(57)【要約】  ４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンからなる群から選択される１種以上のオルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有する皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用組成物が開示される。前記組成物は、皮膚角質幹細胞の増殖を誘導して、皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善効果を示し、これを通じて化粧品又は医薬分野において多様に活用可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンからなる群から選択される１種以上のオルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有する皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用組成物。
【請求項２】
前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、皮膚角質幹細胞の増殖を通じて、皮膚の再生力を向上又は皮膚の弾力を改善させる、請求項１記載の皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用組成物。
【請求項３】
前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体の含量は、組成物全体の重量を基準として、０．００１〜３０重量％である、請求項１記載の皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用組成物。
【請求項４】
前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、ＦＺＤ１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）の発現を増加させる、請求項１記載の皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む化粧料組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む、皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間の皮膚角質幹細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ＫＳＣ）の増殖効果があるオルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の最も重要な役割は、外部の損傷及び細菌の侵入から人体を保護する防御障壁の役割をすることと共に、内部からの熱や水分の損失を防止することである。皮膚は、構造的に、大きく、表皮及び真皮を含み、表皮は平らな六角形の形の死んだ細胞から構成された角質層（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｃｏｒｎｅｕｍ）と、生きている表皮に分けることができる。
【０００３】
生きている表皮は、基底層（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｂａｓａｌｅ）、有棘層（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、顆粒層（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）、及び透明層（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｌｕｃｉｄｕｍ）の４つの層を含む。このうち、基底層に皮膚角質幹細胞が位置しており、皮膚角質幹細胞が持続的に分裂して遷移増幅（Ｔｒａｎｓｉｔ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，  ＴＡ）細胞を作ることになる。これらの細胞は数回の分裂を行い、皮膚発生学的に中／後半部に該当する、皮膚障壁機能に中枢的な役割をする角質細胞を形成する。角質細胞は、分化を進行して、皮膚発生学的に最終段階である、皮膚表面へ押し上げられていくことになる。この過程において、角質細胞の分化と角化が起こりつつ角質層を作ることになり、結局は、角質細胞は角質層から剥がれ落ちる。
人間は、年を取るにつれ、こうした皮膚角質幹細胞や遷移増幅細胞を増殖する能力が低下する。角質細胞を作る能力が低下すると、結局のところ皮膚再生能力が減退して、皮膚の弾力低下等の老化現象が深化する（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｕｃｈｓ  Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００７  Ｆｅｂ  ２２；  ４４５（７１３０）：８３４〜４２
【非特許文献２】Ｌｉ  Ａ，  Ｋａｕｒ  Ｐ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；  ２８９：８７〜９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一実施例の目的は、皮膚再生力向上又は皮膚弾力性改善用組成物を提供することである。
本発明の他の一実施例の目的は、皮膚再生力向上又は皮膚弾力改善用化粧料又は薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
こうした目的を達成するために、本発明に係る組成物は、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンからなる群から選択される１種以上のオルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る組成物は、皮膚角質幹細胞の増殖を誘導することにより、皮膚再生力向上及び／又は皮膚弾力改善効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】α６インテグリン（ＦＬ１−Ｈ）とＣＤ７１（ＦＬ３−Ｈ）がそれぞれ発現する量の差（蛍光の強さ）を示す細胞の分布図を示したグラフである。
【図２】α６インテグリン（ＦＬ１−Ｈ）とＣＤ７１（ＦＬ３−Ｈ）がそれぞれ発現する量の差（蛍光の強さ）を示す細胞の分布図を示したグラフである。点線のグラフ（緑色で表示）は、図１で得られた細胞分布図を示したもの（陰性対照群）であり、各試験群から得た結果との比較のためのものである。
【図３】α６インテグリン（ＦＬ１−Ｈ）とＣＤ７１（ＦＬ３−Ｈ）がそれぞれ発現する量の差（蛍光の強さ）を示す細胞の分布図を示したグラフである。点線のグラフ（緑色で表示）は、図１で得られた細胞分布図を示したもの（陰性対照群）であり、各試験群から得た結果との比較のためのものである。
【図４】α６インテグリン（ＦＬ１−Ｈ）とＣＤ７１（ＦＬ３−Ｈ）がそれぞれ発現する量の差（蛍光の強さ）を示す細胞の分布図を示したグラフである。点線のグラフ（緑色で表示）は、図１で得られた細胞分布図を示したもの（陰性対照群）であり、各試験群から得た結果との比較のためのものである。
【図５】流細胞分析器の測定結果を例示的に示したものである。
【図６】ＦＺＤ１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）遺伝子の発現量を各実験群別に示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、皮膚再生力向上及び／又は皮膚の弾力改善用組成物に関するもので、オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有することを特徴とする。一実施例において、前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、例えば、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンからなる群から選択される１種以上であってよい。
【００１０】
前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、皮膚角質幹細胞の増殖を通じて、皮膚の再生力を向上させ、皮膚の弾力を改善させる効能が認められる。具体的には、皮膚角質幹細胞は、持続的に分裂して遷移増幅細胞を作るようになる。こうした遷移増幅細胞は、十余回以上の分裂をしながら皮膚の主要細胞の一つである角質細胞となり、分化を通じて皮膚表面へ上がっていくことになる。したがって、皮膚角質幹細胞の増殖を通じて究極的には表皮を再生させる役割をすることになる（非特許文献１）。
【００１１】
一実施例において、前記４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンは、それぞれ次の一般式１〜３のように表すことができる。
【００１２】
【化１】
2013502410.tif 000003
【００１３】
【化２】
2013502410.tif 000004
【００１４】
【化３】
2013502410.tif 000005
本発明に係るオルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンは、当業界に知られている公知の方法で製造することができる。前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、例えば、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を生変換することにより製造することができるが、これに限定されない。
【００１５】
一実施例において、前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、組成物全体の重量を基準として、０．００１〜３０重量％の量で含有していてよい。前記誘導体の含量が０．００１重量％未満であると皮膚角質幹細胞の増殖を通じた皮膚の再生及び弾力の改善の効果を十分に得ることができず、３０重量％を超過すると、効果の増加が大きくないために非効率的であり、剤形安定性に問題が生じ得る。
【００１６】
また、皮膚角質幹細胞と遷移増幅細胞に対する標識マーカー（タンパク質）を同定した。その結果、ＣＤ７１とα６インテグリンを標識マーカーとして確認した。
ＣＤ７１タンパク質（又は、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ受容体）は細胞膜に存在するタンパク質で、細胞血流に乗って流れる鉄分と結合するトランスフェリンタンパク質と相互作用をして、受容体を媒介とするトランスフェリンタンパク質の細胞内取込み（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）という過程を経て細胞内に鉄分を供給する役割をする。鉄分は、普通、毒性を持つため、細胞内の鉄分の量は、ＣＤ７１タンパク質の発現量等を通じて十分に調節されなければならない。
【００１７】
もう一つの標識マーカーとしてα６インテグリンが明らかとされたが、前記標識マーカーのタンパク質が発現していないノックアウトマウスにおいて深刻な皮膚水疱の発生が観察され、出生後すぐに死亡するものと知られている。α６インテグリンは、皮膚角質幹細胞において、主にβ４インテグリン（β  ４  ｉｎｔｅｇｒｉｎ）と結合した状態で、ヘミデスモソームという細胞構造複合体の重要な因子をなしている。α６インテグリンは、細胞間コミュニケーション、細胞移動、増殖、及び分化といった多様な領域の細胞機能に影響を与えるものと知られている。
【００１８】
一般的に、皮膚を作る初期段階（ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ）は、皮膚角質幹細胞と遷移増幅細胞が重要な役割をする。皮膚角質幹細胞では、α６インテグリンの発現は強く、ＣＤ７１タンパク質（又は、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ受容体）の発現は弱いという特徴がある（非特許文献２参照）。また、遷移増幅細胞では、α６インテグリンとＣＤ７１タンパク質（又は、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ受容体）がいずれも強い発現を示す特徴がある。
【００１９】
この他にも、ＦＺＤ１も、皮膚角質幹細胞の標識マーカーとして認識されているが、まだこれらのタンパク質が、これらの細胞においてどのような機能をするかは明らかにされていない。
【００２０】
本発明の実験例等においては、前記α６インテグリン、ＣＤ７１タンパク質及びＦＺＤ１遺伝子等の発現程度を測定することにより、オルト−ジヒドロキシイソフラボンの特定誘導体が、皮膚角質幹細胞の増殖効能があることを確認した。
【００２１】
また、本発明は、前記オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を含有する皮膚外用剤組成物を提供する。一実施例において、オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を含有する皮膚再生力向上及び／又は皮膚弾力改善用化粧料組成物及び薬学組成物を提供する。
【００２２】
本発明による皮膚外用剤組成物は、オイル又は水性媒質から溶液、懸濁液又は乳化液の形態で、又は、使用前に無菌、発熱物質が除去された水に溶かして使用する乾燥粉末の形態で剤形化することができる。油中水型乳化液は、オリーブ油等の植物油又は液状パラフィン等の鉱物性オイルを油相とし、大豆レシチン等の天然リン脂質、及びソルビタンモノオレエート等の無水ヘキシトールや脂肪酸のエステルに由来するもの、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート等の無水ヘキシトールと脂肪酸から由来する部分エステルのエチレンオキサイドと縮合した化合物を乳化剤とし、活性成分を乳化させたのである。
【００２３】
本発明の組成物は、化粧料の形態で剤形化された場合には、皮膚再生力向上及び皮膚弾力改善等を通じた老化防止の目的で使用することができる。前記化粧料の剤形は、特に限定されず、例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、アイクリーム、栄養クリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パウダー、エッセンス、パック、ゲル又は皮膚粘着タイプの化粧料の剤形であってよく、また、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ又はスプレーといった経皮投与型の剤形であってよい。また、各々の剤形において、他の成分をその他化粧料組成物の種類又は使用目的等に応じて当業者が困難なく適宜選定して配合することができる。
【００２４】
本発明はまた、前記組成物を含む薬学組成物を提供する。本発明に係る薬学組成物は、皮膚再生力向上及び／又は皮膚弾力改善用組成物であってよい。具体的には、前記薬学組成物は、皮膚角質幹細胞の増殖を通じて皮膚の再生力を向上させ、皮膚の弾力を改善させる効能が認められる。
【００２５】
本発明に係る組成物を医薬品に適用する場合には、前記組成物を有効成分とし使用される無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は液状の形態で経口投与剤或いは非経口投与剤として剤形化することができる。
【００２６】
前記経口投与のための剤形としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、乳濁剤、シロップ剤、ペレット剤等を挙げることができる。また、前記非経口投与のための剤形としては、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤等を挙げることができる。本発明の有効成分を剤形化するために、界面活性剤、賦形剤、着色料、香辛料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、その他常用する補助剤を適当に使用することができる。
【００２７】
本発明に係る前記薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下等に投与することができる。
また、前記活性成分の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重や、治療する特定疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断に応じて変わり得よう。こうした因子に基づいた投与量の決定は、当業者の水準内にある。一般的な投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜１５００ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。
【００２８】
以下、実施例及び試験例等を通じて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらによって限定されるものではない。
［製造例］大豆抽出物の製造
大豆２ｋｇにヘキサン６Ｌを入れ、常温で３回撹拌抽出して脱脂させた。その次に、脱脂した大豆１ｋｇに８０％メタノール４Ｌを入れて３回還流抽出し、１５℃で１日間浸漬させた。続いて、濾過布濾過や遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離された濾液を減圧濃縮した。得られたエキスを水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍｌで３回抽出した。１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノール抽出物を得、これを少量のメタノールに溶かした後、多量のエチルアセテートを追加した。エチルアセテートの追加により生成された沈殿物を乾燥し、大豆抽出物３００ｇを得た。
【００２９】
［実施例１］大豆抽出物を利用した４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン（４’，６，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）の製造
前記製造例１で収得した大豆抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ  １１８８５を、液体量比５〜１０％で接種した。３７℃で７日間培養させた後に、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン０．２３ｇを得た。
【００３０】
［実施例２］ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）を利用した４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイジン５ｇ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．Ｄ７８０２）を１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ  １１８８５を、液体量比５〜１０％で接種した。３７℃で７日間培養させた後に、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン０．３４ｇを得た。
【００３１】
［実施例３］ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を利用した４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイゼイン３ｇ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．Ｄ７８０２）を１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、培養されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ  １１８８５を、液体量比５〜１０％で接種した。続いて３７℃で７日間培養させた後に反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン０．４５ｇを得た。
【００３２】
［実施例４］大豆抽出物を利用した３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン（３’、４’，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）の製造
前記製造例１で収得した大豆抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ  １１７３２を、液体量比５〜１０％で接種した。３０℃で７日間培養させた後に、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン０．２３ｇを得た。
【００３３】
［実施例５］ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）を利用した３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイジン５ｇ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．３０４０８）を１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ  １１７３２を、液体量比５〜１０％で接種した。３７℃で７日間培養させた後に、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン０．４４ｇを得た。
【００３４】
［実施例６］ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を利用した３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイゼイン３ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ  １１７３２を、液体量比５〜１０％で接種した。３７℃で７日間培養させた後に反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン０．４５ｇを得た。
【００３５】
［実施例７］大豆抽出物を利用した４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン（４’，７，８−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）の製造
前記製造例１で収得した大豆抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ  １１７３２を、液体量比５〜１０％で接種した。３０℃で７日間培養させた後に、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン０．１６ｇを得た。
【００３６】
［実施例８］ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）を利用した４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイジン５ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ  １１７３２を、液体量比５〜１０％で接種した。３７℃で７日間培養させた後に、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン０．５５ｇを得た。
【００３７】
［実施例９］ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を利用した４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイゼイン３ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌した後、３０℃に冷却させた。冷却後、予め培養されたバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ  １１７３２を、液体量比５〜１０％で接種した。３７℃で７日間培養させた後に反応を終了させた。培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて攪拌し（３回）、沈殿した塩を濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン０．４２ｇを得た。
【００３８】
［実験例１］フローサイトメトリー解析を通じた角質細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ＫＳＣ）の測定
人間の皮膚角質細胞（Ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）をロンザ社（Ｌｏｎｚａ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｃ２５０７Ａ）から購入して、２５ｃｍ２  Ｔフラスコに継代培養を行い、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。実験は、細胞の２〜３世代継代培養（ｐａｓｓａｇｅ）後に進行した。
【００３９】
細胞培養液は、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ、Ｉｎｃ．  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）の方法に従い、５００ｍｌのＫＢＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ−３１０３）培地にＫＧＭ−２ビュレットキット（ＫＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）（２ｍｌ）、ヒト表皮成長因子（０．５ｍｌ）、インスリン（０．５ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５ｍｌ）、トランスフェリン（０．５ｍｌ）、エピネフリン（０．５ｍｌ）、ゲンタマイシンスルフェート＋アンホテリシン−Ｂ（ＧＡ−１０００，  ０．５ｍｌ）を入れて使用した。
【００４０】
細胞の継代培養後、２日程度後に、５０％程度の細胞密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が見られれば、血清を欠乏させて（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）、２４時間後、上記においてそれぞれ製造した４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、又は３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンの３種について、それぞれ１０μMの濃度で２４時間処理した。人間の皮膚角質細胞を０．２５％トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）で２５ｃｍ２  Ｔフラスコから分離した後、１，５００ｒｐｍで５分間、細胞を沈めてから培養液を除去した後、３ｍｌのブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）、２％ウシ血清タンパク質（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ＫＧＭ−２）を入れて細胞を懸濁した。４℃で１５分間細胞（約１０６個の細胞）を適応させた後、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）が付着したα６インテグリン（ａｌｐｈａ６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ）抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  ＣＡ，  ＵＳ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．５５５７３５）とＰＥ−Ｃｙ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ｃｙａｎｉｎｅ）が付着したＣＤ７１抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  ＣＡ，  ＵＳ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．５５１１４３）をそれぞれ１０μｌ（１μｇ／μｌ）ずつ入れ、４℃で４５分間反応させた。一方、陰性対照群として使用される細胞には、ＦＩＴＣ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ，  Ｋ  Ｉｓｏｔｙｐｅ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．５５５８４３）と、ＰＥ−Ｃｙ５、マウスＩｇＧ１  Ｋ  Ｉｓｏｔｙｐｅ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．５５５７５０）をやはり１０μｌ（１μｇ／μｌ）ずつ入れ、４℃で４５分間反応させた。
【００４１】
反応が終った後、３ｍｌのウォッシングバッファー（Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：２％ウシ血清タンパク質（ＢＳＡ）ＫＧＭ−２）で２回洗浄した後、細胞を懸濁した。その後、流細胞分析器（ＦＡＣＳ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳ）を通じて分析した。具体的には、流細胞分析器に前記反応した細胞を入れ、コンピュータイメージ像（ＦＡＣＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ）で象限を設定するようになると（非特許文献２参照）、ＣＤ７１タンパク質を弱く、そして、α６インテグリンを強く発現することを特徴とする皮膚角質幹細胞の数の変化が現われるようになり、分離がなされる。例えば、流細胞分析器の測定結果は、図５のように表され得る。図５を参照すると、右上の１象限を基準に、反時計方向に２，３，４象限となる。１象限は、ＣＤ７１とα６インテグリンが強く発現された領域、２象限は、ＣＤ７１は強く発現し、α６インテグリンは弱く発現された領域は、３象限は、ＣＤ７１とα６インテグリンがいずれも弱く発現された領域、そして４象限は、ＣＤ７１は弱く発現し、α６インテグリンは強く発現された領域を示す。
【００４２】
具体的な流細胞分析器の測定結果は、下記の表１に整理した。
【００４３】
【表１】
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また、下記の表２は、陰性対照群（ダイゼイン；Ｄａｉｄｚｅｉｎ）と、４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボンをそれぞれ１０μM処理した後に、ＣＤ７１は弱く発現され、α６インテグリンは強く発現される領域、つまり４象限に該当する角質幹細胞の数及び陰性対照群との対比％を表した結果である。
【００４４】
【表２】
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表２の結果から、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン、又は４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボン１０μMをそれぞれ処理した場合、陰性対照群（ダイゼイン、Ｄａｉｄｚｅｉｎ）に比べて、ＣＤ７１タンパク質は弱く発現され、α６インテグリンは強く発現される皮膚角質幹細胞の数がそれぞれ２５．８％、６６．２％、１４０％増加することを確認することができる。
【００４５】
［実験例２］オルト−ジヒドロキシイソフラボン誘導体の皮膚幹細胞ＦＺＤ１遺伝子発現水準に対する効果測定
実験例１に記載の方法と同一の方法で、人間の皮膚角質細胞を培養した後、角質幹細胞を分離し、血清を欠乏させた後、２４時間経過後、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボンをそれぞれ１０μMの濃度で２４時間処理した。その後、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して細胞内のＲＮＡを分離した。分離されたＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｔ，  ＱＩＡＧＥＮ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）できれいに精製した後、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡの質を確認した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を利用して、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて定量的に分析した。皮膚角質幹細胞における各遺伝子の発現パターンの変化を、アプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(R)ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，  ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，  ＣＡ）（ＦＺＤ１−ＨＳ００２６８９４３＿ｓ１（ＴａｇＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎａｍｅ））を利用して発現量を確認した。実験結果は、下記図６に示した。
【００４６】
図６を参照すると、陰性対照群に比べて、４’，６，７−トリヒドロキシイソフラボン、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン、及び４’，７，８−トリヒドロキシイソフラボンをそれぞれ処理した場合、ＦＺＤ１の発現がそれぞれ約１．９倍、１．４倍、２．６倍程度増加することを確認した。
【００４７】
以下に前記組成物の剤形例を示すが、本発明を限定しようとするものではなく、単に具体的に説明しようとするものである。
［剤形例１］栄養化粧水
下記表３に記載の組成に従い、通常の方法で栄養化粧水を製造した。
【００４８】
【表３】
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［剤形例２］栄養クリーム
下記表４に記載の組成に従い、通常の方法で栄養クリームを製造した。
【００４９】
【表４】
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［剤形例３］マッサージクリーム
下記表５に記載の組成に従い、通常の方法でマッサージクリームを製造した。
【００５０】
【表５】
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［剤形例４］パック
下記表６に記載の組成に従い、通常の方法でパックを製造した。
【００５１】
【表６】
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［剤形例５］軟膏
下記表７に記載の組成に従い、通常の方法で軟膏を製造した。
【００５２】
【表７】
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本発明が属する分野における通常の知識を有する者であれば、前記内容を基に、本発明の範囲中において多様な応用及び変形を行うことが可能であろう。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係る組成物は、皮膚角質幹細胞の増殖を誘導することにより、皮膚再生力向上及び／又は皮膚弾力改善効果を示し、これを通じて化粧品又は医薬分野において多様に活用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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