(57)【要約】本願の態様は、グラチラマー酢酸塩の平均分子量を正確に決定するためのグラチラマー酢酸塩の分子量マーカーに関する。本発明は、グラチラマー酢酸塩に対応するアミノ酸組成、および約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの間である同定された分子量を有する分子量マーカーを提供する。本発明の分子量マーカーは、アミノ酸であるアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になり、ここで、アラニンのモル分率は約０．３８〜約０．５０であり、グルタミン酸のモル分率は約０．１３〜約０．１５であり、チロシンのモル分率は約０．０８〜約０．１０であり、リシンのモル分率は約０．３〜約０．４である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラチラマー酢酸塩に対応するアミノ酸組成、および約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの間である同定された分子量を有する分子量マーカー。
【請求項２】
前記同定された分子量が約２，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間である、請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項３】
前記同定された分子量が約２，０００ダルトンから約１５，０００ダルトンの間である、請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項４】
前記同定された分子量が約２，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間である、請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項５】
約０．３８〜約０．５０のアラニン、約０．１３〜約０．１５のグルタミン酸、約０．０８〜約０．１０のチロシン、および約０．３〜約０．４のリシンのモル分率で、アミノ酸であるアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になる、請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項６】
１６８３３ダルトンのピーク平均分子量を有する分子量マーカー１、８９０８ダルトンのピーク平均分子量を有する分子量マーカー２、５００６ダルトンのピーク平均分子量を有する分子量マーカー３、または３７０９ダルトンのピーク平均分子量を有する分子量マーカー４である、請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項７】
請求項１に記載の分子量マーカーを調製するためのプロセスであって、
（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム内でグラチラマー酢酸塩ポリペプチドを分画するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で収集された画分を分子量カットオフ膜に通過させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）から収集された前記画分を凍結乾燥させることによって分子量マーカーを単離するステップと
を含むプロセス。
【請求項８】
ステップ（ａ）の前記ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムが、デキストランが共有結合している高度に架橋された多孔質アガロース粒子を基とする複合媒体であるＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）か、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋されたアリルデキストランであるＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）か、高度に架橋された多孔質アガロース粒子を基とする、高い物理的および化学的安定性を有する媒体であるＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）か、またはエピクロロヒドリンで架橋されたデキストランであるＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
ステップ（ｂ）で使用される前記分子カットオフ膜が、１ＫＤａ〜１０ＫＤａ、１ＫＤａ〜２０ＫＤａ、または１ＫＤａ〜３０ＫＤａの範囲である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項１０】
グラチラマー酢酸塩またはその別の薬学的に許容される塩のピーク平均分子量を決定するための方法であって、前記方法は、前記グラチラマー酢酸塩またはその薬学的に許容される塩の平均分子量を決定するために、前記グラチラマー酢酸塩または別の薬学的に許容されるその塩をクロマトグラフィーカラムでクロマトグラフィーにかけるステップを含み、前記クロマトグラフィーカラムは、請求項１に記載の複数の分子量マーカーを使用することよって較正される、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の分子量マーカーを使用することによる、ゲル浸透クロマトグラフィーカラムの較正のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序論）
本願の態様は、グラチラマー酢酸塩の分子量マーカーとして使用するため、およびグラチラマー酢酸塩の平均分子量を正確に決定するための、所定のアミノ酸配列をまったく有さないポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
グラチラマー酢酸塩（以前はコポリマー−１として公知）は、Ｌ−アラニン、Ｌ−リシン、およびＬ−チロシン酢酸塩を有する化学的に設計されたＬ−グルタミン酸ポリマーである。これは、式（Ｉ）の構造式
【０００３】
【化１】
2013535474.tif 000002
を有する。
【０００４】
グラチラマー酢酸塩は、ポリペプチドの合成混合物の酢酸塩であり、このポリペプチドのそれぞれは、０．１４１、０．４２７、０．０９５、および０．３３８の平均モル分率をそれぞれ有する４つの天然に存在するアミノ酸、すなわち、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、およびＬ−リシンから本質的になる。グラチラマー酢酸塩の平均分子量は、５，０００〜９，０００ダルトンである。グラチラマー酢酸塩は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．の登録商標であるＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）として米国で販売されている。グラチラマー酢酸塩は、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を有する患者における再発の頻度の低減に適応される。
【０００５】
特許文献１は、この特許で同定されているアミノ酸配列を有する７つのポリペプチドを開示している。特許文献２は、ポリペプチドの混合物を含有する医薬品を得るためのプロセスを開示している。ポリペプチドのそれぞれは、アラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になる。上記混合物は、４０００〜１３，０００ダルトンの平均分子量を有し、混合物中で、アラニンのモル分率は０．４２７であり、グルタミン酸のモル分率は０．１４１であり、リシンのモル分率は０．３３７であり、チロシンのモル分率は０．０９３である。この特許は、ポリペプチドのそれぞれがアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になるポリペプチドの水性混合物のバッチの分子量分布を決定することを教示している。分子量分布決定は、混合物が、医薬品中に含有させるための４０００〜１３，０００ダルトンの平均分子量を有するか否かを決定するのにゲル浸透クロマトグラフィーカラムを使用する。この決定方法は、複数の分子量マーカー（この複数の分子量マーカーはそれぞれ、ポリペプチドであって、アラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になり、所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドである）をカラムクロマトグラフィーにかけて、カラム上の保持時間と分子量の関係を確立することによって、ゲル浸透クロマトグラフィーカラムを使用して得られる分子量を較正するステップを含む。
【０００６】
特許文献３は、ポリペプチドのそれぞれが、アラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になる、ポリペプチドの混合物を含有する医薬品を得るためのプロセスを開示している。ポリペプチドの混合物は、２０００〜４０，０００ダルトンの平均分子量を有し、混合物中で、アラニンのモル分率は０．３８〜０．５であり、グルタミン酸のモル分率は０．１３〜０．１５であり、チロシンのモル分率は０．０８〜０．１０であり、リシンのモル分率は０．３〜０．４である。プロセスの間、ポリペプチドのそれぞれがアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になる、ポリペプチドの混合物のバッチは、ゲル浸透クロマトグラフィーカラムを使用して試験されることによって、混合物が、医薬品中に含有させるための２０００〜４０，０００ダルトンの平均分子量を有するか否かが決定される。試験方法は、複数の分子量マーカー（この複数の分子量マーカーのそれぞれがポリペプチドであり、このポリペプチドがアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になり、所定のアミノ酸配列を有する）をカラムクロマトグラフィーにかけて、カラム上の保持時間と分子量の関係を確立することによって、ゲル浸透クロマトグラフィーカラムを較正するステップを含み、前記関係は、ポリペプチドの混合物の平均分子量を決定するのに使用される。
【０００７】
グラチラマー酢酸塩ポリペプチド組成物のピーク平均分子量を決定するための標準として有用なグラチラマー酢酸塩の分子量マーカーを提供する必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，５１４，９３８号
【特許文献２】米国特許第７，０７４，５８０号
【特許文献３】米国特許第７，１６３，８０２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本願は、グラチラマー酢酸塩ポリペプチド（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）のピーク平均分子量を決定するための標準として有用である、グラチラマー酢酸塩の分子量マーカーとして使用するための、所定のアミノ酸配列をまったく有さないポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、保持時間（ＲＴ）ベースのアルゴリズムを使用した、本分子量マーカーのＲＴ対これらのマーカーの分子量の対数のプロットである。
【図２】図２は、実施例１によって調製した分子量マーカー１のＭＡＬＤＩスペクトルの実例である。
【図３】図３は、実施例１によって調製した分子量マーカー２のＭＡＬＤＩスペクトルの実例である。
【図４】図４は、実施例１によって調製した分子量マーカー３のＭＡＬＤＩスペクトルの実例である。
【図５】図５は、実施例１によって調製した分子量マーカー４のＭＡＬＤＩスペクトルの実例である。
【図６】図６は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の円偏光二色性スペクトルの実例である。
【図７】図７は、実施例１によって調製した分子量マーカー２の円偏光二色性スペクトルの実例である。
【図８】図８は、実施例１によって調製した分子量マーカー３の円偏光二色性スペクトルの実例である。
【図９】図９は、実施例１によって調製した分子量マーカー４の円偏光二色性スペクトルの実例である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本願は、グラチラマー酢酸塩ポリペプチドのピーク平均分子量を決定するための標準として有用である、グラチラマー酢酸塩の分子量マーカーとして使用するための、所定のアミノ酸配列をまったく有さないポリペプチドを提供する。
【００１２】
本願は、グラチラマー酢酸塩ポリペプチドのピーク平均分子量を決定するためのグラチラマー酢酸塩の分子量マーカーとして使用するためのポリペプチドを提供する。
【００１３】
一態様では、本願は、ポリペプチドの平均分子量を決定するための分子量マーカーとして使用するための、グラチラマー酢酸塩ポリペプチドに対応するアミノ酸組成、および約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約１５，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間である同定された分子量を有するポリペプチドを提供する。
【００１４】
一態様では、本願は、グラチラマー酢酸塩の平均分子量を決定するための分子量マーカーとして使用するための、グラチラマー酢酸塩に対応するアミノ酸組成、および約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約１５，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間である同定された分子量を有するポリペプチドを提供する。
【００１５】
一態様では、本願は、ポリペプチドの平均分子量を決定するための分子量マーカーとして使用するための、アラニンは約０．３８〜約０．５０、グルタミン酸は約０．１３〜約０．１５５、チロシンは約０．０８〜約０．１２、およびリシンは約０．２８〜約０．４のモル分率で、アミノ酸であるアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になるポリペプチドを提供する。
【００１６】
一態様では、本願は、グラチラマー酢酸塩の平均分子量を決定するための分子量マーカーとして使用するための、アラニンは約０．３８〜約０．５０のモル分率、グルタミン酸は約０．１３〜約０．１５５のモル分率、チロシンは約０．０８〜約０．１２のモル分率、およびリシンは約０．２８〜約０．４のモル分率で、アミノ酸であるアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になるポリペプチドを提供する。
【００１７】
一態様では、本願は、個々に、または列挙した順序で以下のステップのうちの１つまたは複数を含む、本願の分子量マーカーを調製するためのプロセスを提供する：
（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム内でグラチラマー酢酸塩ポリペプチドを分画するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で収集された画分を分子量カットオフ膜に通過させるステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で収集された画分を凍結乾燥させることによって分子量マーカーを単離するステップ。
【００１８】
一態様では、本願は、個々に、または列挙した順序で以下のステップのうちの１つまたは複数を含む、本願の分子量マーカーを調製するためのプロセスを提供する：
（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム内でグラチラマー酢酸塩を分画するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で収集された画分を分子量カットオフ膜に通過させるステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で収集された画分を凍結乾燥させることによって分子量マーカーを単離するステップ。
【００１９】
ステップ（ａ）は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム内でグラチラマー酢酸塩の試料を分画するステップを伴う。ステップ（ａ）で使用することができるゲル濾過に適したクロマトグラフィー媒体には、それだけに限らないが、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）、およびＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）などが含まれる。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）は、デキストランが共有結合した高度に架橋された多孔質アガロース粒子に基づく複合媒体である。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｉｅｓの商標である。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋されたアリルデキストランである。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの商標である。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）は、高度に架橋された多孔質アガロース粒子に基づく、高い物理的および化学的安定性を有する媒体である。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＣｏｍｐａｎｙであるＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄの商標である。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）は、エピクロロヒドリンで架橋されたデキストランである。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｉｅｓの商標である。
【００２０】
グラチラマー酢酸塩の試料は、適当な溶媒中に溶解させることによって調製することができ、次いで、得られる溶液は、シリンジフィルターを通じて任意の望まれない粒子状物質を除去するために濾過される。グラチラマー酢酸塩の試料を調製するのに使用することができる適当な溶媒には、それだけに限らないが、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ（登録商標）水などが含まれる。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の登録商標である。
【００２１】
ステップ（ａ）で使用することができる適当な緩衝剤には、それだけに限らないが、酢酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、および塩化ナトリウム、またはこれらの混合物が含まれる。
【００２２】
ステップ（ｂ）は、狭い分子量分布を有するマーカーを得るために、ステップ（ａ）で収集された画分を、分子カットオフ膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に通過させるステップを伴う。ステップ（ｂ）で使用することができる適当な分子カットオフ膜は、１ＫＤａ〜１０ＫＤａ、または１ＫＤａ〜２０ＫＤａ、または１ＫＤａ〜３０ＫＤａの範囲とすることができる。
【００２３】
ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で収集された個々の画分の任意選択の凍結乾燥を先に行い、溶媒中に凍結乾燥物を溶解させ、次いで分子カットオフ膜に通過させることができる。
【００２４】
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）から収集された画分を凍結乾燥させることによる分子量マーカーの単離を伴う。
【００２５】
本願のマーカーの分子量は、当技術分野で記載された方法を含む任意の方法によって決定することができる。例えば、本願のマーカーの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、または低角レーザー光散乱検出（ＬＡＬＬＳ）、または多角度光散乱検出（ＭＡＬＬＳ）によって決定することができる。
【００２６】
本願のプロセスのインプットとして使用されるグラチラマー酢酸塩は、当技術分野で記載されたプロセスを含む任意のプロセスによって得ることができる。例えば、グラチラマー酢酸塩は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／３４１０２号に記載されたプロセスによって調製され得る。
【００２７】
一態様では、本願は、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩のピーク平均分子量を決定するための方法であって、この方法は、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の平均分子量を決定するために、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩をクロマトグラフィーカラムでクロマトグラフィーにかけるステップを含み、クロマトグラフィーカラムは、本願の複数の分子量マーカーを使用することによって較正され、分子量マーカーのそれぞれは、所定のアミノ酸配列をまったく有さないポリペプチドである方法を提供する。
【００２８】
一態様では、本願は、グラチラマー酢酸塩またはその薬学的に許容される塩のピーク平均分子量を決定するための方法であって、この方法は、グラチラマー酢酸塩またはその薬学的に許容される塩のピーク平均分子量を決定するために、グラチラマー酢酸塩またはその薬学的に許容される塩をクロマトグラフィーカラムでクロマトグラフィーにかけるステップを含み、クロマトグラフィーカラムは、本願の複数の分子量マーカーを使用することによって較正され、分子量マーカーのそれぞれは、所定のアミノ酸配列をまったく有さないポリペプチドである方法を提供する。
【００２９】
別の態様では、本願は、本願の分子量マーカーを使用することによる、ゲル浸透クロマトグラフィーカラムの較正のプロセスを提供する。
【００３０】
一態様では、本願は、分子量分画カラムでポリペプチドの平均分子量を決定するための複数の分子量マーカーを提供する。
【００３１】
一態様では、本願は、分子量分画カラムでグラチラマー酢酸塩の平均分子量を決定するための複数の分子量マーカーを提供する。
【００３２】
別の態様では、本願は、本願のグラチラマー酢酸塩分子量マーカーの分子量の対数と、分子量分画カラム上の分子量マーカーの保持時間との間の直線関係を提供する。
【００３３】
ポリペプチド、例えば、コポリマー１（医薬品で使用するためのグラチラマー酢酸塩調製物）を認証するために、調製物中のポリペプチドの平均分子量を正確に決定する必要がある。ポリペプチドに類似した化学的特性および物理的特性を有する分子量マーカーは、生産バッチの分子量を決定するのに正確でロバストな較正セットを提供する。本願は、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩調製物の平均分子量を決定するための分子量マーカーとして有用なポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩の誘導体を提供する。
【００３４】
本願の分子量マーカーは、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩にほぼ対応するアミノ酸組成、および約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの間、約２，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間、約２，０００ダルトンから約１５，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間である同定された分子量を有するポリペプチドを含み、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩の平均分子量を正確に決定するのに有用である。同定される分子量に対する要求事項から、分子量マーカーは、高度に多分散しているべきでなく、狭い分子量分布を有するべきであるということになる。本願の分子量マーカーは、固定された配列のマーカーではない。
【００３５】
一態様では、本願は、規定されたモル比で、アミノ酸であるアラニン、グルタミン酸、チロシン、およびリシンから本質的になる分子量マーカーを提供する。本願の分子量マーカーのアミノ酸のモル比は、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩において見出されるものと同じである。
【００３６】
モル比のこのような対応は、最良の分子量マーカーをもたらし、その理由は、こうしたマーカーは、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩のものと類似した電荷および分子形状を有することになるからである。構造的に異なったマーカーが使用される場合、マーカーは、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩コポリマー調製物と幾分異なって移動または溶出する場合があるが、これらの調製物は、マーカーの分子量と同じ分子量を有する。
【００３７】
複数の分子量マーカーは、ポリペプチドである。複数のマーカーは、２個〜約１０個、またはそれ以上であり得る。これらのポリペプチドのそれぞれは、約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの間、約２，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間、約２，０００ダルトンから約１５，０００ダルトンの間、または約２，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間である同定されたピーク平均分子量、およびポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩のアミノ酸組成にほぼ対応するアミノ酸組成を有する。
【００３８】
このような本願の複数の分子量マーカーが、ポリペプチド、例えば、グラチラマー酢酸塩の平均分子量を決定するための標準として使用される場合、クロマトグラフィーカラム上の本願の分子量マーカーの保持時間と、マーカーの分子量の対数との間にほぼ直線的である関係が存在する。保持時間と分子量の間にほぼ直線関係を確立するのに十分な複数のマーカーが使用される。
【００３９】
本願の分子量マーカーは、グラチラマー酢酸塩ポリペプチドと類似した治療活性を有することができる。これらのマーカーは、任意の利用可能な分子量決定手順または装置を使用して、任意の分子サイズ識別システムにおいて使用することができる。例えば、本マーカーを、ポリペプチドの分子量決定に使用される任意のクロマトグラフィー手順または装置の較正に使用され得る。このようなクロマトグラフィー装置は、ポリペプチドの分子サイズに基づいてポリペプチドを分離する分子量サイジングカラムとすることができる。分子量サイジングカラムの例として、ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラム、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）カラム、およびＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）カラムが挙げられる。
【００４０】
定義
文脈により別段に示唆されていない限り、以下の定義を本発明に関連して使用する。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）は、ビーズに形成された、共有結合で架橋されたデキストラン／ビスアクリルアミドコポリマーゲルである。これは、５ｋＤ〜１５０万ダルトンのサイズ範囲の分子を分離するために、ゲル濾過カラム中で使用される。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−１００は、１ｋＤ〜１００ｋＤの分子量範囲を有し、２５〜７５μｍの粒径を有する。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの登録商標である。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２は、生体分子の高性能ゲル濾過のために最適化された、架橋されたアガロースベースの媒体である。これは、約２×１０６Ｍｒの排除限界を有し、８〜１２μｍのビーズ直径を有する架橋アガロースのコンポジットである。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．の商標である。ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）は、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標である。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの登録商標である。
【００４１】
本願のある特定の具体的態様および実施形態を、以下の実施例を参照してより詳細に説明する。これらは、例示目的のみで提供されており、いずれの様式においても本願の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。記載される手順の合理的な変化は、本発明の範囲内であることが意図されている。本発明の特定の態様を例示および説明してきたが、様々な他の変更および改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることが当業者には明白である。したがって、本発明の範囲内であるすべてのそのような変更および改変を添付の特許請求の範囲内に包含することが意図されている。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
グラチラマー酢酸塩の分子量マーカーの調製
マトリックス：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−１００ＨＲ（高分解能）
ベッド体積：３２０ｍＬ
溶出モード：定組成（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
流量：１．８ｍＬ／分
波長：２８０ｎｍおよび２１５ｎｍ
移動相：リン酸塩緩衝液（ｍＭ）、ｐＨ７．２、水４Ｌ当たりＮａＣｌ  ３５．０５ｇ（１５０ｍＭ）とともにＮａＨ２ＰＯ４  ７．７２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ２０．４５ｇ
試料調製：グラチラマー酢酸塩（３５０ｍｇ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１０ｍＬ）中に溶解させ、０．４５μｍのシリンジフィルターを通じて濾過する。
【００４３】
カラムを、上記で調製した移動相を用いて安定化させる。移動相の流量を一定に保ち、ベースラインが一定値に到達するまで安定化を継続する。試料を、ポンプＢアセンブリーを通じて同じ流量でカラムにロードする。注入マーキング（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｉｎｇ）を示すのにセットマークオプションを使用する。吸光度を２１５ｎｍおよび２８０ｎｍなどの２つの波長で記録する。ほぼ１１１ｍＬの溶出量で、２８０ｎｍのピークが上昇し始める。９ｍＬの各画分を送達するように画分コレクターを始動する。１８０ｍＬの溶出量で、ピークはその最大値に到達する。移動相の流れは、依然として継続する。約３００ｍＬの溶出量で、ピークは、そのベースラインにほとんど到達する。約１５個の画分を収集し（９ｍＬの各量）、分画を停止する。収集した画分のうち、ピークの上昇部からの１つの画分、ピーク頂点付近の２つの画分、およびピークの尾部の１つの画分を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２カラムでクロマトグラフィーにかけ、画分のそれぞれについてのピーク保持時間を記録する。これらの画分のそれぞれは、異なる保持時間で溶出する。
【００４４】
同じ手順を多数のバッチについて繰り返した。選択した画分は、分画の間のこれらの溶出時間および溶出量が一定であるとき、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）−１２カラム内の同じ保持時間で溶出した。収集した画分を、それぞれ８０〜９０ｍｇになるように個々に凍結乾燥させる。
【００４５】
次いで、ＲＴ約２３．０分、ＲＴ約２６分、ＲＴ約２９分、およびＲＴ約３０分における４つの選択した画分を、それぞれ、１０ＫＤａの分子量カットオフ膜、３ＫＤａの分子量カットオフ膜、３ＫＤａの分子量カットオフ膜、および３ＫＤａの分子量カットオフ膜に通して濃縮する。濃縮溶液を個々に凍結乾燥させることによって、１５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、および１２ｍｇの表題化合物を得る。
【００４６】
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）による本願のマーカーの分子量の確認を以下に示す。
【００４７】
【化２】
2013535474.tif 000003
（実施例２）
グラチラマー酢酸塩分子量マーカーの調製
マトリックス：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−１００ＨＲ（高分解能）
ベッド体積：９００ｍＬ
ベッド高：４６０ｍｍ
溶出モード：定組成
流量：４．８ｍＬ／分
波長：２８０ｎｍおよび２１５ｎｍ
移動相：リン酸塩緩衝液（ｍＭ）、ｐＨ７．２、水４Ｌ当たりＮａＣｌ  １１．６８８ｇとともにＮａＨ２ＰＯ４  ７．７２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ２０．４５ｇ
試料調製：グラチラマー酢酸塩（１５００ｍｇ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１０ｍＬ）中に溶解させ、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過する。
【００４８】
カラムを、上記の調製した移動相を用いて安定化させる。移動相の流量を一定に保ち、２１５ｎｍでの吸収のベースラインが一定値に到達するまで安定化を継続する。試料を、ポンプＢアセンブリーを通じて同じ流量でカラムにロードする。注入ローディング（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｌｏａｄｉｎｇ）を示すのにセットマークオプションを使用する。吸光度を２１５ｎｍおよび２８０ｎｍなどの２つの波長で記録する。ほぼ４２０ｍＬの溶出量で、２１５ｎｍのピークが上昇し始める。１０ｍＬの各画分を送達するように画分コレクターを始動する。ほぼ６４０ｍＬの溶出量で、ピークはその最大値に到達する。移動相の流れは、依然として継続する。約１０２５ｍＬの溶出量で、ピークは、そのベースラインにほとんど到達する。分画を停止する。画分コレクターからの２つの連続した画分を一緒に混合して、それぞれ２０ｍＬの要求される画分量を得る。分画後、次サイクルのために移動相を用いてカラムを安定化させる。多数のバッチについて同じ手順を繰り返した。各バッチからのプールした画分を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２カラムでクロマトグラフィーにかけ、画分のそれぞれについてのピーク保持時間を記録した。それぞれ表１、２および３に示したように、これらの画分のそれぞれは、異なる保持時間で溶出する。異なるバッチからの同様の保持時間を有する画分を一緒にプールしてさらに処理した。
【００４９】
【表１】
2013535474.tif 000004
【００５０】
【表２】
2013535474.tif 000005
【００５１】
【表３】
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プールした各画分（画分３＆４〜画分１９＆２０）からの溶液（６０ｍＬ）を遠心カットオフ膜（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＣｕｔＯｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ製の５ｋＤａのカットオフ膜）中に注ぎ、量が２０ｍＬに濃縮されるまで、２５℃および３０００ＲＰＭの速度で６０分間遠心分離した。Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水（２０ｍＬ）をチューブの保持液側に添加してさらに洗浄し、２０ｍＬが浸透側に移動するまで再び遠心分離した。膜チューブのそれぞれからの保持溶液を別個に収集した。濃縮溶液を個々に凍結乾燥させることによって、１５０ｍｇ、１８７ｍｇ、２９２ｍｇ、５３７ｍｇ、５８０ｍｇ、および２７７ｍｇの表題化合物を得る。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）による本願のマーカーの分子量の確認を以下に示す。
【００５２】
【表４】
2013535474.tif 000007
（実施例３）
本願の分子量マーカーを用いたＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２カラムの較正
上記実施例１に示した手順によって調製される分子量マーカー、およびグラチラマー酢酸塩調製物は、保持時間（ＲＴ）と分子量の対数との間の同様の相関を実証することが予想される。本願の分子量マーカーをＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２カラムでクロマトグラフィーにかける。マーカーのそれぞれについてのピーク保持時間を記録する。分子量（ＭＷ）の対数と保持時間（ＲＴ）の線形相関を以下のように計算する。
【００５３】
Ｌｏｇ  ＭＷ＝Ａ＋Ｂ×ＲＴ
式中、ＭＷは分子量であり、ＲＴは保持時間であり、ＡおよびＢはそれぞれ、計算される回帰関数の切片および傾きである。
【００５４】
【表５】
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同様の様式で、上記実施例２に示した手順によって調製される分子量マーカー、およびグラチラマー酢酸塩調製物は、保持時間（ＲＴ）と分子量の対数との間の同様の相関を実証することが予想される。本願の分子量マーカーをＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２カラムでクロマトグラフィーにかける。マーカーのそれぞれについてのピーク保持時間を記録する。分子量（ＭＷ）の対数と保持時間（ＲＴ）の線形相関を以下のように計算する。
【００５５】
Ｌｏｇ  ＭＷ＝Ａ＋Ｂ×ＲＴ
式中、ＭＷは分子量であり、ＲＴは保持時間であり、ＡおよびＢはそれぞれ、計算される回帰関数の切片および傾きである。
【００５６】
【表６】
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Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）、またはグラチラマー酢酸塩からなる任意の他の医薬組成物の分子量を決定するためのこれらのマーカーを利用する前に、マーカーとグラチラマー酢酸塩の間の構造相関性を確立することが必須である。上記実施例１に示した手順によって調製される分子量マーカーのＣＤ（円偏光二色性）プロファイルをＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）と比較し、２つのプロファイルは同様であることが見出され、これらの構造上の均質性を示した。
【００５７】
次いで、上記様式で予め較正したＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）−１２カラムを使用することによって、導入者（ｉｎｎｏｖａｔｏｒ）のＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）ロット、およびグラチラマー酢酸塩の異なるバッチ試料の分子量を決定した。以下の表中のデータは、結果が、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）について提案された５〜９ＫＤａの指定された限度の十分範囲内であることを示す。
【００５８】
【表７】
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本願全体にわたって、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示全体は、本明細書中で説明され、特許請求された本発明の日付における、当業者に公知の最新技術をより完全に説明するために、本願中に参考として本明細書に援用される。
【００５９】
本発明の特定の実施形態を例示および説明してきたが、様々な他の変更および改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者には明白である。したがって、本発明の範囲内であるすべてのそのような変更および改変を添付の特許請求の範囲内に包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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