(57)【要約】  本明細書では、Ｃ．ジェジュニ内に自然に存在するＮ結合型グリコシル化シークオンの繰り返しを含む、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドと呼ばれるペプチドを説明する。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードする構築物の発現に続いて、精製され単離された形状にすることができ、あるいはＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは全体もしくは一部において合成ペプチドである。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、典型的にはそれに付着するグリカンとともに使用される。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは単独で、または異なるタンパク質もしくはペプチドと組み合わせて用いることができ、抗原／抗体送達系の開発、ワクチン、医薬品および診断検査薬の調製、カンピロバクターおよび他の感染症に立ち向かう療法の研究で用いるキメラタンパク質またはペプチドに組み込むことができる。
2013539963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸の繰り返しを少なくとも２回含むペプチド。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の前記繰り返しが近接しているか、またはわずか６個のアミノ酸によって隔てられている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを９回含むペプチド。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しが、近接しているか、またはわずか６個のアミノ酸によって隔てられている、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、周辺質分泌を可能にするシグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸の前記繰り返しのうちの少なくとも１つでグリコシル化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項で主張される少なくとも１つのペプチドと、第２のペプチドまたはタンパク質とを含むキメラタンパク質。
【請求項８】
前記第２のペプチドまたはタンパク質が、カンピロバクター（Campylobacter）に由来するもしくは固有であるペプチドまたはタンパク質を含む、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記第２のタンパク質またはペプチドが、ＡｃｒＡ、毒素、トキソイド、抗体または周辺質タンパク質である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記毒素またはトキソイドが、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）またはジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来する、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記抗体が樹状細胞を標的とする、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
複数のグリコシル化部位を含むキメラタンパク質を生成する方法であって、
第２のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列に直接的にもしくはリンカーポリヌクレオチドを介して作用可能に連結した請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ遺伝子を操作することと、
宿主内で前記キメラ遺伝子を発現させることと、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記第２のペプチドまたはタンパク質がＡｃｒＡ、毒素、トキソイド、抗体または周辺質タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のタンパク質が抗体を含み、および前記キメラタンパク質が、カンピロバクター感染症を処置するためのアジュバントを含まない組成物において使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のタンパク質またはペプチドが、カンピロバクターに由来するまたは固有である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記毒素またはトキソイドが、百日咳菌、破傷風菌またはジフテリア菌に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が樹状細胞を標的とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主が大腸菌（E. coli）である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
複数のＮ結合型グリカンによって前記キメラタンパク質をグリコシル化することをさらに含む、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｎ結合型グリカンが、Ｃ．ジェジュニ（C. jejuni）に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
真核生物、細菌および／または古細菌起源のＮ−グリカンを示すための請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２２】
例えばワクチン中のグリカンキャリアとしての、請求項６に記載のペプチドまたは請求項７に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項２３】
前記ワクチンが、動物由来感染症のヒト病原体、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）またはカンピロバクターレクタス（Campylobacter rectus）に起因する旅行者下痢症に対するワクチン接種用である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記動物由来感染症のヒト病原体が、ネコおよびイヌにおけるカンピロバクターウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）、ブタにおけるカンピロバクターコリー（Campylobacter coli）またはニワトリにおけるカンピロバクタージェジュニである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記ワクチンが、カンピロバクター・フィタス・ペネレアリス（Campylobacter fetus venerealis）またはカンピロバクター・フィタス・フィタス（Campylobacter fetus venerealis）に起因する不妊性および流産を予防するためのウシまたはヒツジのワクチン接種用である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
ワクチン製剤中のアジュバントとしての請求項６に記載のペプチドの使用。
【請求項２７】
ワクチンまたは医薬品の調製のための第２のタンパク質またはペプチドとの組み合わせでの請求項６に記載のペプチドの使用。
【請求項２８】
ワクチンまたは医薬品の調製のための請求項７に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項２９】
前記第２のペプチドまたはタンパク質が、カンピロバクターに由来するまたは固有であるタンパク質を含む、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記第２のタンパク質がＡｃｒＡ、毒素、トキソイド、抗体または周辺タンパク質である、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記毒素またはトキソイドが、百日咳、破傷風菌またはジフテリア菌に由来する、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体が樹状細胞を標的とする、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
請求項６に記載のペプチドまたは請求項７に記載のキメラタンパク質を含むワクチン。
【請求項３４】
前記ワクチンが、動物由来感染症のヒト病原体、カンピロバクタージェジュニに起因する旅行者下痢症、またはカンピロバクターレクタスに起因する歯周病に対するワクチン接種用である、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３５】
前記動物由来感染症のヒト病原体が、ネコおよびイヌにおけるカンピロバクターウプサリエンシス、ブタにおけるカンピロバクターコリーまたはニワトリにおけるカンピロバクタージェジュニである、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
前記ワクチンが、カンピロバクター・フィタス・ペネレアリスまたはカンピロバクター・フィタス・フィタスに起因する不妊性および流産を予防するためのウシまたはヒツジのワクチン接種用である、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３７】
対象において細菌感染症を診断する方法であって、
（ｉ） 前記対象から採取した試料を請求項６に記載のペプチドと接触させることであって、グリカンは細菌抗原の上に存在する代表的なグリカンである、接触させることと、
（ｉｉ）請求項６に記載のペプチドの結合によって形成された結合複合体を、細菌抗原に特異的な抗体によって検出することと、
を含み、
結合複合体の存在が対象における細菌感染症を示している、
方法。
【請求項３８】
請求項６に記載のペプチドが固体支持体上に固定化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記固体支持体が、マイクロタイタープレート、ポリマービーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズまたは膜の表面である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細菌抗原が、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、動物由来感染症のヒト病原体、カンピロバクタージェジュニ、カンピロバクターレクタス、カンピロバクターレクタス、カンピロバクター・フィタス・ペネレアリスまたはカンピロバクター・フィタス・フィタス由来である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記動物由来感染症のヒト病原体が、カンピロバクターウプサリエンシス、カンピロバクターコリーまたはカンピロバクタージェジュニである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象において細菌感染症を診断するためのイムノアッセイキットであって、
（ａ） 各ペプチドが細菌抗原である少なくとも１つのグリカンを含む、請求項６に記載の１または複数のペプチドの混合物と、
（ｂ）請求項６に記載の１または複数のペプチドの前記混合物を前記対象からの生体試料と接触させるため、および請求項６に記載のペプチドの結合によって形成された結合複合体の形成を、細菌抗原に特異的である試料中の抗体でモニターするための使用説明書と、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年９月３日に出願の米国特許仮出願第６１／３７９，８９６号に対する有益性と優先権を主張し、本明細書に明確に記載されているかのように、該米国特許仮出願の全体を本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、Ｎ結合型グリコシル化のための複数の連続的なシークオンを含むカンピロバクター由来のペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
アスパラギン（Ｎ結合型）タンパク質グリコシル化は、かつてε-プロテオバクテリア・カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）内でそれが発見されるまで、真核生物と古細菌内だけに存在すると考えられていた（Szymanski CMら,1999: Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Mol Micro, 32(5): 1022-1030; Wacker Mら, 2002: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298(5599): 1790-1793; Young NMら, 2002: Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. J Biol Chem, 277(45): 42530-42539）。真核細胞において、Ｎ結合型グリコシル化は必須過程であり、触媒サブユニットであるＳＴＴ３を有する９個のタンパク質からなるオリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体によって触媒される（概説に関しては以下を参照されたい：Yan A & Lennarz WJ., 2005: Unraveling the mechanism of protein N-linked glycosylation. J Biol Chem, 280(5): 3121-3124）。Ｃ．ジェジュニにおいて、Ｎ結合型グリコシル化は周辺質内で生じ、ＳＴＴ３オルソロガスタンパク質のＰｇ１Ｂは、受容体ペプチドおよびタンパク質へのオリゴ糖の転移に関与する鍵酵素である。分泌された受容体ペプチド内のコンセンサス配列（Ｎ結合型グリコシル化シークオン）が存在することが、Ｐｇ１Ｂによる認識のために必要である。このシークオンは、Ｄ／Ｅ−Ｘ１−Ｎ−Ｘ２−Ｓ／Ｔからなり、Ｘ１とＸ２は、プロリン以外のいずれのアミノ酸であり得る（Kowarik Mら, 2006: Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence. EMBO J, 25(9): 1957- 1966）。
【０００４】
Ｃ．ジェジュニＮ結合型グリカンの構築のための現在のモデルを図1１に示す（Szymanski CMら, 2003 : Campylobacter - a tale of two protein glycosylation systems. Trends Microbiol, 5(11): 233-238）。バクトプレニル−ピロリン酸に結合したヘプタサッカリドは、ヌクレオチド活性化糖類の添加によって、サイトゾル内に構築される（Szymanski CMら, 2003 : Campylobacter - a tale of two protein glycosylation systems. Trends Microbiol, 5(11): 233-238; Szymanski CMら, 2003: Detection of conserved N-linked glycans and phase-variable lipooligosaccharides and capsules from Campylobacter cells by mass spectrometry and high resolution magic angle spinning NMR spectroscopy. J Biol Chem, 278(27): 24509-24520）。完全なヘプタサッカリドは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体ＰｇｌＫによって、内膜を横切って周辺質に移動される（Alaimo Cら, 2006: Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J, 25(5): 967-976）。次いで、オリゴ糖はＰｇｌＢによってＮ結合型グリコシル化シークオンへ移されるか、または遊離オリゴ糖（ｆＯＳ）として細胞膜周辺腔に放出される（Nothaftら, 2009: Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. PNAS, 106(35): 15019-15024）。（Young NMら, 2002: Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. J Biol Chem, 277(45): 42530-42539; Wacker Mら, 2002: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298(5599): 1790-1793）。
【０００５】
Ｃ．ジェジュニのN結合型タンパク質グリコシル化機構は機能的に大腸菌へ移すことができると実証された（Wacker Mら, 2002：N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298(5599)： 1790-1793）。これにより、糖タンパク質工学への当該手法の利用が急速に高まり、様々な目的で工学的グリカン構造の可能性が切り開かれた。例として、N結合型糖化タンパク質およびN結合型グリコシル化のさらなる研究や、治療上有用な抗体およびワクチンの製造といった治療への応用などが挙げられる。
【０００６】
だが、大腸菌内でＣ．ジェジュニグリコシル化機構を使用するＮ結合型糖タンパク質工学には、いくつかの不利な点と限界がある。組換え糖タンパク質生産にとって最重要の限界の一つは、天然の糖タンパク質内に存在するＮ結合型グリコシル化シークオンの数である。当業者が認識するように、現在利用できる分子生物学的技術は、天然のグリコシル化タンパク質内にさらなるＮ結合潟グリコシル化シークオンの挿入および通常グリコシル化されないタンパク質内にＮ結合型グリコシル化シークオンの挿入さえも可能にする。しかしながら、これらのＮ結合型グリコシル化部位の挿入は、大部分は試行錯誤の手法を伴う。タンパク質の三次元構造についてのかなりの知識がなければ、一部のＮ結合型グリコシル化部位は、タンパク質グリコシル化機構に到達できないタンパク質の領域に挿入されることもある（Kowarik Mら, 2006: N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science, 314 (5802): 1148-1150; Kowarik Mら, 2006: Definition of the bacterial N-linked glycosylation site consensus sequence. EMBO J, 25(9): 1957-1966）。さらに、タンパク質の三次元構造に関する情報がないと、Ｎ結合型グリコシル化シークオンの連続挿入が妨げられることもある。Kowarik Mら（２００６）によって同定されたＮ結合型グリコシル化シークオンは、タンパク質内でセグメントを形成することが確認されたが、１つのタンパク質内で同定されたそのようなシークオンはただ１つだけであり、またはシークオンは該タンパク質内で広く間隔が空いていた。タンパク質の構造情報がなければ、タンパク質内に複数のN結合型グリコシル化シークオンまたは連続的なシークオンを導入して、組換え宿主内で効率的なグリコシル化を確実にすることは極めて難しい。
【０００７】
さらに、タンパク質またはペプチド内でのＮ結合型グリコシル化シークオンの工学は、多大な時間を必要とし、かつ時として費用のかかる過程である。これは、特に、治療用抗体および／またはワクチンの開発の場合、問題となり得る。
【０００８】
したがって、上述の諸問題の一部を回避すると同時に、効率的にかつ組換えでグリコシル化され得るＮ結合型グリコシル化シークオンを複数含むペプチドおよびタンパク質が必要とされている。
【０００９】
この背景情報は、出願者が本発明との関連性が可能であると考える情報を明らかにする目的で提供される。前述の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成すると承認することは必ずしも意図されず、またはそのように解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本出願の目的は、複数のＮ結合型グリコシル化シークオンを含んでいるペプチドとその調製方法およびその使用を提供することである。広範な態様によれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列セットを少なくとも２コピー含むペプチドが提供される（本明細書ではこのペプチドを「ＧｌｙｃｏＴａｇ」ペプチドと呼ぶ）。一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列セットを９コピー含む。配列番号１に記載のアミノ酸配列セットの複数のコピーは、近接し得るか、またはわずか６個のアミノ酸によって隔てられ得る。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、周辺質分泌を促進するシグナルペプチドをさらに含むことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
別の広範な態様によれば、少なくとも１つのＧｌｙｃｏＴａｇペプチドと第２のペプチドまたはタンパク質を含むキメラタンパク質が提供される。ＧｌｙｃｏＴａｇは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも２コピー含み、それらは近接し得るか、またはわずか６個のアミノ酸によって隔てられ得る。一実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、カンピロバクターに由来する、またはカンピロバクターに固有のタンパク質を含む。一実施形態では、第２のタンパク質は、ＡｃｒＡである。一実施形態では、第２のタンパク質またはペプチドは、毒素、トキソイド、抗体および周辺質タンパク質からなる群から選択される。毒素またはトキソイドは、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）およびジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）から選択される群に由来し得る。一実施形態では、第２のタンパク質またはペプチドとして選択される抗体は、樹状細胞を標的にする。
【００１２】
別の広範な態様によれば、複数のグリコシル化部位を含むキメラタンパク質を生成する方法が提供され、該方法は、第２のペプチドまたはタンパク質、例えば、細胞膜周辺腔に対してキメラタンパク質を標的にすることができるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に直接的にもしくはリンカーを介して作用可能に連結されるＧｌｙｃｏＴａｇをコードする核酸配列を含むキメラ遺伝子を操作するステップと、結果としてもたらされるキメラ遺伝子を宿主内で発現させるステップとを含む。宿主は、大腸菌であり得る。
【００１３】
一実施形態では、第２のペプチドまたはタンパク質は、毒素もしくはトキソイド、抗体または周辺質タンパク質を含む。一実施形態では、毒素またはトキソイドは、百日咳菌、破傷風菌またはジフテリア菌に由来する。一実施形態では、第２のタンパク質は抗体を含み、およびキメラタンパク質はカンピロバクター感染症を処置するためのアジュバントを含まない組成物で用いられる。一実施形態では、抗体は樹状細胞を標的とする。一実施形態では、第２のタンパク質またはペプチドは、カンピロバクターに由来する、またはカンピロバクター固有のタンパク質を含む。別の実施形態では、第２のタンパク質は、ＡｃｒＡである。
【００１４】
一実施形態では、キメラタンパク質を生成する方法は、複数のＮ結合型グリカンを有するキメラペプチドまたはタンパク質をグリコシル化するさらなるステップを含む。一実施形態では、Ｎ結合型グリカンは、Ｃ．ジェジュニに由来する。
【００１５】
本明細書に記述されるＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、多くの異なる目的で用いられ得る。一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを用いて、真核生物、細菌および／または、古細菌起源のＮ−グリカンを示すことができる。別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを用いて、Ｏ−グリカンを示すことができる。一実施形態では、特定のグリカンでグリコシル化される場合、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、ネコおよびイヌにおけるカンピロバクターウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）、ブタにおけるカンピロバクターコリー（Campylobacter coli）およびニワトリにおけるカンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）からなる群から選択される動物由来感染症のヒト病原体に対するワクチン接種のためのグリカンキャリアとして用いられることができる。別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、カンピロバクタージェジュニに起因する旅行者下痢症に対するワクチン接種のためのグリカンキャリアとして用いられることができる。別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをウシおよびヒツジのワクチン接種のためのグリカンキャリアとして用いて、カンピロバクター・フィタス・ペネレアリス（Campylobacter fetus venerealis）およびカンピロバクター・フィタス・フィタス（Campylobacter fetus fetus）に起因する不妊症および流産を予防することができる。さらに別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、細菌感染症であると疑われる対象から採取した試料中の細菌性グリカンを表示し、次いで抗血清の存在もしくは非存在を決定し、または定量化するために用いられる診断方法において使用されることができる。
【００１６】
別の実施形態では、本発明のＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、ワクチン製剤中のアジュバントとして用いられることができる。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、ワクチンまたは医薬品の調製用の第２のタンパク質またはペプチドと組み合わせて用いられることもできる。第２のペプチドまたはタンパク質は、カンピロバクターに由来する、またはカンピロバクター固有のタンパク質を含み得る。一実施形態では、第２のタンパク質は、ＡｃｒＡである。一実施形態では、第２のタンパク質またはペプチドは、毒素、トキソイド、抗体および周辺質タンパク質からなる群から選択される。毒素またはトキソイドは、百日咳菌、破傷風菌またはジフテリア菌に由来し得る。一実施形態では、第２のタンパク質として選択される抗体は、樹状細胞を標的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明は、その構成および操作方法の両方に関して、以下の説明、およびいくつかの図にわたり類似の数字が用いられている種々の実施形態の添付図面を参照することによって最も良く理解され得る。
【００１８】
【図１】先行技術で決定される場合の、Ｃ．ジェジュニ内のＮ結合型グリコシル化過程の模式図である。
【図２Ａ】ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮを使用することによるＣｊ１４３３ｃタンパク質セグメントの生物情報分析からの図である。１４３３ｃタンパク質の最初の７０のアミノ酸を、ＳｉｇｎａｌＰプログラム（バージョン３．０）(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）で分析して、周辺質タンパク質であるＣｊ１４３３ｃの可能性を評価した。該アルゴリズムは、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化に必須であるＣ．ジェジュニの細胞膜周辺腔への分泌にとって必要なシグナルペプチド配列の非存在を明らかに示した。
【図２Ｂ】ＳｉｇｎａｌＰ−ＨＭＭを使用することによるＣｊ１４３３ｃタンパク質のセグメントの生物情報分析からの図である。１４３３ｃタンパク質の最初の７０のアミノ酸を、ＳｉｇｎａｌＰプログラム（バージョン３．０）(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）で分析して、周辺質タンパク質であるＣｊ１４３３ｃの可能性を評価した。該アルゴリズムは、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化に必須であるＣ．ジェジュニの細胞膜周辺腔への分泌にとって必要なシグナルペプチド配列の非存在を明らかに示した。
【図３】Ｃ．ジェジュニ１４３３ｃタンパク質の最初の１５０のアミノ酸の配列を表す（配列番号３１）。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチド（配列番号１の繰り返し９回）を含んでいるこの配列は、＊＊と＊＊との間に位置している。細菌のＮ−グリコシル化シークオン（ＤＬＮＮＴ）を下線で示す。
【図４】ＧｌｙｃｏＴａｇをＡｃｒＡ構築物に融合した構築物番号１、２および３の組成物を示す。構築物１、２および３ために、カンピロバクター・フィタス・フィタス（Ｃｆｆ）のＮ−糖タンパク質のＡｃｒＡを用いた（ＡｃｒＡＣｆｆ）。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、構築物１内のＮ末端で（ＧｌｙｃｏＴａｇ−ＡｃｒＡＣｆｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質を得るために）、構築物２内のＣ末端で（ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質を得るために）、および構築物３内のＡｃｒＡタンパク質のリポイルドメインと、α−ヘアピンドメインとの中間に（Ｎ−ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｃ−ＡｃｒＡＣｆｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質を得るために）挿入された。「ｓｓ」はペクチン酸リアーゼＢのリーダー配列を表し、「Ｈｉｓ６」はヘキサヒスチジンタグを表す。
【図５】図４に記述した構築物を用いて産生したＧｌｙｃｏＴａｇ−ＡｃｒＡＣｆｆ融合タンパク質の第一世代の発現を示しているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ペクチン酸リアーゼＢリーダーシー配列（ｓｓ）を用いて、該タンパク質を周辺質に方向づけた。２８℃で増殖させた大腸菌(E.coli)ＢＬ２１内での融合タンパク質の発現に続いて、１ｍＭ  ＩＰＴＧでの１８時間の誘導後、細胞の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロットを行った。Ｃ末端融合構築物（構築物２、レーン２）だけが予想された大きさ５５ｋＤａのタンパク質をもたらした。
【図６Ａ】図４に示す構築物１によるＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質のアミノ酸配列である。ｐＥＴ２２ｂ由来のｐｅｌＢリーダー配列（ｓｓ）およびヘキサヒスチジンアミノ酸配列はイタリック体で示し、Ｎ結合型グリコシル化シークオンは太文字で、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは下線で示す。
【図６Ｂ】図４に示す構築物２によるＧｌｙｃｏＴａｇ−ＡｃｒＡＣｆｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質のアミノ酸配列である。ｐＥＴ２２ｂ由来のｐｅｌＢリーダー配列（ｓｓ）およびヘキサヒスチジンアミノ酸配列はイタリック体で示し、Ｎ結合型グリコシル化シークオンは太文字で、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは下線で示す。
【図６Ｃ】図４に示す構築物３によるドメイン間Ｎ−ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｃ−ＡｃｒＡＣｆｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質のアミノ酸配列である。ｐＥＴ２２ｂ由来のｐｅｌＢリーダー配列（ｓｓ）およびヘキサヒスチジンアミノ酸配列はイタリック体で示し、Ｎ結合型グリコシル化シークオンは太文字で、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは下線で示す。
【図７Ａ】Ｃ．ジェジュニのｐｇｌ機構の存在下で、周辺質で発現した、可溶性のＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質（構築物２）の精製を示す電気泳動図の写真を示す。精製のためにＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた。レーン１は、粗細胞溶解液の試料である；レーン２は、カラムフロースルーの試料である；およびレーン３は、イミダゾール２５０ｍＭで得た溶出液の試料である。
【図７Ｂ】抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット法によって生成したＨｉｓタグ付きタンパク質の免疫ブロットの写真を示す。レーン１は、ＡｃｒＡＣｆｆタンパク質の試料であり、レーン２は、ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質の試料である。
【図７Ｃ】Ｃ．ジェジュニＮ−グリカン特異的抗血清を用いたウエスタンブロット法によって生成したＨｉｓタグ付きタンパク質の免疫ブロットの写真を示す。レーン１は、ＡｃｒＡＣｆｆタンパク質の試料であり、レーン２は、ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質の試料である。
【図７Ｄ】図７Ｃのレーン２の拡大図であり、最高１１までのヘプタサッカリドを有するＮグリコシル化融合タンパク質を示す。
【図８Ａ】異種大腸菌（E. coli）タンパク質グリコシル化系でトキソイオド−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質（ｔｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質）を生成するために用いた構築物の模式図である。ジフテリア菌ＮＣＴＣ１３１２９のｔｏｘＣ遺伝子のＮ末端の部分（ｎｔ７９〜ｎｔ６５４）のＣ末端にＧｌｙｃｏＴａｇを融合した。「ｓｓ」はペクチン酸リアーゼＢのリーダー配列を表し、「Ｈｉｓ６」はヘキサヒスチジンタグを表す。
【図８Ｂ】異種大腸菌タンパク質グリコシル化系で樹状細胞標的単鎖抗体−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質（ｓｃＦｖ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−融合タンパク質）を生成するために用いた構築物の模式図である。マウス樹状細胞上のＤＥＣ−２０５受容体を認識するｓｃＦｖのＣ末端にＧｌｙｃｏＴａｇを融合した。「ｓｓ」はペクチン酸リアーゼＢのリーダー配列を表し、「Ｈｉｓ６」はヘキサヒスチジンタグを表す。
【図８Ｃ】異種大腸菌タンパク質グリコシル化系でｔｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の発現を示している１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動図の写真を示す。該融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。レーン１は、ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭを用いて１８時間タンパク質発現を誘導した後の全細胞溶解液の試料である；レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーからのフロースルーの試料である；およびレーン３は、イミダゾール２５０ｍＭを用いて溶出したタンパク質の試料である。
【図８Ｄ】大腸菌（ｐｇｌ＋）（レーン１）または大腸菌（ｐｇｌ−）（レーン２）内でカンピロバクタージェジュニＮ−グリカン特異的ｈＲ６によるｔｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質のグリシル化の免疫検出を示している電気泳動図の写真を示す。
【図８Ｅ】異種大腸菌タンパク質グリコシル化系でｓｃＦｖ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の発現を示す１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動図の写真を示す。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて該融合タンパク質を精製した。レーン１は、ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭを用いて１８時間タンパク質発現を誘導した後の全細胞溶解液の試料である；レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーからのフロースルーの試料である；およびレーン３は、イミダゾール２５０ｍＭを用いて溶出したタンパク質の試料である。
【図８Ｆ】大腸菌（ｐｇｌ＋）（レーン１）または大腸菌（ｐｇｌ−）（レーン２）内でｈＲ６抗血清によるｓｃＦｖ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質のグリシル化の免疫検出を示している電気泳動図の写真を示す。
【図９Ａ】異種大腸菌タンパク質グリコシル化系でトキソイド−（ＧｌｙｃｏＴａｇ）２融合タンパク質（ｔｏｘＣＣｄ−（ＧｌｙｃｏＴａｇ）２融合タンパク質）を生成するために用いた構築物の模式図である。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの連続２コピーを、ジフテリア菌ＮＣＴＣ１３１２のｔｏｘＣ遺伝子のＮ末端の部分（ｎｔ７９〜ｎｔ６５４）のＣ末端に融合した。「ｓｓ」はペクチン酸リアーゼＢのリーダー配列を表し、「Ｈｉｓ６」はヘキサヒスチジンタグを表す。
【図９Ｂ】Ｃ．ジェジュニヘプタサッカリドを用いて発現させ、グリコシル化したｔｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇおよびｔｏｘＣＣｄ−（ＧｌｙｃｏＴａｇ）２の融合タンパク質の検出を示す。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した（上の図８で記述したように）ｔｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇタンパク質（レーン２）およびｔｏｘＣＣｄ−（ｇｌｙｃｏＴａｇ）２（レーン３）融合タンパク質の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のｈＲ６抗血清を用いるウエスタンブロット。プラスミドｐＡＣＹＣ上のＣ．ジェジュニタンパク質グリコシル化オペロンの存在下での大腸菌ＢＬ２１でのタンパク質発現は、ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭを用いて１８時間誘導した。明確にするために、個々の糖タンパク質特異的シグナルは、対応するシグナルの横に線で示す。ｋＤａでの分子量マーカーの大きさ（レーン１）は、左側に示す。
【図１０】Ｎ−グリカン特異的抗体応答を要約した棒グラフである。ＥＬＩＳＡ プレート（Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ）の表面を一価のリピドＡ−Ｎ−グリカン複合体（Ｃ．ジェジュニのタンパク質グリコシル化遺伝子クラスターを発現させる大腸菌Ｏ−抗原ポリメラーゼ突然変異系統（Wacker Mら, 2002: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298(5599): 1790-1793)から、Manoharan Rら, 1990:UV resonance Raman spectra of bacteria, bacterial spores, protoplasts, and calcium dipicolinate. J. Microbiol. Methods 11 (1): 1-15に従って調製した）で一晩覆った。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％、ｐＨ７．３）でプレートを３回洗浄し、続いてスキムミルク２％によるブロッキングステップを室温で３時間実施した。プレートをＰＢＳＴで１回洗浄して、１：５０で希釈した（ＰＢＳＴ中で）マウス血清を加えて、室温で２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで洗浄して、アルカリホスファターゼで標識した抗マウス抗体（Santa Cruz、ＰＢＳＴで１：１０００希釈）とともにインキュベートした。室温で１時間後に、プレートをＰＢＳＴで３〜４回洗浄して、各ウェルにＰＮＰＰを加え、３０分後にマイクロプレートリーダーを使用して、ＯＤ４０５ｎｍおよびＯＤ５７０ｎｍ（バックグラウンド）を測定した。各棒は、表示した抗原群のバックグラウンドを引いた値を表し、２つの実験的繰り返しおよび２つの技術的繰り返しを表す標準偏差は、エラーバーで示す。
【図１１Ａ】２１日目からのＮ−グリカン特異的抗体応答を要約した棒グラフである。記述したように（図１０）、ＥＬＩＳＡプレートの表面を覆った。記述したように（図１０において）、希釈したマウス血清（ＰＢＳＴで１：１００に）を用いて、Ｎ−グリカン特異的免疫応答の分析を行った。
【図１１Ｂ】３５日目からのＮ−グリカン特異的抗体応答を要約した棒グラフである。記述した（図１０）ように、ＥＬＩＳＡプレートの表面を覆った。記述したように（図１０において）、希釈したマウス血清（ＰＢＳＴで１：１００に）を用いて、Ｎ−グリカン特異的免疫応答の分析を行った。
【図１２Ａ】表３に概要を述べるように、複数の群においてカンピロバクタージェジュニによって１日齢のニワトリにコロニー形成を行った後に得たコロニー数（コロニー形成単位）を表す。各棒は、各群のコロニー形成レベルの中央値を表す。
【図１２Ｂ】Ｃ．ジェジュニ（＋）またはリピドＡコア（−）の一価のリピドＡ結合型Ｎ−グリカンを産生する大腸菌抽出物を消化したプロテイナーゼＫに対する免疫ブロットを、１６％ＤＯＣゲル上で分離し、異なるニワトリからの血清（最終採血、［群−表示したニワトリ数］）で精査することで行った後の４群および５群のニワトリ血清におけるＩｇＧ（ＩｇＹ）液性応答を示す。Ｎ−グリカン特異的抗血清（ｈＲ６）で精査した陽性対照（陽性［＋ｖｅ］対照）と比較した場合の、Ｎ−グリカン特異的シグナルの分子量を矢印で示す。１群のニワトリ（陰性対照［−ｖｅ］対照）の最終採血から得た血清プールでは、Ｎ−グリカン特異的シグナルは得られなかった。
【図１３】表４に概要を述べるように、複数の群においてカンピロバクタージェジュニによって１日齢のニワトリにコロニー形成を行った後に得たコロニー数（コロニー形成単位）を表す。各棒は、各群のコロニー形成レベルの中央値を表す。
【図１４】異種大腸菌タンパク質グリコシル化系でマルトース結合タンパク質−第Ｘａ因子−ＧｌｙｃｏＴａｇ−ヘキサヒスチジン融合タンパク質（Ｍａｌ−ＧＴ−Ｈｉｓ）を生成するために用いた構築物の模式図である。アミロース−アガロース・アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されることができる「ＭａｌＥ」のＣ末端にこのＧｌｙｃｏＴａｇを融合する。「Ｐｔａｃ」はＩＰＴＧ誘導可能プロモーターを表し、「ＭａｌＥ」はマルトース結合タンパク質を表し、「Ｘａ部位」は第Ｘａ因子プロテアーゼ認識配列を表し、「ｓｓ」はペクチン酸リアーゼＢのリーダー配列を表し、「Ｈｉｓ６」はヘキサヒスチジンタグを表す。
【図１５】ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの検出およびＣ．ジェジュニヘプタサッカリドでグリコシル化したＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの検出を示す。アミロース−アガロース・アフィニティークロマトグラフィーで精製したＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の第Ｘａ因子プロテアーゼによる消化後（レーン１、Ｈｉｓ−Ｔａｇ特異的抗血清；レーン３、ｈＲ６抗血清）、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した（上の図８に記述したように）ＧｌｙｃｏＴａｇの１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、およびアミロース−アガロース・アフィニティークロマトグラフィーで精製したＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の第Ｘａ因子プロテアーゼによる消化後（レーン２、Ｈｉｓ−Ｔａｇ特異的抗血清；レーン４、ｈＲ６抗血清）、Ｃ．ジェジュニのタンパク質グリコシル化機構の存在下で発現したグリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇをＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した（上の図８に記述したように）ものの１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、Ｈｉｓ−Ｔａｇ特異的抗血清と、カンピロバクタージェジュニＮ−グリカン特異的ｈＲ６抗血清とを用いるウエスタンブロットを示す。プラスミドｐＡＣＹＣ上のＣ．ジェジュニタンパク質グリコシル化オペロンの存在下または非存在下での大腸菌ＤＨ５αでのタンパク質発現は、ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭを用いて１８時間誘導した。明確にするために、個々の糖タンパク質特異的シグナルは、対応するシグナルの横に線で示す。ｋＤａでの分子量マーカーの大きさは、左側に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野での当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲で使用する、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈でそうではないと明白に示されていない限り、複数の参照を含む。
【００２１】
本明細書で使用する用語「含む」は、それに続く記載が限定的なものであり、かつ必要に応じて、任意の他のさらなる好適な項目、例えば、１または複数のさらなる特徴、構成要素および／または成分を含むこともあり、または含まないこともあることを意味すると理解されることなる。
【００２２】
用語「核酸配列」（または核酸分子）は、一本鎖または二本鎖形状でのＤＮＡまたはＲＮＡ、具体的には、本発明によるタンパク質もしくはタンパク質の断片をコードするＤＮＡを指す。
【００２３】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、互換的に使用され、特定の作用様式、大きさ、三次元構造または由来に関係なくアミノ酸の鎖からなる分子を指す。したがって、タンパク質の「断片」または「部分」は、依然として「タンパク質」と呼ばれ得る。本明細書で使用する用語「ペプチド」は、短いポリペプチドを指す。
【００２４】
本明細書で使用する用語「トキソイド」は、その毒性が化学物質（例えばホルマリン）または熱処理にいずれかで弱められ、抑制され、または不活性化されているが、他の特性、通常は免疫原性が維持されている細菌性毒素を指す。本明細書で使用する用語トキソイドは、弱められ、抑制され、または不活性化された毒素のタンパク質またはペプチド断片を包含する。
【００２５】
用語「遺伝子」は、領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味し、細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写され、好適な調節領域（例えばプロモーター）に作用可能に連結される。このように、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含む５’リーダー配列、および例えば転写終結点を含む３’非翻訳配列などのいくつかの作用可能に連結された配列を含む。
【００２６】
「キメラ遺伝子」（または組換え遺伝子）は、ある種において本来は、通常見られないいずれの遺伝子、特に、その核酸配列の１つまたは複数の部分が本来は互いに関連しないある遺伝子を指す。例えば、プロモーターは本来、転写領域の一部もしくは全体と、または別の調節領域と関連しない。用語「キメラ遺伝子」は、その中のプロモーターまたは転写調節配列が、１もしくは複数のコード配列に、またはアンチセンス（センス鎖の逆相補鎖）もしくは反転した繰り返し配列（センスとアンチセンス、それによって転写後、ＲＮＡ転写物が二本鎖ＲＮＡを形成する）に作用可能に連結されている発現構築物を含むと理解される。
【００２７】
本明細書で使用する用語「作用可能に連結される」とは、機能的関係でポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、その核酸は「作用可能に連結される」。例えば、プロモーター（というより転写調節配列）が、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、それは、そのコード配列に作用可能に連結されている。作用可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が通常、近接しており、および「キメラタンパク質」を生成するために、２つのタンパク質コード領域を結合することが必要ならば、近接し、かつ読み枠内にあることを意味する。「キメラタンパク質」は、それ自体は本来、見られないが、結合ドメインの機能性を示す機能タンパク質を形成するために結合される種々のタンパク質の「ドメイン」（またはモチーフ）で構成されるタンパク質である。また、キメラタンパク質は、２種以上の天然のタンパク質からなる融合タンパク質であり得る。本明細書で使用する用語「ドメイン」とは、特定の構造または機能を有するタンパク質の任意の部分またはドメインを意味し、そのドメインの少なくとも機能特性を有する新たなハイブリットタンパク質をもたらすために、別のタンパク質に移されることができる。
【００２８】
本明細書で使用する用語「標的ペプチド」とは、細胞膜周辺腔などの細胞内小器官もしくは部位に対して、または細胞外間隙（分泌シグナルペプチド）に対してタンパク質を標的にすることができるアミノ酸配列を指す。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質のアミノ末端側終端（Ｎ末端側終端）をコードする核酸配列に融合させる（フレーム単位で）ことができる。
【００２９】
本明細書では、「核酸構築物」または「ベクター」は、組換えＤＮＡ技術を用いて得た人工核酸分子を意味し、それを用いて宿主細胞に外来性ＤＮＡを送達することができると理解される。ベクターは、例えば、選択可能なマーカー、多重クローニング部位等（以下を参照されたい）の分子クローニングでの使用を容易にするために、遺伝因子をさらに含むことができる。
【００３０】
本明細書で使用する用語「ＧｌｙｃｏＴａｇペプチド」とは、推定細胞質タンパク質Ｃｊ１４３３ｃ由来のＮ結合型グリコシル化シークオンのコピーを２以上有するペプチドを指し、Ｃ．ジェジュニ株１１１６８に天然に存在する。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、精製または単離した形状にすることができ、任意にそれに付着したグリカン類を含む。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、単独でまたは異なるタンパク質もしくはペプチドと組み合わせて用いられることができ、および例えば抗原／抗体送達系の開発、ワクチン、医薬品および診断検査薬の調製、およびカンピロバクター感染症に立ち向かうための療法の研究において、キメラタンパク質またはペプチドに組み込むことができる。
【００３１】
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを用いて、真核生物、細菌および／または古細菌の供給源のものを含むＮ−グリカン、またはこれらの３つの供給源のいずれかもしくはすべてに由来する酵素から産生されたＮ−グリカン模倣物を示すことができる。さらに、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを用いて、スレオニンだけが必要な場合、いずれのＯ−グリカンを示すことができる。
【００３２】
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、Ｃ．ジェジュニ株１１１６８（図３、配列番号３１）のタンパク質Ｃｊ１４３３ｃのＮ末端アミノ酸配列に由来する。このタンパク質のセグメントは、アミノ酸配列ＫＩＤＬＮＮＴ（配列番号１）の繰り返しを９含み、各繰り返しは、Ｎ結合型グリコシル化シークオン（ＤＬＮＮＴ）を含む。生物情報分析（図２Ａおよび２Ｂ）は、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを含んでいるＣｊ１４３３ｃタンパク質が細菌の細胞膜周辺腔に分泌されず、したがって天然の宿主における細菌のＮ結合型グリコシル化の必要条件の１つが欠けていることを示した。さらに、ＴＭｐｒｅｄ（Prediction of Trans membrane Regions and Orientation)プログラム（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）およびタンパク質内の膜貫通ヘリックスの予測のためのＴＭＨＭＭプログラム（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）を使用したが、Ｃｊ１４３３ｃ内の膜貫通ドメインの存在を予測しなかった。したがってＣｊ１４３３ｃタンパク質が、グリコシル化に非常に感受性が高い配列を含むであろうことは、予想外であった。これらの生物情報学分析に加えて、Ｓｃｏｔｔら（２０１０）によって行われた総糖タンパク質の分析は、Ｃ．ジェジュニ内のＮ結合型糖タンパク質としてＣｊ１４３３ｃタンパク質を検出できなかった（Scott NEら, 2010: Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, HCD and ETD-MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Mol Cell Proteomics, Manuscript M000031-MCP201として２０１０年４月１日に発表された）。理論にとらわれることを望むものではないが、これらの分析法がＮ−グリカン受容体ペプチドとしてＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの使用に成功したことは、思いも寄らなかったであろうことは、当業者にとって明らかである。驚くべきことに、本発明者らは、それが当てはまらないことを実証した。一実施形態では、種々の宿主系においてＮ結合型グリコシル化を可能にするために、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、宿主細胞から輸送を可能にするシグナルペプチドを含むように修飾されることができる。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌細胞の周辺質への輸送を可能にする。一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、ペクチン酸リアーゼＢリーダー配列に融合される。
【００３３】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを３〜３０回含む。
【００３４】
別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを３〜３０回含み、それらの繰り返しは、最高６個のアミノ酸によって互いに分離される。
【００３５】
別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを３〜３０回含み、それらの繰り返しは近接している。
【００３６】
別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを少なくとも９回含み、それらの繰り返しは、最高６個のアミノ酸によって互いに分離される。
【００３７】
別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを少なくとも９回含み、それらの繰り返しは近接している。
【００３８】
別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しをおよそ９回含み、それらの配列番号１の９回の繰り返しは近接している。別の実施形態では、それらの配列番号１の９回の繰り返しは、最高６個のアミノ酸によって互いに分離される。
【００３９】
約９のＮ結合型グリコシル化シークオンを含むＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、グリカン構造の完全な、もしくはほぼ完全な相補体を晒し、それによって単一タンパク質またはペプチド内で多数のグリカン残基を効果的に晒すことが、現在では決定されている。配列番号１に記載のアミノ酸配列の繰り返しを９回含むＧｌｙｃｏＴａｇペプチドのグリコシル化は、各々０〜９のグリカン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて示すように）を含むグリコシル化ペプチドの混合物を生成することができる。
【００４０】
一例において、異なるグリカン構造をＧｌｙｃｏＴａｇペプチドに添加することができる。例えば、異なるグリカンをグリコシル化部位上に添加するには、異なるグリカンを大腸菌内の異なるグリコシル化経路を用いて達成することができる。特定の一例では、ＧｌｙｃｏＴａｇを完全にグリコシル化することは何もできないように、各遺伝子クラスター（異なるグリコシル化経路のための）と関連する誘導可能なプロモーターを用いる。
【００４１】
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの調製
当業者によって容易に認識されるように、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドおよびＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを含むタンパク質は、種々の周知の方法を用いて調製されることができる。
【００４２】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、固体ペプチド合成を用いて、天然源から得られるペプチドを単離して全体的にまたは部分的に合成される。あるいは、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、天然源から得られるペプチドを単離して全体的にまたは部分的に調製される。
【００４３】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化機構を随意に含む宿主細胞において、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを当技術分野で知られている技術を用いて組換え発現させることによって調製される。一実施形態では、宿主細胞は、Ｃ．ジェジュニのｐｇｌ機構を発現するように形質転換されている大腸菌である（Wacker Mら, 2002: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298(5599): 1790-3）。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードする核酸配列の宿主細胞への導入のためのキメラ遺伝子とベクターとの、好ましくは安定な構築物は通常、糖技術分野では知られている。キメラ遺伝子を生成するために、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードする核酸配列は、標準の分子生物学的技術を用いて、宿主細胞内での発現に好適なプロモーター配列に作用可能に連結される。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチド核酸配列がプロモーター配列の下流のベクターに簡単に挿入されるようにするには、このプロモーター配列がベクター内にすでに存在していてもよい。次いで、このベクターを用いて、宿主細胞を形質転換し、そのキメラ遺伝子は核ゲノム内にまたはプラスミド中に挿入されて、好適なプロモーターを用いてそこで発現される。一実施形態では、キメラ遺伝子は、微生物細胞（例えばバクテリア）内での発現のために好適なプロモーターと、それに作用可能に連結された本明細書に記載のＧｌｙｃｏＴａｇペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む。
【００４４】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするために、親和性タグに融合される。一実施形態では、親和性タグは、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドのＮ末端に融合される。一実施形態では、親和性タグは、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドのＣ末端に融合される。もちろん、当業者が認識するように、検討される親和性精製の種類に応じて、多種多様な異なる親和性タグが用いられることができる。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの精製を補助するのに用いられることができる親和性タグの具体例としては、エピトープタグ（クロマトグラフィータグ）、およびより具体的には、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグと呼ばれることもある）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを使用する方法および系
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、多種多様な異なる用途で用いられることができる。一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、ワクチン製剤のアジュバントとして用いられることができる。もちろん、当業者が認識するように、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、意図される用途に応じて、異なるＮ−グリカンを保有するように設計されることができる。
【００４６】
一実施形態では、特異的グリカンでグリコシル化される場合、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、カンピロバクターウプサリエンシス（ネコおよびイヌにおける）、カンピロバクターコリー（ブタにおける）およびカンピロバクタージェジュニ（ニワトリにおける）などの動物由来感染症のヒト病原体に対するワクチン接種のためのグリカンキャリアとして用いられることができる。別の例として、これも限定することを意図しないが、特異的グリカンでグリコシル化されたＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを用いて、ヒトに旅行者下痢症（カンピロバクタージェジュニ）に対するワクチン接種することができ、および不妊症および流産（カンピロバクター・フィタス・ペネレアリスおよびカンピロバクター・フィタス・フィタス）を予防するために、ウシおよびヒツジにワクチン接種することができる。
【００４７】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、当技術分野で知られている技術を用いて、受容体タンパク質、ペプチドまたは抗体によって組換えで同時発現させることができる。受容体タンパク質、ペプチドおよび抗体としては、毒素、トキソイド、周辺質タンパク質、抗体と樹状細胞標的抗体が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、タンパク質はＡｃｒＡである。一実施形態では、毒素は百日咳菌、破傷風菌またはジフテリア菌によって発現される毒素から選択されることができる。もちろん、多くの他の例があり得る。受容体タンパク質、ペプチドまたは抗体とのＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの同時発現は、カンピロバクターもしくは他の細菌に対するワクチンまたは有効性が向上したワクチンを含むさまざまな有用な医薬品の調製のための基礎としての役割を果たすことができるので、これは特に有利になり得る。一例では、これも限定することを意図しないが、特異的グリカンでグリコシル化され、かつ他のタンパク質およびペプチドによって同時発現される場合、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、カンピロバクターウプサリエンシス（ネコおよびイヌにおける）、カンピロバクターコリー（ブタにおける）およびカンピロバクタージェジュニ（ニワトリにおける）などの動物由来感染症のヒト病原体に対するワクチン接種のためのグリカンキャリアとして用いられることができる。別の例として、これも限定することを意図しないが、他のタンパク質およびペプチドと、特異的グリカンでグリコシル化されたＧｌｙｃｏＴａｇペプチドとの同時発現を用いて、旅行者下痢症（カンピロバクタージェジュニ）に対するワクチン、ならびにカンピロバクター・フィタス・ペネレアリスおよびカンピロバクター・フィタス・フィタスに対するワクチンを調製することができる。
【００４８】
本発明の一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇを受容体タンパク質、ペプチドまたは抗体と融合させて、大腸菌または別の発現生物体の周辺質にこの融合物を向かわせるまたは該周辺質に対して融合物を標的にすることができる。多価のＧｌｙｃｏＴａｇは、標的タンパク質中にさらなるＮ−グリカン受容体配列を操作する必要もなく、複数コピーで種々のグリカン構造をタンパク質キャリアまたはペプチドキャリアに高密度で付着する有利性がある。それは、複数のＮ−グリカン構造を示すことができるタンパク質およびペプチドの組換え発現を可能にするので、これは、特に有利になり得る。当業者が認識するように、多種多様なキャリアペプチドおよびキャリアタンパク質は、ＧｌｙｃｏＴａｇｔｐとの融合に好適である。これらとしては、毒素、トキソイド、周辺質タンパク質、抗体および樹状細胞標的抗体が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、タンパク質はＡｃｒＡである。一実施形態では、毒素は百日咳菌、破傷風菌またはジフテリア菌によって表される毒素から選択されることができる。もちろん、多くの他の例があり得る。キャリアタンパク質に融合したＧｌｙｃｏＴａｇは、カンピロバクターに対するワクチンおよび有効性が向上したワクチンを含むさまざまな有用な医薬品のための基礎としての役割を果たすことができるので、これは特に有利になり得る。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、アジュバントを含まない組成物でさえも用いられることができる。一例では、これも限定することを意図しないが、特異的グリカンでグリコシル化された場合、ＧｌｙｃｏＴａｇは、カンピロバクターウプサリエンシス（ネコおよびイヌにおける）、カンピロバクターコリー（ブタにおける）およびカンピロバクタージェジュニ（ニワトリにおける）などの動物由来感染症のヒト病原体に対するワクチン接種のためのグリカンキャリアとして用いられることができる。別の一例として、これも限定することを意図しないが、特異的グリカンでグリコシル化されたＧｌｙｃｏＴａｇを用いて、ヒトに旅行者下痢症（カンピロバクタージェジュニ）に対するワクチン接種することができ、ならびに不妊症および流産（カンピロバクター・フィタス・ペネレアリスおよびカンピロバクター・フィタス・フィタスを予防するために、ウシおよびヒツジにワクチン接種することができる。容易に認識されるように、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、任意の病原体免疫原性糖質エピトープ用のワクチンの調製で用いられることができる。別の非限定例では、好適にグリコシル化されたＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、口腔病原体（Ｃ．レクタス）に対するワクチンの製造で用いられることができる。
【００４９】
当業者が認識するように、ＧｌｙｃｏＴａｇをタンパク質またはペプチドに融合することができる方法は、いろいろとある。ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、タンパク質グリコシル化機構をコードする遺伝子の存在下で、ＧｌｙｃｏＴａｇ上の各部位のＮ−グリコシル化をもたらす大腸菌などの選択された発現ベクター生物体の周辺質を標的にすることができるタンパク質に直接またはリンカーを介して融合されることができる。
【００５０】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇ融合ペプチドもしくはタンパク質、またはキメラタンパク質は、第２のペプチドまたはタンパク質のコード配列に作用可能に連結されたＧｌｙｃｏＴａｇペプチドのコード配列を含むキメラ遺伝子の発現から調製される。したがって、そのようなキメラ遺伝子と、宿主生物体におけるキメラ遺伝子の宿主生物でキメラ遺伝子の発現のためにそのようなキメラ遺伝子の発現のための適切な配列とを含むベクターも提供される。
【００５１】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドとタンパク質との間の融合物には、アフィニティークロマトグラフィーによって精製を容易にするための親和性タグを含み得る。もちろん、当業者が認識するように、検討される親和性精製の種類に応じて、多種多様な異なる親和性タグが用いられることができる。さらに、融合産物の性質によって、親和性タグは、Ｎ末端またはＣ末端に置かれ得る。
【００５２】
一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを修飾して、ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の存在下で発現するいかなる脂質結合糖質を付着することができる。
【００５３】
別の実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、診断アッセイ方法または診断アッセイ系で用いられる。この実施形態の一例では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、感染性細菌に特有の特異的グリカンを示すように設計される。次いで、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを免疫アッセイで用いて、感染性細菌に対して作られた抗体を検出して、任意に定量化することができる。免疫学的方法では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを、細菌感染症を有するのではないかと疑われる対象からの生体試料と接触させて、その混合物をインキュベートして、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドと、試料中に存在する示されるグリカンに特異的な抗体との間に結合複合体を形成させる次いで、結合複合体は、標準方法を用いて検出され、任意に定量化される。当業者によって認識されるように、このアッセイは、免疫アッセイに関して種々の周知の技術を用いて、行われ得る。一実施形態では、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、生体試料との接触の前に、固体支持体上に固定化される。固体支持体は、例えば、マイクロタイタープレート、ポリマービーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズまたは膜であり得る。
【００５４】
別の態様によると、上述のグリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドと、グリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドおよび該グリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの抗原成分に対応する細菌抗原に特異的な抗体によって形成される結合複合体の検出用試薬とを含むイムノアッセイキットが提供される。このイムノアッセイキットは、使用説明書および／または細菌感染症を有するのではないかと疑われる対象からの試料を採取する容器もしくは別の手段をさらに含み得る。
【００５５】
本発明がより十分に理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例証目的だけのためであり、本発明の範囲を多少なりとも限定すると解釈されてはならない。さらに、これらの実施例は、当業者にとって明白である本発明の均等物および変形例を排除することを意図しているものではない。
【実施例】
【００５６】
実施例１：ＧｌｙｃｏＴａｇ／ＡｃｒＡ融合タンパク質の調製
２つのＮ−グリコシル化シークオンを天然に有するカンピロバクター・フィタス・フィタス（ＡｃｒＡＣｆｆ）をタンパク質キャリアとして用いた。大腸菌ＢＬ２１内でＣ．フィタス・フィタスのＡｃｒＡ遺伝子を発現させるために、分泌（Ｓｅｃ）経路を介してタンパク質を細胞膜周辺腔に向けるためのプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen）上のペクチン酸リアーゼＢ（ｐｅｌＢ）リーダー配列を用いて、プラスミドを構築した。したがって、プライマーＡｃｒＡＣｆｆ−ＮｃｏＩ（５’−ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＣ−３’［配列番号３］）およびＡｃｒＡCｆｆ−ＸｈｏＩ（５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＴＡＴＣＧ−３’［配列番号４］）を用いて、Ｃ．フィタス・フィタス８２−２０由来の染色体ＤＮＡからのＡｃｒＡ遺伝子のヌクレオチド６７〜１０５２を増幅し、一方ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩのための制限酵素部位（下線で示す）を同時に導入した。このＰＣＲ産物を、同じ制限酵素で消化させたプラスミドｐＥＴ２２ｂに挿入した。ＡｃｒＡタンパク質は、天然の宿主における周辺質タンパク質であり、およびＣ．ジェジュニタンパク質グリコシル化オペロンの存在下で大腸菌ＢＬ２１内で発現すると（ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭでの誘導の後、図７Ｃ、レーン１））、Ｎ結合型グリコシル化の標的でもある.
【００５７】
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチド配列は、以下の通りに調製した：Ｃｊ１４３３ｃンパク質［配列番号２］のＮ末端をコードするＤＮＡ配列、ＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴ  ＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡ  ＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡ  ＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡ  ＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＴＴＡＴＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩのための制限酵素部位は、太文字で示す）は、ゲノム配列決定株カンピロバクタージェジュニ１１１６８（Parkhill Jら, 2000: The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hyper-variable sequences. Nature, 403(6770): 665-668）の染色体ＤＮＡからの遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（１４３３ｃ−ＸｈｏＩ−１：５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣ−３’［配列番号５］および１４３３ｃ−ＸｈｏＩ−２：５’−ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧ−３’［配列番号６］）を用いるＰＣＲで生成した。消化したＤＮＡ断片をフレーム単位で、Ｎ末端（構築物１、図４［配列番号７］）に、Ｃ末端（構築物２、図４［配列番号８］に）、およびＡｃｒＡＣｆｆコード配列（構築物３、図４［配列番号９］）のヌクレオチド４５７位でＣ．フィタス・フィタスＡｃｒＡタンパク質（ＡｃｒＡＣｆｆ）のリポイル−ドメインとα−ヘアピンドメインの間（Symmons Mら, 2009: The assembled structure of a complete tripartite bacterial multidrug efflux pump. PNAS, 106(17): 6893-6894に記述されるように）に融合させた。構築物１の場合、上記のＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ部位を通して導入した。構築物２の場合、上記のＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ部位を通して導入した。構築物３の場合、上記のＰＣＲ産物をＮｈｅＩ部位を通して導入した。それぞれの部位へのＰＣＲ産物の正しい挿入は、ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。融合タンパク質（構築物１、２および３）は、以下の通りに大腸菌ＢＬ２１発現系で発現させた。０．６のＯＤ６００で（３７℃での増殖後）、培養物を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導して、細胞を同じ温度でさらに１時間増殖させた。培養物を氷上で１５分間冷却して、細胞を遠心（４℃、１０，０００ｒｐｍで１５分間）によって収集し、１培養液量の氷冷ＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄して、最終的に、最初の培養液量の１／２０に再懸濁させた。細胞は、超音波処理（１分間のパルスを３回）によって破壊して、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心させた。Ｔｈｅ  ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Qiagen）を用いて上清からＨｉｓタグ付きタンパク質を精製した。続いて、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製したタンパク質の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥで行い、ウエスタンブロット分析を、ヘキサヒスチジンタグ（Santa Cruz Biotech Inc.）に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて行った。ヘキサヒスチジンタグに特異的なウ��スタンブロットは、構築物２だけが約５５ｋＤａ（図５、レーン２）の正しい大きさでタンパク質の過剰発現をもたらしたことを示した。Ｎ末端（構築物１）、Ｃ末端（構築物２）およびドメイン間（構築物３）のＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質の推定アミノ酸配列をそれぞれ、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示す。
【００５８】
実施例２：大腸菌ＢＬ２１でのＧｌｙｃｏＴａｇ／ＡｃｒＡ構築物２の発現
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ｐＡＣＹＣ（ｐｇｌ−Ｃｊ））上に位置したＣ．ジェジュニグリコシル化機構の存在下で、大腸菌ＢＬ２１での発現（Wacker Mら, 2002: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298(5599): 1790-1793）は、Ｃ末端ＡｃｒＡ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質の可溶性で周辺質の発現をもたらした。この融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製して、ヘキサヒスチジン（Santa Cruz Biotechnology Inc.）に対して特異的なモノクローナル抗体と、Ｃ．ジェジュニＮ−グリカン特異的抗血清（ｈＲ６）とを用いてウエスタンブロット法で試験した。図７Ｂおよび７Ｃは、ｈＲ６と抗ヘキサンヒスチジン（抗Ｈｉｓ）によるウエスタンブロット分析結果を示す。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１のＮ−グリカンが付着した融合タンパク質が観察されたので、部位占有の混合が生じる。図７Ｄに示すように、Ｃ．ジェジュニヘプタサッカリドが１１付着した（ＡｃｒＡの本来の部位に２、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの部位に９）キメラ糖タンパク質を検出することができた。この結果は予想外のものであった。特定のタンパク質構造は、グリコシル化の効率を向上させることが以前に提唱されていたが、本実施例では、Ｎ結合型グリコシル化シークオン（ＤＬＮＮＴ）は、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドにおいてわずかに２つのアミノ酸（ＫＩ）によって分離されたからである。
【００５９】
実施例３：ＧｌｙｃｏＴａｇトキソイド融合タンパク質の調製
実施例１に記述したように調製した配列番号１のＧｌｙｃｏＴａｇ配列を、百日咳菌（ｐｔｘＡ，Ｎ末端、ｎｔ１〜５３７）、破傷風菌（ｔｅｔ、Ｃ末端、ｎｔ２５６６〜３９４５）およびジフテリア菌ＮＣＴＣ（ｔｏｘＣｄ、ｎｔ７９〜６５４）の免疫賦活トキソイドの遺伝子産物のＮ末端およびＣ末端に融合させた（図８Ａ）。ＰＣＲ産物は、以下のトキソイド遺伝子特異的オリゴヌクレオチドで生成し、一方制限酵素部位を挿入した（ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ）：
【００６０】
【表１】
2013539963.tif 000003
【００６１】
Aminianら (2007)によって記述されたプラスミドはＰＣＲ反応に対する鋳型としての役割を果たす（Aminianら, 2007: Expression and purification of a trivalent pertussis toxin-diphtheria toxin-tetanus toxin fusion protein in Escherichia coli. Protein Expr Purif, 51(2): 170-178）。得られたＰＣＲ産物を、Ｎ末端またはＣ末端のＧｌｙｃｏＴａｇ  ＡｃｒＡＣｆｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現しているプラスミドに導入した。したがって、ヘキサヒスチジンコード配列により近いＸｈｏＩ制限酵素部位およびｐｅｌＢリーダーペプチドをコードする配列により近いＮｃｏＩ部位を、以下のオリゴヌクレオチドによるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Stratagene）を用いるquick change変異誘発によって除去した：
【００６２】
【表２】
2013539963.tif 000004
【００６３】
Ｎ末端ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質またはＣ末端ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードするプラスミドは、鋳型としての役割を果たした。
【００６４】
その後、Ｃ末端またはＮ末端のヘキサヒスチジンタグ付きＧｌｙｃｏＴａｇ−毒素遺伝子構築物のいずれかを作製するために、ＡｃｒＡＣｆｆタンパク質のコード配列をＰＣＲ増殖毒素遺伝子と交換して（上述のように）、ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩを通して挿入した。
【００６５】
融合タンパク質の発現、大腸菌の細胞膜周辺腔への分泌およびＮ−グリコシル化を上述のように分析した。異種大腸菌タンパク質グリコシル化系（上記を参照されたい）における発現、親和性タグ（上記を参照されたい）、およびグリコシル化によって、Ｃ末端ｐｅｌＢ−ｔｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−ヘキサヒスチジン構築物を実証し得る（図８Ｃおよび８Ｄ）。この場合もやはり、１、２、３、４、５、６、７、８および９のＮ−グリカンが付着した融合タンパク質が観察されたので、部位占有の混合が生じる（図８Ｃおよび８Ｄ）。興味深いことに、Ｎ−グリカンキャリアペプチドは、構築物の価数を増加させる融合で二量体形成を誘導すると思われる。
【００６６】
実施例４：１つのトキソイドタンパク質に融合した２つのＧｌｙｃｏＴａｇペプチドの調製
ＴｏｘＣＣｄ−（ＧｌｙｃｏＴａｇ）２融合タンパク質（図９Ａ）を作製するために、 配列番号１０の第２のＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを、実施例３で作製したＴｏｘＣＣｄ融合タンパク質に付着させた。したがって、Ｃ末端ｐｅｌＢ−ＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードするプラスミドのｈｏｌ消化後に得られた２５８ｂｐのゲル精製ＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ消化したＣ末端ｐｅｌＢ−ＴｏｘＣＣｄ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードするプラスミドに挿入した。第２のＧｌｙｃｏＴａｇをコードするＤＮＡ配列の位置付けを、ヘキサヒスチジンをコードするプラスミドＤＮＡ配列内のハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドよって配列決定するＤＮＡで確認した。Ｃ．ジェジュニのＮ−グリカンによる発現とグリコシル化（Ｃ．ジェジュニタンパク質グリコシル化機構をコードするプラスミドの存在下で）およびＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを上述のように行った。Ｎ−グリカン特異的抗血清（ｈＲ６）を用いるウエスタンブロット法による分析で、最高１８のＣ．ジェジュニＮ−グリカンが付着したタンパク質が得られた。しかし、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８のＮ−グリカンが付着した融合タンパク質が観察されたので、部位占有の混合が生じる。
【００６７】
実施例５：ＧｌｙｃｏＴａｇ／抗体融合タンパク質の調製
実施例１に記述したように調製した配列番号１０のＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードする配列を、樹状細胞（ＤＣ）のＤＥＣ−２０５受容体を認識し、かつ上述のように大腸菌ＢＬ２１内で発現し得る（図８Ｂ）一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＣ末端およびＮ末端で融合した（Wang WWら. 2009: A versatile Afunctional dendritic cell targeting vaccine vector. Mol Pharm, 6(1): 158-172）。したがって、ＰＣＲ産物は、特異的オリゴヌクレオチドで生成し（Ａｂ−１４３３−ＸｈｏＩ５’−
ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣ−３’［配列番号２１］、ｐＥＴ−Ｐｓｔｌ５’−
ＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧ−３’［配列番号２２］プラスミドｐＷＥＴ７とともに；Ａｂ−１４３３−ＮｃｏＩ，
５’−ＡＴＡＴＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣ−３’［配列番号２３］およびｐＥＴ−ＫｐｎＩ  ＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧ−３’[配列番号２４] プラスミドｐＷＥＴ５とともに）、該オリコヌクレオチドは、プラスミドｐＷＥＴ７から（Ｃ末端ｓｃＦｖＤＥＣ２０５−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合を作製するために）およびプラスミドｐＷＥＴ５から（Ｎ末端ｓｃＦｖＤＥＣ２０５−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合を生成するために）ｓｃＦｖ−ＤＥＣ２０５遺伝子を増殖する（Wang WWら, 2009: A versatile bifunctional dendritic cell targeting vaccine vector. Mol Pharm, 6(1): 158-172）。トキソイド−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の作製について上述したものと同様の戦略を適用して、ＡｃｒＡＣｆｆコードＤＮＡ配列をｓｃＦｖＤＥＣ２０５コードＤＮＡ配列と交換した。異種大腸菌タンパク質グリコシル化系において、Ｃ末端ｐｅｌＢ−ｓｃＦｖＤＥＣ２０５−ＧｌｙｃｏＴａｇ−ヘキサヒスチジン構築物の発現（上述のように）、親和性タグ精製（上述のように）およびグリコシル化を行うことができた（図８Ｅおよび８Ｆ）。この場合もやはり、１、２、３、４、５、６、７、８および９のＮ−グリカンが付着した融合タンパク質が観察されたので、部位占有の混合が生じる。
【００６８】
樹状細胞（ＤＣ）に対するＮ−グリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを直接的に標的とする目的は、必要な抗原の量を減らし、かつ免疫刺激のためのアジュバント必要性を排除することである。ＤＣは免疫系の抗原提示細胞であり、自然免疫応答および適応免疫応答で、特に、Ｔ細胞およびＢ細胞の免疫を予備刺激するまたは活性化する際に、重要な役割を担う。
【００６９】
実施例６：ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質によるマウスの免疫化
各々５匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを含む６群を、表１に記載の精製したＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質で免疫化した。
【００７０】
【表３】
2013539963.tif 000005
【００７１】
１〜６群のマウス血清（標準手順を用いて単離した）において続いて起きた体液性（抗体）応答は、Ｎ−グリカン特異的抗体が２、３、４、５群で、かつ２＞４＞３＞５の順で産生したことを示した。Ｎ−グリカンに対する体液性応答は、１群および６群では観察されなかった（図１０）。
【００７２】
実施例７：精製したＧｌｙｃｏＴａｇによるマウスの免疫化
各々５匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを含む７群を、表２に記載の精製したＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質で免疫化した。
【００７３】
【表４】
2013539963.tif 000006
【００７４】
２１日目（図１１Ａ）および３５日目（図１１Ｂ）の１〜６ｖ群のマウス血清（標準手順を用いて単離した）において続いて起きた体液性（抗体）応答は、Ｎ−グリカン特異的抗体が３、５および７群で、かつ３＞５＝７の順で産生したことを示した。Ｎ−グリカンに対する有意な体液性応答は、１、２、４および６群で観察されなかった。
【００７５】
興味深いことに、ＧｌｙｃｏＴａｇ単独での使用が、ＧｌｙｃｏＴａｇをトキソイドに結合した時よりも強い抗体応答を誘導したことをこれらの結果は実証している。
【００７６】
実施例８：ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質によるニワトリの免疫化
各々８羽のニワトリを含む８群を、以下の通り精製されたＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質で免疫化した：０日目、すべてのニワトリ（５羽を無作為に選んだ）の１０％の盲腸スワブは、微好気的条件下での２日間のインキュベーションの後、Ｋａｒｍａｌｉ選択的寒天プレート上に播種したとき、カンピロバクターによるコロニー形成を示してなかった。７日目、５００μＬの事前採血を各ニワトリから採取し、その後に（無菌ＰＢＳ中で調製した抗原をフロイント完全アジュバントと１：１の比で用いて）筋肉内（ＩＭ）に２回の注射によって（異なる部位に１５０μＬ）、または経口（Ｏ）投与によって投与し、各ニワトリに対して総量３００μＬで５μｇの抗原による１回目の抗菌処置を行った（表３）。２１日目、試験採血を行い、その後に、同じ抗原製剤だが、フロイトン完全アジュバントをフロイトン不完全アジュバントと置換して用いて２回目の抗菌処置を行った。２８日目、２〜８群内のニワトリに、カンピロバクタージェジュニ（無菌ＰＢＳ中で調製した１．５×１０＊８細胞）を強制経口投与（抗原投与）した。３５日目、ニワトリを安楽死させて、血液試料を各ニワトリから採取し（最終採血）、次いで盲腸内容物の１０倍段階希釈液（１０＊−２〜１０＊−１０）をＫａｒｍａｌｉ選択的寒天プレート上に播種することによって各ニワトリの盲腸内のカンピロバクターの量を分析してコロニー形成レベルを決定した。微好気的条件下での２日間のインキュベーションの後、カンピロバクターのコロニーの形成を記録した（図１２Ａ）。ＴｏｘＣ−ＧＴｌ、１−９Ｃ．ジェジュニ（Ｃｊ）−グリカン（ＩＭ）およびマイクロカプセル化（ＭＣ）ＴｏｘＣ−ＧＴ１、１−９Ｃｊ−グリカン（Ｏ）によるワクチン接種後、カンピロバクタージェジュニのコロニー形成レベルの減少が得られた。血清（標準手順を用いて単離した）において続いて起きた体液性（抗体）応答は、Ｎ−グリカン特異的抗体が４群および５群のニワトリにおいて産生したことを示した。Ｎ−グリカンに対する体液性応答は、１群のニワトリの血清プールで観察されなかった（図１２Ｂ）。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
キトサン（ＣＳ）をベースにしたナノ粒子を使用しているマイクロカプセル化抗原（ＭＣ）を、記述されるように（Makhlof A., Tozuka Y., and Takeuchi H., 2011:Design and evaluation of novel pH-sensitive chitosan nanoparticles for oral insulin delivery, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 42(5), 445-451）ポリアニオントリポリリン酸（ＴＰＰ）を用いた正に荷電したＣＳの高分子電解質複合体形成によって調製した。
【００７９】
実施例９：ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質によるニワトリの用量依存的免疫化
各々８羽ニワトリを含む８群を、１−９Ｃｊ−グリカンを保有する精製したＧｌｙｃｏＴａｇ融合ＴｏｘＣ−ＣＴｌタンパク質を以下の通り筋肉内注射で免疫化した：各々８羽のニワトリを含む８群を、（表４）に記載の精製したＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質で免疫化した。０日目、すべてのニワトリ（５羽を無作為に選んだ）の１０％の盲腸スワブは、微好気的条件下での２日間のインキュベーションの後、Ｋａｒｍａｌｉ選択的寒天プレート上に播種したとき、カンピロバクターによるコロニー形成を示してなかった。７日目、５００μＬの事前採血を各ニワトリから採取し、その後に（無菌ＰＢＳ中で調製した抗原をフロイント完全アジュバントと１：１の比で用いて）筋肉内（ＩＭ）に２回の注射によって（異なる部位に１５０μＬ）投与し、各ニワトリに対して総量３００μＬでの抗原による１回目の抗菌処置を行った（表３）。２１日目、試験採血を行い、その後に、同じ抗原製剤だが、フロイトン完全アジュバントをフロイトン不完全アジュバントと置換して用いて２回目の抗菌処置を行った。２８日目、２〜８群内のニワトリに、カンピロバクタージェジュニ野生型（１０＊２または１０＊６）を強制経口投与（抗原投与）した。３５日目、ニワトリを安楽死させて、血液試料を各ニワトリから採取し（最終採血）、次いで盲腸内容物の１０倍段階希釈液（１０＊−２〜１０＊−１０）をＫａｒｍａｌｉ選択的寒天プレート上に播種することによって各ニワトリの盲腸内のカンピロバクターの量を分析してコロニー形成レベルを決定した。微好気的条件下での２日間のインキュベーションの後、カンピロバクターのコロニーの形成を記録した（図１３）。
【００８０】
【表６】
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【００８１】
カンピロバクター抗原投与用量依存的様式で、ＴｏｘＣ−ＧＴ１、１−９Ｃｊ−グリカン（ＩＭ）によるワクチン接種後、カンピロバクターのコロニー形成レベルの減少が得られた。
【００８２】
実施例１０：精製したＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の調製
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号１０）を含むＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＣＳ４９２（５’−ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’［配列番号２５］）およびＣＳ４９１（５’−ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧ−３’[配列番号２６]）を使い、プラスミドＡｃｒＡＣｆｆ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓを鋳型として用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Stratagene）でＸｈｏＩ部位を除去して、増幅した。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化させて、ＳａｌＩ−消化ｐ２ｘプラスミド（New England Biotech）と結合させた。挿入物の正しい位置づけを、ＣＳ４９１を有する産物の配列決定によって確認した。
【００８３】
大腸菌内でプラスミドｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ（New England Biolabs）上に位置するＩＰＴＧ誘導可能なｐｔａｃプロモーターからのＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の転写は、ＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の周辺質発現をもたらす（配列番号２７）。
【００８４】
大腸菌内での過剰発現の後、以下の組み合わせを用いてＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質を精製することができる：ｉ）アミロースアフィニティークロマトグラフィー；ｉｉ）ＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質のタンパク質切断（例えば、第Ｘａ因子による）；およびｉｉｉ）分子ふるいクロマトグラフィー。すべての場合において、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、純粋な形で得られる。
【００８５】
実施例１１：ＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質を用いるＧｌｙｃｏＴａｇの調製
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号１０）を含んでいるＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＣＳ４９２（５’−ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’［配列番号２８］）およびＣＳ４９４（５’−ＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧ−３’ [配列番号２９）を使って、プラスミドＡｃｒＡＣｆｆ−ＧＴ−Ｈｉｓ−（quick change mutagenesisによってＸｈｏＩを除去）を鋳型として用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させて、ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２Ｘと結合させた。
【００８６】
大腸菌内でプラスミドｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ上に位置するＩＰＴＧ誘導可能なｐｔａｃプロモーターからのＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質の転写は、ＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ−Ｈｉｓ融合タンパク質の周辺質発現をもたらす（配列番号３０、図１４）。
【００８７】
カンピロバクタージェジュニグリコシル化オペロンの存在下または非存在下で、大腸菌内での過剰発現の後、以下の組み合わせを用いてＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質を精製することができる：ｉ）アミロースアフィニティークロマトグラフィー；ｉｉ）ＭａｌＥ−ＧｌｙｃｏＴａｇ融合タンパク質のタンパク質切断（例えば、第Ｘａ因子による、図１５）；およびｉｉｉ）分子ふるいクロマトグラフィー、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー、またはゲル上での分離後の電気溶出。すべての場合において、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは、純粋な形で得られる。
【００８８】
実施例１２：ワクチンとしてのＧｌｙｃｏＴａｇ
付着オリゴ糖に対する免疫原性の研究において、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをオリゴ糖キャリアペプチドとして用いることができる。グリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇを免疫賦活性タンパク質（毒素）に融合することができ、付加的なアジュバントの必要性が排除されることになる。グリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを、種々の種／用途用の好ましい／標準化されたアジュバントと組み合わせて投与することができる。必要に応じて、糖が何も付着してない、または１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９の糖が付着したＧｌｙｃｏＴａｇトペプチドの混合物（図７Dに見られる）として存在する複数のグリシル化ＧｌｙｃｏＴａｇの化学的消化またはタンパク質消化後に純粋なグリコシル化ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドを得ることができる。
【００８９】
ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドをグリコシル化することで、化学的切断またはタンパク質切断からの防御をもたらす。アミノ酸繰り返し（配列番号１）に付着されるオリゴ糖は、プロテアーゼトリプシンによって切断を防ぐ。プロテアーゼへの曝露後、非グリコシル化されたまたは不完全にグリコシル化されたＧｌｙｃｏＴａｇペプチドは切断されたのに対して、ＧｌｙｃｏＴａｇペプチドのグリコシル化された部分は、インタクトのままであったことが観察されたことで、この性質が確認された。
【００９０】
本明細書で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関係する分野の当業者の技術レベルを示しており、各個々の刊行物、特許、および特許出願が具体的にかつ個々に参照によって組み込まれることを示されているように、同じ範囲まで参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本発明についてこのように説明してきたが、本発明が多くの方法で変化し得ることは、明らかであろう。このような変化は、本発明の精神および範囲からの逸脱とは見なされるべきではなく、当業者にとって明らかであるこのようなすべての変更は次の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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