(57)【要約】  【課題】    【解決手段】  本発明の実施形態は、低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法を含む。特に、本発明は、１段階の結晶化ステップにより約９５％以上のステビオールグリコシドと約７５％以上のレバウディオシドＡを含む実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を得るための低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法に関する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
低純度レバウディオシドＡ組成物を精製する方法であって、
低純度レバウディオシドＡ組成物と有機溶媒を混合し、低純度レバウディオシドＡ溶液を形成するステップであって、該低純度レバウディオシドＡ組成物は乾燥ベースで純度約６０重量％未満のレバウディオシドＡを含んでおり、該有機溶媒は約１０〜約２５重量％の水をさらに含んでいるステップと、
レバウディオシドＡと、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドからなる群から選択される１つ又は複数の別のステビオールグリコシドと、を含む実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物を、低純度レバウディオシドＡ溶液から１段階で結晶化するステップと、
を含み、
前記ステビオールグリコシドは、前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物中に乾燥ベースで約９５重量％を超えて存在し、
前記レバウディオシドＡは、前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物中に乾燥ベースで約８５重量％を超えて存在し、
前記レバウディオシドＡの質量収率は、約２０重量％を超え、前記ステビオールグリコシドの質量収率は、約２５重量％を超える、方法。
【請求項２】
低純度レバウディオシドＡ組成物を精製する方法であって、
低純度レバウディオシドＡ組成物と有機溶媒を混合し、低純度レバウディオシドＡ溶液を形成するステップであって、該低純度レバウディオシドＡ組成物は、乾燥ベースで純度約６０重量％未満のレバウディオシドＡを含んでおり、該有機溶媒は、任意で最大約２５重量％の水をさらに含んでいるステップと、
レバウディオシドＡと、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドからなる群から選択される１つ又は複数の別のステビオールグリコシドとを含む実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物を、前記低純度レバウディオシドＡ溶液から１段階で結晶化するステップと、
を含み、
前記ステビオールグリコシドは、前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物中に乾燥ベースで約９５重量％を超えて存在し、
前記レバウディオシドＡは、前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物中に乾燥ベースで約７５重量％を超えて存在し、
前記レバウディオシドＡの質量収率は、約２０重量％を超え、前記ステビオールグリコシドの質量収率は、約２５重量％を超える、方法。
【請求項３】
前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物は、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドからなる群から選択されるいずれか一つのステビオールグリコシドを約２５％以上含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物は、ステビオールビオシドを約２％以上含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記実質的に純粋なステビオールグリコシド混合物は、ステビオシドを約２０％以上含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レバウディオシドＡ溶液の加熱ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記レバウディオシドＡ溶液の冷却ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１段階の結晶化においてレバウディオシドＡ溶液を撹拌する、又は撹拌しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
レバウディオシドＡの結晶化促進に十分な量のレバウディオシドＡの適切な温度での前記レバウディオシドＡ溶液のシーディングステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の分離及び洗浄ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の乾燥ステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つの有機溶媒がアルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルコールは、エタノールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルコールは、メタノールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールは、エタノールとメタノールの混合物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記エタノール及びメタノールは、メタノール約１重量部に対してエタノール約２０重量部〜約１重量部の重量比で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記エタノール及びメタノールは、メタノール約１重量部に対してエタノール約３重量部〜約１重量部の重量比で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの有機溶媒は、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１プロパノール、イソプロパノール、１ブタノール、２ブタノール、ｔｅｒｔブタノール、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒と前期粗レバウディオシドＡは、前記レバウディオシドＡ溶液中に、粗レバウディオシドＡ約１重量部に対して含水有機溶媒約４重量部〜約１０重量部の重量比で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法はほぼ室温で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記レバウディオシドＡ溶液を約２０℃〜約４０℃の範囲の温度に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記レバウディオシドＡ溶液を約４０℃〜約６０℃の範囲の温度に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記レバウディオシドＡ溶液をほぼ還流温度に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記レバウディオシドＡ溶液を約５分〜約６０分間加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステビオールグリコシドの結晶化は、約０．５時間〜約５日間（１２０時間）の期間継続される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願情報）
[0001]  本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、それぞれ「Rebaudioside A Composition and Method for Purifying Rebaudioside A」と題する２００６年６月１９日出願の米国仮出願第６０／８０５，２１６号及び２００７年２月１２日出願の第６０／８８９，３１８号の優先権を主張する、２００７年５月２１日付米国特許出願第１１／７５１，６２７号の一部継続出願である、２００９年１２月３１日出願の米国出願第１２／６５０，６３７号の優先権を主張する。これらの出願の開示は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
[0002]  本発明は、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を高収率で得るための低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法全般に関する。別の態様では、本発明は、許容可能なレベルのレバウディオシドＡを有する実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を高収率で得るための低純度レバウディオシドＡ及び低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  レバウディオシドＡは、高甘味度ジテルペノイドグリコシド甘味料であり、その化学構造は、
【化１】
2013516423.tif 000002
である。レバウディオシドＡは、日本、シンガポール、台湾、マレーシア、韓国、中国、イスラエル、インド、ブラジル、オーストラリア及びパラグアイで商業的に栽培されるステビアレバウディアナ（ベルトニ）植物体（「ステビア」）から、他のステビオールグリコシドとともに分離及び抽出される。レバウディオシドＡは、機能及び官能特性が多くの高甘味度甘味料より優れた、代替ノンカロリー甘味料である。加工された形態のステビアは、砂糖の３〜３００倍の甘味度を有することがあるが、ステビアは苦味成分も有する。ステビア中に存在する主要４種類のジテルペノイド甘味料のうち、レバウディオシドＡは最も苦みが少なく、持続性の後味が最も少ない。苦味は、多くの場合、抽出物中の不純物によるものである。
【０００４】
[0004]  現行のＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品添加物専門家会議（ＪＥＣＦＡ）の基準は、ステビオールグリコシドの総量の純度が９５％以上になっていることを要求する。現行のステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシドの含有量が８０〜９２重量％からのものしか入手できず、これらの組成物のコストは、ステビオールグリコシド及び／又はレバウディオシドＡの純度レベルが上昇するにつれて大きく上昇する。さらに、これらの組成物は一般に、ステビオールグリコシド中のレバウディオシドＡの純度が不十分である（例えば、一般的にレバウディオシドＡが８０重量％以下しかない）。
【０００５】
[0005]  レバウディオシドＡとステビオシドの混合物からレバウディオシドＡを精製する従来報告されていた取り組みでは、多数の精製ステップを繰り返すことが必要である。米国特許第５，９６２，６７８号は、無水メタノール溶液を用いて純度８０％のレバウディオシドＡを得るレバウディオシドＡ再結晶化を開示する。無水メタノールを使った再結晶化を多数回繰り返すことによって、レバウディオシドＡの純度を９５％超まで高めることができる。米国特許公開第２００６／００８３８３８号は、エタノールと４〜１５％までの水を含む溶液による再結晶化を通じたレバウディオシドＡの精製を開示する。日本の特許出願第５５−２３７５６号は、純度８０％のレバウディオシドＡを得るために、含水エタノール（７０％超）からの結晶化によってレバウディオシドＡ及びステビオシドを精製する方法を開示する。米国特許公開第２００７／００８２１０３号は、含水エタノールからの再結晶化によってレバウディオシドＡを精製する方法を開示し、粗レバウディオシド（６０％）から２段階の再結晶化で純度９８％超のレバウディオシドを９７％の収率で生成すると主張する。しかし、これらの先行技術による方法では、現行のＪＥＣＦＡ基準を満たすことのできる実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物や、十分な純度のレバウディオシドＡ組成物は、１段階の再結晶化のみによっては得られない。
【０００６】
[0006]  したがって、実質的に純粋なステビオールグリコシド及びレバウディオシドＡ組成物を調製するための、簡便、効率的かつ経済的な方法が必要になる。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]  本発明の例示的実施形態は、低純度のステビオールグリコシド組成物を精製し、高い純度を有する実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を高い収率で得る方法を提供することにより、上述の必要に対応する。
【０００８】
[0008]  特定の実施形態では、低純度のステビオールグリコシド組成物の精製方法は簡単な結晶化を含む。特に、上記方法は、ステビオールグリコシド溶液を作るための低純度のステビオールグリコシドＡ組成物（低純度のステビオールグリコシド組成物は乾燥ベースで総ステビオールグリコシドを最大９２％含む）と有機溶媒の混合、及びその後の低純度のステビオールグリコシド溶液からの実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物（レバウディオシドＡと、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドからなる群から選択される１つ又は複数の別のステビオールグリコシドを含む）の１段階の結晶化を含む。ステビオールグリコシドは、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物中に、乾燥ベースで９５重量％以上が存在している。ある実施形態では、レバウディオシドＡは、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物中に、乾燥ベースで７５重量％以上が存在している。実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の総収量は、２５重量％以上である。
【０００９】
[0009]  発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。他に別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語、学術用語及び略語は、本発明に関連する当業者であれば、共通に理解するところと同じ意味を有する。本発明の実施においては、本明細書で説明する方法及び組成物と類似又は同等の方法及び組成物を使用することができるが、適した方法及び組成物の説明は、上記方法及び組成物のいずれによっても本明細書に記載する本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0010]本発明の実施形態に従ったレバウディオシドＡ多形形態と、アモルファス形態のレバウディオシドＡの形成及び変換の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0011]  ステビオールグリコシド組成物は、天然の高甘味度甘味料として使用できる。レバウディオシドＡはステビオールグリコシドの一つで、ステビオールグリコシド組成物中に様々な量で見られる。ステビオールグリコシド（レバウディオシドＡを含む）の総量の増加につれて、組成物のコストも実質的に上昇する。同様に、ステビオールグリコシド組成物中のレバウディオシドＡの量の増加につれて、組成物のコストはやはりいっそう上昇する。
【００１２】
[0012]  米国特許出願第１１／７５１，６２７号において、出願人は、天然の高甘味度甘味料としての使用に適した実質的に純粋なレバウディオシドＡ組成物の簡便かつ経済的な調製方法を開示した。「実質的に純粋なレバウディオシドＡ」という語句は、レバウディオシドＡ乾燥重量の少なくとも約８５％、レバウディオシドＡ乾燥重量の少なくとも約９０％、レバウディオシドＡ乾燥重量の約９５％〜約９８％まで、及びレバウディオシドＡ乾燥重量の約９９％〜約１００％までを含むレバウディオシドＡ組成物を指して使用された。
【００１３】
[0013]  出願人は、甘味及びこれらの天然高甘味度甘味料組成物の質が、組成物中に存在するレバウディオシドＡの量によってのみならず、組成物中に存在する総ステビオールグリコシドの合計量によっても影響を受けることを発見している。したがって、経済的な方法で実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の調製方法を提供する必要性が存在する。特に、経済的な方法で、高純度のレバウディオシドＡを含む実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の調製方法を提供する必要性が存在する。
【００１４】
[0014]  本発明の例示的実施形態は、低純度のステビオールグリコシド組成物を実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物に精製する方法を提供することによって、これらの必要性を満たす。結果として生じる実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の構成及び収率は、有機溶媒の種類及び量、溶液の温度、沈殿温度、混合時間、沈殿時間、並びに溶液のシーディングといったパラメータの適切な選定を通じてコントロールできる。
【００１５】
[0015]  上記方法は、一般に、低純度ステビオールグリコシド組成物及び有機溶媒からの実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の１段階の結晶化を含む。本発明のその他の例示的実施形態は、高純度のレバウディオシドＡを含む実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物も包含する。
【００１６】
低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法
[0016]  低純度ステビオールグリコシド組成物は、最大９２重量％の純度でステビオールグリコシドを含むものが商業的に入手可能である。本明細書で使用される場合、「粗ステビオールグリコシド組成物」及び「低純度ステビオールグリコシド組成物」は、ステビオールグリコシドを約８０重量％〜約９２重量％まで含有する組成物を指して、互換的に使用される。
【００１７】
[0017]  特定の実施形態では、低純度ステビオールグリコシド組成物は、乾燥ベースで最大約６０重量％のレバウディオシドＡを含む。本明細書で使用される場合、「粗レバウディオシドＡ組成物」又は「低純度レバウディオシドＡ組成物」は、レバウディオシドＡを約１５重量％〜約６０重量％まで含有する、約３０重量％〜約６０重量％まで含有する、又は約４０重量％〜約６０重量％まで含有する組成物を指して、互換的に使用される。粗レバウディオシドＡ組成物の残部は、一般に他のステビオールグリコシド及び不純物を含む。一般に、商業的に入手可能な低純度レバウディオシドＡ組成物は、約８０重量％〜約９２重量％までのステビオールグリコシドを含有する。
【００１８】
[0018]  また、ステビアの植物体から抽出された、低純度ステビオールグリコシド組成物及び未加工形態の粗レバウディオシドＡを、本明細書に記載する方法を用いて精製し得ることも想定される。
【００１９】
[0019]  低純度ステビオールグリコシド組成物の精製についての例示的実施形態では、低純度ステビオールグリコシド組成物を有機溶媒と混合して低純度ステビオールグリコシド溶液とすることができる。有機溶媒は、任意で最大約２５重量％の水をさらに含み得る。例えば特定の実施形態では、有機溶媒は、約３重量％〜約２０重量％まで、約５重量％〜約１５重量％まで、約５重量％〜約１０重量％まで、又はその間のいずれかの量の水をさらに含み得る。有機溶媒の非限定的な例としては、アルコール、アセトン、アセトニトリル、及び酢酸エチルが挙げられる。本明細書で使用される場合、アルコールは、直鎖型、分岐鎖型又は環状型のあらゆるアルコールを指し、置換された、又は置換されていないアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基が少なくとも一つのヒドロキシル基部分に付加されたものを指す。アルコールの非限定的な例としては、エタノール、メタノール、イソプロパノール、１プロパノール、１ブタノール、２ブタノール、ｔｅｒｔブタノール、及びイソブタノールが挙げられる。
【００２０】
[0020]  例示的実施形態では、有機溶媒は、水と少なくとも一つの有機溶媒の混合物を含む。別の例示的実施形態では、少なくとも一つの有機溶媒はアルコールを含み、アルコールはエタノール、メタノール、又はそれらの混合物を含む。少なくとも一つの有機溶媒がエタノールとメタノールの混合物を含む例示的実施形態では、エタノールとメタノールは、メタノール約１重量部に対してエタノール約２０重量部〜約１重量部までの割合で有機溶媒中に混合され得る。別の例示的実施形態では、エタノールとメタノールは、メタノール約１重量部に対してエタノール約３重量部〜約１重量部までの割合で有機溶媒中に混合され得る。
【００２１】
[0021]  例示的実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液は、低純度ステビオールグリコシド約１重量部に対して有機溶媒約１０重量部〜約４重量部までの割合で、有機溶媒と低純度ステビオールグリコシド組成物を含む。別の例示的実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液は、低純度ステビオールグリコシド約１重量部に対して有機溶媒約５重量部〜約３重量部までの割合で、有機溶媒と低純度ステビオールグリコシド組成物を含む。
【００２２】
[0022]  有機溶媒と低純度ステビオールグリコシド組成物を含む低純度ステビオールグリコシド溶液の調製方法は、適切ないかなる温度ででも実施し得る。一般に、約２０℃〜約８５℃までの温度が可能である。例えばある実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液をほぼ室温（およそ２２〜２５℃）で調製し得る。別の実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液は、ステビオールグリコシド溶液を、約２０℃〜約７０℃まで、約２０℃〜約６０℃まで、約２０℃〜約４０℃まで、又は約４０℃〜約６０℃までの範囲に加熱することによって調製し得る。さらに別の実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液は、低純度ステビオールグリコシド溶液をほぼ還流温度（およそ８５℃）に加熱することによって調製し得る。低純度ステビオールグリコシド溶液を調製（又は混合）するステップの実施時間は、低純度ステビオールグリコシドを有機溶媒中に実質的に懸濁させるのに適した長さとすることができる。例えば低純度ステビオールグリコシド溶液は、低純度ステビオールグリコシド溶液を、約５分〜約６０分まで、約５分〜約３０分まで、約１０分〜約１５分まで、又はこれらの間のいずれかの時間混合することによって調製し得る。
【００２３】
[0023]  低純度ステビオールグリコシド組成物を精製する方法は、低純度ステビオールグリコシド溶液からレバウディオシドＡを含む実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を１段階で結晶化することをさらに含む。特定の実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液の結晶化は低純度ステビオールグリコシド溶液の冷却をさらに含み得る。一般に、低純度ステビオールグリコシド溶液は、低純度ステビオールグリコシド溶液からのステビオールグリコシド及びレバウディオシドＡの沈殿に適した温度（「沈殿温度」）まで冷却することができる。上記沈殿温度の非限定的な例としては、約４℃〜約３５℃まで、約１５℃〜約２５℃まで、又はそれらの間のいずれかの温度が可能である。低純度ステビオールグリコシド溶液の結晶化は、低純度ステビオールグリコシド溶液から所望の収量の実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を得るために十分な時間をかけて（「沈殿時間」又は「冷却時間」）発生させることができる。例えば特定の実施形態では、低純度ステビオールグリコシド溶液の結晶化は、約０．５時間〜約１２０時間（５日間）まで、約１２時間〜約９６時間（４日間）まで、約２４時間（１日間）〜約７２時間（３日間）まで、約４８時間（２日間）、又はそれらの間のいずれかの長さの時間で進行することができる。
【００２４】
[0024]  低純度ステビオールグリコシド溶液の結晶化後、レバウディオシドＡを含む実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物が得られる。「実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物」は、本明細書では（乾燥ベースで）約９５重量％以上のステビオールグリコシドを含む組成物を指す。ステビオールグリコシドは、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド及びズルコシドからなる群から選択した１つ又は複数の別のステビオールグリコシドと組み合わさったレバウディオシドＡを含んでいてもよい。特定の実施形態では、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物は、約７０重量％以上のレバウディオシドＡを含む。特定の実施形態では、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物は、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、及びステビオールビオシドをさらに含む。実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物は、一般に、（乾燥ベースで）約７０重量％以上、約７５重量％以上、約８０重量％以上、約８５重量％以上、約９０重量％以上、約９５重量％以上、又は約９７重量％以上のレバウディオシドＡを含む。
【００２５】
[0025]  特定の実施形態では、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物及びレバウディオシドＡの総収率は、それぞれ約２５％以上及び約２０％以上が可能である。本明細書では、収率は一般に、開始質量に比較して得られた質量を指す。したがって、ステビオールグリコシドの収率は、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物における９種類のステビオールグリコシドの質量を、低純度ステビオールグリコシド中の９種類のステビオールグリコシドの開始質量と比較することによって決定できる。同様に、レバウディオシドＡの収率は、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物中に存在するレバウディオシドＡの質量を、低純度ステビオールグリコシド中に存在するレバウディオシドＡの開始質量と比較することによって決定できる。例示的実施形態では、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物及びレバウディオシドＡの総収率は、約１５％以上、約４０％以上、又は約６０％以上が可能である。
【００２６】
[0026]  例示的実施形態では、低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法は、低純度ステビオールグリコシド溶液の結晶化開始に当たり、任意で低純度ステビオールグリコシド溶液のシーディングをさらに含むことができる。シーディングは一般に、結晶化の進行が可能な温度と同一温度で実施することができる。例えば特定の実施形態では、シーディングは約１８℃〜約３５℃の範囲の温度で実施される。低純度ステビオールグリコシド溶液のシーディングは一般に、レバウディオシドＡ及びその他のステビオールグリコシドの沈殿を増進するために十分な量の実質的に純粋なレバウディオシドＡの結晶を、低純度ステビオールグリコシド溶液に添加することによって実施できる。沈殿を増進するために十分な量は、一般に、低純度ステビオールグリコシド溶液中に、約０．０００１重量％〜約１重量％まで、約０．０１重量％〜約１重量％まで、又はこのうちのいずれかの量の実質的に純粋なレバウディオシドＡ組成物を含み得る。
【００２７】
[0027]  別の例示的実施形態では、上記方法は、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の結晶化後、その分離と洗浄をさらに含む。実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物は、垂直方向及び水平方向の有孔式バスケット型遠心分離、固体用ボウル型遠心分離、デカンタ型遠心分離、ピーラー型遠心分離、押出排出型遠心分離、ハインケル型遠心分離、分離板型遠心分離及びサイクロン分離を含むがこれらに限定されない遠心力を利用する種々の固液分離技術によって、その上澄み（有機溶媒及び不純物）から分離し得る。さらに、ベルト、ドラム、ヌッチェ型、リーフ、プレート、ローゼンムント型、スパークラー型、並びにバッグフィルター及びフィルタープレスの利用を含むがこれらに限定されない何らかの加圧、減圧又は重力式ろ過法によって分離速度を高めてもよい。固液分離デバイスの操作は、連続的であってもよいし、半連続的であってもよいし、バッチ様式であってもよい。実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を、種々の有機溶媒及びそれらの混合物を用い、分離デバイス上で洗浄してもよいし、窒素又はアルゴンを含むがこれらに限定されない幾つかの気体を用い、分離デバイス上で部分的に乾燥するか、又は完全に乾燥し、残留液体溶媒を蒸発させてもよい。実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を、固体を溶解させるか、又は固体形態を維持しながら、液体、気体を用いるか、又は機械的な手段で分離デバイスから自動的に取り出してもよいし、又は手動で取り出してもよい。
【００２８】
[0028]  さらに別の例示的実施形態では、上記方法は、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物の乾燥をさらに含む。上記組成物の乾燥に適した方法は当業者に既知のもので、ロータリーバキューム型乾燥機、流動床乾燥機、ロータリートンネル型乾燥機、プレート型乾燥機、トレー型乾燥機、ナウター型乾燥機、スプレードライヤー、フラッシュドライヤー、ミクロンドライヤー、パン型乾燥機、高速及び低速のパドルドライヤー並びにマイクロ波ドライヤーの使用が挙げられるが、これらに限定されない。例示的実施形態では、実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物は、窒素パージ又はアルゴンパージを用い、約４０℃〜約６０℃までの温度で、約５時間〜約５日間まで、約１日〜約４日まで、約２日〜約３日まで、又はそのうちのいずれかの期間乾燥させて、残留溶媒を除去する。
【００２９】
[0029]  さらなる精製が所望される場合、本明細書で説明される低純度ステビオールグリコシド組成物の精製方法を繰り返してもよく、又は実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物をカラムクロマトグラフィー等の別の精製方法を用いてさらに精製してもよい。
【００３０】
[0030]  本明細書でステビオールグリコシド組成物に関して使用される場合、純度は、ステビオールグリコシド組成物中の選択ステビオールグリコシド（例えば、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＥ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシド）の重量パーセントを表す。本明細書でレバウディオシドＡに関して使用される場合、純度は、低純度ステビオールグリコシド組成物中又は実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物中のレバウディオシドＡの重量パーセントを表す。したがって、本明細書で規定される実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物は、特定の純度のレバウディオシドＡと、特定の純度の選択ステビオールグリコシドの総計を含む。組成物の残部は、存在量が検出限界を下回る不純物又はその他のステビオールグリコシドを含み得る。存在量が組成物全体の約０．１重量％未満の不純物又はその他のステビオールグリコシドは、検出限界を下回るとみなされる。
【００３１】
[0031]  選択ステビオールグリコシドは一般に、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドからなる群から選択される１つ又は複数の別のステビオールグリコシドを含む。例えばある実施形態では、総ステビオールグリコシドの総量は、９種類のステビオールグリコシド、すなわちレバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドの組合せに基づく。別の実施形態では、ステビオールグリコシドの合計は、７種類のステビオールグリコシド、すなわちレバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド及びステビオールビオシドの組合せに基づく。当業者であれば、ステビオールグリコシドの総合計に含まれるステビオールグリコシドが、種々の管理機関（例えばＪＥＣＦＡ、米国食品医薬品局等）の規定する特定の食品規則又は食品勧告に基づいて選択され得ることが理解されるだろう。
【００３２】
[0032]  組成物の純度は、当業者に既知の方法を用いて測定することができる。そのような方法の一つに高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。当業者であれば、試料中の水分が純度測定の精度に影響し得ることも理解されたい。したがって、純度を測定する際は組成物が実質的に乾燥しているべきである。本明細書で使用される場合、「実質的に乾燥した組成物」と「乾燥ベースで」の語は互換的に使用され、最大約１０重量％の水分を含んでもよい。
【００３３】
レバウディオシドＡの多形形態及びアモルファス形態
[0033]  出願人が米国特許出願第１１／７５１，６２７号にすでに説明したとおり、レバウディオシドＡ組成物の精製によりレバウディオシドＡの種々の多形形態及びアモルファス形態が形成され得る。出願人は、少なくとも３種類の異なるレバウディオシドＡ多形形態をすでに特定した。すなわち、形態１：レバウディオシドＡ水和物、形態２：無水レバウディオシドＡ、及び形態３：レバウディオシドＡ溶媒和物である。出願人は、この少なくとも３種類のレバウディオシドＡ多形形態に加え、アモルファス形態のレバウディオシドＡ（形態４）も特定した。
【００３４】
[0034]  多形性は、ある物質が結晶格子内での分子の配列及び／又は構造の異なる２つ以上の結晶状態で存在する能力と定義される。有機合成物の約３０％が多形性を示すと考えられる（Zell他、Tetrahedron 56(36)6603-16 (2000)）。多形性は、医薬品、顔料及び染料、甘味料、火薬及び農薬の調合において重要である。多形性は、濃度、融点、及び溶解速度といった物理的性質を変化させ得る。
【００３５】
[0035]  本明細書で使用される場合、アモルファスは非晶質固体材料を指す。レバウディオシドＡのアモルファス形態（形態４）は、レバウディオシドＡの多形形態（形態１、２又は３）と比較して溶解速度が高まる。当業者であれば、甘味料組成物の溶解速度が甘味を付加される固体及び液体の組成物の調合において重要であり得ることを理解されたい。甘味を付加される組成物の非限定的な例としては、チューインガム、焼き菓子及びパン、及び飲料が挙げられる。
【００３６】
[0036]  レバウディオシドＡの多形形態３種類及びレバウディオシドＡのアモルファス形態の材料特性を以下の表にまとめる。
【表１】
2013516423.tif 000003
上記材料特性は、もっぱらレバウディオシドＡの多形形態及びアモルファス形態についての特定の実施形態を説明するためのものである。当業者であれば、無水レバウディオシドＡ多形体（形態２）、レバウディオシドＡ溶媒和物多形体、及びレバウディオシドＡアモルファスが吸湿性を有し、乾燥ベースで最大約１０重量％の水分を吸収し得ることを理解されたい。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、本明細書で説明する方法は一般に、無水レバウディオシドＡ多形体（形態２）及び／又はレバウディオシドＡアモルファス組成物（形態４）を産生すると考えられる。
【００３７】
[0037]  図１で説明されるとおり、産生される多形形態又はアモルファス形態の型は、水性有機溶液の組成物、結晶化のステップの温度、及び乾燥のステップの温度といった要因に依存し得る。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、形態１と形態３は１段階の結晶化中に形成されると考えられ、一方、形態２は、形態１及び形態３からの変換後、乾燥のステップ中に形成されると考えられる。
【００３８】
[0038]  結晶化のステップの温度が約２０℃〜約５０℃までの低温で、かつ水性有機溶媒中の有機溶媒に対する水の比率が低いと、形態３が形成される。結晶化のステップの温度が約５０℃〜約８０℃までの高温で、かつ水性有機溶媒中の有機溶媒に対する水の比率が高いと、形態１が形成される。形態１は、無水溶媒中、ほぼ室温で、約２時間〜約１６時間スラリー化するか、又はほぼ還流温度下で、約０．５〜約３時間スラリー化することによって、形態３に変換することができる。形態３の多形体は、ほぼ室温で約１６時間、又はほぼ還流温度下で約２〜約３時間、水中でスラリー化することによって、形態１に変換することができる。乾燥過程中に形態３を形態２に変換することができる。しかし、乾燥温度を約７０℃よりも高くするか、又は実質的に純粋なレバウディオシドＡ組成物の乾燥時間を長くすると、レバウディオシドＡが分解し、実質的に純粋なレバウディオシドＡ組成物中に不純物である残存レバウディオシドＢが増えてしまう。水を加えることによって、形態２を形態１に変換することができる。
【００３９】
[0039]  形態４は、当業者に周知の方法を用い、レバウディオシドＡの初期精製中に得ることができ、又はいずれかの単独の多形体から若しくはこれらの組合せから直接に得ることができる。さらに、形態４は、上記方法以外の精製手段を通じて得た低純度レバウディオシドＡ組成物又は実質的に純粋なレバウディオシドＡ組成物から得ることができる。レバウディオシドＡのアモルファス形態を作成する方法の非限定的な例としては、レバウディオシドＡ組成物のボールミルによる粉砕、沈殿、凍結乾燥、極低温での粉砕及びスプレードライが挙げられる。
【００４０】
[0040]  本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例はいかなる意味でも本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の説明を読めば、本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、様々な他の実施形態、変形、及び同等物を思い付くことができることを明確に理解されるだろう。他に別段の指定がない限り、パーセント表示（％）は重量％である。
【００４１】
実施例
[0041]  本明細書で以下の実施例において説明されるレバウディオシドＡ組成物の純度は、ＨＰＬＣを用いて決定された。ＨＰＬＣ分析の実施方法は、当業者には周知である。簡単に説明すると、ＺＯＲＢＡＸ  ＮＨ２カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用い、温度３０℃でＨＰＬＣ分析を実施した。移動相は２０％の緩衝溶液（酢酸０．０１２５％及び酢酸アンモニウム０．０１２５％）及び８０％のアセトニトリルを含み、流速１．５ｍＬ／分であった。各試料のうち１２μＬを２組（duplicate）注入し、ＵＶ検出器を用いてこの試料を２１０ｎｍ（帯域幅４ｎｍ）で分析し、参照を２６０ｎｍ（帯域幅１００ｎｍ）とした。ＨＰＬＣ分析には、４０分〜６０分までの実行時間が必要だった。
【００４２】
[0042]  酢酸アンモニウム０．１２５ｇと氷酢酸１２５μＬを１リットルの水に溶かして、酢酸０．０１２５％及び酢酸アンモニウム０．０１２５％の緩衝溶液を調製した。レバウディオシドＢの保持時間は、酢酸に対する酢酸アンモニウムの割合を変化させながら、両者を合わせた合計を０．０２５％に保つことによって調整した。酢酸の量を増やすとレバウディオシドＢの保持時間は減少した。
【００４３】
[0043]  移動相は、緩衝溶液をアセトニトリルと混合し、レバウディオシドＡの保持時間が７．０±０．５分になるように調製した。これは、当初は約２０％の緩衝液だった（緩衝液２００ｍＬとアセトニトリル８００ｍＬ）。アセトニトリルの量を１〜２％ずつ増やすと、レバウディオシドＡの保持時間が約１分間ずつ増えた。
【００４４】
[0044]  ７５０ｍＬのアセトニトリルと２５０ｍＬの緩衝溶液を混合して希釈溶液を調製した。標準レバウディオシドＡは、２０．０±０．５ｍｇ（直近の０．１ｍｇまで記録）の標準レバウディオシドＡを４ｍＬの希釈溶液で希釈することによって調製し、約５０００ｍｇ／Ｌの標準液を作成した。このレバウディオシドＡ標準液を、１０．８μＬ、１１．４μＬ、１２．６μＬ及び１３．２μＬ注入した。含水量は、標準液を調製するたびにカールフィッシャー法によって測定し、分析証明書に従い、溶媒純度に基づいて補正を行った。あるいは、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２１ｍｇ及び２２ｍｇ（それぞれ±０．２）の標準レバウディオシドＡである個別の試料を４ｍＬの希釈溶液で希釈することによって、標準レバウディオシドＡを調製した（水分及び純度を補正）。個別に調製した試料を、試料と同じレベル（１２μＬ）注入した。
【００４５】
[0045]  標準ステビオシドは、１２．５±０．５ｍｇ（直近の０．１ｍｇまで記録）の標準ステビオシドを５ｍＬの希釈溶液で希釈することによって調製し、約２５００ｍｇ／Ｌの標準液（ストックＡ）を作成した（水分及び純度を補正）。次に、希釈溶液１０ｍＬに対して１ｍＬのストックＡを用いて標準ステビオシドを希釈し、２５０ｍｇ／Ｌの標準液（ストックＢ）を作成し、標準ストックを最終的な濃度が２．５〜５０ｍｇ／Ｌになるように希釈した。
【００４６】
[0046]  レバウディオシドＡ組成物の試料は、１２５±２ｍｇ（直近の０．１ｍｇまで記録）のレバウディオシドＡ組成物を希釈液２５ｍＬで希釈することによって調製し、約５０００ｍｇ／Ｌの試料溶液を作成した（水分及び純度を補正）。試料を直ちに分析しない場合は窒素中にヘッドスペース無しで保管し、乾燥させた。
【００４７】
[0047]  以下の表は、レバウディオシドＡ及びその他のステビオールグリコシドの保持時間（ＲＴ）の指針となる。しかし、当業者であれば、保持時間が必要に応じて変更され得ることを理解することができるだろう。
【表２】
2013516423.tif 000004
【００４８】
[0048]  低純度レバウディオシドＡ組成物（４１重量％〜６２重量％までのレバウディオシドＡを含む）を、１段階の結晶化を用いて精製し、高純度のレバウディオシドＡと高い収率を有する実質的に純粋なステビオールグリコシド組成物を得た。レバウディオシドＡの純度が約４１重量％〜約６２重量％までであり、かつ総ステビオールグリコシド含有量が約８８重量％〜約９２重量％までの、異なる５種類の低純度レバウディオシドＡ組成物を用いた（分析的ＨＰＬＣ分析に基づく）。これらの実施例におけるステビオールグリコシドの総量は、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド及びステビオールビオシドの合計量を基準にした。
【００４９】
[0049]  低純度レバウディオシドＡ組成物２種類を、Shenzhen（Shenzhen NII Natural Food Ingredients C., Ltd., China）から入手した。低純度レバウディオシドＡ組成物２種類を、Shandong（Shandong Huaxian Stevia Limited-Liability Company, China）から入手した。さらにもう１種類の低純度レバウディオシドＡ組成物を、Hailin（Hailin Farm, China）から入手した。これらの組成物それぞれのレバウディオシドＡ及び総ステビオールグリコシドの含有量を、次の表３に記す。
【表３】
2013516423.tif 000005
【００５０】
実施例集Ａ
[0050]  結晶化の実験条件を表４及び表５にまとめ、結果は表６にまとめる。
【００５１】
[0051]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ）を、混合温度で所望の期間撹拌しながら有機溶媒と混合し、実質的に透明な溶液を得た。溶液を室温（２２℃）まで冷却し、また任意で、実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）によるシーディングを行った。一般に沈殿は、室温まで冷却されるとほぼ即時に発生した。沈殿物をろ過し、室温又は低温のエタノール（９５％、２２℃又は４℃）で洗浄し、５０〜６０℃の真空オーブンデシケータ内で２日〜４日間乾燥させた。
【００５２】
[0052]  発生した沈殿物の量を決定し、ユニバーサルＣＡＤ（帯電エアロゾル）検出器を用いて沈殿物を分析的ＨＰＬＣ（アジレント１１００）にかけ、レバウディオシドＡの量並びに７種類のステビオールグリコシド（レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドを含む）及び９種類のステビオールグリコシド（レバウディオシドＡ、レバウディオシドＢ、レバウディオシドＣ、レバウディオシドＤ、レバウディオシドＦ、ステビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド及びステビオールビオシドを含む）の総量の両方を定量的に測定した。次に、質量収量の合計及びレバウディオシドＡの収量の合計（総収量及び低純度レバウディオシドＡ組成物中に存在するレバウディオシドＡの総量に対する比較の両方）を決定した。実施例の６番、７番、１０番、１１番、１２番、１５番、１６番、２５番、２６番、２７番、３１番、３２番、３６番及び３７番については、以下にさらに詳細に記載する。
【表４】
2013516423.tif 000006
【表５】
2013516423.tif 000007
【表６】
2013516423.tif 000008
【００５３】
実施例６
[0053]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４１％）を３００ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、撹拌しながら６分間、５２℃に加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で３日間置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（５〜１０ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを８１％、及び総ステビオールグリコシドを９５％含有するステビオールグリコシド組成物１７．４５ｇ（収率３４．９０％）を得た。
【００５４】
実施例７
[0054]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４１％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、撹拌しながら１３分間、５７℃に加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で４日間置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（５〜１０ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを７９％、及び総ステビオールグリコシドを９６％含有するステビオールグリコシド組成物１８．１７ｇ（収率３６．３４％）を得た。
【００５５】
実施例１０
[0055]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４１％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）及び１０ｍＬの水と混合し、撹拌しながら３０分間、３５〜４０℃に加熱した。この溶液を冷却し、その後、室温（２２℃）で実質的に純粋なレバウディオシドＡ（＋９９．０％）をシーディングして、室温で１日間、４℃で１日間、そして再度室温で１日間静置した。沈殿物をろ過し、エタノール（３×１０ｍＬ、９５％、４℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを９７％、及び総ステビオールグリコシドを９８％含有するステビオールグリコシド組成物１２．３ｇ（収率２４．６％）を得た。
【００５６】
実施例１１
[0056]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４１％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）及び１０ｍＬの水と混合し、水冷式還流凝縮機に取り付け、撹拌しながら８５℃のウォーターバス内で５〜６分間加熱した。この溶液を冷却し、その後、室温（２２℃）で実質的に純粋なレバウディオシドＡ（＋９９．０％）をシーディングして、撹拌しながら室温で３日間置いた。４日目に沈殿物をろ過し、エタノール（３×１０ｍＬ、９５％、４℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（６０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを９０％、及び総ステビオールグリコシドを９８％含有するステビオールグリコシド組成物１２．９７ｇ（収率２５．９４％）を得た。
【００５７】
実施例１２
[0057]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、６２％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）及び５０ｍＬのメタノール（１００％）と混合し、撹拌しながら１０分間、５０℃に加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で１晩置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（２×３０ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを８１％、及び総ステビオールグリコシドを９７％含有するステビオールグリコシド組成物２９．５８ｇ（収率５９．１７％）を得た。
【００５８】
実施例１５
[0058]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、６２％）を４００ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、撹拌しながら２１分間、５３℃に加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で１晩置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（１０〜１５ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを８９％、及び総ステビオールグリコシドを９７％含有するステビオールグリコシド組成物２６．９３ｇ（収率５３．８７％）を得た。
【００５９】
実施例１６
[0059]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、６２％）を２５０ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、室温（２２℃）で６０分間撹拌した。この溶液を撹拌しながら室温で１晩置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（１０〜１５ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（６０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを９３％、及び総ステビオールグリコシドを９８％含有するステビオールグリコシド組成物２６．６ｇ（収率５３．２％）を得た。
【００６０】
実施例２４
[0060]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４２％）を１５０ｍＬの酢酸エチルと混合し、室温（２２℃）で１５分間撹拌した。沈殿物をろ過し、その後、３００ｍＬのエタノール（９５％）で再懸濁し、撹拌しながら１０分間、５２℃に加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で４日間置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（５〜１０ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを７４％、及び総ステビオールグリコシドを９４％含有するステビオールグリコシド組成物１８．８３ｇ（収率３７．６７％）を得た。
【００６１】
実施例２６
[0061]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４２％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）及び１０ｍＬの水と混合し、撹拌しながら３０分間、３５〜４０℃に加熱した。この溶液を冷却し、その後、室温（２２℃）で実質的に純粋なレバウディオシドＡ（＋９９．０％）をシーディングして、室温で１日間、４℃で１日間静置した。沈殿物をろ過し、エタノール（３×１０ｍＬ、９５％、４℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを９７％、及び総ステビオールグリコシドを９８％含有するステビオールグリコシド組成物１４．３ｇ（収率２８．６％）を得た。
【００６２】
実施例２７
[0062]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４２％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）及び１０ｍＬの水と混合し、水冷式還流凝縮機に取り付け、撹拌しながら８５℃のウォーターバス内で５〜６分間加熱した。この溶液を冷却し、その後、室温（２２℃）で実質的に純粋なレバウディオシドＡ（＋９９．０％）をシーディングして、撹拌しながら室温で３日間置いた。４日目に沈殿物をろ過し、エタノール（３×１０ｍＬ、９５％、４℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（６０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを９１％、及び総ステビオールグリコシドを９７％含有するステビオールグリコシド組成物１１．５６ｇ（収率２３．１２％）を得た。
【００６３】
実施例３１
[0063]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、５１％）を４００ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、撹拌しながら８分間、５６℃に加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で１晩置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（１０〜１５ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを７９％、及び総ステビオールグリコシドを９７％含有するステビオールグリコシド組成物２６．５９ｇ（収率５３．１８％）を得た。
【００６４】
実施例３２
[0064]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、５１％）を２００ｍＬのエタノール（９５％）及び１０ｍＬの水と混合し、水冷式還流凝縮機に取り付け、撹拌しながら７８℃のウォーターバス内で６〜８分間加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で１晩置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（３×１０ｍＬ、９５％、４℃）で洗浄し、真空オーブンデシケータ内（６０℃）で４日間乾燥させて、レバウディオシドＡを９６％、及び総ステビオールグリコシドを９９％含有するステビオールグリコシド組成物１７．９１ｇ（収率３５．８２％）を得た。
【００６５】
実施例３６
[0065]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４６％）を４００ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、撹拌しながら５６℃で７．５分間加熱した。この溶液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で５日間置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（１０〜１５ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄して、真空オーブンデシケータ内（５０℃）で２日間乾燥させて、レバウディオシドＡを７７％、及び総ステビオールグリコシドを９６％含有するステビオールグリコシド組成物１８．６４ｇ（収率３７．２８％）を得た。
【００６６】
実施例３７
[0066]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５０ｇ、４６％）を２５０ｍＬのエタノール（９５％）及び１５ｍＬの水と混合し、室温（２２℃）で６０分間撹拌した。この溶液を、撹拌しながら室温で１晩置いた。沈殿物をろ過し、エタノール（１０〜１５ｍＬ、９５％、２２℃）で洗浄して、真空オーブンデシケータ内（６０℃）で４日間乾燥させ、レバウディオシドＡを９０％、及び総ステビオールグリコシドを９６％含有するステビオールグリコシド組成物１３．２ｇ（収率２６．４０％）を得た。
【００６７】
実施例集Ｂ
[0067]  種々の有機溶媒及び実験条件を用いて、低純度レバウディオシドＡ組成物の１段階の結晶化を行った。結晶化１回ごとに、発生した沈殿物の量を決定し、ユニバーサルＣＡＤ（帯電エアロゾル）検出器を用いて沈殿物を分析的ＨＰＬＣ（アジレント１１００）にかけ、生成組成物中のレバウディオシドＡの量を定量的に測定した。次に、質量収量の合計及びレバウディオシドＡの収量の合計（総収量及び低純度レバウディオシドＡ組成物中に存在するレバウディオシドＡの総量に対する比較の両方）を決定した。結果を表７にまとめ、実験条件の詳細を以下に記載する。
【表７】
2013516423.tif 000009
【００６８】
実施例１
[0068]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、６２％）を４０ｍＬのエタノール（９０％）と混合し、２０分間、４５℃〜５８℃に加熱した。この溶液を熱いうちにろ過し、微量の不溶物を除去した。ろ液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で４４時間置いた。沈殿物をろ過し、無水エタノール（２２℃）で洗浄し、２４時間乾燥させて、レバウディオシドＡを９２．５％含有するステビオールグリコシド組成物２．１５ｇ（収率４３％）を得た。
【００６９】
実施例２
[0069]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、６２％）を２０ｍＬのエタノール（９０％）と混合し、２０分間、４５℃〜５８℃に加熱した。この溶液を熱いうちにろ過し、微量の不溶物を除去した。ろ液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で４４時間置いた。沈殿物をろ過し、含水エタノール（７０％、−５℃）で洗浄し、真空デシケータ（vacuum over dririte）により６５℃で２４時間乾燥させて、レバウディオシドＡを９４．９６％含有するステビオールグリコシド組成物２．２ｇ（収率４４％）を得た。
【００７０】
実施例３
[0070]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、６２％）を２０ｍＬのエタノール（９５％）と混合し、２０分間、４５℃〜５０℃に加熱した。この溶液を熱いうちにろ過し、微量の不溶物を除去した。ろ液を冷却し、撹拌しながら室温（２２℃）で４４時間、及び５℃で１時間置いた。沈殿物をろ過し、無水エタノール（０℃）で洗浄し、真空デシケータにより６５℃で２４時間乾燥させて、レバウディオシドＡを９６．３％含有するステビオールグリコシド組成物２．５５ｇ（収率５１％）を得た。
【００７１】
実施例４
[0071]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、６２％）を２０ｍＬのエタノール（９５％）及び０．３５ｍＬの水と混合し、室温（２２℃）で２日間撹拌した。この溶液を０℃〜５℃に冷却し、撹拌しながらこの温度で４時間置いた。沈殿物をろ過し、含水エタノール（９５％、０℃）で洗浄し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８７％含有するステビオールグリコシド組成物３．２５ｇ（収率６５％）を得た。
【００７２】
実施例５
[0072]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、６２％）を２０ｍＬの無水エタノール及び１．０ｍＬのメタノールと混合し、室温（２２℃）で２日間撹拌した。この溶液を０℃〜５℃に冷却し、撹拌しながらこの温度で４時間置いた。沈殿物をろ過し、無水エタノール（０℃）で洗浄し、６０℃で２０時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを７７．６％含有するステビオールグリコシド組成物３．３２ｇ（収率６６．４％）を得た。
【００７３】
実施例６
[0073]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、４１％）を２０ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）と混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で１７時間撹拌した。この溶液を０℃〜５℃に冷却し、撹拌しながらこの温度で４時間置いた。沈殿物をろ過し、含水エタノール（９５％、０℃）で洗浄し、６０℃で４８時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８１．０％含有するステビオールグリコシド組成物１．８７ｇ（収率３７．２％）を得た。
【００７４】
実施例７
[0074]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５ｇ、４１％）を２０ｍＬの含水エタノール（９０％、２２℃）と混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で７２時間撹拌した。沈殿物をろ過し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８１．６２％含有するステビオールグリコシド組成物１．６５ｇ（収率３３％）を得た。
【００７５】
実施例８
[0075]  低純度レバウディオシドＡ組成物（１０ｇ、６２％）を５９．４ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）及び０．６ｍＬの水と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で２日間撹拌した。沈殿物をろ過し、含水エタノール（９５％、４℃）で洗浄し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを９０．６％含有するステビオールグリコシド組成物５．８２ｇ（収率５８．２％）を得た。
【００７６】
実施例９
[0076]  低純度レバウディオシドＡ組成物（１０．０ｇ、４６％）を３０ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で２日間撹拌した。沈殿物をろ過し、含水エタノール（９５％、５℃）で洗浄し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを７３％含有するステビオールグリコシド組成物４．４ｇ（収率４４％）を得た。
【００７７】
実施例１０
[0077]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５．０ｇ、５１％）を１２．５ｍＬの含水エタノール（９０％、２２℃）と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で１８時間撹拌した。この溶液を０℃〜５℃に冷却し、撹拌しながらこの温度で３時間置いた。沈殿物をろ過し、６０℃で２０時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８４．７２％含有するステビオールグリコシド組成物２．６ｇ（収率５２％）を得た。
【００７８】
実施例１１
[0078]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５．０ｇ、４６％）を１２．５ｍＬの含水エタノール（９０％、２２℃）と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で２４時間撹拌した。この溶液を０℃〜５℃に冷却し、撹拌しながらこの温度で４時間置いた。沈殿物をろ過し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを７８％含有するステビオールグリコシド組成物２．２４ｇ（収率４５％）を得た。
【００７９】
実施例１２
[0079]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５．０ｇ、６２％）を２５ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）と室温（２２℃）で１５分間混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で２４時間撹拌した。沈殿物をろ過し、含水エタノールで洗浄し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８３．４６％含有するステビオールグリコシド組成物２．３ｇ（収率４６％）を得た。
【００８０】
実施例１３
[0080]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５．０ｇ、４１％）を２５ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で４８時間撹拌した。沈殿物をろ過し、無水エタノール（４℃）で洗浄し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８０．０％含有するステビオールグリコシド組成物１．８５ｇ（収率３７％）を得た。
【００８１】
実施例１４
[0081]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５．０ｇ、５１％）を２０ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）及び０．１ｍＬの水と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で２４時間撹拌した。沈殿物をろ過し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８８．０％含有するステビオールグリコシド組成物１．８５ｇ（収率３７％）を得た。
【００８２】
実施例１５
[0082]  低純度レバウディオシドＡ組成物（５．０ｇ、４３％）を２０ｍＬの含水エタノール（９５％、２２℃）及び０．１ｍＬの水と室温（２２℃）で混合した。この溶液に実質的に純粋なレバウディオシドＡ（９９．０％超）をシーディングして、室温（２２℃）で７２時間撹拌した。沈殿物をろ過し、含水エタノール（９５％）で洗浄し、６０℃で２４時間真空乾燥させて、レバウディオシドＡを８５．８２％含有するステビオールグリコシド組成物１．３６ｇ（収率２７％）を得た。
【００８３】
[0083]  本発明を特定の実施形態に関して詳細に説明したが、上記内容を理解した当業者であれば、これらの実施形態の変更、変形及び同等物を容易に思い付くことができることを理解することができるだろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその同等物として評価されるべきである。
【図１】
2013516423.tif 000010
【国際調査報告】
2013516423.tif 000011
2013516423.tif 000012