(57)【要約】  ハイドロフォビン、タンパク質および/またはポリサッカライドならびに対応する変性酵素を含む食物組成物であって、該変性酵素の活性は実質的に低減されている食物組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.015MMU未満、好ましくは0.01MMU未満の検出可能なマンナナーゼ活性、
0.1EGU未満、好ましくは0.05EGU未満の検出可能なエンドグルコナーゼ活性、
1.3PU未満、好ましくは1PU未満、より好ましくは0.5PU未満の検出可能なシステインプロテアーゼ活性、
またはそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される酵素活性を有するハイドロフォビン組成物。
【請求項２】
前記マンナナーゼ活性は、少なくとも0.001MMU、より好ましくは少なくとも0.005MMUである、請求項1に記載のハイドロフォビン組成物。
【請求項３】
前記エンドグルコナーゼ活性は、少なくとも0.001EGU、より好ましくは少なくとも0.005EGU、最も好ましくは少なくとも0.01EGUである、請求項1に記載のハイドロフォビン組成物。
【請求項４】
前記システインプロテアーゼ活性は、少なくとも0.01PU、より好ましくは少なくとも0.05PU、より好ましくは少なくとも0.1PUである、請求項1に記載のハイドロフォビン組成物。
【請求項５】
ハイドロフォビンを(製品の総重量に基づき)少なくとも0.001重量%、好ましくは少なくとも0.005重量%、より好ましくは少なくとも0.01重量%含み、
0.015MMU未満、好ましくは0.01MMU未満のマンナナーゼ活性、
0.1EGU未満、好ましくは0.05EGU未満のエンドグルコナーゼ活性、
1.3PU未満、好ましくは1PU未満、より好ましくは0.5PU未満のシステインプロテアーゼ活性、
またはそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される酵素活性を有する食物組成物。
【請求項６】
前記マンナナーゼ活性は、少なくとも0.001MMU、より好ましくは少なくとも0.005MMUである、請求項5に記載の食物組成物。
【請求項７】
前記エンドグルコナーゼ活性は、少なくとも0.001EGU、より好ましくは少なくとも0.005EGU、最も好ましくは少なくとも0.01EGUである、請求項5に記載の食物組成物。
【請求項８】
前記システインプロテアーゼ活性は、少なくとも0.01PU、より好ましくは少なくとも0.05PU、より好ましくは少なくとも0.1PUである、請求項5に記載の食物組成物。
【請求項９】
ミルクタンパク質、大豆タンパク質、セルロース、セルロース誘導体、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、柑橘類の繊維、デンプン、デンプン誘導体、ローカストビーンガム、グアーガム、フェヌグリークガムおよびタラガムから選択されるタンパク質および/またはポリサッカライドを含む、請求項5から8のいずれか一項に記載の食物組成物。
【請求項１０】
気体を含ませた冷凍菓子、ムース、泡立てられたクリーム、乳製品を含まないクリーム、マヨネーズ、ドレッシング、スプレッド、スープ、ソースまたは飲料、より好ましくは、空気を含ませた冷凍菓子である、請求項5から9のいずれか一項に記載の食物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にハイドロフォビンならびにポリサッカライドおよび/またはタンパク質を含む食物組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロフォビンは、増殖培地にハイドロフォビンを分泌する、糸状不完全菌(例えば、トリコデルマ(Trichoderma))などの糸状菌、担子菌および子嚢菌を培養することによって得られる。あるいは、ハイドロフォビンは、組み換え技術の使用によって得ることもできる。例えば、宿主細胞、典型的には微生物は、ハイドロフォビンを発現するように改変されてもよい。一般に、ハイドロフォビンを含む増殖培地は、発酵過程のその他の生成物も含む。
【０００３】
特許文献１には、例えば、アイスクリームなどの気体を含ませた食品中に気泡を作り出し安定化させることに対して、ハイドロフォビンが非常に有効であることが開示されている。多くの食品は、安定剤または増粘剤としてポリサッカライド(例えば、ローカストビーンガム、グアーガムおよびカルボキシメチルセルロース)を含む。食品は、ミルクタンパク質などのタンパク質も含む場合が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第1626361号
【特許文献２】国際公開第01/74864号
【特許文献３】国際公開第96/41882号
【特許文献４】国際公開第01/57076号
【特許文献５】国際公開第00/58342号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wessels、1997年、Adv. Microb. Physio. 38: 1〜45頁
【非特許文献２】Wosten、2001年、Annu Rev. Microbiol. 55: 625〜646頁
【非特許文献３】De Vochtら、1998年、Biophys. J. 74: 2059〜68頁
【非特許文献４】Wostenら、1994年、Embo. J. 13: 5848〜54頁
【非特許文献５】Talbot、2003年、Curr. Biol, 13: R696〜R698頁
【非特許文献６】MacCabeおよびVan Alfen、1999年、App. Environ. Microbiol 65: 5431〜5435頁
【非特許文献７】Collenら、2002年、Biochim Biophys Acta. 1569: 139〜50頁
【非特許文献８】Calonjeら、2002年、Can. J. Microbiol. 48: 1030〜4頁
【非特許文献９】Askolinら、2001年、Appl Microbiol Biotechnol. 57: 124〜30頁
【非特許文献１０】De Vriesら、1999年、Eur J Biochem. 262: 377〜85頁
【非特許文献１１】Aroら、(2001年) J. Biol. Chem. 276:24309〜14頁
【非特許文献１２】Knowlesら、(1987年) TIBTECH 5:255〜61頁
【非特許文献１３】Schulein(1988年) Methods Enzymol. 160:234〜43頁
【非特許文献１４】NevalainenおよびPenttila(1995年) Mycota 303〜319頁
【非特許文献１５】Suurnakkiら、(2000年) Cellulose 7: 189〜209頁
【非特許文献１６】Freer(1993年) J. Biol. Chem. 268:9337〜42頁
【非特許文献１７】Linderら、2001年、Biomacromolecules 2: 511〜517頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、これまでにポリサッカライドおよび/またはタンパク質を含む食品にハイドロフォビンを使用することに関連する以前には判っていなかった課題を認識し、解決した。本発明者らは、ハイドロフォビン調製物は、一般にハイドロフォビンに加えて、マンナナーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼなどの酵素を含む生成過程のさまざまな副生成物を含むことを発見した。こうした酵素が特定の量を超えて存在すると、最終的な食品に含まれるハイドロフォビンの特性は妨げないが、それら酵素に対応するタンパク質/ポリサッカライドを変性させる可能性がある。この結果、タンパク質/ポリサッカライドの機能性が失われ、さらには、食品の品質に悪影響を及ぼす。例えば、食品に増粘剤としてポリサッカライドが含まれる場合、ポリサッカライドの変性が、食品に必要とされる粘度を与えることの妨げになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、第1の態様において、本発明は、
・0.015MMU未満、好ましくは0.01MMU未満の検出可能なマンナナーゼ活性、
・0.1EGU未満、好ましくは0.05EGU未満の検出可能なエンドグルコナーゼ活性、
・1.3PU未満、好ましくは1PU未満、より好ましくは0.5PU未満の検出可能なシステインプロテアーゼ活性、
またはそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される酵素活性を有するハイドロフォビン組成物に関する。
【０００８】
これにより、ハイドロフォビン組成物が、精製方法を必要とせずに、最終的な食品の特性を損なうことのない量の残留酵素を含むことが可能になる。
【０００９】
好ましくは、マンナナーゼ活性は、少なくとも0.001MMU、より好ましくは少なくとも0.005MMUである。
【００１０】
好ましくは、エンドグルコナーゼ活性は、少なくとも0.001EGU、より好ましくは少なくとも0.005EGU、最も好ましくは少なくとも0.01EGUである。
【００１１】
好ましくは、システインプロテアーゼ活性は、少なくとも0.01PU、より好ましくは少なくとも0.05PU、より好ましくは少なくとも0.1PUである。
【００１２】
これにより、必要とされる場合、最終製品の特性に悪影響を及ぼすことなく、組成物が小さな酵素活性を有することが可能になる。
【００１３】
好ましくは、ハイドロフォビンは、クラスIIハイドロフォビンであり、より好ましくは、ハイドロフォビンは、HFB IIである。
【００１４】
本発明の第2の態様は、ハイドロフォビンを(製品の総重量に基づき)少なくとも0.001重量%、好ましくは少なくとも0.005重量%、より好ましくは少なくとも0.01重量%含み、
・0.015MMU未満、好ましくは0.01MMU未満のマンナナーゼ活性、
・0.1EGU未満、好ましくは0.05EGU未満のエンドグルコナーゼ活性、
・1.3PU未満、好ましくは1PU未満、より好ましくは0.5PU未満のシステインプロテアーゼ活性、
またはそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される酵素活性を有する食物組成物を提供することである。
【００１５】
好ましくは、マンナナーゼ活性は、少なくとも0.001MMU、より好ましくは少なくとも0.005MMUである。
【００１６】
好ましくは、エンドグルコナーゼ活性は、少なくとも0.001EGU、より好ましくは少なくとも0.005EGU、最も好ましくは少なくとも0.01EGUである。
【００１７】
好ましくは、システインプロテアーゼ活性は、少なくとも0.01PU、より好ましくは少なくとも0.05PU、より好ましくは少なくとも0.1PUである。
【００１８】
好ましくは、ハイドロフォビンは、クラスIIハイドロフォビンである、より好ましくは、ハイドロフォビンは、HFB IIである。
【００１９】
好ましくは、食物組成物は、ミルクタンパク質、大豆タンパク質、セルロース、セルロース誘導体、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、柑橘類の繊維、デンプン、デンプン誘導体、ローカストビーンガム、グアーガム、フェヌグリークガム(fenugreek gum)およびタラガムから選択されるタンパク質および/またはポリサッカライドを含む。
【００２０】
好ましくは、食物組成物は、気体を含ませた冷凍菓子、ムース、泡立てられたクリーム、乳製品を含まないクリーム、マヨネーズ、ドレッシング、スプレッド、スープ、ソースまたは飲料である。より好ましくは、食物組成物は、気体を含ませた冷凍菓子である。
【００２１】
好ましくは、ポリサッカライドは、ガラクトマンナンであり、酵素は、マンナナーゼである。
【００２２】
定義
ハイドロフォビン
ハイドロフォビンは、疎水性/親水性界面で自己集合でき、以下の保存配列:
Xn-C-X5〜9-C-C-X11〜39-C-X8〜23-C-X5〜9-C-C-X6〜18-C-Xm(配列番号:1)
を有する明確に定義された種類のタンパク質である(非特許文献１; 非特許文献２)。ここで、Xは、任意のアミノ酸を表わし、nおよびmは独立に整数を表わす。典型的には、ハイドロフォビンは、最大125アミノ酸長さを有する。保存配列中のシステイン残基(C)は、ジスルフィド架橋の一部である。本発明の文脈において、ハイドロフォビンという用語は、配列:
Xn-C-X1〜50-C-X0〜5-C-X1〜100-C-X1〜100-C-X1〜50-C-X0〜5-C-X1〜50-C-Xm(配列番号:2)
を含むタンパク質などの、疎水性-親水性界面で自己集合してタンパク質膜を生じる特性をやはり示す機能的に同等のタンパク質、またはその一部であって疎水性-親水性界面で自己集合してタンパク質膜を生じる特性をやはり示すものを含めた広い意味を持つ。本発明の定義によると、自己集合は、タンパク質をテフロン(Teflon)(登録商標)に吸着させ、円偏光二色性を使用し、二次構造(一般に、α-ヘリックス)の存在を確認することによって検出することができる(非特許文献３)。
【００２３】
膜の形成は、タンパク質溶液中でテフロン(登録商標)シートをインキュベートして、水または緩衝液により少なくとも3回洗浄することによって確認することができる(非特許文献４)。タンパク質膜は、当該技術分野において確立された蛍光マーカーによる標識化などの任意の適した方法によってまたは蛍光抗体の使用によって可視化することができる。mおよびnは、典型的には0から2000の範囲の値であるが、より一般的には、mおよびnの合計が100または200未満である。本発明の文脈におけるハイドロフォビンの定義には、ハイドロフォビンと別のポリペプチドとの融合タンパク質ならびにハイドロフォビンとポリサッカライドなどの他の分子との複合体が含まれる。
【００２４】
今までに確認されたハイドロフォビンは、一般にクラスIまたはクラスIIのいずれかとして分類される。疎水性界面で自己集合して両親媒性膜になる分泌タンパク質として両方のタイプのものが真菌で確認されている。クラスIハイドロフォビンの集合体は、一般に比較的不溶性であるが、クラスIIハイドロフォビンの集合体は、さまざまな溶媒に容易に溶解する。好ましくは、ハイドロフォビンは、クラスIIハイドロフォビンである。好ましくは、ハイドロフォビンは、水溶性であり、これは、水に少なくとも0.1%、好ましくは少なくとも0.5%可溶であることを意味する。少なくとも0.1%可溶であるとは、99.9mlの水に溶かした0.1gのハイドロフォビンを20℃において30分間30,000gで遠心分離した場合に、ハイドロフォビンが沈殿しないこと意味する。
【００２５】
ハイドロフォビン様タンパク質(例えば、「チャプリン(chaplin)」)は、アクチノミセス(Actinomycete)およびストレプトミセス(Streptomyces)種などの糸状性細菌でも確認されている(特許文献２; 非特許文献５)。こうした細菌性タンパク質は、真菌のハイドロフォビンと比較して、2つのシステイン残基しかないこともあるため、最大でも1つのジスルフィド架橋しか形成できない場合もある。そのようなタンパク質は、配列番号1および2に示される共通配列を有するハイドロフォビンの機能等価物の一例であり、本発明の範囲内にある。
【００２６】
ハイドロフォビンは、糸状菌などの天然の供給源から任意の適した方法によって抽出することにより得られる。例えば、ハイドロフォビンは、増殖培地にハイドロフォビンを分泌する糸状菌の培養によって、または60%エタノールによる真菌の菌糸体からの抽出によって得られる。もともとハイドロフォビンを分泌する宿主生物からハイドロフォビンを単離するのが特に好適である。好適な宿主は、糸状不完全菌(例えば、トリコデルマ)、担子菌および子嚢菌である。特に好適な宿主は、クリパリン(cryparin)と称されるハイドロフォビンを分泌するクリフォネクトリア・パラシティカ(Cryphonectria parasitica)などの食品グレードの生物である(非特許文献６)。
【００２７】
あるいは、ハイドロフォビンは、組み換え技術の使用によって得ることもできる。例えば、宿主細胞、典型的には微生物は、ハイドロフォビンを発現するように改変されてもよく、そのハイドロフォビンは、その後、本発明にしたがって単離され、使用できる。ハイドロフォビンをコードする核酸構築物を宿主細胞に導入するための技術は、当該技術分野において周知である。16を超える真菌種からハイドロフォビンをコードする34を超える遺伝子がクローン化されてきた(例えば、アガリクス・ビスポルス(Agaricus bisporus)で確認されたハイドロフォビンの配列を示している特許文献３、および非特許文献２を参照のこと)。組み換え技術は、ハイドロフォビンの配列を改変するためまたは所望の特性/改善された特性を有する新規のハイドロフォビンを合成するためにも使用できる。
【００２８】
一般に、適切な宿主細胞または生物は、所望のハイドロフォビンをコードする核酸構築物によって形質転換される。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写および翻訳に必要な因子をコードする適切な発現ベクターに、適した条件下で発現するような手法で挿入することができる(例えば、適切な配向および正しい読み枠ならびに適切な標的および発現配列)。こうした発現ベクターを構築するために必要とされる方法は、当業者に周知である。
【００２９】
配列をコードするポリペプチドを発現させるために、多数の発現系を使用することができる。こうしたものとしては、これらに限定されるものではないが、適切な発現ベクターにより形質転換されたすべての細菌、真菌(酵母菌を含む)、昆虫細胞系、植物細胞培養系および植物が挙げられる。好適な宿主は、食品グレード、すなわち「一般的に安全と認められる」(GRAS)と考えられるものである。
【００３０】
適した真菌種としては、(以下に限定されるものではないが)サッカロミセス属、クリベロミセス(Kluyveromyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、カンジダ(Candida)属、シゾサッカロミセス(Schizo saccharomyces)属などの酵母菌、ならびに(以下に限定されるものではないが)アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ属、ムコール(Mucor)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、フザリウム(Fusarium)属などの糸状性菌種が挙げられる。
【００３１】
ハイドロフォビンをコードする配列は、天然に確認されるハイドロフォビンにアミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%一致するか、または100%一致する。しかしながら、当業者は、ハイドロフォビンの生物学的活性を低下させない保存的置換またはその他のアミノ酸の変更を行うことができる。本発明の目的において、こうした天然に存在するハイドロフォビンと高いレベルで一致したハイドロフォビンも「ハイドロフォビン」という用語に包含される。
【００３２】
ハイドロフォビンは、例えば、特許文献４に記載される手順によって培養培地または細胞抽出物から精製でき、この手順には、ハイドロフォビンを含む溶液中に存在するハイドロフォビンを表面に吸着させ、その後、その表面をTween 20などの界面活性剤と接触させて、その表面からハイドロフォビンを溶出することが含まれる。非特許文献７; 非特許文献８; 非特許文献９および非特許文献１０も参照のこと。
【００３３】
ハイドロフォビンは、気相を安定化できるような形態および量で添加される。すなわち、ハイドロフォビンは、その気泡を安定化させる特性を利用する目的で意図的に製品に投入される。したがって、ハイドロフォビンポリペプチドを含む可能性のある真菌の混入物を含んだ成分が存在するか、または添加される場合、これは本発明の文脈におけるハイドロフォビンの添加には相当しない。
【００３４】
一般に、ハイドロフォビンは、単離された形態で、一般には、固体の重量に基づいて純粋物質が少なくとも10%というような、少なくとも部分的に精製された形態で、本発明の製品に添加される。
【００３５】
「単離された形態」とは、もともとハイドロフォビンを発現するキノコなどの天然に存在する生物の一部としてハイドロフォビンが添加されるのではないことを意味する。むしろ、ハイドロフォビンは、一般に天然に存在する供給源から抽出されるか、または宿主生物の組み換え発現によって得られることになる。
【００３６】
ハイドロフォビンの生成
ハイドロフォビンは、T.リーゼイ(T. reesei)から生成され、その後、続いてポリペプチドの量を減らすために熱処理および/または限外ろ過することができる。
【００３７】
代わりに、あるいは熱処理および/または限外ろ過と組み合わせて、ハイドロフォビンは、耐熱性のEGVポリペプチドの生成を低減するか、または妨げることによってT.リーゼイから生成することができる。
【００３８】
第1の方法では、ハイドロフォビンは、破壊されたegl5遺伝子および付加的な機能性タンパク質をコードする1つまたは複数の内在性遺伝子を有するトリコデルマ宿主細胞にハイドロフォビンをコードする遺伝子を導入すること;ハイドロフォビンおよび付加的な機能性タンパク質を生成するのに適した培地で宿主細胞をインキュベートすること;ならびに付加的な機能性タンパク質を実質的に不活化するのに十分な高温にハイドロフォビンおよび付加的なタンパク質をさらすことによってトリコデルマ宿主細胞から生成されてもよい。この高温は、ハイドロフォビンを不活化するには不十分であり、機能性egl5遺伝子によって生成されるEGVセルラーゼを不活化するにも不十分である可能性がある。ここで、ハイドロフォビンは、付加的なタンパク質からの作用が実質的になくても活性の形態または機能する形態で生成される。
【００３９】
第2の方法では、ハイドロフォビンは、ハイドロフォビンをコードする遺伝子、破壊されたegl5遺伝子、および1つまたは複数の付加的な機能性タンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子を含むトリコデルマ宿主細胞で、ハイドロフォビンおよび1つまたは複数の付加的な機能性タンパク質を生成すること;宿主細胞から得られたタンパク質の混合物を、1つまたは複数の付加的な機能性タンパク質を実質的に不活化するには十分であるが、ハイドロフォビンおよび機能性egl5遺伝子によって生成されるEGVセルラーゼを不活化するには不十分な高温にさらすことによって、トリコデルマ宿主細胞から生成されてもよい。ここで、ハイドロフォビンは、付加的な機能性タンパク質からの作用が実質的になくても活性の形態または機能する形態で生成される。
【００４０】
第3の方法では、ハイドロフォビンは、ハイドロフォビンをコードする遺伝子、破壊されたegl5遺伝子および付加的な機能性タンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子を含むトリコデルマ宿主細胞から得られるタンパク質の混合物を高温にさらして1つまたは複数の付加的な機能性タンパク質を不活化することにより、付加的な機能性タンパク質からの作用がなくても活性の形態または機能する形態のハイドロフォビンを生成することによってトリコデルマ宿主細胞から生成されてもよい。
【００４１】
上記のどの方法の場合でも、一部の実施形態において、本来egl5遺伝子を含む宿主細胞のegl5遺伝子は破壊される。一部の実施形態において、本来egl5遺伝子を含む宿主細胞のegl5遺伝子は欠失する。一部の実施形態において、egl5遺伝子は、相同組換えによって欠失する。
【００４２】
上記のどの方法の場合でも、一部の実施形態において、1つまたは複数の付加的なタンパク質は、易熱性タンパク質である。一部の実施形態において、1つまたは複数の付加的なタンパク質は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される。一部の実施形態において、1つまたは複数の付加的なタンパク質は、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼおよびβ-グルコシダーゼからなる群から選択される。
【００４３】
上記のどの方法の場合でも、一部の実施形態において、高温は、90℃以上の温度である。一部の実施形態において、高温への曝露は、5分以上である。一部の実施形態において、高温への曝露は、60分以上である。
【００４４】
「トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)」は、子嚢菌門の糸状菌に該当する。この生物は、以前はトリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)として、さらにヒポクレア・イェコリナ(Hypocrea jecorina)としても分類されていた。
【００４５】
「T.リーゼイEGVセルラーゼ」とは、配列番号:33のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、配列番号:33と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、またはさらに少なくとも約99%以上のアミノ酸配列相同性を有し、セルロース基質に対するエンドグルカナーゼ活性を有し、本明細書中に記載されるアッセイを使用して耐熱性である。「EGV」は、本明細書中で「EG5」と称されることもある。
【００４６】
「T.リーゼイegl5遺伝子」とは、上記記載のようなEGVセルラーゼまたは関連ポリペプチドをコードする核酸を指す。例となるegl5遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号:32として示される。
【００４７】
ポリペプチドに関する「耐熱性」とは、予め選択された高温に予め選択された時間さらされた後のポリペプチドの生物学的活性保持能力を指す。生物学的活性は、酵素活性、結合活性、表面活性の特性、またはポリペプチドのその他のあらゆる活性もしくは特有の性質である場合もある。ポリペプチドは、予め選択された高温に予め選択された時間曝露された後に、もとの活性の少なくとも半分を維持している場合に耐熱性であると見なされる。大まかにいうと、予め選択された温度および時間は、EGV以外のT.リーゼイのセルラーゼを実質的に不活化するために必要とされる温度および時間である。こうした条件は、egl5遺伝子が欠失したT.リーゼイ宿主細胞のセルラーゼ活性をアッセイすることによって容易に確立できる。
【００４８】
場合によって、少なくとも約70℃、少なくとも約75℃、少なくとも約80℃、少なくとも約85℃、少なくとも約90℃、またはさらに少なくとも約95℃の温度に、少なくとも約3分間、少なくとも約5分間、少なくとも約10分間、少なくとも約15分間、少なくとも約20分間、少なくとも約30分間、少なくとも約45分間、またはさらに少なくとも約60分間の時間曝露された後、その生物学的活性の少なくとも半分(すなわち、少なくとも50%)を保持している場合に、タンパク質は耐熱性であると見なされる。一例では、予め選択された温度は、約90℃以上であり、予め選択された時間は、約5分以上である。別の例では、予め選択された温度は、約90℃以上であり、予め選択された時間は、約60分以上である。耐熱性ポリペプチドには、記載される通りの曝露の後、その生物学的活性の少なくとも半分(すなわち、少なくとも50%)が元に戻るような、高温において可逆的に変性するポリペプチドが含まれる。
【００４９】
「実質的に活性でない」(または同様の語句)は、特定の活性がハイドロフォビンを含む食物組成物中で検出できないか、またはハイドロフォビンの特性を妨げない量で存在するかのいずれか意味する。
【００５０】
「遺伝子の欠失」とは、宿主細胞のゲノムからの遺伝子の除去を指す。
【００５１】
「遺伝子の破壊」とは、宿主細胞の機能性遺伝子産物、例えば、タンパク質の発現を実質的に妨げるあらゆる遺伝学的または化学的操作を広く指す。例となる破壊方法としては、機能性遺伝子産物の発現を実質的に妨げるための(ポリペプチドをコードする配列、プロモーター、エンハンサーもしくは別の調節エレメントなどの)遺伝子の任意の部分の完全または部分的な欠失あるいはそれらの突然変異誘発(置換、挿入、欠失およびそれらの組み合わせなど)が挙げられる。
【００５２】
「機能性遺伝子」とは、有効な遺伝子産物、一般にタンパク質を生成するために細胞の構成要素が使用できる遺伝子である。「機能性」遺伝子は、有効な遺伝子産物を生成するために細胞の構成要素が使用できないように改変される「破壊された」遺伝子とは正反対のものである。例となる機能性遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、EGV以外のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペルヒドロラーゼ(perhydrolase)、エステラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチナーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、アミダーゼ、およびその他の酵素、構造タンパク質、界面活性タンパク質、結合タンパク質などが挙げられる。
【００５３】
T.リーゼイ宿主細胞は、例えば、本明細書中で記載のアッセイを使用して測定されるような耐熱性セルラーゼ活性を示すEGVポリペプチドの生成を妨げるために遺伝学的または化学的に変えられた場合、「耐熱性EGVセルラーゼの生成を妨げるように改変された」ことになる。そのような改変としては、これらに限定されるものではないが、egl5遺伝子の欠失、egl5遺伝子の破壊、コードされたEGVポリペプチドがもはや耐熱性でなくなるようなegl5遺伝子の改変、コードされたEGVポリペプチドがもはやセルラーゼ活性を示さないようなegl5遺伝子への改変、コードされたEGVポリペプチドがもはや分泌されないようなegl5遺伝子の改変、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５４】
変性酵素（Denaturing Enzymes）
本明細書中で使用される場合、「変性酵素」という用語は、タンパク質またはポリサッカライドを分解する酵素を意味する。本発明による食物組成物は、1つまたは複数のタンパク質および/またはポリサッカライドならびに少なくとも1つの対応する変性酵素を含む。「対応する」とは、食物組成物が、食物組成物中に存在するタンパク質および/またはポリサッカライドを分解する酵素を含むことを意味する。したがって、例えば、プロテアーゼは、タンパク質(例えば、ミルクタンパク質)、セルロースは、セルロース物質(例えば、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース)、マンナナーゼは、マンノースベースのポリサッカライド(例えば、ローカストビーンガムおよびグアーガム)、アミラーゼは、デンプンおよびマルトデキストリンなどのデンプン誘導体、キシラナーゼは、キシランに対応する変性酵素である。
【００５５】
セルロースおよびヘミセルロースは、光合成によって生成される最も豊富な植物物質である。セルロースおよびヘミセルロースは、高分子基質を単量体の糖に加水分解できる細胞外酵素を生成する多くの微生物(例えば、細菌、酵母菌および真菌)によってエネルギー源として分解され、使用され得る(非特許文献１１)。
【００５６】
セルラーゼは、セルロース(β-1,4-グルカンまたはβ-D-グルコシド結合)を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生成する酵素である。セルラーゼは、従来、エンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.4)(「EG」)、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ(EC 3.2.1.91;「CBH」)およびβ-グルコシダーゼ(β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ; EC 3.2.1.21;「BG」)の3つの主要な種類に分類されてきた(非特許文献１２、および非特許文献１３)。エンドグルカナーゼは、主にセルロース繊維のアモルファスの部分に作用して結晶度の低い領域で内部の1,4-グルコシド結合を加水分解する。セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元または非還元末端からセロビオースを加水分解し、結晶性セルロースを分解することができる(非特許文献１４)。効率的な結晶性セルロースの可溶化には、セルラーゼ系にセロビオヒドロラーゼ(CBH)が存在することが必要と考えられている(非特許文献１５)。β-グルコシダーゼが作用すると、セロビオース、セロオリゴ糖およびその他のグルコシドからD-グルコース単位が遊離する(非特許文献１６)。β-グルコシダーゼはまた、セロビオースなどの炭水化物残基のみを含むグリコシドだけではなく、メチルβ-D-グルコシドおよびp-ニトロフェニルグルコシドなどのアルキルおよび/またはアリールベータ-D-グルコシドの加水分解も触媒することが明らかとなってきた。
【００５７】
セルラーゼは、多くの細菌、酵母菌および真菌によって生成されることがわかっている。ある真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼまたはCBH-タイプのセルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはEG-タイプのセルラーゼ、およびβ-グルコシダーゼまたはBG-タイプのセルラーゼを含む完全なセルラーゼ系を生成する。その他の真菌および細菌は、CBH-タイプのセルラーゼをほとんど発現しないかまたは全く発現しない。トリコデルマ・リーゼイ(ヒポクレア・イェコリナとも称される)は、多数のセルラーゼを発現し、その例としては、2種類のCBH、すなわちCBHI(Cel7a)およびCBHII(Cel6a)、少なくとも8種類のEG、すなわちEGI(Cel7b)、EGII(Cel5a)、EGIII(Cel12a)、EGIV(Cel61a)、EGV(Cel45a)、EGVI(Cel74a)、EGVII(Cel61b)およびEGVIII(Cel5b)、ならびに少なくとも5種類のBG、すなわちBG1(Cel3a)、BG2(Cel1a)、BG3(Cel3b)、BG4(Cel3c)およびBG5(Cel1b)が挙げられる。EGIV、EGVIおよびEGVIIIは、キシログルカナーゼ活性も有している。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「セルラーゼ」は、β-1,4-グルカンまたはβ-D-グルコシド結合を加水分解して、例えば、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などをセルロースから生成する酵素である。セルラーゼとしては、例えば、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β-グルコシダーゼなどが挙げられる。
【００５９】
マンナナーゼ
マンナナーゼは、ポリサッカライドであるガラクトマンナン(例えば、ローカストビーンガム(LBG)、グアーガム、タラガムおよびフェヌグリークガム)ならびにグルコマンナンを含むマンナンとして知られる化合物を分解する酵素である。
【００６０】
プロテアーゼ
プロテアーゼ酵素(ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも称される)は、タンパク質を分解する酵素群である。そのうち特に関連するのは、ミルクタンパク質、大豆タンパク質およびゼラチンを分解するプロテアーゼ酵素である。
【００６１】
「エンドグルカナーゼ(EG)」は、主にセルロース繊維のアモルファスの部分に作用して、結晶度の低い領域で内部のβ-1,4-グルコシド結合を加水分解するセルラーゼである。
【００６２】
「ヘミセルラーゼ」および「キシラナーゼ」は、互いに同義なものとして使用され、5炭糖を含むポリサッカライドのグリコシド結合を加水分解できる酵素を一般に指す。そのような酵素としては、例えば、マンナナーゼ、アラビナナーゼ、グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシロシダーゼなどが挙げられる。
【００６３】
MMU=マンナナーゼマンノースユニット
1MMUは、毎分1μmolのD-マンノースに相当する還元糖を生成する(pH7.0、0.24%ローカストビーンガム(LBG)、50℃の条件下)、ハイドロフォビン1ミリグラム当たりのマンナナーゼの量である。
【００６４】
EGU(エンドグルカナーゼユニット)は、毎分1μmolの還元糖を生成する、ハイドロフォビンの1ミリグラム当たりのエンドグルコナーゼの量である。これは、この場合にはNovozymeのセルラーゼ標準に対して相対的に測定される。
【００６５】
プロテアーゼユニット(PU)は、pH6.2、25℃において毎分1μmolのN-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE)を加水分解する、ハイドロフォビン1mgあたりのシステインプロテアーゼの量に相当する。これは、この場合にはパパイン(Sigma)標準に対して相対的に測定される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例1のアイスクリームについての融解結果のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の食物組成物は、通常、室温(常温製品)、チルド温度(例えば、約4℃)または冷凍(0℃未満、一般に、約-18℃)で保存されるおよび/または供される製品とすることができる。
【００６８】
特に好適な一実施形態において、本食物組成物は、アイスクリームまたはフローズンヨーグルトなどの気体を含ませた冷凍菓子である。別の実施形態において、本組成物は、ムース、泡立てられたクリーム、または乳製品を含まないクリームである。その他の好適な食物組成物としては、マヨネーズ、ドレッシング、スプレッド、スープ、ソースおよび飲料、菓子製品およびベーカリー製品が挙げられる。
【００６９】
一般に、本食物組成物は、ハイドロフォビンを(製品の総重量に基づき)少なくとも0.001重量%、好ましくは少なくとも0.005重量%、より好ましくは少なくとも0.01重量%、例えば約0.05重量%含む。典型的には、製品は、ハイドロフォビンを1重量%未満、より好ましくは0.1重量%未満含むことになる。ハイドロフォビンは、単一の供給源または複数の供給源からのものであってもよく、例えば、2つ以上の異なるハイドロフォビンの混合物でもよい。
【００７０】
本食物組成物は、タンパク質および/またはポリサッカライドを含む。好適なタンパク質としては、乳製品のタンパク質および大豆タンパク質が挙げられる。好適なポリサッカライドとしては、ガラクトマンナン(ローカストビーンガム、グアーガム、タラガム、フェヌグリークガムなど)、グルコマンナン、マンナン、セルロース(カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース、柑橘類の繊維)が挙げられる。
【００７１】
本発明の食物組成物は、好ましくは水を含む。含水量は、(他の成分の量に応じて)変化してよく、典型的には製品の総重量に基づき5〜99.5重量%、好ましくは20〜95重量%である。
【００７２】
本発明の食物組成物は、油/脂肪を含んでもよい。適した油/脂肪としては、ココナツ油、コーン油、綿実油、キャノーラ油(ナタネ油)、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油(落花生油)、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ油、バター脂肪および魚油(例えば、タラ肝油)が挙げられる。さらに、本食物組成物は、製品に必要とされるおよび/または所望されるその他の成分を含んでもよい。食品に一般に使用される成分は、乳化剤、香料、着色料、保存料;糖類、例えば、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、コーンシロップ、糖アルコール;果物または植物のピューレ、抽出物、小片または汁である。
【００７３】
本食物組成物は、気体を含ませていなくても、または気体を含ませていても、すなわち、気体が意図的に組成物に混入されていてもよい。気体は、任意の気体でよいが、好ましくは、特に食品関係においては、空気、窒素、亜酸化窒素または二酸化炭素などの食品グレードの気体である。気体を含ませる程度は、「オーバーラン」を単位として定義され、%オーバーランとして以下のように容積で定められる。
%オーバーラン=[(気体を含ませた製品の容積-ミックスの最初の容積)/ミックスの最初の容積]×100
ここで、気体を含ませた製品および気体を含ませていないミックスの容積は、それぞれ一定質量の製品または最初のミックスの容積である。
【００７４】
気体を含ませた製品のオーバーランは、所望の製品特性によって変化することもある。オーバーランは、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも25%または50%である。オーバーランの量は、好ましくは400%未満、より好ましくは300%または200%未満である。気体を含ませた冷凍菓子についてのオーバーランは、最も好ましくは70から150%である。泡立てられたクリーム、または乳製品を含まないクリーム、および関連製品についてのオーバーランは、最も好ましくは100から160%である。
【００７５】
本発明の気体を含ませた製品は、ハイドロフォビンが存在していることにより安定しており、これは、製品がその形態および特性を長期間にわたって維持することを意味する。気泡の安定性は、気体を含ませた後の所与の時点において残っている最初のオーバーランの割合で明らかにされる。
【００７６】
以下、本発明について、下記に非限定的な実施例を挙げて、1つの図面を参照しながら、さらに説明する。
【実施例１】
【００７７】
表1に示した配合を使用してアイスクリームを作製した。ターボミキサーを備えたタンクに80℃の水を添加した。乾燥した砂糖を安定剤と混合し、タンクに添加して、続いてスキムミルク粉末、液糖、油および香料を添加した。そのミックスを60〜70℃で約10分間混合した。その後、そのミックスを150バールで均質化し、プレート式熱交換器において82℃で25秒間低温殺菌した。その後、そのミックスをプレート式熱交換器で4℃に冷やし、穏やかに撹拌しながら4℃の熟成タンクで一晩寝かせた。
【００７８】
ハイドロフォビンを含む配合2〜4については、ホッパーに移しアイスクリームフリーザーによって加工する5分前の後の時点で、このタンパク質をミックスに添加した。
【００７９】
そのミックスに気体を含ませ(目標のオーバーランは100%)、シリーズ15のオープンダッシャーを備えた表面掻き取り式熱交換器(Crepaco W04表面掻き取り式熱交換器)でフリージングした。部分的にフリージングされたアイスクリームをフリーザーから出し、500mLの厚紙の箱に入れた。
【００８０】
【表１】
2013539983.tif 000002
【００８１】
3つの異なるハイドロフォビン調製物を使用し、ハイドロフォビン調製物を含まない対照サンプルも作製した。
【００８２】
pH7.0、50℃におけるローカストビーンガムの1,4-β-D-マンノシド結合の加水分解を測定することによって、各ハイドロフォビン調製物のマンナナーゼ活性を求めた。それをMMUで表わす。酵素活性は以下の通りであった。
【００８３】
【表２】
2013539983.tif 000003
【００８４】
特許文献１で使用されたハイドロフォビンのマンナナーゼ活性も測定した。これは、フィンランドのVTT Biotechnologyから入手した。これは、本質的に、特許文献５、および非特許文献１７に記載される通りにトリコデルマ・リーゼイから精製されたものである。これは、少なくとも0.019MMUであることがわかった。
【００８５】
一定の温度環境でアイスクリームが溶けた速度を以下のように測定した。大きさが25×25cmであり、3mmの網目を有し、1mmの太さのワイヤーで作製された、ステンレス鋼ワイヤーの網状格子を、(試験するサンプル全量を回収するのに十分な容積の)回収容器の上につるされた穴径2cmの60度の漏斗上に置いた。回収容器は、容器に回収された材料を計量するためのはかりの上に置いた。回収された質量を記録するために、はかりをデータ記録システムに接続した。格子、漏斗、容器およびはかりからなる装置を、20℃の一定温度に設定されたキャビネットに入れた。キャビネットは、最大12セットのこうした装置を同時に収納することができた。
【００８６】
寸法が14.5×9×3.8cmの長方形の塊状のアイスクリームサンプルを-25℃のフリーザー内で平衡状態にし、その後、メモリをゼロにしたはかりで格子とともに計量した(サンプルの最も大きな平面の一方が格子と接触している)。その後、融解キャビネット内の利用可能な位置にサンプルをランダムに並べた。すべてのサンプルを漏斗に置くと、データ記録システムが1分毎に回収される材料の量を記録した。この期間にわたって回収されたサンプルの質量から、下記式を使用してサンプルの質量損失の割合を算出した。
【００８７】
【数１】
2013539983.tif 000004
【００８８】
ここで、
Mt=t分の時点にはかりで記録された質量(グラム)
M0=分析開始、すなわちt=0分の時点にはかりで記録された質量(グラム)
F=製品の最初の質量(グラム)
である。
【００８９】
図1は、対照サンプル(例1)についてが、最も良好に(最もゆっくりと)融解していることを示している。例2および例3は、やや速いが依然として許容される融解速度であり、これに対し、例4は、さらに速く融解した。アイスクリーム配合物中に存在する安定剤(ローカストビーンガム)には、融解速度を遅らせる効果がある。しかしながら、(ハイドロフォビン調製物からの)マンナナーゼが存在すると、それがローカストビーンガムのマンナン骨格を分解し、それにより分子量が小さくなり、ひいてはその融解を遅らせる能力が落ちる。こうしたデータは、変性酵素の活性が実質的に低減されれば、許容される融解が得られることを示している。
【図１】
2013539983.tif 000005
【配列表】
2013539983000001.app
【国際調査報告】
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2013539983.tif 000007
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