造のための原料で活用可能であるため、大量産生技術の開発が大変重要である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は（ａ）コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物からアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させて得た変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び（ｂ）前記の生成された３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
また、本発明は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｈａＤ）、転写活性因子遺伝子（ＤｈａＲ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ＤｈａＴ）及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子ＩＩ遺伝子（ＤｈａＢＡ２）が欠失されているクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）変異体（ＡＫ菌株）に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されていて、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び前記の生成された３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する工程を含む３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
一観点において、本発明は、（ａ）コエンザイムＢ１２生成能を有し、グリセロールを炭素源として、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する能力を有する微生物においてアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅させた変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び（ｂ）前記の生成された３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する工程を含む、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法に関する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
他の観点において、本発明は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｈａＤ）、転写活性因子遺伝子（ＤｈａＲ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ＤｈａＴ）及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子ＩＩ遺伝子（ＤｈａＢＡ２）が欠失されているクレブシエラ・ニューモニエ変異体（ＡＫ菌株）に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されていて、グリセロールを炭素源として３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して、３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程、及び前記の生成された３−ヒドロキシプロピオン酸を回収する工程を含む３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例３：クレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ菌株の培養を通したグリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸の産生
５Ｌ発酵槽を利用してクレブシエラ・ニューモニエＡＫ−ＶＯＴＨｋ菌株の増殖程度を調べると共に、培養上澄水のグリセロールの残存量と３−ヒドロキシプロピオン酸、１，３−プロパンジオールをはじめとする代謝産物の生成量をクロマトグラフィー法で分析した。
培地組成は下記の通りである：
２０ｇ／Ｌグリセロール、３．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．００２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、１ｍＬ鉄溶液［５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、４ｍＬ  ＨＣｌ（３７％、ｗ／ｖ）］及び１ｍＬ微量元素溶液［７０ｍｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２、１００ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２００ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２４Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ、２５ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２６Ｈ２Ｏ、３５ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、４ｍＬ  ＨＣｌ（３７％、ｗ／ｖ）]。
【国際調査報告】
2013509175.tif 000015
2013509175.tif 000016
2013509175.tif 000017
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